СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПИВНОГО СУСЛА
METHOD OF PREPARING BEER WORT

Ссылка на список последовательностей
Эта заявка содержит список последовательностей в машиночитаемой форме. Эта машиночитаемая форма включена в настоящее описание в качестве ссылки.
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к способу получения пивного сусла. Настоящее изобретение, в частности, относится к способу получения пивного сусла путем добавления особой глюкоамилазы.
Уровень техники
В современных процессах затирания ферменты часто добавляют при низком содержании ферментов в солоде или с целью использования всего смолотого зерна. Ферменты могут быть также добавлены при затирании хорошо модифицированного солода с высоким содержанием ферментов для увеличения выхода экстракта и количества ферментируемых сахаров. Используемые ферменты включают амилазу, глюкоамилазу, пуллуланазу и т.д.
В патенте США № 3379534 описано получение пива с низким содержанием декстрина при использовании амилоглюкозидазы.
В патенте США № 4536477 описана термостойкая глюкоамилаза, специально используемая для получения глюкозных сиропов из крахмала.
В публикации WO 2009/075682 описано применение особой пуллуланазы для получения пивного сусла при использовании в процессе затирания меньшего количества ферментного белка.
Aspergillus
niger
В публикации Matthews et al., 2001, Journal of Institute of brewing 107(3), p.185-194, описано получение пива с низким содержанием углеводов путем затирания при высокой температуре с использованием глюкоамилазы, выделенной из .
Все еще существует потребность в методах, позволяющих сократить время затирания и увеличить профиль сахара в процессе получения пивного сусла.
Сущность изобретения
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что при использовании особой глюкоамилазы затирание может быть произведено при добавлении меньшего количество фермента, при этом может быть сокращено время затирания и улучшен профиль сахара в сусле.
Таким образом, одним аспектом настоящего изобретения является способ получения пивного сусла, включающий добавление в затор глюкоамилазы, которая является активной в условиях затирания при температуре, равной по меньшей мере 65°С.
Другим аспектом настоящего изобретения является способ получения пивного сусла, включающий добавление в затор глюкоамилазы, которая является активной в процессе фильтрации и сохраняет по меньшей мере 10% остаточной активности при 80°С.
В соответствии с одним аспектом изобретения остаточную активность измеряют при рН 6,0 по образованию глюкозы с использованием мальтодекстрина в качестве субстрата.
Таким образом, еще одним аспектом настоящего изобретения является способ получения пивного сусла, включающий добавление в затор глюкоамилазы, которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности, представленной в SEQ ID NO:1.
В соответствии с одним аспектом изобретения процесс затирания по этому способу включает стадию инкубации, выполняемую по меньшей мере при 65°С в течение по меньшей мере 20 минут.
В соответствии с одним аспектом изобретения глюкоамилаза является активной в процессе фильтрации.
В соответствии с другим аспектом изобретения глюкоамилаза является активной в процессе затирания отварным способом.
В соответствии с другим аспектом изобретения указанный способ дополнительно включает добавление пуллуланазы.
В соответствии с другим аспектом изобретения указанный способ дополнительно включает добавление протеазы.
В соответствии с другим аспектом изобретения указанный способ дополнительно включает добавление ксиланазы.
В соответствии с другим аспектом изобретения указанный способ дополнительно включает добавление липазы.
В соответствии с другим аспектом изобретения указанный способ дополнительно включает добавление целлюлазы.
В соответствии с другим аспектом изобретения указанный способ дополнительно включает добавление амилазы.
В соответствии с другим аспектом изобретения указанный способ дополнительно включает добавление бета-глюканазы.
В соответствии с одним аспектом изобретения глюкоамилазу вводят в начале затирания.
В соответствии с другим аспектом изобретения глюкоамилазу вводят во время затирания.
В соответствии с одним аспектом изобретения глюкоамилазу вводят во время фильтрации.
В соответствии с другим аспектом изобретения глюкоамилазу добавляют при температуре от 65°С до 90°С.
В соответствии с одним аспектом изобретения в результате осуществления способа по настоящему изобретению получают сусло, содержащее более 80% глюкозы по сравнению в общим содержанием углеводов в сусле.
В соответствии с одним аспектом изобретения концентрация глюкоамилазы составляет от около 0,0005 до около 200 мг ферментного белка (ЕР) на грамм общей массы смолотого зерна.
В соответствии с одним аспектом изобретения затор получают из смолотого зерна, включающего осоложенное и/или неосоложенное зерно.
Penicillium
В соответствии с одним аспектом изобретения глюкоамилазу получают из .
Penicillium
oxalicum
В соответствии с другим аспектом изобретения глюкоамилазу получают из .
В соответствии с одним аспектом изобретения сусло далее сбраживают для получения алкогольного напитка.
В соответствии с другим аспектом изобретения алкогольным напитком является пиво.
Одним аспектом настоящего изобретения является применение для получения пивного сусла глюкоамилазы, которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности, представленной в SEQ ID NO:1.
Подробное описание изобретения
Процессы пивоварения хорошо известны в данной области и обычно включают стадии соложения, затирания и сбраживания. Затирание представляет собой процесс превращения крахмала из солода молотого ячменя и твердых добавок в ферментируемые и неферментируемые сахара для получения сусла требуемого состава. Традиционный процесс затирания включает смешивание солода молотого ячменя и добавок с водой при определенной температуре и в определенном объеме для продолжения биохимических изменений, начавшихся в процессе соложения. Процесс затирания выполняют в течение определенного периода времени при разных температурах для активации эндогенных ферментов, отвечающих за расщепление белков и углеводов. Наиболее важным изменением, происходящим в процессе затирания, является превращение молекул крахмала в ферментируемые сахара. Основными ферментами, вызывающими превращение крахмала в традиционном процессе затирания, являются альфа-амилазы, бета-амилазы и декстраназы. Альфа-амилаза очень быстро восстанавливает нерастворимый и растворимый крахмал, расщепляя молекулы крахмала на многочисленные более короткие цепи, на которые может воздействовать бета-амилаза. В результате данного процесса образуется дисахарид, представляющий собой мальтозу. Помимо мальтозы в процессе затирания образуются олигомеры глюкозы с короткими разветвленными цепями. Олигомеры глюкозы с короткими разветвленными цепями являются неферментируемыми сахарами и определяют вкус и калорийность получаемого пива. После затирания, когда весь крахмал расщеплен, необходимо отделить жидкий экстракт (солод) от твердых веществ (дробин). Отделение солода, фильтрация, имеет важное значение, так как твердые вещества содержат большое количество белка, плохо модифицированного крахмала, жиров, силикатов и полифенолов (дубильных веществ). Перед фильтрацией температура затора может быть повышена примерно до 75°С-78°С (165°F-173°F) (данный процесс известен как затирание отварным способом). Сусло, отделенное от дробин, может быть подвергнуто сбраживанию при помощи пивных дрожжей с получением пива. Экстракт, оставшийся в дробинах после отделения первого сусла, также может быть выделен путем добавления горячей воды к фильтровальной лепешке. Этот процесс называется барботажем. Горячая вода протекает через дробины и растворяет оставшийся экстракт. Разбавленное сусло называется вторым суслом, и плотность получаемого из него экстракта отличается от исходной плотности первого сусла на 1-2%. После добавления хмеля сусло кипятят. В результате этого процесса происходит денатурация многих веществ, в том числе нескольких белков, и осаждение полифенолов. После охлаждения и удаления осадка полученное пивное сусло (а) аэрируют и добавляют дрожжи. После основного процесса брожения, обычно продолжающегося в течение 5-10 дней, большую часть дрожжей удаляют и так называемое молодое пиво (b) хранят при низкой температуре, обычно при 0-5°С, в течение 1-12 недель. В течение указанного периода оставшиеся дрожжи осаждаются вместе с полифенолами. Для удаления оставшихся полифенолов пиво фильтруют. Ферментированное пиво (с) карбонизируют до розлива в бутылки. Диоксид углерода не только сообщает «полноту вкуса» или улучшает «консистенцию» и является усилителем аромата, он также увеличивает вспенивание и играет важную роль в увеличении срока хранения продукта. С дополнительной информацией, относящейся к стандартным процессам пивоварения, можно ознакомиться в публикации «Technology Brewing and Malting» by Wolfgang Kunze of the Research and Teaching Institute of Brewing, Berlin (VLB), 2nd revised Edition 1999, ISBN 3-921690-39-0.
Олигомеры глюкозы с короткими разветвленными цепями, образовавшиеся в процессе затирания, могут быть гидролизованы путем добавления экзогенных ферментов (ферментов, добавляемых в солод). Ферменты, расщепляющие разветвленные цепи, такие как пуллуланаза и изоамилаза, гидролизуют альфа-1-6-гликозидные связи, образующие разветвленные цепи, в процессе расщепления крахмала, облегчая, таким образом, гидролиз, осуществляемый бета-амилазой и глюкоамилазами, в результате чего образуется больше мальтозы и глюкозы и меньше неферментируемых декстринов.
