Средство для стимуляции регенерации ткани печени при парентеральном введении и способ стимуляции регенерации ткани печени на его основе
MEANS FOR STIMULATION OF LIVER TISSUE REGENERATION AT PARENTERAL ADMINISTRATION AND METHOD FOR STIMULATION OF LIVER TISSUE REGENERATION BASED THEREON

Изобретение относится к лекарственным средствам и способам стимулирования регенерации ткани печени и может быть использовано в медицине и ветеринарии.
1
6
12
В настоящее время известны препараты, улучшающие метаболические процессы в печени, к которым относятся природные антиоксиданты, в частности витамины группы В (В, В, В), аскорбиновая кислота, витамин Е, витамин А; препараты из лекарственных растений - Лив-52 (Большая Российская Энциклопедия лекарственных средств, М.: Издательство Ремедиум, т. 2, 2002, с. 435). Известны средства, улучшающие обмен веществ в клетках печени, среди которых следует отметить силибинин (Большая Российская Энциклопедия лекарственных средств, М.: Издательство Ремедиум, т. 2, 2002, с. 719); сирепар (Большая Российская энциклопедия лекарственных средств, М.: Издательство Ремедиум, т. 2 2002, с. 722); эссенциале (патент РФ №2462251, опубл. 27.09.2012 г.); а также синтетические пептидные препараты (патент РФ №2166957, опубл. 2000 г.).
Указанные выше известные средства обладают только однонаправленным действием, а именно - улучшают метаболические процессы в печени и повышают ее устойчивость к патогенным воздействиям.
перорального
Bac. subtillis
Bac. subtillis
Известно клинико-экспериментальное обоснование  применения пробиотика споробактерина (на основе бактерии  534) в комплексной терапии при механической желтухе (А.А. Третьяков, А.А. Стадников, А.В. Валышев Кафедры хирургии ФППС, гистологии Оренбургской государственной медицинской академии. Журнал "Анналы травматологии и ортопедии", №2, 2001 г. ). Учитывая полученные авторами экспериментальные данные о механизмах транслокации  534 в условиях механической желтухи, путях ее миграции из желудочно-кишечного тракта в билиарную систему, противомикробных и стимулирующих регенераторные процессы в печени свойствах сенной палочки, наблюдалась эффективность действия препарата споробактерина, созданного на основе этого микроорганизма в комплексном лечении хронического и острого холангита.
Известно средство Эссенциале, обладающее гепатопротекторным действием (Машковский М.Д. Лекарственные средства. - 15-е изд. - М.: Новая Волна, 2005. - С.526-528). Создан он на основе эссенциальных фосфолипидов, а говоря точнее - высокоочищенной фракции фосфатидилхоллина, имеющей название дилинолеоилфосфатидилхоллин. Фирма-производитель: A.NATTERMANN and Cie. GmbH (Германия). Эссенциале препарат предназначен как для перорального приема (выпускается в форме капсул), так и для парентерального (в форме ампул для инъекций). Препарат вводится внутривенно по (5-10) мл в сутки, а в сложных случаях доза может быть увеличена до 20 мл. Кроме того, существуют особые условия введения Эссенциале: лекарственное средство разводят кровью больного или раствором глюкозы [(5-10) %] в пропорции один к одному и уже после этого вливают внутривенно. Внутримышечное введение препарата категорически запрещено по причине возникновения местного раздражения. Курс лечения с помощью инъекций обычно составляет 10 дней и дополняется приемом капсул. Общая продолжительность лечения Эссенциале довольно длительная - до полугода. Гепатопротектор Эссенциале не представлен в фармакопеях стран Северной Америки, Европы, Австралии и Новой Зеландии и не включен в Клинические Рекомендации - практические руководства для врачей и хирургов, которыми они пользуются для принятия решений по диагностике и лечению заболеваний, как не подтвердившие своей практической значимости.
Недостатком данного препарата и схемы его применения является то, что он не позволяет полностью купировать синдромы воспаления, холестаза и печеночно-клеточной недостаточности.
Известен способ коррекции гиперхолестеринемии пробиотиком, при этом в качестве пробиотика больному перорально дают по 1 мл 2 раза в сутки споробактерин жидкий в течение 30 дней (патент РФ №2388479, МПК A61K 35/74, A61P 3/06, опубл. 10.05.2010 г.).
Недостатком данного способа является невысокая эффективность коррекции гиперхолестеринемии пробиотиком.
Bacillus subtillis
7
Известно лечебное средство для восстановления функции печени при хроническом гепатите С, содержащее гепатопротектор (Эссенциале, Фосфоглив, Урсосан) и бактериальный препарат споробактерин в жидкой форме, представляющий собой жизнеспособные клетки штамма  ВКМ 1666 D в концентрации не менее 10 КОЕ/мл в изотоническом растворе натрия хлорида (Князькина О.В. Автореферат диссертации на соискание ученой степени к.м.н. «Микробиоценоз кишечника у больных хроническим гепатитом С и его коррекция», Москва 2013 г., стр. 7).
