ЭФФЕКТИВНЫЙ ГИДРОЛИЗ ЛИГНОЦЕЛЛЮЛОЗЫ, СОВМЕЩЕННЫЙ С ВЫРАБОТКОЙ ФЕРМЕНТОВ
EFFICIENT LIGNOCELLULOSE HYDROLYSIS WITH INTEGRATED ENZYME PRODUCTION

Область техники, к которой относится изобретение
В настоящем изобретении предлагается способ биотехнологической выработки мономерных соединений, таких как сахара и/или этанол, из лигноцеллюлозного сырья.
Предшествующий уровень техники
2
Из-за ограниченных ресурсов минерального топлива и требований по уменьшению выбросов CO в химической индустрии осуществляется поиск более надежных производственных путей для изготовления ценных химических веществ, таких как жидкое топливо и продукты базовой химии. Часть стратегии сфокусирована на преобразовании лигноцеллюлозной биомассы в разнообразные химические вещества или топливо, такое как этанол. Лигноцеллюлозная биомасса содержит целлюлозу (~25-40% масс./масс. сух. вещ.), гемицеллюлозу (~15-25% масс./масс. сух. вещ.) и лигнин (~15-30% масс./масс. сух. вещ.) в качестве основных компонентов и минорные количества других углеводов, смол, белков и неорганических соединений. Конкретная композиция любого сырья может быть определена по описанию Sluiter et al., 2008. Среди форм растительной биомассы лигноцеллюлозная биомасса, полученная из любых отходов лесного и сельского хозяйства, такая как древесные отходы и солома зерновых, особенно подходит для преобразования в ценные химические вещества и топливо из-за их доступности, низкой стоимости и природощадящего производства. Кроме того, анализ жизненного цикла технологических процессов, использующих лигноцеллюлозное сырье, демонстрирует сниженный выброс парниковых газов по сравнению с процессами, основанными на другом сырье.
Были описаны различные варианты способов преобразования лигноцеллюлозной биомассы в этанол и другие продукты базовой химии (Pejo et al., 2008). Для реализации этих способов в промышленном масштабе особенно целесообразно перенести максимальное количество энергии, углерода и массы, содержащихся в возобновляемом сырье, в конечные продукты. В настоящее время ни один из описанных способов преобразования не был реализован в полной степени.
Типовыми процессами биотехнологического преобразования лигноцеллюлозного материала (например, соломы) в ценные продукты (например, этанол) являются: механическое размельчение, физико-химическая предварительная обработка, ферментативный гидролиз, ферментация и извлечение продукта.
Ключевой барьер в реализации выработки этанола из целлюлозы в промышленных масштабах заключается в эффективном по стоимости ферментативном гидролизе предварительно обработанной лигноцеллюлозы при высоких концентрациях твердых веществ.
Гидролиз целлюлозной фракции был идентифицирован как одно из основных препятствий в преобразовании лигноцеллюлозы в этанол. В настоящее время цена и эффективность ферментов, которые требуются для эффективного гидролиза биомассы, являются основными узкими местами.
Преобразование древесного или сельскохозяйственного лигноцеллюлозного материала в сахара и далее в этанол является сложным процессом, охватывающим несколько стадий, включая последовательные комбинации механического размельчения биомассы, гидротермической предварительной обработки, ферментативного или химического гидролиза биомассы, микробной ферментации гидролизатов биомассы и извлечение этанола дистилляцией или с помощью технологических эквивалентов.
Механическое размельчение биомассы
Типичные стадии размельчения включают механическую обработку, такую как резка, толчение или помол сырья, которые, как правило, требуют значительного потребления энергии и значимых производственных затрат. Сырье разрезают или толкут до частиц размером от 0,5 мм до 2 см, что дает однородную суспензию в водной фазе. Суспендирование частиц сырья в поддающуюся перекачке взвесь, которая может быть перенесена в дальнейшие типовые процессы, требует больших количеств воды, что вносит дополнительный вклад в производственные затраты способа (Tolan, 2002).
Предварительная обработка
Преобразование лигноцеллюлозного материала в продукты, такие как этанол, часто включает стадию физико-химической предварительной обработки. Цели предварительной обработки заключаются в удалении и отделении гемицеллюлозы от целлюлозы, в разрушении и удалении лигниновой оболочки, уменьшении кристалличности целлюлозы, увеличении доступной площади поверхности целлюлозы и/или увеличении размера пор целлюлозы для облегчения проникновения гидролизующих агентов (Tolan, 2002; Wyman et al., 2005). Стадия предварительной обработки предпочтительно мобилизует пентозную фракцию указанной биомассы, при этом также усиливает перевариваемость твердой целлюлозосодержащей фракции (Wyman et al., 2005).
2
4
3
4
4
Стадию предварительной обработки часто проводят с использованием водной взвеси. Предпочтительно такая взвесь имеет высокое содержание твердых веществ, на которые в сухой массе сырья приходится порядка 20-40% (масс./масс.). Способ предварительной обработки часто включает гидротермическую обработку биомассы под подвышенным давлением (~100-250°C) в отсутствие или в присутствии кислотных (т.е. HSO, HCl, HPO) или основных (т.е. NHOH, NaOH, KOH, извести) катализаторов, которые добавляются в концентрациях от 0,1 до 15% масс./масс. сырья (Kumar et al., 2009а; Kumar et al., 2009b; Kumar et al., 2009с, Wyman et al., 2005). Время реакции варьируется от 10 с до 2 ч для обеспечения эффективной трансформации компонентов биомассы при приготовлении к гидролизу и ферментации биомассы.
Альтернативные стратегии предварительной обработки включают мягкие гидротермические обработки с использованием органических растворителей или ионных жидкостей для уменьшения неподатливости биомассы и для солюбилизации лигнинового и целлюлозного компонентов биомассы. Эти последние варианты предварительной обработки часто имеют более высокую цену и ограниченную эффективность.
Chandra et al. (2007) пишут, что гидротермическая предварительная обработка в отсутствие или в присутствии разведенной кислоты является предпочтительным способом уменьшения неподатливости биомассы для гидролиза, поскольку данный способ придает подвижность гемицеллюлозе и частично деполимеризует лигнин без солюбилизации. Кроме того, данный способ в результате дает аморфные волокна целлюлозы с большой площадью поверхности, которая идеальная для ферментативного гидролиза.
В зависимости от природы катализаторов и примененного профиля температуры, предварительная обработка также может привести к образованию растворимых ингибиторов, включая уксусную кислоту, сахар (например, фурфурол, HMF) или продукты деградации лигнина, которые могут уменьшать эффективность дальнейших процессов гидролиза и ферментации (Margeot et al., 2009). Для увеличения эффективности гидролиза и ферментации надосадочную жидкость после предварительной обработки необходимо отбрасывать или ее необходимо детоксифицировать (Tolan, 2002).
Гидролиз предварительно обработанной биомассы
Распад взвеси предварительно обработанной биомассы в ферментируемые мономерные сахара может быть выполнен гидролизом либо с помощью кислоты, либо с помощью ферментов. Ферментативный гидролиз является более селективным и менее энергоемким, чем сравнимые химические (например, на основе кислоты) методологии, следовательно, обеспечивая более благоприятные экономические показатели процесса и потенциально более высокий выход этанола в ходе ферментации.
Ферментные системы и смеси более чем одной ферментативной активности
В этом смысле подходящими ферментными системами являются ферментные системы, которые преобразуют полимерные сахара, такие как целлюлоза и гемицеллюлоза, в мономеры гексоз (т.е. в глюкозу) и пентоз (т.е. в ксилозу), как правило, содержащие активности целлюлаз, гемицеллюлаз и бета-глюкозидаз. Ферментные системы, содержащие активности целлюлаз и бета-глюкозидаз, часто получают в погруженных культурах грибов, например, Trichoderma sp. и/или Aspergillus sp. Остаток грибной биомассы, как правило, отделяют от ферментационной среды и отбрасывают. Ферментационную среду затем концентрируют, стабилизируют и для транспортировки изготовляют из нее продукт с полученными ферментами.
Ферментативных гидролиз биомассы, как правило, проводят в условиях, при которых общая дозировка фермента составляет 1-5% масс./масс. (10-20 FPU/г целлюлозы) сырья. В зависимости от режима дозирования и конкретного состава ферментов прикладной ферментной системы, биомасса гидролизуется при температуре 40-55°C в течение 1-7 дней. Вплоть до примерно 80-90% масс./масс. полимерных сахаров, содержащихся в биомассе, преобразуются в их соответствующие мономеры.
Согласно Kristensen et al. (2009) ферментативный гидролиз биомассы часто проводят при более низком содержании твердых веществ 10-20% масс./масс. Содержание сухого вещества выше 15% масс./масс. часто приводит к значимым потерям в выходе мономерных сахаров. Этот эффект обусловлен проблемами, связанными с гомогенным перемешиванием взвесей с высоким содержанием твердых веществ, приводящим к неравномерному распределению ферментов. Кроме того, накопление конечных продуктов, таких как целлобиоза и глюкоза, высвобожденных в процессе ферментативного гидролиза, может привести к специфическому ингибированию активностей целлюлаз и бета-глюкозидаз (Xiao et al., 2004a).
Cardona & Sanchez (2007) описывают применение предварительно обработанной надосадочной жидкости и/или полученных ранее гидролизатов биомассы в качестве субстрата для роста и индукции при выработке ферментов грибами. Howard et al. (2003) описывают прямое применение истощенной жидкой ферментационной среды после грибной ферментации для гидролиза. Rao et al. (1985) описывают использование цельной взвести грибной ферментации для эффективного гидролиза целлюлозных субстратов. Для выработки гидролитических ферментов использовали искусственные среды, которые не позволяли адаптировать системы гидролитических ферментов для конкретного сырья и/или для варианта предварительной обработки. Другой недостаток способа, описанного Rao et al. (1985), заключается в том, что способ ограничен секретируемыми ферментными активностями, так как ничего не предпринимается для облегчения высвобождения несекретируемых или связанных с клеточной поверхностью ферментов.
