ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИ ПРИЕМЛЕМАЯ СОЛЬ (Е)-N-[4-[[3-ХЛОР-4-(2-ПИРИДИЛМЕТОКСИ)ФЕНИЛ]АМИНО]-3-ЦИАНО-7-ЭТОКСИ-6-ХИНОЛИЛ]-3-[(2R)-1-МЕТИЛПИРРОЛИДИН-2-ИЛ]ПРОП-2-ЕНАМИДА, СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЕ ПРИ ЛЕЧЕНИИ РАКА
PHARMACEUTICALLY ACCEPTABLE SALT (E)-N-[4-[[3-CHLORO-4-(2-PYRIDYLMETHOXY) PHENYL] AMINO] -3-CYANO-7-ETHOXY-6-QUINOLYL] -3-[(2R)-  1- METHYLPYRROLIDIN-2-YL] PROP-2-ENAMIDE, METHOD FOR PRODUCTION AND USE THEREOF IN TREATING CANCER

Область изобретения
Настоящее изобретение относится к фармацевтически приемлемой соли 6-аминохиназоолина или 3-цианохинолиновым производным, способу ее получения и медицинскому применению. В частности, настоящее изобретение относится к фармацевтически приемлемой соли (E)-N-[4-[[3-хлор-4-(2-пиридилметокси)фенил]амино]-3-циано-7-этокси-6-хинолил]-3-[(2R)-1-метилпирролидин-2-ил]проп-2-енамида, способу ее получения и ее применению в качестве терапевтического агента, и в частности, в качестве ингибитора протеинкиназы.
Предшествующий уровень техники
Трансдукция сигнала представляет собой фундаментальный механизм, посредством которого внеклеточные стимулы передаются внутрь клеток, регулируя соответствующие физические ответы, включающие пролиферацию, дифференцировку и апоптоз. Большая часть этих процессов трансдукции сигнала использует процесс обратимого фосфорилирования белков, включающие специфические протеинкиназы и фосфатазы.
Существуют два класса протеинкиназ (PK): белковые тирозинкиназы (PTK) и серин-треониновые киназы (STK). PTK могут фосфорилировать тирозиновый остаток на белке. STK могут фосфорилировать сериновый или/и треониновый остаток. Тирозинкиназы могут быть разделены на тирозинкиназы рецепторного типа (рецепторная тирозинкиназа, RTK) или нерецепторного типа (нерецепторная тирозинкиназа). В настоящее время в человеческом геноме идентифицированы приблизительно 90 тирозинкиназ, из которых приблизительно 60 относятся к рецепторному типу и приблизительно 30 относятся к нерецепторному типу.
Семейство рецепторных тирозинкиназ (RTK) включает множество подсемейств, таких как (1) семейство рецептора EGF (эпидермального фактора роста), включающее EGFR, HER-2, HER-3 и HER-4; (2) семейство инсулинового рецептора, включающее инсулиновый рецептор (IR), рецептор инсулиноподобного фактора роста-I (IGF-IR) и инсулиноподобный рецептор (IRR); (3) семейство класса III, такие как рецептор фактора роста тромбоцитов (PDGFR), рецептор фактора стволовых клеток (SCF) (c-Kit) RTK, рецептор fms-связанной тирозинкиназы 3 (Flt3) и рецептор колониестимулирующего фактора 1 (CSF-1R) и т.п. Иначе, рецептор фактора роста гепатоцитов c-Met, фактор роста эндотелия сосудов (VEGFR) и т.п. также относятся к семейству RTK. Они играют критическую роль в контроле клеточного роста и дифференцировки, и представляют собой ключевые медиаторы клеточных сигналов, приводящих к продукции цитокинов, таких как факторы роста (Schlessinger and Ullrich, Neuron 1992, 9, 383).
Подсемейство EGFR (ErbB, HER) играет критическую роль в контроле клеточной пролиферации и выживания. Эти RTK состоят из внеклеточного гликозилированного связывающего лиганд домена, трансмембранного домена и внутриклеточного цитоплазматического каталитического домена. Ферментативная активность рецепторных тирозинкиназ может быть стимулирована путем опосредованной лигандами гомодимеризации или гетеродимеризации. Димеризация приводит в результате к фосфорилированию тирозиновых остаток на рецепторах в каталитическом домене, приводя впоследствии к сайту связывания. За ним следует активация внутриклеточных сигнальных путей, таких как пути, вовлекающие ассоциирующуюся с микротрубочками протеинкиназу (MAP киназу) и фосфатидилинозитол-3-киназу (PI3 киназу). Активация этих путей связана с регуляцией клеточного цикла и апоптоза. Обнаружили, что такие мутантные и сверхэкспрессированнные формы тирозинкиназ, такие как EGFR, HER-2, представлены в большой доле обычных видов рака человека, таких как рак молочной железы, рак предстательной железы, немелкоклеточный рак легкого, рак пищевода, рак яичников и рак поджелудочной железы и т.п. Преобладание и релевантность тирозинкиназ подтверждается в онкогенезе и раковом росте.
Предполагают синтезировать новые соединения, обладающие активностями против пролиферации опухолевых клеток. Ожидается, что эти соединения ингибируют одну или более чем одну RTK или STK, и полезны для лечения или уменьшения интенсивности физиологических расстройств с сверхпролиферацией клеток, опосредованных RTK или STK, и опосредованных ангиогенезом.
Описание настоящего изобретения относится к сериям фармацевтически приемлемых солей (Е)-N-[4-[[3-хлор-4-(2-пиридилметокси)фенил]амино]-3-циано-7-этокси-6-хинолил]-3-[(2R)-1-метилпирролидин-2-ил]проп-2-енамида и их применениям, в частности в качестве ингибиторов протеинкиназ.
Автор изобретения обнаружил, что свободное основание (E)-N-[4-[[3-хлор-4-(2-пиридилметокси) фенил]амино]-3-циано-7-этокси-6-хинолил]-3-[(2R)-1-метилпирролидин-2-ил]проп-2-енамид плохо растворим в обычных растворителях и, таким образом, является не благоприятным для того, чтобы его готовили в медицинскую лекарственную форму, ограничивающую их биодоступность in vivo. Таким образом, существует острая потребность в улучшении их растворимости и фармакокинетическом поглощении для того, чтобы соответствовать обычному способу получения лекарственных форм. По сравнению со свободным основанием (Е)-N-[4-[[3-хлор-4-(2-пиридилметокси)фенил]амино]-3-циано-7-этокси-6-хинолил]-3-[(2R)-1-метилпирролидин-2-ил]проп-2-енамидом растворимость и фармакокинетика фармацевтически приемлемых солей соединения значительно улучшается, и способ синтеза упрощается.
Настоящее изобретение относится к тому, чтобы предложить фармацевтически приемлемые соли соединений формулы (I), таким образом, улучшая их физические/химические свойства и фармакокинетические характеристики.
Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение относится к тому, чтобы предложить фармацевтически приемлемую соль формулы (I) и способ ее получения. Предпочтительно, соль дималеат формулы (I) обладает преимуществами в растворимости, биодоступности и фармакокинетике по сравнению с самим соединением формулы (I) и другими его солями.
где
n равен 1, 2 или 3; и
М представляет собой молекулу кислоты.
