ТЕРАПЕВТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ ЭКТОИНА
THERAPEUTIC USE OF EKTOIN

Изобретение относится к композициям, содержащим эктоин, гидроксиэктоин или соответствующие соли, сложные эфиры и амиды.
Осмолиты или совместимые растворенные вещества из экстремофильных микроорганизмов образуют известную группу низкомолекулярных защитных веществ. Экстремофилы являются очень необычными микроорганизмами, так как они оптимально размножаются при высоких концентрациях солей (до 200 г/л NaCl) и высоких температурах (60-110°C), которые у мезофильных (нормальных) организмов привели бы к тяжелым повреждениям клеточной структуры. Поэтому в последние годы было затрачено много исследовательских усилий, чтобы идентифицировать биохимические компоненты, ведущие к заметной стабилизации клеточных структур. Хотя многие ферменты из гипертермофильных микроорганизмов стабильны и при высоких температурах, обычно это несправедливо для клеточных структур термо- и гипертермофильных организмов. Высокой термостабильности клеточных структур существенно способствуют низкомолекулярные органические вещества (совместимые растворенные вещества, осмолиты) во внутриклеточной среде. В последние годы впервые удалось идентифицировать различные новые осмолиты в экстремофильных микроорганизмах. В некоторых случаях уже удалось показать вклад этих соединений в защиту клеточных структур, прежде всего ферментов, от жары и сухости (K. Lippert, E.A. Galinski, Appl.Microbiol. Biotech. 1992, 37, 61-65; P. Louis, H.G. Trüper, E.A. Galinski,Appl. Microbiol.Biotech. 1994, 41, 684-688; Ramos et al., Appl. Environm. Microbiol. 1997, 63, 4020-4025; Da Costa, Santos, Galinski, Adv. in Biochemical Engineering Biotechnology, 61, 117-153).
Для ряда совместимых растворенных веществ были выявлены возможности целесообразного применения в области медицины, косметики и биологии. К важнейшим совместимым растворенным веществам относятся при этом эктоин (2-метил-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-4-карбоновая кислота) и ее производные. Так, например, в патенте EP 0 887418 A2 описано применение эктоина и гидроксиэктоина (5-гидрокси-2-метил-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-4-карбоновая кислота) для лечения кожных болезней или в качестве активной добавки для криозащиты биологически активных веществ и клеток. Документ DE10 2006 056766 A1 показывает применение эктоина для лечения синдромов капиллярной утечки (Vascular Leak Syndrom, VLS). Следующими примерами являются стабилизация вакцин (DE 10065986 A1) или дерматологическое применение для лечения нейродермита (DE 10330243 A1).
Структура натурального L-эктоина ((S)-2-метил-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-4-карбоновая кислота) показана ниже:
Кроме того, было описано также выгодное применение гидроксиэктоина для различных целей. Структура натурального гидроксиэктоина ((4S,5S)-5-гидрокси-2-метил-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-4-карбоновая кислота) представлена ниже:
Лечение заболеваний легких, вызванных воздействием взвешенной пыли, и сердечно-сосудистых заболеваний является предметом европейского патента EP 1641442 B1. Там описана ингаляция лекарственных композиций, содержащих эктоин или гидроксиэктоин, для борьбы с такими болезнями. Однако заболевания, вызванные другими причинами, а не воздействием взвешенной пыли, не являются объектом этого патента.
При многих воспалительных явлениях важную роль играют нейтрофильные гранулоциты, сокращенно нейтрофилы, в частности в борьбе с вирусными и бактериальными патогенами. Нейтрофилы в большом числе образуются в костном мозге. Патогены разрушаются в результате выделения активных форм кислорода и ферментов, как миелопероксидаза, эластаза или матриксная металлопротеиназа. Однако так как эти реакции связаны с побочными эффектами на затронутых тканях, должна осуществляться строгая регуляция, чтобы нейтрофильное воспаление не выходило за борьбу с собственно патогенами. Соответственно, активируется сигнальный каскад, который ведет к апоптозу нейтрофильных гранулоцитов. Однако медиаторы воспаления задерживают апоптоз и продлевают, таким образом, продолжительность жизни нейтрофилов. Скопление нейтрофилов и моноцитов в месте инфекции представляет собой основной компонент воспаления. Длительная задержка апоптоза может приводить к хроническим воспалительным явлениям. Примерами являются хроническое воспаление легких или хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ).
