СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КИСЛОМОЛОЧНОГО ПРОДУКТА С ПРИРОДНЫМ ВИТАМИНОМ К2 (ВАРИАНТЫ) И КИСЛОМОЛОЧНЫЙ ПРОДУКТ, ПОЛУЧЕННЫЙ ДАННЫМ СПОСОБОМ
METHOD FOR PRODUCTION OF FERMENTED MILK PRODUCT WITH NATURAL VITAMIN K2 (VERSIONS) AND CULTURED MILK PRODUCT OBTAINED USING SAID METHOD

Область техники.
Изобретение относится к пищевой промышленности и может быть использовано при производстве кисломолочных продуктов, обогащенных природным витамином К2, в частности, при производстве творога, творожного сыра, простокваши, кисломолочных напитков и других продуктов, в том числе для детского питания.
Уровень техники
Витамин K является жирорастворимым витамином, который встречается в двух естественных формах: витамин K1 (или филлохинон) и витамин K2 (или менахинон). Кроме природных витаминов К, в настоящее время известен ряд производных нафтохинона, которые получены синтетическим путем, наиболее известен витамин К3 (или менадион) (Lamson et al., 2003).
Витамин K1 синтезируется растениями. Наиболее богаты витамином K1 зеленые листовые овощи, которые дают от 50 до 800 мкг на 100 г пищи. Также витамин K1 содержат зеленые томаты, плоды шиповника, листья шпината, капуста (брюссельская и цветная), крапива, хвоя, овес, соя, рожь, пшеница. Травы, богатые витамином К1: люцерна, зеленый чай, ламинария, крапива, овес и пастушья сумка. Значительно меньше содержится витамина К1 в корнеплодах и фруктах. Из пищевых продуктов наиболее богатое содержание этого витамина в печени свиньи, яйцах.
Следует помнить, что, несмотря на то что витамин К1 находится в широком спектре овощной пищи, тем не менее, поскольку витамин является жирорастворимым, для того, чтобы его усвоение осуществлялось нормально (неважно, является ли он продуктом деятельности бактерий или получен с пищей), в кишечнике должно быть немного жира.
Что касается витамина K2, он продуцируется бактериями кишечной флоры. Он также продуцируется в небольших количествах в некоторых пищевых продуктах в результате процесса брожения (сыр, традиционные азиатские продукты, такие как японские мисо и натто, приготовленные на базе сои, подвергнутой брожению, и т.д.). Витамин K2 могут синтезировать многие бактерии. Так, помимо бактерий кишечной флоры и, более конкретно, видов Escherichia coli, Bacillus subtilis и Bacteroides spp., можно назвать некоторые виды или подвиды молочнокислых бактерий, такие как Lactococcus lactis spp. lactis, Lactococcus lactis spp. cremoris, Leuconostoc lactis, Leuconostoc mesenteroides и Propionibacterium sp. Количество витамина K2, синтезированного этими бактериями, обычно варьирует примерно от 29 до 90 мкг/л сквашенного молока (Morishita et al., 1999). Важно отметить, что экспериментальные работы по получению витамина K2 чаще всего проводят на базе лиофилизатов клеточной массы, и результаты этих экспериментов демонстрируют значительную неоднородность уровня выработки К2 в зависимости от тестируемых штаммов, уровень которого может варьироваться от однократного до более чем трехкратного (Morishita et al., 1999; Parker et al., 2003).
Сейчас известно, что большинство бактерий синтезируют ограниченное количество нафтохинонов, у которых одинаковое 2-метил-1,4-нафтохиноновое кольцо, но которые отличаются по длине боковой изопренной цепи, расположенной в 3 позиции, которые обычно содержат 5-13 прениловых юнитов (по 5 углеродов в каждом). Эти вещества известны как длинноцепочечные МК, или МК-n, где n - кол-во прениловых юнитов.
Молочнокислые бактерии Lactococcus lactis spp. Cremoris продуцируют больше всего МК-8 и МК-9.
В 1943 г. А.В. Палладии и М.М. Шемякин синтезировали дисульфидное производное 2-метил-1,4-нафтохинона (витамин К3), получившее название викасол, который применяется в медицинской практике в качестве заменителя витамина К. Он не может реализовывать все функции природного витамина К (Lamson et al., 2003).
