БИОДЕГРАДИРУЕМЫЕ ГЛЮКОЗАМИНМУРАМИЛПЕПТИДЫ ДЛЯ МОДУЛЯЦИИ АПОПТОЗА
BIODEGRADED GLUCOSAMINE MURAMYL PEPTIDES FOR APOPTOSIS MODULATION

Данная заявка заявляет приоритет заявки на патент США №10/409846 под названием "Biodegradable Glucosaminemuramyl Peptides For Apoptosis Modulation" с датой подачи 9 апреля 2003 г., указывающей в качестве авторов изобретения Slesarev и др. и включенной здесь путем ссылки.
Область изобретения
Настоящее изобретение относится к апоптоз-модулирующим глюкозаминмурамилпептидам, полученным путем гидролиза грамположительных бактерий специфической эндопептидазой, способам их получения и лекарственным пищевым композициям для контроля и лечения состояний, вызванных цитотоксичностью фактора некроза опухоли альфа (TNF-альфа).
Предпосылки изобретения
Апоптоз, или программируемая клеточная гибель, представляет собой естественный процесс, который играет существенную роль в обеспечении развития и поддержания многоклеточных организмов путем устранения нежелательных клеток. Однако, если происходит чрезмерная стимуляцию этого процесса, то ее результатом может быть гибель клеток и нейродегенеративные расстройства, такие как ревматоидный артрит, хроническая сердечная, печеночная и почечная недостаточность, респираторный дистресс-синдром взрослых, кахексия, вызванная раком, удар, сердечный приступ и сердечная недостаточность (Sharma R., and Anker SD, Int. J. Cardiol., 2002, 85:161-171, Argiles J M et al., Int. J. Biochem Cell Biol., 2003, 35:405-409, Castellanos M, et al., Stroke, 33:982-987, Cusack M R, et al., Amer. Coll. Cardiol., 2002, 39:1917-23, Agnoletti L. et al, Circulation, 1999, 100: 1983-1991).
Медиаторы, которые могут запускать апопотоз, включают в себя TNF-альфа, Fas и трансформирующий ростовой фактор бета, нейромедиаторы, удаление фактора роста, потерю прикрепления внеклеточного матрикса и чрезвычайные колебания уровней внутриклеточного кальция (Afford and Randhawa, Mol. Pathol., 2000, 53:55-63). Среди них пути уничтожения с участием TNF-альфа рассматриваются как наиболее общий путь передачи сигнала при апоптозе. Этот цитокин также вовлечен в утомление, связанное с раком, лейкопению, анемию и тромбоцитопению (Kurzrock R., Cancer, 2001, 92:1684-8). TNF-альфа также вовлечен в развитие нейродегенеративных расстройств, таких как болезнь Альцгеймера и Паркинсона, боковой амиотрофический склероз (БАС), пигментный ринит и рассеянный склероз (McGuire SO et al., Exp Neurol., 2001, 169:219-230). Его патогенная роль является ключевой в развитии обширного поражения головного мозга, легких и сердца (Barone F.С. et al., Stroke, 1997, 28:1233-1244, Armstrong L. et al., Thorax, 1997, 52: 442-446). Концентрации TNF-альфа в плазме крови постоянно увеличена у пациентов после инфаркта миокарда (Ridker P., et al., Circulation, 2000, 101: 2149-2153).
Наряду с идентификацией системной реакции на TNF-альфа в качестве основного компонента в патогенезе синдрома септического шока (Jaecshke Н., et al., J. Immunol., 1998, 160:3480-3486) большая часть современных работ была сосредоточена на модуляции этой реакции. Для очистки как эндотоксина, так и цитокинов была предложена высокоскоростная гемофильтрация (Sharma VK and Dellinger RP, Expert Opin Investig Drugs, 2003, 12:139-152). Гипотензивный и провоспалительный эффекты TNF-альфа ингибировались растворимыми рецепторами/антагонистами рецепторов и противовоспалительными цитокинами, такими как интерлейкин 10. Используемые в настоящее время экспериментальные способы лечения вовлекают трансформирующий фактор роста бета, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, интерферон phi и антитело против TNF-альфа (Stamm Ch., et al., Circulation, 101, suppl. 1, 350-351). Кроме того, менее известные цитокины, такие как ингибирующий фактор миграции макрофагов и белок из группы I высокоподвижных белков, будут тестироваться клинически (Zanotti S., et al., Expert Opin Investig Drugs, 2002, 11:1061-75).
