ШТАММ ВИРУСА ГРИППА А/Гонконг/1/68/162/35 (H3N2)-УНИВЕРСАЛЬНЫЙ ДОНОР ВНУТРЕННИХ ГЕНОВ ДЛЯ РЕАССОРТАНТОВ И РЕАССОРТАНТНЫЕ ШТАММЫ А/СПБ/ГК/09 (H1N1) И А/НК/Astana/6:2/2010 (H5N1), ПОЛУЧЕННЫЕ НА ЕГО ОСНОВЕ
INFLUENZA VIRUS STRAIN A/Hongkong/1/68/162/35 (H3N2) - UNIVERSAL DONOR OF INTERNAL GENES FOR REASSORTANTS, AND REASSORTANT STRAINS A/SPB/GK/09 (H1N1) AND A/HK/Astana/6:2/2010 (H5N1) PREPARED THEREOF

Изобретение относится к области медицинской биотехнологии и предназначено для применения при получении реассортантов вируса гриппа A, используемых в производстве живых и инактивированных вакцин.
Изобретение направлено на снижение временных и ресурсных затрат при получении вакцинных штаммов для вакцин против гриппа.
В настоящее время для получения живых (ЖГВ) и инактивированных (ИГВ) вакцин против гриппа используют разные штаммы, полученные методом классической генетики - реассортации генов эпидемических вирусов и вирусов-доноров внутренних генов, обладающих заданными свойствами. Вакцинные штаммы должны содержать гены поверхностных белков от эпидемических вирусов и гены внутренних белков от вируса-донора.
Для живых вакцин против гриппа A в качестве доноров используют 2 холодоадаптированных (ХА) штамма: A/Ленинград/134/17/57 (H2N2) в России и A/Ann Arbor/6/60 (H2N2) в США, которые отвечают основным требованиям к донорам для ЖГВ, в первую очередь ареактогенностью для человека и высокой иммуногенностью [Живая вакцина против гриппа, 1994; СПб. Наука. 151 с.; Antiviral research, 1981; N 1: p.339-365].
Донор A/Arm Arbor/6/60-ca(H2N2) был разработан Maassab H.F. в 1967 г. [Nature, 1967; Vol.213: р.612-614]. «Дикий» штамм предшественник A/Ann Arbor/6/60(H2N2) был выделен на первичной культуре клеток почки курицы (chicken kidney cells - СК клетки) и в последующем пассирован на КЭ при снижаемой после каждых 8-10 пассажей температуре от 33°C до 25°C. В итоге был получен холодоадаптированный вариант A/Ann Arbor/6/60-ca(H2N2). Число пассажей при низкой температуре в названии вируса не обозначено, однако обозначен фенотип вируса: ca=cold adapted. Для ИГВ этот донор не используется.
Исследования эффективности различных вакцин на основе ХА донора A/Ann Arbor/6/60 методом искусственного челленджа (инфекцией диким вирусом, спустя 1-3 месяца после иммунизации), проведенные R.Cough и Т.Cates, показали, что у всех вакцинированных в период челленджа не наблюдалось никаких признаков заболевания, в то время как среди невакцинированных уровень заболеваемости достигал 58-60%.
Донор A/Ленинград/134/17/57(H2N2) разработан отечественными учеными Г.И. Александровой и А.А. Смородинцевым в середине 60-х годов. Путем серии пассажей эпидемического вируса A/Ленинград/134/57 в куриных эмбрионах (КЭ) при оптимальной (32°C) и пониженной (25°C) температуре был получен штамм, безвредный для человека. Накопление мутаций в геноме вируса A/Ленинград/134/57, приведших к выраженной аттенуации (фенотип ca, ts - холодоадаптированный, температурочувствительный), происходило в процессе пассирования при пониженной температуре (25°C-27°C). Для получения ИГВ этот донор не применяют.
Рекомбинанты обоих подтипов H1N1 и H3N2 на основе ХА штамма Ленинград/134/17/57, как правило, сохраняли ts-фенотип своего ХА «родителя». Живая вакцина из этих реассортантов была безвредна и ареактогенна для взрослых, в том числе для лиц с низким исходным уровнем, или совсем не имевших антител против вакцинного штамма. Изучение эффективности вакцин посредством мониторинга заболеваемости среди вакцинированных и невакцинированных в эпидемический период показало высокую эпидемиологическую эффективность препаратов ЖГВ.
Известно, что штаммы-доноры A/Ленинград/134/17/5 7(H2N2) и A/Ann Arbor/6/60-ca(H2N2) помимо способности размножаться при пониженной температуре обладают также свойством ограниченной репликации при повышенной до 39-40°C температуре, то есть являются температурочувствительными. Инфекционная активность штаммов при различных температурах обозначена в табл.1.
Аттенуированность штаммов доноров была показана на различных животных моделях. Оба штамма размножались только в верхних дыхательных путях мышей, размножение в легких мышей было ограниченным и на 3-й день уже не детектировалось. Штамм A/Ann Arbor/6/60-ca был также изучен на хорьках как наиболее близкой к человеку модели для оценки вакцинных штаммов. Репликация штамма A/Ann Arbor/6/60-ca была ограничена носами животных (в отличие от его дикого предшественника).
Табл. 1.
Инфекционная активность холодоадаптированных штаммов-доноров при различных температурах.
Инфекционная активность, lgЭИД50/0.2 мл
25°C
33°C
39-40°C
A/Ленинград/134/17/57(H2N2)
6,5
8,0
1,0
A/Ann Arbor/6/60-ca(H2N2)
6,8
7,8
0,6
В качестве донора внутренних генов для инактивированных вакцин против гриппа используют вирус субтипа AH1N1 - A/Пуэрто Рико/8/34. Вирус давно используется в производстве вакцин, детально изучен, не опасен для человека и имеет громадное преимущество перед другими - высокую репродуктивность - свойство, повышающее рентабельность вакцин.
В 1960 году впервые был применен метод получения антигенно актуального высокорепродуктивного в КЭ штамма путем рекомбинации эпидемического вируса гриппа A подтипа H2N2 и штамма A/Пуэрто Рико/8/34(H1N1) - сокращенно A/PR/8/34. В 1973 г. было предложено использовать штамм A/PR/8/34 в качестве основного донора для конструирования противогриппозных вакцин. На основе этого донора было приготовлено 8 реассортантов вируса гриппа сероподтипов H1N1 и H3N2, которые были всесторонне изучены на восприимчивых людях разного возраста в лабораториях США, Западной Европы и Австралии. Реассортанты, полученные на высокорепродуктивном доноре A/PR/8/34 из-за неизвестной истории культивирования разрешены только для получения ИГВ, но не ЖГВ.
Использование штамма A/PR/5/8/34 в качестве донора было основано на отсутствии реактогенности и высокой иммуногенности испытанных реассортантов, превышающих в 3-4 раза общепринятый минимальный защитный уровень гуморальных антител (1:32). Инфекционная активность штамма A/PR/8/34 в КЭ достигает 9,5-10 lgЭИД50/0,2 мл [Живая вакцина против гриппа, 1994; СПб. Наука, 151 с.].
На данный момент существуют две различные линии штамма PR8 - штамм PR8 университета Кэмбридж (Великобритания) и штамм PR8 университета Маунт-Синай (США). Второй из них является более приспособленным к росту в КЭ и передает это преимущество 6:2 рекомбинантам, наследующим 6 генов от донора и 2 гена от эпидемического штамма. Аминокислотные различия между двумя штаммами 2-х линий имеются практически во всех внутренних генах, в том числе, с изменением свойств в генах PB1, PB2, PB1-F2, NS2, M2 (табл.2).
Табл. 2
Аминокислотные различия между штаммом A/PR/8/34 линии Кэмбридж и штаммом PR8-UW (линии Маунт-Синай)
Белок
А.к. позиция
Аминокислота
A/PR/8/34 - Cambridge
A/PR/8/34-UW
Изменение свойств а.к.
