ИММОБИЛИЗОВАННЫЙ БИОКАТАЛИЗАТОР ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ФУМАРОВОЙ КИСЛОТЫ
IMMOBILIZED BIOACATALYST FOR FUMARIC ACID PRODUCTION

Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к биокатализаторам в виде клеток мицелиальных грибов, иммобилизованных в матрицу нерастворимого носителя, продуцирующих фумаровую кислоту (ФК). Изобретение может быть использовано для микробиологического синтеза фумаровой кислоты, являющейся ценным продуктом для пищевой, фармацевтической и косметической промышленности, полупродуктом органического синтеза, исходным сырьем для синтеза биоразлагаемых полимеров.
Известен биокатализатор в виде свободных клеток мицелиальных грибов, способных синтезировать и секретировать ФК в среду их культивирования [Carol A. Roa Engel et al, Appl. Microbiol. Biotechnol. (2008) 78: 379-389, Enzyme and Microbial Technology (2011) 48: 39-47]. Накапливающаяся в среде фумаровая кислота способствует снижению pH среды культивирования до 3,0, что негативно влияет на жизнеспособность используемых в качестве биокатализатора клеток грибов и приводит к снижению продуктивности процесса.
Для биотехнологического получения органических кислот целесообразно использовать биокатализаторы, представляющие собой иммобилизованные клетки продуцентов, характеризующиеся повышенной стабильностью в средах с низким значением pH. Такой подход позволяет не только повысить устойчивость клеток к негативным воздействиям pH среды и высоких концентраций накапливающейся кислоты, но и повысить жизнеспособность клеток и, как следствие, продуктивность процесса. Кроме того, иммобилизация клеток позволяет значительно упростить стадию отделения биокатализатора от культуральной жидкости. Иммобилизованные биокатализаторы (ИБК) более привлекательны с экономической точки зрения за счет возможности их многократного использования, а также существенного сокращения объемов отработанной биомассы клеток-продуцентов, подлежащих утилизации после каждого рабочего цикла [RU 2253677 C2, опубл. 10.06.2005; RU 2383618 C1, опубл. 10.03.2010].
Rhizopus,
Известен ИБК на основе клеток мицелиальных грибов рода Rhizopus (R. arrhizus, R. nigricans и R. oryzae) и полиуретанового носителя, который способен трансформировать различные углеводсодержащие субстраты (моносахариды, отходы крахмалопаточного производства и другие углеводсодержащие продукты) в фумаровую кислоту [Helena Kautola, Yui-Yen Linko Production of fumaric acid with immobilized biocatalysts // Applied Biochemistry and Biotechnology Spring/Summer 1990, V. 24-25, Issue 1, pp 161-170, Podgorska, M. Kasprzak, D. Szwajgier Fumaric acid production by Rhizopus nigricans and Rhizopus oryzae using apple juice // Pol. J. Food Nutr. Sci. 2004, Vol. 13/54, No 1, pp. 47-50, Helena Kautola, Yu-Yen Linko Fumaric acid production from xylose by immobilized Rhizopus arrhizus cells // Applied Microbiology and Biotechnology October 1989, Volume 31, Issue 5-6, pp 448-452, M. Petrucciolia, E. Angianib, F. Federici Semi-continuous fumaric acid production by Rhizopus arrhizus immobilized in polyurethane sponge // Process Biochemistry Volume 31, Issue 5, June 1996, Pages 463-469, F. Federici, M. Petruccioli Fumaric acid production by Rhizopus arrhizus immobilized on polyurethane sponge // Progress in Biotechnology Volume 11, 1996, Pages 655-660, E.]. Иммобилизованный биокатализатор представляет собой клетки микроскопического гриба рода полученные в иммобилизованном состоянии методом адсорбции спор в матрицу полиуретанового носителя с последующим их прорастанием в поры носителя и формированием мицелия, пронизывающего носитель. Для получения биокатализатора в питательную среду вносят суспензию спор и частицы полиуретана в требуемом соотношении и проводят культивирование в среде формирования (роста) в течение 20 ч при 33°C. Полученный ИБК используют для получения фумаровой кислоты из различных сахаров (глюкозы, сахарозы, фруктозы, ксилозы, мальтозы, галактозы). При этом в ходе получения фумаровой кислоты необходима частичная нейтрализация pH среды, для чего изначально в среду вносят карбонат кальция.
