Роль альтернативного сплайсинга генов цитокинов в формировании полиморфной структуры цитокиновой сети

Медицинская иммунология

2001, Т. 3, № 3, стр 389-400 UOJOpbl

© 2001, СПб РО РААКИ

РОЛЬ АЛЬТЕРНАТИВНОГО СПЛАЙСИНГА ГЕНОВ ЦИТОКИНОВ В ФОРМИРОВАНИИ ПОЛИМОРФНОЙ СТРУКТУРЫ ЦИТОКИНОВОЙ СЕТИ

Сенников С.В., Силков А.Н., Козлов В.А.

Институт клинической иммунологии СО РАМН, г. Новосибирск

Резюме. В представленном обзоре рассмотрена роль альтернативного сплайсинга генов цитокинов в формировании полиморфных вариантов белков цитокиновой сети. Изоформы цитокинов, образующиеся в результате альтернативного сплайсинга соответствующих мРНК, являются продуктами одного и того же гена, но обладают иными, иногда противоположными эффектами на клетки и могут в значительной степени изменять опосредованные ими клеточные реакции. Их экспрессия может меняться в онтогенезе и для ряда изоформ цитокинов имеет тканеспецифический характер. Механизм альтернативного сплайсинга генов часто используется в клетках человека и животных для образования растворимых и мембраносвязанных форм рецепторов. Изучение тканеспецифической экспрессии различных изоформ цитокинов может во многом поменять наши взгляды на регуляцию в гемо- и иммунопоэзе, а также дать в руки клинических иммунологов специфические биологические препараты с новыми свойствами.

Ключевые слова: экспрессия генов, цитокины, альтернативный сплайсинг, изоформы.

Sennikov S.V., Silkov A.N., Kozlov VA.

THE ROLE OF CYTOKINE GENE ALTERNATIVE SPLICING IN THE FORMATION

OF POLYMORPHIC STRUCTURE OF THE CYTOKINE NETWORK

Abstract. This review concerns the role of alternative splicing of cytokine genes in the formation of polymorphic variants of the cytokine network proteins. Cytokine isoforms resulting from alternative splicing of correspondent mRNA are the products of the same gene but they have different and in some cases opposite influence on target cells and can change cell reactions they mediate. Their expression can vary during ontogenesis and have tissue-specific nature for some cytokine isoforms. Aalternative splicing mechanism is used in human and animal cells for the production of soluble and membrane-bound receptors. The investigation of tissue-specific expression of cytokine isoforms may change our view on regulation of hemo- and immunopoiesis and provide clinical immunologists with specific biological pharmaceuticals with new properties.

Система цитокинов представляет собой универ- лено, что цитокины могут продуцироваться различ-

сальную регуляторную сеть медиаторов, предназна- ными типами клеток организма, что, с одной отороченных для контроля процессов пролиферации и ны, затрудняет понимание роли того или иного типа

дифференцировки клеточных элементов в крове- клеток - продуцентов цитокина - в регуляции про-

творной, иммунной и в других гомеостатических цессов пролиферации, дифференцировки и функ-

системах организма. Каждый цитокин характеризу- циопальной активности различных типов клеток, а

ется целым спектром различных эффектов на раз- с другой-расширяет наши представления об их ре-

личные ткани, причем биологические эффекты раз- гуляторной роли.

личных цитокинов могут перекрываться. Установ- В многочисленных исследованиях, выполнен-

____________________________________________ ных за последние 5-7 лет, продемонстрировано су-

Адрес для переписки: • шествование новых механизмов для формирования

Сенников Сергей Витальевич, полиморфной структуры системы цитокинов. Это

Институт клинической иммунологии СО РАМН, аллельный полиморфизм генов цитокинов и альтер-

630099, Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14. нативный сплайсинг генов цитокинов. С одной сто-

Тел.: (383-2) 221910, факс (383-2) 227028. роны, эти механизмы формируют еще более слож-

E-ma.il: ici@online.nsk.su ную полиморфную цитокиновую сеть в организме,

но с другой стороны, они позволяют взглянуть на ее организацию с новой стороны.

В представленном обзоре будет рассмотрена роль альтернативного сплайсинга генов цитокинов в формировании полиморфных вариантов белков цитоки-новой сети.

Альтернативный сплайсинг - это способ процессинга про-мРНК с образованием семейства близких по строению мРНК, каждая из которых состоит из специфического набора экзонов и кодирует одну из изоформ белка. Альтернативный сплайсинг позволяет получать разные продукты от одного единственного гена без изменения его геномной организации, посредством продукции мРНК кодирующих структурно родственные белки, одинаковые аминокислотные последовательности которых определяются общими экзонами, а индивидуальные аминокислотные последовательности экзонами, участвующими в альтернативном сплайсинге. Получаемые белки могут выполнять как сходные, так и отличные функции. Сплайсинг транскриптов некоторых генов может происходить по-разному, в зависимости от типа ткани, стадии развития организма, пола [1].

Выделяют несколько типов альтернативного сплайсинга.

Первый тип основан на использовании разных промоторов, отстоящих друг от друга на некотором расстоянии, для получения про-мРНК с отличными по длине 5’ концами.

Пример:Два варианта 1Ь-111А транскрибируются с одного гена, но имеют разные первые экзоны, благодаря использованию разных промоторов и регуляторных с1&-элементов ДНК [29,35].

Второй тип показан для про-мРНК, имеющих 3’ проксимальные последовательности разной длины в результате использования альтернативных сайтов полиаденилирования.

Пример: Таким образом происходит образование секреторной и мембраносвязанной форм ЫЬ-5Я [98].

Третий - наиболее разнообразный и сложный тип альтернативного сплайсинга, при котором из абсолютно идентичных про-мРНК формируются разные функциональные мРНК. В про-мРНК присутствуют все потенциальные экзоны, и при сплайсинге происходит выбор между ними.

Пример: И-482 является производной, альтернативно сплайсированной формой пре-мРНК 1Ь-4, в которой удален 2 экзон [2,93]. Также образуются альтернативные варианты 1Ь-6 [52]и 1Ь-2 [101].

В некоторых случаях в сплайсинге третьего типа могут принимать участие критические сайты сплайсинга, расположенные внутри экзона или интрона, что приводит к укорочению экзона или его удлинению за счет интронной последовательности соответственно. Такой вариант событий возможен только при сохранении соответствующей рамки считывания и свойствен, как правило, вирусам. Однако недавно

было показано наличие и использование криптичес-1сих сайтов сплайсинга такими цитокинами, как: т1Ь-15 (т^оп 5) [80, 76], ТвРа (дополнительный экзон а внутри интрона 5) [110].

Механизм выбора сайтов сплайсинга для генов, и в частности для генов цитокинов, вероятно, неоднозначен. Имеются два основных предположения:

1. Выбор сайтов зависит от структурных элементов самой про-мРНК и промежуточных продуктов сплайсинга т. н. цис-факторов.

2. Основную роль играют транс-факторы, в том числе и тканеспецифичные, белки и другие РНК, влияющие на выбор вырезаемых интронов.

Использование сайтов сплайсинга часто носит иерархический характер, что, возможно, вызвано относительными конкурентными преимуществами предпочтительных 5’ и 3’ сайтов в процессе образования сплайсингосом. В ряде экспериментов показано, что при мутациях в конститутивных сайтах начинают использоваться альтернативные (ранее неиспользуемые) сайты [1].

Влияние транс-факторов также имеет место при альтернативном сплайсинге третьего типа (одинаковых про-мРНК), когда синтез особых малых ядер-ных рибонуклеопротеинов (мяРНП) и белков типа матураз зависит от определенных физиологических условий, типа ткани или стадии развития организма. Механизм альтернативного сплайсинга генов цитокинов в каждом случае будет иметь свои особенности и требует изучения. В 1997 году вышел первый мини-обзор по известным альтернативным сплайс-вариантам цитокинов Б-Р^атаэ. За последние годы список изоформ цитокинов, образующих в результате альтернативного сплайсинга, значительно пополнился и требует обобщения и дальнейшего изучения их биологической функции.

В настоящее время обнаружены изоформы цитокинов, полученных в результате альтернативного сплайсинга для следующих цитокинов: 1Ь-1(3,1Ь-1а,

1Ь2,1Ь-4,1Ь-6,1Ь7,1Ы5, М-СБР, С-СБР, ТвР-а, с-кк, {’аз-антиген, 1Ь-Ша, онкостатин М, рецепторы для 1Ь-2,1Ь-4,1Ь-5, П.-6,1Ь-9, СМ-СБР, эритропоэ-тина, ферментов, участвующих в образовании про-стагландинов и окислов азота, некоторые хемокины (VСАМ) и т. д. Для всех остальных генов цитокинов по-видимому, альтернативные варианты еще не найдены и ждут своих исследователей.

Далее более подробно будут рассмотрены различные примеры изученных форм альтернативного сплайсинга генов цитокинов и их возможное биологическое значение.