Поэтому основная задача в борьбе с хроническими воспалениями состоит в борьбе с воспалением, вызванным накоплением нейтрофилов. При этом следует отметить проблему, что нейтрофилы, в отличие от других, вовлеченных в воспаление клеток, неудовлетворительно реагируют на кортикостероиды. Поэтому были бы желательны лекарства, которые ограничивают антиапоптотическое действие медиаторов воспаления, кортикостероидов и других веществ.
Теперь же неожиданно было обнаружено, что лечение эктоином или гидроксиэктоином по меньшей мере частично устраняет антиапоптотическое действие медиаторов воспаления, кортикостероидов и других веществ и, таким образом, восстанавливает естественную степень выраженности апоптоза нейтрофильных гранулоцитов, не обнаруживая при этом только проапоптотическое действие. Поэтому изобретение относится к композиции, содержащей эктоин, гидроксиэктоин и/или соль, сложный эфир или амид этого соединения, для подавления антиапоптотических сигналов нВ нейтрофильные гранулоциты и другие, участвующие в воспалениях клетки, такие как макрофаги, эозинофильные гранулоциты, базофильные гранулоциты, тучные клетки, лимфоциты, эпителиоидные клетки и дендритные клетки. Подавление антиапоптотических сигналов обычно связано с лечением или профилактикой воспалений, причем здесь особую роль играют хронические воспаления. Особое значение имеет борьба с воспалениями, относящимися к дыхательным путям и легким, в частности воспаления легких, астма, хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ), синдром острой дыхательной недостаточности (acute respiratory distress syndrome, ARDS), кистозный фиброз, фиброз легких, силикоз, саркоидоз, аллергии и бронхиальная гиперреактивность.
Подавление апоптоза нейтрофильных гранулоцитов в исследованных воспалительных реакциях объясняется опосредованным мембранами активированием сопряженных с мембранами сигнальных путей через PI3-K (фосфатидилинозитол-3-киназа). Это ведет к активированию протеинкиназы B (AKT) и в конечном счете к повышению уровня Mcl-1, белка с антиапоптотическим действием. Предполагается, что эктоин снижает активирование AKT.
Нейтрофильная воспалительная реакция исследовалась на крысах, которым интратрахеально вводили углеродные наночастицы. Это делалось как с эктоином, так и без эктоина. Затем крыс исследовали в разные моменты времени, причем через два дня можно было наблюдать существенное уменьшение числа нейтрофилов в группе, получавшей эктоин, по сравнению с группой, получавшей плацебо. Эффективность через два дня соответствует наблюдаемому снижению выделения cinc-1, т.е. хемокина, играющего важную роль при воспалении. Сначала происходит выделение cinc-1, в первую очередь эпителиальными клетками и макрофагами, тогда как в более поздние моменты времени доминирует выделение нейтрофилов, присутствующих в конце в большом числе. Снижение выделения cinc-1 через два дня при приеме эктоина показывает, что к этому времени количество нейтрофилов уменьшилось.
Удалось также показать, что введение эктоина в двух дозах в 1-й и 2-й день после начала воспалительной реакции имело практически такой же эффект, что и введение эктоина при начале воспалительной реакции. Таким образом, эктоин можно применять не только профилактически, но также для лечения уже имеющегося воспаления. При повторном приеме эктоина после неоднократного инициирования воспалительной реакции также можно было наблюдать уменьшение числа нейтрофилов, а также снижение уровня cinc-1, что подтвержает применимость при лечении хронических воспалений.
