Способ количественного определения N-(фосфонометил)-глицина и N-(фосфонометил)-иминодиуксусной кислоты
METHOD FOR QUANTITATIVE DETERMINATION OF N-(PHOSPHONOMETHYL)-GLYCINE AND N-(PHOSPHONOMETHYL)-IMINODIACETIC ACID

Изобретение относится к аналитической химии, конкретно к методу ИК-спектрометрии и может быть использовано для количественного определения основных ингредиентов реакционной смеси, образующейся при каталитическом окислении N-(фосфонометил)иминодиуксусной кислоты (ФИДУК) пероксидом водорода с образованием N-(фосфонометил)глицина (глифосата). N-(фосфонометил)глицин - пестицид, арборицид, гербицид с широким спектром активности. Глифосат является действующим началом препаратов, применяющихся для борьбы с сорняками, в том числе в России (раундап, торнадо, утал, форсат, фосулен, цидокор, глиалка, глисол, глитан, глифонин, глицел, интосорг, нитосорг).
В литературе описаны способы анализа глифосата, а также продуктов его биоразложения, основанные на различных физико-химических методах [Кузнецова Е.М., Гринько А.П., Чмиль В.Д. Методы определения глифосата в сельскохозяйственном и продовольственном сырье и продуктах питания // Проблеми харчування. 2008. V. 3-4. P. 55; Arkan T.,  The role of derivatization techniques in the analysis of glyphosate and aminomethyl-phosphonic acid by chromatography // Microchem. J. Elsevier B.V. 2015. V. 121. P. 99].
Наиболее простые способы качественного определения глифосата в смеси с продуктами его разложения основаны на методе тонкослойной хроматографии (ТСХ), где для визуализации результата разделения смеси используют или реакцию первичных и вторичных аминогрупп с нингидрином [Зеленкова Н.Ф., Винокурова Н.Г. Определение глифосата и продуктов его биодеградации хроматографическими методами. Журн. Аналит. Химии, 2008. Т. 63, № 9, С. 958], или дериватизацию с образованием нитрозопроизводных [Young J.C., Khan S.U., Marriage P.B. Fluorescence detection and determination of glyphosate via its N-nitroso derivative by thin-layer chromatography // J. Agric. Food Chem. 1977. V. 25, № 4. P. 918]. При этом метод ТСХ можно также использовать для количественного анализа глифосата и его основного продукта разложения - N-аминометилфосфоновой кислоты (АМФК) [Методы определения микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде: Справочник. - Т. 2 / Сост. Клисенко М.А., Калинина А.А., Новикова К.Ф., Хохолькова Г.А. - М.: Агропромиздат, 1992. - 416 с]. Однако способы количественного определения методом ТСХ глифосата и ФИДУК при их совместном присутствии в смеси не описаны в технической литературе.
Описан способ анализа глифосата, основанный на методе ЯМР-спектроскопии [Cartigny B., Azaroual N., Imbenotte M., Mathieu D., Vermeersch G., Goullé J., Lhermitte M. Determination of glyphosate in biological fluids by 1H and 31P NMR spectroscopy // Forensic Sci. Int. 2004. V. 143, № 2-3. P. 141]. Существенными недостатками этого способа являются необходимость использования сложного оборудования (ЯМР-спектрометр) и высокие требования к квалификации обслуживающего персонала.
Известен способ количественного анализа глифосата в смеси с близким по строению природным гербицидом - глюфосинатом (RS-2-амино-4-гидроксиметилфосфоноилбутановая кислота) - и продуктами их разложения с использованием методов капиллярного электрофореза, где определение фосфоновых кислот после разделения смесей выполняют с использованием масс-спектрометрического детектора [Goodwin L., Startin J.R., Keely B.J., Goodall D.M. Analysis of glyphosate and glufosinate by capillary electrophoresis-mass spectrometry utilising a sheathless microelectrospray interface // J. Chromatogr. A. 2003. V. 1004, № 1-2. P. 107]. Однако подобных подходов к количественному определению глифосата в смеси с ФИДУК в литературе также не описано.
