БАКТЕРИАЛЬНАЯ СИСТЕМА ДЛЯ НОРМАЛИЗАЦИИ МИКРОБИОЦЕНОЗА ОРГАНИЗМА ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ

Полезная модель относится к биотехнологии, а именно к медицинским и ветеринарным препаратам, а именно к бактериальным системам, предназначенным для нормализации микробиоценоза организма человека и животных.
В настоящее время проблема дисбактериозов и кишечных дисфункций является по-прежнему актуальной, что обусловлено комплексом причин различного характера: ухудшение экологической ситуации, воздействие ксенобиотиков (промышленных и бытовых загрязнителей, биохимически чужеродных соединений, консервантов, пестицидов, гербицидов, нитратов, нитритов, и т.д.), нерациональное и несбалансированное питание (дефицит пищевых волокон, избыток консервированных и рафинированных продуктов, авитаминозы и т.д.), повышенная хронизация и аллергизация населения, рост иммунодефицитных состояний, стрессы, грубые нарушения микробиоценоза в результате антибактериальной, гормональной или лучевой терапии, микро- и макроэлементозы и т.д. Функции нормальной микрофлоры в организме жизненно важные и очень обширные: защитная, синтезирующая, регуляторная, десенсибилизирующая, дезинтоксикационная, ферментативная, иммуностимулирующая (Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Дисбактериозы и эубиотики» / ЖМЭИ, 1996, №5, с.124-125; «Микробиоценоз кишечника. Современные представления о норме и патологии. Принципы коррекции нарушений» / Методические рекомендации для врачей, под ред. С.А.Курилович; сост. И.О.Светлова, Г.С.Солдатова, М.И.Лосева, Т.И.Поспелова, Новосибирск, 1998, 26 стр.).
Известны бактериальные системы, содержащие живые бактериальные клетки эубиотиков: бифидобактерий, лактобактерий, колибактерий, молочнокислых бактерий, энтерококков и.т.д. (Заявка WO 85/03848, МКИ А23С 9/12, опубл. 12.09.85 г.; ЕВП №0154614, МКИ А23С 9/123, опубл. 11.09.85 г.)
Недостатками известных технических решений являются низкая детоксикационная активность и, как следствие, низкая колонизирующая способность. Причины этих недостатков следующие. Нарушения нормофлоры, дисбактериозы, кишечные дисфункции, как правило, сопровождаются токсикозами той или иной степени, которые затрудняют колонизацию слизистой кишечника бактериями-пробиотиками. А детоксикационная активность вышеупомянутых препаратов развивается только по мере заселения кишечника нормальной микрофлорой. Кроме того, при прохождении через желудок значительная (подавляющая) часть бактерий гибнет в неблагоприятной желудочной среде и под действием ферментов. В настоящее время такие препараты рассматриваются в большей степени как компоненты диетического и лечебно-профилактического питания, но не используются в лечебных целях.
Известны бактериальные системы, в которых бактерии-пробиотики защищены от инактивирующего действия желудочной среды («Микробиоценоз кишечника. Современные представления о норме и патологии. Принципы коррекции нарушений» / Методические рекомендации для врачей, под ред. С.А.Курилович; сост. И.О.Светлова, Г.С.Солдатова, М.И.Лосева, Т.И.Поспелова / Новосибирск, 1998, 26 стр.)… Известные бактериальные системы выполнены в виде кишечнорастворимых капсул. Их терапевтическая эффективность выше, чем у сухих и жидких концентратов. В настоящее время это наиболее широко распространенные препараты, примеры: линекс, бифинорм, бификол, примадофилус бифидус, нормоспектрум и т.д.
Принципиальными недостатками известных бактериальных систем являются низкая детоксикационная активность: она развивается только по мере заселения стенок кишечника полезной микрофлорой (так же, как у некапсулированных форм пробиотиков), а также низкая колонизационная эффективность. Причина низкой колонизирующей эффективности заключается в том, что макрокапсулированные формы пробиотиков действуют, в основном, на просветную микрофлору, а для организма определяющей является микрофлора, локализованная на стенках кишечника. Бактерии просветной микрофлоры вместе с содержимым кишечника передвигаются по кишечнику и эвакуируются естественным путем, соответственно, макрокапсулированные формы пробиотиков действуют локально и недолговременно.
