ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЙ ПРЕПАРАТ, ВКЛЮЧАЮЩИЙ АНТИТЕЛО ПРОТИВ РЕЦЕПТОРА EGF
PHARMACEUTICAL PREPARATION CONTAINING EGF RECEPTOR ANTIBODY

Настоящее изобретение относится к фармацевтическому препарату, включающему антитело, которое направлено против рецептора эпидермального фактора роста (EGFR), к его получению и применению.
Разнообразные исследования in vitro и in vivo показали, что блокирование EGFR с помощью антител оказывает действие, направленное против опухолей на различных уровнях, например, путем ингибирования пролиферации раковых клеток, снижения ангиогенеза, опосредованного опухолью, индукции апоптоза раковых клеток и повышения токсических эффектов радиотерапии и традиционной химиотерапии.
МАВ с225 (INN: цетуксимаб) представляет собой клинически одобренное антитело, которое связывается с рецептором EGF. Цетуксимаб представляет собой химерное антитело, вариабельные участки которого имеют происхождение от мыши, а константные участки имеют человеческое происхождение. Цетуксимаб впервые был описан Naramura и др., Cancer Immunol. Immunotherapy 1993, 37: 343-349 и в WO 96/40210 A1.
MAB 425 является исходно мышиным антителом, которое направлено против EGFR, который сверхэкспрессируется в опухолевых клетках, в частности, в клетках карциномы А431. Его гуманизированные и химерные формы описаны, например, в ЕР 0531472 A1; Kettleborough и др. Protein Engineering 1991, 4: 773-783; Bier и др.,Cancer Chemother. Pharmacol. 2001, 47: 519-524; Bier и др. Cancer Immunol. Immunother. 1998, 46: 167-173. EMD 72000 (h425) представляет собой форму MAB 425, которая находится на фазе клинических испытаний 1/11. Константный участок этого антитела состоит из k-цепи и человеческой γ-1 цепи.
Человеческие анти-EGFR антитела могут быть получены с помощью методики XenoMouse, как описано в WO 91/10741 A1, WO 94/02602 A1 и WO 96/33735 A1. Специфические антитела, которые были получены с помощью этой методики и в настоящее время подвергаются клиническим испытаниям, представляют собой ABX-EGF (Abgenix, Crit. Rev. Oncol. Hematol. 2001, 38: 17-23; Cancer Research 1999, 59: 1236-43).
Антитела, направленные против EGFR, описаны также, например, в ЕР 0586002 В1 и в J. Natl. Cancer Inst. 1993, 85: 27-33 (MAB 528).
Подобно другим антителам, анти-EGFR антитела также используются парентерально в виде раствора для терапевтического применения. Особая проблема растворов, включающих эти антитела, заключается в их склонности к агрегации и образованию белковых мультимеров. В случае восстанавливаемых мультимеров, это явление может объясняться образованием случайных внутримолекулярных дисульфидных мостиков посредством взаимодействия между остатками, находящимися поблизости друг от друга. Гидрофобные взаимодействия и образование в результате этого невосстанавливаемых мультимеров также является возможным. Кроме того, также могут происходить реакции дезамидирования, которые впоследствии приводят к реакциям разложения белка. Описанные реакции денатурации возникают, в частности, при хранении в условиях повышенной температуры или во время сдвиговых стрессов, например при транспортировке.
Как следствие указанной тенденции к агрегации, выпадение продукта в осадок происходит при хранении растворов антитела, означая при этом, что воспроизводимое изъятие из контейнера, содержащего раствор, является сомнительным. Кроме того, при парентеральном введении раствора, содержащего частицы, может возникнуть эмболия. Это приводит к тому, что введение анти-EGFR антител пациенту в требуемой в каждом случае дозе не всегда можно гарантировать воспроизводимым образом при использовании раствора антител, и введение не может происходить с необходимой надежностью.
Несмотря на то, что фильтрование перед осуществлением инъекции позволяет устранить агрегаты, этот способ, однако, включает дополнительный этап и является, таким образом, сложным и не очень приемлемым для клинической практики. В дополнение к этому, проблема воспроизведения дозы остается нерешенной, поскольку в каждом случае из раствора удаляется неизвестная фракция антител и образование частиц после фильтрации продолжает представлять риск для безопасности.
