Эффективность некоторых новых противоопухолевых препаратов на моделях опухолей человека

творческий исследовательский контакт этих специалистов с патологами для более интенсивного внедрения результатов исследований в клиническую практику.

Рассматривая роль патологической анатомии в клинической онкологии на современном этапе, следует уделить особое внимание проблеме так называемого терапевтического патоморфоза опухолей. Наряду с определением уровней или степеней морфологической зрелости различных новообразований, с которыми может быть связана чувствительность последних к различным терапевтическим воздействиям, патологам приходится выяснять критерии оценки реакции опухолевых структур на различные виды лечебных воздействий для объективного суждения об их эффективности. Проблема эта представляется достаточно сложной, особенно в настоящее время и в ближайшей перспективе, когда на смену традиционным химиолучевым воздействиям, по-видимому, все в большем объеме будут приходить как неспецифические, так и специфические иммунобиологические методы и факторы с использованием иммуномодуляторов (интерферон, интерлейкин и другие лимфокины). При этих формах терапевтического воздействия, кроме местных процессов дегенеративно-дистрофического характера, вероятно, будут возникать общерезорбтив-ные процессы с извращенными токсико-аллер-гическими реакциями в организме-опухоленоси-теле, которые потребуют сёрьезной общебиологической и общепатологической оценки.

Специальное внимание современной клинической патологии привлекает проблема так называемых «малых раков», или «минимальных нео-плазий». Это касается новообразований практически любой локализации и относится как к солидным опухолям, так и к системным поражениям. Хотя само понятие «минимальная нео-плазия» еще не получило достаточно точного определения, тем не менее эта проблема реально стоит перед патологами и клиницистами и требует своего решения как в смысле точного

определения стадии поражения, так и в отношении объема терапевтических воздействий и прогноза. В известной мере для лимфопролиферативных поражений и лейкозов данная проблема может быть связана с выявлением групп повышенного риска и разработкой мер первичной профилактики.

Таким образом, патологическая анатомия играет существенную и даже базовую роль в современной клинической онкологии. В ее задачи входит разработка номенклатуры и принципов классификации опухолей, предопухолевых и опухолеподобных процессов; детальная морфологическая диагностика опухолей; оценка эффективности методов противоопухолевой терапии; выяснение причин и механизмов смерти онкологических больных. В этом отношении патологическая анатомия не может, избежать элементов прагматизма и в значительной мере по объему своей деятельности призвана отвечать на повседневные практические запросы онкологической клиники.

Однако подлинно крупных научных достижений онкопатология может добиться не путем дифференциации знаний и дальнейшего дробления этой научной дисциплины, а посредством широкой интеграции на базе глубокого и всестороннего изучения явлений с мультидисципли-нарным подходом к сумме фундаментальных и конкретных фактов, добытых различными научными дисциплинами.

Поступила 08.01.90

ROLE AND POSITION OF PATHOLOGY IN THE MODERN CLINICAL ONCOLOGY

Yu. N. Soloviev

The pathological anatomy has a very important significance and carries out basic role in the modern clinical oncology. Pathology gave majority of names and classifications of the tumors. It is absolutely necessary for diagnostics and for choosing correct treatment for all tumors. But for future development pathology needs multidisciplinary approaches to all scientific data of modern oncology.

Экспериментальные исследования

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 1990 УДК 615.277.3

И. К. Бухарова, Е. С. Ревазова, Л. В. Мороз ЭФФЕКТИВНОСТЬ НЕКОТОРЫХ НОВЫХ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ПРЕПАРАТОВ НА МОДЕЛЯХ ОПУХОЛЕЙ ЧЕЛОВЕКА

НИИ клинической онкологии и лаборатория экспериментальных моделей опухолей

Вопросы корреляции экспериментального прогнозирования противоопухолевой активности препаратов и данных клинической апробации остаются в центре проблем химиотерапии. При пред-клиническом изучении новых отечественных препаратов впервые изучен спектр их действия на моделях опухолей человека-, созданных в ВОНЦ АМН СССР. Эти модели — штаммы опу-

холей человека, трансплантированные оестимус-ным мышам и крысам,— оригинальны, ранее не изучались, поэтому исследованы параметры развития опухолей и состояние животных, чувствительность серии штаммов к препаратам разных классов.

В работе приводятся сведения об активности I . указанных моделях препаратов двух классов — гормоноцитостатика (кортифен) и платиновых комплексов (оксоплатина и циклоплатам), что позволяет предположить их клиническую эффективность при соответствующих заболеваниях.