Нарушения нормофлоры, дисбактериозы, кишечные дисфункции, как правило, сопровождаются токсикозами той или иной степени, поэтому схемы лечения таких нарушений и дисфункций предполагают включение средств детоксикационной терапии.
Для профилактики и лечения многих патологических состояний, обусловленных нарушением эндоэкологии, широкое распространение получили энтеросорбенты. Это различные типы активных углей, например, активированный уголь, карбактин, карболонг, полифепан и т.д., природные материалы и их аналоги (микрокристаллическая целлюлоза, цеолиты, хитозаны, пектины, микросорб и т.д.), синтетические минеральные сорбенты и другие материалы, которые используются для очищения организма от шлаков, тяжелых металлов, радионуклидов и других токсинов. Энтеросорбенты снижают эффекты экзо- и эндотоксикозов.
Дальнейший шаг в конструировании эффективных препаратов-пробиотиков - это получение комплексных бактериальных систем, представляющих собой энтеросорбент с иммобилизованными на нем живыми бактериями-эубиотиками. Терапевтическая эффективность таких бактериальных систем складывается из сорбционной (детоксикационной) активности и защитной способности используемого энтеросорбента, последняя проявляется в функциональной и колонизационной активности иммобилизованных бактерий-эубиотиков.
5
Известна бактериальная система, включающая энтеросорбент - активированный уголь - и иммобилизованные на нем микробные клетки-эубиотики (Патент РФ №2017486, МПК А61К 31/00, опубл. 15.08.94 г.).
Недостатком известной бактериальной системы является низкая колонизационная активность, причиной чего являются недостатки активированного угля, как энтеросорбента: активированные угли быстро забиваются, активно поглощают низкомолекулярные гормоны, ферменты и газы кишечника, что ухудшает работу кишечника. Кроме того, защитные свойства активированного угля недостаточны. Это обусловлено тем, что, используемый в качестве носителя активированный уголь с размером частиц менее 30 мкм представляет собой тонкопористый сорбент с преобладанием микропор и высокой удельной поверхностью. Вследствие этого микробные клетки расположены на внешней поверхности частиц сорбента и недостаточно защищены от неблагоприятных воздействий окружающей среды, включая инактивирующее действие желудочной среды.
6
Известна бактериальная система, включающая углеродминеральный энтеросорбент и иммобилизованные на нем компоненты (клетки эубиотиков, иммобилизованные на нем совместно с питательной средой) - прототип (Патент РФ №2118535, МПК А61К 35/74, С12N 11/14, опубл. 10.09.98 г.).
Недостатками известной бактериальной системы являются недостаточная колонизационная и функциональная активность, к тому же адсорбционная (детоксикационная) способность энтеросорбента в нем существенно понижена за счет сорбции компонентов питательной среды с клетками-эубиотиками. Все это не способствует высокой терапевтической активности.
6
8
10
Авторам известно одно из направлений усовершенствования бактериальных систем. Это направление заключается в увеличении содержания в бактериальных системах клеток эубиотиков, десорбируемых с поверхности сорбента, что увеличивало бы суммарную колонизационную и функциональную активность. По этому пути пошли авторы следующих патентов, создававших БАД Экофлор: Патент РФ №2164801, МПК А61К 35/74, А23С 9/12, С12N 1/08, опубл. 10.04.2001 г., патент РФ №2317089, МПК А61К 35/74, А61Р 43/00 опубл. 20.02.2008 г. С получаемых препаратов смывается 10-10 КОЕ/г бифидобактерий. В результате адсорбционная (детоксикационная) способность используемого энтеросорбента СУМС-1 (энтерумина) уменьшается даже по сравнению с прототипом. Предлагаемый в вышеуказанных патентах подход к конструированию бактериальных систем хорош для бактериальных систем, использующихся в качестве биологически активных добавок (БАД) к пище для профилактики дисбактериозов у сравнительно здоровых людей. При заболеваниях же существенным фактором, стабилизирующим дисбиоз, является интоксикация. В этих случаях крайне желательно усилить детоксикационную (адсорбционную) активность бактериальной системы.
Задача полезной модели - усиление детоксикационной (адсорбционной) активности бактериальной системы и увеличение функциональной и колонизирующей активности иммобилизованных клеток-эубиотиков.
