Изучение антигельминтной активности пижмы обыкновенной Tanacetumvulgare в экспериментах с Caenorhabditiselegans

сельскохозяйственные науки

УДК 615.284

ИЗУЧЕНИЕ АНТИГЕЛЬМИНТНОЙ АКТИВНОСТИ ПИЖМЫ ОБЫКНОВЕННОЙ TANACETUM VULGARE В ЭКСПЕРИМЕНТАХ С CAENORHABDITIS ELEGANS

Егорова Анастасия Васильевна, младший научный сотрудник; Институт проблем экологии и недропользования Академии наук Республики Татарстан, Казань, Российская Федерация Нигматуллина Альбина Фаварисовна, младший научный сотрудник1, магистрант2; 1Институт проблем экологии и недропользования Академии наук Республики Татарстан, Казань, Российская Федерация 2Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань,

Российская Федерация Калинникова Татьяна Борисовна, кандидат биологических наук,

заведующая лабораторией; Институт проблем экологии и недропользования Академии наук Республики Татарстан, Казань, Российская Федерация

Аннотация: В экспериментах с почвенной нематодой Caenorhabditis elegans показано, что водный экстракт цветков пижмы обладает антигельминтой активностью. В диапазоне концентраций 0.3-10 % экстракт T. vulgare вызывает нарушения моторной программы плавания нематод. Сходство токсического действия экстракта пижмы и антигельминтного препарата левамизол на организм C. elegans позволяет предположить, что мишенью токсического действия экстракта пижмы является нервная система нематод. Динамика токсического действия экстракта пижмы на организм C. elegans позволяет предположить возможность быстрой адаптации нематод к веществам, содержащимся в экстракте T. vulgare. Использование C. elegans для изучения нематоцидной активности T. vulgare позволит идентифицировать компоненты экстракта пижмы, эффективные для использования в качестве антигельминтных средств, и выявить механизм антигельминтного действия экстракта пижмы. Ключевые слова: Tanacetum vulgare; Caenorhabditis elegans; антигельминтные препараты; левамизол; нематоцидная активность экстрактов пижмы.

STUDY OF ANTHELMINTIC ACTIVITY OF TANACETUM VULGARE IN EXPERIMENTS

WITH CAENORHABDITIS ELEGANS

Egorova Anastasia Vasilevna, Research Assistant; Research Institute for Problems of Ecology and Mineral Wealth Use of Tatarstan Academy

of Sciences, Kazan, Russia Nigmatullina Albina Phapharisovna, Research Assistant1, master's student2; Research Institute for Problems of Ecology and Mineral Wealth Use of Tatarstan Academy

of Sciences, Kazan, Russia 2Kazan (Volga region) Federal University, Kazan, Russia Kalinnikova Tatiana Borisovna, Candidate of Biological Sciences, Head of the Laboratory; Research Institute for Problems of Ecology and Mineral Wealth Use of Tatarstan Academy

of Sciences, Kazan, Russia

Abstract: In experiments with soil nematode Caenorhabditis elegans it was shown that aqueous extract of Tansy flowers possesses anthelmintic activity. In concentrations range 0.3-10 % T. vulgare extract caused disturbances in motor program of nematodes'swimming. Similarity in toxic action Tansy extract and anthelmintic drug levamisole on C. elegans organism made it possible to suppose that nematodes' nervous system is a target for toxic action of Tansy extract Dynamic of toxic action of Tansy flowers on C. elegans organism made it possible to suppose the possibility of quick adaptation of nematodes to substances contained in T. vulgare extract. Using of C. elegans to study nematocidal activity of T. vulgare can allow to identify components of Tansy extract effective as anthelmintic drugs and detect the mechanism of anthelmintic action of Tansy extract.

Keywords: Tanacetum vulgare; Caenorhabditis elegans; anthelmintic drugs; levamisole; nematocidal activity of Tansy extract.

