СПОСОБ ПОДГОТОВКИ КОМПЛЕКСА ВНУТРЕННИХ ОРГАНОВ МЕЛКИХ ЖИВОТНЫХ К МОРФОЛОГИЧЕСКИМ ИССЛЕДОВАНИЯМ
METHOD OF PREPARING COMPLEX OF INTERNAL ORGANS OF SMALL ANIMALS FOR MORPHOLOGIC ANALYSIS

Изобретение относится к области ветеринарной медицины, экспериментальной медицины, биологии и может применяться для фиксации комплекса органов у мелких животных с последующими морфологическими исследованиями.
Изучение взаимосвязи органов, составляющих отдельные комплексы (органы грудной и брюшной полостей, дыхательной системы, желудочно-кишечного тракта и т.д.) невозможно без сохранения их анатомической взаиморасположенности (топографии) и целостности. Так, например, нельзя отпрепарировать брыжейку, не нарушая топографию кишечника (Ярославцев Б.М. Анатомическая техника. Фрунзе, 1961. С.188).
Известен метод Брунетти (Выводцев Д.И. Простой и общедоступный способ бальзамирования трупов без вскрытия полостей. - Воен. Мед. Журнал, 1870; Выводцев Д.И. О бальзамировании вообще и новом способе бальзамирования трупов. Воен. Мед. Журнал, 1876; Выводцев Д.И. Новый способ хранения анатомических препаратов. Врач, 1880, №47; Выводцев Д.И. Бальзамирование и способ сохранения анатомических препаратов и трупов животных СПБ, 1881).
Метод Брунетти предназначен для изготовления демонстрационных препаратов. Заключается он в том, что сосуды органа или целого трупа (не большого) вначале промывались водой, а затем промывались спиртом. Для удаления жира через сосуды пропускался сернистый эфир. Далее вся система органа наполнялась таннином, который играл роль дубильного вещества. После этого через сосудистую систему органа пропускался сухой подогретый воздух, благодаря которому орган высушивался изнутри. В результате препараты выставлялись без банок, в полусухом состоянии, имели объемную форму, были эластичны и подвижны. Такой способ Брунетти использовал для демонстрации фрагментов тела: торсы человека или кисти рук и т.д.
Недостатки способа
1. Возможность использования способа лишь для демонстрации органов и фрагментов тел.
2. Хотя органы сохраняли натуральную величину, но теряли свою микроскопическую структуру.
3. Процесс приготовления препаратов весьма сложен.
Известны методы изготовления замороженных анатомических препаратов по Пирогову (Ярославцев Б.М. Анатомическая техника. Фрунзе 1961. С.27-28); а также изготовление микропрепаратов (Коржевский Д.Э. Краткое изложение гистологической техники для врачей и лаборантов - гистологов. - Изд-во ООО «Кроф». - СПб. - 2005. - С.31).
Метод Пирогова Н.И. заключается в заморозке отдельных фрагментов тела и его горизонтальном распиле. Очевидным плюсом является возможность визуализации топографии органов, которая давала точное и наглядное представление о строении тела человека. Кроме того, распилы красивы и точны.
Недостатки метода
1. Взаиморасположение органов можно было увидеть лишь в «плоском» виде и на ограниченном фрагменте.
2. Дальнейшие гистологические исследования при данном методе не предполагались.
Наиболее близким по своей технической сущности являются методы:
- метод изготовления пластинчатых патолого-анатомических препаратов по Талалаеву (Талалаев В.Т. Бальзамирование трупов. БЭМ, т.11. Талалаев В.Т. Пластинчатые патолого-анатомические препараты и техника их изготовления. Моск. Мед. журнал, 1924, №5).
Метод изготовления пластинчатых патолого-анатомических препаратов по Талалаеву: из свежего, нефиксированного органа вырезается тонкая пластинка, которая фиксируется и обрабатывается по методу Кайзеринга. А именно: после фиксации пластинка отжимается и проводится через 96° спирты. Далее производится заливка в уксуснокислый агар и препарат закладывается между двумя стеклами.