7
Задача решается тем, что в заявляемой бактериальной системе, содержащей носитель, представляющий собой углеродминеральный энтеросорбент, иммобилизованные на нем бактерии-эубиотики, компоненты питательной и защитной среды, углеродминеральный энтеросорбент модифицирован окислительной обработкой, а титр бактерий-эубиотиков в готовом препарате составляет 1 - 1×10 КОЕ на грамм препарата. При этом углеродминеральный энтеросорбент представляет собой либо энтерумин, либо СУМС-1, клетки-эубиотики представляют собой либо бифидобактерий, либо лактобактерии, либо их смесь.
Технический эффект заявляемой полезной модели заключается в повышении детоксикационной активности (сорбционной способности), в увеличении функциональной и колонизирующей активности иммобилизованных клеток-эубиотиков.
7
7
Сущность полезной модели: для получения заявляемой бактериальной системы для нормализации микробиоценоза организма человека и животных используют углеродминеральный сорбент либо типа Энтерумин, либо СУМС-1, который подвергают окислительному модифицированию, и иммобилизованные живые лиофильно высушенные бактерии-эубиотики в заведомо пониженной по сравнению с прототипом концентрации - 1-1×10 КОЕ/г. Такая мягкая оксигенизация поверхности повышает тропность поверхности сорбента к иммобилизованным бактериям и повышает жизнеспособность этих бактерий. Повышенная тропность и жизнеспособность позволяет уменьшить концентрацию бактерий в препарате до 1-1×10 КОЕ/г, и таким образом повысить по сравнению с прототипом сорбционную (детоксикационную) активность бактериальной системы для нормализации микробиоценоза организма человека и животных. В результате повышается функциональная и колонизационная активность иммобилизованных бактерий в бактериальной системе для нормализации микробиоценоза организма человека и животных.
Сущность полезной модели далее иллюстрируется примерами.
Способ получения бактериальной системы.
Модификацию поверхности и иммобилизацию клеток проводят по влагоемкости По определению, влагоемкость - это общее количество жидкости (воды, раствора), необходимое для полного смачивания поверхности и заполнения пор сорбента. Измеряется опытным путем, для сорбента типа Энтерумин или СУМС-1 находится в пределах 650-750 мл/кг сорбента.
7
1 кг углеродминерального энтеросорбента типа Энтерумин пропитывают по влагоемкости 700 мл 3-5% раствора перекиси водорода. Перемешивают до однородного состояния и выдерживают при комнатной температуре 30-40 минут или при повышенной температуре 50-60°С 10-15 минут, затем промывают 1-2 раза 1 л дистиллированной воды, после чего воду сливают, сорбент высушивают при температуре 70-100°С до сыпучего состояния и остаточной влажности не более 7%. Готовый модифицированный сорбент охлаждают до температуры ниже 10°С, и пропитывают по влагоемкости 700 мл раствора жидкого концентрата, содержащего бактерии-эубиотики (бифидобактерии) и компоненты питательной и защитной среды. Перемешивают до однородного состояния и полного увлажнения, далее подвергают замораживанию и лиофильной сушке. После сушки получают готовую бактериальную систему для нормализации микробиоценоза организма человека и животных. Все работы ведут с соблюдением мер асептики. Титр бактерий в готовой бактериальной системе для нормализации микробиоценоза организма человека и животных в КОЕ/г. (колониеобразующих единицах на грамм препарата) определяют стандартным методом биотитрования на питательных средах. В зависимости от титра исходного используемого концентрата титр составляет 1-1×10 КОЕ/г.
Сравнительное изучение адсорбционной активности бактериальных систем для нормализации микробиоценоза организма человека и животных.
12
12
Адсорбционную активность бактериальных систем сравнивали на модели сорбции субстрата - витамина B, в стандартизированных условиях. Схема эксперимента: через 3 г сухого препарата в колонке прокачивают 30 мл раствора витамина B с концентрацией 200 мг витамина на литр раствора, со скоростью циркуляции 60 мл/мин. Через 10 минут и 30 минут отбирают пробы раствора, спектрофотометрически измеряют остаточную концентрацию витамина в растворе и рассчитывают адсорбционная способность в %. Измерение оптической плотности проводят в условиях, соответствующих мутным растворам. Результаты представлены в таблице 1 для бактериальных систем для нормализации микробиоценоза организма человека и животных, включающих бифидобактерии и в таблице 2 для бактериальных систе для нормализации микробиоценоза организма человека и животных м, включающих смесь бифидобактерии и лактобактерий.