Общепринятый способ для стабилизации моноклональных антител представляет собой сублимационную сушку растворов, включающих антитела и вспомогательные вещества. Однако лиофилизация требует значительных затрат времени и энергозатрат и, таким образом, является дорогостоящей. Кроме того, лиофилизат должен быть сначала восстановлен перед введением.
ЕР 0073371 описывает препараты для внутривенного введения, включающие иммуноглобулины, указанные препараты имеют значение рН от 3,5 до 5,0 для стабилизации. Однако такие низкие значения рН приводят к нежелательной несовместимости реакций в сайте инъекции.
US 6171586 В1 раскрывает применение ацетатного буфера со значением рН от 4,48 до 5,5, сурфактанта и полиола в водной композиции антител, содержащей NaCl для исключения модификации изотоничности. Благодаря отсутствию модификации изотоничности, несовместимые реакции в сайте инъекции могут также иметь место.
В качестве примеров дополнительных композиций, включающих специфические антитела, можно сделать ссылку на ЕР 0280358, ЕР 0170983 и US 5945098.
При этом ЕР 0280358 описывает добавление декстрана к раствору антитела для стабилизации против действия определенных гормонов, при этом достигали стабильности в течение 9 месяцев.
ЕР 0170983 описывает стабилизацию термолабильного моноклонального антитела путем прогревания вместе с гидролизованным яичным альбумином, в результате чего антитело оставалось стабильным после хранения в течение 7 дней при 45°С. Однако прибавление белков других видов к композициям, предназначенным для парентерального введения, является нежелательным по причинам, ассоциированным с этим, в частности, из-за их возможной антигенности.
US 5945098 раскрывает применение глицина, полисорбата 80 и полиэтиленгликоля для стабилизации водного раствора иммуноглобулина G.
DE 10133394 А1 раскрывает применение фосфатного буфера в интервале значений рН от 6 до 8 и эстера жирной кислоты полиоксиэтиленсорбита для стабилизации водного раствора антитела цетуксимаба. Несмотря на факт, что это значительно снижает образование видимых агрегатов, химическая стабильность, в частности, в стрессовых условиях, значительно ухудшается. Кроме того, композиция не демонстрирует стабильности к (высоко)температурному стрессу, например, длительному хранению при 40°С.
Задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы отыскать водную композицию, специфически предназначенную для антител, направленных против EGFR, которая является приемлемой для парентерального введения, хорошо переносится и стабильна при хранении при комнатной температуре в течение, по крайней мере, 24 месяцев. Стабильность при хранении также должна сохраняться в случае воздействия сдвиговых сил, которые возникают при транспортировке и при модифицированных климатических условиях, в частности, при повышенной температуре и атмосферной влажности. Кроме того, композиция должна иметь простой состав и не включать каких-либо вспомогательных веществ, которые являются сомнительными с токсикологической точки зрения.
Неожиданным образом было установлено, что композиция, которая соответствует этим требованиям, находится в форме раствора, который, в дополнение к антителу, направленному против эпидермального фактора роста (анти-EGFR антитела), включает буфер, аминокислоту и сурфактант. Настоящее изобретение, таким образом, относится к водному фармацевтическому препарату, который, в дополнение к анти- EGFR антителу, включает буфер, аминокислоту и сурфактант.
Для целей настоящего изобретения водный препарат представляет собой таковой, в котором, по крайней мере, часть присутствующего растворителя состоит из воды. Дополнительные составляющие растворителя, которые могут присутствовать, представляют собой все растворители, которые являются приемлемыми для парентерального применения, в частности, спирты, такие как, например, этанол, пропанол, пропандиол или глицерин. Водный препарат предпочтительно включает в качестве растворителя воду или смеси этанол/вода; растворитель, в частности, предпочтительно состоит из воды.
Присутствующее антитело может представлять собой любое анти-EGFR антитело, в частности, мышиные, гуманизированные или химерные антитела, упомянутые в начале, а также человеческие анти-EGFR антитела, которые были и могут быть получены с помощью указанной методики XenoMouse. Предпочтение отдается анти-EGFR антителу цетуксимабу или EMD 72000, или одному из мышиных, гуманизированных или химерных аналогов антитела, соответствующим им. Особое предпочтение отдается водным препаратам, которые включают цетуксимаб или EMD 72000 в качестве антитела.