При использовании для гидролиза биомассы ферментных систем, полученных из Trichoderma, активности внеклеточных бета-глюкозидаз зачастую являются скорость- и выход-лимитирующими из-за их относительно низкой удельной активности и значимого ингибирования конечным продуктом, глюкозой, высвобожденной в ходе процесса (Xiao et al., 2004a, Shewale, 1982).Следовательно, препараты или смеси целлюлаз, как правило, дополняются альтернативными бета-глюкозидазными (BGL) активностями, которые продуцируются, например, Aspergillus niger (Seidle et al., 2004). Стандартные режимы дозировок для препаратов BGL рекомендуют добавление от 0,01 до 2 единиц целлобиазы (CBU) на г целлюлозы для улучшения кинетики гидролиза и увеличения выхода мономерных Сахаров (Chauve et al., 2010).
Альтернативные стратегии устранения технической проблемы гидролиза биомассы при более высоких концентрациях твердых веществ включают способы, в которых ферментативный гидролиз и ферментацию проводятся одновременно (SSF).
Ферментация этанола
Промышленное производство этанола традиционно проводят с помощью дрожжей S. cerevisiae. He так давно для эффективного использования сахаров, полученных из сырого лигноцеллюлозного материала, которые не являются глюкозой, были разработаны новые микробные штаммы (либо дрожжей, либо бактерий). Использование пентоз и всех гексоз улучшает экономику производства этанола.
Извлечение продукта
Этанол, как правило, извлекается из ферментационной среды с помощью известных способов дистилляции и/или ректификации.
Проблема, которая должна быть решена
Обычные способы деградации биомассы являются либо неэффективными, либо зависят от требующего времени и затрат добавления отдельно выработанных ферментов или ферментных смесей, которые подходят для деградации конкретной биомассы. Следовательно, задача настоящего изобретения заключается в обеспечении улучшенного способа деградации биомассы, такой как лигноцеллюлозная биомасса, в обход этих недостатков.
Сущность изобретения
В настоящем изобретении предлагается способ деградации предварительно обработанной лигноцеллюлозной биомассы, включающий стадии:
с) культивирования микроорганизма, способного вырабатывать по меньшей мере один фермент, обладающий целлюлолитической и/или гемицеллюлолитической активностью в ростовой среде, с получением посредством этого обогащенной микроорганизмом суспензии, содержащей указанный по меньшей мере один фермент;
d) обработки микроорганизма и/или обогащенной микроорганизмом суспензии стадии с);
е) гидролиза предварительно обработанной биомассы продуктом стадии d) в реакторе для получения растворимых сахаров.
В некоторых случаях предварительно обработанная лигноцеллюлозная биомасса была получена из лигноцеллюлозной биомассы с помощью физико-химической обработки. Существует возможность того, что ростовая среда стадии с) содержит лигноцеллюлозную биомассу, которая предварительно была обработана. В частном воплощении вышеуказанного, конечная ростовая среда, в которой культивируется микроорганизм, содержит часть предварительно обработанной взвеси так, чтобы способ деградации лигноцеллюлозной биомассы включал стадии:
a) физико-химической предварительной обработки лигноцеллюлозной биомассы для получения предварительно обработанной взвеси;
b) разделения предварительно обработанной взвеси стадии а) на две части, часть А и часть В;
c) включения части А в сырую ростовую среду для получения конечной ростовой среды, и культивирование по меньшей мере одного микроорганизма, способного продуцировать по меньшей мере один фермент, имеющий целлюлолитическую и гемицеллюлолитическую активность в конечной ростовой среде, с получением посредством этого обогащенной микроорганизмом суспензии, содержащей указанный по меньшей мере один фермент;
d) обработки микроорганизма и/или обогащенной микроорганизмом суспензии стадии с);
е) гидролиза биомассы части В и продукта части d) в реакторе для получения растворимых сахаров.
Грибы являются предпочтительными микроорганизмами в стадии с). Обработка стадии d) может происходить физически, или механически, или химически, или с помощью комбинации вышеуказанного. Растворимые сахара, полученные в стадии е), необязательно могут быть подвергнуты дальнейшим способам преобразования, таким как выработка этанола. С этой целью может быть проведено разделение на твердую фазу/жидкую фазу так, чтобы получить обогащенную сахаром жидкую фазу, содержащую растворимые сахара.
В настоящем изобретении предлагается улучшенный способ гидролиза лигноцеллюлозной биомассы. В текущем изобретении описан способ гидролиза и ферментации для производства этанола из остатков лигноцеллюлозной биомассы (пример которого показан на Фиг.1), который включает эффективное использование ферментов, вырабатываемых совместно с ним.
Согласно настоящему изобретению, выработка гидролитических ферментов включена в данный процесс, предпочтительно в непосредственной близости процесса гидролиза. Затем полную ферментационную взвесь, содержащую растворимые ферментные системы и грибную биомассу, использует для гидролиза лигноцеллюлозного сырья в составляющие сахара. Совместная выработка указанных ферментных систем с помощью части предварительно обработанного сырья в качестве ферментационной среды обуславливает оптимальную гибкость вариантов сырья и предварительной обработки.
В ключевом аспекте изобретения неожиданно было обнаружено, что физическая, или механическая, или химическая обработка микробной биомассы, в частности механическая фрагментация грибной биомассы перед ферментативным гидролизом, будет приводить к ускорению кинетики гидролиза и превосходному выходу мономерных сахаров (например, глюкозы) по сравнению с использованием ферментационной надосадочной жидкости или питательной среды без обработки микробной биомассы или с помощью только компонентов растворимых гидролитических ферментов, содержащихся в очищенной надосадочной жидкости ферментационной питательной среды.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение охватывает улучшенный способ деградации биомассы, такой как лигноцеллюлозная биомасса. Биомасса, которая подвергается обработке способом по настоящему изобретению, может быть биомассой, описанной ниже. К таковой относится биомасса, содержащая большие частицы или куски, такие как древесные отходы, кукурузная солома, жом сахарного тростника, солома злаков, и, следовательно, механическое размельчение необязательно может быть проведено до осуществления конкретного способа настоящего изобретения.
В ином случае основная часть частиц биомассы, например 90% или большее количество частиц, достаточно малы и могут быть обработаны в суспензии (взвеси), т.е. они имеют диаметр не больше чем 2 см, предпочтительно не больше чем 0,5 см, более предпочтительно не больше чем 2 мм, так что механическое размельчение не требуется. Однако, в случае проведения размельчения, его проводят следующим образом.
Механическое размельчение
Согласно предпочтительному воплощению изобретения, любая лигноцеллюлозная биомасса будет подвергнута грубому размельчению с использованием устройства, такого как молот, или шаровая мельница, или дробилка, или любого другого типа, или комбинаций таких аппаратов, подходящих для разрезания остатков биомассы на куски, в которых 90% или большее количество частиц имеет диаметр не больше чем 2 мм, что приводит к получению биомассы с малым размером частиц.
Предварительная обработка
Цель предварительной обработки заключается в дестабилизации и/или частичном гидролизе полимерных структур (малых частиц) биомассы. Биомасса, которую подвергают предварительной обработке, как правило, является сухой, т.е. не суспендированной в жидкой фазе. Эту биомассу затем переносят в реакционный сосуд с помощью любой системы транспортировки, известной в данной области, такой как, например, конвейерная лента или винтовой транспортер. Состоящую из мелких частиц биомассу переносят в устойчивый к давлению сосуд и затем подвергают предварительной обработке.
Продукт стадии предварительной обработки синонимично называют «взвесью», или «предварительно обработанной биомассой», или «предварительно обработанной лигноцеллюлозной биомассой», или «взвесью предварительно обработанной биомассы».
2
4
2
3
3
4
2
2
4
Предварительная обработка может быть химической предварительной обработкой, т.е. обработкой с помощью кислоты или щелочи. Предпочтительно, такая обработка может быть проведена в присутствии кислотного катализатора, который в неограничивающем примере может быть выбран из числа HSO, HNO, HCl, HPO, SO. В особенно предпочтительном воплощении кислота представляет собой HSO. Кислотный катализатор может быть применен в концентрациях 0-10% масс./масс. сух. вещ. сырья. В более предпочтительном воплощении изобретения концентрацию кислоты корректируют до 0,1-3% масс./масс. сух. вещ. сырья.
В ином случае предварительная обработка может быть термической обработкой, например экспонированием температурой выше 80°C. Однако наиболее предпочтительно, если химическая и термическая обработки объединены. В еще более предпочтительном воплощении изобретения гидротермическая предварительная обработка может быть проведена либо при атмосферном давлении, либо при давлении выше атмосферного. Предварительная обработка в присутствии кислотного катализатора также может представлять собой введение горячего пара под давлением, дающего температуры от 120 до 250°C. В этих условиях биомасса может быть предварительно обработана в интервале от 0,1 до 60 мин перед дальнейшим процессированием и необязательной стадией нейтрализации, которые могут представлять собой внесение извести или любой другой щелочи так, чтобы рН реакционной среды стал равен 3,5-6.
В другом аспекте изобретения механическое размельчение и предварительная обработка могут быть проведены одновременно: в данном случае предпочтительно сухую биомассу транспортируют в сосуд для предварительной обработки, где она в это время контактирует с водой. Гидротерминческая предварительная обработка может быть механически объединена со стадией размельчения из биомассы, так чтобы предварительную обработку можно было провести в периодическом или непрерывном режиме. В качестве неограничивающего примера режима непрерывной предварительной обработки, можно привести предварительную обработку, проводимую в закрытом устойчивом к давлению сосуде, оборудованном механизмом винтового конвейера.
В другом предпочтительном воплощении изобретения гидротермическую предварительную обработку проводят в режиме парового взрыва, при котором биомассу подвергают инъекции горячего пара выше атмосферного давления. Индуцированное паром давление предпочтительно будет составлять 1-30 атм (120-250°C), которому указанная биомасса будет подвергаться в течение 0,1-60 мин. После этого давление в реакционном сосуде резко снижают посредством переноса предварительно обработанной биомассы в во вторичный сосуд для сбора. Неограничивающим примером реакционного сосуда для проведения предварительной обработки паровым взрывом может быть реактор - паровой генератор (Autoclave Engineers, Эри, Пенсильвания), состоящий из реактора с паровой рубашкой, состоящей из трубы «Hastelloy», закрытой двумя шаровыми клапанами. Ассоциированные электрические нагреватели, расположенные на всех открытых, не покрытых рубашкой поверхностях реактора, контролируют заданную температуру предварительной обработки. Прямая инъекция пара также используется для быстрого придания биомассе температуры предварительной обработки. Для поддержания искомой температуры предварительной обработки давление пара корректируется и контролируется. Все предварительно обработанные материалы выходят через сменный мундштук на дне реактора и собираются в нейлоновой сумке, поддерживаемой толстостенным испарителем с рубашкой и охлаждением.
