СКОНСТРУИРОВАННЫЕ ВАРИАНТЫ ДНК-ПОЛИМЕРАЗЫ

1. Сконструированная ДНК-полимераза, содержащая полипептидную последовательность, имеющую по меньшей мере 85% или более идентичность последовательности с эталонной последовательностью SEQ ID NO: 6, или их функциональным фрагментом, где сконструированная ДНК-полимераза содержит по меньшей мере одну мутацию в положении 515, 685, 691, 495, 479, 567, 667 или их комбинациях, и где положения аминокислот из полипептидной последовательности пронумерованы на основании SEQ ID NO: 6.
2. Сконструированная ДНК-полимераза по п.1, где полипептидная последовательность содержит по меньшей мере мутацию 515F, 515G, 515L, 515R, 685K, 685D, 691S, 691G, 495N, 479P, 479Q, 567G, 667N, 667T или их комбинации.
3. Сконструированная ДНК-полимераза по п.1, где полипептидная последовательность содержит по меньшей мере мутацию в положениях 515, 685, 691, 495, 479, 667 или их комбинации.
4. Сконструированная ДНК-полимераза по п.3, где полипептидная последовательность содержит по меньшей мере мутацию 515F, 515G, 515L, 515R, 685K, 685D, 691S, 691G, 479P, 479Q, 667N, 667T или их комбинации.
5. Сконструированная ДНК-полимераза по п.1, где полипептидная последовательность содержит по меньшей мере мутацию в положениях 515, 495, 479 или их комбинации.
6. Сконструированная ДНК-полимераза по п.5, где полипептидная последовательность содержит по меньшей мере мутацию 515L, 495N, 479P, 479Q или их комбинации.
7. Сконструированная ДНК-полимераза по п.1, где полипептидная последовательность содержит по меньшей мере мутацию в положении 515.
8. Сконструированная ДНК-полимераза по п.7, где полипептидная последовательность содержит по меньшей мере мутацию 515F, 515G, 515L или 515R.
9. Сконструированная ДНК-полимераза по любому из пп. 1-8, где указанная полипептидная последовательность имеет по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93% или 94% или более идентичности последовательности с эталонной последовательностью SEQ ID NO: 6.
10. Сконструированная ДНК-полимераза по любому из пп. 1-8, где указанная полипептидная последовательность имеет по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с эталонной последовательностью SEQ ID NO: 6.
11. Сконструированная ДНК-полимераза по любому из пп. 1-10, где полипептидная последовательность дополнительно содержит по меньшей мере одну замену или набор замен в положениях 21, 21/66/247/282, 247/282/575, 282/575, 283/647/702/743, 339/647/661/664/668/702/712, 372/391/702, 391, 391/647/659/661/668/671/712/716, 391/647/659/661/668/671/716, 391/647/659/664/668/702/728/732, 391/647/659/664/671/702, 391/647/661/664/671/702/716, 391/647/671/728, 391/659/702/716/732/737, 391/661/664/668/671/716/737, 391/671, 391/702/712/716/732/743, 647/659/661/664/668/702, 647/659/664/668/702/712/737, 647/659/668/671/716/728, 647/668, 647/668/671/712, 659/702/743, 661/664/668/671/716, 668/702, 671/702, 671/702/716, 702, 743,или их комбинации, где положения аминокислот пронумерованы на основании SEQ ID NO: 6.
12. Сконструированная ДНК-полимераза по п. 11, где полипептидная последовательность дополнительно содержит по меньшей мере одну замену или набор замен 21E, 21E/66T/247G/282R, 247G/282K/575L, 282K/575L, 283M/647H/702A/743A, 339L/647H/661T/664L/668E/702A/712V, 372S/391E/702A, 391E, 391E/647H/659E/661T/668E/671P/712V/716I, 391E/647H/659E/661T/6168E/716I, 391E/647H/659E/664L/668E/702A/728A/732E, 391E/647H/659E/664L/671P/702A, 391E/647H/661T/664L/671P/702A/716I, 391E/1P47H/672A/728A, 391E/659E/702A/716I/732E/737R, 391E/661T/664L/668E/671P/716I/737R, 391E/671P, 391E/702A/712V/716I/732E/743A, 647H/6159E/6159E/6159E/6159E/664L/668E/702A, 647H/659E/664L/668E/702A/712V/737R, 647H/659E/668E/671P/716I/728A, 647H/668E, 647H/668E/671P/712V, 659E/432A/732A/702A/728A/647H/668E/671P/712A, 661T/664L/668E/671P/716I, 668E/702A, 671P/702A, 671P/702A/716I, 702A, 743A или их комбинации, где положения аминокислот пронумерованы на основании SEQ ID NO: 6.
