ФЕРМЕНТЫ ЖИДКОСТИ ИКРИНОК, ПОЛУЧАЕМОЙ ПРИ ВЫЛУПЛЕНИИ, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
ENZYMES OF LIQUID EGGS PRODUCED DURING HATCHING, AND USE THEREOF

Настоящее изобретение относится к применению хориолизина и очень кислых белков (VAP), получаемых из жидкости икринок рыб, получаемой при вылуплении, отдельно или в комбинации в различных косметических и медицинских применениях на коже. Настоящее изобретение также относится к очень кислым белкам, которые описаны для их применения.
Кожа представляет собой один из наиболее уязвимых органов тела. Хотя они редко угрожают жизни, заболевания или патологические состояния кожи могут быть неприятными и вызывать хроническую нетрудоспособность. Кроме того, так как кожа является настолько видимой, заболевания и патологические состояния кожи могут приводить к психологическому стрессу. Следовательно, существует постоянная необходимость в эффективном лечении заболеваний и патологических состояний кожи.
Кожа является самым крупным органом тела, составляя около 12-16 процентов массы тела человека. Она осуществляет множество жизненно важных функций, как барьерное, так и регулирующее взаимодействие между внешним миром и контролируемым окружением в нашем организме.
Кожа состоит из 3 слоев, а именно эпидермиса, дермы и подкожного слоя. Эпидермис является самым верхним, эпителиальным слоем кожи. Он действует как физический барьер, предотвращающий потерю воды из организма, и предотвращающий попадание в тело веществ и организмов. Его толщина варьируется в зависимости от области тела.
Эпидермис состоит из слоистого плоского эпителия, т.е. он состоит из слоев расплющенных клеток. Кожа, волосы и ногти являются кератинизированными, что обозначает, что они имеют мертвую, твердую гидрофобную поверхность, состоящую из белка, называемого кератином. Эпидермис делается непроницаемым из-за содержания внеклеточных липидов, ассоциированных с кератиноцитами, особенно в среднем слое эпидермиса (stratum lucidum). Слизистые мембраны (например, пищевода, ротоглоточной полости, репродуктивных органов и других) преимущественно являются некератинизированными и влажными. Эпидермис имеет три основных типа клеток, а именно, кератиноциты (клетки кожи), меланоциты (пигмент-продуцирующие клетки) и клетки Лангерганса (иммунные клетки). Клетки Меркеля представляют собой четвертые, менее распространенные эпидермальные клетки.
Кератиноциты созревают и дифференцируются с накоплением кератина при движении наружу. Они в конечном счете отпадают или отслаиваются. Они формируют четыре или пять отдельных слоев, которые от наиболее поверхностного к наиболее глубокому представляют собой (i) Stratum corneum (роговой слой) с мертвыми, высушенным твердыми клетками без ядер, (ii) Stratum granulosum (гранулярный слой) с клетками, содержащими базофильные гранулы и отделенными снаружи от рогового слоя тонким блестящим слоем, (iii) Stratum spinulosum (колючий, игольчатый или шиповатый слой клеток), в котором клетки становятся все больше уплощенными при движении наружу и (iv) Stratum basale (базальный слой) с колонообразными (высокими) регенеративными клетками.
Непосредственно под эпидермисом находится базальная мембрана, специализированная структура, которая лежит между эпидермисом и дермой.
Дерма представляет собой фиброзную соединительную ткань или поддерживающий слой кожи. Основными волокнами являются волокна коллагена и эластина, которые переплетены.
Подкожный слой представляет собой жировой слой непосредственно под дермой и эпидермисом. Он также называется подкожной тканью, гиподермой или слоем. Подкожный слой преимущественно состоит из жировых клеток (адипоцитов), нервов и кровеносных сосудов.
Новые эпителиальные клетки кожи создаются в нижнем слое кожи, гранулезном слое. С течением времени клетки мигрируют к поверхности кожи и становятся более кислыми. В течение их 30-дневного путешествия они умирают и становятся насыщенными кератином. Кератин-ассоциированные липиды важны, так как они защищают кожу от внешних элементов.
Заболевания, повреждения, факторы окружающей среды, возраст, уровень гормонов, лекарственные препараты, вещества, наносимые наружно или потребляемые внутрь, генетические состояния или множество других факторов, действующих на кожу, могут приводить к отклонениям от нормы или нарушениям. Некоторые из таких отклонений от нормы или нарушений могут быть чисто косметическими по природе, например, сухость кожи, морщины или измененная пигментация, или могут быть более тяжелыми, приводя к боли или дискомфорту, например, экзема и псориаз.
Сухость кожи является одним из наиболее частых состояний или заболеваний кожи. Хотя определенные лица являются более подверженными к сухости кожи, состояние может поражать каждого, вне зависимости от возраста, пола или типа кожи.
Сухость кожи развивается, когда наружный слой кожи (роговой слой с блестящим слоем) обедняется водой. Когда этот слой хорошо увлажнен, он минимизирует потери воды через кожу и помогает не впускать раздражающие факторы, аллергены и патогенные микроорганизмы. Однако, когда роговой слой высыхает, его защитная функция снижается. Это допускает большие потери воды, оставляя кожу восприимчивой к факторам окружающей среды.
В нормальных условиях роговой слой имеет содержание воды от 10% до 30%. Вода придает коже ее мягкую, гладкую и гибкую текстуру. Вода приходит из атмосферы, подлежащих слоев кожи и пота. Жир, продуцируемый кожными железами, и жирные вещества, продуцируемые клетками кожи, действуют как натуральные увлажнители, позволяя роговому слою изолировать воду.
Организм непрерывно теряет воду через поверхность кожи путем испарения. В нормальных условиях скорость потери низка и вода адекватно замещается. Характерные признаки и симптомы сухой кожи возникают, когда потери воды превосходят замещение воды и содержание воды в роговом слое падает ниже 10%.
Крайне желательными являются увлажнители, которые улучшают или устраняют сухость кожи. Тогда как в области техники известно множество увлажнителей, сохраняется необходимость в натуральных продуктах, которые являются эффективными и мягкими.
Другим частым заболеванием или состоянием кожи является избыточное количество рогового слоя кожи. Такое состояние может возникать в результате недостаточного отслаивания рогового слоя или вследствие избыточного отложения кератина в роговом слое. Последнее может возникать, когда естественные процессы разрушения кожи становятся неравномерными, что придает коже сухой и шершавый характер. Доброкачественные гиперпролиферативные расстройства включают эпидермолитический гиперкератоз (или трещины кожи) и кератоз фолликулов кожи. Одним обычным доброкачественным гиперпролиферативным состоянием является периферическая гипертрофия вокруг шрамов и/или образование келоидов. Другими гиперпролиферативными состояниями являются омозолелости, мозоли, гиперкератозные бородавки (особенно veruca vulgaris), ихтиоз и ладонно-подошвенный кератоз.
Существующее лечение включает отшелушивание или хирургическое вмешательство в крайних случаях. Гиперкератоз обычно лечат путем увлажнения рогового слоя и удаления утолщенной кожи.
Отшелушивание также может использоваться для удаления измененных эпидермальных клеток, например, эпидермальных клеток из эпидермиса, имеющего расстройства пигментации, например, печеночные пятна.
Отшелушивание удаляет наружные слои эпидермиса, чтобы открыть под ними более новые клетки кожи. Отшелушивание может быть достигнуто физическими средствами (например, абразия кожи) или химическими средствами. Химические эксфолианты включают скрабы, содержащие салициловую кислоту, гликолевую кислоту, фруктовые ферменты, лимонную кислоту или яблочную кислоту, и могут наноситься в высоких концентрациях дерматологом, или в более низких концентрациях в продуктах для домашнего применения. Химическое отшелушивание может включать применение продуктов, которые содержат альфа гидроксикислоты (AHA) или бета гидроксикислоты (BHA), или ферменты, которые действуют, разрыхляя клееподобные вещества, которые скрепляют клетки вместе в соединения клеток, позволяя им легко удаляться. Такой тип отшелушивания рекомендуется для людей, лечащих акне.
Наибольшим недостатком отшелушивания является высокая стоимость некоторых продуктов и способов, используемых для достижения этого. Отшелушивание приводит к некоторому исходному покраснению кожи. Ближе к концу химических пилингов кожа замораживается, с цветом, варьирующимся на поверхности кожи от ярко белого до серого. Следовательно, желательны более эффективные способы, которые являются более мягкими для кожи.
Следовательно остается необходимость в методах лечения, подходящих для увлажнения кожи и/или для отшелушивания рогового слоя кожи.
Неожиданно было обнаружено, что определенные молекулы, которые обнаруживают в жидкости икринок рыб, получаемой при вылуплении, являются очень эффективными увлажнителями и эксфолиантами, а именно, хориолизин и заново идентифицированная группа очень кислых белков (VAP).
Вылупление рыбных эмбрионов достигается по меньшей мере частично посредством так называемых ферментов вылупления, хориолизинов. Хориолизин представляет собой металлопротеиназу, обнаруживаемую в жидкости икринок рыб, получаемой при вылуплении, и обычно обнаруживается в двух формах, а именно высокохориолитический фермент (хориолизин H, HCE) и низкохориолитический фермент (хориолизин L, LCE), которые являются сходными по некоторым структурным и каталитическим характеристикам и принадлежат к семейству астацина, но с существенно различными предпочтительными субстратами.
У лосося LCE является относительно необычным по сравнению с известными хориолизинами других видов рыб, и может применяться для целей, которые описаны в настоящем описании далее. Последовательность LCE лосося представлена в SEQ ID NO: 1, ниже.
Как упомянуто выше, в настоящее время была идентифицирована группа очень кислых белков (VAP) в жидкости икринок рыб, получаемой при вылуплении путем осаждения из других компонентов в 80% ацетоне и удаления ацетона выпариванием центрифугированного осадка, как описано в примерах.
Такие VAP образуются путем протеолитического расщепления полимеризованной и сшитой скорлупы или хориона во время вылупления и представляют собой фрагменты компонентов, включенных в хорион во время оогенеза, таких как хориогенин H и L, как описано в настоящем описании ниже более подробно. Указанные фрагменты хориогенных белков, которые называются VAP, высвобождаются в перивителлиновую жидкость во время вылупления, становясь компонентами икорной жидкости. VAP появляются в различных формах. При анализе изоэлектрическим фокусированием (см. примеры), VAP I, II и III (как обсуждается ниже) появляются в по меньшей мере 2, 6 и 3 изоформах, соответственно.
