Сравнение различных методов молекулярногенетического анализа соматических мутаций в гене K-ras при колоректальном раке

АКТУАЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ ОНКОЛОГИИ

Ф.А. Амосенко1, 2, И.В. Карпов3, А.В. Поляков1, С.П. Коваленко4, В.А. Шаманин3, Л.Н. Любченко2

1 ФГБУ Медико-генетический научный центр РАМН, Москва

2 ФГБУ Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва

3 Лаборатория генодиагностики «БиоЛинк», Новосибирск 4 Институт молекулярной биологии и биофизики СО РАМН, Новосибирск

Сравнение различных методов молекулярногенетического анализа соматических мутаций в гене при колоректальном раке

Проведено сравнение двух подходов для анализа соматических точечных мутаций в кодонах 12 и 13 гена К-газ: методов ПЦР/ЗЗСР/ЛСЯЗ/ секвенирования и аллель-специфической ПЦР в режиме реального времени (отечественный коммерческий набор «ККЛЯ-7Ш»). Сравнение проводили на 62 образцах геномной ДНК, выделенной из замороженных карцином толстой кишки, подвергшихся ручной микродиссекции. Результаты, полученные с помощью двух подходов, совпали для 59 карцином (95,2% случаев). Специфичность и чувствительность детекции К-а мутаций с помощью набора «ККЛЯ-7Ш» составили 100и 96,4%, соответственно, а с использованием методов ПЦР/ЛСЯЗ/ЗЗСР/ автоматического секвенирования — 94,1 и 100%, соответственно. Ложноположительные данные отсутствовали при детекции мутаций с помощью набора «КРЛЯ-7Ш» и составили 2 случая (5,9%) при исследовании методами ПЦР/ЛСЯЗ/ЗЗСР/автоматического секвенирования. Единственный ложноотрицательный результат (3,6%) был получен при анализе мутаций набором «ККЛЯ-7Ш».

Ключевые слова: колоректальный рак, соматические мутации гена ^гт, сравнение методов детекции мутаций, таргетная терапия.

Введение

Ген К-газ (официальное название — \-Ki-ras2, другие названия — КВЛБ2, ВЛБК2) локализован на хромосоме 12 (12р 12.1). Его продукт р21гав относится к семейству малых GTPаз и в норме является GTP-зависимым медиатором передачи сигналов для рецепторных тирозин-киназ [1]. Наиболее хорошо изучена роль р21гав в сигнальных каскадах Raf/MEK/ERK и RAS/PI3K/PTEN/Akt, которые контролируют пролиферацию, дифференци-ровку, апоптоз и выживание клеток [1—3]. Соматические мутации К-газ часто встречаются в опухолях различной

локализации [4, 5]. При колоректальныхраках (КРР), занимающих по распространенности в мире третье место [6], К-газ мутации обнаруживают с частотой 20—50% [7—10], в основном в кодонах 12 и 13 [11] и значительно реже в кодоне 61 [4]. Эти мутации уменьшают GTPазную активность р21гав, что приводит к накоплению в клетке конститутивно активированной GTP-связанной формы белка [4, 5, 12]. Мутантный р21гав индуцирует пролиферацию и трансформацию клеток [13, 14]. Активирующие соматические мутации гена К-газ играют важную роль на разных стадиях развития КРР, включая инициацию и метастазирование; кроме того, они определяют прогноз

F.A. Amosenko1,2, I.V. Karpov3, A.V. Polyakov1, S.P. Kovalenko4, V.A. Shamanin3, L.N. Lyubchenko2

1 Scientific centre of medical genetics, RAMS, Moscow

2 Blokhin Russian oncological scientific centre RAMS, Moscow

3 Laboratory of genetic diagnosis «BioLink», Novosibirsk

4 Institute of molecular biology and biophysics Siberian division of RAMS, Novosibirsk

Comparison of different methods of molecular-genetic analysis of somatic mutations in K-ras gene in patients with colorectal cancer

Two approaches to somatic point mutations in 12 and 13 codones of K-ras gene were analyzed: PCR/SSCP/ACRS/sequencing and allele-specific PCR in the real-life regimen (Russian set «KRAS-7M»). The comparison was carried out on 62 examples of genomic DNA extracted from frozen colon carcinomas, which underwent manual dissection. The results obtained in two attempts were consistent in 95,2% (N=59). Specificity and sensitivity of K-ras mutations detection using «KRAS-7M» set were 100 and 96,4% respectively, and 94,1 and 100% respectievly using PCR/SSCP/ACRS/ automatic sequencing. False positive results were absent when detecting with «KRAS-7M» and accounted for 2 cases (5,9%) when using PCR/SSCP/ ACRS/automatic sequencing. The only false negative response (3,6%) was obtained analyzing mutations using «KRAS-7M».

