Поликомпонентная вакцина для иммунопрофилактики и иммунотерапии заболеваний, вызываемых условно патогенными микроорганизмами
MULTICOMPONENT VACCINE FOR IMMUNOPROPHYLAXIS AND IMMUNOTHERAPY OF DISEASES CAUSED BY OPPORTUNISTIC PATHOGENS

Поликомпонентная вакцина для иммунопрофилактики и иммунотерапии заболеваний, вызываемых условно патогенными микроорганизмами.
Изобретение относится к области медицинской иммунологии, к исследованию молекулярно-клеточного механизма действия иммунобиологического лекарственного средства для профилактики и терапии хронических воспалительных заболеваний бактериальной и вирусной этиологии.
Поликомпонентная вакцина из антигенов условно-патогенных микроорганизмов относится к классу терапевтических вакцин. Термин «терапевтическая вакцина» используют для обозначения вакцин, которые в отличие от иммуномодуляторов микробного происхождения, обладают способностью активировать не только врожденный, но и адаптивный иммунитет [Семенов Б.Ф., Егорова Н.Б., Семенова И.Б., Курбатова Е.А. Терапевтические вакцины. Российские медицинские вести. 2000, №3:26-32]. Активация эффекторов врожденного иммунитета, приводящая к последующему развитию адаптивного иммунитета, определяется наличием в составе терапевтических вакцин паттерн-ассоциированный молекулярных структур микроорганизмов.
В настоящее время известно, что консервативные антигенные структуры бактерий (Pathogen-Associated Molecular Patterns - PAMPs): липополисахарид, тейхоевая кислота, пептидогликан, белки наружной мембраны и др., являющиеся общими для многих видов бактерий, активируют паттерн-распознающие рецепторы (Pattern-Recognition Re-ceptors - PRRs), такие как сигнальные Толл-подобные рецепторы (Toll-like Receptors - TLRs), экспрессируемые на мембране иммуно-компетентных клеток, и могут быть одним из инструментов управления системой врожденного иммунитета [Пащенко М.В., Пинегин Б.В., Физиология клеток врожденной иммунной системы: дендритные клетки. Иммунология. 2006, №6: 368-378. Medzhitov R., Janeway Jr. С.А. Innate immunity: impact in the adaptive immune response. Curr. Opin. Immunol.1997, 9: 4-9. Medzhitov R., Janeway Jr. C.A.Decoding the patterns of self and nonself by the innate immune system. Science. 2002, 296:298-300]. Лигандами для TLR2 являются пептидогликан и тейхое-вая кислота, для TLR4 - липополисахарид, для TLR9 - ДНК. Взаимодействие PAMPs с TLRs приводит к активации ядерного фактора транскрипции NF-κВ и экспрессии генов провоспалительных и противовоспалительных цитокинов, определяя направленность развития иммунного ответа по Th1 или Th2 пути [Mosman T.R., Fong Т.А., Specific assay for cytokine production. J. Immunol. Meth.1989, 116(2): 151-158. Romagnani S., Parronchi O., Delios M.M. et al. An update on human Th1 and Th2 cells. Int. Arch. Allergy Immunol. 1997, 11:153-156].
Аналогами поликомпонентной вакцины являются иммуномоду-ляторы микробного происхождения, которые в отличие от поликомпонентной вакцины не вызывают активации адаптивного иммунитета с образованием специфических IgG-антител к антигенам, входящим в их состав. Клинический эффект от их применения непродолжительный - от 3 до 6 месяцев, схема применения длительная (4-5 месяцев).
