ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК, ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI - ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО БЕЛКА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЗМЕТИОНИНОВОГО ИНТЕРФЕРОНА АЛЬФА-2b ЧЕЛОВЕКА ИЗ ЭТОГО ГИБРИДНОГО БЕЛКА
FUSION PROTEIN, ESCHERICHIA COLI STRAIN BEING FUSION PROTEIN PRODUCER AND METHOD FOR PRODUCING METHIONINE-FREE HUMAN INTERFERON ALPHA-2b OF SUCH FUSION PROTEIN

Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа получения безметионинового (не содержащего N-концевого метионина) интерферона альфа-2b человека.
Интерферон альфа-2b - вариант интерферона альфа-2 человека (IFN-α2), отличающийся наличием остатка гуанина (G) в позиции 137 кодирующей области [Kaluz et al., 1993 Acta Virol. 37:97-100; Kaluz et al., 1994, Acta Virol. 38:101-4; Lee et al., 1995, J Interferon Cytokine Res. 15:341-9], которая приводит к появлению остатка аргинина (Arg) в последовательности белка.
IFN-α2 относится к классу цитокинов, обладающих противовирусной активностью, и является представителем семейства альфа-интерферонов, секретируемых практически всеми типами вирус-инфицированных клеток человека [Pfeffer et al., 1998, Cancer Research 58: 2489-2499].
Рекомбинантный IFN-α2 применяют для терапии вирусных и опухолевых заболеваний [Samuel, 2001, Clinical Microbiology Reviews, 14:778-809; Schadendorf et al., 2009, Annals of Oncology, 20 (Supplement 6): vi41-vi50; Pfeffer et al., 1998, Cancer Research 58:2489-2499], в том числе для лечения твердых опухолей, таких как рак мочевого пузыря, рак почки, ВИЧ-индуцированная саркома Капоши и др. [Torti, 1988, J.Clin.Oncol., 6:476-483; Vugrin et al., 1985, Cancer Treat. Rep., 69:817-820; Rios et al., 1985, J.Clin.Oncol., 3:506-512]. IFN-α2 являются основными терапевтическими средствами, используемыми для лечения хронических форм гепатитов В и С [Clark V., Nelson D.R., 2009, Clin Liver Dis, 13:351-363].
N-концевым аминокислотным остатком природного IFN-α2 является цистеин, связанный дисульфидной связью с 98 цистеином белка [Bodo G., Fogy I., 1985, The Interferon System, pp.23-27; Wetzel et al., 1981, J. Interfer. Res., 1:381-90]. В то же время у некоторой части молекул рекомбинантных IFN-α2, выделяемых из клеток Escherichia coli (E.coli), на N-конце остается дополнительный остаток метионина (формилметионина), что делает рекомбинантный IFN-α2 модифицированным белком.
th
Избыточный N-концевой метионин может влиять на стабильность и иммуногенность белков [Ben-Bassat A., Bauer K., 1987, Nature 326, 315], а также в ряде случаев приводит к потере их биологической активности [Rabbani et al., 1988, J Biol Chem, 263:1307-1313]. В связи с тем что с 2005 г. Европейская Фармакопея ограничила производство и использование на территории европейских стран препаратов, содержащих модифицированный IFN-a2 [Eur. Pharm., 5 ed.: 2004], проблема удаления N-концевого метионина из состава IFN-α2 бактериального происхождения приобрела еще большее значение.
В клетках E.coli, остающихся одними из основных продуцентов рекомбинантных белков, удаление (процессинг) N-концевого метионина детерминируется радиусом бокового радикала следующего за метионином аминокислотного остатка синтезируемого белка [Hirel et al., 1989, Proc Natl Acad Sci USA, 86(21):8247-51; Dalbøge et al., FEBS Lett. 1990; 266(1-2):1-3]. Однако такой процессинг часто оказывается неполным в случае гиперэкспрессии белка [Yasueda et al., 1991, Appl Microbiol Biotechnol, 36:211-215; Hwang et al., 1999, Biochem J, 338:335-342].
К числу ферментативных способов удаления N-концевого метионина из состава рекомбинантных белков относятся:
- удаление метионина с использованием метионинаминопептидазы [Shapiro et al., 1988, Anal. Biochem, 175:450-461; Solbiati et al., 1999, J Mol Biol, 290:607-14; Liao et al., 2004, Protein Science, 13:1802-1810];
- способы, основанные на биосинтезе удлиненного белка, между N-концевым метионином и зрелой частью которого введена короткая последовательность сайта узнавания какой-либо протеиназы. Последующая протеиназная обработка удлиненного белка приводит к удалению введенной последовательности вместе с N-концевым метионином [US5665566; Belagaje et al., 1997, Protein Sci, 6:1953-1962; Hosfield Т., Lu Q., 1999, Anal Biochem, 269:10-6; Jenny R.J. et al., 2003, Protein Express Purif, 31:1-11].
Заявляемый способ основан на биосинтезе в клетках Е.coli предшественника безметионинового IFN-α2, содержащего в своем составе последовательность зрелого интерферона, слитого с последовательностью дрожжевого белка SUMO (Small Ubiquitine-like protein Modifier) [Johnson et al., 1997, EMBO J, 16:5509-5519; Muller et al., 1998, EMBO J, 17:61-70], относящегося к семейству убиквитин-подобных белков (УПБ).
УПБ представляют собой метки белковой природы, которые в клетках эукариот используются для мечения других белков, в результате чего последние изменяют свою функциональную активность [Hochstrasser М., 2000, Science, 289:563-564]. Помимо убиквитина в семейство УПБ входят белки SUMO, Rub1, Hub1, ISG15, Apg12, Apg8, Urm1, Ana 1a и Ana 1b. В ходе мечения C-концевые остатки УПБ коньюгируют с Б-аминогруппами лизина на поверхности модифицируемых белков [Jentsch S., Pyrowolakis G., 2000, Trends Cell Biol, 10:335-342; Muller et al., 2001, Nat Rev Mol Cell Biol 2:202-210]. В основе большинства способов биотехнологического использования белков семейства УПБ, за исключением APG12 и URMI, лежит их природное свойство синтезироваться в виде удлиненных предшественников, подвергающихся посттрансляционному процессингу, приводящему к высвобождению универсальной С-концевой последовательности Гли-Гли [Malakhov et al., 2004, J Struct Funct Genom, 5:75-86].
