Влияние экстремальных значений Pн на морфологические особенности дрожжей Saccharomyces cerevisiae

УДК 663.125/663.252.4

ВЛИЯНИЕ ЭКСТРЕМАЛЬНЫХ ЗНАЧЕНИЙ рН НА МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ДРОЖЖЕЙ БЛССИАЯОМУСЕБ СЕЯЕУ1Б1ЛЕ

© 2018 Э.А. Исламмагомедова, Э.А. Халилова, С.Ц. Котенко, Р.З. Гасанов, Д.А. Аливердиева

Прикаспийский институт биологических ресурсов Дагестанского научного центра РАН, г. Махачкала

Статья поступила в редакцию 30.07.2018

Изучено влияние экстремальных условий на физиологическое состояние клеток дрожжей Saccharomyces. В работе использовались штамм S. cerevisiae Y-503, гетерозиготный тетраплоид, полученный методом селекции в результате лазерного воздействия на смешанную культуру клеток промышленных штаммов, и S. cerevisiae DAW-3a - гетероталличный гаплоид, потомок линии штамма Y-503. Показано, что функциональное состояние дрожжей тесно связано с их морфологическими параметрами. В условиях рН - стресса происходят изменения формы и размеров клеток Y-503 и DAW-3a, обнаружено наличие зернистой цитоплазмы, крупные вакуоли в отдельных клетках. Обнаружено, что экстремальные условия влияют на морфологические особенности гигантских колоний. Оптимальным для роста колоний исследуемых дрожжей является рН 4.5, при этом клетки Y-503 и DAW-3a были достаточно устойчивы к экстремально высоким (11.0) и низким (3.0) рН. В условиях экстремальных концентраций МаС1 и рН клетки приобретали округлую форму, для гигантских колоний было характерно уменьшение размеров, изменение поверхности, профиля и структуры. Показано, что исследуемые штаммы S. cerevisiae по-разному реагируют на вариации концентраций соли и значений рН. Возможно, это объясняется различной плоидно-стью Y-503 и DAW-3a. Показана способность S. cerevisiae Y-503 и S. cerevisiae DAW-3a к росту в неблагоприятных условиях, что делает эти штаммы дрожжей перспективными для использования в различных биотехнологиях.

Ключевые слова: дрожжи БассЬагошусеБ, морфология, клетки, гигантские колонии, экстремальные условия, стресс.

Большой интерес исследователей к изучению стрессовых воздействий на микроорганизмы и механизмов регуляции метаболизма клеток в процессе антистрессовой адаптации объясняется актуальностью поиска экстремо-фильных штаммов - перспективных объектов различных биотехнологий [1 - 4]. В уникальных природных экосистемах, где экстремальные значения рН часто сочетаются с высокими кон-

Исламмагомедова Эльвира Ахмедовна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории биохимии и биотехнологии. E-mail: islammagomedova@mail.ru Халилова Эсланда Абдурахмановна, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории биохимии и биотехнологии. E-mail: eslanda61@mail.ru

Котенко Светлана Цалистиновна, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории биохимии и биотехнологии. Гасанов Расул Закирович, младший научный сотрудник лаборатории биохимии и биотехнологии. E-mail: gacanov@bk.ru

Аливердиева Динара Алиевна, кандидат биологических наук, зам. директора по научной работе, зав. лаб. биохимии и биотехнологии. E-mail: aliverdieva_d@mail.ru

центрациями солей, микроорганизмы располагают комплексом адаптационных механизмов. Так, уравновешивание внешнего осмотического давления происходит либо за счет накопления или синтеза цитоплазматических осморегуля-торов, либо в результате накопления заряженных ионов из окружающей среды [5]. В биотехнологических процессах жизнеспособность штаммов дрожжей, устойчивых к экстремальным условиям, может быть повышена в результате предварительного воздействия небольших доз стрессоров [6].