В работе КаШ Н., Уоип Н.У. (1996) обнаружен альтернативно сплайсированный транскрипт 1Ь-1Р в мононуклеарных клетках периферической крови человека, стимулированных митогеном. В сплайс, варианте отсутствовал 5 экзон. Этот участок необходим для созревания белка с участием фермента 1Ь-1 (3 -кон-

вертазы. В макрофагах легких свиньи, собак и кошек, стимулированных ЛПС, обнаружены две изоформы мРНК IL-ia. Клонирование и секвенирование короткого и длинного фрагментов показало их идентичность, за исключением специфических 174 нуклеотидных оснований. В макрофагах лошади и коров короткий фрагмент не был идентифицирован [95].

Установлено существование нескольких изоформ IL-IRa в клетках человека и мыши. В разных статьях приводятся разные названия для этих изоформ. В работе Weissbach L. с соавт. (1998) приводится структура экзонов различных изоформ IL-IRa, которые автор обозначил как IL-1SRA, Туре 1IL-1 IRA, Туре 11IL-1 IRA, IL-1 IRAEX0 , В результате альтернативного сплайсинга РНК продуцируются, по крайней мере,

3 иесекреторные формы IL-IRa, не имеющие сигнальных пептидов, конститутивно экспрессирующиеся в эпителиальных клетках и кератиноцитах, обозначенные как Туре 1 IL-1 IRA, Туре 11 IL-1 IRA и IL-1 IRA Кроме того, продуцируется мРНК, кодирующая внеклеточную форму, названную IL-1SRA, экспрессия которой контролируется отдельным промотором [14, 29, 35, 46, 73]. IL-1SRA изоформа весом 17кДа секретируется в виде гликопротеина 22-26 kDa моноцитами, нейтрофилами, фибробластами, эпителиальными и микроглиальными клетками. Внутриклеточная форма 1 типа 18кДа определяется в цитоплазме моноцитов, кератиноцитов, эпителиальных клеток, фибробластов. Вторая внутриклеточная форма 16кДа выявляется в нейтрофилах, гепатоцитах и моноцитах. Третья внутриклеточная изоформа - IL-1 IRAEX0N3 была обнаружена в хондроцитах и кератиноцитах [106]. Таким образом, наблюдается тканеспецифическая экспрессия различных изоформ IL-IRa, функция которых is настоящее время выясняется.

Для IL-2 также проводятся исследования по аль-тернативномому сплайсингу мРНК [101]. Было установлено, что в мононуклеарных клетках периферической крови, стимулированных ОКТЗ моноклональными антителами, идентифицируются 3 формы мРНК IL-2: полноразмерная и изоформы, названные IL-252 и IL-283. При клонировании этих вариантов и их сик-венировании установлено, что IL-252 и IL-253 формы мРНК имеют, соответственно, делеции последовательностей второго и третьего экзонов без сдвига рамки считывания. Авторами были получены рекомбинантные белки этих изоформ и оттестирована их биологическая активность в сравнении с рекомбинантным полноразмерным IL-2. Установлено, что рекомбинантные белки IL-252 и IL-253 не обладали костимулирующим эффектом на пролиферацию мононуклеарных клеток, активированных ОКТЗ моноклональными антителами, в отличие от рекомбинантного полноразмерного IL-2. Более того, при добавлении альтернативных форм IL-2 вместе с полноразмерным IL-2 они ингибировали способность последнего стимулировать пролиферацию активированных мононуклеарных клеток. Далее этой

же группой авторов было показано, что альтернативные формы IL-2 ингибируют способность полноразмерного IL-2, меченного 1И1, связываться с активированными мононуклеарными клетками, экспрессирующими высокоаффинные рецепторы для IL-2. Авторы заключают, что изоформы являются естественными антагонистами IL-2 и могут быть использованы как терапевтические препараты для ингибиции эффектов IL-2 на клетки мишени.

Аналогичные работы проводятся и для IL-4. Альтернативная форма мРНК IL-4 со сплайсированным вторым экзоном, названная IL-452, была описана [2, 93]. Идентичность двух форм мРНК IL-4 подтверждена клонированием и секвенированием полученных последовательностей [7, 84, 93]. Экспрессия мРНК IL-452 обнаружена в мононуклеарных клетках периферической крови у всех доноров [2,93], в Т клетках [2] и В лимфоцитах [56], а также показана в клетках миндалевидной железы, в клетках бронхоальвеолярного лаважа, в клетках легких, кишечника и тимуса [9, 56]. Кроме того, экспрессия мРНК обоих форм IL-4 показана в тканях плаценты, децидуальной ткани амниохориона [25]. В наших исследованиях показано наличие как полноразмерной мРНК IL-4, так и альтернативной формы в эритроидных клетках фетальной печени человека (данные не опубликованы). Наличие двух форм мРНК IL-4 показано в клеточных линиях В95/8, DoHH2, HL60, Jyrkat, К562, Namalwa, P3HR1, Raji [56], причем количественное соотношение двух форм мРНК в этих линиях различное. В работе Alms с соавт. (1996) установлено, что нестимулированные мононуклеарные клетки периферической крови экспрессируют обе формы мРНК IL-4, причем мРНК IL-4 было в 3,5 раза больше, чем мРНК IL-452. При изучении кинетики экспрессии двух форм мРНК IL-4 в стимулированных ОКТЗ моноклональными антителами мононуклеарных клетках периферической крови установлено, что экспрессия мРНК IL-4 возрастает значительнее, чем мРНК IL-452, и на 8 часов она в 7 раз выше, чем альтернативная форма, но к 12 часам это соотношение возвращается к первоначальному соотношению. На 24 и 48 часов соотношение мРНК IL-4 и мРНК IL-452 было как 4:1. Следовательно, внешние воздействия могут менять соотношение двух форм мРНК, экспрессирующейся в мононуклеарных клетках [2]. Этой же группой авторов показано, что у некоторых здоровых доноров экспрессируется больше альтернативной формы мРНК IL-4, чем полноразмерной. Тем не менее, в большинстве исследований показано, что у здоровых доноров экспрессия мРНК IL-4 полноразмерной является доминантой по отношению к альтернативной форме мРНК IL-4. Так, в работе [7] установлено, что только у двух доноров из 20 наблюдается экспрессия мРНК IL-482 выше, чем мРНК IL-4. Напротив, в клетках бронхоальвеолярного лаважа (10 проб) и тимоцитах (3 пробы) была

более выражена экспрессия мРНК IL-452 [7]. Эти данные свидетельствуют, что экспрессия двух форм IL-4 является тканеспецифической.

При различных патологических состояниях наблюдаются изменения в уровне экспрессии мРНК для IL-4 и IL-452. У больных с рассеянным склерозом наблюдается повышение уровня мРНК обоих форм в мононуклеарных клетках периферической крови по сравнению с группой здоровых доноров. Причем уровень альтернативной формы повышается сильнее, чем полноразмерной формы мРНК IL-4. Это повышение сопровождается повышением уровня самого IL-4 в сыворотке крови больных рассеянным склерозом [84]. Увеличение мРНК IL-452 относительно мРНК IL-4 в мононуклеарных клетках периферической крови регистрируется при ювенильном ревматоидном артрите [70]. Повышение уровня альтернативной формы мРНК IL-4 наблюдается также и в клетках эндоб-ронхиальных биоптатов при астме [39], а также в клетках бронхоальвеолярного лаважа у пациентов с рассеянным склерозом [10]. При туберкулезе также наблюдается повышение эспрессии полноразмерной и альтернативной форм мРНК IL-4 мононуклеарных клетках периферической крови [88].

В дальнейших исследованиях был получен рекомбинантный белок IL-452 и изучены его эффекты на различные функции Т, В лимфоцитов и моноцитов [5, 7]. Установлено, что рекомбинантный IL-452 связывается с человеческими IL-4R экспрессирующими клеточными линиями Н9 и Raji [7] с более низкой аффинностью, чем рекомбинантный IL-4, и ингибирует IL-4 стимулированную Т-клеточную пролиферацию. Также показано, что рекомбинантный белок IL-452 блокирует ингибиторное действие rhIL-4 на ЛПС-индуцированную экспрессию цикло-оксигеназы-2 и секрецию простагландина Е2 моноцитами [5] и дозозависимо уменьшает связывание моноцитами 1251-меченного hIL-4. Для В лимфоцитов rhIL-452 выступает как антагонист IL-4 индуцированного синтеза IgE и экспрессии CD23 [5]. Основываясь на этих данных, авторы предполагают, что rhIL-452 связывается с рецептором IL-4 на этих клетках не вызывает конформационных изменений в рецепторе и не обеспечивает трансдукцию сигнала в клетку. В то же время, этой же группой авторов показано, что rhIL-452 и rhIL-4 могут выступать как агонисты в своем действии на фибробласты, так как оба белка стимулируют пролиферацию и продукцию коллагена этими клетками [10]. Показано, что поликлональные антитела против IL-4 распознают рекомбинантный белок IL-452 [7], в то же время антител, специфичных только к rhIL-452, еще не получено, в связи с чем вопрос о его продукции in vivo остается открытым. Тем не менее, данные, приводимые в статье [5] о способности мРНК rhIL-452 связываться с рибосомами, указывают, что эта мРНК может транслироваться.