Одним аспектом настоящего изобретения является способ получения пива с низким содержанием углеводов. Типичное сусло состоит из смеси выделенных из крахмала углеводов, которые классифицируются как ферментируемые или неферментируемые углеводы в зависимости от их способности превращаться в этанол под воздействием пивных дрожжей. В обычном процессе затирания ферментируемые углеводы образуются в результате гидролиза зернового крахмала альфа- и бета-амилазами солода. Крахмал является полимером глюкозы, в котором остатки глюкозы связаны альфа-1,4 связями или альфа-1,6 связями. Во время цикла затирания крахмал сначала солюбилизируется, после чего часть молекул крахмала гидролизуется с образованием неферментируемых декстринов и низкомолекулярных сахаров, таких как глюкоза, мальтоза и мальтотриоза, которые под воздействием пивных дрожжей могут ферментироваться в этанол. Фракция неферментируемого или предельного декстрина состоит из всех сахаров с более высокой степенью полимеризации (DP), чем у мальтотриозы. Состав сусла может варьировать в зависимости от исходного материала, циклов затирания и других переменных параметров. Углеводы типичного сусла состоят из 65-80% ферментируемых сахаров и 20-35% неферментируемых предельных декстринов. Во время брожения ферментируемая фракция превращается в этанол до конечной концентрации 3-6% масс./масс. Предельные декстрины не превращаются в этанол и остаются в полученном пиве, увеличивая содержание углеводов в напитке. При получении пива с низким содержанием углеводов или сверхсбраженного пива предпринимается попытка получить большую долю спирта и меньшее количество остаточного декстрина. В пивоварении часто используют глюкоамилазы для уменьшения содержания предельных декстринов. Однако, поскольку глюкоамилазы более эффективно гидролизуют альфа-1,4 связи и менее эффективно гидролизуют альфа-1,6 связи, указанные ферменты обычно используют в очень больших концентрациях.
Одним аспектом настоящего изобретения является способ получения сусла с низким содержанием неферментируемых сахаров. Другим аспектом изобретения является способ получения сусла с высоким содержанием глюкозы. Еще одним аспектом изобретения является способ получения сусла с низким содержанием мальтозы. Способ по настоящему изобретению характеризуется активностью должным образом выбранной глюкоамилазы.
Было установлено, что применение глюкоамилаз, которые являются активными при гораздо более высоких температурах, чем глюкоамилазы, обычно используемые в пивоварении, характеризуется целым рядом преимуществ. Например, при использовании глюкоамилаз, проявляющих активность во время фильтрации, было установлено, что такие глюкоамилазы оказывают благоприятное воздействие не только на стадии осахаривания, но также на протяжении остальной части процесса фильтрации. Поэтому может быть использовано меньшее количество глюкоамилазы для достижения действительной степени ферментации (RDF). Альтернативно способ по настоящему изобретению позволяет достичь более высоких значений RDF и/или сократить время осахаривания при 60-64°С. Также было установлено, что глюкоамилаза, активная при более высоких температурах, позволяет вводить в затор добавки, крахмал которых характеризуется высокой температурой желатинизации, такие как кукуруза, рис и сорго. Высокий уровень гидролиза крахмала в таких добавках достигается при наличии активности глюкоамилазы в процессе желатинизации крахмала. Кроме того, было установлено, что более высокая эффективность может быть достигнута при добавлении пуллуланазы и включения в процесс затирания стадии выдерживания, когда происходит желатинизация крахмала добавок и пуллуланаза и глюкоамилаза находятся в активном состоянии.
Определения терминов
В настоящем описании изобретения использованы разные термины, значение которых известно специалистам в данной области. Однако несколько терминов имеют специальные значения, определяемые ниже.
В использованном здесь значении термин «смолотое зерно» означает сырье, содержащее крахмал или сахар, которое является основой для производства пива, например ячменный солод и добавляемое зерно. Смолотое зерно не содержит добавленной воды.
Термин «солод» означает любое осоложенное зерно хлебного злака, в частности ячмень.
Термин «добавка» означает часть смолотого зерна, которая не является ячменным солодом. Добавка может быть любым растительным сырьем с высоким содержанием крахмала, например неосоложенным зерном, которое включает, не ограничиваясь ими, ячмень, кукурузу, рис, сорго и пшеницу, а также может включать легко ферментируемый сахар и/или сироп. Крахмал некоторых добавок характеризуется относительно низкой температурой желатинизации, что позволяет вводить их в затор вместе с солодом, в то время как другие добавки, такие как рис, кукуруза и сорго, характеризуются более высокой температурой желатинизации, и такие добавки обычно готовят отдельно и ожиживают, используя альфа-амилазу, до добавления их в затор.
Термин «затор» означает крахмалосодержащую пульпу, включающую измельченный ячменный солод, измельченное неосоложенное зерно, другое крахмалсодержащее сырье или их комбинацию, пропитанную водой и предназначенную для получения сусла.
Термин «сусло» означает неферментированную жидкость, получаемую после экстракции смолотого зерна в процессе затирания.
Термин «дробины» означает отделенные твердые вещества, оставшиеся после экстракции смолотого зерна и отделения сусла.
Термин «пиво» означает сбраженное сусло, то есть алкогольный напиток, полученный из ячменного солода, необязательной добавки и хмеля. Термин «пиво» в использованном здесь значении означает по меньшей мере пиво, приготовленное из затора, полученного из неосоложенных хлебных злаков, а также из затора, полученного из осоложенных хлебных злаков, и всех заторов, полученных из смеси осоложенных и неосоложенных хлебных злаков. Термин «пиво» означает разные виды пива, полученные с использованием добавок, и разные виды пива, содержащие все возможные спиртовые фракции.
о
р
о
р
с
Термин «желатинизация крахмала» означает необратимое упорядоченное и неупорядоченное превращение, которому подвергается крахмал при нагревании в присутствии воды. Исследование постепенного процесса желатинизации крахмала и определение начальной и максимальной температуры (Т и Т) желатинизации крахмала может быть выполнено при помощи дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC). Термин «начальная температура желатинизации (Т)» означает температуру, при которой начинается процесс желатинизации. Термин «максимальная температура желатинизации (Т)» означает температуру эндотермального максимума. Термин «конечная температура желатинизации (Т)» означает температуру, при которой заканчивается процесс желатинизации.
Идентичность последовательностей: подобие двух аминокислотных последовательностей определяется параметром «идентичности последовательностей».
В соответствии с целями настоящего изобретения идентичность двух аминокислотных последовательностей определяется с помощью алгоритма Нидлмана-Ванша (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), использованного в программе Needle пакета программ EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends in Genetics 16: 276-277), предпочтительно версия 5.0.0 или более поздняя версия. В указанной программе использованы следующие параметры: штраф за разрыв 10, штраф за удлинение разрыва 0,5 и матрица замен EBLOSUM62 (версия BLOSUM62 пакета программ EMBOSS). Значение «самой длинной идентичной последовательности», указанной в программе Needle (полученной при использовании опции -nobrief), служит в качестве процентного значения идентичности и вычисляется следующим образом:
(идентичные остатки × 100)/(длина сравниваемой последовательности - общее число разрывов в сравниваемой последовательности)
Получение сусла
Одним аспектом настоящего изобретения является способ получения пивного сусла, который включает добавление в затор глюкоамилазы, активной в условиях затирания при температуре, равной по меньшей мере 65°С.
Другим аспектом изобретения является способ получения пивного сусла, включающий добавление в затор глюкоамилазы, которая остается активной во время фильтрации и сохраняет по меньшей мере 10% остаточной активности при 80°С.
В соответствии с одним аспектом изобретения остаточную активность измеряют при рН 6,0 по образованию глюкозы с использованием мальтодекстрина в качестве субстрата.
Одним аспектом настоящего изобретения является способ получения пивного сусла. В частности, настоящее изобретение относится к способу получения пивного сусла, включающему добавление в затор глюкоамилазы, которая по меньшей мере на 50% идентична последовательности, представленной в SEQ ID NO:1.
В соответствии с одним аспектом изобретения затор получают путем измельчения смолотого зерна, включающего солод и/или добавку. Смолотое зерно, к которому может быть предпочтительно добавлена вода, предварительно нагревают для достижения требуемой температуры в момент образования затора. Если температура образовавшегося затора ниже требуемой температуры, производят дополнительное нагревание для достижения требуемой температуры. Требуемая температура затора предпочтительно достигается в течение 15 минут или более предпочтительно в течение 10 минут, например в течение 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 минут, еще предпочтительнее в течение 1 минуты после образования затора, или наиболее предпочтительно требуемая температура достигается в момент образования затора. Профиль температур в процессе затирания может быть аналогичен профилю температур в обычном процессе затирания, при осуществлении которого температуры задаются с возможностью достижения оптимального расщепления сухого смолотого зерна солодовыми ферментами.
Процесс затирания обычно включает контролируемое ступенчатое повышение температуры, при котором каждая стадия соответствует одному ферментативному действию, следующему за другим действием, в результате чего происходит разрушение белков, стенок клеток и крахмала. Профили температур процесса затирания хорошо известны в данной области. В настоящем изобретении стадию осахаривания (расщепления крахмала) в процессе затирания предпочтительно осуществляют при температуре от 60°С до 66°С, более предпочтительно от 61°С до 65°С, еще предпочтительнее от 62°С до 64°С и наиболее предпочтительно от 63°С до 64°С. В конкретном варианте осуществления изобретения температура осахаривания равна 64°С.
Одним аспектом настоящего изобретения является способ получения пивного сусла, включающий добавление в затор глюкоамилазы, которая является активной в условиях затирания при температуре, равной по меньшей мере 65°С. В соответствии с другим аспектом изобретения глюкоамилаза является активной в условиях затирания при температуре, равной по меньшей мере 68°С, например, 70°С, например, 72°С, например, 75°С, например, 76°С, например, 77°С, например, 78°С, например, 79°С, например, 80°С.
В соответствии с одним аспектом изобретения глюкоамилаза является активной во время фильтрации затора.
