Иммунногенный слитый белок
IMMUNOGENIC FUSED PROTEIN

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к области микробиологии и технологии получения вакцин, а также к разработке иммуногенного слитого белка, способного обеспечить иммунитет к инфекциям Streptococcus группы В. Более конкретно, настоящее изобретение относится к новому иммуногенному слитому белку, который придает иммунитет к инвазивным штаммам Streptococcus группы В. Оно также относится к выделенной нуклеотидной последовательности, кодирующей иммуногенный слитый белок; к вектору; к клетке-хозяину; к вакцине; и к способу предупреждения или лечения инфекции Streptococcus группы В.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Стрептококки группы В (Streptococcus agalactiae) (GBS) являются основной причиной инвазивных бактериальных инфекций, включая менингит, в неонатальном периоде. Только в Соединенных Штатах в настоящее время насчитывается примерно 5000 случаев в год инвазивного заболевания, вызванного этой бактерией. Общая смертность от этих инфекций составляет примерно 10% и многие из выживших младенцев имеют постоянные неврологические осложнения. В связи с этим были предприняты большие усилия для поиска способов предупреждения и лечения, а также анализа механизмов, посредством которых GBS вызывают инфекции.
GBS также может вызывать мастит у коров, заболевание крупного рогатого скота, которое имеет большое экономическое значение. Поэтому разработка вакцины против GBS-инфекций представляет интерес также и для ветеринарной медицины.
Примерно 20% всех женщин являются вагинальными носителями GBS, а вертикальная передача из материнской половой системы, вероятно, является наиболее распространенным источником инфекции при неонатальном заболевании, вызванном этой бактерией. Однако, только примерно 1% младенцев, которые колонизированы GBS при рождении, поражаются серьезной инфекцией. Следовательно, другие факторы, отличные от воздействия бактерий во время родов, должны вносить вклад в развитие неонатального заболевания.
Стрептококковые штаммы группы В разделены на девять серотипов (Ia, Ib и II-VIII) на основе структуры полисахаридной капсулы (Baker, J Inf Dis 1990. 161: 917). Четыре "классических" серотипа Ia, Ib, II и III встречаются примерно в равных пропорциях среди штаммов в нормальной флоре, но тип III является клинически наиболее важным серотипом, в частности потому, что он вызывает большинство случаев менингита. Поскольку капсула является известным фактором вирулентности, она изучена довольно подробно, в частности в штаммах типа III. Были предприняты усилия по разработке вакцины, в которой полисахаридная капсула III типа является существенным компонентом.
В ЕР 0866133 раскрыта вакцина, способная защитить реципиента от инфекции, вызванной Streptococcus группы В. Изобретение относится к применению комбинации полисахарида и фрагмента эпсилон-белка. Кроме того, раскрыто, что эпидемиологические данные свидетельствуют о том, что типоспецифическая капсула играет важную роль в иммунитете к инфекциям, вызванным Streptococcus группы В (см. страницу 7, строки 2-3). Кроме того, существует ряд различных комбинаций разных белков и полисахаридов, упомянутых в заявке, но все заявленные объекты содержат полисахарид, что указывает на важность этого конкретного компонента. Однако использование полисахаридной капсулы в качестве вакцины может вызвать проблемы из-за перекрестных реакций с тканями человека (Pritchard et al., Infect Immun 1992. 60: 1598). Поэтому было бы очень полезно разработать вакцину, основанную на белках, а не на полисахаридах.
В документе Gravekamp et al., Infection and Immunity, Dec 1997, p 5216-5221 раскрыта оценка иммуногенности, а также защиты для некоторого числа повторов альфа (α)-С-белка, и также только N-концевой части. Было обнаружено, что иммуногенность уменьшалась с увеличением числа повторов (см. Фиг. 2В). Однако в анализе защиты также было обнаружено, что антитела против N-концевого участка в основном отвечают за защиту, по сравнению с антителами против N-концевого участка (см. стр. 5219 левая колонка, строка 6 снизу и стр. 5220 правая колонка, стоки 26-29).
В WO 9410317 описано использование альфа-белка, поверхностного белка GBS, в разработке конъюгированной вакцины. Недостатком этого белка является то, что он обычно не экспрессируется штаммами типа III, которые являются причиной многих серьезных инфекций GBS. Следовательно, защитный иммунитет против этих штаммов не будет вызван вакциной на основе альфа-белка.
В WO 9421685 описано использование белка Rib, поверхностного белка GBS, в разработке вакцины. Этот белок вызывает иммунитет при введении с квасцами. Однако белок Rib имеет тот недостаток, что он не вызывает защитного иммунитета против всех штаммов GBS.
В WO 2008127179 описан слитый белок, содержащий по меньшей мере один первый фрагмент N-концевого участка поверхностного белка стрептококков группы В или его аналог, гомолог, производное или иммунологически родственную аминокислотную последовательность или их фрагменты, который слит по меньшей мере с одним вторым фрагментом N-концевого участка поверхностного белка стрептококков группы В или его аналогом, гомологом, производным или иммунологически родственной аминокислотной последовательностью или их фрагментами, где по меньшей мере один первый и второй фрагмент N-концевого участка поверхностных белков стрептококков группы В происходят из разных штаммов стрептококков группы В, и где слитый белок способен вызывать защитный иммунитет против стрептококков группы В.
В документе Lindahl et al, Nonimmunodominant Regions Are Effective As Building Blocks In A Streptococcal Fusion Protein Vaccine, Cell Host & Microbe 2, 427-434, December 2007, раскрыт слитый белок, содержащий N-концевые области поверхностных белков Rib и AlpC стрептококков группы В.
В документе Maeland et al, Survey of Immunological Features of the Alpha-Like Proteins of Streptococcus agalactiae, Clinical and Vaccine Immunology, February 2015 Volume 22 Number 2 раскрыто, что двухкомпонентная вакцина, где один иммуногенный пептид соответствует участку области повтора C-alpha или Alp1, один из которых вступает в сильную перекрестную реакцию (Фиг. 2; Таблица 1), и один пептид соответствует участку области повтора Alp3 или Rib, один из которых также вступает в сильную перекрестную реакцию (Фиг. 3; Таблица 1), может обеспечивать широкую защитную активность.
Несмотря на успехи в разработке вакцины, подходящей для предупреждения GBS-заболевания, все еще существует потребность в дополнительных способах и вакцинах для предупреждения и лечения GBS-заболеваний. Таким образом, остается необходимость в исследовании вакцинных стратегии, способных вызывать защитный иммунитет против широкого спектра штаммов GBS.
Соответственно, основной задачей настоящего изобретения является предложение иммуногенного слитого белок, который может быть использован в вакцине, способной вызывать защитный иммунитет против GBS-инфекций.
Еще одной задачей настоящего изобретения является создание вакцины, которая вызывает защитный иммунитет против многих клинически важных штаммов GBS.
Другой целью настоящего изобретения является создание вакцины, содержащей один или несколько иммуногенных слитых белков, которые вызывают защитный иммунитет против GBS-инфекций. Один или несколько белков имеют несколько преимуществ перед вакциной, состоящей из многочисленных белков, например стоимость производства и безопасность.
Средства выполнения каждой из вышеуказанных целей, а также другое станет очевидными из описания изобретения, представленного ниже.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение основано на осознании авторами настоящего изобретения того, что освещение слитого белка, раскрытого в WO 2008127179, является более ограниченным, чем считалось ранее. Это связано с тем, что до настоящего времени считалось, что важный серотип Ia стрептококков группы В преимущественно экспрессирует поверхностный белок AlpC, тогда как исследования перекрестной реактивности, выполненные для настоящего изобретения, показали, что большинство бактерий серотипа Ia стрептококков группы В экспрессируют Alp1 вместо AlpC.
Кроме того, было установлено, что перекрестную реактивность между разными N-концевыми доменами Alp/Rib нельзя прямо прогнозировать на основании гомологии последовательностей доменов. Это было установлено, когда перекрестную реактивность кроличьих антител, индуцированную против ранее раскрытого слитого белка Rib-AlpC-NN, раскрытого в WO 2008127179, тестировали против N-концевых доменов поверхностных белков Rib, AlpC, Alp1 и Alp2 Streptococcus, и против иммуногенного слитого белка по первому аспекту настоящего изобретения, как представлено ниже. Результаты показали похожие реактивности против слитого белка Rib-AlpC-NN и N-концевых доменов AlpC. Однако 10-кратное увеличение реактивности наблюдали против N-концевых доменов Rib и Alp2. Еще более низкую перекрестную реактивность наблюдали в отношении N-концевых доменов Alp1 и иммуногенного слитого белка по первому аспекту настоящего изобретения. Кроме того, мыши, иммунизированные иммуногенным слитым белком по первому аспекту настоящего изобретения, показали 2-log снижение перекрестной реактивности со слитым белком Rib-AlpC-NN по сравнению с титром, полученным против иммуногенного слитого белка по первому аспекту настоящего изобретения. Аналогично, мыши, иммунизированные слитым белком Rib-AlpC-NN, показали похожее снижение реактивности против иммуногенного слитого белка по первому аспекту настоящего изобретения и, кроме того, максимальное количество связывания с перекрестно-реактивными эпитопами также было уменьшено.
Соответственно, авторы настоящего изобретения обнаружили неожиданную потребность в дополнительном иммуногенном слитом белке, включающем Alp1, Alp2 или Alp 4, для получения защиты от инфекций, вызванных Streptococcus группы В.
Таким образом, первый аспект настоящего изобретения относится к иммуногенному слитому белку, содержащему:
первую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью N-концевого участка первого поверхностного белка Streptococcus группы В, которая слита со
второй аминокислотной последовательностью, имеющей по меньшей мере 80% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью N-концевого участка второго поверхностного белка Streptococcus группы В,
где каждый из первого и второго поверхностного белка Streptococcus группы В выбран из группы, состоящей из белка Rib, белка Alp1, белка Alp2, белка Alp3, белка Alp4 и белка AlpC, где иммуногенный слитый белок содержит по меньшей мере одну аминокислотную последовательностью, имеющую по меньшей мере 80% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью N-концевого участка поверхностного белка Alp1, Alp2, Alp3 или Alp4 Streptococcus группы В, и где иммуногенный слитый белок способен индуцировать защитный иммунитет против Streptococcus группы В.
Основным преимуществом иммуногенного слитого белка по изобретению является то, что он содержит по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью N-концевого участка поверхностного белка Alp1, Alp2, Alp3 или Alp4 Streptococcus группы В, каждый из которых экспрессируется многими клинически значимыми штаммами Streptococcus группы В и, самое важное, обеспечивает защитный иммунитет против этих дополнительных важных штаммов.
Иммуногенный слитый белок имеет то преимущество, что он является иммуногенным даже без адъюванта, однако его также можно использовать с адъювантом для повышения иммуногенности, вызывая защитный иммунитет против штаммов, экспрессирующих поверхностные белки. Кроме того, иммуногенный слитый белок по настоящему изобретению может быть использован в вакцине по настоящему изобретению и, как ожидается, будет вводиться с квасцами или гидроксидом алюминия (AlOH), адъювантом, одобренным для применения у людей. В отличие от этого, недавно описанная "универсальная вакцина", как сообщалось, работала вместе с адъювантом Фрейнда, сильно раздражающим компонентом, который не может быть использован в медицине человека (Maione, D. et al, Science 2005. 309:148-150).
