Выделение пептидных фракций сыворотки крови больных алкоголизмом и исследование их влияния на активность основных карбоксипептидаз

жены отдельно, что свидетельствует о существенных различиях в акустической структуре брачных криков географически отдаленных популяций одного вида лягушек. Таким образом, приведенные данные указывают, вероятно, на отсутствие географической изменчивости параметров звуковых у прудовой лягушки, и довольно значительную географическую изменчивость звуков озерной лягушки. Однако, окончательное решение вопроса об изменчивости характера звуковых

В связи с вышеизложенным, можно сделать вывод, что особенности звуковой сигнализации являются хорошим диагностическим признаком. Спектральные характеристики звукового сигнала специфичны для каждого из трёх видов зеленых лягушек и обнаруживаемые различия являются в большинстве случаев статистически достоверными. Анализ временных и частотных параметров брачных криков представляет собой точный и удобный способ идентификации видов Rana esculenta-комплекс. Таким образом, проведенные нами исследования указывают на перспективность использования биоакустического метода при изучении видов зеленых лягушек.

список литературы

1. Боркин Л. Я., Даревский И. С. Сетчатое (гибридогенное) видообразование у позвоночных // Журн. общ. биол. 1980. Т. 41. № 4. С. 485-506.

2. Кузьмин С. Л. Земноводные бывшего СССР. М.: Товарищество научных изданий КМК, 1999. 298 с.

сигналов зеленых лягушек требует увеличения объема данных.

На графике дискриминантного анализа (рис. 2) видно, что съедобная лягушка по основным акустическим параметрам занимает промежуточное положение между родительскими видами, т. е. наследование признаков звуковых сигналов съедобной лягушки происходит, видимо, по принципу, сходному с наследованием морфологических признаков.

3. Лада Г. А. Среднеевропейские зелёные лягушки (гибридогенный комплекс Rana esculenta): введение в проблему // Флора и фауна Черноземья. Тамбов: Изд-во Тамбовского университета, 1995. С. 88-109.

4. Berger L. Embrional and larval development of F1 generation of green frogs different combinations // Acta zool. Cracov. 1967. Vol. 12. № 7. P. 123-160.

5. Berger L. Morphology of the F1 generation of various crosses within Rana esculenta-complex // Acta zool. Cracov. 1968. Vol. 13. № 13. P. 301-324.

6. Lode T. Character convergence in advertisement call and mate choice in two genetically distinct water frog hybri-dogenetic lineages (Rana kl. esculenta, Rana kl. grafi) // J. Zool. Syst. Evol. 2001. № 39. C. 91-96.

7. Roesli M., Reyer H.-U. Male vocalization and female choice in the hybridogenetic Rana lessonae/Rana esculenta complex // Animal behaviour. 2000. № 60. P. 745-755.

8. Tunner H. G. Die Klonale Struktur einer Wasserfroschpopulation // Z. zool. Syst. und Evolut.-forsch. 1974. Bd. 12. № 4. S. 309-314.

таблица 2.

результаты пошагового дискриминантного анализа параметров звуковых сигналов озерной (Я. п&Ьип^), прудовой (Я. ¡еввопае) и съедобной (К. евсиЫпЪа) лягушек

Признак Факторные нагрузки

Функция 1 Функция 2 Функция 3 Функция 4

Длительность 0,13 0,05 -0,57 -0,65

Доминантная частота начала -0,11 0,06 0,30 -0,66

Максимальная доминантная частота -0,07 0,01 0,09 -0,64

Количество пульсов 0,60 0,36 -0,37 -0,40

Длительность/количество пульсов -0,62 0,22 -0,62 -0,38

Интервал между пульсами -0,64 0,28 -0,49 0,14

Х2-тест 357,36 174,49 67,96 26,80

Степени свободы 24 15 8 3

Доля объясненной дисперсии 72,91 11,26 1,63 0,88

УДК 612.015

выделение пептидных фракций сыворотки крови вольных Алкоголизмом и исследование их влияния на Активность основных кАрвокСиПЕПТиДАЗ

А. К. КОРНЕВА, А. г. БОБЫЛЁВ, А. В. КУЗНЕЦОВА, А. А. ВИНОГРАДОВА, М. Т. ГЕНГИН Пензенский государственный педагогический университет им. В. Г. Белинского

кафедра биохимии

Из сыворотки крови здоровых людей и больных алкоголизмом выделены пептидные фракции. Были использованы два метода - осаждение белков при кипячении (ь-МСМ) и при добавлении трихлоруксусной кислоты (ТХУ-МСМ).