Авторы описывают в настоящем описании три VAP, которые были идентифицированы и которые обладают неожиданными свойствами, как описано в настоящем описании далее. Последовательности таких VAP были определены масс-спектроскопией, как описано в примерах, и представлены в SEQ ID NO: 2-4.
VAP I, II и III, как указано в настоящем описании, имеют последовательности, как указано в SEQ ID NO: 2, 3 и 4, соответственно.
VAP I имеет 117 аминокислот в размере и молекулярную массу около 15,5 кДа и pI около 3,5. Такой VAP представляет собой фрагмент 439 аминокислотного, 57 кДа белка скорлупы (также называемого как белок zona radiata, SEQ ID NO: 5). VAP I может альтернативно быть получен из гомологичного белка zona radiata, включающего 467 остатков аминокислот (SEQ ID NO: 8).
VAP II имеет 261 аминокислоту в размере и молекулярную массу около 35 кДа и pI около 4,0. Такой VAP представляет собой фрагмент белка из 524 аминокислот, 68 кДа хориогенина H бета (SEQ ID NO: 6).
VAP III имеет 224 аминокислоты в размере и молекулярную массу около 29 кДа и pI около 5,2. Такой VAP представляет собой фрагмент белка из 438 аминокислот, 57 кДа хориогенина L (SEQ ID NO: 7).
Как показано в примерах и обсуждается выше, каждый VAP может существовать в различных изоформах.
Следовательно, в первом аспекте настоящее изобретение обеспечивает полипептид, состоящий из:
(i) последовательности аминокислот, как указано в любой из SEQ ID NO: 2-4, или последовательности, которая является по меньшей мере на 50% идентичной указанной последовательности или части любой из указанных последовательностей; и необязательно
(ii) фланкирующей последовательности аминокислот на N и/или C конце последовательности аминокислот в (i), которая имеет от 1 до 100 аминокислот в длину.
"Полипептиды", как указано в настоящем описании, представляют собой молекулы с предпочтительно более чем 50, 100, 150, 200 или 250 остатками и/или менее чем 400, 300, 200 или 100 остатками или диапазоном, выбираемым из них. Как указано в настоящем описании "часть" предпочтительно включает по меньшей мере 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200 или более аминокислот последовательности, из которой ее получают. Указанная часть может быть получена из центральной или N-концевой или C-концевой части последовательности. В предпочтительном аспекте указанная часть состоит из полноразмерной последовательности, из которой ее получают, из которой удалены по меньшей мере 1, 2, 3, 4 или 5 остатков аминокислот, предпочтительно с N-конца.
Как указано в настоящем описании "фланкирующая последовательность" представляет собой последовательность аминокислот, которая прикреплена к терминальному N или C концу центральной последовательности аминокислот посредством обычных пептидных связей с образованием непрерывной последовательности аминокислот (за исключением модифицированных в функциональных эквивалентах, как обсуждается в настоящем описании ниже). Фланкирующая последовательность может присутствовать на N или C терминальном конце центральной последовательности аминокислот или может присутствовать на обоих концах. Фланкирующая последовательность может быть такой короткой как 1 аминокислота, или такой длинной как 100 аминокислот, предпочтительно от 1-50 (или от 5-100 или 10-50), например, 1-25, например, 1-5 аминокислот в длину. Когда фланкирующие последовательности присутствуют и на N и на C терминальных концах, они могут быть одинаковыми или различными последовательностями и могут быть одинаковой или различной длины. Фланкирующие последовательности могут быть получены из исходной последовательности, фрагмент которой представляет собой интересующий VAP, или может иметь менее чем 80, 70, 60 или 50% идентичности нативной последовательности в сравниваемой части (см., например, нативные последовательности относительно SEQ ID NO: 2-4, представленные в SEQ ID NO: 5-7, соответственно и SEQ ID No: 8, которая обеспечивает альтернативную нативную последовательность для SEQ ID NO: 2).
Предпочтительно указанная последовательность в части (i) выше является по меньшей мере на 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичной последовательности (SEQ ID NO:2-8), с которой ее сравнивают.
Идентичность последовательности может быть определена, например, с использованием банка данных белковых последовательностей SWISS-PROT с использованием FASTA pep-cmp с вариабельным памфактором и штрафом за создание гэпа, установленным на 12,0 и штрафом за удлинение гэпа, установленным на 4,0, и окном из 2 аминокислот. Предпочтительно указанное сравнение проводят по всей длине последовательности, но может быть проведено на более маленьком окне сравнения, например, менее чем 200, 100 или 50 соседних аминокислот.
Предпочтительно такие полипептиды, связанные с идентичностью последовательностей, являются функционально эквивалентными полипептидам, которые представлены в указанных SEQ ID NO. Такие функционально эквивалентные полипептиды могут принимать форму производных, как указано ниже. Подобным образом полипептиды с последовательностями, как указано в SEQ ID NO, могут быть модифицированы, не влияя на последовательность полипептида, как описано ниже.
Более того, "части", как описано в настоящем описании, могут быть функционально эквивалентными. Предпочтительно указанные части удовлетворяют условиям идентичности (относительно сравниваемого участка), упомянутым в настоящем описании. Предпочтительные полипептиды по изобретению, включая части и полипептиды, которые включают вышеописанные фланкирующие последовательности, предпочтительно являются кислыми, например, имеют рН от 3 до 5,5, предпочтительно от 3,5 до 5,2.
Как указано в настоящем описании, чтобы достичь "функциональной эквивалентности" полипептид может иметь несколько сниженную эффективность в осуществлении медицинской или косметической функции относительно материнской молекулы (т.е. молекулы, из которой он был получен, например, путем замены аминокислот), но предпочтительно является таким же эффективным или более эффективным. Следовательно, функциональная эквивалентность относится к полипептиду, который является эффективным для лечения состояния или заболевания или для косметического улучшения состояния и/или вида кожи, как указано в настоящем описании, т.е. для уменьшения одного или более симптомов у пациента, например, вида, текстуры, толщины или содержания влаги кожи, как описано в настоящем описании далее. Это может быть оценено путем сравнения эффектов производного полипептида относительно полипептида, из которого он получен, качественным или количественным образом, например, путем проведения анализов, представленных в примерах. Где возможны количественные результаты, производное является по меньшей мере на 30, 50, 70 или 90% таким же эффективным, как материнский полипептид.
Функционально-эквивалентные белки, которые связаны с или получены из естественного белка, могут быть получены путем модификации нативной последовательности аминокислот посредством единственной или множества замен аминокислот (например, 2-20, предпочтительно 2-10), добавлений и/или делеций (обеспечивая их соответствие вышеупомянутым требованиям к идентичности последовательностей), без нарушения функции молекулы. Такие белки кодируются "функционально эквивалентными молекулами нуклеиновых кислот", которые создают путем соответствующих замен, добавления и/или делеций одного или более оснований.
Предпочтительными функциональными эквивалентами являются "аддитивные" варианты, в которых создают амино и/или карбокси концевые сшитые белки или полипептиды, включающие дополнительный белок или полипептид, сшитый с материнским полипептидом. Как описано выше, любые последовательности, которые при добавлении к центральному полипептиду, образуют непрерывную последовательность аминокислот, ограничены фланкирующими последовательностями, как описано выше.
Дополнительными предпочтительными функциональными эквивалентами являются варианты "делеции" или "усечения", в которых создаются белки или полипептиды, где с центрального полипептида удалены амино и/или карбокси концевые остатки. В определенном предпочтительном варианте осуществления изобретения остатки удаляют с аминоконца, где удаляют по меньшей мере 1, 2, 3, 4 или 5 остатков аминокислот. Такие функциональные эквиваленты представляют собой части, как описано в настоящем описании ранее.
Salmonidae
Salmo
Oncorhynchus
Особенно предпочтительными функционально-эквивалентными вариантами являются натуральные биологические варианты (например, аллельные варианты или географические варианты в рамках видов или альтернативно в различных родах, например, растений, животных или бактерий, в частности рыб, особенно из семейства , особенно подсемейств  и ) и производных, полученных с использованием известных методик. Например, молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие функционально-эквивалентные белки, могут быть получены химическим синтезом или в рекомбинантной форме с использованием известных методик или сайт-направленного мутагенеза, включая делецию, случайный мутагенез или ферментативное отщепление и/или сшивку нуклеиновых кислот.
Настоящее изобретение также обеспечивает молекулу нуклеиновой кислоты, состоящую из последовательности нуклеотидов, которая кодирует только указанный полипептид или ее комплементарную последовательность.
В предпочтительном аспекте настоящее изобретение, таким образом, обеспечивает молекулу нуклеиновой кислоты, состоящую из:
(i) последовательности нуклеотидов, как указано в любой из SEQ ID NO: 10-12, последовательности, которая является по меньшей мере на 50% идентичной указанной последовательности или последовательности, которая гибридизуется с указанной последовательностью в нестрогих условиях связывания 6×SSC/50% формамида при комнатной температуре и промывке в условиях высокой строгости, например, 2×SSC, 65°C, где SSC=0,15 M NaCl, 0,015 M цитрат натрия, pH 7,2, или последовательности, комплементарной любой из вышеуказанных последовательностей, или их части; и необязательно
(ii) фланкирующей последовательности нуклеотидов на 5' или 3' конце последовательности нуклеотидов в (i), которая имеет от 1 до 300 нуклеотидов в длину,
или комплементарной им последовательности.
Предпочтительно указанная молекула нуклеиновой кислоты кодирует полипептид, как указано в настоящем описании выше.
"Молекулы нуклеиновой кислоты", как указано в настоящем описании, представляют собой молекулы с предпочтительно более чем 150, 300, 450, 600 или 750 оснований и/или менее чем 1200, 900, 600 или 300 оснований или диапазоном, выбранным из них. "Части", как указано выше, предпочтительно включают по меньшей мере 90, 120, 150, 180, 210, 240, 270, 300, 450 или 600 оснований нуклеотидов последовательности, из которой ее получили. Предпочтительно указанные части кодируют N-концевые, центральные или C-концевые пептиды, как описано в настоящем описании выше. В предпочтительном аспекте указанная часть состоит из полноразмерной последовательности, из которой ее получали, из которой по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 оснований были удалены, предпочтительно с 5' конца.
