Изучение кинетики роста штаммов бактерий-антагонистов возбудителей фузариоза при периодическом культивировании

А. М. Асатурова,

научный сотрудник ГНУ ВНИИ масличных культур

ИЗУЧЕНИЕ КИНЕТИКИ РОСТА ШТАММОВ БАКТЕРИЙ-АНТАГОНИСТОВ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ФУЗАРИОЗА ПРИ ПЕРИОДИЧЕСКОМ КУЛЬТИВИРОВАНИИ

УДК 632.9:633.854.78

Введение. В условиях Северного Кавказа, наряду с такими вредоносными болезнями подсолнечника, как белая гниль, ложная мучнистая роса и фомопсис, все большее распространение получает фузариоз, вызывая корневые гнили всходов, трахеомикозные увядания растений, а также загнивание корзинок и семян (Масли-енко, Мурадосилова, 2000; Саукова, 2001; Антонова, 2002; Бородин, Котлярова, Терещенко, 2006). Решение проблемы защиты подсолнечника от возбудителей фузариоза связано с разработкой комплекса эффективных мероприятий, включающих также и микробиологический метод. Микробиологические препараты для защиты подсолнечника от возбудителей фу-зариоза в нашей стране отсутствуют.

Основными этапами разработанной нами концепции создания микробиопрепаратов являются: изыскание из природных источников штаммов-антагонистов возбудителей болезней, ступенчатый скрининг штаммов в лабораторных и полевых условиях, токсикологическая оценка перспективных штаммов, разработка препаративных форм, регламентов производства и хранения, обоснование стратегии применения биопрепаратов (Маслиенко, 2005).

Ступенчатый скрининг выявил в качестве объектов исследований перспективные бактериальные штаммы Oif 2-1, Sgrc-1, Fa 4-1 и D 7-1, выделенные из ризосферы, ризопланы и растительных остатков подсолнечника (Асатурова, 2005; Асатурова, Мас-лиенко, 2006). Изучаемые штаммы проявляют антагонистические свойства в отношении широкого круга патогенных представителей рода Fusarium (F. se-mitectum, F. gibbosum, F. javanicum, F. solani и F. monili-forme), а также ряда других фитопатогенов, распространенных на подсолнечнике: Sclerotinia scleroti-orum, Sclerotium bataticola, Alternaria sp., Phomopsis he-lianthi и Verticillium dahliae. Кроме того, отобранные потенциальные биоагенты обеспечивают на жестком фоне искусственного заражения возбудителями фузариоза эффективную защиту семян и проростков подсолнечника (до 77,3 %), активно колонизируют корень и оказывают ростостимулирующее действие на культуру подсолнечника (увеличение массы корня на 52,9-82,4 %, массы ростка - на 44,7-55,3 %) (Маслиенко, Асатурова, 2006; Асатурова, Шипиевская, 2007).

Создание эффективных биологических средств защиты растений предполагает разработку лабораторного

регламента массовой наработки биопрепаратов на основе изучения физиологических признаков перспективных штаммов. Поэтому целью настоящей работы явилось изучение количественных закономерностей роста популяции перспективных бактериальных штаммов в реальных условиях периодического культивирования, что впоследствии позволит решить задачу по оптимизации технологических режимов наработки биопрепаратов.

Материалы и методы. Объектами изучения являлись штаммы бактерий-антагонистов возбудителей фузариоза подсолнечника Oif 2-1, Sgrc-1, Fa 4-1 и D 7-1.

При изучении динамики периодического роста бактерии культивировали в течение трех суток. Культивирование осуществляли на термостатированных качалках (195 об./мин.) при оптимальных температурах: 25 °С для флюоресцирующих штаммов Oif 2-1 и Sgrc-1 и 30 °С для бациллярных штаммов Fa 4-1 и D 7-1. Культивирование осуществляли в колбах Эрленмейера (750 мл) с объемом питательной среды 150 мл и предварительным внесением посевной (маточной) культуры (2 % от объема питательной среды). Для выращивания культур использовали жидкие питательные среды Кинга В (для штаммов Oif 2-1 и Sgrc-1) и Тайлона 3 (для штаммов Fa 4-1 и D 7-1) следующего состава:

Среда Кинга В

Пептон - 20,0;

Глицерин - 15,0;

MgSO4 х 7 Н2О - 1,5;

K2HГО4 безводный - 1,5;

Вода дистиллированная.