Bacillus subtillis
7
перорально
Известен способ восстановления функции печени при хроническом гепатите С, включающий прием препаратов-гепатопротекторов (Эссенциале, Фосфоглив, Урсосан) по 2 капсулы 3 раза в сутки во время еды курсом до 3-х месяцев и бактериальный препарат споробактерин в жидкой форме, представляющий собой жизнеспособные клетки штамма  ВКМ 1666 D в концентрации не менее 10 КОЕ/мл  по 1 мл, два раза в день за 30 минут до приема пищи, разводя назначенную дозу в 15 мл остуженной кипяченой воды, в течение 3 месяцев. (Князькина О.В. Автореферат диссертации на соискание ученой степени к.м.н. «Микробиоценоз кишечника у больных хроническим гепатитом С и его коррекция», Москва 2013 г., стр. 7).
В группе больных, принимавших споробактерин и гепатопротекторы, уменьшились проявления дисбактериоза толстого кишечника, улучшились клиническая картина, некоторые биохимические показатели (АлАТ, АсАТ, ЩФ, билирубин), показатели гуморального и клеточного иммунитета, а также снизилась вирусная нагрузка, в отличие от группы пациентов, не принимавших пробиотик споробактерин, у которых значимых изменений не выявлено.
Однако указанное лечебное средство и способ его применения для восстановления функции печени при хроническом гепатите С имеют недостаточный лечебный эффект, связанный с восстановлением клеток печени.
Ниже приведен ряд лечебных средств на основе пробиотиков и способы их парентерального применения (внутривенное, внутримышечное, внутрибрюшинное и подкожное) для лечения некоторых инфекционных и соматических заболеваний организма.
Corynebacterium diphtheriae tox-
Известен способ получения пробиотического препарата корпускулярных антигенов коринебактерий липопептидополисахаридной природы для профилактики и лечения туберкулеза (патент РФ №2468816, МПК A61K 39/05, C12N 1/20, опубл. 10.12.2012 г.). Для этого наращивают биомассу пробиотического симбионтного штамма  №2 ГИСК им. Л.А. Тарасевича в жидкой питательной среде, содержащей гидролизат казеина, осаждают полученные микробные клетки центрифугированием, промывают осадок целых клеток при центрифугировании, далее клетки суспендируют в растворе хлорида натрия, дезинтегрируют при температуре (25-30)°C в течение 15 мин при частоте 20 кГц и амплитуде 14 мкм, повторно центрифугируют при 5000 g и удаляют оставшиеся целые клетки, полученный надосадок центрифугируют при 14000 g в течение 20 мин и получают осадок, содержащий корпускулярные антигены клеточных стенок коринебактерий, осадок ресуспендируют в растворе стабилизатора и подвергают дезинтеграции при температуре (25-30)°C в течение 5 мин при частоте 20 кГц и амплитуде 14 мкм, полученный дезинтеграт клеточных стенок разводят до концентрации (225-275) мкг/мл, стерилизуют и высушивают целевой продукт методом лиофилизации. Указанный пробиотический бактериальный препарат для профилактики и лечения туберкулеза, содержащий корпускулярные антигены коринебактерий липопептидополисахаридной природы вводят подкожно мышам для проверки его профилатического действия против туберкулеза.
Bacillus subtillis
Bacillus subtillis
3
3
Известен способ получения препарата для лечения радиационных поражений организма животных, предусматривающий выращивание споровой культуры  3 на питательной среде, содержащей плацентарно-эмбрионально-маточный гидролизат тканей и органов животных, содержащий 90 мг % аминного азота, полученный из плаценты, эмбрионов и матки убойных животных, получение культуральной жидкости  3, добавление суспензиеобразующей монтмориллонитовой фракции цеолита и гидролизата лактоальбумина, смешивание в соотношениях 1:1:0,5 соответственно, стерилизацию и розлив во флаконы (патент РФ №2366448, МПК A61K 38/01, A61K 35/50, опубл. 16.09.2009 г.). Используют цеолит, предварительно подвергнутый обработке соляной кислотой с последующим удалением дистиллированной водой растворимых солей и кварца, причем из оставшихся частиц цеолита отмучены частицы монтмориллонита величиной (0,0006-0,0009) мм, с последующим высушиванием полученной фракции. Известен также способ лечения радиационных поражений организма животных путем однократного подкожного введения в организм препарата, полученного по указанному выше способу, в дозах (7-10) см (мелким) и (15-20) см (и крупным) из расчета (6,5-7,5) мг сухого вещества на 1 кг живой массы в первые (1-10) суток после облучения (патент РФ №2366448, МПК A61K 38/01, A61K  35/50, опубл. 16.09.2009 г.).
Известен способ лечения телят, больных неспецифической катаральной бронхопневмонией, включающий использование антибактериального средства, отхаркивающих и противовоспалительных фитопрепаратов (патент РФ №2321393, МПК A61K 31/00, опубл. 10.04.2008 г.). В качестве антибактериального средства применяют биопрепарат Зимун 4.24 внутримышечно, в дозе (0,07-0,14) мл/кг живой массы один раз в сутки в течение (5-6) сут, в качестве отхаркивающего и противовоспалительного средства мукалтин внутрь, в дозе (100-150) мг на голову 2 раза в сут, в качестве витаминов аскорбиновую кислоту внутрь по (5-6) г на голову 2 раза в сут., тривит внутримышечно в дозе (2-2,5) мл на голову однократно в первые сутки терапии, в качестве аналептика сульфокамфокаин 10%-ный в дозе (2-4) мл 2 раза в сут.