В первом своем аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтически приемлемой соли (Е)-N-[4-[[3-хлор-4-(2-пиридилметокси)фенил]амино]-3-циано-7-этокси-6-хинолил]-3-[(2R)-1-метилпирролидин-2-ил]проп-2-енамиду формулы (I), где указанная соль представляет собой обычную неорганическую соль или органическую соль в области техники. Кроме того, указанная неорганическая соль выбрана из группы, состоящей из гидрохлорида, гидробромида, сульфата, нитрата и фосфата, предпочтительно гидрохлорида, более предпочтительно дигидрохлорида; где указанная органическая соль выбрана из группы, состоящей из пара-толуолсульфоната, метансульфоната, малеата, тартрата, сукцината, ацетата, трифторацетата, фумарата, цитрата, бензолсульфоната, бензоата, нафталинсульфоната, лактата и L-малата, предпочтительно L-яблочной кислоты, метансульфоната, сукцината, пара-толуолсульфоната или малеата, наиболее предпочтительно, малеата. В частности, соль малеат соединения формулы (I) обладает преимуществами в растворимости, биодоступности и фармакокинетике по сравнению с самим соединением формулы (I) и другими его солями.
Во втором своем аспекте настоящее изобретение относится к способу получения фармацевтически приемлемой соли (E)-N-[4-[[3-хлор-4-(2-пиридилметокси)фенил]амино]-3-циано-7-этокси-6-хинолил]-3-[(2R)-1-метилпирролидин-2-ил]проп-2-енамида, и указанное соединение может быть получено в соответствии с обычным в области техники способом образования соли. В частности, в указанном способе осуществляют стадию взаимодействия (E)-N-[4-[[3-хлор-4-(2-пиридилметокси)фенил]амино]-3-циано-7-этокси-6-хинолил]-3-[(2R)-1-метилпирролидин-2-ил]проп-2-енамида с соответствующей кислотой с образованием соли, где указанная кислота представляет собой неорганическую кислоту/органическую кислоту, выбранную из группы, состоящей из ортофосфорной кислоты, соляной кислоты, серной кислоты, азотной кислоты, бромистоводородной кислоты, пара-толуолсульфоновой кислоты, метансульфоновой кислоты, малеиновой кислоты, винной кислоты, янтарной кислоты, уксусной кислоты, трифторуксусной кислоты, фумаровой кислоты, лимонной кислоты, бензолсульфоновой кислоты, бензойной кислоты, нафталинсульфоновой кислоты, молочной кислоты и L-яблочной кислоты.
Фармацевтически приемлемые соли по настоящему изобретению как правило включают без ограничения:
Пример №
Структура и название
1
<img file="00000002.tif" he="37" wi="69" img-content="undefined" img-format="tif" />
(E)-N-[4-[[3-хлор-4-(2-пиридилметокси)фенил]амино]-3-циано-7-этокси-6-хинолил]-3-[(2R)-1-метилпирролидин-2-ил]проп-2-енамид малеат
2
<img file="00000003.tif" he="34" wi="63" img-content="undefined" img-format="tif" />
(E)-N-[4-[[3-хлор-4-(2-пиридилметокси)фенил]амино]-3-циано-7-этокси-6-хинолил]-3-[(2R)-1-метилпирролидин-2-ил]проп-2-енамид дималеат
3
<img file="00000004.tif" he="37" wi="78" img-content="undefined" img-format="tif" />
(E)-N-[4-[[3-хлор-4-(2-пиридилметокси)фенил]амино]-3-циано-7-этокси-6-хинолил]-3-[(2R)-1-метилпирролидин-2-ил]проп-2-енамид L-малат
4
<img file="00000005.tif" he="33" wi="64" img-content="undefined" img-format="tif" />
(E)-N-[4-[[3-хлор-4-(2-пиридилметокси)фенил]амино]-3-циано-7-этокси-6-хинолил]-3-[(2R)-1-метилпирролидин-2-ил]проп-2-енамид метансульфонат
5
<img file="00000006.tif" he="37" wi="71" img-content="undefined" img-format="tif" />
(E)-N-[4-[[3-хлор-4-(2-пиридилметокси)фенил]амино]-3-циано-7-этокси-6-хинолил]-3-[(2R)-1-метилпирролидин-2-ил]проп-2-енамиддиметансульфонат
6
<img file="00000007.tif" he="36" wi="69" img-content="undefined" img-format="tif" />
(E)-N-[4-[[3-хлор-4-(2-пиридилметокси)фенил]амино]-3-циано-7-этокси-6-хинолил]-3-[(2R)-1-метилпирролидин-2-ил]проп-2-енамид триметансульфонат
7
<img file="00000008.tif" he="40" wi="67" img-content="undefined" img-format="tif" />
(E)-N-[4-[[3-хлор-4-(2-пиридилметокси)фенил]амино]-3-циано-7-этокси-6-хинолил]-3-[(2R)-1-метилпирролидин-2-ил]проп-2-енамид пара-толуолсульфонат
8
<img file="00000009.tif" he="41" wi="70" img-content="undefined" img-format="tif" />
(E)-N-[4-[[3-хлор-4-(2-пиридилметокси)фенил]амино]-3-циано-7-этокси-6-хинолил]-3-[(2R)-1-метилпирролидин-2-ил]проп-2-енамид сукцинат
9
<img file="00000010.tif" he="37" wi="72" img-content="undefined" img-format="tif" />
(E)-N-[4-[[3-хлор-4-(2-пиридилметокси)фенил]амино]-3-циано-7-этокси-6-хинолил]-3-[(2R)-1-метилпирролидин-2-ил]проп-2-енамид дигидрохлорид
В третьем своем аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей терапевтически эффективное количество фармацевтически приемлемой соли (Е)-N-[4-[[3-хлор-4-(2-пиридилметокси)фенил]амино]-3-циано-7-этокси-6-хинолил]-3-[(2R)-1-метилпирролидин-2-ил]проп-2-енамида и фармацевтически приемлемые носители. Настоящее изобретение также относится к способу приготовления композиции, при котором осуществляют стадию комбинирования фармацевтически приемлемой соли с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем.
В четвертом своем аспекте настоящее изобретение относится к применению фармацевтически приемлемой соли (E)-N-[4-[[3-хлор-4-(2-пиридилметокси)фенил]амино]-3-циано-7-этокси-6-хинолил]-3-[(2R)-1-метилпирролидин-2-ил]проп-2-енамида или его фармацевтической композиции в приготовлении лекарственного средства для лечения заболеваний, связанных с протеинкиназами, где указанные протеинкиназы выбраны из группы, состоящей из рецепторных тирозинкиназ EGFR и рецепторных тирозинкиназ HER-2.
В пятом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения заболеваний, связанных с протеинкиназами, при котором осуществляют введение терапевтически эффективного количества фармацевтически приемлемой соли (E)-N-[4-[[3-хлор-4-(2-пиридилметокси)фенил]амино]-3-циано-7-этокси-6-хинолил]-3-[(2R)-1-метилпирролидин-2-ил]проп-2-енамида или его фармацевтической композиции субъекту, нуждающемуся в таком введении.
В шестом своем аспекте настоящее изобретение относится к применению фармацевтически приемлемой соли (E)-N-[4-[[3-хлор-4-(2-пиридилметокси)фенил]амино]-3-циано-7-этокси-6-хинолил]-3-[(2R)-1-метилпирролидин-2-ил]проп-2-енамида или его фармацевтической композиции при приготовлении лекарственного средства на основе протеинкиназного ингибитора, где указанные протеинкиназы выбраны из группы, состоящей из EGFR и HER-2.
