ПРОТИВОВИРУСНОЕ СРЕДСТВО
ANTIVIRAL AGENT

Область технического применения
Настоящее изобретение касается противовирусного средства, способного инактивировать обширный круг вирусов.
Предпосылки настоящего изобретения
В последние годы поступают сообщения об увеличении случаев смерти в результате вирусных инфекций, таких как тяжелый острый респираторный синдром (ТОРС) или атипичная пневмония, норовирус или «желудочный» грипп и «птичий» грипп. За счет более развитых транспортных сетей, а также из-за постоянной миграции вирусов вероятность пандемии представляет собой глобальную опасность. Опасность новых вирусов гриппа также является неотложной проблемой, которая требует немедленных действий. Несмотря на то что одним из решений этой проблемы является разработка противовирусных вакцин, и в настоящее время она ускоряется, однако из-за своей специфичности вакцины эффективны только для предотвращения инфекций, вызванных конкретными вирусами. Поскольку производство вакцин - это процесс, требующий значительного времени, заранее запасти необходимое количество определенной вакцины часто бывает затруднительно. Поэтому существует чрезвычайная потребность в противовирусных средствах, демонстрирующих антивирусную активность в отношении широкого круга вирусов.
Вирусы делятся на такие, которые инкапсулированы в липидсодержащую мембрану, называемую оболочкой, и на неинкапсулированные. Поскольку в основном оболочка состоит из липидов, то ее можно легко разрушить путем обработки этанолом, органическими растворителями, мылом и другими дезинфицирующими средствами. Поэтому вирусы в оболочке можно легко инактивировать (а именно уменьшить или исключить их способность к инфицированию) этими дезинфицирующими средствами. Напротив, считается, что вирусы без оболочки обладают высокой устойчивостью к этим дезинфицирующим средствам. Используемые здесь термины «инактивация вирусной активности» и «антивирусная активность» касаются одной и той же активности.
В целях исследования описанной выше проблемы были разработаны неорганические противовирусные средства, спектр активности которых шире, чем спектр органических противовирусных средств. Например, сообщается о том, что ткань, пропитанная противомикробным красящим средством и ионами двухвалентной меди, обладает способностью инактивировать вирус гриппа (патентный документ 1). Имеется также сообщение, касающееся противовирусной ткани, полученной из карбоксилсодержащей ткани, пропитанной соединением меди (патентный документ 2). Кроме того, сообщается об ультратонком медном волокне, полученном холодной обработкой, и это волокно эффективно для инактивации вируса «птичьего» гриппа (патентный документ 3). Имеются также сообщения об использовании для инактивации вирусов других элементов, например об использовании фотокатализатора - оксида титана (патентные документы 4 и 5).
Документы по более ранней технологии
Патентные документы
Патентный документ 1 - выложенная патентная заявка Японии №2006-188499.
Патентный документ 2 - международная патентная заявка №WO 05/083171, брошюра.
Патентный документ 3 - выложенная патентная заявка Японии №2008-138323.
Патентный документ 4 - выложенная патентная заявка Японии №2005-160494.
Патентный документ 5 - выложенная патентная заявка Японии №2009-072430.
Краткое содержание настоящего изобретения
Задачи, которые должно решить настоящее изобретение
Однако подход к решению с помощью иона двухвалентной меди требует, чтобы указанный ион меди был стабилизирован путем его смешивания с другими веществами. В связи с этим количественное соотношение иона меди состава лимитировано. Другими словами, существенно, чтобы состав включал стабилизатор иона двухвалентной меди, а это приводит к уменьшении свободы при разработке состава. Подход с использованием карбоксилсодержащего волокна, пропитанного соединением меди, предусматривает наличие солей помимо карбоксильных групп. Это лимитирует количество соединения меди, которое можно перенести с помощью волокон, что приводит к недостаточной противовирусной эффективности. Помимо этого, подход с использованием металлической меди требует специального процесса промывки, необходимой в целях сохранения противовирусной активности, иначе при налипании пыли или грязи на поверхность указанная активность теряется. Все это делает описываемый подход нежелательно сложным и непрактичным. Подход с применением оксида титана и других фотокатализаторов также затруднителен, поскольку для проявления активности фотокатализаторов необходимо мощное ультрафиолетовое излучение, а при недостаточном количестве указанного излучения активация способности этих катализаторов к инактивированию может занять значительное время.
Для решения описанных выше задач настоящее изобретение обеспечивает противовирусное средство, которое способно инактивировать вирусы, а также продукты, содержащие такое противовирусное средство.
Способы решения указанных задач
Во-первых, изобретение касается противовирусного средства, содержащего в качестве активного ингредиента по меньшей мере один иодид, образованный из иода и элемента, находящегося в 4-8 периодах, 8-15 групп периодической таблицы.
Во-вторых, изобретение касается противовирусного средства из указанного выше первого пункта, отличающегося тем, что указанный элемент, находящийся в 4-8 периодах, 8-15 групп периодической таблицы представляет собой Cu, Ag, Sb, Ir, Ge, Sn, Tl, Pt, Pd, Bi, Au, Fe, Co, Ni, Zn, In или Hg.
