СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ НИЗКОКОПИЙНОЙ ДНК Neisseria gonorrhoeae ПРИ МАЛО- И БЕССИМПТОМНОЙ ГОНОКОККОВОЙ ИНФЕКЦИИ
METHOD FOR DETECTING LOW-COPY-NUMBER DNA OF NEISSERIA GONORRHOEAE IN LOW- AND ASYMPTOMATIC GONOCOCCAL INFECTIONS

Изобретение относится к области медицины, а именно к способам выявления низкокопийных молекулярных маркеров Neisseria gonorrhoeae (ДНК N. gonorrhoeae) для применения в диагностике пациентов при мало- и бессимптомной урогенитальной гонококковой инфекции, характеризующейся низкой бактериальной нагрузкой (низкокопийной ДНК) [1].
Известен способ определения локализации возбудителей инфекций в мочеполовом тракте у мужчин (патент РФ №2367355, МПК А61В 10/00, C12Q 1/68, з. 09.01.2008 г.), включающий последовательный отбор проб мочи и секрета предстательной железы, выделенных при мочеиспускании и после массажа предстательной железы, гигиеническую обработку полового члена после каждой операции отбора, сопоставление количеств возбудителей инфекций в пробах, определение их локализаций в соответствии с количествами в пробах, предварительно соскабливают эпителиальные клетки уретры из ладьевидной ямки - проба 1, вводят в уретру физраствор, собирают его при излитии - проба 2; отбирают среднюю порцию мочи при последующем полном мочеиспускании - проба 3, после чего вводят повторно в уретру физраствор и сливают его, затем массируют предстательную железу и собирают ее секрет - проба 4, а локализацию возбудителей инфекций определяют в каждой из отобранных проб по распределению количественного содержания их ДНК в пробах с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПНР РВ).
Недостаток способа заключается в том, что в нем не решена проблема обработки и концентрации клинического материала для выявления низкокопийной ДНК N. gonorrhoeae в мочеполовом тракте у пациентов с мало- и бессимптомной гонококковой инфекцией.
Наиболее близкой по технической сущности к заявляемому способу, является перечень процедур получения образцов и предварительной обработки мочи, направленной на концентрирование клеток микроорганизмов, описанный в «Клинических рекомендациях ФГУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора «Правила проведения клинических лабораторных исследований. Молекулярно-биологическое исследование для выявления ДНК и/или РНК возбудителей инфекций, передаваемых половым путем (Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma genitalium, Trichomonas vaginalis) ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, 2014».
Согласно известному способу, проводят отбор первой порции утренней мочи в количестве 20-30 мл, флакон с мочой взбалтывают. Переносят 1 мл мочи в стерильную одноразовую пробирку объемом 1,5 мл, используя отдельный наконечник с фильтром для каждого образца. Центрифугируют 5 мин при 10000 g (12 тыс. об/мин на центрифуге «MiniSpin», Eppendorf). При наличии большого количества солей ресуспендируют верхний слой осадка солей в объеме 1 мл и затем снова центрифугируют. Используя вакуумный отсасыватель с колбой-ловушкой, полностью удаляют надосадочную жидкость, не захватывая осадок и используя для каждого образца отдельный наконечник (без фильтра). Осадок разводят транспортной средой до конечного объема 0,2 мл. Тщательно перемешивают содержимое пробирки на вортексе и используют для экстракции ДНК.
Однако, предложенный в методических рекомендациях способ (прототип) рассчитан на выявление высококопийной ДНК N. gonorrhoeae при клинически выраженной инфекции и не решает проблемы выявления низкокопийной ДНК N. gonorrhoeae при мало- и бессимптомной урогенитальной гонококковой инфекции, в связи с тем, что в анализ берут осадок из 1 мл средней порции мочи.
Задачей изобретения является усовершенствование метода обнаружения ДНК N. gonorrhoeae особенно при мало- и бессимптомной урогенитальной гонококковой инфекции, характеризующейся низкой бактериальной нагрузкой (низкокопийной ДНК).
