СРЕДСТВО ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РЕВМАТОИДНОГО АРТРИТА
MEDICATION FOR TREATMENT OF RHEUMATOID ARTHRITIS

Техническая область
Настоящее изобретение относится к лекарственным средствам для лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена, которые содержат антитело к рецептору IL-6 в качестве активного ингредиента.
Предпосылки изобретения
IL-6 представляет собой цитокин с различными функциями и продуцируется различными видами клеток, такими, как Т-клетки, В-клетки, моноциты, фибробласты, остеобласты, кератиноциты, эндотелиальные клетки, мезангиальные клетки и синовиальные клетки (Непатентные документы 1 и 2). IL-6 связывается с IL-6-рецептором, и затем сигнал передается в клетки после связывания комплекса IL-6/рецептор IL-6 с gp130 (Непатентный документ 3). Существует два типа рецепторов IL-6: мембранного типа и растворимая форма. Растворимая форма рецептора IL-6 также может образовывать комплекс IL-6/рецептор IL-6 и, таким образом, способна обеспечивать передачу сигнала через связывание с gp130.
Ревматоидный артрит (РА) представляет собой системное воспалительное заболевание неизвестной причины, и его основными симптомами являются частые артриты и прогрессирующее разрушение суставов. Внесуставные симптомы включают распространение патологических изменений в легкие, почки и подкожные ткани. Отличительным признаком РА является устойчивый синовит, несмотря на то, что существуют различные системные симптомы. Патологической функциональной особенностью этого заболевания является разрушение хрящей, синовит, который вызывает эрозию костей и последующую функциональную потерю сустава. При РА происходит увеличение кровеносных сосудов в суставах, и лейкоциты, такие как лимфоциты и макрофаги, мигрируют из кровеносных сосудов в суставные синовиальные ткани. В суставе происходит местный иммунный ответ, где воспалительная реакция индуцируется действием цитокинов, произведенных из лимфоцитов и макрофагов. В результате, деструкция хрящей/костей прогрессирует.
in vitro
При РА наблюдается следующее: увеличивается скорость осаждения эритроцитов, возрастает уровень СРБ (C-реактивного белка), увеличивается число тромбоцитов, увеличивается уровень поликлональных иммуноглобулинов и присутствует ревматоидный фактор. Возникло предложение, что IL-6 вовлечен в эти изменения. Как сообщалось, уровень IL-6 повышен в сыворотке и суставной жидкости больных РА, и, таким образом, существует корреляция между уровнем IL-6 и степенью активности заболевания РА (Непатентные документы от 4 до 6). Также было показано, что у пациентов с РА продуцирование IL-6 в синовиальной ткани увеличено (Непатентный документ 7). Кроме того, сообщалось, что IL-6 вовлечен в резорбцию кости путем активирования дифференциации клеток-предшественников остеокластов в остеокласты в присутствии растворимого рецептора IL-6 (Непатентный документ 8). Эти обнаружения позволяют предположить, что IL-6 и растворимый рецептор IL-6 принимают участие в разрушении сустава. Действительно, в суставной жидкости больных РА уровень растворимого рецептора IL-6 повышен. Концентрации растворимого рецептора IL-6 и IL-6 являются достаточно высокими и сравнимы с уровнями, которые дают возможность индуцировать остеокласты (Непатентный документ 9). Таким образом, предполагается, что IL-6 вовлечен в различные процессы, такие как образование антител, инфильтрация лимфоцитов, образование паннуса, разрушение суставов, острофазовая реакция и анемия в патогенезе РА (Непатентный документ 10). Результаты недавних клинических исследований РА продемонстрировали отличный эффект гуманизированного антитела против IL-6R (TOCILIZUMAB), которое может связываться как с рецептором IL-6R мембранного типа, так и растворимым рецептором IL-6 и, тем самым, ингибировать IL-6-сигнал. Это говорит о том, что ингибирование рецептора IL-6 является высокоэффективным терапевтическим способом лечения РА (Непатентный документ 10).
Также известно, что, в дополнение к РА, TOCILIZUMAB является эффективным при лечении хронического артрита у детей и болезни Кастлемена.
Прототипные документы рассматриваемой области, связанные с настоящим изобретением, представлены ниже.
Прототипные документы рассматриваемой области
[Непатентные документы]
[Непатентный документ 1] Kishimoto T. The biology of interleukin-6. Blood 1989; 74: 1-10.
[Непатентный документ 2] Guerne PA, Zuraw BL, Vaughan JH, Carson DA, Lцtz M. Synovium 20 as a source of interleukin 6 in vitro. Contribution to local and systemic manifestations of arthritis. J Clin Invest 1989; 83: 585-92.
[Непатентный документ 3] Nishimoto N, Kishimoto T. Interleukin 6: from bench to bedside. Nature Clinical Practice Rheumatology 2006; 11: 19-26.
[Непатентный документ 4] Hirano T, Matsuda T, Turner M, Miyasaka N, Buchan G, Tang B, 25 Sato K, Shimizu M, Maini R, Feldmann M, Kishimoto T: Excessive production of interleukin 6/B cell stimulatory factor-2 in rheumatoid arthritis. European Journal of Immunology 1988; 18: 1797-1801.
[Непатентный документ 5] Houssiau FA, Devogelaer JP, Van Damme J, De Deuxchaisnes CN, Van Snick J: Interleukin-6 in synovial fluid and serum of patients with rheumatoid arthritis and 30 other inflammatory arthritides. Arthritis & Rheumatism. 1988; 31: 784-788.
[Непатентный документ 6] Madhok R, Crilly A, Watson J, Capell HA. Serum interleukin 6 levels in rheumatoid arthritis: correlations with clinical and laboratory indices of disease activity. Ann Rheum Dis 1993; 52:232-4.
[Непатентный документ 7] Sack U, Kinne RW, Marx T, Heppt P, Bender S, Emmrich F: 35 Interleukin-6 in synovial fluid is closely associated with chronic synovitis in rheumatoid arthritis. Rheumatolology International 1993; 13: 45-51.
[Непатентный документ 8] Tamura T, Udagawa N, Takahashi N, Miyaura C, Tanaka S, Yamada Y, Koishihara Y, Ohsugi Y, Kumaki K, Taga T, Kishimoto T, Suda T: Soluble interleukin-6 receptor triggers osteoclast formation by interleukin 6. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA 1993; 90: 11924-11928.
[Непатентный документ 9] Kotake S, Sato K, Kim KJ, Takahashi N, Udagawa N, Nakamura I, Yamaguchi A, Kishimoto T, Suda T, Kashiwazaki S: Interleukin-6 and soluble interleukin-6 receptors in the synovial fluids from rheumatoid arthritis patients are responsible for osteoclast- like cell formation. Journal of Bone & Mineral Research 1996; 11: 88-95.
[Непатентный документ 10] Inhibiting interleukin-6 in rheumatoid arthritis. Choy E. Curr 10 Rheumatol Rep. 2008 Oct; 10(5): 413-7.
Раскрытие изобретения
[Проблемы, разрешаемые путем изобретения]
Настоящее изобретение было осуществлено в свете вышеуказанных обстоятельств. Целью данного изобретения является предоставление лекарственных средств для лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена, которые включают в качестве активного ингредиента антитело к рецептору IL-6. Конкретнее, настоящее изобретение представляет лекарственные средства для лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена, которые включают в качестве активного ингредиента антитело против рецептора IL-6 с улучшенными антиген-нейтрализующей способностью, фармакокинетикой (сохранение в плазме), иммуногенностью, безопасностью и физико-химическими свойствами, благодаря замененным аминокислотам в Tocilizumab, которое применялось в качестве лекарственного средства для лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена.