Как указано в настоящем описании "фланкирующая последовательность" представляет собой последовательность нуклеотидов, которая прикреплена к терминальному 5' или 3' концу центральной последовательности нуклеотидов посредством обычных фосфодиэфирных связей с образованием непрерывной последовательности нуклеотидов (за исключением модифицированных в функциональных эквивалентах, как обсуждается в настоящем описании ранее). Фланкирующая последовательность может присутствовать на 5' или 3' терминальном конце центральной последовательности нуклеотидов или может присутствовать на обоих концах. Фланкирующая последовательность может быть настолько короткой, как 1 нуклеотид, или длинной, как 300 нуклеотидов, предпочтительно от 1-150 (или от 15-300 или 30-150), например, 1-75, например, 1-15 нуклеотидов в длину. Когда фланкирующие последовательности присутствуют и на 5' и на 3' терминальных концах, они могут быть одинаковыми или различными последовательностями и могут быть одинаковой или различной длины. Фланкирующие последовательности могут быть получены из нативной последовательности, фрагментом которой является интересующая последовательность, кодирующая VAP, или могут иметь менее чем 80, 70, 60 или 50% идентичность с нативной кодирующей последовательностью в сравниваемой части (см., например, нативные последовательности относительно SEQ ID NO: 10-12, представленные в SEQ ID NO:13-15, соответственно и SEQ ID NO: 16, которая обеспечивает альтернативную нативную последовательность для SEQ ID NO: 10).
Предпочтительно указанная последовательность в части (i) выше является по меньшей мере на 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичной последовательности (SEQ ID NO:10-16), с которой ее сравнивают.
Идентичность последовательности может быть определена посредством, например, поиска FASTA с использованием пакетов GCG, со значениями по умолчанию и переменным памфактором и штрафом за создание гэпа, установленным на 12,0, и штрафом за удлинение гэпа, установленным на 4,0, с окном из 6 нуклеотидов.
Предпочтительно связанные с указанной идентичностью последовательности или гибридизованные молекулы нуклеиновой кислоты являются функционально эквивалентными молекулам нуклеиновой кислоты, которые представлены в указанных SEQ ID NO. Такие функционально эквивалентные молекулы нуклеиновой кислоты могут принимать форму производных, как указано далее, и расцениваются функционально эквивалентными, если они кодируют полипептиды, которые расцениваются функциональными эквивалентами в соответствии с тестами, описанными в настоящем описании ранее. Предпочтительными функциональными эквивалентами являются таковые, которые кодируют предпочтительные полипептиды, как указано выше, например, молекулы нуклеиновой кислоты, которые кодируют полипептиды, обнаруженные у иных родов или видов, чем специфические молекулы, упомянутые в настоящем описании.
Более того, "части", как описано в настоящем описании, могут быть функциональными эквивалентами. Предпочтительно такие части удовлетворяют условиям идентичности (относительно сравниваемого участка) или гибридизации, упомянутым в настоящем описании. Предпочтительно молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению, включая части и последовательности нуклеотидов, включая вышеописанные фланкирующие последовательности, предпочтительно кодируют кислые полипептиды, как описано в настоящем описании ранее.
Молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению и для применения в соответствии с изобретением могут быть одно- или двухцепочечными ДНК, кДНК или РНК, предпочтительно ДНК, и включают дегенеративные, по существу идентичные и гибридизованные последовательности, как описано выше. В идеале, однако, молекулами являются ДНК или кДНК.
Полипептиды по изобретению или для применения в соответствии с изобретением, включают таковые, которые являются модифицированными без влияния на последовательность полипептида, например, путем химической модификации, включая дегликозилирование или гликозилирование. Такие полипептиды могут быть получены путем модификации полипептида после синтеза/выделения, не влияя на функциональность, например, определенного гликозилирования, метилирования и др. определенных остатков.
Полипептиды по изобретению или для применения в соответствии с изобретением, могут также принимать форму пептидомиметиков, которые могут быть расценены производными, в которых функциональные характеристики полипептида сохраняются, но представлены в виде отличной, например, непептидной структуры. Такие пептидомиметики были успешно разработаны и используются для других определенных медицинских применений.
Пептидомиметики, в особенности непептидные молекулы могут быть созданы посредством различных процессов, включая конформационное создание лекарственных средств, скрининг, дизайн фокусированной библиотеки и классическую медицинскую химию. Могут быть использованы не только олигомеры неестественных аминокислот или другие органические связующие блоки, но также углеводы, гетероциклические или макроциклические соединения или любые органические молекулы, которые включают структурные элементы и конформацию, которая обеспечивает молекулярную электростатическую поверхность, которая имитирует такие же свойства 3-мерной конформации пептида, могут быть использованы способами, известными в области техники.
Следовательно, пептидомиметики могут нести небольшой или совершенно не нести подобия пептидного остова. Пептидомиметики могут включать полностью синтетическую непептидную форму (например, основанную на углеводородном скелете с соответствующими заместителями) или могут сохранять один или более элементов пептида, на котором они основаны, например, путем изменения одной или более аминокислот или замены одной или более аминокислот альтернативными непептидными компонентами. Пептидоподобные матрицы включают псевдопептиды и циклические пептиды. Структурные элементы, расцененные как избыточные для функции пептида, могут быть минимизированы для сохранения только функции каркаса, или удалены, когда необходимо.
Когда пептидомиметики сохраняют один или более пептидных элементов, т.е. более чем одну аминокислоту, такая аминокислота может быть заменена нестандартной или ее структурным аналогом. Аминокислоты, сохраняющиеся в последовательностях, также могут быть изменены или модифицированы (например, помечены, гликозилированы или метилированы), пока сохраняются функциональные свойства полипептидов по изобретению или для применения в соответствии с изобретением. Пептидомиметики называют как "получаемые из" определенной полипептидной последовательности. Под этим обозначают, что пептидомиметик создан со ссылкой на определенную полипептидную последовательность, так что он сохраняет структурные характеристики пептида, которые необходимы для его функции. Это могут быть определенные боковые цепи полипептида или потенциал водородных связей для его структуры. Такие характеристики могут быть обеспечены непептидными компонентами или одним или более остатками аминокислот, или связи, связывающие указанные остатки аминокислот полипептида, могут быть модифицированы, так чтобы улучшить определенные функции полипептида, такие как стабильность или устойчивость к протеазам, при сохранении структурных характеристик полипептида, которые необходимы для его функции.
Примеры нестандартных или структурных аналогов аминокислот, которые могут быть использованы, представляют собой D аминокислоты, амидные изоэфиры (такие как N-метиламид, ретро-обратный амид, тиоамид, тиоэфир, фосфонат, кетометилен, гидроксиметилен, фторвинил, (E)-винил, метиленамино, метилентио или алкан), L-N метиламинокислоты, D-α метиламинокислоты, D-N-метиламинокислоты. Примеры необычных аминокислот перечислены в таблице 1.
<b>Таблица 1</b>
Необычная аминокислота
Код
Необычнаяаминокислота
Код
α-аминомасляная кислота
Abu
L-N-метилаланин
Nmala
α-амино-α-метилбутират
Mgabu
L-N-метиларгинин
Nmarg
Аминоциклопропан-карбоксилат
Cpro
L-N-метиласпарагин
Nmasn
L-N-метиласпарагиновая кислота
Nmasp
Аминоизомасляная кислота
Aib
L-N-метилцистеин
Nmcys
Аминонорборнил-карбоксилат
Norb
L-N-метилглутаминин
Nmgln
L-N-метилглутамининовая кислота
Nmglu
Циклогексилаланин
Chexa
L-N-метилметилгистидин
Nmhis
Циклопентилаланин
Cpen
L-N-метилизолейцин
Nmile
D-аланин
Dal
L-N-метиллейцин
Nmleu
D-аргинин
Darg
L-N-метиллизин
Nmlys
D-аспарагиновая кислота
Dasp
L-N-метилметионин
Nmmet
D-цистеин
Dcys
L-N-метилнорлейцин
Nmnle
D-глутаминин
Dgln
L-N-метилнорвалин
Nmnle
D-глутаминоваякислота
Dglu
L-N-метилорнитин
Nmorn
D-гистидин
Dhis
L-N-метилфенилаланин
Nmphe
D-изолейцин
Dile
L-N-метилпролин
Nmpro
D-лейцин
Dleu
L-N-метилсерин
Nmser
D-лизин
Dlys
L-N-метилтреонин
Nmthr
D-метионин
Dmet
L-N-метилтриптофан
Nmtrp
D-орнитин
Dorn
L-N-метилтирозин
Nmtyr
D-фенилаланин
Dphe
L-N-метилвалин
Nmval
D-пролин
Dpro
L-N-метилэтилглицин
Nmetg
D-серин
Dser
L-N-метил-т-бутилглицин
Nmtbug
D-треонин
Dthr
L-норлейцин
Nle
D-триптофан
Dtrp
L-норвалин
Nva
D-тирозин
Dtyr
α-метиламиноизобутират
Maib
D-валин
Dval
α-метил-γ-аминобутират
Mgabu
D-α-метилаланин
Dmala
α-метилциклогексилаланин
Mchexa
D-α-метиларгинин
Dmarg
α-метилциклопентилаланин
Mcpen
D-α-метиласпарагин
Dmasn
α-метил-α-нафтилаланин
Manap
D-α-метиласпартат
Dmasp
α-метилпеницилламин
Mpen
D-α-метилцистеин
Dmcys
N-(4-аминобутил)глицин
Nglu
D-α-метилглутаминин
Dmgln
N-(2-аминоэтил)глицин
Naeg
D-α-метилгистидин
Dmhis
N-(3-аминопропил)глицин
Norn
D-α-метилизолейцин
Dmile
N-амино-α-метилбутират
Nmaabu
D-α-метиллейцин
Dmleu
α-нафтилаланин
Anap
D-α-метиллизин
Dmlys
N-бензилглицин
Nphe
D-α-метилметионин
Dmmet
N-(2-карбамилэтил)глицин
Ngln
D-α-метилорнитин
Dmorn
N-(карбамилметил)глицин
Nasn
D-α-метилфенилаланин
Dmphe
N-(2-карбоксиэтил)глицин
Nglu
D-α-метилпролин
Dmpro
N-(карбоксиметил)глицин
Nasp
D-α-метилсерин
Dmser
N-циклобутилглицин
Ncbut
D-α-метилтреонин
Dmthr
N-циклогептилглицин
Nchep
D-α-метилтриптофан
Dmtrp
N-циклогексилглицин
Nchex
D-α-метилтирозин
Dmty
N-циклодецилглицин
Ncdec
D-α-метилвалин
Dmval
N-циклододецилглицин
Ncdod
D-N-метилаланин
Dnmala
N-циклооктилглицин
Ncoct
D-N-метиларгинин
Dnmarg
N-циклопропилглицин