Key words: colorectal cancer, K-ras gene somatic mutations, mutation detection methods comparison, targeted treatment.

и ответ на лечение [15—20]. Именно поэтому детекция K-ras мутаций важна для современной клинической онкологии. В частности, применение в клинике таргетной терапии моноклональных антител к эпидермальному фактору роста (EGFR, Epidermal growth factor receptor) в схеме лечения метастатического рака толстой кишки (мРТК) существенно увеличило спрос на недорогие и надежные методы выявления соматических мутаций в гене K-ras в индивидуальных образцах спорадических опухолей.

Одна из основных проблем детекции мутаций в гене K-ras обусловлена гетерогенностью клинических образцов: как правило, они содержат смесь раковых и различного типа нормальных клеток. При этом количество раковых клеток в образце может быть очень низким. Кроме того, раковые клетки могут проявлять клональную гетерогенность, вследствие которой специфические мутации присутствуют далеко не во всех клетках опухоли [21]. Именно поэтому основное требование к методам детекции K-ras мутаций в клинических образцах — способность выявлять небольшие фракции мутантной ДНК на фоне большого количества ДНК дикого типа.

В настоящее время для обнаружения мутаций в опухолях толстой кишки применяется ПЦР-амплификация анализируемого участка с последующей детекцией ано-36 малий различными методами: секвенирование, анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ), анализ одноцепочечного конформацион-ного полиморфизма (SSCP, Single-strand conformation polymorphism analysis), гибридизация с аллель-специфическими олигонуклеотидами, плавление высокого разрешения (HRM), аллель-специфическая ПЦР в режиме реального времени (ас-рв-ПЦР) и другие [22—27]. У каждого из этих методов существуют как преимущества, так и недостатки. Так, преимуществом методов секвенирования является их способность выявлять все возможные точечные мутации и невысокая стоимость. Ограничение секвениро-вания заключается в недостаточной чувствительности: 5—10% мутантных аллелей K-ras на фоне последовательностей ДНК дикого типа для пиросеквенирования и от 10 до 30% мутантных аллелей — для секвениро-вания по Сэнгеру [28—30]. Преимуществом ас-рв-ПЦР является наличие закрытой системы, предохраняющей от контаминации, и высокая чувствительность, выявляющая до 1% мутантных аллелей на фоне ДНК дикого типа [31]. Недостатками ас-рв-ПЦР являются трудоемкость оптимизации аллель-специфических реакций и способность обнаруживать только выбранные мутации.

В данной работе мы сравнили результаты детекции соматических мутаций гена K-ras в карциномах толстой кишки с использованием методов ПЦР/ACRS/SSCP/сек-венирования и ас-рв-ПЦР, составляющей основу отечественного коммерческого набора «KRAS-7M» (БиоЛинк, Новосибирск).

Материалы и методы Пациенты

Исследовали образцы опухолей 63 российских больных спорадическим КРР, прооперированных в 1999—2005 годах в НИИ клинической онкологии РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. Выборка больных включала 25 мужчин и 38 женщин в возрасте 24—87 лет (средний возраст 62,7 года). За исключением пяти человек опубликованная ранее работа [10] была выполнена на этой же выборке больных.

Образцы опухолей и выделение ДНК

Все исследуемые опухоли были представлены аденокарциномами с различной локализацией в толстой кишке, различной дифференцировкой и различными TNM-стадиями. Для обогащения раковыми клетками замороженные образцы опухолей подвергали ручной микродис-секции под гистологическим контролем. Геномную ДНК из замороженной ткани опухолей выделяли с помощью набора «QIAamp DNA Tissue Mini Kit» (Qiagen, Германия).

Анализ мутаций протоонкогена K-ras

Для детекции мутаций K-ras использовали два подхода: ПЦР/AСRS/SSCP/секвенирование и аллель-специфическую ПЦР в режиме реального времени. Первый подход, описанный в работе [10], включает одноэтапную ПЦР с различными парами праймеров, позволяющими амплифицировать различные фрагменты гена K-ras, содержащие кодоны 12 и 13 (табл. 1). При амплификации фрагментов размером 157 п.о. и 161 п.о. праймеры вводят в ген дикого типа искусственные сайты узнавания для эндонуклеаз BstN1 и Hae III, соответственно. В ходе последующего рестрикционного анализа определяли образцы с мутациями в кодонах 12 или 13. Эти образцы подвергали SSCP-анализу (использовали фрагменты размером 290 п.о.) (см. табл. 1). Всего было идентифицировано 7 типов SSCP-аномалий [10]. Для 30 образцов, содержащих по данным ACRS и SSCP мутации K-ras, проводили автоматическое секвенирование продуктов ПЦР на аппарате «3130 Genetic Analyzer» (Applied Biosystems, США), используя те же праймеры, что и при ПЦР-амплификации.

