Основные направления исследований дальневосточных природных популяций ризобий

Вестник ДВО РАН. 2016. № 2

УДК 001.2:576.8

М.В. ЯКИМЕНКО, С.А. БЕГУН

Основные направления исследований дальневосточных природных популяций ризобий

Представлены основные этапы многолетней (с 1969 г. по настоящее время) деятельности лаборатории биологических исследований Всероссийского научно-исследовательского института сои. Первые работы лаборатории были посвящены изучению общей микрофлоры почв Амурской области и испытанию бактериальных препаратов в посевах зерновых культур и сои. В течение ряда лет определяли биологическую азотфиксацию у сои за счет симбиотических взаимоотношений с природными популяциями специфичных ризобий. В результате создана уникальная коллекция наиболее ценных штаммов клубеньковых бактерий сои, на основе которых разработано микробиологическое удобрение «БиоБеСтА».

Ключевые слова: соя, ризобии, штаммы, препараты.

Basic directions of researches of the Far Eastern natural populations of rhizobia. M.V. YAKIMENKO, S.A. BEGUN (All-Russian Scientific Research Institute of Soybean, Blagoveshchensk).

The article presents the basic stages of the long-term research work (from 1969 to present) of the biological investigation laboratory of the All-Russian Scientific Research Institute of Soybean. The first works of the laboratory were devoted to the study of total soil microflora of the Amur Region and to the test of bacterial preparations in cereal crops and soybean. For several years the laboratory staff has carried out researches to determine the size of biological nitrogen fixation in soybean by means of symbiotic relations with natural populations of specific rhizobia. The result is a unique collection of the most valuable strains of nodule bacteria of soybean, on the basis of which microbiological fertilizer «BioBeStA» has been developed.

Key words: soybean, rhizobia, strains, preparations.

Природные условия Амурской области и биологические особенности сои потребовали значительного расширения научных исследований симбиотической деятельности растений данной культуры. В связи с этим в 1969 г. при отделе агрохимии Всероссийского научно-исследовательского института сои (ВНИИ сои) создана лаборатория микробиологии. Первые ее работы были посвящены изучению общей микрофлоры почв Амурской области и испытанию бактериальных препаратов (нитрагин, азотобактерин, фосфоробактерин) в посевах зерновых культур и сои [1, 6, 8, 9].

В 1974 г. научным сотрудником института С.А. Бегуном выделена первая чистая культура ризобий сои из почв Серышевского района Амурской области. Штамм отнесен к медленнорастущему виду Bradyrhizobium japonicum (Jordan, 1982) [2].

В 1978 г. из почв Бурейского района Амурской области выделен в чистую культуру первый коллекционный штамм ризобий сои, отнесенный к быстрорастущему виду Sino-rhizobium fredii (Scholia, Elkan, 1984). С этого времени сотрудники лаборатории сосредоточились на изучении дальневосточных природных популяций клубеньковых бактерий сои и начали отбор перспективных штаммов ризобий с использованием микробиологических

*ЯКИМЕНКО Мария Владимировна - кандидат биологических наук, заведующая лабораторией, БЕГУН Степан Алексеевич - кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник (Всероссийский научно-исследовательский институт сои, Благовещенск). *Е-таП: mariy-y@yandex.ru

методов исследования [5]. В основу научной работы были положены идеи крупнейших российских исследователей явления симбиотической азотфиксации Л.М. Доросинского, Е.Н. Мишустина, В.К. Шильниковой.

Цель и задачи исследований - всестороннее изучение дальневосточных природных популяций ризобий, инфицирующих сою, отбор наиболее ценных по хозяйственно полезным свойствам штаммов и определение влияния агротехнических факторов на эти микроорганизмы.

На первом этапе провели широкое обследование районов произрастания дикорастущей и культурной сои в Амурской области, Хабаровском и Приморском краях с целью изучения ареала распространения природных популяций ризобий сои, установлен факт их высокой активности.