Альтернативный сплайсинг гена IL-6

В настоящее время для гена IL-6 обнаружена одна сплайс-форма, образующаяся в результате альтернативного сплайсинга второго экзона (с сохранением рамки считывания), который кодирует аминокислотные остатки, важные в gpl30-onocpeflOBanHOM пути переноса сигнала [52,53]. Матричные РНК IL-6 - полноразмерного и IL-6 - сплайс варианта детектируются в ЛПС стимулированных мононуклеарах периферической крови, в моноцитах и лимфоцитах [52]. В клетках человеческой линии карциномы 5637 превалирует в основном полноразмерная форма мРНК IL-6 [52]. В работе Sato М. ссоавт. (1999) продемонстрировано, что в человеческих кератиноцитах экспрессируется как полноразмерная мРНК IL-6, так и ее альтернативная форма. Анализ нуклеотидной последовательности показал, что в альтернативной форме отсутствует 2 экзон. В наших исследованиях альтернативная и полноразмерная мРНК IL-6 была идентифицирована как в нестимулированных, так и в стимулированных КонА (24 часа) мононуклеарных клетках периферической крови здоровых доноров, а также в эритроидных клетках, выделенных из фетальной печени человека (данные не опубликованы). С помощью Western blot анализа клеточных лизатов стимулированных ЛПС мононуклеарных клеток периферической крови с анти IL-6 антисывороткой был идентифицирован банд размером 17kD, который был сопоставим с молекулярным весом альтернативно сплайсированной изоформы IL-6 с недостающим 2 экзоном [52]. На основании этого авторы предполагают, что альтернативный вариант мРНК IL-6 транслируется, но для подтверждения этой гипотезы необходим аминокислотный сиквенс этого белка. В работе Santhanam U. с соавт. (1989) в человеческих фибробластах также детектировался полипептид IL-6 17-19 kD. Kestler D.P. с соавторами (1995) проклонировали альтернативный вариант IL-6 и экспрессировали его в E.coli. Авторы провели сравнительное изучение очищенного альтернативного рекомбинантного белка IL-6 и полноразмерного рекомбинанатного IL-6 по их биологической активности. В тесте активации пролиферации клеток мышиной плазмацитомы 7TD1 установлено, что обе формы IL-6 стимулируют пролиферацию этих клеток, но полноразмерный вариант IL-6 был в 104 -105 раз более активен, чем альтернативный вариант. Альтернативный вариант IL-6 не обладал ингибиторной активностью на пролиферацию клеток мышиной плазмацитомы 7TD1, стимулированной IL-6 даже при соотношении 200/1, и таким образом в этом тесте не являлся естественным ингибитором IL-6. Известно, что IL-6 выступает как ингибитор роста и индуктор дифференцировки миелоидных клеточных линий [68]. В тесте IL-6 на антипролиферативную активность мышиной миелобластной линии Ml и

человеческой клеточной линии НЬ-60 установлено, что обе формы 1Ь-6 ингибировали пролиферацию М1 клеточной линии в концентрациях 1-1000 нг/мл, при этом полноразмерный 1Ь-6 в 10-200 раз был более эффективен, чем альтернативный вариант 1Ь-6. Напротив, для НЬ-60 клеток альтернативный вариант 1Ь-6 в дозах 0,2-2 мкг/мл проявил большую активность, чем полноразмерный 1Ь-6. После 72-часо-вой инкубации клеток НЬ-60 с альтернативным вариантом 1Ь-6 индукция экспрессии СБ11Ь (моноци-тарный дифференцировочный антиген) выявлена в более чем 30% клеток, в сравнении с 7%, полученными для 1Ь-6. Известно, что лизоцим индуцируется в миелоидных клетках в ответ на дифференцировоч-ные агенты, в том числе на 1Ь-6 [83]. После 16-часовой инкубации НЬ-60 в присутствии полноразмерного или альтернативного 1Ь-6 количество мРНК лизоцима увеличивается примерно одинаково. При культивировании НЬ-60, в присутствии альтернативного 1Ь-6 в дозе 1мкг/мл, фагоцитоз индуцируется в более чем 35 % клеток, а в присутствии 1Ь-6 в той же дозе фагоцитоз выявлен менее чем в 10% клеток. На основании этих данных авторы заключают, что альтернативный вариант 1Ь-6 не является естественным ингибитором полноразмерного 1Ь-6, имеет разную тканевую специфичность действия и может играть роль в модуляции роста и дифференци-ровке гемопоэтических клеток [52].

Онкостатин М (ОБМ) является членом семейства 1Ь-6 подобных цитокинов и проявляет плейотропное действие в различных биологических системах, включая гемопоэз, нейрогенез и остеогенез. ОБМ продуцируется активированными Т-лимфоцитами и макрофагами. В системе цитокинов ОБМ стимулирует экспрессию 1Ь-6 и его рецептора в основных типах клеток. У мышей ген ОБМ одним из первых активируется в ответ на 1Ь-2,1Ь-3 и ЕРО. Установлено, что у мышей этот цитокин существует в виде двух изоформ: одна полноразмерная мРНК ОБМ (все три эк-зона) и одна альтернативная без второго экзопа шРНК ОБМ13. Экспрессия мРНК полноразмерного и альтернативного вариантов ОБМ различается качественно и количественно в клетках костного мозга, тимуса селезенки и эмбриональных клетках [104].

Лейкемия ингибирующий фактор (ЫБ) получил свое название за способность вызывать терминальную дифференцировку клеток мышиной лейкемии (линия М1). Этот цитокин также относится к 1Ь-6 - семейству цитокинов и участвует в регуляции различных реакций в иммунной, кроветворной, нервной, сердеч-но-сосудистой и др. системах. ЫБ индуцирует рост миеломных клеток, в синергизме с 1Ь-3 повышают ко-лониеобразование примитивными бластными коло-ннеобразуюшими клетками, стимулирует синтез белков острой фазы гепатоцитами и т.д. В результате альтернативного сплайсинга мРНК ЫР образуются три варианта белка этого медиатора ЫР-Э, ЫР-М и

LIF-T, состоящие из альтернативно сплайсированно-го первого экзона и общего второго и третьего экзо-нов [44, 102]. LIF-D у мышей и человека существует в виде секреторной формы, LIF-M у мышей и человека - в виде секреторной и внутриклеточной, a LIF-T -в виде внутриклеточной формы [43, 81,102].

Одним из важных иммунорегуляторных цитокинов является IL-7. IL-7 играет незаменимую роль в выживании и пролиферации как зрелых Т-клеток, так и их предшественников. Кроме того, показано его участие в дифференцировке Т-клеток (преимущественно TCRyS) и В-клеток, а также влияние на функции NK и моноцитов/макрофагов. Показано, что в ряде случаев нарушения в системе IL-7 связаны с развитием тяжелого комбинированного иммунодефицита. Установлено, что альтернативный сплайсинг пре-мРНК IL-7 человека приводит к удалению

4 экзона и к образованию изоформы, названной IL-754 [32]. Эта изоформа детектируется в лейкеми-ческих клетках у детей с острой лимфобластной лейкемией. В работе Korte A., Moricke А., (1999) в лей-кемических клетках клеточной линии Raji были идентифицированы новые варианты мРНК IL-7, образующиеся в результате альтернативного сплайсинга: три формы без сдвига рамки считывания (IL-754/

5, IL-753/4, IL-753/4/5 и три формы со сдвигом рамки считывания (IL-7(-56bp экзон2), IL-754(-56bp экзон2), IL-753/4/5(-56bp экзон2)). Авторы предполагают, что сгшайс изоформы IL-7 может играть роль в модулировании IL-7-опосредованной биологической активности и в патогенезе лейкемий.

IL-15 - цитокин, играющий центральную роль в развитии, поддержании и функционировании NK-клеток, а также стимулирующий пролиферацию активированных Т-клеток. На покоящиеся В-клетки этот цитокин не оказывает влияния, но индуцирует их пролиферацию и синтез ими иммуноглобулинов при костимуляторных воздействиях. Экспрессия IL-15 показана для целого ряда тканей: плацента, скелетные мышцы, почки, легкие, фибробласты, моноциты и др. Для гена IL-15 человека и мыши показано существование двух изоформ, образующих в результате альтернативного сплайсинга [60,71,76,

78, 80, 97]. При изучении эффективности трансляции in vitro мышиных изоформ IL-15 [76] установлено, что трансляция изоформы кДНК IL-15 с альтернативным экзоном 5 более эффективна, чем кДНК IL-15 с “нормальным” 5 экзоном. Эти изоформы отличаются между собой по длине сигнального пептида. Обе изоформы кодируют идентичные белки 1L-15. Авторы этих работ предполагают что для этих изоформ существуют различные регуляторные механизмы на уровне транскрипции, трансляции и секреции.

