КОРМОВАЯ ДОБАВКА С ПРОБИОТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ ДЛЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ, ПТИЦ, ЛОШАДЕЙ И РЫБ
FODDER ADDITIVE WITH PROBIOTIC ACTIVITY FOR FARM ANIMALS, BIRDS, HORSES AND FISH

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии, в частности к сухой кормовой добавке «Профорт» с пробиотической активностью, содержащей жизнеспособные бактерии штамма Enterococcus faecium 1-35 и жизнеспособные бактерии штамма Bacillus megaterium В4801 и используемой в составе корма для сельскохозяйственных животных, птиц, лошадей, рыб.
Известны препараты с пробиотической активностью, используемые при кормлении сельскохозяйственных животных и птицы и содержащие микроорганизмы, в том числе бактерии Enterococcus faecium.
Известна синбиотическая композиция для коррекции дисбиотических нарушений микробиоценоза желудочно-кишечного тракта, включающая пребиотическую составляющую и пробиотическую составляющую в виде комбинации штаммов бактерий Lactobacillus delbrueckii TS1-06 и Lactobacillus fermentum TS3-06, а также высушенных культуральных жидкостей с метаболитами пробиотического штамма бактерий Bacillus subtilis ВКПМ B-2335 и метаболитами пробиотического штамма бактерий Enterococcus faecium L-3, RU №2592988 C1, A61K 35/741, A61K 36/899, A61K 47/02, 27.07.2016.
Известен штамм бактерий Enterococcus faecium Ef79OSAU, обладающий антагонистической активностью в отношении бактерий рода Listeria и вида Enterococcus faecalis, депонированный под регистрационным номером-1251 и используемый для приготовления пробиотических препаратов, RU №2571852 С2, C12N 1/20, А61K 35/744, 20.12.2015.
6
9
Известна кормовая добавка с пробиотической активностью на минеральной основе, используемая в составе корма для сельскохозяйственных животных и птицы, состоящая из жизнеспособных спор спорообразующих бактерий штамма Bacillus subtilis 111 с титром 2×10-6×10 КОЕ/г и наполнителя - диатомит в виде обожженной крошки, RU №2569002 C1, А23K 1/16, А23K 1/175, 20.11.2015.
8
8
Известно средство для профилактики мастита у коров в период лактации, содержащее пробиотические штаммы, имеющие состав в следующем соотношении компонентов, мас. %: Bacillus subtilis - В-5225 - 4% в концентрации 1×10 КОЕ/мл, Enterococcus faecium СТФ 1/56 - 4% в концентрации 1×10 КОЕ/мл, глицерин - 2%, стерильная вода - остальное - 90%, RU №2560277 С1, А61K 35/741, А61K 35/744, 20.08.2015.
Известны штамм Enterococcus faecium 8G-1 (NRRL В-50173), штамм Enterococcus faecium 8G-73 (NRRL B-50172) и штамм Bacillus pumilus 8G-134 (NRRL B-50174), обеспечивающие улучшение состояния здоровья жвачных животных, на основе любого из указанных штаммов или их комбинации в сочетании с монензином получают состав, обеспечивающий лечение или профилактику ацидоза, улучшение показателей здоровья жвачных животных и/или повышение их продуктивности, RU №2528859 С2, C12N 1/20, С12Р 1/04, А61K 35/74, 20.09.2014.
Известен препарат для лечения и профилактики дисбактериальных состояний кишечника у птиц, содержащий инулин и закваску живых микроорганизмов Lactobacillus acidophilus, Enterococcus faecium, №2410105 C1, A61K 35/66, 27.01.2011.
Известен штамм бактерий Bacillus licheniformis BKM В-2414Д, используемый для получения компонента пробиотической кормовой добавки, предназначенной для производства высококачественных кормов, повышающих продуктивность и снижающих риск желудочно-кишечных заболеваний животных, птицы и рыб, RU №2398872 C1, C12N 1/20, А23K 1/165, 10.09.2010.
Известна пробиотическая кормовая добавка в виде смеси микроорганизмов, выбранных из группы Enterococcus faecium, DSM 16211, Lactobacillus reuteri, DSM 16350, Lactobacillus salivarius ssp. salivarius, DSM 16351, Pediococcus acidilactici, DSM 16210, Bifidobacterium animalis, DSM 16284, позволяющая предотвратить вредное действие микробов в пищеварительной системе сельскохозяйственных птиц, RU №2372788 С2, А23K 1/00, А23K 1/18, 20.11.2009.
Известна кормовая добавка для молодняка свиней, содержащая сухой свекловичный жом и дополнительно пробиотик, в состав которого входят культуры бактерий Bifidobacterium globosum, Enterococcus faecium и Bacillus subtilis, фумаровую кислоту и цеолит, RU №2359465 C1, А23K 1/00, 27.06.2009.
Известна пробиотическая добавка, используемая при изготовлении комбикормов, содержащих пробиотики для сельскохозяйственных животных, птицы и рыб, и содержащая биомассу спорообразующих бактерий Bacillus subtilis B-2250 и/или Bacillus licheniformis B-2252, и носитель сорбент, содержащий аэросил гидрофильный марки А и гидрофобный марки AM, а также влагоемкий наполнитель, RU №2252956 С2, C12N 1/20, А23K 1/165, 27.05.2005; RU №2203947 С1, С12N 1/20, 10.05.2003.