Другим преимуществом настоящего изобретения является то, что вакцинная композиция по настоящему изобретению может состоять из иммуногенного слитого белка согласно первому аспекту настоящего изобретения в сочетании с дополнительным слитым белком, таким как слитый белок Rib-AlpC-NN из WO 2008127179, таким образом создается иммуногенный продукт, способный обеспечить полный охват защиты от всех клинически значимых штаммов Streptococcus группы В с использованием только двух слитых белков вместо необходимости использовать 5 или 6, или даже более, разных капсульных белков.
Более конкретно, настоящее изобретение относится к иммуногенному слитому белку; иммуногенному продукту; выделенной нуклеотидной последовательности; вектору; клетке-хозяину; вакцине; и к способу предупреждения или лечения инфекций, вызванных Streptococcus группы В.
Настоящее изобретение описано более подробно ниже.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
На Фиг. 1 показано, что слитый белок Rib-AlpC-NN из WO 2008127179 обеспечивает более высокие титры антител против N-концевых участков гомотипичных N-концевых доменов, включенных в вакцинный антиген, чем против гетеротипичных перекрестно-реактивных N-концевых доменов из Alp1 и Alp2/3. На различия указывает разница кратности увеличения на Фиг. 1С и наибольшее различие наблюдается между вакцинированными субъектами при рассмотрении абсолютных чисел на Фиг. 1В.
На Фиг. 2 показано, что вакцинная композиция по настоящему изобретению, состоящая из иммуногенного слитого белка по первому аспекту настоящего изобретения в сочетании со слитым белком Rib-AlpC-NN из WO 2008127179, обеспечивает максимальный охват против всех N-окончаний, то есть добавление остальных N-концевых доменов к вакцинной композиции усиливает реакцию на эти домены сверх того, что обеспечивается в отношении перекрестной реактивности, обеспечиваемой одним слитым белком Rib-AlpC-NN.
На Фиг. 3 показано, что существует линейная корреляция между уровнями IgG для иммуногенного слитого белка из WO 2008127179 и титрами ОРА (опсонофагоцитарной активности) против и вакцинных, и перекрестно-реактивных штаммов Alp, что означает, что субъекты, получающие высокие уровни антител также против остальных N-концевых доменов, также будут функционально активными. Однако такие высокие уровни получают у небольшого количества субъектов при иммунизации одним слитым белком Rib-AlpC-NN, следовательно, необходимо включение дополнительных N-концевых доменов в вакцинную композицию, и
На Фиг. 4 показано, что квасцы являются лучшим адъювантом, чем PolyIC, для иммуногенных слитых белков по настоящему изобретению.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В данном описании, если не указано иное, "а" или "an" означает "один или более".
В тексте описания любые и все литературные источники конкретно включены в данную патентную заявку посредством ссылки.
В первом воплощении иммуногенного слитого белка по первому аспекту настоящего изобретения, иммуногенный слитый белок содержит:
первую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью N-концевого участка первого поверхностного белка Streptococcus группы В, которая слита со
второй аминокислотной последовательностью, имеющей по меньшей мере 80% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью N-концевого участка второго поверхностного белка Streptococcus группы В,
где каждый из первого и второго поверхностного белка Streptococcus группы В выбран из группы, состоящей из белка Rib, белка Alp1, белка Alp2, Alp3 и белка AlpC, где иммуногенный слитый белок содержит по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью N-концевого участка поверхностного белка Alp1, Alp2, Alp3 или Alp4 Streptococcus группы В, и где иммуногенный слитый белок способен индуцировать защитный иммунитет против Streptococcus группы В.
Термин "иммуногенный" подразумевает наличие способности вызывать иммунный ответ. Иммуногенный слитый белок по изобретению является иммуногенным и характеризуется своей способностью вызывать защитный иммунный ответ против по меньшей мере GBS, содержащих поверхностные белки, из которых состоят N-концевые участки, посредством иммуногенного слитого белка.
Для цели настоящего изобретения термин "слитый белок" относится к комплексу из двух или более белковых участков или их фрагментов, содержащему, например, N-концевой участок белка Alp1 Streptococcus группы В и N-концевой участок белка Alp2 Streptococcus группы В. Например, может присутствовать один N-концевой участок Alp1 и один N-концевой участок Alp2, или 2, 3, 4 или 5 фрагментов N-концевого участка белков Alp1 и Alp2, где число N-концевых участков из двух белков необязательно должны быть одинаковым.
Комбинирование полипептидов с получением слитого белка может быть осуществлено несколькими способами, например: химически посредством сочетания, конъюгации или сшивания, либо непосредственно, либо с помощью промежуточной структуры; физически, путем связывания посредством захвата в или на макромолекулярной структуре; или путем молекулярного биологического слияния, посредством комбинации рекомбинантных молекул нуклеиновых кислот, которые содержат фрагменты нуклеиновой кислоты, способные кодировать каждый из указанных двух участков, так что в конечном итоге получается один непрерывно экспрессируемый продукт.
Для цели настоящего изобретения термин "белок" относится к молекулярной цепи аминокислот. Белок не имеет определенной длины и может, если требуется, быть модифицирован in vivo или in vitro, например посредством гликозилирования, амидирования, карбоксилирования или фосфорилирования. В частности, в данное определение включены пептиды, олигопептиды и полипептиды. Белок или пептид могут иметь природное или синтетическое происхождение. В данном контексте слитый белок означает два или более полипептидов, ковалентно связанных друг с другом либо прямо, либо косвенно, с помощью некоторых средств, таких как упомянуты выше. Термин "слитый" означает создание слитого белка, как указано выше.
Термин "N-концевой участок" по отношению к настоящему изобретению относится к N-концевому участку (N) белка. Примеры аминокислотных последовательностей N- концевых участков поверхностных белков Streptococcus группы В представлены в SEQ ID NO: 2, 4, 8, 10 и 14.
В частности, примеры N-концевых участков белков Streptococcus группы В включают N-концевой участок белка Rib, Alp1, Alp2, Alp3, Alp4 и AlpC Streptococcus группы В, в том числе пептиды, кодирующие нативные аминокислотные последовательности N-концевых участков природного белка Rib, Alp1, Alp2, Alp3, Alp4 и AlpC, или могут представлять собой функциональные производные нативных последовательностей этих областей, где эти функциональные производные сохраняют свою способность вызывать защитный иммунитет против Streptococcus группы В. Предполагается, что термин "функциональные производные" включает части последовательностей и фрагменты N-концевых участков; а также включает варианты природных белков (таких как белки, имеющие изменения в аминокислотной последовательности, но которые сохраняют способность вызывать иммунитет, вирулентность или антигенные свойства, проявляемые природной молекулой), например с измененной фланкирующей последовательностью.
Штаммы Streptococcus группы В, также называемые здесь GBS, хорошо известны и могут быть выделены из крови инфицированных людей. GBS являются наиболее распространенной причиной неонатального сепсиса в Соединенных Штатах и несут ответственность за примерно 5000 случаев в год.
Указание "стрептококки группы В" отражает тот факт, что стрептококки были разделены на иммунологические группы, основанные на присутствии специфических углеводных антигенов на их клеточных поверхностях. В настоящее время идентифицированы группы от А до О (Davis, B.D. et al., In: Microbiology, 3rd. Edition, page 609, (Harper & Row, 1980).
Процент гомологии может быть определен, например, путем сравнения информации о последовательности с использованием компьютерной программы GAP, версия 6.0, доступной в University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG). В программе GAP используется метод выравнивания Needleman и Wunsch (J Mol Biol 1970 48:443), с изменениями Smith и Waterman (Adv Appl Math 1981 2:482). В кратком изложении, программа GAP определяет сходство, как количество выровненных символов (то есть нуклеотидов или аминокислот), которые являются сходными, деленное на общее количество символов в более короткой из двух последовательностей. Предпочтительные параметры по умолчанию для программы GAP включают: (1) унитарную матрицу сравнения (содержащую значение 1 для идентичных и 0 для неидентичных) и взвешенную матрицу сравнения по Gribskov and Burgess (Nucl Acids Res 1986 14:6745), как описано Schwartz and Dayhoff, eds. (Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C. 1979, pp. 353-358); (2) штраф 3.0 за каждый гэп и дополнительный штраф 0,10 за каждый символ в каждом гэпе; и (3) отсутствие штрафа за концевые гэпы.
Белок Rib Streptococcus группы В, также упоминаемый в данном описании как Rib и белок Rib, представляет собой известный в данной области поверхностный белок, и, например, описан в WO 9421685. Обозначение "Rib" относится к: устойчивости к протеазам, иммунитету и группе В. Белок Rib был впервые выделен из штамма стрептококка группы В серотипа III в виде отдельного белка массой 95 кДа. Белок Rib экспрессируется почти всеми штаммами Streptococcus группы В клинически значимого серотипа III, который вызывает большинство случаев менингита, и некоторыми штаммами других серотипов, таких как II. Кроме того, Rib экспрессируется всеми штаммами гипервирулентного клона типа III. Был разработан способ очистки белка Rib и было показано, что антитела к этому белку защищают от летальной инфекции штаммами, экспрессирующими белок Rib (для получения дополнительных подробностей, таких как последовательности ДНК и белка см. WO 9421685). Нуклеиновокислотная последовательность и аминокислотная последовательность для N-концевого участка Rib приведены в SEQ ID: 1 и 2.
Белок Alp1 также известен, как эпсилон-белок, и представляет собой альфа-протеин-подобный белок Streptococcus группы В (Creti et al. Clin Microbiol. 2004.42:1326-9). Нуклеиновокислотная последовательность и аминокислотная последовательность N-концевого участка Alp1 приведены в SEQ ID: 7 и 8. Аминокислотная последовательность представляет собой (SEQ ID No 8):
Белок Alp2 представляет собой другой альфа-протеин-подобный белок, впервые идентифицированный в штамме серотипа V (Lachenauer, С.S., R. Creti, J. L. Michel, and L. C. Madoff. 2000. Mosaicism in the alpha-like protein genes of group В streptococci. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:9630-9635.). Подобно другим представителям семейства, белок Alp2 имеет N-концевой домен и несколько повторяющихся доменов по направлению к С-концу. Впоследствии этот белок был обнаружен также в других изолятах GBS, таких как серотипы Ia и III (Lindahl et al. Surface Proteins of Streptococcus agalactiae and Related Proteins in Other Bacterial Pathogens, CLINICAL MICROBIOLOGY REVIEWS, Jan. 2005, p. 102-127). Нуклеиновокислотная последовательность и аминокислотная последовательность N-концевого участка Alp2 представлены в SEQ ID NO: 9 и 10.