В соответствии с одним аспектом изобретения процесс затирания по настоящему изобретению включает, не ограничиваясь ею, стадию затирания отварным способом. В соответствии с одним аспектом изобретения стадия затирания отварным способом включает, не ограничиваясь ею, инкубацию затора при температуре, равной по меньшей мере 65°С, в течение по меньшей мере 20 минут. В соответствии с одним аспектом изобретения стадия затирания отварным способом включает инкубацию затора при температуре, равной по меньшей мере 65°С, например, по меньшей мере 66°С, по меньшей мере 67°С, по меньшей мере 68°С, по меньшей мере 69°С, по меньшей мере 70°С, по меньшей мере 71°С, по меньшей мере 72°С, по меньшей мере 73°С, по меньшей мере 74°С, по меньшей мере 75°С, по меньшей мере 76°С, по меньшей мере 77°С, по меньшей мере 78°С, по меньшей мере 79°С, по меньшей мере 80°С, по меньшей мере 81°С, по меньшей мере 82°С, по меньшей мере 83°С, по меньшей мере 84°С или по меньшей мере 85°С, в течение по меньшей мере 20 минут, например, по меньшей мере 25 минут, по меньшей мере 30 минут, по меньшей мере 35 минут, по меньшей мере 40 минут, по меньшей мере 45 минут, по меньшей мере 50 минут, по меньшей мере 55 минут, по меньшей мере 60 минут, по меньшей мере 65 минут, по меньшей мере 70 минут, по меньшей мере 75 минут, по меньшей мере 80 минут, по меньшей мере 85 минут, по меньшей мере 90 минут, по меньшей мере 95 минут, по меньшей мере 100 минут, по меньшей мере 105 минут, по меньшей мере 110 минут, по меньшей мере 115 минут, по меньшей мере 120 минут, по меньшей мере 125 минут, по меньшей мере 130 минут, по меньшей мере 135 минут, по меньшей мере 140 минут, по меньшей мере 145 минут и по меньшей мере 150 минут. В конкретном варианте осуществления изобретения затирание отварным способом выполняют при 75°С в течение 120 минут.
В соответствии с одним аспектом изобретения значение рН затора находится в пределах от около 4,6 до около 6,4. В соответствии с другим аспектом изобретения значение рН находится в пределах от около 4,6 до 6,2, например, в пределах от около 4,8 до около 6,0, предпочтительно в пределах от около 5,0 до около 6,0, более предпочтительно в пределах от около 5,0 до около 5,6, еще предпочтительнее в пределах от около 5,0 до около 5,4.
Солод предпочтительно получают из одного или нескольких видов зерна, выбираемых из кукурузы, ячменя, пшеницы, ржи, сорго, проса и риса. Солод предпочтительно является ячменным солодом. Из смолотого зерна предпочтительно получают от 0,5% до 99%, предпочтительно от 1% до 95%, более предпочтительно от 5% до 90%, еще предпочтительнее от 10% до 80% солода.
Помимо осоложенного зерна смолотое зерно предпочтительно включает добавку, такую как неосоложенная кукуруза или другое неосоложенное зерно, например ячмень, пшеница, рожь, овес, кукуруза, рис, майло, просо и/или сорго, или неочищенное и/или очищенное сырье, содержащее крахмал и/или сахар, полученное из таких растений, как пшеница, рожь, овес, кукуруза, рис, майло, просо, сорго, картофель, батат, маниок, тапиока, саго, банан, сахарная свекла и/или сахарный тростник. В соответствии с настоящим изобретением добавки могут быть получены из клубней, корней, стеблей, листьев, бобов, хлебных злаков и/или цельного зерна. Предпочтительными являются добавки, получаемые из кукурузы и/или риса, более предпочтительной добавкой является рисовый крахмал, кукурузный крахмал и/или кукурузная мука грубого помола. Затор предпочтительно содержит от 1% до 60%, предпочтительно от 5% до 45%, более предпочтительно от 10% до 40% добавленного крахмала. Добавка может также включать легко ферментируемые углеводы, такие как сахара или сиропы, и может быть добавлена в солодовый затор до, во время или после процесса затирания по настоящему изобретению, но добавку предпочтительно вводят после процесса затирания. До образования затора солод и/или добавку предпочтительно измельчают и наиболее предпочтительно подвергают сухому или мокрому помолу. В соответствии с одним аспектом изобретения добавка имеет высокую температуру желатинизации, в частности более высокую начальную температуру желатинизации, например, такую как у кукурузы, риса и сорго. В соответствии с одним аспектом изобретения добавку желатинизируют до затирания. В соответствии с другим аспектом изобретения добавку не желатинизируют до затирания.
В соответствии с одним аспектом изобретения затор включает по меньшей мере 20% добавок, которые имеют температуру желатинизации крахмала, предпочтительно начальную температуру желатинизации, равную по меньшей мере 65°С. В соответствии с другим аспектом изобретения затор включает по меньшей мере 25%, например, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65% добавок, имеющих температуру желатинизации, предпочтительно начальную тьемпературу желатинизации, равную по меньшей мере 65°С.
В соответствии с одним аспектом изобретения затор включает по меньшей мере 10% неосоложенного зерна по сравнению с общим количеством смолотого зерна. В соответствии с другим аспектом изобретения затор включает по меньшей мере 15%, например по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60% неосоложенного зерна.
В соответствии с одним аспектом изобретения добавка является кукурузой. В соответствии с другим аспектом изобретения затор включает по меньшей мере 20% кукурузной добавки. В соответствии с одним аспектом изобретения затор включает по меньшей мере 25%, например по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, в частности по меньшей мере 60% кукурузной добавки.
В соответствии с одним аспектом изобретения в затор добавляют нежелатинированную кукурузу.
В соответствии с одним аспектом изобретения добавка является рисом. В соответствии с другим аспектом изобретения затор включает по меньшей мере 20% рисовой добавки. В соответствии с одним аспектом изобретения затор включает по меньшей мере 25%, например по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, в частности по меньшей мере 60% рисовой добавки.
В соответствии с одним аспектом изобретения в затор добавляют нежелатинированный рис.
В соответствии с одним аспектом изобретения в затор добавляют экзогенную глюкоамилазу и/или глюкоамилаза изначально присутствует в заторе. В соответствии с одним аспектом изобретения глюкоамилазу вводят в начале затирания. В соответствии с другим аспектом изобретения глюкоамилазу вводят в процессе затирания. В соответствии с другим аспектом изобретения глюкоамилазу вводят во время фильтрации.
В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения в затор добавляют еще один или несколько ферментов, которые включают, не ограничиваясь ими, альфа-амилазу, изоамилазу, протеазу, целлюлазу, глюканазу, лакказу, ксиланазу, липазу, фосфолиполазу, фитазу, фитин и эстеразу.
В соответствии с одним аспектом изобретения при осуществлении способа по настоящему изобретению добавляют еще один фермент, который включает, не ограничиваясь ею, пуллуланазу.
В соответствии с одним аспектом изобретения при осуществлении способа по настоящему изобретению добавляют еще один фермент, который включает, не ограничиваясь ею, амилазу, предпочтительно альфа-амилазу.
В соответствии с одним аспектом изобретения при осуществлении способа по настоящему изобретению добавляют еще один фермент, который включает, не ограничиваясь ею, протеазу.
В соответствии с одним аспектом изобретения при осуществлении способа по настоящему изобретению добавляют еще один фермент, который включает, не ограничиваясь ею, целлюлазу.
В соответствии с одним аспектом изобретения при осуществлении способа по настоящему изобретению добавляют еще один фермент, который включает, не ограничиваясь ею, ксиланазу.
В соответствии с одним аспектом изобретения при осуществлении способа по настоящему изобретению добавляют еще один фермент, который включает, не ограничиваясь ею, липазу.
В соответствии с одним аспектом изобретения при осуществлении способа по настоящему изобретению добавляют еще один фермент, который включает, не ограничиваясь ею, глюканазу, предпочтительно бета-глюканазу.
В соответствии с одним аспектом изобретения при осуществлении способа по настоящему изобретению достигаются более высокие уровни глюкозы в сусле. В соответствии с одним аспектом изобретения содержание глюкозы увеличивается по меньшей мере на 1%, например по меньшей мере на 2%, по меньшей мере на 3%, по меньшей мере на 4%, по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 6%, по меньшей мере на 7%, по меньшей мере на 8%, по меньшей мере на 9%, по меньшей мере на 10% по сравнению с суслом, приготовленным при отсутствии такой глюкоамилазы.
В соответствии с одним аспектом изобретения при осуществлении способа по настоящему изобретению получают сусло, содержащее по меньшей мере 80% глюкозы по сравнению с общим содержанием углеводов в сусле. В соответствии с другим аспектом изобретения сусло содержит по меньшей мере 81% глюкозы, например по меньшей мере 82%, по меньшей мере 83%, по меньшей мере 84%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 92,5%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 93,5%, по меньшей мере 94% глюкозы по сравнению с общим содержанием углеводов в сусле.
В соответствии с одним аспектом изобретения в затор и/или сусло не добавляют глюкозный сироп.
В соответствии с другим аспектом изобретения при осуществлении способа по настоящему изобретению дополнительная глюкоза образуется при температурах в интервале от 65°С до 90°С. В соответствии с одним аспектом изобретения дополнительная глюкоза, образовавшаяся при температурах в интервале от 65°С до 90°С, составляет по меньшей мере 1%, например по меньшей мере 2%, по меньшей мере 3%, по меньшей мере 4%, по меньшей мере 5%, по меньшей мере 6%, по меньшей мере 7%, по меньшей мере 8%, по меньшей мере 9%, по меньшей мере 10% по сравнению с суслом, приготовленным при отсутствии такой глюкоамилазы.
В соответствии с одним аспектом изобретения при осуществлении способа по настоящему изобретению достигается более низкая концентрация мальтозы в сусле. В соответствии с одним аспектом изобретения концентрация мальтозы уменьшается по меньшей мере на 0,5%, например по меньшей мере на 1%, по меньшей мере на 2%, по меньшей мере на 3%, по меньшей мере на 4%, по меньшей мере на 5% по сравнению с суслом, приготовленным при отсутствии такой глюкоамилазы.
