НОВЫЕ МОЛОЧНОКИСЛЫЕ БАКТЕРИИ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
NEW LACTIC ACID BACTERIA AND APPLICATION THEREOF

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к новым молочнокислым бактериям и, более конкретно, к новым молочнокислым бактериям и различным их применениям в пищевых продуктах и лекарственных средствах, которые могут ингибировать аллергические реакции посредством различных физиологических активностей, таких как иммунорегуляторный эффект, эффект ингибирования воспалительных реакций и др.
Предпосылки создания изобретения
Реакция гиперчувствительности относится к реакции, которая наносит вред организму человека, вызывая в живом организме человека чрезмерную иммунную реакцию на непатоген, вместо того, чтобы проявлять к нему иммунологическую толерантность. Реакцию гиперчувствительности условно классифицируют на четыре типа в соответствии с механизмом ее действия. Реакция гиперчувствительности 1-го типа протекает таким образом, что специфический антиген связывается с Ig, который в основном связан с Fc-рецептором тучной клетки. Такую реакцию также называют реакцией гиперчувствительности немедленного типа, поскольку реакция протекает сразу после взаимодействия с антигеном. Реакция гиперчувствительности 1-го типа, как правило, вызывается крупнодисперсными антигенами, которые вдыхаются в процессе дыхания. В качестве крупнодисперсных антигенов выступает пыльца растений и т. д. В качестве заболеваний или симптомов, вызываемых реакцией гиперчувствительности 1-го типа, выступают острая крапивница, атопический дерматит, аллергический ринит, бронхиальная астма и т. д. Реакция гиперчувствительности 2-го типа вызывается малыми молекулами, которые ковалентно связываются с поверхностным компонентом клеток человека и таким образом создают модифицированную структуру, которую иммунная система распознает как гетерогенный материал. При реакции гиперчувствительности 2-го типа B-клетки продуцируют IgG против нового эпитопа, после чего IgG связывается с модифицированной клеткой и таким образом вызывает разрушение клетки посредством активности системы комплемента и фагоцитоза. Реакция гиперчувствительности 3-го типа вызывается растворимыми иммунными комплексами, которые образуются посредством связывания растворимого белкового антигена и IgG, который вырабатывается против растворимого белкового антигена. При реакции гиперчувствительности 3-го типа часть иммунных комплексов прикрепляется к небольшому участку стенки кровеносного сосуда или легочной альвеолы в легком, активируя таким образом систему комплемента, что запускает воспалительную реакцию, наносящую повреждение ткани и ухудшающую физиологическую функцию ткани. Реакция гиперчувствительности 4-го типа вызывается продуктами антигенспецифических эффекторных Т-клеток и также называется отсроченной реакцией гиперчувствительности, поскольку она проявляется через один-три дня после взаимодействия с антигеном.
Реакция гиперчувствительности 1-го типа является немедленной реакцией, опосредуемой IgE. Антитела IgE продуцируются плазмоцитами, в основном присутствующими в слизистых оболочках органов дыхания и пищеварения. Такие вырабатываемые антитела IgE обладают очень высокой аффинностью с поверхностными рецепторами тучных клеток и базофилов и, следовательно, преимущественно связываются с этими клетками. Это является сенсибилизированным состоянием, в котором большинство поверхностных рецепторов тучных клеток и базофилов связаны с антителами IgE. При взаимодействии с аллергеном в сенсибилизированном состоянии аллерген связывается с антителом IgE, вызывая таким образом реакцию между рецепторами, после чего гранула в тучной клетке сливается с клеточной мембраной, таким образом секретируя такие химические медиаторы, как гистамин, цистеиниллейкотриен, простагландин и тромбоксан. Такие химические медиаторы вызывают аллергическую реакцию немедленного типа, увеличивая проницаемость сосудов, расширяя кровеносные сосуды, сокращая гладкие мышцы и ускоряя секреторные функции железы.
Аллергический ринит, одно из заболеваний, в основе которого лежит указанная реакция гиперчувствительности 1-го типа, относится к симптоматическому расстройству, которое приводит к появлению симптомов в носу, глазах, ушах, горле и т. п., вызывая опосредованное IgE воспаление после взаимодействия с аллергеном. Такой аллергический ринит подразделяют на интермиттирующий AR или персистирующий AR на основании длительности симптомов по руководствам от Allergic Rhinitis and Its Impact on Asthma Working Group и снова подразделяют на легкий, умеренный и тяжелый. Распространенность аллергического ринита обычно составляет приблизительно 10-30% у взрослых и приблизительно 40% у маленьких детей с небольшой разницей в зависимости от направителей сообщения из различных стран. Факторами риска развития аллергического ринита являются аллергены в помещении и на улице, а также случай, при котором уровень IgE в сыворотке крови составляет 100 МЕ/мл или больше в возрасте до шести лет. Аллергический ринит может быть причиной осложнения в форме синусита, отита среднего уха или конъюнктивита. При хроническом прогрессировании такое заболевание может усугубить астму и синусит и, как следствие, обуславливать нарушение сна, затруднение внимания или дезадаптацию в социальной жизни. Астма, одно из заболеваний, в основе которого лежит указанная реакция гиперчувствительности 1-го типа, относится к заболеванию, при котором такие симптомы, как респираторный дистресс, кашель, легочная обструкция и т. д., возникают периодически или нерегулярно, а также относится к типичному аллергическому заболеванию, в основе которого лежит сочетание генетических и внешних факторов. Другими словами, такая астма возникает в таком случае, когда унаследованная от родителей аллергическая конституция и вызывающие астму внешние факторы задействованы во взаимодействии друг с другом, таким образом вызывая нарушение иммунной системы, и является в основном хронической и рецидивирующей.
Были исследованы различные терапевтические способы лечения аллергических заболеваний, вызванных реакцией гиперчувствительности 1-го типа. Например, для лечения применяют противоаллергические лекарственные средства, антагонисты гистаминовых рецепторов (антигистаминные средства), стероиды и т. д. Тем не менее, известно, что все приведенные далее варианты обладают значительными побочными эффектами: антигистаминные средства, которые ингибируют передачу сигнала от периферических нервов, конкурируя с гистамином за связывание с гистаминовыми рецепторами; противоаллергические лекарственные средства, которые пытаются уменьшить симптомы, ослабляя активность клеток, продуцирующих химические медиаторы; и стероиды, которые уменьшают воспаление путем ослабления иммунной реакции, большинство из которых не оказывают надежного терапевтического эффекта.
В то же время, молочнокислые бактерии являются продуктом, который был впервые получен Мечниковым, который предпринял попытку подкисления кишечного содержимого с целью предупреждения роста гнилостных организмов и, таким образом, достижения терапевтического эффекта. В случае же рода Lactobacillus, который считается типичным представителем молочнокислых бактерий, к настоящему времени обнаружено более 165 его видов. В виде живой формы пробиотических молочнокислых бактерий, которые применяли для лечения аллергических заболеваний, по имеющимся сведениям существует штамм Lactobacillus acidophilus L-92 от аллергических симптомов, вызываемых пыльцой гималайского кедра в Японии.
В пищеварительном тракте человека находится множество молочнокислых бактерий, которые полезны для человеческого организма, и в настоящее время проходят исследования по применению молочнокислых бактерий, выделенных из пищеварительного тракта человека, с целью создания лекарственных препаратов или функциональных пищевых продуктов. В частности, прием терапевтических средств от аллергических заболеваний может быть необходим в течение длительного периода времени, и, следовательно, данные средства должны обладать такими характеристиками, как простота приема и высокий уровень безопасности. Молочнокислые бактерии относятся к группе кандидатов, которые особенно подходят для лечения указанных выше заболеваний, а также удовлетворяют требованиям для такого лечения.
Подробное описание настоящего изобретения
Техническая задача
Настоящее изобретение применимо к традиционному уровню техники, и целью настоящего изобретения является получение новых молочнокислых бактерий, обладающих иммунорегуляторным эффектом и эффектом ингибирирования воспалительных реакций.
Также, другой целью настоящего изобретения является обеспечение различных применений новых молочнокислых бактерий в пищевых и лекарственных продуктах.
В частности, целью настоящего изобретения является получение новых молочнокислых бактерий Bifidobacterium longum IM55 или Lactobacillus plantarum IM76.
Другой целью настоящего изобретения является получение фармацевтической композиции для предупреждения или лечения аллергических заболеваний, содержащей Bifidobacterium longum IM55, Lactobacillus plantarum IM76 или их смеси.
Другой целью настоящего изобретения является получение пищевой композиции для предупреждения или облегчения тяжести аллергических заболеваний, содержащей Bifidobacterium longum IM55, Lactobacillus plantarum IM76 или их смеси.
Еще одной целью настоящего изобретения является получение фармацевтической композиции для предупреждения или лечения иммунопатологических заболеваний или воспалительных заболеваний, содержащей Bifidobacterium longum IM55, Lactobacillus plantarum IM76 или их смеси.
Также, еще одной целью настоящего изобретения является обеспечение способа предупреждения или лечения аллергических заболеваний, включающего стадию введения индивидууму Bifidobacterium longum IM55, Lactobacillus plantarum IM76 или их смесей.
Дополнительно, еще одной целью настоящего изобретения является обеспечение применения Bifidobacterium longum IM55, Lactobacillus plantarum IM76 или их смесей при предупреждении или лечении аллергических заболеваний.
Более того, еще одной целью настоящего изобретения является обеспечение применения Bifidobacterium longum IM55, Lactobacillus plantarum IM76 или их смесей при получении лекарственного средства для предупреждения или лечения аллергических заболеваний.
Кроме того, еще одной целью настоящего изобретения является получение композиции, содержащей Bifidobacterium longum IM55 KCCM11961P, Lactobacillus plantarum IM76 KCCM11962P или их смеси, для применения при предупреждении или лечении аллергических заболеваний.
Решение технической задачи
В одном аспекте для достижения указанных целей в настоящем изобретении предусмотрен Bifidobacterium longum IM55 (депозитарий: Корейский центр культур микроорганизмов (KCCM), дата депонирования: 20 января 2017 года, и регистрационный номер: KCCM11961P).
Bifidobacterium longum IM55 по настоящему изобретению характеризуется тем, что является новой молочнокислой бактерией Bifidobacterium longum, выделенной и идентифицированной из экскрементов человека.
Последовательность 16S rDNA для идентификации и классификации Bifidobacterium longum IM55 по настоящему изобретению является такой же, как и последовательность под SEQ ID NO: 1, которая прилагается к настоящему описанию. Таким образом, Bifidobacterium longum IM55 KCCM11961P по настоящему изобретению может содержать последовательность 16S rDNA под SEQ ID NO: 1.
Как видно из результата анализа указанной последовательности 16S rDNA под SEQ ID NO: 1, такая последовательность была на 99% гомологична последовательности известных штаммов Bifidobacterium longum, что демонстрирует наивысшее молекулярно-филогенетическое родство с Bifidobacterium longum. Таким образом, указанная молочнокислая бактерия была идентифицирована как Bifidobacterium longum, затем получила название Bifidobacterium longum IM55, а затем была депонирована в KCCM 20 января 2017 года (регистрационный номер: KCCM11961P).
В настоящем изобретении указанный Bifidobacterium longum IM55 в качестве источника углерода может использовать D-глюкозу, D-маннит, D-лактозу, D-сахарозу, D-мальтозу, салицин, D-ксилозу, L-арабинозу, цитрат железа с эскулином, D-рафинозу и D-сорбит.
В другом аспекте для достижения указанных целей в настоящем изобретении предусмотрен Lactobacillus plantarum IM76 (депозитарий: Корейский центр культур микроорганизмов (KCCM), дата депонирования: 20 января 2017 года, и регистрационный номер: KCCM11962P).
Lactobacillus plantarum IM76 по настоящему изобретению характеризуется тем, что является новой молочнокислой бактерией Lactobacillus plantarum, выделенной и идентифицированной из кимчхи, которое является традиционным ферментированным пищевым продуктом.
Последовательность 16S rDNA для идентификации и классификации Lactobacillus plantarum IM76 по настоящему изобретению является такой же, как и последовательность под SEQ ID NO: 2, которая прилагается к настоящему описанию. Таким образом, Lactobacillus plantarum IM76 KCCM11962P по настоящему изобретению может содержать последовательность 16S rDNA под SEQ ID NO: 2.
Как видно из результата анализа указанной последовательности 16S rDNA под SEQ ID NO: 2, такая последовательность была на 99% гомологична последовательности известных штаммов Lactobacillus plantarum, что демонстрирует наивысшее молекулярно-филогенетическое родство с Lactobacillus plantarum. Таким образом, указанная молочнокислая бактерия была идентифицирована как Lactobacillus plantarum, затем получила название Lactobacillus plantarum IM76, а затем была депонирована в KCCM 20 января 2017 года (регистрационный номер: KCCM11962P).
В настоящем изобретении указанный Lactobacillus plantarum IM76 в качестве источника углерода может использовать L-арабинозу, D-рибозу, D-галактозу, D-глюкозу, D-фруктозу, D-маннозу, маннит, сорбит, N-ацетилглюкозамин, амигдалин, арбутин, эскулин, салицин, целлобиозу, мальтозу, лактозу, мелибиозу, сахарозу, трегалозу, рафинозу, гентиобиозу, D-туранозу и глюконат.
В другом аспекте для достижения указанных целей в настоящем изобретении предусмотрена фармацевтическая композиция для предупреждения или лечения аллергических заболеваний, содержащая Bifidobacterium longum IM55 KCCM11961P, Lactobacillus plantarum IM76 KCCM11962P или их смеси.
В настоящем изобретении термин «аллергическое заболевание» означает заболевание, нарушение или ненормальное состояние, которое индуцируется гиперергией к определенному материалу человеческого организма, то есть чрезмерной реакцией иммунной системы на привнесенный извне материал. Указанный привнесенный извне материал может быть аллергеном, т. е. антигеном, который становится причиной аллергического заболевания. Указанная аллергия может означать реакцию гиперчувствительности, вызываемую таким образом, что посредством привнесенного извне материала высвобождается такой медиатор воспаления, как гистамин, и таким образом это приводит к появлению заболевания, и указанная реакция гиперчувствительности может быть реакцией гиперчувствительности 1-го типа, реакцией гиперчувствительности 2-го типа, реакцией гиперчувствительности 3-го типа или реакцией гиперчувствительности 4-го типа. В настоящем изобретении указанное аллергическое заболевание может представлять собой заболевание, вызванное IgE-опосредованной реакцией гиперчувствительности 1-го типа, и, в частности, оно может быть выбрано из группы, состоящей из ринита, атопии, астмы, атопического дерматита, аллергического конъюнктивита, аллергического отита среднего уха, крапивницы и анафилактического шока. Более конкретно, указанное аллергическое заболевание в настоящем изобретении может представлять собой ринит, атопию или астму.
Помимо эффекта контроля, предупреждения, облегчения тяжести и лечения описанных выше аллергических заболеваний композиция по настоящему изобретению также демонстрирует отличный эффект при контроле, предупреждении, облегчении тяжести и лечении аллергических заболеваний и их осложнений путем нормализации микроорганизмов кишечника, модифицированных вследствие аллергических заболеваний.
«Bifidobacterium longum IM55» по настоящему изобретению является таким, как описано выше.