Методы исследования. Исследования проводили на бестимусных мышах BALB/c возрастом 6—8 нед и беспородных бестимусных крысах возрастом 4—6 нед с перевиваемыми штаммами опухолей человека, которые получены в лаборатории экспериментальных моделей в результате серийных трансплантаций операционного материала или клеточных культур опухолей человека и морфологически им

соответствуют [5]. Штаммы припивали подкожно взвесью опухолевых клеток в растворе Хеикса. За ростом опухолей следили в динамике, измеряя их объем каждые 4 -5 дней, определяли периоды максимального роста каждого штамма, продолжительность жизни животных с трансплантатами. Бес-тимусных животных распределяли на контрольные и опытные группы по 4—6 животных в каждой, лечение начинали через 7—15 дней после прививки при наличии пальпируемых опухолей объемом 0,3—1,5 см3. Применяли оптимальные режимы и дозы и рациональные пути введения. Противоопухолевый эффект оценивали по проценту торможения роста опухолей, вычисленному по разности объемов опухолей в опытных и контрольных группах, а также по увеличению продолжительности жизни животных. В ряде опытов определяли состав и морфологию периферической крови (из хвостовой вены) через 5—6 дней после введения препаратов.

Результаты и о б с у ж д е н и е. Синтезированный в ВОНЦ гормоноцитостатик кортифен — сложный эфир хлорфенацила и кортикостероидного гормона — отобран для клинических испытаний на основе высокой противоопухолевой активности на перевиваемых опухолях мышей: аденокарциномах молочной железы, толстой и тонкой кишки, легкого, раке шейки матки, гепато-мах [3]. В наших исследованиях использованы штаммы двух меланом (Мел-1, Мел-3), трех раков толстой кишки (РТК-1, РТК-2, РТК-7), рака почки (Рпоч-1), рака тела матки человека (РТМ), трансплантированные бестимусным мышам, и хо-рионэпителиомы (ХЭ), рака тела матки (РТМ), саркомы Юинга (СЮ) и фибросаркомы, трансплантированные бестимусным крысам. Кортифен вводили подкожно в лекарственной форме (ампу-лированный раствор в косточковом масле) в дозе 40 мг/кг одно- и двукратно. Результаты исследований представлены в табл. 1.

На меланомы кортифен существенного действия не оказал. Различную чувствительность проявили три штамма аденокарциономы толстой кишки: наименее чувствителен РТК-1, выраженная чувствительность у РТК-2 и РТК-7 (ТРО — 70— 80%). Оба чувствительных штамма по гистологической картине — низкодифференцированные аденокарциномы с выраженным слизеобразова-нием, РТК-7 — с солидными участками. Нечув-

ствительна аденокарцинома средней степени диф-ференцировки.

Светлоклеточный рак почки, полученный из операционного материала, также чувствителен к кортифену: в течение месяца после однократного введения терапевтический эффект сохранялся на уровне 60—70 %.

Низкодифференцированный рак тела матки чувствителен при прививке как мышам (самкам и самцам), так и крысам. Выраженный и стойкий эффект получен после однократного введения мышам (более 60%) и двукратного — крысам (90 %).

При трансплантации крысам хорионэпителио-мы противоопухолевый эффект в течение 20 дней составлял от 80 до 60 %. Аналогичную активность проявил кортифен и при фибросаркоме, меньшую (50 %) — при саркоме Юинга.

Кортифен несколько (не более, чем на 50%) увеличивал продолжительность жизни мышей с раком почки, мышей и крыс — с раком тела матки, крыс — с хорионэпителиомой и фибро-саркомой.

Удовлетворительное состояние животных в процессе опытов свидетельствовало об оптимальном режиме лечения. Действие на кровь было умеренным: через 5 дней после однократного введения в дозе 40 мг/кг у бестимусных мышей с Мел-1 общее количество лейкоцитов снизилось до 74 %, лимфоцитов — до 73 %, нейтро-филов—до 81 % от контрольного уровня.

Таким образом, кортифен проявил выраженную активность против штаммов рака тела матки, хорионэпителиомы, рака почки, двух из трех аденокарцином толстой кишки, фибросаркомы и слабую активность при саркоме Юинга и меланоме.