[Средства для решения данных проблем]
Авторы настоящего изобретения создали антитела против рецептора IL-6 с улучшенной антиген-нейтрализующей способностью, фармакокинетикой (сохранение в плазме), иммуногенностью, безопасностью и физико-химическими свойствами, благодаря замененным аминокислотам в Tocilizumab, которое применялось в качестве лекарственного средства для лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена. Затем авторы настоящего изобретения показали, что фармацевтические вещества, включающие в качестве активного ингредиента описанное выше антитело против рецептора IL-6, полезны при лечении ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена.
Конкретнее, настоящее изобретение представляет следующие [1]-[3]:
[1] средство для лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена, которое включает в себя в качестве активного ингредиента описанное ниже антитело:
(a) антитело, которое содержит тяжелую цепь, включающую:
CDR1 (гипервариабельный участок 1), имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 (CDR1 VH3-M73),
CDR2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 (CDR2 VH3-M73), и
CDR3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 (CDR3 VH3-M73);
(b) антитело, которое содержит легкую цепь, включающую:
CDR1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 (CDR1 VL3),
CDR2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5 (CDR2 VL3), и
CDR3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6 (CDR3 VL3); или
(c) антитело, которое содержит тяжелую цепь, включающую:
CDR1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 (CDR1 VH3-M73),
CDR2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 (CDR2 VH3-M73), и
CDR3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 (CDR3 VH3-M73),
и легкую цепь, включающую:
CDR1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 (CDR1 VL3),
CDR2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5 (CDR2 VL3), и
CDR3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6 (CDR3 VL3);
[2] средство для лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена, которое включает в качестве активного ингредиента описанное ниже антитело:
(a) антитело, которое содержит тяжелую цепь, включающую вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 7 (вариабельная область VH3-M73);
(b) антитело, которое содержит легкую цепь, включающую вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 8 (вариабельная область VL3); или
(c) антитело, которое содержит тяжелую цепь, включающую вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 7 (вариабельная область VH3-M73), и легкую цепь, включающую вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 8 (вариабельная область VL3); и
[3] средство для лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена, которое включает в качестве активного ингредиента описанное ниже антитело:
(a) антитело, которое содержит тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 (VH3-M73);
(b) антитело, которое содержит легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10 (VL3); или
(c) антитело, которое содержит тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 (VH3-M73), и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10 (VL3).
Настоящее изобретение также предоставляет следующее:
[4] способ лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена, который включает стадию введения описанного ниже антитела:
(a) антитело, которое содержит тяжелую цепь, включающую:
CDR1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 (CDR1 VH3-M73),
CDR2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 (CDR2 VH3-M73), и
CDR3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 (CDR3 VH3-M73);
(b) антитело, которое содержит легкую цепь, включающую:
CDR1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 (CDR1 VL3),
CDR2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5 (CDR2 VL3), и
CDR3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6 (CDR3 VL3); или
(c) антитело, которое содержит тяжелую цепь, включающую:
CDR1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 (CDR1 VH3-M73),
CDR2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 (CDR2 VH3-M73), и
CDR3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 (CDR3 VH3-M73),
и легкую цепь, включающую:
CDR1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 (CDR1 VL3),
CDR2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5 (CDR2 VL3), и
CDR3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6 (CDR3 VL3);
[5] способ лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена, который включает стадию введения описанного ниже антитела:
(a) антитело, которое содержит тяжелую цепь, включающую вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 7 (вариабельная область VH3-M73);
(b) антитело, которое содержит легкую цепь, включающую вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 8 (вариабельная область VL3); или
(c) антитело, которое содержит тяжелую цепь, включающую вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 7 (вариабельная область VH3-M73), и легкую цепь, включающую вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 8 (вариабельная область VL3);
[6] способ лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена, который включает стадию введения описанного ниже антитела:
(a) антитело, которое содержит тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 (VH3-M73);
(b) антитело, которое содержит легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10 (VL3); или
(c) антитело, которое содержит тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 (VH3-M73), и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10 (VL3);
[7] применение описанного ниже антитела:
(a) антитело, которое содержит тяжелую цепь, включающую:
CDR1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 (CDR1 VH3-M73),
CDR2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 (CDR2 VH3-M73), и
CDR3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 (CDR3 VH3-M73);
(b) антитело, которое содержит легкую цепь, включающую:
CDR1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 (CDR1 VL3),
CDR2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5 (CDR2 VL3), и
CDR3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6 (CDR3 VL3); или
(c) антитело, которое содержит тяжелую цепь, включающую:
CDR1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 (CDR1 VH3-M73),
CDR2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 (CDR2 VH3-M73), и
CDR3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 (CDR3 VH3-M73),
и легкую цепь, включающую:
CDR1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 (CDR1 VL3),
CDR2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5 (CDR2 VL3), и
CDR3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6 (CDR3 VL3),
при производстве средства для лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена;
[8] применение описанного ниже антитела:
(a) антитело, которое содержит тяжелую цепь, включающую вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 7 (вариабельная область VH3-M73);
(b) антитело, которое содержит легкую цепь, включающую вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 8 (вариабельная область VL3); или
(c) антитело, которое содержит тяжелую цепь, включающую вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 7 (вариабельная область VH3-M73), и легкую цепь, включающую вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 8 (вариабельная область VL3),
при производстве средства для лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена;
[9] использование описанного ниже антитела:
(a) антитело, которое содержит тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 (VH3-M73);
(b) антитело, которое содержит легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10 (VL3); или
(c) антитело, которое содержит тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 (VH3-M73), и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10 (VL3)
при производстве средства для лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена;
[10] описанное ниже антитело для применения в способе лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена:
(a) антитело, которое содержит тяжелую цепь, включающую:
CDR1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 (CDR1 VH3-M73),
CDR2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 (CDR2 VH3-M73), и
CDR3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 (CDR3 VH3-M73);
(b) антитело, которое содержит легкую цепь, включающую:
CDR1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 (CDR1 VL3),
CDR2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5 (CDR2 VL3), и
CDR3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6 (CDR3 VL3); или
(c) антитело, которое содержит тяжелую цепь, включающую:
CDR1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 (CDR1 VH3-M73),
CDR2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 (CDR2 VH3-M73), и
CDR3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 (CDR3 VH3-M73),
и легкую цепь, включающую:
CDR1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 (CDR1 VL3),
CDR2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5 (CDR2 VL3), и
CDR3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6 (CDR3 VL3);
[11] описанное ниже антитело для применения в способе лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена:
(a) антитело, которое содержит тяжелую цепь, включающую вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 7 (вариабельная область VH3-M73);
(b) антитело, которое содержит легкую цепь, включающую вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 8 (вариабельная область VL3); или
(c) антитело, которое содержит тяжелую цепь, включающую вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 7 (вариабельная область VH3-M73), и легкую цепь, включающую вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 8 (вариабельная область VL3); и
[12] описанное ниже антитело для применения в способе лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена:
(a) антитело, которое содержит тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 (VH3-M73);
(b) антитело, которое содержит легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10 (VL3); или
(c) антитело, которое содержит тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 (VH3-M73), и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10 (VL3).
[Эффекты изобретения]
Средства для лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена, которые включают в качестве активного ингредиента антитело к рецептору IL-6, производимое при помощи настоящего изобретения, обладающее улучшенными антиген-нейтрализующей способностью, фармакокинетикой (поддержание в плазме), иммуногенностью, безопасностью и физико-химическими свойствами. Поэтому можно уменьшать частоту введения, и они могут оказывать пролонгированный терапевтический эффект.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 представляет собой график, демонстрирующий временную зависимость концентрации антитела в плазме после введения TOCILIZUMAB или Fv4-M73 в количестве 1 мг/кг яванским макакам.
Фиг. 2 представляет собой график, демонстрирующий временную зависимость концентрации СРБ в плазме после введения TOCILIZUMAB или Fv4-M73 в количестве 1 мг/кг яванским макакам.
