Влияние криоглобулинов на электрофоретическую подвижность эритроцитов при различных заболеваниях

Импульсная активность бульбарных кардиоваскулярных нейронов при гипоксии и гиперкапнии

периодом 26 ± 2,52 с. Не выявлено направленности реакции нейронов на это воздействие: их импульсная активность как учащалась, так и урежалась (р > 0,5).

Таким образом, в условиях перерезки нервов Геринга афферентные кардиоваскулярные нейроны не изменяют импульсную активность при гипоксии. Гиперкапния приводит к изменению импульсной активности этих нейронов менее чем в половине случаев. В этих условиях вставочные кардиоваскулярные нейроны, как и афферентные, реагируют на гиперкапнию почти в половине случаев. Однако, в отличие от афферентных нейронов, они также в половине случаев реагируют и на гипоксию.

Заключение

Подытоживая полученные данные в целом, можно прийти к заключению, что перерезка нервов Геринга не влияет на чувствительность афферентных нейронов к гипоксии и гиперкапнии: не изменяется количество прореагировавших нейронов и длительность латентного периода реакции на гиперкапнию. Чувствительность же вставочных кардиоваскулярных нейронов к гипоксии и гиперкапнии меняется. Так, в условиях перерезки нервов Геринга количество вставочных нейронов, изменяющих импульсную активность при гипоксии, уменьшается в 2 раза. При гиперкапнии количество прореагировавших нейронов также сокращается вдвое. Кроме того, почти в

1,5 раза увеличивается латентный период реакции и исчезает ее направленность: нейроны как уменьшают, так и увеличивают импульсную активность. Подобная реакция нейронов была выявлена N.L.Nichols и соавт. в срезах мозга крыс на уровне солитарного тракта методом patch clamp в конфигурации wholecell [12]. Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что изменение активности вставочных нейронов бульбарного сердечно-сосудистого центра при изменении газового состава крови обусловлено информацией, поступающей к ним от хеморецепторов не только синокаротидной зоны, но и аортальной зоны. На это указывает наличие нейронов, реагирующих на гипоксию в условиях прекращения поступления к ним информации от хеморецепторов синокаротидной зоны. При гиперкапнии, информация к вставочным кардиоваскулярным нейронам поступает как от артериальных хеморецепторов, так и от центральных хеморецепторов. Изменения при гиперкапнии импульсной активности зарегистрированных нами афферентных нейронов обусловлены, по-видимому, информацией, поступающей к ним от центральных хеморецепторов. Отсутствие реакции этих нейронов на гипоксию может быть связано с тем, что они, в основном, получают информацию от рецепторов по толстым миелинизирован-ным волокнам, в то время как информация от хеморецепторов передается по более тонким нервным волокнам [11, 13].

Литература

1. Powell F.L., Huey K.A., Dwinell M.R. Central nervous system mechanisms of ventilator acclimatization to hypoxia // Respir Physiol. 2000. V.121. P.223-236.

2. Li A., Emond L., Natti E. Brainstem catecholaminergic neurons modulated both respiratory and cardiovascular function // Adv. Exp. Med. Biol. 2008. V.605. №10. P.371-376.

3. Comroe J.H. The peripheral chemoreceptors // Handbook of Physiology. Sect. 3. Respiration. V.1. Washington D.C., American Physiological Society. Baltimore, Md.: Distributed by Williams & Wilkins, 1964. P.557-583.

4. Савельев H.K. К механизму реакции дыхания и тонуса сосудов конечности при гипоксии // Вопросы регуляции дыхания и кислородного обеспечения организма. Куйбышев: Изд-во Куйбышев. мед. ин-та, 1974. C.71-76.

5. Passino C., Giannoni A., Milli M. et al. Recent knowledges on chemosensitivity to hypoxia and hypercapnia in cardiovascular disease // Recenti Prog Med. 2010. V.101. №7-8. P.308-313.

6. Kara T., Narkiewicz R., Somers V.K. Chemoreflexes — physiology and clinical implications // Acta Physiol. Scand. 2003. V.177.

№3. P.377-384.

