Разработка оптимальных методов криоконсервирования кроветворных клеток пуповинной крови человека для трансплантаций

Оригинальные исследования

ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Разработка оптимальных методов криоконсервирования кроветворных клеток пуповинной крови человека для трансплантаций

В.В. Гришина

Банк криоконсервированных биоматериалов ГУ Российского онкологического научного центра им. H.H. Блохина РАМН, Москва.

Ключевые слова: пуповинная кровь, гемопоэтические стволовые клетки, криоконсервация.

Целью данного исследования явилась разработка способа сбора, фракционирования пуповинной крови и криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток. Отработан способ сбора пуповинной крови в строенный контейнер Fenwal, Baxter. Разработана методика фракционирования пуповинной крови с использованием полиглюкина. Отработана методика криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток с использованием 5% раствора ДМСО в сочетании с полиглюкином и замораживании в парах жидкого азота при постоянной скорости охлаждения. Создана и протестирована компьютерная база данных для хранения информации об образцах пуповинной крови. Разработанные методики могут быть успешно применены для заготовки, длительного хранения гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови с последующей трансплантацией больным, страдающим онкологическими заболеваниями.

Введение

В настоящее время значительно возрос интерес к пуповинной крови [ПК] как к альтернативному источнику репопулирующих гемопоэтических стволовых клеток (ГСК), пригодному для трансплантации [1, 2].

Впервые трансплантация ГСК, полученных из ПК сестры (сиблинга), была произведена в 1988 году шестилетнему ребенку, страдающему анемией Фанкони [3]. К настоящему времени по всему миру произведено более 2000 неродственных и более 400 родственных трансплантаций стволовых клеток ПК как детям, так и взрослым [4-7].

Использование ПК для трансплантации имеет ряд преимуществ по сравнению с другими источниками ГСК [1, 8].

1. Сбор ПК - безопасная, технически легко выполнимая процедура, не представляющая угрозы для здоровья матери и новорожденного и не требующая общей анестезии при сборе.

2. Образцы ПК, находящиеся на длительном хранении в криобанках, типированы по HLA-системе и могут быть сразу использованы для трансплантации. Таким образом, исключаются задержки, возникающие при поиске, сборе и типирова-нии костного мозга донора, которые могут быть фатальными для больных злокачественными заболеваниями крови.

3. Увеличивается вероятность подбора ГСК редких HLA-типов для трансплантации представителям этнических меньшинств.

4. Значительно снижается риск передачи некоторых латентных инфекций, передаваемых трансмиссивным путем.

5. Многими авторами отмечена эффективность использования частично совместимых по ^А-типу трансплантатов.

6. Частота развития и тяжесть течения «реакции трансплантат против хозяина» при трансплантации ГСК ПК ниже, чем при трансплантации костного мозга.

7. Появляется недорогая форма биологического страхования жизни в связи с возможностью использования клеток ПК в качестве аутологичного трансплантата.

Принципиальным недостатком ПК можно считать малое количество ГСК, получаемых при единичной заготовке, а также невозможность повторного сбора [2, 9,10].

Поэтому основными задачами при заготовке ПК являются следующие.

1. Сбор максимального объема ПК.

2. Максимальное выделение ядросодержащих клеток (ЯСК) из ПК.

3. Сохранение жизнеспособности ГСК на всех этапах.

До начала сбора ПК беременная женщина должна дать согласие на сбор и хранение пуповинной крови ее новорожденного ребенка. Тщательно изучается соматический, акушерско-гинекологический и семейный анамнез у беременной для выявления возможных генетических нарушений и инфекционных заболеваний, передающихся гематогенным путем [2]. Каждую беременную обязательно обследуют на носительство HBs-Ag, наличие антител к возбудителям гепатита С, В1/1Ч-инфекции, сифилиса, Т-клеточного лейкоза человека и цито-мегаловирусной инфекции. При выявлении положительных серологических реакций у беременной сбор ПК не проводится.

Сбор ПК осуществляется после рождения ребенка, когда плацента еще находится в полости матки, или после рождения последа, а также во время операции кесарева сечения. Существуют закрытый и открытый способы заготовки ПК [2, 11]. При открытом способе сбор ПК осуществляется в контейнер, антикоагулянт в который добавляют вручную непосредственно перед эксфузией, что увеличивает риск микробной контаминации, получаемого материала. При использовании открытого способа сбора ПК микробная контаминация отмечается в 12,5% - 30 % случаев [1, 11]. В связи с этим, в настоящее время в большинстве зарубежных клиник для сбора ПК используют специальные закрытые трансфузионные

Тема выпуска: пуповинная кровь

системы, содержащие антикоагулянт (гепарин, кислотный-цитрат-декстроза (ACD), цитрат-фосфат-декстроза (CPD), или цитрат-фосфат-декстрозы - аденина (CPDA)), и оснащенные дренажной иглой [2]. Риск микробной контаминации при закрытом способе забора ПК составляет лишь 3,3% [12]. Кроме того, средний объем получаемой крови при закрытом способе сбора несколько выше и составляет 70-80 мл [11 ], в то время как при открытом - 60-70 мл [2, 11].

По данным литературы, объем получаемой ПК может зависеть от многих факторов, таких как масса тела новорожденного, время пересечения пуповины, срок беременности, длина пуповины [8].

Время наложения зажимов на пуповину после рождения ребенка имеет выраженное влияние на объем получаемой ПК. F. ВегйзШ et а1. показали, что если пуповина клеммиру-ется в течение 30 секунд после рождения ребенка, то объем собираемой крови в среднем составляет 77±23 мл, а если позже 30 секунд, то объем получаемой ПК уменьшается как минимум вдвое [12]. Опубликованные данные опыта нескольких учреждений показали, что пережатие пуповины и забор ПК во время отхождения плаценты (при этом используется сжимающее действие сокращающихся мышц матки) позволяет забрать больший объем ПК (в среднем 90-100 мл), чем пережатие пуповины и забор крови после отхождения плаценты (обычно около 50-60 мл) [14, 19].

