БИФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ ИНГИБИТОР АНГИОГЕНЕЗА И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ
BIFUNCTIONAL ANGIOGENESIS INHIBITOR AND ITS APPLICATION

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
[0001] Настоящее изобретение относится к бифункциональному ингибитору ангиогенеза и его применению, в частности, к слитому белку, обладающему VEGF-ингибирующей активностью и FGF-ингибирующей активностью, а также к его применению в ингибировании вызванной двумя факторами VEGF и FGF или вызванной повышенным уровнем глюкозы пролиферации клеток, миграции клеток и/или формирования просвета, таком как ингибирование ангиогенеза в сетчатке, связанных с ангиогенезом заболеваний глаз, диабетической ретинопатии, возрастной макулодистрофии и т.п.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0002] Неоваскуляризация глазного дна представляет собой серьезное осложнение различных заболеваний глаз. Неоваскуляризация может происходить практически во всех тканях глаза, таких как роговица, цилиарное тело радужной оболочки, сосудистая оболочка, сетчатка, желтое пятно и диск зрительного нерва, вызывая серию патологических изменений, таких как кровоизлияние в ткани, экссудацию и гиперплазию этих областей, нарушая, таким образом, структуру и функцию глазного яблока и вызывая серьезное нарушение зрительной функции. Эта серия заболеваний глазного дна включает диабетическую ретинопатию (ДР), ретинопатию недоношенных (РН), возрастную макулодистрофию (ВМД) и т.п., которые серьезно влияют на зрение и даже вызывают слепоту.
[0003] Исследования показали, что VEGF в настоящее время известен как наиболее специфический и эффективный фактор роста для ангиогенеза. С 1990-х годов лекарственные средства, направленно воздействующие на VEGF и ингибирующие ангиогенез в глазном дне путем блокирования сигнального пути VEGF, стали активным направлением для разработки. Ранибизумаб (торговое название Луцентис) может специфично связываться с VEGF-A, и был одобрен FDA США для лечения влажной формы возрастной макулодистрофии и диабетического макулярного отека. VEGF Trap-Eye (афлиберцепт или Эйлеа) представляет собой рекомбинантный белок против VEGF, разработанный Regeneron Pharmaceuticals в США, и была подана дополнительная заявка на лечение ДМО, поскольку по результатам клинических исследований была продемонстрирована удовлетворительная эффективность при ДМО (диабетическом макулярном отеке). KH902 (конберцепт) представляет собой VEGFR-Fc рекомбинантный белок, разработанный компанией Chengdu Kanghong Company для лечения возрастной макулодистрофии (ВМД), который был одобрен для выпуска в продажу в декабре 2013 года. Успешное применение ранибизумаба с VEGF в качестве мишени в клинических исследованиях и клиническое применение при ДР показывает, что VEGF является одной из основных эффективных мишеней при ДР.
[0004] Хотя лекарственные средства, направленно воздействующие на VEGF, претерпели существенный клинический прогресс, регуляция ангиогенеза является очень сложным процессом с динамическим балансом, поскольку ангиогенез регулируется множеством факторов. Из-за значительных ограничений существующих лекарственных средств в клиническом лечении, способы дополнительного улучшения эффекта клинического лечения средствами против ангиогенеза не только представляют проблему, которую необходимо решить исследователям, но и являются предметом исследований и разработок следующего поколения антиангиогенных средств.
[0005] Фактор роста фибробластов (FGF), который представляет собой семейство факторов роста, которые связываются с гепарином, играет важную роль в различных биологических функциях, таких как пролиферация клеток, дифференцировка, миграция, ангиогенез и туморогенез. Он выполняет свои различные биологические функции при связывании и активации рецепторов FGF (FGFR) на клеточной поверхности. Рецептор фактора роста фибробластов (FGFR) представляет собой рецептор, который связывается с членами семейства факторов роста фибробластов (FGF), и часть которого участвует в патологическом процессе.
#
[0006] Заявители в патенте CN201110131029.X раскрыли биспецифический слитый белок, направленно воздействующий на VEGF и FGF (слитый белок 28 в патенте CN 201110131029.X, далее кратко обозначаемый как VF28), результаты исследований показали, что слитый белок VF28 обладает хорошей биологической активностью и может эффективно воздействовать на мишени VEGF и FGF, оказывая значимый эффект при лечении или профилактике опухолей и/или заболеваний, связанных с глазным ангиогенезом. Однако в ходе исследования было обнаружено, что активность полученного VF28 становилась нестабильной при увеличении времени хранения. В длительных тестах 3 партий стоковых растворов VF28 (в условиях длительного теста при -80°C±10°C) анализ активности связывания (метод ИФА) проводили после хранения в течение 0 часа, 1 месяца, 3 месяцев, 6 месяцев, при этом данные показали, что результаты тестов активности связывания 1 партии, 2 партий и 3 партий стоковых растворов VF28 соответственно не соответствовали требованиям критериев оценки в каждой точке времени мониторинга через 1 месяц, 3 месяца и 6 месяцев (из-за несоответствия активности связывания в конце FGF). В тесте на стабильность трех партий готовых продуктов VF28 в условиях ускоренного теста анализ клеточной активности проводили после помещения на один месяц в условия ускоренного теста при 25°C±2°C. Результаты показали, что результаты теста клеточной активности одной из трех партий готовых продуктов VF28 превышали критерии оценки и не соответствовали критериям оценки.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0007] В ответ на вышеуказанные проблемы настоящее изобретение относится к бифункциональному ингибитору ангиогенеза с модифицированной структурой, RC28-05, направленно воздействующему на VEGF и FGF, который не только обладает хорошей биологической активностью и может эффективно ингибировать ангиогенез в сетчатке, оказывая заметное терапевтическое действие при заболеваниях глаз, таких как диабетическая ретинопатия, возрастная макулодистрофия, но также и продукты, полученные на его основе, являются стабильными при хранении, не разлагаются и имеют низкие требования к температуре при хранении и окружающей среде.
[0008] В частности, настоящее изобретение относится к бифункциональному ингибитору ангиогенеза, имеющему аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:1.
[0009] Кроме того, бифункциональный ингибитор ангиогенеза имеет VEGF-ингибирующую активность и FGF-ингибирующую активность.
[0010] Кроме того, бифункциональный ингибитор ангиогенеза может ингибировать вызванную двумя факторами VEGF и FGF или вызванную высоким уровнем глюкозы пролиферацию клеток, миграцию клеток и/или формирование просвета.
[0011] Настоящее изобретение относится к применению вышеуказанного бифункционального ингибитора ангиогенеза в получении лекарственного средства для ингибирования ангиогенеза в сетчатке.
[0012] Кроме того, изобретение относится к применению вышеуказанного бифункционального ингибитора ангиогенеза в получении лекарственного средства для лечения связанных с ангиогенезом заболеваний глаз.
[0013] Предпочтительно связанные с ангиогенезом заболевания глаз выбраны из группы, состоящей из: возрастной макулодистрофии, такой как сухая форма ВМД и влажная форма ВМД, диабетической ретинопатии, такой как непролиферативная ДР, пролиферативная ДР и ДМО, диабетического макулярного отека, ретинопатии недоношенных и окклюзии сосудов сетчатки.
[0014] Кроме того, изобретение относится к применению вышеуказанного бифункционального ингибитора ангиогенеза в лекарственном средстве для уменьшения повреждения сетчатки у субъекта с диабетом.