Бронховаксом и его аналог - бронхомунал " бактериальные лизаты 8 видов микроорганизмов: Streptococcus pneumoniae, Heamophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella ozenae, Staphylococcus aureus, Moraxella catarrhalis, Streptococcus pyogenes, Strepto-coccus viridans, полученные воздействием щелочи. Каждый из микроорганизмов находится в препарате в равной пропорции. Бактериальный экстракт содержит менее 1 нг ЛПС/мг.Препараты предназначены для перорального применения в капсулах. Длительность иммунотерапии хронических воспалительных заболеваний органов дыхания на фоне базисной терапии составляет 4 месяца [Dererme J.Ph., Delclaux В. Clinical experience with OM-85 BV in upper and lower respiratory tract infections. Respiration. 1992, 59. - Suppl. 3. - 28-31. Paupe J. Immunotherapy with an oral bacterial extract (OM-85 BV) for upper respiratory infections. Respiration. 1991,58:150-154. Emmerich В., Pachmann K., Mila-tovic D., Emslander H. Influence of OM-85 BV on different humoral and cellular immune defence mechanisms of the respiratory tract. Respiration. 1992, 59 Suppl 3:19-23.]. У пациентов, получавших бронховаксом, отмечали повышение уровня sIgA в секретах верхних дыхательных путей и желудочно-кишечного тракта [Emmerich В., Pachmann К., Milatovic D., Emslander Н. Influence of OM-85 BV on different humoral and cellular immune defence mechanisms of the respiratory tract. Respiration. 1992], IFNγ и активности макрофагов. Лишь в единичных исследованиях авторы отмечали увеличение CD3 лимфоцитов и NK-клеток. При этом нарастания тиров специфических антител к антигенам микроорганизмов, входящих в состав препарата, не выявлено.

Топические бактериальные лизаты (ИРС19, Имудон) предназначены для профилактики и лечения респираторных заболеваний ЛОР-органов и заболеваний полости рта. Применение этих препаратов способствовало сокращению числа респираторных инфекций, потребности в антибактериальных препаратах, обеспечивало профилактический эффект, предотвращая возможные осложнения. Иммунологические показатели при приеме ИРС19 и имудона характеризовались увеличением содержания sIgA в слюне и носовом секрете, усилении выработки лизоцима. Не выявлено стимулирующего влияния ИРС19 на системные показатели клеточного и гуморального иммунитета [Маркова Т.П., Чувиров Д.Г. Применение топических иммуномо-дуляторов в группе часто и длительно болеющих детей. Иммуно-коррекция в педиатрии. - М. - Медицина для всех. - 2001. - с. 91-99].

Наиболее близким аналогом поликомпонентной вакцины является Рибомунил, состоящий из рибосомальных фракций Klebsiella pneumoniae, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae и про-теогликана К. pneumoniae в качестве адъюванта. В состав рибомунила входит РНК, рибосомы, белки и протеогликан. Препарат выпускают в таблетках или в инъекционной форме. Рибомунил предназначен для лечения заболеваний респираторного тракта и для профилактики ОРВИ [Хаитов P.M., Борисова A.M., Хорошилова Н.В. и др. Применение рибосомального препарата рибомунила для коррекции иммунной системы у больных хроническим бронхитом. Сб. научных трудов под ред. проф. Н.А.Коровиной. Опыт применения рибомунила в России. 1996. с. 16-23]. Длительность курса лечения составляет 6 месяцев. При исследовании иммунологических показателей у пациентов с хроническим бронхитом показана коррекция содержания субпопуляций лимфоцитов CD4 и CD8, sIgA в секретах до нормальных значений, существенное влияние на показатели фагоцитарного звена иммунитета, что коррелировало с положительной динамикой сопутствующих воспалительных процессов. Получен положительный эффект применения рибомунила при реабилитации часто болеющих детей, а также при включении рибомунила в комплексную терапию детей с бронхиальной астмой. При использовании рибомунила у детей с дерматореспираторным синдромом в ходе проведения основного и поддерживающего курсов терапии уровень IL-2 имел тенденцию к повышению. Выраженный клинический эффект от проводимой терапии наблюдали у детей, когда на фоне лечения рибомунилом повышался уровень IL-2 в периферической крови. В ходе проведения основного и поддерживающего курсов терапии уровень IL-4 снижался. Отмечен рост содержания IL-2 и IFNγ в периферической крови и снижение уровня TNFα. Повышение уровня IFNγ после лечения рибомунилом отмечали у детей с хронической легочной патологией [Коровина Н.А., Захарова И.Н., Заплатников А.Л. и др. Опыт применения и перспективы использования рибомунила в педиатрической практике. Сб. научных трудов под ред. проф. Н.А.Коровиной. Опыт применения рибомунила в России. 1996. с. 30-33.]. В экспериментальных исследованиях продемонстрировано, что введение рибомунила мышам приводило к повышению уровня специфических антител к антигенам четырех видов микроорганизмов, входящих в его состав и снижало летальность при экспериментальной инфекции [Michel F.B., Dussourd d'Hinterland L., Bousquet J.et al. Immuno-stimulation by a ribosomal vaccine associated with a bacterial cell wall adjuvant in humans. Infect Immun. 1978, 20(3):760-769].