Учитывая малые количества ПК в единичном образце ряд авторов рекомендует использовать объем полученной ПК для решения вопроса о целесообразности дальнейшего хранения и использования биоматериала для трансплантаций. Согласно их рекомендациям, объемы собираемой крови менее 40-45 мл подлежат выбраковке [16, 20]. Дюссельдорфский банк Неткорд с 1997 года собирает только единицы крови, потенциально пригодные для трансплантации пациентам весом 50-70 кг и имеющие объем не менее 80 мл [17].

По опыту большинства исследователей редко удается получить образцы ПК более 100 мл. Максимальный же объем ПК, по данным литературы, может составить до 200 мл [8]. Одной из основных задач при заборе ПК является максимально возможный её объем.

Криоконсервировать ПК можно и без предварительной обработки. Однако эритроциты и гранулоциты при замораживании и размораживании лизируются, и продукты лизиса могут вызывать неблагоприятные реакции у реципиента. Кроме этого, эритроциты могут быть несовместимы по эрит-роцитарным антигенам (АВО и Rh) с реципиентом. Поэтому, а также для уменьшения объема биоматериала (экономия места), перед долгосрочным хранением ПК проводят ее фракционирование для выделения ядросодержащих клеток [2].

С целью уменьшения общего объема крови и удаления эритроцитов и гранулоцитов для дальнейшего замораживания клеток используют различные методы и вещества для выделения ЯСК, такие как:

1. Седиментация желатином или гидроксиэтилкрахма-лом (гранулоциты при данном методе не удаляются) [13, 14];

2. Выделение ЯСК в градиенте плотности на основе фиколла или перколла [13];

3. Фракционирование ПК при помощи центрифугирования (эффективен для наиболее свежих образцов) [12];

4. Лизис эритроцитов хлоридом аммония [15].

В связи с вышесказанным, основной задачей при заготовке ПК является обеспечение наименьшей потери ГСК. В настоящее время в мире существует несколько методик сбора, фракционирования ПК и криоконсервирования ГСК. Актуальностью данного исследования является разработка метода фракционирования ПК, а также режима замораживания, способных обеспечить наименьшие потери клеточной массы и её функциональной активности.

Основная цель криоконсервирования ПК - сохранение жизнеспособности ГСК при длительном хранении в ультра-низких температурах [21]. Этапами криоконсервирования биоматериала являются: замещение нормальной окружающей среды клетки криофилактиком; глубокое охлаждение суспензии клеток [замораживание); длительное хранение при низких и ультранизких температурах; размораживание.

Наиболее опасными для жизнеспособности клеток при их заготовке являются этапы замораживания и размораживания. При замораживании ГСК значительная часть их может разрушаться. В основном это происходит во время перехода межклеточной среды из жидкой фазы в твердую. Для уменьшения процента гибели клеток используют специальные вещества - криопротекторы [22, 23, 24]. Традиционный метод криоконсервирования ГСК заключается в добавлении ДМСО к клеточной суспензии в концентрации 10% и замораживании в среднем на 1 градус в минуту с использованием электронного программного замораживателя и хранением в жидком азоте или парах жидкого азота [25].

Протоколы криоконсервирования для ПК в основном базируются на методиках, установленных для костного мозга и стволовых клеток периферической крови [26].

Раствор, использующийся для защиты клеток при криоконсервировании - криофилактик - должен отвечать следующим требованиям: не должен быть токсичным в концентрации 2-4 моль/л и легко проникать через мембрану [27]. В настоящее время во всем мире в качестве криофилакти-ка широко используется ДМСО. Он доказал свою ценность для криозащиты различных клеток и тканей. Его быстрое проникновение в клетку минимизирует осмотический стресс, а концентрация 1,5 М [10%) или меньшая не токсична для клеток, по крайней мере, в течение некоторого времени [25]. Однако, помимо защитной функции, ДМСО в высоких концентрациях может оказывать токсическое действие на клетки крови, приводящее, в конечном счете, к их гибели. Поэтому, в последние годы отмечена тенденция в разработке оптимальных методов криоконсервирования костного мозга и клеток ПК путем сочетания в одном растворе нескольких ограждающих веществ различного механизма действия в низких концентрациях [интрацеллюлярного раствора ДМСО и экстрацеллюлярного раствора гидроксиэтилкрахмала, альбумина) [22, 23, 24]. C. Donaldson et а1. [28] изучали влияние различных концентраций ДМСО в сочетании с 4% ГЭК [в конечной концентрации). Используя концентрации ДМСО от 5% до 10% и 4% ГЭК, авторы показали, что сохранность клеток CD34+ практически не изменялась. Однако при снижении ДМСО с 5% до 2,5%, по их данным, отмечалась гибель клеток ПК с 85,4% до 12,2%. E. Richter et а1. пришли к заключению, что 5% и 10% концентрации ДМСО с аутологичной сывороткой одинаково эффективны для криоконсервирования ПК [29]. S. Herold et а1. [30] использовали крио-защитный раствор, состоящий из трех ингредиентов - ДМСО, очищенного человеческого альбумина и среды RPMI [в пропорции: 14:5), который прибавляли к клеточной взвеси в эквивалентном соотношении 1:1 [в конечной концентрации ДМСО - 5%). После размораживания сохранность КОЕ-ГМ составила более 94%. Исходя из приведенных данных, основным криофилактиком в настоящее время остается ДМСО.

ДМСО является относительно нетоксичным веществом для реципиента, хотя некоторые авторы сообщали о неблагоприятных реакциях при инфузиях больших объемов костного мозга и периферических стволовых клеток [31]. Токсичность ДМСО является дозозависимой [32]. Возможными реакциями на введение являются тошнота, рвота, спастические боли в животе, затруднение дыхания, покраснение кожи лица и шеи, брадикардия и гипотония. Как правило, эти симптомы проходят самостоятельно. Для профилактики токсических,

Оригинальные исследования

пирогенных и аллергических реакций во время трансфузии размороженного материала больному проводят стандартную десенсибилизирующую премедикацию [33, 34].