В геноме дрожжей Saccharomyces cerevisiae (S.cerevisiae) содержится ген SMT3, расположенный между нуклеотидными позициями 1469403-1469708 хромосомы IV [база данных NCBI]. Ген SMT3 кодирует белок SMT3 - дрожжевой SUMO. Дрожжевой SUMO синтезируется в виде 101-аминокислотного предшественника, из которых 98 составляют зрелый белок, из которых остатки 13-98 важны для формирования его нативной структуры [Mossessova E., Lima С.D., 2000, Mol Cell, 5:865-876]. Эукариотические SUMO, включая дрожжевой SMT3, имеют сходную трехмерную структуру, которая подобна структуре убиквитина и характеризуется плотно уложенными бета-слоями, обернутыми вокруг единственной альфа-спирали [Bayer et al., 1998, J Mol Biol, 280:275-286]. Как и другие члены семейства УПБ белки SUMO из различных организмов синтезируются в виде предшественников, содержащих C-концевые удлинения размером от 2 до 12 аминокислотных остатков, которые являются продолжением консервативного С-концевого мотива Гли-Гли [Müller et al., 2001, Nature, 2:202-210]. Несмотря на различные С-концевые удлинения и довольно низкую степень гомологии аминокислотных последовательностей, например дрожжевого SUMO и SUMO-1 человека (47%), протеиназа Ulp1 дрожжей S.cerevisiae способна процессировать оба белковых предшественника [Mossessova E., Lima С.D., 2000, Mol. Cell, 5:865-876].
Протеиназа Ulp1 относится к семейству цистеиновых протеиназ ULP. Каталитический домен протеиназы Ulp1 локализован в С-концевой области белка, в частности полноценной ферментативной активностью обладает ее С-концевой фрагмент размером 275 аминокислотных остатков [Li S.-J., Hochstrasser M., 2003, J Cell Biol, 160:1069-1081; Butt et al., 2005, Protein Express Purif, 43:1-9] (в дальнейшем - протеиназа ULP275). Как и другие члены этого семейства in vivo протеиназа Ulp1 осуществляет деконьюгацию SUMO и меченых белков-мишеней, а также отвечает за процессинг нативного предшественника SUMO. Основными наиболее известными особенностями протеиназы Ulp1 являются две: 1) действие протеиназы Ulp1 направлено на гидролиз пептидных или изопептидных связей, соединяющих консервативный С-концевой дипептид Гли-Гли зрелого SUMO и аминокислотный остаток белка-мишени; 2) связываясь с белком-мишенью, протеиназы семейства ULP узнают не отдельный сайт, а трехмерную структуру белков SUMO [Butt et al., 2005, Protein Express Purif, 43:1-9; Wilkinson, 1997, FASEB J, 11:1245-1256; Chang C.H., Back S.H., 1999, Biochem Biophys Res Commun, 266:633-640].
Свойство нативной протеиназы Ulp1 и ее С-концевого фрагмента распознавать белок SUMO и его производные в составе коньюгатов и предшественников и осуществлять их высокоспецифичный и эффективный процессинг, практически независимо от природы аминокислотного остатка (исключая пролин), соединенного с консервативным С-концевым дипептидом Гли-Гли, лежит в основе использования искусственно созданных экспрессионных SUMO-систем. Их отличительной чертой является биосинтез целевых белков в виде гибридных предшественников, содержащих в N-концевой области последовательность белка SUMO или его производных, удаляемых, например, в ходе протеолитического процессинга in vitro [Malakhov et al., 2004, J Struct Funct Genom, 5:75-86; Marblestone et al., 2006, Protein Science, 15:182-189]. SUMO-системы используют для: 1) увеличения экспрессии белков в клетках эукариотических и прокариотических организмов; 2) увеличения растворимости экспрессируемых белков; 3) облегчения процесса очистки белков за счет включения в их состав аффинных N-концевых полипептидов; 4) получения белков с измененными N-концевыми остатками [Malakhov et al., 2004, J Struct Funct Genom, 5:75-86].
Известен слитый белок, состоящий из белка SUMO дрожжей и белка IkB человека [US6872551], который является рекомбинантным продуктом, его очищают из лизатов клеток Е.coli и расщепляют с помощью протеиназы Ulp1. Однако в отличие от IFN-α2 у белка IkB на стыке с SUMO отсутствует образующий дисульфидную связь остаток цистеина. Таким образом, Ulp1-процессинг гибрида SUMO-IkB приводит к высвобождению обычного аминоконцевого аминокислотного остатка белка IkB, а не прочного структурного элемента, содержащего дисульфидную связь, как это требуется в случае нативного безметионинового IFN-α2. По этой причине данные о результативности процессинга гибридных белков, подобных SUMO-IkB, не могли служить гарантией того, что Ulp1-процессинг будет эффективен и в отношении гибрида SUMO и нативного безметионинового IFN-α2. Сведений о биосинтезе слитого белка IFN-α2 с белком SUMO в источниках информации не обнаружено.
Таким образом, описанные выше свойства системы SUMO-протеиназа Ulp1 можно суммировать следующим образом: 1) известно, что протеиназа Ulp1 способна гидролизовать пептидную связь, соединяющую консервативный С-концевой дипептид Гли-Гли зрелого SUMO с любым последующим аминокислотным остатком (кроме пролина), который, в свою очередь, может быть связан единичной пептидной связью со следующим аминокислотным остатком; 2) известно, что протеиназа Ulp1 способна гидролизовать изопептидную связь, соединяющую консервативный С-концевой дипептид Гли-Гли зрелого SUMO с аминокислотным остатком белка (лизином), который, в свою очередь, может быть связан двумя пептидными связями с соседними аминокислотными остатками белка; 3) было неизвестно, способна ли протеиназа Ulp1 гидролизовать пептидную связь, соединяющую консервативный С-концевой дипептид Гли-Гли зрелого SUMO с аминокислотным остатком белка (цистеином), который связан с другими аминокислотными остатками белка одновременно пептидной и дисульфидной связями, т.е. входит в состав необычного структурного элемента белка. Однако именно такая активность протеиназы Ulp1 была необходима для гидролиза пептидной связи между С-концевым дипептидом SUMO и N-концевым цистеином нативного IFN-α2 человека.