Ncpro
D-N-метиласпарагин
Dnmasn
N-циклоундецилглицин
Ncund
D-N-метиласпартат
Dnmasp
N-(2,2-дифенилэтил)глицин
Nbhm
D-N-метилцистеин
Dnmcys
N-(3,3-дифенилпропил)глицин
Nbhe
D-N-метилглутаминин
Dnmgln
N-(3-гуанидинопропил)глицин
Narg
D-N-метилглутаминат
Dnmglu
N-(1-гидроксиэтил)глицин
Nthr
D-N-метилгистидин
Dnmhis
N-(гидроксиэтил)глицин
Nser
D-N-метилизолейцин
Dnmile
N-(имидазолилэтил)глицин
Nhis
D-N-метиллейцин
Dnmleu
N-(3-индолилэтил)глицин
Nhtrp
D-N-метиллизин
Dnmlys
N-метил-γ-аминобутират
Nmgabu
N-метилцикло-гексилаланин
Nmchexa
D-N-метилметионин
Dnmmet
D-N-метилорнитин
Dnmorn
N-метилциклопентилаланин
Nmcpen
N-метилглицин
Nala
D-N-метилфенилаланин
Dnmphe
N-метиламиноизобутират
Nmaib
D-N-метилпролин
Dnmpro
N-(1-метилпропил)глицин
Nile
D-N-метилсерин
Dnmser
N-(2-метилпропил)глицин
Nleu
D-N-метилтреонин
Dnmthr
D-N-метилтриптофан
Dnmtrp
N-(1-метилэтил)глицин
Nval
D-N-метилтирозин
Dnmtyr
N-метилнафтилаланин
Nmanap
D-N-метилвалин
Dnmval
N-метилпеницилламин
Nmpen
γ-аминомасляная кислота
Gabu
N-(п-гидроксифенил)глицин
Nhtyr
L-т-бутилглицин
Tbug
N-(тиометил)глицин
Ncys
L-этилглицин
Etg
пеницилламин
Pen
L-гомофенилаланин
Hphe
L-α-метилаланин
Mala
L-α-метиларгинин
Marg
L-α-метиласпарагин
Masn
L-α-метиласпартат
Masp
L-α-метил-т-бутилглицин
Mtbug
L-α-метилцистеин
Mcys
L-метилэтилглицин
Metg
L-α-метилглутаминин
Mgln
L-α-метилглутаминат
Mglu
L-α-метилгистидин
Mhis
L-α-метилгомофенилаланин
Mhphe
L-α-метилизолейцин
Mile
N-(2-метилтиоэтил)глицин
Nmet
L-α-метиллейцин
Mleu
L-α-метиллизин
Mlys
L-α-метилметионин
Mmet
L-α-метилнорлейцин
Mnle
L-α-метилнорвалин
Mnva
L-α-метилорнитин
Morn
L-α-метилфенилаланин
Mphe
L-α-метилпролин
Mpro
L-α-метилсерин
Mser
L-α-метилтреонин
Mthr
L-α-метилтриптофан
Mtrp
L-α-метилтирозин
Mtyr
L-α-метилвалин
Mval
L-N-метилгомофенил-аланин
Nmhphe
N-(N-(2,2-дифенилэтил)карбамилметил)глицин
Nnbhm
N-(N-(3,3-дифенилпропил)карбамилметил)глицин
Nnbhe
1-карбокси-1-(2,2-дифенилэтиламино)циклопропан
Nmbc
L-O-метилсерин
Omser
L-O-метилгомосерин
Omhser
Нестандартные аминокислоты, которые могут быть использованы, включают конформационно ограниченные аналоги, например, такие как Tic (для замены F), Aib (для замены A) или пипеколовая кислота (для замены Pro).
Полипептиды и молекулы нуклеиновой кислоты, обсуждаемые выше, также включают производные, которые были модифицированы, например, для облегчения их применения в фармацевтических применениях (обсуждаемых ниже), например, путем добавления нацеливающих или функциональных групп, например, для улучшения липофильности, улучшения клеточного транспорта, растворимости и/или стабильности. Следовательно, олигосахариды, жирные кислоты, жирные спирты, аминокислоты, пептиды или полипептиды могут быть конъюгированы с вышеупомянутыми молекулами полипептидов или нуклеиновых кислот. Молекулы нуклеиновых кислот могут присутствовать в вирусном носителе, как обсуждается в настоящем описании далее.
Полипептиды также охватывают производные в форме "пролекарств" или "пропептидов" такие, что добавленный компонент может быть удален расщеплением при введении, например, путем отщепления заместителя, добавленного посредством этерификации, который может быть удален действием эстераз. Такие пролекарства включают натуральные предшественники естественных белков, которые расщепляются, например, протеолизом для получения интересующего полипептида. Такие предшественники могут быть неактивными в форме предшественника, но могут активироваться протеолитическим расщеплением. Однако любая последовательность, которая при добавлении к центральному полипептиду образует непрерывную последовательность аминокислот, ограничена фланкирующими последовательностями, как описано выше. Альтернативно они могут иметь более длинные фланкирующие последовательности, с условием, что они не распространяются за молекулы, которые являются нативной последовательностью, из которой получают фрагмент VAP (например, SEQ ID NO: 5-8 в отношении последовательностей аминокислот и SEQ ID NO: 13-16 для последовательностей нуклеотидов) или последовательностью с по меньшей мере 50, 60, 70, 80 или 90% идентичностью последовательности в сравниваемой части.
Молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению или для применения в соответствии с изобретением, следовательно, сходным образом охватывают молекулы, которые кодируют такие пролекарства или предшественники. Однако, любые последовательности, которые при добавлении к центральному полинуклеотиду образуют непрерывную последовательность нуклеотидов, ограничены фланкирующими последовательностями, как описано выше. Альтернативно, они могут удлинять фланкирующие последовательности, с условием, что они не распространяются за молекулы, которые представляют собой нативные последовательности, из которых получают фрагмент VAP или последовательность с по меньшей мере 50, 60, 70, 80 или 90% идентичностью последовательности относительно такой последовательности в сравниваемой части.
Модифицированные полипептиды или молекулы нуклеиновой кислоты, как описано выше, могут быть исследованы, чтобы удостовериться, что они сохраняют функциональную активность относительно немодифицированной молекулы путем определения, обладают ли они такими же или сходными медицинскими или косметическими эффектами.
Молекулы нуклеиновой кислоты, описанные выше, могут легко связываться с последовательностью, контролирующей экспрессию, или рекомбинантным ДНК клонирующим носителем или вектором, содержащим такую рекомбинантную молекулу ДНК. Это позволяет внутриклеточную экспрессию полипептида по изобретению или для применения в соответствии с изобретением в качестве генного продукта, экспрессия которого направляется геном(ами), введенным в интересующие клетки. Экспрессия гена регулируется промотором, активным в интересующих клетках, и он может быть вставлен в любой форме линейного или кольцевого вектора ДНК для включения в геном или для независимой репликации или транзиторной трансфекции/экспрессии. Подходящие методики трансформации или трансфекции хорошо описаны в литературе. Альтернативно, голая молекула ДНК может быть введена непосредственно в клетку для применения, описанного в настоящем описании.
Соответствующие векторы экспрессии включают соответствующие контрольные последовательности, такие как, например, трансляционные (например, старт и стоп кодоны, сайты связывания рибосом) и транскрипционные контрольные элементы (например, участки промотора-оператора, стоп последовательности терминирования), связанные в соответствующей рамке считывания с молекулами нуклеиновой кислоты, требуемыми для осуществления способа по изобретению, как описано в настоящем описании далее. Соответствующие векторы могут включать плазмиды и вирусы (включая и бактериофаги и вирусы эукариот). Подходящие вирусные векторы включают бакуловирус и также аденовирус, аденоассоциированный вирус, вирус герпеса и вирус коровьей оспы/оспы. Множество других вирусных векторов описаны в области техники. Предпочтительные векторы включают векторы экспрессии бактерий и млекопитающих pGEX-KG, pEF-neo и pEF-HA. Молекула нуклеиновой кислоты может быть удобно сшита с ДНК, кодирующей дополнительный полипептид, например, глютатион-S-трансферазу, для получения сшитого белка при экспрессии.
Следовательно, как видно из следующего аспекта, настоящее изобретение обеспечивает вектор, предпочтительно вектор экспрессии, включающий молекулу нуклеиновой кислоты, как определено выше.
Другие аспекты изобретения включают способы для получения рекомбинантных молекул нуклеиновых кислот по изобретению, включающие вставку последовательностей нуклеотидов по изобретению, кодирующих полипептиды по изобретению, в вектор нуклеиновой кислоты.
В способах, как описано в настоящем описании далее, полипептиды можно вводить в клетки путем трансфекции клетки молекулой нуклеиновой кислоты по изобретению. Как упомянуто выше, настоящее изобретение, следовательно, распространяется на молекулы нуклеиновой кислоты, состоящей из, или включающей, последовательность, которая кодирует полипептиды по изобретению, как описано в настоящем описании. Предпочтительно указанные молекулы нуклеиновой кислоты содержатся в векторе, например, векторе экспрессии.
Молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению или для применения в соответствии с изобретением, предпочтительно содержащиеся в векторе, могут быть введены в клетку любыми соответствующими средствами. Подходящие методики трансформации или трансфекции хорошо описаны в литературе. Известно множество методик и они могут быть использованы для введения таких векторов в клетки прокариот или эукариот для экспрессии. Предпочтительные клетки хозяева для этой цели включают клеточные линии насекомых, клеточные линии эукариот или E. coli, такие как штамм BL21/DE3. Изобретение также распространяется на трансформированные или трансфицированные клетки-хозяева прокариот или эукариот, содержащие молекулу нуклеиновой кислоты, особенно вектор, как описано выше.
Дополнительный аспект изобретения обеспечивает способ получения полипептида по изобретению, как определено в настоящем описании выше, который включает культивирование клетки хозяина, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты, как определено выше, в условиях, посредством которых экспрессируется указанный полипептид и таким образом продуцируется указанная молекула. Экспрессируемый полипептид образует дополнительный аспект по изобретению.
Изобретение также распространяется на полипептид, кодируемый молекулой нуклеиновой кислоты, как описано в настоящем описании ранее. Он может быть получен путем экспрессии клетки хозяина, как описано выше.
Клетки, продуцирующие и секретирующие полипептиды по изобретению, но которые были модифицированы относительно нативных клеток путем экспрессии материала, кодирующего нуклеиновую кислоту, образуют дополнительные аспекты по изобретению.
Полипептиды или молекулы нуклеиновой кислоты, используемые в композициях и применениях по изобретению, как определено в настоящем описании ниже, могут быть получены или выделены из естественных источников или могут быть созданы полностью или частично синтетически.
