УЛУЧШЕННЫЙ РАЗБАВИТЕЛЬ ДЛЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ КЛЕТОЧНО-АССОЦИИРОВАННОГО АЛЬФАГЕРПЕСВИРУСА
IMPROVED DILUENT FOR VACCINE AGAINST CELL-ASSOCIATED ALPHA-HERPESVIRUS

Настоящее изобретение относится к области вакцинологии, более конкретно, настоящее изобретение относится к применению разбавителя для стабилизации клеток, инфицированных клеточно-ассоциированным альфагерпесвирусом, в процессе использования, кроме того, настоящее изобретение относится к способу указанной стабилизации в процессе использования, к вакцине против клеточно-ассоциированного альфагерпесвируса и способу получения указанной вакцины.
Альфагерпесвирусы являются важными патогенными микроорганизмами для людей и почти всех видов животных на Земле, а также для видов животных, имеющих отношение к коммерческому сельскому хозяйству. Методом выбора для обеспечения дешевой и эффективной защиты от инфекций и болезней является вакцинация. Например, в коммерческих птицеводческих хозяйствах обычной практикой является вакцинация птиц от болезни Марека и инфекционного ларинготрахеита, которые являются очень важными заболеваниями в птицеводстве с точки зрения здоровья животных и экономической эффективности работы. Подробности описаны, например, в справочниках, таких как: «The Merck veterinary manual» (2010, 10th ed., 2010, C.M. Kahn edt., ISBN: 091191093X), и: «Disease of poultry» (2008, 12th ed., Y. Saif ed., Iowa State Univ. press, ISBN-10: 0813807182).
Iltovirus
alphaherpesvirinae
Птичий ларинготрахеит представляет собой респираторное заболевание домашней птицы, вызываемое вирусом инфекционного ларинготрахеита (ILTV), также известным как герпесвирус куриных 1 или птичий герпесвирус 1. ILTV относится к роду  в подсемействе . Инфекция вызывает дыхательную недостаточность, сопровождающуюся удушьем и выделением кровянистого экссудата. Инфекция ILTV быстро распространяется и может поражать до 100% инфицированного стада. Заболевание может вызвать снижение яйценоскости, потерю массы тела, повышенную чувствительность к вторичной инфекции и даже общую смертность. Для ILTV существуют живые ослабленные вакцины, но они несут потенциальную опасность остаточной вирулентности или возврата к вирулентности. Недавно были описаны векторные вакцины, такие как Innovax™-ILT, см. ниже.
Mardivirus
alphaherpesvirinae
Болезнь Марека является высокоинфекционным заболеванием домашней птицы и встречается во всем мире. Типичными признаками заболевания являются Т-клеточные лимфомы в нескольких органах и нервах. Это может приводить к различным симптомам, в том числе к параличу и смерти, а также к потере яичной продуктивности и выбраковке на убой. Болезнь Марека вызывается вирусом болезни Марека (MDV), который принадлежит к роду  в подсемействе .
MDV были классифицированы на основе биологических и серологических свойств по трем основным серотипам: MDV серотипа 1 (MDV1), также известный как герпесвирус куриных 2, является основной причиной болезни Марека, так как он онкогенен для домашней птицы, и были описаны различные патотипы от умеренного до очень вирулентного. Были получены аттенуированные штаммы MDV1, которые используются в ослабленных живых вирусных вакцинах, примерами штаммов MDV1 являются штаммы RB1B, 814 и CVI-988 Rispens (Cui et al., 2013, PLoS One, vol. 8: e53340), например, как в Nobilis™ Rismavac (MSD Animal Health).
MDV серотипа 2 (MDV2), также известный как герпесвирус куриных 3, имеет небольшую патогенность для домашней птицы. Были получены штаммы для живых вакцин, например на основе штамма SB1 (Petherbridge et al., 2009, J. Virol. Meth., vol. 158, p. 11), например, как в Nobilis™ Marexine SB1 (MSD Animal Health).
Наконец, MDV серотипа 3 также известен как герпесвирус индюшачьих 1, но обычно именуется герпесвирусом индеек (HVT). HVT впервые был описан в 1970 г. (Witter et al., 1970, Am. J. Vet. Res., vol. 31, p. 525) и является непатогенным. Интересно, однако, что вакцинация HVT обеспечивает перекрестный защитный иммунитет против MDV серотипов 1 и 2, что делает этот вирус естественным образом пригодным в качестве основы для живой вакцины против MDV1 и 2. В результате вакцинации HVT в настоящее время подвергаются почти все новорожденные цыплята в сельском хозяйстве, что приводит к тому, что во всем мире ежегодно вводится до 5 миллиардов доз вакцины HVT.
Вакцины HVT обычно основаны на штаммах, таких как PB1 или FC-126, например, как в Nobilis™ Marexine CA126 (MSD Animal Health).
Когда требуется защита от высоковирулентных вариантов MDV, могут использоваться комбинированные вакцины, состоящие из вакцины HVT и вакцинных штаммов MDV1 или MDV2.
Вакцины против MDV описаны, например, в монографии Европейской фармакопеи 0589 от апреля 2013 года.
HVT и MDV реплицируются в лимфоцитах периферической крови птицы и вызывают продолжительный иммунный ответ. Это свойство также применяют при использовании MDV или HVT в качестве вирусной векторной вакцины для экспрессии и доставки домашней птице различных иммуногенных белков от других птичьих патогенов, см., например, Международные патентные заявки WO87/04463 и WO2013/082317. На протяжении многих лет в этих векторах были экспрессированы многие гетерологичные гены, такие как ген белка слияния (F-ген) вируса болезни Ньюкасла (NDV) (Sondermeijer et al., 1993, Vaccine, vol. 11, p. 349-358); ген вирусного белка 2 (VP2) вируса инфекционного бурсита (IBDV) (Darteil et al., 1995, Virology, vol. 211, p. 481-490); гены белка гликопротеина D и I (gD/gI) ILTV; и ген Ea1a поверхностного антигена паразита эймерия (Cronenberg et al., 1999, Acta Virol., vol. 43, p. 192-197).
Это привело к появлению множества коммерческих продуктов на основе векторных вакцин HVT, например: с геном F NDV: Innovax™ ND и Vectormune™ HVT-NDV (Ceva); с геном VP2 IBDV: Vaxxitek™ HVT+IBD (Merial; более ранее наименование: Gallivac™ HVT-IBD) и Vectormune™ HVT-IBD (Ceva); и с генами gD/gI ILTV в Innovax™ LT. Все вакцины Innovax от компании MSD Animal Health.
Возможны даже множественные вставки гетерологичных генов в HVT, например, генов NDV-F и IBDV-VP2, как в Innovax™ ND-IBD. Также векторные вакцины HVT могут, в свою очередь, комбинироваться с классическими вакцинными штаммами MDV серотипа 1 или 2, так как в препарате Innovax™ ND-SB.
Альтернативно, вектор HVT может быть использован для экспрессии и доставки терапевтического белка, например, цитокина, для управления иммунным ответом у кур (Международная патентная заявка WO2009/156.367; и Tarpey et al., 2007, Vaccine, vol. 25, p. 8529-8535).
in
vivo
Некоторые альфагерпесвирусы являются в некоторой степени клеточно-ассоциированными вирусами; примерами являются вирус ветряной оспы, ILTV, MDV и HVT. Такие вирусы не (полностью) лизируют свою клетку-хозяина после завершения своей репликации. Следовательно, этот тип вируса распространяется внутри зараженного животного-хозяина через межклеточный контакт. Распространение на других животных происходит путем передачи зараженных клеток; например, для MDV и HVT это означает, что вирусная инфекция  распространяется посредством вдыхания инфицированных клеток кожи, которые выделяются из фолликулов перьев инфицированных птиц.
in ovo
Новорожденные цыплята сталкиваются с инфекционным давлением MDV с первого дня жизни. К счастью, вакцины HVT и векторные вакцины HVT могут использоваться у цыплят в очень раннем возрасте, поскольку они безопасны и (когда являются клеточно-ассоциированными) относительно нечувствительны к антителам, полученным из материнского организма. Таким образом, вакцины HVT вводят цыплятам в день их вылупления из яйца (день первый) или даже до вылупления, пока они еще находятся в яйце. Этот последний подход, так называемая «вакцинация », является формой вакцинации эмбрионов, которая (для цыплят) обычно применяется на 18-й день эмбрионального развития (ЭР), приблизительно за 3 дня до вылупления. Этот тип вакцинации в настоящее время обычно проводится с использованием автоматизированного оборудования.
Первые вакцины HVT были разработаны в конце 1960-х годов. Исторический обзор предоставлен Schat (2016, Avian Dis., vol. 60, p. 715-724). Первоначально основное внимание уделялось разработке бесклеточных лиофилизированных вакцин. В этом типе вакцины бесклеточный HVT готовили и стабилизировали в буфере, называемом SPGA, по первым буквам названий входящих в него питательных веществ сахароза, фосфат, глутамат и альбумин (Calnek et al., 1970, Appl. Microbiol., vol. 20, p. 723-726). SPGA содержит: сахарозу: 218 мМ (74,6 мг/мл); монокалийфосфат: 3,8 мМ (0,52 мг/мл); дикалийфосфат: 7,2 мМ (1,26 мг/мл); глутамат натрия: 4,9 мМ; и 1% масса/объем бычьего альбумина в воде высокой степени чистоты. Другими вариантами SPGA были добавление 0,2% масса/объем натриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и/или замена 1% БСА белковым гидролизатом в той же концентрации. Альтернативно БСА может быть заменен желатином или поливинилпирролидоном. Даже простые сахарозофосфатные буферы были описаны для восстановления лиофилизированных вакцин HVT.