Ближайшим аналогом заявляемых штаммов является рекомбинантный штамм E.coli КССМ 10053 - продуцент интерферона альфа-2b человека, содержащего N-концевой метионин [KR20000065580].
Ближайшим аналогом заявляемого способа является способ [KR20000065580] получения безметионинового интерферона альфа-2b человека путем его выщепления ферментом метионинаминопептидазой из состава синтезированного в клетках штамма E.coli КССМ 10053 белка-предшественника, являющегося метионин-содержащим интерфероном. Основным недостатком известного способа является необходимость проведения длительной (12-20 часов) ферментативной обработки белка-предшественника. Дополнительные трудности может вызывать последующий перевод безметионинового белка в биологически активное состояние в условиях, необходимых для формирования дисульфидных связей [Morehead et al., 1984, Biochemistry, 23:2500-7], а также процесс отделения целевого безметионинового интерферона от метионин-содержащего предшественника, вследствие их незначительного физико-химического отличия.
Задачей заявляемой группы изобретений является расширение арсенала способов получения безметионинового IFN-α2 человека.
Задачу решают путем конструирования:
- гена, кодирующего гибридный белок SUMO-2b - предшественник безметионинового интерферона альфа-2b, составной частью которого является последовательность безметионинового интерферона альфа-2b человека, слитая с последовательностью белка SUMO дрожжей Saccharomyces cerevisiae;
- штамма бактерий Escherichia coli ВКПМ В-10879 - продуцента гибридного белка SUMO-2b - предшественника безметионинового интерферона альфа-2b человека;
и разработки
- способа получения безметионинового интерферона альфа-2b человека путем микробиологического синтеза и выделения гибридного белка SUMO-2b - предшественника безметионинового интерферона альфа-2b, составной частью которого является последовательность безметионинового интерферона альфа-2b человека, слитая с последовательностью белка SUMO дрожжей Saccharomyces cerevisiae, с последующим ферментативным выщеплением из его состава безметионинового интерферона путем обработки протеиназой из семейства ULP в условиях, способствующих формированию в интерфероне правильно замкнутых дисульфидных связей.
Принципиальной частью гибридного белка SUMO-2b является слитый белок SUMIN, в состав которого входит последовательность безметионинового интерферона альфа-2b, слитая с аминокислотной последовательностью белка SUMO дрожжей с 13 по 98 аминокислотный остаток. Вместе с тем в составе гибридного белка, содержащего последовательность слитого белка SUMIN, может присутствовать дополнительное N-концевое удлинение слитого белка, не являющееся принципиальным для осуществления заявляемого способа.
Заявляемый способ основан на биосинтезе гибридного белка SUMO-2b - предшественника безметионинового интерферона альфа-2b, содержащего в своем составе последовательность слитого белка SUMIN, и на последующем высвобождении безметионинового интерферона альфа-2b из состава предшественника в ходе протеолитического процессинга с использованием протеиназы ULP275.
В основу заявляемого способа положен установленный нами факт, заключающийся в том, что в отличие от протеиназ, активность которых ингибируется поблизости от структурного элемента белка, содержащего дисульфидную связь [Hubbard et al., 1994, Protein Sci, 3:757-768; Hubbard et al., 1998, Protein Engineering, 11:349-359], протеиназа ULP275 способна эффективно гидролизовать пептидную связь вблизи такого структурного элемента. Эта открытая нами, ранее никем не описанная активность протеиназы ULP275 позволяет эффективно и корректно процессировать гибридный белок SUMO-2b, в составе которого последовательность SUMO соединена пептидной связью с первым аминокислотным остатком безметионинового интерферона, соединенном с другими аминокислотными остатками белка одновременно пептидной и дисульфидной связями. Как следствие, ферментативная обработка гибридного белка SUMO-2b протеиназой ULP275 приводит к высвобождению не обычной аминоконцевой последовательности, а целой N-концевой структуры безметионинового IFN-α2, содержащей корректно замкнутую дисульфидную связь.
Это впервые обнаруженное свойство системы SUMO, состоящей из заявляемого слитого белка SUMIN и протеиназы ULP275, дополняет список ранее известных свойств систем SUMO и расширяет возможности их применения.
Обнаруженное нами свойство системы SUMO используют в заявляемом способе, подвергая ферментативной обработке гибридный белок SUMO-2b, содержащий корректно установленные дисульфидные связи, что позволяет проводить ферментативное расщепление предшественника безметионинового IFN-α2 одновременно с его ренатурацией и приводит к значительному сокращению продолжительности процесса получения безметионинового IFN-α2.
Фермент протеиназу ULP275 для осуществления заявляемого способа получают с использованием сконструированного штамма E.coli ECR-ULP275 (пример 9). Биосинтез, выделение и очистку протеиназы ULP275 осуществляют как описано в примере 12.
Для осуществления заявляемого способа конструируют штаммы E.coli: заявляемый ВКПМ В-10879 и лабораторный Origami-SUMO-2b - продуценты гибридного белка SUMO-2b - предшественника безметионинового интерферона альфа-2b.
Процесс получения заявляемого штамма-продуцента гибридного белка SUMO-2b состоит из нескольких этапов.
Этап 1. Конструирование рекомбинантных плазмид.
Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК для экспрессии гена гибридного белка SUMO-2b осуществляют на основе лабораторного вектора рЕТ-22-15, являющегося производным векторов рЕТ-22b(+) и рЕТ-15b(+) (Novagen), обеспечивающего индуцируемую экспрессию генов в клетках E.coli под контролем промотора РНК-полимеразы Т7. Сконструированная плазмида pET-SUMO-2b помимо векторной части содержит фрагмент ДНК размером 800 пар оснований, кодирующий структурный ген гибридного белка SUMO-2b - предшественника безметионинового интерферона альфа-2b человека.
Этап 2. Трансформация штаммов-реципиентов.