Далее в течение ряда лет определяли размеры биологической азотфиксации у сои за счет симбиотических взаимоотношений с природными популяциями специфичных ризо-бий. Нами разработан метод определения размеров симбиотической азотфиксации у сои, основанный на использовании скуднорастущих форм сои с неэффективными клубеньками [4]. Эти формы получены методом индивидуального отбора из сортов сои амурской селекции. Отмечено, что в зависимости от экологических и агротехнических факторов, активности макро- и микросимбионтов доля биологического азота в урожае сои может варьировать в пределах 20-80 % от общей потребности.

Путем многочисленных опытов получен большой объем данных о влиянии типов почв, предшественников, удобрений, извести, микроэлементов (медь, кобальт, железо, марганец, магний и особенно молибден), пестицидов, гербицидов на численность вирулентных клубеньковых бактерий сои в почвах и на образование клубеньков на корнях растения-хозяина [5]. Изучен антигенный состав природных популяций ризобий сои. Определены особенности образования клубеньков на корнях растения-хозяина более чем у 200 сортов сои мировой коллекции, предоставленных Всероссийским институтом растениеводства. Выявлены сорта сои, не образующие клубеньков на корнях, скуднора-стущие формы с неэффективными клубеньками и сорта с различной степенью интенсивности клубенькообразования независимо от активности природных популяций ризобий. Изучена динамика клубенькообразования у сортов сои с различным периодом вегетации, а также в вариантах с возрастающими дозами азотных удобрений и молибдата аммония.

С целью определения наиболее эффективных штаммов в 1975-2014 гг. в полевых мелкоделяночных опытах на двух типах почв Амурской области исследовано свыше 1 000 штаммов ризобий сои селекции ВНИИ сои.

Начиная с 1977 г. наряду с селекционной работой в лабораторных условиях отрабатывали технологию производства и применения биопрепарата на основе лучших коллекционных штаммов ризобий сои. Было проведено 14 производственных опытов по испытанию биопрепарата в хозяйствах области. В результате получено микробиологическое удобрение «БиоБеСтА», в основе которого - коллекционный запатентованный штамм ризобий ББ-491. Штамм внесен в базу «Перспективные изобретения» (2010 г.), отмечен Федеральной службой по интеллектуальной собственности дипломом в номинации «100 лучших изобретений России» (2012 г.). Автор разработки и создатель лабораторной коллекции штаммов ризобий - к.б.н. С.А. Бегун.

Детальное изучение морфолого-культуральных, физиолого-биохимических и хозяйственно полезных свойств природных популяций ризобий сои в Восточно-Азиатском регионе позволило выявить наиболее ценные штаммы клубеньковых бактерий сои для сохранения их в коллекции (табл. 1).

В настоящее время в лабораторной коллекции соевых ризобий насчитывается свыше 200 наиболее ценных штаммов видов В. ]аропкит и & fredii с различными свойствами, в том числе обладающих высокой активностью и вирулентностью (штаммы, устойчивые

1 Свидетельство о регистрации биопрепарата (совместно с ЗАО «Аметис») получено 8 апреля 2014 г.

Таблица 1

Коллекция чистых культур клубеньковых бактерий сои и других зернобобовых культур Всероссийского научно-исследовательского института сои, 2016 г.

Регион выделения штаммов Всего штаммов Ризобии сои Ризобии других зернобобовых культур

Bradyrhizobium ]'аротеит Sinorhizobium fredii

Амурская область 240 89 63 88

Хабаровский край 1 1 0 0

Приморский край 6 2 4 0

Еврейская автономная

область 4 3 1 0

Магаданская область 19 0 0 19

Сахалинская область 1 0 0 1

Китай 18 15 3 0

Итого штаммов 289 110 71 108

к повышенным концентрациям молибдена, протравителям, гербицидам, повышенным температурам, щелоче- и кислотообразующие, с различной осмоустойчивостью, газообразующие и др.) [3].

В ходе исследований установлено, что коллекционные штаммы могут до 90 % повышать долю симбиотического азота в урожае в контролируемых условиях и до 7 ц/га - семенную продуктивность сои на фоне спонтанной инокуляции, а в районах, где природные популяции отсутствуют, - до 8-20 ц/га. При этом помимо повышения урожайности за счет улучшения азотфиксации культуры ризобий оказывают на растение стимулирующий и оздоравливающий эффект [10].