105
Met
Ile
Нет
251
Lys
Arg
Нет
PB2
299
Lys
Arg
Нет
360
Ser
Tyr
Нет
504
Val
Ile
Нет
702
Arg
Lys
Нет
175
Lys
Asn
Да
205
Ile
Met
Да
PB1
208
Arg
Lys
Нет
216
Gly
Ser
Нет
563
Arg
Ile
Да
PB1-F2
59
Lys
Arg
Нет
60
Gin
Arg
Да
PA
158
Arg
Lys
Нет
550
Leu
Ile
Нет
353
Val
Leu
Нет
NP
425
Val
Ile
Нет
430
Thr
Asn
Нет
M2
27
Ala
Thr
Да
39
Ile
Thr
Да
NS1
55
Glu
Lys
Да
101
Glu
Asp
Нет
NS2
89
Val
Ile
Нет
Было проведено сравнение рекомбинантов, с одинаковыми поверхностными антигенами подтипа H5N1, полученных на основе различных линий штаммов-доноров A/PR/8/34 [Virology, 2007; 366: 23-27]. Установлено, что рекомбинанты, созданные на основе разных штаммов A/PR/8/34, обладают разной репродуктивной активностью.
Рекомбинант с поверхностными антигенами штамма A/Вьетнам/1194/2004(H5N1), созданный на основе A/PR/8/34-UW, обладал повышенной репродуктивной активностью (9,17 lgЭИД50/мл) по сравнению со штаммом NIBRG-14 (8,32 lgЭИД50/мл), созданным на основе донора A/PR/8/34 Кэмбриджского университета. Отмеченная инфекционная активность измерялась при 37°C.
При 33°C репродуктивность рекомбинанта на A/PR/8/34-Cambridge не изменялась, а рекомбинанта на A/PR/8/34-UW возрастала в 2,2 раза (+0,2 lgЭИД50/мл). Сравнение рекомбинантов по количеству HA, получаемого из эквивалентного количества аллантоиса, показало, что рекомбинант на A/PR/8/34-UW давал концентрацию HA в 2,7-5,1 раз больше, чем рекомбинант на A/PR/8/34-Cambridge [Virology. 2007. 366: 23-27].
Существование разных доноров внутренних генов для реассортантов, используемых в производстве живых и инактивированных вакцин, требует раздельного создания штаммов для ЖГВ и ИГВ. Получение реассортантных штаммов для вакцин ЖГВ и ИГВ и проверка их соответствия стандартам требует работы разных коллективов в течение 3-4 месяцев, что влечет за собой двойные материальные и временные затраты.
Цель изобретения состояла в создании штамма вируса гриппа - универсального донора внутренних генов для вакцинных штаммов, используемых при производстве как живой, так и инактивированной гриппозных вакцин.
Задача решена методом классической аттенуации вируса гриппа A путем пассажей в организме чужеродного хозяина - куриных эмбрионах, при оптимальной (32-33°C) и пониженной (25-26°C) температурах.
Сущностью данного изобретения является создание штамма вируса гриппа A(H3N2), обладающего одновременно высокой репродуктивностью (9,0-10,0 lgЭИД50/0,2 мл) и маркерами аттенуации: холодоадаптированностью (ca) и температурочувствительностью (ts), способностью активно репродуцироваться при пониженных температурах и полным отсутствием или низкой активностью репродукции при повышенных температурах. Это делает созданный штамм пригодным для получения на его основе реассортантов как для ЖГВ, так и для ИГВ. При этом, эпидемические вирусы гриппа A могут быть разных подтипов, что подтверждено примерами получения реассортантов донора A/Гонконг/1/68/162/35 с генетически удаленными подтипами вирусов.
Благодаря единому донору аттенуации, разработка новых вакцинных штаммов требует меньше времени, трудозатрат и денежных средств.
1. История вируса. Оценка реактогенности и иммуногенных свойств первых пассажных вариантов вируса A/Гонконг/1/68 на волонтерах.
Штамм A/Гонконг/1/68/162/35 (H3N2) создан на основе эпидемического вируса A/Гонконг/1/68(H3N2), выделенного на куриных эмбрионах от больного человека в 1968 г. в Гонконге, и переданный в НИИ гриппа из Всемирного Центра по гриппу (Лондон) в 1969 г. на уровне 5-го пассажа.
6,0-7,4
50/0,2 мл
В 1969-70 гг. в НИИ гриппа в процессе подготовки живой гриппозной вакцины для гриппа A(H3N2) на волонтерах были изучены реактогенные и иммуногенные свойства вируса, прошедшего несколько пассажей на развивающихся куриных эмбрионах. Экспериментальные серии препаратов из испытуемых вариантов штамма A/Гонконг/1/68 готовили и контролировали в соответствии с МРТУ-42 на живую гриппозную вакцину. Концентрация активного вируса, вводившегося людям, составляла 10 ЭИД [Иммунология и специфика профилактики гриппа у детей. Сб. трудов ВНИИ гриппа, 1971; Л., с.166-175].
Вирус, полученный после 12 пассажа в куриных эмбрионах, сохранял способность вызывать клинические проявления гриппозной инфекции у людей, в том числе, средней степени тяжести - у 29,2%. Реактогенные свойства вариантов A/Гонконг/1/15, A/Гонконг/1/21 и A/Гонконг/1/25, полученных после 15, 21 и 25 пассажей, были испытаны на контингентах молодых мужчин численностью от 156 до 569 человек в группах. При интраназальном введении этих вариантов отмечалось появление реакций 1 степени (легкой) у 14,6-24,3% привитых людей, а реакции средней тяжести регистрировались не более, чем у 2,0% волонтеров, что не превышало допустимого уровня остаточной вирулентности для живых гриппозных моновакцин. Среди 128 непривитых людей контрольной группы реакции 1 степени регистрировались в 10,1% случаев и лишь у одного человека отмечен подъем температуры до 37,6((0,8%). Таким образом, варианты вируса A/Гонконг/1/68, прошедшие свыше 15 пассажей в куриных эмбрионах, были безвредными для людей и по показателям реактогенности отвечали требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам вируса гриппа (табл.3) [Иммунология и специфика профилактики гриппа у детей. Сб. трудов ВНИИ гриппа, 1971: Л., с.166-175].
Полученный в 1970 г. вакцинный штамм A/Гонконг/1/68/25 использовался в качестве ЖГВ, но его дальнейшая разработка в качестве донора внутренних генов не предполагалась. Вместе с тем, было очевидно, что пассирование этого вируса привело к усилению таких свойств как гемагглютинирующая активность и репродуктивность, важных для вакцинных производственных штаммов.
В начале 2000-х годов работа с вирусом была возобновлена с целью создания донора аттенуации и высокой репродуктивности, т.е. универсального донора для обоего типа вакцин. Был выбран пассажный вариант A/Гонконг/1/68/25(Н3Н2), приобретший признаки аттенуации. Выбранный кандидат отличался по субтипу от существующих доноров аттенуации A/Ленинград/134/17/57(H2N2) и A/Ann Arbor/6/60-ca(H2N2), и от донора высокой репродуктивности - A/Пуэрто Рико/8/34(H1N1).
Табл. 3
Реактогенность и приживаемость вариантов вируса A/Гонконг/1/68 на разных этапах аттенуации
Число пассажей вируса на куриных эмбрионах
Количество привитых людей
Из них дали температурную реакцию
Приживаемость вируса
1 степени
2-3 степени
Число обследованных людей
Вирус выделен
всего
%
всего
%
всего
%
12
24
12
50,0
7
29,2
18
12
66,6
15
156
38
24,3
3
2,0
-
21
596
109
18,3
11
1,8
88
49
55,6
25
253
37
14,6
5
1,9
-
-
-
Плацебо
128
12
10,1
1
2. Аттенуация штамма A/Гонконг/1/68 (H3N2) путем пассирования на куриных эмбрионах при оптимальной 32-33°C и пониженной (25°C-26°C) температурах.
Дальнейшую аттенуацию штамма A/Гонконг/1/68/25 проводили путем пассирования через развивающиеся куриные эмбрионы с инкубацией последних при температуре 32-33°C в течение 48 часов. Проведено 137 пассажей, всего - 162 пассажа.
Одним из основных требований к вирусам - донорам внутренних генов для вакцинных штаммов является способность активно репродуцироваться при пониженной температуре - холодоадаптированность и сниженная способность репродуцироваться при повышенной температуре - температурочувствительность. В связи с этим штамм A/Гонконг/1/68/162 (A/ГК/162) был подвергнут холодовой адаптации путем последовательных пассажей на КЭ при 25-26°C с инкубацией после заражения при температуре 25-26°C. При этой температуре вирус прошел 35 пассажей.
Всего в целях аттенуации штамма проведено 162 пассажа в куриных эмбрионах при температуре 32°C и 35 пассажей при пониженной (26°C) температуре.