2
В качестве штаммов-реципиентов используют штаммы E.coli BL21(DE3) и Origami 2(DE3) (Novagen), несущие в хромосоме ген РНК полимеразы фага Т7. Плазмиду pET-SUMO-2b вводят в клетки этих штаммов с помощью процесса трансформации. Клетки обоих штаммов подготавливают для трансформации с помощью обработки CaCl [Маниатис с соавт., 1984, Москва, Мир]. Трансформированные штаммы отбирают на селективной среде, содержащей антибиотик ампициллина-сульфат [Маниатис с соавт., 1984, Москва, Мир]. В результате трансформации получают штаммы E.coli: заявляемый, сконструированный на основе реципиентного штамма BL21(DE3), и лабораторный - на основе Origami 2(DE3). Полученные штаммы в ответ на внесение в среду культивирования индуктора ИПТГ [Маниатис с соавт., 1984, Москва, Мир] способны синтезировать гибридный белок SUMO-2b - предшественник безметионинового интерферона альфа-2b человека.
Заявляемый штамм депонирован во Всероссийской Коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) как штамм Escherichia coli ВКПМ В-10879 - продуцент предшественника безметионинового интерферона альфа-2b человека (гибридного белка SUMO-2b).
Свойства заявляемого штамма ВКПМ В-10879.
Морфологические.
Грамотрицательные слабоподвижные палочки с закругленными концами 1,5-2,0 мкм в длину.
Через 12 часов роста при температуре 37°С на агаре Луриа [Маниатис с соавт., 1984, Москва, Мир] образует беловатые полупрозрачные колонии диаметром 1,5-2,5 мм; поверхность колоний гладкая, края ровные, структура однородная, консистенция пастообразная, легко суспендируются в воде.
Через 40-48 часов роста при температуре 37°С на среде М9 [Маниатис с соавт., 1984, Москва, Мир] образует серовато-беловатые полупрозрачные, слегка выпуклые с блестящей поверхностью колонии диаметром 0,5-1,5 мм.
Физиолого-биохимические.
Аэроб, желатину не разжижает, индола не образует.
В качестве источника углерода усваивает глюкозу, сахарозу и различные органические кислоты, в некоторых случаях спирты: этанол, глицерин.
В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной и нитратной формах, так и органические соединения в виде аминокислот, пептона, триптона, дрожжевого экстракта и т.д.
В качестве минеральных солей используют фосфаты калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфаты железа и марганца, мел.
Устойчив к антибиотику ампициллину в концентрации 100 мкг/мл.
Растет при температуре 20-40°С рН 5,0-9,0.
Заявляемый штамм ВКПМ В-10879 и лабораторный Origami-SUMO-2b в ответ на индукцию с помощью ИПТГ или лактозы синтезируют гибридный белок SUMO-2b - предшественник безметионинового интерферона альфа-2b человека.
Условия хранения.
В лиофилизованном состоянии при температуре -70°С.
Для осуществления способа используют штаммы бактерий E.coli, несущие в составе плазмидной ДНК фрагменты ДНК, кодирующие синтез гибридного белка SUMO-2b - предшественника безметионинового интерферона альфа-2b человека.
Штаммы культивируют в подходящей питательной среде, включающей источники углерода, азота и минеральные соли, обычно используемые для выращивания клеток E.coli при температуре от 24 до 37°С [Маниатис с соавт., 1984, Москва, Мир]. По достижении культурами штаммов ранней логарифмической фазы роста в среду культивирования вносят индуктор ИПТГ в концентрации от 0,1 до 2 мМ или лактозу в концентрации от 0,5 до 3%. Через 0,5-10 часов роста клетки штаммов-продуцентов накапливают целевой белок SUMO-2b в виде нерастворимых телец включения в количестве от 5 до 30% от суммарного белка клеток. Нерастворимые тельца включения выделяют и очищают, а находящийся в их составе синтезированный гибридный белок SUMO-2b подвергают растворению [RU2319502].
Ренатурацию белка SUMO-2b проводят, как описано [RU2319502], за исключением того, что в ренатурационную смесь вносят фермент - протеиназу ULP275.
На этом этапе в общей ренатурационной смеси ведут одновременно три процесса, а именно: окончание ренатурации и формирования дисульфидных связей в составе целевого белка SUMO-2b, а также ферментативное удаление SUMO из его состава под действием добавленной протеиназы ULP275. Полученный целевой продукт - ренатурированный безметиониновый интерферон альфа-2b человека, содержащий корректно замкнутые дисульфидные связи, подвергают окончательной очистке.
8
Очищенный безметиониновый интерферон альфа-2b человека имеет следующие характеристики: чистота не ниже 96%, последовательность первых пяти N-концевых аминокислот идентична последовательности нативного безметионинового IFN-α2 человека, специфическая активность составляет 2,0×10 МЕ/мг.
Пример 1. Клонирование гена интерферона альфа-2b человека.
Ген интерферона альфа-2b человека амплифицируют в реакции ПЦР с использованием праймеров N466 (ataccatggaaaagagatgtgatctgcctcaaacccacagcctaggtagccgt) и N467 (atctcgagtcattctttacttcttaaggattcttgcaagttt) и матрицы на основе ДНК плазмиды pSX50 [RU2319502], при этом в 5'-концевую область структурного гена интерферона вводят уникальный сайт рестриктазы XmaJ1 без изменения аминокислотной последовательности кодируемого белка. Полученный в результате амплификации фрагмент ДНК размером 510 пар оснований (п.о.) элюируют из агарозного геля с использованием кита Qiagen (Qiagen, cat. №28706), обрабатывают рестриктазами NcoI и XhoI и клонируют в векторе pUC18-NX, содержащего в составе модифицированного полилинкера плазмиды pUC18 сайты NcoI и XhoI.
В результате получают плазмиду pUC18-IFN2b, в составе которой первичную структуру клонированного гена интерферона альфа-2b человека подтверждают путем определения его нуклеотидной последовательности по стандартной методике [Zimmermann J, Voss H, Schwager С, Stegemann J, Ansorge W. FEBS Lett. 1988; 233:432-436] с использованием стандартных pUC-праймеров.
