Структурные превращения макромолекул синтетических неионогенных полимеров и ДНК в водно-солевых растворах

ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ, Серия А, 2007, том 49, № 2, с. 329-335

РАСТВОРЫ

УДК 541.64:539.2:532.73

СТРУКТУРНЫЕ ПРЕВРАЩЕНИЯ МАКРОМОЛЕКУЛ СИНТЕТИЧЕСКИХ НЕИОНОГЕННЫХ ПОЛИМЕРОВ И ДНК В ВОДНО-СОЛЕВЫХ РАСТВОРАХ

© 2007 г. Е. В. Ануфриева, М. Г. Краковяк, Т. Н. Некрасова, Р. Ю. Смыслов, О. В. Назарова, Е. Ф. Панарин

Институт высокомолекулярных соединений Российской академии наук 199004 Санкт-Петербург, Большой пр., 31 Поступила в редакцию 15.06.2006 г. Принята в печать 06.10.2006 г.

Люминесцентным методом наносекундной динамики обнаружено влияние солевых добавок на структурные превращения не содержащих ионогенных групп макромолекул синтетических полимеров и молекул ДНК. При добавлении солей поливалентных металлов в макромолекулах поли-К-н-пропилметакриламида наблюдается переход клубок-глобула, в молекулах ДНК - изменения структуры, при которых интеркалированный в ДНК в водном растворе низкомолекулярный органический катион переходит в раствор. Эти изменения проявляются при добавлении ионов поливалентных металлов в количестве один ион М13+ на десять фосфатных групп ДНК. Так же действуют и соли поликатионов, добавленные в раствор интерполиэлектролитного комплекса ДНК-поликатион.

Изменение межмолекулярных взаимодействий в водно-солевых растворах неионогенных полимеров наиболее детально изучено на примере поли-К-винилкапролактама (ПВК) [1]. Влияние солевых добавок на структурообразование в водных растворах биополимеров широко представлено в работах [2]. Обсуждается влияние солевых добавок на структурные переходы в макромолекулах белков, на конформационные особенности ряда других природных полимеров, в том числе ДНК, и на температуру осаждения синтетических полимеров [3].

Задача настоящей работы - установить влияние солевых добавок в водных растворах на внутримолекулярные взаимодействия в неионогенных полимерах в условиях, исключающих осаждение полимеров, а также на внутримолекулярные взаимодействия в свободных молекулах ДНК, и в молекулах ДНК, включенных в интер-полиэлектролитные комплексы (ИПЭК). Изменение внутримолекулярных взаимодействий в макромолекулах синтетических полимеров влияет на структурную организацию макромолекул и может быть изучено методами наносекундной ди-

Е-таП: polar@mail.macro.ru (Ануфриева Елизавета Викторовна).

намики, которые отражают изменения наносе-кундных внутримолекулярных контактов, ответственных за структурные переходы в макромолекулах [4].

В макромолекулах ДНК изменение внутримолекулярных взаимодействий может влиять в первую очередь на внутримолекулярные контакты между основаниями ДНК, что скажется на контактах с молекулами ДНК низкомолекулярных органических катионов, интеркалированных в ДНК. Явление интеркаляции низкомолекулярных органических катионов в ДНК широко используется при анализе взаимодействия ДНК с поликатионами [5, 6].

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

В качестве синтетического полимера использовали поли-К-н-пропилметакриламид (ППМА). Индикатором внутримолекулярного структуро-образования в макромолекулах полимера служило формирование внутримакромолекулярных глобул, которое определяется методом поляризованной люминесценции по изменению времен релаксации для люминесцентно меченого полимера [4], полученного по методике [7]. Концентрация ППМА в растворе 0.05 мг/мл, концентрация ДНК

