СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОБЪЕМОВ И ПЛОЩАДЕЙ ПОВЕРХНОСТЕЙ КЛЕТОК ДИАТОМОВЫХ ВОДОРОСЛЕЙ
METHOD FOR DETERMINING VOLUME AND SURFACE AREA OF DIATOM CELLS

Изобретение относится к гидробиологии, а точнее экологии водорослей, и может быть использовано для определения объемов и площадей поверхностей клеток диатомовых водорослей, оценки их морфометрических характеристик и функционального состояния.
Объемы и площади поверхности одноклеточных диатомовых водорослей (микроводорослей), которые в большинстве водных экосистем по обилию и числу видов доминируют над представителями микроводорослей других систематических отделов, - это один из важных показателей состояния водных сообществ, используемый для оценки продуктивности водоемов, интенсивности круговорота углерода и кремния, функционального и экологического состояния акваторий.
Известен методический подход, так называемый геометрический подход, позволяющий определять как объемы, так и поверхности одноклеточных водорослей, в том числе и диатомовых [1]. Он основан на сопоставлении формы клеточной оболочки (кремниевого панциря у диатомовых) с различными геометрическими телами (сфероидами, конусами, цилиндрами), объемы и поверхности которых принимаются за таковые клеток. Этот подход начали применять еще с 50-х годов прошлого века и используют до сих пор, хотя он имеет серьезный недостаток, обусловленный неправильной имитацией формы микроводорослей, имеющих сложное строение, и последующей неверной оценкой их объемов и площадей поверхностей.
Известен альтернативный способ, предложенный еще в начале XX в., который основан на построении из пластических материалов (глины, гипса, воска, пластилина) увеличенной модели микроорганизма [2]. Объем построенной модели определяется по объему вытесненной ею жидкости, а площадь поверхности - по массе краски, пошедшей на ее окрашивание [3]. Главный недостаток способа состоит в том, что созданная модель статична, она отражает конкретную форму живого объекта, в то время как последняя существенно изменяется в процессе развития организма. Поэтому для каждого исследуемого организма приходится строить новую модель, что при большом обилии в пробах разнообразных по форме микроводорослей практически выполнить невозможно.
В последнее время разработано большое количество геометрических моделей, представляющих собой комбинацию разнообразных геометрических тел (сфероидов, цилиндров, конусов и пр.), которые используются для аппроксимации формы одноклеточных водорослей и последующего расчета их объемов и площадей поверхностей [4, 5]. Однако серьезным недостатком данных моделей является невозможность правильного воспроизведения сложных форм многих микроводорослей, что приводит к получению не точных и не объективных результатов.
Известен способ построения трехмерных геометрических моделей диатомовых водорослей рода Cymbella [6], который предусматривает построение моделей диатомовых водорослей по заранее выполненным фотографиям. Для построения моделей используют векторные контуры створок, а также трапециевидный контур поперечного сечения панциря. Для ускорения процесса построения предварительно создают типичные трехмерные модели некоторых наиболее массовых представителей диатомовых водорослей. Расчет объема и площади поверхности клеток выполняют, используя типичную модель, соответствующую исследуемому виду микроводоросли, размеры которой соотносят с длиной и шириной этой клетки. Недостатком способа является то, что он позволяет конструировать трехмерные модели только небольшой группы диатомовых имеющих клиновидную форму панциря.
В основу изобретения «Способ определения объемов и площадей поверхностей клеток диатомовых водорослей» поставлена задача получения достоверных и объективных результатов путем построения компьютерных трехмерных геометрических моделей, имитирующих форму кремниевых панцирей клеток диатомовых.
Поставленная задача решается тем, что трехмерные геометрические модели, имитирующие форму панцирей диатомовых, создаются из компьютерных оцифрованных (оконтуренных замкнутыми ломаными линиями) проекций панцирей диатомовых, путем объединения этих плоских проекций в трехмерный каркас будущей модели, который затем покрывают полигональной поверхностью, что и формирует готовую модель. В зависимости от формы панциря диатомовой водоросли для построения моделей используется от одной до трех оцифрованных проекций панциря на взаимно ортогональные плоскости. Цифровые проекции панцирей клеток строятся по изображениям диатомовых, но в отличие от простого оконтуривания границ изображений в способе использован подход, принятый в геометрической морфометрии [8]. Он основан на расстановке вдоль границ изображений клеток, в морфологически значимых местах границ, ключевых вершин, которые объединяются в замкнутую ломаную линию при помощи кубических кривых Безье. Данная операция выполняется в любом векторном редакторе, например, в программах CorelDRAW или Inkscape. Выбор кривых Безье объясняется удобством их использования для последующих модификаций формы проекций, что дает возможность имитировать морфологическую изменчивость клеток диатомовых водорослей в процессе онтогенеза и соотносить размеры построенных трехмерных моделей с размерами наблюдаемых клеток.
