ТРЕОНИНСИНТАЗА ИЗ NICOTIANA TABACUM И ОТНОСЯЩИЕСЯ К НЕЙ СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ
NICOTIANA TABACUM THREONINE SYNTHASE AND RELATED METHODS OF USE

Область техники
В настоящем изобретении раскрыт ген треонинсинтазы из Nicotiana tabacum и его варианты, гомологи и фрагменты. В частности, описана модификация экспрессии указанного гена или активности кодируемого им белка для увеличения уровней свободного метионина в таких растениях, как растения табака. Это может использоваться для получения необходимых вкусовых и ароматических характеристик табака путем повышения в нем уровней метионала.
Уровень техники
Увеличение содержание таких ароматизаторов, как ароматизирующие вещества, в табаке может давать в результате требуемый вкус при курении табака. Такие ароматизаторы могут быть получены, например, из аминокислот, которые подвергают реакциям Майяра. Метионал (3-(метилтио)пропанал) представляет собой ароматическое соединение, которое отвечает за запах "печеного картофеля". Получения метионала можно вызвать термически, когда метионал образуется из метионина и производных метионина. Расщепление метионина по Штреккеру предусматривает взаимодействие с альфа-дикарбонильными соединениями, которые представляют собой промежуточные соединения в реакциях Майяра и приводят к образованию метионала.
Были разработаны различные способы увеличения количества свободного метионина в растениях, например, к растениям могут быть добавлены экзогенные аминокислоты. Тем не менее, применение экзогенно добавленных аминокислот приводит к существенному увеличению производственной себестоимости, а также представляет собой проблему безопасности и регулирования.
Биосинтез как метионина, так и треонина связан с метаболическим путем аспартата. У растений их пути биосинтеза расходятся на уровне O-фосфогомосерина (ОРН). Ферменты цистатионин-гамма-синтаза (CGS) и треонинсинтаза (TS) конкурируют за общий субстрат O-фосфогомосерин. Уровни свободного метионина могут быть потенциально увеличены за счет избыточной экспрессии или ингибирования экспрессии ферментов, вовлеченных в путь биосинтеза аспартата.
Одним возможным подходом является избыточная экспрессия цистатионин-гамма-синтазы. Другой подход подразумевает под собой снижение экспрессии треонинсинтазы. Тем не менее, на сегодняшний день все указанные подходы, направленные на изменение генов треонинсинтазы, приводили к фенотипам, которые оказывали неблагоприятное воздействие на целое растение. В статье Bartlem et al. (2000) Plant Physiol., 2000, 123:101-110) описаны мутации в гене треонинсинтазы растений резуховидки. Раскрыты мутанты, несущие мутацию одной пары оснований в гене, кодирующем треонинсинтазу, проявляющие избыточное накопление метионина и значительно сниженный уровень треонина. Тем не менее, раскрытые мутанты резуховидки страдали от сниженного роста по сравнению с растениями дикого типа. Отставание в росте может быть отменено только при добавлении треонина или изолейцина.
В статье Zeh et al. (2001) Plant Physiol., 2001, 127:792-802 раскрыты трансгенные растения картофеля, полученные с помощью антисмыслового трансгенного подхода с использованием конститутивного промотора 35S вируса мозаики цветной капусты. Наряду с тем, что раскрытые трансгенные растения картофеля проявляли высокие уровни метионина, они также страдали от сниженного роста по сравнению с растениями дикого типа.
В статье Avraham et al. (2005) Transgenic Research, 2005, 14:299-311 описаны трансгенные растения резуховидки, которые получали с помощью антисмыслового трансгенного подхода. Наряду с тем, что раскрытые трансгенные растения проявляли повышенный уровень метионина, они страдали от сильно аномальных фенотипов, включающих в себя значительное замедление роста, сниженный размер листьев розетки и хлоротические листья.
Для таких растений, как растения табака, существует необходимость в комбинации повышенного уровня свободного метионина и сохранения таких определенных агрономически необходимых свойств, как скорость роста и общий размер растений, и без необходимости добавления каких-либо экзогенных ингредиентов. Цель настоящего изобретения состоит в удовлетворении указанной необходимости.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение основано, по меньшей мере частично, на данных о том, что снижение (например, ингибирование) экспрессии или активности треонинсинтазы в растениях или растительных клетках, таких как растения или растительные клетки табака, приводило к увеличению концентрации метионина в растительных клетках или одной или нескольких частях растения по сравнению с контрольным растением или растительной клеткой. Удивительно, что генетически модифицированное растение не проявляет какого-либо изменения в своем общем внешнем виде по сравнению с контрольным растением. Этот факт является неожиданным, принимая во внимание различные неблагоприятные фенотипы, наблюдаемые у трансгенных растений резуховидки или картофеля. Указанный факт может успешно использоваться, поскольку растения применяются для коммерческого производства различных продуктов, включая в себя табак, где изменения во внешнем виде либо являются неприемлемыми для производства, либо могут приводить к неприемлемо сниженным выходам продукции. Также не требуется добавление экзогенной аминокислоты. Более того, аэрозоль, который высвобождается при нагревании табака, содержит повышенный уровень метионала по сравнению с табаком, полученным из контрольного растения. Увеличение метионала в дыме или аэрозоле производит требуемый вкус, запах или как вкус, так и запах при использовании табака.
Аспекты и варианты осуществления согласно настоящему изобретению представлены в прилагаемой формуле изобретения.
Согласно одному аспекту предусматривается выделенный полинуклеотид, содержащий, состоящий или состоящий, по сути, из последовательности, кодирующей треонинсинтазу и характеризующейся по меньшей мере 90% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:3.
Согласно другому аспекту предусматривается выделенный полинуклеотид, содержащий, состоящий или состоящий, по сути, из последовательности, кодирующей треонинсинтазу и характеризующейся по меньшей мере 87% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:5.
Согласно дополнительному аспекту предусматривается выделенный полинуклеотид, содержащий, состоящий или состоящий, по сути, из последовательности, кодирующей треонинсинтазу и характеризующейся по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO:20.
Согласно другому аспекту предусматривается выделенный полипептид, кодируемый любым одним из полинуклеотидов согласно настоящему изобретению.
Согласно другому аспекту предусматривается выделенный полипептид, характеризующийся по меньшей мере 95% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 или SEQ ID NO:8.
Согласно другому аспекту предусматривается выделенный полипептид, характеризующейся по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO:21.
Согласно другому аспекту предусматривается конструкт, вектор или вектор экспрессии, содержащий любой один (например, один или больше, два или больше, три или больше или четыре или больше) из полинуклеотидов согласно настоящему изобретению.
Согласно другому аспекту предусматривается мутантная, не встречающаяся в природе растительная клетка или трансгенная растительная клетка, содержащая по меньшей мере один (например, один или больше, два или больше, три или больше или четыре или больше) из полинуклеотидов или по меньшей мере один (например, один или больше, два или больше, три или больше или четыре или больше) из полипептидов. Согласно другому аспекту предусматривается мутантное, не встречающееся в природе растение или трансгенное растение, содержащее растительную клетку согласно настоящему изобретению. Соответственно, экспрессия одной или нескольких кодирующих треонинсинтазу последовательностей или активность кодируемых ими белков треонинсинтазы снижается, и часть растения табака характеризуется увеличениям содержания метионина по меньшей мере на 5% по сравнению с контрольное растение табака, в котором экспрессия или активность треонинсинтазы не была снижена, или при этом концентрация метионала в дыме или аэрозоле увеличивается по меньшей мере на 5% по сравнению с дымом или аэрозолем из контрольного растения табака.
Дополнительный аспект относится к способу увеличения концентрации метионина по меньшей мере в части растения табака, предусматривающему стадии: (i) снижение экспрессии или активности одного или нескольких треонинсинтаз (например, двух или больше, трех или больше или четырех или больше) в растении табака, предпочтительно при этом треонинсинтаза содержит полинуклеотидную последовательность или полипептидную последовательность, описанную в настоящем документе; (ii) измерение концентрации метионина по меньшей мере в части мутантного, не встречающегося в природе или трансгенного растения табака, полученного на стадии (i); и (iii) идентификация мутантного, не встречающегося в природе растения или трансгенного растения табака, в котором концентрация метионина была увеличена по сравнению с контрольным растением. Предпочтительно общий внешний вид мутантного, не встречающегося в природе растения или трансгенного растения табака по существу аналогичен контрольному растению табака через такой период, как три месяца после пересадки в поле или через 36 дней после прищипывания верхушки.
Согласно одному варианту осуществления не требуется добавление таких экзогенных питательных веществ, как аминокислоты, например, треонина и/или изолейцина.
Согласно другому аспекту предусматривается мутантное, не встречающееся в природе растение табака или трансгенное растение табака, или материал растения табака, извлеченный или извлекаемый из него, которое получают или могут получить с помощью указанного способа.
Согласно другому аспекту также предусматривается мутантное, не встречающееся в природе растение табака или трансгенное растение табака, причем экспрессия одной или нескольких кодируемых треонинсинтазу последовательностей (например, двух или больше, трех или больше или четырех или больше) или активность кодируемого ими белка треонинсинтазы снижается, и часть растение табака характеризуется увеличением содержания метионина по меньшей мере на 5% по сравнению с контрольным растением табака, в котором экспрессия или активность треонинсинтазы не была снижена, или при этом концентрация метионала в дыме или аэрозоле увеличивается по меньшей мере на 5% по сравнению с дымом или аэрозолем из контрольного растения табака.
Соответственно, общий внешний вид указанного растения является по существу сходным или визуально неотличимым от контрольного растения через такой период, как без ограничения три месяца после пересадки в поле или 36 дней после прищипывания верхушки. Предпочтительно (i) высота стебля мутантных, не встречающихся в природе или трансгенных растений табака является по существу аналогичной высоте стебля контрольных растений табака через такой период, как без ограничения три месяца после пересадки в поле или 36 дней после прищипывания верхушки; (ii) содержание хлорофилла в мутантных, не встречающихся в природе или трансгенных растениях табака по существу аналогично содержанию хлорофилла в контрольных растениях табака через такой период, как без ограничения три месяца после пересадки в поле или 36 дней после прищипывания верхушки; или как (i), так и (ii).
Соответственно, концентрация треонина в части растения (например, листьях) увеличивается по сравнению с контрольным растением; и предпочтительно при этом (а) концентрация метионина в части растения (например, листьях) составляет по меньшей мере приблизительно 0,03 мг/г; (b) концентрация треонина в листьях составляет по меньшей мере приблизительно 0,5 мг/г; (с) концентрация метионала в дыме или аэрозоле при нагревании составляет по меньшей мере приблизительно 2000 мкг/г; или комбинация двух или больше из (а), (b) и (с).
Также предусматривается биомасса, семя или листья, содержащие клетки или ткань из описанного в настоящем документе мутантного, не встречающегося в природе растения или трансгенного растения. Также предусматривается табачный продукт, содержащее часть мутантного, не встречающегося в природе растения или трансгенного растения, его биомассу или его листья или комбинацию указанного, как описано в настоящем документе.
Согласно дополнительному аспекту предусматривается способ получения метионала, предусматривающий стадии:
(а) обеспечение части мутантного, не встречающегося в природе или трансгенного растения табака; биомассы, семени или листьев; или табачного продукта, описанных в настоящем документе; и (b) проведение их нагревания.
Согласно дополнительному аспекту предусматривается способ идентификации табачного материала, который высвобождает повышенные уровни метионала в аэрозоль при нагревании, предусматривающий стадии: (а) получение образца табачного материала; (b) определение профиля молекулярной массы образца; и (с) сравнение профиля молекулярной массы при одном или нескольких соотношениях массы к заряду; причем увеличения при определенных соотношениях массы к заряду по сравнению с контрольным растением является признаком того, что уровни метионала в аэрозоле будут повышенными.
Табачный материал, идентифицированный или идентифицируемый с помощью настоящего способа также предусматривается согласно дополнительному аспекту настоящего описания.
Дополнительные аспекты согласно настоящему изобретению представлены ниже.
Химерный ген, содержащий полинуклеотид, функционально связанный с одной или несколькими регуляторными последовательностями.
Полинуклеотидный конструкт NtTS, содержащий, состоящий или состоящий, по сути, из по меньшей мере 15-30 нуклеотидов, 30-50 нуклеотидов, 50-100 нуклеотидов, 100-150 нуклеотидов, 150-200 нуклеотидов, 200-300 нуклеотидов, 300-400 нуклеотидов, 400-500 нуклеотидов, 500-600 нуклеотидов или 600-700 нуклеотидов.
Потребительский продукт, включающий в себя или использующий растительный материал, биомассу, семя или листья согласно настоящему изобретению.
Клеточная линия, содержащая (например, один или больше, два или больше, три или больше или четыре или больше) выделенный полинуклеотид, химерный ген, полинуклеотидный конструкт, двухцепочечную РНК, конъюгат или вектор экспрессии и подобное согласно настоящему изобретению.
Способ модулирования экспрессии ДНК NtTS или активности кодируемого ею белка в клетке, причем указанный способ предусматривает введение (например, одного или больше, двух или больше, трех или больше или четырех или больше из) химерного гена, полинуклеотидного конструкта, двухцепочечной РНК, конъюгата или вектора экспрессии согласно настоящему изобретению.
Способ обнаружения, выделения, амплификации или анализа полинуклеотида NtTS, причем способ предусматривает стадию предоставления образца, содержащего полинуклеотид, и гибридизации указанного полинуклеотида с молекулой полинуклеотида, содержащей нуклеотидную последовательность по меньшей мере из 10 смежных нуклеотидов из выделенной нуклеотидной последовательности согласно настоящему изобретению.
Применение средства, которое модулирует экспрессию ДНК NtTS и активность кодируемого ею белка или активность кодируемого ею белка для снижения содержания метионина по меньшей мере в части растения по меньшей мере на 5% по сравнению с контрольным растением.
Способ или применение согласно настоящему изобретению, причем средство представляет собой или происходит из NtTS ДНК, химерного гена NtTS, полинуклеотидного конструкта, содержащего полинуклеотид NtTS, антисмысловой РНК, двухцепочечной РНК, сДНК, конъюгата, содержащего полинуклеотид NtTS и по меньшей мере один ненуклеотидный или неполинуклеотидный фрагмент, ковалентно прикрепленный к нему, рибозим, мутаген, "цинковый палец", низкомолекулярную молекулу или мегануклеазу.
Согласно другому варианту осуществления полинуклеотидный(е) фрагмент(ы) кодирует(ют) антисмысловую нуклеиновую кислоту, рибозим, РНК, которая осуществляет опосредуемый сплайсосомой транс-сплайсинг, интерферирующую РНК (РНК-и), гидовую РНК или другую нетранслируемую РНК и подобное. Согласно другому варианту осуществления полинуклеотидный(е) фрагмент(ы) кодирует(ют) РНК-и.
Согласно дополнительному аспекту предусматривается способ получения табачного продукта, предусматривающий стадии: (а) получение семени из мутантного, не встречающегося в природе или трансгенного растения табака; (b) посев и выращивание из семени растения; (с) сбор растения; и (d) получение табачного продукта из собранного растения.
Вышеупомянутые варианты осуществления раскрыты в качестве вариантов осуществления каждого из описанных выше аспектов.
Краткое описание чертежей
На фигуре 1 показаны профили LC-MS высушенных листьев VC-4, TN90-4, NtTS1-3, NtTS2-3, NtTS3-2 после экстракции с помощью метанола и разделения на колонке WatersXBridge Shield RP18. VC-4 представляет собой содержащее только вектор контрольное растение; TN90 представляет собой немодифицированное растение табака, которое представляет фон; NtTS1-3, NtTS2-3 и NtTS3-2 представляют собой растения Nicotiana tabacum, которые содержат подвергнутый сайленсингу с помощью РНК-и ген треонинсинтазы. Стрелки указывают на пики приблизительно в 5, 9, 17 и 19 минут.
Определения
Предусматривается, что технические термины и выражения, используемые в описании настоящей заявки, как правило, имеют значения, которые обычно им приписываются в настоящей области техники ботаники и молекулярной биологии. Все определения последующих терминов применяются для обеспечения полного содержания настоящей заявки. Слово "содержащий" не исключает другие элементы или стадии, и формы единственного числа не исключают множественное число. Отдельная стадия может выполнять функции нескольких признаков, перечисленных в формуле изобретения. Термины "приблизительно", "по сути" и "приближенно" в контексте указанного числового значения или диапазона относится к значению или диапазону, которое находится в пределах 20%, в пределах 10% или в пределах 5%, 4%, 3%, 2% или 1% от данного значения или диапазона.
Термин "выделенный" относится к любому объекту, взятому из его естественной среды, но термин не имеет дополнительного значения относительно какой-либо степени очистки.
"Вектор" относится к носителю нуклеиновой кислоты, который содержит комбинацию компонентов нуклеиновой кислоты для обеспечения транспортировки нуклеиновой кислоты, конструктов нуклеиновой кислоты и конъюгатов нуклеиновой кислоты и подобного. Подходящие векторы включают в себя эписомы, способные к внехромосомной репликации, такие как кольцевые плазмиды, плазмиды двухцепочечной ДНК; линеаризированные плазмиды двухцепочечной ДНК и другие векторы любого происхождения.
"Вектор экспрессии" представляет собой носитель нуклеиновой кислоты, который содержит комбинацию компонентов ДНК для обеспечения экспрессии нуклеиновой кислоты, конструктов нуклеиновой кислоты и конъюгатов нуклеиновой кислоты и подобного. Подходящие векторы экспрессии включают в себя эписомы, способные к внехромосомной репликации, такие как такие как кольцевые плазмиды, плазмиды двухцепочечной ДНК; линеаризированные плазмиды двухцепочечной ДНК и другие функционально эквивалентные векторы экспрессии любого происхождения. Вектор экспрессии содержит по меньшей мере промотор, расположенный против хода транскрипции и функционально связанный с нуклеиновой кислотой, конструктом нуклеиновой кислоты или конъюгатом нуклеиновой кислоты, как определено ниже.
Термин "конструкт" относится к двухцепочечному, рекомбинантному фрагменту ДНК, содержащему один или несколько полинуклеотидов. Конструкт содержит "матричную цепь", спаренную по основаниям с комплементарной "смысловой или кодирующей цепью". Данный конструкт может быть вставлен в вектор в двух возможных ориентациях, или в такой же (или смысловой) ориентации, или в обратной (или анисмысловой) ориентации по отношению к ориентации промотора, расположенного внутри такого вектора, как вектор экспрессии.
"Промотор" относится к элементу/последовательности нуклеиновой кислоты, как правило, расположенному против хода транскрипции и функционально связанному с фрагментом двухцепочечной ДНК. Промоторы могут быть получены полностью из участков, вблизи от представляющего интерес нативного гена или могут состоять из различных элементов, полученных из различных нативных промоторов или синтетических сегментов ДНК.
Термины "гомология, идентичность или сходство" относятся к степени сходства последовательностей между двумя полипептидами или между двумя молекулами нуклеиновой кислоты на основании выравнивания последовательностей. Степень гомологии между двумя отдельными последовательностями нуклеиновой кислоты, подлежащим сравнению, представляет собой функцию от числа идентичных, или совпадающих, нуклеотидов в сравниваемых положениях. Процентная идентичность может быть определена путем визуального осмотра и математического расчета. Альтернативно, процентная идентичность двух последовательностей нуклеиновой кислоты может быть определена путем сравнения информации о последовательностях с использованием такой компьютерной программы, как ClustalW, BLAST, FASTA или Смита-Уотермана.
Термин "растение" относится к любому растению на любой стадии его жизненного цикла или развития, и его потомству. Согласно одному варианту осуществления растение представляет собой растение табака, которое относится к растению, принадлежащему к роду Nicotiana. Предпочтительные виды, культивары, гибриды и сорта растения табака описаны в настоящем документе.
"Растительная клетка" относится к структурной и физиологической единице растения. Растительная клетка может находиться в форме протопласта без клеточной стенки, выделенной отдельной клетки или культивируемой клетки, или в виде части такой более высокоорганизованной единицы, как без ограничения ткань растения, орган растения или целое растение.
Термин "растительный материал" относится к любой твердой, жидкой или газообразной композиции или их комбинации, получаемой из растения, включая в себя биомассу, листья, листовую пластинку, центральную жилку, стебли, корни, цветы или части цветов, плоды, пыльцу, ооциты, зиготы, семена, черенки, секреты, экстракты, клеточные или тканевые культуры или любые другие части или продукты растения. Согласно одному варианту осуществления растительный материал содержит или состоит из биомассы, семени или листьев. Согласно другому варианту осуществления растительный материал содержит или состоит из листьев.
Термин "сорт" относится к популяции растений, которые характеризуются общими постоянными характеристиками, которые отделяют их от других растений того же вида. Наряду с тем, что сорт характеризуется одним или несколькими отличительными признаками, он дополнительно может характеризоваться очень малой общей изменчивостью между особями в пределах сорта. Сорт часто продают в коммерческих целях.
Используемый в настоящем документе термин "линия" или "линия разведения" обозначает группу растений, которых используют в ходе разведения растения. Линия отличается от сорта, поскольку она проявляет небольшую изменчивость между особями в отношении одного или нескольких представляющих интерес признаков, хотя может иметь место некоторая изменчивость между особями в отношении других признаков.
Используемый в настоящем документе термин "снижать" или "сниженный" относится к снижению на от приблизительно 10% до приблизительно 99%, от приблизительно 10% до приблизительно 95% или меньше, от приблизительно 10% до приблизительно 90% или меньше или снижению по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или по меньшей мере на 100% или больше в отношении количества или такой активности, как без ограничения полипептидная активность, транскрипционная активность и/или экспрессия белка.
Используемый в настоящем документе термин "ингибировать" или "подвергнутый ингибированию" относится к снижению на от приблизительно 98% до приблизительно 100%, или снижению по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99%, но особенно на 100% в отношении количества или такой активность, как без ограничения полипептидная активность, транскрипционная активность и/или экспрессия белка.
Используемый в настоящем документе термин "увеличивать" или "увеличенный" относится к увеличению на от приблизительно 10% до приблизительно 99% или увеличению по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или по меньшей мере на 100%, 200%, 300%, 400% или 500% или больше в отношении количества или такой активность, как без ограничения полипептидная активность, транскрипционная активность и/или экспрессия белка.
Термин "контрольный" в контексте контрольного растения или контрольных растительных клеток относится к растению или растительным клеткам, в которых экспрессия или активность треонинсинтазы не была модифицирована (например, увеличена или снижена) и поэтому они могут предоставлять возможность для сравнения с растением, в котором экспрессия или активность треонинсинтазы была модифицирована. Контрольное растение может содержать пустой вектор. Контрольное растение может соответствовать растению дикого типа.
Подробное описание изобретения
Согласно одному аспекту предусматривается выделенный полинуклеотид, содержащий, состоящий или состоящий, по сути, из полинуклеотидной последовательности и характеризующийся по меньшей мере 60% идентичности последовательности по отношению к любой из последовательностей, описанных в настоящем документе, включая в себя любые полинуклеотиды, представленные в списке последовательностей. Соответственно, выделенные полинуклеотиды содержат, состоят или состоят, по сути, из последовательности, характеризующейся по меньшей мере 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности по отношению к ним.