Другое предварительное исследование продемонстрировало, что рекомбинантный GM-CSF (колониестимулирующий фактор гранулоцитов и макрофагов) активирует экспрессию HLA-DR (антигенов главного комплекса гистосовместимости II класса) на моноцитах, таким образом обращая иммунный паралич у пациентов с тяжелым сепсисом. Кроме того, происходило одновременное увеличение TNF-ответа в цельной крови (Nierhaus A., et al. Intensive Care Med, 2003, 21).
Такая же ситуация была отмечена у крыс с ожоговым шоком. Группа невыживших животных имела более низкие уровни G-CSF (гранулоцитарного колониестимулирующего фактора) в сыворотке крови и более высокое содержание TNF-альфа по сравнению с выжившими животными. Добавление GM-CSF может существенно улучшить выживаемость животных с инфекцией ожоговых ран после тяжелого ожогового шока (Yan R., et al. Zhonghua Zhen Xing Shao Shang Wai Ke Za Zi, 1997, 13:368-372). TNF-альфа в сыворотке крови также увеличивался после травмы мягких тканей и геморрагического шока, приводящих к острому респираторному дистресс-синдрому у взрослых (ОРДС) (Jarrar D, et al. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol., 2002, 283: 799-805).
Ишемия/реперфузия (И/Р) вызывает цитокиновый ответ и продукцию реакционноспособных форм кислорода, которые воздействуют на органы, удаленные от мест И/Р. Кроме того, печеночный TNF-альфа играл важную роль в поражении печени во время операции на почках (Serteser M., et al., J. Surg Res, 2002, 107: 234-40).
Внутривенная инъекция цельных молочнокислых бактерий значительно уменьшала тахиаритмию и улучшала восстановление ишемизированного сердца крыс (Oxman Т., et al. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 278, H1717-H1724).
Тем не менее, большинство разнообразных биодеградируемых глюкозаминмурамилпептидов не было выделено и протестировано в отношении цитопротекторных эффектов.
Краткое описание сущности изобретения
Настоящее изобретение основано на открытии, что гидролиз пептидных связей и пептидной поперечной сшивки грамположительных бактерий приводит к высвобождению новых глюкозаминмурамилпептидов, обладающих высокой активностью в отношении ингибирования цитотоксичности TNF-альфа. Поэтому в первом аспекте изобретения предложены новые биодеградируемые глюкозаминмурамилтри-, тетра-, пента-, гекса- и октапептиды, которые обладают свойствами модуляции апоптоза и полезны для лечения всех состояний, ассоциированных с повышенной активностью лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в сыворотке крови. Примерами таких состояний являются ишемическое повреждение при реперфузии, атеросклероз, сердечный приступ, церебральный инфаркт и хроническая сердечная недостаточность. Заявители также продемонстрировали, что увеличенные цитопротекторные свойства этих мурамилпептидов вызваны наличием двух или более D-аминокислот, ковалентно связанных с L-аминокислотами.
В еще одном аспекте настоящего изобретения предложен способ выделения высокочистых биодеградируемых глюкозаминмурамилпептидов, включающий выделение бактериальной стенки с последующим гидролизом лизоцимом и эндопептидазами и очистку препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ).
Кроме того, еще один аспект этого изобретения представляет собой получение лекарственного пищевого продукта для диетического контроля всех состояний, вызванных увеличением TNF-альфа и ЛДГ. Новый лекарственный пищевой продукт, состоящий из гидролизованной бактериальной стенки или целой бактерии, может быть использован для уменьшения системной цитокиновой токсичности, приводящей к увеличению ЛДГ и кахексии. Такой лекарственный пищевой продукт может быть использован для уменьшения ЛДГ-ассоциированной злокачественности и поражения, вызванного лучевой терапией и химиотерапией. Конкретно, пищевой продукт по настоящему изобретению может быть рекомендован пациентам, страдающим от общей токсичности после химиотерапии, такой как лейкоцитопения, тромбоцитопения и высокий уровень билирубина с повышенными уровнями печеночных ферментов. Кроме того, в настоящем изобретении предложено питание для уменьшения утомления и мышечной дистрофии при раке.