Полученные заявляемым способом геометрические модели намного точнее имитируют особенности строения клеток диатомовых водорослей имеющих сложную форму панциря, что позволяет получать более точные значения объемов и поверхностей таких клеток. Так как многие диатомовые водоросли, занимающие разное таксономическое положение, имеют схожие формы проекций панцирей, то однажды построенные цифровые проекции многократно используются для моделирования разнообразных видов диатомовых, то есть они обладают свойством универсальности.
Изобретение поясняется иллюстрациями. На фиг.1 представлены фотографии клеток диатомовых водорослей (фотографии створок), на границах которых, в морфологически значимых (ключевых) местах расставлены маркеры, изображенные стрелками. На фиг. 2 - маркеры при помощи кривых Безье объединены в векторные кривые, описывающие форму границ изображенных клеток. На фиг. 3 - векторные кривые, размещенные в пространстве так, что они формируют каркасы трехмерных моделей панцирей диатомовых водорослей. На фиг. 4 - трехмерные модели клеток диатомовых, созданные путем покрытия каркасов полигональной поверхностью. На фиг. 5 - ключевые вершины исходных проекций смещены в новую позицию, что приводит к модификации трехмерных моделей, показанных на фиг. 6. На фиг. 7-9 - приемы построения каркасов трехмерных моделей диатомовых водорослей с разной формой панцирей. На фиг. 10 - демонстрация работы алгоритма покрытия поверхностью. На фиг. 11 - трехмерные модели некоторых видов бентосных диатомовых водорослей Черного моря.
Способ реализуется следующим образом:
1. Отбор проб диатомовых водорослей, их обработка и фотографирование осуществляются в соответствии с методами, предусмотренными для этих целей. Желательно получить фотографии представителей диатомовых с разных ракурсов: со стороны створки и пояска.
2. Цифровые проекции строятся в любом векторном редакторе, в котором есть инструмент для создания кубических кривых Безье, например, в программах CorelDRAW, Inkscape. Кривые Безье используются для обводки контуров клеток диатомовых, при этом управляющие вершины кривых Безье размещаются в морфологически значимых местах границы контура клетки, соответствующих наиболее вероятным местам изменения формы границы в процессе развития микроводоросли.
Построение трехмерных моделей панцирей диатомовых водорослей осуществляют в два этапа. На первом шаге формируют каркасы будущих моделей, для чего используют векторные проекции панцирей диатомовых. На втором шаге эти каркасы «обтягивают» полигональной поверхностью, что формирует трехмерную модель.
3. Построенные трехмерные модели должны быть модифицированы так, чтобы их размеры и пропорции соответствовали размерам и пропорциям исследуемых клеток. Для этих целей необходимо изменить пропорции и размеры исходных проекций панциря, при помощи которых была создана трехмерная модель. Такую операцию выполняют путем перемещения управляющих вершин кривых Безье, описывающих данные проекции, в новую позицию. В процессе онтогенеза клетки диатомовой происходит постепенное изменение формы проекций панциря, главным образом формы створки. В некоторых локальных участках проекции панциря становятся уже, в других - шире по отношению к соседним участкам. Положение ключевых вершин кривых Безье, описывающих форму проекций, совпадает с положением таких морфологически значимых частей панциря. Поэтому соответствующее перемещение ключевых вершин в новое положение позволяет имитировать описанную изменчивость формы проекций панциря диатомовых водорослей, а также соотносить размеры проекций с размерами микроводоросли.
4. Расчет объемов и площадей поверхностей трехмерных геометрических моделей панцирей диатомовых водорослей выполняется следующим образом. Трехмерная модель представляет собой множество граничащих друг с другом плоских ориентированных граней. Площадь поверхности трехмерной модели равна сумме площадей всех этих граней. Объем трехмерной модели равен сумме объемов всех пирамид, основаниями которых служат грани модели, а вершины которых находятся в одной произвольно выбранной точке. Так как грани трехмерной модели имеют ориентацию, то значение объема каждой пирамиды имеет знак, зависящий от того, с какой стороны - внутренней или внешней - видно основание пирамиды из ее вершины. При суммировании объемов пирамид их перекрывающиеся части взаимно уничтожатся, и в результате получается объем исходной модели.
Пример.
Построение трехмерных геометрических моделей массовых видов бентосных диатомовых водорослей прибрежья Севастополя (Черное море).
Пробы бентосных диатомовых водорослей отбирали с рыхлых грунтов в акватории Севастопольской бухты в соответствии со стандартной методикой. Идентификацию, измерение и фотосъемку видов диатомовых производили с помощью микроскопа Zeiss Axiostar Plus, оборудованного камерой Canon PowerShot А640. Обводку контуров панцирей клеток диатомовых водорослей выполняли в векторном редакторе CorelDRAW. Оцифрованные контуры использовали для построения трехмерных моделей диатомовых водорослей с помощью специально разработанного для этих целей программного обеспечения. Построение каркасов выполняли при помощи нескольких алгоритмов:
а) создание каркаса трехмерных моделей клеток диатомовых водорослей с цилиндрической формой панциря. Такая форма характерна для большинства центричных и многих пеннатных диатомовых из родов Caloñéis, Eunotia, Gyrosigma, Pleurosigma и пр. Для построения каркаса используются проекции створки панциря диатомовой, которые последовательно «нанизываются» на отрезок прямой линии, называемой направляющей (фиг. 7). Для создания каркаса моделей диатомовых с закрученным панцирем проекции створки на каждом шаге «нанизывания» дополнительно поворачиваются вокруг направляющей на некоторый угол (фиг. 7). Еще один вариант модификации проекций, важный для моделирования некоторых форм диатомовых водорослей, заключается в изменении размеров проекций (масштабировании) на всех или некоторых шагах (фиг. 7). Комбинация масштабирования и поворота проекции створки, а также использование вместо прямолинейной криволинейной направляющей позволяет строить каркасы разнообразных панцирей диатомовых водорослей.