Анти-EGFR антитело может присутствовать в композиции в соответствии с изобретением в концентрации от 0,1 мг/мл до 50 мг/мл, предпочтительно от 2 мг/мл до 10 мг/мл, в частности предпочтительно приблизительно 5 мг/мл.
Буферы, которые могут использоваться, в основном представляют собой все физиологически переносимые вещества, которые являются приемлемыми для установления желаемого значения рН, такие как, например, цитратные соли, ацетатные соли, соли гистидина, сукцинатные соли, малатные соли, фосфатные соли или лактатные соли и/или их соответствующие свободные кислоты или основания, а также смеси различных солей и/или их кислот или оснований. Буфер предпочтительно состоит из одной или более цитратной(ых) соли(ей), ацетатной(ых) соли(ей), соли(ей) гистидина, сукцинатной(ых) соли(ей), малатной(ых) соли(ей), фосфатной(ых) соли(ей) или лактатной(ых) соли(ей) и/или их соответствующей(их) свободной(ых) кислоты(кислот) или основания(ний), или смеси одной или более различных солей, и/или их кислоты(кислот), или основания(оснований). В данном случае термин «смесь» охватывает как смеси различных солей той же кислоты, такие как, например, смеси различных цитратных солей, так и смеси солей различных кислот, таких как, например, смеси цитратных и ацетатных солей. Буфер предпочтительно состоит из одной или более цитратной(ых) соли(ей) и/или ее свободной кислоты (например, лимонной кислоты, моногидрата лимонной кислоты, дигидрата цитрата тринатрия, моногидрата цитрата трикалия), ацетатной(ых) соли(ей) и/или ее свободной кислоты (например, уксусной кислоты, ацетата натрия, тригидрата ацетата натрия) или L-гистидина и/или его соли присоединения кислоты, такой как, например, моногидрата моногидрохлорида L-гистидина. Препарат в соответствии с изобретением преимущественно включает буфер в концентрации от 10 до 100 ммоль/л, предпочтительно от 2 до 20 ммоль/л, особенно предпочтительно приблизительно 10 ммоль/л.
рН препарата находится в интервале от 5,0 до 6,0, предпочтительно от 5,2 до 5,8, особенно предпочтительно приблизительно 5,5.
Препарат в соответствии с изобретением является физиологически хорошо переносимым, может быть легко получен, может быть точно отмерян и является стабильным в отношении анализа структуры, продуктов разложения и агрегатов на протяжении времени хранения, при процессах повторного замораживания и оттаивания и механического стресса. Он является стабильным при хранении в течение периода времени, по крайней мере, от 3 месяцев до 4 лет при температуре холодильника (2-8°С). Неожиданно было обнаружено, что препарат в соответствии с изобретением является также стабильным при хранении в течение периода времени до двух лет при повышенной температуре и высоких уровнях атмосферной влажности, например, при 25°С и 60% относительной атмосферной влажности, или в течение периода 3 месяцев при температуре 40°С и 75% относительной атмосферной влажности.
Аминокислота, присутствующая в препарате, может быть основной аминокислотой, такой как, например, аргинино, гистидин, орнитин, лизин, или нейтральной аминокислотой, такой как, например, глицин, метионин, изолейцин, лейцин и аланин, или ароматической аминокислотой, такой как, например, фенилаланин, тирозин или тритофан. Основные аминокислоты предпочтительно используются в форме их неорганических солей (преимущественно в форме солей хлористоводородной кислоты, то есть в виде гидрохлоридов аминокислоты). Используемая аминокислота предпочтительно в каждом случае представляет собой L-форму. Аминокислота, которая присутствует в препарате, в частности, предпочтительно представляет собой L-аргинин, глицин или L-метионин.
Препарат включает аминокислоту в концентрации от 2 до 200 ммоль/л, предпочтительно от 50 до 150 ммоль/л, в частности, предпочтительно приблизительно 100 ммоль/л.
