СХЕМЫ ВВЕДЕНИЯ
INJECTION SCHEMES

Перекрестные ссылки на родственные заявки
[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет и преимущество согласно предварительной заявке на патент США номер 62/238529, поданной 7 октября 2015 г., и предварительной заявке на патент США номер 62/372259, поданной 8 августа 2016 г., содержание каждой из которых полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки.
Уровень техники
[0002] Система комплемента представляет собой систему, состоящую более чем из 30 белков плазмы и клеточно-связанных белков, играющую важную роль как во врожденном, так и в приобретенном иммунитете. Белки системы комплемента функционируют в виде серий ферментативных каскадов за счет разнообразных белковых взаимодействий и процессов расщепления. Активация комплемента происходит тремя основными путями: через антителозависимый классический путь, альтернативный путь и путь лектина, связывающего маннозу (MBL). Ненадлежащая или избыточная активация комплемента является основной причиной или фактором, способствующим развитию ряда серьезных заболеваний и состояний, и на протяжении последних нескольких десятилетий значительные усилия были направлены на изучение различных ингибиторов комплемента для применения в качестве терапевтических агентов.
Краткое описание
[0003] В некоторых аспектах настоящее изобретение обеспечивает определенные аналоги компстатина длительного действия и/или настоящее изобретение относится к указанным аналогам. Например, в настоящем изобретении предложены и/или настоящее изобретение относится к таким аналогам компстатина длительного действия, композициям, их содержащим, и к способам их получения, идентификации, характеризации и/или применения. Согласно некоторым аспектам в настоящем изобретении предложена физиологически приемлемая композиция, содержащая аналог компстатина длительного действия, и/или настоящее изобретение относится к указанной композиции. Согласно некоторым аспектам в настоящем изобретении предложена композиция фармацевтического класса, содержащая аналог компстатина длительного действия, и/или настоящее изобретение относится к указанной композиции. Среди прочего, согласно некоторым аспектам в настоящем тексте описаны в особенности подходящие аналоги компстатина длительного действия и, более того, предложены конкретные дозы, форматы доз, схемы введения, композиции однократных доз и другие технологии, связанные с введением аналогов компстатина длительного действия субъектам-людям, например, конкретным субъектам-людям, например, страдающим от одного или нескольких определенных заболеваний, нарушений или состояний и/или подверженных указанным заболеваниям, нарушениям или состояниям.
[0004] В некоторых аспектах настоящее изобретение обеспечивает способы лечения субъекта, нуждающегося в лечении комплемент-опосредованного нарушения, причем указанные способы могут включать введение указанному субъекту аналога компстатина длительного действия с применением конкретных доз, форматов доз (например, композиций однократных доз и/или конкретных составов) и/или схем введения (например, путей введения, интервалов введения доз и т.д. согласно некоторым вариантам реализации, которые, как было установлено, являются особенно пригодными для лечения определенных заболеваний, нарушений или состояний).
[0005] Согласно некоторым вариантам реализации комплемент-опосредованное нарушение, которое лечат согласно настоящему изобретению, представляет собой пароксизмальную ночную гемоглобинурию (ПНГ), атипичный гемолитико-уремический синдром (аГУС) или другое нарушение, связанное с комплемент-опосредованным гемолизом. Согласно некоторым вариантам реализации указанное нарушение представляет собой ишемическое/реперфузионное (И/Р) повреждение (например, в результате инфаркта миокарда, тромбоэмболического инсульта или хирургического вмешательства). Согласно некоторым вариантам реализации указанное нарушение представляет собой травму. Согласно некоторым вариантам реализации указанное нарушение представляет собой отторжение трансплантата. Согласно некоторым вариантам реализации указанное нарушение представляет собой хроническое респираторное нарушение, например, астму или ХОБЛ (хроническую обструктивную болезнь легких).
е
е
[0006] Все статьи, книги, заявки на патент, патенты, другие публикации, вебсайты и базы данных, упоминаемые в настоящем документе, включены в него посредством ссылок. В случае противоречия между настоящим описанием и любой из включенных ссылок настоящее описание (включая любые поправки к нему) будет иметь решающее значение. Если не указано иное, в настоящем документе используются принятые в соответствующих областях техники значения терминов и сокращения. При реализации некоторых описанных в настоящем документе аспектов могут использоваться стандартные методики молекулярной биологии, культивирования клеток, технология рекомбинантных нуклеиновых кислот (например, ДНК), иммунологии и/или синтеза, детекции, манипулирования и количественного определения нуклеиновых кислот и полипептидов, и т.п., соответствующие квалификации специалиста в данной области техники. См., например: Ausubel, F., et al., (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols in Immunology, Current Protocols in Protein Science, Current Protocols in Cell Biology, выпущенные издательством John Wiley & Sons, N.Y., например, издание, актуальное на январь 2010 или более позднее; Sambrook, Russell, Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3 изд., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 2001; 4 изд., 2012.
Краткое описание чертежей
[0007] На фиг. 1 представлен график, отражающий процент ингибирующей активацию комплемента активности аналога компстатина СА28 (SEQ ID NO: 28) и трех аналогов компстатина длительного действия (СА28-1, СА28-2, СА28-3) как функции от концентрации пептида (мкМ). Ингибирование активации комплемента исследовали in vitro с применением анализа ингибирования классического пути комплемента. На графике представлены значения, полученные усреднением результатов двух серий измерений. СА28 (круги; красный цвет), СА28-1 (кресты (х); синий цвет); СА28-2 (треугольники, зеленый цвет), СА28-3 (квадраты (фиолетовый цвет)).
[0008] На фиг. 2 представлен график, отражающий процент ингибирующей активацию комплемента активности СА28 и аналогов компстатина длительного действия СА28-2 и СА28-3 как функции от концентрации соединения (мкМ). СА28 (квадраты, светло-серый цвет), СА28-2 (ромбы, черный цвет), СА28-3 (круги, темно-серый цвет). СА28-3 представляет собой соединение, которое содержит несколько пептидных фрагментов (т.е. множество фрагментов). Хотя активность, приходящаяся на пептидный фрагмент, меньше активности отдельной молекулы СА28, общая активность СА28-3 в пересчете на моли выше активности СА28.
[0009] На фиг. 3 представлен график концентраций СА28 и аналогов компстатина длительного действия СА28-2 и СА28-3 в плазме от времени у яванских макаков после одной внутривенной инъекции. СА28 вводили в количестве 200 мг/кг. Каждый из СА28-2 и СА28-3 вводили в количестве 50 мг/кг. При расчете доз для указанных экспериментов предполагалось, что вводимые вещества СА28-2 и СА28-3 содержат 80 масс. % активного соединения в пересчете на сухую массу. Однако при анализе образцов стандартная кривая подразумевала 100 масс. % активного соединения в пересчете на сухую массу, примерно на 30%. Таким образом, значения Cmax выше реальных Cmax. СА28 (квадраты, светло-серый), СА28-2 (треугольники, черный), СА28-3 (круги, темно-серый).
[0010] На фиг. 4 представлен график, отражающий процент ингибирующей активацию комплемента активности СА28 и аналогов компстатина длительного действия СА28-4 как функции от концентрации соединения (мкМ). Ингибирование активации комплемента исследовали in vitro с применением анализа ингибирования классического пути комплемента. На графике представлены значения, полученные усреднением результатов четырех серий измерений СА28-4. СА28 (квадраты, светло-серый цвет), СА28-4 (кресты, черный цвет).
[0011] На фиг. 5 представлен график, отражающий зависимость концентраций от времени для СА28 и аналогов компстатина длительного действия СА28-2, СА28-3 и СА28-4 у яванских макаков после одной внутривенной инъекции. СА28 вводили в количестве 200 мг/кг. Каждый из СА28-2, СА28-3 и СА28-4 вводили в количестве 50 мг/кг. При расчете доз для указанных экспериментов предполагалось, что вводимые вещества СА28-2 и СА28-3 содержат 80 масс. % активного соединения в пересчете на сухую массу. Однако при анализе образцов стандартная кривая подразумевала 100 масс. % активного соединения в пересчете на сухую массу. Таким образом, значения Cmax превосходят значения Cmax, которые были бы получены при введении указанных соединений в означенных дозах в пересчете на сухую массу, примерно на 30%. СА28 (квадраты, светло-серый), СА28-2 (треугольники, черный), СА28-3 (круги, темно-серый), СА28-4 (перевернутые треугольники, черный).
[0012] На фиг. 6 представлена хроматограмма, демонстрирующая детекцию по ультрафиолетовому излучению (УФ) аналога компстатина длительного действия на основе ПЭГ с применением ВЭЖХ с обращенной фазой. Пик со временем удерживания (RT) 33,68 минут соответствует пегилированному аналогу компстатина и имеет относительную площадь 96%.
[0013] На фиг. 7 представлен график, отражающий процент ингибирующей активацию комплемента активности СА28 и аналогов компстатина длительного действия CA28-2CS, CA28-2GS, CA28-2HS и CA28-2TS, как функции от концентрации соединения (мкМ). CA28-2CS (ромбы, красный цвет); CA28-2GS (кресты, синий цвет); CA28-2HS (треугольники, зеленый цвет); CA28-2TS (квадраты, черный цвет).
[0014] На фиг. 8 представлен график, отражающий процент ингибирующей активацию комплемента активности СА28 и бифункционализированного аналога компстатина длительного действия, CA28-2GS-BF, как функции от концентрации соединения (микромоли). СА28 (незакрашенные круги, синий цвет); CA28-2G-SBF (закрашенные круги, красный цвет)
[0015] На фиг. 9 представлен график, отражающий зависимость концентрации в плазме от времени СА28 и аналога компстатина длительного действия CA28-2GS-BF у яванских макаков либо после одной внутривенной инъекции (СА28 (квадраты, красный цвет) и CA28-2GS-BF (круги, фиолетовый), либо при введении посредством подкожной инъекции один раз в день в течение 7 дней (только CA28-2GS-BF, звездочки, синий цвет). CA28-2GSBF вводили в концентрации 25 мг/мл. Объем дозы составлял 2 мл/кг для в.в. (внутривенного) и 0,28 мл/кг/день для подкожного введения. Данные для СА28 получали в ходе другого эксперимента, в котором указанное соединение также содержалось в 5% декстрозе, а его концентрация составляла 20 мг/мл при объеме дозы 10 мл/кг. Основа в каждом случае была представлена 5% декстрозой в воде.
[0016] На фиг. 10(A) и 10(B) приведены графики, отражающие процент ингибирующей активацию комплемента активности СА28 и бифункционализированного аналога компстатина длительного действия, CA28-2TS-BF, как функции от концентрации соединения (микромоли). (А) Ингибирование классического пути с помощью СА28 (круги, красный цвет) и CA28-2TS-BF (кресты, синий цвет). (В) Ингибирование альтернативного пути. СА28 (круги, красный цвет) и CA28-2TS-BF (кресты, синий цвет).
[0017] На фиг. 10(C) (при размере фрагмента 40 кДа ПЭГ) показана структура CA28-2TS-BF.
[0018] На фиг. 11 представлен график, отражающий зависимость концентрации в плазме от времени СА28 и аналога компстатина длительного действия CA28-2TS-BF у яванских макаков после одной внутривенной инъекции СА28 в дозе 200 мкг/кг (квадраты, красный цвет), одной внутривенной инъекции CA28-2TS-BF в дозе 7 мкг/кг (звездочки, фиолетовый), однократной подкожной инъекции CA28-2TS-BF в дозе 7 мкг/кг (круги, синий цвет) или подкожной инъекции CA28-2TS-BF в дозе 7 мкг/кг один раз в день в течение 7 последовательных дней (перевернутые треугольники, зеленый цвет). Основа в каждом случае представляла собой 5% декстрозу в воде.
[0019] На фиг. 12 показан анализ с применением проточной цитометрии отложения С3 на красных клетках крови пациента с ПНГ, на которые воздействовали активированным комплементом в модифицированном тесте Хэма. (А) Представлены результаты эксперимента с разведениями, демонстрирующего эффект СА28 на отложение С3. (В) Представлены результаты эксперимента с разведениями, демонстрирующего эффект CA28-2GS-BF на отложение С3. Использованные концентрации соединения приведены на каждой панели и над ней.
[0020] На фиг. 13 показан анализ с применением проточной цитометрии отложения С3 на красных клетках крови пациента с ПНГ, на которые воздействовали активированным комплементом в модифицированном тесте Хэма при отсутствии ингибиторов комплемента (левая панель), в присутствии моноклонального антитела против С5 экулизумаба (средняя панель) и в присутствии CA28-2GS-BF (правая панель).
[0021] На фиг. 14 показан график индуцированного сывороткой гемолиза ex vivo, который наблюдается в исследовании многократных нарастающих доз аналога компстатина длительного действия, содержащего 40 кДа ПЭГ, у здоровых субъектов.
Подробное описание некоторых вариантов реализации
[0022] I. Определения
[0023] Термины «приблизительно» или «примерно» применительно к числу обычно включают числа, попадающие в диапазон ±10%, согласно некоторым вариантам реализации ±5%, согласно некоторым вариантам реализации ±1%, согласно некоторым вариантам реализации ±0,5% от числа, если не указано или иным образом очевидно из контекста иное (за исключением случаев, когда такое число недопустимым образом превышает 100% от возможного значения).
[0024] «Компонент комплемента» или «белок комплемента» представляет собой белок, вовлеченный в активацию системы комплемента или принимающий участие в одной или более комплемент-опосредованной активности. Компоненты классического пути комплемента включают, например, C1q, C1r, C1s, С2, С3, С4, С5, С6, С7, С8, С9 и C5b-9-комплекс, также называемый мембраноатакующим комплексом (МАК), и активные фрагменты или продукты ферментативного расщепления каких-либо из вышеперечисленных компонентов (например, С3а, C3b, С4а, C4b, С5а и т.п.). Компоненты альтернативного пути включают, например, факторы В, D и пропердин. Компоненты лектинового пути включают, например, MBL2, MASP-1 и MASP-2. Компоненты комплемента также включают клеточно-связанные рецепторы растворимых компонентов комплемента, отличающиеся тем, что указанный рецептор опосредует одну или более биологических активностей такого растворимого компонента комплемента после связывания указанного растворимого компонента комплемента. Такие рецепторы включают, например, рецептор С5а (C5aR), рецептор С3а (C3aR), рецептор комплемента 1 (CR1), рецептор комплемента 2 (CR2), рецептор комплемента 3 (CR3, также известный как CD45) и т.п. Следует иметь в виду, что термин «компонент комплемента» не подразумевает включение таких молекул и молекулярных структур, которые служат в качестве «триггеров» для активации комплемента, например, комплексов антиген-антитело, чужеродных структур, обнаруживаемых на поверхностях микроорганизмов или искусственных поверхностях, и т.п.
[0025] «Комплемент-опосредованное нарушение» представляет собой любое нарушение, для которого, согласно имеющимся данным или предположениям, по меньшей мере у некоторых субъектов, страдающих от указанного нарушения, активация комплемента является способствующим и/или по меньшей мере отчасти причинным фактором; например, нарушения, при которых активация комплемента приводит к повреждению тканей. Неограничивающие примеры комплемент-опосредованных нарушений включают, не ограничиваясь перечисленными, (i) различные нарушения, характеризующиеся гемолизом или гемолитической анемией, такие как атипичный гемолитико-уремический синдром, болезнь Холодовых агглютининов, пароксизмальная ночная гемоглобинурия, трансфузионные реакции; (ii) отторжение трансплантата (например, сверхострое или острое отторжение трансплантата) или дисфункцию трансплантата; (iii) нарушения, включающие ишемическое/реперфузионное повреждение, такие как травма, хирургическое вмешательство (например, реконструкция при аневризме), инфаркт миокарда, ишемический инсульт; (iv) нарушения дыхательной системы, такие как астма и хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ); (v) артрит, например, ревматоидный артрит; (vi) глазные нарушения, такие как возрастная макулярная дегенерация (ВМД), диабетическая ретинопатия, глаукома и увеит. Термин «нарушение» в настоящем документе применяют взаимозаменяемо с терминами «заболевание», «состояние» и аналогичными терминами, для обозначения любого нарушения здоровья или состояния анормального функционирования организма, например, любого состояния, при котором показана организация медицинского ухода и/или хирургического вмешательства, или в связи с которым субъект обращается за надлежащей медицинской и/или хирургической помощью. Следует также понимать, что конкретные нарушения перечислены в конкретных категориях для удобства и это не подразумевает ограничения настоящего изобретения. Следует понимать, что определенные нарушения могут быть перечислены в нескольких подходящих категориях.
[0026] «Регуляторный белок комплемента» представляет собой белок, вовлеченный в регуляцию активности комплемента. Регуляторный белок комплемента может понижающе регулировать активность комплемента, например, ингибируя активацию комплемента или инактивируя или ускоряя разрушение одного или более активированных белков комплемента. Примеры регуляторных белков комплемента включают ингибитор С1, связывающий С4 белок, кластерин, витронектин, CFH, фактор I и клеточно-связанные белки CD46, CD55, CD59, CR1, CR2 и CR3.
[0027] «Выделенный» в настоящем документе означает 1) отделенный от по меньшей мере некоторых компонентов, с которыми изначально обычно имеется связь в природе; 2) обработанный или очищенный с применением способа, включающего участие человека; и/или 3) не встречающийся в природе, например, присутствующий в искусственной среде. В целом, если не указано или иным образом не очевидно иное, любое вещество, продукт, агент, композиция и т.п., может при необходимости считаться «выделенным».
[0028] «Связанный» в настоящем документе в отношении двух или большего количества фрагментов означает, что указанные фрагменты физически связаны или соединены друг с другом с образованием достаточно стабильной молекулярной структуры, так что указанные фрагменты остаются связанными в условиях, при которых образуется указанная связь, и, предпочтительно, в условиях, при которых применяют указанную новую молекулярную структуру, например, в физиологических условиях. Согласно определенным предпочтительным вариантам реализации настоящего изобретения указанная связь представляет собой ковалентную связь. Согласно другим вариантам реализации указанная связь является нековалентной. Фрагменты могут быть связаны либо прямо, либо непрямо. Если два фрагмента прямо связаны, они либо ковалентно связаны друг с другом, либо находятся на достаточно близком расстоянии, так что их связь поддерживается за счет межмолекулярных сил между указанными двумя фрагментами. Если два фрагмента связаны непрямо, каждый из них связан либо ковалентно, либо нековалентно с третьим фрагментом, за счет которого поддерживается связь между указанными двумя фрагментами. В целом, если говорится, что два фрагмента связаны «соединяющим фрагментом» или «соединяющей частью», связь между указанными двумя связанными фрагментами является непрямой, и, как правило, каждый из связанных фрагментов ковалентно связан с соединяющим фрагментом. Два фрагмента могут быть связаны с помощью «линкера». Линкер может представлять собой любой подходящий фрагмент, который вступает в реакцию с указанными соединениями, связывая их за разумный период времени, в условиях, соответствующих стабильности указанных соединений (участки которых могут быть защищены в надлежащих случаях, в зависимости от условий), в достаточном количестве, с удовлетворительным выходом. Как правило, линкер содержит по меньшей мере две функциональные группы, одна из которых вступает в реакцию с первым соединением, а другая вступает в реакцию со вторым соединением. Следует иметь в виду, что после того, как линкер прореагировал со связываемыми соединениями, термин «линкер» может относиться к части полученной структуры, которая происходит из указанного линкера, или, по меньшей мере, к части, которая не включает прореагировавшие функциональные группы. Соединяющий фрагмент может содержать часть, не участвующую в образовании связи с соединяемыми соединениями, основное назначение которой может состоять в пространственном разделении указанных соединений. Такая часть может называться «спейсером».
[0029] В настоящем документе фраза «физиологические условия» относится к совокупности условий, таких как температура, концентрация солей, рН, которые по меньшей мере частично имитируют условия, как правило, наблюдаемые в организме живого субъекта, например, субъекта-млекопитающего. Согласно некоторым аспектам физиологические условия относятся к условиям в водной среде, например, в среде, содержащей по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 97%, 99% или приблизительно 100% воды по объему. Согласно некоторым вариантам реализации другие жидкости, если они присутствуют, по существу не влияют на вторичную или третичную структуру белка. Согласно некоторым вариантам реализации физиологические условия по меньшей мере частично имитируют условия, наблюдаемые в физиологической жидкости, такой как кровь или внеклеточная жидкость, например, в интерстициальной жидкости, например, субъекта-млекопитающего. Разнообразные физиологические условия, подходящие для, например, анализов in vitro, известны в данной области техники. Обычно среда в физиологических условиях содержит физиологическую концентрацию соли, например, хлорида натрия. Согласно некоторым вариантам реализации физиологическая концентрация соли относится к концентрации, варьирующей в диапазоне от приблизительно 250 мОсм/л до приблизительно 350 мОсм/л, например, от приблизительно 275 мОсм/л до приблизительно 325 мОсм/л, например, приблизительно 300 мОсм/л. Согласно некоторым вариантам реализации физиологические условия являются приблизительно изотоническими относительно физиологической жидкости, например, крови или внеклеточной жидкости, например, интерстициальной жидкости. Согласно некоторым вариантам реализации физиологические условия включают значения рН, варьирующие в диапазоне от приблизительно 6,5 до приблизительно 7,8, например, от приблизительно 7,0 до приблизительно 7,5. Согласно некоторым вариантам реализации физиологическая среда содержит буферное вещество, способствующее поддержанию рН среды в физиологическом диапазоне. Согласно некоторым вариантам реализации физиологические условия включают такие условия, что типичный белок млекопитающих, например, белок, который, как правило, присутствует в физиологической жидкости, такой как кровь или внеклеточная жидкость, по существу сохраняет вторичную и, в соответствующих случаях, третичную структуру, которой такой белок обладает в физиологической жидкости, в которой обычно присутствует. Согласно некоторым вариантам реализации компоненты физиологической среды, как правило, по существу нетоксичны для клеток млекопитающих в концентрации, в которой они присутствуют в физиологической среде. Разнообразные физиологические среды (иногда называемые «буферами») перечислены в различных стандартных источниках, такие как цитируемые выше (например, Sambrook, et al., Protocols series). Согласно некоторым вариантам реализации физиологическая температура варьирует в диапазоне от приблизительно 25 градусов С приблизительно до 38 градусов С, например, приблизительно от 30 градусов С приблизительно до 37 градусов С, например, от 35 градусов С до 37 градусов С.
[0030] «Полипептид» в настоящем документе относится к аминокислотному полимеру, необязательно содержащему один или более аналогов аминокислот. Белок представляет собой молекулу, состоящую из одного или более полипептидов. Пептид представляет собой относительно короткий полипептид, длина которого, как правило, составляет приблизительно от 2 до 60 аминокислот, например, от 8 до 40 аминокислот. Термины «белок», «полипептид» и «пептид» могут использоваться взаимозаменяемо. Полипептиды в настоящем документе могут включать аминокислоты, такие как встречающиеся в белках в природе, аминокислоты, не встречающиеся в белках в природе и/или аналоги аминокислот, которые не являются аминокислотами. В настоящем документе «аналог» аминокислоты может представлять собой другую аминокислоту, структурно сходную с указанной аминокислотой, или соединение, не являющееся аминокислотой, структурно сходное с указанной аминокислотой. Существует значительное число известных в данной области техники аналогов 20 аминокислот, обычно обнаруживаемых в белках («стандартных» аминокислот). Одна или более аминокислот полипептида может быть модифицирована, например, добавлением химического соединения, такого как углеводная группа, фосфатная группа, фарнезильная группа, изофарнезильная группа, жирнокислотная группа, линкер для конъюгирования, функционализирования или другой модификации, и т.п. Определенные подходящие неограничивающие аналоги и модификации описаны в WO 2004026328 и/или ниже. Указанный полипептид может быть ацетилирован, например, на N-конце и/или амидирован, например, на С-конце.
[0031] Термин «очищенный» в настоящем документе относится к веществам, которые были отделены от по меньшей мере некоторых или большинства компонентов, с которыми они связаны в природе или исходно при получении, или с которыми они были связаны перед очищением. В целом, такое очищение включает участие человека. Очищенные агенты могут быть частично очищенными, по существу очищенными или чистыми. Такие агенты могут быть, например, чистыми по меньшей мере на 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более чем на 99%. Согласно некоторым вариантам реализации нуклеиновую кислоту, полипептид или малую молекулу очищают таким образом, что он(а) составляет по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более от общего количества материала с нуклеиновой кислотой, полипептидом или малой молекулой, соответственно, присутствующего в составе. Согласно некоторым вариантам реализации органическое вещество, например, нуклеиновую кислоту, полипептид или малую молекулу очищают таким образом, что он(а) составляет по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более от общего количества органического материала, присутствующего в составе. Оценка чистоты может быть основана, например, на сухой массе, размере пиков при хроматографическом определении (ГХ, ВЭЖХ и т.п.), распространенности молекул, электрофоретических методах, интенсивности полос на геле, спектроскопических данных (например, ЯМР), элементного анализа, высокопроизводительном секвенировании, масс-спектрометрии или любом принятом в данной области техники методе количественного определения. Согласно некоторым вариантам реализации вода, буферные вещества, ионы и/или малые молекулы (например, синтетические предшественники, такие как нуклеотиды или аминокислоты), могут необязательно присутствовать в очищенном составе. Очищенный агент может быть получен путем отделения от других веществ (например, других клеточных материалов), или путем синтеза таким образом, что достигается требуемая степень чистоты. Согласно некоторым вариантам реализации «частично очищенный» в отношении молекулы, продуцируемой клеткой, означает, что молекула, продуцируемая клеткой, более не присутствует в указанной клетке, например, клетка была лизирована и, необязательно, по меньшей мере некоторый клеточный материал (например, клеточная стенка, клеточная(ые) мембрана(ы), клеточная(ые) органелла(ы) был удален, и/или указанная молекула была отделена или изолирована от по меньшей мере некоторых молекул того же типа (белок, РНК, ДНК и т.п.), присутствовавших в лизате.
[0032] «Рекомбинантные клетки-хозяева», «клетки-хозяева» и другие подобные термины обозначают прокариотические или эукариотические клетки или линии клеток, которые содержат экзогенную нуклеиновую кислоту (как правило, ДНК), такую как экспрессионный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, которая кодирует представляющий интерес полипептид. Следует понимать, что такие термины включают потомков исходной(ых) клетки(клеток), в которую(ые) был(а) введен(а) вектор или другая нуклеиновая кислота. Подходящие клетки-хозяева включают любые клетки, обычно используемые в данной области техники для экспрессирования полинуклеотидов (например, для получения полипептида(ов), кодируемого(ых) такими полинуклеотидами), включая, например, прокариоты, такие как Е. coli или другие бактерии, такие как виды Escherichia; Lactobacillus, Bacillus (например, В. subtilis), Salmonella, Pseudomonas, Streptomyces, Staphylococcus и т.п.; и эукариоты, включая, например, грибы, такие как дрожжи (например, Pichia (например, Pichia pastoris), Kluyveromyces, например, K. lactis, Hansenula, например, Н. polymorpha). Примеры других грибных клеток представлены клетками мицелиальных грибов, например, Aspergillus spp., Neurospora spp., Fusarium spp. или Trichoderma spp., например, штаммов A. oryzae, A. nidulans или A. niger; клетками насекомых (например, Sf9), растительными клетками и клетками животных, например, клетками млекопитающих, таких как СНО, R1.1, B-W, L-M, клетками почек африканских зеленых мартышек (например, COS-1, COS-7, BSC-1, BSC-40 и ВМТ-10) и культивируемых клеток человека. Также охвачены генетически модифицированные клетки генетически модифицированных (например, трансгенных) растений и животных, отличающиеся тем, что рекомбинантный полипептид продуцируется по меньшей мере некоторыми такими клетками. Полипептид может секретироваться в молоко, быть получен из растительного материала и т.п. Экзогенная нуклеиновая кислота может стабильно поддерживаться в виде эписомы, такой как плазмида, или может по меньшей мере частично быть интегрирована в геном клетки-хозяина, необязательно после копирования или обратного транскрибирования. Такие термины, как «клетки-хозяева» и т.п., также используются для обозначения клеток или линий клеток, которые могут использоваться в качестве реципиентов экзогенной нуклеиновой кислоты перед введением нуклеиновой кислоты. «Рекомбинантный полинуклеотид» обычно представляет собой полинуклеотид, который содержит последовательности нуклеиновых кислот, которые не встречаются в природе в напрямую связанном виде. Например, указанные последовательности нуклеиновых кислот могут встречаться в разных генах или у разных видов, или одна или более указанных последовательностей могут представлять собой вариант встречающейся в природе последовательности, или могут по меньшей мере частично представлять собой искусственную последовательность, не являющуюся гомологичной встречающейся в природе последовательности. «Рекомбинантный полипептид» обычно представляет собой полипептид, по меньшей мере частично получаемый путем транскрипции и трансляции экзогенной нуклеиновой кислоты рекомбинантной клеткой-хозяином или бесклеточной экспрессионной системой in vitro, и/или содержащий последовательности аминокислот, которые не встречаются в природе в напрямую связанном виде. В последнем случае рекомбинантный полипептид может называться «химерным полипептидом». Последовательности аминокислот в химерном полипептиде могут, например, встречаться в разных генах или у разных видов, или одна или более последовательностей могут представлять собой вариант встречающейся в природе последовательности или могут по меньшей мере частично представлять собой искусственную последовательность, не являющуюся идентичной или согласно некоторым вариантам реализации не являющуюся гомологичной встречающейся в природе последовательности на участке, составляющем значительную часть длины. Следует понимать, что химерный полипептид может содержать два или большее количество полипептидов. Например, первый и второй полипептиды А и В химерного полипептида могут быть непосредственно связаны (А-В или В-А) или могут быть разделены частью третьего полипептида С (А-С-В или В-С-А). Согласно некоторым вариантам реализации часть С представлена полипептидным линкером, который может, например, содержать несколько остатков глицина и/или серина, или любые из широкого ряда других аминокислот. Согласно некоторым вариантам реализации два или большее количество полипептидов могут быть связаны неполипептидным(и) линкером(ами). «Рекомбинантный» в настоящем документе охватывает согласно некоторым вариантам реализации полипептиды, полученные путем присоединения (например, химическим конъюгированием, ферментативным конъюгированием) более коротких рекомбинантных полипептидов, которые могут быть получены в рекомбинантных клетках-хозяевах. Согласно некоторым вариантам реализации рекомбинантный полипептид может содержать сигнальную последовательность, направляющую секрецию указанного полипептида, или последовательность, направляющую экспрессированный полипептид в конкретный компартмент или органеллу. Подходящие последовательности известны в данной области техники. Могут быть выбраны последовательности, подходящие для представляющего интерес типа клетки-хозяина (например, бактериальные, грибные, клетки млекопитающих, растений и т.п.). Согласно некоторым вариантам реализации сигнальная последовательность может быть расположена на N-конце или С-конце или около него (например, в пределах 10-50 аминокислот). Согласно некоторым вариантам реализации полипептид содержит метку. Метка может быть полезна для облегчения детекции и/или очищения содержащего ее белка. Примеры меток включают полигистидиновую метку (например, метка 6X-His) (SEQ ID NO: 69), глутатион-S-трансферазу, мальтоза-связывающий белок, метку NUS, метку SNUT, метку Strep, эпитопные метки, такие как V5, НА, Мус или FLAG. Согласно некоторым вариантам реализации сайт расщепления протеазы расположен в области между меткой и полипептидом, что позволяет отделить полипептид от метки посредством воздействия протеазой. Согласно некоторым вариантам реализации полинуклеотид, который кодирует рекомбинантный полипептид, является по меньшей мере частично кодон-оптимизированным для экспрессии в представляющей интерес клетке-хозяине (например, бактериальной, грибной, клетке млекопитающего, растения и т.п.). Метка может быть расположена на N- или С-конце или рядом с ним (например, в пределах 10-50 аминокислот) полипептида согласно различным вариантам реализации. Рекомбинантный полипептид может быть выделен, очищен и т.п. с применением любых из разнообразных способов. См., например, Sambrook, Protocols series, или другие стандартные источники. Способы применения могут включать, например, диализ (например, с применением мембран с заданным размером пор), хроматографию, преципитацию, очищение в геле или аффинные методы, при которых согласно некоторым вариантам реализации может использоваться метка или специфический связывающий реагент, такой как антитело.
nd
[0033] Термин «реактивные функциональные группы» в настоящем документе относится к группам, включающим, не ограничиваясь перечисленными, олефины, ацетилены, спирты, фенолы, простые эфиры, оксиды, галиды, альдегиды, кетоны, карбоновые кислоты, сложные эфиры, амиды, цианаты, изоцианаты, тиоцианаты, изотиоцианаты, амины, гидразины, гидразоны, гидразиды, диазогруппы, диазоний, нитрогруппы, нитрилы, меркаптаны, сульфиды, дисульфиды, сульфоксиды, сульфоны, сульфоновые кислоты, сульфиновые кислоты, ацетали, кетали, ангидриды, сульфаты, изонитрилы сульфеновой кислоты, амидины, имиды, имидаты, нитроны, гидроксиламины, оксимы, гидроксамовые кислоты, тиогидроксамовые кислоты, аллены, ортоэфиры, сульфиты, енамины, инамины, мочевины, псевдомочевины, семикарбазиды, карбодиимиды, карбаматы, имины, азиды, азосоединения, азоксисоединения и нитрозосоединения, сложные эфиры н-гидроксисукцинимида, малеимиды, сульфгидрилы и т.п. Способы получения каждой из указанных функциональных групп общеизвестны в данной области техники, и их применение или модификация для конкретной цели находится в пределах компетенции специалиста в данной области техники (см., например, Sandler and Karo, eds. ORGANIC FUNCTIONAL GROUP PREPARATIONS, Academic Press, San Diego, 1989, и Hermanson, G., Bioconjugate Techniques, 2 ed., Academic Press, San Diego, 2008.
-3
-4
-5
-6
-7
-8
-9
[0034] «Специфическое связывание» обычно относится к физической связи между целевым полипептидом (или, в более общем случае, целевой молекулой) и связывающей молекулой, такой как антитело или лиганд. Связывание, как правило, зависит от наличия конкретной структурной особенности мишени, такой как антигенная детерминанта, эпитоп, связывающий карман или углубление, распознаваемой связывающей молекулой. Например, если антитело специфично в отношении эпитопа А, присутствие полипептида, содержащего эпитоп А, или присутствие свободного немеченого А в реакции, включающей и свободный меченый А, и связывающую молекулу, присоединяющуюся к нему, снизит количество меченого А, который связывается с указанной связывающей молекулой. Следует понимать, что специфичность не обязательно должна быть абсолютной, и обычно относится к контексту, в котором происходит связывание. Например, в данной области техники общеизвестно, что многие антитела перекрестно реагируют с другими эпитопами, помимо имеющихся в целевой молекуле. Такая перекрестная реакционная способность может быть приемлемой, это зависит от предполагаемого применения антитела. Специалист в данной области техники сможет отобрать антитела или лиганды с достаточной степенью специфичности, подходящие для любого конкретного применения (например, для обнаружения целевой молекулы, для терапевтических целей и т.п.). Следует также понимать, что специфичность может оцениваться в контексте дополнительных факторов, таких как аффинность связывающей молекулы в отношении мишени относительно аффинности указанной связывающей молекулы в отношении других мишеней, например, конкурентных. Если связывающая молекула проявляет высокую аффинность в отношении целевой молекулы, которую необходимо обнаруживать с ее помощью, и низкую аффинность в отношении нецелевых молекул, указанное антитело, вероятно, является приемлемым реагентом. После того как специфичность связывающей молекулы в одном или более контекстах установлена, она может применяться в других, предпочтительно сходных, контекстах без необходимости повторных проверок ее специфичности. Согласно некоторым вариантам реализации аффинность (по оценке равновесной константы диссоциации, Kd) двух молекул, демонстрирующих специфическое связывание, составляет 10 М или менее, например, 10 М или менее, например, 10 М или менее, например, 10М или менее, 10М или менее, 10 М или менее, или 10 М или менее в протестированных условиях, например, в физиологических условиях.
[0035] «Субъект», лечение которого проводят в соответствии с настоящим изобретением, как правило, представляет собой человека, не являющегося человеком примата или низшее животное (например, мышь или крысу), у которого экспрессируется или присутствует по меньшей мере какой(ие)-либо компонент(ы) комплемента С3 примата (например, человека) и, необязательно, один или более дополнительных компонентов комплемента примата. Согласно некоторым вариантам реализации указанный субъект является особью мужского пола. Согласно некоторым вариантам реализации указанный субъект является особью женского пола. Согласно некоторым вариантам реализации указанный субъект является взрослым, например, человеком в возрасте по меньшей мере 18 лет, например, от 18 до 100 лет. Согласно некоторым вариантам реализации возраст субъекта-человека составляет по меньшей мере 12 лет. Согласно некоторым вариантам реализации субъект является взрослым, например, человеком в возрасте по меньшей мере 18 лет, например, от 18 до 100 лет. Согласно некоторым вариантам реализации возраст субъекта составляет по меньшей мере 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 или 80 лет. Согласно некоторым вариантам реализации указанный субъект является ребенком, например, человеком в возрасте от 0 до 4 лет, или от 5 до 11 лет.
[0036] «Лечение» в настоящем документе в отношении лечения субъекта относится к обеспечению лечения, т.е. обеспечению любого типа организации медицинского ухода или хирургического лечения субъекта. Указанное лечение может предоставляться для того, чтобы обратить, облегчить, подавить прогрессирование, предотвратить или снизить вероятность наступления заболевания, или для того, чтобы обратить, облегчить, ингибировать или предотвратить прогрессирование, предотвратить или снизить вероятность появления одного или более симптомов или проявлений заболевания. «Предотвращать» относится к предотвращению наступления заболевания, появления симптома или проявления заболевания в течение по меньшей мере некоторого периода времени по меньшей мере у некоторых индивидуумов. Лечение может включать введение соединения или композиции указанному субъекту после развития одного или более симптомов или проявлений, свидетельствующих о заболевании, например, для того, чтобы обратить, облегчить, снизить тяжесть и/или подавить или предотвратить прогрессирование указанного заболевания и/или обратить, облегчить, снизить тяжесть и/или подавить один или более симптомов или проявлений указанного заболевания. Соединение или композиция может быть введена субъекту, у которого развилось заболевание или имеется повышенный риск развития указанного заболевания по сравнению с представителем общей популяции. Соединение или композиция может быть введена субъекту, у которого развилось заболевание и имеется повышенный риск развития одного или более конкретных симптомов, проявлений указанного заболевания или обострений указанного заболевания по сравнению с другими индивидуумами, у которых диагностировано указанное заболевание, либо по сравнению с типичным или средним риском возникновения такого симптома, проявления или обострения у указанного субъекта. Например, на указанного субъекта мог воздействовать «триггер», который обуславливает возникновение повышенного риска (в частности, временно повышенного риска) развития обострения у указанного субъекта. Соединение или композиция может быть введена профилактически, т.е. до развития какого-либо симптома или проявления указанного заболевания. Как правило, в этом случае у субъекта имеется риск развития указанного заболевания, например, относительно представителя общей популяции, необязательно имеющего совпадающие возраст, пол и/или другой(ие) демографический(ие) показатель(и).
[0037] «Вектор» может представлять собой любую из разнообразных молекул нуклеиновой кислоты, вирусов или их частей, способных опосредовать вход, например, перенос, транспорт и т.п. представляющей интерес нуклеиновой кислоты между разными генетическими средами или в клетку. Представляющая интерес нуклеиновая кислота может быть связана, например, введена в вектор с применением, например, рестрикции и лигирования. Векторы включают, например, ДНК или РНК плазмиды, космиды, встречающиеся в природе или модифицированные вирусные геномы или их части, нуклеиновые кислоты, которые могут быть упакованы в вирусные капсиды, мини-хромосомы, искусственные хромосомы и т.п. Плазмидные векторы, как правило, включают точку начала репликации (например, для репликации в прокариотических клетках). Плазмида может включать частично или полностью вирусный геном (например, вирусный промотор, энхансер, сигналы процессинга или упаковки, и/или последовательности, достаточные для получения нуклеиновой кислоты, которая может быть интегрирована в геном клетки-хозяина и/или может вызвать получение инфекционного вируса). Вирусы или их части, которые могут использоваться для введения нуклеиновых кислот в клетки, могут называться вирусными векторами. Вирусные векторы включают, например, аденовирусы, аденоассоциированные вирусы, ретровирусы (например, лентивирусы, вирус осповакцины и другие поксвирусы, герпесвирусы (например, вирус простого герпеса) и др. Бакуловирус подходит, например, для применения в клетках насекомых. Известно значительное число растительных вирусных векторов, которые включают, например, основанные на или содержащие вирус мозаики цветной капусты, вирус табачной мозаики или один или более их генетических элементов (например, промотор 35S вируса мозаики цветной капусты). Вирусные векторы могут содержать или не содержать достаточную вирусную генетическую информацию для продуцирования инфекционного вируса при введении в клетки-хозяева, т.е. вирусные векторы могут быть компетентными по репликации или дефектными по репликации. Согласно некоторым вариантам реализации, например, если отсутствует достаточная информация для продуцирования инфекционного вируса, она может обеспечиваться клеткой-хозяином или другим вектором, введенным в указанную клетку, например, есть требуется получение вируса. Согласно некоторым вариантам реализации такая информация не обеспечивается, например, если получение вируса не требуется. Нуклеиновая кислота для переноса может быть встроена во встречающийся в природе или модифицированный вирусный геном или его часть, или может присутствовать в вирусном капсиде в виде отдельной молекулы нуклеиновой кислоты. Вектор может содержать одну или более нуклеиновых кислот, кодирующих маркер, подходящий для идентификации и/или выбора клеток, которые приняли вектор. Маркеры включают, например, различные белки, которые повышают или понижают либо устойчивость, либо чувствительность к антибиотикам или другим агентам (например, белок, придающий устойчивость к антибиотику, такому как пуромицин, гигромицин или бластицидин), ферменты, активность которых может быть детектирована с помощью анализов, известных в данной области техники (например, β-галактозидаза или щелочная фосфатаза), и белки или РНК, которые детектируемым образом влияют на фенотип экспрессирующих их клеток (например, флуоресцентные белки). Векторы часто включают один или более надлежащим образом расположенных сайтов для рестрикционных ферментов, которые могут применяться для облегчения встраивания в вектор нуклеиновой кислоты, например, нуклеиновой кислоты, которую требуется экспрессировать. Экспрессионный вектор представляет собой вектор, в который была встроена или может быть встроена требуемая нуклеиновая кислота таким образом, что она будет функционально связана с регуляторными элементами (также называемыми «регуляторными последовательностями», «элементами контроля экспрессии» или «последовательностями контроля экспрессии») и может экспрессироваться в виде РНК-транскрипта (например, мРНК, которая может быть транслирована в белок, или некодирующая РНК). Экспрессионные векторы включают регуляторную(ые) последовательность(и), например, последовательности контроля экспрессии, достаточную(ые) для направления транскрипции функционально связанной нуклеиновой кислоты по меньшей мере в некоторых условиях; другие элементы, необходимые для экспрессии или содействующие экспрессии, могут обеспечиваться, например, клеткой-хозяином или экспрессионной системой in vitro. Такие регуляторные последовательности, как правило, включают промотор и могут включать энхансерные последовательности или вышерасположенные активирующие последовательности. Согласно некоторым вариантам реализации вектор может включать последовательности, кодирующие 5'-нетранслируемую область и/или 3'-нетранслируемую область, которая может содержать сигнал расщепления и/или полиаденилирования. В целом, регуляторные элементы могут содержаться в векторе до встраивания нуклеиновой кислоты, которую требуется экспрессировать, или могут содержаться во встроенной нуклеиновой кислоте, или могут быть встроены в вектор после встраивания нуклеиновой кислоты, которую требуется экспрессировать. В настоящем документе говорится, что нуклеиновая кислота и регуляторный(ые) элемент(ы) «функционально связаны», если они ковалентно связаны таким образом, что экспрессия или транскрипция указанной нуклеиновой кислоты находится под влиянием или контролем указанного(ых) регуляторного(ых) элемента(ов). Например, область промотора функционально связана с нуклеиновой кислотой, если указанная область промотора способна обеспечивать транскрипцию указанной нуклеиновой кислоты. Специалисту в данной области техники известно, что конкретные характеристики регуляторных последовательностей, подходящих для экспрессии генов, могут варьировать у разных видов или типов клеток, но могут, в целом, включать в качестве подходящих последовательности, задействованные при инициации транскрипции, процессинге РНК или инициации трансляции. Выбор и дизайн подходящего вектора и регуляторного(ых) элемента(ов) находятся в пределах возможностей и компетенции специалиста в данной области техники. Например, специалист в данной области техники может выбрать подходящий промотор (или другие последовательности контроля экспрессии) для экспрессии в клетках нужного вида (например, в прокариотических (бактериальных) или эукариотических (например, клетках грибов, растений, видов млекопитающих)) или типа. Вектор может содержать промотор, способный направлять экспрессию в клетках млекопитающих, такой как подходящий вирусный промотор, например, из цитомегаловируса (ЦМВ), ретровируса, вируса обезьян (например, SV40), папилломавируса, вируса герпеса или другого вируса, инфицирующего клетки млекопитающих, или промотор млекопитающих, например, из такого гена, как EF1-альфа, ген убиквитина (например, убиквитин В или С), глобина, актина, фосфоглицераткиназы (ФГК) и т.п., или составного промотора, такого как протомор CAG (комбинация раннего энхансерного элемента ЦМВ и промотора куриного бета-актина). Согласно некоторым вариантам реализации может применяться промотор человека. Согласно некоторым вариантам реализации может применяться, например, промотор, который обычно направляет транскрипцию эукариотической РНК-полимеразой I («промотор pol I») (промотор U6, H1, 7SK или тРНК, или его функциональный вариант). Согласно некоторым вариантам реализации используют промотор, который обычно направляет транскрипцию эукариотической РНК-полимеразой II («промотор pol II») или его функциональный вариант. Согласно некоторым вариантам реализации используют промотор, который обычно направляет транскрипцию эукариотической РНК-полимеразой III («промотор pol III»), например, промотор для транскрипции рибосомальной РНК (не являющейся 5S рРНК) или его функциональный вариант. Специалист в данной области техники может выбрать подходящий промотор для направления транскрипции представляющей интерес последовательности. Примеры экспрессионных векторов, которые могут применяться в клетках млекопитающих, включают, например, группу векторов pcDNA, группу векторов pSV2, группу векторов pCMV, группу векторов pRSV, группу векторов pEF1, векторы Gateway и т.п. Согласно некоторым вариантам реализации используют регулируемый(ые) (например, индуцируемый(ые) или репрессируемый(ые)) элемент(ы) контроля экспрессии, например, регулируемый промотор, таким образом, чтобы экспрессию можно было регулировать, например, включать или повышать, или выключать или понижать. Согласно некоторым вариантам реализации вектор может содержать полинуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид, при этом указанная полинуклеотидная последовательность располагается в рамке с нуклеиновой кислотой, встроенной в указанный вектор, таким образом, что образуется N-концевой или С-концевой гибрид. Согласно некоторым вариантам реализации полипептид, кодируемый указанной полинуклеотидной последовательностью, может содержать сигнальную последовательность (которая направляет секрецию белка) или последовательность, которая направляет экспрессированный белок в конкретную органеллу или локализацию в клетке, например, в ядро или митохондрии. Согласно некоторым вариантам реализации полипептид содержит метку. Метка может быть полезна для облегчения детекции и/или очищения содержащего ее белка. Примеры меток включают полигистидиновую метку (например, метку 6X-His) (SEQ ID NO: 69), глутатион-S-трансферазу, мальтоза-связывающий белок, метку NUS, метку SNUT, метку Strep, эпитопные метки, такие как V5, НА, Мус или FLAG. Согласно некоторым вариантам реализации сайт расщепления протеазы расположен в области между белком, кодируемым встроенной нуклеиновой кислотой, и указанным полипептидом, позволяя удалять указанный полипептид с помощью воздействия протеазой. Векторы могут быть введены в клетки-хозяева с применением способов, известных в данной области техники. Специалист сможет выбрать подходящий способ на основе, например, вектора, типа клеток и т.п. Примеры подходящих способов включают, например, опосредованную фосфатом кальция трансфекцию, трансфекцию с применением любого из разнообразных коммерчески доступных реагентов, например, на основе липидов или не на основе липидов, таких как FuGENE, липофектамин, TurboFect; электропорации; бомбардировки микрочастицами и т.п. Такие способы подробно описаны в стандартных источниках, например, у Sambrook, Protocols series, и др.
[0038] В настоящем документе термин «алифатический» обозначает фрагмент углеводорода, который может представлять собой прямую цепь (т.е. быть неразветвленным), быть разветвленным или циклическим (в том числе конденсированным, мостиковым и спиро-конденсированным полициклическим) и может быть полностью насыщенным, либо содержать одну или более единиц ненасыщенности, но не является ароматическим. Если не указано иное, алифатические группы содержат 1-30 атомов углерода. Согласно некоторым вариантам реализации алифатические группы содержат 1-10 атомов углерода. Согласно другим вариантам реализации алифатические группы содержат 1-8 атомов углерода. Согласно другим вариантам реализации алифатические группы содержат 1-6 атомов углерода, и согласно дальнейшим вариантам реализации алифатические группы содержат 1-4 атома углерода. Подходящие алифатические группы включают, но не ограничены перечисленными, линейные или разветвленные, алкильные, алкенильные и алкинильные группы, и их гибриды, такие как (циклоалкил)алкил, (циклоалкенил)алкил или (циклоалкил)алкенил.
[0039] В настоящем документе «алкил» относится к насыщенному неразветвленному, разветвленному или циклическому углеводороду, содержащему приблизительно от 1 до приблизительно 22 атомов углерода (и всем комбинациям и субкомбинациям диапазонов и конкретных количеств атомов углерода в них), согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения - предпочтительно приблизительно от 1 до приблизительно 12, или приблизительно от 1 до приблизительно 7 атомов углерода. Алкильные группы включают, но не ограничены перечисленными, метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, т-бутил, н-пентил, циклопентил, изопентил, неопентил, н-гексил, изогексил, циклогексил, циклооктил, адамантил, 3-метилпентил, 2,2-диметилбутил и 2,3-диметилбутил.
[0040] В настоящем документе «галоген» относится к F, Cl, Br или I.
[0041] В настоящем документе «алканоил» относится к необязательно замещенному прямому или разветвленному алифатическому ациклическому остатку, содержащему приблизительно 1-10 атомов углерода (и все комбинации и субкомбинации диапазонов, а также конкретное число атомов углерода), например, приблизительно от 1 до 7 атомов углерода, который, как подразумевается, присоединен к концевой С=O группе одинарной связью (и может также называться «ацильной группой»). Алканоильные группы включают, но не ограничены перечисленными, формил, ацетил, пропионил, бутирил, изобутирил, пентаноил, изопентаноил, 2-метил-бутирил, 2,2-диметоксипропионил, гексаноил, гептаноил, октаноил и т.п.; для целей настоящего изобретения формальную группу считают алканоильной группой. «Низший алканоил» относится к необязательно замещенному прямому или разветвленному алифатическому ациклическому остатку, содержащему приблизительно от 1 до приблизительно 5 атомов углерода (и все комбинации и субкомбинации диапазонов, а также конкретное число атомов углерода). Такие группы включают, но не ограничены перечисленными, формил, ацетил, пропионил, бутирил, изобутирил, пентаноил, изопентаноил и т.п.
[0042] В настоящем документе «арил» относится к необязательно замещенной моно- или бициклической ароматической кольцевой системе, содержащей от приблизительно 5 до приблизительно 14 атомов углерода (и все комбинации и субкомбинации диапазонов и конкретных количеств атомов углерода в них), предпочтительно от приблизительно 6 до приблизительно 10 атомов углерода. Неограничивающие примеры включают, например, фенил и нафтил.
[0043] В настоящем документе «аралкил» относится к алкильным радикалам, несущим арильный заместитель и содержащим от приблизительно 6 до приблизительно 22 атомов углерода (и все комбинации и субкомбинации диапазонов, а также конкретное число атомов углерода), согласно некоторым вариантам реализации - предпочтительно приблизительно от 6 до приблизительно 12 атомов углерода. Аралкильные группы необязательно могут быть замещенными. Неограничивающие примеры включают, например, бензил, нафтилметил, дифенилметил, трифенилметил, фенилэтил и дифенилэтил.
[0044] В настоящем документе термины «алкокси» и «алкоксил» относятся к необязательно замещенной группе алкил-О-, где алкил соответствует приведенному выше определению. Примеры алкоксигрупп и алкоксильных групп включают метокси, этокси, н-пропокси, и-пропокси, н-бутокси и гептокси.
[0045] В настоящем документе «карбокси» относится к группе -С(=O)ОН.
[0046] В настоящем документе «алкоксикарбонил» относится к -С(=O)O-алкильной группе, где алкил соответствует приведенному выше определению.
[0047] В настоящем документе «ароил» относится к -С(=O)-арильной группе, где арил соответствует приведенному выше определению. Примеры ароильных групп включают бензоил и нафтоил.
[0048] Термин «циклическая кольцевая система» относится к ароматической или неароматической частично ненасыщенной или полностью насыщенной 3-10-членной кольцевой системе, которая включает одиночные кольца с 3-8 атомами, и би- и трициклические кольцевые системы, которые могут включать ароматические 5- или 6-членные арильные или ароматические гетероциклические группы, конденсированные с неароматическим кольцом. Указанные гетероциклические кольца включают таковые, содержащие от 1 до 3 гетероатомов, независимо выбранных из группы, состоящей из кислорода, серы и азота. Согласно определенным вариантам реализации термин «гетероциклический» относится к неароматическому 5-, 6- или 7-членному кольцу или полициклической группе, в которой по меньшей мере один кольцевой атом представляет собой гетероатом, выбранный из группы, состоящей из О, S и N, включая, но не ограничиваясь перечисленными, би- или трициклическую группу, содержащую конденсированные шестичленные кольца с одним-тремя гетероатомами, независимо выбранными из группы, состоящей из кислорода, серы и азота. Согласно некоторым вариантам реализации «циклическая кольцевая система» относится к циклоалкильной группе, которая согласно настоящей заявке относится к группам с 3-10, например, 4-7 атомами углерода. Циклоалкилы включают, не ограничиваясь перечисленными, циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклогептил и т.п., которые являются необязательно замещенными. Согласно некоторым вариантам реализации «циклическая кольцевая система» относится к циклоалкенильному или циклоалкинильному фрагменту, который является необязательно замещенным.
2
3
2
3
[0049] Как правило, замещенные химические фрагменты содержат один или более заместителей, замещающих водород. Примеры заместителей включают, например, галоген, алкил, циклоалкил, аралкил, арил, сульфгидрил, гидроксил (-ОН), алкоксил, циано (-CN), карбоксил (-СООН), -С(=O)O-алкил, аминокарбонил (-C(=O)NH), -N-замещенный аминокарбонил (-C(=O)NHR''), CF, CFCF и т.п. Применительно к вышеперечисленным заместителям каждый фрагмент R'' может независимо представлять собой, например, любой из Н, алкила, циклоалкила, арила или аралкила.
[0050] В настоящем документе «L-аминокислота» относится к любой из встречающихся в природе левовращающих альфа-аминокислот, обычно присутствующих в белках или сложных алкильных эфирах указанных альфа-аминокислот. Термин «D-аминокислота» относится к правовращающим альфа-аминокислотам. Если не указано иное, все упоминаемые в настоящем документе аминокислоты представляют собой L-аминокислоты.
[0051] В настоящем документе «ароматическая аминокислота» представляет собой аминокислоту, содержащую по меньшей мере одно ароматическое кольцо, например, арильную группу.
[0052] В настоящем документе «ароматический аналог аминокислоты» представляет собой аналог аминокислоты, содержащий по меньшей мере одно ароматическое кольцо, например, арильную группу.
[0053] II. Система комплемента
th
th
[0054] Для облегчения понимания настоящего изобретения и без какого-либо ограничения настоящего изобретения в настоящем разделе приведено краткое описание комплемента и путей его активации. Более подробную информацию можно найти, например, в Kuby Immunology, 6 ed., 2006; Paul, W.E., Fundamental Immunology, Lippincott Williams & Wilkins; 6 ed., 2008; и Walport MJ., Complement. First of two parts. N Engl J Med., 344(14): 105 8-66, 2001.
