Значение полиморфизма генов антиоксидантных ферментов в формировании бронхолегочной дисплазии у недоношенных новорожденных

КЛИНИЧЕСКИЙ ПОЛИМОРФИЗМ СИНДРОМА ВЕГЕТАТИВНОЙ ДИСТОНИИ У ДЕТЕЙ ГОРОДА АБАКАНА В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ЭТНИЧЕСКИХ И ПАТОБИОМЕХАНИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ

Павлинова Е.Б.

Омская государственная медицинская академия,

г. Омск

ЗНАЧЕНИЕ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ АНТИОКСИДАНТНЫХ ФЕРМЕНТОВ В ФОРМИРОВАНИИ БРОНХОЛЕГОЧНОЙ ДИСПЛАЗИИ У НЕДОНОШЕННЫХ НОВОРОЖДЕННЫХ

В последнее время был проведен ряд исследований по выявлению генов-кандидатов при бронхолегочной дисплазии (БЛД). Одним из перспективных направлений является определение однонуклеотидных замен в генах антиоксидан-тных ферментов. В работе исследован уровень маркеров оксидативного стресса у недоношенных новорожденных, имеющих риск развития БЛД, в зависимости от наличия полиморфных вариантов генов ферментов манганилсупероксид-дисмутазы (MnSOD) и глютаматцистеинлигазы (GCL) для уточнения их вклада в формирование заболевания. Основную группу составили 60 недоношенных детей. Идентификацию аллельных вариантов, обусловленных точечными нуклеотидными заменами, выполнили с помощью аллель-специфической полимеразной цепной реакции. У пациентов группы риска развития БЛД статистически значимо чаще регистрировались минорные аллели -129Т GCLC и -60Т sod2. В 44,4 % случаев дети, развившие БЛД, имели гетерозиготный генотип 129 СТ GCLC (р < 0,05), а полиморфный генотип 58ТСsod2 диагностирован у 30 % пациентов (р < 0,05). Недоношенные дети с полиморфными вариантами генов MnSOD и GCL имели более низкий уровень общей антиоксидантной способности, супероксиддисмутазы и глютатиона в сыворотке крови по сравнению с детьми с обычным генотипом. Таким образом, можно предположить, что полиморфизм генов антиоксидантных ферментов имеет патогенетическое значение в формировании БЛД.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: недоношенные дети; бронхолегочная дисплазия; антиоксидантные ферменты; полиморфизм генов.

Pavlinova E.B.

Omsk State Medical Academy, Omsk

THE VALUE OF ANTIOXIDANT ENZYME GENE POLYMORPHISM IN THE FORMATION

OF BRONCHOPULMONARY DYSPLASIA IN PREMATURE INFANTS

Recently, a number of studies to identify candidate genes in bronchopulmonary dysplasia (BPD). One promising direction is to identify single-nucleotide substitutions in the genes of antioxidant enzymes. In this paper we investigated markers of oxidative stress in preterm infants at risk of BPD, depending on the availability of polymorphic variants of genes of enzymes manganese superoxide dismutase (MnSOD) and glutathione cystein ligaze (GCL) to clarify their contribution to the formation of the disease. The main group consisted of 60 preterm infants. Identification of allelic variants caused by point nucleotide substitutions, performed with allele-specific polymerase chain reaction. Patients at risk of BPD were significantly more likely detected minor alleles -129T and -60T GCLC sod2. In 44,4 % of children who have developed BPD had a heterozygous genotype CT 129 GCLC (p < 0,05), and polymorphic genotype of 58 TC sod2 was diagnosed in 30 % of patients (p < 0,05). Premature babies with polymorphic variants of genes MnSOD and GCL had lower levels of total antioxidant capacity, superoxide dismu-tase and glutathione in the blood serum as compared to children with normal genotype. Thus, we can assume that the antioxidant enzyme gene polymorphism has a pathogenetic role in the formation of BPD.

KEY WORDS: premature infants; bronchopulmonary dysplasia; antioxidant enzymes; gene polymorphism.

Болезни легких занимают важное место в структуре заболеваемости и смертности новорожденных и грудных детей. С неонатальным периодом связана такая патология легких, как бронхолегочная дисплазия (БЛД), формирующаяся преимущественно у недоношенных детей и имеющая хроническое течение. Проблема БЛД является актуальной в педиатрии и, в частности, в детской пульмонологии. Это связано с тем, что данная патология является наиболее распространенной формой среди хронических заболеваний легких в раннем возрасте и второй по частоте после бронхиальной астмы в последующие периоды детства [1].