Согласно одному варианту осуществления предусматривается выделенный полинуклеотид, содержащий, состоящий или состоящий, по сути, из полинуклеотидной последовательности, кодирующей треонинсинтазу и характеризующейся по меньшей мере 90% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 и/или SEQ ID No. 3. Соответственно, выделенные полинуклеотиды содержат, состоят или состоят, по сути, из последовательности, характеризующейся по меньшей мере 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 или SEQ ID No. 3. SEQ ID NO:1 представляет собой ДНК последовательность треонинсинтазы из N. tabacum. SEQ ID NO:2 представляет собой ДНК последовательность треонинсинтазы, амплифицированную с помощью ПЦР с обратной транскриптазой ((ОТ)-ПЦР) из выделенной РНК из N. tabacum (сорт Hicks Broad Leaf) и секвенированную. Указанная последовательность присутствует в одном из двух предках N. tabacum, Nicotiana sylvestris, как показано с помощью анализов ОТ-ПЦР. SEQ ID NO:3 представляет собой ДНК последовательность треонинсинтазы, амплифицированную с помощью ОТ-ПЦР из РНК, выделенной из N. tabacum (сорт Hicks Broad Leaf).
Согласно другому варианту осуществления предусматривается выделенный полинуклеотид, содержащий, состоящий или состоящий, по сути, из полинуклеотидной последовательности, кодирующей треонинсинтазу и характеризующейся по меньшей мере 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID No. 4 или SEQ ID No. 5. SEQ ID NO:4 соответствует геномной ДНК последовательности SEQ ID NO:3. По сравнению с SEQ ID NO:1 интрон из 137 п.н. расположен в положении 234 от старт-кодона ATG. SEQ ID NO:5 соответствует геномной ДНК последовательности треонинсинтазы из N. tomentosiformis.
Согласно другому варианту осуществления предусматривается выделенный полинуклеотид, содержащий, состоящий или состоящий, по сути, из полинуклеотидной последовательности, кодирующей треонинсинтазу и характеризующейся по меньшей мере 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% или 90% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID No. 20. Соответственно, выделенные полинуклеотиды содержат, состоят или состоят, по сути, из последовательности, характеризующейся по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID No. 20. SEQ ID NO:20 представляет собой ДНК последовательность треонинсинтазы из N. tabacum и характеризуется 85% идентичности последовательности с SEQ ID No. 1, 86% идентичности последовательности с SEQ ID No. 2, и 86% идентичности последовательности с SEQ ID No. 3.
Термин "полинуклеотид NtTS" относится к полинуклеотидам, кодирующим треонинсинтазу из Nicotiana tabacum, содержащим, состоящим или состоящим, по сути, из полинуклеотидов с существенной гомологией (то есть, сходством последовательностей) или существенной идентичностью по отношению к SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 или SEQ ID NO:20; фрагментам полинуклеотида NtTS, включающим в себя фрагменты SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 SEQ ID NO:5 или SEQ ID NO:20; и фрагменты SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 или SEQ ID NO:20 с существенной гомологией (то есть, сходством последовательностей) или существенной идентичностью к ним, которые характеризуются по меньшей мере приблизительно 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, или 99% или 100% идентичности последовательности по отношению к соответствующим фрагментам SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 или SEQ ID NO:20. Иллюстративные фрагменты представлены в SEQ ID No 9-19. Как описано в настоящем документе, вариант может характеризоваться по меньшей мере приблизительно 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, или 99% идентичности последовательности по отношению к последовательности SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 или SEQ ID NO:20. Полинуклеотид NtTS также включает в себя последовательности, содержащие достаточную или существенную степень идентичности или сходства с SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 или SEQ ID NO:20 для кодирования полипептида, который функционирует в качестве треонинсинтазы. Согласно одному варианту осуществления термин "полинуклеотид NtTS" относится к полимеру нуклеотидов, который содержит, состоит или состоит, по сути, из полинуклеотида, разработанного в настоящем документе в виде SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 или SEQ ID NO:20.
Термин "полинуклеотид" относится к полимеру нуклеотидов, который может представлять собой немодифицированную или модифицированную дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) или рибонуклеиновую кислоту (РНК). Соответственно, полинуклеотид может представлять собой без ограничения геномную ДНК, комплементарную ДНК (кДНК), мРНК или антисмысловую РНК или их фрагмент(ы). Более того, полинуклеотид может представлять собой одноцепочечную или двухцепочечную ДНК, ДНК, которая представляет собой смесь одноцепочечных и двухцепочечных участков, гибридную молекулу, содержащую ДНК и РНК, или гибридную молекулу со смесью одноцепочечных и двухцепочечных участков или их фрагмент(ы).
Описанный в настоящем документе полинуклеотид, как правило, будет содержать фосфодиэфирные связи, хотя в некоторых случаях, предусмотрены полинуклеотидные аналоги, которые могут содержать альтернативные остовы, содержащие, например, фосфорамидатные, фосфоротиоатные, фосфородитиоатные или O-метилфосфороамидитные связи; и пептидные полинуклеотидные остовы и связи. Другие аналоги полинуклеотидов включают в себя аналоги с положительно-заряженными остовами; неионными остовами и нерибозными остовами. Модификации рибозо-фосфатного остова могут быть выполнены по разнообразным причинам, например, для увеличения стабильности и периода полужизни таких молекул в физиологическом окружении или в качестве зондов на биочипе. Могут быть получены смеси встречающихся в природе полинуклеотидов и аналогов; альтернативно, могут быть получены смеси различных полинуклеотидных аналогов и смеси встречающихся в природе полинуклеотидов и аналогов.
Известны разнообразные полинуклеотидные аналоги, включая в себя, например, фосфорамидатные, фосфоротиоатные, фосфородитиоатные, O-метилфосфороамидитные связи и пептидные полинуклеотидные остовы и связи. Другие аналоги полинуклеотидов включают в себя аналоги с положительно-заряженными остовами; неионными остовами и нерибозными остовами. Также предусматриваются полинуклеотиды, содержащие один или несколько карбоциклических сахаров.
Другие аналоги включают в себя пептидные полинуклеотиды (PNA), которые представляют собой пептидные полинуклеотидные аналоги. Эти остовы по существу являются неионными при нейтральных условиях в отличие от сильнозаряженного фосфодиэфирного остова встречающихся в природе полинуклеотидов. Это может привести к преимуществам. Во-первых, остов PNA может проявлять улучшенную кинетику гибридизации. PNA характеризуются более сильными изменениями в температуре плавления (Tm) для несовпадающих пар оснований по сравнению с абсолютно совпадающими. ДНК и РНК, как правило, проявляют 2-4°С снижение Tm для внутреннего несовпадения. С неионным остовом PNA это снижение близко к 7-9°С. Аналогично, вследствие неионной природы гибридизация оснований, прикрепленных к этим остовам, является относительно нечувствительной к концентрации соли. Кроме того, PNA может не расщепляться или расщепляться в меньшей степени с помощью клеточных ферментов и, таким образом, может быть более стабильным.
Среди применений раскрытых полинуклеотидов и комбинаций их фрагментов находится применение фрагментов в качестве зондов в анализах гибридизации нуклеиновых кислот или праймеров в анализах амплификации нуклеиновых кислот. Такие фрагменты, как правило, содержат по меньшей мере приблизительно 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 или больше смежных нуклеотидов последовательности ДНК. Согласно другим вариантам осуществления фрагмент ДНК содержит по меньшей мере приблизительно 10, 15, 20, 30, 40, 50 или 60 или больше смежных нуклеотидов последовательности ДНК. Таким образом, согласно одному аспекту также предусматривается способ обнаружения полинуклеотидов NtTS, предусматривающий применение зондов и/или праймеров. Иллюстративные праймеры представлены в SEQ ID No: 10-14. Необязательно, указанные праймеры могут использоваться в качестве зондов. Иллюстративные праймеры или зонды могут гибридизироваться с участками, которые являются гомологичными между SEQ ID No:1, 2 и 3 или SEQ ID NO:20. Иллюстративные праймеры или зонды могут гибридизироваться с нуклеотидами 1-46 в SEQ ID No:1, 2 и 3; с нуклеотидами 1-52 в SEQ ID NO:20; с нуклеотидами 99-141 в SEQ ID NO:1; с нуклеотидами 102-144 в SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:3; с нуклеотидами 102-153 в SEQ ID NO:20; с нуклеотидами 1325-1362 в SEQ ID No:1, 2 и 3; или с нуклеотидами 1334-1371 в SEQ ID NO:20.
Основные параметры, влияющие на выбор условий гибридизации и руководство для разработки подходящих условий описаны в Sambrook, J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.). Используя знания о генетической коде в комбинации с аминокислотными последовательностями, описанными в настоящем документе, могут быть получены множества вырожденных олигонуклеотидов. Такие олигонуклеотиды являются применимыми в качестве праймеров, например, в полимеразных цепных реакциях (ПЦР), с помощью которых фрагменты ДНК выделяют и амплифицируют. Согласно определенным вариантам осуществления вырожденные праймеры могут использоваться в качестве зондов для генетических библиотек. Такие библиотеки будут включать в себя без ограничения библиотеки кДНК, геномные библиотеки и даже электронные EST (метка экспрессирующейся последовательности) или ДНК библиотеки. Гомологичные последовательности, идентифицированные с помощью указанного способа, затем используются в качестве зондов для идентификации гомологов последовательностей NtTS, идентифицированных в настоящем документе.
Также потенциальным применением характеризуются полинуклеотиды и олигонуклеотиды (например, праймеры или зонды), которые гибридизируются при условиях пониженной жесткости, как правило, условиях умеренной жесткости и зачастую в условиях высокой жесткости с полинуклеотидом NtTS, описанном в настоящем документе. Основные параметры, влияющие на выбор условий гибридизации и руководство для разработки подходящих условий представлены в Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y.) и могут быть легко определены специалистами в настоящей области техники на основании, например, длины или состава оснований полинуклеотида.
Одним путем осуществления условия умеренной жесткости подразумевает под собой применение раствора предварительной отмывки, содержащего 5х стандартный раствор цитрата натрия, 0,5% додецилсульфата натрия 1,0 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (рН 8,0), гибридизационного буфера, содержащего приблизительно 50% формамида, 6х стандартного раствора цитрата натрия, и температуры гибридизации, составляющей приблизительно 55°С (или другие сходные растворы для гибридизации, такие как раствор, содержащий приблизительно 50% формамида с температурой гибридизации, составляющей приблизительно 42°С), и условия отмывки, представляющие собой приблизительно 60°С в 0,5х стандартном раствора цитрата натрия, 0,1% додецилсульфате натрия. Как правило, условия высокой жесткости определяют как условия гибридизации, описанные выше, но с отмывкой приблизительно при 68°С, в 0,2х стандартном растворе цитрата натрия, 0,1% додецилсульфате натрия. SSPE (1x SSPE представляет собой 0,15 М хлорида натрия, 10 мМ фосфата натрия и 1,25 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты, рН 7,4) может быть заменен на стандартный раствор цитрата натрия (1x стандартный раствор цитрата натрия представляет собой 0,15 М хлорида натрия и 15 мМ цитрата натрия) в гибридизационных и отмывочных буферах; отмывки проводят в течение 15 минут после завершения гибридизации. Следует понимать, что температура отмывки и концентрация соли в отмывочном растворе может быть доведена при необходимости до достижения требуемой степени жесткости путем применения основных соединений, которые управляют реакциями гибридизации и стабильностью двойной спирали, как известно специалистам в настоящей области техники и описано дополнительно ниже (смотрите, например, Sambrook et al., ранее). При гибридизации полинуклеотида с целевым полинуклеотидом неизвестной последовательности, принимаю, что длина гибрида аналогична длине гибридизирующегося полинуклеотида. Когда гибридизируются полинуклеотиды известной последовательности, то длину гибрида можно определить путем выравнивания последовательностей полинуклеотидов и идентификации участка или участков с оптимальной комплементарностью последовательностей. Температура гибридизации для гибридов, которые предположительно составляют в длину меньше чем 50 пар оснований, должна быть на 5-10°С меньше, чем температура плавления (Tm) гибрида, где Tm определяют согласно следующим уравнениям. Для гибридов, составляющий меньше чем 18 пар оснований в длину, Tm (°С)=2(число оснований А+Т)+4(число оснований G+C). Для гибридов выше 18 пар оснований в длину, Tm (°C)=81,5+16,6(log10 [Na+])+0,41(% G+C)-(600/N), где N представляет собой количество оснований в гибриде, и [Na+] представляет собой концентрацию ионов натрия в гибридизационном буфере ([Na+] для 1х стандартного раствора цитрата натрия = 0,165М). Как правило, каждый такой гибридизирующийся полинуклеотид характеризуется длиной, составляющей по меньшей мере 25% (зачастую по меньшей мере 50%, 60%, или 70% и чаще всего по меньшей мере 80%) от длины полинуклеотида, с которым он гибридизируется, и характеризуется по меньшей мере 60% идентичности последовательности (например, по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) с полинуклеотидом, с которым он гибридизируется.
Специалистам в настоящей области техники понятно, что линейная ДНК характеризуется двумя возможными ориентациями: 5'-3' направление и 3'-5' направление. Например, если выбранная последовательность расположена в 5'-3' направлении и если вторая последовательность расположена в 5'-3' направлении в пределах одной и той же молекулы/цепи полинуклеотида, то выбранная последовательность и вторая последовательность ориентированы в одинаковом направлении или характеризуются одинаковой ориентацией. Как правило, промоторная последовательность и представляющий интерес ген, находящийся под управлением под указанного промотора, расположены в одинаковой ориентации. Тем не менее, по отношению к выбранной последовательности, расположенной в 5'-3' направлении, если вторая последовательность расположена в 3'-5' направлении в пределах одной и той же молекулы/цепи полинуклеотида, то выбранная последовательность и вторая последовательность ориентированы в антисмысловом направлении или характеризуются антисмысловой ориентацией. Две последовательности, характеризующиеся антисмысловыми ориентациями в отношении друг к другу, могут альтернативно быть описаны как характеризующиеся одинаковой ориентацией, если выбранная последовательность (5'-3' направление) и обратная комплементарная последовательность по отношению к выбранной последовательности (выбранной последовательности, расположенной в 5'-3' направлении) расположены в пределах одной и той же молекулы/цепи полинуклеотида. Представленные в настоящем документе последовательности показаны в 5'-3' направлении.
Предусмотренные в настоящем документе рекомбинантные конструкты могут использоваться для трансформации растений или растительных клеток для модулирования уровней экспрессии белка NtTS. Рекомбинантный полинуклеотидный конструкт может содержать полинуклеотид, кодирующий описанный в настоящем документе полинуклеотид NtTS, функционально связанный с регуляторным участком, подходящий для экспрессии полипептида NtTS в растении или клетке. Таким образом, полинуклеотид может содержать кодирующую последовательность, которая кодирует описанный в настоящем документе полипептид NtTS.
Полипептид NtTS, кодируемый рекомбинантным полинуклеотидам, может представлять собой нативный полипептид NtTS или может быть гетерологичным для клетки. В некоторых случаях рекомбинантный конструкт содержит полинуклеотид, который снижает или ингибирует экспрессию модулирующего NtTS полипептида, функционально связанного с регуляторным участком. Примеры подходящих регуляторных участков описаны в настоящем документе.
Также предусматриваются векторы, содержащие рекомбинантные полинуклеотидные конструкты, такие как описанные в настоящем документе рекомбинантные полинуклеотидные конструкты. Подходящие остовы векторов включают в себя, например, остовы, рутинно используемые в настоящей области техники, такие как плазмиды, вирусы, искусственные хромосомы, ВАС, YAC или РАС. Подходящие векторы экспрессии включают в себя без ограничения плазмиды и вирусные векторы, полученные, например, из бактериофага, бакуловирусов и ретровирусов. Различные векторы и системы экспрессии являются коммерчески доступными.
Векторы также могут включать в себя, например, источники репликации, участки прикрепления к матриксу (SAR) или маркеры. Маркерный ген может придавать растительной клетке селектируемый фенотип.Например, маркер может обеспечивать биоцидную устойчивость, например, устойчивость к антибиотику (например, канамицину, G418, блеомицину или гигромицину или гербициду (например, глифозату, хлорсульфурону или фосфинотрицину). Кроме того, вектор экспрессии может включать в себя последовательность-метку, разработанную для облегчения проведения манипуляции или обнаружения (например, очищения или определения локализации) экспрессированного полипептида. Такие последовательности-метки, как последовательности люциферазы, бета-глюкуронидазы (GUS), зеленого флуоресцентного белка (GFP), глутатион-S-трансферазы (GST), полигистидина, с-myc или гемагглютинина, как правило, экспрессируются в виде слияния с кодируемым полипептидом. Такие метки могут быть вставлены в любом месте в полипептиде, включая в себя либо карбокси-конец, либо амино-конец.
Растение или растительная клетка могут быть трансформированы с помощью рекомбинантного полинуклеотида, интегрированного в ее геном так, чтобы стать стабильно трансформированной. Стабильно трансформированные клетки, как правило, сохраняют введенный полинуклеотид с каждым клеточным делением. Растение или растительная клетка также могут быть временно трансформированы так, что рекомбинантный полинуклеотид не интегрируется в ее геном. Временно трансформированные клетки, теряют весь или некоторую часть введенного рекомбинантного полинуклеотида с каждым клеточным делением так, что введенный рекомбинантный полинуклеотид не может быть обнаружен в дочерних клетках после достаточного числа клеточных делений.
В настоящей области техники доступен ряд способов для трансформации растительной клетки, которые включены в настоящий документе, включая в себя биобалистику, техники генной пушки, опосредованная Agrobacterium трансформация, опосредованная вирусным вектором трансформация и электропорация. Система Agrobacterium для интеграции чужеродной ДНК в растительные хромосомы была тщательно изучена, модифицирована и использовалась для генной инженерии растений. Оголенные рекомбинантные молекулы ДНК, содержащие последовательности ДНК, соответствующие исследуемому очищенному белку табака, функционально связанные, в смысловой или антисмысловой ориентации, с регуляторными последовательностями, присоединяют к соответствующим последовательностям Т-ДНК общепринятыми способами. Их вводят в протопласты табака с помощью техник на основе полиэтиленгликоля или с помощью техник электропорации, обе их которых являются стандартными. Альтернативно, такие векторы, содержащие рекомбинантные молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие исследуемый очищенный белок табака, вводят в живые клетки Agrobacterium, которые затем переносят нуклеиновую кислоту в растительные клетки. Трансформация с помощью оголенной ДНК, не сопровождаемой Т-ДНК векторными последовательностями, может осуществляться посредством слияния протопластов табака с ДНК-содержащими липосомами или посредством электропорации. Оголенная ДНК, не сопровождаемая Т-ДНК векторными последовательностями, также может использоваться для трансформации клеток табака посредством инертных, высокоскоростных микрочастиц.
Если клетка или культивируемая ткань используется в качестве реципиентная ткань для трансформации, растения могут быть регенерированы из трансформированных культур при необходимости с помощью техник, известных специалистам в настоящей области техники.
Выбор регуляторных участков, подлежащих включению в рекомбинантный конструкт, зависит от нескольких факторов, включающих в себя без ограничения эффективность, селектируемость, индуцибельность, необходимый уровень экспрессии и клеточно- или тканепредпочтительная экспрессия. Для специалиста в настоящей области техники рутинной процедурой является модулирование экспрессии кодирующей последовательности с помощью соответствующим образом осуществленного выбора и размещения регуляторных участков по отношению к кодирующей последовательности. Транскрипцию полинуклеотида можно модулировать аналогичным образом. Некоторые подходящие регуляторные участки инициируют транскрипцию исключительно или преимущественно в определенных типах клеток. Способы идентификации и определения характеристик регуляторных участков в растительной геномной ДНК известны в настоящей области техники.
Подходящие промоторы включают в себя тканеспецифические промоторы, распознающиеся тканеспецифическими факторами, присутствующими в различных типах тканей или клеток (например, корнеспецифические промоторы, специфические для побега промоторы, специфические для ксилемы промоторы) или присутствующими в ходе различных стадий развития или присутствующими в ответ на различные условия окружающей среды. Подходящие промоторы включают в себя конститутивные промоторы, которые могут активироваться в большинстве типах клеток без необходимости в специфических индукторах. Примеры подходящих промоторов для управления продукцией полипептида NtTS РНК-и, включают в себя промотры вируса мозаики цветной капусты 35S (CaMV/35S), SSU, OCS, lib4, usp, STLS1, B33, nos или убиквитина или фазеолина. Специалисты в настоящей области техники способны создать многочисленные варианты рекомбинантных промоторов.
Тканеспецифические промоторы представляют собой транскрипционные контрольные элементы, которые являются активными только в конкретных клетках или тканях в определенные периоды времени в ходе развития растения, например, в вегетативных тканях или репродуктивных тканях. Тканеспецифическая экспрессия может быть преимущественной, например, когда предпочтительна экспрессия полинуклеотидов в определенных тканях. Примеры тканеспецифические промоторы под управлением связанного с развитием фактора включают в себя промоторы, которые могут инициировать транскрипцию только (или преимущественно только) в определенных тканях, таких как вегетативные ткани, например, корни или листья, или репродуктивные ткани, такие как плод, семязачатки, семена, пыльца, пестики, цветы или любая эмбриональная ткань. Репродуктивные тканеспецифические промоторы могут представлять собой, например, специфические для пыльника, специфические для семязачатка, специфические для зародыша, специфические для эндосперма, специфические для интегумента, специфические для семени и семенной оболочки, специфические для пыльцы, специфические для лепестка, специфические для чашелистика или их комбинации.
Подходящие специфические для листа промоторы включают в себя промотор пируватортофосфатдикиназы (PPDK) из растения С4 (маиса), промотор cab-m1Ca+2 из маиса, промотор связанного с myb гена Arabidopsis thaliana (Atmyb5), промоторы рибулозабифосфаткарбоксилазы (RBCS) (например, гены RBCS 1, RBCS2 и RBCS3A помидора, экспрессирующиеся в листьях и выращенных на свету сеянцах, RBCS1 и RBCS2, экспрессирующиеся в развивающихся плодах помидора или промотор рибулозабифосфаткарбоксилазы, экспрессирующийся почти исключительно в клетках мезофилла в листовых пластинках и листовых влагалищах на высоких уровнях).
Подходящие специфические для старения промоторы включают в себя промотор помидора, активный в течение созревания плодов, старения и сбрасывания листьев, промотор маиса для гена, кодирующего цистеинпротеазу. Могут использоваться подходящие специфические для пыльника промоторы. Могут быть выбраны подходящие предпочтительные для корня промоторы, известные специалистам в настоящей области техники. Подходящие предпочтительные для семени промоторы включают в себя как семяспецифические промоторы (такие промоторы активны в течение развития семян, такие как промоторы запасных беков семян) и промоторы прорастания семени (такие промоторы активны в ходе прорастания семян). Такие предпочтительные для семени промоторы включают в себя без ограничения Cim1 (индуцируемая цитокинином мРНК); cZ19B1 (19 кДа зеин маиса); milps (мио-инозитол-1-фосфатсинтаза); mZE40-2, также известный как Zm-40; nucle; и celA (целлюлозосинтаза). Гамма-зеин представляет собой специфический для эндосперма промотор. Glob-1 представляет собой специфический для зародыша промотор. Для двудольных семяспецифические промоторы включают в себя без ограничения бета-фазеолин фасоли, напин, β-конглицин, лектин сои, круциферин и подобное. Для однодольных семяспецифические промоторы включают в себя без ограничения промотор зеина маиса 15 кДа, промотор зеина 22 кДа, промотор зеина 27 кДа, промотор g-зеина, промотор γ-зеина 27 кДа (такой как промотор gzw64A, см. учетный номер Genbank S78780), промотор waxy, промотор shrunken 1, промотор shrunken 2, промотор глобулина 1 (см. учетный номер Genbank L22344), промотор Itp2, промотор cim1, промоторы end1 и end2 маиса, промотор nuc1, промотор Zm40, eep1 и еер2; lec1, промотор тиоредоксина Н; промотор mlip15, промотор PCNA2; и промотор shrunken-2.