Фиг. 3 представляет собой график, демонстрирующий временную зависимость соотношения несвязанного растворимого рецептора IL-6 в плазме после введения TOCILIZUMAB или Fv4-M73 в количестве 1 мг/кг яванским макакам.
Фиг. 4 представляет собой график, демонстрирующий ингибирующий эффект TOCILIZUMAB и Fv4-M73 на продуцирование MCP-1 синовиальными клетками, полученными из человеческих пациентов с РА.
Фиг. 5 представляет собой график, демонстрирующий ингибирующий эффект TOCILIZUMAB и Fv4-M73 на продуцирование VEGF синовиальными клетками, полученными из человеческих пациентов с РА.
Способ воплощения изобретения
Настоящее изобретение относится к средствам для лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена, которые включают в качестве активного ингредиента антитело, перечисленное ниже:
(a) антитело, которое содержит тяжелую цепь, включающую:
CDR1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 (CDR1 VH3-M73),
CDR2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 (CDR2 VH3-M73), и
CDR3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 (CDR3 VH3-M73);
(b) антитело, которое содержит легкую цепь, включающую:
CDR1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 (CDR1 VL3),
CDR2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5 (CDR2 VL3), и
CDR3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6 (CDR3 VL3); или
(c) антитело, которое содержит тяжелую цепь, включающую:
CDR1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 (CDR1 VH3-M73),
CDR2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 (CDR2 VH3-M73), и
CDR3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 (CDR3 VH3-M73),
и легкую цепь, включающую:
CDR1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 (CDR1 VL3),
CDR2, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5 (CDR2 VL3), и
CDR3, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6 (CDR3 VL3).
Настоящее изобретение также относится к средствам для лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена, которые включают в качестве активного ингредиента антитело, перечисленное ниже:
(a) антитело, которое содержит тяжелую цепь, включающую в вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 7 (вариабельная область VH3-M73);
(b) антитело, которое содержит легкую цепь, включающую вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 8 (вариабельная область VL3); или
(c) антитело, которое содержит тяжелую цепь, включающую вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 7 (вариабельная область VH3-M73), и легкую цепь, включающую вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 8 (вариабельная область VL3).
Настоящее изобретение также относится к средствам для лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена, которые включают в качестве активного ингредиента антитело, перечисленное ниже:
(a) антитело, которое содержит тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 (VH3-M73);
(b) антитело, которое содержит легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10 (VL3); или
(c) антитело, которое содержит тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 (VH3-M73), и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10 (VL3).
Настоящее изобретение также предоставляет антитела, содержащие аминокислотную последовательность, в которой одна или несколько аминокислот (как правило, 30 аминокислот или менее, предпочтительно 10 аминокислот или менее, более предпочтительно пять аминокислот или менее, и еще более предпочтительно, три аминокислоты или менее) изменены (заменены, удалены, добавлены, и/или встроены) или модифицированы в антителе по настоящему изобретению, содержащем описанную выше аминокислотную последовательность. Такие антитела, содержащие изменения или модификации аминокислотной последовательности, предпочтительно обладают активностью (антиген-связывающей активностью, антиген-нейтрализующей активностью и др.), эквивалентной таковой исходного антитела.
Кроме того, антитела, используемые в качестве антител по настоящему изобретению, могут представлять собой биспецифические антитела. Биспецифическое антитело относится к антителу, которое имеет вариабельные области в одной и той же молекуле антитела, которые узнают разные эпитопы. Биспецифическое антитело по настоящему изобретению может представлять собой биспецифическое антитело, которое узнает разные эпитопы на молекуле рецептора IL-6, или биспецифическое антитело, в котором один из антиген-связывающих участков узнает рецептор IL-6, а другой антиген-связывающий участок узнает другое вещество. Примеры антигенов, которые связываются с другим антиген-связывающим участком биспецифического антитела, которое сконструировано из рецептор IL-6-узнающего антитела по настоящему изобретению, включают IL-6, TNFα, TNFR1, TNFR2, CD80, CD86, CD28, CD20, CD19, IL-1α, IL-β, IL-1R, RANKL, RANK, IL-17, IL-17R, IL-23, IL-23R, IL-15, IL-15R, BlyS, лимфотоксин α, лимфотоксин β, лиганд LIGHT, LIGHT, VLA-4, CD25, IL-12, IL-12R, CD40, CD40L, BAFF, CD52, CD22, IL-32, IL-21, IL-21R, GM-CSF, GM-CSFR, M-CSF, M-CSFR, IFN- α, VEGF, VEGFR, EGF, EGFR, CCR5, APRIL и APRILR.
Каркасные области FRs, используемые для антител по настоящему изобретению, не являются особенно ограниченными и могут быть соответствующим образом отобраны специалистами в рассматриваемой области. Никаких особых ограничений не существует, однако, предпочтительнее использовать каркасные области, полученные от людей. Каркасные области FRs могут представлять собой каркасные области, имеющие изменение аминокислот в природной последовательности.
Константные области, использованные для антител по настоящему изобретению, не являются особенно ограниченными и могут быть соответствующим образом отобраны специалистами в рассматриваемой области. Никаких особых ограничений не существует, однако, предпочтительнее использовать константные области, полученные от людей. Константные области могут представлять собой константные области, имеющие изменение аминокислот в природной последовательности.
Описанные выше антитела по настоящему изобретению представляют собой антитела против рецептора IL-6, которые являются превосходящими по антиген-нейтрализующей способности, фармакокинетике (поддержание в плазме), иммуногенности, безопасности и/или физико-химическим свойствам. Антитела являются особенно полезными в качестве средств для лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена.
Антитела по настоящему изобретению можно производить способами, известными специалистам в рассматриваемой области.
Антитела по настоящему изобретению можно производить, например, при помощи следующей генно-инженерной методологии. Ген, кодирующий антитело по настоящему изобретению, конструируют и вставляют в соответствующий вектор; а затем вектор вводят в хозяина для продуцирования антитела (смотри, например, Borrebaeck C. A. K. and Larrick J. W. THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990).
Таким образом, настоящее изобретение представляет способы продуцирования антитела по настоящему изобретению, которые включают стадию культивирования клетки-хозяина, содержащей вектор, в который введен ген, кодирующий антитело по настоящему изобретению.
Конкретнее, настоящее изобретение представляет способы продуцирования антитела по настоящему изобретению, которые включают стадии:
(a) культивирование клетки-хозяина, содержащей вектор, в который введен ген, кодирующий антитело по настоящему изобретению; и
(b) получение антитела, кодируемого геном.
В частности, когда антитело производится с использованием клеток млекопитающих, ген такого антитела можно экспрессировать с использованием ДНК, в которой функционально соединены общеизвестный подходящий промотор, ген экспрессируемого антитела и сигнал полиаденилирования, расположенный ниже по течению от гена с 3'-стороны, или с использованием вектора, несущего ДНК. Примером промотора/энхансера является быстрый ранний промотор/энхансер цитомегаловируса человека.
Кроме того, в качестве промотора/энхансера, который можно использовать для экспрессии антитела по настоящему изобретению, можно использовать вирусные промоторы/энхансеры ретровирусов, вирусов полиомы, аденовирусов, вакуолизирующий обезьяний вирус 40 (SV-40) или подобные, или промоторы/энхансеры, полученные из клеток млекопитающих, такие как промотор/энхансер фактора элонгации 1α (HEF1α) человека или подобные.
et al
et al.
et al.
Экспрессию антитела можно легко осуществлять при помощи, например, способа Mulligan . (Mulligan, R. C. , Nature (1979) 277: 108-114) c использованием промотора/энхансера SV40, или способа Mizushima  (Mizushima, S. and Nagata, S. Nucleic Acids Res. (1990) 18: 5322) c использованием промотора/энхансера HEF1α.