Известна поликомпонентная вакцина для иммунотерапии и иммунопрофилактики заболеваний, вызываемых условно патогенными микроорганизмами, содержащая смесь антигенов, выделенных из штаммов Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris, Escherichia coli и Staphylococcus aureus. В качестве антигена из Klebsiella pneumoniae она содержит липополисахарид, ассоциированный с белком наружной мембраны, протеогликан с химическим составом 10,0-20,0% белка, 30,0-40,0% углеводов, с мол.м. более 20 000 Да. В качестве антигена из Proteus vulgaris она содержит липополисахарид, ассоциированный с белком наружной мембраны, с химическим составом: 40,0-60,0% белка, 25,0-35,0% углеводов, с мол.м. более 20 000 Да. В качестве антигена Escherichia coli она содержит липополисахарид, ассоциированный с белком наружной мембраны, с химическим составом 16,0-20,0% белка, 15,0-30,0% углеводов, с мол.м. более 20 000 Да. В качестве антигена из Staphylococcus aureus - антиген клеточной стенки, содержащий тейхоевую кислоту, пептидогилкан и лабильные белки с химическим составом: 13,0-21,0% белка, 8,0-16,0% углеводов, с мол.м. более 20 000 Да. Антигены указанных штаммов берут в соотношении 1:1:1: 1,2 г по сухому весу на 1 л вакцины. Концентрирование и очистку антигенов проводят ультрафильтрацией и диафильтрацией (Патент RU 2209081 A61K 39/116, 2003).
Поликомпонентная вакцина отличатся короткой схемой введения (не более 1 месяца), обеспечивает длительный (1 год и более) клинический эффект при патологических процессах бактериальной и вирусной этиологии: хроническом бронхите, абсцессе легкого, бронхиальной астме, атопическом дерматите, пиодермии, герпесвирусной инфекции. [Егорова Н.Б., Курбатова Е.А. Иммунотерапевтическая концепция использования микробных антигенов при атопии и патологии, ассоциированной с условно-патогенной микрофлорой (на примере поликомпонентной вакцины Иммуновак-ВП-4). Медицинская иммунология. 2008,10, №1:13-20]. Анализ результатов исследований, проведенных в клинических условиях, как на ограниченных группах больных, так и в строго контролируемых условиях при различной патологии, позволил выявить ряд общих особенностей, присущих действию микробных антигенов, входящих в состав поликомпонентной вакцины: сокращение числа и тяжести рецидивов (обострений) заболевания; увеличение сроков ремиссии; уменьшение объема применяемых лекарственных средств, в том числе антибиотиков и глюкокор-тикостероидов; снижение количества сопутствующих острых респираторных вирусных инфекций (ОРВИ); коррекция количества и функциональной активности субпопуляций лимфоцитов (CD3, CD4, CD8, CD 16, CD72); программирование пролиферации и активации CD4 Т -клеток по Th1 пути; коррекция синтеза изотипов иммуноглобулинов в сторону снижения IgE и повышения IgG, IgA, sIgA. Однако механизм активации эффекторов врожденного и адаптивного иммунитета под действием поликомпонентной вакцины недостаточно раскрыт.