В частности, Bifidobacterium longum IM55, содержащийся в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, может представлять собой его живую клетку, его неживую клетку, продукт его культивирования, его лизат или его экстракт, но можно без ограничения использовать любую форму Bifidobacterium longum IM55 при условии, что он может оказывать превентивный или терапевтический эффект при аллергических заболеваниях.
«Lactobacillus plantarum IM76» по настоящему изобретению является таким, как описано выше.
В частности, Lactobacillus plantarum IM76, содержащийся в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, может представлять собой его живую клетку, его неживую клетку, продукт его культивирования, его лизат или его экстракт, но можно без ограничения использовать любую форму Lactobacillus plantarum IM76 при условии, что он может оказывать превентивный или терапевтический эффект при аллергических заболеваниях.
В настоящем изобретении смесь Bifidobacterium longum IM55 и Lactobacillus plantarum IM76 может быть смешана в диапазоне, который позволяет достичь эффекта предупреждения или лечения аллергических заболеваний, и указанное соотношение смеси может находиться в диапазоне без ограничения от 10:1 до 1:10. В частности, соотношение Bifidobacterium longum IM55 и Lactobacillus plantarum IM76 может составлять 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9 или 1:10. Их смесь демонстрирует существенный эффект предупреждения или лечения аллергических заболеваний в результате синергического эффекта, в основе которого лежит смешивание таких молочнокислых бактерий.
В настоящем изобретении термин «живая клетка» означает собственно новую молочнокислую бактерию по настоящему изобретению; «неживая клетка» означает молочнокислую бактерию, которая простерилизована посредством нагревания, повышения давления, обработки лекарственными средствами или др.; и «лизат» означает молочнокислую бактерию, которая разрушена посредством ферментативной обработки, гомогенизации, ультразвуковой обработки или др. Также, в настоящем изобретении термин «экстракт» означает продукт, полученный в результате проведения экстракции молочнокислых бактерий с помощью известного экстракционного раствора.
В настоящем изобретении термин «продукт культивирования» означает продукт, полученный путем культивирования молочнокислых бактерий в известной среде, и указанный продукт может включать новые молочнокислые бактерии. Указанная среда может быть выбрана из известной жидкой среды или твердой среды и может без ограничения представлять собой, например, жидкую среду MRS, жидкую среду GAM, агаровую среду MRS, агаровую среду GAM или агаровую среду BL.
Также, в настоящем изобретении термин «предупреждение» означает все действия, которые ингибируют симптом аллергических заболеваний или задерживают его прогрессирование при введении фармацевтической композиции по настоящему изобретению.
Также, в настоящем изобретении термин «лечение» означает все действия, которые улучшают или благоприятным образом изменяют симптом аллергических заболеваний при введении фармацевтической композиции по настоящему изобретению.
Содержание новых молочнокислых бактерий и т. д., которые являются эффективным компонентом фармацевтической композиции по настоящему изобретению, можно регулировать в различных диапазонах в зависимости от конкретной формы композиции и ее назначения или аспекта ее применения. В фармацевтической композиции по настоящему изобретению содержание эффективного компонента не сильно ограничено и может составлять, например, от 0,01 до 99 вес. %, в частности от 0,1 до 75 вес. %, и, более конкретно, от 0,5 до 50 вес. % в пересчете на общий вес композиции.
Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может дополнительно содержать по меньшей мере один известный эффективный компонент, обладающий иммунорегуляторным эффектом, эффектом ингибирования воспалительных реакций и эффектом предупреждения или лечения аллергических заболеваний (например, астмы, ринита, атопического дерматита и т. д.).
В частности, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может дополнительно содержать по меньшей мере одно вещество, выбранное из группы, включающей хитозан, инулин и цитрусовый пектин.
В фармацевтической композиции по настоящему изобретению содержатся указанные хитозан, инулин, цитрусовый пектин или смеси по меньшей мере двух из них, и, следовательно, они могут выступать в качестве пребиотиков при достижении новыми молочнокислыми бактериями эффекта предупреждения и лечения аллергических заболеваний.
Также, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может дополнительно содержать добавки, такие как фармацевтически приемлемые носители, в дополнение к новым молочнокислым бактериям, которые являются эффективным компонентом. Носитель, который может содержаться в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, включает без ограничения лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбит, маннит, ксилит, эритрит, мальтит, крахмал, аравийскую камедь, альгинат, желатин, фосфат кальция, силикат кальция, целлюлозу, метилцеллюлозу, микрокристаллическую целлюлозу, поливинилпирролидон, воду, метилгидроксибензоат, пропилгидроксилбензоат, тальк, стеарат магния, минеральное масло и др.
Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть составлена в виде лекарственной формы для перорального введения или лекарственной формы для парентерального введения с помощью традиционного способа и может быть составлена с применением разбавителей или вспомогательных веществ, таких как наполнители, сухие разбавители, связующие, увлажнители, разрыхлители, поверхностно-активные вещества и т. п., которые обычно применяются для составления в препарат.
При составлении в твердый препарат для перорального введения к фармацевтической композиции по настоящему изобретению можно отнести препараты в форме таблеток, пилюль, порошка, гранул, капсул и т. п., и такой твердый препарат может содержать по меньшей мере одно вспомогательное вещество, например крахмал, карбонат кальция, сахарозу, лактозу, желатин или др., в его эффективном компоненте. Также, помимо простых вспомогательных веществ твердый препарат может содержать смазывающие вещества и т. п., такие как без ограничения стеарат магния и тальк.
При составлении в жидкий препарат для перорального введения фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может содержать суспендирующие средства, жидкость для приема внутрь, эмульсию, сироп и др., а также может содержать различные вспомогательные вещества, например без ограничения увлажнители, подсластители, ароматизаторы, консерванты и т. д., в дополнение к воде и жидкому парафину, которые зачастую применяют в качестве простых разбавителей.
При составлении в препарат для парентерального введения фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может содержать стерилизованный водный раствор, неводный растворитель, суспендирующие средства, эмульсию, лиофилизированные препараты или суппозитории. В качестве неводного растворителя и суспендирующего растворителя можно включить без ограничения следующие вещества: пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительное масло, такое как оливковое масло, подходящий для инъекции сложный эфир, такой как этилолеат, и т. д. В качестве основы для суппозиториев можно использовать следующие вещества: витепсол, макрогол, твин 61, масло какао, лаурин, глицерожелатин и т. д.
Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно вводить перорально или парентерально млекопитающим, в том числе людям, в соответствии с предполагаемым способом. В качестве способа парентерального введения задействуют способы наружного применения на коже, внутрибрюшинной инъекции, ректальной инъекции, подкожной инъекции, внутривенной инъекции, внутримышечной инъекции, интраторакальной инъекции или т. п. Доза фармацевтической композиции по настоящему изобретению не сильно ограничена, при условии, что ее количество является фармацевтически эффективным, и ее диапазон варьирует в зависимости от веса пациента, его возраста, пола, состояния здоровья, рациона, времени введения, способа введения, скорости выведения и тяжести заболевания. Обычная суточная доза фармацевтической композиции по настоящему изобретению не сильно ограничена, но может составлять, в частности, от 0,1 до 3000 мг/кг и, более конкретно, от 0,5 до 2000 мг/кг в пересчете на эффективный компонент и ее можно вводить один раз в день или разделить на несколько приемов в день.
Указанное «фармацевтически эффективное количество» означает количество, достаточное для лечения заболевания с приемлемым соотношением польза/риск, применимым к медицинскому лечению, и его можно определить на основании факторов, в том числе типа заболевания, степени тяжести, активности лекарственного средства, чувствительности к лекарственному средству, времени введения, пути введения, скорости выведения, периода лечения и параллельно применяемого лекарственного средства, а также других факторов, хорошо известных в области фармацевтики.
Указанное «введение» означает введение индивидууму любым подходящим способом заранее определенного количества фармацевтической композиции по настоящему изобретению. В этом случае индивидуум относится к животным и, как правило, может быть млекопитающим, на которого лечение с применением новых молочнокислых бактерий по настоящему изобретению может оказывать благоприятный эффект. Предпочтительный пример такого индивидуума может включать приматов, таких как люди. Также, к такому индивидууму можно отнести всех индивидуумов, имеющих симптом аллергических заболеваний или имеющих риск получения такого симптома.
Дополнительно, в другом аспекте для достижения указанных целей в настоящем изобретении предусмотрена пищевая композиция для предупреждения или облегчения тяжести аллергических заболеваний, содержащая Bifidobacterium longum IM55 KCCM11961P, Lactobacillus plantarum IM76 KCCM11962P или их смеси.
В настоящем изобретении термины «Bifidobacterium longum IM55», «Lactobacillus plantarum IM76», «аллергическое заболевание» и т. п. имеют то же значение, что описано выше.
Пищевую композицию по настоящему изобретению можно применять в качестве функционального пищевого продукта для здорового питания. Упомянутый «функциональный пищевой продукт для здорового питания» означает пищевой продукт, приготовленный и обработанный с применением сырьевого материала или компонента, которые обладают функциональной возможностью, полезной для организма человека в соответствии с Актами о функциональных пищевых продуктах для здорового питания (Health Functional Food Acts), а «функциональная возможность» означает употребление такого пищевого продукта с целью регулирования уровня питательных веществ относительно структур и функций организма человека или получения эффекта, полезного для состояния здоровья, такого как физиологическое действие и т. д.
Пищевая композиция по настоящему изобретению может содержать обычные пищевые добавки, и решение, является ли определенный элемент подходящим в качестве указанных «пищевых добавок» или нет, принимают на основе характеристик и стандартов для такого элемента в соответствии с общими правилами, другими общими способами тестирования, а также с Кодексом пищевых добавок, одобренным Министерством по безопасности пищевых продуктов и лекарственных средств, если отсутствуют другие нормативы.
В качестве элементов, перечисленных в указанном «Кодексе пищевых добавок», могут быть, например, химические соединения, такие как кетоны, глицин, цитрат калия, никотиновая кислота, коричная кислота и т. д.; естественные добавки, такие как краситель полученный из хурмы, экстракт солодки, кристаллическая целлюлоза, краситель, полученный из гаоляна, гуаровая камедь и т. д.; и смешанные составы, такие как состав с L-глутаматом натрия, щелочные добавки для лапши, состав из консервантов, состав из смол и т. д.
Пищевая композиция по настоящему изобретению может содержать Bifidobacterium longum IM55, Lactobacillus plantarum IM76 или их смеси в количестве от 0,01 до 99 вес. %, в частности, от 0,1 до 75 вес. % и, более конкретно, от 0,5 до 50 вес. % в пересчете на общий вес композиции.
Также, пищевая композиция по настоящему изобретению может быть приготовлена и переработана в форму таблетки, капсулы, порошка, гранулы, жидкости, пилюли и т. д., предназначенных для предупреждения и/или облегчения тяжести аллергических заболеваний.
Например, пищевую композицию в указанной форме таблетки можно приготовить путем гранулирования Bifidobacterium longum IM55, Lactobacillus plantarum IM76 или их смесей и смесей вспомогательных веществ, связующих, разрыхлителей и других добавок с помощью традиционного способа; затем внося туда смазывающие вещества и т. д.; а затем производя формование прессованием, или можно приготовить путем непосредственного внесения указанных смесей в установку для формования прессованием. Также, функциональный пищевой продукт для здорового питания в указанной форме таблетки при необходимости может содержать корригирующее вещество и т. д. и при необходимости может быть покрыт соответствующим покрывающим средством.
Из пищевых композиций в форме капсулы препарат в форме твердой капсулы можно приготовить путем внесения Bifidobacterium longum IM55, Lactobacillus plantarum IM76 либо их смесей и смесей добавок, таких как вспомогательные вещества и т. д., или их гранул либо гранул с покрытием в обычную твердую капсулу, а препарат в форме мягкой капсулы можно приготовить путем внесения Bifidobacterium longum IM55, Lactobacillus plantarum IM76 либо их смесей и смесей добавок, таких как вспомогательные вещества и т. д., в основу капсулы с желатином и т. д. При необходимости указанный препарат в форме мягкой капсулы может содержать пластификаторы, красители, консерванты и т. д., такие как глицерин, сорбит или др.
при необходимости
Пищевую композицию в форме пилюли можно составить путем формования Bifidobacterium longum IM55, Lactobacillus plantarum IM76 или их смесей и смесей вспомогательных веществ, связующих, разрыхлителей и т. д. посредством соответствующего способа и можно нанести на нее покрытие из белого сахара или других подходящих формирующих покрытие средств или можно покрыть формирующим покрытие пилюли средством с применением, , крахмала, талька или соответствующих материалов.
Пищевую композицию в форме гранулы можно приготовить в гранулированной форме с Bifidobacterium longum IM55, Lactobacillus plantarum IM76 или их смесями и смесями вспомогательных веществ, связующих, разрыхлителей и т. д. посредством подходящего способа, и, при необходимости, она может содержать ароматизаторы, корригирующее вещество и т. д. При проведении последующего гранулометрического теста на функциональном пищевом продукте для здорового питания в форме гранул с ситами № 12 (1680 мкм), № 14 (1410 мкм) и № 45 (350 мкм) все количество проходит через сито № 12, 5% или меньше от общего количества остаются на сите № 14, и 15,0% или меньше от общей суммы может пройти через сито № 45.
Определение таких терминов, как указанные вспомогательные вещества, связующие, разрыхлители, скользящие вещества, корригирующее вещество, ароматизаторы и т. д., включает таковые, которые имеют такие же или схожие функции, как и у описанных в документах, известных из уровня техники (пояснительное издание Корейской фармакопеи, Munseong Publishing, the Korean Association of Colleges of Pharmacy, the 5th revised edition, p33-48, 1989).
Тип указанного пищевого продукта особо не ограничен. В качестве примера пищевого продукта, к которому можно добавить экстракт по настоящему изобретению, можно привести напитки, жевательные резинки, витаминные комплексы, питьевые продкты и т. д., в том числе пищевые композиции в традиционном смысле, в частности, функциональные пищевые продукты для здорового питания.
Более того, в другом аспекте для достижения указанных целей в настоящем изобретении предусмотрена фармацевтическая композиция для предупреждения или лечения иммунопатологических заболеваний или воспалительных заболеваний, содержащая Bifidobacterium longum IM55 KCCM11961P, Lactobacillus plantarum IM76 KCCM11962P или их смеси.
В настоящем изобретении термины, относящиеся к фармацевтической композиции, содержащей «Bifidobacterium longum IM55» и «Lactobacillus plantarum IM76», являются такими же, как описано выше.
В настоящем изобретении термин «иммунопатологическое заболевание» означает заболевание, которое становится проблематичным при возникновении определенной иммунной реакции и, в частности, может представлять собой без ограничения аутоиммунное заболевание, отторжение трансплантата или болезнь «трансплантат против хозяина». Аутоиммунное заболевание может представлять собой болезнь Крона, эритему, ревматоидный артрит, тиреоидит Хашимото, пернициозную анемию, болезнь Аддисона, диабет 1-го типа, волчанку, синдром хронической усталости, синдром фибромиалгии, гипотиреоз и гипертиреоз, склеродермию, болезнь Бехчета, воспалительное заболевание кишечника, рассеянный склероз, миастению гравис, синдром Меньера, синдром Гийена-Барре, синдром Шегрена, лейкоплакию, эндометриоз, псориаз, лейкоплакию, системную склеродермию, астму, язвенный колит или др.