3
4
4
2
2
4
2
4
3
3
2
2
2
2
3
В-третьих, изобретение касается противовирусного средства по приведенному выше второму пункту, отличающееся тем, что указанный иодид представляет собой по меньшей мере один иодид, выбранный из группы, состоящей из Cul, Agl, SbI, IrI, GeI, GeI, SnI, SnI, TlI, PtI, PtL, ВiI, AuI, AuI, FeI, CoI, NiI, ZnI, HgI и InI.
В-четвертых, изобретение касается противовирусного средства, которое в качестве активного ингредиента содержит частицы по меньшей мере одного одновалентного соединения меди.
В-пятых, изобретение касается противовирусного средства по приведенному выше четвертому пункту, отличающегося тем, что указанное соединение одновалентной меди представляет собой хлорид, ацетат, сульфид, иодид, бромид, пероксид, оксид или тиоцианид.
3
2
2
В-шестых, изобретение касается противовирусного средства по приведенному выше четвертому пункту, отличающегося тем, что указанное соединение одновалентной меди представляет собой по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, состоящей из CuCl, CuOOCCH, CuBr, CuI, CuSCN, CuS и CuО.
В-седьмых, изобретение касается волокнистой структуры, содержащей указанное противовирусное средство по приведенным выше пунктам с первого по шестой, или указанное противовирусное средство по приведенным выше пунктам с первого по шестой иммобилизовано на внешней поверхности этой волокнистой структуры.
В-восьмых, изобретение касается формованного изделия, содержащего указанное противовирусное средство по приведенным выше пунктам с первого по шестой, или указанное противовирусное средство по приведенным выше пунктам с первого по шестой иммобилизовано на внешней поверхности этого формованного изделия.
В-девятых, изобретение касается пленки или листа, содержащего указанное противовирусное средство по приведенным выше пунктам с первого по шестой, или указанное противовирусное средство по приведенным выше пунктам с первого по шестой иммобилизовано на внешней поверхности этой пленки или листа.
Эффекты настоящего изобретения
Согласно настоящему изобретению обеспечивается способное инактивировать вирусы противовирусное средство, а также продукт, содержащий указанное противовирусное средство.
Наилучший способ реализации настоящего изобретения
Противовирусное средство согласно представленному варианту в качестве активного ингредиента содержит: или частицы по меньшей мере одного иодида, образованного из иода и элемента, находящегося в 4-8 периодах, 8-15 групп периодической таблицы, или частицы по меньшей мере одного соединения одновалентной меди.
Несмотря на то что в настоящее время все еще неясен механизм, по которому противовирусное средство по представленному изобретению инактивирует вирусы, однако предполагается, что при контакте иодида или соединения одновалентной меди по предлагаемому варианту с вирусами происходит воздействие на вирусную ДНК или РНК, при котором их цитоплазма инактивируется или разрушается. Предполагается также, что соединение одновалентной меди инактивирует вирусы следующим образом:
поскольку ионы одновалентной меди, образуемые под воздействием атмосферной влаги на соединении одновалентной меди, превращаются в более устойчивые ионы двухвалентной меди, то при этом высвобождаются электроны, и эта передача электронов воздействует на электрические заряды на поверхности вирусов, инактивируя их.
Иодид или соединение одновалентной меди, служащие в качестве активного ингредиента противовирусного средства по настоящему варианту, демонстрируют свою противовирусную активность не будучи смешанными, например, со стабилизатором. Другими словами, разрабатывая противовирусное средство по настоящему варианту можно быть более свободными в отношении его составляющих по сравнению с разработкой стандартных противовирусных средств.
Помимо этого, поскольку противовирусное средство по настоящему варианту не нуждается в смешивании ни с какими стабилизаторами или с им подобными соединениями, то это средство можно получить простым способом, не требующим никаких предварительных обработок противовирусных компонентов. Далее, противовирусное средство по настоящему варианту устойчиво при диспергировании в дисперсионной среде типа воздуха или воды, поэтому в специальных операциях промывки нет необходимости. Таким образом, указанное противовирусное средство способно легко проявлять свою противовирусную активность и поддерживать ее.
Поскольку уже сейчас многие иодиды и соединения одновалентной меди коммерчески доступны для использования согласно настоящему варианту, то эти соединения при их химической устойчивости можно использовать сравнительно простым способом в многочисленных практических приложениях, например, для перемешивания со смолами или с красками.
3
4
4
2
2
4
2
4
3
2
2
2
2
2
3
По меньшей мере один иодид для применения по настоящему варианту, имеющий противовирусную активность, образован из иода и элемента, находящегося в 4-8 периодах, 8-15 групп периодической таблицы. Предпочтительно, чтобы указанный элемент из 4-8 периодов, 8-15 групп периодической таблицы представлял собой Cu, Ag, Sb, Ir, Ge, Sn, Tl, Pt, Pd, Bi, Au, Fe, Co, Ni, Zn, In или Hg. Более предпочтительно, чтобы частицы иодида, содержащиеся в противовирусном средстве по настоящему варианту, представляли собой частицы, по меньшей мере одного иодида, выбранного из группы, состоящей из CuI, AgI, SbI, IrI, GeI, GeI, SnI, SnI, TiI, PtI, PtI, ВiI, AuI, AuI, FeI, CoI, NiI, ZnbI, HgI и InI.
