Критерии позитивности для IgG антител в методе иммунного блоттинга при болезни Лайма

УДК: 616-097

КРИТЕРИИ ПОЗИТИВНОСТИ ДЛЯ АНТИТЕЛ В МЕТОДЕ ИММУННОГО БЛОТТИНГА ПРИ БОЛЕЗНИ ЛАЙМА

В. Г. Барскова*, Л.П. Ананьева*, В. А. Насонова*, А.С. Стир** * Институт ревматологии РАМН, Москва, Россия ** Новоанглийский медицинский центр, Бостон, США

Резюме.

В настоящее время в России не существует единых унифицированных критериев для диагностики болезни Лайма методом вестерн-блот.

Цель исследования. Разработка критериев серопозитивности для IgG антител с акцентом на диагностику болезни Лайма у пациентов с суставными проявлениями.

Материал и методы. 97 пациентов с болезнью Лайма, контрольная группа сывороток - 145 образцов. Антиборрелиозные антитела класса IgG исследовались с тремя штаммами Borrelia burgdorferi sensu lato методом вестерн-блот, подготовленным мануфактурным способом. Лучшая распознавательная способность теста достигалась наличием 3 из 11 IgG антител. Такая дефиниция может быть использована для всех трех штаммов В. burgdorferi sensu stricto, B.garinii и B.afzelii.

Результаты. При данном подходе позитивный результат был обнаружен в 0-18% случаев у пациентов с локальной мигрирующей эритемой < 4 недель длительности, в 23%-39% случаев диссеминированной инфекции < 20 недель длительности, в 39%-4б% случаев поздних артритов/ артралгий >6 месяцев ( специфичность 93%-99%).

Заключение. IgG вестерн-блот при ограниченной чувствительности может повысить специфичность серологического тестирования у пациентов с болезнью Лайма.

Ключевые слова: болезнь Лайма, вестерн-блот. артриты.

Болезнь Лайма (БЛ) - инфекционное, природно-очаговое, трансмиссивное заболевание, вызываемое спирохетой В. burgdorferi (Bb) и при укусах иксодовыми клещами. БЛ поражает многие органы и системы организма, однако наиболее часто встречается поражение кожи, суставов, нервной системы и сердца [13].

Значительная часть мирового нозоареа-ла БЛ находится в России [3]. И в Европе и в Азии этот клещевой спирохетоз может вызываться тремя штаммами Bb sensu lato. B.afzelii, Bb sensu stricto и В. garinii [б]. Несмотря на то, что некоторые симптомы болезни, например, мигрирующая эритема, были известны в России давно, описание суставного синдрома как проявление разных стадий болезни относится к недавнему времени [1,4].

В США, где циркулирует лишь один па-

Адрес для переписки:

В.Г. Барскова,

115522, Москва, Каширское шоссе, 34-а Институт ревматологии РАМН, тел.: (095) 114-34-29.

тогенный генотип боррелии (ВЬ веши эЫсЮ), рекомендуется двухступенчатый подход к серологической диагностике. Первой ступенью является обследование сыворотки методом иммуноферментного анализа (ИФА) или в непрямой реакции иммунофлюоресценции (нРИФ). В случае получения позитивного или сомнительного результатов требуется подтверждение серопозитивности методом вестерн-блот (ВБ).

Центр по контролю над заболеваемостью США (СОС) рекомендовал единые критерии для ВБ - наличие 5 из 10 диагностически значимых полос специфических антител [8]. Однако в Европе и Азии не существует единых унифицированных критериев. Основная причина этого заключается в штаммовой гетерогенности возбудителя, циркулирующего в Евразии [6].

Использование ВБ у российских пациентов с БЛ показало, что набор белков, с которыми наиболее часто и ярко реагировали сыворотки, был различным для каждого из трех

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ

РЕВМАТОЛОГИЯ

№5.2001

изученных штаммов, относящихся к разным генотипам [5]. Стандарт серопозитивности СОС, примененный к американскому штамму В31, '‘работал” только в 19% случаев, а к российскому штамму 1Р-3 - в 30%.

