Способ микроклонального размножения гречихи in vitro
METHOD FOR MICROPROPAGATION OF BUCKWHEAT IN VITRO

Изобретение относится к области сельского хозяйства и биотехнологии, для микроклонального размножения гречихи in vitro.
Известны способы микроклонального размножения гречихи, при которых для повышения эффективности регенерации и коэффициента размножения микроклоны культивируют на средах, содержащих различные цитокинины (стимуляторы роста): 6-бензиламинопурин (6-БАП), 2-изопентениладенин (2ip), мета-тополин (ТОР), кинетин (KIN) и др. (Dobránszki J. (2009). Role of cytokinins and explant type in shoot multiplication of buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench) in vitro. Eur. J. Plant Sci. Biotechnol. 3 (1), 66-70; Klocová L., Gubišová M. (2008). Evaluation of different approaches to buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench.) micropropagation. Czech Journal of Plant Breeding 44, 66-72; Romchatngoen S., Kachonpadungkitti Y., Hisajima S. (1998). Micropropagation of buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench.) plant in vitro. Journal of the Society of High Technology in Agriculture 10, 231-236; Neškovic V., Vinterhalter В., Miljuš-Djuki J., Ghalawenji N. (1990). Micropropagation of recessive determinate genotypes of buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench.) as an alternate approach to uniform seed production. Plant Breeding. 105, 337-340).
Недостатками этих способов являются невысокие темпы роста и развития эксплантов и коэффициента размножения, низкое качество получаемых микроклонов (появление розеток, отсутствие корней), дороговизна применяемых стимуляторов роста.
Известны способы микроклонального размножения гречихи, при которых для повышения эффективности регенерации и усиления ризогенеза в питательные среды для микроклонального размножения вносят ауксины (стимуляторы роста): β-индолилмасляную кислоту (ИМК), α-нафтилуксусную кислоту (НУК), индолил-3-уксусную кислоту (ИУК) (Румянцева Н.И., Сергеева Н.В., Хакимова Л.Э. и др. Органогенез и соматический эмбриогенез в культуре двух видов гречихи. Физиология растений (1989), 36 (1), 187-194; Румянцева Н.И. Морфогенез в культуре тканей гречихи: теоретические и прикладные аспекты. Дис. … канд. биол. наук. Казань, 1990. 217 с.; Takahata Y. Plant regeneration from cultured immature inflorescence of Common Buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench) and Perennial Buckwheat (F. cymosum Meisn.). Japan J. Breed. (1988), 38 (4), 409-413).
Недостатками этих способов являются дороговизна применяемых препаратов для стимуляции роста, а также низкие темпы роста и развития регенерантов и невысокий коэффициент размножения, что ведет к удлинению технологического процесса получения полноценных микроклонов.
Известен способ размножения гречихи in vitro с получением селекционно-ценных сомаклонов (патент RU 2229219, МПК А01Н 4/00, C12N 5/00, А01Н 1/04, 2002 г.), при котором культивируют каллусную ткань, проводят индукцию органогенеза и получают растения-регенеранты.
Однако данный способ не экономичен, поскольку получение каллусной ткани требует дополнительных затрат средств, реактивов и времени.
Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому изобретению является способ микроклонального размножения гречихи, при котором используется питательная среда с минеральной основой по Мурасиге-Скуга (далее - МС) (Murashige, Т., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tussue cultures. Physiol. Plant. (1962), 15, 473-497. DOI 10.1098/rstb.2000.0713), дополненная рекомендуемым соотношением компонентов согласно исследованиям Н.И. Румянцевой и др. (Румянцева Н.И. Морфогенез в культуре тканей гречихи: теоретические и прикладные аспекты. Дис. … канд. биол. наук. Казань, 1990. 217 с.; Румянцева Н.И., Сергеева Н.В., Хакимова Л.Э. и др. Органогенез и соматический эмбриогенез в культуре двух видов гречихи. Физиология растений (1989), 36 (1), 187-194) и использованная в работе Е.Н. Барсуковой (Барсукова Е.Н. Использование метода культуры ткани в селекции гречихи. Дисс. … канд. с.-х. наук, Благовещенск, 2000. 160 с.).
Компоненты, которые входят в состав питательной среды в данном способе микроклонального размножения, представлены в табл. 1.
Однако представленный способ имеет некоторые недостатки. Растения, культивируемые таким способом, могут отставать в росте, корнеобразование замедляется, что в совокупности снижает коэффициент размножения и возможность оптимальной приживаемости микроклонов, а также увеличивает длительность технологического процесса.
Введение в среду регуляторов роста в виде кинетинов или ауксинов увеличивает эффективность регенерации, но при этом повышается стоимость питательной среды, что приводит к возрастанию себестоимости получаемых растений-регенерантов. К тому же, для приготовления среды используют гидролизат казеина, что также ведет к дополнительным затратам.
Целью изобретения является уменьшение сроков получения нормально развитых микроклонов и снижение себестоимости получаемых регенерантов.
Указанная цель достигается тем, что в предлагаемый способ микроклонального размножения гречихи in vitro, включающий культивирование микроклонов на питательной среде, содержащей макро- и микроэлементы по прописи Мурасиге-Скуга, 20 г/л сахарозы и 6 г/л агар-агара, согласно изобретения в состав питательной среды дополнительно вводят деалкоголизированный экстракт Fagopyrum esculentum в количестве 1-5 мл/л.