Патогенез БЛД многофакторный. Хорошо известны основные риски развития БЛД: повреждение легких ИВЛ (высокой концентрацией кислорода в дыхательной смеси, давлением, объемом); незрелость легочной ткани (респираторный дистресс-синдром); недостаточность антиоксидантной защиты; внутриутробная и постнатальная инфекция [2]. В последнее время, в связи с развитием перинатальных технологий и улучшением оказания помощи глубоко недоношенным детям (применение препаратов сурфактанта, щадящие методики искусственной вентиляции легких) «ятрогенные» причины развития БЛД максимально компенсированы, однако количество детей, страдающих заболеванием, не становится меньше. По данным литературы, БЛД чаще всего формируют недоношенные дети с низкой и экстремально низкой массой тела при рождении, которые необязательно нуждались в высоких концентрациях и длительной терапии кислородом, не всем из них проводилась механическая вентиляция легких, а у некоторых вообще не было РДС [3]. Поэтому главную роль отводят эндогенным факторам риска, к которым, в частности, относится генетическая предрасположенность

[4].

В последнее время был проведен ряд исследований по выявлению генов-кандидатов при БЛД, вызывающих нарушения на уровне антиоксидантной и иммунной систем защиты организма, функционирования сосудистой системы лёгких и системы продук-

Корреспонденцию адресовать:

ПАВЛИНОВА Елена Борисовна,

644047, г. Омск, ул. Ленина, д.12,

ГБОУ ВПО ОмГМА Минздравсоцразвития России. Тел.: 8 (3812) 36-16-47; 8 (3812) 36-22-20.

E-mail: 123elena@mail.ru

ции белков сурфактанта [5-7]. Одним из перспективных направлений является определение однонуклеотидных замен в генах антиоксидантных ферментов. Например, такая взаимосвязь с риском формирования БЛД была показана для гена глутатион-Б-тран-сферазы-Р1 [8]. На наш взгляд, необходимы дальнейшие исследования генетических полиморфизмов ферментов, обеспечивающих защиту от окислительного стресса, таких как супероксиддисмутаза (SOD) и глутаматцистеин лигаза (GCL) у недоношенных новорожденных.

Фермент SOD представлен тремя вариантами (изоформами): цитозольная — Cu,ZnSOD, митохондриальная — MnSOD и внеклеточная ЭSOD. Вторая форма фермента — это содержащий в активном центре марганец тетрамерный белок, находящийся в митохондриях [9]. Li Y. и др. (1995) предположили, что MnSOD требуется для нормального функционирования биологических тканей, поддерживая целостность митохондриальных ферментов восприимчивых к прямой инактивации супероксидом [10]. Ген MnSOD (sod 2) расположен в дистальной части хромосомы 6q25.3 и не имеет сколько-нибудь значимой гомологии с Си^п-СОД и ЭСОД. Bastaki М. и др. (2006) проанализировали активность MnSOD в митохондриях у здоровых некурящих людей и обнаружили, что ее активность на 15 % выше у женщин, чем у мужчин, и на 33 % выше у лиц с СТ или ТТ генотипами полиморфизма 47 С/Т, чем у лиц с СС. Исследователи пришли к выводу, что вариабельность антиоксидантной активности фермента объясняется значительными ассоциациями с тремя известными генетическими полиморфизмами [11]. Кроме того, возможно наличие других вариантов однонуклеотидных замен в гене MnSOD, которые могут влиять на уровень экспрессии, активность протеина или его конформацию.

SOD и каталаза не нуждаются в кофакторах, что делает их работу автономной, не зависящей от функционирования других клеточных структур. В то же время, для работы глутатион-зависимых ферментов необходим восстановленный глутатион, который синтезируется посредством реакций, осуществляемых GCL и глютатионсинтетазой. Фермент GCL — это гетеродимер, состоящий из каталитической (GCLC) и регуляторной (GCLM) субъединицы. Каталитическая субъединица обеспечивает каталитическую активность фермента, а регуляторная повышает каталитическую эффективность [12]. Они кодируются

ЗНАЧЕНИЕ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ АНТИОКСИДАНТНЫХ ФЕРМЕНТОВ В ФОРМИРОВАНИИ БРОНХОЛЕГОЧНОЙ ДИСПЛАЗИИ У НЕДОНОШЕННЫХ НОВОРОЖДЕННЫХ

генами ОСЬС (в локусе 6р12) и ОСЬМ (в локусе 1р22-р21), соответственно. Мыши, не имеющие гена каталитической субъединицы, умирают до рождения [13]. Мыши, не имеющие гена регуляторной субъединицы, не имеют фенотипических проявлений заболевания, хотя показывают пониженный уровень глу-татиона и имеют повышенную чувствительность к токсическим поражениям [14]. В исследованиях Ыа-еашига Б. (2002) и Оу8т R. (2007) был установлен полиморфизм генов ОСЬМ и ОСЬС [15, 16]. Экспрессия генов локализована преимущественно в эпителиальных клетках дыхательных путей, что, возможно, объясняет высокую антиоксидантную активность жидкости, прилегающей к апикальной части эпителия. Ро81ша D. с соавторами исследовали повреждающее действие табачного дыма в зависимости от полиморфизма генов, кодирующих ОСЬС. Авторы установили, что полиморфизм гена ОСЬС влияет на прогрессивное снижение функции легких: в этой группе отмечались более тяжелые стадии хронической обс-труктивной болезни легких [17]. Вероятно, возможный вклад однонуклеотидных замен в генах антиоксидан-тных ферментов в патогенез заболевания заключается в изменении баланса прооксидантов и антиоксидантов в организме недоношенного ребенка и усилении патологического воздействия свободных радикалов на незрелую легочную ткань, что может привести к формированию БЛД.