Известно, что при выращивании дрожжей на средах с высоким рН и содержанием ЫаС1 клетки становятся более округлыми; происходит стабилизация липидного состава митохон-дриальных мембран, накопление ионов натрия, свободных жирных кислот и аминокислот, что дает возможность клетке нейтрализовать повышенное содержание соли в среде культивирования [7]. В ответ на стресс при низких значениях рН происходит изменение клеточного метаболизма дрожжей Б. cerevisiae: перегруппировка ли-пидов и уменьшение фосфатидилхолина, одного из основных компонентов клеточной мембраны; перераспределение углеводов в клеточной стенке; значительное изменение белков агрегации, ответственных за снижение темпов ро-

ста клеток [8]. Одним из механизмов адаптации некоторых культур микроорганизмов, существующих в природе при низких рН, являются происходящие изменения в последовательности нуклеотидов в хромосомной ДНК [9, 10]. В щелочной среде культивирования происходит увеличение содержания белков митохондрий относительно белков цитоплазмы [11], проявляется способность ферментов функционировать при высоких значениях рН. Так, оптимумы рН большинства ферментов галоалкалофильных микроорганизмов находятся в области щелочных значений.

Независимо от вида воздействия, в экстремальных условиях происходят индукция стресс - белков, накопление полифосфатных и появление липидных гранул, появление в составе липидов жирных кислот с длинной цепью, однотипные изменения ультраструктуры клеток дрожжей - увеличение размеров митохондрий, повышение численности и размеров перокси-сом [9, 12].

Дрожжи обладают высокой адаптивной способностью, обеспечивающей их существование в экстремальных условиях среды. В этом плане представляет интерес изучение физиологического состояния клеток дрожжей в условиях стресса. Целью работы является исследование влияния различных значений рН на морфологические особенности Saccharomyces cerevisiae.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследований являлись штаммы S. cerevisiae Y-503 и S. cerevisiae DAW-3a из коллекций лаборатории биохимии и биотехнологии ПИБР ДНЦ РАН и Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ФГУП Гос-НИИГенетика. Штамм S. cerevisiae Y-503 получен в результате лазерного воздействия на промышленный штамм S. cerevisiae 73 в Прикаспийском институте биологических ресурсов ДНЦ РАН [13]. Штамм Y-503 является гетерозиготным те-траплоидом, штамм DAW^ - гетероталличным гаплоидом, потомком линии штамма Y-503 [14]. Принадлежность штаммов S. cerevisiae Y-503 и S. cerevisiae DAW^ к таксону S. cerevisiae была подтверждена с помощью молекулярно-генетиче-ских методов [14].

Штаммы дрожжей выращивались на твердой стандартной среде YPD: дрожжевой экстракт - 0.5 % (BD, США), пептон - 0.5 % (BD, США), глюкоза (D-глюкоза) - 2.0 % (Merk, Германия), агар-агар - 2.5 % (Difco, Нидерланды) на чашках Петри в течение двадцати суток при температуре 30оС при значениях рН: 3.0, 4.5, 7.0, 9.0, 11.0. Кислотность среды корректировалась 1N HCl или 4М KOH (Россия). Для приготовления агаризованной среды с рН 3.0 растворы YPD и

агар-агара автоклавировались отдельно, а затем стерильно объединялись [15].

В работе использовались приборы: ламинарный бокс ВЛ-12 1000 (Россия), сушильный шкаф SNOL 67/350 (Utenos, Литва), микроскоп СХ21 (Olympus, Япония), pH- метр Анион 4100 (Анион, Россия); весы аналитические DV215CD (Ohaus Discovery, Швейцария).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Показано, что в условиях рН - стресса происходят морфологические изменения клеток и гигантских колоний штаммов S. cerevisiae Y-503 и S. cerevisiae DAW-3a. Морфологические параметры клеток дрожжей тесно связаны с их функциональным состоянием. Обнаружено наличие зернистой цитоплазмы, подтверждающей присутствие запасных питательных веществ; 15 % клеток содержало крупную вакуоль. Проведенный морфометрический анализ исследованных штаммов показал, что изменение рН среды отразилось на форме и размерах клеток (рис. 1). Обнаружено, что при культивировании на твердых средах для клеток штамма Y-503 характерно появление R - форм, в отличие от штамма DAW-3a. При выращивании дрожжей на средах с низким содержанием pH 3.0 количество клеток R - формы составляло почти 50 %, и по мере увеличения рН количество таких клеток уменьшалось. В щелочной среде культивирования (pH 11.0) клетки R - формы полностью отсутствовали. Во всех вариантах форма клеток Y-503 в основном овальная, но имелись и округлые клетки небольшого размера. Клетки DAW-3a были более однородны и имели в основном округлую форму. Можно сделать вывод, что значение рН 4.5 среды являлось оптимальным для роста обоих штаммов дрожжей.