Сурфактанты, которые могут использоваться, представляют собой все сурфактанты, обычно используемые в фармацевтических препаратах, предпочтительно эстеры жирной кислоты полиэтиленсорбита и сополимеры полиоксиэтилена-полиоксипропилена. Эстеры жирной кислоты полиэтиленсорбита являются также хорошо известными под торговыми наименованием Твин. Приемлемые эстеры жирной кислоты полиэтиленсорбита представляют собой, в частности, полиоксиэтилен(20)сорбитмонолаурат, полиоксиэтилен(20)сорбитмонопальмитат и полиоксиэтилен(20)сорбитмоностеарат. Предпочтение отдается полиоксиэтилен(20)сорбитмонолаурату и полиоксиэтилен(20)сорбитмоноолеату, в частности, предпочтение отдается полиоксиэтилен(20)сорбитмоноолеату. Сополимеры полиоксиэтилена-полиоксипропилена также являются известными под торговым наименованием Полоксамер. Особенно предпочтительный сополимер полиоксиэтилена-полиоксипропилена представляет собой Полоксамер 407 (CAS 9003-11-6).
Сурфактанты могут присутствовать в композиции в концентрации от 0,001 вес.% до 1,0 вес.%. Если эстеры жирной кислоты полиоксиэтиленсорбита присутствуют в качестве сурфактантов, то они предпочтительно присутствуют в количестве от 0,005 до 0,1 вес.%, в частности, предпочтительно в количестве приблизительно 0,01 вес.%. Если присутствуют сополимеры полиоксиэтилена-полиоксипропилена, то они предпочтительно представлены в количестве от 0,01 до 0,5 вес.%, в частности, предпочтительно 0,1 вес.%.
Для того чтобы повысить переносимость при парентеральном введении осмотическое давление предпочтительно находится в изотоническом интервале, то есть осмотическое давление составляет от приблизительно 250 до 350 осмолей/кг. Препарат также может вводиться непосредственно внутривенно, внутриартериально, а также подкожно существенно безболезненно.
В соответствии с предпочтительным воплощением препарат в соответствии с изобретением, таким образом, дополнительно включает модификатор изотоничности, предпочтительно физиологически переносимую соль, такую как, например, хлорид натрия или хлорид калия, или физиологически переносимый полиол, такой как, например, глюкоза или глицерин, в концентрации, необходимой для модификации изотоничности. Таким образом, изобретение также относится к водному препарату, включающему анти-EGFR антитело, буфер, аминокислоту, сурфактант и модификатор изотоничности в концентрации, необходимой для модификации изотоничности. Хлорид натрия, в частности, предпочтительно присутствует в качестве модификатора изотоничности.
Кроме того, растворы в соответствии с изобретением могут дополнительно включать физиологически переносимые вспомогательные вещества, такие как, например, антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота или глютатион, консерванты, такие как фенол, м-крезол, метил- или пропилпарабен, хлорбутанол, тиомерсал или хлорид бензалкония, полиэтиленгликоли (ПЭГ), такие как ПЭГ 400, ПЭГ 3000, 3350, 4000 или 6000, дисахариды, такие как трегалоза или сахароза, или циклодекстрины, такие как гидроксипропил-β-циклодекстрин, ульфобутилэтил-β-циклодекстрин, α-циклодекстрин или γ-циклодекстрин.
В соответствии с особенно предпочтительным воплощением данного изобретения водный препарат включает приблизительно 5 мг/мл цетуксимаба или EMD 72000, приблизительно 10 ммоль/л цитратного или гистидинового буфера, который имеет значение рН примерно 5,5, приблизительно 100 ммоль/л глицина, аргинина или L-метионина, приблизительно 100 ммоль/л хлорида натрия и приблизительно 0,01% полиоксиэтилен(20)сорбитмоноолеата.
Водный препарат может быть получен путем прибавления указанных вспомогательных агентов к раствору, включающему анти-EGFR антитело. С этой целью определенные объемы маточных растворов, которые включают указанные дополнительные вспомогательные вещества, в определенных концентрациях преимущественно прибавляют к раствору, который имеет определенную концентрацию анти-EGFR антитела, которое получено из своего препарата. Эту смесь, если это является желательным, разводят до предварительно рассчитанной концентрации водой или буферным раствором. Альтернативно, вспомогательные вещества можно также прибавлять как твердые вещества к исходному раствору, включающему анти-EGFR антитело. Если анти-EGFR антитело находится в твердой форме, например в форме лиофилизата, то препарат в соответствии с изобретением может быть получен путем начального растворения соответствующих антител в воде или водном растворе, включающем одно или более вспомогательных веществ, и последующего прибавления необходимых в каждом случае количеств маточных растворов, включающих дополнительные вспомогательные вещества, а также дополнительных вспомогательных веществ в твердой форме и/или воды. Анти-EGFR антитело может также предпочтительно непосредственно растворяться в растворе, включающем все дополнительные вспомогательные вещества.