в растворе 0.07 мг/мл. Для формирования интер-полиэлектролитного комплекса ДНК-поликатион использовали следующие поликатионы: поли-^^диметиламиноэтилметакрилат (ПДМАЭМ), сополимеры N,N-диметиламиноэтилметакрилата с N-винилпирролидоном (ВП) или ^метакрило-иламиноглюкозой (МАГ), сополимеры ^диэтил-аминоэтилметакрилата (ДЭАЭМ) с МАГ, поли-виниламин (таблица). Для сополимеров с небольшим содержанием катионных звеньев (до 20 мол. %) значения ММ рассчитывали из значений характеристической вязкости [п] по формулам для по-ли-^метакрилоиламиноглюкозы, а при большом содержании звеньев ДМАЭМ или ДЭАЭМ приведены значения только [п]. Люминесцентно меченый ПДМАЭМ получали по методике [7]. Индикатор внутримолекулярного структурооб-разования в макромолекулах ДНК - интеркали-рованный в ДНК низкомолекулярный органический катион, интенсивно люминесцирующий (или не люминесцирующий) и высоко подвижный в воде в отсутствие ДНК и теряющий (или приобретающий) люминесценцию и теряющий подвижность при интеркаляции в ДНК. Об уменьшении подвижности свидетельствует увеличение времен вращательной релаксации катиона от 1 до 96 нс. В качестве таких катионов использовали: акридиновый оранжевый

И3С-№

профлавин

И2Ы

трипафлавин

СИз ^-СИ3

ИС1,

И I

ИС1,

СИз N

-ЫИ,

ИС1,

аурамин

(ИзС)2Ы

Ы(СИз),

С II

ЫИ

ИС1,

этидий бромид

И2№

КИ2

солянокислый 9-антрилметиламин

Вг-

• ИС1.

СИ2 I 2 ЫИ2

Для взаимодействия с поликатионом ПДМАЭМ в воде брали люминесцирующий в связанном с макромолекулами состоянии анион 8-анилинонафта-лин-1-сульфонат

.2+

2

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При добавлении А1С13 к водному раствору не-ионогенного полимера ППМА изменяется время релаксации полимерных цепей т, что свидетельствует о формировании глобулярной структуры в макромолекулах ППМА. Доказательством формирования глобулярных структур является характер изменения т (рис. 1), отражающий сначала рост внутримолекулярной заторможенности, а затем появление нового релаксационного процесса с меньшим значением т. Уменьшение значения т после роста внутримолекулярной заторможенности обычно указывает на компактизацию мак-ромолекулярного клубка и появление нового ре-

СТРУКТУРНЫЕ ПРЕВРАЩЕНИЯ МАКРОМОЛЕКУЛ Характеристика исследованных (со)полимеров

(Со)полимер

Структурная формула

[П], дл/г

Растворитель

Т, °С

х

Поли^^-диметиламиноэтилме-такрилат

^^Диметиламиноэтилметакри-лат-N-винилпирролидон т : п = 49 : 51

СН3

О=С I

0

1

СН2 I 2 СН2 I 2

Нз^ ЧСНз

СН3

-ЕН3С"СЫ СН2~СН^т

С=О N

0 О"

СН2

1 2 СН2 I 2 N

НзС' ЧСНз

о

^^Диметиламиноэтилметакри-лат-N-метакрилоиламиноглюкоза

т : п = 93 : 7

т : п = 82 : 18

т : п = 55 : 45

^^Диэтиламиноэтилметакри-лат-N-метакрилоиламиноглюкоза

СН3

4сн2-С1—

С=О

I ОН

рОнЛ,

ОН у -О

СН2ОН

СН3 —

I ^ I J т

С=О

ОН

т : п = 57.5 : 42.5

I О СН2ОН

Н5С

5С2

Поливиниламин гидрохлорид

-ЕОТ2-Ш+,

I

НС1

0.065 0.2

1 М нитрат

20 °С

0.18

25 120

0.1 М

СН3СОО№

25°С

Шз 0.1 М

С=О 1 0.14 25°С 35

1 0 1 СН2 1 ^ 0.11 20

СН2 1 2 0.10

1 N ЧСНз

СН3 1 п3 0.18 ДМФА 25°С

С=О 1

1 О

1 Ш2

СН2

N ЧС2Н5

1.03 0.1 М №С1 25°С 75

з

т, нс 1QQQ

5QQ

^eop = k[n]Mn/RT

А/люм

2QQ

1QQ

Q-J

Q Q.4 Q.8

Koнцeнтpaция AlCl3, мoль|л

Рис. 1. Зaвиcимocть вpeмeни peлaкcaции т, xa-paктepизyющeгo нaнoceкyнднyю пoдвижнocть мaкpoмoлeкyл ППMA с M = 1.7 x 1Q5, oт coдep-жaния AlCl3 в вoднo-coлeвoм pacтвope. спал = = Q.Q5 мг|мл.

