Способ биообезвреживания микотоксинов
METHOD FOR MYCOTOXINES BIOTECHBREGATION

Изобретение относится к области биологического обезвреживания микотоксинов, являющихся продуктами метаболизма грибов, поражающими и загрязняющими сельскохозяйственное сырье, продукты питания, корма для животных как в процессе выращивания сельскохозяйственных культур, так и при хранении продуктов их переработки, а именно изобретение относится к способу ферментативного гидролиза микотоксинов, молекулы которых содержат лактонное кольцо (зеараленона, патулина, дезоксиниваленола, стеригматоцистина - метаболического предшественника афлатоксинов), как в виде чистых веществ, так и в составе сложных по химическому составу сред, в том числе в сельскохозяйственном сырье, кормах для животных, продуктах питания.
Как правило, микотоксины отличаются высокой стабильностью и не разрушаются при высокой температуре, в силу чего могут сохраняться даже в прошедших термическую обработку продуктах питания и кормах. Микотоксины представляют серьезную опасность для здоровья человека и животных, так как при попадании в организм позвоночных эти соединения оказывают канцерогенное, эстрогенное, нейродегенеративное, иммуно-супрессивное и тератогенное воздействие, вызывая разного рода острые и тяжелые хронические заболевания [Zain М.Е. Impact of mycotoxins on humans and animals // J. Saudi Chemical Society, 2011, 15, 129-144; DaRocha M.E.B., Freire F.D.O., Maia F.B.F., Guedes M.I.F., Rondina D. Mycotoxins and their effects on human and animal health. // Food Control, 2014, 36, 159-165].
К числу наиболее токсичных среди известных микотоксинов относятся дезоксиниваленол (ДОН), зеараленон (ЗЕА) и патулин (ПАТ), а также стеригматоцистин (СЦН) - микотоксин и предшественник синтеза других микотоксинов - афлатоксинов [Karlovsky P., Suman М., Berthiller F., Meester J.De, Eisenbrand G., Perrin I., Oswald I.P., Speijers G., Chiodini A., Recker Т., Dussort P. Impact of food processing and detoxification treatments on mycotoxin contamination // Mycotoxin Res (2016) 32: 179-205]:
Среди способов биологического обезвреживания микотоксинов наибольший интерес вызывают ферментативные способы, так как ферменты катализируют природные процессы деструкции микотоксинов, которые протекают в условиях, благоприятных для окружающей среды, не требуют повышенных температур, атмосферного давления, присутствия агрессивных щелочных или кислотных реагентов, растворителей [Yan Zhu, Yousef I. Hassan, Christena Watts, Ting Zhou Innovative technologies for the mitigation of mycotoxins in animal feed and ingredients-A review of recent patents // Animal Feed Science & Technology (2016) 216: 19-29]. Действие ферментов имеет высокую специфическую направленность, и активность ферментов, как правило, выше, чем активность целых клеток микроорганизмов, применяемых для деградации микотоксинов, поскольку ферменты катализируют отдельные реакции, а не комплексы метаболических биохимических реакций. В отличие от микроорганизмов, ферменты не требуют наличия питательных веществ в средах, где проводится деструкция микотоксинов. Введение ферментов в среду с микотоксинами вместо интактных клеток [Патент US 008119172 В2, 2012, Microorganism for detoxification of mycotoxins, namely ochratoxins and/or zearalenons, as well as method and use thereof, A23L 1/28, C12N 1/00] существенно повышают безопасность таких процессов обработки и они, как белки, могут легко инактивироваться после разложения микотоксинов под действием различных факторов, тогда как в случае клеток микроорганизмов требуется обязательная стерилизация обрабатываемых сред.