Цель — исследовать уровень маркеров оксидатив-ного стресса у недоношенных новорожденных группы риска развития БЛД в зависимости от наличия полиморфных вариантов генов MnSOD и ОСЬ для уточнения их вклада в формирование заболевания.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В фиксированное когортное проспективное контролируемое исследование были включены 60 недоношенных детей, имевших, в соответствии с прогностическими параметрами, определенными по методу А. Вальда, высокий риск развития БЛД (основная группа). Пациенты получали лечение в реанимационном и отделении недоношенных детей Омской областной детской клинической больницы и Городского перинатального центра в 2008-2010 гг. Это дети со сроком гестации 27-35 недель, поступившие из родильных домов на второй этап выхаживания в реанимационное отделение стационара (из них 37 мальчиков, 22 девочки, 2 двойни). Пациенты исследуемой группы имели дыхательные расстройства (респираторный дистресс-синдром), все находились на искусственной вентиляции легких. Критериями исключения являлись: наличие врожденных пороков развития легких и сердца (за исключением открытого артериального протока и открытого овального окна); генерализованной внутриутробной инфекции, сепсиса, аспирационного синдрома; проведение ИВЛ по

поводу тяжелого гипоксического поражения центральной нервной системы (ЦНС) и пороков развития ЦНС. Группу контроля составили недоношенные дети без респираторных нарушений со сроком гестации 33-36 недель, не нуждавшиеся в респираторной поддержке с момента рождения и находившиеся на втором этапе выхаживания в отделении недоношенных детей (n = 30, из них 14 мальчиков, 16 девочек, 1 двойня).

В процессе динамического наблюдения за основной группой сформированы 2 подгруппы: 27 пациентов, у которых развилась БЛД (1 подгруппа), и 33 ребенка без поражения легких (2 подгруппа). Диагноз БЛД был поставлен по критериям Jobe и Ban-calary (2001) на основании наличия потребности в дополнительном кислороде в возрасте 28 суток жизни. Степень тяжести БЛД определялась в 36 недель постконцептуального возраста (у детей со сроком гестации менее 32 недель) либо в 56 дней жизни (у детей со сроком гестации 32 недели и более).

У всех детей проводился анализ данных материнского анамнеза, состояния ребенка после рождения, оценивались данные клинического осмотра, инструментальных методов обследования (рентгенографии органов грудной клетки, эхокардиографии, электрокардиографии).

Обследуемым пациентам проводилось молекулярно-генетическое исследование венозной крови, стабилизированной 2,5 % раствором ЭДТА в соотношении 10 : 1. Образцы геномной ДНК выделяли из лейкоцитарной фракции с использованием комплекса реагентов «SNP-экспресс». Исследован аллельный полиморфизм 3 генетических маркеров (табл. 1):

- полиморфизм гена MnSOD, в котором тимидин в позиции 58, относящейся к 3 экзону, замещен на цитозин, что приводит к изменению аминокислотного остатка изолейцина на треонин и способствует снижению активности фермента [18].

- полиморфизм гена MnSOD, в котором цитозин в позиции 60 в 3 экзоне замещен на тимин, что приводит к замене аминокислоты лейцин на фенилаланин и изменению уровня MnSOD [18].

- полиморфизм каталитической субъединицы GCL, который заключается в точечной замене в позиции 129 цитозина на тимин [19].

Амплификацию участков геномной ДНК, содержащих указанные полиморфизмы, осуществляли на основе технологии полимеразной цепной реакции (ПЦР). Идентификацию аллельных вариантов, обусловленных точечными нуклеотидными заменами, выполнили с помощью аллель-специфической ПЦР.

Кроме того, у детей основной и контрольной групп были исследованы общая окислительная способность крови (Т_О_С) и общая антиоксидантная способность крови (Т_А_С), которые определяют баланс между прооксидантами и антиоксидантами и изменены при заболеваниях, вызываемых повреждением

Сведения об авторах:

ПАВЛИНОВА Елена Борисовна, канд. мед. наук, доцент, кафедра педиатрии факультета последипломного образования, ГБОУ ВПО ОмГМА Минздравсоцразвития России, г. Омск, Россия. E-mail: 123elena@mail.ru

Таблица 1

Распределение полиморфизмов GCLC и sod2 в основной и контрольной группах

ЧВ аллеля ЧВ генотипа

Полиморфизм Аллель Основная группа, n = 60 Контрольная группа, n = 30 Генотип Основная группа, n = 60 Контрольная группа, n = 30

129 С* 96

GCLC 129 С/Т 129 Т* 24 (20 %) 4 (6,7 %) 129 (ТТ) 1 (1,7 %) 0

129

58 Т 107

sod2 58 Т/С 58 С 13 (10,8 %) 5 (8,3 %) 58 (СС) 1 (1,7 %) 0

58

60 С 107

sod2 60 С/Т 60 Т* 13 (10,8 %) 2 (3,3 %) 60 (ТТ) 1 (1,7 %) 0

60

Примечание: * различия между группами 1 и 2 статистически значимые (критерий х2 с поправкой Йетса); ЧВ - частота встречаемости.

