ШТАММ ASPERGILLUS CLAVATUS - ПРОДУЦЕНТ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ С КЕРАТИНОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ
ASPERGILLUS CLAVATUS STRAIN - PRODUCER OF PROTEOLITIC ENZYMES WITH KERATINOLYTIC ACTIVITY

Изобретение относится к области биотехнологии, получению протеолитических ферментов с кератинолитической активностью.
Кератины - нерастворимые фибриллярные белки, синтезируемые в клетках эпителия позвоночных животных (Herrmann and Aebi, 2004). Кератины выполняют различные функции в организме, в том числе обеспечивают механическую защиту при онтогенетической и филогенетической адаптации животных к условиям внешней среды (Fraser et al., 1972; Schweizer et al., 2006).
Ферменты, гидролизующие кератин, востребованы в различных сферах экономики: биомедицине для удаления прионных контаминаций, изготовления гипоаллергенных трансплантатов, лечения и диагностики ряда кожных и нейродегенеративных заболеваний; текстильной и кожевенной промышленности для предания материалу необходимых свойств; а также в сельском хозяйстве для утилизации (биодеградации) отходов, богатых кератином (перьев, щетины и др.), и изготовления кормовых добавок (Purchase et al., 2016).
Развитие методов переработки отходов сельского хозяйства -актуальная задача современной биотехнологии. Применяемые в настоящее время методы утилизации побочных продуктов животноводства и птицеводста, богатых кератином, не отвечают предъявляемым экономикой требованиям. Захоранивание, сжигание, химический гидролиз, а также карбонизация являются энергоемкими процессами, требующими больших территорий, высококвалифицированного персонала и сложного оборудования и приводящими к загрязнению среды парниковыми газами, сажей и патогенными микроорганизмами. Ферментативное расщепление кератинов позволит не только снизить нагрузку на окружающую среду, но также получать продукты переработки кератинсодержащих материалов, востребованных в косметологии, медицине и биохимической промышленности - аминокислоты и олигопептиды (Shestakova et al., 2021).
К источникам кератинолитических ферментов относятся археи, бактерии и грибы. Мицелиальные грибы - одни из наиболее перспективных промышленных продуцентов кератиназ, так как они способны секретировать многокомпонентные комплексы протеаз с широкой субстратной специфичностью и широким диапазоном действия, что является несомненным преимуществом для биодеградации, а также их культивирование возможно в твердофазных условиях на отходах животноводства, что позволит снизить расходы воды и энергии для производства целевого продукта, тем самым снижая нагрузку на окружающую среду и повышая рентабельность производства кератинолитических ферментов (da Silva et al., 2016; de Oliveira et al., 2019).
Известны коммерческие препараты протеиназы К, получаемые при культивировании Engyodontium album и некоторых рекомбинантных штаммов бактерий. Существенным недостатком этого фермента для биодеградации является проявление высокой кератинолитической активности лишь в высокоочищенном виде, что результирует в высокой стоимости продукта (Ebeling et al., 1974; Kuczius and Groschup, 1999).
Известен продуцент кератинолитических ферментов штамм Trichophyton sp.95 (патент CN1405305 A). Протеазы этого штамма обладают широкой субстратной специфичностью, гидролизуют как альфа-, так и бета-кератин, и могут быть применены в пищевой промышленности, при производстве кормовых добавок и детергентов. Однако недостатками Trichophyton sp.95 являются патогенность для человека и длительное время культивирования (6-7 дней).
Ближайшим аналогом является культура микроскопического гриба Aspergillus fumigatus. Она наиболее близка к новому штамму по таксономическому положению. Синтезирует внеклеточные протеолитические ферменты с кератинолитической активностью при росте на среде с добавлением куриного пера в качестве основного источника углерода и азота. Недостатками этой культуры являются необходимость длительного культивирования (21 день) и патогенность для человека, так как Aspergillus fumigatus - основной инфекционный агент при аспергиллезах легких человека (Sivakumar and Raveendran, 2015).
В основу настоящего изобретения положена задача поиска нового продуцента протеолитических ферментов с кератинолитической активностью, обладающего способностью секретировать высокоактивный целевой продукт при культивировании на отходах птицеводства.
Задача решается с помощью вновь выделенного авторами почвенного штамма Aspergillus clavatus А16. Штамм А16 депонирован во Всероссийскую коллекцию микроорганизмов (ВКМ) под номером F-1593.