Обычно полипептиды и молекулы нуклеиновой кислоты выделяют в соответствии с протоколами, описанными в примерах и ниже, или как описано в Yasumasu ef al, 1989, J. Biochem., 105, p212-218 в отношении хориолизина, который таким образом включен в виде ссылки, особенно в отношении методики выделения. Такие способы и продукты таких способов, когда они относятся к VAP, описанным в настоящем описании, образуют дополнительные аспекты изобретения.
Следовательно, в дополнительном аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ выделения одного или более полипептидов (VAP или связанных последовательностей), как описано в настоящем описании, из жидкости икринок, получаемой при вылуплении, (например, лосося), включающий по меньшей мере стадии:
a) суспендирования икры в минимальном объеме воды (например, менее чем объем икры);
b) индукции синхронизированного, быстрого вылупления указанной икры (предпочтительно, так чтобы вылупление заканчивалось в течение менее чем 3 часов для более чем 95% эмбрионов);
c) фильтрации вылупившейся икры для получения жидкости икринок, получаемой при вылуплении;
d) добавления ацетона к указанной жидкости икринок, получаемой при вылуплении до конечной концентрации 80% об/об; и
e) проведения низкоскоростного центрифугирования указанной жидкости, где указанный полипептид(ы) присутствует в осадке; и необязательно
f) отделения полипептидов, присутствующих в осадке со стадии e), для выделения отдельных полипептидов, например, с использованием ионообменной колонки.
Предпочтительной ионообменной колонкой является колонка DEAE-Sepharose CL-6B, однако подходящие альтернативы легко доступны.
Salmonidae
Salmo
Salmo salar
Oncorhynchus
Предпочтительно указанную жидкость икринок, получаемую при вылуплении, получают из рыбы, особенно , в частности , например,  (Атлантический лосось) и  (Тихоокеанский лосось).
Изобретение далее распространяется на полипептиды, полученные вышеописанным способом.
Полипептиды или молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению или для применения в соответствии с изобретением являются предпочтительно почти свободными от любых загрязняющих компонентов, происходящих из исходного материала или материалов, используемых в методике выделения или их синтетического получения. Особенно предпочтительно соединение очищают до степени чистоты более чем 50 или 60%, например >70, 80 или 90%, предпочтительно более чем 95 или 99% чистоты, что оценивают масс/масс (сухой вес). Такие уровни чистоты соответствуют специфическим интересующим молекулам, но включают их продукты разложения. Когда возможно, используют обогащенные препараты, которые имеют более низкую чистоту, например, содержат более чем 1, 2, 5 или 10% интересующей молекулы, например, более чем 20 или 30%. Полипептиды по изобретению или для применения в соответствии с изобретением могут быть очищены посредством, например, хроматографии (например, ВЭЖХ, исключающей по размеру, ионообменной, аффинной, гидрофобного взаимодействия, обратной фазы) или капиллярного электрофореза.
Полипептиды по изобретению или для применения в соответствии с изобретением могут быть получены синтетически, например, путем связывания более мелких синтетически полученных пептидов или удобнее путем рекомбинантной экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей указанный полипептид, как описано в настоящем описании ранее.
Молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению или для применения в соответствии с изобретением могут быть получены синтетически, например, путем амплификации последовательности нуклеиновой кислоты, как описано в настоящем описании. Полипептиды и молекулы нуклеиновой кислоты VAP, описанные в настоящем описании, могут быть использованы, как описано в настоящем описании ниже, вызывая различные косметические и/или медицинские эффекты, и образуют предпочтительные молекулы для этой цели.
Кроме того, более длинные белки (и их кодирующие последовательности), которые включают вышеописанные фрагменты, такие как полноразмерные нативные белки, могут быть использованы для способов, описанных в настоящем описании ниже. Следовательно, для применений, описанных ниже, полипептид, который может быть использован, распространяется на полипептид, включающий последовательность аминокислот, как указано в любой из последовательностей NO: 2-8 или последовательность, которая является по меньшей мере на 50% идентичной указанной последовательности или части любой из указанных последовательностей.
Определения, как они относятся к полипептидам, частям, идентичности последовательностей и функционально эквивалентным белкам употребляются сходным образом, и предпочтительные значения идентичности последовательностей, как указано выше, также являются применимыми. Предпочтительно полипептиды представляют собой фрагменты нативных белков (необязательно с фланкирующими последовательностями), как описано в настоящем описании ранее. Сходным образом для применений, описанных ниже, молекулы нуклеиновой кислоты, которые могут быть использованы, распространяются на молекулы нуклеиновой кислоты, включающие последовательность нуклеотидов, которая кодирует полипептид по изобретению или более длинный полипептид, как описано выше, или комплементарную им последовательность. Предпочтительно применения осуществляют с фрагментами нативных кодирующих последовательностей (необязательно с фланкирующими последовательностями), как описано в настоящем описании ранее.
Следовательно, для применений, описанных ниже, молекула нуклеиновой кислоты, которая может быть использована, распространяется на молекулу нуклеиновой кислоты, включающую последовательность нуклеотидов, как указано в любой из SEQ ID NO: 10-16 или последовательность, которая является на по меньшей мере 50% идентичной указанной последовательности, или последовательности, которая гибридизуется с указанной последовательностью в нестрогих условиях связывания 6×SSC/50% формамида при комнатной температуре и промывке в условиях высокой строгости, например, 2×SSC, 65°C, где SSC=0,15 M NaCl, 0,015M цитрат натрия, pH 7,2, или последовательности, комплементарной любой из вышеуказанных последовательностей, или части любой из указанных последовательностей.
Как указано далее в настоящем описании в отношении применений по изобретению ссылка на полипептиды и молекулы нуклеиновой кислоты относится к более широкому определению, т.е. не только фрагментам нативных молекул, которые необязательно содержат фланкирующие последовательности, как описано выше.
В добавление к вышеописанным VAP, также было обнаружено, что дополнительный белок, обнаруживаемый в жидкости икринок рыб, получаемой при вылуплении, обладает преимущественными косметическими и/или медицинскими применениями, которые являются комплементарными таковым VAP, а именно хориолизин L, как обсуждалось в настоящем описании ранее.
Следовательно, полипептиды или молекулы нуклеиновой кислоты, как описано в настоящем описании, могут быть использованы ex vivo или in vitro, на частях животных или продуктах, например, образцах кожи, особенно, когда предусматривается, что они будут повторно введены в организм, из которого их получили, например, в форме трансплантата кожи.
Однако полипептиды и молекулы нуклеиновой кислоты, как описано в настоящем описании, являются предпочтительными для применения in vivo, как обсуждается более подробно ниже.
Полипептиды и молекулы нуклеиновой кислоты, как обсуждается в настоящем описании, имеют применение в лечении различных нарушений, расстройств или состояний, как описано в настоящем описании далее.
Настоящее изобретение, следовательно, распространяется на фармацевтическую композицию, включающую полипептид или молекулу нуклеиновой кислоты, как описано в настоящем описании ранее, и одно или более фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ и/или разбавителей.
Альтернативно установлено, настоящее изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию, включающую:
(i) полипептид, включающий последовательность аминокислот, как указано в SEQ ID NO: 1, или последовательность, которая является по меньшей мере на 50% идентичной указанной последовательности, или часть любой указанной последовательности;
(ii) полипептид, включающий последовательность аминокислот, как указано в SEQ ID NO: 2, или последовательность, которая является по меньшей мере на 50% идентичной указанной последовательности, или часть любой указанной последовательности;
(iii) полипептид, включающий последовательность аминокислот, как указано в SEQ ID NO: 3, или последовательность, которая является по меньшей мере на 50% идентичной указанной последовательности, или часть любой указанной последовательности; и/или
(iv) полипептид, включающий последовательность аминокислот, как указано в SEQ ID NO: 4, или последовательность, которая является по меньшей мере на 50% идентичной указанной последовательности, или часть любой указанной последовательности;
и одно или более фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества и/или разбавители.
В предпочтительном аспекте, когда предусматривается применение более длинных последовательностей, чем таковые, представленные в SEQ ID NO: 2-4 в вышеуказанном списке, SEQ ID NO: 2-4 могут быть заменены SEQ ID NO: 5-7, соответственно, и где SEQ ID NO: 2 может альтернативно быть заменена на SEQ ID NO: 8.
Предпочтительные полипептиды представляют собой такие, как описано в настоящем описании ранее, в особенности, в отношении VAP, фрагменты нативных последовательностей, необязательно содержащие фланкирующие последовательности. Ссылки на фармацевтические композиции в настоящем описании могут быть прочитаны как охватывающие косметические композиции.
Альтернативно или дополнительно указанная композиция может включать кодирующую последовательность указанного полипептида, т.е. молекулы нуклеиновой кислоты, как описано в настоящем описании ранее (например, (v) одну или более молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих полипептид, как указано в любом из (i)-(iv) выше или ее комплементарная последовательность). Предпочтительными молекулами нуклеиновой кислоты являются, как описано в настоящем описании ранее, т.е. со ссылками на SEQ ID NO: 9-16, предпочтительно 9-12.
В предпочтительном аспекте указанная композиция включает комбинацию указанных компонентов, например, компоненты (ii)-(iv) выше (т.е. все описанные VAP) или любые комбинации указанных 4 компонентов, перечисленных выше.
Под "фармацевтически приемлемым" или "физиологически приемлемым" понимают, что ингредиент должен быть совместимым в композиции с другими ингредиентами, а также физиологически приемлемым для пациента.
Активный ингредиент для введения может быть соответствующим образом модифицирован для применения в фармацевтической композиции. Например, соединения, используемые в соответствии с изобретением, могут быть стабилизированы против разрушения путем использования производных, как описано выше.
Активный ингредиент также может быть стабилизирован в композиции, например, путем использования соответствующих добавок, таких как соли или неэлектролиты, ацетат, ЭДТА (для VAP и связанных полипептидов), цитрат (для VAP и связанных полипептидов), Tris, фосфатный или ацетатный буферы, маннит, глицин, HSA (человеческий альбумин сыворотки) или полисорбат.
Молекула нуклеиновой кислоты или полипептид, как описано в настоящем описании, может присутствовать в указанных композициях в виде единственного активного ингредиента или может быть скомбинирована с другими ингредиентами, особенно другими активными ингредиентами, например, для улучшения терапевтического эффекта или для получения композиции, более приятной для потребителя. Указанным другим компонентом может быть один из 4 необязательных компонентов, описанных выше, или альтернативный компонент.