[0055] Комплемент представляет собой часть системы врожденного иммунитета, играющую важную роль в защите организма от инфекционных агентов. Система комплемента включает более чем 30 сывороточных и клеточных белков, вовлеченных в три главных пути, известных как классический, альтернативный и лектиновый пути. Классический путь обычно запускается связыванием комплекса антигена и IgM- либо IgG-антитела с С1 (хотя некоторые другие активаторы могут также инициировать указанный путь). Активированный С1 расщепляет С4 и С2 с получением С4а и C4b, наряду с С2а и C2b. C4b и С2а объединяются с образованием С3-конвертазы, которая расщепляет С3 с образованием С3а и C3b. При связывании C3b с С3-конвертазой образуется С5-конвертаза, которая расщепляет С5 на С5а и C5b. С3а, С4а и С5а являются анафилотоксинами и опосредуют различные реакции при остром воспалительном ответе. С3а и С5а являются также хемотаксическими факторами, привлекающими клетки иммунной системы, такие как нейтрофилы.
[0056] Альтернативный путь инициируется и амплифицируется, например, на поверхности микроорганизмов и различных комплексных полисахаридов. В указанном пути гидролиз С3 до С3(H2O), который происходит спонтанно на низком уровне, приводит к связыванию фактора В, который расщепляется фактором D с образованием жидкофазной С3-конвертазы, которая активирует комплемент расщеплением С3 на С3а и C3b. C3b связывается с мишенями, такими как клеточная поверхность, и образует комплекс с фактором В, который позднее расщепляется фактором D с образованием С3-конвертазы. Поверхностно-связанные С3-конвертазы расщепляют и активируют дополнительные молекулы С3, что приводит к быстрому отложению C3b непосредственно рядом с участком активации, а также к дополнительному образованию С3-конвертазы, которая, в свою очередь, синтезирует дополнительный C3b. Указанный процесс приводит к запуску цикла расщепления С3 и образования С3-конвертазы, существенно усиливающего ответ. Расщепление С3 и связывание следующей молекулы C3b с С3-конвертазой приводит к образованию С5-конвертазы. С3- и С5-конвертазы указанного пути контролируются молекулами клетки-хозяина CR1, DAF, MCP, CD59 и fH. Механизм действия указанных белков включает либо ускоряющую распад активность (т.е. способность к разложению конвертаз), либо способность функционировать в качестве кофакторов при разрушении C3b или C4b фактором I, или обе способности. В норме присутствие регуляторных белков комплемента на поверхностях клеток-хозяев предотвращает значительную активацию комплемента на них.
[0057] С5-конвертазы, синтезируемые в обоих путях, расщепляют С5 с образованием С5а и C5b. C5b затем связывается с С6, С7 и С8 с образованием C5b-8, который катализирует полимеризацию С9 с образованием мембраноатакующего комплекса (МАК) C5b-9. Указанный МАК встраивается в мембраны целевых клеток и вызывает лизис клеток. Присутствие небольших количеств МАК на мембране клеток может приводить к разнообразным последствиям помимо гибели клетки.
[0058] Лектиновый путь комплемента инициируется связыванием связывающего маннозу лектина (MBL) и MBL-связанной серин-протеазы (MASP) с углеводами. Ген MB1-1 (известный как LMAN-1 у человека) кодирует интегральный мембранный белок I типа, локализованный в промежуточной области между эндоплазматическим ретикулумом и аппаратом Гольджи. Ген MBL-2 кодирует растворимый связывающий маннозу белок, обнаруживаемый в сыворотке. В лектиновом пути человека MASP-1 и MASP-2 вовлечены в протеолиз С4 и С2, приводящий к описанному выше образованию С3-конвертазы.
[0059] Активность комплемента регулируется различными белками млекопитающих, называемыми белками контроля комплемента (ССР/БКК) или регуляторными белками активации комплемента (RCA) (патент США №6897290). Указанные белки различаются в отношении специфичности лигандов и механизма(ов) ингибирования комплемента. Они могут ускорять нормальный распад конвертаз и/или функционировать в качестве кофакторов фактора I, ферментативно расщепляя C3b и/или C4b на более маленькие фрагменты. БКК характеризуются присутствием нескольких (как правило, 4-56) гомологичных мотивов, известных как короткие консенсусные повторы (SCR/ККП), белковых модулей контроля комплемента (БКК) или доменов SUSHI приблизительно 50-70 аминокислот длиной, которые содержат консервативный мотив, включающий четыре связанных дисульфидными связями цистеина (две дисульфидные связи), пролин, триптофан и множество гидрофобных остатков. Семейство БКК включает рецептор комплемента типа 1 (CR1; C3b:C4b рецептор), рецептор комплемента типа 2 (CR2), мембранный кофакторный белок (МСР; CD46), ускоряющий распад фактор (DAF), фактор комплемента Н (fH) и C4b-связывающий белок (C4bp). CD59 представляет собой мембраносвязанный регуляторный белок комплемента, структурно не родственный указанным БКК. Регуляторные белки комплемента обычно служат для ограничения активации комплемента, которая в ином случае могла бы происходить на клетках и в тканях указанного млекопитающего, например, хозяина-человека. Таким образом, «собственные» клетки обычно защищены от разрушительных эффектов, которые возникали бы в случае активации комплемента на указанных клетках. Недостаточность или дефекты регуляторного(ых) белка(ов) комплемента вовлечена(ы) в патогенез разнообразных комплемент-опосредованных нарушений, например, описываемых в настоящем документе.
[0060] III. Аналоги компстатина
[0061] Компстатин представляет собой циклический пептид, который связывается с С3 и ингибирует активацию комплемента. В патенте США №6319897 описан пептид с последовательностью Не-[Cys-Val-Val-Gln-Asp-Trp-Gly-His-His-Arg-Cys]-Thr (SEQ ID NO: 1), с дисульфидной связью между двумя цистеинами, выделенными скобками. Следует понимать, что название «компстатин» не было использовано в патенте США №6319897, но затем стало применяться в научной и патентной литературе (см., например, Morikis, et al., Protein Sci., 7(3):619-27, 1998) для обозначения пептида, имеющего такую же последовательность, что и SEQ ID NO: 2, описанная в патенте США №6319897, но амидированного на С-конце, как показано в таблице 1 (SEQ ID NO: 8). Термин «компстатин» применяют в настоящем документе в соответствии с таким использованием (т.е. для обозначения последовательности SEQ ID NO: 8). Были разработаны аналоги компстатина, имеющие более высокую комплемент-ингибирующую активность по сравнению с компстатином. См., например, WO 2004/026328 (PCT/US 2003/029653), Morikis, D., et al., Biochem Soc Trans. 32(Pt 1):28-32, 2004, Mallik, В., et al., J. Med. Chem., 274-286, 2005; Katragadda, M., et al. J. Med. Chem., 49: 4616-4622, 2006; WO 2007062249 (PCT/US 2006/045539); WO 2007044668 (PCT/US 2006/039397), WO/2009/046198 (PCT/US 2008/078593); WO/2010/127336 (PCT/US 2010/033345) и описание ниже.
[0062] Аналоги компстатина могут быть ацетилированы или амидированы, например, на N-конце и/или С-конце. Например, аналоги компстатина могут быть ацетилированы на N-конце и амидированы на С-конце. В соответствии с принятым в данной области техники значением в настоящем документе термин «компстатин» и описанные в настоящем документе активности аналогов компстатина относительно активности компстатина относятся к компстатину, амидированному на С-конце (Mallik, 2005, выше).
[0063] Конкатемеры или мультимеры компстатина или его комплемент-ингибирующего аналога также подходят для настоящего изобретения.
[0064] В настоящем документе термин «аналог компстатина» включает компстатин и любой его комплемент-ингибирующий аналог. Термин «аналог компстатина» охватывает компстатин и другие соединения, разработанные или идентифицированные на основе компстатина, комплемент-ингибирующая активность которых составляет по меньшей мере 50% от такой активности компстатина по оценке, например, с применением любого анализа активации комплемента из общепринятых в данной области техники, или по существу аналогичных или эквивалентных анализов. Определенные подходящие анализы описаны в патенте США №6319897, WO 2004/026328, Morikis, выше, Mallik, выше, Katragadda 2006, выше, WO 2007062249 (PCT/US 2006/045539); WO 2007044668 (PCT/US 2006/039397), WO/2009/046198 (PCT/US 2008/078593); и/или WO/2010/127336 (PCT/US2010/033345). В указанном анализе может быть измерен, например, опосредованный альтернативным или классическим путем лизис эритроцитов, или он может представлять собой анализ ELISA. Согласно некоторым вариантам реализации применяют анализ, описанный в WO/2010/135717 (PCT/US 2010/035871).
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
[0065] Активность аналога компстатина может быть выражена через IC (концентрация соединения, которое ингибирует активацию комплемента на 50%), где более низкая IC, как известно в данной области техники, указывает на более высокую активность. Активность предпочтительного аналога компстатина для применения согласно настоящему изобретению по меньшей мере равна активности компстатина. Заметим, что определенные модификации, которые, как известно, снижают или полностью ингибируют комплемент-ингибирующую активность, могут быть прямо исключены из любого варианта реализации настоящего изобретения. С помощью анализа опосредованного альтернативным путем лизиса эритроцитов было установлено, что IC для компстатина составляет 12 мкМ (WO 2004/026328). Следует иметь в виду, что точное значение IC для конкретного аналога компстатина при измерении будет варьировать в зависимости от условий эксперимента (например, от концентрации в сыворотке, применяемой для анализа). Используются сравнительные значения, например, полученные в экспериментах, в которых IC определяют для нескольких разных соединений в идентичных по существу условиях. Согласно одному из вариантов реализации IC аналога компстатина не превышает IC компстатина. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения активность указанного аналога компстатина в 2-99 раз выше активности компстатина (т.е. значение IC указанного аналога в 2-99 раз меньше значения IC компстатина). Например, указанная активность может быть в 10-50 раз выше активности компстатина или в 50-99 выше активности компстатина. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения активность указанного аналога компстатина в 99-264 выше активности компстатина. Например, указанная активность может быть в 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200,210, 220, 230, 240, 250, 260 или 264 раза выше активности компстатина. Согласно определенным вариантам реализации указанная активность в 250-300, в 300-350, в 350-400 или в 400-500 раз выше активности компстатина. Настоящее изобретение также охватывает аналоги компстатина с активностью, превышающей активность компстатина в 500-1000 или более раз. Согласно определенным вариантам реализации IC указанного аналога компстатина составляет от приблизительно 0,2 мкМ до приблизительно 0,5 мкМ. Согласно определенным вариантам реализации IC указанного аналога компстатина составляет от приблизительно 0,1 мкМ до приблизительно 0,2 мкМ. Согласно определенным вариантам реализации IC указанного аналога компстатина составляет от приблизительно 0,05 мкМ до приблизительно 0,1 мкМ. Согласно определенным вариантам реализации IC указанного аналога компстатина составляет от приблизительно 0,001 мкМ до приблизительно 0,05 мкМ.
d
d
d
[0066] K связывания компстатина с С3 может быть измерена с применением изотермической титрационной калориметрии (Katragadda, et al., J. Biol. Chem., 279(53), 54987-54995, 2004). Было установлено, что связывающая способность различных аналогов компстатина в отношении С3 коррелирует с их активностью, при этом более низкая K, как известно в данной области техники, указывает на более высокую связывающую способность. Линейная корреляция между связывающей способностью и активностью была показана для некоторых протестированных аналогов (Katragadda, 2004, выше; Katragadda 2006, выше). Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения указанный аналог компстатина связывается с С3 с K, значение которой составляет от 0,1 мкМ до 1,0 мкМ, от 0,05 мкМ до 0,1 мкМ, от 0,025 мкМ до 0,05 мкМ, от 0,015 мкМ до 0,025 мкМ, от 0,01 мкМ до 0,015 мкМ или от 0,001 мкМ до 0,01 мкМ.
[0067] Соединения, «разработанные или идентифицированные на основе компстатина», включают, но не ограничены перечисленными, соединения, содержащие аминокислотную цепь, последовательность которой получают: (i) модифицируя последовательность компстатина (например, заменой одной или более аминокислот указанной последовательности компстатина другой аминокислотой или аналогом аминокислоты, встраиванием одной или более аминокислот или аналога аминокислоты в указанную последовательность компстатина или удалением одной или более аминокислот из указанной последовательности компстатина); (ii) отбором из пептидной библиотеки фагового дисплея, в которой одна или более аминокислот компстатина рандомизированы и необязательно затем модифицированы в соответствии со способом (i); или (iii) идентификацией при скрининге в отношении соединений, конкурирующих за связывание с С3 или его фрагментом с компстатином или любым его аналогом, полученным с помощью способов (i) или (ii). Многие подходящие аналоги компстатина содержат гидрофобный кластер, бета-изгиб и дисульфидный мостик.
[0068] Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения последовательность указанного аналога компстатина содержит последовательность или состоит по существу из последовательности, получаемой осуществлением 1, 2, 3 или 4 замещений в последовательности компстатина, т.е. заменой 1, 2, 3 или 4 аминокислот в последовательности компстатина другой стандартной аминокислотой или нестандартной аминокислотой. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения изменена аминокислота в положении 4. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения изменена аминокислота в положении 9. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения изменены аминокислоты в положениях 4 и 9. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения изменены только аминокислоты в положениях 4 и 9. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения изменена аминокислота в положении 4 или 9; или, согласно некоторым вариантам реализации, изменены обе аминокислоты 4 и 9, и дополнительно изменено до 2-х аминокислот в положениях, выбранных из 1, 7, 10, 11 и 13. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения изменены аминокислоты в положениях 4, 7 и 9. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения изменены аминокислоты в положении 2 или 12, либо в обоих положениях, при условии, что при указанном изменении сохраняется способность указанного соединения к циклизации. Такое(ие) изменение(ия) в положениях 2 и/или 12 может(гут) осуществляться наряду с к изменением(ями) в положениях 1, 4, 7, 9, 10, 11 и/или 13. Последовательность любого из указанных аналогов компстатина, которую получают заменой одной или более аминокислот в последовательности компстатина, необязательно также содержит до 1, 2 или 3 дополнительных аминокислот на С-конце. Согласно одному из вариантов реализации указанная дополнительная аминокислота представляет собой Gly. Последовательность любого из указанных аналогов компстатина, которую получают заменой одной или более аминокислот в последовательности компстатина, необязательно также содержит до 5 или до 10 дополнительных аминокислот на С-конце. Следует понимать, что аналоги компстатина могут обладать любой одной или несколькими характеристиками или свойствами различных вариантов реализации, описанных в настоящем документе, и характеристики или свойства любого варианта реализации могут дополнительно характеризовать любой другой описанный в настоящем документе вариант реализации, если не указано или не очевидно из контекста иное. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения последовательность указанного аналога компстатина содержит последовательность, идентичную последовательности компстатина, за исключением положений, соответствующих положениям 4 и 9 в последовательности компстатина, или состоит по существу из такой последовательности.
[0069] Компстатин и определенные аналоги компстатина, активность которых выше активности компстатина, содержат исключительно стандартные аминокислоты («стандартными аминокислотами» являются глицин, лейцин, изолейцин, валин, аланин, фенилаланин, тирозин, триптофан, аспарагиновая кислота, аспарагин, глутаминовая кислота, глутамин, цистеин, метионин, аргинин, лизин, пролин, серии, треонин и гистидин). Определенные аналоги компстатина, обладающие повышенной активностью, содержат одну или более нестандартных аминокислот. Подходящие нестандартные аминокислоты включают моно- и мультигалогенированные (например, фторированные) аминокислоты, D-аминокислоты, гомо-аминокислоты, н- алкил-аминокислоты, дегидроаминокислоты, ароматические аминокислоты (отличные от фенилаланина, тирозина и триптофана), орто-, мета- или пара-аминобензойную кислоту, фосфоаминокислоты, метоксилированные аминокислоты и α,α-дизамещенные аминокислоты. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения аналог компстатина получают заменой одной или более L-аминокислот в аналоге компстатина, описываемом где-либо в настоящем документе, соответствующей D-аминокислотой. Такие соединения и способы их применения представляют собой аспекты настоящего изобретения. Примеры подходящих нестандартных аминокислот включают 2-нафтилаланин (2-NaI), 1-нафтилаланин (1-NaI), 2-инданилглицинкарбоновую кислоту (2Ig1), дигидротриптофан (Dht), 4-бензоил-L-фенилаланин (Вра), 2-α-аминомасляную кислоту (2-Abu), 3-α-аминомасляную кислоту (3-Abu), 4-α-аминомасляную кислоту (4-Abu), циклогексилаланин (Cha), гомоциклогексилаланин (hCha), 4-фтор-L- триптофан (4fW), 5-фтор-L-триптофан (5fW), 6-фтор-L-триптофан (6fW), 4-гидрокси-L-триптофан (4OH-W), 5-гидрокси-L-триптофан (5OH-W), 6-гидрокси-L-триптофан (6OH-W), 1-метил-L-триптофан (1MeW), 4-метил-L-триптофан (4MeW), 5-метил-L-триптофан (5MeW), 7-аза-L-триптофан (7aW), α-метил-L-триптофан (αMeW), β-метил-L-триптофан (βMeW), N-метил-L-триптофан (NMeW), орнитин (orn), цитруллин, норлейцин, γ-глутаминовую кислоту и т.п.
1
5
1
5
[0070] Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения указанный аналог компстатина содержит один или более аналогов Trp (например, в положении 4 и/или 7 относительно последовательности компстатина). Примеры аналогов Trp приведены выше. См. также Beene, et. al. Biochemistry 41: 10262-10269, 2002 (где описаны, в том числе, моно- и мультигалогенированные аналоги Trp); Babitzke & Yanofsky, J. Biol. Chem. 270: 12452-12456, 1995 (где описаны, в том числе, метилированные и галогенированные Trp, и другие Trp- и индольные аналоги); и патенты США 6214790, 6169057, 5776970, 4870097, 4576750 и 4299838. Другие аналоги Trp включают варианты, замещенные (например, метальной группой) по α- или β-углероду, и, необязательно, также в одном или нескольких положениях на индольном кольце. Аминокислоты, содержащие два или большее количество ароматических колец, включая замещенные, незамещенные или альтернативно замещенные варианты, представляют интерес в качестве аналогов Trp. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения указанный аналог Trp, например, в положении 4, представляет собой 5-метокси, 5-метил-, 1-метил- или 1-формил-триптофан. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения применяют аналог Trp (например, в положении 4), содержащий 1-алкильный заместитель, например, низший алкильный (например, С-С) заместитель. Согласно определенным вариантам реализации применяют N(α) метилтриптофан или 5-метилтриптофан. Согласно некоторым вариантам реализации применяют аналог, содержащий 1-алканоильный заместитель, например, низший алканоил (например, С-С). Примеры включают 1-ацетил-L-триптофан и L-β-триптофан.
[0071] Согласно определенным вариантам реализации указанный аналог Trp имеет повышенную гидрофобность по сравнению с Trp. Например, индольное кольцо может быть замещено одной или большим количеством алкильных (например, метальных) групп. Согласно определенным вариантам реализации указанный аналог Trp принимает участие в гидрофобных взаимодействиях с С3. Такой аналог Trp может находиться, например, в положении 4 относительно последовательности компстатина. Согласно определенным вариантам реализации указанный аналог Trp содержит замещенный или незамещенный компонент бициклического ароматического кольца или два или большее количество замещенных или незамещенных компонентов моноциклического ароматического кольца.
[0072] Согласно определенным вариантам реализации указанный аналог Trp имеет повышенную склонность к образованию водородных связей с С3 по сравнению с Trp, но не обладает повышенной гидрофобностью по сравнению с Trp. Указанный аналог Trp может иметь повышенную полярность по сравнению с Trp и/или повышенную способность к участию в электростатическом взаимодействии с донором водородной связи на С3. Определенные примеры аналогов Trp, которым свойственна повышенная способность к образованию водородных связей, содержат электроотрицательный заместитель на индольном кольце. Такой аналог Trp может быть расположен, например, в положении 7 относительно последовательности компстатина.
2
[0073] Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения указанный аналог компстатина содержит один или более аналогов Ala (например, в положении 9 относительно последовательности компстатина), например, аналоги Ala, идентичные Ala, за исключением того, что они содержат одну или более CH-групп в боковой цепи. Согласно определенным вариантам реализации указанный аналог Ala представляет собой неразветвленную аминокислоту с одной метальной группой, такую как 2-Abu. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения указанный аналог компстатина содержит один или более аналогов Trp (например, в положении 4 и/или 7 относительно последовательности компстатина) и аналог Ala (например, в положении 9 относительно последовательности компстатина).
n
m
[0074] Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения указанный аналог компстатина представляет собой соединение, которое содержит пептид, имеющий последовательность (X'aa)- Gin - Asp - Хаа - Gly-(X''aa), (SEQ ID NO: 2), где каждый X'aa и каждый Х''аа представляет собой независимо выбранную аминокислоту или аналог аминокислоты, причем Хаа представляет собой Trp или аналог Trp, и при этом n>1 и m>1 и значение n+m составляет от 5 до 21. Указанный пептид имеет коровую последовательность Gln - Asp - Хаа - Gly (SEQ ID NO:70), где Хаа представляет собой Trp или аналог Trp, например, аналог Trp, обладающий повышенной склонностью к образованию водородных связей с донором Н-связи по сравнению с Trp, однако согласно некоторым вариантам реализации не обладает повышенной гидрофобностью по сравнению с Trp. Например, указанный аналог может быть таким, в котором индольное кольцо Trp замещено электроотрицательным фрагментом, например, галогеном, таким как фтор. Согласно одному варианту реализации Хаа представляет собой 5-фтортриптофан. Специалисту в данной области техники будет ясно, что, при отсутствии указывающих на обратное данных, любой не встречающийся в природе пептид, последовательность которого содержит указанную коровую последовательность, и который ингибирует активацию комплемента и/или связывается с С3, будет получен на основе последовательности компстатина. Согласно альтернативному варианту реализации Хаа представляет собой аминокислоту или аналог аминокислоты, не являющийся аналогом Trp, допускающий образование бета-изгиба пептидом Gln - Asp - Хаа - Gly.
[0075] Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения указанный пептид имеет коровую последовательность X'aa-Gln - Asp - Хаа - Gly (SEQ ID NO: 3), где X'aa и Хаа выбраны из Trp и аналогов Trp. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения указанный пептид имеет коровую последовательность X'aa-Gln - Asp - Хаа - Gly (SEQ ID NO: 3), где Х'аа и Хаа выбраны из Trp, аналогов Trp и других аминокислот или аналогов аминокислот, содержащих по меньшей мере одно ароматическое кольцо. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения указанная коровая последовательность образует бета-изгиб в контексте пептида. Указанный β-изгиб может быть гибким, позволяя пептиду существовать в двух или большем количестве конформаций, по оценке, например, с применением ядерного магнитного резонанса (ЯМР). Согласно определенным вариантам реализации Х'аа представляет собой аналог Trp, содержащий замещенный или незамещенный компонент бициклического ароматического кольца или два или большее количество замещенных или незамещенных компонентов моноциклического ароматического кольца. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения Х'аа выбран из группы, состоящей из 2-нафтилаланина, 1-нафтилаланина, 2-инданилглицин-карбоновой кислоты, дигидротриптофана и бензоилфенилаланина. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения Х'аа представляет собой аналог Trp, обладающий повышенной гидрофобностью по сравнению с Trp. Например, Х'аа может представлять собой 1-метилтриптофан. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения Хаа представляет собой аналог Trp, обладающий повышенной склонностью к образованию водородных связей по сравнению с Trp, но, согласно некоторым вариантам реализации, не обладающий повышенной гидрофобностью по сравнению с Trp. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения указанный аналог Trp, обладающий повышенной склонностью к образованию водородных связей по сравнению с Trp, содержит модификацию на индольном кольце Trp, например, в положении 5, такую как замещение атома галогена на атом Н в положении 5. Например, Хаа может представлять собой 5-фтортриптофан.
[0076] Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения пептид имеет коровую последовательность X'aa-Gln - Asp - Хаа - Gly-X''aa (SEQ ID NO: 4), где каждый из Х'аа и Хаа независимо выбран из Trp и аналогов Trp, а Х''аа выбран из His, Ala, аналогов Ala, Phe и Trp. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения Х'аа представляет собой аналог Trp, обладающий повышенной гидрофобностью по сравнению с Trp, такой как 1-метилтриптофан или другой аналог Trp с алкильным заместителем на индольном кольце (например, в положении 1, 4, 5 или 6). Согласно определенным вариантам реализации Х'аа представляет собой аналог Trp, содержащий замещенный или незамещенный компонент бициклического ароматического кольца или два или большее количество замещенных или незамещенных компонентов моноциклического ароматического кольца. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения Х'аа выбран из группы, состоящей из 2-нафтилаланина, 1-нафтилаланина, 2-инданил глицин-карбоновой кислоты, дигидротриптофана и бензоилфенилаланина. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения Хаа представляет собой аналог Trp, обладающий повышенной склонностью к образованию водородных связей с С3 по сравнению с Trp, но, согласно некоторым вариантам реализации, не обладает повышенной гидрофобностью по сравнению с Trp. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения указанный аналог Trp, обладающий повышенной склонностью к образованию водородных связей по сравнению с Trp, содержит модификацию на индольном кольце Trp, например, в положении 5, такую как замещение атома галогена на атом Н в положении 5. Например, Хаа может представлять собой 5-фтортриптофан. Согласно определенным вариантам реализации Х''аа представляет собой Ala или аналог Ala, такой как Abu, или другую неразветвленную аминокислоту с одной метильной группой. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения указанный пептид имеет коровую последовательность X'aa-Gln - Asp - Хаа - Gly-X''aa (SEQ ID NO: 4), где каждый из Х'аа и Хаа независимо выбран из Trp, аналогов Trp и аминокислот или аналогов аминокислот, содержащих по меньшей мере одну ароматическую боковую цепь, и Х''аа выбран из His, Ala, аналогов Ala, Phe и Trp. Согласно определенным вариантам реализации Х''аа выбран из аналогов Trp, ароматических аминокислот и аналогов ароматических аминокислот.
n
m
[0077] Согласно определенным предпочтительным вариантам реализации настоящего изобретения указанный пептид является циклическим. Указанный пептид может быть циклизован связью между любыми двумя аминокислотами, одна из которых представляет собой (Х'аа), а другая расположена в (Х''аа). Согласно определенным вариантам реализации длина циклической части указанного пептида составляет от 9 до 15 аминокислот, например, 10-12 аминокислот. Согласно определенным вариантам реализации длина циклической части указанного пептида составляет 11 аминокислот, со связью (например, дисульфидной связью) между аминокислотами в положениях 2 и 12. Например, длина пептида может составлять 13 аминокислот, со связью между аминокислотами в положениях 2 и 12, которая обеспечивает образование циклической части длиной 11 аминокислот.
2
2
n
2
2
2
[0078] Согласно определенным вариантам реализации указанный пептид содержит последовательность или состоит из последовательности X'aa1 - Х'аа2 -Х'аа3-Х'аа4 -Gln-Asp-Xaa-Gly- X'aal - Х''аа2- Х''аа3- Х''аа4- Х''аа5 (SEQ ID NO: 5). Согласно определенным вариантам реализации Х'аа4 и Хаа выбраны из Trp и аналогов Trp, и X'aa1, Х'аа2, Х'аа3, Х''аа1, Х''аа2, Х''аа3, Х''аа4 и Х''аа5 независимо выбраны из аминокислот и аналогов аминокислот. Согласно определенным вариантам реализации Х'аа4 и Хаа выбраны из ароматических аминокислот и аналогов ароматических аминокислот. Любой(ые) один или более из X'aa1, Х'аа2, Х'аа3, Х''аа1, Х''аа2, Х'аа3, Х''аа4 и Х''аа5 могут быть идентичны аминокислоте в соответствующем положении компстатина. Согласно одному из вариантов реализации Х''аа1 представляет собой Ala или неразветвленную аминокислоту с одиночной метальной группой. Указанный пептид может быть циклизован ковалентной связью между (i) X'aa1, Х'аа2 или Х'аа3; и (ii) Х''аа2, Х''аа3, Х''аа4 или Х''аа5. Согласно одному варианту реализации указанный пептид циклизован ковалентной связью между Х'аа2 и Х''аа4. Согласно одному варианту реализации каждая из указанных ковалентно связанных аминокислот представляет собой Cys, и указанная ковалентная связь представляет собой дисульфидную (S-S) связь. Согласно другим вариантам реализации указанная ковалентная связь представляет собой С-С, С-О, C-S или C-N связь. Согласно определенным вариантам реализации один из указанных ковалентно связанных остатков представляет собой аминокислоту или аналог аминокислоты с боковой цепью, содержащей первичный или вторичный амин, другой ковалентно связанный остаток представляет собой аминокислоту или аналог аминокислоты с боковой цепью, содержащей группу карбоновой кислоты, и указанная ковалентная связь представляет собой амидную связь. Аминокислоты или аналоги аминокислот с боковой цепью, содержащей первичный или вторичный амин, включают лизин и диаминокарбоновые кислоты с общей структурой NH(CH)CH(NH)COOH, такие как 2,3-диаминопропионовая кислота (ДАПК), 2,4-диаминомасляная кислота (ДАМК) и орнитин (orn), где n=1 (ДАПК), 2 (ДАМК) и 3 (orn), соответственно. Примеры аминокислот с боковой цепью, содержащей группу карбоновой кислоты, включают дикарбоновые аминокислоты, такие как глутаминовая кислота и аспарагиновая кислота. Могут также применяться аналоги, такие как бета-гидрокси-L-глутаминовая кислота. Согласно некоторым вариантам реализации пептид циклизован тиоэфирной связью, например, согласно описанию в PCT7US 2011/052442 (WO/2012/040259). Например, согласно некоторым вариантам реализации дисульфидная связь в любом из указанных пептидов заменена тиоэфирной связью. Согласно некоторым вариантам реализации образуется цистатионин. Согласно некоторым вариантам реализации указанный цистатионин представляет собой дельта-цистатионин или гамма-цистатионин. Согласно некоторым вариантам реализации модификация включает замену дисульфидной связи Cys-Cys между цистеинами на Х'аа2 и Х''аа4 в SEQ ID NO: 5 (или в соответствующих положениях в других последовательностях) с добавлением СН, с образованием гомоцистеина на Х'аа2 или Х''аа4, и введение тиоэфирной связи с образованием цистатионина. Согласно одному из вариантов реализации указанный цистатионин представляет собой гамма-цистатионин. Согласно другому варианту реализации указанный цистатионин представляет собой дельта-цистатионин. Другая модификация в соответствии с настоящим изобретением включает замену дисульфидной связи тиоэфирной связью без добавления СН, с образованием таким образом лантитионина. Согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина, содержащий тиоэфир вместо дисульфидной связи, имеет повышенную стабильность, по меньшей мере в некоторых условиях, по сравнению с аналогом компстатина, содержащим дисульфидную связь.
[0079] Согласно определенным вариантам реализации указанный аналог компстатина представляет собой соединение, которое содержит пептид, имеющий последовательность:
[0080] Xaal - Cys - Val - Хаа2 - Gln - Asp - Xaa2* - Gly - Хаа3-His - Arg - Cys - Xaa4 (SEQ ID NO: 6); где:
1
1
1
1
1
Xaa1 представляет собой Ile, Val, Leu, B-Ile, B-Val, B-Leu или дипептид, содержащий Gly-Ile или B-Gly-Ile, и В представляет собой первый блокирующий фрагмент;
2
Хаа2 и Хаа2* независимо выбраны из Trp и аналогов Trp; Хаа3 представляет собой His, Ala или аналог Ala, Phe, Trp или аналог Trp; Хаа4 представляет собой L-Thr, D-Thr, Ile, Val, Gly, дипептид, выбранный из Thr-Ala и Thr-Asn, или трипептид, содержащий Thr-Ala-Asn, при этом карбоксиконцевой - ОН любого из указанных L-Thr, D-Thr, Ile, Val, Gly, Ala или Asn необязательно заменен на второй блокирующий фрагмент В; и
2
указанные два остатка Cys соединены дисульфидной связью. Согласно некоторым вариантам реализации Хаа4 представляет собой Leu, Nle, His или Phe, или дипептид, выбранный из Хаа5-Ala и Xaa5-Asn, или трипептид Xaa5-Ala-Asn, где Хаа5 выбран из Leu, Nle, His или Phe, и где карбоксиконцевой -ОН любого из указанных L-Thr, D-Thr, Ile, Val, Gly, Leu, Nle, His, Phe, Ala или Asn необязательно заменен на второй блокирующий фрагмент В; и указанные два остатка Cys соединены дисульфидной связью.
[0081] Согласно другим вариантам реализации Xaa1 отсутствует или представляет собой любую аминокислоту или аналог аминокислоты, и Хаа2, Хаа2*, Хаа3 и Хаа4 соответствуют определению, данному выше. Если Xaa1 отсутствует, к N-концевому остатку Cys может быть присоединен блокирующий фрагмент В1.
2
[0082] Согласно другому варианту реализации Хаа4 представляет собой любую(ой) аминокислоту или аналог аминокислоты, a Xaa1, Хаа2, Хаа2* и Хаа3 соответствуют определению, данному выше. Согласно еще одному варианту реализации Хаа4 представляет собой дипептид, выбранный из группы, состоящей из: Thr-Ala и Thr-Asn, где карбоксиконцевой -ОН или Ala, или Asn необязательно заменен на второй блокирующий фрагмент В.
[0083] Согласно любому варианту реализации аналога компстатина с последовательностью SEQ ID NO: 6 Хаа2 может представлять собой Trp.
[0084] Согласно любому варианту реализации аналога компстатина с последовательностью SEQ ID NO: 6 Хаа2 может представлять собой аналог Trp, содержащий замещенный или незамещенный компонент бициклического ароматического кольца или два или большее количество замещенных или незамещенных компонентов моноциклического ароматического кольца. Например, указанный аналог Trp может быть выбран из 2-нафтилаланина (2-NaI), 1-нафтилаланина (1-NaI), 2-инданилглицин-карбоновой кислоты (Ig1), дигидротриптофана (Dht) и 4-бензоил-L-фенилаланина.
[0085] Согласно любому варианту реализации аналога компстатина с последовательностью SEQ ID NO: 6 Хаа2 может представлять собой аналог Trp с повышенной гидрофобностью по сравнению с Trp. Например, указанный аналог Trp может быть выбран из 1-метилтриптофана, 4-метилтриптофана, 5-метилтриптофана и 6-метилтриптофана. Согласно одному из вариантов реализации указанный аналог Trp представляет собой 1-метилтриптофан. Согласно одному из вариантов реализации Хаа2 представляет собой 1-метилтриптофан, Хаа2* представляет собой Trp, Хаа3 представляет собой Ala, а другие аминокислоты идентичны соответствующим аминокислотам компстатина.
[0086] Согласно любому варианту реализации аналога компстатина с последовательностью SEQ ID NO: 6 Хаа2* может представлять собой аналог Trp, такой как аналог Trp с повышенной склонностью к образованию водородной связи с С3 по сравнению с Trp, которому, согласно некоторым вариантам реализации, не свойственна повышенная по сравнению с Trp гидрофобность. Согласно определенным вариантам реализации указанный аналог Trp содержит электроотрицательный заместитель на индольном кольце. Например, указанный аналог Trp может быть выбран из 5-фтортриптофана и 6-фтортриптофана.
[0087] Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения Хаа2 представляет собой Trp, а Хаа2* представляет собой аналог Trp с повышенной склонностью к образованию водородной связи с С3 по сравнению с Trp, которому, согласно некоторым вариантам реализации, не свойственна повышенная по сравнению с Trp гидрофобность. Согласно определенным вариантам реализации аналога компстатина с последовательностью SEQ ID NO: 6 Хаа2 представляет собой аналог Trp с повышенной по сравнению с Trp гидрофобностью, такой как аналог Trp, выбранный из 1-метилтриптофана, 4-метилтриптофана, 5-метилтриптофана и 6-метилтриптофана, и Хаа2* представляет собой аналог Trp с повышенной склонностью к образованию водородной связи с С3 по сравнению с Trp, которому согласно некоторым вариантам реализации не свойственна повышенная гидрофобность по сравнению с Trp. Например, согласно одному варианту реализации Хаа2 представляет собой метилтриптофан, а Хаа2* представляет собой 5-фтортриптофан.
[0088] Согласно некоторым из упомянутых выше вариантов реализации Хаа3 представляет собой Ala. Согласно некоторым из упомянутых выше вариантов реализации Хаа3 представляет собой неразветвленную аминокислоту с одиночной метальной группой, например, Abu.
[0089] в настоящем изобретении также предложены аналоги компстатина с последовательностью SEQ ID NO: 6 согласно приведенному выше описанию, где Хаа2 и Хаа2* независимо выбраны из Trp, аналогов Trp и других аминокислот или аналогов аминокислот, которые содержат по меньшей мере одно ароматическое кольцо, и Хаа3 представляет собой His, Ala или аналог Ala, Phe, Trp, аналог Trp либо другую ароматическую аминокислоту или аналог ароматической аминокислоты.
1
2
1
1
1
[0090] Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения блокирующий фрагмент, присутствующий на N- или С-конце любого из описанных в настоящем документе аналогов компстатина, представляет собой любой фрагмент, стабилизирующий пептид, предотвращая его разрушение, которое иначе произошло бы в крови или интерстициальной жидкости млекопитающего (например, человека или не являющегося человеком примата). Например, блокирующий фрагмент В может представлять собой любой фрагмент, изменяющий структуру N-конца пептида таким образом, чтобы ингибировать расщепление пептидной связи между N-концевой аминокислотой указанного пептида и смежной аминокислотой. Блокирующий фрагмент В может представлять собой любой фрагмент, изменяющий структуру С-конца пептида таким образом, чтобы ингибировать расщепление пептидной связи между С-концевой аминокислотой указанного пептида и смежной аминокислотой. Могут применяться любые подходящие блокирующие фрагменты, известные в данной области техники. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения блокирующий фрагмент В содержит ацильную группу (т.е. часть карбоновой кислоты, остающуюся после удаления -ОН-группы). Указанная ацильная группа, как правило, содержит от 1 до 12 атомов углерода, например, от 1 до 6 атомов углерода. Например, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения блокирующий фрагмент В выбран из группы, состоящей из: формила, ацетила, проприонила, бутирила, изобутирила, валерила, изовалерила и т.п. Согласно одному из вариантов реализации блокирующий фрагмент В представляет собой ацетильную группу, т.е. Xaa1 представляет собой Ac-Ile, Ac-Val, Ac-Leu или Ac-Gly-Ile.
2
1
2
[0091] Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения блокирующий фрагмент В представляет собой первичный или вторичный амин (-NH или -NHR, где R представляет собой органический фрагмент, такой как алкильная группа).
1
2
[0092] Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения блокирующий фрагмент В представляет собой любой фрагмент, нейтрализующий или уменьшающий положительный заряд, который в ином случае может присутствовать на N-конце при физиологических уровнях рН. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения блокирующий фрагмент В представляет собой любой фрагмент, нейтрализующий или уменьшающий отрицательный заряд, который в ином случае может присутствовать на С-конце при физиологических уровнях рН.
[0093] Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения аналог компстатина ацетилирован или амидирован на N-конце и/или С-конце, соответственно. Аналог компстатина может быть ацетилирован на N-конце, амидирован на С-конце и/или и ацетилирован на N-конце, и амидирован на С-конце. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения аналог компстатина содержит алкильную или арильную группу на N-конце, а не ацетильную группу.
[0094] Согласно определенным вариантам реализации указанный аналог компстатина представляет собой соединение, которое содержит пептид, имеющий последовательность:
[0095] Xaa1 - Cys - Val - Хаа2 - Gln - Asp - Xaa2* - Gly - Хаа3-His - Arg - Cys - Xaa4 (SEQ ID NO: 7); где:
Xaa1 представляет собой Ile, Val, Leu, Ac-Ile, Ac-Val, Ac-Leu или дипептид, содержащий Gly-Ile или Ac-Gly-Ile;
2
Xaa2 и Xaa2* независимо выбраны из Trp и аналогов Trp; Хаа3 представляет собой His, Ala или аналог Ala, Phe, Trp или аналог Trp; Хаа4 представляет собой L-Thr, D-Thr, Не, Val, Gly, дипептид, выбранный из Thr-Ala и Thr-Asn, или трипептид, содержащий Thr-Ala-Asn, при этом карбоксиконцевой -ОН любого из L-Thr, D-Thr, Ile, Val, Gly, Ala или Asn необязательно заменен на -NH; и указанные два остатка Cys соединены дисульфидной связью. Согласно некоторым вариантам реализации Хаа4 представляет собой Leu, Nle, His или Phe, или дипептид, выбранный из Хаа5-Ala и Xaa5-Asn, или трипептид Xaa5-Ala-Asn, где Хаа5 выбран из Leu, Nle, His или Phe, и где карбоксиконцевой -ОН любого из указанных L-Thr, D-Thr, Ile, Val, Gly, Leu, Nle, His, Phe, Ala или Asn необязательно заменен вторым блокирующим фрагментом В2; и указанные два остатка Cys соединены дисульфидной связью.
[0096] Согласно некоторым вариантам реализации Xaa1, Хаа2, Хаа2*, Хаа3 и Хаа4 соответствуют приведенному выше описанию для различных вариантов реализации последовательности SEQ ID NO: 6. Например, согласно некоторым вариантам реализации Хаа2* представляет собой Trp. Согласно определенным вариантам реализации Хаа2 представляет собой аналог Trp с повышенной гидрофобностью по сравнению с Trp, например, 1-метилтриптофан. Согласно определенным вариантам реализации Хаа3 представляет собой Ala. Согласно определенным вариантам реализации Хаа3 представляет собой неразветвленную аминокислоту с одиночной метальной группой.
[0097] Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения Xaa1 представляет собой Ile, и Хаа4 представляет собой L-Thr.
[0098] Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения Xaa1 представляет собой Ile, Хаа2* представляет собой Trp, и Хаа4 представляет собой L-Thr.
[0099] в настоящем изобретении также предложены аналоги компстатина с последовательностью SEQ ID NO: 7 согласно приведенному выше описанию, где Хаа2 и Хаа2* независимо выбраны из Trp, аналогов Trp, других аминокислот или аналогов ароматических аминокислот, и Хаа3 представляет собой His, Ala или аналог Ala, Phe, Trp, аналог Trp либо другую ароматическую аминокислоту или аналог ароматической аминокислоты.
[00100] Согласно определенным вариантам реализации любого из указанных аналогов компстатина, описанных в настоящем документе, применяют аналог Phe, но не Phe.
[00101] В таблице 1 приведен неограничивающий список аналогов компстатина, подходящих для настоящего изобретения. В левой колонке приведены сокращенные обозначения указанных аналогов с отмеченными конкретными модификациями в означенных положениях (1-13) относительно исходного пептида, компстатина. В соответствии с использованием в данной области техники термин «компстатин» в настоящем документе, как и сравнительные активности описанных в настоящем документе аналогов компстатина по сравнению с компстатином, относятся к пептиду компстатину, амидированному на С-конце. Если не указано иное, пептиды в таблице 1 амидированы на С-конце. Выделение жирным шрифтом применяют для обозначения определенных модификаций. Активность относительно активности компстатина приведена на основании данных из опубликованных источников и описываемых в них анализов (WO 2004/026328, WO 2007044668, Mallik, 2005; Katragadda, 2006). В случаях обращения к нескольким публикациям, где указывается активность, используют значение, опубликованное позже; следует понимать, что значения могут корректироваться в случае расхождений между данными анализов. Следует также иметь в виду, что согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения пептиды, перечисленные в таблице 1, при применении в терапевтических композициях и способах согласно настоящему изобретению циклизованы дисульфидной связью между двумя остатками Cys. Варианты способов циклизации указанных пептидов также входят в объем настоящего изобретения. Как уже отмечалось, согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения одна или более аминокислот аналога компстатина (например, любого из аналогов компстатина, описанных в настоящем документе) может представлять собой N-алкил-аминокислоту (например, N-метил-аминокислоту). Например, без ограничения, по меньшей мере одна аминокислота в составе циклической части указанного пептида, по меньшей мере одна аминокислота в направлении N-конца относительно циклической части и/или по меньшей мере одна аминокислота в направлении С-конца относительно циклической части может представлять собой N-алкил-аминокислоту, например, N-метил-аминокислоту. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения аналог компстатина содержит, например, N-метилглицин, к примеру, в положении, соответствующем положению 8 компстатина и/или в положении, соответствующем положению 13 компстатина. Согласно некоторым вариантам реализации один или более из аналогов компстатина в таблице 1 содержит по меньшей мере один N-метилглицин, например, в положении, соответствующем положению 8 компстатина и/или в положении, соответствующем положению 13 компстатина. Согласно некоторым вариантам реализации один или более аналогов компстатина в таблице 1 содержит по меньшей мере один N-метил-изолейцин, например, в положении, соответствующем положению 13 компстатина. Например, Thr на С-конце или около С-конца пептида, последовательность которого приведена в таблице 1, или любой другой последовательности аналога компстатина, может быть заменен на N-метил-Ile. Как очевидно, согласно некоторым вариантам реализации N-метилированные аминокислоты содержат N-Метил-Gly в положении 8 и N-метил-Ile в положении 13. Согласно некоторым вариантам реализации N-метилированные аминокислоты содержат N-метил-Gly в коровой последовательности, такой как последовательность SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4. Согласно некоторым вариантам реализации N-метилированные аминокислоты содержат N-метил-Gly в такой коровой последовательности, как последовательность SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 7.
[00102] Таблица 1
Н/д=нет данных.
[00103] Согласно определенным вариантам реализации композиций и способов, предложенных в настоящем изобретении, указанный аналог компстатина имеет последовательность, выбранную из последовательностей 9-36. Согласно определенным вариантам реализации композиций и способов, предложенных в настоящем изобретении, указанный аналог компстатина имеет последовательность, выбранную из последовательностей SEQ ID NO: 14, 21, 28, 29, 32, 33, 34 и 36. Согласно определенным вариантам реализации композиций и/или способов согласно настоящему изобретению указанный аналог компстатина имеет последовательность, выбранную из последовательностей SEQ ID NO: 30 и 31. Согласно одному варианту реализации композиций и способов, предложенных в настоящем изобретении, указанный аналог компстатина имеет последовательность SEQ ID NO: 28. Согласно одному варианту реализации композиций и способов, предложенных в настоящем изобретении, указанный аналог компстатина имеет последовательность SEQ ID NO: 32. Согласно одному варианту реализации композиций и способов, предложенных в настоящем изобретении, указанный аналог компстатина имеет последовательность SEQ ID NO: 34. Согласно одному варианту реализации композиций и способов, предложенных в настоящем изобретении, указанный аналог компстатина имеет последовательность SEQ ID NO: 36.
1
2
1
2
1
2
1
1a
1
1a
1a
1а
1a
2
2a
2
2a
2a
2a
1a
2a
1a
2a
1a
2a
1a
2a
1a
2a
1a
2a
2
[00104] Согласно некоторым вариантам реализации блокирующий фрагмент В содержит аминокислоту, которая может быть представлена как Хаа0. Согласно некоторым вариантам реализации блокирующий фрагмент В содержит аминокислоту, которая может быть представлена как XaaN. Согласно некоторым вариантам реализации блокирующий фрагмент В и/или В содержит нестандартную аминокислоту, такую как D-аминокислота, N-алкил-аминокислота (например, N-метил-аминокислота). Согласно некоторым вариантам реализации блокирующий фрагмент В и/или В содержит нестандартную аминокислоту, которая представляет собой аналог стандартной аминокислоты. Согласно некоторым вариантам реализации аналог аминокислоты содержит низший алкил, низший алкокси или галогеновый заместитель по сравнению со стандартной аминокислотой, аналогом которой он является. Согласно некоторым вариантам реализации заместитель находится на боковой цепи. Согласно некоторым вариантам реализации заместитель находится на альфа-углеродном атоме. Согласно некоторым вариантам реализации блокирующий фрагмент В, содержащий аминокислоту, например, нестандартную аминокислоту, также содержит фрагмент B. Например, блокирующий фрагмент В может быть представлен как B-Хаа0. Согласно некоторым вариантам реализации B нейтрализует или уменьшает положительный заряд, который может в противном случае присутствовать на N-конце при физиологических значениях рН. Согласно некоторым вариантам реализации В содержит или состоит из, например, ацильной группы, которая, например, содержит от 1 до 12 атомов углерода, например, от 1 до 6 атомов углерода. Согласно определенным вариантам реализации блокирующий фрагмент B выбирают из группы, состоящей из: формила, ацетила, пропионила, бутирила, изобутирила, валерила, изовалерила и т.п. Согласно некоторым вариантам реализации блокирующий фрагмент В, содержащий аминокислоту, например, нестандартную аминокислоту, может также содержать фрагмент B. Например, блокирующий фрагмент В может быть представлен как XaaN-B, где N обозначает соответствующий номер аминокислоты (который зависит от системы нумерации, используемой для остальной части пептида). Согласно некоторым вариантам реализации B нейтрализует или уменьшает отрицательный заряд, который может в противном случае присутствовать на С-конце при физиологических значениях рН. Согласно некоторым вариантам реализации B содержит или состоит из первичного или вторичного амина (например, NH). Следует понимать, что блокирующая активность фрагмента B-Хаа0 и/или XaaN-B может быть обеспечена любым из или обоими компонентами указанного фрагмента согласно различным вариантам реализации. Согласно некоторым вариантам реализации блокирующий фрагмент или его часть, например, остаток аминокислоты, может вносить вклад в увеличение аффинности указанного соединения в отношении С3 или C3b и/или повышать активность указанного соединения. Согласно некоторым вариантам реализации вклад в аффинность или активность остатка аминокислоты может быть по меньшей мере таким же значимым, как и вклад в блокирующую активность. Например, согласно некоторым вариантам реализации Хаа0 и/или XaaN в B-Хаа0 и/или XaaN-B могут функционировать, главным образом повышая аффинность или активность указанного соединения, тогда как B и/или B могут ингибировать расщепление и/или нейтрализовать заряд пептида. Согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина содержит последовательность аминокислот, соответствующую любой из SEQ ID NO: 5-36, при этом указанная последовательность из SEQ ID NO: 5-36 дополнительно удлинена на N- и/или С-конце. Согласно некоторым вариантам реализации указанная последовательность может быть представлена как B-Хаа0-ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ-XaaN-B, где «ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ» представлена любой из SEQ ID NO: 5-36, при этом B и B могут независимым образом присутствовать или отсутствовать. Например, согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина содержит B-Хаа0-X'aa1-Х'аа2-Х'аа3-Х'аа4-Gln-Asp-Xaa-Gly-X''aal-Х''аа2-Х''аа3-Х''аа4-Х''аа5-XaaN-B (SEQ ID NO: 71), где X'aa1-Х'аа2-Х'аа3-Х'аа4, Xaa, X''aa1, X''aa2, Х'аа3, Х'аа4 и Х"аа5 соответствуют приведенным выше для последовательности SEQ ID NO: 5.
1a
2a
[00105] Согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина содержит B-Хаа0-Xaa1-Cys-Val-Xaa2-Gln-Asp-Xaa2*-Gly-Хаа3-His-Arg-Cys-Xaa4-XaaN-B (SEQ ID NO: 72), где Xaa1, Xaa2, Xaa2*, Хаа3 и Хаа4 соответствуют приведенным выше для последовательности SEQ ID NO: 6, или где Xaa1, Xaa2, Xaa2*, Хаа3 и Хаа4 соответствуют указанным для последовательности SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 7.
1a
2a
[00106] Согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина содержит B-Хаа0-Xaa1-Xaa2-Хаа3-Хаа4-Хаа5-Хаа6-Хаа7-Хаа8-Хаа9-Хаа10-Xaa11-Xaa12-Xaa13-XaaN-B (SEQ ID NO: 73), где Xaa1, Xaa2, Хаа3, Хаа4, Хаа5, Хаа6, Хаа7, Хаа8, Хаа9, Xaa10, Xaa11, Xaa12 и Хаа13 идентичны аминокислотам в положениях 1-13 любых их последовательностей SEQ ID NO: 9-36.
1
2
1
2
1
1a
2
2a
1
2
1
2
2
2
2
2
[00107] Согласно некоторым вариантам реализации Хаа0 и/или XaaN в любой последовательности аналога компстатина содержит аминокислоту, которая содержит ароматическое кольцо с алкильным заместителем в одном или более положениях. Согласно некоторым вариантам реализации алкильный заместитель представляет собой низший алкильный заместитель. Например, согласно некоторым вариантам реализации алкильный заместитель представляет собой метальную или этильную группу. Согласно некоторым вариантам реализации заместитель расположен в любом положении, не устраняющем ароматический характер указанного соединения. Согласно некоторым вариантам реализации заместитель расположен в любом положении, не устраняющем ароматический характер кольца, к которому присоединен указанный заместитель. Согласно некоторым вариантам реализации заместитель расположен в положении 1, 2, 3, 4 или 5. Согласно некоторым вариантам реализации Хаа0 содержит O-метильный аналог тирозина, 2-гидроксифенилаланина или 3-гидроксифенилаланина. Для целей настоящего описания «т» в нижнем регистре, за которым следует трехбуквенное обозначение аминокислоты, может применяться для конкретного указания на то, что аминокислота представляет собой N-метил-аминокислоту. Например, обозначение «mGly» используется в настоящем документе для обозначения N-метилглицина (также иногда называемого саркозином, или Sar). Согласно некоторым вариантам реализации Хаа0 представляет собой или содержит mGly, Tyr, Phe, Arg, Trp, Thr, Tyr(Me), Cha, mPhe, mVal, mIle, mAla, DTyr, DPhe, DArg, DTrp, DThr, DTyr(Me), mPhe, mVal, mIle, DAla или DCha. Например, согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина содержит пептид, имеющий последовательность B-Ile-[Cys-Val-Trp(Me)-Gln-Asp-Trp-mGly-Ala-His-Arg-Cys]-mIle-B (SEQ ID NO: 74) или B-Ile-[Cys-Val-Trp(Me)-Gln-Asp-Trp-mGly-Ala-His-Arg-Cys]-mIle-B (SEQ ID NO: 75). Два остатка Cys в активных соединениях соединены дисульфидным мостиком. Согласно некоторым вариантам реализации указанный пептид ацетилирован на N-конце и/или амидирован на С-конце. Согласно некоторым вариантам реализации В содержит B-Хаа0 и/или В содержит XaaN-B, согласно описанию выше. Например, согласно некоторым вариантам реализации В содержит или состоит из Gly, mGly, Tyr, Phe, Arg, Trp, Thr, Tyr(Me), mPhe, mVal, mIle, mAla, DTyr, DPhe, DTrp, DCha, Dala; и В содержит NH, например, карбоксиконцевой -ОН в mIle заменен на NH. Согласно некоторым вариантам реализации В содержит или состоит из mGly, Tyr, DTyr или Tyr(Ме), и В содержит NH, например, карбоксиконцевой -ОН в mile заменен на NH. Согласно некоторым вариантам реализации Ile в положении Xaa1 заменен на Gly. Эффективность ингибирования комплемента и/или показатели связывания C3b выбранных аналогов компстатина описаны в WO/2010/127336 (PCT/US 2010/033345) и/или у Qu, et al., Immunobiology (2012), doi:10.1016/j.imbio.2012.06.003.
[00108] Согласно некоторым вариантам реализации блокирующий фрагмент или его часть, например, остаток аминокислоты, может вносить вклад в увеличение аффинности соединения в отношении С3 или C3b, и/или повышать активность указанного соединения. Согласно некоторым вариантам реализации вклад в аффинность или активность аминокислоты или аналога аминокислоты может быть более значимым, чем блокирующая активность.