E. coli,
et al.
et al.
et al.
et al.
et al.
В случае, когда антитело производится с использованием  антитело можно экспрессировать при помощи функционально связанного общераспространенного подходящего промотора, сигнальной последовательности для секреции антитела и гена антитела, который следует экспрессировать. Примеры промоторов включают промотор lacZ и промотор araB. Промотор lacZ можно использовать в соответствии со способом Ward  (Ward, E. S. , Nature (1989) 341: 544-546; Ward, E. S. , FASEB J. (1992) 6: 2422-2427), а промотор araB можно использовать в соответствии со способом Better  (Better, M. , Science (1988) 240: 1041-1043).
E. coli
et al.
В случае, когда продуцирование антитела осуществляется в периплазму , в качестве сигнальной последовательности для секреции антитела можно использовать сигнальную последовательность pelB (Lei, S. P.  J. Bacteriol. (1987) 169: 4379-4383). После отделения антител, продуцированных в периплазму, структуру антитела подвергают повторному сворачиванию и затем используют (смотри, например, WO 96/30394).
E. Coli,
Участок начала репликации можно получить из SV-40, вирусов полиомы, аденовирусов, вируса папилломы крупного рогатого скота (BPV) и подобных. Кроме того, для увеличения числа копий гена в клетке-хозяине экспрессионный вектор может содержать, в качестве селективного маркера, ген аминогликозид фосфотрансферазы (APH), ген тимидинкиназы (TK), ген ксантингуанинфосфорибозилтрансферазы (Ecogpt)  ген дигидрофолатредуктазы (dhfr) и подобное.
Для получения антител по настоящему изобретению можно использовать любую систему продуцирования.
in vitro
in vivo
in vitro
Системы продуцирования и пригодны в качестве систем для продуцирования антител. Системы продуцирования, в которых используются эукариотические клетки и прокариотические клетки, являются примерами систем продуцирования.
Xenopus laevis
Nicotiana tabacum
Saccharomyces cerevisiae
Aspergillus niger
Системы продуцирования, которые используют клетки животных, клетки растений или клетки грибков, являются доступными при использовании эукариотических клеток. Известные клетки животных включают (1) клетки млекопитающих, например, CHO, COS, миеломы, почек детеныша хомячка (ВНК), HeLa, Vero и подобные, (2) клетки земноводных, такие как ооциты , и (3) клетки насекомых, такие как sf9, sf21, Tn5 и подобные. Известные клетки растений включают клетки, полученные из , и эти клетки можно культивировать в качестве каллюсов. Известные клетки грибков включают дрожжи, например, рода Saccharomyces, как, например, , и мицелиальные грибы, например, рода Aspergillus, такие как .
E. coli
Bacillus subtilis.
Системы продуцирования, которые используют бактериальные клетки, являются доступными при использовании прокариотических клеток. Примеры бактериальных клеток включают и
in vitro
in vivo
Антитела можно получать путем введения представляющего интерес гена антитела в эти клетки при помощи трансформации, а затем культивирования этих трансформантов . Трансформанты можно культивировать с использованием известных способов. Например, в качестве питательной среды можно использовать DMEM, МЭМ, RPMI 1640 или IMDM, и это можно применять с добавлением сывороток, таких как фетальная телячья сыворотка (ФТС). Кроме того, антитела можно продуцировать путем передачи клеток с введенным геном антитела в брюшную полость или подобное у животных.
in vivo
С другой стороны, системы продуцирования  включают системы продуцирования с использованием животных и системы продуцирования с использованием растений. Млекопитающие, насекомые и т.п. используются в системах продуцирования с использованием животных.
Можно использовать млекопитающих, таких как коза, свинья, овца, мышь и крупный рогатый скот (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993). Альтернативно можно использовать насекомых, таких как шелковичный червь. При использовании растений можно использовать, например, табак.
et al.
Гены антител вводят в такие животные или растения, после чего антитела продуцируют в организме животных или растений, а затем извлекают. Например, ген антитела подготавливают в качестве слитого гена путем встраивания гена антитела в ген, кодирующий белок, который специфически производится в молоке, такой как ген β-казеина коз. Фрагменты ДНК, содержащие слитый ген, в которой был встроен ген антитела, затем инъецируют в эмбрионы козы, которые затем вводят в коз. Нужное антитело затем можно получать из молока, произведенного трансгенными козами, которые рождены козами, получившими эмбрионы, или их потомством. Для увеличения производства молока, содержащего представляющее интерес антитело, в трансгенных коз можно надлежащим образом вводить гормоны (Ebert, K.M. , Bio/Technology (1994) 12: 699-702).
et al.
Agrobacterium tumefaciens
Nicotiana tabacum
et al
В случае использования шелковичного червя, для инфицирования шелковичных червей применяют бакуловирусы, несущие ген представляющего интерес антитела, после чего представляющее интерес антитело получают из жидкостей организма (Maeda, S. , Nature (1985) 315: 592-594). В случае использования табака, ген представляющего интерес антитела встраивают в экспрессионный вектор растений, например, pMON 530, и вектор затем можно вводить в бактерию, как, например, . Бактерии затем используют для инфицирования табака, как, например, , после чего из листьев этого табака получают нужные антитела (Julian К.-С. Ma ., Eur. J. Immunol. (1994) 24: 131-138).
in vitro
in vivo
При продуцировании антитела с использованием системы продуцирования  или , как описано выше, каждую ДНК, кодирующую тяжелую цепь (H-цепь) или легкую цепь (L-цепь) антитела, можно по отдельности включать в экспрессионный вектор для одновременной трансформации клетки-хозяина, или альтернативно ДНК, кодирующие H-цепь и L-цепь, можно встраивать в один экспрессионный вектор, для трансформации клетки-хозяина (смотри Международную патентную заявку No. WO 94/11523).
Антитела, продуцируемые и экспрессируемые, как описано выше, можно выделять из внутреннего содержания клеток или из клеточного окружения или из организмов-хозяев, и затем очищать до гомогенности. Антитела, используемые в настоящем изобретении, можно выделять/очищать с помощью аффинной хроматографии. Колонки, используемые в аффинной хроматографии, включают, например, протеин-А колонки и протеин-G колонки. Носители, используемые для аффинной хроматографии, включают, например, HyperD, POROS и Sepharose F.F. Кроме того, возможно использование других традиционных способов выделения и/или очистки белков. Такие способы не являются особенно ограниченными.
Например, антитела по настоящему изобретению можно выделять/очищать с помощью соответствующим образом выбранных/скомбинированных хроматографий, фильтров, ультрафильтрации, высаливания, диализа и т.д., в дополнение к описанной выше аффинной хроматографии. Такие хроматографии включают, например, ионообменную хроматографию, гидрофобную хроматографию и гель-фильтрацию, и могут применяться для высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Кроме того, возможно использование обращенно-фазовой ВЭЖХ.
Концентрацию антитела, подготовленного, как описано выше, можно определить путем измерения оптической плотности, иммуноферментным анализом (ИФА) или т.д. В частности, в случае измерения оптической плотности раствор антитела разводят PBS(-) и измеряют оптическую плотность при длине волны 280 нм. Концентрацию рассчитывают по оптической плотности (1,35 OD=1 мг/мл). Альтернативно, в случае использования ИФА химический анализ может проводиться по следующей методике. А именно, 100 мкл антител козла к IgG человека (TAG) в разведении 1 мкг/мл в 0,1 М бикарбонатном буфере (pH 9,6) добавляют к 96-луночному планшету (Nunc) и инкубируют в течение ночи при 4°C для иммобилизации антител. После блокирования к планшету добавляют соответствующим образом разведенное антитело по настоящему изобретению, соответствующим образом разведенный образец, содержащий антитело, или IgG (CAPPEL) человека в качестве стандарта (100 мкл), затем планшет выдерживают в течение одного часа при комнатной температуре.