В ВОНЦ АМН СССР продолжается углубленное предклиническое изучение двух отечественных комплексов платины: оксоплатины и цик-лоплатама. Оксоплатина (комплекс четырехвалентной платины) синтезирован в ИОиНХ АН СССР им. Н. С. Курнакова. Оба комплекса в активности на перевиваемых опухолях мышей

Таблица 1

Противоопухолевая активность кортифена (40 мг/кг) на штаммах опухолей человека

Продолжительность жизни, дни Средний объем опухолей в конце опыта, см3 Торможение роста опухоли, %

Штамм Пол Режим введения срок после лечения, ДНИ

контроль ОПЫТ контроль ОПЫТ контроль опыт

Мыши

Мел-1 Самцы 40/10 днейХ2 60 (31—78) 38 (17—61) 6,2 4,4 35 55

Мел-3 Самцы 40X1 34 (12—63) 33 (18—44) 5,7 4,1 25 27

РТК-7 Самцы 40/9 днейХ2 30 (17—46) 28 (13—48) 13,9 5,2 80 70

РТК-2 Самки 40X1 33 (21—51) 35 (26—45) 16,3 13,3 69 10

РТК-1 Самки 40X1 30 (21—42) 29 (17—40) 15,7 13,1 0 20

Рпоч-1 Самцы 40X1 51 (48—56) 77 (73—83) 6,9 2,6 70 69

РТМ Самки 40X1 19 (13—35) 25 (14—52) 11,5 3,9 60 66

Самцы 45X1 18 (14—24) 20 (11—23) 11,2 4,1 40 63

РТМ

ХЭ

сю

ФС

Самки

Самки

Самцы

Самцы

40/9 днейХ2 40X1 40X1 40X1

Крысы 31

157

70

42

34

21

24

39

8,7

53

81

50

82

94

67

0

74

2 В-к ВОНЦ № 1

9

Противоопухолевая активность оксоплатины и циклоплатама на штаммах опухолей человека

Штамм Препарат Доза, мг/кг одно- крат- но Продолжительность жи.-мш мышей, дни Средний объем опухоли о конце опыта, см* Тор можение роста опухоли, %

контроль опыт контроль ОПЫТ срок после лечения, дни

10 1 20 30

Оксоплатина 60 44 (15—57) 59 (35—111) 10,9 1,2 90 95 90

Мел-1 Оксоплатина 60 70 (55—98) 61 (30—100) 12,3 0,9 90 98 92

Циклоплатам 60 Забиты через 20 дней 8,4 1,9 67 77

Платидиам 5 60 (31—78) 55 (23—82) 3,5 1 40 21 58

Мел-2 Циклоплатам 60 38 (37—39) 36 (25—47) 14 3,1 25 78

Оксоплатина 60 34 (22—63) 48 (30—67) 5,7 3,6 36 37 37

Мел-3 Циклоплатам 60 40 (25—47) 50 (47—56) 7,6 3,9 40 48

Платидиам 5 34 (22—63) 38 (18—54) 5,7 2,4 33 44 58

Рпоч-1 Оксоплатина 60 60 (48—69) 83 (64—109) 6,9 2,3 81 81 67

Оксоплатина 60 48 (46—49) 48 (44—52) 49 17 83 66 65

Циклоплатам 60 48 (46—49) 47 (35—58) 49 23,5 65 63 53

ЛБ-1 Оксоплатина 60 41 (34—45) 44 (18—69) 72 0,5 89 86 99,9

Циклоплатам 60 41 (34—45) 55 (18—95) 72 8 91 79 89

не уступали американской цис-платине, широко применяемой в химиотерапии [4].

Оксоплатину и циклоплатам изучали на штаммах меланомы (Мел-1, Мел-2, Мел-3), рака почки (Рпоч-1, Рпоч-2), лимфомы Беркитта (ЛБ-1) человека. Препараты растворяли в физиологическом растворе и вводили в адекватных по токсичности дозах. Результаты изучения противоопухолевой активности приведены в табл. 2.

Высокочувствительным к изученным комплексам оказался штамм лимфомы Беркитта: торможение роста опухолей после однократного введения оксоплатины составляет 99 %, циклоплатама— 89%. Оксоплатина значительно и длительно тормозила рост двух штаммов рака почки (67—83 %). Активность циклоплатама на этой модели несколько слабее (53—65 %). На Мел-1 оксоплатина проявила высокую стойкую активность (90 %) в течение 1 мес после однократного введения, активность циклоплатама меньше— 77%, такой же эффект циклоплатама и на Мел-2. Платидиам (чешский аналог цис-пла-тины) на Мел-1 менее активен, чем оксоплатина и циклоплатам. Мел-3 оказался малочувствительным к платиновым комплексам.