Предпочтительно, если время и температуру обработки будут выбирать таким образом, чтобы максимальное количество составляющих биомассы гидролизовалось до составных мономеров наиболее эффективным и экономичным способом без выработки значимых количеств продуктов деградации, таких как фурфурол.
Обычно фракция лигнина предварительно обработанного сырья будет находится в диапазоне 10-70% масс. лигнина/масс. сух. вещ. предварительно обработанного сырья. Содержание лигнина предварительно обработанного сырья может быть измерено способами, известными в специалистам в данной области, такими как, например, без ограничения перечисленным, те что, описаны в: http://www.nrel.gov/biomass/analytical_procedures.html.
После указанных вариантов предварительной обработки содержание сухого твердого вещества полученной взвеси биомассы будет составлять около 10-50% масс./масс. сух. вещ. сырья. Первичная цель выбранной стратегии предварительной обработки заключается в выборе наиболее энергетически эффективного и рентабельного способа, с помощью которого лигноцеллюлозная биомасса будет приготовлена так, чтобы большая часть пентозной фракции солюбилизировалось, а целлюлозные волокна были доступны для ферментных систем, используемых в дальнейших гидролитических процессах. Перенос биомассы в конкретные типовые процессы будет осуществляться откачкой или исключительно самотеком.
Базовый способ настоящего изобретения
В настоящем изобретении предлагается способ деградации предварительно обработанной лигноцеллюлозной биомассы, включающий стадии:
c) культивирования микроорганизма, способного вырабатывать по меньшей мере один фермент, обладающий целлюлолитической и/или гемицеллюлолитической активностью в ростовой среде, с получением посредством этого обогащенной микроорганизмом суспензии, содержащей указанный по меньшей мере один фермент;
d) обработки микроорганизма и/или обогащенной микроорганизмом суспензии стадии с);
е) гидролизу предварительно обработанной биомассы продуктом стадии d) в реакторе для получения растворимых сахаров.
Предпочтительно, чтобы в этом способе предварительно обработанная лигноцеллюлозная биомасса была получена из лигноцеллюлозной биомассы с помощью физико-химической обработки, такой как предварительная обработка, описанная выше.
В особенно предпочтительном воплощении изобретения ростовая среда стадии с) содержит лигноцеллюлозную биомассу, которая предпочтительно была предварительно обработана. Различные ферментные активности, такие как, без ограничения перечисленным, целлюлолитические и гемицеллюлолитические активности, вместе образуют ферментную систему, т.е. ферментные системы являются смесями более чем одной ферментативной активности. Более чем одна из этих активностей в некоторых случаях может содержаться в одной и той же полипептидной молекуле, однако, более типично, если ферментная система содержит смесь нескольких, например больше чем двух, т.е. больше чем трех, различных ферментных полипептидов, где каждый имеет по меньшей мере одну искомую активность, так что объединенные активности образуют ферментную систему.
Способы и системы, описанные данным изобретением, отличаются от замыслов предшествующего уровня техники. В настоящем изобретении предлагаются совместная выработка ферментов, где последовательно для гидролиза биомассы используются предварительно обработанная биомасса и суспензия микроорганизма, полученная в стадии d). Неожиданно было показано, что присутствие надосадочной жидкости предварительной обработки не оказывает влияния на дальнейшие процедуры гидролиза и ферментации. Кроме того, к удивлению было показано, что применение цельной ферментационной взвеси, содержащей мицелий и надосадочную жидкость, полученные при выработке фермента, демонстрирует превосходную эффективность при гидролизе биомассы по сравнению с только лишь надосадочной жидкостью, полученной при выработке фермента, или по сравнению со сравнимыми коммерческими ферментными препаратами. Кроме того, продемонстрировано, что физическая, и/или механическая, и/или химическая обработка микроорганизма согласно стадии d) обеспечивает оптимальную активацию ферментных систем экстра- и внутриклеточного гидролиза, которые действуют синергично в дальнейших гидролитических процессах, что приводит к оптимальной деградации лигноцеллюлозного сырья в мономерные сахара, такие как глюкоза и ксилоза.
Выработка ферментов (стадия с)
Выработка ферментов согласно стадии (с) характеризуется следующим: взвесь предварительно обработанной лигноцеллюлозной биомассы в первой стадии инокулируется микроорганизмом, который может быть микроорганизмом, относящимся к бактериям, археям, дрожжам или грибам, который способен обеспечивать целлюлолитические и/или гемицеллюлолитические ферментативные активности. Целлюлолитическая активность является активностью, способной деградировать, например гидролизовать, целлюлозу, например способна гидролизовать некоторые или все гликозидные связи в ней. Гемицеллюлолитическая активность является активностью, способной деградировать, например гидролизовать, гемицеллюлозу, например способна гидролизовать некоторые или все гликозидные связи в ней. Строительные блоки гемицеллюлозы включают ксилан, глюкуроноксилан, арабиноксилан, глюкоманнан и ксилоглюкан.
В неограничивающем примере указанные ферментативные активности включают экзо- и эндоцеллюлазы (т.е. целлобиогидролазу (СВН) I, II, эндоглюканазу (EG) I-IV, бета-глюкозидазу (BGL), экзо- и эндогемицеллюлазы (т.е. ксиланазу, ксилозидазу, ксилобиазу, арабиназу, арабинофукозидазу, маннаназу, маннозидазу, галактазу и галактозидазу) и эстеразы (Howard et al., 2003, Lynd et al., 2002). Таким образом, изобретение включает предпочтительное воплощение, в котором по меньшей мере один фермент с целлюлолитической и/или гемицеллюлолитической активностью имеет одну или несколько активностей, выбранных из группы, состоящей из целлобиогидролазы I типа или II типа (СВН I или СВН II), эндоглюканазы типов I, II, III и IV (EGI, EGII, EGIII, EGIV), бета-глюкозидазы (BGL), эстеразы, экзогемицеллюлазы и эндогемицеллюлазы. Еще более предпочтительно, если экзогемицеллюлазу и эндогемицеллюлазу преимущественно выбирают из ксиланазы, ксилобиазы, арабиназы, арабинофукозидазы, мананназы, маннозидазы, галактазы и галактозидазы.
Неограничивающие примеры бактерий, обеспечивающих указанные ферментные активности, которые, следовательно, могут быть использованы согласно настоящему изобретению, включают Actinobacter sp., Agrobacterium sp., Bacillus sp., Burkholdria sp., Clostridia sp., Caldicellulosiruptor sp., Cellvibrio sp., Halobacterium sp., Pseudomonas sp., Paenibacillus sp., Xanthomonas sp. и Thermobifida sp. (Howard et al., 2003, Maki et al., 2009).
Неограничивающие примеры архей, обеспечивающих указанные ферментные активности, которые, следовательно, предпочтительно могут быть использованы согласно настоящему изобретению, включают Pyrochoccus sp.; Sulphobolus sp., Staphylothermus sp. и Thermococcus sp. (Maki et al., 2009).
Грибы, в целом, являются наиболее предпочтительными микроорганизмами для настоящего изобретения. Способ по данному изобретению предпочтительно может быть проведен так, чтобы микроорганизмом являлся гриб, который предпочтительно выбирают из группы, состоящей из: Trichoderma sp., Aspergillus sp., Penicillium sp. и Talaromyces sp. Неограничивающие примеры грибов, обеспечивающих указанные ферментные активности, которые могут быть, следовательно, предпочтительно использованы согласно настоящему изобретению, включают Aspergillus sp., Chaetomium sp., Chrysosporium sp., Fusarium sp., Humicola sp., Orpinomyces sp., Pencillium sp., Phanerochaete sp., Piromyces sp., Talaromyces sp., Trametes sp. и Trichoderma sp. или их соответствующие голоморфы (Howard et al., 2003). Особенно предпочтительным является гриб, выбранный из Trichoderma sp. и Talaromyces sp.
Выбор продуцирующего фермент организма может быть определен углеводной композицией предварительно обработанной сырьевой взвеси, количеством ферментных активностей, свойственных конкретным организмам, и биофизическими характеристиками, охватывающими параметры, такие как температурная стабильность, селективность субстрата, удельная активность и устойчивость к ингибиторам.
Для индукции выработки ферментов указанные микроорганизмы будут инкубироваться при подходящей для роста температуре, которая может, как правило, варьироваться от 14 до 102°C, предпочтительно в диапазоне 28-102°C, в зависимости от используемого микроорганизма. Время инкубации до начала выработки фермента может варьироваться значительным образом в зависимости от типа микроорганизма (Lynd et al., 2002), а предварительно обработанное сырье может быть протестировано способами, описанными Xiao et al. (2004b) или Bobey and Ederer (1981).
600
В предпочтительном аспекте настоящего изобретения, выработка фермента достигается с помощью гиперпродуцирующего целлюлазу штамма мицелиального гриба Trichoderma reesei (анаморф: Hypocrea jecornia). Неограничивающим примером такого организма является штамм Rut-С30 Trichoderma ressei (Lynd et al., 2002, Szijarto et al., 2004). В еще одном предпочтительном аспекте изобретения грибные ферментные системы вырабатываются на предварительно обработанной биомассе, в качестве единственного значимого источника углерода. Предпочтительно это осуществляется с грибами, такими как Trichoderma reesei. Стартовые культуры Trichoderma reesei могут быть выращены на предварительно обработанной взвеси до начала спорообразования, что можно количественно оценить с помощью способов, таких как спектрофотометрические измерения при OD нм. Гриб затем выращивают в течение 3-7 дней в условиях постоянного перемешивания при 50-250 об/мин, рН, температуры, а также в условиях контроля кислорода. Для получения максимального количества фермента и биомассы критичной является инкубация гриба при 30°C и при рН~5 в течение всей ферментации. На 5 день, как правило, достигается максимальная выработка биомассы и фермента, что позволяет продолжить обработку.
