СПОСОБ КОНСЕРВИРОВАНИЯ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ Lactobacillus delbrueckii
METHOD FOR PRESERVATION OF LACTOBACILLUS DELBRUECKII Lactic acid bacteria

Изобретение относится к микробиологии, а именно к консервированию Lactobacillus delbrueckii - промышленного продуцента молочной кислоты, используемой в качестве пищевой добавки в различных пищевых и перерабатывающих технологиях.
Известен способ консервирования Fusarium moniliforme Pg-7, предусматривающий замораживание в среде с криопротекторами, при этом скорость замораживания в интервале от (15-20)°С до (-70)-(-90)°С составляет 1-2°С в мин, а в качестве криопротектора используют 1-3%-ный раствор сахарозы, или 1-5%-ный раствор диметилсульфоксида, или 1-3%-ный раствор глицерина (Пат. 1110799 SU, С 12N 1/00. Опубл. 30.08.1984). Недостатком данного способа является то, что он предусматривает консервирование мицелиальных клеток Fusarium moniliforme, не обеспечивая при этом повышение биосинтетической активности клеток.
Наиболее близким к заявляемому является способ консервирования молочнокислых бактерий замораживанием, предусматривающий получение суспензии бактерий в жидкой лактозосодержащей питательной среде, состоящей из молочной сыворотки, гидролизованного молока, лимоннокислого или уксуснокислого натрия со стимулятором роста, отделение бактерий от суспензии центрифугированием, смешивание полученной при этом биомассы с защитной средой, содержащей сахарозу и глицерин, и замораживание полученной смеси в жидком азоте (А.с. 457727 СССР, С12К 3/00. Опубл. 25.01.1975). Недостатком прототипа является то, что он предназначен для консервирования молочнокислых бактерий, культивируемых на лактозосодержащих питательных средах (молочной сыворотке, гидролизованном молоке), существенно отличающихся по физиологическим и биохимическим характеристикам от промышленного продуцента молочной кислоты - сахарозосбраживающих молочнокислых бактерий Lactobacillus delbrueckii. При этом способ по прототипу не обеспечивает повышение биосинтетической (кислотообразующей) активности бактерий. Кроме того, он предусматривает осуществление процесса консервирования замораживанием смеси биомассы с защитной средой, содержащей сахарозу и глицерин, в жидком азоте, что сопряжено с техническими трудностями.
Задача, на которую направлено предлагаемое изобретение, состоит в создании эффективного и практически доступного способа консервирования клеток промышленного продуцента молочной кислоты - молочнокислых бактерий Lactobacillus delbrueckii, культивируемых на сахарозосодержащих питательных средах (водных растворах сахара-песка).
Техническим результатом изобретения является повышение биосинтетической (кислотообразующей) активности молочнокислых бактерий Lactobacillus delbrueckii при консервировании. Технический результат достигается тем, что в способе консервирования молочнокислых бактерий Lactobacillus delbrueckii, предусматривающем получение суспензии бактерий в жидкой питательной среде, отделение бактерий от суспензии центрифугированием, получая при этом биомассу, смешивание полученной биомассы с защитной средой, содержащей сахарозу и глицерин, и замораживание полученной смеси. При получении суспензии бактерий используют жидкую питательную среду, состоящую из сахарозы, солодовых ростков и мела, причем указанные компоненты берут в следующем соотношении мас.%: (10-12) - сахароза, (3-5) - солодовые ростки и (4-6) - мел, смесь биомассы с защитной средой перед замораживанием охлаждают при температуре 4-6°С, выдерживают при данной температуре в течение 1 ч, после чего замораживают при температуре (-18)-(-20)°С.
Используемые в предлагаемом способе приготовления смеси биомассы молочнокислых бактерий и защитной среды установленного качественного и количественного состава, предварительное охлаждение смеси биомассы с защитной средой до заданной температуры и выдерживание ее при данной температуре в течение определенного времени позволяют получить биомассу с оптимизированной плотностью популяции молочнокислых бактерий, находящихся в стационарной фазе роста, избежать резких осмотических и температурных градиентов, создать условия для максимальной дегидратации клеток до начала фазового перехода вода-лед и, таким образом, предотвратить внутриклеточное льдообразование. В совокупности это обусловливает повышение резистентности клеток продуцента к повреждающим факторам как при замораживании, так и при хранении в замороженном состоянии и способствует сохранению их морфологических признаков, физиологических характеристик, биохимической активности и генетической стабильности.