Сравнение функциональной активности иммобилизованных бифидобактерии (бактерий-эубиотиков) в бактериальных системах.
Функциональную активность иммобилизованных бифидобактерии определяли стандартным методом по активности кислотообразования. Схема эксперимента: в 25 мл среды Блаурокка внесли одинаковые количества бактериальной системы (по 3 г), инкубировали при температуре 37°С в течение 48 часов при периодическом перемешивании. По окончании инкубации отбирали 2 пробы по 10 мл и оттитровывали их раствором едкого натра в концентрации 0,1 моль/л до рН=8,5, значения полученных титров усредняли. Показатель активности выражали в градусах Тернера, вычисленных по формуле: Т°=А×К×10, где А - количество мл раствора едкого натра, использованное на титрование; К - поправка к титру раствора едкого натра; 10 - поправочный коэффициент на массу анализируемой пробы. Результаты представлены в таблице 3.
Сравнение относительной колонизационной активности бактериальных систем.
Относительную колонизационную активность бифидобактерий в бактериальных системах оценивали по их способности колонизировать определенный объем питательной среды в одинаковых стандартизованных условиях. Схема эксперимента: одинаковую дозу бактериальных систем для нормализации микробиоценоза организма человека и животных (3 г) вносили в 25 мл среды Блаурокка, инкубировали при температуре 37°С в течение 72 часов при периодическом перемешивании. По окончании инкубации отбирали пробы и раститровывали их стандартным методом серийных разведении на тиогликолевой среде для определения концентраций бактерий в культуральной среде в КОЕ/мл. С учетом этих титров, объема питательной среды 25 мл и с учетом разбавления (3 грамма на 25 мл среды) рассчитывали общий прирост бифидобактерий (разы, условная колонизационная активность). Результаты представлены в таблице 4 для бактериальных систем для нормализации микробиоценоза организма человека и животных, включающих бифидобактерий и в таблице 5 для бактериальных систем для нормализации микробиоценоза организма человека и животных, включающих смесь бифидобактерий и лактобактерий.
Преимущества заявляемой бактериальной системы для нормализации микробиоценоза организма человека и животных заключаются в следующем:
- повышение сорбционной (детоксикационной) способности бактериальной системы для нормализации микробиоценоза организма человека и животных,
- увеличение функциональной и колонизирующей активности иммобилизованных бактерий эубиотиков бактериальной системы для нормализации микробиоценоза организма человека и животных.
Все это способствует повышению терапевтической эффективности.
Таблица 1
Бактериальные системы для нормализации микробиоценоза организма человека и животных, содержащие бифидобактерии
№
Образцы
Содержание бифидобактерии в бактериальной системе, КОЕ/г
Адсорбционная способность по витамину B<sub>12</sub>, %
за 10 минут
за 30 минут
1
Прототип
1,2×10"
40
65
2
Заявляемая бактериальная система для нормализации микробиоценоза организма человека и животных 1
2,5×10<sup>6</sup>
55
78
3
Заявляемая бактериальная система для нормализации микробиоценоза организма человека и животных 2
7,5×10<sup>2</sup>
67
91
4
Заявляемая бактериальная система для нормализации микробиоценоза организма человека и животных 3
«1»*
71
93
5
Бактериальная система на немодифицированном сорбенте
2,0×106
52
74
«1»* - условная концентрация, образец получен путем отмывки предыдущего образца 2 физиологическим раствором до отсутствия живых бактерий в промывочном растворе. То есть, по формальным признакам образец не содержит бактерий. Однако после добавления питательной среды к образцу наблюдается интенсивный рост бактерий, что указывает на наличие в его составе прочно связанных недесорбирующихся бактерий, которые, тем не менее, остаются в жизнеспособном состоянии и активно размножаются. Существующие методы анализа не позволяют установить точное количество (концентрацию) таких бактерий. Условная концентрация «1 КОЕ/г» означает, что в образце содержится как минимум одна жизнеспособная бактерия.