Примеры индуцируемых промоторов включают в себя промоторы, чувствительные к атаке патогена, анаэробным условиям, повышенной температуре, свету, засухе, пониженной температуре или высокой концентрации соли. Индуцируемые патогеном промоторы включают в себя промоторы из связанных с патогенезом белков (PR белков), которые индуцируются после инфицирования патогеном (например, PR белки, SAR белки, бета-1,3-глюканаза, хитиназа).
В дополнение к растительным промоторам другие подходящие промоторы могут быть получены из бактериального источника, например, промотор октопинсинтазы, промотор нопалинсинтазы и другие промоторы, полученные из Ti плазмид), или могут быть получены из вирусных промоторов (например, промоторы 35S и 19S РНК вируса мозаики цветной капусты (CaMV), конститутивные промоторы вируса табачной мозаики, 19S и 35S промоторы вируса мозаики цветной капусты (CaMV) или 35S промотор вируса мозаики норичника шишковатого).
Термин "полипептид NtTS " относится к полипептиду, кодирующему треонинсинтазу из Nicotiana tabacum, и включает в себя полипептиды, содержащие, состоящие или состоящие, по сути, из аминокислотной последовательности, кодируемой полинуклеотидом по меньшей мере приблизительно с 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:3 или полинуклеотидом по меньшей мере приблизительно с 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%,87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 или SEQ ID NO:20; фрагментами полинуклеотида NtTS SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 или SEQ ID NO:20; и фрагментами SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 или SEQ ID NO:20, которые характеризуются по меньшей мере приблизительно 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности по отношению к соответствующими фрагментами SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 или SEQ ID NO:20. Иллюстративные фрагменты представлены в SEQ ID No 9-19. Полипептиды NtTS также включают в себя последовательности, содержащие достаточную или существенную степень идентичности или сходства с SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 или SEQ ID NO:8, чтобы функционировать в качестве треонинсинтазы, и включают в себя последовательности по меньшей мере с 95% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 или SEQ ID NO:21. SEQ ID NO. 6 представляет собой транслированную последовательность из SEQ ID NO:1. SEQ ID NO:7 представляет собой транслированную последовательность из SEQ ID NO:2. SEQ ID NO:8 представляет собой транслированную последовательность из SEQ ID NO. 3. SEQ ID NO:21 представляет собой транслированную последовательность из SEQ ID NO:20 и характеризуется 89% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 или SEQ ID NO:9.
Согласно одному варианту осуществления фрагменты полипептидов NtTS сохраняют треонинсинтазную активность. Полипептиды NtTS также включают в себя варианты и мутанты, полученные путем введения любого типа изменений (например, вставок, делеций или замен аминокислот; изменений в состояниях гликозилирования; изменений, которые воздействуют на рефолдинг или изомеризации, состояния трехмерные структуры или состояния самосборки), которые могут быть преднамеренно сконструированы или выделены из естественного источника, при условии, что они сохраняют свою функцию в качестве треонинсинтазы. Полипептиды NtTS могут находиться в линейной форме или могут быть циклизированы с использованием известных способов. Термин "полипептид NtTS" может относиться к полипептиду, содержащему, состоящему или состоящему, по сути, из последовательности, представленной в SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 или SEQ ID NO:21.
Согласно другому аспекту предусматривается выделенный полипептид, содержащий, состоящий или состоящий, по сути, из полипептидной последовательности, характеризующейся по меньшей мере 60% идентичности последовательности по отношению к любой из описанных в настоящем документе последовательностей, включающих в себя любые представленные в списке последовательностей Полипептиды. Соответственно, выделенные полипептиды содержат, состоят или состоят, по сути, из последовательности, характеризующейся по меньшей мере 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности по отношению к ним.
Полипептиды NtTS включают в себя варианты, полученные путем введения любого типа изменений (например, вставок, делеций или замен аминокислот; изменений в состояниях гликозилирования; изменений, которые воздействуют на рефолдинг или изомеризации, состояния трехмерные структуры или состояния самосборки), которые могут быть преднамеренно сконструированы или выделены из естественного источника. Вариант может содержать изменения, которые производят молчащее изменение и дает в результате функционально эквивалентный белок. Преднамеренные аминокислотные замены могут быть произведены на основании сходства в полярности, заряде, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфифильной природе остатков при условии, что сохраняется вторичная связывающая активность вещества. Например, отрицательно заряженные аминокислоты включают в себя аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту; положительно заряженные аминокислоты включают в себя лизин и аргинин; и аминокислоты с незаряженными полярными концевыми группами, характеризующиеся сходными значениями гидрофильности, включают в себя лейцин, изолейцин, валин, глицин, аланин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, фенилаланин и тирозин. Консервативные замены могут быть произведены, например, согласно таблице ниже. Аминокислоты в одном и том же блоке во второй колонке и предпочтительно в одной линии в третьей колонке могут быть заменены друг на друга:
Алифатические
Неполярные
Gly Ala Pro Ile Leu Val
Полярные - незаряженные
Cys Ser Thr Met Asn Gly
Полярные - заряженные
Asp Glu Lys Arg
Ароматические
His Phe Trp Tyr
Полипептид NtTS может представлять собой зрелый белок или незрелый белок или белок, полученный из незрелого белка. Полипептиды NtTS могут находиться в линейной форме или могут циклизироваться с использованием известных способов. Полипептиды NtTS содержат по меньшей мере 10, по меньшей мере 20, по меньшей мере 30 или по меньшей мере 40 смежных аминокислот.
Согласно одному варианту осуществления предусматривается выделенный полипептид, кодируемый любым одним из полинуклеотидов, содержащих, состоящих или состоящих, по сути, из последовательности, кодирующей треонинсинтазу и характеризующейся по меньшей мере 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 или SEQ ID No. 3 или любым одним из полинуклеотидов, содержащих, состоящих или состоящих, по сути, из последовательности, характеризующейся по меньшей мере 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 100% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5 или SEQ ID NO:20.
Согласно другому варианту осуществления предусматривается выделенный полипептид, кодирующий треонинсинтазу и содержащий, состоящий или состоящий, по сути, из полипептидной последовательности, характеризующейся по меньшей мере 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности по отношению к последовательности, представленной в SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 или SEQ ID NO:21.
Согласно другому варианту осуществления предусматривается выделенный полипептид, кодирующий треонинсинтазу и содержащий, состоящий или состоящий, по сути, из последовательности, представленной в SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 или SEQ ID NO:21.
В настоящем документе также раскрыты фрагменты полипептидных последовательностей, соответственно, такие фрагменты сохраняют активность треонинсинтазы.
Варианты мутантного полипептида могут использоваться для создания мутантных растений, не встречающихся в природе растений или трансгенных растений, содержащих мутантный полипептид NtTS. Соответственно, мутантный полипептид NtTS сохраняет активность треонинсинтазы.
Полипептид может быть получен путем культивирования трансформированных или рекомбинантных клеток-хозяев при условиях культивирования, подходящих для экспрессии полипептида. Полученный экспрессированный полипептид затем может быть очищен от такой культуры с использованием известных способов очистки. Очистка полипептида может включать в себя аффинную колонку, содержащую средства, которые будут связывать полипептид; одну или несколько стадий на колонке через такие аффинные смолы; одну или несколько стадий, предусматривающих хроматографию с гидрофобным взаимодействием или иммуноаффинную хроматографию. Альтернативно, полипептид также может экспрессироваться в форме, которая будет облегчать очистку. Например, он может экспрессироваться в виде полипептида слияния, такого как полипептид слияния связывающего мальтозу полипептида (МВР), глутатион-5-трансферазы (GST) или тиоредоксина (TRX). Наборы для экспрессии и очистки полипептидов слияния являются коммерчески доступными. Полипептид может быть помечен эпитопом и впоследствии очищен с использованием специфического антитела, направленного а такой эпитоп. Одна или несколько стадий такой жидкостной хроматографии, как обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография, может использоваться для дальнейшей очистки полипептида. Некоторые или все вышеизложенные стадии очистки, в различных комбинациях, могут использоваться для обеспечения по существу гомогенного рекомбинантного полипептида. Очищенный таким образом полипептид может по существу не содержать другие полипептиды, и в настоящем документе его определяют как "по существу очищенный полипептид"; такие очищенные полипептиды включают в себя полипептиды NtTS, фрагменты, варианты и подобное. Экспрессия, выделение и очистка полипептидов и фрагментов может осуществляться с помощью любой подходящей техники, включающей в себя без ограничения описанные в настоящем документе способы.
Также возможно использовать такую аффинную колонку, как моноклональное антитело, образованное против полипептидов, для аффинной очистки экспрессированных полипептидов. Эти полипептиды могут быть удалены из аффинной колонки с использованием общепринятых техник, например, в элюирующем буфере с высокой концентрации соли и затем диализированные в буфер с пониженной концентрацией солей для применения или путем изменения рН или других компонентов в зависимости от используемой аффинной матрицы, или могут быть конкурентно удалены с использованием встречающегося в природе субстрата аффинного фрагмента.
Полипептид также можно получить с помощью известного традиционного химического синтеза. Способы конструирования полипептидов или их фрагментов с помощью синтетических способов известны специалистам в настоящей области техники. Синтетически сконструированные полипептидные последовательности, на основании того, что характеризуются первичными, вторичными или третичными структурными или конформационными характеристиками, общими с нативными полипептидами, могут обладать общими для них биологическими свойствами, включающими в себя биологическую активность.
Используемый в настоящем документе термин 'не встречающийся в природе' описывает объект (например, полинуклеотид, генетическую мутацию, полипептид, растение, растительную клетку и растительный материал), который не образуется естественным образом в природе или не существует в природе. Такие не встречающийся в природе объекты или искусственные объекты можно получить, синтезировать, инициировать, модифицировать, провести в отношении них вмешательство или манипуляцию с помощью способов, описанных в настоящем документе или которые известны в настоящей области техники. Таким образом, в качестве примера, не встречающееся в природе растение, не встречающаяся в природе растительная клетка или не встречающийся в природе растительный материал может быть получен с использованием таких традиционных техник разведения растений, как возвратное скрещивание, или с помощью таких технологий манипуляции с генами, как антисмысловая РНК, интерферирующая РНК, мегануклеаза и подобное. В качестве дополнительного примера, не встречающееся в природе растение, не встречающаяся в природе растительная клетка или не встречающийся в природе растительный материал может быть получен путем интрогрессии или с помощью переноса одной или нескольких генетических мутаций (например, одного или нескольких полиморфизмов) из первого растения или растительной клетки во второе растение или растительную клетку (которая сама по себе может быть встречающейся в природе) так, чтобы полученное растение, растительная клетка или растительный материал или их потомство содержало генетическую структуру (например, геном, хромосоме или их сегмент), которая не образуется в природе или не существует в природе. Полученное растение, растительная клетка или растительный материал является, таким образом, искусственным или не встречающимся в природе. Соответственно, искусственное или не встречающееся в природе растение или растительная клетка могут быть получены путем модификации генетической последовательность в первом встречающемся в природе растении или растительной клетке, даже если полученная генетическая последовательность встречается в природе во втором растении или растительной клетке, которая содержит генетический фон, отличный от первого растения или растительной клетки. Различия в генетическом фоне могут быть обнаружены с помощью фенотипических различий или с помощью таких техник молекулярной биологии, известных в настоящей области техники, как секвенирование нуклеиновых кислот, присутствие или отсутствие генетических маркеров (например, маркеров микросателлитных РНК).
Согласно другому варианту осуществления в настоящем документе предусматриваются антитела, являющиеся иммунореактивными по отношению к полипептидам NtTS. Представленные в настоящем документе полипептиды NtTS, фрагменты, варианты, полипептиды слияния и подобное могут использоваться в качестве "иммуногенов" в получении антитител, иммунореактивных по отношению к ним. Такие антитела могут специфически связываться с полипептидами NtTS посредством антигенсвязывающий сайтов антитела. Специфически связывающие антитела представляют собой антитела, которые будут специфически распознавать и связываться с семейством полипептидов NtTS, гомологами и вариантами, но не с другими молекулами. Согласно одному варианту осуществления антитела являются специфическими для полипептидов, характеризующихся аминокислотной последовательностью NtTS, представленной в настоящем документе, и не дают перекрестную реакцию с другими полипептидами.
Более конкретно, полипептиды, фрагмент, варианты, полипептиды слияния и подобное содержат антигенные детерминанты или эпитопы, которые вызывают образование антител. Эти антигенные детерминанты или эпитопы могут быть либо линейными, либо конформационными (прерывистыми). Линейные эпитопы состоят из одного фрагмента аминокислот полипептида, тогда как конформационные или прерывистые эпитопы состоят из фрагментов аминокислот из различных участков полипептидной цепи, которые приходят в непосредственную близость при укладке полипептида. Эпитопы могут быть идентифицированы с помощью любого из известных в настоящей области техники способов. Кроме того, эпитопы из полипептидов могут использоваться в качестве реагентов для исследований в анализах и для очистки специфических связывающих антител от таких веществ, как поликлональные сыворотки или супернатанты из культивируемых гибридом. Такие эпитопы или их варианты могут быть получены с использованием таких известных в настоящей области техники техник, как твердофазный синтез, химическое или ферментативное расщепление полипептида, или с использованием технологии рекомбинантной ДНК.
Как поликлональные, так и моноклональные антитела к полипептидам можно получить с использованием общепринятых техник. Гибридомные клеточные линии, которые производят моноклональные антитела, специфические по отношению к полипептидам, также предусматриваются в настоящем документе. Такие гибридомы могут быть получены и идентифицированы с помощью общепринятых техник. Для получения антител различные животные-хозяева могут быть иммунизированы путем инъекции полипептида NtTS, его фрагмента, варианта или мутантов. Такие животные-хозяева могут среди прочего включать в себя без ограничения кроликов, мышей и крыс. Различные адъюванты могут использоваться для увеличения иммунологического ответа. В зависимости от вида-хозяина такие адъюванты включают в себя без ограничения адъювант Фрейнда (полный и неполный), такие минеральные гели, как гидроксид алюминия, такие поверхностно-активные вещества, как лизолецитин, плюрониловые полиолы, полианионы, пептиды, масляные эмульсии, гемоцианин фиссуреллы, динитрофенол и потенциально применимые адъюванты человека, такие как BCG (бацилла Кельмета-Герена) и Corynebacterium parvum. Моноклональные антитела могут быть выделены с помощью общепринятых техник. Такие моноклональные антитела могут принадлежать любому классу иммуноглобулинов, включая в себя IgG, IgM, IgE, IgA, IgD и любой их подкласс.
Антитела также могут использоваться в анализах для обнаружения присутствия полипептидов или фрагментов, либо in vitro, либо in vivo. Антитела также могут использоваться в очистке полипептидов или фрагментов с помощью иммуноаффинной хроматографии.
Композиции, которые могут снижать экспрессию или активность треонинсинтазы, включают в себя без ограничения специфические для последовательности полинуклеотиды, которые могут препятствовать транскрипции одного или нескольких эндогенных генов треонинсинтазы; специфические для последовательности полинуклеотиды, которые могут препятствовать трансляции транскриптов РНК треонинсинтазы (например, двухцепочечных РНК, микроРНК, миРНК (малая интерферирующая), рибозимов); специфические для последовательности полинуклеотиды, которые могут препятствовать стабильность белка треонинсинтазы; специфические для последовательности полинуклеотиды, которые могут препятствовать ферментативной активности белка треонинсинтазы или связывающей активности белка треонинсинтазы по отношению к субстратам или регуляторным белкам; антитела, которые проявляют специфичность в отношении белка треонинсинтазы; низкомолекулярные соединения, которые могут препятствовать стабильности белка треонинсинтазы или ферментативной активности белка треонинсинтазы или связывающей активности белка треонинсинтазы; белки "цинковые пальцы", которые связывают полинуклеотид треонинсинтазы; и мегануклеазы с активностью в отношении полинуклеотида треонинсинтазы.
Антисмысловая технология представляет собой один широко известный способ, который может использоваться для модулирования (например, снижения или ингибирования) экспрессии полипептида NtTS. Полинуклеотид гена NtTS, который необходимо подавить, клонируют и функционально связывают с регуляторным участком и последовательностью терминации транскрипции так, чтобы транскрибировалась антисмысловая цепь РНК. Рекомбинантный конструкт затем трансформируют в растения и получают антисмысловую цепь РНК. Полинуклеотид не обязательно должен быть полной последовательностью подавляемого гена, но, как правило, будет по существу комплементарным по меньшей мере части смысловой цепи подавляемого гена (независимо от того, находится ли она в кодирующем или некодирующем участке).
Полинуклеотид может быть транскрибирован в рибозим, или каталитическую РНК, который оказывает влияние на экспрессию мРНК. Рибозимы могут быть разработаны для специфического спаривания фактически с любой целевой РНК и расщеплять фосфодиэфирный остов в конкретном месте, тем самым функционально инактивируя целевую РНК. Гетерологичные полинуклеотиды могут кодировать рибозимы, разработанные для расщепления конкретных транскриптов мРНК, таким образом препятствуя экспрессии полипептида. Рибозимы типа hammerhead применимы для разрушения конкретных мРНК, хотя могут использоваться различные рибозимы, которые расщепляют мРНК на последовательностях сайт-специфического распознавания. Рибозимы типа hammerhead расщепляют мРНК в положениях, обусловленных фланкирующими участками, которые образуют комплементарные пары оснований с целевой мРНК. Единственным требованием является то, что целевая РНК содержит 5'-UG-3' нуклеотидную последовательность. Конструкция и получение рибозимов типа hammerhead известны в настоящей области техники. Последовательности рибозимов типа hammerhead могут быть окружены такой стабильной РНК, как транспортная РНК (тРНК) для увеличения эффективности расщепления in vivo.
Согласно одному варианту осуществления специфические для последовательности полинуклеотиды, которые могут препятствовать трансляции РНК транскрипта(ов) треонинсинтазы, представляют собой РНК-и. РНК-интерференция ("РНК-и") или РНК-сайленсинг представляет собой эволюционно консервативный процесс, с помощью которого специфические мРНК могут быть направлены на ферментативное расщепление. Двухцепочечная РНК (двухцепочечная РНК) должна быть введена в клетку или произведена клеткой (например, двухцепочечным РНК вирусом или полинуклеотидами РНК-и NtTS) для инициации пути РНК-и. Двухцепочечная РНК может превращаться во множественные двойные спирали миРНК длиной 21-23 п.н. ("миРНК") с помощью РНКаз III, которые представляют собой специфические для двухцепочечных РНК эндонуклеазы ("Dicer"). миРНК впоследствии могут распознаваться с помощью индуцируемых РНК комплексов сайленсинга ("RISC"), которые стимулируют раскручивание миРНК посредством АТР-зависимого процесса. Раскрученная антисмысловая цепь миРНК направляет активированный RISC к нацеленной мРНК (например, вариантам РНК NtTS), содержащей последовательность, комплементарную антисмысловой цепи миРНК. Нацеленная мРНК и антисмысловая цепь могут формировать спираль А-формы, и большая борозда спирали А-формы может распознаваться с помощью активированного RISC. Целевая мРНК может расщепляться с помощью активированного RISC на одном сайте, определенном с помощью сайта связывания 5'-конца цепи миРНК. Активированный RISC может повторно использоваться для катализа другого события расщепления.
Векторы экспрессии РНК-и NtTS могут содержать конструкты РНК-и NtTS, кодирующие полинуклеотиды РНК-и NtTS, которые проявляют активность РНК-интерференции путем снижения уровня экспрессии мРНК NtTS, пре-мРНК NtTS или родственных вариантов РНК NtTS. Векторы экспрессии могут содержать промотор, расположенный против хода транскрипции и функционально связанный с конструктом РНК-и NtTS, как дополнительно описано в настоящем документе. Векторы экспрессии РНК-и NtTS могут содержать подходящий минимальный коровый промотор, представляющий интерес конструкт РНК-и NtTS, вышележащий (5') регуляторные участок, нижележащий (3') регуляторный участок, включающий в себя сигналы терминации транскрипции и полиаденилирования, и другие последовательности, известные специалистам в настоящей области техники, такие как различные селективные маркеры.
Полинуклеотиды NtTS могут быть получены в различных формах, включающих в себя двухцепочечные структуры (а именно, двухцепочечную молекулу РНК, содержащую антисмысловую цепь и комплементарную смысловую цепь), двухцепочечные шпилькообразные структуры ("дцРНК-и"), или одноцепочечные структуры (а именно, молекулу оцРНК, содержащую только антисмысловую цепь). Структуры могут содержать двойную спираль, асимметричную двойную спираль, шпилечную или асимметричную шпилечную вторичную структуру, характеризующуюся самокомплементарными смысловыми и антисмысловыми цепями. дсРНК-и NtTS можно ферментативно превратить в двухцепочечные миРНК NtTS. Одна из цепей двойной спирали миРНК NtTS может отжигаться с комплементарной последовательностью в пределах целевой мРНК NtTS и родственных вариантов РНК NtTS. Двойные спирали миРНК/мРНК распознаются с помощью RISC, который может расщепить РНК NtTS в многочисленных сайтах зависимым от последовательности способом, приводя к расщеплению целевой мРНК NtTS и родственных вариантов РНК NtTS.
Двухцепочечные молекулы РНК могут включать в себя молекулы миРНК, собранные из одного олигонуклеотида в структуру типа стебель-петля, причем самокомплементарные смысловые и антисмысловые участки молекулы миРНК связаны посредством полинуклеотидного(ых) или неполинуклеотидного(ых) линкера(ов), а также кольцевую одноцепочечную РНК, характеризующуюся двумя или больше структурами типа петля и стеблем, содержащим самокомплементарные смысловые и антисмысловая цепи, причем кольцевая РНК может процессироваться или in vivo, или in vitro для получения активной молекулы миРНК, способной опосредовать РНК-и.
Применение молекул малой шпилечной РНК (мшРНК) также подразумевается в настоящем документе, и они содержат специфическую антисмысловую последовательность в дополнение к обратной комплементарной (смысловой) последовательности, как правило, отделенную с помощью последовательности спейсера или последовательности типа петля. Расщепление спейсера или петли обеспечивает одноцепочечную молекулу РНК и ее обратную комплементарную молекулу так, что они могут отжигаться для формирования двухцепочечной молекулы РНК (необязательно с дополнительным стадиями процессинга, которые могут приводить к добавлению или удалению одного, двух, трех или больше нуклеотидов с 3'-конца или 5'-конца любого или обоих цепей). Спейсер может быть достаточной длины для предоставления антисмысловым и смысловым последовательностям возможности отжигаться и формировать двухцепочечную структуру (или стебель) перед расщеплением спейсера (и необязательно последующие стадии процессинга, которые могут приводить к добавлению или удалению одного, двух, трех или больше нуклеотидов с 3'-конца или 5'-конца любого или обоих цепей). Спейсерная последовательность, как правило, представляет собой неродственную нуклеотидную последовательность, которая расположена между двумя комплементарными участками нуклеотидной последовательности, которые, при отжиге в двухцепочечный полинуклеотид, содержат мшРНК. Спейсерная последовательность, как правило, содержит приблизительно 3 - приблизительно 100 нуклеотидов.
