ВАКЦИННАЯ КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ МУТАНТНЫЙ ЧЕЛОВЕЧЕСКИЙ ИНТЕРЛЕЙКИН-15
VACCINE COMPOSITION CONTAINING MUTANT HUMAN INTERLEUKIN-15

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, иммунологии и фармацевтической промышленности, в частности к активной иммунизации с использованием полипептидов, содержащих мутантный интерлейкин-15 (IL-15), для лечения заболеваний, связанных с суперэкспрессией IL-15.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Цитокин, известный как IL-15, представляет собой 14-15 кДа гликопротеин, который одновременно был описан двумя группами как фактор роста, активирующий Т-клетки (Grabstein KH., et al. Science 1994; 264: 965-8; Burton, JD., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994; 91: 4935-9). мРНК IL-15 широко экспрессируется в клетках и тканях, однако из-за сильного посттранскрипционного контроля экспрессии этого белка на уровне трансляции и внутриклеточного транспорта его трудно найти в этих клетках или клеточном супернатанте (Bamford RN., et al. J. Immunol. 1998; 160: 4418-26; Kurys G., et al. J Biol Chem. 2000; 275: 30653-9).
-11
Биологические эффекты IL-15 опосредуются через его связывание с рецептором клеточной мембраны, состоящим из трех субъединиц: α, β и γ. IL-15Rα является специфической высокоаффинной (Kd 10) субъединицей, которая связывается с IL-15, β-субъединица также связывается с IL-2, а γ-субъединица является общим рецептором для нескольких цитокинов, таких как: IL-2; IL-4; IL-7; IL-9; IL-15; IL-21 (Bamford RN., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994; 91: 4935-9; Giri JG., et al. EMBO J. 1995; 14: 3654-63).
IL-15 является иммуностимулирующим цитокином, который способствует пролиферации и функциональной активности T, B и NK-клеток (Giri JG., Et al. EMBO J. 1994; 13: 2822-30), активирует нейтрофилы и модифицирует секрецию монокинов (Girard D., et al. Blood 1996; 88: 3176-84; Alleva DG., et al. J. Immunol. 1997; 159: 2941-51). Кроме того, этот цитокин индуцирует пролиферацию NK-клеток, CD56, и действует вместе с IL-12, индуцируя IFN-γ и фактор некроза опухоли (TNF)-α (Ross ME. and Caligiuri MA. Blood 1997; 89: 910-8; Fehniger TA., et al. Transplant Proc. 1999; 31: 1476-8).
Была найдена связь между нерегулируемой экспрессией или суперэкспрессией IL-15 и развитием нескольких заболеваний, включая болезнь Крона (Kirman I. and Nielsen OH. Am. J. Gastroenterol. 1996; 91(9): 1789-94), псориаз (Rückert R., et al., J. Immunol. 2000; 165: 2240-50), лейкоз (Yamada Y., et al. Blood 1998; 91: 4265-72; Yamada Y. and Kamihira S. Leuk Lymphoma 1999; 35(1-2):37-45) и ревматоидный артрит (РА) (McInnes IB. Immunology Today 1998; 19: 75-9).
В проведенных раннее исследованиях было выдвинуто предположение, что IL-15 предшествует TNF-α в цитокиновом каскаде, выступая в качестве важного фактора миграции Т-клеток в синовиальную жидкость (FFeldmann M., et al. Annu Rev Immunol. 1996; 14: 397-440; McInnes IB., et al. Nat Med. 1997; 3: 189-95). Кроме того, согласно сообщению Ziolkowska et al., IL-15 индуцирует экспрессию IL-17 в суставах у пациентов с РА и стимулирует высвобождение синовиоцитами нескольких медиаторов воспаления, таких как IL-6, IL-8, GM-CSF, и простагландина E2; что позволяет предположить важную роль IL-15 в патогенезе РА (Ziolkowska M., et al. J. Immunol. 2000; 164: 2832-8).
На моделях животных была показана эффективность использования молекул-антагонистов IL-15. Ruchatz et al. создали растворимый фрагмент из альфа-субъединицы мышиного рецептора (IL-15Rα) и продемонстрировали, что этот фрагмент ингибирует индуцированный коллагеном артрит у мышей DBA/1 (Ruchatz H., et al. J. Immunol. 1998; 160: 5654-60).