Компоненты жидкой питательной среды (сахароза, сухие солодовые ростки, мел) известны как вещества, используемые при культивировании молочнокислых бактерий; компоненты защитной среды (сахароза, глицерин) также известны как вещества, используемые в качестве криопротекторов при консервировании микроорганизмов замораживанием. Вместе с тем обнаружено, что совокупность оптимизированного количественного состава жидкой питательной среды и предварительного охлаждения смеси биомассы с защитной средой до заданной температуры и выдерживания ее при данной температуре в течение определенного времени обеспечивает неожиданный положительный эффект - повышение биосинтетической (кислотообразующей) активности молочнокислых бактерий Lactobacillus delbrueckii и, соответственно, повышение эффективности способа их консервирования. Кроме того, упрощение способа по сравнению с прототипом даст возможность использовать при консервировании бытовые холодильные камеры.
Способ осуществляют следующим образом.
9
3
Суспензию молочнокислых бактерий Lactobacillus delbrueckii B-8744 (Пат. 2283345 РФ, С12Р 7/56, опубл. 10.09.2006) - промышленного продуцента молочной кислоты получали культивированием в стерилизованной водной питательной среде, содержащей сахарозу (сахар-песок) в количестве (10-12)%, солодовые ростки (стимулятор роста) - (3-5)% и мел (нейтрализующий агент) - (4-6)%, в термостате при температуре (49-51)°С. При достижении стационарной фазы роста клеток молочнокислых бактерий и оптимальной плотности их популяции (1-3)×10 клеток в 1 см суспензию бактерий в жидкой питательной среде центрифугируют, после чего осадок, содержащий биомассу, смешивают с защитной средой, включающей 10%-ный водный раствор сахарозы (сахара-песка) и 10%-ный водный раствор глицерина. Полученную смесь биомассы с защитной средой помещают в стерильные криопробирки, охлаждают при температуре 4-6°С и выдерживают при данной температуре в течение 1 ч, затем замораживают при температуре (-18)-(-20)°С и хранят при данной температуре.
Оценку биосинтетической (кислотообразующей) активности молочнокислых бактерий Lactobacillus delbrueckii B-8744 проводили после активирования продуцента размораживанием при температуре (39-41)°С в течение 1 мин.
Способ поясняется следующими примерами, иллюстрирующими способ консервирования и хранения молочнокислых бактерий Lactobacillus delbrueckii в смеси биомассы и защитной среды.
Пример 1.
3
9
3
9
3
В стерильную колбу вместимостью 2 дм вносили стерилизованные компоненты жидкой питательной среды: 1400 г водного раствора, содержащего 1022 г воды, 140 г сахара-песка, 42 г сухих солодовых ростков, 56 г природного молотого мела и 140 г культуры молочнокислых бактерий Lactobacillus delbrueckii B-8744 плотностью популяции 2,4×10 клеток в 1 см, культивировали в термостате при температуре (49-51)°С в течение 24 ч. Полученную суспензию бактерий в жидкой питательной среде с плотностью популяции 2,6×10 клеток в 1 см в стационарной фазе роста центрифугировали. Осадок, полученный после центрифугирования, содержащий биомассу в количестве 6,7 г, смешивали с защитной средой, включающей 10%-ный водный раствор сахарозы (сахара-песка) в количестве 6,7 г и 10%-ный водный раствор глицерина в количестве 13,4 г. Полученную смесь биомассы с защитной средой помещают в стерильные криопробирки (52 образца), охлаждают при температуре 4-6°С и выдерживают при данной температуре в течение 1 ч, затем замораживают при температуре (-18)-(-20)°С и хранят при данной температуре.
Характеристика биосинтетической (кислотообразующей) активности активированных молочнокислых бактерий Lactobacillus delbrueckii B-8744 после замораживания и хранения смеси биомассы и защитной среды, полученной по примеру 1, в течение 12 мес. приведена в таблице.