3. Биологические свойства вируса A/Гонконг/1/68/162/35.
В процессе аттенуации были изучены следующие биологические свойства вируса: способность размножаться в развивающихся куриных эмбрионах, гемагглютинирующая активность в отношении эритроцитов кур, чувствительность к ингибиторам сывороток животных, антигенные свойства в перекрестной реакции торможения гемаггютинации (РТГА) с различными типоспецифическими сыворотками, безвредность для лабораторных животных.
Полученные штаммы взаимодействовали с термостабильными γ-ингибиторами сывороток различных лабораторных животных до титра 1:80-1:320. Чувствительность вируса к сывороточным ингибиторам не менялась в процессе пассажей на куриных эмбрионах. В перекрестной РТГА вирус нейтрализовался штаммоспецифической крысиной сывороткой A/Гонконг/1/68 до титра 1:160 и не реагировал с типоспецифическими сыворотками к вирусам A/H1N1, A/H2N2, A/H3N2, B и сыворотками к вирусам Сендай и NDV. Вирус обладал высокой гемагглютинирующей активностью в отношении куриных эритроцитов.
Инфекционная и гемагглютинирующая активность увеличивалась по мере нарастания пассажей как при оптимальной, так и при пониженной температуре (табл.4).
Характеристика инфекционной активности исходного штамма A/Гонконг/1/68/ (H3N2), холодоадаптированного штамма A/Гонконг/1/68/162/35 (H3N2) и промежуточных вариантов при оптимальной (32°C) и пониженной (26°C) температурах представлена также в табл.5. Для сравнения использованы штаммы A/PR/8/34(H1N1) - общепринятый донор для получения высокоурожайных реассортантов для инактивированных гриппозных вакцин и донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57(Н2М2), используемый в РФ для приготовления вакцинных штаммов для живой гриппозной вакцины [Живая вакцина против гриппа, 1994; СПб. Наука. 151 с.].
Табл. 4
Биологические свойства пассажных вариантов вируса A/Гонконг/1/68
Инфекционная активность в КЭ при оптимальной температуре (32°C), lg ЭИД50/0,2 мл
Инфекционная активность в КЭ при пониженной температуре (26°C), lg ЭИД50/0,2 мл
Гемагглютинирующая активность, ГАЕ/50 мкл
Вариант штамма
A/Гонконг/1/68/15
7,2
64
2,5
A/Гонконг/1/68/150
8,5
512
2,5
A/Гонконг/1/68/162/10
8.5
512-1024
3,0
A/Гонконг/1/68/162/35
9,0
1024-2048
8,5
По своей инфекционной активности разработанный штамм A/Гонконг/1/68/162/35 превосходил донор аттенуации A/Ленинград/134/57/17 при пониженной температуре (26°C) на 2,0 lg ЭИД 50/0,2 мл, а при оптимальной (32°C) на 1,0 lg ЭИД 50/0,2 мл, то есть штамм обладал более выраженными свойствами холодовой адаптации (ca), чем существующий донор для ЖГВ, и инфекционной активностью, равной донору для ИГВ (табл.5). Полученный вирус чрезвычайно слабо размножался при 139-40°C, то есть обладал вторым маркером аттенуации - темперотурочувствительностью (ts).
Также новый донор был сопоставим по активности с используемым в настоящее время для получения производственных штаммов штаммом - донором высокой репродуктивности - A/PR/8/34.
Были изучены ростовые характеристики штамма A/Гонконг /1/68/162/35/09 в культуре клеток MDCK, а также его репродуктивная активность в верхних и нижних дыхательных путях мышей. В носовых ходах мышей вирус репродуцировался до 5,5 lg ЭИД 50/мл, в легких - до 2,75 lg ЭИД 50/мл.
Табл. 5
Характеристика инфекционной активности вариантов штамма A/Гонконг/1/68
Штамм
Инфекционная активность (lg ЭИД<sub>50/0,2</sub> мл) при температуре:
Гемагглютинирующая активность, ГАЕ/50 мкл
26°C
32°C
39°C
A/Гонконг/1/68/15
2,5
7,2
н/и
64
A/Гонконг/1/68/162/35 (H3N2)
8,5
9,0
1,0
1024-2048
A/Ленинград/134/57/17(H2N2)
6,5
8,0
1,0
64-128
A/PR/8/34
3,5
9,0-9,5
8,5
1024
Сравнительная характеристика основных биологических свойств исходного штамма A/Гонконг/1/68/ и холодоадаптированного штамма A/Гонконг/1/68/162/35 представлена в табл.6.
Табл. 6
Сравнительная характеристика репродуктивных свойств штаммов вируса гриппа A/Гонконг/1/68 и A/Гонконг /1/68/162/35/09
Штамм
Инфекционная активность при температуре (lg ЭИД<sub>50/0,2</sub> мл)
RCT<sub>26</sub>
RCT<sub>39</sub>
Фенотип
Гемагглютинирующая активность, ГАЕ/50 м кл
26°C
32°C
39°C
A/Гонконг/1/68/15
2,5
7,25
5,0
4,75
2,25
non-ca, non-ts
64
A/Гонконг/1/68/162/35 (H3N2)
8,5
9,0
1,0
0,5
8,0
ca, ts
1024-2048
Штамм A/Гонконг/1/68/162/35 (H3N2) был проконтролирован на токсичность для белых мышей и морских свинок. Испытания проводили в соответствии с Методическими указаниями МУК4.1/4.2.588-96, заражая мышей внутрибрюшинно в дозе 1 мл, морских свинок подкожно в той же дозе, и наблюдая за животными в течение 7 суток. Согласно проведенным исследованиям вирусная популяция не была токсична для лабораторных животных. Все животные остались живы. Максимальная потеря веса не превышала для мышей 7%, для свинок - 4%.
50/0,2 мл
50/0,2 мл
Таким образом, в результате пассирования инфекционная активность вируса гриппа A/Гонконг/1/68/162/35, по сравнению с исходным штаммом, выросла более, чем на 1,5 lg ЭИД при 32°С и на 6 lg ЭИД при 26°C. Гемагглютинирующая активность возросла в 20-40 раз. Штамм приобрел ca, ts-фенотип, был нетоксичен для лабораторных животных.
4. Секвенирование вируса A/Гонконг/1/68/162/35(Н3Н2).
Шесть «внутренних» генов штамма A/Гонконг/1/162/35(H3H2), двух промежуточных вариантов (A/ГК/1/68/7 и A/ГК/1/68/162) были секвенированы и сопоставлены с нуклеотидными и аминокислотными последовательностями вируса A/ГК/1/68, взятыми из Gene Bank, с целью выявления мутаций в указанных генах в процессе пассирования в КЭ.
Вирусную РНК выделяли с использованием коммерческого набора РИБО-сорб (ФГУ ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия). Различные сегменты генома амплифицировали методом ОТ-ПЦР с использованием специально подобранных пар праймеров, набора PEBEPTA-L для обратной транскрипции и комплекта реагентов для ПЦР производства ФГУ ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора (Россия). Очистку ПЦР продуктов осуществляли методом горизонтального ЭФ в 1,7% агарозном геле с последующим выделением ДНК из геля с помощью коммерческого набора QIA Quick Gel Extraction Kit (Qia-gen, США). Реакцию секвенирующей ПЦР ставили с использованием коммерческого набора ABI PRISM BigDye Terminator v3.1 Kit (Applied Biosystems, США). Анализ продуктов реакции секвенирования, очищенных от остаточных терминаторов, производились системой ABI PRISM 3100-Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США). Сборку нуклеотидных последовательностей, их обработку и выравнивание осуществляли в программном пакете Vector NTI 10 Advance (Invitrogen, США). В качестве референс-контроля использовали последовательности сегментов генома эпидемического штамма A/Гонконг/1/68(H3K2), взятые из базы данных GenBank (accession numbers: AF348170, AF348172, AF348174, AF348180, AF348188, AF348198).
Секвенирование генов вируса A/Гонконг/1/68/162/35(H3N2) выявило по сравнению с исходным эпидемическим вирусом ряд мутаций в генах PB-2, PB-1, PA, NP, M1 и NS (табл.7). Фенотипически часть мутаций проявилась в аминокислотных заменах, в том числе, со сменой заряда и гидрофильности: по 1 замене в генах PB2, PA, M, NS и по 2 замены в генах PB1 и NP. На стадии холодовой адаптации произошли мутации в генах PB2 (C 2256Т), PA (G 1347А) и NP (A 875G). Мутации в двух последних генах сопровождались заменами аминокислот в соответствующих белках: Met 441 Не и Glu 232 Gly.