Поскольку разными мицелиальными грибами синтезируются различные по химической структуре микотоксины, то максимальный интерес составляют ферменты и способы биологического обезвреживания микотоксинов с их помощью, основанные на каталитическом действии ферментов, которые могут применяться для разрушения нескольких микотоксинов, то есть обладающих некоторой универсальностью действия. Так сегодня известен ряд способов биологического обезвреживания ряда микотоксинов, основанных на использовании окислительно-восстановительных ферментов, в частности, лакказы, цитохрома Р-450, F420-зависимой оксидоредуктазы, Mn-пероксидазы [Wu Y.Z., Lu F.P., Jiang H.L., Tan СР., Yao D.S., Xie C.F., Liu D.L. The furofuran-ring selectivity, hydrogen peroxide production and low Km value are the three elements for highly effective detoxification of aflatoxin oxidase. // Food Chem. Toxicol., 2015, v.76, p.125-131; J.F. Alberts, W.C.A. Gelderblom, A. Botha, W.H. van Zyl Degradation of aflatoxin B1 by fungal laccase enzymes International Journal of Food Microbiology 135 (2009) 47-52; Патент WO 2009077447 A1 Process for degrading zearalenone in a feed product employing laccase (2009), C12P 1/00, A23K 1/00, A23L 1/03].
Несмотря на то, что эффективность этих способов биологического обезвреживания микотоксинов, основанных на ферментативных окислительных процессах, является относительно высокой (так, например, за 48 часов достигается максимальная (90%-ная) деградация микотоксина при его концентрации 312 мг/л, то есть скорость разложения микотоксина составляет 5,85 мг/л/ч) [Yehia R.S. Aflatoxin detoxification by manganese peroxidase purified from Pleurotus ostreatus. // Braz. J. Microbiol., 2014, v. 45(1), p. 127-3], эти способы обладают рядом существенных недостатков: нестабильность самих применяемых ферментов, требования к особым условиям их хранения и использования в способах обезвреживания микотоксинов (применение дополнительных дорогостоящих редокс-медиаторов, введение перекиси водорода в среду, необходимость обеспечения повышенных концентраций кислорода в средах, содержащих микотоксины) и др. Однако главный из недостатков заключается в том, что в результате применения этих окислительных способов ферментативной обработки микотоксинов образуются продукты не менее, а иногда и более токсичные, чем исходные токсины [Н. Zeinvand-Lorestani, O. Sabzevari, N. Setayesh, M. Amini, A. Nili-Ahmadabad, M. A.aramarzi Comparative study of in vitro prooxidative properties and genotoxicity induced by aflatoxin B1 and its laccase-mediated detoxification products // Chemosphere 135 (2015) 1-6; P. Karlovsky Biological Detoxification of Fungal Toxins and its Use in Plant Breeding, Feed and Food ProductionNat. // Toxins (1999) 7: 1-23].
Токсичность микотоксинов определяется совокупностью токсических групп, присутствующих в структуре их молекул, и в этой связи они имеют структурное сходство. Так, общая токсичность дезоксиниваленола, зеараленона, патулина и стеригматоцистина определяется наличием лактонного кольца в молекуле этих микотоксинов. В этой связи высок интерес к ферментам, способным осуществлять трансформацию именно этого лактонного кольца в структуре микотоксинов с получением продуктов трансформации, не обладающих токсичностью исходного вещества. К числу таких ферментов, катализирующих гидролиз эфирной связи в лактонном кольце относятся лактоназы.
Так, известен способ биологического обезвреживания такого микотоксина как зеараленон, основанный на гидролизе лактонного кольца в молекуле зеаралинона лактоназой, за которым следует спонтанное декарбоксилирование [Takahashi-Ando, N., Kimura, М., Kakeya, Н., Osada, Н., Yamaguchi, I., A novel lactonohydrolase responsible for the detoxification of zearalenone: enzyme purification and gene cloning. Biochemical journal, (2002), 365, 1-6; Takahashi-Ando, N.. Ohsato Sh, Shibata Т., Hamamoto H. Metabolism of Zearalenone by Genetically Modified Organisms Expressing the Detoxification Gene from Clonostachys rosea. App. Environ. Microbiol., 2004 Vol. 70, No. 6 p. 3239-3245]. Данный способ позволяет при 30°C достичь 100% эффективности биообезвреживания зеараленона при его исходной концентрации 43,4 мг/л за 38 часов в присутствии рекомбинантной полигистидинсодержащей лактоназы при внесении ее в виде высокоочищенного фермента в среду с микотоксином (Tris-HCl буфер, pH 7.5) в концентрации 1,2 мг/л [Е. Vekiru, S. Fruhauf, С. Hametner, G. Schatzmayr, R. Krska 1, W.D. Moll, R. Schuhmacher Isolation and characterisation of enzymatic zearalenone hydrolysis reaction products // World Mycotoxin J., 2016; 9 (3): 353-363]. Использование рекомбинантной лактоназы для применения этого способа на практике позволяет осуществлять наработку фермента в необходимом количестве и проводить его очистку до максимального уровня каталитической активности. Однако существенными недостатками этого способа является низкая скорость гидролиза зеараленона (1,142 мг/л/ч) и возможность использования по этому способу фермента только для гидролиза одного микотоксина - зеараленона. Для других микотоксинов, одержащих лактонное кольцо в своей структуре (патулина, дезоксиниваленола и стеригматоцистина) аналогичных реакций разложения под действием того же фермента не показано.
