ПРЕПАРАТ 4-Hydroxy-17R-Methylincisterol, ВЛИЯЮЩИЙ НА ТКАНЕВОЙ ОБМЕН, И ПРИМЕНЕНИЕ ШТАММА ГРИБА Pleurotus 1137 ДЛЯ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ
PREPARATION-4-Hydroxy-17R-Methylincisterol AFFECTING TISSUE EXCHANGE AND APPLICATION OF Pleurotus 1137 FUNGUS STRAIN FOR MAKING IT

Изобретение относится к медицине, медицинской и биологической промышленностям, в частности к штаммам грибов-продуцентов биологически активных веществ и препаратов на их основе, и может быть использовано при производстве и применении биологически активных препаратов и пищевых добавок на основе грибных продуцентов.
Одной из перспективных групп растений, чей химический состав биологически активных веществ и свойства этих веществ в настоящее время изучаются достаточно полно, являются высшие базидиальные грибы.
Исследованием лечебных свойств высших базидиальных грибов и практическим их применением в области медицины занимаются ученые ряда стран на протяжении последних 50-ти лет. Результаты этих исследований особо широко используются в Китае, Японии, Корее, США, Канаде, России и в последнее время в Норвегии.
Среди метаболитов высших грибов выделены и идентифицированы вещества из шляпочных грибов, которые являются иммуномодуляторами и проявляют существенные противоопухолевые, кардиоваскулярные, противовирусные, антибактериальные, противопаразитарные, гепатозащитные и противодиабетические свойства (Материалы IV Международной конференции «Наука и практика грибоводства (М., Международная Ассоциация Грибоводов. 1997 г.; Перспективы использования в медицине веществ, образуемых базидиальными грибами. Обзор (International Journal of Medicinal Mushrooms. Vol.3, 31-62, 1999)).
Известно примерно 200 видов шляпочных грибов, которые обладают ярко выраженными вышеперечисленными свойствами. Однако большинство веществ, входящих в состав грибов, полностью не определены и только около 10 видов грибов используются для получения лекарственных средств. Так, например, в Японии, Китае, России, Украине, Белоруссии, США, Канаде и Норвегии были разработаны несколько цитостатиков-полисахаридов, используемых как лекарственные препараты. Их получают при культивировании в погруженных условиях Trametes versicolor (PSK, Krestin; Jopan; GLUCANOVA NORWAY 2010).
Вместе с тем создание новых препаратов до настоящего времени во многом сдерживается сложной дорогостоящей технологией получения из базидиомицетов линий чистых культур и веществ, обладающих стабильностью требуемых лечебных свойств. Прежде всего это обосновывается тем, что образование ценных для фармакологии метаболитов зависит от условий культивирования продуцента и, по мнению большинства авторов, носит нестабильный штаммозависимый специфический характер.
Поэтому в настоящее время мы не располагаем специфическими противоопухолевыми и гиперлипидемическими безопасными, нетоксическими средствами, получаемыми из высших базидиомицетов.
Что касается наличия в настоящее время выделенного из высших базидиомицетов биологически активного вещества одного из производных эргостерина 4-hydroxy-17R-methylincisterol, способного предотвращать размножение клеток рака без токсических проявлений на организм человека или эффективно регулировать липидный обмен в организме человека, то такого рода опубликованные сведения в литературе отсутствуют и авторам неизвестны.
Для лечения онкологических заболеваний широко применяются противоопухолевая химиотерапия с использованием целого ряда цитостатиков. К наиболее эффективно используемым относятся: циклофосфан, доксорубицин, вепезид, таксаны, метотрексат, 5-фторурацил, применяемые на практике как отдельно, так и в сочетании друг с другом.
В последнее десятилетие в фармакологии препаратами №1 по объему применения стали так называемые статины. С химической точки зрения группа статинов неоднородна и представлена совершенно неблизкими соединениями. Однако самыми используемыми в фармакологии статинами являются производные стеролов, продуцируемые низшими грибами из рода Aspergillus.
Самыми типичными из них являются ловастатин и симвастин, полусинтетические модификации которых выпускаются под десятками названий в качестве эффективных антигиперлипидемических средств. Эти препараты, в частности Зокор, снижают риск инсультов и бляшкообразования за счет уменьшения содержания холестерина и оптимизации соотношения липопротеинов низкой и высокой плотности в крови человека.
Активными исследованиями действия ловастатина выявлена одна из, по-видимому, главных мишеней его действия. Показано, что ловастатин (и, возможно, ряд других статинов) является ингибитором одного из ферментов синтеза холестерина из мевалоната, а именно 3-гидрокси-3-метилглутарил-коэнзим А-редуктазы (ГМГ-КоА-редуктазы). В то же время ясно, что мишеней для действия статинов может быть и больше, в соответствии с этапами синтеза и метаболизма холестерина.
В последнее время опубликованы чрезвычайно интригующие данные о том, что статины обладают онкопротекторными свойствами, при этом механизмы такого эффекта остаются неизвестными. Интересно, что сочетание таких же разнонаправленных эффектов восточная медицина приписывает так называемым «медицинским» грибам, в частности грибам вешенка из рода Pleurotus. Лиофильно высушенные порошки плодовых тел этих грибов широко используются в восточной медицине, хотя пока нет химически идентифицированных препаратов из этих грибов.
Между тем, существенным ограничением в достижении максимальной эффективности противоопухолевой или антигиперлипидемической терапии является токсичность цитостатиков и статинов. Именно токсические проявления в ходе их применения, как правило, ограничивают проведение адекватного лечения. Терапия зачастую проводится сниженными дозами лекарств с увеличением интервалов между курсами, и, как результат, лечение бывает не всегда удовлетворительным.
Поэтому активно продолжают разрабатываться подходы к снижению токсических проявлений противоопухолевых и гиполипидемических препаратов. Однако до настоящего времени в практической медицине нет достаточно эффективных для широкого применения таких препаратов.