В соответствии с одним аспектом изобретения при осуществлении способа по настоящему изобретению увеличивается концентрация глюкозы и уменьшается концентрация мальтозы в сусле. В соответствии с одним аспектом изобретения концентрация глюкозы увеличивается по меньшей мере на 1%, например по меньшей мере на 2%, по меньшей мере на 3%, по меньшей мере на 4%, по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 6%, по меньшей мере на 7%, по меньшей мере на 8%, по меньшей мере на 9%, по меньшей мере на 10% и концентрация мальтозы уменьшается по меньшей мере на 0,5%, например, по меньшей мере на 1%, по меньшей мере на 2%, по меньшей мере на 3%, по меньшей мере на 4%, по меньшей мере на 5% по сравнению с суслом, приготовленным при отсутствии такой глюкоамилазы.
В соответствии с одним аспектом изобретения при осуществлении способа по настоящему изобретению сокращается время затирания. В соответствии с одним аспектом изобретения при осуществлении способа по настоящему изобретению время затирания сокращается по меньшей мере на 5 минут, например по меньшей мере на 10 минут, по меньшей мере на 15 минут, по меньшей мере на 20 минут, по меньшей мере на 25 минут, более предпочтительно по меньшей мере на 30 минут по сравнению со способом, выполняемым при отсутствии такой глюкоамилазы.
В соответствии с одним аспектом изобретения при осуществлении способа по настоящему изобретению время затирания составляет менее 120 минут. В соответствии с другим аспектом изобретения время затирания составляет менее 110 минут, например менее 100 минут, менее 90 минут, менее 80 минут, менее 70 минут, менее 60 минут, менее 50 минут, в частности менее 40 минут.
В соответствии с одним аспектом изобретения при осуществлении способа по настоящему изобретению сокращается время осахаривания, то есть время в процессе затирания, когда температура находится в интервале от 60°С до 66°С. В соответствии с одним аспектом изобретения время осахаривания составляет менее 60 минут. В соответствии с другим аспектом изобретения время осахаривания составляет менее 58 минут, например менее 56 минут, менее 54 минут, менее 52 минут, менее 50 минут, менее 48 минут, менее 46 минут, менее 44 минут, менее 42 минут, менее 40 минут, менее 38 минут, менее 36 минут, менее 34 минут, менее 32 минут, менее 30 минут, менее 28 минут, менее 26 минут, менее 24 минут, менее 22 минут, в частности менее 20 минут.
В соответствии с другим аспектом изобретения при осуществлении способа по настоящему изобретению уменьшается количество вводимого фермента, в частности количество глюкоамилазы. В соответствии с одним аспектом изобретения количество вводимой глюкоамилазы уменьшается по меньшей мере на 10%, например по меньшей мере на 15%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 35%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 45%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 55%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, в частности по меньшей мере на 75% по сравнению со способом, выполняемым при использовании известной глюкоамилазы.
В процессе затирания крахмал, экстрагируемый из смолотого зерна, постепенно гидролизуется в ферментируемые сахара и декстрины с более короткими цепями. Затор предпочтительно не содержит крахмала при тестировании йодом до экстракции сусла.
Приготовление сусла из затора обычно включает процеживание сусла с целью отделения дробин, то есть нерастворимого зерна и шелухи, составляющей часть смолотого зерна. Дробины вымывают, пропуская через них или разбрызгивая горячую воду, благодаря чему из смолотого зерна удаляется оставшийся экстракт. Необязательное применение термостойкой целлюлазы при осуществлении способа по настоящему изобретению позволяет эффективно снизить уровень бета-глюкана, что облегчает процеживание сусла, в результате чего сокращается время цикла и достигается более высокий выход экстракта. Выход экстракта предпочтительно составляет по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 81%, более предпочтительно по меньшей мере 82%, еще предпочтительнее по меньшей мере 83%, в частности, по меньшей мере 84%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 91%.
Saccharomyces
S
cerevisiae
S
uvarum
После отделения от сусла дробин смолотого зерна сусло может быть использовано в том виде, как есть, или может быть обезвожено для получения концентрированного и/или высушенного сусла. Концентрированное и/или высушенное сусло может быть использовано в качестве пивного экстракта, для ароматизации солодового экстракта при производстве безалкогольных солодовых напитков, солодового уксуса, изделий из дробленого зерна для завтрака, кондитерских изделий и т.д. В предпочтительном варианте осуществления изобретения сусло сбраживают для приготовления алкогольного напитка, предпочтительно пива, например эля, крепкого эля, горького пива, крепкого портера, черного пива, легкого пива, экспортного пива, солодового напитка, ячменного вина, happoushu (японское пиво), высокоалкогольного пива, слабоалкогольного пива, низкокалорийного пива или светлого пива. Сбраживание сусла может включать введение в сусло жидкого дрожжевого раствора, содержащего свежие дрожжи, то есть ранее не использовавшиеся дрожжи, или рециркулированные дрожжи. Могут быть использованы любые дрожжи, пригодные для пивоварения, в частности, дрожжи, выбираемые из видов  spp., таких как .  и . , включающих природные или искусственно созданные варианты указанных организмов. Методы сбраживания сусла для получения пива хорошо известны специалисту в данной области.
Способ по настоящему изобретению может включать добавление в сбраженное сусло гидрогеля диоксида кремния для повышения коллоидной устойчивости пива. Указанные способы могут далее включать добавление в сбраженное сусло кизельгура и фильтрацию для осветления пива. Одним аспектом настоящего изобретения является пиво, полученное из указанного сусла, в частности пиво, полученное путем сбраживания сусла с образованием пива. Пиво может относиться к любому типу, включая, например, эль, крепкий эль, крепкий портер, черное пиво, легкое пиво, экспортное пиво, солодовый напиток, happoushu (японское пиво), высокоалкогольное пиво, слабоалкогольное пиво, низкокалорийное пиво или светлое пиво.
Одним аспектом настоящего изобретения является использование в процессе получения сусла глюкоамилазы, аминокислотная последовательность которой по меньшей мере на 50% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:1.
Одним аспектом настоящего изобретения является сусло, полученное способом по настоящему изобретению.
Другим аспектом настоящего изобретения является пиво и способ получения указанного пива с использованием сусла, приготовленного способом по настоящему изобретению.
Ферменты
Ферменты, используемые в настоящем изобретении, следует выбирать с учетом их способности сохранять достаточную активность при температуре осуществления способов по настоящему изобретению, а также их способности сохранять достаточную активность при умеренно кислом значении рН в заторе и добавлении в эффективных количествах. Ферменты могут быть выделены из любого источника, предпочтительно из растений или водорослей и более предпочтительно из микроорганизмов, таких как бактерии или грибы.
Глюкоамилаза (ЕС 3.2.1.3)
Глюкоамилазы (глюкан-1,4-альфа-глюкозидаза, ЕС 3.2.1.3) являются ферментами, катализирующими гидролиз концевых остатков (1->4)-связанной альфа-D-глюкозы из невосстанавливаемых концов цепей с высвобождением бета-D-глюкозы. Альтернативными названиями глюкоамилазы являются, например, 4-альфа-D-глюканглюкогидролаза, амилоглюкозидаза, экзо-1,4-альфа-глюкозидаза, гамма-амилаза, альфа-глюкозидаза лизосом и т.д.
Глюкоамилаза может быть получена из микроорганизма или растения. В соответствии с целями настоящего изобретения термин «полученный из» применительно к данному источнику означает, что полипептид, кодированный нуклеотидной последовательностью, продуцирован источником или штаммом, в который была введена нуклеотидная последовательность из указанного источника. В соответствии с предпочтительным аспектом изобретения полипептид, полученный из данного источника, секретируется из клетки.
Candida, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces
Yarrowia
Acremonium, Agaricus, Alternaria, Aspergillus, Aureobasidium, Botryospaeria, Ceriporiopsis, Chaetomidium, Chrysosporium, Claviceps, Cochliobolus, Coprinopsis, Coptotermes, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Diplodia, Exidia, Filibasidium, Fusarium, Gibberella, Holomastigotoides, Humicola, Irpex, Lentinula, Leptospaeria, Magnaporthe, Melanocarpus, Meripilus, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Piromyces, Poitrasia, Pseudoplectania, Pseudotrichonympha, Rhizomucor, Schizophyllum, Scytalidium, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trichoderma, Trichophaea, Verticillium, Volvariella
Xylaria
Глюкоамилаза по настоящему изобретению может быть продуцирована грибами. Например, глюкоамилаза может быть получена из дрожжей, таких как  или . Глюкоамилазу предпочтительно получают из нитчатых грибов, таких как полипептид , или , обладающих активностью глюкоамилазы.
Acremonium cellulolyticus, Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium inops, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium zonatum, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola grisea, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Irpex lacteus, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium funiculosum, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Penicillium thomii, Penicillium oxalicum, Thielavia achromatica, Thielavia albomyces, Thielavia albopilosa, Thielavia australeinsis, Thielavia fimeti, Thielavia microspora, Thielavia ovispora, Thielavia peruviana, Thielavia spededonium, Thielavia setosa, Thielavia subthermophila, Thielavia terrestris, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, или Trichoderma viride
В соответствии с другим предпочтительным аспектом изобретения глюкоамилазу получают из .
Penicillium oxalicum
Penicillium oxalicum
В соответствии с более предпочтительным аспектом изобретения глюкоамилазу получают из . В соответствии с наиболее предпочтительным аспектом изобретения глюкоамилаза является полипептидом , обладающим активностью глюкоамилазы, например полипептидом, включающим SEQ ID NO:1.