В седьмом своем аспекте настоящее изобретение относится к применению фармацевтически приемлемой соли (E)-N-[4-[[3-хлор-4-(2-пиридилметокси)фенил]амино]-3-циано-7-этокси-6-хинолил]-3-[(2R)-1-метилпирролидин-2-ил]проп-2-енамида или фармацевтической композиции в качестве лекарственного средства для лечения заболеваний, связанных с протеинкиназами, где указанные заболевания представляют собой рак, выбранный из группы, состоящей из рака легкого, рака молочной железы, плоскоклеточного рака и рака желудка.
В восьмом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу регуляции каталитической активности протеинкиназ, при котором осуществляют приведение в контакт указанной протеинкиназы с фармацевтически приемлемой солью (E)-N-[4-[[3-хлор-4-(2-пиридилметокси)фенил]амино]-3-циано-7-этокси-6-хинолил]-3-[(2R)-1-метилпирролидин-2-ил]проп-2-енамида, где указанная протеинкиназа выбрана из группы, состоящей из рецепторной тирозинкиназы EGFR или рецепторной тирозинкиназы HER-2.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение дополнительно описано при помощи следующих примеров, которые не предназначены для того, чтобы ограничить объем изобретения.
Примеры
-1
-6
-1
-6
Структуры всех соединений идентифицируют при помощи ядерного магнитного резонанса (NMR) и/или масс-спектрометрии (MS). Химический сдвиг NMR (δ) зарегистрирован в виде млн (10). NMR осуществляют на спектрометре Bruker AVANCE-400. Растворитель для детекции представляет собой дейтерированный диметилсульфоксид (d-DMSO) с тетраметилсиланом (TMS) в качестве внутреннего стандарта, и химический сдвиг регистрируют в виде млн (10).
MS определяют на масс-спектрометре FINNIGAN LCQAd (ESI (ионизация путем распыления электронов)) (Thermo, Model: Finnigan LCQ advantage MAX).
HPLC определяют на спектрометре/жидкостном хроматографе высокого давления Agilent 1200DAD (хроматографическая колонка Sunfire С18 150×4,6 мм) и спектрометре/жидкостном хроматографе высокого давления Waters 2695-2996 (хроматографическая колонка Gimini C18 150×4,6 мм).
В колоночной хроматографии в общем используют в качестве носителя силикагель Yantai Huanghai 200~300 меш.
Исходные вещества по настоящему изобретению известны и могут быть приобретены в ABCR GmbH & Со. KG, Acros Organics, Aldrich Chemical Company и т.п., или они могут быть получены при помощи обычных способов синтеза, известных в области техники.
Если не указано иное, то следующие взаимодействия осуществляют в атмосфере аргона или атмосфере азота.
Термин ″атмосфера аргона″ или ″атмосфера азота″ относится к тому, что реакционный сосуд оборудован баллоном, заполненным приблизительно 1 л аргона или азота.
Термин ″атмосфера водорода″ относится к тому, что реакционный сосуд оборудован баллоном, заполненным приблизительно 1 л водорода.
Если не указано иное, то раствор, используемый в примерах, относится к водному раствору.
Если не указано иное, то температура реакции представляет собой комнатную температуру.
Комнатная температура представляет собой наиболее подходящую температуру реакции, составляющую 20°C-30°C.
Процессы реакции в примерах контролируют при помощи тонкослойной хроматографии (TLC). Система проявляющих растворителей включает систему дихлорметана и метанола, систему н-гексана и этилацетата, систему петролейного эфира и этилацетата и ацетон.
Долю растворителя по объему корректируют в соответствии с полярностью соединений.
Элюирующая система для колоночной хроматографии содержит А:
систему дихлорметана, метанола и ацетона; Б: систему гексана и этилацетата. Долю растворителя по объему корректируют в соответствии с полярностью соединений, и иногда также может быть добавлено небольшое количество аммиака и уксусной кислоты.
Пример 1
(Е)-N-[4-[[3-хлор-4-(2-пиридилметокси)фенил]амино]-3-циано-7-этокси-6-хинолил]-3-[(2R)-1-метилпирролидин-2-ил]проп-2-енамид малеат
Стадия 1
[(2R)-1-Метилпирролидин-2-ил]метаноллитий алюминий гидрид (230 мг, 6 ммоль) и N-трет-бутоксикарбонил-R-пролинол 1a (400 мг, 2 ммоль) растворяли в 10 мл безводного тетрагидрофурана в бане лед-вода партиями. После обнаружения того, что газ больше не выделяется, реакционную смесь нагревали до температуры дефлегмации в течение 2 часов. В реакционную смесь по каплям добавляли 5 мл метанола в бане лед-вода, а затем добавляли 5 мл воды, сушили над безводным сульфатом магния, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением указанного в заголовке соединения [(2R)-1-метилпирролидин-2-ил]метанола 1b (221 мг, выход 77,0%) в виде бесцветного масла.
MS m/z (ESI): 116 [M+1]
Стадия 2
(2R)-1-Метилпирролидин-2-формальдегид
Диметилсульфоксид (820 мкл, 11,46 ммоль) растворяли в 5 мл дихлорметана в бане с сухим льдом, а затем медленно добавляли по каплям оксалилхлорид (968 мг, 7,64 ммоль). После перемешивания в течение 45 минут к раствору добавляли раствор [(2R)-1-метилпирролидин-2-ил]метанола 1b (220 мг, 1,91 ммоль) в 2 мл дихлорметана. Реакционную смесь перемешивали в течение еще 45 минут, и добавляли триэтиламин (1,9 мл, 13,37 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 10 минут, затем нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 1 часа. Реакционную смесь последовательно промывали водой (20 мл) и насыщенным рассолом (10 мл). Объединенные органические экстракты сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении, и образующиеся в результате остатки очищали при помощи колоночной хроматографии с щелочным оксидом алюминия с элюирующей системой А с получением указанного в заголовке соединения (2R)-1-метилпирролидин-2-формальдегида 1c (300 мг) в виде желтого твердого вещества, которое непосредственно использовали на следующей стадии без очистки.
Стадия 3
N-[4-[[3-Хлор-4-(2-пиридилметокси)фенил]амино]-3-циано-7-этокси-6-хинолил]-2-диэтоксифосфорил-ацетамид
N,N′-Карбонилдиимидазол (487 мг, 3 ммоль) растворяли в 4 мл тетрагидрофурана. Смесь нагревали до 40°C в масляной бане, по каплям к смеси добавляли раствор диэтилфосфоноуксусной кислоты (588 мг, 3 ммоль) в тетрагидрофуране (4 мл) и перемешивали в течение 30 минут до следующей стадии.
6-Амино-4-[[3-хлор-4-(2-пиридилметокси)фенил]амино]-7-этокси-хинолин-3-карбонитрил 1d (446 мг, 1 ммоль, полученный при помощи хорошо известного способа: заявка на патент W02005028443) при 40°C растворяли в 4 мл тетрагидрофурана, а затем по каплям добавляли вышеописанный реакционный раствор. После перемешивания в течение 12 часов реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении и экстрагировали дихлорметаном (50 мл × 3). Объединенные органические экстракты промывали насыщенным рассолом (30 мл × 2), сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении, и образующиеся в результате остатки очищали при помощи колоночной хроматографии с силикагелем с элюирующей системой А с получением указанного в заголовке соединения N-[4-[[3-хлор-4-(2-пиридилметокси)фенил]амино]-3-циано-7-этокси-6-хинолил]-2-диэтоксифосфорил-ацетамида 1e (624 мг, выход 99,9%) в виде светло-желтого твердого вещества.