13. Сконструированная ДНК-полимераза по любому из пп. 1-10, где полипептидная последовательность дополнительно содержит по меньшей мере одну замену или набор замен в положениях аминокислот 18/387, 24/719, 43/528, 48/760, 101/646, 108/679, 223, 257, 282, 359, 360, 361, 362, 376/619, 390, 391, 394, 394/399, 420, 421, 478, 502, 506, 514, 521, 528, 583/730, 603, 619, 631, 646, 655, 662, 666, 668, 702, 721, 738, 754, 760, 761 или их комбинации, где положения аминокислот пронумерованы на основании SEQ ID NO: 6.
14. Сконструированная ДНК-полимераза по п. 13, где полипептидная последовательность дополнительно содержит по меньшей мере одну замену или набор замен 18H/387C, 24M/719A, 43L/528S, 48H/760H, 101S/646R, 108C/679S, 223N, 257R., 257W, 282R, 359C, 360R, 360T, 360V, 361G, 361M, 361W, 361R, 361M, 361W, 362R, 376V / 619F, 390A, 390G, 390Q, 391A, 391G, 394G, 394 м / 399R, 394N, 394T, 420A, 420G, 420i, 420k, 420V, 421M, 421Q, 478L, 502A, 506R, 514R, 521P, 521T, 528A, 528S, 521T, 528A, 528S, 583N / 730A, 603R, 619C, 619V, 631G, 646R, 655W, 662C, 666T, 668C, 668L, 702A, 721R, 721T, 738V, 754C, 760F, 760G, 761R, 761W или их комбинации, где положения аминокислот пронумерованы на основании SEQ ID NO: 6.
15. Сконструированная ДНК-полимераза по п. 1, где указанная сконструированная ДНК-полимераза содержит полипептидную последовательность, которая имеет по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 24, 26, 28 или 824.
16. Сконструированная ДНК-полимераза по п. 1, где указанная сконструированная ДНК-полимераза содержит полипептидную последовательность, имеющую по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности с последовательностью по меньшей мере одного сконструированного варианта ДНК-полимеразы, указанного в таблице 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 6.2 и/или 6.3.
17. Сконструированная ДНК-полимераза по п. 1, где указанная сконструированная ДНК-полимераза содержит полипептидную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 24, 128, 130, 158, 162, 174, 240, 304, 304, 306, 308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 406, 408, 410, 412, 414, 416, 418, 420, 422, 424, 426, 428, 430, 432, 434, 436, 438, 440, 442, 444, 446, 448, 450, 452, 454, 456, 458, 460, 462, 464, 466, 468, 470, 472, 474, 476, 478, 480, 482, 484, 486, 488, 490, 492, 494, 496, 498, 500, 502, 504, 506, 508, 510, 512, 514, 516, 518, 520, 522, 524, 526, 528, 530, 532, 534, 536, 538, 540, 542, 544, 546, 548, 550, 552, 554, 556, 558, 560, 562, 564, 566, 568, 570, 572, 574, 576, 578, 580, 582, 584, 586, 588, 590, 592, 594, 596, 598, 600, 602, 604, 606, 608, 610, 612, 614, 616, 618, 620, 622, 624, 626, 628, 63 0, 632, 634, 636, 638, 640, 642, 644, 646, 648, 650, 652, 654, 656, 658, 660, 662, 664, 666, 668, 670, 672, 674, 676, 678, 680, 682, 684, 686, 688, 690, 692, 694, 696, 698, 700, 702, 704, 706, 708, 710, 712, 714, 716, 718, 720, 722, 724, 726, 728, 730, 732, 734, 736, 738, 740, 742, 744, 746, 748, 750, 752, 754, 