Кинетика восстановления медиаторов электронного транспорта клетками дрожжей debaryamyces hansenii и бактерий Gluconobacter oxydans в присутствии глюкозы

УДК 543.55:579.222.2

КИНЕТИКА ВОССТАНОВЛЕНИЯ МЕДИАТОРОВ ЭЛЕКТРОННОГО ТРАНСПОРТА КЛЕТКАМИ ДРОЖЖЕЙ DEBARYAMYCES HANSENII И БАКТЕРИЙ GLUCONOBACTER OXYDANS В ПРИСУТСТВИИ ГЛЮКОЗЫ

А.С. Зайцева, А.Д. Туровская, А.Р. Гришаева, Е.И. Шишкарева,

В. А. Арляпов

Спекрофотометрическим методом были найдены кинетические параметры (константа скорости и порядок реакции) восстановления медиаторов клетками дрожжей Debaryamyces hansenii и бактерий Gluconobacter oxydans в присутствии избытка окисляемого субстрата - глюкозы. Установлено, что восстановление медиаторов при концентрации ниже константы Михаэлиса является реакцией первого порядка и подчиняется механизму «пинг-понг». С учетом полученных констант скорости восстановления выявлен наиболее перспективный медиатор для дрожжей D. hansenii -нейтральный красный, и для бактерий G. oxydans - 2,6-дихлорфенолиндофенол. Константы скорости восстановления медиаторов составили 0,018±0,003 и 0,27±0,03 дм3/(г хс) соответственно. С помощью кислородного электрода было установлено, что восстановление естественного акцептора электронов - кислорода является реакцией нулевого порядка. По относительным скоростям восстановления акцепторов электрона показано, что медиатор успешно конкурирует с кислородом, что позволяет использовать системы «клетки-медиатор» в биоэлектрокатализе без необходимости деаэрации.

Ключевые слова: медиаторный биосенсор, ферментативная кинетика, бактерии Gluconobacter oxydans, дрожжи Debaryamyces hansenii.

Введение

Медиаторный перенос широко используется в биоэлектрохимии для разработки биосенсоров [1-3] и биотопливных элементов [4, 5]. Преимуществом использования медиаторных сенсоров является то, что результаты измерений не зависят от парциального давления кислорода в среде, а так же то, что они нечувствительны к изменениям рН среды. Использование медиаторов электронного транспорта в анодном отсеке биотопливного элемента позволяет сократить эксплуатационные затраты, так как медиатор успешно конкурирует с естественным акцептором электронов - кислородом, и необходимость в деаэрации отсутствует.

Таким образом, кинетические исследования взаимодействия клеток и медиаторов более чем актуально. Эффективность получения аналитического сигнала в биосенсорах и эффективность преобразования химической энергии субстрата в электрическую в биотопливных элементах зависит от скорости восстановления медиатора клетками, которая существенно различается для разных типов микроорганизмов и медиаторов. В связи с этим, целью данной работы является определение

констант скорости взаимодействия эукариот D. hansenii и бактерий G. oxydans с медиаторами электронного транспорта.

В качестве медиаторов были использованы следующие соединения: тионин, метиленовый синий, нейтральный красный и 2,6-дихлорфенолиндофенол. Их использование обуславливается тем, что они нетоксичны и широко используются в качестве переносчиков электронов от активного центра ферментов клеток к поверхности электрода.

В качестве модельных микроорганизмов были использованы бактерии G. oxydans и дрожжи D. hansenii. Клетки дрожжей D. hansenii были использованы в качестве микроорганизмов, так как характеризуются широким спектром окисляемых субстратов и стабильностью ферментативных систем в стрессовых условиях, что делает данные микроорганизмы перспективными при разработки сенсоров для мониторинга параметров окружающей среды [6]. Бактерии G. oxydans обладают уникальной организацией метаболической системы, характеризующейся поверхностной локализацией ряда основных окислительных ферментов и высокой оперативностью электрон-транспортной цепи, что обеспечивает быстрый ответ биосенсора [7]. Бактерии G. oxydans широко используются для создания биосенсоров и биотопливных элементов. Установление констант скорости взаимодействия медиаторов с клетками выбранных микроорганизмов позволит целенаправленно выбирать медиатор электронного транспорта при разработке биосенсоров и биотопливных элементов.

