МОДУЛИРОВАНИЕ ЭКСПРЕССИИ АПОЛИПОПРОТЕИНА СIII (АРОСIII)
MODULATION OF APOLIPOPROTEIN CIII (ApoCIII) EXPRESSION

Перечень последовательностей
Данная заявка подана вместе с Перечнем последовательностей в электронном формате. Перечень последовательностей предоставлен в виде файла с названием BIOL0130WOSEQ.TXT, созданного 27 апреля 2012 г. размером 8 кбайт. Информация в электронном формате Перечня последовательностей включена в данное описание путем ссылки в полном объеме.
Область изобретения
В данном описании предложены способы, соединения и композиции для уменьшения экспрессии мРНК и белка Аполипопротеина CIII (ApoCIII), и увеличения активности ЛПВП или ЛПВП у животного. Также, в данном описании предложены способы, соединения и композиции ингибитора ApoCIII для уменьшения связанных с ApoCIII заболеваний или состояний у животного.
Уровень техники
Липопротеины представляют собой шаровидные, мицеллоподобные частицы, которые состоят из неполярного ядра ацилглицеридов и эфиров холестерина, окруженных амфифильным покрытием из белка, фосфолипида и холестерина. Липопротеины классифицируются на 5 широких категорий на основании их функциональных и физических свойств: хиломикроны, липопротеины очень низкой плотности (ЛПОНП), липопротеины промежуточной плотности (ЛППП), липопротеины низкой плотности (ЛПНП) и липопротеины высокой плотности (ЛПВП). Хиломикроны переносят пищевые липиды из кишечника к тканям. ЛПОНП, ЛППП и ЛПНП все переносят триацилглицериды и холестерин от печени к тканям. ЛПВП переносят эндогенный холестерин от тканей к печени
Частицы липопротеинов подвергаются непрерывной метаболической обработке, и их свойства и состав варьируют. Плотность липопротеинов увеличивается без увеличения диаметра частицы, поскольку плотность их внешнего покрытия меньше, чем плотность внутреннего ядра. Белковые компоненты липопротеинов известны как аполипопротеины. Как минимум, 9 аполипопротеинов распространены в значительных количествах среди различных липопротеинов человека.
Аполипопротеин C-III (ApoCIII) представляет собой компонент ЛПВП и богатых триглицеридами липопротеинов (ТГ). Повышение уровня ApoCIII связано с гипертриглицеридемией. Соответственно, ApoCIII играет роль в развитии гипертриглицеридемии, фактора риска заболевания коронарных артерий (Davidsson et al., J. Lipid Res. 2005. 46: 1999-2006). ApoCIII замедляет клиренс богатых триглицеридами липопротеинов, ингибируя липолиз как посредством ингибирования липопротеинлипазы, так и препятствуя связыванию липопротеина с гликозаминогликановой матрицей на поверхности клетки (Shachter, Curr. Opin. Lipidol., 2001, 12, 297-304).
Ген, кодирующий человеческий аполипопротеин C-III (который также носит название АРОСЗ, APOC-III, ApoCIII и АРО C-III), был клонирован в 1984 г. тремя исследовательскими группами (Levy-Wilson et al., DNA, 1984, 3, 359-364; Protter et al., DNA, 1984, 3, 449-456; Sharpe et al., Nucleic Acids Res., 1984, 12, 3917-3932). Кодирующая последовательность прерывается тремя интронами (Protter et al., DNA, 1984, 3, 449-456). Ген ApoCIII человека размещен приблизительно через 2,6 тысячи пар основ в направлении 3' по отношению к гену аполипопротеина А-1, и эти два гена транскрибируются конвергентно (Karathanasis, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1985, 82, 6374-6378). Также клонирован вариант аполипопротеина С-III человека с мутацией Thr74 до Ala74, выделенный у больного с необыкновенно высокими уровнями аполипопротеина C-III в сыворотке. Поскольку Thr74 O-гликозилирован, мутант Ala74, таким образом, приводил к повышению в сыворотке уровней ApoCIII без углеводного фрагмента (Maeda et al., J. Lipid Res., 1987, 28, 1405-1409). Другие варианты или виды полиморфизма, которые модулируют экспрессию ApoCIII, были идентифицированы позже. При некоторых видах полиморфизма повышается уровень ApoCIII. Повышенные уровни ApoCIII ассоциируются с повышенными уровнями триглицеридов (ТГ) и такими заболеваниями, как сердечно-сосудистое заболевание, метаболический синдром, ожирение и диабет (Chan et al., Int J Clin Pract, 2008, 62: 799-809; Onat et al., Atherosclerosis, 2003, 168: 81-89; Mendivil et al., Circulation, 2011, 124: 2065-2072).
Пять видов полиморфизма идентифицированы на участке промотора гена: С (в положении -641 гена) до A, G (в положении -630 гена) до А, делеция Т (в положении -625 гена), С (в положении -482 гена) до Т, и Т (в положении -455 гена) до С. Все эти виды полиморфизма находятся в неравновесном сцеплении с полиморфизмом SstI в 3' нетранслируемом участке. Полиморфный сайт SstI различает аллели S1 и S2, и аллель S2 ассоциируется с повышенными уровнями триглицеридов в плазме (Dammerman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1993, 90, 4562-4566). Промотор ApoCIII регулируется вниз инсулином, и данный полиморфный сайт отменяет регуляцию инсулином. Таким образом, потенциальная чрезмерная экспрессия ApoCIII, которая приводит к утрате регуляции инсулином, может быть фактором, способствующим развитию гипертриглицеридемии, связанной с аллелью S2 (Li et al., J. din. Invest., 1995, 96, 2601-2605). Полиморфизм Т (в положении -455 гена) до С связан с повышением риска заболевания коронарных артерий (Olivieri et al., J. Lipid Res., 2002, 43, 1450-1457). Другие виды полиморфизма гена ApoCIII человека, который связан с увеличением экспрессии ApoCIII и/или уровня триглицеридов, включают: С (в положении 1100) до Т, С (в положении 3175) до G, Т (в положении 3206) до G, С (в положениях 3238) до G, и т.п. (Tilly et al., J. Lipid Res., 2003, 44: 430-436; Waterworth et al., Arterioscler Thromb Vase Biol, 2000, 20: 2663-2669; Petersen et al., N Engi J Med, 2010, 362: 1082-1089).
В дополнение к инсулину, идентифицированы другие регуляторы экспрессии гена ApoCIII. Элемент ответа на «осиротевший» ядерный рецептор rev-erb альфа размещен в положениях от -23 до -18 гена, на участке промотора ApoCIII. Rev-erb альфа уменьшает активность промотора ApoCIII (Raspe et al., J. Lipid Res., 2002, 43, 2172-2179). Участок промотора ApoCIII от положений с -86 по -74 гена распознается двумя ядерными факторами CIIIbl и CIIIB2 (Ogami et al., J. Biol. Chem., 1991, 266, 9640-9646). Экспрессия ApoCIII также регулируется вверх ретиноидами, действующими через ретиноидный рецептор X, и изменения в распространении ретиноидного рецептора Х влияют на транскрипцию ApoCIII (Vu-Dac et al., J. din. Invest., 1998, 102, 625-632). Показано, что белок специфичности 1 (Sp1) и ядерный фактор-4 (HNF-4) гепатоцитов действуют синергетично для трансактивации промотора аполипопротеина C-III через сайт связывания с HNF-4 (Kardassis et al., Biochemistry, 2002, 41, 1217-1228). HNF-4 также действует в сочетании с SMAD3-SMAD4 для трансактивации промотора ApoCIII (Kardassis et al., J. Biol. Chem., 2000, 275, 41405-41414).
Трансгенные мыши и мыши с «нокаутированными» генами дополнительно определили роль ApoCIII в липолизе. Чрезмерная экспрессия ApoCIII у трансгенных мышей приводит к гипертриглицеридемии и нарушенному клиренсу ЛПОНП-триглицеридов (de Silva et al., J. Biol. Chem., 1994, 269, 2324-2335; Ito et al., Science, 1990, 249, 790-793). Мыши с «нокаутированными» генами с полным отсутствием белка ApoCIII продемонстрировали значительно сниженные уровни холестерина и триглицеридов в плазме, по сравнению с мышами дикого типа, и были защищены от гипертриглицеридемии после приема пищи (Maeda et al., J. Biol. Chem., 1994, 269, 23610-23616).
Общие уровни ApoCIII в плазме идентифицированы как основной детерминант триглицеридов сыворотки, и эпидемиологические исследования продемонстрировали, что липопротеины ApoCIII и АроВ, которые содержат ApoCIII как компонент, являются независимыми прогностическими факторами заболевания коронарных сосудов сердца (Sacks et al., Circulation. 2000. 102: 1886-1892; Lee et al., Arterioscler Thromb Vase Biol. 2003. 23: 853-858). Исследования также демонстрируют, что ApoCIII представляет собой ключевой детерминант в клиренсе богатых триглицеридами липопротеинов и их остатков при гипертриглицеридемических состояниях, включая висцеральное ожирение, инсулинорезистентность и метаболический синдром (Mauger et al., J. Lipid Res. 2006. 47: 1212-1218; Chan et al., Clin. Chem. 2002. 278-283; Ooi et al., Clin. Sci. 2008. 114: 611-624).
Гипертриглицеридемия представляет собой общий клинический штрих, связанный с повышенным риском кардиометаболического заболевания (Hegele et al. 2009, Hum Mol Genet, 18: 4189-4194; Hegele and Pollex 2009, Mol Cell Biochem, 326: 35-43), а также случаями острого панкреатита в наиболее тяжелых формах (Toskes 1990, Gastroenterol Clin North Am, 19: 783-791; Gaudetet al. 2010, Atherosclerosis Supplements, 11: 55-60; Catapano et al. 2011, Atherosclerosis, 217S: S1-S44; Tremblay et al. 2011, J Clin Lipidol, 5: 37-44). Примеры кардиометаболических заболеваний включают, не ограничиваясь ими, диабет, метаболический синдром/инсулинорезистентность и генетические расстройства, такие как семейная хиломикронемия, семейная комбинированная гиперлипидемия и семейная Гипертриглицеридемия.
Гипертриглицеридемия представляет собой последствие повышенной выработки и/или сниженного или замедленного катаболизма богатых триглицеридами липопротеинов (ТГ): ЛПОНП и, в меньшей степени, хиломикрон (ХМ). Погранично высокие уровни ТГ (150-199 мг/дл) широко распространены в общей популяции и представляют собой общий компонент состояний метаболического синдрома/инсулинорезистентности. Это же справедливо для высоких уровней ТГ (200-499 мг/дл), за исключением того, что по мере повышения уровней ТГ в плазме, базовые генетические факторы играют все более и более важную этиологическую роль. Самые высокие уровни ТГ (≥500 мг/дл) чаще всего ассоциируются также с повышенными уровнями ХМ и сопровождаются повышенным риском острого панкреатита. Риск панкреатита рассматривается как клинически значимый, если уровень ТГ превышает 880 мг/дл (>10 ммоль), и Европейское Сообщество Атеросклероза/Европейское Сообщество Кардиологии (EAS/ESC) в директивах 2011 г. заявляют, что обязательными являются действия по предупреждению острого панкреатита (Catapanoet al. 2011, Atherosclerosis, 217S: S1-S44). Согласно директивам EAS/ESC 2011, гипертриглицеридемия является причиной приблизительно 10% всех случаев панкреатита, и развитие панкреатита может происходить при уровнях ТГ 440-880 мг/дл. На основе полученных в ходе клинических исследований доказательств, которые демонстрируют, что повышенные уровни ТГ являются независимым фактором риска для атеросклеротического ЗКС, директивы Панели III Национальной Образовательной Программы по Холестерину для Взрослых (NCEP 2002, Circulation, 106: 3143-421), а также Американской Диабетической Ассоциации (ADA 2008, Diabetes Care, 31: S12-S54) рекомендуют целевой уровень ТГ менее 150 мг/дл, чтобы снизить риск сердечно-сосудистых заболеваний.
У мышей с «нокаутированным» геном ApoCIII присутствовала нормальная кишечная абсорбция липидов и печеночная секреция триацилглицеридов ЛПОНП, но быстрый клиренс триацилглицеридов ЛПОНП и эфиров холестерина ЛПОНП из плазмы, который, возможно, объясняет наблюдаемую гиполипидемию (Gerritsen et al., J. Lipid Res. 2005. 46: 1466-1473; Jong et al., J. Lipid Res. 2001. 42: 1578-1585). Указано, что частицы ЛПОНП с ApoCIII играют ведущую роль в идентификации высокого риска заболевания коронарных сосудов сердца при гипертриглицеридемии (Campos et al., J. Lipid Res. 2001. 42: 1239-1249). Общегеномное исследование ассоциаций выявило, что нулевая мутация ApoCIII от природы встречается у населения ланкастерских аманитов и демонстрирует благоприятный профиль липидов и очевидную защиту сердца, без видимых вредных эффектов (Pollin et al., Science. 2008. 322: 1702-1705). У носителей мутации наблюдаются более низкие уровни триглицеридов и ЛПНП-холестерина в сыворотке натощак и после приема пищи, и более высокие уровни ЛПВП-холестерина.
th
Класс липопротеинов ЛПВП включает гетерогенную и полидисперсную популяцию частиц, которые обладают наибольшей плотностью и наименьшим размером (Havel and Kane. In, The Metabolic & Molecular Bases of Inherited Disease. 8 Edition. McGraw-Hill, New York, 2001: 2705-16). ЛПВП представляет собой комплекс макромолекулярных липидов (холестерин, триглицериды и фосфолипиды) и белков (аполипопротеины (аро) и ферменты). Поверхность ЛПВП содержит, главным образом, аполипопротеины А, С и Е. Функция некоторых из этих апопротеинов состоит в направлении ЛПВП от периферических тканей к печени. На уровни ЛПВП в сыворотке могут повлиять базовые генетические причины (Weissglas-Volkov and Pajukanta, JLipidRes, 2010, 51: 2032-2057).
Эпидемиологические исследования показали, что повышенные уровни ЛПВП защищают против сердечно-сосудистого заболевания или заболевания коронарных сосудов сердца (Gordon et al., Am. J. Med. 1977. 62: 707-714). Такое влияние ЛПВП-холестерина не зависит от концентраций триглицеридов и ЛПНП-холестерина. В клинической практике, низкие уровни ЛПВП-холестерина в плазме обычнее ассоциируются с другими расстройствами, которые увеличивают содержание триглицеридов в плазме, например, центральное ожирение, инсулинорезистентность, сахарный диабет 2 типа и заболевание почек (хроническая почечная недостаточность или нефротическая протеинурия) (Kashyap.Am. J. Cardiol. 1998. 82: 42U-48U).
В настоящий момент не известно терапевтических средств прямого действия, которые влияли бы на функцию ApoCIII. Постулировано, что гиполипидемический эффект лекарственных средств класса фибратов осуществляется через механизм, где активируемый пролифератором пероксисом рецептор (PPAR) опосредует вытеснение HNF-4 из промотора аполипопротеина C-III, что приводит к подавлению транскрипции аполипопротеина C-III (Hertz et al., J. Biol. Chem., 1995, 270, 13470-13475). Гиполипидемические лекарственные средства класса статинов также снижают уровни триглицерида через неизвестный механизм, который приводит к повышению уровней мРНК липопротеинлипазы и снижению уровней аполипопротеина C-III в плазме (Schoonjans et al., FEBS Lett., 1999, 452, 160-164). Таким образом, остается давно ощущаемая потребность в дополнительных средствах, способных эффективно ингибировать функцию аполипопротеина C-III.
Антисмысловая технология заявляет о себе как эффективное средство уменьшения экспрессии определенных генных продуктов и, таким образом, может быть уникально пригодной для ряда сфер терапевтического, диагностического и исследовательского применения с целью модуляции ApoCIII.
Ранее нами были раскрыты композиции и способ ингибирования ApoCIII антисмысловыми соединениями в US 20040208856 (патент США 7,598,227), US 20060264395 (патент США 7,750,141) и WO 2004/093783. В настоящей заявке мы раскрываем неожиданный результат, заключающийся в том, что антисмысловое ингибирование ApoCIII приводит к повышению уровней ЛПВП и снижению уровней триглицеридов после приема пищи. Такой результат будет полезным, например, для лечения, предупреждения, отодвигания, уменьшения или облегчения любого одного или более заболеваний, таких как сердечно-сосудистое заболевание (например, заболевание коронарных сосудов сердца или атерогенные заболевания). Например, повышенные уровни триглицеридов после приема пищи (не натощак) идентифицированы как значимый фактор риска сердечно-сосудистых заболеваний (Bansal et al., JAMA, 2007, 298: 309-16; Nordestgaard et al., JAMA, 2007, 298: 299-308). Также, в настоящей заявке ингибирование экспрессии ApoCIII неожиданно приводило к увеличению клиренса хиломикрон и, таким образом, важно с точки зрения предотвращения хиломикронемии (Chait et al., 1992, Adv Intern Med. 1992, 37: 249-73), дислипидемического состояния, вызванного ненадлежащим клиренсом хиломикрон триглицеридов. Тяжелые формы хиломикронемии могут приводить к панкреатиту, угрожающему жизни состоянию. Путем ингибирования кишечного ApoCIII было бы уменьшено ингибирование липопротеинлипазы, и клиренс хиломикрон триглицеридов был бы увеличен, таким образом, предупреждая панкреатит.
Краткое описание изобретения
В данном описании предложены способы повышения уровней ЛПВП путем введения животному соединения, нацеленного на ApoCIII.
В некоторых вариантах предлагается способ профилактики, лечения, облегчения, замедления начала или снижения риска сердечно-сосудистого заболевания, расстройства или состояния у животного, включающий введение животному соединения, нацеленного на ApoCIII. Соединение, которое вводят животному, предотвращает, лечит, облегчает, замедляет начало или снижает риск сердечно-сосудистого заболевания, расстройства или состояния путем повышения уровней ЛПВП в организме животного.
В некоторых вариантах предлагается способ снижения риска сердечно-сосудистого заболевания у животного, включающий введение животному терапевтически эффективного количества соединения, содержащего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 12-30 связанных нуклеозидов, причем модифицированный олигонуклеотид является комплементарным нуклеиновой кислоте ApoCIII. В некоторых вариантах нуклеиновая кислота ApoCIII является такой, как показано в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах соединение содержит модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 12-30 связанных нуклеозидов, в котором последовательность нуклеиновых оснований содержит, как минимум, 8 смежных нуклеиновых оснований ISIS 304801 (SEQ ID NO: 3). В дальнейших вариантах соединение, которое вводят животному, снижает риск сердечнососудистого заболевания путем повышения уровней ЛПВП.
В некоторых вариантах предлагается способ профилактики, лечения, облегчения или уменьшения, как минимум, одного симптома сердечно-сосудистого заболевания у животного, включающий введение животному терапевтически эффективного количества соединения, содержащего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 12-30 связанных нуклеозидов, причем модифицированный олигонуклеотид является комплементарным нуклеиновой кислоте ApoCIII. В некоторых вариантах нуклеиновая кислота ApoCIII является такой, как показано в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах соединение содержит модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 12-30 связанных нуклеозидов, в котором последовательность нуклеиновых оснований содержит, как минимум, 8 смежных нуклеиновых оснований ISIS 304801 (SEQ ID NO: 3). В дальнейших вариантах соединение, которое вводят животному, предотвращает, лечит, облегчает или уменьшает, как минимум, один симптом сердечно-сосудистого заболевания у животного путем повышения уровней ЛПВП в организме животного.
В некоторых вариантах предлагается способ повышения уровней ЛПВП в организме животного путем введения животному соединения, состоящего из ISIS 304801 (SEQ ID NO: 3) с целью повышения уровней ЛПВП в организме животного.
В некоторых вариантах предлагается способ профилактики, лечения, облегчения или уменьшения, как минимум, одного симптома сердечно-сосудистого заболевания у животного путем введения животному соединения, состоящего из ISIS 304801 (SEQ ID NO: 3) с целью профилактики, лечения, облегчения или уменьшения, как минимум, одного симптома сердечно-сосудистого заболевания у животного путем повышения уровней ЛПВП в организме животного.
В некоторых вариантах предлагается способ повышения уровней ЛПВП в организме животного путем введения животному модифицированного олигонуклеотида, содержащего последовательность SEQ IDNO: 3 (ISIS 304801) причем модифицированный олигонуклеотид содержит: сегмент промежутка, состоящий из 10 связанных дезоксинуклеозидов; сегмент 5' крыла, состоящий из 5 связанных нуклеозидов; сегмент 3' крыла, состоящий из 5 связанных нуклеозидов; причем сегмент промежутка расположен непосредственно прилегающим к и между сегментом 5' крыла и сегментом 3' крыла, и при этом каждый нуклеозид каждого сегмента крыла содержит 2'-O-метоксиэтилсахар, причем каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин, и причем каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфоротиоатную связь, причем модифицированный олигонуклеотид повышает уровни ЛПВП у животного.
В некоторых вариантах предлагается способ профилактики, лечения, облегчения или уменьшения, как минимум, одного симптома сердечно-сосудистого заболевания у животного путем введения животному модифицированного олигонуклеотида, содержащего последовательность ISIS 304801 (SEQ ID NO: 3) причем модифицированный олигонуклеотид содержит: сегмент промежутка, состоящий из 10 связанных дезоксинуклеозидов; сегмент 5' крыла, состоящий из 5 связанных нуклеозидов; сегмент 3' крыла, состоящий из 5 связанных нуклеозидов; причем сегмент промежутка расположен непосредственно прилегающим к и между сегментом 5' крыла и сегментом 3' крыла, и причем каждый нуклеозид каждого сегмента крыла содержит 2'-O-метоксиэтилсахар, причем каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин, и причем каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфоротиоатную связь, причем модифицированный олигонуклеотид предотвращает, лечит, облегчает или уменьшает, как минимум, один симптом у животного с сердечно-сосудистым заболеванием путем повышения уровней ЛПВП в организме животного.
В некоторых вариантах предлагается способ повышения уровней ЛПВП в организме животного путем введения животному соединения, содержащего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 12-30 связанных нуклеозидов, причем модифицированный олигонуклеотид является комплементарным нуклеиновой кислоте ApoCIII, как показано в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, с целью повышения уровней ЛПВП в организме животного.
В некоторых вариантах предлагается способ профилактики, лечения, облегчения или уменьшения, как минимум, одного симптома сердечно-сосудистого заболевания у животного путем введения животному соединения, содержащего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 12-30 связанных нуклеозидов, причем модифицированный олигонуклеотид является комплементарным нуклеиновой кислоте ApoCIII, как показано в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, с целью профилактики, лечения, облегчения или уменьшения, как минимум, одного симптома сердечно-сосудистого заболевания у животного путем повышения уровней ЛПВП в организме животного.
В некоторых вариантах предлагается способ снижения уровней ТБХЭ путем введения животному соединения, нацеленного на ApoCIII. В некоторых вариантах соединение содержит модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 12-30 связанных нуклеозидов, последовательность нуклеиновых оснований которого комплементарна нуклеиновой кислоте ApoCIII. В некоторых вариантах последовательность нуклеиновых оснований содержит, как минимум, 8 смежных нуклеиновых оснований ISIS 304801 (SEQ ID NO: 3). В некоторых вариантах соединение состоит из нуклеиновых оснований ISIS 304801 (SEQ ID NO: 3).
В некоторых вариантах предлагается способ повышения уровня ApoAl, PON1, клиренса жиров, клиренса хиломикрон триглицеридов, клиренса триглицеридов после приема пищи или уровней ЛПВП путем введения животному соединения, нацеленного на ApoCIII. В некоторых вариантах соединение содержит модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 12-30 связанных нуклеозидов, последовательность нуклеиновых оснований которого комплементарна нуклеиновой кислоте ApoCIII. В некоторых вариантах последовательность нуклеиновых оснований содержит, как минимум, 8 смежных нуклеиновых оснований ISIS 304801 (SEQ ID NO: 3). В некоторых вариантах соединение состоит из нуклеиновых оснований ISIS 304801 (SEQ ID NO: 3).
В некоторых вариантах предлагается способ профилактики, замедления или облегчения течения панкреатита, который включает: (а) выбор животного, страдающего или находящегося в группе риска панкреатита, и (б) введение животному соединения, нацеленного на ApoCIII, и, причем панкреатит предотвращается, замедляется, или его течение облегчается.
В некоторых вариантах предлагается способ профилактики, замедления или облегчения течения панкреатита, который включает: (а) выбор животного, страдающего или находящегося в группе риска панкреатита, и (б) введение животному соединения, нацеленного на ApoCIII, таким образом, увеличивая клиренс хиломикрон, и, при этом, панкреатит предотвращается, замедляется, или его течение облегчается.
В некоторых вариантах животное страдает или находится в группе риска по гипертриглицеридемии. В некоторых вариантах гипертриглицеридемия относится к фредериксоновскому типу II, IV или V. В некоторых вариантах у животного присутствует генетический дефект, ведущий к гипертриглицеридемии. В некоторых вариантах генетический дефект представляет собой гетерозиготный дефицит липопротеинлипазы или полиморфизм ApoCIII. В некоторых вариантах уровень триглицеридов в организме животного составляет ≥500 мг/дл, и присутствует гетерозиготный дефицит липопротеинлипазы.
В некоторых вариантах уровень триглицеридов в организме животного находится в интервале 100-200 мг/дл, 100-300 мг/дл, 100-400 мг/дл, 100-500 мг/дл, 200-500 мг/дл, 300-500 мг/дл, 400-500 мг/дл, 500-1000 мг/дл, 600-1000 мг/дл, 700-1000 мг/дл, 800-1000 мг/дл, 900-1000 мг/дл, 500-1500 мг/дл, 1000-1500 мг/дл, 100-2000 мг/дл, 150-2000 мг/дл, 200-2000 мг/дл, 300-2000 мг/дл, 400-2000 мг/дл, 500-2000 мг/дл, 600-2000 мг/дл, 700-2000 мг/дл, 800-2000 мг/дл, 900-2000 мг/дл, 1000-2000 мг/дл, 1100-2000 мг/дл, 1200-2000 мг/дл, 1300-2000 мг/дл, 1400-2000 мг/дл или 1500-2000 мг/дл.
В некоторых вариантах увеличение клиренса хиломикрон увеличивает клиренс триглицеридов после приема пищи и/или уменьшает уровень триглицеридов после приема пищи.
В некоторых вариантах предлагается применение соединения, нацеленного на ApoCIII, с целью профилактики, лечения, облегчения или уменьшения, как минимум, одного симптома сердечно-сосудистого заболевания путем повышения уровней ЛПВП.
В некоторых вариантах предлагается применение соединения, нацеленного на ApoCIII, с целью повышения уровней ЛПВП в организме животного.
В некоторых вариантах предлагается применение соединения, нацеленного на ApoCIII, для получения лекарственного средства, предназначенного для повышения уровней ЛПВП в организме животного.
В некоторых вариантах предлагается применение соединения, нацеленного на ApoCIII, для получения лекарственного средства, предназначенного для улучшения соотношения ТГ к ЛПВП.
Подробное описание изобретения
Следует понимать, что как вышеизложенное общее описание, так и следующее подробное описание являются только иллюстративными и поясняющими, и не ограничивают заявленного изобретения. В данном описании применение единственного числа включает множественное число, если конкретно не указано иное. В данном описании "или" означает "и/или", если не указано иное. Кроме того, использование термина "включающий", а также других форм, таких как "включает" и "включенный", не является ограничивающим. Также такие термины, как "элемент" или "компонент", включают как элементы, так и компоненты, содержащие одну единицу, а также элементы и компоненты, которые содержат более чем одну субъединицу, если конкретно не указано иное.
Заголовки разделов, используемые в данном описании, предназначены только для организационных целей и не должны интерпретироваться как ограничивающие описанный объект. Все документы или части документов, цитируемых в данной заявке, в том числе, но не ограничиваясь ими, патенты, патентные заявки, статьи, книги и трактаты, таким образом, явно включены путем ссылки на части документа, обсуждаемого в данном описании, а также в полном объеме.
Определения
Если только не были предложены специфические определения, номенклатура, используемая в связи с, а также методики и методы аналитической химии, синтетической органической химии и медицинской и фармацевтической химии, описанные в данном описании, является хорошо известной и обычно применяемой в данной области. Стандартные методы могут применяться для химического синтеза и химического анализа. Если это разрешено, все патенты, заявки, опубликованные заявки и другие публикации, номера доступа GENBANK и связанная информация о последовательностях, доступная через базы данных, такие как Национальный центр биотехнологической информации (НЦБИ), и другие данные, на которые есть ссылки в данном описании, включены путем ссылки на части документа, обсуждаемого в данном описании, а также в полном объеме.
Если только не указано иное, следующие термины имеют следующие значения:
2
2
3
"2'-O-метоксиэтил" (также 2'-МОЭ, 2'-O(CH)-ОСН и 2'-O-(2-метоксиэтил)) обозначает O-метокси-этил-модификацию положения 2' фурозильного кольца. 2'-O-Метоксиэтил-модифицированный сахар является модифицированным сахаром.
"2'-O-Метоксиэтилнуклеотид" обозначает нуклеотид, содержащий 2'-O-метоксиэтил-модифицированный сахарный фрагмент.
"3' Сайт-мишень" обозначает нуклеотид нуклеиновой кислоты-мишени, комплементарный к крайнему 3'-нуклеотиду конкретного антисмыслового соединения.
"5' Сайт-мишень" обозначает нуклеотид нуклеиновой кислоты-мишени, комплементарный к крайнему 5'-нуклеотиду конкретного антисмыслового соединения.
"5-Метилцитозин" обозначает цитозин, модифицированный метильной группой, присоединенной в 5' положении. 5-Метилцитозин представляет собой модифицированное нуклеиновое основание.
"Приблизительно" означает в пределах ±10% значения. Например, если это указано, "маркер может быть увеличен приблизительно на 50%", подразумевается, что маркер может быть увеличен на 45-55%.
"Активный фармацевтический агент (средство)" обозначает субстанцию или субстанции в фармацевтической композиции, которые обеспечивают терапевтическое действие при введении индивидууму. Например, в некоторых вариантах антисмысловой олигонуклеотид, нацеленный на ApoCIII, представляет собой активный фармацевтический агент (средство).
"Активный участок-мишень" или "участок-мишень" обозначает участок, на который нацелено одно или более активных антисмысловых соединений. "Активные антисмысловые соединения" обозначают антисмысловые соединения, которые снижают уровни нуклеиновой кислоты-мишени или уровни белка.