Для существующего донора A/Ленинград/134/17/57(H2N2) мутациями, определяющими температурочувствительность, были мутации в генах PB2 и PB1, приведшие к замене аминокислот Val 478 Leu (PB2) и Lys 265 Asn, Val 591 Ile (PB1). Мутации в генах PB2 и PA определили холодовую адаптацию (Leu 28 Pro, Val 341 Leu в гене PA и Val 478 Leu в PB2) [Основы аттенуации вируса гриппа. Автореферат И.В. Киселевой на соискание степени д.б.н. 2001. СПб. 33 с.]. При этом, решающую роль в образовании ts фенотипа имели мутации в PB2 гене.
Какие мутации ответственны за появление маркеров аттенуации - ts и ca в едином доноре A/Гонконг/1/68/162/35(H3N2) определили путем целенаправленного получения и исследования свойств одногенных и двугенных мутантов.
После 10-кратного пассирования вируса A/Гонконг/1/68/162/35(H3N2) на КЭ, был проведен повторный сиквенс внутренних генов. Показано, что все отмеченные мутации сохранились, новые мутации не выявлены, то есть вирусный геном сохранил стабильность. По этим признакам полученный штамм соответствовал требованиям к новым донорам.
Таким образом, при длительном пассировании в гетерологичной системе репродукции развивающихся куриных эмбрионов был получен аттенуированный высокорепродуктивный штамм, имеющий множественные мутации в геноме, безвредный для лабораторных животных, и обладающий высокими показателями инфекционной и гемагглютинирующей активности.
Табл.7
Мутации в доноре A/Гонконг/1/68/162/35(H3N2), обозначен ГК ca, по отношению к исходному вирусу A/Гонконг/1/68, обозначен ГК/1/68, и пассажными вариантами A/Гонконг/1/68/7, обозначен ГК7, и A/Гонконг/1/68/162, обозначен ГК162
Ген
Нуклеотид
ГКЛ/68
ГК7
ГК162
ГК ca
ак
ГК/1/68
ГК7
ГК162
ГК ca
375
G
G
T
T
120
Glu
Glu
Asp
Asp
1093
T
T
C
C
360
Туг
Tyr
His
His
PB2
1299
G
G
A
A
-
-
Leu
Leu
-
!!
1554
C
A
A
A
-
-
Leu
Leu
-
1765
A
G
G
G
584
Не
Val
Val
Val
2256
C
C
C
T
-
-
-
654
G
G
A
A
-
-
-
-
-
1145
С
С
A
A
374
Ala
Ala
Glu
Glu
!!
1314
A
G
A
A
-
-
-
Arg
-
РВ1
1903
C
C
T
T
627
Pro
Pro
Ser
Ser
!!
2145
A
A
G
G
-
-
-
-
-
2175
C
C
A
A
-
-
-
-
-
не код. обл.
410
T
C
T
T
129
Ile
Thr
Ile
Ile
990
T
T
C
C
-
-
-
-
-
!!
1347
G
G
G
A
441
Met
Met
Met
Ile
PA
1428
C
C
T
T
-
-
-
-
-
1464
C
C
T
T
-
-
-
-
-
1503
A
G
G
G
-
-
-
-
-
1551
T
T
C
C
-
-
-
-
-
2042
A
G
G
G
673
Lys
Arg
Arg
Arg
24
G
A
n/a
A
-
-
-
n/a
-
304
G
G
A
A
102
Gly
Gly
Arg
Arg
NP
540
C
C
T
T
-
-
-
-
869
A
G
A
A
290
Asp
Gly
Asp
Asp
875
A
A
A
G
292
Glu
Glu
Glu
Gly
!!
916
C
C
T
T
-
-
-
-
-
!!
1179
A
A
G
G
-
-
-
-
-
105
G
G
A
A
-
-
-
-
-
M
613
G
G
A
A
M1:205
Val
Val
Ile
Ile
691
G
G
A
A
M1:231
Asp
Asp
Asn
Asn
785
A
A
C
C
M2:33
Ile
Ile
Leu
Leu
!!
787
C
T
T
T
Ile
Ile
Leu
Leu
13
A
C
C
C
-
-
-
-
-
NS
264
С
G
G
G
NS1:81
Ile
Met
Met
Met
676
A
A
G
G
NS1:219
Lys
Lys
Glu
Glu
не код. обл.
Условные обозначенияГК/1/68 - штамм A/Гонконг/1/68(H3N2), нуклеотидные последовательности генов которого взяты из базы данных GenBank (номера последовательностей: AF348170, AF348172, AF348174, AF348180, AF348188, AF348198)Нуклеотидные последовательности штаммов ГК7, ГК162 и ГКca определены по данным секвенированияНумерация нуклеотидных и аминокислотных замен дана относительно штамма ГКca- - означает, что замена нуклеотида по данному положению не приводит к замене аминокислоты!! - аминокислотные замены сопровождаются сменой заряда/полярности/гидрофильности аминокислотыак - аминокислота
Полученный вирус A/Гонконг/1/68/162/35 (H3N2), кратко: A/ГК/1/68/162/35 (H3N2) представляет собой универсальный донор, соответствующий требованиям к новым донорам аттенуации (табл.8), изложенным в приказе Минздрава России и РАМН №156/29 от 07.05.1998 г., и может быть использован для получения высокорепродуктивных аттенуированных реассортантных штаммов вируса гриппа для живых и инактивированных вакцин. Штамм был депонирован в Государственную коллекцию вирусов под номером ГКВ №2442 (паспорт штамма и свидетельство о депонировании прилагаются).
Табл. 8
Соответствие штамма A/Гонконг/1/68/162/35 (H3N2) требованиям к новым донорам аттенуации (Приложение N 4 к приказу Минздрава России и РАМН от 07.05.1998 г. N 156/29)
ТРЕБОВАНИЯ К НОВЫМ ДОНОРАМ АТТЕНУАЦИИ
НОВЫЙ ДОНОР A/ГОНКОНГ/1/68/162/35 (H3N2)
донор должен быть получен на основе вируса гриппа человека с известной историей культивирования, исключая пассажи на перевиваемых клеточных культурах.
Соответствует (получен от больного человека, пассажная история - 197 пассажей на КЭ).
донор должен быть получен методом холодовой адаптации, который обеспечивает безопасность и генетическую стабильность ХА вариантов.
Соответствует (162 пассажа при оптимальной - 32°C и 35 при пониженной t°-26°C).
донор должен иметь комплекс генетических маркеров и исследован в молекулярно-биологических и биохимических тестах, включая секвенирование "внутренних" генов исходного и ХА вариантов.
Сделан полный синквес внутренних генов исходного вируса и донора на разных этапах аттенуации. Паспортизированы биологические свойства.
геном донора аттенуации должен иметь мутации всех (или большей части) генов, кодирующих негликозилированные белки.
Соответствует (содержит мутации в генах PB2, PB1, PA, NP, M и NS.)
5. Получение и характеристика реассортантов разных подтипов вируса гриппа, полученных на основе донора A/Гонклнг/68/162/35(H3N2).
Пример 1. Получение вакцинного штамма A/СПб/ГК/09 (H1N1).
Штамм был получен методом классической генетической реассортации с последующей селекцией на основе результатов тестов РГА, РТГА и ПЦР.
В качестве родительских штаммов были взяты вирусы - донор аттенуации и высокой репродуктивной активности A/Гонконг/1/68/162/35 (H3N2) и эпидемический штамм A/Санкт-Петербург/48/09 (H1N1), подобный референс штамму A/Бризбен /59/07(H1N1).
Реассортант получен по классической схеме:
1. Смешанный пассаж вирусов в куриных эмбрионах. Вирусы смешивали в соотношении 1:1 и культивировали при 32°C в течение 24 ч. По итогам пассажа собран общий пул вирусов (титр в РГА - 1:1024).
