Спектроскопические исследования слоёв тетрапиррольных пигментов. I. слои из экстрактов пигментов листьев высших растений

М. Н. Букина, А. В. Бармасов, А. И. Кононов, Л. Н. Баранова, В. Е. Холмогоров

СПЕКТРОСКОПИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ СЛОЁВ ТЕТРАПИРРОЛЬНЫХ ПИГМЕНТОВ.

I. СЛОИ ИЗ ЭКСТРАКТОВ ПИГМЕНТОВ ЛИСТЬЕВ ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ

Введение. Тетрапиррольные пигменты уникальны благодаря целому комплексу физико-химических, спектральных и полупроводниковых свойств, что делает их крайне перспективными для практического применения во многих направлениях. Оптические спектры растворов, твёрдых плёнок и монокристаллов тетрапиррольных пигментов определяются состоянием агрегации молекул пигмента [11, 15, 19]. При этом возможность существования различных агрегатов тетрапиррольных пигментов [19], обладающих специфическими физическими свойствами, усложняет разработку устройств, использующих уникальные свойства таких пигментов.

Хлорофилл — природный тетрапиррольный пигмент, пиррольные пентакольца в котором образуют плоскую макроциклическую структуру, а азоты пиррольных колец координационно связаны с ионом Мg2+ (рис. 1). В IV пиррольном кольце к остатку пропионовой кислоты присоединён длинноцепочечный углеводородный остаток С20Н39 (высокомолекулярный спирт фитол), который даёт хлорофиллу способность встраиваться в липидный слой мембран хлоропластов.

Высшие растения и большинство водорослей (за исключением сине-зелёных и красных) содержат в основном две формы хлорофилла: хлорофилл а (Хл а) и хлорофилл Ь (Хл Ь). Хл Ь отличается от Хл а тем, что при углеродном атоме 3 вместо метильной

© М. Н. Букина, А. В. Бармасов, А. И. Кононов, Л. Н. Баранова, В. Е. Холмогоров, 2008

нгс=нс

сн3

СН, НС-----с=о

I I

С^ООС—СНг СООСН*

Рис. 1. Структура хлорофилла.

Во всех точках соединения, если не отмечено, подразумеваются атомы углерода.

сн2 сн2

Рис. 2. Структура Хл а и Хл Ь.

группы имеется формильная группа СНО (рис. 2).

В электронном спектре Хл а (рис. 3) проявляются полосы поглощения с максимумами (в скобках указаны значения молярного коэффициента поглощения): 410 нм (7,6-104), 430 нм (11,8• 104), 516 нм (1,5-104), 534 нм (0,4-104), 578 нм (0,8-104) и 662 нм

Е-10'4

X, нм

Рис. 3. Электронные спектры поглощения

Хл а (1) и Хл Ь (2) [15, 20].

Рис. 4- Оптические спектры поглощения Хл а в диэти-ловом эфире (1) и слоя Хл а (2), полученного из раствора в диэтиловом эфире и выдержанного в насыщенных парах

Н2О + С2Н5ОС2Н5.

(9,0-104). Так, в растворах Хл а в эфире (рис. 4) максимумы основных полос электронного поглощения расположены при 430 нм (полоса Соре) и 662 нм (пп*-переход). Кроме того, имеются менее интенсивные полосы, максимумы которых находятся при 410 и 578 нм. В электронном спектре ХлЬ (рис. 3) присутствуют полосы поглощения: 430 нм (5,7-104), 455 нм (15,9-104), 549 нм (0,6-104), 595 нм (1,2-104), 644 нм (5,6-104).

Хл а способен образовывать с водой комплексы разного состава. При концентрации Хл а 1,1-10 5 М/л в спиртоводной смеси 1:2 происходит заметное понижение интенсивности длинноволновой полосы, а полоса Соре изменяется незначительно. При понижении концентрации спирта до 10% наблюдаются изменения полос поглощения, и появляется выраженный максимум при 720 нм. Эти изменения в спектре отражают ди-меризацию и дальнейшую полимеризацию в растворе пигмента. Максимумы в области 680 нм относят к димерам, а 720 нм — к сложным агрегатам. В этих агрегатах различное количество молекул воды, вероятно, координируется за счёт водородных связей между плоскостями порфириновых колец. Из температурной зависимости спектров следует, что энергия диссоциации сложных агрегатов равна 23 кДж/М [20].