Первый российский опыт применения двухступенчатой диагностики БЛ показал необходимость применения отечественных штаммов возбудителей и разработки собственных критериев серопозитивности в ВБ [2].

Цель предпринятого нами исследования заключалась в разработке критериев серопо-зитивности в ВБ для антител с акцентом на диагностику БЛ у пациентов с суставными проявлениями.

Материал и методы.

Было отобрано 97 пациентов с БЛ, которые наблюдались в Институте ревматологии РАМН. Большинство пациентов подверглись укусу клеща в Московской области. Диагноз установлен на основании наличия мигрирующей эритемы (МЭ), обнаруживаемой при осмотре или в анамнезе.

МЭ, являющаяся первым и главным клиническим критерием БЛ, определялась нами согласно рекомендациям СОС, общепринятым во всем мире [7]. Эритема характеризовалась как распространяющееся пятно, чаще в виде классического кольцевидного элемента с просветлением в центре и эритематозиым венчиком по периферии. Иногда окраска эритемы была гомогенной. Обязательными условиями были следующие: размер эритемы более 5см в диаметре и ее описание авторами или другими врачами, имеющими опыт в диагностике БЛ.

Основываясь на общепринятом делении болезни на стадии, все пациенты были разделены на 4 группы. Первая группа - 17 пациентов с локальной МЭ длительностью не более 4 недель. Вторая группа -8 пациентов с хронической МЭ более 4 недель без каких-либо других клинически выявляемых признаков болезни. Третья группа - 44 пациента, у которых вслед за МЭ развились признаки диссеминированной инфекции, длящиеся < 20 недель. Основными клиническими проявлениями стадии диссеминации явились вторичные эритемы , миокардит с/без атриовентрикулярной блокады, парез лицевого нерва, радикулярный синдром, артралгин или интермиттирующий артрит. Четвертая группа - 28 пациентов, у которых в течение полугола после МЭ возникло поражение суставов в виде олигоартрита и артралгии, длящееся более 6 месяцев и не от-

носящееся к другим известным видам артритов. Сыворотки этих пациентов хранились при температуре -20°С. Контрольная группа сывороток составила 145 образцов. Из них 30 от больных с болезнью Бехчета, 28 с болезнью Рейтера, 19 с фибромиалгией и 58 с другими ревматическими заболеваниями, включая ревматоидный артрит, остеоартроз, очаговую склеродермию, 10 сывороток от здоровых лиц.

Техника вестерн-блота. Антиборрелиоз-ные антитела класса 1§С исследовались с тремя штаммами ВЬ зепви 1а1о. Выявление антител к ВЬ зепви б^чЛо штамм В-31 (изолированный из клещей I. эсарЫат, штат Нью-Йорк) проводилось с помощью коммерческого набора реагентов для выполнения вестерн-блота. Подготовка антигена двух других штаммов -В. garimi штамм 1р-90 (изолированный из клещей I. регзи!са1ш, Хабаровский край) и В. аГге1н штамм 1р-3 (изолированный из клещей Г.псшпб, Ленинградская область) выполнено специально для исследования. Собственно исследование проведено согласно инструкции, прилагающейся к каждому набору, куда также входили контрольные сыворотки (позитивный, слабопозитивный и отрицательный контроли). Считывание результата проводилось следующим образом: в случае наличия в сыворотке антител, они реагировали в определенном локусе с уже нанесенными специфическими белками определенного молекулярного веса по принципу антиген-антитело на полосе (стрипе), окрашиваясь в синий цвет. Для определения молекулярного веса антител проводилось сравнение стрипов, на которые была нанесена исследуемая сыворотка и позитивный контроль. Молекулярный вес фиксировался лишь в том случае, если окраска локусов была не бледнее такового на слабопозитивном контроле, за который принимается стрип с нанесенным флагелярным белком ВЬ весом 41 кДа.