Bacillus subtillis
Е. Coli
Экономическая эффективность данного способа лечения на один рубль затрат составляет 5,71 руб. Зимун 4.24 - препарат, разработанный учеными ООО НПФ «Исследовательский центр - 1», содержит споровую биомассу бактерий  штамм 7048 и наполнитель. Представляет собой прозрачную мутноватую жидкость, при хранении допускается образование осадка желтовато-белого цвета на дне флакона, который при встряхивании легко разбивается на равномерную взвесь. Препарат обладает высокой антагонистической активностью к широкому спектру патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. На непатогенные штаммы  антагонистическим действием не обладает. Помимо этого препарат стимулирует регенерационные процессы в организме, активизирует обменные процессы и биосинтез белка, нормализует окислительно-восстановительные процессы, повышает интенсивность роста молодняка и сохранность животных. Согласно исследованиям авторов препарат Зимун 4.24 не обладает острой и хронической токсичностью, кумулятивным эффектом, не вызывает анафилактического шока, развития септических процессов и воспалительных реакций. Его длительное парентеральное применение в высоких дозах не оказывает повреждающего воздействия на внутренние органы и картину крови белых мышей, он не обладает негативным влиянием на репродуктивную функцию и не вызывает мутаций половых клеток.
Однако в вышеприведенных аналогах отсутствуют сведения о стимулировании регенерации ткани печени при различных заболеваниях.
Известен способ стимуляции регенерации печеночной ткани (Патент РФ №2134582, МПК A61K 35/55, A61K 31/56, опубл. 20.08.1999 г.), при котором регенерационная терапия печени осуществляется путем подкожного введения экспериментальным животным вытяжки коры свиных или фетальных (человеческих) надпочечников в дозе по 0,5 мл в количестве двух инъекций. Способ повышает эффективность регенерации печеночной ткани и восстановление паренхимы патологически измененной печени с одновременным снижением побочных эффектов от применяемого синтетического лекарственного средства.
Недостатком выше условного аналога является сложность и затратность воспроизведения предложенной технологии ввиду сложности получения вытяжки фетальных надпочечников, свободной от вирусов и чужеродных белков.
Известен способ стимуляции регенерации печени с применением стимуляторов физической природы (патент РФ №2198621, МПК A61B 18/12, A61B 17/00, опубл. 20.02.2003 г.), в котором проводят прижигание капсулы печени в шахматном порядке силой тока 8 мА с шириной шага 2 см до снижения величины тканевого давления на (5-10) % от исходного, при этом стимуляция вызывает ответную реакцию структурных элементов печени и заканчивается достоверным увеличением объема гепатоцитов без нарушения строения печени.
Однако в данном способе подобное воздействие может проводиться только под общей анестезией в виде операции с раскрытием брюшной полости для получения доступа к органу.
Наиболее близким аналогом (прототипом) средства для стимулирования регенерации ткани печени является фармацевтическая композиция, характеризующаяся тем, что содержит в качестве активного начала эффективное количество пептида глутамил-аспартил-лейцин общей формулы H-Glu-Asp-Leu-OH последовательности 1 [SEQ ID NO: 1] и фармацевтически приемлемый носитель (патент РФ №2297239, МПК A61K 38/06, A61P 1/16, опубл. 20.04.2007 г.).
Наиболее близким способом стимуляции регенерации ткани печени (прототипом) является способ, заключающийся во введении пациенту фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного начала пептид глутамил-аспартил-лейцин общей формулы H-Glu-Asp-Leu-OH последовательности 1 [SEQ ID NO: 1] в дозе 0,01-100 мкг/кг массы тела, по крайней мере, один раз в день в течение периода, необходимого для достижения терапевтического эффекта (патент РФ №2297239, МПК A61K 38/06, A61P 1/16, опубл. 20.04.2007 г.). Введение осуществляют внутримышечно. Применение фармацевтической композиции, содержащей пептид H-Glu-Asp-Leu-OH в разных дозировках, способствовало нормализации уровня билирубина и активности АЛТ, что свидетельствует о нормализации метаболических процессов в печени, снижении активности воспалительного процесса и восстановлении синтеза тканеспецифических белков клетками печени. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о свойстве фармацевтической композиции, содержащей пептид H-Glu-Asp-Leu-OH, стимулировать регенерацию ткани печени. Кроме того, результаты исследований подтверждают целесообразность применения фармацевтической композиции, содержащей пептид H-Glu-Asp-Leu-OH, в комплексном лечении хронического гепатита в фазе обострения и ремиссии.
Однако данное средство-прототип и способ его применения обладают недостаточным терапевтическим действием вследствие малого накопления препарата в печени, из-за наличия нарушений тканевого кровообращения данного органа, свойственных хроническим гепатитам и циррозам, а также недостаточная биодоступность данного препарата для ткани печени при введении его внутримышечно.
Bacillus subtillis
Техническим результатом изобретения является повышение стимуляции пролиферации гепатоцитов с сохраненной гистологической структурой и замещение пораженной паренхимы печени на здоровую при лечения гепатита, цирроза печени, острой печеночной недостаточности, хронической недостаточности печени за счет повышения накопления пробиотика  в печени.