Ростовая среда, как правило, содержит источник углерода, источник азота, необязательно витамины и микроэлементы. Источник углерода предоставляется в количестве 1-30% масс./об., более предпочтительно 1-10% масс./об. и еще более предпочтительно 1-8% масс./об. среды для культивирования. Источники углерода могут содержать нативную или предварительно обработанную лигноцеллюлозную биомассу, такую как дерево, солому зерновых, жмых, просо и целлюлозу, и сырую бумажную пульпу, полученную в целлюлозно-бумажном производстве. Альтернативные источники углерода могут содержать очищенную целлюлозу, пульпу, молочную сыворотку, мелассу или сахара, такие как глюкоза и лактоза. Может быть использована комбинация источников углерода, в которой одним источником углерода является продукт стадии b) или ее эквивалентов, а дополнительным источником углерода является что-либо из описанного выше в данном абзаце. Источник азота предоставляется в количестве 0,1-10% масс./об., более предпочтительно 0,1-8% масс./об. и даже более предпочтительно 0,1-4% масс./об. среды для культивирования. Источники азота включают соевый экспеллерный жмых, жидкий кукурузный экстракт, дрожжевой экстракт, зеленую муку (молотую траву), пшеничные отруби, барду и неорганические соли аммония. Витамины и микроэлементы могут быть предоставлены в количестве 0-5% масс./об., более предпочтительно, 0,001-1% масс./об. среды для культивирования. Минералы, обогащающие среду для культивирования, могут включать соли Fe, Mn, Zn и Со, тогда как витамины, добавляемые в среду для культивирования, могут включать комплексы витамина В, биотин, коальбумин.
Точные композиции сред для культивирования и физические условия для эффективного роста продуцентов ферментов-целлюлаз известны специалистам в данной области. Конечный отбор ростовой среды будет зависеть от используемого микроорганизма.
В предпочтительном воплощении изобретения, как биомасса микроорганизма, так и истощенная среда для ферментации, содержащая остаточную лигноцеллюлозную биомассу и основную часть ферментных активностей целлюлаз и гемицеллюлоаз, будут использованы в дальнейшей стадии обработки биомассы.
В настоящем изобретении, к удивлению, было установлено, что значимые пропорции активностей целлюлаз и гемицеллюлаз сохраняются на остаточной предварительно обработанной сырьевой биомассе и продуцируемой грибной биомассе.
Еще более интересной оказалась демонстрация того, что гидролиз биомассы был более эффективен при использовании цельной фермент-содержащей взвеси (надосадочной жидкости и мицелия/биомассы) по сравнению с экспериментами, в которых для гидролиза использовали только содержащую фермент надосадочную жидкость или коммерческие препараты ферментов.
Это необязательно может быть достигнуто разделением взвеси биомассы, полученной предварительной обработкой на два потока, так чтобы одна часть подвергалась стадии с), а другая напрямую направлялась на стадию е). Авторы с удивлением обнаружили, что часть предварительно обработанной биомассы может быть подвержена воздействию ростовой среды микроорганизма. Понятно, что таким образом микроорганизм способен продуцировать ферменты, подходящие для деградации предварительно обработанной биомассы. Поэтому в настоящем изобретении также предлагается в пределах предпочтительного воплощения способ деградации лигноцеллюлозной биомассы, включающий стадии:
а) физико-химической предварительной обработки лигноцеллюлозной биомассы для получения предварительно обработанной взвеси;
b) разделения предварительно обработанной взвеси стадии а) на две части, часть А и часть В;
c) включения части А в сырую ростовую среду для получения конечной ростовой среды и культивирование по меньшей мере одного микроорганизма, способного продуцировать по меньшей мере один фермент, имеющий целлюлолитическую и гемицеллюлолитическую активность в конечной ростовой среде, с получением посредством этого обогащенной микроорганизмом суспензии, содержащей указанный по меньшей мере один фермент;
d) обработки микроорганизма и/или обогащенной микроорганизмом суспензии стадии с);
е) гидролиза биомассы части В и продукта части d) в реакторе для получения растворимых сахаров.
Блок-схема способа представлена на Фигуре 1.
В предпочтительном воплощении данного способа часть А является меньшей частью предварительно обработанной взвеси, полученной в стадии а), которая, предпочтительно, составляет от 1 до 20% (массы сухого твердого вещества), более предпочтительно от 1 до 5% (массы сухого твердого вещества) и наиболее предпочтительно от 1 до 5% (массы сухого твердого вещества). Твердое вещество является твердотельными частицами, т.е. частицами, которые не солюбилизируются в жидкой фазе в условиях, используемых в способе.
Обработка микроорганизма (стадия (d)
Неожиданно было установлено, что физическая, и/или механическая, и/или химическая обработка ферментационной взвести в стадии d) перед стадией гидролиза е) и оказания воздействия на обработанный продукт стадией е) будет улучшать кинетику гидролиза биомассы, что приведет к более высокому выходу растворимых сахаров (Фигура 2). Подразумевается, что более высокий выход растворимых сахаров может быть получен после 72 ч в условиях, описанных в примере 4, при оказании воздействия стадии d) на продукт стадии с), а не в случае, когда стадия d) опускается. В документах предшествующего уровня техники (Rao et al., 1985) такая обработка не описана. Контрольные эксперименты, в который коммерческий препарат целлюлазы (Celluclast, «Novozymes», Дания) / BGL (Novo 188, «Novozymes», Дания) был механически обработан перед гидролизом лигноцеллюлозы, не привели к улучшению кинетики гидролиза лигноцеллюлозы или к более высокому выходу растворимых сахаров.
В одном воплощении микроорганизм, полученный на стадии культивирования с), выделяют после стадии культивирования, например, центрифугированием или с помощью других процедур, хорошо известных в данной области. В данном воплощении выделенный микроорганизм подвергают воздействию стадии d). Однако, в альтернативном и более предпочтительном воплощении изобретения, цельная содержащая микроорганизм суспензия, т.е. продукт культивирования стадии с), содержащий микроорганизм и ростовую среду, физически, и/или механически, и/или химически обрабатывается перед гидролизом биомассы. Использование для гидролиза биомассы содержащей микроорганизм суспензии, а не только надосадочной жидкости содержащей микроорганизм суспензии, позволяет более эффективно дозировать фермент в дальнейших процессах гидролиза биомассы, что, к своему удивлению, обнаружили авторы изобретения. Обработка может быть физической, механической, химической или их комбинацией.
В предпочтительном осуществлении изобретения на практике содержащую микроорганизм суспензию подвергают перемешиванию при повышенных скоростях ротора в ферментационном сосуде. В еще одном предпочтительном осуществлении данного изобретения на практике содержащую микроорганизм суспензию закачивают и фрагментируют в трубопроводе, содержащем гомогенизатор «ultrathorax». Любое из этих воплощений может быть особенно полезным, если микроорганизмом является гриб, так что обработка включает обработку грибного мицелия.
3
3
3
Механическую обработку можно провести следующим образом: можно оказать на микроорганизм или суспензию микроорганизма воздействие с затратами энергии на единицу объема 1-500 кВт/м, более предпочтительно - 1-200 кВт/м и еще более предпочтительно 1-100 кВт/м, предпочтительно длительностью 0,1-60 мин, более предпочтительно 1-30 мин, еще более предпочтительно 1-10 мин.
Механическая обработка может быть выбрана из обработки миксером, обработки гомогенизатором и обработки мельницей. Такая механическая обработка может оказывать механическое сдвиговое напряжение или дробящую силу на микроорганизм и может разрывать или разрушать клеточные мембраны и/или клеточные стенки или грибной мицелий или его части. Несколько таких обработок могут быть объединены друг с другом. Разрыв или разрушение клеточных структур, таких как клеточные мембраны и/или клеточные стенки или грибной мицелий или его части, может быть проверено способами, хорошо известными специалистам в данной области, например микроскопией.
В предпочтительном осуществлении данного изобретения на практике содержащую микроорганизм суспензию обрабатывают, т.е. фрагментируют при повышенной скорости импеллера в конце цикла выработки фермента.
Эффективность механического процесса контролируется относительным градиентом энергии, примененной к биомассе микроорганизма в реакционном сосуде.
В ином случае сдвиговое напряжение, которое приводит к увеличению активности гидролитических ферментов, может быть индуцировано закачиванием содержащей микроорганизм ферментационной взвести из сосуда для ферментации в сосуд для гидролиза. Содержащую микроорганизм взвесь можно закачать и фрагментировать в трубопроводе. Таким образом, микроорганизм может быть фрагментирован. В единицах скоростей сдвига на содержащую микроорганизм взвесь оказывают воздействие при 1600-50000 1/с, более предпочтительно 1600-27000 1/с, а еще более предпочтительно 1600-10000 1/с. Эта обработка подходит для индукции и повышения активности гидролитических ферментов. Эту обработку можно провести в течение периода времени от 0,01 до 100 с.
В ином случае содержащая микроорганизм взвесь может быть гомогенизирована при высоком давлении, или обработана ультразвуком, или обработана другими устройствами, известными специалистам в данной области как индуцирующие высокое напряжение сдвига, такими как «Ultraturax». В предпочтительном осуществлении изобретения на практике содержащую микроорганизм взвесь подвергают перемешиванию при повышенных скоростях ротора в ферментационном сосуде. В еще одном предпочтительном осуществлении изобретения на практике содержащую микроорганизм суспензию закачивают в трубопровод. Таким образом, микроорганизм может быть фрагментирован. В единицах скоростей сдвига на содержащую микроорганизм взвесь оказывают воздействие при 1600-50000 1/с, более предпочтительно 1600-27000 1/с, а еще более предпочтительно 1600-10000 1/с, для индукции увеличения гидролитической активности фермента в течение периода времени от 0,01 до 100 с.