В настоящем изобретении термин «воспалительное заболевание» в совокупности означает заболевания, при которых основным участком поражения являются воспалительные очаги. Воспалительное заболевание по настоящему изобретению может представлять собой по меньшей мере одно, выбранное из группы, включающей артрит, подагру, гепатит, ожирение, кератит, гастрит, энтерит, нефрит, колит, диабет, туберкулез, бронхит, плеврит, перитонит, спондилит, панкреатит, воспалительную боль, уретрит, цистит, вагинит, атеросклероз, септицемию, ожог, дерматит, периодонтит и гингивит. В частности, указанное воспалительное заболевание может представлять собой колит.
Помимо эффекта контроля, предупреждения, облегчения тяжести и лечения описанных выше воспалительных заболеваний композиция по настоящему изобретению также демонстрирует отличный эффект при контроле, предупреждении, облегчении тяжести и лечении воспалительных заболеваний и их осложнений путем нормализации микроорганизмов кишечника, которые модифицированы вследствие воспалительных заболеваний.
Более того, в другом аспекте для достижения указанных целей в настоящем изобретении предусмотрена пищевая композиция для предупреждения или облегчения тяжести иммунопатологических заболеваний или воспалительных заболеваний, содержащая Bifidobacterium longum IM55 KCCM11961P, Lactobacillus plantarum IM76 KCCM11962P или их смеси.
В настоящем изобретении термины, относящиеся к пищевой композиции, содержащей «Bifidobacterium longum IM55» и «Lactobacillus plantarum IM76», являются такими же, как описано выше.
Помимо этого, в другом аспекте для достижения указанных целей в настоящем изобретении предусмотрен способ предупреждения или лечения аллергических заболеваний, включающий стадию введения индивидууму Bifidobacterium longum IM55 KCCM11961P, Lactobacillus plantarum IM76 KCCM11962P или их смесей.
В настоящем изобретении такие термины, как «Bifidobacterium longum IM55», «Lactobacillus plantarum IM76», «введение», «индивидуум», «аллергическое заболевание» и т. п., имеют то же значение, что описано выше.
В дополнение, в другом аспекте для достижения указанных целей в настоящем изобретении предусмотрено применение Bifidobacterium longum IM55 KCCM11961P, Lactobacillus plantarum IM76 KCCM11962P или их смесей при предупреждении или лечении аллергических заболеваний.
Также, в другом аспекте для достижения указанных целей в настоящем изобретении предусмотрено применение Bifidobacterium longum IM55 KCCM11961P, Lactobacillus plantarum IM76 KCCM11962P или их смесей при получении лекарственного средства для предупреждения или лечения аллергических заболеваний.
Дополнительно, в другом аспекте для достижения указанных целей в настоящем изобретении предусмотрена композиция, содержащая Bifidobacterium longum IM55 KCCM11961P, Lactobacillus plantarum IM76 KCCM11962P или их смеси, для применения при предупреждении или лечении аллергических заболеваний.
Более того, в другом аспекте для достижения указанных целей в настоящем изобретении предусмотрен способ предупреждения или лечения иммунопатологических заболеваний или воспалительных заболеваний, включающий стадию введения индивидууму Bifidobacterium longum IM55 KCCM11961P, Lactobacillus plantarum IM76 KCCM11962P или их смесей.
В настоящем изобретении такие термины, как «Bifidobacterium longum IM55», «Lactobacillus plantarumIM76», «введение», «индивидуум», «иммунопатологическое заболевание», «воспалительное заболевание» и т. п., имеют то же значение, что описано выше.
Более того, в другом аспекте для достижения указанных целей в настоящем изобретении предусмотрено применение Bifidobacterium longum IM55 KCCM11961P, Lactobacillus plantarum IM76 KCCM11962P или их смесей при предупреждении или лечении иммунопатологических заболеваний или воспалительных заболеваний.
Помимо этого, в другом аспекте для достижения указанных целей в настоящем изобретении предусмотрено применение Bifidobacterium longum IM55 KCCM11961P, Lactobacillus plantarum IM76 KCCM11962P или их смесей при получении лекарственного средства для предупреждения или лечения иммунопатологических заболеваний или воспалительных заболеваний.
В дополнение, в другом аспекте для достижения указанных целей в настоящем изобретении предусмотрена композиция, содержащая Bifidobacterium longum IM55 KCCM11961P, Lactobacillus plantarum IM76 KCCM11962P или их смеси, для применения при предупреждении или лечении иммунопатологических заболеваний или воспалительных заболеваний.
Преимущественные эффекты
Bifidobacterium longum IM55 или Lactobacillus plantarum IM76 по настоящему изобретению является безопасным без токсичности для организма человека, обладает превосходными физиологическими активностями, такими как иммунорегуляторный эффект и эффект ингибирования воспалительных реакций, и имеет эффект нормализации микроорганизмов кишечника. Таким образом, Bifidobacterium longum IM55, Lactobacillus plantarum IM76 или их смеси можно применять в качестве материала для предупреждения, облегчения тяжести или лечения не только аллергических заболеваний, но также и иммунопатологических заболеваний и воспалительных заболеваний.
Краткое описание графических материалов
5
5
На фиг. 1 представлен график, на котором видно, что концентрация IL-10 повышается при обработке макрофагов с помощью Bifidobacterium longum IM55 или Lactobacillus plantarum IM76 (NOR - нормальная контрольная группа; LPS - группа с индуцированными воспалительными реакциями; I55 - группа с индуцированными воспалительными реакциями + введенная доза Bifidobacterium longum IM55 в количестве 1×10 КОЕ/мл; и I76 - группа с индуцированными воспалительными реакциями + введенная доза Lactobacillus plantarum IM76 в количестве 1×10 КОЕ/мл далее обозначают то же самое на фиг. 2-4).
На фиг. 2 представлен график, на котором видно, что концентрация IL-12 снижается при обработке макрофагов с помощью Bifidobacterium longum IM55 или Lactobacillus plantarum IM76.
На фиг. 3 представлен график, на котором видно, что концентрация IL-10 повышается при обработке дендроцитов с помощью Bifidobacterium longum IM55 или Lactobacillus plantarum IM76.
На фиг. 4 представлен график, на котором видно, что концентрация TNF-α снижается при обработке дендроцитов с помощью Bifidobacterium longum IM55 или Lactobacillus plantarum IM76.
5
5
На фиг. 5 представлен график, на котором видно, что уровень экспрессии GATA3 ингибируется в результате обработки с помощью Bifidobacterium longum IM55 или Lactobacillus plantarum IM76 при индуцировании дифференцировки Т-клеток в Th2-клетки (NOR - нормальная контрольная группа; ThI - группа с введенной дозой индуктора цитодифференцировки в Th2; I55 - группа с индуцированной цитодифференцировкой в Th2 + введенная доза Bifidobacterium longum IM55 в количестве 1×10 КОЕ/мл; и I76 - группа с индуцированной цитодифференцировкой в Th2 + введенная доза Lactobacillus plantarum IM76 в количестве 1×10 КОЕ/мл далее обозначают то же самое на фиг. 6).
На фиг. 6 представлен график, на котором видно, что уровень экспрессии IL-5 ингибируется в результате обработки с помощью Bifidobacterium longum IM55 или Lactobacillus plantarum IM76 при индуцировании дифференцировки Т-клеток в Th2-клетки.
5
5
На фиг. 7 представлен график, на котором видно, что уровень экспрессии FOXp3 увеличивается в результате обработки с помощью Bifidobacterium longum IM55 или Lactobacillus plantarum IM76 при индуцировании дифференцировки Т-клеток в Treg-клетки (NOR - нормальная контрольная группа; TrI - группа с введенной дозой индуктора цитодифференцировки в Treg; I55 - группа с индуцированной цитодифференцировкой в Treg + введенная доза Bifidobacterium longum IM55 в количестве 1×10 КОЕ/мл; и I76 - группа с индуцированной цитодифференцировкой в Treg + введенная доза Lactobacillus plantarum IM76 в количестве 1×10 КОЕ/мл далее обозначают то же самое на фиг. 8).
На фиг. 8 представлен график, на котором видно, что уровень экспрессии IL-10 увеличивается в результате обработки с помощью Bifidobacterium longum IM55 или Lactobacillus plantarum IM76 при индуцировании дифференцировки Т-клеток в Treg-клетки.
9
9
На фиг. 9 представлен график, на котором видно, что концентрация IL-5 в сыворотке снижается при введении Bifidobacterium longum IM55 или Lactobacillus plantarum IM76 в животную модель с индуцированными аллергическим ринитом и астмой (NOR - нормальная контрольная группа (которой перорально вводили только PBS); CON или AR - группа с индуцированным заболеванием; DX - группа с индуцированным заболеванием + введенная внутрибрюшинно доза дексаметазона в количестве 1 мг/кг по весу; I55 - группа с индуцированным заболеванием + введенная перорально доза Bifidobacterium longum IM55 в количестве 1×10 КОЕ/мышь; и I76 - группа с индуцированным заболеванием + введенная перорально доза Lactobacillus plantarum IM76 в количестве 1×10 КОЕ/мышь далее обозначают то же самое на фиг. 10-17).
На фиг. 10 представлен график, на котором видно, что концентрация IgE в сыворотке снижается при введении Bifidobacterium longum IM55 или Lactobacillus plantarum IM76 в животную модель с индуцированными аллергическим ринитом и астмой.
На фиг. 11 представлен график, на котором видно, что концентрация IL-4 в сыворотке снижается при введении Bifidobacterium longum IM55 или Lactobacillus plantarum IM76 в животную модель с индуцированными аллергическим ринитом и астмой.
На фиг. 12 представлен график, на котором видно, что концентрация IL-5 в жидкости бронхоальвеолярного лаважа (BALF) снижается при введении Bifidobacterium longum IM55 или Lactobacillus plantarum IM76 в животную модель с индуцированными аллергическим ринитом и астмой.
На фиг. 13 представлен график, на котором видно, что концентрация IL-4 в BALF снижается при введении Bifidobacterium longum IM55 или Lactobacillus plantarum IM76 в животную модель с индуцированными аллергическим ринитом и астмой.
На фиг. 14 представлен график, на котором видно, что скорость распределения Th2-клеток в BALF снижается при введении Bifidobacterium longum IM55 или Lactobacillus plantarum IM76 в животную модель с индуцированными аллергическим ринитом и астмой.
На фиг. 15 представлен график, на котором видно, что скорость распределения эозинофилов в BALF снижается при введении Bifidobacterium longum IM55 или Lactobacillus plantarum IM76 в животную модель с индуцированными аллергическим ринитом и астмой.
На фиг. 16 представлен график, на котором видно, что концентрация IL-10 в BALF повышается при введении Bifidobacterium longum IM55 или Lactobacillus plantarum IM76 в животную модель с индуцированными аллергическим ринитом и астмой.
На фиг. 17 представлен график, на котором видно, что скорость распределения Treg-клеток в BALF повышается при введении Bifidobacterium longum IM55 или Lactobacillus plantarum IM76 в животную модель с индуцированными аллергическим ринитом и астмой.
9
9
На фиг. 18 представлен график, на котором видно, что показатель симптомов ринита (чихание и трение носа) снижается при введении Bifidobacterium longum IM55 или Lactobacillus plantarum IM76 в животную модель с индуцированными аллергическим ринитом и астмой (NOR - нормальная контрольная группа (которой перорально вводили только PBS); AR - группа с индуцированным заболеванием; DX - группа с индуцированным заболеванием + введенная внутрибрюшинно доза дексаметазона в количестве 1 мг/кг по весу; I55 - группа с индуцированным заболеванием + введенная перорально доза Bifidobacterium longum IM55 в количестве 1×10 КОЕ/мышь; и I76 - группа с индуцированным заболеванием + введенная перорально доза Lactobacillus plantarum IM76 в количестве 1×10 КОЕ/мышь далее обозначают то же самое на фиг. 19-26).
На фиг. 19 представлен график, на котором видно, что концентрация IL-4 в носовой полости снижается при введении Bifidobacterium longum IM55 или Lactobacillus plantarum IM76 в животную модель с индуцированными аллергическим ринитом и астмой.
На фиг. 20 представлен график, на котором видно, что концентрация IL-5 в носовой полости снижается при введении Bifidobacterium longum IM55 или Lactobacillus plantarum IM76 в животную модель с индуцированными аллергическим ринитом и астмой.
На фиг. 21 представлен график, на котором видно, что нарушение функции носовой полости и увеличение размеров эпителиальных клеток в носовой полости снижаются при введении Bifidobacterium longum IM55 или Lactobacillus plantarum IM76 в животную модель с индуцированными аллергическим ринитом и астмой.
На фиг. 22 представлен график, на котором видно, что уровень экспрессии GATA3 в легочных тканях снижается при введении Bifidobacterium longum IM55 или Lactobacillus plantarum IM76 в животную модель с индуцированными аллергическим ринитом и астмой.
На фиг. 23 представлен график, на котором видно, что уровень экспрессии IL-10 в легочных тканях повышается при введении Bifidobacterium longum IM55 или Lactobacillus plantarum IM76 в животную модель с индуцированными аллергическим ринитом и астмой.
На фиг. 24 представлен график, на котором видно, что уровень экспрессии FOXp3 в легочных тканях повышается при введении Bifidobacterium longum IM55 или Lactobacillus plantarum IM76 в животную модель с индуцированными аллергическим ринитом и астмой.
На фиг. 25 представлен график, на котором видно, что уровень экспрессии IL-5 в легочных тканях снижается при введении Bifidobacterium longum IM55 или Lactobacillus plantarum IM76 в животную модель с индуцированными аллергическим ринитом и астмой.
На фиг. 26 представлен график, на котором видно, что степень индуцирования воспаления и отечности в легочных тканях снижается при введении Bifidobacterium longum IM55 или Lactobacillus plantarum IM76 в животную модель с индуцированными аллергическим ринитом и астмой.
9
9
9
На фиг. 27 представлен график, на котором видно, что показатель симптомов ринита (чихание и трение носа) и концентрация IL-5 в носовой полости снижаются при введении смеси Bifidobacterium longum IM55 и Lactobacillus plantarum IM76 (в соотношении 1:1, 1:3 и 1:9) в животную модель с индуцированными аллергическим ринитом и астмой (NOR - нормальная контрольная группа (которой перорально вводили только PBS); AR - группа с индуцированным заболеванием; DX - группа с индуцированным заболеванием + введенная внутрибрюшинно доза дексаметазона в количестве 1 мг/кг по весу; 1:1 - группа, которой вводили перорально дозу смеси Bifidobacterium longum IM55 и Lactobacillus plantarum IM76 в соотношении 1:1 (всего 1×10 КОЕ/мышь); 1:3 - группа, которой вводили перорально дозу смеси Bifidobacterium longum IM55 и Lactobacillus plantarum IM76 в соотношении 1:3 (всего 1×10 КОЕ/мышь); и 1:9 - группа, которой вводили перорально дозу смеси Bifidobacterium longum IM55 и Lactobacillus plantarum IM76 в соотношении 1:9 (всего 1×10 КОЕ/мышь) далее обозначают то же самое на фиг. 28).
На фиг. 28 представлен график, на котором видно, что уровень экспрессии IL-5 в сыворотке снижается при введении смеси Bifidobacterium longum IM55 и Lactobacillus plantarum IM76 (в соотношении 1:1, 1:3 или 1:9) в животную модель с индуцированными аллергическим ринитом и астмой.
