ПРОГНОЗИРОВАНИЕ И ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ ПРЕЭКЛАМПСИИ
PREDICTING AND PREVENTING PREECLAMPSIA

Ссылка на родственные заявки
Настоящая заявка в соответствии с 35 U.S.С. 119(е) притязает на приоритет предварительной заявки на патент США №61/200150, зарегистрированной 24 ноября 2008 г., которая полностью для всех целей включена в настоящее описание в качестве ссылки.
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к способам оценки повышенного риска возникновения преэклампсии у беременных женщин. Представленные в настоящем описании способы основаны на измерении уровней релаксина и необязательно на измерении уровней С-реактивного белка в биологическом образце, взятом из организма беременной женщины. Кроме того, изобретение относится к способам снижения риска возникновения преэклампсии путем введения беременной женщине фармацевтической препаративной формы, содержащей релаксин.
Предпосылки создания изобретения
Преэклампсия (которую называют также токсикозом) представляет собой угрожающее жизни состояние, поражающее беременных женщин, которое возникает, как правило, в конце второго или третьего триместра беременности, а также у постнатальных женщин в первые шесть недель после родов. Это состояние диагностируют по первому появлению белка в моче (протеинурия) и высокому кровяному давлению. Состояние поражает почки, печень, головной мозг, сердце и плаценту беременной женщины. Преэклампсия возникает примерно в восьми-десяти процентах случаев беременности и ослабевает лишь по окончании беременности либо в результате родов, либо в результате кесарева сечения. Ее причина все еще остается до конца невыясненной. Наиболее часто Преэклампсия возникает при первой беременности. Известно также, что определенные группы беременных женщин имеют несколько более высокий риск возникновения преэклампсии, к ним относятся женщины старше 35 лет и моложе 18 лет; женщины, генетически предрасположенные к этому состоянию;
женщины, страдающие возникшей ранее гипертензией, диабетом, аутоиммунными заболеваниями типа волчанки, различными наследственными тромбофилиями типа фактора V Лейдена, или заболеваниями почек; страдающие ожирением женщины и женщины с многоплодием (двойни, тройни и т.д.). Одним из факторов наиболее значительного риска развития преэклампсии является Преэклампсия, имевшая место во время предыдущей беременности.
Хотя, как правило, Преэклампсия развивается после двенадцатой недели беременности, она может начинаться также и раньше, если имеет место пузырный занос (хориоаденома). Преэклампсия может либо развиваться постепенно, либо возникать внезапно, и она может как оставаться слабой на протяжении беременности, так и становиться серьезной. Помимо высокого кровяного давления и протеинурии к общим симптомам относятся повышенный уровень мочевой кислоты, нарушения зрения, такие как мигающие вспышки или затуманенное зрение, постоянные головные боли, значительное опухание рук и ног, застой жидкости в организме, боль в верхней правой части живота. При отсутствии лечения Преэклампсия может повреждать печень или почки матери, приводить к недостаточному снабжению плода кислородом и вызывать эклампсию (припадки). Беременная женщина с признаками преэклампсии должна находиться под пристальным наблюдением лечащего врача. Преэклампсию от средней до серьезной степени часто лечат в клинике, назначая постельный режим с применением сульфата магния и лекарственных средств против высокого кровяного давления. К сожалению, до настоящего времени истинным «излечением» преэклампсии все еще остаются только роды. Действительно, если женщина страдает серьезной преэклампсией или находится в предродовом периоде беременности, сопровождающемся преэклампсией от слабой до умеренной степени, то до настоящего времени роды все еще остаются лучшим лечебным мероприятием. В этом случае роды инициируют с помощью лекарственного средства, если не является необходимым осуществлять кесарево сечение. Как правило, в течение первых нескольких дней после родов кровяное давление у матери возвращается к нормальному уровню, однако в случае серьезной преэклампсии для возвращения кровяного давления к нормальному уровню может потребоваться несколько недель.
В частности, диагноз преэклампсии устанавливают в том случае, когда у беременной женщины возникает высокое кровяное давление (если при двух отдельных измерениях, проведенных с промежутком времени, составляющим по меньшей мере четыре часа, обнаружены величины давления, равные или превышающие 140/90 мм рт. столба) и количество белка в 24-часовом образце мочи составляет 300 мг (т.е., протеинурия). Долгое время наличие опухания или отека (прежде всего рук и лица) рассматривали как важный признак для установления диагноза преэклампсии, однако в современной медицинской практике для установления диагноза необходимым считается наличие только гипертензии и протеинурии, поскольку вплоть до 40% женщин с нормальным течением беременности также могут иметь отек. Однако наличие «ямочного» отека, т.е. необычного опухания, имеющего место прежде всего на руках, ногах или лице, который отличается тем, что сохраняет в течение некоторого времени углубление, вызванное нажатием, может иметь важное значение и о нем необходимо проинформировать лечащего врача. Хотя эклампсия потенциально является фатальным заболеванием, преэклампсия может иметь совершенно асимптоматический характер или она может присутствовать наряду с симптомами типичных ассоциированных с беременностью недомоганий. Например, эпигастральную боль, свидетельствующую о том, что заболевание затрагивает печень, и которая является типичной для серьезной формы преэклампсии, которую называют синдромом HELLP (синдром, характеризующийся наличием гемолиза, повышенного уровня печеночных ферментов и низкого уровня тромбоцитов (Hemolysis, Elevated Liver enzymes and Low Platelets)), легко можно спутать с изжогой, представляющей собой часто встречающуюся проблему при беременности. Таким образом, предположительный диагноз преэклампсии зависит от ряда совпадающих признаков, при этом, как правило, установить определенный диагноз не представляется возможным до тех пор, пока не произойдет уменьшение симптомов после родов.
Несмотря на то, что в области диагностики преэклампсии были достигнуты определенные успехи, практикующие врачи продолжают заниматься разработкой оптимальных стратегий мониторинга беременных женщин, имеющих риск развития преэклампсии. Необходим подход, обеспечивающий защиту как матери, так и ребенка от вредных воздействий преэклампсии. В настоящем изобретении предложено решение указанной проблемы с помощью способов, позволяющих определять, имеет ли беременная женщина преэклампсию или является предрасположенной к ней, или нет.
Краткое описание предпочтительных вариантов осуществления изобретения
В настоящем изобретении предложены способы, позволяющие оценивать риск и снижать вероятность развития преэклампсии у беременных женщин. Одним из важных преимуществ настоящего изобретения является то, что оно позволяет оценивать риск развития преэклампсии на ранней стадии беременности, что дает возможность своевременно начинать терапевтическое лечение. Другое преимущество настоящего изобретения заключается в том, что беременных женщин, для которых установлено, что они имеют повышенный риск развития преэклампсии, можно лечить с использованием вводимого в относительно низких дозах релаксина или его агониста, предупреждая или ослабляя тем самым преэклампсию. Введение релаксина на ранней стадии может существенно уменьшать количество обусловленных преэклампсией осложнений при беременности у беременных женщин, которые испытывают относительный недостаток в Н2-релаксине в течение первого триместра беременности. Поскольку релаксин присутствует в организме беременной женщины в естественных условиях, то лечение путем введения экзогенного релаксина не должно сопровождаться вредными побочными действиями. Еще одно преимущество настоящего изобретения состоит в том, что на его основе для исследования и/или клинических опытов можно отбирать «обогащенную» популяцию пациенток, что позволяет проводить более полное изучение преэклампсии и развития заболевания на подгруппе беременных женщин, предрасположенных к преэклампсии.
Одним из объектов настоящего изобретения является способ оценки риска развития преэклампсии у беременной женщины, заключающийся в том, что отбирают беременную женщину, находящуюся на первом триместре беременности, и определяют уровень белка релаксина в организме беременной женщины с целью оценки риска развития преэклампсии у женщины. Другим объектом настоящего изобретения является способ оценки риска развития преэклампсии у беременной женщины, заключающийся в том, что отбирают беременную женщину, находящуюся на втором триместре беременности, и определяют уровень белка релаксина в организме беременной женщины с целью оценки риска развития преэклампсии у женщины. Следующим объектом настоящего изобретения является способ оценки риска развития преэклампсии у беременной женщины, заключающийся в том, что отбирают беременную женщину до проявления у нее симптомов преэклампсии и определяют уровень белка релаксина в организме беременной женщины с целью оценки риска развития преэклампсии у женщины. Релаксин можно выявлять в крови. Предпочтительно релаксин выявляют с использованием антитела к релаксину, такого как моноклональное антитело или поликлональное антитело. В одном из вариантов осуществления изобретения срок беременности у женщины составляет от 5 до 14 недель. В другом варианте осуществления изобретения срок беременности у женщины составляет от 5 до 28 недель. В следующем варианте осуществления изобретения беременная женщина вынашивает более чем одного ребенка. В другом варианте осуществления изобретения беременная женщина имеет возраст более 35 лет. В следующем варианте осуществления изобретения беременная женщина имеет возраст не более 18 лет. Еще в одном варианте осуществления изобретения беременная женщина генетически предрасположена к преэклампсии. В следующем варианте осуществления изобретения способ дополнительно предусматривает определение уровня С-реактивного белка (CRP) в организме беременной женщины. CRP выявляют в крови. Предпочтительно CRP выявляют с использованием антитела к CRP, такого как моноклональное антитело или поликлональное антитело.
Другим объектом настоящего изобретения является способ снижения вероятности развития преэклампсии у беременной женщины, заключающийся в том, что отбирают беременную женщину, находящуюся на первом триместре беременности, где у беременной женщины уровень релаксина в крови составляет менее чем примерно 500 пг/мл. Следующим объектом настоящего изобретения является способ снижения вероятности развития преэклампсии у беременной женщины, заключающийся в том, что отбирают беременную женщину, находящуюся на втором триместре беременности, где у беременной женщины уровень релаксина в крови составляет менее чем примерно 500 пг/мл. Другим объектом настоящего изобретения является способ снижения вероятности развития преэклампсии у беременной женщины, заключающийся в том, что отбирают беременную женщину до проявления у нее симптомов преэклампсии, где у беременной женщины уровень релаксина в крови составляет менее чем примерно 500 пг/мл. Кроме того, способ предусматривает введение релаксина в виде фармацевтической препаративной формы беременной женщине с целью уменьшения вероятности развития преэклампсии у беременной женщины. Релаксин можно вводить беременной женщине в количестве, составляющем от примерно 10 до примерно 100 мкг/кг веса тела пациентки в день. В одном предпочтительном варианте осуществления избретения релаксин вводят беременной женщине в количестве, составляющем примерно 30 мкг/кг веса тела пациентки в день. Введение релаксина можно начинать сразу после обнаружения его дефицита и продолжать на протяжении всего периода беременности. В этом случае релаксин вводят пациентке таким образом, чтобы поддерживать, например, концентрацию релаксина в сыворотке на уровне, составляющем примерно 10 нг/мл, на протяжении всего периода беременности. Фармацевтическую препаративную форму, содержащую релаксин, можно вводить подкожно (SQ) или другими путями. Например, релаксин можно вводить путем непрерывной инфузии с помощью инфузионных насосов.
Релаксин, применяемый в фармацевтических препаративных формах, предлагаемых в изобретении, может представлять собой, например, синтетический или рекомбинантный релаксин, или фармацевтически эффективный агонист релаксина или его миметик. В одном из вариантов осуществления изобретения, релаксин представляет собой человеческий Н1-релаксин. В другом варианте осуществления изобретения релаксин представляет собой человеческий Н2-релаксин. Еще в одном варианте осуществления изобретения, релаксин представляет собой человеческий Н3-релаксин. В другом варианте осуществления изобретения релаксин представляет собой синтетический или рекомбинантный человеческий релаксин, или фармацевтически эффективный агонист, или миметик релаксина. Так, беременную женщину, имеющую риск развития преэклампсии, можно лечить с использованием фармацевтической препаративной формы, содержащей синтетический или рекомбинантный человеческий релаксин, или Агонист, или миметик релаксина. В одном из вариантов осуществления изобретения беременную женщину лечат с использованием синтетического человеческого релаксина. В другом варианте осуществления изобретения беременную женщину лечат с использованием рекомбинантного человеческого релаксина. В следующем варианте осуществления изобретения беременную женщину лечат с использованием фармацевтически эффективного агониста или миметика релаксина. Релаксин можно вводить беременной женщине многими различными путями, включая (но, не ограничиваясь только ими) подкожный, внутримышечный, внутривенный, подъязычный пути введения и введение путем ингаляции. Одним из предпочтительных путей введения является введение подкожным (SQ) путем.
