Способ получения посадочного материала хризантемы в условиях in vitro
METHOD OF CREATING PLANTING MATERIAL FOR CHRYSANTHEMUMS IN VITRO

Изобретение относится к области сельскохозяйственной биотехнологии, и может быть использовано для массового получения генетически однородного посадочного материала ценных сортов и гибридов хризантем.
Известен ряд способов получения растений-регенерантов in vitro: активация развития существующих в растении меристем, индукция образования адвентивных почек непосредственно на первичном экспланте, соматический эмбриогенез, индукция образования адвентивных почек в первичной и пересадочной каллусной ткани (Патент RU №2560592, Патент RU №2619052).
Однако все перечисленные способы имеют, как свои преимущества, так и недостатки.
Работы по клонированию хризантем в условиях in vitro ведутся во многих странах, в том числе и России. Однако предлагаемые технологии малоэффективны, так как они зависят от количества и качества исходного материала. Как правило, в качестве первичного экспланта при размножении растений хризантемы in vitro используют черенки с одной или двумя пазушными почками, а также листовые пластинки. Реже используют семена.
Так, например, известен способ размножения хризантем за счет активации развития существующих в растении меристем. Способ предусматривает культивирование на питательной среде черенков длиной 10-15 мм с одной пазушной почкой, которые нарезают с растения-донора. Для массового производства генетически однородного посадочного материала ценных сортов и гибридов растений необходимо таких черенков нарезать с интактного растения в количестве не менее 50-100 шт., так как при введении в культуру in vitro после стерилизации может выжить всего лишь 50% эксплантов в связи с неправильным подбором стерилизующего агента и его временной экспозиции воздействия (см. автореферат дис…к.б.н. / Гранда Харамильо Роберто Карлос. - МСХА имени К.А. Тимирязева. - Москва, 2009. - 19 с.). Следует отметить, что недостатком данного способа является то, что изолирование такого количества черенков с одного растения может привести к полной гибели растения и потери ценного сортового материала. Кроме того, недостатком этого способа является также невысокий коэффициент размножения. Так, из одной пазушной почки развивается на первом пассаже всего лишь один микропобег. При его последующем микрочеренковании коэффициент размножения составляет, как правило, 5-7. Отсюда следует, что в течение последующего пассажа (1 месяц культивирования) можно получить всего 5-7 растений. Если коэффициент размножения на каждом пассаже составляет 5-7, то в течение 6 месяцев культивирования можно получить 16807 растений-регенерантов.
Известен способ, предусматривающий размножение растений хризантемы in vitro на питательной среде, содержащей электрохимически активированные водные растворы: анолит нейтральный катодно-обработанный (анолит АНК) и католит. Черенки с одной или двумя пазушными почками нарезают с интактных растений и подвергают стерилизации раствором анолита АНК в концентрации 0,03% в течение 10 мин. Это позволило авторам получить выход 90-100% стерильных и жизнеспособных эксплантов. На этапе собственно микроразмножения в качестве стимулятора роста и развития растений авторы предлагают применять католит, что позволяет избежать быстрого старения тканей, а также витрификации (гипергидратации) побегов, которая встречается в ходе микроразмножения (Патент RU №2560592).
Недостатком данного способа является то, что, как и в первом аналоге, изолирование черенков осуществляется с одного растения, что может привести к полной его гибели и даже к потери ценного сортового материала. Кроме того, недостатком указанного способа является также невысокий коэффициент размножения.
Известен также способ размножения растений хризантемы in vitro -получение растений-регенерантов в первичной и пересадочной каллусной ткани. В качестве первичного экспланта авторы предлагают использовать семена (Патент RU №2619052) - прототип.
Способ предусматривает культивирование семян на питательной среде Мурасига и Скуга (МС) с добавлением 0,7% агар-агара, 1 мг/л БАП, 0,1-1 мг/л ИУК в течение 1 пассажа (26 суток) до появления каллуса. Затем каллусы пересаживают на питательную среду МС с половинной концентрацией всех компонентов и с добавлением 0,2-1 мг/л БАП. и культивируют в течение 2-4 пассажей до появления растений-регенерантов.
Недостатком данного способа является то, что растения-регенеранты, полученные из дедифференцированных клеток каллусной ткани, как правило, генетически неоднородны между собой (наблюдается сомаклональная вариабельность, проявляющаяся как на морфологическом, так и на генетическом уровне) и отличаются от растения-донора. Такие растения представляют интерес только для селекционеров, но не для производителей высококачественного посадочного материала.