Материалы и методы

Штаммы микроорганизмов. В работе использовали дрожжи Debaryamyces hansenii ВКМ Y-2482 и бактерии Gluconobacter oxydans ВКМ B-1280, полученные из Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ РАН г. Пущино.

Культивирование дрожжевых клеток D. hansenii. Клетки штамма Debaryomyces hansenii BKM Y-2482 выращивали на богатой минеральной среде (жидкая глюкозо-пептонная питательная среда). Применяли следующий состав жидкой среды: глюкоза (Sigma, США) - 10 г/дм , пептон (Sigma, США) - 5 г/дм , дрожжевой экстракт (Sigma, США) - 0,5 г/дм3. Среду для выращивания клеток стерилизовали автоклавированием при давлении в 1 атм в течение 45 мин. Клетки выращивали аэробно 18-20 часов в качалочных колбах объемом 750 см при температуре 29 °С. Затем полученную биомассу центрифугировали при комнатной температуре 10 мин (8000 об/мин). Полученный центрифугат промывали 20 мМ фосфатным буфером, рН 6,8. Осевшие клетки переносили в свежие порции буфера, распределяли по порциям и осаждали на центрифуге «Eppendorf» 5 мин при 8000 об/мин. Промытую биомассу взвешивали и хранили в микропробирках при температуре -15 °С. Вес всех порций биомассы

регистрировали. Для каждой серии опытов использовали новые клетки, размороженные в течение 1 часа при комнатной температуре, а затем разбавленные 20 мМ натрий-фосфатным буфером рН 6,8.

Культивирование бактериальных клеток G. oxydans. Питательную среду для выращивания клеток стерилизовали автоклавированием при давлении 1,1 атм в течение 30 мин. Культивирование бактерий проводили на питательной среде следующего состава: D-сорбит (Sigma, США) - 200 г/дм ; дрожжевой экстракт (Sigma,

33

США) - 20 г/дм ; дистиллированная вода - 100 см , pH среды - 5,2-5,5, при температуре 28 °С, в течение 18-20 часов. После культивирования клетки собирали центрифугированием при 12 000 об/мин в течение 10 мин и отмывали двукратно 20 мМ натрий-фосфатным буфером с рН 6,6. Осевшие клетки переносили в свежие порции буфера, распределяли по порциям и осаждали на центрифуге «Eppendorf» 5 мин при 12000 об/мин. Полученные осадки в пробирках «Эппендорф» на 1,5 мл подсушивали на воздухе в течение часа, и замораживали для длительного хранения при температуре -15 °С. Вес всех порций биомассы регистрировали. Для каждой серии опытов использовали новые клетки, размороженные в течение 1 часа при комнатной температуре, а затем разбавленные 20 мМ натрий-фосфатным буфером рН 6,0.

Спектрофотометрическое измерение скорости восстановления медиаторов клетками. Скорость восстановления медиатора измеряли спектрофотометрическим методом с помощью спектрофотометра СФ-104 (ООО «Аквилон», Москва). В измерительную кювету и в кювету сравнения последовательно вводили 3 мл фосфатного буферного раствора (рН=6,0 и рН=6,8 для бактерий G. oxydans и дрожжей D. hansenii соответственно) и 30 мкл смеси биокатализаторов (1:1 мг сырого веса/мкл) после чего растворы тщательно перемешивались. Далее в кювету сравнения вводили окисляемый субстрат - глюкозу (200 мкл 1 М раствор) и снимали зависимость оптической плотности от времени при длине волны, соответствующей максимуму поглощения окисленной формы медиатора в соответствии с табл. 1.