Обнаружено, что выделенные пептидные фракции сыворотки крови влияют на активность основных карбоксипептидаз, карбоксипептидазы Н и ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы, участвующих в регуляции биосинтеза активных пептидов.

Традиционно критерием состояния организма является баланс протеиназной системы сыворотки крови. При патологических состояниях, связанных с воспалительными процессами, этот баланс нарушается, вследствие чего в крови изменяется соотношение белков и пептидов [1, 11]. Показано, что изменение содержания пептидов в сыворотке крови может служить маркером воспаления [10]. В настоящее время активно исследуются функции пептидов сыворотки крови у здоровых людей и при различных заболеваниях [13, 14].

Целью настоящей работы было получить пептидные фракции сыворотки крови здоровых людей и больных алкоголизмом и исследовать их влияние на активность протеолитических ферментов - карбоксипептидазы Н и ФМСФ-ингибируемой карбоксипеп-тидазы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

клинические группы

Исследована сыворотка крови 65 больных алкоголизмом в возрасте от 25 до 55 лет, госпитализированных в отделение неотложной наркологической помощи (ОННП) Областной наркологической больницы г. Пензы. Контрольную группу составили 6 клинически здоровых людей.

Группа 1 - больные алкоголизмом с клиническими проявлениями металкогольных психозов (алкогольного делирия (АД)).

Группа 2 - больные алкоголизмом с выраженными симптомами алкогольно-абстинентного синдрома (ААС).

Группа 3 - больные хроническим алкоголизмом с выраженными соматическими проявлениями (обострение хронических заболеваний, гепатоз, гепатит, ми-окардиопатия).

Группа 4 - больные, прошедшие курс комплексной терапии (инфузионная, антиседативные препараты, витамины, ноотропы, гепатопротекторы).

Контроль - группа клинически здоровых людей.

Получение пептидных фракций сыворотки крови

Пептидные фракции сыворотки крови получали двумя методами.

1) ТХУ-МСМ. Белки сыворотки крови осаждали при добавлении трихлоруксусной кислоты (ТХУ-МСМ). Конечная концентрация ТХУ в пробе - 7%. Белки отделяли центрифугированием (7000 об/мин, 30 мин). Супернатант диализовали против рабочего буферного раствора (0.05 М ацетат натрия, 0,05 М №С1, pH 5,6 в течение 3-5 ч.). Изменения объема фракции после диализа не наблюдалось.

2) ^МСМ. Белки сыворотки крови отделяли после тепловой денатурации. Сыворотку крови, разбавленную буферным раствором в соотношении 1:1, помещали в кипящую баню на 15 мин. Белковый осадок отделяли центрифугированием (4000 об/мин, 15 мин).

Уровень содержания пептидов во фракциях ТХУ-МСМ и ^МСМ определяли спектрофотометрически (СФ-2000). Индекс интоксикации (ИИ) А280/А260 рассчитывали аналогично [6].

определение активности карбоксипептидаз

Активность ферментов определяли по расщеплению флуорогенных субстратов: для карбоксипептида-зы Н - дансил-Phe-A1a-Aгg, селективный ингибитор гуанидиноэтилмеркаптоянтарная кислота (GEMSA), для ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы дан-сил-Phe-Leu-Aгg, селективный ингибитор фенилме-тилсульфонилфторид.

В качестве источника КП Н использовали 1 %-ный гомогенат мозга крысы, в качестве источника ФМСФ КП использовали 1 % гомогенат печени крысы.

Для экстракции продукта реакции в пробы добавляли хлороформ и после отделения хлороформной фазы и измеряли флюоресценцию на флюориметре Фм-Ц-2 (к 360 нм, к 530 нм).

^ 4 ех ; ет '

определение влияния пептидных фракций сыворотки крови на активность карбоксипептидаз

Для определения влияния фракции МСМ на активность ферментов к 150 мкл 50 мМ натрий-аце-татного буфера, рН 5,6 прибавляли 20 мкл фракции МСМ. В случае контрольной пробы 140 мкл буферного раствора и 20 мкл фракции МСМ смешивали с 10 мкл селективного ингибитора (25 мкМ водного раствора GEMSA в случае КП Н и 25 мМ спиртовой раствор ФМСФ в случае ФМСФ-КП).

Аликвоту пептидной фракции сыворотки крови добавляли к ферменту (1%-ному гомогената ткани (мозга в случае КПН и печени в случае ФМСФ-КП)), и пробы преинкубировали 8 минут при 37°С. Реакцию начинали прибавлением раствора субстрата (Dns-Phe-А1а-А^ в случае КП Н и Dns-Phe-Leu-Aгg в случае ФМСФ-КП) и по вышеуказанным методикам определяли остаточную активность карбоксипептидаз как разность флюоресценции в пробах, содержащих МСМ и селективные ингибиторы (GEMSA или ФМСФ).