тканей свободными радикалами. Значения Т_А_С и Т_О_С были найдены с помощью микропланшетно-го колориметрического теста. Также были оценены содержание в сыворотке крови фермента суперок-сиддисмутазы и глутатиона, как продуктов, уровень которых может изменяться при наличии однонуклеотидных замен в генах соответсвующих антиоксидан-тных ферментов. Супероксиддисмутазу определяли в сыворотке крови с использованием стандартных реактивов на биохимическом анализаторе «Screen Master». Содержание восстановленного глутатиона в сыворотке крови определяли методом J. Sedlak (1968). Исследование генетических и биохимических маркеров проводилось на первой неделе жизни ребенка.

Статистическая обработка результатов выполнена с использованием лицензионных программ «MS Exсel», «Statistica-б». Частоты встречаемости аллелей и генотипов определяли прямым подсчетом. При соответствии данных нормальному распределению значения количественных признаков представлялись в виде M ± 8, где М — среднее значение количественного признака, 8 — стандартное отклонение среднего. Проверка статистических гипотез осуществлялась путем выявления различий между сравниваемыми группами с применением критерия хи-квадрат, U-критерия Манна-Уитни. При всех статистических расчетах критический уровень ошибки р принимался равным 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Срок гестации у детей основной группы составил 30,9 ± 2,3 недель, средняя масса при рождении — 1563,40 ± 416,31 г (900,0-2290,0); у детей группы сравнения срок гестации 33,2 ± 1,6 недели, масса при рождении 1824,17 ± 241,74 г (1640,0-2490,0). Таким образом, дети основной группы отличались по

массе тела и сроку гестации от детей группы сравнения, что обусловлено формированием основной группы (табл. 2).

Состояние при рождении у всех детей основной группы оценено как тяжелое или очень тяжелое, тяжесть состояния была обусловлена наличием дыхательной недостаточности II-III ст. и неврологической симптоматики (синдром угнетения ЦНС) на фоне недоношенности. При физикаль-ном исследовании легких у всех детей с респираторным дистресс-синдромом отмечалось ослабленное неравномерное дыхание, рассеянная крепитация, реже сухие и влажные мелкопузырчатые хрипы.

Результаты анализа полиморфных локусов генов MnSOD и ОСЬ основной группы и группы контроля представлены в таблице 1. У пациентов группы риска развития БЛД и у недоношенных пациентов без дыхательных расстройств преобладал обычный генотип 129 СС ОСЬС (61,6 % и 86,7 %, соответственно, х2 = 0,84; р > 0,05), 58 ТТ 8оа2 (80 % и 83,3 %, х2 = 0,02; р > 0,05), 60 СС 8оа2 (81,6 % и 93,3 %, х2 = 1,42; р > 0,05). Однако в основной группе достоверно чаще встречалось гетерозиготное носительство мутантного гена ОСЬС (36,7 % против 13,3 %, соответственно, х2 = 6,73; р < 0,05). Кроме того, частота встречаемости стандартных аллелей -129С ОСЬС и -60С sod2 была выше в группе контроля, а у пациентов группы риска развития заболевания статистически значимо чаще регистрировались минорные аллели -129Т ОСЬС и 60Т sod2. Возможно, это привело к более низкой защите от окислительного стресса, что способствовало формированию БЛД у части пациентов основной группы. Ген-генная ассоциация 129 СТ ОСЬС и 58 тС sod2 была найдена у 4 детей, 129 СТ ОСЬС и 60 СТ sod2 — у 1 ребенка.

В процессе наблюдения среди детей основной группы были сформированы две подгруппы. В 1 подгруп-

Таблица 2

Показатели антропометрии и гестационного возраста детей основной группы и группы сравнения

Показатель Основная группа, n = 60 Группа сравнения, n = 30 Р*

Масса тела, г 1563,4 ± 416,31 1824,17 ± 241,74 0,009

Длина тела, см 40,77 ± 3,69 44,01 ± 3,78 0

Окружность груди, см 27,8 ± 2,70 30,57 ± 2,98 0

Окружность головы, см 25,50 ± 2,49 27,18 ± 2,72 0,009

Срок гестации, нед 30,9 ± 2,34 33,20 ± 1,63 0

Примечание: * сравнение двух групп переменных с помощью критерия Манна-Уитни.