756, 758, 760, 762, 764, 766, 768, 770, 772, 774, 776, 778, 780, 782, 784, 786, 788, 790, 792, 794, 796, 798, 800, 802, 804, 806, 808, 810, 816, 818, 820, 822, 824, 826, 828, 830, 832, 834, 836, 838, 840, 842, 844, 846, 848, 850, 852, 854, 856, 858, 860, 862, 864, 866, 868, 870, 872, 874, 876, 878, 880, 882, 884, 886, 888, 890, 892, 894, 896, 898, 900, 902, 904, 906, 908, 910, 912, 914, 916, 918, 920, 922, 924, 926, 928, 930, 932, 934, 936, 938, 940, 942, 944, 946, 948, 950, 952, 954, 956, 958, 960, 962, 964, 966, 968, 970, 972, 974, 976, 978, 980, 982, 984, 986, 988, 990, 992, 994, 996, 998, 1000, 1002, 1004, 1006, 1008, 1010, 1012, 1014, 1016, 1018, 1020, 1022, 1024, 1026, 1026 8, 1030, 1032, 1034, 1036, 1038, 1040, 1042, 1044, 1046, 1048, 1050, 1052, 1054, 1056, 1058, 1060, 1062, 1064, 1070, 1070, 1074, 1078, 1107 1078, 1080 или 1082.
18. Сконструированная ДНК-полимераза по п. 1, где указанная сконструированная ДНК-полимераза содержит полипептидную последовательность SEQ ID NO: 24, 26, 28, 824 или 1082.
19. Сконструированная ДНК-полимераза по п. 17 или 18, где указанная сконструированная ДНК-полимераза имеет делецию из 11 или 12 аминокислот на амино-конце полипептидной последовательности.
Pyrococcus furiosus
Thermococcus
Thermus aquaticus
20. Сконструированная ДНК-полимераза по любому из пп. 1-19, имеющая по меньшей мере одно улучшенное свойство по сравнению с ДНК-полимеразой дикого типа, выбранной из ДНК-полимеразы Pfu из , ДНК-полимеразы группы B из вида  штамма 2319×1 и ДНК-полимеразы Taq из .
21. Сконструированная ДНК-полимераза по п.20, имеющая по меньшей мере одно улучшенное свойство по сравнению с ДНК-полимеразой дикого типа, где указанное улучшенное свойство выбрано из получения увеличенного количества продукта в полимеразных цепных реакциях, большей точности и большей термостабильности.
Pyrococcus furiosus
Thermococcus
Thermus aquaticus.
22. Сконструированная ДНК-полимераза по любому из пп. 1-21, где указанная сконструированная ДНК-полимераза образует больший выход продукта в полимеразных цепных реакциях, чем ДНК-полимераза дикого типа, где указанная ДНК-полимераза дикого типа выбрана из ДНК-полимеразы Pfu из , ДНК-полимеразы группы B из вида  штамма 2319×1 и ДНК-полимеразы Taq из
Pyrococcus furiosus
Thermococcus
Thermus aquaticus
23. Сконструированная ДНК-полимераза по любому из пп. 1-22, где указанная сконструированная ДНК-полимераза имеет большую точность, чем ДНК-полимераза дикого типа, где указанная ДНК-полимераза дикого типа выбрана из ДНК-полимеразы Pfu из , ДНК-полимеразы группы B из вида  штамма 2319×1 и ДНК-полимеразы Taq из .
Pyrococcus furiosus
Thermococcus
Thermus aquaticus
24. Сконструированная ДНК-полимераза по любому из пп. 1-23, где указанная сконструированная ДНК-полимераза имеет большую термостабильность, чем ДНК-полимераза дикого типа, где указанная ДНК-полимераза дикого типа выбрана из ДНК-полимеразы Pfu из , ДНК-полимеразы группы B из вида  штамма 2319×1 и ДНК-полимеразы Taq из .
