Влияние трипсина и ингибитора трипсина соевых бобов на свертывание крови, фибринолиз, агрегацию тромбоцитов и гемолитическую активность комплемента in vitro

индексы тонуса и реактивности, а также коэффициент асимметрии кровенаполнения статистически значимо не изменились за время применения ортодонтического лечения.

Следовательно, можно говорит о том, что при аномалии прикуса наблюдается изменение гемодинамики по сосудам экстракраниальных артерий, а вследствие ортодонтического лечения брекет-системой, при перемещении зуба и установке правильного положения его в зубной дуге, происходит изменение гемодинамики в лицевой артерии, поверхностной височной артерии, верхнечелюстной артерии.

литература

1. гусева Е.и. Методы исследования в неврологии и нейрохирургии. М.: нолидж, 2000. 336 с.

2. Зенков л.н., Ронкин М.П., Максименко и.М. и др. Функциональная диагностика нервных болезней. М.: Медицина, 1991. 64 с.

3. кованов В.В., Аникина Т.В. Хирургическая анатомия артерий человека. М.: Медицина, 1974. С. 360.

4. кунцевич Т.Н. Ультразвуковая допплерография сосудов дуги аорты и их ветвей: Мет. рек. М., 1996. 30 с.

5. Никитин Ю.М. Ультразвуковая допплерография в диагностике поражений магистральных артерий головы и основания мозга. М.: Институт неврологии РАМН, 2003. 46 с.

6. Рулье К.Ф. Цит. Давыдовский И.В. Общая патология человека. М., 1969. 19 с.

7. Сепетлиев д. Статистические методы в научных медицинских исследованиях. М.: Медицина. 1968. 420 с.

8. Susami Т., Kuroda Т., Amagasa Т. // Cleft. Palate Craniofac. J. 1996. Vol. 33, №.5. Р. 445-449.

9. Yilmaz S., Kiliec A.R., Keles A. // Am. Jourmal Orthod. Dentofacial Orthop. 2000. Vol. 117, №2. Р. 156-163.

удК 633.1 : 577.1

и.Э. Иамирский, м.А. штарберг, и.г. Белоглазова, Е.А. Бородин

влияние трипсина и ингибитора трипсина соевых бобов на свертывание крови, фибринолиз, агрегацию тромбоцитов и гемолитическую активность комплемента in vitro

Амурская государственная медицинская академия, г. Благовещенск

Соевые бобы содержат в значительных количествах ингибитор трипсина (СИТ), количество которого составляет до 10% от общего содержания белков [1]. Большая часть СИТ термолабильна и разрушается в процессе термической обработки соевых продуктов [2]. Около 20% СИТ термостабильны и, попадая в составе соевых продуктов в желудочно-кишечный тракт, частично могут всасываться [3]. Ранее нами было установлено, что прием соевых коктейлей здоровыми молодыми людьми на протяжении 2 нед. сопровождался снижением общей протеолитической активности сыворотки крови [4]. С целью ответа на вопрос: на какие протеолитические процессы, протекающие в организме, может оказывать влияние СИТ, в настоящей работе нами проведено исследование влияния очищенного СИТ на свертывание крови, фибринолиз, агрегацию тромбоцитов и гемолитическую активность комплемента в условиях in vitro.

Материалы и методы

В работе использованы СИТ производства «Реанал»

— фармацевтический препарат «Гордокс» производства «Гедеон Рихтер» (Венгрия), комплемент лиофилизиро-ванный и гемолитическая диагностическая сыворотка жидкая «Эколаб» (Россия). Показатели, характеризующие свертывание крови (тромбиновое время, протромбино-вое время, активированное время реакции) и фибринолиз (фибринолиз-тест) определяли с помощью стандартных наборов реактивов общепринятыми в клинической лабораторной диагностике методами. Агрегацию тромбоцитов исследовали на анализаторе агрегации тромбоцитов «Solar АР 2110» кинетическим методом по уменьшению светопоглощения плазмы крови. Кровь забирали у здоровых людей утром натощак из локтевой вены самотеком в силиконированные пробирки. В качестве антикоагулянта использовали 3,8% раствор нитрата натрия, добавляемый к крови в соотношении 1 : 9. Обогащенную тромбоцитами плазму получали центрифугированием крови при 100 g в течение 15 мин. Для получения бестромбоцитной плазмы, используемой для установки нулевой точки, принимаемой за 100%-ное пропускание, оставшийся после отбора

