Денситометрическое определение некоторых лекарственных веществ в крови

УДК 340.67:615.214.2.099.074:543.544 © А.В. Воронин, 2018

А.В. Воронин ДЕНСИТОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ НЕКОТОРЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ВЕЩЕСТВ В КРОВИ

ФГБОУ ВО «Самарский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Самара

Цель исследования - разработка методики количественного определения ряда лекарственных веществ в крови методом тонкослойной хроматографии с компьютерной денситометрией. Объектом исследования были модельные образцы крови, содержащие морфин, кодеин, верапамил, баклофен, доксиламин, амитриптилин. Определены параметры идентификации веществ методом тонкослойной хроматографии, исследованы интерференционные эффекты. Пределы обнаружения в образцах крови составили для морфина, кодеина, амитриптилина 600,0 нг/мл (5,0 мкг в пробе), для верапамила, доксиламина - 150,0 нг/мл (1,0 мкг в пробе), для баклофена - 75,0 нг/мл (0,5 мкг в пробе). Для количественного определения использовали сканирование хроматограмм, обработку изображения и построение градуировочной зависимости в компьютерной программе. Градуировочные зависимости описываются уравнениями полиномиальной (квадратичной) регрессии. Пределы количественного определения для разных веществ составили от 300,0 до 1500,0 нг/мл; правильность и сходимость в сериях параллельных определений не превышают 25%.

Таким образом, разработана методика анализа лекарственных веществ в крови методом тонкослойной хроматографии с компьютерной денситометрией. Рабочие диапазоны методики позволяют использовать ее в судебно-химической экспертизе и клиническом химико-токсикологическом анализе.

Ключевые слова: лекарственные вещества, тонкослойная хроматография, компьютерная денситометрия, количественное определение.

A.V. Voronin THE DENSITOMETRIC QUANTITATION OF SOME DRUGS IN WHOLE BLOOD

The study objective was the development of quantitation technique for some drugs in whole blood using thin-layer chromatography with videodensitometry. The study subject was model samples of whole blood containing morphine, codeine, verapamil, baclofen, doxylamine, amitriptyline. The identification parameters of drugs by thin-layer chromatography were defined, interferences of blood matrix and other drugs were studied. Limits of detection in blood samples were 600,0 ng/ml (5,0 ^g/spot) for morphine, codeine, amitriptyline, 150,0 ng/ml (1,0 ^g/spot) for verapamil, doxylamine, 75,0 ng/ml (0,5 ^g/spot) for baclofen. For drug quantita-tion the chromatograms were scanned, images were processed and calibration models were designed using videodensitometry computer program. The calibration model is described by polynomial (square) regression. The limits of quantitation for different drugs were from 300,0 to 1500,0 ng/ml; accuracy and precision does not exceed 25%.

Thus, a quantitation technique for analysis of some drugs in whole blood by thin-layer chromatography with videodensitometry was developed. The ranges of quantitation allow using this technique for forensic chemistry and clinical analytical toxicology.

Key words: drugs, thin-layer chromatography, videodensitometry, quantitation.

В практике судебно-химической экспертизы и химико-токсикологического анализа актуальной задачей является получение информации о наличии токсикологически важных веществ в биологических жидкостях на этапе скрининга. Метод тонкослойной хроматографии (ТСХ) является экспрессным, высокопроизводительным и достаточно селективным. Введение в процедуру ТСХ-анализа денситометрии дает аналитику возможность количественного определения и документирования результатов [1]. Также следует отметить преимущество ТСХ перед колоночными вариантами хроматографиче-ского анализа - высокая производительность и отсутствие ложноположительных результатов, связанных с переносом анализируемых веществ из одной пробы в другую в хромато-графической системе [2].

Цель исследования - разработка методики количественного определения ряда лекарственных веществ в крови методом тонкослойной хроматографии с компьютерной ден-ситометрией.