7. Oikawa S., Hirakawa H., Kusakabe T. et al. Autonomic cardiovascular responses to hypercapnia in conscious rat: the roles of the chemo-and baroreceptors // Autonomic Neurosci. 2005. V.117. №2.

P.105-114.

8. Steinback C.D., Salzer D., Medeiros PJ. et al. Hypercapnic vs. hypoxic control of cardiovascular, cardiovagal, and sympathetic function // Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 2009. V.296. P.R402-R410.

9. Путыгин C.B., Михайлова С.Д., Косицкий Г.И. К характеристике нейронов бульбарного сердечно-сосудистого центра. М., 1985. (рукопись депонирована в ВИНИТИ 10.03.1986 г., №1633-В86).

10. Franz D.N., Iggo A. Conduction failure in myelinated and non-myelinated axon at low temperatures // J. Physiol. (London). 1968. V.199. P.319-345.

11. Paintal A.S. Vagal sensory receptors and their reflex effects // Physiol. Rev. 1973. V.53. №1. P.159-227.

12. Nichols N.L., Wilkinson K.A., Powell F.L. et al. Chronic hypoxia suppresses the CO2 response of solitary complex (Sc) neurons from rats // Respir Physiol Neurobiol. 2009. V.168. №3. P.272-280.

13. Donoghue S., Felder R.B., Jordan D., Spyer K.M. The central projections of carotid baroreceptors and chemoreceptors in the cat: a neurophysiological study // J. Physiol. (London). 1984. V.347. P.397-409.

Информация об авторах:

Семушкина Татьяна Михайловна, кандидат медицинских наук, ведущий научный сотрудник НИЛ патологии сердечно-сосудистой системы Российского национального исследовательского медицинского университета им. Н.И.Пирогова Адрес: 117997, Москва, ул. Островитянова, 1 Телефон: (495) 434-2188

Соколов Александр Викторович, кандидат медицинских наук, доцент кафедры нормальной физиологии, ведущий научный сотрудник НИЛ патологии сердечно-сосудистой системы Российского национального исследовательского медицинского университета им. Н.И.Пирогова

Адрес: 117997, Москва, ул. Островитянова, 1 Телефон: (495) 434-2188 E-mail: dr.al.sokolov@gmail.com

Микаелян Нина Погосовна, доктор медицинских наук, главный научный сотрудник НИЛ патологии сердечно-сосудистой системы Российского национального исследовательского медицинского университета им. Н.И.Пирогова Адрес: 117997, Москва, ул. Островитянова, 1 Телефон: (495) 434-2188

Сторожаков Геннадий Иванович, академик РАМН, профессор, заведующий кафедрой госпитальной терапии № 2 лечебного факультета Российского национального исследовательского медицинского университета им. Н.И.Пирогова Адрес: 117997, Москва, ул. Островитянова, 1 Телефон: (495) 434-4656

61

МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОБЛЕМЫ

Влияние криоглобулинов на электрофоретическую подвижность эритроцитов при различных заболеваниях

Н.А.Константинова, И.Ю.Куликова, Е.Н.Карандашов

Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И.Пирогова, кафедра экспериментальной и теоретической физики медико-биологического факультета, Москва

~\ Исследовали температурную зависимость электрофоретической подвижности эритроцитов, нагруженных криоглобулинами, выделенными из сыворотки крови больных с различными заболеваниями и с различными формами одного заболевания (системная красная волчанка, хронический гломерулонефрит, атеротромботиче-ский и кардиоэмболический варианты инсульта). Эритроциты получали из крови здоровых доноров. Установлено, что криоглобулины существенно изменяют электрофоретическую подвижность эритроцитов. Это изменение может быть разнонаправленным: как в сторону увеличения, так и в сторону уменьшения, — в зависимости от природы заболевания и формы его проявления. Показано, что комплексы криоглобулинов распадаются при повышении температуры. Сделан вывод, что электрофоретический метод оценки криокомплексов является достаточно информативным, в частности, позволяет оценить степень их гетерогенности.