В дополнительном аспекте настоящего изобретения предложен пищевой продукт, полезный для лечения пациентов, страдающих от гепатотоксичности, вызванной химическими агентами, анестетиками, лекарствами и алкоголем. Пищевой продукт и напиток, обогащенные гликопетидом, могут быть особенно полезными для людей, страдающих от сопутствующего цирроза печени, таким образом предотвращая тяжелое утомление и поражение головного мозга, вызванное аммиаком. Кроме того, в настоящем изобретении предложен пищевой продукт для метаболических детоксикаций канцерогенных химических соединений и мутагенов.
Еще один аспект настоящего изобретения включает диетические способы ингибирования дермального апоптоза с уменьшением при этом клинических симптомов псориаза.
В то же время еще один аспект этого изобретения заключается в том, чтобы предложить способ защиты легких у пациентов, страдающих от легочных заболеваний, таких как респираторный дистресс-синдром взрослых, фиброз и кардиогенный отек легких.
Краткое описание графических материалов
Для более подробного изложения сделана ссылка на следующее обсуждение в свете сопутствующих графических материалов, где:
Фиг.1 иллюстрирует цитопротекторную активность нового GMHP (глюкозаминмурамилгексапептида) в сравнении с GMDP (глюкозаминмурамилдипептидом).
Фиг.2. демонстрирует ингибирование цитотоксичности TNF-альфа D-аминокислотами в комбинации с такой же концентрацией N-ацетилглюкозамина (NAG).
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к новым глюкозаминмурамилтри-, тетра- и пентапептидам, полученным путем гидролиза специфической эндопептидазой, к лекарственным пищевым продуктам и напиткам, содержащим в качестве эффективного компонента гликопептид, экстрагированный из грамположительных бактерий. В данном изобретении также предложен лекарственный пищевой продукт для специфического ингибирования цитотоксичности TNF-альфа, который может быть введен людям перорально в виде разовой дозы в количестве 1 мг/кг. Предпочтительной может быть доза 2-10 мг/кг. Для безопасности могут быть предпочтительны гликопептидные комплексы из молочнокислых бактерий, таких как Lactobacillus или Bifidum.
2
Глюкозаминмурамилтетрапептид представляет собой основную структурную единицу гликопротеинов-пептидогликанов. В клеточной стенке они связаны с тейхоевой кислотой и полисахаридами фосфатной диэфирной связью. Пептидогликановые цепи поперечно сшиты друг с другом с образованием большого слоя, который окружает клетку. Поперечные связи образуются между двумя тетрапептидами на соседних гликановых цепях. Группа ε-NH диаминопимелиновой кислоты в третьем положении на 1 гликане связывается с группой СООН D-аланина на соседнем гликане в Lactobacillus Plantarum. Большая часть бактерий видов Lactobacillus имеют L-лизин или L-орнитин вместо диаминопимелиновой кислоты. Пептидная связь образует поперечную связь между соседними гликановыми цепями.
Важно отметить, что 60-90% общих основных единиц связаны с соседними гликановыми цепями в грамположительных бактериях. Очевидно, что существует необходимость в гидролизе этой поперечной связи для высвобождения новых биологически активных глюкозаминмурамилпептидов. Недавно для гидролиза Brevibactehum flavum, Corynebacterium herculis и Colynobacterium glutamicum были предложены бромелаин и лизин-эндопептидазы (Shionoya et al, 2003, патент США №6506388). Однако ни бромелаин, ни лизин-эндопептидаза не могут расщеплять прямую поперечную связь между диаминопимелиновой кислотой и D-аланином в пептидогликановой цепи этих бактерий. В результате предложенные ферменты являются бесполезными для получения глюкозаминмурамилтри-, тетра- и пентапептидов из этих бактерий. Недавно из L. plantarum были выделены только глюкозаминмурамил-L-аланин, D-глутамилдиаминопимелиновая кислота (трипептид) и тетрапептид (Takase et al, патент США №4545932, 1985). Трипептид (глюкозаминмурамил-L-аланин, D-глютамилдиаминопимелиновую кислоту) получали путем применения диаминопимелиновая кислота-D-аланин-пептидазы. Иммуностимулирующие свойства этого тетрапептида были хорошо охарактеризованы.