1
2
2
[00109] Согласно определенным вариантам реализации композиций и способов, предложенных в настоящем изобретении, указанный аналог компстатина имеет последовательность, соответствующую приведенной в таблице 1, но Ас-группа в ней заменена на вариант блокирующего фрагмента В, соответствующий описанию в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации-NH группа заменена на вариант блокирующего фрагмента В, соответствующий описанию в настоящем документе.
[00110] Согласно одному из вариантов реализации указанный аналог компстатина связывается по существу с той же областью β-цепи С3 человека, что и компстатин. Согласно одному варианту реализации указанный аналог компстатина представляет собой соединение, которое связывается с фрагментом С-концевой части β-цепи С3 человека с молекулярной массой, составляющей приблизительно 40 кДа, с которым связывается компстатин (Soulika, A.M., et al., Mol. Immunol., 35:160, 1998; Soulika, A.M., et al., Mol. Immunol. 43(12):2023-9, 2006). Согласно определенным вариантам реализации указанный аналог компстатина представляет собой соединение, которое связывается с участком связывания компстатина, определяемым структурой компстатина-С3, например, кристаллической структурой или установленной с применением ЯМР трехмерной структурой. Согласно определенным вариантам реализации указанный аналог компстатина представляет собой соединение, которое способно замещать компстатин в структуре компстатин-С3 и формирует по существу такие же межмолекулярные контакты с С3, что и компстатин. Согласно определенным вариантам реализации указанный аналог компстатина представляет собой соединение, которое связывается с участком связывания пептида с последовательностью, приведенной в таблице 1, например, SEQ ID NO: 14, 21, 28, 29, 32, 33, 34 или 36, 37, 71, 72, 73, 74 или 75, или другой последовательностью аналога компстатина, описанной в настоящем документе, в структуре пептид-С3, например, а кристаллической структуре. Согласно определенным вариантам реализации указанный аналог компстатина представляет собой соединение, которое связывается с участком связывания пептида, имеющего последовательность SEQ ID NO: 30 или 31, в структуре пептид-C3, например, в кристаллической структуре. Согласно определенным вариантам реализации указанный аналог компстатина представляет собой соединение, которое способно замещать пептид с последовательностью SEQ ID NO: 9-36, например, соединение, которое способно замещать пептид с последовательностью SEQ ID NO: 14, 21, 28, 29, 32, 33, 34 или 36, 37, 71, 72, 73, 74 или 75, или другой последовательностью аналога компстатина, описанной в настоящем документе, в структуре пептид-C3, и образующее по существу такие же межмолекулярные контакты с C3, что и указанный пептид. Согласно определенным вариантам реализации указанный аналог компстатина представляет собой соединение, которое способно замещать пептид с последовательностью SEQ ID NO: 30 или 31 в структуре пептид-C3, и образующее по существу такие же межмолекулярные контакты с C3, что и указанный пептид.
[00111] Специалист в данной области техники легко сможет определить, связывается ли аналог компстатина с фрагментом С-концевой части β-цепи C3, с применением рутинных экспериментальных методов. Например, специалист в данной области техники может синтезировать фотосшиваемый вариант указанного аналога компстатина включением фотосшивающей аминокислоты, такой как р-бензоил-L-фенилаланин (Вра) в указанное соединение, например, на С-конце указанной последовательности (Soulika, A.M., et al., выше). Необязательно могут быть включены дополнительные аминокислоты, например, эпитопная метка, такая как метка FLAG или НА-метка, для облегчения обнаружения указанного соединения, например, с применением вестерн-блоттинга. Аналог компстатина инкубируют с указанным фрагментом и инициируют сшивание. Колокализация указанного аналога компстатина и С3 фрагмента указывает на связывание. Поверхностный плазменный резонанс может также применяться для определения того, связывается ли аналог компстатина с участком связывания компстатина на С3 или его фрагменте. Специалист в данной области техники может использовать программное обеспечение для молекулярного моделирования, чтобы предсказать, образует ли соединение по существу такие же межмолекулярные контакты с C3, что и компстатин или пептид с последовательностью любого из указанных в таблице 1 пептидов, например, SEQ ID NO: 14, 21, 28, 29, 32, 33, 34 или 36, или, согласно некоторым вариантам реализации, SEQ ID NO: 30 или 31, 37, 71, 72, 73, 74 или 75, или с другой последовательностью аналога компстатина, описанной в настоящем документе.
rd
[00112] Аналоги компстатина могут быть получены с помощью различных известных в данной области техники способов искусственного синтеза пептидов, посредством конденсирования остатков аминокислот, например, в соответствии со стандартными способами пептидного синтеза, могут быть получены экспрессированием in vitro или в живых клетках подходящих кодирующих последовательностей нуклеиновых кислот с помощью известных в данной области техники способов. Например, пептиды могут быть синтезированы с применением стандартных твердофазных методик согласно описанию у Malik, выше, Katragadda, выше, WO 2004026328 и/или WO 2007062249. Может быть проведена, а затем снята защита потенциально реакционноспособных фрагментов, таких как аминогруппы и карбоксильные группы, реактивные функциональные группы и т.п., с применением различных защитных групп и методик, известных в данной области техники. См., например, «Protective Groups in Organic Synthesis» («Защитные группы в органическом синтезе»), 3 ed. Greene, Т.W. and Wuts, P.G., Eds., John Wiley & Sons, New York: 1999. Пептиды могут быть очищены с применением стандартных методов, таких как ВЭЖХ с обращенной фазой. Разделение диастереомеров пептидов, при необходимости, может быть выполнено с применением известных способов, таких как ВЭЖХ с обращенной фазой. При необходимости составы могут быть лиофилизированы и затем растворены в подходящем растворителе, например, в воде. рН полученного раствора может быть скорректирован, например, до физиологических значений рН, с применением основания, такого как NaOH. Пептидные составы при необходимости могут быть охарактеризованы с помощью масс-спектроскопии, например, для подтверждения массы и/или образования дисульфидной связи. См., например, Mallik, 2005, и Katragadda, 2006.
2
[00113] Согласно определенным вариантам реализации аналог компстатина может представлять собой или содержит клеточно-реактивный аналог компстатина. Клеточно-реактивные аналоги компстатина представляют собой соединения, которые содержат фрагмент аналога компстатина и клеточно-реактивную функциональную группу, которая способна вступать в реакцию с функциональной группой, экспонированной на поверхности клетки, например, при физиологических условиях, для образования ковалентной связи. Таким образом, клеточно-реактивный аналог компстатина становится ковалентно присоединенным к клетке. Не опираясь на конкретную теорию, считают, что присоединенный к клетке аналог компстатина защищает клетку от опосредованного комплементом повреждения за счет, например, связывания с С3 (который может находиться в форме С3(HO)) на поверхности клетки и/или поблизости от клетки и ингибирования отщепления и активации C3, и/или за счет связывания с C3b и ингибирования его депонирования на клетке или участия в каскаде активации комплемента. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения контакт выделенных клеток с клеточно-реактивным аналогом компстатина осуществляют ex vivo (за пределами тела). Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения клетки присутствуют в выделенной ткани или органе, например, в ткани или органе, которые будут трансплантированы субъекту. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения контакт клеток с клеточно-реактивным аналогом компстатина осуществляют in vivo путем введения клеточно-реактивного аналога компстатина субъекту. Клеточно-реактивный аналог компстатина становится ковалентно присоединенным к клеткам in vivo. Согласно некоторым аспектам подход согласно настоящему изобретению защищает клетки, ткани и/или органы от пагубных эффектов активации комплемента в течение по меньшей мере двух недель без необходимости в возобновлении лечения в течение данного времени.
[00114] Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложены и/или применяются аналоги компстатина, содержащие нацеливающий фрагмент, который нековалентно связывается с молекулой-мишенью, присутствующей на поверхности клеток или тканей, или с внеклеточным веществом, не присоединенным к клеткам или тканям. Такие аналоги компстатина называют в настоящей заявке «аналогами компстатина нацеленного действия». Часто молекула-мишень представляет собой белок или углевод, присоединенный к мембране клетки и экспонированный на поверхности клетки. Нацеливающий фрагмент направляет аналог компстатина к клетке, ткани или расположению, восприимчивому к активации комплементом. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения контакт выделенных клеток с аналогом компстатина нацеленного действия осуществляют ех vivo (за пределами тела). Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения клетки присутствуют в выделенной ткани или органе, например, ткани или органе, которые будут трансплантированы субъекту. Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения аналог компстатина нацеленного действия вводят субъекту, и данный аналог становится нековалентным способом присоединенным к клетке, ткани или внеклеточному веществу in vivo. Согласно некоторым аспектам подход согласно настоящему изобретению защищает клетки, ткани и/или органы от пагубных эффектов активации комплемента в течение по меньшей мере двух недель без необходимости в возобновлении лечения в течение данного времени. Согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина нацеленного действия содержит как нацеливающий фрагмент, так и клеточно-реактивный фрагмент. Нацеливающий фрагмент направляет аналог компстатина, например, к конкретному типу клеток, путем нековалентного связывания с молекулой на таких клетках. Затем клеточно-реактивный фрагмент ковалентно связывается с клеткой или внеклеточным веществом. Согласно другим вариантам реализации аналог компстатина нацеленного действия не содержит клеточно-реактивного фрагмента.
[00115] Согласно некоторым аспектам аналог компстатина может представлять собой или содержать аналог компстатина длительного действия, причем аналоги компстатина длительного действия содержат фрагмент, такой как полиэтиленгликоль (ПЭГ), который увеличивает время жизни соединения в организме (например, за счет снижения его клиренса из крови). Согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина длительного действия не содержит нацеливающего фрагмента или клеточно-реактивного фрагмента. Согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина длительного действия содержит нацеливающий фрагмент и/или клеточно-реактивный фрагмент.
[00116] Аналог компстатина, необязательно связанный с клеточно-реактивным фрагментом или нацеливающим фрагментом, может быть модифицирован добавлением такой молекулы, как полиэтиленгликоль (ПЭГ), либо сходных молекул, для стабилизации соединения, снижения его иммуногенности, увеличения времени жизни в организме, повышения или снижения растворимости и/или повышения устойчивости к разложению. Способы пегилирования общеизвестны в данной области техники (V Veronese, P.M. & Harris, Adv. Drug Deliv. Rev. 54, 453-456, 2002; Davis, F.F, Adv. Drug Deliv. Rev. 54, 457-458, 2002); Hinds, K.D. & Kirn, S.W. Adv. Drug Deliv. Rev. 54, 505-530 (2002; Roberts, M.J., Bentley, M.D. & Harris, J.M. Adv. Drug Deliv. Rev. 54, 459-476; 2002); Wang, Y.S. et al. Adv. Drug Deliv. Rev. 54, 547-570, 2002). Широкий ряд полимеров, таких как ПЭГ и модифицированные ПЭГ, в том числе дериватизированные ПЭГ, к которым можно удобным образом присоединить полипептиды, описан в каталоге Nektar (Nektar Advanced Pegylation 2005-2006 Product Catalog, Nektar Therapeutics, Сан-Карлос, Калифорния), где также приведены подробные описания подходящих процедур конъюгации. Согласно еще одному варианту реализации аналог компстатина конденсирован с Fc-доменом иммуноглобулина или его частью. Согласно некоторым другим вариантам реализации аналог компстатина конъюгирован с фрагментом альбумина или со связывающим альбумин пептидом. Соответственно, согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина модифицируют с помощью одного или более полипептидных или неполипептидных компонентов, например, указанный аналог компстатина пегилируют либо конъюгируют с другим фрагментом. Согласно некоторым вариантам реализации указанный компонент не является Fc-доменом иммуноглобулина или его частью. Аналог компстатина может быть представлен мультимером или частью супрамолекулярного комплекса, который может содержать либо один вид молекулярных соединений, либо несколько разных видов (например, несколько разных аналогов).
[00117] Согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина представляет собой многовалентное соединение, содержащее множество фрагментов аналога компстатина, ковалентно или нековалентно связанных с полимерным скелетом или скаффолдом. Указанные фрагменты аналога компстатина могут быть идентичными или разными. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения указанное многовалентное соединение содержит несколько экземпляров, или копий, одного фрагмента аналога компстатина. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения указанное многовалентное соединение содержит один или более экземпляров каждого из двух или большего количества неидентичных фрагментов аналога компстатина, например, 3, 4, 5 или более разных фрагментов аналога компстатина. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения число фрагментов аналога компстатина («n») составляет от 2 до 6. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения n составляет от 7 до 20. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения n составляет от 20 до 100. Согласно другим вариантам реализации n составляет от 100 до 1000. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения n составляет от 1000 до 10000. Согласно другим вариантам реализации n составляет от 10000 до 50000. Согласно другим вариантам реализации n составляет от 50000 до 100000. Согласно другим вариантам реализации n составляет от 100000 до 1000000.
[00118] Фрагменты аналога компстатина могут быть присоединены непосредственно к полимерному скаффолду или могут быть присоединены соединяющим фрагментом, который связывает указанный фрагмент аналога компстатина и полимерный скаффолд. Указанный соединяющий фрагмент может быть присоединен к одному фрагменту аналога компстатина и к полимерному скаффолду. В качестве альтернативы, к соединяющему фрагменту может быть присоединено несколько фрагментов аналога компстатина таким образом, что указанный соединяющий фрагмент прикрепляет к полимерному скаффолду несколько фрагментов аналога компстатина.
[00119] Согласно некоторым вариантам реализации указанный аналог компстатина содержит аминокислоту с боковой цепью, содержащую первичный или вторичный амин, например, остаток Lys. Например, остаток Lys, или последовательность, содержащую остаток Lys, добавляют на N-конце и/или С-конце указанного аналога компстатина. Согласно некоторым вариантам реализации остаток Lys отделен от циклической части указанного аналога компстатина жестким или гибким спейсером. Указанный спейсер может, например, включать замещенную или незамещенную, насыщенную или ненасыщенную алкильную цепь, цепь олиго(этиленгликоля) и/или другие фрагменты, например, согласно описанию в Разделе VI применительно к линкерам. Длина указанной цепи может составлять, например, от 2 до 20 атомов углерода. Согласно другим вариантам реализации указанный спейсер представляет собой пептид. Длина указанного пептидного спейсера может составлять, например, от 1 и 20 аминокислот, например, от 4 до 20 аминокислот. Подходящие спейсеры могут содержать или состоять, например, из нескольких остатков Gly, нескольких остатков Ser, либо и тех, и других остатков. Аминокислота с боковой цепью, содержащая первичный или вторичный амин и/или по меньшей мере одна аминокислота в спейсере необязательно представляет собой D-аминокислоту. Может использоваться любой из разнообразных полимерных скелетов или скаффолдов. Например, полимерный скелет или скаффолд может представлять собой полиамид, полисахарид, полиангидрид, полиакриламид, полиметакрилат, полипептид, полиэтиленоксид или дендример. Подходящие способы и полимерные скелеты описаны, например, в WO 98/46270 (PCT/US 98/07171) или WO 98/47002 (PCT/US 98/06963). Согласно одному из вариантов реализации указанный полимерный скелет или скаффолд содержит несколько реактивных функциональных групп, таких как карбоновые кислоты, ангидридные или сукцинимидные группы. Проводят реакцию указанного полимерного скелета или скаффолда с аналогами компстатина. Согласно одному из вариантов реализации указанный аналог компстатина содержит любую из множества различных реакционноспособных функциональных групп, такую как карбоновые кислоты, ангидридные или сукцинимидные группы, с которыми проводят реакцию подходящих групп на полимерном скелете. В качестве альтернативы, сначала проводят реакцию мономерных единиц, которые могут быть соединены друг с другом с образованием полимерного скелета или скаффолда, с аналогами компстатина, и полученные мономеры полимеризуют. Согласно другому варианту реализации короткие цепи предварительно полимеризуют, функционализируют, а затем из смеси коротких цепей разных композиций собирают более длинные полимеры.
[00120] IV. Миметики компстатина
[00121] Структура компстатина известна в данной области техники, а также известны ЯМР-структуры для ряда аналогов компстатина с более высокой активностью, чем у компстатина (Malik, выше). Структурная информация может применяться для разработки миметиков компстатина.
[00122] Согласно одному из вариантов реализации миметик компстатина представляет собой любое соединение, которое конкурирует с компстатином или любым аналогом компстатина (например, аналогом компстатина, последовательность которого приведена в таблице 1) за связывание с С3 или его фрагментом (таким как 40 кДа фрагмент β-цепи, с которым связывается компстатин). Согласно некоторым вариантам реализации указанный миметик компстатина обладает активностью, равной или превышающей активность компстатина. Согласно некоторым вариантам реализации указанный миметик компстатина более стабилен, перорально доступен или обладает лучшей биодоступностью, чем компстатин. Указанный миметик компстатина может представлять собой пептид, нуклеиновую кислоту или малую молекулу. Согласно определенным вариантам реализации указанный миметик компстатина представляет собой соединение, которое связывается с участком связывания компстатина, определяемым структурой компстатин-C3, например, кристаллической структурой или трехмерной структурой, установленной в ходе ЯМР-экспериментов. Согласно определенным вариантам реализации указанный миметик компстатина представляет собой соединение, которое способно замещать компстатин в структуре компстатин-C3, и образующее по существу такие же межмолекулярные контакты с C3, что и компстатин. Согласно определенным вариантам реализации указанный миметик компстатина представляет собой соединение, которое связывается с участком связывания пептида, имеющего последовательность, приведенную в таблице 1, например, SEQ ID NO: 14, 21, 28, 29, 32, 33, 34 или 36, или согласно некоторым вариантам реализации SEQ ID NO: 30 или 31. или с другой последовательностью аналога компстатина, в структуре пептид-С3. Согласно определенным вариантам реализации указанный миметик компстатина представляет собой соединение, которое способно замещать пептид с последовательностью, приведенной в таблице 1, например, SEQ ID NO: 14, 21, 28, 29, 32. 33, 34 или 36, или согласно некоторым вариантам реализации SEQ ID NO: 30 или 31, или другой последовательностью аналога компстатина, в структуре пептид-C3, и образующее по существу такие же межмолекулярные контакты с C3, что и указанный пептид. Согласно определенным вариантам реализации указанный миметик компстатина имеет непептидный остов, но содержит боковые цепи, расположенные соответственно последовательности, полученной на основе последовательности компстатина.
[00123] Специалисту в данной области техники будет понятно, что после того как конкретная нужная конформация короткого пептида подтверждена, для получения пептида или пептидомиметика, соответствующего указанной конформации, могут применяться общеизвестные способы. См., например, G.R. Marshall (1993), Tetrahedron, 49: 3547-3558; Hruby and Nikiforovich (1991), Molecular Conformation and Biological Interactions, P. Balaram & S. Ramasehan, eds., Indian Acad. of Sci., Bangalore, PP. 429-455), Eguchi M, Kahn M., Mini Rev Med Chem., 2(5):447-62, 2002. Особое значение для настоящего изобретения имеет то, что структура пептидных аналогов может быть дополнительно скорректирована с учетом влияния остатков аминокислот различных боковых цепей, например, на эффекты функциональных групп или пространственные ограничения, согласно имеющимся в соответствующей области техники данным относительно компстатина и его аналогов, в том числе.
[00124] Специалистам в данной области техники будет понятно, что для получения конкретной конформации остова и функциональных групп боковых цепей, необходимых для связывания с С3 и ингибирования активации комплемента, пептидный миметик может подходить так же хорошо, как и пептид. Соответственно, предполагается, что в объем настоящего изобретения входит получение и применение С3-связывающего ингибирующего комплемент соединения с использованием либо встречающихся в природе аминокислот, производных аминокислот, аналогов аминокислот, либо не являющихся аминокислотами молекул, способных соединяться с образованием остова в подходящей конформации. Непептидный аналог или аналог, содержащий пептидные и непептидные компоненты, в настоящем документе иногда называется «пептидомиметиком» или «изостерическим миметиком» для обозначения замещений или разновидностей пептида, обладающих в общем аналогичными конформационными особенностями остова и/или других функциональных групп, таким образом, достаточно сходные с приводимыми в качестве примеров пептидами для ингибирования активации комплемента. В более общем случае миметиком компстатина является любое соединение, в котором фармакофоры размещаются аналогично их положению в компстатине, даже если остов отличается.
[00125] Применение пептидомиметиков при разработке высокоаффинных аналогов пептидов общеизвестно в данной области техники. Принимая во внимание ротационные ограничения, сходные с ограничениями, свойственными остаткам аминокислот в составе пептида, можно провести анализ аналогов, содержащих неаминокислотные фрагменты, и уточнить их конформационные мотивы при помощи диаграммы Рамачандрана (Hruby & Nikiforovich 1991), наряду с другими известными методами.
[00126] Специалист в данной области техники легко сможет подобрать подходящие методы скрининга для идентификации дополнительных миметиков компстатина и отбора обладающих требуемой ингибирующей активностью. Например, компстатин или его аналог может быть помечен (например, радиоактивной или флуоресцентной меткой) и приведен в контакт с С3 в присутствии разных концентраций тестируемого соединения. Оценивают способность указанного тестируемого соединения уменьшать связывание аналога компстатина с С3. Тестируемое соединение, которое значительно уменьшает связывание указанного аналога компстатина с C3, представляет собой потенциальный миметик компстатина. Например, тестируемое соединение, которое уменьшает концентрацию в равновесном состоянии комплекса аналога компстатина с C3, или которое уменьшает скорость образования комплекса аналога компстатина с С3 по меньшей мере на 25% или по меньшей мере на 50%, представляет собой потенциальный миметик компстатина. Специалисту в данной области техники будет ясно, что может применяться несколько вариантов скрининга. Соединения для скрининга включают природные продукты, библиотеки аптамеров, фаг-дисплейные библиотеки, библиотеки соединений, синтезированных с применением комбинаторной химии, и т.п. Настоящее изобретение охватывает синтезирование комбинаторной библиотеки соединений на основе описанной выше коровой последовательности и скрининг указанной библиотеки для идентификации миметиков компстатина. Любой из указанных способов может также применяться для идентификации новых аналогов компстатина, имеющих более высокую ингибирующую активность, чем аналоги компстатина, протестированные к настоящему времени. Следует иметь в виду, что миметики компстатина могут применяться в клеточно-реактивных соединениях согласно настоящему изобретению, и в настоящем изобретении предложены такие клеточно-реактивные миметики компстатина.
[00127] V. Клеточно-реактивные аналоги компстатина или аналоги компстатина длительного действия
2
2
1
1
[00128] Как отмечено выше, согласно определенным вариантам реализации в настоящем изобретении предложены и/или применяются разнообразные клеточно-реактивные аналоги компстатина. Согласно некоторым аспектам клеточно-реактивный аналог компстатина содержит соединение с формулой A-L-M, где А представляет собой фрагмент, содержащий клеточно-реактивную функциональную группу J, L представляет собой необязательно присутствующую соединяющую часть, и М содержит фрагмент аналога компстатина. Указанный фрагмент аналога компстатина может согласно различным вариантам реализации включать любой аналог компстатина, например, любой из описанных выше аналогов компстатина. Формула A-L-M охватывает варианты реализации, в которых A-L присутствует на N-конце указанного фрагмента аналога компстатина, варианты реализации, в которых A-L присутствует на С-конце указанного фрагмента аналога компстатина, варианты реализации, в которых A-L присоединен к боковой цепи аминокислоты указанного фрагмента аналога компстатина, и варианты реализации, в которых одинаковые или разные A-L присутствуют на обоих концах М. Следует иметь в виду, что в тех случаях, когда определенный(ые) аналог(и) компстатина присутствует(ют) в качестве фрагмента аналога компстатина в соединении с формулой A-L-M, функциональная группа указанного аналога компстатина будет вступать в реакцию с функциональной группой L с образованием ковалентной связи с А или L. Например, клеточно-реактивный аналог компстатина, где фрагмент аналога компстатина включает аналог компстатина с аминокислотой с боковой цепью, содержащей первичную аминогруппу (NH) (такой аналог компстатина, который может быть представлен формулой R-(NH)), может иметь формулу R-NH-L- А, где образовалась новая ковалентная связь с L (например, N-С) и утрачен водород. Соответственно, термин «фрагмент аналога компстатина» включает молекулярные структуры, в которых по меньшей мере один атом аналога компстатина принимает участие в образовании ковалентной связи со вторым фрагментом, например, модификации боковой цепи. Сходный принцип применим к фрагментам аналога компстатина, присутствующим в описанном выше многовалентном соединении. Согласно некоторым вариантам реализации блокирующий фрагмент на N-конце или С-конце аналога компстатина, например, аналога компстатина, описанного выше в Разделе IV, заменен на A-L в структуре клеточно-реактивного аналога компстатина. Согласно некоторым вариантам реализации или L содержит блокирующий фрагмент. Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина имеет молярную активность, составляющую по меньшей мере приблизительно 10%, 20% или 30%, например, от 30% до 40%, от 30% до 50%, от 30% до 60%, от 30% до 70%, от 30% до 80%, от 30% до 90% или более от активности соответствующего аналога компстатина, имеющего такую же последовательность аминокислот (и, в надлежащих случаях, один или более блокирующих фрагментов), но не содержащего клеточно-реактивный фрагмент. Согласно некоторым вариантам реализации, отличающимся тем, что клеточно-реактивный аналог компстатина содержит несколько фрагментов аналога компстатина, молярная активность указанного клеточно-реактивного аналога компстатина составляет по меньшей мере приблизительно 10%, 20% или 30%, например, от 30% до 40%, от 30% до 50%, от 30% до 60%, от 30% до 70%, от 30% до 80%, от 30% до 90% или более от суммарной активности указанных фрагментов аналога компстатина.
[00129] Клеточно-реактивный фрагмент А согласно различным вариантам реализации может включать любую из разнообразных клеточно-реактивных функциональных групп J. В целом, клеточно-реактивная функциональная группа может быть выбрана по меньшей мере частично на основании таких факторов, как (а) конкретная функциональная группа, на которую необходимо нацеленно воздействовать; (b) способность указанной реактивной функциональной группы вступать в реакцию с целевой функциональной группой в физиологически приемлемых условиях ex vivo (например, при физиологически приемлемых значениях рН и осмолярности) и/или условиях in vivo (например, в крови); (с) специфичность реакции между указанной реактивной функциональной группой и целевой функциональной группой в физиологически приемлемых условиях ех vivo и/или in vivo; (d) стабильность (например, в условиях in vivo) ковалентной связи, образующейся при реакции указанной реактивной функциональной группы с целевой функциональной группой; (е) простота синтеза клеточно-реактивного аналога компстатина, содержащего указанную реактивную функциональную группу, и т.п. Согласно некоторым вариантам реализации выбирают реактивную функциональную группу, которая вступает в реакцию с целевой химической группой без высвобождения замещаемой группы. Согласно некоторым вариантам реализации выбирают реактивную функциональную группу, которая приводит к высвобождению замещаемой группы при реакции с мишенью. Соединения, содержащие такие группы, могут подходить, например, для мониторинга прогресса и/или степени реакции. Согласно некоторым вариантам реализации замещаемая группа является физиологически приемлемой для клеток, тканей или органов в синтезируемом количестве (например, в отношении концентрации и/или синтезируемого абсолютного количества) и/или медицински приемлемой для субъекта в синтезируемом in vivo количестве (например, в отношении концентрации в соответствующей физиологической жидкости, такой как кровь, и/или в отношении абсолютного синтезируемого количества). Согласно некоторым вариантам реализации синтезированную ех vivo замещаемую группу по меньшей мере частично удаляют, например, промыванием клеток, либо промыванием или перфузированием ткани или органа, например, солевым раствором.
[00130] Согласно многим вариантам реализации клеточно-реактивная функциональная группа, подходящая для настоящего изобретения, вступает в реакцию с боковой цепью остатка аминокислоты и/или с N-концевой аминогруппой или С-концевой карбоксильной группой белка. Согласно некоторым вариантам реализации указанная клеточно-реактивная функциональная группа реакционноспособна в отношении сульфгидрильных (-SH) групп, которые присутствуют в боковых цепях остатков цистеина. Согласно некоторым вариантам реализации применяют малеимидную группу. Малеимидные группы вступают в реакцию с сульфгидрильными группами остатков цистеина в белках при физиологических рН и образуют стабильную тиоэфирную связь. Согласно некоторым вариантам реализации применяют галогенацетильную группу, такую как йодоацетильная или бромацетильная группа. Галогенацетилы вступают в реакцию с сульфгидрильными группами при физиологических рН. Реакция йодоацетильной группы протекает с нуклеофильным замещением йода атомом серы из сульфгидрильной группы с образованием в результате стабильной тиоэфирной связи. Согласно другим вариантам реализации используют йодацетамидную группу.
2
Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивная функциональная группа вступает в реакцию с аминогруппами (-NH), которые присутствуют на N-концах белков и в боковых цепях остатков лизина (ε-аминогруппа). Согласно некоторым вариантам реализации применяют активированный сложный эфир, например, сукцинимидиловый сложный эфир (т.е. сложный NHS-эфир). Например, при синтезе может применяться н-гидроксисукцинимид (NHS) или его водорастворимый аналог (сульфо-NHS), таким образом, полученный клеточно-реактивный аналог компстатина содержит сложный NHS-эфир. Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивная функциональная группа вступает в реакцию с карбоксильными (-СООН) группами, которые присутствуют на С-концах белков и в боковых цепях различных аминокислотных остатков. Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина реакционноспособен в отношении гидроксильных (-ОН) групп, которые присутствуют в боковых цепях различных аминокислот и в углеводных фрагментах гликозилированных белков.
[00131] В целом, соединяющая часть L может включать любой один или более алифатических и/или ароматических фрагментов, допускающих образование стабильного соединения, объединяющего связанные фрагменты. Термин «стабильный» в настоящем документе предпочтительно относится к соединениям, обладающим достаточной стабильностью, чтобы позволять получение и сохранение целостности указанного соединения на протяжении достаточного периода времени, например, подходящего для одной или более из описанных в настоящем документе целей. Согласно некоторым вариантам реализации L содержит насыщенную или ненасыщенную замещенную или незамещенную разветвленную или неразветвленную алифатическую цепь длиной от 1 до 30, от 1 до 20, от 1 до 10, от 1 до 6, или 5 или менее атомов углерода, где под длиной имеется в виду число атомов С в главной (наиболее длинной) цепи. Согласно некоторым вариантам реализации указанная алифатическая цепь содержит один или более гетероатомов (О, N, S), который может быть выбран независимо. Согласно некоторым вариантам реализации по меньшей мере 50% атомов главной цепи L являются атомами углерода. Согласно некоторым вариантам реализации L содержит фрагмент насыщенного алкила (СН2)п, где n составляет от 1 до 30.
2
2
n
[00132] Согласно некоторым вариантам реализации L содержит один или более гетероатомов и имеет длину в общей сложности от 1 до 1000, от 1 до 800, от 1 до 600, от 1 до 400, от 1 до 300, от 1 до 200, от 1 до 100, от 1 до 50, от 1 до 30 или от 1 до 10 атомов углерода в цепи. Согласно некоторым вариантам реализации L содержит фрагмент олиго(этиленгликоля) (-(O-СН-СН-)), где значение n составляет от 1 до 500, от 1 до 400, от 1 до 300, от 1 до 200, от 1 до 100, от 10 до 200, от 200 до 300, от 100 до 200, от 40 до 500, от 30 до 500, от 20 до 500, от 10 до 500, от 1 до 40, от 1 до 30, от 1 до 20 или от 1 до 10.
2
[00133] Согласно некоторым вариантам реализации L содержит ненасыщенный фрагмент, такой как -СН=СН- или -СН-СН=СН-; фрагмент, содержащий неароматическую циклическую кольцевую систему (например, циклогексильный фрагмент), ароматический фрагмент (например, ароматическую циклическую кольцевую систему, такую как фенильный фрагмент); фрагмент простого эфира (-С-O-С-); амидный фрагмент (-C(=O)-N-); фрагмент сложного эфира (-СО-O-); карбонильный фрагмент (-С(=O)-); фрагмент имина (-C=N-); фрагмент тиоэфира (-С-S-C-); аминокислотный остаток; и/или любой фрагмент, который может быть образован в ходе реакции двух совместимых реактивных функциональных групп. Согласно определенным вариантам реализации в одном или нескольких фрагментах соединяющей части либо в клеточно-реактивном фрагменте один или более атомов водорода (или других атомов) независимо замещены одним или большим количеством фрагментов, например, но не ограничиваясь перечисленными, алифатическими; ароматическими, арилом; алкилом, аралкилом, алканоилом, ароилом, алкокси; тио; F; Cl; Br; I; -NO2; -CN; -CF3; -CH2CF3; -СНС12; -CH2OH; -CH2CH2OH; -CH2NH2; -CH2SO2CH3; - или -GRG1 где G представляет собой -O-, -S-, -NRG2-, -С(=O)-, -S(=O)-, -SO2-, -С(=O)O-, -C(=O)NRG2-, -OC(=O)-, -NRG2C(=O)-, -ОС(=O)O-, -OC(=O)NRG2-, -NRG2C(=O)O-, -NRG2C(=O)NRG2-, -C(=S)-, -C(=S)S-, -SC(=S)-, -SC(=S)S-, -C(=NRG2)-, -C(=NRG2)O-, -C(=NRG2)NRG3-, -OC(=NRG2)-, -NRG2C(=NRG3)-, -NRG2SO2-, -NRG2SO2NRG3-, или -SO2NRG2-, где каждый из RG1, RG2 и RG3 независимо включает, не ограничиваясь перечисленными, водород, галоген или необязательно замещенный алифатический, ароматический или арильный фрагмент. Следует иметь в виду, что циклические кольцевые системы, в случае присутствия в качестве заместителей, могут необязательно быть присоединены линейным фрагментом. Предпочтительно применяют такие комбинации заместителей и переменных параметров, предусмотренных настоящим изобретением, которые обеспечивают образование стабильных соединений, подходящих для любого одного или нескольких из описанных в настоящем документе способов, например, подходящих для лечения одного или нескольких нарушений и/или для осуществления контакта с клеткой, тканью или органом согласно описанию в настоящем документе, и/или подходящих в качестве промежуточных соединений при получении одного или более из таких соединений.
Pj
Pj
2
n
2
2
n
2
m
2
2
n
2
p
2
m
2
р
2
2
n
2
2
[00134] L согласно различным вариантам реализации может включать любой один или более фрагментов из описанных в предыдущем параграфе. Согласно некоторым вариантам реализации L содержит два или большее количество разных фрагментов, связанных друг с другом с образованием структуры, как правило, длиной от 1 до приблизительно 60 атомов, от 1 до приблизительно 50 атомов, например, от 1 до 40, от 1 до 30, от 1 до 20, от 1 до 10 или от 1 до 6 атомов, где под длиной подразумевается число атомов в главной (наиболее длинной) цепи. Согласно некоторым вариантам реализации L содержит два или большее количество разных фрагментов, связанных друг с другом с образованием структуры, как правило, содержащей от 1 до приблизительно 40, например, от 1 до 30, например, от 1 до 20, от 1 до 10 или от 1 до 6 атомов углерода в главной (наиболее длинной) цепи. В целом, структура такого клеточно-реактивного аналога компстатина может быть представлена формулой А-(L)j-M, где значение j составляет, как правило, от 1 до 10, и каждый L независимо выбран из фрагментов, описанных в предыдущем параграфе. Согласно многим вариантам реализации L содержит одну или более углеродсодержащих цепей, таких как -(СН)- и/или -(O-СН-СН-), которая(ые) соединена(ы) ковалентно друг с другом и/или с клеточно-реактивной функциональной группой или аналогом компстатина, например, фрагментами (например, амидными фрагментами, фрагментами сложных эфиров или простых эфиров), образующимися при реакции двух совместимых реактивных функциональных групп. Согласно некоторым вариантам реализации L содержит фрагмент олиго(этиленгликоля) и/или насыщенную алкильную цепь. Согласно некоторым вариантам реализации L содержит -(CH)-C(=O)-NH-(CHCHO)(CH)C(=O)- или -(CH)-C(=O)-NH-(СН)(ОСНСН)C(=O)-. Согласно некоторым вариантам реализации m, n и р подобраны таким образом, что число атомов углерода в указанной цепи составляет от 1 до 500, например, от 2 до 400, от 2 до 300, от 2 до 200, от 2 до 100, от 2 до 50, от 4 до 40, от 6 до 30 или от 8 до 20. Согласно некоторым вариантам реализации значение m составляет от 2 до 10, значение n составляет от 1 до 500 и/или значение р составляет от 2 до 10. Согласно некоторым вариантам реализации значение m составляет от 2 до 10, значение n составляет от 1 до 400 и/или значение р составляет от 2 до 10. Согласно некоторым вариантам реализации значение m составляет от 2 до 10, значение n составляет от 1 до 300 и/или значение р составляет от 2 до 10. Согласно некоторым вариантам реализации значение m составляет от 2 до 10, значение n составляет от 1 до 200 и/или значение р составляет от 2 до 10. Согласно некоторым вариантам реализации значение m составляет от 2 до 10, значение n составляет от 1 до 100 и/или значение р составляет от 2 до 10. Согласно некоторым вариантам реализации значение m составляет от 2 до 10, значение n составляет от 1 до 50 и/или значение р составляет от 2 до 10. Согласно некоторым вариантам реализации значение m составляет от 2 до 10, значение n составляет от 1 до 25 и/или значение р составляет от 2 до 10. Согласно некоторым вариантам реализации значение m составляет от 2 до 10, значение n составляет от 1 до 8 и/или значение р составляет от 2 до 10. Необязательно по меньшей мере один -СН- заменен на CH-R, где R может представлять собой любой заместитель. Необязательно по меньшей мере один -СН-заменен на гетероатом, циклическую кольцевую систему, фрагмент амида, сложного эфира или простого эфира. Согласно некоторым вариантам реализации L не включает алкильную группу, содержащую более чем 3 атома углерода в наиболее длинной цепи. Согласно некоторым вариантам реализации L не включает алкильную группу, содержащую более чем 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 11 атомов углерода в наиболее длинной цепи.
1
P1
2
P2
3
P3
P
1
2
3
P
[00135] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения А содержит клеточно-реактивную функциональную группу J и линкер L, содержащий соединяющую часть L и реактивную функциональную группу, которая вступает в реакцию с аналогом компстатина с образованием А-М. Согласно некоторым вариантам реализации применяют бифункциональный линкер L, содержащий две реактивные функциональные группы и соединяющую часть L. Реактивные функциональные группы из L вступают в реакцию с подходящими реактивными функциональными группами из А и М с образованием клеточно-реактивного аналога компстатина A-L-M. Согласно некоторым вариантам реализации указанный аналог компстатина содержит линкер L, содержащий соединяющую часть L. Например, согласно приведенному ниже описанию, линкер, содержащий реактивную функциональную группу, может присутствовать на N- или С-конце, либо фрагмент, содержащий реактивную функциональную группу, может быть присоединен к N- или С-концу линкером. Соответственно, L может содержать несколько соединяющих частей L, привнесенных, например, А, линкером(ами), применяемым(и) для объединения А и М, и/или аналогом компстатина. Следует понимать, что в случае присутствия в структуре A-L-M определенная(ые) реактивная(ые) функциональная(ые) групп(ы), присутствующая(ие) до реакции в L, L, L и т.п., пройдет(ут) через реакцию, так что только часть(и) указанной(ых) реактивной(ых) функциональной(ых) групп(ы) будет(ут) присутствовать в конечной структуре A-L-М, и указанное соединение будет содержать фрагменты, образованные в ходе реакции указанных функциональных групп. В общем случае, если соединение содержит две или большее количество соединяющих частей, указанные соединяющие части могут быть одинаковыми либо разными, и могут быть независимо выбраны согласно различным вариантам реализации. Несколько соединяющих частей L могут быть соединены друг с другом с образованием большей соединяющей части L, и по меньшей мере к некоторым из таких соединяющих частей может быть присоединен один или более аналогов компстатина и/или одна или более клеточно-реактивных функциональных групп. В молекулах, содержащих несколько аналогов компстатина, указанные аналоги компстатина могут быть одинаковыми либо разными, и в том случае, если они разные, могут быть независимо выбраны. То же относится и к соединяющим частям, и к реактивным функциональным группам. Настоящее изобретение охватывает применение многовалентных аналогов компстатина, содержащих одну или более клеточно-реактивных функциональных групп, и применение конкатемеров аналогов компстатина, содержащих одну или более клеточно-реактивных функциональных групп. Согласно некоторым вариантам реализации по меньшей мере одна связь представляет собой стабильную нековалентную связь, такую как биотин/(стрепт)авидиновая связь, или другую нековалентную связь приблизительно эквивалентной силы.
2
2
n
2
[00136] Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина содержит аналог компстатина, в котором любая из последовательностей SEQ ID NO: 3-36, 71, 72, 73, 74 или 75, удлинена за счет одной или более аминокислот на N-конце, С-конца, или на обоих концах, причем по меньшей мере одна из указанных аминокислот имеет боковую цепь, содержащую реактивную функциональную группу, такую как первичный или вторичный амин, сульфгидрильная группа, карбоксильная группа (которая может присутствовать в виде карбоксилатной группы), гуанидиногруппа, фенольная группа, индольное кольцо, тиоэфир или имидазольное кольцо. Согласно некоторым вариантам реализации указанная(ые) аминокислота(ы) представляет(ют) собой L-аминокислоту(ы). Согласно некоторым вариантам реализации любая одна или более из указанных аминокислот представляет собой D-аминокислоту. Если добавлено несколько аминокислот, указанные аминокислоты могут быть независимо выбраны. Согласно некоторым вариантам реализации указанную реактивную функциональную группу (например, первичный или вторичный амин) используют в качестве мишени для добавления фрагмента, содержащего клеточно-реактивную функциональную группу. Аминокислоты с боковой цепью, содержащей первичный или вторичный амин, включают лизин (Lys) и диаминокарбоновые кислоты с общей структурой NH(CH)CH(NH)COOH, такие как 2,3-диаминопропионовая кислота (ДАПК), 2,4-диаминомасляная кислота (ДАМК) и орнитин (orn), где n=1 (ДАПК), 2 (ДАМК) и 3 (orn), соответственно. Согласно некоторым вариантам реализации по меньшей мере одна аминокислота представляет собой цистеин, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, аргинин, тирозин, триптофан, метионин или гистидин. Цистеин содержит боковую цепь, содержащую сульфгидрильную группу. Аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота содержат боковую цепь, содержащую карбоксильную группу (способную к ионизации до карбоксилатной группы). Аргинин содержит боковую цепь, содержащую гуанидиногруппу. Тирозин содержит боковую цепь, содержащую фенольную группу (способную к ионизации до фенолатной группы). Триптофан содержит боковую цепь, содержащую индольное кольцо. Метионин содержит боковую цепь, содержащую тиоэфирную группу. Гистидин содержит боковую цепь, содержащую имидазольное кольцо. Доступен широкий ряд нестандартных аминокислот, содержащих боковые цепи, включающие одну или более таких реактивных функциональных групп, в том числе встречающиеся в природе аминокислоты и аминокислоты, отсутствующие в природе. См., например, Hughes, В. (ed.). Ammo Acids, Peptides and Proteins in Organic Chemistry, Volumes 1-4, Wiley-VCH (2009-2011); Blaskovich, M., Handbook on Syntheses of Amino Acids General Routes to Amino Acids, Oxford University Press, 2010. Настоящее изобретение охватывает варианты реализации, в которых одну или более нестандартных аминокислот применяют для добавления к основе фрагмента, содержащего клеточно-реактивную функциональную группу. Любая одна или более из указанных аминокислот может быть защищена подходящим образом во время синтеза указанного соединения. Так, одна или более аминокислот могут быть защищены во время реакции(й), вовлекающей(их) боковую цепь целевой аминокислоты (мишени). Согласно некоторым вариантам реализации, которые отличаются тем, что в качестве основы для добавления фрагмента, содержащего клеточно-реактивную функциональную группу, применяют содержащую сульфгидрил аминокислоту, указанный сульфгидрил защищают во время циклизации указанного соединения за счет образования внутримолекулярной дисульфидной связи между другими аминокислотами, например, цистеинами.
1
1
1
2
2
2
2
1
1
P3
P3
P3
P3
P3
P3
P3
P3
P3
P3
P3
[00137] В содержащемся в данном параграфе описании аминокислота с боковой цепью, содержащей аминогруппу, приводится в качестве примера. Настоящее изобретение охватывает аналогичные варианты реализации, когда применяется аминокислота с боковой цепью, содержащей другие реактивные функциональные группы. Согласно некоторым вариантам реализации аминокислоту с боковой цепью, содержащей первичный или вторичный амин, присоединяют непосредственно к N-концу или С-концу любой из SEQ ID NO: 3-36, 37, 71, 72, 73, 74 или 75, или пептидной связью. Согласно некоторым вариантам реализации аминокислоту с боковой цепью, содержащей первичный или вторичный амин, присоединяют к N- или С-концу любой из SEQ ID NO: 3-36, 37, 71, 72, 73, 74 или 75, или соединяющей (линкерной) частью, которая может содержать любой один или более соединяющих фрагментов из описанных выше. Согласно некоторым вариантам реализации по меньшей мере две аминокислоты добавляют на одном либо на обоих концах. Указанные две или большее количество добавленных аминокислот могут быть соединены друг с другом пептидными связями, или по меньшей мере некоторые из указанных добавленных аминокислот могут быть соединены друг с другом соединяющей частью, которая может содержать любой один или более соединяющих фрагментов из описанных в настоящем документе. Соответственно, согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина содержит фрагмент аналога компстатина М с формулой B1-R1- M -R2-B2, где M представляет любую из последовательностей SEQ ID NO: 3-36, 37, 71, 72, 73, 74 или 75, либо R1 или R2 может отсутствовать; по меньшей мере один R1 и R2 содержит аминокислоту с боковой цепью, содержащей первичный или вторичный амин; и В1 и В2 представляют собой необязательно присутствующие блокирующие фрагменты. R1 и/или R2 может/могут быть присоединен(ы) к M пептидной связью или непептидной связью. R1 и/или R2 может/могут содержать соединяющую часть L. Например, R1 может иметь формулу М-L и/или R2 может иметь формулу L-M, где L представляет собой соединяющую часть, и М содержит по меньшей мере одну аминокислоту с боковой цепью, содержащей первичный или вторичный амин. Например, М может представлять собой Lys или аминокислотную цепь, содержащую Lys. Согласно некоторым вариантам реализации L содержит одну или более аминокислот или состоит из одной или более аминокислот. Например, длина L может составлять от 1 до приблизительно 20 аминокислот, например, от 4 до 20 аминокислот. Согласно некоторым вариантам реализации L содержит несколько остатков Gly, Ser и/или Ala, либо состоит из нескольких остатков Gly, Ser и/или Ala. Согласно некоторым вариантам реализации L не включает аминокислоты, содержащие реакционноспособную SH-группу, такие как Cys. Согласно некоторым вариантам реализации L содержит фрагмент олиго(этиленгликоля) и/или насыщенную алкильную цепь. Согласно некоторым вариантам реализации L присоединен к N-концевой аминокислоте M амидной связью. Согласно некоторым вариантам реализации L присоединен к С-концевой аминокислоте M амидной связью. Указанное соединение может быть затем удлинено на любом либо на обоих концах добавлением следующей(их) соединяющей(их) части(ей) и/или аминокислот(ы). Указанные аминокислоты могут быть одинаковыми либо разными; в том случае, если аминокислоты разные, они могут быть выбраны независимо. Согласно некоторым вариантам реализации применяют две или большее количество аминокислот с боковыми цепями, содержащими реактивные функциональные группы, отличающиеся тем, что указанные реактивные функциональные группы могут быть одинаковыми либо разными. Указанные две или большее количество реактивных функциональных групп могут применяться в качестве основы для добавления двух или большего количества фрагментов. Согласно некоторым вариантам реализации добавляют два или большее количество клеточно-реактивных фрагментов. Согласно некоторым вариантам реализации добавляют клеточно-реактивный фрагмент и нацеливающий фрагмент. Согласно некоторым вариантам реализации после включения указанной аминокислоты в пептидную цепь к боковой цепи аминокислоты присоединяют линкер и/или клеточно-реактивный фрагмент. Согласно некоторым вариантам реализации линкер и/или клеточно-реактивный фрагмент уже присоединен к боковой цепи аминокислоты до применения указанной аминокислоты при синтезе клеточно-реактивного аналога компстатина. Например, может применяться производное Lys, содержащее присоединенный к его боковой цепи линкер. Указанный линкер может содержать клеточно-реактивную функциональную группу или может позже быть модифицирован таким образом, чтобы содержать клеточно-реактивную функциональную группу.
n
n
2
[00138] Более подробное описание определенных клеточно-реактивных аналогов компстатина приводится ниже. В приведенном ниже описании пептид с последовательностью аминокислот Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr (SEQ ID NO: 37) (соответствующий аналогу компстатина с последовательностью SEQ ID NO: 28, где звездочками в SEQ ID NO: 37 обозначены цистеины в активном соединении, соединенные дисульфидной связью, и (1Me)Trp означает 1-метил-триптофан)), применяют в качестве типового фрагмента аналога компстатина; малеимид (сокращенно Mal) применяют в качестве примера клеточно-реактивной функциональной группы; (СН2) и (O-СН2-СН2) применяют в качестве примеров соединяющих частей; лизин применяют в качестве примера аминокислоты, содержащей реактивную функциональную группу (в некоторых соединениях), и ацетилирование и амидирование N- и С-концов, соответственно, применяют в качестве необязательно присутствующих типовых блокирующих фрагментов в некоторых соединениях и выделяют курсивом, т.е. Ас и NN, соответственно. Следует иметь в виду, что указанные соединения могут быть получены с применением разнообразных методов синтеза и с использованием разнообразных предшественников. Обсуждение различных методов синтеза и предшественников ниже не подразумевает ограничения настоящего изобретения. В общем случае, любое свойство любого из описанных ниже или в настоящем документе соединений может быть без ограничений скомбинировано со свойством(ами) других описанных ниже или в настоящем документе соединений, и настоящее изобретение охватывает такие варианты реализации.
2
5
[00139] Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный фрагмент обеспечивается клеточно-реактивным соединением, содержащим малеимидную группу (в качестве клеточно-реактивной функциональной группы) и алкановую кислоту (RCOOH), где R представляет собой алкильную группу. Например, может применяться 6-малеимидокапроновая кислота (Mal-(СН)-СООН), изображенная ниже.
[00140] Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный фрагмент обеспечивается производным алкановой кислоты, которое содержит активированный фрагмент карбоновой кислоты, например, фрагмент ОН, которой был преобразован в лучшую замещаемую группу. Например, может быть проведена реакция карбоксильной группы соединения I с ЭДК, с последующей реакцией с NHS (который может необязательно быть представлен водорастворимым сульфо-NHS), с получением сложноэфирного производного N-гидроксисукцинимида 6-малеимидокапроновой кислоты, т.е. сложного эфира N-гидроксисукцинимида (NHS) 6-малеимидогексановой кислоты (изображенного ниже).
[00141] Соединение с последовательностью SEQ ID NO: 37 может быть модифицировано на N- и/или С-конце для получения клеточно-реактивного аналога компстатина. Например, соединение II может применяться для синтеза следующего клеточно-реактивного аналога компстатина посредством реакции с N-концевой аминогруппой Не.
2
5
2
[00142] Малеимид-(СН)-С(=O)-Ile-Cys*-Val-(1Ме)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-NH (SEQ ID NO: 38). Следует иметь в виду, что в последовательности SEQ ID NO: 38 фрагмент -С(=O) присоединен к непосредственно С-концевой аминокислоте (Ile) связью C-N, где N является частью указанной аминокислоты и не показан.
[00143] Согласно другим вариантам реализации малеимидная группа соединена с Thr на С-конце с получением следующего клеточно-реактивного аналога компстатина:
2
5
[00144] Ac-Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-(C=O)-(СН)-малеимид (SEQ ID NO: 39).
2
2
n
2
m
[00145] Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина может быть синтезирован с применением бифункционального линкера (например, гетеробифункционального линкера). Типовой гетеробифункциональный линкер, содержащий фрагменты (СН-СН-O) и (СН) (где m=2), приведен ниже:
[00146] Соединение III содержит малеимидную группу в качестве клеточно-реактивной функциональной группы и фрагмент сложного NHS-эфира, который легко вступает в реакцию с аминогруппой (например, N-концевой аминогруппой или аминогруппой боковой цепи аминокислоты).
[00147] Вариант реализации соединения III, где n=2, может применяться для синтеза следующего клеточно-реактивного аналога компстатина с применением аналога компстатина с последовательностью SEQ ID NO: 37:
2
2
2
2
2
2
2
2
2
[00148] Малеимид-(СН)-С(=O)-NH-CHCHOCHCHOCHCHC(=O)-Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-NH (SEQ ID NO: 40)
2
2
n
[00149] Следует иметь в виду, что в соединении с последовательностью SEQ ID NO: 40 фрагмент -С(=O) присоединен к N-концевой аминокислоте (остаток Не) связью C-N, где N является частью указанной аминокислоты и не показан. Согласно некоторым вариантам реализации линкер имеет формулу Соединения III, где n≥1. Примеры значений n для фрагмента (СН-СН-O) приведены в настоящем документе.
[00150] Согласно некоторым вариантам реализации алкильная цепь, соединяющая фрагмент малеимида с остальной частью молекулы, содержит большее или меньшее число метиленовых единиц, фрагмент олиго(этиленгликоля) содержит большее или меньшее число единиц этиленгликоля и/или указанный фрагмент олиго(этиленгликоля) фланкирован большим или меньшим количеством метиленовых единиц с любой или с обеих сторон, по сравнению с соединением с последовательностью SEQ ID NO: 39 или SEQ ID NO: 40. Примеры клеточно-реактивных аналогов компстатина, иллюстрирующие некоторые из таких вариантов, приведены ниже (SEQ ID NO: 41-46);
2
2
2
2
2
2
2
[00151] Малеимид-(СН)-С(=O)-NH-CHCHOCHCHC(=O)-Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-NH (SEQ ID NO: 41)
2
3
2
2
2
2
2
2
[00152] Малеимид-(СН)-С(=O)-NH-CHCHOCHCHOCHC(=O)-Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-NH (SEQ ID NO: 42)
2
5
2
2
2
2
2
2
[00153] Малеимид-(СН)-С(=O)-NH-CHCHOCHCHOCHC(=O)-Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-NH (SEQ ID NO: 43)
2
4
2
2
2
2
2
2
2
[00154] Малеимид-(CH)-C(=O)-NH-CHCHOCHCHOCHCHC(=O)-Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-NH (SEQ ID NO: 44)
2
2
2
2
2
2
2
2
2
[00155] Малеимид-(СН)-С(=O)-NH-CHCHOCHCHOCHCHC(=O)-Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-NH (SEQ ID NO: 45)
2
5
2
2
2
2
2
2
[00156] Малеимид-(СН)-С(=O)-NH-CHCHOCHCHOCHC(=O)-Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-NH (SEQ ID NO: 46)
[00157] Согласно некоторым вариантам реализации SEQ ID NO: 37 удлинен включением остатка Lys на N- или С-конце указанного пептида, например, согласно приведенному ниже примеру для С-концевой связи:
2
[00158] Ac-Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-Lys-NH (SEQ ID NO: 47).
[00159] Согласно некоторым вариантам реализации остаток Lys присоединен к N-или С- концу последовательности SEQ ID NO: 37 пептидным линкером, например, согласно приведенному ниже примеру для С-концевой связи:
2
[00160] Ac-Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-(Gly)5-Lys-NH (SEQ ID NO: 48).
