СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЦИПРОФЛОКСАЦИНА В ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТАХ
METHOD OF CIPROFLOXACIN EVALUATION IN DRUG PREPARATIONS

Изобретение относится к высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с флуориметрическим детектором с использованием организованных сред, позволяющих более чем в 8 раз понизить предел обнаружения ципрофлоксацина в лекарственных препаратах и может быть использовано в анализе многокомпонентных лекарственных препаратов в практике контрольно-аналитических лабораторий фармацевтических предприятий и аптечной сети.
Ципрофлоксацин относится к группе фторхинолонов производных 4-хинолон-3-карбоновой кислоты и широко используется в клинической практике. Известны различные методы определения ципрофлоксацина и других антибиотиков группы фторхинолонов: микробиологические, например, диффузии в агар, спектрофотометрические, хроматографические, например высокоэффективная жидкостная хроматография.
Фармакопейный метод [Фирсов А.А., Алексеева M.Е., Кулешов С.У. // Хим.-фарм. журн. 1995. №3. С.24] определения основан на микробиологическом тесте, включающем диффузию антибиотика в агар (питательную среду) и сравнение угнетения роста тест-микроорганизма определенными концентрациями испытуемого препарата со стандартами антибиотика. Минимальная определяемая концентрация составляет 0.05 мкг/мл. Микробиологические способы широко распространены, просты и не требуют дорогостоящего оборудования. Кроме того, они обеспечивают удовлетворительную чувствительность и точность при терапевтических концентрациях фторхинолонов в исследуемых средах.
Однако они характеризуются длительностью анализа, зависимостью аналитического сигнала от свойств антибиотика (его растворимости, молярной массы и т.п.), не связанных с его активностью, чувствительностью тест-культур к качеству агара, используемого в способе.
2+
3+
Спектрофотометрический метод определения основан на образовании комплексов с ионами Сu или Fe [Kapetanovic V., Milovanovic I., Erceg M. / / Talanta. 1996. V.43. Р.2123.; Mathur S.C., Kumar Y., Murugesan N. // Indian Drugs. 1992. V.29. P.376], а также ионных ассоциатов с органическими реагентами ряда сульфофталеина [Tosunoglu S., Savci N. // Acta Pharm. Turc. 1993. V.35. P.1; Anal. Abstr. 1994. V.56. 3 G 49]. Этот метод определяет от 3 до 25 мг/мл ципрофлоксацина, невысокая чувствительность и низкая избирательность являются недостатком указанного метода, а в экстракционном варианте - необходимо использование токсичных органических растворителей.
Наиболее близким к предлагаемому техническому решению относится метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) для определения ципрофлоксацина в коровьем молоке [Tyczkowska K.L., Voyksner R.D., Anderson K.L. //J.Chromatogr. B. 1994. V.658. P.341] с помощью фотодиодного детектора.
К недостаткам метода можно отнести продолжительность определения (время разделения 15-20 мин), а также использование в качестве подвижной фазы высокотоксичного метанола.
Задачей изобретения является понижение предела обнаружения и расширение спектра исследуемых объектов - смеси антибиотиков группы фторхинолонов, хинолонов и тетрациклинов, например, в лекарственных формах, а также функциональных возможностей способа за счет использования организованных сред циклодекстринов, позволяющих модифицировать подвижную фазу и повысить интенсивность аналитического сигнала антибиотика при образовании комплекса включения состава антибиотик:γ-циклодекстрин 1:1.
Технический результат заключается в повышении чувствительности обнаружения при уменьшении времени, необходимого для анализа, и снижении токсичности.
Поставленная задача решается тем, что в способе количественного определения ципрофлоксацина в лекарственных препаратах, заключающемся в приготовлении двух одинакового объема проб разбавленного испытуемого раствора, добавляют реагент - γ-циклодекстрин и в одну из проб вводят стандартную добавку ципрофлоксацина, последовательно анализируют на жидкостном хроматографе с флуоресцентным детектором и обращено-фазовой хроматографической колонкой в изократическом режиме, используя в качестве подвижной фазы смесь ацетонитрил: ацетатно-аммиачный буфер (43:57 об./об., рН 4.3). Время удерживания ципрофлоксацина 2 мин. Расчет концентрации производят но формуле
x
ст
1
2
1
C=C·S/S-S,
ст
где С - стандартная добавка ципрофлоксацина мг/мл;
1
S - площадь пика ципрофлоксацина в исследуемом растворе;
2
S- площадь пика ципрофлоксацина в исследуемом растворе со стандартной добавкой;
x
С - искомая концентрация ципрофлоксацина в лекарственном препарате мг/мл.