Следует отметить, что в объем изобретения входят совершенные и несовершенные формы вышеуказанных видов и другие таксономические эквиваленты, например анаморфы, независимо от названия вида, под которым они известны. Специалисты в данной области могут легко идентифицировать соответствующие эквиваленты.
Штаммы указанных видов могут быть приобретены в ряде коллекций культур, таких как Американская коллекция типовых культур (АТСС), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) и Коллекция патентных культур сельскохозяйственной научно-исследовательской службы, Северный региональный научно-исследовательский центр (NRRL).
Кроме того, такие полипептиды могут быть идентифицированы и получены из других источников, включая микроорганизмы, выделенные из природных источников (таких как почва, компост, вода и т.д.) методами, известными в данной области, например, с использованием в качестве зонда полинуклеотида, кодирующего полипептид. Методы выделения микроорганизмов из естественной среды хорошо известны в данной области. Затем полинуклеотид может быть получен путем скрининга геномной библиотеки или библиотеки кДНК такого микроорганизма. Полинуклеотид, кодирующий полипептид, обнаруженный с помощью одного или нескольких зондов, может быть выделен или клонирован методами, хорошо известными специалистам в данной области (см., например, публикацию Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY).
В соответствии с одним аспектом изобретения глюкоамилаза содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 50%, например по меньшей мере на 51%, по меньшей мере на 52%, по меньшей мере на 53%, по меньшей мере на 54%, по меньшей мере на 55%, по меньшей мере на 56%, по меньшей мере на 57%, по меньшей мере на 58%, по меньшей мере на 59%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 61%, по меньшей мере на 62%, по меньшей мере на 63%, по меньшей мере на 64%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 66%, по меньшей мере на 67%, по меньшей мере на 68%, по меньшей мере на 69%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 71%, по меньшей мере на 72%, по меньшей мере на 73%, по меньшей мере на 74%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 76%, по меньшей мере на 77%, по меньшей мере на 78%, по меньшей мере на 79%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 81%, по меньшей мере на 82%, по меньшей мере на 83%, по меньшей мере на 84%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 86%, по меньшей мере на 87%, по меньшей мере на 88%, по меньшей мере на 89%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или даже по меньшей мере на 99% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:1.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения глюкоамилаза содержит аминокислотную последовательность, которая отличается не более чем на 100 аминокислот, предпочтительно не более чем на 80 аминокислот, более предпочтительно не более чем на 50 аминокислот, более предпочтительно не более чем на 30 аминокислот, еще предпочтительнее не более чем на 20 аминокислот и наиболее предпочтительно не более чем на 10 аминокислот от аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1.
Одним аспектом настоящего изобретения является применение в способе получения сусла глюкоамилазы, содержащей аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 50%, например по меньшей мере на 51%, по меньшей мере на 52%, по меньшей мере на 53%, по меньшей мере на 54%, по меньшей мере на 55%, по меньшей мере на 56%, по меньшей мере на 57%, по меньшей мере на 58%, по меньшей мере на 59%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 61%, по меньшей мере на 62%, по меньшей мере на 63%, по меньшей мере на 64%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 66%, по меньшей мере на 67%, по меньшей мере на 68%, по меньшей мере на 69%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 71%, по меньшей мере на 72%, по меньшей мере на 73%, по меньшей мере на 74%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 76%, по меньшей мере на 77%, по меньшей мере на 78%, по меньшей мере на 79%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 81%, по меньшей мере на 82%, по меньшей мере на 83%, по меньшей мере на 84%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 86%, по меньшей мере на 87%, по меньшей мере на 88%, по меньшей мере на 89%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или даже по меньшей мере на 99% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:1.
В соответствии с одним аспектом изобретения оптимальная температура глюкоамилазы равна по меньшей мере 65°С. В соответствии с другим аспектом изобретения оптимальная температура равна по меньшей мере 66°С, например по меньшей мере 67°С, по меньшей мере 68°С, по меньшей мере 69°С, по меньшей мере 70°С, по меньшей мере 71°С, по меньшей мере 72°С, по меньшей мере 73°С, по меньшей мере 74°С, по меньшей мере 75°С, по меньшей мере 76°С, по меньшей мере 77°С, по меньшей мере 78°С, по меньшей мере 79°С, в частности по меньшей мере 80°С, при определении на основании способности фермента высвобождать глюкозу в процессе инкубации при температуре 32-85°С и значении рН 5,0-6,0 в течение 1 часа. В соответствии с одним аспектом изобретения значение рН в процессе инкубации равно 6,0. В соответствии с другим аспектом изобретения значение рН равно 5,8. В соответствии с одним аспектом изобретения значение рН равно 5,6. В соответствии с другим аспектом изобретения значение рН равно 5,4. В соответствии с одним аспектом изобретения значение рН равно 5,2. В соответствии с другим аспектом изобретения значение рН равно 5,0.
В одном варианте осуществления изобретения оптимальная температура глюкоамилазы равна примерно 65-75°С при определении на основании способности фермента высвобождать глюкозу в процессе инкубации при температуре 32-85°С и значении рН 6,0 в течение 1 часа в соответствии с описанием, приведенным в примере №1.
В одном варианте осуществления изобретения глюкоамилаза обладает остаточной активностью, равной по меньшей мере 10%, в частности по меньшей мере 11%, например, 12%, например, 13%, например, 14%, например, 15%, например, 16%, например, 17%, например, 18%, например, 19%, например, 20%, в частности, по меньшей мере 21%, например, 22%, например, 23%, например, 24%, например, 25%, например, 26%, например, 27%, например, 28%, например, 29%, например, 30%, например, 31%, например, 32%, при определении на основании способности фермента высвобождать глюкозу при рН 6,0, которую измеряют по образованию глюкозы с использованием мальтодекстрина в качестве субстрата в соответствии с описанием, приведенным в примере №1.
В соответствии с одним аспектом изобретения глюкоамилазу добавляют в концентрации от около 0,0005 до около 200 мг ферментного белка на грамм общей массы смолотого зерна, предпочтительно от около 0,001 до около 100, более предпочтительно от около 0,01 до около 50, еще предпочтительнее от около 0,05 до около 2,0 мг ферментного белка (ЕР) на грамм общей массы смолотого зерна.
В соответствии с одним аспектом изобретения концентрация добавляемой глюкоамилазы меньше 0,4 мг ферментного белка (ЕР) на грамм общей массы смолотого зерна. В соответствии с другим аспектом изобретения концентрация глюкоамилазы меньше 0,35, в частности меньше 0,3, меньше 0,25, меньше 0,2, меньше 0,15 мг ферментного белка (ЕР) на грамм общей массы смолотого зерна.
Пуллуланаза (ЕС 3.2.1.41)
Пуллуланаза (ЕС 3.2.1.41) катализирует гидролиз (1->6)-альфа-D-глюкозидных связей в пуллулане, амилопектине и гликогене, а также в предельных альфа- и бета-декстринах амилопектина и гликогена. Указанные ферменты ранее были классифицированы как ЕС 3.2.1.69. Альтернативными названиями указанных ферментов являются альфа-декстрин-эндо-1,6-альфа-глюкозидаза, или амилопектин-6-глюканогидролаза, или фермент, расщепляющий разветвленные цепи, или предельная декстриназа, или пуллулан-6-глюканогидролаза.
Pyrococcus
Bacillus
Bacillus acidopullulyticus
Bacillus naganoencis
Bacillus deramificans
Bacillus
Пуллуланаза по настоящему изобретению предпочтительно является пуллуланазой, выделяемой, например, из  или , в частности из вида , например, описанного в публикации Kelly et al., 1994, FEMS Microbiol. Letters 115: 97-106, или пуллуланазой, производимой компанией Novozymes A/S под названием Promozyme 400L. Указанная пуллуланаза может быть также выделена из  или  (патент США № 5736375). Пуллуланаза также может быть пуллуланазой, генетически созданной, например, из штамма .
Pyrococcus
woesei
Fervidobacterium
Thermococcus celer
Pyrodictium abyssel
Fervidobacterium
pennavorans
Desulforococcus mucosus
Другие пуллуланазы могут быть выделены из вида , описанного в РСТ/DK91/00219, или указанная пуллуланаза может быть выделена из вида  sp. Ven 5, описанного в РСТ/DK92/00079, или указанная пуллуланаза может быть выделена из вида , описанного в РСТ/DK95/00097, или указанная пуллуланаза может быть выделена из вида , описанного в РСТ/DK95/00211, или указанная пуллуланаза может быть выделена из вида , описанного в РСТ/DK95/00095, или указанная пуллуланаза может быть выделена из вида , описанного в РСТ/DK95/00098.
Bacillus
acidopullulyticus
Пуллуланазу наиболее предпочтительно выделяют из . Предпочтительной пуллуланазой, пригодной для использования в способах и/или композициях по настоящему изобретению, является пуллуланаза, содержащая аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 50%, в частности по меньшей мере на 55%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 66%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 86%, по меньшей мере на 87%, по меньшей мере на 88%, по меньшей мере на 89%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или даже на 100% идентична последовательности пуллуланазы 3, описанной в WO2009075682.
Пуллуланаза может быть добавлена в эффективных количествах, хорошо известных специалисту в данной области. В соответствии с одним аспектом изобретения пуллуланазу добавляют в количестве 0,1-3 PUN/г сухой массы, в частности 0,2-2,9, 0,3-2,8, 0,3-2,7, 0,3-2,6, 0,3-2,5, 0,3-2,4, 0,3-2,3, 0,3-2,2, 0,3-2,1, 0,3-2,0, 0,3-1,9, 0,3-1,8, 0,3-1,7, 0,3-1,6, наиболее предпочтительно пуллуланазу добавляют в количестве 0,3-1,5, предпочтительно 0,4-1,4, более предпочтительно 0,5-1,3, более предпочтительно 0,6-1,2, более предпочтительно 0,7-1,1, более предпочтительно 0,8-1,0, более предпочтительно 0,9-1,0. В конкретном варианте осуществления изобретения указанный фермент добавляют в количестве 0,3 PUN/г сухой массы, в частности 0,4 PUN/г сухой массы, 0,5 PUN/г сухой массы. В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения доза указанного фермента не превышает 1 PUN/г сухой массы.