Плазмида pUC18-IFN2b несет ген интерферона альфа-2b человека, в последовательности которого содержится уникальный сайт рестриктазы XmaJ1.
Пример 2. Клонирование гена SMT3 дрожжей S.cerevisiae и конструирование гена гибридного белка SUMO-2b.
Ген SMT3 амплифицируют в ходе ПЦР с использованием в качестве матрицы хромосомной ДНК штамма S.cerevisiae Y618 [Kartasheva et al., 1996, Yeast 12:1297-1300]. Амплификацию проводят в две стадии. Сначала амплифицируют два перекрывающихся фрагмента ДНК, для чего используют следующие пары праймеров:
Фрагмент 1 размером 129 п.о.:
N450 (5'-atatccatggaaaagagatctgactcagaagtcaatcaagaa)
N454 (5'-cttgaagaaaatctctgaa)
Фрагмент 2 размером 230 п.о.:
N453 (5'-ttcagagattttcttcaag)
N468 (5'-tacctaggctgtgggtttgaggcagatcacatccaccaatctgttctctgtga).
Амплифицированные фрагменты ДНК элюируют из агарозного геля как в примере 1, и их смесь используют для ПЦР-лигирования. Для этого проводят ПЦР-амплификацию на смеси фрагментов 1 и 2 в качестве матрицы. Праймерами для амплификации служат N450 и N468. Полученный в результате ПЦР фрагмент ДНК размером 340 п.о. элюируют из агарозного геля, обрабатывают рестриктазами NcoI и XmaJI и клонируют в плазмиде pUC18-IFN2b (Пример 1), содержащей ген интерферона альфа-2b и расщепленной по тем же сайтам. В результате клонирования получают плазмиду pUC18-SUMO-IFN2b, в составе которой нуклеотидную последовательность клонированного гена SMT3 подтверждают секвенированием.
Полученная плазмида pUC18-SUMO-IFN2b содержит уникальный фрагмент ДНК NcoI/XhoI размером 803 п.о., кодирующий ген гибридного белка SUMO-2b (SEQ ID NO:1), составной частью которого является слитый белок SUMIN (SEQ ID NO:2), представляющий собой последовательность безметионинового интерферона альфа-2b человека, прецизионно слитого с последовательностью белка SUMO дрожжей Saccharomyces cerevisiae.
Пример 3. Конструирование вектора рЕТ-22-15.
ДНК вектора pET-15b(+) (Novagen) расщепляют по уникальным сайтам MluI и NcoI, образовавшийся фрагмент ДНК размером 827 п.о. элюируют из агарозного геля, и клонируют в плазмиде pET-22b(+) (Novagen), расщепленной по тем же сайтам.
В результате клонирования получают вектор рЕТ-22-15, который используют для клонирования гена гибридного белка SUMO-2b.
Пример 4. Клонирование последовательности ДНК, кодирующей протеиназу ULP275.
Последовательность ДНК, кодирующую протеиназу ULP275, амплифицируют в ходе ПЦР с использованием в качестве матрицы хромосомной ДНК лабораторного штамма S.cerevisiae Y618. Праймерами для амплификации служат N447 (5'-atatggatcctctttggaaaggaaacataagga) и N448 (5'-attagaattctttaatgcatcggttaaaatcaaatgggcaat). Амплифицированный фрагмент ДНК размером 842 п.о. элюируют из агарозного геля как в примере 1, обрабатывают рестриктазами BamHI и EcoRI и клонируют в вектор pUC18-His, содержащий в составе полилинкера последовательность ДНК, фланкированную сайтами EcoRI и XhoI и кодирующую полипептид, состоящий из 6 остатков гистидина.
В результате получают плазмиду pUC18-ULP275, в составе которой подтверждают структуру гена ULP275 путем определения его нуклеотидной последовательности по стандартной методике.
Плазмида pUC18-ULP275 содержит уникальный BamHI/XhoI фрагмент ДНК, кодирующий протеиназу ULP275, несущую на С-конце последовательность из 6 остатков гистидина, отвечающую за связывание белка с Ni-NTA-сорбентом в условиях металлохелатной хроматографической очистки.
Пример 5. Получение плазмиды pET-SUMO-2b.
Рекомбинантная плазмида pET-SUMO-2b представляет собой совокупность SalI/NcoI фрагмента ДНК векторной плазмиды рЕТ-22-15 (пример 3) размером 5420 п.о. и NcoI/XhoI фрагмента ДНК плазмиды pUC18-SUMO-IFN2b (пример 2) размером 803 п.о., заключающего ген SUMO-2b - гибридного предшественника безметионинового интерферона альфа 2b.
Для получения плазмиды pET-SUMO-2b плазмиду pUC18-SUMO-IFN2b (пример 2) расщепляют с помощью рестриктаз NcoI и XhoI, образовавшийся фрагмент ДНК размером 803 п.о. элюируют из геля и лигируют с ДНК вектора рЕТ-22-15, расщепленного с помощью рестриктаз NcoI и SalI. Лигирование проводят с помощью ДНК-лигазы фага Т4. В результате получают плазмиду pET-SUMO-2b размером 6223 п.о.
Плазмида pET-SUMO-2b является экспрессионной, ее используют для биосинтеза гибридного белка SUMO-2b, необходимого для получения рекомбинантного безметионинового интерферона альфа-2b человека. В составе плазмиды pET-SUMO-2b ген гибридого белка SUMO-2b находится под контролем промотора фага Т7.
Пример 6. Получение плазмиды pET28-ULP275.
Плазмиду pET28-ULP275 получают на основе вектора pET28b(+) (Novagen) в несколько стадий. Сначала из состава вектора удаляют фрагмент ДНК, расположенный между сайтами рестрикции NcoI и BamHI. Для этого ДНК плазмиды pET28b(+) расщепляют с помощью рестриктаз Ncol и BamHI, образовавшиеся липкие концы достраивают до тупых с использованием фермента фрагмента Klenow ДНК-полимеразы I E.coli и лигируют с помощью ДНК-лигазы фага Т4. В результате получают плазмиду рЕТ28-NB1, в составе которой оказываются восстановлены оба использованных сайта рестрикции. На следующем этапе изменяют рамку считывания полипептида, инициируемого с кодона ATG, входящего в состав сайта NcoI. Для этого ДНК плазмиды pET28-NB1 расщепляют с помощью рестриктазы NcoI, образовавшиеся липкие концы достраивают до тупых с использованием фермента фрагмента Klenow ДНК-полимеразы I E.coli и лигируют с помощью ДНК-лигазы фага Т4. В результате получают плазмиду рЕТ28-NB2, которую используют для клонирования гена протеиназы ULP275.