Среда Тайлона 3

Сахароза чистая - 10,0;

Кукурузный экстракт - 5,0; (Ш4)2НГО4 - 2,0;

КН2ГО4 - 2,0;

MgSO4 х 7 Н20 - 0,25;

Са СОз - 1,0;

Вода дистиллированная.

Отбор проб для анализа жидких культур (ЖК) исследуемых штаммов осуществляли через 8, 16, 24, 36, 48 и 72 часа от начала культивирования.

Для определения численности бактериальных клеток в ЖК использовали метод Коха (Нетрусов,

Егорова, Захарчук, 2005). Определение числа клеток этим методом включает три этапа: приготовление разведений, посев на питательную среду в чашки Петри (ЧП) и подсчет выросших колоний.

Для приготовления разведений стерильную водопроводную воду разливали по 9 мл в стерильные сухие пробирки. Затем 1 мл исследуемой суспензии стерильной пипеткой переносили в колбу с 99 мл стерильной воды. Затем отбирали 1 мл суспензии и переносили в пробирку с 9 мл стерильной воды. Полученное разведение тщательно перемешивали, несколько раз вбирая в пипетку и выпуская из неё полученную суспензию клеток. Таким же образом готовили все последующие разведения. Высев исследуемой ЖК осуществляли глубинным способом. Для этого по 1 мл из соответствующего разведения переносили в 3 стерильные ЧП. Затем заливали в чашки по 15-20 мл среды, расплавленной и остуженной до 45-50 °С, и смешивали питательную среду с посевным материалом легкими вращательными движениями, после чего чашки оставляли на горизонтальной поверхности до застывания среды. Колонии бактерий подсчитывали через 5-7 суток инкубации. Количество клеток в 1 мл исследуемой ЖК вычисляли по формуле:

и стационарную фазы (Мосичев, Складнев, Котов, 1982).

Кинетика роста бациллярных штаммов Ба 4-1 и Б 7-1

Результаты исследования развития бацилл-антагонистов Ба 4-1 и Б 7-1 при периодическом способе выращивания представлены на рисунке 1.

1400 - 1200 ~ 1000 Р ц

- 800 3 § Ё И

- 600 0 н Й &

- 400 ^ К

- 200 н 4 0

8 16 24 36 48 72 Время культивирования, часы -Р-Ба 4-1 ОБ 7-1

Рисунок 1 - Кинетика роста штаммов бактерий-антагонистов Ба 4-1 и Б 7-1 при периодическом культивировании

Т = а х 10" , V

где Т - количество колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 мл;

а - среднее число колоний, выросших после посева из данного разведения;

V - объем суспензии, взятый для посева;

10" - коэффициент разведения.

Результаты и обсуждение. Известно, что основной стадией любого микробиологического производства является производственное культивирование соответствующего микроорганизма, проводимое либо с целью увеличения микробной массы - биомассы, либо для получения продуктов метаболизма растущей популяции микроорганизмов (Мосичев, Складнев, Котов, 1982). Для разработки производства биофунгицидов комплексного действия необходимо получение ЖК с оптимальной плотностью микробных клеток в сочетании с высокой концентрацией антифунгальных веществ.

Периодическую культуру можно рассматривать как замкнутую систему, которая в своем развитии проходит четыре основные фазы: начальную (лаг-фазу), экспоненциальную (фазу логарифмического роста), стационарную и фазу отмирания (деградации) (Нетрусов, Егорова, Захарчук, 2005). Также выделяют переходную фазу, связывающую начальную и экспоненциальную фазы, и фазу затухающего роста, связывающую экспоненциальную

В процессе культивирования штаммов Ба 4-1 и Б 7-1 были выделены следующие фазы роста.

Лаг-фаза начиналась после внесения в среду посевной (маточной) культуры с титром 8,5 х 109 КОЕ/мл у штамма Ба 4-1 и 3,2 х 1010 КОЕ/мл у штамма Б 7-1 и продолжалась до 8 часов. Необходимо отметить, что численность популяции в это время не увеличивалась, то есть происходило увеличение объема клеток, но не деление.

Переходная фаза для бациллярных штаммов отмечалась в период с 8 до 24 часов. Численность популяции исследуемых штаммов начала увеличиваться и составила у штамма Ба 4-1 3,0 х 1010 КОЕ/мл, а у штамма Б 7-1 - 2,6 х 1010 КОЕ/мл.