Для колониестимулирующих факторов M-CSF и G-CSF также показано наличие изоформ, образующихся в результате альтернативного сплайсинга.

Для мРНК M-CSF мышей обнаружен альтернативный вариант [96], экспрессирующийся в мышиной стромальной клеточной линии ST2, который содержит дополнительную последовательность 140 пар оснований в первом экзоне. Альтернативный вариант мРНК M-CSF обнаружен также в мышиных клеточных линиях фибробластов L в стромальной клеточной линии РА6. Этой же группой авторов была получена плазмида с кДНК альтернативного M-CSF и экспрессирована в COS7 клетках. В супернатантах от этих клеток тестировалась специфическая M-CSF активность на M-CSF-зависимой клеточной линии M-NFS-60. Для M-CSF человека также обнаружены изоформы, образующиеся в результате альтернативного сплайсинга и кодирующие белки с разным количеством аминокислот и функциональными свойствами [61,109,112]. В обзоре Е. R. Stanley (2001) приводятся данные о существовании 4 форм мРНК M-CSF: две из которых секреторные и две -мембраносвязанные.

Для G-CSF обнаружено два варианта мРНК в клетках карциномы, в то же время в мышиных клетках альтернативный вариант не найден [74, 100]. Этой группой авторов показано, что альтернативный вариант белка G-CSF обладает схожей биологической активностью с нормальной формой G-CSF.

Для медиатора фактора роста фибробластов также известны разные варианты мРНК образующиеся в результате альтернативного сплайсинга [6,23,65, 67, 79, 103] экспрессия которых зависит от типа ткани.

Установлены множественные формы мРНК фактора роста гепатоцитов, образующиеся в результате альтернативного сплайсинга [16-19]. Белковые продукты этих изоформ отличаются по эффекту на синтез ДНК, токсичности в высоких концентрациях и способности ингибировать пролиферацию клеток, активированных полноразмерныой формой фактора роста гепатоцитов [17, 18, 19, 24, 54, 66, 72, 92].

Для человеческого, мышиного и свиного тромбо-поэтина также показано существование изоформ, образующихся в результате альтернативного сплайсинга. Для мРНК тромбопоэтина показано существование по крайней мере трех изоформ [21,31,37,42,82].

Для фактора стволовых клеток (SCF) показано существование двух форм секреторной и мембраносвязанной (без 6 экзона), образующихся в результате альтернативного сплайсинга в стромальных клетках костного мозга человека и мыши [3, 99] и в клетках Сертоли у мышей [59]. Показано, что обе формы SCF увеличивают число клеток предшественников в культуре стромальных клеток, при этом наблюдаются качественные различия по типу кроветворных колоний [99]. В работе Welker Р. (2000) показано, что определение соотношения экспрессии мРНК SCF растворимой и мембраносвязанной форм в клеточных мела-номных линиях и меланоцитах кожи может служить прогностическим признаком их малигнизации.

В 1999 году Ауго1сН с соавторами показали наличие альтернативного варианта мРНК для мышиного РавЬ. Укороченный транскрипт получил название РаэЬз, и является результатом удаления при сплайсинге фрагмента размером 661п.о. Вырезаемый фрагмент содержит последовательность, кодирующую внутриклеточный, трансмембранный и часть внеклеточного доменов. РаэЬз в биологических тестах показал себя как ингибитор апоптоза Т-лимфоцитов, запускаемого комплексом ТСК/СВЗ. Таким образом, этот сплайс-вариант может иметь большое значение в регуляции апоптоза хронически стимулированных Т-клеточных клонов или периферических активированных Т-клеток, контролируемого Раэ/РазЬ системой [И].

Список цитокинов, для которых показано существование изоформ мРНК образующих в результате альтернативного сплайсинга, постоянно пополняется, и к указанным выше можно добавить такие медиаторы, как инсулин-подобный фактор роста-1 (ЮР-1) [69], гипоксия-индуцируемый фактор-1 (Н1Р-1) [40], фактор роста сосудистого эндотелия (УЕСР) [105], ангиопоэтин-1 [49], фактор роста нервов (ЫСР) [28].

Таким образом, изоформы мРНК, получаемые при использовании клеткой альтернативных промоторов или сайтов сплайсинга, формируют пока мало исследованный, новый уровень в сложной системе цитоки-новой регуляции. Гены цитокинов могут экспрессироваться в виде различных изоформ белков, обладающих как агонистическими, так и антагонистическими свойствами, и их синтез может меняться в онтогенезе и в зависимости от типа ткани. Следует отметить, что, кроме теоретического значения, такие формы представляют большой интерес для фармакологии.

Механизм альтернативного сплайсинга используется также в клетках человека и животных для образования растворимых и мембраносвязанных форм рецепторов. Для 1Ь-Ш 1уре 11 показано существование двух мРНК, образующих в результате альтернативного сплайсинга и кодирующих растворимую и мембраносвязанную формы [64]. Гамма-цепь рецептора 1Ь-2, используемая рецепторами 1Ь-4,1Ь-

7, 1Ь-9, 11.-13, и 1Ь-15 в гемопоэтических клетках, экспрессируется в двух формах [91]. Нормальный транскрипт длиннее альтернативного на 72 нуклеотида, что связано с делецией вблизи З'-конца. Это изменение определяет потерю 24 аминокислот, включая константный тирозиновый домен, который используется несколькими членами семейства цито-киновых рецепторов. Присутствие этих двух отличных форм демонстрировалось в клеточных линиях человека и периферических лимфоцитах крови. Усеченный мутант изменял биохимические пути, активизированные цитокинами, позволяя предполагать, что гамма С - длинный и гамма С - короткий могут использовать различные пути передачи сигналов и играть важную роль в определении клеточного от-

вета на IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-13, IL-15. Для IL-4 показано существование мембраносвязанной и растворимой формы рецептора [22], для IL-5 показано существование одной мембраносвязанной и двух растворимых форм IL-5Ra [50, 98]. Для GM-CSFRa показано существование шести изоформ, образующихся в результате альтернативного сплайсинга, а для GM-CSFRb общей для GM-CSF, IL-3 и IL-5 две изоформы [36, 38, 47, 87], которые различаются на растворимые и мембраносвязаниые формы, а также по некоторым функциональным свойствам. Для рецептора G-CSF показано существование семи изоформ мРНК [13, 26, 33, 62, 89, 108, ИЗ]. Для рецептора TNFp75 показано существование двух изоформ, образующихся в результате альтернативного сплайсинга, одна из которых весом 50kDa является внутриклеточной [90]. Для мРНК hIL-15Ra также показано образование изоформ с помощью альтернативного сплайсинга 2,3 и 7 экзонов [4,27,30]. Для мРНК IL-9R показаны различные изоформы, образующиеся в результате альтернативного 3, 4, 5, 7 и 8 экзонов и образующие мембраносвязанные и растворимые формы рецептора, отличающиеся по своим функциональным свойствам [41]. Для IL-7Ra идентифицированы различные растворимые, трансмембранные и внутриклеточные изоформы, образующиеся в результате альтернативного сплайсинга [58]. Растворимая и мембраносвязанная формы IL-6 также образуются в результате альтернативного сплайсинга [48, 77]. Для EpoR человека, крыс и мышей также показан альтернативный сплайсинг в результате которого образуется растворимая и мембраносвязанная формы рецептора эритропоэтина [12, 34, 45].

Альтернативный сплайсинг первого экзона показан и для мРНК рецептора IL-11 [75]. Изоформы с-kit (SCF-R), которые отличаются по присутствию или отсутствию четырех аминокислот (GNNK) в около-мембранном регионе внеклеточного домена рецептора и экспрессируются на одинаковых уровнях в NIH3T3 клетках, показывая дифференциальный эффект на признаки трансформации, также используют отличные сигнальные пути [15]. Изоформы незначительно отличаются в их афинности к kit лиганду (SLF). Но после его связывания изоформа показала более быстрое и обширное аутофосфорилирование тирозина и более быструю интернализацию. Таким образом, изоформы c-kit показывают различные сигнальные характеристики и имеют различную трансформирующую активность в NIH3T3 клетках.