3
2
2
Предпочтительно также, чтобы соединение одновалентной меди для применения в настоящем варианте, обладающее противовирусной активностью, представляло собой хлорид, ацетат, сульфид, иодид, бромид, пероксид, оксид или тиоцианид. Более предпочтительно, чтобы частицы соединения одновалентной меди, содержащиеся в противовирусном средстве по настоящему варианту, представляли собой частицы по меньшей мере одного соединения, выбранного из группы, состоящей из CuCl, CuOOCCH, CuBr, CuI, CuSCN, CuS и CuO.
4
Из описанных выше иодидов или соединений одновалентной меди для применения по настоящему варианту благодаря их высокой устойчивости при хранении на открытом воздухе особенно предпочтительны частицы по меньшей мере одного соединения, выбранного из группы, состоящей из CuI, AgI, SnI, CuCl, CuBr и CuSCN.
Несмотря на то что иодиды или соединения одновалентной меди для применения по настоящему варианту могут иметь частицы любого размера, определяемого квалифицированными в этой области людьми, указанные частицы обеспечиваются предпочтительно в виде мелких частиц, средний размер которых составляет 500 мкм или менее. Если эти частицы, для последующего вытягивания из них волокон, требуется смешать со смолой, то для того, чтобы предотвратить снижение прочности волокон предпочтительно, чтобы средний размер указанных частиц составлял 1 мкм или менее. В настоящем варианте с точки зрения получения, обработки и химической устойчивости предпочтительно, чтобы размер частиц составлял 1 нм или более, хотя это могут быть частицы любого размера, определяемого квалифицированными в этой области людьми. Используемый здесь термин «средний размер частиц» касается среднего объемного размера частиц.
Противовирусное средство по настоящему варианту может быть использовано для инактивации неограниченного круга вирусов вне зависимости от типа их генома и от того, имеют ли указанные вирусы оболочку. Примеры таких вирусов включают риновирус, вирус полиомиелита, ротавирус, норовирус, энтеровирус, гепатовирус, астровирус, саповирус, вирус гепатита Е, вирусы гриппа А/В/С, вирус парагриппа, вирус эпидемического паротита, вирус кори, метапневмовирус человека, вирус желтой лихорадки, вирус тропической лихорадки, вирус японского энцефалита, вирус западного Нила, вирусы гепатита В/С, западные вирусы конского энцефалита, вирус О' нуонг-нуонг, вирус краснухи, вирус Ласа, вирус Мэтчупо, вирус Сабиа, вирус геморраргической лихорадки Конго, вирус флеботомной лихорадки, вирус Ханте, вирус бешенства, возбудитель геморрагической лихорадки Эбола, вирус Марбурга, вирус Ласа летучей мыши, вирус лейкемии Т-клеток человека, вирус иммунодефицита человека, коронавирус человека, коронавирус атипичной пневмонии, парвовирус человека, полиомавирус человека, вирус папилломы человека, аденовирус, вирус герпеса, вирус ветряной оспы, вирус опоясывающего лишая, цитомегаловирус, вирус оспы, вирус оспы обезьян, вирус оспы коров, вирус оспы моллюсков.
Указанное противовирусное средство по настоящему варианту может быть использовано в различных формах. В то время как с точки зрения манипулирования противовирусное средство по настоящему варианту наиболее предпочтительно использовать, например, в форме порошка, однако его можно применять и в любой другой пригодной форме. Например, указанное противовирусное средство можно диспергировать в дисперсионной среде, типа воды. Если противовирусное средство по настоящему варианту диспергируют в дисперсионной среде, то предпочтительно, чтобы такая дисперсия содержала в качестве активного ингредиента 0,2 масс.% (или более) иодида или соединения одновалентной меди, это необходимо для того, чтобы гарантировать достаточную противовирусную активность. В настоящем варианте, например, количество противовирусного средства в дисперсии предпочтительно составляет 30 масс.% (или менее) в целях гарантии ее устойчивости и удобства обращения, хотя указанная дисперсия может содержать противовирусное средство в любом приемлемом количестве, определяемом квалифицированным в данной области человеком.
Для того чтобы усилить требуемый эффект, указанное противовирусное средство по настоящему варианту можно использовать в сочетании с известным противовирусным средством типа этанола и хлорноватистой кислоты. Далее, противовирусное средство может быть закристаллизовано внутри волокна или других субстратов (или на их поверхности), предназначенных для того, чтобы они содержали в своем составе указанное противовирусное средство, или чтобы это противовирусное средство, было иммобилизовано на них. Кроме того, указанное противовирусное средство может быть смешано с другими противовирусными средствами, противомикробными средствами, противоплесневыми средствами, противоаллергенными средствами, катализаторами, антиотражательными материалами, или теплоизолирующими материалами.
Помимо этого, противовирусное средство по настоящему варианту может быть обеспечено в форме волокнистой структуры, которая содержит указанное противовирусное средство, или это противовирусное средство иммобилизовано на ее внешней поверхности.