При культивировании на средах с низким значением pH 3.0 наблюдалось уменьшение размеров клеток дрожжей, особенно штамма DAW-3a. В щелочных условиях обнаружено разнообразие клеток Y-503, однородность и небольшое уменьшение размеров DAW-3a (таблица).

Одним из параметров, по которому оценивали действие рН на физиологические особенности штаммов Y-503 и DAW-3a, была морфология гигантских колоний. Нами исследованы двадцатисуточные культуры, выращенные в чашках Петри при 30°С на плотной питательной среде при pH 3.0, 4.5, 7.0, 9.0 и 11.0. Обнаружено, что происходящие в экстремальных условиях трансформации в биохимических процессах и скорости клеточного деления дрожжей оказывают влияние и на морфологические особенности колоний.

Морфологические исследования показали незначительное изменение формы (округлая,

Таблица. Изменение формы и размеров (мкм) клеток Б. сетеу1з1ае У-503 и Б. сетеу1з1ае DAW-3a при выращивании на питательной среде с различными значениями рН

значения рН

рН 3.0 рН 4.5 рН 7.0 рН 9.0 рН 11.0

ШтаммыК

Б. cerevisiae Форма: Я-; Форма: Я-; Форма: Форма: Форма:

У-503 овальная; овальная; овальная; Я- овальная; Я- овальная

округлая Размеры: 4x15; 8x10; 6x7; 3x3; 2x3 округлая Размеры: 4x15; 8x9; 7x8;5x6; 3x3 Размеры: 4x15; 4x10; 4x9;8x9;6x7; 5x6; 3x3 Размеры: 8x8; 6x8; 4х9;4х6 Размеры: 7x9; 5x6;4x6; 2x3

Б. cerevisiae Форма: Форма: Форма: Форма: Форма:

ЭЛШ-Зя округлая округлая; округлая округлая; округлая

Размеры: 10x12; 6x7; 5x6; 3x3; 2x3 овальная Размеры: 10x12; 7x8; 5x6; 3x3 Размеры: 8x9; 6x7;5x6; 3x3 овальная Размеры: 7x9; 8x8:6x7; 5x6 Размеры: 6x7; 5x5; 4x5; 2x3

а)

рНЗ рН 4.5 рН 7.0 рН 9.0 рН 11.0

б)

Рис. 1. Влияние различных значений рН на морфологию клеток Б. сегЫз{ае У-503

в виде цветка), поверхности (радиально исчерченная), профиля (плоский, со слегка выпуклым центром), цвета (бежевый с сероватым оттенком) и структуры (пастообразная, мажущаяся) макроколоний. Установлено, что в процессе роста оба штамма проявили достаточную устойчивость к экстремальным значениям рН. При этом выявлено существенное изменение размеров гигантских колоний У-503 и ЭЛШ-За в зависимости от рН среды (рис. 2).

Обнаружено, что значение рН 4.5 являлось оптимальным для роста колоний обоих штаммов дрожжей. Дрожжевые клетки достаточно устойчивы к значительным изменениям рН окружающей среды. Однако внутриклеточные процессы обладают высокой чувствительностью к рН, постоянная величина которой поддерживается с помощью эффективных буферных систем. По сравнению с оптимальными значениями повышение или уменьшение рН среды культивирования сначала снижает, а затем приостанавливает рост дрожжевых клеток.