При втором подходе мутации в гене K-ras детектировали методом ас-рв-ПЦР. ПЦР в режиме реального времени проводили в термоциклере «iQ5 iCycler» (BioRad, США). В случаях расхождения данных ACRS/SSCP и ас-рв-ПЦР образцы повторно тестировали методом ас-рв-ПЦР с помощью набора «TheraScreen KRAS» (DxS, Великобритания).

Принцип действия набора «KRAS-7M»

Набор «KRAS-7M» позволяет выявлять мутации в кодонах 12 и 13 гена K-ras (p.Gly12Cys, p.Gly12Ser, p.Gly12Arg, p.Gly12Val, p.Gly12Asp, p.Gly12Ala, p.Gly13Asp) в том случае, если содержание мутантного

Таблица 1. Праймеры для ПЦР амплификации различных фрагментов гена К-газ, содержащих кодоны 12 и 13

Праймер Нуклеотидная последовательность Продукт ПЦР

Ras - 1F 5'-GTACTGGTGGAGTATTTGATA 290

Ras - 1R 5'-ACT CAT GAAAATGGT CAGAGA

Bst - F 5'-ACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGACCT 157 [32]

Bst - R 5'-TCAAAGAATGGTCCTGGACC

Ras - 1F 5-GTACTGGTGGAGTATTTGATA 161

KRAS -R 5-TTTTAT cgt caaggcact cttgcctagg

Примечание. Подчеркнуты основания, не комплементарные ДНК дикого типа.

Amplification Chart

Amplification Chart

Рис. Детекция мутации K-ras c.35G>C (p.Gly12Ala) с помощью набора «KRAS-7M» методом аллель-специфической ПЦР в режиме реального времени

Примечание. 4 нг ДНК человека, содержащей ген K-ras дикого типа (WT, линия с точками), и 4 нг ДНК из клеток RPMI 8226 с мутацией p.Gly12Ala (линия без точек) амплифицировали с помощью контрольных праймеров на константный участок гена K-ras (A) или с помощью аллель-специфических праймеров для K-ras p.Gly12Ala (B). Реакции проводили в двойных повторах в термоциклере «iQ5 iCycler» (Bio-Rad). Приведены результаты ПЦР в режиме реального времени с детекцией флуоресценции SYBRGreen; уровень фона — 100,00 (серая линия). Оба образца имеют близкие величины Ct~17,0 с контрольными праймерами (А), но разные Ct с аллель-специфическими праймерами (Б).

37

аллеля составляет не менее 5% ДНК-копий гена. Анализ проводится методом ас-рв-ПЦР. Количество циклов ПЦР, необходимых для того, чтобы флуоресценция превысила уровень фона, называется О:. ПЦР с аллель-специфическими праймерами на ДНК с мутацией К-газ ведет к уменьшению С: на 7—10 циклов по сравнению с ДНК без мутаций, что позволяет отличить ДНК с мутацией К-газ от нормальной ДНК (рис.).

Величина С: зависит от количества и качества ДНК, используемой в ПЦР. Поэтому для нормировки результатов ПЦР все образцы тестируют в контрольной ПЦР на константный участок гена К-газ. Таким образом, при тесте на 7 мутаций с каждым образцом ДНК проводится 8 реакций: одна контрольная реакция с парой контрольных праймеров на константный участок гена К-газ и семь реакций с семью парами аллель-специфических праймеров, разнесенных в 7 пробирок и соответствующих разным мутациям кодонов 12 и 13 гена К-газ. Образцы тестируют в двойных повторах и результаты ПЦР для каждой мутации представляют в виде разницы ёС: = QAS — ОС, где CtAS — это С: препарата ДНК в ПЦР к данной мутации К-газ; ОС — С: препарата ДНК в контрольной ПЦР. Для контроля аналитической чувствительности теста в набор входит положительный ДНК-стандарт, который содержит 5% каждой из мутаций гена К-газ. Положительный стандарт тестируют вместе с неизвестными образцами и результат ПЦР неизвестного образца учитывают путем сравнения значения ёО образца для данной мутации с ёО положительного стандарта для той же мутации. Образец является положительным (содержащим мутацию), если ёО образца равно или меньше ёО положительного стандарта. Образец является отрицательным (без мутации или содержание мутации менее 5%), если ёО образца больше ёО стандарта.