Исходя из вышесказанного, для криоконсервации ПК необходимо использовать ДМСО в минимально допустимых концентрациях (5%) в сочетании с веществом, которое само по себе являлось бы криофилактиком и было бы наиболее благоприятной средой для ЯСК, а также не требовало бы отмывания клеточной взвеси при её применении.

После добавления криофилактика биоматериал в специальных криоконтейнерах [криомешках или криоампулах] замораживают по определенной программе [2].

Наиболее важной составляющей для сохранения в функционально-активном состоянии клеток на данном этапе является скорость охлаждения клеточной взвеси, особенно в период фазы кристаллизации [22, 28]. Оптимальной скоростью замораживания считают такую, при которой не достигается дегидратация клеток и сохраняется достаточная внутриклеточная концентрация солей для предотвращения внутриклеточного замерзания [25]. Hunt Charles J. et а1. в своих опытах показали, что нет статистически существенного различия между охлаждением ПК со скоростью 1 и 2,5°С/мин. Однако, при скорости охлаждения 10°С/мин жизнеспособность клеток значительно понижалась [26]. Donaldson С. et а1. сообщили, что жизнеспособность стволовых клеток существенно снижается уже при скорости охлаждения ПК 5°С/мин [28]. Оба этих исследования указывают, что: жизнеспособность клеток напрямую зависит от скорости охлаждения; оптимальной нормой замораживания является скорость от 1°C до 2,5°С/мин [26, 28].

Традиционно замораживание биоматериала проводится в аппарате, где жидкий азот закачивается в замораживающуюся камеру так, чтобы температура охлаждения ГСК падала с постоянной скоростью, обычно, 2°С/мин. При переходе биоматериала из жидкой стадии в твердую высвобождается теплота плавления, которая потенциально способна вызвать деструкцию клеток. Дополнительная порция азота требуется в этой точке, чтобы сгладить тепловое плато [плато кристаллизации]. Замораживание ПК в программируемом аппарате требует постоянного наблюдения со стороны оператора, тщательно следящего за соблюдением температурного режима в камере [21]. Так, в работе Gorin N.C. et а1. сообщалось о неудачных трансплантациях костного мозга, так как был нарушен температурный режим в программном замораживателе [увеличение скорости охлаждения свыше 5°С/мин после выделения теплоты плавления] [35]. Замораживание в программируемом аппарате - исторический стандарт для криоконсервации ГСК [36], хотя оно имеет следующие факторы риска, которые могут быть фатальными для больных: возможный отказ техники, электроники; человеческий фактор; перебои в электроснабжении.

В настоящее время в литературе сообщается, что для криоконсервации ГСК возможно использовать незапрог-раммированное [механическое] замораживание [36].

Некоторые исследователи описали успешное использование упрощенной техники замораживания, при которой взвесь стволовых клеток с криофилактиком помещали в механический морозильник при температуре минус 80°C, который также служил местом для длительного хранения [37].

Мы же поставили перед собой задачу разработать наиболее надежный, недорогой в использовании и в то же время - высоко эффективный метод замораживания ПК, который бы исключал использование программируемой аппаратуры.

Когда биоматериал ПК достигает заключительной температуры минус 120°C, его переносят в постоянное хранилище

в жидкий азот или пары жидкого азота [21 ]. Многие лаборатории считают хранение стволовых клеток в жидком азоте более надежным ввиду присутствия большего количества азота. Тем не менее, жидкий азот может служить источником вирусов. Лаборатории, погружающие компоненты в жидкий азот, должны иметь методику для предотвращения этого перекрестного инфицирования. Особенно важно, чтобы мешки для хранения, на которые попала кровь снаружи, в жидком азоте не хранились [38].

Максимальное время хранения, или срок годности крио-консервированной ПК, в настоящее время являются неизвестными, но при устойчивых условиях хранения ГСК, вероятно, останутся жизнеспособными в течение многих десятилетий [1]. Недавние работы Broxmeyer E. et а1. показали, что после 15 лет хранения в замороженном состоянии ГСК ПК сохраняют свою пролиферативную активность и поэтому остаются пригодными для трансплантации [39].

Размораживание стволовых клеток ПК осуществляется непосредственно перед инфузией при температуре 37°С в водяной бане [2, 11].

Основной задачей при размораживании является быстрое оттаивание внутриклеточных кристаллов льда и предотвращение таяния и повторного замерзания более крупных внутриклеточных кристаллов льда, которые могут перфорировать мембрану клетки [38]. Размороженный биоматериал может вводиться реципиенту без отмывания от криофилактика. Но поскольку пересадки ГСК ПК часто выполняются детям, относительная доза ДМСО может быть большей, чем желательна, и неблагоприятные эффекты ДМСО могут быть более серьезны. Некоторые лаборатории отмывают биоматериал немедленно после размораживания, чтобы уменьшить дозу ДМСО [14].

Одно из основных требований при заготовке ПК, которую в дальнейшем планируется использовать для трансплантации, является тщательное ведение учетных данных, а также исключение ошибки при присвоении первичного номера биоматериалу.

Контейнер с ПК, поступающий в банк на хранение, должен быть обязательно промаркирован. В маркировке указывают название лечебно-профилактического учреждения, название компонента, объем и название консервирующего средства, паспортные данные матери, пол ребенка и его массу, дату и время забора крови, температурный режим хранения [20].

Также должны быть фиксированы все результаты анализов, дата и время выделения и криоконсервации стволовых клеток, присвоенный номер биоматериала и код хранения ПК. Вся информация должна находиться как на бумажных носителях, так и занесена в базу данных компьютера.

Компьютеризированное регистрирование данных банка неродственных ПК позволяет клиницистам осуществлять поиск потенциальных трансплантатов, используя данные о количестве ядросодержащих клеток в трансплантате, данные по генетике HLA для подбора степени и типа соответствия [24].