В изобретении предложено также применение релаксина для оценки риска развития преэклампсии у беременной женщины, заключающееся в том, что отбирают беременную женщину, находящуюся на первом триместре беременности, и определяют уровень белка релаксина в организме беременной женщины, на основе чего оценивают риск развития преэклампсии у женщины. Кроме того, в изобретении предложено также применение релаксина для оценки риска развития преэклампсии у беременной женщины, заключающееся в том, что отбирают беременную женщину, находящуюся на втором триместре беременности, и определяют уровень белка релаксина в организме беременной женщины, на основе чего оценивают риск развития преэклампсии у женщины. Кроме того, в изобретении предложено также применение релаксина для оценки риска развития преэклампсии у беременной женщины, заключающееся в том, что отбирают беременную женщину до проявления у нее симптомов преэклампсии и определяют уровень белка релаксина в организме беременной женщины, на основе чего оценивают риск развития преэклампсии у женщины. Кроме того, в изобретении предложено также применение релаксина для уменьшения вероятности развития преэклампсии у беременной женщины, заключающееся в том, что отбирают беременную женщину, находящуюся на первом триместре беременности, где у беременной женщины уровень релаксина в кровотоке составляет менее чем примерно 500 пг/мл. Кроме того, в изобретении предложено также применение релаксина для уменьшения вероятности развития преэклампсии у беременной женщины, заключающееся в том, что отбирают беременную женщину, находящуюся на втором триместре беременности, где у беременной женщины уровень релаксина в кровотоке составляет менее чем примерно 500 пг/мл. Кроме того, в изобретении предложено также применение релаксина для уменьшения вероятности развития преэклампсии у беременной женщины, заключающееся в том, что отбирают беременную женщину до проявления у нее симптомов преэклампсии, где у беременной женщины уровень релаксина в кровотоке составляет менее чем примерно 500 пг/мл.
Кроме того, в настоящем изобретении предложен способ оценки того, имеет ли беременная женщина повышенный риск развития преэклампсии, заключающийся в том, что: а) измеряют концентрацию Н2-релаксина в биологическом образце, полученном из организма беременной женщины, до проявления симптома преэклампсии; и б) определяют, что беременная женщина имеет повышенный риск развития преэклампсии, если концентрация Н2-релаксина меньше, чем предельное значение нижнего квартиля концентрации, характерной для беременной женщины. В некоторых вариантах осуществления изобретения нижний квартиль концентрации представляет собой концентрацию Н2-релаксина, которая разделяет нижние 25% от верхних 75% концентраций Н2-релаксина, измеренных в группе беременных женщин со сходным внутриутробным возрастом плода и имеющих сходное место проживания.
Для целей настоящего изобретения в некоторых вариантах осуществления изобретения в качестве сходной популяции беременных женщин со сходным внутриутробным возрастом плода рассматривают популяцию беременных женщин, находящихся на одинаковом триместре, предпочтительно с внутриутробным возрастом плода, находящимся в пределах плюс/минус один месяц или более предпочтительно плюс/минус две недели от внутриутробного возраста плода тестируемой женщины (например, беременной женщины, для которой осуществляют стадии а) и б)). Для целей настоящего изобретения в некоторых вариантах осуществления изобретения в качестве сходной популяции беременных женщин, имеющих сходное место проживания, рассматривают популяцию беременных женщин, проживающих на одном и том же континенте, в одной и той же стране, предпочтительно в пределах 1000 миль, или более предпочтительно в пределах 500 миль от места проживания тестируемой женщины (например, беременной женщины, для которой осуществляют стадии а) и б)). В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения биологический образец представляет собой образец плазмы или сыворотки. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения уровень Н2-релаксина измеряют с использованием антитела к Н2-релаксину, в то время как в подгруппе указанных вариантов осуществления изобретения, уровень Н2-релаксина измеряют методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Указанный в некоторых вариантах осуществления изобретения момент времени «до проявления симптома преэклампсии» представляет собой момент времени, относящийся к первому триместру беременности у женщины, который продолжается с 5 по 15 неделю беременности.
В настоящем изобретении предложены также способы, в которых беременная женщина относится к группе женщин, предрасположенных к преэклампсии, где группа включает одну или несколько женщин, имеющих первую беременность, имеющих возраст более 35 лет, имеющих возраст менее 18 лет, имеющих многоплодную беременность и имеющих определенное предсостояние. В некоторых вариантах осуществления изобретения предсостояние выбирают из группы, включающей гипертензию, диабет, волчанку, тромбофилию, заболевания почек и ожирение. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения предельное значение нижнего квартиля концентрации составляет примерно 500 пг/мл. Кроме того, в настоящем изобретении предложены способы, которые дополнительно предусматривают измерение концентрации С-реактивного белка (CRP) в биологическом образце и в которых определяют, что беременная женщина имеет повышенный риск развития преэклампсии, если концентрация CRP составляет более чем примерно 13,5 мкг/мл, даже если концентрация Н2-релаксина составляет больше чем примерно 500 пг/мл.
В альтернативном варианте настоящего изобретения предложены способы, которые дополнительно предусматривают измерение концентрации С-реактивного белка (CRP) в биологическом образце и в которых определяют, что беременная женщина имеет повышенный риск развития преэклампсии, если концентрация CRP составляет менее чем примерно 1,5 мкг/мл, даже если концентрация Н2-релаксина составляет больше чем примерно 500 пг/мл. В настоящем изобретении предложены также способы определения того, имеет ли беременная женщина преэклампсию, заключающиеся в том, что: а) измеряют концентрацию Н2-релаксина в биологическом образце, полученном из организма беременной женщины; и б) определяют, что беременная женщина имеет преэклампсию, если концентрация Н2-релаксина меньше предельного значения нижнего квартиля концентрации, характерной для беременной женщины. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения биологический образец получают из организма беременной женщины в том случае, если у нее присутствует по меньшей мере один симптом преэклампсии, и способ применяют в частности для установления диагноза преэклампсии у беременной женщины. В определенном поднаборе этих вариантов осуществления изобретения по меньшей мере один симптом преэклампсии представляет собой один или несколько симптомов из группы, включающей отек, сильную головную боль, изменение зрения, боль в верхней части живота, тошноту, рвоту, головокружение, пониженное мочеотделение и внезапное прибавление веса, составляющее более двух фунтов в неделю.
В настоящем изобретении предложены также способы снижения вероятности того, что у беременной женщины может развиться преэклампсия, заключающиеся в том, что: а) отбирают беременную женщину, у которой концентрация Н2-релаксина в сыворотке в биологическом образце, взятом в период первого триместра беременности, составляет менее чем примерно 500 пг/мл; и б) вводят беременной женщине Н2-релаксин в виде фармацевтической препаративной формы с целью снижения вероятности того, что у нее может развиться преэклампсия. В некоторых вариантах осуществления изобретения Н2-релаксин вводят беременной женщине в количестве, составляющем примерно 30 мкг/кг веса тела в день на протяжении всего оставшегося периода беременности (например, после того, как было проведено определение концентрации Н2-релаксина). В некоторых вариантах осуществления изобретения Н2-релаксин вводят беременной женщине таким образом, чтобы на протяжении периода беременности поддерживать концентрацию релаксина в сыворотке на уровне, составляющем примерно 10 нг/мл. В предпочтительных способах концентрацию Н2-релаксина в сыворотке определяют с помощью иммуноанализа. В некоторых вариантах осуществления изобретения за первый триместр принимают период с 5 по 15 неделю беременности. В некоторых вариантах осуществления изобретения беременная женщина относится к группе женщин, предрасположенных к преэклампсии, где группа включает одну или несколько женщин, имеющих первую беременность, имеющих возраст более 35 лет, имеющих возраст менее 18 лет, имеющих многоплодную беременность и имеющих определенное предсостояние. В некоторых вариантах осуществления изобретения предсостояние выбирают из группы, включающей гипертензию, диабет, волчанку, тромбофилию, заболевания почек и ожирение. В некоторых наиболее предпочтительных вариантах осуществления изобретения беременная женщина является жительницей Северной Америки. Более предпочтительно беременная женщина является жительницей индустриальной северо-восточной области Северной Америки (например, проживающей в пределах 250 миль от Питтсбурга).
Кроме того, в настоящем изобретении предложено моноклональное антитело, обладающее реактивностью в отношении Н2-релаксина, где моноклональное антитело получено с помощью гибридомы, депонированной в Американской коллекции типовых культур (АТСС) под регистрационным номером РТА-8423. В других вариантах осуществления изобретения предложен набор для иммуноанализа, включающий моноклональное антитело, полученное с помощью гибридомы с регистрационным номером РТА 8423, микропланшет и инструкции по измерению концентрации Н2-релаксина в образце. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения иммуноанализ представляет собой иммуносорбентный анализ Н2-релаксина, в котором дополнительно используют поликлональное антитело к релаксину.
Краткое описание чертежей
На чертежах показано:
на фиг.1 - концентрации релаксина в сыворотке страдающих преэклампсией (РЕ) женщин (HPU- и HP-группы) в зависимости от внутриутробного возраста плода. Линиями соединены данные, полученные для образцов, взятых из организма одной и той же женщины. Ромбами обозначены образцы, полученные из организма беременных женщин, у которых позднее развилась преэклампсия и у которых уровни эндогенного релаксина составляли менее 500 пг/мл в первые 15 недель. Квадратами обозначены образцы, полученные из организма беременных женщин, у которых позднее развилась преэклампсия, но у которых уровни эндогенного релаксина составляли более чем примерно 500 пг/мл. Ромбами обозначены образцы, взятые из организма беременных женщин, у которых не развилась преэклампсия. Следует отметить, что у небольшого количества женщин с нормальным исходом беременности концентрации релаксина в первые 15 недель были ниже 500 пг/мл;
на фиг.2 - двумерная гистограмма (т.е. кластер преэклампсии) концентрации релаксина в первом образце, взятом из организма тестируемых женщин. Первый образец получали в период с 5 по 11 неделю внутриутробного возраста плода, поскольку отбор женщин для участия в опыте происходил в различное время;
на фиг.3 - проиллюстрировано классификационное и регрессионное дерево (CART) для беременных HPU- и НР-женщин (т.е. для страдающих преэклампсией женщин), в котором количество расщеплений равно единице, а количество конечных узлов равно двум. Специфичность при учете результатов измерений релаксина (Rlx) составляла 96%, при этом чувствительность составляла 37%. Данные, использованные при построении этого классификационного дерева, представлены на фиг.1. Представленные результаты свидетельствуют о том, что концентрацию релаксина в сыворотке можно использовать для идентификации популяции женщин, имеющих высокий риск развития преэклампсии на более поздней стадии беременности. Этот прогноз может быть сделан за несколько месяцев до появления клинических симптомов преэклампсии;
на фиг.4 - CART-анализ для беременных HPU- и НР-женщин (т.е. страдающих преэклампсией женщин), в котором количество расщеплений равно трем, а количество конечных узлов равно четырем. При учете результатов измерений релаксина (Rlx) и С-реактивного белка (CRP) специфичность составляла 93%, при этом чувствительность возросла до 83% по сравнению с вариантом, когда учитывали только релаксин (Rlx) (см. фиг.3). Дополнительный учет результатов измерений CRP позволил идентифицировать женщин, предрасположенных к преэклампсии, которые не были идентифицированы на основе определения только концентрации релаксина (Rlx);
на фиг.5 - классификационное дерево для беременных HPU-, HU- или НР-женщин (т.е. для гипертензивных женщин, включая страдающих преэклампсией женщин), в котором количество расщеплений равно трем, а количество конечных узлов равно четырем. При учете результатов измерений релаксина (Rlx) и С-реактивного белка (CRP) специфичность составляла 63%, а чувствительность составляла 96%;
на фиг.6 - классификационное дерево для беременных HPU-, HU- или НР-женщин (т.е. для гипертензивных женщин, включая страдающих преэклампсией женщин), в котором количество расщеплений равно пяти, а количество конечных узлов равно шести. При учете результатов измерений релаксина (Rlx), С-реактивного белка (CRP) и креатинина (CREAT) специфичность составляла 92%, а чувствительность составляла 87%.
Подробное описание изобретения
Общий обзор
Один из объектов настоящего изобретения относится к способам оценки риска развития преэклампсии у беременных женщин. Методы, предлагаемые в настоящем изобретении, основаны на измерении уровня релаксина и необязательно С-реактивного белка (CRP) в биологическом образце, полученном из организма беременной женщины в течение первого триместра. Поскольку преэклампсия является одной из основных причин, по которой женщины обращаются в больницу во время беременности, то она ассоциирована с большими затратами для системы здравоохранения. До настоящего времени прогноз для беременных женщин, у которых установлена преэклампсия или выявлены ее симптомы, был угрожающим, поскольку преэклампсия часто приводит к необходимости преждевременного прекращения беременности посредством кесарева сечения вследствие угрозы здоровью матери или плоду, прежде всего в тех случаях, когда кровяное давление у матери поднимается выше 140/90 мм рт. столба. В настоящее время не существует других способов исцеления от преэклампсии, отличных от прекращения беременности. Для снижения остроты указанной проблемы в настоящем изобретении предложен тест, который можно применять для оценки вероятности или риска развития преэклампсии. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения тесты проводят на ранней стадии беременности (например, в первом триместре), что дает возможность осуществлять мониторинг женщин и предпринимать соответствующее вмешательство для предупреждения полного развития преэклампсии. Раннее получение информации о повышенном риске развития преэклампсии позволяет лечащему врачу с самого начала стабилизировать состояние беременной пациентки. В свою очередь, вмешательство в форме терапевтического лечения, предпринимаемого с целью предупреждения или снижения высокого кровяного давления, снижает риск смерти матери и ребенка и, кроме того, снижает риск возникновения необходимости преждевременного прекращения беременности.