Давно признано, что хлорофилл и вода взаимодействуют между собой специфически [3]. Вода является уникальным нуклеофилом для хлорофилла, так как проявляет не только способность к образованию водородных связей, но и электронно-акцепторные и электронно-донорные свойства. Эти два свойства молекулы воды в совокупности с её малыми размерами обуславливают возникновение хлорофилл-водных комплексов и кристаллов хлорофилла [1, 2, 21]. Водные коллоидные растворы, микрокристаллы, плёнки Хл а имеют батохромно смещённые длинноволновые полосы, при этом для микрокристаллов характерна полоса электронного поглощения с максимумом 740 нм, которая отсутствует в фотосинтезирующих клетках в листьях высших растений. Сдвиги максимума длинноволновой полосы и изменения формы этой и других полос для микрокристаллов и плёнок близки. Они сложно зависят от структуры кристаллов, способа упаковки и других факторов. Все эти изменения являются результатом агрегации и сложных взаимодействий молекул пигмента на малых расстояниях при плотной упаковке, взаимодействий, отличающихся по характеру от ассоциации в воде [20].

К настоящему времени отсутствуют данные, которые позволили бы решить вопрос о том, насколько самостоятельно может происходить самосборка молекул хлорофилла.

Решение этой проблемы, а также моделирование процессов разложения воды в химических системах [6] имеют практическое значение как для создания искусственных систем преобразования световой энергии в другие виды энергии, так и для создания электрохимических систем на основе природных полупроводников. При этом основную роль в самоорганизации структуры могут играть кооперативные свойства воды и взаимодействия между водой и пигментом [5, 6]. При таком подходе к проблеме сенсибилизированного фоторазложения воды можно избежать сложностей в конструировании системы, поскольку структура воды интегрируется с пигментным аппаратом. Этими соображениями объясняется интерес авторов к спектроскопическим исследованиям слоёв различных тетрапиррольных пигментов — как природных, так и синтетических.

Экспериментальная часть. В данной работе исследовались растворы Хл а в ди-этиловом эфире, растворы пигментов листьев высших растений в ацетоне, а также в диэтиловом эфире, и приготовленные из этих растворов слои на стёклах.

Исходным материалом для приготовления слоёв природных пигментов служил ацетоновый экстракт пигментов из высушенных зелёных листьев крапивы. Экстракт содержал преимущественно Хл а, а также в незначительных количествах Хл b и феофи-тин, каротиноиды и липиды. Слои пигментов готовили из концентрированных растворов путём нанесения нескольких капель на поверхности стёкол. Применялся специально очищенный и осушенный ацетон.

Спектры поглощения растворов и слоёв регистрировались с помощью двухлучевого призменного спектрофотометра Specord UV VIS. Спектры испускания и возбуждения люминесценции снимались на спектрофлюориметре Hitachi 850.

Оценку ориентационного порядка анизотропных молекул пигментов в поверхностных слоях плёнок на стёклах производили методом двойного лучепреломления (ДЛП) при прохождении поляризованного света через плёнку под углом к поверхности, отличным от нормального [4, 22]. Метод основан на измерении разности фаз S, возникающей между двумя поляризованными во взаимноперпендикулярных направлениях компонентами световой волны при её прохождении через плёнку под углом падения ф [14]. При этом S = B (1 — cos 2у>), где коэффициент B пропорционален фактору ориентационной упорядоченности S = ^ (3cos2 в — 1) (в — угол между вектором поляризуемости молекулы и нормалью к поверхности). Для молекул хлорофилла вектор поляризуемости лежит преимущественно в плоскости молекулы. Таким образом, по знаку B можно определить ориентацию молекулы хлорофилла относительно поверхности.

В оптическом спектре слоя Хл a, полученного из раствора в диэтиловом эфире и выдержанного в насыщенных парах H2O + C2H5OC2H5 (рис. 4), присутствует интенсивная полоса поглощения при 740 нм, которую обычно отождествляют с микрокристаллами пигмента [20]. Широкую полосу поглощения в спектральной области 400550 нм с небольшим максимумом при 470 нм, по-видимому, можно приписать переходным формам Хл а: молекулярные ^ нанокристаллические ^ микрокристаллические, но прямых доказательств этого не имеется. О возможном образовании таких форм при агрегации тетрапиррольных пигментов свидетельствуют результаты, полученные при изучении оптических спектров слоёв синтетических аналогов хлорофиллов — фталоци-анинов [7-10, 18, 23].

В ацетоновом экстракте из высушенных листьев крапивы хлорофиллы оказываются свободными от белка, но содержат жёлтые пигменты — каротиноиды, небольшие концентрации синих пигментов — фикобилинов и зелёных — феофитинов. Каротиноиды имеют электронные спектры поглощения, расположенные в области А < 400 нм. Молекулы каротиноидов являются антиоксидантами, защищающими молекулы хлоро-

Рис. 5. Оптический спектр поглощения раствора пигмента в диэтиловом эфире.