Для цитирования: Егорова, А. В. Изучение антигельминтной активности пижмы обыкновенной Tanacetum vulgare в экспериментах с Caenorhabditis elegans / А. В. Егорова, А. Ф. Нигматуллина, Т. Б. Калинникова. - Текст : электронный // Наука без границ. - 2020. - № 5 (45). - С. 21-28. - URL: https://nauka-bez-granic. ru/№-5-45-2020/5-45-2020/

For citation: Egorova A.V., Nigmatullina A.F., Kalinnikova T.B. Study of anthelmintic activity of Tanacetum vulgare in experiments with Caenorhabditis elegans // Scince without borders, 2020, no. 5 (45), pp. 21-28.

Гельминты - одна из самых распространенных групп паразитов, поражающих человека, животных и растения. По данным Всемирной организации здравоохранения, различными гель-минтозами поражены не менее 2 млрд человек, 135 тыс. человек ежегодно погибают от гельминтозов. Ежегодный ущерб, причиняемый гельминтами животноводству и растениеводству, оценивается в несколько миллиардов долларов [1]. В настоящее время самым распространенным и наиболее эффективным способом борьбы с паразитическими нематодами являются синтетические антигельминтные препараты разных химических групп. Для борьбы с фитонематодами при-

меняются нематоциды системного действия [2-3]. Применение синтетических препаратов для борьбы с паразитическими нематодами помимо очевидной выгоды обладает рядом недостатков. Во-первых, уже с первого применения нематоцидов происходит отбор устойчивых к ним форм гельминтов. Как следствие, эффективность использования химических про-тивопаразитарных средств снижается, и для успешной борьбы с нематодами необходимо применение новых препаратов, либо увеличение дозы существующих [4]. Во-вторых, известно, что мишенью действия большинства токсикантов, включая нематоциды, является нервная система [2]. Поэто-

му одним из побочных эффектов применения синтетических нематоцидов может быть их негативное влияние на нервную систему теплокровных животных и человека.

В настоящее время интенсивно развивается так называемое органическое сельское хозяйство. Это подразумевает использование растительных препаратов для профилактики и лечения заболеваний животных. Разведение животных без использования традиционных лекарственных средств называют этноветеринарией [5]. Для лечения гельминтозов в народной медицине и этноветеринарии используют соки и экстракты растений, таких как чеснок, пижма обыкновенная, полынь горькая, крушина, девясил и др. [6].

Чаще других растений для лечения гельминтозов в народной медицине и этноветеринарии используют цветки пижмы обыкновенной Tanacetum vulgare [6]. Цветки пижмы имеют сложный химический состав. Они содержат несколько групп биологически активных соединений, таких как эфирное масло, флавоноиды, ги-дроксикоричные кислоты. Наличие в цветках T. vulgare таких флавоноидов, как апигенин, лютеолин, цинарозид и яцеидин, обуславливает желчегонные и гепатопротекторные свойства препаратов пижмы [6-8]. Эфирное масло T. vulgare, содержащее туйон, камфору, борнеол, туйол, пинен и та-нацетол, обладает антигельминтной активностью. Механизмом антигель-минтного действия эфирного масла пижмы является поражение нервной системы, приводящее к снижению двигательной активности, параличу и гибели гельминтов. В ряде случаев наблюдаются морфологические измене-

ния тегумента паразитов [6].

Для оценки биологической активности синтетических антигельминтных препаратов в последние несколько десятилетий успешно используют сво-бодноживущую почвенную нематоду Caenorhabditis elegans [3]. Тем не менее, в научной литературе отсутствует информация о возможной токсичности экстрактов T. vulgare для организма C. elegans. Поэтому целью этой работы явилась проверка предположения о том, что C. elegans является удобным модельным организмом для изучения нематоцидной активности не только синтетических нематоцидов, но и T. vulgare.

Методика исследования

Эксперименты проводили с молодыми половозрелыми нематодами линии C. elegans N2 дикого типа, предоставленной Caenorhabditis Genetics Center. Нематод выращивали при 22°C в чашках Петри со стандартной средой выращивания (3 г/л NaCl, 17 г/л бактоагар, 2.5 г/л бактопептон, 5 мг/л холестерин, 1мМ CaCl2, 1мМ MgSO4, 25 мл/л калийфосфатный буфер (pH 6.0)), засеянной E. coli OP50 [8]. Эксперименты проводили в NG буфере (3 г/л NaCl, 1мМ CaCl2, 1мМ MgSO4, 25 мл/л калийфосфатный буфер (pH 7.0)) [8].