В целях локализации или иммобилизации противовирусного средства на волокнистой структуре указанное средство по настоящему варианту может быть подвергнуто любой обработке, соответствующей выбору квалифицированного в этой области человека. Например, противовирусное средство по настоящему варианту может быть дополнительно введено в полимерный материал, и его можно пластифицировать и впрясть в волокно таким образом, чтобы полимерная структура содержала указанное противовирусное средство. Или же, используя связующий агент, противовирусное средство может быть иммобилизовано на волокнистой структуре типа тканого полотна или нетканого полотна. Указанное противовирусное средство может быть также иммобилизовано на неорганическом материале (типа цеолита), который, в свою очередь, иммобилизован на волокнистой структуре, образуя противовирусную волокнистую структуру. Используемая здесь фраза «противовирусное средство содержится» предназначена для того, чтобы включались те случаи, в которых указанное противовирусное средство подвергается воздействию извне.
Конкретные примеры волокнистой структуры включают: респиратор, фильтр кондиционера воздуха, фильтр воздухоочистителя, одежду, экран от насекомых и сеть для домашней птицы. Примеры полимерных материалов для формирования волокнистой структуры включают: полиэфир, полиэтилен, полипропилен, поливинилхлорид, полиэтилентерефталат, полибутилентерефталат, политетраметилен-терефталат, нейлон, акрил, политетрафторэтилен, поливиниловый спирт, кевлар (особопрочное синтетическое волокно), полиакриловую кислоту, поли(метилметакрилат), вискозу, блестящую ткань (парчу), ацетат, триацетат, хлопок, пеньку, шерсть, шелк и бамбук.
Далее, противовирусное средство по настоящему варианту может быть обеспечено в виде формованного изделия, которое содержит указанное противовирусное средство, или это средство иммобилизовано на его внешней поверхности. Так же, как и в случае с волокнистой структурой, в целях локализации или иммобилизации указанного противовирусного средства на внешней поверхности формованного изделия, противовирусное средство по настоящему варианту можно подвергнуть любой обработке, соответствующей выбору квалифицированного в этой области человека. Например, если формованное изделие изготавливают из органического материала (типа полимера), то противовирусное средство можно подвергнуть пластификации вместе с указанным полимером перед его отливкой в формованное изделие. Если формованное изделие изготавливают из неорганического материала (типа металла), то с помощью связующего агента указанное противовирусное средство может быть иммобилизовано на внешней поверхности формованного изделия. Формованное изделие, содержащее противовирусное средство по настоящему варианту, способно инактивировать любой вирус, который вступает в контакт с указанным формованным изделием. Например, если телефонная трубка содержит противовирусное средство по настоящему варианту или это средство иммобилизовано на внешней поверхности трубки, то с ее помощью можно предотвратить инфицирование человека, который использовал эту трубку после субъекта, инфицированного некоторым вирусом.
Так же, как и в случае описанных выше волокнистых структур и формованных изделий, противовирусное средство по настоящему изобретению может быть обеспечено в виде листа или пленки, которые содержат указанное противовирусное средство, или это средство иммобилизовано на его внешней поверхности; для этого применяют аналогичную методику иммобилизации с помощью пластификации или при использовании связующего. Конкретные примеры такой пленки или листа включают обои, упаковочный пакет или упаковочную пленку. Вирусы, прикрепленные к поверхности таких пленок или листов, инактивируются под действием противовирусной активности указанного противовирусного средства. Таким образом, госпитальную инфекцию или инфицирование медицинских инструментов вирусами можно предотвратить путем нанесения на стены больничных палат описанных выше обоев или с помощью заворачивания медицинского инструмента в описанный выше упаковочный пакет или упаковочную пленку.
Противовирусное волокно, которое содержит иодид одновалентной меди, например, в виде частиц указанного иодида или соединения одновалентной меди или в котором иодид одновалентной меди иммобилизован на внешней поверхности этого волокна, можно изготовить различными способами. К этим способам относятся следующие: методика, при которой иод абсорбируется на волокне, и содержащее иод волокно обрабатывают водным раствором соединения меди таким образом, что получаемое в результате изделие содержит иодид одновалентной меди; методика, включающая диспергирование порошка иодида одновалентной меди в расплавленном полимере и вытягивание указанного полимера в виде нити; методика, включающая диспергирование порошка иодида одновалентной меди в растворе полимера и вытягивание указанного раствора полимера в виде нити; методика, включающая механический размол, предназначенный для иммобилизации порошка иодида одновалентной меди на поверхности волокна; а также методика, при которой для иммобилизации иодида одновалентной меди на поверхности волокна используется покровное средство. Эти методики можно применять с различными полимерными материалами в целях получения полимерного материала, который содержит иодид одновалентной меди, или материала, в котором иодид одновалентной меди иммобилизован на его внешней поверхности, при этом диапазон концентраций широкий - от низкого значения до высокого.