Из анализа известных аналогичных технических решений выявлено, что технической проблемой в данной области является необходимость расширения арсенала средств, для массового получения генетически однородного посадочного материала ценных сортов и гибридов хризантем.
Техническим результатом изобретения является ускорение процесса массового получения генетически однородного, высококачественного посадочного материала хризантем для промышленного цветоводства ценных сортов и гибридов хризантемы.
Для решения указанной проблемы и достижения заявленного технического результата в качестве первичного экспланта используют язычковые цветки, которые изолируют с раскрывшихся цветочных бутонов и культивируют на питательной среде, содержащей минеральные соли по прописи Мурасига и Скуга. В качестве индуктора образования адвентивных почек служат гормоны 6-бензиламинопурин (БАП) в концентрации 1 мг/л и индолилуксусная кислота (ИУК) 0,5 мг/л), а также препарат Аминовен 15-ти процентный в концентрации 3 мл/л. Развитые в побеги адвентивные почки к концу пассажа отделяют от материнского экспланта и самостоятельно культивируют на среде МС с содержанием только препарата 15%-ного Аминовен, взятого в той же концентрации.
Конкретный пример осуществления предполагаемого способа
Для размножения хризантемы можно использовать один срезанный цветущий побег, на котором имеется один или несколько цветов. Каждый цветок хризантемы разделить на отдельные лепестки (язычковые цветки). С одного цветка можно изолировать до 50 шт язычковых цветков, которые помещают в марлевые мешочки и в условиях ламинар-бокса проводят поверхностную их стерилизацию 0,1%-ным раствором сулемы в течение 5 минут с последующим выдерживанием в стерильной дистиллированной воде. Язычковые лепестки вынимают из марлевого мешочка и равномерно раскладывают на поверхности питательной среды в чашках Петри. Культивирование язычковых лепестков проводят на питательной среде, содержащей минеральные соли по прописи Мурасига и Скуга. В качестве индуктора образования адвентивных почек служат гормоны (6-бензиламинопурин (БАП) в концентрации 1 мг/л и индолилуксусная кислота (ИУК) 0,5 мг/л), а также препарат Аминовен 15-ти процентный в концентрации 3 мл/л. Чашки Петри с эксплантами переносят в световую комнату, где поддерживается температура 230С, 16-часовой фотопериод, освещение белыми люминесцентными лампами, интенсивность освещения 3 тыс.лк. Через 15 суток отмечается появление в базальной части язычковых лепестков адвентивных почек, среднее количество которых составляет 12-15 шт. К концу пассажа (30 суток) адвентивные почки развиваются в побеги, которые отделяют от материнского экспланта и самостоятельно культивируют на среде МС без гормонов, но с содержанием препарата Аминовен 15-ти процентного в концентрации 3 мл/л. При среднем коэффициенте размножения 5-7 и изолировании с одного цветочного бутона всего 10 язычковых лепестков, то в течение 6 месяцев культивирования можно получить 312130 растений-регенерантов.
Предлагаемый способ получения генетически однородного посадочного материала хризантем сочетает ряд положительных свойств, которые позволяют использовать ее в практической работе:
1. Технология предполагает использовать в небольших количествах легкодоступный материал (цветы) для клонирования.
2. Присутствие в составе питательной среды сильного индуктора морфогенеза (15%-ный Аминовен 3 мл/л) (дешевая технология).
3. Предлагаемый способ легок в исполнении по сравнению с ранее предложенными изобретениями авторов.
4. Предлагаемая технология позволяет получить в 18 раз больше посадочного материала хризантем по сравнению с ранее предложенными изобретениями авторов.
Заявляемое изобретение направлено на устранение недостатков, которые свойственны наиболее распространенным способам получения высококачественного посадочного материала растений хризантем. Известных в научно-технической и патентной литературе способов с аналогичной технологией не обнаружено. Результат, полученный у данного решения и обусловленный применением в качестве первичного экспланта язычковых цветков, не достигался в известных решениях.
Использование изобретения позволит увеличить выход генетически стабильного, высококачественного посадочного материала хризантем в 18 раз, что дает возможность получать их в количестве, достаточном для промышленного цветоводства ценных сортов и гибридов хризантем.