Однако быстро стало понято, что эффективность лиофилизированных вакцин против MDV была не такой хорошей, как для клеточно-ассоциированных вакцин. Однако такая вакцина требует гораздо более сложных мер предосторожности для стабилизации не только вируса, но и инфицированной клетки-хозяина, таких как хранение суспензии инфицированных клеток-хозяев в жидком азоте и восстановление в обогащенной среде, чтобы обеспечить восстановление здоровья клетки после оттаивания. Это, например, описано в: Zanella & Granelli (1974, Avian Pathol., vol. 3, p. 45-50), и: Damm (1974, Bull. Parent. Drug Assoc., vol. 28, p. 98-102). Также Colwell et al. (1975, Avian Dis., vol. 19, p. 781-790) сравнили ряд коммерческих разбавителей для клеточно-ассоциированных вакцин против MDV, но подробное описание их состава не приводятся. Сравнение проводилось относительно TPB (триптозофосфатного бульона), который содержит декстрозу, соль, фосфат и 2% раствор (масса/объем) триптозы, которая представляет собой пептон (смесь аминокислот и пептидов) казеина бычьего молока, полученный ферментативным гидролизом при помощи панкреатических ферментов.
В работе Geerligs & Hoogendam (2007, Avian Disease, vol. 51, p. 969-973) описано исследование условий оттаивания и разбавления клеточно-ассоциированной вакцины MDV1 штамма CVI-988. Используемые разбавители представляют собой SPGA/ЭДТА или коммерческий разбавитель вакцины Poulvac™ Marek (Zoetis). В «Инструкции по применению лекарственного препарата» (ИПЛП) Poulvac Marek состав этого разбавителя описан следующим образом: сахароза: 51,2 мг/мл (150 мМ); монокалия дигидрофосфат: 0,52 мг/мл (3,8 мМ); дикалия моногидрофосфат: 1,26 мг/мл (7,2 мМ); N-Z-амин: 15 мг/мл (1,5% масса/объем); и индикатор значения pH.
Аналогичным образом, в ИПЛП разбавителя для вакцин Nobilis™: Nobilis™ Разбавитель CA его компоненты описаны как: «сахароза, панкреатический гидролизат казеина, одноосновный фосфат калия», а также он включает в себя индикатор значения pH. В этом разбавителе концентрация пептона составляет 1,4% (масса/объем).
С середины 1970-х годов вакцинация клеточно-ассоциированными вакцинами MDV и HVT стала стандартом в птицеводстве. Даже несмотря на то, что получение клеточно-ассоциированных вирусов MDV, HVT и векторов на основе HVT и доставка многих миллионов доз этих вакцин являются весьма сложными задачами, поскольку все процессы должны быть оптимальными как для клеток-хозяев, так и для вакцинного вируса. Основными проблемами являются ограниченная доступность подходящих клеток-хозяев и относительная нестабильность вируса.
in vitro
Что касается клеток-хозяев, то пролиферация вирусов ILTV, MDV и HVT ограничивается клетками птиц. Для этого типа существует только несколько стабильных клеточных линий, доступных для культивирования , и очень немного тех, на которых эти вирусы достигают высоких титров. Поэтому культивирование обычно проводится на свежеприготовленных первичных клетках; например, свежие фибробласты куриных эмбрионов (CEF) готовятся каждые несколько дней, из 10-дневных куриных эмбрионов с использованием переваривания трипсином. Наряду с трудоемкостью процесса, на качество первичных клеток может также влиять различия между партиями эмбрионов. Многообещающей разработкой в этом отношении является создание рекомбинантно иммортализованной линии CEF, как описано в Международной патентной заявке WO2016/087560.
Что касается стабильности, то клеточно-ассоциированная природа этих вирусов является критическим фактором, из-за которому выживаемость вируса в значительной степени зависит от жизнеспособности клеток-хозяев. В то время как ILTV может быть легко получен как бесклеточный вирус, к HVT и MDV это относится в (намного) меньшей степени, и они (намного) более стабильны, когда находятся внутри клетки-хозяина. Таким образом, хотя существуют бесклеточные лиофилизированные вакцины MDV и HVT, основная масса коммерческих вакцин MDV и HVT, а также векторных вакцин на основе HVT производится в виде концентрированной суспензии инфицированных вирусом клеток, упакованной в герметичные стеклянные ампулы, которые замораживаются и хранятся в жидком азоте. Впоследствии «холодная цепь» поддерживается путем отправки вакцин в контейнерах с жидким азотом конечным потребителям по всему миру. Понятно, что это очень сложно с логистической точки зрения.
Неправильное хранение или обращение с клеточно-ассоциированными вакцинами может привести к потере титра вакцинного вируса, что приведет к тому, что мишени не получат полную дозу, что приведет к снижению эффективности защиты. Чтобы стабилизировать инфицированные вирусом клетки-хозяева, их замораживают в криопротективной среде, обычно содержащей сыворотку крови (теленка) и ДМСО. Непосредственно перед использованием вакцины быстро оттаивают и разводят до нужного титра на дозу. Как правило, это делается путем разведения суспензии инфицированных клеток в разбавителе, который может поставляться вместе с вакциной, в соотношении 1:25-1:100. Разбавитель обеспечивает стабильность при использовании в течение времени, необходимого для введения вакцины группе целевых животных, обычно 1-2 часа.
Учитывая огромное количество доз, требуемых каждый год для вакцинации против болезни Марека и инфекционного ларинготрахеита, и особенно в связи со сложным производством и логистикой этих вакцин, крайне желательно извлечь как можно больше из их вирусного титра при доставке целевому животному, нуждающемуся в такой вакцинации. Обычно восстановление в стандартном разбавителе уменьшает потерю титра до 0,4-0,6 log10 бляшкообразующих единиц, (БОЕ)/мл, в течение периода использования, равного 2 часам, при комнатной температуре. Однако для некоторых векторных вакцин HVT иногда наблюдались более высокие потери вирусного титра; эти потери затем компенсировались путем обеспечения более высокого начального титра.
Таким образом, целью настоящего изобретения является преодоление недостатков предшествующего уровня техники и удовлетворение этой потребности в данной области техники путем разработки способов и средств для улучшения разбавителя, используемого для восстановления вакцин против клеточно-ассоциированных альфагерпесвирусов.
Неожиданно было обнаружено, что эта цель может быть достигнута, и следовательно, один или несколько недостатков предшествующего уровня техники могут быть преодолены путем использования модифицированного разбавителя для клеток, инфицированных клеточно-ассоциированным альфагерпесвирусом. В улучшенном разбавителе содержится значительно меньше белкового ингредиента по сравнению с разбавителями, обычно используемыми для этой цели в данной области техники.
Использование этого разбавителя обеспечивает улучшенную стабильность в процессе использования, благодаря чему потеря титра даже самого чувствительного клеточно-ассоциированного альфагерпесвируса в разведении после оттаивания теперь может быть уменьшена до 0,4 log10 БОЕ/мл или менее в течение 4 часов при комнатной температуре после восстановления вакцины. Это полезное уменьшение потери титра имеет огромное экономическое значение для этого сектора промышленности.
Это было неожиданно, поскольку в течение более 40 лет обычной практикой было использование больших количеств белкового вещества в разбавителе для вакцин против клеточно-ассоциированных альфагерпесвирусов, таких как MDV или HVT, обычно с 1,4-1,5% (масса/объем) белка в современных коммерческих разбавителях.
Тем не менее, авторы настоящего изобретения обнаружили, что концентрация белка в разбавителе может быть значительно снижена до уровня ниже 0,5% (масса/объем) и даже до нуля, обеспечивая при этом превосходную стабильность в процессе использования.
Настоящее изобретение позволяет более полно использовать представленный вирус в вакцине против альфагерпесвирусов, или, в качестве альтернативы, оно позволяет использовать для компенсации потерь меньший избыток вируса.
Наиболее значительные преимущества достигаются в том случае, если улучшенный разбавитель совсем не содержит белка. Это приводит к снижению затрат, так как гидролизат белка является относительно дорогим ингредиентом; повышению безопасности, так как снижается риск введения посторонних агентов; повышению эффективности производства, так как исчезает необходимость очищать производственную линию после каждого производственного цикла; и повышению стабильности производства, так как новый разбавитель больше не содержит плохо определяемых химических соединений с непостоянным составом, что обеспечивает значительно улучшенную контролируемость качества ингредиентов и воспроизводимость конечного продукта. Кроме того, разбавитель, не содержащий белков, является разбавителем, «не содержащим животных компонентов», а также разбавителем «с определенным химическим составом», что является важным аспектом безопасности и стабильности. Также все ингредиенты разбавителя можно стерилизовать.
Точно не известно, как или почему содержание белка в разбавителе может быть настолько сильно снижено, без влияния на его стабилизирующие свойства. Хотя авторы настоящего изобретения не ограничивают себя какой-либо теорией или моделью, которая могла бы объяснить этот результат, они предполагают, что, возможно, обычно используемый белковый компонент на самом деле никогда не производил однозначно полезного эффекта, а скорее вводил разнообразные отрицательные эффекты, например, влиял на значение рН разбавителя. С уменьшением или даже устранением таких мешающих эффектов буферный раствор с сахаром может обеспечить эффективную стабилизацию инфицированных вирусом клеток в течение периода использования.