Известны способы количественного анализа смесей глифосата с его метаболитами, основанные на методе высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). При этом в качестве элюента, как правило, используют фосфатные буферные растворы. Прямое детектирование аналитов осуществляют с использованием фотометрических детекторов при длине волны 195 нм [Moye H.A., Boning A.J. A Versatile Fluorogenic Labelling Reagent for Primary and Secondary Amines: 9-Fluorenylmethyl Chloroformate // Anal. Lett. 1979. V. 12, № 1. P. 25]. Недостатком этого способа детектирования является его низкая чувствительность. Повышение чувствительности анализа возможно путем проведения предколоночной или постколоночной дериватизации аналитов с целью введения в молекулы фосфоновых кислот хромофорных групп, обладающих высокими значениями коэффициентов экстинкции в области УФ-излучения. Для предколоночной дериватизации используют такие реагенты, как 9-(фторметил)хлорформиат [Moye H.A., Boning A.J. A Versatile Fluorogenic Labelling Reagent for Primary and Secondary Amines: 9-Fluorenylmethyl Chloroformate // Anal. Lett. 1979. V. 12, № 1. P. 25], 5-диметиламинонафталин-1-сульфонилхлорид [Зеленкова Н.Ф., Винокурова Н.Г., Леонтьевский А.А. Определение аминсодержащих фосфоновых кислот и аминокислот в виде дансильных производных хроматографическими методами. Журн. Аналит. Химии, 2010. Т. 65, № 11, С. 1169]. Постколоночную дериватизацию выполняют с использованием системы орто-фталевый альдегид / меркаптоэтанол, при этом полученные производные определяют флуориметрическим детектором (λвозбуждения = 320 - 340 нм, λэмиссии = 340 - 380 нм) [Winfield T.W. Determination of glyphosate in drinking water by direct aqueous injection HPLC, postcolumn derivatization, and fluorescence detection / T.W. Winfield // EPA. - Method 547, 1990. - 16 p]. Использование масс-спектрометрических детекторов позволяет выполнять анализ с высокой степенью чувствительности без дериватизации аналитов. [Nagatomi Y., Yoshioka T., Yanagisawa M., Uyama A., Mochizuki N. Simultaneous LC-MS/MS Analysis of Glyphosate, Glufosinate, and Their Metabolic Products in Beer, Barley Tea, and Their Ingredients // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2013. V. 77, № 11. P. 2218].
Необходимо отметить, что все рассмотренные выше методы предназначены для количественного определения глифосата только в смеси с продуктами его биоразложения.
Известные способы количественного определения глифосата и ФИДУК в продуктах реакции окисления ФИДУК основаны на методе ВЭЖХ с прямым фотометрическим определением аналитов при длине волны 190-200 нм [Pinel C., Landrivon E., Lini H., Gallezot P. Effect of the Nature of Carbon Catalysts on Glyphosate Synthesis // J. Catal. 1999. V. 182, № 2. P. 515-519, Riley D.P., Fields D.L., Rivers W. Homogeneous catalysts for selective molecular oxygen driven oxidative decarboxylations // J. Am. Chem. Soc. 1991. V. 113, № 9. P. 3371, Riley D.P., Fields D.L. Electron transfer agents in metal-catalyzed dioxygen oxidations: effective catalysts for the interception and oxidation of carbon radicals // J. Am. Chem. Soc. 1992. V. 114, № 5. P. 1881].
Одним из недостатков этого метода является его низкая чувствительность, обусловленная тем, что значения коэффициентов молярной экстинкции аналитов относительно невысоки, т.к. в их молекулах присутствует только одна хромофорная функциональная группа - карбонильная. Вследствие этого максимумы поглощения исследуемых соединений, регистрируемые в диапазоне длин волн 200-800 нм, выражены нечетко, что приводит к значительной погрешности анализа. Использование метода ВЭЖХ для анализа продуктов реакции окисления ФИДУК также обладает рядом недостатков, к которым относятся сравнительно дорогостоящее и сложное оборудование, расходные материалы и реактивы, что осложняет количественный анализ глифосата и ФИДУК при совместном присутствии, особенно в условиях промышленного производства.
Вследствие низкой летучести аминофосфоновых кислот способы количественного определения глифосата и продуктов его разложения методом газовой хроматографии (ГХ) с использованием пламенно-ионизационного детектора или детектора по теплопроводности без модификации аналитов не имеют практической значимости и не описаны в технической литературе. Существующие способы анализа аминофосфоновых кислот предполагают предваряющую анализ модификацию (дериватизацию) данных соединений с получением летучих производных (дериватов). Для решения этой задачи описаны системы реагентов: трифторэтанол / трифторуксусный ангидрид [Deyrup C.L., Chang S.M., Weintraub R.A., Moye H.A. Simultaneous esterification and acylation of pesticides for analysis by gas chromatography. 1. Derivatization of glyphosate and (aminomethyl)phosphonic acid with fluorinated alcohols-perfluorinated anhydrides // J. Agric. Food Chem. 1985. V. 33, № 5. P. 944]; изобутиловый эфир муравьиной кислоты / диазометан [Kataoka H., Sakiyama N., Makita M. Gas chromatographic analysis of aminoalkylphosphonic acids and aminoalkyl phosphates // J. Chromatogr. A. 1988. V. 436, P. 67]; и ряд других систем. При этом для количественного анализа глифосата и ФИДУК при совместном присутствии, основанном на использовании метода ГХ, предложен способ, в основе которого лежит образование соответствующих летучих метилсилильных производных [RU 2753453, G01N 30/02, 16.08.2021]. Последнее является недостатком способа, поскольку требует использования дорогостоящих реактивов и дополнительного оборудования, необходимого для проведения реакции дериватизации аналитов.