3
Читателю будет понятно, что изобретение включает конкретную комбинацию значений, описанных в данном документе. Например, любую конкретную скорость сдвига или диапазон скоростей сдвига, описанных в данном документе, следует понимать как конкретно описанную вместе с любым конкретным временем осуществления такой обработки (мин. или с), описанным в данном документе. Также, любое воздействие с затратами энергии на единицу объема или диапазон воздействий с затратами энергии на единицу объема, описанных в данном документе, следует понимать как конкретно описанную вместе с любым конкретным временем применения такого воздействия (мин или с), описанным в данном документе. Также частью изобретения являются те из воплощений, в которых продукт воздействия с затратами энергии на единицу объема (кВт/м) и время (мин) эквивалентны любому продукту, описанному в данном документе. Также частью изобретения являются те из воплощений, в которых продукт скорости сдвига (1/с) и время (с) эквивалентны любому из продуктов, описанных в данном документе.
В конкретном воплощении изобретения методологии механического или химического лизиса объединяются, что повышает эффективность каждого из способов.
В конкретном осуществлении изобретения на практике микроорганизм или содержащую микроорганизм суспензию смешивают с поверхностно-активным веществом, наиболее предпочтительно с Triton Х-100, в концентрациях 0,01-2% масс./масс. сух. вещ. мицелия, более предпочтительно 0,01-1% масс./масс. сух. вещ. мицелия, а еще более предпочтительно 0,01-0,5% масс./масс. сух. вещ. мицелия. Затем смесь микроорганизм/поверхностно-активное вещество предпочтительно подвергают описанному выше процессу фрагментации, который особенно пригоден, например, в случае, если организм является грибом, для фрагментации мицелия. (Поверхностно-активные вещества или детергенты - это ничем особенным не ограниченный класс органических соединений, которые, как правило, содержат как гидрофобные группы, так и гидрофильные группы и, таким образом, имеют амфифильный характер.)
В другом предпочтительном осуществлении изобретения на практике микроорганизм или содержащую микроорганизм суспензию смешивают с органическим растворителем, содержащим что-либо из аминов, эфиров и спиртов, например, этанол в концентрациях 1-30% масс./об., более предпочтительно 1-20% масс./об. и даже более предпочтительно 1-5% масс./об. Затем смесь микроорганизм/поверхностно-активное вещество подвергают описанному выше процессу фрагментации, который особенно пригоден, например, в случае, когда организм является грибом, для фрагментации мицелия.
Конкретная мощность, воздействующая на взвесь, может быть получена либо повышенной скоростью импеллера сосуда для ферментации путем закачки ферментационной взвеси из источника в целевой сосуд, либо посредством гомогенизации под высоким давлением в особом реакционном сосуде. Добавление химических агентов, таких как соли, органические растворители, ферменты и поверхностно-активные вещества значимо снижает мощность, необходимую для достижения эффективного лизиса мицелия и высвобождения внутриклеточных ферментных компонентов.
2
2
6
3
В другом аспекте изобретения механическая обработка осуществляется химическим лизисом, который может быть проведен добавлением неорганических солей (осмолизом), ферментов, органических растворителей и/или поверхностно-активных веществ. В одном конкретном аспекте изобретения лизис клеток мицелия индуцируется добавлением 0,01-10 М, более предпочтительно 0,01-5 М и еще более предпочтительно 0,1-1 М неорганических солей, таких как NaCl, KCl, или других агентов химического стресса, таких как (NH)CO, CHClN.
В другом конкретном аспекте изобретения реактив химического лизиса может содержать заряженное или незаряженное поверхностно-активное вещество (Biotechnol Lett. (1980) 2, pp.43-48), такое как Tween-80 (незаряженное), Triton X-100 (незаряженное), SDS (отрицательно заряженное) или СТАВ (положительно заряженное), которые наносятся в концентрациях 0,1-3% масс./масс. сух. вещ. микробной биомассы, более предпочтительно 0,1-1% масс./масс. сух. вещ. микробной биомассы, а еще более предпочтительно 0,5-1% масс./масс. сух. вещ. микробной биомассы, соответственно.
В другом аспекте изобретения реактив химического лизиса может содержать фермент или ферментную систему, такую как хитиназа (Plant Pathol. (200) 49, pp.573-589), которые применяют в концентрациях 0,01-10% масс./масс. сух. вещ. микробной биомассы, более предпочтительно 0,01-1% масс./масс. сух. вещ. мицелия, а еще более предпочтительно 0,01-0,1% масс./масс. сух. вещ. мицелия, соответственно, с последующей инкубацией при 20-70°C в течение 0,1-72 ч, соответственно.
В конкретном воплощении изобретения на практике методологии механического или химического лизиса объединяются, что, как считается, повышает эффективность каждого из способов.
3
3
В конкретном осуществлении изобретения на практике микроорганизм смешивают с поверхностно-активным веществом, наиболее предпочтительно с Triton X-100 в концентрациях 0,01-5 масс./масс. сух. вещ. биомассы микроорганизмов, более предпочтительно 0,01-1% масс./масс. сух. вещ. биомассы микроорганизмов. Затем на смесь микроорганизма/поверхностно-активного вещества оказывают воздействие с затратами энергии на единицу объема 1-500 кВт/м, более предпочтительно 1-200 кВт/м в течение 0,1-60 мин для эффективной обработки.
3
3
В другом предпочтительном осуществлении изобретения на практике биомассу микроорганизмов смешивают с органическим растворителем, содержащим что-либо из аминов, эфиров и спиртов, например этанол в концентрациях 5-40% масс./об., более предпочтительно 20-40% масс./об. и даже более предпочтительно 30-35% масс./об. Затем на смесь микроорганизма/органического растворителя оказывают воздействие с затратами энергии на единицу объема 1-500 кВт/м, более предпочтительно 1-200 кВт/м в течение 0,1-60 мин для эффективной обработки.
Конкретная мощность, воздействующая на взвесь, может быть получена либо повышенной скоростью импеллера сосуда для ферментации путем закачки ферментационной взвеси из источника в целевой сосуд, либо посредством гомогенизации под высоким давлением в особом реакционном сосуде. Добавление химических агентов, таких как соли, органические растворители, ферменты и поверхностно-активные вещества, снижает мощность, необходимую для достижения эффективного лизиса мицелия и высвобождения внутриклеточных ферментных компонентов.
Неожиданно было обнаружено, что высвобождение активностей внутриклеточных ферментов из фермент-продуцирующего организма может повысить эффективность гидролиза примененной ферментной системой так, что могут быть применены режимы с более низкими дозами целлюлаз и бета-глюкозидаз.
Данные изобретения неожиданно продемонстрировали, что фрагментированная или, в ином случае, физически или механически или химически обработанная перед гидролизом мицелиальная биомасса высвободит столько бета-глюкозидазы (BGL), сколько в противном случае необходимо будет добавить извне для получения похожего выхода гидролиза. Фрагментирование и добавление активностей BGL извне имеют кумулятивный эффект, дающий более высокие выходы сахаров и улучшенную кинетику осахаривания.
Высвобождение связанных с мицелием ферментных активностей также позволяет снизить дозировку целлюлаз без риска ухудшить кинетику гидролиза или выход растворимых сахаров из лигноцеллюлозной биомассы. В целом, замыслы, описанные в данном документе, демонстрируют, что использование предварительно обработанного сырья, в виде единой ростовой среды, обеспечивает производство ферментных систем, которые очень хорош адаптированы для разложения этого конкретного лигноцеллюлозного материала. Следовательно, локальная выработка ферментов, описанная в данном изобретении, предусматривает максимальную гибкость при выборе лигноцеллюлозного сырья и вариантов предварительной обработки. Кроме того, использование цельной истощенной ферментационной взвеси для дальнейших процессов гидролиза биомассы предусматривает более эффективный режим дозирования, который повышает выход продукта и эффективность затрат на ферменты.
Дозировки ферментов в процессах гидролиза также могут быть снижены путем высвобождения внутриклеточных ферментных активностей из фермент-продуцирующих организмов, стимулируя эффективность внеклеточных ферментных систем.
Если для выработки ферментов используется гриб, то цель стадии обработки d) заключается в разрушении всех частей гриба, например грибного мицелия.
Гидролиз биомассы (стадия (е)
Для завершения разложения лигноцеллюлозного сырья предварительно обработанной биомассы в ферментируемую мономерные гексозные (т.е. глюкозу) и пентозные (т.е. ксилозу) сахара, истощенную ферментационную взвесь (надосадочную жидкость и мицелий) из совместной выработки ферментов добавляют вместе с предварительно обработанной биомассой в реактор для гидролиза биомассы. Как широко известно, гексозы являются моносахаридами с шестью атомами углерода, пентозы являются моносахаридами с пятью атомами углерода.
В неограничивающем примере взвесь предварительно обработанной биомассы, имеющая содержание твердого вещества вплоть до 30%, предпочтительно 15-30% (масс./масс.), может быть гидролизована в периодическом режиме.
Для специалистов в данной области очевидно, что дозировка системы гидролитических ферментов, температура инкубации, продолжительность отработки, необязательные режимы подпитки для гидролиза биомассы и эффективность гидролиза в сущности связаны с конкретными применяемыми ферментной системой и сырьем.
В конкретном воплощении изобретения гидролиз взвеси предварительно обработанной биомассы будет осуществлен ферментными системами, выработанными указанным мицелиальным грибом Trichoderma reesei.
В этом случае предварительно обработанную взвесь смешивают с истощенной и необязательно фрагментированной ферментационной взвесью, содержащей системы гидролитических ферментов. Предпочтительный режим дозирования лигноцеллюлозного сырья в этих условиях находится в диапазоне 0,1-1% масс. фермента/масс. сырья или 1-20 FPU/г целлюлозы, содержащимся в сырье (Zu et al., 2009).
Гидролиз предварительно обработанной биомассы выполняется при температурах 45-55°C при продолжительности обработки в диапазоне 18-72 ч. В особенно предпочтительном воплощении данного изобретения периодический гидролиз предварительно обработанной соломы зерновых выполняется при дозировках ферментов в диапазоне 0,25-0,8% масс. фермента/сухого твердого вещества предварительно обработанного сырья с или без обогащения дополнительной бета-глюкозидазой и при температуре 50-53°C в течение 72 ч. Удивительно, но даже режимы с низкими дозировками ферментов дают больше 50% масс./масс. относительно общего количества сахаров, которые могли бы быть получены из содержащихся в указанном сырье. Эти высокие выходы сахаров при низких режимах дозировки ферментов могут быть достигнуты вследствие совмещенной с процессом выработки эффективных ферментных систем, как было описано выше.