В целях достижения более высокой антивирусной активности противовирусное волокно, включающее противовирусное средство по настоящему варианту, предпочтительно содержит в качестве активного ингредиента иодид или иммобилизованный иодид в количестве, составляющем 0,2 масс.% или более относительно указанного противовирусного волокна. Несмотря на то что максимальное количество иодида, содержащееся в противовирусном волокне (или иммобилизованном на нем), конкретно не ограничено и его может определить квалифицированный в данной области человек, однако для того, чтобы гарантировать прочность и другие физические характеристики указанного противовирусного волокна, предпочтительно, чтобы оно содержало иодид в количестве, составляющем 80 масс.% или менее. Количество иодида, содержащегося в противовирусном волокне, можно измерить с помощью термогравиметрического анализа, титрования и атомно-абсорбционной спектрометрии.
Противовирусное волокно, которое содержит иодид одновалентной меди, например, в виде соединения одновалентной меди или в виде иодида одновалентной меди, иммобилизованного на внешней поверхности этого волокна, можно изготовить различными способами. К этим способам относятся следующие: методика, включающая введение хлорида одновалентной меди в расплавленный полимер, их совместное вытягивание в нить для диспергирования иодида одновалентной меди в указанном полимере и последующее формирование волокна из этого полимера; методика, включающая механический размол в целях иммобилизации порошка хлорида одновалентной меди на поверхности волокна; методика, при которой для иммобилизации иодида одновалентной меди на поверхности волокна применяется покровное средство; методика, включающая диспергирование порошка хлорида одновалентной меди в полимере, растворенном в определенном растворителе, и последующее нанесение полученной дисперсии на другой материал в целях иммобилизации хлорида одновалентной меди; а также методика, включающая растворение хлорида одновалентной меди в водной соляной кислоте, погружение гидрофильного полимерного материала (типа Нейлона 6 или полиакриловой кислоты) в указанный водный раствор для иммобилизации ионов одновалентной меди на полимерном материале и последующее погружение этого полимерного материала в водную соляную кислоту в целях кристаллизации хлорида одновалентной меди. Или же хлорид одновалентной меди может быть инкапсулирован с помощью чувствительного к температуре поли(Н-изопропилакриламида) для того, чтобы получить капсулы, которые, в свою очередь, используют для формирования волокна, содержащего указанные капсулы, или чтобы получить капсулы, иммобилизованные на внешней поверхности этого волокна.
Несмотря на то что выше отмечалось, что противовирусное волокно предпочтительно содержит иодид меди или он иммобилизован на этом волокне в количестве, составляющем от 0,2 масс.% до 80 масс.% относительно массы указанного противовирусного волокна, однако для применения по настоящему варианту по упомянутым выше причинам противовирусное волокно предпочтительно содержит другие иодиды или соединения одновалентной меди или они иммобилизованы в количестве на этом волокне, составляющем от 0,2 масс.% до 80 масс.% относительно массы указанного противовирусного волокна. Необходимо понимать, что указанная волокнистая структура также предпочтительно содержит противовирусное средство, или это средство иммобилизовано на волокнистой структуре в количестве, составляющем от 0,2 масс.% до 80 масс.% относительно массы волокнистой структуры.
Примеры
Далее настоящее изобретение будет описано со ссылкой на примеры, не ограничивающие настоящее изобретение.
Оценка противовирусной активности с помощью активности в отношении гемагглютинации.
Примеры 1-27
Каждый из коммерчески доступных порошков соединений иода или одновалентной меди, показанных в таблице 1, суспендировали в 100 мкл MEM (минимально обогащенной среде), это делалось для того, чтобы в целях оценки противовирусной активности была получена суспензия с концентрацией, составляющей 5 масс.% и 0,5 масс.%. Используемый здесь термин «концентрация суспензии» обозначает процентное содержание по массе определенного компонента (типа иодида или соединения одновалентной меди) в суспензии относительно общей массы (=100%) всех ее компонентов, включая иодид или соединение одновалентной меди, а также растворитель.
Способ оценки
Для примеров 1-27 при стандартной оценке гемагглютинации (НА) использовали титр НА, при этом наблюдая полную агглютинацию визуально. Используемый вирус представлял собой вирус гриппа (influenza A/kitakyusyu/159/93 (H3N2)), культивированный в клетках MDCK.
Конкретно, были приготовлены серийные растворы вируса двукратного разведения, которые разбавляли фосфатно-солевым буфером. В каждую ячейку пластиковой пластины на 96 ячеек было введено по 50 мкл каждого разведения, а затем в них было добавлено по 50 мкл 0,5% суспензии эритроцитов цыплят. Пластину оставили при 4°С на 60 мин, а после этого определяли титр гемагглютинации. Его величина для этого раствора вирусов составила 256.
Затем каждое из веществ из примеров, представленных в таблице 1, разбавили фосфатно-солевым буфером до концентрации суспензии, составляющей 10 масс.% и 1 масс.%. К 450 мкл каждого из указанных двух образцов с соответствующими концентрациями было добавлено по 450 мкл описанного выше раствора вируса, титр которого, как было установлено, составил 256. Получившаяся в результате суспензия взаимодействовала в течение 10 мин при встряхивании в ротаторе для микропробирок. В качестве контроля 450 мкл раствора вируса с титром гемагглютинации, составляющий 256, добавили к 450 мкл фосфатно-солевого буфера, и так же, как и для других образцов, получившуюся в результате суспензию встряхивали в течение 10 мин в ротаторе для микропробирок.