Были запатентованы и другие молекулы-антагонисты IL-15, включая мутанты IL-15 по одному или более аминокислотным остаткам и моноклональные антитела к зрелому IL-15, которые блокировали сигнальную трансдукцию через его рецептор (патенты №№ US6001973, US6177079, US6168783, US6013480). Несмотря на описание их применения в вышеупомянутых патентных документах, в литературе описано мало исследований, подтверждающих их эффективность.
В мае 2002 года компания Genmab объявила о проведении фаз I и II клинических исследований анти-IL-15 антитела (HuMax-IL-15) (патент № US6177079). Хотя лечение оказалось хорошо переносимым, результаты исследования на фазе II с участием 110 пациентов, страдающих РА, не показали какой-либо значимой эффективности (Baslund B., et al. Arthritis & Rheumatism. 2005; 52:2686-92). Другие исследования проводили, используя химерный белок, состоящий из мутанта IL-15 и фрагмента Fc иммуноглобулина, который связывается с клетками, экспрессирующими рецептор IL-15. Было показано, что этот слитый белок, названный CRB-15, эффективен в мышиной модели артрита, вызванного коллагеном, причем CRB-15 снижал частоту и тяжесть заболевания и предотвращал прогрессирование артрита после установления диагноза (Ferrari-Lacraz S., et al. J Immunol. 2004; 173(9):5818-26).
Escherichia coli
В 2003 году Santos et al. предложили способ вакцинации, включающий активную иммунизацию с использованием IL-15, полученного из  (публикация международной заявки на патент № WO 2004/032956). Однако белок, полученный в этом хозяине, оказался биологически активным, поскольку он способствовал пролиферации CTLL-2, IL-2/IL-15-зависимой клеточной линии (Santos-Savio A., et al. Biotecnol. Apl. 2000; 17:221-4). Это элемент является недостатком, учитывая тот факт, что небольшие количества иммуногена, которые высвобождаются и попадают в кровоток, вызывают нежелательный ответ. Известно, что этот цитокин в физиологических условиях является фактором роста Т-клеток памяти (Kanai T., et al. J Immunol. 1996; 157(8):3681-7; Kanegane H. and Tosato G. Blood 1996; 88(1):230-5). Воспалительный процесс при РА характеризуется активацией и рекрутированием Т-клеток в синовиальную жидкость (Wilkinson PC. and Liew FY. Exp Med. 1995; 181: 1255-9), поэтому иммунизация активной молекулой IL-15 может способствовать развитию заболевания.
Вопрос получения вакцин для активной иммунотерапии при заболеваниях, связанных с суперэкспрессией IL-15, которые имели бы терапевтические преимущества по сравнению с современными методами лечения, направленными на лечение этого типа заболеваний, по-прежнему остается актуальным.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение решает вышеупомянутую проблему путем получения вакцинной композиции, отличающейся тем, что она содержит полипептид, который содержит мутантный человеческий IL-15, определенный как SEQ ID No. 1, по меньшей мере один вакцинный адъювант и фармацевтически приемлемые эксципиенты или носители.
Ген IL-15 выделяли из активированных липополисахаридами (ЛПС) моноцитов и амплифицировали с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием олигонуклеотидов, специфичных для введения мутации в последовательность IL-15. В частности, Asp 8 и Gln 108 заменяли на Ser. Мутированный полипептид получали с модификациями в упомянутых выше аминокислотных остатках, далее называемый IL-15Mut, с чистотой более 95%.
В одном из вариантов осуществления изобретения вакцинная композиция содержит полипептид, содержащий идентифицированный мутантный IL-15 (IL-15Mut) с SEQ ID No. 1, который получали методом рекомбинантной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК). Для получения этой молекулы можно использовать хозяев, известных специалистам в данной области, таких как бактерии, дрожжи, клетки млекопитающих и т.д.