Information about authors:

PAVLINOVA Elena Borisovna, candidate of medical sciences, docent, department of pediatrics, Omsk State Medical Academy, Omsk, Russia. E-mail: 123elena@mail.ru

ЗНАЧЕНИЕ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ АНТИОКСИДАНТНЫХ ФЕРМЕНТОВ В ФОРМИРОВАНИИ БРОНХОЛЕГОЧНОЙ ДИСПЛАЗИИ У НЕДОНОШЕННЫХ НОВОРОЖДЕННЫХ

Таблица 3

Распределение полиморфизмов GCLC и sod2 у детей, развивших БЛД и не сформировавших заболевание

ЧВ аллеля ЧВ генотипа

Полиморфизм Аллель Подгруппа 1 (БЛД), п = 27 Подгруппа 2 (без БЛД), п = 33 Генотип Подгруппа 1 (БЛД), п = 27 Подгруппа 2 (без БЛД), п = 33

129 С* 40

С^С 129 С/Т 129 Т* 14

129 Т/Т 1 (3,7 %) 0

58 Т 44

бос12 58 Т/С 58 С* 10

58 СС 1 (3,7 %) 0

60 С 46

бос12 60 С/Т 60 Т 8

60 Т/Т 1 (3,7 %) 0

Примечание: * различия между группами 1 и 2 статистически значимые (критерий х2 с поправкой Йетса); ЧВ - частота встречаемости.

пу вошли 27 детей, которые развили БЛД, во 2 подгруппу — 33 пациента, у которых на 28 день жизни патология отсутствовала. Более значимые геномные различия, на наш взгляд, были выявлены между подгруппами, сформировавшимися внутри основной группы (табл. 3). У 12 детей (44,4 %), имевших БЛД, был диагностирован гетерозиготный генотип 129 СТ ОСЬС (х2 = 4,86; р < 0,05), а также носительство 58 ТС sod2 (х2 = 4,04; р < 0,05), что достоверно чаще, чем у пациентов, не развивших заболевание. По одному ребенку из 1 подгруппы имели гомозиготные генотипы 129 ТТ ОСЬС, 58 СС sod2, 60 ТТ sod2, однако различия не были статистически значимыми.

Частота встречаемости минорных аллелей генов ферментов ОСЬ и MnSOD также была в 5 раз выше в группе детей, страдающих БЛД (-129Т ОСЬС, х2 = 4,82; р < 0,05; -58С sod2, х2 = 5,76; р <

0,05). Это позволило сделать предположение, что дети с полиморфными генотипами ОСЬ и MnSOD чаще формируют БЛД, чем дети группы риска развития заболевания, не имеющие мутации.

Учитывая, что полиморфизм генов sod2 и ОСЬС может влиять на уровень, активность соответствующих ферментов и их конформацию, нами были определены биохимические параметры, которые, на наш взгляд, наиболее полно характеризуют состояние про-оксидантной и антиоксидантной систем организма наблюдаемых детей. Значения исследуемых биохимических маркеров у детей группы риска развития БЛД и у детей без дыхательных расстройств приведены в таблице 4.

Достоверных отличий при количественном исследовании общей окислительной способности, супе-роксиддисмутазы и глютатиона в сыворотке крови у детей основной и контрольной групп выявлено не было. Однако, как видно из таблицы 4, пациенты из группы риска развития БЛД имели более низкие значения вышеперечисленных показателей по сравнению с контролем. Кроме того, общая антиоксидантная способность у пациентов основной группы была недостаточной (1-1,3 ммоль/л — промежуточная антиоксидантная способность), а в группе детей без дыхательных расстройств значения Т_А_С достигали нормального уровня и были статистически значимо выше, чем у недоношенных из группы риска развития БЛД. Вероятно, это привело к более выраженному оксидативному стрессу у детей основной группы, что способствовало развитию патологического процесса в легочной ткани.

Далее мы проанализировали уровень маркеров оксидативного стресса у детей группы риска развития БЛД в зависимости от наличия полиморфных генов антиоксидантных ферментов. Необходимо отметить, что у пациентов с полиморфными вариантами гена ОСЬС (табл. 5), гена 58Т/С sod2 (табл. 6),

Таблица 4

Значения биохимических параметров у детей группы риска развития БЛД и группы контроля

Основная Группа

Параметры группа, сравнения, Р*

п = 60 п = 30

Т_О_С (ммоль/л) 0,24 ± 0,09 0,27 ± 0,7 0,57

Т_А_С (ммоль/л) 1,23 ± 0,77 2,27 ± 0,97 0,003

Супероксиддисмутаза (Ед СОД/мл) 0,4 ± 0,04 0,85 ± 0,15 0,05

Глютатион (ммоль/л) 1,18 ± 0,13 1,19 ± 0,14 0,65

Примечание: * сравнение двух групп переменных с помощью

критерия Манна-Уитни.