Ключевые слова: криоглобулины, криокомплексы, криопреципитат, электрофоретическая подвижность эритроцитов, системная красная волчанка, хронический гломерулонефрит,

_\ атеротромботический инсульт, кардиоэмболический инсульт

Effect of cryoglobulins on electrophoretic mobility of erythrocytes in various diseases

N.A.Konstantinova, I.Yu.Kulikova, E.N.Karandashov

The Russian National Research Medical University named after N.I.Pirogov,

Department of Experimental and Theoretical Physics of Medical-Biological Faculty, Moscow

~\ The temperature dependence of the electrophoretic mobility of erythrocytes loaded with cryoglobulins, isolated from serum of patients with various diseases and different forms of a disease (systemic lupus erythematosus, chronic glomerulonephritis, atherothrombotic and cardioembolic ischemic stroke options) was investigated. Erythrocytes were obtained from healthy donors' blood. It was established that cryoglobulins significantly changed electrophoretic mobility of erythrocytes. This change may be in different directions: both upward and downward, depending on the nature of the disease and forms of its manifestation. It was shown that cryoglobulins complexes decompose at elevated temperatures. It was concluded that the electrophoretic method for estimating cryocomplexes is quite informative, in particular, to assess the extent of their heterogeneity.

Key words: cryoglobulins, cryocomplexes, cryoprecipitate, electrophoretic mobility of red blood cells, systemic lupus erythematosus, chronic glomerulonephritis, atherothrombotic stroke,

J cardioembolic stroke

Криоглобулины (КГ) — это иммуноглобулины с аномальной температурной растворимостью, преципитирующие и образующие криокомплексы (КК) при снижении температуры. Криоглобулины обнаруживают в крови при заболеваниях самой различной этиологии: аутоиммунной, лимфопролиферативной, инфекционной и др. [1]. В последние годы показано, что криоглобулины принимают активное участие в процессах сердечно-сосудистых повреждений при инфаркте и инсульте [2, 3].

Для корреспонденции:

Константинова Нелля Александровна, доктор биологических наук, профессор, заведующая кафедрой экспериментальной и теоретической физики медико-биологического факультета Российского национального исследовательского медицинского университета им. H.И.Пирогова Адрес: 117997, Москва, ул. Островитянова, 1 Телефон: (499) 246-8771

Статья поступила 17.04.2012 г., принята к печати 05.06.2012 г.

62

Существующие в настоящее время экспериментальные данные о физико-химических и биологических свойствах криоглобулинов не имеют однозначной трактовки и не укладываются в существующие концепции.

Вместе с тем установлено, что высокий уровень криоглобулинов в крови даже при нечетко выраженной патологии — это признак скрытых аутоиммунных процессов, протекающих в организме, которые могут при определенных условиях привести к развитию заболевания с тяжелейшими клиническими проявлениями [2, 3]. Именно поэтому дальнейшее изучение структурных и физико-химических свойств криобелков и их комплексов представляется чрезвычайно важным и актуальным.

Цель исследования — изучить влияние криоглобулинов, полученных из сыворотки крови больных с различной патологией, на электрофоретическую подвижность эритроцитов при изменении температуры.

Влияние криоглобулинов на электрофоретическую подвижность эритроцитов при различных заболеваниях

Материалы и методы

В исследование были включены больные системной красной волчанкой (СКВ — 12 человек), хроническим гломерулонефритом (ХГН — 16 человек), а также больные с атеротромботическим инсультом (АТИ — 18 человек) и кардиоэмболическим инсультом (КЭИ — 14 человек). Клиническое обследование больных СКВ и ХГН проводили на базе отделения нефрологии Клиники нефрологии, внутренних и профессиональных заболеваний им. Е.М.Тареева Первого МГМУ им. И.М.Сеченова. Обследование больных с инсультами и забор биологических образцов выполняли на кафедре фундаментальной и клинической неврологии и нейрохирургии РНИМУ им. Н.И.Пирогова.

Криоглобулины выделяли из сыворотки крови больных по стандартной методике [4]. Эритроциты получали из крови здоровых доноров также по стандартной методике.

Для количественной оценки образующегося при различных температурах криопреципитата использовали спектрофотометрический метод A.E.Kalovidorius в модификации Н.А.Константиновой [5]. Измерения проводили на спектрофотометре «Cary-50» (США) при длине волны 280 нм, в расчетах использовали коэффициент экстинкции 1,4.