4
Соответствующие исследования проводились также с изолированными нейтрофильными гранулоцитами человека. Удалось показать, что снижение степени выраженности апоптоза из-за провоспалительных факторов, как углеродные наночастицы (CNP), LTB или GM-CSF, можно было по меньшей мере частично, в зависимости от концентрации, компенсировать введением эктоина. Введение только эктоина в нейтрофилы без предшествующего лечения провоспалительными факторами не вело к повышению степени выраженности апоптоза. Это показывает, что эктоин в принципе действует не проапоптически, а скорее подавляет развертывающиеся при воспалении антиапоптотические механизмы.
in vivo
Хотя анти-антиапоптотическая эффективность была подтверждена в опытах  и in vitro, в которых воспалительная реакция запускалась с помощью углеродных наночастиц, она ими не ограничена, напротив, настоящее изобретение явно относится также к таким воспалениям, которые не вызваны действием взвешенной пыли. Тогда как в патенте EP 1641442 B1 исходили еще из того, что эктоин лишь напрямую борется с вредным действием взвешенной пыли, теперь удалось показать, что лечение воспалений эктоином начинается с восстановления естественной степени выраженности апоптоза нейтрофилов.
Кроме того, особенно предпочтительной оказалась комбинация эктоина/гидроксиэктоина или соответствующего производного с кортикостероидами, в частности с глюкокортикоидами, как дексаметазон, будесонид, бетаметазон, триамцинолон, флуокортолон, метилпреднизолон, дефлазакорт, преднизолон, преднизон, клопреднол, кортизон, гидрокортизон, флуокортин, клокортолон, клобетазон, алклометазон, флуметазон, флупредниден, флуорандренолон, предникарбат, мометазон, метилпреднизолон, флутиказон, галометазон, флуоцинолон, дифлорасан, дезоксиметазон, флуоцинонид, флудрокортизон, дефлазакорт, римексолон, клопреднол, амцинонид, галцинонид, дифлукортолон, клобетазол или соли, сложные эфиры, амиды, сольваты или гидраты этих соединений.
4
Хотя кортикостероиды известны как эффективное средство против воспалений, они играют в борьбе с нейтрофильными воспалениями двойственную роль, так как они снижают естественный апоптоз нейтрофилов. Поэтому комбинация кортикостероида с эктоином/гидроксиэктоином сочетает предпочтительное противовоспалительное действие стероида с восстановлением естественной степени выраженности апоптоза и, тем самым, со снижением нежелательного антиапоптотического действия кортикостероидов эктоином/гидроксиэктоином. Примерами являются комбинации эктоина или соответствующих производных с дексаметазоном и/или будесонидом. Альтернативными выгодными комбинациями являются эктоин/гидроксиэктоин с GM-CSF, лейкотриенами, как LTB, теофиллином (1,3-диметилксантин), антагонистами лейкотриена, ингибиторами фосфодиэстеразы (PDE-ингибитор, в частности ингибитор PDE4), антагонистами мускариновых рецепторов, антихолинергическими средствами, как бромид ипратропия или бромид тиотропия, или с другими лекарственными веществами, которые нежелательным образом снижают естественную степень выраженности апоптоза нейтрофилов.
При комбинации кортикостероидов с эктоином/гидроксиэктоином особое значение имеет также лечение заболеваний легких, в частности воспалений легких, астмы (бронхиальная астма), хронических обструктивных болезней легких (ХОБЛ), синдрома острой дыхательной недостаточности (ARDS), кистозного фиброза, фиброза легких, силикоза, саркоидоза, аллергий и бронхиальной гиперреактивности. При этом целесообразно выполнить композицию, подходящую для ингаляции. При этом композиция может быть жидкой как раствор или находиться в твердой форме, причем при необходимости композицию целесообразно распылять в виде аэрозоля с помощью ингалятора и вдыхать.
Введение кортикостероидов и эктоина/гидроксиэктоина не должно в каждом случае происходить из одной и той же лекарственной формы, но важен, однако, одновременный или близкий по времени прием, чтобы активные вещества функционально взаимодействовали вышеописанным образом. Соответственно, изобретение относится также к комбинированному препарату, который содержит по меньшей мере две отдельные композиции, а именно одну композицию, содержащую эктоин, гидроксиэктоин и/или соль, сложный эфир или амид этого соединения, а также другую композицию, которая содержит кортикостероид. Таким образом, комбинированный препарат представляет собой набор из двух композиций, которые проявляют свою полную эффективность только вместе. Под кортикостероидом может иметься в виду, в частности, один из вышеназванных глюкокортикоидов.