а также 60 С/Т sod2 (табл. 7), выявили достоверно более низкие значения общей антиоксидантной способности, чем у детей с обычным генотипом. Кроме того, пациенты с мутацией ОСЬС имели промежуточный уровень антиоксидантной способности (табл. 5), а у недоношенных детей с однонуклеотидными заменами в гене sod2 общая антиоксидантная способность была вообще низкой (табл. 6, табл. 7), учитывая нормативные значения. В литературе имеются единичные публикации, описывающие изменения этих параметров у недоношенных новорожденных. Так, Dizdar Е.А. (2011) также отметил низкие значения Т_А_С у недоношенных новорожденных с гестационным возрастом менее 28 недель, развивших респираторный дистресс-синдром, тогда как уровень Т_О_С у них достоверно не изменялся. Кроме того, автором выявлена корреляция между снижением общей антиок-сидантной способности крови у детей с респираторным дистресс-синдромом и длительностью респираторной поддержки, а также неблагоприятным исходом заболевания [20].

Количественные значения фермента супероксид-дисмутазы в плазме крови были низкими, как у детей группы риска развития БЛД, так и у пациентов контрольной группы (табл. 5). Та же тенденция отмечена в исследовании Nassi N. [21], которые опре-

Таблица 5

Показатели, характеризующие тяжесть оксидативного стресса, у недоношенных детей из группы риска развития БЛД с полиморфными вариантами гена GCL

Мутация GCLC

Параметры Есть Нет Р*

n = 23 n = 37

Т_О_С (ммоль/л) 0,31 ± 0,08 0,28 ± 0,1 0,28

Т_А_С (ммоль/л) 1,07 ± 0,62 1,64 ± 0,75 0,025

Супероксиддисмутаза 0,11 ± 0,02 0,2 ± 0,03 0,08

Глютатион (ммоль/л) 1,11 ± 0,23 1,31 ± 0,15 0

Примечание: * сравнение двух групп переменных с помощью критерия Манна-Уитни.

Таблица 6

Показатели, характеризующие тяжесть оксидативного стресса, у недоношенных детей из группы риска развития БЛД с полиморфными вариантами гена 58Т/С sod2

Мутация 58Т/С sod2

Параметры Есть Нет Р*

n = 12 n = 48

Т_О_С (ммоль/л) 0,26 ± 0,08 0,29 ± 0,09 0,47

Т_А_С (ммоль/л) 0,74 ± 0,42 1,59 ± 0,88 0,001

Супероксиддисмутаза 0,14 ± 0,01 0,24 ± 0,02 0,047

Глютатион (ммоль/л) 1,23 ± 0,23 1,24 ± 0,14 0,86

Примечание: * сравнение двух групп переменных с помощью критерия Манна-Уитни.

Таблица 7

Показатели, характеризующие тяжесть оксидативного стресса, у недоношенных детей из группы риска развития БЛД с полиморфными вариантами гена 60 С/Т sod2

Мутация 60 С/Т sod2

Параметры Есть Нет Р*

n = 11 n = 49

Т_О_С (ммоль/л) 0,29 ± 0,09 0,29 ± 0,10 0,72

Т_А_С (ммоль/л) 0,75 ± 0,44 1,57 ± 0,81 0,002

Супероксиддисмутаза 0,08 ± 0,03 0,19 ± 0,09 0,058

Глютатион (ммоль/л) 1,32 ± 0,12 1,2 ± 0,21 0,11

Примечание: * сравнение двух групп переменных с помощью критерия Манна-Уитни.

деляли супероксиддисмутазу в плазме и эритроцитах доношенных и недоношенных новорожденных и пришли к выводу, что снижение уровня фермента наблюдается в течение 100 дней после рождения. Однако некоторые исследователи обнаружили нормальную или увеличенную экспрессию MnSOD и активность внеклеточной SOD в ткани легких детей с респираторным дистресс-синдромом, впоследствии развивших БЛД [22]. В соответствии с полученными нами результатами, у недоношенных детей с однонуклеотидной заменой 58 Т/С в гене sod2 значения супероксиддисмутазы были достоверно меньше,

чем у детей с генотипом 58 Т/Т sod2 (табл. 6). Учитывая, что фактически 30 % детей, развивших впоследствии БЛД, имели полиморфный генотип sod2 и, соответственно, снижение уровня SOD, можно предположить, что этот патогенетический механизм имеет важное значение в повреждении легочных структур. Вероятно, изменения связаны с тем, что фермент су-пероксиддисмутаза, инактивирующий супероксидный радикал, может предотвращать активацию и индукцию синтеза матриксных металлопротеиназ. Матриксные металлопротеиназы (ММП) — семейство ферментов, разрушающих белки внеклеточного матрикса [23]. Установлено, что ММП играют важную роль в ряде физиологических и патологических процессов, включая эмбриогенез, заживление ран, воспаление, сердечно-сосудистые болезни, болезни легких и рак [24]. Активность ММП контролируется тканевыми ингибиторами металлопротеиназ [25]. Другими не менее важными регуляторами активности и синтеза ММП, по данным экспериментальных исследований, являются АФК, эффекты которых ограничиваются энзимными и неэнзимными антиоксидантами [26]. Оксиданты стимулируют нуклеарные факторы транскрипции (NFkB), которые, в свою очередь, активируют гены, ответственные за синтез интерлейкина 1, интерлейкина 8, фактора некроза опухоли а и других провос-палительных цитокинов, что приводит к привлечению нейтрофилов и эскалации генерации активных форм кислорода. Последние способствуют высвобождению ММП и повышают коллагеназную активность, что ведет к разрушению компонентов экстрацеллю-лярного матрикса и развитию фиброза в легочной ткани.