Статистика. Статистический анализ проведен с помощью кси-квадрата, точного метода Фишера. Был также использован метод построения характеристических кривых в целях достижения компромисса между чувствительностью и специфичностью (рис.). По оси ординат обозначена частота истинно положительных результатов (чувствительность), по оси абсцисс - частота ложноположительных результатов (1 минус специфичность) по всему диапазону точек разделения. Значение по осям соответствует вероятностям от 0 до 1 (т.е. от 0 до 100%). Кривые отображают, как меняются

специфичность и чувствительность метода в зависимости от того, сколько локусов наиболее часто встречаемых антител мы выбираем для серологического подтверждения диагноза (от 11 до 1).

Результаты. Среди 97 пациентов с БЛ наиболее выраженный антительный ответ отмечался к белкам весом 39, 41,

45, 58 кДа (таблица 1). Частота реагирования среди 3 штаммов ВЬ Белей 1а1.о была одинаковой. Исключение составили два белка. Белок весом 37 кДа выявлялся чаще при исследовании сывороток с применением штамма В^алпп, а белок весом 39 кДа - при использовании штамма В. аГге1п. Среди 145 контрольных образцов реактивность с различными белками боррелии обнаруживалась лишь в нескольких сыворотках. Однако применяя штамм В. garinii, мы выявили реактивность с флагелярным белком весом 41 кДа среди 58 контрольных образцов (41%). Частота такого реагирования оказалась значительно выше, чем с двумя другими штаммами.

Для выработки критериев позитивности в методе вестерн-блот для ДО антител мы использовали метод построения характеристических кривых для 11 полос, обнаруженных у пациентов с различными стадиями бо-

Характеристические крипые для 11 IgG полос с тремя

разднчнымн штаммами боррелии.

у/

5^

—•— B.burgdorferi

- -О - B.afzelii

—£— B.garinii

0 №------------,----------,-----------,----------,-----------,

О 0,2 0,4 0,6 0,8 1

I - СПС111|ф|1Ч11иСТ1.

лезни (рис.). Со всеми тремя штаммами зоны специфичности и чувствительности были практически одинаковыми как для 3, так и для 11

полос антител, поэтому наличие 3 специфичных антител явилось минимальным количеством для сохранения высокой специфичнос-

ти. В связи с тем , что штамм боррелии, вызвавшей в каждом конкретном случае инфицирование, клиницистам обычно неизвестен, мы считали предпочтительным разработку единых критериев для различных штаммов. В результате этого мы определили как обязательный позитивный результат ВБ для антител наличие 3 из 11 полос молекулярным весом 18, 23, 28, 30, 37, 39, 41, 45, 58, 66, 93 кДа.

В таблице 2 представлены чувствительность и специфичность ВБ у пациентов с различными клиническими проявлениями. Так, у 18% пациентов первой группы и у 39% четвертой группы выявлялись позитивные результаты ВБ при использовании ВЬ вег^и вЫсЮ, при этом специфичность составила 99%. Абсолютно идентичная картина наблюдалась со штаммом В^аппп: 18 и 39% соответственно, при специфичности 93%. Используя штамм В.аГгеШ, позитивный результат не обнаружен у пациентов с локальной МЭ, однако определялся у 46% пациентов четвертой группы (поздние ар-

Таблица 1

Частота реактивности сывороток пациентов с болезнью Лайма и в контрольной группе с белками B.burgdorferi класса IgG (%).

Пациенты с БЛ (N-97) Контрольная группа (N-145) '

kDa ВЬ* Ва* Bg* ВЬ Ва Bg

18 6 12 12 0 1 3

23 6 7 15 1 1 8

2S 10 21 6 1 10 1

30 9 7 11 1 7 10

37 6 6 ?о** 1 4 6

39 17 45** 30 2 1 5

41 44 44 40 9 13 40**

45 31 17 18 4 2 5

58 31 36 29 2 6 8

66 17 21 15 13 12 7

93 18 22 24 2 2 8

* - ВЬ - B.burgdorferi sensu stricto, Ва - B.afzelii, Bg - B.garinii ** - Статистическая значимость 0.001 отмечена среди пациентов с БЛ к белкам класса IgG весом 37 и 39 kDa и среди контрольной группы к белку 41 kDa.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ РЕВМАТОЛОГИЯ №5, 2001

триты/артралгии). Специфичность при этом составила 97%. Таким образом, серопозитив-ность по ВБ была выше у пациентов с поздней инфекцией и суставными проявлениями по сравнению с ранними стадиями болезни. В целом серопозитивность в используемом нами методе обнаружена у небольшого количества пациентов с БЛ.