После промывки добавляют 100 мкл разведенных в 5000 раз антител к IgG человека, меченных щелочной фосфатазой (BIO SOURCE), и инкубируют один час при комнатной температуре. После промывки добавляют раствор субстрата и инкубируют, и оптическую плотность измеряют при 405 нм, используя ридер для микропланшетов Model 3550 (Bio-Rad), для расчета концентрации представляющего интерес антитела.
3
125
125
Активность антитела, используемого в настоящем изобретении, по ингибированию IL-6-обусловленной передачи сигнала можно оценить с помощью традиционных способов, известных специалистам в рассматриваемой области. Например, IL-6 добавляют к культурам IL-6-зависимых миеломных клеточных линий человека (S6B45 и KPMM2), T-клеточной линии лимфомы Леннерта человека KT3 или IL-6-зависимой клеточной линии MH60.BSF2; и накопление H-тимидина IL-6-зависимыми клетками определяют в присутствии ингибитора IL-6. Альтернативно, культивируют экспрессирующие рецептор IL-6 клетки U266, и к культуре одновременно добавляют I-меченый IL-6 и ингибитор IL-6, и затем определяют I-меченый IL-6, связанный с клетками, экспрессирующими рецептор IL-6. В дополнение к группе ингибиторов IL-6, в описанные выше тест-системы включают группу отрицательного контроля без ингибитора IL-6. IL-6-ингибирующую активность ингибитора IL-6 можно оценить путем сравнения результатов для обеих групп.
Антитела, используемые в настоящем изобретении, могут представлять собой фрагменты антител или модифицированные продукты этого, при условии, что они могут соответствующим образом использоваться в настоящем изобретении. Например, такие фрагменты антител включают Fab, F(ab')2, Fv и отдельную цепь Fv (scFv) и sc(Fv)2, в которой Fvs H- и L-цепей связываются вместе с помощью соответствующих линкеров.
Антитела, используемые в настоящем изобретении, также включают модифицированные антитела, такие как антитела, связанные с различными молекулами, такими как полиэтиленгликоль (ПЭГ). Здесь «антитело» включает такие модифицированные антитела. Такие модифицированные антитела можно получать путем химической модификации полученного антитела. Такие способы ранее были приняты в данной области.
Tocilizumab, которое представляет собой гуманизированное антитело против рецептора IL-6 человека, было одобрено в Японии в качестве лекарственного средства для лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей (например, подростковый идиопатический артрит, который действует в большинстве суставов, и системный подростковый идиопатический артрит) и болезни Кастлемена.
Описанные выше антитела по настоящему изобретению представляют собой антитела, у которых антиген-нейтрализующая способность, кинетика в крови, иммуногенность, безопасность и физико-химические свойства были улучшены путем изменения аминокислот в Tocilizumab. Само собой разумеется, что описанные выше антитела по настоящему изобретению обладают тем же терапевтическим эффектом, что и Tocilizumab, и, таким образом, могут использоваться в качестве лекарственных средств для лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей и болезни Кастлемена.
Лекарственные средства по настоящему изобретению можно вводить в виде фармацевтического препарата и можно вводить системно или местно при помощи перорального или парентерального способов. Например, можно выбрать внутривенное введение, внутримышечное введение, внутрибрюшинное введение, подкожное введение, введение при помощи суппозиториев, инфузию в толстую кишку или кишечнорастворимое средство для перорального введения. Соответствующий способ введения можно выбрать в зависимости от возраста пациента и симптомов. В большинстве случаев, эффективную дозу выбирают в пределах диапазона от 0,01 до 100 мг/кг массы тела при каждом введении. Альтернативно, дозу можно выбрать в пределах диапазона от 1 до 1000 мг/пациента, предпочтительно в пределах диапазона от 50 до 250 мг/пациента. Предпочтительную дозу также могут подобрать специалисты в рассматриваемой области.
Лекарственные средства по настоящему изобретению могут содержать фармацевтически приемлемые носители, такие как консерванты и стабилизаторы. «Фармацевтически приемлемый носитель» означает материал, который можно вводить совместно с описанными выше лекарственными средствами и который может оказывать или может не оказывать вышеописанный терапевтический эффект. Альтернативно, такой носитель может представлять собой материал, который не обладает терапевтическим эффектом, но создает дополнительный или синергический стабилизирующий эффект, в случае применения в комбинации с антителом.
Примеры фармацевтически приемлемых материалов включают стерилизованную воду, физиологический раствор, стабилизаторы, наполнители, буферы, консерванты, сурфактанты, комплексообразующие средства (например, ЭДТК) и связующие вещества и тому подобное.
В настоящем изобретении, примеры сурфактантов включают неионный сурфактант. Типичные примеры включают сорбитановые эфиры жирных кислот, такие как сорбитановый эфир монокаприловой кислоты, сорбитановый эфир монолауриловой кислоты или сорбитановый эфир монопальмитиновой кислоты; глицериновые эфиры жирных кислот, такие как глицериновый эфир монокаприловой кислоты, глицериновый эфир мономиристиновой кислоты или глицериновый эфир моностеариновой кислоты; полиглицериновые эфиры жирных кислот, таких как декаглицериновый эфир моностеариновой кислоты, декаглицериновый эфир дистеариновой кислоты или декаглицериновый эфир монолинолевой кислоты; полиоксиэтиленсорбитановые эфиры жирных кислот, таких как полиоксиэтиленсорбитановый эфир монолауриловой кислоты, полиоксиэтиленсорбитановый эфир моноолеиновой кислоты, полиоксиэтиленсорбитановый эфир моностеариновой кислоты, полиоксиэтиленсорбитановый эфир монопальтитиновой кислоты, полиоксиэтиленсорбитановый эфир триолеиновой кислоты или полиоксиэтиленсорбитановый эфир тристеариновой кислоты; полиоксиэтиленсорбитоловые эфиры жирных кислот, такие как полиоксиэтиленсорбитоловый эфир тетрастеариновой кислоты, полиоксиэтиленсорбитоловый эфир тетраолеиновой кислоты; полиоксиэтиленглицероловые эфиры жирных кислот, такие как полиоксиэтиленглицероловый эфир моностеариновой кислоты; полиэтиленгликолевые эфиры жирных кислот, такие как полиэтиленгликолевый эфир дистеариновой кислоты; полиоксиэтиленалкиловые эфиры, такие как полиоксиэтиленлауриловый эфир; полиоксиэтиленполиоксипропиленалкиловый эфир, такой как полиоксиэтиленполиоксипропиленгликоль, полиоксиэтиленполиоксипропиленпропиловый эфир или полиоксиэтиленполиоксипропиленцетиловый эфир; полиоксиэтилен алкилфениловый эфир, такой как полиоксиэтилен нонилфениловый эфир; полиоксиэтиленовые затвердевшие касторовые масла, такие, как полиоксиэтиленовое касторовое масло, или полиоксиэтиленовое затвердевшее касторовое масло (полиоксиэтиленовое гидрогенизированное касторовое масло); полиоксиэтиленовые производные пчелиного воска, такие как полиоксиэтиленсорбитоловый пчелиный воск; полиоксиэтиленланолиновые производные, такие как полиоксиэтиленланолин; и полиоксиэтиленамид жирных кислот с гидрофильно-липофильным балансом (HLB) от 6 до 18, такой как полиоксиэтиленстеариламид.