Кроме того, учитывая данные о подавлении активации ММП-9 (желатиназы) неферментным антиоксидантом N-ацетилцистеином [27], в патогенезе окислительного стресса и повреждения легких имеет значение содержание глютатиона в сыворотке крови. Известно, что содержание этого небелкового ти-ола значительно увеличивается у маловесных детей после рождения [28]. По нашим данным, содержание глютатиона у детей группы риска развития БЛД достоверно не отличалось от группы контроля, т.е. имело нормальные значения. Однако в группе детей, у которых диагностирован полиморфный генотип GCLC, количество глутатиона в сыворотке было статистически значимо ниже, чем у недоношенных, не имевших данный полиморфизм. В результате нашего исследования почти у половины развивших БЛД детей (44,4 %) выявлен гетерозиготный генотип 129 СТ GCLC против 21,5 % случаев у пациентов, не сформировавших заболевание (х2 = 4,86; р < 0,05), что могло привести к усилению оксидативного стресса, потенцированию апоптоза бронхиальных эпителиальных клеток, дальнейшему ремоделированию стенок бронхов и формированию заболевания. Таким образом, по нашим данным, дети группы риска развития БЛД с полиморфными вариантами гена GCLC и 58 Т/С sod2 формируют недостаточную антиоксидантную защиту, что, возможно, провоцирует более выраженное повреждение ткани легких.

ЗНАЧЕНИЕ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ АНТИОКСИДАНТНЫХ ФЕРМЕНТОВ В ФОРМИРОВАНИИ БРОНХОЛЕГОЧНОЙ ДИСПЛАЗИИ У НЕДОНОШЕННЫХ НОВОРОЖДЕННЫХ

ВЫВОДЫ:

1. У пациентов группы риска развития БЛД статистически значимо чаще регистрировались минорные аллели -129Т ОСЬС и -60 Т sod2, что могло способствовать снижению антиоксидантной защиты и усилению ОС.

2. У половины развивших БЛД детей (44,4 %) выявлен гетерозиготный генотип 129 СТ ОСЬС против 21,5 % случаев у пациентов, не сформировавших заболевание (р < 0,05). Полиморфный генотип 58 ТС sod2 диагностирован у 30 % недоношенных (р < 0,05). Этот результат позволил сделать вывод, что дети, имеющие такой аллельный поли-

морфизм, достоверно чаще формировали заболевание.

3. У недоношенных детей группы риска развития БЛД с полиморфными вариантами гена ОСЬС, гена 58 Т/С sod2, а также 60 С/Т sod2 выявили достоверно более низкие значения общей ан-тиоксидантной способности, чем у детей с обычным генотипом.

4. Пациенты основной группы с полиморфными вариантами генов MnSOD и ОСЬ имели более низкий уровень супероксиддисмутазы и глютатиона в сыворотке крови, что могло способствовать повышению синтеза АФК, инициации активности ММП и формированию фиброза в легочной ткани.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Бронхолегочная дисплазия в стадии хронической болезни у детей грудного и раннего возраста /Д.Ю. Овсянников [и др.] //Педиатрия. - 2007. - Т. 86, № 4. - С. 35-42.

2. Овсянников, Д.Ю. Бронхолегочная дисплазия у детей первых трех лет жизни /Д.Ю. Овсянников: Автореф. дис. ... докт. мед. наук. -М., 2010. - 24 с.

3. Клименко, Т.М. Новое в дефиниции патогенеза бронхолегочной дисплазии у новорожденных /Т.М. Клименко, В.С. Агашков //Здоровье ребенка. - 2011. - № 1. - С. 115-120.

4. Бронхолегочная дисплазия у детей. Современный взгляд на проблему диагностики и лечения /А.С. Сенаторова [и др.] //Соврем. педиатрия. - 2010. - № 1(29). - С. 105-112.

5. Data mining and multiparameter analysis of lung surfactant protein genes in bronchopulmonary dysplasia /M. Rova [et al.] //Hum. Mol. Genet. - 2004. - V. 13, N 11. - P. 1095-1104.

6. Polymorphism of tumor necrosis factor and risk and severity of bronchopulmonary dysplasia among very low birth weight infants /S.N. Kaz-zi [et al.] //Pediatrics. - 2004. - V. 114, N 2. - P. 243-248.

7. Matrix metalloproteinase gene polymorphisms and bronchopulmonary dysplasia: identification of MMP16 as a new player in lung development /A. Hadchouel [et al.] //PLoS One. - 2008. - V. 3, N 9. - P. 3188.