9
9
8
На фиг. 29 представлен график, на котором видно, что концентрация IL-4 и IL-5 в толстой кишке снижается, а концентрация IL-10 в ней повышается при введении Bifidobacterium longum IM55, Lactobacillus plantarum IM76 или их смесей в животную модель с индуцированными аллергическим ринитом и астмой (NOR - нормальная контрольная группа (которой перорально вводили только PBS); AR - группа с индуцированным заболеванием; DX - группа с индуцированным заболеванием + введенная внутрибрюшинно доза дексаметазона в количестве 1 мг/кг по весу; I55 - группа с индуцированным заболеванием + введенная перорально доза Bifidobacterium longum IM55 в количестве 1×10 КОЕ/мышь; и I76 - группа с индуцированным заболеванием + введенная перорально доза Lactobacillus plantarum IM76 в количестве 1×10 КОЕ/мышь; и PM - группа с индуцированным заболеванием + введенная перорально доза Bifidobacterium longum IM55 и Lactobacillus plantarum IM76, каждого в количестве 5×10 КОЕ/мышь, далее обозначают то же самое на фиг. 30).
На фиг. 30 представлен график, на котором видно, что состав микроорганизмов кишечника изменяется при введении Bifidobacterium longum IM55, Lactobacillus plantarum IM76 или их смесей в животную модель с индуцированными аллергическим ринитом и астмой.
Принцип изобретения
Далее настоящее изобретение будет описано более подробно с помощью иллюстративных вариантов осуществления. Тем не менее, последующие иллюстративные варианты осуществления предложены только для дополнительной ясной иллюстрации технических признаков настоящего изобретения, но их не следует истолковывать как ограничивающие объем защиты настоящего изобретения.
Пример 1. Выделение и идентификация молочнокислых бактерий
(1) Выделение молочнокислых бактерий
Экскременты здорового человека мужского/женского пола возрастом 20 лет, живущего в Сеуле, или здорового человека мужского/женского пола возрастом 60 лет, живущего в Гурье, провинции Чолла-Намдо, или приготовленное дома кимчхи из капусты вносили в бульон GAM и суспендировали в нем (Nissui Pharmaceutical, Япония). После этого отбирали его надосадочную жидкость и пересаживали в агаровую среду MRS (Difco, США) или агаровую среду GAM (Nissui Pharmaceutical, Япония). Полученную в результате среду культивировали в анаэробных условиях при 37°С в течение приблизительно 48 часов, после чего из нее выделяли штаммы Lactobacillus spp. и штаммы Bifidobacterium spp., образовавшие колонии.
(2) Идентификация выделенных молочнокислых бактерий
Для штаммов, выделенных из человеческих экскрементов или кимчхи из капусты, подтверждали их виды и давали им названия в соответствии с окрашиванием по Граму, физиологическими характеристиками, последовательностями 16S rDNA и др. у этих штаммов. Административные номера и названия штаммов, присвоенные выделенным молочнокислым бактериям, приведены в приведенных далее таблицах 1 и 2. Молочнокислые бактерии, выделенные из человеческих экскрементов, представляли собой 15 видов Bifidobacterium longum (учетные №№ 51-65 из таблицы 1), 10 видов Bifidobacterium adolescentis (учетные №№ 66-75 из таблицы 1) и 10 видов Lactobacillus acidophilus (учетные №№ 90-99 из таблицы 2), тогда как молочнокислые бактерии, выделенные из кимчхи из капусты представляли собой 14 видов Lactobacillus plantarum (учетные №№ 76-89 из таблицы 2).
Таблица 1
Учетный №
Название штамма
Учетный №
Название штамма
51
Bifidobacterium longum IM51
64
Bifidobacterium longum IM64
52
Bifidobacterium longum IM52
65
Bifidobacterium longum IM65
53
Bifidobacterium longum IM53
66
Bifidobacterium adolescentis IM66
54
Bifidobacterium longum IM54
67
Bifidobacterium adolescentis IM67
55
Bifidobacterium longum IM55
68
Bifidobacterium adolescentis IM68
56
Bifidobacterium longum IM56
69
Bifidobacterium adolescentis IM69
57
Bifidobacterium longum IM57
70
Bifidobacterium adolescentis IM70
58
Bifidobacterium longum IM58
71
Bifidobacterium adolescentis IM71
59
Bifidobacterium longum IM59
72
Bifidobacterium adolescentis IM72
60
Bifidobacterium longum IM60
73
Bifidobacterium adolescentis IM73
61
Bifidobacterium longum IM61
74
Bifidobacterium adolescentis IM74
62
Bifidobacterium longum IM62
75
Bifidobacterium adolescentis IM75
63
Bifidobacterium longum IM63
Таблица 2
Учетный №
Название штамма
Учетный №
Название штамма
76
Lactobacillus plantarum IM76
88
Lactobacillus plantarum IM88
77
Lactobacillus plantarum IM77
89
Lactobacillus plantarum IM89
78
Lactobacillus plantarum IM78
90
Lactobacillus acidophilus IM90
79
Lactobacillus plantarum IM79
91
Lactobacillus acidophilus IM91
80
Lactobacillus plantarum IM80
92
Lactobacillus acidophilus IM92
81
Lactobacillus plantarum IM81
93
Lactobacillus acidophilus IM93
82
Lactobacillus plantarum IM82
94
Lactobacillus acidophilus IM94
83
Lactobacillus plantarum IM83
95
Lactobacillus acidophilus IM95
84
Lactobacillus plantarum IM84
96
Lactobacillus acidophilus IM96
85
Lactobacillus plantarum IM85
97
Lactobacillus acidophilus IM97
86
Lactobacillus plantarum IM86
98
Lactobacillus acidophilus IM98
87
Lactobacillus plantarum IM87
99
Lactobacillus acidophilus IM99
Среди штаммов, описанных в приведенной выше таблице 1, было идентифицировано, что Bifidobacterium longum IM55 является грамположительной бациллой, которая не проявляет каталазную активность и не имеет споры. Также было показано, что 16S rDNA Bifidobacterium longum IM55 имеет последовательность под SEQ ID NO: 1. В результате сравнения последовательностей 16S rDNA Bifidobacterium longum IM55 с помощью поиска с применением BLAST было показано, что штамм Bifidobacterium longum, имеющий такую же последовательность 16S rDNA, вообще не давал результатов при поиске и имел последовательность 16S rDNA, на 99% гомологичную последовательности 16S rDNA известного штамма Bifidobacterium longum. Также, среди физиологических характеристик Bifidobacterium longum IM55 анализировали доступность источника углерода с помощью теста на ферментацию сахара с применением набора API (название модели: API 20 strep; и производитель: BioMerieux’s, США), при этом его результаты показаны в приведенной далее таблице 3. В приведенной ниже таблице 3 «+» означает, что доступность источника углерода была положительной, а «-» означает, что доступность источника углерода была отрицательной.
Таблица 3
Источник углерода
Название штамма
Источник углерода
Название штамма
Bifidobacterium longum IM55
Bifidobacterium longum IM55
L-триптофан
-
Желатин
-
Мочевина
-
Цитрат железа с эскулином
+
D-глюкоза
+
Глицерин
-
D-маннит
+
D-целлобиоза
-
D-лактоза
+
D-манноза
-
D-сахароза
+
D-мелицитоза
-
D-мальтоза
+
D-рафиноза
+
Салицин
+
D-сорбит
+
D-ксилоза
+
D-рамноза
-
L-арабиноза
+
D-трегалоза
-
Среди штаммов, описанных в приведенной выше таблице 2, было установлено, что Lactobacillus plantarum IM76 был грамположительной бациллой. Также было показано, что 16S rDNA Lactobacillus plantarum IM76 имеет последовательность под SEQ ID NO: 2. В результате сравнения последовательностей 16S rDNA Lactobacillus plantarum IM76 с помощью поиска с применением BLAST было показано, что штамм Lactobacillus plantarum, имеющий такую же последовательность 16S rDNA, вообще не давал результатов при поиске, и такая последовательность была на 99% гомологична последовательности 16S rDNA известного штамма Lactobacillus plantarum. Также, среди физиологических характеристик Lactobacillus plantarum IM76 анализировали доступность источника углерода с помощью теста на ферментацию сахара с применением набора API (название модели: API 50 CHL; и производитель: BioMerieux’s, США), при этом его результаты показаны в приведенной далее таблице 4. В приведенной ниже таблице 4 «+» означает, что доступность источника углерода была положительной, а «-» означает, что доступность источника углерода была отрицательной.
Таблица 4
Источник углерода
Название штамма
Источник углерода
Название штамма
Lactobacillus plantarum IM76
Lactobacillus plantarum IM76
Глицерин
-
Салицин
+
Эритрит
-
Целлобиоза
+
D-арабиноза
-
Мальтоза
+
L-арабиноза
+
Лактоза
+
D-рибоза
+
Мелибиоза
+
D-ксилоза
-
Сахароза
+
L-ксилоза
-
Трегалоза
+
D-адонит
-
Инулин
-
Метил-β-D-ксилопиранозид
-
Мелецитоза
-
D-галактоза
+
Рафиноза
+
D-глюкоза
+
Крахмал
-
D-фруктоза
+
Гликоген
-
D-манноза
+
Ксилит
-
L-сорбоза
-
Гентиобиоза
+
L-рамноза
-
D-тураноза
+
Дульцит
-
D-ликсоза
-
Инозит
-
D-тагатоза
-
Маннит
+
D-фукоза
-
Сорбит
+
L-фукоза
-
α-метил-D-маннозид
-
D-арабит
-
α-метил-D-глюкозид
-
L-арабит
-
N-ацетилглюкозамин
+
Гюконат
+
Амигдалин
+
2-Кетоглюконат
-
Арбутин
+
5-Кетоглюконат
-
Эскулин
+
Пример 2. Тест на эффект ингибирования воспалительных реакций, вызываемый молочнокислыми бактериями
(1) Тест на эффект ингибирования воспалительных реакций, вызываемый молочнокислыми бактериями, на макрофагах
6
4
Шестинедельного самца мыши линии C57BL/6J (20-23 г) приобретали у Raonbio Co., Ltd. Мыши внутрибрюшинно вводили 2 мл стерилизованного 4% тиогликолята и спустя 96 часов ее анестезировали. После этого мыши внутрибрюшинно вводили 8 мкл среды RPMI 1640. Спустя 5-10 минут у мыши внутрибрюшинно экстрагировали среду RPMI (в том числе макрофаги), затем среду центрифугировали в условиях 1000 об./мин. в течение 10 минут, а затем дважды промывали, снова средой RPMI 1640. Макрофаги высевали в 24-луночный планшет в количестве 0,5×10 клеток на лунку, затем культивировали в течение 24 часов, а затем с него удаляли неприкрепившиеся клетки. Культуральную жидкость с макрофагами обрабатывали тестируемым материалом, т. е. молочнокислыми бактериями, а также индуктором воспалительной реакции, т. е. липополисахаридом (LPS), в течение 90 минут или 24 часов, а затем из них получали надосадочную жидкость и клетки. В этот момент времени концентрация молочнокислых бактерий, которыми производили обработку, составляла 1×10 КОЕ/мл. Также, для сравнения эффектов, оказываемых молочнокислыми бактериями, в качестве тестируемого материала использовали различные пребиотики.
Уровень экспрессии TNF-α из указанной полученной надосадочной жидкости измеряли с помощью набора для ELISA. Также, уровень экспрессии p65 (NF-κB), p-p65 (фосфор-NF-κB) и β-актина измеряли в указанных полученных клетках с помощью способа иммуноблоттинга. В частности, отбирали 50 мкг надосадочной жидкости и подвергали электрофорезу в SDS-содержащем 10% (мас./об.) полиакриламидном геле в течение одного с половиной часа. Подвергнутый электрофорезу образец переносили на нитроцеллюлозную бумагу в условиях 100 В и 400 мА в течение одного часа и 10 минут. Нитроцеллюлозную бумагу, на которую был перенесен образец, подвергали блокированию с помощью 5% обезжиренного молока в течение 30 минут, затем трижды промывали PBS-Tween в течение минут каждый раз, а затем подвергали реакции в течение ночи с добавлением первичных антител (Santa Cruz Biotechnology, США) в соотношении 1:100. После этого такую бумагу промывали три раза в течение десяти минут каждый раз и подвергали реакции с добавлением вторичных антител (Santa Cruz Biotechnology, США) в соотношении 1:1000 в течение одного часа и 20 минут. Затем такую бумагу промывали три раза в течение 15 минут каждый раз, затем давали сформироваться цвету флуоресценции, затем проявляли, а затем измеряли интенсивность хромофорной полосы. Результаты тестирования эффекта ингибирования воспалительной реакции, оказываемого молочнокислыми бактериями на макрофагах, приведены в представленных далее таблицах 5-7.
Таблица 5
Тестируемый материал для обработки макрофагов
Степень ингибирования активации NF-κB (p-p65/p65)
Степень ингибирования экспрессии TNF-α
Необработанные
-
-
Bifidobacterium longum IM51
+
+
Bifidobacterium longum IM52
++
++
Bifidobacterium longum IM53
++
++
Bifidobacterium longum IM54
++
+
Bifidobacterium longum IM55
+++
+++
Bifidobacterium longum IM56
++
++
Bifidobacterium longum IM57
+
+
Bifidobacterium longum IM58
+
+
Bifidobacterium longum IM59
+
+
Bifidobacterium longum IM60
+
+
Bifidobacterium longum IM61
+
+
Bifidobacterium longum IM62
+
+
Bifidobacterium longum IM53
+
+
Bifidobacterium longum IM64
+
+
Bifidobacterium longum IM65
+
+
Bifidobacterium adolescentis IM66
+++
+
Bifidobacterium adolescentis IM67
+
+
Bifidobacterium adolescentis IM68
+
+
Bifidobacterium adolescentis IM69
+
+
Bifidobacterium adolescentis IM70
+
+
Bifidobacterium adolescentis IM71
+
+
Таблица 6
Тестируемый материал для обработки макрофагов
Степень ингибирования активации NF-κB (p-p65/p65)
Степень ингибирования экспрессии TNF-α
Bifidobacterium adolescentis IM72
+
+
Bifidobacterium adolescentis IM73
+
+
Bifidobacterium adolescentis IM74
+
+
Bifidobacterium adolescentis IM75
+
+
Lactobacillus plantarum IM76
+++
+++
Lactobacillus plantarum IM77
+
++
Lactobacillus plantarum IM78
+
+
Lactobacillus plantarum IM79
+
++
Lactobacillus plantarum IM80
+
+
Lactobacillus plantarum IM81
+++
+++
Lactobacillus plantarum IM82
+
+
Lactobacillus plantarum IM83
+
+
Lactobacillus plantarum IM84
+
+
Lactobacillus plantarum IM85
+
+
Lactobacillus plantarum IM86
+
+
Lactobacillus plantarum IM87
++
++
Lactobacillus plantarum IM88
+
+
Lactobacillus plantarum IM89
+
+
Lactobacillus acidophilus IM90
+
+
Lactobacillus acidophilus IM91
+++
+++
Lactobacillus acidophilus IM92
+
+
Lactobacillus acidophilus IM93
+
+
Таблица 7
Тестируемый материал для обработки макрофагов
Степень ингибирования активации NF-κB (p-p65/p65)
Степень ингибирования экспрессии TNF-α
Lactobacillus acidophilus IM94
+
+
Lactobacillus acidophilus IM95
+
+
Lactobacillus acidophilus IM96
+
+
Lactobacillus acidophilus IM97
+
+
Lactobacillus acidophilus IM98
+
+
Lactobacillus acidophilus IM99
+
+
Инулин
++
++
Цитрусовый пектин
++
+
Каррагенан
+
-
Трегалоза
+
-
Лактулоза
+
-
Циклодекстрин
+
-
Карбоксиметилцеллюлоза
+
+
Желатин
+
+
Хитозан
++
++
Альгиновая кислота
+
+
Фруктоолигосахарид
+
+
Обезжиренный соевый белок
+
+
Яблочный пектин
+
++
Арабиногалактан
+
++
Ксилан
+
-
* Степень ингибирования: -, <10%; +, 10-30%; ++, 30-60%; +++, >60%
В итоге проведенных тестов, результаты которых показаны в таблицах 5-7, было установлено, что эффект ингибирования воспалительных реакций на макрофагах различается в зависимости от типов молочнокислых бактерий. В частности, в случае молочнокислых бактерий Bifidobacterium spp. и молочнокислых бактерий Lactobacillus spp. было установлено, что эффект ингибирования воспалительных реакций различается не только в зависимости от вида, но также в зависимости от штаммов, даже если эти штаммы относятся к одному и тому же виду. Среди этих штаммов в случае Bifidobacterium longum IM55 и Lactobacillus plantarum IM76 было установлено, что степень ингибирования активации NF-kB и степень ингибирования экспрессии TNF-α во всех случаях в тот же момент времени являются высокими.