E.coli
В одном из вариантов осуществления изобретения полипептид IL-15Mut получали из , поэтому он не был гликозилированным, в отличие от аутологичного белка, присутствующего в организме человека. Этот мутированный цитокин не является биологически активным в анализе пролиферации клеток CTLL-2, поскольку он не способен индуцировать рост этих клеток, зависимых от IL-15. В клетках CTLL-2 IL-15Mut конкурирует с нативным IL-15 за связывание с рецептором, но не индуцирует передачу сигналов, будучи мутированным по аминокислотам Asp 8 и Gln 108, которые являются ключевыми остатками для взаимодействия с субъединицами β и γ рецептора. Это является преимуществом по сравнению с методом, предложенным Santos et al. (публикация международной заявки на патент № WO 2004/032956), заключающимся в более низкой частоте возникновения нежелательных явлений, вызываемых провоспалительной активностью этого цитокина у получающих лечение пациентов.
В одном из аспектов настоящего изобретения полипептид, содержащий мутантный IL-15, определенный как SEQ ID No. 1, ходящий в состав вакцинной композиции, представляет собой слитый полипептид. В конкретном варианте осуществления слитый полипептид, содержащий мутантный IL-15, определенный как SEQ ID No. 1, также содержит T-эпитопы, при концентрации белка 200 мкг.
В настоящем изобретении методом рекомбинантной ДНК был сконструирован мутантный IL-15, который соответствует SEQ ID No. 1, структурно отличающийся от природных цитокинов локализацией дисульфидных мостиков. Эта особенность позволяет получить иммунный ответ путем воздействия на маскированные или иммунодоминантные эпитопы.
Chlorocebus sabaeus
E.coli
ТМ
Для демонстрации концепции, предложенной в настоящем изобретении, использовали приматов, не являющиеся человеком (), исходя из того факта, что аминокислотная последовательность IL-15 у этого вида максимально гомологична таковой у человека (~97% идентичности) (Grabstein KH., et al. Science 1994; 264 (5161): 965-8). Было продемонстрировано, что активная иммунизация таких приматов вакцинной композицией, содержащей полипептид IL-15Mut, определенный как SEQ ID No. 1, с использованием гидроксида алюминия (альтернативно называемого Alumina) и масляного адъюванта Montanide ISA-51, приводит к образованию антител, которые ингибируют биологическую активность нативного IL-15 в клетках CTLL-2. Эта клеточная линия, используемая в анализах нейтрализации, экспрессирует три субъединицы рецептора IL-15 и является зависимой от пролиферации этого цитокина (Eisenman J., et al. Cytokine 2002; 20 (3):121-9). В этом анализе сыворотка показала зависимое от дозы ингибирование пролиферации. Этот ответ превышал ответ в группе животных, иммунизированных полипептидом, определенным как SEQ ID No. 2 (белок IL-15, полученный у ). Результаты также показали, что иммунизация более высокой дозой (350 мкг) полипептида SEQ ID No. 1 усиливает продуцирование нейтрализующих антител через 15 дней после второй иммунизации. Эта особенность является преимуществом, состоящим в том, что нужный эффект достигается при меньшем количестве введений вакцинной композиции по настоящему изобретению.
Учитывая высокий процент сходства между мутированным полипептидом SEQ ID No. 1 и обезьяньим IL-15, неожиданно было обнаружено, что иммунизация этим мутированным белком вызывает образование нейтрализующих антител к нативному IL-15. Однако настоящее изобретение демонстрирует, что иммунизация мутированным полипептидом, определенным как SEQ ID No. 1, вызывает образование нейтрализующих аутоантитела к аутологичному IL-15. Кроме того, удивительным оказался тот факт, что ответ нейтрализующих антител, образованных в результате введения этого полипептида (SEQ ID No. 1), оказался сильнее ответа, полученного в результате активной иммунизации рекомбинантным IL-15 (SEQ ID No. 2).
Вакцинную композицию по настоящему изобретению можно вводить несколькими способами, известными специалистам в данной области. Количество вакцинного антигена в композиции может варьировать в зависимости от заболевания, подлежащего лечению. В одном из вариантов осуществления изобретения количество антигена (полипептида, содержащего мутантный человеческий IL-15, определенный как SEQ ID No. 1) находится в диапазоне от 200 до 500 мкг на дозу вакцины. В ходе иммунизации пациента могут быть введены повторные дозы, и композиции могут содержать вакцинные адъюванты, хорошо известные в области вакцинации, такие как соли алюминия и эмульсии вода-в-масле, а также другие адъюванты, которые находятся на стадии разработки, для получения в организме пациента необходимых уровней анти-IL-15 антител.