В качестве фармакологически приемлемых солей эктоина/гидроксиэктоина подходят соли щелочных или щелочноземельных металлов, в частности соли калия, натрия, магния и кальция, а также соли с органическими основаниями, как, например, соли с нетоксичными алифатическими или ароматическими аминами.
В результате реакции карбоксильной группы эктоина/гидроксиэктоина со спиртами или аминами можно получить соответствующие сложные эфиры или амиды, которые также применимы согласно изобретению. В случае амида атом азота может, со своей стороны, содержать насыщенные или ненасыщенные, линейные или разветвленные алкильные группы. В случае гидроксиэктоина гидроксильная группа может также реагировать с карбоновой кислотой с образованием соответствующего сложного эфира.
Выгодным оказалось, помимо прочего, применение эктоинамида 2-гидрокси-5-аминобензойной кислоты. Структурная формула приводится ниже:
Тем самым речь идет об 2-метил-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-4-карбоновой кислоты амиде 2-гидрокси-5-аминобензойной кислоты. Предпочтительно имеется в виду соответствующий амид L-эктоина: амид (S)-2-метил-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-4-карбоновой кислоты. Это соединение было протестировано и обнаружило эффективность, сравнимую с эффективностью самого эктоина (ср. фигуру 7). Возможно также применение соответствующего амида гидроксиэктоина (5-гидрокси-2-метил-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-4-карбоновая кислота), предпочтительно L-гидроксиэктоина ((4S,5S)-5-гидрокси-2-метил-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-4-карбоновая кислота), т.е. гидроксиэктоинамида 2-гидрокси-5-аминобензойной кислоты. Соответствующий амид может также присутствовать в ионной или цвиттер-ионной форме. Таким образом, изобретение относится также к указанным соединениям или солям, сложным эфирам или амидам этих соединений и к композициям, которые содержат эти соединения или соли, сложные эфиры или амиды. Композиции могут служить для применения в качестве лекарственных средств, в частности для подавления антиапоптотических сигналов на нейтрофильные гранулоциты, макрофаги, эозинофильные гранулоциты, базофильные гранулоциты, тучные клетки, лимфоциты, эпителиоидные клетки, дендритные клетки или другие вовлеченные в воспаление клетки.
Вообще говоря, активные вещества согласно изобретению при необходимости могут быть также обработаны другими активными веществами с применением фармакологически безопасных вспомогательных веществ и добавок для получения лекарственных средств, предпочтительно подходящих для ингаляции. Такими добавками в жидких готовых формах для ингаляции являются в первую очередь вода, при необходимости с добавлением дополнительных растворителей, стабилизаторов, консервантов, эмульгаторов, антиоксидантов, наполнителей или агентов растворения. В качестве дальнейших активных веществ возможны противоастматические средства, бронхолитические средства, нестероидные противовоспалительные вещества (NSAID) или отхаркивающие средства. В качестве консервантов подходят: хлорид бензалкония, хлорбутанол, тиомерсал, метилпарабен, пропилпарабен, сорбиновая кислота и ее соли, эдетат натрия, фенилэтиловый спирт, хлоргексидина гидрохлорид, ацетат и диглюконат, цетилпиридиния хлорид или бромид, хлоркрезол, фенилацетат ртути, фенилнитрат ртути, фенилборат ртути, феноксиэтанол.
Композиции по изобретению могут также включать подходящие буферные системы или другие вспомогательные вещества для регулирования pH, чтобы устанавливать величину pH и удерживать в диапазоне значений 4-8, предпочтительно от 5 до 7,5. Подходящими буферными системами являются цитрат, фосфат, трометамол, глицин, борат, ацетат. Эти буферные системы могут быть получены из таких веществ как лимонная кислота, мононатрийфосфат, динатрийфосфат, глицин, борная кислота, тетраборат натрия, уксусная кислота или ацетат натрия.
Концентрация эктоина/гидроксиэктоина или соответствующих производных типично составляет, в расчете на композицию, от 0,001 до 50 вес.%, предпочтительно от 0,05 до 20 вес.%, в частности от 0,1 до 10 вес.%.
В случае введения в твердой форме, например, с помощью порошковых ингаляторов, целесообразно использовать только легко всасывающиеся нераздражающие наполнители, как микронизированная лактоза.
