Способ оценки состава биопленок грамположительных бактерий
METHOD OF ASSESSING THE COMPOSITION OF BIOFILMS OF GRAM-POSITIVE BACTERIA

Изобретение относится к медицине, а именно к микробиологии, инфекционным болезням, дезинфектологии и может быть использовано для изучения действия факторов на биопленку и биопленкообразующую способность грамположительных микроорганизмов.
Биопленки - высокоорганизованные, подвижные, непрерывно изменяющиеся гетерогенные сообщества микроорганизмов, состоящие, как правило, из клеточной части и, преимущественно полисахаридного, матрикса, обеспечивающего защиту от неблагоприятных внешних факторов, в том числе эффекторов иммунитета и антибиотиков, снижая эффективность антибиотикотерапии в десятки раз (Сидоренко С.В. и соавт., 2017). Существующие методы визуализации биопленки не предусматривают дифференцированной окраски ее компонентов, т.к. нет возможности установить субстрат, окрашиваемый генцианвиолетом, поскольку этот краситель может формировать комплексы как с внутриклеточными, так и внеклеточными структурами. Такой подход не позволяет адекватно оценивать антибиопленочные эффекты препаратов, в то время как результаты изучения взаимодействия лекарственных средств с компонентами биопленки могут обеспечивать их наиболее корректный выбор.
Известен способ оценки биопленокоообразующей способности микроорганизмов при 45-минутной экспозиции в 0,1% водном растворе генцианвиолета с последующей его экстракцией спиртом в течение 45 минут [Карпова Т.Н., Дронина Ю.Е., Алексеева Н.В., Романова Ю.М., Тартаковский И.С. Формирование биопленок Legionella spp. в эксперименте // Журн. микробиол. - 2008. - №1. - С. 1-7.].
Недостатки прототипа: недостаточная точность способа из-за отсутствия возможности дифференцировки компонентов биопленки, длительность процедуры.
Технический результат: повышение информативности способа за счет дифференцировки клеточной составляющей и матрикса биопленки, сокращение времени процедуры.
Сущность метода заключается в том, что для оценки компонентного состава биопленок используют двухэтапный подход, позволяющий на первом этапе оценить долю матрикса, а на втором - ее клеточные и экстрацеллюлярные (внеклеточные) компоненты в совокупности. Такой дифференцированный анализ дает возможность определять точки действия лекарственных препаратов и повышать терапевтический эффект за счет комбинации лекарственных средств, с различными мишенями действия.
Способ осуществляют следующим образом:
Биопленки исследуемых культур формируют в плоскодонных микротитрационных планшетах традиционным способом, подготавливая не менее 5 повторностей на каждый вариант эксперимента. Далее в планшет вносят 0,1%-водный раствор генцианвиолета на 5 минут, а затем раствор Люголя на 2 минуты. По окончании окраски планшеты промывают забуференным раствором и высушивают на воздухе, предохраняя их от попадания солнечных лучей. В таком состоянии планшеты можно хранить.
На первом этапе часть лунок (не менее 5) заливают 70% спиртом и сразу же переносят элюат в новую планшету.
На втором этапе другую часть лунок (не менее 5) так же заливают 70% спиртом и выдерживают 15 минут, после чего собирают элюат в новую планшету.
Все пробы фотометрируют при длине волны 560 нм.
Для вычисления доли матрикса и клеточной составляющей в составе биопленки используют формулу:
бв
15
М=(ОП/ОП)×100,
Кб=100-М, где
М - доля матрикса, %
Кб - доля клеточной составляющей, %
бв
ОП - оптическая плотность проб, когда спирт для элюации выдерживали не более 1 минуты,
15
ОП - оптическая плотность проб, когда спирт для элюации выдерживали 15 минут.
Примеры конкретного выполнения
Пример 1. В планшеты с готовыми биопленками Staphylococcus aureus вносили 200 мкл 0,1%-водного раствора генцианвиолета на 5 минут. Окрашивание проводили в темноте. После инкубации краситель из планшета сливали и однократно промывали. Затем вносили 200 мкл раствора Люголя на 2 минуты. Завершали процедуру окраски - промывкой планшета и его высушиванием. После высушивания в лунки планшета вносили 200 мкл 70% раствора спирта. Часть лунок после внесения спирта тут же декантировали, перенося элюат в новую планшету для фотометрии, а вторую половину лунок выдерживали со спиртом не менее 15 минут. Фотометрирование проводили при 560 нм.