Изобретение также относится к применению полипептида, содержащего мутантный человеческий IL-15, определенный как SEQ ID No. 1, для получения лекарственного средства для активной иммунотерапии заболевания, ассоциированного с суперэкспрессией IL-15. Специалистам в данной области техники хорошо известны заболевания, связанные с аберрантной экспрессией или суперэкспрессией IL-15.
В одном из вариантов осуществления изобретения полипептид, содержащий мутантный человеческий IL-15, определенный как SEQ ID No. 1, используют для получения лекарственного средства для активной иммунотерапии аутоиммунного заболевания, выбранного из группы, состоящей из РА, болезни Крона, язвенного колита и псориаза.
В другом аспекте изобретения указанный полипептид используется для активной иммунотерапии заболевания, ассоциированного с суперэкспрессией IL-15, такого как гематологические злокачественные новообразования. В конкретном варианте осуществления гематологическая неоплазия представляет собой лейкоз или лимфому.
Изобретение также относится к способу лечения заболеваний, ассоциированных с суперэкспрессией IL-15. Этот способ характеризуется введением пациенту терапевтически эффективного количества вакцинной композиции, содержащей полипептид, содержащий мутантный человеческий IL-15, определенный как SEQ ID No. 1. Как указано выше, указанная вакцинная композиция подходит для введения человеку и инициирует образование нейтрализующих антител к аутологичному IL-15.
Способ по изобретению, включающий активную иммунизацию составом, содержащим IL-15Mut (SEQ ID No. 1), подходящим для генерации нейтрализующих анти-IL-15 аутоантител, позволяет нейтрализовать нерегулируемые количества этого цитокина у пациентов, страдающих аутоиммунными заболеваниями и имеющими гематологические злокачественные новообразования. Этот способ является более эффективным по сравнению со способом, предложенным в международной заявке на патент № WO 2004/032956, исходя из того факта, что используемый для активной иммунизации антиген лишен биологической активности.
Способ по изобретению можно использовать для лечения заболеваний, ассоциированных с суперэкспрессией IL-15, включая РА, псориаз и воспалительные заболевания кишечника. В частности, при этих патологиях предпочтительной является выработка антител, нейтрализующих активность IL-15. У пациентов, страдающих этими заболеваниями, способ активной иммунотерапии по изобретению можно сочетать с введением других лекарственных средств, таких как противовоспалительные средства или антагонисты других цитокинов. Эти лекарственные средства включают, например, стероидные лекарственные средства, такие как кортикостероиды, и традиционные противоревматические лекарственные средства, модифицирующие заболевание (например, метотрексат).
Способ по изобретению также можно использовать для лечения таких заболеваний, как гематологические злокачественные новообразования, включая лейкемию и лимфомы. В этом контексте активную иммунотерапию вакцинной композицией по изобретению можно комбинировать с введением пациенту по меньшей мере одного фармацевтически приемлемого цитостатика.
Способ по изобретению является предпочтительным, поскольку уровни антител, генерируемых в организме пациента, являются более стабильными с течением времени, чем уровни, вводимые пассивной иммунизацией. С другой стороны, частота введений вакцинных композиций, содержащих мутантный IL-15, намного ниже, чем при пассивной иммунизации антителами к цитокину (в способе по настоящему изобретению интервал между введениями является более длительным). Кроме того, количество белка на дозу и количество введений, необходимых для вакцинации, ниже, чем количество, необходимое для лечения другими молекулами-антагонистами IL-15, что подразумевает более низкую стоимость продукта и более высокую степень соблюдения режима лечения.
Иммунизация полипептидом, определенным как SEQ ID No. 1, приводит к образованию антитела с более высокой нейтрализующей активностью по сравнению с активностью, наблюдаемой в группе, иммунизированной рекомбинантным белком SEQ ID No. 2. Применение антигена, который не является биологически активным, приводит к снижению частоты появления нежелательных явлений у пациентов, получающих вакцину, содержащую такой антиген.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фиг. 1. Чистота IL-15Mut. Полученный ОФ-ВЭЖХ хроматографический профиль IL-15Mut (A) и рекомбинантного IL-15 (B), полученные в E.coli, которые использовали в качестве антигена для вакцинного препарата.