Широко известно, что витамин K1 связан с процессом свертывания крови. Так, большой дефицит витамина K1 приводит к кровотечениям с аномальным удлинением времени свертывания и к кровоподтекам. Долгое время считалось, что значительный дефицит витамина K1 редко встречается у взрослых, поскольку в принципе потребности в витамине могут в приемлемой степени покрываться за счет разнообразного и сбалансированного питания, а также за счет эндогенного образования витамина кишечными бактериями. В связи с этим к группе риска относятся следующие категории людей:
- новорожденные, в кишечнике которых при рождении отсутствуют бактерии, продуцирующие витамин K;
- лица с нарушенными функциями печени, желчного пузыря или кишечника (болезни печени, муковисцидоз, колиты, дизентерия);
- лица, принимающие антибиотики в течение длительного времени;
- люди, получающие противосвертывающие средства для предотвращения образования сгустков крови.
Основной симптом - кровотечения из носа, ран, кровоизлияния в кожу или желудочное кровотечение, сопровождаемое рвотой. Кровь может появляться в моче или кале. Наиболее опасно кровотечение в ткань мозга.
Витамин К1 необходим для нормального образования в печени белков плазмы крови, участвующих в свертывании крови. Витамин К1 участвует в превращении предшественника протромбина (препротромбина) в протромбин.
2+
2+
Чтобы протромбин мог активироваться и превращаться в тромбин, он должен связать ионы Са. При недостатке витамина К в организме синтезируются дефектные молекулы протромбина, неспособные правильно связывать ионы Са.
2+
В нормальной молекуле протромбина содержится несколько остатков γ-карбоксиглутаминовой кислоты, которая и связывает ионы Са.
Витамин К входит в состав ферментной системы, катализирующей γ-карбоксилирование остатков глутаминовой кислоты в составе протромбина.
В настоящее время изучена роль витамина К в стимулировании превращения протеинсвязанного глутамата в γ-карбоксиглутамата (Gla), который содержится в костях, почках, плаценте, поджелудочной железе, селезенке и легких.
Gla-содержащий белок в костях называется остеокальцином или костным Gla-протеином. Он является одним из важнейших неколлагеновых белков в экстрацеллюлярном матриксе костей. Было показано, что он усиливает синтез альбумина (основного транспортного белка крови) и, что совершенно неожиданно и очень важно, ферментов пищеварения - пепсина, трипсина, липазы, амилазы и других, то есть он обладает и анаболическим действием - способен оживлять, активировать процессы синтеза в организме.
Позднее было установлено, что влияние витамина K на здоровье человека не ограничивается только его ролью в механизмах свертывания крови. Действительно, с 80-х годов было признано, что витамин K также играет роль в костном метаболизме (Hart et al., 1984; Hart et al., 1985). Наибольшую роль в этой реакции играет витамин K2. Он создает условия карбоксилирования остеокальцина, основного протеина, который регулирует процесс костеобразования. В случае дефицита витамина K2 эта реакция не происходит, что влечет за собой повышение соотношения декарбоксилированного остеокальцина к карбоксилированному остеокальцину в крови (Väänänen et al., 1999).
В связи с большой ролью, которую играет витамин К2 в костеобразовании, он все чаще и чаще упоминается в литературе как многообещающий путь сохранения костного здоровья человека в течение всей его жизни.
Ранее рекомендованные нормы приема витамина K у человека (1,5 мкг/день/кг веса) были установлены только с учетом его роли в процессе свертывания крови. Так, последние исследования наводят на мысль, что эти рекомендованные нормы приема являются в конечном счете заниженными, если также учитывать активность витамина K2 в костном метаболизме (Ronden et al., 1998). Если потребности в витамине K2 еще плохо известны, это не умаляет значимости того факта, что поступление в организм небольшого количества витамина связано с низкой костной массой и повышенным риском возникновения переломов у взрослых (Hart et al., 1985; Knapen et al., 1989; Szulc et al., 1993; Booth et al., 2000). Кроме того, исследования действия витамина у женщин в период менопаузы показали, что витамин K может привести к снижению потерь костной ткани в этой целевой группе (Shiraki et al., 2000; Braam et al., 2003). И наконец, опыты на животных показали, что он мог бы оказывать благоприятное воздействие в момент пика костной массы и это действие будет более выраженным при синергическом сочетании с витамином D. При этом исследования, ясно связывающие витамин K2 и костный рост, в настоящее время проводились только на животных.
