Штамм суспензионной культуры клеток растения диоскорея дельтовидная (Dioscorea deltoidea Wall) под обозначением ИФР-ДМ-05-pro N89 - продуцент протодиосцина
DIOSCOREA DELTOIDEA WALL CELL SUSPENSION CULTURE STRAIN UNDER NAME OF IGF-DM-05-PRO N89 - PROTODIOSCINA PRODUCER

Область применения
Изобретение относится к биотехнологии, в частности культивированию клеток растения диоскореи дельтовидной, и может быть использовано для получения ценного биологически активного соединения - протодиосцина, которое широко применяется в ветеринарии, в спортивной медицине, косметологии и при производстве функциональных продуктов питания.
Уровень техники
Диоскорея дельтовидная представляет собой многолетнюю листопадную лиану, длина которой может достигать 5 метров, с корневищем с клубневидными утолщениями, желтыми на изломе. Стебли могут ветвиться, иметь чешуйки или колючки. Растение является двудомным. Относится к роду Dioscorea L., к однодольному семейству Dioscoreaceae R. Brawn. [Mars Sautour, Anne-Claire Mitaine-Offer, Maric-Aleth Lacaille-Dubois (2006) The Dioscorea genus: a reviev of bioactive steroid saponins // J. Nat Med. - №61 - P. 91-101].
Главные биологические и фармакологические свойства диоскореи дельтовидной связаны с стероидным гликозидами. Они обладают цитотоксическим, противоопухолевым и противогрибковым действием, являются основой для производства стероидных гормонов с антивоспалительной, адрогенной, эстрогенной и контрацептивной активностью [Vanisree М., Lee C.-Y., Lo S.-F., Nalawawade S. M., Lin C. Y., Hsin-Sheng T. (2004) Studies on the production of some important secondary metabolites from medicinal plants by plant tissue culture // Bot. Bull. Acad. Sin. - 45 - pp. 1-22].
Стероидные гликозиды оказались эффективными при лечении ревматизма, бронхиальной астмы, гемолитической анемии, гемодиатеза. Важная роль отводится стероидным гликозидам в усилении устойчивости растений к стрессовым факторам среды и фитопатогенам [Васильева И.С., Пасешниченко В.А. (2000) Стероидные гликозиды растений и культуры клеток диоскореи, их метаболизм и биологическая активность. // Успехи биологической химии - 40 - с. 153-204]. В медицине начаты широкомасштабные исследования по применению стероидных гликозидои в качестве гипотензивных (диоспонин, полисионин), иммуномодулирующих, адаптогенных, укрепляющих препаратов (грибестан, витатон и др.).
В Институте физиологии растений в 1969 г. Саркисовой М.А. и Бутенко Р.Г. была получена суспензионная культура Dioscorea deltoidea из корневища стерильного проростка. [Каранова С.Л. (2006) Использование методов клеточной селекции и индуцированного мутагенеза для получения штаммов культивируемых - клеток Dioscorea deltoidea Wall с повышенным биосинтезом стероидов. // Биотехнология - №2 - с. 16-19]. Впоследствии Карановой С.Л. для увеличения биосинтетического потенциала культуры клеток D. deltoidea и увеличения выхода диосгенина был использован химический мутаген N-нитрозо-N-метилмочевипа (N-HMM). После обработки клеток исходного штамма ДМ-1, содержащего в составе сапогенинов диосгенин и его (258)-эпимер-ямогенин разными дозами этого мутагена, была получена серия мутантных штаммов. Один их штаммов - ИФР-ДМ-0,5 характеризовался высоким содержанием стероидных гликозидов (до 12% к сухой массе клеток) и присутствием фуростаполовых гликозидов - протодиосцина и дельтазида, при этом их содержание в 4-6 раз превосходило содержание сапогенинов в исходном штамме [Каранова С.Л., Носов A.M., Шамина З.Б., Пауков В.Н. (1986) Продуктивность различных клеточных линий диоскореи дельтовидной. // В сб.: Культура клеток растений и биотехнология. - М.: Наука , с. 83-87]. Были проведены работы по исследованию возможности увеличения накопления клеточной биомассы и уровня биосинтеза диосгенина в суспензионной культуре клеток D. deltoidea [Бутенко Р., Гусев М., Корженевская Т., Юрина Т. (1981) Влияние возраста суспензионных культур диоскореи и табака на репродуктивную выживаемость и характер роста клеток. // Физиология растений. Т. 28 - вып. 3 - С. 562-569]; [Носов A.M. (1992) Особенности метаболизма стероидов в культивируемых клетках диоскореи дельтовидной как основа биотехнологии получения фуростаполовых гликозидов // дисс. докт. биол наук. - М.: НИП-КИ прикладной биохимии - с. 243]. Кроме того, было показано, что полученные штаммы обладают удовлетворительными характеристиками для осуществления аппаратурного выращивания в различных режимах. [Липский А.Х. (1993) Физиология роста клеток растений в биореакторах (периодические режимы): автореф. дис. канд. биол. наук. // М.: ИФР РАН - 25 с]; [Кандараков О.Ф., Воробьев А.С., Носов A.M. (1994) Биосинтетические характеристики популяции клеток Dioscorea deltoidea при проточном культивировании. // Физиология растений - №.41 - сс. 913-917]; [Орешников А.В. (1996) Физиология популяции культуры клеток Dioscorea deltoidea в условиях закрытого протока. // дисс. канд. биол. наук. - М.: ИФР РАН - с. 115]. Необходимо отметить, что несмотря на то, что на данный момент существует значительное количество штаммов культур клеток диоскореи дельтовидной, тем не менее для них для всех характерен синтез смеси фуростаноловых гликозидов - протодиосцина, и дельтозида и их изомеров (в относительно равных соотношениях).