Однако абсолютное большинство йогуртовых бактерий рода Lactobacillus и Bifidum имеют отличающуюся структуру их основной пептидогликановой единицы. Глюкозаминмурамилтетрапептид содержит L-лизин или L-орнитин в третьем положении вместо диаминопимелиной кислоты. Кроме того, пептидные субъединицы пептидогликана поперечно сшиты либо посредством единичных D-изоаспарагиновых остатков или сложных остатков L- или D-аминокислот, выбранных из группы серина, аланина, треонина, глицина и глутамина. Таким образом, существует реальная практическая необходимость в высвобождении из крупной пептидогликановой цепи значительного количества биологически активных глюкозаминди-, три-, тетра-, пента- и гексапептидов.
Присутствие двух или трех D-аминокислот может усилить цитопротекторные свойства, описанные для глюкозаминмурамилдипептида. Для этой цели авторы изобретения предложили гидролизовать поперечные пептидные связи. Расщепление этой связи может быть осуществлено также путем гидролиза карбоксильной связи аспарагиновой кислоты или карбоксильных связей L-лизина в третьем положении. Могут быть использованы разнообразные специфические эндопептидазы, которые расщепляют карбоксильную связь глутаминовой кислоты, глицина, серина, треонина, лизина, аспарагиновой кислоты, аланин-аланин. Они имеют растительное, бактериальное или животное происхождение.
В настоящем изобретении бактерии обязательно представляют собой специфические бактерии, поскольку они продуцируют различные поперечносшитые остатки, которые требуют присутствия специфической эндопептидазы для гидролиза поперечной связи. Однако с точки зрения безопасности и утилизации отходов предпочтительными являются лактат-продуцирующие бактерии, например, Lactobacillus acidophilus, butgaricus, fermentum или Bifidobacterium infants.
Культура бактерий, относящихся к родам Lactobacillus, Bifidobacterium, и Streptococcus thermophilus, может быть получена известным способом в подходящей среде. Центрифугированные клетки, лиофилизированные клетки, клетки, убитые нагреванием, и клетки, высушенные распылением, могут быть использованы для цели получения новых глюкозаминмурамилпептидов. Они могут быть получены либо путем гидролиза препаратов выделенных бактериальных стенок, либо путем гидролиза целых бактерий с последующей очисткой гель-фильтрацией на сефадексе. Отмытые бактериальные клетки должны быть обработаны проназой или папаином для растворения поверхностных белков, затем их кипятят в течение 10 мин в ионном детергенте. В качестве детергента для отделения бактериальной стенки от протопласта может быть рекомендован 5%-ный додецилсульфат натрия. Протопласт удаляют в виде супернатанта после центрифугирования при 10000 об/мин в течение 20 мин. Удаление протопласта позволяет эффективно очищать разрушенный материал по настоящему изобретению в соответствии с тем, как изложено в примерах.
Пептидная поперечная связь этой бактериальной стенки может быть гидролизована трипсином и глицин-эндопептидазой, которые также представляют собой пищевые добавки. Оптимальными условиями считают температуру 27-30°С, рН 6,0 в течение 4-6 часов. Гликановая группировка может быть разрушена лизоцимом. Гидролиз лизоцимом считают оптимальным при температуре 55°С, рН, равном 6,0, в течение 48 часов.
Оба фермента могут быть удалены ультрафильтрацией с предельным значением 3000 Да. Высококонцентрированный раствор новых глюкозаминмурамилпептидов может быть получен после обратного осмоса. Новый биодеградируемый глюкозаминмурамилпептид может быть идентифицирован аналитической обращенно-фазовой ВЭЖХ с последующим выделением и очисткой препаративной ВЭЖХ.