Что касается модуляторов токсичности выделенных из биологически активных веществ высших базидиомицетов, то сведения о подобного рода соединениях в литературе отсутствуют, за исключением разработанной в соответствии с патентом РФ №2192873 и серийно выпускаемой в настоящее время в России биологически активной добавки к пище «Экстракт мицелия вешенки «ОВОДОРИН» в виде геля (Свидетельство о государственной регистрации №77.99.23.3.У.11397.12.09 от 14.12.2009 г.) и в виде сиропа (Свидетельство о государственной регистрации №77.99.23.3.У.11398.12.09 от 14.12.2009 г.)
Известен препарат, влияющий на тканевой обмен, и применение штамма гриба Pleurotus ostreatus 1137 для его получения (патент РФ 2192873, кл. А61К 35/70, 2001 г.), используемый в биотехнологии и медицине при производстве и применении биологически активных добавок к пище на основе грибных продуцентов.
Согласно описанию и формуле этого изобретения известный препарат обладает противоопухолевой активностью и способностью модулировать проявление гематологической токсичности цитостатиков. Препарат производят путем глубинного культивирования гриба Pleurotus ostreatus 1137 (ВКПМ, F-819) с последующим разделением мицелия и культуральной жидкости и выделением из мицелия экстракцией этанолом при кислом или нейтральном значениях рН среды биологически активных веществ с антимикробной активностью, содержащих аминокислоты (глицин, аланин, треонин, серии, лейцин) и углеводы (глюкозу, глюкозамин, арабинозу, ксилозу).
Препарат выполнен в виде обезвоженных гранул или таблеток или в виде гелеобразного сиропа.
Штамм Pleurotus ostreatus 1137 (ВКПМ, F-819) применяется в качестве продуцента физиологически активных веществ с противоопухолевой активностью.
Кроме того, препарат проявляет антимикробную активность в отношении как грамположительных, так и грамотрицательных бактерий.
На основе описанного в патенте штамма гриба Pleurotus ostreatus 1137 (ВКПМ, F-819) получен препарат, обладающий широким спектром лечебно-профилактического действия, в т.ч. и антиоксидантной активностью.
Вместе с тем до настоящего времени исследования по выделению производной стерола (4-hydroxy-17R-methylincisterol) из разработанного экстракта мицелия вешенки (патент РФ №2192873 от 08.05.2001 г.) и его идентификации не проводилось.
Задачей настоящего изобретения является разработка биологически активного препарата на основе штамма гриба Pleurotus ostreatus 1137 с эффективной полифункциональной медико-биологической активностью, влияющего на тканевой обмен без проявления побочных отрицательных эффектов, в т.ч. токсичности, на организм человека.
Технический результат состоит в расширении арсенала действия лекарственного препарата, выделяемого из состава биологически активных веществ экстракта мицелия Pleurotus ostreatus 1137, и снижении токсичности при его применении в качестве препарата с противоопухолевой и гиполипидемической активностями.
21
32
3
Результат достигается тем, что препарат, влияющий на тканевой обмен, получен в результате глубинного культивирования гриба Pleurotus ostreatus 1137 (ВКПМ, F-819) с последующим отделением мицелия от культуральной жидкости и выделением из мицелия экстракцией этанолом при кислом значении рН среды низкомолекулярных от 100 до 500 дальтон биологически активных веществ с последующим выделением из них дихлорметаном производной стерола 4-hydroxy-17R-methylincisterol с установленным молекулярным весом 332.2452 методами UPLC/MS/MS и TOF-масс-спектрометрии, брутто-формулой СНO методом TOF-масс-спектрометрии и структурной формулой методом ЯМР: 13С, APT, HMQC, НМВС и COSY данных
и обладает способностью ингибировать размножение клеток рака и регулировать липидный обмен организма.
Препарат может производиться в виде обезвоженных гранул или таблеток или в виде водно-спиртового раствора или в виде сиропа.
Штамм Pleurotus ostreatus 1137 (ВКПМ, F-819) применяется в качестве продуцента биологически активного вещества производной стерола 4-hydroxy-17R-methylincisterol.
Штамм культуры Pleurotus ostreatus 1137 хранится во Всероссийской коллекции Промышленных Микроорганизмов, ГосНИИгенетика под регистрационным номером ВКПМ, F-819 и характеризуется следующими признаками.
Культурно-морфологическая характеристика
1. Рост на агаризованных средах
Агаризованное сусло
Мицелий хорошо развит, ватообразный. Растущий мицелий стелющийся, край колонии войлочный, ровный. Скорость роста высокая: за 7-9 суток после высева в центр чашки Петри диаметром 10 см наблюдается полное обрастание агаровой среды. Цвет мицелия белый. Экзопигмент отсутствует. При длительном культивировании (до 30 суток) цвет мицелия не меняется.
Гифы септированные, ветвление частое, под острым или прямым углом, тип ветвления моноподиальный. Образуются пряжки. Диаметр большинства гиф от 2 до 4 мкм; также присутствуют гифы с диаметром от 1 до 8 мкм.
Пептонно-триптонный агар
Мицелий хорошо развит, войлочный. Рост стелющийся, растущий край паутинный, ровный. Скорость роста высокая. Цвет мицелия белый, при длительном культивировании (более 21 суток) возможны палевые или светло-коричневые участки. Экзопигмент отсутствует.
Соевый агар
Мицелий скудный, паутинный, сквозь мицелий видна агаровая среда. Характер роста стелющийся, растущий край ровный, паутинный. Скорость роста низкая: после высева в центр чашки Петри диаметром 10 см наблюдается полное обрастание агаровой среды только на 12-14 сутки роста. Цвет мицелия белый. Экзопигмент отсутствует.
2. Глубинное культивирование
Глубинное культивирование осуществляется в колбах емкостью 750 мл с объемом среды 40...150 мл на качалке с 200 оборотами в минуту. Засев проводили кусочками агара с мицелием.
Среда с суслом
Число колоний зависит от нагрузки посевного материала. За 10-14 суток роста образуется несколько плотных колоний округлой формы, сформировавшихся вокруг посевного материала, и/или много мелких дочерних колоний. Цвет мицелия от белого до светло-бежевого. Цвет среды в процессе культивирования осветляется. Прозрачность среды не меняется. Вес мицелия находится в прямой зависимости от концентрации сусла в среде (от 0,6 до 3 баллингов).