Биокатализатор характеризуется следующими недостатками:
3
- низкая продуктивность единицы объема ИБК по целевому продукту, составляющая - 0,2÷0,5 г ФК/ч/дм ИБК, при этом за 1 рабочий цикл фумаровая кислота может быть накоплена в среде в концентрации 7÷18,5 г/л;
- относительно невысокая длительность эффективного использования - до 1230 часов при использовании питательных сред, содержащих ксилозу;
- низкие конечные концентрации фумаровой кислоты, накапливаемые в среде, что приводит к увеличению затрат на стадии выделения целевого продукта из раствора;
- использованный метод иммобилизации (сорбция спорового материала с последующим формированием мицелия на носителе) не гарантирует постоянство характеристик ИБК, поскольку сорбирующаяся для формирования активного мицелия концентрация спор на носителе не постоянна;
- нестабильность в кислой среде.
4
2
3
3
Наиболее близким к заявляемому изобретению является иммобилизованный биокатализатор для получения фумаровой кислоты на основе мицелиального гриба R. oryzae F - 1032(ВКПМ), описанный в работе [Сенько О.В. и др. «Ресурсосберегающая биотехнология получения фумаровой кислоты из возобновляемого растительного сырья». Вестник Кузбасского государственного технического университета, 2013, №1, с. 111-113]. Отмечается, что биокатализатор получен по методике, описанной в патенте РФ на изобретение №2253677, в соответствии с которой для наращивания спорового материала клетки гриба Rhizopus oryzae высевают на чашки Петри с агаризованной средой следующего состава: 20 г/л глюкозы, 200 г/л тертого картофеля, 0,2 г/л MgSO×HO, 0,2 г/л CaCO, 20 г/л агара (pH 6,5) и выращивают при 28°C в течение 48 ч. Проращивание иммобилизованного спорового материла - формирование готового биокатализатора в виде иммобилизованного грибного мицелия - проводят в среде, содержащей 100 г/л глюкозы, 10 г/л дрожжевого экстракта, 20 г/л CaCO, т.е. в условиях, которые обеспечивают повышение лактатдегидрогеназной активности биокатализатора, играющей основополагающую роль в целевом использовании биокатализатора для получения молочной, а не фумаровой кислоты. Как следствие, применение биокатализатора по прототипу позволяет получить относительно невысокие показатели его продуктивности по фумаровой кислоте и длительности эффективного использования: максимальный выход фумаровой кислоты составляет 0,35 г/г субстрата, а длительность применения биокатализатора составляет 480 часов.
Задачей настоящего изобретения является создание устойчивого в кислой среде, высокопродуктивного иммобилизованного биокатализатора для получения растворов фумаровой кислоты с высокой концентрацией целевого продукта, пригодного для длительного и многократного использования на различных средах, в том числе на гидролизатах, полученных из углеводсодержащего сырья, не имеющего пищевой ценности.
4
2
4
4
2
4
2
2
4
2
Поставленная задача решена иммобилизованным биокатализатором для получения фумаровой кислоты, представляющим собой клетки мицелиального гриба рода Rhizopus, способные продуцировать фумаровую кислоту, введенные исходно в виде спор в матрицу нерастворимого носителя и пророщенные для формирования мицелия, пронизывающего носитель, причем функцию нерастворимого носителя выполняет криогель поливинилового спирта, в который включены споры в процессе его формирования, отличающимся тем, что проращивание спор проводят в среде, содержащей (NH)SO (2,36 г/л), MgSO×7HO (0,2 г/л), ZnSO×7HO (0,07 г/л); KHPO×3HO (1,0 г/л), а сформированный в результате проращивания спор иммобилизованный биокатализатор имеет следующий состав, мас. %:
биомасса мицелия (сухой вес)
6,5÷16,3
поливиниловый спирт
2,1÷6,0
вода
до 100
Заявляемый ИБК обеспечивает получение технического результата, который, в сравнении с прототипом, состоит в увеличении максимального выхода фумаровой кислоты и увеличении максимального времени его эффективного использования. Применение заявляемого ИБК позволяет существенно расширить перечень субстратов, которые могут быть использованы для получения целевого продукта. В отличие от прототипа, получение фумаровой кислоты с помощью заявляемого ИБК не требует введения в среду каких-либо агентов, нейтрализующих pH.