А

Рис. 6. Оптические спектры поглощения раствора пигментов в ацетоне (1) и слоя, выдержанного в парах воды (2).

филлов от окисления при действии молекулярного кислорода.

Для оценки содержания Хл а в экстракте были приготовлены растворы пигментов в ацетоне и в диэтиловом эфире. Электронный спектр поглощения раствора пигмента в эфире, показан на рис. 5. Используя значение молярного коэффициента поглощения £ = 9• 104 для максимума поглощения при 662 нм, нами была определена концентрация Хл а в исходных растворах, которая оказалась с « 3• 10—5 М/л.

Полосы у 510 и 550 нм принадлежат безметальному хлорофиллу феофитину, образовавшемуся в ацетоновой вытяжке в процессе хранения (рис. 5 и 6).

Из растворов пигментов по разработанной нами технологии были приготовлены тонкие слои пигментов. Спектры поглощения слоёв содержат полосы с максимумами при 610, 680-690, 700 и 710 нм. Они отличаются от спектров поглощения исходных растворов Хл а тем, что максимумы полос поглощения сдвинуты в длинноволновую область от 660 до 700 нм и содержат слабую полосу поглощения с максимумом при 710 нм, принадлежащую, как известно, агрегированным формам Хл а. Для стимулирования агрегации молекул Хл а твёрдые слои помещали в атмосферу насыщенных паров ацетона (эфира) и воды на несколько часов (от 1 до 6 час) при 20 °С. Электронные спектры поглощения таких слоёв показаны на рис. 6. Характерной особенностью этих спектров является неоднородное уширение полос, возможно, из-за присутствия в слоях различных длинноволновых форм Хл а.

Для выявления новых полос поглощения в области 660-720 нм в слоях пигментов, приготовленных таким способом, были записаны разностные спектры поглощения сло-ёв относительно растворов с приблизительно одинаковой концентрацией Хл а (рис. 7). В разностных спектрах заметно проявляются новые полосы поглощения с максимумами при 680 и 710-720 нм, принадлежащие агрегированным формам Хл а.

Спектры испускания и возбуждения люминесценции раствора пигмента в ацетоне приведены на рис. 8. Спектр возбуждения люминесценции подобен спектру поглощения раствора образца (рис. 6) и содержит полосы с максимумами в районе 620 нм и 665 нм. В спектре испускания люминесценции наблюдается интенсивная полоса 676 нм люминесценции мономеров и более слабая длинноволновая (720 нм) полоса, соответствующая

Рис. 7. Разностный оптический спектр: слой пигмента относительно спектра раствора пигмента в ацетоне.

Рис. 8. Спектры испускания и возбуждения люминесценции раствора пигмента в ацетоне: 1 — спектр испускания люминесценции (длина волны возбуждения— 410 нм); 2 — спектр возбуждения люминесценции (длина волны регистрации — 710 нм).

Рис. 9. Спектры испускания и возбуждения слоёв пигмента: 1 — спектр испускания люминесценции (длина волны возбуждения — 410 нм); 2 — спектр возбуждения люминесценции (длина волны регистрации — 710 нм).

люминесценции агрегатов. Для спектров люминесценции слоёв (рис. 9) характерно иное по сравнению с растворами соотношение интенсивностей максимумов: длинноволновая агрегатная полоса более интенсивна. Это свидетельствует о том, что основной вклад в люминесценцию слоёв вносят агрегаты пигментов. В спектре возбуждения также наблюдаются изменение, характерное для образования агрегатов хлорофилла — уши-

рение полосы 665 нм, соответствующей поглощению мономерных структур, за счёт возбуждения коротковолновых форм Хл а и межмолекулярного переноса энергии на длинноволновые формы.

Для стимулирования образования агрегированных форм Хл а слои пигментов также получали на поверхности воды, которая предварительно наносилась на стеклянную подложку, а затем испарялась. В полученных таким способом слоях были обнаружены особенно широкие длинноволновые полосы поглощения Хл а.

Предварительные данные измерений ДЛП плёнок различной толщины, полученных из экстрактов пигментов листьев высших растений, показывают, что параметр ориентационного порядка S отличен от нуля, что свидетельствует об упорядоченности молекул пигментов в тонких приповерхностных слоях.

Заключение. Результаты предварительного исследования показывают, что молекулы Хл а способны к самосборке в агрегированные формы (димеры, мультимеры) не только в естественных условиях — в фотосинтезирующих клетках высших растений, но и в слоях, полученных из ацетоновых растворов пигментов зелёных листьев при обязательном участии молекул воды.