Одно или более вспомогательных веществ, которые присутствуют в препарате в соответствии с изобретением, могут преимущественно уже быть добавленными во время или в конце процесса получения определенного антитела EGFR. Это предпочтительно можно осуществлять путем растворения анти-EGFR антитела непосредственно в водном растворе, включающем один, более, чем один, или все дополнительные вспомогательные вещества, на заключительном этапе очистки, осуществляемом после его получения. Для того чтобы получить препарат, соответствующий(ие) дополнительный(ые) ингредиент(ы) потом только необходимо прибавить в меньшем количестве в каждом случае и/или не прибавлять вообще. Является особенно предпочтительным для соответствующего ингредиента, чтобы его растворяли непосредственно в водном растворе, включающем все дополнительные вспомогательные вещества на заключительном этапе очистки, который осуществляют после его приготовления.
Если раствор, включающий соответствующее антитело и вспомогательные вещества, еще не имеет желаемого значения рН, то его устанавливают путем прибавления кислоты или основания, предпочтительно используя кислоту или основание, уже содержащиеся в буферной системе. После этого осуществляют стерильную фильтрацию.
Водный препарат в соответствии с изобретением может предпочтительно использоваться для лечения опухолевых заболеваний.
Представленные примеры объясняют данное изобретение, не ограничивая его.
Пример 1 (Пример сравнения 1)
Водный раствор, включающий:
2 мг/мл цетуксимаба
10 ммоль/л натрий фосфатного буфера рН 7,2
145 ммоль/л хлорида натрия
Приготовление осуществляли путем смешивания определенных объемов водных растворов, содержащих соответствующие вспомогательные вещества, в определенной концентрации. Использовали следующие растворы:
Раствор А (раствор активного ингредиента), содержащий:
18 мг/мл цетуксимаба
10 ммоль/л натрий фосфатного буфера рН 7,2
(состоящий из 2,07 г/л 7-гидрата гидрофосфата динатрия и 0,31 г/л моногидрата дигидрофосфата натрия)
145 ммоль/л хлорида натрия
(Раствор получали путем повторной буферизации активного ингредиента против раствора В с помощью тангенциальной проточной фильтрации на заключительном этапе очистки активного ингредиента, которая происходит после его приготовления).
Раствор В (раствор буфер/соль)
Соответствует раствору А, но не включает активного ингредиента.
Для получения раствора сравнения 1 1,11 объемных частей раствора А и 8,89 объемных частей раствора В соединяли друг с другом.
Приготовленный раствор перед перенесением во флаконы фильтровали при использовании стерильного фильтра и переносили во флаконы для инъекций. Флаконы для инъекций закрывали пробками и обжимали края.
Пример 2 (Пример сравнения 2)
Водный раствор, включающий:
2 мг/мл цетуксимаба
10 ммоль/л натрий фосфатного буфера рН 7,2
145 ммоль/л хлорида натрия
0,01 вес.% полиоксиэтилен(20)сорбитмоноолеата
Приготовление осуществляли путем смешивания определенных объемов водных растворов, включающих соответствующие ингредиенты, в определенных концентрациях. Кроме раствора А, использовали следующий раствор.
Раствор С (раствор буфер/соль, включающий полиоксиэтилен(20)сорбитмоноолеат)
Соответствует раствору В, но дополнительно включает
0,0125 вес.% полиоксиэтилен(20)сорбитмоноолеата.
Для получения раствора сравнения 2 1,11 объемных частей раствора А и 8,89 объемных частей раствора С соединяли друг с другом.
Приготовленный раствор перед перенесением во флаконы фильтровали при использовании стерильного фильтра и переносили во флаконы для инъекций. Флаконы для инъекций закрывали пробками и обжимали края.