Результаты

В табл. 2 приведены результаты определения мутаций в кодонах 12 и 13 гена К-газ с помощью ПЦР/AСRS/

SSCP/секвенирования и ас-рв-ПЦР. Из 63 образцов опухолевой ДНК для анализа оказался непригодным образец № 34, который содержал недостаточное количество материала. Таким образом, из 62 протестированных образцов ДНК результаты, полученные с использованием двух подходов, совпали для 59 карцином (95,2% случаев). В 27 из этих образцов с помощью набора «KRAS-7M» были идентифицированы 6 различных гетерозиготных мутаций в гене K-ras (пять в кодоне 12 и одна в кодоне 13; частота мутаций 43,6%). С помощью ПЦР/ACRS/SSCP/ секвенирования выявлено 7 различных гетерозиготных мутаций в 30 образцах опухолевой ДНК: пять в кодоне 12 и две в кодоне 13 (частота мутаций 48,4%). Для 22 образцов с мутациями результаты были подтверждены секвениро-ванием (см. табл. 2).

Расхождения результатов, обнаруженных при использовании различных методов исследования, выявлены только для трех образцов (№ 14, 50 и 55). Они приведены в табл. 3. В таблицу также включены данные, полученные с помощью коммерческого набора «TheraScreen KRAS». Этот набор предназначен для детекции тех же мутаций, что и набор «KRAS-7M», но имеет более высокую чувствительность. Он позволяет выявлять мутации в образцах ДНК человека, содержащих 1% мутантных ДНК-копий гена K-ras. Ложноотрицательный результат, полученный с помощью наборов «KRAS-7M» и «TheraScreen KRAS» для клинического образца № 14, объясняется тем фактом, что мутация p.Gly13Arg в гене K-ras, определенная при секвенировании ДНК, не входит в состав этих наборов, поскольку встречается относительно редко. Образцы ДНК № 50 и 55, мутации в которых не были обнаружены с помощью наборов, оказались подозрительными как по данным ПДРФ-анализа, так и SSCP-анализа: в обоих случаях зоны мутантной ДНК (мутация p.Gly12Val) присутствовали в очень небольших, следовых количествах. В повторных экспериментах подозрительные результаты воспроизводились: были видны зоны мутантной ДНК с очень слабой окраской как бромистым этидием при ПДРФ-анализе, так и SYBRGreen при SSCP-анализе. Но,

Таблица 2. Мутации в гене К-а (кодоны 12 и 13), выявленные в образцах карцином толстой кишки

38

Ф

№ образца Методы анализа

Аллель-специфическая ПЦР в режиме реального времени ПЦР/АСЯ8/88СР ПЦР/секвенирование

1 N нт**

2 р^1у^ег р^1уШег p.G1y12Seг

3 N N нт

4 р^1у12Ар р^1у12А8р p.G1y12Asp

5 р^1у12Су8 p.G1y12Cys -

6 N N нт

7 N N нт

8 N N нт

9 N N нт

10 р^1у13Ар р^1у13А8р р^уИ^р

11 N N нт

12 N N нт

13 N N нт

14 N р^1у13А^ p.G1y13Aгg

15 N N нт

16 р^1у13Ар p.G1y13Asp -

17 N N нт

18 N N нт

19 N N нт

20 N N нт

21 р^іу^ег р^1уШег р^1уШег

22 N N нт

23 N N нт

24 N N нт

25 N N нт

26 р^1у12Ар р^1у12А8р p.G1y12Asp

27 р^1у13Ар p.G1y13Asp р^уИ^р

28 р^1у12Уа1 p.G1y12Va1 -

29 р^1у12Ар p.G1y12Asp -

30 N N нт

31 р^1у12А1а р^1у12А1а p.G1y12A1a

32 р^1у13Ар p.G1y13Asp p.G1y13Asp

33 N N нт

34 нт нт нт

35 р^1у12Ар p.G1y12Asp p.G1y12Asp

36 р^1у13Ар p.G1y13Asp p.G1y13Asp

37 N N нт

38 N N нт

39 N N нт

40 р^1у12Ар p.G1y12Asp -

41 N N нт

42 N N нт

43 р^1у12Ар p.G1y12Asp p.G1y12Asp

44 р^1у12А1а p.G1y12A1a p.G1y12A1a

45 N N нт

46 N N нт

47 N N нт

48 N N нт

49 р^1у12Ар p.G1y12Asp p.G1y12Asp

50 N p.G1y12Va1 -

51 р^1у12Ар p.G1y12Asp p.G1y12Asp

52 р^1у12Ар p.G1y12Asp p.G1y12Asp

53 р^1у12Су8 p.G1y12Cys -

54 р^1у12Уа1 p.G1y12Va1 p.G1y12Va1

55 N p.G1y12Va1 -

%

Окончание табл. 2

№ образца Методы анализа

Аллель-специфическая ПЦР в режиме реального времени ПЦР/ACRS/SSCP ПЦР/секвенирование