Таким образом, в одном аспекте настоящее изобретение относится к применению разбавителя для стабилизации в процессе использования клеток, инфицированных клеточно-ассоциированным альфагерпесвирусом, отличающемуся тем, что разбавитель содержит сахар, фосфатный буфер и не более приблизительно 0,7% (масса/объем) белка.
Применение разбавителя в соответствии с настоящим изобретением служит для восстановления инфицированных вирусом клеток после их извлечения из хранения в замороженном состоянии. Разбавитель способствует восстановлению здоровья инфицированных клеток и поддерживает это здоровье в течение нескольких часов при комнатной температуре. Затем восстановленные инфицированные клетки в разбавителе могут быть введены человеку или целевым животным, нуждающимся в таком лечении.
Термин «в процессе использования» относятся к его общему значению, используемому в нескольких нормативных руководствах, таких как Европейская фармакопея и раздел 9 Кодекса Федеральных Правил США, для обозначения требований по стабильности в использовании и сроку годности в использовании.
Для настоящего изобретения периодом процесса использования является период, в течение которого клетки, инфицированные клеточно-ассоциированным альфагерпесвирусом, находятся в разбавителе настоящего изобретения. Этот период начинается после смешивания инфицированных клеток (обычно из оттаявшей клеточной суспензии) и разбавителя и заканчивается введением инфицированных клеток в разбавителе в целевой организм.
«Разбавитель» для применения в соответствии с настоящим изобретением представляет собой водную жидкость. Поскольку разбавитель предназначен для введения людям или животным, его необходимо готовить в соответствии с надлежащими стандартами фармацевтического производства, например, чтобы он был стерильным и практически не содержал пирогенов.
Вирус является «клеточно-ассоциированным», если он остается в большей или меньшей степени в своей клетке-хозяине после завершения цикла репликации. Примерами клеточно-ассоциированных альфагерпесвирусов являются вирус ветряной оспы, ILTV, MDV и HVT.
Используемый в настоящем изобретении термин «сахар» относится к любому химическому соединению из группы водорастворимых углеводов с относительно низкой молекулярной массой, которые обычно имеют сладкий вкус. Термин «сахар» включает в себя восстанавливающие сахара (такие как фруктоза и мальтоза), невосстанавливающие сахара (такие как сахароза и трегалоза), сахарные спирты (такие как ксилит и сорбит), сахарные кислоты (такие как глюконовая кислота и винная кислота) и их смеси. Термин «сахар» также охватывает моно-, ди- или полисахариды вплоть до гексасахаридов включительно.
Используемый здесь термин «содержит» (а также его варианты, такие как «содержат», «содержащий» и «содержащийся»), предназначен для обозначения всех элементов и в любой возможной комбинации, возможной для настоящего изобретения, которые охватываются или включены в текстовый раздел, абзац, пункт формулы изобретения и т. д., где используется этот термин, даже если такие элементы или комбинации не указаны явно, и не исключая любой из таких элементов или комбинаций.
Таким образом, любой такой текстовый раздел, абзац, пункт формулы изобретения и т. д., следовательно, также может относиться к одному или нескольким вариантам осуществления изобретения, в которых термин «содержит» (или его варианты) заменен такими терминами, как «состоит из», «состоящий из» или «состоит практически из».
Термин «белок» относится к молекуле, имеющей 2 или более аминокислот. Белок может быть нативным или зрелым белком, пре- или про-белком или частью белка. Среди прочего в определение белка включены пептиды, олигопептиды и полипептиды. Для настоящего изобретения белок может быть чистым, очищенным или выделенным белком или может быть более или менее неочищенным препаратом, содержащим два или более разных белков разных типов и размеров. Примерами неочищенного белкового препарата являются белковые экстракты или продукты ферментативного расщепления или гидролизаты источника белка. Источник белка может быть животного или растительного происхождения. Примерами распространенных источников белка для приготовления экстрактов являются казеин коровьего молока, шкуры животных, мясо или ткани животных, дрожжи и соя.
Для настоящего изобретения термин «количество белка» в разбавителе для использования в соответствии с настоящим изобретением относится к общему количеству белка в разбавителе и определяется как «% масса/объем», то есть процентное отношение массы к объему. Этот процент должен определяться на основе объема самого разбавителя, и, следовательно, не на основе конечной вакцинной композиции, готовой для введения, которая приготовлена путем смешивания инфицированных клеток с разбавителем.
Аналогично количество белка в разбавителе для применения в соответствии с настоящим изобретением определяется для самого разбавителя до его объединения с инфицированными клетками. Это делается потому, что такие инфицированные клетки обычно будут содержаться в богатой среде для замораживания, которая будет содержать определенное количество белка.
Без ущерба для состава и концентраций композиции разбавителя для применения в соответствии с настоящим изобретением, как описано здесь, разбавитель также можно производить, продавать или хранить в более концентрированной форме, например, сконцентрированным 2 или более раз. Эту концентрированную форму разбавителя затем разбавляют до конечной 1× концентрации перед применением в соответствии с настоящим изобретением. Такая концентрация разбавителя выгодна, например, по логистическим причинам, для уменьшения объема и экономии затрат на упаковку и транспортировку.
Подробности предпочтительных вариантов осуществления изобретения и дополнительных аспектов изобретения будут описаны ниже.
Используемый в настоящем изобретении термин «приблизительно» означает, что число может варьировать в диапазоне±10% от его указанного значения. Предпочтительно термин «приблизительно» означает±9% от его значения, более предпочтительно термин «приблизительно» означает±8, 7, 6, 5, 4, 3, 2% от его значения или даже термин «приблизительно» означает±1% от его значения, в таком порядке предпочтения.
Как описано здесь, очень предпочтительным является, чтобы разбавитель для применения в соответствии с настоящим изобретением содержал небольшое количество или вообще не содержал белок.
Таким образом, в одном варианте осуществления применения в соответствии с настоящим изобретением разбавитель содержит не более приблизительно 0,45% (масса/объем) белка. Предпочтительно разбавитель содержит не более приблизительно 0,6, 0,5, 0,45, 0,4, 0,35, 0,3, 0,25, 0,2, 0,15, 0,1, 0,05, 0,03, 0,01% (масса/объем) белка в указанном порядке предпочтения.
Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления применения в соответствии с настоящим изобретением разбавитель содержит не более приблизительно 0,1% (масса/объем) белка.
В более предпочтительном варианте осуществления применения в соответствии с настоящим изобретением разбавитель не содержит белка.
Термин «не содержит белка» фактически означает, что в разбавителе нет белкового химического соединения; то есть, он практически не содержит белка, и при приготовлении разбавителя не используется и не добавляется белок, гидролизат и т.д. Однако это не исключает присутствия следовых количеств белка в разбавителе, которые можно обнаружить с помощью современных или высокочувствительных методов и оборудования. В соответствии с настоящим изобретением разбавитель не содержит белка, если он содержит не более 0,0001% (масса/объем) белка, то есть не более 1 мг белка на литр разбавителя при его 1× концентрации.
В настоящем изобретении при указании диапазона, или одностороннего, или двустороннего, предполагается, что он включает в себя указанную конечную точку (точки).
Как описано здесь, разбавитель для применения в соответствии с настоящим изобретением имеет предпочтительно использовать с клетками, инфицированными клеточно-ассоциированным альфагерпесвирусом.
Mardivirus
Iltovirus
В одном из вариантов осуществления применения в соответствии с настоящим изобретением клеточно-ассоциированный альфагерпесвирус относится к роду, выбранному из  и .
Предпочтительно клеточно-ассоциированный альфагерпесвирус выбран из вируса ветряной оспы, ILTV, MDV и HVT.
В более предпочтительном варианте осуществления применения в соответствии с настоящим изобретением клеточно-ассоциированный альфагерпесвирус выбиран из MDV и HVT.
В одном из вариантов осуществления применения в соответствии с настоящим изобретением клеточно-ассоциированный альфагерпесвирус представляет собой герпесвирус индеек.
alphaherpesvirinae
Mardivirus
Iltovirus
Используемый здесь термин «альфагерпесвирус» относится к вирусу подсемейства , имеющему характерные признаки членов своих таксономических групп, такие как морфологические, геномные и биохимические характеристики, а также биологические характеристики, такие как физиологическое, иммунологическое или патологическое поведение. То же самое относится и к определению рода, такого как  или , а также к определению названия отдельных видов вирусов.
Как известно в данной области техники, отнесение микроорганизма в конкретной таксономической группе основано на комбинации таких признаков. Следовательно, изобретение также включает в себя виды альфагерпесвируса, которые представляют собой любой из его субтаксонов, например, подвид, штамм, изолят, генотип, вариант, подтип или подгруппа и тому подобное.
Кроме того, для специалиста в данной области техники будет очевидно, что, хотя конкретное подсемейство, род или вид альфагерпесвируса для настоящего изобретения в настоящее время могут быть отнесены к этой группе, однако это таксономическая классификация может изменяться с течением времени, так как новое понимание может привести к повторной классификации в новую или другую таксономическую группу. Однако, поскольку это не меняет сам микроорганизм или его антигенный репертуар, а только его научное название или классификацию, такие повторно классифицированные микроорганизмы остаются в пределах объема изобретения.
Образцы клеточно-ассоциированного альфагерпесвируса для применения в настоящем изобретении могут быть получены из различных источников, например, как полевые изоляты от человека, или от животного в дикой природе или на ферме, или из различных лабораторий, (депозитарных) учреждений или (ветеринарных) университетов.