При выращивании дрожжей на средах с экстремально низким значением рН 3.0 размер колоний по сравнению с оптимальным рН уменьшался почти в 1.9 (У-503) и 1.8 раза (БЛШ-3а).

Установлено, что при культивировании дрожжей на средах с рН 7.0 размер колоний по сравнению с рН 4.5 уменьшился в 1.7 (У-503) и 2.4 раза (БЛШ-3Л). Среда с нейтральным значением рН для исследуемых штаммов не являлась оптимальной, однако существенного ингибирования роста дрожжей не наблюдалось.

В щелочных условиях (рН 9.0 и 11.0) нами так-

же обнаружена способность дрожжевых клеток к адаптации. При этом установлено уменьшение размеров гигантских колоний при выращивании на средах с экстремально высокими рН в 2.6 раз (У-503) и в 2.4 - 2.7 раза (БЛШ-3а) соответственно по сравнению с оптимальным рН.

Проведенный нами анализ морфологических особенностей гигантских колоний и клеток У-503 и БЛШ-3а в зависимости от экстремальных значений рН среды показал, что изученные дрожжи обладают способностью активно развиваться в неблагоприятных условиях: на средах с экстремально высокими (11.0) и низкими (3.0) рН, что делает эти штаммы перспективными для использования в биотехнологии производства спирта, целлюлозы, осмотически активных веществ, биополимеров, ферментов.

Обнаружено, что морфологические особенности исследуемых дрожжей зависят не только от условий культивирования, но и от свойств различных штаммов. Как было сказано выше, при критических значениях рН клетки штамма БЛШ-3а были более однородны и имели в основном округлую форму. Гигантские колонии также имели отличия, в том числе размеры колоний У-503 были несколько больше по сравнению с другим вариантом (рис. 3). Возможно, это объясняется различной плоидностью штаммов У-503 и БЛШ-3а. Известно, что одним из механизмов адаптации дрожжей является полиплоидия [16], часто приводящая к диверсификации генетической информации [17] и обеспечивающая преимущество определенного фенотипа в условиях стресса [18].

а)

рН 3.0

рН 4.5

рН 7.0

рН 9.0

рН 11.0

б)

Рис. 2. Влияние различных значений рН на морфологию гигантских колоний 5. cerevisiae У-503

6-

Е -

£ ^

24

О §

£ 1-1

1 -

♦У, сегел^шае У-503 Л\ сегеушае ОА\У -За

ш

0

8

10

-1 12

рН среды

Рис. 3. Динамика изменения размеров гигантских колоний дрожжей БассНаютусеБ в зависимости от экстремальных значений рН

а)

рН 9.0 + НаС1 рН 9.0

б)

Рис. 4. Особенности роста клеток (а) и гигантских колоний (б) 5. сегеухБхае У-503 на средах при рН 9.0 в присутствии и отсутствии 5% №С1

В целях исследования адаптации дрожжей в условиях многофакторного влияния окружающей среды были изучены морфологические показатели дрожжей У-503 при культивировании на средах с экстремальными значениями №С1 и

рН (рис. 4). Показано, что, в отличие от колоний, культивируемых при рН 9.0, гигантские колонии, выращенные на средах с содержанием КаС1 5% при рН 9.0, характеризуются уменьшением размеров (более чем в 2 раза), изменением по-

верхности (радиально исчерченная, с каймой) и профиля (более выпуклый), уплотнением структуры. Клетки приобретали более округлую форму, что находит подтверждение в литературе [7].