обогащенный тромбоцитами плазмы осадок повторно центрифугировали при 2000g в течение 15 мин. Эту же плазму использовали для стандартизации (разведения) обогащенной тромбоцитами плазмы до оптимального содержания тромбоцитов — 200-250х109/л. Объем инкубационной смеси — 0,5 мл. Агрегацию тромбоцитов инициировали внесением АДФ или адреналина в конечной концентрации 2,5-5х10-6 М. Влияние СИТ и ПИТ на гемолитическую активность комплемента изучали по скорости гемолиза эритроцитов в гемолитической системе в присутствии комплемента. Процесс гемолиза регистрировали на анализаторе агрегации тромбоцитов «Solar АР 2110» по уменьшению оптической плотности гемолитической системы (гемолитическая сыворотка и эритроциты барана) в динамике. За 100%-ное пропускания принимали пробу с полным гемолизом эритроцитов. Инкубационная смесь объемом 3 мл содержала 1,9 мл физиологического раствора, 1 мл гемолитической системы и 0,1 мл комплемента в контрольной пробе. В опытных пробах осуществляли пре-динкубацию комплемента с трипсином, СИТ или ПИТ в различных конечных концентрациях на протяжении 5 мин. Трипсин-ингибиторную активность СИТ и ПИТ измеряли по замедлению скорости гидролиза БАЭЭ трипсином спектральным методом по поглощению при 253 нм [5].

результаты и обсуждение

Как видно из представленных в таблице результатов исследования влияния трипсина и СИТ на свертывание крови и фибринолиз, добавление к плазме крови трипсина в конечной концентрации 0,1% сопровождается уменьшением в 1,5-2 раза величин протромбинового и тромбино-вого времени, активированного времени реакции, отражая возрастание скорости свертывания крови под влиянием экзогенной протеазы. Внесение в инкубационную смесь СИТ в конечной концентрации 0,1% оказывает противоположный эффект и приводит к увеличению указанных показателей в 1,5-3 раза. Аналогичное влияние трипсин и СИТ оказывают на фибринолиз. Время растворения тромба (фибринолиз-тест) уменьшается в 2 раза при добавлении трипсина и увеличивается в 2,5 раза при добавлении СИТ. Полученные результаты ясно указывают, что трипсин и СИТ, не имеющие непосредственного отношения

Рис. 1. Влияние трипсина и СИТ на АДФ-инициируемую агрегацию тромбоцитов: кривая 1 — плазма крови; кривая 2 — плазма + трипсин; кривая 3 — плазма + СИТ. Условия получения обогащенной тромбоцитами плазмы крови и регистрации агрегации тромбоцитов

резюме

в условиях in vitro трипсин увеличивает скорость свертывания крови, фибринолиза, Адф- и адреналин-иници-ируемой агрегации тромбоцитов, а соевый ингибитор трипсина замедляет скорость этих процессов. в низких концентрациях трипсин замедляет скорость гемолиза эритроцитов в гемолитической системе в присутствии комплемента, а в более высоких предупреждает гемолиз. соевый и панкреатический ингибиторы трипсина не влияют на гемолитическую активность комплемента. соевый ингибитор трипсина не уступает по ингибиторной активности панкреатическому и может явиться основой для создания фармацевтического препарата ингибитора протеаз.

I.E. Pamirsky, M.A. Shtarberg, I.G. Beloglazova, E.A. Borodin

the influence of trypsin and soy bean

TRYPSIN INHIBITOR ON BLOOD cLOTTING,

fibrinolysis, platelets aggregation AND hemolytic ACTIVITY OF THE cOPMPLEMENT IN VITRO

Amur state medical academy, Blagoveshchensk Summary

Trypsin increases the rate blood clotting, fibriniolysis, ADP-and adrenaline-initiated platelets aggregation whole soy bean trypsin inhibitore decreases the rate of these processes in vitro. In low concentrations trypsin slows down the rate of erythro-cyte hemolysis by complement and in higher concentrations totally blocks hemolysis. Both soy bean and pancreatic trypsin inhibitors do not influence the reaction of complement binding. Soy bean trypsin inhibitor has similar inhibitory activity with pancreatic one and may represent basis for the development of pharmaceutical preparation of protease inhibitor.

к процессам гемостаза, могут оказывать влияние на эти процессы, катализируемые высокоспецифичными протеа-зами. Трипсин их активирует, а СИТ замедляет.

Влияние трипсина и СИТ на агрегацию тромбоцитов весьма схоже с их влиянием на свертывание крови и фиб-ринолиз. Как видно из экспериментальных кривых инициированной АДФ агрегации тромбоцитов, в присутствии трипсина скорость агрегации тромбоцитов возрастает, а в присутствии СИТ снижается (рис. 1). Эффекты трипсина включают увеличение максимальной агрегации, степени агрегации на 5 мин регистрации, уменьшение времени агрегации (время достижения максимальной агрегации) и возрастание начальной скорости агрегации. Эффекты ингибитора трипсина противоположны.

Процессы протеолиза играют важную роль в действии на клетки системы комплемента, ряд компонентов которой относят к классу сериновых протеаз. Поэтому представляло интерес исследовать влияние трипсина, СИТ, а также фармацевтического препарата ингибитора протеаз «Гор-докс», действующим началом которого является выделяемый из поджелудочных желез свиней и крупнорогатого скота ПИТ, на гемолитическую активность комплемента.