Экспоненциальная фаза (фаза логарифмического роста) была зафиксирована от 24 до 72 часов. Рост культуры происходил с максимальной скоростью, так как именно в этой фазе влияние лимитирующих и ингибирующих факторов сведено до минимума: компоненты питательной среды имеются в избытке, а продукты обмена еще не накопились. Максимальный титр клеток был отмечен именно в данный период и составил 5,5 х 1011 КОЕ/мл у штамма Ба 4-1 и 1,3 х 1012 КОЕ/мл у штамма Б 7-1.

При наступлении стационарной фазы происходило прекращение роста бациллярных клеток после 72 часов культивирования.

Фаза отмирания при культивировании штаммов Ба 4-1 и Б 7-1 нами не была отмечена.

Анализ кинетического роста исследуемых объ-

ектов позволяет сделать вывод о том, что оптимальными сроками культивирования для бацил-лярныхштаммов являются 48-72 часа. Именно в данный период растущей культуры компоненты питательной среды активно потреблялись или практически полностью утилизировались (к 72 часам) бактериями, что подтвердил титр опытных партий ЖК штаммов (Ба 4-1 - 1,3-5,5 х 1011 КОЕ/мл; Б 7-1 - 1,3 х 1011 - 5,5 х 1012 КОЕ/мл), а продукты обмена, в том числе и антифунгальные вещества, активно накапливались.

Кинетика роста флюоресцирующих штаммов О^ 2-1 и 8ягс-1

Динамика периодического роста пигментирующих бактерий Oif 2-1 и явно отличалась от таковой бациллярных штаммов (рис. 2).

6000

10 12 КОЕ/мл у КОЕ/мл у штам-

5000

4000 -

I о В «

ср

« § 2000 Оч

н к н

3000

1000 -

8 16 24 36 48 72

Время культивирования, часы

-о^гс-1 -o-Oif 2-Т~1

Рисунок 2 - Кинетика роста штаммов бактерий-антагонистов Oif 2-1 и 8^с-1 при периодическом культивировании

Если продолжительность лаг-фазы при культивировании флюоресцирующих бактерий составила так же, как и у бациллярных штаммов 8 часов (с титром маточных культур 2,4 х 1011 КОЕ/мл у штамма Sgrc-1 и 1,5 х 1012 КОЕ/мл у штамма Oif 21), то переходная фаза сократилась в 2 раза и продолжалась в период с 8 до 16 часов (рисунок 2). Вероятно, это связано с более быстрой адаптацией маточной культуры пигментирующих бактерий к питательной среде и отсутствием споровой стадии.

Экспоненциальная фаза у штаммов Oif 2-1 и Sgrc-1 наблюдалась в течение более короткого промежутка времени с 16 до 36 часов, то есть протекала в 2,4 раза быстрее, чем у штаммов Ба 4-1 и Б 7-1. Титр ЖК исследуемых бактерий в этот период у штамма Sgrc-1 составил 5,0 х 1012 КОЕ/мл, а у штамма Oif 2-1 - 9,7 х 1012 КОЕ/мл. Для сравнения, необходимо подчеркнуть, что титр ЖК бацилляр-

ных штаммов достиг максимума лишь к 72 часам культивирования (рисунок 1).

Стационарная фаза отмечалась уже после 36 часов культивирования и характеризовалась замедлением роста культур.

Важно отметить, что в процессе культивирования штаммов Sgrc-1 и Oif 2-1 была зафиксирована фаза отмирания (дегенерации), которая начиналась после 40 и продолжалась до 72 часов, и характеризовалась уменьшением численности популяции. Титр ЖК снизился с 3,6 до 2,4 х 1 п12 штамма Sgrc-1 и с 3,9 до 3,0 х 1012 ма Oif 2-1.

Полученные экспериментальные данные по кинетике роста штаммов Sgrc-1 и Oif 2-1 свидетельствуют о том, что оптимальными сроками культивирования для пигментирующих бактерий являются 36-48 часов. Образцы ЖК в этот период характеризовались высоким титром (Sgrc-1 - 5,0-3,6 х 1012 КОЕ/мл; Oif 2-1 - 9,7-3,9 х 1012 КОЕ/мл) в сочетании с существенной концентрацией продуктов обмена, вследствие эффективной утилизации компонентов питательной среды.