Данное техническое решение, как наиболее близкое к заявляемому по способу биологического обезвреживания микотоксина (зеараленона), молекула которого содержит лактонное кольцо, на основе его ферментативного гидролиза под действием фермента, обладающего лактоназной активностью, принято за прототип.
Задачей предлагаемого изобретения является способ биологического обезвреживания микотоксинов, молекулы которых содержат лактонное кольцо, на основе их ферментативного гидролиза под действием фермента с лактоназной активностью, осуществляющего высокоэффективную деструкцию микотоксинов как в виде чистых веществ, так и в составе сложных по химическому составу сред, в том числе в сельскохозяйственном сырье, кормах для животных, продуктах питания.
6
Поставленная задача решается тем, что гексагистидинсодержащая органофосфатгидролаза (His-OPH), проявляющая лактоназную активность, вводится в виде высокоочищенного растворимого или регидратированного лиофилизованного препарата, или ферментного полиэлектролитического комплекса, или препарата иммобилизованного фермента, а также в виде супернатанта клеточного гомогената в реакционную смесь, содержащую при pH 6,5-10,5 до 0,5 г/кг или 0,5 г/л микотоксина, имеющего в своей структуре лактонное кольцо.
6
6
6
Применение фермента His-OPH, проявляющего более высокую лактоназную активность с расширенным субстратным спектром действия в сравнении с природными лактоназами [Sirotkina M.S., Efremenko E.N. Rhodococcus lactonase with organophosphate hydrolase (OPH) activity and His-tagged OPH with lactonase activity: evolutionary proximity of the enzymes and new possibilities in their application. // Appl. Microb. Biotech., 2014, 98 (6), p. 2647-2656], гарантирует возможность масштабирования предлагаемого способа биологического обезвреживания различных микотоксинов, содержащих лактонное кольцо, так как применение простой процедуры выделения фермента с использованием металлохелатирующей хроматографии [Efremenko Е., Votchitseva Y., Plieva F., Galaev I., Mattiasson B. Purification of His-organophosphate hydrolase using monolithic supermacroporous polyacrylamide cryogels developed for immobilized metal affinity chromatography. // Appl. Microb. Biotech., 2006, 70 (5), p. 558-563] обеспечивает возможность его получения в промышленных количествах при использовании штамма Escherichia coli ЦКМИБХ-29 [Патент РФ №2255975 (2005) Рекомбинантная плазмидная ДНК pTES-His-OPH, кодирующая полипептид со свойствами органофосфатгидролазы, и штамм бактерий E. coli - продуцент полипептида со свойствами органофосфатгидролазы. C12N 1/21, 15/52, 15/70].
6
Предлагаемый к применению фермент His-OPH вместо природных и рекомбинантных полигистидинсодержащих лактоназ характеризуется улучшенными каталитическими характеристиками по различным лактонсодержащим субстратам, что должно обеспечить существенное улучшение показателей процесса биологического обезвреживания микотоксинов (увеличение скорости их деструкции), а также гарантирует расширение перечня микотоксинов, содержащих лактонное кольцо, подвергающихся ферментативному гидролизу.
6
Заявляемый способ биологического обезвреживания микотоксинов осуществляется тем, что к среде, содержащей микотоксин, имеющий в своем строении лактонное кольцо, и находящийся в среде при pH 6,5-10,5 в концентрации до 0,5 г/кг или 0,5 г/л в виде чистого вещества или в сложных по химическому составу смесях и композициях, в том числе в сельскохозяйственном сырье, кормах для животных, продуктах питания, привносится ферментный препарат гексагистидинсодержащей органофосфатгидролазы (His-OPH), проявляющей лактоназную активность, в виде высокоочищенного растворимого или регидратированного лиофилизованного препарата, или ферментного полиэлектролитического комплекса, или препарата иммобилизованного фермента, а также в виде супернатанта клеточного гомогената так, чтобы он обеспечивал 100% гидролиз микотоксина в течение минимального времени.