MS m/z (ESI): 624 [M+1]
Стадия 4
(E)-N-[4-[[3-хлор-4-(2-пиридилметокси)фенил]амино]-3-циано-7-этокси-6-хинолил]-3-[(2R)-1-метилпирролидин-2-ил]проп-2-енамид
N-[4-[[3-Хлор-4-(2-пиридилметокси)фенил]амино]-3-циано-7-этокси-6-хинолил]-2-диэтоксифосфорил-ацетамид 1е (250 мг, 0,40 ммоль) растворяли в 10 мл безводного тетрагидрофурана в бане с сухим льдом, а затем по каплям добавляли раствор литий бис(триметилсилил)амида (1М) в толуоле (440 мкл, 0,44 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 30 минут, по каплям добавляли раствор (2R)-1-метилпирролидин-2-формальдегида 1с (90 мг, 0,80 ммоль) в тетрагидрофуране (5 мл) и перемешивали в течение 30 минут, затем нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 12 часов. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении, и образующиеся в результате остатки очищали при помощи колоночной хроматографии с силикагелем с элюирующей системой А с получением указанного в заголовке соединения (Е)-N-[4-[[3-хлор-4-(2-пиридилметокси)фенил]амино]-3-циано-7-этокси-6-хинолил]-3-[(2R)-1-метилпирролидин-2-ил]проп-2-енамида 1f (46 мг, выход 19,7%) в виде желтого твердого вещества.
MS m/z (ESI): 583,4 [M+1]
1
6
H NMR (400 МГц, DMSO-d): δ 9,16 (s, 1H), 8,63 (d, 1H), 8,56 (s, 1H), 8,26 (s, 1H), 7,83-7,80 (dd, 1H), 7,76-7,50 (m, 2H), 7,57-7,56 (m, 1H), 7,40 (s, 1H), 7,38 (s, 1H), 7,19 (d, 1H), 7,06-7,03 (m, 2H), 6,34-6,31 (d, 1H), 5,35 (s, 2H), 4,39 (m, 2H), 4,27-4,26 (m, 1H), 3,32 (m, 1H), 3,10 (m, 1H), 2,73 (s, 3Н), 2,37-2,36 (m, 2H), 2,07-2,01 (m,2H), 1,64 (t, 3H)
Стадия 5
(Е)-N-[4-[[3-Хлор-4-(2-пиридилметокси)фенил]амино]-3-циано-7-этокси-6-хинолил]-3-[(2R)-1-метилпирролидин-2-ил]проп-2-енамид малеат
(Е)-N-[4-[[3-хлор-4-(2-пиридилметокси)фенил]амино]-3-циано-7-этокси-6-хинолил]-3-[(2R)-1-метилпирролидин-2-ил]проп-2-енамид 1f (500 мг, 0,86 ммоль) и малеиновую кислоту (109 мг, 0,94 ммоль) при перемешивании растворяли в 5 мл дихлорметана. После перемешивания в течение 1 часа при к.т. реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении с получением (E)-N-[4-[[3-хлор-4-(2-пиридилметокси)фенил]амино]-3-циано-7-этокси-6-хинолил]-3-[(2R)-1-метилпирролидин-2-ил]проп-2-енамид малеата 1 (609 мг, выход 100%) в виде желтого твердого вещества.
MS m/z (ESI): 584,4 [M+1-116]
1
3
H NMR (400 МГц, CDCl): δ 9,22 (s, 1H), 8,63 (m, 1H), 8,52 (m, 1H), 8,42 (s, 1H), 7,84 (m, 1H), 7,74 (m, 1H), 7,69 (m, 1H), 7,58 (m, 1H), 7,26 (m, 1H), 7,02 (m, 2H), 6,92 (m, 1H), 6,72 (m, 1H), 6,25 (s, 2H), 5,27 (s, 2H), 4,27 (m, 2H), 3,90 (m, 2H), 3,00 (m, 1H), 2,87 (m, 2H), 2,21 (m, 4H), 2,09 (m, 1H), 1,56 (t, 3H, J=8 Гц)
Пример 2
(Е)-N-[4-[[3-Хлор-4-(2-пиридилметокси)фенил]амино]-3-циано-7-этокси-6-хинолил]-3-[(2R)-1-метилпирролидин-2-ил]проп-2-енамид дималеат
(E)-N-[4-[[3-хлор-4-(2-пиридилметокси)фенил]амино]-3-циано-7-этокси-6-хинолил]-3-[(2R)-1-метилпирролидин-2-ил]проп-2-енамид дималеат
(E)-N-[4-[[3-хлор-4-(2-пиридилметокси)фенил]амино]-3-циано-7-этокси-6-хинолил]-3-[(2R)-1-метилпирролидин-2-ил]проп-2-енамид 1f (200 мг, 0,34 ммоль) при перемешивании растворяли в 6 мл этанола, а затем добавляли малеиновую кислоту (80 мг, 0,68 ммоль). После того, как реакционную смесь перемешивали в течение 0,5 часов и оставляли на 12 часов при к.т., в нее добавляли 10 мл диэтилового эфира и фильтровали. Твердое вещество промывали диэтиловым эфиром (20 мл) и сушили в вакууме с получением указанного в заголовке продукта (E)-N-[4-[[3-хлор-4-(2-пиридилметокси)фенил]амино]-3-циано-7-этокси-6-хинолил]-3-[(2R)-1-метилпирролидин-2-ил]проп-2-енамид дималеата 2 (220 мг, выход 78,6%) в виде желтого твердого вещества.
MS m/z (ESI): 583,4 [M+1-232]
1
3
H NMR (400 МГц, CDCl): δ 9,12 (s, 1H), 8,57 (m, 1H), 8,51 (m, 1H), 8,37 (s, 1H), 7,79 (m, 1H), 7,71 (m, 1H), 7,63 (m, 1H), 7,52 (m, 1H), 7,21 (m, 1H), 7,00 (m, 2H), 6,90 (m, 1H), 6,57 (m, 1H), 6,25 (s, 4H), 5,23 (s, 2H), 4,21 (m, 2H), 3,91 (m, 2H), 3,11 (m, 1H), 2,85 (m, 2H), 2,22 (m, 4H), 2,01 (m, 1H), 1,54 (t, 3H, J=8 Гц)
Пример 3
(Е)-N-[4-[[3-Хлор-4-(2-пиридилметокси)фенил]амино]-3-циано-7-этокси-6-хинолил]-3-[(2R)-1-метилпирролидин-2-ил]проп-2-енамид L-малат
Стадия 1
(Е)-N-[4-[[3-хлор-4-(2-пиридилметокси)фенил]амино]-3-циано-7-этокси-6-хинолил]-3-[(2R)-1-метилпирролидин-2-ил]проп-2-енамид L-малат
(Е)-N-[4-[[3-хлор-4-(2-пиридилметокси)фенил]амино]-3-циано-7-этокси-6-хинолил]-3-[(2R)-1-метилпирролидин-2-ил]проп-2-енамид 1f (300 мг, 0,51 ммоль) при перемешивании растворяли в 5 мл дихлорметана, а затем добавляли L-яблочную кислоту (75,9 мг, 0,56 ммоль). После перемешивания в течение 4 часов при к.т. реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении и сушили в вакууме с получением (Е)-N-[4-[[3-хлор-4-(2-пиридилметокси)фенил]амино]-3-циано-7-этокси-6-хинолил]-3-[(2R)-1-метилпирролидин-2-ил]проп-2-енамид L-малата 3 (375 мг, выход 100%) в виде желтого твердого вещества.