Влияние фракции МСМ на активность карбокси-пептидаз рассчитывали в процентах по отношению к активности фермента без фракции МСМ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

определение индекса интоксикации

При исследовании уровня МСМ сыворотки крови обычно используется осаждение сывороточных белков трихлоруксусной кислотой (ТХУ) с последующим определением А280/А260 в надосадочной жидкости. Этот показатель - индекс интоксикации (ИИ) коррелирует с тяжестью интоксикации при различных патологиях [6].

Нам представлялось интересным исследовать влияние МСМ на активность карбоксипептидаз, но известно, что ТХУ полностью ингибирует эти ферменты.

Для получения фракций МСМ, не содержащих ТХУ, мы использовали 2 способа - диализ ТХУ-фракции сыворотки крови (ТХУ-МСМ) и удаление сывороточных белков после их тепловой денатурации (^МСМ).

Для оценки индекса интоксикации А280/А260 во фракциях, полученных кипячением сыворотки крови

(^МСМ) больных алкоголизмом по сравнению с контрольной группой здоровых людей обнаружено повышение этого показателя у больных алкоголизмом. Наиболее выражено увеличение индекса интоксикации (ИИ) у больных с тяжелыми формами алкоголизма (депрессии, психические расстройства и т. п.) (рис. 1а).

а.

б.

Индекс интоксикации ЫЖМ

Индекс интоксикации ТХУ-МСМ

1,2

0,8

0,6

0,4

0,2

коктроль (здоровые) группа 1 группа 2

контроль (здоровые) группа 1 группа 2

Рис. 1. Значения индекса интоксикации (А280/А260) в разных группах.

Контроль - группа клинически здоровых людей; группа 1 - больные алкоголизмом с выраженными симптомами алкогольного делирия (АД); группа 2 - больные алкоголизмом с алкогольно - абстинентным синдромом (ААС).

Индекс интоксикации больных алкоголизмом, оцененный по определению поглощения фракции ТХУ - МСМ после диализа оказался почти вдвое ниже, чем у контрольной группы здоровых людей (рис. 1б). Вероятно, при диализе были удалены некоторые низкомолекулярные пептиды, содержащие ароматические аминокислоты и влияющие на поглощение при 280 нм.

Исследование влияния низкомолекулярных фракций сыворотки крови на активность ФМСФ-ингиби-руемой карбоксипептидазы

ФМСФ-ингибируемая карбоксипептидаза (ФМСФ-КП) - фермент, открытый М. Т. Генгиным с сотрудниками в лаборатории биохимии ПГПУ им. В. Г. Белинского [3, 4, 7, 8], вероятно относится к классу сериновых кар-боксипептидаз. Было показано, что уровень ФМСФ-кП коррелирует с распределением биологически активных пептидов-гормонов. Предполагается, что этот фермент вовлечен в биосинтез и процессинг нейропептидов [8, 9]. Так как многие проявления алкоголизма (возбуждение, эйфория, депрессии и т. п.) напрямую связаны с нарушением баланса нейропептидов, представляет интерес изучение влияния фракций МСМ сыворотки крови больных алкоголизмом на активность ФМСФ-кП.

В качестве источника ФМСФ-КП использовали гомогенат печени крысы, определяя активность фермента с использованием специфичекского ингибитора сериновых протеина - ФМСФ и субстрата карбокси-пептидазо-В-подобных ферментов - Dns-Phe-Leu-Aгg.

Мы использовали фракции МСМ, полученные после осаждения сывороточных белков двумя методами - кипячением (^МСМ) и добавлением ТХУ. Эти

фракции оказывали различное действие на активность ФМСФ-КП. Наибольшие различия наблюдались при использовании фракции ^МСМ. Термостабильная пептидная фракция сыворотки крови здоровых людей оказывала значительное ингибирующее влияние на активность ФМСФ-КПА (остаточная активность -30 %, рис. 2).

Вероятно, в сыворотке крови здоровых людей присутствуют ингибиторы протеиназ, контролирующие активность ферментов, что сказывается на уровне активных нейропептидов. При алкоголизме уровень этих ингибиторов снижается. Так, при добавлении термостабильной фракции сыворотки крови (^МСМ) больных алкоголизмом в острой стадии алкогольного абстинентного синдрома (ААС) (1 и 2 группы) мы наблюдали лишь незначительное снижение активности ФМСФ-КП (остаточная активность - 85 %). В условиях терапии (ноотропы, седативные препараты, витамины и т. д.) ингибирующее влияние сыворотки крови больных алкоголизмом восстанавливалось, но не достигало высоких ингибирующих значений контрольной группы здоровых людей (рис. 2).

