Сравнительный анализ критериев формирования групп морских свинок используемых для моделирования реакций гиперчувствительности замедленного типа

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ КРИТЕРИЕВ ФОРМИРОВАНИЯ ГРУПП МОРСКИХ СВИНОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ДЛЯ МОДЕЛИРОВАНИЯ РЕАКЦИЙ ГИПЕРЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ

ЗАМЕДЛЕННОГО ТИПА

Ю.М. Мясоедов

Аннотация. В исследовании представлен сравнительный анализ критериев, используемых при формировании групп морских свинок, используемых для постановки тестов гиперчувствительности замедленного типа. Показана возможность применения критерия, характеризующегося зависимость между воспалительной реакцией в месте введения M. bovis и воспалительной реакцией в месте введения ППД туберкулина.

Ключевые слова: гиперчувствительность замедленного типа, микобактерии M. bovis, ППД туберкулин, воспалительная реакция, морские свинки.

Туберкулиновая гиперчувствительность замедленного типа (ГЗТ) является клеточно опосредованным иммунным ответом IV типа, развивающегося в организме млекопитающих на введение микобактерий M. bovis. При моделировании туберкулиновой ГЗТ используются сельскохозяйственные и лабораторные виды животных. Наиболее часто в качестве лабораторной модели применяются морские свинки, так как их восприимчивость к представителям рода Mycobacterium, в сравнении с другими животными выше [2]. Способность микобактерий вызывать состояние гиперчувствительности у морских свинок явилось основанием для разработки ряда тестов, таких как: оценка качества противотуберкулёзных вакцин [3]; определение биологической активности инфекционных аллергенов [1].

В свою очередь, при определении биологической активности ППД туберкулина для получения достоверных результатов методически предусмотрено формирование групп экспериментальных животных по следующим критериям: полу, массе, возрасту [1]. При этом, в ходе клинических наблюдений, в гуманной медицине была выявлена зависимость критерия размера воспалительной реакции в месте внутрикожного введения ми-кобактерий с критерием размера воспалительной реакции в месте введения ППД туберкулина. Данная взаимосвязь широко используется во фтизиатрии [5].

Зависимость, выявленная в клинических исследованиях, предполагает наличие подобной зависимости и у морских свинок в процессе моделирования туберкулиновой ГЗТ, определение которой может быть использовано при формировании групп морских свинок. Принимая во внимание выше изложенное целью исследования было: сравнительный анализ критериев подбора групп морских свинок, используемых для определения биологической активности ППД туберкулина.

В исследовании применялись рандинбредные самки морских свинок, альбиносы, одномоментно полученные из НЦБМТ РАМН (Крюково), массой 500-650 гр, содержащиеся на стандартном гранулированном корме ПТ-90 со свободным доступом к воде. Всего в исследованиях было использовано 67 голов.

В работе был использован туберкулин очищенный ППД для млекопитающих (производство ФГУП «Курская биофабрика») с содержанием 10000 МЕ/см3 (PPD-bovine), разведение которого осуществляли на фосфатном буфере (рН 7,0).

В исследовании были использованы микобактерии M. bovis штамм BCG (ФГУП «НПО» Микроген), из которых приготавливали суспензию на фосфатном буфере (рН 7,0) для последующей внутрикожной сенсибилизации животных.

Статистическую обработку результатов эксперимента проводилась при помощи программного обеспечения

Microsoft office Excel 2007 и методами биометрии. Результаты принимались за достоверные при р< 0,05 [7].

Исследование было осуществлено в 2 этапа. При реализации первого этапа была определена корреляционная зависимость между массой тела, воспалительной реакции в месте введения ППД и воспалительной реакции в месте введения M. bovis. При реализации второго этапа исследования была изучена статистическая ценность критерия зависимости воспалительной реакции в месте внутрикожного введения микобактерий с размером воспалительной реакции в месте введения ППД туберкулина.

Для выполнения первого этапа была сформирована группа морских свинок по массе, возрасту, масти, полу (n=25). Животные были внутрикожно сенсибилизированы микобактериями M. bovis BCG, в дозе 0,2 мг/0,1см3. Через месяц после сенсибилизации морским свинкам внутрикожно в кожу боковой поверхности справа и слева вводили три разведения ППД туберкулина в дозе 20 МЕ и три разведения в дозе 2 Me (PPD- bovine). Всего каждому животному было осуществлено 6 инъекций. Через 24 часа после введения разведений были определены и рассчитаны средние взаимно перпендикулярные размеры воспалительной реакции в месте введения ППД с последующим суммированием значений отдельно по каждому животному, что соответствовало I ряду переменных. Последовательно измерена воспалительная реакция в месте введения M. bovis с расчётом среднего значения, что составляло II ряд переменных, и определена масса тела, что составляло III ряд переменных. Результаты измерений представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Статистические значения критериев, M±m

Критерии

Суммарное значение воспалительной реакции в месте введения ППД

73,6±4,83 9,45±0,60 583±17,32

Значения массы тела, размера воспалительной реакции в месте введения M. bovis, размера воспалительной реакции в месте введения ППД были использованы для оценки корреляционной зависимости. Результаты анализа представлены в таблице 2.

Проведённый анализ продемонстрировал, что критерии характеризуются различной зависимостью между собой. Так, корреляция между суммарным значением воспалительной реакции в месте введения ППД и массой тела была ниже среднего уровня - 0,26 (0,3<r<0,5) и не достигала заданного уровня значимости (р>0,05).