Для получения плазмиды pET28-ULP275 плазмиду pUC18-ULP275 (пример 4) расщепляют с помощью рестриктаз BamHI и XhoI, образовавшийся фрагмент ДНК размером 855 п.о. элюируют из геля как в примере 1 и лигируют с ДНК вектора pET28-NB2, расщепленного с помощью рестриктаз BamHI и XhoI. В результате получают плазмиду pET28-ULP275 размером 6091 п.о.
Плазмиду pET28-ULP275 используют для биосинтеза протеиназы ULP275. В составе плазмиды pET28-ULP275 ген протеиназы ULP275 находится под контролем промотора фага Т7.
Пример 7. Конструирование заявляемого штамма E.coli ВКПМ В-10879.
2
В качестве штамма-реципиента используют штамм E.coli BL21(DE3) - ВКПМ В-6954. Плазмиду pET-SUMO-2b (пример 5) вводят в клетки реципиентного штамма с помощью процесса трансформации с применением реактива CaCl [Маниатис с соавт., 1984, Москва, Мир]. Трансформант отбирают на селективной среде, содержащей антибиотик ампициллина сульфат.
В результате трансформации получают заявляемый штамм, который депонирован во Всероссийской Коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) как Escherichia coli ВКПМ В-10879.
Штамм ВКПМ В-10879 несет экспрессионную плазмиду pET-SUMO-2b и в ответ на внесение в среду культивирования индуктора ИПТГ способен синтезировать гибридный белок SUMO-2b, который используют для получения безметионинового интерферона альфа-2b.
Пример 8. Конструирование лабораторного штамма E.coli Origami-SUMO-2b.
Для конструирования лабораторного штамма E.coli в качестве штамма-реципиента используют штамм E.coli Origami 2(DE3) (Novagen) - ВКПМ В-10187, несущий в хромосоме ген РНК полимеразы фага Т7. Конструирование штамма E.coli Origami-SUMO-2b осуществляют, как в примере 7.
В результате получают лабораторный штамм E.coli Origami-SUMO-2b, который несет экспрессионную плазмиду pET-SUMO-2b и в ответ на внесение в среду культивирования индуктора ИПТГ способен синтезировать гибридный белок SUMO-2b.
Пример 9. Конструирование штамма E.coli ECR-ULP275.
Штамм E.coli ECR-ULP275 получают методом, как в примере 8, за исключением того, что для трансформации реципиентного штамма E.coli BL21(DE3) - ВКПМ В-6954 используют плазмиду pET28-ULP275 (пример 7).
В результате трансформации получают штамм E.coli ECR-ULP275. Этот штамм несет экспрессионную плазмиду pET28-ULP275 и в ответ на внесение в среду культивирования индуктора ИПТГ способен синтезировать протеиназу ULP275, которую используют для получения безметионинового интерферона.
Пример 10. Биосинтез и выделение гибридного белка SUMO-2b из клеток заявляемого штамма ВКПМ В-10879.
Штамм выращивают в колбах, содержащих по 50 мл среды 2xYT состава (в мас.%): триптон - 1,6, дрожжевой экстракт - 1, NaCI - 0,5, вода - остальное, содержащей антибиотик канамицин в концентрации 40 мкг/мл в течение 16-18 часов на орбитальной качалке со скоростью 200-300 об/мин при температуре 37°С. Затем в колбы вносят по 50 мл свежей среды 2xYT, содержащей антибиотик ампициллина сульфат в концентрации 100 мкг/мл и индуктор ИПТГ в концентрации 80 мкМ. После этого продолжают культивирование в течение 3 часов.
Клеточную биомассу отделяют от среды центрифугированием (15000g).
Из полученной биомассы выделяют и проводят отмывку тел включения, содержащих нерастворимую форму белка SUMO-2b - предшественника безметионинового интерферона. Выделение и отмывку тел включения проводят так же, как выделение и очистку нерастворимой формы интерферона [RU2319502]. В результате получают грубую фракцию нерастворимых телец включения, содержащих предшественник безметионинового интерферона с выходом не менее 10% от сырого веса клеточной биомассы.
Пример 11. Биосинтез гибридного белка SUMO-2B клетками лабораторного штамма Origami-SUMO-2B.
Биосинтез гибридного белка SUMO-2b клетками лабораторного штамма Origami-SUMO-2b осуществляют как в примере 10, за исключением того, что штаммом-продуцентом служит лабораторный штамм Origami-SUMO-2b. В условиях индукции клетки лабораторного штамма Origami-SUMO-2b накапливают целевой белок SUMO-2b в количестве не менее 10% от суммарного белка клеток.
Пример 12. Биосинтез, выделение и очистка протеиназы ULP275.