Известны способы получения препаратов с пробиотической активностью для сельскохозяйственных животных, птицы и рыбы, содержащие микроорганизмы:
8
Известен способ получения комплексного кормового препарата для сельскохозяйственных животных, птицы и рыбы, характеризующийся тем, что получают жидкую культуру штамма Corynebacterium glutamicum ВКПМ В-1959 и жидкие культуры штаммов Bacillus subtilis ВКПМ В-8130, Bacillus subtilis ВКПМ В-2984, Bacillus subtilis ВКПМ В-4099 и Bacillus licheniformis ВКПМ В-4162, затем 30 л жидкой культуры штамма Corynebacterium glutamicum ВКПМ В-1959 добавляют к 35 л смеси, состоящей из жидких культур Bacillus subtilis ВКПМ В-8130, Bacillus subtilis ВКПМ В-2984 и Bacillus subtilis ВКПМ В-4099, взятых в соотношении 6:6:1 соответственно, и полученную общую смесь жидких культур в количестве 65 л наносят на 200 кг предварительно подготовленного носителя - стерильного свекловичного жома, обогащенного ферментолизатом дрожжей Saccharomyces cerevisiae, и проводят твердофазную ферментацию, затем добавляют 65 л жидкой культуры Bacillus licheniformis ВКПМ В-4162, содержащей не менее 5,6×10 КОЕ/г, смесь тщательно перемешивают и высушивают до влажности 8-10%, после чего добавляют сухие порошки трав, перемешивают и подвергают дроблению до получения однородной массы, RU №2499829 C1, C12N 1/20, А23K 1/00, 27.11.2013; RU №2477614 C1, А23K 1/16, А23K 1/14, 20.03.2013.
Известны способы получения препаратов с пробиотической активностью для сельскохозяйственных животных и птицы, содержащие бактерии Enterococcus faecium:
Известен способ получения биопрепарата с пробиотическими свойствами для кормления сельскохозяйственных животных и птицы, содержащего в своем составе смесь эфирных масел чеснока, эвкалипта, розмарина и тимьяна, штамм бактерий Enterococcus faecium 1-35 и наполнитель, RU №2458527 C1, А23K 1/165, 20.08.2012.
8
Известно приготовление маточной культуры совместным выращиванием в условиях глубинного культивирования молочнокислых микроорганизмов Enterococcus faecium В 3491, Lactobacillus plantarum В 3242, Bifidobacterium bifidum AC 1247, взятых в соотношении 1:1:1 до заданного достижения биотитра каждого микроорганизма не менее 5-10 КОЕ/мл, обеспечивающее получение пробиотического препарата для профилактики желудочно-кишечных заболеваний, повышения сохранности и прироста живой массы молодняка сельскохозяйственных животных, RU №2380107 C1, А61K 35/66, А23K 1/165, 27.01.2010.
Использование микроорганизмов в известных препаратах с пробиотической активностью, в том числе и в кормовых добавках, бактерий Enterococcus faecium очень разнообразно и требует индивидуального подбора введения их в корм в каждом конкретном случае.
Известен штамм бактерий Bacillus megaterium и его использование:
Известен штамм бактерий Bacillus megaterium var. phosphaticum BKM В-2357Д, мобилизующий фосфор и кремний из объектов литосферы, устойчивый к полигексаметиленгуанидину и перспективный для получения бактериального препарата, RU №2327737 С2, C12N 1/20, C05F 11/08, 27.06.2008.
Известный штамм бактерий Bacillus megaterium является перспективным для получения бактериальных препаратов.
Кроме того, известный штамм бактерий Bacillus megaterium используют для биологической очистки сточных вод от загрязнений, для рекультивации почв, загрязненных нефтью, для микробиологической защиты растений, RU №2185339 С2, C02F 3/34, C12N 1/20, 20.07.2002; RU №2037472 C1, C02F 3/34, C12N 1/20, 19.06.1995; RU №2571219 С2, C12N 11/14, В09С 1/10, C02F 3/34, 20.12.2015; RU №2421291 С2, В09С 1/10, C12N 1/26, 20.06.2011; RU №2558291 С2, C12N 1/20, A01N 63/00, 27.07.2015; RU №2539025 C1, A01N 63/00, C12N 1/20, 10.01.2015; RU №2518252 С1, A01N 63/00, 10.06.2014; RU №2454075 С2, A01N 63/00, C12N 1/20, 27.06.2012; RU №2147181 C1, A01N 63/00, C05F 11/08, 10.04.2000.
Известны кормовые добавки на основе минеральных носителей:
Известна кормовая добавка для свиней, представляющая собой природный минерал Водинского месторождения Красноярского района Самарской области, содержащий в своем составе 47,37% серы и 21,4% кальция, RU №2480025 С2, А23K 1/175, 27.04.2013.
Известна кормовая добавка для молодняка крупного рогатого скота, включающая бентонит Донгузского месторождения, подсолнечный фуз и неорганический селенит натрия, а в качестве наполнителя - отруби пшеничные, RU №2497382 С2, А23K 1/16, А23K 1/175, 10.11.2013.
Известна кормовая добавка для животных и птицы, включающая природный цеолит, RU №2484640 C1, А23K 1/00, 20.06.2013; RU №2467591 C1, А23K1/16, А23K 1/00, 27.11.2012; RU №2448472 С2, А23K 1/175, 27.04.2012; RU №2390254 C1, А23K 1/00, А23K 1/16, А23K 1/175, 27.05.2010; RU №2385623 С2, А23K 1/16, А23K 1/175, 10.04.2010; RU №2374896 С1, А23K 1/00, А23K 1/175, 10.12.2009; RU №2262863 C2, A23K1/16, A23K 1/175, 27.10.2005.
Известна кормовая добавка для крупного рогатого скота, включающая растительные и зерновые компонентов и минеральную добавку в виде голубой глины, являющейся природным сорбентом и дешевым источником жизненно необходимых макро- и микроэлементов и обладающей высокими адсорбционными и ионообменными свойствами, RU №2238659 С2, А23K 1/16, А23K 1/175, 27.10.2004.