Недостатки способа
1. Возможность использования способа лишь для макроскопической демонстрации фрагмента ткани органов.
2. Отсутствие возможности изучить микроскопическую структуру.
3. Процесс приготовления препаратов сложен.
Задачей настоящего изобретения является целостная фиксация комплекса (с сохранением топографии) органов мелких животных с последующими комплексными морфологическими исследованиями.
Настоящая задача решается тем, что в способе подготовки внутренних органов мелких животных к морфологическим исследованиям, включающем снятие шкуры, иссечение ребер и мускулатуры, грудной кости, иссекают фрагмент, содержащий комплекс органов, с третьего шейного позвонка по десятый грудной позвонок, его помещают в фиксирующую жидкость при температуре 20-37°C на 1-7 суток с последующим вымачиванием зафиксированного объекта от одного до пяти часов в проточной воде, а затем нарезают материал на отдельные фрагменты толщиной 0,2-0,3 см, маркируют и ведут дальнейшую фиксацию. В качестве фиксирующей жидкости используют 10% водный раствор формалина.
Фиг.1. Способ подготовки комплекса внутренних органов мелких животных к морфологическим исследованиям. 3 этап.
Фиг.2. Способ подготовки комплекса внутренних органов мелких животных к морфологическим исследованиям. 4 этап.
Фиг.3. Способ целостной фиксации комплекса органов мелких животных с последующими морфологическими исследованиями. 8 этап.
A
B
C
На чертежах показаны: удаленные фрагменты ребер (1), удаленная мускулатура с ребер грудного отдела позвоночника (2), легкое (3), левое ушко сердца (4). Иссеченный фрагмент от 3-4 шейных позвонков до 10 грудного позвонка (5), пищевод (6), трахея (7), региональный лимфатический узел (8), сердце и эпикардиальный жир (9), легкие (10). . Фрагмент (вентральной) доли легкого кролика. Наливка лимфатической системы синей массой Герота. Бронх (11). . Фрагмент легкого, залитый в парафин (на блоке) (12), гистологический срез (13). . Подслизистая основа бронха с железами (14). Гематоксилин - эозин. Ув. 400.
Наливка лимфатической системы производится синей массой Герота.
Пример: в соответствии с поставленной целью эксперимента было необходимо исследовать легкие и региональные лимфатические узлы кролика с сохранением их анатомической взаиморасположенности и целостности, с последующим комплексом гистологических исследований. Манипуляции производились в несколько этапов:
1 этап. Снятие шкурки с тушки животного по общепринятой методике (Жаров А.В., Иванов И.В., Стрельников А.П. Вскрытие и патолого-анатомическая диагностика болезней сельскохозяйственных животных. / Под редакцией В.П.Шишкова, А.В.Жарова. - М.: Колос. - 1999, - С.15-20).
2 этап. Рассечение мускулатуры шеи, грудной кости; удаление грудной кости, ребер с права и слева.
3 этап. Удаление мускулатуры с ребер и грудного отдела позвоночника (фиг.1).
Анализ фиг.1: показаны фрагменты удаленных ребер (в том числе и грудная кость), а также удаленная с них и позвоночника мускулатура, что необходимо для более удобного иссечения соответствующего фрагмента (этап 4).
4 этап. Иссечение необходимого фрагмента (в данном случае, с 3-4 шейного позвонка до 10 грудного позвонка). На анатомическом объекте при этом остается пищевод, трахея, региональные лимфатические узлы, сердце, легкие и фрагменты кровеносных сосудов и грудного лимфатического протока (фиг.2).
Анализ фиг.2: показан иссеченный фрагмент, включающий шейный и грудной отдел позвоночника, легкие, сердца, региональный лимфатический узел и сосуды. Это позволяет сохранить форму внутренних органов, зафиксированных в известном положении, не нарушая при этом топографию, которая хорошо визуализируется, что необходимо для описания, фотографирования и т.д.