Центрифугированные клетки для гидролиза целых бактерий очищают посредством обработки проназой или папаином. Затем биомассу разбавляют дистиллированной водой в отношении 1:10 для гидролиза лизоцимом. Протопласт (в виде фракции осадка) удаляют после центрифугирования при 4000 об/мин в течение 1 часа. Супернатант концентрируют 4 раза после ультрафильтрации с предельным значением 3000 Да и нанофильтрации с обратным осмосом.
Могут быть использованы стандартные способы очистки гликопептидных комплексов. Более конкретно гидролиз в соответствии с вышеупомянутыми способами применяют в отношении анионообменной колонки для удаления лизоцима и высокомолекулярных нуклеиновых кислот. Кроме того, для разрушения оставшихся белков и нуклеиновых кислот могут быть использованы, соответственно, протеаза и нуклеаза. Для удаления ферментов может быть использована гидрофобная хроматография путем пропускания этих ферментов через колонку со смолой. Глюкозаминмурамилпептидная композиция может быть фракционирована гель-хроматографией.
Широкое разнообразие специфических эндопептидаз может быть применено для гидролиза поперечной межпептидной связи. В целях безопасности предпочтительны трипсин (Е.С.3.4.21.4) и глицин-эндопептидаза (Е.С.3.4.22.25). Например, из Papaya Carica была выделена глицин-эндопептидаза или пептидаза В. В отличие от папаина, она расщепляет связь на карбоксильном конце глицина, остатка, который поперечно сшивает основные пептидогликановые единицы Bifidobacterium infantis, В. breve, В. asteroides, В. parvulorum, В. globosum и Streptococus viridance. Такое специфически нацеленное расщепление поперечной связи приводит к высвобождению новых биодеградируемых пептидов: N-ацетилглюкозамин-N-ацетилмурамил-L-Аlа-D-изоGlu-L-Lуs-D-Аlа, N-ацетилглюкозамин-N-ацетилмурамил-L-Ala-D-Glu-L-Lys-D-Ala, биодеградируемого
Трипсин и лизил-эндопептидаза (Е.С.3.4.24.50) расщепляют связь на карбоксильном конце лизина. Такое специфическое расщепление приводит к высвобождению нового трипептида N-ацетил-N-глюкозамин-N-ацетилмурамил-L-Ala-изоGlu-L-Lys и гексапептида:
после протеолиза пептидогликана Lactobacillus bulgaricus, L. helveticus, L.jugurti, L. lactis, L. acidophilus, L. salivarius, L. delbruckii, L. leichmannii, L. jensenii, L. casei, L. rhamnosus, L. tolerans, L. fusiformis, L. pseudoplantarum, L. coryneformis, L. torquens, L. curvatis, L. xylosus, L. zeae, L. brevis, L. buchneri, L. fructovoranse, L. malefermentans, L. pastorianus, L. parvus, L. frigidus, L. hilgardii, Bifidobacterium eriksonii, B. coryneforme и B. indicum.
Кратковременный гидролиз пептидогликана тех же бактерий флавастацином (Е.С.3.4.24.76) расщепляет пептидную связь на N-конце аспарагиновой кислоты. Это вызывает высвобождение еще одного нового биодеградируемого пентапептида:
Гидролиз В. bifidum фловастацином приводит к высвобождению другого нового гексапептида:
Гидролиз пептидогликана L. fermentum фловастацином приводит к высвобождению нового пентапептида:
Кроме того, еще одна эндопептидаза сахарализин (Е.С.3.4.24.37) может быть использована для гидролиза пептидной поперечной связи Ala-Ala. Гидролиз Lactobacillus coprophilus, Bifidobacterium globosum, Streptococcus thermophilus, Leuconostoc paramesenteroides и amelibiosus сахарализином приводит к высвобождению нового
Гидролиз сахарализином поперечной пептидной связи в пептидогликановой цепи Lactobacillus minor, Bifidobacterium adolescentis, Leuconostoc lactis, L. lactophitum, L. cremoris и L. mesenteroides приводит к новому
Расщепление поперечной связи пептидогликана Bifidobacterium lactentis, В. longum, В. suis той же самой эндопептидазой может привести еще к одному новому биодеградируемому соединению:
Еще один аспект изобретения представляет собой получение биодеградируемого GMDP, который имеется в продаже в виде полусинтетического или синтетического лекарства. Ферментативный гидролиз каждой грамположительной или грамотрицательной бактерии может быть осуществлен при помощи пептидиллизин-металлопротеиназы или эндопептидазы V8 (Е.С.3.4.21.82), происходящей из S. aureous. Пептидиллизин-металлопротеиназа (Е.С.3.4.24.20) расщепляет N-конец лизина. Эндопептидаза V8 гидролизует карбоксильную связь глутаминовой кислоты, высвобождая таким образом природный GMDP.