Композиция, включающая один или более полипептидов или молекул нуклеиновых кислот, описанных в настоящем изобретении, также может включать примеси, например, после получения указанного одного или более полипептидов или молекул нуклеиновых кислот по изобретению из натуральных источников. В композициях, включающих указанный один или более полипептидов или молекул нуклеиновых кислот, как описано в настоящем описании, каждый из указанных полипептида(ов) или молекул(ы) нуклеиновых кислот может присутствовать в диапазоне от 0,0001 до 30% масс/масс фармацевтической композиции. Предпочтительно указанный полипептид(ы) или молекула(ы) нуклеиновой кислоты присутствуют в диапазоне 0,01-10%, или как описано в настоящем описании далее.
В дополнительном аспекте изобретения композиции, как описано в настоящем описании, предназначены для использования в терапии.
Как упомянуто выше, полипептиды и молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению проявляют терапевтические свойства в лечении поражений, расстройств или состояний кожи путем увлажнения и/или отшелушивания кожи.
Предпочтительные поражения, патологические состояния или расстройства, которые лечат, представляют собой сухость кожи, кожу, в которой роговой слой толще, чем желательно, например, гиперкератозные состояния, или кожу с нежелательной пигментацией в эпидермисе, например, печеночные, возрастные, солнечные или коричневые пятна. Лечение может быть косметическим, например, лечение нормальной, но сухой или утолщенной кожи (такой как мозоли, омозолелости или гиперкератозные бородавки), или лечение расстройств пигментации, таких как печеночные пятна, или терапевтическим, например, для лечения акне, экземы, псориаза или бородавок, приводящих к боли.
Как указано в настоящем описании "расстройство" относится к основному патологическому расстройству в организме с симптомами или без симптомов относительно нормального организма, которое может возникать в результате, например, инфекции или приобретенного или врожденного генетического дефекта. "Поражение" или "состояние" относится к нерегулярности или дефекту кожи относительно нормальной оптимальной кожи, но которое не является результатом патологических нарушений. Дефект/отклонение от нормы могут возникать в результате возраста, повреждения, факторов окружающей среды, уровня гормонов, лекарственных препаратов, наносимых наружно или потребляемых веществ, генетических состояний или множества других факторов, которые приводят к нарушению функций кожи, способствуя развитию отклонений от нормы.
Расстройство, поражение или состояние могут быть только косметическими или некосметическими, требуя медицинского лечения, или их комбинацией.
Как указано в настоящем описании "косметический" относится к лечению, которое не излечивает, лечит или предотвращает заболевание или расстройство, но вместо этого служит в качестве продукта ухода за кожей или для модификации или улучшения вида кожи, например, цвета, текстуры или содержания влаги в коже.
"Некосметический" (или медицинский) ингредиент, используемый в медицинском лечении, как описано в настоящем описании, служит для излечения, уменьшения, лечения или предотвращения одного или более симптомов расстройства, например, боли или дискомфорта.
Основой лечения, описанного в настоящем описании, являются эффекты увлажнения и отшелушивания кожи VAP и/или хориолизином, как описано в настоящем описании. Такие эффекты были показаны в примерах, представленных в настоящем описании.
Следовательно, предусматривается лечение, основанное на увлажняющих и/или отшелушивающих свойствах VAP и/или хориолизина.
Следовательно, изобретение обеспечивает косметический или некосметический способ отшелушивания и/или увлажнения кожи животного, где полипептид, молекулу нуклеиновой кислоты или фармацевтическую композицию, как описано в настоящем описании ранее, вводят указанному животному.
Следовательно, со ссылкой на вышеуказанное, настоящее изобретение обеспечивает косметический или некосметический способ отшелушивания и/или увлажнения кожи животного, где полипептид, молекулы нуклеиновой кислоты или фармацевтическую композицию вводят указанному животному, где указанный полипептид включает последовательность аминокислот, как указано в любой из последовательностей NO: 1-8 (предпочтительно 1-4) или последовательность, которая является на по меньшей мере 50% идентичной указанной последовательности или часть любой из указанных последовательностей; указанная молекула нуклеиновой кислоты кодирует указанный полипептид или является его комплементарной последовательностью (например, последовательность нуклеотидов, как указано в любой из SEQ ID NO: 9-16 (предпочтительно 9-12) или последовательность, которая является на по меньшей мере 50% идентичной указанной последовательности или последовательность, которая гибридизуется с указанной последовательностью в нестрогих условиях связывания 6×SSC/50% формамида при комнатной температуре и промывке в условиях высокой строгости, например, 2×SSC, 65°C, где SSC=0,15 M NaCl, 0,015M цитрата натрия, pH 7,2, или последовательность, которая комплементарна любой из вышеуказанных последовательностей, или части любой из указанных последовательностей), и указанная фармацевтическая композиция включает один или более из указанных полипептидов или молекул нуклеиновой кислоты и одно или более фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество и/или разбавитель.
Как описано выше и на что ссылаются в настоящем описании, вышеописанные последовательности полипептида и нуклеотидов, определяемые ссылками на SEQ ID NO: 2-8 и 10-16, представляют собой VAP или связанные последовательности и таковые, определяемые ссылками на SEQ ID NO: 1 и 9, представляют собой хориолизин или связанные последовательности.
Как указано в настоящем описании, "отшелушивание" относится к удалению поверхностных клеток поверхности эпителия, которая в коже уравнивается для очистки или десквамации рогового слоя эпидермиса. "Увлажнение", как указано в настоящем описании, охватывает увлажнители, которые предотвращают потерю воды из кожи, а также увлажнители (влагоудерживающие вещества), которые притягивают и удерживают воду при нанесении на кожу, и умягчители (которые исправляют нарушенную десквамацию).
Альтернативно указано, что настоящее изобретение обеспечивает полипептид, молекулу нуклеиновой кислоты или фармацевтическую композицию, как описано в настоящем описании, для применения в отшелушивании и/или увлажнении кожи животного. (Соединение или композиция могут альтернативно использоваться для получения лекарственного препарата для такой цели).
Как упомянуто выше, такие отшелушивающие и/или увлажняющие свойства являются преимущественными для лечения или профилактики множества поражений, расстройств или состояний кожи.
В предпочтительном аспекте поражение, состояние или расстройство кожи, которое лечат или предотвращают, представляет собой сухость кожи. Ее можно лечить путем увлажнения и/или отшелушивания.
"Сухость кожи", как указано в настоящем описании, относится к эпидермису, который теряет влагу или жир, часто характеризующемуся рисунком тонких линий, чешуйчатостью и зудом. Сухость кожи может возникать как состояние кожи как таковое (например, из-за возраста, теплового/холодового/сухого повреждения) или может быть симптомом расстройства или состояния кожи, такого как солнечное повреждение, экзема, контактный дерматит, псориаз или ихтиоз (врожденное состояние, вызывающее заметное шелушение кожи).
В дополнительном предпочтительном аспекте, поражение, состояние или расстройство, которое лечат или предотвращают, представляет собой утолщение рогового слоя кожи. Его можно лечить путем увлажнения и/или отшелушивания.
Такое утолщение рогового слоя кожи может возникать при состояниях, таких как мозоли или омозолелости, которые представляют собой защитные подушечки, состоящие из утолщенного верхнего слоя кожи из-за повторяющегося трения области или бородавки на коже. Такие методы также могут быть использованы для лечения или профилактики акне, которые имеют в своем течении кератинизацию. Утолщение рогового слоя может быть состоянием, как таковым, или может быть симптомом состояния или расстройства кожи.
В следующем предпочтительном аспекте поражением, состоянием или расстройством, которое лечат или предотвращают, является расстройство или нарушение пигментации кожи. Его можно лечить отшелушиванием.
Расстройства или нарушения пигментации кожи могут возникать как результат возраста, гормональных изменений, генетических факторов, заболеваний или солнечного или другого повреждения. Изменение пигментации может возникать в результате локального избытка меланоцитов или увеличения активности меланоцитов или обоих. Расстройства пигментации включают печеночные, солнечные или возрастные пятна (солнечное лентиго) и другие дефекты, такие как веснушки.
Альтернативно указано, следовательно, что настоящее изобретение обеспечивает косметический или некосметический способ лечения или профилактики состояния или расстройства кожи животного, где указанная кожа является ненормально сухой, роговой слой кожи ненормально утолщен или кожа имеет расстройство пигментации, где полипептид, молекулу нуклеиновой кислоты или фармацевтическую композицию, как описано в настоящем описании ранее, вводят указанному животному. Указанные состояния или расстройства представляют собой предпочтительно описанные в настоящем описании ранее.
Как указано в настоящем описании "ненормальный" определяют относительно нормальной оптимальной кожи, т.е. здоровой, увлажненной, нормально пигментированной и нестарой кожи.
В дополнительном альтернативном положении изобретение обеспечивает полипептид, молекулу нуклеиновой кислоты или фармацевтическую композицию, как описано в настоящем описании, для применения в косметическом или некосметическом способе лечения или профилактики состояния или расстройства кожи животного, где указанная кожа является ненормально сухой, роговой слой кожи ненормально утолщен или кожа имеет расстройство пигментации. (Соединение или композиция могут альтернативно использоваться для получения лекарственного препарата для этой цели).
В предпочтительном аспекте медицинское и/или косметическое применение достигается путем местного нанесения на кожу.
Предпочтительно для медицинских или косметических показаний, полагаясь по меньшей мере частично на эффекты отшелушивания активных ингредиентов, фармацевтические композиции, используемые для этой цели, включают один или более VAP (или их связанных веществ, как описано в настоящем описании) и/или хориолизин (или его связанные последовательности, как описано в настоящем описании).
Предпочтительно для медицинских или косметических показаний, полагаясь по меньшей мере частично на увлажняющие эффекты активных ингредиентов, фармацевтические композиции, используемые для этой цели, включают один или более VAP (или их связанные последовательности, как описано в настоящем описании).
Следовательно, в определенном предпочтительном аспекте, один или более VAP (или их связанные последовательности, как описано в настоящем описании) и/или хориолизин (или его связанные последовательности, как описано в настоящем описании) могут быть использованы для лечения расстройств, при которых кожа является ненормально сухой, роговой слой кожи ненормально утолщен или в которой присутствует дефект пигментации, например, мозоли, омозолелости, бородавки, экзема, контактный дерматит, псориаз, ихтиоз, акне и печеночные пятна.
В дополнительном особенно предпочтительном аспекте один или более VAP (или их связанные последовательности, как описано в настоящем описании) могут быть использованы для лечения расстройств, при которых кожа является ненормально сухой.