"Сопутствующее введение" обозначает сопутствующее введение двух агентов (средств) в любой форме, в которой фармакологическое действие обоих проявляется в организме больного в одно и то же время. Сопутствующее введение не требует введения обоих средств в одной фармацевтической композиции, в одной лекарственной форме или одним и тем же способом. Влияние обоих агентов (средств) не обязательно проявляется в одно и то же время. Эффект должен только частично перекрываться в течение периода времени, и не должен иметь одинаковую протяженность.
"Введение" обозначает доставку фармацевтического агента (средства) в организм индивидуума, и включает, не ограничиваясь ими, введение медицинским работником и самостоятельное введение.
"Агент (средство)" обозначает активную субстанцию, которая может обеспечить терапевтическое действие при введении животному. "Первый агент (средство)" обозначает терапевтическое соединение по изобретению. Например, первый агент может быть антисмысловым олигонуклеотидом, нацеленным на ApoCIII. "Второй агент (другое средство)" обозначает второе терапевтическое соединение по изобретению (например, второй антисмысловой олигонуклеотид, нацеленный на ApoCIII) и/или не-ApoCIII терапевтическое соединение.
"Облегчение" обозначает уменьшение, как минимум, одного показатели, признака или симптома связанного заболевания, расстройства или состояния. Выраженность показателей может определяться субъективными или объективными мерами, которые известны специалистам в данной области.
"Животное" обозначает человека или животное, в том числе, но не ограничиваясь ими, мыши, крысы, кролики, собаки, кошки, свиньи и негуманоидные приматы, в том числе, но не ограничиваясь ими, обезьяны и шимпанзе.
"Антисмысловая активность" обозначает любую обнаружимую или измеримую активность, относящуюся к антисмысловой гибридизации соединения с нуклеиновой кислотой-мишенью. В некоторых вариантах антисмысловая активность представляет собой уменьшение количества или экспрессии нуклеиновой кислоты-мишени или белка, кодируемого такой нуклеиновой кислотой-мишенью.
"Антисмысловое соединение" обозначает олигомерное соединение, которые способно гибридизоваться с нуклеиновой кислотой-мишенью посредством водородной связи. В данном описании термин "антисмысловое соединение" включает фармацевтически приемлемые производные соединений, описанных в данном описании.
"Антисмысловое ингибирование" обозначает снижение уровней нуклеиновой кислоты-мишени или уровней белка-мишени в присутствии антисмыслового соединения, комплементарного к нуклеиновой кислоте-мишени, по сравнению с уровнями нуклеиновой кислоты-мишени или уровнями белка-мишени в отсутствие антисмыслового соединения.
"Антисмысловой олигонуклеотид" обозначает одноцепочечный олигонуклеотид, содержащий последовательность нуклеиновых оснований, которая позволяет гибридизацию с соответствующим участком или сегментом нуклеиновой кислоты-мишени. В данном описании термин "антисмысловой олигонуклеотид" включает фармацевтически приемлемые производные соединений, описанных в данном описании.
"ApoCIII обозначает любую нуклеиновую кислоту или последовательность белка, кодирующую ApoCIII. Например, в некоторых вариантах ApoCIII включает последовательность ДНК, кодирующую ApoCIII, последовательность РНК, транскрибированную из ДНК, кодирующей ApoCIII (в том числе, геномной ДНК, содержащей интроны и экзоны), последовательность мРНК, кодирующую ApoCIII, или пептидную последовательность, кодирующую ApoCIII.
"мРНК ApoCIII" обозначает мРНК, кодирующую белок ApoCIII.
"Белок ApoCIII" обозначает любую последовательность белка, кодирующую ApoCIII.
"Атеросклероз" обозначает затвердение артерий, поражающее крупные и среднего размера артерии, и характеризуется присутствием жировых отложений. Жировые отложения называются "атеромами" или "бляшками", которые состоят, в основном, из холестерина и других жиров, кальция и рубцовой ткани и повреждают выстилку артерий.
"Бициклический сахар" обозначает фурозильное кольцо, модифицированное соединением мостиком двух негеминальных атомов кольца. Бициклический сахар является модифицированным сахаром.
"Бициклическая нуклеиновая кислота" или "БНК" обозначает нуклеозид или нуклеотид, в котором фуранозная часть нуклеозида или нуклеотида содержит мостик, соединяющий два углеродных атома на фуранозном кольце, с образованием таким образом бициклической системы колец.
"Кэп-структура" или "концевой кэп-фрагмент" обозначает химические модификации, которые осуществлены на любом из концов антисмыслового соединения.
"Сердечно-сосудистое заболевание" или "сердечно-сосудистое расстройство" обозначает группу состояний, связанных с сердцем, кровеносными сосудами или кровообращением. Примеры сердечно-сосудистых заболеваний включают, не ограничиваясь ими, аневризму, стенокардию, аритмию, атеросклероз, цереброваскулярное заболевание (инсульт), заболевание коронарных сосудов сердца, гипертензию, дислипидемию, гиперлипидемию, гипертриглицеридемию или гиперхолестеринемию.
"Химически отличный участок" обозначает участок антисмыслового соединения, который некоторым образом химически отличается от другого участка такого же антисмыслового соединения. Например, участок, содержащий 2'-O-метоксиэтил-нуклеотид, химически отличается от участка, содержащего нуклеотид без 2'-O-метоксиэтил-модификаций.
"Химерное антисмысловое соединение" обозначает антисмысловое соединение, которое содержит, как минимум, два химически отличных участка.
"Холестерин" представляет собой молекулу стероида, найденную в мембранах клеток всех тканей животных. Холестерин должен транспортироваться в плазме крови животного липопротеинами, включая липопротеины очень низкой плотности (ЛПОНП), липопротеины промежуточной плотности (ЛППП), липопротеины низкой плотности (ЛПНП) и липопротеины высокой плотности (ЛПВП). "Холестерин плазмы" обозначает сумму всех липопротеинов (ЛПОНП, ЛППП, ЛПНП, ЛПВП), этерифицированных и/или неэтерифицированных в плазме или сыворотке.
"Ингибитор абсорбции холестерина" обозначает средство, которое тормозит абсорбцию экзогенного холестерина, поступающего из пищевых продуктов.
"Сопутствующее введение" подразумевает введение двух или более агентов (средств) индивидууму. Два или более средства могут находиться в одной фармацевтической композиции или могут находиться в отдельных фармацевтических композициях. Каждое из двух или более средств можно вводить одним и тем же или различными способами. Сопутствующее введение включает параллельное или последовательное введение.
"Комплементарность" обозначает способность к спариванию нуклеиновых оснований первой нуклеиновой кислоты и второй нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах комплементарность между первой и второй нуклеиновой кислотой может быть между двумя цепями ДНК, между двумя цепями РНК или между цепями ДНК и РНК. В некоторых вариантах определенные нуклеиновые основания на одной цепи соответствуют комплементарному основанию, образующему водородную связь, на другой цепи. В некоторых вариантах все нуклеиновые основания на одной цепи соответствуют комплементарному основанию, образующему водородную связь, на другой цепи. В некоторых вариантах первая нуклеиновая кислота представляет собой антисмысловое соединение, и вторая нуклеиновая кислота представляет собой нуклеиновую кислоту-мишень. В некоторых из таких вариантов антисмысловой олигонуклеотид представляет собой первую нуклеиновую кислоту, и нуклеиновая кислота-мишень представляет собой вторую нуклеиновую кислоту.
"Смежные нуклеиновые основания" обозначают нуклеиновые основания, непосредственно смежные друг по отношению к другу.
3
"Ограниченный этил" или "cEt" обозначает бициклический нуклеозид, содержащий фуранозильный сахар, который содержит метил(метиленокси) (4'-СН(СН)-O-2') мостик между углеродными атомами 4' и 2'.
"Перекрестно-реагирующий" обозначает олигомерное соединение, нацеленное на одну последовательность нуклеиновой кислоты, которое может, гибридизоваться с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, в некоторых случаях антисмысловой олигонуклеотид, нацеленный на ApoCIII человека, может перекрестно реагировать с ApoCIII мыши. Будет ли олигомерное соединение перекрестно реагировать с другой последовательностью нуклеиновой кислоты, кроме его предусмотренной мишени, зависит от степени комплементарности соединения с нецелевой последовательностью нуклеиновой кислоты. Чем выше степень комплементарности между олигомерным соединением и нецелевой нуклеиновой кислотой, тем вероятнее олигомерное соединение будет перекрестие реагировать с нуклеиновыми кислотами.
"Излечение/лечение" обозначает способ, который восстанавливает здоровье, или назначенное лечение заболевания.
"Заболевание коронарных сосудов сердца (ЗКС)" обозначает сужение мелких кровеносных сосудов, которые поставляют кровь и кислород к сердцу, что часто является результатом атеросклероза.
"Дезоксирибонуклеотид" обозначает нуклеотид, содержащий водород в положении 2' сахарной части нуклеотида. Дезоксирибонуклеотиды могут быть модифицированы любым из разнообразных заместителей.
"Сахарный диабет" или "диабет" представляет собой синдром, характеризующийся нарушенным метаболизмом и аномально высоким уровнем сахара в крови (гипергликемия), что является результатом недостаточных уровней инсулина или сниженной чувствительности к инсулину. Характерные симптомы включают чрезмерную выработку мочи (полиурия) за счет высоких уровней глюкозы в крови, чрезмерную жажду и повышенное потребление жидкости (полидипсия) для компенсации увеличенного мочеиспускания, затуманивание зрения в результате воздействия высокого уровня глюкозы в крови на оптические структуры глаза, необъяснимую потерю массы и летаргию.
"Диабетическая дислипидемия" или "диабет 2 типа с дислипидемией" обозначает состояние, характеризующееся диабетом 2 типа, снижением уровней ЛПВП-Х, повышением уровней триглицеридов и повышением содержания плотных частиц ЛПНП маленького размера.
"Разбавитель" обозначает ингредиент в композиции, который не обладает фармакологической активностью, но необходим или желателен с фармацевтической точки зрения. Например, разбавитель в инъекционной композиции может быть жидкостью, например, солевым раствором.
"Дислипидемия" обозначает расстройство метаболизма липидов и/или липопротеинов, в том числе, чрезмерную выработку или дефицит липидов и/или липопротеинов. Дислипидемия может проявляться повышением уровня липидов, таких как хиломикроны, холестерин и триглицериды, а также липопротеинов, таких как холестерин липопротеинов низкой плотности (ЛПНП). Примером дислипидемии является хиломикронемия.
"Единица лекарственной формы" обозначает форму, в которой доставляется фармацевтический агент, например, пилюля, таблетка или другая единица лекарственной формы, известная из уровня техники. В некоторых вариантах единица лекарственной формы представляет собой флакон, содержащий лиофилизированный антисмысловой олигонуклеотид. В некоторых вариантах единица лекарственной формы представляет собой флакон, содержащий ресуспендированный антисмысловой олигонуклеотид.
"Доза" обозначает указанное количество фармацевтического средства, доставляемое за одно введение или в указанный период времени. В некоторых вариантах дозу можно вводить в виде одного, двух или более болюсов, таблеток или инъекций. Например, в некоторых вариантах, если желательно подкожное введение, желательная доза требует объема, который сложно адаптировать к одной инъекции, поэтому две или более инъекций могут использоваться для доставки желательной дозы. В некоторых вариантах фармацевтическое средство вводят инфузией в течение длительного периода времени или непрерывно. Дозы могут быть указаны как количество фармацевтического средства в час, день, неделю или месяц. Дозы также могут быть указаны как мг/кг или г/кг.
"Эффективное количество" или "терапевтически эффективное количество" обозначает количество активного фармацевтического средства, достаточное для достижения желательного физиологического результата у индивидуума, нуждающегося в средстве. Эффективное количество может варьировать от одного индивидуума к другому, в зависимости от состояния здоровья и физического состояния индивидуума, который подлежит лечению, таксономической группы индивидуумов, которые подлежат лечению, состава композиции, оценки медицинского состояния индивидуума и других соответствующих факторов.
"Система Фредериксона" используется для классификации первичных (генетических) причин дислипидемии на несколько подгрупп или типов. Типы дислипидемии, которые могут поддаваться коррекции лечением соединениями, раскрытыми в данном описании, включают, не ограничиваясь ими, фредериксоновский тип II, IV и V.
"Фредериксоновский тип I" существует в нескольких формах: тип 1а представляет собой дефицит липопротеинлипазы в результате дефицита ЛПНП или измененного ароС-II; тип Ib представляет собой семейный дефицит апопротеина CII, состояние, вызванное недостатком активатора липопротеинлипазы; и тип 1 с представляет собой хиломикронемию за счет циркулирующего ингибитора липопротеинлипазы. Тип I представляет собой редкое расстройство, которое обычно присутствует в детстве. Оно характеризуется выраженным повышением содержания хиломикрон и чрезвычайно высокими уровнями ТГ (всегда значительно превышающими 1000 мг/дл, и нередко достигающими 10000 мг/дл или выше) с эпизодами боли в животе, рецидивирующего острого панкреатита, сопровождающимися высыпаниями кожными ксантомами и гепатоспленомегалией. У больных редко развивается атеросклероз, возможно, из-за того, что частицы липопротеинов в плазме слишком большие, чтобы проникнуть в интиму артерий (Nordestgaard et al., J Lipid Res, 1988, 29: 1491-1500; Nordestgaard et al., Arteriosclerosis, 1988, 8: 421-428). Тип I обычно вызывается мутациями гена ЛПНП или гена кофактора ароС-II, что приводит к неспособности пораженных индивидуумов вырабатывать функционально активные ЛПНП. Такие мутации у больных гомозиготные или составные гетерозиготные. Распространенность составляет приблизительно 1 на 1000000 в общей популяции, и намного выше в Южной Африке и Восточном Квебеке в результате «эффекта основателя». Больные отвечают минимально или не отвечают на лекарственные средства для снижения уровня ТГ (Tremblay et al., J Clin Lipidol, 2011, 5: 37-44; Brisson et al., Pharmacogenet Genom, 2010, 20: 742-747) и, таким образом, используется ограничение жира в рационе до 20 г/сутки или менее, чтобы управлять симптомами данного редкого расстройства.
"Фредериксоновский тип II" представляет собой наиболее распространенную форму первичной гиперлипидемии. Он дополнительно классифицируется на тип IIa и тип IIb, в основном, в зависимости от того, присутствует ли повышение уровней ЛПОНП в дополнение к уровням холестерина ЛПНП (ЛПНП-Х). Тип IIa (семейная гиперхолестеринемия) может быть спорадическим (за счет диетических факторов), полигенным или истинно семейным в результате мутации в гене рецептора ЛПНП на хромосоме 19 (0,2% популяции) или гене аполипопротеина В (АроВ) (0,2%). Семейную форму характеризуют сухожильные ксантомы, ксантелазма и раннее сердечно-сосудистое заболевание. Распространенность данного заболевания составляет около 1 на 500 для гетерозигот и 1 на 1000000 для гомозигот. Тип IIb (также известный как комбинированная семейная гиперлипопротеинемия) представляет собой смешанную гиперлипидемию (высокие уровни холестерина и ТГ), вызванную повышением уровней ЛПНП-Х и ЛПОНП. Высокие уровни ЛПОНП являются результатом чрезмерной выработки субстратов, в том числе, ТГ, ацетил-КоА, и увеличения синтеза В-100. Они также могут быть вызваны уменьшением клиренса ЛПНП. Распространенность в популяции составляет около 10%.
"Фредериксоновский тип III" (также известный как дисбеталипопротеинемия) представляет собой заболевание удаления ремнанта или заболевание широкой беты (Fern et al., J din Pathol, 2008, 61: 1174-118). Оно возникает за счет богатых холестерином ЛПОНП (Р-ЛПОНП). Обычно, у больных с таким состоянием повышены уровни холестерина и ТГ в плазме из-за замедленного клиренса остатков хиломикрон и ЛПОНП (например, ЛППП). Замедленный клиренс является результатом дефекта аполипопротеина Е (ароЕ). Нормально функционирующий ароЕ, содержащийся на ремнантах, позволил бы связывание с рецептором ЛПНП и удаление из кровотока. Аккумуляция остатков у пораженных индивидуумов может приводить к ксантоматозу и раннему заболеванию коронарных и/или периферических сосудов. Наиболее распространенной причиной типа III является наличие генотипа ароЕ Е2/Е2. Его распространенность оценена как приблизительно 1 на 10 000.
"Фредериксоновский тип IV" (также известный как семейная гипертриглициридемия) - аутосомальное доминантное состояние, присутствующее приблизительно у 1% населения. Уровни ТГ повышаются в результате избыточной выработки ЛПОНП печенью или гетерозиготного дефицита ЛПНП, но они почти всегда ниже 1000 мг/дл. Уровни холестерина в сыворотке обычно находятся в пределах нормы. Расстройство является гетерогенным, и на фенотип существенно влияют факторы внешней среды, особенно потребление углеводов и этанола.
«Фредериксоновский тип V» включает высокие уровни ЛПОНП и хиломикрон. Он характерен для носителей вариантов гена ЛПНП с утратой функции, связанной с активностью ЛПНП, как минимум, 20% (т.е. частичный дефицит ЛПНП по сравнению с фредериксоновским типом I). У таких субъектов плазма похожа на молоко и присутствует тяжелая гипертриглицеридемия из-за хиломикрон и ЛПОНП. Уровни ТГ неизменно выше 1000 мг/дл, и уровни общего холестерина всегда повышены. Обычно присутствует низкий уровень ЛПНП-Х. Это также ассоциируется с повышенным риском острого панкреатита, непереносимости глюкозы и гиперурикемии. Симптомы, в общем, присутствуют во взрослой жизни (>35 лет) и, хотя распространенность относительно низкая, такие субъекты встречаются намного чаще, чем субъекты с гомозиготной или составной гетерозиготной недостаточностью ЛПНП.
"Полностью комплементарный" или "100% комплементарность" обозначает, что каждому нуклеиновому основанию в последовательности нуклеиновых оснований первой нуклеиновой кислоты соответствует комплементарное нуклеиновое основание во второй последовательности нуклеиновых оснований второй нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах первая нуклеиновая кислота представляет собой антисмысловое соединение, и вторая нуклеиновая кислота представляет собой нуклеиновую кислоту-мишень.
"Химерный олигонуклеотид" обозначает химерное антисмысловое соединение, в котором внутренний участок, содержащий множество нуклеозидов, которые поддерживают расщепление РНКазой H, расположен между внешними участками, содержащими один или более нуклеозидов, причем нуклеозиды, составляющие внутренний участок, химически отличаются от нуклеозида или нуклеозидов, составляющих внешние участки. Внутренний участок может называться "промежутком" или "сегментом промежутка", и внешние участки могут носить название "крыльев" или "сегментов крыла."
"Расширенный промежутком" обозначает химерное антисмысловое соединение, содержащее антисмысловой сегмент промежутка длиной 12 или более смежных 2'-дезоксирибонуклеозидов, расположенный между и непосредственно смежный к сегментам 5' и 3' крыла, содержащим от 1 до 6 нуклеозидов.
"Глюкоза" представляет собой моносахарид, используемый клетками в качестве источника энергии и воспалительного промежуточного соединения. "Глюкоза плазмы" обозначает наличие глюкозы в плазме.
"Липопротеин высокой плотности-Х (ЛПВП-Х)" обозначает холестерин, связанный с частицами липопротеина высокой плотности. Концентрация ЛПВП-Х в сыворотке (или плазме) обычно определяется в мг/дл или нмоль/л. "ЛПВП-Х" и "ЛПВП-Х в плазме" обозначают ЛПВП-Х в сыворотке и плазме, соответственно.
"Ингибитор ГМГ-КоА редуктазы" обозначает средство, которое действует посредством ингибирования фермента ГМГ-КоА редуктазы, такое как аторвастатин, розувастатин, флувастатин, ловастатин, правастатин и симвастатин.
"Гибридизация" обозначает отжиг комплементарных молекул нуклеиновых кислот. В некоторых вариантах комплементарные молекулы нуклеиновых кислот включают антисмысловое соединение и нуклеиновую кислоту-мишень.
"Гиперхолестеринемия" обозначает состояние, характеризующееся повышенным уровнем холестерина или циркулирующего (в плазме) холестерина, ЛПНП-холестерина и ЛПОНП-холестерина, в соответствии с директивами Отчета экспертной панели Национальной Образовательной Программы по Холестерину (NCEP) на тему Обнаружения, оценки, лечения повышенного уровня холестерина у взрослых (см., Arch. Int. Med. (1988) 148, 36-39).
"Гиперлипидемия" или "гиперлипемия" представляет собой состояние, характеризующееся повышенными уровнями липидов в сыворотке или циркулирующих (в плазме) липидов. Данное состояние проявляется аномально высокой концентрацией жиров. Липидные фракции в кровотоке представляют собой холестерин, липопротеины низкой плотности, липопротеины очень низкой плотности, хиломикроны и триглицериды. Фредериксоновская классификация гиперлипидемии основана на характере ТГ и богатых холестерином липопротеиновых частиц, который определяется электрофорезом или ультрацентрифугированием и обычно используется для характеристики первичных причин гиперлипидемии, такой как гипертриглицеридемия (Fredrickson and Lee, Circulation, 1965, 31: 321-327; Fredrickson et al., New Eng J Med, 1967, 276 (I): 34-42).
"Гипертриглицеридемия" обозначает состояние, характеризующееся повышенными уровнями триглицеридов. Его этиология включает первичные (т.е. генетические причины) и вторичные факторы (другие базовые причины, такие как диабет, метаболический синдром/инсулинорезистентность, ожирение, низкий уровень физической активности, курение сигарет, избыточное потребление спиртного и рацион с высоким содержанием углеводов), или, чаще всего, комбинацию обоих (Yuan et al. CMAJ, 2007, 176: 1113-1120).
"Идентификация" или "выбор животного с метаболическим или сердечно-сосудистым заболеванием" обозначает идентификацию или выбор субъекта, склонного или страдающего диагностированным метаболическим заболеванием, сердечно-сосудистым заболеванием или метаболическим синдромом; или идентификацию или выбор субъекта, у которого присутствует любой из симптомов метаболического заболевания, сердечно-сосудистого заболевания или метаболического синдрома, в том числе, но не ограничиваясь ими, гиперхолестеринемия, гипергликемия, гиперлипидемия, гипертриглицеридемия, гипертензия, повышенная инсулинорезистентность, сниженная чувствительность к действию инсулина, масса тела выше нормы и/или содержание жира в организме выше нормы или любая их комбинация. Такая идентификация может быть проведена любым способом, в том числе, не ограничиваясь ими, стандартными клиническими тестами или оценкой, такими как измерение уровня холестерина в сыворотке или кровотоке (плазма), измерение уровня глюкозы в сыворотке крови или кровотоке (плазма), измерение уровня триглицеридов в сыворотке или кровотоке (плазма), измерение артериального давления, измерение содержания жира в организме, измерение массы тела, и т.п.
"Улучшенный исход сердечно-сосудистого заболевания" обозначает уменьшение частоты сердечно-сосудистых катастроф или снижение их риска. Примеры сердечнососудистых катастроф включают, не ограничиваясь ими, смерть, повторный инфаркт, инсульт, кардиогенный шок, отек легких, остановку сердца и нарушения ритма предсердий.
"Непосредственно смежный" означает отсутствие промежуточных элементов между непосредственно смежными элементами, например, между участками, сегментами, нуклеотидами и/или нуклеозидами.
"Повышение уровня ЛПВП" или "увеличение концентрации ЛПВП" обозначает повышение уровня ЛПВП у животного после введения, как минимум, одного соединения по изобретению, по сравнению с уровнем ЛПВП у животного, не получавшего соединения.
"Индивидуум" или "субъект" или "животное" обозначает человека или животное, выбранное для лечения или терапии.
"Индуцировать", "ингибировать", "потенцировать", "повышать", "увеличивать", "уменьшать", "снижать" или подобные термины обозначают количественные отличия между двумя состояниями. Например, "количество, эффективное для ингибирования активности или экспрессии ApoCIII" означает, что уровень активности или экспрессия ApoCIII в обработанном образце будет отличаться от уровня активности или экспрессии ApoCIII в необработанном образце. Такие термины применяются, например, к уровням экспрессии и уровням активности.
"Ингибирование экспрессии или активности" обозначает уменьшение или блокаду экспрессии или активности РНК или белка, и необязательно указывает на полное отсутствие экспрессии или активности.
"Инсулинорезистентность" определяется как состояние, при котором нормальные количества инсулина недостаточны для получения нормальной реакции на инсулин жировых клеток, клеток мышц и печени. Инсулинорезистентность в жировых клетках приводит к гидролизу хранящихся триглицеридов, что увеличивает содержание свободных жирных кислот в плазме крови. Инсулинорезистентность в мышце уменьшает захват глюкозы, тогда как Инсулинорезистентность в печени уменьшает хранение глюкозы, при этом оба эффекта способствуют повышению содержания глюкозы в крови. Высокие уровни инсулина и глюкозы в плазме вследствие инсулинорезистентности часто приводят к метаболическому синдрому и диабету 2 типа.
"Чувствительность к действию инсулина" является мерой того, насколько эффективно индивидуум утилизирует глюкозу. Индивидуум с высокой чувствительностью к инсулину эффективно утилизирует глюкозу, тогда как индивидуум с низкой чувствительностью к инсулину неэффективно утилизирует глюкозу.
"Межнуклеозидная связь" обозначает химическую связь между нуклеозидами.
"Внутривенное введение" обозначает введение в вену.
"Связанные нуклеозиды" обозначают смежные нуклеозиды, которые связаны между собой.
"Снижающий уровень липидов" обозначает уменьшение уровня одного или более липидов в организме субъекта. "Повышающий уровень липидов" обозначает повышение уровня липидов (например, ЛПВП) в организме субъекта. Снижение уровня липидов или повышение уровня липидов может происходить при введении одной или более доз во времени.
"Лекарственное средство для снижения уровня липидов" или "агент для снижения уровня липидов" обозначает схему лечения, проводимого субъекту для снижения уровня одного или более липидов в организме субъекта. В некоторых вариантах лекарственное средство для снижения уровня липидов вводят с целью снижения уровня одного или более из ТБХЭ, АроВ, общего холестерина, ЛПНП-Х, ЛПОНП-Х, ЛППП-Х, не-ЛПВП-Х, триглицеридов, плотных частиц ЛПНП небольшого размера и Lp(a) в организме субъекта. Примеры лекарственного средства для снижения уровня липидов включают статины, фибраты, ингибиторы микросомального белка-переносчика триглицеридов.
"Липопротеин", например, ЛПОНП, ЛПНП и ЛПВП, обозначает группу белков, которые найдены в сыворотке, плазме и лимфе, и важны для транспорта липидов. Химический состав каждого липопротеина отличается, в частности, для ЛПВП характерно более высокое соотношение белка против липида, тогда как для ЛПОНП характерно более низкое соотношение белка против липида.
"Липопротеин низкой плотности-холестерин (ЛПНП-Х)" обозначает холестерин, переносимый частицами липопротеина низкой плотности. Концентрация ЛПНП-Х в сыворотке (или плазме) обычно определяется в мг/дл или нмоль/л. "ЛПНП-Х сыворотки" и "ЛПНП-Х плазмы" обозначает ЛПНП-Х в сыворотке и плазме, соответственно.
"Основные факторы риска" обозначают факторы, которые способствуют высокому уровню риска конкретного заболевания или состояния. В некоторых вариантах основные факторы риска заболевания коронарных сосудов сердца включают, не ограничиваясь ими, курение сигарет, гипертензию, низкий уровень ЛПВП-Х, семейный анамнез заболевания коронарных сосудов сердца, возраст и другие факторы, раскрытые в данном описании.
"Метаболическое расстройство" или "метаболическое заболевание" обозначает состояние, характеризующееся изменением или расстройством метаболической функции. "Метаболический" и "метаболизм" представляют собой термины, хорошо известные из уровня техники, и, в общем, включают целый ряд биохимических процессов, которые происходят в живом организме. Метаболические расстройства включают, не ограничиваясь ими, гипергликемию, преддиабетическое состояние, диабет (типа 1 и типа 2), ожирение, инсулинорезистентность, метаболический синдром и дислипидемию вследствие диабета 2 типа.
"Метаболический синдром" обозначает состояние, характеризующееся набором липидных и нелипидных факторов риска сердечно-сосудистого заболевания метаболического происхождения. В некоторых вариантах метаболический синдром выявляют по наличию любого из 3-х следующих факторов: объем талии более 102 см у мужчин или более 88 см у женщин; уровень триглицеридов сыворотки, как минимум, 150 мг/дл; уровень ЛПВП-Х менее 40 мг/дл у мужчин или менее 50 мг/дл у женщин; артериальное давление, как минимум, 130/85 мм рт. ст; и уровень глюкозы в крови натощак, как минимум, 110 мг/дл. Эти показатели могут быть легко измерены в клинической практике (JAMA, 2001, 285: 2486-2497).
"Рассогласование" или "некомплементарное нуклеиновое основание" обозначает случай, когда нуклеиновое основание первой нуклеиновой кислоты не способно спариваться с соответствующим нуклеиновым основанием второй или целевой нуклеиновой кислоты (нуклеиновой кислоты-мишени).
"Смешанная дислипидемия" обозначает состояние, характеризующееся повышенным уровнем холестерина и повышенным уровнем триглицеридов.
"Модифицированная межнуклеозидная связь" обозначает замещение или любую модификацию природной межнуклеозидной связи. Например, фосфоротиоатная связь является модифицированной межнуклеозидной связью.
"Модифицированное нуклеиновое основание" обозначает любое нуклеиновое основание, кроме аденина, цитозина, гуанина, тимидина или урацила. Например, 5-метилцитозин является модифицированным нуклеиновым основанием. "Немодифицированное нуклеиновое основание" обозначает пуриновые основания аденин (А) и гуанин (G), и пиримидиновые основания тимин (Т), цитозин (С) и урацил (U).
"Модифицированный нуклеозид" обозначает нуклеозид, содержащий, как минимум, один модифицированный сахарный фрагмент и/или модифицированное нуклеиновое основание.
"Модифицированный нуклеотид" обозначает нуклеотид, содержащий, как минимум, один модифицированный сахарный фрагмент, модифицированную межнуклеозидную связь и/или модифицированное нуклеиновое основание.
"Модифицированный олигонуклеотид" обозначает олигонуклеотид, содержащий, как минимум, один модифицированный нуклеотид.