лaкcaциoннoгo пpoцecca - пoдвижнocти мaкpoмo-лeкyлы ^к цeлoгo [4, 8, 9]. Дeйcтвитeльнo, экcпepимeнтaльнoe знaчeниe т пpи coдepжaнии AlCl3, paвнoм Q.8 мoль|л, coвпaдaeт с вpeмeнeм peлaкcaции, xapaктepизyющим пoдвижнocть rao-•УЛЫ кaк цeлoгo, paccчитaнным пo фopмyлe

Q.4 Q.6

[Mtn+] : [ДHK]

Рис. 2. Зaвиcимocть интeнcивнocти люми^с-цeнции А/люм низкoмoлeкyляpнoгo opгaничe-cкoгo кaтиoнa aнтpилмeтилaминa, интepкaли-poвaннoгo в ДHK, oт coдepжaния иoнa пoливa-лeнтнoгo мeтaллa Mtn+, oтнeceннoгo к coдepжaнию фocфaтныx ^упп ДHK, в вoднoм

pacтвope ДЖ. 1 - Tb3+, 2 - Ca2+, 3 - Rb+ = Q.Q7 мг|мл. А/

люм /нaбл "

/

CДHK :

ДЖ-

В этом cooтнoшeнии M - мoлeкyляpнaя мacca пo-лимepa, T и n - тeмпepaтypa и вяз^оть paCTBop^ тeля. В pacчeтe иcпoльзyютcя знaчeния xapa^e-pиcтичecкoй вязкocти paCTBopa пoлимepa [n] = 34 см3|г и k = 1.2 ^к для бeлкoвoй глoбyлы, пo-cкoлькy [n] ~ 1|т [4], a знaчeния 3-4 см3|г являются пpeдeльными.

Пpи дoбaвлeнии к paCTBopy ДHK с интepкaли-poвaнными низкoмoлeкyляpными opгaничecкими кaтиoнaми yжe тaкoгo мaлoгo кoличecтвa coли AlCl3 или TbCl3, пpи кoтopoм coдepжaниe иoнoв Al3+ или Tb3+ нa пopядoк нижe, чeм coдepжaниe фocфaтныx гpyпп ДHK, cтpyктypa ДHK пpeтep-пeвaeт измeнeния, и низкoмoлeкyляpныe ^rao-ны пepexoдят из ДHK в pacтвop. O6 этoм cb^â-тeльcтвyeт кooпepaтивный poCT кaк интeнcивнo-сти люминecцeнции, тaк и пoдвижнocти. Haпpимep, в cлyчae coлянoкиcлoгo aнтpилмeтил-aминa и тpипaфлaвинa (pиc. 2) пpи измeнeнии co-дepжaния в pacтвope Al3+ или Tb3+ oт Q.Q5 дo Q.2 [Mt3+] : [ДHK] интeнcивнocть люми^с^нции кa-

тиoнoв вoзpacтaeт oт 3Q дo 16Q oтн. eд., a вpeмя вpaщaтeльнoй peлaкcaции т yмeньшaeтcя oт 9б дo 1 нс. В paбoтe [1Q] пoкaзaнo, что имeннo в этих ycлoвияx, т^. пpи дoбaвлeнии иoнoв пoливaлeнт-нoгo мeтaллa, ДHK кoмпaктизyeтcя, нa что y^-зывaeт двyкpaтнoe yмeньшeниe пpивeдeннoй вяз-кocти pacтвopa ДHK.