Bacillus subtillis
Bacillus subtillis
Bacillus subtillis
Bacillus subtillis
7
Указанный технический результат достигается тем, что средство для стимуляции регенерации ткани печени при парентеральном введении в организм, согласно изобретению, оно содержит жидкую форму жизнеспособных клеток бактерий   в концентрации не менее 10 КОЕ/мл в изотоническом растворе натрия хлорида. В качестве бактерий   оно содержит рекомбинантный штамм   ВКПМ В-10641, обладающий антибактериальной, фунгицидной и вирулицидной активностью и продуцирующий альфа-2 интерферон человека.
Bacillus subtillis
7
Указанный технический результат достигается также тем, что в способе стимуляции регенерации ткани печени, включающем парентеральное введение в организм средства для стимуляции регенерации ткани печени в течение периода, необходимого для достижения терапевтического эффекта, согласно изобретению, в качестве средства для стимуляции регенерации ткани печени используют жидкую форму жизнеспособных клеток штамма бактерий  ВКПМ В-10641 в концентрации не менее 10 КОЕ/мл в изотоническом растворе натрия хлорида в виде суспензии, а введение указанного средства осуществляют инфузионно внутривенно капельно или внутривенно струйно однократно в количестве 1-2 мл на 1 кг живой массы тела при ресуспендировании дозы в 200 мл изотонического раствора натрия хлорида.
Bacillus subtillis
Bacillus subtillis
Bacillus subtillis
Штамм бактерий  IC-1435-1-1 обладает бактерицидной, фунгицидной и вирулицидной активностью и депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУП ГосНИИГенетика под регистрационным номером ВКПМ В-10641. Штамм  IC-1435-1-1 получен путем селекции рекомбинантного штамма бактерий  IC-16. Указанный штамм подвергался селекции на подавление бактериального и грибного роста, а также по признаку количества продуцируемого интерферона α-2 лейкоцитарного человеческого.
amyloliquefaciens
Candida
B. subtillis
Плазмида рВМВ 105 способна реплицироваться в бациллах и содержит в своем составе ген альфа-2- интерферона человека, промотор для экспрессии этого гена, сайт посадки рибосом (SD-сайт) и сигнальный пептид альфа-амилазы  для секреции интерферона в культуральную среду. С лучшими клонами проводили эксперименты по подавлению роста: энтеробактерий, грамположительных кокков, неферментируюших бактерий, грибов рода , возбудителей фузариоза растений, пурпуровой пятнистости малины, септориоза малины. Определение активности интерферона проводили на культуре клеток с использованием вируса энцефаломиокардита мышей. Концентрация человеческого альфа-2 интерферона, полученная методом подавления ЦПД, была не менее 30 МЕ/г исследуемого образца, что на порядок выше, чем в исходном штамме-прототипе  В-7092.
Bacillus subtillis,
Bacillus subtillis
B. subtillis
B. subtillis
Lactobacillus
Bifidobacterium
B. subtillis
Механизмы пробиотического действия бактерий  в том числе  ВКПМ В-10641, связаны с синтезом противомикробных веществ, усилением неспецифического и специфического иммунитета, стимуляцией роста нормальной микрофлоры кишечника и выделением пищеварительных ферментов.  выделяет рибосомально синтезируемые пептиды, нерибосомально синтезируемые пептиды и непептидные вещества с широким спектром противомикробной активности, охватывающим грамположительные, грамотрицательные бактерии, вирусы и грибы. Резистентность к данным противомикробным веществам возникает редко. Усиление неспецифического иммунитета связано с активацией макрофагов и высвобождением из них провоспалительных цитокинов, повышением барьерной функции слизистой оболочки кишечника, выделением витаминов и аминокислот (включая незаменимые). Усиление специфического иммунитета проявляется активацией Т и В-лимфоцитов и высвобождением из последних иммуноглобулинов - IgG и IgA. стимулирует рост нормальной микрофлоры кишечника, в частности бактерий родов  и  (Севастьяненко А.В. Механизмы действия пробиотиков на основе  // Актуальная инфектология. №2(11), стр. 35-44). http://cyberleninka.ru/article/n/mehanizmy-deystviya-probiotikov-na-osnove-bacillus-subtilis#ixzz4YGwap3ZK.
Методика культивирования бактерий Bacillus subtillis для получения микробной биомассы заявляемого средства.
Bacillus subtillis
Для получения биомассы спор бактерий штаммы  ВКПМ В-10641 культивировали на жидкой питательной среде следующего состава:
- пептон мясной ферментативный - 10,0 г;
- дрожжевой экстракт - 5,0 г;
- хлорид натрия - 5,0 г;
3
- дистиллированная вода - до общего объема 1 дм.
рН (7,2±0,2).
3
3
8
3
10
3
На 1 дм ферментационной питательной среды использовали 10 см посевного материала с титром 10 КОЕ/см. Процесс выращивания биомассы осуществляли в ферментере в течение (48±2) часов. При указанном способе культивирования может быть получен титр спор (5-10)×10 КОЕ/см.
7
Полученную биомассу бактерий разбавляли изотоническим раствором натрия хлорида до получения титра не менее 10 КОЕ/мл.
Ниже приведены примеры 1-2 заявляемого средства в жидкой форме следующих составов:
Пример 1.
Bacillus subtillis
9
Бактерии штамма  ВКПМ В-10641- 10 КОЕ/мл живых клеток и спор; натрия хлорида - 70 г; воды дистиллированной - до одного литра.
Пример 2.