"Модифицированный сахар" обозначает замещение или модификацию природного сахара. Например, 2'-O-метоксиэтил-модифицированный сахар является модифицированным сахаром.
"Мотив" обозначает образец химически отличных участков в антисмысловом соединении.
"Природная межнуклеозидная связь" обозначает 3'-5' фосфодиэфирную связь.
"Природный сахарный фрагмент" обозначает сахар, найденный в ДНК (2'-Н) или РНК (2'-ОН).
"Нуклеиновая кислота" обозначает молекулы, состоящие из мономерных нуклеотидов. Нуклеиновая кислота включает рибонуклеиновые кислоты (РНК), дезоксирибонуклеиновые кислоты (ДНК), одноцепочечные нуклеиновые кислоты (оцДНК), двухцепочечные нуклеиновые кислоты (дцДНК), малые интерферирующие рибонуклеиновые кислоты (миРНК) и микроРНК (микроРНК). Нуклеиновая кислота также может содержать комбинацию этих элементов в одной молекуле.
"Нуклеиновое основание" обозначает гетероциклический фрагмент, способный спариваться с основанием другой нуклеиновой кислоты.
"Комплементарность нуклеиновых оснований" обозначает нуклеиновое основание, способное спариваться с другим нуклеиновым основанием. Например, в ДНК аденин (А) комплементарен тимину (Т). Например, в РНК аденин (А) комплементарен урацилу (U). В некоторых вариантах комплементарное нуклеиновое основание обозначает нуклеиновое основание антисмыслового соединения, способное спариваться с нуклеиновым основанием его нуклеиновой кислоты-мишени. Например, если нуклеиновое основание в определенном положении антисмыслового соединения способно образовывать водородную связь с нуклеиновым основанием в определенном положении нуклеиновой кислоты-мишени, то олигонуклеотид и нуклеиновая кислота-мишень рассматриваются как комплементарные по указанной паре нуклеиновых оснований.
"Последовательность нуклеиновых оснований" обозначает порядок смежных нуклеиновых оснований, независимо от любой модификации сахара, связи или нуклеинового основания.
"Нуклеозид" обозначает нуклеиновое основание, соединенное с сахаром.
"Миметический нуклеозид" включает структуры, используемые для замены сахара или сахара и основания, и, необязательно, связи, в одном или более положениях олигомерного соединения; например, миметический нуклеозид, содержащий морфолино, циклогексенил, циклогексил, тетрагидропиранил, бицикло или трицикло миметические сахара, такие как нефуранозные сахарные единицы.
"Нуклеотид" обозначает нуклеозид, содержащий фосфатную группу, ковалентно присоединенную к сахарной части нуклеозида.
"Миметический нуклеотид" включает структуры, используемые для замены нуклеозида и связи в одном или более положениях олигомерного соединения, например, такие как пептиднуклеиновые кислоты или морфолиновые группы (морфолиновые группы, присоединенные посредством -N(H)-C(=O)-O- или другой нефосфодиэфирной связи).
"Олигомерное соединение" или "олигомер" обозначает полимер из связанных мономерных субъединиц, которые способны гибридизоваться с участком молекулы нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах олигомерные соединения представляют собой олигонуклеозиды. В некоторых вариантах олигомерные соединения представляют собой олигонуклеотиды. В некоторых вариантах олигомерные соединения представляют собой антисмысловые соединения. В некоторых вариантах олигомерные соединения представляют собой антисмысловые олигонуклеотиды. В некоторых вариантах олигомерные соединения представляют собой химерные олигонуклеотиды.
"Олигонуклеотид" обозначает полимер из связанных нуклеозидов, каждый из которых может быть модифицированным или немодифицированным, независимо друг от друга.
"Парентеральное введение" подразумевает введение посредством инъекции или инфузии. Парентеральное введение включает подкожное введение, внутривенное введение, внутримышечное введение, внутриартериальное введение, внутрибрюшинное введение или интракраниальное введение, например, интратекальное или интрицеребровентрикулярное введение. Введение может быть непрерывным, хроническим, кратковременным или прерывистым.
"Пептид" обозначает молекулу, образованную соединением, как минимум, двух аминокислот амидной связи. Пептид обозначает полипептиды и белки.
"Фармацевтический агент (средство)" обозначает субстанцию, которая обеспечивает терапевтический эффект при введении индивидууму. Например, в некоторых вариантах антисмысловой олигонуклеотид, нацеленный на ApoCIII, представляет собой фармацевтический агент (средство).
"Фармацевтическая композиция" или "композиция" обозначает смесь субстанций, пригодных для введения индивидууму. Например, фармацевтическая композиция может содержать один или более активных ингредиентов и фармацевтический носитель, такой как стерильный водный раствор.
"Фармацевтически приемлемый носитель" обозначает средство или разбавитель, который не влияет отрицательно на структуру соединения. Некоторые из таких носителей дают возможность фармацевтическим композициям принимать форму, например, таблеток, пилюль, драже, капсул, жидкостей, гелей, сиропов, жидких или густых суспензий и пастилок для приема субъектом внутрь. Некоторые из таких носителей дают возможность фармацевтическим композициям принимать форму для инъекций, инфузии или местного нанесения. Например, фармацевтически приемлемый носитель может быть стерильным водным раствором.
"Фармацевтически приемлемое производное" или "соли" включают производные соединений, описанных в данном описании, такие как сольваты, гидраты, эфиры, пролекарства, полиморфы, изомеры, меченные изотопами варианты, фармацевтически приемлемые соли и другие производные, известные в данной области.
"Фармацевтически приемлемые соли" обозначают физиологически и фармацевтически приемлемые соли антисмысловых соединений, т.е. соли, которые сохраняют желательную биологическую активность материнского соединения и не оказывают дополнительно нежелательного токсичного воздействия. Термин "фармацевтически приемлемая соль" или "соль" включает соль, полученную с фармацевтически приемлемыми нетоксичными кислотами или основаниями, в том числе, неорганическими или органическими кислотами и основаниями. "Фармацевтически приемлемые соли" соединений, описанных в данном описании, могут быть получены способами, известными из уровня техники. Обзор фармацевтически приемлемых солей см. в Stahl and Wermuth, Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use (Wiley-VCH, Weinheim, Germany, 2002). Натриевые соли антисмысловых олигонуклеотидов пригодны и хорошо известны для терапевтического введения человеку. Соответственно, в одном из вариантов соединения, описанные в данном описании, находятся в форме натриевой соли.
"Фосфоротиоатная связь" обозначает связь между нуклеозидами, в которой фосфодиэфирная связь модифицирована путем замены одного из не образующих мостик атомов кислорода на атом серы. Фосфоротиоатная связь представляет собой модифицированную межнуклеозидную связь.
"Часть" обозначает некоторое количество смежных (т.е. связанных) нуклеиновых оснований нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах часть представляет собой некоторое количество смежных нуклеиновых оснований нуклеиновой кислоты-мишени. В некоторых вариантах часть представляет собой некоторое количество смежных нуклеиновых оснований антисмыслового соединения.
"Предупреждать" обозначает отодвигать или предупреждать манифестацию или развитие заболевания, расстройства или состояния в течение периода времени от нескольких минут до неопределенного времени. Предупреждать также обозначает снижать риск развития заболевания, расстройства или состояния.
"Пролекарство" обозначает терапевтическое средство, которое получено в неактивной форме, и которое превращается в активную форму (т.е. лекарственное средство) в организме или его клетках под действием эндогенных ферментов или других химических веществ или условий.
"Повышение" подразумевает увеличение количества. Например, повышение уровней ЛПВП в плазме подразумевает увеличение количества ЛПВП в плазме.
"Соотношение ТГ к ЛПВП" обозначает уровни ТГ относительно уровней ЛПВП. Распространенность высоких уровней ТГ и/или низких уровней ЛПВП связывают с распространенностью сердечно-сосудистых заболеваний, исходов и смертности. "Улучшение соотношения ТГ к ЛПВП" подразумевает снижение уровней ТГ и/или повышение уровней ЛПВП.
"Снижение" подразумевает уменьшение до меньшей степени, размера, количества или числа. Например, снижение уровней триглицеридов в плазме подразумевает уменьшение количества триглицеридов в плазме.
"Участок" или "целевой участок (участок-мишень)" определяется как часть нуклеиновой кислоты-мишени, содержащая, как минимум, одну поддающуюся идентификации структуру, функцию или характеристику. Например, целевой участок может содержать 3' нетранслируемую область, 5' нетранслируемую область, экзон, интрон, соединение экзон/интрон, кодирующий участок, участок инициации трансляции, участок окончания трансляции или другой определенный участок нуклеиновой кислоты. Структурно определенные участки для ApoCIII могут быть получены по номеру доступа из баз данных последовательностей, таких как НЦБИ., и такая информация включена в данное описание путем ссылки. В некоторых вариантах целевой участок может содержать последовательность от 5' сайта мишени одного сегмента-мишени в пределах участка-мишени до 3' сайта мишени другого сегмента-мишени в пределах участка-мишени.
"Рибонуклеотид" обозначает нуклеотид, содержащий гидроксигруппу в положении Т сахарной части нуклеотида. Рибонуклеотиды могут быть модифицированы любым из различных заместителей.
"Второй агент (другое средство)" или "второй терапевтический агент (другое терапевтическое средство)" обозначает средства, которые могут применяться в комбинации с "первым агентом (средством)". Второй терапевтический агент может включать, не ограничиваясь ими, миРНК или антисмысловой олигонуклеотид, в том числе, антисмысловые олигонуклеотиды, нацеленные на ApoCIII. Второй агент может также включать анти-ApoCIII антитела, ингибиторы пептида ApoCIII, средства для снижения уровня холестерина, средства для снижения уровня липидов, средства для снижения уровня глюкозы и противовоспалительные средства.
"Сегменты" определены как более маленькие подчасти участков в пределах нуклеиновой кислоты. Например, "целевой сегмент (сегмент-мишень)" обозначает последовательность нуклеотидов нуклеиновой кислоты-мишени, на которую нацелено одно или более антисмысловых соединений. "5' сайт" мишени обозначает крайний 5' нуклеотид сегмента-мишени. "3' сайт" мишени обозначает крайний 3' нуклеотид сегмента-мишени.
"Сокращенные" или "укороченные" версии антисмысловых олигонуклеотидов или нуклеиновых кислот-мишеней, описанных в данном описании, включают делецию одного, двух или более нуклеозидов.
"Побочные эффекты" обозначают физиологические реакции, связанные с лечением, кроме желательных эффектов. В некоторых вариантах побочные эффекты включают реакции в месте инъекции, аномальные результаты печеночных проб, нарушение функции почек, токсичность для печени, токсичность для почек, аномалии центральной нервной системы, миопатии и недомогание. Например, повышенные уровни аминотрансферазы в сыворотке могут указывать на токсичность для печени или нарушение функции печени. Например, повышение уровня билирубина может указывать на токсичность для печени или нарушение функции печени.
"Одноцепочечный олигонуклеотид" обозначает олигонуклеотид, который не гибридизуется с комплементарной цепью.
"Специфично гибридизующийся" обозначает антисмысловое соединение, обладающее достаточной степенью комплементарности к нуклеиновой кислоте-мишени, чтобы оказывать желательное воздействие, при демонстрации минимального или отсутствии воздействия на нецелевые нуклеиновые кислоты, в условиях, в которых желательно специфичное связывание, т.е. в физиологических условиях в случае анализов in vivo и терапевтического применения.
"Статин" обозначает средство, которое ингибирует активность ГМГ-КоА редуктазы.
"Подкожное введение" подразумевает введение непосредственно под кожу.
"Субъект" обозначает человека или животное, выбранное для лечения или терапии.
"Симптом сердечно-сосудистого заболевания или расстройства" обозначает феномен, который возникает в результате и сопровождает сердечно-сосудистое заболевание или расстройство, а также служит указанием на него. Например, стенокардия; боль в груди; одышка; сердцебиение; слабость; головокружение; тошнота; повышение потоотделение; тахикардия; брадикардия; аритмия; мерцание предсердий; отек нижних конечностей; цианоз; усталость; слабость; онемение лица; онемение конечностей; хромота или мышечные спазмы; вздутие живота; или лихорадка являются симптомами сердечно-сосудистого заболевания или расстройства.
"Нацеливание" или "нацеленный" обозначает процесс конструирования и селекции антисмыслового соединения, которое специфично гибридизуется с нуклеиновой кислотой-мишенью и вызывает желательный эффект.
"Нуклеиновая кислота-мишень (целевая нуклеиновая кислота)", "РНК-мишень (целевая РНК)" и "транскрипт РНК-мишень (целевой транскрипт РНК)" все обозначают нуклеиновую кислоту, на которую могут быть нацелены антисмысловые соединения.
"Терапевтическое изменение образа жизни" обозначает модификацию рациона и образа жизни, цель которой состоит в снижении содержания жира/массы жировой ткани и/или уровня холестерина. Такая модификация может снижать риск развития заболевания сердца, и может включать рекомендации по диетическому потреблению общего суточного количества калорий, общего жира, насыщенных жиров, полиненасыщенных жиров, ненасыщенных жиров, углеводов, белков, холестерина, нерастворимых волокон, а также рекомендации по физической активности.
"Лечить" обозначает введение соединения по изобретению с целью изменения или улучшения протекания заболевания, расстройства или состояния.
"Триглицерид" или "ТГ" обозначает липид или нейтральный жир, состоящий из глицерина, соединенного с тремя молекулами жирных кислот.
"Диабет 2 типа" (также известный как "сахарный диабет 2 типа", "сахарный диабет, тип 2", "диабет 2 типа", "инсулиннезависимый диабет (ИНЗСД)", "связанный с ожирением диабет" или "диабет зрелого возраста") представляет собой метаболическое расстройство, которое, прежде всего, характеризуется инсулинорезистентностью, относительным дефицитом инсулина и гипергликемией.
"Немодифицированный нуклеотид" обозначает нуклеотид, состоящий из природных нуклеиновых оснований, сахарных фрагментов и межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах немодифицированный нуклеотид представляет собой РНК нуклеотид (т.е. β-D-рибонуклеозиды) или ДНК нуклеотид (т.е. β-D-дезоксирибонуклеозид).
"Сегмент крыла" обозначает один или несколько нуклеозидов, модифицированных таким образом, чтобы придать олигонуклеотиду такие свойства, как повышенная ингибирующая активность, повышенное сродство связывания с нуклеиновой кислотой-мишенью или устойчивость к разложению нуклеазами in vivo.
Некоторые варианты
В некоторых вариантах предлагается способ снижения уровней ApoCIII в организме животного путем введения животному соединения, нацеленного на ApoCIII, таким образом, снижая уровни ApoCIII. В некоторых вариантах уровни ApoCIII снижаются в печени или тонком кишечнике.
В некоторых вариантах предлагается способ повышения уровней ЛПВП и/или улучшения соотношения ТГ к ЛПВП у животного путем введения животному соединения, причем соединение нацелено на ApoCIII и повышает уровни ЛПВП и/или улучшает соотношение ТГ к ЛПВП.
В некоторых вариантах предлагается способ предупреждения, отодвигания или облегчения протекания сердечно-сосудистого заболевания, расстройства, состояния или его симптома у животного, включающий введение животному соединения, нацеленного на ApoCIII, причем соединение, которое вводят животному, предупреждает, лечит или облегчает протекание сердечно-сосудистого заболевания, расстройства, состояния или симптома у животного путем повышения уровней ЛПВП в организме животного и/или улучшения соотношения ТГ к ЛПВП.
В некоторых вариантах предлагается способ предупреждения, отодвигания или облегчения протекания панкреатита у животного, включающий введение животному соединения, нацеленного на ApoCIII, причем соединение, которое вводят животному, предупреждает, лечит или облегчает протекание панкреатита у животного путем повышения уровней ЛПВП в организме животного и/или улучшения соотношения ТГ к ЛПВП. В некоторых вариантах панкреатит является острым панкреатитом.
В некоторых вариантах предлагается способ предупреждения, лечения, облегчения, отодвигания начала или снижения риска сердечно-сосудистого заболевания, расстройства или состояния у животного, который включает введение животному соединения, нацеленного на ApoCIII, причем соединение предупреждает, лечит, облегчает, отодвигает начало или снижает риск сердечно-сосудистого заболевания, расстройства или состояния у животного путем повышения уровней ЛПВП в организме животного и/или улучшения соотношения ТГ к ЛПВП.
В некоторых вариантах предлагается способ снижения уровней ТБХЭ путем введения животному соединения, нацеленного на ApoCIII.
В некоторых вариантах предлагается способ повышения уровня ApoA1, PON1, клиренса жиров, клиренса хиломикрон триглицеридов и/или уровней ЛПВП путем введения животному соединения, нацеленного на ApoCIII. В некоторых вариантах предлагается способ улучшения соотношения ТГ к ЛПВП.
В некоторых вариантах нуклеиновая кислота ApoCIII представляет собой любую из последовательностей, содержащихся в GENBANK, номер доступа NM_000040.1 (включена в данное описание как SEQ ID NO: 1), и GENBANK, номер доступа NT_033899.8 укороченная от нуклеотида 20262640 до 20266603 (включена в данное описании как SEQ ID NO: 2).
В некоторых вариантах соединение, нацеленное на ApoCIII, представляет собой модифицированный олигонуклеотид. В дальнейших вариантах модифицированный олигонуклеотид содержит последовательность нуклеиновых оснований, содержащую, как минимум, 8 смежных нуклеиновых оснований ISIS 304801 (SEQ ID NO: 3). В некоторых вариантах модифицированный олигонуклеотид является, как минимум, на 80%, как минимум, на 85%, как минимум, на 90%, как минимум, на 95%, как минимум, на 98% или, как минимум, на 100% комплементарным SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2.
В некоторых вариантах модифицированный олигонуклеотид состоит из одноцепочечного модифицированного олигонуклеотида.
В некоторых вариантах модифицированный олигонуклеотид состоит из 12-30 связанных нуклеозидов.
В некоторых вариантах модифицированный олигонуклеотид состоит из 20 связанных нуклеозидов.
В некоторых вариантах соединение содержит, как минимум, одну модифицированную межнуклеозидную связь. В некоторых вариантах межнуклеозидная связь представляет собой фосфоротиоатную межнуклеозидную связь.
В некоторых вариантах соединение содержит, как минимум, один нуклеозид, содержащий модифицированный сахар. В некоторых вариантах, как минимум, один модифицированный сахар представляет собой бициклический сахар. В некоторых вариантах, как минимум, один модифицированный сахар включает 2'-O-метоксиэтил.
В некоторых вариантах соединение содержит, как минимум, один нуклеозид, содержащий модифицированное нуклеиновое основание. В некоторых вариантах модифицированное нуклеиновое основание представляет собой 5-метилцитозин.
В некоторых вариантах соединение содержит модифицированный олигонуклеотид, содержащий: (i) сегмент промежутка, состоящий из связанных дезоксинуклеозидов; (ii) сегмент 5' крыла, состоящий из связанных нуклеозидов; (iii) сегмент 3' крыла, состоящий из связанных нуклеозидов, причем сегмент промежутка расположен непосредственно смежным к и между сегментом 5' крыла и сегментом 3' крыла, и при этом каждый нуклеозид каждого сегмента крыла содержит модифицированный сахар.
В некоторых вариантах соединение содержит модифицированный олигонуклеотид, содержащий: (i) сегмент промежутка, состоящий из 8-12 связанных дезоксинуклеозидов; (ii) сегмент 5' крыла, состоящий из 1-5 связанных нуклеозидов; (iii) сегмент 3' крыла, состоящий из 1-5 связанных нуклеозидов, причем сегмент промежутка расположен непосредственно смежным к и между сегментом 5' крыла и сегментом 3' крыла, и при этом каждый нуклеозид каждого сегмента крыла содержит 2'-O-метоксиэтилсахар, притом, что каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин, и при этом каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфоротиоатную связь.
В некоторых вариантах соединение содержит модифицированный олигонуклеотид, содержащий: (i) сегмент промежутка, состоящий из 10 связанных дезоксинуклеозидов; (ii) сегмент 5' крыла, состоящий из 5 связанных нуклеозидов; (iii) сегмент 3' крыла, состоящий из 5 связанных нуклеозидов, причем сегмент промежутка расположен непосредственно смежным к и между сегментом 5' крыла и сегментом 3' крыла, и при этом каждый нуклеозид каждого сегмента крыла содержит 2'-O-метоксиэтилсахар, притом, что каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин, и при этом каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфоротиоатную связь.
В некоторых вариантах модифицированный олигонуклеотид содержит последовательность нуклеиновых оснований, содержащую, как минимум, 8 смежных нуклеиновых оснований последовательности нуклеиновых оснований ISIS 304801 (SEQ ID NO: 3).
В некоторых вариантах предлагается способ снижения риска сердечно-сосудистого заболевания у животного путем введения животному терапевтически эффективного количества соединения, содержащего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 12-30 связанных нуклеозидов, причем модифицированный олигонуклеотид является комплементарным к нуклеиновой кислоте ApoCIII, и при этом модифицированный олигонуклеотид повышает уровни ЛПВП и/или улучшает соотношение ТГ к ЛПВП. В некоторых вариантах нуклеиновая кислота ApoCIII представляет собой любую из SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах модифицированный олигонуклеотид является, как минимум, на 80%, как минимум, на 85%, как минимум, на 90%, как минимум, на 95%, как минимум, на 98% или, как минимум, на 100% комплементарным к SEQ ID NO: I или SEQ ID NO: 2. В дальнейших вариантах модифицированный нуклеотид содержит, как минимум, 8 смежных нуклеиновых оснований последовательности нуклеиновых оснований ISIS 304801 (SEQ ID NO: 3).
В некоторых вариантах предлагается способ предупреждения, лечения, облегчения или уменьшения, как минимум, одного симптома сердечно-сосудистого заболевания у животного, включающий введение животному терапевтически эффективного количества соединения, содержащего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 12-30 связанных нуклеозидов и комплементарный к нуклеиновой кислоте ApoCIII. В некоторых вариантах нуклеиновая кислота ApoCIII представляет собой любую из SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах модифицированный олигонуклеотид является, как минимум, на 80%, как минимум, на 85%, как минимум, на 90%, как минимум, на 95%, как минимум, на 98% или, как минимум, на 100% комплементарным к SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2. В дальнейших вариантах соединение, которое вводят животному, предупреждает, лечит, облегчает или уменьшает, как минимум, один симптом сердечно-сосудистого заболевания путем повышения уровней ЛПВП и/или улучшения соотношения ТГ к ЛПВП. В дальнейших вариантах модифицированный олигонуклеотид содержит, как минимум, 8 смежных нуклеиновых оснований ISIS 304801 (SEQ ID NO: 3).
В дальнейших вариантах симптомы сердечно-сосудистого заболевания включают, не ограничиваясь ими, стенокардию; боль в груди; одышку; сердцебиение; слабость; головокружение; тошноту; повышенное потоотделение; тахикардию; брадикардию; аритмию; мерцание предсердий; отек нижних конечностей; цианоз; усталость; слабость; онемение лица; онемение конечностей; хромоту или мышечные спазмы; вздутие живота; или лихорадку.
В некоторых вариантах предлагается способ повышения уровней ЛПВП и/или улучшения соотношения ТГ к ЛПВП у животного путем введения животному соединения, состоящего из последовательности нуклеиновых оснований ISIS 304801 (SEQ ID NO: 3). В дальнейших вариантах предлагается способ предупреждения, лечения, облегчения или уменьшения, как минимум, одного симптома сердечно-сосудистого заболевания у животного путем введения животному соединения, состоящего из последовательности нуклеиновых оснований ISIS 304801 (SEQ ID NO: 3), таким образом, повышая уровни ЛПВП и/или улучшая соотношение ТГ к ЛПВП у животного.
В некоторых вариантах предлагается способ повышения уровней ЛПВП и/или улучшения соотношения ТГ к ЛПВП у животного путем введения животному модифицированного олигонуклеотида, содержащего последовательность ISIS 304801, причем модифицированный олигонуклеотид содержит: (i) сегмент промежутка, состоящий из 10 связанных дезоксинуклеозидов; (ii) сегмент 5' крыла, состоящий из 5 связанных нуклеозидов; (iii) сегмент 3' крыла, состоящий из 5 связанных нуклеозидов, причем сегмент промежутка расположен непосредственно смежным к и между сегментом 5' крыла и сегментом 3' крыла, и при этом каждый нуклеозид каждого сегмента крыла содержит 2'-O-метоксиэтилсахар, притом, что каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин, и при этом каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфоротиоатную связь.
В некоторых вариантах предлагается способ предупреждения, лечения, облегчения или уменьшения, как минимум, одного симптома сердечно-сосудистого заболевания у животного путем введения животному модифицированного олигонуклеотида, содержащего последовательность ISIS 304801 (SEQ ID NO: 3), причем модифицированный олигонуклеотид соединения включает: (i) сегмент промежутка, состоящий из 10 связанных дезоксинуклеозидов; (ii) сегмент 5' крыла, состоящий из 5 связанных нуклеозидов; (iii) сегмент 3' крыла, состоящий из 5 связанных нуклеозидов, причем сегмент промежутка расположен непосредственно смежным к и между сегментом 5' крыла и сегментом 3' крыла, и при этом каждый нуклеозид каждого сегмента крыла содержит 2'-O-метоксиэтилсахар, притом, что каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин, и при этом каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфоротиоатную связь.
В некоторых вариантах предлагается способ повышения уровней ЛПВП и/или улучшения соотношения ТГ к ЛПВП у животного путем введения животному соединения, содержащего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 12-30 связанных нуклеозидов, причем модифицированный олигонуклеотид является комплементарным к нуклеиновой кислоте ApoCIII. В некоторых вариантах нуклеиновая кислота ApoCIII представляет собой любую из SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах модифицированный олигонуклеотид является, как минимум, на 80%, как минимум, на 85%, как минимум, на 90%, как минимум, на 95%, как минимум, на 98% или, как минимум, на 100% комплементарным к SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2.
В некоторых вариантах предлагается способ предупреждения, лечения, облегчения или уменьшения, как минимум, одного симптома сердечно-сосудистого заболевания у животного путем введения животному соединения, содержащего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 12-30 связанных нуклеозидов, причем модифицированный олигонуклеотид является комплементарным к нуклеиновой кислоте ApoCIII и повышает уровни ЛПВП у животного. В некоторых вариантах нуклеиновая кислота ApoCIII представляет собой любую из SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах модифицированный олигонуклеотид является, как минимум, на 80%, как минимум, на 85%, как минимум, на 90%, как минимум, на 95%, как минимум, на 98% или, как минимум, на 100% комплементарным к SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2.
В некоторых вариантах предлагается способ снижения уровней ТБХЭ путем введения животному соединения, нацеленного на ApoCIII. В некоторых вариантах соединение содержит модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 12-30 связанных нуклеозидов, причем модифицированный олигонуклеотид является комплементарным к нуклеиновой кислоте ApoCIII. В некоторых вариантах нуклеиновая кислота ApoCIII представляет собой любую из SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах модифицированный олигонуклеотид является, как минимум, на 80%, как минимум, на 85%, как минимум, на 90%, как минимум, на 95%, как минимум, на 98% или, как минимум, на 100% комплементарным к SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах соединение содержит модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 12-30 связанных нуклеозидов, и содержит последовательность нуклеиновых оснований, содержащую, как минимум, 8 смежных нуклеиновых оснований ISIS 304801 (SEQ ID NO: 3). В некоторых вариантах соединение состоит из нуклеиновых оснований ISIS 304801 (SEQ ID NO: 3).
В некоторых вариантах предлагается способ повышения уровня ApoA1, PON1, клиренса жиров, клиренса хиломикрон триглицеридов и/или уровней ЛПВП путем введения животному соединения, нацеленного на ApoCIII. В некоторых вариантах соединение содержит модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 12-30 связанных нуклеозидов, причем модифицированный олигонуклеотид является комплементарным к нуклеиновой кислоте ApoCIII. В некоторых вариантах нуклеиновая кислота ApoCIII представляет собой любую из SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах модифицированный олигонуклеотид является, как минимум, на 80%, как минимум, на 85%, как минимум, на 90%, как минимум, на 95%, как минимум, на 98% или, как минимум, на 100% комплементарным к SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах соединение содержит модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 12-30 связанных нуклеозидов, и содержит последовательность нуклеиновых оснований, содержащую, как минимум, 8 смежных нуклеиновых оснований ISIS 304801 (SEQ ID NO: 3). В некоторых вариантах соединение состоит из нуклеиновых оснований ISIS 304801 (SEQ ID NO: 3).
В некоторых вариантах животное является человеком.
В некоторых вариантах сердечно-сосудистое заболевание представляет собой аневризму, стенокардию, аритмию, атеросклероз, цереброваскулярное заболевание, заболевание коронарных сосудов сердца, гипертензию, дислипидемию, гиперлипидемию, гипертриглицеридемию или гиперхолестеринемию. В некоторых вариантах дислипидемия представляет собой хиломикронемию.
В некоторых вариантах животное находится в группе риска панкреатита. В некоторых вариантах снижение уровней ApoCIII в печени и/или тонком кишечнике предупреждает панкреатит. В некоторых вариантах повышение уровней ЛПВП и/или улучшение соотношения ТГ к ЛПВП предупреждает панкреатит.
В некоторых вариантах снижение уровней ApoCIII в печени и/или тонком кишечнике увеличивает клиренс триглицеридов после приема пищи. В некоторых вариантах повышение уровней ЛПВП и/или улучшение соотношения ТГ к ЛПВП увеличивает клиренс триглицеридов после приема пищи. В некоторых вариантах снижение уровней ApoCIII в печени и/или тонком кишечнике снижает уровень триглицеридов после приема пищи. В некоторых вариантах повышение уровней ЛПВП и/или улучшение соотношения ТГ к ЛПВП снижает уровень триглицеридов после приема пищи.
В некоторых вариантах снижение уровней ApoCIII в печени и/или тонком кишечнике улучшает соотношение ЛПВП к ТГ.
В некоторых вариантах соединение вводят парентерально. В других вариантах парентеральное введение является подкожным введением.
В некоторых вариантах соединение вводят совместно со вторым средством. В некоторых вариантах второе средство представляет собой средство для снижения уровня глюкозы. В некоторых вариантах второе средство представляет собой средство для снижения ЛПВП, ТГ или холестерина.
В определенных вариантах соединение и второе средство вводят параллельно или последовательно.
В некоторых вариантах соединение находится в форме соли. В дальнейших вариантах соединение дополнительно включает фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.