Отдельно среди наркологических больных была выделена группа людей с сочетанными патологией -хронический алкоголизм, отягощенный гепатитом, почечной и сердечной недостаточностью (группа 3, рис. 2). Фракция ^МСМ сыворотки крови больных 2-й группы оказывала наибольший ингибирующий эффект на активность ФМСФ-КП (остаточная активность - 20 %). Вероятно, при длительном употреблении алкоголя нарушаются белок-синтезирующие функции печени, что приводит к дестабилизации компенсаторных механизмов, имеющим место в остром периоде заболевания.

1

0

а.

Влияние ШСМ на активность ФМСФ-КП

б.

Влияние ТХУ-МСМ на активность ФМСФ-КП

120

* 100

Л I° 80 Ш 5

I 60 I

о 40

ТО I° 20

0

Активность ФМСФ-КП в печени крысы, %

Остаточная активность ФМСФ-КП,

%

Рис. 2. Влияние термостабильной фракции (I - МСМ) и ТХУ - МСМ фракции средних молекул сыворотки крови на активность ФМСФ - КП. Группа 1 - больные алкоголизмом с выраженными симптомами алкогольного делирия (АД); группа 2 - больные алкоголизмом с алкогольно - абстинентным синдромом (ААС); группа 3 - больные хроническим алкоголизмом с соматическими проявлениями; группа 4 - больные, прошедшие курс комплексной терапии; контроль - группа клинически здоровых людей.

На рис. 2б приведены результаты исследований по влиянию на активность ФМСФ-КП диализованной фракции сыворотки крови здоровых людей и больных алкоголизмом (ТХУ-МСМ). ТХУ-МСМ сыворотки крови здоровых людей оказывали активирующее влияние на ФМСФ-КП. Фракции ТХУ-МСМ сыворотки крови больных алкоголизмом снижали активность ФМСФ-КП в среднем на 20 % (рис. 2б).

Таким образом, фракции МСМ сыворотки крови, полученные при осаждении сывороточных белков ТХУ и кипячением, не однозначно влияли на актив-

ность ФМСФ - КП. Возможно, пептидные фракции сыворотки крови, полученные после осаждения белков разными способами, отличаются по соотношению пептидов различных молекулярных масс. Диа-лизованнная ТХУ-МСМ -фракция содержит меньше низкомолекулярных пептидов (до 1000 к Да), чем недиализованная ^МСМ (удаление белков кипячением).

Неоднозначно также действуют МСМ-фракции сыворотки крови на активность карбоксипептидазы Н (рис. 3).

а.

Влияние 1-МСМ на активность КП Н.

б.

Влияние ТХУ-МСМ на активность КП Н,

ш»

мозгкрьюы контроль (здоровые) группа 1 группа 2

200

чО

180 = 160 ¡5 140 £ 120 | 100

£ 80 I 60

I 40 20 0

и

о

мозг крысы контроль (здоровые) группа 4

Рис. 3. Влияние фракций I - МСМ и фракций ТХУ - МСМ сыворотки крови на активность КП Н.

Группа 1 - больные алкоголизмом с выраженными симптомами алкогольного делирия (АД); группа 2 - больные алкоголизмом с алкогольно - абстинентным синдромом (ААС); группа 4 - больные, прошедшие курс комплексной терапии; контроль - группа клинически здоровых людей.

КП Н - основной фермент процессинга нейропептидов, относится к классу карбоксипептидазо-В-подобных ферментов, катализирует реакцию отщеп-

ления положительно заряженных аминокислот с С-конца пептидов [2, 5, 12]. У здоровых людей фракция ^МСМ, содержащая преимущественно низкомолеку-

лярные пептиды, оказывала ингибирующее действие на активность КП Н (остаточная активность - 29,7 %), а диализованная фракция ТХУ-МСМ активировала КП Н (активность после прибавления ТХУ-МСМ -120%). Влияние ^МСМ сыворотки крови больных алкоголизмом на активность КП Н прослеживалась более четко, чем влияние диализованных ТХУ-МСМ (рис. 3).

ВЫВОДЫ

1. обнаружено, что пептидные фракции средних молекул (МСМ) сыворотки крови, полученные различными способами (осаждение белков ТХУ (ТХУ-МСМ) и кипячением (^МСМ)) по-разному действуют на активность основных карбоксипептидаз - кар-боксипептидазы Н и ФМСФ-ингибируемой карбок-сипептидазы.