[0015] Предпочтительно повреждение сетчатки является кратковременным повреждением сетчатки.
[0016] Кроме того, кратковременное повреждение сетчатки выбрано из группы, состоящей из сокращения количества апоптотических клеток в сосудистой сети сетчатки, уменьшения проникновения через гемато-ретинальный барьер, ингибирования реактивной пролиферации глиальных клеток сетчатки и улучшения ультраструктуры невральной сетчатки и кровеносных сосудов сетчатки.
[0017] Предпочтительно повреждение сетчатки является долговременным повреждением сетчатки.
[0018] Кроме того, долговременное повреждение сетчатки выбрано из группы, состоящей из уменьшения проникновения через ретинальный барьер и ингибирования утолщения базальной мембраны капилляров.
[0019] Кроме того, изобретение относится к применению вышеуказанного бифункционального ингибитора ангиогенеза в получении лекарственного средства для улучшения области аваскулярной перфузии сетчатки или уменьшения количества ядер клеток ретинальной неоваскуляризации у субъекта с ретинопатией. Предпочтительно субъект с ретинопатией является недоношенным ребенком.
[0020] Кроме того, изобретение относится к применению вышеуказанного бифункционального ингибитора ангиогенеза в получении лекарственного средства для уменьшения пролиферации эндотелиальных клеток сосудов сетчатки, миграции и/или формирования просвета у субъекта.
[0021] Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, включающему нуклеотидную последовательность, кодирующую бифункциональный ингибитор ангиогенеза, где аминокислотная последовательность бифункционального ингибитора ангиогенеза показана в SEQ ID NO: 1, а нуклеотидная последовательность показана в SEQ ID NO:3.
[0022] Настоящее изобретение также относится к конструкции нуклеиновой кислоты, включающей вышеуказанный полинуклеотид, где полинуклеотид функционально связан с одной или несколькими регуляторными последовательностями, которые направляют продукцию полипептида в хозяине экспрессии.
[0023] Настоящее изобретение также относится к вектору, включающему вышеуказанный полинуклеотид, предпочтительно вектор является вектором экспрессии, где полинуклеотид функционально связан с одной или более регуляторными последовательностями, которые направляют продукцию полипептида в хозяине экспрессии.
[0024] Настоящее изобретение также относится к клетке-хозяину, включающей вышеуказанную полинуклеотидную конструкцию или нуклеиновую кислоту, или вектор экспрессии, где полинуклеотид функционально связан с одной или более регуляторными последовательностями, которые направляют продукцию полипептида. Предпочтительно клетка является клеткой млекопитающего или гуманизированной клеткой. Более предпочтительно клетка является клеткой CHO.
[0025] Настоящее изобретение также относится к способу получения бифункционального ингибитора ангиогенеза, включающему культивирование клетки-хозяина, описанной в любом из предыдущих пунктов, при условиях, обеспечивающих экспрессию бифункционального ингибитора ангиогенеза, и выделение ингибитора.
[0026] Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, включающей полипептид и/или вектор, описанный в любом из предыдущих абзацев.
[0027] Настоящее изобретение также относится к набору, включающему вышеуказанную композицию.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0028] Фиг. 1. Ингибиторные эффекты VF28 и RC28-05 в отношении пролиферации клеток HUVEC, стимулированных VEGF165.
[0029] Фиг. 2. Ингибиторные эффекты VF28 и RC28-05 в отношении пролиферации клеток HUVEC, стимулированных bFGF.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
[0030] Определения:
[0031] Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем изобретении, имеют свои обычные значения, известные средним специалистам в данной области. По поводу определений и терминов в уровне техники специалисты в данной области могут, в частности, обратиться к Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel). Сокращенные обозначения аминокислотных остатков являются стандартными 3-буквенными и/или 1-буквенными кодами, используемыми в данной области для обозначения одной из 20 обычно используемых L-аминокислот.
[0032] Хотя числовые диапазоны и приближенные значения параметров показаны в широком объеме настоящего изобретения, числовые значения, показанные в конкретных примерах, записаны с максимальной точностью. Однако любое числовое значение должно содержать некоторую ошибку, которая вызвана стандартным отклонением соответствующих измерений. Кроме того, следует понимать, что все раскрытые в настоящем изобретении диапазоны охватывают любые возможные поддиапазоны, входящие в них. Например, записанный диапазон "от 1 до 10" следует рассматривать как включающий любые возможные поддиапазоны между минимальным значением 1 и максимальным значением 10 (включая конечные точки); то есть все поддиапазоны, начинающиеся с минимального значения 1 или больше, например от 1 до 6,1, и поддиапазоны, заканчивающиеся максимальным значением 10 или меньше, например от 5,5 до 10. Кроме того, любую ссылку, указанную как "включенную в настоящий документ", следует понимать как включенную во всей своей полноте.
[0033] При использовании в настоящем изобретении термин "растворимый" белок относится к белку, который растворяется в водном растворе при биологических значениях температуры, уровня рН и осмотического давления. В некоторых конкретных технических решениях слитый белок согласно настоящему изобретению является растворимым слитым белком.
[0034] При использовании в настоящем изобретении термин "выделенный" относится к следующим веществам и/или соединениям, которые: (1) отделены от по меньшей мере некоторых компонентов, первоначально связанных с ним (в естественном окружении и/или в условиях теста), и/или (2) получены, изготовлены и/или произведены искусственно. Отделенные вещества и/или соединения могут быть отделены по меньшей мере от приблизительно 10%, приблизительно 20%, приблизительно 30%, приблизительно 40%, приблизительно 50%, приблизительно 60%, приблизительно 70%, приблизительно 80%, приблизительно 90%, приблизительно 95%, приблизительно 98%, приблизительно 99%, по существу 100% или 100% других компонентов, первоначально связанных с ними. В некоторых конкретных технических решениях слитый белок согласно настоящему изобретению является выделенным слитым белком.
[0035] Термин "VEGF" при использовании в настоящем изобретении относится к фактору роста эндотелия сосудов. Термин "VEGFR" при использовании в настоящем изобретении относится к рецептору фактора роста эндотелия сосудов, которым может быть VEGFR1, VEGFR2 и/или VEGFR3. Предпочтительно VEGFR в настоящем изобретении представляет собой VEGFR1 и/или VEGFR2, предпочтительно VEGFR человека.
[0036] Термин "FGF" при использовании в настоящем изобретении относится к фактору роста фибробластов. Термин "FGFR" при использовании в настоящем изобретении относится к рецептору фактора роста фибробластов, которым может быть FGFR1, FGFR2, FGFR3 и/или FGFR4. Предпочтительно FGFR в настоящем изобретении представляет собой FGFR1, более предпочтительно FGFR1 человека.
[0037] Термин "субъект" при использовании в настоящем изобретении включает млекопитающих, таких как человек, таких как домашние животные (такие как собаки, кошки и т.п.), домашних животных (таких как коровы, овцы, свиньи, лошади и т.п.) или лабораторных животных (таких как обезьяны, крысы, мыши, кролики, морские свинки и т.п.).