Добавление указанного peaгента вызывает образование комплекса включения состава антибиотик:γ-циклодексирин 1:1. Это понижает предел обнаружения искомого вещества.
-2
-5
Исходный раствор ципрофлоксацина 0,25 мг/мл готовили растворением 0,0125 г его порошка, с содержанием основного вещества не менее 98% в 50 мл дистиллированной воды. Раствор γ-циклодексирина концентрации 1·10М приготовлен растворением в 25 мл дистиллированной воды 0.0324 г сухого вещества, содержащего не менее 98% основное компонента. Реакцию проводят в среде ацетатно-аммиачного буферного раствора в слабокислой среде с рH 4-5. Для построения градировочною графика в каждую из восьми пробирок вносили 1 мл ацетатно-аммиачного буферного раствора. 0.25 мл 5·10 М γ-циклодексирина, затем различные объемы исходного раствора ципрофлоксацина в диапазоне концентраций от 0.10-100 мкг/мл, разбавляли буферным раствором до общего объема 5 мл и из каждой пробирки отбирали аликвоту 50 мкл, которую вводили в хроматограф. В качестве подвижной фазы используют смесь ацетонитрил:ацетатно-аммиачный буфер (43:57 об./об., рН 4,3), время удерживания ципрофлоксацина 2 мин. Градуировочный график строили в координатах площадь пика - концентрация ципрофлоксацина. В таблице 1 представлены некоторые метрологические характеристики определения ципрофлоксацина.
Таблица 1Метрологические характеристики определения ципрофлоксацина в отсутствии и присутствии γ-циклодекстрина
Определяемый компонент
Реагент
Диапазон определяемых концентраций, мкг/мл
ПрО, мкг/мл
Уравнение градуировочного графика
r<sup>2</sup>
Ципрофлоксацин
-
2,5-100
1,7
y=17,6x+80,6
0,998
γ-циклодекстрин
0,25-75
0,2
y=28,5x+64,5
0,997
Ципрофлоксацин на фоне антибиотиков
-
2,5-100
1,4
y=15,4x+220
0,996
γ-циклодекстрин
0,25-75
0,2
y=26,6x+64.5
0,997
Как видно из таблицы, предел обнаружения ципрофлоксацина в присутствии γ-циклодекстрина понижается более чем в 8 раз.
Время удерживания составляет 2 мин, что сокращает время анализа. Кроме этого вместо токсичного растворителя метанола используется менее токсичный ацетонитрил.
Определение ЦФ в лекарственных препаратах. Разработанная методика апробирована на дозированных лекарственных препаратах, содержащих ципрофлоксацин - глазных каплях различного производства: «Ципролет» фирмы Dr.Reddy's laboratories (Индия), «Ципрофлоксацин» АКОС Синтез (г.Курган), «Ципромед» Promed Exports (Индия). Кроме определяемого ципрофлоксацина, лекарственный препарат содержит вспомогательные вещества: этилендиаминтетрауксусную кислоту, маннитол, ацетат натрия, уксусную кислоту.
Методика определения.
-3
Исследуемый раствор глазных капель разбавляют в 25 раз. Из полученного раствора отбирают в пробирку аликвоту 0.2 мл, добавляют 0.25 мл 5·10М γ-циклодекстрин и разбавляют до общего объема 5 мл ацетатно-аммиачным буферным раствором рН 4.3. Аликвоту полученного раствора 50 мкл вводят в хроматограф, измеряют площадь хроматографического пика ципрофлоксацина и по градуировочному графику определяют содержание ципрофлоксацина в лекарственных препаратах.