Криогель поливинилового спирта (ПВС) обладает хорошими эксплуатационными характеристиками, а также высокой пористостью гелевой матрицы, обеспечивающей незатрудненную диффузию субстратов и продуктов [Лозинский В.И. Новое семейство макропористых и сверхмакропористых материалов биотехнологического назначения - полимерные криогели. // Известия РАН. Сер. Химическая, 2008, №5, с. 1-18]. Криогель ПВС химически стабилен при низких значениях pH в присутствии органических кислот, а также в присутствии возможных побочных продуктов распада природных полисахаридов и накапливающихся в среде микробных метаболитов. Известно его применение для получения биокатализаторов, предназначенных для получения этанола из пентоз [RU 2391402 С2, опубл. 10.06.2010] и молочной кислоты [RU 2253677 С2, опубл. 10.06.2005].
3
2
4
3
2
4
Принципиальную важность для возможности получения заявляемого технического результата имеет правильный подбор состава питательной среды для формирования иммобилизованного биокатализатора, обеспечивающий максимальное проявление требуемой биологической активности - способности продуцировать и выделять в среду фумаровую кислоту. Выбор состава используемых для получения катализатора сред основан на результатах проведенных авторами экспериментальных исследований, направленных на изучение структуры и свойств иммобилизованных биокатализаторов в зависимости от состава сред, использованных для их получения. Было обнаружено, что в присутствии таких неорганических солей, как карбонат кальция CaCO, хлорид натрия NaCl, однозамещенный фосфат калия KHPO, происходит коллапс криогеля поливинилового спирта, формируемого за счет слабых водородных связей между параллельно располагающимися в пространстве полимерными цепями. Криогель начинает сжиматься (коллапсирует), при этом происходят сужение пор и затруднение массообменных процессов, в результате чего затрудняется доступ кислорода к мицелию, формируемому в порах за счет прорастания спор, и, как следствие, аэробные условия переходят в микроаэрофильные, и далее - в анаэробные. В условиях недостатка кислорода клетки адаптируются и переключаются на другие метаболические пути, при этом вместо фумаровой кислоты в среде накапливаются метаболиты, характерные для анаэробных процессов - этанол, ацетат, молочная кислота. Нами выяснено, что именно процесс продуцирования фумаровой кислоты клетками мицелиальных грибов является очень сильно зависимым от концентрации кислорода в среде, а отсюда - и от размера пор носителя, в котором накапливается мицелий, продуцирующий фумаровую кислоту, а размер пор, в свою очередь, регулируется составом среды, и в частности, ее солевым составом. Таким образом, состав питательных сред, используемых для получения заявляемого биокатализатора, и, в первую очередь, солевой состав является неочевидным и существенно важным признаком, характеризующим биокатализатор через способ его получения, поскольку непосредственно влияет на состояние криогеля, от которого зависит возможность достижения продемонстрированных далее высоких показателей продуктивности биокатализатора, длительности его полезного использования и конечной концентрации фумаровой кислоты, получаемой за один цикл. Как видно из табл. 1 (фиг.1), в которой приведены примеры состава и условий получения заявляемого ИБК, ни в одном из примеров не использованы среды, содержащие в своем составе такие неорганические соли, как карбонат кальция CaCO, хлорид натрия NaCl, однозамещенный фосфат калия KHPO, которые, как правило, входят в состав питательных сред, используемых в биотехнологических процессах.