Антиапоптотические свойства полусинтетического аналога GMDP были продемонстрированы ранее (Slesarev V., Ellithorpe R., and Dimitrov Т., Med Oncol., 1998). Однако биодеградируемый глюкозаминтри-, тетра-, пента-, гекса- и октапептид никогда не был выделен и протестирован на ингибирование цитотоксичности TNF-альфа. Также стоит отметить, что они имеют более чем одну D-аминокислоту, которая способна усилить цитопротекторные свойства. Авторы изобретения продемонстрировали, что присутствие по меньшей мере двух D-аминокислот увеличивает цитопротекторную активность по сравнению с GMDP.
Обнаружено, что суточная доза пептидогликана в диапазоне от 50 до 2000 мг может быть приемлема для диетического контроля цитотоксичности TNF-альфа, причем оптимальный диапазон составляет 200-1500 мг в сутки. Приемлемой может быть суточная доза выделенного тетра-, пента- и гексапептида в диапазоне от 10 до 100 мг, причем оптимальный диапазон составляет 10-50 мг.
Когда глюкозаминмурамилпептиды по настоящему изобретению применяют в качестве основного лекарственного средства, оно может быть введено перорально в виде порошка, таблеток, дисперсии, капсул, кондитерского изделия, напитков и тому подобного. Когда их применяют в качестве фармацевтического или косметического агента, они могут быть введены перорально, ректально или вагинально в виде спреев, таблеток, суппозиториев или капсул.
Описание предпочтительных воплощений
Далее представлены конкретные воплощения способа получения.
Пример 1. Выделение N-ацетилглюкозамин-N-ацетилмурамил-L-Аla-D-изоGlu-L-Lys-D-Asp-D-Ala из Lactobacillus bulgaricus
1. Получение биомассы
2
4
3
4
4
Ферментацию Lactobacillus bulgaricus осуществляли в ферментере объемом 300 л с рабочим объемом 220 л. Жидкая питательная среда состояла из 10 г/л дрожжевого экстракта, 20 г/л глюкозы, 20 г/л пептона+мясного экстракта, 2 г/л КНРO, 5 г/л CHCOONa, 0,2 г/л MgSO, 0,05 г/л MnSO и 0,1 г/л Tween 80.
3
3
Ферментацию осуществляли в анаэробных условиях при температуре 40+-3°С. Период ферментации составлял 22 часа. Биомассу отделяли от суспензии на центрифуге Sorvall 3B при 4000 об/мин. Выход влажной биомассы составлял 1,6 кг, сухой биомассы - 440 г. Влажную биомассу дважды промывали 1 л дистиллированной воды, затем суспендировали в 1 л СНСООNа в течение 2-4 часов и затем промывали водой с использованием центрифуги Servile-5B при 8000 об/мин. Биомассу в течение 1-2 часов выдерживали в 1 л СНСООNа при 60-80°С и промывали дистиллированной водой. Затем для промывания биомассы использовали 50-70%-ный этанол до тех пор, пока жидкость супернатанта не становилась бесцветной. 96%-ный этанол использовали для стабилизации биомассы. Эта обработка была необходима для сохранения биомассы при комнатной температуре для последующего гидролиза. Влажную биомассу следует хранить при -60°С.