Таблица 2
Бактериальная система для нормализации микробиоценоза организма человека и животных, содержащая смесь бифидобактерий и лактобактерий
№
Образцы
Суммарное содержание молочнокислых бактерий в бактериальной системе, КОЕ/г
Адсорбционная способность по витамину B<sub>12</sub>, %
за 10 минут
за 30 минут
1
Прототип
1,6×108
39
63
2
Заявляемая бактериальная система для нормализации микробиоценоза организма человека и животных 4
7,0×10<sup>7</sup>
53
74
3
Заявляемая бактериальная система для нормализации микробиоценоза организма человека и животных 5
2,5×10<sup>3</sup>
65
87
4
Заявляемая бактериальная система для нормализации микробиоценоза организма человека и животных 6
«1»*
71
93
5
Бактериальная система на немодифицированном сорбенте
3,0×10<sup>6</sup>
51
72
«1»* - условная концентрация, образец получен путем отмывки предыдущего образца 5 физиологическим раствором до отсутствия живых бактерий в промывочном растворе. То есть, по формальным признакам образец не содержит бактерий. Однако после добавления питательной среды к образцу наблюдается интенсивный рост бактерий, что указывает на наличие в его составе прочно связанных недесорбирующихся бактерий, которые, тем не менее, остаются в жизнеспособном состоянии и активно размножаются. Существующие методы анализа не позволяют установить точное количество (концентрацию) таких бактерий. Условная концентрация «1 КОЕ/г» означает, что в образце содержится как минимум одна жизнеспособная бактерия.
Таблица 3
Бактериальные системы для нормализации микробиоценоза организма человека и животных, содержащие бифидобактерии
№
Образцы
Содержание бифидобактерии в бактериальной системе, КОЕ/г
Кислотопродукция, градусы Тернера, Т°
1
Прототип
1,2×10<sup>8</sup>
65,2
2
Заявляемая бактериальная система 1
2,5×10<sup>2</sup>
99,4
3
Заявляемая бактериальная система 2
7,5×10<sup>2</sup>
71,5
4
Заявляемая бактериальная система 3
«1»*
67,0
5
Препарат на немодифицированном сорбенте
2,0×10<sup>6</sup>
63,5
«1»* - смотри примечание к таблице 1.
Таблица 4
Бактериальные системы для нормализации микробиоценоза организма человека и животных, содержащие бифидобактерии
№
Образцы
Содержание бифидобактерии в бактериальной системе, КОЕ/г
Биотитр культуральных растворов, КОЕ/мл
Общий прирост бактерий, разы
1
Прототип
1,2×10<sup>8</sup>
2,4×10<sup>8</sup>
20
2
Заявляемая бактериальная система для нормализации микробиоценоза организма человека и животных 1
2,5×10<sup>6</sup>
7,8×10<sup>8</sup>
2,5×10<sup>3</sup>
3
Заявляемая бактериальная система для нормализации микробиоценоза организма человека и животных 2
7,5×10<sup>2</sup>
8,5×10<sup>7</sup>
9.4×10<sup>5</sup>
4
Заявляемая бактериальная система для нормализации микробиоценоза организма человека и животных 3
«1»*
6,2×10<sup>6</sup>
5,1×10<sup>7</sup>
5
Бактериальная система на немодифицированном сорбенте
2,0×10<sup>6</sup>
3,5×10<sup>7</sup>
1,5×10<sup>2</sup>
«1»* - смотри примечание к таблице 1.
Таблица 5
Бактериальная система для нормализации микробиоценоза организма человека и животных, содержащая смесь бифидобактерий и лактобактерий
№
Образцы
Суммарное содержание молочнокислых бактерий в бактериальной системе, КОЕ/г
Биотитр культуральных растворов, КОЕ/мл
Общий прирост бактерий, разы
1
Прототип
1,6×10<sup>8</sup>
8,2×10<sup>8</sup>
42
2
Заявляемая бактериальная система 4
7,0×10<sup>7</sup>
7,2×10<sup>8</sup>
8,6×10<sup>1</sup>
3
Заявляемая бактериальная система 5
2,5×10<sup>3</sup>
1,5×10<sup>8</sup>
5,0×10<sup>5</sup>
4
Заявляемая бактериальная система 6
«1»*
2,1×10<sup>6</sup>
1,7×10<sup>7</sup>
5
Бактериальная система на немодифицированном сорбенте
9,1×10<sup>6</sup>
5,7×10<sup>7</sup>
5,1×10<sup>1</sup>
«1»* - смотри примечание к таблице 2.