[0038] Слитый белок согласно настоящему изобретению может дополнительно включать посттрансляционные модификации. Такие модификации включают, без ограничения, ацетилирование, карбоксилирование, гликозилирование, фосфорилирование, липидирование и ацилирование. В результате модифицированный белок может включить неаминокислотные компоненты, такие как полиэтиленгликоль, липиды, полисахариды или моносахариды и фосфорную кислоту. Влияние таких неаминокислотных компонентов на функцию белка можно тестировать, как описано в настоящем изобретении. В случае продукции белков в клетках, посттрансляционный процессинг также может быть важен для правильного фолдинга и/или функции слитого белка. Различные клетки (такие как CHO, HeLa, MDCK, 293, WI38, NIH-3T3 или HEK293) имеют специфический клеточный аппарат и уникальные механизмы для такой посттрансляционной активности, и для обеспечения правильной модификации и процессинга белков могут быть выбраны разные клетки.
[0039] Белки, описанные в настоящем изобретении, могут быть получены любым способом, известным в уровне техники. Например, они могут быть получены с помощью химического синтеза или при экспрессии нуклеиновой кислоты. Пептиды, используемые в настоящем изобретении, могут быть легко получены в соответствии с хорошо известными стандартными методами жидкофазного или, предпочтительно, твердофазного пептидного синтеза, известными в данной области (см., например, J. M. Stewart and J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd edition, Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois (1984), в M. Bodanzsky and A. Bodanzsky, The Practice of Peptide Synthesis, Springer Verlag, New York (1984)). Слитый белок можно получить при использовании известных в данной области методик образования одной или более внутримолекулярных поперечных связей между остатками цистеина, расположенными в полипептидной последовательности, которая, как ожидается, будет включена в белок (см., например, патент США 5478925). Кроме того, слитый белок, описанный в настоящем изобретении, может быть стандартно модифицирован путем добавления цистеинов или биотинов на C-конец или N-конец гибридного белка.
[0040] Термин "терапевтически эффективное количество" или "эффективное количество" при использовании в настоящем изобретении относится к дозе, достаточной для демонстрации своего действия субъекту, которому будут ее вводить. Фактическое количество, а также частота и график введения будут зависеть от собственного состояния субъекта и тяжести состояния. Назначение лечения (например, определение дозы и т.п.), в конечном счете, является сферой ответственности врачей общей практики и других врачей и зависит от принятия ими решения, обычно с учетом заболевания, подлежащего лечению, состояния отдельного пациента, участка доставки, способа введения и других факторов, известных врачам.
#
[0041] При использовании в настоящем изобретении термин "VF28" означает определенный слитый белок VEGFR-FGFR, включающий второй Ig-подобный домен VEGFR1, третий Ig-подобный домен VEGFR2 и часть, полученную из промежуточной функциональной области последовательности Ig-подобного домена FGFR, второго Ig-подобного домена FGFR, третьего Ig-подобного домена FGFR и Fc-фрагмента. VF28 является сокращенным обозначением 28 слитого белка в китайском патенте 201110131029.X, способ конструирования которого и другую соответствующую информацию можно найти в описании китайского патента 201110131029.X. В частности, аминокислотная последовательность VF28 показана в SEQ ID NO:2.
[0042] При использовании в настоящем изобретении термин "стоковый раствор" относится к раствору слитого белка, очищенному и фасованному в контейнере для промежуточного хранения. Стоковый раствор в настоящем изобретении получают с помощью афинной хроматографии, обработки с целью удаления вируса, грубой фильтрации и хроматографии, а также тонкой фильтрации раствора клеточной культуры. Термин "готовый продукт" при использовании в настоящем изобретении относится к раствору слитого белка, полученному путем стерилизации и фильтрации стокового раствора с его последующим фасованием в стерильный конечный контейнер и упаковкой. Готовый продукт в настоящем патенте получают путем стерилизации и фильтрации стокового раствора с добавлением в некотором соотношении вспомогательных материалов (дигидрофосфата натрия, хлорида натрия, сахарозы, полисорбата 80).
[0043] При использовании в настоящем изобретении термин "FGF-Trap" относится к слитому белку FGFR-Fc, который может использоваться в качестве ловушки (англ. trap) FGF, антагонистически воздействуя, таким образом, на FGF. В частности, FGF-Trap, используемый в примерах настоящего изобретения, представляет собой слитый белок 26# FGFR, способ конструирования которого и другую соответствующую информацию можно найти в CN102219860A.
[0044] Термин "VEGF-Trap" при использовании в настоящем изобретении относится к слитому белку VEGFR-Fc, который может использоваться в качестве ловушки VEGF, антагонистически воздействуя, таким образом, на VEGF. В частности, VEGF-Trap, используемый в примерах настоящего изобретения, представляет собой рекомбинантный белок против VEGF (EYLEA, Эйлеа), разработанный компанией Regeneron Pharmaceutical, США, который доступен в продаже.
[0045] Примеры используются для более подробного описания и пояснения настоящего изобретения и не должны рассматриваться в качестве ограничения настоящего изобретения.
[0046] Пример 1: Выбор клеток-хозяев
6
[0047] Клетки яичника китайского хомячка (CHO/dhfr-), дефицитные по гену дигидрофолатредуктазы (DHFR), были приобретены в ATCC, США под номером в каталоге CRL-9096 и номером партии 3916620. Клетки CHO/dhfr культивировали в полной среде IMDM с добавлением гипоксантина и тимидина (HT) и 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS). Клетки были полигональными и росли адгерентно. После 3 пассажей клетки замораживали в жидком азоте для хранения. Для получения клеток CHO/dhfr, адаптированных к бессывороточной суспензионной культуре, пробирку с замороженными клетками размораживали в водяной бане при 37°C и суспендировали в среде Ex-Cell 302 CHO (Sigma), содержащей 10% FBS и HT, затем адгерентно выращивали во флаконе для культур клеток. Если клетки росли хорошо, их суспендировали в 30 мл среды Ex-Cell 302 CHO, содержащей 5% фетальной бычьей сыворотки, для культивирования во встряхиваемом флаконе. Когда клетки вырастали до 1-2×10/мл, клетки переносили в среду для культивирования клеток Ex-Cell 302 CHO, содержащую 2,5% фетальной бычьей сыворотки, для культивирования во встряхиваемом флаконе. Таким образом, поэтапно проводили адаптацию в среде Ex Cell 302, содержащей 1,5% и 0,5% фетальной телячьей сыворотки, соответственно, при культивировании во встряхиваемом флаконе. Наконец, клетки суспендировали в бессывороточной среде Ex Cell 302 CHO для культивирования во встряхиваемом флаконе. Если клетки росли хорошо, клетки собирали с помощью центрифугирования, суспендировали в среде Ex-Cell 302 CHO, содержащей 10% ДМСО, и замораживали в жидком азоте для хранения, получив банк исходных клеток CHO, адаптированных в бессывороточной культуре. Клетки СНО, адаптированные в бессывороточной культуре, были круглыми или почти круглыми в условиях суспензионной культуры.