2. Гидролиз
3
2
2
3
3
1,6 кг влажной биомассы промывали дистиллированной водой и 0,5 М СНСООН, затем ресуспендировали в 2,5 л НО и хранили при 90°С в течение 20-30 мин. После этого ее разбавляли в 10 л НО+70 г NаНСО (для достижения рН, равного 6,0) и добавляли 8 г лизоцима (Canadian Inovatech, Inc., Vancouver, Canada). Гидролиз осуществляли в течение 11,5 ч в инкубаторе с перемешиванием при 54°С. Затем в течение 6 ч добавляли 3 г трипсина. Добавляли 110 мл СНСООН для достижения рН, равного 4,0, и центрифугировали на центрифуге Beckman J-6g при 4000 об/мин в течение 30 мин.
3. Первая ультрафильтрация
2
Использовали картриджи с мембраной, способной задерживать соединения с молекулярной массой менее 30000 Да и с S, равной 0,09 м, при скорости 2,5 л/ч (Millipore Corp, USA). 1,8 л раствора, содержащего удерживаемые нуклеиновые кислоты, фосфолипиды и лизоцим, отбрасывали. 10 л пропускали через колонку с микропористым катионитом в Н-форме для удаления остаточного лизоцима и пигментов.
4. Вторая гель-хроматография
Sephadex G-25 и G-50 использовали для выделения этого нового глюкозаминмурамилпептида. Был идентифицирован отдельный пик фракции нейтрального гликопептида. Эту фракцию с молекулярной массой 1000 Да собирали и лиофилизировали. Аминокислотный анализ обнаружил L-Ala-, D-изоGlу, D-Asp и L-Lys в соотношении 2:1:1. Соотношение L-Ala и D-Ala составляло 1:1.
Пример 2. Ингибирование цитотоксичности TNF-альфа при помощи GMHP
Клетки А549 (рак легких человека) засевали в 6-луночные планшеты и через 24 ч (70% конфлюэнтности) обрабатывали 25 мкг/мл циклогексимида (СНХ) и либо 100 Ед./мл человеческого TNF (Beoringer), либо агонистическим моноклональным антителом к FAS (Panerva) в концентрации 200 нг/мл. GMDP и GMHP добавляли непосредственно перед цитокином в концентрациях, приведенных в подписях к фиг.Через двадцать часов после обработки 20 мкл культурального супернатанта удаляли и активность ЛДГ тестировали в 96-луночных планшетах в трех параллелях. Образцы анализировали в микропланшет-ридере EL340 (Biotec Instruments, Inc) при длине волны 490 нм. Фиг.1 демонстрирует эффект GMDP и GMHP на высвобождение ЛДГ. Можно наблюдать повышенную активность GMHP в сравнении с GMDP. Уровень активности ЛДГ был соизмерим с фоновым высвобождением ЛДГ контрольными интактными клетками.
Пример 3. Эффект D-аминокислоты на ингибирование цитотоксичности TNF-альфа.
Цель этого эксперимента заключалась в том, чтобы продемонстрировать синергический эффект NAG и D-глутамина на высвобождение ЛДГ. Технически эксперимент был аналогичен примеру 1. Оба ингредиента добавляли в концентрации 1 мкг/мл. Можно видеть, что L-глутамин не защищает клетки от цитотоксичности TNF-альфа (Фиг.2). Для композиции NAG+D-глутамин наблюдали почти 50%-ное ингибирование активности ЛДГ. Этот пример объясняет, почему GMHP обладает большей активностью по сравнению с GMDP. Глюкозаминмурамилгексапептид имеет 3 D-аминокислоты, тогда как GMDP имеет только один D-изоглутамин.
Пример 4. Эффективность N-ацетил-глюкозаминпентапептидов в отношении хронической сердечной недостаточности
Пациент Т., 72 года, белый мужчина, представлен для оценки его состояния в ходе лечения антигипертензивными средствами и его истории застойной сердечной недостаточности. Он утверждал, что у него имеются усталость и одышка. Он принимал каптоприл три раза в сутки по 50 мг, кордарон 200 мг в сутки, кумадин таблетки 5 мг, 1/2 таблетки по четным дням и целая таблетка по нечетным дням, аспирин 1 г в сутки. История достоверна только в отношении гипертензии, застойной сердечной недостаточности и псориаза.