Любой представляющий интерес полинуклеотид РНК NtTS может быть получен с помощью выбора подходящего состава последовательностей, размера петли и длины стебля для получения шпилечной двойной спирали NtTS. Подходящий диапазон для разработки длин стебля шпилечной двойной спирали включает в себя длины стебля, составляющие по меньшей мере приблизительно 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 нуклеотидов, такие как приблизительно 14-30 нуклеотидов, приблизительно 30-50 нуклеотидов, приблизительно 50-100 нуклеотидов, приблизительно 100-150 нуклеотидов, приблизительно 150-200 нуклеотидов, приблизительно 200-300 нуклеотидов, приблизительно 300-400 нуклеотидов, приблизительно 400-500 нуклеотидов, приблизительно 500-600 нуклеотидов и приблизительно 600-700 нуклеотидов. Подходящий диапазон для разработки длин петли шпилечной двойной спирали включает в себя длины петли, составляющие приблизительно 4-25 нуклеотидов, приблизительно 25-50 нуклеотидов или длиннее, если длина стебля шпилечной двойной спирали является значительной. Согласно определенным вариантам осуществления молекула двухцепочечной РНК (дцРНК) или одноцепочечной РНК (оцРНК) составляет приблизительно 15 - приблизительно 40 нуклеотидов в длину. Согласно другому варианту осуществления молекула миРНК представляет собой молекулу дцРНК или оцРНК, составляющую приблизительно 15 - приблизительно 35 нуклеотиды в длину. Согласно другому варианту осуществления молекула миРНК представляет собой молекулу дцРНК или оцРНК, составляющую приблизительно 17 - приблизительно 30 нуклеотидов в длину. Согласно другому варианту осуществления молекула миРНК представляет собой молекулу дцРНК или оцРНК, составляющую приблизительно 19 - приблизительно 25 нуклеотидов в длину. Согласно другому варианту осуществления молекула миРНК представляет собой молекулу дцРНК или оцРНК, составляющую приблизительно 21 - приблизительно 23 нуклеотидов в длину. Согласно определенным вариантам осуществления шпилечные структуры с участками двойной спирали длиннее, чем 21 нуклеотид, могут стимулировать эффективный направленный на миРНК сайленсинг, независимо от последовательности и длины петли.
Целевая последовательность мРНК, как правило, составляет приблизительно 14 - приблизительно 50 нуклеотидов в длину. Целевая мРНК, следовательно, может быть отсканирована в отношении участков, составляющих приблизительно 14 - приблизительно 50 нуклеотидов в длину, которые предпочтительно соответствуют одному или нескольким из следующих критериев для целевой последовательности: соотношение A+T/G+C составляет приблизительно 2:1 - приблизительно 1:2; АА динуклеотид или СА динуклеотид на 5'-конце целевой последовательности; последовательность, составляющая по меньшей мере 10 последовательных нуклеотидов, уникальная для целевой мРНК (т.е., последовательность не присутствует в других последовательностях мРНК из того же растения); и отсутствие "серий" более чем трех последовательных нуклеотидов гуанина (G) или больше чем трех последовательных нуклеотидов цитозина (С). Эти критерии могут оцениваться с использованием различных техник, известны в настоящей области техники, например, такие компьютерные программы, как BLAST, могут использоваться для исследования общедоступных баз данных для определения того, уникальная ли выбранная целевая последовательность для целевой мРНК. Альтернативно, целевая последовательность может быть выбрана (и последовательность миРНК разработана) с использованием коммерчески доступного компьютерного программного обеспечения (например, OligoEngine, Target Finder и siRNA Design Tool, которые являются коммерчески доступными.
Согласно одному варианту осуществления выбирают целевые последовательности мРНК, которые составляют приблизительно 14 - приблизительно 30 нуклеотидов в длину, которые соответствуют одному или нескольким описанным выше критериям. Согласно другому варианту осуществления выбирают целевые последовательности, которые составляют приблизительно 16 - приблизительно 30 нуклеотидов в длину, которые соответствуют одному или нескольким описанным выше критериям. Согласно дополнительному варианту осуществления выбирают целевые последовательности, которые составляют приблизительно 19 - приблизительно 30 нуклеотидов в длину, которые соответствуют одному или нескольким описанным выше критериям. Согласно другому варианту осуществления выбирают целевые последовательности, которые составляют приблизительно 19 - приблизительно 25 нуклеотиды в длину, которые соответствуют одному или нескольким описанным выше критериям.
Согласно иллюстративному варианту осуществления молекулы, используемые для модулирования экспрессии, содержат специфическую последовательность (например, антисмысловую последовательность), которая комплементарна по меньшей мере 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или больше смежным нуклеотидам любой из описанных в настоящем документе полинуклеотидных последовательностей NtTS, таких как SEQ ID No:1-5 или 20.
Согласно дополнительному иллюстративному варианту осуществления молекулы, используемые для модулирования экспрессии, содержат последовательность (например, антисмысловую последовательность), которая комплементарна по меньшей мере 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 или больше смежным нуклеотидам из нуклеотидов 1-46 в SEQ ID No:1, 2 и 3; из нуклеотидов 1-52 в SEQ ID NO:20; из нуклеотидов 99-141 в SEQ ID NO:1; из нуклеотидов 102-144 в SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:3; из нуклеотидов 102-153 в SEQ ID NO:20; из нуклеотидов 1325-1362 в SEQ ID No: 1, 2 и 3; или из нуклеотидов 1334-1371 в SEQ ID NO:20.
Согласно дополнительному иллюстративному варианту осуществления молекулы, используемые для модулирования экспрессии, содержат последовательность (например, антисмысловую последовательность), которая комплементарна по меньшей мере 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 или больше смежным нуклеотидам из нуклеотидов 454-805 в SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:3 или нуклеотидов 463-814 в SEQ ID NO:20.
Специфическая антисмысловая последовательность, содержащаяся в молекуле миРНК, может быть идентична или по существу идентична последовательности, комплементарной целевой последовательности. Согласно одному варианту осуществления специфическая антисмысловая последовательность, содержащаяся в молекуле миРНК, по меньшей мере приблизительно на 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности, комплементарной целевой последовательности мРНК. Способы определения идентичности последовательности известны в настоящей области техники, и идентичность последовательности может быть определены, например, с использованием программы BLASTN программного обеспечения Wisconsin Computer Group (GCG) или представленной на веб-сайте NCBI.
Специфическая антисмысловая последовательность молекул миРНК, может проявлять изменчивость за счет различия (например, на нуклеотидную замену, включающую в себя транзицию или трансверсию) на одном, двух, трех, четырех или больше нуклеотидах от последовательности целевой мРНК. Когда такие нуклеотидные замены присутствуют в антисмысловой цепи двухцепочечной молекулы РНК, комплементарный нуклеотид в смысловой цепи, с которым замещенный нуклеотид, формирует пару оснований с помощью водородной связи, может быть соответствующим образом замещен или нет. Также предусматриваются двухцепочечные молекулы РНК, в которых один или несколько нуклеотидных замен происходят в смысловой последовательности, но не в антисмысловой цепи. Когда антисмысловая последовательность молекулы миРНК содержит один или несколько несовпадений между нуклеотидной последовательностью миРНК и целевой нуклеотидной последовательностью, как описано выше, несовпадения могут быть обнаружены на 3'-конце, 5'-конце или в центральной части антисмысловой последовательности.
Согласно другому варианту осуществления молекулы миРНК содержат специфическую антисмысловую последовательность, которая способна к селективной гибридизации при жестких условиях с частью встречающегося в природе целевого гена или целевой мРНК. Как известно специалистам в настоящей области техники, вариации в степени жесткости условий гибридизация могут достигаться путем изменения времени, температуре или концентрации растворов, используемых для стадий гибридизации и отмывки. Подходящие условия также могут зависеть частично от конкретных используемых нуклеотидных последовательностей, например, последовательности целевой мРНК или гена.
Один способ индукции сайленсинга двухцепочечной РНК в растениях представляет собой трансформацию с генным конструктом, производящим шпилечную РНК (см. Smith et al. (2000) Nature, 407, 319-320). Такие конструкты содержат инвертированные участки последовательности целевого гена, отделенные подходящим спейсером. Вставка функционального растительного интронного участка в качестве спейсерного фрагмента дополнительно увеличивает эффективность инукции генного сайленсинга, вследствие образования сплайсированной с интроном шпилечной РНК (Wesley et al. (2001) Plant J., 27, 581-590). Соответственно, длина стебля составляет приблизительно 50 нуклеотидов - приблизительно 1 т.п.н. в длину. Способы получения сплайсированной с интроном шпилечной РНК подробно описаны в настоящей области техники (см., например, Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry (2008) 72, 2, 615-617).
Молекулы РНК-и, характеризующиеся двойной спиралью или двухцепочечной структурой, например, двухцепочечная РНК или мшРНК, могут содержать тупые концы или могут содержать 3' или 5' липкие концы. Используемый в настоящем документе термин "липкий конец" относится к неспаренному нуклеотиду или нуклеотидам, которые выпячиваются из структуры двойной спирали, когда 3'-конец одной цепи РНК продолжается за пределы 5'-конца другой цепи (3' липкий конец) или наоборот (5' липкий конец). Содержащие липкий конец нуклеотиды могут представлять собой рибонуклеотиды, дезоксирибонуклеотиды или их модифицированные варианты. Согласно одному варианту осуществления по меньшей мере одна цепь молекулы РНК-и содержит 3' липкий конец, составляющий приблизительно 1 - приблизительно 6 нуклеотидов в длину. Согласно другим вариантам осуществления 3' липкий конец составляет приблизительно 1 - приблизительно 5 нуклеотиды, приблизительно 1 - приблизительно 3 нуклеотидов и приблизительно 2 - приблизительно 4 нуклеотидов в длину.
Когда молекула РНК-и содержит 3' липкий конец на одном конце молекулы, другой конец может представлять собой тупой конец или также содержать липкий конец (5' или 3'). Когда молекула РНК-и содержит липкий конец на обоих концах молекулы, длина липких концов может быть одинаковой или различной. Согласно одному варианту осуществления молекула РНК-и содержит 3' липкие концы, составляющие приблизительно 1 - приблизительно 3 нуклеотидов на обоих концах молекулы. Согласно дополнительному варианту осуществления молекула РНК-и представляет собой двухцепочечную РНК, характеризующуюся 3' липким концом из 2 нуклеотидов на обоих концах молекулы. Согласно еще одному варианту осуществления нуклеотиды, содержащие липкий конец РНК-и представляют собой динуклеотиды ТТ или динуклеотиды UU.
При определении процентной идентичности молекулы РНК-и, содержащей один или несколько липких концов, по отношению к целевой последовательности мРНК, липкий(е) конец(концы) могут учитываться или не учитываться. Например, нуклеотиды из 3' липкого конца и до 2 нуклеотидов из 5'- или 3'-конца двойной цепи могут быть модифицированы без значительной потери активности молекулы миРНК.
Молекулы РНК-и могут содержать одну или несколько 5' или 3'-кэп-структур. Молекула РНК-и может содержать кэп-структуру на 3'-конце смысловой цепи, антисмысловой цепи или как смысловой, так и антисмысловой цепей; или на 5'-конце смысловой цепи, антисмысловой цепи или как смысловой, так и антисмысловой цепей молекулы РНК-и. Альтернативно, молекула РНК-и может содержать кэп-структуру как на 3'-конце, так и на 5'-конце молекулы РНК-и. Термин "кэп-структура" относится к химической модификации, введенной на любых концах олигонуклеотиды, которая защищает молекулы от экзонуклеазного расщепления и также может облегчать доставку или локализацию внутри клетки.
Другая применимая к молекулам РНК-и модификация представляет собой химическое связывание с молекулой РНК-и одного или нескольких фрагментов или конъюгатов, которые усиливают активность, распределение в клетке, клеточное поглощение, биодоступность или стабильность молекулы РНК-и. Полинуклеотиды могут быть синтезированы или модифицированы с помощью способов, общепринятых в настоящей области техники. Химические модификации могут включать в себя без ограничения 2' модификации, введение искусственных оснований, ковалентное прикрепление к лиганду и замещение фосфатных связей тиофосфатными связями. Согласно указанному варианту осуществления целостность структуры двойной спирали усиливается с помощью по меньшей мере одной и, как правило, двух химических связей. Химическое связывание может достигаться с помощью любой из разнообразия хорошо известных техник, например, путем введения ковалентных, ионных или водородных связей; гидрофобных взаимодействий, ван-дер-ваальсовых или стэкинг-взаимодействий; посредством металло-ионной координации или посредством применения пуриновых аналогов.
Согласно другому варианту осуществления нуклеотиды на одной или обеих отдельных цепях могут быть модифицированы для снижения или ингибирования активации таких клеточных ферментов, как, например, без ограничения определенные нуклеазы. Техники для снижения или ингибирования активации клеточных ферментов известны в настоящей области техники, включая в себя без ограничения 2'-амино-модификации, 2'-фтор-модификации, 2'-алкил-модификации, модификации незаряженного остова, морфолино-модификации, 2'-O-метил-модификации и фосфорамидат. Таким образом, по меньшей мере одна 2'-гидроксильная группа нуклеотидов на двухцепочечной РНК замещена химической группой. Кроме того, по меньшей мере один нуклеотид может быть модифицирован для образования закрытого нуклеотида. Такой закрытый нуклеотид содержит метиленовый или этиленовый мостик, который соединяет 2'-кислород рибозы с 4'-углеродом рибозы. Введение закрытого нуклеотида в олигонуклеотид улучшает аффинность для комплементарных последовательностей и увеличивает температуру плавления на несколько градусов.
Лиганды могут быть конъюгированы с молекулой РНК-и, например, для усиления ее клеточного поглощения. Согласно определенным вариантам осуществления гидрофобный лиганд конъюгируют с молекулой для облегчения прямого проникновения через клеточную мембрану. Эти подходы использовались для облегчения проникновения антисмысловых олигонуклеотидов в клетку. В определенных случаях конъюгация катионного лиганда с олигонуклеотидами зачастую приводит к улучшенной устойчивости к нуклеазам. Иллюстративные примеры катионных лигандов включают в себя пропиламмоний и диметилпропиламмоний. Антисмысловые олигонуклеотиды могут сохранять свою высокую аффинность связывания с мРНК, когда катионный лиганд распределен по всему олигонуклеотиду.
Описанные в настоящем документе молекулы и нуклеотиды могут быть получены с использованием хорошо известных техник твердофазного синтеза. Дополнительно или альтернативно могут использоваться любые другие способы для такого синтеза, известные в настоящей области техники.
Различные варианты осуществления относятся к векторам экспрессии NtTS, содержащим один или несколько полинуклеотидов NtTS или конструктов РНК-и NtTS, которые содержат один или несколько полинуклеотидам NtTS.
Различные варианты осуществления относятся к векторам экспрессии, содержащим один или несколько полинуклеотидов NtTS или один или несколько конструктов РНК-и NtTS.
Различные варианты осуществления относятся к векторам экспрессии, содержащим один или несколько полинуклеотидов NtTS или один или несколько конструктов РНК-и NtTS, кодирующих один или несколько полинуклеотидов РНК-и NtTS, способных к самоотжигу для образования шпилечной структуры, причем конструкт содержит (а) один или несколько полинуклеотидов NtTS; (b) вторую последовательность, кодирующую спейсерный элемент, который образует петлю шпилечной структуры; и (с) третью последовательность, содержащую обратную комплементарную последовательность первой последовательности, расположенную в той же ориентации, что и первая последовательность, причем вторая последовательность расположена между первой последовательностью и третьей последовательностью, и вторая последовательность функционально связана с первой последовательностью и третьей последовательностью.
Раскрытые последовательности могут использоваться для конструирования различных полинуклеотидов NtTS, которые не образуют шпилечные структуры. Например, двухцепочечная РНК NtTS может быть образована с помощью (1) транскрибирования первой цепи ДНК NtTS путем функционального связывания с первым промотором, и (2) транскрибирования обратной комплементарной последовательности первой цепи фрагмента ДНК NtTS путем функционального связывания со вторым промотором. Каждая цепь полинуклеотида NtTS может транскрибироваться из одного вектора экспрессии или из различных векторов экспрессии. Двойная спираль РНК NtTS, характеризующаяся РНК-интерферирующей активностью, может ферментативно превращаться в миРНК для снижения уровней РНК NtTS.
Таким образом, различные варианты осуществления относятся к векторам экспрессии NtTS, содержащим полинуклеотид NtTS или конструкт РНК-и NtTS, кодирующие полинуклеотиды РНК-и NtTS, способные к самоотжигу, в которых конструкт содержит (а) один или несколько описанных в настоящем документе полинуклеотидов NtTS; и (b) вторую последовательность, содержащую комплементарную (например, обратную комплементарную) последовательность первой последовательности, расположенную в той же ориентации, что и первая последовательность.
Предусматриваются различные композиции и способы снижения уровней экспрессии эндогенного NtTS путем стимуляции косупрессии экспрессии гена NtTS. Явление косупрессии является результатом введения множественных копий трансгена в растительную клетку-хозяин. Интеграция множественный копий трансгена может привести к сниженной экспрессии трансгена и нацеленному воздействию на эндогенный ген. Степень косупрессии зависит от степени идентичности последовательности между трансгеном и нацеленным эндогенным геном. Сайленсинг как эндогенного гена, так и трансгена может происходить путем обширного метилирования подвергнутых сайленсингу локусов (т.е., представляющего интерес эндогенного промотора и эндогенного гена), что может препятствовать транскрипции. Альтернативно, в некоторых случаях косупрессия эндогенного гена и трансгена может происходить путем посттранскрипционного сайленсинга гена ("PTGS"), при котором транскрипты могут производиться, но усиленные скорости расщепления препятствуют накоплению транскриптов. Полагают, что механизм косупрессии с помощью PTGS имеет сходство с РНК-интерференцией в том отношении, что РНК, по-видимому, представляет собой как важный инициатор, так и мишень в этих процессах, и может быть опосредован, по меньшей мере частично, такими же молекулярными механизмами, вероятно, посредством направляемого РНК расщепления мРНК.
Косупрессия нуклеиновая кислота NtTS может быть достигнута путем интеграции множественных копий нуклеиновой кислоты NtTS или ее фрагментов, в качестве трансгена, в геном представляющего интерес растения. Растение-хозяин может быть трансформировано с вектором экспрессии, содержащим промотор, функционально связанный с нуклеиновой кислотой NtTS или ее фрагментами. Различные варианты осуществления относятся к векторам экспрессии для стимуляции косупрессии эндогенных генов NtTS, содержащим промотор, функционально связанный с полинуклеотидом NtTS.
Различные варианты осуществления относятся к способам модулирования (например, снижения или ингибирования) уровня экспрессии ДНК NtTS путем интеграции множественных копий полинуклеотида NtTS в геном растения (табака), предусматривающим: трансформацию растительной клетки-хозяина с вектором экспрессии, который содержит промотор, функционально связанный с полинуклеотидом NtTS.
Предусматриваются различные композиции и способы снижения уровня экспрессии эндогенного гена NtTS путем снижения или ингибирования трансляции мРНК NtTS. Растительная клетка-хозяин (клетка табака) может быть трансформирована с вектором экспрессии, содержащим: промотор, функционально связанный с полинуклеотидом NtTS, расположенным в антисмысловой ориентации по отношению к промотору, для обеспечения экспрессии полинуклеотидов РНК, характеризующихся последовательностью, комплементарной части MPHKNtTS.
Различные векторы экспрессии для снижения или ингибирования трансляции мРНК NtTS могут содержать: промотор, функционально связанный с полинуклеотидом NtTS, в котором последовательность расположена в антисмысловой ориентации по отношению к промотору. Длины антисмысловых полинуклеотидов РНК NtTS могут варьировать и могут составлять приблизительно 15-20 нуклеотидов, приблизительно 20-30 нуклеотидов, приблизительно 30-50 нуклеотидов, приблизительно 50-75 нуклеотиды, приблизительно 75-100 нуклеотидов, приблизительно 100-150 нуклеотидов, приблизительно 150-200 нуклеотидов и приблизительно 200-300 нуклеотидов.
Также предусматриваются способы получения мутантных полинуклеотидов и полипептидов NtTS. Любое представляющее интерес растение, включающее в себя растительную клетку или растительный материал, может быть генетически модифицировано с помощью различных известных способов для индукции мутагенеза, включающих в себя сайт-направленный мутагенез, олигонуклеотид-направленный мутагенез, химически индуцируемый мутагенез, индуцируемый облучением мутагенез, мутагенез с использованием модифицированных оснований, мутагенез с использованием рваной двойной спирали ДНК, мутагенез с двухцепочечным разрывом, мутагенез с использованием дефектного в отношении репарации штамма-хозяина, мутагенез с помощью полного синтеза гена, перестановка ДНК и другие эквивалентные способы.
Альтернативно, нацеленное воздействие на гены NtTS для инактивации может осуществляться путем введения рибозимов, полученных из ряда малых кольцевых РНК, которые способны к саморасщеплению и репликации в растениях. Эти РНК могут реплицироваться либо отдельно (вироидные РНК), либо с хелперным вирусом (сателлитные РНК). Примеры подходящих РНК включают в себя РНК, полученные из вироида солнечной пятнистости авокадо, и сателлитные РНК, полученные из вируса кольцевой пятнистости табака, вируса временной полосатой пятнистости люцерны, вируса крапчатости Nicotiana velutina, вируса крапчатости Solanum nodiflorum и вируса крапчатости клевера подземного. Различные целевые РНК-специфические рибозимы известны специалистам в настоящей области техники.
Согласно некоторым вариантам осуществления экспрессию полипептида NtTS снижают с помощью таких нетрансгенных способов, как создание одного или нескольких мутаций в гене NtTS. Способы, которые случайным образом вводят мутацию в последовательность гена, могут включать в себя химический мутагенез, мутагенез EMS и радиационный мутагенез. Способы, который вводят одну или несколько нацеленных мутаций в клетку, включают в себя без ограничения технологию редактирования генома, в частности, опосредованный нуклеазой "цинковые пальцы" мутагенез, TILLING (индуцированные нацеленным воздействие очаговые повреждения в геномах), гомологичную рекомбинацию, олигонуклеотид-направленный мутагенез и опосредованный мегануклеазой мутагенез.
Некоторые не ограничивающие примеры мутаций представляют собой делеции, вставки и миссенс-мутации по меньшей мере одного нуклеотида, однонуклеотидные полиморфизмы (SNP) и простой повтор последовательности. После мутации может быть проведен скрининг для идентификации делеции, которые создают преждевременные стоп-кодоны или в других отношениях нефункциональные гены NtTS. Скрининг мутантов может быть проведен путем секвенирования или с применением одного или нескольких зондов или праймеров, специфических в отношении гена или белка NtTS. Также могут быть созданы специфические мутации в полинуклеотидов NtTS, которые приводят к сниженной экспрессии гена NtTS, сниженной стабильности мРНК NtTS или сниженной стабильности белка NtTS. Такие растения в настоящем документе имеют название мутантные растения.
Мутантные растения могут содержать любую комбинацию одной или нескольких мутаций, которые приводят к сниженным уровням полипептида NtTS. Например, мутантные растения могут содержать одну мутация в одном гене NtTS или множественные мутации в одном гене NtTS. Соответственно, раскрыты мутантные растения, содержащие мутантные полипептидные варианты NtTS.
Согласно одному варианту осуществления семена из растений подвергают мутагенезу и затем из них выращивают мутантные растения первого поколения. Растения первого поколения затем самоопыляются, и из семян из растения первого поколения выращивают растения второго поколения, которые затем подвергают скринингу в отношении мутаций в их локусах NtTS. Хотя мутировавший растительный материал может быть подвергнут скринингу в отношении мутаций, преимущество скрининга растений второго поколения состоит в том, что все соматические мутации соответствуют генеративным мутациям. Специалисту в настоящей области техники будет понятно, что разнообразные растительные материалы, включающие в себя без ограничения семена, пыльцу, ткань растения или растительные клетки, могут быть подвергнуты мутагенезу для создания мутантных растений NtTS. Тем не менее, тип подвергаемого мутагенезу растительного материала может быть изменен, когда нуклеиновая кислота растения подвергается скринингу в отношении мутаций. Например, когда пыльца подвергается мутагенезу перед опылением немутировавшего растения, то из семян, полученных из опыления, выращивают растения первого поколения. Каждая клетка растений первого поколения будет содержать мутации, созданные в пыльце; таким образом, эти растения первого поколения могут затем подвергаться скринингу в отношении мутаций NtTS вместо ожидания второго поколения.