Белок Alp3 является еще одним альфа-протеин-подобным белком, также известным как R28. Он очень похож на белок R28, также обнаруженный в S. pyogenes (Lachenauer, С.S., R. Creti, J.L. Michel, and L.C. Madoff. 2000. Mosaicism in the alpha-like protein genes of group В streptococci. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:9630-9635 и Lindahl et al. Surface Proteins of Streptococcus agalactiae and Related Proteins in Other Bacterial Pathogens, CLINICAL MICROBIOLOGY REVIEWS, Jan. 2005, p. 102-127). Его структура является более сложной, чем у других альфа-протеин-подобных белков, но он сохраняет N-концевой домен, который идентичен этому домену в Alp2, а С-концевые повторяющиеся участки очень похожи на Rib. Нуклеиновокислотная последовательность и аминокислотная последовательность N-концевого участка Alp3 являются такими же, как для Alp2, и представлены в SEQ ID NO: 9 и 10.
Белок Alp4 представляет собой альфа-протеин-подобный белок, который до сих пор был идентифицирован только в штамме Prague 25/60 (Fanrong Kong, Sonia Gowan, Diana Martin, Gregory James, and Gwendolyn L. Gilbert. Molecular Profiles of Group В Streptococcal Surface Protein Antigen Genes: Relationship to Molecular Serotypes. JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Feb. 2002, p. 620-626). Он является новым представителем альфа-протеин-подобного семейства со структурой, аналогичной структуре других представителей, с отличающимся N-концевым доменом и повторяющимися участками по направлению к С-концу. Нуклеиновокислотная последовательность и аминокислотная последовательность N-концевого участка Alp4 представлены в SEQ ID NO: 13 и 14.
Белок AlpC Streptococcus группы В, также известный как альфа-белок, представляет собой известный в данной области поверхностный белок Streptococcus группы В. В WO 9410317 описана конъюгированная вакцинная композиция, содержащая альфа-белок. Нативный предшественник белка AlpC Streptococcus группы В, как описано в WO 9410317, имеет молекулярную массу 108 кДа. В результате отщепления предполагаемой сигнальной последовательности из 41 аминокислоты получается зрелый белок 104 кДа. (Обратите внимание, однако, что сигнальная последовательность, как было показано впоследствии, имеет длину 56 аминокислотных остатков: Stalhammar-Carlemalm et al., J Exp Med 177, 1593; 1993). 20 кДа N-концевой участок антигена AlpC не имеет гомологии с ранее описанными белковыми последовательностями и за ним следует серия из девяти тандемных повторяющихся единиц, которые составляют 74% зрелого белка. Каждая повторяющаяся единица (обозначенная здесь "R") идентична и состоит из 82 аминокислот с молекулярной массой примерно 8500 дальтон, которые кодируются 246 нуклеотидами. С-концевой участок антигена AlpC содержит мотив якорного домена клеточной стенки, присутствующий в ряде грамположительных поверхностных белков. Нуклеиновокислотная последовательность и аминокислотная последовательность N-концевого участка AlpC представлены в SEQ ID NO: 3 и 4.
Каждый из белков Rib, Alp1 и AlpC из GBS включает уникальный N-концевой участок (N) и область длинного повтора (R). Белки, экспрессируемые штаммами GBS ВМ110 и А909, имеют 12 и 9 повторов соответственно. Участки заякоривания на клеточной стенке располагаются на С-концах.
N-концевые области Alp2 и Alp3 идентичны.
Тандемные повторы в Rib и альфа идентичны в каждом белке, но не между белками, и варьируются в изолятах по количеству. За исключением этой вариации последовательности Rib и альфа являются стабильными среди штаммов. Эти два белка проявляют незначительную антигенную перекрестную реактивность или вообще не имеют ее.
Термин "защитный иммунитет" по отношению к настоящему изобретению относится к способности сывороточных антител и/или цитотоксического Т-клеточного ответа, индуцированного во время иммунизации, защищать (частично или полностью) от заболевания, вызванного инфекционным агентом, таким как стрептококки группы В. То есть у позвоночного животного, иммунизированного вакцинами по изобретению, будет происходить ограниченный рост и распространение Streptococcus группы В. Чтобы определить, индуцирован защитный иммунитет слитым белком или вакциной, можно использовать методы, хорошо известные специалисту в данной области. Например, для определения, индуцирует ли иммунизация с помощью слитого белка или вакцины по изобретению защитный иммунитет против инфекции Streptococcus группы В, иммунизированных тестируемых животных провоцируют Streptococcus группы В и измеряют рост и распространение Streptococcus группы В. Например, чтобы определить, индуцирован ли защитный иммунитет, можно использовать способы в соответствии со способами, описанными в приведенных ниже примерах.
В одном воплощении иммуногенного слитого белка по первому аспекту настоящего изобретения первая аминокислотная последовательность может иметь по меньшей мере 90, например 95, 96, 97, 98 или 99% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью N-концевого участка первого поверхностного белка Streptococcus группы В, и вторая аминокислотная последовательность может иметь по меньшей мере 90, например по меньшей мере 95, 96, 97, 98 или 99% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью N-концевого участка второго поверхностного белка Streptococcus группы В.
Иммуногенный слитый белок содержит по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, например по меньшей мере 90, например 95, 96, 97, 98 или 99% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью N-концевого участка поверхностных белков Alp1, Alp2, Alp3 или Alp4 Streptococcus группы В.
В одном предпочтительном воплощении иммуногенного слитого белка по первому аспекту настоящего изобретения иммуногенный слитый белок содержит по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, например по меньшей мере 90, например 95, 96, 97, 98 или 99% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью N-концевого участка поверхностных белков Alp1, Alp2 или Alp3 Streptococcus группы В.
В более предпочтительном воплощении иммуногенного слитого белка по первому аспекту настоящего изобретения иммуногенный слитый белок содержит по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, например по меньшей мере 90, например 95, 96, 97, 98 или 99% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью N-концевого участка поверхностного белка Alp1 Streptococcus группы В.
В еще одном воплощении иммуногенного слитого белка по первому аспекту настоящего изобретения иммуногенный слитый белок дополнительно содержит
третью аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью N-концевого участка третьего поверхностного белка Streptococcus группы В, которая слита с одной из первой и второй аминокислотных последовательностей, где третий поверхностный белок Streptococcus группы В выбран из группы, состоящей из белка Rib, белка Alp1, белка Alp2, белка Alp3, белка Alp4 и белка AlpC.
Это полезно, поскольку это обеспечивает иммуногенный слитый белок, способный вызывать защитный иммунитет против большого числа штаммов Streptococcus группы В.
В одном воплощении иммуногенного слитого белка по первому аспекту настоящего изобретения третья аминокислотная последовательность имеет по меньшей мере 90, например по меньшей мере 95, 96, 97, 98 или 99% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью N-концевого участка третьего поверхностного белка Streptococcus группы В.
В еще одном воплощении иммуногенного слитого белка по первому аспекту настоящего изобретения иммуногенный слитый белок дополнительно содержит
четвертую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью N-концевого участка четвертого поверхностного белка Streptococcus группы В, которая слита с одной из первой и третьей аминокислотных последовательностей, где четвертый поверхностный белок Streptococcus группы В выбран из группы, состоящей из белка Rib, белка Alp1, белка Alp2, белка Alp3, белка Alp4 и белка AlpC.
Это полезно, поскольку это обеспечивает иммуногенный слитый белок, способный вызывать защитный иммунитет против большого числа штаммов Streptococcus группы В.
В одном воплощении иммуногенного слитого белка по первому аспекту настоящего изобретения четвертая аминокислотная последовательность имеет по меньшей мере 90, например по меньшей мере 95, 96, 97, 98 или 99% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью N-концевого участка четвертого поверхностного белка Streptococcus группы В.
Следует подчеркнуть, что первая, вторая, третья и четвертая аминокислотные последовательности могут быть организованы в любом порядке в иммуногенном слитом белке. При этом аминокислотные последовательности предпочтительно расположены от первой до четвертой.
В одном воплощении иммуногенного слитого белка по первому аспекту настоящего изобретения иммуногенный слитый белок состоит из первой и второй аминокислотной последовательности, из первой, второй и третьей аминокислотной последовательности, или альтернативно из первой, второй, третьей и четвертой аминокислотной последовательности.
В еще одном воплощении иммуногенного слитого белка по первому аспекту настоящего изобретения первый и второй поверхностный белок Streptococcus группы В, или возможно первый, второй и третий поверхностный белок Streptococcus группы В, или возможно первый, второй, третий и четвертый поверхностный белок Streptococcus группы В происходят из разных штаммов Streptococcus группы В. Это подразумевает небольшую изменчивость последовательности фрагментов N-концевого участка, но не будет изменять биологические свойства и их функциональную способность вызывать защитный иммунитет. Это является полезным, так как увеличивает количество штаммов Streptococcus группы В, против которых иммуногенный слитый белок по первому аспекту настоящего изобретения обеспечивает защиту.
В еще одном воплощении иммуногенного слитого белка по первому аспекту настоящего изобретения первый и второй поверхностный белок Streptococcus группы В, или возможно первый, второй и третий поверхностный белок Streptococcus группы В, или возможно первый, второй, третий и четвертый поверхностный белок Streptococcus группы В являются различными. Это является полезным, так как увеличивает количество штаммов Streptococcus группы В, против которых иммуногенный слитый белок по первому аспекту настоящего изобретения обеспечивает защиту.
В еще одном воплощении иммуногенного слитого белка по первому аспекту настоящего изобретения один из первого и второго поверхностного белка Streptococcus группы В представляет собой белок Alp1 и другой представляет белок Alp2 или наоборот. Это является полезным, так как ожидается, что слияние N-концов Alp1 и Alp2 обеспечит преимущества в защите против Streptococcus группы В.
В еще одном воплощении иммуногенного слитого белка по первому аспекту настоящего изобретения первая аминокислотная последовательность имеет по меньшей мере 80%, например по меньшей мере 85%, например по меньшей мере 90%, например 95, 96, 97, 98 или 99% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 8, и
вторая аминокислотная последовательность имеет по меньшей мере 80%, например по меньшей мере 85%, например по меньшей мере 90%, например 95, 96, 97, 98 или 99% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 10.
Термин "идентичность последовательности" указывает на количественную величину гомологии двух аминокислотных последовательностей равной длины или двух нуклеотидных последовательностей равной длины. Если две сравниваемые последовательности имеют не одинаковую длину, они должны быть выровнены с максимально возможным соответствием. Идентичность последовательностей может, например, быть рассчитана с помощью программы BLAST, например программы BLASTP или программы BLASTN (Pearson W. R and D.J. Lipman (1988) PNAS USA 85:2444-2448) (www.ncbl.nlm.nlh.gov/BLAST).
В еще одном воплощении иммуногенного слитого белка по первому аспекту настоящего изобретения иммуногенный слитый белок содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, например по меньшей мере 85%, например по меньшей мере 90%, например 95, 96, 97, 98 или 99% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 12.