В мaкpoмoлeкyлax ДHK cтpyктypныe измeнe-ния, влияющиe нa ee взaимoдeйcтвиe с интepкa-лиpoвaнным низкoмoлeкyляpным opгaничecким кaтиoнoм, пpoиcxoдят пpи дoбaвлeнии нe тольта иoнoв пoливaлeнтныx мeтaллoв, нo и пoликaтиo-нa. Koнeчнo, пpи ввeдeнии пoликaтиoнa cнaчaлa фopмиpyeтcя ИПЭK (пoликaтиoн-ДHK), нo включeниe ДHK в ИПЭK нeзнaчитeльнo влияeт нa пoдвижнocть или люми^с^нцию интepкaли-poвaннoгo в ДHK низкoмoлeкyляpнoгo opгaничe-cкoгo кaтиoнa фис. 3). Toлькo пpи избыткe пoли-кaтиoнa пocлe oбpaзoвaния ИПЭK нaблюдaeтcя кooпepaтивный выюд из ДHK интepкaлиpoвaн-нoгo низкoмoлeкyляpнoгo кaтиoнa. Пpи этом чacть мoлeкyл пoликaтиoнa, дoбaвлeннoгo в pac-твop пocлe фopмиpoвaния ИПЭ^ oкaзывaeтcя cвoбoднoй, нe взaимoдeйcтвyющeй с фocфaтны-ми гpyппaми ДHK.

Q

Формирование ИПЭК и появление в растворе свободного поликатиона определяется по изменению наносекундной подвижности люминесцент-но меченого поликатиона, (данные рис. 3 получены для поликатиона ПДМАЭМ). Время релаксации поликатиона т возрастает от 20 до 70 нс при включении поликатиона в ИПЭК и постепенно уменьшается до значения, отвечающего свободному поликатиону, который обнаруживается в растворе после завершения формирования ИПЭК.

Появление поликатиона, не связанного с ДНК, следует также из того, что поликатион, добавленный к ИПЭК, и поликатион в воде в отсутствие ДНК одинаково взаимодействуют с анионом АНС. Как видно из рис. 3, АНС в обоих случаях имеет одинаковую интенсивность люминесценции, т.е. избыточное количество поликатиона, введенное в раствор ДНК после включения ее в ИПЭК, действительно не связывается с ДНК, а остается свободным и взаимодействует с анионом АНС.

Все наблюдаемые явления - формирование глобулярной структуры в макромолекулах ППМА или структурные изменения ДНК при введении в раствор низкомолекулярных или полимерных ионов могут быть вызваны, вероятно, как и при добавлении солей к раствору ПВК, изменением в структуре воды [1], которые, по-видимому, могут происходить или в объеме всего раствора (в случае неионогенного полимера), или в слое, примыкающем либо к фосфатным группам свободной ДНК (при введении М13+), либо к ИПЭК (при появлении свободного поликатиона).

Таким образом, формирование ИПЭК с поликатионом не приводит к вытеснению из ДНК в раствор интеркалированного в ДНК низкомолекулярного органического катиона. Это значит, что выход последнего происходит вследствие появления свободных (избыточных) поликатионов, а не в результате конкуренции поликатиона с низкомолекулярным катионом за взаимодействие с ДНК. Отсюда следует также, что изменение интенсивности люминесценции низкомолекулярного катиона, интеркалированого в ДНК, не может быть индикатором образования ИПЭК. Именно свободный поликатион может влиять на структуру воды и тем самым вызывать те изменения структуры ДНК, которые способствуют выходу в раствор низкомолекулярного органического

^ПДМАЭМ х !°4, моль/л

Рис. 3. Зависимость времени релаксации т макромолекул люминесцентно меченого ПДМАЭМ, от содержания этого полимера в водном растворе в присутствии ДНК (7) и зависимость интенсивности люминесценции АНС /АНС от содержания ПДМАЭМ в водном растворе в присутствии (2) и в отсутствие ДНК (3); СдНК = 0.07 мг/мл. Значение т в отсутствие ДНК равно 20 нс.

иона. Приведенные данные показывают, что не только неорганические ионы (солевые добавки) могут оказывать влияние на структуру воды и способствовать структурным превращениям макромолекул.