Одна единица пуллуланазы (PUN) равна количеству фермента, которое в стандартных условиях (то есть при времени реакции, равном 30 минутам, температуре 40°С, значении рН 5,0 и использовании 0,2% пуллулана в качестве субстрата) гидролизует пуллулан, высвобождая углевод с восстанавливающей способностью, эквивалентной 1 микромолю глюкозы в минуту. Активность пуллуланазы измеряют по увеличению содержания восстанавливаемого сахара (реакция Сомогии-Нельсона) в следующих условиях: субстрат: 0,2% пуллулана, рН 5,0, время реакции 30 минут. Образцы анализируют при помощи спектрофотометра при оптической плотности (OD) 520 нм.
В соответствии с одним аспектом изобретения при осуществлении способа по настоящему изобретению используют как глюкоамилазу, так и пуллуланазу.
Альфа-амилаза (ЕС 3.2.1.1)
Bacillus
Bacillus
B
licheniformis
B
amyloliquefaciens
stearothermophilus
Bacillus
Aspergillus
Aspergillus niger
Альфа-амилаза, пригодная для использования в способах и/или композициях по настоящему изобретению, может быть альфа-амилазой . Хорошо известные альфа-амилазы  включают альфа-амилазу, выделенную из штамма . , .  и B. . В соответствии с одним аспектом настоящего изобретения альфа-амилаза  является альфа-амилазой, описанной в WO 99/19467, со страницы 3, строка 18, до страницы 6, строка 27. Указанная альфа-амилаза предпочтительно по меньшей мере на 50%, более предпочтительно по меньшей мере на 60%, более предпочтительно по меньшей мере на 70%, более предпочтительно по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, предпочтительно по меньшей мере на 91%, предпочтительно по меньшей мере на 92%, предпочтительно по меньшей мере на 93%, предпочтительно по меньшей мере на 94%, более предпочтительно по меньшей мере на 95%, предпочтительно по меньшей мере на 96%, предпочтительно по меньшей мере на 97%, более предпочтительно по меньшей мере на 98% и наиболее предпочтительно по меньшей мере на 99% идентична аминокислотной последовательности, представленной как SEQ ID NO:3 в WO 99/19467, при наличии мутаций: I181* + G182* + N193F. В объем настоящего изобретения также входит амилаза Termamil SC компании Novozymes A/S. Другая альфа-амилаза, пригодная для использования в способах по настоящему изобретению, может быть любой грибной альфа-амилазой, например альфа-амилазой, выделенной из вида  и предпочтительно из штамма . Особенно пригодны для настоящего изобретения грибные альфа-амилазы, содержащие аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 55%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85% или даже по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности, представленной как SEQ ID NO:1 в WO 2002/038787.
2+
Количество добавляемой альфа-амилазы зависит от разных параметров и, как правило, известно специалисту в данной области. В соответствии с одним аспектом изобретения активность альфа-амилазы в заторе равна 0,1-1,0 KNU/г, более предпочтительно 0,2-0,4 KNU/г и наиболее предпочтительно 0,25-0,35 KNU/г сухой массы хлебного злака. Одна килоединица альфа-амилазы Novo (KNU) равна 1000 NU. Одна KNU соответствует количеству фермента, которое в стандартных условиях (то есть при 37°С±0,05; 0,0003 М Са и рН 5,6) высвобождает растворимый декстрин из 5,26 г сухого вещества крахмала Merck Amylum.
Изоамилаза (ЕС 3.2.1.68)
Другим ферментом, используемым в способах и/или композициях по настоящему изобретению, может быть альтернативный фермент, расщепляющий разветвленные цепи, такой как изоамилаза (ЕС 3.2.1.68). Изоамилаза гидролизует альфа-1,6-D-глюкозидные связи разветвленных цепей в амилопектине и предельных бета-декстринах и отличаются от пуллуланаз неспособностью воздействовать на пуллулан и ограниченным воздействием на предельные альфа-декстрины. Изоамилаза может быть добавлена в эффективных количествах, хорошо известных специалисту в данной области.
Протеаза
Приемлемыми протеазами являются микробные протеазы, такие как грибные и бактериальные протеазы. Предпочтительными протеазами являются кислотные протеазы, то есть протеазы, способные гидролизовать белки в кислотных условиях при значении рН ниже 7. Протеазы уменьшают общую длину цепей высокомолекулярных белков, в результате чего в заторе образуются низкомолекулярные белки. Низкомолекулярные белки необходимы для питания дрожжей, а высокомолекулярные белки обеспечивают устойчивость пены. Таким образом, специалисту в данной области хорошо известно, что протеаза должна быть добавлена в сбалансированном количестве, которое обеспечивает образование свободных аминокислот для дрожжей и одновременно оставляет достаточно высокомолекулярных белков для стабилизации пены. В соответствии с одним аспектом изобретения активность протеазы обеспечивается системой протеолитических ферментов, обладающих приемлемой активностью образования FAN, которая включает эндопротеазы, экзопептидазы или любую их комбинацию, предпочтительно металлопротеазу. Указанная протеаза предпочтительно по меньшей мере на 50%, более предпочтительно по меньшей мере на 60%, более предпочтительно по меньшей мере на 70%, более предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 91%, более предпочтительно по меньшей мере на 92%, более предпочтительно по меньшей мере на 93%, более предпочтительно по меньшей мере на 94%, более предпочтительно по меньшей мере на 95%, более предпочтительно по меньшей мере на 96%, более предпочтительно по меньшей мере на 97%, более предпочтительно по меньшей мере на 98% и наиболее предпочтительно по меньшей мере на 99% или даже на 100% идентична аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:6, описанной в WO9967370. В соответствии с другим аспектом изобретения указанная протеаза является ферментом Neutrase, производимым компанией Novozymes A/S. Протеазы могут быть добавлены в количестве 0,0001-1000 AU/кг сухого вещества, предпочтительно 1-100 AU/кг сухого вещества и наиболее предпочтительно в количестве 5-25 AU/кг сухой массы хлебного злака. Протеолитическую активность можно определить, используя денатурированный гемоглобин в качестве субстрата. При осуществлении метода Ансона определения протеолитической активности на основе гемоглобина денатурированный гемоглобин расщепляют и нерасщепленный гемоглобин осаждают трихлоруксусной кислотой (ТСА). Количество продукта, растворяемого ТСА, определяют при помощи фенолового реагента, который вызывает окрашивание в синий цвет при использовании тирозина и триптофана. Одна единица Ансона равна количеству фермента, которое в стандартных условиях (то есть при 25°С, рН 7,5 и времени реакции, равном 10 минутам) расщепляет гемоглобин с начальной скоростью, при которой высвобождается такое количество продукта, растворяемого ТСА, которое вызывает такое же окрашивание феноловым реагентом, что и один миллиэквивалент тирозина.
Целлюлаза (ЕС 3.2.1.4)
Aspergillus
Trichoderma
Humicola
Fusarium
H
insolens
insolens
Целлюлаза может быть выделена из микробов, например из штамма нитчатых грибов (например, , , , ). Конкретные примеры целлюлаз включают эндоглюканазу (эндоглюканазу I), получаемую из .  и далее определяемую аминокислотной последовательностью, показанной на фиг.14 в WO 91/17244, и эндоглюканазу H.  длиной 43 кДа, описанную в WO 91/17243.
Конкретной целлюлазой, пригодной для использования в способах по настоящему изобретению, может быть эндоглюканаза, такая как эндо-1,4-бета-глюканаза. Особенно пригодной является бета-глюканаза, представленная в SEQ ID NO:2 в WO 2003/062409 и гомологичных последовательностях. Коммерчески доступные препараты на основе целлюлазы, пригодные для использования в настоящем изобретении, включают CELLUCLAST, CELLUZYME, CEREFLO и ULTRAFLO (компании Novozymes A/S), LAMINEX™ и SPEZYME CP (компании Genencor Int.) и ROHAMENT 7069 W (компании Rohm, Германия). Бета-глюканазы могут быть добавлены в количестве 1,0-10000 BGXU/кг сухого вещества, предпочтительно 10-5000 BGXU/кг сухого вещества, предпочтительно 50-1000 BGXU/кг сухого вещества и наиболее предпочтительно 100-500 BGXU/кг сухого вещества.
Одна единица бета-глюканазы (BGXU) соответствует количеству фермента, необходимому для получения 1 микромоля восстанавливаемых сахаров в минуту в стандартных условиях (инкубация при 30°С в течение 10 минут при рН 4,40).
Ксиланаза
Ксиланазы известны в данной области. В соответствии с одним аспектом изобретения активность ксиланазы обеспечивается ксиланазой, относящейся к семейству гликозилгидролаз 10. В соответствии с одним аспектом изобретения указанная ксиланаза по меньшей мере на 50%, более предпочтительно по меньшей мере на 60%, более предпочтительно по меньшей мере на 70%, более предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 91%, более предпочтительно по меньшей мере на 92%, более предпочтительно по меньшей мере на 93%, более предпочтительно по меньшей мере на 94%, более предпочтительно по меньшей мере на 95%, более предпочтительно по меньшей мере на 96%, более предпочтительно по меньшей мере на 97%, более предпочтительно по меньшей мере на 98% и наиболее предпочтительно по меньшей мере на 99% или даже на 100% идентична ксиланазе, описанной в WO 94/21785. В соответствии с другим аспектом изобретения ксиланаза является ферментом Shearzyme компании Novozymes A/S. Активность ксиланазы в заторе предпочтительно равна 0,02-0,1 FXU(S)/г, более предпочтительно 0,04-0,08 FXU(S)/г сухой массы хлебного злака.