Таблица 1

Длина волны и коэффициент экстинкции в максимуме спектра

поглощения водных растворов медиаторов

Медиатор 3 s, дм /(моль-см) ^Max, нм Литература

2,6-дихлорфенолиндофенол 22-104 608 [8]

Метиленовый синий 3,76-104 660 [9]

Тионин 5,65-104 598 [9]

Нейтральный красный 2,75-104 530 [10]

По изменению оптической плотности была определена скорость восстановления медиатора клетками во времени, как тангенс угла наклона О^а) с учётом коэффициента экстинкции.

Амперометрическое измерение скорости восстановления кислорода клетками. В измерительную кювету с 5 мл буферного раствора (рН=6,0 и рН=6,8 для дрожжей и бактерий) добавляли 30 мкл суспензии клеток (конечная концентрация дрожжей в кювете составила 4,2

3 3

г/дм , а бактерий 2,5 г/дм ). Затем измеряли изменение концентрации кислорода в растворе с помощью БПК-термооксиметра «Эксперт-001» (ООО «Эконикс-Эксперт», Россия) в кинетическом режиме при введении 30 мкл 1М глюкозы при постоянном перемешивании раствора магнитной мешалкой (400 об/мин).

Результаты и их обсуждения

Процесс взаимодействия медиатора с дрожжевыми клетками можно описать следующим образом: субстрат проникает через наружную мембрану клетки и взаимодействует с ферментами клеток, в результате фермент восстанавливается и, в свою очередь, отдает электроны молекуле медиатора непосредственно или через определенный сайт дыхательной цепи. В данном случае можно говорить о двухсубстратной реакции, которая протекает по механизму «пинг-понг», когда последовательные стадии взаимодействия субстратов и с активным центром фермента разделены необратимым химическим превращением, что можно описать схемой 1-2.

V к2

8 + Еок Е8 -^ Р + Ев

к-1

кз ^ k4 Мок + Ев ^^ ЕМ -^ Мв + Еок

к-з

, (2) где S и P - субстрат и продукт; Мок и Мв - окисленная и восстановленная форма электронного акцептора;

Еок и Ев - фермент клетки в окисленной и восстановленной форме, соответственно;

k1, k-1, k2, k3, k-3 и k представляют константы скоростей соответствующих стадий реакции.

Общее уравнение скорости двухсубстратной ферментативной реакции, протекающей по механизму «пинг-понг» можно записать в виде схемы з.

у _ _kkat [E]0__

1 + Ks/ + Km/ + /[S ] + /[M ],

где [S] и [М] - концентрация субстрата и медиатора соответственно; [E] - концентрация ферментного комплекса in vivo; ккат - каталитическая константа реакции;

К и Км - константы Михаэлиса для субстрата и медиатора, соответственно.

Последние три константы связаны с константами скорости схемы 1,2 следующими соотношениями.

,

_ к: кц-кз

к.

. (6) При условии избытка субстрата уравнение можно упростить и получить уравнения типа Михаэлиса-Ментен для медиатора:

к [Е ] К

V = —каГ / (при-^ << 1 - избыток субстрата).

1 + Км/ [5 ]

1 + /[М ]

медиатора данное уравнение

При низкой концентрации преобразуется в линейный вид:

ка, [Е ]0[М ] кк 3 к 4

V = к' ' = ^ [ Е]о[М ] = [Е ]о[М ] = ках [Е ]0[М ]

[М ] +Км КМ к _з+к 4 .

В результате чего можно найти константу скорости взаимодействия медиатора с биокатализатором к0х. Чем выше данная константа, тем быстрее медиатор забирает электроны от активного центра клеток. Исходя из уравнения, кинетика восстановления медиатора соответствует реакции первого порядка, что наблюдалось в большинстве систем «субстрат-клетки-медиатор» [11].

Для определения констант скорости взаимодействия медиатора с биокатализатором были получены зависимости скорости восстановления медиаторов клетками в избытке окисляемого субстрата. На рис. 1 представлены зависимости скорости восстановления медиатора дрожжами В. ИатепИ и бактериями О. охуйат от концентрации медиаторов.

Полученные зависимости аппроксимировали уравнением Михаэлиса-Ментен, основные параметры которого приведены в табл. 2.

