Способ диагностики рака желудка с гиперэкспрессией Her2/neu
DIAGNOSTIC TECHNIQUE FOR STOMACH CANCER WITH HER2/NEU OVEREXPRESSION

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для радионуклидной диагностики рака желудка с гиперэкспрессией Her2/neu.
Рак желудка (РЖ) в настоящее время занимает лидирующие позиции по заболеваемости, как среди женского, так и среди мужского населения. В последние годы для лечения РЖ наряду с химиотерапией широко применяется таргетный препарат трастузумаб (Герцептин), являющийся гуманизированным моноклональным антителом, специфичным к рецептору эпидермального фактора роста человека 2-го типа (HER2) [Slamon D.J., Clark G.M., Wong S.G. et.al.  Human breast cancer: correlation of relapse a survival with amplification of the Her-2/neu oncogenes // Science. 1987. Vol. 235. P. 177–182]. Открытое международное рандомизированное контролируемое исследование III фазы (TOGA), которое включило 122 исследовательских центра из 24 стран, показало, что РЖ с положительным HER2-статусом встречается в 16-22% случаев, а применение трастузумаба в комплексной терапии пациентов с гиперэкспрессией HER2 в комбинации с  капецитабином и фторурацилом при местно-распространенном РЖ приводит к  достоверному увеличению продолжительности жизни пациентов. Медиана выживаемости в группе больных, получавших Герцептин в комбинации с химиотерапией, составила 13,8 мес, а в группе больных, получавших только химиотерапию, - 11,1 мес.
В настоящее время для определения статуса Her2/neu активно применяются несколько методик: иммуногистохимическое исследование (ИГХ), флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) и хромогенная гибридизация in situ (CISH) [[Чернов В.И., Брагина О.Д., Синилкин И.Г. и соавт. Радиоиммунотерапия: современное состояние проблемы // Вопросы онкологии. 2016. Т. 62. № 1. С. 24-26].Однако при несомненных достоинствах используемых методов они имеют ряд существенных недостатков, к которым можно отнести невозможность проведения in vivo исследования для оценки распространенности опухолевого процесса (первичный опухолевый узел, состояние регионарных лимфатических узлов, оценка отдаленных органов и тканей), гетерогенность опухоли, а также недоступность материально-технического оснащения в большинстве лабораторий на территории Российской Федерации.
Одним из направлений молекулярной визуализации является использование неинвазивных радионуклидных методов. Для таргетной доставки радионуклида необходимо использование структуры, обладающее высокой аффинностью, специфичностью связывания непосредственно с мишенью, локализующейся как в нормальных, так и в патологически измененных тканях, низкой иммуногенностью, и более того, высокой стабильностью, проявляющейся способностью к противостоянию с  различными химическими средами в процессе мечения. Более того, в процессе медицинской визуализации высокоаффинные направленные молекулы должны быстро находить мишень в организме пациента, несвязанные компоненты быстро удаляться из организма, таким образом, облегчая визуализацию опухоли и сокращая время между введением препарата и обследованием. В последнее время активно изучается новый класс связывающих белков, получивший название «альтернативные каркасные белки», одним из  представителей которого являются DARPin (Design Ankyrin Repeat Protein), отвечающие всем необходимым требованиям для создания эффективного радиохимического соединения [Nicholes N., Date A., Beaujean P. et.al. Modular protein switches derived from antibody mimetic proteins // Protein Engineering, Design and Selection. 2016. Vol. 29. P. 77-85].
1/2
99m
99m
Наиболее часто используемым радионуклидом для проведения диагностических исследований как на территории Российской Федерации, так и в мире, остается короткоживущий (Т=6,02 ч) технеций-99м (Тс). Как правило, технециевые радиофармпрепараты (РФП) изготавливаются в виде стандартных наборов реагентов (лиофилизатов) к генератору технеция-99м, которые представляют собой приготовленные методом сублимационной сушки при низких температурах смеси [Лыков A.B. Сублимационная сушка // В кн.: Теория сушки. - М., Энергия. -1968. - С. 334 – 362]. При их смешивании с выделенного из генератора элюатом технеция-99м (раствор натрия пертехнетата, Тс), получается готовый РФП с заданными свойствами. Срок годности лиофилизатов обычно составляет 1 год.