MS m/z (ESI): 583,4 [M+1-134]
1
H NMR (400 МГц, MeOD): δ 8,96 (s, 1H), 8,58 (m, 1H), 8,38 (s, 1H), 7,94 (m, 1H), 7,73 (m, 1H), 7,42 (m, 2H), 7,24 (s, 1H), 7,19 (m, 2H), 6,98 (m, 1H), 6,71 (m, 1H), 5,51 (s, 1H), 5,28 (m, 2H), 4,34 (m, 2H), 3,64 (m, 2H), 2,92 (m, 2H), 2,67 (m, 3Н), 2,58 (m, 1H), 2,31 (m, 1H), 2,17 (m, 1H), 2,09 (m, 2H), 1,98 (m, 1H), 1,58 (t, 3Н, J=8 Гц)
Пример 4
(Е)-N-[4-[[3-Хлор-4-(2-пиридилметокси)фенил]амино]-3-циано-7-этокси-6-хинолил]-3-[(2R)-1-метилпирролидин-2-ил]проп-2-енамид метансульфонат
Стадия 1
(Е)-N-[4-[[3-Хлор-4-(2-пиридилметокси)фенил]амино]-3-циано-7-этокси-6-хинолил]-3-[(2R)-1-метилпирролидин-2-ил]проп-2-енамид метансульфонат
(Е)-N-[4-[[3-Хлор-4-(2-пиридилметокси)фенил]амино]-3-циано-7-этокси-6-хинолил]-3-[(2R)-1-метилпирролидин-2-ил]проп-2-енамид 1f (150 мг, 0,26 ммоль) при перемешивании растворяли в 2 мл этанола, а затем добавляли метансульфоновую кислоту (1,67 мл, 0,26 ммоль). После перемешивания в течение 12 часов при к.т. в реакционную смесь добавляли 2 мл диэтилового эфира и фильтровали. Твердое вещество промывали диэтиловым эфиром (10 мл) и сушили в вакууме с получением указанного в заголовке продукта (E)-N-[4-[[3-хлор-4-(2-пиридилметокси)фенил]амино]-3-циано-7-этокси-6-хинолил]-3-[(2R)-1-метилпирролидин-2-ил]проп-2-енамид метансульфоната 4 (120 мг, выход 69,0%) в виде желтого твердого вещества.
MS m/z (ESI): 583,4 [M+1-96]
1
6
H NMR (400 МГц, DMSO-d): δ 11,10 (m, 1H), 10,00 (s, 1H), 9,91 (m, 1H), 9,11 (s, 1H), 9,01 (s, 1H), 8,60 (d, 1H, J=4 Гц), 8,03 (m, 1H), 7,57 (m, 2H), 7,47 (m, 4H), 6,92 (m, 2H), 5,31 (s, 2H), 4,43 (m, 2H), 4,01 (m, 2H), 3,73 (m, 3H), 3,14 (s, 2H), 2,80 (m, 2H), 2,32 (m, 1H), 2,27 (m, 3H), 1,51 (t, 3H, J=8 Гц)
Пример 5
(Е)-N-[4-[[3-Хлор-4-(2-пиридилметокси)фенил]амино]-3-циано-7-этокси-6-хинолил]-3-[(2R)-1-метилпирролидин-2-ил]проп-2-енамиддиметансульфонат
Стадия 1
(Е)-N-[4-[[3-Хлор-4-(2-пиридилметокси)фенил]амино]-3-циано-7-этокси-6-хинолил]-3-[(2R)-1-метилпирролидин-2-ил]проп-2-енамиддиметансульфонат
(Е)-N-[4-[[3-Хлор-4-(2-пиридилметокси)фенил]амино]-3-циано-7-этокси-6-хинолил]-3-[(2R)-1-метилпирролидин-2-ил]проп-2-енамид 1f (200 мг, 0,34 ммоль) при перемешивании растворяли в 2 мл этанола, а затем добавляли метансульфоновую кислоту (4,45 мл, 0,68 ммоль). После перемешивания в течение 12 часов при к.т. в реакционную смесь добавляли 2 мл диэтилового эфира и фильтровали, твердое вещество промывали диэтиловым эфиром (10 мл) и сушили в вакууме с получением указанного в заголовке продукта (Е)-N-[4-[[3-хлор-4-(2-пиридилметокси)фенил]амино]-3-циано-7-этокси-6-хинолил]-3-[(2R)-1-метилпирролидин-2-ил]проп-2-енамид диметансульфоната 5 (180 мг, выход 67,7%) в виде желтого твердого вещества.
MS m/z (ESI): 583,4 [M+1-192]
1
6
H NMR (400 МГц, DMSO-d): δ 11,17 (m, 1H), 10,04 (s, 1H), 9,98 (m, 1H), 9,18 (s, 1H), 9,05 (s, 1H), 8,67 (d, 1H, J=4 Гц), 8,01 (m, 1H), 7,68 (m, 2H), 7,50 (m, 4H), 6,91 (m, 2H), 5,39 (s, 2H), 4,40 (m, 2H), 4,14 (m, 2H), 3,71 (m, 6H), 3,22 (s, 2H), 2,82 (m, 2H), 2,36 (m, 1H), 2,32 (m, 3Н), 1,52 (t, 3H, J=8 Гц)
Пример 6
(Е)-N-[4-[[3-Хлор-4-(2-пиридилметокси)фенил]амино]-3-циано-7-этокси-6-хинолил]-3-[(2R)-1-метилпирролидин-2-ил]проп-2-енамидтриметансульФонат
Стадия 1
(Е)-N-[4-[[3-Хлор-4-(2-пиридилметокси)фенил]амино]-3-циано-7-этокси-6-хинолил]-3-[(2R)-1-метилпирролидин-2-ил]проп-2-енамидтриметансульфонат
(E)-N-[4-[[3-Хлор-4-(2-пиридилметокси)фенил]амино]-3-циано-7-этокси-6-хинолил]-3-[(2R)-1-метилпирролидин-2-ил]проп-2-енамид 1f (150 мг, 0,26 ммоль) при перемешивании растворяли в 1 мл этанола, а затем добавляли метансульфоновую кислоту (5,00 мл, 0,78 ммоль). После перемешивания в течение 12 часов в реакционную смесь добавляли 2 мл диэтилового эфира и фильтровали, твердое вещество промывали диэтиловым эфиром (10 мл) и сушили в вакууме с получением указанного в заголовке продукта (E)-N-[4-[[3-хлор-4-(2-пиридилметокси)фенил]амино]-3-циано-7-этокси-6-хинолил]-3-[(2R)-1-метилпирролидин-2-ил]проп-2-енамид триметансульфоната 6 (140 мг, выход 62,5%) в виде желтого твердого вещества.