Технический результат заключается в повышении точности диагностики урогенитальной гонококковой инфекции путем выявления низкокопийной ДНК N gonorrhoeae в мочеполовом тракте у пациентов с мало- и бессимптомной урогенитальной гонококковой инфекцией.
Поставленная задача решается за счет того, что в способе выявления ДНК N. gonorrhoeae, включающий отбор первой порции утренней мочи в количестве 20-30 мл, предварительную обработку, направленную на концентрирование клеток микроорганизмов путем взбалтывания флакона, отбора средней пробы мочи объемом 1 мл в стерильную одноразовую пробирку объемом 1,5 мл, центрифугирование 5 мин при 12000 об/мин, полное вакуумное удаление супернатанта, при наличии большого количества солей ресуспендирование верхнего слоя осадка солей в объеме 1 мл транспортной среды, повторное центрифугирование, удаление надосадочной жидкости, разведение осадка транспортной средой до конечного объема 0,2 мл, тщательное перемешивание содержимого пробирки, дальнейшее использование полученного материала для экстракции ДНК,
2
проводят концентрирование необходимого объема первой порции утренней мочи (20 мл) центрифугированием при 12000 об/мин 30 минут в конических центрифужных пробирках объемом 15 мл; затем удаляют супернатант, оставляя 100 мкл осадка, производят объединение осадков (200 мкл) в одну стерильную пробирку объемом 2 мл и отмывку от солей и ингибиторов физиологическим раствором, концентрируют центрифугированием при 12000 об/мин в течение 10 минут, производят полное удаление супернатанта, на дне пробирки оставляют плотный осадок, к которому добавляют сразу лизирующий буфер, в объеме, предусмотренном наборами реагентов для экстракции ДНК сорбционным методом, включающими 1 отмывку и амплифицируют набором реагентов с аналитической чувствительностью не менее 10 ГЭ/мл.
2
Сущность изобретения состоит в определенных подходах, способствующих повышению точности диагностики (детекции низкокопийной ДНК N. gonorrhoeae) при мало- и бессимптомной урогенитальной гонококковой инфекции, учитывая биологическую особенность - содержание этиологического агента в соскобном отделяемом уретры и моче в малых количествах после неоднократного приема неэффективных антибактериальных препаратов, выбор в качестве объекта исследования - концентрированного осадка из 20 мл первой порции утренней мочи, содержащего количество бактериальных частиц, достаточного для достижения порога чувствительности и детекции методом ПЦР РВ с заявленной аналитической чувствительностью 10 ГЭ/мл (Таблица 1; Таблица 2) из ДНК, экстрагированной сорбционным методом, включающими 1 отмывку, включен дополнительный этап обогащения образца, исследуемого материала в процессе пробоподготовки.
Способ выявления низкокопийных молекулярных маркеров N. gonorrhoeae (ДНК N. gonorrhoeae) применяется в диагностике пациентов с мало- и бессимптомной урогенитальной гонококковой инфекцией, которая характеризуется скудным соскобным отделяемым из уретры, низкой бактериальной нагрузкой (низкокопийной ДНК) в образцах соскобного отделяемого уретры и мочи; формируется в результате приема неэффективных антибактериальных препаратов классов пеницилинов, тетрациклинов, фторхинолонов, к которым в 50-80% случаев, развилась резистентность клинических изолятов N. gonorrhoeae и они исключены из современных схем лечения гонококковой инфекции [2].
Способ осуществляется следующим образом.
1. Первую порцию утренней мочи собирают в контейнер, в объеме 20 мл, взбалтывают и переносят одноразовой пастеровской пипеткой по 10 мл в конические центрифужные градуированные пробирки типа Falcon, объемом 15 мл.
2. Проводят 1 концентрирование пробы - центрифугируют при 12000 об/мин в течение 30 минут.
3. Затем, удаляют супернатант, оставляя осадок около 100 мкл, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник без фильтра. 4. Переносят осадки в одну пробирку типа Eppendorf объемом 2 мл (общий объем 200 мкл) ресуспендируют осадок в 1 мл 0,45% физиологического раствора, чтобы отмыть пробу от солей и ингибиторов.
5. Проводят 2 концентрирование пробы - центрифугируют при 12000 об/мин в течение 10 минут.