До 1992 г. регулярно лучшими штаммами ризобий сои селекции ВНИИ сои пополнялась коллекция Института сельскохозяйственной микробиологии (Санкт-Петербург). Более 10 штаммов прошли испытание в Географической сети опытов страны. Эти штаммы показали высокую эффективность в Казахстане, Грузии, Молдавии, Украине, Ставрополье, Хабаровском и Приморском краях, Сибири, хорошо известны в Китае, Индии, Чехословакии, Таджикистане, Узбекистане [7].

Параллельно сотрудники лаборатории собирали коллекции чистых культур ризобий клевера, люцерны, донника, астрагала, эспарцета, вики, козлятника, гороха, фасоли, а также разных видов дрожжей и диазатрофов. В 2009 г. 9 коллекционных штаммов ризобий 2 видов переданы во Всероссийскую коллекцию микроорганизмов (г. Пущино); на 4 штамма получены патенты.

Многолетний опыт исследования дальневосточных природных популяций клубеньковых бактерий сои показал, что их видовой состав не ограничивается изучаемыми видами. В настоящее время в лаборатории проводится идентификация других видов ризобий, нодулирующих сою. Для этих целей в течение ряда лет на опытном участке лаборатории биологических исследований ВНИИ сои высевают некоторые зернобобовые культуры.

В 1999 г. впервые из клубеньков маша (фасоли золотистой) выделены в чистую культуру штаммы ризобий, нодулирующие не только маш, но и сою. В 2012 г. образование клубеньков отмечено на корнях вигны (V radiata, V. unguiculata). Штаммы, выделенные в чистую культуру из клубеньков этих растений, хорошо образуют клубеньки как на корнях вигны, так и на корнях сои и фасоли золотистой.

В 2014 г. продолжали изучение клубенькообразования на корнях 11 зернобобовых культур (вигна - 2 вида, маш, горох, соя, фасоль, нут, бобы, арахис, люпин, чина). Выделено и оставлено в лабораторной коллекции 52 штамма чистых культур ризобий. Проведено первичное изучение их интенсивности роста на соевой агаризованной минерально-растительной среде с маннитом и лактозой, контрольной среде (мясо-пептонный агар). Планируется изучение их культуральных и биохимических свойств.

Таблица 2

Вирулентность штаммов ризобий, выделенных в чистую культуру из клубеньков зернобобовых культур при инокуляции семян сои, маша и вигны

Индекс штамма* Кол-во штаммов Соя, сорт Гармония Маш, P. aureus Вигна

V. radiata, к3098 V. unguiculata, к460

клубеньки, шт/раст. вирулентность, % клубеньки, шт/раст. вирулентность, % клубеньки, шт/раст. вирулентность, % клубеньки, шт/раст. вирулентность, %

Ву 10 3,7 60-100 2,2 30-100 5,5 10-100 5,8 0-100

Вр 14 3,1 50-100 3,3 0-100 8,4 10-100 0 0

Фз 4 1,9 22-90 12,3 75-100 0,3 0-40 0,2 0-11

648а 1 7,6 100 2,5 50 0,1 11 0 0

*Ву - V. unguiculata, Вр - V. radiata, Фз - фасоль золотистая.

В настоящее время поводится определение вирулентности этих штаммов, и в первую очередь на сое. Предполагается, что вновь выделенные штаммы чистых культур ризобий из клубеньков некоторых зернобобовых культур относятся к новым видам бактерий, ноду-лирующих сою (табл. 2).

Другое приоритетное направление работы лаборатории в настоящее время - поиск препаратов, способных в той или иной степени стимулировать симбиотическую азотфик-сацию в посевах сои и изучение их совместимости с коллекционными штаммами.

В 2009-2010 гг. в полевых мелкоделяночных опытах на луговых черноземовидных почвах изучали влияние анализируемых препаратов на урожай семян сои сорта Гармония. Использовали общепринятую методику проведения полевых опытов [5]. Препараты «Инозит», «Янтарная кислота», «Индолилуксусная кислота», «Максим», «Круйзер» и «Новосил» применяли для предпосевной обработки семян сои, микроэлементы FeSO4, М^04 и MgSO4 - для опрыскивания посевов сои дважды: в фазу конца цветения и фазу начала плодообразования. Работы выполняли на фоне предпосевной обработки семян сои штаммом ризобий сои ББ-49. Все изучаемые препараты достоверно повысили урожайность семян сои (табл. 3).