Технический результат предлагаемого изобретения заключается в раскрытии механизма защитного действия поликомпонентной вакцины от бактериальных и вирусных патогенов при пероральном и подкожном методах иммунизации путем активации Толл-подобных рецепторов TLRs 2, 4 и 9, что подтверждает присутствие в поликомпонентной вакцине паттерн-ассоциированных молекулярных структур микроорганизмов (пептидогликан, тейхоевая кислота, липополисахарид, бактериальная ДНК), приводящих к экспрессии цитокинов (IL-1β, IL-6, IL-12, IFNγ, TNFα) и формированию адаптивного иммунитета, проявляющимся в продукции специфических IgG-антител к антигенам, входящим в состав вакцины. В результате активации эффекторов врожденного и адаптивного иммунитета поликомпонентная вакцина защищает экспериментальных животных от бактериальной и вирусной инфекции и объясняет терапевтический и профилактический эффект ее применения в клинической практике.
Объектом настоящего исследования являются мембраноассоци-ированные и секретируемые молекулы иммунокомпетентных клеток экспериментальных животных при энтеральном (внутрь через рот) и подкожном методах введения поликомпонентной вакцины.
При 3-кратной пероральной иммунизации экспериментальных животных в селезенке увеличивалась экспрессия TLR 9 по сравнению с контролем (*P <0,05). В лимфоидной ткани, ассоциированной с носовой полостью/бронхами (NALT/BALT) и желудочно-кишечным трактом (GALT) TLR 4 и 9 по сравнению с контролем (*Р <0,05) (табл. 1).
Активация TLRs приводила к экспрессии генов цитокинов. В сыворотке крови перорально иммунизированных животных повышался уровень цитокинов IL-1β, IL-6, IL-12 (*Р <0,05) (табл. 2).
При 2-кратной подкожной иммунизации экспериментальных животных в селезенке и лимфоидной ткани, ассоциированной с носовой полостью/бронхами (NALT/BALT) увеличивалась экспрессия TLR 2,4 и 9 по сравнению с контролем (*Р <0,05) (табл. 1). В лимфоидной ткани, ассоциированной с желудочно-кишечным трактом (GALT) изменений не выявлено. Активация TLRs приводила к экспрессии генов цитокинов. В сыворотке крови перорально иммунизированных животных повышался уровень цитокинов IL-1β, IL-6, IL-12, IFNγ по сравнению с контролем (*P <0,05) (табл. 2).
Эти данные подтвердились в опытах in vitro. Под действием поликомпонентной вакцины на мембране дендритных клеток, генерированных из костного мозга неиммунизированных экспериментальных животных, увеличивалась экспрессия TLRs 2, 4, 9 по сравнению с контролем (*Р <0,05) (табл. 3). Дендритные клетки под действием поликомпонентной вакцины продуцировали в культуральную среду высокий уровень IL-6, IL-12, TNFα (*Р <0,05) (табл. 4).
Активация TLRs с последующей продукцией цитокинов приводила к формированию адаптивного иммунного ответа с продукцией IgG-антител к антигенам, входящим в состав поликомпонентной вакцины через 7 суток после подкожной иммунизации разовой дозой 4 мг по сравнению с показателями до иммунизации (*Р <0,05) (табл. 5).
Следствием активации врожденного и адаптивного иммунитета при подкожном и пероральном введении поликомпонентной вакцины явилась защита экспериментальных животных от заражения штаммами бактерий: клебсиеллы, стафилококка, протея, кишечной палочки, синегнойной палочки, гемофильной палочки типа Ь, пневмококка, сальмонеллы (табл. 6, 7). Протективную активность при заражении экспериментальных животных через 24 часа после иммунизации рассматривали как следствие активации врожденного иммунитета, через 5-8 суток после иммунизации - как активацию адаптивного иммунитета. При активации адаптивного иммунитета протективная активность была выше, чем при активации врожденного иммунитета. Неспецифическая защита (врожденный иммунитет) от вирусной инфекции через 24 часа после подкожной или пероральной иммунизации поликомпонентной вакциной продемонстрирована при заражении вирусом гриппа (табл. 8) и вирусом герпеса при подкожном методе иммунизации (табл. 9).