56 N N нт

57 p.Gly12Cys p.Gly12Cys p.Gly12Cys

58 p.Gly12Asp p.Gly12Asp p.Gly12Asp

59 p.Gly12Asp p.Gly12Asp p.Gly12Asp

60 N N нт

61 N N нт

62 p.Gly12Val p.Gly12Val, p.Gly13Arg p.Gly12Val

63 p.Gly12Cys p.Gly12Cys p.Gly12Cys

Примечание. * — иорма (без мутации); ** — ие тестировали.

Таблица 3. Результаты определения К-газ мутаций в трех образцах карцином толстой кишки с ложноположительными и ложноотрицательными данными

№ образца Методы исследования

AORS SSCP Секвенирование Набор “KRAS-7M” Набор «TheraScreen KRAS»

14 + + c.37G>C (p.Gly13Arg) иорма1 иорма1

50 + + - иорма иорма

55 + + — иорма иорма

39

Примечание. 1 — мутация c.37G>C ие входит в состав наборов «KRAS-7M» и «TheraScreen KRAS». Таблица 4. Сравнительные характеристики методов анализа K-ras мутаций в карциномах толстой кишки

Метод исследования Специфичность, % Чувствительность, % Ложноположительные результаты, % Ложноотрицательные результаты, %

ПЦР/AСRS/SSCP/секвенирование 94,1 (32/34) 100 (28/28) 5,9 (2/34) —

Набор «KRAS-7M» 100

принимая во внимание тот факт, что аналитическая чувствительность SSCP-анализа составляет не менее 10% мутантной ДНК от тотальной ДНК в исследуемом образце [33], а заявленная чувствительность набора «TheraScreen KRAS» — 1%, т.е. в 10 раз выше, мы посчитали результаты ACRS- и SSCP-анализов ложноположительными.

Для сравнительной количественной оценки диагностических возможностей ПЦР/AСRS/SSCP/секвениро-вания и набора «KRAS-7M» использовали критерии диагностической чувствительности и специфичности. Для определения чувствительности метода число истинноположительных образцов делили на число истинноположительных плюс число ложноотрицательных образцов. Для определения специфичности метода число истинноотрицательных образцов делили на число истинноотрицательных плюс число ложноположительных образцов. В результате в исследованной серии образцов ДНК, выделенных из замороженных карцином толстой кишки, диагностическая специфичность и чувствительность для PCR/AСRS/SSCP/секвенирования составили 94,1 и 100%, соответственно, а для набора «KRAS-7M» — 100 и 96,4%, соответственно (табл. 4). Чувствительность метода секвенирования была ниже: 78,6% (22/28). Следует отметить, что в 6 образцах ДНК, отрицательных по результатам секвенирования (№ 5, 16, 28, 29, 40 и 53), присутствовали пики, соответствующие мутантному аллелю, но с незначительным превышением фона. Таким

образом, результаты наших исследований показали, что ас-рв-ПЦР, ACRS и SSCP обладают сходной диагностической чувствительностью, которая в данной серии образцов значительно превысила таковую при использовании секвенирования.

Обсуждение

Сравнительно недавно в протокол лечения больных мРТК были добавлены цетуксимаб (Эрбитукс) и пани-тумумаб (Вектибикс) — препараты на основе моноклональных антител, направленные против EGFR [34, 35]. Оба препарата обладают активностью в первой и второй линиях терапии мРТК как сами по себе, так и в комбинации с оксалиплатином или иринотеканом [34, 36, 37]. Антитела к EGFR были выбраны для таргетной терапии, исходя из того, что примерно в 80% колоректальных карцином наблюдается его гиперэкспрессия [38]. В многочисленных клинических испытаниях, а также при ретроспективных исследованиях убедительно показано, что положительный ответ на лечение анти-EGFR-антите-лами дают только те больные мРТК, чьи опухоли содержат нормальную (немутированную или дикую) последовательность гена К-газ. В то же время больные с мутациями в кодонах 12 или 13 не получают пользу от такой терапии [19, 20]. На основании этих результатов в настоящее

время при решении вопроса о введении панитумумаба или цетуксимаба в схему лечения мРТК для исключения мутаций исследуют статус К-газ. Это позволяет избежать применения неэффективных препаратов, способных при минимуме пользы оказывать побочное токсическое действие, а также избежать ненужных трат (стоимость лечения препаратами Эрбитукс и Вектибикс составляет около 100 000 долларов США в год) [39].