Также, в случае хитозана, инулина и цитрусового пектина в качестве пребиотиков было установлено, что степень ингибирования активации NF-kB и степень ингибирования экспрессии TNF-α были очень хорошими по сравнению с другими пребиотиками.
(2) Тест на эффект ингибирования воспалительных реакций, вызываемый молочнокислыми бактериями, на дендроцитах
6
4
Иммуноциты выделяли из костного мозга мыши линии C57BL/6 (самец, 20-23 г) с применением RPMI 1640, содержащей 10% FBS, 1% антибиотиков, 1% глутамакса и 0,1% меркаптоэтанола, затем обрабатывали буфером для лизиса RBC, а затем промывали. Указанные клетки разделяли в каждую лунку 24-луночного планшета, затем обрабатывали GM-CSF и IL-4 в соотношении 1:1000, а затем культивировали. На 5-й день культивирования клеткам заменяли среду на новую, затем собирали на 8-й день их культивирования, а затем использовали в качестве дендроцитов. После этого дендроциты высевали в 24-луночный планшет по 0,5×10 клеток на лунку, затем обрабатывали тестируемым материалом, т. е. молочнокислыми бактериями, а также индуктором воспалительной реакции, т. е. липополисахаридом (LPS), в течение 90 минут или 24 часов, а затем из них получали надосадочную жидкость и клетки. В этот момент времени концентрация молочнокислых бактерий, которыми производили обработку, составляла 1×10 КОЕ/мл. Также, для сравнения эффектов, оказываемых молочнокислыми бактериями, в качестве тестируемого материала использовали различные пребиотики.
Измеряли уровень экспрессии IL-10 и IL-12 из указанной полученной надосадочной жидкости посредством набора для ELISA. Также, уровень экспрессии p65 (NF-κB), p-p65 (фосфор-NF-κB) и β-актина измеряли у клеток, которые были получены после обработки тестируемым материалом в течение 90 минут, с помощью того же способа иммуноблоттинга, что и в вышеописанном примере 2.(1). Результаты тестирования эффекта ингибирования воспалительной реакции, оказываемого молочнокислыми бактериями на дендроцитах, приведены в представленных далее таблицах 8-10.
Таблица 8
Тестируемый материал для обработки дендроцитов
Степень ингибирования активации NF-κB (p-p65/p65)
Степень ингибирования экспрессии IL-12
Степень повышения экспрессии IL-10
Необработанные
-
-
-
Bifidobacterium longum IM51
+
+
+
Bifidobacterium longum IM52
++
-
-
Bifidobacterium longum IM53
+
-
-
Bifidobacterium longum IM54
+
+
+
Bifidobacterium longum IM55
+++
++
+++
Bifidobacterium longum IM56
++
++
++
Bifidobacterium longum IM57
+
+
+
Bifidobacterium longum IM58
+
+
-
Bifidobacterium longum IM59
+
+
-
Bifidobacterium longum IM60
+
+
-
Bifidobacterium longum IM61
+
+
-
Bifidobacterium longum IM62
+
+
-
Bifidobacterium longum IM53
+
+
-
Bifidobacterium longum IM64
+
+
+
Bifidobacterium longum IM65
+
+
-
Bifidobacterium adolescentis IM66
+++
++
-
Bifidobacterium adolescentis IM67
+
+
+
Bifidobacterium adolescentis IM68
+
+
+
Bifidobacterium adolescentis IM69
+
+
-
Bifidobacterium adolescentis IM70
+
+
-
Bifidobacterium adolescentis IM71
+
+
-
Таблица 9
Тестируемый материал для обработки дендроцитов
Степень ингибирования активации NF-κB (p-p65/p65)
Степень ингибирования экспрессии IL-12
Степень повышения экспрессии IL-10
Bifidobacterium adolescentis IM72
+
+
-
Bifidobacterium adolescentis IM73
+
+
+
Bifidobacterium adolescentis IM74
+
+
+
Bifidobacterium adolescentis IM75
+
+
+
Lactobacillus plantarum IM76
++
++
++
Lactobacillus plantarum IM77
+
+
+
Lactobacillus plantarum IM78
+
+
+
Lactobacillus plantarum IM79
+
+
-
Lactobacillus plantarum IM80
+
+
+
Lactobacillus plantarum IM81
+
+
+
Lactobacillus plantarum IM82
+
+
-
Lactobacillus plantarum IM83
+
+
+
Lactobacillus plantarum IM84
+
+
+
Lactobacillus plantarum IM85
+
+
+
Lactobacillus plantarum IM86
+
+
-
Lactobacillus plantarum IM87
++
++
+
Lactobacillus plantarum IM88
+
+
-
Lactobacillus plantarum IM89
+
+
-
Lactobacillus acidophilus IM90
+
+
+
Lactobacillus acidophilus IM91
+
+
-
Lactobacillus acidophilus IM92
+
+
-
Lactobacillus acidophilus IM93
+
+
+
Таблица 10
Тестируемый материал для обработки дендроцитов
Степень ингибирования активации NF-κB (p-p65/p65)
Степень ингибирования экспрессии IL-12
Степень повышения экспрессии IL-10
Lactobacillus acidophilus IM94
+
+
-
Lactobacillus acidophilus IM95
+
+
-
Lactobacillus acidophilus IM96
+
+
-
Lactobacillus acidophilus IM97
+
+
-
Lactobacillus acidophilus IM98
+
+
-
Lactobacillus acidophilus IM99
+
+
+
Инулин
++
+
+
Цитрусовый пектин
++
++
++
Каррагенан
+
+
-
Трегалоза
+
+
+
Лактулоза
+
+
-
Циклодекстрин
+
+
-
Карбоксиметилцеллюлоза
+
+
-
Желатин
+
+
+
Хитозан
++
+
++
Альгиновая кислота
+
+
+
Фруктоолигосахарид
+
+
-
Обезжиренный соевый белок
+
+
+
Яблочный пектин
+
+
-
Арабиногалактан
+
+
+
Ксилан
+
+
++
* Степень ингибирования: -, <10%; +, 10-30%; ++, 30-60%; +++, >60%
* Степень повышения: -, <10%; +, 10-50%; ++, 50-100%; +++, >100%
В итоге проведенных тестов, результаты которых показаны в таблицах 8-10, было установлено, что эффект ингибирования воспалительных реакций на дендроцитах различается в зависимости от типов молочнокислых бактерий. В частности, в случае молочнокислых бактерий Bifidobacterium spp. и молочнокислых бактерий Lactobacillus spp. было установлено, что эффект ингибирования воспалительных реакций различается не только в зависимости от вида, но также в зависимости от штаммов, даже если эти штаммы относятся к одному и тому же виду. В частности, часть штаммов демонстрировала результаты, при которых экспрессия IL-12 повышалась. С другой стороны, большинство штаммов демонстрировала результаты, при которых экспрессия IL-10 снижалась. Среди этих штаммов в случае Bifidobacterium longum IM55 и Lactobacillus plantarum IM76 было установлено, что степень ингибирования активации NF-kB и степень ингибирования экспрессии IL-12 были наиболее высокими, и в то же самое время степень повышения экспрессии IL-10 была наиболее высокой.
Также, в случае хитозана, инулина и цитрусового пектина в качестве пребиотиков было установлено, что степень ингибирования активации NF-kB, степень ингибирования экспрессии IL-12 и степень повышения экспрессии IL-10 были очень хорошими по сравнению с другими пребиотиками.
Из вышеописанного примера 2 видно, что среди различных молочнокислых бактерий Bifidobacterium longum IM55 и Lactobacillus plantarum IM76 демонстрировали наиболее хороший эффект ингибирования воспалительных реакций. Также, среди различных пребиотиков было установлено, что хитозан, инулин и цитрусовый пектин демонстрировали очень хороший эффект ингибирования воспалительных реакций.
Пример 3. Оценка иммунорегуляторного эффекта, оказываемого молочнокислыми бактериями
(1) Степень дифференцировки клеток
Для контроля, предупреждения, облегчения тяжести или лечения аллергических заболеваний, в частности заболеваний, вызванных реакцией гиперчувствительности 1-го типа, важно снизить выработку IgE-антител и повысить выработку регуляторных Т-клеток (Treg-клеток), высвобождающих IL-10 при иммунной реакции на аллерген. Известно, что аллергическая реакция осложняется не только благодаря медиаторам, образованным тучными клетками, базофилами и т. п., но также благодаря действию цитокинов, секретируемых из этих клеток, и часть симптомов, которые проявляются в виде аллергической реакции, являются следствием действия этих цитокинов. Такие цитокины, как TNF-α, IL-4, IL-5, IL-6, IL-13 и т. д., образуются в тучных клетках, и эти цитокины играют роль в сборе нейтрофилов и эозинофилов. Также, IL-4 и IL-13, секретируемые из тучных клеток, активируют B-клетки для образования IgE-антител, а IL-5 играет роль в сборе и активации эозинофилов. Цитокины, такие как IL-4 и IL-5, обычно классифицируют на Th2-цитокины, поскольку многие из этих цитокинов секретируются из Th2-клеток, и цитокины, секретируемые из тучных клеток и Th2-клеток, связываются с соответствующими рецепторами и таким образом оказывают свое действие, индуцируя взаимодействие между клетками и усиливая аллергическую реакцию. Также может возникнуть симптом аллергического шока, если TNF-α, типичный провоспалительный цитокин, систематически вырабатывается в большом количестве при аллергическом состоянии.
Таким образом, для оценки иммунорегуляторного эффекта, оказываемого молочнокислыми бактериями, выделенными из экскрементов или кимчхи из капусты, измеряли влияние молочнокислых бактерий на иммунные реакции клеток селезенки путем измерения степени ингибирования дифференцировки в клетки, секретирующие указанные цитокины и повышающие степень дифференцировки в Treg-клетки.
5
5
В частности, у мыши линии C56BL/6J выделяли селезенку, затем ее разрушали, затем суспендировали в среде RPMI 1640, содержащей 10% FCS, а затем выделяли CD4 Т-клетки с применением набора для выделения CD4 Т-клеток (MiltenyiBiotec, Бергиш-Гладбах, Германия). Выделенные CD4 Т-клетки распределяли в 12-луночном планшете по 5×10 клеток на лунку. После этого клетки культивировали в каждой лунке с добавлением антител к CD3, антител к CD28, IL-2 и IL-12 для индуцировании дифференцировки Т-клеток в Th1-клетки; с добавлением антител к CD3, антител к CD28, IL-2 и IL-4 для индуцировании дифференцировки Т-клеток в Th2-клетки; с добавлением антител к CD3, антител к CD28, IL-6 и TGF-β для индуцировании дифференцировки Т-клеток в Th17-клетки; и с добавлением антител к CD3 и антител к CD28 для индуцировании дифференцировки Т-клеток в Treg-клетки, и вносили в них тестируемый материал, т. е. молочнокислые бактерии, в количестве 1×10 КОЕ на лунку, а затем культивировали в течение четырех дней. Также, для сравнения эффектов, оказываемых молочнокислыми бактериями, в качестве тестируемого материала использовали различные пребиотики.

После этого измеряли эффективность дифференцировки выделенных из селезенки Т-клеток в Th1-клетки, Th2-клетки, Th17-клетки и Treg-клетки. В частности, клетки из культуральной жидкости окрашивали с помощью антител к FOXp3 или антител к IL-17A, после чего распределение Th1-клеток, Th2-клеток, Th17-клеток и Treg-клеток анализировали с помощью устройства для FACS (сортировки флуоресцентно-активированных клеток) (C6 Flow Cytometer System, Сан-Хосе, Калифорния, США), результаты которой приведены в последующих таблицах 11-13. В приведенных ниже таблицах 11-13 молочнокислые бактерии показаны без их видовых названий, и авторами настоящего изобретения им присвоены названия штаммов.