Мутагены, создающие точечные мутации, короткие делеции, вставки, трансверсии и/или транзиции, включающие в себя химические мутагены или облучение, могут использоваться для создания мутаций. Мутагены включают в себя без ограничения этилметансульфонат (EMS), метилметансульфонат (MMS), N-этил-N-нитрозомочевину (ENU), триэтилмеламин (ТЕМ), N-метил-N-нитрозомочевину (MNU), прокарбазин, хлорамбуцил, циклофосфамид, диэтилсульфат, мономер акриламид, мелфалан, азотистый иприт, винкристин, диметилнитрозамин, N-метил-N'-нитро-нитрозогуанидин (MNNG), нитрозогуанидин, 2-аминопурин, 7,12-диметил-бенз(а)антрацен (DMBA), этиленоксид, гексаметилфосфорамид, бусульфан, диэпоксиалканы (диэпоксиоктан (DEO), диэпоксибутан (ВЕВ) и подобное), 2-метокси-6-хлор-9[3-(этил-2-хлор-этил)аминопропиламино]акридиндигидрохлорид (ICR-170) и формальдегид. Также предусматриваются спонтанные мутации в локусе NtTS, которые могли быть вызваны напрямую мутагеном, при условии, что они приводят к требуемому фенотипу. Подходящие мутагенные средства также включают в себя, например, такое ионизирующее облучение, как рентгеновские лучи, гамма-лучи, облучение быстрыми нейтронами и УФ облучение. Любой известный специалистам в настоящей области техники способ получения растительной нуклеиновой кислоты может использоваться для получения растительной нуклеиновой кислоты для скрининга в отношении мутации NtTS. Любой известный специалистам в настоящей области техники способ получения растительной нуклеиновой кислоты может использоваться для получения растительной нуклеиновой кислоты для скрининга в отношении мутации NtTS.
Полученная нуклеиновая кислота из отдельных растений, растительных клеток или растительного материала может необязательно быть объединена для ускорения скрининга в отношении мутаций в гене NtTS популяции растений, происходящих из подвергнутой мутагенезу растительной ткани, клеток или материала. Одно или несколько последующих поколений растений, растительных клеток или растительного материала могут быть подвергнуты скринингу. Размер необязательно объединенной группа зависит от чувствительности используемых способов скрининга.
После того, как образцы нуклеиновых кислот необязательно объединили, их могут подвергать таким специфическим для полинуклеотида NtTS техникам амплификации, как полимеразная цепная реакция (ПЦР). Любой один или несколько праймеров или зондов, специфических в отношении гена NtTS или последовательностей, непосредственно прилежащих к гену NtTS, могут использоваться для амплификации последовательности NtTS в пределах образца необязательно объединенных нуклеиновых кислот. Предпочтительно один или несколько праймеров разрабатывают для амплификации участков локуса NtTS, где наиболее вероятно возникновение полезных мутаций. Наиболее предпочтительно праймер разрабатывают для обнаружения мутаций в пределах участков полинуклеотида NtTS. Кроме того, предпочтительно, чтобы праймер(ы) избегал(и) известных полиморфных сайтов для упрощения скрининга в отношении точечных мутаций. Для облегчения обнаружения продуктов амплификации один или несколько праймеров или зондов могут метить с использованием любого общепринятого способа введения метки. Праймер(ы) или зонды могут быть разработаны на основании описанных в настоящем документе последовательностей NtTS с использованием способов, которые широко распространены в настоящей области техники. Полиморфизмы могут быть идентифицированы с помощью известных в настоящей области техники способов.
Согласно дополнительному аспекту предусматривается способ получения мутантного растения. Способ предусматривает предоставление по меньшей мере одной клетки растения, содержащей ген, кодирующий функциональный полипептид NtTS. Далее по меньшей мере одну клетку растения обрабатывают при условиях, эффективных для модулирования активности гена NtTS. Затем проводят размножение по меньшей мере одной мутантной растительной клетки в мутантное растение, причем мутантное растение содержит модулированный уровень полипептида NtTS по сравнению с таковым у контрольного растения. Согласно одному варианту осуществления настоящего способа получения мутантного растения стадия обработки предусматривает воздействие по меньшей мере на одну клетку химического средства для мутагенеза, как описано выше и при условиях, эффективных для получения по меньшей мере одной мутантной растительной клетки. Согласно другому варианту осуществления настоящего способа стадия обработки предусматривает воздействие по меньшей мере на одну клетку источника облучения при условиях, эффективных для получения по меньшей мере одной мутантной растительной клетки. Термин "мутантное растение" включает в себя растения-мутанты, в которых генотип модифицирован по сравнению с контрольным растением, соответственно, с помощью способа, отличного от генной инженерии или генетической модификации.
Согласно определенным вариантам осуществления мутантное растение, мутантная растительная клетка или мутантный растительный материал могут содержать одну или несколько мутаций, которые возникли естественным образом в другом растении, растительной клетке или растительном материале и обеспечивают необходимый признак. Эта мутация может быть введена (например, интрогрессирована) в другое растение, растительную клетку или растительный материал (например, растение, растительную клетку или растительный материал с генетическим фоном, отличным от растения, из которого была получена мутация) для обеспечения ему признака. Таким образом, в качестве примера, мутация, которая произошла естественным образом в первом растении, может быть введена во второе растение, например, второе растение с генетическим фоном, отличным от первого растения. Специалист в настоящей области техники, следовательно, способен провести поиск и идентифицировать растение, несущее естественным образом в своем геноме один или несколько мутантных аллелей гена NtTS, которые обеспечивают необходимый признак. Мутантный(е) аллель(и), которые возникает(ют) естественным образом, могут быть перенесены во второе растение с помощью различных способов, включающие в себя разведение, возвратное скрещивание и интрогрессию для получения линий, сортов или гибридов, содержащих одну или несколько мутаций в гене NtTS. Растения, демонстрирующие необходимый признак, могут быть подвергнуты скринингу из пула мутантных растений. Соответственно, селекцию проводят с использованием данных об описанных в настоящем документе нуклеотидных последовательностях NtTS. Впоследствии, возможно провести скрининг в отношении генетического признака, указывающего на повышенные уровни свободного метионина по сравнению с контролем. Такой подход скрининга может предусматривать применение общепринятых техник амплификации и/или гибридизации нуклеиновых кислот, обсуждаемых в настоящем документе. Таким образом, дополнительный аспект относится к способу идентификацит мутантного растения, предусматривающему стадии: (а) предоставление содержащего полинуклеотид NtTS образца из растения; и (b) определение последовательности нуклеиновой кислоты полинуклеотида NtTS, причем различие в последовательности полинуклеотида NtTS по сравнению с полинуклеотидом NtTS контрольного растения является признаком того, что указанное растение представляет собой мутантное в отношении NtTS растение. Согласно другому аспекту предусматривается способ идентификации мутантного растения, которое накапливает повышенные уровни свободного метионина по сравнению с контрольным растением, предусматривающий стадии: (а) предоставление образца из растения, подлежащего скринингу; (b) определение того, содержит ли указанный образец одну или несколько мутаций в полинуклеотиде NtTS; и (с) определение содержания метионина в указанном растении; причем если указанный образец содержит одну или несколько мутаций в полинуклеотиде NtTS, которые модулируют экспрессию или активность кодируемого белка по сравнению с контрольным растением, и часть растения характеризуется увеличением в содержании метионина по меньшей мере на 5% по сравнению с контрольным растением, в котором экспрессия или активность треонинсинтазы не была снижена, то это указывает на встречающееся в природе мутантное растение, которое накапливает повышенные уровни свободного метионина. Согласно другому аспекту предусматривается способ получения мутантного растения, которое накапливает повышенные уровни свободного метионина по сравнению с контрольным растением, предусматривающий стадии: (а) предоставление образца из первого растения; (b) определение того, содержит ли указанный образец одну или несколько мутаций в полинуклеотиде NtTS, которые приводят к накоплению в нем повышенных уровней свободного метионина; и (с) перенос одной или нескольких мутаций во второе растение. Мутация(и) могут быть перенесены во второе растение с использованием таких различных известных в настоящей области техники способов, как генная инженерия, манипуляции с генами, интрогрессия, разведение растений, возвратное скрещивание и подобное. Согласно одному варианту осуществления первое растение представляет собой встречающееся в природе растение. Согласно одному варианту осуществления второе растение содержит генетический фон, отличный от фона первого растения. Согласно другому аспекту предусматривается способ получения мутантного растения, которое накапливает повышенные уровни свободного метионина по сравнению с контрольным растением, предусматривающий стадии: (а) предоставление образца из первого растения; (b) определение того, содержит ли указанный образец одну или несколько мутаций в полинуклеотиде NtTS, которые приводят к накоплению в нем повышенных уровней свободного метионина; и (с) интрогрессия одной или нескольких мутаций из первого растения во второе растение. Согласно одному варианту осуществления стадия интрогрессии предусматривает разведение растений, необязательно включающее в себя возвратное скрещивание и подобное. Согласно одному варианту осуществления первое растение представляет собой встречающееся в природе растение. Согласно одному варианту осуществления второе растение содержит генетический фон, отличный от первого растения. Согласно одному варианту осуществления первое растение не представляет собой культивар или элитный культивар. Согласно одному варианту осуществления второе растение представляет собой культивар или элитный культивар. Дополнительный аспект относится к мутантному растению (включающему в себя мутантное растение - культивар или элитный культивар), полученному или получаемому с помощью описанных в настоящем документе способов. Согласно определенным вариантам осуществления мутантные растения могут содержать одну или несколько мутаций, локализованных только на таком специфическом участке растения, как в пределах последовательности полинуклеотида NtTS. Согласно настоящему варианту осуществления оставшаяся геномная последовательность мутантного растения будет аналогичной или по существу аналогичной растения до мутагенеза.
Согласно определенным вариантам осуществления мутантные растения могут содержать одну или несколько мутаций, локализованных в более чем одном участке растения, таком как в пределах последовательности полинуклеотида NtTS и в одном или нескольких дополнительных участках генома. Согласно настоящему варианту осуществления оставшаяся геномная последовательность мутантного растения не будет аналогичной или не будет по существу аналогичной таковой у растения до мутагенеза. Согласно определенным вариантам осуществления мутантные растения могут не содержать одну или несколько мутаций в одном или больше, двух или больше, трех или больше, четырех или больше или пяти или больше экзонов полинуклеотида NtTS; или могут не содержать одну или несколько мутаций в одном или больше, двух или больше, трех или больше, четырех или больше или пяти или больше интронов полинуклеотида NtTS; или могут не содержать одну или несколько мутаций в промоторе полинуклеотида NtTS; или могут не содержать одну или несколько мутаций в 3' нетранслируемом участке полинуклеотида NtTS; или могут не содержать одну или несколько мутаций в 5' нетранслируемом участке полинуклеотида NtTS; или могут не содержать одну или несколько мутаций в кодирующем участке полинуклеотида NtTS; или могут не содержать одну или несколько мутаций в некодирующем участке полинуклеотида NtTS; или любую комбинацию двух или больше, трех или больше, четырех или больше, пяти или больше; или шести или больше их частей.
Согласно одному варианту осуществления последовательность (например, комплементарная последовательность), которая составляет по меньшей мере 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 или больше смежных нуклеотидов из нуклеотидов 1-46 в SEQ ID No:1, 2 и 3; из нуклеотидов 1-52 в SEQ ID NO:20; из нуклеотидов 99-141 в SEQ ID NO:1; из нуклеотидов 102-144 в SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:3; из нуклеотидов 102-153 в SEQ ID NO:20; из нуклеотидов 1325-1362 в SEQ ID No:1, 2 и 3; или из нуклеотидов 1334-1371 в SEQ ID NO:20, используется для модулирования экспрессии.
Согласно другому варианту осуществления последовательность (например, комплементарная последовательность), которая составляет по меньшей мере 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 или больше смежных нуклеотидов из нуклеотидов 454-805 в SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:3 или из нуклеотидов 463-814 в SEQ ID NO:20, используется для модулирования экспрессии. Согласно дополнительному аспекту предусматривается способ идентификации растения, растительной клетки или растительного материала, содержащего мутацию в гене, кодирующем NtTS, предусматривающий: (а) проведение мутагенеза растения, растительной клетки или растительного материала; (b) получение образца нуклеиновой кислоты из указанного растения, растительной клетки или растительного материала или их потомков; и (с) определение последовательности нуклеиновой кислоты гена, кодирующего NtTS или его вариант или фрагмент, причем различие в указанной последовательности указывает на одну или несколько мутаций в нем.
Белки "цинковые пальцы" могут использоваться для модулирования экспрессит или активности треонинсинтазы. Согласно различным вариантам осуществления геномная последовательность ДНК, содержащая часть или всю кодирующую последовательность полинуклеотида NtTS, модифицируют с помощью опосредованного нуклеазой "цинковые пальцы" мутагенеза. На геномной последовательности ДНК проводят поиск уникального сайта для связывания белка "цинковые пальцы". Альтернативно, на геномной последовательности ДНК проводят поиск двух уникальных сайтов для связывания белка "цинковые пальцы", причем оба сайта находятся на противоположных цепях и близко друг к другу, например, на расстоянии 1, 2, 3, 4, 5, 6 или больше пар оснований. Соответственно, предусматриваются белки "цинковые пальцы", которые связываются с полинуклеотидами NtTS.
Белок "цинковые пальцы" может быть сконструирован для распознавания выбранного целевого сайта в гене NtTS. Белок "цинковые пальцы" может содержать любую комбинацию мотивов, полученных из естественных ДНК-связывающих доменов "цинковые пальцы" и не являющихся естественными ДНК-связывающих доменов "цинковые пальцы" путем усечения или удлинения или способа сайт-направленного мутагенеза, объединенного с таким способом селекции, как без ограничения селекция на основе фагового дисплея, бактериальная двухгибридная селекция или бактериальная одногибридная селекция. Термин "не являющийся естественным ДНК-связывающий домен "цинковые пальцы" относится к ДНК-связывающему домену "цинковые пальцы", который связывается с последовательностью из трех пар оснований в пределах целевой ДНК и не встречается в клетке или организме, содержащем ДНК, которая подлежит модификации. Способы разработки белка "цинковые пальцы", который связывается со специфическими нуклеотидными последовательностями, которые являются уникальными для целевого гена, известны в настоящей области техники.
Нуклеаза "цинковые пальцы" может быть сконструирована путем осуществления слияния первого полинуклеотида, кодирующего белок "цинковые пальцы", который связывается с полинуклеотидом NtTS, и второго полинуклеотида, кодирующего такую неспецифическую эндонуклеазу, как без ограничения эндонуклеазы типа IIS. Белок слияния между белком "цинковые пальцы" и нуклеазой может содержать спейсер, состоящий их двух пар оснований, или альтернативно спейсер может состоять из трех, четырех, пяти, шести, семи или больше пар оснований. Согласно различным вариантам осуществления нуклеаза "цинковые пальцы" вводит двухцепочечный разрыв в регуляторный участок, кодирующий участок или некодирующий участок геномной последовательности ДНК полинуклеотида NtTS и приводит к снижению уровня экспрессии полинуклеотида NtTS или снижения активности кодируемого им белка. Расщепление с помощью нуклеазы "цинковые пальцы" зачастую приводит к делеции ДНК на сайте расщепления после репарации ДНК с помощью негомологичного соединения концов.
Согласно другим вариантам осуществления белок "цинковые пальцы" может быть выбран для связывания с регуляторной последовательностью полинуклеотида NtTS. Более конкретно, регуляторная последовательность может содержать сайт инициации транскрипции, старт-кодон, участок экзона, границу экзон-интрон, терминатор, или стоп-кодон. Соответственно, настоящее изобретение относится к мутантному, не встречающемуся в природе или трансгенному растению или растительным клеткам, полученным с помощью оппосредованного нуклеазой "цинковые пальцы" мутагенеза вблизи или в пределах гена NtTS, и способам получения такого растения или растительной клетки с помощью опосредованного нуклеазой "цинковые пальцы" мутагенеза. Способы доставки белка "цинковые пальцы" и нуклеазы "цинковые пальцы" в растение аналогичны способам, описанным ниже для доставки мегануклеазы.
Согласно другому аспекту настоящее изобретение дополнительно относится к способам получения мутантных, не встречающихся в природе или трансгенных или иным образом генетически модифицированных растений с использованием таких мегануклеаз, как I-CreI. Встречающиеся в природе мегануклеазы, а также рекомбинантные мегануклеазы могут использоваться, чтобы специфически вызвать двухцепочечный разрыв на одном сайте или на относительно небольшом количестве сайтов в геномной ДНК растения для обеспечения разрушения гена NtTS. Мегануклеаза может представлять собой сконструированную мегануклеазу с измененными свойствами распознавания ДНК. Белки мегануклеазы могут быть оставлены в растительные клетки с помощью разнообразия различных известных в настоящей области техники механизмов.
Настоящее изобретение предусматривает применение мегануклеаз для инактивации полинуклеотидов NtTS в растительной клетке или растении. В частности, настоящее изобретение относится к способу инактивации полинуклеотида NtTS в растении с использованием мегануклеазы, предусматривающему: (а) предоставление растительной клетки, содержащей полинуклеотид NtTS; (b) введение мегануклеазы или кодирующего мегануклеазу конструкта в указанную растительную клетку; и (с) предоставление мегануклеазе возможности по существу инактивировать полинуклеотид NtTS.
Мегануклеазы могут использоваться для расщепления сайтов распознавания мегануклеазы в пределах кодирующих участков полинуклеотида NtTS. Такое расщепление часто приводит к делеции ДНК на сайте распознавания мегануклеазы после мутагенной репарации ДНК с помощью негомологичного соединения концов. Такие мутации в кодирующей ген последовательности, как правило, являются достаточными для инактивации гена. Указанный способ модификации растительной клетки предусматривает, во-первых, доставку кассеты экспрессии мегануклеазы в растительную клетку с использованием подходящего способа трансформации. Для наибольшей эффективности необходимо соединить кассету экспрессии мегануклеазы с селектируемым маркером и провести селекцию в отношении успешно трансформированных клеток в присутствии средства селекции. Этот подход будет приводить к интеграции кассеты экспрессии мегануклеазы в геном, тем не менее, он может не понадобиться, если растение, вероятно, требует разрешения регуляторного органа. В таких случаях кассета экспрессии мегануклеазы (и связанный селектируемый маркерный ген) может быть сегрегирована в последующих поколениях растений с использованием общепринятых техник разведения. Альтернативно, растительные клетки вначале могут быть трансформированы с кассетой экспрессии мегануклеазы, не содержащей селектируемый маркер и могут выращиваться на средах, не содержащих средство для селекции. При таких условиях фракция обработанных клеток будет приобретать кассету экспрессии мегануклеазы и будет временно экспрессировать сконструированную мегануклеазу без интеграции кассеты экспрессии мегануклеазы в геном. Поскольку это не отражается на эффективности трансформации, в этой последней процедуре трансформации требуется, чтобы большее количество обработанных клеток подвергалось скринингу для получения необходимой модификации генома. Описанный выше подход также может применяться для модификации растительной клетки при использовании белка "цинковые пальцы" или нуклеазы "цинковые пальцы".
После доставки кассеты экспрессии мегануклеазы растительные клетки выращивают вначале при условиях, которые являются типичными для конкретной процедуры трансформации, которая использовалась. Это может означать выращивание трансформированных клеток на средах при температурах ниже 26°С, зачастую в темноте. Такие стандартные условия могут использоваться в течение периода времени, составляющего предпочтительно 1-4 дней, для обеспечения восстановления растительной клетки от процесса трансформации. В любой момент после этого начального восстановительного периода температура выращивания может быть повышена для стимуляции активности сконструированной мегануклеазы для расщепления и мутации сайта распознавания мегануклеазы.
Для определенных применений может быть необходимо точное удаление полинуклеотида NtTS из генома растения. Такие применения возможны с использованием пары сконструированных мегануклеаз, каждая из которых расщепляет сайт распознавания мегануклеазы на любой стороне предусмотренной делеции.
Растения, подходящие для применения в генетической модификации согласно настоящему изобретению, включают в себя однодольные и двудольные растения и растительные клеточные системы, включающие в себя виды из одного из следующих семейств: Acanthaceae, Alliaceae, Alstroemeriaceae, Amaryllidaceae, Apocynaceae, Arecaceae, Asteraceae, Berberidaceae, Bixaceae, Brassicaceae, Bromeliaceae, Cannabaceae, Caryophyllaceae, Cephalotaxaceae, Chenopodiaceae, Colchicaceae, Cucurbitaceae, Dioscoreaceae, Ephedraceae, Erythroxylaceae, Euphorbiaceae, Fabaceae, Lamiaceae, Linaceae, Lycopodiaceae, Malvaceae, Melanthiaceae, Musaceae, Myrtaceae, Nyssaceae, Papaveraceae, Pinaceae, Plantaginaceae, Poaceae, Rosaceae, Rubiaceae, Salicaceae, Sapindaceae, Solanaceae, Taxaceae, Theaceae или Vitaceae.
Подходящие виды могут включать в себя представителей родов Abelmoschus, Abies, Acer, Agrostis, Allium, Alstroemeria, Ananas, Andrographis, Andropogon, Artemisia, Arundo, Atropa, Berberis, Beta, Bixa, Brassica, Calendula, Camellia, Camptotheca, Cannabis, Capsicum, Carthamus, Catharanthus, Cephalotaxus, Chrysanthemum, Cinchona, Citrullus, Coffea, Colchicum, Coleus, Cucumis, Cucurbita, Cynodon, Datura, Dianthus, Digitalis, Dioscorea, Elaeis, Ephedra, Erianthus, Erythroxylum, Eucalyptus, Festuca, Fragaria, Galanthus, Glycine, Gossypium, Helianthus, Hevea, Hordeum, Hyoscyamus, Jatropha, Lactuca, Linum, Lolium, Lupinus, Lycopersicon, Lycopodium, Manihot, Medicago, Mentha, Miscanthus, Musa, Nicotiana, Oryza, Panicum, Papaver, Parthenium, Pennisetum, Petunia, Phalaris, Phleum, Pinus, Poa, Poinsettia, Populus, Rauwolfia, Ricinus, Rosa, Saccharum, Salix, Sanguinaria, Scopolia, Secale, Solanum, Sorghum, Spartina, Spinacea, Tanacetum, Taxus, Theobroma, Triticosecale, Triticum, Uniola, Veratrum, Vinca, Vitis и Zea.