Известна органоминеральная кормовая добавка, содержащая наполнитель и кремнесодержащий материал, в качестве которого добавка содержит диатомит Инзенского месторождения Ульяновской области с содержанием кремнезема 81,30-85,60% или опоку Дубинского месторождения Ульяновской области с содержанием кремнезема 84,10-89,62%, имеющие высокую пористость и гигроскопичность с возможностями накапливания физиологически активных веществ из наполнителя, RU №2199883 C1, А23K 1/16, А23K 1/175, 10.03.2003.
6
Известна кормовая добавка с фитопробиотической активностью на минеральной основе, используемая в составе корма для сельскохозяйственных животных и птицы и состоящая из жизнеспособных бактерий штамма Enterococcus faecium 1-35 с титром бактерий не менее 10 КОЕ/мг, растительного сырья и диатомита в виде обожженной крошки, RU №2574689 C1, А23K 1/16, 10.02.2016.
Известные кормовые добавки содержат в своем составе природные материалы на основе глины, или торфа, или природного цеолита (наиболее распространенного), которые в каждом конкретном случае имеют индивидуальные технологии обработки.
Известен кормовой продукт для сельскохозяйственных животных и птиц, содержащий в своем составе наполнитель и высушенную биомассу комплекса бактерий микроорганизмов, RU №2552872 C1, А23K 1/16, 10.06.2015.
Данное техническое решение принято в качестве ближайшего аналога настоящего изобретения.
Кормовой продукт ближайшего аналога содержит в своем составе сорбционный материал в виде смеси вермикулита и бентонитовой глины, молочную кислоту, янтарную кислоту, лимонную кислоту и дополнительно высушенную биомассу Lactobacillus acidophilus, Enterococcus faecium, Bacillus subtilis, Bacillus polymyxa.
В кормовом продукте ближайшего аналога другого состава не предусмотрено.
В основу настоящего изобретения положено решение задачи, позволяющей создать новую кормовую добавку «Профорт», повысить количественную и качественную составляющую пробиотической активности и расширить функциональную применимость и ее использование.
Технический результат настоящего изобретения заключается в создании новой кормовой добавки «Профорт» на основе штаммов Enterococcus faecium 1-35 и Bacillus megaterium В4801, в получении суммарного эффекта двух штаммов бактерий с высокой пробиотической активностью и в возможности как нанесения сухой биомассы этих штаммов на различные носители: отруби (Вариант 1), шрот подсолнечный (Вариант 2), обожженная крошка диатомита (Вариант 3), трепел (Вариант 4), так и ее использования.
Согласно изобретению эта задача решается за счет того, что кормовая добавка с пробиотической активностью для сельскохозяйственных животных, птиц, лошадей и рыб содержит в своем составе наполнитель и высушенную биомассу комплекса бактерий микроорганизмов.
7
8
7
8
Кормовая добавка содержит высушенную биомассу двух штаммов: штамм бактерий Enterococcus faecium 1-35 с титром живых бактерий 3,8×10-2,2×10 КОЕ и штамм бактерий Bacillus megaterium В-4801 с титром живых бактерий 3,8×10-3,3×10 КОЕ.
Вариант 1
7
7
Высушенная биомасса этих штаммов нанесена в смеси в равных количествах на наполнитель в виде отрубей, содержащих живых бактерий Enterococcus faecium 1-35 3,8×10 КОЕ и живых бактерий Bacillus megaterium В-4801 3,8×10 КОЕ в 1 г кормовой добавки.
Вариант 2
8
8
Высушенная биомасса этих штаммов нанесена в смеси в равных количествах на наполнитель в виде шрота подсолнечного, содержащего живых бактерий Enterococcus faecium 1-35 1,8×10 КОЕ и живых бактерий Bacillus megaterium В-4801 1,0×10 КОЕ в 1 г кормовой добавки.
Вариант 3
8
8
Высушенная биомасса этих штаммов нанесена в смеси в равных количествах на наполнитель в виде обожженной крошки диатомита, содержащей живых бактерий Enterococcus faecium 1-35 2,2×10 КОЕ и живых бактерий Bacillus megaterium В-4801 2,1×10 КОЕ в 1 г кормовой добавки.
Вариант 4
8
8
Высушенная биомасса этих штаммов нанесена в смеси в равных количествах на наполнитель в виде трепела, содержащего живых бактерий Enterococcus faecium 1-35 1,3×10 КОЕ и живых бактерий Bacillus megaterium В-4801 3,3×10 КОЕ в 1 г кормовой добавки.
Заявителем не выявлены источники, содержащие информацию о технических решениях, идентичных настоящей группе изобретений, что позволяет сделать вывод о его соответствии критерию «новизна».
За счет реализации отличительных признаков группы изобретений (в совокупности с признаками, указанными в ограничительной части формулы) достигаются важные новые свойства объекта.
Кормовая добавка «Профорт» нормализует процессы пищеварения.
Живые бактерии Enterococcus faecium 1-35 способствуют созданию нормальной микрофлоры, повышению переваримости и усвояемости питательных веществ рациона.
Живые бактерии Bacillus megaterium В-4801 при совместном использовании с живыми бактериями Enterococcus faecium 1-35 повышают пробиотическую активность.
Использование предложенных наполнителей Варианты 1-4 при взаимодействии с высушенной биомассой бактерий Enterococcus faecium 1-35 и Bacillus megaterium В-4801 улучшает показатели роста и развития сельскохозяйственных животных, птиц, лошадей и рыб и расширяет функциональную применимость.
Заявителю не известны какие-либо публикации, которые содержали бы сведения о влиянии отличительных признаков группы изобретений на достигаемый технический результат. В связи с этим, по мнению заявителя, можно сделать вывод о соответствии заявляемых технических решений критерию «изобретательский уровень».
Настоящую группу изобретений осуществляют следующим образом.
Кормовую добавку «Профорт» с пробиотической активностью используют в составе корма для сельскохозяйственных животных, птиц, лошадей и рыб.