Токсическое действие водного экстракта пижмы оценивали в экспериментах с одиночными особями и группами из 50 нематод. Для получения водного экстракта пижмы 15 г сухих измельченных цветков заливали 200 мл горячей дистиллированной воды и выдерживали на кипящей водяной бане в течение 30 минут. Остывший настой процеживали через мельничный газ с диаметром ячеек 35 мкм и выпаривали в водяной бане с темпе-

ратурой 60°C до конечного объема 10 мл. Полученный экстракт хранили в морозильной камере при температуре -18°C. Экстракт размораживали непосредственно перед экспериментом.

В экспериментах с одиночными особями, инкубированными в 1 мл NGM, оценивали влияние экстракта T. vulgaris на плавание нематод, индуцированное механическим стимулом. Показателями нарушения моторной программы плавания являлись нарушения координации сокращения и расслабления мышц, необходимой для синусоидальных движений тела при плавании. Эти нарушения фиксировали с использованием стереоскопического микроскопа SMZ-05 при температуре 22°C через 15, 30, 60 и 90 минут инкубации с токсикантом. В качестве позитивного контроля в этих экспериментах использовали анти-гельминтный препарат левамизол. В экспериментах с группами из 50 особей, инкубированными в 1 мл NGM, фиксировали нарушения спонтанной

двигательной активности через 2 и 4 часа инкубации нематод при 22°C. Эксперименты проводили в трех по-вторностях с использованием 50 нематод в каждом эксперименте. Статистическую обработку результатов проводили с использованием углового преобразования Фишера ф*.

Результаты и обсуждение

Известно, что механизмом токсического действия многих нематоцидов является нарушение интегративных функций нервной системы беспозвоночных. Одной из таких функций является регуляция локомоции. Причиной токсического действия экстракта T. vulgaris на организмы паразитических нематод может быть потеря двигательной активности вследствие нарушений в системе нейронов, регулирующих локомоцию. Для проверки этого предположения нами были проведены эксперименты, в которых изучали действие экстракта T. vulgaris на плавание C. elegans.

%

Минуты

Рисунок 1 - Влияние экстракта T. vulgare на локомоцию C. elegans. По оси ординат доля особей без нарушений локомоции

Как показано на рис. 1, добавление в среду инкубации нематод 5 или 10 % экстракта пижмы вызывало нарушения плавания нематод, индуцированного механическим стимулом. Через 15 минут инкубации различия токсического действия двух концентраций экстракта пижмы составляли 15 %; через 90 минут эти различия сглаживались (рис. 1). Добавление в среду инкубации экстракта пижмы в низких концентрациях (0.3-1.2 %) вызывало нарушения моторной программы плавания у 1-30 % нематод (рис. 2).

Сходное с экстрактом T. vulgaris негативное влияние на плавание C. elegans, индуцированное механическим стимулом, оказывал синтетический не-матоцид левамизол в концентрации 8-125 мкМ (рис. 3). При увеличении времени экспозиции к левамизолу сохранялись различия в эффективности токсического действия разных его концентраций (рис. 3). Экстракт T. vulgare оказывал негативное влияние не только на плавание C. elegans, индуцированное механическим стимулом, но и на спонтанную двигательную активность нематод (табл.).

Рисунок 2 - Влияние низких концентраций экстракта T. vulgare на локомоцию

C. elegans.

По оси ординат доля особей без нарушений локомоции

Результаты проведенных экспериментов показывают, что водный экстракт пижмы обладает антигель-минтной активностью. Сходство в нарушениях поведения C. elegans, индуцированных экстрактом T. vulgare и

агонистом н-холинорецепторов нематод левамизолом, позволяет предположить, что мишенью действия компонентов экстракта пижмы, вызывающих нарушения поведения, является нервная система С. elegans.