Bacillus subtillis
7
Бактерии штамма  ВКПМ В-10641- 10 КОЕ/мл живых клеток и спор; натрия хлорида - 90 г; воды дистиллированной - до одного литра.
Пример 3.
Bacillus subtillis
7
Способ стимуляции регенерации ткани печени. Способ включает парентеральное введение в организм средства для стимуляции регенерации ткани печени в течение периода, необходимого для достижения терапевтического эффекта. В качестве средства для стимуляции регенерации ткани печени используют жидкую форму жизнеспособных клеток штамма бактерий  ВКПМ В-10641 в концентрации не менее 10 КОЕ/мл в изотоническом растворе натрия хлорида в виде суспензии. По показаниям указанное средство используют в соответствии с примером 1 или 2 инфузионно внутривенно капельно или внутривенно струйно однократно в количестве не более 250 мкл на 1 кг живой массы тела при ресуспендировании дозы в 200 мл изотонического раствора натрия хлорида.
Ниже приведены экспериментальные данные в примерах 4, 5, и 6, подтверждающие эффективность использования заявляемого способа.
Пример 4.
Bacillus subtillis
Было проведено доклиническое исследование штамма  ВКПМ В-10641 на крысах породы Вистар. Животные выращивались в условиях питомника лабораторных животных по стандартной технологии. На момент проведения эксперимента все подопытные животные были массой (260-280) г. Способ введения штамма - инъекция в хвостовую вену суспензии штамма в изотоническом растворе натрия хлорида. Доза штамма на одно животное - 1 мл. Введение медленное струйное.
В опыте определяли время персистирования штамма в крови животных, физиологический статус по общему и биохимическому анализу крови, гистологическую структуру внутренних органов животных, для чего были сформированы по принципу аналогов 6 групп, по 10 голов обоего пола в каждой:
B. subtillis
4
1 группа: штамм  ВКПМ В-10641 внутривенно в дозе 250 мкл/кг живой массы с титром 10 КОЕ/мл, однократно.
B. subtillis
5
2 группа: штамм  ВКПМ В-10641 внутривенно в дозе 250 мкл/кг живой массы с титром 10 КОЕ/мл, однократно.
B. subtillis
6
3 группа: штамм  ВКПМ В-10641 внутривенно в дозе 250 мкл/кг живой массы с титром 10 КОЕ/мл, однократно.
B. subtillis
7
4 группа: штамм  ВКПМ В-10641 внутривенно в дозе 250 мкл/кг живой массы с титром 10 КОЕ/мл, однократно.
B. subtillis
8
5 группа: штамм  ВКПМ В-10641 внутривенно в дозе 250 мкл/кг живой массы с титром 10 КОЕ/мл, однократно.
B. subtillis
9
6 группа: штамм  ВКПМ В-10641 внутривенно в дозе 250 мкл/кг живой массы с титром 10 КОЕ/мл, однократно.
B. subtillis
Каждому животному на 1 кг живой массы однократно инъецировали 250 мкл жидкого штамма  В-10641 в разных концентрациях в зависимости от номера группы. Для учета динамики выделения штамма у животных отбирали кровь из хвостовой вены с периодичностью один раз в сутки до прекращения выделения бактерий. Для определения лейкоцитарной формулы и проведения биохимического анализа сыворотки кровь отбирали до начала эксперимента, на третий день и после окончания персистирования штамма при эвтаназии. Органы для изучения морфологии отбирали после окончания персистирования штамма при убое.
При ежедневном клиническом осмотре животных опытных групп в течение всего эксперимента отклонений не выявлено. Температура, пульс, дыхание, общее состояние соответствовали физиологической норме.
Динамика выделения штамма из крови представлена в таблице 1.
B. subtillis
7
8
9
Поскольку в группах 1, 2, 3 уже через сутки от момента начала эксперимента титр штамма  был равен нулю, последующее снятие данных в этих группах было прекращено. В группах с введением суспензии препарата с титрами 10, 10 КОЕ/мл на голову время персистирования штамма В. subtilis в крови составило 5 суток, с титром 10 КОЕ/мл на голову - 7 суток.
7
9
4
6
До эксперимента показатели общеклинического анализа крови животных соответствовали норме (табл. 2), наблюдали незначительное понижение общего количества лейкоцитов (лейкопению), которая при сохранении нормальности лейкоцитарной формулы не имеет в данном случае диагностического значения. На третьи сутки со дня начала эксперимента у животных, которым вводили штамм с титрами (10-10) КОЕ/мл, наблюдали повышение общего количества лейкоцитов, которое соответствовало норме, а также сдвиг в лейкоцитарной формуле с увеличением содержания эозинофилов и палочкоядерных нейтрофилов. Кровь опытных животных, которым вводили штамм с титрами (10-10) КОЕ/мл, согласно изученным показателям общеклинического анализа, соответствовала крови нативных животных, исследованных до начала эксперимента. К моменту выведения штамма из крови у животных всех опытных групп показатели общего анализа крови соответствовали нормальным (табл. 3 и 4).
Примечание: Б - базофилы, Э - эозинофилы, ПН - палочкоядерные нейтрофилы, СН - сегментоядерные нейтрофилы, Л - лимфоциты, М - моноциты.
Лейкоцитарная формула крови подопытных животных также не имела отклонений.
Примечание: (+) - наличие штамма, (-) - отсутствие штамма, 0 - штамм не выделен.