Как указано в настоящем описании, измерение уровней релаксина у беременных женщин позволяет прогнозировать, будет ли у женщины развиваться преэклампсия. Низкие уровни релаксина сами по себе являются высокоспецифичным индикатором рассматриваемого состояния. Понятие «релаксин» (встречающийся в естественных условиях релаксин и эндогенный релаксин), используемое в настоящем описании применительно к людям, относится к Н2-релаксину, если специально не указано иное. На фиг.1 и фиг.3 продемонстрировано, что, если уровни релаксина у беременных женщин находятся ниже 500 пг/мл, то вероятность того, что у женщин будет развиваться преэклампсия, составляет 96% (см. фиг.3, на которой проиллюстрирован CART-анализ). Фактически, у одной трети страдающих преэклампсией женщин, идентифицированных на основе данных, представленных на фиг.1, уровни релаксина находились ниже 500 пг/мл. В других вариантах осуществления изобретения, в которых в дополнение к измерению уровней релаксина измеряют уровни встречающегося в естественных условиях С-реактивного белка (CRP), чувствительность теста является еще более высокой. Например, на фиг.4 продемонстрировано, что, если уровни CRP составляют менее чем примерно 1,5 мкг/мл или более чем примерно 13,5 мкг/мл, то чувствительность теста возрастает до 83%.
Другой объект настоящего изобретения относится к способам предупреждения или снижения вероятности развития преэклампсии путем введения фармацевтически активного Н2-релаксина или агониста Н2-релаксина. Более конкретно, если уровни эндогенного релаксина находятся ниже 500 пг/мл, то для того, чтобы стабилизировать состояние женщин в период беременности и предупреждать развитие преэклампсии, беременным женщинам можно вводить экзогенный Н2-релаксин. В этом случае беременным женщинам вводят в течение оставшейся части периода беременности (например, после измерений уровней Н2) фармацевтическую препаративную форму, содержащую синтетический или рекомбинантный человеческий релаксин или агонист релаксина, при этом релаксин служит прежде всего в качестве профилактического средства.
Определения
Понятия «эндогенный релаксин» или «встречающийся в естественных условиях релаксин» используют в настоящем описании взаимозаменяемо, и они относятся к встречающемуся в естественных условиях пептидному гормону релаксину, который хорошо известен в данной области. В женском организме релаксин продуцируется в желтом теле (corpus luteum) в яичнике, молочной железе и в период беременности также в плаценте, хорионе и отпадающей (децидуальной) оболочке. Уровни эндогенного релаксина возрастают после овуляции в результате его производства corpus luteum и достигают пика в середине и поздней лютеиновой фазе менструального цикла. Если во время цикла оплодотворение не происходит, то концентрации релаксина снижаются до необнаруживаемого уровня. Однако, если во время цикла происходит оплодотворение, то концентрации релаксина быстро возрастают, достигая пика в первом триместре. Затем концентрации релаксина начинают медленно снижаться, но остаются на повышенном уровне в период беременности. В контексте настоящего описания понятие «релаксин» (встречающийся в естественных условиях и эндогенный релаксин) применительно к человеку относится к Н2-релаксину, если не указано иное.
В контексте настоящего описания понятие «экзогенный релаксин» обозначает неэндогенный человеческий релаксин, включая интактный полноразмерный человеческий релаксин или часть молекулы релаксина, которая сохраняет биологическую активность. Понятие «экзогенный релаксин» включает человеческий H1-препрорелаксин, прорелаксин и релаксин; Н2-препрорелаксин, прорелаксин и релаксин; и Н3-препрорелаксин, прорелаксин и релаксин. Понятие «релаксин» включает также биологически активный (который называют также «фармацевтически активным») релаксин, полученный из рекомбинантных, синтетических или природных источников, а также варианты релаксина, такие как варианты аминокислотной последовательности. Таким образом, понятие включает синтетический человеческий релаксин и рекомбинантный человеческий релаксин, в том числе синтетический человеческий Н1-, Н2- и Н3-релаксин и рекомбинантный человеческий Н1-, Н2- и Н3-релаксин. Кроме того, понятие включает действующие субстанции, обладающие релаксин-подобной активностью, такие как агонисты релаксина, миметики релаксина и/или аналоги релаксина и их фрагменты, сохраняющие биологическую активность, в том числе все субстанции, которые конкурентно вытесняют связанный релаксин из рецептора релаксина (такого, например, как рецептор LGR7, рецептор LGR8, GPCR135, GPCR142 и т.д.). Так, фармацевтически эффективный агонист или миметик релаксина представляет собой любую субстанцию, обладающую релаксин-подобной активностью, которая может связываться с рецептором релаксина, вызывая релаксин-подобный ответ. Кроме того, не является необходимым, чтобы нуклеотидная последовательность человеческого релаксина, применяемого согласно настоящему изобретению, была идентичной на 100% нуклеотидной последовательности человеческого релаксина (например, H1, H2 и/или Н3), но она может быть идентичной по меньшей мере примерно на 40%, 50%, 60%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%. 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% нуклеотидной последовательности человеческого релаксина. Релаксин, применяемый согласно настоящему изобретению, можно получать с помощью любого метода, известного специалистам в данной области. Примеры таких методов проиллюстрированы, например, в US №5759807, а также описаны у Bullesbach и др., The Journal of Biological Chemistry 266(17), 1991, c.10754-10761. Примеры молекул релаксина и их аналоги описаны, например, в US №5166191.
Встречающийся в естественных условиях биологически активный релаксин можно получать из таких источников, как человек, представители мышиных (т.е. из крысы или мыши), свинья или другие млекопитающие. Под это понятие подпадает также релаксин, модифицированный с целью увеличения его времени полужизни in vivo, например, пэгилированный релаксин (т.е. релаксин, конъюгированный с полиэтиленгликолем), релаксин с модифицированными аминокислотами, которые подвергаются расщеплению под действием расщепляющих ферментов, и т.п. Понятие включает также релаксин, содержащий А- и В-цепи, укороченные на N- и/или С-конце. В целом, в Н2-релаксине А-цепь может варьироваться от А(1-24) до А(10-24), а В-цепь может варьироваться от В(1-33) до В(10-22); в H1-релаксине А-цепь может варьироваться от А(1-24) до А(10-24), а В-цепь может варьироваться от В(1-32) до В(10-22). Под объем понятия «релаксин» подпадают также и другие варианты, полученные в результате инсерций, замен или делеций одного или нескольких аминокислотных остатков, варианты с измененным гликозилированием, негликозилированный релаксин, органические и неорганические соли, полученные ковалентной модификацией производные релаксина, препрорелаксин и прорелаксин. Понятие включает также аналог релаксина, имеющий аминокислотную последовательность, отличающуюся от последовательности дикого типа (т.е. от встречающейся в естественных условиях), в том числе (но не ограничиваясь только ими) аналоги релаксина, описанные в US №5811395. К возможным модификациям аминокислотных остатков релаксина относятся ацетилирование, формилирование или аналогичная защита свободных аминогрупп, включая N-концевые аминогруппы, амидирование С-концевых групп или формирование сложных эфиров гидроксильных или карбоксильных групп, например модификация остатка триптофана (Trp) в В2 путем добавления формильной группы. Формильная группа представляет собой типичный пример легко удаляемой защитной группы.
Другие возможные модификации включают замену одной или нескольких встречающихся в естественных условиях аминокислот в В- и/или А-цепях на другие аминокислоты (включая D-форму встречающейся в естественных условиях аминокислоты), в том числе (но не ограничиваясь только ими) замену фрагмента Met в В24 на норлейцин (Nle), валин (Val), аланин (Ala), глицин (Gly), серии (Ser) или гомосерин (HomoSer). Другими возможными модификациями являются удаление из цепи путем делеции встречающейся в естественных условиях аминокислоты или добавление в цепь одной или нескольких дополнительных аминокислот. Дополнительными модификациями являются аминокислотные замены в стыках В/С и С/А прорелаксина, где указанные модификации облегчают отщепление С-цепи от прорелаксина; и вариант релаксина, содержащий не встречающийся в естественных условиях С-пептид, например, описанный в US №5759807.
Понятие «релаксин» включает также слитые полипептиды, содержащие релаксин и гетерологичный полипептид. Гетерологичный полипептид (например, полипептид, отличный от релаксина), являющийся компонентом слияния, может находиться на С-конце или N-конце слитого белка по отношению к фрагменту, представляющему собой релаксин. Гетерологичными полипептидами могут служить обнаруживаемые иммунологическими методами полипептиды (например, «эпитопные метки»); полипептиды, обладающие способностью генерировать обнаруживаемый сигнал (например, зеленый флуоресцентный белок, ферменты, такие как щелочная фосфатаза, и другие субстанции, известные в данной области); терапевтические полипептиды, включая (но не ограничиваясь только ими) цитокины, хемокины и факторы роста. Все такие вариации или изменения структуры молекулы релаксина, приводящие к получению вариантов, подпадают под объем настоящего изобретения, если они сохраняют функциональную (биологическую) активность релаксина. Предпочтительно любая модификация аминокислотной последовательности или структуры релаксина не должна повышать его иммуногенность в организме индивидуума, обработанного вариантом релаксина. Варианты релаксина, обладающие требуемой функциональной активностью, легко можно идентифицировать с помощью методов анализа in vitro и in vivo, известных в данной области.
Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения относятся к способам, предусматривающим введение агониста релаксина. Применяемый согласно некоторым способам агонист релаксина активирует один или несколько сопряженных с родственным релаксину G-белком рецепторов (GPCR), выбранных из группы, включающей (но не ограничиваясь только ими) RXFP1, RXFP2, RXFP3, RXFP4, FSHR (LGR1), LHCGR (LGR2), TSHR (LGR3), LGR4, LGR5, LGR6 LGR7 (RXFP1) и LGR8 (RXFP2). В некоторых вариантах осуществления изобретения агонист релаксина содержит аминокислотную последовательность, представленную в формуле I WO 2009/007848 на имя фирмы Compugen (содержание документа, относящееся к описанию последовательностей агониста релаксина, включено в настоящее описание в качестве ссылки). Примеры агонистов релаксина описаны также в международной заявке на патент PCT/US2009/044251 на имя фирмы Corthera, содержание которой, относящееся к описанию последовательностей агониста релаксина, представленных в SEQ ID NO: 4-8, включено в настоящее описание в качестве ссылки.
Под объем настоящего изобретения подпадают также гомологи полипептидов формулы I, аминокислотные последовательности таких гомологов могут быть по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 55%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или более, например, на 100%, идентичными аминокислотной последовательности приведенного в качестве примера агониста релаксина (например, имеющего последовательность, представленную в SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 6 PCT/US2009/044251 на имя фирмы Corthera), где указанную степень идентичности можно определять с помощью пакета программ BlastP Национального центра биотехнологической информации (National Center of Biotechnology Information, NCBI) с использованием задаваемых по умолчанию параметров, которые необязательно и предпочтительно включают следующие: фильтрация - включена (эта опция фильтрует с помощью программы Seg (белок) повторяющиеся последовательности или последовательности низкой сложности из группы запрашиваемых последовательностей), матрица баллов - BLOSUM62 для белков, размер слова равен 3, величина Е равна 10, цены за брешь составляют 11,1 (цена за введение (инициализацию) бреши и за инициализацию и удлинение бреши). Необязательно и предпочтительно степень идентичности/гомологии нуклеотидных последовательностей определяют с помощью пакета программ BlastN Национального центра биотехнологической информации (NCBI) с использованием задаваемых по умолчанию параметров, что предпочтительно предусматривает применение программы фильтрации DUST и предпочтительно включает также использование величины Е, равной 10, фильтрацию последовательностей низкой сложности и использование размера слова, равного 11. И, наконец, под объем настоящего изобретения подпадают также фрагменты указанных выше полипептидов и полипептиды, имеющие мутации, такие как делеции, инсерции или замены одной или нескольких аминокислот, которые могут встречаться в естественных условиях или могут быть индуцированы искусственным путем, либо случайным, либо направленных образом.