Способностью к самоорганизации (самосборке в мультимеры) могут обладать не только молекулы хлорофилла, но и молекулы других тетрапиррольных пигментов (порфирины, гемоглобины, цитохромы), принимающие участие в важнейших биологических процессах, а также перспективные органические полупроводники с высокой светочувствительностью — фталоцианины.

Summary

M. N. Bukina, A. V. Barmasov, A. I. Kononov, L. N. Baranova, V. E. Kholmogorov. Spectroscopic Investigations Of Layers Of Tetrapyrrole Pigments. I. Layers Of Extracts From Pigments Of Higher Plants.

In the given work, the formation of layers of chlorophyll a and extracts of pigments from higher plants leaves was investigated. It is shown by optical methods, that molecules of chlorophyll a (including those from higher plants leaves) are capable to self-assembly in the aggregated forms (dimers, multimers) in artificial model systems. These processes occur at obligatory participation of molecules of water.

Литература

1. Jacobs E. V., Valter A. E, Holt A. S. // Arh. Biochem. and biophys. 1954. Vol. 91. P. 228.

2. Katz J.J., Ballschmitter K., Garcia-Morin M., Strain H.H., Uphaus R. A. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1968. Vol. 60. P. 100.

3. Rabinowitch E. I. Photosynthesis. Vol. 1. New York, 1945. P. 540.

4. Stein R. S. // J. Pol. Sci. 1957. Vol. 24. P. 383-391.

5. Udal’tsov A. V., Kazarin L. A., Sweshnikov A. A. // J. Mol. Struct. 2001. Vol. 562. P. 227-239.

6. Udal’tsov A. V., Kovalev Yu. V. // J. Photochem. Photobiol. A: Chem. 2000. Vol. 135. P. 93202.

7. Vernon L. P., Seely G. R. The chlorophylls. New York; London, 1966.

8. Акимов И. А., Денисюк И. Ю., Мешков А. М. // Оптика и спектроскопия. 1994. Том 77, №6. С. 954-958.

9. Акимов И. А., Денисюк И. Ю., Мешков А. М., Горелова А. В. // Оптический журнал. 2003. Том 70, №2. С. 3-8.

10. Акимов И. А., Мешков А. М. // Оптика и спектроскопия. 2005. Том 98, №3. С. 460-464.

11. Бармасов А. В., Коротков В. И., Холмогоров В. Е. // Применение оптической спектроскопии в адсорбции и катализе: Тезисы докладов 10 Всесоюзного семинара, Ленинград, 6-8 сентября, 1988. Л., 1988. С. 99.

12. Биофизика фотосинтеза / Под ред. А. Б. Рубина. М., 1975. 224 с.

13. Годнее Т. Н. Строение хлорофилла и методы его количественного определения. Минск, 1952.

14. Грищенко А. Е. Механооптика полимеров. СПб., 1996. 196 с.

15. Гуринович Г. П., Севченко А.Н., Соловьёв К. Н. Спектроскопия хлорофилла и родственных соединений. Минск, 1968. 517 с.

16. Клейтон Р. Фотосинтез. Физические механизмы и химические модели / Пер. с англ. М., 1984.

17. Красновский А. А. Преобразование энергии света при фотосинтезе. Молекулярные механизмы. М., 1974.

18. Малькова Е.А., Петрова О. В., Лебедева Н. Ш. // Областная конференция молодых учёных «Молодая наука — развитию Ивановской области». Иваново, 21-22 апреля 2005 г. Тез. докл. С. 188-189.

19. Теренин А. Н. Фотоника молекул красителей и родственных соединений. Л., 1967. 617 с.

20. Холмогоров В. Е. Фотосинтез // Фотохимические процессы в слоях / Под ред. А. В. Ельцов. Л., 1978. С. 5-50.

21. Холмогоров В.Е., Бобровский А. П. Труды Московского общества испытателей природы. Том ХЫХ. Проблемы биофотохимии / Под ред. А. Б. Рубин, В. Д. Самуилов. М., 1973. С. 92-103.

22. Черкасов А.Н., Витовская М. Г., Бушин С. В. // Высокомолек. соед. 1976. Т. 18, №7. С.1628-1634.

23. Юрре Т. А., Рудая Л. И., Климова Н. В., Шаманин В. В. // Физика и техника полупроводников. 2003. Т. 37. Вып. 7. С. 835-843.

Статья поступила в редакцию 27 апреля 2007 г.