2-3 индивидуальные колонии трансформированных клеток штамма ECR-ULP275 засевают в пробирки в 5 мл среды 2xYT, содержащей антибиотик канамицин в концентрации 40 мкг/мл и глюкозу в концентрации 20 г/л и выращивают в течение 16-18 часов на орбитальной качалке со скоростью 200-300 об/мин при температуре 37°С. Клетки собирают центрифугированием и суспендируют в 100 мл свежей среды 2xYT, содержащей антибиотик канамицин в концентрации 40 мкг/мл. Суспензию клеток переносят в колбы и культивируют в прежних условия в течение 1 часа, после чего к растущей культуре добавляют индуктор IPTG до концентрации 40 мкМ. Индукцию проводят в течение 3 часов, культивируя клетки в прежних условиях.
x
3-x
4
Клетки собирают центрифугированием (15000g) и суспендируют в 5 мл буфера для лизиса клеток (буфер LB) состава 50 мМ NaHPO, рН 8,0; 300 мМ NaCl; 20 мМ Имидазол рН 8,0; вода - остальное. К клеточной суспензии добавляют лизоцим до концентрации 1 мг/мл и выдерживают смесь в течение 30 минут во льду. Суспензию озвучивают во льду 6 раз по 30 секунд с 0.5-1.0' перерывами для охлаждения при мощности ультразвукового устройства 200-300 Вт. Лизат осветляют, подвергая его центрифугированию в течение 30 минут при 10000g при температуре 4°С.
x
3-x
4
Колонку, содержащую 1 мл Ni-NTA агарозы (Qiagen), промывают 5 мл буфера LB, после чего на колонку наносят осветленный лизат со скоростью потока 1 мл/мин. Промывают колонку последовательно 10 мл буфера LB, 10 мл промывочного буфера состава 50 мМ NaHPO, рН 6,0; 300 мМ NaCl; 10% глицерин; вода - остальное, содержащего Имидазол рН 6,0 в концентрации 20 мМ; и 5 мл промывочного буфера, содержащего Имидазол рН 6,0 в концентрации 150 мМ. После этого белок элюируют с колонки, используя 2 мл промывочного буфера, содержащего Имидазол рН 6,0 в концентрации 450 мМ. В полученный элюат вносят Твин-20 до концентрации 0,1%.
Полученный элюат диализуют против буфера, содержащего 50 мМ Трис-HCl рН 8,0, 150 мМ NaCl, 2 мМ дитиотрейтола и 0,1% Твин-20.
Концентрацию элюированного белка измеряют спектрофотометрически при длине волны 280 нм. Для расчетов концентрации белка используют коэффициент экстинкции Кэкс=0,94.
После измерения концентрации диализованный препарат белка протеиназы ULP275_разводят в 2 раза глицерином и хранят при -18°С.
Пример 13. Получение и очистка безметионинового интерферона альфа-2b человека.
Получение и очистку интерферона альфа-2b человека без N-концевого метионина с использованием гибридного белка SUMO-2b проводят в несколько этапов.
Этап 1. Растворение, ренатурация и процессинг гибридного белка SUMO-2b
К полученной суспензии тел включения, содержащих нерастворимую форму белка SUMO-2b (пример 10), добавляют сухой гуанидин гидрохлорид (конечная концентрация составляет 6 М) или мочевину (конечная концентрация - 8 М), раствор Трис-HCl, рН8,0 (конечная концентрация - 20 мМ), ЭДТА (конечная концентрация - 5 мМ), дитиотрейтол (конечная концентрация - 50 мМ). Полученную смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 2 часов. Нерастворенный материал удаляют центрифугированием (15000 g), а раствор подвергают стерилизующей фильтрации через мембрану с диаметром пор 0,22 мкм.
Ренатурацию белка SUMO-2b проводят путем разбавления полученного раствора в 100 раз буфером состава: 20 мМ Трис-HCl (рН 8,0), 35 мМ NaCI, 0,8 М мочевина, 0,1% Тритон Х-114, 1 мМ окисленного глутатиона, 1 мМ восстановленного глутатиона, вода - остальное. Ренатурацию ведут в течение 18 часов при температуре +5÷12°С и постоянном перемешивании со скоростью 80 об/мин.
По истечении указанного времени в ренатурационную смесь при перемешивании со скоростью 120 об/мин добавляют раствор, содержащий протеиназу ULP-275 из расчета 4 мг протеиназы на 12 г тел включения. Полученную смесь инкубируют в течение 3 часов при температуре +12°С при постоянном перемешивании со скоростью 80 об/мин.
Ферментативное расщепление белка SUMO-2b под действием протеиназы ULP-275 останавливают путем разбавления и закисления реакционной смеси. Для этого в реакционную смесь при перемешивании со скоростью 120 об/мин добавляют в указанной последовательности следующие компоненты:
- 0,25 М раствор ЭДТА, рН 8,0 до конечной концентрации 1 мМ;
- воду очищенную, охлажденную до температуры +5°С, до 25% от объема ренатурационной смеси;
- 2,5 М раствор натрия ацетата, рН 4,5, до конечной концентрации 12,5 мМ.
Полученную смесь фильтруют с использованием через фильтр с номинальным размером пор 0,45 мкм. Полученный раствор целевого белка называют - раствор Р.
Этап 2. Захват целевого белка
Все последующие стадии очистки безметионинового интерферона альфа-2b человека проводят с использованием системы жидкостной хроматографии Akta Purifier (GE Healthcare) при температуре +2÷8°С.
Процедуру захвата целевого белка проводят с использованием колонны XK 50/20 (GE Healthcare) с рабочим объемом 250 мл, содержащей сорбент карбоксиметил-сефарозу Fast Flow (GE Healthcare). Рабочая скорость потока - 30 мл/мин. Колонну уравновешивают 650 мл буфера В-8 состава 50 мМ натрия ацетата рН 5,0, 1 мМ ЭДТА, вода - остальное, после чего наносят раствор ренатурированного и процессированного целевого белка - раствор Р. После нанесения белка колонну промывают 4 л буфера В-8. Элюцию целевого белка проводят простым линейным градиентом 0-100% буфера В-9 состава 50 мМ натрия ацетата, 0,5 М натрия хлорида, 1 мМ ЭДТА, рН 5,5, вода - остальное, объем градиента 1200 мл. Элюцию безметионинового интерферона альфа-2b отслеживают по оптической плотности при длине волны 280 нм. Полученный на этом этапе раствор безметионинового интерферона альфа-2b называют - раствор СМ-1.
Этап 3. Обращенно-фазная хроматография
Процедуру проводят с использованием колонны с рабочим объемом 400 мл, содержащей сорбент С 18. Рабочая скорость потока - 50 мл/мин. Колонну уравновешивают 700 мл буфера А состава: 30% ацетонитрил, 0,2% трифторуксусная кислота, вода - остальное. После этого на колонну наносят раствор СМ-1 и промывают колонну 700 мл буфера А.