MS m/z (ESI): 583,4 [M+1-288]
1
6
H NMR (400 МГц, DMSO-d): δ 10,97 (m, 1H), 9,99 (s, 1H), 9,89 (m, 1H), 9,27 (s, 1H), 9,08 (s, 1H), 8,71 (d, 1H, J=4 Гц), 7,93m, 1H), 7,62 (m, 2H), 7,51 (m, 4H), 6,94 (m, 2H), 5,27 (s, 2H), 4,37 (m, 2H), 4,09 (m, 2H), 3,67 (m, 9H), 3,19 (s, 2H), 2,78 (m, 2H), 2,31 (m, 1H), 2,27 (m, 3H), 1,52 (t, 3H, J=8 Гц)
Пример 7
(Е)-N-[4-[[3-Хлор-4-(2-пиридилметокси)фенил]амино]-3-циано-7-этокси-6-хинолил]-3-[(2R)-1-метилпирролидин-2-ил]проп-2-енамид пара-толуолсульфонат
Стадия 1
(Е)-N-[4-[[3-Хлор-4-(2-пиридилметокси)фенил]амино]-3-циано-7-этокси-6-хинолил]-3-[(2R)-1-метилпирролидин-2-ил]проп-2-енамид пара-толуолсульфонат
(Е)-N-[4-[[3-Хлор-4-(2-пиридилметокси)фенил]амино]-3-циано-7-этокси-6-хинолил]-3-[(2R)-1-метилпирролидин-2-ил]проп-2-енамид 1f (300 мг, 0,514 ммоль) при перемешивании растворяли в 3 мл смешанного растворителя н-пропанол/вода (3/1), а затем добавляли пара-толуолсульфоновой кислоты моногидрат (117 мг, 0,617 ммоль). После перемешивания в течение 0,5 часов при к.т. реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении и сушили в вакууме с получением указанного в заголовке продукта (E)-N-[4-[[3-хлор-4-(2-пиридилметокси)фенил]амино]-3-циано-7-этокси-6-хинолил]-3-[(2R)-1-метилпирролидин-2-ил]проп-2-енамид пара-толуолсульфоната 7 (410 мг, выход 98,0%) в виде желтого твердого вещества.
MS m/z (ESI): 584,2 [M+1-172]
1
H NMR (400 МГц, MeOD): δ 8,56 (s, 1H), 8,46 (s, 1H), 8,26 (s, 1H), 7,85 (m, 1H), 7,65 (m, 4H), 7,40 (m, 5H), 7,12 (m, 1H), 7,00 (m, 2H), 6,81 (m, 2H), 5,12 (s, 2H), 4,14 (m, 4H), 3,54 (m, 7H), 2,83 (m, 3H), 2,33 (m, 6H), 1,56 (t, 3H, J=7,2 Гц)
Пример 8
(Е)-N-[4-[[3-Хлор-4-(2-пиридилметокси)фенил]амино]-3-циано-7-этокси-6-хинолил]-3-[(2R)-1-метилпирролидин-2-ил]проп-2-енамид сукцинат
Стадия 1
(E)-N-[4-[[3-Хлор-4-(2-пиридилметокси)фенил]амино]-3-циано-7-этокси-6-хинолил]-3-[(2R)-1-метилпирролидин-2-ил]проп-2-енамид сукцинат
(Е)-N-[4-[[3-Хлор-4-(2-пиридилметокси)фенил]амино]-3-циано-7-этокси-6-хинолил]-3-[(2R)-1-метилпирролидин-2-ил]проп-2-енамид 1f (400 мг, 0,69 ммоль) при перемешивании растворяли в 5 мл дихлорметана, а затем добавляли янтарную кислоту (89,0 мг, 0,75 ммоль). После перемешивания в течение 0,5 часов при к.т. реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении и сушили в вакууме с получением указанного в заголовке продукта (E)-N-[4-[[3-хлор-4-(2-пиридилметокси)сренил]амино]-3-циано-7-этокси-6-хинолил]-3-[(2R)-1-метилпирролидин-2-ил]проп-2-енамид сукцината 8 (442 мг, выход 90,4%) в виде желтого твердого вещества.
MS m/z (ESI): 583,4 [M+1-118]
1
H NMR (400 МГц, MeOD): δ 12,21 (s, 2H), 9,62 (s, 1H), 8,96 (s, 1H), 8,61 (s, 1H), 8,47 (m, 1H), 7,87 (m, 1H), 7,59 (m, 1H0,7,39 (m, 2H), 7,25 (m, 2H), 6,66 (m, 1H), 5,76 (m, 1H), 5,29 (s, 2H), 4,31 (m, 2H), 4,03 (m, 1H), 3,32 (m, 2H), 2,50 (m, 2H), 2,24 (m, 1H), 1,48 (t, 3H, J=7,2 Гц)
Пример 9
(Е)-N-[4-[[3-Хлор-4-(2-пиридилметокси)фенил]амино]-3-циано-7-этокси-6-хинолил]-3-[(2R)-1-метилпирролидин-2-ил]проп-2-енамид дигидрохлорид
Стадия 1
(Е)-N-[4-[[3-Хлор-4-(2-пиридилметокси)фенил]амино]-3-циано-7-этокси-6-хинолил]-3-[(2R)-1-метилпирролидин-2-ил]проп-2-енамид дигидрохлорид
(E)-N-[4-[[3-Хлор-4-(2-пиридилметокси)фенил]амино]-3-циано-7-этокси-6-хинолил]-3-[(2R)-1-метилпирролидин-2-ил]проп-2-енамид 1f (1000 мг, 1,71 ммоль) при перемешивании растворяли в 5 мл дихлорметана, а затем добавляли раствор соляной кислоты в диэтиловом эфире (1М, 3,42 мл, 3,42 ммоль). После перемешивания в течение 0,5 часов в ледяной бане реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении и сушили в вакууме с получением указанного в заголовке продукта (E)-N-[4-[[3-хлор-4-(2-пиридилметокси)фенил]амино]-3-циано-7-этокси-6-хинолил]-3-[(2R)-1-метилпирролидин-2-ил]проп-2-енамид дигидрохлорида 9 (1500 мг, выход 100%) в виде желтого твердого вещества.
MS m/z (ESI): 583,2 [M+1-72]
1
3
H NMR (400 МГц, CDCl): δ 9,16 (s, 1H), 8,60 (s, 1H), 8,51 (s, 1H), 8,13 (s, 1H), 7,79 (m, 1H), 7,68 (m, 1H), 7,45 (m, 1H), 7,35 (s, 1H), 7,33 (d, 1H, J=4 Гц), 7,25 (m, 1H), 7,13 (m, 1H), 7,01 (m, 1H), 6,98 (m, 1H), 6,19 (m, 1H), 5,31 (s, 2H), 4,35 (dd, 2H, J=8 Гц, J=16 Гц), 4,24 (m, 1H), 3,19 (m, 1H), 2,85 (m, 1H), 2,33 (m, 4H), 2,09 (m, 1H), 1,60 (t, 3H, J=8 Гц)
Примеры тестов
Биологическая оценка
Пример 1: анализ ингибирования пролиферации клеток egfr
Следующий анализ in vitro предназначен для определения активности соединений по настоящему изобретению в отношении ингибирования пролиферации клеток человеческой эпидермоидной карциномы А431, имеющих высокий уровень экспрессии EGFR.
50
50
Следующий анализ in vitro предназначен для определения активности тестируемых соединений в отношении ингибирования пролиферации раковых клеток, обладающих высоким уровнем экспрессии EGFR. Активность представлена значением IC (средней ингибирующей концентрации). Общие процедуры анализа являются следующими: выбрали раковые клетки А431, имеющие высокий уровень экспрессии EGFR, и засевали в 96-луночный культуральный планшет с подходящей плотностью (например 5000 клеток/мл среды). Клетки затем инкубировали в инкубаторе с диоксидом углерода до достижения ими 85% конфлюэнтности. Затем клеточную культуральную среду заменяли на свежую среду, содержащую тестируемые соединения с сериями разведении (как правило, 6-7 концентраций). Клетки вновь помещали в инкубатор и непрерывно выращивали в течение 72 часов. Активность тестируемых соединений в отношении ингибирования клеточной пролиферации определяли с использованием способа с сульфородамином В (SRB). Значения IC рассчитывали в соответствии с уровнем ингибирования при различных концентрациях тестируемых соединений.