Таблица 3

Влияние изучаемых препаратов на урожайность семян сои сорта Гармония

Вариант Урожайность семян, т/га Прибавка урожайности семян

2009 г. 2010 г. в среднем т/га % к контролю

Контроль 1,95 2,89 2,42 - -

Инозит 2,11 3,10 2,60 0,18 7

Максим 2,18 3,01 2,59 0,17 7

Круйзер 2,27 3,12 2,69 0,27 11

Новосил 2,14 2,93 2,53 0,11 4

Янтарная кислота 2,28 3,38 2,83 0,41 17

ИУК 2,15 3,15 2,65 0,23 9

MgSO4 2,33 3,04 2,68 0,26 11

FeSO4 2,13 3,33 2,73 0,31 13

м^о4 2,15 3,16 2,65 0,23 9

В 2013-2014 гг. в полевых условиях на сорте сои МК 100 проведено совместное испытание стимуляторов роста «Дигидрокверцетин», «Арабиногалактан», «Лариксин» с запатентованными коллекционными штаммами ризобий ББ-49 и СМ-42. Получена достоверная прибавка урожайности семян сои (2,7-3,7 ц/га).

Таким образом, многолетнее всестороннее изучение дальневосточных природных популяций клубеньковых бактерий позволило выявить их видовое многообразие, определить препараты, стимулирующие симбиотическую азотфиксацию. В результате разработан способ определения размеров симбиотической азотфиксации у сои, отобраны наиболее ценные штаммы ризобий по хозяйственно полезным свойствам. Создана уникальная коллекция чистых культур этих микроорганизмов, на их основе разработано микробиологическое удобрение «БиоБеСтА».

ЛИТЕРАТУРА

1. Андросов И.С. О микробиологической активности почв Приамурья // Вопросы развития сельского хозяйства Приамурья. Благовещенск: Амур. кн. изд-во, 1955. С. 55-60.

2. Бегун С.А. Влияние клубеньковых бактерий на продуктивность сои в районах давнего соесеяния: авто-реф. дис. ... канд. биол. наук. Л.: ВАР, 1983. 16 с.

3. Бегун С.А. Особенности свойств штаммов клубеньковых бактерий сои амурского происхождения // Проблемы соеводства на Дальнем Востоке: сб. науч. тр. Новосибирск: ДВО РАСХН, 1992. С. 70-76.

4. Бегун С.А., Якименко М.В. Способ определения размеров симбиотической азотфиксации у сои в полевых условиях: пат. 2514664; опубл. 27.04.2014, Бюл. № 12.

5. Бегун С.А., Тильба В.А. Способы, приемы изучения и отбора эффективных штаммов клубеньковых бактерий сои. Методы аналитической селекции. Благовещенск: Зея, 2005. 70 с.

6. Тен Хак Мун. Микробиологические процессы в почвах островов Притихоокеанской зоны. М.: Наука, 1977. 180 с.

7. Тильба В.А. Аборигенная популяция ризобий сои основной соесеющей зоны России: дис. . д-ра биол. наук в форме науч. доклада. Владивосток, 1998. 47 с.

8. Тильба В.А., Бегун С.А., Якименко М.В. Изучение природных популяций клубеньковых бактерий сои российского Дальнего Востока // Аграрные проблемы научного обеспечения Дальнего Востока: сб. науч. тр. / ВНИИ сои, ДВРНЦ, РАСХН. Благовещенск: ООО «Типография», 2004. С. 5-8.

9. Тильба В.А., Голодяев Г.П. Микробиологические исследования некоторых почв под посевами сои на Дальнем Востоке // Бюл. ВНИИ сои. Вып. 3/4. Новосибирск: Сов. Сибирь, 1975. 66 с.

10. Якименко М.В. Изменение свойств клубеньковых бактерий сои родов Bradyrhizobium и Sinorhizobium амурской селекции под воздействием экологических факторов: автореф. дис. ... канд. биол. наук. Благовещенск: Изд-во ДальГАУ, 2006. 23 с.