Кормовая добавка содержит высушенную биомассу двух штаммов: штамм бактерий Enterococcus faecium 1-35 и штамм бактерий Bacillus megaterium В-4801.
Штамм бактерий Enterococcus faecium 1-35 депонирован в коллекции Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветпрепаратов (ВГНКИ) 20.03.2008 под регистрационным номером Enterococcus faecium ВГНКИ 08.03.53-ДЕП и хранится в коллекции микроорганизмов ООО «БИОТРОФ».
Штамм бактерий Bacillus megaterium В-4801 депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУП ГосНИИ Генетика под регистрационным номером ВКПМ: В-4801 и хранится в коллекции микроорганизмов ООО «БИОТРОФ».
Приготовление сухой биомассы штаммов бактерий Enterococcus faecium 1-35 и Bacillus megaterium В-4801 и кормовой добавки «Профорт».
Экспериментальные образцы культур штаммов бактерий Enterococcus faecium 1-35 и Bacillus megaterium В-4801 нарабатывают в ферментерах.
7
8
7
8
Для получения кормовой добавки «Профорт» берут высушенную биомассу штамма бактерий Enterococcus faecium 1-35 с титрами живых бактерий в пределах 3,8×10-2,2×10 КОЕ и штамм бактерий Bacillus megaterium В-4801 с титрами живых бактерий в пределах 3,8×10-3,3×10 КОЕ.
Высушенные биомассы этих штаммов наносят в смеси в равных количествах на наполнитель.
7
7
В качестве наполнителя используют отруби, содержащие живых бактерий Enterococcus faecium 1-35 3,8×10 КОЕ и живых бактерий Bacillus megaterium В-4801 3,8×10 КОЕ в 1 г кормовой добавки (Вариант 1).
Отруби соответствуют ГОСТ 7169-66.
8
8
В качестве наполнителя используют шрот подсолнечный, содержащий живых бактерий Enterococcus faecium 1-35 1,8×10 КОЕ и живых бактерий Bacillus megaterium В-4801 1,0×10 КОЕ в 1 г кормовой добавки (Вариант 2).
Шрот подсолнечный соответствует ГОСТ 11246-96.
8
8
В качестве наполнителя используют обожженную крошку диатомита, содержащую живых бактерий Enterococcus faecium 1-35 2,2×10 КОЕ и живых бактерий Bacillus megaterium В-4801 2,1×10 КОЕ в 1 г кормовой добавки (Вариант 3).
Диатомит - осадочная горная порода рыхлая или слабосцементированная, состоящая из останков диатомовых водорослей и имеющая серый или желтый цвет слабых тонов.
Химически диатомит более чем на 80% состоит из водного кремнезема.
Диатомит в виде обожженной крошки поставляет "Диатомовый Комбинат" г. Инза Ульяновской области.
8
8
В качестве наполнителя используют трепел, содержащий живых бактерий Enterococcus faecium 1-35 1,3×10 КОЕ и живых бактерий Bacillus megaterium В-4801 3,3×10 КОЕ в 1 г кормовой добавки (Вариант 4).
Трепел соответствует ТУ 5761-001-59266087-2005.
«Сохранность бактерий на разных типах носителей» приведена в таблице 1.
Количественное содержание живых бактерий определено экспериментально и является оптимальным.
Смесь живых бактерий Enterococcus faecium 1-35 и Bacillus megaterium В-4801 наносят на наполнители по Вариантам 1-4 соответственно и влажные компоненты кормовой добавки «Профорт» сушат.
Высушивание компонентов кормовой добавки «Профорт» проводят в шкафах сушильных РТ-ШС воздушно-тепловым способом при температуре от 55°С до 60°С в течение 9 часов до конечной влажности 7,0-7,2%.
После сушки компоненты кормовой добавки «Профорт» направляют на размол на дробилку кормов ДКР-3.
Кормовую добавку «Профорт» размалывают до состояния порошка.
Органолептические, физико-химические и микробиологические показатели кормовой добавки «Профорт»
1. Определение внешнего вида и цвета
Определение внешнего вида и цвета проводят визуально при дневном рассеянном свете или при освещении лампами накаливания или люминесцентными лампами.
Кормовая добавка «Профорт» представляет собой сыпучий порошок, от светло-серого до кирпичного цвета и имеет характерный запах.
2. Определение содержания влаги (ГОСТ Р 54951)
Массовую долю влаги определяют в двух параллельных навесках. Из эксикатора извлекают две чистые просушенные бюксы и взвешивают с погрешностью не более 0,01 г. Образец средней пробы тщательно перемешивают и помещают в каждую взвешенную бюксу навеску массой 5,0 г, после чего бюксы закрывают крышками и ставят в эксикатор. Разогревают шкаф до 140°С и быстро помещают в него открытые бюксы с навесками продукта. Образец высушивают в течение 2 ч, считая с момента установления температуры 140°С. По окончании высушивания бюксы вынимают из шкафа тигельными щипцами, закрывают крышками и переносят в эксикатор для полного охлаждения примерно на 20 мин., но не более 2 ч. Охлажденные бюксы взвешивают с погрешностью не более 0,01 г и помещают в эксикатор до окончания обработки результатов анализа.
Массовую долю влаги в процентах (X) вычисляют по формуле:
1
2
1
X=100 (м-м)/м,
1
где м - масса навески добавки до высушивания, г;
2
м - масса навески добавки после высушивания, г.
Допускаемое расхождение между результатами двух параллельных определений не должно превышать 0,2%. За окончательный результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений.
Содержание влаги не должно превышать 12,0%.
Для определения содержания влаги может быть использован термогравиметрический метод.