Существенным техническим результатом заявляемого изобретения является:
- проведение биологического обезвреживания микотоксинов, имеющих в своем строении лактонное кольцо, в сложных по химическому составу средах, а не только в виде чистых веществ,
- значительное увеличение скорости эффективного разложения микотоксинов при сокращении времени, необходимого для их 95-100%-ного разложения.
Заявляемое техническое решение позволяет решить существенную экологическую и экономическую проблему, связанную с обезвреживанием микотоксинов и сохранением возможности использования или безопасной последующей утилизации сельскохозяйственного сырья или продуктов его переработки.
Предлагаемый способ в отличие от аналогов и прототипа позволяет осуществить высокоэффективное биологическое обезвреживание не одного, а нескольких различных микотоксинов, имеющих лактонное кольцо, с использованием одного и того же фермента, благодаря чему может быть существенно упрощено решение проблемы разложения и детоксификации микотоксинов, продуцируемых разными микроскопическими грибами, на практике. Кроме того, способ позволяет осуществить разложение отдельных микотоксинов (патулина и стеригматоцистина), для которых вообще неизвестно аналогичное ферментативное разложение.
6
Заявляемый способ предполагает возможность применения различных каталитических форм фермента His-OPH, позволяющих сохранять стабильность действия фермента, в том числе в широком диапазоне pH и в средах с разными, в том числе и экстремально высокими и чрезвычайно токсичными концентрациями микотоксинов в присутствии накапливающихся продуктов их гидролиза, образование которых способствует снижению pH среды.
Ниже приводятся конкретные примеры реализации заявляемого технического решения.
6
Пример 1. Гидролиз зеараленона в виде чистого вещества под действием полигистидинсодержащей органойфосфатгидролазы His-OPH, вводимой в реакцию виде раствора высокоочищенного фермента
2
4
2
4
2
2
2
6
-4
Для получения высокоочищенного фермента His-OPH выращивают клетки бактерий Escherichia coli ЦКМИБХ 29 [Патент РФ №2255975 (2005) Рекомбинантная плазмидная ДНК pTES-His-OPH, кодирующая полипептид со свойствами органофосфатгидролазы, и штамм бактерий E. coli - продуцент полипептида со свойствами органофосфатгидролазы. C12N 1/21, 15/52, 15/70] на среде следующего состава: триптон - 12,0 г/л, дрожжевой экстракт - 24,0 г/л, глицерин - 4,0 мл/л, KHPO - 6,95 г/л, KHPO×3HO- 12,54 г/л, в которую добавляют CoCl×6HO (10 М), а также ампициллин (100 мкг/мл) и канамицин (25 мкг/мл). 16-часовой инокулят вносят в колбу, содержащую 100 мл питательной среды, биомассу клеток выращивают при 30°C и постоянном перемешивании (200 об/мин) до тех пор, пока оптическая плотность при длине волны 540 нм не достигнет 0,6, после чего добавляют изопропил-β,D-галактопиранозит (0,4 мМ) как индуктор синтеза целевого фермента. После этого клетки культивируют в течение 12 ч. Полученную биомассу отделяют центрифугированием (5000 g, 15 мин), взвешивают и ресуспендируют в 50 мМ фосфатном буфере (pH 7,4), содержащем 300 мМ хлорида натрия. Клетки разрушают обработкой ультразвуком (частота 44 кГц) и осадок клеточного дебриса отделяют центрифугированием (15000 g, 30 мин). К супернатанту добавляют равный объем 50% суспензии Ni-NTA агарозы в 50 мМ фосфатном буфере (pH 6,5) и перемешивают. Хроматографическую колонку заполняют полученной суспензией, промывают элюирующим буфером (50 мМ раствор фосфата натрия (pH 6,0), содержащий 300 мМ хлорид натрия) и элюируют фермент с колонки градиентным раствором имидазола (от 0 до 0,5 М). Полученные фракции, содержащие His-OPH, объединяют и подвергают диализу против 20 мМ фосфатно-карбонатного буфера (pH 8,5). В результате получают высокоочищенный препарат His-OPH с концентрацией 1 мг белка/мл и 98% гомогенностью по белку.