Материалы и методы

Сбор ПК проводили из вены пупочного канатика после рождения доношенного ребенка [38-42 недели гестации] при естественных родах с соблюдением правил асептики и антисептики. Все роженицы были обследованы на носи-тельство вирусного гепатита В и С, ВИЧ-инфекцию и сифилис. Сбор ПК проводили в закрытые системы (Fenwal, Baxter и «Гемакон», Россия] с антикоагулянтом путем дренирования пупочной вены после рождения ребенка до отделения плаценты. Кровь самопроизвольно вытекала в контейнер, содержащий антикоагулянт. Заканчивали сбор

I I I I I I

ГЕ^КШ

Тема выпуска: пуповинная кровь

ПК после полного спадения пупочной вены. После этого трубку, соединяющую иглу с мешком, герметизировали с помощью металлической клеммы.

В пробах исходного материала определяли: количество лейкоцитов, тромбоцитов, эритроцитов, уровень гемоглобина, гематокрит; лейкоцитарную формулу; количество клеток с иммунофенотипом CD34+; количество КОЕ-ГМ; морфо-метрию форменных элементов [компьютерная]; жизнеспособность клеток.

Для выделения ЯСК и удаления эритроцитов в контейнер с ПК вводили полиглюкин [декстран 60000] в соотношении 1:1 и 1:2. После перемешивания, для седиментации эритроцитов, контейнер подвешивали на 30-120 минут. После появления четкой границы, разделяющей клетки от жидкой части крови, супернатант переводили в один из меньших контейнеров [второй пережимали]. После этого мешок с осадком запаивали и отсекали.

Оставшийся осадок использовали в качестве образцов для различных анализов, необходимых для тестирования ПК, а именно: определение бактериального загрязнения крови, наличие антител к ВИЧ-1/2, бледной трепонеме, HbsAg, антител к вирусу гепатита С, выявление ДНК возбудителей Neisseria gonorrhoeae, Toxoplasma gondii и цитомегало-вируса.

Для оценки эффективности полиглюкина, как седимен-тирующего вещества, а также для выявления оптимальных соотношений полиглюкина и ПК в осадке и надосадке определяли:

• количество лейкоцитов, тромбоцитов, эритроцитов, уровень гемоглобина, гематокрит;

• лейкоцитарную формулу;

• морфометрию форменных элементов [компьютерная];

• жизнеспособность клеток.

Методика криоконсервирования ГСК ПК

Д о б а в л е н и е к р и о ф и л а к т и к а

1. Для уменьшения объема надосадка супернатант концентрировали путем центрифугирования при скорости вращения центрифуги [Jouan KR 4i] 2000 оборотов в минуту в течение 10 мин при +18°С. С помощью плазмоэкстрактора из контейнера максимально удаляли плазму во второй контейнер системы для забора донорской крови. После этого мешок с плазмой запаивали и отсекали. Остаточный объем надосадка составлял 25-30 мл.

2. К полученному концентрированному надосадку, содержащему ГСК, добавляли при постоянном перемешивании равный объем полиглюкина с ДМСО [25-30 мл, из них ДМСО составлял 2,5-3 мл]. Раствор ДМСО в полиглюкине [10-12%] готовили заранее в одинарном контейнере «ком-попласт». Перемешивание ДМСО с полиглюкином сопровождалось экзотермической реакцией с выделением умеренного количества тепла. Конечная концентрация ДМСО в замораживаемом материале составляла 5-6%. Для добавления раствора ДМСО использовали Y-образную систему, которая обеспечивала одновременное смешивание раствора ДМСО и ПК и перевод их в криоконтейнер. В качестве криоконтенейра использовали криомешок «Hemofreeze DF 200», Frezenius. После перевода жидкостей в криомешок при помощи плазмоэкстрактора из него удаляли воздух и 2 мл клеточной взвеси для тестирования. Криомешок дважды запаивали ниже уровня иглы при помощи запаивателя мешков «Hemofreeze». Порт с иглой отрезали по первой линии запаивания.

3. Для определения массы клеточной взвеси мешок с биоматериалом взвешивали. Проводили пересчет массы на объем.

3 а м о р а ж и в а н и е к л е т о ч н о й в з в е с и

1. Для замораживания криомешок с клеточной взвесью помещали горизонтально в криобокс, выполненный из многослойной фанеры [общая толщина 10 мм) с плотно закрывающей крышкой и соответствующий размеру криомешка. 3атем криобокс с замораживаемым материалом переносили в пары жидкого азота при температуре минус 167±2°С.

2. Средняя скорость охлаждения биоматериала при температуре от 0°С до минус 40°С составляла 1,53 ±0,9°С/мин.

3. Через 1-2 часа от начала замораживания криомешок с биоматериалом переносили в хранилище для длительного хранения в жидкий азот. Температура хранения составляла -196°С. Время хранения биоматерила - от 1 до 30 суток.

Р а з м о р аж и в а н и е с т в о л о в ы х к л е т о к

Биоматериал размораживали непосредственно перед исследованием на водяной бане при температуре (38±2)°С до момента перехода замороженного материала в жидкую фазу.

Эффективность разрабатываемого метода криоконсервирования оценивали по следующим показателям:

• количество лейкоцитов, тромбоцитов, эритроцитов, уровень гемоглобина, гематокрит;

• лейкоцитарная формула;

• морфометрия форменных элементов [компьютерная);

• жизнеспособность клеток

• кинетика изменения температуры в биоматериале и в криобоксе на протяжении всего этапа замораживания.

Лабораторные методы исследования

1. Количество лейкоцитов, тромбоцитов, эритроцитов, гемоглобин, гематокрит определяли на гематологическом анализаторе Coulter Act8, Beckmann.

2. Подсчет лейкоцитарной формулы производили в световом микроскопе при стандартной окраске мазков по Романовскому.

3. Количество клеток с иммунофенотипом CD34+ определяли в проточном цитометре FAC Scan (Becton Dickinson USA).

4. Жизнеспособность ЯСК определяли путем окрашивания клеток трипановым синим и Annexini V.

5. Для бактериального посева образцов ПК использовали среды «HiMedia», Индия.

6. Для проведения ПЦР [полимеразная цепная реакция) использовали тест-системы ДиаГен-CMV [выявление ДНК возбудителя цитомегаловируса), ДиаГен- Toxoplasma, [выявление ДНК возбудителя Toxpolasma gondii), ДиаГен-Gonorrhoeae [выявление ДНК возбудителя Neisseria gonorrhoeae) ЗАО «Лаборатория генно-инженерных систем «Лагис».