В данное изобретение необязательно включено добавление бета-глюкозидазы в стадию е) данного способа.
Предпочтительно, если реакция гидролиза отличается тем, что растворимые сахара, полученные в стадии е), содержат мономерные С5- и/или С6-сахара, предпочтительно глюкозу и/или ксилозу.
В предпочтительном воплощении данного изобретения гидролизат биомассы, содержащий обогащенную сахарами надосадочную жидкость, и твердые лигнинсодержащие отходы будут подвергаться процедуре разделения на жидкую фазу/твердую фазу, которая может быть выполнена, например, центрифугированием, фильтрацией или просто декантированием самотеком. Понятно, что растворимые сахара являются всеми сахарами, которые преимущественно могут быть обнаружены жидкой фазе, если проведено разделение на жидкую фазу/твердую фазу, как известно специалистам.
Ферментация гидролизатов биомассы
Необязательный дополнительный аспект данного изобретения заключается в ферментации гидролизата биомассы, полученного в стадии е). Таким образом, в изобретение также включен способ, описанный выше, который дополнительно отличается тем, что обогащенная сахарами фаза процессируется далее. В конкретном воплощении обогащенная сахарами жидкая фаза процессируется далее в этанол. Микроорганизмы могут быть применены в смысле данного изобретения для преобразования гидролизатов биомассы, содержащих пентозы и гексозы, в этанол.
Предпочтительно, если на данной стадии используется обогащенная сахарами жидкая фаза, полученная на стадии е), которая имеет высокое содержание поддающихся ферментации сахаров, предпочтительно порядка 15-50% масс./об. Содержание сахаров в данном контексте означает содержание всех пентоз и гексоз. В предпочтительном воплощении изобретения гидролизат биомассы имеет содержание сахаров 16-25% масс./об. В более предпочтительном воплощении изобретения, гидролизат биомассы также содержал дополнительные питательные вещества (т.е. белки, соли и сахара), перенесенные из процессов совместной выработки ферментов.
Ферментация гидрализата биомассы в этанол может быть выполнена с помощью микробных штаммов, которые демонстрируют надежность в способе, высокую устойчивость к ингибиторам/этанолу, надежный выход продукта при высокой и низкой концентрации сахаров. Неограничивающие примеры организмов, которые могут конвертировать сахара в этанол, включают пекарские дрожжи S. cerevisiae, Pichia stipitis, Hansenula polymorpha, Clostridium acetobutylicum, Thermoanaerobacterium saccharolyticum, Zymomonas mobilis, Е. coli, Klebsiella oxytoca и Fusarium oxysporum.
Критериями выбора вариантов способа и отбора организма являются надежность способа, устойчивость к продукту/ингибиторам/температуре и сообразно высокий выход этанола (Fischer et al., 2008; Matsushika et al., 2009).
Этанольная ферментация может быть проведена при температурах в диапазоне 28-70°C в течение 10-48 часов в зависимости от температурного оптимума и эффективности ферментации используемого микроорганизма (Matsushika et al., 2009).
Из описаний предшествующего уровня техники известно, что теоретические пределы преобразования для преобразования гексоз в этанол могут составлять 51% масс./масс.(т.е. 1 г глюкозы в 0,51 г этанола) для дрожжей (Matsushika et al., 2009).
Согласно данному документу неожиданно было установлено, что предварительная обработка не влияет на эффективность гидролиза биомассы и процессы ферментации.
Ферментации гексоз дрожжевыми штаммами могут быть проведены при температурах 28-35°C, рН 4-6 и могут быть закончены в течение 10-48 часов. В результате ферментации получается взвесь, содержащая дрожжевую биомассу и около 0,5-25% масс./об. этанола в зависимости от изначальной концентрации сахаров в гидролизате биомассы и эффективности преобразования пентозных и гексозных сахаров.
Извлечение этанола
Извлечение этанола из ферментационных жидкостей может быть выполнено различными способами, известными специалистам в данной области. Одной из таких процедур является процесс обычной дистилляции и ректификации, основанный на оборудовании, применяемом в пивоваренной и химической промышленности, таком как дистилляционные колонны. Эти технологии хорошо развиты в промышленности, а по сути известны и альтернативные устройства (Leland, 2008, Cardona and Sanchez, 2007). В альтернативном воплощении изобретения этанол извлекают с помощью отпарной технологии, неограничивающими примерами которой являются отпаривание в вакууме, отпаривание газом, испарение распылением.
Практические осуществления текущего изобретения могут давать выход этанола 90-100% об./об. Это продукт необязательно может быть смешан с добавками или в ином случае обработан для составления продукта, который будет доставлен конечному потребителю.
Определение терминов
В настоящем изобретении используется несколько терминов, которые определены ниже.
Термин «Биомасса» и «лигноцеллюлозная биомасса» относится к любому целлюлозному или лигноцеллюлозному материалу и включает материалы, содержащие целлюлозу и необязательно также содержащие гемицеллюлозу, лигнин, крахмал, полисахариды, олигосахариды и/или моносахариды. Биомасса также может содержать дополнительные компоненты, такие как белки, липиды, воски, фенольные смолы и стероиды. Биомасса, в общем, может быть получена из одиночного источника или содержать смесь, полученную из более чем одного источника; например, биомасса могла бы содержать смесь пшеничной полбы и соломы или смесь травы и листьев. Неограничивающими примерами биомассы являются биоэнергетические культуры, сельскохозяйственные культуры, твердые городские отходы, твердые промышленные отходы, шлам бумажного производства, мусор, древесные отходы и отходы лесного хозяйства. В частности, неограничивающие примеры чистой биомассы включают овсяную полбу, кукурузные початки, остатки сельскохозяйственных культур, такие как кукурузная листовая обертка, кукурузная солома, трава, пшеница, пшеничная солома, ячмень, ячменная солома, сено, рисовая солома, просо, грязная бумага, жом сахарного тростника, сорго, соя, компоненты, полученные при перемалывании зерна, деревья, ветки, корни, листья, древесные стружки, древесные опилки, кусты, овощи, фрукты, цветы и навоз.
Термин «механическое размельчение» относится к любому механическому способу уменьшения размера частиц биомассы. Неограничивающими примерами применений размельчения является молотовое перемалывание или дробление.
Термин «предварительно обработанная биомасса» означает биомассу, которая была подвергнута физико-химической обработке перед осахариванием. Обработки, такие как предварительные обработки, далее будут описаны в данном документе.
Термин «лигноцеллюлозный» относится к композиции, содержащей как лигнин, так и целлюлозу. Лигноцеллюлозный материал также может содержать гемицеллюлозу.
Термин «целлюлозный» относится к композиции, содержащей целлюлозу.
Термин «осахариваниие» или «гидролиз биомассы» относится к выработке поддающихся ферментации сахаров из полисахаридов.
Термин «поддающийся ферментации сахар» относится к олигосахаридам и моносахаридам, которые могут быть использованы в качестве источника углерода микроорганизмом в процессе ферментации для изготовления продуктов, таких как этанол.
Термин «гидролизат» относится к продукту осахаривания, который содержит сахара, выработанные в процессе осахаривания, оставшаяся негидролизуемая биомасса и ферменты, используемые для гидролиза биомассы.
Термин «взвесь» относится к смеси нерастворимого материала и жидкости.
Термин «поддающаяся смешиванию взвесь» относится к взвеси, которая становится фактически гомогенной под действием системы перемешивания. «Смешиваемость» относится к этому свойству взвеси.
Термин «тщательно перемешанная взвесь» относится к состоянию, при котором компоненты взвеси фактически равномерно распределены (гомогенно) по всей взвеси.
Под «массой сухого вещества» или «масс. сух. вещ.» подразумевается масса биомассы, из которой удалена вся или почти вся вода. Масса сухого вещества, как правило, измеряется согласно стандарту Е1756-01 Американского общества по испытаниям и материалам (ASTM) (Стандартный способ определения общего количества твердых веществ в биомассе) или стандарту Т-412 om-02 Технической Ассоциации целлюлозно-бумажной промышленности. Inc. (TAPPI) (Влажность в Пульпе, Бумаге и Картоне).
Термин «масса сухого вещества» (масс. сух. вещ.) или «сухое вещество» (сух. вещ.) относится к общему количеству сухого вещества биомассы, добавленной в реактор периодической или подпитываемой периодической системы, рассчитанной на момент добавления как процент от общей массы реакционной композиции в реакторе в конце прогона.