В некоторых вариантах предлагается применение соединения, нацеленного на ApoCIII, для получения лекарственного средства для снижения уровней ApoCIII у животного. В некоторых вариантах предлагается применение соединения, нацеленного на ApoCIII, для снижения уровней ApoCIII у животного. В некоторых вариантах уровни ApoCIII снижаются в печени или тонком кишечнике. В некоторых вариантах предлагается применение соединения, нацеленного на ApoCIII, для получения лекарственного средства для предупреждения, лечения, облегчения или уменьшения, как минимум, одного симптома сердечно-сосудистого заболевания, путем повышения уровней ЛПВП и/или улучшения соотношения ТГ к ЛПВП. В некоторых вариантах предлагается применение соединения, нацеленного на ApoCIII, для предупреждения, лечения, облегчения или уменьшения, как минимум, одного симптома сердечно-сосудистого заболевания, путем повышения уровней ЛПВП и/или улучшения соотношения ТГ к ЛПВП. В некоторых вариантах предлагается применение соединения, нацеленного на ApoCIII, для повышения уровней ЛПВП и/или улучшения соотношения ТГ к ЛПВП у животного. В некоторых вариантах предлагается применение соединения, нацеленного на ApoCIII, для получения лекарственного средства для повышения уровней ЛПВП и/или улучшения соотношения ТГ к ЛПВП у животного. В некоторых вариантах соединение является, как минимум, на 80%, как минимум, на 85%, как минимум, на 90%, как минимум, на 95%, как минимум, на 98% или как минимум, на 100% комплементарным к последовательности нуклеиновой кислоты ApoCIII. В некоторых вариантах нуклеиновая кислота ApoCIII представлена любой из SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах соединение представляет собой модифицированный олигонуклеотид. В некоторых вариантах модифицированный олигонуклеотид содержит последовательность нуклеиновых оснований, содержащую, как минимум, 8 нуклеиновых оснований ISIS 304801 (SEQ ID NO: 3). В некоторых вариантах модифицированный олигонуклеотид содержит последовательность нуклеиновых оснований ISIS 304801 (SEQ ID NO: 3). В некоторых вариантах предлагается применение соединения, нацеленного на ApoCIII, для получения лекарственного средства для лечения животного, страдающего панкреатитом или подверженного риску панкреатита. В некоторых вариантах предлагается применение соединения, нацеленного на ApoCIII, для лечения животного, страдающего панкреатитом или подверженного риску панкреатита. В некоторых вариантах предлагается применение соединения, нацеленного на ApoCIII, для получения лекарственного средства для снижения уровней ApoCIII в печени и/или тонком кишечнике. В некоторых вариантах предлагается применение соединения, нацеленного на ApoCIII, для снижения уровней ApoCIII в печени и/или тонком кишечнике. В некоторых вариантах предлагается применение соединения, нацеленного на ApoCIII, для получения лекарственного средства для предупреждения панкреатита. В некоторых вариантах предлагается применение соединения, нацеленного на ApoCIII, для предупреждения панкреатита.
В некоторых вариантах предлагается применение соединения, нацеленного на ApoCIII, для получения лекарственного средства для снижения уровней ApoCIII в печени и/или тонком кишечнике животного с гипертриглицеридемией. В некоторых вариантах предлагается применение соединения, нацеленного на ApoCIII, с целью снижения уровней ApoCIII в печени и/или тонком кишечнике животного с гипертриглицеридемией. В некоторых вариантах предлагается применение соединения, нацеленного на ApoCIII, для получения лекарственного средства для повышения клиренса триглицеридов после приема пищи. В некоторых вариантах предлагается применение соединения, нацеленного на ApoCIII, с целью повышения клиренса триглицеридов после приема пищи. В некоторых вариантах предлагается применение соединения, нацеленного на ApoCIII, для получения лекарственного средства для снижения уровня триглицеридов после приема пищи. В некоторых вариантах предлагается применение соединения, нацеленного на ApoCIII, с целью снижения уровня триглицеридов после приема пищи.
Антисмысловые соединения
Олигомерные соединения включают, не ограничиваясь ими, олигонуклеотиды, олигонуклеозиды, аналоги олигонуклеотидов, миметики олигонуклеотидов, антисмысловые соединения, антисмысловые олигонуклеотиды и миРНК. Олигомерное соединение может быть "антисмысловым" по отношению к целевой нуклеиновой кислоте, и это означает, что соединение способно к гибридизации с целевой нуклеиновой кислотой посредством водородной связи.
В некоторых вариантах антисмысловое соединение содержит последовательность нуклеиновых оснований, которая, при написании в направлении от 5' к 3', включает обратную комплементарность целевого сегмента к целевой нуклеиновой кислоте, на которую оно нацелено. В некоторых из таких вариантов, антисмысловой олигонуклеотид содержит последовательность нуклеиновых оснований, которая, при написании в направлении от 5' к 3', включает обратную комплементарность целевого сегмента к целевой нуклеиновой кислоте, на которую оно нацелено.
В некоторых вариантах длина антисмыслового соединения, нацеленного на нуклеиновую кислоту ApoCIII, составляет 12-30 нуклеотидов. Другими словами, длина антисмыслового соединения составляет 12-30 связанных нуклеиновых оснований. В других вариантах антисмысловое соединение содержит модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 8-80, 10-80, 12-50, 15-30, 18-24, 19-22 или 20 связанных нуклеиновых оснований. В некоторых из таких вариантов антисмысловое соединение содержит модифицированный олигонуклеотид длиной 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 или 80 связанных нуклеиновых оснований или в интервале, определенном любыми двумя из упомянутых выше значений. В некоторых вариантах антисмысловое соединение представляет собой антисмысловой олигонуклеотид.
В некоторых вариантах антисмысловое соединение содержит сокращенный или укороченный модифицированный олигонуклеотид. В сокращенном или укороченном модифицированном олигонуклеотиде один или более нуклеозидов могут быть удалены с 5' конца (5' укорачивание), один или более нуклеозидов могут быть удалены с 3' конца (3' укорачивание) или один или более нуклеозидов могут быть удалены из центральной части. Альтернативно, удаленные нуклеозиды могут быть распределены в модифицированном олигонуклеотиде, например, в антисмысловом соединении один нуклеозид удален с 5' конца и один нуклеозид удален с 3' конца.
Если один дополнительный нуклеозид присутствует в удлиненным олигонуклеотиде, дополнительный нуклеозид может быть расположен в центральной части, на 5' или 3' конце олигонуклеотида. Если присутствуют два или более дополнительных нуклеозидов, дополнительные нуклеозиды могут быть смежными по отношению друг к другу, например, в олигонуклеотиде, содержащем два нуклеозида, добавленных к центральной части, к 5' концу (5' добавление) или, альтернативно, к 3' концу (3' добавление) олигонуклеотида. Альтернативно, дополнительные нуклеозиды могут быть распределены в антисмысловом соединении, например, в олигонуклеотиде, содержащем один нуклеозид, добавленный 5' концу, и одну субъединицу, добавленную к 3' концу.
Можно увеличить или уменьшить длину антисмыслового соединения, такого как антисмысловой олигонуклеотид, и/или ввести рассогласование оснований без потери активности. Например, в Woolf et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7305-7309, 1992) серия антисмысловых олигонуклеотидов длиной 13-25 нуклеиновых оснований была проверена на предмет способности индуцировать расщепление целевой РНК в модели инъекции ооцита. Антисмысловые олигонуклеотиды длиной 25 нуклеиновых оснований с 8 или 11 рассогласованиями оснований вблизи концов антисмысловых олигонуклеотидов были способны направлять специфическое расщепление целевой мРНК, хотя и в меньшей степени, чем антисмысловые олигонуклеотиды, которые не содержали рассогласований. Также, целевое специфическое расщепление было достигнуто с использованием антисмысловых олигонуклеотидов длиной 13 нуклеиновых оснований, в том числе, содержащих 1 или 3 рассогласований.
Gautschi et al (J. Natl. Cancer Inst. 93: 463-471, March 2001) продемонстрировали способность олигонуклеотида, на 100% комплементарного к мРНК bcl-2 и содержащего 3 рассогласования bcl-xL мРНК, снижать экспрессию как bcl-2, так и bcl-xL in vitro и in vivo. К тому же, данный олигонуклеотид продемонстрировал высокую противоопухолевую активность in vivo.
Maher and Dolnick (Nuc. Acid. Res. 16: 3341-3358, 1988) проверили серию тандемных антисмысловых олигонуклеотидов длиной 14 нуклеиновых оснований, и антисмысловых олигонуклеотидов длиной 28 и 42 нуклеиновых основания, состоящих из последовательности 2-х или 3-х тандемных антисмысловых олигонуклеотидов, соответственно, на предмет их способности останавливать трансляцию дигидрофолатредуктазы человека в анализе на ретикулоцитах кролика. Каждый из трех антисмысловых олигонуклеотидов длиной 14 нуклеиновых оснований по отдельности мог воспрепятствовать трансляции, хотя на более низком уровне, чем антисмысловые олигонуклеотиды длиной 28 или 42 нуклеиновых основания.
Мотивы антисмыслового соединения
В некоторых вариантах антисмысловые соединения, нацеленные на нуклеиновую кислоту ApoCIII, содержали химически модифицированные субъединицы, организованные в паттерны или мотивы, для обеспечения таких свойств антисмысловых соединений, как повышенная ингибирующая активность, повышенное сродство связывания с целевой нуклеиновой кислотой или устойчивость к расщеплению нуклеазами in vivo.
Химерные антисмысловые соединения обычно содержат, как минимум, один модифицированный участок, чтобы обеспечить повышенное сопротивление расщеплению нуклеазой, увеличение захвата клеткой, увеличение сродства связывания с целевой нуклеиновой кислотой и/или повышение ингибирующей активности. Второй участок химерного антисмыслового соединения необязательно может служить субстратом для клеточной эндонуклеазы РНКазы Н, которая расщепляет цепь РНК в дуплексе РНК:ДНК.
3
2
Антисмысловые соединения, содержащие мотив химерного нуклеотида, считаются химерными антисмысловыми соединениями. В химерном нуклеотиде внутренний участок, содержащий множество нуклеотидов, который поддерживает расщепление РНКазой Н, расположен между внешними участками, содержащими множество нуклеотидов, которые с химической точки зрения отличаются от нуклеозидов внутреннего участка. В случае антисмыслового олигонуклеотида, содержащего мотив химерного нуклеотида, сегмент промежутка, в общем, служит субстратом для расщепления эндонуклеазой, в то время как сегменты крыла включают модифицированные нуклеозиды. В некоторых вариантах участки химерного нуклеотида дифференцированы видами сахарных фрагментов, каждый из которых содержит отличный участок. Виды сахарных фрагментов, которые используются для дифференциации участков химерного нуклеотида, могут в некоторых вариантах включать β-D-рибонуклеозиды, β-D-дезоксирибонуклеозиды, 2'-модифицированные нуклеозиды (такие 2'-модифицированные нуклеозиды могут включать, среди прочего, 2'-МОЕ, и 2'-O-СН), и модифицированные бициклическим сахаром нуклеозиды (такие модифицированные бициклическим сахаром нуклеозиды могут включать содержащие мостик 4'-(CH)n-O-2', в котором n=1 или n=2). Предпочтительно, каждый отличный участок содержит однородные остатки сахара. Мотив крыло-промежуток-крыло часто описывают как "X-Y-Z", в котором "X" представляет длину участка 5' крыла, "Y" представляет длину промежутка, и "Z" представляет длину участка 3' крыла. В данном описании химерный нуклеотид, описываемый как "X-Y-Z", имеет такую конфигурацию, что сегмент промежутка расположен непосредственно смежным к каждому из сегмента 5' крыла и сегмента 3' крыла. Таким образом, отсутствуют промежуточные нуклеотиды между сегментом 5' крыла и сегментом промежутка или сегментом промежутка и сегментом 3' крыла. Любое из антисмысловых соединений, описанных в данном описании, может содержать мотив химерного нуклеотида. В некоторых вариантах Х и Z одинаковые; в других вариантах они различны. В предпочтительном варианте длина Y составляет от 8 до 15 нуклеотидов, длина X, Y или Z может составлять 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или более нуклеотидов. Таким образом, химерные нуклеотиды включают, не ограничиваясь ими, например 5-10-5, 4-8-4, 4-12-3, 4-12-4, 3-14-3, 2-13-5, 2-16-2, 1-18-1, 3-10-3, 2-10-2, 1-10-1, 2-8-2, 6-8-6, 5-8-5, 1-8-1, 2-6-2, 2-13-2, 1-8-2, 2-8-3, 3-10-2, 1-18-2 или 2-18-2.
В некоторых вариантах антисмысловое соединение как мотив "химерного крыла" имеет конфигурацию крыла-промежутка или промежутка-крыла, т.е. конфигурацию X-Y или Y-Z, как изложено выше для конфигурации химерного нуклеотида. Таким образом, конфигурации химерного крыла включают, не ограничиваясь ими, например 5-10, 8-4, 4-12, 12-4, 3-14, 16-2, 18-1, 10-3, 2-10, 1-10, 8-2, 2-13 или 5-13.
В некоторых вариантах антисмысловые соединения, нацеленные на нуклеиновую кислоту ApoCIII, содержат мотив химерного нуклеотида 5-10-5.
В некоторых вариантах антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеиновую кислоту ApoCIII, содержит расширенный промежутком мотив.
Целевые нуклеиновые кислоты, целевые участки и последовательности нуклеотидов
Нуклеотидные последовательности, которые кодируют ApoCIII, включают, не ограничиваясь ими, следующие: GENBANK номер доступа NM_000040.1 (включена в данное описание как SEQ ID NO: 1) и GENBANK номер доступа NT_033899.8 укороченная от нуклеотида 20262640 до 20266603 (включена в данное описание как SEQ ID NO: 2).
Следует понимать, что последовательность, сформулированная в каждой SEQ ID NO в Примерах, содержащихся в данном описании, является независимой от любой модификации сахарного фрагмента, межнуклеозидной связи или нуклеинового основания. Как таковые, антисмысловые соединения, определенные SEQ ID NO, независимо могут содержать одну или более модификаций сахарного фрагмента, межнуклеозидной связи или нуклеинового основания. Антисмысловые соединения, описанные номером Isis (Isis No) показывают комбинацию последовательности нуклеиновых оснований и мотива.
В некоторых вариантах целевой участок представляет собой структурно определенный участок нуклеиновой кислоты-мишени. Например, целевой участок может содержать 3' UTR, 5' UTR, экзон, интрон, соединение экзон/интрон, кодирующий участок, участок инициации трансляции, участок окончания трансляции или другой определенный участок нуклеиновой кислоты. Структурно определенные участки для ApoCIII могут быть получены по номеру доступа из баз данных последовательностей, таких как NCBI, и такая информация включена в данное описание путем ссылки. В некоторых вариантах целевой участок может содержать последовательность от целевого сайта 5' одного целевого сегмента в пределах целевого участка до целевого сайга 3' другого целевого сегмента в пределах целевого участка.
В некоторых вариантах "целевой сегмент" представляет собой меньшую часть целевого участка в пределах нуклеиновой кислоты. Например, целевой сегмент может быть последовательностью нуклеотидов нуклеиновой кислоты-мишени, на которую нацелено одно или более антисмысловых соединений. "Целевой сайт 5'" обозначает расположенный на 5'-конце нуклеотид целевого сегмента, "целевой сайт 3'" обозначает расположенный на 3'-конце нуклеотид целевого сегмента.
Целевой участок может содержать один или более целевых сегментов. Множественные целевые сегменты в пределах целевого участка могут частично перекрываться. Альтернативно, они могут не перекрываться. В некоторых вариантах целевые сегменты в пределах целевого участка разделены не более чем приблизительно 300 нуклеотидами. В некоторых вариантах целевые сегменты в пределах целевого участка разделены количеством нуклеотидов, которое составляет не более чем или не более чем приблизительно 250, 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 или 10 нуклеотидами на целевой нуклеиновой кислоте или представляет собой интервал, определенный любыми двумя из предшествующих значений. В некоторых вариантах целевые сегменты в пределах целевого участка разделены не более чем или не более чем приблизительно 5 нуклеотидами на целевой нуклеиновой кислоте. В некоторых вариантах целевые сегменты являются смежными. Предусмотрены целевые участки, определенные интервалом, содержащим начало нуклеиновой кислоты, которое представляет собой любой из целевых 5' сайтов или целевых 3' сайтов, перечисленных в данном описании.
Нацеливание включает определение, как минимум, одного целевого сегмента, с которым гибридизуется антисмысловое соединение таким образом, чтобы оказывать желательное влияние. В некоторых вариантах желательное влияние представляет собой снижение уровней нуклеиновой кислоты-мишени мРНК. В некоторых вариантах желательное влияние представляет собой снижение уровней белка, кодируемого нуклеиновой кислотой-мишенью или фенотипическое модифицирование, связанное с нуклеиновой кислотой-мишенью.
Пригодные сегменты-мишени могут быть найдены в пределах 5' UTR, кодирующего участка, 3' UTR, интрона, экзона или соединения экзон/интрон. Сегменты-мишени, содержащие старт-кодон или стоп-кодон, также представляют собой подходящие сегменты-мишени. Подходящий сегмент-мишень может специфично исключать некоторый структурно определенный участок, такой как старт-кодон или стоп-кодон.
Определение пригодных сегментов-мишеней может включать сравнение последовательности нуклеиновой кислоты-мишени с другими последовательностями в геноме. Например, алгоритм BLAST может применяться для идентификации участков сходства между различными нуклеиновыми кислотами. Такое сравнение может предупредить отбор последовательностей антисмысловых соединений, которые способны гибридизоваться неспецифическим образом с другими последовательностям, кроме выбранной нуклеиновой кислоты-мишени (т.е. нецелевые последовательности).
Может существовать вариация активности (например, как определяется процентным уменьшением уровней нуклеиновой кислоты-мишени) антисмысловых соединений в пределах активного участка-мишени. В некоторых вариантах снижение уровней мРНК ApoCIII указывает на ингибирование экспрессии ApoCIII. Снижение уровней белка ApoCIII может указывать на ингибирование экспрессии мРНК мишени. Далее, фенотипические модифицирования могут указывать на ингибирование экспрессии ApoCIII. Например, повышение уровней ЛПВП, снижение уровней ЛПНП или снижение уровней триглицеридов находятся среди фенотипических модификаций, которые можно анализировать на предмет ингибирования экспрессии ApoCIII. Другие фенотипические показания, например, симптомы, связанные с сердечно-сосудистым заболеванием, также можно оценивать; например, стенокардию; боль в груди; одышку; сердцебиение; слабость; головокружение; тошноту; повышенное потоотделение; тахикардию; брадикардию; аритмию; мерцание предсердий; отек нижних конечностей; цианоз; усталость; слабость; онемение лица; онемение конечностей; хромоту или мышечные спазмы; вздутие живота; или лихорадку.
Гибридизация
В некоторых вариантах происходит гибридизация между антисмысловым соединением, раскрытым в данном описании, и нуклеиновой кислотой ApoCIII. Наиболее общий механизм гибридизации включает участие водородной связи (например, Watson-Crick, Hoogsteen или образование обратной Hoogsteen водородной связи) между комплементарными нуклеиновыми основаниями молекул нуклеиновой кислоты.
Гибридизация может происходить в различных условиях. Строгие условия зависят от последовательности и определяются природой и составом молекул нуклеиновой кислоты, которые подлежат гибридизации.
rd
Способы определения того, способна ли последовательность к специфичной гибридизации с нуклеиновой кислотой-мишенью, хорошо известны в данной области (Sambrooke and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3 Ed., 2001). В некоторых вариантах антисмысловые соединения, предложенные в данном описании, способны специфично гибридизоваться с нуклеиновой кислотой ApoCIII.
Комплементарность
Антисмысловое соединение и нуклеиновая кислота-мишень комплементарны друг к другу, когда достаточное количество нуклеиновых оснований антисмыслового соединения может образовывать водородную связь с соответствующими нуклеиновыми основаниями нуклеиновой кислоты-мишени, таким образом, чтобы оказывать желательный эффект (например, антисмысловое ингибирование нуклеиновой кислоты-мишени, такой как нуклеиновая кислота ApoCIII).
Антисмысловое соединение может гибридизоваться с одним или более сегментов нуклеиновой кислоты ApoCIII таким образом, что промежуточные или смежные сегменты не участвуют в процессе гибридизации (например, петлевая структура, рассогласование или структура «шпильки»).
В некоторых вариантах антисмысловые соединения, предложенные в данном описании, или указанная их часть являются на или, как минимум, на 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% комплементарными к нуклеиновой кислоте ApoCIII, участку-мишени, сегменту-мишени или указанной их части. Процент комплементарности антисмыслового соединения к нуклеиновой кислоте-мишени может быть определен с применением шаблонных способов.
Например, антисмысловое соединение, в котором 18 из 20 нуклеиновых оснований антисмыслового соединения комплементарны к участку-мишени, и таким образом, будут специфично гибридизоваться, будут представлять 90%-ную комплементарность. В данном примере, остальные некомплементарные нуклеиновые основания могут быть сгруппированы или перемежаться комплементарными нуклеиновыми основаниями, и не обязательно должны быть смежными по отношению друг к другу или к комплементарным нуклеиновым основаниям. Как таковое, антисмысловое соединение длиной 18 нуклеиновых оснований, содержащее 4 (четыре) некомплементарных нуклеиновых основания, обрамленные двумя участками полной комплементарности с нуклеиновой кислотой-мишенью, обладают общей комплементарностью с нуклеиновой кислотой-мишенью 77,8%, и, таким образом, находятся в пределах контекста настоящего изобретения. Процент комплементарности антисмыслового соединения с участком нуклеиновой кислоты-мишени может быть определен шаблонным применением программ BLAST (поисковые инструменты для базового локального выравнивания) и программ PowerBLAST, известных из уровня техники (Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403 410; Zhang and Madden, Genome Res., 1997, 7, 649 656). Процент гомологии, идентичность последовательностей или комплементарность могут быть определены, например, с помощью программы Gap (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.), с использованием значений, устанавливаемых по умолчанию, где применяется алгоритм Smith and Waterman (Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482-489).
В некоторых вариантах антисмысловые соединения, предложенные в данном описании или указанные их части являются полностью комплементарными (т.е. на 100% комплементарными) к нуклеиновой кислоте-мишени или указанной ее части. Например, антисмысловое соединение может быть полностью комплементарным к нуклеиновой кислоте ApoCIII или участку-мишени или сегменту-мишени или ее последовательности-мишени. В данном описании "полностью комплементарный" подразумевает, что каждое нуклеиновое основание антисмыслового соединения способно к точному спариванию оснований с соответствующими нуклеиновыми основаниями нуклеиновой кислоты-мишени. Например, антисмысловые соединения длиной 20 нуклеиновых оснований полностью комплементарны к последовательности-мишени, длина которой составляет 400 нуклеиновых оснований до тех пор, пока в нуклеиновой кислоте-мишени присутствует соответствующая часть длиной 20 нуклеиновых оснований, которая полностью комплементарна к антисмысловому соединению. «Полностью комплементарный» также может использоваться со ссылкой на указанную часть первой и/или второй нуклеиновой кислоты. Например, часть длиной 20 нуклеиновых оснований антисмыслового соединения длиной 30 нуклеиновых оснований может быть "полностью комплементарной" к последовательности-мишени длиной 400 нуклеиновых оснований. Часть длиной 20 нуклеиновых оснований олигонуклеотида длиной 30 нуклеиновых оснований полностью комплементарна к последовательности-мишени, если последовательность-мишень содержит соответствующую часть длиной 20 нуклеиновых оснований, причем каждое нуклеиновое основание комплементарно к части антисмыслового соединения длиной 20 нуклеиновых оснований. В то же время, полноразмерные антисмысловые соединения длиной 30 нуклеиновых оснований могут быть или не быть полностью комплементарными к последовательности-мишени, в зависимости от того, будут ли оитальные 10 нуклеиновых оснований антисмыслового соединения также комплементарными к последовательности-мишени.
Некомплементарное(ые) нуклеиновое(ые) основание(я) может быть расположено на 5' конце или на 3' конце антисмыслового соединения. Альтернативно, некомплементарное(ые) нуклеиновое(ые) основание(я) может быть расположено во внутреннем положении антисмыслового соединения. Если присутствуют два или более некомплементарных нуклеиновых оснований, они могут быть смежными (т.е. связанными) или несмежными. В одном из вариантов некомплементарное нуклеиновое основание расположено в сегменте крыла антисмыслового олигонуклеотида химерного нуклеотида.
В некоторых вариантах антисмысловые соединения, которые содержат ровно или менее 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 нуклеиновых оснований, включают не более 4, не более 3, не более 2 или не более 1 некомплементарного(ых) нуклеинового(ых) основания(й) относительно нуклеиновой кислоты-мишени, такой как нуклеиновая кислота ApoCIII или указанная ее часть.
В некоторых вариантах антисмысловые соединения, которые содержат ровно или менее, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеиновых оснований, содержат не более 6, не более 5, не более 4, не более 3, не более 2 или не более 1 некомплементарного(ых) нуклеинового(ых) основания(й) относительно нуклеиновой кислоты-мишени, такой как нуклеиновая кислота ApoCIII или указанная ее часть.
Антисмысловые соединения, предложенные в данном описании, также включают комплементарные к части нуклеиновой кислоты-мишени. В данном описании "часть" обозначает некоторое количество смежных (т.е. связанных) нуклеиновых оснований в пределах участка или сегмента нуклеиновой кислоты-мишени. "Часть" может также обозначать некоторое количество смежных нуклеиновых оснований антисмыслового соединения. В некоторых вариантах антисмысловые соединения комплементарны к части сегмента-мишени длиной, как минимум, 8 нуклеиновых оснований. В некоторых вариантах антисмысловые соединения комплементарны к части сегмента-мишени длиной, как минимум, 10 нуклеиновых оснований. В некоторых вариантах антисмысловые соединения комплементарны к части сегмента-мишени длиной, как минимум, 12 нуклеиновых оснований. В некоторых вариантах антисмысловые соединения комплементарны к части сегмента-мишени длиной, как минимум, 15 нуклеиновых оснований. Также предусмотрены антисмысловые соединения, которые комплементарны к части сегмента-мишени длиной, как минимум, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более нуклеиновых оснований или с длиной в интервале, определенном любыми двумя из этих значений.
Идентичность
Антисмысловые соединения, предложенные в данном описании, также могут обладать определенным процентом идентичности с конкретной последовательностью нуклеотидов, SEQ ID NO или последовательностью соединения, представленного конкретным номером Isis или его частью. В данном описании антисмысловое соединение идентично последовательности, раскрытой в данном описании, если оно обладает такой же способностью спариваться с нуклеиновыми основаниями. Например, РНК, которая содержит урацил вместо тимидина в раскрытой последовательности ДНК, считалась бы идентичной последовательности ДНК, поскольку и урацил, и тимидин спариваются с аденином. Также предусматриваются укороченные и удлиненные версии антисмысловых соединений, описанных в данном описании, а также соединения, содержащие неидентичные основания относительно антисмысловых соединений, предложенных в данном описании. Неидентичные основания могут быть смежными по отношению друг к другу или распределены в антисмысловом соединении. Процент идентичности антисмыслового соединения вычисляют согласно количеству оснований с идентичным спариванием оснований относительно последовательности, с которой его сравнивают.
В некоторых вариантах антисмысловые соединения или их части являются, как минимум, на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичными одному или более антисмысловых соединений или SEQ ID NO или их частей, раскрытых в данном описании.
Модификации
Нуклеозид представляет собой комбинацию оснований и Сахаров. Часть нуклеинового основания (также известного как основание) нуклеозида обычно представляет собой фрагмент гетероциклического основания. Нуклеотиды представляют собой нуклеозиды, которые дополнительно содержат фосфатную группу, ковалентно связанную с сахарной частью нуклеозида. Для тех нуклеозидов, которые содержат пентофуранозильный сахар, фосфатная группа может быть связана с 2', 3' или 5' гидроксильными фрагментами сахара. Олигонуклеотиды образуются посредством ковалентной связи смежных нуклеозидов друг с другом, чтобы сформировать линейный полимерный олигонуклеотид. В пределах структуры олигонуклеотида, фосфатные группы обычно называют образующими межнуклеозидные связи олигонуклеотида.
Модификации антисмысловых соединений включают замены или модификации межнуклеозидных связей, сахарных фрагментов или нуклеиновых оснований. Модифицированные антисмысловые соединения часто предпочтительны по сравнению с природными формами благодаря желательным свойствам, таким как, например, увеличение захвата клеткой, повышенное сродство к нуклеиновой кислоте-мишени, повышенная стабильность в присутствии нуклеаз или увеличенная ингибирующая активность.
Химически модифицированные нуклеозиды также могут использоваться для повышения сродства связывания сокращенного или укороченного антисмыслового олигонуклеотида к нуклеиновой кислоте-мишени. Таким образом, сравнимые результаты часто могут быть получены с использованием более коротких антисмысловых соединений, которые содержат такие химически модифицированные нуклеозиды.
Модифицированные межнуклеозидные связи
Природная межнуклеозидная связь между РНК и ДНК представляет собой 3'-5' фосфодиэфирную связь. Антисмысловые соединения, содержащие одну или более модифицированных, т.е. неприродных, межнуклеозидных связей часто предпочтительны по сравнению с антисмысловыми соединениями, содержащими природные межнуклеозидные связи, благодаря желательным свойствам, например, таким как увеличение захвата клеткой, повышенное сродство к нуклеиновым кислотам-мишеням и повышенная стабильность в присутствии нуклеаз.
Олигонуклеотиды, содержащие модифицированные межнуклеозидные связи, содержат межнуклеозидные связи, которые сохраняют атом фосфора, а также межнуклеозидные связи, которые не содержат атома фосфора. Характерные фосфорсодержащие межнуклеозидные связи, включают, не ограничиваясь ими, фосфодиэфиры, фосфотриэфиры, метилфосфонаты, фосфорамидат и фосфоротиоаты. Способы получения фосфорсодержащих и не фосфорсодержащих соединений хорошо известны.
В некоторых вариантах антисмысловые соединения, нацеленные на нуклеиновую кислоту ApoCIII, содержат одну или более модифицированных межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах модифицированные межнуклеозидные связи представляют собой фосфоротиоатные связи. В некоторых вариантах каждая межнуклеозидная связь антисмыслового соединения представляет собой межнуклеозидную фосфоротиоатную связь.