Прединкубация СИТ и ПИТ с комплементом не оказывает влияния на скорость гемолиза эритроцитов в гемо-

Влияние трипсина и соевого ингибитора трипсина на свер тывание крови и фибринолиз

Показатели крови Протром-биновое время

Плазма крови 25±1,9 62,3±4,2 88±9,7 15,3±1,9

Плазма+ трипсин 19±1,3 р12<0,01 Немедленное образование гелеобразного сгустка 58±4,7 р12<0,02 8,7±0,5 р12<0,005

Плазма + СИТ 43±4,6 р1;<0,002 93±9,1 р13<0,02 258±17 р13<0,001 38±0,9 р13<0,001

0Г Г 2' :г 4' ГУ (¡г 7

контроль —*—СИ Г -  -МИГ

Рис. 2. Влияние трипсина (верхний) СИТ и ПИТ (нижний) на гемолитическую активность комплемента

литической системе в присутствии комплемента (рис. 2). В отличие от этого, прединкубация комплемента с трипсином уменьшает скорость гемолиза эритроцитов при использовании низких концентраций трипсина (конечные концентрации 0,0001 и 0,001%) и полностью подавляет гемолиз при использовании более высоких концентраций (0,01% и выше) (рис. 2). Влияние трипсина на скорость гемолиза эритроцитов проявляется в значительно более низких концентрациях (0,0001-0,001%), чем его влияние на свертывание крови, фибринолиз и агрегацию тромбоцитов (0,01%). Противоположный эффект трипсина на гемолитическую активность комплемента по отношению к его влиянию на реакции гемостаза можно объяснить разрушением трипсином белковых факторов системы комплемента на стадии прединкубации. Отсутствие эффектов СИТ и ПИТ на скорость гемолиза эритроцитов может быть обусловлено различными молекулярными причинами, в частности, независимостью скорость-ли-митирующей стадии гемолиза эритроцитов от протеоли-тических реакций и т.д.

В целом полученные результаты свидетельствуют, что протекающие в организме высокоспецифичные проте-олитические процессы могут регулироваться протеазами и ингибиторами протеаз, не имеющими прямого отношения к этим процессам. В частности, трипсин и СИТ in vitro оказывают выраженное влияние на процессы гемостаза. В клинике используются препараты ингибиторов протеаз на основе ПИТ, выпускаемые несколькими фирмами с разными торговыми названиями: «Гордокс», «Контрикал», «Тразилол» и др. Существенным недостатком этих препа-

ратов является характерная для всех препаратов, на основе животных белков, возможность одновременного внесения в организм патогенных вирусов. Согласно литературным данным, трипсин-ингибиторная активность СИТ и ПИТ примерно одинакова и составляет ~3-8 ИЕ/мг ингибитора, в зависимости от степени очистки. При исследовании трипсин-ингибиторной активности имеющихся в нашем распоряжении СИТ и ПИТ ингибиторная активность СИТ в 2 раза уступала таковой ПИТ в расчете на миллиграмм белка и в 1,5 раза превосходила ее в расчете на моль ингибитора с учетом молекулярных масс СИТ (21384 Da) и ПИТ (6511 Da). Способность СИТ влиять на протеоли-тические процессы, протекающие в организме человека, открывает перспективу создания фармацевтического препарата — ингибитора протеаз на основе СИТ, который был бы лишен указанного недостатка. Реальность подобной перспективы подтверждается протеомным анализом СИТ и ингибиторов сериновых протеаз (серпинов) организма животных и человека, свидетельствующим о высокой степени гомологии СИТ, ПИТ, альфа-1-антитрипсина и антитромбина [5].

Выводы

1. В условиях in vitro трипсин увеличивает, а СИТ замедляет скорость свертывания крови, фибринолиза, АДФ-и адреналин-инициируемой агрегации тромбоцитов.

2. Трипсин замедляет скорость гемолиза эритроцитов в гемолитической системе в присутствии комплемента.

3. СИТ И ПИТ не влияют на гемолиз эритроцитов в аналогичных условиях.

4. Полученные результаты свидетельствуют о перспективности исследования — возможности создания фармацевтического препарата — ингибитора протеаз на основе СИТ.

Литература

1. Бородин Е.А., Бородина Г.П., Штарберг М.А. и др. // Дальневост. мед. журнал. 2003. №3. С. 14-17.

2. Нартикова В.Ф., Пасхина Т.С. // Современные методы в биохимии. М., 1977. С. 188-191.

3. Anderson R.L., Wolf W.J. // J. Nutr. 1995. Vol. 125, №3. P.581-588.

4. Birk Y. // Int. J. Pept. Protein Res. 1985. Vol. 25, №2. P. 113-131.

5. Borodin E., Pamirski I., Shtarberg M. et al. // IV Russia and China Medical Forum. Blagoveshchensk, 2007. P. 31-35.

6. Kennedy A.R. // Pharmacol. Ther. 1998. Vol. 78, P. 167-209.