Опыт 1
Углеродные наночастицы (CNP, 14 нм, Printex 90, Degussa, Франкфурт, Германия) суспендировали с помощью ультразвуковой обработки в фосфатно-буферном солевом растворе (PBS). Готовили также растворы эктоина в PBS концентрацией 0,1 и 1 мМ. Самок крыс Fisher 344 обрабатывали интратрахеально 0,4 мл суспензии частиц CNP. Через 1 и 2 дня проводили лечение 0,4 мл раствора эктоина или PBS. На третий день крыс умерщвляли, легкие промывали 4 раза 5 мл PBS. Клетки каждого животного суспендировали в 1 мл PBS и центрифугировали. Гранулы промывали один раз PBS и повторно суспендировали в 300 мкл гипотонического раствора (0,1% цитрата натрия, 0,1% Triton X 100), содержащего 50 мкг/мл иодида пропидия (PI). Затем проводили флуорометрию для определения степени выраженности апоптоза.
*
Получены результаты, показанные на фигуре 1 (C: контроль без обработки CNP; : существенная разница с контрольной группой без обработки CNP; †: существенная разница с животными, обработанными только CNP и PBS).
Опыт 2
Влияние эктоина на апоптоз исследовали на нейтрофилах человека. Нейтрофилы от здоровых молодых доноров (3 мужского и 2 женского пола) выделяли и обрабатывали указанным количеством эктоина (мМ). Лечение проводили одним эктоином (незакрашенные столбцы) или с 33 мкг/мл CNP (черные столбцы). Контрольной группе (C) эктоин вообще не вводили. Результаты показаны на фигуре 2.
Определение количества апоптотических клеток проводили следующим образом: нейтрофилы суспендировали в 300 мкл гипотонического раствора, содержащего иодид пропидия (PI). Флуоресценцию PI измеряли методом проточной цитометрии (цитометр FACScan производства BD Biosciences). Результаты представлены как процент гиподиплоидного содержания ДНК (sub-G1), соответствующий фрагментированной ДНК, характерной для апоптотических клеток.
Вызванное CNP снижение степени выраженности апоптоза можно было практически компенсировать введением значительных количеств эктоина.
*
(: значительная разница с контрольной группой без обработки CNP; †: значительная разница с нейтрофилами, обработанным только CNP и PBS).
Опыт 3
4
*
Эффект эктоина на апоптоз исследовали на нейтрофилах человека. Нейтрофилы от здоровых молодых доноров (3 мужского и 2 женского пола) выделяли и предварительно обрабатывали 2 ч PBS (темные столбцы) или 1 мМ эктоина (светлые столбцы). Затем проводили обработку 33 мкг/мл углеродных наночастиц (ufCB: ультратонкая углеродная сажа), 300 нМ LTB, 20 нг/мл GM-CSF или 1 мкМ дексаметазона, или не проводили никакой обработки провоспалительными факторами. Результаты представлены на фигуре 3 (†: значительная разница с контрольной группой; : значительная разница с нейтрофилами, обработанными только провоспалительными факторами и PBS, определение количества апоптотических клеток аналогично опыту 2).
Опыт 4
4
*
Эффект эктоина на апоптоз устанавливали аналогично опыту 3 на пациентах, страдающих ХОЗЛ, и на соответствующих пожилых пациентах, не болеющих ХОЗЛ. Нейтрофильные гранулоциты предварительно обрабатывали 2 часа 1 мМ эктоина или PBS, затем проводили в течение 16 ч обработку 33 мкг/мл CNP, 300 нМ LTB, 20 нг/мл GM-CSF или PBS. Удалось установить более высокий базовый апоптоз, тем не менее стимуляторы воспалительных процессов снижают апоптоз, и дополнительная обработка эктоином значительно восстанавливает степень выраженности апоптоза. Результаты представлены на фигуре 4 (темные столбцы: предварительная обработка эктоином; светлые столбцы: предварительная обработка PBS; : значительная разница с контрольной группой без CNP или медиаторов воспаления; §: значительная разница с обработкой без эктоина; определение количества апоптотических клеток аналогично опыту 2).