Модифицированные сахарные фрагменты
1
2
1
2
1
12
Антисмысловые соединения по изобретению необязательно могут содержать один или более нуклеозидов, в которых сахарная группа модифицирована. Такие нуклеозиды с модифицированными сахарами могут обеспечивать антисмысловым соединениям повышенную устойчивость к нуклеазе, повышенное сродство связывания или некоторое другое предпочтительное биологическое свойство. В некоторых вариантах нуклеозиды содержат химически модифицированные фрагменты рибофуранозного кольца. Примеры химически модифицированных рибофуранозных колец включают, не ограничиваясь ими, добавление групп заместителей (в том числе, 5' и 2' групп заместителей, соединение мостиком не геминальных атомов кольца для образования бициклических нуклеиновых кислот (БНК), замену кислородного атома рибозильного кольца на S, N(R) или C(R)(R) (каждый из R, R и R независимо представляет собой Н, C-C алкил или защитную группа) и их комбинации. Примеры химически модифицированного сахара включают 2'-F-5'-метилзамещенный нуклеозид (см. Международную заявку РСТ WO 2008/101157, опубликованную 8/21/08 относительно других раскрытых 5',2'-бисзамещенных нуклеозидов) или замену кислородного атома рибозильного кольца на S, с дальнейшим замещением в 2'-положении (см. опубликованную патентную заявку США US 2005-0130923, опубликованную 16 июня 2005 г.) или, альтернативно, 5'-замещение БНК (см. Международную заявку РСТ WO 2007/134181, опубликованную 11/22/07, в которой ЛНК замещена, например, группой 5'-метил или 5'-винил).
3
2
3
2
2
2
2
3
1
10
3
2
2
2
3
2
2
m
n
2
m
n
2
1
2
2
m
n
1
m
n
1
10
Примеры нуклеозидов, содержащих модифицированные сахарные фрагменты, включают, не ограничиваясь ими, нуклеозиды, содержащие группы заместителей 5'-винил, 5'-метил (R или 5), 4'-S, 2'-F, 2'-ОСН, 2'-OCHCH, 2'-OCHCHF и 2'-O(CH)OCH. Заместитель в положении 2' также может быть выбран из аллила, амино, азидо, тио, O-аллила, O-C-C алкила, OCF, OCHF, O(CH)SCH, O(CH)-O-N(R)(R), O-CH-C(=O)-N(R)(R) и O-CH-C(=O)-N(R)-(CH)-N(R)(R), в которых каждый из R, R и R независимо представляют собой Н или замещенный или незамещенный C-С алкил.
2
2
2
3
2
3
3
3
2
3
2
3
2
1
12
2
3
2
2
В данном описании "бициклические нуклеозиды" обозначают модифицированные нуклеозиды, содержащие бициклический сахарный фрагмент. Примеры бициклических нуклеозидов включают, не ограничиваясь ими, нуклеозиды, содержащие мостик между атомами 4' и 2' рибозильного кольца. В некоторых вариантах антисмысловые соединения, предложенные в данном описании, включают один или более бициклических нуклеозидов, содержащих мостик 4'-2'. Примеры таких соединенных мостиком 4'-2' бициклических нуклеозидов включают, не ограничиваясь ими, соединение одной из формул: 4'-(CH)-O-2' (ЛНК); 4'-(CH)-S-2'; 4'-(CH)2-O-2' (ЭНК); 4'-СН(СН)-O-2' и 4'-СН(CHOCH)-O-2' (и их аналоги, см. патент США 7,399,845, выданный 15 июля 2008 г.); 4'-С(СН)(СН)-O-2' (и его аналоги, см. опубликованную Международную заявку WO/2009/006478, опубликованную 8 января 2009 г.); 4'-CH-N(ОСН)-2' (и его аналоги, см. опубликованную Международную заявку WO/2008/150729, опубликованную 11 декабря 2008 г.); 4'-CH-O-N(СН)-2' (см. опубликованную патентную заявку США US2004-0171570, опубликованную 2 сентября 2004 г.); 4'-CH-N(R)-O-2', в котором R представляет собой Н, С-С алкил или защитную группу (см. патент США 7,427,672, выданный 23 сентября 2008 г.); 4'-CH-С(Н)(СН)-2' (см. Chattopadhyaya et al., J. Org. Chem., 2009, 74, 118-134); и 4'-CH-С(=CH)-2' (и его аналоги, см. опубликованную Международную заявку WO 2008/154401, опубликованную 8 декабря 2008 г.).
Дополнительные отчеты, связанные с бициклическими нуклеозидами, также можно найти в опубликованной литературе (см.например: Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456; Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630; Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2000, 97, 5633-5638; Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222; Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039; Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129(26) 8362-8379; Elayadi et al., Curr. Opinion Invest. Drugs, 2001, 2, 558-561; Braasch et al., Chem. Biol., 2001, 8, 1-7; и Orum et al., Curr. Opinion Mol. Ther., 2001, 3, 239-243, патенты США 6,268,490; 6,525,191; 6,670,461; 6,770,748; 6,794,499; 7,034,133; 7,053,207; 7,399,845; 7,547,684; и 7,696,345; патентные публикации США US2008-0039618; US2009-0012281; патенты США серийный номер 60/989,574; 61/026,995; 61/026,998; 61/056,564; 61/086,231; 61/097,787; и 61/099,844; опубликованные международные заявки РСТ WO 1994/014226; WO 2004/106356; WO 2005/021570; WO 2007/134181; WO 2008/150729; WO 2008/154401; и WO 2009/006478. Каждый из вышеуказанных бициклических нуклеозидов может быть получен содержащим одну или более стереохимических конфигураций сахара, в том числе, например α-L-рибофураноза и β-D-рабофураноза (см. международную заявку PCT/DK98100393, опубликованную 25 марта 1999 г. как WO 99/14226).
a
b
n
a
b
a
a
a
2
x
a
В некоторых вариантах бициклические сахарные фрагменты нуклеозидов БНК включают, не ограничиваясь ими, соединения, содержащие, как минимум, один мостик между положениями 4' и 2' пентофуранозильного сахарного фрагмента, причем такие мостики независимо содержат 1 или от 2 до 4 связанных групп, независимо выбранных из -[C(R)(R)]-, -C(R)=C(R)-, -C(R)=N-, -С(=O)-, -C(=NR)-, -C(=S)-, -O-, -Si(R)-, -S(=O)- и -N(R)-;
в которых:
x равно 0, 1 или 2;
n равно 1, 2, 3 или 4;
a
b
1
12
1
12
2
12
2
12
2
12
2
12
5
20
5
20
5
7
5
7
1
1
2
1
3
1
2
1
1
каждый из R и R независимо представляет собой Н, защитную группу, гидроксил, C-C алкил, замещенный C-C алкил, C-C алкенил, замещенный C-C алкенил, C-C алкинил, замещенный C-C алкинил, С-С арил, замещенный С-С арил, гетероциклический радикал, замещенный гетероциклический радикал, гетероарил, замещенный гетероарил, C-C алициклический радикал, замещенный С-С алициклический радикал, галоген, OJ, NJJ, SJ, N, COOJ, ацил (С(=O)-Н), замещенный ацил, CN, сульфонил (S(=O)-J) или сульфоксил (S(=O)-J); и
1
2
1
12
1
12
2
12
2
12
2
12
2
12
5
20
5
20
1
12
1
12
каждый из J и J независимо представляет собой Н, C-C алкил, замещенный C-C алкил, C-C алкенил, замещенный C-C алкенил, C-C алкинил, замещенный C-C алкинил, С-С арил, замещенный C-C арил, ацил (С(=O)-Н), замещенный ацил, гетероциклический радикал, замещенный гетероциклический радикал, C-C аминоалкил, замещенный C-C аминоалкил или защитную группу.
a
b
n
a
b
n
a
b
a
b
2
2
2
3
2
2
2
2
2
1
12
В некоторых вариантах мостик бициклического сахарного фрагмента представляет собой -[C(R)(R)]-, -[C(R)(R)]-O-, -C(RR)-N(R)-O- или -C(RR)-O-N(R)-. В некоторых вариантах мостик представляет собой 4'-CH-2', 4'-(CH)2-2', 4'-(CH)-2', 4'-CH-O-2', 4'-(CH)-O-2', 4'-CH-O-N(R)-2' и 4'-CH-N(R)-O-2'-, причем каждый из R независимо представляет собой Н, защитную группу или C-C алкил.
2
В некоторых вариантах бициклические нуклеозиды дополнительно определены изомерной конфигурацией. Например, нуклеозид, содержащий 4'-2' мостик метилен-окси, может находиться в a-L конфигурации или в β-D конфигурации. Ранее, α-L-метиленокси (4'-CH-O-2') РНК был введен в антисмысловые олигонуклеотиды, которые демонстрировали антисмысловую активность (Frieden et al., Nucleic Acids Research, 2003, 21, 6365-6372).
2
2
2
2
2
2
3
2
2
2
3
2
3
В некоторых вариантах бициклические нуклеозиды включают, не ограничиваясь ими, (А) α-L-метиленокси (4'-CH-O-2') БНК, (В) β-D-метиленокси (4'-CH-O-2') БНК, (С) этиленокси (4'-(CH)-O-2') БНК, (D) аминоокси (4'-CH-O-N(R)-2') БНК, (Е) оксиамино (4'-CH-N(R)-O-2') БНК, и (F) метил(метиленокси) (4'-СН(СН)-O-2') БНК, (G) метилен-тио (4'-CH-S-2') БНК, (Н) метилен-амино (4'-CH-N(R)-2') БНК, (I) метил карбоциклический (4'-CH-СН(СН)-2') БНК, и (J) пропилен карбоциклический (4'-(CH)-2') БНК, как показано ниже.
1
12
в которых Вх представляет собой фрагмент основания, и R независимо представляет собой Н, защитную группу или C-C алкил.
В некоторых вариантах предложены бициклические нуклеозиды Формулы I:
в которых:
Вх представляет собой фрагмент гетероциклического основания;
a
b
c
2
c
2
c
2
2
c
2
c
c
2
-Q-Q-Q- представляет собой -CH-N(R)-CH-, -C(=O)-N(R)-CH-, -CH-O-N(R)-, -CH-N(R)-O- или -N(R)-O-CH;
c
1
12
R представляет собой C-C алкил или защитную группу для аминогруппы; и
а
b
каждый из Т и T независимо представляет собой Н, защитную группу для гидроксигруппы, группу конъюгата, реакционно-способную фосфорсодержащую группу, фосфорсодержащий фрагмент или ковалентное присоединение к среде подложки.
В некоторых вариантах предложены бициклические нуклеозиды Формулы II:
в которых:
Вх представляет собой фрагмент гетероциклического основания;
а
b
каждый из Т и T независимо представляет собой Н, защитную группу для гидроксигруппы, группу конъюгата, реакционно-способную фосфорсодержащую группу, фосфорсодержащий фрагмент или ковалентное присоединение к среде подложки;
a
1
6
2
6
2
6
1
6
2
6
2
6
Z представляет собой C-С алкил, C-С алкенил, C-С алкинил, замещенный C-С алкил, замещенный C-С алкенил, замещенный C-С алкинил, ацил, замещенный ацил, замещенный амид, тиол или замещенный тио.
c
c
d
c
3
c
e
c
d
c
d
e
1
6
1
6
c
В одном из вариантов каждая из замещенных групп независимо является моно- или полизамещенной группами заместителей, независимо выбранными из галогена, оксо, гидроксила, OJ, NJJ, SJ, N, OC(=X)J, и NJC(=X)NJJ, причем каждый из J, J и J независимо представляет собой Н, C-С алкил или замещенный C-С алкил, и Х представляет собой О или NJ.
В некоторых вариантах предложены бициклические нуклеозиды Формулы III:
в которых:
Вх представляет собой фрагмент гетероциклического основания;
а
b
каждый из Т и T независимо представляет собой Н, защитную группу для гидроксигруппы, группу конъюгата, реакционно-способную фосфорсодержащую группу, фосфорсодержащий фрагмент или ковалентное присоединение к среде подложки;
b
1
6
2
6
2
6
1
6
2
6
2
6
Z представляет собой C-С алкил, C-С алкенил, C-С алкинил, замещенный C-Салкил, замещенный C-С алкенил, замещенный C-С алкинил или замещенный ацил (С(=O)-).
В некоторых вариантах предложены бициклические нуклеозиды Формулы IV:
в которых:
Вх представляет собой фрагмент гетероциклического основания;
а
b
каждый из Т и T независимо представляет собой Н, защитную группу для гидроксигруппы, группу конъюгата, реакционно-способную фосфорсодержащую группу, фосфорсодержащий фрагмент или ковалентное присоединение к среде подложки;
d
1
6
1
6
2
6
2
6
2
6
2
6
R представляет собой C-С алкил, замещенный C-С алкил, C-С алкенил, замещенный C-С алкенил, C-С алкинил или замещенный C-С алкинил;
a
b
c
d
1
6
1
6
2
6
2
6
2
6
2
6
1
6
1
6
1
6
1
6
каждый из q, q, q и q независимо представляет собой Н, галоген, C-С алкил, замещенный C-С алкил, C-С алкенил, замещенный C-С алкенил, C-С алкинил или замещенный C-С алкинил, C-С алкоксил, замещенный C-С алкоксил, ацил, замещенный ацил, C-С аминоалкил или замещенный C-С аминоалкил;
В некоторых вариантах предложены бициклические нуклеозиды Формулы V:
в которых:
Вх представляет собой фрагмент гетероциклического основания;
а
b
каждый из Т и T независимо представляет собой Н, защитную группу для гидроксигруппы, группу конъюгата, реакционно-способную фосфорсодержащую группу, фосфорсодержащий фрагмент или ковалентное присоединение к среде подложки;
a
b
e
f
1
12
1
12
2
12
2
12
2
12
2
12
1
12
1
12
j
j
j
2
j
j
k
3
j
j
k
j
j
k
j
k
j
k
j
k
каждый из q, q, q и q независимо представляет собой водород, галоген, C-C алкил, замещенный C-C алкил, C-C алкенил, замещенный C-C алкенил, C-C алкинил, замещенный C-C алкинил, C-C алкокси, замещенный C-C алкокси, OJ, SJ, SOJ, SOJ, NJJ, N, CN, C(=O)OJ, C(=O)NJJ, C(=O)J, O-C(=O)NJJ, N(H)C(=NH)NJJ, N(H)C(=O)NJJ или N(H)C(=S)NJJ;
e
f
g
h
или q и q вместе представляют собой =C(q)(q);
g
h
1
12
1
12
каждый из q и q независимо представляет собой Н, галоген, C-C алкил или замещенный C-C алкил.
2
Синтез и получение мономеров метиленокси (4'-CH-O-2') БНК аденина, цитозина, гуанина, 5-метил-цитозина, тимина и урацила, наряду с их олигомеризацией, и свойства распознавания нуклеиновой кислоты описаны (Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630). БНК и их получение также описаны в WO 98/39352 и WO 99/14226.
Аналоги метиленокси (4'-CHz-O-2') БНК и 2'-тио-БНК также были получены (Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222). Также описано получение замкнутых аналогов нуклеозида, содержащих олигодезоксирибонуклеотидные дуплексы как субстраты для полимераз нуклеиновых кислот (Wengel et al., WO 99/14226). К тому же, синтез 2'-амино-БНК, нового, конформационно ограниченного олигонуклеотидного аналога с высоким сродством, описан в уровне техники (Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039). Кроме того, ранее были получены 2'-амино- и 2'-метиламино-БНК, и сообщалось о термической стабильности их дуплексов с комплементарными РНК и ДНК.
В некоторых вариантах предлагаются бициклические нуклеозиды Формулы VI:
в которых:
Вх представляет собой фрагмент гетероциклического основания;
а
b
каждый из Т и T независимо представляет собой Н, защитную группу для гидроксигруппы, группу конъюгата, реакционно-способную фосфорсодержащую группу, фосфорсодержащий фрагмент или ковалентное присоединение к среде подложки;
i
j
k
l
1
12
1
12
2
12
2
12
2
12
2
12
1
12
1
12
j
j
j
2
j
j
k
3
j
j
k
j
j
k
j
k
j
k
j
k
каждый из q, q, q и q независимо представляет собой водород, галоген, C-C алкил, замещенный C-C алкил, C-C алкенил, замещенный C-C алкенил, C-C алкинил, замещенный C-C алкинил, C-C алкоксил, замещенный C-C алкоксил, OJ, SJ, SOJ, SOJ, NJJ, N, CN, C(=O)OJ, C(=O)NJJ, C(=O)J, O-C(=O)NJJ, N(H)C(=NH)NJJ, N(H)C(=O)NJJ или N(H)C(=S)NJJ; и
i
j
l
k
g
h
g
h
1
12
1
12
или q и q или q и q вместе представляют собой =C(q)(q), причем каждый из q и q независимо представляет собой Н, галоген, C-C алкил или замещенный C-C алкил.
2
2
Описан один карбоциклический бициклический нуклеозид, содержащий мостик 4'-(CH)з-2' и алкенильный аналог мостика 4'-СН=СН-CH-2' (Freier et al., Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4429-4443 и Albaek et al., J. Org. Chem., 2006, 71, 7731-7740). Также описаны синтез и получение карбоциклических бициклических нуклеозидов наряду с их олигомеризацией и биохимическими исследованиями (Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129(26), 8362-8379).
В данном описании "бициклический нуклеозид 4'-2'" или "4'-2' бициклический нуклеозид" обозначает бициклический нуклеозид, содержащий фуранозное кольцо, которое содержит мостик, соединяющий два углеродных атома фуранозного кольца, который соединяет атом углерода 2' и атом углерода 4' сахарного кольца.
В данном описании "моноциклические нуклеозиды" обозначают нуклеозиды, содержащие модифицированные сахарные фрагменты, которые не являются бициклическими сахарными фрагментами. В некоторых вариантах сахарный фрагмент или аналог сахарного фрагмента в нуклеозиде может быть модифицирован или замещен в любом положении.
2
n
m
3
2
n
2
2
n
3
2
n
2
n
2
2
3
2
n
2
n
3
2
1
12
3
3
3
3
2
3
2
2
3
2
В данном описании "2'-модифицированный сахар" подразумевает фуранозильный сахар, модифицированный в положении Т. В некоторых вариантах такие модификации включают заместителей, выбранных из: галогенида, в том числе, но не ограничиваясь ими, замещенный и незамещенный алкокси, замещенный и незамещенный тиоалкил, замещенный и незамещенный аминоалкил, замещенный и незамещенный алкил, замещенный и незамещенный аллил, а также замещенный и незамещенный алкинил. В некоторых вариантах модификации Т выбраны из заместителей, включая, но не ограничиваясь ими: O[(CH)O]CH, O(CH)NH, O(CH)CH, O(CH)F, O(CH)ONH, OCHC(=O)N(H)CH и O(CH)ON[(CH)CH], где значение пит составляет от 1 до приблизительно 10. Другие группы 2'-заместителей также могут быть выбраны из: C-C алкила, замещенного алкила, алкенила, алкинила, алкарила, аралкила, O-алкарила или O-аралкила, SH, SCH, OCN, Cl, Br, CN, F, CF, OCF, SOCH, SOCH, ONO, NO, N, NH, гетероциклоалкила, гетероциклоалкарила, аминоалкиламино, полиалкиламино, замещенного силила и расщепляющей РНК группы, репортерной группы, интеркалятора, группы для улучшения фармакокинетических свойств или группы для улучшения фармакодинамических свойств антисмыслового соединения, и других заместителей с подобными свойствами. В некоторых вариантах модифицированные нуклеозиды содержат боковую цепь 2'-МОЕ (Baker et al., J. Biol. Chem., 1997, 272, 11944-12000). Такое замещение 2'-МОЕ описано как обеспечивающее улучшенное сродство связывания, по сравнению с немодифицированными нуклеозидами и другими модифицированными нуклеозидами, такими как 2'-O-метил, O-пропил и O-аминопропил. Также показано, что олигонуклеотиды, содержащие заместитель 2'-МОЕ, являются антисмысловыми ингибиторами экспрессии гена с многообещающими характеристиками для применения invivo (Martin, Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504; Altmann et al., Chimia, 1996, 50, 168-176; Altmann et al., Biochem. Soc. Trans., 1996, 24, 630-637; и Altmann et al., Nucleosides Nucleotides, 1997, 16, 917-926).
В данном описании "модифицированный тетрагидропирановый нуклеозид" или "модифицированный ТГП нуклеозид" обозначает нуклеозид, содержащий 6-членный тетрагидропирановый "сахар", заменяющий пентафуранозильный остаток в нормальных нуклеозидах (заменитель сахара). Модифицированные ТГП нуклеозиды включают, не ограничиваясь ими, обозначаемые в уровне техники как гекситолнуклеиновая кислота (ГНК), анитолнуклеиновая кислота (АНК), маннитолнуклеиновая кислота (МНК) (см. Leumann, Bioorg. Med. Chem., 2002, 10, 841-854), фтор-ГНК (Ф-ГНК) или те соединения Формулы VII:
в которых, как минимум, для одного из указанных тетрагидропирановых аналогов нуклеозида Формулы VII, независимо:
Вх представляет собой фрагмент гетероциклического основания;
а
b
а
b
а
b
каждый из Т и T независимо представляет собой группу межнуклеозидной связи, соединяющую тетрагидропирановый аналог нуклеозида с антисмысловым соединением, или один из Т и T представляет собой группу межнуклеозидной связи, соединяющую тетрагидропирановый аналог нуклеозида с антисмысловым соединением, и другой из Т и T представляет собой Н, защитную группу для гидроксильной группы, группу связанного конъюгата или 5' или 3'-концевую группу;
1
2
3
4
5
6
7
1
6
1
6
2
6
2
6
2
6
1
6
1
2
1
2
1
3
1
1
2
3
1
2
1
1
2
3
1
6
каждый из q, q, q, q, q, q и q независимо представляет собой водород, C-С алкил, замещенный C-С алкил, C-С алкенил, замещенный С-С алкенил, С-С алкинил или замещенный C-С алкинил; и каждый из R и R выбран из водорода, гидроксила, галогена, замещенного или незамещенного алкокси, NJJ, SJ, N, OC(=X)J, OC(=X)NJJ, NJC(=X)NJJ и CN, причем Х представляет собой О, S или NJ, и каждый из J, J и J независимо представляет собой Н или C-С алкил.
1
2
3
4
5
6
7
1
2
3
4
5
6
7
1
2
3
4
5
6
7
1
2
1
2
1
2
1
2
В некоторых вариантах предлагаются модифицированные ТГП нуклеозиды Формулы VII, причем каждый из q, q, q, q, q, q и q представляет собой Н. В некоторых вариантах, как минимум, один из q, q, q, q, q, q и q не является Н. В некоторых вариантах, как минимум, один из q, q, q, q, q, q и q представляет собой метил. В некоторых вариантах предлагаются ТГП нуклеозиды Формулы VII, причем один из R и R представляет собой фтор. В некоторых вариантах R представляет собой фтор, и R представляет собой Н; R представляет собой метокси и R представляет собой Н, и R представляет собой метоксиэтокси, и R представляет собой Н.
1
10
3
2
2
3
2
2
3
2
2
m
n
2
m
n
m
n
1
10
В данном описании "2'-модифицированный" или "2'-замещенный" обозначает нуклеозид, содержащий сахар, который содержит заместитель в положении 2', кроме Н или ОН. 2'-Модифицированные нуклеозиды, включают, не ограничиваясь ими, бициклические нуклеозиды, в которых мостик, соединяющий два углеродных атома сахарного кольца, соединяет атом углерода 2' и другой атом углерода сахарного кольца; и нуклеозиды с не соединенными мостиком 2' заместителями, такими как аллил, амино, азидо, тио, O-аллил, O-C-С алкил, -OCF, O-(CH)-O-СН, 2'-O(CH)SCH, O-(CH)-O-N(R)(R) или O-CH-C(=O)-N(R)(R), в которых каждый из R и R независимо представляет собой Н или замещенный или незамещенный C-С алкил. 2'-Модифицированные нуклеозиды могут дополнительно содержать другие модификации, например, при других положениях сахара и/или в нуклеиновом основании.
В данном описании "2'-F" обозначает нуклеозид, содержащий сахар, который содержит атом фтора в положении 2'.
3
3
В данном описании каждый из "2'-ОМе" или "2'-ОСН" или "2'-O-метил" обозначает нуклеозид, содержащий сахар, который содержит группу -ОСН в положении 2' сахарного кольца.
2
2
3
2
2
3
В данном описании каждый из "МОЕ (МОЭ)" или "2'-МОЕ (2'-МОЭ)" или "2'-OCHCHOCH" или "2'-O-метоксиэтил" обозначает нуклеозид, содержащий сахар, который содержит группу -OCHCHOCH в положении 2' сахарного кольца.
В данном описании "олигонуклеотид" обозначает соединение, содержащее множество связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах один или более из множества нуклеозидов модифицированы. В некоторых вариантах олигонуклеотид содержит один или более рибонуклеозидов (РНК) и/или дезоксирибонуклеозидов (ДНК).
Из уровня техники также известны многие другие системы бициклических и трициклических колец заменителей сахара, которые могут использоваться с целью модификации нуклеозидов для введения в антисмысловые соединения (см., например, обзорную статью: Leumann, Bioorg. Med. Chem., 2002, 10, 841-854).
В такие системы колец могут быть введены различные комплементарные замены с целью повышения активности.
Способы получения модифицированного сахара хорошо известны специалистам в данной области.
В нуклеотидах, содержащих модифицированные сахарные фрагменты, фрагменты нуклеиновых оснований (природные, модифицированные или их комбинация) сохраняются для гибридизации с подходящей нуклеиновой кислотой-мишенью.
3
3
В некоторых вариантах антисмысловые соединения содержат один или более нуклеозидов, содержащих модифицированные сахарные фрагменты. В некоторых вариантах модифицированный сахарный фрагмент представляет собой 2'-МОЕ. В некоторых вариантах модифицированные 2'-МОЕ нуклеозиды расположены в мотиве химерного нуклеотида. В некоторых вариантах модифицированный сахарный фрагмент представляет собой бициклический нуклеозид, содержащий мостиковую группу (4'-СН(СН)-O-2'). В некоторых вариантах модифицированные (4'-СН(СН)-O-2') нуклеозиды расположены в крыльях мотива химерного нуклеотида. В некоторых вариантах модифицированный сахарный фрагмент представляет собой cEt. В некоторых вариантах модифицированные cEt нуклеотиды расположены в крыльях мотива химерного нуклеотида.
Модифицированные нуклеиновые основания
Модификации или замещения в нуклеиновых основаниях (или основаниях) структурно отличаются, хотя по-прежнему функционально взаимозаменяемы с природными или синтетическими немодифицированными нуклеиновыми основаниями. Как природные, так и модифицированные нуклеиновые основания способны к участию в водородной связи. Такие модификации нуклеинового основания могут обеспечивать устойчивость к нуклеазе, сродство связывания или некоторое другое предпочтительное биологическое свойство антисмысловых соединений. Модифицированные нуклеиновые основания включают синтетические и природные нуклеиновые основания, такие как, например, 5-метилцитозин (5-me-С). Некоторые замещения в нуклеиновых основаниях, в том числе, замещения в 5-метилцитозине, особенно пригодны для повышения сродства связывания антисмыслового соединения с нуклеиновой кислотой-мишенью. Например, показано, что замещения в 5-метилцитозине увеличивают стабильность дуплекса нуклеиновой кислоты на 0,6-1,2°С (Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T. and Lebleu, В., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278).
3
Дополнительные модифицированные нуклеиновые основания включают 5-гидроксиметилцитозин, ксантин, гипоксантин, 2-аминоаденин, 6-метил- и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-пропил- и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-тиоурацил, 2-тиотимин и 2-тиоцитозин, 5-галогенурацил и цитозин, 5-пропинил(-С≡С-СН)урацил и цитозин и другие алкинильные производные пиримидиновых оснований, 6-азоурацил, цитозин и тимин, 5-урацил (псевдоурацил), 4-тиоурацил, 8-галоген-, 8-амино-, 8-тиол-, 8-тиоалкил-, 8-гидроксил- и другие 8-замещенные аденины и гуанины, 5-галоген-, особенно 5-бром-, 5-трифторметил- и другие 5-замещенные урацилы и цитозины, 7-метилгуанин и 7-метиладенин, 2-F-аденин, 2-амино-аденин, 8-азагуанин и 8-азааденин, 7-дезазагуанин и 7-дезазааденин и 3-дезазагуанин и 3-дезазааденин.
Фрагменты гетероциклических оснований могут включать те, в которых пуриновое или пиримидиновое основание заменено другими гетероциклами, например, 7-дезазааденином, 7-дезазагуанозином, 2-аминопиридином и 2-пиридоном. Нуклеиновые основания, особенно пригодные для повышения сродства связывания антисмысловых соединений, включают 5-замещенные пиримидины, 6-азапиримидины и N-2, N-6 и O-6 замещенные пурины, в том числе, 2-аминопропиладенин, 5-пропинилурацил и 5-пропинилцитозин.
В некоторых вариантах антисмысловые соединения, нацеленные на нуклеиновую кислоту ApoCIII, включают одно или более модифицированных нуклеиновых оснований. В некоторых вариантах расширенные промежутком антисмысловые олигонуклеотиды, нацеленные на нуклеиновую кислоту ApoCIII, содержат одно или более модифицированных нуклеиновых оснований. В некоторых вариантах модифицированное нуклеиновое основание представляет собой 5-метилцитозин. В некоторых вариантах каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин.
Композиции и способы разработки фармацевтических композиций
Антисмысловые олигонуклеотиды могут быть смешаны с фармацевтически приемлемой активной или инертной субстанцией для получения фармацевтических композиций или препаратов. Композиции и способы разработки фармацевтических композиций зависят от целого ряда критериев, в том числе, но не ограничиваясь ими, способа введения, тяжести заболевания или вводимой дозы.
Антисмысловые соединения, нацеленные на нуклеиновую кислоту ApoCIII, могут применяться в фармацевтических композициях путем объединения антисмыслового соединения с подходящим фармацевтически приемлемым разбавителем или носителем.