2. Первый селективный пассаж в присутствии кроличьей иммунной сыворотки к вирусу A/ГК/1/68/162/35 (H3N2). Для селекции в работу брали сыворотку, обработанную RDE, с титром 1:1280. Отобранную вируссодержащую жидкость (ВАЖ) смешивали с иммунной сыворткой A/ГК/1/68/162/35 (H3N2) в соотношении 1:1. Смесь выдерживали при комнатной температуре в течение часа и заражали куриные эмбрионы. Эмбрионы культивировали при 25°C в течение 72 ч. По окончании культивирования с ВАЖ от каждого эмбриона ставили РГА. По результатам (отсутствие гемагглютинации) был собран общий пул ВАЖ от всех эмбрионов.
3. Слепой пассаж. Заражали курные эмбрионы цельной аллантоисной жидкостью, собранной после первого селективного пассажа со всех КЭ. По окончании инкубации титры геммаглютинирующей активности ВАЖ составили 1:128-1:256.
4. Второй селективный пассаж в присутствии кроличьей иммунной сыворотки к вирусу A/ГК/1/68/162/35/ (H3N2). Заражали куриные эмбрионы ВАЖ после накопления, инкубировали при 25°C в течение 72 часов. По результатам РГА и ОРТГА с ВАЖ от каждого эмбриона для клонирования был выбран вариант с наибольшей геммаглютинирующей активностью, который в тесте обратной РТГА не взаимодействовал с сывороткой к A/ГК/1/68/162/35 (H3N2) и взаимодействовал с сывороткой к вирусу A/СПб/48/09 (H1N1).
-2
-8
5. Первое клонирование методом предельных разведений проводили в присутствии кроличьей иммунной сыворотки к вирусу A/ГК/1/68/162/35 (H3N2). Делали последовательные 10-кратные разведения ВАЖ от 2 селективного пассажа и каждым разведением от 10 до 10 заражали по 10 КЭ. Эмбрионы инкубировали при оптимальной 32°C и при пониженной температуре 25°C. По окончании инкубирования с ВАЖ от каждого эмбриона ставили РГА и ОРТГА.
6. Вирусы, проявившие наибольшую гемагглютинирующую активность, были протестированы методом ПЦР со специфичными праймерами и ОТ-ПЦР рестрикционного анализа. По результатам был отобран 1 клон с заданной структурой генома 6:2.
-7
-10
7. Второе клонирование методом предельных разведений в присутствии кроличьей иммунной сыворотки к вирусу A/ГК/1/68/162/35 (H3N2). Делали последовательные 10-кратные разведения отобранного клона и каждым разведением от 10 до 10 заражали по 10 КЭ. Эмбрионы инкубировали при 32°C в течение 48 часов. По окончании инкубирования с ВАЖ от каждого эмбриона ставили РГА и ОРТГА.
8. Методом ПЦР со специфичными праймерами и ОТ-ПЦР рестрикционного анализа были проанализированы 2 клона. Клоны имели структуру генома 6:2 (6 генов от донора A/Гонгонг/1/68/162/35 (H3N2) и 2 гена от эпидемического вируса A/СПб/48/09 (H1N1).
Результаты ПЦР и RFLP анализа.
Для анализа состава генома реассортантов на основе A/Гонконг/1/68/162/35(H3N2) и A/Санкт-Петербург/48/09 (H1N1-Brizbane/59 like) применялась специально разработанная схема ПЦР-рестрикционного анализа. Схема была составлена на основе сравнения нуклеотидных последовательностей генов штаммов A/Гонконг/1/68/162/35(H3N2) и A/Бризбен/59/07(H1N1) (GenBank accession numbers: CY058484-CY058486, CY058491). В табл.9 перечислены исследованные гены внутренних и неструктурных белков, участки, содержащие точечные отличия и соответствующие рестриктазы с указанием позиции сайта расщепления. Положение рестриктазы в графе под определенным штаммом означает, что амплифицированная копия фрагмента РНК данного вируса подвергается рестрикции указанным ферментом.
Табл. 9
Схема ПЦР-рестрикционного анализа для определения состава генома реассортантов на основе штаммов A/Гонконг/1/68/162/35(H3N2) и A/Санкт-Петербург/48/09 (H1N1)
Ген
Участок
A/ГК/1/68/162/35
A/СПб/48/09
PB2
851-1264
EcoPI (1100)
-
PB1
1237-1649
HindIII (1504)
-
PA
1474-2195
Ama87I (1612)
-
NP
6-743
BamHI (262,478)
BamHI (478)
M
551-957
Bsa29 I (845)
-
NS
342-882
-
BsmFI (585, 666)
По результатам анализа предварительных образцов, реассортанты с соотношением генов 6:2 были отобраны для дальнейшей работы.
После ряда дополнительных клонирований с целью очистки популяции и выявления наиболее репродуктивно активного штамма, был получен и накоплен итоговый образец.
Подготовлено 2 серии лиофилизированного штамма A/СПб/ГК/09 (H1N1). Полуфабрикат и лиофилизированный вирус охарактеризован и проконтролирован в соответствии с требованиями к реассортантным штаммам.
50
Изучение репродуктивной активности реассортанта A/СПб/ГК/09 (H1N1) при различных температурах показало, что реассортат получил признак холодоаптированности от донора A/ГК/1/68/162/35 (H3N2) и характеризовался высокой урожайностью (9,3 lg ЭИД/мл) при оптимальной температуре. Результаты приведены в табл.10
Табл. 10
Инфекционная активность реассортанта A/СПб/ГК/09 (H1N1) на основе донора A/ГК/1/68/162/35/09 (H3N2) при различных температурах.
Штамм
Инфекционная активность при температуре (lg ЭИД<sub>50</sub>/мл)
RCT26
RCT39
Фенотип
26°C
32°C
39°C
A/Гонконг/1/68/162/35 (H3N2)
8,5
9,0
1,5
0,5
7,5
са, ts
A/СПб/ГК/09 (H1N1) (реассортант)
6,5
9,3
3,5
2,8
5,8
са, ts
A/СПб/48/09(H1N1)
4,0
8,25
3,75
4,25
4,5
non-ca, ts
Гемагглютинирующую активность вируса оценивали в РТГА с эритроцитами кур. Как следует из представленных в табл.17 данных, гемагглютинирующая активность реассортанта (1:512) была выше, чему у «дикого» вируса A/СПб/48/09 (1:256), хотя уступала гемагглютинирующей активности донора (1:1024).
6
50
Изучение безвредности реассортантного штамма A/СПб/ГК/09 (H1N1) и родительских вирусов A/Санкт-Петербург/48/09 (H1N1) и A/Гонконг/1/68/162/35 (H3N2) на самках мышей линии BALB/c (по 15 в группе) при интраназальном инфицировании под легкой анестезией аллантоисной жидкостью, содержащей A/СПб/ГК/09 (H1N1) или родительские штаммы в дозе 10 ЭИД, показало, что реассортантный штамм не является патогенным для мышей, то есть он не вызывает гибель, снижения массы тела и развития клинических симптомов инфекции. Результаты представлены на рис.1 «Показатели снижения веса мышей после заражения реассортантом A/СПб/ГК/09 (H1N1) (а) и родительскими вирусами A/Санкт-Петербург/48/09 (H1N1) (б) и A/Гонконг/1/68/162/35/09 (H3N2) (в)», где по оси абсцисс указаны сутки наблюдения, по оси ординат - масса животных в процентах.
50
мл
50
мл
50
мл
Репродукцию вируса в легких и носовых ходах мышей на 3-и сутки определяли по показателям титрования суспензии органов в куриных эмбрионах (табл.11). Реассортант A/СПб/ГК/09 (H1N1) более эффективно репродуцировался в носовых ходах (1,45 lg ЭИД/), чем в легочной ткани (<1,2 lg ЭИД,/) - Родительский штамм A/СПб/48/09 (H1N1) репродуцировался в легких мышей в титре 4,45 lg ЭИД/.
50
мл
Низкая репродуктивная активность реассортанта на основе холодоадаптированного донора A/Гонконг/1/68/162/35 (H3N2) в легких мышей и репродукция в носовых ходах (1,45 lg ЭИД/) подтвердили аттенуированный фенотип вируса для мышей, присущий холодоадаптированным вариантам.