Пример 2.
3
9
9
3
В стерильную колбу вместимостью 2 дм вносили стерилизованные компоненты жидкой питательной среды: 1400 г водного раствора, содержащего 980 г воды, 154 г сахара-песка, 56 г сухих солодовых ростков, 70 г природного молотого мела и 140 г культуры молочнокислых бактерий Lactobacillus delbrueckii B-8744 плотностью популяции 2,0×10 клеток в 1 см, культивировали в термостате при температуре (49-51)°С в течение 24 ч. Полученную суспензию бактерий в жидкой питательной среде с плотностью популяции 1,6×10 клеток в 1 см в стационарной фазе роста центрифугировали. Осадок, полученный после центрифугирования, содержащий биомассу в количестве 6,5 г, смешивали с защитной средой, включающей 10%-ный водный раствор сахарозы (сахара-песка) в количестве 6,5 г и 10%-ный водный раствор глицерина в количестве 13,0 г. Полученную смесь биомассы с защитной средой помещают в стерильные криопробирки (52 образца), охлаждают при температуре 4-6°С и выдерживают при данной температуре в течение 1 ч, затем замораживают при температуре (-18)-(-20)°С и хранят при данной температуре.
Характеристика биосинтетической (кислотообразующей) активности активированных молочнокислых бактерий Lactobacillus delbrueckii B-8744 после замораживания и хранения смеси биомассы и защитной среды, полученной по примеру 2, в течение 12 мес. приведена в таблице.
Пример 3.
3
9
3
9
3
В стерильную колбу вместимостью 2 дм вносили стерилизованные компоненты жидкой питательной среды: 1400 г водного раствора, содержащего 938 г воды, 168 г сахара-песка, 70 г сухих солодовых ростков, 84 г природного молотого мела и 140 г культуры молочнокислых бактерий Lactobacillus delbrueckii B-8744 плотностью популяции 3,0×10 клеток в 1 см, культивировали в термостате при температуре (49-51)°С в течение 24 ч. Полученную суспензию бактерий в жидкой питательной среде с плотностью популяции 2,7×10 клеток в 1 см в стационарной фазе роста центрифугировали. Осадок, полученный после центрифугирования, содержащий биомассу в количестве 6,8 г смешивали с защитной средой, включающей 10%-ный водный раствор сахарозы (сахара-песка) в количестве 6,8 г и 10%-ный водный раствор глицерина, в количестве 13,6 г. Полученную смесь биомассы с защитной средой помещают в стерильные криопробирки (52 образца), охлаждают при температуре 4-6°С и выдерживают при данной температуре в течение 1 ч, затем замораживают при температуре (-18)-(-20)°С и хранят при данной температуре.
Характеристика биосинтетической (кислотообразующей) активности активированных молочнокислых бактерий Lactobacillus delbrueckii B-8744 после замораживания и хранения смеси биомассы и защитной среды, полученной по примеру 3, в течение 12 мес. приведена в таблице.
Выводы.
Как видно из таблицы, предлагаемый способ обеспечивает повышение биосинтетической (кислотообразующей) активности молочнокислых бактерий Lactobacillus delbrueckii при консервировании замораживанием и последующем хранении. Преимуществом предлагаемого способа является также то, что при его осуществлении используются бытовые холодильные камеры.
Таблица
Характеристика биосинтетической (кислотообразующей) активности активированных молочнокислых бактерий Lactobacillus delbrueckii B-8744 после замораживания и хранения смеси биомассы и защитной среды в течение 12 мес.
Наименование показателя
Значение показателя
Контроль (замораживание без криопротектора)
Пример 1
Пример 2
Пример 3
Продуктивность молочнокислых бактерий, г/дм<sup>3</sup>×ч, в расчете на молочную кислоту
1,15
1,46
1,46
1,45
Скорость сбраживания сахара, г/дм<sup>3</sup>×ч
1,47
1,56
1,55
1,53
Коэффициент биоконверсии сахара в молочную кислоту
0,782
0,950
0,949
0,951