Термин «ферменты осахаривания» или «гидролизующие ферменты» может относиться к системе ферментов осахаривания, содержащей один или большее количество ферментов (в которой предпочтительно больше одного фермента), используемой для гидролиза полимерной биомассы, посредством которого в гидролизат высвобождаются олигосахариды и/или моносахариды. Система ферментов осахаривания включает один или несколько ферментов, выбранных из группы «гликозидаз», которые гидролизуют любые связи ди-, олиго- и полисахаридов и рассматриваются в классификации ферментов ЕС 3.2.1.Х общей группы «гидролаз» (ЕС 3.). Кроме того, могут присутствовать дополнительные ферменты, которые могут принадлежать к данной группе или могут не принадлежать к ней. Гликозидазы, пригодные для настоящего способа, могут быть упорядочены по компонентам биомассы, которые они гидролизуют. Гликозидазы, пригодные для настоящего способа, включают гликозидазы, гидролизующие целлюлозу (например, целлюлазы, эндоглюканазы, экзоглюканазы, целлобиогидролазы, бета-глюкозидазы), гликозидазы, гидролизующие гемицеллюлозу, называемые гемицеллюлазами (например, ксиланазы, эндоксиланазы, экзоксиланазы, бета-ксилозидазы, арабиноксиланазы, маннаназы, галактазы, пектиназы, глюкуронидазы) и гликозидазы, гидролизующие крахмал (например, амилазы, α-амилазы, β-амилазы, глюкоамилазы, α-глюкозидазы, изоамилазы). Кроме того, полезным может быть добавление других активностей к системе ферментов осахаривания, таких как пептидазы (ЕС 3.4-х.у), липазы (ЕС 3.1.1-х и 3.1.4.х), лигниназы (ЕС 1.11.1.x) и феруоилэстеразы (ЕС 3.1.1.73) для помощи при высвобождении полисахаридов от других компонентов биомассы. В данной области хорошо известно, что микроорганизмы, которые продуцируют гидролизующие полисахариды ферменты, часто демонстрируют некую активность, такую как деградация целлюлозы, которая катализируется несколькими ферментами или группой ферментов, имеющих различные субстратные специфичности. Таким образом, «целлюлаза» из микроорганизма может включать группу ферментов, все или некоторые из которых могут вносить вклад в целлюлозодеградирующую активность. Коммерческие или некоммерческие ферментные препараты, такие как целлюлаза, могут содержать множество ферментов, в зависимости от схемы очистки, используемой для получения фермента. Таким образом, ферменты осахаривания, используемые в настоящем способе, включают по меньшей мере одну «целлюлазу», и данная активность может быть катализирована более чем одним ферментом. В некоторых случаях, ферменты осахаривания, используемые в настоящем способе, могут содержать по меньшей мере одну гемицеллюлазу, обычно в зависимости от типа предварительно обработанной биомассы, используемой в настоящем способе. Например, в гемицеллюлазе, как правило, нет необходимости, если осахариваемая биомасса предварительно обработана кислотой, и ее, как правило, включают, если осахариваемую биомассу предварительно обрабатывают в нейтральных или щелочных условиях. Ферменты осахаривания могут быть получены коммерчески, примером является целлюлаза «Spezyme CP» («Genencor International», Рочестер, Нью-Йорк) и ксиланаза «Multifect» («Genencor»). Кроме того, ферменты осахаривания могут быть получены биологически, в том числе с помощью рекомбинантных микроорганизмов. Для использования в настоящем способе могут быть разработаны новые ферменты для осахаривания.
SSF означает одновременное осахаривание и ферментацию.
Примеры
Использованы следующие термины:
«ВЭЖХ» - высокоэффективная жидкостная хроматография, «С» - градус Цельсия, «кПа» - килопаскаль, «М» - метр, «мм» - миллиметр, «КВт» - киловатт, «мкм» - микрометр, «мкл» - микролитр, «мл» - миллилитр, «л» - литр, «мин» - минута «мМ» - миллимоль, «см» - сантиметр, «г» - грамм, «кг» - килограмм, «масс.» - масса, «ч» - час, «темп.» или «Т» - температура, «теор.» - теоретический, «предварительно обработ.» предварительная обработка, «DWB» - масса сухого вещества биомассы, «ASME» - американское общество инженеров-механиков, «s.s.» - нержавеющая сталь, «in”» - дюйм, «PSD» - распределение частиц по размерам, «D-50» - диаметр частиц, где 50% от совокупного объема частиц меньше этого размера, «D-95» обозначает диаметр частиц, где 95% совокупного объема частиц меньше этого размера, «об/мин» - обороты в минуту.
4
2
Серную кислоту, гидроксид аммония, уксусную кислоту, ацетамид, дрожжевой экстракт, глюкозу, ксилозу, сорбит, MgSO·7НО, фосфорную кислоту и лимонную кислоту приобрели у «Sigma-Aldrich» (Сент-Луис, Миссури).
Композиция биомассы измеряется любым из стандартных методов, хорошо известным в данной области, таких как ASTM E1758-01 «Стандартный способ определения углеводов с помощью ВЭЖХ».
Пример 1. Измерение мономерных сахаров
Для определения прогресса гидролиза соломы образцы собирают через соответствующие интервалы, и содержание растворимых сахаров определяли с помощью ВЭЖХ.
Растворимые сахара (такие как глюкоза, целлобиоза, ксилоза, ксилобиоза, галактоза, арабиноза и манноза) в осахаренном растворе измеряли с помощью ВЭЖХ («Agilent Technologies», Пало-Алто, Калифорния).
Моносахариды измеряли напрямую в гидролизате. Нерастворимое вещество удаляли из гидролизата с помощью центрифуги. рН разделенной жидкости корректировали, при необходимости, с помощью серной кислоты. Отделенную жидкость разводили, при необходимости, затем фильтровали через 0,2 мкм шприцевой фильтр прямо в ампулу для ВЭЖХ.
2
4
Для анализа общих растворенных сахаров 10 мл разведенного образца помещали в ампулу под давлением и добавляли 349 мкл 75% HSO. Ампулу запечатывали и помещали в автоклав на час для гидролиза всех сахаров в моносахариды. Образцы охлаждали и из рН корректировали карбонатом натрия до необходимого значения рН, затем образцы фильтровали в ампулы для ВЭЖХ и анализировали с помощью ВЭЖХ. После прогона определяли концентрации в образце на основании стандартных кривых для каждого из соединений.
Пример 2. Физико-химическая предварительная обработка пшеничной соломы
2
4
Пшеничную солому перемалывали до размера частиц меньше, чем 2 см. Затем молотую солому смешивали с водой и добавляли HSO в качестве катализатора предварительной обработки с последующей гидротермической обработкой под высоким давлением.
Полученную суспензию предварительно обработанного сырья затем использовали для выработки гидролитического фермента и для процесса осахаривания в дальнейших процессах.
Пример 3. Выработка гидролитических ферментов с помощью предварительно обработанного сырья
Ферменты гидролиза (т.е. целлюлазы и гемицеллюлазы) для преобразования лигноцеллюлозного материала в составляющие их сахара были получены в погруженных культурах мицелиального гриба Trichoderma reesei.
В основной стадии культивирования посевные культуры выращивали в 2 л перемешиваемой колбе, заполненной 400 мл культуральной питательной среды, которая была дополнена 2% масс./об. предварительно обработанной биомассы (см. пример 2) и 0,5% об./об. жидкого кукурузного экстракта. Среду инокулировали препаратом грибных спор, имеющим оптическую плотность (OD) при 600 нм, равную 10. Культуры в перемешиваемых колбах выращивали в течение 48 часов при 30°C и рН 5 при постоянном перемешивании 250 об/мин.
Для биореакторов с рабочим объемом 5 л было проведено масштабирование посевной культуры. Композиция культуральной среды была идентичной комбинации первичной посевной культуры. Каждый биореактор инокулировали 10% об./об. первичной посевной культуры. Культуру выращивали при 30°C (рН 5) в течение 48 часов при постоянном перемешивании 350 об/мин.
2
Основную выработку ферментов проводили в 150 л биореакторе с рабочим объемом 100 л. Культуральные среды были идентичны средам предыдущих посевных культур. Однако для выработки гидролитических ферментов добавляли 8% масс./об. предварительно обработанной биомассы и 2% об./об. жидкого кукурузного экстракта Культуральную питательную среду инокулировали 5% об./об. вторичной посевной культурой. Фермент-продуцирующий гриб Trichoderma reesei затем выращивали при 30°C в условиях постоянного перемешивания при 350 об/мин. Рост инициировали в течение 5 дней при константном значении pO 25% для обеспечения оптимальной выработки ферментов в аэробных условиях. Через 5 дней условий культивирования собирали цельную фермент-содержащую взвесь, включающую остатки предварительно обработанной биомассы, истощенную ферментационную питательную среду и грибной мицелий.
Концентрацию общего растворимого фермента (белка) в ферментационной питательной среде (надосадочной жидкости) определяли по методу Бредфорд с использование бычьего сывороточного альбумина в качестве эталона для сравнения (Bradford, M., 1976).
В дальнейших экспериментах по гидролизу использовали либо содержащую фермент надосадочную жидкость, либо цельную ферментационную взвесь (надосадочная жидкость + предварительно обработанная биомасса + грибной мицелий).
Пример 4. Гидролиз соломы
Предварительно обработанную пшеничную солому гидролизовали либо с помощью системы целлюлаз, содержащей (i) надосадочную жидкость, описанную в примере 3, (ii) полную грибную суспензию (грибной мицелий + биомасса + надосадочная жидкость) или (iii) полную грибную суспензию, при этом грибной мицелий был фрагментирован перед гидролизом соломы. Эксперименты по гидролизу также необязательно были проведены в присутствии добавляемой извне бета-глюкозидазы (BGL).
Реакции гидролиза проводили в реакционном объеме 1 л с 20% масс./масс. сух. вещ. предварительно обработанной соломы при 50°C в течение 72 часов в среде, рН которой был скорректирован до 5. Режим дозировки гидролитических ферментов составлял 0,5% массы целлюлазы/массы предварительно обработанной соломы. Дозировка ферментов была привязана к общей концентрации белков в истощенной ферментационной питательной среде, согласно определению в примере 2. Необязательно реакции проводили с добавлением активности BGL (Novo 188, «Novozymes», Дания). Активность BGL вносили в количестве 2 единицы целлобиазы (CBU)/мг целлюлазы. CBU определяли согласно описанию Prior et al. (2008).
Реакции осахаривания проводили в биореакторной системе при постоянном перемешивании (50 об/мин) для обеспечения равных условий реакций. В конкретных экспериментах содержащую гидролитические ферменты ферментационную взвесь фрагментировали при повышении скорости импеллера (L5M, «Silverson Machines Ltd.») до 8000 об/мин в течение 30 минут перед дальнейшим процессом гидролиза лигноцеллюлозы. Для определения кинетики гидролиза и выхода глюкозы образцы забирали через 3, 7, 24 и 48 часов. Явное высвобождение глюкозы измеряли методом ВЭЖХ, как описано выше. Результаты различных вариантов гидролиза представлены на Фиг.2.
Данные на Фиг.2 указывают на то, что фрагментация грибной биомассы перед гидролизом улучшает кинетику гидролиза и повышает конечный выход глюкозы, если для гидролиза предварительно обработанной соломы используется фермент-содержащая суспензия гриба Trichoderma (см. пример 3) без обогащения BGL, d.
Эксперименты по гидролизу предварительно обработанной соломы, проведенные только с обогащенной BGL ферментационной питательной средой (надосадочной жидкостью), продемонстрировали схожую кинетику гидролиза и конечный выход глюкозы, что и в реакциях, проведенных с цельной фрагментированной ферментационной взвесью в отсутствие BGL.