В качестве сурфактантов можно также перечислить анионные сурфактанты. Типичные примеры анионных сурфактантов могут включать алкилсульфатные соли, имеющие алкильную группу от 10 до 18 атомов углерода, такие как цетилсульфат натрия, лаурилсульфат натрия или олеилсульфат натрия; полиоксиэтиленалкилэфирсульфатные соли, чей средний моль добавленного этиленоксида составляет от двух до четырех, и число атомов углерода в алкильной группе составляет от 10 до 18, такие как полиоксиэтиленлаурилсульфат натрия; солей алкилсульфосукцинатных эфиров с числом атомов углерода в алкильной группе от 8 до 18, как, например, натриевая соль лаурилсульфосукцинатного эфира; природные сурфактанты, такие как лецитин или глицерофосфолипид; сфингофосфолипиды, такие как сфингомиелин; и сахарозные эфиры жирных кислот с числом атомов углерода в жирной кислоте от 12 до 18.
Один или комбинацию из двух или нескольких из этих сурфактантов можно добавлять в лекарственные средства по настоящему изобретению. Предпочтительным сурфактантом для использования в препаратах по настоящему изобретению является полиоксиэтиленсорбитановый эфир жирных кислот, как например, Полисорбат 20, 40, 60, 80 или подобные, где особенно предпочтительными являются Полисорбат 20 и 80. Также является предпочтительным полиоксиэтиленполиоксипропиленгликоль, представленный Poloxamer (например, Pluronic F-68).
Количество добавляемого сурфактанта различается в зависимости от типа используемого сурфактанта, но для Полисорбата 20, Полисорбата 80 или Полоксамера 188 составляет, как правило, 0,0001-10% (масса/объем), предпочтительно 0,001-5% и более предпочтительно 0,005-3%.
Буферы по настоящему изобретению включают такие, как буферы на основе фосфорной кислоты, лимонной кислоты, уксусной кислоты, яблочной кислоты, винной кислоты, янтарной кислоты, молочной кислоты, фосфата калия, глюконовой кислоты, каприловой кислоты, дезоксихолевой кислоты, салициловой кислоты, триэтаноламина, фумаровой кислоты, других органических кислот, буфер на основе угольной кислоты, трис-буфер, гистидиновый буфер, имидазольный буфер и т.п.
Растворенные составы можно подготовить путем растворения в водных буферах, известных в области растворенных составов. Концентрация буфера, как правило, составляет 1-500 мМ, предпочтительно 5-100 мМ и даже более предпочтительно 10-20 мМ.
Лекарственные средства по настоящему изобретению могут дополнительно включать другие низкомолекулярные полипептиды, белки, такие как сывороточный альбумин, желатин и иммуноглобулин, аминокислоты, сахара и углеводы, такие как полисахариды и моносахариды, и сахарные спирты.
Примеры аминокислот по настоящему изобретению включают основные аминокислоты, такие как аргинин, лизин, гистидин и орнитин, и неорганические соли этих аминокислот (предпочтительно в форме хлоридных солей и фосфатных солей, или конкретнее, фосфаты аминокислот). В случае использования свободных аминокислот, рН доводят до предпочтительного значения путем добавления подходящего физиологически приемлемого буфера, как, например, неорганических кислот, в частности, соляной кислоты, фосфорной кислоты, серной кислоты, азотной кислоты, муравьиной кислоты или их солей. В таких случаях, использование соли фосфорной кислоты является особенно полезным, поскольку можно получить особенно стабильный лиофилизированный продукт. Это особенно полезно, когда препарат в существенной степени не содержат органические кислоты, такие как яблочная кислота, винная кислота, лимонная кислота, янтарная кислота или фумаровая кислота, или когда соответствующий анион (ион малата, ион тартрата, ион цитрата, ион сукцината, ион фумарата или подобные) не присутствуют. Предпочтительными аминокислотами являются аргинин, лизин, гистидин или орнитин. Кроме того, можно использовать кислые аминокислоты, такие как глутаминовая кислота и аспарагиновая кислота и соли этого (предпочтительно натриевые соли); нейтральные аминокислоты, такие как изолейцин, лейцин, глицин, серин, треонин, валин, метионин, цистеин, или аланин; или ароматические аминокислоты, такие как фенилаланин, тирозин, триптофан или его производное N-ацетилтриптофан.
Примеры сахаров и углеводов, таких как полисахариды и моносахариды, по настоящему изобретению включают декстран, глюкозу, фруктозу, лактозу, ксилозу, маннозу, мальтозу, сахарозу, трегалозу и раффинозу.
Примеры сахарных спиртов по настоящему изобретению включают маннитол, сорбитол, инозитол и подобные.
В случае, когда фармацевтическое средство по настоящему изобретению используется в виде водного раствора, применяемого для инъекций, раствор можно смешивать с, например, физиологическим раствором и изотоническими растворами, которые содержат глюкозу или другие дополнительные вещества, такие как D-сорбитол, D-маннозу, D-маннитол и хлорид натрия. Раствор можно также комбинировать с соответствующими солюбилизирующими веществами, такими как алкоголь (например, этанол), полиалкоголь (например, пропиленгликоль или ПЭГ), или неионные сурфактанты (например, полисорбат 80 или HCO-50).
При желании можно включать разбавители, солюбилизирующие вещества, средства для поддержания pH, успокаивающие средства, серосодержащие восстановители и антиоксиданты.
N
N
Примеры серосодержащих восстановителей по настоящему изобретению включают -ацетилцистеин, -ацетилгомоцистеин, тиоктовую кислоту, тиодигликоль, тиоэтаноламин, тиоглицерол, тиосорбитол, тиогликолевую кислоту и соли этого, тиосульфат натрия, глутатион и соединения, несущие сульфгидрильные группы, такие как тиоалканоидные кислоты с числом атомов углерода от одного до семи.
Примеры антиоксидантов по настоящему изобретению включают эриторбовую кислоту, дибутилгидрокситолуол, бутилгидроксианизол, α-токоферол, токоферолацетат, L-аскорбиновую кислоту и ее соли, L-аскорбилпальмитат, L-аскорбилстеарат, бисульфит натрия, сульфит натрия, триамилгаллат, пропилгаллат и комплексообразующие вещества, такие динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТК), пирофосфат натрия и метафосфат натрия.
et al.
et al.
Если необходимо, фармацевтические препараты можно заключать в микрокапсулы (микрокапсулы, изготовленные из гидроксиметилцеллюлозы, желатина, поли[метилметакрилата] или подобных), или помещать в коллоидные системы доставки лекарственных средств (как, например, липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсия, наночастицы и нанокапсулы) (смотри, например, «Remington's Pharmaceutical Science 16th edition», Осло, Ed., 1980). Способы подготовки фармацевтических средств как фармацевтических средств с контролируемым высвобождением, также хорошо известны, и такие способы можно примененять в настоящем изобретении (Langer , J. Biomed. Mater. Res. (1981) 15: 167-277; Langer, Chem. Tech. (1982) 12: 98-105; Патент США No. 3773919; Европейская (EP) заявка на патент No. 58481; Sidman , Biopolymers (1983) 22: 547-556; EP 133988). Кроме того, объем жидкости для подкожного введения может быть увеличен путем добавления или смешивания гиалуронидазы к средству (например, смотри WO 2004/078140).
Используемые фармацевтически приемлемые носители должным образом выбираются из числа упомянутых выше или их комбинаций, в соответствии с лекарственной формой, но не ограничиваются этим.
Настоящее изобретение относится к способам лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена, которые включают стадию введения субъекту лекарственного средства по настоящему изобретению. Здесь, «субъект» относится к организму или части тела организма, в который вводится лекарственные средства по настоящему изобретению. Организмы включают в себя животных (например, человека, разновидности домашних животных и диких животных), но не ограничиваются специфически этим. Описанные выше «части тела организма» не особенно ограничены.
В настоящем изобретении, выражение «вводить» включает в себя пероральное или парентеральное введение. Пероральное введение включает введение в форме пероральных средств, и лекарственные формы для пероральных средств можно выбрать из гранул, порошков, таблеток, капсул, растворенных средств, эмульсий, суспензий и подобных.