До начала эксперимента животные имели некоторые отклонения в биохимическом профиле сыворотки крови. Так, у самцов и самок было пониженное содержание щелочной фосфатазы и глюкозы, а также повышен креатинин относительно нормальных показателей (табл. 5).
По результатам патологоанатомического вскрытия внешних визуальных изменений и патологий внутренних органов не установлено. В таблице 5 представлены данные по морфометрии печени и селезенки.
B. subtillis
B. subtillis
4
6
7
9
Установлено, что при введении суспензии штамма  с титрами 10-10 КОЕ/мл линейные размеры печени и селезенки остаются неизменными в сравнении с нативными животными, органы которых были исследованы до начала эксперимента. При введении суспензии штамма  с титрами (10-10) КОЕ/мл наблюдали незначительное увеличение длины печени и ее массы, а также повышение клеточности паренхимы органа.
Результаты биохимического исследования крови представлены в табл. 6.
По результатам патологоанатомического вскрытия внешних визуальных изменений и патологий внутренних органов не установлено. Ниже представлены данные по морфометрии печени и селезенки (табл. 6).
Результаты биохимического исследования крови представлены в табл. 7.
4
6
7
8
5
6
Повторный забор крови у всех животных опытных групп осуществляли на третий день от начала эксперимента (от введения штамма парентерально внутривенно). Результаты представлены в табл. 8. Установлено, что введение штамма с титрами (10-10) КОЕ/мл не вызывает увеличения ACT в сыворотке крови. У животных, которым вводили штамм с титрами (10-10) КОЕ/мл, происходит увеличение активности печеночных ферментов, а именно ACT, и одного субстрата - общего билирубина. Прочие ферменты, в том числе ферменты печени АЛТ, щелочная фосфатаза, субстрат - общий белок, остаются в норме. В группах животных, которым вводили штамм с титрами 10, 10 КОЕ/мл, незначительно увеличивается содержание общего билирубина.
Так же, как и у нативных животных, у опытных уровень глюкозы в сыворотке крови остается пониженным, поэтому несоответствие норме данного показателя нельзя относить на счет влияния парентерального введения штаммов в кровь животных.
Окончательные результаты биохимического анализа сыворотки крови представлены в табл. 9. Установлено, что все показатели, имевшие отклонения животных опытных групп, на момент выведения штамма из крови пришли в норму, в том числе ферменты и субстраты, характеризующие работу печени.
Пример 5
Bacillus subtillis
Bacillus subtillis
Было изучено действие штамма бактерий  ВКПМ В-10641, ресуспендированного в изотоническом растворе натрия хлорида при парентеральном (внутривенном) введении на кроликах, и динамика персистирования штамма в организме животных. Объектами исследований были кролики породы «советская шиншилла», обоего пола, возраста 12 месяцев, массой (3500±100) г. Штамм бактерий  ВКПМ В-10641.
Эксперимент состоял из нескольких этапов.
На первом определяли время персистирования штамма в крови животных, для чего были сформированы по принципу аналогов 6 групп, по 10 голов обоего пола в каждой:
B. subtillis
4
1 группа: штамм  ВКПМ В-10641 внутривенно в дозе 250 мкл/кг живой массы с титром 10 КОЕ/мл, однократно.
B. subtillis
5
2 группа: штамм  ВКПМ В-10641 внутривенно в дозе 250 мкл/кг живой массы с титром 10 КОЕ/мл, однократно.
B. subtillis
6
3 группа: штамм  ВКПМ В-10641 внутривенно в дозе 250 мкл/кг живой массы с титром 10 КОЕ/мл, однократно.
B. subtillis
7
4 группа: штамм  ВКПМ В-10641 внутривенно в дозе 250 мкл/кг живой массы с титром 10 КОЕ/мл, однократно.
B. subtillis
8
5 группа: штамм  В-10641 внутривенно в дозе 250 мкл/кг живой массы с титром 10 КОЕ/мл, однократно.
B. subtillis
9
6 группа: штамм  ВКПМ В-10641 внутривенно в дозе 250 мкл/кг живой массы с титром 10 КОЕ/мл, однократно.
B. subtillis
Каждому животному на 1 кг живой массы однократно инъецировали 250 мкл жидкого штамма ; ВКПМ В-10641 в разных концентрациях в зависимости от номера группы. Для учета динамики выделения штамма у животных отбирали кровь из ушной вены с периодичностью один раз в 2 суток до прекращения выделения бактерий.
На втором этапе определяли время персистирования штамма в крови животных групп 1-3 первого эксперимента в связи с тем, что первоначально выбранная кратность забора крови (через 24 часа от начала введения) не позволила выявить введенный штамм в крови.
Для этого из животных были сформированы по принципу аналогов 3 группы, по 5 голов обоего пола в каждой:
B. subtillis
4
1 группа: штамм  ВКПМ В-10641 внутривенно в дозе 1000 мкл с титром 10 КОЕ/мл на голову, однократно.
B. subtillis
5
2 группа: штамм  ВКПМ В-10641 внутривенно в дозе 1000 мкл с титром 10 КОЕ/мл на голову, однократно.
B. subtillis
6
3 группа: штамм  ВКПМ В-10641 внутривенно в дозе 1000 мкл с титром 10 КОЕ/мл на голову, однократно.