Таким образом, экстремальные значения рН существенно влияют на морфофизиоло-гические и культуральные свойства дрожжей Saccharomyces. Показаны морфологические изменения клеток и гигантских колоний штаммов Y-503 и DAW-3a в условиях рН - стресса. Оптимальным для роста дрожжей является рН 4.5, при этом клетки исследованных штаммов были достаточно устойчивы к экстремальным значениям рН 3.0 и рН 11.0. Представленные результаты выполнены в рамках исследований по адаптации микроорганизмов к стрессу и могут быть полезны для решения практических задач, связанных с разработкой биотехнологий, основанных на использовании устойчивых к экстремальным условиям штаммов дрожжей.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Caspeta L., Nielsen J. Thermotolerant yeast strains adapted by Laboratory evolution show trade-off at ancestral temperatures and preadaptation to other stresses // MBio. 2015. 6(4): 431-446. doi: 10.1128/ mBio.00431-15

2. Аливердиева Д.А. Мамаев Д.В., Лагутина Л.С., Шольц К.Ф. Особенности изменения содержания субстратов эндогенного дыхания в клетках Saccharomyces cerevisiae при низкой температуре // Биохимия. 2006. 71(1): 50-58. doi: 10.1134/ S0006297906010056

3. Borrull A., Lopez-Martínez G., Miro-Abella E., Salvado Z., Poblet M., Cordero-Otero R., Rozes N. New insights into the physiological state of Saccharomyces cerevisiae during ethanol acclimation for producing sparkling wines // Food Microbiology. 2016. 54: 20 - 29.

4. Zhao X.O., Bai F.W. Mechanisms of yeast stress tolerance and its manipulation for efficient fuel ethanol production. Biotechnology. 2009. 144(1): 2330. doi: 10.1016/j.jbiotec

5. Деткова Е.Н., Болтянская Ю.В. Осмоадаптация галоалкалофильных бактерий: роль осморегуля-торов и возможности их практического применения // Микробиология. 2007. 76(5): 581-593. doi: 10.1134/S0026261707050013

6. Balakumar S., Arasaratnam V. Osmo-, thermo- and ethanol- tolerances of Saccharomyces cerevisiae S1 // Brazilian Journal of Microbiology. 2012. 43(1): 157166. doi: 10.1590/S1517-838220120001000017

7. Секова В.Ю., Исакова Е.П., Дерябина Ю.И. Применение экстремофильных дрожжей Yarrowia lipolytica в биотехнологии (обзор) // Прикладная биохимия и микробиология. 2015. 51(3): 290-304. doi: 10.7868/

S0555109915030150

8. Berterame N.M, Porro D., Ami D., Branduardi P. Protein aggregation and membrane lipid modifications under lactic acid stress in wild type and OPI1 deleted Saccharomyces cerevisiae strains // Microbial Cell Factories. 2016. 15(39): 1-12. doi: 10.1186/s12934-016-0438-2

9. Weissgram M., Gstottner J., Lorantfy B., Tenhaken R., Herwig C., Weber H.K. Generation of PHB from spent sulfite liquor using halophilic microorganisms // Microorganisms. 2015. 3: 268 - 289. doi: 10.3390/ microorganisms3020268

10. Maruyama Y., Toshiyuki I., Kodama H., Matsuura A. Availability of amino acids extends chronological lifespan by suppressing hyper-acidification of the environment in Saccharomyces cerevisiae// PLoS ONE. 2016. 1(3): 1-19. doi: 10.1371/journal.pone.0151894

11. Гусева М.А., Эпова Е.Ю., Ковалёв Л.И., Шевелёв А.Б. Изучение механизмов адаптации дрожжей Yarrowia lipolytica к щелочным условиям среды методами протеомики // Прикладная биохимия и микробиология. 2010. 46(3): 336-341.

12. Аринбасарова А.Ю., Бирюкова Е.Н., Меденцев А.Г. Антистрессовые системы дрожжей Yarrowia lipolytica (Обзор) // Прикладная биохимия и микробиология. 2015. 51(2): 122-131. doi: 10.7868/ S0555109915020026

13. Абрамов Ш.А., Котенко С.Ц., Далгатова Б.И., Маммаев А.Т., Пейсахова Д.С. Штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae Y-503, используемый в производстве хлебобулочных изделий // Патент СССР 1284998 (С12 N 1/18, С12 R 1:865). 1987. 3: 104.