7. Определение наличия антител к ВИЧ-1/2, HbsAg, антител к вирусу гепатита С проводили при помощи имму-ноферментного анализа.

8. Для выявления антител к бледной трепонеме в пуповинной крови использовалась реакция пассивной гемагглю-тинации [РПГА).

9. Компьютерную морфометрию форменных элементов ПК проводили на аппаратно-программном комплексе «МЕ-КОС-Ц1» производства ЗАО «Медицинские компьютерные системы». Комплекс рекомендован М3 РФ к использованию [регистрационное удостоверение № 29/100070198/ 1282-01 от 16.04.01.).

Инструментальные средства, используемые для

создания базы данных ПК

• Для проектирования системы - язык UML [Microsoft Visio2002).

I I I I I I

ГЕ^КШ

Оригинальные исследования

• СУБД - Access2000.

• Для реализации приложения - Delphi7 .

Результаты

Объектом исследования служили образцы ПК [n=278], полученные путем эксфузии из пуповинной вены после рождения и отделения новорожденных от пупочного канатика. Вес новорожденных составлял от 2450 до 4430 г.

Сбор пуповинной крови

Отработан закрытый способ забора ПК. Из 278 образцов ПК 11 собрано в систему для забора крови типа «Гема-кон» со 100 мл антикоагулянта глюгицир [из них 2 мешка разорвались при дальнейших стандартных манипуляциях, поэтому дальнейший сбор в системы «Гемакон» был прекращен], а 267 - в систему для забора крови Fenwal, Baxter с 63 мл антикоагулянт CPDA.

Антикоагулянт, содержащийся в системах, использовали полностью. Это связано с тем, что удаление части антикоагулянта приводит к разгерметизации контейнера и увеличивает потенциальный риск микробной контаминации. Кроме того, объем ПК невозможно точно знать заранее. Если даже объем собранной ПК минимален [<60 мл], то избыток антикоагулянта все равно удаляется при дальнейших манипуляциях [фракционировании, центрифугировании].

Средний объем полученной ПК в одном образце составил [n=278] 69,7±31,1мл [от 15 до 199 мл].

Среднее количество ЯСК в полученных нами образцах ПК [n=125] составило 1,04±0,53x109 [разброс от 0,15*109 до 2,66*109]. При сравнении объема и клеточности каждого образца ПК выявлена прямая достоверная зависимость между этими показателями [n=125; r=0,79, р<0,05; rs=0,82, р=0,0001]. Однако некоторые малые по объему образцы ПК имели достаточно высокую клеточность [например: в объеме 22 мл - 0,45*109 ЯСК, в 35 мл - 0,64*109].

По данным литературы, необходимое количество для трансплантации ЯСК в эксфузате ПК должно составлять 3,7*107на килограмм веса реципиента [7]. В 2001 г. Gluckman E. показала, что оптимальной дозой для трансплантаций является количество ЯСК не менее 2*107 на килограмм веса реципиента. Мы проанализировали абсолютное количество лейкоцитов в каждой единице собранной ПК с учетом этих параметров. Данные приводятся в табл. 1.

Наибольшее количество образцов [34%] содержит 0,51 -1,0*109 ЯСК, что достаточно для трансплантации реципиенту весом 25,5-50 кг [13,7-27кг]. Эксфузаты, содержащие

0,1-0,5*109 лейкоцитов, также возможно использовать для трансплантации у детей массой тела до 25 кг [13,5 кг]. Таким образом, при принятии решения о целесообразности хранения малых объемов ПК следует ориентироваться не на объем эксфузата, а на количество ЯСК в образце.

Для изучения гемопоэтического потенциала ПК в 20 эксфузатах исходной ПК был произведен подсчет клеток

с иммунофенотипом CD34+ и в 11 эксфузатах определено количество КОЕ-ГМ: среднее количество клеток CD34+ составило 2,15±1,65*106, количество КОЕ-ГМ

23,3±21,89*104. Данные свидетельствуют о том, что ПК является источником ГСК.

Также проанализирован клеточный состав ПК. В 78 образцах исходной ПК произведен подсчет форменных элементов на гематологическом анализаторе. Из них в 15 образцах определена лейкоцитарная формула. Наибольшую дисперсию имели показатели лейкоцитов, от 5,74*109/л до 31,04х109/л (15,56±5,08*109/л), и тромбоцитов, от 125х109/л до 442,31х109/л (298,36±69,50х109/л).

Для 10 образцов ПК была выполнена компьютерная морфометрия, которая наглядно отразила изменения на всех этапах заготовки ПК. Результаты морфометрии показали, что в исходной ПК присутствуют обычные для крови новорожденных типы лейкоцитов, а также эритроциты и тромбоциты. Число разрушенных ЯСК составило 7,2%.

Мы провели исследование по изменению жизнеспособности ЯСК в зависимости от температуры и времени хранения. Результаты свидетельствуют, что достоверной разницы процента погибших ЯСК при хранении в холодильнике 4±2°C и при хранении при комнатной температуре нет. Процентное содержание погибших ЯСК через 24 часа хранения статистически достоверно больше (Р=0,003), чем через 12 часов при температуре +22°C и имеет тенденцию к достоверности (Р=0,065) при температуре +4°C. Однако эта разница [1,27 % и 2,18 %, 1,25% и 1,9%) незначима.

Выделение клеточной фракции

С целью уменьшения общего объема крови и удаления эритроцитов и гранулоцитов для дальнейшего замораживания мы предлагаем для фракционирования ПК использовать полиглюкин, так как он имеет ряд преимуществ перед другими веществами [желатин, гидроксиэтилкрахмал, фиколл или перколл, хлорид аммония), применяющимися для выделения ЯСК ПК, а именно:

1. Полиглюкин является легко доступным стандартным препаратом.

2. Использование полюглюкина не требует отмывания клеточной взвеси после его применения, так как данный препарат предназначен для в/в введения.