%

100 90 -80 -70 60 -50 -40 -30 -20 -10 О

15

30 60

Минуты

90

Левамизол:  8 мкМ ЕЭ 16 мкМ Е 32 мкМ 0 64 мкМ S 125 мкМ

Рисунок 3 - Влияние левамизола на локомоцию С. г^аив. По оси ординат доля нематод, сохранивших нормальную локомоцию

Таблица

Токсическое действие экстракта цветков пижмы на организм C. elegans

Время экспозиции нематод к экстракту пижмы, час Доля нематод с нарушениями моторной программы плавания, %

Концентрация экстракта пижмы, %

3.12 6.25 12.5 25 50

2 1.0±0.8 5.0±1.7 16.0±3.0 31.5±3.7 67.0±3.8

4 1,0±0.8 10.0±2.4 15.0±2.9 43.5±4.0 97.0±1.4

В наших экспериментах выявились различия в негативном действии левамизола и экстракта T. vulgare на плавание C. elegans, индуцированное механическим стимулом. Токсическое действие левамизола на организм C. elegans значительно возрастало при увеличении времени экспозиции к нему. При этом усиливались различия в негативном действии разных концентраций левамизола (рис. 3). Токсическое действие экстракта пижмы на нематод развивалось значительно медленнее. Особенно хорошо это

проявилось при изучении действия малых доз экстракта на плавание C. elegans, индуцированное механическим стимулом (рис. 2). При увеличении времени экспозиции нематод к экстракту пижмы сглаживались различия между действием разных концентраций (рис. 1-2). Это позволяет предположить возможность быстрой адаптации C. elegans к веществам, содержащимся в экстракте T. vulgare. Нельзя исключить наличие в экстракте пижмы веществ, оказывающих противоположное действие на организмы

нематод. Скорость проникновения этих веществ через кутикулу нематод и, как следствие, скорость их накопления во внутренней среде организма, может отличаться. Это, в свою очередь, определяет динамику токсического действия экстракта пижмы на организм C. elegans. Ранее было показано различие в действии на организм Schistosoma mansoni неочищенного экстракта и эфирного масла пижмы. Неочищенный экстракт T. vulgare оказывал более сильное негативное действие на выживаемость, двигательную активность и плодовитость S. mansoni, чем эфирное масло. Кроме того, неочищенный экстракт пижмы вызывал нарушения тегумента. Эфирное масло не оказывало влияния на тегумент. В целом, неочищенный экстракт пижмы оказывал на S. mansoni действие,

сходное с действием антигельминтно-го препарата празиквантела [11].

В целом результаты работы позволяют сделать вывод о том, что использование почвенной нематоды C. elegans для изучения нематоцидной активности T. vulgare может быть перспективным. Во-первых, это позволит идентифицировать компоненты экстракта пижмы, эффективные для использования в качестве антигельминтных средств. Во-вторых, использование C. elegans в качестве модельного организма позволит выявить механизм антигельминтного действия экстракта пижмы. В-третьих, C. elegans можно использовать для сравнения анти-гельминтной активности экстрактов T. vulgare, полученных разными способами.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Кляритская, И. Л. Современные представления о лечении и диагностике гельминто-зов / И. Л. Кляритская, И. А. Вильцанюк, Е. И. Григоренко, С. Н. Чернуха. - Текст : непосредственный // Кримський терапевтичний журнал. - 2010. - № 2. - С. 144-147.

2. Holden-Dye L., Walker R.J. Anthelmintic drugs and nematicides: studies in Caenorhabditis elegans // Wormbook, ed. The C. elegans Research Community. 2014. - URL: http://www. wormbook.org

3. Sant'anna V., Vommaro R.C., de Souza W. Caenorhabditis elegans as a model for the screening of anthelmintic compounds: ultrastructural study of the effects of albendazole // Exp. Parasitol. 2013. Vol. 135. Pp. 1-8.

4. Shalaby H.A. Anthelmintic resistance; how to overcome it? // Iranian J. Parasitol. 2013. Vol. 8. Pp. 18-32.

5. Orengo K.O., Maitho T., Mbaria J.M., Maingi N., Kitaa J.M. In vitro anthelmintic activity of Allium sativum, Allium cepa and Jatropha curcas against Toxocara canis and Ancylostoma caninum // African J. Pharmac. Pharmacol. 2016. Vol. 10. Pp. 465-471.