Aspergillus aculeatus
Активность ксиланазы может быть выражена в единицах FXU(S), определяемых при рН 6,0, при использовании ремазолксилана (4-О-метил-D-глюкуроно-D-ксилана, окрашенного ремазолом, бриллиантовым голубым R, Fluka) в качестве субстрата. Образец ксиланазы инкубируют с ремазолксилановым субстратом. Нерасщепленный окрашенный субстрат осаждают этанолом. Оставшийся синий цвет в супернатанте (определяемый спектрофотометрическим методом при 585 нм) пропорционален активности ксиланазы, после чего единицы ксиланазы определяют относительно стандартного фермента в стандартных условиях реакции, то есть при концентрации субстрата 0,45% масс./об., концентрации фермента 0,04-0,14 FXU(S)/мл при 50,0°С, рН 6,0 и времени реакции, равном 30 минутам. Активность ксиланазы в единицах FXU(S) измеряют относительно стандартного фермента Novozymes FXU(S) (компании Novozymes), представляющего собой однокомпонентный препарат ксиланазы, Shearzyme, полученный из .
Липаза
Fusarium
F
oxysporum
F
heterosporum
A
tubigensis
Rhizopus
R
oryzae
Thermomyces
T
lanuginosus
Thermomyces
lanuginosus
Fusarium
oxysporum
Липазы известны в данной области. В одном варианте осуществления изобретения активность липазы обеспечивается липазой, обладающей активностью в отношении триглицеридов, и/или галактолипидов, и/или фосфолипидов. Активность липазы предпочтительно обеспечивается липазой, получаемой из  (включая .  и . ), Aspergillus (включая . ),  (включая . ) или  (включая . ), или их вариантом. В качестве примера можно привести Lipopan X (Lipopan Xtra), являющийся вариантом липазы , включающим замены G91A +D96W +E99K +P256V +G263Q +L264A +I265T +G266D +T267A +L269N +270A +271G +272G +273F (+274S), которая описана в WO2004099400A2. В соответствии с другим аспектом изобретения липаза является липазой/фосфолипазой, получаемой из , которая описана в европейском патенте ЕР 869167 и производится компанией Novozymes A/S под названием Lipopan F. В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения липаза представляет собой липазу Lipozyme TL или Lipolase компании Novozymes A/S, Дания, которая особенно хорошо влияет на скорость фильтрации и удаление шелухи. Указанная липаза также может быть липазой Lipex, которая является вариантом липазы Lipozyme компании Novozymes A/S, Дания. Липазы расщепляют липиды ячменя, например, превращая триглицериды в неполные глицериды и свободные жирные кислоты. Благодаря этому продукт становится менее мутным и затор значительно лучше фильтруется. Активность липазы в заторе предпочтительно равна 0-50 LU/г, в частности 0-40 LU/г, 0-30 LU/г, 0-20 LU/г сухой массы хлебного злака. Одна единица липазы (LU) соответствует количеству фермента, высвобождающему 1 микромоль титруемой масляной кислоты в минуту при 30°С, рН 7,0, использовании аравийской камеди в качестве эмульгатора и трибутирина в качестве субстрата.
Ферменты могут быть добавлены в виде композиций. Композиции могут состоять из одного или нескольких ферментов, при этом может быть использовано несколько ферментных композиций. Ферментная композиция, помимо ферментов, может также содержать по меньшей мере одно другое вещество, которое включает, не ограничиваясь ими, буфер, поверхностно-активные вещества и т.д. Ферментные композиции могут быть использованы в любой форме, известной в данной области, такой как, например, твердое вещество, жидкость, эмульсия, гель или паста. Такие формы известны специалисту в данной области. В соответствии с одним аспектом изобретения могут быть добавлены несколько ферментных композиций, каждая из которых может содержать разные ферменты. В соответствии с другим аспектом изобретения может быть добавлена одна ферментная композиция, содержащая все необходимые ферменты. В соответствии с другим аспектом изобретения может быть добавлена одна ферментная композиция, содержащая несколько ферментов, и по меньшей мере еще одна композиция, содержащая некоторые или все остальные ферменты. Ферменты могут быть добавлены одновременно или последовательно или даже в виде комбинации двух ферментов с последующим добавлением еще одного фермента.
Настоящее изобретение далее проиллюстрировано нижеследующими примерами, которые никоим образом не ограничивает объем заявленного изобретения.
Материалы и методы
Активность глюкоамилазы
Активность глюкоамилазы может быть измерена в единицах AGU.
Единица глюкоамилазы (AGU) соответствует количеству фермента, которое позволяет гидролизовать 1 микромоль мальтозы в минуту в стандартных условиях (37°С, рН 4,3, субстрат: мальтоза 100 мМ, буфер: ацетат 0,1 М, время реакции: 6 минут, как указано ниже для процесса инкубации с глюкоамилазой), в результате чего образуется глюкоза.
Инкубация с глюкоамилазой
Субстрат:
мальтоза 100 мМ
Буфер:
ацетат 0,1 М
рН:
4,30±0,05
Температура инкубации:
37°С±1°С
Время реакции:
6 минут
Рабочий диапазон фермента:
0,5-4,0 AGU/мл
Анализ включает 3 стадии реакции.
Стадия 1 является ферментативной реакцией.
Глюкоамилаза, ЕС 3.2.1.3 (экзо-альфа-1,4-глюканглюкогидролаза) гидролизует мальтозу с образованием альфа-D-глюкозы. После инкубации реакцию прекращают, добавляя NaOH.
На стадиях 2 и 3 происходит конечная реакция.
Глюкоза фосфорилируется под воздействием АТР при выполнении реакции, катализируемой гексокиназой. Образовавшийся глюкозо-6-фосфат окисляется до 6-фосфоглюконата под воздействием глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы. В процессе осуществления той же реакции эквимолярное количество NAD+ восстанавливается в NADH, в результате чего увеличивается оптическая плотность при 340 нм. Может быть использована система автоанализатора, такая как анализатор Konelab 30 (Thermo Fisher Scientific).
Цветная реакция
Трис-буфер
примерно 35 мМ
Аденозинтрифосфат (АТР)
0,7 мМ
NAD<sup>+</sup>
0,7 мМ
Mg<sup>2+</sup>
1,8 мМ
Гексокиназа
>850 ед./л
Глюкозо-6-Р-DH
>850 ед./л
рН
примерно 7,8
Температура
37,0°С±1,0°С
Время реакции
420 сек
Длина волны
340 нм
Химические вещества, используемые в качестве буферов и субстратов, представляли собой коммерческие продукты, характеризующиеся по меньшей мере степенью чистоты реагентов.
Ферменты
Глюкоамилазы, содержащие SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 и SEQ ID NO:4, были получены стандартными методами рекомбинантных ДНК, например, описанными в WO 2011/127802.
Примеры
Пример 1. Оптимальная температура глюкоамилаз
Оптимальную температуру глюкоамилазы, содержащей разные последовательности, определяли по способности ферментов высвобождать глюкозу в процессе инкубации при температуре от 32°С до 85°С и значении рН 6,0. Были использованы 4 разные глюкоамилазы, содержащие SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4. 10 мкл раствора фермента (0,5 мг глюкоамилазы/мл в 10 мМ буфера NaOAc, рН 6,0, с 0,02% тритона Х-100) смешивали с 190 мкл раствора субстрата (10,5% мальтодекстрина DE11 в 50 мл NaOAc). Смесь инкубировали при 32°С, 55°С, 60°С, 65°С, 70°С, 80°С или 85°С в течение 1 часа. После инкубации 10 мкл образца смешивали с 190 мкл воды Milli-Q (20-кратное разведение) для всех образцов за исключением образца, инкубированного при 32°С, который разводили только в 5 раз. Концентрацию глюкозы (мг/мл) в образце определяли при помощи ферментного анализа с использованием муратоза-GOD (глюкоза из автонабора Wako, 439-90901).
10 мкл разведенного образца переносили на 96-луночный планшет, добавляли 200 мкл прекращающего реакцию реагента и измеряли оптическую плотность при 505 нм. Значение оптической плотности преобразовывали в мг/мл глюкозы, используя стандартную кривую глюкозы. Результаты приведены в нижеследующей таблице 1.
Таблица 1Оптимальная температура глюкоамилаз, измеренная при рН 6,0 по образованиюглюкозы (мг/мл) с использованием мальтодекстрина в качестве субстрата
°С
SEQ ID NO:3
SEQ ID NO:1
SEQ ID NO:2
SEQ ID NO:4
мг/мл глюкозы
Остаточная активность в % (макс. = 100%)
мг/мл глюкозы
Остаточная активность в % (макс. = 100%)
мг/мл глюкозы
Остаточная активность в % (макс. = 100%)
мг/мл глюкозы
Остаточная активность в % (макс. = 100%)
32
3,62
17,24
3,84
15,04
3,36
26,99
3,80
20,45
55
15,85
75,48
15,25
59,71
10,55
84,74
14,71
79,17
60
20,44
97,33
19,82
77,60
12,45
100,00
18,58
100,00
65
21,0
100,00
22,57
88,37
10,11
81,20
16,63
89,50
70
14,47
68,90
25,54
100,00
2,31
18,55
5,75
30,95
75
3,73
17,76
23,13
90,56
0,47
3,78
1,40
7,53
80
1,20
5,71
8,29
32,46
0,26
2,09
0,65
3,50
85
0,63
3,00
1,57
6,15
0,17
1,37
0,37
1,99
Из таблицы видно, что глюкоамилаза, содержащая SEQ ID NO:1, характеризуется более высокой оптимальной температурой (70°С) по сравнению с другими измеренными глюкоамилазами (60-65°С).