14. Аливердиева Д.А., Мамаев Д.В., Лагутина Л.С. Транспорт сукцината в клетки Saccharomyces cerevisiae после продолжительной холодовой преинкубации // Прикладная биохимия и микробиология. 2009. 45(5): 577-585. doi: 10.1134/ S0003683809050111

15. Пименова М.Н., Гречушкина Н.Н. Руководство к практическим занятиям по микробиологии (под ред. Н.С. Егорова, 3-е издание). М.: МГУ, 1995. 224 с.

16. Swinnen S., Fernandez-Nino M., Gonzalez-Ramos D., Antonius J.A., Maris A.J.A., Nevoigt E. The fraction of cells that resume growth after acetic acid addition is a strain-dependent parameter of acetic acid tolerance in Saccharomyces cerevisiae // Yeast Research. 2014. 14: 642-653. doi: 10.1111/1567-1364.12151

17. Storchova Z. Ploidy changes and genome stability in yeast // Yeast. 2014. 31: 421-430. doi: 10.1002/ yea.3037

18. Anderson C.A., Roberts S., ZhangH., Kelly C.M., Kendall A., Lee C., Gerstenberger J., Koenig A.B., Kabeche R., Gladfelter A.S. Ploidy variation in multinucleate cells changes under stress // Mol .Biol. Cell. 2015. 26(6): 1129-1140. doi: 10.1091/mbc.E14-09-1375

INFLUENCE OF EXTREME pH ON MORPHOLOGICAL FEATURES OF YEAST SACCHAROMYCES CEREVISIAE

© 2018 E.A. Islammagomedova, E.A. Khalilova, S.Ts. Kotenko, R.Z. Gasanov, D.A. Aliverdieva

Caspian Institute of Biological Resources of Dagestan Scientific Centre RAS, Makhachkala

The effect of extreme conditions on the physiological state of yeast Saccharomyces cells was studied. The strain S. cerevisiae Y-503, heterozygous tetraploid, which was obtained by means of selection method after laser action on a mixed cell culture of industrial strains, and S. cerevisiae DAW-3a is a heterothallic haploid, a descendant of line strain Y-503, were used in the work. It was shown that the functional state of yeast was closely related to their morphological parameters. Under conditions of pH stress, changes in the shape and size of Y-503 and DAW-3a cells occured, the presence of a granular cytoplasm a large vacuole in individual cells. It was found that in extreme conditions also affect the morphological features of giant colonies. PH 4.5 was optimal for growth of the yeast colonies, while the Y-503 and DAW-3a cells were sufficiently resistant to extremely high (11.0) and low (3.0) pH. In conditions of extreme NaCl and pH the cells acquired a rounded shape, for giant colonies a decrease of sizes, a change of the surface, profile and structure were characteristic. It was shown that the studied S. cerevisiae strains react differently to variations of salt concentrations and pH values. Perhaps this is due to the different ploidy of Y-503 and DAW-3a. Demonstrated ability of S. cerevisiae Y-503 and S. cerevisiae DAW-3a to grow in unfavorable conditions makes these strains promising objects for use in various biotechnologies. Keywords: yeast Saccharomyces, morphology, cells, giant colonies, extreme conditions, stress

Elvira Islammagomedova, Candidate of Biological Sciences, Senior Researcher at the Laboratory of Biochemistry and Biotechnology. E-mail: islammagomedova@mail.ru. Eslanda Khalilova, Candidate of Biological Sciences, Leading Researcher at the Laboratory of Biochemistry and Biotechnology. E-mail: eslanda61@mail.ru Svetlana Kotenko, Candidate of Biological Sciences, Leading Researcher at the Laboratory of Biochemistry and Biotechnology.

Rasul Gasanov, Associate Researcher at the Laboratory of Biochemistry and Biotechnology. E-mail: gacanov@bk.ru

Dinara Aliverdieva, Candidate of Biological Sciences, Deputy Director on Scientific Work, Head at the Laboratory of Biochemistry and Biotechnology. E-mail: aliverdieva_d@mail.ru