Обсуждение.

ВБ используется повсеместно в серодиагностике БЛ, зачастую как окончательная “точка над и” при решении конкретных диагностических задач и выборе терапевтической

тактики. Однако проблема эта в настоящее время далека от решения и остается одной из самых важных, так как в итоге обусловливает врачебную тактику.

Даже а регионах, где циркулирует лишь один штамм боррелии, например в США, существует ряд проблем, которые отягощают трактовку серологических исследований: 1) экспрессия ВЬ общих или перекрестно-реа-гирующих бактериальных антигенов; 2) индивидуальность гуморального ответа; 3) отсутствие стандартизации метода [6]. Последняя проблема считается решенной в США, хотя, по нашему мнению, с определенными допусками. Так, стандартизованными считаются только одобренные FDA (Food and Drug Administration) наборы для ВЬ. Тем не менее тестирование Коллегией американских патологов показало большое количество вариаций как в результатах, так и в их интерпретации. Последнее указывает на то, что, помимо вышеуказанных сложностей, определенную роль играет субъективный фактор [14].

По сути похожими являются сложности в трактовке этого метода в Европе, усугуб-

ленные циркуляцией трех штаммов. По мнению U. Hauser и B.Wilske, желательным является выбор одного штамма для диагностики, но в настоящее время это не представляется возможным. Эти авторы предприняли попытку выработать единые критерии для нескольких штаммов. Однако, столкнувшись с той же проблемой низкой чувствительности и специфичности, были вынуждены провести диффе-ренцировку по штаммам [12]. Наши результаты по частоте серопозитивности среди пациентов с различными стадиями болезни согласуются с данными других авторов: спектр ан-

тител нарастает с длительностью болезни, а частота выявления антител значительно увеличивается при системных проявлениях болезни [10,12].

Помимо этого, было показано, что гуморальный ответ среди европейских пациентов с БЛ представляется более ограниченным по сравнению с американскими пациентами [9].

Дополнительным осложняющим фактором является то, что антибактериальная терапия, независимо от эффективности, может быстро и стойко абортировать образование антител. В этом случае даже при персистенции симптомов болезни антитела могут не выявляться. Мы предполагаем, что немалая часть негативных результатов, полученных среди пациентов с несомненной картиной позднего бор-релиоза, обусловлена именно этим фактом.

Несмотря на различные штаммы, технические характеристики метода (применение различных гелей, моноклональных антител для идентификации и т.д.), разнообразные методики считывания (субъективные, денситометри-ческие), мы можем констатировать, что полученные нами данные, согласуются с современ-

Таблица 2

Чувствительность и специфичность 1"С весгерн-блота у пациентов с различными стадиями болезни Лайма

Группы обследованных B.burgdorferi B.afzelii B.garinii

Чувств. Специф. Чувств. Специф. Чувств. Специф.

1 18 99 0 97 18 93

2 25 99 25 97 25 93

3 23 99 39 97 32 93

4 39 99 46 97 39 93

ными представлениями об европейском борре-лиозе, отражая сложности диагностики и закономерностей гуморального ответа при этой болезни. Предлагаемые нами критерии представляются адекватными для современного этапа развития методической базы серологической диагностики БЛ. Критерии могут быть рекомендованы для серологического диагноза и, в первую очередь, для распознавания поздних ревматических проявлений БЛ.

Выражаем искреннюю благодарность профессору Коренбергу Э.И. (Институт эпидемиологии и микробиологии нм Н.Ф.Гамалеи) за предоставление отечественных штаммов боррелии.

ЛИТЕРАТУРА.

!. Ананьева Л.П., Барскова В.Г., Скрнпннкова И.А. и соавт. Стадийное течение Лайм-боррелиоза у больных с мигрирующей эритемой. В сб. "Проблемы клещевых боррелпозов" пол ред. проф КорембергаЭ И М. 1993,66-73

2. Ананьева Л.П. Боррелиоз Лайма и его ревматические проявления. Авторсф. докт. дисс. М., 1999.