3
3. Определение количества живых бактерий (КОЕ/см)
Определение концентрации микробных клеток Bacillus megaterium В-4801 (КОЕ/г)
3
-1
-2
-8
3
-5
-6
-7
-8
3
Для определения содержания бактерий Bacillus megaterium В-4801 в кормовой добавке «Профорт» исследуют по три образца каждой партии. Из отобранных для анализа образцов берут 10 г и переносят в колбу с 90 см 0,9%-ного стерильного раствора хлорида натрия, получая, таким образом, исходное разведение 10. После пятиминутного взбалтывания из него методом серийных десятикратных разведений приготавливают разведения с 10 по 10, в каждом случае используя отдельную стерильную пипетку. В стерильные чашки Петри разливают по 20 см расплавленного мясопептонного агара и оставляют их до застывания питательной среды. Из разведений 10, 10, 10 и 10 делают высевы по 0,1 см на три чашки Петри для каждого разведения, растирая материал стерильным стеклянным шпателем по поверхности среды. После чего чашки Петри инкубируют при температуре 37(±1)°С в течение 24 часов.
Подсчитывают число колоний Bacillus megaterium В-4801.
Число живых клеток (КОЕ) бактерий в 1 г препарата (X) вычисляют по формуле:
где X - количество колониеобразующих единиц;
1
2
3
a; а; а - количество колоний в учитываемом разведении;
10n - кратность разведения, в котором учитывается рост.
Допускаемые расхождения между результатами двух параллельных определений не должны превышать 20% по отношению к большему значению. В противном случае измерения повторяют.
За окончательный результат испытаний принимают среднеарифметическое значение результатов двух параллельных измерений.
Определение концентрации микробных клеток Enterococcus faecium 1-35 (КОЕ/г)
Приготовливают агаризованную среду.
2
4
3
3
Для приготовления среды берут панкреатический гидролизат рыбной муки 10,0 г, экстракт пекарных дрожжей - 5,0 г, глюкоза - 2,0 г; KНРО - 2,0 г; NaHCO - 1 г; твин-80 - 0,5 мл; натрия азид - 0,5 г; 2,3,5-трифенилтетразолий хлорид - 0,1 г; кристаллический фиолетовый 0,001 г; агар - 10 г, воду питьевую до 1000 см.
Порядок приготовления: в стерильную коническую колбу вносят все перечисленные компоненты, кроме агара, приливают воду и растворяют в ней внесенные соли при подогреве до кипения. Затем вносят агар микробиологический и расплавляют его путем подогрева среды. Кислотность среды доводят с помощью натрия двууглекислого, либо соляной кислоты до 6,9-7,3. Стерилизуют среду при 1 атм в течение 10 мин.
-6
-7
-8
3
Из разведений 10, 10, 10, приготовленных выше стерильной пипеткой, по 1 см раствора переносят в 3 чашки Петри, а затем заливают их стерильной расплавленной и охлажденной до 55°С средой. Круговыми движениями чашек Петри в них перемешивают среду и оставляют на столе до застывания агара. Чашки со средами помещают в термостат и выдерживают при 37°С в течение 1-2 суток. Затем производят подсчет выросших колоний помощью прибора для подсчета колоний.
Испытания проводят в двух параллельных повторностях.
На чашках подсчитывают число колоний Enterococcus faecium 1-35.
Число живых клеток (КОЕ) бактерий в 1 г препарата (X) вычисляют по формуле 1.
За окончательный результат испытаний принимают среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений, допускаемое расхождение между которыми не должно превышать 10%.
4. Определение микробиологической чистоты проводят по ГОСТ Р 55291
Кормовая добавка «Профорт» не должна содержать бактерий семейства Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa, Staphyloccocus aureus. Контаминация мезофильными аэробными, факультативно анаэробными микроорганизмами, дрожжевыми и плесневыми грибами не должна превышать 300 тыс. бактерий в 1 г добавки.
5. Определение безвредности
3
3
3
Готовят рабочий раствор кормовой добавки «Профорт». Для этого 0,25 г биопрепарата разводят в 5,0 см стерильного 0,9% раствора хлорида натрия. В течение пяти дней пяти беспородным мышам массой 18-20 г, с помощью иглы, на конце которой наплавлена олива диаметром 1,0-2,0 мм, вводят внутрижелудочно по 1,0 см приготовленного рабочего раствора. Параллельно пяти контрольным мышам внутрижелудочно вводят по 1,0 см стерильного 0,9%-ного раствора хлорида натрия, использованного для приготовления рабочего раствора. Наблюдение за мышами ведут в течение 7 дней.
Кормовая добавка «Профорт» безвредна, если в течение срока наблюдения все мыши из опытной и контрольной групп остаются живыми и клинически здоровыми. При гибели одной или нескольких мышей проверку повторяют на удвоенном их количестве. При гибели хотя бы одной мыши в повторном опыте кормовую добавку «Профорт» бракуют.
«Органолептические, физико-химические и микробиологические показатели кормовой добавки «Профорт»» представлены в таблице 2.
Исследования по использованию предложенной кормовой добавки «Профорт» представлены в примерах 1-5.
При исследовании кормовой добавки «Профорт» были использованы наполнители согласно Вариантам 1-4.
Пример 1
Использование кормовой добавки «Профорт» с пробиотической активностью в птицеводстве
Опыт проводили на базе ФГБУ СГЦ «Загорское ЭПХ» ВНИТИП г. Сергиев Посад Московской области в период с 01 августа по 06 сентября 2016 г. на цыплятах-бройлерах кросса «Кобб-500»
Было сформировано 2 группы цыплят-бройлеров (контрольная и опытная) по 1000 голов в каждой.
Выращивали цыплят-бройлеров в клеточных батареях «Big Dutcmen» в одинаковых условиях содержания и кормления согласно «Методическому руководству по кормлению сельскохозяйственной птицы», 2015.
Плотность посадки, световой и температурный режим осуществляли согласно «Методическим рекомендациям по технологическому проектированию птицеводческих предприятий», 2013.