Идеальный метод анализа К-газ мутаций, предназначенный для клинической практики, должен быть достаточно простым в применении, давать минимальное число ложноположительных и ложноотрицательных результатов и позволять проводить скрининг большого количества больных. При этом важно не просто знать о наличии мутации, но также, какая именно эта мутация, каким методом она была определена, какой образец опухоли использовали для анализа (свежий операционный материал, замороженную ткань или парафиновый блок), а также процент опухолевых клеток, присутствующих в исследуемом образце.

В нашей работе мы провели анализ К-газ мутаций в образцах замороженных карцином толстой кишки, подвергшихся ручной микродиссекции, с использованием двух подходов: ПЦР/ACRS/SSCP/секвенирования и ас-рв-ПЦР. В результате этой работы мы показали 40 высокую чувствительность и специфичность (94—100%) для ACRS, SSCP и ас-рв-ПЦР. Следует подчеркнуть, что сравнение этих методов было проведено с использованием одних и тех же шифрованных образцов опухолевой ДНК разными сотрудниками лабораторий, находящихся в разных городах России (Москва и Новосибирск).

Обнаружение следовых количеств мутантных последовательностей гена К-газ в образцах № 50 и 55 было воспроизведено в трех независимых экспериментах с помощью ACRS и SSCP, но не было подтверждено набо-

рами «KRAS-7M» и «TheraScreen KRAS». Мы посчитали результаты, полученные с помощью наборов, более достоверными и, исходя из этого, рассчитывали диагностическую чувствительность и специфичность методов. Если же предположить, что в данной работе аналитическая чувствительность методов ACRS и SSCP оказалась выше, чем ас-рв-ПЦР, то следует сделать вывод о присутствии в образцах карцином № 50 и 55 K-ras мутаций только в незначительной фракции опухолевых клеток (меньше 1%). Тогда как в основной массе клеток этих карцином с TNM стадиями III B и IV для образцов № 50 и 55, соответственно, мутации отсутствуют, возможно, из-за того, что они были приобретены на более поздних стадиях прогрессии опухолей. В настоящее время корреляция между присутствием K-ras мутаций в небольшой фракции опухолевых клеток (<1%) и отсутствием эффекта от лечения цетуксимабом или панитумумабом не установлена. Поэтому столь высокая чувствительность детекции этих мутаций не является необходимой [40].

Заключение

ПЦР/ACRS/SSCP/секвенирование и отечественный набор «KRAS-7M» на основе аллель-специфической ПЦР в режиме реального времени могут быть использованы для детекции мутаций в кодонах 12 и 13 гена K-ras в замороженных клинических образцах опухолей толстой кишки, подвергшихся ручной микродиссекции. Результаты тестов имеют высокую сходимость с чувствительностью и специфичностью методов 94—100% для исследованной серии образцов.

Работа частично финансировалась Фондом поддержки малых форм предприятий в научно-технической сфере, госконтракт № 7319р/10172 с ООО «БиоЛинк».

ЛИТЕРАТУРА

1. Marshall C.J. Small GTPases and cell cycle regulation. Biochem. Soc. Trans. 1999; 27 (4): 363-370.

2. Chang F., Lee J.T., Navolanic P.M. et al. Involvement of PI3K/ Akt pathway in cell cycle progression, apoptosis, and neoplastic transformation: a target for cancer chemotherapy. Leukemia. 2003; 17: 590-603.

3. McCubrey J.A., Steelman L.S., Chappell WH. et al. Roles of the Raf/MEK/ERK pathway in cell growth, malignant transformation and drug resistance. Biochim. Biophys. Acta. 2007; 1773: 1263-1284.

4. Bos J.L. K-ras oncogenes in human cancer: a review. Cancer Res. 1989; 49: 4682-4689.

5. Minamoto T., Mai M., Ronai Z. K-ras mutation: early detection in molecular diagnosis and risk assessment of colorectal, pancreas, and lung cancers — a review. Cancer Detect. Prev. 2000; 24: 1-12.

6. Parkin D.M., Bray F., Ferlay J. et al. Global cancer statistics. 2002; CA. Cancer J. Clin. 2005; 55 (2): 74-108.

7. Brink M., de Goeij A.F., Weijenberg M.P. et al. K-ras oncogene mutations in sporadic colorectal cancer in the Netherlands cohort study. Carcinogenesis. 2003; 24 (4): 703-710.