Материал и методы

В работе использовали стандартные образцы следующих веществ: морфин (в форме сульфата), кодеин, верапамил (в форме гидрохлорида), баклофен, доксиламин (в форме сукцината), амитриптилин (в форме гидрохлорида) (LGC Standards, Великобритания).

Модельные образцы крови готовили путем добавления к образцам крови, не содержащим наркотических средств, психотропных и лекарственных веществ, расчетного количества стандартных образцов вышеуказанных веществ (в виде метанольных растворов в концентрации 10,0 мкг/мл в пересчете на соответствующее основание). Диапазоны концентраций лекарственных веществ в пробах крови составляли: морфин, кодеин, амит-риптилин - 500,0-10000,0 нг/мл; верапамил, доксиламин - 100,0-5000,0 нг/мл; баклофен -50,0-2000,0 нг/мл.

Пробоподготовку образцов крови осуществляли жидкость-жидкостной экстракцией. Объем пробы крови составлял 10 мл; условия экстракции были следующими: для

морфина, кодеина - смесь хлороформ-изопропанол (9:1) при рН 8-9; для баклофена -хлороформ-н-бутанол (6:4) при рН 4; для остальных лекарственных веществ - хлороформ при рН 9-11. Полученные экстракты упаривали до сухого остатка в токе теплого воздуха при температуре не более 40°С. Сухой остаток растворяли в 50 мкл смеси хлороформ - этанол (1:1).

Условия хроматографического разделения были следующими:пробу объемом 50 мкл наносили микрошприцем на пластины для ТСХ «Сорбфил-ПТСХ-П-А-УФ» размером 10^15 см в виде полосы толщиной не более 1 мм и шириной не более 0,5 см, при нанесении зону первичной адсорбции высушивалии теплым воздухом.

В качестве систем растворителей (подвижных фаз) использовали: для морфина, кодеина, верапамила, доксиламина, амит-риптилина - этилацетат-метанол-аммиак 25% (ЭМА) (17:2:1), толуол-ацетон-этанол-аммиак 25% (ТАЭА) (45:45:7:3); для верапамила, баклофена - метанол-аммиак 25% (100:1,5) (МА); для баклофена - дихлорметан-этанол-аммиак 25% (67,5:30:2,5) (ДЭА). Насыщение камеры парами растворителей проводили в течение 30 мин.

Детектирование хроматограмм проводили реактивом Драгендорфа для морфина, коде-

Для определения предела обнаружения исследуемых веществ были проанализированы модельные образцы крови в следующих диапазонах концентраций: для морфина, кодеина, верапамила, доксиламина, амитрипти-лина - 100,0-5000,0 нг/мл; для баклофена -50,0-2000,0 нг/мл.

Для пробоподготовки использовали образцы крови объемом 10 мл, а объем пробы, наносимой на хроматографическую пластину,

ина, верапамила, доксиламина, амитриптилина - реактивом Марки, для морфина, кодеина -раствором нингидрина в ацетоне 0,05%, а также в УФ-свете, при длине волны 254 нм (морфин, кодеин, верапамил, доксиламин, амит-риптилин) и при 365 нм (доксиламин).

Полученные хроматограммы фиксировали путем сканирования с оптическим разрешением 900 dpi в True Color-режиме на планшетном сканере, сохраняли в виде файлов с расширением jpeg и обрабатывали с использованием программы «ТСХ-менеджер 4.0» [3, 4].

Определение пределов обнаружения и диапазона определяемых концентраций, интерференционных эффектов, правильности и прецизионности проводили в соответствии рекомендациями «Руководства по валидации аналитических методик, используемых в су-дебно-химическом и химико-

токсикологическом анализе биологического материала» [5].

Результаты и обсуждение

В табл. 1 приведены параметры методики идентификации исследуемых лекарственных веществ в модельных образцах крови. Были использованы подвижные фазы и варианты детектирования анализируемых веществ, наиболее часто используемые в практике су-дебно-химической экспертизы.