B. subtillis
Каждому животному на 1 кг живой массы однократно инъецировали 250 мкл штамма  ВКПМ В-10641 в разных разведениях в зависимости от номера группы. Для учета динамики выделения штамма у животных отбирали кровь из ушной вены с периодичностью один раз в час до прекращения выделения бактерий.
B. subtillis
На третьем этапе определяли летальную дозу штамма  ВКПМ В-10641, для чего из животных были сформированы по принципу аналогов 4 группы, по 5 голов обоего пола в каждой:
B. subtillis
9
1 группа (группа D): штамм  ВКПМ В-10641 внутривенно в дозе 500 мкл/кг живой массы с титром 10 КОЕ/мл на голову, однократно, инфузионно, при ресуспендировании дозы в 200 мл изотонического раствора натрия хлорида, со скоростью.
B. subtillis
9
2 группа (группа С): штамм  ВКПМ В-10641 внутривенно в дозе 700 мкл/кг живой массы с титром 10 КОЕ/мл на голову, однократно, инфузионно, при ресуспендировании дозы в 200 мл изотонического раствора натрия хлорида, со скоростью.
B. subtillis
9
3 группа (группа В): штамм  ВКПМ В-10641 внутривенно в дозе 1000 мкл/кг живой массы с титром 10 КОЕ/мл на голову, однократно, инфузионно, при ресуспендировании дозы в 200 мл изотонического раствора натрия хлорида, со скоростью.
B. subtillis
9
4 группа (группа А): штамм  ВКПМ В-10641 внутривенно в дозе 2000 мкл/кг живой массы с титром 10 КОЕ/мл на голову, однократно, инфузионно, при ресуспендировании дозы в 200 мл изотонического раствора натрия хлорида, со скоростью.
После инъекции (инфузии) определяли физиологическое состояние животных и в динамике отслеживали выживаемость.
В ходе эксперимента определяли следующие показатели:
1. Физиологические данные:
- температура тела;
- пульс;
- число дыхательных движений в минуту.
2. Показатели крови:
- биохимические;
- микробиологические (для определения времени персистирования штамма в крови);
- гематологические (определение количества лейкоцитов, лейкограмма).
3. Гистологическое исследование внутренних органов (печень, селезенка, почки, сердце, легкие).
B. subtillis
4. Наличие штамма  ВКПМ В-10641 во внутренних органах (печени, селезенке, почках, сердце, легких).
Физиологические данные и показатели крови определяли с первой учетной даты (перед инъекцией (инфузией) препарата) и до прекращения персистирования штамма в крови. Эвтаназия всех животных первого этапа была произведена на 11-й день эксперимента.
При ежедневном клиническом осмотре животных опытных групп первого этапа в течение всего эксперимента отклонений не выявлено. Температура, пульс, дыхание, общее состояние соответствовали физиологической норме.
Динамика выделения штамма из крови представлена в таблице 10.
B. subtillis
B. subtillis
7
8
9
Поскольку в группах 1, 2, 3 уже на 1 день эксперимента титр штамма  был равен нулю, последующее снятие данных в этих группах было прекращено. В группах с введением суспензии штамма с титрами 10, 10 КОЕ/мл на голову время персистирования штамма  в крови составило 5 суток, с титром 10 КОЕ/мл на голову - 7 суток.
Количество лейкоцитов у подопытных животных соответствовало физиологической норме.
Примечания: Б - базофилы, Э - эозинофилы, ПН - палочкоядерные нейтрофилы, СН - сегментоядерные нейтрофилы, Л - лимфоциты, М - моноциты.
Лейкоцитарная формула крови подопытных животных также не имела отклонений (табл. 11, 12).
Примечание: (+) - наличие штамма, (-) - отсутствие штамма, 0 - штамм не выделен.
По результатам патологоанатомического вскрытия внешних визуальных изменений и патологий внутренних органов не установлено. У животных 6 группы отмечено незначительное увеличение селезенки, не выходящее за пределы анатомической нормы для данного вида животных. Внутренние органы были стерильны, за исключением печени и селезенки, в которых выявляли введенный штамм (табл. 13).
Результаты второго этапа эксперимента представлены в таблице.
B. subtillis
4
6
Установлено, что среднее время персистирования штамма в крови подопытных животных (табл. 14) при введении суспензии штамма  ВКПМ В-10641 с титрами (10-10) КОЕ/мл на голову составляет в среднем (12-13) часов.
По результатам третьего этапа эксперимента при введении доз 500, 700, 1000 и 2000 мкл/кг живой массы у животных отмечали легкое возбуждение и увеличение частоты дыхания. Через 30 мин от начала введения препарата зарегистрированные симптомы исчезали, показатели возвращались к норме. При ежедневном клиническом осмотре третьего этапа эксперимента в течение всего эксперимента отклонений не выявлено. Температура, пульс, дыхание, общее состояние соответствовали физиологической норме. В результате исследования крови животных третьего этапа эксперимента не установлено отклонений от физиологической нормы в количественных показателях лейкоцитов и сдвигов в лейкоцитарной формуле.
На Фиг. 1 и 2 представлены фотографии печени кролика, увеличение 10×40, окраска гематоксилин-эозином.
Морфологическое изучение гистологических срезов печени и селезенки показало наличие процессов пролиферации клеток в дольках печени, а также увеличение диаметра гепатоцитов и появление многоядерных клеток и клеток в состоянии митоза (фиг. 1, 2).