Осуществление настоящего изобретения.
Пример 1. Исследование экспрессии Толл-подобных рецепторов на мононуклеарных лейкоцитах селезенки мышей и определение цитокинов в сыворотке крови при пероральном и подкожном методах иммунизации.
Мышей линии BALB/c иммунизировали поликомпонентной вакциной трехкратно перорально разовой дозой 2000 мкг/мышь с помощью канюли или двукратно подкожно разовой дозой 200 мкг/мышь с помощью шприца. В каждой группе иммунизировали по 6 мышей. Через 24 часа мышей выводили из опыта под эфирным наркозом. Брали кровь из яремной вены для исследования уровня цитокинов, а затем извлекали лимфоидные органы и ткани, гомогенизировали, отмывали средой RPMI-1640 и выделяли мононукларные лейкоциты с помощью одноступенчатого градиента плотности фиколл-урографина для оценки экспрессии Толл-подобных рецепторов. Определение экспрессии Толл-подобных рецепторов TLR 2, 4 и 9 на мононуклеарных лейкоцитах селезенки, лимфатических узлов, назо-/бронхоассоциированой лимфоидной ткани (NALT/BALT), лимфоидной ткани, ассоциированной с желудочно-кишечным трактом (GALT) проводили с помощью моноклональных антител (Caltag Laboratories, США) против соответствующих антигенов. Результаты оценивали с помощью проточного цитофлуориметра (Beckman Coulter FC-500, США). В результате после 3-кратного перорального введения в селезенке увеличивалось количество клеток, экспрессирующих TLR 9 до 3,1%; в NALT/BALT TLR 4 и 9 до 1,8 и 2,5% соответственно; в GALT TLR 4 и 9 до 11,3 и 12,5% соответственно. При 2-кратном подкожном введении в селезенке увеличивалось количество клеток, экспрессирующих TLR2, 4 и 9 до 9,9; 10,2 и 10,5% соответственно; в NALT/BALT 3,2; 1,4 и 4,3 соответственно.
Исследование уровня цитокинов у этих же мышей, иммунизированных перорально или подкожно поликомпонентной вакциной, проводили с помощью ИФА тест-системы фирмы Bender MedSystems (США). Детекцию результатов осуществляли с помощью проточной цитофлуориметрии. В сыворотке крови иммунизированных мышей определяли уровни цитокинов. После 3-кратного перорального введения концентрация IL-1β составила 16,3 пг/мл, IL-6 - 128 пг/мл, IL-12 - 10,4 пг/мл; после 2-кратного подкожного введения концентрация IL-1β составила 66 пг/мл, IL-6 - 205 пг/мл, IL-12 - 37 пг/мл; IFNγ - 35 пг/мл.
Пример 2. Определение тиров IgG-антител в сыворотке крови иммунизированных кроликов.
Кролика породы «Шиншилла» иммунизировали подкожно 2-кратно 4 мг поликомпонентной вакцины с интервалом 7 дней. Через 7 дней определяли титр IgG-антител к каждом компоненту, водящему в состав вакцины, методом твердофазного ИФА. На планшетах иммобилизовали антигены клебсиеллы, протея, кишечной палочки и стафилококка (5 мкг/лунка). Сыворотку разводили 1:3200 и вносили в лунки планшетов в объеме 100 мкл. Инкубировали в течение 1 часа при 37°С, промывали фосфатно-солевым буфером с 0,05% Tween 20 в объеме 200 мкл. Прибавляли вторичные антитела к IgG кролика в объеме 100 мкл, инкубировали в течение 1 часа при 37°С, промывали как указано ранее. Прибавляли ТМБ для окрашивания продуктов реакции в объеме 100 мкл, инкубировали 15 мин в темноте. Реакцию останавливали 1 М раствором серной кислоты. Детекцию результатов проводили на микропланшетном ИФА-ридере при оптической плотности 450 нм. В результате титр антител к кишечной палочке, клебсиелле, протею и стафилококку составил 2,0; 1,7; 1,9; 1,6 у.е. соответственно.