8. Samowitz WS., Curtin K., Schaffer D. et al. Relationship of Ki-ras mutations in colon cancers to tumor location, stage, and survival: a population-based study. Cancer Epidemial. Biomarkers Prev. 2000;

9 (11): 1193-1197.

9. Slattery M.L., Curtin K., Anderson K. et al. Associations between dietary intake and Ki-ras mutations in colon tumors: a population-based study. Cancer Res. 2000; 60 (24): 6935-6941.

10. Amosenko F.A., Korchagina E.L., Matveeva T.I. et al. Mutation analysis of K-ras protooncogene in colorectal adenocarcinomas and polyps in Russian patients. Russian J. Genetics. 2010; 46 (5): 617-624.

11. Vogelstein B., Fearon E.R., Stanley S.R. et al. Genetic alterations during colorectal tumor development. N. Engl. J. Med. 1988; 319: 525-532.

12. Lowy D.R., Willumsen B.M. Function and regulation of ras. Annu. Rev. Biochem. 1993; 62: 851-891.

13. Al-Mulla F., Milner-White E.J., Going J.J. et al. Structural differences between valine-12 and aspartate-12 Ras proteins may modify carcinoma aggression. J. Pathol. 1999; 187: 433-438.

14. Tuveson D.A., Shaw A.T., Willis N.A. et al. Endogenous oncogenic K-ras (G12D) stimulates proliferation and widespread neoplastic and developmental defects. Cancer Cell. 2004; 5: 375-387.

15. Smakman N., Borel Rinkes I. H., Voest E. E. et al. Control of colorectal metastasis formation by K-ras. Biochim. Biophys. Acta. 2005; 1756: 103-114.

16. Castagnola P., Giaretti W. Mutant KRAS, chromosomal instability and prognosis in colorectal cancer. Biochim. Biophys. Acta. 2005; 1756: 115-125.

17. Pajkos G., Kiss I., Sandor J. et al. The prognostic value of the presence of mutations at the codons 12, 13, 61 of Ki-ras oncogene in colorectal cancer. Anticancer Res. 2000; 20: 1695-1701.

18. Colin A., Smith G., Carey F. A. et al. The prognostic significance of K-ras, p53, and APC mutations in colorectal carcinoma. Gut. 2005; 54 (9): 1283-1286.

19. Lievre A., Bachet J.B., Boige V. et al. KRAS mutations as an independent prognostic factor in patients with advanced colorectal cancer treated with cetuximab. J. Clin. Oncol. 2008; 26: 374-379.

20. Amado R.G., Wolf M., Peeters M. et al. Wild-type KRAS is required for panitumumab efficacy in patients with metastatic colorectal cancer. J. Clin. Oncol. 2008; 26: 1626-1634.

21. Taniguchi K., Okami J., Kodama K. et al. Intratumor heterogeneity of epidermal growth factor receptor mutations in lung cancer and its correlation to the response to gefitinib. Cancer Sci. 2008; 99: 929-935.

22. Fox J.C., England J., White P. et al. The detection of K-ras mutations in colorectal cancer using the amplification — refractory mutation system. Br. J. Cancer. 1998; 77: 1267-1274.

23. Poehlmann A., Kuester D., Meyer F. et al. K-ras mutation detection in colorectal cancer using the pyrosequencing technique. Pathol. Res. Pract. 2007; 203 (7): 489-497.

24. Taback B., Bilchik A.J., Saha S. et al. Peptide nucleic acid clamp PCR a novel K-ras mutation detection assay for colorectal cancer microme-tastases in lymph nodes. Int. J. Cancer. 2004; 111 (3): 409-414.

25. Lleonart M.E., Ramon Y., Cajal S. et al. Sensitive and specific detection of K-ras mutations in colon tumors by short oligonucleotide mass analysis. Nucl. Acids Res. 2004; 32: 53.

26. Bjorheim J., Lystad S., Lindblom A. et al. Mutation analyses of KRAS exon 1 comparing three different techniques: temporal temperature gradient electrophoresis, constant denaturant capillary electrophoresis and allele specific polymerase reaction. Mutat. Res. 1998; 403: 103-112.

27. Do H., Krypuy M., Mitchell P. et al. High resolution melting analysis for rapid and sensitive EGFR and KRAS mutation detection in formalin fixed paraffin embedded biopsies. BMC Cancer. 2008; 8: 142.

28. Li J., Wang L., Mamon H. et al. Replacing PCR with COLD-PCR enriches variant DNA sequences and redefines the sensitivity of genetic testing. Nat. Med. 2008; 14 (5): 579-584.