Понятие «беременность» относится к периоду беременности продолжительностью девять месяцев (продолжительностью 40 недель, начиная с последнего периода менструации), который традиционно подразделяют на три триместра, т.е. на отдельные периоды продолжительностью примерно по три месяца, в течение которых имеют место различные фазы развития плода. Первый триместр представляет собой период, в течение которого происходит основная дифференцировка клеток. Считается, что он заканчивается, когда мать впервые ощущает движение плода (первые признаки шевеления плода), что обычно происходит примерно в конце третьего месяца (или примерно с 12 по примерно 14 неделю внутриутробного возраста плода). Второй триместр представляет собой период быстрого роста и созревания систем организма (примерно с 15 по примерно 28 неделю внутриутробного возраста плода). Преждевременно родившийся на втором триместре плод может оказаться жизнеспособным, что зависит от больничного ухода. Третий триместр знаменует конечную стадию развития плода, на которой завершается формирование систем, происходит накопление жира под кожей плода и плод перемещается в положение, необходимое для рождения (примерно с 29 по примерно 42 неделю внутриутробного возраста плода). Этот триместр заканчивается непосредственно родами.
Понятие «примерно», используемое применительно к указанной величине, включает величины, находящиеся в диапазоне вплоть до 10% выше или ниже указанной величины (например, от 90 до 110% от указанной величины). Например, скорость внутривенной (IV) инфузии, составляющая примерно 30 мкг/кг/день, включает скорости IV инфузии, составляющие от 27 мкг/кг/день до 33 мкг/кг/день.
Понятие «терапевтически эффективное» относится к количеству фармацевтически активного релаксина, которое приводит к измеримому требуемому медицинскому или клиническому благоприятному действию на пациента по сравнению со статусом пациента на исходном уровне или статусом женщины, не подвергавшейся обработке, или обработанной плацебо (например, не обработанной релаксином женщины).
Преэклампсия
Преэклампсия (или пре-эклампсия) может быть обусловлена слабой (неглубокой) имплантацией (внедрением) плаценты, которая становится гипоксичной, вызывая иммунную реакцию, которая характеризуется секрецией подвергающихся позитивной регуляции воспалительных медиаторов из плаценты, воздействующих на сосудистый эндотелий. Неглубокое внедрение может быть обусловлено ответом материнской иммунной системы на плаценту. Эта теория основана на фактах, позволяющих предположить отсутствие врожденной иммунологической переносимости отцовских антигенов, вырабатываемых плодом и его плацентой. Существует мнение о том, что в некоторых случаях преэклампсии в организме матери отсутствуют рецепторы белков, которые плацента секретирует для осуществления понижающей регуляции материнского иммунного ответа (Moffett и др., Placenta, приложение А, 2007, c.51-56). Однако во многих случаях преэклампсии материнский ответ на плаценту, по-видимому, должен быть таким, который позволяет происходить нормальному внедрению. Возможно, что женщины с высокими исходными уровнями воспаления, обусловленными лежащими в их основе состояниями, такими как хроническая гипертензия или аутоиммунное заболевание, могут обладать меньшей переносимостью воспалительного воздействия, связанного с беременностью.
Было выдвинуто много теорий, с помощью которых пытались объяснить причины возникновения преэклампсии, в них связывают рассматриваемый синдром с наличием следующих состояний: повреждение эндотелиальных клеток, иммунное отторжение плаценты, нарушенная перфузия плаценты, измененная сосудистая реактивность, дисбаланс между простациклином и тромбоксаном, сниженный уровень клубочковой фильтрации, сопровождающийся удержанием соли и воды, сниженный внутрисосудистый объем, повышенная раздражимость центральной нервной системы, диссеминированное внутрисосудистое свертывание, растягивание мышц матки (ишемия), факторы, связанные с питанием, включая дефицит витаминов, и генетические факторы.
Развитие преэклампсии представляет собой двухстадийный процесс, характеризующийся наличием высоковариабельной первой стадии, в результате которой плацента оказывается предрасположенной к гипоксии, после чего происходит высвобождение растворимых факторов, которые приводят, например, к повреждению эндотелиальных клеток, измененной сосудистой реактивности, классическому нарушению клубочкового эндотелиоза, сниженному внутрисосудистому объему, воспалению и т.п. Результаты некоторых исследований подтверждают мнение о том, что неадекватное снабжение плаценты кровью приводит к высвобождению гормонов или химических агентов, которые, в том случае, когда мать предрасположена к рассматриваемому состоянию, вызывают повреждение эндотелия (выстилки кровеносных сосудов), изменению метаболизма, воспалению и другим патологическим реакциям (Clinical Obstetrics and Gynaecology, под ред. Drife и Magowan, глава 39, cc.367-370).
В некоторых исследованиях выдвинуто предположение о том, что гипоксия, обусловленная неадекватной перфузией, приводит к повышающей регуляции sFlt-1, VEGF и агониста PLGF, что вызывает повреждение материнского эндотелия и ограничение роста плаценты (Maynard и др., J Clin Invest, 111(5), 2003, c.649-658). Кроме того, известно, что у беременных женщин, у которых развилась преэклампсия, повышен уровень эндоглина, представляющего собой антагонист TGF-бета (Venkatesha и др., Nat Med, 12(6), 2006, cc.642-649). Растворимый эндоглин, по-видимому, подвергается повышающей регуляции плацентой в ответ на повышающую регуляцию эндоглина клеточной поверхности, продуцируемого материнской иммунной системой, хотя существует также возможность того, что sEng продуцируется материнским эндотелием. Уровни как sFlt-1, так и sEng возрастают при повышении серьезности заболевания, при этом уровни sEng превышают уровни sFlt-1 в случаях, когда имеет место синдром HELLP. Синдром HELLP представляет собой серьезный вариант преэклампсии, характеризующийся гемолизом, повышенными уровнями печеночных ферментов и низкими уровнями тромбоцитов. Как sFlt-1, так и sEng, подвергаются в определенной степени повышающей регуляции у всех беременных женщин, что подтверждает идею о том, что гипертензивное заболевание при беременности свидетельствует о нарушении нормальной адаптации при беременности. Исходное отторжение материнским организмом цитотрофобластов плаценты может являться причиной неадекватного ремоделирования спиральных артерий в случаях преэклампсии, ассоциированной с неглубоким внедрением, что приводит к последующей гипоксии и возникновению материнских симптомов в ответ на повышающую регуляцию sFlt-1 и sEng.
Имеются данные о том, что у женщин, у которых развилась преэклампсия, повышается содержание фетальных клеток, таких как фетальные эритробласты, а также не связанной с клеточной поверхностью фетальной ДНК, в материнском кровотоке. Эти данные позволили выдвинуть гипотезу о том, что преэклампсия представляет собой болезненное состояние, при котором повреждение плаценты, такое как вызванное гипоксией повреждение, дает возможность фетальному материалу поступать в материнский кровоток, вызывая иммунный ответ и повреждению эндотелия, приводящему, в конце концов, к преэклампсии и эклампсии.
Статистические данные свидетельствуют о том, что преэклампсия и связанные с беременностью нарушения, такие как эклампсия и связанные с беременностью гипертензивные нарушения, являются причиной большинства смертей матерей, а также смертей и болезней грудных детей во всем мире. От этих нарушений ежегодно умирает примерно 76000 женщин. Преэклампсия является особенно опасной, поскольку у некоторых женщин симптомы совершенно отсутствуют. Это обусловливает необходимость разработки способов скрининга и прогноза, требующихся для диагностирования рассматриваемого состояния. После того как у женщин диагностирована преэклампсия или гипертензивная беременность, им можно назначать любое(ые) одно или несколько лекарственных средств из группы, включающей метилдопу, гидралазин, лабеталол, нифедипин, сульфат магния, бетаметазон и дексаметазон.
Профилактические стратегии, основанные на применении кальция, аспирина и антиоксидантов (например, витаминов С и Е), оказались недостаточно успешными. В некоторых случаях при использовании аспирина может иметь место небольшое снижение риска развития преэклампсии по данным метаанализа (в сотрудничестве с PARIS), однако это не приводит к исцелению. Строгий контроль кровяного давления позволяет предупреждать серьезные угрожающие здоровью матери состояния, такие как «удар», но он также не позволяет полностью излечивать заболевание.
Релаксин
Эндогенный или встречающийся в естественных условиях релаксин представляет собой пептидный гормон, сходный по размеру и форме с инсулином. Более конкретно, релаксин представляет собой эндокринный и аутокринный/паракринный гомон, относящийся к суперсемейству генов инсулина. Активная форма кодируемого белка состоит из А-цепи и В-цепи, соединенных друг с другом дисульфидными связями, белок содержит две дисульфидные связи, расположенные между цепями, и одну, расположенную внутри цепи (цепь А). Таким образом, его структура очень сходна со структурой инсулина по расположению дисульфидных связей. У человека известны три неаллельных гена релаксина, а именно релаксин-1 (RLN-1 или H1), релаксин-2 (RLN-2 или Н2) и релаксин-3 (RLN-3 или Н3). H1 и Н2 обладают высокой степенью гомологии последовательностей. Описаны два полученных в результате альтернативного сплайсинга варианта транскрипта, кодирующие различные изоформы этого гена. H1 и Н2 дифференциально экспрессируются в репродуктивных органах (см. US №5023321; и Garibay-Tupas и др., Molecular and Cellular Endocrinology, 219, 2004, c.115-125), в то время как НЗ в основном присутствует в головном мозге. В данной области описана эволюция пептидного семейства релаксинов и их рецепторов (см. Wilkinson и др., ВМС Evolutionary Biology, 5(14), 2005, cc.1-17; и Wilkinson и Bathgate, Relaxin and Related Peptides, глава 1, изд-во Landes Bioscience and Springer Science + Business Media, 2007).
Считается, что релаксин активирует специфические рецепторы релаксина, а именно LGR7 (RXFP1) и LGR8 (RXFP2), а также GPCR135 и GPCR142. LGR7 и LGR8 представляют собой содержащие богатые лейцином повторы, сопряженные с G-белком рецепторы (LGR), которые образуют уникальную подгруппу сопряженных с G-белком рецепторов. Они содержат восьмиспиральный трансмембранный домен и большой гликозилированный эктодомен и являются отдаленно родственными рецепторам гликопротеогормонов, таких как LH-рецептор или FSH-рецептор. Указанные рецепторы релаксина обнаружены в сердце, гладких мышцах, соединительной ткани и центральной и вегетативной нервной системе. Обладающие высокой активностью релаксины, такие как H1, Н2, свиной и китовый релаксин, обладают определенной общей последовательностью. Релаксины, последовательности которых отличаются от консервативных последовательностей H1 и Н2, такие как крысиный, акулий, собачий и лошадиный релаксины, характеризуются пониженной биоактивностью в отношении рецепторов LGR7 и LGR8 (Bathgate и др., Ann NY Acad Sci, 1041, 2005, c.61-76; Receptors for Relaxin Family Peptides). Однако сходный с Н2-релаксином, Н3-релаксин активирует рецептор LGR7 (Satoko и др., J Biol Chem, 278(10), 2003, c.7855-7862). Кроме того, было установлено, что Н3 активирует рецептор GPCR135 (Van der Westhuizen, Ann NY Acad Sci, 1041, 2005, cc.332-337) и рецептор GPCR142. GPCR135 и GPCR142 представляют собой два структурно родственных сопряженных с G-белком рецептора. Мышиный и крысиный GPCR135 обладают высокой степенью гомологии (т.е., превышающей 85%) с человеческим GPCR135 и обладают фармакологическими свойствами, очень сходными со свойствами человеческого GPCR135. Человеческий и мышиный, а также крысиный релаксин-3 связываются с высокой аффинностью с мышиным, крысиным и человеческим GPCR135 и активируют их. В отличие от этого, мышиный GPCR142 обладает меньшим сходством (т.е. гомологией на уровне 74%) с человеческим GPCR142. Были клонированы гены GPCR142 обезьяны, коровы и свиньи и было установлено, что они обладают высокой степенью гомологии (т.е., превышающей 84%) с человеческим GPCR142. Определение фармакологических характеристик GPCR142 различных видов позволило установить, что релаксин-3 связывается с высокой аффинностью с GPCR142 различных видов (Chen и др., Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 312(1), 2005, c.83-95).
Релаксин и беременность
Характерная функция релаксина связана с физиологией женских половых путей, она включает регулирование биохимических процессов, участвующих в ремоделировании внеклеточного матрикса шейки матки и влагалища в процессе беременности и разрушение плодных оболочек при родах. Эти модификации позволяют плоду перемещаться по родовому каналу и предупреждают дистоцию (т.е. существенное замедление или прекращение спуска плода или дилатации шейки матки, или обоих указанных процессов при родах). Кроме того, релаксин стимулирует рост матки и плаценты и воздействует на развитие и пролиферацию сосудов в эндометрии (Parry и др., Adv Exp Med Biol, 612, 2007, c.34-48).