E.coli
Фиг. 2. Оценка биологической активности IL-15Mut с помощью анализа пролиферации клеток CTLL-2. (A) Пролиферация клеток, индуцированная серийными разведениями нативного IL-15 (R&D), IL-15Mut и рекомбинантного IL-15, полученного в . (B) Кривые клеточной пролиферации в присутствии серийных разведений IL-15Mut и фиксированной концентрации нативного IL-15.
TM
Фиг. 3. Оценка методом ELISA образования анти-IL-15 антител у обезьян, иммунизированных IL-15Mut или IL-15, с использованием в качестве адъюванта гидроксида алюминия (A) или Montanide ISA-51 (B). Графики представляют средние значения титров антител для трех животных в каждой экспериментальной группе, через 15 дней после второй и третьей иммунизации.
Фиг. 4. Оценка нейтрализующей способности отдельных сывороток в клетках CTLL-2 после третьей иммунизации с использованием в качестве адъюванта гидроксида алюминия. (A) группа IL-15, (B) группа IL-15Mut в дозе 200 мкг, (C) группа IL-15Mut в дозе 350 мкг и (D) группа плацебо. Линия, обозначенная как разведение нативного IL-15, представляет наивысший уровень пролиферации клеток, а линия, обозначенная минимумом, указывает на минимальный уровень пролиферации клеток CTLL-2, выращенных в культуральной среде без цитокинов.
ТМ
Фиг. 5. Оценка в клетках CTLL-2 нейтрализующей способности пула сывороток, полученных от животных, иммунизированных IL-15Mut и рекомбинантным IL-15. Показаны нейтрализующие эффекты, наблюдаемые в каждой группе через 15 дней после второй и третьей иммунизаций с использованием в качестве адъюванта гидроксида алюминия (A) или Montanide (B). Линия, обозначенная как разведение нативного IL-15, представляет наивысший уровень пролиферации клеток, а линия, обозначенная минимумом, указывает на минимальный уровень пролиферации клеток CTLL-2, выращенных в культуральной среде без цитокинов.
ПОДРОБНОЕ РАСКРЫТИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ/ПРИМЕРЫ РЕАЛИЗАЦИИ
Пример 1. Получение полипептида IL-15Mut в
E.coli
8
108
E.coli
E.coli
ДНК, кодирующую человеческий IL-15, выделяли из ЛПС-активированных моноцитов и амплифицировали методом ПЦР (температура отжига 60°C в течение 25 циклов) с использованием специфических праймеров для замены Asp и Gln на Ser в последовательности IL-15 (праймер 5´ CAT GCC ATG GCA AAC TGG GTG AATGTA ATA AGT TCT TTG AAA и праймер 3´ C GGGATCCCG TTA AGA AGT GTT GAT GAA CAT AGA GAC AAT). Продукт ПЦР расщепляли Nco I/BamH I (Promega, США) и клонировали в вектор экспрессии . IL-15Mut, полученный в виде телец включения, солюбилизировали 8M мочевиной. Процесс ренатурации выполняли на 1,6×40 см колонке (GE Healthcare Life Sciences, США), заполненной сефадексом G-25 Fine (Pharmacia Biotech, Швеция) и уравновешенной 0,1 М трис-буфером и 0,15 М NaCl; рН 8,0 при скорости потока 7 мл/мин. Собранный образец наносили на 1,6×10 см колонку (GE Healthcare, США), заполненную Q Sepharose Fast Flow (GE Healthcare, США), и использовали линейный градиент элюирования от 0,2 М до 0,5 М NaCl при скорости потока 2 мл/мин. Образец, элюированный 0,5 М NaCl, наносили на колонку С4 (1×25 см, 10 мкм, Vydac, США) со скоростью потока 1,0 мл/мин. Белки разделяли, используя подвижную фазу, содержащую 0,1% трифторуксусную кислоту (TFA) и ацетонитрил с чистотой для ВЭЖХ); использовали следующий градиент: 0-30% в течение 5 мин; 30% в течение 10 мин; 30-40% в течение 5 мин; 40-50% в течение 30 мин; 50-60% в течение 60 мин; 60-80% в течение 5 мин при потоке 2,5 мл/мин. Разделение белков контролировали при 226 нм. Метод Брэдфорда использовали для определения общей концентрации белка в соответствии с инструкциями производителя. Немутантный белок IL-15 также получали методом рекомбинации в , как описано ранее (Santos-Savio A., et al. Biotecnol. Apl. 2000; 17:221-4).