Более того, последние исследования позволили получить дополнительные аргументы в пользу влияния витамина K2 на костный метаболизм и, более конкретно, на построение и сохранение костной массы (Booth et al., 2000; Shiraki et al., 2000; Braam et al., 2003; Hirano et Ishi, 2002).
В отличие от взрослых пока существует мало данных о благоприятном действии витамина K2 на костный метаболизм ребенка. Известно только то, что важно оптимизировать костную массу в период роста для создания максимального костного запаса и защиты взрослого от риска возможного остеопороза.
В свете этого, на рынке пищевых продуктов уже имеются промышленные изделия, содержащие значительное количество витамина K2. Более конкретно, можно назвать некоторые молочные продукты, которые содержат молочнокислые бактерии, такие как кисломолочные продукты с фруктовыми наполнителями («Petits Gervais aux Fruits»), выпускаемые во Франции. Однако следует отметить, что, с одной стороны, содержание витамина К2 в этих продуктах, как правило, зависит от типа используемых микроорганизмов и, с другой стороны, штаммы Lactococcus lactis, которые традиционно используются в молочных продуктах, не продуцируют витамин K2 в достаточном количестве, чтобы полностью удовлетворить потребности организма и даже способствовать временному уменьшению возможного дефицита витамина K.
Следовательно, существует потребность в современном способе приготовления пищевых продуктов, более конкретно продуктов, получаемых путем брожения, и/или свежих молочных продуктов, которые содержат витамин K2 в количестве, достаточном для удовлетворения потребностей и, при необходимости, для восполнения дефицита как у детей и подростков, так и у взрослых, и лиц старшего возраста. Употребление данных продуктов позволит организму построить и поддерживать хорошую костную конституцию. Потребность в витамине К (МР-2008 года): у детей с 1 года до 3-х лет составляет 30 мкг в сутки, у детей от 3 до 11 лет - 60 мкг в сутки, у подростков с 11 до 18 лет - 70-100 мкг в сутки, у взрослых - 120 мкг в сутки.
Известен способ получения кисломолочных продуктов, содержащих витамин К2 (патент RU 2446211, С2, 10.11.2010), включающий получение варианта штамма молочнокислых бактерий Lactococcus lactis subsp.cremoris, который продуцирует в стандартных условиях сквашивания количество витамина K2, превышающее, по меньшей мере, примерно в 1,2 раза то количество, которое продуцирует исходный штамм молочнокислых бактерий, культивируемый в тех же условиях, для чего используют селективную среду, выбранную из числа питательных сред, содержащих бацитрацин или окислитель, такой как перекись, получение закваски, производство пищевого продукта, обогащенного витамином K2, путем добавления одного варианта и/или, по меньшей мере, одной закваски в молочное сырье и сквашивание, и получение упомянутого продукта, обогащенного витамином K2. Указанный способ требует длительных и сложных работ по выделению подходящего штамма и наращивания необходимого количества бактерий, требует большого количества микроорганизмов, а также постоянное аэрирование продукта.
6
9
Также известен способ получения кисломолочного продукта, содержащего витамин К2 (WO 2012031851, А1, 15.03.2012), включающий внесение в молочную основу бактерий Lactococcus lactis subsp. cremoris CHCC 12464 DSM 23588 в количестве от 1×10 до 1×10 КОЕ/г, сквашивание основы в подходящих условиях (30°C до pH 4,4-4,6) 8-20 ч, охлаждение до 6°С  - что замедляет процесс ферментации и нарастания клеток Lactococcus lactis subsp. cremoris CHCC 12464 DSM 23588, возможно добавление других микроорганизмов или добавок в основу и фасовка. Указанный способ требует использование специального штамма, внесение большого количества микроорганизмов в молочную основу и долгое время ферментации.
