Способ дифференциации бактерий Vibrio cholerae от бактерий представителей рода Aeromonas
METHOD FOR DIFFERENTIATION OF VIBRIO CHOLERAE BACTERIA FROM BACTERIA OF REPRESENTATIVES OF THE GENUS AEROMONAS

Предлагаемое изобретение относится к медицинской микробиологии, а именно к дифференциации бактерий рода Vibrio и рода Aeromonas по признакам отсутствия аргининдигидролазы, наличия ферментации сахарозы с применением дифференцирующей смеси реагентов (питательной среды) определенного состава и может быть использовано в лабораторной практике при идентификации холерного вибриона.
Среды и микротест-системы, используемые в настоящее время для идентификации штаммов холерного вибриона, многообразны, обеспечивают изучение биохимических признаков, в том числе ферментацию углеводов и аминокислот. Регламентированная действующими методическими указаниями [1] схема лабораторного исследования на холеру предусматривает использование на IV этапе (отбор подозрительных на холерный вибрион колоний в посевах на плотные среды нативного материала, а также в высевах из 1-й и 2-й сред накопления) и Vэтап (отбор культур и проведение их идентификации) полиуглеводных сред: Клиглера, Росселя, лактозо-сахарозной, маннозо-сахарозной. В основе отбора подозрительных колоний с помощью этих сред для последующей идентификации лежит способность вибрионов ферментировать глюкозу и сахарозу со сдвигом рН среды в кислую сторону вследствие накопления молочной, янтарной и уксусной кислот без газообразования, отсутствие способности к ферментации лактозы и к продукции сероводорода.
Недостатком всех применяемых в лабораторной диагностике холеры полиуглеводных сред является отсутствие возможности дифференциации культур рода Vibrio от представителей близкородственных глюкозо и сахарозопозитивных микроорганизмов, прежде всего, Aeromonas, которым свойственно наличие фермента аргининдигидролазы.
Известен способ дифференциации вибрионов и аэромонад с помощью вариантов среды Мёллера с добавлением соответствующей аминокислоты (лизин, орнитин, аргинин; контрольный вариант - без добавления аминокислот) [2]. Среда Мёллера имеет следующий состав (г/л):
экстракт молодого мяса (1 кг мяса + 1 л дистиллированной воды) - 5,0;
пептон - 5,0;
1,6% раствор бромкрезолового пурпурного - 0,6 мл;
0,2% раствор крезолового красного - 2,5 мл;
глюкоза - 0,5;
6
пиридоксаль (или витамин В) - 0,005;
аминокислота (L-лизин, L-орнитин, L-аргинин) - 10,0
дистиллированная вода - 1,0 л
рН 6,6. Цвет готовой среды - сиреневый.
Варианты среды Мёллера (с лизином, орнитином, аргинином или контрольный - без добавления аминокислот) разливают по 2 мл в химически чистые стерильные пробирки с ватно-марлевыми пробками, стерилизуют в паровом стерилизаторе (автоклаве) при 104°C 20 минут, затем в пробирки с этими вариантами засевают по одной бактериологической петле №2 (по Чаплевскому) 18-часовой агаровой культуры исследуемого микроорганизма и добавляют 0,5-1,0 мл стерильного вазелинового масла. Посевы инкубируют при 37°C, а учет результатов проводят в течение 24-96 часов. При ферментации глюкозы, входящей в состав среды Мёллера, сначала происходит сдвиг рН в кислую сторону (от сиреневого цвета к желтому) во всех пробирках. В последующем при работе ферментов декарбоксилаз и дигидролаз аминокислот происходит защелачивание среды в результате образования аминов. Цвет среды в этих случаях становится фиолетовым.
Представители рода Vibrio защелачивают варианты среды Мёллера с лизином и орнитином, т.к. декарбоксилируют лизин и орнитин, и не имеют дигидролазы аргинина. Бактерии рода Aeromonas вызывают защелачивание варианта этой среды с аргинином потому, что обладают аргининдигидролазой.
Использование данной среды не предусмотрено на IV и V этапах лабораторной диагностики холеры и позволяет проводить дифференциацию только по признаку ферментации аминокислот. Сахароза в состав среды Мёллера не входит. Осуществление приведенного способа дифференциации занимает довольно много времени - от 24 до 96 ч включительно.