6. Tolochko K.V., Vyshnevska L.I. Scientific justification of anthelmintic medicines based on medical plant material // Int. J. Green Pharmacy. 2017. Vol. 11. Pp. 154-159.

7. Куркина, А. В. Исследование флавоноидного состава цветков пижмы обыкновенной (Tanacetum vulgare L.) / А. В. Куркина. - Текст : непосредственный // Химия растительного сырья. - 2011. - № 4. - С. 209-212.

8. Kalinnikova T. B., Kolsanova R. R., Belova E. B., Shagidullin R. R., Gainutdinov M. Kh. Opposite responses of the cholinergic nervous system to moderate heat stress and hyperthermia in two soil nematodes // J. Therm. Biol. 2016. Vol. 62. Pp. 37-49.

9. Godinho L.S., Aleixo de Carvalho L.S., Barbosa de Castro C.C., Dias M.M., de Faria Pinto P., Crotti A.E.M., Pinto P.L.S., de Moraes J., Da Silvo Filho A.A. Anthelmintic activity of crude extract and essential oil of Tanacetum vulgare (Asteraceae) against adult worms of

Schistosoma mansoni // Sci. World J. 2014. Vol. 1. Pp. 1-9. REFERENCES

1. Klyaritska I.L., Viltsanyuk I.A., Grigorenko E.I., Chernukha S.M. Sovremennye predstavleniya o lechenii I diagnostike gelmintosov [Modern concepts of diagnosis and treatment helmintosis]. Krymskii terapevticnii zhurnal - The Crimea Therapeutic J. 2010, no 2, pp. 144-147.

2. Holden-Dye L., Walker R.J. Anthelmintic drugs and nematicides: studies in Caenorhabditis elegans // Wormbook, ed. The C. elegans Research Community. 2014. Available at: http:// www.wormbook.org.

3. Sant'anna V., Vommaro R.C., de Souza W. Caenorhabditis elegans as a model for the screening of anthelmintic compounds: ultrastructural study of the effects of albendazole // Exp. Parasitol. 2013, vol. 135, pp. 1-8.

4. Shalaby H.A. Anthelmintic resistance; how to overcome it? // Iranian J. Parasitol. 2013, vol, 8, pp. 18-32.

5. Orengo K.O., Maitho T., Mbaria J.M., Maingi N., Kitaa J.M. In vitro anthelmintic activity of Allium sativum, Allium cepa and Jatropha curcas against Toxocara canis and Ancylostoma caninum // African J. Pharmac. Pharmacol. 2016, vol. 10, pp. 465-471.

6. Tolochko K.V., Vyshnevska L.I. Scientific justification of anthelmintic medicines based on medical plant material. Int. J. Green Pharmacy. 2017, vol. 11, pp. 154-159.

7. Kurkina A.V. Issledovanie flafonoidnogo sostava tsvetkov pizhmy obyknovennoi (Tanacetum vulgare L.) [The study of flavonoid composition of Tansy (Tanacetum vulgare L.) flowers]. Khimiya rastitel'nogo syrya - Chemistry of plant raw materials. 2011, no 4, pp. 209-212.

8. Kalinnikova T.B., Kolsanova R.R., Belova E.B., Shagidullin R.R., Gainutdinov M.Kh. Opposite responses of the cholinergic nervous system to moderate heat stress and hyperthermia in two soil nematodes // J. Therm. Biol. 2016, vol. 62, pp. 37-49.

9. Godinho L.S., Aleixo de Carvalho L.S., Barbosa de Castro C.C., Dias M.M., de Faria Pinto P., Crotti A.E.M., Pinto P.L.S., de Moraes J., Da Silvo Filho A.A. Anthelmintic activity of crude extract and essential oil of Tanacetum vulgare (Asteraceae) against adult worms of Schistosoma mansoni // Sci. World J. 2014, vol. 1, pp. 1-9.

Материал поступил в редакцию 25.04.2020 © Егорова А.В., Нигматуллина А.Ф., Калинникова Т.Б., 2020