8
11
Наиболее близким аналогом к заявленной группе изобретений является способ получения кисломолочного продукта и получаемый продукт (RU 2447144 от 10.04.2012). Способ включает заквашивание молочной смеси, содержащей жир, живыми бактериальными клетками, предварительно подготовленными путем культивирования штаммов молочнокислых бактерий, продуцирующих витамин К2, в условиях аэрирования покоящихся клеток на подходящей для этого питательной среде, в количестве примерно от 10 КОЕ/мл до 10 КОЕ/мл. В качестве бактерий используют штаммы Lactococcus lactis, Leuconostoc lactis, Leuconostoc  pseudomesenteroides, Leuconostoc mesenteroides, Leuconostoc dextranicum, Enterococcus faecium и Propionibacterium sp. Сквашивание молочной смеси продолжают в течение примерно от 4 ч до 48 ч при температуре примерно от 4°C до 50°C. В результате получают кисломолочный продукт с повышенным содержанием витамина К2.
Предварительное культивирование штаммов указанных бактерий в условиях снабжения их кислородом воздуха путем аэрирования или перемешивания требует длительного времени и не обеспечивает стабильного качества и органолептических показателей получаемого кисломолочного продукта. Необходимость получения живых бактериальных клеток существенно усложняет процесс производства кисломолочных продуктов, требует дополнительного расхода энергии, а нестабильность живых бактериальных клеток затрудняет получение стабильного вкуса и качества кисломолочного продукта. У приготовленной таким образом живой заквасочной культуры ограниченный период жизни - не более 8 ч. Кроме этого, существует риск микробиологического загрязнения на этапе производства и внесения биомассы заквасочной культуры в молочную смесь.
Раскрытие изобретения
Задачами настоящего изобретения являются разработка способа получения широкого спектра кисломолочных продуктов, имеющих в своем составе повышенное содержание витамина К2, по сравнению со стандартными условиями сквашивания или ферментации, а также разработка таких продуктов.
При решении поставленных задач достигаются следующие технические результаты:
- увеличение содержания витамина К2 в кисломолочном продукте, по крайней мере, в 1,5 раза по сравнению с известными способами производства таких продуктов;
- уменьшение времени технологического процесса за счет исключения предварительного культивирования и ферментации для получения живой закваски;
- сокращение затрат энергии на производство кисломолочных продуктов;
- уменьшение риска микробиологического загрязнения готового продукта за счет использования замороженной заквасочной культуры;
- увеличение стабильности качества и органолептических показателей получаемого кисломолочного продукта.
Для решения поставленных задач в первом варианте способа получения кисломолочного продукта готовят молочную смесь путем ее последовательной нормализации по жиру и белку, гомогенизации и пастеризации. Затем перемешивают охлажденную до температуры сквашивания молочную смесь с закваской, состоящей из бактерий Lactococcus Cremoris и Lactococcus Lactis, и сквашивают до величины pH 4,4-4,8. Охлаждают сквашенную смесь до температуры 10-12°C, насыщают воздухом, выдерживают, по крайней мере, в течение 1 ч и затем охлаждают полученный кисломолочный продукт до температуры хранения.
Во втором варианте способа получения кисломолочного продукта, включающего подготовку молочной смеси путем ее последовательной нормализации по жиру и белку, гомогенизацию и пастеризацию, перемешивание охлажденной до температуры сквашивания молочной смеси с закваской. Используют закваску, состоящую из бактерий Lactococcus Cremoris и Lactococcus Lactis и пробиотических культур. Затем проводят сквашивание до величины pH 4,4-4,8, охлаждение до температуры 10-12°C, насыщение сквашенной смеси воздухом, выдержку, по крайней мере, в течение 1 ч и последующее охлаждение кисломолочного продукта до температуры хранения.
Целесообразно перед перемешиванием молочной смеси с закваской проводить дополнительно активацию закваски путем растворения в стерильных условиях замороженной закваски в стерилизованном молоке и последующей выдержки 15-25 мин при комнатной температуре.
В частном случае перемешивают молочную смесь с закваской в течение 30-60 мин.
Для получения кисломолочного продукта, такого как творог, после выдержки дополнительно отделяют от сквашенной смеси сыворотку, используя ультрафильтрацию.