У человека релаксин, присутствующий в кровотоке, в основном продуцируется corpus luteum яичника как у беременных, так и у не беременных женщин. Его уровень достигает пика примерно через 14 дней после овуляции и затем при отсутствии беременности снижается, приводя к менструации. В течение первого триместра беременности его уровни в сыворотке возрастают. Кроме того, релаксин продуцируется в децидуальной оболочке и трофобласте, но этот релаксин, по-видимому, не попадает в кровоток. Уровни релаксина достигают пика в течение 14 недель первого триместра. Релаксин имеет важное значение для роста и ремоделирования репродуктивной и нескольких других типов ткани в процессе беременности. Как отмечалось выше, действие релаксина опосредуется рецепторами релаксина.
Дети, рожденные матерями, страдавшими преэклампсией, часто имеют низкий вес при рождении и в дальнейшей жизни имеют больший риск возникновения последующих сердечно-сосудистых состояний. Матери, родившие детей с низким весом, имеют больший риск развития ишемической болезни сердца и обусловленной ей смерти. Более конкретно, для страдавших преэклампсией женщин, преждевременно родивших ребенка с низким весом, коэффициент госпитализации по поводу ишемической болезни сердца или смерти в десять раз больше, чем для контрольных женщин. Существуют надежные доказательства того, что риск развития сердечно-сосудистых заболеваний у женщин, страдающих преэклампсией, выше, чем у женщин, не страдающих указанным состоянием. Действительно, любое гипертензивное нарушение при беременности повышает в дальнейшем риск возникновения гипертензии и «удара». Известно также, что через два-четыре месяца после родов у двух третей женщин, имевших преэклампсию, все еще может иметь место микроальбуминурия (т.е. присутствие в небольших количествах белка, например, альбумина, в моче). Для женщин в пост-менопаузальном периоде микроальбуминурия представляет собой значительный фактор риска развития сердечно-сосудистых заболеваний. Кроме того, преэклампсия ассоциирована с устойчивостью к инсулину и повышенными уровнями гомоцистеина, что создает долговременный риск для женщин (Davison и др., J Am Soc Nephrol, 15, 2004, c.2440-2448).
1-32
B
При нормальной беременности уровень клубочковой фильтрации (GFR) и почечный плазмоток возрастают на 40-65 и 50-85 процентов соответственно. Важно отметить, что релаксин опосредует почечную вазодилатацию в процессе беременности. Известно, что релаксин повышает активность сосудистой желатиназы, обеспечивая тем самым превращение большего количества ЕТ в ET, что приводит к почечной вазодилатации, гиперфильтрации и снижению миогенной реактивности малых почечных артерий посредством эндотелиального рецептора ET и оксида азота (Jeyabalan и др., Frontiers in Bioscience 12, 2007, c.2425-2437).
Мочевая кислота представляет собой конечный продукт метаболизма пурина. Пурины в естественных условиях продуцируются в организме и поступают также с пищей. У человека большая часть присутствующей в кровотоке мочевой кислоты продуцируется в печени и примерно 66% ее экскретируется почками, в то время как примерно 33% экскретируется через желудочно-кишечный тракт. Концентрация мочевой кислоты в сыворотке, как правило, снижается при нормальной беременности вследствие повышения уровня GFR, снижения реабсорбции в проксимальных канальцах и возможного изменения электростатического заряда клубочкового фильтра. Предполагается, что антиангиогенные факторы, поступающие из плаценты при преэклампсии, могут вносить вклад в развитие гломерулярного эндотелиоза (т.е. почечных гистологических повреждений, характерных для преэклампсии), протеинурии и гипертензии при указанном заболевании. У большинства женщин, страдающих преэклампсией, почечный плазмоток и уровень клубочковой фильтрации несколько снижены вследствие повышенного афферентного артериолярного сопротивления и/или сниженного коэффициента ультрафильтрации. При этом концентрация мочевой кислоты в сыворотке в основном повышена вследствие сниженного почечного клиренса. Снижение GFR приводит к снижению уровня профильтрованной мочевой кислоты. Кроме того, сокращение объема плазмы вносит вклад в повышение реабсорбции натрия в проксимальных канальцах. Повышение экскреции белка мочи при преэклампсии является вторичным следствием изменений селективности клубочкового фильтра в отношении размера и/или заряда, возможно, что оно приводит к повышению давления в клубочковых капиллярах и ухудшает реабсорбцию в проксимальных канальцах (см. Jeyabalan и др., выше).
При нормальной беременности у женщины происходит повышение экскреции с мочой общего белка, альбумина, низкомолекулярных белков и фермента почечных канальцев. В случае беременности, сопровождающейся преэклампсией, происходит снижение почечной функции. Как установлено в некоторых исследованиях, уровень GFR и эффективный почечный плазмоток (ERPF) снижаются на 32% и 24% соответственно (см. Jeyabalan и др., выше). Механизм, ответственный за ухудшение почечного кровотока при преэклампсии, до сих пор полностью не изучен. По-видимому, пониженный ERPF обусловлен высоким сопротивлением почечных сосудов. Повышенное сопротивление афферентных почечных сосудов (прегломерулярных артериол) может являться основным фактором, обусловливающим повышенное общее сопротивление почечных сосудов. Следовательно, повышенный тонус афферентных артериол при преэклампсии может защищать клубочек от повреждения, вызываемого высокими системными артериальными давлениями. Снижение ERPF, коэффициента ультрафильтрации или обоих указанных параметров может представлять собой возможный механизм снижения GFR при преэклампсии (см. Jeyabalan и др., выше).
Не вдаваясь в конкретную теорию, можно принять широко распространенное мнение о том, что механизм, лежащий в основе действия релаксина, базируется на стимуляции вазодилатации и ангиогенеза. Во-первых, считается, что релаксин стимулирует ангиогенез в матке, необходимый для обеспечения более прочного соединения кровеносных сосудов плода и матери (т.е. для увеличения количества материнских спиральных артерий, для модификации материнских спиральных артерий и/или для стимулирования инвазии трофобласта в материнские спиральные артерии). Повышение ангиогенеза и вазодилатации оказывает направленное воздействие на патогенез, обусловленный преэклампсией, а именно на недостаточное поступление крови от матери к ребенку и пониженную перфузию плаценты и материнских органов. При введении релаксина беременной женщине релаксин связывается с рецепторами в матке и плаценте и стимулирует производство VEGF. В свою очередь, VEGF связывается с эндотелиальными клетками, стимулируя ангиогенез. Это обеспечивает улучшение поступление крови от матери к ребенку. Во-вторых, релаксин является эффективным вазодилататором и поэтому может улучшать маточно-плацентальную перфузию и системную перфузию материнских органов, которые обе снижаются у женщин, страдающих преэклампсией. Релаксин осуществляет свое действие посредством пути синтазы оксида азота, стимулируя при этом увеличение вазодилатации у человека под воздействием оксида азота NO. Таким образом, введение релаксин при беременности может предупреждать развитие одного из наиболее вредных симптомов преэклампсии (т.е. высокого кровяного давления, составляющего 140/90 мм рт.столба, или превышающего этот уровень). В-третьих, известно, что уровень клубочковой фильтрации (GFR) и почечный плазмоток (RPF) снижаются при преэклампсии, что приводит к серьезному гипертензивному осложнению беременности. Таким образом, введение релаксина может увеличивать также почечный кровоток у беременных женщин, еще более снижая тем самым риски, связанные с преэклампсией. Кроме того, релаксин обладает потенциальными противовоспалительными действиями.
С-реактивный белок (CRP) и беременность
CRP представляет собой плазменный белок, продуцируемый в печени в ответ на воспаление в организме. Воспаление может быть вызвано повреждением, инфекцией или определенным состоянием, таким как высокое кровяное давление. Считается, что CRP представляет собой компонент врожденной иммунной системы и является маркером хронического системного воспаления. CRP является также независимым прогностическим фактором сердечно-сосудистых состояний. Существует мнение о том, что при нормальной беременности уровень CRP как реактанта острой фазы возрастает сразу, как только снижается синтез альбумина вследствие повышения уровней IL-6 и других цитокинов в кровотоке. Важно отметить, что при преэклампсии уровни IL-1 и IL-6 повышены, что может объяснить причину повышения при преэклампсии также и уровней CRP. Эти данные согласуются с воспалительным ответом при нормальной беременности, который сильно возрастает при преэклампсии. Таким образом, проведение обследования беременных женщин в отношении уровней CRP в сыворотке в дополнение к определению уровней релаксина в сыворотке может дать дополнительную информацию о том, какова вероятность того, что у этих женщин будет развиваться преэклампсия. Использование CRP в качестве дополнительного фактора позволяет повысить чувствительность представленного в настоящем описании теста, основанного на анализе уровней Н2-релаксина.
Было установлено, что уровни CRP в сыворотке повышены у женщин с анамнезом эклампсии (например, имевших случаи припадков) в период беременности, сопровождавшейся преэклампсией). Фактически, женщины с анамнезом преэклампсии или эклампсии имеют повышенный риск развития сердечно-сосудистого заболевания после беременности по причине(ам), остающейся(имся) невыясненными. По-видимому, воспаление, дислипидемия и устойчивость к инсулину ассоциированы с повышенным риском развития преэклампсии, и CRP, в том случае, когда его уровень повышен, является индикатором воспаления и риска развития сердечно-сосудистых заболеваний (Hubel и др., Hypertension, 51, 2008, c.1499-1505).
Низкие уровни релаксина позволяют прогнозировать преэклампсию Для анализа данных, полученных в опыте на беременных женщинах, который описан в экспериментальных примерах, применяли CART (классификационное и регрессионное дерево). В качестве параметров для прогнозирования преэклампсии использовали уровни релаксина и необязательно С-реактивного белка (CRP). Как продемонстрировано на фиг.1, внутриутробный возраст плода во время беременности разделяли на три периода, а именно, с 0 по 15 неделю (первый триместр), с 15 по 25 неделю (второй триместр) и с 25 по 35 неделю (третий триместр). Важно проводить обследование беременных женщин в отношении выявления маркеров преэклампсии как можно раньше для того, чтобы иметь возможность начинать лечение с целью предупреждения полного развития заболевания. Таким образом, обследование женщин в течение первого триместра является более предпочтительным по сравнению с обследованием женщин во время второго или третьего триместра беременности. Можно обследовать женщин во время второго и/или третьего триместра беременности, если это нельзя было осуществить раньше.
CART представляет собой непараметрический метод, позволяющий получать либо классификационное, либо регрессионное дерево, в зависимости от того, является зависимая переменная категорийной или численной соответственно. Деревья получают с помощью набора правил на основе значений определенных переменных из набора данных, используемых для моделирования. Сами по себе правила выбирают на основе того, насколько хорошо расщепления, сделанные на основе значений переменных, дают возможность различать результаты, основанные на зависимых переменных. После того, как правило выбрано и узел расщеплен на два, ту же самую логику применяют к каждому «дочернему» узлу (т.е. осуществляют рекурсивную процедуру). Расщепление может прекращаться, если CART не обнаруживает дальнейшего прироста, или если ситуация удовлетворяет определенным предварительно установленным правилам остановки. Каждая ветвь дерева оканчивается концевым узлом. Каждый результат попадает в один и только один концевой узел, и каждый концевой узел определяется единственным образом набором правил.
Наличие преэклампсии, как правило, определяют на основе симптомов, таких как гипертензия и протеинурия. Некоторые беременные женщины страдают также от повышенного уровня мочевой кислоты. Таким образом, женщин, страдающих преэклампсией, подразделяют на две группы, а именно, на тех женщин, которые страдают гипертензией и протеинурией (HP), и тех женщин, которые страдают гипертензией, протеинурией и повышенным уровнем мочевой кислоты (HPU). Важно отметить, что если беременные женщины не имеют симптомов протеинурии, то, как правило, считают, что у них беременность с гипертензивным синдромом, а не беременность с синдромом преэклампсии, это же имеет место в случае наличия гипертензии и повышенного уровня мочевой кислоты (HU). Для целей представленного в настоящем описании CART-анализа в таблице 1 представлены следующие группы:
Таблица 1
нормальная беременность
HPU = гипертензия, протеинурия, мочевая кислота
HP = гипертензия, протеинурия
HU = гипертензия, мочевая кислота
преэклампсия = наличие одновременно и HPU, и HP
беременность с синдромом гипертензии = HPU, наличие одновременно и HP, и HU
На классификационном дереве, представленном на фиг.3, количество расщеплений равно единице, а количество концевых узлов равно двум. Более конкретно, в верхнем прямоугольнике указано, что в данном случае 35 женщин классифицированы как имеющие преэклампсию (штриховая линия) и 24 женщины классифицированы как имеющие нормальную беременность (сплошная линия). Из общего числа 59 женщин, участвовавших в опыте, у 14 женщин уровень Н2-релаксина составлял менее 476,7 пг/мл, а у 45 женщин уровень Н2-релаксина составлял более 476,7 пг/мл. Для того чтобы дополнительно оценить, насколько специфичен тест на основе определения уровня релаксина (релаксиновый тест), страдающих преэклампсией женщин и женщин с нормальной беременностью разделяли на две группы, в одном прямоугольнике, расположенном слева, объединены те женщины, у которых уровень релаксина был ниже 476,7 пг/мл, а еще в одном прямоугольнике, расположенном справа, объединены те женщины, у которых уровень релаксина был выше 476,7 пг/мл. Как видно из данных, представленных слева, среди тех женщин, у которых уровни релаксина были ниже 476,7 пг/мл, у 13 женщин развилась преэклампсия, в то время как только у одной женщины была нормальная беременность, что свидетельствует о том, что рассматриваемый тест является высокоспецифичным (см. пример 2, в котором анализ описан более подробно).