[0048] Пример 2: Ген, представляющий интерес
[0049] Слитый белок RC28-05 является слитым белком с бифункциональной, ингибирующей ангиогенез активностью, который состоит из неполных аминокислотных последовательностей VEGFR и FGFR, слитых с Fc-фрагментом иммуноглобулина человека, аминокислотная последовательность которого показана ниже (как показано в SEQ ID NO:1):
GRPFVEMYSE IPEIIHMTEG RELVIPCRVT SPNITVTLKK FPLDTLIPDG KRIIWDSRKG 60
FIISNATYKE IGLLTCEATV NGHLYKTNYL THRQTNTIID VVLSPSHGIE LSVGEKLVLN 120
CTARTELNVG IDFNWEYPSS KHQHKKLVNR DLKTQSGSEM KKFLSTLTID GVTRSDQGLY 180
TCAASSGLMT KKNSTFVRVH EKPVAPYWTS PEKMEKKLHA VPAAKTVKFK CPSSGTPNPT 240
LRWLKNGKEF KPDHRIGGYK VRYATWSIIM DSVVPSDKGN YTCIVENEYG SINHTYQLDV 300
VERSPHRPIL QAGLPANKTV ALGSNVEFMC KVYSDPQPHI QWLKHIEVNG SKIGPDNLPY 360
VQILKTAGVN TTDKEMEVLH LRNVSFEDAG EYTCLAGNSI GLSHHSAWLT VLEADKTHTC 420
PPCPAPELLG GPSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SHEDPEVKFN WYVDGVEVHN 480
AKTKPREEQY NSTYRVVSVL TVLHQDWLNG KEYKCKVSNK ALPAPIEKTI SKAKGQPREP 540
QVYTLPPSRD ELTKNQVSLT CLVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP VLDSDGSFFL 600
YSKLTVDKSR WQQGNVFSCS VMHEALHNHY TQKSLSLSPG K 641
[0050] Нуклеотидная последовательность RC28-05 показана ниже (1923 пн) (как показано в SEQ ID NO: 3):
ggtagaccat tcgtagagat gtacagtgaa atccccgaaa ttatacacat gactgaagga 60
agggagctcg tcattccctg ccgggttacg tcacctaaca tcactgttac tttaaaaaag 120
tttccacttg acactttgat ccctgatgga aaacgcataa tctgggacag tagaaagggc 180
ttcatcatat caaatgcaac gtacaaagaa atagggcttc tgacctgtga agcaacagtc 240
aatgggcatt tgtataagac aaactatctc acacatcgac aaaccaatac aatcatagat 300
gtggttctga gtccgtctca tggaattgaa ctatctgttg gagaaaagct tgtcttaaat 360
tgtacagcaa gaactgaact aaatgtgggg attgacttca actgggaata cccttcttcg 420
aagcatcagc ataagaaact tgtaaaccga gacctaaaaa cccagtctgg gagtgagatg 480
aagaaatttt tgagcacctt aactatagat ggtgtaaccc ggagtgacca aggattgtac 540
acctgtgcag catccagtgg gctgatgacc aagaagaaca gcacatttgt cagggtccat 600
gaaaaacccg tagctccata ttggacatcc ccagaaaaga tggaaaagaa attgcatgca 660
gtgccggctg ccaagacagt gaagttcaaa tgcccttcca gtgggacccc aaaccccaca 720
ctgcgctggt tgaaaaatgg caaagaattc aaacctgacc acagaattgg aggctacaag 780
gtccgttatg ccacctggag catcataatg gactctgtgg tgccctctga caagggcaac 840
tacacctgca ttgtggagaa tgagtacggc agcatcaacc acacatacca gctggatgtc 900
gtggagcggt cccctcaccg gcccatcctg caagcagggt tgcccgccaa caaaacagtg 960
gccctgggta gcaacgtgga gttcatgtgt aaggtgtaca gtgacccgca gccgcacatc 1020
cagtggctaa agcacatcga ggtgaatggg agcaagattg gcccagacaa cctgccttat 1080
gtccagatct tgaagactgc tggagttaat accaccgaca aagagatgga ggtgcttcac 1140
ttaagaaatg tctcctttga ggacgcaggg gagtatacgt gcttggcggg taactctatc 1200
ggactctccc atcactctgc atggttgacc gttctggaag ccgacaaaac tcacacatgc 1260
ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa 1320
cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg 1380
agccacgaag accctgaggt caagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat 1440
gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc 1500
accgtcctgc accaggactg gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa 1560
gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca 1620
caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc 1680
tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag 1740
ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc 1800
tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc 1860
gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt 1920
aaa 1923
[0051] Обычный вектор экспрессии встраивали после введения двух сайтов расщепления на оба конца последовательности гена-мишени RC28-05. Клетки CHO трансфицировали общим методом для отбора штамма клеток, экспрессирующих RC28-05, и проводили экспрессию слитого белка RC28-05.
[0052] Пример 3: Анализ аффинности слитого белка
[0053] VF28 и RC28-05 тестировали на аффинность при использовании ForteBio Octet (PALL). PBS (pH 7,4) добавляли в виде сбалансированного раствора в каждую лунку колонки 1 планшета для детектирования A-E, датчик погружали в раствор и активировали в течение 10 мин; RC28-05 и VF28 соответственно разбавляли PBS до концентрации 50 нМ и добавляли в колонку 2 рядов A-E 96-луночного планшета для анализа с помощью программы, установленной на нанесение, в течение 300 сек; PBS добавляли в качестве сбалансированного раствора в каждую лунку колонки 3 рядов A-E планшета для детектирования, с помощью программы, установленной на базовый уровень, в течение 180 сек; rhVEGF (R&D) и rhFGF (R&D) разбавляли соответственно до концентрации 500 нМ и 400 нМ при использовании PBS в качестве разбавителя, а затем серийно разводили в соотношении 1:2 для трех градиентов (всего четыре градиента) до концентрации 62,5 нМ и 50 нМ. Серийные разведения образцов добавляли в колонку 4 рядов A-D 96-луночного планшета, тогда как разведение добавляли в колонку 4 ряда E в качестве отрицательного контроля, с помощью программы, установленной на связывание, в течение 600 сек; PBS добавляли в качестве раствора для диссоциации в каждую лунку в колонке 5 рядов A-E с помощью программы, установленной на диссоциацию, в течение 1800 сек; добавляли 10 мМ глицина (pH 1,5) и PBS в качестве раствора для регенерации и раствора для нейтрализации в колонки 6 и 7 рядов A-E, соответственно, с помощью программ, соответственно установленных на регенерацию и нейтрализацию, по 15 сек каждая, с повтором 5 раз. Всего протестировали 3 цикла, данные анализировали с помощью программы Data analysis 7.0. Значение равновесной константы (KD) вычисляли с вычитанием фона при использовании соответствующего несвязанного с rhVEGF/rhFGF сенсора в качестве контроля. Результаты показаны в Таблице 1. Результаты показали, что RC28-05 и VF28 обладают хорошей аффинностью к rhVEGF и rhFGF.
