СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ ВИРУСНЫХ ЧАСТИЦ С УПРОЩЕННЫМ ГЛИКОЗИЛИРОВАНИЕМ ПОВЕРХНОСТНЫХ БЕЛКОВ

1. Способ получения моногликозилированного вируса гриппа, который включает:
a) наращивание гемагглютинин-антигена (НА) вируса гриппа в подходящем хозяине с эффективным количеством ингибитора маннозидазы, где концентрация ингибитора маннозидазы достаточна для ингибирования α-маннозидазы I в пути N-гликозилирования; и
b) выделение НА-антигена вируса гриппа и приведение его в контакт с эндогликозидазой (Endo H), где концентрация Endo H достаточна для удаления гликанов с высоким содержанием маннозы; и
c) выделение моногликозилированного НА-антигена вируса гриппа.
2. Способ по п. 1, в котором НА-антиген получен из высокопатогенного вируса гриппа H5N1.
3. Способ по п. 2, в котором высокопатогенным вирусом гриппа H5N1 является NIBRG-14.
4. Способ по п. 1, в котором ингибитором маннозидазы является кифунензин (Kif).
5. Способ по п. 1, в котором ингибитором маннозидазы является деоксиманноджиримицин (DMJ).
6. Способ по п. 1, в котором НА-антиген вируса гриппа рекомбинантно получен в клеточной культуре.
7. Способ по п. 1, в котором клеточная культура содержит клетки MDCK, клетки Vero или клетки PER.С6.
9
2
8. Способ по п. 1, в котором результатом ингибирования α-маннозидазы I являются гликопротеины с Man(GlcNAc).
9. Способ по п. 1, в котором НА-антиген вируса гриппа содержит целый вирус гриппа.
10. Способ по п. 9, в котором целый вирус гриппа выращен в хозяине, курином яйце с зародышем, свободном от особых патогенов (SPF).
11. Способ по п. 10, в котором кифунензин добавлен в алантоисную полость куриного яйца с зародышем, свободного от особых патогенов (SPF).
12. Способ по п. 6, в котором куфунензин добавлен к клетке-хозяину, содержащей рекомбинантный НА-антиген гриппа.
13. Способ по п. 11, в котором кифунензин добавлен в концентрации от 0,005 до 0,5 мг/мл.
14. Способ по п. 12, в котором кифунензин добавлен в концентрации от 0,005 до 0,5 мг/мл.
15. Способ по п. 6, в котором извлечение НА-антигена гриппа включает выделение рекомбинантно-продуцируемого НА-антигена гриппа из клетки-хозяина.
16. Способ по п. 10, в котором извлечение НА-антигена гриппа включает инкубацию в течение времени, достаточного для роста вируса гриппа; и затем выделение алантоисной жидкости, содержащей вирус гриппа.
17. Способ по п. 15, в котором высвобожденный НА-антиген вируса гриппа обрабатывается от около 0,1 до около 100 мкг/мл Endo Н.
18. Способ по п. 16, в котором высвобожденный НА-антиген вируса гриппа обрабатывается от около 0,1 до около 100 мкг/мл Endo Н.
19. Способ по п. 16, в котором моногликозилированный вирус гриппа выделен способом, включающим ультрацентрифугирование в градиенте плотности.
20. Способ по п. 1, дополнительно включающий очистку моногликозилированного НА-антигена вируса гриппа способом, включающим ультрафильтрацию.
21. Способ по п. 20, в котором ультрафильтрация включает применение 0,2 мкм фильтра.
22. Способ по п. 1, дополнительно включающий анализ моногликозилированного вируса гриппа с помощью электронной микроскопии.
23. Способ по п. 1, дополнительно включающий количественное определение моногликозилированного вируса гриппа способом, включающим обработку РNGазой.
24. Способ по п. 1, дополнительно включающий количественное определение моногликозилированного вируса гриппа способом, включающим электрохроматографию ДСН-ПААГ.
25. Способ по п. 1, дополнительно включающий анализ композиции гликанов выделенного моногликозилированного вируса гриппа способом, включающим масс-спектрометрию.
26. Способ по любому из пп. 1-25, в котором НА-антиген вируса гриппа выбирают из группы, состоящей из H1, Н3 и Н5 моногликозилированных гликопротеинов вируса гриппа.
27. Моногликозилированный НА-антиген вируса гриппа (целый или рекомбинантный вирус) полученный способом по любому из пп. 1-26.
28. Применение моногликозилированного НА-антигена вируса гриппа (целого вируса или рекомбинанта), полученного способом по любому из пп. 1-26, для приготовления вакцины.
29. Способ получения вируса с упрощенным гликаном, который включает:
a) наращивание антигена из вируса в подходящем хозяине с эффективным количеством ингибитора гликозилирования, где концентрация ингибитора гликозилирования достаточна для ингибирования гликозидазы в пути N-гликозилирования; и
b) извлечение вирусного антигена и приведение его в контакт с эндогликозидазой; и
c) выделение вирусного антигена с упрощенным гликаном.
30. Способ по п. 29, в котором вирус выбран из ортомиксовируса, ретровируса и флавивируса.
31. Способ по п. 29, в котором вирус выбирают из HIV, HCV, вируса Денге, вируса Западного Нила и вируса гриппа.
32. Способ по п. 29, в котором ингибитор гликозидазы выбран из кинефузина, австралина, кастаноспермина, деоксиноджиримицина, деоксиманноджиримицина, свайнсонина и манностатина А.
33. Способ по п. 29, в котором вирусный антиген рекомбинантно продуцируется в клеточной культуре.
34. Способ по п. 33, в котором вирусный антиген содержит целый вирус.
35. Способ по п. 34, в котором целый вирус выращен в клеточной культуре.
36. Способ по п. 29, в котором упрощенный гликан является моногликозилатом.