Пример 3 (композиция в соответствии с изобретением)
5 мг/мл цетуксимаба
10 ммоль/л цитратного буфера рН 5,5
100 ммоль/л глицина
100 ммоль/л хлорида натрия
0,01 вес.% полиоксиэтилен(20)сорбитмоноолеата
Приготовление осуществляли путем смешивания определенных объемов водных растворов, включающих соответствующие ингредиенты, в определенных концентрациях.
Раствор D (раствор активного ингредиента в цитратном буфере)
16 мг/мл цетуксимаба
10 ммоль/л цитратного буфера рН 5,5
(состоящий из 2,1014 г/л моногидрата лимонной кислоты)
(Раствор получали путем повторной буферизации активного ингредиента против раствора Е с помощью тангенциальной проточной фильтрации на заключительном этапе очистки активного ингредиента, которая происходит после его приготовления).
Раствор Е (буферный раствор):
Соответствует раствору D, но не содержит активного ингредиента.
Раствор F (раствор буфер/соль):
Соответствует раствору Е, но включает
145,5 ммоль/л глицина,
145,5 ммоль/л хлорида натрия и
0,015 вес.% полиоксиэтилен(20)сорбитмоноолеата.
Для получения композиции в соответствии с изобретением 3,125 объемных частей раствора D и 6,875 объемных частей раствора F соединяли друг с другом.
Приготовленный раствор перед перенесением во флаконы фильтровали при использовании стерильного фильтра и переносили во флаконы для инъекций. Флаконы для инъекций закрывали пробками и обжимали края.
Пример 4
Следующие растворы получали аналогично способу примеров, описанных выше:
Пример 4.1, раствор, включающий:
5 мг/мл цетуксимаба
100 ммоль/л глицина
0,01 вес.% полиоксиэтилен(20)сорбитмоноолеата
10 ммоль/л цитратного буфера рН 5,5
(состоящий из 2,9410 г/л дигидрата цитрата тринатрия).
Пример 4.2, раствор, включающий:
5 мг/мл цетуксимаба
100 ммоль/л глицина
100 ммоль/л хлорида натрия
0,01 вес.% полиоксиэтилен(20)сорбитмоноолеата
10 ммоль/л цитратного буфера рН 5,5
(состоящий из 2,1014 г/л моногидрата лимонной кислоты)
Пример 4.3, раствор, включающий:
5 мг/мл EMD 72000
100 ммоль/л глицина
100 ммоль/л хлорида натрия
0,01 вес.% полиоксиэтилен(20)сорбитмоноолеата
10 ммоль/л цитратного буфера рН 5,5
(состоящий из 2,1014 г/л моногидрата лимонной кислоты).
Пример 4.4, раствор, включающий:
5 мг/мл цетуксимаба
100 ммоль/л L-метионина
0,01 вес.% полиоксиэтилен(20)сорбитмоноолеата
10 ммоль/л цитратного буфера рН 5,5
(состоящий из 2,1014 г/л моногидрата лимонной кислоты).
Пример 4.5, раствор, включающий:
5 мг/мл цетуксимаба
100 ммоль/л глицина
0,01 вес.% полиоксиэтилен(20)сорбитмоноолеата
10 ммоль/л ацетатного буфера рН 5,5
(состоящий из 1,3608 г/л тригидрата ацетата натрия).
Пример 4.6, раствор, включающий:
5 мг/мл цетуксимаба
100 ммоль/л глицина
0,01 вес.% полиоксиэтилен(20)сорбитмоноолеата
10 ммоль/л гистидинового буфера рН 5,5
(состоящий из 2,069 г/л моногидрата моногидрохлорида L-гистидина).
Пример 4.7, раствор, включающий:
5 мг/мл цетуксимаба
100 ммоль/л глицина
0,01 вес.% полиоксиэтилен(20)сорбитмонолаурата
10 ммоль/л цитратного буфера рН 5,5
(состоящий из 2,1014 г/л моногидрата лимонной кислоты).
Пример 4.8, раствор, включающий:
5 мг/мл цетуксимаба
100 ммоль/л глицина
0,1 вес.% сополимера 407 полиоксиэтилена-полиоксипропилена
(Полоксамер 407)
10 ммоль/л цитратного буфера рН 5,5
(состоящий из 2,1014 г/л моногидрата лимонной кислоты).