После этого провели осаждение твердого компонента на микроцентрифуге, супернатант собрали и использовали в качестве эталонного раствора. Были приготовлены серийные двукратные разведения указанного эталонного раствора (каждый по 50 мл), которые разбавили фосфатно-солевым буфером. К каждому разведению было добавлено по 50 мкл 0,5% суспензии эритроцитов цыплят, получившуюся при этом суспензию оставили на 60 мин при 4°С, а после этого определяли титр гемагглютинации. Полученные результаты приведены в таблице 2. В каждой реакционной смеси каждое вещество имело концентрацию, составляющую 5 масс.% и 0,5 масс.%, поскольку к каждому из образцов было добавлено равное количество раствора вируса.
Таблица 1
Номер примера
Название вещества
Молекулярная формула
Производитель (ретейлор)
Уровень качества
1
Медь (I) иодид
CuI
Wako
Первая степень чистоты Wako
2
Серебро (I) иодид
AgI
Wako
Химически чистый
3
Сурьма (III) иодид
SbI<sub>3</sub>
Strem Chemicals (Wako)
99,90%
4
Иридий (IV) иодид
IrI<sub>4</sub>
Alfa Aesar (Wako)
99,95%
5
Германий (IV) иодид
GeI<sub>4</sub>
Alfa Aesar (Wako)
99,999%
6
Германий (II) иодид
GeI<sub>2</sub>
AIDRICH
99,99%
7
Олово (II) иодид
SnI<sub>2</sub>
Alfa Aesar (Wako)
99+%
8
Олово (IV) иодид
SnI<sub>4</sub>
Strem Chemicals (Wako)
95%
9
Таллий (I) иодид
TlI
WAKO
Оптически чистый
10
Платина (II) иодид
PtI<sub>2</sub>
Strem Chemicals (Wako)
99%
11
Платина (IV) иодид
PtI<sub>4</sub>
Alfa Aesar (Wako)
99,95%
12
Палладий (II) иодид
PdI<sub>2</sub>
Strem Chemicals (Wako)
13
Висмут (III) иодид
BiI<sub>3</sub>
Strem Chemicals (Wako)
99,999%
14
Золото (I) иодид
AuI
Strem Chemicals (Wako)
99% Wako
15
Золото (III) иодид
AuI<sub>3</sub>
ChemPur Feinchemikalien und
Forschungsbedarf GmbH (Wako)
16
Железо (II) иодид
FeI<sub>2</sub>
Aldrich
<99,99%
17
Кобальт (II) иодид
CoI<sub>2</sub>
Aldrich
95%
18
Никель(II) иодид
NiI<sub>2</sub>
Alfa Aesar (Wako)
99,50%
19
Цинк (II) иодид
ZnI<sub>2</sub>
Wako
Первая степень чистоты Wako
20
Серебро(I) иодид
HgI
Wako
Химически чистый
21
Индий (III) иодид
InI<sub>3</sub>
Alfa Aesar (Wako)
99,999%
22
Медь (I) хлорид
CuCl
Wako
Реагент специальной степени
23
Медь (I) бромид
CuBr
Wako
Первая степень чистоты Wako
24
Медь (I) ацетат
CuOOCCH<sub>3</sub>
Tokyo Chemical Industry
98% реагент
25
Медь (I) тиоцианат
CuSCN
Wako
Химически чистый
26
Медь (I) сульфат
Cu<sub>2</sub>S
Alfa Aesar (Wako)
99,5%
27
Медь (I) оксид
Cu<sub>2</sub>O
Wako
99,5+0%
(Замечание) Wako=Wako Pure Chemical Industries
Таблица 2
Номер примера
Название вещества
Молекулярная формула
Титр НА
Концентрация вещества (масс.%)
5
0,5
1
Медь (I) иодид
CuI
8
32
2
Серебро (I) иодид
AgI
32
64
3
Сурьма (III) иодид
SbI<sub>3</sub>
16
32
4
Иридий (IV) иодид
IrI<sub>4</sub>
32
64
5
Германий (IV) иодид
GeI<sub>4</sub>
<2
<2
6
Германий (II) иодид
GeI<sub>4</sub>
<2
2
7
Олово (II) иодид
SnI<sub>2</sub>
<2
2
8
Олово (IV) иодид
SnI<sub>4</sub>
<2
2
9
Таллий (I) иодид
TlI
32
64
10
Платина (II) иодид
PtI<sub>2</sub>
<2
64
11
Платина (IV) иодид
PtI<sub>4</sub>
32
64
12
Палладий (II) иодид
PdI<sub>2</sub>
2
64
13
Висмут (III) иодид
BiI<sub>3</sub>
8
64
14
Золото (I) иодид
AuI
4
64
15
Золото (III) иодид
AuI<sub>3</sub>
8
64
16
Железо (II) иодид
FeI<sub>2</sub>
<2
<2
17
Кобальт (II) иодид
CoI<sub>2</sub>
<2
8
18
Никель (II) иодид
NiI<sub>2</sub>
<2
4
19
Цинк (II) иодид
ZnI<sub>2</sub>
<2
4
20
Серебро (I) иодид
HgI
32
64
21
Индий (III) иодид
InI<sub>3</sub>
<2
<2
22
Медь (I) хлорид
CuCl
<2
<2
23
Медь (I) бромид
CuBr
<2
32
24
Медь (I) ацетат
CuOOCCH<sub>3</sub>
<2
<2
25
Медь (I) тиоцианат
CuSCN
16
64
26
Медь (I) сульфат
Cu<sub>2</sub>S
16
64
27
Медь (I) оксид
Cu<sub>2</sub>O
8
64
Контроль
(Фосфатно-солевой буфер)
128
(Замечание 1) «<2» в таблице обозначает самое низкое из определяемых значение НА титра