За прототип выбран способ дифференциации холерных вибрионов от негазообразующих аэромонад [3], заключающееся в том, что выращивают исследуемые культуры микроорганизмов на плотных питательных средах в течение 18 ч при 37°C с последующей обработкой их микробных взвесей 1% раствором формалина и троекратной отмывкой физиологическим раствором, обработкой раствором глюкозооксидазы (0,3-0,5 мг на пробу) в 0,15 М фосфатном буфере и выделением О-антигена путем экстракции в течение 1 часа 70% водным раствором фенола (3 мл на пробу) с последующим центрифугированием при 5000 об/мин в течение 20 минут, при этом дифференциация холерных вибрионов от негазообразующих аэромонад происходит при обнаружении в О-антигене фруктозы у Vibrio cholerae при помощи резорцинового реактива (по 2 мл спиртового раствора резорцина и 6 мл концентрированной соляной кислоты на пробу), вследствие чего происходит красное окрашивание.
Недостатком этого способа является его трудоемкость, применения дорогостоящего оборудования почти на каждом из его этапов, а фермент глюкозооксидаза требует специальных условий хранения (при -20°C).
Технической задачей предполагаемого изобретения является разработка способа, позволяющего дифференцировать штаммы Vibrio cholerae от штаммов, относящихся к роду Aeromonas на V этапе лабораторной диагностики холеры по признакам наличия ферментации сахарозы и отсутствия дигидролазы аргинина в течение 12-24 часа.
Способ дифференциации бактерий Vibrio cholerae от бактерий представителей рода Aeromonas, включающий следующие этапы:
а) готовят питательную среду с дифференцирующей смесью реагентов с навесками: пептона ферментативного сухого - 1,0 г/л, натрия хлористого - 5,0 г/л, агар-агара микробиологического - 12,0 г/л, вносят в 2-х литровую емкость, доводят объем дистиллированной водой до 1 литра и устанавливают рН 8,2 с помощью 20%-ного водного раствора гидроокиси натрия и 12%-ного водного раствора соляной кислоты, затем смесь варят в паровом стерилизаторе  в течение 45-65 минут при постоянном помешивании до полного растворения агара, определяют объем полученной смеси, куда добавляют L-Аргинин солянокислый - 13,0 г/л, калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный - 0,3 г/л, доводят рН 6,7, добавляя 12%-ный водный раствор соляной кислоты и 20%-ный водный раствор гидроокиси натрия,  после этого вносят в полученную смесь добавки: сахарозу - 1,0 г/л, натрий серноватистокислый 5-водный - 0,3 г/л, двойную сернокислую соль закиси железа и аммония  6-водную (Соль Мора) - 0,2 г/л, бромтимоловый синий водорастворимый - 0,03 г (в виде 1,6%-ного спиртового раствора - 1,88 мл), крезоловый красный водорастворимый - 0,005 г (в виде 0,1%-ного спиртового раствора – 5 мл) с последующим перемешиванием до полного растворения,
б) проводят предварительную подготовку исследуемых штаммов Vibrio choleraе и Aeromonas   путем высева в пробирки с 5 мл 1%-ной пептонной воды и инкубируют при температуре 37°C в течение 3-5 часов, затем высевают бактериологической петлей №2 (по Чаплевскому) на чашку Петри со щелочным агаром Мартена рН 7,7 и 12-18 часов культивируют при 37°C, потом  с поверхности агара отбирают  колонии холерных вибрионов  (аэромонад)  по соответствующей морфологии,
в) осуществляют посев культур исследуемых штаммов Vibrio choleraе и Aeromonas      уколом в столбик  питательной среды с дифференцирующей смесью реагентов, которую заранее разливают в стерильные пробирки по 7-8 мл и стерилизуют при 104°C в течение 20 минут, при этом на каждый штамм используют по две пробирки со смесью, которая застывает в наклонном положении,  после этого посевы инкубируют при 37°C  12-24 часа, образуя скошенную часть и столбик,
г)  учёт результатов определяют визуально по окрашиванию скошенной части в пробирках, в случае изменения последней из исходного зелёного цвета в жёлтый  - штаммы относят к виду Vibrio choleraе, а изменение окраски скошенной части от исходного зелёного цвета в синий  -  штаммы относят к роду   Aeromonas.
Способ осуществляется следующим образом.
Предлагаемый способ дифференциации бактерий - представителей рода Vibrio и рода Aeromonas включает четыре этапа его осуществления:
1. Приготовление дифференцирующей смеси реагентов (питательной среды);
2. Подготовка штаммов холерного вибриона и аэромонад;
3. Посев штаммов в дифференцирующую смесь реагентов (питательную среду);
4. Учет результатов.