Табл. 11
Репродукция в легких и носовой полости реассортантного штамма A/СПб/ГК/09 (H1N1) при интраназальном введении белым мышам в дозе 6,5 lg ЭИД<sub>50</sub>
Штамм
Репродукция в легких (lg ЭИД<sub>50</sub>/<sub>мл</sub>)
Репродукция в носовых ходах (lg ЭИД<sub>50</sub>/<sub>мл</sub>)
Максимальное снижение веса, %
A/СПб/ГК/09 (H1N2) (реассортант)
<1,2
1,45
<1
A/Санкт-Петербург/48/09 wt (H1N1)
4,45
3,2
1
A/Гонконг/1/68/162/35 (H3N2)
2,75
5,5
0
Контроль
<0,5
<0,5
0
Для проверки на генетическую стабильность и стабильность основных биологических свойств, реассортант A/СПб/ГК/09(H1N1) прошел 5 последовательных пассажей при 32°C в системе куриных эмбрионов при заражении по 0,2 мл в аллантоисную полость цельным неразведенным материалом. Штамм, прошедший 5 пассажей, был проверен на состав генома методом ПЦР и рестрикционного анализа, на антигенную специфичность методом РТГА, а также на инфекционную активность и сохранение ts- и ca- фенотипов методом определения ЭИД50 при различных температурах инкубации.
По результатам исследований, после 5-кратного пассирования в системе куриных эмбрионов штамм A/СПб/ГК/09(H1N1) сохранял антигенную специфичность, высокую инфекционную активность, а также ts- и ca- фенотипы.
В образце, прошедшем 5 пассажей, не было выявлено примесей реассортантов с другим составом генома, либо с другими поверхностными антигенами, что говорит о генетической стабильности созданного реассортанта A/СПб/ГК/09(H1N1).
Двукратная интраназальная иммунизация мышей реассортантом A/СПб/ГК/09 выявила более чем 4-кратный прирост гуморальных антител, определяемых как в РТГА, так и в ИФА в реакции нейтрализации (РН) (табл.12).
Подготовлен паспорт штамма. Штамм депонирован в Государственную коллекцию вирусов под №2627. Характеристика полученного рекомбинантного штамма вируса A/СПб/ГК/09 приведена в прилагаемом Удостоверении о депонировании штамма.
Штамм соответствует требованиям приказа №156/29 от 07.05.1998 г. Минздравсоцразвитя РФ и РАМН «О подготовке новых вакцинных производственных и диагностических штаммов вируса гриппа и их внедрение в производство вакцин и диагностических препаратов» и пригоден к использованию в производстве противогриппозных вакцин, т.е. изобретение обладает техническим результатом.
Табл. 12
Выработка гуморальных антител на интраназальную иммунизацию вируса A/СПб/ГК/09
Вирус
Доза вируса при иммунизации мышей, lg ЭИД50
Средний титр вируса в органах мышей на 3 сутки после инокуляции, lg ЭИД<sub>50</sub>/<sub>мл</sub>
Титры вирусспецифических антител после 1-й иммунизации
Титры вирусспецифических антител после 2-й иммунизации
в сыворотках
в сыворотках
носовые ходы
легкие
PH (СГТ)
РТГА (СГТ)
IgG(lg)
РН (СГТ)
РТГА (СГТ)
IgG (lg)
A/ГК/1/68/162/35 (H3N2)
6,5
5,5
2,75
nd
9,5
4,2±0,25
эксперимент не проводился
A/СПб/НК/09 (H1N1)
6,5
1,45
<1,2
≤4
8
3,68±0,45
128
51
4,25±0,4
A/СПб/48/09 wt (H1N1)
6,5
3,2
4,45
32
9,5
3,98±0,62
эксперимент не проводился
Контроль
PBS
<1,2
<1,2
≤4
≤4
≤3,00
≤4
≤4
≤3,00
Пример 2. Получение вакцинного штамма A/HK/Astana/6:2/2010 (H5N1).
Штамм был получен методом классической генетики с последующей селекцией на основе результатов тестов РГА, РТГА и ПЦР.
Родительские штаммы: донор высокой репродуктивной активности: A/ГК/1/68/162/35/09 (H3N2) и штамм, полученный методом обратной генетики: A/Astana/PR8(UW)RG/6:2/2009(H5Nl) и содержащий 6 генов, кодирующих внутренние белки от вируса A/PR/8/34, два гена от вируса птичьего гриппа AH5N1. В сайте расщепления гемагглютинина удалены 8 основных аминокислот - один из факторов патогенности вируса H5N1.
Этапы получения реассортанта A/Astana/PR8(UW)RG/6:2/2009 (H5N1) были аналогичны получению реассортанта А/СПб/ГК/09(НШ1), приведенным в примере 1, и включали: смешанный пассаж, два селективных (при температуре 32 и 25°C) в присутствии кроличьей иммунной сыворотки, слепое пассирование и 3 клонирования методом предельных разведений в присутствии иммунной кроличьей сыворотки.
После каждого клонирования по результатам ПЦР со специфичными праймерами и ОТ-ПЦР рестрикционного анализа отбирали клоны со структурой генома 6:2 (6 генов от донора и 2 гена от вируса A/Astana/PR8(UW)RG/6:2/2009(H5Nl) (табл.13).
Табл. 13
Схема ПЦР-рестрикционного анализа для определения состава генома реассортантов на основе штаммов A/Гонконг/1/68/162/35(H3N2) и A/Astana/PR8(UW)RG/6:2/2009(H5N1).
Ген
Участок
ГК
Астана/UW
PB2
851-1264
EcoRI (1100)
-
PB1
1237-1649
HindIII (1504)
-
PA
1141-1608
BamHI (1242)
-
NP
6-743
BamHI (262, 478)
BamHI (478)
M
551-957
Bsa29 I (845)
-
NS
107-441
BslFI (130, 335)
-
Анализ наиболее перспективных клонов на состав генома.
Отобранные в результате клонирования наиболее репродуктивные клоны были проанализированы на состав генома. Был выполнен анализ всех генов внутренних и неструктурных белков отобранных образцов с использованием в качестве контролей обоих родительских штаммов. Также дополнительно проводили ПЦР с AH3N2 вирус-специфичными праймерами для выявления в образцах примесных реассортантов гемагглютинином или нейраминидазой от вируса донора.
Полученные электрофореграммы генов клонов №81 и 86 и контрольных образцов A/HK-ca и A/Astana/PR8(UW)RG/6:2/2009(H5Nl) представлены на рис.2-7, где на рис.2 дан ген Pb2 с последовательно нанесенными фрагментами до (pb2) и после (pb2*) рестрикции, на рис.3 - ген PB1 с последовательно нанесенными фрагментами до (pb1) и после (pb1*) рестрикции, на рис.4 - ген PA с последовательно нанесенными фрагментами до (pa) и после (pa*) рестрикции, на рис.5 - ген NP с последовательно нанесенными фрагментами до (np) и после (np*) рестрикции, на рис.6 - ген M с последовательно нанесенными фрагментами до (m) и после (m*) рестрикции, на рис.7 - ген NS с последовательно нанесенными фрагментами до (ns) и после (ns*) рестрикции.
Результаты ПЦР с типо-специфичными праймерами к различным субтипам гемагглютинина/нейраминидазы представлены на рис.8.
Анализ наиболее репродуктивных клонов A/HK/Astana/6:2/2010(H5N1) дан в табл.14.
Табл. 14
Результаты анализа состава генома образцов клонов (№81, 86).
№ образца
PB2
PB1
PA
NP
M
NS
NA
Примесь H3
Примесь N2
81
ГКса
ГКса
ГКса
ГКса
ГКса
ГКса
N1
нет
нет
86
ГКса
ГКса
ГКса
ГКса
ГКса
ГКса
N1
нет
нет
Была подготовлена серия лиофилизированного штамма A/HK/Astana/6:2/2010 (H5N1). Полуфабрикат и лиофилизированный вирус был охарактеризован и проконтролирован в соответствии с требованиями к реассортантным штаммам.
50
Полученный в процессе реассортации штамм A/HK/Astana/6:2/2010 (H5N1) репродуцировался при оптимальной температуре до титров 9,5 lg ЭИД/мл, что соответствует инфекционной активности как донора A/Гонконг/1/68/162/35 (H3N2), так и родительского рекомбинантного штамма A/Astana/PR8(UW)RG/6:2/2009(H5N1). Изучение репродукции при пониженной и повышенной температурах показало, что реассортантный штамм приобрел от донора свойства холодоадаптированности и температурочувствительности, т.е. является аттенуированным. Результаты приведены в табл.15.
Табл. 15
Инфекционная активность реассортанта A/HK/Astana/6:2/2010 (H5N1) на основе донора A/Гонконг/1/68/162/35 (H3N2) при различных температурах.