Из гиперболической зависимости был выделен линейный участок градуировочной кривой с тангенсом угла наклона к0хх [Е]. Для нахождения константы к0х, полученное произведение необходимо разделить на концентрацию клеток. В табл. з представлены константы скорости, полученные в данной работе, а также константы скорости взаимодействия медиаторов в других системах.

Я ё 0,015-

5 10 15 20 25

Концентрация метиленого синего,мкмоль/л

0.45

§ 0.40 -

I 3

5 ^ 0.35

о

а §

О

0.30 -

«Г 0.25 -| а

Й 0.20 к

ч

I 0.15

0.10

Концентрация метиленового синего, мкмоль/дм3

0

30

а б

Рис 1. Зависимости скорости восстановления медиатора метиленового синего от концентрации медиатора клетками: а - дрожжей О. Натвш

Таблица 2

Параметры гипербоидальной зависимости восстановления _медиаторов клетками__

Медиатор/микроорганизмы Константа Михаэлиса медиатора Км, мкмоль/дм3 Максимальная скорость ферментативной Коэффициент корреляции

реакции Утах, 3 мкмоль/

Тионин/ В. Натеши 5,08±0,03 0,0558± 0,0009 0,9825

Метиленовый синий/ В. Натеши 7,07±0,02 0,0457±0,0004 0,9696

Нейтральный красный/ В. Наш8еши 16,9±0,6 0,17±0,02 0,9840

2,6-

Дихлорфенолиндофенол/ В. Наш8еши 0,43±0,08 0,0051±0,0002 0,9719

Тионин/ О. охуйашъ 2,1±0,2 0.057±0.003 0,9249

Метиленовый синий/ О. 7,1±0,3 0,449±0,008 0,9961

охуйаш8

Нейтральный красный/ О. охуйаш8 2,1±0,2 0,33±0,03 0,9677

2,6-

Дихлорфенолиндофенол/ О. охуйаш8 0,51±0,02 0,76±0,03 0,9795

Таблица 3

Константы скорости восстановления медиаторов бактериями

О. вхуйат, дрожжами Б. Натвни и ферментативными системами

Биоматериал/ медиатор/ субстрат Константа, з дм /(гхс) Ссылка

Дрожжи В. Натепи/ тионин/ глюкоза (0,05 мМ) 0,014±0,004 Данная работа

Дрожжи В. Натепи/ метиленовый синий/ глюкоза (0,05мМ) 0,007±0,001 То же

Дрожжи В. Натепи/ нейтральный красный/ глюкоза(0,05мМ) 0,018±0,003 То же

Дрожжи В. Натепи/ 2,6-дихлорфенолиндофенол/ глюкоза (0,05мМ) 0,008±0,002 То же

Бактерии О. охуйат/ метиленовый синий/ глюкоза (0,1 М) 0,017±0,003 То же

Бактерии О. охуйат/ нейтральный красный/ глюкоза (0,1 М) 0,18±0,02 То же

Бактерии О. охуйат/ тионин/ глюкоза (0,1М) 0,059±0,006 То же

Бактерии О. охуйат/ 2,6-дихлорфенолиндофенол/ глюкоза (0,1 М) 0,27±0,03 То же

Глюкозооксидаза/ тионин/ глюкоза (0,1М) 0,32±0,03 [12]

Глюкозооксидаза/ галлоциан/ глюкоза(0,1М) 0,0008±0,0002 [12]

Пероксидаза хрена/ ферроцен/ перикись (0,24 мМ) 0,59±0,09 [13]

Пероксидаза хрена/ этилферроцен/ перикись (0,24 мМ) 0,45±0,02 [13]

Из табл. з следует, что скорость восстановления медиаторов в системе «субстрат-медиатор-клетки» сопоставима со скоростью восстановления медиаторов в системе «субстрат-медиатор-фермент». Наиболее перспективным медиатором для дрожжей В. НатеппН является нейтральный красный, а для бактерий О. охуйат - 2,6-дихлорфенолиндофенол, так как в этих системах константа скорости взаимодействия клеток с медиатором выше.