SEQ ID NO: 12 демонстрирует аминокислотную последовательность иммуногенного слитого белка, содержащего N-конец Alp1, слитый с N-концом Alp2. Аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 12) представляет собой:
В еще одном воплощении иммуногенного слитого белка по первому аспекту настоящего изобретения иммуногенный слитый белок модифицирован посредством гликозилирования, амидирования, карбоксилирования или фосфорилирования, или конъюгирован с капсульным полисахаридом или антигеном RSV (респираторный синцитиальный вирус), как описано ниже в отношении третьего аспекта настоящего изобретения.
Это является полезным, так как такие полипептиды могут иметь повышенную иммуногенность. Такие полипептиды могут быть получены, когда нативные формы полипептидов или их фрагменты модифицируют или подвергают обработке для усиления их иммуногенного характера у предполагаемого реципиента. Многочисленные методы, которые можно использовать, без чрезмерного проведения экспериментов, чтобы существенно увеличить иммуногенность описанных здесь полипептидов, доступны и хорошо известны специалистам в данной области. Например, полипептиды могут быть модифицированы путем связывания с динитрофенольными группами или арсаниловой кислотой, или посредством денатурации теплом и/или SDS (додецилсульфат натрия). В частности, если полипептиды представляют собой небольшие химически синтезированные полипептиды, может быть желательно связать их с иммуногенным носителем. Связывание, конечно, не должно мешать способности полипептида или носителя функционировать надлежащим образом. Обзор некоторых общих подходов в стратегиях сочетания см. в Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, ed. E. Harlow and D. Lane (1988). Полезные иммуногенные носители хорошо известны в данной области. Примерами таких носителей являются гемоцианин лимфы улитки (KLH); альбумины, такие как бычий сывороточный альбумин (BSA) и овальбумин, PPD (очищенное белковое производное туберкулина); эритроциты; столбнячный анатоксин; холерный анатоксин; агарозные гранулы; активированный уголь; или бентонит.
Второй аспект настоящего изобретения касается иммуногенного продукта, содержащего иммуногенный слитый белок по первому аспекту настоящего изобретения и дополнительно содержащего второй иммуногенный белок, содержащий по меньшей мере две аминокислотные последовательности, где эти две аминокислотные последовательности состоят из первой аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере 80%, например по меньшей мере 85%, например по меньшей мере 90%, например 95, 96, 97, 98 или 99% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 2, слитой со второй аминокислотной последовательностью, имеющей по меньшей мере 80%, например по меньшей мере 85%, например по меньшей мере 90%, например 95, 96, 97, 98 или 99% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 4, где второй иммуногенный слитый белок способен вызывать защитный иммунитет против Streptococcus группы В.
Второй иммуногенный слитый белок может иметь аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 6. Соответствующая последовательность ДНК показана в SEQ ID NO: 5. Это является полезным, поскольку получается иммуногенный продукт, способный обеспечить полный охват защиты от всех клинически значимых штаммов Streptococcus группы В с использованием только двух слитых белков вместо необходимости использовать 5 или 6 или даже более разных капсульных белков.
Предпочтительно, иммуногенный продукт согласно второму аспекту настоящего изобретения содержит иммуногенный слитый белок по первому аспекту настоящего изобретения, где один из первого и второго поверхностного белка Streptococcus группы В (в иммуногенном слитом белке) представляет собой белок Alp1, а другой белок представляет собой Alp2. Более предпочтительно, первая аминокислотная последовательность (в иммуногенном слитом белке) имеет по меньшей мере 80%, например по меньшей мере 85%, например по меньшей мере 90%, например 95, 96, 97, 98 или 99% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 8 и вторая аминокислотная последовательность (в иммуногенном слитом белке) имеет по меньшей мере 80%, например по меньшей мере 85%, например по меньшей мере 90%, например 95, 96, 97, 98 или 99% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 10. Еще более предпочтительно, иммуногенный слитый белок содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, например по меньшей мере 85%, например по меньшей мере 90%, например 95, 96, 97, 98 или 99% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 12.
Таким образом, в одном предпочтительном воплощении иммуногенного продукта по второму аспекту настоящего изобретения иммуногенный слитый белок содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 12, и второй иммуногенный слитый белок содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 6.
Кроме того, в одном воплощении иммуногенного продукта согласно второму аспекту настоящего изобретения иммуногенный слитый белок состоит из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 12, и второй иммуногенный слитый белок состоит из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 6. Предпочтительно, в иммуногенном продукте нет других белков или аминокислотных последовательностей, отличных от аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 6 и 12.
На Фиг. 1А показано, что слитый белок Rib-AlpC-NN из WO 2008127179 обеспечивает более высокие титры антител против N-концевых участков гомотипичных N-концевых доменов, включенных в вакцинный антиген, чем в отношении гетеротипичных перекрестно-реагирующих N-концевых доменов Alp1 и Alp2/3. На различия указывает разница в кратности увеличения на Фиг. 1С и больший разброс между вакцинированными субъектами, наблюдаемый при рассмотрении абсолютных значений на Фиг. 1В.
Влияние иммуногенного продукта согласно второму аспекту настоящего изобретения дополнительно показано на Фиг. 2А-С.Так на Фиг. 2А показано, что иммунизация слитым белком RibN-AlpCN из WO 2008127179 (обозначенным как GBS-NN) обеспечивает одинаковые титры против N-концевых участков Rib и AlpC, но более низкие перекрестно-реагирующие титры. С другой стороны, иммунизация слитым белком Alp1N-Alp2/3N согласно первому аспекту настоящего изобретения (обозначенным как GBS-NN2) обеспечивает одинаковые титры против N-концевых участков Alp1 и Alp2/3, однако также здесь с более низкими перекрестно-реагирующими титрами, как видно на Фиг. 2В. При объединении этих двух слитых белков в иммуногенном продукте по второму аспекту настоящего изобретения (обозначенном как GBS-NN+NN2), как показано на Фиг. 2С, охват (титры) увеличивается для всех N-концевых участков Rib, AlpC, Alp1, Alp2/3. Соответственно, очень широкая защита против GBS достигается с помощью иммуногенного продукта согласно второму аспекту настоящего изобретения.
Кроме того, на Фиг. 3 показано, что существует линейная корреляция между уровнями IgG для иммуногенного слитого белка RibN-AlpCN из WO 2008127179 и титрами ОРА (опсонофагоцитарной активности) против как вакцинных, так и перекрестно-реагирующих штаммов Alp. Таким образом, на Фиг. 3 показано, что антитела, образуемые против иммуногенного слитого белка RibN-AlpCN, специфичные к N-концам Rib и AlpC, находящиеся в слитом белке, а также специфичные к другим N-концевым участкам, то есть N-концевым участкам Alp1 и Alp2/3 (Alp1N и alp2/3N посредством перекрестной реактивности), являются функционально активными и могут вызывать гибель бактерий GBS посредством опсонофагоцитарной реакции. Это означает, что субъекты, получающие высокий уровень антител также против остальных N-концевых доменов, также являются функционально активными. Поскольку, однако, такой высокий уровень получают у небольшого количества субъектов при иммунизации одним слитым белком Rib-AlpC-NN, то включают дополнительные N-концевые домены, то есть иммуногенный слитый белок по первому аспекту настоящего изобретения, в иммуногенный продукт и/или вакцину.
Третий аспект настоящего изобретения касается вакцины, содержащей фармацевтически приемлемый носитель, возможно адъювант, и фармацевтически эффективное количество иммуногенного слитого белка по первому аспекту настоящего изобретения или иммуногенного продукта по второму аспекту настоящего изобретения, где вакцина способна вызывать защитный иммунитет против Streptococcus группы В.
Термин "фармацевтически приемлемый носитель" означает любой подходящий приемлемый эксципиент, адъювант, носитель, разбавитель, обычно используемый в фармацевтических композициях.
Вакцина может представлять собой вакцинную композицию.
Вакцина может, в дополнение к слитому белку, включать другие фармакологически приемлемые ингредиенты, такие как соли, буферы, иммуноактивные компоненты, адъюванты (AlOH), увлажнители, эмульгирующие и суспендирующие агенты, или подсластители, вкусоароматизаторы, ароматизаторы или другие вещества, которые являются желательными для повышения эффективности композиции. Композиция считается "фармакологически приемлемой", если ее введение может переноситься реципиентом.
В предпочтительном воплощении вакцины по третьему аспекту настоящего изобретения эта вакцина содержит фармацевтически эффективное количество иммуногенного продукта по второму аспекту настоящего изобретения. Это является полезным, так как иммуногенный продукт обеспечивает широкую защиту против GBS.
Многовалентную вакцину можно также получить, объединив иммуногенный слитый белок или иммуногенный продукт с другими компонентами, включая другие слитые белки, как описано выше, включая, без ограничения ими, дифтерийный анатоксин или столбнячный анатоксин, или полисахариды, с использованием способов, известных в данной области. Вакцина может, кроме того, содержать дополнительные антигены, такие как антигены RSV или антигены Е. coli. Специалистам в данной области хорошо известны способы получения и приготовления вакцин и вакцинных композиций. Выбор ингредиентов будет, например, меняться в зависимости от пути введения композиции. Например, композиции для парентерального введения включают стерильные водные или неводные растворы, суспензии и эмульсии. Примерами неводных растворителей являются пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло, и инъецируемые органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Носители или герметичные повязки можно использовать для повышения проницаемости кожи и усиления абсорбции антигена. Жидкие лекарственные формы для перорального введения обычно могут содержать раствор липосом, содержащих жидкую лекарственную форму. Подходящие формы для суспендирования липосом включают эмульсии, суспензии, растворы, сиропы и эликсиры, содержащие инертные разбавители, обычно используемые в данной области, такие как очищенная вода.
В еще одном воплощении третьего аспекта настоящего изобретения вакцина может содержать дополнительный иммуноактивный компонент. Дополнительным иммуноактивным компонентом может быть антиген, иммуностимулирующее вещество и/или вакцина; любой из них может содержать адъювант.
4
2
4
2
4
4
Адъюванты представляют собой вещества, которые можно использовать для специфического усиления специфического иммунного ответа. Обычно адъювант и композицию смешивают перед презентацией иммунной системе или вносят раздельно, но в то же самое место, у животного или человека, подвергаемого иммунизации. Адъюванты можно примерно разделить на несколько групп на основании их состава. Эти группы включают масляные адъюванты (например полные и неполные адъюванты Фрейнда), минеральные соли, например AlK (SO), AlNa (SO), AlNH (SO), AlOH, диоксид кремния, каолин и углерод, полинуклеотиды (например polyIC и polyAU кислоты) и некоторые природные вещества (например воск D из Mycobacterium tuberculosis, а также вещества, обнаруженные у Corynebacterium parvum или Bordetella pertussis, и у представителей рода Brucella). В число веществ, которые особенно полезны в качестве адъювантов, входят сапонины, такие как, например, Quil А. Примеры веществ, подходящих для использования в вакцинных композициях, представлены в Remington's Pharmaceutical Sciences (Osol, A, Ed, Mack Publishing Co, Easton, PA, pp. 1324-1341 (1980).