Среда с соевой мукой
Число точек роста значительное, что связано с иммобилизацией мицелия на частицах соевой муки в среде. Рост густой кашицеобразный. При отстаивании мицелий практически не оседает.
Физиолого-биохимическая характеристика
Штамм, как и другие представители рода Pleurotus, растет на различных источниках растительного сырья, содержащих целлюлозу.
Штамм утилизирует глюкозу, сахарозу, декстрин, крахмал, целлюлозу, глицерин.
В качестве источника азота штамм использует пептон, триптон, соевую и овсяную муку.
Растет в диапазоне температур от 8 до 34°С, сохраняет жизнеспособность при температуре от 0 до 40°С, оптимальная температура для роста 24°С.
Растет при значениях рН от 4 до 8, при оптимуме от 6 до 7.
Строгий аэроб.
Патогенность
Штамм не патогенен для людей и животных, но, как представитель вида Pleurotus ostreatus, фитопатогенен для ослабленных лиственных деревьев. Базидиоспоры могут вызывать аллергические реакции у людей.
Антагонистические свойства
В условиях глубинного культивирования проявляется антимикробная активность в отношении грамположительных, грамотрицательных бактерий и грибов.
Новое назначение штамма Pleurotus ostreatus 1137 заключается в его применении в качестве продуцента биологически активного вещества производной стерола 4-hydroxy-17R-methylincisterol.
В основу изобретения положено применение штамма Pleurotus ostreatus 1137 для создания на его основе препарата 4-hydroxy-17R-methylincisterol, обладающего способностью ингибировать размножение клеток рака и регулировать липидный обмен организма.
Для поверхностного культивирования Pleurotus ostreatus 1137 и тест-штаммов использовали триптонный агар, а также соевую агаровую среду, овсяную агаровую среду и сусло-агар.
Препарат 4-hydroxy-17R-methylincisterol, влияющий на тканевой обмен, получали биотехническим способом с использованием гриба Pleurotus ostreatus 1137. В соответствии с патентом РФ №2192873 от 08.05.2001 г. указанная культура выращивается глубинным способом в жидкой стерильной питательной среде.
Процесс получения препарата 4-hydroxy-17R-methylincisterol включал 4 последовательно выполняемых этапа:
I ЭТАП - выращивание биомассы мицелия:
- селекционные работы со штаммом;
- приготовление посевного материала (на агаризованной среде);
- глубинное культивирование мицелия (выращивание на жидких средах и отделение мицелия от культуральной жидкости).
II ЭТАП - Приготовление сгущенного экстракта из мицелия Pleurotus ostreatus 1137 в виде геля:
- экстракция;
- фильтрация;
- упаривание экстракта (в вакууме).
III ЭТАП - Выделение из сгущенного экстракта мицелия Pleurotus ostreatus 1137 в виде геля биологически активного вещества производной стерола 4-hydroxy-17R-methylincisterol дихлорметаном.
IV ЭТАП - Приготовление лекарственной формы препарата 4-hydroxy-17R-methylincisterol в виде обезвоженных гранул или таблеток или в виде водно-спиртового раствора или в виде сиропа.
Глубинное культивирование мицелия проводили в колбах объемом 750 мл на среде, содержащей 0,65 баллинга сусла; воду водопроводную, рН не корректировали. Также использовали среду Эттера, среду 2663, мясопептонный бульон и их модификации. Объем среды в колбах составлял 40…150 мл. Для аэрирования колбы помещали на роторную качалку с 200 об/мин. Инкубирование проводили от 7 до 24 суток при температуре 26…28°С.
Тест-штаммы инкубировали при температуре 28…37°С в течение 17…24 час.
Установлено, что из числа испытанных питательных сред наиболее оптимальной для роста мицелия по биомассе и антимикробной активности является 0,65 баллинговое сусло.
Для получения препарата вначале мицелий отделяли от нативного раствора центрифугированием.
Из мицелия биологически активные вещества выделяли экстракцией этанолом при кислом значении рН.
Экстракт упаривали в вакууме до гелеобразного состояния с процентным содержанием воды до 30%. Для биологических испытаний использовали упаренный концентрат в виде геля, выделенный из мицелия при кислом значении pН.
Экстракт мицелия Pleurotus ostreatus 1137 в виде геля представляет собой смесь низкомолекулярных биологически активных веществ, обладающих антимикробной активностью.
Для определения антимикробной активности экстракта мицелия Pleurotus ostreatus 1137 в качестве тест-культур использовали грамположительные и грамотрицательные бактерии.
Грамположительные бактерии:
Bacillus mycoides 537;
Bacillus pumilis NCTC 8241;
Leuconostoc mesenteroides ВКПМ B-4177;
Micrococcus luteus NCTC 8340;
Staphylococcus aureus FDA 209P (MSSA);
Staphylococcus aureus UHA 00761 (MRSA);
Грамотрицательные бактерии:
Escherichia coli ATCC 25922;
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853;
Comamonas terrigena ВКПМ B-7571.
Антимикробную активность экстракта мицелия Pleurotus ostreatus 1137 определяли методом диффузии в агаре.
В чашки Петри диаметром 10 см разливали по 15 мл триптонного агара. На застывшую поверхность среды высевали сплошным газоном тест-культуры.
Концентрат экстракта мицелия Pleurotus ostreatus 1137 в количестве 10 мл наносили на диски фильтровальной бумаги диаметром 6 мм. Диски помещали на поверхность агаровой среды, засеянной тест-культурами.
После суток инкубирования выявляли зоны задержки роста тест-штамма.
В результате установлено, что исследуемый штамм Pleurotus ostreatus 1137 проявляет антимикробную активность в отношении как грамположительных, так и грамотрицательных бактерий (табл.1).
На основе вышеописанного штамма получен препарат 4-hydroxy-17R-methylincisterol, обладающий способностью ингибировать размножение клеток рака и регулировать липидный обмен организма.
Выделение из сгущенного экстракта мицелия Pleurotus ostreatus 1137 в виде геля биологически активного вещества производной стерола 4-hydroxy-17R-methylincisterol дихлорметаном производили следующим образом.