Штамм Aspergillus clavatus F-1593 при глубинном и твердофазном культивировании на питательной среде с добавлением перемолотого или цельного куриного пера синтезирует внеклеточные ферменты с казеинолитической и кератинолитической активностью. Выделение кератинолитических ферментов из культуральной жидкости проводят известными методами с помощью осаждения белков сульфатом аммония до степени насыщения 80%. Сформированные осадки центрифугируют, переносят в буфер (рН 8.2) и диализуют для удаления солей аммония при 4°С против того же буфера, далее снова центрифугируют и удаляют нерастворимую часть (Ландау и др., 1998). Раствор хранят в холодильнике при 4°С или лиофилизируют для длительного хранения. Активность измеряют за счет проведения реакций с 1% суспензией кератина шерсти (рН 8.2).
Штамм Aspergillus clavatus A16 (F-1593) идентифицирован по морфолого-культуральным признакам (Domsch et al., 2007) и методом секвенирования ITS-региона рДНК (Henry et al., 2000). Его нуклеотидная последовательность депонирована в Генбанке под номером OK559552. Штамм относится к семейству Trichocomaceae, порядку Eurotiales, классу Eurotiomycetes, подотделу Pezizomycotina, отделу Ascomycota.
Культурально-морфологические признаки.
Штамм хорошо растет на стандартных агаризованных средах -сусло-агар, среда Чапека при температуре 25-28°С. Спороношение штамм начинает на 2-3 сут, формируя обильноспороносящие колонии. На среде сусло-агар штамм Aspergillus clavatus F-1593 образует широкорастущие бархатистые белые колонии с волнистыми краями, приобретающие сине-зеленую окраску на 2-4 день культивирования и травянисто-зеленую при старении. Ножки конидиеносцев бесцветные, споры, образующиеся на фиалидах, расположенных на элипсоидных головках, окрашены. Обратная сторона колонии гладкая, белая, бывает с охристой пигментацией в центре. На жидкой среде при перемешивании штамм растет в виде мелких пеллет от светло-бежевого до темно-бежевого цвета, состоящих из тяжей ветвящегося мицелия с конидиями. При твердофазном культивировании штамм обрастает цельные куриные перья, морфология культуры схожа с ростом на агаризованных средах.
Физиолого-биохимические признаки.
Оптимум роста штамма лежит в интервале температур 25-30°С. Использует широкий спектр источников азота, как восстановленные -аммоний, пептон, казеин, гидролизат рыбной муки, кератин, так и окисленные - нитраты. В глубинной культуре лучше растет на полусинтетической среде, содержащей перемолотое куриное перо, нитрат натрия и гидролизат рыбной муки, и значениях рН, близким к нейтральным (6.0-7.0), постепенно подщелачивая среду. При росте в твердофазных условиях перемолотое куриное перо заменяют на цельное. Условия аналогичные. Штамм обладает хорошей протеолитической (казеинолитической) и относительно невысокой липолитической активностью.
Штамм поддерживают на косяках с сусло-агаром 4-5°Б с начальным рН 6.0-6.2 или на среде Чапек-агар при комнатной температуре с пересевом через 1-3 месяца, а при хранении при 4°С с пересевом через 6-12 месяцев или под вазелиновым маслом с пересевом 1 раз в год. Штамм культивируют при 28°С на среде сусло-агар (сусло - 4, агар - 2, %) 5-7 суток.
Пример 1. Казеинолитическая и кератинолитическая активность протеаз культуральной жидкости Aspergillus clavatus F-1593 при глубинном культивировании.
В качестве посевного материала используют двухсуточную культуру, полученную на среде, содержащей сусло, глюкозу и пептон. Штамм Aspergillus clavatus F-1593 выращивают в условиях глубинного культивирования в 100 мл питательной среды в качалочных колбах объемом 750 мл на орбитальных качалках (200 об/мин) при 28°С. Дальнейшее культивирование штамма проводят при тех же условиях на многокомпонентной полусинтетической среде следующего состава, %:
3
NaNO- 0.3;
2
4
KHPO- 0.1;
4
2
MgSO×7HO - 0.05;
KCl - 0.05;
2
FeSO4×7HO - 0.001;
глюкоза - 3.0;
гидролизат рыбной муки - 0.5;
перемолотое куриное перо - 0.5; рН 6.0.
Пробы мицелия отделяют от среды (фильтрованием через бумажный фильтр или центрифугированием) и получают культуральную жидкость, которую используют для определения казеинолитической и кератинолитической активности.