Парентеральное введение включает введение впрыскиваемой формы, примеры которой включают внутривенное введение, подкожное введение, внутримышечное введение и внутрибрюшинное введение. Кроме того, эффектов способов по настоящему изобретению можно достичь путем введения, составленного из олигонуклеотидов гена, предназначенного для введения в живой организм с помощью способов генной терапии. Фармацевтические средства по настоящему изобретению можно применять местно в подвергаемом лечению участке. Например, средства можно вводить путем местных инфузий или с помощью катетера во время операции, или путем целевой генной доставки ДНК, кодирующей пептид по настоящему изобретению.
Лекарственные средства по настоящему изобретению можно вводить субъекту после развития симптома заболевания, или профилактически до его развития.
Настоящее изобретение также относится к использованию антител по настоящему изобретению при производстве средств для лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена. Кроме того, настоящее изобретение относится к антителам по настоящему изобретению для применения в способах лечения ревматоидного артрита, хронического артрита у детей или болезни Кастлемена.
Аминокислоты, содержащиеся в аминокислотных последовательностях по настоящему изобретению, можно посттрансляционно модифицировать (например, модификация N-концевого глютамина на пироглютаминовую кислоту путем пироглютамизации хорошо известна специалистам в данной области). Естественно, такие посттрансляционно модифицированные аминокислоты включены в аминокислотные последовательности по настоящему изобретению.
Escherichia coli
Далее, цепи сахаров, которые связаны с антителами по настоящему изобретению, могут быть любой структуры. Цепь сахаров в положении 297 (нумерация ЕС) может представлять собой цепь сахаров любой структуры (предпочтительно фукозилированная сахарная цепь), или в этом положении может отсутствовать присоединение какой-либо цепи сахаров (например, этого можно достичь путем продуцирования антител в  или путем внесения изменений таким образом, чтобы в позиции 297, по нумерации ЕС, не присоединялась никакая цепь сахаров).
Все цитируемые здесь ссылки прототипов включены в этом описании в качестве ссылки.
ПРИМЕРЫ
Ниже в данном документе, настоящее изобретение будет конкретно описано со ссылкой на Примеры, однако их не следует рассматривать в качестве ограничения этого.
[ПРИМЕР 1] РК/PD-тест антител к рецептору IL-6 человека на макаках
TOCILIZUMAB (H-цепь WT-IgG1/SEQ ID NO: 13; L-цепь WT-kappa/SEQ ID NO: 14), а также Fv4-M73 (H-цепь VH3-M73/SEQ ID NO: 9; L-цепь VL3-kappa/SEQ ID NO: 10), в которое была введена аминокислотная замена или подобное, для улучшения антиген-нейтрализующей способности, кинетики в крови, иммуногенности, безопасности и физико-химических свойств TOCILIZUMAB, экспрессировали и очищали при помощи способов, известных специалистам в рассматриваемой области (смотри справочный пример для способов). Эти антитела оценивались по их эффекту в качестве лекарственного средства для лечения ревматоидного артрита, по следующей методике.
Каждое из TOCILIZUMAB и Fv4-M73 внутривенно вводили однократно в дозе 1 мг/кг яванским макакам, чтобы оценить их временную кривую концентрации в плазме крови (смотри справочный пример для способа). Временные кривые концентрации в плазме для TOCILIZUMAB и Fv4-M73 после внутривенного введения продемонстрированы на Фиг. 1. Результат показал, что Fv4-M73 обнаружил значительное улучшение фармакокинетики у яванских макак по сравнению с TOCILIZUMAB.
Оценивалась эффективность каждого из антител по нейтрализации рецептора IL-6 мембранного типа яванского макака. IL-6 яванского макака подкожно вводили в область поясницы в количестве 5 мкг/кг ежедневно с Дня 6 по День 18 после введения антител (с Дня 3 по День 10 для TOCILIZUMAB), и концентрацию СРБ для каждого животного определяли через 24 часа (смотри справочный пример для способа). Временная кривая концентрации СРБ после введения каждого антитела показана на Фиг.2. Для оценки эффективности каждого антитела по нейтрализации растворимого рецептора IL-6 яванского макака, определяли концентрацию несвязанного растворимого рецептора IL-6 яванского макака в плазме крови яванских макак и рассчитывали долю несвязанного растворимого рецептора IL-6 (смотри справочный пример для способа). Временная кривая процентного содержания несвязанного растворимого рецептора IL-6 после введения каждого антитела показана на Фиг. 3.
Fv4-M73 нейтрализовало рецептор IL-6 мембранного типа яванского макака более устойчивым образом и подавляло повышение СРБ в течение более длительного периода, по сравнению с TOCILIZUMAB. Кроме того, Fv4-M73 нейтрализовало растворимый рецептор IL-6 яванского макака более устойчивым образом и подавляло повышение несвязанного растворимого рецептора IL-6 яванского макака в течение более длительного периода по сравнению с TOCILIZUMAB. Эти результаты показывают, что Fv4-M73 превосходит TOCILIZUMAB в поддержании нейтрализации рецептора IL-6 мембранного типа и растворимого рецептора IL-6.
[ПРИМЕР 2]
Известно, что хемоатрактантный белок моноцитов (MCP)-1 вовлечен в клеточную инвазию моноцитов, T-клеток, NK-клеток и базофилов. Сообщалось, что MCP-1 сильно экспрессируется в синовиальной ткани/синовиальной жидкости больных РА (J. Clin. Invest., Sep 1992; 90(3): 772-9) и, как считается, вовлечен в патологическое состояние РА (Inflamm Allergy Drug Targets, Mar 2008; 7(1): 53-66).
VEGF является мощным ангиогенным фактором и, как известно, продуцируется, например, макрофагами, фибробластами и синовиальными клетками в синовиальной мембране больных РА (J. Rheumatol., Sep 1995; 22(9): 1624-30). Кроме того, уровень VEGF в сыворотке крови больных РА коррелирует с активизацией болезни и рентгенографическим прогрессированием заболевания (Arthritis Rheum., Jun 2003; 48(6): 1521-1529; и Arthritis Rheum., Sep 2001; 44(9): 2055-64), и уровень VEGF в сыворотке крови снижается при лечении больных РА антителом против IL-6R TOCILIZUMAB; поэтому VEGF, как считается, также играет важную роль в патологическом состоянии РА (Mod. Rheumatol. 2009; 19(1): 12-9; and Mediators Inflamm. 2008; 2008: 129873).
Таким образом, проверялось, могут ли TOCILIZUMAB и Fv4-M73 ингибировать продуцирование MCP-1 и VEGF синовиальными клетками, полученными от РА-пациентов человека, которое происходит от стимулирования sIL-6R и IL-6.
4
2
2
Синовиальные клетки, полученные от РА-пациентов человека (TOYOBO), засевали в 96-луночные планшеты в среду IMDM, содержащую 5% FCS, в концентрации 2×10 клеток/0,05 мл/лунку и помещали на 90 минут в СО-инкубатор (37°C, 5% СО). Добавляли 0,05 мл TOCILIZUMAB и Fv4-M73, разведенных до соответствующих концентраций, планшеты оставляли еще на 15 минут, затем добавляли 0,05 мл растворимого рецептора IL-6 (SR344: подготовленного в соответствии со способом, описанным в справочном примере). Планшеты оставляли еще на 30 минут, а затем добавляли 0,05 мл IL-6 (TORAY) (конечные концентрации растворимого рецептора IL-6 и IL-6 составляли 50 нг/мл для каждого). После двух дней культивирования собирали культуральные супернатанты, и концентрации MCP-1 и VEGF в культуральных супернатантах определяли с помощью ELISA kit (Biosource and Pierce Biotechnology). Результаты показаны на Фиг. 4 и 5. TOCILIZUMAB и Fv4-M73 ингибировали продуцирование MCP-1 и VEGF синовиальными клетками, полученными от РА-пациента человека, после стимулирования растворимым рецептором IL-6 и IL-6 зависящим от концентрации образом.