Таким образом, значительное количество представленных в литературе методов количественного анализа глифосатсодержащих смесей основано на принципе их хроматографического разделения, общим недостатком которых является необходимость использования и дорогостоящего оборудования, и реактивов, и расходных материалов. В этой связи использование относительно простого и доступного метода ИК-спектрометрического анализа для решения задачи количественного определения глифосата и ФИДУК представляется практически значимым.
Гф
ФИДУК
-1
-1
Наиболее близким к предлагаемому решению является способ определения глифосата, основанный на использовании метода ИК-спектрометрии [Ющенко Д.Ю., Малышева Л.В., Баранова С.С., Хлебникова Т.Б., Пай З.П. Определение глифосата в продуктах окисления N-фосфонометилиминодиуксусной кислоты методом ИК-спектрометрии // Журн. Аналит. Химии, 2013. Т. 68, № 11, С. 1075]. В основе этого способа анализа лежит определение оптических плотностей D (при 1562 см) и D (при 721 см), пропорциональных мольным концентрациям глифосата и ФИДУК. При этом определяемые мольные концентрации глифосата () и ФИДУК () являются полуколичественными величинами и не позволяют оценить истинное содержание аналитов в образце. Последнее является недостатком прототипа.
Изобретение решает задачу эффективного способа количественного анализа глифосата и ФИДУК методом ИК-спектрометрии с использованием внутреннего стандарта.
Отличительным признаком предлагаемого технического решения является определение количественного содержания глифосата и ФИДУК при их совместном присутствии методом ИК-спектрометрии с использованием внутреннего стандарта. Для этого выполняют:
• пробоподготовку, которая заключается в добавлении к анализируемому образцу внутреннего стандарта - роданида калия (РК), с последующей регистрацией ИК-спектра образца, приготовленного в таблетке (матрице) из бромида калия KBr;
-1
• количественное определение глифосата и ФИДУК относительно внутреннего стандарта, основываясь на значениях оптических плотностей характеристических полос поглощения для глифосата, ФИДУК и роданида калия (1562, 721 и 747 см соответственно).
Технический результат - выполнение количественного анализа глифосата и ФИДУК в присутствии внутреннего стандарта (роданида калия) методом ИК-спектрометрии в матрицах (таблетках) из КBr с удовлетворительной точностью с получением воспроизводимых результатов.
Другими преимуществами предложенного способа являются:
- использование простого и доступного оборудования для проведения анализа;
- сокращение времени непосредственного анализа в сравнении с описанными методами жидкостной/газовой хроматографии для решения поставленной задачи.
Задача анализа глифосата и ФИДУК при их совместном присутствии (в частности, в пробах, отобранных из реакционных смесей), решается методом ИК-спектрометрического анализа в присутствии внутреннего стандарта.
Описание предлагаемого технического решения.
К навеске глифосата, или ФИДУК, или их смеси общей массой от 5.0 до 200.0 мг добавляют 20.0 мг роданида калия и тщательно перемешивают. Из полученной смеси отбирают навеску массой 8 мг и смешивают её с 300 мг безводного KBr, затем тщательно растирают в агатовой ступке и прессуют с получением таблетки.
-1
-1
-1
Задача количественного анализа глифосата и ФИДУК решается способом ИК-спектрометрического анализа путем сопоставления величин оптической плотности полос поглощения глифосата (1562 см, деф.), ФИДУК (721 см, вал.) и роданида калия (747 см, вал.). Характерный вид ИК-спектра смеси этих соединений приведен на рисунке (Фиг.) На этом изображении видно, что выбранные полосы индивидуальны и не перекрываются между собой.
Метод внутреннего стандарта заключается в том, что к навеске анализируемого вещества добавляют известное количество внутреннего стандарта - постороннего соединения, дающего в ИК-спектре хорошо разрешенный пик.
-1
-1
-1
Расчет содержания глифосата и ФИДУК в определяемой пробе выполняют, исходя из отношения величин оптической плотности полос поглощения глифосата (1562 см, деф.) или ФИДУК (721 см, вал.) к величине оптической плотности полосы поглощения роданида калия (747 см, вал.).
гф
Ф
Массу глифосата (М) и ФИДУК (М) в образце вычисляют по формулам:
,
1562
721
747
где D, D, D - величины оптических плотностей полос поглощения глифосата, ФИДУК и роданида калия в анализируемом образце соответственно;
Гф
Ф
К, К - поправочные коэффициенты чувствительности глифосата, ФИДУК, соответственно.