Клетки-хозяева, которые инфицированы клеточно-ассоциированным альфагерпесвирусом в соответствии с настоящим изобретением, предпочтительно имеют птичье происхождение, поскольку было обнаружено, что такие клетки обеспечивают оптимальные условия для репликации клеточно-ассоциированных альфагерпесвирусов, которые являются инфекционными для птиц.
Aves
Используемый в настоящем изобретении термин «птица» относится к организму таксономического класса . Предпочтительно донорское животное для клеток-хозяев представляет собой птицу сельскохозяйственного назначения, такую как курица, индейка, утка, гусь, куропатка, павлин, перепел, голубь, фазан, цесарка или страус.
Более предпочтительными являются птицы, выбранные из группы, состоящей из курицы, индейки, утки и гуся. Еще более предпочтительным птичьим организмом-донором клеток-хозяев является курица.
В одном из вариантов осуществления применения в соответствии с настоящим изобретением инфицированные клетки представляют собой фибробласты птиц.
Способы, позволяющие охарактеризовать клетки как птичьего и фибробластного происхождения включают в себя нескольких хорошо известных методов, таких как кариотипирование и обнаружение специфических маркеров, экспрессируемых клетками.
Птичьи клетки настоящего изобретению, которые инфицированы клеточно-ассоциированным альфагерпесвирусом, могут быть первичными клетками, полученными из организма птицы или его частей. Предпочтительно клетки птицы представляют собой фибробласты куриных эмбрионов (CEF).
Альтернативно и предпочтительно птичьи клетки являются вторичными клетками, то есть, получены из клеточной линии.
Еще более предпочтительными являются птичьи клетки, инфицированные клеточно-ассоциированным альфагерпесвирусом в соответствии с настоящим изобретением, полученные из иммортализованной линии клеток CEF, как описано в Международной патентной заявке WO2016/087560.
Чтобы восстановить и стабилизировать инфицированные клетки для применения в соответствии с настоящим изобретением, разбавитель для применения в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно имеет значение pH, равное или близкое к оптимальному значению pH для этих клеток. Для клеток, которые могут быть инфицированы MDV, HVT или ILTV, это означает, что значение pH предпочтительно находится в диапазоне от приблизительно 7,0 до приблизительно 7,8.
Таким образом, в варианте осуществления применения в соответствии с настоящим изобретением разбавитель имеет значение pH в диапазоне от приблизительно 7,0 до приблизительно 7,8.
Более предпочтительно разбавитель для применения в соответствии с настоящим изобретением имеет значение pH в диапазоне от приблизительно 7,1 до приблизительно 7,7; более предпочтительно в диапазоне от приблизительно 7,1 до приблизительно 7,6.
В еще более предпочтительном варианте осуществления применения в соответствии с настоящим изобретением разбавитель для применения в соответствии с настоящим изобретением имеет значение pH в диапазоне от приблизительно 7,1 до приблизительно 7,5.
Чтобы установить и поддерживать значение pH разбавителя для применения в соответствии с настоящим изобретением на желаемом уровне, разбавитель содержит фосфатный буфер.
2
4
2
4
В предпочтительном варианте осуществления применения в соответствии с настоящим изобретением фосфатный буфер в разбавителе представляет собой, так называемый буфер Гомори, состоящий из смеси одноосновного дигидрофосфата и двухосновного моногидрофосфата. Фосфатные химические соединения могут быть получены из любой обычной соли, такой как, например, натриевая или калиевая соль, причем обе эти соли могут быть солью одного типа или могут быть разными солями. Эти фосфатные химические соединения имеют несколько синонимов, например, NaHPO называется двухосновный фосфат натрия или динатрия гидрофосфат. В равной степени, например, KHPO называется монокалийфосфат, или дигидрофосфат калия.
2
4
2
4
В предпочтительном варианте осуществления применения в соответствии с настоящим изобретением фосфатный буфер в разбавителе состоит из NaHPO и KHPO.
Предпочтительно объединенный фосфатный буфер находится в концентрации приблизительно от 5 до 25 мМ; более предпочтительно объединенный фосфатный буфер находится в концентрации приблизительно 10 мМ.
2
4
2
4
2
4
2
4
Предпочтительно NaHPO находится в концентрации от приблизительно 5 до приблизительно 9 мМ, а KHPO находится в концентрации от приблизительно 1 до приблизительно 4 мМ; предпочтительно концентрация NaHPO составляет приблизительно 8 мМ, а концентрация KHPO составляет приблизительно 2,5 мМ.
Для стабилизации клеток, инфицированных клеточно-ассоциированным альфагерпесвирусом в соответствии с настоящим изобретением, разбавитель для применения в соответствии с настоящим изобретением содержит сахар.
В одном варианте осуществления применения в соответствии с настоящим изобретением сахар в разбавителе представляет собой, по меньшей мере, один из сахаров, выбранный из группы, состоящей из глюкозы, лактозы, сахарозы, мальтозы, трегалозы, декстрозы, сорбита и маннита.
В предпочтительном варианте осуществления применения в соответствии с настоящим изобретением сахар в разбавителе представляет собой сахарозу.
В одном варианте осуществления применения в соответствии с настоящим изобретением сахар в разбавителе находится в концентрации от приблизительно 50 до приблизительно 500 мМ.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения сахар находится в концентрации приблизительно от 75 до 400 мМ; более предпочтительно в концентрации приблизительно от 100 до 350 мМ.
Наряду с улучшением стабилизирующих свойств разбавителя, оптимизация количества сахара также является способом регулирования осмолярности разбавителя. Это имеет значение для предотвращения раздражения тканей при парентеральном введении вакцины в целевой организм, а также для обеспечения оптимальной стабильности в процессе использования инфицированных клеток настоящего изобретения.
В одном варианте осуществления применения в соответствии с настоящим изобретением осмолярность разбавителя настоящего изобретения специально не регулируется; осмолярность как правило составляет от 150 до 350 миллиосмоль/кг (мОсм/кг).
В предпочтительном варианте осуществления изобретения осмолярность разбавителя настоящего изобретения поддерживается в более физиологическом диапазоне значений, и разбавитель предпочтительно имеет изотоническую осмолярность.
Это означает, что разбавитель предпочтительно имеет осмолярность приблизительно от 250 и 300 мОсм/кг; более предпочтительно от приблизительно 280 до приблизительно 290 мОсм/кг.
Чтобы получить разбавитель для применения в соответствии с настоящим изобретением с такой осмолярностью можно регулировать содержание ионов, например, путем включения солей, таких как хлорид натрия и/или хлорид калия, или путем увеличения концентрации сахарозы.
В предпочтительном варианте осуществления применения в соответствии с настоящим изобретением концентрация калия в разбавителе находится на физиологическом уровне внеклеточной среды организма позвоночных или около него; это означает, что концентрация калия составляет от приблизительно 3 до приблизительно 5 мМ.
Уровень натрия может затем варьироваться для балансирования общей осмолярности и может составлять приблизительно от 50 до 250 мМ.
Разбавитель для применения в соответствии с настоящим изобретением может содержать консервант, такой как тимеросал, мертиолат, фенольные соединения и/или гентамицин. Предпочтительно консервант не используется.
Разбавитель для применения в соответствии с настоящим изобретением может содержать некоторое количество ионов магния. Было обнаружено, что ионы магния способствуют восстановлению здоровья инфицированных клеток-хозяев после оттаивания, что приводит к снижению потери титра клеточно-ассоциированного альфагерпесвируса. Примечательно, что этот эффект оказался специфичным для магния, так как было обнаружено, что другой двухвалентный катион, кальций, не оказывает такого положительного действия.
В варианте осуществления применения в соответствии с настоящим изобретением разбавитель содержит ионы магния в концентрации от приблизительно 0,1 до приблизительно 10 миллимолей на литр (мМ).
Что касается диапазона количества ионов магния в разбавителе для применения в соответствии с настоящим изобретением, то верхняя граница ограничена по практическим причинам, так как слишком высокие количества магния могут вызывать образование осадка при тепловой стерилизации разбавителя, например, в комбинация с фосфатным химическим соединением(ями) в разбавителе. Нижняя граница ограничена сохраняющимся эффектом стабилизации инфицированных клеток.
В предпочтительном варианте осуществления применения в соответствии с настоящим изобретением разбавитель содержит ионы магния в концентрации от приблизительно 0,2 до приблизительно 9 мМ. Более предпочтительно от 0,3 до 8 мМ, от 0,4 до 5 мМ; от 0,5 до 2,5 мМ; от 0,6 до 2 мМ; от 0,7 до 1,5 мМ; или даже от 0,75 до 1,25 мМ, в таком порядке предпочтения.
В еще более предпочтительном варианте осуществления применения в соответствии с настоящим изобретением разбавитель содержит ионы магния в концентрации приблизительно 1 мМ.
Разбавитель для применения в соответствии с настоящим изобретением может содержать некоторое количество цитрата. Было обнаружено, что цитрат способствует восстановлению здоровья инфицированных клеток-хозяев после оттаивания, что приводит к снижению потери титра клеточно-ассоциированного альфагерпесвируса. Этот эффект может быть обусловлен использованием цитрата в качестве метаболита для инфицированных вирусом клеток и/или его действием в качестве антиоксиданта. При добавлении цитрата в разбавитель полученные через 4 часа при температуре 25°C титры были выше на 0,5 БОЕ/мл.