В некоторых вариантах "фармацевтический носитель" или вспомогательное "вещество" является фармацевтически приемлемым растворителем, суспендирующим агентом или любым другим фармакологически инертным носителем для доставки одной или более нуклеиновых кислот в организм животного. Вспомогательное вещество может быть жидким или твердым, и может быть выбрано с учетом планируемого способа введения, чтобы предусмотреть желательную массу, консистенцию, и т.п., при объединении с нуклеиновой кислотой и другими компонентами данной фармацевтической композиции. Типичные фармацевтические носители включают, не ограничиваясь ими, связующие агенты (например, прежелатинизированный кукурузный крахмал, поливинилпирролидон или гидроксипропилметилцеллюлоза, и т.п.); наполнители (например, лактоза и другие сахара, микрокристаллическая целлюлоза, пектин, желатин, сульфат кальция, этилцеллюлоза, полиакрилаты или гидрофосфат кальция, и т.п.); смазывающие вещества (например, стеарат магния, тальк, кремнезем, коллоидный кремния диоксид, стеариновая кислота, стеараты металлов, гидрогенизированные растительные масла, зерновой крахмал, полиэтиленгликоли, натрия бензоат, натрия ацетат, и т.п.); дезинтегранты (например, крахмал, натрий крахмал гликолят, и т.п.); и увлажняющие средства (например, натрий лаурилсульфат, и т.п.).
Фармацевтически приемлемые органические или неорганические вспомогательные вещества, которые не реагируют нежелательным образом с нуклеиновыми кислотами, пригодные для парентерального или непарентерального введения, могут также использоваться для получения композиций по настоящему изобретению. Пригодные фармацевтически приемлемые носители включают, не ограничиваясь ими, воду, солевые растворы, спирты, полиэтиленгликоли, желатин, лактозу, амилозу, магния стеарат, тальк, кремниевую кислоту, вязкий парафин, гидроксиметилцеллюлозу, поливинилпирролидон, и т.п.
Фармацевтически приемлемый разбавитель включает буферизованный фосфатом солевой раствор (ФБР). ФБР представляет собой разбавитель, пригодный для применения в композициях, которые вводятся парентерально. Соответственно, в одном из вариантов, используемых в способах, описанных в данном описании, представлена фармацевтическая композиция, содержащая антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеиновую кислоту ApoCIII, и фармацевтически приемлемый разбавитель. В некоторых вариантах фармацевтически приемлемый разбавитель представляет собой ФБР. В некоторых вариантах антисмысловое соединение представляет собой антисмысловой олигонуклеотид.
Фармацевтические композиции, содержащие антисмысловые соединения, охватывают любые фармацевтически приемлемые соли, эфиры или соли таких эфиров или олигонуклеотид, который, при введении животному, в том числе человеку, способен обеспечивать (прямо или косвенно) биологически активный метаболит или его остаток. Соответственно, например, раскрытие также описывает фармацевтически приемлемые соли антисмысловых соединений, пролекарства, фармацевтически приемлемые соли таких пролекарств и другие биологические эквиваленты. Пригодные фармацевтически приемлемые соли включают, не ограничиваясь ими, натриевые и калиевые соли.
Пролекарство может включать введение комплементарных нуклеозидов на одном или обоих концах антисмыслового соединения, которые отщепляются эндогенными нуклеазами в организме с образованием активного антисмыслового соединения.
Конъюгированные антисмысловые соединения
Антисмысловые соединения могут быть ковалентно присоединены к одному или более фрагментов или конъюгатов, которые увеличивают активность, распространение в клетках или захват клетками полученных антисмысловых олигонуклеотидов. Типичные группы конъюгатов включают фрагменты холестерина и липидные фрагменты. Дополнительные группы конъюгатов включают углеводы, фосфолипиды, биотин, феназин, фолат, фенантридин, антрахинон, акридин, флуоресцеины, родамины, кумарины и красители.
Антисмысловые соединения также могут быть модифицированы таким образом, чтобы содержать одну или более стабилизирующих групп, которые, в общем, присоединены к одному или обоим концам антисмысловых соединений для увеличения таких свойств, как, например, устойчивость к нуклеазе. В стабилизирующие группы включены кэп-структуры. Такие концевые модификации защищают антисмысловое соединение от разложения экзонуклеазами, и могут помочь в доставке и/или локализации в пределах клетки. Кэп может присутствовать на 5'-конце (5'-кэп) или на 3'-конце (3'-кэп), или может присутствовать на обоих конках. Кэп-структуры шапки хорошо известны из уровня техники и включают, например, инвертированный дезокси безосновный кэп. Кроме того, стабилизирующие 3'- и 5'-группы, которые могут использоваться для покрытия одного или обоих концов антисмыслового соединения с целью обеспечения устойчивости к нуклеазе, включают раскрытые в WO 03/004602, опубликованной 16 января 2003 г.
Культура клеток и обработка антисмысловыми соединениями
Влияние антисмысловых соединений на уровень активности или экспрессию нуклеиновых кислот или белков ApoCIII может быть проверено in vitro на различных видах клеток. Типы клеток, используемые для таких анализов, доступны от коммерческих продавцов (например, Американская коллекция типовых культур, Manassus, VA; Zen-bio, Inc., Research Triangle Park, NC; Clonetics Corporation, Walkersville, MD), и клетки культивируют согласно инструкциям продавца с использованием коммерчески доступных реактивов (например Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). Иллюстративные типы клеток включают, не ограничиваясь ими, клетки HepG2, клетки Нер3В, клетки Huh7 (печеночно-клеточная карцинома), первичные гепатоциты, клетки А549, фибробласты GM04281 и клетки LLC-MK2.
Тестирование антисмысловых олигонуклеотидов in vitro
В данном описании описаны способы обработки клеток антисмысловыми олигонуклеотидами, которые могут быть модифицированы соответствующим образом для обработки другими антисмысловыми соединениями.
В целом, клетки обрабатывают антисмысловыми олигонуклеотидами, когда клетки достигают приблизительно 60-80% слияния в культуре.
Один из реактивов, обычно используемых для введения антисмыслового олигонуклеотида в культивируемые клетки, включает реактив катионной трансфекции липида LIPOFECTIN (Invitrogen, Carlsbad, CA). Антисмысловые олигонуклеотиды смешивают с LIPOFECTIN в OPTI-MEM 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA), чтобы достичь желательной конечной концентрации антисмыслового олигонуклеотида и концентрации LIPOFECTIN, которая обычно варьирует в интервале 2-12 мкг/мл на 100 нМ антисмыслового олигонуклеотида.
Другой реактив, используемый для введения антисмыслового олигонуклеотида в культивируемые клетки, включает LIPOFECTAMINE 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Антисмысловой олигонуклеотид смешивают с LIPOFECTAMINE 2000 в среде OPTI-МЕМ 1 со сниженным содержанием сыворотки (Invitrogen, Carlsbad, CA), чтобы достичь желаемой концентрации антисмыслового олигонуклеотида и концентрации LIPOFECTAMINE, которая обычно варьирует в интервале 2-12 мкг/мл на 100 нМ антисмыслового олигонуклеотида.
Другой реактив, используемый для введения антисмыслового олигонуклеотида в культивируемые клетки, включает Cytofectin (Invitrogen, Carlsbad, CA). Антисмысловой олигонуклеотид смешивают с Cytofectin в среде OPTI-MEM 1 со сниженным содержанием сыворотки (Invitrogen, Carlsbad, CA), чтобы достичь желательной концентрации антисмыслового олигонуклеотида и концентрации Cytofectin, которая обычно варьирует в интервале 2-12 мкг/мл на 100 нМ антисмыслового олигонуклеотида.
Другой реактив, используемый для введения антисмыслового олигонуклеотида в культивируемые клетки, включает Oligofectamine™ (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). Антисмысловой олигонуклеотид смешивают с Oligofectamine™ в среде Opti-MEM™-1 со сниженным содержанием сыворотки (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA), чтобы достичь желательной концентрации олигонуклеотида, с соотношением Oligofectamine™ к олигонуклеотиду приблизительно 0,2-0,8 мкл на 100 нМ.
Другой реактив, используемый для введения антисмыслового олигонуклеотида в культивируемые клетки, включает FuGENE 6 (Roche Diagnostics Corp., Indianapolis, IN). Антисмысловое олигомерное соединение смешивают с FuGENE 6 в 1 мл не содержащей сыворотки среды RPMI, чтобы достичь желательной концентрации олигонуклеотида, с соотношением FuGENE 6 к олигонуклеотиду 1-4 мкл FuGENE 6 на 100 нМ.
Другая техника, используемая для введения антисмысловых олигонуклеотидов в культивируемые клетки, включает электропорацию (Sambrooke and Russell in Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Third Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. 2001).
Клетки обрабатывают антисмысловыми олигонуклеотидами шаблонными способами. Урожай клеток обычно собирают через 16-24 час после обработки антисмысловым олигонуклеотидом, и в этой точке времени уровни РНК или белка нуклеиновой кислоты-мишени измеряют способами, известными из уровня техники и описанными в данном описании (Sambrooke and Russell in Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Third Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. 2001). В целом, если обработку выполняют с несколькими повторениями, данные представляют как среднюю величину повторений.
Концентрация используемого антисмыслового олигонуклеотида варьирует от одной линии клеток к другой. Способы определения оптимальной концентрации антисмыслового олигонуклеотида для конкретной линии клеток хорошо известны из уровня техники (Sambrooke and Russell in Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Third Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. 2001). При трансфицировании с помощью LIPOFECTAMINE2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA), Lipofectin (Invitrogen, Carlsbad, CA) или Cytofectin™ (Genlantis, Сан Диего, CA) антисмысловые олигонуклеотиды обычно используют в концентрациях, варьирующих от 1 нМ до 300 нМ. При трансфицировании с применением электропорации антисмысловые олигонуклеотиды используют в более высоких концентрациях, варьирующих от 625 до 20000 нМ.
Выделение РНК
Анализ РНК может выполняться на общей клеточной РНК или поли(А)+ мРНК. Способы выделения РНК хорошо известны из уровня техники (Sambrooke and Russell in Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Third Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. 2001). РНК получают с использованием способов, хорошо известных из уровня техники, например, с использованием реактива TRIZOL (Invitrogen, Carlsbad, CA) согласно рекомендуемым протоколам производителя.
Анализ ингибирования уровней или экспрессии мишени
Ингибирование уровней или экспрессии нуклеиновой кислоты ApoCIII может быть проанализировано разнообразными способами, известными из уровня техники (Sambrooke and Russell in Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Third Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. 2001). В качестве примера, уровни нуклеиновой кислоты-мишени могут быть количественно определены, например, анализом методом нозерн-блоттинга, конкурентной полимеразной цепной реакцией (ПЦР) или количественной ПЦР в реальном времени. Анализ РНК может выполняться на общей клеточной РНК или поли(А)+ мРНК. Способы выделения РНК хорошо известны из уровня техники. Анализ методом нозерн-блоттинга также является шаблонным в данной области. Количественная ПНР в реальном времени может быть традиционно выполнена с использованием коммерчески доступной системы обнаружения последовательности ABI PRISM 7600, 7700 или 7900, доступной от PE-Applied Biosystems, Foster City, CA и используемой согласно инструкциям производителя.
Анализ уровней РНК мишени методом количественной ПЦР в реальном времени
Количественная оценка уровней РНК мишени может быть выполнена методом количественной ПЦР в реальном времени с использованием системы обнаружения последовательности ABI PRISM 7600, 7700 или 7900, доступной от PE-Applied Biosystems, Foster City, CA согласно инструкциям производителя. Методы количественной ПЦР в реальном времени хорошо известны из уровня техники.
Перед проведением ПЦР в реальном времени, выделенную РНК подвергают реакции с обратной транскриптазой (ОТ), которая дает комплементарную ДНК (кДНК), в дальнейшем используемую в качестве субстрата для ПЦР-амплификации в реальном времени. Реакции ОТ и ПЦР в реальном времени выполняются последовательно в одной и той же ячейке с образцом. Реактивы для ОТ и ПНР в реальном времени получены от Invitrogen (Carlsbad, CA). Реакции ОТ и ПЦР в реальном времени осуществляются способами, хорошо известными специалистам из уровня техники.
Количества целевого гена (или РНК), полученные с помощью ПЦР в реальном времени, могут быть нормализованы с использованием уровня экспрессии гена, экспрессия которого является постоянной, такого как циклофилин А, или количественным определением общей РНК с использованием RIBOGREEN (Invitrogen, Inc. Carlsbad, CA). Экспрессию циклофилина А определяют количественно с помощью ПЦР в реальном времени, проводя ее одновременно с мишенью, мультиплексно или отдельно. Общее количество РНК определяют с использованием реактива для количественного определения РНК RIBOGREEN (Invitrogen, Inc. Carlsbad, CA). Методы количественного определения РНК с помощью RIBOGREEN приведены в Jones, L.J., et al, (Analytical Biochemistry, 1998, 265, 368-374). Инструмент CYTOFLUOR 4000 (РЕ Applied Biosystems, Foster City, CA) используются для измерения флуоресценции RIBOGREEN.
Сконструированы зонды и праймеры для гибридизации с нуклеиновой кислотой ApoCIII. Способы конструирования зондов и праймеров для ПЦР в реальном времени хорошо известны из уровня техники и могут включать применение программного обеспечения, такого как программное обеспечение PRIMER EXPRESS (Applied Biosystems, Foster City, CA).
Для получения количеств целевого гена, методом ОТ-ПЦР в реальном времени можно использовать уровень экспрессии GAPDH или Циклофилина А, генов, экспрессия которых является постоянной, или количественно определяя общую РНК с использованием RiboGreen™ (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR). Экспрессия GAPDH или Циклофилина А может быть количественно определена ОТ-ПЦР в реальном времени, при проведении одновременно с мишенью, мультиплексно или отдельно. Количество общей РНК было определено с использованием реактива для количественного определения РНК RiboGreen™ (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR).
Анализ уровней белка
Антисмысловое ингибирование нуклеиновых кислот ApoCIII может быть оценено путем измерения уровней белка ApoCIII. Уровни белка ApoCIII могут быть оценены или количественно определены различными способами, хорошо известными из уровня техники, такими как иммунопреципитация, анализ методом вестерн-блоттинга (иммуноблоттинг), твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), количественные анализы белка, анализы активности белка (например, анализы активности каспазы), иммуногистохимия, иммуноцитохимия или флуоресцентная сортировка клеток (FACS) (Sambrooke and Russell in Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Third Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. 2001). Антитела, нацеленные на мишень, могут быть идентифицированы и получены из различных источников, таких как каталог антител MSRS (Aerie Corporation, Birmingham, MI) или могут быть получены традиционными способами получения моноклональных или поликлональных антител, хорошо известными из уровня техники. Антитела, пригодные для обнаружения ApoCIII человека и мыши, коммерчески доступны.
Тестирование антисмысловых соединений in vivo
Антисмысловые соединения, например, антисмысловые олигонуклеотиды, изучали на животных, чтобы оценить их способность ингибировать экспрессию ApoCIII и продуцировать фенотипические изменения. Тестирование может выполняться на нормальных животных или на экспериментальных моделях заболеваний. Для введения животным, антисмысловые олигонуклеотиды вводят в фармацевтически приемлемый разбавитель, такой как буферизованный фосфатом солевой раствор. Введение включает парентеральные способы введения. Вычисление доз антисмыслового олигонуклеотида и частоты введения проводят с учетом таких факторов, как способ введения и масса тела животного. После периода лечения антисмысловыми олигонуклеотидами, РНК выделяют из ткани и измеряют изменения экспрессии нуклеиновой кислоты ApoCIII. Также измеряют изменения уровней белка ApoCIII.
Некоторые показания
В некоторых вариантах, предложенных в данном описании, представлены способы лечения индивидуума, включающие введение одной или более фармацевтических композиций, как описано в данном описании. В некоторых вариантах индивидуум страдает сердечно-сосудистым заболеванием или метаболическим расстройством.
В некоторых вариантах сердечно-сосудистое заболевание представляет собой аневризму, стенокардию, аритмию, атеросклероз, цереброваскулярное заболевание, заболевание коронарных сосудов сердца, гипертензию, дислипидемию, гиперлипидемию, гипертриглицеридемию или гиперхолестеринемию, инсульт, и т.п. В некоторых вариантах дислипидемия представляет собой хиломикронемию.
Как описано в примерах ниже, показано, что соединения, нацеленные на ApoCIII, как описано в данном описании, модулируют физиологические маркеры или фенотипы сердечнососудистого заболевания. В некоторых из экспериментов, соединения повышали уровни ЛПВП и снижали уровни ЛПНП и триглицеридов, по сравнению с животными, не получавшими лечения. В некоторых вариантах повышение уровней ЛПВП и снижение уровней ЛПНП и триглицеридов было связано с ингибированием ApoCIII соединениями.
В некоторых вариантах физиологические маркеры сердечно-сосудистого заболевания могут быть определены количественно. Например, уровни ЛПВП могут быть измерены и определены количественно, например, стандартными анализами липидов. Для таких маркеров, в некоторых вариантах, маркер может увеличиваться приблизительно на 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 99% или интервал, определенный любыми двумя из этих значений.
Также, в данном описании предложены способы предупреждения, лечения или облегчения симптома, связанного с сердечно-сосудистым заболеванием у субъекта, нуждающегося в этом. В некоторых из вариантов предложен способ снижения частоты манифестации симптома, связанного с сердечно-сосудистым заболеванием. В некоторых из вариантов предложен способ уменьшения тяжести симптома, связанного с сердечнососудистым заболеванием. В таких вариантах способы включают введение индивидууму, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества соединения, нацеленного на нуклеиновую кислоту ApoCIII.
Сердечно-сосудистые заболевания характеризуются многочисленными физическими симптомами. Любой симптом, известный специалисту в данной области, который связан с сердечно-сосудистым заболеванием, может быть предупрежден, лечен, облегчен или иным способом модулирован, как было описано в способах выше. В некоторых вариантах симптом может представлять собой любой из, но не ограничиваясь ими, стенокардии; боли в груди; одышки; сердцебиения; слабости; головокружения; тошноты; повышения потоотделения; тахикардии; брадикардии; аритмии; мерцания предсердий; отека нижних конечностей; цианоза; усталости; слабости; онемения лица; онемения конечностей; хромоты или мышечных спазмов; вздутия живота; или лихорадки.
В некоторых вариантах симптом представляет собой стенокардию. В некоторых вариантах симптом представляет собой боль в груди. В некоторых вариантах симптом представляет собой одышку. В некоторых вариантах симптом представляет собой сердцебиение. В некоторых вариантах симптом представляет собой слабость. В некоторых вариантах симптом представляет собой головокружение. В некоторых вариантах симптом представляет собой тошноту. В некоторых вариантах симптом представляет собой повышенное потоотделение. В некоторых вариантах симптом представляет собой тахикардию. В некоторых вариантах симптом представляет собой брадикардию. В некоторых вариантах симптом представляет собой аритмию. В некоторых вариантах симптом представляет собой мерцание предсердий. В некоторых вариантах симптом представляет собой отек нижних конечностей. В некоторых вариантах симптом представляет собой цианоз. В некоторых вариантах симптом представляет собой усталость. В некоторых вариантах симптом представляет собой слабость. В некоторых вариантах симптом представляет собой онемение лица. В некоторых вариантах симптом представляет собой онемение конечностей. В некоторых вариантах симптом представляет собой хромоту или мышечные спазмы. В некоторых вариантах симптом представляет собой вздутие живота. В некоторых вариантах симптом представляет собой злокачественную кратковременную лихорадку.
В некоторых вариантах метаболические расстройства включают, не ограничиваясь ими, гипергликемию, преддиабетическое состояние, диабет (типа I и типа II), ожирение, инсулинорезистентность, метаболический синдром и диабетическую дислипидемию.
В некоторых вариантах соединения, нацеленные на ApoCIII, как описано в данном описании, модулируют физиологические маркеры или фенотипы метаболического расстройства. В некоторых вариантах физиологические маркеры метаболического расстройства могут поддаваться количественному определению. Например, уровни глюкозы или инсулинорезистентность могут быть измерены и определены количество стандартными анализами, известными из уровня техники. Для таких маркеров, в некоторых вариантах, маркер может снижаться приблизительно на 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 99% или интервал, определенный любыми двумя из этих значений. В другом примере, чувствительность к действию инсулина или уровни ЛПВП могут быть измерены и определены количественно стандартными анализами, известными из уровня техники. Для таких маркеров, в некоторых вариантах, маркер может увеличиваться приблизительно на 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 99% или интервал, определенный любыми двумя из этих значений.
Также, в данном описании предложены способы предупреждения, лечения или облегчения симптома, связанного с метаболическим расстройством у субъекта, нуждающегося в этом. В некоторых из вариантов предложен способ снижения частоты манифестации симптома, связанного с метаболическим расстройством. В некоторых из вариантов предложен способ уменьшения тяжести симптома, связанного с метаболическим расстройством. В таких вариантах способы включают введение индивидууму, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества соединения, нацеленного на нуклеиновую кислоту ApoCIII.
Метаболические расстройства характеризуются многочисленными физическими симптомами. Любой симптом, известный специалисту в данной области, который связан с метаболическим расстройством, можно предупреждать, лечить, облегчать протекание или иным способом модулировать, как было описано в способах выше. В некоторых вариантах симптом может представлять собой любой из, но не ограничиваясь ими, чрезмерной секреции мочи (полиурия), чрезмерной жажды и повышенного потребления жидкости (полидипсия), затуманивания зрения, необъяснимого снижения массы тела и летаргии.
В некоторых из вариантов предложены способы лечения индивидуума, включающие введение терапевтически эффективного количества одной или более фармацевтических композиций, как описано в данном описании. В некоторых вариантах индивидуум страдает сердечно-сосудистым заболеванием. В некоторых вариантах введение терапевтически эффективного количества антисмыслового соединения, нацеленного на нуклеиновую кислоту ApoCIII, сопровождается контролем уровней ApoCIII или маркеров сердечно-сосудистого заболевания, диабета или другого патологического процесса, связанного с экспрессией ApoCIII, чтобы определить реакцию индивидуума на введение антисмыслового соединения. Реакция индивидуума на введение антисмыслового соединения используется врачом для определения объема и продолжительности терапевтического вмешательства.
В некоторых вариантах введение антисмыслового соединения, нацеленного на нуклеиновую кислоту ApoCIII, приводит к уменьшению экспрессии ApoCIII, как минимум, приблизительно на 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 99% или интервал, определенный любыми двумя из этих значений. В некоторых вариантах экспрессия ApoCIII снижается до ≤ 50 мг/л, ≤ 60 мг/л, ≤ 70 мг/л, ≤ 80 мг/л, ≤ 90 мг/л, ≤ 100 мг/л, ≤ 110 мг/л, ≤ 120 мг/л, ≤ 130 мг/л, ≤ 140 мг/л, ≤ 150 мг/л, ≤ 160 мг/л, ≤ 170 мг/л, ≤ 180 мг/л, ≤ 190 мг/л или ≤ 200 мг/л.
В некоторых вариантах введение антисмыслового соединения, нацеленного на нуклеиновую кислоту ApoCIII, приводит к повышению уровней ЛПВП, как минимум, приблизительно на 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 99% или интервал, определенный любыми двумя из этих значений.
В некоторых вариантах введение антисмыслового соединения, нацеленного на нуклеиновую кислоту ApoCIII, приводит к снижению уровня ТГ (после приема пищи или натощак) как минимум приблизительно на 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99%, или интервал, определенный любыми двумя из указанных значений. В некоторых вариантах, уровень ТГ (после приема пищи или натощак) снижается до ≤ 100 мг/дл, ≤ 110 мг/дл, ≤ 120 мг/дл, ≤ 130 мг/дл, ≤ 140 мг/дл, ≤ 150 мг/дл, ≤ 160 мг/дл, ≤ 170 мг/дл, ≤ 180 мг/дл, ≤ 190 мг/дл, ≤ 200 мг/дл, ≤ 210 мг/дл, ≤ 220 мг/дл, ≤ 230 мг/дл, ≤ 240 мг/дл, ≤ 250 мг/дл, ≤ 260 мг/дл, ≤ 270 мг/дл, ≤ 280 мг/дл, ≤ 290 мг/дл, ≤ 300 мг/дл, ≤ 350 мг/дл, ≤ 400 мг/дл, ≤ 450 мг/дл, ≤ 500 мг/дл, ≤ 550 мг/дл, ≤ 600 мг/дл, ≤ 650 мг/дл, ≤ 700 мг/дл, ≤ 750 мг/дл, ≤ 800 мг/дл, ≤ 850 мг/дл, ≤ 900 мг/дл, ≤ 950 мг/дл, ≤ 1000 мг/дл, ≤ 1100 мг/дл, ≤ 1200 мг/дл, ≤ 1300 мг/дл, ≤ 1400 мг/дл, ≤ 1500 мг/дл, ≤ 1600 мг/дл, ≤ 1700 мг/дл, ≤ 1800 мг/дл или ≤ 1900 мг/дл.
В некоторых вариантах фармацевтические композиции, содержащие антисмысловое соединение, нацеленное на ApoCIII, используются для получения лекарственного средства для лечения пациента, страдающего или уязвимого к сердечно-сосудистому заболеванию.
Введение
Соединения или фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно вводить множеством способов, в зависимости от того, будет ли желательным местное или системное лечение, и от области, которая подлежит лечению. Введение может быть пероральным или парентеральным.
В некоторых вариантах соединения и композиции, описанные в данном описании, вводят парентерально. Парентеральное введение включает внутривенную, внутриартериальную, подкожную, внутрибрюшинную или внутримышечную инъекцию или инфузию.
В некоторых вариантах парентеральное введение является инфузией. Инфузия может быть хронической или непрерывной или кратковременной или прерывистой. В некоторых вариантах введенные инфузионно фармацевтические средства доставляют с помощью насоса. В некоторых вариантах инфузию проводят внутривенно.
В некоторых вариантах парентеральное введение представляет собой инъекцию. Инъекция может быть проведена с помощью шприца или насоса. В некоторых вариантах инъекция представляет собой инъекцию болюса. В некоторых вариантах инъекцию осуществляют непосредственно в ткань или орган. В некоторых вариантах парентеральное введение представляет собой подкожное введение.
В некоторых вариантах препараты для парентерального введения могут включать стерильные водные растворы, которые могут также содержать буферные вещества, разбавители и другие подходящие добавки, такие как, не ограничиваясь ими, усилители проникновения, соединения-носители и другие фармацевтически приемлемые носители или вспомогательные вещества.
В некоторых вариантах препараты для перорального введения соединений или композиций по изобретению могут содержать, не ограничиваясь ими, фармацевтические носители, вспомогательные вещества, порошки или гранулы, микрочастицы, наночастицы, суспензии или растворы в воде или безводных средах, капсулы, гелевые капсулы, саше, таблетки или мини-таблетки. Загустители, вкусовые добавки, разбавители, эмульгаторы, вспомогательные вещества для суспендирования или связующие вещества могут быть желательными. В некоторых вариантах препараты для перорального введения являются такими, в которых соединения по изобретению вводят в сочетании с одним или более усилителей проникновения, поверхностно-активных веществ и хелатирующих агентов.
Дозы
В некоторых вариантах фармацевтические композиции вводят согласно схеме введения (например, доза, частота и продолжительность введения), причем схема введения может быть выбрана таким образом, чтобы достичь желательного эффекта. Желательный эффект может представлять собой, например, снижение уровня ApoCIII или предотвращение, уменьшение, облегчение протекания или замедление прогрессирования заболевания или состояния, связанного с ApoCIII.
В некоторых вариантах переменные схемы введения регулируют таким образом, чтобы обеспечить желательную концентрацию фармацевтической композиции в организме субъекта. "Концентрация фармацевтической композиции" в связи со схемой введения может обозначать соединение, олигонуклеотид или активный ингредиент фармацевтической композиции. Например, в некоторых вариантах, дозу и частоту введения регулируют таким образом, чтобы обеспечить концентрацию фармацевтической композиции в ткани или плазме в количестве, достаточном для достижения желательного эффекта.
Дозы зависят от тяжести и ответа патологического состояния, которое подлежит лечению, с длительностью курса лечения от нескольких дней до нескольких месяцев или до излечения или ослабления патологического состояния. Дозы также зависят от активности лекарственного средства и метаболизма. В некоторых вариантах дозы составляют от 0,01 мкг до 100 мг на кг массы тела или в пределах интервала дозы 0,001-1000 мг, и могут вводиться ежедневно один или более раз в день, еженедельно, ежемесячно или ежегодно или хотя бы один раз каждые 2-20 лет. После успешного лечения, может быть желательным для пациента проходить поддерживающую терапию, чтобы предупредить рецидив патологического состояния, причем олигонуклеотид вводят в поддерживающих дозах, варьирующих от 0,01 мкг до 100 мг на кг массы тела, от ежедневного введения один или более раз в день до введения один раз в каждые 20 лет, или в дозах, варьирующих от 0,001 мг до 1000 мг.
Некоторые комбинированные схемы лечения
В некоторых вариантах первое средство, содержащее соединение, описанное в данном описании, вводят параллельно с одним или более других средств. В некоторых вариантах такие другие средства созданы для лечения того же заболевания, расстройства или состояния, что и первое средство, описанное в данном описании. В некоторых вариантах такие другие средства созданы для лечения других заболеваний, расстройств или состояний, чем первое средство, описанное в данном описании. В некоторых вариантах первое средство создано для лечения нежелательного побочного эффекта другого средства. В некоторых вариантах другие средства вводят параллельно с первым средством для лечения нежелательного эффекта первого средства. В некоторых вариантах такие вторые средства созданы для лечения нежелательного побочного эффекта одной или более фармацевтических композиций, как описано в данном описании. В некоторых вариантах другие средства вводят параллельно с первым средством, чтобы обеспечить комбинированный эффект. В некоторых вариантах другие средства вводят параллельно с первым средством, чтобы обеспечить синергетический эффект. В некоторых вариантах параллельное введение первых и вторых средств дает возможность применять более низкие дозы, чем требовались бы для достижения терапевтического или профилактического эффекта, если бы средства вводили в качестве независимой терапии.
В некоторых вариантах одна или более композиций, описанных в данном описании, и одно или более других фармацевтических средств вводят одновременно. В некоторых вариантах одну или более композиций по изобретению и одно или более других фармацевтических средств вводят в разное время. В некоторых вариантах одну или более композиций, описанных в данном описании, и одно или более других фармацевтических средств вводят совместно в один препарат. В некоторых вариантах одну или более композиций, описанных в данном описании, и одно или более других фармацевтических средств получают отдельно.
В некоторых вариантах другие средства включают, не ограничиваясь ими, средство для снижения уровня ApoCIII, средство для снижения уровня холестерина, средство для снижения уровня не-ЛПВП липидов (например, ЛПНП), средство для повышения уровня ЛПВП, рыбий жир, ниацин, фибрат, статин, DCCR (соль диазоксида), средство для снижения уровня глюкозы и/или противодиабетическое средство. В некоторых вариантах первое средство вводят в комбинации с максимально переносимой дозой второго средства. В некоторых вариантах первое средство вводят субъекту, который не отвечает на максимально переносимую дозу второго средства.