Целесообразно после насыщения сквашенной молочной смеси воздухом ее выдержать в течение 4-6 ч.
При осуществлении обоих вариантов способа получают кисломолочный продукт, в частности творог.
Краткое описание чертежей.
Фиг. 1. Хроматограмма измерения содержания витамина К2 в закваске.
Фиг. 2. Хроматограмма измерения содержания витамина К2 в кисломолочном продукте (творог), приготовленном на стандартной закваске известным способом.
Фиг. 3 Хроматограмма измерения содержания витамина К2 в кисломолочном продукте (творог), приготовленном по заявленному способу.
Осуществление изобретения
В первом варианте способа получения кисломолочного продукта готовят молочную смесь, для этого ее нормализуют по жиру и белку и гомогенизируют. Для гомогенизации используют установку, обеспечивающую, в частности, 2-ступенчатую гомогенизацию, например  Tetra Term Lacta 15. Пастеризацию проводят при любых стандартных условиях нагрева и выдержки, например, на пластинчатой пастеризационно-охладительной установке, при 100°C в течение 5 мин с последующим охлаждением молока до 28-36°C, лучше до 32°C, с использованием той же установки. Далее молочную смесь перекачивают в танк, где происходит перемешивание охлажденной до температуры сквашивания (28-36°C) молочной смеси с закваской, состоящей из бактерий Lactococcus Cremoris, Lactococcus Lactis. Соотношение количества бактерий в закваске может меняться в широком диапазоне от 5% до 95% каждого вида бактерий, но наилучшие результаты получаются при соотношении, например, в интервале 1:1-1:2 или 2:1. Сквашивание ведут до получения в смеси величины рН 4,4-4,8. Количество закваски, как правило, составляет 400-1000 г на 1 т молочной смеси. После этого насыщают сквашенную молочную смесь воздухом путем периодического перемешивания, например, рамной мешалкой в танке в течение 1-8 ч.
Насыщение сквашенной смеси воздухом можно производить любым известным способом. Например, с использованием способа барботирования (пропускание воздуха через продукт), рамной, пропеллерной или турбовинтовой мешалкой, барботированием и мешалкой одновременно, циркуляцией с использованием кулачкового, центробежного, винтового или мембранного насоса. Длительность перемешивания зависит от выбранного способа по известным закономерностям: чем интенсивнее перемешивание, тем меньше время.
Затем перекачивают охлажденную до t=10-12°C сквашенную смесь (калье) в другой танк, проводят выдержку, по крайней мере, в течение 1 ч. Охлаждение до температуры 10-12°C можно проводить на пластинчатом охладителе, например марки ОХЛ-15 компании Молмаш.
При охлаждении ниже температуры 10°C существенно возрастает расход энергии на охлаждение, а также замедляется процесс взаимодействия воздуха со сквашенной молочной смесью, и 1 ч выдержки не обеспечивает получение продукта с требуемыми вкусовыми качествами. При температуре выше 12°C существенно увеличивается термодинамическое воздействие вкачанного воздуха, что также приводит к нарушению вкуса готового продукта. По истечении времени выдержки проводят последующее охлаждение кисломолочного продукта до температуры хранения, которая обычно составляет 4-6°C.
Во втором варианте осуществления способа для получения кисломолочного продукта, в способе по варианту 1 используют закваску, в которую к смеси лактобактерий Lactococcus Cremoris и Lactococcus Lactis добавлены пробиотические культуры. В качестве пробиотических культур могут быть использованы любые, но предпочтительнее Bifidobacterium, и/или Lactobacterium acidophilum, и/или Lactobacterium casei, и/или Lactobacterium rhamnosus. Содержание каждой из этих бактерий в закваске может меняться в широком диапазоне концентраций, например от 5% до 95%, но лучше выбирать соотношения в интервале 1:1:1-1:2:1 или 2:1:1.
Можно перед перемешиванием молочной смеси с закваской дополнительно активировать закваску путем растворения в стерильных условиях замороженной закваски в стерилизованном молоке и выдержку полученной растворенной закваски в течение 15-25 мин при комнатной температуре, что дает активацию (перевод) микроорганизмов из спящего состояния в активное.
Целесообразно перемешивать молочную смесь с закваской в течение 30-60 мин при температуре сквашивания, составляющей 31-34°C.