Кератинолитическую активность внеклеточных протеаз определяют спектрофотометрически с использованием 1% суспензии кератина шерсти в 0.05 М Трис-HCl буфере (рН 8.2). Для проведения реакции к 100 мкл культуральной жидкости добавляют 200 мкл суспензии кератина. Реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 30 мин в термошейкере при 600 об/мин. Реакцию останавливают добавлением 300 мкл 10% раствора трихлоруксусной кислоты. Далее образцы центрифугируют в течение 5 мин при 14000 об/мин, после чего в надосадочной жидкости измеряют оптическую плотность при длине волны 280 нм. За единицу активности (Е) принимают количество фермента, которое вызывает изменение оптической плотности на 0.01 ед. в условиях проведения реакции.
Казеинолитическую активность внеклеточных протеаз микромицета определяют модифицированным методом Ансона-Хагихары, суть которого заключается в определении активности фермента как характеристики пропорциональной количеству аминокислоты тирозина, входящей в состав олигопептидов, образующихся во время гидролиза казеина. Для проведения реакции к 100 мкл культуральной жидкости добавляют 200 мкл 1% раствора казеина по Хаммерштайну в 0.1 М Трис-HCl буфере (рН 8.2). Реакционную смесь инкубируют при 37°С в течение 10 мин в термошейкере при 600 об/мин. Реакцию останавливают добавлением 300 мкл 10% раствора трихлоруксусной кислоты. Далее образцы центрифугируют в течение 5 мин при 14000 об/мин, после чего в надосадочной жидкости измеряют оптическую плотность при длине волны 275 нм (Осмоловский и др., 2016). За единицу активности (Е) принимают количество фермента, которое вызывает изменение оптической плотности на 0.01 ед. в условиях проведения реакции.
Повторность в опытах - 3-х кратная.
Максимум казеинолитической и кератинолитической активности штамма Aspergillus clavatus F-1593 при росте в глубинных условиях составляет 47.5 Е и 55.6 Е, соответственно, и приходится на 4 сутки культивирования.
Пример 2. Казеинолитическая и кератинолитическая активность протеаз культуральной жидкости Aspergillus clavatus F-1593 при твердофазном культивировании.
В качестве посевного материала используют споровую суспензию Aspergillus clavatus F-1593. Твердофазное культивирование проводят в конических колбах объемом 250 мл с цельными куриными перьями (0.7 г). В колбы добавляют 10 мл питательной среды следующего состава, %:
3
NaNO- 0.3;
2
4
KHPO- 0.1;
4
2
MgSO×7HO - 0.05;
KCl - 0.05;
4
2
FeSO×7HO - 0.001;
глюкоза - 3.0;
гидролизат рыбной муки - 0.5;
рН 6.0.
Засев осуществляют споровой суспензией объемом 1 мл, полученной путем смыва спор с выращенной на сусло-агаре культуры (5-7 сутки) стерильным водным 0.001% раствором Твина-80. Культивирование проводят в статичных условиях при 28°С.
Для элюции протеолитических ферментов используют 0.05 М Трис-HCl буфер, рН 8.2. В колбы с культурой добавляют по 35 мл буфера, после чего их помещают на орбитальную качалку (200 об/мин) на 60 мин. Элюат отфильтровывают через бумажные фильтры и используют для определения казеинолитической и кератинолитической активности аналогично примеру 1.
Повторность в опытах - 3-х кратная.
Максимум казеинолитической и кератинолитической активности штамма Aspergillus clavatus F-1593 при росте в твердофазных условиях составляет 73.4 Е и 55.2 Е, соответственно, и приходится на 3-5 сутки культивирования.
Пример 3. Сравнение длительности культивирования Aspergillus clavatus F-1593 и ближайших аналогов - штаммов-продуцентов кератинолитических ферментов.
Длительность культивирования штаммов микроскопических грибов для наработки протеолитических ферментов с кератинолитической активностью представлено в Таблице 1.
Штамм Aspergillus clavatus F-1593 является продуцентом внеклеточных протеолитических ферментов с кератинолитической активностью, при этом необходимое время культивирования для наработки целевого продукта снижается по сравнению с известными ближайшими аналогами.
Список литературы:
1. Ландау Н.С., Кураков А.В., Туликова О.М., Батомункуева Б.П., Струкова С.М., Егоров Н.С., 1998. Экстрацеллюлярные протеиназы микромицетов с фибринолитическими и антикоагулятными свойствами. Микробиология, 67, 2,215-220.