7
9
Наиболее выраженные положительные гистологические изменения были отмечены при введении штамма с титрами (10-10) КОЕ/мл.
B. subtillis
7
7
Таким образом, оптимальной концентрацией штамма  ВКПМ В-10641 для парентерального (инъекционного, инфузионного) внутривенного введения с целью стимуляции регенерационных процессов в печени является 10 КОЕ/мл. Дальнейшее увеличение титра нецелесообразно, поскольку не вызывает существенно большую стимуляцию регенерации печеночной паренхимы, чем введение штамма с титром 10 КОЕ/мл.
Пример 6.
Bacillus subtillis
Гепатотропное действие заявляемого препарата на острую токсичность определяли (Прозоровский В.Б. и др. "Экспресс-метод определения средней эффективной дозы и ее ошибки", Фармакология и токсикология, 1978, №4, с. 494-502) штамма  ВКПМ В-10641 на крысах породы Вистар. Животные выращивались в условиях питомника лабораторных животных по стандартной технологии. На момент проведения эксперимента все подопытные животные были массой (260-280) г.
примеру 2
Bacillus subtillis
7
Группе 1 вводили заявляемый препарат по , содержащий бактерии штамма  ВКПМ В-10641 в количестве 10 КОЕ/мл живых клеток; натрия хлорида - 90 г; воды дистиллированной - до одного литра. Препарат вводили способом по примеру 3 инфузионно внутривенно (медленное струйное) в хвостовую вену однократно в количестве 1 мл на одно животное.
Группе 2 вводили препарат-аналог, содержащий Эссенциале.
Группа 3 - крысы с модельным гепатитом, вызванным четыреххлористым углеродом - не получала лечебные препараты. Группа 4 - интактные животные.
Каждая группа состояла из 10 особей обоего пола массой (140-160) г.
Четыреххлористый углерод вводили подкожно ежедневно в 50% растворе в вазелиновом масле в течение 4 дней подряд в количестве 0,4 мл/100 г массы.
4
Клиническая картина отравления CCl развивается медленно. Основные симптомы тяжелой интоксикации проявляются только к концу 2-х суток и через 4-7 суток приводят к летальному исходу. У всех пораженных наблюдается тяжелое повреждение печени вплоть до жирового перерождения органа.
Результаты сравнительной эффективности заявляемого препарата по примеру 2 и препарата-аналога Эссенциале представлены в таблице 15.
При гепатите в сыворотке крови крыс регистрировалось повышение уровня аланинаминотрансферазы (АлАТ) в полтора раза, незначительно изменялся уровень аспартатаминотрансферазы (АсАТ), на 30% снижался коэффициент де
Ритиса (АсАТ/АлАТ), на 17% возрастала щелочная фосфатаза, в 3 раза повышалась тимоловая проба и на 25% снижался уровень общего белка.
Биохимические показатели сыворотки крови свидетельствовали о наличии у крыс умеренной гиперферментемии, следовательно, и умеренной степени цитолитического синдрома (модель гепатита).
Как видно из таблицы 15, введение животным заявляемого препарата по примеру 2 улучшало биохимические показатели сыворотки крови и значительно снижало степень цитолиза. При этом заявляемый препарат уменьшал явления цитолиза и другие показатели крови на большую величину, чем аналог Эссенциале. Различия в их действии наиболее заметны по показателю тимоловой пробы. Это позволяет признать заявляемый препарат более эффективным при лечении экспериментального гепатита.
4
Анализ биохимических показателей липидного обмена в паренхиме печени показал, что введение животным CCl (модель гепатита) вызывало значительные сдвиги в липидном обмене гепатоцитов. Так, уровень общего холестерина (ОХ) в печени вырос более чем в 3 раза (таблица 16) и, соответственно, возросли в процентном соотношении: триглицериды (ТГ), эфиры холестерина (ЭХ); в абсолютных величинах: ЭХ, ТГ, неэтерифицированные жирные кислоты (НЭЖК), свободный холестерин (СХ), фосфолипиды (ФЛ). Кроме того, изменилось процентное соотношение липидных фракций в печени.
Прием заявляемого препарата привел к снижению доли общего холестерина, по сравнению с моделью гепатита; уровень фосфолипидов как в абсолютном, так и процентном отношении приблизился к показателям интактных животных; снизились по сравнению с моделью уровень эфиров холестерина и повысился уровень неэтерифицированных жирных кислот, что является показателем стимуляции компенсаторных механизмов, сопровождающих нормализацию липидного обмена в печени.
Bacillus subtillis
Bacillus subtillis
Таким образом, вышеприведенные результаты, приведенные в примерах 4-6, подтверждают заявленный технический результат изобретения: повышение стимуляции пролиферации гепатоцитов с сохраненной гистологической структурой и замещение пораженной паренхимы печени на здоровую при лечения гепатита, цирроза печени, острой печеночной недостаточности, хронической недостаточности печени за счет повышения накопления пробиотика  в печени. Бактерии-пробиотики, в частности бактерии штамма  ВКПМ В-10641, при парентеральном введении в организм оказывают стимулирующее действие на функциональную активность макрофагов (на клетки мононуклеарной фагоцитирующей системы) организма. Повышение активности системы фагоцитирующих мононуклеаров активирует внутриклеточную (в печени) регенерацию.