Опыты 5-7
Для опытов 5-7 нейтрофильные гранулоциты получали из крови, взятой на исследование. Группы 1 и 2 состояли из лиц, входящих в текущее исследование на пациентах. Пациенты-мужчины (возраст от 40 до 80 лет) со стабильным протеканием ХОЗЛ (GOLD III/IV) и здоровые контрольные пациенты в такой же возрастной группе.
Кроме того, к клиническим исследованиям привлекались молодые добровольцы мужского пола (группа 3).
Опыт 5
1
4

6
Эффект эктоина в комбинации с кортикостероидом будесонидом на степень выраженности апоптоза нейтрофилов представлен на фигуре 5. Измерялись клетки sub-G посредством окрашивания йодидом пропидия (проточный цитометр FACS). Клетки: первичные периферические нейтрофилы. Выделение нейтрофилов проводили центрифугированием с градиентом Percoll. Культивировали 2×10 нейтрофилов в присутствии 33 мкг/мл CNP, 300 нМ LTB, 20 нг/мл GM-CSF, 1 мкМ будесонида, 1 мМ эктоина и их комбинаций в течение 16 ч. Фигура 5A: суммированы клетки из всех проб (n=15), фигура 5B: клетки пациентов, больных ХОЗЛ (n=5), фигура 5C: клетки контрольных здоровых пожилых (n=5), фигура 5D: клетки молодых добровольцев (n=5).
4
Лечение будесонидом ведет к снижению степени выраженности апоптоза нейтрофилов. Можно видеть, что предварительная обработка клеток 1 мМ эктоина в значительной степени предотвращает антиапоптотические эффекты будесонида. Эффект наблюдается во всех группах, а также в совокупности групп. Эффект удалось показать в случае нейтрофильных гранулоцитов, которые не обрабатывались провоспалительно действующими веществами. Но и при комбинации провоспалительно действующих веществ (CNP, LTB, GM-CSF) с будесонидом эктоин успешно подавлял антиапоптотическое действие.
Опыт 6

6
Влияние эктоина в комбинации с будесонидом на антиапоптотические сигналы показано на фигуре 6. Соответствующие сигналы проводились через протеинкиназу B (Akt) и Mcl-1 при выбранных образцах нейтрофилов путем измерения Akt-фосфорилирования и уровня белка Mcl-1, клетками служили первичные периферические нейтрофилы человека. Выделение нейтрофилов осуществляли центрифугированием с градиентом Percoll, культивированием 2×10 нейтрофилов в присутствии 33 мкг/мл CNP, 1 мкМ будесонида, 1 мМ эктоина и их комбинации в течение 6 ч. Проводили выделение белка, вестерн-блоттинг, люминесцентный анализ на рентгеновских пленках на материале соответственно 3 больных ХОБЛ и 3 лиц из соответствующей возрастной группы. Результат четко показывает антиапоптотическое действие будесонида, который активирует сигнальный путь Akt и повышает количество антиапоптотического белка Mcl-1. Эктоин способен противодействовать этому эффекту, также и в присутствии CNP.
Опыт 7
1

6
Влияние различных других испытуемых веществ на степень выраженности апоптоза человеческих нейтрофилов показано на фигуре 7. Измеряли клетки sub-G путем окрашивания йодидом пропидия (проточный цитофлуориметр FACS). Клетки: первичные периферические нейтрофилы человека. Нейтрофилы выделяли с помощью центрифугирования с градиентом Percoll и культивирования 2×10 нейтрофилов в присутствии 33 мкг/мл CNP, 1 мкМ будесонида, 1 мМ эктоина, 1 мМ мочевины, 1 мМ эктоинамида и их комбинации в течение 16 ч. Клетки были взяты у молодых добровольцев (группа 3), n=5, bud = будесонид. Два других испытуемых веществ (мочевина и эктоинамид 2-гидрокси-5-аминобензойной кислоты) испытывали на их способность подавлять антиапоптотическое действие на нейтрофилы. Оба вещества не оказывали никакого эффекта на фоновую степень выраженности апоптоза. Эктоинамид был способен снижать степень выраженности апоптоза, обусловленную наночастицами углерода (CNP), с или без будесонида, а мочевина нет.