Таблица 11
Тестируемый материал для обработки Т-клеток селезенки
Степень ингибирования дифференцировки
Степень повышения дифференцировки
Th1-клетка
Th2-клетка
Th17-клетка
Treg-клетка
Необработанные
-
-
-
-
IM51
+
+
+
+
IM52
++
-
-
-
IM53
+
-
+
+
IM54
+
+
+
+
IM55
+++
+++
+++
+++
IM56
++
+
+
+
IM57
++
-
+
+
IM58
++
-
+
-
IM59
+
+
+
-
IM60
+
+
+
-
IM61
++
+
++
+
IM62
++
+
++
+
IM63
+
+
+
+
IM64
++
++
+
+
IM65
+
+
+
+
IM66
+++
+
++
+
IM67
++
+
++
+
IM68
++
+
++
+
IM69
+
+
+
+
IM70
++
+
++
+
IM71
++
+
++
+
Таблица 12
Тестируемый материал для обработки Т-клеток селезенки
Степень ингибирования дифференцировки
Степень повышения дифференцировки
Th1-клетка
Th2-клетка
Th17-клетка
Treg-клетка
IM72
+
+
+
+
IM73
++
+
+
+
IM74
+
+
+
+
IM75
+++
+
+
++
IM76
++
+++
+++
+++
IM77
+
+
+
+
IM78
+
+
++
++
IM79
+
+
++
+
IM80
+
++
+
+
IM81
+
+
++
+
IM82
+
+
+
+
IM83
+
++
++
+
IM84
+
+
++
+
IM85
+
+
+
+
IM86
+
+
+
+
IM87
+
+
++
+
IM88
+
+
+
+
IM89
++
+
++
+
IM90
+
+
+
+
IM91
+
+
+
+
IM92
+
+
+
+
IM93
++
+
++
+
Таблица 13
Тестируемый материал для обработки Т-клеток селезенки
Степень ингибирования дифференцировки
Степень повышения дифференцировки
Th1-клетка
Th2-клетка
Th17-клетка
Treg-клетка
IM94
+
+
+
+
IM95
+
+
+
+
IM96
++
++
++
+
IM97
+
+
+
+
IM98
+
+
+
-
IM99
+
+
+
+
P1
+
+
+
+
P2
+
+++
++
++
P3
+++
++
+
+
P4
+
+
+
+
P5
+
++
-
++
P6
++
+
++
+
P7
++
++
++
-
P8
+
++
+
+
P9
+
++
+
+
P10
+
+
++
+
P11
+
+
+
++
P12
+
+
+
+
P13
+
+
+
-
P14
+
+
+
-
P15
++
+
++
-
* Степень ингибирования: -, <10%; +, 10-30%; ++, 30-60%; +++, >60%
* Степень повышения: -, <10%; +, 10-50%; ++, 50-100%; +++, >100%
* P1: инулин; P2: цитрусовый пектин; P3: каррагенан; P4: трегалоза; P5: лактулоза; P6: циклодекстрин; P7: карбоксиметилцеллюлоза; P8: желатин; P9: хитозан; P10: альгиновая кислота; P11: фруктоолигосахарид; P12: обезжиренный соевый белок; P13: яблочный пектин; P14: арабиногалактан; и P15: ксилан
В итоге проведенных экспериментов, результаты которых показаны в таблицах 11-13, было установлено, что степень дифференцировки Т-клеток различается в зависимости от типов молочнокислых бактерий. В частности, в случае молочнокислых бактерий Bifidobacterium spp. степень ингибирования дифференцировки в Th1-клетки, Th2-клетки и Th17-клетки и степень повышения дифференцировки в Treg-клетки различаются в зависимости от типов молочнокислых бактерий, и часть молочнокислых бактерий демонстрировала результаты, при которых степень ингибирования дифференцировки в Th2-клетки и степень повышения дифференцировки в Treg-клетки противоположны таковым у других молочнокислых бактерий. Среди этих молочнокислых бактерий для Bifidobacterium longum IM55 было установлено, что степень ингибирования дифференцировки в Th1-клетки, Th2-клетки и Th17-клетки была наиболее высокой, и в то же время степень повышения дифференцировки в Treg-клетки была наиболее высокой. Также, молочнокислые бактерии Lactobacillus spp. демонстрировали результаты, схожие с результатами у молочнокислых бактерий Bifidobacterium spp., у которых степени ингибирования и повышения дифференцировки клеток различались в зависимости от типа молочнокислых бактерий. Среди этих молочнокислых бактерий для Lactobacillus plantarum IM76 было установлено, что степень ингибирования дифференцировки в Th1-клетки, Th2-клетки и Th17-клетки и степень повышения дифференцировки в Treg-клетки были наиболее высокими.
(2) Степень экспрессии цитокинов
Также измеряли степень экспрессии транскрипционных факторов и цитокинов у Th1-клеток, Th2-клеток, Th17-клеток и Treg-клеток, дифференцированных из Т-клеток селезенки. В частности, уровни экспрессии соответствующим образом анализировали с помощью qRT-PCR в отношении T-bet, IFN-γ и IL-12 из культуральной жидкости в случае индуцирования дифференцировки Th1-клеток; GATA3 и IL-5 из культуральной жидкости в случае индуцирования дифференцировки Th2-клеток; RORγt и IL-17 из культуральной жидкости в случае индуцирования дифференцировки Th17-клеток; и Foxp3 и IL-10 из культуральной жидкости в случае индуцирования дифференцировки Treg-клеток. В последующей таблице 14 показаны результаты таким образом, что последовательность праймера, который применяли для qRT-PCR, соответствует последовательности мишени амплификации. Также, в последующих таблицах 15 и 16 показаны результаты изменения степеней экспрессии транскрипционных факторов и цитокинов у Th1-клеток, Th2-клеток, Th17-клеток и Treg-клеток, дифференцированных из Т-клеток селезенки. В приведенных ниже таблицах 15-16 молочнокислые бактерии показаны без их видовых названий, и авторами настоящего изобретения им присвоены названия штаммов.
Таблица 14
Мишень амплификации
Тип праймера
Последовательность праймера
T-bet
Прямой (SEQ ID NO: 3)
5’-CCTCTTCTATCCAACCAGTATC-3’
Обратный (SEQ ID NO: 4)
5’-CTCCGCTTCATAACTGTGT-3’
IFN-γ
Прямой (SEQ ID NO: 5)
5’-TCAAGTGGCATAGATGTGGAAGAA-3’
Обратный (SEQ ID NO: 6)
5’-TGGCTCTGCAGGATTTTCATG-3’
GATA3
Прямой (SEQ ID NO: 7)
5’-GAAGGCATCCAGACCCGAAAC-3’
Обратный (SEQ ID NO: 8)
5’-ACCCATGGCGGTGACCATGC-3’
IL-5
Прямой (SEQ ID NO: 9)
5’-AAAGAGAAGTGTGGCGAGGAGAGAC-3’
Обратный (SEQ ID NO: 10)
5’-CCTTCCATTGCCCACTCTGTACTCATC-3’
RORγt
Прямой (SEQ ID NO: 11)
5’-ACAGCCACTGCATTCCCAGTTT-3’
Обратный (SEQ ID NO: 12)
5’-TCTCGGAAGGACTTGCAGACAT-3’
IL-17
Прямой (SEQ ID NO: 13)
5’-TTTAACTCCCTTGGCGCAAAA-3’
Обратный (SEQ ID NO: 14)
5’-CTTTCCCTCCGCATTGACAC-3’
FOXp3
Прямой (SEQ ID NO: 15)
5’-CCCATCCCCAGGAGTCTT-3’
Обратный (SEQ ID NO: 16)
5’-ACCATGACTAGGGGCACTGTA-3’
IL-10
Прямой (SEQ ID NO: 17)
5’-ATGCTGCCTGCTCTTACTGACTG-3’
Обратный (SEQ ID NO: 18)
5’-CCCAAGTAACCCTTAAAGTCCTGC-3'
GAPDH
Прямой (SEQ ID NO: 19)
5’-TGCAGTGGCAAAGTGGAGAT-3’
Обратный (SEQ ID NO: 20)
5’-TTTGCCGTGAGTGGAGTCAT-3’
Таблица 15
Тестируемый материал для обработки Т-клеток селезенки
Степень ингибирования экспрессии
Степень повышения экспрессии
T-bet
IFN-γ
GATA3
IL-5
RORγt
IL-17
FOXp3
IL-10
Необработанные
-
-
-
-
-
-
-
-
IM51
+
++
+
+
+
+
+
+
IM52
++
+
-
+
-
+
-
-
IM53
+
+
-
+
+
++
+
-
IM54
+
+
+
++
+
+
++
+
IM55
+++
+
+++
+++
+++
+++
+++
+++
IM56
++
+
+
++
+
++
+
++
IM57
++
++
-
+
+
+
+
+
IM58
++
++
-
++
+
+
-
-
IM59
+
+
+
+
+
+
-
+
IM60
+
++
+
++
+
+
-
-
IM61
++
+
+
++
++
++
+
-
IM62
++
+
+
++
++
++
+
+
IM63
+
++
+
+
+
+
+
-
IM64
++
+
++
++
+
+
+
+
IM65
+
+
+
+
+
+
+
-
IM66
++
+
+
+
++
++
+
+
IM67
+
+
+
+
++
+
+
+
IM68
++
++
+
+
++
++
+
+
IM69
+
+
+
+
+
+
+
-
IM70
++
+
+
+
++
++
+
+
IM71
++
+
+
+
++
++
+
+
IM72
+
++
+
+
+
+
+
+
IM73
++
+
+
+
+
+
+
+
IM74
+
+
+
+
+
+
+
+
Таблица 16
Тестируемый материал для обработки Т-клеток селезенки
Степень ингибирования экспрессии
Степень повышения экспрессии
T-bet
IFN-γ
GATA3
IL-5
RORγt
IL-17
FOXp3
IL-10
IM75
++
+
+
+
+
+
++
+
IM76
++
++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
IM77
+
+
+
++
+
+
+
+
IM78
+
+
+
+
++
++
++
+
IM79
+
+
+
++
++
++
+
-
IM80
+
+
++
+
+
+
+
+
IM81
+
+
+
+
++
++
+
+
IM82
+
+
+
+
+
+
+
+
IM83
+
++
++
++
++
++
+
+
IM84
+
+
+
+
++
++
+
+
IM85
+
++
+
++
+
+
+
+
IM86
+
+
+
+
+
+
+
-
IM87
+
+
+
+
++
++
+
+
IM88
+
++
+
+
+
++
+
-
IM89
++
+
+
+
++
+
+
-
IM90
+
+
+
++
+
+
+
+
IM91
+
+
+
++
+
+
+
-
IM92
+
+
+
+
+
+
+
-
IM93
++
+
+
++
++
+
+
+
IM94
+
+
+
+
+
+
+
+
IM95
+
+
+
+
+
+
+
-
IM96
++
+
++
++
++
++
+
-
IM97
+
+
+
+
+
+
+
+
IM98
+
+
+
+
+
+
-
-
IM99
+
+
+
+
+
+
+
+
* Степень ингибирования: -, <10%; +, 10-30%; ++, 30-60%; +++, >60%
* Степень повышения: -, <10%; +, 10-50%; ++, 50-100%; +++, >100%
В итоге проведенных измерений, результаты которых показаны в таблицах 15 и 16, было установлено, что степень изменения экспрессии цитокинов различается в зависимости от типов молочнокислых бактерий. В частности, в случае молочнокислых бактерий Bifidobacterium spp. часть молочнокислых бактерий демонстрировала результаты, при которых степень ингибирования экспрессии GATA3 и IL-5 противоположна таковой у других молочнокислых бактерий. Среди этих молочнокислых бактерий для Bifidobacterium longum IM55 было установлено, что степень ингибирования экспрессии T-bet, IFN-γ, GATA3, IL-5, RORγt и IL-17 была наиболее высокой, и в то же время степень повышения экспрессии FOXp3 и IL-10 была наиболее высокой. Также, в случае молочнокислых бактерий Lactobacillus spp. часть молочнокислых бактерий демонстрировала результаты, схожие с таковыми у молочнокислых бактерий Bifidobacterium spp., у которых степень изменения экспрессии цитокинов также отличалась. Среди этих молочнокислых бактерий для Lactobacillus plantarum IM76 было установлено, что степень ингибирования экспрессии T-bet, IFN-γ, GATA3, IL-5, RORγt и IL-17 была наиболее высокой, и в то же время степень повышения экспрессии FOXp3 и IL-10 была наиболее высокой.
Пример 4. Тест на эффект ингибирования воспалительных реакций, вызываемый IM55 или IM76
Среди молочнокислых бактерий, выделенных в приведенном выше примере 1, проводили тест на эффект ингибирования воспалительных реакций, вызываемый Bifidobacterium longum IM55 и Lactobacillus plantarum IM76.
(1) Тест на эффект ингибирования воспалительных реакций, вызываемый IM55 или IM76, на макрофагах
6
6
5
Семинедельную самку мыши линии BALB/c (20-22 г) приобретали у Raonbio Co., Ltd. и позволяли ей акклиматизироваться в течение семи дней перед экспериментом. Мыши внутрибрюшинно вводили 2 мл 4% тиогликолята, затем, спустя 96 часов, ее умерщвляли. Жидкости из брюшной полости собирали с 10 мл RPMI 1640, затем центрифугировали при 300 ×g в течение 10 минут, а затем промывали с помощью RPMI 1640. Клетки высевали в 12-луночный микропланшет в количестве 0,5×10 клеток на лунку, затем культивировали в среде RPMI 1640, содержащей 1% антибиотика-фунгицида и 10% FBS, при 37°С в течение 20 часов, а затем трижды промывали. Прикрепившиеся клетки использовали в качестве макрофагов. Для измерения эффекта, оказываемого IM55 или IM76 на экспрессию цитокинов, макрофаги в количестве 1×10 клеток/лунка обрабатывали молочнокислыми бактериями в количестве 1×10 КОЕ/мл, а также индуктором воспалительной реакции, т. е. LPS, в течение 20 часов. Уровень экспрессии каждого цитокина измеряли с помощью того же набора для ELISA, что и в приведенном выше примере 2.(1). В результате измерения было установлено, что экспрессия IL-10 повышалась, а экспрессия IL-12 ингибировалась при введении IM55 или IM76 (фиг. 1 и 2).
(2) Тест на эффект ингибирования воспалительных реакций, вызываемый IM55 или IM76, на дендроцитах
6
Клетки костного мозга мыши собирали у семинедельной самки мыши линии BALB/c (20-22 г) с помощью RPMI 1640 в соответствии с известным способом (Immunopharmacol. Immunotoxicol., 2016, 38, 447-454). 2×10 собранных клеток высевали в 12-луночный планшет и культивировали в среде RPMI 1640, содержащей rGM-CSF в количестве 20 нг/мл, 10% FBS, 1% антибиотика-фунгицида и гентамицин в количестве 150 мкл/л.
5
Для измерения эффекта, оказываемого IM55 или IM76 на экспрессию цитокинов, у указанных клеток заменяли кондиционированную среду на 3-й и 6-й дни культивирования для удаления от них гранулоцитов, а затем обрабатывали молочнокислыми бактериями в количестве 1×10 КОЕ/мл и LPS в количестве 100 нг/мл на 8-й день культивирования. Уровень экспрессии каждого цитокина измеряли с помощью того же набора для ELISA, что и в приведенном выше примере 2.(2). В результате измерения было установлено, что экспрессия IL-10 повышалась, а экспрессия TNF-α ингибировалась при введении IM55 или IM76 (фиг. 3 и 4).
Из результатов описанного выше примера 4 можно видеть, что новые молочнокислые бактерии, т. е. Bifidobacterium longum IM55 и Lactobacillus plantarum IM76, демонстрировали отличный эффект ингибирования воспалительных реакций и, следовательно, демонстрировали отличный эффект в отношении предупреждения, облегчения тяжести и лечения воспалительных заболеваний.
Пример 5. Оценка иммунорегуляторного эффекта, оказываемого IM55 или IM76
Степень дифференцировки Т-клеток анализировали посредством способа, схожего с описанным выше в примере 3, для оценки иммунорегуляторного эффекта, оказываемого Bifidobacterium longum IM55 и Lactobacillus plantarum IM76, среди молочнокислых бактерий, выделенных из тех, которые описаны выше в примере 1.
5
5
5
В частности, у семинедельной самки мыши линии BALB/c (20-22 г) в стерильных условиях выделяли селезенку, затем соответствующим образом разрушали, а затем обрабатывали забуференным в трис хлоридом аммония. Полученные клетки суспендировали в среде RPMI 1640, содержащей 10% FCS, после чего из клеточной суспензии выделяли Т-клетки с применением набора для выделения клеток Pan T Cell Isolation Kit II. Клетки соответствующим образом культивировали с добавлением антител к CD28 (1 мкг/мл), антител к CD3 (1 мкг/мл), rIL-4 (10 мкг/мл) и rIL-2 (10 мкг/мл) для индуцирования дифференцировки выделенных T-клеток (1×10 клеток/лунка) в Th2-клетки; и с добавлением антител к CD28 (1 мкг/мл) и антител к CD3 (1 мкг/мл) для индуцирования дифференцировки T-клеток (1×10 клеток/лунка) в Treg-клетки, и клетки также соответствующим образом культивировали в течение четырех дней с добавлением IM55 или IM76 в количестве 1×10 КОЕ/мл на лунку. Из этих клеток выделяли РНК, после чего уровень экспрессии IL-10, GATA3, FOXp3 и IL-5 анализировали путем проведения qRT-PCR. QRT-PCR проводили такую же, как и в описанном выше примере 3, и с применением того же праймера, что описан в приведенной выше таблице 14.