Был проведен отдельный опыт меньшего масштаба с использованием образцов, полученных для менее подробно охарактеризованной популяции беременных женщин, проживающих в Австралии. Во втором опыте только два образца содержали релаксин в концентрации менее 500 пг/мл, и из этих двух только один образец был получен от женщины, страдающей преэклампсией. Этот опыт отличался от первого более крупного опыта, проведенного с использованием образцов, взятых из организма беременных женщин с определенным внутриутробным возрастом плода, которые проживали в Северной Америке (например, в Питтсбурге, шт.Пенсильвания). Помимо возможных различий в образцах, использованных в двух опытах, австралийская популяция, участвовавшая в опыте, предположительно представляла собой гомогенную кавказскую популяцию, в то время как свыше 30% женщин в североамериканской популяции, участвовавшей в опыте, представляли собой афро-американок. Таким образом, в предпочтительных вариантах осуществления изобретения образцы крови получают от беременных женщин во время первого триместра беременности. В некоторых вариантах осуществления изобретения беременные женщины проживают в Северной Америке. В поднаборе этих вариантов осуществления изобретения североамериканские индивидуумы проживают в Соединенных Штатах и/или Канаде. В других вариантах осуществления изобретения изучаемые женщины имеют африканское происхождение.
Введение релаксина предупреждает развитие преэклампсии Преэклампсия представляет собой опасное состояние, которое может возникнуть в любой момент во время беременности, при родах и в послеродовом периоде, продолжающемся вплоть до шести недель, хотя наиболее часто она возникает в последнем триместре и чаще всего не ранее 20-35-й недели беременности. Преэклампсия может развиваться постепенно или возникать совершенно внезапно, в виде вспышки в течение считанных часов, несмотря на то, что признаки и симптомы не проявлялись в течение нескольких месяцев. Когда Преэклампсия присутствует в скрытой форме и ее неожиданно обнаруживают при осуществлении обычного измерения кровяного давления и/или анализа мочи, а ребенок уже почти доношен (внутриутробный возраст более 36 недель), то индуцируют роды, ребенок рождается, а за матерью устанавливают тщательное наблюдение. Если преэклампсия возникает в более ранний период беременности, то ее воздействие является еще более значительным. Например, матери может быть предписан постельный режим, медикаментозное лечение и даже госпитализация, чтобы держать под контролем ее кровяное давление. Лучше всего, чтобы ребенок как можно дольше находился во внутриутробном состоянии. К сожалению, единственным путем излечения от преэклампсии являются роды ребенка, и наилучшим вариантом для матери может оказаться родить ребенка до срока. Лечащий врач может предписывать медикаментозное лечение с применением гипотензивных средств, таких как бета-блокаторы, блокаторы кальциевых каналов, гидралазин, альфа-метилдопа, клонидин, и в редких случаях, лазикс или диуретики (водные пилюли), хотя последние, как правило, являются нежелательными. Если оказывается невозможным регулировать кровяное давление с помощью медикаментозного лечения и ухода и имеется риск для здоровья матери и/или ребенка, то матери можно вводить стероиды, способствующие достижению полного развития легких ребенка, для того, чтобы оказалось возможным преждевременно родить жизнеспособного ребенка.
В настоящем изобретении предложен способ идентификации беременной женщины, предрасположенной к преэклампсии, что позволяет предпринимать шаги для снижения вероятности того, что у нее может развиваться преэклампсия. Кроме того, в настоящем изобретении предложены способы снижения риска или предупреждения развития преэклампсии, заключающиеся в том, что беременной женщине в течение первого и/или второго триместра беременности вводят Н2-релаксин, если уровень Н2-релаксина, измеренный в образце плазмы или сыворотки, взятом в течение первого триместра ее беременности, составляет менее чем примерно 500 пг/мл. Предпочтительно Н2-релаксин вводят беременным женщинам в профилактических целях, как только обнаруживают, что уровни релаксина являются низкими (например, составляют менее 500 пг/мл). Однако часто преэклампсия не проявляется вплоть до 20-35-й недели беременности. Поэтому, если релаксин вводят на более поздних сроках беременности до проявления симптомов, это может все еще оказывать благоприятное действие с точки зрения уменьшения вероятности полного развития преэклампсии.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения релаксин представляет собой синтетический человеческий релаксин. В другом варианте осуществления изобретения релаксин представляет собой рекомбинантный человеческий релаксин. В следующем варианте осуществления изобретения в качестве релаксина применяют агонист релаксина или миметик релаксина. Если осуществляют введение релаксина, то предпочтительно он представляет собой Н2-релаксин. В других вариантах осуществления изобретения релаксин представляет собой химерный релаксин, содержащий А- или В-цепь Н2-релаксина и А- или В-цепь H1- или Н2-релаксина. Синтетические человеческие релаксины и химерные релаксины можно приобретать у фирмы CBL Biopharma (Боулдер, шт.Колорадо). В некоторых вариантах осуществления изобретения в качестве релаксина применяют агонист Н2-релаксина из числа тех, которые выпускаются фирмой Compugen (Тель-Авив, Израиль). В других менее предпочтительных вариантах осуществления изобретения релаксин представляет собой человеческий H1-релаксин или человеческий Н3-релаксин. Релаксин можно вводить пациентке в количестве, составляющем от примерно 10 до примерно 100 мкг/кг веса тела пациентки в день, после того, как обнаружен его дефицит. В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения релаксин вводят пациентке в количестве, составляющем примерно 30 мкг/кг веса тела пациентки в день, в течение всей беременности или в течение части периода беременности. Релаксин в этом случае вводят пациентке для того, чтобы поддерживать, например, концентрацию релаксина в сыворотке на уровне, составляющем примерно 10 нг/мл, в течение беременности. Фармацевтическую препаративную форму, содержащую релаксин, можно вводить подкожно (SQ) или другими путями.
Благоприятное воздействие введения релаксина беременной женщине, по-видимому, является результатом непосредственного действия релаксина в качестве специфического в отношении рецептора агента, стимулирующего как ангиогенез, так и вазодилатацию. Усиление ангиогенеза оказывает направленное воздействие на причину преэклампсии, а именно, на недостаточное поступление крови от матери к ребенку, которое, в конце концов, приводит к опасному повышению кровяного давления у матери. Кроме того, усиление вазодилатации способствует снижению кровяного давления, а также увеличению почечного кровотока в почках, что еще больше уменьшает симптомы преэклампсии. Таким образом, если беременной женщине вводят фармацевтическую композицию, содержащую активный релаксин или фармацевтически эффективный агонист релаксина, мишенью которого являются специфические рецепторы релаксина (например, рецепторы LRG7, LGR8, GPCR135, GPCR142), то это приводит к ослаблению или предупреждению преэклампсии.
«Обогащенная» человеческая популяция
Одним из преимуществ раннего обнаружения является возможность расширить группу женщин, у которых с большей вероятностью может развиться заболевание, пригодных для научных исследований и/или клинических опытов, и облегчить тем самым тестирование профилактических мероприятий. Настоящее изобретение дает возможность применять новый скрининговый процесс, который включает отбор «обогащенной» популяции пациентов для клинических опытов и/или научных исследований, проводимых с целью более глубокого изучения преэклампсии и развития заболевания и нахождения путей борьбы с указанным заболеванием. «Обогащенную» популяцию женщин можно отбирать на основе тестирования с целью выявления низких уровней релаксина, в этом случае для получения релевантных с научной и/или клинической точки зрения результатов требуется намного меньше пациентов. Можно проводить тестирование беременных женщин, находящихся на первом или втором триместре беременности, или у которых еще не проявились симптомы преэклампсии, для определения уровней релаксина в кровотоке и отбирать тех из них, у которых уровень релаксина составляет менее чем примерно 500 пг/мл, для включения в «обогащенную» популяцию пациентов. Без проведения такого важного процесса отбора может потребоваться осуществлять скрининг с участием сотен женщин для того, чтобы определить, оказывает ли новое лекарственное средство или агент воздействие на преэклампсию. Таким образом, в изобретении предложен способ скрининга новых агентов, предназначенных для лечения или предупреждения преэклампсии, путем проведения клинического опыта и/или научного исследования, заключающийся в том, что отбирают беременных женщин, для которых существует более высокая вероятность развития преэклампсии, из «обогащенной» популяции и на этих женщинах проводят тестирование эффективности новых агентов. «Обогащенная» популяция включает женщин, находящихся на первом и втором триместре беременности, или женщин, у которых еще не проявились симптомы преэклампсии, имеющих уровни релаксина в кровотоке, составляющие менее чем примерно 500 пг/мл.
Содержащие релаксин композиции и препаративные формы
Релаксин, агонисты релаксина, миметики релаксина и/или аналоги релаксина включают в состав фармацевтических препаративных форм, предназначенных для применения в способах, предлагаемых в изобретении. В качестве фармацевтического средства, предлагаемого в изобретении, можно применять любую композицию или любое соединение, которое может стимулировать биологический ответ, ассоциированный со связыванием биологически или фармацевтически активного релаксина (например, синтетического релаксина, рекомбинантного релаксина) или агониста релаксина (например, аналога релаксина или релаксин-подобного модулятора, или миметика релаксина) с рецепторами релаксина. Общие сведения, касающиеся методов приготовления препаративных форм и их введения, подробно описаны в научной литературе (см. Remington's Pharmaceutical Sciences, изд-во Maack Publishing Co, Easton Pa.). Фармацевтические препаративные формы, содержащие фармацевтически активный релаксин, можно приготавливать с помощью любого метода, известного в области изготовления фармацевтических средств. Можно приготавливать препаративные формы, содержащие фармацевтически активный релаксин или агонисты релаксина, которые применяют в способах, предлагаемых в изобретении, для введения любым общепринятым путем, включая (но не ограничиваясь только ими) подкожный (SQ), внутримышечный, внутривенный, подъязычный пути введения, местное применение, введение оральным путем и введение путем ингаляции. Служащие в качестве иллюстрации примеры представлены ниже. В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения релаксин вводят подкожно (SQ).
Если лекарственные средства вводят подкожно (SQ), то препаративные формы, содержащие фармацевтически активный релаксин или фармацевтически эффективный агонист релаксина, могут находиться в форме стерильного инъекционного препарата, такого как стерильная инъекционная водная или масляная суспензия. Например, релаксин можно разводить в ацетате натрия при рН 5,0, в котором он очень хорошо растворяется и обладает стабильностью. Пациенткам можно вводить содержащую релаксин композицию путем непрерывной инфузии в течение необходимого периода времени. Например, можно использовать инфузионные насосы для релаксина, закачивающие релаксин через канюлю в иглу, которая введена подкожно, а насосы пациентка может носить на ремне под одеждой. Релаксин можно вводить также путем осуществляемых согласно графику инъекций релаксина, при этом осуществляют мониторинг пациентки в отношении симптомов преэклампсии. Дозы для пациентки можно регулировать применительно к конкретной пациентке.
Суспензии релаксина можно приготавливать согласно известным в данной области методам с использованием пригодных для этой цели диспергирующих или смачивающих веществ и суспендирующих агентов, упомянутых выше. Стерильный инъекционный препарат может представлять собой также стерильный инъекционный раствор или суспензию в нетоксичном пригодном для парентерального введения разбавителе или растворителе. К пригодным наполнителям и растворителям, которые можно применять для этой цели, относятся вода и раствор Рингера, изотонический раствор хлорида натрия. Кроме того, в качестве растворителя или суспендирующей среды можно применять обычные стерильные нелетучие масла. Для этой цели можно использовать любое мягкое нелетучее масло, включая моно- или диглицериды. Кроме того, для приготовления инъекционных средств можно использовать жирные кислоты, такие как олеиновая кислота.