Метрологические характеристики предложенного способа определяют в соответствии с рекомендациями ICH [Ich. Validation of analytical procedures: text and methodology q2(r1) // International conference on harmonisation of technical requirements for registration of pharmaceuticals for human use. Geneva, switzerland, 2005], основываясь на стандартных методах [Statistics and chemometrics for analytical chemistry / J.C. Miller and J.N. Miller. / Harlow, England Pearson Prentice Hall, 2005]. Полученные значения приведены в таблице 1.
Таблица 1. Метрологические характеристики определения количества глифосата и ФИДУК (для навесок массой от 30 до 200 мг) в присутствии роданида калия (20.0 мг) с использованием метода ИК-спектрометрии (доверительный интервал, P=0.95).
Параметр
Глифосат
ФИДУК
Линейный диапазон, мг (количество точек)
6.0-200.0, (10)
7.0-200.0, (10)
Предел обнаружения, мг
11.9
13.2
Предел определения, мг
35.0
40.0
Поправочный коэффициент чувствительности, К
0.065±0.004
0.35±0.02
Стандартное отклонение для коэффициента чувствительности, σ
3.6
4.0
t - критерий, t
29.8
50.0
<img file="00000005.jpg" he="13" wi="25" img-content="undefined" img-format="jpg" />,где r - корреляционный момент, n - количество точек.
Экспериментальным путем обнаружено, что указанный технический результат обеспечивается именно совокупностью предложенных признаков, при реализации которых достигается количественное определения глифосата и ФИДУК в образце.
Оценку точности и воспроизводимости предложенного способа выполняют методом «введено-найдено» для серии модельных смесей, приготовленных таким образом, что они содержат глифосат или ФИДУК или их смесь, а также возможные побочные продукты, получающиеся при реализации промышленных процессов получения глифосата [Tian J., Shi H., Li X., Yin Y., Chen L. Coupling mass balance analysis and multi-criteria ranking to assess the commercial-scale synthetic alternatives: a case study on glyphosate // Green Chemistry. 2012. T. 14, № 7. C. 1990-1990. doi 10.1039/c2gc35349k].
Модельные смеси для оценки точности и воспроизводимости предложенного способа анализа (примеры 1-8) готовят следующим образом.
Пример 1.
0.95, 3
Точно взвешенное количество ФИДУК массой 200.0 мг, примеси общей массой 10.0 мг, а также 20.0 мг роданида калия смешивают и тщательно растирают в агатовой ступке с получением образца общей массой 230.0 мг. В качестве примесей используют аминометилфосфоновую кислоту и N-(метил)-аминофосфоновую кислоту в соотношении 1:1. Из модельной смеси отбирают навеску массой от 6 до 12 мг, смешивают в агатовой ступке с 300.0 мг бромистого калия (KBr), прессуют с получением таблетки и анализируют. Измерения проводят на ИК-спектрометре при температуре 15-30°С и влажности от 0 до 85%. Полученные результаты определения глифосата и ФИДУК приведены в таблице 2, количество измерений n = 3, доверительный интервал P = 0.95, коэффициент Стьюдента t = 4.3.
0.95, 3
Модельные смеси для оценки точности и воспроизводимости предложенного способа анализа (Примеры 2-8) готовят аналогичным образом с той разницей, что варьируют точно взвешенные количества ФИДУК и глифосата, при этом суммарная масса определяемых компонентов составляет 200.0 мг (таблица 2). Итоговая масса каждой навески модельной смеси составляет 230.0 мг. Полученные результаты оценки точности и воспроизводимости предлагаемого способа определения глифосата и ФИДУК приведены в таблице 2, количество измерений в каждой точке n = 3, доверительный интервал P = 0.95, коэффициент Стьюдента t = 4.3.
Таблица 2 - Результаты оценки точности и воспроизводимости предлагаемого способа определения глифосата и ФИДУК, выполненные на примере модельных смесей.
№примера
Введено, мг
Найдено, мг (σ)
Глифосат
ФИДУК
Глифосат
ФИДУК
1
200.0
-
198.3±6.5 (2.5)
-
2
165.0
35.0
164.7±6.2 (2.5)
29.3±5.2 (2.1)
3
160.0
40.0
159.3±3.8 (1.5)
40.3±2.9 (1.2)
4
120.0
80.0
120.3±5.2 (2.1)
79.3±3.8 (1.5)
5
80.0
120.0
79.7±3.8 (1.5)
121.0±4.9 (2.0)
6
35.0
165.0
34.3±3.8 (1.5)
164.3±5.2 (2.1)
7
30.0
170.0
23.3±6.2 (1.5)
171.0±6.5 (2.6)
8
-
200.0
-
200.3±7.5 (3.1)
σ - стандартное отклонение