бв
15
Штамм S. aureus АТСС 28922: ОП=0,310; ОП=2,356; М=13,2%; Кб=86,8%. В составе биопленки, сформированной коллекционным штаммом удельный вес матрикса составляет 13,2%, а на клеточный компонент приходится 86,8%. Такое соотношение компонентов соответствует оптимальному для стафилококков уровню, что обусловлено адекватными условиями культивирования штамма.
Пример 2. Чтобы оценить влияние лизоцима на биопленкообразующую способность штамма Staphylococcus aureus АТСС 28922 при формировании биопленок в планшеты дополнительно вносили раствор лизоцима гидрохлорида в концентрации 1 мг/мл. На сформированные биопленки добавляли по 200 мкл 0,1%-водного раствора генцианвиолета на 5 минут. Окрашивание проводили в темноте. После инкубации краситель из планшета сливали и однократно промывали. Затем вносили 200 мкл раствора Люголя на 2 минуты. Завершали процедуру окраски - промывкой планшета и его высушиванием. После высушивания в лунки планшета вносили 200 мкл 70% раствора спирта. Часть лунок после внесения спирта тут же декантировали, перенося элюат в новую планшету для фотометрии, а вторую половину лунок выдерживали со спиртом не менее 15 минут. Фотометрирование проводили при 560 нм.
бв
15
Штамм S. aureus АТСС 28922 после культивирования в присутствии лизоцима гидрохлорида: ОП=0,834; ОП=2,559; М=32,6%; Кб=67,4%. В составе биопленки, сформированной коллекционным штаммом при действии лизоцима, удельный вес матрикса составляет 32,6%, а клеточный компонент - 67,4%, что связано с ингибирующим действием фермента на планктонные формы. Ответная реакция проявляется интенсификацией биопленкообразования за счет формирования защитного матрикса, что указывает на нецелесообразность использования лизоцима в терапии.
Пример 3. Для оценки действия цефазолина на биопленкообразующую способность штамма Staphylococcus aureus АТСС 28922 в лунки планшета дополнительно вносили раствор антибиотика в концентрации 50 мкг/мл. На готовые пленки S. aureus в планшеты вносили 200 мкл 0,1%-водного раствора генцианвиолета на 5 минут. Окрашивание проводили в темноте. После инкубации краситель из планшета сливали и однократно промывали. Затем вносили 200 мкл раствора Люголя на 2 минуты. Завершали процедуру окраски - промывкой планшета и его высушиванием. После высушивания в лунки планшета вносили 200 мкл 70% раствора спирта. Часть лунок после внесения спирта тут же декантировали, перенося элюат в новую планшету для фотометрии, а вторую половину лунок выдерживали со спиртом не менее 15 минут. Фотометрирование проводили при 560 нм.
бв
15
Штамм S. aureus АТСС 28922 после культивирования. в присутствии цефазолина: ОП=0,189; ОП=0,453; М=41,7%; Кб=58,3%. В составе биопленки, сформированной коллекционным штаммом при действии цефазолина, удельный вес матрикса увеличивается до 41,7%, а доля клеточного компонента существенно снижается. Полученный результат связан с действием антибиотика, который, как известно, ингибирует синтез основного вещества клеточной стенки стафилококков - пептидогликана. В результате этого число клеток в биопленке существенно снижается. Оставшиеся жизнеспособными клетки стафилококка, компенсаторно увеличивают продукцию веществ матрикса для защиты от антибиотика. В связи с этим, при использовании цефазолина необходимо дополнять терапевтическую схему препаратами (протеазы, липазы, нуклеазы), действие которых направлено на разрушение матрикса.
Положительный эффект заявляемого способа состоит в следующем: способ оценки компонентного состава биопленок грамположительных бактерий позволяет отдифференцировать внеклеточные вещества и структуры матрикса биопленки, окрашиваемые генцианвиолетом, обеспечивая получение дополнительной информации, способствующей повышению эффективности антимикробной терапии, при сокращении времени исследования.