Таблица 1. Статистика результатов сравнения аффинности RC28-05 и VF28
<b>Образцы</b>
<b>Факторы</b>
<b>Равновесная константа KD (M)</b>
<b>Константа связывания kon (1/Мс)</b>
<b>Константа диссоциации kdis (1/с)</b>
<b>N</b>
RC28-05
rhVEGF165
2,70E-10±1,28E-10
2,30E+05±0,64E+05
5,65E-05±0,75E-05
3
VF28
rhVEGF165
2,51E-10±5,65E-11
2,76E+05±7,94E+04
6,68E-05±1,31E-05
3
RC28-05
rhFGF2
3,28E-09±1,60E-09
2,66E+04±1,01E+04
7,96E-05±2,42E-05
3
VF28
rhFGF2
5,24E-09±2,07E-09
1,90E+04±1,74E+03
9,78E-05±3,26E-05
3
[0054] Пример 4: Исследование активности слитого белка в клетках
4
2
50
[0055] Клетки HUVEC после 10 пассажей инокулировали в 96-луночный планшет в количестве 100 мкл/лунка (т.е. 5000 клеток/лунка) при плотности, доведенной до 5×10 клеток/мл. После прикрепления клеток добавляли кондиционированную среду или фактор VEGF165 или bFGF (40 нг/мл), или VEGF165+различные концентрации лекарственных средств RC28-05 или VF28 (конечные концентрации 0, 0,0125, 0,0625, 0,125, 0,25, 0,5, 1, 5, 25 нМ) или bFGF+различные концентрации лекарственных средств RC28-05 или VF28 (конечные концентрации 0, 0,0156, 0,0625, 0,25, 0,5, 1, 2, 8, 32 нМ) в количестве 100 мкл/лунка с конечным объемом культуры 200 мкл/лунка, 3 экземпляра на образец; культивирование производили непрерывно при 37°C в инкубаторе с 5% CO. Через 72 часа после добавления лекарственного средства культуральную среду в 96-луночном планшете удаляли досуха с помощью центрифугирования и в каждую лунку добавляли базальную среду для культивирования эндотелиальных клеток, содержащую 10% CCK-8, по 100 мкл/лунка. Инкубирование проводили при 37°C в течение 4 часов и определяли OD450 с помощью фотометра для микропланшетов. Степень ингибирования соответствующими лекарственными средствами пролиферации клеток HUVEC, стимулированных VEGF165/bFGF при каждой концентрации, вычисляли как уровень ингибирования пролиферации клеток % = (OD фактор - OD (фактор+лекарственное средство))/OD фактор ×100. Значения IC лекарственных средств вычисляли с помощью программы Prism, и уровни ингибирования максимальной концентрации лекарственного средства тестировали с применением измеренных значений. Сравнивали различия между RC28-05 и VF28 в ингибировании пролиферации клеток HUVEC при стимуляции VEGF165/bFGF. Результаты ингибирования VF28 и RC28-05 пролиферации клеток HUVEC, стимулированных VEGF165/bFGF, показаны на Фиг. 1 и Фиг. 2, и статистика максимального уровня ингибирования и значений IC50 представлена в Таблице 2. Результаты показали, что RC28-05 и VF28 обладали значимым ингибирующим действием на пролиферацию клеток HUVEC, стимулированных VEGF165/bFGF.
Таблица 2. Ингибирующее действие RC28-05 и VF28 на пролиферацию клеток HUVEC, стимулированных VEGF165/bFGF
<b>Лекарственные средства</b>
<b>Стимулирующие факторы</b>
<b>IC</b><sub><b>50</b></sub><b> (нМ)</b>
<b>Максимальный уровень ингибирования (%)</b>
VF28
VEGF<sub>165</sub>
0,48
82,34±1,83
bFGF
3,20
70,16±2,79
RC28-05
VEGF<sub>165</sub>
0,43
80,19±0,27
bFGF
1,50
70,40±1,05
[0056] Пример 5: Получение стоковых растворов RC28-05 и готовых продуктов
[0057] Способ получения стоковых растворов RC28-05 и готовых продуктов был таким же, как для VF28, который, в частности, был следующим:
1) После центрифунгирования раствора клеточной культуры супернатант собирали для афинной хроматографии с белком A;
2) После обработки всего собранного элюата органическими растворителями/детергентами (S/D), к элюату добавляли 1% полисорбата 80 (в/об) и 0,3% трибутилфосфата (в/об) и помещали на 20-25°C в течение 6 ч для инактивации вирусов с липидной оболочкой;
3) После вышеуказанной обработки катионообменную хроматографию на сефарозе использовали для удаления сопутствующих примесей, таких как полимеры и продукты деградации;
4) Анионообменную хроматографию проводили со всеми собранными элюатами для удаления небольшого количества агрегатов, белков клеток-хозяев (CHO), хозяйской ДНК и эндотоксинов и т.п.;
5) Пермеат после вышеуказанной хроматографии собирали и затем фильтровали на наномембране для удаления вирусов, не имеющих липидной оболочки;
6) После ультрафильтрации и концентрирования белкового раствора после наномембранной фильтрации до некоторой концентрации (10-15 мг/мл), буферный раствор в объеме 10-12 объемов концентрированного белка (0,02 моль/л дигидрофосфата натрия, 0,015 моль/л хлорида натрия, 0,2 моль/л сахарозы, pH 6,8) использовали для диализа с заменой буфера, после чего белковый раствор концентрировали (40-45 мг/мл). После добавления 0,02% (в/об) полисорбата 80 и перемешивания до растворения, производили фильтрацию с использованием мембраны с порами 0,45+0,2 мкм и получаемый в результате белковый раствор представлял собой стоковые растворы RC28-05 с концентрацией белка 40-45 мг/мл.
[0058] 7) Получение готовых продуктов: Способ получения 1000 пробирок готовых продуктов с концентрацией 40 мг/мл (0,2 мл/пробирка) был следующим. Концентрацию белка RC28-05 в вышеуказанных стоковых растворах белка определяли и обозначали как C мг/мл, при этом в общей сложности требовалось получить 220 мл раствора белка с учетом 10% потери при заполнении. При этом общее требуемое количество белка составило 220 мл*40 мг/мл*0,2 мл=8,8 г белка, и требуемый объем стокового раствора белка составил V=8,8/C*1000 (мл). Буферный раствор (0,02 моль/л дигидрофосфата натрия, 0,015 моль/л хлорида натрия, 0,2 моль/л сахарозы, 0,02% (в/об) полисорбата 80) добавляли к V мл стокового раствора белка до получения объема 220 мл и перемешивали до гомогенного состояния. Фильтрацию производили с использованием фильтрующей мембраны с размером пор не больше 0,22 мкм для стерилизации. После фасования, закатывания алюминиевой мембраной и упаковки получали готовые продукты RC28-05.
[0059] Пример 6: Исследование стабильности RC28-05 (стоковые растворы/готовые продукты)
[0060] 1. Анализ стабильности стоковых растворов RC28-05
[0061] (1) Анализ чистоты при различном времени хранения (-80°C±10°C)
[0062]  метод ЭВЭЖХ
[0063] 3 партии стоковых растворов RC28-05 (номера партий: RC28-05-YY20160329, RC28-05-YY20160330, RC28-05-YY20160331), помещали в условия длительного теста при -80°C±10°C на 0 часов, 6 месяцев, 9 месяцев и 12 месяцев для анализа чистоты (метод ЭВЭЖХ). Результаты анализа чистоты тестируемых образцов с помощью эксклюзионной хроматографии в каждой контрольной точке времени показали, что все основные пики составляли ≥95,0%. Для получения более подробной информации см. Таблицу 14.