После насыщения сквашенной молочной смеси воздухом лучше выдержать ее 4-6 ч при температуре 10-12°C.
Можно для получения кисломолочного продукта типа творога или свежего сыра после выдержки сквашенной молочной смеси дополнительно отделить от нее сыворотку путем, например, ультрафильтрации.
При осуществлении заявленных способов получают кисломолочный продукт, содержащий повышенное содержание природного витамина К2 в количестве от 5 до 60 мкг/100 грамм продукта.
Пример 1
Готовят молочную смесь, для чего смешивают 2,175 тонны молока цельного с массовой долей жира 3,4% с 2,850 тоннами обезжиренного молока с массовой долей жира 0,05%. Полученную нормализованную молочную смесь с массовой долей жира 1,5% и белка 3,15% подогревают для процесса гомогенизации до температуры 52°C, гомогенизируют в две ступени при давлении 22,5 МПа, чтобы жир равномерно распределился в молочной смеси. Затем ее пастеризуют, нагревая до температуры 100°С с выдержкой 5 мин. После этого охлаждают помещенную в ферментационный танк молочную смесь до температуры 32°С и вносят 500 г закваски, состоящей из смеси бактерий Lactococcus Cremoris и Lactococcus Lactis. Соотношение бактерий в смеси 1:1. Сквашивают в течение 8 ч до pH 4,7. Затем включают охлаждение ледяной водой через рубашку ферментационного танка и перемешивают в течение 1 ч рамной мешалкой для насыщения ферментированной смеси воздухом. Охлаждают до 10°C и выдерживают 6 ч. Готовый продукт фасуют и хранят при температуре 6°C.
Пример 2
Готовят молочную смесь, также как в примере 1, подогревают ее для процесса гомогенизации до температуры 54°C, гомогенизируют в две ступени - 22,5 МПа, чтобы жир равномерно распределился в молоке. Пастеризуют молоко при 95°С с выдержкой 4 мин. Охлаждают до температуры 34°С, затем вносят в танк 1000 г закваски, состоящей из смеси Lactococcus Cremoris : Lactococcus Lactis : пробиотическая культура Bifidobacterium в соотношении концентраций 1:1:2. Сквашивают в течение 6 ч до pH 4,6. Включают охлаждение ледяной водой через рубашку ферментационного танка с одновременным перемешиванием в течение 2 ч для насыщения ферментированной смеси воздухом. Охлаждают до 12°C и выдерживают 1 ч. Готовый продукт фасуют и хранят при температуре 5°C.
Пример 3
Осуществляют способ, как в примере 2, но в качестве пробиотической культуры используют бактерии Lactobacterium acidophilum.
Пример 4
Осуществляют способ, как примере 2, только в качестве пробиотической культуры используют бактерии Lactobacterium casei.
Пример 5
Осуществляют способ, как примере 2, только в качестве пробиотической культуры используют бактерии Lactobacterium rhamnosus.
Пример 6
Осуществляют способ, как примере 1 или 2, только перед перемешиванием молочной смеси с закваской проводят дополнительно предварительную активацию заквасочных микроорганизмов. Для этого 1 кг закваски помещают в стерильных условиях в 10 л стерилизованного молока и выдерживают 20 мин при комнатной температуре, составляющей примерно 20 ° С.
Пример 7
Осуществляют способ, как примере 1 или 2, только после внесения закваски в молоко 30 минут проводят перемешивание молочной смеси с закваской.
Пример 8
Осуществляют способ, как примере 1 или 2, только после выдержки сквашенной молочной смеси ее подогревают до 50°C и проводят ультрафильтрацию через металлокерамические мембраны с размером пор 0.1 мкм. Полученный фильтрат представляет собой кисломолочный продукт - творог. Его охлаждают до 10°C и фасуют. Готовый продукт хранят при температуре 6°С.
Пример 9
Осуществляют способ как в примере 2, но после насыщения ферментированной смеси воздухом ее охлаждают до 11°C и выдерживают 4 ч.
Пример 10
Осуществляют способ, как в примере 1, но после насыщения ферментированной смеси воздухом ее охлаждают до 10°C и выдерживают 1 ч.