б) создание каркасов моделей диатомовых водорослей с клиновидной формой панциря. Такую характерную форму имеют диатомовые водоросли из родов Amphora, Cymbella, Encyonema, Licmophora, Rhopalodia и др. Для построения каркаса также используется оцифрованные проекции створки диатомовой водоросли, которые поворачиваются относительно одной из своих сторон и смещаются вдоль прямой линии, перпендикулярной данной стороне, на некоторый малый шаг (рис. 8). Створки упомянутых диатомовых обычно имеют серповидную, ладьевидную (в виде половины эллипса) или булавовидную формы. Стороной, относительно которой осуществляется поворот, является вогнутая сторона серповидных, прямая - ладьевидных и более суженная - булавовидных створок.
в) построение каркасов моделей панцирей диатомовых водорослей с изогнутой, выпукло-вогнутой и прочими сложными формами из родов Achnanthes, Diploneis, Rhoicosphenia и пр. Здесь используется три проекции панциря диатомовой водоросли на створковую, продольную и поперечную плоскости. Две из них, соответствующие проекциям створки и продольного сечения пояска диатомовой, являются направляющими, задающими размер третьей проекции панциря, которая скользит вдоль них (рис. 9).
Для создания готовой трехмерной модели построенный каркас, который состоит из совокупности сечений панциря диатомовой водоросли, покрывали полигональной поверхностью, состоящей из множества плоских треугольных или многоугольных граней, каждая из которых соединяет вершины двух соседних сечений (фиг. 10).
В результате было построено 65 трехмерных геометрических моделей (фиг. 11), имитирующих форму панцирей более чем 120 видов и внутривидовых таксонов бентосных диатомовых водорослей. Построенные модели были использованы для вычисления индивидуальных объемов и площадей поверхностей представителей диатомовых, и дальнейшего вычисления их биомасс. Объемы и площади поверхностей клеток диатомовых водорослей также были рассчитаны при помощи геометрических фигур, рекомендуемых в работах [4, 5]. Значения объемов и поверхностей, рассчитанные двумя способами, и различия между ними представлены в табл. 1.
Анализ таблицы показал, что около половины полученных двумя способами значений объемов и площадей поверхностей различались на 30-70%; трехмерные модели более точно имитируют форму панцирей диатомовых водорослей, так как они созданы по оцифрованным проекциям этих панцирей. Точность расчетов объемов и поверхностей клеток диатомовых, а также их биомассы существенно повышается. Источники информации:
1. Киселев И.А. Методы исследования планктона // Жизнь пресных вод СССР. -1956.-Т. 4.,№ 1.-С. 234.
2. Lohman H. Untersuchungen zur Veststellung des vollstândigen Gehaltes des Meers on Plankton - Kiel: Wissensch Meeresuntersuchungen. - 1908.
3. Кольцова Т.И. Определение объема и поверхности клеток фитопланктона// Биологические науки. - 1970. - № 6. - С. 114-119.
4. Брянцева Ю.В., Лях А.М., Сергеева А.В. Расчет объемов и площадей поверхности одноклеточных водорослей Черного моря. - Севастополь, 2005. - 25 с. (Препринт / НАН Украины, Институт Биологии Южных морей).
5. Лях А.М., Брянцева Ю.В. Формулы для вычисления объемов и поверхностей микроводорослей, находящихся в коллекции ИнБЮМ // Микроводоросли Черного моря: проблемы сохранения биоразнообразия и биотехнологического использования / Под ред. Ю.Н. Токарева, 3.3. Финенко, Н.В. Шадрина; НАН Украины; Институт биологии южных морей. - Севастополь: ЭКОСИ-Гидрофизика, 2008. - С. 281-290.
6. Лях A.M. Геометрические моделирование диатомовых водорослей рода Cymbella Agardh // Экология моря. - 2007. - Вып. 74. - С. 50-55.
7. Лях А.М. Оценка морфометрических характеристик диатомовых водорослей с использованием трехмерных геометрических моделей: автореф. дисс., к.б.н. -Севастополь, 2010. - 24 с.
8. Павлинов И.Я. Геометрическая морфометрия - новый аналитический подход к сравнению компьютерных образов // Информационные и телекоммуникационные ресурсы в зоологии и ботанике: 2-й междунар. симпозиум: тезисы докл. - Санкт-Петербург, 2001. -С. 65-90.