Пример 2. Определение чистоты IL-15Mut методом ОФ-ВЭЖХ.
Modified Lowry Protein Assay Kit)
Образцы, собранные из основного пика в результате очистки методом ОФ-ВЭЖХ, оценивали в отношении их чистоты, которцю выражали в процентах. Концентрацию белка определяли модифицированным методом Лоури, используя набор реагентов «Модифицированный набор для анализа белка методом Лоури» ( (Thermo Scientific, США), в соответствии с инструкциями производителя. Анализ ОФ-ВЭЖХ выполняли, используя 50 мкг белков, очищенных на колонке Chromolith Performance C8 (4,6 × 100 мм, 2 мкм, Merck, США) с градиентом от 0 до 80% AcN/0,1% TFA в течение 15 минут при скорости потока 2,5 мл/мин. Длину волны детектирования устанавливали равной 226 нм. Чистоту определяли с помощью программы Image J v1.32. Полученный IL-15Mut имел чистоту, равную 96%, как показано на фиг.1; тогда как немутантный рекомбинантный IL-15 получали с чистотой 98%.
Пример 3. Оценка биологической активности IL-15Mut в клеточной линии CTLL-2.
3
2
Для оценки биологической активности IL-15Mut выполняли анализ пролиферации в клеточной линии CTLL-2. Биологическую активность измеряли путем стимуляции пролиферации клеток CTLL-2, используя окрашивание митохондрий 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромидом (МТТ, 3-[4,5-диметилтиазол-2]-ил]-2,5-дифенилтетразолия бромид) (Mossman TJ. Immunol. Methods 1983; 65 (1-2):55-63), следуя описанной ниже процедуре. Выполняли двукратные серийные разведения рекомбинантного IL-15, нативного IL-15 (R & D, США) и IL-15Mut (начальная концентрация 25 нг/мл) в 96-луночных планшетах (Costar, США) в 50 мкл среды RPMI с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) и 50 мкг/мл гентамицина. Также выполняли серийные разведения мутированного IL-15 с начальной концентрацией 6 мкг/мл в 30 мкл среды RPMI с добавками. Разведения IL-15Mut инкубировали вместе с 20 мкл 300 пг/мл нативного IL-15. Затем добавляли клетки CTLL-2, предварительно промытые средой RPMI, в количестве 5×10 клеток/лунка в 50 мкл среды. Планшет инкубировали в течение 72 ч в условиях 5% СО при 37°С и 98% относительной влажности. Жизнеспособность клеток определяли окрашиванием МТТ. IL-15Mut оказался не биологически активным, поскольку он не вызывал пролиферацию клеток CTLL-2, в отличие от рекомбинантного IL-15 (SEQ ID No. 2) и нативного IL-15, которые стимулировали пролиферацию в зависимости от дозы (фиг. 2).
Пример 4. Схема иммунизации зеленых мартышек
Chlorocebus sabaeus
ТМ
Животных (зеленых мартышек ) делили на 6 групп по 3 животных в каждой: группа плацебо, которая получала раствор фосфатно-солевого буфера (PBS) в адъюванте, гидроксиде алюминия (Brenntag Biosector, Дания), группа, иммунизированная 200 мкг полипептида, определенного как SEQ ID No. 2 (группа IL-15), и две другие группы, которые получали 200 мкг или 350 мкг полипептида, определенного как SEQ ID No. 1, в комбинации с гидроксидом алюминия в концентрации 1,8 мг/мл, а также еще две экспериментальные группы, иммунизированные 200 мкг полипептида, определенного как SEQ ID No. 1 или SEQ ID No. 2 в комбинации с адъювантом Montanide ISA-51 (50:50 об./об.). Введение иммуногена осуществляли подкожно в несколько участков межлопаточной области общим объемом 0,5 мл. Проводили три иммунизации с интервалами 15 дней между первой и второй и 2 месяца между второй и третьей. Образцы крови собирали перед выполнением схемы иммунизации (преиммунная сыворотка) и через 15 дней после второй и третьей иммунизаций. Комплемент инактивировали путем инкубации сывороток при 56°С в течение 30 мин. Жизненные показатели, температуру, частоту сердечных сокращений и массу тела регистрировали на протяжении всей схемы иммунизации.