Из проведенного анализа становится понятным, что означают зависимости на рис. 4, на которых по мере добавления свободного поликатиона к раствору ДНК наблюдается переход от плавного изменения интенсивности люминесценции /люм низкомолекулярного катиона, интеркалированного в ДНК, при образовании ИПЭК к кооперативному изменению после образования ИПЭК. Кооперативный выход интеркалированного низкомолекулярного катиона после образования ИПЭК указывает на то, что изменение структуры ДНК, влияющее на интеркалирован-ный в ДНК низкомолекулярный катион, происходит не в процессе формировании ИПЭК, а после его завершения. При этом наблюдается кооперативное увеличение наносекундной подвижности или доли свободных органических катионов, характеризуемой величиной 9своб, и возрастание интенсивности люминесценции (рис. 5). Показано, что эти изменения не зависят от природы низкомолекулярного органического катиона (данные

/ отн 1 люм

9-

6-

3-

Т, нс 75

60

45

0.4 0.8 1.2

[Поликатион]:[ДНК]

Тлюм х 10

15

1-3

10

1 (б)  -----

\ \2

1 1 1 __  1 1

12 [Поликатион]:[ДНК]

Алюм, Т, нс, ^своб

300

200

100

0.8 1.2 [ПДМАЭМ]:[ДНК]

Рис. 5. Интенсивность люминесценции А/люм (1), время релаксации т, характеризующее подвижность ионов трипафлавина (2), и доля ионов три-пафлавина Эсвоб, перешедших из ДНК в раствор (3), в зависимости от соотношения [ПДМАЭМ] : [ДНК] для ДНК с интеркалированным низкомолекулярным органическим катионом трипафла-вином. Значения Эсвоб определяли из времен релаксации для свободного Тсвоб и связанного Тсвяз трипафлавина по соотношению всвоб/тсвоб + (1 -

' своб)/тсвяз 1/тнабл.

0

5

0

Рис. 4. Интенсивность люминесценции /люм низкомолекулярного органического катиона, ин-теркалированного в ДНК, в водном растворе ДНК (1, 2) и время релаксации макромолекул поликатиона Т (Г) в зависимости от содержания поликатиона. 1, V - ПДМАЭМ, 2 - поливинил-амин. а - трипафлавин, • - аурамин.

получены для всех низкомолекулярных катионов, представленных выше, и частично приведены на рис. 6) и определяются только строением поликатиона. В зависимости от химического строения поликатиона вытеснение из ДНК низкомолекулярного катиона происходит при разных значениях отношения N : Р, где N и Р - количество звеньев катиона и оснований ДНК в молях, например, для ПДМАЭМ и поливиниламина при значениях N : Р = 0.25 и 0.75 соответственно (рис. 4). При частичной замене катионных звеньев неионогенными путем включения незаряженных звеньев сомономера в полимерную цепь указанные величины остаются неизменными. Подобная картина наблюдается при изменении ММ поликатиона. Данные получены для ПДМАЭМ с М = 2.5 х 104 и 12 х 104.

Даже небольшое изменение химического строения катионного звена (при переходе от ДМАЭМ к ДЭАЭМ) отражается на значении N : Р, при котором начинается выход низкомолекулярных органических катионов из ДНК в раствор.

Влияющие на интеркаляцию низкомолекулярных органических катионов в ДНК ионы поливалентных металлов (рис. 2) одновременно вызывают, по данным работы [10], компактизацию ДНК, что позволяет связать структурные изменения ДНК, воздействующие на интеркаляцию низкомолекулярного катиона в системе поликатион-ДНК, с компактизацией ДНК, происходящей лишь после формирования ИПЭК, в результате изменений водного окружения ДНК, обусловленных добавлением свободного поликатиона.