5 этап. Помещение выделенного фрагмента в фиксирующую жидкость для последующей фиксации.
Анатомический объект должен свободно помещаться и лежать в емкости. Фрагмент позвоночника здесь необходим, поскольку он играет роль остова, за счет которого органы свободно находятся в фиксирующем растворе, не деформируясь и сохраняя при этом свою топографию и естественный вид.
Фиксация фрагмента в нейтральном 10% водном растворе формалина при температуре 37°C первые 24 час, а при необходимости 7 и более дней и при комнатной температуре.
Обоснование правильности подхода: легкие покрыты серозной оболочкой, состоящей из рыхлой соединительной ткани, висцеральный листок которой богат эластическими волокнами. Волокна - тонкие ветвящиеся гомогенные нити, формирующие сеть, толщина эластических волокон от 0,2 мкм до 15 мкм (в связках).
Под плеврой находится паренхима легкого, которая состоит из респираторных бронхиол, альвеолярных ходов, альвеолярных мешков и альвеол в комплексе со связанными с ними кровеносными и лимфатическими сосудами, соединительной тканью и нервами (Александровская О.В., Радостина Т.Н., Козлов Н.А. Цитология, гистология и эмбриология. - М.: Агропромиздат. - 1987. - С.394-397.). Т.е. легкое по своей структуре представляет собой пористый орган, поэтому 10% водный раствор формалина легко пропитывает ткани легкого.
Классический кусочек ткани, взятый для гистологических исследований, не должен превышать в ширину 0,5 см, а в длину 1 см (Коржевский Д.Э. Краткое изложение гистологической техники для врачей и лаборантов-гистологов. - Изд-во ООО «Кроф». - СПб. - 2005, - С.31).
Региональные лимфатические узлы легких кролика имеют длину от 2,6±0,07 мм (новорожденные) до 0,71±0,42 мм (взрослые, 2-3 года); ширина 1,1±0,04 и 2,57±0,14 мм соответственно (Чумаков В.Ю. Лимфатическое русло сердца некоторых млекопитающих. Абакан, 1997, с.179).
6 этап. Вымачивание зафиксированного объекта в проточной воде от 1 часа и более (по необходимости).
7 этап. Нарезка материала (через всю толщу органа) на отдельные фрагменты, толщиной 0,2-0,3 см (фиг.3). После фиксации ткань легкого становится плотноватой, что обеспечивает нарезку материала как продольно, так и поперечно через всю долю легкого, что обуславливается целью исследований.
Тот же принцип приемлем и для региональных лимфатических узлов.
Анализ фиг.3: показана последовательная работу с фрагментом ткани. Фиг.3. A.: на срезе фрагмента доли легкого четко просматривается топография элементов легкого: паренхимы, бронхов (1), кровеносных сосудов, что необходимо для описательной части исследований. В связи с правильно проведенной фиксацией ткань режется легко и не деформируется при этом. Фиг.3. B.: фрагмент материала, залитый в парафин (на блоке) (2), и гистологический срез (3) толщиной 5-7 микрометров. Фиг.3. C.: последний этап исследований - гистологические исследования. На микрофотографии представлен гистологический срез подслизистой основы бронха с железами (4), ткань при этом хорошо воспринимает красители, структуры клетки не подвержены аутолизу, т.о. это подтверждает правильность разработки и осуществления способа.
8 этап. Маркировка, дальнейшая фиксация в нейтральном 10% водном растворе формалина (при необходимости).
9 этап. Проведение гистологических исследований по общепринятой схеме.
Таким образом, способ подготовки комплекса внутренних органов мелких животных к морфологическим исследованиям включает целостную фиксацию комплекса органов мелких животных, что позволяет сохранить естественную форму органов, зафиксированных в известном положении, не нарушая при этом их топографию. Заключительным этапом данного способа являются комплексные морфологические исследованиями.