Пример 5. Определение анти-IL-15-антител в сыворотке иммунизированных животных.
ТМ
Титры специфических Ab к IL-15 измеряли методом непрямого ELISA, согласно которому 96-луночные планшеты EIA (Costar, США) покрывали 1 мкг/мл полипептида, определенного как SEQ ID No. 2, в течение 16 часов при 25°C. Планшеты блокировали 1% бычьим сывороточным альбумином (BSA, Sigma-Aldrich, США) в PBS в течение 90 минут при 37°C с последующей промывкой 3 раза 0,05% Твин 20 в PBS. PBS, 0,05% Твин 20 и 0,01% BSA-разбавленные сыворотки (начальное разведение 1:5000) добавляли в лунки в объеме 100 мкл и инкубировали в течение 90 мин при 37°С. Затем лунки промывали 3 раза и инкубировали меченным пероксидазой античеловеческим IgG (Fc-специфическим) Ab (Sigma, США), разведенным в PBS в соотношении 1:10000. После инкубации в течение 1 часа при 37°С планшеты промывали 5 раз и инкубировали со 100 мкл раствора субстрата. Реакцию останавливали через 15 минут, добавляя 50 мкл 0,5 М раствора серной кислоты, и измеряли оптическую плотность при 450 нм с помощью планшетного ридера для ELISA. Титр Ab принимали как самое высокое разведение сыворотки, обеспечивающее по меньшей мере двукратное увеличение значения оптической плотности (OD) при 450 нм по сравнению со значением сыворотки, полученной от каждого животного до иммунизации. Данные обрабатывали с помощью программы GraphPad Prism v6.05 (GraphPad Software, Inc.). Полученные результаты показаны на фиг. 3, которые указывают на то, что активная иммунизация мутантным полипептидом IL-15 (соответствующая SEQ ID No. 1) вызывает выроботку анти-IL-15 антител как с гидроксидом алюминия, так и Montanide, используемыми в качестве адъюванта.
Пример 6. Определение нейтрализующей способности сывороток иммунизированных животных
Для оценки нейтрализующей способности сывороток проводили анализ пролиферации клеток CTLL-2. Пролиферация этой IL-2-зависимой клеточной линии также происходит в присутствии IL-15 (максимальная пролиферация соответствует клеткам, инкубированным с 300 пг/мл нативного IL-15), тогда как в отсутствие цитокина клетки не пролиферируют (минимум: клетки, выращенные в культуральной среде без IL-15). В этом анализе детектировали молекулы, которые связываются с IL-15 и препятствуют трансляции сигнала через его рецептор, ингибируя пролиферацию этой клеточной линии.