Пример 5
-1
Стабильность композиции в соответствии с изобретением анализировали в анализе на стресс. С этой целью флаконы, содержащие раствор в соответствии с Примерами 1 и 2, хранили при температуре 25°С и 60%-ной относительной атмосферной влажности, а также при 40°С и 75%-ной относительной атмосферной влажности. В дополнение флаконы, содержащие растворы в соответствии с Примерами 1, 2 и 3, встряхивали в течение пяти дней в аппарате для встряхивания при частоте 150 мин при комнатной температуре и трижды замораживали при -20°С и последовательно вновь оттаивали при +5°С. Перед хранением и через определенные промежутки времени хранения флаконы анализировали визуально при использовании прямого освещения с помощью источника люминисцентного света и определяли абсорбцию растворов при 350 нм, что представляет собой меру мутности. Для того чтобы проиллюстрировать влияние хранения или обработки, относительную мутность в каждом случае подсчитывали по отношению к исходному значению. Кроме того, флаконы анализировали с помощью гель-фильтрационной жидкостной хроматографии высокого разрешения в отношении содержания цетуксимаба, агрегатов и продуктов разложения.
Результаты представлены в Таблице 1.
Таблица 1
Итоговые данные в отношении стабильности композиции в соответствии с изобретением (Пример 3) и двух растворов сравнения (Примеры 1 и 2)
Исследуемый раствор
Хранение [время/ условия]
Цетуксимаб [%]
Агрегаты [%]
Продукты разложения [%]
Мутность при λ=350 нм
Относительная мутность при λ=350 нм
Визуальная оценка
Пример 1
0 недель
99,67
0,12
0,22
0,005
1,00
Мелкие частицы, небольшое количество, прозрачный
Пример 1
8 недель 25°С/60% отн.вл.
98,99
0,28
0,73
0,0081
1,62
Крупные частицы, большое количество, прозрачный
Пример 1
8 недель 40°С/75% отн.вл.
95,08
3,23
1,69
0,0235
4,70
Крупные частицы, большое количество, прозрачный
Пример 1
Встряхивание в теч. 5 дней при 150 об/мин. и отн.вл.
99,60
0,17
0,24
0,829
165,80
Очень крупные частицы, очень большое количество, мутный
Пример 1
3 цикла замораживание/ оттаивание при -20°С и +5°С
99,68
0,14
0,18
0,0089
1,78
Крупные частицы, высокое содержание частиц, прозрачный
Пример 2
0 недель
99,62
0,18
0,21
0,0048
1,00
Частицы отсутствуют, прозрачный
Пример 2
8 недель 25°С/60% отн.вл.
99,02
0,28
0,70
0,0071
1,48
Мелкие частицы, небольшое количество, прозрачный
Пример 2
8 недель 40°С/75% отн.вл.
93,95
4,34
1,72
0,0241
5,02
Мелкие частицы, небольшое количество, прозрачный
Пример 2
Встряхивание в теч. 5 дней при 150 об/мин. и отн.вл.
99,51
0,26
0,23
0,0075
1,56
Отсутствие частиц, прозрачный
Пример 2
3 цикла замораживание/ оттаивание при -20°С и +5°С
99,61
0,21
0,18
0,0064
1,48
Отсутствие частиц, прозрачный
Пример 3
0 недель
99,72
0,15
0,14
0,018
1,00
Отсутствие частиц, прозрачный
Пример 3
8 недель 25°С/60% отн.вл
99,38
0,18
0,44
0,020
1,08
Мелкие частицы, небольшое количество, прозрачный
Пример 3
8 недель 40°С/75% отн. вл.
98,15
0,46
1,40
0,030
1,63
Мелкие частицы, небольшое количество, прозрачный
Пример 3
Встряхивание в теч. 5 дней при 150 об/мин. и отн.вл.
99,15
0,70
0,15
0,019
1,04
Отсутствие частиц, прозрачный
Пример 3
3 цикла замораживание/ оттаивание при -20°С и +5°С
99,75
0,14
0,12
0,018
1,00
Отсутствие частиц, прозрачный
Результаты ясно показывают, что композиция в соответствии с изобретением имеет значительно большую стабильность по сравнению с растворами сравнения, известными из уровня техники.