3
1
2
Влияние двух разных адъювантов на иммунный ответ описанного ранее слитого белка из WO 2008127179 было протестировано на мышах. Мышей иммунизировали один раз в сутки 0 без адъюванта или с альгидрогелем (гидроксид алюминия) или PolylC в качестве адъюванта. На 15 неделе наблюдались значительно более высокие титры у мышей, иммунизированных в присутствии альгидрогеля (примерно 5×10), по сравнению как с вариантом без адъюванта (примерно 2×10), так и с PolyIC (примерно 10). Провоцирование мышей на 15 неделе белком без адъювантов и измерение титров антител на 16 неделе оказывало относительно небольшое влияние на группу, первоначально получавшую белок без адъюванта (A), 1-log увеличение на группу PolyIC (С), но относительно небольшое влияние на группу с альгидрогелем, имевшую уже высокий титр (В). Несмотря на то, что титры в группе PolyIC увеличились, она не достигла уровня группы альгидрогеля.
Таким образом, ожидается, что альгидрогель будет особенно эффективным адъювантом для иммуногенного слитого белка по первому аспекту настоящего изобретения и, следовательно, особенно полезным в вакцине согласно третьему аспекту настоящего изобретения.
Результаты представлены на Фиг. 4. Мышей иммунизировали 3 мкг слитого белка RibN-AlpC-N (называемого GBS-NN) из WO 2008127179.
Соответственно, в предпочтительном воплощении вакцины по третьему аспекту настоящего изобретения, вакцина дополнительно содержит гидроксид алюминия в качестве адъюванта.
Кроме того, в одном воплощении вакцины согласно третьему аспекту настоящего изобретения, эта вакцина содержит фармацевтически эффективный носитель, гидроксид алюминия и иммуногенный продукт согласно второму аспекту настоящего изобретения, где в иммуногенном продукте по второму аспекту настоящего изобретения иммуногенный слитый белок состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 12, и второй иммуногенный слитый белок состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 6. Предпочтительно, в вакцине нет никаких других белков или аминокислотных последовательностей, отличных от аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 6 и 12.
В еще одном воплощении третьего аспекта настоящего изобретения вакцина, альтернативно или дополнительно, содержит клетку-хозяина в соответствии с седьмым аспектом настоящего изобретения.
В еще одном воплощении третьего аспекта настоящего изобретения иммуногенный слитый белок конъюгирован с капсульным полисахаридом, предпочтительно бактериальным полисахаридом, более предпочтительно полисахаридом Streptococcus группы В.
Использование полипептида, белка или слитого белок в качестве носителя для полисахарида в конъюгированной вакцине хорошо известно в данной области, см., например US 6855321, WO 9410317 и US 4496538).
Под полисахаридом подразумевают любой линейный или разветвленный полимер, состоящий из моносахаридных остатков, обычно связанных гликозидными связями, который, таким образом, включает олигосахариды. Предпочтительно, полисахарид содержит от 2 до 50 моносахаридных единиц, более предпочтительно от 6 до 30 моносахаридных единиц. Полисахаридный компонент может быть основан на, или являться производным полисахаридных компонентов полисахаридной капсулы многих грамположительных и грамотрицательных бактериальных патогенов, таких как Н. influenzae, N. meningitidis и S. pneumoniae. Другие бактерии, полисахаридные компоненты которых могут быть конъюгированы с белками-носителями по настоящему изобретению, включают Staphylococcus aureus, Klebsiella, Pseudomonas, Salmonella typhi, Pseudomonas aeruginosa и Shigella dysenteriae. Полисахаридные компоненты, подходящие для применения в соответствии с этим аспектом настоящего изобретения, включают олигосахарид Hib, липополисахарид Pseudomonas aeruginosa (Seid and Sadoff, 1981), липополисахариды из Salmonella (Konadu et al., 1996) и О-специфический полисахарид из Shigella dysenteriae (Chu et al, 1991). Другие полисахаридные компоненты, подходящие для использования в соответствии с настоящим изобретением, хорошо известны специалистам в данной области техники. Фрагменты бактериального капсульного полисахарида могут быть получены любым подходящим способом, таким как кислотный гидролиз или ультразвуковое облучение (Szn et al, 1986). Другие способы получения полисахаридных компонентов хорошо известны специалистам в данной области.
В одном воплощении настоящего изобретения полисахарид представляет собой капсульный полисахарид, полученный из Streptococcus группы В или их эквивалентов.
Полисахаридный компонент конъюгированной вакцины будет предпочтительно связан с белком-носителем ковалентной связью. Особенно предпочтительным способом связывания полисахарида и белка является восстановительное аминирование. Другие способы включают: активацию полисахарида с помощью бромциана с последующим взаимодействием с дигидразидом адипиновой кислоты (спейсер) и конъюгацией с карбонильными группами белка-носителя с использованием растворимых карбодиимидов (Shneerson et al, 1986); функционализацию белка-носителя дигидразидом адипиновой кислоты с последующим связыванием с полисахаридами, активированными бромцианом (Dick et al., 1989); химическую модификацию как белка-носителя, так и полисахарида с последующим их связыванием (Marburg et at, 1986; Marburg et al, 1987 и 1989).
Молекула полисахарида может быть связана с белком-носителем при помощи спейсерной молекулы, такой как адипиновая кислота. Эта спейсерная молекула может быть использована для облегчения связывания белка с полисахаридом. После выполнения реакции связывания конъюгат может быть очищен при помощи диафильтрации или других известных способов для удаления непрореагировавшего белка или полисахаридных компонентов.
Если полисахарид получен из бактериального патогена, отличного от GBS, конъюгат может вызывать иммунитет против двух или более патогенов, например нескольких типов бактерий. Это является потенциально важным применением иммуногенного слитого белка. Для получения конъюгированной вакцины существенным преимуществом будет являться то, что белковая часть состоит из одного слитого белка. Специалисту в данной области техники очевидно, что вакцинная композиция по настоящему изобретению может содержать другие вещества или соединения, не упомянутые выше, например другие разбавители, эмульгаторы или стабилизаторы, или другие белки или полисахариды. Такие вещества или соединения должны придавать композиции нужные свойства.
Вакцину по третьему аспекту настоящего изобретения можно вводить парентерально, внутримышечно, внутривенно, внутрибрюшинно, внутрикожно, через слизистую оболочку, под слизистую оболочку, местно или подкожно.
Четвертый аспект настоящего изобретения касается вакцины согласно третьему аспекту настоящего изобретения для применения в профилактике и лечении инфекции, вызванной Streptococcus группы В.
Пятый аспект настоящего изобретения касается нуклеотидной последовательности, содержащей
по меньшей мере одну первую нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 7, или ее фрагменты, слитые, например, посредством химического присоединения, путем конъюгации или путем сшивания с
по меньшей мере одной второй нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 9, или его фрагментами, или альтернативно,
по меньшей мере одну нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 11.
Шестой аспект настоящего изобретения касается вектора, содержащего нуклеотидную последовательность согласно пятому аспекту настоящего изобретения.
Для экспрессии нуклеотидных последовательностей по данному изобретению можно использовать широкий спектр экспрессионных комбинаций хозяин/вектор. Полезные экспрессионные векторы для эукариотических хозяев включают, например, векторы, содержащие последовательности контроля экспрессии из SV40, вируса папилломы крупного рогатого скота, аденовируса, аденоассоциированного вируса, цитомегаловируса и ретровирусов. Полезные экспрессионные векторы для бактериальных хозяев включают бактериальные плазмиды, такие как плазмиды из Е. coli, включающие pBluescript, pGEX2T, векторы pUC, col E1, pCR1, pBR322, pMB9 и их производные, плазмиды из более широкого спектра хозяев, такие как RP4, фаговые ДНК, например многочисленные производные фага лямбда, например лямбда GT10 и лямбда GT11, NM989 и другие ДНК-фаги, такие как М13 и нитевидные одноцепочечные ДНК-фаги. Полезные экспрессионные векторы для дрожжевых клеток включают плазмиду 2.mu. и ее производные. Полезные векторы для клеток насекомых включают pVL 941.
Кроме того, для экспрессии нуклеотидных последовательностей/ДНК-последовательностей по настоящему изобретению в этих векторах может быть использована любая из широкого спектра последовательностей контроля экспрессии. Полезные последовательности контроля экспрессии включают последовательности контроля экспрессии, ассоциированные со структурными генами вышеупомянутых экспрессионных векторов. Примеры полезных последовательностей контроля экспрессии включают, например, ранние и поздние промоторы SV40 или аденовируса, lac-систему, trp-систему, систему ТАС или TRC, промоторы Т3 и Т7, основные области оператора и промотора фага лямбда, участки контроля белка оболочки fd, промотор 3-фосфоглицераткиназы или других гликолитических ферментов, промоторы кислой фосфатазы, например Pho5, промоторы системы альфа-спаривания дрожжей и другие конститутивные и индуцируемые промоторные последовательности, которые, как известно, контролируют экспрессию генов прокариотических или эукариотических клеток или их вирусов, и различные их комбинации.
Седьмой аспект настоящего изобретения относится к клетке-хозяину, содержащей вектор по шестому аспекту настоящего изобретения.
В одном воплощении седьмого аспекта настоящего изобретения клетка-хозяин может представлять собой грамотрицательную бактериальную клетку, грамположительную бактериальную клетку, дрожжевую клетку, клетку насекомого, клетку животного, клетку африканской зеленой обезьяны, клетку человека или клетку растения.
В других воплощениях клетки-хозяина по седьмому аспекту настоящего изобретения клетка-хозяин может быть выбрана из группы, состоящей из Е. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, Aspergillus, Lactobacillus, шигеллы, сальмонеллы, листерии, Streptococcus, стафилококков и грибов. Однако Е. coli является предпочтительной клеткой-хозяином.
Широкий спектр одноклеточных клеток-хозяев пригоден для экспрессии нуклеотидных последовательностей/последовательностей ДНК по настоящему изобретению. Эти хозяева могут включать хорошо известные эукариотические и прокариотические хозяева, такие как грамотрицательные и грамположительные штаммы, такие как штаммы Е. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, Streptococcus, стафилококков, лактобактерий, аспергилл, шигеллы, сальмонеллы, листерии, грибов, дрожжей, клетки насекомых, такие как Spodoptera frugiperda (SF9), клетки животных, такие как клетки СНО (яичника китайского хомячка) и мышей, клетки африканской зеленой обезьяны, такие как COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40 и BMT 10, клетки человека и растительные клетки в культуре ткани. Предпочтительные организмы-хозяева включают бактерии, такие как Е. coli и В. subtilis, и клетки млекопитающих в культуре тканей.