Водные суспензии, предлагаемые в изобретении, содержат релаксин в смеси с эксципиентами, пригодными для приготовления водных суспензий. Такими эксципиентами могут являться суспендирующее вещество, такое как натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы, метилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, альгинат натрия, поливинилпирролидон, трагакантовая камедь и аравийская камедь, и диспергирующие или смачивающие вещества, такие как встречающийся в естественных условиях фосфатид (например, лецитин), продукт конденсации алкиленоксида и жирной кислоты (например, стеарат полиоксиэтилена), продукт конденсации этиленоксида и алифатического спирта с длинной цепью (например, гептадекаэтиленоксиэтанол), продукт конденсации этиленоксида и частичного эфира жирной кислоты и гекситола (например, полиоксиэтиленсорбитолмоноолеат) или продукт конденсации этиленоксида и частичного эфира жирной кислоты и ангидрида гекситола (например, полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат). Водная суспензия может содержать также один или несколько консервантов, таких как этил- или н-пропил-пара-гидроксибензоат, один или несколько красителей, один или несколько корригентов и один или несколько подслащивающих веществ, таких как сахароза, аспартам или сахарин. Можно регулировать осмолярность препаративных форм.
Масляные суспензии можно приготавливать путем суспендирования релаксина в растительном масле, таком как арахисовое масло, оливковое масло, кунжутное масло или кокосовое масло, или в минеральном масле, таком как жидкий парафин. Масляные суспензии могут содержать также загуститель, такой как пчелиный воск, твердый парафин или цетиловый спирт. Для получения имеющих приятный вкус препаратов можно добавлять подслащивающие вещества. Указанные препаративные формы можно консервировать путем добавления антиоксиданта, такого как аскорбиновая кислота.
Диспергируемые порошки и гранулы, предлагаемые в изобретении, которые можно применять для приготовления водных суспензий путем добавления воды, можно приготавливать из смеси релаксина с диспергирующим, суспендирующим и/или смачивающим веществом и одним или несколькими консервантами. Примеры пригодных диспергирующих или смачивающих веществ и суспендирующих веществ приведены выше. Могут присутствовать также дополнительные эксципиенты, например подслащивающие вещества, корригенты и красители.
Фармацевтические препаративные формы, предлагаемые в изобретении, могут находиться также в виде эмульсий типа масло-в воде. Масляная фаза может представлять собой растительное масло, такое как оливковое масло или арахисовое масло, минеральное масло, такое как жидкий парафин, или их смесь. Пригодными эмульгаторами могут служить встречающиеся в естественных условиях камеди, такие как аравийская камедь и трагакантовая камедь, встречающиеся в естественных условиях фосфатиды, такие как соевый лецитин, эфиры и частичные эфиры жирных кислот и ангидридов гекситола, такие как сорбитанмоноолеат, и продукты конденсации указанных частичных эфиров и этиленоксида, такие как полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат. Эмульсия может содержать также подслащивающие вещества и корригенты. Можно приготавливать сиропы и эликсиры с использованием подслащивающих веществ, таких как глицерин, сорбитол или сахароза. Такие препаративные формы могут содержать также уменьшающее раздражение вещество, консервант, корригент или краситель.
Пути введения и режимы дозирования препаративных форм, содержащих релаксин
Препаративные формы, содержащие фармацевтически активный Н2-релаксин или фармацевтически эффективный химерный Н2-релаксин, агонист или миметик, которые применяют в способах, предлагаемых в изобретении, можно вводить любым общепринятым путем, включая (но не ограничиваясь только ими) подкожный, внутримышечный, внутривенный, подъязычный пути введения, местное применение, введение оральным путем или путем ингаляции. Путь введения может зависеть от фармакокинетических и иных характеристик лекарственных средств и состояния здоровья пациентки. Ниже приведены общие руководства.
4
Способы, предлагаемые в изобретении, позволяют снижать вероятность развития преэклампсии у беременных женщин. Количество релаксина, рассматриваемого индивидуально или в комбинации с другим веществом или лекарственным средством, которое достаточно для этой цели, обозначают как терапевтически эффективная доза. Схема приема лекарственного средства и количества, являющиеся эффективными для такого применения, т.е. «режим дозирования», может зависеть от различных факторов, включая общее состояние здоровья пациентки, физический статус пациентки, тип беременности (например, одноплодная или многоплодная беременность), возраст и т.п. При составлении режима дозирования лекарственного средства для пациентки следует принимать во внимание также путь введения. Режим дозирования должен учитывать также фармакокинетические характеристики, т.е. скорость абсорбции, биологическую доступность, метаболизм, клиренс и т.п. С учетом этих принципов релаксин можно применять для уменьшения или предупреждения развития преэклампсии у беременных женщин. В изобретении предложены также релаксин или агонист или миметик релаксина и необязательно другое лекарственное средство, предназначенные для одновременного, раздельного или последовательного введения. Например, в изобретении предложены релаксин и необязательно гипотензивное лекарственное средство, предназначенные для совместного терапевтического применения в случае необходимости. Как описано в другом примере, в изобретении предложены также релаксин и необязательно MgSO для применения в комбинированной терапии с целью профилактики припадков.
В изобретении предложено также применение релаксина для приготовления лекарственного средства, предназначенного для уменьшения или предупреждения развития преэклампсии у беременных женщин. Указанное лекарственное средство приготавливают для введения в период беременности. В изобретении предложено также применение релаксина, или аналога, или миметика релаксина в способе снижения вероятности развития преэклампсии, в котором релаксин получают с целью его введения беременным женщинам.
Известный уровень техники позволяет практикующему врачу определять режим дозирования релаксина для каждой конкретной беременной женщины. Приведенные ниже в качестве иллюстративного примера руководства по применению релаксина можно использовать для определения режима дозирования, т.е. схемы введения доз и уровней доз препаративных форм, содержащих фармацевтически активный релаксин, которые вводят при осуществлении на практике способов, предлагаемых в изобретении. В качестве общего руководства можно принять, что суточная доза фармацевтически активного человеческого Н1-, Н2- и/или Н3-релаксина (например, синтетического, рекомбинантного, аналога, агониста, миметика и т.д.), как правило, составляет от примерно 10 до примерно 100 мкг/кг веса тела пациентки в день. В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения доза релаксина составляет 30 мкг/кг на в течение всего периода беременности. В другом варианте осуществления изобретения указанные дозы обеспечивают, например, концентрации релаксина в сыворотке, составляющие примерно 10 нг/мл. В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения фармацевтически эффективный релаксин или его агонист вводят в дозе, составляющей примерно 30 мкг/кг/день в течение всей беременности или в течение части периода беременности. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения фармацевтически эффективный релаксин или его агонист вводят в дозе, составляющей от примерно 10 до примерно 100 мкг/кг/день в течение всей беременности или в течение части периода беременности. В другом варианте осуществления изобретения введение релаксина продолжают таким образом, чтобы поддерживать концентрацию релаксина в сыворотке на уровне, составляющем от примерно 0,5 до примерно 300 нг/мл, более предпочтительно от примерно 0,5 до примерно 100 нг/мл и наиболее предпочтительно от примерно 0,5 до примерно 10 нг/мл. Наиболее предпочтительно введение релаксина продолжают таким образом, чтобы в течение всего периода беременности поддерживать концентрацию релаксина в сыворотке на уровне 10 нг/мл или выше. Такие концентрации релаксина дают возможность снижать вероятность развития у матери преэклампсии и обусловленных ею симптомов, таких как гипертензия, высокое кровяное давление, протеинурия, почечная недостаточность, и смертельного исхода. Кроме того, такие концентрации релаксина дают возможность снижать вероятность рождения младенцев с низким весом и ассоциированных с этим рисков, а также смерти младенцев, или предупреждения таких случаев. В зависимости от индивидуума введение релаксина продолжают в течение определенного периода времени или так долго, как это требуется для достижения стабильного состояния у беременной матери и у ребенка. Например, релаксин можно вводить путем непрерывной инфузии вплоть до окончания периода беременности. Это можно обеспечивать с помощью инфузионного насоса или других средств. В альтернативном варианте релаксин можно вводить в течение первого и/или второго триместра только в случае необходимости.
Специфические в отношение релаксина и CRP-специфические антитела
2
В данном разделе описаны способы получения антител, обладающих способностью специфически распознавать эпитопы релаксина и/или CRP. Такими антителами могут служить (но не ограничиваясь только ими) поликлональные антитела, моноклональные антитела (МАт), человеческие, гуманизированные или химерные антитела, одноцепочечные антитела, Fab-фрагменты, F(ab')-фрагменты, фрагменты, полученные с использованием экспрессионной библиотеки Fab-фрагментов, антиидиотипические (анти-Id) антитела и эпитопсвязывающие фрагменты любого из указанных выше антител. Для производства антител к релаксину и/или CRP можно осуществлять иммунизацию различных животных-хозяев путем инъекции белка релаксина, или белка CRP, или фрагмента любого из них. Такими животными-хозяевами могут служить (но не ограничиваясь только ими) кролики, мыши и крысы. Для повышения иммунологического ответа можно применять в зависимости от видов хозяев различные адъюванты, включая (но не ограничиваясь только ими) адъювант Фрейнда (полный и неполный), минеральные гели, такие как гидроксид алюминия, поверхностно-активные вещества, такие как лизолецитин, плюроновые полиолы, полианионы, пептиды, масляные эмульсии, гемоцианин лимфы улитки, динитрофенол и потенциально полезные для человека адъюванты, такие как BCG (бацилла Кальметта-Герена) и Corynebacterium parvum.
Поликлональные антитела представляют собой гетерогенные популяции молекул антител, полученные из сыворотки животных, иммунизированных антигеном, таким как релаксин или CRP, или обладающим антигенной функциональностью производным релаксина или CRP. Для производства поликлональных антител можно осуществлять иммунизацию животных-хозяев из числа описанных выше путем инъекции релаксина или CRP. Мониторинг зависимости титра антител в иммунизированном животном от времени можно осуществлять с помощью стандартных методов, таких как твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), с использованием иммобилизованного полипептида. При необходимости молекулы антител можно выделять из организма животного (например, из крови) и подвергать дополнительной очистке с помощью хорошо известных методов, таких как хроматография с использованием белка А, для выделения IgG-фракции. Моноклональные антитела, которые представляют собой гомогенные популяции антител к конкретному антигену, такому как релаксин или CRP, можно получать любым из методов, обеспечивающих продуцирование молекул антител в непрерывных клеточных культурах, которые хорошо известны в данной области. Такие антитела могут относиться к любому классу иммуноглобулинов, включая IgG, IgM, IgE, IgA, IgD и любой их подкласс. Гибридому, продуцирующую МАт, предлагаемые в настоящем изобретении, можно культивировать in vitro или in vivo.
В качестве альтернативы методу получения, основанному на применении секретирующих моноклональные антитела гибридом, моноклональное антитело к релаксину и/или CRP можно идентифицировать и выделять путем скрининга рекомбинантной комбинаторной библиотеки иммуноглобулинов (например, фаговой дисплейной библиотеки антител) с использованием релаксина, CRP или их производных. Наборы для создания и скрининга фаговых дисплейных библиотек поступают в продажу. Кроме того, под объем изобретения подпадают рекомбинантные антитела, такие как химерные и гуманизированные моноклональные антитела, содержащие как человеческие фрагменты, так фрагменты антител из видов кроме человека, которые можно создавать стандартными методами рекомбинантной ДНК. Химерное антитело представляет собой молекулу, в которой присутствуют различные фрагменты, выведенные из различных видов животных, например молекулу, содержащую вариабельную область, выведенную из мышиного МАт, и константную область человеческого иммуноглобулина (см., например, US №№4816567 и 4816397). Гуманизированные антитела представляют собой молекулы антител из видов кроме человека, в которых присутствуют один или несколько гипервариабельных участков (CDR), выведенных из видов кроме человека, и каркасный участок из молекулы человеческого иммуноглобулина (см., например, US №5585089). Такие химерные и гуманизированные моноклональные антитела можно получать методами рекомбинантной ДНК, известными в данной области.
Представленные в настоящем описании антитела можно использовать в любом анализе, с помощью которого осуществляют тестирование крови беременных женщин для измерения уровней релаксина с целью определения того, имеют ли женщины более высокий риск развития преэклампсии, чем соответствующие здоровые, используемые в качестве контроля женщины. Если уровни релаксина в крови становятся ниже чем примерно 500 пг/мл, то женщины имеют более высокий риск развития преэклампсии и нуждаются в тщательном наблюдении и/или лечении релаксином в течение всего периода или части периода беременности. Кровь беременной женщины необязательно можно подвергать дополнительному тестированию для определения уровней CRP с целью осуществления более чувствительного анализа. Если уровни CRP в крови составляют менее 1,5 мкг/мл или выше 13,5 мкг/мл, то это свидетельствует о еще большей вероятности того, что у женщин может развиться преэклампсия. Для этой цели можно применять любой метод анализа, позволяющий точно измерять уровни релаксина и/или CRP в крови, включая ELISA, биоанализы, иммунноанализы и другие виды анализов. Можно использовать также поступающие в продажу наборы.