Экстракт мицелия Pleurotus ostreatus 1137 в виде геля (1 г) растворяли в 96% этаноле в концентрации 100 мг/мл. Полученный раствор (аликвоты по 400 мкл) разделяли хроматографически на полупрепаративной - ВЭЖХ-системе Gilson, состоящей из 2-х насосов с головками 25SC, манометрического модуля, смесителя, инжектора с петлей 500 мкл, колоночного термостата и делителя потока (1:10), УФ-детектора с переменной длиной волны и управляющей программы. Была использована полупрепаративная колонка 24·250 мм с сорбентом Диасорб С16Т (10 мкм). Состав подвижной фазы: 96% этанол/0.1% трифторуксусная кислота в воде 60:40, при скорости потока 10 мл/мин и температуре 30°С. Возможно использование аналогичной хроматографической системы и аналогичной обращено-фазной колонки. Время анализа - 40 мин, детектирование при длине волны 230 нм, интересующий пик имеет время удерживания 20-25 мин. Фракцию, содержащую интересующий пик, собирали, добавляли 30% раствор аммиака до нейтрального значения рН 6-8 и упаривали на роторном испарителе при температуре 45-55°С на 2/3 по объему до появления опалесценции раствора. К оставшемуся раствору добавляли равный объем дихлорметана, экстрагировали и органический слой отделяли на делительной воронке.
Органический слой упаривали на роторном испарителе без нагревания и растворяли в 1 мл 96% этанола. Полученный раствор (аликвоты по 100 мкл) разделяли с помощью аналитической ВЭЖХ на системе Agilent 1100, состоящей из четырехканального насоса с дегазатором, колоночного термостата, автосамплера, диодно-матричного УФ-детектора и управляющей программы ChemStation. Была использована аналитическая колонка 4,6·250 мм с сорбентом Luna С 18(2) (5 мкм). Возможно использование аналогичной хроматографической системы и аналогичной обращено-фазной колонки. Состав подвижной фазы: ацетонитрил/вода 79:21, при скорости потока 1 мл/мин и температуре 25°С. Время анализа - 21 мин, детектирование при длине волны 230 нм, интересующий пик имеет время удерживания 15-18 мин. Фракцию, содержащую интересующий пик, собирали и упаривали на роторном испарителе при температуре 45-55°С на 2/3 по объему до появления опалесценции раствора. К оставшемуся раствору добавляли равный объем дихлорметаном, экстрагировали и органический слой отделяли на делительной воронке. Органический слой упаривали на роторном испарителе без нагревания, растворяли в 1 мл дихлорметана и сушили в эксикаторе. Выход препарата 4-hydroxy-17R-methylincisterol составил 8 мг.
Хроматограмма исходного раствора (анализ экстракта дихлорметаном на аналитической колонке Luna C18(2) (5 мкм) 4,6·150 мм, подвижная фаза: ацетонитрил/вода/1% ТФУ в воде=79:16:5, скорость потока 1,5 мл/мин при 25°С, детекция при 230 нм, время удерживания интересующего вещества 6-7 мин, время анализа 13 мин) приведена на фиг.1.
Пример полупрепаративного разделения на аналитической ВЭЖХ-системе: анализ фракции после препаративного ВЭЖХ на аналитической колонке Luna С18(2) (5 мкм) 4,6·250 мм подвижная фаза: ацетонитрил/вода 79:21, скорость потока 1,0 мл/мин при 25°С, УФ-детекция при 230 нм приведена на фиг.2 (время удерживания вещества 16 мин).
Хроматограмма очищенного вещества (аликвота 10 мкл: ВЭЖХ на аналитической колонке Luna C18(2) (5 мкм) 4,6·250 мм подвижная фаза: ацетонитрил/вода 79:21, скорость потока 1,0 мл/мин при 25°С, детекция при 230 нм) приведена на фиг.3.
21
32
3
Молекулярная формула СНO была определена по точной массе методом времяпролетной UPLC/MS/MS масс-спектрометрии. Спектр 13С содержит 21 сигнал атомов углерода. Число протонов, присоединенных к каждому атому, было определено комбинированием спектров 13С, 1Н, APT и HMQC. Химические сдвиги и мультипликативность углеродных сигналов приведены в таблице 2.
Результаты определения молекулярного веса и брутто-формулы приведены на фиг.4, 5, 6.
На фиг.4 разница между пиками 688 и 1021 составляет 333. 333.16+23(Na+)=356.16, 332.52·2+23=688.04, 332.54·3+23=1020.62.
На фиг.5 ион 331.38 соответствует массе 332.38. Разница между пиками 331.38 и 663.97 составляет 332.59. 332.34·3-1=996.01, 332.28·4-1=1328.12. Вывод: молекулярный вес 332.28-333.16 ем.
На фиг.6 приведено определение точной массы, которое проводили методом времяпролетной масс-спектрометрии (TOF).
21
32
3
355.2295=CНONa+(15ppm);
21
33
3
333.2452=CНО+(8ppm).
Проведенные по программе «Structure Elucidator/ACDlabs (Канада)» [Журнал Аналитической химии, 2008, т.63, No.1, cc.18-26] структурные исследования позволили установить структуру препарата.
Структура определялась комбинированием 13С, APT, HMQC, НМВС и COSY данных. Для определения относительной конфигурации оптически активных центров был использован спектр ROESY.
Программа генерирует набор структур, которые соответствуют исходным данным по химическим сдвигам и 2D корреляциям.
Спектр COSY содержит 27 однозначных корреляций, которые показаны на предложенной структуре в виде прерывистой линии (фиг.7). Практически все теоретически возможные корреляции COSY присутствуют в спектре. Только корреляции между двумя парами атомов не были найдены в спектре - в основном из-за маскировки другими корреляциями с близким химическим сдвигом. Например, корреляция между атомами 8 и 12 (1.49-1.88 ppm) очень близка по химическому сдвигу к корреляции между двумя протонами, присоединенными к атому 7 (1.48-1.92). Корреляция между атомами 7 и 15 (1.48-1.50 ppm) слишком близка к интенсивным диагональным пикам. Дополнительно на спектре присутствует одна корреляция между атомами 14 и 17, показанная на фиг.7 в виде прерывистой линии с точками. Информация, полученная из спектра COSY, позволила однозначно установить скелет молекулы.