Разумеется, следует понимать, что не все векторы и последовательности контроля экспрессии функционируют одинаково хорошо при экспрессии нуклеотидных последовательностей/последовательностей ДНК по изобретению. Также не все хозяева одинаково хорошо функционируют с одной и той же системой экспрессии. Однако специалист в данной области может сделать выбор из этих векторов, последовательностей контроля экспрессии и хозяев без чрезмерного экспериментирования и без отклонения от объема настоящего изобретения. Например, при выборе вектора следует учитывать хозяина, так как вектор должен реплицироваться в нем. Также следует учитывать количество копий вектора, способности контролировать это число копий и экспрессию любых других белков, кодируемых вектором, таких как маркеры устойчивости к антибиотикам. При выборе последовательности контроля экспрессии также следует учитывать множество факторов. Они включают, например, относительную силу последовательности, ее контролируемость и ее совместимость с нуклеотидными последовательностями/последовательностями ДНК по данному изобретению, особенно в отношении потенциальных вторичных структур. Одноклеточные хозяева следует выбирать путем рассмотрения их совместимости с выбранным вектором, токсичности продукта, кодируемого нуклеотидными последовательностями/последовательностями ДНК по изобретению, характеристики их секреции, их способности правильно укладывать белок, их ферментации или требований при культивирования, а также легкости очистки от них продуктов, кодируемых нуклеотидными последовательностями/ последовательностями ДНК по изобретению. В рамках этих параметров специалист в данной области может выбрать различные комбинации векторов/последовательностей контроля экспрессии/хозяев, в которых будет экспрессироваться нуклеотидные последовательности/последовательности ДНК по изобретению при культивировании или в крупномасштабной животной культуре.
Полипептиды, то есть N-концевые фрагменты, белки и иммуногенный слитый белок, кодируемые нуклеотидными последовательностями/последовательностями ДНК по изобретению могут быть выделены из микробной культуры или культуры клеток и очищены с использованием любого из множества традиционных способов, включающих: жидкостную хроматографию такую как нормальная или с обращенной фазой, с использованием ВЭЖХ, FPLC (жидкостной хроматографии быстрого разрешения) и тому подобного; аффинную хроматографию (например с неорганическими лигандами или моноклональными антителами); ионообменную хроматографию, гель-фильтрационную хроматографию; хроматографию с иммобилизованными хелатами металлов; гель-электрофорез; тангенциальную поточную фильтрацию и тому подобное. Специалист в данной области может выбрать наиболее подходящие способы выделения и очистки без отклонения от объема настоящего изобретения.
Кроме того, полипептиды, то есть N-концевые фрагменты, белки и иммуногенный слитый белок по настоящему изобретению, могут быть получены с помощью любого из нескольких химических методов. Например, они могут быть получены с использованием твердофазной технологии синтеза, первоначально описанной в R.В. Merrifield (J Am Chem Soc 1963 83:2149-54), или они могут быть получены посредством синтеза в растворе. Краткое изложение методов пептидного синтеза можно найти в Е. Gross & Н. J. Meinhofer, 4 The Peptides: Analysis Synthesis, Biology; Modern Techniques Of Peptide And Amino Acid Analysis, John Wiley & Sons, (1981); и M. Bodanszky, Principles Of Peptide Synthesis, Springer-Verlag (1984).
Восьмой аспект настоящего изобретения относится к способу получения иммуногенного слитого белка, включающему стадии
а. Получение клетки-хозяина согласно седьмому аспекту настоящего изобретения,
б. Размножение клетки-хозяина,
в. Очистка иммуногенного слитого белка согласно первому аспекту настоящего изобретения и
г. Получение иммуногенного слитого белка.
Альтернативно, иммуногенный слитый белок может быть получен в бесклеточной экспрессионной системе.
Такие системы содержат все существенные факторы для экспрессии с соответствующей рекомбинантной нуклеиновой кислоты, функционально связанной с промотором, который будет функционировать в этой конкретной системе.
Девятый аспект настоящего изобретения относится к способу предупреждения или лечения инфекции, вызванной стрептококками группы В, который включает введение субъекту эффективного количества вакцины, как описано здесь. Эти способы включают введение субъекту фармацевтически эффективного количества вакцины по изобретению. В соответствии с настоящим изобретением также предложено применение иммуногенной композиции по изобретению для изготовления вакцины для предупреждения или лечения инфекции, вызванной стрептококками группы В.
Иммунопрофилактика матери вакциной для защиты от инфекции стрептококками группы В как матери, так и младенца первых месяцев жизни уже давно предлагается в качестве возможного пути. Таким образом, одно воплощение способа по девятому аспекту изобретения включает введение женщине эффективного количества вакцины, как описано здесь, которая способна придать иммунитет к инфекции еще не родившемуся ребенку женщины. Согласно этому воплощению вакцину вводят небеременной или беременной женщине в условиях времени и количества, достаточных, чтобы вызвать продуцирование антител, которые служат для защиты как женщины, так и плода или новорожденного (посредством пассивной передачи антител через плаценту).
Термины "предупреждение или лечение" в его различных грамматических формах по отношению к настоящему изобретению относится к предупреждению, исцеление, реверсии, ослаблению, облегчению, уменьшению, подавлению, минимизации, ингибированию или прекращению (1) вредных эффектов расстройства, ассоциированного с инфекцией, вызванной Streptococcus группы В, (2) прогрессирования расстройства или (3) возбудителя заболевания (Streptococcus группы В). Кроме того, предполагается, что термины "предупреждение или лечение" включают создание полного или частичного иммунитета субъекта к инфекции, вызванной стрептококками группы В.
Десятый аспект настоящего изобретения относится к способу предупреждения или лечения инфекции, вызванной Streptococcus группы В, которая включает введение нуждающемуся в этом человеку необходимого количества антител, вызванных воздействием вакцины на другого человека в соответствии с одним аспектом изобретения. Согласно этому воплощению субъект наделяется устойчивостью к Streptococcus группы В посредством пассивной иммунизации, то есть вакцину вводят хозяину-волонтеру (то есть человеку или млекопитающему), извлекают индуцированную антисыворотку и непосредственно вводят ее реципиенту с предполагаемой инфекцией, вызванной Streptococcus группы В. Предполагается, что такую антисыворотку можно вводить беременной женщине (во время или до родов), в условиях времени и количества, достаточных для того, чтобы антисыворотка послужила бы для защиты плода или новорожденного (посредством пассивного включения антител через плаценту).
Таким образом, вакцина или антисыворотка по настоящему изобретению могут быть введены либо до начала инфекции (чтобы предотвратить или ослабить ожидаемую инфекцию), либо после начала фактической инфекции.
Вакцину можно вводить людям или животным, включая млекопитающих и птиц, таким как грызуны (мышь, крыса, морская свинка или кролик); птицы (индейка, курица или цыпленок); другие сельскохозяйственные животные (корова, лошадь, свинья или поросенок); домашние животные (собака, кошка и другие домашние животные); и люди. Хотя многих животных можно лечить вакциной по изобретению, но предпочтительным субъектом для лечения является человек или хозяйственно ценные животные и сельскохозяйственные животные, такие как рыба, например тилапия, и верблюды.
Вакцину можно вводить субъекту в соответствии со способами, известными в данной области техники. Такие способы включают применение, например парентеральное, например посредством всех способов инъекций в, или через, кожу: например внутримышечное, внутривенное, внутрибрюшинное, внутрикожное, через слизистую оболочку, под слизистую оболочку или подкожное. Кроме того, они могут быть нанесены местно в виде капель, спрея, геля или мази на эпителий слизистой оболочки глаза, носа, рта, ануса или влагалища, или на эпидермис наружного слоя кожи в любой части тела. Другими возможными путями нанесения являются распыление, аэрозоль или внесение порошка посредством ингаляции через дыхательные пути. В этом последнем случае размер используемых частиц будет определять, насколько глубоко эти частицы будут проникать в дыхательные пути. Альтернативно, применение может быть осуществлено через пищу путем объединения с пищей, кормом или питьевой водой, например в виде порошка, жидкости или таблетки, или путем введения непосредственно в рот в виде жидкости, геля, таблетки или капсулы, или в анус в виде суппозитория. Вакцину можно также вводить в виде ДНК-вакцины.
Существует множество различных способов регулирования времени иммунизации. Можно применять композиции по изобретению более одного раза для увеличения уровней и разновидностей экспрессии репертуара иммуноглобулинов, экспрессируемых иммунизированным животным. Как правило, при использовании нескольких иммунизаций, эти иммунизации будут отделены друг от друга одним-двумя месяцами.
Термин "эффективное количество" по отношению к настоящему изобретению относится к количеству, которое обеспечивает терапевтический эффект для данного состояния и режима введения. Это предварительно определенное количество активного вещества, рассчитанное для получения нужного терапевтического эффекта в сочетании с необходимыми добавками и разбавителями; то есть носителем или разбавителем для введения. Кроме того, предполагается, что он означает количество, достаточное для уменьшения и, наиболее предпочтительно, предупреждения клинически значимого дефицита в активности и реакции хозяина. Альтернативно, терапевтически эффективное количество является достаточным, чтобы вызвать улучшение клинически значимого состояния хозяина. Как понятно специалистам в данной области, количество соединения может варьироваться в зависимости от его удельной активности. Подходящие дозы могут содержать заданное количество активной композиции, рассчитанное для получения нужного терапевтического эффекта в сочетании с необходимыми разбавителями; то есть носителем или добавкой. Кроме того, дозировка для введения будет варьироваться в зависимости от используемого ингредиента или ингредиентов, возраста, массы и т.д. подлежащего лечению субъекта.
Эксперименты по определению дозы проводили для ранее описанного слитого белка, раскрытого в WO 2008127179, на мышах и на людях. У мышей зависимость доза-эффект наблюдали при дозах от примерно 80 нг до 2 мкг в присутствии альгидрогеля, то есть AlOH, с плато, достигаемым при количестве более 2 мкг. У людей тестировали дозы 10 мкг, 50 мкг и 100 мкг в отсутствие или в присутствии альгидрогеля. Для группы альгидрогеля доза 10 мкг находится как раз на вершине кривой зависимости эффекта от дозы, а дозы 50 и 250 мкг находились на плато. Таким образом, предпочтительные для человека дозы иммуногенного слитого белка по первому аспекту настоящего изобретения в присутствии альгидрогеля находятся в диапазоне от 1 до 250 мкг, предпочтительно от 10 до 150 мкг, предпочтительно от 25 до 100 мкг, или от 40 до 80 мкг. В отсутствие альгидрогеля предпочтительные для человека дозы иммуногенного слитого белка по первому аспекту настоящего изобретения составляют от 10 до 100 мкг, предпочтительно от 50 до 500 мкг, или предпочтительно от 100 до 250 мкг.
Как правило, дозировка может состоять из начальной инъекции, наиболее вероятно с адъювантом, за которой, наиболее вероятно, следует одна или несколько бустерных инъекций. Предпочтительно, бустерные инъекции можно вводить примерно через 1 и 6 месяцев после первоначальной инъекции.
--->
SEQUENCE LISTING
<110>  MinervaX ApS
<120>  Immunogenic Fusion Protein
<130>  P11065PC00
<160>  14
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  537
<212>  DNA
<213>  Streptococcus sp.