В медиаторном биоэлектрокатализе ключевым является вопрос, конкурирует ли медиатор с естественным акцептором электронов кислородом. Для ответа на данный вопрос находили относительные

з

скорости восстановления 50 мкмоль/дм медиаторов в отсутствии кислорода и относительную скорость восстановления кислорода в отсутствие медиатора [11], т.е. сколько мкмоль медиатора или кислорода в единицу времени восстанавливает 1 г биоматериала. В нашем

исследовании также были найдены начальные скорости восстановления 50 мкмоль/дм3 медиаторов используемыми клетками микроорганизмов, полученные результаты приведены в табл. 4.

Таблица 4

Начальная скорость восстановления 50 мкмоль/дм медиаторов

различными микроорганизмами, мкмольхг'^с1

Микроорганизмы Медиатор Скорость, мкмольхг"1 хс"1 Ссылка

D. hansenii Тионин 0,19 Данная работа

D. hansenii Метиленовый синий 0,15 То же

D. hansenii Нейтральный красный 0,57 То же

D. hansenii 2,6- Дихлорфенолиндофенол 0,05 То же

G. oxydans Тионин 0,03 То же

G. oxydans Метиленовый синий 0,2 То же

G.oxydans Нейтральный красный 0,17 То же

G.oxydans 2,6- Дихлорфенолиндофенол 0,38 То же

Azotobacter chroococcum Тионин 28,7 [11]

Bacillus subtilis Метиленовый синий 1,91 [1Ц

Bacillus subtilis Тионин 18,0 [11]

Proteus vulgaris Бриллиантовый крезоловый синий 1,03 [11]

Pseudomonas putida Метиленовый голубой 0,43 [11]

Proteus vulgaris Сафранин 0,07 [11]

Таким образом, скорости восстановления медиатора существенно различается для разных типов микроорганизмов и медиаторов, что может сказаться на эффективности работы медиаторного биосенсора.

Следующим этапом исследования было установление кинетических параметров реакции восстановления естественного акцептора электронов -кислорода клетками В. Нaшseшii и О. охуйаш8 в присутствии глюкозы. Вследствие того, что измерение начальной скорости окисления субстрата при различной концентрации кислорода затруднено, расчет кинетических параметров был сделан из одной кинетической кривой, представленной на рис. 2.

200 250 300 350 400 450

200 400 600 800 1000 1200 Время, с

Время

2,1

1,8

1,7

1,6

1,5

а б

Рис 2. Кинетическая кривая потребления кислорода: а - дрожжами О.

НатвпИ

Концентрация кислорода практически линейно снижается в течение первых 7-10 минут после добавления глюкозы как при использовании дрожжевых клеток, так и при использовании бактериальных, что соответствует кинетике реакции нулевого порядка (концентрация кислорода не влияет на скорость окисления субстрата). Если перестроить полученные кинетические кривые в координатах логарифм скорости (^Я) от логарифма концентрации (^С), то можно убедиться, что получаемые кривые параллельны оси абсцисс (для дрожжей ^Я=-16,2±0,1; а для бактерий ^Я=-18,8±0,2), что также подтверждает нулевой порядок реакции (метод Вант-Гоффа). Аппроксимация экспериментальных кривых в данном интервале времени уравнением линейной регрессии позволяет определить константу скорости и начальную скорость восстановления кислорода. Таким образом, константа скорости восстановления кислорода для дрожжей В. НатвпИ составляет 0,84±0,08 мкмоль/(л*с), а скорость восстановления кислорода 0,20±0,05 мкмоль/(г*с), а для бактерий О. охуйат константа скорости и скорость восстановления кислорода равняется 0,034±0,001 мкмоль/(л*с) и 0,013±0,002 мкмоль/(г*с), соответственно.

Для установления конкуренции между кислородом и медиатором сравнивали относительные скорости восстановления акцепторов электронов изучаемыми клетками. В табл. 5 сведены скорости восстановления медиаторов и кислорода для дрожжей В. НатвпИ и бактерий О. охуйат с учетом того, что при восстановлении молекула

кислорода принимает 4 электрона, а изучаемые медиаторы 2 электрона [11].