(Замечание 2) контроль осуществляется при 0% концентрации фосфатно-солевого буфера (чистый фосфатно-солевой буфер)
4
2
2
4
2
2
2
2
2
3
3
Результаты таблицы 2 показывают, что каждое из веществ из примеров 1-27 обладает способностью инактивировать вирус. Как показано, при 5% концентрации титр гемагглютинации для каждого из веществ составляет 32, это указывает на то, что инактивируется 75% вирусов или более. В частности, каждое из веществ GeI, GeI, SnI, SnI, PtI, FeI, CoI, NiI, ZnI, InI, CuCl, CuBr и CuOOCCH вызывает высокую активность, составляющую 99% или более по инактивации вируса (эта величина представляет собой самое низкое значение, определяемое с помощью такого анализа).
Оценка противовирусной активности путем инактивации вируса гриппа и кошачьего кальцивируса.
Как описывалось ранее, вирусы подразделяются на вирусы, инкапсулированные в липидсодержащую мембрану, называемую оболочкой, и на неинкапсулированные вирусы. В связи с этим оценивалась способность исследуемых соединений инактивировать вирусы в оболочке и вирусы без оболочки. В качестве вируса в оболочке использовался вирус гриппа (influenza A/kitakyusyu/159/93 (H3N2)), а в качестве вируса без оболочки - кошачий кальцивирус (штамм F9), являющийся стандартной альтернативой не содержащему оболочки норовирусу.
Коммерчески доступный порошок иодида одновалентной меди суспендировали в 100 мкл разбавленного раствора MEM до получения концентрации суспензии, составляющей 5 масс.%, 1 масс.%, 0,2 масс.% и 0,1 масс.%. Эти суспензии обозначаются как примеры 28, 29, 30 и 31 соответственно. Была проведена оценка противовирусной активности каждой из этих суспензий в отношении кошачьего кальцивируса и указанного вируса гриппа.
Коммерчески доступный порошок хлорида одновалентной меди суспендировали в 100 мкл разбавленного раствора MEM до получения концентрации суспензии, составляющей 2 масс.%, 1 масс.%, 0,5 масс.% и 0,25 масс.%. Эти суспензии обозначаются как примеры 32, 33, 34 и 35 соответственно. Была проведена оценка противовирусной активности каждой из этих суспензий в отношении кошачьего кальцивируса и указанного вируса гриппа.
Способ оценки противовирусной активности
-2
-5
2
Противовирусная активность в примерах 28-35 оценивалась по тесту бляшкообразования, который способен выявлять вирус с высокой точностью. Более конкретно, по 100 мкл каждого из раствора вируса добавляли в 100 мкл раствора каждого из исследуемых образцов и в 100 мкл разбавленного раствора MEM (в качестве контрольной пробы). Все растворы были помещены в инкубатор с температурой 25°С, в котором их встряхивали с частотой 200 об/мин. После периода встряхивания, который был заранее установлен в целях завершения взаимодействия вируса с каждым из соединений каждого образца, было добавлено 1800 мкл протеинового бульона с концентрацией 20 мг/мл. Каждый из образцов был серийно разбавлен разведенным MEM раствором до концентрации, составляющей от 10 до 10 (10-стадийное разведение). После проведения реакции осуществили инокуляцию образца растворов кошачьего кальцивируса на конфлюэнтные клетки CrFK (использовалось по 100 мкл каждой пробы), а инокуляцию образцов растворов вируса гриппа - на клетки MDCK (использовалось по 100 мкл каждой пробы). Затем после 90-минутной абсорбции каждую пластину сверху покрыли 0,7% средой агара. Пластины, инокулированные кошачьим кальцивирусом, инкубировали в течение 48 ч, а пластины, инокулированные вирусом гриппа, инкубировали в течение 64 ч; процессы проводили в инкубаторе с 5% CO при 34°С. После этого клетки были зафиксированы формалином и окрашены метиленовым синим. Провели подсчет количества бляшек и вычислили титр вируса в бляшкообразующих единицах (PFU/0,1 мл, Log 10), которые представляют собой меру противовирусной активности. Полученные результаты приведены в таблицах 3 и 4.