2
2
2
2
[00161] Согласно некоторым вариантам реализации к N- или С-концу аналога компстатина добавляют линкер, содержащий первичный или вторичный амин. Согласно некоторым вариантам реализации указанный линкер содержит алкильную цепь и/или фрагмент олиго(этиленгликоля). Например, может применяться NH(CHCHO)nCHC(=O)OH (например, 8-амино-3,6-диоксаоктановая кислота (АЕЕАс) или 11-амино-3,6,9-триоксаундекановая кислота) или ее сложный NHS-эфир (например, сложный NHS-эфир 8-амино-3,6-диоксаоктановой кислоты или 11-амино-3,6,9-триоксаундекановой кислоты). Согласно некоторым вариантам реализации полученное соединение представлено следующим (часть, соответствующая линкеру, выделена жирным шрифтом);
2
2
5
2
[00162] NH(CH)C(=O)-Ile-Cys-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys-Thr-NH (SEQ ID NO: 49)
2
2
2
2
2
2
[00163] NH(CHCHO)CHC(=O)-Ile-Cys-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys-Thr-NH (SEQ ID NO: 50)
[00164] Согласно некоторым вариантам реализации остаток Lys присоединен к N- или С-концу SEQ ID NO: 37 линкером, содержащим непептидную часть. Например, указанный линкер может содержать алкильную цепь, цепь олиго(этиленгликоля) и/или циклическую кольцевую систему. Согласно некоторым вариантам реализации применяют 8-АЕЕАс или ее сложный NHS-эфир, получая (в случае присоединения Lys на С-конце) следующее соединение (часть, относящаяся к 8-АЕЕАс, выделена жирным шрифтом):
2
2
2
2
2
2
[00165] Ac-Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-NH-CHCHOCHCHOCH-С(=O)-Lys-NH (SEQ ID NO: 51)
[00166] Следует иметь в виду, что в последовательностях SEQ ID NO: 49 и 50 фрагмент -С(=O) присоединен к смежному остатку Не C-N связью, где N является частью указанной аминокислоты и не показан. Сходным образом, в SEQ ID NO: 51 фрагмент -С(=O) присоединен к смежному остатку Lys C-N связью, где N является частью указанной аминокислоты и не показан. Следует также иметь в виду, что в SEQ ID NO: 51 фрагмент NH присоединен к непосредственно N-концевой аминокислоте (Thr) C-N связью, где С представляет собой атом углерода карбонила указанной аминокислоты и не показан.
[00167] Соединения с последовательностями SEQ ID NO: 47-51 могут легко быть модифицированы по первичной аминогруппе с получением клеточно-реактивного аналога компстатина. Например, может быть проведена реакция соединений с последовательностями SEQ ID NO: 47-51 (или других соединений, содержащих первичный или вторичный амин и фрагмент аналога компстатина) со сложным эфиром N-сукцинимидила 6-малеимидокапроновой кислоты с получением следующих клеточно-реактивных аналогов компстатина:
2
5
2
[00168] Ac-Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-Lys-(С(=O)-(СН)-Mal)-NH (SEQ ID NO: 52).
2
5
2
[00169] Ac-Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-(Gly)5-Lys-(C(=O)-(CH)-Mal)-NH (SEQ ID NO: 53).
2
5
2
5
2
[00170] Mal-(CH)-(C(=O)-NH(CH)C(=O)-Ile-Cys-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys-Thr-NH (SEQ ID NO: 54)
2
5
2
2
2
2
2
[00171] Mal-(CH)-(C(=O)NH(CHCHO)CHC(=O)-Ile-Cys-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys-Thr-NH (SEQ ID NO: 55)
2
2
2
2
2
2
5
2
[00172] Ac-Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-NH-CHCHOCHCHOCH-C(-O)-Lys-(C(=O)-(CH)-Mal)-NH (SEQ ID NO: 56)
2
2
2
2
2
2
[00173] Согласно другому варианту реализации клеточно-реактивный аналог компстатина представлен следующим: Ac-Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-Lys-C(=O)-CH(OCHCH)NH(C(=O)-(CH)5-Mal)-NH (SEQ ID NO: 57).
[00174] В настоящем изобретении предложены варианты последовательностей SEQ ID NO: 38-57, где -Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr- (SEQ ID NO: 76) заменен на последовательность аминокислот, содержащую последовательность аминокислот любого другого аналога компстатина, например, согласно любой из SEQ ID NO 3-27 или 29-36, 37, 71, 72, 73, 74 или 75, при условии, что блокирующий(ие) фрагмент(ы), присутствующий(ие) на N- и/или С-концах аналога компстатина, могут отсутствовать, быть заменены на линкер (который может содержать блокирующий фрагмент) или присоединены к другой N- или С-концевой аминокислоте, присутствующей в соответствующем(их) варианте(ах).
[00175] Другие бифункциональные кросс-линкеры, содержащие малеимид в качестве клеточно-реактивного фрагмента и сложный NHS-эфир в качестве амино-реакционноспособного фрагмента, подходящего для различных вариантов реализации настоящего изобретения, включают, например, сукцинимидил 4-(р-малеимидофенил)бутират (SMPB); сукцинимидил 4-(N-малеимидометил)-циклогексан-1-карбоксилат (SMCC); сложный эфир N-γ-малеимидобутирил-оксисукцинимида (GMBS). Добавление сульфоната к кольцу NHS дает водорастворимые аналоги, такие как сульфосукцинимидил(4-йодоацетил)-аминобензоат (сульфо-SIAB), сульфо-сукцинимидил 4-(N-малеимидометил)-циклогексан-1-карбоксилат (сульфо-SMCC), сульфо-сукцинимидил 4-(р-малеимидофенил)бутират (сульфо-SMPB), сульфо-N-γ-малеимидобутирил-оксисукцинимид сложный эфир (сульфо-GMBS) и т.п., которые могут позволить избежать необходимости использования органического растворителя. Согласно некоторым вариантам реализации применяют длинноцепочечный вариант любого из вышеназванных аналогов, содержащий спейсерный отрезок между фрагментом сложного NHS-эфира и остальной частью указанной молекулы. Указанный спейсер может содержать, например, алкильную цепь. Примером является сукцинимидил-4-[N-малеимидометил] циклогексан-1-карбокси-[6-амидокапроат].
[00176] Согласно некоторым вариантам реализации применяют бифункциональный линкер, содержащий сложный NHS-эфир (в качестве амино-реакционноспособного фрагмента) и йодоацетильную группу (реакционноспособную в отношении сульфгидрильных групп). Такие линкеры включают, например, н-сукцинимидил(4-йодоацетил)-аминобензоат (SIAB); сукцинимидил 6-[(йодоацетил)-амино]гексаноат (SIAX); сукцинимидил 6-[6-(((йодоацетил)амино)-гексаноил) амино]гексаноат (SIAXX); сукцинимидил 4-((йодоацетил)амино)метил)-циклогексан-1-карбоксилат (SIAC); сукцинимидил 6-((((4-(йодоацетил)амино)метил-циклогексан-1-карбонил)амино)гексаноат (SIACX);
[00177] Согласно некоторым вариантам реализации применяют бифункциональный линкер, содержащий сложный NHS-эфир (в качестве амино-реакционноспособного фрагмента) и пиридил-дисульфидную группу (в качестве клеточно-реактивного фрагмента, реакционноспособного в отношении сульфгидрильных групп). Примеры включают N-сукцинимидил 3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP); сукцинимидилоксикарбонил-α-метил-α-(2-пиридилдитио)толуол (SMPT) и варианты, содержащие сульфонат на кольце NHS и/или спейсер, содержащий алкильную цепь между фрагментом сложного NHS-эфира и остальной частью молекулы (например, сукцинимидил 6-(3-[2-пиридилдитио]-пропионамидо)гексаноат) (LC-SPDP). Могут применяться варианты таких линкеров, содержащие дополнительные или другие фрагменты. Например, для спейсера может быть использована более длинная или более короткая алкильная цепь, либо вместо алкильной цепи может быть использован фрагмент олиго(этиленгликоля).
[00178] В общем случае клеточно-реактивный аналог компстатина может быть синтезирован с применением разнообразных методов. Клеточно-реактивные соединения, содержащие клеточно-реактивную функциональную группу и линкер, часто доступны для приобретения в виде готовых составляющих. Например, 6-малеимидокапроновую кислоту и сложный эфир N-гидроксисукцинимида 6-малеимидокапроновой кислоты можно приобрести у различных поставщиков. В качестве альтернативы, такие соединения могут быть синтезированы с применением известных в данной области техники способов. См., например, Keller О, Rudinger J. Helv Chim Acta. 58(2):531-41, 1975 и Hashida S, et al., J Appl Biochem., 6(1-2):56-63, 1984. См. также Hermanson, G. выше, и ссылки в указанном источнике, для ознакомления с описаниями способов и реагентов, подходящих для синтеза конъюгатов. В целом, настоящее изобретение охватывает любой способ получения соединения, содержащего фрагмент аналога компстатина и клеточно-реактивную функциональную группу, и полученные соединения.
[00179] Согласно некоторым вариантам реализации при синтезе линейного пептида применяют аминокислоту, содержащую линкер, присоединенный к боковой цепи. Указанный линейный пептид может быть синтезирован с применением стандартных методов пептидного синтеза, известных в данной области техники, например, с помощью стандартного твердофазного синтеза пептидов. Линейный пептид затем циклизуют (например, окислением остатков Cys с образованием внутримолекулярного дисульфида). Затем может быть проведена реакция указанного циклического соединения с линкером, содержащим клеточно-реактивную функциональную группу. Согласно другим вариантам реализации проводят реакцию фрагмента, содержащего клеточно-реактивную функциональную группу, с линейным соединением, перед его циклизацией. В общем случае реактивные функциональные группы могут быть подходящим образом защищены, чтобы избежать ненужной реакции между ними во время синтеза клеточно-реактивного аналога компстатина. Клеточно-реактивная функциональная группа, любая из боковых цепей аминокислот и/или любой или оба конца указанного пептида могут быть защищены во время указанной реакции, а затем защита может быть снята. Например, SB-группы остатков Cys и/или SH-реакционноспособные фрагменты, такие как малеимиды, могут быть защищены до окончания циклизации, чтобы избежать реакции между ними. Условия реакции подбирают по меньшей мере частично с учетом необходимых для конкретной(ых) реактивной(ых) функциональной(ых) групп(ы) условий получения удовлетворительного выхода за приемлемый период времени. Температура, рН и концентрация реагентов могут быть скорректированы для обеспечения нужной степени или скорости реакции. См., например, Hermanson, выше. Требуемый продукт может быть очищен, например, с удалением непрореагировавшего соединения, содержащего клеточно-реактивную функциональную группу, непрореагировавшего аналога компстатина, линкера(ов), продуктов, отличных от требуемого клеточно-реактивного аналога компстатина, которые могли образоваться в ходе реакции, других веществ, присутствующих в реакционной смеси и т.п. Композиции и способы получения клеточно-реактивных аналогов компстатина и промежуточные материалы при их синтезе, представляют собой аспекты настоящего изобретения.
[00180] Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения вышеописанный(ые) линкер(ы) применяют при получении аналогов компстатина, содержащих такой фрагмент, как цепь полиэтиленгликоля (ПЭГ) или другой(ие) полимер(ы), например, стабилизирующий указанное соединение, увеличивающий время его жизни в организме, повышающий его растворимость, уменьшающий иммуногенность и/или повышающий его устойчивость к разрушению. Без какого-либо ограничения настоящего изобретения в настоящем документе такой фрагмент может называться «снижающим клиренс фрагментом» (СКФ), а аналог компстатина, содержащий такой фрагмент, может называться «аналогом компстатина длительного действия» (LACA). Согласно некоторым вариантам реализации среднее время полужизни в плазме аналога компстатина длительного действия составляет по меньшей мере 1 день, например, 1-3 дня, 3-7 дней, 7-14 дней, или 14-28 дней, при введении в/в в дозе 10 мкг/кг людям или не являющимся людьми приматам, или в дозе, составляющей приблизительно 1-3 мкг/кг, 3-5 мкг/кг, 5-10 мкг/кг, например, 7 мкг/кг. Согласно некоторым вариантам реализации среднее время полужизни в плазме аналога компстатина длительного действия составляет по меньшей мере 1 день, например, 1-3 дней, 3-7 дней, 7-14 дней или 14-28 дней, при введении подкожно, например, в дозе, составляющей приблизительно 1-3 мкг/кг, 3-5 мкг/кг, 5-10 мкг/кг, например, 7 мкг/кг, людям или не являющимся людьми приматам. Согласно некоторым вариантам реализации среднее время полужизни (например, конечное время полужизни) в плазме аналога компстатина длительного действия составляет приблизительно от 4-10, 5-9, 5-8, 6-9, 7-9 или 8-9 дней, например, приблизительно 4; 4,5; 5; 5,5; 6; 6,5; 7; 7,5; 8; 8,5; 9; 9,5 или 10 дней при введении внутривенно, например, в дозе, составляющей приблизительно 1-3 мкг/кг, 3-5 мкг/кг или 5-10 мкг/кг, например, 7 мкг/кг, людям или не являющимся людьми приматам. Согласно некоторым вариантам реализации среднее время полужизни (например, конечное время полужизни) в плазме аналога компстатина длительного действия составляет приблизительно от 4-10, 5-9, 5-8, 6-9, 7-9 или 8-9 дней, например, приблизительно 4; 4,5; 5; 5,5; 6; 6,5; 7; 7,5; 8; 8,5; 9; 9,5 или 10 дней, при введении подкожно, например, в дозе, составляющей приблизительно 1-3 мкг/кг, 3-5 мкг/кг, 5-10 мкг/кг, например, 7 мкг/кг, людям или не являющимся людьми приматам. Согласно определенным вариантам реализации аналог компстатина длительного действия характеризуется тем, что он интенсивно абсорбируется из участка введения на протяжении периода времени после подкожной инъекции и обеспечивает, например, через или спустя приблизительно 1-2 дня после введения, уровень в крови, сопоставимый с уровнем, которого можно добиться при введении того же количества соединения внутривенно. Согласно некоторым вариантам реализации указанный уровень в крови через или спустя приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или более дней после введения подкожной дозы находится в пределах приблизительно 5%, 10%, 15%, 20% или 25% от уровня в крови, которого можно добиться при введении того же количества соединения внутривенно. См., например, фиг. 11, демонстрирующую фармакокинетику вводимой внутривенно и подкожно дозы для типового описанного в настоящем документе соединения приблизительно через 1-2 дня после введения. Согласно некоторым вариантам реализации среднее время полужизни в плазме аналога компстатина длительного действия при введении в/в в дозе 10 мкг/кг людям или не являющимся людьми приматам увеличивается по меньшей мере в 2 раза, например, например, в 2-5, 5-10, 10-50 или 50-100, или 100-150 или 150-200 раз по сравнению с соответствующим аналогом компстатина, имеющим такую же последовательность (и, в надлежащих случаях, содержащим один или более блокирующих фрагментов) но не содержащим указанный СКФ. Следует понимать, что согласно различным вариантам реализации такое увеличение времени полужизни может наблюдаться после введения другими путями, например, подкожного введения, и/или при применении других доз, например, других описанных в настоящем документе доз, например, 20 мкг/кг.
[00181] Как уже отмечалось, согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина согласно любой из SEQ ID NO: 3-36, 37, 71, 72, 73, 74 или 75 удлинен одной или более аминокислотами на N-конце, С-конце или на обоих концах, при этом по меньшей мере одна из указанных аминокислот содержит боковую цепь, содержащую реактивную функциональную группу, такую как первичный или вторичный амин, сульфгидрильную группу, карбоксильную группу (которая может присутствовать в виде карбоксилатной группы), гуанидиногруппу, фенольную группу, индольное кольцо, тиоэфир или имидазольное кольцо, что облегчает конъюгирование с реактивной функциональной группой с присоединением СКФ к указанному аналогу компстатина. Следует понимать, что в соответствующем аналоге компстатина, не содержащем СКФ, может также отсутствовать одна или более таких аминокислот из присутствующих в аналоге компстатина длительного действия, которому он соответствует. Таким образом, подразумевается, что соответствующий аналог компстатина, содержащий любой из SEQ ID NO: 3-36, 37, 71, 72, 73, 74 или 75, и не содержащий СКФ, «имеет такую же последовательность аминокислот», что и последовательности SEQ ID NO: 3-36, 37, 71. 72, 73, 74 или 75, соответственно. Например, подразумевается, что соответствующий аналог компстатина, содержащий последовательность аминокислот согласно SEQ ID NO: 14, 21, 28, 29, 32, 33, 34 или 36 и не содержащий СКФ, «имеет такую же последовательность аминокислот», что и SEQ ID NO: 14, 21, 28, 29, 32, 33, 34 или 36, соответственно.
[00182] Согласно некоторым вариантам реализации время полужизни в плазме представляет собой конечное время полужизни после введения одной в/в дозы. Согласно некоторым вариантам реализации время полужизни в плазме представляет собой конечное время полужизни после достижения равновесного состояния после введения нескольких в/в доз. Согласно некоторым вариантам реализации после введения примату одной в/в дозы или после введения нескольких в/в доз достигается значение Cmах аналога компстатина длительного действия в плазме, превышающее значение для соответствующего аналога компстатина, не содержащего СКФ, по меньшей мере в 5 раз, например, в 5-50 раз. Согласно некоторым вариантам реализации после введения примату одной в/в дозы или после введения нескольких в/в доз достигается значение Сmах аналога компстатина длительного действия в плазме, превышающее значение для соответствующего аналога компстатина, не содержащего СКФ, в 10-20 раз.
[00183] Согласно некоторым вариантам реализации примат представляет собой человека. Согласно некоторым вариантам реализации примат представляет собой не являющегося человеком примата, например, обезьяну, такую как яванский макак или макак-резус.
[00184] Согласно некоторым вариантам реализации почечный клиренс аналога компстатина длительного действия в течение первых 24 часов после введения в/в в дозе 10 мг/кг или 20 мкг/кг людям или не являющимся людьми приматам ниже по меньшей мере в 2 раза, например, в 2-5, 5-10, 10-50 или 50-100, или в 100-150, или в 150-200 раз, чем почечный клиренс соответствующего аналога компстатина. Следует понимать, что согласно различным вариантам реализации такое снижение почечного клиренса может наблюдаться после введения другими путями, например, подкожного введения, и/или при применении других доз, например, других описанных в настоящем документе доз, например, 20 мкг/кг.
[00185] Концентрация аналога компстатина в образцах крови и/или мочи может быть измерена с применением, например, УФ, ВЭЖХ, масс-спектроскопии (МС) или антител к СКФ, или комбинации таких способов, как ЖХ/МС или ЖХ/МС/МС. Параметры фармакокинетики, такие как время полужизни и клиренс, могут быть определены с применением способов, известных специалистам в данной области техники. Фармакокинетический анализ может быть выполнен, например, с применением программного обеспечения WinNonlin v 5.2 (Pharsight Corporation, Сент-Луис, Миссури) или других подходящих программ.
[00186] Согласно определенным вариантам реализации СКФ стабилен в физиологических условиях на протяжении по меньшей мере 24 часов или более. Согласно определенным вариантам реализации СКФ стабилен в крови, плазме или сыворотке млекопитающего, например, примата, например, человека или не являющегося человеком примата (например, обезьяны) на протяжении по меньшей мере 24 часов. Согласно различным вариантам реализации по меньшей мере 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более молекул СКФ остаются интактными при инкубировании в физиологических условиях на протяжении 24 часов, 48 часов, 72 часов, 96 часов, 120 часов, 144 часов, 168 часов или более. Согласно различным вариантам реализации по меньшей мере 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более молекул СКФ остаются интактными при инкубировании в крови, плазме или сыворотке при 37 градусах С на протяжении 48 часов, 72 часов, 96 часов, 120 часов, 144 часов, 168 часов или более. Инкубирование может проводиться с применением СКФ в концентрации от 1 мкг/мл до приблизительно 100 мг/мл согласно различным вариантам реализации. Образцы могут анализироваться в различные моменты времени. Размер или интактность могут оцениваться с применением, например, хроматографии (например, ВЭЖХ), масс-спектрометрии, вестерн-блоттинга или любого другого подходящего способа. Такие характеристики стабильности могут быть приданы фрагменту, конъюгированному с СКФ. Согласно различным вариантам реализации аналог компстатина длительного действия, содержащий СКФ, может обладать любыми из вышеупомянутых характеристик стабильности. Согласно некоторым аспектам интактный в отношении аналога компстатина длительного действия означает, что указанный фрагмент аналога компстатина остается конъюгированным с СКФ, и размер СКФ остается приблизительно таким же, как и вначале инкубирования или введения.
[00187] Согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина длительного действия обладает молярной активностью, составляющей по меньшей мере приблизительно 10%, 20%, 30%, например, от 30% до 40%, от 30% до 50%, от 30% до 60%, от 30% до 70%, от 30% до 80%, от 30% до 90% или более от активности соответствующего аналога компстатина, имеющего такую же последовательность аминокислот (и, в надлежащих случаях, содержащего один или более блокирующих фрагментов), но не содержащего СКФ. В некоторых вариантах реализации, согласно которым аналог компстатина длительного действия содержит несколько фрагментов аналога компстатина, молярная активность указанного аналога компстатина длительного действия составляет по меньшей мере приблизительно 10%, 20% или 30%, например, от 30% до 40%, от 30% до 50%, от 30% до 60%, от 30% до 70%, от 30% до 80%, от 30% до 90% или более от суммарной активности указанных фрагментов аналога компстатина.
2
2
n
[00188] Согласно некоторым вариантам реализации полиэтиленгликоль (ПЭГ) содержит фрагмент (CHCHO) с молекулярной массой, составляющей по меньшей мере 500 дальтон.
2
2
n
[00189] Согласно некоторым вариантам реализации описанный выше линкер содержит фрагмент (CHCHO) со средней молекулярной массой от приблизительно 500; 1000; 1500; 2000; 5000; 10 000; 20 000; 30 000; 40 000; 50 000; 60 000; 70 000; 80 000; 90 000; до 100 ООО дальтон.
2
2
n
[00190] Согласно некоторым вариантам реализации средняя молекулярная масса ПЭГ составляет по меньшей мере 20000 Дальтон, и до приблизительно 100000; 120000; 140000; 160000; 180000; или 200000 Дальтон. «Средняя молекулярная масса» относится к среднему значению молекулярной массы. Согласно некоторым вариантам реализации полидисперсность D фрагмента (CHCHO) составляет от 1,0005 до 1,50, например, от 1,005 до 1,10; 1,15;1,20; 1,25; 1,30; 1,40 или 1,50; или принимает любое значение от 1,0005 до 1,50.
2
2
n
2
2
n
2
2
n
[00191] Согласно некоторым вариантам реализации фрагмент (CHCHO) является монодисперсным, и значение полидисперсности фрагмента (CHCHO) составляет 1,0. Такие монодисперсные фрагменты (CHCHO) известны в данной области техники, коммерчески доступны у Quanta BioDesign (Пауэлл, Огайо) и включают, в качестве неограничивающего примера, монодисперсные фрагменты, значение n для которых составляет 2, 4, 6, 8, 12, 16, 20 или 24.
2
2
n
2
2
n
2
2
n
2
2
n
2
2
n
2
2
n
2
2
n
[00192] Согласно некоторым вариантам реализации соединение содержит несколько (т.е. множество) фрагментов (CHCHO), отличающихся тем, что общая молекулярная масса указанных (CHCHO) фрагментов составляет приблизительно от 1000, 5000, 10000, 20000, 30000, 40000, 50000, 60000, 70000, 80000, 90000 до 100000 дальтон. Согласно некоторым вариантам реализации средняя общая молекулярная масса указанного соединения или фрагментов (CHCHO) составляет по меньшей мере 20000 Дальтон, и до приблизительно 100000; 120000; 140000; 160000; 180000; или 200000 Дальтон. Согласно некоторым вариантам реализации указанное соединение содержит несколько фрагментов (CHCHO) определенной длины, например, n=4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 или более. Согласно некоторым вариантам реализации указанное соединение содержит достаточное число фрагментов (CHCHO) определенной длины, чтобы общая молекулярная масса указанных фрагментов (CHCHO) составляла от приблизительно 1000, 5000, 10000, 20000, 30000, 40000, 50000, 60000, 70000, 80000, 90000 до 100000 дальтон. Согласно некоторым вариантам реализации средняя общая молекулярная масса указанного соединения или фрагментов (CHCHO) составляет по меньшей мере 20000 Дальтон и до приблизительно 100000; 120000; 140000; 160000; 180000; или 200000 Дальтон. Согласно некоторым вариантам реализации значение n составляет от приблизительно 30 до приблизительно 3000.
[00193] Согласно некоторым вариантам реализации фрагмент аналога компстатина присоединяют на каждом из концов линейного ПЭГ. Бифункциональный ПЭГ, содержащий реактивную функциональную группу на каждом конце указанной цепи, может применяться, например, согласно приведенному выше описанию. Согласно некоторым вариантам реализации указанные реактивные функциональные группы идентичны, тогда как согласно некоторым вариантам реализации на каждом конце присутствуют разные реактивные функциональные группы.
2
2
n
2
2
n
2
2
n
2
2
n
2
2
n
2
2
n
2
2
n
2
2
2
2
n
[00194] Согласно некоторым вариантам реализации несколько фрагментов (CHCHO) представлено в виде разветвленных структур. Ветви могут быть присоединены к линейному полимерному остову (например, в виде гребенчатой структуры) или могут отходить от одной или более групп центрального ядра, например, в виде звездообразной структуры. Согласно некоторым вариантам реализации разветвленная молекула содержит от 3 до 10 цепей (CHCHO). Согласно некоторым вариантам реализации разветвленная молекула содержит от 4 до 8 цепей (CHCHO). Согласно некоторым вариантам реализации разветвленная молекула содержит 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 или 3 цепи (CHCHO).Согласно некоторым вариантам реализации звездообразная молекула содержит 10-100, 10-50, 10-30 или 10-20 цепей (CHCHO), отходящих от группы центрального ядра. Согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина длительного действия, таким образом, может содержать, например, 3-10 фрагментов аналога компстатина, например, 4-8 фрагментов аналога компстатина, каждый из которых присоединен к цепи (CHCHO) функциональной группой на конце указанной цепи. Согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина длительного действия может содержать, например, 10-100 фрагментов аналога компстатина, каждый из которых присоединен к цепи (CHCHO) функциональной группой на конце указанной цепи. Согласно некоторым вариантам реализации ветви (иногда называемые «ветвями») разветвленных или звездообразных ПЭГ содержат приблизительно одинаковое количество фрагментов (CHCHO). Согласно некоторым вариантам реализации длины по меньшей мере некоторых ветвей могут отличаться. Следует понимать, что согласно некоторым вариантам реализации одна или более цепей (CHCHO) не содержит присоединенного фрагмента аналога компстатина. Согласно некоторым вариантам реализации по меньшей мере приблизительно к 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 100% указанных цепей присоединен фрагмент аналога компстатина.
2
2
n
2
2
n
[00195] В целом, в показанных в настоящем документе соединениях фрагмент полиэтиленгликоля изображен с атомом кислорода с правой стороны повторяющегося звена или с левой стороны повторяющегося звена. В тех случаях, когда изображен только один вариант ориентации, настоящее изобретение охватывает обе ориентации (т.е. (CHCHO) и (ОСНСН)) фрагментов полиэтиленгликоля для конкретного соединения или класса; либо, в тех случаях, когда соединение или класс содержит несколько фрагментов полиэтиленгликоля, настоящим изобретением охвачены все комбинации ориентации.
2
2
n
3
2
2
n
[00196] Формулы некоторых примеров монофункциональных ПЭГ, содержащих реактивную функциональную группу, приведены ниже. С иллюстративной целью показаны формулы, в которых указанная(ые) реактивная(ые) функциональная(ые) группа(ы) включает(ют) сложный NHS-эфир, но могут применяться и другие реактивные функциональные группы, например, соответствующие приведенному выше описанию. Согласно некоторым вариантам реализации показан (CHCHO) с метоксигруппой (ОСН) на левом конце, однако следует понимать, что изображенные ниже и в других местах в настоящем документе цепи могут оканчиваться другим OR-фрагментом (например, алифатической группой, алкильной группой, низшей алкильной группой или любой другой подходящей концевой группой ПЭГ) или ОН-группой. Следует также иметь в виду, что, согласно различным вариантам реализации фрагмент (CHCHO) с NHS-группой могут соединять фрагменты, отличные от изображенных.
[00197] Согласно некоторым вариантам реализации монофункциональный ПЭГ имеет формулу А:
где «Реактивная функциональная группа» и n соответствуют определению, данному выше, и описанию классов и подклассов в настоящем документе;
1
R представляет собой водород, алифатическую группу или любую подходящую концевую группу; и
1-12
2
2
2
x
x
x
x
x
Т представляет собой ковалентную связь или прямую или разветвленную углеводородную цепь C, где одна или более углеродных единиц Т необязательно и независимо заменена на -O-, -S-, -N(R)-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -N(R)C(O)-, -C(O)N(R)-, -S(O)-, -S(O)-, -N(R)SO- или -SON(R)-; и
x
1-6
каждый R независимо представляет собой водород или алифатический C.
[00198] Примеры монофункциональных ПЭГ формулы А включают:
2
m
[00199] В формуле I фрагмент, содержащий реактивную функциональную группу, имеет общую структуру -CO-(CH)-COO-NHS, где m=2. Согласно некоторым вариантам реализации монофункциональный ПЭГ имеет структуру, соответствующую формуле I, где значение m составляет от 1 до 10, например, от 1 до 5. Например, согласно некоторым вариантам реализации m равен 3, как показано ниже:
2
m
[00200] В формуле II фрагмент, содержащий реактивную функциональную группу, имеет общую структуру -(CH)-COO-NHS, где m=1. Согласно некоторым вариантам реализации монофункциональный ПЭГ имеет структуру, соответствующую формуле II, где значение m составляет от 1 до 10 (например, где m равен 5, как показано в формуле III, приведенной ниже), или где m равен 0 (как показано ниже в формуле IIIa).
2
2
n
[00201] Согласно некоторым вариантам реализации бифункциональный линейный ПЭГ содержит фрагмент, содержащий реактивную функциональную группу на каждом из концов. Указанные реактивные функциональные группы могут быть одинаковыми (гомобифункциональными) или разными (гетеробифункциональными). Согласно некоторым вариантам реализации структура бифункционального ПЭГ может быть симметричной, при этом для соединения реактивной функциональной группы с кислородными атомами на каждом конце цепи -(CHCHO) применяют одинаковые фрагменты. Согласно некоторым вариантам реализации для соединения указанных двух реактивных функциональных групп с ПЭГ-частью указанной молекулы применяют разные фрагменты. Структуры типовых бифункциональных ПЭГ изображены ниже. Для иллюстративных целей приведены формулы, в которых указанная(ые) реактивная(ые) функциональная(ые) группа(ы) включают сложный NHS-эфир, но могут использоваться и другие реактивные функциональные группы.
[00202] Согласно некоторым вариантам реализации бифункциональный линейный ПЭГ имеет формулу В:
где каждый Т и «Реактивная функциональная группа» независимо соответствуют приведенным выше определениям и описаны в классах и подклассах в настоящем документе, и n соответствует приведенным выше определениям и описан в классах и подклассах в настоящем документе.
[00203] Примеры бифункциональных ПЭГ, имеющих формулу В, включают:
2
m
[00204] В формуле IV фрагмент, содержащий реактивную функциональную группу, имеет общую структуру -(CH)-COO-NHS, где m=1. Согласно некоторым вариантам реализации бифункциональный ПЭГ имеет структуру, соответствующую формуле IV, где значение m составляет от 1 до 10, например, от 1 до 5. Согласно определенным вариантам реализации m=0, например, фрагмент, содержащий реактивную функциональную группу, имеет общую структуру -COO-NHS. Например, согласно некоторым вариантам реализации бифункциональный ПЭГ имеет структуру формулы IVa, как показано ниже:
2
m
[00205] В формуле V фрагмент, содержащий реактивную функциональную группу, имеет общую структуру -CO-(CH)-COO-NHS, где m=2. Согласно некоторым вариантам реализации бифункциональные ПЭГ имеют структуру, соответствующую формуле V, где значение m составляет от 1 до 10, например, от 1 до 5. Согласно определенным вариантам реализации, например, m=2, как показано ниже:
[00206] Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложен аналог компстатина, конъюгированный с полимером. Согласно некоторым вариантам реализации для синтеза таких конъюгатов проводят реакцию функциональной группы (например, амина, гидроксила или тиольной группы) на аналоге компстатина с ПЭГ-содержащим соединением, имеющим «реактивную функциональную группу» согласно описанию в настоящей заявке. К примеру, формулы III и IV, соответственно, могут образовывать конъюгаты аналога компстатина со структурой:
где  представляет собой точку присоединения аминогруппы на аналоге компстатина. Согласно определенным вариантам реализации аминогруппа представляет собой группу боковой цепи лизина.
[00207] Следует иметь в виду, что могут быть получены соответствующие конъюгаты с любым из описанных в настоящей заявке ПЭГ-содержащих соединений и классов, в зависимости от выбора реактивной функциональной группы и/или функциональной группы компстатина. Например, формулы IVa и Va, соответственно, могут образовывать конъюгаты аналога компстатина со структурой
Согласно определенным вариантам реализации ПЭГ-компонент таких конъюгатов имеет среднюю молекулярную массу, составляющую приблизительно 20 кДа - 100 кДа, приблизительно 20 кДа - 90 кДа, приблизительно 20 кДа - 80 кДа, приблизительно 20 кДа - 70 кДа, приблизительно 20 кДа - 60 кДа, приблизительно 20 кДа - 50 кДа, приблизительно 30 кДа - 80 кДа, приблизительно 30 кДа - 70 кДа, приблизительно 30 кДа - 60 кДа, приблизительно 30 кДа - 50 кДа, приблизительно 30 кДа - 45 кДа, приблизительно 35 кДа - 50 кДа, приблизительно 35 кДа - 45 кДа, приблизительно 36 кДа - 44 кДа, приблизительно 37 кДа - 43 кДа, приблизительно 38 кДа - 42 кДа или приблизительно 39 кДа - 41 кДа. Согласно определенным вариантам реализации ПЭГ-компонент таких конъюгатов имеет среднюю молекулярную массу, составляющую приблизительно 40 кДа.
[00208] Термин «бифункциональный» или «бифункционализированный» иногда используется в настоящем документе для обозначения соединения, содержащего два фрагмента аналога компстатина, связанных с СКФ. Такие соединения могут обозначаться буквами «BF». Согласно некоторым вариантам реализации бифункционализированное соединение является симметричным. Согласно некоторым вариантам реализации связи между СКФ и каждым из фрагментов аналога компстатина бифункционализированного соединения являются идентичными. Согласно некоторым вариантам реализации каждая связь между СКФ и аналогом компстатина бифункционализированного соединения содержит карбамат.Согласно некоторым вариантам реализации каждая связь между СКФ и аналогом компстатина бифункционализированного соединения содержит карбамат и не содержит сложного эфира. Согласно некоторым вариантам реализации каждый аналог компстатина бифункционализированного соединения непосредственно связан с СКФ через карбамат. Согласно некоторым вариантам реализации каждый аналог компстатина бифункционализированного соединения непосредственно связан с СКФ через карбамат, и указанное бифункционализированное соединение имеет структуру:
[00209] Согласно некоторым вариантам реализации формул и вариантов реализации, описанных в настоящем документе,  компстатина представляет точку присоединения группы боковой цепи лизина в аналоге компстатина, имеющем структуру:
где символом  обозначена точка присоединения химического фрагмента к оставшейся части молекулы или химической формулы.
2
2
n
[00210] Согласно некоторым вариантам реализации разветвленный, гребенчатый или звездообразный ПЭГ содержит фрагмент, содержащий реактивную функциональную группу на конце каждой из нескольких цепей -(CHCHO). Указанные реактивные функциональные группы могут быть одинаковыми, либо по меньшей мере две группы могут быть разными. Согласно некоторым вариантам реализации разветвленный, гребенчатый или звездообразный ПЭГ имеет формулу, выбранную из следующих:
2
1
[00211] где каждый R независимо представляет собой «реактивную функциональную группу», или R, и каждый из Т, n и «реактивных функциональных групп» независимо соответствует приведенным выше определениям и описан в классах и подклассах в настоящей заявке. Структура примеров разветвленных ПЭГ (с 8 ветвями, или ветвями), содержащих NHS-фрагменты в качестве реактивных функциональных групп, изображена ниже:
[00212] Структура примеров разветвленных ПЭГ (с 4 ветвями или ветвями), содержащих NHS-фрагменты в качестве реактивных функциональных групп, изображена ниже:
2
2
2
2
[00213] Число ветвей, отходящих от остова, может варьировать. Например, число 4 в приведенных выше формулах VI и VII может быть изменено на любое другое целое число от 0 до 10 согласно различным вариантам реализации. Согласно определенным вариантам реализации одна или более ветвей не содержат реакционноспособной функциональной группы; указанная ветвь оканчивается группой -CH-CH-OH или -CHCHOR согласно приведенному выше описанию.
[00214] Согласно некоторым вариантам реализации разветвленный ПЭГ имеет структуру, соответствующую формуле VII, VIII или IX (или их вариантам с другим количеством ветвей) при условии, что х представляет собой
[00215] Согласно некоторым вариантам реализации разветвленный ПЭГ имеет структуру, соответствующую формуле VII, VIII или IX (или их вариантам с другим количеством ветвей) при условии, что х представляет собой
2
2
m
[00216] Разумеется, метиленовая (CH) группа в приведенном выше фрагменте х может, в качестве альтернативы, содержать более длинную алкильную цепь (СН), где т принимает значения до 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 20 или 30, или может содержать один или более других фрагментов из описанных в настоящей заявке.
[00217] Согласно некоторым вариантам реализации примеры разветвленных ПЭГ, содержащих NHS или малеимидные реакционноспособные группы, изображены ниже:
[00218] Согласно некоторым вариантам реализации применяют вариант с формулой Х или XI, где 3 или каждая из 4 ветвей содержит реактивную функциональную группу.
[00219] Также могут быть приведены следующие примеры ПЭГ:
2
2
n
Как уже отмечалось, следует иметь в виду, что, согласно описанию в настоящей заявке, в различных вариантах реализации между пептидным компонентом и фрагментом (CHCHO)-R аналога компстатина длительного действия может быть введен любой из разнообразных фрагментов, такой как линейный алкил, сложный эфир, амид, ароматическое кольцо (например, замещенный или незамещенный фенил), замещенная или незамещенная циклоалкильная структура или их комбинации. Согласно некоторым вариантам реализации такой(ие) фрагмент(ы) может(гут) придавать соединению большую чувствительность к гидролизу, который может отсоединять пептидную часть указанного соединения от СКФ. Согласно некоторым вариантам реализации такое высвобождение может увеличивать проникновение в ткани in vivo и/или повышать активность указанного соединения. Согласно некоторым вариантам реализации гидролиз представляет собой общий (например, кислотно-щелочной) гидролиз. Согласно некоторым вариантам реализации гидролиз представляет собой катализируемый ферментами, например, катализируемый эстеразой. Разумеется, могут происходить оба типа гидролиза. Примеры ПЭГ, содержащих один или более таких фрагментов и сложный NHS-эфир в качестве реактивной функциональной группы, приведены ниже:
[00221]
[00222]
[00223]
[00224] Согласно некоторым вариантам реализации разветвленный (с несколькими ветвями) ПЭГ или звездообразный ПЭГ содержит пентаэритритное ядро, гексаглицериновое ядро или трипентаэритритное ядро. Следует понимать, что согласно некоторым вариантам реализации ветви не обязательно отходят от одной точки.
[00225] Монофункциональные, бифункциональные, разветвленные и другие ПЭГ, содержащие одну или более реактивных функциональных групп, могут согласно некоторым вариантам реализации быть получены, например, от NOF America Corp. Уайт-Плейнс, Нью-Йорк или от ВОС Sciences, 45-16 Рэмси Роад, Ширли, Нью-Йорк 11967, США, в том числе, или могут быть получены с применением способов, известных в данной области техники.
[00226] Согласно некоторым вариантам реализации связь между СКФ и аналогом компстатина содержит карбамат. Согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина непосредственно связан с СКФ через карбамат. Согласно некоторым вариантам реализации связь между СКФ и аналогом компстатина не содержит сложного эфира. Согласно некоторым вариантам реализации связь между СКФ и аналогом компстатина содержит карбамат и не содержит сложного эфира. Согласно некоторым вариантам реализации связь между СКФ и аналогом компстатина содержит карбамат и не содержит связи, более чувствительной к гидролизу в водной среде, чем карбамат. Согласно некоторым вариантам реализации СКФ содержит фрагмент ПЭГ или состоит из фрагмента ПЭГ.
[00227] Согласно некоторым вариантам реализации связь между СКФ и аналогом компстатина содержит амид. Согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина непосредственно связан с СКФ через амид. Согласно некоторым вариантам реализации связь между СКФ и аналогом компстатина содержит амид и не содержит сложного эфира. Согласно некоторым вариантам реализации связь между СКФ и аналогом компстатина содержит амид и не содержит связи, более чувствительной к гидролизу в водной среде, чем амид. Согласно некоторым вариантам реализации СКФ содержит фрагмент ПЭГ или состоит из фрагмента ПЭГ.
[00228] Согласно некоторым вариантам реализации один или более аналогов компстатина мультифункционализированного соединения (например, бифункционализированного, трифункционализированного или более высокофункционализированного соединения) связаны с СКФ связью, содержащей карбамат. Согласно некоторым вариантам реализации один или более аналогов компстатина мультифункционализированного соединения (например, бифункционализированного, трифункционализированного или более высокофункционализированного соединения) связан с СКФ связью, которая не содержит сложного эфира. Согласно некоторым вариантам реализации один или более аналогов компстатина мультифункционализированного соединения (например, бифункционализированного, трифункционализированного или более высокофункционализированного соединения) связан с СКФ связью, которая содержит карбамат и не содержит сложного эфира. Согласно некоторым вариантам реализации один или более аналогов компстатина мультифункционализированного соединения (например, бифункционализированного, трифункционализированного или более высокофункционализированного соединения) связаны с СКФ связью, которая содержит карбамат и не содержит связи, более чувствительной к гидролизу в водной среде, чем карбамат. Согласно некоторым вариантам реализации каждый аналог компстатина мультифункционализированного соединения (например, бифункционализированного, трифункционализированного или более высокофункционализированного соединения) непосредственно связан с СКФ через карбамат.
[00229] Согласно некоторым вариантам реализации СКФ содержит фрагмент ПЭГ или состоит из фрагмента ПЭГ. Согласно некоторым вариантам реализации один или более аналогов компстатина мультифункционализированного соединения (например, бифункционализированного, трифункционализированного или более высокофункционализированного соединения) связан с СКФ связью, содержащей амид. Согласно некоторым вариантам реализации один или более аналогов компстатина мультифункционализированного соединения (например, бифункционализированного, трифункционализированного или более высокофункционализированного соединения) связан с СКФ связью, которая содержит амид и не содержит сложного эфира. Согласно некоторым вариантам реализации один или более аналогов компстатина мультифункционализированного соединения (например, бифункционализированного, трифункционализированного или более высокофункционализированного соединения) связаны с СКФ связью, которая содержит амид и не содержит связи, более чувствительной к гидролизу в водной среде, чем амид. Согласно некоторым вариантам реализации каждый аналог компстатина мультифункционализированного соединения (например, бифункционализированного, трифункционализированного или более высокофункционализированного соединения) непосредственно связан с СКФ через амид. Согласно некоторым вариантам реализации СКФ содержит фрагмент ПЭГ или состоит из фрагмента ПЭГ.
[00230] Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложен аналог компстатина, конъюгированный с полимером, при этом указанный полимер не является ПЭГ. Согласно некоторым вариантам реализации полимер представляет собой полиоксазолин (ПОЗ). Примеры моно- и полифункционализированных полиоксазолиновых производных для прямой конъюгации или для конъюгации линкером, изображены ниже:
x
l
2
2
n
Z-T-[N(COR)CHCH]-T-R;
l
x
a
l
2
2
m
2
2
n
R-{[N(CO-T-Z)CHCH]-[N(COR)CHCH]}-T-R;
l
l
x
2
a
l
2
2
p
2
2
n
2
2
m
R-{[N(CO-T-Z)CHCH]-[N(COR)CHCH]-[N(CO-T-Z)CHCH]}-T-R;
l
l
x
2
a
2
2
p
2
2
n
2
2
m
R-{[N(CO-T-Z)CHCH]-[N(COR)CHCH]-[N(CO-T-Z)CHCH]}-T-Z;
l
x
l
x
l
2
2
n
2
2
m
R-[N(COR)CHCH]-T-B(-R)(-T-Z)-T-[N(COR)CHCH]-R;
где:
1
2
каждый из Z, Z и Z независимым образом представляет собой реактивную функциональную группу, соответствующую приведенному выше определению и описанную в классах и подклассах в настоящем документе;
x
1
каждый из Т, R и R независимым образом соответствует приведенному выше определению и описан в классах и подклассах в настоящем документе;
каждый из m, n и р независимым образом представляет собой целое число от 0 до 1000, с тем ограничением, что сумма m, n и р для каждой формулы не равна 0;
а = «ran», то есть случайный («random») сополимер, или «block», то есть блок-сополимер;
В представляет собой разветвленный фрагмент, связанный линкером или без линкера с другими частями полимера.
Другие примеры функционализированных полиоксазолиновых производных для конъюгации подробно описаны в данной области техники, включая, но не ограничиваясь описанными в опубликованных патентных заявках РСТ WO/2010/006282, WO/2009/089542, WO/2009/043027 и WO/2008/106186, каждая из которых полностью включена в настоящий документ посредством ссылки.
[00231] Примеры конъюгатов аналога компстатина с полиоксазолиновыми полимерами изображены ниже:
где каждая переменная независимым образом соответствует приведенному выше определению и описана в классах и подклассах в настоящем документе.
[00232] Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложен аналог компстатина, конъюгированный с полимером, при этом указанный аналог компстатина соединен с полимером через один или более линкеров. Согласно некоторым вариантам реализации полимер выбирают из содержащих ПЭГ соединений и родов, описанных выше и в классах и подклассах в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложены конъюгаты аналогов компстатина с содержащими ПЭГ соединениями и родами, описанными в настоящем документе, отличающиеся тем, что указанный аналог компстатина соединен с содержащими ПЭГ фрагментами через один или большее количество линкеров. Моно- и полифункциональные ПЭГ, которые содержат одну или более реактивных функциональных групп для конъюгации, определены выше и описаны в классах и подклассах в настоящем документе, включая, но не ограничиваясь соответствующими формулами A, I, Ia, II, III, IIIa, В, IV, IVa, V, Va, С, D, E, F, G, Н, VI, VII, VIII, IX, X, XI, XII, XIII, XIV, XV или XVI.
2
2
2
2
[00233] Подходящие линкеры для соединения аналога компстатина и фрагмента полимера, такого как ПЭГ или полиоксазолин, подробно описаны выше и в классах и подклассах в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации линкер содержит несколько функциональных групп, при этом одна функциональная группа соединена с аналогом компстатина, и другая соединена с фрагментом полимера. Согласно некоторым вариантам реализации линкер представляет собой бифункциональное соединение. Согласно некоторым вариантам реализации линкер имеет структуру NH(CHCHO)nCHC(=O)OH, где n принимает значения от 1 до 1000. Согласно некоторым вариантам реализации линкер представляет собой 8-амино-3,6-диоксаоктановую кислоту (АЕЕАс). Согласно некоторым вариантам реализации линкер активируют для конъюгации с фрагментом полимера или функциональной группой аналога компстатина. Например, согласно некоторым вариантам реализации карбоксильную группу АЕЕАс активируют до конъюгации с аминогруппой боковой цепи группы лизина.
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
[00234] Согласно некоторым вариантам реализации для конъюгации с фрагментом полимера, либо прямой, либо посредством линкера, используют подходящую функциональную группу (например, аминную, гидроксильную, тиольную группу или группу карбоновой кислоты) на аналоге компстатина. Согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина конъюгирован через аминную группу с фрагментом ПЭГ линкером. Согласно некоторым вариантам реализации аминная группа представляет собой α-аминогруппу остатка аминокислоты. Согласно некоторым вариантам реализации аминная группа представляет собой аминную группу боковой цепи лизина. Согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина конъюгирован с фрагментом ПЭГ через аминогруппу боковой цепи лизина (ε-аминогруппа) линкером, имеющим структуру NH(CHCHO)nCHC(=O)OH, где n принимает значения от 1 до 1000. Согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина конъюгирован с фрагментом ПЭГ через аминогруппу боковой цепи лизина линкером АЕЕАс. Согласно некоторым вариантам реализации линкер NH(CHCHO)nCHC(=O)OH вводит фрагмент -NH(CHCHO)nCHC(=O)- на боковую цепь лизина компстатина после конъюгации. Согласно некоторым вариантам реализации линкер АЕЕАс вводит фрагмент -NH(CHCHO)CHC(=O)- на боковую цепь лизина компстатина после конъюгации.
[00235] Согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина конъюгирован с фрагментом полимера линкером, при этом указанный линкер содержит фрагмент АЕЕАс и остаток аминокислоты. Согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина конъюгирован с фрагментом полимера линкером, при этом указанный линкер содержит фрагмент АЕЕАс и остаток лизина. Согласно некоторым вариантам реализации полимер представлен ПЭГ. Согласно некоторым вариантам реализации С-конец аналога компстатина соединен с аминогруппой АЕЕАс, и С-конец АЕЕАс соединен с остатком лизина. Согласно некоторым вариантам реализации С-конец аналога компстатина соединен с аминогруппой АЕЕАс, и С-конец АЕЕАс соединен с α-аминогруппой остатка лизина. Согласно некоторым вариантам реализации С-конец аналога компстатина соединен с аминогруппой АЕЕАс, С-конец АЕЕАс соединен с α-аминогруппой остатка лизина, а фрагмент полимера, например, фрагмент ПЭГ, конъюгирован через ε-аминогруппу указанного остатка лизина. Согласно некоторым вариантам реализации С-конец остатка лизина модифицирован. Согласно некоторым вариантам реализации С-конец остатка лизина модифицирован путем амидирования. Согласно некоторым вариантам реализации N-конец аналога компстатина модифицирован. Согласно некоторым вариантам реализации N-конец аналога компстатина ацетилирован.
[00236] Примеры конъюгатов, содержащих линкер АЕЕАс и полимер, изображены ниже, при этом  обозначает точку
присоединения аминной группы на аналоге компстатина,  обозначает аналог компстатина, присоединенный через С-конец, и при этом каждая из других переменных независимым образом соответствует приведенному выше определению и описана в классах и подклассах в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации аминная группа представляет собой аминогруппу боковой цепи лизина.
2
2
2
2
[00237] Согласно определенным вариантам реализации аналог компстатина может быть представлен как M-AEEAc-Lys-B, где B представляет собой блокирующий фрагмент, например, NH, M представляет любые из последовательностей SEQ ID NO: 3-36, 37, 71, 72, 73, 74 или 75, при условии, что С-концевая аминокислота, соответствующая любой из SEQ ID NO: 3-36, 37, 71, 72, 73, 74 или 75, связана пептидной связью с AEEAc-Lys-B. NHS-фрагмент монофункционального или мультифункционального (например, бифункционального) ПЭГ вступает в реакцию со свободным амином боковой цепи лизина с образованием монофункционализированного (один фрагмент аналога компстатина) или мультифункционализированного (несколько фрагментов аналога компстатина) аналога компстатина длительного действия. Согласно различным вариантам реализации любая аминокислота, содержащая боковую цепь, которая содержит реактивную функциональную группу, может применяться вместо Lys (или в дополнение к Lys). Может быть проведена реакция монофункционального или мультифункционального ПЭГ, содержащего подходящую реактивную функциональную группу, с такой боковой цепью, аналогично реакции ПЭГ с активированным сложным NHS-эфиром с Lys.
[00238] В отношении любых из описанных выше формул и структур следует понимать, что варианты реализации, в которых компонент с аналогом компстатина содержит любой описанный в настоящем документе аналог компстатина, например, прямо раскрыт любой аналог компстатина, соответствующий последовательностям SEQ ID NO; 3-36, 37, 71, 72, 73, 74, 75. Например, без ограничения, аналог компстатина может содержать последовательность аминокислот, соответствующую последовательности SEQ ID NO: 28. Пример аналога компстатина длительного действия, в котором компонент с аналогом компстатина содержит последовательность аминокислот, соответствующую последовательности SEQ ID NO: 28, изображен на фиг. 10(С). Следует понимать, что фрагмент ПЭГ может иметь различную молекулярную массу или среднюю молекулярную массу в различных вариантах реализации, согласно описанию в настоящем документе. Например, может варьировать молекулярная масса индивидуальных цепей в составе и/или разные составы могут иметь разную среднюю молекулярную массу и/или полидисперсность, согласно описанию в настоящем документе. Согласно определенным вариантам реализации фрагмент ПЭГ в соединении на фиг. 10(С) имеет среднюю молекулярную массу, составляющую приблизительно от 20 кДа до 100 кДа, приблизительно 20 кДа - 90 кДа, приблизительно 20 кДа - 80 кДа, приблизительно 20 кДа - 70 кДа, приблизительно 20 кДа - 60 кДа, приблизительно 20 кДа - 50 кДа, приблизительно 30 кДа - 80 кДа, приблизительно 30 кДа - 70 кДа, приблизительно 30 кДа - 60 кДа, приблизительно 30 кДа - 50 кДа, приблизительно 30 кДа - 45 кДа, приблизительно 35 кДа - 50 кДа, приблизительно 35 кДа - 45 кДа, приблизительно 36 кДа - 44 кДа, приблизительно 37 кДа - 43 кДа, приблизительно 38 кДа - 42 кДа, или приблизительно 39 кДа - 41 кДа. Согласно некоторым вариантам реализации фрагмент ПЭГ в соединении на фиг. 10(С) имеет среднюю молекулярную массу приблизительно от 30 кДа до приблизительно 50 кДа, например, приблизительно от 35 кДа до приблизительно 45 кДа, приблизительно от 37,5 кДа до приблизительно 42,5 кДа. Согласно определенным вариантам реализации, при которых фрагмент ПЭГ имеет среднюю молекулярную массу, составляющую приблизительно 40 кДа, например, от 37,5 кДа до 42,5 кДа, 38 кДа, 39 кДа, 40 кДа, 41 кДа, 42 кДа, указанное соединение иногда называется в настоящем документе CA28-2TS-BF. Согласно определенным вариантам реализации соединение, содержащее СКФ, например, фрагмент ПЭГ, который имеет среднюю молекулярную массу, составляющую приблизительно 40 кДа, например, от 37,5 кДа до 42,5 кДа, 38 кДа, 39 кДа, 40 кДа, 41 кДа, 42 кДа, конечное время полужизни указанного соединения составляет по меньшей мере приблизительно 5 дней, например, приблизительно 5-10 дней, например, приблизительно 5, 6, 7, 8, 9 дней, при введении в/в или подкожно не являющимся человеком приматам или людям, например, в дозе приблизительно 1-3 мкг/кг, 3-5 мкг/кг или 5-10 мкг/кг.
[00239] Согласно некоторым аспектам настоящее изобретение относится к использованию клик-химии в отношении аналогов компстатина. «Клик-химия» общеизвестна в данной области техники и подходит для применения согласно некоторым аспектам настоящего изобретения. Клик-химия включает согласно некоторым вариантам реализации универсальные реакции циклоприсоединения между азидами и алкинами, обеспечивающие ряд полезных применений. Способы осуществления реакций клик-химии известны в данной области техники и описаны в источниках: Kolb, H.C.; Sharpless, K.B., Drug Disc. Today, 2003, 1128-1137; Moses, J.E.; Moorhouse, A.D.; Chem. Soc. Rev., 2007, 1249-1262; которые полностью включены в настоящий документ посредством ссылки. Клик-химия представляет собой распространенный способ биоконъюгации благодаря высокой реакционноспособности и селективности, даже в биологических средах. См.: Kolb, H.C.; Finn, M.G.; Sharpless, K.B. Angew. Chem. Int. Ed. 2001, 40, 2004-2021; и Wang, Q.; Chan, Т.R.; Hilgraf, R.; Fokin, V.V.; Sharpless, К.В.; Finn, M. G. J. Am. Chem. Soc. 2003, 725, 3192-3193. Кроме того, доступные на сегодняшний день рекомбинантные техники и методы синтеза позволяют вводить азиды и несущие алкины неканонические аминокислоты в пептиды, белки, клетки, вирусы, бактерии и другие биологические объекты, которые состоят из белков или экспонируют белки. См.: Link, А. J.; Vink, M. К. S.; Tirrell, D. A. J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 10598-10602; Deiters, A.; Cropp, Т.A.; Mukherji, M.; Chin, J.W.; Anderson, C.; Schultz, P. G. J. Am. Chem. Soc. 2003, 725, 11782-11783.