Таким образом, в одном варианте осуществления применения в соответствии с настоящим изобретением разбавитель содержит цитрат в концентрации от приблизительно 0,1 до приблизительно 10 миллимолей на литр (мМ).
Более высокая концентрация цитрата может оказывать влияние на рН разбавителя, что может быть компенсировано корректировкой буферной силы.
В предпочтительном варианте осуществления применения в соответствии с настоящим изобретением разбавитель содержит цитрат в концентрации от приблизительно 0,2 до приблизительно 9 мМ. Более предпочтительно от 0,3 до 8 мМ; от 0,4 до 5 мМ; от 0,5 до 2,5 мМ; от 0,6 до 2 мМ; от 0,7 до 1,5 мМ; или даже от 0,75 до 1,25 мМ, в таком порядке предпочтения.
В еще более предпочтительном варианте осуществления применения в соответствии с настоящим изобретением разбавитель содержит цитрат в концентрации приблизительно 1 мМ.
Разбавитель в соответствии с настоящим изобретением может также содержать индикатор значения pH для визуального контроля любого микробиологического загрязнения. Индикатор значения pH может быть любым фармацевтически приемлемым индикатором, эффективным в диапазоне значений pH от 5 до 8; предпочтительным индикатором значения pH является фенолсульфофталеин в количестве приблизительно от 0,005 до 0,05 мг/мл.
Более предпочтительно количество фенолсульфофталеина составляет приблизительно 0,01-0,02 мг/мл.
В одном варианте осуществления применения в соответствии с настоящим изобретением к разбавителю применяются одно или несколько условий, выбранных из следующей группы:
- разбавитель содержит не более приблизительно 0,6, 0,5, 0,45, 0,4, 0,35, 0,3, 0,25, 0,2, 0,15, 0,1, 0,05, 0,03, 0,01% (масса/объем) белка в указанном порядке предпочтения;
- разбавитель не содержит белков;
Mardivirus
Iltovirus
- в разбавителе клеточно-ассоциированный альфагерпесвирус относится к роду, выбранному из  и ;
- в разбавителе клеточно-ассоциированный альфагерпесвирус выбран из вируса ветряной оспы, ILTV, MDV и HVT; предпочтительно выбран из MDV и HVT;
- клетки, которые инфицированы клеточно-ассоциированным альфагерпесвирусом настоящего изобретения, предпочтительно имеют птичье происхождение; предпочтительно донорским животным для клеток-хозяев является птица сельскохозяйственного назначения, такая как курица, индейка, утка, гусь, куропатка, павлин, перепел, голубь, фазан, цесарка или страус; более предпочтительными являются птицы, выбранные из группы, состоящей из курицы, индейки, утки и гуся. Еще более предпочтительным птичьим организмом-донором клеток-хозяев является курица.
- инфицированные клетки являются фибробластами птиц; предпочтительно, птичьи клетки являются вторичными клетками; более предпочтительно, клетками фибробластов птиц, инфицированными клеточно-ассоциированным альфагерпесвирусом настоящего изобретения, являются клетки, полученные из иммортализованной линии клеток CEF, как описано в Международной патентной заявке WO2016/087560;
- разбавитель имеет значение pH в диапазоне от приблизительно 7,0 до приблизительно 7,8; предпочтительно от приблизительно 7,1 до приблизительно 7,7; от приблизительно 7,1 до приблизительно 7,6; более предпочтительно от приблизительно 7,1 до приблизительно 7,5;
- в разбавителе фосфатный буфер представляет собой так называемый буфер Гомори, состоящий из смеси одноосновного дигидрофосфата и двухосновного моногидрофосфата;
2
4
2
4
2
4
2
4
2
4
2
4
- фосфатный буфер разбавителя состоит из NaHPO и KHPO; предпочтительно NaHPO находится в концентрации от приблизительно 5 до приблизительно 9 мМ, а KHPO находится в концентрации от приблизительно 1 до приблизительно 4 мМ; предпочтительно объединенный фосфатный буфер находится в концентрации приблизительно 10 мМ; предпочтительно NaHPO находится в концентрации приблизительно 8 мМ, а KHPO находится в концентрации приблизительно 2,5 мМ;
- в разбавителе сахар представляет собой, по меньшей мере, один из сахаров, выбранный из группы, состоящей из глюкозы, лактозы, сахарозы, мальтозы, трегалозы, декстрозы, сорбита и маннита; в предпочтительном варианте осуществления изобретения сахар представляет собой сахарозу;
- в разбавителе концентрация сахара составляет от приблизительно 50 до приблизительно 500 мМ; приблизительно от 75 до 400 мМ; или даже от приблизительно 100 до приблизительно 350 мМ;
- разбавитель имеет осмолярность приблизительно от 150 до 350 мОсм/кг; более предпочтительно приблизительно от 250 до 300; или даже от приблизительно 280 до приблизительно 290 мОсм/кг;
- в разбавителе калий находится на уровне приблизительно 3-5 мМ, а натрий находится на уровне от 50 до 250 мМ;
- разбавитель содержит ионы магния в концентрации от приблизительно 0,1 до приблизительно 10 миллимолей на литр (мМ), от 0,2 до 9 мМ, от 0,3 до 8 мМ, от 0,4 до 5 мМ; от 0,5 до 2,5 мМ; от 0,6 до 2 мМ; от 0,7 до 1,5 мМ; или даже от 0,75 до 1,25 мМ, в таком порядке предпочтения;
- разбавитель содержит ионы магния в концентрации приблизительно 1 мМ;
- разбавитель содержит цитрат в концентрации от приблизительно 0,1 до приблизительно 10 мМ, от 0,2 до 9 мМ, от 0,3 до 8 мМ, от 0,4 до 5 мМ; от 0,5 до 2,5 мМ; от 0,6 до 2 мМ; от 0,7 до 1,5 мМ; или даже от 0,75 до1,25 мМ, в таком порядке предпочтения;
- разбавитель содержит цитрат в концентрации приблизительно 1 мМ; и
- разбавитель содержит индикатор значения pH, который является фармацевтически приемлемым и эффективен в диапазоне значений pH от 5 до 8; предпочтительным индикатором значения pH является фенолсульфофталеин в количестве приблизительно от 0,005 до 0,05 мг/мл; более предпочтительно количество фенолсульфофталеина составляет приблизительно 0,01-0,02 мг/мл.
2
4
2
4
В одном варианте осуществления применения в соответствии с настоящим изобретением разбавитель не содержит белков; предназначен для стабилизации в процессе использования клеток, инфицированных клеточно-ассоциированным альфагерпесвирусом, выбранным из MDV и HVT; имеет значение pH в диапазоне приблизительно от 7,0 до 7,5; содержит в фосфатном буфере KHPO в концентрации от приблизительно 1 до приблизительно 4 мМ и NaHPO в концентрации от приблизительно 5 до приблизительно 9 мМ; сахар представляет собой сахарозу, и его содержание составляет от приблизительно 100 до 350 мМ; натрий содержится в концентрации приблизительно от 50 до 250 мМ; и количество фенолсульфофталеина составляет приблизительно 0,01-0,02 мг/мл.
Как описано, разбавитель для применения в соответствии с настоящим изобретением обеспечивает улучшенную стабильность при использовании восстановленных клеток, инфицированных клеточно-ассоциированным альфагерпесвирусом. Кроме того, применение улучшенного разбавителя имеет ряд практических и экономических преимуществ.
Таким образом, в другом аспекте настоящее изобретение относится к способу стабилизации в процессе использования клеток, инфицированных клеточно-ассоциированным альфагерпесвирусом, где этот способ включает в себя этап смешивания суспензии указанных инфицированных клеток с разбавителем для применения в соответствии с настоящим изобретением.
Смешивание выполняется с использованием обычных инструментов и методов, как правило, в соответствии с рекомендациями производителя суспензии инфицированных клеток, например, как описано в инструкции по применению, прилагаемой к продукту суспензии клеток, и/или в инструкции по применению, прилагаемой к разбавителю.
in ovo
В примере способа настоящего изобретения суспензию инфицированных клеток в замораживающей среде извлекают из низкотемпературного хранилища, быстро размораживают и затем объединяют с разбавителем. В более подробном примере: ампулу, содержащую приблизительно 2 мл суспензии клеток, инфицированных клеточно-ассоциированным альфагерпесвирусом, что составляет, например 1000 доз вакцины, оттаивают на водяной бане; содержимое ампулы помещают в приблизительно 200 мл разбавителя, что дает разведение суспензии инфицированных клеток приблизительно 1:100. Смесь клеток в разбавителе вводят по 0,2 мл в целевой организм подкожно или внутримышечно. В качестве альтернативы, когда введение должно осуществляться путем введения , этот инокулят помещают в 50 мл разбавителя, что дает разведение суспензии инфицированных клеток приблизительно 1:25, для объема дозы 50 мкл на яйцо.
В момент смешивания разбавитель может находиться при комнатной температуре или может быть охлажден при температуре 2-8°C. Предпочтительно, чтобы в момент смешивания разбавитель находился при комнатной температуре, то есть при температуре от приблизительно 15 до приблизительно 30°C; или даже от приблизительно 20 до приблизительно 25°C. Было установлено, что это обеспечивает лучшую сохранность вирусного титра клеточно-ассоциированного альфагерпесвируса.
Как описано здесь, и применение, и способ настоящего изобретения особенно подходят для приготовления вакцины против инфекции или заболевания, вызванного клеточно-ассоциированным альфагерпесвирусом настоящего изобретения.