8. Association of glutathione-S-transferase-P1 (GST-PI) polymorphisms with bronchopulmonary dysplasia /M.H. Manar [et al.] //J. Perinatol. -2004. - V. 24, N 1. - P. 30-35.

9. Кольман, Я. Наглядная биохимия: пер. с нем. /Я. Кольман, К.-Г. Рем. - М., 2009. - 469 с.

10. Dilated cardiomyopathy and neonatal lethality in mutant mice lacking manganese superoxide dismutase /Y. Li [et al.] //Nat. Genet. - 1995. -

V. 11, N 4. - P. 376-381.

11. Genotype-activity relationship for Mn-superoxide dismutase, glutathione peroxidase 1 and catalase in humans /M. Bastaki [et al.] //Phar-macogenet. Genomics. - 2006. - V. 16, N 4. - P. 279-286.

12. Gipp, J.J. Structure of the human glutamate-L-cysteine ligase catalytic (GLCLC) subunit gene /J.J. Gipp, R. T. Mulcahy //Cytogenet. Cell Ge-

net. - 2000. - V. 88, N 1-2. - P. 130-132.

13. Knockout of the mouse glutamate cysteine ligase catalytic subunit (Gclc) gene: embryonic lethal when homozygous, and proposed model for moderate glutathione deficiency when heterozygous /T.P. Dalton [et al.] //Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2000. - V. 279, N 2. - P. 324-329.

14. Initial characterization of the glutamate-cysteine ligase modifier subunit gclm(-/-) knockout mouse. Novel model system for a severely compromised oxidative stress response /Y.Yang [et al.] //J. Biol. Chem. - 2002. - V. 277, N 51. - P. 49446-49452.

15. Impaired glutathione synthesis in schizophrenia: convergent genetic and functional evidence /R. Gysin [et al.] //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -2007. - V. 104, N 42. - P. 16621-16626.

16. Polymorphism in glutamate-cysteine ligase modifier subunit gene is associated with impairment of nitric oxide-mediated coronary vasomotor function /S. Nakamura [et al.] //Circulation. - 2003. - V. 108, N 12. - P. 1425-1427.

17. Lung function loss, smoking, vitamin C intake, and polymorphisms of the glutamate - cysteine ligase genes /M. Siedlinski [et al.] //Am. J. Resp. Crit. Care Med. - 2008. - V. 178, N 1. - P. 13-19.

18. Miao, L. Regulation of superoxide dismutase genes: implications in diseases /L. Miao, D.K. St Clair //Free Rad. Biol. Med. - 2009. - V. 47, N 4. - P. 344-356.

19. Association of polymorphism in glutamate-cysteine ligase catalytic subunit gene with coronary vasomotor dysfunction and myocardial infarction /S. Koide [et al.] //J. Am. Coll. Cardiol. - 2003. - V. 41, N 4. - P. 539-545.

20. Total antioxidant capacity and total oxidant status after surfactant treatment in preterm infants with respiratory distress syndrome /E.A. Diz-dar [et al.] //Ann. Clin. Biochem. - 2011. - V. 48, N 5. - P. 462-467.

21. Anti-oxidant enzymes and related elements in term and preterm newborns /N. Nassi [et al.] //Pediat. Int. - 2009. - V. 51, N 2. - P. 183-187.

22. Kinnula, V.L. Superoxide dismutases in the lung and human lung diseases /V.L. Kinnula, J.D. Crapo [et al.] //Am. J. Resp. Crit. Care Med. -2003. - V. 167. - P. 1600-1619.

23. Greenlee, K.J. Matrix metalloproteinases in lung: multiple, multifarious, and multifaceted /K.J. Greenlee, Z. Werb, F. Kheradmand //Physi-ol. Rev. - 2007. - V. 87. - P. 69-98.

24. Regulation of matrix metalloproteinases: an overview /S. Chakraborti [et al.] //Mol. Cell Biochem. - 2003. - V. 253. - P. 269-285.

25. Cunningham, L.A. Multiple roles for MMPs and TIMPs in cerebral ischemia /L.A. Cunningham, M. Wetzel, G.A. Rosenberg //Glia. - 2005. -

V. 50. - P. 329-339.

26. Nelson, K.K. Mitochondrial redox control of matrix metalloproteinases /K.K Nelson, J.A. Melendez //Free Radic. Biol. Med. - 2004. - V. 37,

N 6. - P. 768-784.

27. Galis, Z.S. Matrix metalloproteinases in vascular remodeling and atherogenesis: the good, the bad, and the ugly /Z.S. Galis, J.J. Khatri //Circ. Res. - 2002. - V. 90. - P. 251-262.

28. Glutathione synthesis rates in early postnatal life //D. Rook [et al.] //Pediat. Res. - 2010. - V. 67, N 4. - P. 407-411.

36

№3(50) 2012 с/^иь h^Stm вс7|узбассе