Соответственно, сохранение эффекта для Fv4-M73 как антитела, нейтрализующего рецептор IL-6 (эффект связывания с рецептором IL-6 и блокирование сигналов рецептора IL-6 мембранного типа и растворимого рецептора IL-6), значительно превосходит таковое для TOCILIZUMAB, частота введения и дозы могут быть значительно сокращены по сравнению с TOCILIZUMAB, и, кроме того, Fv4-M73 ингибирует продуцирование MCP-1 и VEGF синовиальными клетками, полученными от РА-пациента человека. Таким образом, было показано, что Fv4-M73 представляет собой очень эффективное лекарственное средство против РА.
Справочные примеры
Подготовка растворимого рекомбинантного рецептора IL-6 человека
et al
Растворимый рекомбинантный рецептор IL-6 человека рецептора IL-6 человека, который является антигеном, получали, как описано ниже. Была образована клеточная линия СНО, стабильно экспрессирующая растворимый рецептор IL-6 человека, содержащий последовательность от N-концевой 1-й до 344-й аминокислоты, опубликованной в J. Biochem. (1990) 108: 673-676 (Yamasaki ., Science (1988) 241: 825-828 (GenBank #X12830)). Растворимый рецептор IL-6 человека очищали из культурального супернатанта экспрессирующих SR344 клеток СНО при помощи трех хроматографий на колонках: хроматографии на колонке с Blue Sepharose 6 FF, аффинной хроматографии с использованием колонки с иммобилизованным антителом, специфическим для SR344, и гель-фильтрационной колоночной хроматографии. Фракцию, элюированную в качестве основного пика, использовали как окончательно очищенный образец.
Подготовка рекомбинантного растворимого рецептора IL-6 (cIL-6R) яванского макака
et al.
Олиго-ДНК праймеры подготавливали на основе раскрытой последовательности гена рецептора IL-6 макака-резуса (Birney , Ensembl 2006, Nucleic Acids Res. 2006 Jan 1; 34 (Database issue): D556-61). Фрагмент ДНК, кодирующий полный ген рецептора IL-6 яванского макака, подготавливали при помощи ПЦР с использованием праймеров и, в качестве матрицы, кДНК, полученной из поджелудочной железы яванского макака. Полученный в результате фрагмент ДНК был встроен в вектор для экспрессии в животной клетке, и с использованием вектора подготавливали линию СНО с устойчивой экспрессией (продуцирующая cyno.sIL-6R клеточная линия СНО). Культуральную среду продуцирующей cyno.sIL-6R линии СНО очищали с помощью колонки HisTrap (GE Healthcare Bioscience), а затем концентрировали при помощи Amicon Ultra-15 Ultracel-10k (Millipore). Окончательно очищенный образец растворимого рецептора IL-6 яванского макака (в дальнейшем cIL-6R) получали путем дальнейшей очистки на гель-фильтрационной колонке Superde×200pg16/60 (GE Healthcare Bioscience).
Подготовка рекомбинантного IL-6 (cIL-6) яванского макака
IL-6 яванского макака подготавливали в соответствии с методикой, описанной ниже. Подготавливали нуклеотидную последовательность, кодирующую 212 аминокислот, депонированную под SWISSPROT Accession No. P79341, и клонировали в вектор для экспрессии в клетках животных. Полученный в результате вектор вводили в клетки СНО для подготовки линии СНО с устойчивой экспрессией (продуцирующей cyno.IL-6R клеточной линии СНО). Культуральную среду продуцирующей cyno.IL-6R линии СНО очищали при помощи колонки SP-Sepharose/FF (GE Healthcare Bioscience) и затем концентрировали при помощи Amicon Ultra-15 Ultracel-5k (Millipore). Окончательно очищенный образец IL-6 яванского макака (в дальнейшем cIL-6) получали путем дальнейшей очистки на гель-фильтрационной колонке Superde×75pg26/60 (GE Healthcare Bioscience), а затем концентрировали при помощи Amicon Ultra-15 Ultracel-5k (Millipore).
Подготовка, экспрессия и очистка вариантов TOCILIZUMAB
5
TM
2
2
Плазмидные фрагменты, кодирующие нужные последовательности антител, встраивали в вектор для экспрессии в клетках животных, чтобы сконструировать экспрессионные векторы для представляющих интерес H-цепей и L-цепей. Нуклеотидные последовательности полученных экспрессионных векторов определяли способом, известным специалистам в рассматриваемой области. Антитела экспрессировали при помощи способа, описанного ниже. Клеточную линию HEK293H (Invitrogen), полученную из эмбрионального рака почек человека, суспендировали в DMEM (Invitrogen) с добавлением 10% фетальной сыворотки крови крупного рогатого скота (Invitrogen). Клетки засевали в чашки, в количестве 10 мл/чашка в чашки для приросших клеток (10 см в диаметре; CORNING) с плотностью клеток от 5 до 6×10 клеток/мл и культивировали в СО-инкубаторе (37°C, 5% СО) в течение одного полного дня и ночи. Затем среду удаляли отсасыванием и добавляли 6,9 мл среды CHO-S-SFM-II (Invitrogen). Подготовленную плазмиду вводили в клетки при помощи способа липофекции. Полученные в результате культуральные супернатанты собирали, центрифугировали (приблизительно 2000 g, 5 минут, комнатная температура) для удаления клеток и стерилизовали путем фильтрации через 0,22-мкм фильтр MILLEX(R)-GV (Millipore) для получения супернатантов. Антитела очищали из полученных культуральных супернатантов способом, известным специалистам в рассматриваемой области, с использованием rProtein A Sepharose Fast Flow (Amersham Biosciences). Для определения концентрации очищенного антитела измеряли оптическую плотность при 280 нм с использованием спектрофотометра. Концентрации антител рассчитывали по определенным значениям при помощи коэффициента поглощения, рассчитанного способом PACE (Protein Science (1995) 4: 2411-2423).
РК/PD-тест для определения концентрации антител в плазме концентрации СРБ и несвязанного растворимого рецептора IL-6 у макаков
Концентрации в плазме яванских макак определяли путем ELISA с помощью способа, известного специалистам. Концентрацию СРБ определяли при помощи автоматизированного анализатора (TBA-120FR; Toshiba Medical Systems Co.) с использованием Cias R СРБ (KANTO CHEMICAL CO., INC.). Концентрацию в плазме несвязанного растворимого рецептора IL-6 яванского макака у яванских макак определяли в соответствии с методикой, описанной ниже. Все антитела типа IgG (IgG яванского макака, антитело против рецептора IL-6 человека и комплекса антитела против рецептора IL-6 человека с растворимым рецептором IL-6 яванского макака) в плазме адсорбировали на протеин A путем нагружения плазмы крови яванского макака на соответствующее количество rProtein A Sepharose Fast Flow resin (GE Healthcare), высушенной в 0,22-мкм фильтрационной ячейке (Millipore). Затем, раствор в ячейке сливали с помощью высокоскоростной центрифуги для сбора раствора, который просочился. Раствор, который просочился, не содержит связанного с протеином А комплекса антитела против рецептора IL-6 человека с растворимым рецептором IL-6 яванского макака. Таким образом, концентрацию несвязанного растворимого рецептора IL-6 можно определять путем измерения концентрации растворимого рецептора IL-6 яванского макака в растворе, который просочился через протеин А. Концентрацию растворимого рецептора IL-6 яванского макака определяли при помощи способа, известного специалистам, для измерения концентрации рецептора IL-6 человека. Растворимый рецептор IL-6 яванского макака (cIL-6R), подготовленный, как описано выше, использовали в качестве стандарта. Процентное содержание несвязанного растворимого рецептора IL-6 рассчитывали по следующей формуле.