Таблица 5

Сводная таблица относительных скоростей потребления кислорода и

Акцептор электронов Скорость восстановления с учетом количества электронов

Дрожжи В. НатепИ Бактерии О. oxydans

Кислород 0,05

Тионин 0,09

Метиленовый синий 0,07

Нейтральный красный 0,28

2,6-Дихлорфенолиндофенол 0,025

Относительная скорость восстановления медиаторов в большинстве случаев превышает относительную скорость потребления кислорода. Таким образом, можно сделать вывод об отсутствие конкуренции кислорода и медиатора. Вероятно, это связано с тем, что перенос электронов на медиатор протекает на стадии, предшествующей лимитирующей стадии при восстановлении кислорода или восстановление медиатора не спарено с синтезом АТФ [11].

Заключение

На основе спекрофотометрических и амперометрических исследований кинетики биохимического восстановления медиаторов и кислорода клетками В. Нansenii и О. охуйат установлено, что восстановление медиаторов при концентрации ниже константы Михаэлиса является реакцией первого порядка и подчиняется механизму «пинг-понг», а восстановление кислорода является реакцией нулевого порядка.

Определены константы скорости восстановления тионина, метиленового синего, нейтрального красного, 2,6-дихрохфенолиндофенола и кислорода дрожжами В. НатепИ и бактериями О. oxydans. С учетом полученных значений установлено, что наиболее перспективным медиатором для дрожжей является нейтральный красный, а для бактерий О. oxydans 2,6-дихлорфенолиндофенол (константа скорости восстановления медиаторов 0,018±0,003 и 0,27±0,03 дм3/(г*с) соответственно).

По относительным скоростям восстановления акцепторов электрона было установлено, что скорость восстановление медиаторов в большинстве случаем происходит быстрее, чем восстановление кислорода. Таким образом, медиатор успешно конкурирует с кислородом, что

позволяет использовать системы «клетки-медиатор» в биоэлектрокатализе без необходимости деаэрации.

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 16-48-710959 р_а и Правительства Тульской области, договор ДС/44.

Библиографический список

1. Hu J.S., Gao G.F., Xia S.L. A Mediated BOD Microsensor Based on Poly (Neutral Red) and Bacteria Modified Interdigited Ultramicroelectrode Array // International journal of electrochemical science. 2016. V. 11. I. 7. P. 6387-6402.

2. Development of a mediated whole cell-based electrochemical biosensor for joint toxicity assessment of multi-pollutants using a mixed microbial consortium / G.F. Gao, J.X. Qiana, D.F. Fang [et al.] // Analytica chimica acta. 2016. V. 924. I. 4. P. 21-28.

3. A reagentless electrochemical biosensor based on thionine wrapped E. coli and chitosan-entrapped carbon nanodots film modified glassy carbon electrode for wastewater toxicity assessment/ D.A. Fang, G.F. Gao, J.S. Shena [et al.] //Electrochimica Acta. 2016. V. 21. I. 2. P. 123-131.

4. Choi O.T., Sang B. I. Extracellular electron transfer from cathode to microbes: application for biofuel production // Biotechnology for biofuels. 2016. V. 9. I. 1. P. 1-14.

5. Hubenova Y., Mitov M. Extracellular electron transfer in yeast-based biofuel cells: A review // Bioelectrochemistry. 2015. V. 106. P. 177-185.

6. Tanaka K.R., Vega C. A., Tamamushi R.L. Thionine and ferric chelate compounds as coupled mediators in microbial fuel cells // Bioelectrochemistry and Bioenergetics. 983. V. 11. I. 4-6. P. 289-297.

7. Получение стабильного рецепторного элемента биосенсора, иммобилизацией бактериальных клеток Gluconobacter oxydans в пленку из поливинилового спирта, модифицированного N-винилпирролидоном/ В. А. Алферов, Н.М. Филатова, Л.Д. Асулян [и др.] // Известия ТулГУ. Естественные науки. 2011. № 1. C. 210-219.