Цыплята-бройлеры обеих групп получали полнорационный комбикорм с составом и питательностью согласно «Методическому руководству по кормлению сельскохозяйственной птицы», 2015.
Первая группа контрольная получала основной рацион (ОР) - полнорационный комбикорм согласно «Методическому руководству по кормлению сельскохозяйственной птицы», 2015.
Вторая группа опытная получала основной рацион (ОР) - полнорационный комбикорм согласно «Методическому руководству по кормлению сельскохозяйственной птицы», 2015 с кормовой добавкой «Профорт» из расчета 500 г/т.
Продолжительность опыта - 37 дней.
В период опыта учитывались основные зоотехнические показатели: живая масса в 7, 14, 21, 28 дней и в конце выращивания, сохранность поголовья, среднесуточный прирост живой массы и затраты корма на 1 кг прироста живой массы.
Результаты опыта представлены в таблице 3 «Влияние кормовой добавки «Профорт» на основные зоотехнические показатели выращивания цыплят-бройлеров»
Из таблицы 3 видно, что при вводе кормовой добавки «Профорт» в состав рациона цыплят-бройлеров с первого дня жизни и на протяжении всего периода откорма было отмечено увеличение живой массы птицы опытной группы на 4.2%.
Очевиден положительный результат по сохранности птицы, который в опытной группе составил 98,9%, что превышает показатель контрольной группы на 3.8% в абсолютном выражении.
Из таблицы 3 видно, что применение кормовой добавки «Профорт» позволило снизить затраты корма на 1 кг прироста живой массы на 0.4 кг.
8
8
В качестве наполнителя использована обожженная крошка диатомита, содержащая в 1 г кормовой добавки «Профорт» живых бактерий Enterococcus faecium 1-35 2,2×10 КОЕ и живых бактерий Bacillus megaterium В-4801 2,1×10 КОЕ.
Пример 2
Использование кормовой добавки «Профорт» с пробиотической активностью в свиноводстве.
Опыт проводили на базе АО ПЗ «Пламя» Ленинградской области Гатчинского района в период со 02 марта по 01 августа 2016 г. на поросятах группы отъема и группы откорма.
Было сформировано по возврату и живому весу две группы аналогов поросят-отъемышей по 20 голов в каждой и две группы аналогов поросят группы откорма по 15 голов в каждой. Содержание групповое - по 10 голов в клетке поросят группы отъема и по 15 голов в клетке поросят группы откорма.
Кормления двухразовые.
Основной рацион (ОР) поросят-отъемышей (кг):
комбикорм - 1,1; плющенное зерно - 0,5; силос - 0,6; сухое молоко - 35 г; сыворотка - 3,0 л; рыбий жир - 0,2 г; МВД - 300 г.
Основной рацион (ОР) молодняка свиней группы откорма: май, июнь (кг): комбикорм - 1,2; плющенное зерно, дробленка - 1,8; силос - 2,5; сыворотка - 8,0; хлебные отходы - 0,5; мясной бульон - 0,1; МВД - 0,150.
Июль (кг): комбикорм - 1,5; силос - 2,5; сыворотка - 8,0; хлебные отходы - 0,5; мясной бульон - 0,1; дробленка - 1,5.
Первая группа контрольная получала основной рацион (ОР).
Вторая группа опытная получала основной рацион (ОР) с кормовой добавкой «Профорт» из расчета 500 г/т комбикорма.
Результаты опыта представлены в таблице 4 «Влияние кормовой добавки «Профорт» на основные зоотехнические показатели выращивания поросят группы отъема и откорма».
Из таблицы 4 видно, что поросята-отъемыши, получавшие кормовую добавку «Профорт», показали лучшие результаты по сравнению с контрольной группой: среднесуточный привес был выше на 36%, живой вес одной головы в конце опыта на 16,8% превосходил группу контроля. При этом затраты кормов на 1 кг привеса опытных поросят были ниже контрольных на 7,4%.
7
7
В качестве наполнителя использованы отруби, содержащие в 1 г кормовой добавки «Профорт» живых бактерий Enterococcus faecium 1-35 3,8×10 КОЕ и живых бактерий Bacillus megaterium В-4801 3,8×10 КОЕ.
Пример 3
Использование кормовой добавки «Профорт» с пробиотической активностью в животноводстве.
Опыт проводили на базе ЗАО ПЗ «Большевик» Ленинградской области Гатчинского района в период со 18 апреля по 20 июня 2016 г. на дойных коровах.
Было сформировано 2 группы дойных коров черно-пестрой породы галштинизированной второй лактации (контрольная и опытная).
Животные находились на привязном содержании.
Структура основного рациона (ОР) дойных коров (кг):
комбикорм - 8, плющенное зерно - 3, жмых подсолнечный (38% СП) - 1, кукуруза - 0,5, сено клеверо-тимофеечное - 1,0, силос (злаково-бобовый) - 37,5, жом свекловичный сухой - 1,0, меласса из свеклы - 1,0, МВД - 0,235.
Первая группа контрольная получала основной рацион (ОР).
Вторая группа опытная получала основной рацион (ОР) с кормовой добавкой «Профорт» из расчета из расчета 25,0 г на одну голову в сутки.
Продолжительность опыта - 63 дня.
В период опыта учитывались основные зоотехнические показатели: удой, качество молока, количество соматических клеток, биохимический анализ крови, экономические показатели.
Результаты опыта представлены в таблице 5 «Влияние кормовой добавки «Профорт» на продуктивность коров и качество молока».
Из таблицы 5 видно, что среднесуточный, удой молока натуральной жирности в опытной группе был выше на 2,1 кг, содержание жира в молоке было на 0,11% выше, что позволило получить 34,0 кг молока 4%-ой жирности на одну голову в сутки против 31,2 кг в контроле или больше на 2,8 кг.