111
111
1/2
Наиболее близким способом диагностики рака желудка с гиперэкспрессией Her2/neu к предлагаемому способу является способ с использованием меченных индием-111 альтернативных каркасных белков аффибоди (In-ABY-025). Применяемый в  известном способе радиофармацевтический препарат является специфическим и фиксируется на поверхности мембран опухолевых клеток, экспрессирующих Her2/neu, что позволяет их визуализировать как основной опухолевый узел, так и метастатические очаги [Sorensen J., Sandberg D., Sandstrom M., et.al. First-in-Human Molecular Imaging of HER2 Expression in Breast Cancer Metastases Using the In-ABY-025 Affibody Molecule // Tee Journal of Nuclear Medicine. 2014. Vol. 55 (5). P. 730–735]. Основным недостатком данного метода являются неоптимальные радиологические характеристики препарата, связанные с длительным периодом полураспада (Т= 2,8 сут) и следовательно высокой дозой облучения на обследуемого, высокой стоимостью циклотронного производства, а  также наличием в его спектре облучения высокоэнергетических гамма-квантов, препятствующих получению качественных сцинтиграфических изображений. Существенным недостатком также является недоступность получения аффибоди на территории Российской Федерации.
Новый технический результат – повышение специфичности и информативности, снижение осложнений и повышение доступности способа диагностики.
99m
4-
0
Для достижения нового технического результата в способе диагностики рака желудка с гиперэкспрессией Her2/neu, включающий введение радиофармпрепарата и проведение однофотонной эмиссионной компьютерной томографии (ОФЭКТ). В качестве радиофармпрепарата используют РФП на основе меченных технецием-99m рекомбинантных адресных молекул DARPin9_29, радиофармацевтический препарат готовят непосредственно перед введением согласно разработанному авторами лабораторному регламенту: в асептических условиях 1 мл элюата TcO 7 ГБк с помощью шприца добавляют в набор для приготовления трикарбонильного технеция и инкубируют при температуре 100 °C в течение 30 минут, после инкубации 1000 мкл трикарбонила технеция добавляют к 334 мкл DARPin9_29 при концентрация раствора основного вещества 3,6 мг/л и инкубируют при температуре 40 С в течение 60 минут, выполняют очистку полученного соединения от белковых примесей и не связавшихся с технецием молекул DARPin9_29 с использованием очистительных колонок, полученный после очищения препарат в дозе 500 МБк разбавляют в 10 мл физиологического раствора и через стерилизующий фильтр медленно вводят пациенту. Исследование выполняют через 2 часа после внутривенного введения, полученные изображения подвергают постпроцессинговой обработке и при повышении накопления препарата в проекции желудка более чем в 8 раз по отношению к «фоновому» участку диагностируют злокачественную опухоль желудка, экспрессирующую Her2/neu.
99m
На фиг. 1 показаны результаты однофотонной эмиссионной компьютерной томографии с «Tc-DARPin9_29» через 2 часа после введения у пациентки с диагнозом рак тела желудка (T3N0M0).
Способ осуществляют следующим образом
99m
4-
Пациентам вводят радиофармацевтический препарат на основе меченных технецием-99m рекомбинантных адресных молекул DARPin9_29, который готовят непосредственно перед введением согласно разработанному лабораторному регламенту: в  асептических условиях 1 мл элюата TcO 7 ГБк с помощью шприца добавляют в набор для приготовления трикарбонильного технеция и инкубируют при температуре 100°C в течение 30 минут, после инкубации 1000 мкл трикарбонила технеция добавляют к  334 мкл DARPin9_29 при концентрации раствора основного вещества 3,6 мг/л и  инкубируют при температуре 40 °C в течение 60 минут, выполняют очистку полученного соединения от белковых примесей и не связавшихся с технецием молекул DARPin9_29 с использованием очистительных колонок, полученный после очищения препарат в дозе 500 МБк разбавляют в 10 мл физиологического раствора и через стерилизующий фильтр медленно вводят пациенту. Исследование выполняют через 2 часа после внутривенного введения препарата. Выполняют однофотонную эмиссионную компьютерную томографию на двухдетекторной гамма-камере, во время исследования пациент располагается на столе гамма-камеры в положении «лежа на спине» с запрокинутыми за голову руками. В поле зрения детекторов гамма-камеры должны попадать проекция грудной клетки и брюшной полости. Производят запись 32 кадров (64 проекции) по 30 секунд на кадр в матрицу 64х64 пикселя без аппаратного увеличения по стандартным протоколам. Полученные изображения подвергают постпроцессинговой обработке с использованием пакета специализированных программ. При визуализации участков гиперфиксации препарата в проекции желудка более чем в 8 раз превышающее накопление в «фоновом» участке диагностируют злокачественную опухоль.