В наших исследованиях ранее было показано, что трансплантация опухолей человека вызывает различные при разных штаммах изменения морфологических и цитохимических показателей периферической крови бестимусных мышей, которые наиболее стабильны при меланоме [1, 2]. Изменения периферической крови после введения оксоплатины, циклоплатама и платидиама изучили у мышей со штаммом Мел-1. Через 6 сут отмечена умеренная лейкоцитопения за счет снижения лимфоцитов: до 44 % от контроля после введения оксоплатины, до 32 % после введения циклоплатама. При этом число сегментоядерных элементов было несколько повышенным по сравнению с контролем (особенно после введения циклоплатама). Следовательно, оксоплатина и циклоплатам проявили выраженную активность на

штаммах меланомы, рака почки и лимфомы Беркитта.

Таким образом, изученные препараты двух классов проявили различную активность на штаммах опухолей человека, что предполагает и различия в чувствительности соответствующих опухолей у человека. Пареллельно с противоопухолевым эффектом выявлено умеренное действие соединений на периферическую кровь бестимусных мышей.

Изложенные результаты исследований позволяют предложить апробирование изученных препаратов при соответствующих формах злокачественных заболеваний: кортифен — при раке тела матки, хорионэпителиоме, фибросаркоме, светлоклеточном раке почки, низкодифференцированной аденокарциноме толстой кишки; оксоплатину и циклоплатам — при резистентном к химиотерапии раке почки и при чувствительной к химиотерапии лимфоме Беркитта; отечественные комплексы платины целесообразно включить в клиническую полихимиотерапию меланом вместо зарубежной цис-платины.

ЛИТЕРАТУРА

1. Бухарова И. К-, Осокина Л. И., Ревазова Е. С. // Вестн. АМН СССР,— 1988,— Т. 5,— С. 61—63.

2. Бухарова И. К-, Осокина Л. И., Ревазова Е. С. //Экспер. онкол.— 1988.— № 5.— С. 55—57.

3. Лагова Н. Д., Киселев В. И., Курдюмова К. Е. и др. // Вопр. онкол.— 1989.— № 4.— С. 450—455.

4. Пресное М. А., Коновалова А. Л., Горбунова В. А.// Веетн. АМН СССР,— 1986,- Т. 12,— С. 79—89.

5. Ревазова Е. С., Соловьев Ю. Н. // Бюлл. экспер. биол.— 1985,— № 2,— С. 189—191.

Поступила 27.12.89

ON POSSIBILITY OF PREDICTING CLINICAL EFFICACY OF DRUGS USING HUMAN TUMOR MODEL SYSTEMS

I. К. Bukharova, E. S. Revazova, L. V. Moroz

Activity of hormonocytostatic cortifen and platinum complexes oxoplatin and cycloplatam has been shown using human tumor strains transplanted to nude mice and rats. The

action of the drugs on the peripheral blood was determined as moderate. Basing on the investigations’ results it can be suggested to test clinical effectiveness of cortifen against uterine cancer, chorionepithelioma, fibrosarcoma, renal and colon cancer. Oxoplatin and cycloplatam are supposed to have activity against melanoma, kidney cancer and Burkitt’s lymphoma.

© Ю. М. ВАСИЛЬЕВ, И. Д. КАРАВАНОВА УДК 576.535.5:576.311.577.271.37

Ю. М. Васильев, И. Д. Караванова

ДЕЙСТВИЕ ОПУХОЛЕВОГО ПРОМОТОРА, 12-0-ТЕТРА-ДЕКА НО ИЛ ФОРБОЛ-13-АЦЕТАТА НА КУЛЬТИВИРУЕМЫЕ ЭПИТЕЛИАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ

НИИ канцерогенеза

12-0-тетрадеканоилфорбол- 13-ацетат (ТФА) — наиболее мощный из известных в настоящее время агентов, способных вызывать промоцию экспериментального химического канцерогенеза кожи, т. е. активировать и доводить до конца развитие папиллом и карцином из эпидермиса после первоначального (индуцирующего) воздействия канцерогенных веществ [5, 8]. Многие данные указывают на то, что действие агентов-промоторов играет важную роль в развитии опухолей человека. Поэтому исследование механизмов действия ТФА представляет значительный интерес. Недавно выяснен молекулярный механизм действия ТФА: оказалось, что это вещество является мощным и весьма специфичным активатором фермента протеинкиназы С, одного из ключевых звеньев в цепи химических процессов, участвующих в проведении сигналов из внешней среды клетки к внутренним ее структурам и определяющих реакцию клетки на эти сигналы [13]. Установлено, что активация протеинкиназы С — важнейшая часть механизма действия по крайней мере 40 типов разных сигнальных молекул-, в том числе многих гормонов и факторов роста. Заменяя нормальные стимуляторы протеинкиназы С, ТФА обратимо приводит клетку в состояние, характеризующее комплекс изменений пролиферации, дифференци-ровки и морфологии [И, 14, 15, 16]. Во многих случаях такие обратимые изменения, вызываемые ТФА, оказались сходными с необратимыми изменениями, типичными для опухолевой трансформации, возникающей в результате изменений генома. Поэтому их иногда обозначают как «фенотипическую трансформацию».