3. Полиглюкин, благодаря своим дезагрегирующим свойствам, является наиболее благоприятной средой для ЯСК.

Для оценки полиглюкина как седиментирующего вещества было выполнено 110 опытов. Для осаждения эритроцитов производили смешивание полиглюкина с ПК в соотношении 1:1(83 опыта) и в соотношении 1:2 [27 опытов). Осаждение длилось от 30 до 120 минут (до появления четкой границы раздела сред), после чего надосадок, содержащий ЯСК, при помощи плазмоэкстрактора отделяли от осадка.

Таблица 1. Количественное распределение ЯСК ПК с учетом возможного использования для трансплантаций реципиентам различной весовой категории

Параметры Количество лейкоцитов в эксфузате

0,1-0,5х109 0,51-1,0х109 1,01-1,5 х109 1,51-2,0х109 >2х109

% образцов в исследовании

Вес реципиента из расчета 2,0 х107 клеток/кг, кг 5-25 25,5-50 50,5-75 75,5-100 >100

Вес реципиента из расчета 3,7 х107 клеток/кг, кг 2,7-13,5 13,7-27 27,2-40,5 40,8-54 >54

Тема выпуска: пуповинная кровь

57

Для оценки эффективности данного метода фракционирования определяли процент выделенных лейкоцитов, процент удаленных [от исходной ПК] эритроцитов, уровень гематокрита и гемоглобина в надосадке. Результаты приведены в табл. 2.

Как видно из таблицы, полиглюкин является эффективным седиментирующим веществом. Процент удаленных эритроцитов, уровни гемоглобина и гематокрита достоверно не различались при использовании полиглюкина в соотношении 1:1 и 1:2 [P <О,ОО1]. Однако процентное содержание выделенных лейкоцитов при соотношении полиглюкина к ПК 1:1 было

достоверно больше, чем при соотношении 1:2, что является наиболее важным показателем при фракционировании ПК. Поэтому сепарацию с использованием полиглюкина в соотношении к ПК 1:1 следует считать наиболее эффективной.

Оставшийся после фракционирования ПК осадок, содержащий, в основном, эритроциты, гранулоциты и плазму, мы предлагаем использовать в качестве образцов для различных анализов, необходимых для тестирования ПК. Такой подход позволяет избежать лишних потерь ЯСК (в сравнении с использованием цельной ПК).

Таблица 2. Сравнительная характеристика фракционирования ПК при разных соотношениях полиглюкина

№ пп Соотноошение полиглюкина к ПК n Выделение ЯСК, % Удаление эритроцитов, % Гемоглобин в надосадке, г/л Гематокрит в надосадке,%

1 1:1 83 86.2i7.34 95.95i3.68 2.5i2.2 0.83i0.71

2 1:2 27 72.37i13.42 97.10i2.83 3.4i2.7 1.14i0.76

3 Статистическая достоверность - P<0.001 P=0.17 P=0.089 P=0.059

При проведении экспериментов нами было отмечено, что фракционирование ПК проходит более успешно, если время от момента забора до момента фракционирования минимально (табл. 3). Нами установлена обратная зависимость процента выделенных ЯСК от времени хранения пуповинной крови (п=83, г=-0,3; р<0,05 и ге=-0,22; р=0,048 соответственно). Достоверной разницы показателей процента выделенных лейкоцитов при хранении ПК < 6 часов, 6 - <12 часов, 12 - <18 часов, 18 - <24 часа не было (ге=-0,21, р=0,53). Однако процентное содержание выделенных ЯСК при хранении ПК? 24 часов было достоверно меньше, чем при хранении ПК< 6 часов (ге=-0,21, р=0,0012).

Таблица 3. Зависимость эффективности фракционирования от времени хранения ПК

Время хранения ПК до фракционирования, ч n Доля выделенных ЯСК

<6 26 88.58i4.92

6 - < 12 22 86.89i6.96

12 - <18 15 85.52i7.24

18 - <24 13 85.28i7.02

>24 7 80.72i12.07

Криоконсервирование

Наиболее опасным для жизнеспособности ГСК при их заготовке является этап замораживания. Мы разработали метод криоконсервирования ГСК ПК с уменьшением концентрации ДМСО и без использования программного замора-живателя.

В качестве криопротектора ГСК мы предлагаем использовать высокоочищенный ДМСО в конечной концентрации 5% в сочетании с полиглюкином. Применение полиглюкина на этапе криоконсервации ПК позволило снизить количество ДМСО вдвое - до 5-6% конечной концентрации. Это оказалось возможным, во-первых, за счет способности

полиглюкина дезагрегировать клетки и, тем самым, улучшать проникновение криофилактика в них. Во-вторых, полиглю-кин (6% декстран) сам по себе является криофилактиком. Эффективность замораживания ПК с применением данного криофилактика, а также без использования программного замораживателя (применение криобокса) была доказана экспериментально.

Мы поставили перед собой задачу разработать наиболее надежный метод замораживания ПК, который бы исключал использование программируемой аппаратуры. Основным критерием являлась скорость охлаждения биоматериала. Она должна была быть оптимальной - от 1°C до 2,5°С/мин и не превышать 5°С/мин при охлаждении ПК от 0°C до -40°C. В результате экспериментов (использование пластиковых, деревянных контейнеров различной толщины) оказалось, что при замораживании биоматериала,помещенного в контейнер, выполненный из многослойной фанеры (толщина стенок 10 мм, размер соответствует размеру 2 криомешков DF200), в парах жидкого азота скорость охлаждения ПК соответствует заданным нами параметрам. В течение 60 минут был проведен ежеминутный замер температуры как самого криобокса, так и биоматериала. Результаты данного эксперимента представлены на рис.

Динамика температуры криобокса и биоматериала в ходе замораживания

Оригинальные исследования

Как видно из рисунка скорость охлаждения биоматериала ни в одной точке не превышает 5°С/мин и является оптимальной на отрезке замораживания биоматериала от 0 до -40°С (средняя скорость охлаждения биоматериала 1,53 ±0,9°С/мин), что отвечает заданным нами параметрам.