Примеры средств для снижения уровня ApoCIII включают антисмысловой олигонуклеотид ApoCIII, отличный от первого средства, ниацин или антисмысловой олигонуклеотид Аро В.
Примеры средств для снижения уровня глюкозы и/или противодиабетических средств включают, не ограничиваясь ими, терапевтическое изменение образа жизни, агонист PPAR, ингибитор дипептидилпептидазы (IV), аналог GLP-1, инсулин или аналог инсулина, средство для повышения выработки инсулина, ингибитор SGLT2, аналог человеческого амилина, бигуанид, ингибитор альфа-глюкозидазы, метформин, производное сульфонилмочевины, розиглитазон, меглитинид, тиазолидиндион, ингибитор альфа-глюкозидазы, и т.п. Производное сульфонилмочевины может представлять собой ацетогексамид, хлорпропамид, толбутамид, толазамид, глимепирид, глипизид, глибурид или гликлазид. Меглитинид может представлять собой натеглинид или репаглинид. Тиазолидиндион может представлять собой пиоглитазон или розиглитазон. Альфа-глюкозидаза может представлять собой акарбозу или миглитол.
Терапия, направленная на снижения уровня холестерина или липидов, может включать, не ограничиваясь ими, терапевтическое изменение образа жизни, статины, секвестранты желчных кислот, никотиновую кислоту и фибраты. Статины могут представлять собой аторвастатин, флувастатин, ловастатин, правастатин, розувастатин, симвастатин, и т.п. Секвестранты желчных кислот могут представлять собой холезевелам, холестирамин, колестипол, и т.п. Фибраты могут представлять собой гемфиброзил, фенофибрат, клофибрат, и т.п.
Средства для повышения уровней ЛПВП включают лекарственные средства, ингибирующие транспортный белок холестериновых эфиров (ТБХЭ) (такие как торцетрапиб), агонисты рецептора, активируемого пролиферацией пероксисом, Аро-А1, пиоглитазон, и т.п.
Некоторые популяции лечения
Некоторые субъекты с высокими уровнями ТГ подвержены значительному риску сердечно-сосудистых и метаболических заболеваний. У многих субъектов с высоким уровнем ТГ (например, гипертриглицеридемия), существующие способы лечения не могут снизить уровня ТГ до безопасных значений. ApoCIII играет важную роль в метаболизме ТГ и представляет собой независимый фактор риска сердечно-сосудистого заболевания. Ингибирование ApoCIII, как показано в данном описании, значительно снижает уровни ТГ, что может облегчить протекание сердечно-сосудистого или метаболического заболевания или снизить его риск.
Пограничные высокие уровни ТГ (150-199 мг/дл) обычно обнаруживают в общей популяции, и они являются общим компонентом состояний метаболического синдрома/инсулинорезистентности. Высокий уровень ТГ в плазме ≥ 200 мг/дл представляет собой общий клинический признак, связанный с повышенным риском сердечно-сосудистого заболевания (Hegele et al., Hum Mol Genet 2009, 18: 4189-4194; Hegele and Pollex, Mol Cell Biochem, 2009, 326: 35-43). Очень высокие уровни ТГ (≥500 и ≤2000 мг/дл) также чаще всего ассоциируются с повышенными уровнями хиломикрон, и сопровождаются повышенным риском острого панкреатита.
В некоторых вариантах соединения, композиции и способы, раскрытые в данном описании, применяются для лечения субъектов с уровнем ТГ в интервале 100-200 мг/дл, 100-300 мг/дл, 100-400 мг/дл, 100-500 мг/дл, 200-500 мг/дл, 300-500 мг/дл, 400-500 мг/дл, 500-1000 мг/дл, 600-1000 мг/дл, 700-1000 мг/дл, 800-1000 мг/дл, 900-1000 мг/дл, 500-1500 мг/дл, 1000-1500 мг/дл, 100-2000 мг/дл, 150-2000 мг/дл, 200-2000 мг/дл, 300-2000 мг/дл, 400-2000 мг/дл, 500-2000 мг/дл, 600-2000 мг/дл, 700-2000 мг/дл, 800-2000 мг/дл, 900-2000 мг/дл, 1000-2000 мг/дл, 1100-2000 мг/дл, 1200-2000 мг/дл, 1300-2000 мг/дл, 1400-2000 мг/дл или 1500-2000 мг/дл. В некоторых вариантах лечение соединениями, раскрытыми в данном описании, показано для субъекта с уровнем ТГ ≥ 100 мг/дл, ≥ 110 мг/дл, ≥ 120 мг/дл, ≥ 130 мг/дл, ≥ 140 мг/дл, ≥ 150 мг/дл, ≥ 160 мг/дл, ≥ 170 мг/дл, ≥ 180 мг/дл, ≥ 190 мг/дл, ≥ 200 мг/дл, ≥ 300 мг/дл, ≥ 400 мг/дл, ≥ 500 мг/дл, ≥ 600 мг/дл, ≥ 700 мг/дл, ≥ 800 мг/дл, ≥ 900 мг/дл, ≥ 1000 мг/дл, ≥ 1100 мг/дл, ≥ 1200 мг/дл, ≥ 1300 мг/дл, ≥ 1400 мг/дл, ≥ 1500 мг/дл, ≥ 1600 мг/дл, ≥ 1700 мг/дл, ≥ 1800 мг/дл, ≥ 1900 мг/дл, ≥ 2000 мг/дл, ≥ 2100 мг/дл, ≥ 2200 мг/дл, ≥ 2300 мг/дл, ≥ 2400 мг/дл или ≥ 2500 мг/дл.
Некоторые виды гипертриглицеридемии могут характеризоваться системой классификации Фредериксона или системой классификации, описанной Трембле (Tremblay et al., J din Lipidol, 2011, 5: 37-44). В некоторых вариантах соединения, композиции и способы, описанные в данном описании, пригодны для лечения субъектов, страдающих или находящихся в группе риска гипертриглицеридемии фредериксоновского типа II, IV или V.
Фредериксоновский тип IIb (также известный как семейная комбинированная гиперлипопротеинемия) представляет собой смешанную гиперлипидемию (высокие уровни холестерина и ТГ), вызванную повышением уровня ЛПНП-С и ЛПОНП. Высокие уровни ЛПОНП являются результатом чрезмерной выработки субстратов, в том числе, ТГ, ацетил-КоА, и увеличения синтеза В-100. Они также могут быть вызваны снижением клиренса ЛПНП. Распространенность в популяции составляет около 10%.
Фредериксоновский тип IV (также известный как семейная гипертриглицеридемия) - аутосомальное доминантное состояние, присутствующее приблизительно у 1% населения. Уровни ТГ повышаются в результате избыточной выработки ЛПОНП печенью или гетерозиготного дефицита ЛПНП, но они почти всегда ниже 1000 мг/дл. Уровни холестерина в сыворотке обычно находятся в пределах нормы. Расстройство является гетерогенным, и на фенотип существенно влияют факторы внешней среды, особенно потребление углеводов и этанола. В некоторых вариантах соединения, композиции и способы, описанные в данном описании, пригодны для лечения субъектов с уровнем ТГ≥200 мг/дл и гетерозиготным дефицитом ЛПНП или чрезмерной выработкой ЛПОНП. В некоторых вариантах соединения, композиции и способы, описанные в данном описании, пригодны для лечения субъектов с уровнем ТГ≥500 мг/дл и гетерозиготным дефицитом ЛПНП или чрезмерной выработкой ЛПОНП.
Фредериксоновский тип V включает высокие уровни ЛПОНП и хиломикрон. Он характерен для носителей вариантов гена ЛПНП с утратой функции, связанной с активностью ЛПНП, как минимум, 20% (т.е. частичный дефицит ЛПНП). У таких субъектов плазма похожа на молоко и присутствует тяжелая гипертриглицеридемия из-за хиломикрон и ЛПОНП. Уровни ТГ неизменно выше 1000 мг/дл, и уровни общего холестерина всегда повышены. Обычно присутствует низкий уровень ЛПНП-С. Это также ассоциируется с повышенным риском острого панкреатита, непереносимостью глюкозы и гиперурикемии. Симптомы, в общем, присутствуют во взрослой жизни (>35 лет) и, хотя распространенность относительно низкая, такие субъекты встречаются намного чаще, чем субъекты с гомозиготной или составной гетерозиготной недостаточностью ЛПНП. В некоторых вариантах соединения, композиции и способы, описанные в данном описании, пригодны для лечения субъектов с уровнем ТГ≥1000 мг/дл. В некоторых вариантах соединения, композиции и способы, описанные в данном описании, пригодны для лечения субъектов, страдающих или находящихся в группе риска панкреатита в связи с высокими уровнями ТГ у субъекта. В некоторых вариантах соединения, композиции и способы, описанные в данном описании, пригодны для лечения субъектов, страдающих или находящихся в группе риска сердечно-сосудистого или метаболического заболевания в связи с высокими уровнями ТГ у субъекта. В некоторых вариантах сердечно-сосудистое заболевание представляет собой аневризму, стенокардию, аритмию, атеросклероз, цереброваскулярное заболевание, заболевание коронарных сосудов сердца, гипертензию, дислипидемию, гиперлипидемию, гипертриглицеридемию, гиперхолестеринемию, инсульт, и т.п. В некоторых вариантах дислипидемия представляет собой хиломикронемию. В некоторых вариантах метаболические заболевания или расстройства включают, не ограничиваясь ими, гипергликемию, преддиабетическое состояние, диабет (типа I и типа II), ожирение, инсулинорезистентность, метаболический синдром и диабетическую дислипидемию.
В некоторых вариантах лечение соединениями, раскрытыми в данном описании, показано для животного, которое является человеком, с генетическим дефектом, ведущим к повышению уровней ApoCIII и/или уровней триглицеридов. В некоторых вариантах генетический дефект представляет собой аллельный вариант или полиморфизм, который увеличивает экспрессию ApoCIII. В некоторых вариантах полиморфизм представляет собой замену Т (в положении 74) на А, С (в положении -641) на A, G (в положении -630) на А, делецию Т (в положении -625), замену С (в положении -482) на Т, Т (в положении -455) на С, С (в положении 1100) на Т, С (в положении 3175) на G, Т (в положении 3206) на G, С (в положении 3238) на G, и т.п. В некоторых вариантах генетический дефект представляет собой гетерозиготный дефицит липопротеинлипазы.
В некоторых вариантах лечение соединениями, раскрытыми в данном описании, показано для животного, которое является человеком, с повышенными уровнями ApoCIII. В некоторых вариантах повышенный уровень ApoCIII составляет ≥ 50 мг/л, ≥ 60 мг/л, ≥ 70 мг/л, ≥ 80 мг/л, ≥ 90 мг/л, ≥ 100 мг/л, ≥ 110 мг/л, ≥ 120 мг/л, ≥ 130 мг/л, ≥ 140 мг/л, ≥ 150 мг/л, ≥ 160 мг/л, ≥ 170 мг/л, ≥ 180 мг/л, ≥ 190 мг/л, ≥ 200 мг/л, ≥ 300 мг/л, ≥ 400 мг/л или ≥ 500 мг/л.
ПРИМЕРЫ
Неограничивающее раскрытие и включение путем ссылки
Хотя некоторые соединения, композиции и способы, приведенные в данном описании, описаны конкретно в соответствии с определенными вариантами, нижеследующие примеры приведены только для иллюстрации соединений, описанных в данном описании, и не предназначены для ограничения. Каждая из ссылок, цитируемых в настоящей заявке, включена в данное описание путем ссылки в полном объеме.
Пример 1: Влияние антисмыслового ингибирования ApoCIII человека in vivo у трансгенных мышей huApoCIII
Используемые в исследовании трансгенные мыши с трансгеном ApoCIII человека были потомками трансгенного гибрида Fl huApoCIII (Jackson Laboratories, CA) и мышей C57BL/6. В данном анализе использовали ISIS 304801 (ранее раскрытый в патенте США 7,598,227) со стартовым местоположением 508 на SEQ ID NO: I (GENBANK номер доступа NM_000040.1) и стартовым местоположением 3139 на SEQ ID NO: 2 (GENBANK номер доступа NT_033899.8, укороченный от нуклеотидов 20263040 до 20266203), с последовательностью 5'-AGCTTCTTGTCCAGCTTTAT-3' (SEQ ID NO: 3) и мотивом химерного нуклеотида 5-10-5 МОЭ. Другой антисмысловой олигонуклеотид ISIS, 'Соединение X', с мотивом химерного нуклеотида 5-10-5 МОЭ, нацеленный на другой участок SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, также был включен в данный анализ. Другой антисмысловой олигонуклеотид ISIS, 'Соединение Y', с мотивом химерного нуклеотида 5-10-5 МОЭ, нацеленный на последовательность ApoCIII грызуна (GenBank номер доступа NM_023114.3; SEQ ID NO: 5), также был включен в данный анализ.
Лечение
Трансгенных мышей с ApoCIII человека содержали с циклом света/темноты 12 час на рационе Teklad lab ad libitum. Животных акклиматизировали, как минимум, в течение 7 дней в исследовательском учреждении перед началом эксперимента. Антисмысловые олигонуклеотиды (АСО) готовили в ФБР и стерилизовали фильтрацией сквозь фильтр с размером пор 0,2 мкм. Олигонуклеотиды растворяли в 0,9% ФБР для инъекции.
Испытание на самцах и самках мышей проводили отдельно. Мыши-самцы были разбиты на три группы лечения, по 5 мышей в каждой. Две такие группы получали подкожные инъекции ISIS 304801 или Соединениях в дозе 37,5 мг/кг 2 раза в неделю на протяжении 2 недель. Одна группа мышей получала подкожные инъекции ФБР 2 раза в неделю на протяжении 2 недель. Мыши-самки были разбиты на четыре группы лечения, по 4-5 мышей в каждой. Три такие группы получали подкожные инъекции ISIS 304801, Соединения Х или Y в дозе 37,5 мг/кг 2 раза в неделю на протяжении 2 недель. Одна группа мышей получала подкожные инъекции ФБР 2 раза в неделю на протяжении 2 недель. До лечения, а также после введения последней дозы, отбирали образцы крови у каждой мыши, и образцы плазмы анализировали. Через 2 дня после введения последней дозы мышей умерщвляли эвтаназией, органы извлекали, и проводили анализы.
Уровни холестерина и триглицеридов
Триглицериды и холестерин плазмы экстрагировали по методу Bligh и Dyer (Bligh, E.G. and Dyer, W.J. Can. J. Biochem. Physiol. 37: 911-917, 1959) и измеряли с помощью коммерчески доступного набора для определения триглицеридов (DCL Triglyceride Reagent;
Diagnostic Chemicals Ltd.).
Результаты анализа уровней триглицеридов у самцов и самок представлены в табл. 1 и 2, и выражены в мг/дл. Согласно наблюдениям, уровни триглицеридов во всех группах лечения были значительно снижены по сравнению с показателями контрольных групп.
Для измерения различных фракций холестерина (ЛПВП, ЛПНП и ЛПОНП), образцы плазмы из групп самок анализировали методом ВЭЖХ, и результаты представлены в табл. 3. Согласно наблюдениям, антисмысловое ингибирование ApoCIII значительно снижало содержание ЛПОНП, а также существенно повышало уровни ЛПВП. Повышение уровней ЛПВП и снижение уровней ЛПОНП представляет собой благоприятное воздействие антисмыслового ингибирования ApoCIII на сердечно-сосудистую систему и может быть благоприятным для животных из групп риска или страдающих дислипидемическими заболеваниями.
Пример 2: Дозозависимое антисмысловое ингибирование ApoCIII человека у трансгенных мышей huApoCIII
ISIS 304801 и Соединение Х дополнительно изучали в дозозависимом исследовании с использованием трансгенных мышей с ApoCIII человека.
Лечение
Трансгенных мышей с ApoCIII человека содержали с циклом света/темноты 12 час на рационе Teklad lab ad libitum. Животных акклиматизировали, как минимум, в течение 7 дней в исследовательском учреждении перед началом эксперимента. Антисмысловые олигонуклеотиды (АСО) готовили в ФБР и стерилизовали фильтрацией сквозь фильтр с размером пор 0,2 мкм. Олигонуклеотиды растворяли в 0,9% ФБР для инъекции.
Мыши-самки были разбиты на 9 групп лечения, по 3 мыши в каждой. Восемь таких групп получали подкожные инъекции ISIS 304801 или Соединения Х в дозе 1,5 мг/кг/неделю, 5 мг/кг/неделю, 15 мг/кг/неделю или 50 мг/кг/неделю на протяжении 2 недель. Одна группа мышей получала подкожные инъекции ФБР на протяжении 2 недель. До лечения, а также после введения последней дозы, отбирали образцы крови у каждой мыши, и образцы плазмы анализировали. Через 2 дня после введения последней дозы мышей умерщвляли эвтаназией, органы извлекали, и проводили анализы.
Уровни холестерина и триглицеридов
Триглицериды и холестерин плазмы экстрагировали по методу Bligh и Dyer (Bligh, E.G. and Dyer, W.J. Can. J. Biochem. Physiol. 37: 911-917, 1959) и измеряли с помощью коммерчески доступного набора для определения триглицеридов (DCL Triglyceride Reagent; Diagnostic Chemicals Ltd.).
Результаты анализа уровней холестерина и триглицеридов у мышей представлены в табл. 4 и 5, и выражены в мг/дл. Согласно наблюдениям, уровни ЛПВП у мышей, леченных более высокими дозами ISIS 304801, были значительно повышены, что указывает на благоприятное влияние ингибирования ApoCIII олигонуклеотидами. Уровни ЛПНП и триглицеридов в группах лечения высокой дозой были снижены по сравнению с уровнями в контрольных группах. Повышение уровней ЛПВП и снижение уровней ЛПНП и ТГ представляет собой благоприятное влияние антисмыслового ингибирования ApoCIII на сердечно-сосудистую систему и может быть благоприятным для животных из групп риска или страдающих дислипидемическими заболеваниями.
Пример 3: Влияние антисмыслового ингибирования ApoCIII у трансгенных мышей с нулевым рецептором ТБХЭ ЛПНП
-/-
Соединение Y дополнительно изучали на модели трансгенной мыши с ТБХЭ человека и трансгенным LDLr для изучения влияния антисмыслового ингибитора ApoCIII мыши на липиды плазмы и метаболизм липопротеинов у гиперлипидемических мышей.
Лечение
-/-
Трансгенных мышей с ТБХЭ человека и трансгенным ЛПНПr содержали с циклом света/темноты 12 час на западном рационе ad libitum (42% калорий из жира, 0,2% холестерина). Животных акклиматизировали к данному питанию в течение 10 дней в исследовательском учреждении перед началом эксперимента. Антисмысловые олигонуклеотиды (АСО) готовили в ФБР и стерилизовали фильтрацией сквозь фильтр с размером пор 0,2 мкм. Олигонуклеотиды растворяли в 0,9% ФБР для инъекции.
Мыши-самцы в возрасте 8 недель были разбиты на три группы лечения. Одна из таких групп из 6 мышей получала подкожные инъекции Соединения Y в дозе 12,5 мг/кг/неделю в течение 4 недель. Одна группа из 4 мышей получала подкожные инъекции контрольного олигонуклеотида ISIS 141923 (SEQ ID NO: 4) в дозе 12,5 мг/кг/неделю в течение 4 недель. Одна группа из 5 мышей получала подкожные инъекции ФБР в течение 4 недель. Образцы плазмы отбирали непосредственно перед началом лечения, а также через 2 и 4 недели лечения.
Уровни холестерина и триглицеридов
Триглицериды и холестерин плазмы экстрагировали по методу Bligh и Dyer (Bligh, E.G. and Dyer, W.J. Can. J. Biochem. Physiol. 37: 911-917, 1959) и измеряли с помощью коммерчески доступного набора для определения триглицеридов (DCL Triglyceride Reagent; Diagnostic Chemicals Ltd.).
Результаты анализа уровней холестерина и триглицеридов у мышей представлены в табл. 6 и 7, и выражены в мг/дл. Уровни холестерина и триглицеридов в группе лечения были существенно снижены по сравнению с показателями контрольной группы. Снижение уровней холестерина и ТГ представляет собой благоприятное влияние на сердечно-сосудистую систему антисмыслового ингибирования ApoCIII и может быть благоприятным для животных из групп риска или страдающих дислипидемическими заболеваниями.
Ингибирование уровней и активности белка ТБХЭ
Уровни белка ТБХЭ в плазме измеряли с использованием коммерческого набора ELISA (ALPCO, кат. №47-CETHU-E01). Активность белка ТБХЭ измеряли с помощью набора для флуориметрического анализа (Roar Biomedical, Inc. кат. № КВ-СЕТР). Как представлено в табл. 8, лечение антисмысловым олигонуклеотидом уменьшало экспрессию и активность белка ТБХЭ. ТБХЭ (транспортный белок холестериновых эфиров) облегчает обмен триглицеридов и эфиров холестерина между липопротеинами высокой плотности (ЛПВП) и ароВ-содержащими липопротеинами, такими как липопротеины очень низкой плотности (ЛПОНП), ЛПНП и хиломикроны. Снижение содержания ТБХЭ связано с повышенными уровнями ЛПВП и сниженными уровнями ЛПНП (Barter P.J. et al. Artherioscler. Thromb. Vase. Biol. 23: 160-167, 2003). Таким образом, ингибирование уровней и активности белка ТБХЭ представляет собой благоприятное влияние на сердечно-сосудистую систему антисмыслового ингибирования ApoCIII и может быть благоприятным для животных из групп риска или страдающих дислипидемическими заболеваниями. Как и ожидалось, контрольный олигонуклеотид не оказывал существенного влияния на ТБХЭ.
Повышение уровней белка ароА1 и активность параоксаназы-1 (PON1)
Уровни белка АроА1 в плазме измеряли методом ELISA. Активность белка PON1 измеряли с помощью набора для флуорометрического анализа EnzChek Paroxanase (Invitrogen, кат. № Е33702). Как представлено в табл. 9 и 10, лечение антисмысловым олигонуклеотидом увеличивало экспрессию белка АроА1 и повышало активность белка PON1. АроА1 и PON1 представляют собой основные белковые компоненты ЛПВП в плазме (Aviram, M and Rosenblat, M. Curr. Opin. Lipidol. 16: 393-399, 2005). Таким образом, повышение уровня белка и активность этих двух белковых компонентов представляют собой благоприятное влияние на сердечно-сосудистую систему антисмыслового ингибирования ApoCIII, и может быть благоприятным для животных из групп риска или страдающих дислипидемическими заболеваниями. Как и ожидалось, контрольный олигонуклеотид не оказывал влияния ни на один из белков.
Пример 4: Влияние антисмыслового ингибирования ApoCIII на клиренс холестерина ЛПВП у трансгенных мышей с нулевым рецептором ТБХЭ ЛПНП
-/-
Соединение Y дополнительно изучали на модели трансгенной мыши с ТБХЭ человека LDLr для изучения влияния антисмыслового ингибитора ApoCIII на клиренс и метаболизм холестерина ЛПВП у гиперлипидемических мышей.
Лечение
-/-
Трансгенных мышей с ТБХЭ человека и трансгенным ЛПНПr содержали с циклом света/темноты 12 час на западном рационе ad libitum (42% калорий из жира, 0,2% холестерина). Животных акклиматизировали к данному питанию в течение 10 дней в исследовательском учреждении перед началом эксперимента. Антисмысловые олигонуклеотиды (АСО) готовили в ФБР и стерилизовали фильтрацией сквозь фильтр с размером пор 0,2 мкм. Олигонуклеотиды растворяли в 0,9% ФБР для инъекции.
Мыши-самцы в возрасте 8 недель были разбиты на три группы лечения. Одна из таких групп из 6 мышей получала подкожные инъекции Соединения Y в дозе 15 мг/кг/неделю в течение 6 недель. Одна группа из 4 мышей получала подкожные инъекции контрольного олигонуклеотида ISIS 141923 в дозе 15 мг/кг/неделю в течение 6 недель. Одна группа из 5 мышей получала подкожные инъекции ФБР в течение 6 недель. Уровни холестерина и триглицеридов
Триглицериды и холестерин плазмы экстрагировали по методу Bligh и Dyer (Bligh, E.G. and Dyer, W.J. Can. J. Biochem. Physiol. 37: 911-917, 1959) и измеряли с помощью коммерчески доступного набора для определения триглицеридов (DCL Triglyceride Reagent; Diagnostic Chemicals Ltd.).
Результаты анализа уровней холестерина и триглицеридов у мышей представлены в табл. 11, и выражены в мг/дл. Уровни холестерина и триглицеридов в группе лечения были существенно снижены по сравнению с показателями контрольной группы. Снижение уровней холестерина и ТГ представляет собой благоприятное влияние на сердечно-сосудистую систему антисмыслового ингибирования ApoCIII и может быть благоприятным для животных из групп риска или страдающих дислипидемическими заболеваниями.
Клиренс ЛПВП
6
3
3
Мышам из всех групп вводили через хвостовую вену с 1×10 распадов в минуту H-холестеринового эфира (H-CEth)-меченого ЛПВП. Радиомеченый эфир холестерина структурно подобен холестерину, но будет улавливаться тканями, которые его захватили. Таким образом, клиренс радиомеченого эфира холестерина из плазмы и его аккумуляция в печени могут использоваться для оценки влияния на обратный транспорт холестерина. Образцы плазмы отбирали через 5 мин, 1,5 час, 3 час, 6 час и 24 час после инъекции, и радиоактивность подсчитывали с использованием жидкостного сцинтилляционного счетчика. Через 24 час мышей умерщвляли, и печень извлекали. Образцы печени экстрагировали в смеси хлороформ/метанол (2:1), и экстракт продували газообразным азотом, солюбилизировали в сцинтилляционном коктейле и производили подсчет с использованием такого же жидкостного сцинтилляционного счетчика.
Снижение содержания радиоактивной метки, как представлено в табл. 12, связано с клиренсом ЛПВП-эфиров холестерина из плазмы. Результаты показывают, что лечение Соединением Y приводило к увеличению скорости клиренса холестерина ЛПВП из плазмы. Это было связано с увеличенной аккумуляцией радиомеченых эфиров холестерина в печени леченных Соединением Y мышей, как представлено в табл. 13. Таким образом, данные показывают, что ингибирование ApoCIII у таких трансгенных мышей улучшает обратный транспорт холестерина и, таким образом, оказывало бы благоприятное влияние на больных сердечно-сосудистым заболеванием, таких как больные дислипидемическим заболеванием.
Пример 5: Сравнение влияния антисмыслового ингибирования ApoCIII человека у мышей C57BL/6 с моделью мышей с «нокаутированным» ApoCIII
Мыши с «нокаутированным» ApoCIII были получены от Jackson Laboratories (номер хранения 002057), и их сравнивали с мышами C57BL/6, лечеными антисмысловым олигонуклеотидом ApoCIII. В данном исследовании использовали Соединение Z, с мотивом химерного нуклеотида 5-10-5 МОЭ, нацеленное на последовательность ApoCIII грызуна (GenBank номер доступа NM_023114.3; SEQ ID NO: 5).
Лечение антисмысловым олигонуклеотидом
Мышей C57BL/6 содержали с циклом света/темноты 12 час на рационе с высоким содержанием жиров (корм Harland Teklad lab #88137) в течение 1 недели. Антисмысловые олигонуклеотиды (АСО) готовили в ФБР и стерилизовали фильтрацией сквозь фильтр с размером пор 0,2 мкм. Олигонуклеотиды растворяли в 0,9% ФБР для инъекции. Мышей рандомизировали на основании уровней общего холестерина плазмы и триглицеридов в группы по 6-8 мышей в каждой. Три группы мышей C57BL/6 получали еженедельно внутрибрюшинные инъекции Соединения Z в дозах 3,1 мг/кг, 6,3 мг/кг или 12,5 мг/кг в течение 6 недель. Группа мышей C57BL/6 получала еженедельно внутрибрюшинные инъекции ФБР в течение 6 недель. Группа ФБР служила контролем, с которым сравнивали леченые олигонуклеотидом группы и мышей с «нокаутированным» ApoCIII.
Через 2 дня после введения последней дозы мышей умерщвляли эвтаназией, и органы извлекали. Также изучали подобные группы мышей, получавших обычный корм для мышей.
Триглицериды печени
Триглицериды печени измеряли с помощью клинического анализатора Olympus (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Данные представлены в табл. 14 и демонстрируют, что у мышей, леченных антисмысловым олигонуклеотидом ApoCIII, присутствует другой фенотип, чем у мышей с «нокаутированным» ApoCIII. Уровни триглицеридов печени у мышей, леченных высокой дозой антисмыслового олигонуклеотида ApoCIII, были сходны с уровнями контрольной группы ФБР. Уровни триглицеридов в печени мышей с «нокаутированным» ApoCIII были существенно выше, чем у мышей C57BL/6, леченных антисмысловым олигонуклеотидом ApoCIII или контрольной группы ФБР. Таким образом, антисмысловое ингибирование ApoCIII оказывало благоприятное влияние в виде снижения риска стеатоза печени, по сравнению с моделью мышей с «нокаутированным» ApoCIII.
Пример 6: Влияние антисмыслового ингибирования ApoCIII in vivo у мышей C57BL/6
Оценивали влияние антисмыслового ингибирования ApoCIII на уровни липидов плазмы и клиренс жиров.
Лечение
Мышей-самцов C57/BL6 содержали с циклом света/темноты 12 час на западном рационе (Harland Tekland 88137) ad libitum. Животных акклиматизировали, как минимум, в течение 7 дней в исследовательском учреждении перед началом эксперимента. Антисмысловые олигонуклеотиды (АСО) готовили в ФБР и стерилизовали фильтрацией сквозь фильтр с размером пор 0,2 мкм. Олигонуклеотиды растворяли в 0,9% ФБР для инъекции.
Группы по 7-8 мышей в каждой получали внутрибрюшинные инъекции Соединения Z в дозе 12,5 мг/кг/неделю в течение 6 недель. Другая группа мышей получала внутрибрюшинные инъекции контрольного олигонуклеотида ISIS 141923 в дозе 12,5 мг/кг/неделю в течение 6 недель. Третья группа мышей получала внутрибрюшинные инъекции ФБР в течение 6 недель. Через 2 дня после введения последней дозы, мыши голодали в течение 4 час, их умерщвляли и собирали плазму и ткани.