Первый этап. В химически чистую стеклянную термостойкую 2-х литровую колбу (круглую плоскодонную или коническую по ГОСТ25336-82) вносят дистиллированную воду до 1 литра и навески в г/л: ферментативного пептона - 1,0; хлористого натрия - 5,0; агар-агара - 12,0. Устанавливают рН 8,2 при помощи 20% водного раствора гидроокиси натрия и 12% водного раствора соляной кислоты. Варят в паровом стерилизаторе текучим паром в течение 45-65 минут при постоянном помешивании, не допуская пригорания агаровых частиц, в течение 2-3 минут после полного растворения агара. В случае образования осадка фильтруют через ватно-марлевый фильтр (вата медицинская гигроскопическая по ГОСТ 5556-81; марля медицинская по ГОСТ 94121-93). После этого измеряют объем при помощи химически чистого мерного цилиндра (по ГОСТ 1770-74).
Затем добавляют навески в г/л: L-Аргинин солянокислый (по ТУ 6-09-2100-78) - 13,0; калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водноый (по ГОСТ 2493) - 0,3. При этом с помощью 12% водного раствора соляной кислоты и 20% водного раствора гидроокиси натрия доводят состав до рН 6,7. После этого готовят и вносят навески в г/л: сахарозы (по ГОСТ 5833-75) - 1,0; натрия серноватистокислый 5-водный (ГОСТ27068-86) - 0,3; соль закиси железа и аммония двойная сернокислая 6-водная (соль Мора) - 0,2.
Кроме того добавляют спиртовые растворы индикаторов: бромтимоловый синий водорастворимый (по ТУ 6-09-07-1602-87) - 0,03 г (в виде 1,6 спиртового раствора - 1,88 мл) и крезоловый красный водорастворимый (по ТУ 6-09-796-76) - 0,005 г (в виде 0,1% спиртового раствора - 5 мл) с последующим перемешиванием до их полного растворения.
Смесь реагентов (питательную среду) разливают в химически чистые, стерильные пробирки (по ГОСТ 25336-82) с ватно-марлевыми пробками - по 7-8 мл и стерилизуют при 104°C (0,2 атм.) 20 минут в паровом стерилизаторе (автоклаве). Пробирки со смесью реагентов (питательной средой), прошедшей процесс стерилизации, оставляют застывать в наклонном положении с таким расчетом, чтобы образовались скошенная часть и «столбик». Цвет готовой смеси реагентов (питательной среды) - зеленый.
Второй этап - подготовка штаммов холерного вибриона и аэромонад
Штаммы холерных вибрионов и аэромонад, полученные из музея живых культур ФКУЗ Ростовского-на-Дону противочумного института Роспотребнадзора, хранящиеся в лиофилизированном виде или на полужидком агаре Мартена рН 7,7 высевают в пробирки с 5 мл 1%-й пептонной водой и инкубируют при температуре 37°C в течение 3-5 ч, после чего высевают бактериологической петлей N 2 (по Чаплевскому) на чашку с агаром Мартена рН 7,7. Через 12-18 ч культивирования с поверхности агара отбирают типичные по морфологии колонии холерного вибриона (аэромонад) и используют в работе.
Третий этап. Посев культур штаммов холерных вибрионов и аэромонад производят на скошенную часть и уколом в «столбик» дифференцирующей смеси реагентов (питательной среды) в пробирке при помощи бактериологической петли №2 по Чаплевскому. На каждый штамм используют по две пробирки дифференцирующей смеси реагентов (питательной среды). Посевы инкубируют в термостате при 37°C 12-24 ч, затем учитывают результаты.
Четвертый этап - учет результатов.
Штаммы относят к виду Vibrio cholerae, если они при росте на дифференцирующей смеси реагентов (питательной среде) вызывают изменение окраски скошенной части среды и в «столбика» (в пробирке) от зеленого цвета к желтому. Они ферментируют сахарозу с образованием кислых продуктов жизнедеятельности; не обладают дигидролазой аргинина.
Штаммы относят к роду Aeromonas в двух случаях. В первом случае происходит окрашивание скошенной части дифференцирующей смеси реагентов (питательной среды) от исходного зеленого в синий цвет; «столбик» становится желтым. Во втором случае обе части смеси реагентов (питательной среды) в пробирке становятся синего цвета. Это объясняется тем, что для представителей рода Aeromonas характерна ферментация аргинина с образованием продуктов щелочного характера (о чем свидетельствует синяя окраска той или иной части смеси реагентов в пробирке) за счет наличия фермента аргининдигидролазы. Представители рода Aeromonas, как и вида Vibrio, ферментируют сахарозу с образованием кислых продуктов, однако доминирующим становится действие щелочных продуктов вследствие ферментации аргинина аэромонадами и смещение рН дифференцирующей смеси реагентов в щелочную сторону.
Пример 1.