Зарядовые характеристики криокомплексов оценивали по изменению электрофоретической подвижности (ЭФП) эритроцитов человека, нагруженных КГ, относительно ЭФП ненагруженных эритроцитов. ЭФП измеряли с помощью цитоферометра «Opton» (Германия) при токе электрофореза 8 мА и температурах 4 и 37 °С [6]. Эритроциты, нагруженные КГ, хранили не более 1 нед после взятия крови в растворе Олсве-ра с добавлением азида натрия в конечной концентрации 0,1%. Нагружение эритроцитов КГ проводили путем их инкубации при 4 °С в течение 4 ч при конечной концентрации криобелков в растворе не менее 30 мкг/мл. В каждой пробе регистрировали 50 клеток и определяли среднее значение ЭФП.

Для статистической обработки данных использовали программу «Statsoft Statistica 6.0». Для сравнения полученных значений ЭФП и определения статистически достоверных различий между ними использовали непараметрический критерий Манна-Уитни. Выбор данного критерия был обусловлен невозможностью проверки нормальности распределения вследствие малого объема выборки.

Результаты исследования и их обсуждение

Исследования ЭФП нагруженных криобелками эритроцитов, проведенные при 4 °С, показали, что характер изменений этого показателя относительно ЭФП ненагруженных эритроцитов зависит от заболевания. Как видно на рис. 1, КГ, выделенные при ХГН в большей степени изменяют ЭФП эритроцитов, чем КГ, выделенные из сыворотки крови больных СКВ. Однако в обоих случаях нагружение эритроцитов КГ

уменьшало их суммарный поверхностный заряд. При нагружении эритроцитов КГ, выделенными из сыворотки крови больных с изучаемыми вариантами ишемического инсульта (АТИ и КЭИ), наблюдался противоположный эффект: ЭФП нагруженных эритроцитов увеличивалась по сравнению с контролем. Это говорит о том, что общий электростатический заряд нагруженных эритроцитов увеличивался.

При увеличении температуры до 37 °С наблюдалось повышение ЭФП эритроцитов, нагруженных КГ, относительно аналогичного показателя, полученного при 4 °С. Это повышение было характерно для всех групп больных, однако его степень была различной. Так, в случае СКВ ЭФП эритроцитов увеличилась в

1,24 раза, в случае ХГН — в 2,28 раза, при АТИ выявлено увеличение в 1,19 раза, при КЭИ — в 1,28 раза.

Полученные результаты свидетельствуют в первую очередь о том, что КГ при исследуемых нами патологиях по своей природе различны. Специфический характер наблюдаемых изменений ЭФП эритроцитов, нагруженных криобелками, определяется главным образом составом, надмолекулярной структурой сформированных при понижении температуры КК, конформационными перестройками, протекающими в КК на поверхности эритроцита. Наблюдаемый рост значений ЭФП нагруженных криобелками эритроцитов при увеличении температуры может быть обусловлен тем, что в процессе распада КК при нагревании отрицательно заряженные компоненты КК остаются на мембране эритроцита, увеличивая его

Контроль СКВ ХГН АТИ КЭИ

Рис. 1. Зависимость от температуры ЭФП эритроцитов, нагруженных КГ, выделенными из сыворотки крови больных с различными заболеваниями

Светлые столбики — 4 °С, темные — 37 °С. Контроль — ненагруженные эритроциты; СКВ — эритроциты, нагруженные КГ больных системной красной волчанкой, ХГН — хроническим гломерулонефритом, АТИ — атеротравматическим инсультом, КЭИ — кардиоэмболическим инсультом. * — р <0,05 при сравнении с контролем, ** — р <0,05 при сравнении с показателем при 4 °С

63

Н.А.Константинова и др. / Вестник РГМУ, 2012, №4, с. 62-64

1,6

1,4 -

СКВ хгн

стадии заболевания, представлены на рис. 3. Видно, что полученные зависимости различаются по своему характеру. Если для АТИ кривая имеет S-образный характер с областью резкого изменения ЭФП в диапазоне температур от 15 до 20 °С, то аналогичная зависимость для КЭИ имеет линейный характер. Следовательно, КК при АТИ и КЭИ имеют различную природу. Кроме того, линейная зависимость от температуры ЭФП эритроцитов, нагруженных КК из крови больных с АТИ, свидетельствует о большей гетерогенности последних по сравнению с КК из крови больных с КЭИ. Таким образом, КК различаются не только в зависимости от патологии, но и в рамках одной патологии при разных формах ее проявления.