Подходящие виды могут включать в себя Panicum spp.. Sorghum spp., Miscanthus spp., Saccharum spp., Erianthus spp., Populus spp., Andropogon gerardii (бородач), Pennisetum purpureum (пеннисетум красный), Phalaris arundinacea (канареечник клубневой), Cynodon dactylon (бермудская трава), Festuca arundinacea (овсяница высокая), Spartina pectinata (спартина перистая), Medicago sativa (люцерна), Arundo donax (арундо тростниковый), Secale cereale (рожь), Salix spp. (ива). Eucalyptus spp. (эвкалипт), Triticosecale (тритикале-гибрид пшеницы и ржи), бамбук, Helianthus annuus (подсолнечник), Carthamus tinctorius (сафлор), Jatropha curcas (ятрофа), Ricinus communis (клещевина обыкновенная), Elaeis guineensis (пальма), Linum usitatissimum (лен), Brassica juncea. Beta vulgaris (сахарная свекла), Manihot esculenta (маниока), Lycopersicon esculentum (помидор), Lactuca sativa (салат-латук), Musa paradisiaca (банан), Solanum tuberosum (картофель), Brassica oleracea (брокколи, цветная капуста, брюссельская капуста), Camellia sinensis (чай), Fragaria ananassa (земляника), Theobroma cacao (какао), Coffea arabica (кофе), Vitis vinifera (виноград), Ananas comosus (ананас), Capsicum annum (острый и сладкий перец), Allium сера (лук), Cucumis melo (дыня), Cucumis sativus (огурец), Cucurbita maxima (тыква большая столовая), Cucurbita moschata (тыква мускатная), Spinacea oleracea (шпинат), Citrullus lanatus (арбуз), Abelmoschus esculentus (окра), Solanum melongena (баклажан), Rosa spp. (роза), Dianthus caryophyllus (гвоздика садовая), Petunia spp. (петуния), Poinsettia pulcherrima (пуансеттия), Lupinus albus (люпин), Uniola paniculata (овес), полевица (Agrostis spp.), Populus tremuloides (осина), Pinus spp. (сосна), Abies spp. (пихта), Acer spp. (клен), Hordeum vulgare (ячмень), Poa pratensis (мятлик луговой), Lolium spp. (плевел) и Phleum pratense (тимофеевка), Panicum virgatum (просо прутьевидное), Sorghum bicolor (сорго, суданская трава), Miscanthus giganteus (мискантус), Saccharum sp. (сахарный тростник), Populus balsamifera (тополь), Zea mays (кукуруза), Glycine max (соя), Brassica napus (канола), Triticum aestivum (пшеница), Gossypium hirsutum (хлопок), Oryza sativa (рис), Helianthus annuus (подсолнечник), Medicago sativa (люцерна), Beta vulgaris (сахарная свекла) или Pennisetum glaucum (американское просо).
Различные варианты осуществления относятся к мутантным растениям, не встречающимся в природе растениям или трансгенным растениям, модифицированным для снижения уровней экспрессии гена NtTS, тем самым, производя такие растения, как растения табака, в которых уровень экспрессии NtTS является сниженным в представляющих интерес тканях растения по сравнению с контрольным растением. Раскрытые композиции и способы могут применяться по отношению к любому виду из рода Nicotiana, включающего в себя N. rustica и N. tabacum (например, LA B21, LN KY171, TI 1406, Basma, Galpao, Perique, Beinhart 1000-1 и Petico). Другие виды включают в себя N. acaulis, N. acuminata, N. acuminata var. multiflora, N. africana, N. alata, N. amplexicaulis, N. arentsii, N. attenuata, N. benavidesii, N. benthamiana, N. bigelovii, N. bonariensis, N. cavicola, N. clevelandii, N. cordifolia, N. corymbosa, N. debneyi, N. excelsior, N. forgetiana, N. fragrans, N. glauca, N. glutinosa, N. goodspeedii, N. gossei, N. hybrid, N. ingulba, N. kawakamii, N. knightiana, N. langsdorffii, N. linearis, N. longiflora, N. maritima, N. megalosiphon, N. miersii, N. noctiflora, N. nudicaulis, N. obtusifolia, N. occidentalis, N. occidentalis subsp. hesperis, N. otophora, N. paniculata, N. pauciflora, N. petunioides, N. plumbaginifolia, N. quadrivalvis, N. raimondii, N. repanda, N. rosulata, N. rosulata subsp. ingulba, N. rotundifolia, N. setchellii, N. simulans, N. solanifolia, N. spegazzinii, N. stocktonii, N. suaveolens, N. sylvestris, N. thyrsifiora, N. tomentosa, N. tomentosiformis, N. trigonophylla, N. umbratica, N. undulata, N. velutina, N. wigandioides и N. x sanderae.
Трансгенное, не встречающееся в природе или мутантное растение, следовательно, может представлять собой сорт табака или элитный культивар табака, который содержит один или несколько трансгенов или одну или несколько генетических мутаций или их комбинацию. Генетическая(ие) мутация(и) (например, один или несколько полиморфизмов) могут представлять собой мутации, которые не существуют в естественных условиях в отдельном сорте табака или культиваре табака (например, элитном культиваре табака) или может представлять собой генетическую(ие) мутацию(и), которая все-таки существует в естественных условиях при условии, что мутация не существует в естественных условиях в отдельном сорте табака или культиваре табака (например, элитном культиваре табака). В частности применимые сорта Nicotiana tabacum включают в себя табак типа Burley, темного типа, дымовой сушки и восточного типа. Не ограничивающие примеры сортов или культиваров представляют собой: BD 64, СС 101, СС 200, СС 27, СС 301, СС 400, СС 500, СС 600, СС 700, СС 800, СС 900, Coker 176, Coker 319, Coker 371 Gold, Coker 48, CD 263, DF911, табак DT 538 LC Galpao, GL 26H, GL 350, GL 600, GL 737, GL 939, GL 973, HB 04P, HB 04P LC, HB3307PLC, Hybrid 403LC, Hybrid 404LC, Hybrid 501 LC, K 149, K 326, K 346, K 358, K394, K 399, K 730, KDH 959, KT 200, KT204LC, KY10, KY14, KY 160, KY 17, KY 171, KY 907, KY907LC, KTY14xL8 LC, Little Crittenden, McNair 373, McNair 944, msKY 14xL8, Narrow Leaf Madole, Narrow Leaf Madole LC, NBH 98, N-126, N-777LC, N-7371LC, NC 100, NC 102, NC 2000, NC 291, NC 297, NC 299, NC 3, NC 4, NC 5, NC 6, NC7, NC 606, NC 71, NC 72, NC 810, NC BH 129, NC 2002, Neal Smith Madole, OXFORD 207, PD 7302 LC, PD 7309 LC, PD 7312 LC, табак 'Perique', PVH03, PVH09, PVH19, PVH50, PVH51, R 610, R 630, R 7-11, R 7-12, RG 17, RG 81, RG H51, RGH 4, RGH 51, RS 1410, Speight 168, Speight 172, Speight 179, Speight 210, Speight 220, Speight 225, Speight 227, Speight 234, Speight G-28, Speight G-70, Speight H-6, Speight H20, Speight NF3, TI 1406, TI 1269, TN 86, TN86LC, TN 90, TN 97, TN97LC, TN D94, TN D950, TR (Tom Rosson) Madole, VA 309, VA359, AA 37-1, В 13Р, Xanthi (Mitchell-Mor), Bel-W3, 79-615, Samsun Holmes NN, KTRDC №2 Hybrid 49, Burley 21, KY 8959, KY 9, MD 609, PG 01, PG 04, P01, P02, РОЗ, RG 11, RG 8, VA 509, AS44, Banket Al, Basma Drama B84/31, Basma I Zichna ZP4/B, Basma Xanthi BX 2A, Batek, Besuki Jember, С 104, Coker 347, Criollo Misionero, Delcrest, Djebel 81, DVH 405, Galpao Comum, HB04P, Hicks Broadleaf, Kabakulak Elassona, Kutsage E1, LA BU 21, NC 2326, NC 297, PVH 2110, Red Russian, Samsun, Saplak, Simmaba, Talgar 28, Wislica, Yayaldag, Prilep HC-72, Prilep P23, Prilep PB 156/1, Prilep P12-2/1, Yaka JK-48, Yaka JB 125/3, TI-1068, KDH-960, TI-1070, TW136, Basma, TKF 4028, L8, TKF 2002, GR141, Basma xanthi, GR149, GR153, Petit Havana. Также предусматриваются слабо переработанные разновидности описанных выше, даже если они специально не определены в настоящем документе.
Варианты осуществления также относятся к композициям и способам получения мутантных растений, не встречающихся в природе растений, гибридных растений или трансгенных растений, которые были модифицированы для снижения экспрессии или активности треонинсинтазы, что приводит к увеличению концентрации свободного метионина в одной или нескольких частях (например, листьях) растения по сравнению с контролем. Преимущественно, полученные мутантные растения, не встречающиеся в природе растения, гибридные растения или трансгенные растения являются сходными или по существу сходными в отношении общего внешнего вида с контрольными растениями. Такие различные фенотипические характеристики, как степень зрелости, количество листьев на растение, высота стебля, угол врастания листа, размер листа (ширина и длина), длина междоузлия и соотношение между листовой пластинкой и центральной жилкой могут быть оценены путем полевых наблюдений.
Один аспект представляет собой семя мутантного растения, не встречающегося в природе растения, гибридного растения, трансгенного растения согласно настоящему изобретению. Предпочтительно семя представляет собой семя табака. Дополнительный аспект настоящего изобретения представляет собой пыльцу или семязачаток мутантного растения, не встречающегося в природе растения, гибридного растения, трансгенного растения согласно настоящему изобретению. Кроме того, предусматривается описанное мутантное растение, не встречающееся в природе растение, гибридное растение, трансгенное растение, которое дополнительно содержит нуклеиновую кислоту, обеспечивающую мужскую стерильность.
Настоящее изобретение также относится к тканевой культуре регенерируемых клеток мутантного растения, не встречающегося в природе растения, гибридного растения или трансгенного растения или их части, причем культура регенерирует растения, способные экспрессировать все морфологические и физиологические характеристики родительской особи. Регенерируемые клетки согласно настоящему изобретению включают в себя без ограничения клетки из листьев, пыльцы, зародышей, семядолей, гипокотилей, корней, корневых кончиков, пыльников, цветов и их части, семязачатков, побегов, стеблей, стволов, сердцевины и оболочек или каллюса или протопластов, полученных из них.
Согласно одному варианту осуществления высота стебля мутантных, не встречающихся в природе или трансгенных растений по существу аналогична высоте стебля у контрольных растений через три месяца после пересадки в поле или 36 дней после прищипывания верхушки. Например, высота стебля мутантных, не встречающихся в природе или трансгенных растений составляет не меньше чем высота стебля контрольных растений через три месяца после пересадки в поле или 36 дней после прищипывания верхушки. Согласно другому варианту осуществления высота стебля мутантных, не встречающихся в природе или трансгенных растений приблизительно на 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% или 1% выше или ниже, чем высота стебля контрольных растений через три месяца после пересадки в поле или 36 дней после прищипывания верхушки. Согласно другому варианту осуществления содержание хлорофилла в мутантных, не встречающихся в природе или трансгенных растениях по существу аналогично содержанию хлорофилла в контрольных растениях через три месяца после пересадки в поле или 36 дней после прищипывания верхушки. Например, содержание хлорофилла в мутантных, не встречающихся в природе или трансгенных растениях составляет не меньше чем содержание хлорофилла в контрольных растениях через три месяца после пересадки в поле или 36 дней после прищипывания верхушки. Согласно другому варианту осуществления содержание хлорофилла в мутантных, не встречающихся в природе или трансгенных растениях приблизительно на 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% или 1% выше или ниже чем содержание хлорофилла в контрольных растениях через три месяца после пересадки в поле или 36 дней после прищипывания верхушки. Согласно другому варианту осуществления высота стебля мутантных, не встречающихся в природе или трансгенных растений по существу аналогично высоте стебля контрольных растений через три месяца после пересадки в поле или 36 дней после прищипывания верхушки, и содержание хлорофилла в мутантных, не встречающихся в природе или трансгенных растениях по существу аналогично содержанию хлорофилла в контрольных растениях через три месяца после пересадки в поле или 36 дней после прищипывания верхушки. Например, высота стебля мутантных, не встречающихся в природе или трансгенных растений составляет не меньше чем высота стебля контрольных растений через три месяца после пересадки в поле или 36 дней после прищипывания верхушки, и содержание хлорофилла в мутантных, не встречающихся в природе или трансгенных растениях составляет не меньше чем содержание хлорофилла в контрольных растениях через три месяца после пересадки в поле или 36 дней после прищипывания верхушки. Согласно другому варианту осуществления высота стебля мутантных, не встречающихся в природе или трансгенных растений приблизительно на 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% или 1% выше или ниже чем высота стебля контрольных растений через три месяца после пересадки в поле или 36 дней после прищипывания верхушки, и содержание хлорофилла в мутантных, не встречающихся в природе или трансгенных растениях приблизительно на 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% или 1% выше или ниже чем содержание хлорофилла в контрольных растениях через три месяца после пересадки в поле или 36 дней после прищипывания верхушки. Согласно другим вариантам осуществления любая одна или несколько из следующих характеристик: степень зрелости, количество листьев на растение, высота стебля, угол врастания листа, размер листа (ширина и длина), длина междоузлия и соотношение между листовой пластинкой и центральной жилкой и окраска листьев мутантных, не встречающихся в природе или трансгенных растений по существу аналогичны таковым у контрольных растений через три месяца после пересадки в поле или 36 дней после прищипывания верхушки.
Согласно другому аспекту предусматривается способ увеличения концентрации свободного метионина по меньшей мере в части растения (например, листьях), предусматривающий стадии: (i) снижение экспрессии или активности треонинсинтазы в растении, предпочтительно при этом треонинсинтаза содержит описанную в настоящем документе полинуклеотидную последовательность или описанную в настоящем документе полипептидную последовательность; (ii) измерение концентрации свободного метионина по меньшей мере в части (например, листьях) мутантного, не встречающегося в природе растения или трансгенного растения, полученного на стадии (i); и (iii) идентификация мутантного, не встречающегося в природе или трансгенного растения, в котором концентрация свободного метионина была увеличена по сравнению с контрольным растением. Соответственно, общий внешний вид указанного мутантного, не встречающегося в природе или трансгенного растения по существу аналогично контрольному растению через три месяца после пересадки в поле или 36 дней после прищипывания верхушки. Соответственно, концентрация свободного треонина в такой части растения, как листья, увеличивается по сравнению с контрольным растением.
Снижение экспрессии треонинсинтазы по сравнению с контрольным растением может составлять приблизительно 5% - приблизительно 100%, приблизительно 5% - приблизительно 99% или меньше, приблизительно 5% - приблизительно 95% или меньше, приблизительно 5% - приблизительно 90% или меньше, или снижение по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98%, или на 100%, которое включает в себя снижение транскрипционной активности и/или экспрессии белка. Согласно одному варианту осуществления снижение экспрессии треонинсинтазы представляет собой частичное снижение экспрессии, которое включает в себя снижение в транскрипционной активности и/или экспрессии белка. Согласно одному варианту осуществления частичное снижение экспрессии позволяет мутантному, не встречающемуся в природе или трансгенному растению или растительной клетке сохранять остаточные уровни треонинсинтазы.
Снижение активности треонинсинтазы по сравнению с контрольным растением может составлять приблизительно 5% - приблизительно 100%, приблизительно 5% - приблизительно 99% или меньше, приблизительно 5% - приблизительно 95% или меньше, приблизительно 5% - приблизительно 90% или меньше, или снижение по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или на 100% или больше. Согласно одному варианту осуществления снижение активности треонинсинтазы представляет собой частичное снижение активности. Согласно одному варианту осуществления частичное снижение активности позволяет мутантному, не встречающемуся в природе или трансгенному растению или растительной клетке сохранять остаточные уровни треонинсинтазы.
Увеличение концентрации свободного треонина по сравнению с контрольным растением может составлять приблизительно 5% - приблизительно 100%, или увеличение по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или до 100%.
Согласно определенным вариантам осуществления экспрессия SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:20 или активность кодируемого ими белка снижается (например, подвергается сайленсингу или ингибируется). Согласно определенным вариантам осуществления экспрессия SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:20 или активность кодируемого ими белка снижается (например, подвергается сайленсингу или ингибируется). Согласно определенным вариантам осуществления экспрессия SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:20 или активность кодируемого ими белка снижается (например, подвергается сайленсингу или ингибируется). Согласно определенным вариантам осуществления экспрессия SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:3 и SEQ ID NO:20 или активность кодируемого ими белка снижается (например, подвергается сайленсингу или ингибируется). Согласно определенным вариантам осуществления экспрессия SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 и SEQ ID NO:20 или активность кодируемого ими белка снижается (например, подвергается сайленсингу или ингибируется). Согласно определенным вариантам осуществления экспрессия SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 и SEQ ID NO:20 или активность кодируемого ими белка снижается (например, подвергается сайленсингу или ингибируется). Согласно определенным вариантам осуществления экспрессия SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 и SEQ ID NO:20 или активность кодируемого ими белка снижается (например, подвергается сайленсингу или ингибируется). Согласно определенным вариантам осуществления экспрессия SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 и SEQ ID NO:20 или активность кодируемого ими белка снижается (например, подвергается сайленсингу или ингибируется). Согласно определенным вариантам осуществления экспрессия SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:20 или активность кодируемого ими белка снижается (например, подвергается сайленсингу или ингибируется). Согласно определенным вариантам осуществления экспрессия SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:3 или активность кодируемого ими белка снижается (например, подвергается сайленсингу или ингибируется). Согласно определенным вариантам осуществления экспрессия каждой из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:3 или активность каждого из кодируемых ими белков, отдельно или в комбинации, снижается в большей степени, чем экспрессия SEQ ID NO:20. Согласно одному варианту осуществления добавление такие экзогенные ингредиенты, как аминокислоты, например, треонин и/или изолейцин, не являются необходимыми для получения растений с приемлемым внешним видом.
Одной целью является предоставление мутантных растений, трансгенных растений или не встречающихся в природе растений, которые проявляют повышенный уровень свободного метионина при сохранении по существу аналогичного внешнего вида и одной или нескольких агрономических характеристик по сравнению с контрольным растением. Соответственно, в настоящем документе описаны мутантные растения, трансгенные растения или не встречающиеся в природе растения или генетически модифицированные клетки, которые характеризуются повышенным уровнем свободного метионина и сниженной активностью или экспрессией треонинсинтазы по сравнению с контрольными клетками или контрольными растениями табака. Мутантные, трансгенные или не встречающиеся в природе растения или клетки были модифицированы для снижения синтеза треонинсинтазы путем снижения экспрессии одной или нескольких кодирующих полипептиды полинуклеотидных последовательностей, описанных в настоящем документе, предпочтительно кодируемых одним или несколькими полинуклеотидами, содержащими, состоящими или состоящими, по сути, из последовательностей, кодирующих треонинсинтазу и характеризующихся по меньшей мере 87%, 88%, 89%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% и 100% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 и/или SEQ ID NO:3 или одним или несколькими полинуклеотидами, содержащими, состоящими или состоящими, по сути, из последовательностей, кодирующих треонинсинтазу и характеризующихся по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 100% идентичности последовательности по отношению к последовательность SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 или SEQ ID NO:20.
Дополнительный аспект относится к мутантным растениям, не встречающимся в природе растениям или трансгенным растениям, причем экспрессия треонинсинтазы или активность кодируемого посредством нее белка снижается, и часть растений (например, листьев) характеризуется увеличением содержания метионина по меньшей мере на 5% по сравнению с контрольным растением, в котором экспрессия или активность треонинсинтазы не была снижена. Предпочтительно концентрация метионала в дыме или аэрозоле табачных продуктов увеличивается по меньшей мере на 5% по сравнению с дымом или аэрозолем табачного продукта, полученного из контрольного растения.
Увеличение содержания метионина по сравнению с контрольным растением может составлять по меньшей мере приблизительно на 5%, по меньшей мере приблизительно на 10%, по меньшей мере приблизительно на 20%, по меньшей мере приблизительно на 25%, по меньшей мере приблизительно на 30%, по меньшей мере приблизительно на 40%, по меньшей мере приблизительно на 50%, по меньшей мере приблизительно на 60%, по меньшей мере приблизительно на 70%, по меньшей мере приблизительно на 75%, по меньшей мере приблизительно на 80%, по меньшей мере приблизительно на 90%, по меньшей мере приблизительно на 95%, по меньшей мере приблизительно на 96%, по меньшей мере приблизительно на 97%, по меньшей мере приблизительно на 98%, по меньшей мере приблизительно на 99% или приблизительно на 100% или больше.
Увеличение концентрации метионала в дыме или аэрозоле, полученном из табачного продукта, по сравнению с контрольным растением может составлять по меньшей мере приблизительно на 5%, по меньшей мере приблизительно на 10%, по меньшей мере приблизительно на 20%, по меньшей мере приблизительно на 25%, по меньшей мере приблизительно на 30%, по меньшей мере приблизительно на 40%, по меньшей мере приблизительно на 50%, по меньшей мере приблизительно на 60%, по меньшей мере приблизительно на 70%, по меньшей мере приблизительно на 75%, по меньшей мере приблизительно на 80%, по меньшей мере приблизительно на 90%, по меньшей мере приблизительно на 95%, по меньшей мере приблизительно на 96%, по меньшей мере приблизительно на 97%, по меньшей мере приблизительно на 98%, по меньшей мере приблизительно на 99% или приблизительно на 100% или больше.
Соответственно, внешний вид или одна или несколько агрономических характеристик указанного растения по существу аналогичны таковым у контрольного растения через три месяца после пересадки в поле или 36 дней после прищипывания верхушки, предпочтительно при этом высота стебля мутантных, не встречающихся в природе или трансгенных растений по существу аналогична высоте стебля контрольных растений через три месяца после пересадки в поле или 36 дней после прищипывания верхушки и/или содержание хлорофилла в мутантных, не встречающихся в природе или трансгенных растениях по существу аналогично содержанию хлорофилла в контрольных растениях через три месяца после пересадки в поле или 36 дней после прищипывания верхушки.
Соответственно, концентрация свободного метионина в части растения (например, листьях) увеличивается по сравнению с контрольным растением.
Соответственно, (i) концентрация свободного метионина в части растения (например, листьях) составляет по меньшей мере приблизительно 0,026 мг/г, соответственно по меньшей мере приблизительно 0,027 мг/г, соответственно по меньшей мере приблизительно 0,028 мг/г, соответственно по меньшей мере приблизительно 0,029 мг/г, соответственно по меньшей мере приблизительно 0,03 мг/г, соответственно по меньшей мере приблизительно 0,031 мг/г, соответственно по меньшей мере приблизительно 0,032 мг/г, соответственно по меньшей мере приблизительно 0,032 мг/г, соответственно по меньшей мере приблизительно 0,033 мг/г, соответственно по меньшей мере приблизительно 0,034 мг/г; (ii) концентрация свободного треонина в части растения (например, листьях) составляет по меньшей мере приблизительно 0,5 мг/г, соответственно по меньшей мере приблизительно 0,52 мг/г, соответственно по меньшей мере приблизительно 0,54 мг/г, соответственно по меньшей мере приблизительно 0,56 мг/г, соответственно по меньшей мере приблизительно 0,58 мг/г, соответственно по меньшей мере приблизительно 0,6 мг/г; и (iii) концентрация метионала в аэрозоле при нагревании части растения (например, листья) составляет по меньшей мере приблизительно 2000 мкг/г, соответственно по меньшей мере приблизительно 2100 мкг/г, соответственно по меньшей мере приблизительно 2200 мкг/г, соответственно по меньшей мере приблизительно 2500 мкг/г, соответственно по меньшей мере приблизительно 2750 мкг/г, соответственно по меньшей мере приблизительно 3000 мкг/г, соответственно по меньшей мере приблизительно 3250 мкг/г, соответственно по меньшей мере приблизительно 3500 мкг/г, соответственно по меньшей мере приблизительно 3750 мкг/г, соответственно по меньшей мере приблизительно 3800 мкг/г или выше.