При этом методе замораживания сглаживается плато кристаллизации-повышение температуры биоматериала при переходе из жидкой стадии в твердую, за счет теплоты плавления, которая потенциально способна вызвать деструкцию клеток.

По разработанному нами методу были заморожены 167 образцов ПК. Время хранения биоматерила составило от 1 до 30 дней. Потерь ЯСК после размораживания не наблюдалось (оценивалось количество ЯСК до замораживания и после). В размороженных образцах определяли абсолютное количество лейкоцитов, абсолютное количество клеток с иммунофенотипом CD34+, количество жизнеспособных клеток (окрашивание трипановым синим). Результаты этих исследований приведены в табл. 4.

Таблица 4. Количественные показатели анализов размороженных образцов ПК

Параметры n Показатели

Абсолютное количество ЯСК 167 0,76±0,4х109

Абсолютное количество клеток CD34+ 167 2,74±2,67х107

Доля жизнеспособных клеток 118 92,81±3,20

Данные результаты лишь косвенно указывают на сохранность ГСК ПК, замороженных по нашему методу, так как о защитном потенциале ГСК можно судить лишь путем прямого испытания [in vivo). Доказательством эффективности нашей методики являются успешные трансплантации кри-оконсервированных 500 концентратов периферических стволовых клеток и 100 эксфузатов костного мозга больным, находящимся на лечении в РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Гематологическом НЦ РАМН, ГНЦ - институте биофизики М3 России, госпитале им. Н.Н. Бурденко МО РФ.

Архивирование пуповинной крови Для исключения ошибок при внесении первичной информации, ускоренного поиска нужных данных, а также для облегчения работы сотрудников банка нами была разработана база данных [БД).

Разработанные интерфейсы БД значительно облегчают работу при внесении данных [возможно выбрать информацию из предложенного списка], исключают внесение ошибочной информации [невозможно присвоить ПК уже существующий номер, удалить заполненную этажерку, полку], осуществляют быстрый поиск данных о ПК по заданным параметрам, защищают систему от несанкционированного доступа.

Заключение

В результате проведенных исследований показано, что для сбора ПК можно использовать стандартные строенные контейнеры для забора крови Fenwal, Baxter, из которых антикоагулянт не удаляется, а используется полностью. Выявлена прямая зависимость между числом ЯСК и объемом собранной ПК. Тем не менее, при решении вопроса о возможности дальнейшего хранения малых объемов ПК следует ориентироваться не на объем, а на абсолютное количество ЯСК в экс-фузате. Впервые установлена обратная зависимость эффективности фракционирования от времени хранения ПК с момента забора до момента начала ее обработки. Для более успешного выделения ЯСК из ПК время хранения биоматериала должно быть минимальным и не превышать 24 часов. Впервые был применен полиглюкин для фракционирования ПК. Доказана его высокая эффективность как седиментиру-ющего вещества [процент выделенных ЯСК 86,2±7,34%, процент удаленных эритроцитов - 95,95±3,68%]. Установлено, что для выделения ЯСК с минимальными потерями и более полного осаждения эритроцитов целесообразно использовать полиглюкин при добавлении к ПК в соотношении 1:1. Показано, что использование осадка, полученного после фракционирования ПК и обедненного лейкоцитарной фракцией, в качестве образцов для различных анализов значительно уменьшает потери ЯСК. Применение 5% концентрации ДМСО в сочетании с полиглюкином обеспечивает полноценность криопротекции без потерь функциональной активности ГСК, а замораживание концентрата клеток в криобоксе в парах жидкого азота эффективно [потерь ЯСК не было, доля жизнеспособных лейкоцитов после размораживания 92,81±3,20%], надежно [исключает «человеческий фактор», возможный отказ электроники, перебои в электроснабжении] и не требует дорогостоящей аппаратуры. Впервые созданная и протестированная компьютерная база данных для хранения информации о большом количестве образцов ПК позволяет исключить ошибки, ускорить поиск нужной информации и облегчить труд персонала.

Таким образом, предлагаемый единый технологический процесс, включающий в себя сбор, фракционирование, криоконсервирование и архивирование ПК позволяет максимально сохранить жизнеспособность ЯСК. Разработанные методики могут успешно применяться для заготовки и длительного хранения биоматериала, который может быть использован для трансплантаций при онкологических заболеваниях.

rMTEPATyPA:

1. Kurtzberg J. Umbilical Cord Blood Bacing and Transplantation. C.D. Hillyer et al. Blood Banking and Transfusion Medicine 2003; 593-8.

2. Burger S.R. Umbilical Cord Blood Stem Cells. Handbook of Transfusion Medicine Academic Press 2001; 171-8.

3. Gluckman E., Broxmeyer H.E. et al. Hematopoietic reconstitution in a patient with Fanconis anemia by means of umbilical-cord blood from HLA-identical sibling. N. Engl. J. Med. 1989; 321: 1174-8.

4. Glucklnan E., Rocha V., Boyer-Chammard A. et. al. Outcome of cord-blood transplantation fronm related and unrelated donors. N. Engl. J. Med. 1997; 337: 373-81.

5. Kurtzberg J., Laughlin M., Graham M.L. et al. Placental blood as al source of hematopoietic stem cells for transplantation into unrelated recipients. N. Engl. J. Med. 1996; 335: 157-66.

6. Nagarajan R., Neglia J., Ramsay N. et al. Successful treatment of refractory Langerhans cell histiocytosis with unrelated cord blood transplantation. J. Pediatr. Hematol. Oncol. 2001; 23: 629-32.

7. Gluckman E. Hematopoietic Stem-Cell transplants using umbilical-cord blood N. Engl. J. Med. 2001; 344[24): 1860-1.

8. Falkenburg J.H.F., Lim F.T.H. Использование пуповинной крови вместо костного мозга для аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток. РМЖ. 1996; 3[4): 24-31.

9. Rocha V., Cornish J., Sievers E. L. еt al. Comparison of outcomes of unrelated bone marrow and umbilical cord blood transplants in children with acute leukemia. Blood 2001; 97: 2962-71.