Циклическая часть молекулы содержит несколько четвертичных атомов углерода, которые не могут быть установлены с помощью спектра COSY. Поэтому для определения этой части молекулы использован спектр НМВС. Спектр НМВС содержит 85 корреляций (фиг.8 и табл.2). Все теоретически возможные корреляции (2J и 3J) были найдены в спектре НМВС. Дополнительно 4 дальнодействующие корреляции (4J) присутствуют в спектре. Эти корреляции выделены на фиг.8 в виде прерывистой линии с точками.
Установленная структура имеет самое лучшее соответствие с углеродным спектром (среднее отклонение между рассчитанными и экспериментальными значениями составляет 2.6 ppm).
Все вышесказанное позволяет утверждать, что структура препарата установлена однозначно.
Определение стереоконфигурации
Е-конфигурация двойной связи была определена на основании константы спин-спинового взаимодействия (15.1 Hz). Для определения относительной стереоконфигурации четырех стереоцентров циклической системы использовался спектр ROESY. Два стереоцентра в боковой цепи не рассматривались (из-за наличия свободного вращения). Для всех возможных 16 (24) стереоизомеров были рассчитаны расстояния между атомами и сравнены с соответствующими дистанциями, определенными из объемов пиков спектра ROESY. Наиболее вероятная стереоконфигурация изомера приведена на фиг.9 и фиг.10.
На фиг.9 стереоцентры с неопределенной конфигурацией отмечены звездочкой.
На фиг.10 показана 3D модель структуры с ключевыми корреляциями NОЕ.
Следует учесть, что описанный метод пригоден только для определения относительной стереоконфигурации и соединение может иметь зеркальную стереоконфигурацию. Тем не менее, данная конфигурация является предпочтительной, т.к. в общих частях совпадает с конфигурацией известных природных соединений.
1
Химические сдвиги H показаны на фиг.11.
13
Химические сдвиги С показаны на фиг.12.
Задача медико-биологических исследований препарата 4-hydroxy-17R-methylincisterol состояла в получении данных, гарантирующих безопасность его применения в лечебных целях.
Изучены:
- токсическое действие препарата на мышах обоего пола линии BAL В/С, разведения питомника РАМН «Столбовая», в остром эксперименте;
- действие препарата на клеточном уровне in vitro при использовании относительно простой системы культивируемых клеток - нормальных (фибробласты человека) и трансформированных (Hela);
1
57
2
- противоопухолевая активность препарата на модели солидной опухоли меланомы В-16, перевиваемой инбредным мышам BDF - гибриды первого поколения f1 (CB 1/6×DBA) разведения питомника РАМН «Столбовая»;
- гиполипидемическая активность препарата на модели атерогенной холестериновой диеты белым нелинейным лабораторным половозрелым самцам-крысам, полученным из питомника ФГУП ОПХ «Манихино».
Исследования токсического действия препарата 4-hydroxy-17R-methylincisterol проводили с применением двух доз: 100 мг/кг, 200 мг/кг.
В эксперименте были задействованы две группы мышей по 10 особей в каждой группе.
Исследования проводили на мышах с массой ~40 г при однократном внутрижелудочном способе введения препарата. Перед применением препарата каждую его дозу растворяли в 0,5 мл дистиллированной воды. Срок наблюдения составил 14 суток.
Критериями токсического действия исследуемых доз препарата служили: количество павших животных, сроки гибели животных, клиническая картина интоксикации, изменения массы тела в течение всего срока наблюдения, поведение животных, данные аутопсии.
Результаты токсического действия исследуемых доз препарата приведены в табл.3, 4.
В результате проведения указанной серии экспериментов установлено следующее.
При однократном внутрижелудочном введении препарата в испытываемых дозах 100 мг/кг, 200 мг/кг в обеих группах мышей внешних клинических проявлений не наблюдалось.
Внешний вид. В течение 14 суток наблюдения животных шерстяной покров гладкий. По внешнему виду животные между группами не отличались. У животных не отмечали ухудшения аппетита. Стул оформлен, обычного цвета.
Поведение. В течение наблюдения животных подавленности общего состояния животных не наблюдалось.
Смертность. Смертности, произошедшей от введения препарата, не выявлено на протяжении всего срока наблюдения. В группе введения препарата в дозе 100 мг/кг на 13 день пало одно животное вследствии агрессии других особей (см. табл.3).
Масса животных. В течение всего срока наблюдения произведено два контрольных взвешивания. Резкой потери или увеличения массы не выявлено (см. табл.4).
Внутренние органы. При аутопсии мышей по окончании опыта (после14 суток наблюдения) макроскопические внутренние органы без патологии. По состоянию внутренних органов обеих групп мышей они не отличались друг от друга.
Учитывая данные токсических исследований, дальнейшее изучение медико-биологических свойств препарата 4-hydroxy-17R-methylincisterol проводилось в двух однократно в сутки применяемых дозах: 100 мг/кг, 200 мг/кг массы животных.
При исследовании действия препарата на клеточном уровне in vitro в качестве модели для испытаний использовали культивируемые клетки (нормальные и трансформированные). Задачей этих исследований было изучение индивидуального действия препарата на клеточном уровне с использованием относительно простой системы культивируемых клеток - нормальных (фибробласты человека) и трансформированных (Hela).
Количественная оценка потивоопухолевой эффективности действия препарата 4-hydroxy-17R-methylincisterol на уровне in vitro проводилась в сравнении с противоопухолевым действием экстракта мицелия Pleurotus ostreatus 1137 (ВКПМ, F-819) и цитостатика циклофосфан.
Для количественной оценки эффективности действия указанных препаратов использовались показатели, характеризующие жизнеспособность популяции культивируемых клеток, в том числе митотический и апоптический индексы. Митотический индекс отражает способность клеточной популяции к размножению, а апоптический индекс показывает долю клеток, активирующих запрограммированную гибель. Известно, что в злокачественных опухолях апоптоз подавлен, что приводит к интенсивному размножению раковых клеток и формированию метастаз.