6
Для проведения гидролиза микотоксина в герметичную емкость, содержащую 45 мг зеараленона в 1 л 50 мМ Трис-HCl-буфера (pH 7,5), используемого для гидролиза зеараленона как в прототипе, вводят 1,2 мл высокоочищенного препарата фермента His-OPH, чтобы концентрация фермента была 1,2 мг/л, как в прототипе с гистидинсодержащей лактоназой, и оставляют при температуре 30°C без перемешивания. Через 3 часа устанавливают 100% гидролиз зеараленона. Таким образом, скорость гидролиза чистого зеараленона в тех же условиях, что указаны в прототипе, составляет 15 мг/л/ч против 1,142 мг/л/ч, то есть в 13 раз больше. При этом исходно на 1 мг белка приходится 37,5 мг зеараленона (в прототипе - 36,2 мг). Время полного гидролиза исходной концентрации зеараленона сокращено с 38 ч (как в прототипе) до 3 часов, то есть в 12,6 раза.
6
Пример 2. Гидролиз зеараленона в составе измельченного зерна пшеницы под действием His-OPH, вводимой в реакцию виде регидратированного лиофилизованного препарата
6
6
6
Для получения лиофильно высушенного препарата His-OPH, раствор высокоочищенного фермента His-OPH с 98% гомогенностью по белку, исходно полученный, как описано в Примере 1, замораживают при -20°C и высушивают на лиофильной сушилке при остаточном давлении в камере сублиматора 0,2-0,3 мБ до остаточной влажности препарата 6%. Лиофилизованный препарат His-OPH перед использованием в процессе гидролиза микотоксина регидратируют, для этого навеску сухого препарата растворяют в 20 мМ фосфатно-карбонатном буфере (pH 8,5) так, чтобы получить концентрацию 5 мг белка на 1 мл раствора.
Для проведения гидролиза зеараленона при температуре 20°C в герметичную емкость, содержащую 1 кг измельченного зерна с влажностью 84%, вводят раствор чистого вещества зеараленона в 100 мл 20 мМ фосфатно-карбонатного буфера (pH 8,5) так, чтобы получить концентрацию зеараленона 500 мг/кг зерна, и добавляют 2 мл регидратированного лиофилизованного препарата His-OPH. Через 4 часа устанавливают 100% гидролиз микотоксина. Таким образом, скорость гидролиза микотоксина составляет 125 мг/л/ч, при этом исходно на 1 мг белка приходится 12,5 мг зеараленона.
6
Пример 3. Гидролиз дезоксиниваленола в кормовом силосе под действием His-OPH, вводимой в реакцию в виде раствора высокоочищенного фермента
6
6
Для гидролиза дезоксиниваленола в составе кормового силоса согласно заявляемому способу используют раствор высокоочищенного фермента His-ОРН, полученный, как описано в Примере 1. Для проведения гидролиза дезоксиниваленола при температуре 20°C в герметичную емкость, содержащую 1 кг силоса вводят раствор чистого вещества дезоксиниваленола в 50 мл 50 мМ карбонатного буфера (pH 10,5) так, чтобы получить концентрацию зеараленона 250 мг/кг силоса, и добавляют 5 мл раствора His-ОРН. Через 4 часа устанавливают 100% гидролиз микотоксина. Таким образом, скорость гидролиза микотоксина составляет 62,5 мг/л/ч, при этом исходно на 1 мг белка приходится 50 мг дезоксиниваленола.
6
Пример 4. Гидролиз патулина в составе зернового комбикорма под действием His-OPH, вводимой в реакцию в составе супернатанта клеточного гомогената
6
6
6
Для гидролиза патулина согласно заявляемому способу, используют препарат His-OPH, исходно полученный, как описано в Примере 1 до стадии отделения осадка клеточного гомогената центрифугированием (15000 g, 30 мин), получаемого после обработки клеток ультразвуком (частота 44 кГц). Таким образом, фермент His-OPH получают в составе супернатанта в среде 50 мМ фосфатного буфера (pH 6,5) после отделения клеточного дебриса. Супернатант, имеющий общее содержание белка 150 мг/мл, далее используют для гидролиза микотоксина. Компьютерная обработка с помощью Sigma Gel Program результатов электрофоретического анализа, проведенного в SDS-полиакриламидном геле, белкового состава полученного препарата, показывает, что His-OPH в общем составе белков при такой процедуре получения супернатанта клеточного гомогената составляет 12%, то есть 18 мг/мл супернатанта клеточного гомогената.
