МУЛЬТИПЛЕКСНАЯ ГЕНОМНАЯ ИНЖЕНЕРИЯ, НАПРАВЛЯЕМАЯ РНК

1. Способ внесения множественных изменений в ДНК-мишень в клетке, экспрессирующей фермент, который образует колокализационный комплекс с РНК, комплементарной ДНК-мишени, и который расщепляет ДНК-мишень сайт-специфическим образом, включающий
(а) введение в клетку первой чужеродной нуклеиновой кислоты, кодирующей одну или несколько РНК, комплементарных ДНК-мишени и направляющих фермент к ДНК-мишени, в котором одна или несколько РНК и фермент являются членами колокализационного комплекса для ДНК-мишени,
введение в клетку второй чужеродной нуклеиновой кислоты, кодирующей одну или несколько последовательностей донорной нуклеиновой кислоты,
где одна или несколько РНК и одна или несколько последовательностей донорной нуклеиновой кислоты экспрессируются,
где одна или несколько РНК и фермент колокализуются на ДНК-мишени, фермент расщепляет ДНК-мишень, и донорная нуклеиновая кислота вставляется в ДНК-мишень для получения измененной ДНК в клетке, и
повторение стадии (а) множество раз для внесения множественных изменений в ДНК в клетке.
2. Способ по п. 1, в котором фермент представляет собой РНК-направляемый ДНК-связывающий белок.
3. Способ по п. 1, в котором ферментом является Cas9.
4. Способ по п. 1, в котором клетка является эукариотической клеткой.
5. Способ по п. 1, в котором клетка является клеткой дрожжей, клеткой растений или клеткой животных.
6. Способ по п. 1, в котором РНК содержит примерно от 10 до 500 нуклеотидов.
7. Способ по п. 1, в котором РНК содержит примерно от 20 до 100 нуклеотидов.
8. Способ по п. 1, в котором одна или несколько РНК являются направляющими РНК.
9. Способ по п. 1, в котором одна или несколько РНК являются слиянием tracrRNA-crRNA.
10. Способ по п. 1, в котором ДНК является геномной ДНК, митохондриальной ДНК, вирусной ДНК или экзогенной ДНК.
11. Способ по п. 1, в котором вставка одной или нескольких последовательностей донорной нуклеиновой кислоты осуществляется рекомбинацией.
12. Способ по п. 1, в котором вставка одной или нескольких последовательностей донорной нуклеиновой кислоты осуществляется гомологичной рекомбинацией.
13. Способ по п. 1, в котором одна или несколько РНК и одна или несколько последовательностей донорной нуклеиновой кислоты присутствуют на одной или нескольких плазмидах.