Как используется в настоящем описании, "лечение" относится к уменьшению, облегчению или устранению, предпочтительно до нормального уровня, одного или более симптомов или эффектов указанного состояния или расстройства, например, наличия или степени сухости или утолщения кожи, выраженности или площади пигментации, зуда или боли и др. относительно симптомов или эффектов, присутствующих на различных частях тела указанного пациента, где кожа не страдает от указанного состояния или расстройства и не является предметом указанного лечения, или у соответствующего обычного пациента, не получающего указанного лечения.
"Профилактика" относится к абсолютному предотвращению или уменьшению или облегчению степени выраженности или времени (например, отсрочки) развития такого симптома или эффекта. Например, состояния, характеризуемые сухой, утолщенной или патологически пигментированной кожей, могут быть предотвращены путем регулярного нанесения композиций по изобретению до развития такого состояния.
Предпочтительно указанное лечение достигают с использованием полипептидных способов по изобретению. Однако также предусматривается применение кодирующих полинуклеотидов. Это может быть достигнуто, например, способами генной терапии, например, с использованием смысловых последовательностей для возможной экспрессии желаемых молекул в коже.
Способ лечения или профилактики по изобретению может преимущественно быть скомбинирован с введением одного или более активных ингредиентов, которые являются эффективными в лечении или профилактике расстройств или состояний и/или для достижения увлажнения или отшелушивания. Следовательно, фармацевтические композиции по изобретению могут дополнительно содержать один или более таких активных ингредиентов.
В соответствии с еще одним дополнительным аспектом изобретения авторы обеспечивают продукты, содержащие один или более полипептидов или молекул нуклеиновой кислоты, как определено в настоящем описании, и необязательно один или более дополнительных активных ингредиентов, в виде комбинированного препарата для одновременного, раздельного или последовательного применения в лечении людей или животных, предпочтительно, как описано в настоящем описании.
Композиции по изобретению могут быть рецептированы обычным образом с одним или более физиологически приемлемыми носителями, вспомогательными веществами и/или разбавителями в соответствии с методиками, хорошо известными в области техники с использованием легко доступных ингредиентов.
Следовательно, активный ингредиент может быть включен, необязательно вместе с другими активными веществами в виде комбинированного препарата с одним или более обычными носителями, разбавителями и/или вспомогательными веществами для получения обычных галеновых препаратов, таких как таблетки, пилюли, порошки, пастилки, саше, облатки, эликсиры, суспензии (в качестве инъекционных или инфузионных жидкостей), эмульсии, растворы, сиропы, аэрозоли (в виде твердого вещества или в жидкой среде), мази, мягкие и твердые желатиновые капсулы, суппозитории, стерильные инъекционные растворы, стерильные упакованные порошки и подобные. Биоразлагаемые полимеры (такие как полиэфиры, полиангидриды, полимолочная кислота или полигликолевая кислота) также могут быть использованы для твердых имплантатов. Композиции могут быть стабилизированы с использованием лиофилизации, переохлаждения или Permazyme.
Подходящие вспомогательные вещества, носители или разбавители представляют собой лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбит, маннит, крахмалы, гуммиарабик, фосфат кальция, карбонат кальция, лактозу кальция, кукурузный крахмал, альгинаты, трагакант, желатин, силикат кальция, микрокристаллическую целлюлозу, поливинилпирролидон, целлюлозу, водный сироп, воду, воду/этанол, воду/гликоль, воду/полиэтилен, гликоль, пропиленгликоль, метилцеллюлозу, метилгидроксибензоаты, пропилгидроксибензоаты, тальк, стеарат магния, минеральное масло или жирные вещества, такие как твердый жир или их подходящие смеси. Вещества для получения композиций с замедленным высвобождением, такие как карбоксиполиметилен, карбоксиметилцеллюлоза, фталат ацетата целлюлозы или поливинилацетат, также могут быть использованы.
Композиции могут дополнительно включать смазывающие средства, увлажняющие средства, эмульгирующие средства, средства, увеличивающие вязкость, гранулирующие средства, разрыхлители, вяжущие средства, осмотически активные вещества, суспендирующие средства, консерванты, подсластители, ароматизаторы, усилители адсорбции (например, поверхностно проникающие средства или для назального введения, например, соли желчных кислот, лецитины, поверхностно-активные вещества, жирные кислоты, комплексоны), оксидирующие средства, органические растворители, антиоксиданты, стабилизаторы, умягчители, диоксид кремния, альфа-гидроксикислоты, смягчители, антипенные средства, увлажняющие средства, витамины, ароматизаторы, ионные и неионные загустители, поверхностно-активные вещества, наполнители, ионные или неионные загустители, отшелушивающие вещества, полимер, пропеллент, подщелачивающие или подкисляющие средства, замутнители, красители и жирные соединения и подобные.
Композиции по изобретению могут быть рецептированы так, чтобы обеспечить быстрое, длительное или отложенное высвобождение активного ингредиента после введения в организм путем использования методик, хорошо известных в области техники.
Композиция может находиться в любой соответствующей лекарственной форме для возможности доставки или для нацеливания на определенные клетки или ткани, например, в виде эмульсии или в липосомах, ниосомах, микросферах, наночастицах или подобных, в которых может быть абсорбирован, адсорбирован, включен или связан активный ингредиент. Это может эффективно преобразовывать продукт в нерастворимую форму. Такие формы частиц могут преодолевать проблемы и стабильности (например, разрушения) и доставки.
Такие частицы могут нести определенные поверхностные молекулы для улучшения времени циркуляции (например, компоненты сыворотки, поверхностно-активные вещества, полиоксамин 908, PEG и др.) или компоненты для сайт-специфичного нацеливания, такие как лиганды к определенным рецепторам групп клеток. Соответствующие методики для доставки лекарственных средств и для нацеливания хорошо известны в области техники и описаны в W099/62315.
Применение растворов, суспензий, гелей и эмульсий является предпочтительным, например, активный ингредиент может находиться в воде, газе, жидкости на основе воды, масле, геле, эмульсии, эмульсии масло-в-воде или вода-в-масле, дисперсии или их смеси.
Композиции могут быть для местного (т.е. на кожу), перорального или парентерального введения, например, путем инъекции.
Местные композиции и введение, однако, являются предпочтительными и включают гели, кремы, мази, спреи, лосьоны, бальзамы, карандаши, мыла, порошки, пленки, аэрозоли, капли, пены, растворы, эмульсии, суспензии, дисперсии, например, неионные пузырьковые дисперсии, молочко и любые другие обычные фармацевтические или косметические формы в области техники.
Мази, гели и кремы могут, например, быть рецептированы с водной или масляной основой с добавлением подходящих сгущающих и/или гелеобразующих веществ. Лосьоны могут быть рецептированы с водной или масляной основой и, в общем, также содержат одно или более из эмульгирующих, диспергирующих, суспендирующих, сгущающих или красящих веществ. Порошки могут быть образованы с помощью любой подходящей порошкообразной основы. Капли и растворы могут быть рецептированы с водной или неводной основой, также включая одно или более из диспергирующих, растворяющих или суспендирующих веществ. Спреи аэрозоли удобно доставляются из герметичных упаковок с использованием подходящего пропеллента.
Альтернативно композиции могут быть представлены в форме, адаптированной для перорального или парентерального введения. Следовательно, альтернативные фармацевтические формы плоские или покрытые оболочкой таблетки, капсулы, суспензии и растворы, содержат активный компонент необязательно вместе с одним или более инертными обычными носителями и/или разбавителями, например, с кукурузным крахмалом, лактозой, сахарозой, микрокристаллической целлюлозой, стеаратом магния, поливинилпирролидоном, лимонной кислотой, виннокаменной кислотой, водой, водой/этанолом, водой/глицерином, водой/сорбитом, водой/полиэтиленгликолем, пропиленгликолем, стеариловым спиртом, карбоксиметилцеллюлозой или жирными веществами, такими, как твердый жир или их подходящие смеси.
Концентрация активного ингредиента в композициях по изобретению зависит от природы используемого соединения (т.е. полипептида или молекулы нуклеиновой кислоты), типа введения, курса лечения, возраста и массы тела пациента, медицинских показаний, организма или области организма, подвергаемой лечению, и могут варьироваться и корригироваться в соответствии с выбором. Обычно, однако, диапазон концентрации для соединения, описанного в настоящем описании, составляет 0,0001, 0,0005, 0,001 или 0,01 до 25%, например, 0,0005-15%, например, 0,01-10%, например от 0,1 или 0,5 до 5, например, 1-5% (масс/масс конечного препарата для введения, особенно для местного введения).
2
2
2
2
Когда присутствует более чем одно соединение, например, 3 VAP (или связанных молекул), как описано в настоящем описании, каждое соединение может присутствовать в количествах, описанных выше. Указанные концентрации определяют со ссылками на количество соединения как такового, и, таким образом, должны быть сделаны соответствующие поправки, принимая во внимание чистоту композиции. Эффективная разовая доза для VAP (и связанных молекул) может лежать в диапазоне от 0,1-100 мг/см/сутки, предпочтительно 0,1-10 мг/см/сутки, принимаемых в виде разовой дозы, при нанесении местно в зависимости от животного, получающего лечение. Для хориолизина (и связанных молекул) эффективные разовые дозировки могут лежать в диапазоне от около 0,1-100 мЕД/см/сутки, предпочтительно 0,5-10, например, 1-5 мЕД/см/сутки.
Введение может осуществляться любым подходящим способом, известным в области медицины, включая, например, пероральное, кишечное, чрескожное, буккальное, ректальное или местное введение или введение путем ингаляции. Предпочтительные формы введения вводят перорально или наиболее предпочтительно местно. Как понимают, пероральное введение имеет свои ограничения, является ли активный ингредиент усвояемым. Для решения указанной проблемы ингредиенты могут быть стабилизированы, как упомянуто ранее.
Понимают, что так как активный ингредиент для осуществления изобретения принимает множество форм, например, молекула нуклеиновой кислоты (которая может быть в векторе) или полипептид, форма композиции и путь введения будут варьироваться. Предпочтительно, однако, используют жидкие растворы, кремы или суспензии, особенно, например, для перорального введения или местного введения.
Или полипептид или молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению могут быть использованы для вышеуказанных медицинских показаний. В последнем случае методы генной терапии молекулы нуклеиновой кислоты предпочтительно обеспечивают в векторах, которые являются подходящими для трансфекции/трансформации, как описано выше, например, вирусных векторах, таких как аденовирус с использованием методов генной терапии, известных в области техники для медицинских применений.