Штаммы V. cholerae classical P-1 (145) и Aeromonas caviae Р-6051, выросшие на агаре Мартена рН 7,7 в течение 12-18 ч, засевают на скошенную часть и уколом в «столбик» дифференцирующей смеси реагентов (питательной среды) в пробирки бактериологической петлей №2 (по Чаплевскому). При этом используют по две пробирки дифференцирующей смеси реагентов (питательной среды) на каждый штамм. Посевы выращивают в термостате при 37°C. По истечении 12-24 ч инкубирования штамм V cholerae classical P-1 (145) вызывает переход окраски скошенной части и «столбика» смеси реагентов в пробирке от зеленого цвета к желтому.
Вывод: штамм V. cholerae classical P-1 (145) относится к виду Vibrio cholerae (см. таблицу 1).
Штамм Aeromonas caviae Р-6051 при культивировании в тех же условиях вызывает изменение цвета скошенной части смеси реагентов (питательной среды) в пробирке от зеленого цвета к синему; «столбик» приобретает желтый цвет.
Вывод: изменение окраски в синий цвет характерно для бактерий представирелей рода Aeromonas, следовательно штамм Aeromonas caviae Р-6051 относится к ним (см. таблицу 1).
Пример 2.
По технологии примера 1 штаммы V. cholerae El Tor М-878 и Aeromonas caviae Р-6048, выросшие на агаре Мартена рН 7,7 в течение 12-18 ч, засевают на скошенную часть и уколом в «столбик» дифференцирующей смеси реагентов (питательной среды) в пробирки бактериологической петлей №2 (по Чаплевскому). При этом используют по две пробирки смеси реагентов (питательной среды) на каждый штамм. Посевы выращивают в термостате при 37°C. По истечении 12-24 ч инкубирования штамм V cholerae El Tor М-878 вызывает переход окраски скошенной части и «столбика» смеси реагентов (питательной среды) в пробирке от зеленого цвета к желтому.
Вывод: штамм V cholerae El Tor М-878 относится к виду Vibrio cholerae (см. таблицу 2).
Штамм Aeromonas caviae Р-6048 при культивировании в тех же условиях вызывает изменение цвета скошенной части и «столбика» смеси реагентов (питательной среды) в пробирке от зеленого цвета к синему.
Вывод: штамм Aeromonas caviae Р-6048 относится к роду Aeromonas (см. таблицу 2).
Пример 3.
Культуры штаммов V. cholerae O139 MO45 и Aeromonas caviae Р-6052, дифференцировали по выше описанной технологии примера 1,2.
Вывод: штамм V. cholerae non O1 / non O139 Р-9741 относится к виду Vibrio cholerae (Таблица 3).
Штамм Aeromonas caviae Р-6096 при культивировании в тех же условиях вызывает изменение цвета скошенной части и «столбика» смеси реагентов (питательной среды) в пробирке от зеленого цвета к синему. Вывод: штамм Aeromonas caviae Р-6096 относится к роду Aeromonas
(см. таблицу 3).
Пример 4.
Культуры штаммов V. cholerae non 01 / non O139 Р-9741 и Aeromonas caviae Р-6096 диффернцировали по выше описанной технологии прмера 1,2.
По истечении 12-24 ч инкубирования штамм V. cholerae non O1 / non O139 Р-9741 вызывает переход окраски скошенной части и «столбика» смеси реагентов (питательной среды) в пробирке от зеленого цвета к желтому.
Вывод: штамм V. cholerae non O1 / non O139 Р-9741 относится к Vibrio cholerae (см. таблицу 4).
Штамм Aeromonas caviae Р-6096 при культивировании в тех же условиях вызывает изменение цвета скошенной части и «столбика» смеси реагентов (питательной среды) в пробирке от зеленого цвета к синему. Вывод: штамм Aeromonas caviae Р-6096 относится к роду Aeromonas (см. таблицу 4).
Использование предполагаемого изобретения позволяет осуществлять дифференциацию представителей вида Vibrio cholerae от представителей рода Aeromonas на этапе отбора подозрительных колоний при лабораторной диагностике холеры. При этом достигается сокращение времени и объема исследований на последующих этапах лабораторной диагностики холеры, а также ее совершенствование.
Источники информации.
1. Лабораторная диагностика холеры. Методические указания. МУ 4.2.2218-07. - М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2007. - 87 с.
2. Микробиология и лабораторная диагностика холеры (краткое руководство) / Под ред. М.С. Дрожевкиной и В.Н. Милютина. Ростов-на-Дону: Ростовское книжн. изд - во. - 1975. - 136 с.
3. А.с. RU (SU) №722242 от 18.03.81. «Способ дифференциации холерных вибрионов от негазообразующих аэромонад».