Соответственно, (i) концентрация свободного метионина в части растения (например, листьях) составляет по меньшей мере приблизительно 0,03 мг/г; (ii) концентрация свободного треонина в части растения (например, листьях) составляет между приблизительно 0,5 мг/г - 0,65 мг/г; и (iii) концентрация метионала в аэрозоле при нагревании части растения (например, листьев) составляет по меньшей мере приблизительно 2200 мкг/г.
Соответственно, (i) концентрация свободного метионина в части растения (например, листьях) составляет по меньшей мере приблизительно 0,03 мг/г; (ii) концентрация свободного треонина в части растения (например, листьях) составляет между приблизительно 0,5 мг/г - 0,65 мг/г; и (iii) концентрация метионала в аэрозоле при нагревании части растения (например, листьев) составляет между приблизительно 2200 мкг/г и приблизительно 4000 мкг/г, соответственно приблизительно 2200 мкг/г - приблизительно 3850 мкг/г.
Растение может быт нагрето до 100°С или выше, например, по меньшей мере до 125°С, по меньшей мере до 150°С, по меньшей мере до 175°С или по меньшей мере до 200°С, для высвобождения аэрозоля.
Согласно дополнительному аспекту предусматривается мутантное растение, не встречающееся в природе растение или трансгенное растение, причем экспрессия треонинсинтазы или активность кодируемого посредством нее белка снижается и (i) концентрация свободного метионина в части растения (например, листьях) составляет приблизительно 0,03 мг/г; (ii) концентрация свободного треонина в части растения (например, листьях) составляет приблизительно 0,5 - приблизительно 0,7 мг/г; и (iii) концентрация метионала в аэрозоле при нагревании части растения (например, листьев) составляет по меньшей мере приблизительно 2000 мкг/г, и соответственно при этом внешний вид или одна или несколько агрономических характеристик указанного растения по существу аналогичны таковым у контрольного растения через три месяца после пересадки в поле или 36 дней после прищипывания верхушки, предпочтительно при этом высота стебля мутантных, не встречающихся в природе или трансгенных растений по существу аналогична высоте стебля контрольных растений через три месяца после пересадки в поле или 36 дней после прищипывания верхушки и/или содержание хлорофилла в мутантных, не встречающихся в природе или трансгенных растениях по существу аналогично содержанию хлорофилла в контрольных растениях через три месяца после пересадки в поле или 36 дней после прищипывания верхушки.
Согласно настоящему изобретению растение, несущее модифицированный аллель треонинсинтазы, может использоваться в программе разведения растений для создания применимых линий, сортов и гибридов. Модифицированный аллель может представлять собой мутантный аллель. В частности, модифицированный аллель треонинсинтазы интрогресируют в описанные выше коммерчески важные сорта. Таким образом, предусматриваются способы разведения растений, которые предусматривают скрещивание описанного в настоящем документе мутантного растения, не встречающегося в природе растения или трансгенного растения с растением, содержащим другую генетическую идентичность. Способ может дополнительно предусматривать скрещивание растения-потомка с другим растением и необязательно повторение скрещивания до получения потомства с необходимыми генетическими признаками или генетическим фоном. Одна цель, которой служат такие способы разведения, представляет собой введение необходимого генетического признака в другие сорта, линии разведения, гибриды или культивары, в частности, представляющие коммерческий интерес. Другой целью является облегчение стэкинга генетических модификаций различных генов в одном сорте, линиях, гибридах или культиварах растения. Подразумеваются внутривидовые, а также межвидовые скрещивания. Растения-потомки, которые появились от таких скрещиваний, также имеющие название линии разведения, представляют собой примеры не встречающихся в природе растений согласно настоящему изобретению.
Согласно одному варианту осуществления предусматривается способ получения не встречающегося в природе растения, предусматривающий: (а) скрещивание мутантного или трансгенного растения со вторым растением для получения табачного семени-потомства; (b) выращивание табачного семени-потомства при условиях выращивания растения для получения не встречающегося в природе растения. Способ может дополнительно предусматривать: (с) скрещивание предыдущего поколения не встречающегося в природе растения с самим собой или другим растением для получения табачного смени-потомства; (d) выращивание табачного смени-потомства стадии (с) при условиях выращивания растения для поулчения дополнительных не встречающихся в природе растений; и (е) повторение скрещивания и выращивания стадий (с) и (d) много раз для получения дальнейших поколений не встречающихся в природе растений. Способ может необязательно предусматривать перед стадией (а) стадию предоставления родительского растения, которое содержит генетическую идентичность, характеристики которой определяют, и которая не идентична мутантному или трансгенному растению. Согласно некоторым вариантам осуществления в зависимости от программы разведения стадии скрещивания и выращивания повторяют от 0 до 2 раз, от 0 до 3 раз, от 0 до 4 раз, от 0 до 5 раз, от 0 до 6 раз, от 0 до 7 раз, от 0 до 8 раз, от 0 до 9 раз или от 0 до 10 раз для получения поколений не встречающихся в природе растений. Возвратное скрещивание представляет собой пример такого способа, причем потомство скрещивают с одним из его родителей или другим растением, генетически сходным с его родителем, для получения растения-потомка в следующем поколении, который характеризуется генетической идентичностью, которая близка к таковой у одного из родителей. Техники разведения растений, в частности, разведения растений табака, хорошо известны и могут использоваться в способах согласно настоящему изобретению. Настоящее изобретение дополнительно относится к не встречающимся в природе растениям, полученным с помощью этих способов.
Согласно некоторым вариантам осуществления описанных в настоящем документе способов линии, полученные в результате разведения и скрининга в отношении вариантных генов треонинсинтазы, оценивают в полевых условиях с использованием стандартных полевых процедур. В оценку включают контрольные генотипы, включающие в себя исходного немутировавшего родителя, и исследуемые образцы располагают в поле согласно рандомизированному полноблочному плану или другому приемлемому полевому плану. В отношении табака проводят стандартные агрономические действия, например, табак собирают, взвешивают и отбирают образцы для химического и другого общепринятого исследования перед и в ходе сушки. Статистические анализы данных проводят для подтверждения сходства выбранных линий с родительской линией. Цитогенетические анализы выбранных растений необязательно проводят для подтверждения комплементарных взаимодействий хромосом и взаимодействий спаривания хромосом.
Фингерпринтинг ДНК, однонуклеотидный полиморфизм, микросателлитные маркеры или аналогичные технологии могут использоваться в программе разведения с выбором с помощью маркеров (MAS) для переноса или разведения модифицированных или мутантных аллелей гена треонинсинтазы в другие описанные в настоящем документе разновидности табака. Например, селекционер может создать сегрегирующие популяции изгибридизаций генотипа, содержащего мутантный аллель с агрономически необходимым генотипом. Растения в F2 или поколения возвратного скрещивания могут подвергаться скринингу с использованием маркера, разработанного из геномной последовательности треонинсинтазы или ее фрагмента, с использованием одной из перечисленных в настоящем документе техник. Растения, идентифицированные как содержащие мутантный аллель, могут возвратно скрещиваться и самоопыляться для создания второй популяции, подлежащей скринингу. В зависимости от предполагаемого паттерна наследования или используемой технологии MAS, может быть необходимо самоопылить выбранные растения перед каждым циклом возвратного скрещивания для содействия в идентификации необходимых отдельных растений. Возвратное скрещивание или другая процедура разведения может повторяться до восстановления необходимого фенотипа рекуррентного родителя.
Согласно настоящему изобретению в программе разведения успешные скрещивания дают в результате F1 растения, которые являются фертильными. Выбранные F1 растения могут скрещивать с одним из родителей, и растения первого поколения возвратного скрещивания самоопыляют для получения популяции, которую снова подвергают скринингу в отношении экспрессии вариантного гена треонинсинтазы (например, нулевого варианта гена треонинсинтазы). Процесс возвратного скрещивания, самоопыления и скрининга повторяют, например, по меньшей мере 4 раза, пока конечный скрининг не даст в результате растение, которое является фертильным и в достаточной степени сходным с реккурентным родителем. Это растение при необходимости самоопыляют и потомство впоследствии вновь подвергают скринингу для подтверждения того, что растение проявляет экспрессию вариантного гена треонинсинтазы. Согласно некоторым вариантам осуществления популяцию растений в поколении F2 подвергают скринингу в отношении экспрессии вариантного гена треонинсинтазы, например, идентифицируют растение, которое не может экспрессировать треонинсинтазу вследствие отсутствия гена треонинсинтазы согласно стандартным способам, например, с использованием способа ПЦР с праймерами на основании информации о нуклеотидной последовательности для описанной в настоящем документе треонинсинтазы.
Гибридыне сорта могут быть получены путем предотвращения самоопыления женских родительских растений (т.е., дающих семена родителей) первого сорта, позволяя пыльце из мужских родительских растений второго сорта опылять женские родительские растения и позволяя F1 гибридным семенам образоваться на женских растениях. Самоопыление женских растений можно предотвратить путем кастрации цветов на ранней стадии развития цветка. Альтернативно, образование пыльцы можно предотвратить на женских родительских растениях с использованием формирования мужской стерильности. Например, мужскую стерильность можно получить путем цитоплазматической мужской стерильности (CMS) или трансгенной мужской стерильности, причем трансген ингибирует микроспорогенез и/или образование пыльцы, или путем самонесовместимости. Женские родительские растения, содержащие CMS являются особенно применимыми. Согласно вариантам осуществления, в которых женские родительские растения являются CMS, пыльцу собирают из мужских фертильных растений и наносят вручную на рылца женских родительских растений с CMS и собирают полученное семя F1.
Описанные в настоящем документе сорта и линии могут использоваться для образования F1 гибридов простого скрещивания. Согласно таким вариантам осуществления растения родительских сортов могут выращивать в качестве по существу гомогенных соседних популяций для облегчения естественного перекрестного опыления из мужских родительских растений на женские родительские растения. Семя F1, образованное на женских родительских растениях селективно собирают с помощью общепринятых способов. Также могут выращивать два родительских сорта растения вместе и собирать смесь F1 гибридного семени, образованного на женском родителе, и Семене, образованном на мужском родителе как результат самоопыления. Альтернативно, могут быть проведены тройные скрещивания, F1 гибрид простого скрещивания используют в качестве женского родителя и его скрещивают с другим мужским родителем. В качестве другой альтернативы, могут быть получены гибриды двойного скрещивания, причем F1 потомство двух различных простых скрещиваний скрещивают само с собой.
Популяция мутантных, не встречающихся в природе или трансгенных растений может подвергаться скринингу или селекции с отношении тех представителей популяции, которые характеризуются необходимым признаком или фенотипом. Например, популяция потомства одного события трансформации может подвергаться скринингу в отношении тех растений, которые характеризуются необходимым уровнем экспрессии полипептида или полинуклеотида NtTS. Физические и биохимические способы могут использоваться для определения уровней экспрессии. Они включают в себя саузерн-анализ или амплификацию на основе ПЦР для обнаружения полинуклеотида; нозерн-блоттинг, защиту от S1 РНКазы, удлинение праймера или ОТ-ПЦР амплификацию для обнаружения транскриптов РНК; ферментативные анализы для обнаружения ферментативной или рибозимной активности полипептидов и полинуклеотидов; и гель-электрофорез белка, вестерн-блоттинг, иммунопреципитация и иммуноферментные анализы для обнаружения полипептидов. Такие другие техники, как гибридизация in situ, ферментативное окрашивание и иммуноокрашивание, также могут использоваться для обнаружения присутствия или экспрессии полипептидов или полинуклеотидов.
В настоящем документе описаны мутантные, не встречающиеся в природе или трансгенные растительные клетки и растения, содержащие один или несколько рекомбинантных полинуклеотидов, такие как один или несколько выделенных полинуклеотидов NtTS, один или несколько полинуклеотидных конструктов, одну или несколько двухцепочечных РНК, один или несколько конъюгатов или один или несколько векторов/векторов экспрессии.
Согласно некоторым вариантам осуществления растение, в котором снижена экспрессия полинуклеотида NtTS, может характеризоваться увеличением концентрации свободного метионина, особенно в листьях. Концентрация свободного метионина может быть увеличена по меньшей мере приблизительно на 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% или больше по сравнению с концентрацией свободного метионина в соответствующем контрольном растении, в котором экспрессия полинуклеотида NtTS не была снижена.
Согласно некоторым вариантам осуществления растение, в котором снижена экспрессия полинуклеотида NtTS, может характеризоваться уменьшением концентрации свободного треонина, особенно в листьях. Концентрация свободного треонина может быть уменьшена по меньшей мере приблизительно на 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% или больше по сравнению с концентрацией свободного треонина в соответствующем контрольном растении, в котором экспрессия полинуклеотида NtTS не была снижена. Согласно одному варианту осуществления концентрация свободного треонина может быть уменьшена по меньшей мере приблизительно на 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, или 80% или больше по сравнению с концентрацией свободного треонина в соответствующем контрольном растении, в котором экспрессия полинуклеотида NtTS была снижена.
Экспрессию NtTS можно оценить с использованием способов, включающих в себя, например, ОТ-ПЦР, нозерн-блоттинг, защиту от РНКазы, удлинения праймеров, вестерн-блоттинг, гель-электрофорез белка, иммунопреципитацию, иммуноферментные анализы, микрочиповые анализы и масс-спектрометрию. Следует отметить, что если полипептид экспрессируется под контролем тканепредпочтительного или экспрессирующего в широком диапазоне промотора, то экспрессию можно оценить в целом растении или в выбранной ткани. Аналогично, если полипептид экспрессируется в конкретное время, например, в конкретное время в развитии растения или при индукции, то экспрессию можно оценить селективно с необходимый период времени.
Без ограничения описанные в настоящем документе растения могут быть модифицированы для других целей либо до, либо после того, как экспрессия или активность треонинсинтазы подверглась модулированию. Одна или несколько следующих дополнительных генетических модификаций могут присутствовать в мутантных, не встречающихся в природе или трансгенных растениях согласно настоящему изобретению. Согласно одному варианту осуществления один или несколько генов, которые вовлечены в поглощение тяжелых металлов и их транспорт, подвергаются модификации, давая в результате растения или части растений (такие как листья), характеризующиеся пониженным содержанием тяжелых металлов по сравнению с контрольными растениями или их частями без модификации(й). Не ограничивающие примеры включают в себя гены, принадлежащие семейству посредников катионной диффузии (CDF), семейству Zrt-, Irt-подобных белков (ZIP), семейству катионных обменников (САХ), семейству транспортеров меди (СОРТ), семейству АТФазы тяжелых металлов Р-типа (НМА, как описано в международной патентной публикации WO2009074325), семейству гомологов белков связанных с естественной устойчивостью макрофагов (NRAMP) и семейству транспортеров АТФ-связывающей кассеты (АВС), которые принимают участие в транспорте тяжелых металлов. Используемый в настоящем документе термин тяжелый металл включает в себя металлы переходных групп. Согласно другому варианту осуществления один или несколько генов, которые вовлечены в превращение азотистых метаболических промежуточных соединений, подвергаются модификации, давая в результате растения или части растений (такие как листья), которые при нагревании производят пониженные уровни по меньшей мере одного специфического для табака нитрозамина (например, 4-(метилнитрозамино)-1-(3-пиридил)-1-бутанона, N-нитрозонорникотина, N-нитрозоанатабина и N-нитрозоанабазина) по сравнению с контрольными растениями или их частями. Не ограничивающие примеры генов, которые могут быть модифицированы, включают в себя такие гены, кодирующие никотиндеметилазу, как CYP82E4, CYP82E5 и CYP82E10, которые принимают участие в превращении никотина в норникотин и описаны в международных патентных публикациях WO2006091194, WO2008070274, WO2009064771 и международной патентной заявке PCT/US2011/021088.
Примеры других модификаций включают в себя устойчивость к гербициду, например, глифозату, который представляет собой активный ингредиент многих гербицидов широкого спектра. Устойчивые к глифозату трансгенные растения были разработаны путем переноса гена aroA (глифозат-EPSP-синтазы из Salmonella typhimurium и E. coli). Устойчивые к сульфонилмочевине растения были получены путем трансформации мутантного гена ALS (ацетолактатсинтазы) из Arabidopsis. OB белок фотосистемы II из мутантного Amaranthus hybridus был перенесен в растения для получения устойчивых к атразину трансгенных растений; и устойчивые в бромоксинилу трансгенные растения были получены путем введения bxn гена из бактерии Klebsiella pneumoniae. Другая иллюстративная модификация приводит к растениям, устойчивым к насекомым. Токсины Bacillus thuringiensis (Bt) могут представлять эффективный путь замедления появления устойчивых к Bt вредителей, как недавно было показано для брокколи, где расположенные в виде пирамиды гены cry1Ac и cry1C Bt боролись с молью капустной, устойчивой в любому отдельному белку и значительно замедляли развитие устойчивых насекомых. Другая иллюстративная модификация приводит к растениям, устойчивым к заболеваниям, вызванным патогенами (например, вирусами, бактериями, грибами). Были разработаны растения, экспрессирующие ген Ха21 (устойчивость к бактериальному некрозу) вместе с растениями, экспрессирующими как ген слияния Bt и ген хитиназы (устойчивость к желтому стеблевому точильщику и устойчивость к заболеванию эпидермиса). Другая иллюстративная модификация приводит к такой измененной репродуктивной способностью, как мужская стерильность. Другая иллюстративная модификация приводит к растениям, устойчивым к абиотическому стрессу (например, засухе, температуре, засоленности), и устойчивые трансгенные растения были получены путем переноса фермента ацилглицеролфосфата из Arabidopsis; гены, кодирующие маннитдегидрогеназу и сорбитдегидрогеназу, которые вовлечены в синтез маннита и сорбита, улучшают засухоустойчивость. Другая иллюстративная модификация приводит к растениям, которые производят белки с подходящими иммуногенными свойствами для применения у людей. Например, находят применение растения, способные производить белки, которые по существу не содержат альфа-1,3-связанных остатков фукозы, бета-1,2-связанных остатков ксилозы или их обоих, в своем N-гликане. Другие иллюстративные модификации могут приводить к растениям с улучшенными запасными белками и маслами, растениям с усиленной фотосинтетической эффективностью, растениям с пролонгированным сроком хранения, растениям с увеличенным содержанием углеводов и растениям, устойчивым к грибам; растениям, кодирующим фермент, вовлеченный в биосинтез алкалоидов. Также предусматриваются трансгенные растения, в которых экспрессия S-аденозил-L-метионина (SAM) и/или цистатионин-гамма-синтазы (CGS) подверглась модулированию.
Один или несколько таких признаков могут быть интрогрессированы в мутантные, не встречающиеся в природе или трансгенные растения табака согласно настоящему изобретению из другого культивара табака или могут быть напрямую трансформированы в него. Интрогрессия признака(ов) в мутантные, не встречающиеся в природе или трансгенные растения согласно настоящему изобретению может быть достигнута с помощью любого способа разведения растений, известных в настоящей области техники, например, чистопородное разведение, возвратное скрещивание, разведение удвоенных гаплоидов и подобное (см., Wernsman, E. A, and Rufty, R. С. 1987. Chapter Seventeen. Tobacco. Pages 669-698 In: Cultivar Development. Crop Species. W. H. Fehr (ed.), MacMillan Publishing Co, Inc., New York, N.Y 761 pp.). Описанные выше техники на основе молекулярной биологии, в частности RFLP и микросаттелитные маркеры, могут использоваться в таких возвратных скрещиваниях для идентификации потомков, характеризующихся наивысшей степенью генетической идентичности с реккурентным родителем. Это позволяет ускорить получение сортов, характеризующихся по меньшей мере 90%, предпочтительно по меньшей мере 95%, more предпочтительно по меньшей мере 99% генетической идентичности с реккурентным родителем, даже более предпочтительно генетически идентичных реккурентному родителю и дополнительно содержащих признак(и), интрогресированные из донорного родителя. Такое определение генетической идентичности может быть основано на известных в настоящей области техники молекулярных маркерах.
Последнее поколение возвратного скрещивания может самоопыляться для получения чистопородного потомства в отношении нуклеиновой(ых) кислоты(кислот), подлежащей(их) переносу. Полученные растения, как правило, содержат по сути все морфологические и физиологические характеристики мутантных, не встречающихся в природе или трансгенных растений согласно настоящему изобретению, в дополнение в перенесенному(ым) признаку(ам) (например, одному или нескольким признакам одного гена). Точный протокол возвратного скрещивания будет зависеть от подлежащего изменению признака для определения соответствующего протокола исследования. Хотя способы возвратного скрещивания упрощаются, когда подлежащий переносу признак представляет собой доминантный аллель, рецессивный аллель также может быть перенесен. В этом случае может быть необходимо ввести исследование потомства для определения того, успешно ли был перенесен необходимый признак.
Различные варианты осуществления относятся к мутантным растениям, не встречающимся в природе растениям или трансгенным растениям, а также биомассе, в которых уровень экспрессии полинуклеотида NtTS снижают для увеличения концентрации свободного метионина в них, в частности, без ограничения в листьях.
Части таких растений, конкретнее растения табака и более конкретно листовая пластинка и центральная жилка растений табака могут быть введены в состав или использованы в получении различных потребительских продуктов, включающих в себя без ограничения образующие аэрозоли материалы, образующие аэрозоли устройства, курительные изделия, подходящие для курения изделия, бездымные продукты и табачные продукты. Примеры образующих аэрозоль материалов, в частности образующие аэрозоль никотина материалы включают в себя без ограничения табачные композиции, разновидности табака, табачный экстракт, измельченный табак, измельченный фильтр, сушеный табак, измельченный табак, гомогенизированный табак, восстановленный табак и трубочные разновидности табака. Курительные изделия и подходящие для курения изделия представляют собой все типы образующих аэрозоль устройств, включающих в себя образующие аэрозоль никотина устройства. Пример курительных изделий или подходящих для курения изделий включают в себя без ограничения сигареты, сигариллы и сигары. Примеры бездымных продуктов содержат разновидности жевательного табака и нюхательного табака. В определенных образующих аэрозоль устройствах, вместо сжигания, табачную композицию или другой образующий аэрозоль материал нагревают с помощью одного или нескольких электрических нагревательных элементов для получения аэрозоля. В другом типе нагреваемого образующего аэрозоль устройства аэрозоль получают путем переноса тепла из сжигаемого горючего элемента или источника тепла на физически отдельный образующий аэрозоль материал, который может быть расположен внутри, вокруг, рядом или выше источника тепла. Бездымные табачные продукты и различные содержащие табак образующие аэрозоль материалы могут содержать табак в любой форме, включающей в себя высушенные частицы, стружки, гранулы, порошки или суспензию, нанесенную, смешанную, окруженную или иным образом комбинированную с другими ингредиентами в любом формате, например, тонкие спрессованные пластины, пленки, таблетки, пены или гранулы. Используемый в настоящем документе термин 'дым' используют для описания типа аэрозоля, коорый производится такими курительными изделиями, как сигареты (например, сигаретный дым) или путем сжигания образующего аэрозоль материала.
Согласно одному варианту осуществления также предусматривается сушеный растительный материал, включающий в себя сушеные листья или сушеные части растения из описанных в настоящем документе мутантных, трансгенных и не встречающихся в природе растений табака. Способы сушки зеленых листьев табака известны специалистам в настоящей области техники и включают в себя без ограничения воздушную сушку, огневую сушка, дымовую сушку и солнечную сушку. Способ сушки зеленых листьев табака зависит от типа собранного табака. Например, табак Virginia дымовой сушки (светлый), как правило, высушивают в дыму, Burley и определенные темные разновидности, как правило, подвергают воздушной сушке и трубочный табак, жевательный табак и нюхательный табак, как правило, подвергают огневой сушке.