составлял 50 мкл. При определении величины предела обнаружения использовали визуальную регистрацию обработанного изображения хроматограммы, для обработки изображения применяли программные средства «ТСХ-менеджер 4.0» - просмотр хроматограммы в негативе и увеличение контрастности. Наименьшие величины предела обнаружения обеспечивали детектирование в УФ-свете, проявление хроматограмм реактивом Драген-

Таблица 1

Параметры методики идентификации лекарственных веществ в крови

Анализируемое вещество Подвижная фаза Rf Детектирование Предел обнаружения

C, нг/мл m, мкг/проба

Морфин ЭМА 0,31±0,07 Реактив Драгендорфа УФ-свет 254 нм 600,0 5,0*

ТАЭА 0,28±0,05 Реактив Марки 1200,0 10,0

Кодеин ЭМА 0,41±0,05 Реактив Драгендорфа УФ-свет 254 нм 600,0 5,0*

ТАЭА 0,33±0,04 Реактив Марки 1200,0 10,0

Верапамил ЭМА 0,73±0,04 Реактив Драгендорфа УФ-свет 254 нм 150,0 1,0*

МА 0,75±0,03 150,0 1,0*

Баклофен МА 0,70±0,04 Раствор нингидрина в ацетоне 0,05% 75,0 0,5

ДЭА 0,30±0,03 75,0 0,5*

Доксиламин ЭМА 0,69±0,05 Реактив Драгендорфа УФ-свет 254 нм 150,0 1,0*

ТАЭА 0,60±0,03 Реактив Драгендорфа УФ-свет 365 нм 750,0 5,0

Амитриптилин ЭМА 0,71±0,05 Реактив Драгендорфа УФ-свет 254 нм 600,0 5,0

ТАЭА 0,60±0,04 600,0 5,0*

* Варианты анализа, выбранные для количественного определения.

дорфа и раствором нингидрина в ацетоне 0,05% (для баклофена).

Пределы обнаружения методом ТСХ с денситометрической регистрацией составили: для морфина, кодеина, амитриптилина - 600,0 нг/мл (5,0 мкг в пробе), для верапамила, док-силамина - 150,0 нг/мл (1,0 мкг в пробе), для баклофена - 75,0 нг/мл (0,5 мкг в пробе).

Влияние балластных веществ крови на результаты анализа учитывали путем исследования «холостых» проб крови в условиях, приведенных в табл. 1. При этом хроматогра-фических зон в диапазоне значений 0,3-0,8 на пластинках не детектировали.

Интерференционные эффекты оценивались на двух группах модельных образцов

крови: первая группа содержала морфин (1000,0 нг/мл), кодеин (1000,0 нг/мл), верапа-мил (200,0 нг/мл), доксиламин (200,0 нг/мл), амитриптилин (1000,0 нг/мл), вторая - бакло-фен (100,0 нг/мл), верапамил (200,0 нг/мл).

Полное разделение (разрешение ^ более 1,5) наблюдалось для хроматографических зон морфина, кодеина с зонами доксиламина, амит-риптилина, верапамила (табл. 2). Для пар анализируемых веществ, имеющих показатель менее 1,5, при совместном присутствии в пробе количественное определение невозможно.

Исследование на баклофен проводится с использованием подвижной фазы ДЭА, поэтому вышеперечисленные вещества не мешают его определению в крови.

Результаты разделения образцов крови, содержащих комбинации лекарственных веществ

Таблица 2

Анализируемое вещество | | Зоны | Из Анализируемое вещество | | Зоны | Из

Подвижная фаза - ЭМА Подвижная фаза - ТАЭА

Морфин 0,31 1-2 0,89 Морфин 0,28 1-2 0,35

Кодеин 0,41 2-3 4,23 Кодеин 0,33 2-3 3,89

Доксиламин 0,69 3-4 0,15 Доксиламин 0,60 3-4 0,0

Амитриптилин 0,71 4-5 0,17 Амитриптилин 0,60

Верапамил 0,73

Определение характера зависимости аналитического сигнала - площади хроматографи-ческой зоны от концентрации определяемых веществ - показало, что при количестве морфина, амитриптилина свыше 10,0 мкг в пробе, ве-рапамила, доксиламина свыше 5,0 мкг в пробе и баклофена свыше 1,5 мкг в пробе наблюдается отклонение от линейной зависимости.