6. Затем, удаляют весь супернатант, не задевая осадок, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник без фильтра. Осадок может быть видимым или не видимым, в зависимости от состава осадка мочи и располагается на противоположной от центра, нижней (скошенной) части стенки пробирки.
2
7. К осадку без дополнительного разведения транспортной средой, добавляют лизирующий буфер, в объеме, предусмотренном наборами реагентов для экстракции ДНК сорбционным методом, включающими 1 отмывку и амплифицируют набором реагентов с аналитической чувствительностью не менее 10 ГЭ/мл.
Клинический случай 1.
3
Пациент Т. 30 лет, образование высшее, не женат, детей нет. В анамнезе гонококковая инфекция после случайного незащищенного контакта, самолечение антибактериальным препаратом класса фторхинолонов. Через 1,5 месяца обратился самостоятельно за медицинской помощью в клинико-диагностическое отделение УрНИИДВиИ с жалобами на появившийся зуд, жжение в уретре, дискомфорт при мочеиспускании, диспареунию. При осмотре признаков гиперемии, воспаления уретры не выявлено. При микроскопии отделяемого уретры признаков воспаления не установлено - полиморфно-ядерных лейкоцитов (ПЯЛ) 1-2 в поле зрения, в посеве Streptococcus mitis, Staphylococcus anginosus в титре 10 КОЕ/мл. Методом ПЦР РВ ДНК выделенной из соскобного отделяемого уретры инфекции передаваемые половым путем (ИППП) N. gonorrhoeae, С. trachomatis, T. vaginalis, M. genitalium, Mycoplasma hominis, Ureaplasma spp., CMV, HSV-7,2 типа - не обнаружены.
При микроскопии секрета простаты - выраженный лейкоцитоз, 20-100 ПЯЛ в поле зрения; ПЦР РВ ДНК, выделенной из секрета простаты - возбудители ИППП не обнаружены.
ПЦР РВ ДНК выделенной из мочи предварительно обработанной по способу, описанному в прототипе - возбудители ИППП не обнаружены; по предлагаемому способу, результат ПЦР РВ - обнаружена низкокопийная Д НК облигатного патогена N. gonorrhoeae.
Заключение: самостоятельное лечение неэффективным препаратом привело к малосимптомной форме гонококковой инфекции. Предварительная обработка мочи предлагаемым способом позволила выявить в ПЦР РВ низкокопийную ДНК этиологического агента -N. gonorrhoeae.
Клинический случай 2.
Пациент Л., возраст 36 лет. Образование высшее, женат, 2 детей. Наличие незащищенных случайных половых связей не отрицает. Обратился в клинико-диагностическое отделение УрНИИДВиИ с целью обследования на ИППП, после случайного незащищенного полового контакта с жалобами на эпизодические боли, дискомфорт в уретре при мочеиспускании.
Локальный статус: кожа головки полового члена без изменений, губки уретры бледно-розового цвета, соскобное отделяемое из уретры скудное. Микроскопическое исследование отделяемого из уретры: скудное количество клинического материала, единичные клетки эпителия, слизь скудно, лейкоциты единичные на препарат, флора смешанная умеренная.
Микроскопическое исследование секрета простаты - клеток единично, лейкоциты единично, лецитиновые зерна отсутствуют. В бакпосеве - Staphylococcus epidermalis, Corynebacterium glucuronolyticum скудный рост. ПЦР РВ ДНК, выделенной из соскобного отделяемого уретры - ДНК N. gonorrhoeae, С. trachomatis, Т. vaginalis, М. genitalium, М. hominis, Ureaplasma spp., CMV, HSV-7,2 типа - не обнаружены.
ПЦР РВ ДНК выделенной из мочи предварительно обработанной по способу, описанному в прототипе - возбудители ИППП не обнаружены; результат ПЦР РВ ДНК, обработанной по предлагаемому способу - обнаружена низкокопийная ДНК облигатного патогена N. gonorrhoeae.