Эксперименты
В настоящем описании использованы следующие сокращения: мкг (микрограмм); мл (миллилитр); пг (пикограмм); BMI (индекс массы тела); CART (классификационное и регрессионное дерево); Cl (доверительный интервал); CREAT (креатинин); CRP (С-реактивный белок); ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ); HP (гипертензия, протеинурия); HPU (гипертензия, протеинурия, мочевая кислота); HU (гипертензия, мочевая кислота); Rlx или RLX (релаксин).
Представленные ниже конкретные примеры предназначены для иллюстрации изобретения и их не следует рассматривать как ограничивающие объем формулы изобретения.
Пример 1
Опыт с участием беременных женщин, страдающих преэклампсией
Релаксин, пептидный гормон, который высвобождается в corpus luteum яичника, является эффективным вазодилататором при беременности. Концентрации Н2-релаксина в сыворотке возрастают в течение первого триместра и достигают пика в начале второго триместра, что совпадает по времени с выраженной почечной и системной вазодилатацией в материнском организме. Если, в отличие от этого, имеет место неадекватная вазодилататорная адаптация и повышенное системное сосудистое сопротивление, то они являются признаками преэклампсии. В рассматриваемом примере описаны результаты измерения уровней релаксина в сыворотке в период беременности и установление ассоциации между пониженными уровнями релаксина в сыворотке в течение первого триместра и повышенным риском развития преэклампсии.
Проводили исследование методом вложенной выборки с участием 62 женщин со сроком беременности менее 13 недель. Среди 62 женщин, принимавших участие в опыте, у 37 женщин развилась преэклампсия, что было впервые определено после 20 недель беременности по возникновению гипертензии и протеинурии. Остальные женщины оставались нормотензивными и у них беременность протекала без осложнений. Уровни Н2-релаксина измеряли с помощью ELISA (хотя для этой цели можно применять также и другие виды анализа, такие как биоанализ, ОТ-ПЦР и т.д.). Для анализа данных применяли описательную статистику, включая логарифмическую регрессию.
Более конкретно, опыт проводили следующим образом: измеряли концентрацию человеческого релаксина 2 в сыворотке с помощью иммуноанализа, проводимого Сервисной службой по аналитическому тестированию фирмы R&D (Systems Analytical Testing Service) (Миннеаполис, шт.Миннесота). Специфическое в отношении Н2-релаксина моноклональное антитело, которое применяли в этом иммунноанализе, представляло собой мышиный IgGl, продуцируемый гибридомой 3F2.F2. Гибридому 3F2.F2 была создана на фирме BAS Medical, в настоящее время Corthera Inc. (Сан-Матео, шт.Калифорния) и депонирована в соответствии с Будапештским Договором в Американской коллекции типовых культур (АТСС, Манассас, шт.Виржиния) в виде патентного депозита под регистрационным номером РТА-8423. ELISA для Н2-релаксина, в котором применяли продуцированное 3F2.F2 антитело, хорошо валидирован. Не было выявлено значительной перекрестной реактивности или интерференции с рекомбинантным человеческим IGF-1, IGF-II, инсулином (аминокислоты 25-100), инсулинподобным белком 3, релаксином 1 (H1) и релаксином 3 (Н3). Кроме того, не было выявлено значительной перекрестной реактивности или интерференции с рекомбинантным релаксином-2 собак, свиней или грызунов (мышиным и крысиным релаксином).
Различие между концентрациями релаксина в сыворотке у женщин, страдавших преэклампсией, и у контрольных женщин не было статистически значимым (медианные значения и межквартальные диапазоны, 670,4 [456,9-1117,2] по сравнению с 802,3 [570,8-966,4] пг/мл, р=0,47). Однако у женщин, у которых концентрации релаксина были меньше 477 пг/мл, т.е. меньше предельного значения, приблизительно соответствующего нижнему квартилю, соотношение шансов (OR) в пользу развития преэклампсии составляло 6,2 (95% CI 1,3-30,7, р=0,025). После введения коррекции на внутриутробный возраст плода для набора образцов индекс массы тела (BMI), расу и статус курения оказалось, что вероятность развития преэклампсии у этих женщин была выше в 7,4 раза (95% CI 1,4-38,9, р=0,02), этот результат оказался неожиданно высоким. Такая выраженная ассоциация имела место в подгруппе женщин, у которых впервые были обнаружены гипертензия, протеинурия и гиперурикемия, более гомогенный поднабор преэкламптических симптомов с более высоким коэффициентом неблагоприятных исходов (скорректированное OR 6,9, 95% CI 1,2-40, p=0,03).
Результаты данного опыта свидетельствуют о том, что низкая концентрация релаксина в сыворотке представляет собой независимый фактор риска развития преэклампсии. Неадекватная вазодилататорная адаптация, являющаяся следствием дефицита релаксина на ранней стадии беременности, может вносить дополнительный вклад в патогенез преэклампсии.
Пример 2
Статистический анализ результатов прогноза преэклампсии
Для анализа данных, полученных для 69 беременных женщин, характеристики которых представлены в таблице 2, использовали CART (классификационное и регрессионное дерево). Этот расширенный анализ был основан на данных, полученных в первоначальном опыте на женщинах, указанных в примере 1, а также на данных, полученных для нескольких других женщин. Параметрами, которые использовали для прогноза преэклампсии, служили прежде всего уровни Н2-релаксина, и, кроме того, также и уровни С-реактивного белка (CRP). Как представлено на фиг.1, внутриутробный возраст плода в течение беременности был разделен на три периода, а именно, с 0 по 15 неделю (первый триместр), с 15 по 25 неделю (второй триместр) и с 25 по 35 неделю (третий триместр). На фиг.1 представлены зависимости концентрации релаксина в сыворотке у страдающих преэклампсией женщин (HPU- и HP-группы) от внутриутробного возраста плода. Линиями соединены данные, полученные при анализе образцов, взятых у одной и той же женщины. Треугольниками обозначены образцы, взятые у беременных женщин, у которых позднее развилась преэклампсия и у которых уровни эндогенного Н2-релаксина составляли менее 500 пг/мл в первые 15 недель. Квадратами обозначены образцы, взятые у беременных женщин, у которых позднее развилась преэклампсия, но у которых уровни эндогенного Н2-релаксина составляли примерно 500 пг/мл. Ромбами обозначены образцы, взятые у беременных женщин, у которых не развилась преэклампсия. Следует отметить, что у небольшого количества указанных женщин концентрации Н2-релаксина в первые 15 недель составляли меньше 500 пг/мл.
Таблица 2
Характеристики беременных женщин
Категория
Всего
Кавказская раса
Афро-американки
HP
15
11
4
HPU
19
12
7
ни
10
6
4
нормальная беременность
25
16
9
Общий итог
69
45
24
При проведении CART-анализа данные, полученные для всех образцов, взятых у женщин в течение первых 15 недель, были усреднены. Это было обусловлено тем, что для каждой женщины было собрано различное количество образцов, и тем, что они были получены в различные моменты времени в течение указанного периода беременности. Как представлено на классификационном дереве, приведенном фиг.3, количество расщеплений было равно единице, а количество конечных узлов было равно двум. Более конкретно, в верхнем прямоугольнике указано, что в данном случае у 35 женщин, страдающих преэклампсией, уровни Н2-релаксина составляли менее 476,7 пг/мл (столбик, очерченный штриховой линией) и у 24 женщин, имеющих нормальную беременность, уровни эндогенного Н2-релаксина составляли более 476,7 пг/мл (столбик, очерченный сплошной линией). Для того чтобы дополнительно оценить специфичность релаксинового теста, страдающих преэклампсией женщин и женщин с нормальной беременностью разделяли на две группы, в прямоугольнике 2, расположенном слева, объединены данные для женщин, у которых уровень релаксина в сыворотке был ниже 476,7 пг/мл, а в прямоугольнике 3, расположенном справа, объединены данные для женщин, у которых уровень релаксина в сыворотке был выше 476,7 пг/мл. Как видно из данных, представленных в расположенном слева прямоугольнике 2, среди тех женщин, у которых уровни релаксина Н2 были ниже 476,7 пг/мл, у 13 женщин развилась преэклампсия, в то время как только у одной женщины была нормальная беременность, что свидетельствует о том, что рассматриваемый тест является высокоспецифичным. Как видно из данных, представленных в расположенном справа прямоугольнике 3, среди тех женщин, у которых уровни Н2-релаксина превышали 476,7 пг/мл, у 23 женщин была нормальная беременность, а у 22 женщин развилась преэклампсия. Результаты, представленные в расположенном справа прямоугольнике 3, свидетельствуют о целесообразности включения в анализ второго параметра для повышения чувствительности теста.
На фиг.4 представлено то же самое классификационное дерево, что и на фиг.3, но имеющее дополнительные расщепления, сделанные на основе уровней С-реактивного белка (CRP). Группу женщин, имевших уровни Н2-релаксина, превышающие 476,7, расщепляли на тех, у которых уровни CRP составляли менее 13,481 мкг/мл или были равны этому значению, и тех, у которых уровни CRP превышали 13,481 мкг/мл. Важно отметить, что для женщин, у которых уровни CRP превышали 13,81 мкг/мл, имелась очень высокая вероятность развития преэклампсии, что продемонстрировано данными, представленными в прямоугольнике 5, где указано, что у девяти беременных женщин развилась преэклампсия, а одна беременная женщина имела нормальную беременность. Группа, указанная в прямоугольнике 4, была дополнительно расщеплена на тех, у которых уровни CRP были менее 1,4681 мкг/мл или были равны этому значению, и тех, у которых уровни CRP превышали 1,4681 мкг/мл. Как видно из данных, указанных в прямоугольнике 6, у семи женщин развилась преэклампсия, в то время как только одна женщина имела нормальную беременность, что свидетельствует о том, что рассматриваемый тест является более высокоспецифичным. Благодаря учету результатов измерений уровней CRP чувствительность теста возросла до 83 процентов.
На фиг.5 представлено классификационное дерево для женщин с гипертензивной беременностью (HP-, HPU- и HU-пациентки, см. также таблицы 1 и 2). Женщин расщепляли на четыре группы на основе концентраций Н2-релаксина и CRP в сыворотке, измеренных на ранней стадии беременности. Благодаря использованию данных указанных двух измерений был достигнут очень высокий уровень чувствительности. Так, благодаря использованию результатов измерений уровней как релаксина, так и CRP специфичность составила 63%, а чувствительность составила 96%.
На фиг.6 представлено другое классификационное дерево для женщин с гипертензивной беременностью (а именно, для 48 гипертензивных женщин, включая HP-, HPU- и HU-женщин и 25 женщин с нормальной беременностью). Группу женщин расщепляли на основе уровней Н2-релаксина и CRP в сыворотке, как и на фиг.5, а также на основе уровней креатинина, с целью дальнейшего уточнения прогноза. С использованием указанных трех аналитических параметров был разработан обладающий очень большой чувствительностью и специфичностью алгоритм прогноза того, что при беременности в дальнейшем может развиться гипертензия. При использовании данных об уровнях релаксина, CRP и креатинина (CREAT) специфичность составляла 92%, а чувствительность составляла 87%. Поскольку указанные женщины не страдали преэклампсией, а только рассматривались в качестве кандидатов, у которых может иметь место гипертензивная беременность, то для оценки вероятности возникновения гипертензии в дополнение к уровням Н2-релаксина и CRP использовали уровни CREAT.
Пример 3
Прогноз преэклампсии у беременных женщин
Прогноз осуществляют следующим образом. На ранней стадии беременности берут образцы сыворотки у беременной женщины. Определяют концентрацию Н2-релаксина и концентрацию CRP в сыворотке с помощью ELISA. С использованием алгоритма, проиллюстрированного на фиг.3, оценивают вероятность развития преэклампсии. Например, если уровень Н2-релаксина в сыворотке составляет 300 пг/мл, то пациента подвергают лечению с целью предупреждения развития преэклампсии, которое в противном случае почти наверняка будет иметь место. Если уровень релаксина в сыворотке составляет 600 пг/мл, то анализируют также уровень CRP. Если уровень CRP превышает 1,5 мкг/мл или составляет менее 13,5 мкг/мл, то беременность рассматривают как нормальную беременность. Однако если измеренный у беременной женщины уровень CRP выпадает из указанного диапазона, то она имеет повышенный риск развития преэклампсии.
Специалистам в данной области должно быть очевидно, что могут быть сделаны различные модификации и варианты настоящего изобретения без отклонения от объема и сущности изобретения. Хотя изобретение описано со ссылкой на конкретные предпочтительные варианты осуществления, следует понимать, что заявленное изобретение не ограничено только указанными конкретными вариантами его осуществления. Фактически подразумевается, что различные модификации описанных путей осуществления изобретения, очевидные специалистам в данной области, подпадают под объем формулы изобретения.