[00240] В настоящем документе термин «клик-химическая группа» иногда используется для обозначения реактивной функциональной группы, способной принимать участие в клик-химической реакции с подходящей второй реактивной функциональной группой, при этом указанная вторая реактивная функциональная группа также представляет собой клик-химическую группу. Указанные первая и вторая клик-химические группы или объекты (например, молекулы), содержащие такие группы, могут называться комплементарными. Первый и второй объекты, например, молекулы, которые содержат комплементарные клик-химические группы, могут называться клик-химическими партнерами. Объект или молекула, содержащий(ая) клик-химическую группу, может называться «клик-функционализированным(ой)». Связь, образующаяся за счет реакции комплементарных клик-химических партнеров, может называться «клик-химической связью».
[00241] Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложены клик-функционализированные аналоги компстатина, например, для конъюгации с комплементарным фрагментом на молекуле-партнере или биомолекуле-партнере. Согласно некоторым вариантам реализации комплементарная молекула-партнер или биомолекула-партнер представляет собой полимер, пептид, белок или молекулу, функционирующую в качестве снижающего клиренс фрагмента. Согласно некоторым вариантам реализации указанный «клик-функционализированный» фрагмент представляет собой алкин или производное алкина, способный(ое) проходить [3+2] реакции циклоприсоединения с комплементарными несущими азиды молекулами и биомолекулами. Согласно другому варианту реализации «клик-функционализированная» функциональная группа представляет собой азид или производное азида, способный проходить [3+2] реакции циклоприсоединения с комплементарными несущими алкины молекулами и биомолекулами (т.е. клик-химия).
[00242] Согласно некоторым вариантам реализации клик-функционализированный аналог компстатина несет азидную группу на любой группе боковой цепи аналога компстатина. Согласно некоторым вариантам реализации клик-функционализированный аналог компстатина несет азидную группу на группе боковой цепи лизина.
[00243] Согласно некоторым вариантам реализации клик-функционализированный аналог компстатина несет алкиновую группу на любой группе боковой цепи аналога компстатина. Согласно некоторым вариантам реализации клик-функционализированный аналог компстатина несет алкиновую группу на группе боковой цепи лизина.
[00244] Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложены конъюгаты компстатина, содержащие аналог компстатина, молекулу, функционирующую в качестве снижающего клиренс фрагмента, и триазольный линкер. Согласно некоторым вариантам реализации триазольный линкер представляет собой результат клик-химической конъюгации между конъюгатом компстатина и молекулой, функционирующей в качестве снижающего клиренс фрагмента. Согласно некоторым вариантам реализации СКФ может представлять собой любой раскрытый в настоящем документе СКФ. Например, СКФ может представлять собой ПЭГ, полипептид или ПОЗ.
[00245] Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложены конъюгаты компстатина, содержащие аналог компстатина, фрагмент ПЭГ и триазольный линкер. Согласно некоторым вариантам реализации триазольный линкер представляет собой результат клик-химической конъюгации между конъюгатом компстатина и фрагментом ПЭГ.
[00246] Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложены конъюгаты компстатина, содержащие аналог компстатина, фрагмент полиоксазолина и триазольный линкер. Согласно некоторым вариантам реализации триазольный линкер представляет собой результат клик-химической конъюгации между конъюгатом компстатина и фрагментом полиоксазолина.
4
4
2
2
4
4
4
6
[00247] Согласно некоторым вариантам реализации клик-химическая реакция между аналогом компстатина и другим фрагментом катализируется переходным металлом. Медь-содержащие молекулы, катализирующие «клик»-реакцию, включают, не ограничиваясь перечисленными, медную проволоку, бромид меди (CuBr), хлорид меди (CuCl), сульфат меди (CuSO), сульфат пентагидрат меди (CuSO⋅5HO), ацетат меди (Cu(AcO), йодид меди (CuI), [Cu(MeCN)](OTf), [Cu(MeCN)](PF), источники коллоидной меди и источники иммобилизованной меди. Согласно некоторым вариантам реализации другие металлы, такие как рутений. Восстанавливающие агенты, а также органические и неорганические металл-связывающие лиганды могут применяться в сочетании с металлическими катализаторами и включают, не ограничиваясь перечисленными, аскорбат натрия, трис(триазолил)аминовые лиганды, трис(карбоксиэтил)фосфин (ТСЕР), сульфонированные батофенантролиновые лиганды и лиганды на основе бензимидазола.
[00248] Согласно некоторым вариантам реализации аналоги компстатина конъюгируют с другими фрагментами с применением клик-химии без металлов (также известной как клик-химия без меди), обеспечивающей получение композиции или конъюгатов без металлов. В отличие от стандартной клик-химии, также известной как медь-катализируемая клик-химия (CuACC), клик-химические реакции без металлов протекают между либо деформированным циклическим алкином, либо предшественником алкина, таким как оксанорборнадиен, и азидной группой. Как следует из названия, металлический катализатор не является необходимым для протекания реакции. Примеры таких химических реакций включают реакции, включающие циклооктиновые производные (Codelli, et al. J. Am. Chem. Soc., 2008, 130, 11486-11493; Jewett, et al. J. Am. Chem. Soc., 2010, 132, 3688-3690; Ning, et al. Angew. Chem. Int. Ed., 2008, 47, 2253-2255), дифтор-оксанорборненовые производные (van Berkel, et al. ChemBioChem, 2007, 8, 1504-1508) или нитрилоксидные производные (Lutz, et al. Macromolecules, 2009, 42, 5411-5413). Согласно определенным вариантам реализации клик-химическая реакция без металлов представляет собой реакцию [3+2] циклоприсоединения, реакцию Дильса-Альдера или радикальную реакцию присоединения тиол-алкенов без металлов. Примеры клик-химических реакций и клик-химических групп описаны, например, у Joerg Lahann, Click Chemistry for Biotechnology and Materials Science, 2009, John Wiley & Sons Ltd, ISBN 978-0-470-69970-6; Becer, Hoogenboom, and Schubert, Click Chemistry beyond Metal-Catalyzed Cycloaddition, Angewandte Chemie International Edition (2009) 48: 4900-4908. Согласно определенным вариантам реализации клик-химическая группа содержит диарилциклооктин.
[00249] Некоторые примеры клик-химических реакций без металлов представлены на схеме ниже.
[00250] Определенные клик-фрагменты без металлов известны из литературы.
Примеры включают 4-дибензоциклооктинол (DIBO)  (по Ning et al; Angew Chem Int Ed, 2008, 47, 2253); двуфтористые циклооктины (DIFO или DFO)  (по Codelli, et al.; J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 11486-11493.); биарилазациклооктинон (BARAC)  (по Jewett et. al.; J. Am. Chem. Soc. 2010, 132, 3688); или бициклононин (BCN)  (по Dommerholt, et al.; Angew Chem Int Ed, 2010, 49, 9422-9425) или дибензилциклооктин (DBCO)
[00251] Схема реакции, включающей реакцию DBCO и азида, показана ниже:
[00252] В приведенной выше схеме согласно различным вариантам реализации А может содержать или состоять из фрагмента аналога компстатина, и В может содержать или состоять из СКФ, например, полимера, такого как ПЭГ, или ПОЗ, или полипептид, или В может содержать или состоять из фрагмента аналога компстатина и может содержать или состоять из СКФ, например, полимера, такого как ПЭГ, или ПОЗ, или полипептид.
[00253] Согласно некоторым вариантам реализации «клик-функционализированный фрагмент без металла» представляет собой ацетилен или производное ацетилена, способное проходить реакции [3+2] циклоприсоединения с комплементарными несущими азиды молекулами и биомолекулами без применения металлического катализатора.
[00254] Согласно некоторым вариантам реализации группы R и R' клик-химических реагентов без металлов представляют собой аналог компстатина или любую молекулу, описанную в настоящем документе, с которой может быть конъюгирован аналог компстатина. Согласно некоторым вариантам реализации такие аналоги компстатина несут клик-функционализированный фрагмент на боковой цепи лизина. Согласно некоторым вариантам реализации такие аналоги компстатина соединены с клик-функционализированным фрагментом линкером. Согласно некоторым вариантам реализации такие аналоги компстатина соединены с клик-функционализированным фрагментом посредством АЕЕАс.
[00255] Согласно некоторым вариантам реализации клик-химический реагент содержит DBCO. Примеры реагентов и примеры их применения приведены ниже:
[00256] DBCO-кислота. Согласно некоторым вариантам реализации DBCO-кислота может применяться для проведения реакции с амин-содержащим фрагментом.
[00257] Сложный DBCO- NHS-эфир (выше) или сложный DBCO-сульфо-NHS-эфир (ниже) может применяться для включения функциональной группы DBCO в амин-содержащую молекулу, такую как аналог компстатина или полипептид, содержащий остаток лизина.
[00258] Сложный ОВСО-PEG4-NHS-эфир. Согласно некоторым вариантам реализации такой реагент подходит для введения фрагмента DBCO посредством реакции с доступной аминной функциональной группой. Согласно некоторым аспектам присутствие цепи ПЭГ в качестве гидрофильного спейсера может быть полезно для, например, повышения растворимости или обеспечения гибкости.
[00259] DBCO-амин. Согласно некоторым вариантам реализации клик-химический реагент содержит карбонил/карбоксил-реактивный дибензилциклооктин, который может вступать в реакцию с кислотами, активными сложными эфирами и/или альдегидами.
[00260] Согласно определенным вариантам реализации клик-химическая реакция включает циклооктин, изображенный ниже:
[00261] Согласно определенным вариантам реализации клик-химические реакции включают реакции между нитронами и циклооктинами (см., например, Ning, Xinghai; Temming, Rinske P.; Dommerholt, Jan; Guo, Jun; Ania, Daniel В.; Debets, Marjoke F.; Wolfert, Margreet A.; Boons, Geert-Jan et al. (2010). "Protein Modification by Strain-Promoted Alkyne-Nitrone Cycloaddition". Angewandte Chemie International Edition 49 (17): 3065), образование оксимов/гидразонов из альдегидов и кетонов, лигирование тетразинов (см., например, Blackman, Melissa L.; Royzen, Maksim; Fox, Joseph M. (2008). "The Tetrazine Ligation: Fast Bioconjugation based on Inverse-electron-demand Diels-Alder Reactivity". Journal of the American Chemical Society 130 (41): 13518-9), лигирование тетразолов, клик-реакцию на основе изонитрила (см., например, Stackmann, Henning; Neves, .; Stairs, Shaun; Brindle, Kevin M.; Leeper, Finian J. (2011). "Exploring isonitrile-based click chemistry for ligation with biomolecules". Organic & Biomolecular Chemistry 9 (21): 7303) и квадрициклановое лигирование (см., например, Sletten, Ellen M.; Bertozzi, Carolyn R. (2011). "A Bioorthogonal Quadricyclane Ligation". Journal of the American Chemical Society 133 (44): 17570-3). Согласно определенным вариантам реализации клик-химическая реакция представляет собой лигирование по Штаудингеру (фосфин-азид).
[00262] Любой аналог компстатина может быть модифицирован включением клик-химической группы согласно различным вариантам реализации. Например, аналог компстатина, содержащий последовательность, соответствующую любой из SEQ ID NO: 3-36, 37, 71, 72, 73, 74 или 75, может быть модифицирован таким образом. Согласно некоторым вариантам реализации любая такая последовательность также содержит остаток лизина или фрагмент AEEAc-Lys, например, на С-конце. Согласно некоторым вариантам реализации клик-химическую группу встраивают после пептидного синтеза. Например, может быть проведена реакция боковой цепи Lys с азидоуксусной кислотой для введения азидного фрагмента в качестве клик-химической группы. Согласно некоторым вариантам реализации клик-химическую группу встраивают после циклизации, и согласно некоторым вариантам реализации после добавления блокирующего фрагмента на N-и/или С-конце. Согласно некоторым вариантам реализации клик-химическую группу встраивают во время пептидного синтеза. Например, при синтезе аналога компстатина может применяться аминокислота, содержащая боковую цепь, которая содержит клик-химическую группу. Различные подобные аминокислоты коммерчески доступны из ряда источников, например, ААРРТес (Луисвилл, Кентукки), Jena Bioscience GmBH (Йена, Германия). Согласно некоторым аспектам в настоящем документе предложены способы получения клик-химически функционализированного аналога компстатина.
[00263] Согласно некоторым вариантам реализации предложены композиции, содержащие аналог компстатина и клик-химический реагент. Клик-химический реагент может представлять собой любую молекулу, способную вступать в реакцию с боковой цепью аминокислоты или концом соединения, содержащего аналог компстатина, таким образом, чтобы внедрить клик-химическую группу, например, любую клик-химическую группу, известную в данной области техники. Согласно некоторым аспектам композиция может инкубироваться в подходящих условиях (которые могут включать обеспечение подходящего катализатора, света (например, УФ)) для функционализирования аналога компстатина клик-химической функциональной группой. Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложены аналоги компстатина, которые содержат любую клик-химическую группу, включающую описанные в настоящем документе, но не ограничивающуюся ими. Согласно некоторым вариантам реализации предложены способы получения аналога компстатина длительного действия. Согласно некоторым вариантам реализации указанные способы включают смешивание аналога компстатина, содержащего первую клик-химическую группу, с СКФ, содержащим комплементарную клик-химическую группу, в условиях, подходящих для протекания клик-химической реакции. Дополнительные этапы могут включать очищение полученного конъюгата. Согласно некоторым вариантам реализации очищение включает удаление по меньшей мере некоторых непрореагировавших компонентов, например, с применением подходящего поглотителя.
[00264] Согласно некоторым вариантам реализации клик-химическую реакцию используют для соединения двух или большего количества СКФ, по меньшей мере два из которых содержат присоединенный фрагмент аналога компстатина. Указанные фрагменты аналога компстатина могут быть одинаковыми или разными согласно различным вариантам реализации. Указанные фрагменты аналога компстатина могут быть или не быть присоединены к СКФ посредством клик-химической реакции. Например, согласно некоторым вариантам реализации первый гетеробифункциональный ПЭГ, содержащий первую клик-химическую группу на первом конце и сложный NHS-эфир на втором конце, соединяют с фрагментом аналога компстатина через сложный NHS-эфир. В ходе отдельной реакции второй гетеробифункциональный ПЭГ, содержащий вторую клик-химическую группу на первом конце и сложный NHS-эфир на втором конце, соединяют с фрагментом аналога компстатина через сложный NHS-эфир. С полученными двумя соединениями затем проводят клик-химическую реакцию для получения большей молекулы, содержащей два фрагмента аналога компстатина. ПЭГ упоминается как пример СКФ, однако следует понимать, что указанный подход может применяться с любым СКФ. Например, согласно некоторым вариантам реализации он может применяться с СКФ, содержащим полипептид, например, САЧ или его частью, или альбумином или альбумин-связывающим пептидом, или антителом или его частью. Согласно некоторым вариантам реализации указанный подход может применяться с ПОЗ.
[00265] Аналоги компстатина, содержащие клик-химическую группу, могут находить разнообразное применение. Согласно некоторым вариантам реализации проводят реакцию аналога компстатина, содержащего первую клик-химическую группу, с любым веществом, содержащим комплементарную клик-химическую группу. Вещество, содержащее комплементарную клик-химическую группу, может содержать, например, метку (например, флуорофор, флуоресцентный белок, радиоактивный изотоп и т.п.), аффинный реагент, антитело, нацеливающий фрагмент, металл, частицу и т.п. Согласно некоторым вариантам реализации клик-химическую группу используют для присоединения фрагмента аналога компстатина к поверхности, при этом указанная поверхность содержит или функционализирована таким образом, чтобы содержать комплементарную клик-химическую группу. Согласно некоторым вариантам реализации поверхность является сенсорной, например, поверхность или сенсор для захвата/детекции С3. Согласно некоторым вариантам реализации поверхность образует часть медицинского устройства, систему трубок, мембрану, резервуар, имплантат или другой материал, который может контактировать с кровью (например, экстракорпорально) или быть временно или на неопределенный срок имплантирован в организм субъекта (например, протез или устройство для доставки лекарственного средства). Согласно некоторым вариантам реализации поверхность функционализирована аналогом компстатина для уменьшения на ней активации комплемента. Согласно некоторым вариантам реализации устройство или систему трубок используют для циркуляции крови, например, для диализа, во время хирургического вмешательства и т.п. Согласно некоторым вариантам реализации устройство представляет собой гемодиализатор или экстракорпоральный аппарат для поддержания кровообращения. Такие функционализированные аналогом компстатина устройства и способы их получения предложены в настоящем изобретении.
2
2
n
2
2
n
P1
P2
P3
P1
P2
P3
[00266] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения аналог компстатина содержит и клеточно-реактивную функциональную группу, и СКФ. В некоторых аспектах настоящее изобретение обеспечивает варианты молекул любого из вышеупомянутых клеточно-реактивных аналогов компстатина, в которых клеточно-реактивная функциональная группа или фрагмент заменен фрагментом (CHCHO) (например, любым из ПЭГ, описанных в настоящем документе) или другим полимером (например, ПОЗ, полипептидом) с молекулярной массой, составляющей по меньшей мере 500 Дальтон, например, по меньшей мере 1500 Дальтон - приблизительно 100000 Дальтон (например, со средней молекулярной массой, составляющей приблизительно 20000; 30000; 40000; 50000; 60000; 70000; 80000; 90000 или 100000 Дальтон). Согласно некоторым вариантам реализации средняя молекулярная масса указанного соединения или фрагментов (CHCHO) (или другого полимера, например, ПОЗ или полипептида) составляет по меньшей мере 20000 Дальтон и до приблизительно 100000; 120000; 140000; 160000; 180000 или 200000 Дальтон. Таким образом, следует понимать, что идеи, изложенные в настоящем документе относительно клеточно-реактивных аналогов компстатина, например, применяемых фрагментов аналога компстатина и связей, посредством которыхкоторыми фрагмент аналога компстатина присоединен к клеточно-реактивному фрагменту, можно применять в отношении аналогов компстатина длительного действия, и аналог компстатина длительного действия может характеризоваться любой из структур, обозначенных A-L-M, как описано выше, где А включает снижающий клиренс фрагмент (например, любой из снижающих клиренс фрагментов, описанных в настоящем документе), и кроме того, где могут присутствовать один, два или более (например, 3, 4, 5, 6, 7, 8) фрагментов аналога компстатина М, присоединенных к А соединяющими частями, обозначенными в настоящем документе как L (или L, L или L)). Фрагменты аналога компстатина могут содержать пептид, последовательность которого содержит любую из SEQ ID NO: 3-36, 37, 37A, 38A, 39A, 40A или 41А или их вариантов (например, любой вариант, описанный в настоящем документе), необязательно удлиненную одной или более аминокислотами на N-конце, С-конце или их обоих, причем по меньшей мере одна из аминокислот содержит боковую цепь, которая содержит реактивную функциональную группу, такую как первичный или вторичный амин (например, Lys), сульфгидрильную группу, карбоксильную группу (которая может присутствовать в виде карбоксилатной группы), группу гуанидино, фенольную группу, индольное кольцо, тиоэфир или имидазольное кольцо, которое облегчает конъюгацию фрагмента, содержащего СКФ, с аналогом компстатина (при этом понимается, что после конъюгации такая реактивная функциональная группа прореагирует с образованием связи). Также понимается, что где фрагмент аналога компстатина, содержащий любую из SEQ ID NO: 3-36, 37, 37A, 38A, 39A, 40A или 41А или их варианты, удлинен одной или более аминокислотами на N-конце, С-конце или их обоих, причем по меньшей мере одна из аминокислот содержит боковую цепь, содержащую реактивную функциональную группу, такие удлинения из одной или более аминокислот могут быть отделены от циклической части фрагмента аналога компстатина жестким или гибким спейсерным фрагментом, содержащим, например, замещенную или незамещенную, насыщенную или ненасыщенную алкильную цепь, цепь олиго(этиленгликоля) и/или любой из других фрагментов, обозначенных в настоящем документе как L (или L, L или L).
[00267] Ниже приведены примеры аналогов компстатина длительного действия, отличающиеся тем, что значение n достаточно для обеспечения средней молекулярной массы, составляющей от приблизительно 500; 1000; 1500; 2000; 5000; 10000; 20000; 30000; 40000; 50000; 60000; 70000; 80000; 90000 и 100000 Дальтон.
Согласно некоторым вариантам реализации n является достаточным, чтобы обеспечивать среднюю молекулярную массу, составляющую приблизительно от 20000 Дальтон и до приблизительно 100000; 120000; 140000; 160000; 180000; или 200000 Дальтон.
2
2
n
2
[00268] (CHCHO)C(=O)-Ile-Cys-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys-Thr-NH) (SEQ ID NO: 58)
2
2
2
2
2
2
2
[00269] Ac-Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-NH-CHCH-OCH-CHOCH-C(=O)-Lys-C(=O)-(CHCHO)n-NH(SEQ ID NO: 59)
2
2
2
[00270] Ac-Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-Lys-C(=O)-(CHCHO)n-NH(SEQ ID NO: 60).
2
2
2
[00271] Ac-Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-(Gly)5-Lys-C(=O)-(CHCHO)n-NH (SEQ ID NO: 61)
2
2
2
[00272] Ac-(CHCHO)n-C(=0)Lys-(Gly)5-Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-NH) (SEQ ID NO: 62)
2
2
2
[00273] Ac-(CHCHO)nC(=O)Lys-Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-NH) (SEQ ID NO: 63)
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
2
2
2
2
2
2
2
n
3
Q
O
О
О
[00274] В последовательности SEQ ID NO: 58 (CHCHO)n соединен амидной связью с N-концевой аминокислотой. В последовательностях SEQ ID NO: 59-63 указанный фрагмент (CHCHO)n соединен амидной связью с боковой цепью Lys; соответственно, следует понимать, что NH на С-конце в последовательностях SEQ ID NO: 59, 60 и 61 указывает на амидирование С-конца указанного пептида, а в последовательностях SEQ ID NO: 62 и 63 Ас на N-конце указывает на ацетилирование N-конца указанного пептида, согласно приведенному выше описанию. Специалистам в данной области техники также будет понятно, что свободный конец фрагмента (CHCHO)n, как правило, оканчивается (R), где подчеркнутым О обозначен атом О на концевой (CHCHO) группе. Часто (R) представляет собой такой фрагмент, как гидроксильная (Н) или метоксигруппа (-СН), хотя могут использоваться и другие группы (например, другие алкоксигруппы). Соответственно, последовательность SEQ ID NO: 59, например, может быть представлена последовательностью Ас-Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-NH-CHCHOCHCHOCH-C(=O)-Lys-(C(=O)-(CHCHO)-R)-NH2 (SEQ ID NO: 64), где R представляет собой, например, либо Н, либо СН, в случае линейного ПЭГ. В случае бифункционального, разветвленного или звездообразного ПЭГ R представляет собой остальную часть указанной молекулы. Далее, следует понимать, что фрагмент, содержащий реактивную функциональную группу, может варьировать согласно описанию в настоящей заявке (например, соответствуя любой из формул, приведенных в настоящей заявке). Например, аналоги компстатина длительного действия, содержащие ту же пептидную последовательность, что и SEQ ID NO: 64, в которых фрагмент, содержащий реактивную функциональную группу, содержит сложный эфир и/или алкильную цепь, могут быть представлены следующими
2
2
2
2
2
2
m
2
2
n
Ac-Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-NH-CHCHOCHCHOCH-C(=O)-Lys-(C(=O)-(CH)-(CHCHO)-R)-NH2 (SEQ ID NO: 65);
2
2
2
2
2
2
m-
2
2
n
Ac-Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-NH-CHCHOCHCHOCH-C(=O)-Lys-(C(=O)-(CH)C(=O)-(CHCHO)-R)-NH2 (SEQ ID NO: 66)
2
2
2
2
2
2
m-
2
2
2
n
Ac-Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-NH-CHCHOCHCHOCH-C(=O)-Lys-(C(=O)-(CH)C(=O)-(CH)j (CHCHO)-R)-NH2 (SEQ ID NO: 67)
В последовательностях SEQ ID NO: 65-67 m согласно различным вариантам реализации может варьировать от 1 до приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 15, 20 или 30. В последовательностях SEQ ID NO: 67 j согласно различным вариантам реализации может варьировать от 1 и до приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 15, 20 или 30.
2
2
n
Следует также иметь в виду, что согласно описанию в настоящей заявке в различных вариантах реализации между Lys-(C(=O)- и (CHCHO)-R могут быть введены другие фрагменты, такие как амид, ароматическое кольцо (например, замещенный или незамещенный фенил) или замещенная или незамещенная циклоалкильная структура.
[00275] В настоящем изобретении предложены варианты последовательностей SEQ ID NO: 58-67, в которых -Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr- (SEQ ID NO: 76) заменен последовательностью аминокислот, содержащей последовательность аминокислот любого другого аналога компстатина, например, любой из SEQ ID NO 3-27 или 29-36, 37, 71, 72, 73, 74 или 75, при условии, что блокирующий(ие) фрагмент(ы), присутствующий(ие) на N- и/или С-концах аналога компстатина, может (могут) отсутствовать, быть заменен линкером (который может содержать блокирующий фрагмент) или присоединен к другой N- или С-концевой аминокислоте, присутствующей в соответствующем варианте(вариантах).
[00276] Любой аналог компстатина, например, любое соединение, содержащее любую из последовательностей SEQ ID NO: 3-37, 37А, 38А, 39А, 40А или 41А, может согласно различным вариантам реализации быть присоединено через N-конец или С-конец, или рядом с N-концом или С-концом (например, через боковую цепь аминокислоты на N-концевой или С-концевой аминокислоте или рядом с ней), прямо или непрямо, к любому фрагменту, содержащему реактивную функциональную группу, например, любому соединению с формулой I - XVI или формулой А-Н.
[00277] Согласно некоторым вариантам реализации СКФ содержит полипептид, который присутствует в сыворотке человека, или его фрагмент, или по существу аналогичный вариант указанного полипептида или его фрагмента. Согласно некоторым вариантам реализации указанный полипептид, фрагмент или вариант имеет молекулярную массу, составляющую от 5 кДа до 150 кДа, например, по меньшей мере 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 кДа или более, например, от 100 до 120, или от 120 до 150 кДа. Согласно некоторым вариантам реализации получение аналога компстатина длительного действия включает проведение реакции аналога компстатина, содержащего реакционноспособную функциональную группу, с одной или большим количеством аминокислотных боковых цепей указанного полипептида, отличающуюся тем, что указанная боковая цепь содержит совместимую функциональную группу. Согласно некоторым вариантам реализации получение аналога компстатина длительного действия включает проведение реакции аналога компстатина, содержащего реакционноспособную функциональную группу, с N-концевым амином и/или С-концевой карбоксильной группой указанного полипептида. Согласно некоторым вариантам реализации получение аналога компстатина длительного действия включает проведение реакции аналога компстатина, содержащего амино-реактивную функциональную группу, с аминокислотами с боковой цепью, содержащими первичный амин (например, с лизином), и/или с N-концевым амином указанного полипептида. Согласно некоторым вариантам реализации получение аналога компстатина длительного действия включает проведение реакции аналога компстатина, содержащего карбоксил-реактивную функциональную группу, с С-концевой карбоксильной группой указанного полипептида. Согласно некоторым вариантам реализации фрагмент аналога компстатина присоединяют на каждом конце указанного полипептида и, необязательно, к боковой цепи одной или более внутренних аминокислот. Согласно некоторым вариантам реализации получение аналога компстатина длительного действия включает проведение реакции аналога компстатина, содержащего сульфгидрил-реактивную функциональную группу, с одной или большим количеством сульфгидрильных групп указанного полипептида.
2
5
2
[00278] Согласно некоторым вариантам реализации в указанный полипептид вводят по меньшей мере одну реактивную функциональную группу. Например, согласно некоторым вариантам реализации по меньшей мере одну боковую цепь указанного полипептида модифицируют, преобразуя первую реактивную функциональную группу в другую реактивную функциональную группу перед проведением реакции с указанным аналогом компстатина. Согласно некоторым вариантам реализации вводят тиол. Доступно несколько способов введения тиолов в биомолекулы, в том числе восстановление внутренних дисульфидов, а также преобразование аминов, альдегидов или групп карбоновых кислот в тиольные группы. Дисульфидные поперечные связи цистинов в белках могут быть восстановлены до остатков цистеина с применением дитиотреитола (DTT/ДТТ), трис-(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР/ТКЭФ), или трис-(2-цианоэтил)фосфина. Амины могут быть непрямо тиолированы посредством реакции с сукцинимидил 3-(2-пиридилдитио)пропионатом (SPDP) с последующим восстановлением конъюгата 3-(2-пиридилдитио)пропионила с применением ДТТ или ТКЭФ. Амины могут быть непрямо тиолированы посредством реакции с сукцинимидилацетилтиоацетатом, с последующим удалением ацетильной группы 50 мМ гидроксиламином или гидразином при близких к нейтральным значениях рН. Амины могут быть прямо тиолированы с помощью реакции с 2-иминотиоланом, при которой сохраняется общий заряд указанной молекулы и вводится свободный тиол. Остатки триптофана в не содержащих тиолов белках могут быть окислены до остатков меркаптотриптофана, которые могут затем быть модифицированы йодоацетамидами или малеимидами. Может быть проведена реакция полипептида, содержащего один или более тиолов, с аналогом компстатина, содержащим малеимидную группу, такую как Ac-Ile-Cys*-Val-Trp(1-Me)-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-AEEAc-Lys-(С(=O)-(СН)-Mal)-NH (SEQ ID NO: 68), для синтеза аналога компстатина длительного действия.
[00279] Согласно некоторым вариантам реализации указанный полипептид получают рекомбинантным способом. Согласно некоторым вариантам реализации указанный полипептид по меньшей мере частично получают рекомбинантным способом (например, в бактериальных или эукариотических клетках-хозяевах, таких как клетки грибов, насекомых, растений или позвоночных животных) и/или по меньшей мере частично получают с применением химического синтеза. Согласно некоторым вариантам реализации указанный полипептид является очищенным. Например, согласно некоторым вариантам реализации очищают полипептид из лизата клеток-хозяев или из культуральной среды, в которую он был секретирован клетками-хозяевами. Согласно некоторым вариантам реализации указанный полипептид гликозилирован. Согласно некоторым вариантам реализации указанный полипептид не гликозилирован. Согласно некоторым вариантам реализации указанный полипептид представляет собой сывороточный альбумин человека (САЧ). Согласно некоторым вариантам реализации по существу аналогичный вариант указанного полипептида обладает достаточным сходством с полипептидом, вариантом которого он является, чтобы не распознаваться как чужеродный нормальной иммунной системой субъекта, например, субъекта-человека. Согласно некоторым вариантам реализации изменения в последовательностях по существу аналогичного варианта по сравнению с полипептидом, вариантом которого она является, подбирают таким образом, чтобы избежать образования эпитопов МНС класса I. Для предсказания наличия эпитопа МНС класса I в последовательности могут применяться различные известные в данной области техники способы.
[00280] Согласно некоторым вариантам реализации одна или более аминокислот в полипептиде, или линкере, или композиции могут быть выбраны таким образом, чтобы быть гидрофобными или гидрофильными, или выбраны таким образом, чтобы придавать повышенную гидрофильность или, согласно некоторым вариантам реализации, повышенную гидрофобность, соединению, которое их содержит. Как известно в данной области техники, термины «гидрофильный» и «гидрофобный» используются для обозначения степени сродства вещества к воде. Согласно некоторым аспектам гидрофильное вещество обладает высоким сродством к воде, проявляя тенденцию к растворению в воде, смешиванию с водой или к смачиванию водой, тогда как у гидрофобного вещества по существу отсутствует сродство к воде, и оно проявляет тенденцию отталкивать и не абсорбировать воду, и не растворяться в воде, не смешиваться с водой или не смачиваться водой. Аминокислоты могут быть классифицированы на основании их гидрофобности, как общеизвестно в данной области техники. Примерами «гидрофильных аминокислот» являются аргинин, лизин, треонин, аланин, аспарагин, глутамин, аспартат, глутамат, серин и глицин. Примерами «гидрофобных аминокислот» являются триптофан, тирозин, фенилаланин, метионин, лейцин, изолейцин и валин. Согласно определенным вариантам реализации используют аналог стандартной аминокислоты, при этом указанный аналог обладает повышенной или пониженной гидрофильностью или гидрофобностью по сравнению с аминокислотой, аналогом которой является.
[00281] В настоящем изобретении также предложены мультимеры, например, конкатемеры, содержащие два или большее количество (например, от 2 до 10) аналогов компстатина, содержащих СКФ, отличающиеся тем, что средняя молекулярная масса полученной молекулы (или ее СКФ-компонентов) составляет от 20000; 30000; 40000; 50000; 60000; 70000; 80000; 90000; до 100000 Дальтон. Согласно некоторым вариантам реализации средняя молекулярная масса полученной молекулы (или ее СКФ-компонентов) составляет по меньшей мере 20000 Дальтон, и до приблизительно 100000; 120000; 140000; 160000; 180000; или 200000 Дальтон. Согласно некоторым вариантам реализации указанные аналоги компстатина, содержащие СКФ, могут быть связаны с помощью любых из вышеописанных соединяющих фрагментов. Композиции и способы получения аналогов компстатина длительного действия, а также промежуточные продукты синтеза представляют собой аспекты настоящего изобретения.
[00282] Согласно некоторым вариантам реализации общая молекулярная масса аналога компстатина длительного действия, включая фрагменты аналога компстатина, составляет не более 50 кДа. Например, в случае LACA, содержащего 40 кДа ПЭГ, согласно некоторым вариантам реализации молекулярная масса оставшейся части соединения, включая фрагмент или фрагменты аналога компстатина, может составлять не более 10 кДа, например, 1,5 кДа - 5,0 кДа или 5,0 кДа- 10 кДа. Согласно некоторым вариантам реализации общая молекулярная масса LACA, включая фрагменты аналога компстатина, составляет от 45 кДа до 50 кДа. Согласно некоторым вариантам реализации общая молекулярная масса LACA, включая фрагменты аналога компстатина, составляет от 40 кДа до 45 кДа, от 15 кДа до 40 кДа, например, от 15 кДа до 25 кДа, от 25 кДа до 35 кДа, от 35 кДа до 40 кДа. Таким образом, во всех случаях, когда в настоящем описании изобретения упоминается аналог компстатина, содержащий полимер или СКФ, который характеризуется конкретной молекулярной массой или характеризуется молекулярной массой в пределах конкретного диапазона, согласно некоторым вариантам реализации общая молекулярная масса аналога компстатина может превышать молекулярную массу полимера или СКФ, например, на 1,5 кДа - 5 кДа, или согласно некоторым вариантам реализации может превышать молекулярную массу полимера на 5 кДа - 10 кДа. Понятно, что молекулярная масса соединения, например, соединения, содержащего полимер, может означать среднюю молекулярную массу молекул такого соединения в композиции.
[00283] Широкий спектр методов и анализов, подходящих для детекции полимеров, например, ПЭГ, ПОЗ и/или полипептидов, и/или подходящих для измерения физических и/или структурных свойств полимеров, например, ПЭГ, ПОЗ и/или полипептидов, известен в данной области техники и может, при необходимости, применяться для детекции аналога компстатина, например, клеточно-реактивного аналога компстатина, аналога компстатина длительного действия, аналога компстатина нацеленного действия или фрагмента аналога компстатина. Например, доступны способы и анализы, подходящие для определения таких свойств, как агрегация, растворимость, размер, структура, характеристики плавления, чистота, присутствие продуктов разложения или загрязняющих примесей, содержание воды, гидродинамический радиус и т.п. Такие способы включают, например, аналитическое центрифугирование, различные виды хроматографии, такие как жидкостная хроматография (например, ионообменная ВЭЖХ, эксклюзионная ВЭЖХ, ВЭЖХ с обращенной фазой), рассеяние света, капиллярный электрофорез, круговой дихроизм, изотермическая калориметрия, дифференциальная сканирующая калориметрия, флуоресценция, инфракрасное излучение (ИК), ядерный магнитный резонанс (ЯМР), рамановская спектроскопия, рефрактометрия, УФ-спектроскопия/спектроскопия в видимой области, масс-спектрометрия, иммунологические способы и т.п. Следует понимать, что способы могут быть скомбинированы. Согласно некоторым аспектам клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или аналог компстатина нацеленного действия (или композиция, содержащая клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или аналог компстатина нацеленного действия) обладает одним или большим количеством свойств, описанных в настоящем документе, по оценке с применением любых из вышеперечисленных способов. Согласно некоторым аспектам способы, подходящие для детекции и/или количественного определения аналога компстатина длительного действия, описаны в настоящем документе.
[00284] VI. Аналоги компстатина нацеленного действия
-3
-4
-5
-6
-7
-8
-9
[00285] В настоящем изобретении предложены и/или применяются аналоги компстатина нацеленного действия, содержащие нацеливающий фрагмент и фрагмент аналога компстатина, отличающийся тем, что указанный нацеливающий фрагмент нековалентно связывается с целевой молекулой. В некоторых аспектах настоящее изобретение обеспечивает аналоги компстатина нацеленного действия, аналогичные клеточно-реактивным аналогам компстатина, описанным в Разделе VI, отличающиеся тем, что указанные соединения содержат нацеливающий фрагмент помимо или вместо клеточно-реактивного фрагмента. Указанный нацеливающий фрагмент может включать, например, антитело, полипептид, пептид, нуклеиновую кислоту (например, аптамер), углевод, малую молекулу или супрамолекулярный комплекс, который(ая) специфически связывается с целевой молекулой. Согласно некоторым вариантам реализации аффинность (по оценке равновесной константы диссоциации, Kd) нацеливающего фрагмента в отношении целевой молекулы (по оценке равновесной константы диссоциации, Kd) составляет 10 М или менее, например, 10 М или менее, например, 10 М или менее, например, 10М или менее, 10М или менее, 10М или менее, или 10 М или менее в протестированных условиях, например, в физиологических условиях.
[00286] В тех вариантах реализации настоящего изобретения, в которых нацеливающий фрагмент представляет собой антитело, указанное антитело может представлять собой любой иммуноглобулин или его производное, сохраняющее связывающую способность, или любой белок, содержащий связывающий домен, гомологичный или в основном гомологичный связывающему домену иммуноглобулина. Такие белки могут быть получены из природных источников, либо частично или полностью получены синтетически (например, с применением технологий рекомбинантной ДНК, химического синтеза и т.п.). Указанное антитело может принадлежать любому виду, например, человеку, грызуну, кролику, козе, курице и т.п. Указанное антитело может принадлежать к любому классу иммуноглобулинов, в том числе к любому классу иммуноглобулинов человека: IgG, IgM, IgA, IgD и IgE. Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения указанное антитело может представлять собой такой фрагмент антитела, как Fab', F(ab').sub.2, scFv (одноцепочечный вариабельный), или другой фрагмент, сохраняющий участок связывания антигена, или полученный рекомбинантным способом scFv фрагмент, включая полученные рекомбинантным способом фрагменты. См., например. Alien, Т., Nature Reviews Cancer, Vol. 2, 750-765, 2002 и включенные туда ссылки. Могут применяться моновалентные, бивалентные или многовалентные антитела. Указанное антитело может представлять собой химерное антитело, например, такое, в котором вариабельный домен, полученный от грызуна, конденсирован с константным доменом, полученным от человека, соответственно, сохраняющее специфичность антитела грызуна. Согласно некоторым вариантам реализации антитело человека или его часть синтезируют, например, у грызунов, геном которых содержит гены иммуноглобулинов человека, с применением технологии дисплея, такой как фаговый дисплей и т.п. Согласно некоторым вариантам реализации гуманизированное антитело синтезируют прививкой одной или более определяющих комплементарность областей от не являющегося человеком вида (например, мыши) к последовательности антитела человека. Указанное антитело может быть частично или полностью гуманизировано. См., например, Almagro JC, Fransson J. Humanization of antibodies. Front Biosci. 13:1619-33 (2008) для ознакомления с обзором различных способов получения гуманизированных антител, которые могут применяться для получения нацеливающего фрагмента, подходящего для настоящего изобретения. Антитело может быть поликлональным или моноклональным, хотя для целей настоящего изобретения моноклональные антитела, как правило, предпочтительнее. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения применяют F(ab')2 или F(ab') фрагмент, тогда как согласно другим вариантам реализации применяют антитела, содержащие Fc-домен. В данной области техники известны способы получения специфически связывающихся антител практически для любой нужной молекулы. Так, моноклональные или поликлональные антитела могут быть очищены из природных источников, например, из крови или асцитной жидкости животного, у которого синтезируется указанное антитело (например, после иммунизации указанной молекулой или ее антигенным фрагментом), или могут быть получены рекомбинантным путем, в культуре клеток. В данной области техники известны способы получения фрагментов антител, например, с помощью расщепления, дисульфидного восстановления или синтеза.
[00287] Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения нацеливающий фрагмент может представлять собой любую молекулу, специфически связывающуюся с целевой молекулой по механизму, отличному от взаимодействия антиген-антитело. Такой нацеливающий фрагмент называют «лигандом». Например, согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения лиганд может представлять собой полипептид, пептид, нуклеиновую кислоту (например, ДНК или РНК), углевод, липид или фосфолипид, либо малую молекулу. Согласно некоторым вариантам реализации малая молекула представляет собой органическое соединение, либо встречающееся в природе, либо полученное искусственным путем, которое имеет относительно низкую молекулярную массу и не является белком, полипептидом, нуклеиновой кислотой или липидом, как правило, с молекулярной массой, составляющей менее чем приблизительно 1500 г/моль, и, как правило, содержащее несколько углерод-углеродных связей. В общем случае аптамер представляет собой олигонуклеотид (например, РНК или ДНК, необязательно содержащий один или более модифицированных нуклеозидов (например, основания или сахара, отличные от 5 стандартных оснований (A, G, С, Т, U) или Сахаров (рибозы и дезоксирибозы), присутствующих в РНК и ДНК чаще всего), или модифицированные межнуклеозидные связи (например, не-фосфодиэфирные связи), которые, например, стабилизируют указанную молекулу, например, придавая ей большую устойчивость к разложению нуклеазами), который связывается с конкретным белком. Согласно некоторым вариантам реализации длина олигонуклеотида составляет до приблизительно 100 нуклеозидов, например, от 12 до 100 нуклеозидов. Аптамеры могут быть получены с помощью процесса эволюции in vitro, называемого SELEX, и в данной области техники известны способы получения аптамеров, специфичных в отношении представляющего интерес белка. См., например, Brody E N, Gold L. J Biotechnol. 2000 March; 74(1):5-13. Согласно некоторым вариантам реализации применяют пептидную нуклеиновую кислоту или запертую нуклеиновую кислоту.
[00288] Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения нацеливающий фрагмент содержит пептид. Согласно некоторым вариантам реализации пептид, который связывается с представляющей интерес целевой молекулой, идентифицируют с применением технологии дисплея, такой как фаговый дисплей, рибосомный дисплей, дрожжевой дисплей и т.п.
[00289] В качестве лигандов могут применяться малые молекулы. Способы идентификации таких лигандов известны в данной области техники. Например, можно идентифицировать малые молекулы-лиганды для многочисленных представляющих интерес белков с помощью скрининга библиотек малых молекул in vitro, в том числе комбинаторных библиотек, и компьютерного скрининга, например, для идентификации малых органических соединений, которые связываются с
углублениями на поверхности белков (карманами) (Huang, Z., Pharm. & Ther. 86: 201-215, 2000).
[00290] Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения нацеливающие фрагменты не являются белками или молекулами, которые обычно применяют в качестве носителей и конъюгируют с антигенами для стимуляции синтеза антител. Примерами являются белки-переносчики или такие молекулы, как бычий сывороточный альбумин, гемоцианин фиссуреллы, бычий гамма-глобулин и дифтерийный токсин. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения указанный нацеливающий фрагмент не является Fc частью молекулы иммуноглобулина. Согласно некоторым вариантам реализации нацеливающий фрагмент представляет собой часть комплекса, содержащего один или более дополнительных фрагментов, к которым он ковалентно или нековалентно присоединен.
[00291] Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения целевая молекула может представлять собой любую молекулу, синтезируемую клеткой (включая любые формы, экспрессируемые на поверхности указанной клетки, или их модифицированные формы, по меньшей мере отчасти формирующиеся в результате экстраклеточной модификации). Согласно некоторым вариантам реализации целевая молекула представляет собой внеклеточное вещество, присутствующее в ткани или на ткани. Согласно некоторым вариантам реализации целевая молекула характерна для конкретного заболевания или физиологического состояния или характерна для одного или более типов клеток или тканей. Целевая молекула часто представляет собой молекулу, по меньшей мере частично присутствующую на поверхности клетки (например, трансмембранный или иным образом присоединенный к мембраной белок), так что по меньшей мере часть указанной молекулы доступна для связывания с внеклеточным связывающим агентом, таким как антитело. Целевая молекула может быть, но не обязательно, специфичной для какого-либо типа клеток. Например, специфичная для определенного типа клеток целевая молекула часто представляет собой белок, пептид, мРНК, липид или углевод, который присутствует на клетках или в клетках конкретного типа (типов) в большем количестве, чем на клетках или в клетках многих других типов. В некоторых случаях специфичная для определенного типа клеток целевая молекула присутствует в детектируемых количествах только в клетках или на клетках конкретного представляющего интерес типа. В то же время следует иметь в виду, что подходящая специфичная для определенного типа клеток целевая молекула не обязательно должна быть абсолютно специфичной для представляющего интерес типа клеток, чтобы считаться специфичной для указанного типа клеток. Согласно некоторым вариантам реализации уровни экспрессии специфичной для конкретного типа клеток целевой молекулы по меньшей мере в 3 раза выше в клетках данного типа, чем в клетках эталонной популяции, которая может представлять собой, например, смесь, содержащую приблизительно равные количества клеток нескольких (например, 5-10 или более) разных тканей или органов. Согласно некоторым вариантам реализации специфичная для определенного типа клеток целевая молекула присутствует в количествах, по меньшей мере в 4-5 раз, 5-10 раз или более чем в 10 раз больших по сравнению со средней экспрессией в эталонной популяции. Согласно некоторым вариантам реализации обнаружение или измерение специфичной для типа клеток целевой молекулы позволяет специалисту в данной области техники отличить тип или типы клеток, представляющий(ие) интерес, от клеток многих, большинства или всех других типов. В целом, присутствие и/или высокое содержание большинства целевых молекул может быть определено с применением одной или более стандартных техник, таких как нозерн-блоттинг, гибридизация in situ, ОТ-ПЦР, секвенирование, иммунологических способов, таких как иммуноблоттинг, иммунодетекция (например, иммуногистохимическая), или обнаружение с помощью флуоресценции после окрашивания флуоренцентно мечеными антителами (например, с применением FACS), олигонуклеотидных или кДНК микрочипов или мембранных чипов, белкового анализа на микрочипах, масс-спектроскопии и т.п.
[00292] Согласно некоторым вариантам реализации целевая молекула представляет собой канал, переносчик, рецептор или другую молекулу, по меньшей мере частично экспонируемую на поверхности клетки. Согласно некоторым вариантам реализации целевая молекула представляет собой переносчик анионов или водный канал (например, белок аквапорин).
[00293] Согласно некоторым вариантам реализации целевая молекула представляет собой белок, по меньшей мере частично экспонируемый на поверхности эритроцитов, такой как гликофорин (например, гликофорин А, В, С или D) или белок полосы 3.
[00294] Согласно некоторым вариантам реализации указанная целевая молекула представляет собой белок, по меньшей мере частично экспонируемый на поверхности эндотелиальных клеток. Согласно некоторым вариантам реализации указанная целевая молекула присутствует на поверхности нормальных здоровых сосудов. Согласно некоторым вариантам реализации указанная целевая молекула присутствует на поверхности активированных эндотелиальных клеток. Согласно некоторым вариантам реализации указанная целевая молекула присутствует на поверхности активированных эндотелиальных клеток, но не на поверхности неактивированных эндотелиальных клеток. Согласно некоторым вариантам реализации целевая молекула представляет собой молекулу, экспрессия или экспонирование которой индуцируется таким стимулом, как повреждение или воспаление. Согласно некоторым вариантам реализации целевая молекула будет распознана реципиентом как «несобственная» при получении трансплантата, содержащего клетки, экспрессирующие указанную целевую молекулу. Согласно некоторым вариантам реализации указанная целевая молекула представляет собой углеводный ксеноантиген, антитела к которому, как правило, обнаруживаются у человека. Согласно некоторым вариантам реализации указанный углевод включает антиген группы крови. Согласно некоторым вариантам реализации указанный углевод включает ксеноантиген, например, эпитоп альфа-Gal (Galalpha1-3Galbeta1-(3)4GlcNAc-R) (см., например, Macher ВА and Galili U. The Galalpha1, 3Galbeta1, 4GlcNAc-R (alpha-Gal) epitope: a carbohydrate of unique evolution and clinical relevance. Biochim Biophys Acta. 1780(2):75-88 (2008).
[00295] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения аналог компстатина содержит и нацеливающий фрагмент, и СКФ.
[00296] Согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина нацеленного действия содержит несколько нацеливающих фрагментов, которые могут быть одинаковыми или разными. Разные нацеливающие фрагменты могут связываться с одной и той же целевой молекулой или с разными целевыми молекулами. В настоящем изобретении предложен аналог компстатина нацеленного действия, являющийся многовалентным в отношении нацеливающего фрагмента, аналога компстатина, или обоих.
[00297] В целом, настоящее изобретение охватывает любой способ получения соединения, содержащего фрагмент аналога компстатина и нацеливающий фрагмент, и полученные соединения. Согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина нацеленного действия может быть получен с применением способов, в целом аналогичных описанным в Разделе VI, отличающихся тем, что нацеливающий фрагмент применяют вместо клеточно-реактивного фрагмента или наряду с ним. Согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина нацеленного действия, содержащий пептид в качестве нацеливающего фрагмента, синтезируют в виде полипептидной цепи, содержащей фрагмент аналога компстатина и пептидный нацеливающий фрагмент. Указанная полипептидная цепь необязательно содержит один или более спейсерных пептидов между фрагментом аналога компстатина и нацеливающим фрагментом.
[00298] Согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина нацеленного действия имеет молярную активность, составляющую по меньшей мере приблизительно 10%, 20% или 30%, например, от 30% до 40%, от 30% до 50%, от 30% до 60%, от 30% до 70%, от 30% до 80%, от 30% до 90% или более, от активности соответствующего аналога компстатина, имеющего такую же последовательность аминокислот (и, в надлежащих случаях, один или более блокирующих фрагментов), но не содержащего нацеливающего фрагмента. Согласно некоторым вариантам реализации, отличающимся тем, что аналог компстатина нацеленного действия содержит несколько фрагментов аналога компстатина, молярная активность указанного аналога компстатина нацеленного действия составляет по меньшей мере приблизительно 10%, 20% или 30%, например, от 30% до 40%, от 30% до 50%, от 30% до 60%, от 30% до 70%, от 30% до 80%, от 30% до 90% или более, от суммарной активности указанных фрагментов аналога компстатина. Композиции и способы получения аналогов компстатина нацеленного действия и промежуточные продукты синтеза являются аспектами настоящего изобретения.
[00299] VII. Применение
[00300] Клеточно-реактивные аналоги компстатина, аналоги компстатина длительного действия или нацеленного действия имеют широкий ряд применений. В настоящей заявке, без какого-либо ограничения настоящего изобретения, описаны определенные варианты применения клеточно-реактивных аналогов компстатина, аналогов компстатина длительного действия или нацеленного действия и связанные с ними аспекты настоящего изобретения. Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия вводят субъекту, страдающему от комплемент-опосредованного повреждения или имеющему риск возникновения комплемент-опосредованного повреждения органа, ткани или клеток. Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина приводят в контакт с органом, тканью или клетками ex vivo, и он ковалентно связывается с ними. Указанный орган, ткань или клетки вводят субъекту, и они защищены от повреждения, которое в иных обстоятельствах происходило бы под действием системы комплемента реципиента.
[00301] Для целей, описанных в настоящей заявке, могут применяться аналоги компстатина, которые не связываются ковалентно с клетками. Например, может применяться аналог компстатина, модифицированный фрагментом, увеличивающим время жизни указанного соединения в организме, и/или аналог компстатина, содержащий фрагмент, нацеливающий указанный аналог компстатина по отношению к типу клеток или к области, чувствительному(ой) к активации комплемента; настоящее изобретение охватывает такие варианты применения. Согласно некоторым вариантам реализации применяют аналог компстатина длительного действия. Согласно некоторым вариантам реализации применяют аналог компстатина, содержащий нацеливающий фрагмент. Согласно некоторым вариантам реализации применяют аналог компстатина, содержащий как фрагмент, увеличивающий время жизни указанного соединения в организме, так и нацеливающий фрагмент. В тех случаях, когда ниже идет речь о клеточно-реактивном аналоге компстатина, в настоящем изобретении предложены аналогичные композиции и способы, относящиеся к аналогам компстатина нацеленного действия, а также (по меньшей мере в аспектах, подразумевающих введение аналога компстатина субъекту) варианты реализации, отличающиеся тем, что аналог компстатина, не содержащий нацеливающего фрагмента или клеточно-реактивного фрагмента, необязательно аналог компстатина длительного действия, применяют вместо клеточно-реактивного аналога компстатина или наряду с ним.
[00302] Определенные представляющие интерес варианты применения включают: (1) защиту красных клеток крови (кКК) от опосредованного комплементом повреждения у индивидуумов с такими нарушениями, как пароксизмальная ночная гемоглобинурия или атипичный гемолитико-уремический синдром, или другими нарушениями, характеризующимися комплемент-опосредованным лизисом кКК; (2) защиту трансплантированных органов, тканей и клеток от комплемент-опосредованного повреждения; (3) уменьшение ишемического/реперфузионного (И/Р) повреждения (например, у индивидуумов, страдающих от травмы, обструкции сосудов, инфаркта миокарда, или в других ситуациях, при которых может происходить И/Р повреждение); и (4) защиту различных структур организма (например, сетчатки) или мембран (например, синовиальной мембраны), которые могут подвергаться действию компонентов комплемента, от комплемент-опосредованного повреждения при любом из разнообразных комплемент-опосредованных нарушений. Благоприятные эффекты ингибирования активации комплемента на поверхности клеток или других структур организма не ограничены обусловленными непосредственно защитой собственно указанных клеток или структур от прямого комплемент-опосредованного повреждения (например, предотвращением лизиса клеток). Так, ингибирование активации комплемента с применением клеточно-реактивного аналога компстатина может снижать синтез анафилатоксинов и, в результате, приток/активацию нейтрофилов и другие провоспалительные проявления, и/или снижать потенциально разрушительное высвобождение внутриклеточного содержимого, потенциально оказывая, таким образом, благоприятное действие на отдаленные системы органов или на весь организм.
[00303] А. Защита клеток крови
[00304] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина нацеленного действия на клетки и/или аналог компстатина ненацеленного действия (например, аналог компстатина длительного, но ненацеленного действия) применяют для защиты клеток крови от комплемент-опосредованного повреждения. Указанные клетки крови могут представлять собой любой клеточный компонент крови, например, эритроциты (красные клетки крови, кКК), лейкоциты (белые клетки крови, бКК) и/или тромбоциты. Согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина клеточно-нацеленного действия нацелен на целевую молекулу, экспонируемую на поверхности клеток кКК, такую как гликофорин или белок полосы 3. С комплемент-опосредованным повреждением клеток крови связаны разнообразные нарушения. Такие нарушения могут развиваться в результате, например, дефицита или дефектов одного или нескольких клеточных или растворимых СРБ у индивидуума, например, из-за (а) мутации(й) гена(ов), кодирующего(их) такие белки; (b) мутации(ий) в генах, необходимых для синтеза или нормального функционирования одного или нескольких СРБ, и/или (с) присутствия аутоантител против одного или нескольких СРБ. Комплемент-опосредованный лизис кКК может происходить в результате присутствия аутоантител к антигенам кКК, которые могут появляться в связи с разнообразными причинами (часто идиопатическими). У индивидуумов с такой(ими) мутацией(ями) в генах, кодирующих СРБ, и/или антителами против СРБ или против собственных кКК имеется повышенный риск нарушений, включающих комплемент-опосредованное повреждение кКК. У индивидуумов, перенесших один или более характерных для нарушения эпизодов, имеется повышенный риск рецидива.