При исследовании экспрессии Fas в культурах нормальных мононуклеаров периферической крови, активированных митогенами, идентифицировано, по крайней мере, шесть сплайс-вариантов мРНК Fas: FasExo6Del, FasExo3,4Del, FasExo3,4,6Del, FasExo4Del and FasExo4,6Del and FasExo4,7Del [16, 17,20,63]. Интересно, что только FasExo6Del характеризуется делецией с сохранением рамки считыва-

ния, а в остальных вариантах делеции ведут к сдвигу рамки и преждевременной терминации с образованием укороченных белков с С-концом в 21-38 аминокислот, что отличает их от мембраносвязанной формы. Окончательно функции каждой из изоформ не определены. В экспериментах in vitro наблюдается неоднозначность в результатах по ингибированию рекомбинантными белками апоптоза, индуцированного FasL или антителами к Fas. Предполагается, что сплайс-варианты Fas играют важную роль во взаимодействии Fas/FasL, тем самым модулируя реакции, опосредуемые этой парой лиганд/рецептор.

Таким образом, полиморфная цитокиновая сеть формируется с помощью альтернативного сплайсинга как на уровне медиаторов, так и на уровне их рецепторов.

Биологический смысл существования альтернативных вариантов белков может быть связан с выполнением ряда фукций.

Во-первых, это тканеспецифическая экспрессия медиаторов, когда в различных тканях экспрессируются разные изоформы, отличающиеся между собой по своим биологическим эффектам на клетки-мишени. В качестве примера можно привести IL-IRa, IL-482.

Во-вторых, образование секреторных, мембраносвязанных и внутриклеточных форм медиаторов и их рецепторов для выполнения определенных регуляторных функций внутри и вне клетки. В качестве примера можно привести IL-IRa, IL-15.

В-третьих, образование изоформ с антагонистическими функциями, когда при связывании изоформы с рецептором не происходит трансдукции сигнала. Экспрессия этих изоформ может наблюдаться в клеточной популяции параллельно или вслед за экспрессией полноразмерной формы, регулируя биологическую активность полноразмерной формы на клетки мишени. Наличие изоформ с антагонистическими свойствами по отношению к полноразмерной форме показано для IL-4, IL-2.

В-четвертых, образование изоформ агонистов, которые обладают разной степенью активности по сравнению с полноразмерной или отсутствием отдельных свойств, как, например, в случае с изоформой IL-6. Это может быть важно при различных воздействиях, когда нужно усилить или ослабить различные регуляторные эффекты медиаторов на клетки мишени.

В-пятых, это различная экспрессия изоформ цитокинов в онтогенезе. Это может быть связано с функцией медиаторов в регуляции пролиферации и дифференцировки различных типов клеток и их участием в гистогенезе тканей, например, в период эмбрионального и пренатального развития.

Приведенные примеры свидетельствуют о том, что вовлеченность изоформ в процессы, регулируемые белками цитокиновой сети, достаточно распространенное явление, и регуляторное влияние альтер-

нативных форм цитокинов и их рецепторов может иметь место в различных типах клеток. Неодинаковый характер регуляции, осуществляемой полиморфными вариантами вплоть до взаимоисключения из эффекторных путей, позволяет предполагать о возможно ие последней роли данной группы белков в процессах клеточной регуляции. А наличие для некоторых из них тканеспецифичности санкционирует гипотезу о специфических медиаторах цитокино-вой природы, опосредующих ткане- и клеточно-с.пе-цифические реакции.

Изучение тканеспецифической экспрессии различных изоформ цитокинов может во многом поменять наши взгляды на регуляцию в гемо- и иммуно-поэзе, а также может дать в руки клинических иммунологов специфические биологические препараты с новыми свойствами.

Список литературы

1. Сингер М., Берг П. Гены и геномы: в 2-х т.т.2.Пер. с англ., - М. Мир - 1998. - 391 с.

2. Alms W.J., Atamas S.P., Yurovsky V.V., White В. Generation of a variant of human interleukin-4 by alternative splicing. // Mol. Immunol. - 1996. - Vol.33(4-5). - P.361-370.

3. Anderson D.M., Lyman S.D., Baird A., Wignall J.M., Eisenman J., Rauch C., March C.J., Boswell H.S., Gimpel S.D., Cosman D., et al. Molecular cloning of mast cell growth factor, a hematopoietin that is active in both membrane bound and soluble forms. // Cell -1990. - Vol.63( 1). - P.235-243.

4. Anderson D.M., Kumaki S., Ahdieh М., Bertles J., Tometsko М., Loomis A., Giri J., Copeland N.G., Gilbert D.J., Jenkins N.A., et al. Functional characterization of the human interleukin-15 receptor alpha chain and close linkage of IL15RA and IL2RA genes. //J. Biol. Chem. - 1995. -Vol.270(50). - P.29862-29869.

5. Arinobu Y., Atamas S.P., OtsukaT.,Niiro H., Yamaoka K., Mitsuyasu H., Niho Y., Hamasaki N., White B„ Izuhara K. Antagonistic effects of an alternative splice variant of human IL-4, IL-4delta2, on IL-4 activities in human monocytes and В cells. // Cell. Immunol. - 1999. -Vol.l91(2). - P.161-167.

6. Arnaud E., Touriol C., Boutonnet C., Gensac M.C., Vagner S., Prats H., Prats A.C. A new 34-kilodalton isoform of human fibroblast growth factor 2 is cap dependency synthesized by using a non-AUG start codon and behaves as a survival factor. // Mol. Cell. Biol. -1999. - Vol.l9(l). -P.505-514.

7. Atamas S.P., Choi J., Yurovsky V.V., White B. An alternative splice variant of human IL-4, IL-4 delta 2, inhibits IL-4-stimulated T cell proliferation. //J. Immunol. -1996. -Vol.l56(2). - P.435-441.

8. Atamas S.P. Alternative splice variants of cytokines: making a list. // Life Sci. - 1997. - Vol.61(12). - P.1105-1112.

9. Atamas S.P., White B. Interleukin 4 in systemic sclerosis: not just an increase. // Clin. Diagn. Lab. Immunol.

- 1999. - Vol.6(5). P.658-659.

10. Atamas S.P., Yurovsky V.V., Wise R., Wigley F.M., Goter Robinson C.J., Henry P., Alms W.J., White B. Production of type 2 cytokines by CD8 lung cells is associated with greater decline in pulmonary function in patients with systemic sclerosis. // Arthritis Rheum. -1999. -Vol.42(6).-P.l 168-1178.

11. Ayroldi E., D’Adamio F., Zollo O., Agostini M„ Moraca R., Cannarile L., Migliorati G., Delfino D.V., Riccardi C. Cloning and Expression of a Short Fas Ligand: A New Alternatively Spliced Product of the Mouse Fas Ligand Gene. // Blood. - 1999. - Vol.94. - NolO. - P.3456-3467.

12. Barron C., Migliaccio A.R., Migliaccio G., Jiang Y., Adamson J.W., Ottolenghi S. Alternatively spliced mRNAs encoding soluble isoforms of the erythropoietin receptor in murine cell lines and bone marrow. // Gene. - 1994. -Vol.l47(2). - P.263-268.

13. Bernard T., Gale R.E., Linch D.C. Analysis of granulocyte colony stimulating factor receptor isoforms, polymorphisms and mutations in normal haemopoietic cells and acute myeloid leukaemia blasts. // Br. J. Haematol. -1996. - Vol.93(3). - P.527-533.

14. Butcher C, Steinkasserer A, Tejura S, Lennard AC. Comparison of two promoters controlling expression of secreted or intracellular IL-1 receptor antagonist. J Immunol 1994;153(2):701-11.

15. Caruana G., Cambareri A.C., Ashman L.K. Isoforms of c-KIT differ in activation of signalling pathways and transformation of NIH3T3 fibroblasts. // Oncogene -1999.

- Vol.l8(40). - P.5573-5581.

16. Cascino I., Fiucci G„ Papoff G. & Ruberti G. Three functional soluble forms of the human apoptosis-inducing Fas molecule are produced by alternative splicing. // J. Immunol. - 1995. Vol.154. - P.2706-2713.

17. Cascino I., Papoff G., Eramo A., Ruberti G. Soluble fas/apo-1 splicing variants and apoptosis. // Frontiers in Bioscience - 1996. - Vol.l. - P.12-18.

18. Chan A., RubinJ., Bottaro D., Hirschfield D., Chedid M., Aaronson SA. Isoforms of human HGF and their biological activities. // EXS - 1993. - Vol.65. - P.67-79.

19. Chan A.M., Rubin J.S., Bottaro D.P., Hirschfield D.W., Chedid M., Aaronson S.A. Identification of a competitive HGF antagonist encoded by an alternative transcript. // Science -1991. - Vol.254(5036). - P. 1382-1385.

20. ChengJ., Zhou T., Liu C., Shapiro J.P., Brauer M.J., Kiefer M.C., Barr P.J. & Mountz J.D. Protection from Fas-mediated apoptosis by a soluble form of the Fas molecule. /' / Science - 1994. - Vol263. - P.1759-1762.

21. Chang M.S., McNinch J., Basu R„ Shutter J., Hsu R.Y., Perkins C„ Mar V., Suggs S., Welcher A., Li L., et al. Cloning and characterization of the human megakaryocyte growth and development factor (MGDF) gene. // J. Biol. Chem. - 1995. - Vol.270(2). - P.511-514.