-3
Возможен второй вариант реализации. Исследуемый раствор глазных капель разбавляют в 25 раз. Из полученного раствора отбирают в две пробирки одинаковые аликвоты 0.2 мл, добавляют в каждую 0.25 мл 5·10 М γ-циклодекстрина и в одну из них стандартную добавку ципрофлоксацина (20-30 мкг/мл), растворы разбавляют до общего объема 5 мл ацетатно-аммиачным буферным раствором рН 4. Аликвоты полученных растворов 50 мкл последовательно вводят в хроматограф, измеряют площади хроматографических пиков ципрофлоксацина для обеих проб и по расчетной формуле определяют содержание ципрофлоксацина в лекарственных препаратах
x
ст
1
2
1
C=25·C·S/S-S,
ст
где С - стандартная добавка ципрофлоксацина мг/мл;
1
S - площадь пика ципрофлоксацина в исследуемом растворе;
2
S- площадь пика ципрофлоксацина в исследуемом растворе со стандартной добавкой;
x
C - искомая концентрация ципрофлоксацина в лекарственном препарате мг/мл.
Результаты определения представлены в таблице 2.
Таблица 2
Результаты определения ципрофлоксацина в лекарственных препаратах глазных капель* (n=5, Р 0,95)
Препарат
Найдено, мг/мл
S<sub>r</sub>
«Ципролет», Индия
2.62±0.07
0.03
«Ципрофлоксацин», Курган
2.49±0.15
0.06
«Ципpoмeд», Индия
2.29±0.05
0.02
r
r
i
i
2
Ѕ
*
где S - относительное стандартное отклонение, S S/χ, где S - стандартное отклонение, равное S=∑(χ-χ)/n-1), χ- единичный результат определения, χ - средний результат,  - указанное производителем содержание ЦФ - 3 мг/мл.
Контроль правильности определения осуществляли методом стандартных добавок.
Погрешность определения не превышает 0.06.
Предлагаемый способ может быть использован для определения ципрофлоксацина в присутствии других антибиотиков - окситетрациклина, тетрациклина, налидиксовой кислоты и флюмеквина. Рeзультaты определения, время удерживания оказанных антибиотиков и характеристики их хроматографического разделения представлены в таблице 3.
Taблицa 3Количественные хроматографические характеристики антибиотиков в присутствии γ-ЦД
Антибиотик
Время удерживания, мин
Площадь пика
R<sub>S</sub>
α
К'
N
ФТОРХИНОЛОНЫ
ЦФ
2,0
810,0
2,4
1,7
1,0
6,30·10<sup>3</sup>
ФЛ
12,8
47,25
11,9
11,6
5,3
1,22·10<sup>3</sup>
ТЕТРАЦИКЛИНЫ
ТТ
2,7
6,90
2,4
1,7
1,7
1,13·10<sup>3</sup>
ОТТ
6,2
642,7
5,2
5,3
2,8
2,96·10<sup>3</sup>
ХИНОЛОНЫ
НК
3,8
534,3
4,8
2,8
12
1,54·10<sup>3</sup>
S
S
R2
R1
1
2
R2
R1
1
2
R - разрешение пиков, R=(t-t)/{(w+w)/2}, где t, t - время удерживания двух соседних пиков, w, w - ширина пиков, измеренная при основаниях;
R
m
1
R
m
2
R
m
α - коэффициент селективности, α=(t-t)/(t-t), где t - время удерживания антибиотика, t - время пребывания антибиотика в подвижной фазе;
R
m
m
R
m
К' - фактор удерживания, (t-t)/t), где t - время удерживания антибиотка, t - время пребывания антибиотика в подвижной фазе;
R
R
2
N - число теоретических тарелок, N=16(t/W), t- удерживания, W - ширина пика у основания.
В качестве подвижной фазы используют подвижную фазу - смесь ацетонитрил: ацетатно-аммиачный буфер в соотношениях 43:57 об./об., рН=4.3.
-3
Правильность методики оценивали по результатам анализа модельных растворов, содержащих смесь антибиотиков, по методу «введено-найдено». Для приготовления модельных растворов в каждую из десяти пробирок вносили 1 мл ацетатно-аммиачного буферного раствора с рН 4.3, затем последовательно добавляли 0.25 мл 10 М γ-ЦД, 0.6-2.1 мл ЦФ с концентрацией от 0,10-100 мкг/мл, затем добавляли антибиотики в концентрации 50 мкг/мл и разбавляли буферным раствором до общего объема 5 мл. Из каждого раствора отбирали аликвоту 50 мкл и вводили ее в хроматограф. Характеристики хроматографического разделения антибиотиков представлены в таблице 3. Как видно из таблицы, предел обнаружения ципрофлоксацина на фоне других антибиотиков в присутствии γ-циклодекстрина понижается в 6.8 раз. Погрешность определения составляет не более 0.06.