Пример 2. Воздействие разных глюкоамилаз в процессе получения сусла
2+
2+
Процесс затирания дублировали и использовали затор в количестве, имитирующем лабораторные параметры затирания. Зерна кукурузы и хорошо модифицированный солод измельчали с образованием частиц размером 0,2 мм. 0,150 г измельченной кукурузы и 0,015 г хорошо модифицированного солода смешивали с 660 мкл воды, содержащей 100 ч./млн Са. Указанную фракцию инкубировали, встряхивая (1200 об/мин), следующим способом (варка хлебного злака): 10 минут при 45°С, повышение температуры до 80°С на 5°С каждые 5 минут, инкубация в течение 5 минут при 80°С, повышение температуры до 90°С на 5°С каждые 5 минут, инкубация при 90°С в течение 10 минут. К ожиженной фракции зерна добавляли 666,7 мкл воды, содержащей 60 ч./млн Са и 0,169 г хорошо модифицированного солода. В затор добавляли глюкоамилазу из вышеописанных разных источников, имитируя и не имитируя процесс фильтрации, как указано в таблице 2 и таблице 3.
Осахаривание производили следующим образом: 2 часа при 64°С, повышение температуры до 75°С на 5°С каждые 5 минут, инкубация в течение 15 минут при 75°С. Инкубацию прекращали, охлаждая смесь до 20°С, или продолжали инкубацию в течение еще 2 часов, повышая температуру до 78°С, и затем охлаждали до 20°С (имитированная фильтрация). После окончания инкубации массу каждого образца доводили до 2,0 г, образец центрифугировали в течение 5 минут со скоростью 14000 об/мин и супернатант (сусло) анализировали в отношении содержания экстракта и профиля сахара при помощи ВЭЖХ. Результаты приведены в нижеследующей таблице 2. Термин «DP1» (степень полимеризации 1) означает глюкозу или фруктозу, термин «DP2» означает мальтозу, и термин «DP3» означает мальтотриозу. Термины «DP4+» и «DP4/4+» означают декстрин или мальтоолигосахариды со степенью полимеризации 4 или выше.
Таблица 2Профиль сахара (% от общего количества) сусла, полученный в конце затирания в условиях имитированной фильтрации
Фермент
Дозировка (мг ЕР/г общего количества смолотого зерна)
% DP4+ (неферментируемая фракция)
% DP3
% DP2
% DP1<sup>a</sup> (глюкоза)
Контрольный образец
0
18,71
14,35
55,34
11,61
SEQ ID NO:2
0,025
17,53
4,00
50,25
28,22
SEQ ID NO:2
0,1
14,59
1,96
22,41
61,04
SEQ ID NO:2
0,2
9,89
1,68
5,95
82,47
SEQ ID NO:2
0,3
6,57
1,23
2,05
90,14
SEQ ID NO:2
0,5
4,29
0,49
1,47
92,75
SEQ ID NO:1
0,05
13,17
2,15
36,87
47,82
SEQ ID NO:1
0,1
9,16
1,99
16,45
72,39
SEQ ID NO:1
0,2
4,88
1,68
3,69
89,75
SEQ ID NO:1
0,3
3,27
1,41
2,27
93,05
SEQ ID NO:1
0,5
2,10
1,20
1,34
95,37
SEQ ID NO:1
1,0
1,91
1,05
3,32
93,72
SEQ ID NO:3
0,25
16,12
2,57
41,76
39,55
SEQ ID NO:3
2,0
0,54
1,40
2,43
95,63
SEQ ID NO:4
0,1
16,41
2,72
44,46
36,41
SEQ ID NO:4
0,75
4,05
1,38
2,48
92,1
<sup>а</sup> включает небольшое количество фруктозы.
Из таблицы 2 видно, что глюкоамилаза, содержащая SEQ ID NO:1, превосходит другие глюкоамилазы в процессе затирания с последующей имитированной фильтрацией. Для достижения одинакового уровня DP4+ необходима половина количества глюкоамилазы, содержащей SEQ ID NO:1, по сравнению с глюкоамилазой, содержащей SEQ ID NO:2.
Таблица 3Профиль сахара (% от общего количества) сусла в конце затирания без имитированной фильтрации
Фермент
Дозировка (мг ЕР/г общего количества смолотого зерна)
% DP4+ (неферментируемая фракция)
% DP3
% DP2
% DP1<sup>a</sup> (глюкоза)
Контрольный образец
0
18,56
14,03
55,71
11,69
SEQ ID NO:2
0,025
17,19
4,05
50,89
27,87
SEQ ID NO:2
0,25
7,30
1,50
2,20
88,9
SEQ ID NO:2
0,5
3,59
0,76
1,75
93,9
SEQ ID NO:1
0,1
12,85
2,19
34,66
50,3
SEQ ID NO:1
0,16
11,50
2,20
25,30
61,0
SEQ ID NO:1
0,32
5,80
1,90
3,30
89,0
SEQ ID NO:1
0,5
2,62
1,30
1,80
94,28
SEQ ID NO:1
1,0
1,87
1,04
2,70
94,4
SEQ ID NO:3
0,25
16,35
2,50
42,09
39,06
SEQ ID NO:3
2,0
4,08
1,24
2,16
92,52
SEQ ID NO:4
0,1
16,46
2,70
44,82
36,02
SEQ ID NO:4
0,75
4,28
1,36
2,37
91,97
<sup>а</sup> включает небольшое количество фруктозы
Из таблицы 3 видно, что при отсутствии имитированной фильтрации глюкоамилаза, содержащая SEQ ID NO:1, характеризуется таким же профилем сахара, что и глюкоамилаза, содержащая SEQ ID NO:2.
Пример 3. Влияние температуры фильтрации и значения рН на концентрацию фракции DP1
Данный эксперимент был выполнен при использовании 55% солода / 45% кукурузы и времени осахаривания, равном 4 часам. Глюкоамилазу, содержащую SEQ ID NO:1, вводили в количестве 0,3 мг ЕР/общее количество смолотого зерна (1,44 AGU/общее количество смолотого зерна). Было исследовано влияние изменения температур фильтрации и значения рН на фракцию DP1. Результаты приведены в нижеследующей таблице 4.
Таблица 4Влияние изменения температуры фильтрации и значения рНна концентрацию фракций DP1
рН
Температура фильтрации (°С)
Фракция DP1 (в виде % от общего количества сахара)
Испытание 1
Испытание 2
5,0
80
91,8
91,8
5,3
80
92,3
92,2
6,0
80
89,2
89,9
5,0
78
93,7
92,8
5,3
78
92,8
92,7
6,0
78
92,2
92,3
Пример 4. Воздействие глюкоамилазы в комбинации с пуллуланазой
2+
2+
Процесс затирания дублировали и использовали затор в количестве, имитирующем лабораторные параметры затирания. Зерна кукурузы и хорошо модифицированный солод измельчали с образованием частиц размером 0,2 мм. 0,150 г измельченной кукурузы и 0,015 г хорошо модифицированного солода смешивали с 660 мкл воды, содержащей 100 ч./млн Са. Указанную фракцию инкубировали, встряхивая (1200 об/мин), следующим способом (варка хлебного злака): 10 минут при 45°С, повышение температуры до 80°С на 5°С каждые 5 минут, инкубация в течение 5 минут при 80°С, повышение температуры до 90°С на 5°С каждые 5 минут, инкубация при 90°С в течение 10 минут. К ожиженной фракции зерна добавляли 666,7 мкл воды, содержащей 60 ч./млн Са и 0,169 г хорошо модифицированного солода.
На данном этапе добавляли экзогенные ферменты в соответствии с условиями, указанными в таблице 5.
Использованная пуллуланаза имела последовательность SEQ ID NO:3, описанную в WO2009075682.
Осахаривание производили следующим образом: 2 часа при 64°С, повышение температуры до 75°С на 5°С каждые 5 минут, инкубация в течение 15 минут при 75°С. Инкубацию прекращали, охлаждая смесь до 20°С, или продолжали инкубацию в течение еще 2 часов, повышая температуру до 78°С, и затем охлаждали до 20°С (имитированная фильтрация). После окончания инкубации массу каждого образца доводили до 2,0 г, образец центрифугировали в течение 5 минут со скоростью 14000 об/мин и супернатант (сусло) анализировали в отношении содержания экстракта и профиля сахара при помощи ВЭЖХ.
Таблица 5Профиль сахара сусла в заторе, обработанном глюкоамилазойпри наличии и отсутствии пуллуланазы
Условия
Глюкоамилаза, содержащая SEQ ID NO:1
Пуллуланаза
DP1 (глюкоза)
DP1 (фруктоза)
DP2
DP3
DP4+
Затирание без имитированной фильтрации
0,85 AGU/г общего количества смолотого зерна
-
77,0
1,0
11,5
1,9
8,6
Затирание без имитированной фильтрации
0,85 AGU/г общего количества смолотого зерна
0,57 PUNG/г общего количества смолотого зерна
77,6
1,4
14,9
3,0
3,1
Затирание с имитированной фильтрацией
0,85 AGU/г общего количества смолотого зерна
-
89,6
1,1
3,2
1,6
4,5
Затирание с имитированной фильтрацией
0,85 AGU/г общего количества смолотого зерна
0,57 PUNG/г общего количества смолотого зерна
87,7
1,5
5,8
2,4
2,6
Полученные результаты четко указывают на преимущество добавления пуллуланаза вместе с глюкоамилазой в процессе затирания.