Таблица 2 - Значение коэффициента корреляции между критериями__

Вариант Зависимость между критериями Значение r

1 I - II 0,40*

2 II - III 0,33

3 I - III 0,26

Примечание:* Значение достоверно

Коэффициент корреляции между значением воспалительной реакции в месте введения M. bovis и массой тела соответствовал среднему уровню - 0,33, но также не достигал необходимого уровня значимости (р>0,05). В свою очередь, зависимость между воспалительной реакцией в

месте введения M. bovis и суммарным значением воспалительной реакции в месте введения ППД составила -0,40 и соответствовало заданному уровню значимости (р< 0,05). Значение зависимости между воспалительной реакцией в месте введения M. bovis и суммарным значением воспалительной реакции в месте введения ППД, полученная при исследованиях на морских свинках, согласуется с данными на людях и предполагает её практическое использование при формировании групп морских свинок для определения биологической активности ППД туберкулина. Вместе с тем, для выявленной зависимости параметром, предполагающим практическое использование, является специфичность, определяемая при моделировании туберкулиновой аллергии в условиях использования гетерологичного аллергена и сенсибилизации M. bovis. Гетерологичными аллергенами, используемыми для диагностических целей в стране, являются КАМ и ППД для птиц [6]. В свою очередь, учитывая то, что КАМ включает микобактериальные аллергены микобактерий (М. scrofulaceum и M. intracellularae), относящиеся по классификации Раньона ко 2 и 3 группам [7]. При этом М. scrofulaceum характеризуются высокой степенью гомологии с avium [6], что, в свою очередь, обуславливает преимущество при проведении исследований использование КАМ в сравнении с ППД для птиц.

Учитывая вышеизложенное изучение корреляционной зависимости было проведено на гомологичный (ППД для млекопитающих) и гетерологичный (КАМ) аллергены на морских свинках сенсибилизированных M. bovis. При проведении исследования предварительно были подобраны дозировки аллергенов, обеспечивающие развитие ГЗТ на сенсибилизированных морских свинок не ниже 8 мм и не более 25 мм, соответствующие ППД туберкулина для млекопитающих - 8 IU, а для КАМ - 20 ЕД.

При реализации данного этапа сенсибилизация морских свинок осуществлялась, аналогично как при проведении первого этапа исследований (n=25). Через месяц после сенсибилизации животным внутрикожно в кожу боковой поверхности справа и слева инъецировали по одной дозе КАМ и ППД для млекопитающих. Результаты исследований представлены в таблице 3.

Результаты, полученные при проведении второго этапа исследования, продемонстрировали наличие достоверной (р< 0,05) положительной зависимости между воспалительной реакцией в месте введения M. bovis и воспалительной реакцией в месте введения ППД для млекопитающих соответствующее среднему уровню - 0,46. В то же время корреляционная зависимость между воспалительной реакцией в месте введения M. bovis и воспалительной реакцией в месте введения КАМ соответствовала нулевому значению, что в свою очередь свидетельствует о специфичности разработанного критерия.

лина в качестве критерия применять значение воспалительной реакции в месте введения M. bovis.

Показана корреляционная зависимость между значением воспалительной реакции в месте введения M. bovis и значением воспалительной реакции в месте введения туберкулина ППД для млекопитающих, позволяющих использовать в качестве критерия при формировании групп морских свинок, используемых для определения величины биологической активности аллергена.

Список использованных источников

1 ГОСТ 16739-88. Туберкулин сухой очищенный (ППД) для млекопитающих. - М.: Изд-во стандартов. - 21с.

2 Каркищенко Н.Н. Основы биомоделирования. - М.: Межакадемическое изд-во ВПК, 2004. - 607 с.

3 Клименко, Л.И., Полякова Т.С., Бучковская И.Ю. Оценка качества вакцинации БЦЖ по развитию поствакцинального знака // Запорожский медицинский журнал. - 2012. -№1 (70). - С. 86-88.

4 Кошечкин В.А., Иванова З.А. Туберкулёз. - М.: ГЭО-ТАР-Медиа, 2007. - 302 с.

5 Лакин Г.Ф. Биометрия. - М.: Высшая школа, 1990. -С.50-51.

6 Наставление по диагностике туберкулёза животных. Утверждено Департаментом ветеринарии Минсельхоза РФ 18 ноября 2002 г. - М., 2002. - 63 с.

7 Ященко Т.Н., Мечева И.С. Руководство по лабораторным исследованиям при туберкулёзе. - М.: Медицина, 1973. -260 с.

Информация об авторе

Мясоедов Юрий Михайлович, кандидат биологических наук, ФГУП «Курская биофабрика», е-mail: MyasoedovYurij@ Yandex.ru, тел. 8-905-042-61-32.

Таблица 3 - Статистические значения и коэффициент корреляции между гомологичным и гетерологичным аллергенами на группе морских свинок

Показатели Статистически показатели

M ± m r

Значение воспалительной реакции в месте введения M. bovis, мм 9,06±0,6 -

Значение воспалительной реакции в месте введения ППД, мм 13,94±0,87 0,46*

Значение воспалительной реакции в месте введения КАМ, мм 18,0±0,60 0,04

Примечание:* Значение достоверно (р< 0,05).

Таким образом, полученные данные позволяют при формировании групп морских свинок в опытах по определению биологической активности ППД туберку-