В результате анализа в случае обработки IM55 или IM 76 было установлено, что уровень экспрессии GATA3 и IL-5 снижался, ингибируя дифференцировку в Th2-клетки (фиг. 5 и 6), тогда как уровень экспрессии FOXp3 м IL-10 повышался, стимулируя дифференцировку в Treg-клетки (фиг. 7 и 8).
Из результатов описанного выше примера 5 можно видеть, что новые молочнокислые бактерии, т. е. Bifidobacterium longum IM55 и Lactobacillus plantarum IM76, демонстрировали отличный иммунорегуляторный эффект и, следовательно, демонстрировали отличный эффект в отношении предупреждения, облегчения тяжести и лечения иммунопатологических заболеваний.
Пример 6. Оценка эффекта облегчения тяжести, оказываемого молочнокислыми бактериями в отношении ринита и астмы (1)
Бронхоальвеолярный лаваж (BAL), который проводят вместе с бронхиальной эндоскопией, широко используется для сбора клеток и других растворимых компонентов из эпителиального слизистого слоя, который покрывает дыхательные пути и легочные альвеолы. Жидкость бронхоальвеолярного лаважа (BALF) содержит не только различные белки в кровотоке, но также белки, секретируемые из клеток различных типов, включая эпителиальные и воспалительные клетки. BALF обычно используют для диагностики бронхиальной астмы, бронхита или заболевания легких или анализа патологических состояний, вызываемых ими. Поэтому для выявления эффекта облегчения тяжести ринита и астмы анализировали признаки, относящиеся к эффектам, направленным против ринита и противоастматическим эффектам, из сыворотки и тканей легких, а также из BALF.
(1) Экспериментальный способ
Семинедельной самке мыши линии BALB/C (21-23 г) давали акклиматизироваться в течение одной недели в условиях контролируемой среды с влажностью 50%, температурой 25°С и циклом свет/темнота 12:12 часов. После этого 20 мкг вызывающего аллергию овальбумина (OVA) и 2% гидроксида алюминия (Alum) суспендировали в 0,2% фосфатно-солевом буферном растворе (PBS: pH 7,4) и внутрибрюшинно вводили каждой из мышей в первый день и в 14-й день эксперимента. Затем 100 мкг OVA растворяли в 10 мкл дистиллированной воды и намазывали в полости носа каждой из мышей для индуцирования у них аллергического ринита и астмы на 26-й, 27-й и 28-й дни эксперимента. Между тем, тестируемое лекарственное средство, т. е. молочнокислые бактерии, перорально вводили каждой из мышей один раз в день всего в течение пяти дней с 26-го по 30-й дни эксперимента. Также внутрибрюшинно вводили дозу 1 мкг/кг дексаметазона, который применяли в качестве лекарственного средства положительного контроля вместо молочнокислых бактерий. Дополнительно, в случае мышей из нормальной группы, аллергический ринит и астму у них не индуцировали, а вместо OVA и тестируемого лекарственного средства им перорально вводили только фосфатно-солевой буферный раствор (PBS: pH 7,4). Кроме того, в случае мышей из контрольной группы, у них индуцировали аллергический ринит и астму, а в качестве тестируемого лекарственного средства им перорально вводили только фосфатно-солевой буферный раствор (PBS: pH 7,4). После окончания эксперимента мышей анестезировали, после чего у них собирали кровь, ткани легких и BALF. Из собранной крови выделяли сыворотку путем центрифугирования и использовали ее в качестве аналитического образца.
Признаки, связанные с эффектами, направленными против ринита и противоастматическими эффектами, анализировали с применением сыворотки, BALF и тканей легких с помощью различных аналитических способов. Ниже приведен как аналитический способ, так и признаки, которые анализировали с его помощью.
* Твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA): IL-10, IL-5, IL-6, IL-4, IgE и т. д.
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
* FACS (сортировка флуоресцентно-активированных клеток): распределение T-клеток (Th1: CD4/IFN-γ; Th2: CD4/IL-4; Treg: CD4/FOXp3; Th17: CD4/IL-17), распределение эозинофилов (CD11b, Siglec-F)
(2) Экспериментальные результаты
В результате эксперимента было установлено, что экспрессия IL-5, IgE и IL-4, т. е. признаков, связанных с ринитом и астмой, заметно ингибировалась в сыворотке из группы, получавшей дозу IM55 или IM76 (таблица 17 и фиг. 9-11). Также было установлено, что количество IL-5 и IL-4, т. е. признаков, связанных с ринитом и астмой, заметно снижалось, и соотношение Th2-клеток и эозинофилов также заметно снижалось в BALF (таблица 18 и фиг. 12-15). Более того, было установлено, что экспрессия IL-10, связанного с эффектом предупреждения и лечения ринита и астмы, повышалась, и соотношение Treg-клеток повышалось в BALF (таблица 18 и фиг. 16 и 17).
Таблица 17
Классификация экспериментальных групп
Степень ингибирования:
IL-5
IgE
IL-4
Кон.
-
-
-
IM55
+++
++
+++
IM76
++
+
++
Dx
++
+++
+++
Таблица 18
Классификация экспериментальных групп
Степень ингибирования:
Степень повышения:
IL-5
IL-4
Th2-клетка
Эозинофилы
IL-10
Treg-клетка
Кон.
-
-
-
-
-
-
IM55
+++
+++
++
+++
+++
+++
IM76
++
+++
+++
+++
+++
+
Dx
+++
+++
+++
+++
++
-
* Степень ингибирования: -, <10%; +, 10-30%; ++, 30-60%; +++, >60%
* Степень повышения: -, <10%; +, 10-50%; ++, 50-100%; +++, >100%
Пример 7. Оценка эфкекта облегчения тяжести, оказываемого молочнокислыми бактериями в отношении ринита и астмы (2)
(1) Экспериментальный способ
9
9
Модели аллергического ринита, индуцированного OVA, создавали с привязкой к известному способу (Oh et al., Immunopharmacol. Immunotoxicol., 2013, 35, 678-686). В частности, мышей случайным образом разделяли на шесть групп (n=8 на группу). Для пяти групп OVA (20 мкг), разведенный в растворе алюмосульфата калия, внутрибрюшинно вводили мышам в 1-й и 14-й дни эксперимента. 100 мкг OVA растворяли в 10 мкл дистиллированной воды и намазывали в полости носа каждой из указанных мышей для индуцирования у них аллергического ринита и астмы на 26-й, 27-й и 28-й дни эксперимента. Между тем, тестируемый материал (IM55 (1×10 КОЕ/мышь), IM76 (1×10 КОЕ/мышь), дексаметазон (1 мг/кг) или солевой раствор) вводили мышам раз в день всего в течение пяти дней, начиная с 26-го и по 30-й дни эксперимента. В случае мышей нормальной группы, у них не индуцировали аллергический ринит и астму и вводили только физиологический раствор. У мышей вызывали раздражение путем интраназального введения OVA (10 мкл/ноздря, растворенного в 10 мг/мл солевого раствора) в обе их носовые полости, после чего подсчитывали количество случаев поведения, связанного с чиханьем и трением носа (показатель симптомов ринита), в течение 10 минут на 31-й день эксперимента.
Выделяли ткани легкого и носовой полости для биопсии, затем фиксировали 4% нейтрально забуференным формалином, а затем замораживали. С помощью криостата из тканей получали поперечные срезы толщиной 10 мкм и окрашивали гематоксилином и эозином (H&E) и ШИК-реакцией (PAS).
Также анализировали признаки, связанные с эффектами, направленными против ринита и противоастматическими эффектами, из носовой полости, сыворотки, BALF и тканей легкого с помощью различных аналитических способов из приведенного выше примера 3 и т. д. В частности, признаки в носовой полости и сыворотке измеряли с помощью набора для ELISA, а признаки, связанные с ринитом и астмой, в BALF и тканях легкого измеряли с помощью qRT-PCR с применением праймеров из приведенной выше таблицы 14.
(2) Экспериментальные результаты
При обработке мышей с помощью OVA в носовой полости значительно повышался показатель симптомов ринита (количество случаев поведения, связанного с чиханьем и трением носа) и симптомов аллергического ринита, в том числе экспрессия IL-4 и IL-5. Тем не менее, после обработки с помощью IM55 или IM76 уровень симптомов аллергического ринита и IL-4 и IL-5 в носовой полости носа, вызванных OVA, значимо снижался (фиг. 18-20). Также, в случае обработки с помощью IM55 или IM76 уменьшалась тяжесть нарушения функции носовой полости, вызванного OVA, и уменьшалось увеличение размеров эпителиальных клеток в носовой полости (фиг. 21).
Более того, по результатам гистологического исследования, в случае животной модели с индуцированным ринитом у нее индуцировалось возникновение очагов воспаления в легких и отека, повышалась экспрессия IL-5 и GATA3, и снижалась экспрессия IL-10 и FOXp3. Тем не менее, при обработке с помощью IM55 или IM76 ингибировалось нарушение функции тканей легких и увеличение размеров эпителиальных клеток, вызванное OVA, ингибировалась экспрессия GATA3 и IL-5, и повышалась экспрессия FOXp3 и IL-10 (фиг. 22-26).
Пример 8. Оценка эффекта облегчения тяжести, оказываемого смешанными молочнокислыми бактериями в отношении ринита и астмы (3)
Оценку производили не только для эффекта, оказываемого IM55 или IM76 по отдельности, но также и для эффекта, оказываемого смесями IM55 и IM76 на облегчение тяжести в отношении ринита и астмы. В частности, показатель симптомов ринита, степень (%) распределения эозинофильных клеток в BALF и уровень экспрессии цитокинов в крови анализировали с помощью того же способа, что и в описанном выше примере 3, и т. д.
В результате для группы, которой вводили дозу смеси из IM55 и IM76 в соотношении 1:1, 1:3 и 1:9, было обнаружено, что показатель воспалительных симптомов, проверяемый по количеству случаев поведения, связанных с чиханьем и трением носа, снижался и снижался уровень экспрессии IL-5 в носовой полости (фиг. 27). Также было обнаружено, что снижался уровень экспрессии IL-5 в сыворотке (фиг. 28).
Из результатов эксперимента на модели с индуцированным ринитом в приведенных выше примерах 6-8 можно видеть, что смесь Bifidobacterium longum IM55 и Lactobacillus plantarum IM76 демонстрировала эффект предупреждения, облегчения тяжести и лечения астмы и ринита.
Пример 9. Эффект нормализации микроорганизмов и облегчения тяжести колита
Микроорганизмы кишечника, для которых недавно сообщалось, что они оказывают влияние на возникновение и ухудшение аллергических заболеваний, являются важным фактором возникновения аллергических заболеваний. Таким образом, для обнаружения изменения микроорганизмов в толстой кишке в соответствии с введением новых молочнокислых бактерий анализировали экспрессию цитокинов и изменение микроорганизмов кишечника в толстой кишке относительно модели аллергического ринита из описанного выше примера 7.
В частности, из тканей толстой кишки указанной животной модели выделяли 2 мкг РНК с применением термоциклера Takara и премикса SYBR. С указанной РНК проводили qPCR, и праймер, использованный для qPCR, был таким же, как показано в приведенной выше таблице 14.
По результатам анализа, в толстой кишке после обработки OVA экспрессия IL-4 и IL-5 повышалась, а экспрессия IL-10 снижалась. Тем не менее, было установлено, что после обработки с помощью IM55, IM76 или их смесей экспрессия IL-4 и IL-5 снижалась, а экспрессия IL-10 повышалась (фиг. 29).
Также, после выделения толстой кишки из указанной животной модели выделяли 100 нг общей ДНК из жидкости толстой кишки указанной животной модели с применением термоциклера Takara и премикса SYBER. С указанной ДНК проводили qPCR, и праймер, использованный для qPCR, был таким же, как показано в приведенной далее таблице 19.
Таблица 19
Тип бактерий
Тип праймера
Последовательность праймера (5’-3’)
Firmicutes
Прямой (SEQ ID NO: 21)
GGAGYATGTGGTTTAATTCGAAGCA
Обратный (SEQ ID NO: 22)
AGCTGACGACAACCATGCAC
Bacteroidetes
Прямой (SEQ ID NO: 23)
AACGCGAAAAACCTTACCTACC
Обратный (SEQ ID NO: 24)
TGCCCTTTCGTAGCAACTAGTG
Actinobacteria
Прямой (SEQ ID NO: 25)
TGTAGCGGTGGAATGCGC
Обратный (SEQ ID NO: 26)
AATTAAGCCACATGCTCCGCT
δ/γ-Proteobacteria
Прямой (SEQ ID NO: 27)
GCTAACGCATTAAGTRYCCCG
Обратный (SEQ ID NO: 28)
GCCATGCRGCACCTGTCT
TM7
Прямой (SEQ ID NO: 29)
GCAACTCTTTACGCCCAGT
Обратный (SEQ ID NO: 30)
GAGAGGATGATCAGCCAG
По результатам анализа, при обработке с помощью OVA увеличилась популяция Firmicutes, Proteobacteria и TM7, а популяция Bacteroidetes и Actinobacteria уменьшалась, и, следовательно, увеличивалось соотношение Firmicutes/Bacteroides (F/B) и Proteobacteria/Bacteroidetes (P/B). Тем не менее, было установлено, что при обработке с помощью IM55, IM76 или их смесей группа Proteobacteria, которая увеличивалась под действием OVA, значительно ингибировалась, а группа Bacteroidetes и Actinobacteria, которая уменьшалась при возникновении ринита, восстанавливалась (фиг. 30).
Из результатов можно видеть, что IM55, IM76 и их смеси не только нормализовали измененные микроорганизмы кишечника, но также демонстрировали эффект контроля, предупреждения, облегчения тяжести и лечения колита.
Пример 10. Приготовление фармацевтических композиций, содержащих молочнокислые бактерии и т. д.
При приготовлении последующих фармацевтических композиций продукт культивирования Bifidobacterium longum IM55 можно заменить на сам штамм Bifidobacterium longum IM55, его лизат или его экстракт. Также, при приготовлении последующих фармацевтических композиций продукт культивирования Bifidobacterium longum IM55 можно заменить на сам штамм Lactobacillus plantarum IM76, его лизат или его экстракт. Более того, последующая фармацевтическая композиция может дополнительно содержать хитозан.
<10-1> Приготовление порошка
Продукт культивирования Bifidobacterium longum IM55, 20 мг
Лактоза, 100 мг
Тальк, 10 мг
Указанные компоненты смешивали и помещали в воздухонепроницаемую упаковку для приготовления порошка.
<10-2> Приготовление таблетки
Продукт культивирования Bifidobacterium longum IM55, 10 мг
Маисовый крахмал, 100 мг
Лактоза, 100 мг
Стеарат магния, 2 мг
Указанные компоненты смешивали и прессовали для приготовления таблетки в соответствии с традиционным способом приготовления таблеток.