22. Chilton P.M., Fernandez-Botran R. Regulation of the expression of the soluble and membrane forms of the

murine IL-4 receptor. // Cell. Immunol. -1997. - Vol. 180(2).

- P.104-115.

23. Chiu I.M., Wang W.P., Lehtoma K. Alternative splicing generates two forms of mRNA coding for human heparin-binding growth factor. // Oncogene - 1990. -Vol.5(5). - P.755-762.

24. Cioce V., Csaky K.G., Chan A.M., Bottaro D.P., Taylor W.G., Jensen R., Aaronson S.A., Rubin J.S. Hepatocyte growth factor (HGF)/NK1 is a naturally occurring HGF/scatter factor variant with partial agonist/ antagonist activity. // J. Biol. Chem. -1996. - Vol.271(22).

- P. 13110-13115.

25. De Moraes-Pinto M.I., Vince G.S., Flanagan B.F., Hart C.A., Johnson P.M. Localization of IL-4 and IL-4 receptors in the human term placenta, decidua and amniochorionic membranes. // Immunology - 1997. -Vol.90(l). - P.87-94.

26. Dong F., van Paassen M., van Buitenen C., Hoefsloot L.H., Lowenberg B., Touw I.P. A point mutation in the granulocyte colony-stimulating factor receptor (G-CSF-R) gene in a case of acute myeloid leukemia results in the overexpression of a novel G-CSF-R isoform. // Blood -1995.

- Vol.85(4). - P.902-911.

27. Dubois S., Magrangeas F., Lehours P., Raher S., Bernard J„ Boisteau O., Leroy S., Minvielle S., Godard A., Jacques Y. Natural splicing of exon 2 of human interleukin-15 receptor alpha-chain mRNA results in a shortened form wi th a distinct pattern of expression. // J. Biol. Chem. -1999.

- Vol.274(38). - P.26978-26984.

28. Edwards R.H., Selby M.J., Mobley W.C., Weinrich

S.L., Hruby D.E., Rutter W.J. Processing and secretion of nerve growth factor: expression in mammalian cells with a vaccinia virus vector. // Mol. Cell. Biol. -1988. - Vol.8(6). -P.2456-2464.

29. Eisenberg S.P., Evans R.J., Arend W.P., Verderber E., Brewer M.T., Hannum C.H., Thompson R.C. Primary structure and functional expression from complementary DNA of a human interleukin-1 receptor antagonist. //Nature - 1990. - Vol.343(6256). - P.341-346.

30. FehnigerT.A., Caligiuri M.A. Interleukin 15: biology and relevance to human disease. // Blood - 2001. - Vol97(1).

- P.14-32.

31. Foster D.C., Sprecher C.A., Grant F.J., Kramer J.M., Kuijper J.L., Holly R.D., Whitmore T.E., Heipel M.D., Bell L.A., Ching A.F., et al. Human thrombopoietin: gene structure, cDNA sequence, expression, and chromosomal localization. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA - 1994. -Vol.91(26). - P.13023-13027.

32. Frishman J., Long B., Knospe W., Gregory S., Plate J. Genes for interleukin 7 are transcribed in leukemic cell subsets of individuals with chronic lymphocytic leukemia. //J. Exp. Med. -1993. - Vol. 177(4). - P.955-964.

33. Fukunaga R., Seto Y-, Mizushima S., Nagata S. Three different mRNAs encoding human granulocyte colony-stimulating factor receptor. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1990. - Vol.87(22). - P.8702-8706.

34. Fujita M., Takahashi R., Kitada K., Watanabe R., Kitazawa S., Ashoori F., Liang P., Saya H„ Serikawa T„ Maeda S. Alternative splicing of the erythropoietin receptor gene correlates with erythroid differentiation in rat hematopoietic and leukemic cells. // Cancer Lett. - 1997. -Vol.l 12(1). - P.47-55.

35. Gabay C., Porter B., Fantuzzi G., Arend W.P. Mouse IL-1 receptor antagonist isoforms: complementary DNA cloning and protein expression of intracellular isoform and tissue distribution of secreted and intracellular IL-1 receptor antagonist in vivo. //J. Immunol. - 1997. - Vol. 159(12). -P.5905-5913.

36. Gale R.E., Freebum R.W., Khwaja A., Chopra R., Linch D.C.A Truncated isoform of the human beta chain common to the receptors for granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, interleukin-3 (IL-3), and IL-5 with increased mRNA expression in some patients with acute leukemia. // Blood - 1998. - Vol.91(l). - P.54-63.

37. Ghilardi N., Wiestner A., Skoda R.C. Thrombopoietin production is inhibited by a translational mechanism. // Blood - 1998. - Vol.92(ll). - P.4023-4030.

38. Chopra R., Kendall G., Gale R.E., Thomas N.S., Linch D.C. Expression of two alternatively spliced forms of the 5’ untranslated region of the GM-CSF receptor alpha chain mRNA. // Exp. Hematol. - 1996. - Vol.24(6). - P.755-762.

39. Glare E.M., Divjak M., Rolland J.M., Walters E.H. Asthmatic airway biopsy specimens are more likely to express the IL-4 alternative splice variant IL-4delta2. //J. Allergy Clin. Immunol. - 1999. - Vol.l04(5). - P.978-982.

40. Gothie E., Richard D.E., Berra E., Pages G., Pouyssegur J. Identification of alternative spliced variants ofhumanhypoxia-induciblefactor-lalpha.//J. Biol. Chem.

- 2000. - Vol.275(10). - P.6922-6927.

41. Grasso L., Huang M., Sullivan C.D., Messier C.J., Kiser M.B., Dragwa C.R., Holroyd K.J., Renauld J.C., Levitt R.C., Nicolaides N.C. Molecular analysis of human interleukin-9 receptor transcripts in peripheral blood mononuclear cells. Identification of a splice variant encoding for a nonfunctional cell surface receptor. // J. Biol. Chem. -

1998. - Vol.273(37). - P.24016-24024.

42. Gurney A.L., Kuang W.J., Xie M.H., Malloy B.E., Eaton D.L., de Sauvage F.J. Genomic structure, chromosomal localization, and conserved alternative splice forms of thrombopoietin. // Blood - 1995. - Vol.85(4). -P.981-988.

43. Haines B.P., Voyle R.B., Rathjen P.D. Intracellular and extracellular leukemia inhibitory factor proteins have different cellular activities that are mediated by distinct protein motifs. // Mol. Biol. Cell. - 2000. - Vol.11(4). -P. 1369-1383.

44. Haines B.P., Voyle R.B., Pelton T.A., Forrest R., Rathjen P.D. Complex conserved organization of the mammalian leukemia inhibitory factor gene: regulated expression of intracellular and extracellular cytokines. // J. Immunol. - 1999. - Vol. 162(8). - P.4637-4646.

45. Harris K.W., Winkelmann J.C. Enzyme-linked immunosorbent assay detects a potential soluble form of the

erythropoietin receptor in human plasma. // Am. J. Hematol. -1996. - Vol.52(l). - P.8-13.

46. Haskill S., Martin G., Van Le L., Morris J., Peace A„ Bigler C.F. Jaffe G.J., Hammerberg C., Sporn S. A., Fong S., et al. cDNA cloning of an intracellular form of the human interleukin 1 receptor antagonist associated with epithelium. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1991. - Vol.88(9). - P.3681-3685.

47. Heaney M.L., Vera J.C., Raines M.A., Golde D.W. Membrane-associated and soluble granulocyte/ macrophage-colony-stimulating factor receptor alpha subunits are independently regulated in HL-60 cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1995. - Vol.92(6). - P.2365-2369.

48. Horiuchi S., Koyanagi Y„ Zhou Y., Miyamoto H., Tanaka Y., Waki M., Matsumoto A., Yamamoto M., Yamamoto N. Soluble interleukin-6 receptors released from T cell or granulocyte/macrophage cell lines and human peripheral blood mononuclear cells are generated through an alternative splicing mechanism. // Eur. J. Immunol. -1994. - Vol.24(8). - P.1945-1948.

49. Huang Y.Q., Li J.J., Karpatkin S. Identification of a family of alternatively spliced mRNA species of angiopoietin-

1. // Blood - 2000. - Vol.95(6). - P.1993-1999.

50. Karras J.G., McKay R.A., Dean N.M., Monia B.P. Deletion of individual exons and induction of soluble murine interleukin-5 receptor-alpha chain expression through antisense oligonucleotide-mediated redirection of pre-mRNA splicing. // Mol. Pharmacol. - 2000. - Vol.58(2). -P.380-387.

51. Kato H„ Youn H.Y., Ohashi T., Watari T„ Goitsuka R., Tsujimoto H., Hasegawa A. Identification of an alternatively spliced transcript of equine interleukin-1 beta. // Gene -1996. - Vol.l77(l-2). - P.ll-16.

