ГЕНЕТИЧЕСКАЯ АБЛЯЦИЯ КЛЕТОК, НЕСУЩИХ ГЕН PRP, С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СТРАТЕГИИ НАПРАВЛЕННОЙ ПРОМОТОРНОЙ ЛОВУШКИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БЕССЫВОРОТОЧНЫХ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ В КАЧЕСТВЕ ТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ

1. Свободная от прионного белка (PrP), бессмертная, соматическая клеточная линия человека, в которой полностью удалены оба аллеля гена PrP.
2. Клеточная линия по п.1,
(i) которую можно трансфицировать или культивировать в бессывороточных условиях, и/или (ii) которая имеет встроенные аденовирусные последовательности в своем геноме, и/или (iii) которая получена из исходной клетки, выбранной из группы клеток почки, мочевого пузыря, печени, легкого, сердечной мышцы, гладкой мускулатуры, яичника и желудочно-кишечного тракта, предпочтительной исходной клеткой является линия клеток почки человека, и/или (iv) которая подходит для получения рекомбинантных белков.
3. Клеточная линия по п.2, в которой клетки почки являются клетками почки человеческого эмбриона, предпочтительно клетки почки эмбриона человека выбирают из клеток 293 (ATCC CRL-1573; DSM ACC 305), клеток FreeStyle 293 (клетки 293F; Invitrogen R79007) и клеток 293T (DSM ACC 2494), предпочтительно это клетки 293F (Invitrogen R79007).
4. Клеточная линия по любому одному из пп.1-3, в которой аллели гена PrP полностью удалены гомологичной рекомбинацией с нокаутными ловушками, несущими гены селективных или селекционных маркеров, так что экспрессия селективного или селекционного маркера осуществляется с эндогенного PrP-промотора.
5. Клеточная линия по п.3, включающая, но не ограниченная этим, бесприонную клеточную линию 293F, pf293F и все промежуточные смешанные популяции и полученные клоны, необходимые для ее получения.
6. Способ получения свободной от PrP, бессмертной, соматической клеточной линии человека по любому одному из пп.1-5, который включает последовательную делецию ОРС PrP в соответствующей исходной клетке путем гомологичной рекомбинации с несколькими различными конструкциями для нокаута PrP или с одинаковой конструкцией и проведение селекции на антибиотике при постепенно увеличивающихся концентрациях.
7. Способ по п.6, в котором нокаутная конструкция несет одинаковые или различные лишенные промотора гены селекционных маркеров или селективные маркеры, фланкированные двумя последовательностями, гомологичными сайту встраивания внутри гена PrP исходной клетки.
8. Способ по п.7, в котором нокаутные конструкции (i) несут различные гены селекционных маркеров, и/или (ii) дополнительно несут одну из следующих функциональных последовательностей: полиА-последовательность, последовательности, распознаваемые рекомбиназой, IRES (внутренний сайт связывания рибосомы), и/или (iii) гомологичные последовательности имеют длину от 1 до 10 т.п.о., предпочтительно около 6 т.п.о., и/или соответствуют последовательностям выше или ниже ОРС PrP исходной клеточной линии, наиболее предпочтительные гомологичные последовательности показаны в SEQ ID NO: 2 и 3, и/или (iv) селекционные маркеры кодируют положительные маркеры селекции, включающие, но не ограниченные этим: неомицин, зеоцин, гигромицин, а селективные маркеры включают флуоресцентные маркеры, такие как GFP и Dsred, и ферменты, такие как LacZ.
9. Способ по п.8, в котором нокаутные конструкции имеют одну или несколько последовательностей, показанных в SEQ ID NO: 1 и 16.
10. Конструкция для нокаута PrP по любому одному из пп.6-9.
11. Применение свободной от PrP, бессмертной клеточной линии человека по любому одному из пп.1-5 для свободного от PrP, рекомбинантного получения белка человека или антитела, или их производного или мутанта (белка-мишени).
12. Способ получения клеточной линии человека для свободного от PrP, рекомбинантного получения белка человека или антитела, или их производного, или мутанта (белка-мишени), который включает в себя трансфекцию свободной от PrP, бессмертной клеточной линии человека по любому одному из пп.1-5 трансфекционным вектором, содержащим точку инициации репликации и ген, кодирующий указанный белок-мишень человека, при этом ген белка-мишени человека соединен на своем 5'-конце с промотором, а на своем 3'-конце с полиА-сигналом.
13. Способ по п.12, в котором (i) трансфекцию проводят в бессывороточных условиях, и/или (ii) трансфекционный вектор получен из вектора pcDNA3.1 от Invitrogen, и/или (iii) белком-мишенью человека является фактор свертывания крови, такой как фактор VIII (включая фактор VIII дикого типа или фактор VIII с удаленным В-доменом), фактор свертывания крови IX, фактор VII/VIIa, фактор роста человека, такой как G-CSF или GM-CSF, vWF или альфа-1-антитрипсин (А1АТ), или антитело человека.
14. Свободная от PrP, бессмертная клеточная линия-продуцент человека, стабильно трансфицированная, предпочтительно в бессывороточных условиях трансфекционным вектором, описанным в п.12 или 13.
15. Способ свободного от PrP, рекомбинантного получения белка-мишени человека, который включает культивирование, предпочтительно, в бессывороточных условиях, свободной от PrP, бессмертной клеточной линии-продуцента человека по п.14.
16. Свободная от PrP, бессмертная клеточная линия, в которой полностью удалены оба аллеля гена PrP, выбранная из клеток НЕК 293F и Per.C6 (бессмертные клетки сетчатки эмбриона), клеток СНО (клетки яичников китайского хомячка) и клеток ВНК (клетки почки детеныша хомячка).
17. Применение свободной от PrP, бессмертной клеточной линии по п.16 для свободного от PrP, рекомбинантного получения белка человека, или антитела, или их производного, или мутанта (белка-мишени).