Полученные результаты показали, что при индивидуальном действии экстракт мицелия Pleurotus ostreatus 1137 (ВКПМ, F-819) в дозах 100 мг/кг, 200 мг/кг является слабо выраженным индуктором апоптоза и вызывает аномальную сегрегацию хромосом на стадии метафазы и появление хромосомных аберраций типа «мост» на стадии анафазы.
При сочетанном применении экстракта мицелия Pleurotus ostreatus 1137 (ВКПМ, F-819) и циклофосфана проявляется ярко выраженный синергизм, который, в зависимости от концентрации реагентов (экстракт 100 мг/кг, циклофосфан 50 мг/кг и 100 мг/кг) и способа их инсталляции, выражается в частичном подавлении пролиферации и в индукции апоптоза.
Установлено, что сочетанное применение этих препаратов детерминирует способность раковых клеток к включению программы их апоптической гибели. При этом противораковый эффект экстракта мицелия Pleurotus ostreatus 1137 (ВКПМ, F-819) не связан непосредственно с его цитотоксическим действием, а скорее приводит к активации некоторых ферментных систем, в том числе, супероксидисмутазы. Вместе с тем подобный эффект не проявляется у нормальных фибробластов человека.
По результатам исследования препарата 4-hydroxy-17R-methylincisterol установлено, что его применение в дозах 100 мг/кг, 200 мг/кг эквивалентным дозам препарата, 100 мг/кг, 200 мг/кг, в культивируемых трансформированных клетках Hela через 24 часа вызывает ярко выраженный апоптический эффект.
Заявленный препарат в применяемых дозах является сильным индуктором апоптоза в культивируемых трансформированных клетках, увеличивая в 20-30 раз, по сравнению с контролем, количество апоптических клеток. При этом не оказывает апоптического и митостатического действия на нормальные фибробласты.
На основании полученных результатов цитологических исследований культивируемых клеток было установлено, что главным механизмом антиракового эффекта препарата 4-hydroxy-17R-methylincisterol является стимуляция апоптоза в раковых клетках, поэтому разработанный препарат в чистом виде является индуктором апоптоза раковых клеток.
При изучении противоопухолевой активности препарата 4-hydroxy-17R-methylincisterol у животных на модели солидной опухоли меланомы В-16 в эксперименте принимали участие 4 группы мышей (по 8 мышей в каждой группе):
1-я группа - интактный контроль с трансплантированной мышам опухолью меланомы В-16;
2-я группа - трансплантированная мышам опухоль меланомы В-16 с введением препарата 4-hydroxy-17R-methylincisterol в дозе 100 мг/кг, перорально, десятикратно, ежедневно, в первые 10 суток. В первые сутки препарат вводили через 1 час после трансплантации мышам опухоли и затем в последующие 9 суток ежедневно;
3-я группа - трансплантированная мышам опухоль меланомы В-16 с введением циклофосфана (ЦФ) в дозе 50 мг/кг, внутрибрюшинно, однократно, в первые сутки;
4-я группа - трансплантированная мышам опухоль меланомы В-16 с введением сочетанного применения ЦФ в дозе 50 мг/кг, внутрибрюшинно, однократно, в первые сутки и препарата 4-hydroxy-17R-methylincisterol в дозе 100 мг/кг, перорально, десятикратно, ежедневно, в течение 1…10 суток.
Ежедневно во всех 4-х группах проводили осмотр животных для оценки наличия и степени выраженности опухоли (визуально и пальпаторно), а также признаков возможной интоксикации. Фиксировали: среднюю массу опухоли (г); торможение роста опухоли (ТРО) (в %); среднюю продолжительность жизни животных (сутки); увеличение средней продолжительности жизни животных экспериментальных групп относительно продолжительности жизни животных контрольной группы (в %).
Результаты исследований этой серии экспериментов приведены на фиг.13 и в табл.5.
В частности, на фиг.13 показаны результаты противоопухолевой активности 4-hydroxy-17R-methylincisterol и его сочетанного применения с ЦФ на модели меланомы В-16, где:
1 - группа мышей интактного контроля с трансплантированной опухолью меланомы В-16;
2 - экспериментальная группа мышей с трансплантированной опухолью меланомы В-16 с введением препарата 4-hydroxy-17R-methylincisterol в дозе 100 мг/кг, перорально, десятикратно, ежедневно, в первые 10 суток;
3 - экспериментальная группа мышей с трансплантированной опухолью меланомы В-16 с введением ЦФ в дозе 50 мг/кг, внутрибрюшинно, однократно, в первые сутки;
4 - экспериментальная группа мышей с трансплантированной опухолью меланомы В-16 с введением сочетанного применения ЦФ в дозе 50 мг/кг, внутрибрюшинно, однократно, в первые сутки и препарата 4-hydroxy-17R-methylincisterol в дозе 100 мг/кг, перорально, десятикратно, ежедневно, в течение 1…10 суток.
При анализе данных динамики изменения контролируемых показателей в контрольной и экспериментальных группах мышей (см. фиг.13 и табл.5) отмечено, что как при применении заявляемого препарата 4-hydroxy-17R-methylincisterol, так и при сочетанном применении с ЦФ в течение всего времени наблюдения проявляется его противоопухолевый эффект.
Так, например, применение препарата 4-hydroxy-17R-methylincisterol 2-й экспериментальной группой мышей увеличивает по сравнению с 1-й группой мышей интактного контроля среднюю продолжительность их жизни на 25%, применение ЦФ на 10%, а их сочетанное применение на 100%.
При этом средняя продолжительность жизни в 1-й группе мышей интактного контроля составила 20,0±0,6 суток, во 2-й группе мышей 25,0±0,9 суток, в 3-й группе мышей 21,0±0,5 суток, в 4-й группе мышей 40,0±0,5 суток.
Остальные наблюдаемые показатели с доказательством эффективности применяемого препарата 4-hydroxy-17R-methylincisterol приведены в табл.5.
Обобщая результаты изучения эффективности препарата 4-hydroxy-17R-methylincisterol, установлено, что кроме проявления противоопухолевого эффекта применение препарата как отдельно, так и в сочетании с ЦФ существенным образом улучшает клиническую картину «качества» жизни животных (активность, внешний вид, состояние шерсти, поведенческие реакции, масса тела, отсутствие диареи) по сравнению с животными, получившими только ЦФ, а также по сравнению с контрольными опухолевыми мышами.