Штамм
Инфекционная активность при температуре (lg ЭИД<sub>50</sub>/мл)
RCT<sub>26</sub>
RCT<sub>39</sub>
Фенотип
26°C
32°C
39°C
A/Astana/PR8(UW)RG/6:2/2009(H5N1)
3,5
9,5
8,5
6
1
non-ca, non-ts
A/HK/Astana/6:2/2010 (H5N1) (реассортант)
7,5
9,5
3,5
2,0
6
са, ts
A/Гонконг/1/68/162/35 (H3N2)
8,5
9,5
1,5
1,0
8,0
ca, ts
6
50
Безвредность реассортантного штамма A/HK/Astana/6:2/2010 (H5N1) и родительских вирусов A/Astana/PR8(UW)RG/6:2/2009(H5N1) и A/Гонконг/1/68/162/35 (H3N2) исследовали на самках мышей линии BALB/c. Мышей (по 15 в группе) инфицировали интраназально под легкой анестезией аллантоисной жидкостью, содержащей A/HK/Astana/6:2/2010 (H5N1) или родительские штаммы в дозе 10 ЭИД. Массу тела животных определяли в течение 14 дней после заражения. Изучение безвредности показало, что реассортантный штамм не был патогенным для мышей при интраназальном введении, то есть не вызывал значительного снижения массы тела и развития клинических симптомов инфекции. Родительский рекомбинантный штамм A/Astana/PR8(UW)RG/6:2/2009(H5N1) вызывал резкую потерю веса у животных уже на 3 день после заражения. К 6 суткам наблюдения все мыши в группе погибли. Результаты представлены на рис.9, где даны показатели снижения веса после заражения белых мышей реассортантом A/HK/Astana/6:2/2010 (H5N1) (а) и родительскими вирусами A/Astana/PR8(UW)RG/6:2/2009(H5N1) (б) и A/ГК/1/68/162/35 (H3N2) (в). По оси абсцисс представлены сутки наблюдения за животными, по оси ординат - масса в % от исходной.
50
мл
50
мл
50
мл
Репродукцию вируса в легких и носовых ходах мышей на 3-и сутки определяли по показателям титрования суспензии органов в куриных эмбрионах. Родительский штамм A/Astana/PR8(UW)RG/6:2/2009(H5N1) репродуцировался в легких мышей в титре 5,0 lg ЭИД/ и вызывал 100% гибель мышей на 6-е сутки. Титр репродукции реассортанта в легких составил 1,7 lg ЭИД/. Несмотря на то что уровень репродукции вируса в легких незначительно выше, чем уровень репродукции в верхних дыхательных путях (1,45 lg ЭИД/), среди зараженных животных не наблюдалось летальности и уровень снижения веса мышей не превышал 1%. Результаты приведены в табл.16.
Табл. 16
Результаты изучения безвредности реассортантного штамма A/HK/Astana/6:2/2010 (H5N1) на основе донора A/Гонконг/1/68/162/35 (H3N2) при интраназальном введении белым мышам.
Штамм
Репродукция в легких (lg  ЭИД<sub>50</sub>/<sub>мл</sub>)
Репродукция в носовых ходах (Lg ЭИД<sub>50</sub>/<sub>мл</sub>)
Максимальное снижение веса, %
A/HK/Astana/6:2/2010 (H5N1) (реассортант)
1,7
1,45
1
A/Astana/PR8(UW)RG/6:2/2009(H5N1)
5,0
2,5
100% гибель
A/Гонконг/1/68/162/35 (H3N2)
2,75
5,5
0
Контроль
<0,5
<0,5
0
Для проверки на генетическую стабильность и стабильность основных биологических свойств, реассортант A/HK/Astana/6:2/2010(H5N1) прошел 5 последовательных пассажей при 32°C в системе куриных эмбрионов при заражении по 0,2 мл в аллантоисную полость цельным неразведенным материалом. Штамм, прошедший 5 пассажей, был проверен на состав генома методом ПЦР и рестрикционного анализа, на антигенную специфичность методом РТГА, а также на сохранение ts- и ca- фенотипов методом определения инфекционной активности при различных температурах инкубации. Гемагглютинирующая активность реассортанта представлена в табл.17.
Табл. 17
Гемагглютинирующая активность родительских штаммов и реассортантов вируса гриппа A
Вирусы
Выраженность гемагглютинации
Гемагглютинирующая активность, ГАЕ/50 мкл
1:64
1:128
1:256
1:512
1:1024
1:2048
A/HK/Astana/6:2/2010 (H5N1)
++++
++++
++++
++++
+
-
512
A/Astana/RG/6:2/2009 (H5N1)
++++
++++
++++
++++
++++
-
1024
A/Гонконг/1/68/162/35 (H3N2)
++++
++++
++++
++++
++++
-
1024
A/СПб/ГК/09 (H1N1)
++++
++++
++++
++++
-
-
512
А/Санкт-Петербург/48/09 (H1N1)
++++
++++
++++
+
-
-
256
A/лошадь/Отар/764/2007 (H3N8)
++++
++++
++++
+
-
-
256
A/Отар/ГК/6:2/2010 (H3N8);
++++
++++
++++
+++
-
-
512
По результатам исследований, после 5-кратного пассирования в системе куриных эмбрионов, штамм A/HK/Astana/6:2/2010(H5N1) сохранял антигенную специфичность, высокую инфекционную активность, а также ts- и ca- фенотипы.
Также в образце, прошедшем 5 пассажей, не было выявлено примесей реассортантов с другим составом генома, либо с другими поверхностными антигенами, что говорит о генетической стабильности реассортанта A/HK/Astana/6:2/2010(H5N1).
На модели морских свинок были исследованы прививочные свойства вакцинных кандидатов A/HK/Astana/6:2/2010(H5N1).
Для приготовления кандидатной ЖГВ лиофилизированные штаммы-кандидаты восстанавливали в 1 мл стерильного фосфатно-солевого буфера рН 7,2 (PBS) и разводили стерильным PBS до концентрации 7,0 lg ЭИД50/мл. Морских свинок (по 2 свинки на группу) вакцинировали однократно, без наркоза, вводя в оба носовых хода по 200 мкл ЖГВ. Назальные смывы получали до, на 1, 2 и 28 дни после вакцинации путем пропускания 1.0 мл стерильного PBS через носовые ходы животного над стерильной чашкой Петри. Взятие крови из сердца животного в объеме 0.5 мл проводили до и на 28 день после иммунизации. Сыворотки крови животных обрабатывали ферментом RDE (DenkaSeiken, Япония) для удаления неспецифических ингибиторов и хранили при -20°C. Репродукцию вакцинных штаммов в носовых ходах животных оценивали по результатам титрования назальных смывов в системе куриных эмбрионов. Системный иммунный ответ на введение ЖГВ оценивали по титру антигемагглютинирующих антител и вирусспецифических IgG в крови животных, местный иммунный ответ - по титру вирусспецифических IgG в носовых смывах животных методом иммуноферментного анализа. Реакцию торможения гемагглютинации (РТГА) с 0,75% куриными эритроцитами и ИФА проводили по стандартной методике.
Интраназальное введение кандидатной ЖГВ на основе вакцинного штамма A/HK/Astana/6:2/2010(H5N1) не вызывало у морских свинок признаков заболевания, при этом реассортант хорошо репродуцировался в носовых ходах животных (табл.18) и на 2-е сутки после введения выделялись из назальных смывов в титрах 4,2 lgЭИД50/мл соответственно.
Табл. 18
Выделение вируса из носовых ходов морских свинок до и после иммунизации гриппозной вакциной на основе штамма A/HK/Astana/6:2/2010 (H5N1).
ЖГВ
№ животного
Титр вируса, lgЭИД<sub>50/мл</sub>*
До
1 сутки
2 сутки
A/HK/Astana/6:2/2010 (
1
<0,5
>3,2
4,2
H5N1)
2
<0,5
2,7
4,2
* нижний предел определения инфекционной активности вируса составлял 0,5 lgЭИД50/мл
4-кратный прирост антител у морских свинок, иммунизированных ЖГВ на основе штамма A/HK/Astana/6:2/2010 (H5N1), наблюдался по результатам ИФА с сыворотками крови животных, что можно объяснить наибольшей чувствительностью данного метода в случае анализа иммунного ответа на вакцины подтипа H5N1 по сравнению, например, с классической РТГА. Небольшое увеличение титра антигемагглютинирующих антител было зафиксировано только у одного животного из двух, однако прирост локальных антител в носовых ходах, являющихся входными воротами гриппозной инфекции, наблюдался у обоих животных (табл.19).