Таким образом, еще одним аспектом настоящего изобретения является вакцина против клеточно-ассоциированного альфагерпесвируса, вакцина, содержащая клетки, инфицированные указанным вирусом, отличающаяся тем, что клетки суспендированы в разбавителе для применения в соответствии с настоящим изобретением.
В настоящем изобретении «вакцина» представляет собой смесь клеток, инфицированных клеточно-ассоциированным альфагерпесвирусом, и разбавителя для применения в соответствии с настоящим изобретением. На практике это будет разведение суспензии инфицированных клеток, как это предусмотрено производителем вакцины.
Вакцина в соответствии с настоящим изобретением предназначена для введения подходящим человеческим или животным целевым организмам, чтобы вызвать активную иммунизацию, с целью уменьшить инфекцию и/или признаки заболевания, вызванного клеточно-ассоциированным альфагерпесвирусом. Такое уменьшение инфекции означает предотвращение или уменьшение возникновения или распространения продуктивной инфекции альфагерпесвируса у целевого животного. Это достигается, например, путем уменьшения вирусной нагрузки у целевого организма или сокращения продолжительности репликации вируса. В свою очередь, это приводит к уменьшению количества, интенсивности или тяжести поражений и соответствующих клинических признаков заболевания, вызванного вирусной инфекцией, у целевого животного. Такую вакцину в разговорной речи называют «вакциной против альфагерпесвируса» или «альфагерпесвирусной вакциной».
В одном варианте осуществления вакцины в соответствии с настоящим изобретением эта вакцина предназначена для птиц, и клеточно-ассоциированный альфагерпесвирус выбран из ILTV, MDV и HVT.
В одном варианте осуществления изобретения MDV представляет собой вакцинный штамм, выбранный из MDV1 и MDV2.
Более предпочтительно MDV представляет собой штамм, выбранный из RB1B, 814, CVI-988 Rispens и SB1.
В одном варианте осуществления изобретения HVT представляет собой штамм, выбранный из PB1 и FC-126.
В предпочтительном варианте осуществления вакцины в соответствии с настоящим изобретением HVT представляет собой рекомбинантный HVT, который экспрессирует один или несколько гетерологичных антигенов. Примеры рекомбинантного HVT для применения в вакцине настоящего изобретению являются такими, как описано в Международных патентных заявках WO2016/102647 и WO2013/057236.
В еще более предпочтительном варианте осуществления вакцины в соответствии с настоящим изобретением клеточно-ассоциированный альфагерпесвирус представляет собой рекомбинантный HVT или MDV, экспрессирующий один или несколько гетерологичных антигенов, полученных из ILTV, NDV, вируса болезни Гамборо, MDV и вируса птичьего гриппа.
Определение эффективности вакцины в соответствии с настоящим изобретением находится в пределах компетенции практикующего врача и может быть выполнено, например, путем мониторинга иммунологического ответа после вакцинации или путем проверки появления клинических симптомов или смертности после заражения инфекцией например, путем мониторинга признаков заболевания, клинических показателей, серологических параметров или повторного выделения заражающего возбудителя и сравнения этих результатов с ответом на прививку, наблюдаемым у ложно вакцинированных животных. При оценке эффективности вакцины против болезни Марека выживаемость после заражения является удобным показателем наряду с яйценоскостью и конверсией корма.
Другим благоприятным эффектом вакцины настоящего изобретения является предотвращение или уменьшение распространения альфагерпесвируса в стаде или популяции животных и/или в пределах географического района. Следовательно, применение вакцины настоящего изобретения приводит к снижению распространенности альфагерпесвируса.
Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления изобретения вакцина настоящего изобретения эффективна в качестве средства для предотвращения виремии альфагерпесвируса и/или в качестве средства для предотвращения выделения альфагерпесвируса инфицированными людьми или животными.
В другом предпочтительном варианте осуществления вакцины настоящего изобретения вакцина предназначена для снижения распространенности альфагерпесвируса в популяции птиц и/или в географическом районе.
Вакцина настоящего изобретению в принципе может вводиться человеку или животным различными путями применения и в разные моменты их жизни.
in ovo
Однако, поскольку инфекция MDV или ILTV может быть установлена уже в очень раннем возрасте, вакцину настоящего изобретению целесообразно применять как можно раньше. Следовательно, вакцину настоящего изобретению можно применять в день вылупления («день 1») или , например, на 18 день ЭР.
in ovo
Таким образом, в одном варианте осуществления изобретения вакцину настоящего изобретения вводят .
in ovo
in ovo
Оборудование для автоматизированного введения вакцины в яйцо в промышленном масштабе является коммерчески доступным, например, INOVOJECT (Embrex BioDevices). Это обеспечивает максимально раннюю защиту при минимальных затратах на рабочую силу. Известны различные пути инокуляции , такие как в желточный мешок, эмбрион или полость аллантоисной жидкости; по мере необходимости они могут быть оптимизированы. Предпочтительно инокуляцию  проводят таким образом, чтобы игла фактически касалась эмбриона.
В одном варианте осуществления изобретения вакцину настоящего изобретению вводят парентеральным путем; предпочтительно внутримышечно или подкожно.
1
5
2
4
Для вакцины настоящего изобретения предпочтительная доза инокулята вируса составляет от 1 × 10 до 1 × 10 БОЕ клеточно-ассоциированным альфагерпесвирусом на целевую дозу; более предпочтительно от 1 × 10 до 1 × 10 БОЕ/доза; еще более предпочтительно от 500 до 5000 БОЕ/доза; наиболее предпочтительно от приблизительно 1000 до приблизительно 3000 БОЕ/доза.
in ovo
Объем целевой дозу вакцины настоящего изобретению может быть оптимизирован в соответствии с предполагаемым путем введения: для инокуляции  обычно применяют дозу от приблизительно 0,01 до приблизительно 0,5 мл на яйцо, а парентеральную инъекцию обычно проводят дозой от приблизительно 0,1 до приблизительно 1 мл на целевой организм.
Определение иммунологически эффективного количества вакцины настоящего изобретения или оптимизация объема вакцины на дозу находятся в пределах компетенции квалифицированного специалиста в данной области техники.
Вакцина настоящего изобретения может содержать дополнительный иммунологически активный компонент.
В одном варианте осуществления изобретения дополнительный иммунологически активный компонент представляет собой цитокин или иммуностимулирующий олигодезоксинуклеотид.
Иммуностимулирующий олигодезоксинуклеотид предпочтительно представляет собой иммуностимулирующий неметилированный CpG-содержащий олигодезоксинуклеотид (INO), как описано в Международной патентной заявке WO2015/011261.
Предпочтительным INO является агонист птичьего Toll-подобного рецептора (TLR) 21, такой как описано в Международной патентной заявке WO2012/089.800 (семейство X4), в Международной патентной заявке WO2012/160.183 (семейство X43) или в Международной патентной заявке WO2012/160.184 (семейство X23).
В варианте осуществления вакцины в соответствии с настоящим изобретением дополнительный иммунологически активный компонент представляет собой антиген, который получен от микроорганизма, патогенного для птицы. Он может быть «получен» любым подходящим способом, например, в виде «живого» ослабленного, инактивированного или субъединичного антигена из этого патогенного для птицы микроорганизма.
Предпочтительным дополнительным иммунологически активным компонентом является один или несколько живых аттенуированных вакцинных штаммов, выбранных из штамма вируса болезни Ньюкасла C2; штамм вируса инфекционного бурсита D78, PBG98, Cu-1, ST-12 или 89-03; и эймерии.
Вакцина настоящего изобретения может использоваться или в качестве профилактического, или в качестве терапевтического лечения, либо в обоих случаях, поскольку она препятствует как возникновению, так и прогрессированию инфекции, вызванной клеточно-ассоциированным альфагерпесвирусом, или признаков, вызываемого им заболевания.
Схема введения вакцины настоящего изобретения предпочтительно интегрирована в существующие схемы вакцинации другими вакцинами, которые могут потребоваться для целевого организма, с целью снижения стресса для целевого организма и/или снижения трудозатрат. Эти другие вакцины можно вводить одновременно, параллельно или последовательно, способом, совместимым с их зарегистрированным назначением.
Предпочтительно вакцину настоящего изобретения вводят только один раз в виде однократного введения.
В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к способу получения вакцины настоящего изобретения, включающему в себя этап смешивания клеток, инфицированных клеточно-ассоциированным альфагерпесвирусом, и разбавителя для применения в соответствии с настоящим изобретением.
Вакцина настоящего изобретения может быть получена из суспензии клеток, инфицированных клеточно-ассоциированным альфагерпесвирусом настоящего изобретения, и разбавителя для применения в соответствии с настоящим изобретением, описанными здесь способами, которые легко применимы специалистом в данной области техники.
Общие методы и рекомендации, которые применимы к получению вакцин, хорошо известны в данной области техники и описаны, например, в правительственных постановлениях и в таких руководствах, как «Remington: the science and practice of pharmacy» (2000, Lippincot, USA, ISBN: 683306472), и «Veterinary vaccinology» (P. Pastoret et al. ed., 1997, Elsevier, Amsterdam, ISBN 0444819681).
Далее настоящее изобретение будет дополнительно описано с помощью следующих неограничивающих примеров.
Примеры
Пример 1: Схема анализа стабильности
Основу разбавителя для применения в соответствии с настоящим изобретением составляют фосфатный буфер и сахароза.