8. Справочник биохимика: пер. с англ. / Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. М.: Мир. 1991. 554 с.

9. Теренин А.Н. Фотоника молекул красителей. Л.: Наука, 1967.

616 c.

10. Kaila K. pH and brain function. - John Wiley & Sons. 1998. 692 c.

11. Electron transfer coupling in microbial fuel cells: 1. comparison of redox mediator reduction rates and respiratory rates of bacteria / S. D. Roller, H.P. Bennetto, G.M. Delaney [et al.] // Journal of Chemical Technology and Biotechnology. Biotechnology. 1984. V. 34. I. 1. P. 3-12.

12. Вохмянина Д. В. Кинетический метод оценки антиоксидантной активности и безреагентный медиаторный биосенсор: дис... канд. хим. наук. М., 2013. 154 с.

13. Гораль В. Н. Ферроцены как металлоорганические субстраты пероксидазы: механизм окисления, энантиоселективность, реконструкция активного центра: дис. канд. хим. наук. М., 1998. 139 с.

Зайцева Анна Сергеевна, аспирант, Anyuta_Zaytseva@mail.ru, Россия, Тула, Тульский государственный университет,

Туровская Анна Дмитриевна, студент, Anna_turovskaya@mail.ru, Россия, Тула, Тульский государственный университет,

Гришаева Анастасия Романовна, студент, nasty a798 718@yandex. ru, Россия, Тула, Тульский государственный университет,

Шишкарева Елена Игоревна, магистрант, iuri-kurai@yandex.ru, Россия, Тула, Тульский государственный университет,

Арляпов Вячеслав Алексеевич, канд. хим. наук, доцент кафедры химии, v.a.arlyapov@gmail.com, Россия, Тула, Тульский государственный университет

KINETICS OF MEDIATORS REDUCTION BY YEAST DEBARYAMYCES HANSENII AND BACTERIA GLUCONOBACTER OXYDANS IN THE

PRESENTS OF GLUCOSE

A.S. Zaitseva, A.D. Turovskaya, A. R. Grishaeva, E.I. Shishkareva,

V.A. Arlyapov

Kinetic parameters (rate constant and order of reaction) of mediators' reduction by yeast debaryamyces hansenii and bacteria gluconobacter oxydans in the presents of glucose were obtained by using spectrophotometry method. It was established that mediators' reduction at a concentration lower than the Michaelis constant is the reaction of the first order and occurs by the mechanism of "ping-pong". Based on rate constants of mediators such as thio-nin, neutral red, 2.6-dichlorophenolindophenol, methylene blue, there was identified the most promising mediator for the yeast - neutral red, and bacterial G. oxydans - 2,6-dichlorophenolindophenol. Reduction rate constants of mediators were 0.018 ± 0.003 and 0.27 ± 0.03 dm3/(g*s). By using an oxygen electrode, it was found that the reduction of the natural electron acceptor - oxygen is reaction of zero order. According to the relative rate of the electron acceptors reduction it was showed that the mediator successfully competes with oxygen. That property allows using of "mediator-cell" system for bioelectrocatalysis without de-aeration.

Key words: mediator biosensor, bacteria Gluconobacter oxydans, yeast Debarya-myces hansenii.

Zaitseva Anna Sergeevna, post-graduate student, Department of Chemistry, Anyuta_Zaytseva@mail.ru, Russia, Tula, Tula State University,

Turovskaya Anna Dmitrievna, student, Department of Chemistry, Anna_turovskaya@mail.ru, Russia, Tula, Tula State University,

Grishaeva Anastasia Romanovna, student, Department of Chemistry, nastya798718@yandex.ru, Russia, Tula, Tula State University,

Shishkareva Elena Igorevna, master student, Department of Chemistry, juri-kuraj@yanJex.ru, Russia, Tula, Tula State University,

Arlyapov Vyacheslav Alekseevich, candidate of chemical sciences, associate professor, v.a.arlyapov@gmail.com, Russia, Tula, Tula State University