10. Rubinstein P., Carrier C., Scaradavou A. et al. Outcomes among 562 recipients of placental-blood transplants from unrelated donors. N. Engl. J. Med. 1998; 339[22): 1565-77.

Тема выпуска: пуповинная кровь

11. Абдулкадыров К.М., Романенко Н.А., Старков Н.Н. Получение и клиническое применение периферических гемопоэтических стволовых клеток из пуповинной крови. Вопросы онкологии 2000; 46[5): 513-20.

12. Bertolini F., Battaglia M., De Iulio C. et al. Placental blood collection: Effects on Newborns. Blood 1995; 85: 3361-2.

13. Denning-Kendall P., Donaldson C., Nicol A. et al. Optimal processing of human umbilical cord blood for clinical banking. Exp. Hematol. 1996; 24[12): 1394-401.

14. Rubinstein P., Dobrila L., Rosenfield R.E. et al. Processing and cryopreservation of placental/umbilical cord blood for unrelated bone marrow reconstitution. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1995; 92[22): 10119-22.

15. Broxmeyer H.E., Douglas G.W., Hangonc G. et al. Human umbilical cord blood as a potential source of transplantable hematopoietic stem/progenitor cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1989; 86: 3828-32.

16. Ballen K., Greiner D., Shulz L. et al. Blood 1997; 90[10): 311b [4151).

17. Kogler G., Somville T., Gobel U. et al. Haematopoietic transplant potential of related cord blood: the first six yars of the EURICORd/nETCORD Bank Germany. Klin. Pediatr. 1999; 211: 224-32.

18. Pettengell R., Luft T., Henschler R. et al. Direct comparison by limiting dilution analysis of long-term culture-initiating cells in human bone marrow, umbilical cord blood, and blood stem cells. Blood 1994; 84: 3652-9.

19. Владимирская Е.Б., Замораева Н.В., Волынин М.В. Пуповинная кровь -альтернативный источник стволовых клеток для трансплантации. Педиатрия 1997; 4: 9-12.

20. Абдулкадыров К.М. Заготовка, хранение и лабораторное тестирование пуповинной крови. В кн.: К.М. Абдулкадыров Гематология. Новейший справочник. - М.: Эксмо, 2004; 890-901.

21. Szer J. Cryopreservation and functional assment of harvested bone marrow and blood stem cells. Clinical Bone Marrow and Blood Stem Cell Transplantation 2004; 450-6.

22. Федотенков А.Г., Шишкина И.Д., Данилова Л.Д. и др. Ограждающие растворы для криоконсервирования костного мозга. Гематология и трансфузиология 1992; 7-8: 12-5.

23. Чуйков В.А. Механизм криозащитной эффективности и фармакологические свойства диметилсульфоксида. Криобиология 1989; 1: 3-10.

24. Stiff P.J., Koester A.R., Weidner M.K. et al. Autologous bone marrow transplantation using unfractionated cells cryopreserved in dymethylsulphoxide and hydroxyethyl starch without controlled-rate freezing. Blood 1987; 70[4): 974-8.

25. Gee A.P. Bone marrow processing and purging: a practical guide. 1991; 332-7.

26. Hunt C.J., Arn1itage S.E., Pegg D.E. Cryopreservation of umbilical cord blood: 2. Tolerance Of CD34+ cells to multimolar dimethyl sulphoxide and the effect of cooling rate on recovery after freezing and thawing. Cryobiology 2003; 46: 76-8.

27. Meryman H.T., Hornblower M. A method for freezing and washing red blood cells usinga highglycerol concentration. Transfusion 1972; 12: 145.

28. Donaldson C., Armitage W.J., Denning-Kendall P.A. Optimal Cryopreservation of human umbilical cord blood. Bone Marrow Transplant. 1996; 18[4): 725-31.

29. Richter E., Eichler H., Raske D. et al. 5% Me2SO is sufficient to preserve stem cells derived from cord blood. Bone Marrow Transplant. 1998; 22 [Suppl. 1): S16.

30. Herold S., Koehler A., Mueller A. et al. The placental blood program of jena cord blood bank. Blood 1997; 90[10): 326b.

31. Davis J.M., Rowley S.D., Braine H.G. et al. Clinical toxicity of cryopreserved bone marrow graft infusion. Blood 1990; 75: 781-6.

32. Calmels B., Houze P., Hengesse J. et al. Preclinical evaluation of an automated closed fluid management device: CytomateTM, for washing out DMSO from hematopoietic stem cell grafts after thawing. Reprinted from Bone Marrow Transplantation 2003; 31[9): 825-7.

33. Hertenstein B., Stefanic M., Schmeiser T. et al. Cardiac toxicity of bone marrow transplantation: predictive value of cardiologic evaluation before transplant. J. Clin. Oncol. 1994; 12: 998-1004.

34. Keung Y.K., Lau S., Elkayam U. et al. Cardiac arrhythmia after infusion of cryopreserved stem cells. Bone Marrow Transplant. 1994; 14: 363-7.

35. Gorin N.C., Douay L., David R. et al. Delayed kinetics of recovery of haemopoiesis following autologous bone mmarrow transplantation. The role of excessively rapid marrow freezing rates after the release of fusion heat. Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 1983; 19[4): 485-91.

36. Hernandez-Navarro F., Ojeda E., Arrieta R. et al. Hematopoietic cell transplantation using plasma and DMSO without RES, with non-programmed freezing by immersion in a methanol bath: Results in 213 cases. Bone Marrow Transplant. 1998; 21[5): 511-7.

37. Makino S., Harada M., Akashi K. et al. A simplified method for cryopreservation of peripheral blood stem cell at -80°C without rate-controlled freezing. Bone Marrow Transplantat. 1991; 8: 239-44.

38. Румянцев А.Г., Масчан А.А. Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток у детей. Руководство для врачей. - Москва: МИА, 2003: 907.

39. Broxmeyer H.E., Srour E.F. High-efficiency recovery of functional hematopoietic progenitor and stem cells from human cord blood cryopreserved for 15 years. PNAS 2002; 100[2): 645-50.

А