Таблица 14. Результаты анализа чистоты ЭХ стоковых растворов RC28-05 (-80°C±10°C) (%)
<b>Периоды</b><b>Партии</b>
<b>Чистота ЭХ %</b>
<b>T0</b>
<b>6 мес</b>
<b>9 мес</b>
<b>12 мес</b>
<b>RC28-05-YY20160329</b>
<b>98,4</b>
<b>98,2</b>
<b>98,5</b>
<b>100,0</b>
<b>RC28-05-YY20160330</b>
<b>98,0</b>
<b>97,9</b>
<b>98,1</b>
<b>99,8</b>
<b>RC28-05-YY20160331</b>
<b>97,7</b>
<b>97,5</b>
<b>97,8</b>
<b>99,2</b>
<b>Примечание: Критерием оценки чистоты после ЭХ являлся основной пик ≥95,0%;</b><b>"мес" означает "месяц".</b>
[0064]  метод ДСН-ПААГЭ
[0065] 3 партии стоковых растворов RC28-05 (номера партий: RC28-05-YY20160329, RC28-05-YY20160330, RC28-05-YY20160331) помещали в условия длительного теста при -80°C±10°C на 0 часов, 6 месяцев, 9 месяцев и 12 месяцев для анализа чистоты (метод ДСН-ПААГЭ). Результаты показаны в Таблице 15. Данные показали, что при увеличении времени хранения все результаты анализа ДСН-ПААГЭ снижения чистоты стоковых растворов RC28-05 были выше 90%.
Таблица 15. Результаты анализа чистоты ДСН-ПААГЭ стоковых растворов RC28-05 (-80°C±10°C) (%)
<b>Периоды</b><b>Партии</b>
<b>Снижение чистоты согласно ДСН-ПААГЭ %</b>
<b>T0</b>
<b>6 мес</b>
<b>9 мес</b>
<b>12 мес</b>
<b>RC28-05-YY20160329</b>
<b>98,1</b>
<b>98,3</b>
<b>97,7</b>
<b>97,6</b>
<b>RC28-05-YY20160330</b>
<b>98,1</b>
<b>98,1</b>
<b>97,8</b>
<b>97,5</b>
<b>RC28-05-YY20160331</b>
<b>98,8</b>
<b>98,2</b>
<b>97,1</b>
<b>97,8</b>
<b>Примечание: Критерием оценки чистоты после ДСН-ПААГЭ являлось отсутствие снижения чистоты ≥90%;</b><b>"мес" означает "месяц".</b>
[0066] (2) Исследование активности в клетках стоковых растворов при разном времени хранения (-80°C±10°C)
[0067] 3 партии стоковых растворов RC28-05 (номера партий: RC28-05-YY20160329, RC28-05-YY20160330, RC28-05-YY20160331), помещали в условия длительного тестирования при -80°C±10°C на 12 месяцев для анализа активности в клетках; результаты показали, что с помощью анализа активности в клетках стоковых растворов RC28-05, помещенных при -80°C±10°C на 12 месяцев, было обнаружено, что относительная активность клеток в каждую контрольную точку времени в период тестирования соответствовала требованиям качества. См. подробную информацию в Таблице 16.
Таблица 16. Результаты тестов относительной активности в клетках стоковых растворов RC28-05 (-80°C±10°C) (%)
<b>Периоды</b><b>Партии</b>
<b>Относительная активность в клетках %</b>
<b>T0</b>
<b>6 мес</b>
<b>9 мес</b>
<b>12 мес</b>
<b>RC28-05-YY20160329</b>
<b>85,1</b>
<b>92,8</b>
<b>81,8</b>
<b>103,3</b>
<b>RC28-05-YY20160330</b>
<b>93,0</b>
<b>88,1</b>
<b>77,7</b>
<b>95,7</b>
<b>RC28-05-YY20160331</b>
<b>86,7</b>
<b>100,5</b>
<b>92,7</b>
<b>106,0</b>
<b>Примечание: Критерием оценки активности в клетках являлось значение активности, которое должно было составлять 70-130%;</b><b>"мес" означает "месяц".</b>
[0068] (3) Эксперимент на активность связывания стоковых растворов при разном времени хранения (-80°C±10°C)
[0069] 3 партии стоковых растворов RC28-05 (номера партий: RC28-05-YY20160329, RC28-05-YY20160330, RC28-05-YY20160331), помещали в условия длительного тестирования при -80°C±10°C на 12 месяцев для анализа активности связывания (метод ИФА); результаты показали, что с помощью анализа относительной активности связывания стоковых растворов RC28-05, помещенных при -80°C ±10°C на 12 месяцев, было обнаружено, что относительная активность клеток в каждой контрольной точке времени в период тестирования соответствует требованиям качества. См. подробную информацию в Таблице 17.
Таблица 17. Результаты тестов относительной активности связывания стоковых растворов RC28-05 (-80°C±10°C) (%)
<b>Периоды</b><b>Партии</b>
<b>Относительная активность связывания</b>
<b>T0</b>
<b>6 мес</b>
<b>9 мес</b>
<b>12 мес</b>
<b>VEGF</b>
<b>FGF</b>
<b>RC28-05-YY20160329</b>
<b>87,6</b>
<b>97,4</b>
<b>101,4</b>
<b>114,6</b>
<b>92,9</b>
<b>RC28-05-YY20160330</b>
<b>120,2</b>
<b>109,6</b>
<b>99,6</b>
<b>105,0</b>
<b>105,6</b>
<b>RC28-05-YY20160331</b>
<b>103,0</b>
<b>94,5</b>
<b>101,5</b>
<b>103,6</b>
<b>118,9</b>
<b>Примечание: Критерием оценки относительной активности связывания являлось значение относительной активности связывания, которое должно было составлять 70-130%;</b><b>T0 являлось анализом в двойной системе, тогда как остальные точки времени являлись анализом в одиночной системе</b><b>"мес" означает "месяц".</b>
[0070] 2. Анализ стабильности готового продукта RC28-05
[0071] (1) Анализ чистоты при разном времени хранения
[0072]  метод ЭВЭЖХ
[0073] 3 партии готовых продуктов RC28-05 (номера партий: RC28-05-20160401-1, RC28-05-20160401-2, RC28-05-20160401-3) помещали в условия длительного тестирования при 5°C±3°C на 12 месяцев, в условия ускоренного тестирования при 25°C±2°C на 1 месяц, соответственно, для анализа чистоты (метод ЭВЭЖХ). Результаты эксперимента показали, что с помощью анализа чистоты (метод ЭВЭЖХ) готового продукта, помещенного в условия длительного тестирования при 5°C±3°C на 12 месяцев, было обнаружено, что все результаты испытаний чистоты ЭХ тестируемых образцов в каждой контрольной точке времени в течение экспериментального периода составляли приблизительно 95%; тогда как в случае, когда готовый продукт был помещен в условия ускоренного тестирования при 25°C±2°C на 1 месяц, результаты испытаний чистоты испытательных образцов с помощью ЭХ в каждой контрольной точке времени показали, что все основные пики были ≥95,0%. См. подробную информацию в Таблице 18 и Таблице 19.