Таблица 3
Титр вируса (PFU/0,1 мл, Log 10)
Пример 28
Пример 29
Пример 30
Пример 31
Холостой опыт
CuI
CuI
CuI
CuI
CuI
5%
1%
0,2%
0,1%
0%
Вирус гриппа
1 мин
<1
<1
1,17
3,24
7,02
10 мин
<1
<1
<1
2,98
7,00
Кошачий кальцивирус
1 мин
<1
<1
2,11
4,63
6,50
10 мин
<1
<1
1,60
4,2
6,44
Результаты таблицы 3 показывают, что порошок иодида одновалентной меди в течение такого короткого промежутка времени, как 1 мин, демонстрирует значительно высокую инактивацию вируса как в отношении заключенного в оболочку вируса гриппа, так и в отношении не заключенного в оболочку кошачьего кальцивируса.
Таблица 4
Титр вируса (PFU/0,1 мл, Log 10)
Пример 32
Пример 33
Пример 34
Пример 35
Холостой опыт
CuCl
CuCl
CuCl
CuCl
CuCl
2%
1%
0,5%
0,25%
0%
Вирус гриппа
1 мин
<1
<1
<1
1,12
7,02
10 мин
<1
<1
<1
<1
7,00
Кошачий кальцивирус
1 мин
<1
<1
<1
1,05
6,50
10 мин
<1
<1
<1
<1
6,44
Результаты таблицы 4 показывают, что порошок хлорида одновалентной меди в течение такого короткого промежутка времени, как 1 мин, демонстрирует значительно высокую инактивацию вируса, как в отношении заключенного в оболочку вируса гриппа, так и в отношении не заключенного в оболочку кошачьего кальцивируса.
Результаты таблиц 3 и 4 показывают, что в примерах 28 и 29 каждый иодид (образованный из иода и элемента, находящегося в 4-8 периодах, 8-15 групп периодической таблицы), а в примерах 32-34 каждое из соединений одновалентной меди вызывали снижение вируса гриппа до одной миллионной или ниже, а кошачьего кальцивируса - до одной трехсоттысячной или ниже от начального уровня при воздействии этих соединений на указанные вирусы за такой короткий период времени, как 1 мин. Таким образом, скорость инактивации, или противовирусная активность этих соединений для обоих вирусов чрезвычайно высока, и она составляет 99,9999% или более для вируса гриппа и 99,999% или более для кошачьего кальцивируса. Используемый здесь термин «скорость инактивации» представляет собой величину, определяемую следующим уравнением:
Математическое уравнение 1
<mtable columnalign="left"><mtr><mtd><mi>С</mi><mi>к</mi><mi>о</mi><mi>р</mi><mi>о</mi><mi>с</mi><mi>т</mi><mi>ь</mi><mtext> </mtext><mi>и</mi><mi>н</mi><mi>а</mi><mi>к</mi><mi>т</mi><mi>и</mi><mi>в</mi><mi>а</mi><mi>ц</mi><mi>и</mi><mi>и</mi><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mrow><mo>(</mo><mi>%</mi><mo>)</mo></mrow><mo>=</mo></mtd></mtr><mtr><mtd><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mo>=</mo><mn>100</mn><mo>×</mo><msup><mn>10</mn><mrow><mi>т</mi><mi>и</mi><mi>т</mi><mi>р</mi><mtext> </mtext><mi>в</mi><mi>и</mi><mi>р</mi><mi>у</mi><mi>с</mi><mi>а</mi><mtext> </mtext><mi>в</mi><mtext> </mtext><mi>х</mi><mi>о</mi><mi>л</mi><mi>о</mi><mi>с</mi><mi>т</mi><mi>о</mi><mi>м</mi><mtext> </mtext><mi>о</mi><mi>п</mi><mi>ы</mi><mi>т</mi><mi>е</mi></mrow></msup><mtext> </mtext><mtext>-</mtext><msup><mn>10</mn><mrow><mi>т</mi><mi>и</mi><mi>т</mi><mi>р</mi><mtext> </mtext><mi>в</mi><mi>и</mi><mi>р</mi><mi>у</mi><mi>с</mi><mi>а</mi><mtext> </mtext><mi>о</mi><mi>б</mi><mi>р</mi><mi>а</mi><mi>з</mi><mi>ц</mi><mi>а</mi></mrow></msup><mo>/</mo><msup><mn>10</mn><mrow><mi>т</mi><mi>и</mi><mi>т</mi><mi>р</mi><mtext> </mtext><mi>в</mi><mi>и</mi><mi>р</mi><mi>у</mi><mi>с</mi><mi>а</mi><mtext> </mtext><mi>в</mi><mtext> </mtext><mi>х</mi><mi>о</mi><mi>л</mi><mi>о</mi><mi>с</mi><mi>т</mi><mi>о</mi><mi>м</mi><mtext> </mtext><mi>о</mi><mi>п</mi><mi>ы</mi><mi>т</mi><mi>е</mi></mrow></msup></mtd></mtr></mtable>
Как указывалось выше, противовирусное средство по настоящему изобретению демонстрирует чрезвычайно высокий и мгновенный эффект, независимо от типа вируса, поэтому можно рассматривать многочисленные приложения указанного противовирусного средства путем его введения в различные вещества или иммобилизации на них. Таким образом, противовирусное средство по настоящему изобретению должно найти практическое применение.