<400>  1
gggcccctgg gatccgctga agtaatttca ggaagtgctg ttacgttaaa cacaaatatg       60
actaaaaatg ttcagaatgg tagagcatat atagatttat atgatgtgaa aaatgggaaa      120
atagatccat tacaattaat tacgttaaat tcacctgatt taaaagctca gtatgtcatt      180
aggcaaggcg gcaattattt cacacaacct tctgaattga ctactgttgg tgcagctagt      240
attaattata cagtattgaa gacagatgga agtcctcata cgaagcctga tggacaagtg      300
gatattataa acgtttcatt gactatttac aattcttcag ctttgagaga taaaatagat      360
gaagttaaaa agaaagcgga agaccctaaa tgggacgagg gaagtcgcga taaagttttg      420
ataagtttag atgatatcaa aacagatatt gataataatc ctaagacgca atcagacatt      480
gccaataaaa taactgaagt tactaattta gaaaaaatac tagtacctcg aatccca         537
<210>  2
<211>  179
<212>  PRT
<213>  Streptococcus sp.
<400>  2
Gly Pro Leu Gly Ser Ala Glu Val Ile Ser Gly Ser Ala Val Thr Leu
1               5                   10                  15
Asn Thr Asn Met Thr Lys Asn Val Gln Asn Gly Arg Ala Tyr Ile Asp
20                  25                  30
Leu Tyr Asp Val Lys Asn Gly Lys Ile Asp Pro Leu Gln Leu Ile Thr
35                  40                  45
Leu Asn Ser Pro Asp Leu Lys Ala Gln Tyr Val Ile Arg Gln Gly Gly
50                  55                  60
Asn Tyr Phe Thr Gln Pro Ser Glu Leu Thr Thr Val Gly Ala Ala Ser
65                  70                  75                  80
Ile Asn Tyr Thr Val Leu Lys Thr Asp Gly Ser Pro His Thr Lys Pro
85                  90                  95
Asp Gly Gln Val Asp Ile Ile Asn Val Ser Leu Thr Ile Tyr Asn Ser
100                 105                 110
Ser Ala Leu Arg Asp Lys Ile Asp Glu Val Lys Lys Lys Ala Glu Asp
115                 120                 125
Pro Lys Trp Asp Glu Gly Ser Arg Asp Lys Val Leu Ile Ser Leu Asp
130                 135                 140
Asp Ile Lys Thr Asp Ile Asp Asn Asn Pro Lys Thr Gln Ser Asp Ile
145                 150                 155                 160
Ala Asn Lys Ile Thr Glu Val Thr Asn Leu Glu Lys Ile Leu Val Pro
165                 170                 175
Arg Ile Pro
<210>  3
<211>  525
<212>  DNA
<213>  Streptococcus sp.
<400>  3
gggcccctgg gatcctctac aattccaggg agtgcagcga ccttaaatac aagcatcact       60
aaaaatatac aaaacggaaa tgcttacata gatttatatg atgtaaaatt aggtaaaata      120
gatccattac aattaattgt tttagaacaa ggttttacag caaagtatgt ttttagacaa      180
ggtactaaat actatgggga tgtttctcag ttgcagagta caggaagggc tagtcttacc      240
tataatatat ttggtgaaga tggactacca catgtaaaga ctgatggaca aattgatata      300
gttagtgttg ctttaactat ttatgattca acaaccttga gggataagat tgaagaagtt      360
agaacgaatg caaacgatcc taagtggacg gaagaaagtc gtactgaggt tttaacagga      420
ttagatacaa ttaagacaga tattgataat aatcctaaga cgcaaacaga tattgatagt      480
aaaattgttg aggttaatga attagagaaa ttgttagtat tgtca                      525
<210>  4
<211>  175
<212>  PRT
<213>  Streptococcus sp.
<400>  4
Gly Pro Leu Gly Ser Ser Thr Ile Pro Gly Ser Ala Ala Thr Leu Asn
1               5                   10                  15
Thr Ser Ile Thr Lys Asn Ile Gln Asn Gly Asn Ala Tyr Ile Asp Leu
20                  25                  30
Tyr Asp Val Lys Leu Gly Lys Ile Asp Pro Leu Gln Leu Ile Val Leu
35                  40                  45
Glu Gln Gly Phe Thr Ala Lys Tyr Val Phe Arg Gln Gly Thr Lys Tyr
50                  55                  60
Tyr Gly Asp Val Ser Gln Leu Gln Ser Thr Gly Arg Ala Ser Leu Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Asn Ile Phe Gly Glu Asp Gly Leu Pro His Val Lys Thr Asp Gly
85                  90                  95
Gln Ile Asp Ile Val Ser Val Ala Leu Thr Ile Tyr Asp Ser Thr Thr
100                 105                 110
Leu Arg Asp Lys Ile Glu Glu Val Arg Thr Asn Ala Asn Asp Pro Lys
115                 120                 125
Trp Thr Glu Glu Ser Arg Thr Glu Val Leu Thr Gly Leu Asp Thr Ile
130                 135                 140
Lys Thr Asp Ile Asp Asn Asn Pro Lys Thr Gln Thr Asp Ile Asp Ser
145                 150                 155                 160
Lys Ile Val Glu Val Asn Glu Leu Glu Lys Leu Leu Val Leu Ser
165                 170                 175
<210>  5
<211>  1053
<212>  DNA
<213>  Streptococcus sp.
<400>  5
gggcccctgg gatccgctga agtaatttca ggaagtgctg ttacgttaaa cacaaatatg       60
actaaaaatg ttcagaatgg tagagcatat atagatttat atgatgtgaa aaatgggaaa      120
atagatccat tacaattaat tacgttaaat tcacctgatt taaaagctca gtatgtcatt      180
aggcaaggcg gcaattattt cacacaacct tctgaattga ctactgttgg tgcagctagt      240
attaattata cagtattgaa gacagatgga agtcctcata cgaagcctga tggacaagtg      300
gatattataa acgtttcatt gactatttac aattcttcag ctttgagaga taaaatagat      360
gaagttaaaa agaaagcgga agaccctaaa tgggacgagg gaagtcgcga taaagttttg      420
ataagtttag atgatatcaa aacagatatt gataataatc ctaagacgca atcagacatt      480
gccaataaaa taactgaagt tactaattta gaaaaaatac tagtacctcg aatcccagaa      540
ttctctacaa ttccagggag tgcagcgacc ttaaatacaa gcatcactaa aaatatacaa      600
aacggaaatg cttacataga tttatatgat gtaaaattag gtaaaataga tccattacaa      660
ttaattgttt tagaacaagg ttttacagca aagtatgttt ttagacaagg tactaaatac      720
tatggggatg tttctcagtt gcagagtaca ggaagggcta gtcttaccta taatatattt      780
ggtgaagatg gactaccaca tgtaaagact gatggacaaa ttgatatagt tagtgttgct      840
ttaactattt atgattcaac aaccttgagg gataagattg aagaagttag aacgaatgca      900
aacgatccta agtggacgga agaaagtcgt actgaggttt taacaggatt agatacaatt      960
aagacagata ttgataataa tcctaagacg caaacagata ttgatagtaa aattgttgag     1020
gttaatgaat tagagaaatt gttagtattg tca                                  1053
<210>  6
<211>  378
<212>  PRT
<213>  Streptococcus sp.
<400>  6
Gly Pro Leu Gly Ser Ala Ser Val Leu Ile Gly Ile Ser Phe Leu Gly
1               5                   10                  15
Gly Phe Thr Gln Gly Gln Phe Asn Ile Ser Thr Asp Thr Val Phe Ala
20                  25                  30
Ala Glu Val Ile Ser Gly Ser Ala Val Thr Leu Asn Thr Asn Met Thr
35                  40                  45
Lys Asn Val Gln Asn Gly Arg Ala Tyr Ile Asp Leu Tyr Asp Val Lys
50                  55                  60
Asn Gly Lys Ile Asp Pro Leu Gln Leu Ile Thr Leu Asn Ser Pro Asp
65                  70                  75                  80
Leu Lys Ala Gln Tyr Val Ile Arg Gln Gly Gly Asn Tyr Phe Thr Gln
85                  90                  95
Pro Ser Glu Leu Thr Thr Val Gly Ala Ala Ser Ile Asn Tyr Thr Val
100                 105                 110
Leu Lys Thr Asp Gly Ser Pro His Thr Lys Pro Asp Gly Gln Val Asp
115                 120                 125
Ile Ile Asn Val Ser Leu Thr Ile Tyr Asn Ser Ser Ala Leu Arg Asp
130                 135                 140
Lys Ile Asp Glu Val Lys Lys Lys Ala Glu Asp Pro Lys Trp Asp Glu
145                 150                 155                 160
Gly Ser Arg Asp Lys Val Leu Ile Ser Leu Asp Asp Ile Lys Thr Asp
165                 170                 175
Ile Asp Asn Asn Pro Lys Thr Gln Ser Asp Ile Ala Asn Lys Ile Thr
180                 185                 190
Glu Val Thr Asn Leu Glu Lys Ile Leu Val Pro Arg Ile Pro Glu Phe
195                 200                 205
Ser Thr Ile Pro Gly Ser Ala Ala Thr Leu Asn Thr Ser Ile Thr Lys
210                 215                 220
Asn Ile Gln Asn Gly Asn Ala Tyr Ile Asp Leu Tyr Asp Val Lys Leu
225                 230                 235                 240
Gly Lys Ile Asp Pro Leu Gln Leu Ile Val Leu Glu Gln Gly Phe Thr
245                 250                 255
Ala Lys Tyr Val Phe Arg Gln Gly Thr Lys Tyr Tyr Gly Asp Val Ser
260                 265                 270
Gln Leu Gln Ser Thr Gly Arg Ala Ser Leu Thr Tyr Asn Ile Phe Gly
275                 280                 285
Glu Asp Gly Leu Pro His Val Lys Thr Asp Gly Gln Ile Asp Ile Val
290                 295                 300
Ser Val Ala Leu Thr Ile Tyr Asp Ser Thr Thr Leu Arg Asp Lys Ile
305                 310                 315                 320
Glu Glu Val Arg Thr Asn Ala Asn Asp Pro Lys Trp Thr Glu Glu Ser
325                 330                 335
Arg Thr Glu Val Leu Thr Gly Leu Asp Thr Ile Lys Thr Asp Ile Asp
340                 345                 350
Asn Asn Pro Lys Thr Gln Thr Asp Ile Asp Ser Lys Ile Val Glu Val
355                 360                 365
Asn Glu Leu Glu Lys Leu Leu Val Leu Ser
370                 375
<210>  7
<211>  525
<212>  DNA
<213>  Streptococcus sp.
<400>  7
atggccgaag ttattagcgg tagcgcagca accctgaata gcgcactggt taaaaatgtt       60
agcggtggca aagcctatat cgacatctat gatgtgaaaa acggcaaaat tgatccgctg      120
aatctgattg ttctgcctcc gagcaattat agcgccaact attatatcaa acagggtggt      180
cgcattttca ccaatgttaa tcagctgcag acaccgggta cagcaaccat tacctataac      240
attctggatg aaaatggcaa cccgtatacc aaaagtgatg gccagattga tattgttagc      300
ctggttacca ccgtttatga taccaccgaa ctgcgcaata acatcaacaa agttattgag      360
aatgccaacg acccgaaatg gtcagatgat agccgtaaag atgttctgag caaaatcgag      420
gtgatcaaaa acgatattga taacaacccg aaaacccaga gcgatatcga caacaaaatt      480
gtggaagtga acgagctgga aaaactgctg gttctgccgt aataa                      525
<210>  8
<211>  173
<212>  PRT
<213>  Streptococcus sp.