52. Kestler D.P., Agarwal S., CobbJ., Goldstein K.M., Hall R.E. Detection and analysis of an alternatively spliced isoform of interleukin-6 mRNA in peripheral blood mononuclear cells. // Blood -1995. - Vol.86(12). - P.4559-4567.

53. Kestler D.P., Goldstein K.M., Agarwal S., Fuhr J.E., Andrews R„ Hall R.E. Hematopoietic differentiation activity of a recombinant human interleukin-6 (IL-6) isoform resulting from alternatively spliced deletion of the second exon. // Am. J. Hematol. -1999. - Vol.61(3). - P.169-177.

54. Kitamura N., Miyazawa K., Uehara Y., Komada M., Okajima A., Okigaki M., Kitamura A. Gene expression and regulation of HGF-SF. // EXS. -1993. - Vol.65. - P.49-65.

55. Klein S.C., Golverdingen J.G., Bouwens A.G., Tilanus M.G., de Weger R.A. An alternatively spliced interleukin 4 form in lymphoid cells. // Immunogenetics - 1995. -Vol.41(l). - P.57

56. Klein S.C., Golverdingen J.G., van Wichen D.F., Bouwens A.G., Stuij I., Tilanus M.G., Bast E.J., de Weger R.A. Expression of two interleukin 4 mRNA isoforms in B lymphoid cells. // Cell. Immunol. - 1996. - Vol.l67(2). -P.259-268.

57. Korte A., Moricke A., Beyermann B„ Kochling J., Taube T., Kebelmann-Betzing C„ Henze G., Seeger K..

Extensive alternative splicing of interleukin-7 in malignant hematopoietic cells: implication of distinct isoforms in modulating IL-7 activity. // J. Interferon Cytokine Res. -

1999. - Vol.l9(5). - P.495-503.

58. Korte A., Kochling J., Badiali L., Eckert C., Andreae J., Geilen W., Kebelmann-Betzing C., Taube T., Wu S., Henze G., Seeger K. Expression analysis and characterization of alternatively spliced transcripts of human IL-7Ralpha chain encoding two truncated receptor proteins in relapsed childhood all. // Cytokine - 2000. - Vol.l2(ll). - P.1597-1608.

59. Kosaki A., Nelson J., Webster N.J. Identification of intron and exon sequences involved in alternative splicing of insulin receptor pre-mRNA. //J. Biol. Chem. - 1998. -Vol.273(17). - P. 10331-10337.

60. Kurys G., Tagaya Y., Bamford R., Hanover J.A., Waldmann T.A. The long signal peptide isoform and its alternative processing direct the intracellular trafficking of interleukin-15. // J. Biol. Chem. - 2000. - Vol.275(39). P.30653-30659.

61. Ladner M.B., Martin G.A., Noble J. A., Nikoloff D.M., Tal R., Kawasaki E.S., White T.J. Human CSF-1: gene structure and alternative splicing of mRNA precursors. // EMBO J. -1987. - Vol.6(9). - P.2693-2698.

62. Larsen A., Davis T., Curtis B.M., Gimpel S., Sims J.E., Cosman D., Park L., Sorensen E., March C.J., Smith C.A. Expression cloning of a human granulocyte colony-stimulating factor receptor: a structural mosaic of hematopoietin receptor, immunoglobulin, and fibronectin domains. //J. Exp. Med. - 1990. - Vol.l72(6). - P.1559-1570.

63. Liu C., Cheng J. & Mountz J. D. Differential expression of human Fas mRNA species upon peripheral blood mononuclear cell activation. // Biochem. J. - 1995. -Vol.310. - P.957-963.

64. Liu C., Hart R.P., Liu X.J., Clevenger W., Maki R. A., De Souza E.B. Cloning and characterization of an alternatively processed human type II interleukin-1 receptor mRNA. //J. Biol. Chem. - 1996. - Vol.271(34). - P.20965-20972.

65. Liu Y., Ray S.K., Yang X.Q., Luntz-Leybman V., Chiu I.M. A splice variant of E2-2 basic helix-loop-helix protein represses the brain-specific fibroblast growth factor 1 promoter through the binding to an imperfect E-box. //J. Biol. Chem. - 1998. - Vol.273(30). - P.19269-19276.

66. Lokker N.A., Godowski P.J. Generation and characterization of a competitive antagonist of human hepatocyte growth factor, HGF/NK1. //J. Biol. Chem. -1993. - Vol.268(23). - P.17145-17150.

67. Madiai F., Hackshaw K.V., Chiu I.M. Characterization of the entire transcription unit of the mouse fibroblast growth factor 1 (FGF-1) gene. Tissue-specific expression of the FGF-l.AmRNA.//J. Biol. Chem. -1999.

- Vol.274(17). - P.11937-11944.

68. Maekawa T„ Metcalf D„ Gearing D.P. Enhanced suppression of human myeloid leukemic cell lines by

combinations of IL-6, LIF, GM-CSF and G-CSF. // Int. J. Cancer. - 1990. - Vol.45(2). - P.353-358.

69. McKoy G., Ashley W., Mander J., Yang S.Y., Williams N„ Russell B„ Goldspink G. Expression of insulin growth factor-1 splice variants and structural genes in rabbit skeletal muscle induced by stretch and stimulation. // J. Physiol. - 1999. - Vol.516(Pt 2). - P.583-592.

70. McCurdy D. K., Zaldivar F., Sandborg C., Imfeld K. and Berman M. Interleukin-4 (IL-4) and IL-4 antagonist, IL-4d2, expression in synovial fluid from patients with juvenile rheumatoid arthritis (JRA). // Arthritis Rheum. -1998. - Vol.41. - S100.

71. Meazza R., Verdiani S., Biassoni R., Coppolecchia M„ Gaggero A., Orengo A.M., Colombo M.P., Azzarone B., Ferrini S. Identification of a novel interleukin-15 (IL-15) transcript isoform generated by alternative splicing in human small cell lung cancer cell lines. // Oncogene - 1996. -Vol.l2(10). - P.2187-2192.

72. Miyazawa K., Kitamura A., Naka D., Kitamura N. An alternatively processed mRNA generated from human hepatocyte growth factor gene. // Eur. J. Biochem. -1991. -Vol.l97(l). - P.15-22.

73. Muzio M., Polentarutti N., Sironi M., Poli G., De Gioia L„ Introna M., Mantovani A., Colotta F. Cloning and characterization of a new isoform of the interleukin 1 receptor antagonist. //J. Exp. Med. - 1995. - Vol. 182(2). - P.623-628.

74. Nagata S., Tsuchiya M., Asano S., Yamamoto O., Flirata Y., Kubota N, Oheda M., Nomura H., Yamazaki T. The chromosomal gene structure and two mRNAs for human granulocyte colony-stimulating factor. // EMBO T.

- 1986. - Vol.5(3). - P.575-581.

75. Nandurkar H.H., Robb L., Nicholl J.K., Hilton D.J., Sutherland G.R., Begley C.G. The gene for the human interleukin-11 receptor alpha chain locus is highly homologous to the murine gene and contains alternatively spliced first exons. // Int. J. Biochem. Cell. Biol. - 1997. -Vol.29(5). - P.753-766.

76. Nishimura H„ Washizu J., Nakamura N., Enomoto A., Yoshikai Y. Translational efficiency is up-regulated by alternative exon in murine IL-15 mRNA. //J. Immunol. -1998. -Vol. 160(2). -P.936-942.

77. OhJ.W., Revel M., ChebathJ. A soluble interleukin 6 receptor isolated from conditioned medium of human breast cancer cells is encoded by a differentially spliced mRNA. // Cytokine - 1996. - Vol.8(5). - P.401-409.

78. Onu A., Pohl T., Krause H., Bulfone-Paus S. Regulation of IL-15 secretion via the leader peptide of two IL-15 isoforms.//J. Immunol. -1997.-Vol. 158(1).- P.255-262.

79. Payson R.A., Canatan H., Chotani M.A., Wang W.P., Harris S.E., Myers R.L., Chiu I.M. Cloning of two novel forms of human acidic fibroblast growth factor (aFGF) mRNA. // Nucleic Acids Res. - 1993. - Vol21(3). - P.489-495.

80. Prinz M., Flanisch U.K., Kettenmann H., Kirchhoff F. Alternative splicing of mouse IL-15 is due to the use of an

internal splice site in exon 5. // Brain Res. Mol. Brain. Res.

- 1998. - Vol.63(l). - P.155-162.

81. Rathjen P.D., Toth S., Willis A., Heath JK., Smith A.G. Differentiation inhibiting activity is produced in matrix-associated and diffusible forms that are generated by alternate promoter usage. // Cell - 1990. - Vol.62(6). -P. 1105-1114.

82. Romano M., Marcucci R., Baralle F.E. Splicing of constitutive upstream introns is essential for the recognition of intra-exonic suboptimal splice sites in the thrombopoietin gene. //Nucleic Acids Res. 2001. - Vol.29(4). - P.886-894.