Элюцию безметионинового интерферона альфа-2b проводят сложным линейным градиентом 0-100% буфера В состава: 80% ацетонитрил, 0,2% трифторуксусная кислота, вода - остальное. Для элюции используют 3 л буфера В. Элюцию проводят последовательно по следующей схеме (буфер B в буфере А):
- 0-20% - 300 мл;
- 20-28% - 500 мл;
- 28-40% - 1,5 л;
- 40-60% - 600 мл;
- 60-100% - 100 мл.
Элюцию безметионинового интерферона альфа-2b отслеживают, измеряя при длине волны 280 нм оптическую плотность раствора элюата. При достижении значения 50 мУЕ начинают сбор фракций по 8 мл в стеклянные пробирки, содержащие по 4 мл буфера В-11. После элюции колонну промывают 700 мл буфера В.
Собранные фракции элюата анализируют методом ВЭЖХ. Фракции, содержащие безметиониновый интерферон альфа-2b с чистотой не менее 90%, объединяют и разводят в 3 раза буфером В-11 состава: 12,5 мМ натрия ацетата, 1 мМ ЭДТА, рН 4,5. Полученный раствор называют - раствор ОФ-1.
Этап 4. Концентрирование
Процедуру проводят с использованием колонны XK 50/20 (GE Healthcare) с рабочим объемом 250 мл, содержащей сорбент карбоксиметил-сефарозу Fast Flow (GE Healthcare). Рабочая скорость потока - 30 мл/мин. Колонну уравновешивают 650 мл буфера В-8, после чего наносят раствор ОФ-1 и промывают колонну 650 мл буфера В-8. Элюцию проводят при скорости потока 15 мл/мин простым линейным градиентом 0-100% буфера В-9 протяженностью 400 мл. Элюцию безметионинового интерферона альфа-2b отслеживают, измеряя при длине волны 280 нм оптическую плотность раствора элюата. При достижении значения 50 мУЕ осуществляют сбор фракций по 10 мл в стеклянные пробирки. После элюции колонну промывают 350 мл буфера В-9.
Собранные фракции элюата анализируют методом ВЭЖХ. Фракции, содержащие целевой белок с чистотой не ниже 96, пропускают через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм, после чего полученный раствор безметионинового интерферона альфа-2b называют - раствор СМ-2.
Этап 5. Гель-фильтрация
Процедуру проводят с использованием колонны (GE Healthcare) с рабочим объемом 1700 мл, содержащей сорбент Superdex-75 (GE Healthcare). Рабочая скорость потока - 5 мл/мин. Колонну уравновешивают 1,7 л буфера В-10 состава: 25 мМ натрия ацетата, 150 мМ натрия хлорида, 0,5 мМ ЭДТА, рН 5,1, вода - остальное, после чего наносят раствор СМ-2 и промывают колонну 1,7 л буфера В-10. Элюцию безметионинового интерферона альфа-2b отслеживают, измеряя при длине волны 280 нм оптическую плотность раствора элюата. При достижении значения 30 мУЕ осуществляют сбор фракций в стеклянные пробирки.
Собранные фракции элюата анализируют методом ВЭЖХ. Фракции, содержащие безметиониновый интерферон альфа-2b с чистотой не ниже 96%, объединяют и пропускают через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм.
В результате получают высокоочищенный (с чистотой не ниже 96%) препарат безметионинового интерферона альфа-2b человека.
th
Подлинность, концентрацию и чистоту белка в полученном препарате анализируют методом вертикального электрофореза в полиакриламидном геле с/без добавления ДТТ, с окрашиванием серебром, а также методом ВЭЖХ [Eur. Pharm., 5 ed.: 2004]. Описанный способ позволяет получить не менее 500 мг безметионинового интерферона альфа-2b из 10 г грубой фракции телец включения, содержащих белок SUMO-2b - предшественник безметионинового интерферона альфа-2b.
Пример 14. Определение N-концевой последовательности и специфической биологической активности интерферона альфа-2b.
Определяют последовательность пяти N-концевых аминокислот выделенного и очищенного интерферона альфа-2b (пример 13). Анализ проводят методом Эдмана [Edman, 1950] на секвенаторе Procise Sequencing System, model 492 (Applied Biosystems). Последовательность, определенная в результате анализа, в точности совпадает с последовательностью пяти первых аминокислотных остатков зрелого природного интерферона альфа-2 человека.
-5
-5
50
50
Специфическую биологическую активность выделенного и очищенного интерферона альфа-2b определяют методом La Bonnardiere & Laude [1981] в культуре перевиваемых линий клеток MDBK (АТСС № CCL-22), чувствительных к интерферону альфа-типа, в сравнении с международным стандартным образцом (МСО) (WHO International Standard INTERFERON ALPHA 2b, (Human rDNA derived) NIBSC code 95/566) против индикаторного вируса. В качестве индикаторного вируса используют вирус везикулярного стоматита (ВВС) штамм «Индиана» ГКВ ГУ НИИ Вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН (депозит №600) с инфекционным титром не менее 10 ТЦД/мл или вирус энцефаломиокардита мышей (ЕМС) ГКВ ГУ НИИ Вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН (депозит №787) с инфекционным титром не менее 10 ТЦД в 1 мл.
8
Специфическая активность полученного интерферона альфа-2b составляет 2,0×10 ME/мг.
Таким образом, заявляемая группа изобретений позволяет:
- упростить процесс получения биологически активного безметионинового IFN-α2 благодаря использованию эффективной системы ферментативного удаления N-концевого метионина;
- сократить трудозатраты, время и расход реактивов для его получения благодаря отсутствию необходимости раздельного проведения стадий ренатурации IFN-α2, формирования в нем дисульфидных связей и ферментативного удаления N-концевого метионина;
- облегчить решение задачи очистки нативного IFN-α2 от других продуктов реакции благодаря использованию в процессе ферментативного расщепления гибридного белка высокоэффективной и специфичной протеиназы ULP275, а также вследствие значительного различия физико-химических свойств безметионинового IFN-α2 и его гибридного предшественника.
К заявляемой группе изобретений приложены описания сконструированного штамма ECR-ULP275 - продуцирующего протеиназу ULP275, условия его культивирования, а также способы выделения и очистки синтезированной протеиназы.