3
2
50
50
Чтобы оценить нейтрализующую способность антител, полученных от иммунизированых обезьян, проводили двухкратные серийные разведения инактивированных нагреванием сывороток (начальное разведение 1:100) в 96-луночных планшетах в объеме 30 мкл среды RPMI с добавлением 10% FBS и 50 мкг/мл гентамицина. Затем в каждую лунку добавляли 300 пг/мл нативного человеческого IL-15 (R & D, США) в объеме 20 мкл, и планшет инкубировали при 37°C в течение 30 минут. После этого добавляли предварительно промытые клетки CTLL-2 в количестве 5×10 клеток/лунка в 50 мкл и планшет инкубировали в течение 72 часов при 5% CO, 37°C и 98% относительной влажности (Rodríguez Y., et al. Biotecnol. Apl. 2014; 31:291-6). MAB2471 (R & D, США), нейтрализующее Ab к человеческому IL-15, использовали в качестве положительного контроля с начальной концентрацией 1 мкг/мл (двукратные серийные разведения). Жизнеспособность клеток определяли окрашиванием МТТ. Титры нейтрализующих антител в сыворотке выражали в виде разведения сывороток, которое необходимо для ингибирования пролиферации по меньшей мере на 50% (ID), и проводили вычисления с помощью программы Curve Expert версии 1.3.8.0. На фиг.4 показан ингибирующее воздействие сыворотки на нативную пролиферацию клеток CTLL-2, индуцированную IL-15. Эти сыворотки выделяли из животных, иммунизированных полипептидом SEQ ID No. 1 (IL-15Mut) и SEQ ID No. 2 (рекомбинантный IL-15), используя в качестве адъюванта гидроксид алюминия. Значения ID сыворотки, полученной от отдельного животного в каждой экспериментальной группе (3 животных в группе), показаны в таблице 1. При сравнении титров нейтрализующих антител у животных, получавших одинаковую дозу (200 мкг) IL-15Mut (SEQ ID No. 1) и рекомбинантный IL-15 (SEQ ID No. 2), эти титры оказались выше в случае мутированного цитокина.
Таблица 1.
50
Значения ID сыворотки, полученной от животного, через 15 дней после третьей иммунизации.
<b>Иммуноген/Доза</b>
<b>Животные</b>
<b>Титры нейтрализующих антител (ID</b><sub><b>50</b></sub><b>)</b>
IL-15/200 мкг
1
1946
IL-15/200 мкг
2
859
IL-15/200 мкг
3
280
IL-15Mut/200 мкг
1
3547
IL-15Mut/200 мкг
2
809
IL-15Mut/200 мкг
3
3238
IL-15Mut/350 мкг
1
2273
IL-15Mut/350 мкг
2
5218
IL-15Mut/350 мкг
3
1171
ТМ
На фиг.5 показана нейтрализующая способность в клетках CTLL-2 пула сывороток животных, иммунизированных IL-15Mut и рекомбинантным IL15. Сыворотки оценивали через 15 дней после второй и третьей иммунизаций, используя в качестве адъюванта гидроксид алюминия или Montanide. Нейтрализующий эффект сывороток наблюдали после третьей иммунизации у животных, иммунизированных 200 мкг IL-15Mut и рекомбинантным IL-15. Однако в случае сыворотки, соответствующей дозе 350 мкг, нейтрализующий эффект наблюдали уже через 15 дней после второй иммунизации.
50
50
В таблице 2 суммированы значения ID пула сывороток, полученных через 15 дней после второй и третьей иммунизаций, демонстрируя титры нейтрализующих антител в трех экспериментальных группах. Иммунизация более высокой дозой (350 мкг) IL-15Mut (SEQ ID No. 1) вызывает более сильный нейтрализующий ответ через 15 дней после второй иммунизации, если в качестве адъюванта используется гидроксид алюминия. Это является преимуществом, с учетом того факта, что желаемый эффект может быть достигнут при меньшем количестве введений. Дозу 200 мкг вводили в комбинации с Montanide в качестве адъюванта. В этом случае значения ID в группе IL-15Mut также оказались выше, чем значения, полученные в группе рекомбинантного IL-15 после второй и третьей иммунизаций.
Таблица 2.
50
Значения ID пула сывороток через 15 дней после второй и третьей иммунизаций.
<b>Иммуноген/Доза</b>
<b>Количество иммунизаций</b>
<b>Адъювант</b>
<b>Титры нейтрализующих антител (ID</b><sub><b>50</b></sub><b>)</b>
IL-15/200 мкг
2
Гидроксид алюминия
80
IL-15Mut/200 мкг
2
Гидроксид алюминия
206
IL-15Mut/350 мкг
2
Гидроксид алюминия
1308
IL-15/200 мкг
3
Гидроксид алюминия
1256
IL-15Mut/200 мкг
3
Гидроксид алюминия
2836
IL-15Mut/350 мкг
3
Гидроксид алюминия
3576
IL-15/200 мкг
2
Montanide™ ISA-51
50
IL-15Mut/200 мкг
2
Montanide™ ISA-51
175
IL-15/200 мкг
3
Montanide™ ISA-51
1154
IL-15Mut/200 мкг
3
Montanide™ ISA-51
1952