Диапазоны определяемых концентраций в крови для морфина, кодеина и амитриптилина соответствуют летальной концентрации, для верапамила и доксиламина - токсической и летальной концентрациям, для баклофена - терапевтической и токсической концентрациям. Это обусловливает возможность применения предложенной методики для решения задач судеб-но-химической экспертизы, а также клинического химико-токсикологического анализа.

Для оценки правильности и прецизионности (сходимости) методики анализировали образцы крови с известными количествами лекарственных веществ трех уровней концен-

Для изучаемых лекарственных веществ были определены градуировочные зависимости, которые описываются уравнениями полиномиальной (квадратичной) регрессии, а также диапазоны концентраций в крови, в которых возможно проводить количественное определение (рабочие диапазоны методики) методом денситометрии (табл. 3).

траций в пределах рабочего диапазона методики. Определяли сходимость результатов измерений (относительное стандартное отклонение), полученных в 5 разных аналитических циклах - параллельных определений в разные дни (табл. 4).

Относительные погрешности определения морфина, кодеина, верапамила и амит-риптилина в крови, используемые для оценки правильности методики, для всех уровней концентраций не превышали значения ±20,0%. Для верхних уровней концентрации баклофена (800,0 нг/мл) и доксиламина (4000,0 нг/мл) погрешность составляет около ±22,0%.

Таблица 3

Характеристика методики количественного определения лекарственных веществ в крови методом денситометрии

Анализируемое вещество Уравнение градуировочной зависимости Предел количественного определения, нг/мл Диапазон определяемых концентраций, нг/мл

Морфин 0,013-Х2 + 10,3-Х - 730,5 1200,0 1200,0-10000,0

Кодеин 0,021-Х2 + 10,6-Х - 23,8 1400,0 1400,0-10000,0

Верапамил 0,081-Х2 + 36,2-Х - 501,3 300,0 300,0-5000,0

Баклофен 0,014-Х2 + 11,9-Х + 37,6 160,0 160,0-1000,0

Доксиламин 0,010-Х2 + 30,5-Х - 87,2 300,0 300,0-5000,0

Амитриптилин 0,011-Х2 + 10,5-Х + 39,3 1500,0 1500,0-10000,0

Таблица 4

Результаты оценки правильности и прецизионности методики количественного денситометрического определения лекарственных веществ в крови

Анализируемое вещество

Уровни концентраций в образцах крови, нг/мл

Правильность, %

Сходимость между сериями параллельных определений, %

Морфин

Нижний 2000,0 Средний 4000,0 Высокий 8000,0

16,8 14,3 19,6

17,1 7,4 4,1

Кодеин

Нижний 2000,0 Средний 4000,0 Высокий 8000,0

16,2 14,7 16,5

22,7 9,8 5,4

Верапамил

Нижний 500,0 Средний 2000,0 Высокий 4000,0

16,4 14,8 20,2

24,3 10,5 5,8

Баклофен

Нижний 200,0 Средний 400,0 Высокий 800,0

24,8 20,6 22,3

21,8 9,4 5,2

Доксиламин

Нижний 500,0 Средний 2000,0 Высокий 4000,0

19,8 18,0 22,1

22,6 9,9 5,5

Амитриптилин

Нижний 2000,0 Средний 4000,0 Высокий 8000,0

18,8 15,7 20,4

20,1

8.7

4.8

Максимальное значение относительной погрешности определения определялось для баклофена на нижнем уровне концентрации 200,0 нг/мл и составило ±24,8%

Сходимость результатов определений всех анализируемых лекарственных веществ на нижнем уровне концентраций была в диапазоне 17,0-24,0%, на верхнем уровне концентраций - 4,0-6,0%.