25. Сконструированная ДНК-полимераза по любому из пп. 1-24, где указанная полимераза является очищенной.
26. Полинуклеотидная последовательность, кодирующая по меньшей мере одну сконструированную ДНК-полимеразу по любому из пп. 1-25.
27. Полинуклеотидная последовательность по п. 26, где указанная последовательность содержит SEQ ID NO: 1, 5, 21, 23, 25, 27 или 823.
28. Полинуклеотидная последовательность по п. 26 или 27, где указанная полинуклеотидная последовательность является функционально связанной с контрольной последовательностью.
29. Полинуклеотидная последовательность по любому из пп. 26-28, где указанная полинуклеотидная последовательность является оптимизированной по кодонному составу.
30. Экспрессирующий вектор, содержащий по меньшей мере одну полинуклеотидную последовательность по любому из пп. 26-29.
31. Клетка-хозяин, трансформированная по меньшей мере одним экспрессирующим вектором по п.30.
32. Способ получения сконструированного полипептида ДНК-полимеразы в клетке-хозяине, включающий культивирование клетки-хозяина по п.31 в подходящих условиях культивирования, так что продуцируется по меньшей мере одна сконструированная ДНК-полимераза.
33. Способ по п.32, дополнительно включающий выделение по меньшей мере одной сконструированной ДНК-полимеразы из культуры и/или клеток-хозяев.
34. Способ по п.33, дополнительно включающий стадию очистки по меньшей мере одной сконструированной ДНК-полимеразы.
35. Композиция, содержащая по меньшей мере одну сконструированную ДНК-полимеразу по любому из пп. 1-25.
36. Способ высокопроизводительного определения точности ДНК-полимеразы, включающий i) получение: по меньшей мере одной ДНК-полимеразы, указанной по любому из пп. 1-25; репортерной плазмиды, содержащей гены, кодирующие первый репортерный белок и второй репортерный белок, и селективный маркер; системы амплификации, включающей термоциклер и реагенты для проведения полимеразной цепной реакции; и системы очистки; системы трансформации, включающей компетентные клетки-хозяева; и проточного цитометра; ii) воздействие на указанную ДНК-полимеразу и указанную репортерную плазмиду указанной системы амплификации в таких условиях, что репортерная конструкция амплифицируется посредством указанной ДНК-полимеразы для получения продукта ПЦР; iii) циркуляризацию указанного продукта ПЦР для получения циркуляризованных ампликонов ПЦР; vi) трансформацию указанными ампликонами ПЦР с использованием указанной системы трансформации для получения трансформированных клеток; и vii) анализ указанных трансформированных клеток с использованием указанного проточного цитометра; и viii) определение точности указанной ДНК-полимеразы.
37. Способ по п. 36, дополнительно включающий стадию индукции указанных трансформированных клеток.
38. Способ по п. 36 или 37, где указанный первый репортерный белок содержит зеленый флуоресцентный белок.
39. Способ по любому из пп. 36-38, где указанный второй репортерный белок содержит dsRed.
40. Способ по любому из пп. 36-39, где указанный селективный маркер содержит хлорамфениколацетилтрансферазу.
41. Способ по любому из пп. 36-40, где указанную циркуляризацию указанных ампликонов ПЦР проводят с использованием по меньшей мере одной лигазы.
42. Способ по любому из пп. 36-41, где указанные ампликоны ПЦР очищают.
43. Способ по любому из пп. 36-42, дополнительно включающий определение кратности улучшения точности полимеразы по сравнению с эталонной ДНК-полимеразой.
44. Способ по п. 43, где эталонная ДНК-полимераза представляет собой полимеразу дикого типа.
Pyrococcus furiosus
Thermococcus
Thermus aquaticus
45. Способ по п. 44, где указанная полимераза дикого типа выбрана из ДНК-полимеразы Pfu из , ДНК-полимеразы группы B из вида  штамма 2319×1 и ДНК-полимеразы Taq из .