Таблица 18. Результаты тестов чистоты ЭХ готовых продуктов RC28-05 (5°C±3°C) (%)
<b>Периоды</b><b>Партии</b>
<b>Чистота согласно ЭХ</b>
<b>T0</b>
<b>3 мес</b>
<b>6 мес</b>
<b>9 мес</b>
<b>12 мес</b>
<b>RC28-05-20160401-1</b>
<b>98,4</b>
<b>98,4</b>
<b>97,4</b>
<b>96,9</b>
<b>97,9</b>
<b>RC28-05-20160401-2</b>
<b>98,1</b>
<b>98,1</b>
<b>97,0</b>
<b>96,6</b>
<b>97,1</b>
<b>RC28-05-20160401-3</b>
<b>97,7</b>
<b>97,7</b>
<b>96,7</b>
<b>96,4</b>
<b>96,9</b>
<b>Примечание: Критерием оценки чистоты ЭХ являлся основной пик ≥95,0%;</b><b>"мес" означает "месяц".</b>
Таблица 19. Результаты тестов чистоты ЭХ готовых продуктов RC28-05 (25°C±2°C) (%)
<b>Периоды</b><b>Партии</b>
<b>Чистота согласно ЭХ</b>
<b>0 д</b>
<b>10 д</b>
<b>20 д</b>
<b>30 д</b>
<b>RC28-05-20160401-1</b>
<b>98,4</b>
<b>96,6</b>
<b>96,1</b>
<b>96,6</b>
<b>RC28-05-20160401-2</b>
<b>98,1</b>
<b>96,3</b>
<b>95,8</b>
<b>96,1</b>
<b>RC28-05-20160401-3</b>
<b>97,7</b>
<b>96,2</b>
<b>95,6</b>
<b>95,9</b>
<b>Примечание: Критерием оценки чистоты ЭХ являлся основной пик ≥95,0%;</b><b>"мес" означает "месяц".</b>
[0074]  метод ДСН-ПААГЭ
[0075] 3 партии готовых продуктов RC28-05 (номера партий: RC28-05-20160401-1, RC28-05-20160401-2, RC28-05-20160401-3), помещали в условия длительного тестирования при 5°C ±3°C на 12 месяцев, при 25°C±2°C на 1 месяц, соответственно, для анализа чистоты (метод ДСН-ПААГЭ). Результаты показали, что с помощью анализа чистоты (ДСН-ПААГЭ) готового продукта RC28-05, помещенного при 5°C±3°C на 12 месяцев, было обнаружено, что все результаты анализа снижения чистоты тестируемых образцов с помощью ДСН-ПААГЭ в каждой контрольной точке времени в течение теста были больше 90,0%; посредством анализа чистоты (ДСН-ПААГЭ) готового продукта RC28-05, помещенного при 25°C±2°C на 6 месяцев было обнаружено, что снижение чистоты тестируемых образцов согласно ДСН-ПААГЭ в каждой контрольной точке времени стремилось к уменьшению, тогда как результаты всех тестов были больше 90,0%. См. подробную информацию в Таблице 20 и Таблице 21.
Таблица 20. Результаты тестов чистоты ДСН-ПААГЭ готовых продуктов RC28-05 (5°C±3°C) (%)
<b>Периоды</b><b>Партии</b>
<b>Снижение согласно ДСН-ПААГЭ</b>
<b>0 ч</b>
<b>3 мес</b>
<b>6 мес</b>
<b>9 мес</b>
<b>12 мес</b>
<b>RC28-05-20160401-1</b>
<b>98,9</b>
<b>97,7</b>
<b>97,0</b>
<b>96,9</b>
<b>95,7</b>
<b>RC28-05-20160401-2</b>
<b>97,9</b>
<b>97,6</b>
<b>96,7</b>
<b>97,7</b>
<b>95,9</b>
<b>RC28-05-20160401-3</b>
<b>98,0</b>
<b>97,6</b>
<b>97,0</b>
<b>96,9</b>
<b>96,3</b>
<b>Примечание: Критерием оценки чистоты ДСН-ПААГЭ являлось отсутствие снижения чистоты ≥90%;</b><b>"мес" означает "месяц".</b>
Таблица 21. Результаты тестов снижения чистоты ДСН-ПААГЭ готовых продуктов RC28-05 (25°C±2°C) (%)
<b>Периоды</b><b>Партии</b>
<b>Снижение согласно ДСН-ПААГЭ</b>
<b>0 д</b>
<b>10 д</b>
<b>20 д</b>
<b>30 д</b>
<b>RC28-05-20160401-1</b>
<b>98,9</b>
<b>96,3</b>
<b>97,5</b>
<b>97,8</b>
<b>RC28-05-20160401-2</b>
<b>97,9</b>
<b>96,1</b>
<b>97,4</b>
<b>97,6</b>
<b>RC28-05-20160401-3</b>
<b>98,0</b>
<b>96,0</b>
<b>96,8</b>
<b>98,1</b>
<b>Примечание: Критерием оценки чистоты ДСН-ПААГЭ являлось отсутствие снижения чистоты ≥90%;</b><b>"д" означает "день".</b>
[0076] (2) Исследование активности в клетках готовых продуктов при разном времени хранения
[0077] 3 партии готовых продуктов RC28-05 (номера партий: RC28-05-20160401-1, RC28-05-20160401-2, RC28-05-20160401-3) помещали в условия длительного тестирования при 5°C±3°C на 12 месяцев, при 25°C±2°C на 1 месяц, соответственно, для анализа активности в клетках. Результаты показали, что с помощью анализа активности в клетках готового продукта, помещенного при 5°C±3°C на 12 месяцев, было обнаружено, что все относительные результаты активности в клетках тестируемых образцов в каждой контрольной точке времени в течение теста удовлетворяли требованиям критериев оценки; все результаты тестов относительной активности в клетках в каждой контрольной точке времени в течение теста отвечали требованиям качества согласно анализу активности в клетках готового продукта, помещенного при 25°C±2°C на 1 месяц. См. подробную информацию в Таблице 22 и Таблице 23.
Таблица 22. Результаты тестов относительной активности в клетках готовых продуктов RC28-05 (5°C±3°C) (%)
<b>Периоды</b><b>Партии</b>
<b>Относительная активность в клетках</b>
<b>0 ч</b>
<b>3 мес</b>
<b>6 мес</b>
<b>9 мес</b>
<b>12 мес</b>
<b>RC28-05-20160401-1</b>
<b>120,8</b>
<b>125,1</b>
<b>111,8</b>
<b>85,4</b>
<b>100,2</b>
<b>RC28-05-20160401-2</b>
<b>104,3</b>
<b>125,1</b>
<b>96,1</b>
<b>85,0</b>
<b>103,4</b>
<b>RC28-05-20160401-3</b>
<b>105,2</b>
<b>111,7</b>
<b>100,5</b>
<b>93,7</b>
<b>100,3</b>
<b>Примечание: Критерием оценки относительной активности в клетках являлось то, что относительная активность в клетках должна была составлять 70-130%;</b><b>"мес" означает "месяц".</b>
Таблица 23. Результаты тестов относительной активности в клетках готовых продуктов RC28-05 (25°C±2°C) (%)
<b>Периоды</b><b>Партии</b>
<b>Относительная активность в клетках</b>
<b>0 д</b>
<b>10 д</b>
<b>20 д</b>
<b>30 д</b>
<b>RC28-05-20160401-1</b>
<b>120,8</b>
<b>103,4</b>
<b>88,7</b>
<b>110,0</b>
<b>RC28-05-20160401-2</b>
<b>104,3</b>
<b>93,4</b>
<b>90,6</b>
<b>108,4</b>
<b>RC28-05-20160401-3</b>
<b>105,2</b>
<b>94,4</b>
<b>88,0</b>
<b>104,1</b>
<b>Примечание: Критерием оценки чистоты ДСН-ПААГЭ являлось отсутствие снижения чистоты ≥90%;</b><b>"д" означает "день".</b>
[0078] (3) Исследование активности связывания готовых продуктов при разном времени хранения
[0079] 3 партии готовых продуктов RC28-05 (номера партий: RC28-05-20160401-1, RC28-05-20160401-2, RC28-05-20160401-3), помещали в условия длительного тестирования при 5°C±3°C на 12 месяцев, при 25°C±2°C на 1 месяц, соответственно, для анализа активности связывания. Результаты показали, что с помощью анализа активности связывания готовых продуктов, помещенных при 5°C±3°C на 12 месяцев, было обнаружено, что все результаты относительной активности связывания тестируемых образцов в каждой контрольной точке времени в течение теста удовлетворяли требованиям критериев оценки; посредством анализа активности связывания готовых продуктов при 25°C±2°C в течение 1 месяца, все результаты тестов относительной активности связывания (конец VEGF и конец FGF) в каждой контрольной точке времени в течение теста отвечали требованиям качества. См. подробную информацию в Таблице 24 и Таблице 25.