6
Для проведения гидролиза патулина при температуре 20°C в герметичную емкость, содержащую 1 кг зернового комбикорма, с 50 мг микотоксина на 1 кг корма, вводят 200 мл предварительно разбавленного в 1000 раз супернатанта, содержащего His-OPH. Разбавление проводят 50 мМ фосфатным буфером (pH 6,5). Через 2 часа устанавливают 100% гидролиз микотоксина. Таким образом, скорость гидролиза микотоксина составляет 25 мг/л/ч, при этом исходно на 1 мг неочищенного белка приходится 13,8 мг патулина.
6
Пример 5. Гидролиз стеригматоцистина в виде чистого вещества под действием His-OPH, вводимой в реакцию в виде ферментного полиэлектролитного комплекса
6
119
50
W
6
Для гидролиза стеригматоцистина в составе кормового силоса согласно заявляемому способу используют в виде ферментного нековалентного полиэлектролитного комплекса, который получают, как описано в Петенте РФ №2525658 (2014) «Наноразмерный ферментный биокатализатор для детоксификации фосфорорганических соединений in vivo» (C12N 9/16, A62D 3/00, A61K 38/46) при использовании раствора высокоочищенного фермента His-OPH, полученного, как описано в Примере 1, и блок-сополимера полиэтиленгликоля и полиглутаминовой кислоты - ПЭГ-ПГК (M=13 кг/моль), взятых в соотношении «фермент:полианион» в зарядовом соотношении 1:5. Для проведения гидролиза стеригматоцистина при температуре 25°C в герметичную емкость, содержащую 1 л раствора чистого вещества стеригматоцистина в 50 мМ карбонатном буфере (pH 10,5) в концентрации 500 мг/л, добавляют 5 мл ферментного полиэлектролитного комплекса His-OPH. Через 2 часа устанавливают 95% гидролиз микотоксина. Таким образом, скорость гидролиза микотоксина составляет 237,5 мг/л/ч.
6
Пример 6. Гидролиз патулина в составе комбикорма для рыб под действием высокоочищенного фермента His-OPH, иммобилизованного методом сорбции на природном цеолите, обработанном низкотемпературной плазмой
6
6
3
Для гидролиза патулина в составе комбикорма для рыб, согласно заявляемому способу, используют препарат His-OPH, исходно полученный, как описано в Примере 1. Для иммобилизации фермента методом сорбции на природном цеолите, обработанном низкотемпературной плазмой, применяют известный способ [Maslova O.V., Stepanov N.A., Grigor'eva A.I., Bruyako M.G., Efremenko E.N. New effective enzymatic biopreparations based on application of mineral carriers treated by low-temperature plasma for destruction of organophosphates in soil. // Intern. J. Pharmacy &Technology, 2016, V. 8 (4), in press], согласно которому 50 мл высокоочищенного фермента His-OPH смешивают с 10 г минерального носителя, модифицированного с помощью низкотемпературной плазмы [Заявка о выдаче Патента РФ на изобретение №2016126954 от 05.07.2016], и экспонируют при 8°C в течение 6 часов при периодическом перемешивании. После этого носитель с иммобилизованным на нем методом сорбции ферментом промывают 10 мМ раствором NaHCO (pH 7.5) до постоянной остаточной ферментативной активности.
6
Для проведения гидролиза патулина при температуре 20°C в герметичную емкость, содержащую 300 г измельченного овса с 5 мг микотоксина, вводят полученные 10 г минерального носителя, содержащего His-OPH, тщательно перемешивают до равномерного распределения иммобилизованного фермента в обрабатываемой среде, добавляют 50 мл 10 мМ карбонатного буфера (pH 10,5) и вновь перемешивают. Через 0,5 часа устанавливают 100% гидролиз микотоксина. Таким образом, скорость гидролиза микотоксина составляет 10 мг/л/ч.