83. Ruhl S., Pluznik D.H. Dissociation of early and late markers of murine myeloid differentiation by interferon-gamma and interleukin-6. // J. Cell Physiol. - 1993. -Vol.l55(l). - P.130-138.

84. Sakkas L.I., Tourtellotte C., Berney S., Myers A.R., Platsoucas C.D. Increased levels of alternatively spliced interleukin 4 (IL-4delta2) transcripts in peripheral blood mononuclear cells from patients with systemic sclerosis. // Clin. Diagn. Lab. Immunol. - 1999. - Vol.6(5). - P.660-664.

85. Santhanam U., Ghrayeb J., Sehgal P.B., May L.T. Post-translational modifications of human interleukin-6. / / Arch. Biochem. Biophys. - 1989. - Vol.274(l). - P.161-170.

86. Sato M., Sawamura D„ Ina S., Yaguchi T., Hanada K., Hashimoto I. In vivo introduction of the interleukin 6 gene into human keratinocytes: induction of epidermal proliferation by the fully spliced form of interleukin 6, but not by the alternatively spliced form. // Arch. Dermatol. Res. - 1999. - Vol.291(7-8). - P.400-404.

87. Sayani F., Montero-Julian F.A., Ranchin V., Prevost J.M., Flavetta S., ZhuW., Woodman R.C., Brailly H., Brown

C.B. Identification of the soluble granulocyte-macrophage colony stimulating factor receptor protein in vivo. // Blood

- 2000. - Vol.95(2). - P.461-469.

88. Seah G.T., Scott G.M., Rook G.A. Type 2 cytokine gene activation and its relationship to extent of disease in patients with tuberculosis. // J. Infect. Dis. - 2000. -Vol.l81(l). - P.385-389.

89. Seto Y., Fukunaga R., Nagata S. Chromosomal gene organization of the human granulocyte colony-stimulating factor receptor.//J. Immunol. -1992. - Vol. 148(1). - P.259-266.

90. Seitz C., Muller P., Krieg R.C., Mannel D.N., Hehlgans T. A novel p75TNF receptor isoform mediating NFkappaB activation.//J. Biol. Chem. - 2001. - Mar 1 [epub ahead of print].

91. Shi Y.F., Hill M„ Novak A., Chen Z.Q., Wang R.X., Liew C.C., Mills G.B. Human hematopoietic cell express two forms of the cytokine receptor common gamma-chain (gamma c).// Cell Res. -1997. - Vol.7(2).

- P. 195-205.

92. ShimaN., Tsuda E., Goto M„ Yano K., Hayasaka H., Ueda M., Higashio K. Hepatocyte growth factor and its variant with a deletion of five amino acids are distinguishable in their biological activity and tertiary structure. // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1994. - Vol.200(2). - P.808-815.

93. Sorg R.V., Enczmann J., Sorg U.R., Schneider E.M., Wernet P. Identification of an alternatively spliced transcript of human interleukin-4 lacking the sequence encoded by exon 2. // Exp. Hematol. - 1993. - Vol.21(4). -P.560-563.

94. Stanley E.R. A Compendium of Cytokines and Other Mediators of Host Defense. CSF-1. // Cytokine Reference. / Oppenheim J.J. and Feldmann M. - Academic Press., - San Diego,-2001.-P.911-934.

95. Straubinger A.F., Viveiros M.M., Straubinger R.K. Identification of two transcripts of canine, feline, and porcine interleukin-1 alpha. // Gene - 1999. - Vol.236(2). - P.273-280.

96. Suzu S., Hatake K., Ota J., Mishima Y., Yamada M., Shimamura S., Kimura F., Motoyoshi K. Identification of alternatively spliced transcripts encoding murine macrophage colony-stimulating factor. // Biochem. Biophys. Res. Commun. -1998. - Vol.245(l). -P.120-126.

97. Tagaya Y., Kurys G., Thies T.A., Losi J.M., Azimi N., Hanover J.A., Bamford R.N., Waldmann T.A. Generation of secretable and nonsecretable interleukin 15 isoforms through alternate usage of signal peptides. / / Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1997. Vol.94(26). -P.14444-14449.

98. Tavemier J., Tuypens T., Plaetinck G„ Verhee A., Fiers W., Devos R. Molecular basis of the membrane-anchored and two soluble isoforms of the human interleukin

5 receptor alpha subunit. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1992. - Vol.89(15). - P.7041-7045.

99. Toksoz D., Zsebo K.M., Smith K.A., Hu S., Brankow

D., Suggs S.V., Martin F.H., Williams D.A. Support of human hematopoiesis in long-term bone marrow cultures by murine stromal cells selectively expressing the membrane-bound and secreted forms of the human homolog of the steel gene product, stem cell factor. // Proc. Natl. Acad. Sci. US A. -1992. - Vol89(16). - P.7350-7354.

100. Tsuchiya M., Kaziro Y., Nagata S. The chromosomal gene structure for murine granulocyte colony-stimulating factor. // Eur. T. Biochem. - 1987. -Vol.l65(l). - P.7-12.

101. Tsytsikov V.N., Yurovsky V.V., Atamas S.P., Alms W.J., White B. Identification and characterization of two alternative splice variants of human interleukin-

2. //J. Biol. Chem. - 1996. - Vol.271(38). - P.23055-23060.

102. Voyle R.B., Haines B.P., Pera M.F., Forrest R„ Rathjen P.D. Human germ cell tumor cell lines express novel leukemia inhibitory factor transcripts encoding differentially localized proteins. // Exp. Cell. Res. - 1999. - Vol.249(2). -P.199-211.

103. Voulgaropoulou F., Myers R.L., Chiu I.M. Alternative splicing of fibroblast growth factor 1 (FGF-1) transcripts: a cellular dilemma in determining exon selection

and exclusion. // DNA Cell. Biol. - 1994. - Vol. 13(10). -P. 1001-1009.

104. Voyle R.B., Rathjen P.D. Regulated expression of alternate transcripts from the mouse oncostatin M gene: implications for interleukin-6 family cytokines. // Cytokine

- 2000. - Vol.l2(2). - P.134-141.

105. Watkins R.H., D’Angio C.T., Ryan R.M., Patel A., Maniscalco W.M. Differential expression of VEGF mRNA splice variants in newborn and adult hyperoxic lung injury. // Am. J. Physiol. - 1999. - Vol.276(5 Pt 1). - P.858-867.

106. Weissbach L., Tran K., Colquhoun S.A., Champliaud M.F., Towle C.A. Detection of an interleukin-1 intracellular receptor antagonist mRNA variant. // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1998.- Vol.244(l). -P.91-95.

107. Welker P., Schadendorf D., Artuc М., Grabbe J., Henz B.M. Expression of SCF splice variants in human melanocytes and melanoma cell lines: potential prognostic implications. // Br. J. Cancer. - 2000. - Vol.82(8). - P.1453-1458.

108. White S.M., Alarcon M.H.,Tweardy D.J. Inhibition of granulocyte colony-stimulating factor-mediated myeloid maturation by low level expression of the differentiation-defective class IV granulocyte colony-stimulating factor receptor isoform. // Blood - 2000. - Vol.95(ll). - P.3335-3340.

109. Wong G.G., Temple P.A., Leary A.C., Witek-Giannotti J.S, Yang Y.C., Ciarletta A.B., Chung М., Murtha P., Kriz R., Kaufman R.J., et al. Human CSF-1: molecular cloning and expression of 4-kb cDNA encoding the human urinary protein. // Science -1987. - Vol.235(4795). - P. 1504-1508.

110. Xu X., Liao J., Creek K.E., Pirisi L. Human keratinocytes and tumor-derived cell lines express alternatively spliced forms of transforming growth factor-alpha mRNA, encoding precursors lacking carboxyl-terminal valine residues. // Oncogene - 1999. - Vol.l8(40). P.5554-5562.

111. Zav’yalov V. P., Denesyuk A.I., White B., Yurovsky V.V., Atamas S.P., Korpela T. Molecular model of an alternative splice variant of human IL-4, IL-4 delta 2, a naturally occurring inhibitor of IL-4-stimulated T cell proliferation.// Immunol. Lett. -1997. - Vol.58(3). - P. 149-152.

112. Zheng G., Rao Q., Wu K., He Z., Geng Y. Membrane-bound macrophage colony-stimulating factor and its receptor play adhesion molecule-like roles in leukemic cells. // Leuk. Res. - 2000. - Vol.24(5). P.375-383.

113. Ziegler S.F., Davis Т., Schneringer J.A., Franklin T.L., Tough T.W., Teepe М., Larsen A., Williams D.E., Smith C.A. Alternative forms of the human G-CSF receptor function in growth signal transduction.//New Biol. -1991.

- Vol.3(12).-P.1242-1248.

поступила в редакцию 03.05.2001 принята к печати 21.06.2001