Активность соединений по настоящему изобретению:
50
Биологическую активность соединений по настоящему изобретению тестировали путем использования вышеописанного анализа. Значения IC рассчитывали и представили в следующей таблице:
Пример №
IC<sub>50</sub> (EGFR/A431) (мкМ)
1f
0,045
2
0,031
3
0,029
7
0,038
8
0,015
9
0,049
Заключение: малеат и другие соли, и свободное основание соединений формулы (I) обладают очевидной активностью в отношении ингибирования пролиферации клеток А431, обладающих высоким уровнем экспрессии EGFR.
Пример 2: Анализ киназной активности EGFR
Киназную активность EGFR in vitro тестировали при помощи следующего анализа.
50
2
2
3
4
Следующий анализ может быть использован для определения активности соединений по настоящему изобретению в отношении ингибирования киназной активности EGFR. Среднюю ингибирующую концентрацию IC (концентрацию тестируемого соединения, демонстрирующую 50% ингибирование ферментативной активности) для каждого соединения определяли путем инкубации нескольких различных концентраций тестируемых соединений со специфическим ферментом и субстратом. Киназа EGFR, используемая в этом анализе, представляет собой человеческий рекомбинантный белок, который инкубировали с пептидным субстратом при различных концентрациях тестируемых соединений в буферном растворе, содержащем 60 мМ HEPES (рН 7,5), 5 мМ MgCl, 5 мМ MnCl, 3 мкМ NaVO, 1,25 М DTT (дитиотреитол) (1000×) и 20 мкМ АТР (аденозинтрифосфат) при 25°C в течение 45 минут. Киназную активность EGFR количественно определяли путем использования способа флуоресценции с разрешением по времени.
Активность соединений по настоящему изобретению:
50
Биологическую активность соединений по настоящему изобретению тестировали путем использования вышеописанного анализа. Значения IC рассчитывали и представили в следующей таблице:
Пример №
IC<sub>50</sub> (EGFR/BIO) (мкМ)
1f
0,013
1
0,025
2
0,009
3
0,031
7
0,026
8
0,028
9
0,035
Заключение: малеат и другие соли, и свободное основание соединений формулы (I) обладают очевидной активностью в отношении ингибирования киназной активности EGFR.
Пример 3: анализ активности клеток Пег-2
Следующий анализ in vitro предназначен для определения активности соединений по настоящему изобретению в отношении ингибирования пролиферации клеток человеческой карциномы SK-BR-3, имеющих высокий уровень экспрессии HER-2
50
50
Следующий анализ in vitro предназначен для определения активности тестируемых соединений в отношении ингибирования ангиогенеза и пролиферации раковых клеток, обладающих высоким уровнем экспрессии HER-2. Активность представлена значением IC. Общие процедуры анализа являются следующими: выбрали линию раковых клеток SK-BR-3, имеющих высокий уровень экспрессии HER-2, и засевали в 96-луночный культуральный планшет с подходящей плотностью. Клетки затем инкубировали в инкубаторе с диоксидом углерода до достижения ими 60% конфлюэнтности. Затем клеточную культуральную среду заменяли на свежую среду, содержащую тестируемые соединения в различных концентрациях (как правило, 6-7 концентраций). Клетки вновь помещали в инкубатор и непрерывно выращивали в течение 96 часов. Активность тестируемых соединений в отношении ингибирования клеточной пролиферации определяли с использованием способа с сульфородамином В (SRB). Значения IC рассчитывали в соответствии с уровнем ингибирования при различных концентрациях тестируемых соединений.
Активность соединений по настоящему изобретению:
50
Биологическую активность соединений по настоящему изобретению тестировали путем использования вышеописанного анализа. Значения IC рассчитывали и представили в следующей таблице:
Пример №
IC<sub>50</sub> (Her-2/SK-BR-3) (мкМ)
1f
0,059
1
0,064
2
0,049
3
0,056
7
0,045
8
0,078
9
0,069
Заключение: малеат и другие соли, и свободное основание соединений формулы (I) обладают очевидной активностью в отношении ингибирования пролиферации клеток SK-BR-3, обладающих высоким уровнем экспрессии Her-2.
Пример 4: Анализ киназной активности Her-2
Киназную активность Her-2 in vitro тестировали при помощи следующего анализа.
50
2
2
3
4
Следующий анализ может быть использован для определения активности соединений по настоящему изобретению в отношении ингибирования киназы Her-2. Среднюю ингибирующую концентрацию IC (концентрацию тестируемого соединения, демонстрирующую 50% ингибирование ферментативной активности) для каждого соединения определяли путем инкубации нескольких различных концентраций тестируемых соединений со специфическим ферментом и субстратом. Киназа Her-2, используемая в этом анализе, представляет собой человеческий рекомбинантный белок, который инкубировали с пептидным субстратом при различных концентрациях тестируемых соединений в буферном растворе, содержащем 60 мМ HEPES (pH 7,5), 5 мМ MgCl, 5 мМ MnCl, 3 мкМ NaVO, 1,25 М DTT (дитиотреитол) (1000×) и 20 мкМ АТР (аденозинтрифосфат) при 25°C в течение 45 минут. Киназную активность Her-2 определяли путем использования способа флуоресценции с разрешением по времени.
Активность соединений по настоящему изобретению:
50
Биологическую активность соединений по настоящему изобретению тестировали путем использования вышеописанного анализа. Значения IC рассчитывали и представили в следующей таблице:
Пример №
IC<sub>50</sub> (Her-2/SK-BR-3) (мкМ)
1f
0,065
1
0,053
2
0,028
3
0,071
7
0,064
8
0,053
9
0,046
Заключение: малеат и другие соли, и свободное основание соединений формулы (I) обладали очевидной активностью в отношении ингибирования киназной активности Her-2.
Анализ растворимости
В соответствии с обычным измерением растворимости, растворимость соединения формулы (I) и его солей определяли в трех различных системах: вода, физиологический раствор и метанол. Результаты представлены в таблице 1:
Таблица 1
Пример
Величина растворимости (мг/мл)
Физиологический раствор
0,1М соляная кислота
Вода
Пример 1f
0,0026
1,43
0,008
Пример 1
0,19
23,33
12,49
Пример 2
0,36
54,88
1,52
Пример 3
0,08
12,65
17,25
Пример 7
0,10
31,93
5,39
Пример 8
3,32
32,4
22,41
Пример 9
0,2
16,59
0,15
Заключение: По сравнению со свободным основанием и другими солями соединения формулы (I) растворимость малеата соединения формулы (I) была значимо лучше.
Фармакокинетический анализ
Пример теста 1
Фармакокинетический анализ соединений по настоящему изобретению
1. Задача теста
В качестве тестируемых животных использовали крыс. Соединение формулы (I) и другие его соли вводили внутрижелудочно, малеат соединения формулы (I) инъецировали в хвостовую вену для определения концентрации лекарства в плазме крови в различные моменты времени при помощи способа LC/MS/MS (жидкостная хроматография/тандемная масс-спектрометрия). Фармакокинетическое поведение, характеристики и абсолютная биодоступность при пероральном введении соединений по настоящему изобретению исследовали и оценивали у крыс.
2. Протокол
2.1 Тестируемые образцы
Соединение 1f в качестве примера, соединения 1, 2, 4, 5, 6, 7 и 9 в качестве примера.