2. Фракция термостабильных МСМ сыворотки крови здоровых людей подавляет активность карбок-сипептидазы Н и ФМСФ - ингибируемой карбокси-пептидазы.

3. При острых формах алкоголизма наблюдается снижение ингибирующего действия фракции ^МСМ сыворотки крови на активность карбоксипептидазы Н и ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы.

4. В условиях терапии (ноотропы, седативные препараты) уровень ингибирующего действия пептидных фракций сыворотки крови возрастал, но не достигал значений, характерных для контрольной группы здоровых людей.

список ЛИТЕРАТУРЫ

1. Буров Ю. В., Ведерникова К. М. Нейрохимия и фармакология алкоголизма. М.: Медицина, 1985. 240 с.

2. Вернигора А. Н., Генгин М. Т., Никишин Н. Н. Очистка и физико - химические свойства растворимой кар-боксипептидазы Н из серого вещества головного мозга кошки // Биохимия. 1992. Т. 57. № 11. С. 1712-1719.

3. Вернигора A. H., Генгин М. Т., Салдаев Д. А., Щетинина H. В. Распределение активности фенилметилсуль-фонилфторид - ингибируемой карбоксипептидазы в нервной ткани котов // Нейрохимия. 1997. Т. 14. № 4. С. 423-425.

4. Вернигора A. H., Никишин H. H., Генгин М. Т. Частичная характеристика основной фенилметилсуль-фонилфторид - ингибируемой карбоксипептидазы из головного мозга кошки // Биохимия. 1995. Т. 60. № 11. С. 1860-1866.

5. Вернигора A. H., Щетинина Н. В., Генгин М. Т. Исследование активности основных (отщепляющих остатки аргинина и лизина) карбоксипептидаз у крыс разного возраста // Биохимия. 1996. Т. 61. № 10. С. 1848-1856.

6. Габриэлян H. И., Липатова В. И. // Лаб. дело. 1984. № 3. С. 138-140.

7. Генгин М. Т, Вернигора A. H. Иовая карбоксипепти-даза процессинга энкефалинов нервной ткани животных // Укр. биохим. журн. 1989. Т. 61. № 3. С. 62-66.

8. Генгин М. Т., Вернигора A. H. Ферменты процессинга опиоидных пептидов и методы определения их активности // Укр. биохим. журн. 1994. Т. 66. № 2. С. 3-17.

9. Генгин М. Т. ^вая карбоксипептидаза нервной ткани. Региональное распределение и некоторые физико-химические свойства. В кн.: ^рвная система. Л.: ЛТУ, 1991. С. 29-30.

10. ^^лайч^ В. В. Молекулярные механизмы развития эндогенной интоксикации и совершенствование путей детоксикации: Aвтореф. дис. ... докт мед. наук. М., 1984.

11. Шабанов П. Д. Основы наркологии. СПб.: «Лань», 2002. 560 с.

12. Bondy С. A., Whitnall M. H., Brady L. S. Regulation of carboxypeptidase H gene expression in magnocellular neurons: response to osmotic stimulation // Mol. Endocrinol. 1989. Vol. 3. № 12. P. 2086-2092.

13. La Moel G., Strecker G., Guielle G. et al. // Artific. Organs. 1981. Vol. 4. Suppl. P. 17-21.

14. Navarro J., Gerlier D., Touvaine J. et al. // Biomedicine. 1979. Vol. 31. P. 261-264.

УДК 612.015

ВЛИЯНИЕ производных АДАМАНТАНА НА СЕРОТОНИН - ИНДУЦИРУЕМУЮ АГРЕГАЦИЮ ТРОМБОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА in vitro

А. К. КОРНЕВА*, В. А. ЕРМОХИН**, Н. А. КЛЁНОВА***

*Пензенский государственный педагогический университет им. В. Г. Белинского

кафедра биохимии **Самарский государственный университет кафедра органической химии *** Самарский государственный университет кафедра биохимии

В результате проведённого эксперимента выявлено, что синтезированные в химической лаборатории кафедры органической химии СамГУ адамантоиламинопиридины проявляют разнонаправленное действие на серотонин - индуцированную агрегацию тромбоцитов человека in vitro.

Агрегирующая и вазоконстрикторная активность ти тромбоцитов и эндотелия сосудов [6]. Рецепторы

серотонина (5 - гидрокситриптамина) проявляется че- семейства 5-НТ способны к неспецифическому взаи-

рез его связывание с 5-НТ2 рецепторами на поверхнос- модействию с веществами, имеющими в своей струк-