Животные, которым можно наносить или вводить композиции, включают млекопитающих, рептилий, птиц, насекомых и рыб, особенно при разведении рыб (например, лосося или трески). Предпочтительно, животными, у которых применяют композиции по изобретению, являются млекопитающие, особенно приматы, домашний животные, домашний скот и лабораторные животные. Следовательно, предпочтительные животные включают мышей, крыс, кроликов, морских свинок, кошек, собак, обезьян, свиней, коров, коз, овец и лошадей. Особенно предпочтительно композиции наносят или вводят людям.
Следующие примеры даны только в качестве иллюстраций, в которых чертежи, на которые ссылаются, представляют собой следующее:
На фиг. 1 показано изоэлектрическое фокусирование VAP после их очистки;
На фиг. 2 показаны эффекты VAP Атлантического лосося на человеческий эпителий, в котором A и B показывают культуры клеток, подвергнутые воздействию VAP, и C показывает контрольную культуру клеток; и
На фиг. 3 показаны эффекты хориолизина L Атлантического лосося на человеческий эпителий, в котором A показывает культуру кожи, подвергнутую воздействию хориолизина L, и B показывает контрольную культуру кожи.
Пример 1: Идентификация и характеристика VAP
Выделение белка
В рамках анализа компонентов жидкости икринок, получаемой при вылуплении Атлантического лосося, были идентифицированы новые белки, присутствующие в жидкости.
Способ для получения частичной жидкости икринок, получаемой при вылуплении (из которой может быть получена зоназа), которая может быть использована в качестве исходного материала для выделения VAP по изобретению (или их предшествующих последовательностей), представлен в WO99/29836, который таким образом включен в виде ссылки (особенно пример 1 описанного способа, но необязательно без стадии мочевины).
Следовательно, для выделения использовали следующий способ. VAP выделяли из жидкости икринок, получаемой при вылуплении (сырой или фильтрованной через 0,45 мкм фильтры). Впоследствии VAP осаждали путем добавления 4× объемов ацетона при комнатной температуре или при 4°C. После 20-30 минут осажденные VAP собирали в виде осадка после центрифугирования при низкой скорости (около 5000×g) и ресуспендировали в соответствующем буфере (например, 10 мМ TrisHCl, pH8,0 или PBS).
На фиг. 1 показан 2D PAGE VAP после их очистки, как описано выше.
Анализ последовательностей
Заново идентифицированные VAP подвергали характеристике посредством МС анализа трипсинизированных пятен. МС анализом был MALDI-TOF-TOF (Матрикс-ассистированная лазерная десорбция/ионизация. Время полета ×2).
Следующие результаты были получены для наилучшего соответствия, что отражено верхней шкалой.
Из вышеуказанных результатов создавали последовательности VAP путем идентификации пептидов в последовательности VAP посредством МС и затем вставки мешающей последовательности с использованием важных частей известной нативной последовательности, с которой производилось сравнение. Последовательности VAP, идентифицированные таким способом, представлены в SEQ ID NO: 2-4, и нативные последовательности, с которыми их сравнивали, представлены в SEQ ID NO: 5-8.
Пример 2: Медицинское/косметическое применение VAP in vitro
Материалы и методы
Следующие исследования проводили с использованием VAP Атлантического лосося, полученных, как описано в примере 1.
Дифференцированные культуры человеческого эпителия кожи получали от SkinEthics (Nice, France) в день 16 после посева на пластиковый ростовой субстрат с микропорами, допускающими доступ питательных веществ к эпителиальной ткани снизу. Такие культуры имели нормальную морфологию кожи после дифференцировки в течение периода культивирования при 37°C. Такие культуры выдерживали в течение еще двух дней in vitro, так чтобы верхний роговой слой подвергался воздействию воздуха и базальный слой - ростового субстрата.
Параллельные культуры перемещали в 30°C влажную атмосферу и обрабатывали средой Ca, Mg-содержащим фосфатным буферным раствором в течение 6 часов с или без присутствия VAP в количестве 0,5 мг/мл (измеренной при ОП 280). Культуры фиксировали в формалине и заливали в парафин в соответствии со стандартными методиками и окрашивали гематоксилином/эозином.
Результаты
A. Увлажняющие эффекты
Результаты показаны на фиг. 2A-C, на которых A и B показывают культуру кожи, подвергнутую воздействию VAP, и C показывает контрольную культуру кожи. Указанные чертежи показывают, что VAP вызывают отделение пластинки рогового слоя кожи, таким образом возникает "деламинация". Пластинки не открепляются или отшелушиваются, они просто отделяются друг от друга.
Такое разделение вызывается высоко заряженными амфифильными белками, которые встраиваются в роговой слой, и которые из-за их амфифильной природы несут воду для разделения кожных пластинок. Следовательно, вода проникает в роговой слой посредством VAP, уменьшая трансэпидермальные потери воды (TEWL).
Пример 3: Медицинские/косметические применения хориолизина L in vitro
Материалы и методы
Следующие исследования проводили с использованием хориолизина L Атлантического лосося, полученного, как описано в Yasumasu et al., 1989, выше, из жидкости икринок, получаемой при вылуплении лосося.
Культуры человеческого эпителия кожи получали, как описано в примере 2, и хориолизин L из жидкости икринок, получаемой при вылуплении лосося, наносили в концентрации 0,15 мЕД/мл в течение 6 часов при 30°C.
Результаты
A. Отшелушивающие эффекты
Результаты показаны на фиг. 3A и B, на которых A показывает культуру кожи, подвергнутую воздействию хориолизина L лосося, и B показывает контрольную культуру кожи. Результаты показывают, что хориолизин L вызывает деламинацию и разрыв пластинок кожи.
Отшелушивание также может быть проанализировано путем оценки надосадочной жидкости культур клеток для оценки количества эпителиальных клеток, которые удаляются из культур клеток во время обработки. Так как хориолизин L ингибируется 1 мМ ЭДТА, его эффекты легко можно ингибировать для подтверждения его действия на кожу.
Пример 4: Медицинские/косметические применения VAP и хориолизина L in vivo
Косметическое применение
Пациентам, страдающим от сухости кожи и/или кожи, требующей отшелушивания (например, мозоли или омозолелости), давали косметические или плацебо кремы, как описано ниже. Лечение повторяли периодически, например, каждые 8 часов.
Эффекты крема на кожу анализировали на основании качественных эффектов, таких как вид и ощущение (например, зуд) или могли проанализировать количественно, например, по содержанию воды или толщине.
Медицинские применения
Пациентам, страдающим от состояния или поражения кожи, такого как акне, экзема или псориаз, давали лечебный или плацебо кремы, как описано ниже. Лечение повторяли периодически, например, каждые 8 часов.
Эффекты крема на кожу оценивали на основании качественных эффектов, таких как вид, ощущения (например, боль) или цвет или могли оценивать более количественно, например, по размеру оставшегося поражения, степени воспаления или толщине.
Плацебо крем:
<b>Название</b>
<b>Наименование INCI</b>
<b>%</b>
<b>Фаза/темп (</b>°<b>С)</b>
Цетиол V
Децилолеат
4
А/75
Динацерин 660
Олеилэрукат
6
А/75
CUTINA GMS V
Глицерилстеарат
3
А/75
Cire da lanol CTO
Цетеариловый спирт и Цетеарет 33
2
А/75
Накол 16-95
Цетиловый спирт
1
А/75
Эденор L2 SM GS
Стеариновая кислота и Пальмитиновая кислота
3
А/75
Накол 18-94
Цетиловый спирт
1
А/75
Радиа 7730
Изопропилмиристат
4
А/75
dH<sub>2</sub>O
25
В/75
Глицерин 4810
Глиерин
3
В/75
Оптифен
1
В/75
Триэтаноламин 85%
0,4
В/75
dH<sub>2</sub>O
46,3
С/75
Nipa Biopure 100
Имидазолидинилмочевина
0,3
С/25
Косметический/лечебный крем с 10% активного ингредиента
<b>Название</b>
<b>Наименование INCI</b>
<b>%</b>
<b>Фаза/темп (</b>°<b>С)</b>
Цетиол V
Децилолеат
4
А/75
Динацерин 660
Олеилэрукат
6
А/75
CUTINA GMS V
Глицерилстеарат
3
А/75
Cire da lanol CTO
Цетеариловый спирт и Цетеарет 33
2
А/75
Накол 16-95
Цетиловый спирт
1
А/75
Эденор L2 SM GS
Стеариновая кислота и Пальмитиновая кислота
3
А/75
Накол 18-94
Цетиловый спирт
1
А/75
Радиа 7730
Изопропилмиристат
4
А/75
dH<sub>2</sub>O
25
В/75
Глицерин 4810
Глиерин
3
В/75
Оптифен
1
В/75
Триэтаноламин 85%
0,4
В/75
dH<sub>2</sub>O
36,3
С/75
Nipa Biopure 100
Имидазолидинилмочевина
0,3
С/25
VAP и/или хориолизин L
10
25
Последовательности:
SEQ ID NO: 1: Хориолизин L - Атлантический лосось
SEQ ID NO: 2: VAP I - Атлантический лосось
SEQ ID NO: 3: VAP II - лосось
SEQ ID NO: 4: VAP III - лосось
SEQ ID NO: 5: Полноразмерной zr-белок - Атлантический лосось
SEQ ID NO: 6: Полноразмерной хориогенин H - Тихоокеанский лосось
SEQ ID NO: 7: Полноразмерной хориогенин L - Тихоокеанский лосось
SEQ ID NO: 8: Альтернативный zr-белок - Атлантический лосось
SEQ ID NO: 9: Последовательность нуклеотидов, хориолизин L, Атлантический лосось
SEQ ID NO: 10: Последовательность нуклеотидов, кодирующая SEQ ID NO: 2, VAP I
SEQ ID NO: 11: Последовательность нуклеотидов, кодирующая SEQ ID NO: 3, VAP II
SEQ ID NO: 12: Последовательность нуклеотидов, кодирующая SEQ ID NO: 4, VAP III
SEQ ID NO: 13: Полноразмерная последовательность нуклеотидов, кодирующая SEQ ID NO: 5, zr-белок Атлантического лосося
SEQ ID NO: 14: Полноразмерная последовательность нуклеотидов, кодирующая SEQ ID NO: 6, хориогенин H - Тихоокеанский лосось
SEQ ID NO: 15: Полноразмерная последовательность нуклеотидов, кодирующая SEQ ID NO: 7, хориогенин L - Тихоокеанский лосось
SEQ ID NO: 16: Полноразмерная последовательность нуклеотидов, кодирующая SEQ ID NO: 8, альтернативный zr-белок Атлантического лосося