<400>  8
Met Ala Glu Val Ile Ser Gly Ser Ala Ala Thr Leu Asn Ser Ala Leu
1               5                   10                  15
Val Lys Asn Val Ser Gly Gly Lys Ala Tyr Ile Asp Ile Tyr Asp Val
20                  25                  30
Lys Asn Gly Lys Ile Asp Pro Leu Asn Leu Ile Val Leu Thr Pro Ser
35                  40                  45
Asn Tyr Ser Ala Asn Tyr Tyr Ile Lys Gln Gly Gly Arg Ile Phe Thr
50                  55                  60
Ser Val Asn Gln Leu Gln Thr Pro Gly Thr Ala Thr Ile Thr Tyr Asn
65                  70                  75                  80
Ile Leu Asp Glu Asn Gly Asn Pro Tyr Thr Lys Ser Asp Gly Gln Ile
85                  90                  95
Asp Ile Val Ser Leu Val Thr Thr Val Tyr Asp Thr Thr Glu Leu Arg
100                 105                 110
Asn Asn Ile Asn Lys Val Ile Glu Asn Ala Asn Asp Pro Lys Trp Ser
115                 120                 125
Asp Asp Ser Arg Lys Asp Val Leu Ser Lys Ile Glu Val Ile Lys Asn
130                 135                 140
Asp Ile Asp Asn Asn Pro Lys Thr Gln Ser Asp Ile Asp Asn Lys Ile
145                 150                 155                 160
Val Glu Val Asn Glu Leu Glu Lys Leu Leu Val Leu Pro
165                 170
<210>  9
<211>  528
<212>  DNA
<213>  Streptococcus sp.
<400>  9
atggcaagca ccattccggg tagcgcagca accctgaata ccagcattac caaaaacatt       60
cagaatggca acgcctatat cgatctgtat gatgtgaaaa acggtctgat tgatccgcag      120
aatctgattg ttctgaatcc gagcagctat agcgccaact attatatcaa acagggtgcc      180
aaatattaca gcaacccgag cgaaattacc accaccggta gcgcaaccat tacctttaac      240
attctggatg aaaccggcaa cccgcataaa aaagcagatg gtcagattga tattgtgagc      300
gttaacctga ccatttatga tagcaccgca ctgcgtaatc gtattgatga agttattaac      360
aatgccaacg acccgaaatg gtctgatggt agccgtgatg aagtgctgac cggtctggaa      420
aaaatcaaaa aagatatcga taacaacccg aaaacccaga tcgacattga caacaaaatt      480
aacgaagtga acgaaatcga aaaactgctg gttgttagcc tgtaataa                   528
<210>  10
<211>  173
<212>  PRT
<213>  Streptococcus sp.
<400>  10
Ala Ser Thr Ile Pro Gly Ser Ala Ala Thr Leu Asn Thr Ser Ile Thr
1               5                   10                  15
Lys Asn Ile Gln Asn Gly Asn Ala Tyr Ile Asp Leu Tyr Asp Val Lys
20                  25                  30
Asn Gly Leu Ile Asp Pro Gln Asn Leu Ile Val Leu Asn Pro Ser Ser
35                  40                  45
Tyr Ser Ala Asn Tyr Tyr Ile Lys Gln Gly Ala Lys Tyr Tyr Ser Asn
50                  55                  60
Pro Ser Glu Ile Thr Thr Thr Gly Ser Ala Thr Ile Thr Phe Asn Ile
65                  70                  75                  80
Leu Asp Glu Thr Gly Asn Pro His Lys Lys Ala Asp Gly Gln Ile Asp
85                  90                  95
Ile Val Ser Val Asn Leu Thr Ile Tyr Asp Ser Thr Ala Leu Arg Asn
100                 105                 110
Arg Ile Asp Glu Val Ile Asn Asn Ala Asn Asp Pro Lys Trp Ser Asp
115                 120                 125
Gly Ser Arg Asp Glu Val Leu Thr Gly Leu Glu Lys Ile Lys Lys Asp
130                 135                 140
Ile Asp Asn Asn Pro Lys Thr Gln Ile Asp Ile Asp Asn Lys Ile Asn
145                 150                 155                 160
Glu Val Asn Glu Ile Glu Lys Leu Leu Val Val Ser Leu
165                 170
<210>  11
<211>  1047
<212>  DNA
<213>  Streptococcus sp.
<400>  11
atggccgaag ttattagcgg tagcgcagca accctgaata gcgcactggt taaaaatgtt       60
agcggtggca aagcctatat cgacatctat gatgtgaaaa acggcaaaat tgatccgctg      120
aatctgattg ttctgcctcc gagcaattat agcgccaact attatatcaa acagggtggt      180
cgcattttca ccaatgttaa tcagctgcag acaccgggta cagcaaccat tacctataac      240
attctggatg aaaatggcaa cccgtatacc aaaagtgatg gccagattga tattgttagc      300
ctggttacca ccgtttatga taccaccgaa ctgcgcaata acatcaacaa agttattgag      360
aatgccaacg acccgaaatg gtcagatgat agccgtaaag atgttctgag caaaatcgag      420
gtgatcaaaa acgatattga taacaacccg aaaacccaga gcgatatcga caacaaaatt      480
gtggaagtga acgagctgga aaaactgctg gttctgccgg aatttagcac cattccgggt      540
tcagcagcca cactgaatac cagcattacc aaaaacattc agaatggcaa cgcctacatt      600
gatctgtacg atgtaaaaaa tggtctgatc gatccgcaga acctgatcgt gctgaatccg      660
agcagctatt cagccaatta ttatattaaa caaggcgcaa aatactatag caacccgagc      720
gaaattacca ccaccggtag cgccaccatt acgtttaata tcctggacga aaccggtaac      780
ccgcataaaa aagcagatgg tcaaattgat atcgtgagcg ttaacctgac gatttatgat      840
agcacagccc tgcgtaatcg tattgatgaa gtgattaata acgcgaatga tcctaaatgg      900
tccgatggta gtcgtgatga agtactgacc ggtctggaaa aaatcaaaaa agacatcgac      960
aataatccga aaacgcagat tgacattgac aataaaatca acgaggtgaa cgagatcgag     1020
aaactgctgg tagttagcct gtaataa                                         1047
<210>  12
<211>  347
<212>  PRT
<213>  Streptococcus sp.
<400>  12
Met Ala Glu Val Ile Ser Gly Ser Ala Ala Thr Leu Asn Ser Ala Leu
1               5                   10                  15
Val Lys Asn Val Ser Gly Gly Lys Ala Tyr Ile Asp Ile Tyr Asp Val
20                  25                  30
Lys Asn Gly Lys Ile Asp Pro Leu Asn Leu Ile Val Leu Thr Pro Ser
35                  40                  45
Asn Tyr Ser Ala Asn Tyr Tyr Ile Lys Gln Gly Gly Arg Ile Phe Thr
50                  55                  60
Ser Val Asn Gln Leu Gln Thr Pro Gly Thr Ala Thr Ile Thr Tyr Asn
65                  70                  75                  80
Ile Leu Asp Glu Asn Gly Asn Pro Tyr Thr Lys Ser Asp Gly Gln Ile
85                  90                  95
Asp Ile Val Ser Leu Val Thr Thr Val Tyr Asp Thr Thr Glu Leu Arg
100                 105                 110
Asn Asn Ile Asn Lys Val Ile Glu Asn Ala Asn Asp Pro Lys Trp Ser
115                 120                 125
Asp Asp Ser Arg Lys Asp Val Leu Ser Lys Ile Glu Val Ile Lys Asn
130                 135                 140
Asp Ile Asp Asn Asn Pro Lys Thr Gln Ser Asp Ile Asp Asn Lys Ile
145                 150                 155                 160
Val Glu Val Asn Glu Leu Glu Lys Leu Leu Val Leu Pro Glu Phe Ser
165                 170                 175
Thr Ile Pro Gly Ser Ala Ala Thr Leu Asn Thr Ser Ile Thr Lys Asn
180                 185                 190
Ile Gln Asn Gly Asn Ala Tyr Ile Asp Leu Tyr Asp Val Lys Asn Gly
195                 200                 205
Leu Ile Asp Pro Gln Asn Leu Ile Val Leu Asn Pro Ser Ser Tyr Ser
210                 215                 220
Ala Asn Tyr Tyr Ile Lys Gln Gly Ala Lys Tyr Tyr Ser Asn Pro Ser
225                 230                 235                 240
Glu Ile Thr Thr Thr Gly Ser Ala Thr Ile Thr Phe Asn Ile Leu Asp
245                 250                 255
Glu Thr Gly Asn Pro His Lys Lys Ala Asp Gly Gln Ile Asp Ile Val
260                 265                 270
Ser Val Asn Leu Thr Ile Tyr Asp Ser Thr Ala Leu Arg Asn Arg Ile
275                 280                 285
Asp Glu Val Ile Asn Asn Ala Asn Asp Pro Lys Trp Ser Asp Gly Ser
290                 295                 300
Arg Asp Glu Val Leu Thr Gly Leu Glu Lys Ile Lys Lys Asp Ile Asp
305                 310                 315                 320
Asn Asn Pro Lys Thr Gln Ile Asp Ile Asp Asn Lys Ile Asn Glu Val
325                 330                 335
Asn Glu Ile Glu Lys Leu Leu Val Val Ser Leu
340                 345
<210>  13
<211>  310
<212>  DNA
<213>  Streptococcus sp.
<400>  13
gtagttgaag gaagtgctgc aacattaaat actgccatga ctaaaaacat gcagaatggg       60
aatgcatata ttgatattta tgatgttaaa ttaggaaaaa ttgatccatt acaactgatt      120
aaattggaac cgggatacac tgctatttat tacattacac aaggttcaaa agtttatgca      180
aatgtttcgg agctacaaac accaggagca gcgaaagtta attatcgtat tcaaacctct      240
gatggaagcg atcatataaa atctgatggt caattagaca gcgttaatat ttcattaaca      300
gtttatgatt                                                             310
<210>  14
<211>  103
<212>  PRT
<213>  Streptococcus sp.
<400>  14
Val Val Glu Gly Ser Ala Ala Thr Leu Asn Thr Ala Met Thr Lys Asn
1               5                   10                  15
Met Gln Asn Gly Asn Ala Tyr Ile Asp Ile Tyr Asp Val Lys Leu Gly
20                  25                  30
Lys Ile Asp Pro Leu Gln Leu Ile Lys Leu Glu Pro Gly Tyr Thr Ala
35                  40                  45
Ile Tyr Tyr Ile Thr Gln Gly Ser Lys Val Tyr Ala Asn Val Ser Glu
50                  55                  60
Leu Gln Thr Pro Gly Ala Ala Lys Val Asn Tyr Arg Ile Gln Thr Ser
65                  70                  75                  80
Asp Gly Ser Asp His Ile Lys Ser Asp Gly Gln Leu Asp Ser Val Asn
85                  90                  95
Ile Ser Leu Thr Val Tyr Asp
100
<---