Реакция гидролиза с фрагментированной цельной ферментационной взвесью (т.е. грибным мицелием, биомассой и надосадочной жидкостью), дополнительно обогащенной BGL, продемонстрировала наилучшие кинетику гидролиза и выход глюкозы по сравнению со всеми другими исследованными гидролитическими процессами. Этот удивительный эффект может быть следствием высвобождения внутриклеточных и/или связанных с поверхностью микроорганизма ферментных активностей, которые действуют синергично с системами растворимых целлюлаз в ферментационной питательной среде.
Описание чертежей
Фиг.1: Способ преобразования биомассы в этанол, включающий перенос мицелия из места выработки ферментов. L = лигнин, Р = пентоза, Н = гексоза. Фиг.1 является блок-схемой, иллюстрирующей способ биоочистки, используемый для преобразования лигноцеллюлозы в этанол через ферментацию в соответствии с настоящим изобретением.
Фиг.2: Высвобождение глюкозы из предварительно обработанной соломы. Условия гидролиза: 20% масс./масс. сух. вещ. предварительной биомассы, дозировка целлюлазы: 0,5% масс. растворимого фермента/масс. предварительно обработанной биомассы, необязательная дозировка BGL: 2 CBU/мг целлюлазы. Забор образцов в 3, 7, 24, 48, 72 ч. Гидролиз биомассы проводили либо с помощью содержащей фермент питательной среды, либо с помощью фрагментированной/нефрагментированной ферментационной взвеси (надосадочная жидкость питательной среды + биомасса + грибной мицелий) в отсутствие или присутствии дополнительной активности BGL.
Литература
Chauve et al. (2010) Biotechnology for Biofaels 2010, 3:3.
Bradford, M. (1976), Anal. Biochem. 72:248-254.
Prior B.A., Day D.F. (2008) Appl. Biochem. Biotechnol. 146(1-3), pp.151-64.
Pejo, E.T., Oliva, J.M. and Ballestros, M. (2008) Realistic approach for full-scale bioethanol production from lignocellulose: a review J. Sci & Indust. Research 67, pp.874-884.
Howard, R.L., Abotsi, E., van Rensburg, J. Howard, S. (2003) Lignocellulose biotechnology: issues of bioconversion and enzyme production. Afri. J. Biotechnol. 2, pp.602-619.
Sluiter, В. Hames, R. Ruiz, C. Scarlata, J. Sluiter, D. Templeton, and D. Crocker (2008). Determination of Structural Carbohydrates and Lignin in Biomass. Laboratory Analytical Procedure (LAP) Technical Report NREL/TP-510-42618, http://www.nrel.gov/biomass/pdfs/42618.pdf.
Kumar R, Mago G, Balan V, Wyman CE. (2009a). Physical and chemical characterizations of corn stover and poplar solids resulting from leading pretreatment technologies. Bioresour. Technol. 100(17), pp.3948-62.
Kumar R, Wyman CE. (2009b). Effects of cellulase and xylanase enzymes on the deconstruction of solids from pretreatment of poplar by leading technologies. Biotechnol Prog. 2009, 25(2), pp.302-14.
Kumar R, Wyman CE. (2009с). Effect of additives on the digestibility of corn stover solids following pretreatment by leading technologies. Biotechnol Bioeng. 2009, Apr 15; 102(6):1544-57.
Wyman CE, Dale BE, Elander RT, Holtzapple M, Ladisch MR, Lee YY. (2005) Comparative sugar recovery data from laboratory scale application of leading pretreatment technologies to corn stover. Bioresour. Technol. 96(18), pp.2026-32.
Chandra, R.R., Bura, R., Mabee, W.E., Berlin, A., Pan, X., Saddler, J.N. (2007) Substrate Pretreatment: The key to effective enzymatic hydrolysis of lignocellulosics? Adv. Biochem. Engin/Biotechnol. 108, pp.67-93.
Margeot, A., Han-Hägerdahl, В., Edlund, M., Slade, R., Monot, F. (2009) New improvements for lignocellulosic ethanol. Curr. Opin. Biotechnol. 20, pp.1-9.
Chandrakant, P., Bisaria, V.S. (1998) Simultaneous bioconversion of cellulose and hemicellulose to ethnaol. Crit. Rev. Biotechnol. 18, pp.295-331.
Xiao, Z., Zhang, X., Gregg, D.J., Saddler, J.N. (2004a) Effects of sugar inhibition on cellulose and beta-glucosidase during enzymatic hydrolysis of softwood substrates. Appl. Biochem. Biotechnol. 113-116, pp.1115-1125.
Hodge, D.B., Karim, M.N., Schell, D.J., McMillan, J.D. (2009) Model-based fed-batch for high-solids enzymatic cellulose hydrolysis. Appl Biochem Biotechnol. 152, pp.88-107.
Reith, J.H., den Uli, H., van Veen, H., de Laat, W.T.A.M., Niessen, J.J., de Jong, E., Elbersen, H.W., Weusthuis, R., van Dijken, J.P., Raamsdonk, L. (2002) Co-prodcution of bioethanol, electrcity, and heat from biomass residues. In: Twelfth European Conference and Technology Exhibition on Biomass for Energy, Industry and Climate Protection, Amsterdam, The Netherlands.
Palmquist, E., Hahn-Hägerdahl (2000a). Fermentation of lignocellulosic hydrolysates. I: inhibition and detoxification Bioresource Technology 74, pp. 17-24.
Palmquist, E., Hahn-Hägerdahl (2000b). Fermentation of lignocellulosic hydrolysates. II: inhibitors and mechanisms of inhibition. Bioresource Technol. 74, pp.25-33.
Jing, X., Zhang, X. and Bao, J. (2009) Inhibition Performance of Lignocellulose Degradation Products on Industrial Cellulase Enzymes During Cellulose Hydrolysis Applied Biochemistry and Biotechnology 159, pp.696-707.
Xiao, Z., Storms, R. and Tsang, A. (2004b) Microplate-based filter paper assay to measure total cellulase activity. Biotechnology and Bioengineering 88:832-837.
Bobey, D., Ederer, G.M. (1981) Rapid detection of yeast enzymes by using 4-methylumbelliferyl substrates J. Clin. Microbiol., pp.2, 393-394.
Maki, M., Leung, K.T., Qin, W. (2009) The prospects of cellulose producing bacteria for the bioconversion of lignocellulosic biomass. Int. J. Biol. Sci. 5, pp.500-516.
Lynd, L.R., Weimer, P.J., van Zyl, W.H., Pretorius, I.S. (2002) Microbial cellulose utilisation: Fundamentals and biotechnology. Microbiol. and Molecular. Biology Rev. 66, pp.506-577.
Shewale JG. Beta-Glucosidase: its role in cellulase synthesis and hydrolysis of cellulose. (1982) Int J Biochem. 14, pp.435-43.
Seidle, H.F., Marten, I., Shoseyov, O., Huber, R.E. (2004), Physical and kinetic properties of the family 3 beta-glucosidase from Aspergillus niger which is important for cellulose breakdown. The Protein J.23, pp.11-23.
Szijarto, N., Szengyel, Z., Liden, G., Reczey, K. (2004) Dynamics of cellulase prodcution by glucose grown cultures of trichoderma reesei RUT-C30 as a response to addition of cellulose Appl. Biochem. Biophys. 115, pp.115-124.
Kristensen, J.B., Felby, C., Jorgensen, H. (2009) Yield-determining factors in high-solids enzymatic hydrolysis of lignocellulose Biotech. for Biofuels 2, pp.1-22.
Fischer, C.R., Klein-Marcuschamer, D., Stephanopoulos, G. (2008) Selection and optimization of microbial hosts for biofuels production. Metab. Eng. 10(6), pp.295-304.
Shaw A.J., Podkaminer K.K., Desai S.G., Bardsley J.S., Rogers S.R., Thorne P.G., Hogsett D.A., Lynd L.R. (2008) Metabolic engineering of a thermophilic bacterium to produce ethanol at high yield. Proc. Natl. Acad. Sci. 105(37), pp.13769-74.
Campell, J.A., Hansen, R.W., Wilson, J.R. (1999) Cost effective colorimetric microtitre plate enzymic assays for sucrose, glucose and fructose in sugarcane tissue extracts. J. Sci. Food. Agicult. 79, pp.232-236.
Matsushika A., Inoue H., Murakami K., Takimura O., Sawayama S. (2009) Bioethanol production performance of five recombinant strains of laboratory and industrial xylose-fermenting Saccharomyces cerevisiae. Bioresour Technol. 2009 Apr; 100(8):2392-8.
Nigam JN. (2001) Ethanol production from hardwood spent sulfite liquor using an adapted strain of Pichia stipitis. J Ind Microbiol Biotechnol. 26(3), pp.145-50.
Laplace J.M., Delgenes J.P., Moletta R., Navarro J.M. (1992) Alcoholic glucose and xylose fermentations by the coculture process: compatibility and typing of associated strains. Can J Microbiol. 38(7), pp.654-8.
Tolan, J.S. (2002): Iogens process for producing ethanol from cellulosic biomass. Clean Technol. Environ. Policy. 3, pp.339-345.
Cardona, C.A., Sanchez, O.J. (2007) Fuel ethanol production: Process design trends and integration opportunities Bioresource Technol. 98, pp.2415-2457.
Jorgensen, H., Vibe-Pedersen, J., Larsen, J., Felby C. (2006) Liquefaction of lignocellulose at high-solids concentrations. Biotechnology and Bioengineering 96, pp.862-870.
Chadha B.S., Kanwar S.S., Saini H.S., Garcha H.S. (1995) Hybrid process for ethanol production from rice straw. Acta Microbiol Immunol Hung. 42(1):53-9.
Hennessey, S.M. Seapan, M., Blander, R.T., Tucker, M.P. (2006) Process for concentrated biomass saccharification WO 2009/045651 A2.
Leland, M.V. (2008) Separation technologies for recovery and dehydration of alcohols from fermentation broth. Biofuel, Biorpod. Bioref. 2, pp.553-588.
Rao, M., Desphpande, V., Seeta, R., Srinivasan, M.C., Mishra, C. (1985) Hydrolysis of sugarcane Bagasse by mycelium biomass from penicillium funiculosum. Biotechnol. Bioengineer 27, 00.1070-72.