К числу типичных эффектов, вызываемых ТФА, относятся изменения формы клетки, реорганизации межклеточных контактов и цитоскелета [8]. Нашим коллективом [3, 7, 9] был обнаружен и описан новый тип таких реорганизаций, вызываемых ТФА при действии на культивируемые фибробласты: этот эффект выражается в резком усилении разделения клетки на два типа участков: а) подвижные уплощенные (ламеллярные) участки, богатые сетью актиновых микрофила-ментов, и б) неподвижные отростки, бедные актином, но богатые другими цитоскелетными структурами — микро-трубочками и промежуточными филаментами.

Мы высказали предположение, что обнаруженный нами новый механизм — «сегрегация» цитоскелета в результате активации протеинки-

назы С — может играть важную роль в нормальных процессах морфогенеза, например при образовании ' отростков у нервных клеток; многие структурные особенности опухолевых клеток могут быть результатом патологической активации этого механизма.

Важно было выяснить, является ли описанный тип реорганизаций цитоскелета характерным только для фибробластов или общим для различных типов клеток. Поэтому мы исследовали действие ТФА на культивируемые эпителиальные клетки. Результаты этих экспериментов приводятся ниже.

Материалы и методы. В работе использованы клетки эпителия почки собаки линии MDCK. Клетки вели на среде ДМЕМ с 10 % эмбриональной сыворотки (Ин-т им. Гамалеи, Москва). Клетки культивировали в пластиковых чашках (Ленинград) на покровных стеклах. Использован колцемид в концентрации 0,5 7/мл (Serva, ФРГ). 12-0-тетрадеканоилфорбол-13-ацетат (ТФА) (Serva, ФРГ) растворяли в DMSO в концентрации 100 v/мл, хранили при —70 °С, пользовались конечной концентрацией 50 нг/мл.

Морфологические исследования проводили на клетках, фиксированных формалином. Для иммунофлуоресценции клетки предварительно обрабатывали экстрагирующим раствором, содержащим 1 % тритона Х-100 [1], а затем фиксировали 4 % формалином. Поликлональные антитела против тубулина и моноклональные против виментина любезно предоставлены И. С. Тинт. F-актин выявляли с помощью родамин-меченого фаллоидина, полученного от д-ра Виланда (Хейдельберг, ФРГ); моноклональные антитела против кератина № 18 любезно предоставлены д-ром Бартеком (ЧССР). Антитела выявлены с помощью Fitc-меченых антител против иммуноглобулинов мыши (Sigma, USA) или иммуноглобулинов кролика (Sigma, USA).

Результаты. Клетки линии MDCK имеют! полигональную форму, боковые края соседних клеток плотно спаяны друг с другом на всем протяжении; спаянные клетки образуют моно-слойные эпителиальные островки в редкой культуре. В густой культуре такие островки сливаются в сплошной монослой. На свободных краях островков, лишенных контактов с соседями, клетки образуют широкие ламеллярные выросты с полукруглыми краями, лишенные органелл; на контактных краях таких ламелл нет (рис. 1,а).

После инкубации с ТФА (в концентрации 50 нг/мл) в течение 3 ч в редкой культуре MDCK морфология культур резко менялась: компактные эпителиальные островки исчезали, превращаясь в группы клеток, расположенных на том или ином расстоянии друг от друга.

Протяженные «линейные» контакты между клетками исчезали почти полностью, сохранялось иногда лишь небольшое число узких «точечных контактов». Менялась и форма отдельных клеток: они становились более вытянутыми и поляризованными, на некоторых участках краев клеток имелись веерообразные широкие ламеллы, тогда как на других участках периферии образовывались узкие, почти прямые, иногда ветвящиеся отростки длиной, равной 5—7 диаметрам тела клетки. На концах отростков видны небольшие ламеллы (рис. 1,6).

Антитела против тубулина в контроле окрашивали хорошо развитую радиальную систему микротрубочек. В клетках, обработанных ТФА, микротрубочки образовывали толстые тяжи на протяжении всей длины отростка.

Окрашивание фаллоидином выявляло в контроле в клетках много прямых пучков актиновых микрофиламентов (стресс-фибрилл) и хорошо выраженные краевые тяжи актина в области кле-