Согласно другому варианту осуществления описаны табачные продукты, включающие в себя образующие аэрозоль никотина материалы или содержащие табак образующие аэрозоль материалы, содержащие листья, предпочтительно сушеные листья, полученные из листьев описанных в настоящем документе мутантных растений табака, трансгенных растений табака или не встречающихся в природе растений табака. Описанные в настоящем документе табачные продукты могут представлять собой смешанный табачный продукт, который может дополнительно содержать табак из одного или нескольких других сортов растений табака, включающих в себя немодифицированные растения табака.
Процентное отношение свободного метионина в образующих аэрозоль материалах или табачных композициях согласно настоящему изобретению представляет собой значение по меньшей мере приблизительно на 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% и 100% выше по сравнению с образующими аэрозоль материалами или табачными композициями, полученными из немутантных, не встречающихся в природе или нетрансгенных аналогичных растений.
Мутантные, не встречающиеся в природе или трансгенные растения могут характеризоваться другими применениями, например, в сельском хозяйстве. Например, описанные в настоящем документе мутантные, не встречающиеся в природе или трансгенные растения могут использоваться для получения корма для животных и пищевых продуктов для людей.
Настоящее изобретение также относится к способам получения семян, предусматривающим выращивание описанного в настоящем документе мутантного растения, не встречающегося в природе растения или трансгенного растения и сбор семян из выращенных растений. Семена из описанных в настоящем документе растений могут быть кондиционированы и расфасованы в упаковочный материал способами, известными в настоящей области техники для образования производственного изделия. Такой упаковочной материал, как бумага и ткань, хорошо известны в настоящей области техники. Упаковка семян может содержать этикетку, например, бирку или этикетку, прикрепленную к упаковочному материалу, этикетку, напечатанную на упаковочном материале или этикетку, вложенную в упаковку, которая описывает свойства семян в ней.
Дополнительный аспект относится к способу получения метионала, предусматривающему стадии: (а) предоставление части мутантного, не встречающегося в природе или трансгенного растения; биомассы, семени или листьев; или образующих аэрозоль материалов, описанных в настоящем документе; и (b) проведение их нагревания.
Композиции, способы и наборы для генотипирования растений для идентификации, селекции или разведения предусматриваются настоящим изобретением и могут содержать средства обнаружения присутствия полинуклеотида NtTS в образце полинуклеотида. Соответственно, описывается композиция, содержащая один или несколько праймеров для специфической амплификации по меньшей мере части полинуклеотида NtTS и необязательно один или несколько зондов и необязательно один или несколько реагентов для проведения амплификации или обнаружения. Соответственно, раскрыты специфические для гена олигонуклеотидные праймеры или зонды, содержащий приблизительно 10 или больше смежных полинуклеотидов. соответствующих полинуклеотиду NtTS. Указанные праймеры или зонды могут содержать или состоять приблизительно из 15, 20, 25, 30, 40, 45 или 50 или больше смежных полинуклеотидов, которые гибридизируются (например, специфически гибридизируются) с полинуклеотидом NtTS. Согласно некоторым вариантам осуществления праймеры или зонды могут содержать или состоять приблизительно из 10-50 смежных нуклеотидов, приблизительно из 10-40 смежных нуклеотидов, приблизительно из 10-30 смежных нуклеотидов или приблизительно из 15-30 смежных нуклеотидов, которые могут использоваться в зависимых от последовательности способах идентификации гена (например, саузерн-гибридизация) или выделения (например, гибридизация in situ бактериальных колоний или бляшек бактериофагов) или обнаружения гена (например, в виде одного или нескольких праймеров амплификации в амплификации или обнаружении нуклеиновых кислот). Один или несколько специфических праймеров или зондов могут быть разработаны и использованы для амплификации или обнаружения части или всего полинуклеотида NtTS. В качестве конкретного примера два праймера могут использоваться в протоколе полимеразной цепной реакции для амплификации фрагмента нуклеиновой кислоты, кодирующего такую нуклеиновую кислоту NtTS, как ДНК или РНК. Полимеразная цепная реакция также может быть проведена с использованием одного праймера, полученного из последовательности нуклеиновой кислоты NtTS, и второго праймера, который гибридизируется с последовательностью против хода транскрипции или по ходу транскрипции такой последовательности нуклеиновой кислоты NtTS, как промоторная последовательность NtTS, 3'-конец предшественника мРНК или последовательность, полученная из вектора. Примеры термических и изотермических техник, применимых для амплификации in vitro полинуклеотидов, хорошо известны в настоящей области техники. Образец может представлять собой или может быть получен из растения, растительной клетки или растительного материала или табачного продукта, произведенного или полученного из описанного в настоящем документе растения, растительной клетки или растительного материала.
Таким образом, согласно дополнительному аспекту также предусматривается способ обнаружения полинуклеотида NtTS в образце, предусматривающий стадию: (а) предоставления образца, содержащего или, как предполагается, содержащего полинуклеотид; (b) приведения указанного образца в контакт с одним или несколькими праймерами или одним или несколькими зондами для специфического обнаружения по меньшей мере части полинуклеотида NtTS; и (с) обнаружения присутствия продукта амплификации, причем присутствие продукта амплификации является признаком присутствия полинуклеотида NtTS в образце. Согласно дополнительному аспекту также предусматривается применение одного или нескольких праймеров или зондов для специфического обнаружения по меньшей мере части полинуклеотида NtTS. Также предусматриваются наборы для обнаружения по меньшей мере части полинуклеотида NtTS, которые содержат один или несколько праймеров или зондов для специфического обнаружения по меньшей мере части полинуклеотида NtTS. Набор может содержать реагенты для такой амплификации полинуклеотида, как полимеразная цепная реакция (ПЦР), или реагенты для такой технологии обнаружения гибридизации зонда для нуклеиновой кислоты, как саузерн-блоттинг, нозерн-блоттинг, гибридизация in-situ или микрочиповый анализ. Набор может содержать реагенты для такой технологии обнаружения на основе связывания антител, как вестерн-блоттинг, анализы ELISA, SELDI масс-спектрометрия или индикаторные полоски. Набор может содержать реагенты для секвенирования ДНК. Набор может содержать реагенты и/или инструкции для определения содержания метионина, треонина и/или метионала. Согласно некоторым вариантам осуществления набор может содержать инструкции для одного или нескольких описанных способов. Описанные наборы могут быть применимы для определения генетической идентичности, филогенетических исследований, генотипирования, гаплотипирования, чистопородного анализа или разведения растений, в частности с определением балла кодоминирования.
Настоящее изобретение также относится к способу генотипирования растения, растительной клетки или растительного материала, содержащего полинуклеотид NtTS. Генотипирование относится к способу различения гомологов хромосомной пары и может использоваться для установления различия между сегрегантами в растительной популяции. Способы на основе молекулярных маркеров могут использоваться для филогенетических исследований, определения характеристик генетических взаимодействий среди культурных сортов, идентификации скрещиваний или соматических гибридов, определения локализации хромосомных сегментов, оказывающих влияние на контролируемые одним геном признаки, клонирования на основе карт и исследования наследования количественных признаков. Конкретный способ генотипирования может использовать любое число аналитических техник на основе молекулярных маркеров, включающих в себя полиморфизмы длины амплифицированных фрагментов (AFLP). AFLP представляют собой продукт аллельных различий между амплифицированными фрагментами, вызванными изменчивостью нуклеотидной последовательности. Таким образом, настоящее изобретение дополнительно относится к способам отслеживания сегрегации гена или нуклеиновой кислоты NtTS, а также хромосомных последовательностей, генетически свзяанных с такими генами или нуклеиновыми кислотами с использованием таких техник, как анализ AFLP.
Корреляция между метионином, произведенным в растениях, являющихся результатом сайленсинга треонинсинтазы, и химическими соединениями, обнаруженными в сушеном табаке, может быть подвергнута мониторингу в сушеных листьях с использованием масс-спектрометрии. Профили масс-спектрометрии экстрактов растения указывают на то, что сайленсинг треонинсинтазы в растениях приводит к изменениям в растениях, поскольку четыре пика показали измененные профили в линиях с молчащей треонинсинтазой по сравнению с экстрактами из контрольных растений (см. фигуру 1). Три пика увеличиваются в распространенности, тогда как один снижается в распространенности. Эти изменения в профиле могут использоваться для идентификации растений, в которых уровни метионала в аэрозоле, вероятно, являются повышенными. Соответственно, согласно дополнительному аспекту предусматривается способ идентификации табачного материала, который высвобождает повышенные уровни метионала в аэрозоль при нагревании, предусматривающий стадии: (а) получение образца табачного материала; (b) определение профиля молекулярной массы образца; и (с) сравнение профиля молекулярной массы при одном или нескольких соотношениях массы к заряду с таковым у контрольного растения; причем конкретное изменение соотношения массы к заряду по сравнению с контрольным растением является признаком того, что уровни метионала в аэрозоле являются повышенными. Соответственно, молекулярную массу измеряют с помощью масс-спектрометрии, предпочтительно жидкостной хроматографии с масс-спектрометрией (LC-MS), газовой хроматографией с масс-спектрометрией (GC-MS). Согласно дополнительному аспекту предусматривается табачный материал, идентифицированный или идентифицируемый этим способом.
Настоящее изобретение дополнительно описано в представленных ниже примерах, которые представлены для более подробного описания настоящего изобретения. Эти примеры, которые представляют предпочтительный способ, предусмотренный в настоящее время для осуществления настоящего изобретения, предназначены для иллюстрации, а не ограничения настоящего изобретения.
Примеры
Пример 1: Идентификация треонинсинтазы табака
Ген треонинсинтазы табака идентифицируют с использованием последовательностей EST табака, обнаруженных в Tobacco Genome Initiative. Другой EST контиг табака (NCBI_45312-v2pep-fl), близкий к треонинсинтазе табака, собирают из последовательностей EST NCBI. Эта кодирующая последовательность характеризуется точно такой же длиной (1569 п.н.), что и треонинсинтаза табака. Данные с использованием ДНК-микрочипов экзонов Affymetrix (зонды последовательности из NtPMIalg193542e1) показывают, что треонинсинтаза табака в равной степени экспрессируется в корнях, трихомах, зеленых и увядающих листьях N. tabacum. HE обнаружили никаких значительных изменений в уровнях экспрессии генов между листом табака дьмовой сушки (K326, K399) и Burley (TN90, Bu64). Кроме того, низкотемпературный и кадмиевый стресс не влияет на уровни экспрессии треонинсинтазы табака, тем самьм указывая на то, что эта треонинсинтаза, очень вероятно, конститутивно экспрессируется в листе табака.
Пример 2: Избыточная экспрессия цистатионин-гамма-синтазы (CGS)
Arabidopsis thaliana CGS (MT01, TAIR учетный номер АТ3901120) вводят под транскрипционным контролем промотора 35S вируса мозаики цветной капусты в табак Burley TN90 посредством Agrobacterium tumefasciens с использованием классической процедуры на основе листового диска, описанной в литературе. Также вводят ген селекции в отношении к антибиотику канамицину.
Пример 3: Сайленсинг экспрессии треонинсинтазы в растениях табака
С использованием фрагмента ДНК SEQ ID NO:1, получают праймеры для проведения сайленсинга NtTS в табаке с использованием подхода РНК-интерференции. Используемые праймеры представляют собой 5'-ctgaaatcgacagcgatgata-3' (SEQ ID NO:9) и 5'-caaccaatagctaacggagctt-3' (SEQ ID NO:10). Соответствующую последовательность РНК-и амплифицируют из кДНК с помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР) и затем вставляют в вектор Gateway pB7GWIWG2(II) посредством исходного вектора, в точности как подробно описано производителем (Invitrogen). Этот вектор содержит промотор для конститутивной экспрессии (промотор 35S вируса мозаики цветной капусты CaMV) трансгена во всех тканях растения и ген канамицина для селекции в отношении антибиотика канамицина на планшетах с агаровой средой (100 мг/мл). Конструкт затем вводят в геном табака Burley TN90 посредством Agrobacterium tumefasciens с использованием классической процедуры на основе листового диска. Из каллюсов отдельные линии регенерируют и проводят селекцию на канамицине. Подвергнутые РНК-и сайленсингу линии ТО подвергают мониторингу с помощью (i) ОТ-ПЦР на геномной ДНК с использованием одного праймера в 35S промоторе (5'-gagcatcgtggaaaaagaagac-3') и одного праймера в пределах фрагмента, используемого для сайленсинга (5'-aagctccgttagctattggttg-3') и выращивают для получения семян и с помощью (ii) ОТ-ПЦР с использованием специфических праймеров, фланкирующих вставку, используемых для сайленсинга (5'-ttgattcacgtgtcggtaagac-3') и выращивают для получения семян. Семена Т 1 собирают, повторно выращивают на содержащем канамицин агаре и подвергают мониторингу, точно как сеянцы Т0. ПЦР на геномной гДНК показывает, что фрагмент ДНК NtTS вставлен в геном и эффективно подвергает сайленсингу треонинсинтазу табака.
Пример 4: Культивирование растений табака с молчащей треонинсинтазой
Устойчивые к канамицину растения выращивают в подвижных лотках до культивирования в поле (Кентукки, США). 20 растений линии с молчащей треонинсинтазой (линия NtTS-PHK-и; пример 2), линии цистатионин-гамма-синтазы (пример 3), контрольным вектором (VC, pB7GWIWG2(II)) и TN90 US эталонный вид табака культивируют в четырех параллелях из 20 растений. Через три месяца после пересадки в поле (36 дней после прищипывания верхушки), один лист в среднем положении на стебле берут в качестве образца у 10 идентичных растений из 20 для каждой параллели. Листья ("зеленые листья") немедленно помещают в сухой лед и лиофилизируют. 10 растений из лучших двух линий выбирают и затем высушивают согласно агротехническим приемам Burley. После сушки три листа в среднем положении на стебле отбирают в качестве образца. Для мониторинга эффекта сайленсинга в линиях с молчащей треонинсинтазой и для сравнения с линиями цистатионин-гамма-синтазы "зеленые листья" из трех линий измельчали и подвергали анализу свободных аминокислот.
Пример 5: Анализ метионала
Корреляцию между метионином, произведенным в зеленых листьях, являющихся результатом сайленсинга треонинсинтазы, и химическими соединениями, обнаруженными в сушеном табаке, подвергают мониторингу в сушеных листьях с использованием LC-MS с использованием описанных выше линий. Экстракцию проводят в метаноле. Используемое оборудование представляет собой систему Waters Acquity UPLC, присоединенную к масс-спектрометру. Колонка представляет собой WatersXBridge Shield RP18 с использованием в качестве подвижной фазе А смеси вода:ацетонитрил (95:5 объем/объем) и в качестве подвижной фазы В метанол. Профили LC-MS указывают на то, что сайленсинг треонинсинтазы в зеленых листьях приводит к химическому сигналу в сушеных листьях. Более того, четыре пика показывают измененные профили в линиях с молчащей треонинсинтазой по сравнению с контролями (см. фигуру 1). Три пика увеличиваются в распространенности, тогда как один снижается. Это указывает на то, что метионин, который накапливается в зеленых листьях, превращается либо в серосодержащие продукты разложения, либо в производные метионина в сушеных листьях.
Поскольку метионин представляет собой возможный предшественник метионала, мы проанализировали содержание метионала в аэрозоле, образованном после нагревания сушеного табака (TN90, VC, NtTS-1, NtTS-1 и NtTS-3 выбранные зарегистрированные параллели) и подвергали воздействию холодной ловушки. Используемая курительная платформа представляет собой имитатор дыма с источником тепла типа Macor (54 Вт), включающий в себя режим 12 нажатий за 2 с. Перед дымообразованием сушеную листовую пластинку табака разрезали и пропитывали 20% глицерином. Аэрозоли, произведенные путем нагревания пропитанных сушеных листьев табака (100 мг, 3 полных параллели) конденсировали с использованием криогенной системы, разработанной Air Liquid, и растворяли в дихлорметане (2 раза по 5 мл). Уровни метионала в растворах аэрозоля определяли с помощью GC-MS после дериватизации. Ион, производящий наиболее распространенный сигнал, использовали для получения данный в режиме мониторинга одного иона (SIM).
Корреляцию между метионином, произведенным в зеленых листьях, являющихся результатом сайленсинга треонинсинтаза, и химическими соединениями, обнаруженными в сушеном табаке, подвергли мониторингу в сушеных листьях с использованием LC-MS с использованием описанных выше параллельных линий. Экстракцию проводили в метаноле. Используемое оборудование представляет собой систему Waters Acquity UPLC, присоединенную к масс-спектрометру. Колонка представляет собой WatersXBridge Shield RP18 с использованием в качестве подвижной фазе А смеси вода:ацетонитрил (95:5 объем/объем) и в качестве подвижной фазы В метанол. Результаты представлены в таблице 1.
Как показано в таблице 1, NtTS-PHK-и растения не показывают каких-либо визуальных отличий от контрольных растений. Например, высота растений и содержание хлорофилла в растениях табака с молчащей треонинсинтазой было практически идентичным контрольным растениям. Концентрация свободного метионина в зеленых листьях растений табака с молчащей треонинсинтазой была выше, чем в контрольных растениях. Концентрация метионала в аэрозоле была намного выше в растениях табака с молчащей треонинсинтазой, чем в контрольных растениях. Содержание треонина зеленых листьев проявляло снижение на более чем 20% в растениях табака с молчащей треонинсинтазой по сравнению с контрольными растениями.
Пример 6: Анализ экспрессии треонинсинтазы в NtTS-PHK-и линиях табака
SEQ ID No:1, 2, 3 и 20 выравнивали на консенсусе из 1587 оснований от старт-кодона до стоп-кодона. Участки фрагмента, которые являются гомологичными между SEQ ID No:1, 2 и 3 и отличными от SEQ ID NO:20, представляют собой нуклеотиды 1-46 в SEQ ID No:1, 2 и 3 и нуклеотиды 1-52 в SEQ ID NO:20; нуклеотиды 99-141 в SEQ ID NO:1, нуклеотиды 102-144 в SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:3 и нуклеотиды 102-153 в SEQ ID NO:20; и нуклеотиды 1325-1362 в SEQ ID No:1, 2 и 3 и нуклеотиды 1334-1371 в SEQ ID NO:20. Эти последовательности используют для разработки праймеров, специфических для SEQ ID No 1, 2, 3. Также разрабатывают набор праймеров, специфических для SEQ ID NO:20.
NtTS-PHK-и линии получают с использованием участков, соответствующих нуклеотидам 454-805 в SEQ ID NO:1; нуклеотидам 454-805 в SEQ ID NO:2: нуклеотидам 456-805 в SEQ ID NO:3 и нуклеотидам 463-814 в SEQ ID NO:20. 3 отдельных растения из 3 независимых NtTS-PHK-и линий (NtTS1, NtTS2 и NtTS3), положительно экспрессирующих трансген(в) для РНК-и сайленсинга (исследуемых с помощью ПЦР в отношении присутствия 35S промотора в гДНК) подвергают полуколичественной ОТ-ПЦР с использованием праймеров, специфических для SEQ ID No:1, 2 и 3, и праймеров, специфических для SEQ ID NO:20. Тубулин используют в качестве контроля для экспрессии конститутивных генов. 3 растения Burley TN90 используют в качестве контроля для экспрессии транскриптов, связанных с SEQ ID NO:1, 2, 3 и 20.
Использование праймеров, специфических для SEQ ID NO:1, 2 и 3, или праймеров, специфических только для SEQ ID NO:3, или праймеров, специфических только для SEQ ID NO:1 и 2 в полуколичественной ОТ-ПЦР показывает, что частичный сайленсинг в экспрессии треонинсинтаза произошел в каждой из 3 независимых NtTS-PHK-и линий по сравнению с контролем. Использование праймеров, специфических для SEQ ID NO:20, показывает, что произошел частичный сайленсинг в NtTS-PHK-и растениях и что уровень сайленсинга меньше, чем был достигнут для SEQ ID NO:1-3. Обнаружили, что сайленсинга был более эффективным для SEQ ID NO:3, чем для SEQ ID NO:20, хотя % идентичности последовательности между последовательностыми идентичен.
Любая публикация, процитированная или описанная в настоящем документе, предоставляет релевантную информацию, раскрытую до даты подачи настоящей заявки. Утверждения в настоящем документе не должны рассматриваться как допущение того, что авторы насотящего изобретения не наделены правом предшествовать таким раскрытиям. Все публикации, упомянутые в представленном выше описании изобретения, включены в настоящий документе посредством ссылки. Различные модификации и варианты настоящего изобретения будут очевидны специалистам в настоящей области техники, не отклоняясь от объема и сущности настоящего изобретения. Хотя настоящее изобретения было в связи с конкретными предпочтительными вариантами осуществления, следует понимать, что настоящее изобретение, изложенное в формуле изобретения, не должно быть ненадлежащим образом ограничено такими конкретными варианты осуществления. Кроме того, подразумевается, что различные модификации описанных способе осуществления настоящего изобретения, являющиеся очевидными специалистам в клеточной, молекулярной биологии и ботанике или родственных областях, находятся в пределах объема представленной ниже формулы изобретения.
Таблица 1
Избыточная экспрессия CGS
TN90
VC
NtTS-PHK-и линия
Высота стебля (см)
127
121
137
123
Содержание хлорофилла (произвольная единица)
17
18
17
18
Концентрация свободного метионина в зеленых листьях (мг/г)
Линия 1:
0,025
0,017
Линия 1:
0,025
(0,004)
(0,003)
0,032 (0,013)
(0,008)
(average)
(average)
Линия 2:
Линия 2:
0,022
0,034 (0,006)
(0,016)
Концентрация свободного треонина в зеленых листья (мг/г)
Линия 1:
0,851
0,915
Линия 1:
0,876
(0,053)
(0,110)
0,567 (0,051)
(0,221)
Линия 2:
Линия 2:
1,091
0,609 (0,022)
(0,087)
Концентрация метионала в аэрозоле (мкг/г)
NA
916
1400
Линия 1:
3822
Линия 2:
2200
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ
SEQ ID NO:1 (Последовательность ДНК треонинсинтазы из N. tabacum)
SEQ ID NO:2 (Последовательность ДНК треонинсинтазы из N. tabacum (Hicks Broad Leaf), которая также присутствует в Nicotiana sylvestris)
SEQ ID NO:3 (Последовательность ДНК треонинсинтазы из N. tabacum (Hicks Broad Leaf))
SEQ ID NO:4 (Геномная последовательность ДНК SEQ ID NO:3)
SEQ ID NO:5 (Геномная последовательность ДНК треонинсинтазы из Nicotinia tomentosiformis)
SEQ ID NO:6 (Транслированная последовательность SEQ ID NO:1)
SEQ ID NO:7 (Транслированная последовательность SEQ ID NO:2)
SEQ ID NO:8 (Транслированная последовательность SEQ ID NO. 3)
SEQ ID NO:9 (Праймер)
SEQ ID NO:14 (РНК-и последовательность, используемая для сайленсинга треонинсинтазы)
SEQ ID NO:15 (РНК-и последовательность, используемая для сайленсинга треонинсинтазы)
SEQ ID NO:16 (РНК-и последовательность, используемая для сайленсинга треонинсинтазы)
SEQ ID NO:17 (РНК-и последовательность, используемая для сайленсинга треонинсинтазы)
SEQ ID NO:18 (РНК-и последовательность, используемая для сайленсинга треонинсинтазы)
SEQ ID NO:19 (РНК-и последовательность, используемая для сайленсинга треонинсинтазы)
SEQ ID NO:20 (Последовательность ДНК дополнительной треонинсинтазы из N. tabacum)
SEQ ID NO:21 (Транслированная последовательность SEQ ID NO:21)