Табл. 19
Титры антигемагглютинирующих антител, а также вирус специфических IgG в сыворотках крови и локальных IgG в носовых ходах морских свинок до и после введения ЖГВ на основе штамма A/HK/Astana/6:2/2010 (H5N1) (7,0 lg ЭИД<sub>50/мл</sub>).
ЖГВ
№ животного
РТГА
ИФА
системные IgG
локальные IgA
до
после
до
после
до
после
A/HK/Astana/6:2/2010
1
4
4
1000
4000
2
4
(H5N1)
2
4
16
1000
16000
2
16
Реассортантный штамм A/HK/Astana/6:2/2010 (H5N1) хорошо репродуцировался в верхних дыхательных путях морских свинок, не вызывая при этом клинических проявлений или симптомов заболевания.
Таким образом, введение кандидатной ЖГВ индуцировало как системный, так и местный иммунный ответ у морских свинок, при этом увеличение титра вирус-специфических IgG в ответ на вакцинацию превышало 4-кратный порог.
Имеется паспорт штамма. Вирус депонирования в Государственную коллекцию вирусов под №2626. Штамм соответствует требованиям приказа №156/29 от 07.05.1998 г. Минздравсоцразвитя РФ и РАМН «О подготовке новых вакцинных производственных и диагностических штаммов вируса гриппа и их внедрение в производство вакцин и диагностических препаратов» и пригоден для использования в производстве.
Пример 3. Получение вакцинного штамма A/Отар/ГК/6:2/2010 ("H3N8).
На основе разработанного донора A/Гонконг/1/68/162/35 (H3N2) был получен методом классической генетической реассортации штамм A/Отар/ГК/6:2/2010 (H3N8), унаследовавший поверхностные белки от вируса гриппа лошадей A/Лошадь/Отар/764/2007 (H3N8).
Перед смешанным пассажем проводили кросс-реактивацию родительского эпидемического штамма A/Лошадь/Отар/764/2007 (H3N8). Вируссодержащую аллантоисную жидкость обрабатывали УФ в течение 15 минут.
Реассортант получали по схеме:
Смешанный пассаж, первый селективный пассаж в присутствии кроличьей иммунной сыворотки к вирусу A/Гонконг/1/68/162/35 (H3N2), второй селективный пассаж в присутствии кроличьей иммунной сыворотки к вирусу A/Гонконг/1/68/162/35 (H3N2).
Методом ПЦР со специфичными праймерами и ОТ-ПЦР рестрикционного анализа были проанализированы 3 отобранных клона. Для дальнейшей работы, включающей последующие клонирования и отбор реассортантов с составом генома 6:2, отобран один образец, как наиболее соответствующий предъявляемым требованиям.
Клонирования проводили методом предельных разведений в присутствии кроличьей иммунной сыворотки к вирусу A/Гонконг/1/68/162/35 (H3N2). Эмбрионы инкубировали при оптимальной 32°C и при пониженной температуре 25°C. По окончании инкубирования с ВАЖ от каждого эмбриона ставили РГА и ОРТГА. Вирусы, проявившие наибольшую гемагглютинирующую активность, отбирали для последующего клонирования.
Клоны анализировали методом ПЦР со специфичными праймерами и ОТ-ПЦР рестрикционного анализа. Отобранные клоны имели структуру генома 6:2 (6 генов от донора A/Гонконг/1/68/162/35 (H3N2) и 2 гена от вируса A/Лошадь/Отар/764/2007 (H3N8)).
50
26
50
Полученный реассортант A/Отар/ГК76:2/2010 (H3N8) унаследовал от вируса A/Гонконг/1/68/162/35 (H3N2) основные признаки аттенуации: демонстрировал высокую холодоадаптированность, размнажаясь при 26°C до 9,5 lg ЭИД/МЛ (RTC 0), и выраженную температурочувствительность. При температуре 39°C инфекционная активность вируса составляла 1,5 lg ЭИД/мл (RTC39 8,0). См. табл.20.
Табл. 20
Инфекционная активность реассортанта A/Отар/ГК/6:2/2010 (H3N8), полученного на основе донора A/Конконг/1/68/162/35 (H3N2), при различных температурах.
Штамм
Инфекционная активность при температуре (lg ЭИД<sub>50</sub>/мл)
RCT<sub>26</sub>
RCT<sub>39</sub>
Фенотип
26°C
32°C
39°C
A/Лошадь/Отар/764/2007 (H3N8)
6,5
7,5
≥5,5
1,0
2,0
ca, non-ts
A/Отар/ГК/6:2/2010 (H3N8)
9,5
9,5
1,5
0
8,0
ca, ts
A/Гонконг/1/68/162/35 (H3N2)
9,5
10,0
0,5
0,5
9,5
ca, ts
Гемагглютинирующая активность родительских вирусов и реассортанта A/Отар/НК/6:2/2010 (H3N8) представлена в табл.17. Для полученного реассортанта она составляла 512 ГАЕ.
Данные этого примера показывают, что заявляемый донор внутренних генов является универсальным и пригоден при применении в работе с вирусом гриппа подтипа (H3N8).
50
В результате изучения свойств созданного донора внутренних генов для вакцинных штаммов как для ЖГВ, так и для ИГВ на примерах показано, что получены три реассортанта с генетически удаленными вирусами - с эпидемическим вирусом A/Санкт-Петербург/48/09 (H1N1), с генетически модифицированным вирусом птичьего гриппа A/Astana/PR8(UW)RG/6:2/2009(H5N1) и вирусом гриппа лошадей A/Лошадь/Отар/764/2007 (H3N8). Все полученные реассортанты наследовали основные, важные для производства вакцин, свойства вируса-донора - высокую репродуктивность (9,3-9,5 lg ЭИД/МЛ) и признаки аттенуации - холодоадаптированность (ca) и температурочувствительность (ts).
Гемагглютинирующая активность реассортантов составляла 512-1024 ГАЕ. Реассортанты лучше репродуцировались в носовой полости, чем в легких экспериментальных животных, были безвредны, не контаминированы посторонними инфекционными агентами (табл.21).
Интраназальное введение морским свинкам ЖГВ из полученного на основе нового донора реассортанта вызывало образование как местных, так и гуморальных иммуноглобулинов.
Была доказана способность вируса-донора передавать полезные свойства генетическим реассортантам с «дикими» вирусами. Донор A/Гонконг/1/68/162/35 и полученные на его основе реассортанты A/СПб/ГК/09 (H1N1) и A/HK/Astana/6:2/2010 (H5N1) были внесены в Государственную коллекцию вирусов.
Табл. 21
Характеристика реассортантов, полученных на основе созданного донора A/Гонконг/1/168/162/35
Штамм
Биологические свойства
Инфекционная активность при температуре, lg ЭИД<sub>50</sub>/мл
RCT<sub>26</sub>
RCT<sub>39</sub>
фенотип
Гемагглютинирующая активность ГАЕ/50 мкл
Репродукция, lg ЭИД <sub>50</sub>/мл
t°=26°
t°=32°
t°=39°
в легких
в носовой полости
Донор A/ГК/1/68/162/35 (H3N2)
8,5-9,5
9,0-10,0
1,5
0,5
7,5
ca, ts
1024-2048
2,75
5,5
A/СПБ/ГК/09 (H1N1)
6,5
9,3
3,5
2,8
5,8
ca, ts
512
<1,2
1,45
A/Санкт-Петербург/48/09 (H1N1)
4,0
8,25
3,75
4,25
4,5
non ca, non ts
256
4,45
3,2
A/HK/Astana/6:2/2010 (H5N1)
7,5
9,5
3,5
2,0
6,0
Ca, ts
512
1,7
1,45
A/Astana/PR8RG6:2/2009 (H5N1)
3,5
9,5
8,5
6,0
1,0
non ca, non ts
1024
5,0
2,5
A/Отар/ГК/6:2/2010 (H3N8)
9,5
9,5
1,5
0
8,0
ca, ts
512
н/д
н/д
A/Лошадь/Отар/764/2007 (H3N8)
6,5
7,5
≥5,5
1,0
2,0
non ca, non ts
256
н/д
н/д