При изучении гиполипидемической активности препарата у животных на модели атерогенной диеты (АД) в эксперименте принимали участие 4 группы беспородных лабораторных половозрелых самцов-крыс с исходной массой тела 300-350 г (по 8 крыс в каждой группе):
1-я группа - интактный контроль;
2-я группа - атерогенная диета (АД);
3-я группа - АД с применением известного препарата сравнения «Зокор» (симвастин) фирмы «Мерк Шарп и Доум Б.В.», Нидерланды, серии NJ41170, со сроком годности до 08.2010 г. (использован в марте 2009 г.) в дозе 8 мг/кг, перорально, десятикратно, ежедневно, после первых 4 суток применения АД;
4-я группа - АД с заявляемым препаратом 4-hydroxy-17R-methylincisterol в дозе 2 мг/кг, перорально, десятикратно, ежедневно, после первых 4 суток применения АД.
Все испытываемые вещества вводили крысам перорально с интервалом 3 часа после атерогенной нагрузки в течение последних 10 дней АД.
В течение всего эксперимента вели лист наблюдения: выживаемость, общий вид, состояние и поведение животных, изменение массы тела (взвешивание крыс проводили один раз в неделю).
В конце эксперимента у животных после 18 часов голодания брали кровь из хвостовой вены в центрифужные пробирки. Кровь центрифугировали и отбирали сыворотку для проведения биохимических анализов: содержание общего холестерина (ХС общ.); холестерина липопротеинов высокой плотности (ХС ЛПВП); холестерина липопротеинов низкой плотности (ХС ЛПНП); холестерина липопротеинов очень низкой плотности (ХС ЛПОНП); триглицеридов (ТГ); индекс атерогенности (К атер.).
Анализы проводились унифицированными методами на биохимическом фотометре «Стат факс 1904+» производства США с использованием стандартных наборов реагентов.
Результаты исследований этой серии экспериментов приведены на фиг.14, 15 и табл.6, 7.
В частности, на фиг.14 показаны результаты биохимических показателей липидного обмена интактных животных и животных, содержащихся на АД.
На фиг.15 показаны результаты биохимических показателей липидного обмена у подопытных групп крыс, в том числе и у 4 группы, применявшей АД с заявляемым препаратом 4-hydroxy-17R-methylincisterol.
При анализе данных динамики изменения контролируемых показателей экспериментальных групп крыс (фиг.14, 15 и табл.6, 7) отмечено, что:
- во 2-й группе животных, находящихся только на атерогенной диете (фиг.14, табл.6), наблюдаются достоверные отличия в биохимических анализах крови, по отношению к интактным животным (1-я группа);
- после 14 дней атерогенной нагрузки у крыс 2-й группы в сравнении с 1-й интактной группой наблюдается повышение содержания ХС в 1,5 раза (2,9 ммоль/л - против 2 ммоль/л), ХС ЛПНП - в 2,3 раза (1,8 ммоль/л - против 0,8 ммоль/л), ХС ЛПВП на 25%. Содержание ТГ выше в 1,2 раза. За счет повышения ХС и снижения его в антиатерогенных фракциях липопротеидов (ХС ЛПВП) индекс атерогенности (К атер.) возрос более чем в 2 раза (1,8 у.е. - против 3,7 у.е.) в группе животных, получавших атерогенную нагрузку.
Сравнивая показания липидного обмена 3-й и 4-й подопытных групп животных (см. фиг.15, табл.6), можно сделать вывод о том, что введение препарата «Зокор» и заявляемого препарата 4-hydroxy-17R-methylincisterol вызывают уменьшение содержания ХС, хотя эти вещества не одинаково действуют на его снижение. Для препарата «Зокор» наблюдается незначимое снижение этого показателя по сравнению с группой АД. Заявляемый препарат в 4-й группе оказал самое большое влияние на снижение ХС у животных - его уровень оказался почти таким же, как и в 1-й группе интактных крыс - 1,9 ммоль/л.
Содержание антиатерогенной фракции холестерина (ХС ЛПВП) оказалось достоверно выше в 3-й и 4-й группах, получающих «Зокор» и заявляемый препарат. Причем средний показатель этой фракции оказался одинаков для групп, получающих препараты, и интактных животных - 0,7 ммоль/л.
В этих группах содержание ТГ в сыворотке крови оказалось ниже, чем в группе интактных животных.
В крови крыс при добавлении к АД препарата «Зокор» не происходило такого снижения ХС в атерогенной фракции липопротеидов (ХС ЛПНП - 1,8 ммоль/л), как в 4-й группе, получающих заявляемый препарат 4-hydroxy-17R-methylincisterol, что явилось достоверным к группе интактных животных (0,8 ммоль/л). У животных, получавших заявляемый препарат, наблюдается значимо низкое содержание ХС ЛПНП (1,1 ммоль/л) по отношению к животным с АД. Это отразилось и на индексе атерогенности: он оказался достаточно низким - 1,9 у.е. для заявляемого препарата, что превышает всего на 0,1 у.е. индекс атерогенности 1-й группы интактных животных.
По результатам патоморфологических исследований состояния внутренних органов экспериментальных групп животных установлено, что исследуемые органы (грудная и брюшная полости крыс, легкие, щитовидная железа, тимус, сердце, слизистая пищевода, желудок, толстый и тонкий кишечник, поджелудочная железа, селезенка, почки, мочевой пузырь, печень) у подопытных животных 3-й и 4-й групп не отличаются от 1-й группы интактного контроля крыс.
Средние показатели массы тела животных приведены в табл.7.
Таким образом, заявляемый препарат 4-hydroxy-17R-methylincisterol восстанавливает биохимические показатели липидного спектра крови и оказывает липидрегулирующее действие при экспериментальной гиперлипидемии, вызываемой атерогенной диетой.
Заявляемый препарат 4-hydroxy-17R-methylincisterol может быть получен биотехническим способом с использованием культуры гриба Pleurotus ostreatus 1137.