Лабораторные тесты выявили у него уровень сахара в крови не натощак 172, повышенный уровень GGTP (гамма-глутамилтранспептидаза) - 120 ед./л, повышенный уровень триглициридов - 321, уровень BUN (остаточный азот мочевины в крови) - 36, креатинин - 1,4, слегка повышенный уровень глобулинов - 4,1 и сывороточный ферритин - 335 нг/мл. РТ (протромбиновое время) составляло 17,9. Его предыдущая ЭКГ выявила снижение минутного сердечного выброса до 37%. На момент исследования его масса составляет 210 фунтов (примерно 95,3 кг). Его рост составляет 5 футов и 7,5 дюймов (примерно 171 см), давление крови - 130/76 и пульс - 72. Он хорошо развит, упитан и гидратирован, весит значительно больше нормы, мужчина невысокого роста, активный и ориентированный *4. В его конечностях наблюдается легкий цианоз и умеренный +2 отек с возникновением ямки при надавливании. Имеются псориатические пятна на нижних конечностях и на торсе.
Картина:
1. Застойная сердечная недостаточность, стабильная
2. Гипертензия, контролируемая
3. Псориаз, стабильный
В качестве лечебного средства был рекомендован прием глюкопентапептидного экстракта из L. Bulgaricus по 40 мг в сутки.
Через две недели после дополнительной эхокардиограммы и ЭКГ пациент был обследован. Он утверждает, что он чувствует себя значительно лучше. Не имеет жалоб на отечность. Основные показатели состояния организма: он легко поднимается на стол для обследования и спускается без неуверенности и одышки. Масса тела - 198 фунтов (89,8 кг), кровяное давление - 138/86, пульс - 68. В работе сердца отмечается незначительная аритмия без шума. Нормальные S1 и S2 без дрожания или галопа. PMI выше левого апекса. Имеется незначительный +1 отек с возникновением ямки при надавливании в области лодыжки с двух сторон. Псориатические пятна значительно уменьшились по сравнению с предыдущим обследованием. Уровень GGTP и триглицеридов сократился в два раза и находится в пределах нормы. Отмечается двукратное снижение концентрации ферритина - 166 нг/мл. Уровень сахара натощак - 136 мг/дл. Дополнительная эхокардиограмма выявляет 53% фракцию выброса с заметным улучшением по сравнению с предыдущей эхокардиограммой, выполненной месяц назад. Установленный на нем монитор Холтера подтверждает фибрилляцию предсердий и желудочковые сокращения с редким дублем. Электрокардиограмма подтверждает хроническую фибрилляцию предсердий. Картина следующая: 1) уменьшение застойной сердечной недостаточности; 2) гипертензия стабильная; 3) уменьшение псориаза.
Пример 5. Лечение рака ободочной и прямой кишки, карциномы яичника и гепатоцеллюлярного рака глюкотетрапептидами из L. Acidophilus
Двух женщин с карциномой яичника, двух мужчин с раком ободочной и прямой кишки и одного мужчину с гепатоцеллюлярным раком оценивали на ингибирование GGTP глюкотетрапептидным экстрактом из L. Acidophilus. Все они имели метастазы в печени или легком и получали химиотерапию, что привело к развитию нейтропении, тромбоцитопении, лимфоцитопении, повышению уровня прямого билирубина, GGTP и аланинтрансаминазы. У женщин развились тяжелые асциты, потребовавшие аспирации жидкости.
Все пациенты получали пробиотические глюкопептиды в течение 3 недель в дозе 5 мг/кг массы тела. Их общее состояние значительно улучшилось. У всех пациентов отмечается положительный эффект в отношении утомляемости и тошноты. Эффективность в отношении активности GGTP оценивали как процентное изменение от его уровня, измеренного перед лечением. Отмечено 54% ингибирование у пациентов с раком ободочной и прямой кишки и карциномой яичника. Кроме того, отмечаются дополнительные благоприятные эффекты в отношении асцитов. При лечении пробиотическими глюкопепетидами двум женщинам удалось обойтись без аспирации жидкости. Имеет место двукратное увеличение количества белых кровяных телец, а также увеличение количества тромбоцитов вплоть до 47%.