29. Ogino S., Kawasaki T., Brahmandam M. et al. Sensitive sequencing method for KRAS mutation detection by pyrosequencing. J. Mol. Diagn. 2005; 7 (3): 413-421.

30. Ronaghi M., Uhlen M., Nyren P. A sequencing method based on real-time pyrophosphate. Science. 1998; 281 (5375): 363-365.

31. Clayton S.J., Scott F.M., Walker J. et al. K-ras point mutation detection in lung cancer: comparison of two approaches to somat-

ic mutation detection using ARMS allele-specific amplification.

Clin. Chem. 2000; 46 (12): 1929-1938.

32. Levi S., Urbano-Ispizua A., Gill R et al. Multiple K-ras codon 12 mutations in cholangiocarcinomas demonstrated with a sensitive polymerase chain reaction technique. Cancer Res. 1991;

51: 3497-3502.

33. Suzuki Y., Orita M., Shiraishi M. et al. Detection of ras gene mutations in human lung cancers by single-strand conformation polymorphism analysis of polymerase chain reaction products.

Oncogene. 1990; 5: 1037-1043.

34. Jean G.W, Shah S.R. Epidermal growth factor receptor monoclonal antibodies for the treatment of metastatic colorectal cancer. Pharmacotherapy. 2008; 28 (6): 742-754.

35. Peeters M., Balfour J., Arnold D. Review article: panitumumab — a fully human anti-EGFR monoclonal antibody for treatment of metastatic colorectal cancer. Aliment. Pharmacol. Ther. 2008; 28 (3): 269-281.

36. Iqbal S., Lenz H.J. Integration of novel agents in the treatment ofcolorectal cancer. CancerChemother. Pharmacol. 2004; 54 (Suppl. 1):

32-39.

37. de Castro-Carpeno J., Belda-Iniesta C., Casado Saenz E. et al.

EGFR and colon cancer: a clinical view. Clin. Transl. Oncol. 2008;

10 (1): 6-13.

38. Porebska I., Harlozinska A., Bojarowski T. Expression of the tyrosine kinase activity growth factor receptors (EGFR, ERB B2, ERB

B3) in colorectal adenocarcinomas and adenomas. Tumour Biol. 41

2000; 21 (2): 105-115.

39. Tigue C., Fitzner K., Alkhatib M. et al. The value of innovation: the economics of targeted drugs for cancer. Targeted Oncol. 2007;

2 (2): 113-119.

40. Monzon F.A., Ogino S., Hammond E.H. et al. The role of KRAS mutation testing in the management of patients with metastatic colorectal cancer. Arch. Pathol. Lab. Med. 2009; 133: 1600-1606.

КОНТАКТНАЯ ИНФОРМАЦИЯ Амосенко Фаина Аркадьевна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, ведущий научный сотрудник Медико-генетического научного центра РАМН, лаборатории ДНК-диагностики Адрес: 115478, Москва, ул. Москворечье, д. 1 Тел.: (965) 132-78-02, факс: (499) 324-07- 02 Е-таі1: ато88епко@теё^еп.т

Поляков Александр Владимирович, доктор биологических наук, профессор Медико-генетического научного центра

РАМН, заведующий лабораторией ДНК-диагностики

Адрес: 115478, Москва, ул. Москворечье, д. 1

Тел./факс: (495) 221-90-84

Е-таі1: info@dna1ab.ra

Любченко Людмила Николаевна, доктор медицинских наук, заведующая лабораторией клинической онкогенетики

Российского онкологического научного центра им. Н.Н. Блохина РАМН

Адрес: 115478, Москва, Каширское шоссе, д. 24

Тел.: (916) 623-23-66, факс: (499) 324-96-29

Е-таі1: с1іодеп@таі1.ги

Карпов Игорь Владимирович, лаборант ООО «БиоЛинк» лаборатории генодиагностики Адрес: 630117, Новосибирск, ул. Академика Тимакова, д. 2 Тел./факс: (383) 334-86-14 Е-таі1: Ьіо1іпк@іпЬох.ги

Шаманин Владимир Александрович, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории генодиагностики ООО «БиоЛинк»

Адрес: 630117, Новосибирск, ул. Академика Тимакова, д. 2 Тел/факс: (383) 334-86-14 Е-таі1: уа_8Иатапіп@Ьіо1іпк1аЬ.га

Коваленко Сергей Петрович, кандидат биологических наук, заведующий лабораторией генной инженерии Института

молекулярной биологии и биофизики Сибирского Отделения РАМН

Адрес: 630117, Новосибирск, ул. Академика Тимакова, д. 2

Тел/факс: (383) 333-47-10

Е-таі1: 8р_коуа1епко@уаИоо.сот