99m
99m
+
99m
4-
1-2
0-3
0
3
2
3
Способ основан на анализе результатов экспериментальных клинических исследований, для подтверждения эффективности которого в выявлении злокачественных опухолей желудка с гиперэкспрессией Her2/neu было проведено изучение особенностей накопления радиофармацевтического препарата «Tc-DARPin9_29». С этой целью была сформирована  группа  из  6  пациентов  с  верифицированным  диагнозом  рака  желудка  TNM. Всем пациентам внутривенно вводили радиофармацевтический препарат на основе меченных технецием-99m рекомбинантных адресных молекул DARPin9_29 в  дозе 500 МБк. Радиофармацевтический препарат готовили непосредственно перед введением согласно разработанному авторами лабораторному регламенту: для приготовления трикарбонила технеция [Tc(CO)(HO)] использовался набор «CRS Isolink» (Center for Radiopharmaceutical Science, Paul Scherrer Institute, Villigen, Швейцария). Элюат TcO (400–500 мкл, 7 ГБк) был добавлен в набор с последующей инкубацией при температуре 100 °C в течение 30 минут. После инкубации 1000 мкл трикарбонила технеция добавлялось к 1200 мкг DARPin9_29 (концентрация 3,6 мг/л) в  130 мкл PBS (натрий-фосфатный буфер) и инкубировалось при температуре 40 °C в течение 60 минут (лабораторный регламентполучения РФП ЛР-02069303-0217 от 03.02.2017 г.). Радиохимические выход и чистоту определяли с помощью тонкослойной радиохроматографии (ТСРХ), очищение проводили с использованием колонок NAP-5 (GE  Healthcare, Швеция). Анализ хроматограмм проводили с использованием хроматографа Hitachi Chromaster HPLC systems с радиоактивным детектором.
Через 2 часа после внутривенного введения препарата выполняют ОФЭКТ на двухдетекторной гамма-камере E.CAM фирмы SIEMENS в стандартном режиме, производят запись 64 проекций в матрицу 64х64 пикселя с применением низкоэнергетических коллиматоров с энергией 140 КэВ. Окно дифференциального дискриминатора настроено на 20%, аппаратное увеличение не используют.
Полученные при исследовании изображения (сцинтиграммы) подвергали постпроцессинговой обработке с использованием фирменного пакета программ E.Soft (SIEMENS, Германия). Патологическими считали асимметричные участки повышенной аккумуляции препарата в проекции желудка (фиг. 1). Кроме того, при постпроцессинговой обработке производили расчет индекса «опухоль/фон», отражающий соотношение накопления препарата в опухолевой ткани и в здоровой ткани (проекция средостенья). Результаты исследования продемонстрировали 100% чувствительность способа в диагностике рака желудка с гиперэкспрессией Her2/neu, то есть с применением указанного радиофармпрепарата DARPin9_29 удалось выявить опухоль у всех 6 пациентов, включенных в исследование. Произведенные расчеты показали, что средние значения индекса «опухоль/фон» составили 8,35±0,54.
Клинический пример.
Пациентка И., 53 года: Ds.: Рак тела желудка (T3N0M0).
Гистологическое и иммуногистохимическое исследование №хххх-93/20 от 27.04.2020: Низкодифференцированная аденокарцинома желудка. Her2/neu 3+ .
В плане обследования дополнительно выполнена однофотонная эмиссионная компьютерная томография с DARPin9_29 согласно предлагаемому способу.
Результаты исследования представлены на фиг. 1. Визуализируется метаболическая гиперфиксация препарата в проекции тела желудка.
Таким образом, предлагаемый способ диагностики рака желудка с гиперэкспрессией Her2/neu с применением радиофармацевтического препарата на основе меченных технецием-99m рекомбинантных адресных молекул DARPin9_29, позволяет отчетливо визуализировать злокачественные опухоли желудка на метаболическом уровне, а степень аккумуляции представленного радиофармпрепарата в опухоли дает возможность получать сцинтиграфические изображения надлежащего качества. Таким образом, применение нового радиофармацевтического препарата на основе меченных технецием-99m рекомбинантных адресных молекул DARPin9_29 позволит повысить эффективность и специфичность радионуклидной диагностики рака желудка с гиперэкспрессией Her2/neu.