2.2 Тестируемые животные
28 здоровых взрослых крыс SD, самцы и самки поровну, приобретены в SINO-BRITSH SIPPR/BK LAB. ANIMAL LTD., CO, Номер лицензии: SCXK (Shanghai) 2008-0016 и разделены на 7 групп (по 4 крысы в каждой группе).
2.3 Оборудование
Тройной квадрупольный масс-спектрометр TSQ Quantum Ultra AM triple, Thermo Finnigan (US);
Система высокоэффективной жидкостной хроматографии Agilent 1200, Agilent (US).
2.4 Приготовление тестируемых соединений
Группа для внутривенной инъекции: подходящее количество соединений взвешивали, растворяли в DMSO (диметилсульфооксид) и разбавляли нормальным физиологическим раствором до конечного объема. Концентрация образца составляла 2,5 мг/мл.
Группа для внутрижелудочного введения: подходящее количество соединений взвешивали и добавляли в 0,5% CMC-Na с получением суспензии 2,5 мг/мл.
2.5 Введение
32 здоровые взрослые крысы SD, самцы и самки поровну, разделили на 7 групп (по 4 крысы в каждой группе). После ночного поста соединение 1f в качестве примера, соединение 1, 2, 4, 5, 6, 7 и 9 в качестве примера в дозе 25 мг/кг (рассчитанной по основной части) и объеме 10 мл/кг вводили внутрижелудочно или инъецировали в хвостовую вену.
2.6 Отбор образцов
В группе с внутривенной инъекцией образцы крови (0,2 мл) отбирали из орбитального синуса перед введением и через 2 мин, 15 мин, 30 мин, 1,0 ч, 2,0 ч, 4,0 ч, 6,0 ч, 8,0 ч, 12,0 ч, 24,0 ч и 36,0 ч после введения, хранили в гепаринизированных пробирках и центрифугировали в течение 10 минут при 3500 об./мин для отделения плазмы крови. Образцы плазмы крови хранили при -20°C.
В группе с внутрижелудочным введением образцы крови отбирали перед введением и через 0,5, 1,0, 2,0, 3,0, 4,0, 6,0, 8,0, 12,0, 24,0 и 36,0 часов после введения. Способ обработки образцов был таким же, как для группы с внутривенной инъекцией. Крыс кормили через 2 часа после введения.
3. Способ
50 мкл плазмы крови крысы добавляли в 50 мкл серии стандартных растворов соответственно с получением концентрации в плазме крови 50,0, 100, 200, 500, 1000, 2000 и 5000 нг/мл, затем образцы плазмы крови в различных концентрациях смешивали с 50 мкл метанола в течение 3 мин путем использования вортекса, и смесь центрифугировали в течение 10 минут (13500 об./мин). 10 мкл супернатанта анализировали при помощи LC-MS/MS (жидкостной хроматографии/тандемной масс-спектрометрии).
2.9 Расчет фармакокинетических параметров
4. Результаты фармакокинетических параметров
Фармакокинетические параметры соединений по настоящему изобретению представлены на таблице 2.
Таблица 2
Соединение
F (%)
C<sub>max</sub> (мкг/мл)
AUC<sub>0-t</sub> (мкг·ч/мл)
t<sub>1/2</sub> (ч)
MRT (ч)
CL/F (мл/мин/кг)
Vz/F (1/кг)
Пример 1f
42,2
Желудочный зонд 6,47±1,81
52,81±23,59
3,4±0,45
7,66±0,75
0,53±0,18
2,6±0,94
Вена
125,4±38,95
5,25±2,01
4,22±0,71
0,21±0,07
1,72±1,1
Пример 1
47,1
Желудочный зонд 8,99±4,87
104,58±56,54
4,4±1,3
8,93±1,39
0,31±0,16
1,91±1,24
Вена
221,86±76,99
4,92±0,6
5,5±0,99
0,12±0,043
0,89±0,39
Пример 2
48,3
Желудочный зонд 10,19±4,41
116,48±67,23
4,45±1,63
8,03±0,99
0,29±0,19
1,84±1,19
Вена
241,16±92,12
3,74±1,20
2,96±0,47
0,48±0,2
2,84±1,88
Пример 4
63,2
Желудочный зонд 6,92±1,82
92,27±36,97
3,67±0,83
8,4±0,65
0,32±0,16
1,6±0,54
Вена
145,75±40,35
3,77±0,22
5,46±0,48
0,18±0,04
0,99±0,26
Пример 5
72,1
Желудочный зонд 7,88±2,51
81,53±40,46
3,46±0,56
7,95±0,61
0,38±0,19
1,81±0,84
Вена
112,84±62,1
3,12±0,37
4,2±0,99
0,3±0,22
1,33±0,88
Пример 6
50,5
Желудочный зонд 6,27±1,58
81,72±22,16
4,15±0,09
8,59±0,22
0,32±0,09
1,95±0,57
Вена
162,28±55,65
5,27±0,29
4,94±0,58
0,17±0,04
1,25±0,31
Пример 7
39,2
Желудочный зонд 5,16±1,64
44,34±16,01
3,52±0,69
7,9±0,74
0,63±0,27
3,23±1,65
Вена
112,84±62,1
3,12±0,37
4,2±0,99
0,3±0,22
1,33±0,88
Пример 9
57,6
Желудочный зонд 5,87±1,61
66,12±17,17
3,47±0,18
7,96±0,7
0,4±0,12
1,99±0,49
Вена
115,15±33,0 6
4,75±0,32
5,54±0,58
0,23±0,06
1,58±0,46
Заключение: По сравнению со свободным основанием и другими солями соединений формулы (I) малеат соединения формулы (I) значимо улучшает фармакокинетические характеристики и биодоступность и обладает очевидным фармакокинетическим преимуществом.
Для того чтобы продемонстрировать лучшую активность соединений по изобретению по сравнению с известными из уровня техники, Заявитель дополнительно осуществил сравнительные испытания соединений по изобретению и соединений, раскрытых в документе уровня техники CN 101824029. Приведенный ниже сравнительный эксперимент показывает, что хиральное соединение согласно настоящему изобретению (Пример 1f) и его соли имеют более сильный эффект, нежели рацемическое вещество, раскрытое в CN 101824029.
Для соединения согласно CN 101824029 и соединений согласно настоящему изобретению был проведен сравнительный анализ активности в отношении киназы EGFR in vitro и активности в отношении киназы HER-2 in vitro. Полученные результаты показаны ниже.
Как показано в таблице выше:
50
EGFR(BIO): Значения IC для солей согласно изобретению находятся в интервале 0,009-0,035 мкМ; для соединения 1f (R-изомер) это значение составляет 0,013 мкМ; в то время как для рацемата в CN 101824029 оно составляет 0,22 мкМ; то есть, активность указанных солей в 7-25 раз выше, чем активность соединения согласно CN 101824029, и активность соединения 1f в 17 раз выше активности соединения согласно CN 101824029;
50
HER2(BIO): Значения IC указанных солей находятся в интервале 0,045-0,078 мкМ; для соединения 1f (R-изомер) это значение составляет 0,097 мкМ; для рацемата согласно CN 101824029 оно составляет 0,19 мкМ; то есть, активность указанных солей в 2,4-4 раза выше, чем соединения согласно CN 101824029, и активность соединения 1f в 2 раза выше активности соединения согласно CN 101824029.
Таким образом, активность стереоизомерного соединения 1f и его солей согласно настоящему изобретению значительно выше по сравнению с активностью рацемического соединения согласно CN 101824029.