Ингибирование мРНК ApoCIII
Общую РНК извлекали из печени и тонкого кишечника, и мРНК ApoCIII количественно определяли методом ОТ-ПЦР с использованием набора зонда праймера ApoCIII и нормализовали к циклофилину. Результаты представлены в табл. 15, и выражены, как процент ингибирования мРНК ApoCIII по сравнению с контролем ФБР. ISIS 141923 не вызывал снижения уровней мРНК ApoCIII, как и ожидалось. Данные продемонстрировали значительное ингибирование мРНК ApoCIII в печени и тонком кишечнике под действием Соединения Z, по сравнению с контролем ФБР.
Ингибирование кишечной экспрессии ApoCIII может быть значимым для предотвращения хиломикронемии (Chait et al., 1992, Adv Intern Med. 1992, 37: 249-73), дислипидемического состояния, вызванного ненадлежащим клиренсом хиломикрон триглицеридов. Тяжелые формы хиломикронемии могут приводить к панкреатиту, угрожающему жизни состоянию. Путем ингибирования кишечного ApoCIII, ингибирование липопротеинлипазы было бы уменьшено, и клиренс хиломикрон триглицеридов был бы увеличен, таким образом, предупреждая панкреатит. Кроме того, ингибирование кишечного ApoCIII увеличило бы клиренс триглицеридов после приема пищи, таким образом, снижая уровень ТГ после приема пищи - известный фактор риска заболевания коронарных сосудов сердца.
Уровни холестерина и триглицеридов
Холестерин плазмы экстрагировали по методу Bligh и Dyer (Bligh, E.G. and Dyer, W.J. Can. J. Biochem. Physiol. 37: 911-917, 1959) и измеряли с помощью клинического анализатора Olympus (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Холестерин ЛПВП и не-ЛПВП индивидуально измеряли методом ВЭЖХ. Уровни триглицеридов измеряли с применением коммерчески доступного набора для определения триглицеридов (DCL Triglyceride Reagent; Diagnostic Chemicals Ltd., Charlottetown, Канада). Результаты представлены в табл. 16, и выражены в мг/дл. Лечение Соединением Z приводило к значительному снижению уровней общего холестерина, холестерина не-ЛПВП и триглицеридов плазмы, по сравнению с контролем ФБР. Снижение уровней общего холестерина, холестерина не-ЛПВП и ТГ представляет собой благоприятное влияние на сердечно-сосудистую систему антисмыслового ингибирования ApoCIII и может быть благоприятным для животных из групп риска или страдающих дислипидемическими заболеваниями.
Клиренс жиров
Образцы плазмы отбирали в точках 30 мин, 1 час, 2 час, 3 час и 4 час после инъекции, и общее содержимое липидов в плазме измеряли с помощью клинического анализатора Olympus (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Уровень липидов в плазме, как показано в табл. 17 был обратным показателем клиренса липидов из плазмы. Результаты показывают, что лечение Соединением Z приводило к увеличению скорости клиренса жиров из плазмы.
Таким образом, данные показывают, что ингибирование ApoCIII у таких трансгенных мышей улучшает обратный транспорт холестерина, и оказывало бы благоприятное влияние на больных сердечно-сосудистым заболеванием.
Пример 7: Влияние антисмыслового ингибирования ApoCIII in vivo у мышей C57BL/6
Оценивали влияние антисмыслового ингибирования ApoCIII на уровни экспрессии ApoCIII и клиренс жиров.
Лечение
Мышей-самцов C57/BL6 содержали с циклом света/темноты 12 час на западном рационе (Harland Tekland 88137) ad libitum. Животных акклиматизировали, как минимум, в течение 7 дней в исследовательском учреждении перед началом эксперимента. Антисмысловые олигонуклеотиды (АСО) готовили в ФБР и стерилизовали фильтрацией сквозь фильтр с размером пор 0,2 мкм. Олигонуклеотиды растворяли в 0,9% ФБР для инъекции.
Группы по 5 мышей в каждой получали внутрибрюшинные инъекции антисмыслового олигонуклеотида, нацеленного на ApoCIII, Соединения Z, в дозе 12,5 мг/кг/неделю в течение 6 недель. Другая группа мышей получала внутрибрюшинные инъекции контрольного олигонуклеотида ISIS 141923 в дозе 12,5 мг/кг/неделю в течение 6 недель. Через 2 дня после введения последней дозы, мыши голодали в течение ночи, и болюс 200 мкл оливкового масла вводили перорально через зонд. После введения болюса, уровни триглицеридов в плазме измеряли с регулярными промежутками в течение 4 час. Мышей умерщвляли и собирали плазму и ткани.
Ингибирование мРНК ApoCIII
Общую РНК извлекали из печени и тонкого кишечника, и мРНК ApoCIII количественно определяли методом ОТ-ПЦР с использованием набора зонда праймера ApoCIII и нормализовали к циклофилину. Результаты представлены в табл. 18, и выражены, как процент ингибирования мРНК ApoCIII по сравнению с контрольным олигонуклеотидом. Данные продемонстрировали значительное ингибирование мРНК ApoCIII в печени и тонком кишечнике под действием Соединения Z, по сравнению с контрольным олигонуклеотидом.
Как отмечается в любом другом месте данного описания, ингибирование кишечной экспрессии ApoCIII может быть значимым для предотвращения хиломикронемии (Chait et al., 1992, Adv Intern Med. 1992, 37: 249-73), дислипидемического состояния, вызванного ненадлежащим клиренсом хиломикрон триглицеридов. Тяжелые формы хиломикронемии могут приводить к панкреатиту, угрожающему жизни состоянию. Путем ингибирования кишечного ApoCIII, ингибирование липопротеинлипазы было бы уменьшено, и клиренс хиломикрон триглицеридов был бы увеличен, таким образом, предупреждая панкреатит. Кроме того, ингибирование кишечного ApoCIII увеличило бы клиренс триглицеридов после приема пищи, таким образом, снижая уровень ТГ после приема пищи - известный фактор риска заболевания коронарных сосудов сердца.
Клиренс жиров
Образцы плазмы отбирали в точках 0 мин, 30 мин, 60 мин, 120 мин, 180 мин и 240 мин после инъекции, и концентрацию триглицеридов в плазме измеряли с помощью клинического анализатора Olympus (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Результаты показывают, что лечение Соединением Z приводило к увеличению скорости клиренса триглицеридов из плазмы.
Данное исследование можно сравнить с клиническими исследованиями болюса жиров, в ходе которых больные с экспрессией высоких уровней apo-CIII демонстрируют повышенные концентрации ТГ после приема пищи (Petersen K.F. et al., N Engl J Med 2010; 362: 1082-1089).
Пример 8: Влияние антисмыслового ингибирования ApoCIII in vivo у мышей C57BL/6
Оценивали влияние антисмыслового ингибирования ApoCIII на клиренс жиров.
Лечение
Мышей-самцов C57/BL6 содержали с циклом света/темноты 12 час на западном рационе (Harland Tekland 88137) ad libitum. Животных акклиматизировали, как минимум, в течение 7 дней в исследовательском учреждении перед началом эксперимента. Антисмысловые олигонуклеотиды (АСО) готовили в ФБР и стерилизовали фильтрацией сквозь фильтр с размером пор 0,2 мкм. Олигонуклеотиды растворяли в 0,9% ФБР для инъекции.
Группы по 6 мышей в каждой получали внутрибрюшинные инъекции антисмыслового олигонуклеотида, нацеленного на ApoCIII, Соединения Y или Соединения Z, в дозе 12,5 мг/кг/неделю, 6,3 мг/кг/неделю или 3,1 мг/кг/неделю в течение 6 недель. Другая группа мышей получала внутрибрюшинные инъекции контрольного олигонуклеотида ISIS 141923 в дозе 12,5 мг/кг/неделю в течение 6 недель. Еще одна группа мышей получала внутрибрюшинные инъекции ФБР в течение 6 недель. Через 2 дня после введения последней дозы, мыши голодали в течение ночи, и болюс 200 мкл оливкового масла вводили перорально через зонд. После введения болюса, уровни триглицеридов в плазме измеряли с регулярными промежутками в течение 4 час.
Клиренс жиров
Образцы плазмы отбирали в точках 0 мин, 30 мин, 60 мин, 120 мин, 180 мин и 240 мин после инъекции, и концентрацию триглицеридов в плазме измеряли с помощью клинического анализатора Olympus (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Результаты показывают, что лечение Соединением Y и Соединением Z приводило к увеличению скорости клиренса жиров из плазмы. Н/о показывает, что набор данных не был вычислен.
Данное исследование можно сравнить с клиническими исследованиями болюса жиров, в ходе которых больные с экспрессией высоких уровней apo-CIII демонстрируют повышенные концентрации ТГ после приема пищи (Petersen K.F. et al., N Engi J Med 2010; 362: 1082-1089).
Пример 9: Влияние антисмысловых олигонуклеотидов ISIS, нацеленных на ApoCIII человека, на модели гипертриглицеридемии у обезьян
Макак резус, получавших рацион с высоким содержанием фруктозы, лечили ISIS 304801. Оценивали эффективность и переносимость антисмыслового олигонуклеотида, а также как фармакологическое действие.
Лечение
Возраст обезьян составлял 2-4 года, и масса тела 2-5 кг. Обезьяны были распределены на 6 групп по 5 самцов макак резус, выбранных случайным образом, в каждой. Приблизительно 60 г корма (Сертифицированное питание приматов #5048, PMI Nutrition International, Inc.) выдавали каждой обезьяне в группах 1-4 дважды в день. Соответствующую добавку фруктозы (т.е. приблизительно 15% смеси Kool Aid) давали утром в течение 16 недель до введения антисмыслового олигонуклеотида. Чтобы подтвердить достаточное повышение уровня триглицеридов, образцы крови для анализа сыворотки отбирали у всех животных за 1-2 недели до введения олигонуклеотида.
Группы обезьян получали одновременно подкожную инъекцию олигонуклеотида ISIS или ФБР с помощью дозирующей иглы из нержавеющей стали и шприца подходящего размера в один из 4 участков на спине обезьян; каждый участок использовали для одной дозы, по часовой стрелке. Некоторым из групп вводили дозы 3 раза в неделю в течение первой недели (дни 1, 3 и 5) как нагрузочную дозу, и затем 2 раза в неделю в течение недель 2-12 в дозе 5 мг/кг, 10 мг/кг или 20 мг/кг ISIS 304801. Две контрольные группы, по 5 макак резус в каждой, получали ФБР подкожно 3 раза в неделю в течение первой недели (дни 1, 3 и 5), и затем 2 раза в неделю в течение недель 2-12. График введения показан в табл. 21. Обезьян из групп 1-4 умерщвляли на 86-й день.
2
Дополнительную нагрузку высокими дозами жиров давали обезьянам из групп 5 и 6 в форме молочного коктейля из сливок средней жирности. Молочный коктейль был стандартизирован и содержал 782 калории на м поверхности тела, в том числе 77,6% калорий в виде жиров, 19,2% в виде углеводов и 3,1% в виде белка. Обезьяны из групп 5 и 6 голодали на протяжении ночи, и молочный коктейль вводили 1 раз на 84-й день через желудочный зонд. Образцы крови отбирали непосредственно перед (время = 0 час) и через 1, 2, 3, 4 и 6 час после получения жировой нагрузки, чтобы оценить перемещение триглицеридов. Обезьяны отдыхали и голодали в течение 6 час после жировой нагрузки. Обезьян данной группы умерщвляли на 87-й день.
Снижение содержания мишени в печени Анализ РНК
Приблизительно 150 мг печени отбирали в группах 1-4 для анализа мРНК ApoCIII при умерщвлении. Печень разделяли на 2 части и помещали в 2 пробирки, содержащие буфер RLT с 1% бета-меркаптоэтанолом. Ткань гомогенизировали, и экспрессию ApoCIII определяли количественно методом ОТ-ПЦР. Как показано в табл. 22, лечение ISIS 304801 приводило к значительному снижению содержания мРНК ApoCIII в сравнении с контролем ФБР.
Анализ белка
2
Приблизительно 1,5 мл крови отбирали животных во всех группах исследования 1-4 и помещали в пробирку, содержащую K-ЭДТА, а затем центрифугировали для отделения плазмы. Уровни белка ApoCIII были определены количественно на клиническом анализаторе с использованием коммерчески доступного набора для турбидиметрического анализа (Kamiya Biomedical Co., Seattle, WA). Как показано в табл. 23, лечение ISIS 304801 приводило к значительному снижению уровней белка ApoCIII по сравнению с контролем ФБР. Кинетика снижения уровня белка ApoCIII также была проанализирована и представлена в табл. 24.
Анализ частиц липопротеинов
Чтобы установить кинетику угнетения ApoCIII в плазме, образцы плазмы были отобраны за 7 дней перед началом лечения, а также в дни 16, 30 и 86 периода лечения. Образцы обрабатывали методом ЯМР для анализа частиц липопротеинов (Liposcience, Raleigh, NC). Поскольку не наблюдалось существенных отличий в уровне ApoCIII между группами лечения (группы 2-4), результаты анализов представлены только для группы 2 (группа лечения, получавшая 10 мг/кг/неделю). Данные представлены в табл. 25 и 26.
Статистически значимые средние изменения по сравнению с начальными значениями наблюдались для общих триглицеридов плазмы (ТГ), а также для ЛПОНП и хиломикрон ТГ в группе лечения на 30-й день. В то же время, контрольные обезьяны продемонстрировали среднее увеличение тех же параметров. Беспрерывное лечение ISIS 304801 получавших фруктозу обезьян приводило к зависимому от времени увеличению количества частиц холестерина ЛПВП приблизительно на 8 мкмоль/л (табл. 27) и не вело к повышению уровня холестерина ЛПНП в данном исследовании (табл. 28). Не зарегистрировано значительных изменений количества частиц холестерина ЛПНП за период лечения 12 недель, относительно контрольной группы ФБР.
Во время умерщвления печень извлекали, используя метод экстракции Bligh и Dyer (Bligh EG and Dyer WJ. Can J Biochem Physiol 1959; 37: 911-917), и выполняли количественное определение с применением колориметрического анализа ТГ Wako. Антисмысловое ингибирование ApoCIII не увеличивало печеночной аккумуляции ТГ ни в одной из групп лечения относительно контрольной группы ФБР (табл. 29).
Клиренс ТГ из плазмы после приема пищи
Через 10 недель уровни ТГ после приема пищи в плазме обезьян из группы 10 мг/кг/неделю (Группа 2) измеряли в точках 0 час, 1 час, 2 час, 3 час и 4 час после предоставления обезьянам пищи. Как показано в табл. 30 и 31, клиренс ТГ из плазмы после приема пищи был существенно увеличен, на что указывает 38% уменьшение в площади под кривой ТГ после приема пищи (AUC) у обезьян из группы 10 мг/кг/неделю.
Клиренс ТГ после приема пищи также оценивали в Группах 5 и 6 (контроль ФБР и группа 40 мг/кг/неделю после жировой нагрузки) через 12 недель. Данные представлены в табл. 32, и также показывают значительное уменьшение площади под кривой ТГ после приема пищи (AUC) у обезьян указанной группы по сравнению с контролем.
Обезьяны в группе 10 мг/кг/неделю демонстрировали более низкие уровни ТГ в плазме натощак, чем группа ФБР через 10 недель. Результаты у негуманоидных приматов демонстрируют, что антисмысловое ингибирование ApoCIII представляет привлекательную терапевтическую стратегию снижения уровней ТГ и ЛПОНП в плазме индивидуумов с дислипидемией, и лечение может параллельно повышать уровни ЛПВП-Х без побочного действия на ЛПНП-Х.
Пример 10: Клинические испытания ISIS 304801 фазы I
В ходе двойного слепого исследования фазы 1 с однократной и множественными повышающимися дозами (SAD и MAD), здоровые субъекты в возрасте 18-55 лет были рандомизированы в соотношении 3:1 для получения ISIS 304801 или плацебо (физиологический раствор соли).
Субъектам SAD вводили подкожной инъекцией (п/к) однократную дозу 50, 100, 200 или 400 мг (n=4/когорту) в исследовательском центре. Субъекты возвращались в исследовательский центр для амбулаторного посещения на 4-й и 8-й день (окно ± 24 часа) для отбора образцов крови и клинической оценки. За состоянием субъектов наблюдали до 15-го дня, когда их состояние оценивали методом телефонного интервью.
Субъекты MAD получали множественные п/к инъекции доз 50, 100, 200 и 400 мг в исследовательском центре. Субъекты получили нагрузочную схему из 3-х доз в первую неделю (дни 1, 3 и 5), за которой следовало введение 1 раз в неделю в течение 3-х недель (дни 8, 15 и 22). За состоянием субъектов наблюдали в течение 8 недель после введения последней дозы исследуемого лекарственного средства. Субъекты возвращались в исследовательский центр для амбулаторного посещения на 29-й, 36-й и 50-й день (окно ± 24 часа) для оценки безопасности и клинических лабораторных оценок, а также для отбора образцов крови для анализа фармакокинетики. За состоянием субъектов наблюдали до 78-го дня (окно ± 7 дней), когда их состояние оценивали методом телефонного интервью.
Субъекты MAD оставались в исследовательском центре от дня -1 до 6-го и в 22-23-й дни, где они получали диету, показанную в табл. 33. Субъекты голодали, как минимум, в течение 12 час перед отбором образцов крови для оценки на 5-й, 8-й, 15-й, 22-й, 23-й, 29-й, 36-й, 43-й и 50-й дни (окно ± 24 часа).
Результаты
В целом, ISIS 304801 продемонстрировал хороший профиль безопасности и хорошо переносился всеми субъектами без клинически значимого повышения уровня ферментов трансаминаз и значимых побочных эффектов.
Базовые характеристики когорт MAD приведены в табл. 34. Продемонстрировано дозозависимое устойчивое снижение общих уровней apoC-III и ТГ у субъектов MAD, выраженное как процент изменения от начальных значений в табл. 35-36.
Медиана процента изменения от начальных значений в группе множественных доз 50, 100, 200 и 400 мг продемонстрировала снижение общего apoC-III на 20, 17, 71 и 78% и ТГ на 20, 25, 43 и 44%, соответственно, через 1 неделю (29-й день) после введения последней дозы. Снижение было устойчивым, как минимум, в течение 4 недель после введения последней дозы в группах более высокой дозы.
Уровни ТГ, наблюдаемые на 5-й и 23-й день для группы плацебо совпадали с данными субъектов, которые в течение ночи находились в исследовательском центре. Предполагается, что диета, предложенная исследовательским центром, приводила к выбросу в уровнях ТГ у субъектов, ночующих в исследовательском центре. ISIS 304801 снижал данные наблюдения ТГ дозозависимым образом. До некоторой степени, результаты, приведенные в данном описании, указывают на влияние ISIS 304801 на уровень ТГ после приема пищи (хотя уровни ТГ были оценены после 12-часового голодания), поскольку ISIS 304801 уменьшал вызванный питанием выброс ТГ дозозависимым образом.
Значения ЛПНП-Х не изменялись (данные не показаны), в то время как значения ЛПВП-Х демонстрировали тенденцию к увеличению зависимым от лечения образом, как показано в табл. 37.
Пример 11: Клиническое испытание ISIS 304801 фазы II
Рандомизированное, двойное слепое, плацебо-контролируемое исследование «доза-ответ» планируется для оценки фармакодинамического эффекта доза/реакция ISIS 304801 против плацебо на ароС-III натощак в связи с уровнями ЛПОНП. Дополнительные конечные точки для оценки включают: фармакодинамический эффект ISIS 304801 против плацебо на уровни общего ароС-III натощак, ТГ, ароС-II (общего и связанного с ЛПОНП), аполипопротеина В-100 (ароВ-100), аполипопротеина А-1 (ароА-1), аполипопротеина А-2 (ароА-2), аполипопротеина Е (ароЕ), общего холестерина (ОХ), липопротеина низкой плотности-холестерина (ЛПНП-Х), ЛПНП-ТГ, ЛПОНП-Х, ЛПОНП-ТГ, липопротеина не высокой плотности-холестерина (не-ЛПВП-Х), не-ЛПВП-ТГ, ЛПВП-Х, ЛПВП-ТГ, хиломикрон-Х (ХМ-Х), ХМ-ТГ, свободных жирных кислот (СЖК) и глицерина; липидов после приема пищи, характеристики и кинетику аполипопротеинов и липопротеинов, и уровни глюкозы в субпопуляции больных в исследовании, а также более обширная оценка фармакокинетики в другой субпопуляции больных (это не будут те же самые больные, для которых проводили оценку после приема пищи); и безопасность, переносимость и фармакокинетику ISIS 304801.
Для каждого больного, период участия состоит из периода скрининга ≤ 5 недель (который включает контрольный квалификационный период вхождения - 4 недели строгой диеты), 1-недельный период квалификации для исследования/начальной оценки, 13-недельный период лечения и период оценки после лечения длительностью 13 недель, всего 32 недели участия в исследовании. Сопутствующий прием медикаментов и побочные эффекты (ПЭ) будут регистрироваться в течение всех периодов исследования.
Возраст больных будет составлять, как минимум, 18 лет, уровень ТГ натощак ≥ 500 мг/дл в период скрининга, и уровень ТГ натощак ≥ 300 мг/дл и ≤ 2000 мг/дл после контрольного вхождения - 4 недели строгой диеты.
Семьдесят два (72) больных планируются для данного исследования. Запланированное количество составляет 24 больных на когорту дозы (100, 200, 300 мг), причем в каждой когорте будет 18 больных, получающих ISIS 304801 (активное вещество), и 6 больных, получающих плацебо. Подходящие больные будут зарегистрированы в равном соотношении (1:1) в группу не обширного исследования фармакокинетики/после приема пищи (Группа 1) или в группу обширного исследования фармакокинетики/после приема пищи (Группа 2). Больные в Группе 2 будут рандомизированы в равном соотношении (1:1) в группу обширного исследования фармакокинетики (Группа 2а) или группу оценки после приема пищи (Группа 2b). Больные из группы 2а будут рандомизированы в равном соотношении (1:1:1) в 1 из 3 когорт дозы (100, 200, 300 мг) и, в пределах каждой когорты дозы, в соотношении 5:1 для получения активного вещества или плацебо. Больные из группы 2b будут рандомизированы в равном соотношении (1:1) в 1 из 2 когорт дозы (200, 300 мг) и, в пределах каждой когорты дозы, в соотношении 2:1 для получения активного вещества или плацебо. Больные из группы 1 будут рандомизированы в когорту дозы и лечения до той степени, которая обеспечивает общую рандомизацию исследования 1:1:1 в когорте дозы (100, 200, 300 мг) и 3:1 в когорте лечения (активное вещество, плацебо).
Больные будут переведены на строгую диету (после проведения процедур скрининга) на период участия в исследовании. Через 28 дней на строгой диете больным будут проведены начальные измерения, и они будут оценены на предмет квалификации для регистрации в фазу лечения исследования. Больные, которые будут соответствовать критериям включения после диеты на входе, будут зарегистрированы в равном соотношении (1:1) в группу не обширного изучения фармакокинетики/после приема пищи (Группа 1) или группу обширного изучения фармакокинетики/после приема пищи (Группа 2) и рандомизированы в пределах своей группы.
Исследуемое лекарственное средство и лечение
Раствор ISIS 304801 (200 мг/мл, 1,0 мл) будет поставляться в стеклянных флаконах с пробкой емкостью 2 мл.
В качестве плацебо в данном исследования будет использоваться стерильный 0,9% раствор соли.
Раствор ISIS 304801 и плацебо с открытой этикеткой будет готовить провизор (или компетентное уполномоченное лицо). Флаконы предназначены для одноразового использования. Обученный профессионал будет вслепую вводить исследуемое лекарственное средство. Исследуемое лекарственное средство будут вводить п/к инъекцией в живот, бедро или внешнюю область плеча ежедневно в ходе лечения. Дозы 100 и 200 мг будут вводиться в виде одной п/к инъекции. Доза 300 мг будет вводиться в виде двух неконтигуальных п/к инъекций равных объемов.
Больные получат 13 доз исследуемого лекарственного средства в виде п/к инъекции 1 раз в неделю в течение 13 недель (дни 1, 8, 15, 22, 29, 36, 43, 50, 57, 64, 71, 78 и 85).
Больные завершат визиты лечения в день 1±0 дней и в дни 8, 15, 22, 29, 36, 43, 50, 57, 64, 71, 78 и 85 в пределах ± 1 день. Больные в группе обширного изучения фармакокинетики также посетят клинику в дни 2 и 86±0 дней относительно дней 1 и 85, соответственно, для отбора образца крови в точке 24 час. Больные завершат дополнительные посещения в дни 92 и 99 в пределах ± 1 день, день 127 в пределах ± 3 дня, и день 176 в пределах ± 5 дней от планируемой даты посещения. Больные в группе оценки после приема пищи также навестят клинику в день 103 в пределах ± 2 дня и в день, следующий за посещением в день 103 для отбора образца крови в точке 24 час.
Перед каждым посещением, которое включает отбор образца крови для измерения фармакодинамических параметров (дни 8, 15, 29, 43, 57, 71 и 85), больным будет предложена стандартизированная, предварительно приготовленная пища для обеда вечером перед визитов (чтобы гарантировать равную умеренность в потреблении жиров, на больного и на временную точку), после чего они будут голодать. Употребление спиртного будет запрещено за 48 час до указанных посещений клиники.
Кровь будет отбираться для измерения ЛПОНП ароС-III и других фармакодинамических маркеров в дни 8, 15, 29, 43, 57, 71 и 85 (до введения исследуемого лекарственного средства).
Больные в группе оценки после приема пищи будут употреблять стандартизированную, предварительно приготовленную пищу (легкие закуски и обеды (поставляются) и инструкции относительно завтраков и перекусов) в течение 2 дней до оценки после приема пищи. В каждый из дней оценки после приема пищи, после отбора образцов крови, больные будут употреблять стандартизированную жидкую пищу, которая составит приблизительно треть суточной потребности в калориях, со стабильной радиоизотопной меткой, после чего последует серийный отбор образцов крови. Больные получат стандартизированную, предварительно приготовленную пищу через 9 час после употребления жидкой пищи, после чего они будут голодать до отбора образцов крови в точке 24 час на следующий день.
В дополнение к отбору образцов в промежутке, у больных в группе обширной оценки фармакокинетики будет проводиться серийный отбор образцов крови через 24 час после введения первой (день 1-2) и последней (день 85-86) дозы исследуемого лекарственного средства.
Период оценки после лечения
За состоянием больных будут наблюдать до 176-го дня исследования. В течение данного периода, больные будут посещать исследовательский центр для амбулаторной клинической оценки в дни исследования 92, 99, 127 и 176 (и день 103 для больных в группе оценки после приема пищи) для оценки безопасности и клинических лабораторных анализов (отбор образцов крови), консультирования по питанию и мониторинга, регистрации сопутствующего приема медикаментов и сбора информации о побочных эффектах.
Образцы крови для анализа фармакокинетики и фармакодинамики будут отбираться периодически на протяжении периода оценки после лечения. Лабораторные анализы химических показателей сыворотки, мочи, свертываемости, комплемента, гематологических показателей, иммунной функции, функции щитовидной железы и полной панели липидов будут проводиться в различных точках времени в ходе исследования.
Оценки после приема пищи будут проведены на субпопуляции больных, как описано ниже.
Еда после приема пищи, расписание отбора образцов и оценка
Оценка метаболизма липопротеинов после приема пищи будет выполняться с использованием радиомеченой пищи с добавлением отслеживаемой метки, 3Н-пальмитата (300 мкКи, Perkin Elmer Inc., Woodbridge, ON, Канада), с помощью ультразвука введенного в жидкую пищу. Пальмитат представляет собой жирную кислоту, которая является общим компонентом любой диеты. Метка 3Н-пальмитат излучает слабую радиоактивность, эквивалентную рентгеновским лучам. Поскольку пищевой пальмитат встраивается в хиломикроны по мере того, как они образуются в энтероцитах кишечника, это позволяет контролировать появление и клиренс вновь образованных хиломикронов из кровотока. Методология, которая применяется для изучения кинетики появления и клиренса хиломикрон после приема пищи, хорошо обоснована (Mittendorfer et al. 2003, Diabetes, 52: 1641-1648; Bickerton et al. 2007; Normand-Lauziere et al. 2010, PLoS. One, 5: el0956).
Будет предложена жидкая пища (такая как молочный коктейль), содержащая небольшое количество (300 мкКи) радиомеченых жирных кислот (3Н-пальмитат). Жидкая пища будет содержать приблизительно треть суточной потребности в калориях. Начиная с 1 час до 9 час после приема пищи, будет проводиться непрерывная инфузия [U-13C]-K пальмитата (0,01 мкмоль/кг/мин в 100 мл 25% сывороточного альбумина человека; Cambridge Isotopes Laboratories Inc., Andover, MA) и заполненная (1,6 мкмоль/кг) беспрерывная (0,05 мкмоль/кг/мин) инфузия [1,1,2,3,3-2Н]-глицерина (Cambridge Isotopes Laboratories Inc.) будет проводиться, как было описано ранее (Normand-Lauziere et al. 2010, PLoS. One, 5: el 0956). Пальмитат плазмы и скорости появления глицерина будут вычислены с использованием уравнения нестационарного состояния Стила, допуская объем распределения 90 мл/кг и 230 мл/кг, соответственно (Gastaldelli et al. 1999, J Appl. Physiol, 87: 1813-1822).
Образцы крови будут отбираться с промежутками до и после употребления радиомеченой пищи в дни до и после фазы лечения, как отмечается в таблице ниже. Стандартизированная пища будет предоставлена участникам после отбора образцов крови в точке 9 час. Кровь будет отбираться в пробирку, содержащую Na2 ЭДТА и орлистат (30 мкг/мл, Roche, Mississauga, Канада) для предупреждения липолиза триацилглицеридов in vitro, и отдельные образцы будут отбираться в пробирки NaF для определения глюкозы плазмы.
Следующие параметры будут измеряться в каждой точке времени:
- Уровни 3Н-метки в плазме и частицах ХМ
- [U-13C]-K пальмитат в плазме и скорости появления [1, 1, 2, 3, 3-2Н]-глицерина
- Уровни ТГ, OX и ароВ в плазме и частицах ХМ
- Уровни аро CIII, аро CII и аро Е в плазме и частицах ЛПОНП
- Уровни глюкозы в плазме
Образцы плазмы также могут быть использованы для построения профиля белков, связывающихся с лекарственным средством, для целей валидации биоаналитического метода, оценки стабильности и метаболитов или оценки других видов взаимодействия ISIS 304801 с составляющими плазмы.