2
4
2
4
2
Используемый Фосфатный буфер имеет концентрацию 10 мМ, и определенный уровень значения pH этого буфера устанавливают путем подбора состав двух фосфатов. Например, для значения pH 7,3 разбавитель содержал: 0,324 мг/мл KHPO и 1,356 мг/мл NaHPO.2HO.
Сахарозу использовали в концентрации 50 мг/мл (т.е. 150 мМ), некоторые исследуемые образцы разбавителя имели более высокое содержание сахарозы - 92,5 мг/мл (то есть 270 мМ).
Фенолсульфофталеин использовали в концентрации 0,01 или 0,02 мг/мл.
2
К некоторым исследуемым образцам разбавителя добавляли магний в концентрации 1 мМ MgCl.
2
К некоторым исследуемым образцам разбавителя добавляли CaCl до концентрации 0,133 мг/мл.
К некоторым исследуемым образцам разбавителя добавляли цитрат натрия до концентрации 1 мМ.
В состав некоторых исследуемых образцов разбавителя включали пептон: NZ-амин AS от компании Kerry Inc., панкреатический гидролизат казеина, используемый в количестве 1-14 мг/мл.
Положительным контролем для исследований стабильности служила полная культуральная среда CEF, содержащая 1% (объем/объем) сыворотки новорожденного теленка и смесь антибиотиков.
Инкубацию для оценки стабильности в процессе использования проводили путем инкубации образцов CEF, инфицированных HVT, при комнатной температуре (20-25°C) в течение промежутка времени продолжительностью до 4 часов. Затем образцы сразу же титровали на чашках со средой CEF, которые инкубировали в течение ночи.
Вирус, использованный для этих анализов стабильности, представлял собой рекомбинантный векторный вирус HVT, конструкция HVP360, описанная в Международной патентной заявке WO2016/102647. Он содержал двойную вставку гетерологичных генов: гена NDV-F и гена IBDV-VP2. Этот рекомбинантный вирус имел пониженную стабильность в процессе использования по сравнению с нерекомбинантным HVT или MDV в стандартном разбавителе MDV, содержащем 1,4% (масса/объем) пептона.
2
Анализ титрованием были стандартными: CEF получали из 10-дневных куриных эмбрионов и высевали на чашки диаметром 6 см. После прикрепления в течение ночи (38°C, 5% CO), на следующий день, посев инокулировали разбавлениями инкубированных образцов из эксперимента по анализу стабильности. Чашки снова инкубировали до тех пор, пока не становился видимым ЦПЭ (цитопатогенный эффект), обычно приблизительно через 3 дня. Титр определяли путем подсчета ЦПЭ, предпочтительно с использованием иммунофлуоресценции с использованием антитела против вируса HVT.
Пример 2: Изучение роли количества пептона в разбавителе
В первоначальном эксперименте изучали влияние количества пептона. Образцы рекомбинантных CEF, инфицированных HVP360, инкубировали в течение 4 часов при комнатной температуре в композициях разбавителя, содержащих различные количества NZ-амина. Разбавитель, используемый в этих экспериментах, имел значение pH 7,4 и содержал ионы магния и кальция. Одну серию образцов инкубировали в разбавителе плюс 1% (объем/объем) NCS, чтобы имитировать среду для культивирования клеток.
После инкубации образцы титровали на среде CEF, в трех повторностях, а разницу между титром до (t=0 часов) и после инкубации (t=4 часа) рассчитывали как «дельту». Стандартное отклонение титров обычно составляло приблизительно 0,1. Все значения титров приведены в виде Log10 бляшкообразующих единиц на мл.
Таблица 1: Влияние различных количеств пептона на стабильность в процессе использования рекомбинантного HVT в CEF
Титр в 10Log БОЕ/мл
Разбавитель
добавка
добавка 2
t=0 ч
дельта @ t=4 ч
ФБ, pH 7,4, сахароза
Mg, Ca
NZ-амин, 1 мг/мл
6,14
- 0,18
NZ-амин, 7 мг/мл
6,17
- 0,29
NZ-амин, 14 мг/мл
6,18
- 0,56
1% NCS
6,18
- 0,11
ФБ=фосфатный буфер
Как видно из этих результатов, присутствие пептона не могло имитировать эффект NCS, наоборот: там, где NCS давал наименьшую потерю титра из всех протестированных образцов, присутствие пептона в количестве стандартного разбавителя MDV, 14 мг/мл (1,4% (масса/объем)) оказало наиболее отрицательное действие; 7 мг/мл (0,7% (масса/объем)) уже было лучше, и самым лучшим в этом эксперименте было использование разбавителя с 1 мг/мл пептона (0,1%) (масса/объем)). В заключение: меньшее количество пептона дает меньшую потерю титра.
Пример 3: Испытания малых количеств пептона
Проводили дополнительный эксперимент для изучения использования малых количеств пептона. В этом эксперименте разбавитель не содержал магния или кальция, но были протестированы различные значения pH. Титрование проводили в двух повторностях.
Таблица 2: Влияние малых количеств пептона на стабильность в процессе использования рекомбинантного HVT в CEF
Титр в 10Log БОЕ/мл
Разбавитель
pH
добавка
t=0 ч
дельта @ t=4 ч
ФБ, сахароза
7,2
--
5,6
- 0,23
7,4
5,5
- 0,14
7,2
NZ-амин, 1 мг/мл
5,5
- 0,47
7,4
5,5
- 0,34
7,2
NZ-амин, 3 мг/мл
5,5
- 0,62
7,4
5,6
- 0,57
Nobilis Разбавитель CA
5,4
- 1,05
Культуральная среда+1% NCS
5,6
- 0,02
Из этих результатов можно сделать несколько выводов:
- самые большие потери (наибольшая дельта через 4 часа при температуре 25°C) имели место для этой рекомбинантной конструкции HVT при хранении в стандартном коммерческом разбавителе MDV (содержащем 14 мг/мл пептона)
- наименьшие потери были в полной культуральной среде
- базовый разбавитель фосфатного буфера с сахарозой был достаточно эффективен для уменьшения потери титра рекомбинантного HVT в CEF в течение периода времени продолжительностью до 4 часов при комнатной температуре
- магний и кальций не являются необходимыми
- разбавитель c pH 7,4 был более эффективен для уменьшения потерь, чем разбавитель с pH 7,2
- чем меньше количество пептона, тем лучше, при этом не содержащий протеинов разбавитель является наиболее эффективным.
Пример 4: Другие варианты разбавителя
В продолжение эксперимента в приведенном выше Примере 3 были исследованы дополнительные варианты композиций разбавителя: добавление 0,1 мг/мл магния; доведение до изоосмотического значения путем добавления солей: или 3,16 мг/мл NaCl; или комбинации 0,17 мг/мл KCl и 2,92 мг/мл NaCl. Альтернативно, изоосмотические значения были получены путем увеличения содержания сахарозы до 92,5 мг/мл и исключения дополнительных солей.
Также было протестировано включение в разбавитель 1 мМ цитрата.
Результаты стабильности в процессе использования этих различных композиций показали, что:
- небольшое количество магния может обеспечить дальнейшее снижение потери титра; подобное дальнейшее снижение может быть достигнуто при использовании увеличенной концентрации сахарозы.
- разные способы создания изоосмотических значений имели сходные эффекты
- включение в разбавитель 1 мМ цитрата, наряду с фосфатным буфером и сахарозой, повышает стабильность в процессе использования рекомбинантного вируса HVT.
Пример 5: Испытания на животных
Для подтверждения того, что клеточно-ассоциированный альфагерпесвирус все еще эффективен в процессе использовании в качестве вакцины после стабилизации с использованием разбавителя в соответствии с настоящим изобретением, проводили испытания на животных для тестирования защитного эффекта против заражения MDV или NDV или IBDV.
Основой экспериментов будет разделение на несколько опытных групп с соответствующими контролями.
Для проверки защитного эффекта против заражения MDV обычно применяют заражение MDV с использованием птицы, выделяющей вирус в окружающую среду.
Защиту от NDV или IBDV проверяли с использованием соответствующего вирулентного вируса из этих вирусных видов.
Для испытания с использованием птицы, выделяющей вирус в окружающую среду, как правило, используют приблизительно 1140 оплодотворенных куриных яиц; приблизительно 240 из них используют для получения птиц, которые будут служить в качестве птиц, выделяющих вирус. Остальных птиц разделяют на несколько опытных групп и две контрольные группы: одна, получающая контрольную вакцинацию, и другая, не получающая вакцинацию.
Краткая схема запланированных экспериментов выглядит следующим образом:
Общий протокол
- Для изучения стабильности в процессе использования применяли инкубацию CEF, инфицированных рекомбинантным HVT, с разбавителем настоящего изобретения в течение 2-4 часов, в результате чего клетки усваивали разбавитель настоящего изобретения.
- Вакцинные вирусы титровали до начала исследования для установления разведения для целевых доз.
- Цыплят получали в виде 200 оплодотворенных яиц на 14-й день эмбрионального развития (ЭР) и 900 свежих оплодотворенных яиц (1-й день эмбрионального развития) (ЭР 1).
- Яйца сортировали и разделяли на группы следующим образом:
o 240 (ЭР 14) для использования в качестве птиц, выделяющих вирус
o 150 (ЭР 1) для использования в качестве невакцинированных контактов
in ovo
o 750 (ЭР 1) для вакцинации; 125 вакцинировали  в ЭР 18.