<10-3> Приготовления препарата в форме капсулы
Продукт культивирования Bifidobacterium longum IM55, 10 мг
Кристаллическая целлюлоза, 3 мг
Лактоза, 15 мг
Стеарат магния, 0,2 мг
Указанные компоненты смешивали, а затем вносили в желатиновую капсулу для приготовления препарата в форме капсулы в соответствии с традиционным способом приготовления препаратов в форме капсул.
<10-4> Приготовление пилюли
Продукт культивирования Bifidobacterium longum IM55, 10 мг
Лактоза, 150 мг
Глицерин, 100 мг
Ксилит, 50 мг
Указанные компоненты смешивали и готовили в виде пилюли, каждая из которых имела массу 4 г, в соответствии с традиционным способом.
<10-5> Приготовление гранул
Продукт культивирования Bifidobacterium longum IM55, 15 мг
Соевый экстракт, 50 мг
Глюкоза, 200 мг
Крахмал, 600 мг
Указанные компоненты смешивали, после чего к ним добавляли 100 мг 30% этанола, затем сушили при 60°С, затем формовали в гранулы, а затем вносили в упаковку.
<10-6> Приготовление инъекции
Продукт культивирования Bifidobacterium longum IM55, 10 мг
Метабисульфит натрия, 3,0 мг
Метилпарабен, 0,8 мг
Пропилпарабен, 0,1 мг
Подходящее количество стерильной дистиллированной воды для инъекции
Указанные компоненты смешивали, после чего 2 мл смеси вносили в ампулу, затем стерилизовали, а затем готовили в виде инъекционной формы.
Пример 11. Приготовление функциональных пищевых продуктов для здорового питания, содержащих молочнокислые бактерии и т. д.
При приготовлении последующих функциональных пищевых продуктов для здорового питания продукт культивирования Bifidobacterium longum IM55 можно заменить на сам штамм Bifidobacterium longum IM55, его лизат или его экстракт. Также, при приготовлении последующих функциональных пищевых продуктов для здорового питания продукт культивирования Bifidobacterium longum IM55 можно заменить на сам штамм Lactobacillus plantarum IM76, его лизат или его экстракт. Также, последующие функциональные пищевые продукты для здорового питания могут дополнительно содержать хитозан.
<11-1> Приготовление мучного пищевого продукта
0,5 части по весу продукта культивирования Bifidobacterium longum IM55 добавляли в 100 частей по весу муки, после чего полученную смесь использовали для приготовления хлеба, пирога, печенья, крекера и лапши.
<11-2> Приготовление молочных продуктов
0,5 части по весу продукта культивирования Bifidobacterium longum IM55 добавляли в 100 частей по весу молока, после чего указанное молоко использовали для приготовления различных молочных продуктов, таких как масло и мороженое.
<11-3> Приготовление порошка из смешанного зерна
Нешлифованный рис, ячмень, клейкий рис и слезник, которые предварительно желатинизировали и сушили известным способом, обжаривали, а затем перетирали в порошок с размером частиц 60 меш с помощью мельницы.
Черные бобы, черный кунжут и семена периллы, которые предварительно обрабатывали паром и сушили известным способом, также обжаривали, а затем перетирали в порошок с размером частиц 60 меш с помощью мельницы.
Указанные приготовленные зерна, семена и орехи и продукт культивирования Bifidobacterium longum IM55 смешивали в приведенном далее соотношении для приготовления порошка из смешанных зерен.
Зерна (30 частей по весу нешлифованного риса, 17 частей по весу слезника и 20 частей по весу ячменя);
Семена и орехи (7 частей по весу семян периллы, 8 частей по весу черных бобов и 7 частей по черного кунжута);
Продукт культивирования Bifidobacterium longum IM55 (1 часть по весу);
Ganoderma lucidum (0,5 части по весу); и
Rehmannia glutinosa (0,5 части по весу)
<11-4> Приготовление напитка для здорового питания
Вводимые в малых дозах ингредиенты, такие как кукурузная патока с высоким содержанием фруктозы (0,5 г), олигосахарид (4 г), сахар (2 г), кулинарная соль (0,5 г) и вода (77 г), а также 1 г продукта культивирования Bifidobacterium longum IM55 смешивали до однородного состояния, затем быстро пастеризовали, а затем упаковывали в каждую из небольших упаковочных емкостей, таких как стеклянная бутылка, ПЭТ-бутылка и т. д., для получения напитка для здорового питания.
<11-5> Приготовление овощного сока
2 г продукта культивирования Bifidobacterium longum IM55 добавляли в 1000 мл томатного или морковного сока, для получения овощного сока.
<11-6> Приготовление фруктового сока
1 г продукта культивирования Bifidobacterium longum IM55 добавляли в 1000 мл яблочного или виноградного сока, для получения фруктового сока.
6. Регистрационная информация о молочнокислых бактериях
Авторы настоящего изобретения депонировали Bifidobacterium longum IM55 с целью патентования в Корейском центре культур микроорганизмов (Korean Culture Center of Microorganisms), сертифицированном депозитарии (адрес: Yulim Building, 45, Hongjenae 2ga-gil, Seodaemun-gu, Сеул, Южная Корея), 20 января 2017 года, и получили регистрационный номер KCCM11961P. Также, авторы настоящего изобретения депонировали Lactobacillus plantarum IM76 с целью патентования в Корейском центре культур микроорганизмов, сертифицированном депозитарии (адрес: Yulim Building, 45, Hongjenae 2ga-gil, Seodaemun-gu, Сеул, Южная Корея), 20 января 2017 года, и получили регистрационный номер KCCM11962P. Депонирование указанных молочнокислых бактерий было выполнено в соответствии с Будапештским договором о международном признании депонирования микроорганизмов для патентной процедуры.
Как показано выше, настоящее изобретение было описано посредством приведенных выше примеров, но не обязательно ограничено ими, и его можно различным образом модифицировать без отступления от объема и сущности настоящего изобретения. Таким образом, объем защиты настоящего изобретения следует понимать как включающий все варианты осуществления, относящиеся к объему патентной формулы изобретения, прилагаемой к настоящему изобретению.
Регистрационный номер
Название депозитария: Корейский центр культур микроорганизмов (международный)
Регистрационный номер: KCCM11961P
Дата регистрации: 20170120
Название депозитария: Корейский центр культур микроорганизмов (международный)
Регистрационный номер: KCCM11962P
Дата регистрации: 20170120
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>    ЮНИВЕРСИТИ-ИНДАСТРИ КООПЕРЕЙШН ГРУП ОФ КЮН ХЕЕ ЮНИВЕРСИТИ
НАВИФАРМ КО, ЛТД
<120>    НОВЫЕ МОЛОЧНОКИСЛЫЕ БАКТЕРИИ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
<130>    P17045-NVP
<150>    KR 10-2017-0013632
<151>    2017-01-31
<160>    30
<170>    KoPatentIn 3.0
<210>    1
<211>    1377
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    16S rDNA Bifidobacterium longum IM55
<400>    1
gacttgacgg ggcggtgtgt acaaggcccg ggaaacgcat tcaccgcgac gttgctgatt         60
cgcgattact agcgactccg ccttcacgca gtcgagttgc agactgcgat ccgaactgag        120
accggttttc agggatccgc tccgcgtcgc cgcgtcgcat cccgttgtac cggccattgt        180
agcatgcgtg aagccctgga cgtaaggggc atgatgatct gacgtcatcc ccaccttcct        240
ccgagttaac cccggcggtc ccccgtgagt tcccggcata atccgctggc aacacggggc        300
gagggttgcg ctcgttgcgg gacttaaccc aacatctcac gacacgagct gacgacgacc        360
atgcaccacc tgtgaacccg ccccgaaggg aagccgtatc tctacgaccg tcgggaacat        420
gtcaagccca ggtaaggttc ttcgcgttgc atcgaattaa tccgcatgct ccgccgcttg        480
tgcgggcccc cgtcaatttc tttgagtttt agccttgcgg ccgtactccc caggcgggat        540
gcttaacgcg ttagctccga cacggaaccc gtggaacggg ccccacatcc agcatccacc        600
gtttacggcg tggactacca gggtatctaa tcctgttcgc tccccacgct ttcgctcctc        660
agcgtcagta acggcccaga gacctgcctt cgccattggt gttcttcccg atatctacac        720
attccaccgt tacaccggga attccagtct cccctaccgc actcaagccc gcccgtaccc        780
ggcgcggatc caccgttaag cgatggactt tcacaccgga cgcgacgaac cgcctacgag        840
ccctttacgc ccaataattc cggataacgc ttgcacccta cgtattaccg cggctgctgg        900
cacgtagtta gccggtgctt attcaacggg taaactcact ctcgcttgct ccccgataaa        960
agaggtttac aacccgaagg cctccatccc tcacgcggcg tcgctgcatc aggcttgcgc       1020
ccattgtgca atattcccca ctgctgcctc ccgtaggagt ctgggccgta tctcagtccc       1080
aatgtggccg gtcgccctct caggccggct acccgtcgaa gccacggtgg gccgttaccc       1140
cgccgtcaag ctgataggac gcgaccccat cccataccgc gaaagctttc ccagaagacc       1200
atgcgatcaa ctggagcatc cggcattacc acccgtttcc aggagctatt ccggtgtatg       1260
gggcaggtcg gtcacgcatt actcacccgt tcgccactct caccaccaag caaagcccga       1320
tggatcccgt tcgacttgca tgtgttaagc acgccgccag cgttcatcct gagccat          1377
<210>    2
<211>    1421
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    16S rDNA Lactobacillus plantarum IM76
<400>    2
ctggtattga ttggtgcttg catcatgatt tacatttgag tgagtggcga actggtgagt         60
aacacgtggg aaacctgccc agaagcgggg gataacacct ggaaacagat gctaataccg        120
cataacaact tggaccgcat ggtccgagct tgaaagatgg cttcggctat cacttttgga        180
tggtcccgcg gcgtattagc tagatggtgg ggtaacggct caccatggca atgatacgta        240
gccgacctga gagggtaatc ggccacattg ggactgagac acggcccaaa ctcctacggg        300
aggcagcagt agggaatctt ccacaatgga cgaaagtctg atggagcaac gccgcgtgag        360
tgaagaaggg tttcggctcg taaaactctg ttgttaaaga agaacatatc tgagagtaac        420
tgttcaggta ttgacggtat ttaaccagaa agccacggct aactacgtgc cagcagccgc        480
ggtaatacgt aggtggcaag cgttgtccgg gatttattgg gcgtaaagcg agcgcaggcg        540
gttttttaag tctgatgtga aagccttcgg ctcaaccgaa gaagtgcatc ggaaactggg        600
aaacttgagt gcagaagagg acagtggaac tccatgtgta gcggtgaaat gcgtagatat        660
atggaagaac accagtggcg aaggcggctg tctggtctgt aactgacgct gaggctcgaa        720
agtatgggta gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca taccgtaaac gatgaatgct        780
aagtgttgga gggtttccgc ccttcagtgc tgcagctaac gcattaagca ttccgcctgg        840
ggagtacggc cgcaaggctg aaactcaaag gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga        900
gcatgtggtt taattcgaag ctacgcgaag aaccttacca ggtcttgaca tactatgcaa        960
atctaagaga ttagacgttc ccttcgggga catggataca ggtggtgcat ggttgtcgtc       1020
agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctt attatcagtt       1080
gccagcatta agttgggcac tctggtgaga ctgccggtga caaaccggag gaaggtgggg       1140
atgacgtcaa atcatcatgc cccttatgac ctgggctaca cacgtgctac aatggatggt       1200
acaacgagtt gcgaactcgc gagagtaagc taatctctta aagccattct cagttcggat       1260
tgtaggctgc aactcgccta catgaagtcg gaatcgctag taatcgcgga tcagcatgcc       1320
gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc acaccatgag agtttgtaac       1380
acccaaagtc ggtggggtaa ccttttagga accagccgcc t                           1421
<210>    3
<211>    22
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Прямой праймер T-bet
<400>    3
cctcttctat ccaaccagta tc                                                  22
<210>    4
<211>    19
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Обратный праймер T-bet
<400>    4
ctccgcttca taactgtgt                                                      19
<210>    5
<211>    24
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Прямой праймер FN-гамма
<400>    5
tcaagtggca tagatgtgga agaa                                                24
<210>    6
<211>    21
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Обратный праймер FN-гамма
<400>    6
tggctctgca ggattttcat g                                                   21
<210>    7
<211>    21
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Прямой праймер GATA3
<400>    7
gaaggcatcc agacccgaaa c                                                   21
<210>    8
<211>    20
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Обратный праймер GATA3
<400>    8
acccatggcg gtgaccatgc                                                     20
<210>    9
<211>    25
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Прямой праймер IL-5
<400>    9
aaagagaagt gtggcgagga gagac                                               25
<210>    10
<211>    27
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Обратный праймер IL-5
<400>    10
ccttccattg cccactctgt actcatc                                             27
<210>    11
<211>    22
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Прямой праймер ROR гамма t
<400>    11
acagccactg cattcccagt tt                                                  22
<210>    12
<211>    22
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Обратный праймер ROR гамма t
<400>    12
tctcggaagg acttgcagac at                                                  22
<210>    13
<211>    21
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Прямой праймер IL-17
<400>    13
tttaactccc ttggcgcaaa a                                                   21
<210>    14
<211>    20
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Обратный праймер IL-17
<400>    14
ctttccctcc gcattgacac                                                     20
<210>    15
<211>    18
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Прямой праймер FOXp3
<400>    15
cccatcccca ggagtctt                                                       18
<210>    16
<211>    21
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Обратный праймер FOXp3
<400>    16
accatgacta ggggcactgt a                                                   21
<210>    17
<211>    23
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Прямой праймер IL-10
<400>    17
atgctgcctg ctcttactga ctg                                                 23
<210>    18
<211>    24
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Обратный праймер IL-10
<400>    18
cccaagtaac ccttaaagtc ctgc                                                24
<210>    19
<211>    20
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Прямой праймер GAPDH
<400>    19
tgcagtggca aagtggagat                                                     20
<210>    20
<211>    20
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Обратный праймер GAPDH
<400>    20
tttgccgtga gtggagtcat                                                     20
<210>    21
<211>    25
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Прямой праймер Firmicutes
<400>    21
ggagyatgtg gtttaattcg aagca                                               25
<210>    22
<211>    20
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Обратный праймер Firmicutes
<400>    22
agctgacgac aaccatgcac                                                     20
<210>    23
<211>    22
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Прямой праймер Bacteroidetes
<400>    23
aacgcgaaaa accttaccta cc                                                  22
<210>    24
<211>    22
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Обратный праймер Bacteroidetes
<400>    24
tgccctttcg tagcaactag tg                                                  22
<210>    25
<211>    18
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Прямой праймер Actinobacteria
<400>    25
tgtagcggtg gaatgcgc                                                       18
<210>    26
<211>    21
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Обратный праймер Actinobacteria
<400>    26
aattaagcca catgctccgc t                                                   21
<210>    27
<211>    21
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Прямой праймер дельта/гамма-proteobacteria
<400>    27
gctaacgcat taagtryccc g                                                   21
<210>    28
<211>    18
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Обратный праймер дельта/гамма-proteobacteria
<400>    28
gccatgcrgc acctgtct                                                       18
<210>    29
<211>    19
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Прямой праймер TM7
<400>    29
gcaactcttt acgcccagt                                                      19
<210>    30
<211>    18
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Обратный праймер TM7
<400>    30
gagaggatga tcagccag                                                       18
<---