Заключение. Исследуемые штаммы при периодическом культивировании претерпевают значительные изменения в течение всего периода роста, обусловленные непрерывными изменениями окружающей среды и быстрой реакцией на них бактериальных клеток. При этом зафиксировано, что у штаммов Oif 2-1 и Sgrc-1 переходная и экспоненциальная фазы протекают быстрее в 2 и 2,4 раза соответственно, чем у бациллярных бактерий Ба 4-1 и Б 7-1. Таким образом, изучение динамики роста перспективных штаммов бактерий-антагонистов показало, что оптимальными сроками культивирования для бациллярных штаммов Ба 4-1 и Б 7-1 являются 48-72 часов, а для флюоресцирующих бактерий Oif 2-1 и Sgrc-1 - 36-48 часов.

12000

10000

8000

6000

4000

2000

8 Ы 8 О £ И э ^

и & ^ §

Работа выполнена при № 08-04-99010-р_офи.

поддержке гранта РФФИ

Литература

1. Антонова Т. С. Фузариоз и фомопсис подсолнечника: состояние и перспективы исследований // Науч.-технич. бюлл. ВНИИ маслич. культур. -Краснодар, 2002. - Вып. 126. - С. 22-28.

2. Асатурова А. М. Поиск штаммов бактерий-антагонистов возбудителей фузариоза подсолнечника // Фитосанитарное оздоровление экосистем:

0

материалы второго всероссийского съезда по защите растений, (5-10 декабря, 2005 г.). - СПб, 2005.Т. II. - С. 148-150.

3. Асатурова А. М., Маслиенко Л. В. Скрининг штаммов бактерий, проявляющих антагонизм к возбудителям фузариоза подсолнечника // Болезни и вредители масличных культур: Сб. науч. работ ВНИИ маслич. культур. - Краснодар, 2006. - С. 8289.

4. Асатурова А. М., Шипиевская Е. Ю. Отбор перспективных агентов биологического контроля для защиты подсолнечника от возбудителей фуза-риоза // Актуальные вопросы селекции, технологии и переработки масличных культур: Сб. матер. 4-й межд. конф. молодых ученых и специалистов (2729 марта, 2007 г.). - Краснодар, 2007. - С. 8-12.

5. Бородин С. Г., Котлярова И. А., Терещенко Г. А. Специализация видов грибов рода Fusarium на подсолнечнике // Болезни и вредители масличных культур: Сб. науч. работ ВНИИ маслич. культур. - Краснодар, 2006. - С. 52-56.

6. Егоров Н. С. Выделение микробов-антагонистов и биологические методы учета их антибиотической активности. - М.: Изд-во Моск. ун-та, 1957. - 78 с.

7. Маслиенко Л. В. Обоснование и разработка микробиологического метода борьбы с болезнями

подсолнечника // Автореф. дис. ... док. биол. наук.

- Краснодар, 2005. - 49 с.

8. Маслиенко Л. В., Асатурова А. М. Потенциальные биоагенты для защиты подсолнечника от возбудителей фузариоза // Биологическая защита растений - основа стабилизации агроэкосистем: материалы межд. науч. -практ. конф., (20-22 сентября, 2006 г.). - Краснодар, 2006. - Вып. 4. - С. 246-248.

9. Маслиенко Л. В., Мурадосилова Н. В. Видовой состав грибов рода Fusarium на подсолнечнике / // Науч.-технич. бюлл. / ВНИИ маслич. культур. -Краснодар, 2000.- вып. 123. - С. 25-31.

10. Мосичев М. С., Складнев А. А., Котов В. Б. Общая технология микробиологических производств. - М., 1982. - 264 с.

11. Нетрусов Ф. И., Егорова М. А., Захар-чук Л. М. Практикум по микробиологии. - М., 2005.

- 608 с.

12. Саукова С. Л. Виды грибов рода Fusarium, встречающиеся на подсолнечнике, и поражение всходов при разной дозе инфекционной нагрузки // Науч.-технич. бюлл. / ВНИИ маслич. культур. -Краснодар, 2001. - Вып. 124.- С. 166-168.

13. Скворцова И. Н. Методы идентификации и выделения почвенных бактерий рода Pseudomonas.

- М., 1981. - 78 с.