2. Осмоловский А.А., Попова Е.А., Крейер В.Г., Баранова Н.А., Егоров Н. С. 2016. Фибринолитическая и коллагенолитическая активность внеклеточных протеиназ штаммов микромицетов Aspergillus ochraceus L-1 и Aspergillus ustus 1. Вестник Московского университета, 16, 1, 71-75.
3. Патент CN1405305 А, 2001. Efficient, broad-spectrum keratinase and its gene
4. Патент RU2499833 C1, 2012. PRODUCTION METHOD OF KERATINASE FROM Penicillium citrinum 5. da Silva O.S., de Oliveira R.L., Souza-Motta С.М., Porto A.L.F., Porto T.S. 2016. Novel protease from Aspergillus tamarii URM4634: production and characterization using inexpensive agroindustrial substrates by solid-state fermentation. Advances in Enzyme Research, 4, 04, 125.
6. de Oliveira C.C., de Souza A.K.S., de Castro R.J.S. 2019. Bioconversion of chicken feather meal by Aspergillus niger: simultaneous enzymes production using a cost-effective feedstock under solid state fermentation. Indian journal of microbiology, 59, 2, 209-216.
7. Domsch K.H., Gams W., Anderson T-H., 2007. Compendium of soil fungi. Second edition revised by W.Gams. IHW-Verlag & Verlagsbuchhandlung. 700 pp.
8. Ebeling W., Hennrich N., Klockow M., Metz H., Orth H.D., Lang H. 1974. Proteinase K from Tritirachium album Limber. European journal of biochemistry, 47, 91-97.
9. Fraser R.D.B., MacRae T.P., Rogers G.E. 1972. Keratins. Their Composition, Structure and Biosynthesis. Ill.: Springfield, 378-379.
10.Henry Т., Iwen P., Hinrichs H., 2000. Identification of Aspergillus species using Internal transcribed spacer regions 1 and 2. J. Clinical Microb., 1510-1515.
11. Herrmann H., Aebi U. 2004. Intermediate filaments: molecular structure, assembly mechanism, and integration into functionally distinct intracellular scaffolds. Annual review of biochemistry, 73,1, 749-789.
12. Kuczius Т., Groschup M.H. 1999. Differences in proteinase K resistance and neuronal deposition of abnormal prion proteins characterize bovine spongiform encephalopathy (BSE) and scrapie strains. Molecular medicine, 5, 6, 406-418.
13. Masood S., Hussain A., Javid A., Bukahri S.M., Ali W., Ali S., Ghaffar I., Imtiaz A., Amin H., Salahuddin H., Inayat M., Razzaq S., Kafayat F., Rafiq H., Yasmeen M., Muneeb M., Sattar S. 2021. Fungal decomposition of chicken-feather waste in submerged and solid-state fermentation. Brazilian journal of biology. Revista brasleira de biologia, 83, e246389. https://doi.org/10.1590/1519-6984.246389
14. Preczeski K.P., Dalastra C., Czapela F.F., Kubeneck S., Scapini Т., Camargo A. F., Zanivan J., Bonatto C., Stefanski F.S., Venturin В., Fongaro G., Treichel H. 2020. Fusarium oxysporum and Aspergillus sp.as Keratinase Producers Using Swine Hair From Agroindustrial Residues. Frontiers in bioengineering and biotechnology, 8, 71. https://doi.org/10.3389/fbioe.2020.00071
15. Purchase D. 2016. Microbial keratinases: characteristics, biotechnological applications and potential. CAB International. The Handbook of Microbial Bioresources, 10.
16. Schweizer J., Bowden P.E., Coulombe P.A., Langbein L., Lane E.B., Magin T.M., Maltais L., Omary M.B., Parry D.A., Rogers M.A., Wright M.W. 2006. New consensus nomenclature for mammalian keratins. The Journal of cell biology, 174, 2, 169-174.
17. Shestakova A., Timorshina S., Osmolovskiy A. 2021. Biodegradation of keratin-rich husbandry waste as a path to sustainable agriculture. Sustainability, 13,16, 8691.
18. Sivakumar N., Raveendran, S. 2015. Keratin degradation by bacteria and fungi isolated from a poultry farm and plumage. British poultry science, 56(2), 210-217. https://doi.org/10.1080/00071668.2014.996119.