ИБК
ИБК
ИБК
Заявляемый иммобилизованный биокатализатор получают следующим образом. К водному раствору ПВС, содержащему заданную концентрацию полимера, добавляют суспензию спор с концентрацией, обеспечивающей при прорастании спор в объеме полимерной гранулы накопление необходимого количества биомассы иммобилизованного мицелия, способного активно продуцировать фумаровую кислоту. Полученную суспензию дозируют в емкости желаемой формы и проводят процедуру «замораживания-оттаивания», включающую замораживание полученной смеси при температуре от -11 до -21°C, выдерживание при этой температуре в течение 10÷20 часов и последующее размораживание. Формирование биокатализатора в виде активного иммобилизованного мицелия осуществляют путем культивирования гранул криогеля ПВС с включенными в него спорами на питательных средах, состав которых приведен в табл. 1 (фиг.1). Клетки вводят в формирующийся носитель в результате суспендирования спор в растворе ПВС с последующим формированием криогеля и проращиванием спор. Иммобилизация мицелиальных клеток в объеме криогеля ПВС приводит к их пространственному разобщению пористой структурой матрицы, что позволяет создать и удерживать в метаболически активном состоянии высокие концентрации клеток, распределенных и зафиксированных в носителе по объему реактора, и увеличить, таким образом, скорость накопления метаболитов в среде культивирования. Такое пространственное распределение клеток создает улучшенные условия для метаболизма, что обеспечивает увеличение выхода целевого продукта и сохранение высокой продуктивности процесса в течение длительного времени. Как будет показано далее на примерах, общая длительность эффективного использования биокатализатора, определяемая как период его полуинактивации ПП (т.е. время, за которое исходная средняя продуктивность биокатализатора П в данных условиях проведения процесса снижается на 50%), в зависимости от условий проведения процесса достигает 2100 часов. Степень конверсии субстрата с использованием биокатализатора, сформированного в оптимально подобранных условиях, достигает 0,425 гФК/г субстрата (см. табл. 2 (фиг.2), пример 8) при высоком значении показателя конечной концентрации фумаровой кислоты - 51 г/л. Таким образом, степень конверсии субстрата с использованием заявляемого ИБК почти на 18% превышает аналогичный показатель для катализатора по прототипу, а общая длительность его эффективного использования (ПП) превышает аналогичный показатель для биокатализатора по прототипу в 4,3 раза (см. табл. 2    (фиг.2), пример 10).
Количественные соотношения, в которых компоненты (мицелиальная биомасса и ПВС) входят в состав заявляемого иммобилизованного биокатализатора, найдены экспериментально. Содержание ПВС в составе ИБК варьируют изменением концентрации раствора полимера, используемого для приготовления суспензии спор. Выбор концентрации раствора ПВС обусловлен следующим: при содержании ПВС в иммобилизованном биокатализаторе менее 2,1 мас. % происходит формирование больших пор, через которые происходит вымывание спор из носителя, сопровождающееся снижением продуктивности ИБК и уменьшением его механической прочности. При повышении содержания ПВС в иммобилизованном биокатализаторе более 6,0 мас. % сильно повышается вязкость его исходных растворов в суспензии со спорами, что затрудняет равномерное диспергирование спор в среде. Размер образующихся пор заметно уменьшается, что приводит к ухудшению массообменных процессов внутри иммобилизованного биокатализатора и соответственно к снижению его продуктивности. Нижний предел концентрации биомассы мицелия (по сухим веществам) в заявляемом ИБК определяется тем, что при концентрации, меньшей чем 6,5 мас. %, получаемый ИБК обеспечивает недостаточно высокую продуктивность процесса по целевому продукту, а верхний предел концентрации биомассы определяется тем, что при накоплении мицелия в порах полимерной матрицы свыше 16,3 мас. % происходит закупорка пор клетками метаболически активного мицелия настолько, что ухудшаются массообменные условия для клеток, локализованных во внутренних частях гранул ИБК, и его продуктивность снижается.