3. Коренберг Э.И. Проблема болезни Лайма в России. В сб. “Проблемы клещевых боррелиозов” под ред. проф. КоренбергаЭ.И. М.,1993,13-21

4. Лесняк О.М., Лайковская Е.Э., Чарнис М.Я. с соавт Клинический спектр болезни Лайма в Свердловской области. Там же; 74-80.

5. Ananieva L.P., Barskova V.G., Nassonova V.A, Serum antibodies against Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii and Borrelia garinii in Lyme borrclio-sis patients. Analysis by Immunoblot. 2nJ European Symposium on Pathogenesis and Management of Tick-Born Diseases. Vienna, Austria, 1998, 28-30, 29

6. Baranton G, Postic D, Saint Girons I. Delineation of Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia garinii sp. nov. and group VS461 associated with Lyme borreliosis.

Выражаем признательность Robin Ruthazer (New England Medical Center) за статистическую обработку полученных данных, а также научным сотрудникам Института ревматологии (Прокаевой Т.Б., Шубину С.В., Иголкиной Е.В.. Федорову Е.С.), предоставившим сыворотки для контрольной группы.

Лабораторная часть выполнена в New England Medical Center благодаря поддержке Национального Института Здоровья США, грант Фогарти (TW 00514-01, Assurance S-1201-01).

Коммерческие наборы с использованием Bb sensu stricto предоставлены фирмой MarDX Diagnotics, Inc., Carlsbad, California. Подготовка антигена двух других штаммов - В. garinii и В. afzelii выполнена этой же фирмой.

Int. J. Syst. Bacterid., 1992, 42,378-383.

7. CDC. Lyme disease - United States. MMWR surveillance summary. 1993, 42, 345-50

8. CDC. Recommendation for test performance and interpretation from the Second National Conference on the serologic diagnosis of Lyme disease. MMWR 1995, 44(31), 590-1

9. Dressier F, Ackermann R., Steere A. Antibody responses to the three genomic groups of Borrelia burgdorferi in European Lyme borreliosis. J. Infect. Dis., 1994, 169,313-318.

10. Dressier F., Whalen J.A., Reinhardt B.N. Western blotting in the serodiagnosis of Lyme disease. J. Infect. Dis., 1993,167,392-400

11. Golightly M.G. Lyme Borreliosis: Laboratory Consideration. Sem. Neurol., 1997, 17, 1, 11-17

12. Hauser U. Lehnert G, Lobentaizer R. Interpretation criteria for standardized Western Blots for three European species of Borrelia burgdorferi sensu lato. J. Clin. Microbiol., 1997, 35, 6, 1433-1444

13. Steere A. Lyme disease. N. Engl. J.Med., 1989,321.586-96

14. WSLH/CAP Lyme disease surveys. 1993.

Summary.

There are currently no accepted criteria for positive Western blots in Russian patients with Lyme borreliosis. The purpose of the current study was to develop criteria for a positive IgG westem-blot to aid particularly in the diagnosis of patients with joint manifestation of the disorder. Patients: 97 with Lyme disease, 145 - control subjects. IgG antibody responses were determined to 3 species ofB.burgdorferi sensu lato by Western blotting, using blots prepared by manufacturer. The best discriminatory ability of test criteria was chained by requiring any 3 of 11 IgG bands, a definition that could be used with B. burgdorferi sensu stricto, B.garinii and B.afzelii strains. With these 3 antigen preparation, positive IgG blots were found in 0 to 18% of patients with localized erythema migrans of < 4 weeks duration, 23 to 39% of those with disseminated infection < 20 weeks duration, and in 39 to 46% of those with late arthritis/arthralgia of >6 months duration the specificity was 93 to 99%. Thus, IgG Western blotting may bring greater specificity to serologic testing in Lyme borreliosis, but the sensitivity is limited.

Key words: Lvme disease. Western-blots. arthritis.

Поступила: 5.12.2000 r.