- В ЭР 18 яйца, цыплят из которых использовали в качестве птиц, выделяющих вирус, просвечивали на овоскопе и помещали в инкубационные лотки.
- При вылуплении выделяющих вирус цыплят вакцинировали глазной вакциной против болезни Ньюкасла и инфекционного бронхита, помечали шейной меткой и внутрибрюшно инокулировли 200-400 БОЕ вирулентного MDV серотипа 1 и помещены по 50 голов на брудер.
- Птицам предоставляли неограниченный доступ к корму и воде, и ежедневно контролировали и документировали их потребление.
in ovo
- В ED 18 для контроля и вакцинации яйца разделяли на группы лечения, вакцинировали  и помещали в инкубационные лотки. Все используемые вакцины подвергали обратному титрованию.
- При вылуплении невакцинированные контактные цыплята и вакцинированные цыплята получали вакцину против NDV/IBV в виде глазных капель, их помечали шейной меткой и помещали в контакт с птицами, выделяющими вирус.
- Птицам предоставляли неограниченный доступ к корму и воде, и ежедневно контролировали и документировали их потребление.
- На 42-й день птиц, выделяющих вирус, умерщвляли и проводили учет поражений, связанных с MDV.
- На 29-й день после размещения все невакцинированные контактные цыплята и вакцинированные цыплята получали спрей для вакцинации против NDV и IBV.
- На 49 день после размещения всех оставшихся птиц умерщвляли и проводили учет поражений, связанных с MDV.
Оценка цыплят
Регистрировали все случаи гибели, клинические признаки (паралич, кривошея, красная нога) и поражения.
По окончании эксперимента (после вскрытия) регистрировали все поражения.
Данные представляли как % пораженных MDV, кривая выживаемость-лечение и индекс защиты.
Индекс защиты
Индекс защиты (Из) вычисляли по методу Виттера:
ИЗ = (% БМ у невакцинированных цыплят) - (% БМ у вакцинированных цыплят) / (% БМ у невакцинированных цыплят) × 100
БМ=признаки болезни Марека
Условия содержания
Птиц содержали в одном помещении для бройлеров, разделенном на 4 брудера с автоматическими кормушками и ниппельными поилками, с едиными системами инфракрасного отопления и обработки воздуха.
Мониторинг
Птиц ежедневно обследовали на предмет общего состояния здоровья, питания, циркуляции воздуха и воды. Любых больных или мертвых птиц, обнаруженных после двухнедельного размещения, подвергали вскрытию и проводили учет поражений. Птицы, погибшие в течение первых двух недель жизни, рассматривали как погибших в результате «неспецифической» смертности.
Продолжительность эксперимента
Продолжительность эксперимента составляла 63 дня. Выделяющих вирус цыплят размещали за 2 недели до вакцинации и совместно содержали в течение 28 дней. Вакцинированных цыплят и контактных цыплят содержали в течение 7 недель (49 дней).
Пример 6: Результаты эксперимента на животных Примера 5
Эксперимент по вакцинации, описанный в Примере 5, был проведен в середине 2018 года. К сожалению, технический сбой в оборудовании по поддержанию климата в помещении для животных вызвал массовое явление теплового стресса у птиц в различных группах лечения. Это привело к гибели большого количества птиц, а у оставшихся были серьезно нарушены иммунные реакции, что не позволило провести тщательный анализ данных. В настоящее время планируется повторный запуск эксперимента.
Пример 7: Испытание стабильности в процессе использования других клеточно-ассоциированных альфагерпесвирусов
Предпочтительный разбавитель
Предпочтительную композицию разбавителя для использования для стабилизации в соответствии с настоящим изобретением использовали для определения стабильности в процессе использования клеток, инфицированных другими клеточно-ассоциированными альфагерпесвирусами, как из коммерческих вакцин, так и из лабораторных штаммов.
Предпочтительный вариант разбавителя настоящего изобретения не содержал белков и имел значение pH 7,1 после приготовления, которое сдвигалось до 7,0 после тепловой стерилизации.
Таблица 3: Состав предпочтительного разбавителя настоящего изобретения
г/л
мМ
фосфатный буфер
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>
0,451
3,3
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>
1,19
6,7
сахар
сахароза
50
146
натрий
Хлорид натрия
3,16
54
индикатор pH
фенолсульфофталеин
0,01
0,03
вода для инъекций
--
до 1 литра
--
Протестированные вакцины
Различные протестированные вирусы перечислены в Таблице 4. Вирус оттаивали после хранения при отрицательной температуре (-140°C) и разбавляли или в стандартном разбавителе, Nobilis™ CA, или в предпочтительном разбавителе настоящего изобретения. Разведения для титрования готовили, как указано в Таблице 4, и образцы t=0 для титрования вируса немедленно титровали на помещенных на чашки Петри клетках CEF. После 4-часового хранения разбавления при комнатной температуре (приблизительно 21°C), разведения снова отбирали для титрования на CEF, чтобы определить конечную точку стабильности в процессе использования.
Таблица 4: Описание экспериментальных условий тестирования стабильности в процессе использовании вирусов MDV
Тестируемый образец
Тип
Разведение 1:x
Кол-во повторов
Nobilis Rismavac
MDV1
80,000
2
Innovax ILT
HVT+2 вставки
100,000
2
Innovax ND
HVT+1 вставка
500
4
Innovax ND-IBD
HVT+2 вставки
75,000
6
SB1
MDV2
1,000
4
FC126
HVT
40,000
4
Титрование вируса
5
2
2
Чашки Петри (диаметр 6 см) засевали CEF с плотностью 1,1 × 10 клеток/см в 4 мл культуральной среды с антибиотиками. Эти чашки инкубировали в течение ночи при температуре 38°C и 5% СО. Приблизительно через 24 часа клетки CEF достигли приблизительно 80% конфлюэнтности. 100 мкл каждого из образцов, взятых для тестирования на стабильность, добавляли в чашки; количество повторов указано в Таблице 4. Чашки инкубировали еще 3-4 суток до появления вирусных бляшек.
Иммунофлуоресцентный тест
Бляшки на чашках визуализировали с использованием иммунофлуоресцентного анализа. В то время, когда бляшки стали отчетливо видны, клетки на чашках фиксировали с использованием холодного (-20°C) 96%-ного этанола в течение 3-5 минут. Затем чашки трижды промывали с использованием стандартного промывочного буфера. В качестве первого антитела использовали 3 типа моноклональных антител, специфичных для каждого из протестированных в этом эксперименте типов вирусов: HVT, MDV1 или MDV2. Моноклональные антитела разбавляли до соответствующей силы в промывочном буфере, добавляли в планшеты и инкубировали в течение одного часа при температуре 37°C. После этого чашки трижды промывали промывочным буфером. В чашки добавляли конъюгат козьего-антимышиного антитела с красителем Alexa448 (1:1000) в качестве второго антитела и краситель для контрокрашивания Evans Blue (1:1500) в промывочном буфере и инкубировали в течение еще одного часа при температуре 37°C. Затем посуду трижды промывали промывочным буфером. На последнем этапе, к чашкам добавляли 44% глицерина в ФСБ. Вирусные бляшки подсчитывали с использованием флуоресцентного микроскопа, а титры вируса в тестируемых образцах рассчитывали в БОЕ/мл.
Результаты:
Результаты теста на стабильность в процессе использования различных альфагерпесвирусов представлены в Таблице 5 в виде титров в БОЕ/мл в начале испытания и через 4 часа при комнатной температуре. Столбец с дельтой указывает разницу в титре между двумя временными точками. Две панели Таблицы 5 позволяют сравнивать результаты стандартного разбавителя с результатами предпочтительного разбавителя настоящего изобретения.
Таблица 5: Результаты теста на стабильность в процессе использования различных альфагерпесвирусов.
Тестируемый образец
Nobilis Разбавитель CA(10Log БОЕ/мл)
Разбавитель настоящего изобретения(10Log БОЕ/мл)
T=0
T=4 ч
Δ
T=0
T=4 ч
Δ
Nobilis Rismavac
6,0
5,8
0,2
6,0
5,8
0,2
Innovax ILT
6,9
6,5
0,4
6,8
6,4
0,4
Innovax ND
4,3
3,1
1,2
4,2
3,6
0,7
Innovax ND-IBD
7,1
6,7
0,4
7,0
6,7
0,3
SB1
5,4
4,8
0,6
5,4
5,1
0,3
FC126
6,8
6,2
0,6
6,7
6,4
0,4
Как можно ясно видеть, потеря титра в разбавителе настоящего изобретения была или такой же, или меньшей по сравнению со стандартным разбавителем. Этот эффект имел место для всех трех протестированных типов вирусов: HVT, MDV1 и MDV2. Потеря титра в большинстве случаев составляла не более 0,4 10Log БОЕ/мл и, как правило, меньше.
Для одного образца, Innovax ND, потеря титра 0,7 10Log БОЕ/мл была довольно большой в разбавителе настоящего изобретению и превышала нормальную максимальную потерю титра 0,4 10Log БОЕ/мл. Однако для этого образца потеря титра в стандартном разбавителе была даже намного больше - 1,2 10Log БОЕ/мл. Так как это был также вирус, который нуждался в наименьшем разбавлении, то, вероятно, этот образец изначально был не хорошего качества, и он не был репрезентативным в своем роде, хотя на его примере действительно можно видеть впечатляющую разницу в стабилизирующей способности между разбавителем настоящего изобретения и стандартным разбавителем.