[00305] Пароксизмальная ночная гемоглобинурия (ПНГ) представляет собой относительно редкое нарушение, включающее приобретенную гемолитическую анемию, характеризующуюся комплемент-опосредованным внутрисосудистым гемолизом, гемоглобинурией, недостаточностью костного мозга и тромбофилией (склонностью к формированию тромбов). Она поражает приблизительно 16 индивидуумов на миллион по всему миру, встречается у представителей обоих полов и может возникнуть в любом возрасте, часто поражая молодых людей (Bessler, М. & Hiken, J., Hematology Am Soc Hematol Educ Program, 104-110 (2008); Hillmen, P. Hematology Am Soc Hematol Educ Program, 116-123 (2008)). ПНГ представляет собой хроническое истощающее заболевание с периодическими эпизодами острого гемолиза, приводящее к тяжелым клиническим проявлениям и сокращению продолжительности жизни. Помимо анемии, многие пациенты испытывают боли в животе, страдают от дисфагии, эректильной дисфункции и легочной гипертензии, у них имеется повышенный риск почечной недостаточности и тромбоэмболических осложнений.
[00306] ПНГ впервые была описана как отдельное явление в первом десятилетии XIX века, но только в 1950-х годах, после открытия альтернативного пути активации комплемента, была точно установлена причина гемолиза при ПНГ (Parker CJ. Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria: an historical overview. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 93-103 (2008)). В норме CD55 и CD59 присоединены к клеточной мембране гликозилфосфатидилинозитольными (ГФИ) якорями (гликолипидными структурами, заякоривающими определенные белки на плазматической мембране). ПНГ возникает как последствие незлокачественной клональной экспансии гемопоэтической стволовой клетки(клеток), которая(ые) приобрела(и) соматическую мутацию в гене PIGA, кодирующем белок, вовлеченный в синтез ГФИ-якорей (Takeda J, et al. Deficiency of the GPI anchor caused by a somatic mutation of the PIG-A gene in paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. Cell. 73:703-711 (1993)). Потомки таких стволовых клеток дефицитны по ГФИ-заякоренным белкам, в том числе CD55 и CD59. Указанный дефект делает клетки чувствительными к комплемент-опосредованному лизису кКК. Для постановки диагноза часто применяют проточно-цитометрический анализ с применением антител к ГФИ-заякоренным белкам. Он позволяет обнаружить дефицит ГФИ-заякоренных белков на поверхности клетки, определить степень дефицита и долю пораженных клеток (Brodsky RA. Advances in the diagnosis and therapy of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. Blood Rev. 22(2):65-74 (2008). Клетки кКК при ПНГ III типа полностью дефицитны по ГФИ-связанным белкам и высокочувствительны к комплементу, тогда как кКК при ПНГ II типа частично дефицитны и менее чувствительны. FLAER представляет собой флуоренцентно меченый неактивный вариант проаэролизина (бактериального токсина, который связывает ГФИ-якоря), и его все чаще используют вместе с проточной цитометрией для диагностики ПНГ. Отсутствие связывания FLAER с гранулоцитами является достаточным для диагностирования ПНГ. Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина защищает кКК при ПНГ от отложения C3b.
[00307] Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия вводят субъекту, страдающему от атипичного гемолитического синдрома (аГУС). аГУС представляет собой хроническое нарушение, характеризующееся микроангиопатической гемолитической анемией, тромбоцитопенией и острой почечной недостаточностью, и обусловленное неадекватной активацией комплемента, часто по причине наличия мутаций в генах, кодирующих регуляторные белки комплемента (Warwicker, P., et al.. Kidney Int 53, 836-844 (1998); Kavanagh, D. & Goodship, T. Pediatr Nephrol 25, 2431-2442 (2010). Мутации в гене фактора комплемента Н (CFH) являются наиболее частой генетической аномалией среди пациентов с аГУС, и 60-70% указанных пациентов умирает или достигает терминальной стадии почечной недостаточности в течение одного года после начала заболевания (Kavanagh & Goodship, выше). Также описаны мутации фактора I, фактора В, С3, связанных с фактором Н белков 1-5 и тромбомодулина. Другие причины аГУС включают наличие аутоантител против регуляторных белков комплемента, таких как CFH. Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия вводят субъекту, у которого, как было установлено, имеется мутация фактора I, фактора В, С3, связанных с фактором Н белков 1-5 или тромбомодулина, либо, как было установлено, присутствуют антитела против регуляторного белка комплемента, например, CFH.
[00308] Комплемент-опосредованный гемолиз наблюдается в разнородной группе других состояний, включающей аутоиммунные гемолитические анемии, вовлекающие антитела, которые связываются с кКК, и приводящие к комплемент-опосредованному гемолизу. Например, такой гемолиз может происходить при первичной хронической болезни холодовых агглютининов и в ходе определенных реакций на лекарственные препараты и другие чужеродные вещества (Berentsen, S., et al., Hematology 12, 361-370 (2007); Rosse, W.F., Hillmen, P. & Schreiber, A.D. Hematology Am Soc Hematol Educ Program, 48-62 (2004)). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клеточно-реактивный аналог компстатина вводят субъекту, страдающему от хронической болезни Холодовых агглютининов или субъекту, у которого имеется риск возникновения хронической болезни Холодовых агглютининов. Согласно другому варианту реализации клеточно-реактивный аналог компстатина применяют для лечения субъекта, страдающего от HELLP-синдрома, или субъекта, у которого имеется риск возникновения HELLP-синдрома, который диагностируют по наличию гемолиза, повышенных уровней печеночных ферментов и низкому содержанию тромбоцитов, и который по меньшей мере у некоторых субъектов связан с мутациями регуляторного(ых) белка(ов) комплемента (Fakhouri, F., et al., 112: 4542-4545 (2008)).
[00309] Согласно другим вариантам реализации клеточно-реактивные аналоги компстатина применяют для защиты кКК или других клеточных компонентов крови, предназначенных для переливания субъекту. Некоторые примеры таких применений подробнее описаны ниже. Как уже отмечалось, аналоги компстатина нацеленного действия и/или длительного действия могут применяться в описанных выше способах ингибирования комплемент-опосредованного гемолиза и/или повреждения кКК. Согласно некоторым вариантам реализации для лечения ПНГ или аГУС применяют аналог компстатина длительного действия, содержащий фрагмент (CH2CH2O).
[00310] В. Трансплантация
[00311] Трансплантация представляет собой приобретающий все большее значение метод лечения, который обеспечивает способы замещения органов и тканей, поврежденных при травме, заболевании или других состояниях. Почки, печень, легкие, поджелудочная железа и сердце относятся к органам, которые могут быть успешно трансплантированы. Часто трансплантируемые ткани включают кости, хрящи, сухожилия, роговицу, кожу, клапаны сердца и кровеносные сосуды. Трансплантация панкреатического островка или островковых клеток представляет собой перспективный подход для лечения диабета, например, диабета I типа. Для целей настоящего изобретения орган, ткань или клетка (или популяция клеток), который(ая) предназначен(а) для трансплантации, трансплантируется или был(а) трансплантирован(а), может называться «трансплантат». Для целей настоящего изобретения переливание крови считается «трансплантацией».
[00312] При трансплантации трансплантат подвергается разнообразным разрушительным воздействиям и стимулам, которые могут вносить вклад в развитие дисфункции трансплантата и, потенциально, недостаточности трансплантата. Например, ишемическое/реперфузионное (И/Р) повреждение представляет собой распространенную и весомую причину заболеваемости и смертности для многих трансплантатов (в частности, паренхиматозных органов) и может быть главным фактором, определяющим вероятность выживания трансплантата. Отторжение трансплантата представляет собой один из основных рисков, связанных с трансплантацией между генетически отличными индивидуумами, и может приводить к недостаточности трансплантата и необходимости извлечения указанного трансплантата из тела реципиента.
[00313] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина нацеленного действия на клетки и/или аналог компстатина длительного действия применяют для защиты трансплантата от комплемент-опосредованного повреждения. Аналог компстатина нацеленного действия на клетки вступает в реакцию с клетками трансплантата, ковалентно присоединяется к нему и ингибирует активацию комплемента. Аналог компстатина нацеленного действия на клетки связывается с целевой молекулой в трансплантате (например, экспрессируемой эндотелиальными клетками или другими клетками трансплантата) и ингибирует активацию комплемента. Целевая молекула может, например, представлять собой молекулу, экспрессия которой индуцируется или стимулируется таким стимулом, как повреждение или воспаление, молекулу, которая распознается как «несобственная» реципиентом, углеводный ксеноантиген, антитела против которого обычно имеются у людей, например, антиген группы крови, или ксеноантиген, например, молекулу, содержащую эпитоп альфа-Gal. Согласно некоторым вариантам реализации снижение активации комплемента может проявляться в виде снижения средних показателей отложения C4d в кровеносных сосудах трансплантатов, которые были приведены в контакт с аналогом компстатина, например, с клеточно-реактивным аналогом компстатина, по сравнению со средним уровнем отложения C4d в трансплантатах, которые не были приведены в контакт с аналогом компстатина (например, у субъектов с аналогичными трансплантатами, получающих другую аналогичную терапию).
[00314] Трансплантат может быть приведен в контакт с клеточно-реактивным аналогом компстатина длительного действия или нацеленного действия до, во время и/или после трансплантирования, согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения. Например, перед трансплантацией трансплантат, извлеченный из тела донора, может быть приведен в контакт с жидкостью, содержащей клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия. Например, указанный трансплантат может быть погружен в указанный раствор и/или перфузирован указанным раствором. Согласно другому варианту реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия вводят донору перед извлечением трансплантата. Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия вводят реципиенту во время и/или после введения трансплантата. Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный компстатин, аналог длительного действия или нацеленного действия вводят местно в трансплантированный трансплантат. Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина вводят системно, например, внутривенно.

[00315] В настоящем изобретении предложена композиция, содержащая: (а) выделенный трансплантат и (b) клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия. Согласно некоторым вариантам реализации указанная композиция дополнительно содержит жидкий раствор, подходящий для приведения в контакт (например, подходящий для ополаскивания, промывания, погружения, перфузии, поддержания или хранения) с трансплантатом (например, органом), в частности, выделенным трансплантатом, извлеченным из тела донора и предназначенным для трансплантирования реципиенту. Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложена композиция, содержащая: (а) жидкий раствор, подходящий для приведения в контакт с трансплантатом (например, органом); и (b) клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия. Указанный жидкий раствор может представлять собой любой жидкий раствор, физиологически приемлемый для данного трансплантата (например, подходящий осмотический состав, не цитотоксичный), медицински приемлемый с учетом последующего введения трансплантата реципиенту (например, предпочтительно стерильный или по меньшей мере не содержащий неприемлемых количеств микроорганизмов или других загрязняющих примесей) и совместимый с клеточно-реактивным аналогом компстатина (т.е. не устраняющий реакционную способность указанного аналога компстатина), или совместимый с аналогом компстатина длительного действия или нацеленного действия. Согласно некоторым вариантам реализации раствор представляет собой любой известный в данной области техники раствор, предназначенный для любых таких целей. Согласно некоторым вариантам реализации жидкий раствор представляет собой раствор Маршалла, или гиперосмолярный цитратный раствор (Soltran, Baxter Healthcare), раствор Университета Висконсина в Мэдисоне (UW) (ViaSpan™, Bristol Myers Squibb), раствор гистидин-триптофан-кетоглутарат (HTK) (Custodial, Kohler Medical Limited), EuroCollins (Fresenius) и Celsior (Sangstat Medical), Polysol, IGL-1 или AQIX RS-1. Разумеется, могут применяться другие растворы, относящиеся к физиологически приемлемым композициям, например, содержащие эквивалентные или сходные ингредиенты в тех же или в других концентрациях. Согласно некоторым вариантам реализации раствор не содержит ингредиента(ов), с которым(и) указанный клеточно-реактивный аналог компстатина предположительно будет активно вступать в реакцию, и любой раствор может быть модифицирован или разработан таким образом, чтобы не содержать таких ингредиентов. Согласно некоторым вариантам реализации указанный клеточно-реактивный аналог компстатина присутствует в трансплантат-совместимом растворе в концентрации, например, от 0,01 мг/мл до 100 мг/мл, или может быть добавлен к указанному раствору для получения такой концентрации.
[00316] Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложен набор, содержащий: (а) клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия; и (b) трансплантат-совместимый раствор или его твердые (например, в виде порошка) компоненты. Указанный клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия может быть представлен твердой формой (например, порошком) или раствором, в по меньшей мере частично растворенной форме. Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия и/или трансплантат-совместимый раствор представлены в заранее установленных количествах, таким образом, что при их сочетании образуется раствор, содержащий указанный клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия, с подходящей концентрацией для приведения в контакт с трансплантатом. Во многих вариантах реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия и трансплантат-совместимый раствор или его твердые (например, в виде порошка) компоненты находятся в отдельных емкостях, входящих в набор. Согласно некоторым вариантам реализации и клеточно-реактивный аналог компстатина, и компоненты трансплантат-совместимого раствора представлены твердой формой (например, порошком), в отдельных емкостях или в виде смеси. Согласно некоторым вариантам реализации указанный набор содержит инструкции по применению, например, инструкции по добавлению клеточно-реактивного аналога компстатина, аналога компстатина длительного действия или нацеленного действия в трансплантат-совместимый раствор и/или инструкции по приведению трансплантата в контакт с клеточно-реактивным аналогом компстатина. Указанный набор необязательно содержит этикетку, утвержденную государственным агентством, ответственным за контроль продуктов, применяемых для трансплантации, клеточной терапии и/или переливания крови.
[00317] В настоящем изобретении также предложен способ ковалентного связывания аналога компстатина с выделенным трансплантатом, включающий осуществление контакта указанного выделенного трансплантата с клеточно-реактивным аналогом компстатина. В настоящем изобретении также предложен выделенный трансплантат, к которому ковалентно присоединен аналог компстатина. Как правило, к указанному выделенному трансплантату присоединено множество молекул аналога компстатина. Согласно некоторым вариантам реализации трансплантат представляет собой или содержит паренхиматозный орган, такой как почка, печень, легкое, поджелудочная железа или сердце. Согласно некоторым вариантам реализации трансплантат представляет собой или содержит кость, хрящ, фасцию, сухожилие, связки, роговицу, склеру, перикард, кожу, сердечный клапан, кровеносный сосуд, амниотическую мембрану или твердую мозговую оболочку. Согласно некоторым вариантам реализации трансплантат содержит несколько органов, например, трансплантат сердца-легкого или поджелудочной железы-почки. Согласно некоторым вариантам реализации трансплантат включает орган или ткань не полностью. В частности, трансплантат может содержать часть органа или ткани, например, долю печени, участок кровеносного сосуда, лоскут кожи или сердечный клапан. Согласно некоторым вариантам реализации трансплантат содержит препарат, содержащий выделенные клетки или фрагменты ткани, извлеченные из исходной ткани, но сохраняющие по меньшей мере отчасти архитектуру ткани, например, островки поджелудочной железы. Согласно некоторым вариантам реализации препарат содержит выделенные клетки, не связанные друг с другом соединительной тканью, например, гемопоэтические стволовые клетки или клетки-предшественники, полученные из периферической и/или пуповинной крови, либо цельную кровь или любой содержащий клетки продукт крови, например, эритроциты (кКК) или тромбоциты. Согласно некоторым вариантам реализации трансплантат получен от скончавшегося донора (например, после смерти мозга (DBD-донор) или после сердечной смерти). Согласно некоторым вариантам реализации, в зависимости от конкретного типа трансплантата, трансплантат получают от живого донора. Например, почки, участки печени, клетки крови относятся к типам трансплантатов, которые часто получают от живого донора без чрезмерного риска для указанного донора и в соответствии с разумной медицинской практикой.
[00318] Согласно некоторым вариантам реализации трансплантат представляет собой ксенотрансплантат (т.е. донор и реципиент принадлежат к разным видам). Согласно некоторым вариантам реализации трансплантат представляет собой аутотрансплантат (т.е. трансплантат, переносимый из одной части тела в другую часть тела одного и того же индивидуума). Согласно некоторым вариантам реализации трансплантат представляет собой изотрансплантат (т.е. донор и реципиент генетически идентичны). Согласно большинству вариантов реализации указанный трансплантат представляет собой аллотрансплантат (т.е. донор и реципиент являются генетически не идентичными представителями одного вида). В случае аллотрансплантата донор и реципиент могут либо быть, либо не быть генетически связаны (например, они могут быть членами одной семьи). Как правило, донор и реципиент совместимы по группе крови (по меньшей мере совместимы в системе АВО и необязательно - в системах Rh, Kell и/или в других системах антигенной совместимости клеток крови). Кровь реципиента может подвергаться скринингу в отношении аллогенных антител против трансплантата и/или реципиента и донора, так как присутствие таких антител может приводить к сверхострому отторжению (т.е. отторжению, начинающемуся практически немедленно, например, в течение нескольких минут после начала контакта трансплантата с кровью реципиента). Анализ комплемент-зависимой цитотоксичности (КЗЦ) может применяться для скрининга сыворотки субъекта в отношении антител против HLA. Сыворотку инкубируют с панелью лимфоцитов с известным HLA-фенотипом. Если сыворотка содержит антитела против молекул HLA на клетках-мишенях, происходит гибель клетки в результате комплемент-опосредованного лизиса. Использование отобранной панели клеток-мишеней позволяет определить специфичность обнаруженного антитела. Другие техники, подходящие для определения присутствия или отсутствия антител против HLA и, необязательно, определения их HLA-специфичности, включают анализ ELISA, проточно-цитометрический анализ, технологии на основе микрогранул (например, технологию Luminex). Методология проведения указанных анализов общеизвестна, и существуют разнообразные коммерчески доступные наборы для их проведения.
[00319] Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия ингибирует комплемент-опосредованное отторжение. Например, согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия ингибирует сверхострое отторжение. Сверхострое отторжение обусловлено по меньшей мере частично антитело-опосредованной активацией системы комплемента у реципиента через классический путь и, в результате, отложением МАК на трансплантате. Это, как правило, происходит из-за уже присутствующих у реципиента антител, которые вступают в реакцию с трансплантатом. Хотя и желательно попытаться избежать сверхострого отторжения до трансплантации, обеспечив подбор совместимого трансплантата, это не всегда возможно, например, ввиду ограниченности времени и/или ресурсов. Кроме того, у некоторых реципиентов (например, у индивидуумов после неоднократного переливания, у индивидуумов, ранее получавших трансплантаты, у женщин после нескольких беременностей) может уже существовать такое значительное количество антител, в том числе, потенциально, антител против антигенов, проверку в отношении которых обычно не проводят, что своевременно подобрать гарантированно совместимый трансплантат может быть трудно или даже практически невозможно. У таких индивидуумов имеется повышенный риск сверхострого отторжения.
[00320] Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия ингибирует острое отторжение или недостаточность трансплантата. В настоящей заявке «острое отторжение» относится к отторжению, возникающему по меньшей мере через 24 часа, обычно по меньшей мере через несколько дней - неделю после трансплантации, и до 6 месяцев после трансплантации. Острое антитело-опосредованное отторжение (АОО) часто включает резкое повышение уровня донор-специфических аллоантител (ДСА) в течение нескольких первых недель после трансплантации. Не опираясь на конкретную теорию, возможно, что уже существующие клетки плазмы и/или конверсия В-клеток памяти в новые клетки плазмы играют определенную роль в повышении синтеза ДСА. Такие антитела могут вызывать комплемент-опосредованное повреждение трансплантата, которое может быть ингибировано путем приведения указанного трансплантата в контакт с клеточно-реактивным аналогом компстатина. Не опираясь на конкретную теорию, ингибирование активации комплемента в трансплантате может уменьшать лейкоцитарную инфильтрацию (например, нейтрофилами), также вносящую вклад в острую недостаточность трансплантата.
[00321] Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия ингибирует комплемент-опосредованное И/Р повреждение трансплантата. Согласно более подробному описанию, приведенному ниже, И/Р повреждение может происходить при реперфузии ткани, поступление крови в которую временно прерывалось, как это происходит в трансплантируемых органах. Уменьшение И/Р повреждения снижает вероятность наступления острой дисфункции трансплантата или снижает ее тяжесть и уменьшает вероятность развития острой недостаточности трансплантата.
[00322] Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия ингибирует хроническое отторжение и/или хроническую недостаточность трансплантата. В настоящей заявке «хроническое отторжение или недостаточность трансплантата» относится к отторжению или недостаточности, наступающему(ей) по меньшей мере через 6 месяцев после трансплантации, например, через 6 месяцев - 1, 2, 3, 4, 5 лет или более, после трансплантации, часто через месяцы или годы нормального функционирования трансплантата. Это обусловлено хроническим воспалительным и иммунным ответом против указанного трансплантата. Для целей настоящего изобретения хроническое отторжение может включать хроническую васкулопатию аллотрансплантата - этот термин применяют для обозначения фиброза внутренних кровеносных сосудов трансплантированной ткани. Так как за счет программ иммуносупрессивной терапии частота развития острого отторжения была снижена, все более значимым в качестве причины дисфункции и недостаточности трансплантатов становится хроническое отторжение. Появляется все больше доказательств того, что синтез аллоантител В-клетками является важным элементом возникновения хронического отторжения и недостаточности трансплантатов (Kwun J. and Knechtle SJ, Transplantation, 88(8):955-61 (2009). Более раннее повреждение трансплантата может представлять собой способствующий фактор, приводящий к хроническим процессам, таким как фиброз, которые могут приводить, в конечном счете, к хроническому отторжению. Таким образом, ингибирование такого раннего повреждения с помощью применения клеточно-реактивного аналога компстатина может задерживать и/или снижать вероятность наступления или тяжесть хронического отторжения трансплантата.
[00323] Согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина длительного действия вводят реципиенту трансплантата для ингибирования отторжения трансплантата и/или недостаточности трансплантата.
[00324] С. Ишемическое/реперфузионное повреждение
[00325] Ишемическое/реперфузионное (И/Р) повреждение представляет собой важную причину повреждения тканей после травм и при других условиях, связанных с временным прекращением кровотока, например, при инфаркте миокарда, инсульте, тяжелой инфекции, заболевании сосудов, реконструкции при аневризме, сердечно-легочном шунтировании и трансплантации.
[00326] При травме системная гипоксемия, гипотензия и локальное прерывание кровоснабжения в результате ушибов, синдрома сдавливания и повреждения сосудов приводят к ишемии, повреждающей метаболически активные ткани. Восстановление кровоснабжения запускает интенсивную системную воспалительную реакцию, часто более пагубную, чем собственно ишемия. После реперфузии области ишемии синтезируемые и высвобождающиеся местно факторы попадают в систему кровообращения и достигают отдаленных областей, иногда вызывая значительные повреждения органов, не затронутых изначальным ишемическим инсультом, например, легких и кишечника, приводя к дисфункции одного органа и к мультиорганной дисфункции. Активация комплемента происходит вскоре после реперфузии и представляет собой ключевой посредник пост-ишемического повреждения, действующий как прямо, так и опосредованно через хемоаттрактивные и стимулирующие эффекты на нейтрофилы. Все три основных пути комплемента активируются и, функционируя совместно или независимо, включаются в связанные с И/Р нежелательные явления, затрагивающие многие системы органов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия вводят субъекту, незадолго до этого (например, на протяжении предшествующих 2, 4, 8, 12, 24 или 48 часов) перенесшему травму, например, травму, приводящую к возникновению риска И/Р повреждения у указанного субъекта, например, из-за системной гипоксемии, гипотензии и/или локального прерывания кровоснабжения. Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина может быть введен внутрь сосуда, необязательно в кровеносный сосуд, через который кровь поступает в поврежденную часть тела, либо непосредственно в указанную часть тела. Согласно некоторым вариантам реализации субъект страдает от повреждения спинного мозга, травматического повреждения головного мозга, ожога и/или геморрагического шока.
[00327] Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия вводят субъекту до, во время или после хирургической процедуры, например, хирургической процедуры, которая, как ожидается, временно приостановит поступление крови в ткань, орган или часть тела. Примеры таких процедур включают сердечно-легочное шунтирование, ангиопластику, восстановление/замену клапана сердца, реконструкцию при аневризме или другие хирургические операции на сосудах. Указанный клеточно-реактивный аналог компстатина может быть введен до, после и/или на протяжении периода времени, частично совпадающего с хирургической процедурой.
[00328] Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия вводят субъекту, перенесшему ИМ, тромбоэмболический инсульт, тромбоз глубоких вен или эмболию легких. Указанный клеточно-реактивный аналог компстатина может быть введен в комбинации с тромболитическим агентом, таким как тканевый активатор плазминогена (tPA) (например, альтеплазой (активазой), ретеплазой (ретавазой), тенектеплазой (TNK-азой)), анистреплазой (эминазой), стрептокиназой (кабикиназой, стрептазой) или урокиназой (аббокиназой). Указанный клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия может быть введен до, после и/или на протяжении периода времени, частично совпадающего с периодом введения тромболитического агента.
[00329] Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия вводят субъекту для лечения И/Р повреждения.
[00330] D. Другие комплемент-опосредованные нарушения
[00331] Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия вводят в глаз для лечения глазного нарушения, такого как возрастная макулярная дегенерация (ВМД), диабетическая ретинопатия, глаукома или увеит. Например, клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или аналог компстатина нацеленного действия может быть введен в стекловидную полость (например, путем интравитреальной инъекции) для лечения субъекта, страдающего от ВМД или подверженного риску возникновения ВМД. Согласно некоторым вариантам реализации ВМД представляет собой неоваскулярную (влажную) ВМД. Согласно некоторым вариантам реализации ВМД представляет собой сухую ВМД. Как понимает средний специалист в данной области техники, сухая ВМД включает географическую атрофию (ГА), промежуточную ВМД и раннюю АМД. Согласно некоторым вариантам реализации субъекта с ГА лечат с целью замедлить или приостановить прогрессирование заболевания. Например, согласно некоторым вариантам реализации лечение субъекта с ГА снижает скорость гибели клеток сетчатки. Свидетельством снижения скорости гибели клеток сетчатки может быть снижение скорости роста поражения ГА у пациентов, получающих лечение LACA, по сравнению с контролем (например, пациентами, которые получают имитацию инъекции). Согласно некоторым вариантам реализации субъект страдает от промежуточной ВМД. Согласно некоторым вариантам реализации субъект страдает от ранней ВМД. Согласно некоторым вариантам реализации субъекта с промежуточной или ранней ВМД лечат с целью замедлить или приостановить прогрессирование заболевания. Например, согласно некоторым вариантам реализации лечение субъекта с промежуточной ВМД может замедлить или предотвратить прогрессирование в позднюю форму ВМД (неоваскулярную ВМД или ГА). Согласно некоторым вариантам реализации лечение субъекта с ранней ВМД может замедлить или предотвратить прогрессирование в промежуточную ВМД. Согласно некоторым вариантам реализации глаз характеризуется как ГА, так и неоваскулярной ВМД. Согласно некоторым вариантам реализации глаз характеризуется ГА, но не характеризуется влажной ВМД. Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия вводят путем интравитреальной инъекции для лечения глаукомы, увеита (например, заднего увеита) или диабетической ретинопатии. Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия вводят в переднюю камеру, например, для лечения переднего увеита.
[00332] Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия применяют для лечения субъекта, страдающего от аутоиммунного заболевания, или субъекта, у которого имеется риск возникновения аутоиммунного заболевания, например, аутоиммунного заболевания, опосредованного по меньшей мере частично антителами против одного или нескольких собственных антигенов.
[00333] Клеточно-реактивные аналоги компстатина, аналоги компстатина длительного действия или аналоги компстатина нацеленного действия могут быть введены в синовиальную полость, например, субъекту, страдающему от артрита (например, ревматоидного артрита). Разумеется, они могут быть введены системно дополнительно или
[00334] Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия применяют для лечения субъекта, страдающего от внутримозгового кровоизлияния, или субъекта, у которого имеется риск возникновения внутримозгового кровоизлияния.
[00335] Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия применяют для лечения субъекта, страдающего от миастении гравис, или субъекта, у которого имеется риск возникновения миастении гравис.
[00336] Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия применяют для лечения субъекта, страдающего от нейромиелита зрительного нерва (NMO/НЗН), или субъекта, у которого имеется риск возникновения НЗН.
[00337] Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия применяют для лечения субъекта, страдающего от мембранозно-пролиферативного гломерулонефрита (МПГН), или субъекта, у которого имеется риск возникновения МПГН, например, МПГН I типа, МПГН II типа или МПГН III типа.
[00338] Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия применяют для лечения субъекта, страдающего от нейродегенеративного заболевания, или субъекта, у которого имеется риск возникновения нейродегенеративного заболевания. Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия применяют для лечения субъекта, страдающего от нейропатической боли, или субъекта, у которого имеется риск развития нейропатической боли. Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия применяют для лечения субъекта, страдающего от риносинусита или назального полипоза или субъекта, у которого имеется риск возникновения риносинусита или назального полипоза. Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия применяют для лечения субъекта, страдающего от рака, или субъекта, у которого имеется риск возникновения рака. Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия применяют для лечения субъекта, страдающего от сепсиса, или субъекта, у которого имеется риск возникновения сепсиса. Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия применяют для лечения субъекта, страдающего от респираторного дистресс-синдрома взрослых, или субъекта, у которого имеется риск возникновения респираторного дистресс-синдрома взрослых.
[00339] Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия применяют для лечения субъекта, страдающего от анафилаксии или инфузионной реакции, или субъекта, у которого имеется риск возникновения анафилаксии или инфузионной реакции. Например, согласно некоторым вариантам реализации субъект может получать предварительное лечение до, во время или после получения лекарственного средства или основы, которые могут вызывать анафилаксию или инфузионную реакцию. Согласно некоторым вариантам реализации субъект, у которого имеется риск возникновения анафилаксии, или субъект, страдающий от анафилактической реакции на пищевой продукт (например, арахис, моллюски или другие пищевые аллергены), укус насекомого (например, пчелы, осы), получает лечение клеточно-реактивным аналогом компстатина длительного действия или нацеленного действия.
[00340] Указанный клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия может согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения быть введен местно или системно.
[00341] Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия применяют для лечения респираторного заболевания, например, астмы или хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ) или идиопатического легочного фиброза. Указанный клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия может, например, быть введен в дыхательные пути ингаляционным путем, например, в виде сухого порошка или распылением, или может быть введен путем инъецирования, например, внутривенно, внутримышечно или подкожно, согласно различным вариантам реализации. Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия применяют для лечения тяжелой астмы, например, астмы, которая недостаточно контролируется бронходилататорами и/или ингаляционными кортикостероидами.
[00342] Согласно некоторым аспектам предложены способы лечения комплемент-опосредованного нарушения, например, хронического комплемент-опосредованного нарушения, включающие введение ингибитора комплемента длительного действия субъекту, нуждающемуся в лечении указанного нарушения. Указанный аналог компстатина длительного действия согласно различным вариантам реализации может представлять собой любой описанный в настоящем документе аналог компстатина длительного действия. Согласно некоторым аспектам предложены способы лечения связанного с Th17 нарушения, включающие введение ингибитора комплемента длительного действия субъекту, нуждающемуся в лечении указанного нарушения.
[00343] Согласно некоторым аспектам «хроническое нарушение» представляет собой нарушение, персистирующее в течение по меньшей мере 3 месяцев и/или считающееся в данной области техники хроническим нарушением. Согласно многим вариантам реализации хроническое нарушение персистирует в течение по меньшей мере 6 месяцев, например, по меньшей мере 1 года или более, например, в течение неопределенного срока. Специалисту в данной области техники будет понятно, что по меньшей мере некоторые проявления различных хронических нарушений могут быть перемежающимися и/или их тяжесть может нарастать и убывать с течением времени. Хроническое нарушение может быть прогрессирующим, например, имеющим тенденцию к нарастанию тяжести или поражению больших областей с течением времени. В настоящем документе обсуждается ряд хронических комплемент-опосредованных нарушений. Хроническое комплемент-опосредованное нарушение может представлять собой любое хроническое нарушение, при котором задействована активация комплемента (например, избыточная или неадекватная активация комплемента), например, в качестве способствующего и/или по меньшей мере отчасти причинного фактора. Для удобства нарушения иногда группируют на основании органа или системы, в частности, часто поражаемого(ой) у субъектов, страдающих указанным нарушением. Следует иметь в виду, что некоторые нарушения могут поражать несколько органов или систем, и такая(ие) классификация(ии) никоим образом не являются ограничивающими. Кроме того, некоторые проявления (например, симптомы) могут наблюдаться у субъектов, страдающих любым из ряда различных нарушений. С неограничивающей информацией относительно представляющих интерес с точки зрения настоящего изобретения нарушений можно ознакомиться, например, в стандартных терапевтических руководствах, таких как Cecil Textbook of Medicine (например, издание 23),  Principles of Internal Medicine (например, издание 17), и/или стандартных руководствах, посвященных конкретным областям медицины, конкретным системам или органам организма и/или конкретным нарушениям.
[00344] Согласно некоторым вариантам реализации хроническое комплемент-опосредованное нарушение представляет собой связанное с Th2 нарушение. В настоящем документе связанное с Th2 нарушение представляет собой нарушение, характеризующееся избыточным количеством и/или избыточной или неадекватной активностью CD4+хелперных Т-клеток подтипа Th2 («Th2-клеток») в организме или его части, например, по меньшей мере в одной ткани, органе или структуре. Например, может иметь место преобладание Th2-клеток относительно CD4+ хелперных Т-клеток подтипа Th1 («Th1-клеток»), например, по меньшей мере в одной ткани, органе или структуре, пораженной нарушением. Как известно в данной области техники, Th2-клетки, как правило, секретируют характерные цитокины, такие как интерлейкин-4 (ИЛ-4), интерлейкин-5 (ИЛ-5) и интерлейкин-13 (ИЛ-13), тогда как Th1-клетки, как правило, секретируют интерферон-γ (ИФН-γ) и фактор некроза опухоли β (ФНО-β). Согласно некоторым вариантам реализации связанное с Th2 нарушение характеризуется избыточным синтезом и/или количеством ИЛ-4, ИЛ-5 и/или ИЛ-13, например, относительно ИФН-γ и/или ФНО-β, например, по меньшей мере в некоторых из по меньшей мере одной ткани, органа или структуры.
[00345] Согласно некоторым вариантам реализации хроническое комплемент-опосредованное нарушение представляет собой связанное с Th17 нарушение. Согласно некоторым аспектам, описанным более подробно в заявке PCT/US2012/043845, поданной 22 июня 2012 г., озаглавленной «Способы лечения хронических нарушений ингибиторами комплемента» ("Methods of Treating Chronic Disorders with Complement Inhibitors"), активация комплемента и Th17-клетки вовлечены в цикл, который задействует дендритные клетки и антитела и способствует поддержанию патологического иммунологического микроокружения, лежащего в основе ряда нарушений. Не опираясь на конкретную теорию, указанное патологическое иммунологическое микроокружение, однажды возникнув, самоподдерживается и способствует повреждению клеток и тканей. Согласно некоторым аспектам аналоги компстатина длительного действия подходят для лечения связанных с Th17 нарушений.
+
+
[00346] В настоящем документе связанное с Th17 нарушение представляет собой нарушение, характеризующееся избыточным количеством и/или избыточной или неадекватной активностью CD4+ хелперных Т-клеток подтипа Th17 («Th17-клетки») в организме или его части, например, по меньшей мере в одной ткани, органе или структуре. Например, может наблюдаться преобладание Th17-клеток относительно Th1- и/или Th2-клеток, например, по меньшей мере в одной ткани, органе или структуре, пораженной нарушением. Согласно некоторым вариантам реализации преобладание Th17-клеток представляет собой относительное преобладание, например, пропорция Th17-клеток относительно Th1-клеток, и/или пропорция Th17-клеток относительно Th2-клеток увеличивается относительно нормальных значений. Согласно некоторым вариантам реализации пропорция Th17-клеток относительно регуляторных Т-клеток (регуляторные CD4CD25Т-клетки, также называемые «Treg-клетками») увеличивается относительно нормальных значений. Образованию Th17-клеток и/или активации Th17-клеток способствуют различные цитокины, например, интерлейкин 6 (ИЛ-6), интерлейкин 21 (ИЛ-21), интерлейкин 23 (ИЛ-23) и/или интерлейкин 1β (ИЛ-1β). Образование Th17-клеток включает дифференцировку предшественников Т-клеток, например, необученных CD4+ Т-клеток, в фенотип Th17, и их созревание в функциональные Th17-клетки. Согласно некоторым вариантам реализации образование Th17-клеток охватывает любой аспект развития, пролиферации (размножения), выживания и/или созревания Th17-клеток. Согласно некоторым вариантам реализации связанное с Th17 нарушение характеризуется избыточным синтезом и/или количеством ИЛ-6, ИЛ-21, ИЛ-23 и/или ИЛ-1β. Th17-клетки, как правило, секретируют характерные цитокины, такие как интерлейкин-17А (ИЛ-17А), интерлейкин- 17F (ИЛ-17Р), интерлейкин-21 (ИЛ-21) и интерлейкин-22 (ИЛ-22). Согласно некоторым вариантам реализации связанное с Th17 нарушение характеризуется избыточным синтезом и/или количеством эффекторного Th17-цитокина, например, ИЛ-17А, ИЛ-17F, ИЛ-21 и/или ИЛ-22. Согласно некоторым вариантам реализации избыточный синтез или количество цитокина является детектируемым в крови. Согласно некоторым вариантам реализации избыточной синтез или количество цитокина является детектируемым локально, например, по меньшей мере в одной ткани, органе или структуре. Согласно некоторым вариантам реализации связанное с Th17 нарушение связано с уменьшенным количеством Treg и/или уменьшенным количеством связанного с Treg цитокина. Согласно некоторым вариантам реализации Th17-нарушение представляет собой любое хроническое воспалительное заболевание; указанный термин охватывает ряд болезней, характеризующихся самоподдерживающейся иммунной атакой в отношении различных тканей, которая предположительно уже не связана с первоначальным вызвавшим указанную болезнь повреждением (которое может быть неизвестно). Согласно некоторым вариантам реализации связанное с Th17 нарушение представляет собой любое аутоиммунное заболевание. Большинство, если не все «хронические воспалительные заболевания» могут фактически представлять собой аутоиммунные заболевания. Примеры связанных с Th17 нарушений включают воспалительные заболевания кожи, такие как псориаз и атопический дерматит; системную склеродермию и склероз; воспалительное заболевание кишечника (ВЗК) (такое как болезнь Крона и язвенный колит); болезнь Бехчета; дерматомиозит; полимиозит; рассеянный склероз (PC); дерматит; менингит; энцефалит; увеит; остеоартрит; волчаночный нефрит; ревматоидный артрит (РА), синдром Шегрена, рассеянный склероз, васкулит; воспалительные нарушения центральной нервной системы (ЦНС), хронический гепатит; хронический панкреатит, гломерулонефрит; саркоидоз; тиреоидит, патологические иммунные ответы на трансплантацию ткани/органа (например, отторжение трансплантата); ХОБЛ, астму, бронхиолит, гиперчувствительность, пневмонит, идиопатический фиброз легких (ИФЛ), периодонтит и гингивит. Согласно некоторым вариантам реализации Th17 заболевание представляет собой классическое известное аутоиммунное заболевание, такое как диабет I типа или псориаз. Согласно некоторым вариантам реализации связанное с Th17 нарушение представляет собой возрастную макулярную дегенерацию.
[00347] Согласно некоторым вариантам реализации хроническое комплемент-опосредованное нарушение представляет собой связанное с IgE нарушение. В настоящем документе «связанное с IgE нарушение» представляет собой нарушение, характеризующееся избыточным и/или неадекватным синтезом и/или количеством IgE, избыточной или неадекватной активностью продуцирующих IgE клеток (например, продуцирующих IgE В-клеток или плазмоцитов), и/или избыточной и/или неадекватной активностью IgE-отвечающих клеток, таких как эозинофилы или тучные клетки. Согласно некоторым вариантам реализации связанное с IgE нарушение характеризуется повышенными уровнями общего IgE и/или согласно некоторым вариантам реализации аллергенспецифического IgE в плазме субъекта и/или локально.
[00348] Согласно некоторым вариантам реализации хроническое комплемент-опосредованное нарушение характеризуется присутствием аутоантител и/или иммунных комплексов в организме, которые могут активировать комплемент через, например, классический путь. Аутоантитела могут, например, связываться с собственными антигенами, например, на клетках или тканях в организме. Согласно некоторым вариантам реализации аутоантитела связываются с антигенами в кровеносных сосудах, коже, нервах, мышцах, соединительной ткани, сердце, почках, щитовидной железе и т.п. Согласно некоторым вариантам реализации субъект страдает от нейромиелита зрительного нерва, и у субъекта образуются аутоантитела (например, аутоантитело IgG) против аквапорина 4. Согласно некоторым вариантам реализации субъект страдает от пемфигоида, и у субъекта образуются аутоантитела (например, аутоантитело IgG или IgE) против структурного компонента полудесмосомы (например, трансмембранного коллагена XVII (BP 180 или BPAG2) и/или белка семейства плакинов ВР230 (BPAG1). Согласно некоторым вариантам реализации хроническое комплемент-опосредованное нарушение не характеризуется наличием аутоантител и/или иммунных комплексов.
[00349] Согласно некоторым вариантам реализации хроническое комплемент-опосредованное нарушение представляет собой респираторное нарушение. Согласно некоторым вариантам реализации хроническое респираторное нарушение представляет собой астму или хроническую обструктивную болезнь легких (ХОБЛ). Согласно некоторым вариантам реализации хроническое респираторное нарушение представляет собой фиброз легких (например, идиопатический фиброз легких), радиационно-индуцированное повреждение легких, аллергический бронхолегочный аспергиллез, гиперчувствительный пневмонит (также известен как аллергический альвеолит), эозинофильную пневмонию, интерстициальную пневмонию, саркоид, гранулематоз Вегенера или облитерирующий бронхиолит. Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложен способ лечения субъекта, нуждающегося в лечении хронического респираторного нарушения, например, астмы, ХОБЛ, фиброза легких, радиационно-индуцированного повреждения легких, аллергического бронхолегочного аспергиллеза, гиперчувствительного пневмонита (также известного как аллергический альвеолит), эозинофильной пневмонии, интерстициальной пневмонии, саркоида, гранулематоза Вегенера или облитерирующего бронхиолита, при этом указанный способ включает введение ингибитора комплемента длительного действия субъекту, нуждающемуся в лечении указанного нарушения.
[00350] Согласно некоторым вариантам реализации хроническое комплемент-опосредованное нарушение представляет собой аллергический ринит, риносинусит или назальный полипоз. Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложен способ лечения субъекта, нуждающегося в лечении аллергического ринита, риносинусита или назального полипоза, при этом указанный способ включает введение ингибитора комплемента длительного действия субъекту, нуждающемуся в лечении указанного нарушения.
[00351] Согласно некоторым вариантам реализации хроническое комплемент-опосредованное нарушение представляет собой нарушение, поражающее костно-мышечную систему. Примеры таких нарушений включают воспалительные состояния суставов (например, артрит, такой как ревматоидный артрит или псориатический артрит, ювенильный хронический артрит, спондилоартропатии, синдром Рейтера, подагра). Согласно некоторым вариантам реализации нарушение костно-мышечной системы приводит к таким симптомам, как боль, скованность и/или ограниченная подвижность пораженной(ых) части(ей) тела. Воспалительные миопатии включают дерматомиозит, полимиозит и различные другие нарушения с хроническим мышечным воспалением неизвестной этиологии, которые приводят к мышечной слабости. Согласно некоторым вариантам реализации хроническое комплемент-опосредованное нарушение представляет собой миастению гравис. Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложен способ лечения любых из вышеперечисленных нарушений, поражающих костно-мышечную систему, при этом указанный способ включает введение ингибитора комплемента длительного действия субъекту, нуждающемуся в лечении указанного нарушения.
[00352] Согласно некоторым вариантам реализации хроническое комплемент-опосредованное нарушение представляет собой нарушение, поражающее покровную систему. Примеры таких нарушений включают, например, атопический дерматит, псориаз, пемфигоид, пузырчатку, системную красную волчанку, дерматомиозит, склеродермию, склеродерматомиозит, синдром Шегрена и хроническую крапивницу. Согласно некоторым аспектам в настоящем изобретении предложен способ лечения любых из вышеперечисленных нарушений, поражающих покровную систему, при этом указанный способ включает введение ингибитора комплемента длительного действия субъекту, нуждающемуся в лечении указанного нарушения.
[00353] Согласно некоторым вариантам реализации хроническое комплемент-опосредованное нарушение поражает нервную систему, например, центральную нервную систему (ЦНС) и/или периферическую нервную систему (ПНС). Примеры таких нарушений включают, например, рассеянный склероз, другие хронические демиелинизирующие заболевания (например, нейромиелит зрительного нерва), боковой амиотрофический склероз, хроническую боль, инсульт, аллергический неврит, болезнь Хантингтона, болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона. Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложен способ лечения любых из вышеперечисленных нарушений, поражающих нервную систему, при этом указанный способ включает введение ингибитора комплемента, например, клеточно-реактивного аналога компстатина, аналога компстатина длительного действия или нацеленного действия субъекту, нуждающемуся в лечении указанного нарушения.
[00354] Согласно некоторым вариантам реализации хроническое комплемент-опосредованное нарушение поражает кровеносную систему. Например, согласно некоторым вариантам реализации указанное нарушение представляет собой васкулит или другое нарушение, связанное с воспалением сосудов, например, кровеносных сосудов и/или лимфатических сосудов. Согласно некоторым вариантам реализации васкулит представляет собой узелковый полиартрит, гранулематоз Вегенера, гигантоклеточный артериит, синдром Черджа-Стросса, микроскопический полиангиит, пурпуру Шенлейна-Геноха, синдром Такаясу, болезнь Кавасаки или болезнь Бехчета. Согласно некоторым вариантам реализации субъект, например, субъект, нуждающийся в лечении васкулита, положителен по антинейтрофильным цитоплазматическим антителам (АННА).
[00355] Согласно некоторым вариантам реализации хроническое комплемент-опосредованное нарушение поражает желудочно-кишечный тракт. Например, указанное нарушение может представлять собой воспалительное заболевание кишечника, например, болезнь Крона или язвенный колит. Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложен способ лечения хронического комплемент-опосредованного нарушения, поражающего желудочно-кишечный тракт, при этом указанный способ включает введение ингибитора комплемента длительного действия субъекту, нуждающемуся в лечении указанного нарушения.
[00356] Согласно некоторым вариантам реализации хроническое комплемент-опосредованное нарушение представляет собой тиреоидит (например, тиреоидит Хашимото, болезнь Грейвса, послеродовый тиреоидит), миокардит, гепатит (например, гепатит С), панкреатит, гломерулонефрит (например, мембранопролиферативный гломерулонефрит или мембранозный гломерулонефрит) или панникулит.
[00357] Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложены способы лечения субъекта, страдающего хронической болью, отличающиеся тем, что указанные способы включают введение ингибитора комплемента длительного действия субъекту, нуждающемуся в таком введении. Согласно некоторым вариантам реализации субъект страдает нейропатической болью. Нейропатическая боль была определена как боль, инициируемая или вызываемая первичным повреждением или дисфункцией нервной системы, в частности, боль, возникающая как прямое следствие повреждения или заболевания, поражающего соматосенсорную систему. Например, нейропатическая боль может возникать в результате повреждений, в которые вовлечены соматосенсорные пути с повреждением малых волокон периферических нервов и/или спиноталамокортикальной системы в ЦНС. Согласно некоторым вариантам реализации нейропатическая боль возникает в результате аутоиммунного заболевания (например, рассеянного склероза), метаболического заболевания (например, диабета), инфекции (например, вирусного заболевания, такого как опоясывающий лишай или ВИЧ), заболевание сосудов (например, инсульта), травмы (например, телесного повреждения, хирургического вмешательства) или ракового заболевания. Например, нейропатическая боль может представлять собой боль, которая персистирует после излечения телесного повреждения или после исчезновения стимула для периферических нервных окончаний, или боль, которая возникает из-за повреждения нервов. Примеры состояний нейропатической боли или связанных с нейропатической болью включают болезненную диабетическую нейропатию, постгерпетическую невралгию (например, боль, персистирующую или повторно возникающую на участке поражения острым опоясывающим лишаем через 3 или более месяцев после острого эпизода), невралгию тройничного нерва, связанную с раковым заболеванием нейропатическую боль, связанную с химиотерапией нейропатическую боль, связанную с ВИЧ нейропатическую боль (например, при ВИЧ-нейропатии), центральную/постинсультную нейропатическую боль, нейропатию, связанную с болью в спине, например, болью в пояснице (например, при радикулопатии, такой как сжатие корешков спинномозговых нервов, например, сжатие поясничных корешков, которое может происходить в результате грыжи диска), стеноз позвоночного канала, боль при повреждении периферических нервов, фантомные боли конечностей, полинейропатию, боль, связанную с повреждением спинного мозга, миелопатию и рассеянный склероз. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения ингибитор комплемента вводят в соответствии с предложенным в изобретении схемой введения для лечения нейропатической боли у субъекта с одним или несколькими упомянутыми выше состояниями.
[00358] Согласно некоторым вариантам реализации хроническое комплемент-опосредованное нарушение представляет собой хроническое глазное нарушение. Согласно некоторым вариантам реализации указанное хроническое глазное нарушение характеризуется макулярной дегенерацией, хориоидальной неоваскуляризацией (ХНВ), неоваскуляризацией сетчатки (НВС), глазным воспалением или любой комбинацией вышеперечисленного. Макулярная дегенерация, ХНВ, НВС и/или глазное воспаление может представлять собой определяющий и/или диагностический признак указанного нарушения. Примеры нарушений, которые характеризуются одним или большим количеством указанных признаков, включают, не ограничиваясь перечисленными, связанные с макулярной дегенерацией состояния, диабетическую ретинопатию, ретинопатию недоношенных, пролиферативную витреоретинопатию, увеит, кератит, конъюнктивит и склерит. Связанные с макулярной дегенерацией состояния включают, например, возрастную макулярную дегенерацию (ВМД). Согласно некоторым вариантам реализации субъект нуждается в лечении влажной ВМД. Согласно некоторым вариантам реализации субъект нуждается в лечении сухой ВМД. Согласно некоторым вариантам реализации субъект нуждается в лечении географической атрофии (ГА). Согласно некоторым вариантам реализации субъект нуждается в лечении глазного воспаления. Глазное воспаление может поражать значительное число структур глаза, например, конъюнктиву (конъюнктивит), роговицу (кератит), эписклеру, склеру (склерит), увеальный тракт, сетчатку, сосудистую сеть и/или зрительный нерв. Признаки глазного воспаления могут включать присутствие связанных с воспалением клеток, таких как белые клетки крови (например, нейтрофилы, макрофаги) в глазу, присутствие эндогенного(ых) воспалительного(ых) медиатора(ов), один или более таких симптомов, как боль в глазу, краснота, чувствительность к свету, нечеткость зрения и «мушки» перед глазами, и т.п. Увеит представляет собой общий термин, который относится к воспалению в сосудистой оболочке (увеальном тракте) глаза, например, в любых структурах сосудистой оболочки, включая радужку, цилиарное тело или хороид. Специфические типы увеита включают ирит, иридоциклит, циклит, парспланит и хориоидит. Согласно некоторым вариантам реализации субъект нуждается в лечении географической атрофии (ГА). Согласно некоторым вариантам реализации хроническое глазное нарушение представляет собой глазное нарушение, характеризующееся повреждением зрительного нерва (например, дегенерацией зрительного нерва), такое как глаукома.
th
th
[00359] Как отмечалось выше, согласно некоторым вариантам реализации хроническое респираторное заболевание представляет собой астму. Информацию относительно факторов риска, эпидемиологии, патогенеза, диагностики, современных методов современных методов ведения пациентов с астмой и т.п., можно найти, например, в руководстве: "Expert Panel Report 3: Guidelines for the Diagnosis and Management of Asthma". National Heart Lung and Blood Institute. 2007. http://www.nhlbi.nih.gov/guidelines/asthma/asthgdln.pdf. ("NHLBI Guidelines"; www.nhlbi.nih.gov/guidelines/asthma/asthgdln.htm), Global Initiative for Asthma, Global Strategy for Asthma Management and Prevention 2010 "GINA Report") и/или стандартных терапевтических руководствах, таких как Cecil Textbook of Medicine (20 edition),  Principles of Internal Medicine (17 edition), и/или стандартных руководствах, посвященных пульмонологии. Астма представляет собой хроническое воспалительное нарушение дыхательных путей, при котором играют роль многие клетки и клеточные элементы, такие как тучные клетки, эозинофилы, Т-лимфоциты, макрофаги, нейтрофилы и эпителиальные клетки. У индивидуумов, страдающих от астмы, наблюдаются повторяющиеся эпизоды, связанные с такими симптомами, как обструкция, дыхательная недостаточность (также называемая диспноэ, или одышкой), стесненность в груди и кашель. Указанные эпизоды обычно связаны с распространенной, но вариабельной обструкцией дыхательных путей, часто обратимой, спонтанно или в результате лечения. Воспаление также приводит к связанному увеличению существующей бронхиальной гиперреактивности в отношении разнообразных стимулов. Гиперреактивность дыхательных путей (чрезмерная бронхоконстрикция в ответ на стимулы) представляет собой типичный признак астмы. В целом, ограничение поступления воздуха обусловлено бронхоконстрикцией и отеком дыхательных путей. У некоторых пациентов с астмой обратимость ограничения поступления воздуха может быть неполной. Например, ремоделирование дыхательных путей может приводить к устойчивому сужению дыхательных путей. Структурные изменения могут включать утолщение суббазальной мембраны, субэпителиальный фиброз, гипертрофию и гиперплазию гладких мышц дыхательных путей, пролиферацию и дилатацию кровеносных сосудов, гиперплазию и гиперсекрецию слизистых желез.
[00360] У индивидуумов с астмой могут наблюдаться обострения, идентифицируемые как события, характеризующиеся изменением предшествующего статуса индивидуума. Тяжелые обострения астмы могут быть определены как события, которые требуют срочных действий со стороны индивидуума и его/ее лечащего врача для предотвращения серьезного нежелательного исхода, такого как госпитализация или смерть от астмы. Например, при тяжелом обострении астмы может требоваться применение системных кортикостероидов (например, кортикостероидов для перорального применения) у субъекта, у которого астма обычно поддается достаточному контролю без ПКС, или может требоваться увеличение установленной поддерживающей дозы. Умеренные обострения астмы могут быть определены как события, причиняющие субъекту беспокойство, которые указывают на необходимость изменения лечения, но не являющиеся тяжелыми. Указанные события клинически идентифицируют как выходящие за рамки обычного для указанного субъекта диапазона повседневных вариаций астмы.
[00361] Современные медикаменты для применения при астме, как правило, разделяют на два общих класса: медикаменты для долгосрочного контроля («контролирующие медикаменты»), такие как ингаляционные кортикостероиды (ИГКС), кортикостероиды для перорального применения (ПКС), бронходилататоры длительного действия (БДД), модификаторы лейкотриенов (например, антагонисты лейкотриеновых рецепторов или ингибиторы синтеза лейкотриенов, антитела против IgE (омализумаб (Ксолар)), хромолин и недокромил, применяемые для достижения и поддержания контроля персистирующей астмы, и медикаменты быстрого действия, такие как бронходилататоры короткого действия (БКД), применяемые для лечения острых симптомов и обострений. Для целей настоящего изобретения указанные варианты лечения могут называться «традиционной терапией». Лечение обострений может также включать увеличение дозы и/или интенсивности терапии контролирующими медикаментами. Например, для восстановления контроля над астмой может применяться курс ПКС. Современные руководства предусматривают ежедневное введение контролирующего медикамента или, во многих случаях, введение нескольких доз контролирующего медикамента ежедневно субъектам с персистирующей астмой (за исключением Ксолара, который вводится один раз в 2 или 4 недели).