Рис. 2. Зависимость от температуры оптической плотности раствора КГ, выделенных из сыворотки крови больных системной красной волчанкой и хроническим гломерулонефритом

Светлые столбики — 4 °С, темные — 37 °С.

* — р <0,05 при сравнении с показателем при 4 °С

Рис. 3. Зависимость ЭФП эритроцитов, нагруженных КГ, выделенными из сыворотки крови больных с ишемическим инсультом

Сплошная линия — АТИ, прерывистая — КЭИ

отрицательный заряд, а также тем, что суммарный поверхностный заряд КК может перераспределяться за счет конформационных изменений.

Влияние температуры на структуру КК оценивали по изменению оптической плотности раствора КГ, выделенных из крови больных СКВ и ХГН (рис. 2). Увеличение температуры от 4 до 37 °С приводило к двукратному уменьшению оптической плотности раствора КК, которая характеризует размер иммунных комплексов. Таким образом, при повышении температуры КК распадаются. Однако часть компонентов КК может оставаться на мембране эритроцитов, что проявляется изменением их ЭФП.

Результаты исследования температурной зависимости ЭФП эритроцитов, нагруженных КК при 4 °С, выделенными из крови больных АТИ и КЭИ в острой

Выводы

1. Криоглобулины и их комплексы существенно изменяют ЭФП эритроцитов. Это изменение может быть разнонаправленным: как в сторону увеличения, так и в сторону уменьшения, — в зависимости от природы заболевания и формы его проявления.

2. При повышении температуры криокомплексы, связанные с поверхностью эритроцита, распадаются, но некоторые их компоненты остаются связанными с мембраной эритроцита.

3. Электрофоретический метод оценки криокомплексов является достаточно информативным, позволяет оценить степень их гетерогенности.

Литература

1. Chan A.O., Lau J.S., Chan C.H., Shek C.C. Cryoglobulinemia: clinical and perspectives // Hong Kong Med. J. 2008 Feb. V.14 (1). P.55-59.

2. Скворцова В.И., Константинова Н.А., Комаров А.Н. и др. Криоглобулинемия в патогенезе острого ишемического инсульта // Инсульт. Приложение к журналу «Неврология и психиатрия им. Н.И.Корсакова». 2004. №3. C.136-139.

3. Vital A., Favereaux A., Martin-Dupont P. et al. Anti-myelin-associated glycoprotein antibodies and endoneurial cryoglobulin deposits responsible for a severe neuropathy // Acta Neuropathol (Berl). 2001. V.102. P.409-412.

4. Чернохвостова E.B., Баталова Г.Б. Выявление криоглобулинемии и определение ее типа // Тер. архив. 1977. №8. C.69-76.

5. Константинова Н.А. Оценка криоглобулинов в сыворотке крови с учетом циркулирующих иммунных комплексов // Лаб. дело. 1988. №11. C.62-65.

6. Константинова Н.А., Куликова И.Ю. Применение цитоферометра для определения зарядовых характеристик криопреципитатов // Мед. физ. 1995. №2. C.96-98.

Информация об авторах:

Куликова Ирина Юрьевна, кандидат биологических наук, доцент кафедры экспериментальной и теоретической физики медико-биологического факультета Российского национального исследовательского медицинского университета им. Н.И.Пирогова Адрес: 117997, Москва, ул. Островитянова, 1 Телефон: (499) 246-8771

Карандашов Евгений Николаевич, заведующий лабораторией кафедры экспериментальной и теоретической физики медико-биологического факультета Российского национального исследовательского медицинского университета им. Н.И.Пирогова Адрес: 117997, Москва, ул. Островитянова, 1 Телефон: (499) 246-8771

64