По сравнению с прототипом, признаками изобретательского уровня предлагаемого способа микроклонального размножения гречихи in vitro является:
1. «… в состав среды дополнительно вводят деалкоголизированный экстракт Fagopyrum esculentum…», что позволяет:
- сократить срок получения нормально развитых регенерантов, увеличить морфологические показатели культивируемых in vitro растений и повысить коэффициент их размножения;
- усилить ризогенез, что значительно повысит способность микроклонов лучше приживаться и быстрее адаптироваться к новым питательным субстратам;
- не добавлять в питательную среду гидролизат казеина, что снижает себестоимость получаемых микроклонов;
- использовать дешевое, доступное растительное сырье F. esculentum, произрастающего повсеместно и дающего большую вегетативную массу, что уменьшает стоимость питательной среды и, соответственно, себестоимость получаемых микроклонов.
2. «… в количестве 1-5 мл/л среды», что позволяет:
- рационально и экономно использовать экстракт F. esculentum и избежать перерасхода препарата.
Признаки, указанные в отличительной части описания достижения цели, доказывают, что заявляемый способ микроклонального размножения гречихи in vitro обладает новизной. Совокупность признаков, приведенных в сравнении свойств заявляемого и известного решений, дает основание сделать вывод, что заявляемый способ имеет изобретательский уровень.
Техническим результатом изобретения является использование в качестве стимулятора роста микроклонов деалкоголизированного экстракта F. esculentum в количестве 1-5 мл/л среды, полученного из дешевого, доступного сырья при одновременном снижении расхода препарата.
2
5
Предлагаемый способ микроклонального размножения гречихи in vitro иллюстрируется приведенным ниже примером ее осуществления. Жидкий концентрированный экстракт гречихи посевной получают следующим образом. Листья растений высушивают воздушно-теневым методом до уровня влажности 12%, измельчают на мельнице марки ЛЗМ для размола сухих проб до фракции 1 мм, экстракция производится СНОН 70% (EtOH 70%) с использованием емкости с кипящей водой (t около 100°С), проводят вакуум-фильтрацию и переносят полученные извлечения в мерные колбы (100 мл). В результате получают экстракт темно-зеленого цвета с коричневатым оттенком и травяным ароматом. Готовый препарат хранят в герметически закрывающейся емкости из темного стекла в холодильнике. Перед обработкой необходимое количество экстракта деалкоголизируют выпариванием до исчезновения запаха спирта и доводят дистиллированной водой до начального объема.
Пример. В качестве объектов исследований использовали регенераты гречихи посевной двух сортов - Изумруд (индетерминантного типа) селекции ФНЦ агробиотехнологий Дальнего Востока им. А.К. Чайки, и Дикуль (детер-минантного типа) селекции ВНИИ зернобобовых культур, введенных в культуру in vitro. Асептические одноузловые черенки длиной 15-20 мм с пазушной почкой пассировали на питательную среду с минеральной основой по Мурасиге-Скуга, содержащую 20 г/л сахарозы, 6 г/л агара и деалкоголизированные экстракты F. esculentum из расчета 1 мл, 5 мл и 10 мл по вариантам опыта (табл. 2). Контрольный вариант - прототип - способ культивирования микроклонов на питательной среде без добавления экстракта. Повторность опыта - трехкратная. Изолированные in vitro объекты культивировались в пробирках с ватно-марлевыми пробками при освещенности 4 тыс. лк, температуре 22-25°С, фотопериоде 16 ч в условиях культуральной комнаты. Продолжительность пассажа составила 21 сутки.
Приготовление и стерилизация бокса, посуды, инструментов проводились по общепринятым методикам. Результаты приведены в табл. 3.
Согласно проведенным исследованиям, при использовании экстракта достигается значительный положительный эффект, заключающийся в уменьшении срока получения нормально развитых регенерантов (до 21 суток) и увеличении морфологических показателей, культивируемых in vitro растений, в том числе количества междоузлий и соответственно, коэффициента размножения микрорастений. Так, по сравнению с прототипом (контролем), высота регенерантов по вариантам возросла в 1,2-6,0 раза, количество междоузлий и листьев - в 1,2-1,8 раза, длина листовой пластинки - в 1,2-2,3 раза. Коэффициент размножения превзошел контрольные показатели в два и более раза.
В вариантах с использованием экстракта ризогенез многократно усилился, что значительно повышает способность микроклонов лучше приживаться и быстрее адаптироваться к новым питательным субстратам. Следует отметить, что увеличение концентрации экстракта в питательной среде до 10 мл/л не ведет к усилению эффективности экстракта.
Таким образом, способ микроклонального размножения гречихи in vitro, предусматривающего культивирование микроклонов на питательной среде с добавлением деалкоголизированного водного раствора EtOH 70% экстракта F. esculentum в диапазоне концентраций 1-5 мл/л среды, позволяет значительно стимулировать рост пробирочных растений гречихи, быстрее размножать посадочный материал и увеличивать коэффициент их размножения, а также способствует значительному улучшению корневой системы микрорастений, что, соответственно, увеличивает степень приживаемости микроклонов на новых питательных субстратах, в результате чего существенно увеличивается эффективность микроклонального размножения. При этом использование дешевого, доступного сырья для приготовления экстракта снижает себестоимость получаемых микроклонов.