Полученная разница по сумме молочного жира и белка у коров опытной группы (85,84 и 75 кг соответственно) по сравнению с животными контрольной группы (78,48 и 69,7 кг) обусловлена изменением направленности межуточного обмена.
Сопоставимый анализ между группами показывает, что более высокий показатель жирномолочности у животных опытной группы получили как за счет увеличения надоя, так и увеличения процентного содержания жира и белка в молоке. Количество соматических клеток в молоке коров опытной группы снизилось на 28,4% по сравнению с животными контрольной группы.
8
8
В качестве наполнителя использован трепел, содержащий в 1 г кормовой добавки «Профорт» живых бактерий Enterococcus faecium 1-35 1,3×10 КОЕ и живых бактерий Bacillus megaterium В-4801 3,3×10 КОЕ.
Пример 4
Использование кормовой добавки «Профорт» с пробиотической активностью в рыбоводстве.
Опыт проводили на базе ООО «Сумской лососево-сиговый питомник»
Кингисеппского района Ленинградской области в период с 10 января по 10 апреля 2016 г. на мальках и двухгодовиках радужной форели.
Было сформировано 2 группы (контрольная и опытная) мальков (500 голов), которых выращивали в бассейнах внутри помещения, и 2 группы (контрольная и опытная) двухгодовиков радужной форели (300 голов) весом 1200-1400 г в условиях открытого водоема в садках.
Уход за рыбой и кормление осуществляли согласно ФГУП «ВНИРО».
Суточную дозу корма определяли по нормам, разработанным ФГУП «ВНИРО», в зависимости от массы рыбы и температуры воды.
Состав корма основного рациона (ОР): рыбная мука, рыбий жир, соевая мука, пшеница, витамины, минеральные добавки.
Первая группа контрольная получала основной рацион (ОР).
Вторая группа опытная получала основной рацион (ОР) с кормовой добавкой «Профорт» из расчета 2,5 кг на 1 т корма.
Продолжительность опыта - 91 день.
В период опыта учитывались показатели: сохранность поголовья, среднесуточный привес и затраты корма.
Результаты опыта представлены в таблице 6 «Влияние кормовой добавки «Профорт» на рыбоводные показатели выращивания мальков и двухгодовиков радужной форели».
Из таблицы 6 видно, что в опытных группах сохранность поголовья увеличилась на 3,4% на мальках и на 1,4% на взрослой рыбе, среднесуточный привес на мальках опытной группы превысил контроль на 14,4% и на 40,4% на двухгодовиках радужной форели, затраты корма снизились на 31,6% и 25,0% соответственно.
8
8
В качестве наполнителя использован шрот подсолнечный, содержащий в 1 г кормовой добавки «Профорт» живых бактерий Enterococcus faecium 1-35 1,8×10 КОЕ и живых бактерий Bacillus megaterium В-4801 1,0×10 КОЕ.
Пример 5
Использование кормовой добавки «Профорт» с пробиотической активностью в рационе лошадей.
Опыт проводили на базе общественной группы «ПрофиЗОО», объединяющей частных владельцев спортивных лошадей, в деревне Низино, Ломоносовского района, Ленинградской области в период с 01 августа по 20 сентября 2016 г. на спортивных лошадях.
В опыте принимали участие 6 голов взрослых лошадей в возрасте от 3 до 17 лет и 5 голов молодняка в возрасте 5-12 месяцев.
Продолжительность опыта - 50 дней.
В состав основного рациона лошадей вводили кормовую добавку «Профорт» путем подмешивания в сухой гранулированный комбикорм из расчета 50 г на одну голову в сутки для взрослых и 30 г на одну голову в сутки для молодняка.
Через 30 дней кормления лошадей с кормовой добавкой «Профорт» было отмечено некоторое увеличение упитанности животных, улучшение выносливости, меньшую утомляемость и потливость взрослых животных, а молодняк стал активнее потреблять свежескошенную траву и сено.
К завершению опыта, через 50 дней, все положительные аспекты сохранились. Кормовая добавка «Профорт» позволила улучшить перевариваемость корма и усвояемость питательных веществ, что позволило снизить концентратную нагрузку рациона.
7
7
В качестве наполнителя использованы отруби, содержащие в 1 г кормовой добавки «Профорт» живых бактерий Enterococcus faecium 1-35 3,8×10 КОЕ и живых бактерий Bacillus megaterium В-4801 3,8×10 КОЕ.
Введение кормовой добавки «Профорт» положительно сказалось на здоровье животных и способствовало увеличению физической выносливости при сохранении спортивных нагрузок различной интенсивности.
Полученные результаты на основании Примеров 1-5 подтверждают целесообразность использования новой кормовой добавки «Профорт» с пробиотической активностью при приготовлении кормов для сельскохозяйственных животных и птиц, лошадей и рыб.
Эффект всех исследований в приведенных Примерах 1-5 связан, вероятно, еще и со способностью штамма бактерий Bacillus megaterium В-4801 осуществлять биодеструкцию микотоксинов, а использование этого штамма со штаммом Enterococcus faecium 1-35 этот эффект суммирует.
Исследования возможностей штаммов бактерий рода Bacillus, проведенные в марте 2017 г. на ООО «БИОТРОФ», осуществлять биодеструкцию микотоксинов подтверждены экспериментально, но они не отвечают решению поставленной задачи и не могут быть использованы при рассмотрении данной заявки.
Видовая идентификация штамма Enterococcus faecium 1-35 (с помощью молекулярно-генетического анализа секвенирования)
Выделение ДНК.
ДНК выделяли из культуры микроорганизма согласно протоколу «Набора для выделения геномной ДНК из различных источников» (Fermentas).
ПЦР-амплификация.
Праймеры для наработки консервативных фрагментов гена 16S rDNA - 27F AGAGTTTGATCMTGGCTCAG и 1525r AAGGAGGTGWTCCARCC
Режим ПЦР-реакции: 1) 95°С - 3 мин, 2) 35 циклов (95°С - 30 сек, 55°С - 30 сек, 72°С - 1 мин), 3) 72°С - 20 мин.
