СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ ПЕПТИДОВ
SEPARATION METHOD OF LOW-MOLECULAR PEPTIDES

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам выделения низкомолекулярных пептидов из сырья животного происхождения, которые могут служить в качестве биологически активных веществ при создании фармацевтических или косметических композиций.
Известно, что естественные низкомолекулярные пептиды с молекулярной массой до 15 кДа способны поддерживать гомеостаз организма, проявляя разнообразную активность - антибактериальную, противовирусную, антиоксидантную, регенеративную. Пептиды с молекулярной массой менее 3 кДа имеют повышенную биодоступность при наружном применении. Обзор литературы показывает, что в результате ограниченного протеолиза биологически активного белка - предшественника-гемоглобина образуются пептиды, модулирующие функции иммунной, нервной, эндокринной, сердечно-сосудистой и других систем организма [Малкова Н.В. Р-эндорфинподобный пептид иммунорфин: свойства и механизм действия. Дис.к.б.н., М., 2002. 121 с.].
В качестве прототипа принято описание изобретения «Способ выделения низкомолекулярных пептидов» к патенту RU 2416243, МПК A23J 1/20, опубликовано: 20.04.2011, бюл. №11.
Способ осуществляют следующим образом. Получают гидролизат ферментативным гидролизом молозивной казеиново-сывороточной массы с использованием 0,3-0,6 г панкреатина на 1 л гидролизуемой смеси в течение 3-4 часов и с коррекцией среды 25%-ным водным раствором аммиака. К полученному гидролизату добавляют 300 г сефадекса G-25, оставляют на 10 мин, смесь центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 минут. Надосадочный раствор удаляют, набухший гель элюируют дистиллированной водой, вновь центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 минут. Полученные жидкие фракции стерилизуют фильтрацией через мелкопористые фильтры с диаметром пор 0,2 мкм. Из одного литра гидролизата получают 118-123 мл фракции, содержащей низкомолекулярные пептиды с молекулярной массой от 3 до 15 кДа. Для получения сухой формы фракции подвергают лиофильному высушиванию. Наличие низкомолекулярных пептидов во фракции проверяют электрофорезом в ПААГ. В прототипе дано описание выделенных пептидных фракций (табл.1).
Таблица 1
Содержание низкомолекулярных пептидов в гидролизате молозивной казеиново-сывороточной массы (электрофорез в ПААГ)
%±m
Пептиды с молекулярной массой от 7 до 14 кДа
9,3±4,7
Пептиды с молекулярной массой от 3 до 7 кДа
54,3±14,0
Аминокислоты (молекулярная масса менее 3 кДа)
36,4±4,2
Данные табл.1 показывают, что использование предлагаемого способа выделения низкомолекулярных пептидов из гидролизатов молозивной казеиново-сывороточной массы позволяет получить пептиды с молекулярной массой от 3 до 14 кДа с преобладанием пептидов, имеющих молекулярную массу от 3 до 7 кДа.
Признаки изобретения, общие с прототипом, заключаются в наличии ферментативного гидролиза исходного сырья, центрифугировании с последующей стерилизующей фильтрацией полученной субстанции через мелкопористые фильтры с диаметром пор 0,2 мкм.
Недостатком прототипа является способ выделения пептидов с использованием сефадекса G-25, обладающего высокой селективностью по молекулярной массе и способного удерживать до элюции узкий спектр пептидов с молекулярной массой от 1 до 5 кДа, что приводит к удалению большей части низкомолекулярных пептидов с другой молекулярной массой вместе с надосадочной жидкостью после центрифугирования, снижая тем самым биологическую ценность гидролизата.
Задача, решаемая изобретением, заключается в повышении биологической активности пептидов.
Технический результат, обеспечивающий решение поставленной задачи, заключается в снижении молекулярной массы пептидов.
Технический результат достигается тем, что в способе выделения низкомолекулярных пептидов, включающем ферментативный гидролиз исходного сырья, центрифугирование с последующей стерилизующей фильтрацией полученной субстанции через мелкопористые фильтры с диаметром пор 0,2 мкм, согласно изобретению в качестве исходного сырья используют эритромассу крови доноров, которую предварительно подвергают гемолизу, вирусинактивации, инактивации фермента после ферментативного гидролиза, осветлению раствором перекиси водорода с конечной концентрацией 0,83% с последующим выдерживанием при 66°С в течение 15 мин.
Использование в качестве исходного сырья эритромассы крови доноров, включающей в свой состав широкий спектр низкомолекулярных пептидов, обеспечивает дальнейшую возможность их выделения в технологии. Осуществление операций гемолиза, вирусинактивации, инактивации фермента после ферментативного гидролиза и осветления позволяет выделить больший спектр низкомолекулярных пептидов и изготовить необходимую композицию на их основе.
Признаки изобретения, отличающиеся от прототипа, заключаются в использовании в качестве исходного сырья эритромассы крови доноров, которую предварительно подвергают гемолизу, вирусинактивации, инактивации фермента после ферментативного гидролиза, осветлению раствором перекиси водорода с конечной концентрацией 0,83% с последующим выдерживанием при 66 °С в течение 15 мин.
Способ осуществляют следующим образом.
В качестве сырья используют эритромассу крови доноров. Отобранная для переработки эритромасса должна пройти вирусологический контроль (HBS-антиген к вирусу гепатита В, антитела к вирусу гепатита С и ВИЧ отсутствуют), рН (6,81±0,23), содержание аминного азота (249,90±36,35) мг%. Физико-химические параметры могут варьироваться в зависимости от сезона кроводачи, возраста и пола донора.
3
Гидролизат получают ферментативным гидролизом предварительно гемолизированной и вирусинактивированной эритромассы крови доноров с 2% пепсина от исходного объема в течение 144 ч и с коррекцией среды (0,01-0,1)М раствором соляной кислоты до рН (1,5-2,0), инактивируют фермент, осветляют гидролизат раствором перекиси водорода с конечной концентрацией 0,83% с последующим выдерживанием при 66°С в течение 15 мин и осаждают балластные вещества методом центрифугирования при 1,3*10 об/мин в течение 15 мин. Полученную жидкую фракцию подвергают стерилизующей фильтрации через мелкопористые фильтры с диаметром пор 0,2 мкм. Определение молекулярной массы пептидов в гидролизате проводят методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). С 1 л исходного сырья эритромассы получают (100-110) г сухого вещества, что соответствует содержанию аминного азота (390-430) мг%, представленного низкомолекулярными пептидами, аминокислотами (табл.2).
Таблица 2
Содержание низкомолекулярных пептидов в гидролизате эритромассы (метод ВЭЖХ)
%±m
Пептиды с молекулярной массой от 4,5 до 6,0 кДа
89,00±1,20
Пептиды с молекулярной массой от 2 до 4,5 кДа
7,00±0,12
Мелкие пептиды и аминокислоты с молекулярной массой до 1,0 кДа
4,10±0,09
Данные таблицы 2 показывают, что использование предлагаемого способа выделения низкомолекулярных пептидов из эритромассы позволяет получить пептиды с молекулярной массой до 6,0 кДа с преобладанием пептидов, имеющих молекулярную массу от 4,5 до 6,0 кДа (до 90%). Нужно отметить, что при хроматографии образцов обнаруживаются пептиды с молекулярной массой от 2,0 до 4,5 кДа и до 1,0 кДа. Способ обеспечивает получение депротеинизированного раствора, содержащего спектр низкомолекулярных пептидов до 6 кДа, без потерь на фракционирование.