[00362] Как правило, считается, что у субъекта имеется персистирующая астма, если у указанного субъекта наблюдаются симптомы в среднем чаще, чем дважды в неделю, и/или субъект, как правило, использует медикамент быстрого действия (например, БКД) чаще, чем дважды в неделю, для контроля симптомов. «Тяжесть астмы» может быть классифицирована на основании интенсивности лечения, требующегося для контроля астмы у субъекта после лечения релевантных сопутствующих патологий и оптимизации ингаляционных техник и схем (см., например, GINA Report; Taylor, DR, Eur Respir J 2008; 32:545-554). Описание интенсивности лечения может основываться на рекомендованных медикаментах и дозах согласно алгоритму пошагового лечения, с которым можно ознакомиться в таких руководствах, как NHLBI Guidelines 2007, GINA Report, и предшествующих им, и/или в стандартных медицинских руководствах. Например, астма может быть классифицирована как периодическая, легкая, умеренная или тяжелая согласно данным в таблице X, где «лечение» относится к лечению, достаточному для обеспечения наилучшего уровня контроля астмы у субъекта. (Следует понимать, что категории легкой, умеренной и тяжелой астмы, в целом, относятся к персистирующей, а не периодической астме). Специалисту в данной области техники будет понятно, что таблица X приведена для примера, и что не все из указанных медикаментов доступны в любой системе здравоохранения, что может влиять на оценку тяжести астмы в некоторых условиях. Следует также понимать, что на классификацию легкой/умеренной астмы могут влиять другие разрабатываемые или новые методы. Тем не менее остается применимым принцип определения астмы как легкой, если возможно обеспечение достаточного контроля с применением в значительной степени низкоинтенсивного лечения, и тяжелой, если требуется высокоинтенсивное лечение. Тяжесть астмы может также или в альтернативном варианте быть классифицирована на основании присущей заболеванию интенсивности при отсутствии лечения (см., например, NHBLI Guidelines 2007). Оценка может быть сделана на основании текущих спирометрических показателей и описания пациентом симптомов за предшествующие 2-4 недели. Показатели текущих нарушений и будущий риск могут быть оценены и включены в определение уровня тяжести астмы. Согласно некоторым вариантам реализации тяжесть астмы определяют согласно фиг. 3.4(a), 3.4(b), 3.4(c) руководства NHBLI Guidelines, для индивидуумов возрастом 0-4, 5-11 или ≥12 лет, соответственно.
1
1
[00363] «Контроль над астмой» относится к степени снижения или устранения проявлений астмы при лечении (фармакологическом или нефармакологическом). Контроль над астмой может оцениваться на основании таких факторов, как частота симптомов, наличие симптомов в ночное время, объективные показатели функции легких, такие как спирометрические показатели (например, %ОФВ от предсказанного, вариабельность ОФВ, необходимость применения БКД для контроля симптомов). Показатели текущих нарушений и будущий риск могут быть оценены и включены в определение уровня контроля астмы. Согласно некоторым вариантам реализации контроль над астмой определяют согласно фиг. 4.3(a), 4.3(b) или 4.3(c) руководства NHBLI Guidelines, для индивидуумов в возрасте 0-4, 5-11 или ≥12 лет, соответственно.
[00364] В целом, специалист в данной области техники может выбрать подходящие способы определения степени тяжести и/или степени контроля над астмой, и может использоваться любая система классификации, признанная целесообразной специалистами в данной области техники.
[00365] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения субъект, страдающий от персистирующей астмы, получает лечение ингибитором комплемента с применением предложенной в настоящем изобретении схемы. Согласно некоторым вариантам реализации указанный субъект страдает от легкой или умеренной астмы. Согласно некоторым вариантам реализации указанный субъект страдает от тяжелой астмы. Согласно некоторым вариантам реализации субъект страдает от астмы, не поддающейся достаточному контролю при применении традиционной терапии. Согласно некоторым вариантам реализации субъект страдает от астмы, требующей, при лечении с применением традиционной терапии, использования ИГКС для достаточного контроля. Согласно некоторым вариантам реализации субъект страдает от астмы, достаточный контроль которой невозможно обеспечить, несмотря на использование ИГКС. Согласно некоторым вариантам реализации субъект страдает от астмы, требующей, при лечении с применением традиционной терапии, использования ПКС для обеспечения достаточного контроля. Согласно некоторым вариантам реализации субъект страдает от астмы, достаточный контроль которой невозможно обеспечить, несмотря на применение высокоинтенсивной традиционной терапии, включающей ПКС. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения ингибитор комплемента длительного действия вводится в качестве контролирующего медикамента или позволяет субъекту избежать применения или уменьшить дозу традиционного контролирующего медикамента.
[00366] Согласно некоторым вариантам реализации указанный субъект страдает от аллергической астмы, что применимо к большинству страдающих астмой индивидуумов. Согласно некоторым вариантам реализации считается, что у страдающего от астмы субъекта имеется аллергическая астма, если неаллергенный триггер астмы (например, простуда, физические упражнения) неизвестен и/или не идентифицирован по стандартной диагностической оценке. Согласно некоторым вариантам реализации считается, что у страдающего от астмы субъекта имеется аллергическая астма, если у указанного субъекта (i) воспроизводимо развиваются симптомы астмы (или ухудшение симптомов астмы) после воздействия аллергена, или аллергена(ов), к которому(ым) чувствителен указанный субъект; (и) наблюдаются IgE, специфичные в отношении аллергена или аллергена(ов), к которому(ым) чувствителен указанный субъект; (iii) наблюдаются положительные результаты кожной скарификационной пробы на аллерген или на аллерген(ы), к которому(ым) чувствителен указанный субъект; и/или (iv) наблюдает(ют)ся другой(ие) характерный(ые) симптом(ы), соответствующие атопии, такие как аллергический ринит, экзема или повышенные уровни общего IgE в сыворотке. Следует иметь в виду, что конкретный аллергенный триггер может не быть идентифицирован, однако может подозреваться или предполагаться, если у субъекта наблюдается ухудшение симптомов, например, в конкретных условиях.
1
1
1
1
1
1
[00367] Стимуляция аллергеном при вдыхании представляет собой методику, широко используемую при оценке аллергических заболеваний дыхательных путей. Вдыхание аллергена приводит к перекрестной реакции между специфическим в отношении аллергена IgE, связанным с IgE-рецепторами, например, на тучных клетках и базофилах. Происходит активация секреторных путей, что приводит к высвобождению медиаторов бронхоконстрикции и проницаемости сосудов. У индивидуумов с аллергической астмой могут развиваться различные проявления после стимуляции аллергеном, например, ранний астматический ответ (EAR), замедленный астматический ответ (LAR), гиперреактивность дыхательных путей (AHR) и эозинофилия дыхательных путей, каждый из которых может быть детектирован и количественно определен в соответствии с известным уровнем техники. Например, эозинофилия дыхательных путей может быть детектирована по повышению уровня эозинофилов в мокроте и/или жидкости бронхоальвеолярного лаважа. EAR, иногда называемый немедленным астматическим ответом (IAR), представляет собой ответ на стимуляцию аллергеном при вдыхании, который можно детектировать вскоре после вдыхания, как правило, в течение 10 минут (мин.) после вдыхания, например, по уменьшению ОФВ. EAR, как правило, достигает максимума в течение 30 мин. и исчезает в течение 2-3 часов (ч) после стимуляции. Например, можно считать, что у субъекта наблюдается «положительный» EAR, если его/ее ОФВ уменьшается по меньшей мере на 15%, например, по меньшей мере на 20%, в пределах указанного периода времени, относительно исходного ОФВ (где «исходный» в указанном контексте относится к состоянию до стимуляции, например, состоянию, эквивалентному обычному состоянию указанного субъекта при отсутствии обострения астмы и отсутствие воздействия аллергических стимулов, к которым чувствителен указанный субъект). Начало замедленного астматического ответа (LAR), как правило, наступает через 3-8 ч после стимуляции; он характеризуется клеточным воспалением дыхательных путей, повышением бронхососудистой проницаемости и секрецией слизи. Как правило, его детектируют по уменьшению ОФВ, величина которого может быть большей, чем связанного с EAR, и потенциально более клинически значимому. Например, можно считать, что у субъекта наблюдается «положительный» LAR, если его/ее ОФВ в пределах релевантного периода времени уменьшается по меньшей мере на 15%, например, по меньшей мере на 20% относительно исходного ОФВ. Отложенный ответ дыхательных путей (DAR) может начинаться приблизительно через 26-32 ч, достигая максимума приблизительно через 32 и 48 ч и исчезая в течение приблизительно 56 ч после стимуляции (Pelikan, Z. Ann Allergy Asthma Immunol. 2010, 104(5):394-404).
[00368] Согласно некоторым вариантам реализации хроническое респираторное нарушение представляет собой хроническую обструктивную болезнь легких (ХОБЛ). ХОБЛ охватывает спектр состояний, характеризующихся ограничением поступления воздуха, которые не являются полностью обратимыми даже при условии терапии и, как правило, прогрессируют. Симптомы ХОБЛ включают диспноэ (дыхательную недостаточность), пониженную толерантность к физической нагрузке, кашель, образование мокроты, хрипы и стесненность в груди. Индивидуумы с ХОБЛ могут испытывать эпизоды острого (например, развивающегося менее чем за неделю и часто за 24 часов или менее) ухудшения симптомов (называемых обострениями ХОБЛ), частота и продолжительность которых может варьировать и которые связаны со значительными осложнениями. Они могут запускаться такими событиями, как инфекция дыхательных путей, воздействие токсичных частиц или могут иметь неизвестную этиологию. Курение является наиболее распространенным фактором риска развития ХОБЛ; в развитие и прогрессирование указанного заболевания могут вносить вклад и другие воздействия при вдыхании. Роль генетических факторов в ХОБЛ является областью активных исследований. У небольшого процента пациентов с ХОБЛ имеется наследственный дефицит альфа-1-антитрипсина, основного циркулирующего ингибитора сериновых протеаз, и указанный дефицит может приводить к быстро прогрессирующей форме заболевания.
th
th
[00369] Характерные патофизиологические признаки ХОБЛ включают сужение и структурные изменения малых дыхательных путей и разрушение паренхимы легких (в частности, вокруг альвеол), чаще всего в результате хронического воспаления. Хроническое ограничение поступления воздуха, наблюдаемое при ХОБЛ, как правило, включает сочетание указанных факторов, и относительная значимость их вклада в симптомы ограничения поступления воздуха варьирует у разных индивидуумов. Термин «эмфизема» относится к расширению воздушных полостей (альвеол), расположенных дистальнее терминальных бронхиол, с разрушением их стенок. Следует отметить, что термин «эмфизема» часто используется в клинике для обозначения медицинского состояния, связанного с такими патологическими изменениями. Некоторые индивидуумы с ХОБЛ страдают от хронического бронхита, который определен в клинических терминах как кашель с образованием мокроты большую часть дней из 3 месяцев в году, в течение 2 последовательных лет. Дополнительную информацию относительно факторов риска, эпидемиологии, патогенеза, диагностики и современных методов ведения пациентов с ХОБЛ можно найти, например, в руководстве "Global Strategy for the Diagnosis, Management, and Prevention of Chronic Obstructive Pulmonary Disease " («Глобальная стратегия диагностики, ведения пациентов и профилактики при хронической обструктивной болезни легких», обновлялось в 2009 г.), доступном на веб-сайте Global Initiative on Chronic Obstructive Pulmonary Disease, Inc. (GOLD) (www.goldcopd.org), также называемом в настоящем документе "GOLD Report"; руководстве Американского торакального общества / Европейского респираторного общества (American Thoracic Society / European Respiratory Society Guidelines, 2004), доступном на веб-сайте ATS по ссылке: www.thoracic.org/clinical/copd-guidelines/resources/copddoc.pdf, называемом в настоящем документе "ATC/ERS COPD Guidelines"; и стандартных терапевтических руководствах, таких как Cecil Textbook of Medicine (20 edition),  Principles of Internal Medicine (17 edition); и/или стандартных руководствах, посвященных пульмонологии.
[00370] Согласно некоторым вариантам реализации способы, раскрытые в настоящем документе, обеспечивают ингибирование (препятствование, разрушение) описанного выше цикла DC-Th17-B-Ab-C-DC. Например, введение ингибитора комплемента может нарушать цикл, в ходе которого комплемент стимулирует ДК-клетки направлять дифференцировку в сторону фенотипа Th17. В результате количество и/или активность Th17-клеток уменьшается, что, в свою очередь, уменьшает степень опосредованной Th17 стимуляции В-клеток и продуцирование поликлональных антител. Согласно некоторым вариантам реализации указанные эффекты приводят к «перезагрузке» иммунологического микроокружения со сдвигом в сторону более нормального, менее патологического состояния. Как описано в примере 1 PCT/US2012/043845 (WO/2012/178083) и USSN 20140371133 (кратко обощены ниже в примере 27) данные, подтверждающие возможность пролонгированного ингибирующего эффекта ингибирования комплемента в отношении связанного с Th17 синтеза цитокинов, получали в модели астмы на животных.
[00371] Согласно некоторым вариантам реализации ингибирование цикла DC-Th17-B-Ab-C-DC оказывает модифицирующий заболевание эффект. Не опираясь на конкретную теорию, ингибирование цикла DC-Th17-B-Ab-C-DC может не просто лечить симптомы нарушения, но взаимодействовать с фундаментальными патологическими механизмами, которые могут вносить вклад в продолжающееся повреждение ткани, даже в тех случаях, когда симптомы находятся под достаточным контролем, и/или которые могут вносить вклад в обострения заболевания. Согласно некоторым вариантам реализации ингибирование цикла DC-Th17-B-Ab-C-DC приводит к ремиссии хронического нарушения. Согласно некоторым вариантам реализации ремиссия относится к состоянию отсутствия или по существу отсутствия болезненной активности у субъекта с хроническим нарушением, при наличии вероятности рецидива заболевания. Согласно некоторым вариантам реализации ремиссия может поддерживаться на протяжении продолжительного периода времени (например, по меньшей мере 6 месяцев, например, 6-12 месяцев, 12-24 месяцев или более) при отсутствии дальнейшей терапии, или при использовании уменьшенной дозы или увеличенного интервала введения доз. Согласно некоторым аспектам ингибирование комплемента может изменять иммунологическое микроокружение ткани, богатой Th17-клетками, и преобразовывать ее в микроокружение, богатое регуляторными Т-клетками (Treg). Это может позволить иммунной системе «перезагрузиться» и войти в состояние ремиссии. Согласно некоторым вариантам реализации ремиссия, например, может поддерживаться до наступления триггерного события. Триггерное событие может представлять собой, например, инфекцию (которая может приводить к продуцированию поликлональных антител, вступающих в реакцию как с инфекционным агентом, так и с собственным белком), воздействие конкретных условий окружающей среды (например, высоких уровней примесей в воздухе, таких как озон, или конкретное вещество, или компоненты дыма, например, сигаретного дыма, аллергенов) и т.п. Роль могут играть генетические факторы. Например, у индивидуумов, у которых имеются конкретные аллели генов, кодирующих компоненты комплемента, может наблюдаться более высокий исходный уровень активности комплемента, более реактивная система комплемента и/или более низкий исходный уровень активности эндогенных регуляторных белков комплемента. Согласно некоторым вариантам реализации индивидуум имеет генотип, связанный с повышенным риском ВМД. Например, у указанного субъекта может иметься полиморфизм в гене, кодирующем белок комплемента или регуляторный белок комплемента, например, CFH, С3, фактор В, при этом указанный полиморфизм связан с повышенным риском ВМД.
[00372] Согласно некоторым вариантам реализации иммунологическое микроокружение может начать прогрессировать в направлении патологического состояния с течением времени, например, у субъекта, у которого еще не развились симптомы хронического нарушения, или у субъекта, у которого развилось указанное нарушение и который получал лечение согласно описанию в настоящем документе. Такой переход может происходить стохастически (например, быть обусловлен, по меньшей мере частично, предположительно случайными флуктуациями уровней и/или аффинности антител) и/или в результате накопления «подпороговых» триггерных событий, не обладающих достаточной интенсивностью для запуска симптоматической вспышки нарушения.
[00373] Согласно некоторым вариантам реализации предполагается, что относительно короткий курс аналога компстатина длительного действия, например, от 1 недели до 6 недель, например, приблизительно 2-4 недели, может обеспечивать длительный благоприятный эффект. Согласно некоторым вариантам реализации обеспечивается ремиссия на протяжении продолжительного периода времени, например, 1-3 месяца, 3-6 месяцев, 6-12 месяцев, 12-24 месяца или более. Согласно некоторым вариантам реализации у субъекта может проводиться мониторинг и/или профилактическое лечение до возвращения симптомов. Например, субъект может получать лечение до или во время воздействия триггерного события. Согласно некоторым вариантам реализации у субъекта может проводиться мониторинг, например, мониторинг повышения уровня биомаркера, например, биомаркера, содержащего индикатор Th17-клеток или Th17-клеточной активности, или активации комплемента, и субъект может получать лечение при повышении уровня такого биомаркера. См., например, более подробное описание в PCT/US2012/043845.
[00374] VIII. Композиции и введение
[00375] В настоящем изобретении предложены и/или применяются разнообразные композиции, содержащие клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия. Согласно различным вариантам реализации композиция может обладать любым свойством или комбинацией свойств, описанных в настоящей заявке, при условии, что они не являются взаимоисключающими. В настоящем изобретении предложены варианты реализации таких композиций и способы их применения, отличающиеся тем, что указанный аналог компстатина представляет собой любой аналог компстатина.
[00376] Согласно некоторым вариантам реализации композиция содержит очищенный клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия. Очистка может осуществляться с применением разнообразных способов, которые специалист в данной области техники может выбрать, опираясь на требуемую степень чистоты различных компонентов, присутствующих в указанной композиции перед очисткой. Например, может применяться фильтрация, высокоэффективная жидкостная хроматография, аффинная хроматография и/или другие способы и их комбинации. Согласно некоторым вариантам реализации указанная композиция содержит по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или более клеточно-реактивных аналогов компстатина длительного действия или нацеленного действия в процентах от общей массы аналога компстатина. Согласно некоторым вариантам реализации указанная композиция содержит по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или более клеточно-реактивного аналога компстатина длительного действия или нацеленного действия в процентах от общего количества аналога компстатина в пересчете на моли. Согласно некоторым вариантам реализации композиция состоит или по существу состоит из клеточно-реактивного аналога компстатина длительного действия или нацеленного действия.
[00377] Согласно некоторым вариантам реализации композиция, содержащая клеточно-реактивный аналог компстатина, и соединение, содержащее клеточно-реактивную функциональную группу, характеризуются тем, что отношение клеточно-реактивного аналога компстатина к соединению, содержащему клеточно-реактивную функциональную группу, в пересчете на моли составляет по меньшей мере 10:1, 20:1, 50:1, 100:1, 500:1, 1000:1 или более. Согласно некоторым вариантам реализации указанная композиция содержит по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или более клеточно-реактивного аналога компстатина в процентах от общей массы аналога компстатина. Согласно некоторым вариантам реализации указанная композиция содержит по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или более клеточно-реактивного аналога компстатина в процентах от общего количества аналога компстатина в пересчете на моли. Согласно некоторым вариантам реализации композиция содержит по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или более клеточно-реактивного аналога компстатина по массе. Согласно некоторым вариантам реализации композиция содержит по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или более аналога компстатина длительного действия по массе. Согласно некоторым вариантам реализации композиция содержит по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или более аналога компстатина нацеленного действия по массе. Согласно некоторым вариантам реализации композиция содержит по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% или более аналога компстатина нацеленного действия по массе. Согласно некоторым вариантам реализации масса представляет собой сухую массу.
[00378] Согласно некоторым аспектам в настоящем изобретении предложена композиция фармацевтического класса, содержащая клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия. Указанной композиции фармацевтического класса согласно различным вариантам реализации может быть свойственна любая из вышеперечисленных характеристик в отношении чистоты. Указанная композиция фармацевтического класса в достаточной степени свободна от эндотоксинов, тяжелых металлов и неидентифицированных и/или неохарактеризованных веществ, чтобы быть приемлемой, без дополнительной очистки, для применения в качестве фармацевтической композиции, подходящей для введения субъекту-человеку, или для получения фармацевтической композиции для введения субъекту-человеку. Согласно некоторым вариантам реализации указанная композиция фармацевтического класса является стерильной.
[00379] Подходящие составы, например, по существу чистые составы клеточно-реактивного аналога компстатина, аналога компстатина длительного действия или аналога компстатина нацеленного действия или другого активного агента, могут быть скомбинированы с фармацевтически приемлемыми носителями или основами и т.п. для получения подходящей фармацевтической композиции. Термин «фармацевтически приемлемый носитель или основа» относится к нетоксичному носителю или основе, не устраняющему фармакологическую активность указанного соединения, вместе с которым он входит в состав. Специалисту в данной области техники будет понятно, что носитель или основа «нетоксичен/нетоксична», если он совместим с введением субъекту в количестве, подходящем для доставки соединения, без чрезмерной токсичности. Фармацевтически приемлемые носители или основы, которые могут применяться в композициях согласно настоящему изобретению, включают, но не ограничены перечисленными, воду, физиологический солевой раствор, раствор Рингера, раствор ацетата натрия или ацетата калия, 5% декстрозу и т.п. Указанная композиция может содержать другие компоненты, подходящие для нужного состава, например, соответствующие описанию в настоящей заявке. Дополнительные активные соединения, например, соединения, независимо подходящие для лечения субъекта, страдающего от комплемент-опосредованного нарушения, могут также быть включены в указанные композиции. В настоящем изобретении предложены такие фармацевтические композиции, содержащие клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия и, необязательно, второй активный агент, подходящий для лечения субъекта, страдающего от комплемент-опосредованного нарушения.
[00380] Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложена фармацевтически приемлемая композиция, подходящая для введения человеку, упаковка которой содержит этикетку, утвержденную государственным агентством, ответственным за контроль над фармацевтическими агентами, например, Управлением по контролю над пищевыми продуктами и лекарственными средствами США (FDA). Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложен фармацевтический набор или упаковка, содержащая: (а) фармацевтически приемлемый клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия в твердой форме; (b) фармацевтически приемлемый носитель или основу. Согласно некоторым вариантам реализации твердая форма представляет собой порошкообразную форму, например, лиофилизированный порошок. Указанный набор или упаковка необязательно содержит инструкции относительно растворения клеточно-реактивного аналога компстатина, аналога компстатина длительного действия или нацеленного действия в носителе. Согласно некоторым вариантам реализации предложен фармацевтический набор или упаковка. Согласно некоторым вариантам реализации указанная упаковка или набор содержит количество фармацевтической композиции, достаточное по меньшей мере для однократного введения доз, например, содержит от 1 до 200 доз либо любое промежуточное количество или субдиапазон доз. Согласно некоторым вариантам реализации упаковка или набор содержит (i) первый контейнер, содержащий достаточное количество клеточно-реактивного аналога компстатина, аналога компстатина длительного действия или аналога компстатина нацеленного действия для одной или более доз; (ii) второй контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый носитель, подлежащий объединению с содержимым первого сосуда для получения композиции, подходящей для введения субъекту путем, например, подкожной (сокращенно обозначается п/к) или интравитреальной (и/в/т) инъекции. Согласно некоторым вариантам реализации фармацевтическая упаковка или набор содержит одну или более игл и, необязательно, один или более шприцев. Согласно некоторым вариантам реализации предложен по меньшей мере один предварительно заправленный шприц (например, от 1 до 200 или любое промежуточное число поддиапазона). Согласно некоторым вариантам реализации предложена(ы) одна или более единичных лекарственных форм или заранее отмеренных аликвот.Согласно некоторым вариантам реализации предложена(ы) одна или более шприц-ручек или картриджей-ручек. Согласно некоторым вариантам реализации предложены инструкции по введению, которые согласно некоторым вариантам реализации включают инструкции для самостоятельного введения, например, путем подкожной инъекции.
[00381] Фармацевтическая композиция может быть введена субъекту любым подходящим путем введения, в том числе, но не ограничиваясь перечисленными, внутривенно, внутримышечно, подкожно, ингаляционным путем, назально, интратекально, интракраниально, интраартериально, перорально, ректально, трансдермально, внутрикожно, подкожно и т.п. Согласно некоторым вариантам реализации композицию, содержащую клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия, вводят внутривенно. Согласно некоторым вариантам реализации композицию, содержащую клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия, вводят интраартериально. Указанная композиция может быть введена местно, либо в сосудистую систему, снабжающую орган или ткань, либо экстраваскулярно поблизости от органа или ткани. Следует понимать, что термин «введение» охватывает непосредственно введение соединения или композиции субъекту, инструктирование третьих лиц для введения соединения или композиции субъекту, назначение или предложение соединения или композиции субъекту (например, для самостоятельного введения), самостоятельное введение и, в соответствующих случаях, другие способы предоставления соединения или композиции субъекту.
[00382] Фармацевтические композиции, подходящие для инъецирования (например, для внутривенного введения) или введения через помпу или катетер, как правило, включают стерильные водные растворы (для водорастворимых композиций) или дисперсии и стерильные порошки для экстемпорального приготовления стерильных растворов или дисперсий для инъекций. Стерильные растворы могут быть получены введением указанного соединения в нужном количестве в подходящий растворитель, необязательно с одним ингредиентом или с комбинацией ингредиентов, таких как буферы, например, ацетаты, цитраты, лактаты или фосфаты; агенты для коррекции тоничности, такие как хлорид натрия или декстроза; антибактериальные агенты, такие как бензиловый спирт или метилпарабены; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, глутатион или бисульфит натрия; хелатирующие агенты, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота; и другие подходящие ингредиенты и т.п., по необходимости, с последующей стерилизацией фильтрацией. Специалистам в данной области техники известны многие физиологически приемлемые соединения, которые могут быть включены в фармацевтическую композицию. Другие подходящие соединения включают, например, углеводы, такие как глюкоза, сахароза, лактоза; декстраны; аминокислоты, такие как глицин; полиолы, например, маннитол. Указанные соединения могут, например, служить в качестве наполнителей и/или стабилизаторов, например, для порошка, и/или если в процесс получения или хранения входит лиофилизация. Поверхностно-активное(ые) вещество(а), например, Tween-80, Pluronic-F108/F68, дезоксихолевая кислота, фосфатидилхолин и т.п., может(гут) быть включены в композицию, например, для улучшения растворимости или получения микроэмульсии для доставки гидрофобных лекарственных средств. Значение рН при необходимости может быть скорректировано с помощью кислот или оснований, например, соляной кислоты или гидроксида натрия. Состав для парентерального введения может быть заключен в ампулы, одноразовые шприцы или инфузионные мешки, либо в одно- или многодозовые флаконы, изготовленные из стекла или пластика. Предпочтительно растворы для инъекций являются стерильными и не содержат неприемлемых количеств эндотоксина.
[00383] Помимо прочего, в настоящем описании изобретения предложено конкретное понимание того, что в определенных контекстах подкожная и/или внутримышечная инъекция может быть в особенности желательной для введения аналога компстатина, описанного в настоящем документе (например, LACA). Например, согласно некоторым вариантам реализации подкожная и/или внутримышечная инъекция может быть предпочтительной (по сравнению с, например внутривенной доставкой), в частности, для лечения хронических нарушений. В качестве альтернативы или дополнительно, подкожная и/или внутримышечная инъекция может быть в особенности подходящей, когда, например, является желательным и/или ожидается, что пациенты будут самостоятельно вводить композицию аналога компстатина (например, пациентам не требуется введение медицинским работником или пациенты не полагаются на введение медицинским работником, в особенности, когда для такого введения медицинским работником может потребоваться поездка в инфузионный центр).
[00384] Согласно некоторым конкретным аспектам настоящее описание изобретения охватывает понимание того, что согласно тем вариантам реализации, в которых лекарственное средство вводят ежедневно, может быть целесообразным поддерживать более постоянный уровень в крови, чем при более длительном интервале между введением доз, таком как еженедельно или один раз в 2 недели. Более постоянный уровень в крови может быть в особенности желательным согласно некоторым вариантам реализации (например, лечение хронического нарушения, описанного в настоящем документе). В настоящем описании изобретения принимают во внимание, что ежедневая в/в инфузия на долгосрочной основе может являться весьма неудобной, в особенности, для негоспитализированного пациента.
[00385] В настоящем описании изобретения в особенности принимают во внимание, что согласно некоторым вариантам реализации подкожное введение может являться даже более эффективным и/или желательным, чем внутримышечная инъекция, в особенности, когда предусмотрено самостоятельное введение или такое введение является желательным.
[00386] Согласно определенным вариантам реализации композицию, описанную в настоящем документе, и, в особенности, композицию, содержащую LACA, можно вводить с применением устройства, которое доставляет дозу фармацевтической композиции путем инъекции, согласно некоторым вариантам реализации - в режиме по меньшей мере частично автоматической работы после активации. Такое устройство называют в данной области техники «шприц-ручкой» или «автоинжектором», и данные термины используются в настоящем документе взаимозаменяемо. Как правило, шприц-ручка или автоинжектор позволяет инъецировать дозу фармацевтической композиции, содержащуюся в картридже, резервуаре или шприце, через гиподермальную иглу или иглы, вводимые в автоматическом режиме или в ручном режиме, или посредством высокоскоростной струи. Шприц-ручка или автоинжектор могут быть сконструированы для введения однократной дозы или многократных доз.
[00387] Согласно некоторым конкретным вариантам реализации такую шприц-ручку или автоинжектор применяют для внутримышечной и/или подкожной инъекции. Согласно настоящему описанию изобретения шприц-ручка или другой автоинжектор может быть в особенности подходящим для вариантов реализации, в которых применяют подкожную инъекцию. Шприц-ручки, как правило, представляют собой устройства, которые содержат (или в которые может быть введено) лекарственное средство в изолированном картридже или резервуаре и к которым можно присоединить иглу.
[00388] Согласно определенным вариантам реализации, как отмечается в настоящем документе, в настоящем описании изобретения предложено понимание того, что п/к и/или в/м инъекция может быть в особенности желательным способом доставки одного или более LACA, описанных в настоящем документе. Например, в настоящем описании изобретения документально доказаны определенные в особенности желательные и/или эффективные схемы введения, включающие введение LACA путем инъекции (например, путем п/к инъекции); согласно некоторым вариантам реализации такой инъекции достигают с применением шприц-ручки (например, в которую могли предварительно ввести соответствующую дозу или объем). Шприц-ручки могут быть длительного применения (и многоразового применения) или однократного применения. В шприц-ручке длительного применения, как правило, применяют сменный картридж, который удаляют, когда он становится пустым, а в шприц-ручку вставляют новый картридж. Шприц-ручка однократного применения, как правило, поставляется с картриджем или резервуаром, предварительно наполненным лекарственным средством. Когда картридж или резервуар становится пустым, шприц-ручку выбрасывают. Картридж или резервуар могут содержать однократную дозу или многократные дозы. Для применения шприц-ручки к шприц-ручке присоединяют иглу и вводят ее в кожу. Как правило, для введения дозы нажимают на кнопку, хотя согласно некоторым вариантам реализации можно применять другие способы активации. Согласно определенным вариантам реализации автоинжектор может содержать пружинный шприц, хотя средний специалист в данной области техники понимает, что для осуществления автоматического введения доступны множество технологий. Согласно определенным вариантам реализации в результате нажатия на кнопку или активации устройства иным способом игла автоматически вводится, и лекарственное средство доставляется. Согласно определенным вариантам реализации можно разработать автоинжектор для введения иглы в автоматическом режиме и/или точно на требуемую глубину в подкожную ткань. Шприц-ручка или автоинжектор могут содержать устройства, такие как круговая шкала, которая позволяет пользователю выбирать или корректировать дозу или глубину инъекции.
[00389] Согласно определенным вариантам реализации композицию, описанную в настоящем документе, и, в особенности, композицию, содержащую LACA, вводят с применением устройства, содержащего двухкамерный шприц. В одной камере содержится сухое лекарственное средство (например, лиофилизированное). Вторая камера содержит подходящий фармацевтически приемлемый носитель. Для применения устройства лекарственное средство сначала восстанавливают путем смешивания содержимого камер. Смешивание можно осуществить различными способами. Согласно определенным вариантам реализации надавливание на плунжер приводит к тому, что содержимое камер перемешивается, например, путем переноса носителя в камеру, содержащую лиофилизированное лекарственное средство.
[00390] Таким образом, может быть предложено множество устройств для доставки лекарственных средств, содержащих композицию, описанную в настоящем документе (например, содержащую LACA), например, преднаполненные шприцы, двухкамерные шприцы, шприц-ручки длительного применения и/или однократного применения и картриджи, подходящие для применения со шприц-ручками. Такие устройства могут содержать одну или более доз (например, одно или более из любого из количеств доз, описанных в настоящем документе).
[00391] Согласно определенным вариантам реализации настоящее описание изобретения предусматривает обеспечение субъекта (например, по почте или с помощью организованной доставки или другого регулярного способа доставки) набором устройств, описанных в настоящем документе, которые в совокупности обеспечивают снабжение активным средством (например, LACA), достаточное для того, чтобы длиться в течение предопределенного периода времени (например, одну неделю, две недели, три недели, четыре недели и т.д.). Согласно определенным вариантам реализации такой набор регулярно отправляют в место проживания пациента (например, каждую неделю, две недели, три недели, четыре недели и т.д.) с временными рамками, выбранными так, чтобы средство не заканчивалось. Согласно определенным вариантам реализации композиция (например, LACA) может содержаться в контейнере (например, флаконе) или в любом из вышеупомянутых устройств или упаковок для доставки лекарственных средств.
[00392] Согласно определенным вариантам реализации композиция является лиофилизированной или хранится в охлажденном или замороженном виде непосредственно до введения, во время которого ее восстанавливают (в случае лиофилизированной композиции) или оттаивают (в случае замороженной композиции). Перед введением температуру композиции можно привести к комнатной.
[00393] Согласно определенным вариантам реализации композицию можно вводить с применением системы пластырей (например, для подкожного или трансдермального введения). Согласно определенным вариантам реализации пластырь может содержать резервуар или может быть присоединен к резервуару, который может содержать, например, до приблизительно 10 мл раствора, что делает возможным введение пациенту 10 мл раствора в однократном введении.
[00394] Согласно определенным вариантам реализации композиция, содержащая аналог компстатина, описанный в настоящем документе, например, клеточно-реактивный аналог компстатина, LACA или аналог компстатина нацеленного действия, и фармацевтически приемлемый носитель, характеризуется рН в диапазоне от 6,5 до 7,5, например, от 6,8 и 7,2, например, 7,0. В ходе проведения исследований стабильности было установлено, что более низкий рН приводит к увеличению стабильности определенных LACA по сравнению с нейтральным рН. Соответственно, согласно некоторым вариантам реализации композиция, содержащая LACA и фармацевтически приемлемый носитель, характеризуется рН от 6,0 до 6,5, от 5,5 до 6,0 или от 5,0 и 5,5. Согласно определенным вариантам реализации можно применять еще более низкий рН, например, от 4,5 до 5,0. Согласно определенным вариантам реализации композиция также содержит одно или более фармацевтически приемлемых буферных веществ, подходящих для поддержания рН в пределах выбранного диапазона (например, любого из вышеупомянутых диапазонов). Подходящие буферные вещества описаны в настоящем документе (например, ацетаты, цитраты, лактаты или фосфаты). Согласно определенным вариантам реализации композиция дополнительно или в качестве альтернативы содержит соль, например, любую из фармацевтически приемлемых солей, описанных в настоящем документе. Согласно определенным конкретным вариантам реализации композиция содержит фосфат.
[00395] Следует отметить, что для краткости определенные аспекты и варианты реализации, описанные в настоящем описании изобретения, например, в отношении схем введения, доз, способов введения, устройств, применяемых для введения, и/или способов лечения, описаны применительно к аналогам компстатина длительного действия. Однако следует понимать, что предложены аналогичные варианты реализации, в которых аналог компстатина не представляет собой LACA. Аналог компстатина может, например, представлять собой клеточно-реактивный аналог компстатина или аналог компстатина нацеленного действия, который не содержит снижающего клиренс фрагмента.
[00396] Как правило, дисперсии получают введением активного соединения в стерильную основу, которая содержит основную дисперсионную среду и другие подходящие ингредиенты из перечисленных выше. В случае стерильных порошков для получения стерильных растворов для инъекций способы получения могут включать вакуумную и сублимационую сушку, позволяющие получить порошок активного ингредиента плюс любой дополнительный нужный ингредиент, например, из предварительно стерилизованного фильтрацией раствора.
[00397] Согласно определенным вариантам реализации может применяться пероральное введение. Композиции для перорального введения обычно включают инертный разбавитель или съедобный носитель. Для перорального терапевтического введения активное соединение может быть введено в состав со вспомогательными веществами и применяться в форме таблеток, пастилок или капсул, например, желатиновых капсул. В состав композиции могут быть включены фармацевтически совместимые связывающие агенты и/или адъювантные материалы. Указанные таблетки, пилюли, капсулы, пастилки и т.п. могут содержать любой из следующих ингредиентов, либо соединения сходной природы: связывающее вещество, такое как микрокристаллическая целлюлоза, трагакантовая камедь или желатин; вспомогательное вещество, такое как крахмал или лактоза, агент для улучшения распадаемости, такой как альгиновая кислота, Primogel или кукурузный крахмал; смазывающее вещество, такое как стеарат магния или Sterotes; скользящее вещество, такое как коллоидный диоксид кремния; подсластитель, такой как сахароза или сахарин; или вкусоароматический агент, такой как перечная мята, метилсалицилат или апельсиновый ароматизатор. Перорально может быть также введена жидкая композиция. Составы для пероральной доставки могут содержать агенты для повышения стабильности в желудочно-кишечном тракте и/или для усиления абсорбции.
[00398] При введении ингаляционным путем аналог компстатина может быть введен в форме спрей-аэрозоля из емкости под давлением или диспенсера, содержащего подходящее распыляющее вещество, например, газ, такой как углекислый газ. Может применяться дозирующий ингалятор или распылитель. Аэрозоль может содержать жидкие частицы или сухой аэрозоль (например, сухие порошки, крупные пористые частицы и т.п.). Подходящие водные основы, пригодные в различных вариантах реализации, включают воду или солевой раствор, согласно некоторым вариантам реализации необязательно включая спирт. Согласно определенным вариантам реализации композиция содержит глицерол в воде, например, приблизительно 2% глицерол в воде. Согласно определенным вариантам реализации композиция содержит поверхностно-активное вещество, подходящее для введения в легкие. Дополнительно или в качестве альтернативы можно применять другие вспомогательные вещества, подходящие для легочного введения.
[00399] Множество различных устройств доступны для введения путем ингаляции (которое называют взаимозаменяемо «ингаляционным введением», «респираторным введением» или «легочным введением»). Распылители представляют собой устройства, которые преобразуют растворы или суспензии лекарственных средств в аэрозоли, подходящие для осаждения в нижних дыхательных путях. Типы распылителей включают распылители струйного типа, ультразвуковые волновые распылители и электронно-сетчатые распылители. Неполный перечень доступных электронно-сетчатых распылителей включает eFlow (Pari), i-Neb (Respironics), MicroAir (Omron), IHSO Nebulizer (Beurer) и Aeroneb (Aerogen). Можно применять ингалятор Respimat.Soft Mist.™ (Boeringer Ingelheim). Ингалятор отмерянных доз (metered dose inhaler, MDI) представляет собой портативное аэрозольное устройство, в котором для доставки терапевтического средства используется распыляющее вещество. MDI содержат находящуюся под давлением металлическую емкость, которая содержит фармакологическое средство в суспензии или растворе, распыляющее вещество, поверхностно-активное вещество (как правило) и клапан-дозатор. В качестве распыляющих веществ широко применяли хлорфторуглероды (CFC), которые, однако, преимущественно были заменены гидрофторуглеродами (HFC, также известны как гидрофторалканы (HFA)), такими как HFC-134a и HFC-227ea. Другими альтернативными вариантами являются оксид углерода и азот. Ингалятор сухого порошка (dry powder inhaler, DPI) представляет собой активируемое вдохом устройство, которое доставляет лекарственное средство в форме частиц, содержащихся в капсуле или блистере, который прокалывают перед применением, как правило, без использования распыляющего вещества. Примеры DPI, которые на сегодняшний день применяют для доставки лекарственных средств для лечения астмы и/или ХОБЛ, включают, например, Diskus, Aerolizer, HandiHaler, Twisthaler, Flexhaler. Такие устройства можно применять для доставки аналога компстатина согласно различным вариантам реализации. Другие иллюстративные устройства DPI, которые можно применять согласно различным вариантам реализации, включают 3М Conix™, TAIFUN (AKELA Pharma), Acu-Breathe™ (Respirics) и устройства, которые включают технологию Taper Dry Prowder Inhalation, такое как API-5000, в котором активную фармацевтическую субстанцию (АФС) хранят на микроструктурированной ленте-носителе.
[00400] Вспомогательные устройства для ингаляции (inhalation accessory devices, IAD), как правило, разделяют на 2 категории: спейсеры и удерживающие камеры. Спейсеры и удерживающие камеры удлиняют мундштук ингалятора и направляют водяную пыль лекарственного средства в рот, снижая потерю лекарственного средства в воздухе. Применение спейсера с MDI может помочь снизить количество лекарственного средства, которое оседает на задней части горла, улучшая направление и накопление лекарственного средства, доставляемого MDI. Клапанные удерживающие камеры (valved holding chambers, VHC) позволяют облаку мелких частиц лекарственного средства оставаться в спейсере до тех пор, пока пациент не вдохнет его через односторонний клапан, вводя дозу лекарственного средства в легкие. Примеры включают Aerochamber и Optichamber.
[00401] Дисперсные композиции можно охарактеризовать на основе различных параметров, таких как фракция мелкодисперсных частиц (fine particle fraction, FPF), выпущенная доза, средняя плотность частиц и масс-медианный аэродинамический диаметр (ММАД). Подходящие способы известны в данной области техники, некоторые из которых описаны в патентах США №№6942868 и 7048908 и публикациях США №№20020146373, 20030012742 и 20040092470. Согласно определенным вариантам реализации размер частиц аэрозоля для респираторной доставки составляет приблизительно 0,5 мкм - 10 мкм (ММАД), например, приблизительно 5 мкм, хотя можно применять и более мелкие или более крупные частицы. Согласно определенным вариантам реализации применяют частицы с масс-медианным аэродинамическим диаметром от 1 мкм до 25 мкм, например, от 1 мкм до 10 мкм.
3
[00402] Композицию сухих частиц, содержащую частицы диаметром менее приблизительно 1 мм, также называют в настоящем документе сухим порошком. «Сухая» композиция характеризуется относительно низким содержанием жидкости, в результате чего частицы являются легко диспергируемыми, например, в порошковом ингаляционном устройстве для образования аэрозоля или спрея. «Порошок» состоит главным образом или преимущественно исключительно из мелкодисперсных твердых частиц, которые являются относительно свободнотекущими и способными легко диспергироваться в ингаляционном устройстве, а затем быть ингалированными субъектом, предпочтительно, так, чтобы значительная часть частиц могла достичь желаемой части дыхательных путей. Согласно определенным вариантам реализации применяют крупные пористые частицы, которые характеризуются средними геометрическими диаметрами, варьирующими от 3 до 15 мкм, и насыпной плотностью от 0,04 до 0,6 г/см. См., например, патент США №7048908; Edwards, D. et al., Science 276:1868-1871, 1997; и Vanbever, R., et al., Pharmaceutical Res. 16:1735-1742, 1999).
[00403] Согласно некоторым аспектам в настоящем документе описаны различные дозы, схемы введения, композиции и способы, пригодные для лечения пациентов путем ингаляционного введения аналога компстатина. Аналог компстатина может представлять собой любой из аналогов компстатина, описанных в настоящем документе. Аналог компстатина может содержать любой из пептидов, описанных в Разделе III настоящего документа. Например, аналог компстатина может содержать или состоять из любой из SEQ ID No: 3-36, описанных в настоящем документе, и/или может содержать любую из модификаций по сравнению с компстатином, описанным в настоящем документе. Согласно конкретным вариантам реализации аналог компстатина содержит или состоит из пептида, последовательность которого представлена в таблице 1, например, SEQ ID NO: 14, 21, 28, 29, 32, 33, 34 или 36. Согласно конкретным вариантам реализации аналог компстатина не содержит снижающего клиренс фрагмента, клеточно-реактивного фрагмента или нацеливающего фрагмента. Согласно определенным вариантам реализации аналог компстатина характеризуется молекулярной массой от 1,5 кДа до 2,0 кДа или от 2,0 кДа до 2,5 кДа. Согласно определенным вариантам реализации аналог компстатина содержит от 11 до 25 аминокислот, например, точно 13, 14, 15, 16, 17 или 18 аминокислот.
[00404] Согласно определенным вариантам реализации общая ежедневная доза для введения аналога компстатина путем ингаляции (в настоящем документе данный термин используется взаимозаменяемо с «легочным введением» или «респираторным введением») составляет по меньшей мере 5 мг/день, например, по меньшей мере 10 мг/день, по меньшей мере 15 мг/день, по меньшей мере 20 мг/день, по меньшей мере 25 мг/день или по меньшей мере 30 мг/день. Согласно определенным вариантам реализации ежедневная доза составляет 5 мг/день - 20 мг/день, например, 10 мг/день или 15 мг/день. Согласно определенным вариантам реализации ежедневная доза составляет от 20 мг/день до 60 мг/день. Согласно определенным конкретным вариантам реализации доза составляет 10 мг/день, 15 мг/день, 20 мг/день, 25 мг/день, 30 мг/день, 35 мг/день, 40 мг/день, 45 мг/день, 50 мг/день, 55 мг/день или 60 мг/день. Как описано в примерах, в клиническом исследовании фазы 1 аналога компстатина, вводимого здоровым субъектам путем ингаляции, возможное доказательство фармакологической активности наблюдалось в дозах 30 мг/день или 60 мг/день.
[00405] Согласно определенным вариантам реализации ежедневная доза составляет от 60 мг/день до 150 мг/день, например, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140 или 150 мг/день. Согласно определенным вариантам реализации ежедневная доза составляет 150 мг/день - 350 мг/день, например, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340 или 350 мг/день. Согласно определенным вариантам реализации ежедневную дозу можно вводить в ходе однократного введения. Согласно определенным вариантам реализации ежедневную дозу можно вводить в виде двух или более доз в течение дня (например, утром и вечером).
[00406] Для местного нанесения аналог компстатина может быть получен в виде подходящей мази, содержащей активный компонент, суспензированный или растворенный в одном или более носителях. Носители для местного нанесения включают, но не ограничены перечисленными, минеральное масло, жидкий вазелин, белый вазелин, пропиленгликоль, полиоксиэтилен, полиоксипропиленовое соединение, эмульгирующий воск и воду. В качестве альтернативы, фармацевтически приемлемые композиции могут быть получены в виде подходящего лосьона или крема, содержащего аналог компстатина, суспензированный или растворенный в одном или более фармацевтически приемлемых носителей. Подходящие носители включают, но не ограничены перечисленными, минеральное масло, сорбитмоностеарат, полисорбат 60, воск цетиловых эфиров, цетеариловый спирт, 2-октилдодеканол, бензиловый спирт и воду.
[00407] Системное введение может также осуществляться трансмукозально или трансдермально. Для трансмукозального или трансдермального введения в указанном составе могут применяться пенетранты, подходящие для проникновения через такой барьер. Такие пенетранты общеизвестны в данной области техники и включают, например, для трансмукозального введения, поверхностно-активные вещества, соли желчных кислот и производные фусидовой кислоты. Трансмукозальное введение может осуществляться, например, с применением назальных спреев или суппозиториев. Для трансдермального введения активные соединения, как правило, вводят в состав мазей, бальзамов, гелей или кремов, общеизвестных в данной области техники.
[00408] Указанные соединения могут также быть получены в форме суппозиториев (например, на стандартных основах для суппозиториев, таких как масло какао и другие глицериды) или удерживающих клизм для ректальной доставки.
[00409] Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения аналог компстатина или другое активное соединение вводят в состав с носителями, которые защищают указанное соединение от быстрого выведения из организма, например, в составы с контролируемым высвобождением, такие как имплантаты и микрокапсулированные системы доставки. Например, аналог компстатина может быть включен в состав или инкапсулирован в составе с микрочастицами или наночастицами. Могут применяться биоразлагаемые биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры, полимеры простых эфиров, полимолочная кислота, ПМГК и т.п. Липосомы или другие частицы на основе липидов могут применяться в качестве фармацевтически приемлемых носителей. Они могут быть получены в соответствии с известными специалистам в данной области техники способами, например, согласно описанию в патенте США №4522811 и/или в других источниках, ссылки на которые приведены в настоящей заявке. Могут применяться составы-депо, содержащие аналог компстатина. Указанный аналог компстатина высвобождается из депо на протяжении периода времени, например, таким образом, чтобы обеспечить терапевтическую концентрацию на протяжении более длительного периода времени, чем при внутривенном введении соединения. Согласно некоторым аспектам СКФ придает аналогу компстатина свойства депо. Специалисту в данной области техники будет понятно, что для получения состава с контролируемым высвобождением, имплантата и т.п. необходимо выбирать материалы и способы, позволяющие сохранить активность указанного соединения.
[00410] Следует иметь в виду, что аналог компстатина и/или дополнительный(ые) активный(ые) агент(ы) могут быть представлены в виде фармацевтически приемлемой соли. Фармацевтически приемлемые соли включают соли, полученные из фармацевтически приемлемых неорганических и органических кислот и оснований. Примеры подходящих кислых солей включают ацетат, адипат, альгинат, аспартат, бензоат, бензолсульфонат, бисульфат, бутират, цитрат, камфорат, камфорсульфонат, циклопентанпропионат, диглюконат, додецилсульфат, этансульфонат, формиат, фумарат, глюкогептаноат, глицерофосфат, гликолат, гемисульфат, гептаноат, гексаноат, гидрохлорид, гидробромид, гидроиодид, 2-гидроксиэтансульфонат, лактат, малеат, малонат, метансульфонат, 2-нафталинсульфонат, никотинат, нитрат, оксалат, пальмоат, пектинат, персульфат, 3-фенилпропионат, фосфат, пикрат, пивалат, пропионат, салицилат, сукцинат, сульфат, тартрат, тиоцианат, тозилат и ундеканоат. Также фармацевтически приемлемые соли могут быть при необходимости получены в виде солей щелочных или щелочноземельных металлов, таких как соли натрия, калия или кальция, в зависимости от свойств активного агента.
st
[00411] Следует понимать, что упоминаемые в настоящей заявке фармацевтически приемлемые носители, соединения и способы получения приводятся в качестве примеров и являются неограничивающими. См., например, Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 21 Edition. Philadelphia, PA. Lippincott Williams & Wilkins, 2005, для ознакомления с дополнительным описанием фармацевтически приемлемых соединений и способов получения фармацевтических композиций различных видов.
[00412] Фармацевтическая композиция может быть введена в количестве, эффективном для достижения требуемого благоприятного эффекта. Согласно некоторым вариантам реализации эффективное количество является достаточным для обеспечения одного или нескольких следующих благоприятных эффектов: (i) уменьшения по меньшей мере одного симптома или признака комплемент-опосредованного нарушения; (ii) повышения качества жизни; (iii) снижения уровня госпитализации; (iv) снижения смертности. Специалисту в данной области техники будет понятно, что конкретный благоприятный эффект будет зависеть по меньшей мере частично от различных факторов, например, от конкретного нарушения, лечение которого проводится. Специалисту в данной области техники известны симптомы и признаки, которые могут наблюдаться у субъектов с комплемент-опосредованными нарушениями. Примеры симптомов и признаков различных комплемент-опосредованных нарушений представлены в настоящем документе. Так, согласно некоторым вариантам реализации, например, если субъект страдает от ПНГ или аГУС, благоприятный эффект представляет собой уменьшение комплемент-опосредованного лизиса красных клеток крови. Согласно некоторым аспектам благоприятный эффект является статистически значимым и/или терапевтически значимым по оценке специалиста в данной области техники.
[00413] Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения фармацевтическую композицию, содержащую клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия, вводят парентерально. Согласно некоторым вариантам реализации указанную композицию вводят внутривенно. Согласно некоторым вариантам реализации указанную композицию вводят путем внутривенной инъекции. Согласно некоторым вариантам реализации указанную композицию вводят в виде в/в болюса или в/в инфузии. Согласно некоторым вариантам реализации указанную композицию вводят в виде в/в капельного вливания. Согласно некоторым вариантам реализации указанную композицию вводят в виде в/в болюса с последующей в/в инфузией или в/в капельным вливанием. Согласно некоторым вариантам реализации в/в инфузию проводят на протяжении приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 15, 20, 30, 60 или 120 минут. Согласно некоторым вариантам реализации в/в капельное вливание проводят на протяжении более чем приблизительно 60 минут, например, на протяжении приблизительно 1,2,3 или более часов.
[00414] Согласно некоторым вариантам реализации вводят общее количество аналога компстатина, составляющее от приблизительно 0,1 мг/кг/день до приблизительно 2000 мг/кг/день, например, от приблизительно 1 мг/кг/день до приблизительно 1000 мг/кг/день, например, от приблизительно 5 мг/кг/день до приблизительно 500 мг/кг/день. Согласно некоторым вариантам реализации вводят общее количество аналога компстатина, составляющее от приблизительно 10 мг/кг/день до приблизительно 100 мг/кг/день, например, от приблизительно 10 мг/кг/день до приблизительно 50 мг/кг/день например, от приблизительно 10 мг/кг/день до приблизительно 20 мг/кг/день. Согласно некоторым вариантам реализации вводят приблизительно от 0,5 мг/кг/день до приблизительно 10 мг/кг/день аналога компстатина. Согласно некоторым вариантам реализации вводят приблизительно от 1 мг/кг/день до приблизительно 5 мг/кг/день аналога компстатина. Согласно некоторым вариантам реализации вводят приблизительно от 1 мг/кг/день до приблизительно 3 мг/кг/день аналога компстатина. Согласно некоторым вариантам реализации вводят приблизительно от 3 мг/кг/день до приблизительно 5 мг/кг/день аналога компстатина. Согласно некоторым вариантам реализации вводят приблизительно от 5 мг/кг/день до приблизительно 7,5 мг/кг/день аналога компстатина. Согласно некоторым вариантам реализации вводят приблизительно от 7,5 мг/кг/день до приблизительно 10 мг/кг/день аналога компстатина. Следует иметь в виду, что введение нужного общего суточного количества может осуществляться реализацией разнообразных схем введения. Например, нужное количество аналога компстатина может быть введено при однократном введении или при многократном введении, например, в течение 24-часового периода. Например, субъект может получать две или большее количество доз на протяжении 24-часового периода, и указанные дозы могут быть введены за одинаковые периоды времени или за разные периоды времени.
[00415] Согласно некоторым вариантам реализации клеточно-реактивный аналог компстатина, аналог компстатина длительного действия или нацеленного действия вводят с интервалами более 24 часов. Например, согласно различным вариантам реализации дозы могут быть введены в среднем через день, каждые 3-4 дня, еженедельно, раз в две недели и т.п. Согласно некоторым вариантам реализации ковалентно присоединенные аналоги компстатина, аналоги компстатина длительного действия или нацеленного действия защищают клетки, ткани, органы на протяжении периода длительностью недели или месяцы без необходимости повторения лечения. Например, субъекты могут получать поддерживающее повторное лечение с интервалами 1-2 недели, 2-4 недели, 4-6 недель, 6-8 недель или даже реже. Согласно некоторым вариантам реализации по меньшей мере некоторые дозы вводят подкожно. Например, согласно некоторым вариантам реализации предусматривается введение приблизительно 0,1-5 мг/кг/день, например, приблизительно 0,5-2 мг/кг/день; например, в объеме, равном приблизительно 0,25 мл - 2 мл, например, в объеме, составляющем приблизительно 1 мл. Согласно некоторым вариантам реализации концентрация составляет приблизительно 50 мг/мл - приблизительно 300 мг/мл, например, приблизительно 50 мг/мл - приблизительно 100 мг/мл или приблизительно 100 мг/мл - приблизительно 200 мг/мл.