Таким образом, в литературе не было найдено работ по получению и исследованию культуры клеток диоскореи дельтовидной, обладающей стабильным и относительно высоким преимущественным синтезом протодиосцина в клетках самого штамма на фоне сохранения высоких ростовых характеристик.
Задача изобретения
Задача изобретения - получение суспензионного штамма диоскореи дельтовидной Dioscorea deltoidea Wall - продуцента протодиосцина со стабильными ростовыми параметрами, устойчивым синтезом протодиосцина в процессе промышленного аппаратного культивирования и отсутствием сезонной зависимости его получения.
Решение задачи
Эта задача была решена созданием нового суспензионного штамма диоскореи дельтовидной в условиях in vitro, депонированного в Российскую коллекцию культивируемых леток высших растений при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук (ВРККК BP ИФР РАН) под обозначением ИФР-ДМ-05-pro №89 - продуцент протодиосцина.
Перечень иллюстративных материалов
Фигура 1. Ростовые и биосинтетические характеристики культуры клеток диоскореи дельтовидной при выращивании в колбах.
Фигура 2. Ростовые и биосинтетические характеристики культуры клеток диоскореи дельтовидной при выращивании в биореакторе.
Новизна изобретения
Новизной настоящего изобретения является то, что впервые был получен суспензионный штамм растения диоскорея дельтовидная - продуцент протодиосцина с высокими ростовыми характеристиками и стабильным преимущественным высоким синтезом протодиосцина, по сравнению с описанными в литературе аналогами, сохраняющимся без дополнительных методов индукции синтеза, в том числе и при аппаратном культивировании.
Сущность изобретения
По мнению авторов, предлагаемое изобретение состоит в том, что посредством повторной обработки исходного штамма культуры клеток диоскореи дельтовидной мутагеном N-нитрозо-N-метилмочевиной (N-HMM) и последующим помещением клеток в жидкую питательную среду в колбы с постоянным перемешиванием на круговой качалке был получен новый суспензионный штамм с высокими ростовыми характеристиками и стабильным преимущественным высоким синтезом протодиосцина, сохраняющимся в том числе и при аппаратном культивировании.
Реализация изобретения
После обработки исходного штамма культуры клеток диоскореи дельтовидной мутагеном N-нитрозо-N-метилмочевиной (N-HMM) культуру клеток помещают в жидкую питательную среду в колбы с последующим постоянным перемешиванием на круговой качалке.
Для культивирования используют жидкую питательную среду следующего состава (мг/л):
NH<sub>4</sub>NO<sub>3</sub>
1650,000±2,0000
KNO<sub>3</sub>
1900,000±2,0000
MgSO<sub>4</sub>×7H<sub>2</sub>O
370,000±1,0000
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>
170,000±0,1000
CaCl<sub>2</sub>×2H<sub>2</sub>O
440,000±0,5000
H<sub>3</sub>BO<sub>3</sub>
6,200±0,0100
MnSO<sub>4</sub>×4H<sub>2</sub>O
22,300±0,0200
ZnSO<sub>4</sub>×7H<sub>2</sub>O
8,600±0,0100
KI
0,830±0,0010
Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub>×2H<sub>2</sub>O
0,250±0,0010
CuSO<sub>4</sub>×5H<sub>2</sub>O
0,025±0,0001
CoCl<sub>2</sub>×6H<sub>2</sub>O
0,025±0,0001
FeSOP<sub>4</sub>×7H<sub>2</sub>O
2,785±0,001
Na-ЭДТА
3,725±0,001
Кинетин
0,100±0,0010
2.4-Д
0,250±0,0010
Сахароза
30000,000±100,0000
Фолиевая кислота
0,7500±0,0010
Рибофлавин (В2)
0,7500±0,0010
Биотин(Н)
0,1500±0,0010
Пиридоксин (В6)
0,1500±0,0010
Тиамин хлорид (В1)
0,1500±0,0010
Никотинамид
0,30000,1500±0,0010
Кобаламин (В12)
0,0450±0,0010
Са-пантотенат
0,1500±0,0010
Вода дистиллированная
До 1000,000 мл среды
Культивирование проводят в темноте, при 26±1°С, влажности помещения 70±5%, на качалке (100±10 об/мин), в колбах объемом 250 мл (30-40 мл суспензии в колбе). Цикл субкультивирования составляет 2 недели. При пересеве на 1 объем инокулюма вносят от 3 до 5 частей свежей среды, в зависимости от ростовых параметров культуры на момент пересева.