Заключение

Разработана методика количественного определения лекарственных веществ - морфина, кодеина, верапамила, баклофена, док-

силамина, амитриптилина - в крови методом тонкослойной хроматографии с использованием компьютерной денситометрии. Сканирование хроматограмм и использование специальной программы позволили количественно оценить содержание лекарственных веществ в пробах крови.

Данная методика характеризуется показателями правильности и прецизионности, не превышающими значения ±25,0%, и может быть рекомендована для применения в судеб-но-химической экспертизе и экспресс-диагностике острых отравлений.

Сведения об авторе статьи:

Воронин Александр Васильевич - к.фарм.н., доцент, зав. кафедрой химии фармацевтического факультета ФГБОУ ВО СамГМУ Минздрава России. Адрес: 443099, г. Самара, ул. Чапаевская, 89. Тел./факс: 8(846)332-29-07. E-mail: dim-mu2000@mail.ru.

ЛИТЕРАТУРА

1. Кормишин В.А. Денситометрическое определение некоторых накротических средств и психотропных веществ в химико-токсикологических исследованиях: автореф. дис. ... канд. фарм.наук. - Самара, 2014. - 24 с.

2. Объедкова Е.В. Разработка схемы определения стероидных гормонов и нестероидных противовоспалительных препаратов в биологических жидкостях методом ВЭТСХ: дис. ... канд. хим. наук. - СПб., 2014. - 180 с.

3. Ренкевич, А.Ю. Разработка и валидация методики количественного определения 4-аминобутановой кислоты в таблетках алендроната натрия методом мицеллярной тонкослойной хроматографии / А.Ю. Ренкевич, А.Ю. Куликов // Методы и объекты химического анализа. - 2013. - Т.8, № 4. - С.199-206.

4. Разработка и валидация методики количественного определения таблеток 11-дезоксимизопростола/ А.Г. Ялкаев [и др.] // Медицинский альманах. - 2017. - Т. 48, №> 3. - С. 198-202.

5. Методические рекомендации по валидации аналитических методик, используемых в судебно-химическом и химико-токсикологическом анализе биологического материала. - М., 2014. - 76 с.

REFERENCES

1. Kormishin VA. Densitometricheskoe opredelenie nekotoryh nakroticheskih sredstv i psihotropnyh veshhestv v himiko-toksikologicheskih issledovanijah (Densitometric determination of some narcotic drugs and psychotropic substances in chemical-toxicological studies): avtoref. dis. ... kand. farm.nauk, Samara, 2014, 24 p. (In Russ.).

2. Ob"edkova EV. Razrabotka shemy opredelenija steroidnyh gormonov i nesteroidnyh protivovospalitel'nyh preparatov v biologicheskih zhidkostjah metodom VJeTSH (Development of a regimen for determining steroid hormones and non-steroidal anti-inflammatory drugs in biological fluids using the HETC method): dis. ... kand. him.nauk, SPb., 2014, 180 p. (In Russ.).

3. Renkevich A.Yu., Kulikov A.Yu. Development and validation 4-aminobutyric acid assay in alendronate sodium tablets using micellar thin-layer chromatography. Methods and Objects of Chemical Analysis. 2013;8(4):199-206. (In Russ.).

4. Yalkaev A.G., Kildiyarov F.Kn., Kataev V.A. [et al.] Development and validation of the procedure for the quantification of tablets of 11-deoxyimipoprostol. Medical almanac. 2017; 48(3):198-202. (In Russ.).

6. Metodicheskie rekomendacii po validacii analiticheskih metodik, ispol'zuemyh v sudebno-himicheskom i himiko-toksikologicheskom analize biologicheskogo materiala (Methodical recommendations on the validation of analytical techniques used in forensic and chemical toxicological analysis of biological material). Moscow, 2014, 76 p. (In Russ.).