Заключение: отсутствие объективных признаков воспалительного процесса на фоне субъектиных симптомов и данных анамнеза, позволяет сделать вывод о малосимптомной форме урогенитальной инфекции, этиологический агент, которой не был выявлен традиционными методами, в связи с трудностями забора клинического материала при скудном отделяемом из уретры и мочи.
Клинический случай 3.
Пациент В., 27 лет, работает, женат, имеет двоих детей. Со слов пациента, через неделю после незащищенного случайного полового контакта были жалобы на обильные мутные гнойные выделения из уретры, зуд, жжение, дискомфорт. Неоднократно принимал антибактериальные препараты, после окончания терапии симптомы возвращались. Через 8 месяцев с клинически поставленным диагнозом «уретро-окуло-синовиальный» синдром, жалобами на острую боль в правом коленном суставе, боль в спине, конъюктивит, паховый лимфогранулематоз, общую слабость, обратился в клинико-диагностическое отделение УрНИИДВиИ. Локальный статус: кожа головки полового члена без изменений, губки уретры бледно-розового цвета, отделяемое из уретры скудное. Микроскопическое исследование отделяемого из уретры: скудное количество клинического материала, единичные клетки эпителия, слизь, лейкоциты единичные на препарат, флора смешанная умеренная. ПЦР РВ исследование соскобного отделяемого из уретры - при неоднократном упорном обследовании на ИППП, обнаружена низкокопийная ДНК N. gonorrhoeae; Другие возбудители ИППП не обнаружены.
ПЦР РВ ДНК выделенной из мочи предварительно обработанной по способу, описанному в прототипе - возбудители ИППП не обнаружены; результат ПЦР РВ ДНК, обработанной по предлагаемому способу - обнаружена низкокопийная ДНК N. gonorrhoeae.
Заключение: длительное течение при неоднократном превентивном приеме антибактериальных препаратов привело к осложнениям, а также осложнило диагностику урогенитальной инфекции. Низкокопийная ДНК N. gonorrhoeae выделенная по мочи, обработанной по предлагаемому способу, выступила дополнительным подтверждением гонококковой инфекции, выявленной однократно при упорном поиске в соскобном отделяемом уретры.
Клинический случай 4.
Пациент П., 42 года, женат, детей нет. Семейная пара обратилась в центр репродуктивной медицины, где в рамках программы вспомогательной репродукции - суррогатного материнства с экстракорпоральным оплодотворением яйцеклетки, биологическим родителям было назначено обследование на инфекции передаваемые половым путем.
У пациента микроскопическое исследование отделяемого из уретры: единичные клетки эпителия, слизь умеренно, лейкоциты 0-1 в п/зрения, флора смешанная скудная.
ПЦР РВ оделяемого из уретры - ДНК N. gonorrhoeae, С. trachomatis, Т. vaginalis, М. genitalium, М. hominis, Ureaplasma spp., CMV, HSV-1,2 типа - не обнаружено.
ПЦР РВ ДНК выделенной из мочи предварительно обработанной по способу, описанному в прототипе - возбудители ИППП не обнаружены; результат ПЦР РВ ДНК, обработанной по предлагаемому способу - обнаружена низкокопийная ДНК облигатного патогена N. gonorrhoeae.
Заключение: учитывая сложность подготовки, высокую стоимость процедур технологии репродуктивного вспоможения важно проводить исследование на ИППП высокочувствительными методами, включающими наиболее информативные образцы клинического материала и способы их концентрации, способствующие выявлению даже низких концентраций облигатных патогенов.
1. Priest D., Ong J.J., Chow E.P.F., Tabrizi S., Phillips S., Bissessor M, Fairley C.K., Bradshaw C.S., Read T.R.H., Garland S., Chen M. Neisseria gonorrhoeae DNA bacterial load in men with symptomatic and asymptomatic gonococcal urethritis. Sex. Transm. Infect. 2017 Nov;93(7):478-481. doi: 10.1136/sextrans-2016-052950. Epub 2017 Feb 1.
2. Федеральные клинические рекомендации. Дерматовенерология 2015: Болезни кожи. Инфекции, передаваемые половым путем. - 5-е изд., перераб. и доп.- М.: Деловой экспресс, 2016. - 768 с.