В процессе культивирования для полученных суспензионных культур клеток определяют основные физиологические характеристики.
Штамм диоскореи дельтовидной Dioscorea deltoidea Wall под обозначением ИФР-ДМ-05-pro обладает следующими культуральными признаками: биомасса клеток гомогенная, светло-желтой окраски.
Индекс роста (кратность прироста биомассы за одно субкультивирование) определяют по числу клеток, по сырому и сухому весу биомассы. Для определения веса сырой биомассы клетки отделяют от среды культивирования, промывают водой на бумажных фильтрах на вакуумном насосе и взвешивают. Сухую биомассу клеток получают после высушивания образцов при 25±1°С в потоке теплого воздуха. Жизнеспособность оценивают по проценту неокрашенных клеток в 0,1%-ном растворе феносафранина.
В результате постоянного мониторинга состояния культур установлено, что жизнеспособность суспензионных культур стабильно держится на уровне 81 -94%. Ростовые и биосинтетические характеристики культуры клеток представлены на фиг. 1. Продолжительность лаг-фазы роста находилась в пределах 2 суток, фазы экспоненциального роста - 17 суток. Характерная особенность роста штамма культуры клеток диоскореи дельтовидной - короткая фаза стационара (около 2 суток), что является специфическим признаком этой культуры клеток. Ростовые параметры рассчитывали по сухому весу биомассы. Максимальная плотность по сырой и сухой биомассе клеток достигала 94.1 и 9.3 г/л соответственно; основные ростовые показатели: индекс роста - 7.52, удельная скорость роста составляла 0.12 сут-1, продуктивность - 0.29 г/л*сут.
Для определения содержания протодиосцина использовали метод высоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). ВЭЖХ проводили на приборе ShimadzuNexera LC30 (Япония). Пробу в объеме 0,4 мкл наносили на колонку Shim-pack XR-ODS (75×2,0 мм, 2,2 мкм). Скорость подвижной фазы 0,4 мл/мин. В качестве компонентов подвижной фазы использовали ацетонитрил и воду. Элюирование осуществляли в изократическом режиме при соотношении ацетонитрил:вода (23:77, по объему). Детектирование по поглощению при 203 нм. Количественное содержание протодиосцина определяли по стандарту протодиосцина чистотой 98%.
Полученный штамм культивируют в биореакторах барботажного типа общим объемом 20 л (рабочий объем 15 л) в полупроточном режиме (отъемно-доливным способом) при возрастающем расходе воздуха от 0,1 л/л⋅мин по 1,5 л/л мин в течение цикла культивирования, что обеспечивает концентрацию растворенного кислорода в пределах 20-70% от насыщения. Полученный штамм культивируют при температуре 26±1°С, в темноте, на модифицированной среде Мурасиге и Скуга. Состав среды приведен выше. Процесс «отъема суспензии-долива среды» осуществляют при достижении плотности суспензии, соответствующей началу фазы замедления роста. Разбавление средой в каждом цикле субкультивирования проводят до концентрации биомассы, исключающей появление лаг-фазы (не ниже 2,0-2,5 г/л среды по сухому весу). При выращивании в биореакторах сохранялась тенденция к преимущественному синтезу протодиосцина, тогда как синтез дельтозида показан в следовых количествах, что является характерной особенностью данной линии.
Результаты изобретения
Как видно из представленных данных, штамм ИФР-ДМ-05-pro №89 обладает высокой жизнеспособностью при стабильных ростовых и биосинтетических характеристиках при выращивании как в колбах, так и в барботажных биореакторах. Для штамма показан преимущественный синтез протодиосцина при отсутствии или следовых количествах синтеза дельтазида. Удобство такого способа получения протодиосцина состоит в отсутствии сезонной зависимости их производства.