Указанная культура выращивается глубинным способом в жидкой стерильной питательной среде.
Для производства препарата 4-hydroxy-17R-methylincisterol используют:
- агар микробиологический по ГОСТ 17206-84;
- сусло пивное пищевое ГОСТ 51-174-98;
- мицелий гриба вешенки (штамм 1137, BKПM-F819), выращенный в погруженных условиях;
- спирт этиловый ректификат по ГОСТ Р51652-2000;
- кислоту соляную по ГОСТ 3118-77;
- воду питьевую по ГОСТ 2874, ГОСТ Р 51232-98;
- фруктозу кристаллическую, CF4118136AG, фармакопея Германия DAB;
- кислоту лимонную пищевую, ГОСТ 908-79, сорт высший;
- бензоат натрия, 3382SE023494C4, фармакопея Германия DAB;
- дихлорметан ХЧ, ТУ 2631-019-44493179-98, Россия.
Технологический процесс получения препарата промышленным способом с использованием для его получения культуры гриба Pleurotus ostreatus 1137 иллюстрируется следующим примером.
Как указывалось выше в данном описании, технологический процесс получения препарата включает 4 этапа и состоит из следующих операций.
На первом этапе выращивания биомассы мицелия селекционные работы со штаммом (поддержание штамма) проводятся путем пересева на свежую агаровую среду. Для проведения селекционной работы проводится рассев спор, выделение моноспоровых вариантов и оценка их свойств, что позволяет поддерживать целевые признаки культуры.
Посевной материал выращивается в пробирках со скошенной агаровой средой, в составе которой присутствуют пивное сусло, агар и вода. После засева пробирки помещают на 10-12 суток в термостат с температурой 28°С.
Глубинное культивирование мицелия осуществляется в жидкой среде, состоящей из пивного сусла (10%) и питьевой воды. Посевной мицелий со скошенного агара вносят в среду из расчета 1 пробирка посевного материала на 1 л среды. Продолжительность культивирования 12-14 суток при постоянном аэрировании. Выращивание проводится в термостатируемом помещении, оснащенном датчиками контроля с самописцами при температуре воздуха t=28°С.
Отделение выращенной биомассы мицелия от культуральной жидкости производится фильтрованием через, например, марлю до полного истечения жидкости из биомассы. Полученный влажный мицелий подвергается экстракции.
На втором этапе приготовления экстракта мицелия отделенную от культуральной жидкости влажную мицелиальную массу механически измельчают до минимально мелкой фракции и заливают спиртом этиловым ректификатом с добавленной соляной кислотой в концентрации 0,1%. Экстракция проводится в течение 20 часов при температуре 4°С в холодильной камере.
После окончания периода экстракции мицелий отделяется путем фильтрации через марлю, а полученный спиртовой экстракт упаривают в вакуумной установке до состояния вязкого однородного концентрата в форме сгущенного экстракта (геля) постоянного веса с содержанием воды до 30%. Для контроля на соответствие берется навеска получаемого экстракта и определяется содержание углеводов, аминокислот и воды (в соответствии с п.4.6., ГФ ХI, вып.1, с.177).
На третьем этапе из полученного сгущенного экстракта мицелия вешенки в виде геля производится выделение производной стерола 4-hydroxy-17R-methylincisterol с применением дихлорметана.
Пример выделения производной стерола из экстракта производится вышеописанным способом.
На четвертом этапе производится приготовление лекарственной формы препарата 4-hydroxy-17R-methylincisterol в виде обезвоженных гранул или таблеток, или в виде водно-спиртового раствора, или в виде сиропа.
После анализа качества препарат подвергают фасовке и упаковке.
Таким образом, проведенный комплекс исследований заявляемого препарата подтвердил его высокую физиологическую активность с эффективной полифункциональной медико-биологической активностью.
Физиологическое действие препарата заключается в его способности оказывать влияние на тканевый обмен без проявления побочных отрицательных эффектов, в т.ч. токсичности, на организм человека и модулировать проявление противоопухолевой и гиполипидемической активностей.
Применение заявляемого препарата 4-hydroxy-17R-methylincisterol с таким физическим проявлением свойств позволит расширить арсенал действия лекарственного препарата, выделенного из состава биологически активных веществ экстракта мицелия Pleurotus ostreatus 1137, и снизить токсичность при его применении в качестве препарата с противоопухолевой и гиполипидемической активностями.
Таблица 4
Масса тела мышей
№ групп
Группы животных
Масса тела, г
До эксперимента
После эксперимента
1
100 мг/кг
40,1±0, 3
38,2±3,8
2
200 мг/кг
40,9±0, 9
39,2±2,1
Р
р>0,05
р>0,05
Таблица 5
Результаты противоопухолевой активности препарата 4-hydroxy-17R-methylincisterol при его индивидуальном и сочетанном
применении с Циклофосфаном
№ групп
Характер групп
Суточная доза (мг/кг)
Средний объем опухоли (см<sup>3</sup>)
ТРО (%)
Средняя продолжительность жизни животных (сутки)
Увеличение средней продолжительности жизни животных (%)
1
Интактный контроль
-
5,8±0,5**
-
20,0±0,6
-
2
Заявляемый препарат
100
4,5±0,55**
20*
25,0±0,9
25
3
ЦФ
50
2,0±0,25**
50*
21,0±0,5
10
4
Заявляемый препарат+ЦФ
100+50
1,4±0,15**
70*
40,0±0,5
100
* оценка ТРО на 18 сутки после перевивки опухоли;
** оценка среднего объема опухоли на 20 сутки после перевивки опухоли.
Таблица 7
Средние показатели массы животных
№ групп
Характер групп
Суточная доза препарата
Масса животных (г) (М±m)
Начало эксперимента
Начало введения препаратов
Окончание эксперимента
1
Интактный контроль
-
338,9±7,64
339,7±9,57
328,3±8,41
2
АД
5 мг/кг
334,9±7,53
335,7±7,51
337,3±10,68
3
АД+препарат сравнения Зокор
8 мг/кг
338,4±7,35
348,1±8,87
340,7±15,60
4
АД+заявляемый препарат
2 мкг/г
330,0±6,90
337,9±6,79
337,7±8,12