Таблица 24. Результаты тестов относительной активности связывания готовых продуктов RC28-05 (5°C±3°C) (%)
<b>Периоды</b><b>Партии</b>
<b>Относительная активность связывания</b>
<b>0 ч </b>（VEGF; FGF)
<b>3 мес</b>
<b>6 мес</b>
<b>9 мес</b>
<b>12 мес</b>
<b>RC28-05-20160401-1</b>
72,8; 90,5
111,6
107,6
104,9
119,3
<b>RC28-05-20160401-2</b>
76,9; 76,5
116,1
102,4
112,0
109,8
<b>RC28-05-20160401-3</b>
85,5; 86,1
107,1
98,5
110,2
111,1
<b>Примечание: Критерием оценки относительной активности связывания являлось то, что относительная активность связывания должна была составлять 70-130%;</b><b>0 ч являлось анализом в двойной системе, тогда как остальные точки времени являлись анализом в одиночной системе;</b><b>"мес" означает "месяц".</b>
Таблица 25. Результаты тестов относительной активности связывания готовых продуктов RC28-05 (25°C±2°C) (%)
<b>Периоды</b><b>Партии</b>
<b>Относительная активность связывания</b>
<b>0 д </b>（VEGF; FGF)
<b>10 д</b>
<b>20 д</b>
<b>30 д</b>
<b>RC28-05-20160401-1</b>
72,8; 90,5
112,4
104,5
95,7
<b>RC28-05-20160401-2</b>
76,9; 76,5
109,4
120,5
101,2
<b>RC28-05-20160401-3</b>
85,5; 86,1
107,8
118,6
113,1
<b>Примечание: Критерием оценки относительной активности связывания являлось то, что относительная активность связывания должна была составлять 70-130%;</b><b>0 ч являлось анализом в двойной системе, тогда как остальные точки времени являлись анализом в одиночной системе;</b><b>"д" означает "день".</b>
[0080] 3. Выводы из экспериментов
[0081] Было исследовано хранение 3 партий стоковых растворов RC28-05 (номера партий: RC28-05-YY20160329, RC28-05-YY20160330, RC28-05-YY20160331) в условиях длительного тестирования при -80°C±10°C. Были получены следующие результаты:
Чистота согласно ЭХ: 3 партии стоковых растворов RC28-05 были помещены в условия -80°C±10°C на 12 месяцев с их чистотой ЭХ ≥90%.
Снижение чистоты согласно ДСН-ПААГЭ: 3 партии стоковых растворов RC28-05 были помещены при -80°C±10°C на 12 месяцев со снжением их чистоты ≥90%.
Активность в клетках: 3 партии стоковых растворов RC28-05 были помещены при -80°C±10°C на 12 месяцев. С помощью анализа активности в клетках было обнаружено, что относительная активность клеток в каждой контрольной точке времени в течение теста отвечала требованиям качества.
Активность связывания: 3 партии стоковых растворов RC28-05 были помещены при -80°C±10°C на 12 месяцев. С помощью анализа активности в клетках было обнаружено, что относительная активность клеток в каждой контрольной точке времени в течение теста отвечали требованиям качества.
[0082] Исследовали хранение 3 партий готовых продуктов RC28-05 (номера партий: RC28-05-20160401-1, RC28-05-20160401-2, RC28-05-20160401-3) при условиях 5°C±3°C, 25°C±2°C, соответственно. Были получены следующие результаты:
Чистота согласно ЭХ:
3 партии готовых продуктов RC28-05 были помещены в условия 5°C±3°C на 12 месяцев с их чистотой ЭХ ≥90%;
3 партии готовых продуктов RC28-05 были помещены в условия 25°C±2°C на 1 месяц с их чистотой ЭХ ≥90%.
Снижение чистоты согласно ДСН-ПААГЭ:
3 партии RC28-05 готовых продуктов RC28-05 были помещены в условия 5°C±3°C на 12 месяцев со снижением их чистоты согласно ДСН-ПААГЭ ≥90%;
3 партии RC28-05 готовых продуктов RC28-05 были помещены в условия 25°C±2°C на 1 месяц со снижением их чистоты согласно ДСН-ПААГЭ ≥90%.
Активность в клетках:
3 партии готовых продуктов RC28-05 были помещены в условия 5°C±3°C на 12 месяцев, при этом все результаты анализа активности в клетках тестируемых образцов в каждой контрольной точке времени удовлетворяли требованиям критериев оценки;
3 партии готовых продуктов RC28-05 были помещены в условия 25°C±2°C на 1 месяц, при этом все результаты анализа активности в клетках тестируемых образцов в каждой контрольной точке времени удовлетворяли требованиям критериев оценки.
Активность связывания:
3 партии готовых продуктов RC28-05 были помещены при 5°C±3°C на 12 месяцев, при этом все результаты анализа активности в клетках тестируемых образцов в каждой контрольной точке времени удовлетворяли требованиям критериев оценки;
3 партии готовых продуктов RC28-05 были помещены при 25°C±2°C на 1 месяц, при этом все результаты анализа активности в клетках тестируемых образцов в каждой контрольной точке времени удовлетворяли требованиям критериев оценки.
[0083] Из этого могут быть сделаны следующие выводы:
Стоковые растворы RC28-05 можно хранить в стабильном состоянии в течение по меньшей мере 12 месяцев при условиях -80°C±10°C, тогда как стоковый раствор VF28 не удовлетворяет требованиям активности после 6 месяцев при таких же условиях.
Готовые продукты RC28-05 можно хранить в стабильном состоянии в течение по меньшей мере 12 месяцев при условиях 5°C±3°C, тогда как VF28 хранился в стабильном состоянии при таких же условиях в течение 6 месяцев.
Готовые продукты RC28-05 можно хранить в стабильном состоянии при 25°C±2°C в течение по меньшей мере 1 месяца, тогда как 1/3 партий стокового раствора VF28 не удовлетворяли требованиям активности при таких же условиях.
В заключение следует отметить, что стоковые растворы RC28-05 были стабильными при -80°C±10°C, тогда как готовые продукты RC28-05 стабильно хранились при условиях 5°C±3°C (в течение по меньшей мере 12 месяцев) и 25°C±2°C (в течение по меньшей мере 1 месяца), время хранения которых в стабильном состоянии было намного более длительным, чем у VF28 при таких же условиях.
[0084] Настоящее изобретение было проиллюстрировано различными конкретными примерами. Однако специалист в данной области техники сумеет понять, что настоящее изобретение не ограничивается каждым конкретным вариантом осуществления, при этом средний специалист в данной области сможет внести различные изменения или модификации в рамках объема настоящего изобретения, и любые технические признаки, указанные в каких-либо разделах настоящего описания, могут быть объединены друг с другом без отступления от сущности и объема настоящего изобретения. Такие изменения и модификации входят в объем настоящего изобретения.