Клонирование ПЦР-фрагментов осуществляли в векторе pTZ-57R в компетентные клетки E.coli штамма DH5A.
Скрининг трансформантов проводили с помощью метода «ПЦР-колоний» с помощью праймеров М13: fM13: 5'-GCCAGGGTTTTCCCAGTCACGA-3', rM13: 5'-GAGCGGATAACААТТТСAC ACAGG-3.
Режим ПЦР-реакции: 1) 95°С - 3 мин, 2) 35 циклов (95°С - 40 сек, 50°С - 40 сек, 72°С - 1 мин), 3) 72°С - 20 мин.
Определение нуклеотидной последовательности ПЦР-фрагментов проводили с использованием набора реагентов фирмы Beckman (США) в соответствии с рекомендациями изготовителя. Разделение фрагментов и их регистрацию осуществляли с помощью прибора для автоматического секвенирования CEQ8000, Beckman Coulter, США.
Определение филогенетической принадлежности штамма проводили в базе данных NCBI BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)
Результаты анализа
Секвенированный фрагмент ДНК депонируемого штамма (648 п.н.).
Данная последовательность фрагмента ДНК, кодирующего ген 16S рРНК, имеет сходство 100% с последовательностью Enterococcus faecium 1-35 (Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Lactobacillales; Enterococcaceae; Enterococcus) в соответствии с базой данных GenBank (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
Сравнительный анализ последовательности фрагмента ДНК, кодирующего ген 16S рРНК, с наиболее близкими видами в соответствии с базой данных GenBank (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) представлен в таблице 7.
Видовая идентификация штамма Bacillus megaterium В-4801 (с помощью молекулярно-генетического анализа секвенирования)
Выделение ДНК.
ДНК выделяли из культуры микроорганизма согласно протоколу «Набора для выделения геномной ДНК из различных источников» (Fermentas).
ПЦР-амплификация.
Праймеры для наработки консервативных фрагментов гена 16S rDNA - 27F AGAGTTTGATCMTGGCTCAG и 1525r AAGGAGGTGWTCCARCC.
Режим ПЦР-реакции: 1) 95°С - 3 мин, 2) 35 циклов (95°С - 30 сек, 55°С - 30 сек, 72°С - 1 мин), 3) 72°С - 20 мин.
Клонирование ПЦР-фрагментов осуществляли в векторе pTZ-57R в компетентные клетки E.coli штамма DH5A.
Скрининг трансформантов проводили с помощью метода «ПЦР-колоний» с помощью праймеров М13: fM13: 5'-GCCAGGGTTTTCCCAGTCACGA-3', rМ13: 5'-GAGCGGATAACAATTTCAC ACAGG-3.
Режим ПЦР-реакции: 1) 95°С - 3 мин, 2) 35 циклов (95°С - 40 сек, 50°С - 40 сек, 72°С - 1 мин), 3) 72°С - 20 мин.
Определение нуклеотидной последовательности ПЦР-фрагментов проводили с использованием набора реагентов фирмы Beckman (США) в соответствии с рекомендациями изготовителя. Разделение фрагментов и их регистрацию осуществляли с помощью прибора для автоматического секвенирования CEQ8000, Beckman Coulter, США.
Определение филогенетической принадлежности штамма проводили в базе данных NCBI BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)
Результаты анализа
Секвенированный фрагмент ДНК депонируемого штамма (583 п.н.).
Данная последовательность фрагмента ДНК, кодирующего ген 16S рРНК, имеет сходство 99% с последовательностью Bacillus megaterium В-4801 (Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Bacillaceae; Bacillus) в соответствии с базой данных GenBank (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
Сравнительный анализ последовательности фрагмента ДНК, кодирующего ген 16S рРНК, с наиболее близкими видами в соответствии с базой данных GenBank (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) представлен в таблице 8.
Предложенная «Кормовая добавка с пробиотической активностью для сельскохозяйственных животных, птиц, лошадей и рыб» получена по известным биотехнологиям, имеющим широкое применение в сельском хозяйстве, и проведенные исследования по использованию кормовой добавки «Профорт» на базе ФГБУ СГЦ «Загорское ЭПХ» ВНИТИП, г. Сергиев Посад Московской области, на базе АО ПЗ «Пламя» Ленинградской области Гатчинского района, на базе ЗАО ПЗ «Большевик» Ленинградской области Гатчинского района, на базе ООО «Сумской лососево-сиговый питомник» Кингисеппского района Ленинградской области, на базе общественной группы владельцев спортивных лошадей «ПрофиЗОО» д. Низино Ломоносовского района Ленинградской области обусловливают, по мнению заявителя, соответствие ее критерию «промышленная применимость».
Предложенная «Кормовая добавка с пробиотической активностью для сельскохозяйственных животных, птиц, лошадей и рыб» является новой кормовой добавкой широкого спектра действия с высокой пробиотической активностью.
Сохранность бактерий на разных типах носителей
Органолептические, физико-химические и микробиологические показатели кормовой добавки «Профорт»
Влияние кормовой добавки «Профорт» на основные зоотехнические показатели выращивания цыплят-бройлеров
Влияние кормовой добавки «Профорт» на основные зоотехнические показатели выращивания поросят группы отъема и откорма
Влияние кормовой добавки «Профорт» на продуктивность коров и качество молока
Влияние кормовой добавки «Профорт» на рыбоводные показатели выращивания мальков и двухгодовиков радужной форели
Гомология секвенированного фрагмента ДНК штамма Enterococcus faecium 1-35 в соответствии с базой данных GenBank (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)
Гомология секвенированного фрагмента ДНК штамма Bacillus megaterium В4801 в соответствии с базой данных GenBank (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)