Заявляемому иммобилизованному биокатализатору может быть придана любая удобная форма, в частности форма сферических гранул, частиц неправильной формы, гелевых блоков, листов и др. Для этого суспензию спор в растворе полимера либо замораживают в соответствующей форме, либо измельчают полученный криогель ПВС с включенными спорами до проращивания мицелия с помощью предназначенного для этих целей оборудования (экструдеры, грануляторы и т.п.). Возможность варьирования формы иммобилизованного биокатализатора технически и технологически упрощает его практическое применение и масштабирование.
Споровый материал для иммобилизованного биокатализатора получают с применением известных биотехнологических приемов культивирования мицелиальных грибов в соответствии с частными характеристиками используемых культур микроорганизмов. Для получения высококонцентрированных суспензий спор после накопления спор проводят их смыв с поверхности плотных питательных сред с использованием традиционных микробиологических методов, применяемых для получения суспензии спор в водных растворах, и смешивают их с раствором ПВС.
Rhizopus.
Заявляемый ИБК может быть получен с использованием различных мицелиальных грибов, являющихся продуцентами фумаровой кислоты и относящихся к роду
В табл.1(фиг.1) приведены примеры, показывающие некоторые конкретные варианты получения и состав заявляемого иммобилизованного биокатализатора. Данные табл.1(фиг.1), не исчерпывающие всех вариантов, подпадающих под формулу изобретения, показывают возможность получения заявляемого ИБК при использовании разных штаммов, при варьировании исходных концентраций раствора ПВС и суспензии спор, условий формирования иммобилизованного биокатализатора при условии сохранения заявленного солевого состава питательной среды. В результате проращивания спор ИБК, готовый к дальнейшему использованию, имеет следующий состав, мас. %:
биомасса мицелия микроскопического гриба (сухой вес)
6,5÷16,3
поливиниловый спирт
2,1÷6
водная фаза
до 100
Получение фумаровой кислоты с помощью заявляемого ИБК проводят в реакторах с питательными средами в аэробных условиях при температуре 24÷35°C при постоянном перемешивании. Контроль потребления субстрата и накопления метаболитов в среде осуществляют известными методами (хроматографическими и спектрофотометрическими) с использованием стандартного аналитического оборудования.
В табл.2(фиг.2) приведены конкретные примеры получения фумаровой кислоты с использованием заявляемого ИБК из широкого спектра субстратов, в том числе субстратов, не имеющих пищевой ценности, таких, как синтетические питательные среды, среды на основе целлюлозосодержащего сырья, биомассы фототрофных микроорганизмов и макроводорослей. Приведенные примеры, не охватывающие всех возможных вариантов применения заявляемого катализатора для получения фумаровой кислоты, включают использование различных вариантов заявляемого ИБК, приведенных в табл.1(фиг.1), а также показывают возможность получения фумаровой кислоты при варьировании исходных концентраций ИБК и субстрата в различных условиях проведения процесса.
Удобство отделения иммобилизованной биомассы от культуральной среды в сочетании со способностью сохранять высокую продуктивность в течение длительного времени позволяет использовать заявляемый ИБК многократно в длительном периодическом процессе. Для этого после завершения одного рабочего цикла культуральную жидкость, содержащую фумаровую кислоту, сливают через сетчатый фильтр, установленный в ферментере (далее ее используют для выделения конечного продукта), а в ферментер вносят свежую порцию среды, содержащей субстрат, и осуществляют следующий рабочий цикл с использованием того же иммобилизованного биокатализатора в тех же условиях. В таких периодических условиях определяют максимальное время эффективного использования (период полуинактивации) иммобилизованного биокатализатора. Соответствующие данные приведены в табл.2(фиг.2).
Как видно из табл.2(фиг.2) максимальное время эффективного использования заявляемого биокатализатора может достигать 2100 часов (пример 10), что значительно превышает аналогичную величину для катализатора по прототипу.