Представленные результаты показывают, что внутримолекулярные взаимодействия в макромолекулах синтетических неионогенных полимеров и в макромолекулах ДНК высоко чувствительны к введению солевых добавок в водные растворы полимеров. Так, для ДНК содержание солей, влияющих на структуру ДНК, оказывается очень

1люм

100-

50-

0 +

1.2

[ПДМАЭМ]:[ДНК]

Рис. 6. Зависимости А/люм для ДНК с интеркали-рованным трипафлавином (7) и хлоридом ант-рилметиламина (2), а также /люм для ДНК с эти-дий бромидом (5) в водном растворе от соотношения [ПДМАЭМ] : [ДНК]. А/люм = /набл - /о, где /набл и /о - интенсивности люминесценции низкомолекулярного органического катиона при добавлении ПДМАЭМ и в отсутствие ДНК в растворе.

низким - один ион М13+ на десять фосфатных групп ДНК. Низкой оказывается и концентрация свободного поликатиона, действующего на структуру ДНК в ИПЭК. Она составляет, например, для ПДМАЭМ 0.4-0.8 от мольного содержания ДНК, т.е. (0.8-1.6) х 10-4 моль/л при содержании ДНК, равном 2 х 10-4 моль/л (0.07 мг/мл).

Авторы благодарят И.И. Гаврилову за предоставленный образец поливиниламина гидрохлорида.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Кирш Ю.Э. Поли-^винилпирролидон и другие по-ли^-виниламиды. М.: Наука, 1998.

2. Хиппелъ П., Шлейх Т. Структура и стабильность биологических макромолекул. М.: Мир, 1973. С. 320.

3. Zaslavsky B.Ya., Bagirov T.O., Borovskaya A.A., Gulae-va N.D., Miheeva I.M., Mahmudov A.U., Rodniko-va M.N. // Polymer. 1989. V. 30. P. 2103.

4. Anufrieva E.V., Gotlib YuYa. // Adv. Polym. Sci. 1981. V. 40. P. 1.

5. Arigita C, Zuidam N.J., Crommelin D.J.A., Hen-nink W.E. // Pharmaceut. Res. 1999. V. 16. < 10. P. 1534.

6. Howard K.A, Dash P.R, Read M.L., Ward K, Tomkins L.M, Nazarova O, Ulbrich K, Seymour L.W. // Biochim. Biophys. Acta. 2000. V. 1475. P. 245.

7. Ануфриева E.B., Кирпач A.B., Краковяк М.Г., Ананъева Т.Д., Лущик B.B. // Высокомолек. ^ед. А. 2001. Т. 43. < 7. C. 1127.

8. Ануфриева E.B., Кирпач A.B., Краковяк М.Г., Лущик B.B., Soutar J., Swanson L. // Высокомолек. гоед. А. 2000. Т. 42. < 10. C. 1704.

9. Ануфриева E.B., Ананъева Т.Д., Краковяк М.Г., Лущик B.B., Некрасова Т.Н., Смыслов Р.Ю., Шевелева T.B. // Высокомолек. соед. А. 2005. Т. 47. № 2. C. 332.

10. Касъяненко Н.А. Автореф. ... дис. д-ра физ-мат. наук. СПб.: СПбГУ, 2003.

Structural Transformations in Maeromoleeules of Synthetic Nonionogenie Polymers and DNA in Salt-Containing Aqueous Solutions

E. V. Anufrieva, M. G. Krakovyak, T. N. Nekrasova, R. Yu. Smyslov, O. V. Nazarova, and E. F. Panarin

Institute of Macromolecular Compounds, Russian Academy of Sciences, Bol'shoi pr. 31, St. Petersburg, 199004 Russia e-mail: polar@mail.macro.ru

Abstract—The influence of salt additives on structural transformations in macromolecules of synthetic polymers free of ionogenic groups and DNA molecules has been determined with the use of the nanosecond dynamics luminescent method. When polyvalent metal salts are added, a coil-globule transition is observed in macro-molecules of poly(N-n-propylmethacrylamide), while structural transformations occur in DNA macromolecules in aqueous solutions, which are accompanied by the passage of low-molecular-mass organic cations intercalated into DNA into solution. These transformations make themselves evident when polyvalent metal ions are added in an amount of one Mt3+ ion per ten phosphate groups of DNA. The same effect takes place when salts of polycations are added to solutions of DNA-polycation interpolyelectrolyte complexes.