[00416] Согласно некоторым вариантам реализации введение осуществляется ежедневно. Согласно некоторым вариантам реализации введение осуществляют 1 или 2 раза в день. Как подробно описано в приведенных ниже примерах, при ежедневном подкожном введении примера аналога компстатина длительного действия легко достигаются уровни в крови, существенно превышающие 5 мкМ. Согласно некоторым вариантам реализации внутримышечное введение используют для доставки аналогичных количеств соединения.
[00417] Согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина длительного действия вводят субъекту, используя терапевтически эффективное количество, при этом такое введение приводит к достижению концентраций указанного соединения в крови, превышающих уровень более чем по меньшей мере 1 мкМ, по меньшей мере 2 мкМ, по меньшей мере 2,5 мкМ, по меньшей мере 3 мкМ, по меньшей мере 4 мкМ, по меньшей мере 5 мкМ, по меньшей мере 6 мкМ, по меньшей мере 7 мкМ, по меньшей мере 8 мкМ, по меньшей мере 9 мкМ, по меньшей мере 10 мкМ, по меньшей мере 11 мкМ, по меньшей мере 12 мкМ, или по меньшей мере 13 мкМ, по меньшей мере 14 мкМ, по меньшей мере 15 мкМ, по меньшей мере 16 мкМ, по меньшей мере 18 мкМ или по меньшей мере приблизительно 20 мкМ, или по меньшей мере приблизительно 25 мкМ, или уровень, находящийся в пределах любого диапазона от 4 мкМ до приблизительно 15 мкМ, или приблизительно 20 мкМ, или приблизительно 25 мкМ. Согласно некоторым вариантам реализации такой уровень сохраняется на протяжении по меньшей мере приблизительно 24 часов, или по меньшей мере приблизительно 48 часов, или по меньшей мере приблизительно 72 часов, или по меньшей мере приблизительно 96 часов, или по меньшей мере приблизительно 120 часов, или по меньшей мере приблизительно 144 часов после однократной в/в инъекции или после ежедневных подкожных инъекций на протяжении приблизительно 5-7 дней. При пролонгированном усвоении уровни могут поддерживаться в течение более длительного периода, например, до приблизительно 10 дней, 12 дней, 14 дней или более.
[00418] Согласно некоторым вариантам реализации субъект получает такое лечение, чтобы поддерживать равновесный уровень, составляющий приблизительно 1,0 мкМ, приблизительно 2,0 мкМ, приблизительно 2,5 мкМ, приблизительно 3,0 мкМ, приблизительно 3,5 мкМ, приблизительно 4,0 мкМ, приблизительно 4,5 мкМ, приблизительно 5,0 мкМ, приблизительно 5,5 мкМ, приблизительно 6,0 мкМ, приблизительно 6,5 мкМ, приблизительно 7,0 мкМ, приблизительно 7,5 мкМ, приблизительно 8,0 мкМ, приблизительно 8,5 мкМ, приблизительно 9,0 мкМ, приблизительно 9,5 мкМ или приблизительно 10 мкМ. Согласно некоторым вариантам реализации равновесный уровень составляет от приблизительно 1,0 мкМ до приблизительно 10,0 мкМ, например, от приблизительно 2,0 мкМ до приблизительно 5,0 мкМ, от приблизительно 2,5 мкМ до приблизительно 5,0 мкМ, от приблизительно 5,0 мкМ до приблизительно 7,5 мкМ, или от приблизительно 7,5 мкМ до приблизительно 10 мкМ, или принимает любое промежуточное значение в пределах любого из вышеуказанных диапазонов. Согласно некоторым вариантам реализации концентрация является достаточной для ингибирования по существу лизиса красных клеток крови пациентов с ПНГ, на которые воздействовали сывороткой человека in vitro, например, с применением модифицированного анализа Хэма с сывороткой человека (см., например, пример 8). Согласно некоторым вариантам реализации концентрация является достаточной для уменьшения по меньшей мере на 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или более лизиса красных клеток крови пациентов с ПНГ, на которые воздействовали сывороткой человека in vitro, например, с применением модифицированного анализа Хэма с сывороткой человека (см., например, пример 8). Согласно некоторым вариантам реализации анализ Хэма можно проводить с сывороткой человека, уровень магния в которой доведен приблизительно до 0,005 моль/л и рН понижен до приблизительно 6,2 для активации комплемента. В примерах 18 и 19 приведены данные, подтверждающие способность аналогов компстатина, описанных в настоящем документе, ингибировать лизис кКК от пациентов с ПНГ.
[00419] Согласно некоторым аспектам аналоги компстатина, например, аналоги компстатина длительного действия, могут защищать красные клетки крови пациентов с ПНГ от аккумуляции на поверхности значительных количеств С3 и/или продуктов активации С3. Так, пораженные ПНГ красные клетки крови, которые защищены от комплемент-опосредованного лизиса аналогами компстатина, например, аналогами компстатина длительного действия, могут также быть защищены от аккумуляции на поверхности значительных количеств С3 и/или продуктов активации С3. Как известно в данной области техники, экулизумаб (Солирис, Alexion Pharmaceuticals. Inc.), представляет собой гуманизированное моноклональное антитело против С5, одобренное для лечения ПНГ и аГУС в ряде стран (см., например, Dmytrijuk A, FDA report: eculizumab (Soliris) for the treatment of patients with paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. Oncologist. 2008 Sep;13(9):993-1000. doi: 10.1634/theoncologist.2008-0086. Epub 2008 Sep 10; Westra D., A new era in the diagnosis and treatment of atypical haemolytic uraemic syndrome. Neth J Med. 2012 Apr;70(3): 121-9). Сообщалось, что при воздействии экулизумабом на пораженные ПНГ кКК на поверхности указанных клеток может наблюдаться аккумуляция значительных количеств С3 и/или продуктов активации С3, что может вносить вклад в их выведение и/или внесосудистый гемолиз (например, в селезенке), и, соответственно, может по меньшей мере частично обуславливать персистирующие гематологические аномалии, например, персистирующую анемию, которая наблюдается у некоторых пациентов с ПНГ, несмотря на лечение экулизумабом. Не опираясь на конкретную теорию, это может происходить из-за ингибирования экулизумабом образования МАК, защищающего клетки от опосредованного МАК лизиса, но не ингибирующего активацию С3 или отложение С3 и/или продуктов активации С3, и оставляющего пораженные ПНГ клетки уязвимыми для поверхностной активации С3 и отложения С3 и/или продуктов активации С3 ввиду отсутствия ГФИ-заякоренных комплемент-ингибирующих белков. Не опираясь на конкретную теорию, способность аналогов компстатина, описанных в настоящем документе, ингибировать активацию С3 и таким образом ингибировать продуцирование продуктов активации С3, может обеспечить существенное преимущество. Согласно некоторым вариантам реализации субъект, который получал или получает лечение экулизумабом и у которого продолжают наблюдаться признаки гемолиза, например, клинически значимого гемолиза, например, приводящего к анемии и/или требующего переливания крови, получает лечение аналогом компстатина, описанным в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина используют в концентрации, достаточной для того, чтобы уровень С3 и/или продуктов активации С3 на пораженных ПНГ кКК, на которые воздействовали указанным аналогом компстатина (in vitro (например, в анализе Хэма) или in vivo), находился в пределах диапазона, наблюдаемого в нормальных кКК от здоровых субъектов. Согласно некоторым вариантам реализации уровень С3 и/или продуктов активации С3 на пораженных ПНГ кКК, на которые воздействовали указанным аналогом компстатина (in vitro (например, в анализе Хэма) или in vivo), отстоит не более чем приблизительно на 1,2; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; или 5,0 от среднего уровня или верхнего предела нормального уровня. Согласно некоторым вариантам реализации уровень С3 и/или продуктов активации С3 на пораженных ПНГ кКК, на которые воздействовали аналогом компстатина (in vitro (например, в анализе Хэма) или in vivo), ниже уровня С3 и/или продуктов активации С3 на пораженных ПНГ кКК, на которые воздействовали Солирисом в концентрации, обеспечивающей эквивалентную защиту против комплемент-опосредованного лизиса. Согласно некоторым вариантам реализации уровень С3 и/или продуктов активации С3 на пораженных ПНГ кКК, на которые воздействовали аналогом компстатина (in vitro или in vivo), не превышает приблизительно 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40% или 50% от уровня С3 и/или продуктов активации С3 на пораженных ПНГ кКК, на которые воздействовали экулизумабом в концентрации, обеспечивающей эквивалентную защиту против комплемент-опосредованного лизиса. Согласно некоторым вариантам реализации уровень С3 и/или продуктов активации С3 на пораженных ПНГ кКК, на которые воздействовали указанным аналогом компстатина (in vitro или in vivo), отстоит не более чем приблизительно на 1,2; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; или 5,0 от среднего уровня или верхнего предела нормального диапазона. Согласно некоторым вариантам реализации пораженные ПНГ клетки содержат или состоят из пораженных ПНГ клеток II типа, пораженных ПНГ клеток III типа или их сочетания. Согласно некоторым вариантам реализации указанные кКК состоят по меньшей мере на 50%, 60%, 70%о, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или более из клеток III типа и/или II типа. Согласно некоторым вариантам реализации указанные клетки могут содержать некоторое количество клеток I типа. Согласно некоторым вариантам реализации кКК могут быть классифицированы как клетки I, II или III типа на основании уровня ГФИ-заякоренного белка, такого как CD59, на поверхности, который может быть измерен с применением проточной цитометрии, иммунофлуоресценции или ELISA, например, с применением антитела (например, моноклонального антитела) или другого связывающего агента, который связывает указанный ГФИ-заякоренный белок. Согласно некоторым аспектам ингибирование отложения С3 и/или продуктов активации С3 на клетках или поверхностях может применяться в качестве индикатора эффективности аналога компстатина при других комплемент-опосредованных заболеваниях, таких как аГУС, других комплемент-опосредованных гемолитических заболеваниях или других комплемент-опосредованных заболеваниях. Например, согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина ингибирует такое отложение на эндотелиальных клетках у субъекта с аГУС. Согласно некоторым вариантам реализации указанный уровень С3 и/или продукта(ов) активации С3 может быть измерен с применением проточной цитометрии, иммунофлуоресценции или ELISA, например, с применением антитела (например, моноклонального антитела) или другого связывающего агента, который связывает С3 и/или один или более продуктов активации С3. Согласно некоторым вариантам реализации продукт активации С3 представляет собой C3b, С3с или C3d. Согласно некоторым вариантам реализации связывающий агент связывает C3d. Согласно некоторым вариантам реализации связывающий агент связывает C3d и по меньшей мере один другой продукт активации С3. Согласно некоторым вариантам реализации кКК от пациента с ПНГ, приведенные в контакт с аналогом компстатина in vitro (например, в анализе Хэма), защищены от активированного комплемента таким образом, что относительное содержание (процент) клеток I и II типа, и клеток III типа или относительное содержание или процент клеток III и I; II и I; или III и II типа приблизительно соответствуют полученным в контрольном анализе при применении инактивированного комплемента (например, термоинактивированного комплемента). Согласно некоторым вариантам реализации кКК от пациента с ПНГ, приведенные в контакт с аналогом компстатина in vitro (например, в анализе Хэма), защищены от активированного комплемента таким образом, что относительное содержание или процент клеток I и II типа, и клеток III типа, или относительное содержание или процент клеток III и I; II и I; или III и II типа отличаются не более чем на 5% от содержания или процента, полученного в контрольном анализе при применении инактивированного комплемента (например, термоинактивированного комплемента) используют. Согласно некоторым вариантам реализации комплемент может быть инактивирован термической обработкой, которая может быть реализована путем нагревания компонентов комплемента или сыворотки или плазмы, содержащей компоненты комплемента, до 56°С или более.
[00420] Согласно некоторым вариантам реализации для определения уровня лизиса может дополнительно или альтернативно применяться измерение ЛДГ (лактатдегидрогеназы, фермента, в значительных количествах присутствующего в красных клетках крови, который может служить маркером гемолиза), измерение одного или более гематологических показателей, например, измерение гематокрита, уровня гемоглобина, подсчет ретикулоцитов. Согласно некоторым вариантам реализации один или более таких способов может применяться для определения уровня лизиса кКК, например, кКК, чувствительных к комплемент-опосредованному лизису, например, клеток от пациентов с ПНГ, клеток от пациентов с аГУС, клеток от субъектов с другими комплемент-опосредованными гематологическими нарушениями, клеток, подвергающихся воздействию аномально высоких уровней активированного комплемента. Согласно некоторым аспектам в настоящем описании предложен способ, включающий приведение одной или более клеток в контакт in vitro или in vivo с аналогом компстатина, описанным в настоящем документе, и измерение эффекта указанного аналога компстатина на один или более индикаторов комплемент-опосредованного повреждения клеток и/или активации или отложения комплемента на поверхности клеток. Согласно некоторым вариантам реализации указанный контакт одной или более клеток на протяжении достаточного периода времени при достаточной концентрации приводит к уменьшению аномально высокого значения или увеличению аномально низкого значения до значений, находящихся в пределах нормального диапазона, или до значений, отстоящих не более чем на 5%, 10%, 15%, 20% или 25% от нижнего или верхнего предела нормального диапазона.
[00421] Согласно некоторым аспектам в настоящем описании предложен способ выбора или модификации схемы введения (режима дозирования) или одного или более компонентов схемы введения для пациента с комплемент-опосредованным гемолитическим заболеванием, таким как ПНГ. Указанные один или более компонентов схемы введения могут включать дозу, интервал введения доз, способ введения (например, в/в или подкожный) или их комбинацию. Доза может представлять собой нагрузочную дозу, поддерживающую дозу или и то, и другое. Согласно некоторым вариантам реализации от пациента могут быть получены один или более образцов крови, и схема введения аналога компстатина, например, аналога компстатина длительного действия, или ее компонент может быть выбран или модифицирован таким образом, чтобы обеспечивать достижение нужного уровня защиты кКК пациента от лизиса и/или от аккумуляции С3 и/или продукта(ов) активации С3 in vitro. Согласно некоторым вариантам реализации пациенту могут быть введены одна или более доз аналога компстатина, например, аналога компстатина длительного действия, а затем от пациента могут быть получены один или более образцов крови и проведена их оценка в отношении уровня С3 и/или продукта(ов) активации С3 на поверхности. Согласно некоторым вариантам реализации схема введения или ее компонент, например, доза, интервал введения доз или способ введения, может быть выбран или модифицирован таким образом, чтобы обеспечивать достижение нужного уровня защиты кКК пациента от лизиса и/или от аккумуляции С3 и/или продуктов активации С3 in vitro или in vivo. Согласно некоторым вариантам реализации схема введения или ее компонент, например, доза, интервал введения доз или способ введения, может быть выбран или модифицирован таким образом, чтобы обеспечивать достижение нужного уровня защиты кКК пациента от внесосудистого выведения и/или внесосудистого лизиса in vivo. Нужный уровень может быть, например, представлен уровнем, принятым в данной области техники как обеспечивающий клинически значимый благоприятный эффект, уровнем, обеспечивающим клинически значимый благоприятный эффект у конкретного пациента, уровнем в пределах нормального диапазона, уровнем, выбранным медицинским специалистом, или любым другим выбранным уровнем. Нормальный диапазон для параметра может быть известен в данной области техники и/или может представлять собой эталонный диапазон, установленный лабораторией, например, клинической лабораторией, при этом указанное значение релевантного параметра при измерении по меньшей мере у 95%, 96%, 97%, 98% или 99% общей популяции или по меньшей мере у 95%, 96%, 97%, 98% или 99% здоровых индивидуумов (необязательно при совпадающих одной или более демографических переменных, таких как пол, возраст и т.п.) или в полученных от них биологических образцах (таких как образцы крови), находится в пределах указанного эталоннного диапазона. Эталоннный диапазон может быть установлен с применением популяции образцов, репрезентативной для общей популяции или репрезентативной для здоровых индивидуумов.
[00422] Согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина длительного действия, содержащий СКФ, сконструирован таким образом, чтобы обеспечивать более медленную системную абсорбцию после подкожного или внутримышечного введения субъекту по сравнению с аналогом компстатина, не содержащим СКФ. Согласно некоторым вариантам реализации конкретные свойства СКФ, например, длину, выбирают таким образом, чтобы обеспечивать нужную скорость системной абсорбции после подкожного или внутримышечного введения по сравнению по меньшей мере с некоторыми другими СКФ. Согласно некоторым вариантам реализации Cmax понижена по сравнению с сопоставимой дозой аналога компстатина, не связанного с СКФ, что, таким образом, может вносить вклад в поддержание концентрации указанного соединения в плазме в пределах нужного окна концентраций, например, терапевтического окна. Согласно некоторым вариантам реализации композиция с аналогом компстатина длительного действия характеризуется тем, что доза при подкожном введении полностью абсорбируется в пределах приблизительно 1, 2, 3, 4, 6, 8, 12, 15, 30, 45, 60, 90 или 120 часов после введения по оценке на основании визуального осмотра участка инъекции.
[00423] Следует понимать, что может присутствовать начальная стадия лечения, на протяжении которой лечение проводят чаще и/или вводят более высокие дозы. Например, субъекту с ПНГ или аГУС может потребоваться введение нескольких доз для обеспечения защиты существенной части кКК указанного субъекта. После этого могут быть введены более низкие дозы и/или введение доз может быть менее частым, например, для защиты вновь образующихся кКК и/или для поддержания защиты существующих кКК. Разумеется, сходные методы могут в подходящих случаях применяться для лечения любого заболевания. Согласно некоторым вариантам реализации лечение начинают с в/в введения, а затем переходят к альтернативному пути, например, подкожному, внутримышечному, трансдермальному или внутрикожному введению для поддерживающей терапии. В зависимости от заболевания лечение может продолжаться с интервалами, например, на протяжении месяцев, лет или неограниченного периода времени. Подходящие дозы и схема введения зависят по меньшей мере частично от эффективности и времени полужизни указанного аналога компстатина (или другого активного агента), и могут необязательно корректироваться для конкретного реципиента, например, путем введения повышающихся доз до достижения нужного заранее известного отклика, например, требуемой степени ингибирования комплемента и/или защиты клеток. При необходимости, конкретный уровень дозы для любого конкретного субъекта может быть по меньшей мере отчасти выбран на основании разнообразных факторов, включающих активность конкретного используемого соединения, конкретное состояние, лечение которого проводится, возраст, массу тела, общее состояние здоровья, маршрут введения, скорость выведения, комбинирование с любым лекарственным средством и/или выраженность экспрессии или активности белка комплемента, измеренная в одном или более образцах, полученных от указанного субъекта.
[00424] Согласно некоторым аспектам в настоящем документе описаны способы, согласно которым пациента переводят с лечения ингибитором комплемента, который не содержит аналога компстатина, на лечение аналогом компстатина, например, аналогом компстатина длительного действия (LACA), клеточно-реактивным аналогом компстатина или аналогом компстатина нацеленного действия. Для краткости такие способы описаны применительно к LACA, но в качестве альтернативы их можно применять для перевода пациента на лечение клеточно-реактивным аналогом компстатина или аналогом компстатина нацеленного действия. Согласно определенным вариантам реализации пациент, которому вводят аналог компстатина, например, LACA, получает лечение другим ингибитором комплемента, который не содержит аналога компстатина, во время начала терапии аналогом компстатина, например, LACA. Согласно вариантам реализации, в которых пациент, которому вводят аналог компстатина, получает лечение отличным ингибитором комплемента, который не содержит аналога компстатина, во время начала терапии аналогом компстатина, система комплемента пациента (например, согласно оценке с применением подходящего анализа, такого как анализ индуцированного сывороткой гемолиза ex vivo с применением сыворотки пациента) может быть уже заингибирована во время начала терапии LACA. Согласно определенным вариантам реализации отличный ингибитор комплемента представляет собой ингибитор С5 (т.е. агент, который ингибирует активацию и/или активность С5, как правило, в результате связывания с С5). Согласно определенным вариантам реализации ингибитор С5 представляет собой антитело против С5, такое как экулизумаб, миРНК против С5, такую как ALN-CC5 (Alnylam Pharmaceuticals), полипептид против С5, такой как Коверсин (Volution Immuno Pharmaceuticals, Ltd.), или малую молекулу против С5. Согласно определенным вариантам реализации отличный ингибитор комплемента может представлять собой ингибитор С3. Согласно определенным вариантам реализации лечение отличным ингибитором комплемента, например, ингибитором С5, прекращают, и пациента переводят на лечение LACA. Следует понимать, что перевод на лечение LACA, предпочтительно, проводят таким образом, что пациент не испытывает клинически значимого снижения ингибирования системы комплемента в течение перехода к лечению LACA в качестве монотерапии ингибитором комплемента.
[00425] Например, в случае пациента с комплемент-опосредованной гемолитической анемией, такой как ПНГ, пациент не испытывает клинически значимого увеличения гемолиза, например, который оценивают по уровню ЛДГ и/или гемолитической активности сыворотки ex vivo, когда прекращают лечение отличным ингибитором комплемента. Согласно определенным вариантам реализации за пациентом наблюдают, и переход осуществляют таким образом, что пациент не испытывает измеряемого увеличения уровня ЛДГ, составляющего более 10%, или измеряемого увеличения гемолитической активности, составляющего более 10%. Согласно определенным вариантам реализации переход к лечению LACA в виде единственной терапии ингибитором комплемента осуществляют таким образом, чтобы поддержать по меньшей мере 80% ингибирования гемолитической активности сыворотки ex vivo в течение переходного периода. «Переходный период» означает период времени, начинающийся в день первой дозы LACA и оканчивающийся через X дней после последней дозы отличного ингибитора комплемента, умноженных на 4, где «X» представляет собой интервал между введением доз, с которым отличный ингибитор комплемента вводили пациенту до первой дозы LACA, например, рекомендуемый интервал между введением доз отличного ингибитора комплемента при применении в рекомендуемой дозе. «Рекомендуемая доза» лекарственного средства означает дозу, указанную в инструкции по применению данного лекарственного средства на этикетке, одобренной FDA США, или, если лекарственное средство не одобрено FDA, дозу, указанную в инструкции по применению лекарственного средства на этикетке, одобренной органом власти, ответственным за одобрение лекарственных средств в конкретной юрисдикции, в которой применяют лекарственное средство. «Рекомендуемый интервал между введением доз» для лекарственного средства означает интервал между введением доз, указанный для данного лекарственного средства в инструкции по применению и/или на этикетке, одобренной FDA США, или, если лекарственное средство не одобрено FDA, интервал между введением доз, указанный в инструкции по применению и/или на этикетке, одобренной органом власти, ответственным за одобрение лекарственных средств в конкретной юрисдикции, в которой применяют лекарственное средство. Понятно, что лекарственное средство может характеризоваться двумя или более отличными рекомендуемыми схемами введения. Такие схемы введения могут быть подходящими для различных показаний, подходящими для пациентов, которые обладают различными характеристиками, или просто для альтернативных терапевтически эффективных комбинаций доз, интервала между введением доз и путей введения. Когда лекарственное средство характеризуется двумя или более рекомендуемыми схемами введения, понятно, что термин «рекомендуемый интервал между введением доз» означает рекомендуемый интервал между введением доз для конкретной дозы, которую вводят конкретным применяемым путем введения.
[00426] Согласно определенным вариантам реализации LACA сначала вводят пациенту, который получал по меньшей мере одну дозу отличного ингибитора комплемента в течение периода времени, не более чем в 1,5 раза превышающего рекомендуемый интервал между введением доз отличного ингибитора комплемента, например, в течение периода времени, не превышающего рекомендуемый интервал между введением доз отличного ингибитора комплемента, например, в течение периода времени, составляющего не более чем половину рекомендуемого интервала между введением доз отличного ингибитора комплемента. Согласно определенным вариантам реализации пациент получил по меньшей мере одну дозу отличного ингибитора комплемента в течение 2 недель, предшествующих первой дозе LACA пациента. Согласно определенным вариантам реализации пациент получил по меньшей мере одну дозу отличного ингибитора комплемента в течение 1 недели, предшествующей первой дозе LACA пациента. Согласно определенным вариантам реализации пациент получил дозу отличного ингибитора комплемента менее чем за неделю до первой дозы LACA пациента. Согласно определенным вариантам реализации пациент получил дозу отличного ингибитора комплемента в день первой дозы LACA пациента. Согласно определенным вариантам реализации пациента лечат эффективным количеством отличного ингибитора комплемента и эффективным количеством LACA для того, чтобы поддержать терапевтически эффективные уровни в крови как отличного ингибитора комплемента, так и LACA, в течение периода времени. Такой период совместного приема лекарственных средств может длиться в течение, например, от 1 недели до 2 недель, от 2 недель до 4 недель, от 4 недель до 6 недель, от 6 недель до 8 недель, от 8 недель до 12 недель, от 12 недель до 26 недель. Согласно определенным вариантам реализации период совместного приема лекарственных средств может составлять 1, 2, 3, 4, 5 или 6 месяцев. Согласно определенным вариантам реализации период совместного приема лекарственных средств представляет собой период времени от первой дозы LACA до последней дозы отличного ингибитора комплемента. Отличный ингибитор комплемента можно вводить в обычной поддерживающей дозе, которую пациент получал до начала лечения LACA. Согласно определенным вариантам реализации отличный ингибитор комплемента вводят в дозе, которая снижается с течением времени (убывает), пока лечение отличным ингибитором комплемента в конце концов не прекращают. Например, согласно некоторым вариантам реализации дозу отличного ингибитора комплемента можно снизить до приблизительно 67% от поддерживающей дозы, затем до приблизительно 33% от поддерживающей дозы для последней дозы. Согласно определенным вариантам реализации дозу отличного ингибитора комплемента можно снизить до приблизительно 75% от поддерживающей дозы, затем до приблизительно 50% от поддерживающей дозы, затем до приблизительно 25% от поддерживающей дозы для последней дозы. Согласно определенным вариантам реализации суммарный период, в течение которого пациента лечат как LACA, так и отличным ингибитором комплемента (т.е. время от первой дозы LACA до последней дозы первого ингибитора комплемента), составляет от 2 недель до 26 недель. Согласно определенным вариантам реализации дозу отличного ингибитора комплемента не снижают. Вместо этого согласно некоторым вариантам реализации, например, после того, как LACA достиг терапевтически эффективного уровня в крови, уровень отличного ингибитора комплемента в крови снижается, поскольку он метаболизируется или иным способом выводится из организма. Согласно определенным вариантам реализации в течение перехода и/или после него наблюдают за индуцированным сывороткой гемолизом ex vivo, вызванным сывороткой пациента. Согласно определенным вариантам реализации, если индуцированный сывороткой гемолиз ex vivo, вызванный сывороткой пациента, не снижается по меньшей мере на 80%, например, по меньшей мере на 90%, при оценке в течение перехода с лечения отличным ингибитором комплемента на лечение LACA в качестве единственного ингибитора комплемента, дозу LACA можно увеличить. Согласно определенным вариантам реализации снижение опсонизации красных клеток крови пациента с ПНГ фрагментами С3, такими как C3d, выступает в качестве показателя того, что пациент получает терапевтически эффективное количество LACA. Согласно определенным вариантам реализации лечение как отличным ингибитором комплемента, например, ингибитором С5, так и LACA продолжают в течение по меньшей мере 6 месяцев, например, от 6 до 12 месяцев, от 12 до 24 месяцев или более (например, бессрочно). Согласно определенным вариантам реализации отличный ингибитор комплемента и/или LACA вводят в меньшей дозе, чем их применяли бы в качестве монотерапии ингибитором комплемента для пациента. Следует отметить, что аналогичные способы можно применять для перевода пациента с лечения LACA на лечение отличным ингибитором комплемента, при необходимости, или для перевода пациента с лечения первым LACA на лечение отличным LACA.
[00427] Согласно некоторым аспектам в настоящем документе описаны определенные дозы, схемы введения, композиции и способы, подходящие для введения аналога компстатина длительного действия (LACA) субъекту. Согласно некоторым аспектам определенные дозы, схемы введения, композиции и способы, описанные в настоящем документе, применяли в клинических исследованиях, включающих подкожное или интравитреальное введение LACA, содержащего линейный ПЭГ молекулярной массой 40 кДа и два фрагмента аналога компстатина (каждый из которых присоединен к каждому концу линейного ПЭГ), здоровым субъектам-людям или пациентам с ПНГ, или в исследованиях, включающих интравитреальное введение того же LACA пациентам с ВМД (см. примеры). Соответственно, согласно некоторым аспектам дозы, схемы введения, композиции и/или способы, описанные в настоящем документе, можно применять для введения LACA, содержащего линейный ПЭГ молекулярной массой приблизительно 40 кДа и два фрагмента аналога компстатина, субъекту (например, пациенту, который страдает от комплемент-опосредованного нарушения). Согласно определенным вариантам реализации два фрагмента аналога компстатина присоединены к концам линейного ПЭГ (т.е. один фрагмент аналога компстатина присоединен к каждому концу ПЭГ). Согласно определенным вариантам реализации каждый фрагмент аналога компстатина присоединен его С-концом к линейному ПЭГ. Согласно определенным вариантам реализации LACA может представлять собой CA28-2GS-BF или СА28-2TS-BF.
P1
P2
P3
[00428] Как описано в настоящем документе, фрагмент аналога компстатина может содержать спейсер, отделяющий аминокислоту, которая содержит боковую цепь, содержащую реактивную функциональную группу, например, первичный или вторичный амин, сульфгидрил или сульфгидрил-реактивную группу (или аминокислотную последовательность, содержащую такую аминокислоту), от части фрагмента аналога компстатина, содержащей циклическую часть, или такая связывающая часть может отсутствовать. В случае наличия такой спейсерный фрагмент может содержать замещенную или незамещенную, насыщенную или ненасыщенную алкильную цепь, цепь олиго(этиленгликоля) и/или любые из других фрагментов, обозначенных в настоящем документе как L (или L, L или L). Когда в соединении присутствуют два или более фрагментов аналога компстатина, содержащих спейсерные фрагменты, согласно различным вариантам реализации спейсерные фрагменты могут являться одинаковыми или разными. Дозы, схемы введения, композиции и/или способы можно применять для введения аналогов компстатина длительного действия, содержащих фрагменты аналога компстатина, которые содержат любые такие спейсерные фрагменты.
P1
P2
P3
[00429] Как также описано в настоящем документе, согласно различным вариантам реализации фрагменты аналога компстатина могут быть присоединены к ПЭГ (или другому полимеру) любой из широкого множества различных связей. Согласно определенным вариантам реализации один или более фрагментов аналога компстатина могут быть присоединены к СКФ фрагментом, содержащим ненасыщенный алкильный фрагмент, фрагмента, содержащего неароматическую циклическую кольцевую систему, ароматического фрагмента, эфирного фрагмента, амидного фрагмента, сложноэфирного фрагмента, карбонильного фрагмента, иминного фрагмента, тиоэфирного фрагмента, остатка аминокислоты и/или любого из фрагментов, обозначенных выше как L (или L, L или L). Например, как описано в настоящем документе, согласно конкретным вариантам реализации один или более фрагментов аналога компстатина могут быть присоединены к СКФ карбаматной связью, сложноэфирной связью, амидной связью или комбинацией двух или более таких связей. Когда в соединении присутствуют два или более фрагментов аналога компстатина, согласно различным вариантам реализации связи с полимером могут быть одинаковыми или различными. Дозы, схемы введения, композиции и/или способы можно применять для введения аналогов компстатина длительного действия, содержащих фрагменты аналога компстатина, присоединенные к СКФ любым из таких фрагментов.
[00430] Согласно определенным вариантам реализации дозы, схемы введения, композиции и/или способы, описанные в настоящем документе, можно применять для введения LACA, который отличается одним или более аспектами от LACA, применявшегося в клинических исследованиях, описанных в настоящем документе. Например, такой LACA может содержать: (i) отличный полимер в качестве СКФ (например, ПОЗ, полипептид, разветвленный ПЭГ), (и) полимер, который характеризуется молекулярной массой, меньшей или большей, чем 40 кДа, в качестве СКФ; (iii) отличное количество фрагментов аналога компстатина (например, 1, 3, 4 или более фрагментов аналога компстатина вместо 2 фрагментов аналога компстатина), (iv) один или более фрагментов аналога компстатина, содержащих последовательность, которая отличается от SEQ ID NO: 28, вместо SEQ ID NO: 28 (например, любой из других фрагментов аналога компстатина, описанных в настоящем документе); (v) (один или более) фрагментов аналога компстатина, удлиненных отличным остатком аминокислоты (или аминокислотной последовательностью, содержащей такой остаток аминокислоты), которая содержит боковую цепь, содержащую первичный или вторичный амин вместо лизина, или содержащую отличную реактивную функциональную группу, такую как сульфгидрил или сульфгидрил-реактивную группу; (vi) (один или более) фрагментов аналога компстатина, присоединенных к СКФ N-концом фрагмента аналога компстатина, а не С-концом; (vii) отличный блокирующий фрагмент или фрагменты на свободном конце одного или более фрагментов аналога компстатина; (viii) любую комбинацию двух или более из (i), (ii), (iii), (iv), (v), (vi), (vii) и (vii).
[00431] Как упомянуто выше, согласно некоторым аспектам дозы, схемы введения, композиции и/или способы, описанные в настоящем документе, можно применять для введения LACA, содержащего в качестве СКФ полимер (например, ПЭГ) молекулярной массой приблизительно 40 кДа, например, полимер молекулярной массой 36 кДа - 44 кДа, 37 кДа - 43 кДа, 38 кДа - 42 кДа или 39 кДа - 41 кДа. Однако согласно некоторым вариантам реализации дозы, схемы введения, композиции и/или способы можно применять для введения LACA, содержащего полимер, молекулярная масса которого находится в более широком диапазоне. Согласно определенным вариантам реализации, представляющим особенный интерес, молекулярная масса полимера составляет не более 45 кДа. Согласно определенным вариантам реализации полимер характеризуется молекулярной массой 10 кДа - 45 кДа. Согласно определенным вариантам реализации полимер характеризуется молекулярной массой 20 кДа - 45 кДа. Согласно определенным вариантам реализации полимер характеризуется молекулярной массой 30 кДа - 40 кДа. Согласно определенным вариантам реализации полимер характеризуется молекулярной массой 30 кДа - 45 кДа. Согласно определенным вариантам реализации полимер характеризуется молекулярной массой 35 кДа - 45 кДа. Согласно определенным вариантам реализации полимер характеризуется молекулярной массой, превышающей 45 кДа, например, вплоть до 50 кДа. Понятно, что молекулярные массы полимера могут означать среднюю молекулярную массу молекул полимера в композиции, как обсуждается в настоящем документе.
[00432] Согласно определенным вариантам реализации композиции содержат в качестве фармацевтически приемлемого носителя 5% декстрозу. Однако можно применять любой фармацевтически приемлемый носитель.
[00433] Согласно различным вариантам реализации дозы, схемы введения, композиции и/или способы, описанные в настоящем документе, можно применять для лечения любого из комплемент-опосредованных нарушений, упомянутых в настоящем документе. Без ограничения, такие нарушения включают, например, ПНГ, НЗН, тяжелую миастению, аГУС, ХОБЛ, идиопатический легочный фиброз, отторжение органов после трансплантации (например, острое или хроническое отторжение), пемфигоид и ВМД. Согласно определенным вариантам реализации комплемент-опосредованное нарушение представляет собой хроническое комплемент-опосредованное нарушение, например, любое из хронических комплемент-опосредованных нарушений, упомянутых в настоящем документе. Согласно определенным вариантам реализации комплемент-опосредованное нарушение представляет собой Th17-ассоциированное нарушение, например, любое из Th17-ассоциированных нарушений, упомянутых в настоящем документе.
[00434] Согласно некоторым аспектам в настоящем документе описаны различные дозы, схемы введения, композиции и способы, подходящие для лечения пациентов путем подкожного введения LACA. В экспериментах с LACA, содержащим фрагмент 40 кДа ПЭГ, было установлено, что вязкость, а не растворимость, является главным фактором, который ограничивает концентрацию композиции, содержащей LACA, которую можно ввести путем подкожной или и/в/т инъекции способом, который является подходящим для врачей и пациентов с точки зрения времени и давления, необходимых для доставки данного объема композиции через иглу данного внутреннего диаметра или номера калибра. Номер калибра описывает внешний диаметр полой иглы, и больший номер калибра указывает на меньший внешний диаметр. Как правило, иглы, которые характеризуются большим номером калибра, могут быть предпочтительными для пациентов и врачей, поскольку их применение может сопровождаться (или может восприниматься как сопровождаемое) меньшей болью и/или повреждением ткани по сравнению с иглами, которые характеризуются меньшим номером калибра. Внутренний диаметр зависит как от внешнего диаметра, так и от толщины стенок. Для стандартных игл чем выше номер калибра, тем меньше внутренний диаметр (например, игла 27 калибра характеризуется большим внутренним диаметром, чем игла 29 калибра, которая в свою очередь характеризуются большим внутренним диаметром, чем игла 30 калибра).
[00435] Согласно определенным вариантам реализации композиция, например, фармацевтическая композиция, содержащая LACA, характеризуется концентрацией 150 мг/мл. Было установлено, что раствор 150 мг/мл LACA, содержащего 40 кДа ПЭГ, можно легко доставить с применением иглы 27 калибра. Соответственно, согласно некоторым вариантам реализации иглу 27 калибра применяют для введения дозы LACA, содержащего ПЭГ молекулярной массой приблизительно 40 кДа, в концентрации вплоть до 150 мг/мл, например, 100 мг/мл - 150 мг/мл, например, 100 мг/мл, 125 мг/мл или 150 мг/мл. Согласно определенным вариантам реализации композиция, которая содержит LACA, содержащий 40 кДа ПЭГ, характеризуется концентрацией 150 мг/мл - 180 мг/мл. Согласно определенным вариантам реализации композиция, которая содержит LACA, содержащий ПЭГ молекулярной массой приблизительно 40 кДа, характеризуется концентрацией 180 мг/мл - 200 мг/мл. Согласно определенным вариантам реализации иглу 27 калибра применяют для введения композиции, которая содержит LACA, содержащий ПЭГ молекулярной массой приблизительно 40 кДа, в концентрации 150 мг/мл - 160 мг/мл, 160 мг/мл - 170 мг/мл, 170 мг/мл - 180 мг/мл, 180 мг/мл - 190 мг/мл или 190 мг/мл - 200 мг/мл. Разумеется, вместо иглы с номером калибра 27 (или выше) в качестве альтернативы можно применять иглу с меньшим номером калибра (например, калибра 25, 26).
[00436] Настоящее описание изобретения включает вывод о том, что 200 мг/мл раствор LACA, содержащего 40 кДа ПЭГ, можно с легкостью доставить с применением иглы 25 калибра. Согласно определенным вариантам реализации для введения композиции, которая содержит LACA, содержащий 40 кДа ПЭГ, в концентрации 200 мг/мл или более, применяют иглу 25 калибра или иглу 26 калибра. Согласно определенным вариантам реализации для введения композиции, содержащей LACA в концентрации 200 мг/мл - 225 мг/мл или 225 мг/мл - 250 мг/мл, применяют иглу 25 калибра или иглу 26 калибра.
[00437] Согласно некоторым аспектам в настоящем описании изобретения представлена конкретная применимость определенных тонкостенных игл для введения LACA согласно настоящему изобретению. Например, согласно некоторым вариантам реализации тонкостенную иглу применяют для подкожной, внутримышечной или внутриглазной (например, интравитреальной) инъекции LACA. Тонкостенные иглы характеризуются внешними диаметрами, идентичными внешним диаметрам стандартных игл, но большими внутренними диаметрами для данного калибра. Например, тонкостенная игла может характеризоваться размером внутреннего диаметра, который является таким же, как и диаметр стандартной иглы калибра на одно-два значения ниже (например, тонкостенная игла 29 калибра может характеризоваться внутренним диаметром, который является таким же, как и диаметр стандартной иглы 27 калибра или 28 калибра, но внешним диаметром, который является таким же, как и диаметр стандартной иглы 29 калибра). Увеличение внутреннего диаметра может привести к значительному увеличению потока жидкости при данном давлении и/или к значительному снижению давления, необходимого для поддержания данного потока. Меньшее давление означает, что для введения композиции данной вязкости требуется меньшая сила при инъекции. Как правило, меньшая сила при инъекции облегчает введение и вследствие этого обычно является желательным свойством. Согласно определенным вариантам реализации тонкостенная игла характеризуется данным внутренним диаметром, который является постоянным по всей длине иглы. Согласно определенным вариантам реализации тонкостенная игла характеризуется внутренним диаметром, который меняется по длине иглы. Например, диаметр может являться таким же, как диаметр стандартной иглы 29 калибра, на одном конце иглы и увеличиваться до диаметра стандартной иглы 27 калибра на другом конце. Согласно определенным вариантам реализации можно применять микроконическую иглу. Согласно определенным вариантам реализации можно применять иглу со скальпелеподобным наконечником. Длина иглы может варьировать. Согласно определенным вариантам реализации можно применять короткую иглу, такую как игла 5 мм или 6 мм. Согласно определенным вариантам реализации можно применять иглу, длина которой составляет от 6 мм до 8 мм или от 8 мм до 12 мм. Подходящие иглы и шприцы являются коммерчески доступными, например, от компаний Becton Dickinson and Company (BD), Terumo Corp. и т.д.
[00438] Согласно определенным вариантам реализации композицию, которая характеризуется данной вязкостью и/или концентрацией, можно вводить с применением тонкостенной иглы, калибр которой на одно или два значения превышает размер калибра, который, предпочтительно, используют, когда стандартную иглу применяют для введения композиции той же вязкости и/или концентрации при выбранной скорости потока и/или с выбранной силой при инъекции. Например, согласно некоторым вариантам реализации композицию, которую, предпочтительно, вводят с применением стандартной иглы 25 калибра для достижения желаемой скорости потока и/или силы при инъекции, можно вводить с такой же скоростью потока и/или силой при инъекции с применением тонкостенной иглы 26 или 27 калибра. Согласно определенным вариантам реализации композицию, которую, предпочтительно, вводят с применением стандартной иглы 27 калибра для достижения желаемой скорости потока и/или силы при инъекции, можно вводить с такой же скоростью потока и/или силой при инъекции с применением тонкостенной иглы 28 или 29 калибра. Согласно определенным вариантам реализации композицию, которую, предпочтительно, вводят с применением стандартной иглы 29 калибра для достижения желаемой скорости потока и/или силы при инъекции, можно вводить с такой же скоростью потока и/или силой при инъекции с применением тонкостенной иглы 30 или 31 калибра. Согласно определенным вариантам реализации тонкостенную иглу 29 калибра применяют для введения композиции, которая содержит LACA, содержащий полимер (например, ПЭГ) молекулярной массой приблизительно 40 кДа, в концентрации 150 мг/мл - 160 мг/мл, 160 мг/мл - 170 мг/мл, 170 мг/мл - 180 мг/мл, 180 мг/мл - 190 мг/мл или 190 мг/мл - 200 мг/мл. Разумеется, вместо тонкостенной иглы с номером калибра 29 (или выше) в качестве альтернативы можно применять тонкостенную иглу с меньшим номером калибра (например, 27, 28 калибром).
[00439] Согласно некоторым аспектам подходящий объем для индивидуальной п/к инъекции может составлять вплоть до 2 миллилитров (мл) - 3 мл. Таким образом, например, согласно некоторым вариантам реализации путем п/к инъекции можно вводить объем более чем 1,0 мл, например, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9 или 2,0 мл. Согласно определенным вариантам реализации путем п/к инъекции можно вводить объем более чем 2,0 мл, например, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4 или 2,5 мл. Согласно определенным вариантам реализации путем п/к инъекции можно вводить объем более чем 2,5 мл, например, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9 или 3,0 мл. Согласно определенным вариантам реализации применяют объем 1 мл или менее на инъекцию, например, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или 1,0 мл. Согласно определенным вариантам реализации суммарный ежедневный объем, вводимый пациенту, составляет от 1,0 до 2,5 мл, например, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4 или 2,5 мл. Согласно определенным вариантам реализации, в которых вводят две п/к инъекции, можно вводить объем вплоть до 5 мл. Согласно определенным вариантам реализации объем 1,0-2,5 мл вводят в виде однократной ежедневной инъекции. Согласно определенным вариантам реализации объем 1,0-2,5 мл вводят в виде двух отдельных инъекций. Объемы, вводимые в двух отдельных инъекциях, могут являться одинаковыми или различными, при условии, что в совокупности они обеспечивают суммарный объем, достаточный для введения желаемого количества LACA. Согласно определенным вариантам реализации две отдельные инъекции можно вводить с разницей вплоть до 12 часов. Однако согласно некоторым вариантам реализации две отдельные инъекции вводят с разницей вплоть до 5, 10, 15, 20, 30 или 60 минут друг от друга.
[00440] Согласно некоторым аспектам одну или более фиксированных доз можно применять для различных пациентов, масса и/или площадь поверхности тела которых могут варьировать в пределах относительно широких диапазонов. Согласно определенным вариантам реализации могут быть предложены 2, 3 или более различных фиксированных доз, причем различные дозы могут, например, быть более подходящими для индивидуумов, масса и/или площадь поверхности тела которых находится в различных диапазонах.
[00441] Согласно определенным вариантам реализации фиксированную дозу можно применять для введения количества аналога компстатина (например, LACA), которое позволит достичь желаемого уровня ингибирования комплемента (например, который оценивают в образце плазмы) у по меньшей мере 25%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% или более здоровых субъектов, и/или у по меньшей мере 25%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% или более пациентов, которые нуждаются в лечении конкретного нарушения, упомянутого в настоящем документе. Согласно определенным вариантам реализации фиксированную дозу можно применять для введения количества, которое позволит достичь желаемого уровня эффективности (например, который оценивают с применением соответствующей конечной точки) у по меньшей мере 25%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 75% или по меньшей мере 90% пациентов, которые нуждаются в лечении конкретного нарушения, упомянутого в настоящем документе. Согласно некоторым аспектам доза, описанная в настоящем документе, может быть в особенности подходящей для подкожного (п/к) введения. Однако согласно некоторым вариантам реализации дозы, описанные в настоящем документе, можно вводить субъекту с применением других парентеральных путей введения, таких как внутривенный, трансдермальный или внутримышечный пути, вместо подкожного пути или в дополнение к нему. Таким образом, когда в описании упоминается подкожное введение конкретной дозы, описание изобретения обеспечивает варианты реализации, в которых такую дозу вводят отличным путем введения (например, внутривенным, трансдермальным или внутримышечным).
[00442] Согласно определенным вариантам реализации общая ежедневная доза для парентерального введения, например, подкожного введения, LACA, содержащего два фрагмента аналога компстатина и ПЭГ молекулярной массой приблизительно 40 кДа, составляет по меньшей мере 30 мг/день, например, по меньшей мере 45 мг/день, например, по меньшей мере 90 мг/день, например, по меньшей мере 150 мг/день, например, по меньшей мере 180 мг/день. Согласно определенным вариантам реализации ежедневная доза составляет 90 мг/день - 180 мг/день. Согласно определенным вариантам реализации ежедневная доза составляет 180 мг/день - 270 мг/день. Согласно определенным вариантам реализации доза составляет, например, 180 мг/день - 230 мг/день. Согласно определенным вариантам реализации доза составляет по меньшей мере 190 мг/день, например, 190 мг/день - 240 мг/день. Согласно определенным вариантам реализации доза составляет по меньшей мере 200 мг/день, например, 200 мг/день - 250 мг/день. Согласно определенным вариантам реализации доза составляет по меньшей мере 210 мг/день, например, 210 мг/день -260 мг/день. Согласно определенным вариантам реализации доза составляет по меньшей мере 220 мг/день, например, 220 мг/день - 270 мг/день. Согласно определенным вариантам реализации доза составляет по меньшей мере 230 мг/день, например, 230 мг/день-280 мг/день. Согласно определенным конкретным вариантам реализации доза составляет 180 мг/день, 190 мг/день, 200 мг/день, 205 мг/день, 210 мг/день, 215 мг/день, 220 мг/день, 225 мг/день, 230 мг/день, 235 мг/день, 240 мг/день, 245 мг/день, 250 мг/день, 255 мг/день, 260 мг/день, 265 мг/день или 270 мг/день. Согласно определенным вариантам реализации дозу 180 мг/день - 270 мг/день вводят в однократной ежедневной инъекции объемом 1,5 мл - 2,0 мл. Согласно определенным вариантам реализации дозу 180 мг/день - 270 мг/день вводят в однократной ежедневной инъекции объемом вплоть до 2,0 - 2,5 мл. Согласно определенным вариантам реализации дозу 180 мг/день - 270 мг/день вводят в двух ежедневных инъекциях, объем каждой из которых составляет менее 2,0 мл, например, от 1,0 мл до 1,9 мл. Например, согласно конкретному варианту реализации ежедневную дозу 270 мг/день вводят в однократной инъекции в объеме 1,5 мл. Согласно другому конкретному варианту реализации ежедневную дозу 270 мг/день вводят в однократной инъекции объемом 1,8 мл. Согласно другому конкретному варианту реализации ежедневную дозу 270 мг/день вводят в двух ежедневных инъекциях объемом 0,9 мл каждая. Согласно некоторым конкретным вариантам реализации ежедневную дозу 270 мг/день вводят в двух ежедневных инъекциях объемом 0,9 мл - 1,2 мл каждая, например, 1,0 мл, 1,05 мл, 1,1 мл, 1,15 мл или 1,2 мл. Согласно некоторым конкретным вариантам реализации ежедневную дозу 270 мг/день вводят в двух ежедневных инъекциях объемом 1,2 мл - 1,5 мл каждая, например, 1,2 мл, 1,25 мл, 1,35 мл, 1,40 мл, 1,45 мл или 1,5 мл. Согласно некоторым конкретным вариантам реализации ежедневную дозу 270 мг/день вводят в двух ежедневных инъекциях объемом 1,5 мл - 1,9 мл каждая, например, 1,55 мл, 1,6 мл, 1,65 мл, 1,7 мл, 1,75 мл, 1,8 мл, 1,85 мл или 1,90 мл.
[00443] Согласно определенным вариантам реализации общая ежедневная доза для парентерального введения, например, подкожного введения LACA, содержащего два фрагмента аналога компстатина и ПЭГ молекулярной массой приблизительно 40 кДа, составляет 270 мг/день - 360 мг/день. Согласно определенным вариантам реализации доза составляет 270 мг/день - 300 мг/день. Согласно определенным вариантам реализации доза составляет 300 мг/день - 330 мг/день. Согласно определенным вариантам реализации доза составляет 330 мг/день - 360 мг/день. Согласно определенным конкретным вариантам реализации доза составляет 295 мг/день, 300 мг/день, 305 мг/день, 310 мг/день, 315 мг/день, 320 мг/день, 325 мг/день, 330 мг/день, 335 мг/день, 340 мг/день, 345 мг/день, 350 мг/день, 355 мг/день или 360 мг/день. Согласно определенным вариантам реализации дозу 270 мг/день - 360 мг/день вводят в однократной ежедневной инъекции объемом 1,5 мл - 2,0 мл или в однократной ежедневной инъекции объемом вплоть до 2,0 - 2,5 мл. Согласно определенным вариантам реализации дозу 270 мг/день - 360 мг/день (например, любую из вышеупомянутых доз) вводят в двух ежедневных инъекциях, объем каждой из которых составляет менее 2,0 мл, например, от 1,0 мл и 1,9 мл, например, 1,0 мл, 1,05 мл, 1,10 мл, 1,15 мл, 1,20 мл, 1,25 мл, 1,30 мл, 1,35 мл, 1,40 мл, 1,45 мл, 1,50 мл, 1,55 мл, 1,60 мл, 1,65 мл, 1,70 мл, 1,75 мл, 1,80 мл, 1,85 мл, 1,90 мл.
[00444] Согласно определенным вариантам реализации общая ежедневная доза для п/к введения LACA, содержащего два фрагмента аналога компстатина и ПЭГ молекулярной массой приблизительно 40 кДа, составляет по меньшей мере 360 мг/день, например, 360 мг/день - 540 мг/день. Согласно некоторому варианту реализации общая ежедневная доза составляет более чем 360 мг/день, например, до приблизительно 540 мг/день. Например, общая ежедневная доза может представлять собой 370 мг/день, 380 мг/день, 390 мг/день, 400 мг/день, 410 мг/день, 420 мг/день, 430 мг/день, 440 мг/день, 450 мг/день, 460 мг/день, 470 мг/день, 480 мг/день, 490 мг/день, 500 мг/день, 510 мг/день, 520 мг/день, 530 мг/день или 540 мг/день. Согласно определенным вариантам реализации дозу 360 мг/день - 540 мг/день вводят в однократной ежедневной инъекции, например, в объеме приблизительно 2,0 - 2,5 мл или 2,5 мл - 3,0 мл. Согласно определенным вариантам реализации дозу 360 мг/день - вплоть до приблизительно 540 мг/день вводят в двух ежедневных инъекциях, объем каждой из которых составляет менее 2,0 мл, например, от 1,0 мл до 1,9 мл.
[00445] Понятно, что дозы и объемы, описанные в настоящем документе для подкожного введения (или другого парентерального пути введения), можно вводить с применением обособленной иглы и шприца, шприц-ручки, автоинжектора или других устройств, известных специалистам в данной области техники.
[00446] Согласно определенным вариантам реализации лечение аналогом компстатина, например, LACA, путем подкожного введения или другого парентерального пути введения, например, согласно любому из схем введения и/или с применением любой из доз или устройств для введения, описанных в настоящем документе, можно продолжать в течение любого периода времени, например, бессрочно. Согласно определенным вариантам реализации пациент может получать лечение коротким курсом лечения (например, в течение вплоть до 1 недели, 2 недель или вплоть до 1, 2, 3, 4, 5, 6 месяцев). Согласно определенным вариантам реализации такого короткого курса лечения может быть достаточно для модификации течения нарушения (например, ПНГ, НЗН, тяжелой миастении, ХОБЛ), так, чтобы при прерывании лечения поддерживалась длительная ремиссия (например, которая подтверждается отсутствием обострений или рецидивов), т.е. между курсами лечения допускается вымывание LACA из организма. Согласно определенным вариантам реализации субъект может получать лечение коротким курсом один или два раза в год, каждые два года и т.д. Согласно определенным вариантам реализации короткий курс лечения может модифицировать течение нарушения (например, ПНГ, НЗН, тяжелой миастении, ХОБЛ, астмы, идиопатического легочного фиброза, васкулита, пемфигоида), так что длительной ремиссии или излечивания достигают без дополнительного лечения. Не опираясь на конкретную теорию, считают, что короткого курса лечения аналогом компстатина, например, LACA, может быть достаточно для нарушения цикла, который поддерживает иммунный ответ против клеток или тканей (например, их компонентов, таких как белки или липиды), которые являются мишенью атаки иммунной системы при комплемент-опосредованном нарушении. Согласно определенным вариантам реализации, например, короткого курса лечения LACA может быть достаточно для нарушения цикла, который поддерживает иммунный ответ против клеток или тканей в костном мозге (например, против гемопоэтических стволовых клеток) (например, у пациента с ПНГ), в нервной системе (например, против нервных клеток, глиальных клеток) (например, у пациента с НЗН или тяжелой миастенией), в кровеносной системе (например, против эндотелиальных клеток) (например, у пациента с васкулитом), в дыхательной системе (например, у пациента с ХОБЛ, астмой или идиопатическим легочным фиброзом), в системе покровов тела (например, у пациента с пемфигоидом).
[00447] Согласно некоторым аспектам в настоящем документе описаны различные дозы, схемы введения, композиции и способы применения для лечения пациента, который нуждается в лечении комплемент-опосредованного глазного нарушения, которое поражает задний сегмент глаза, например, сетчатку, путем интравитреального (и/в/т) введения LACA. Согласно определенным вариантам реализации глазное нарушение представляет собой ВМД, например, запущенную ВМД (географическую атрофию (ГА) или неоваскулярную ВМД), диабетическую ретинопатию, глаукому или увеит.
[00448] Согласно определенным вариантам реализации доза для интравитреальной инъекции LACA, содержащего два фрагмента аналога компстатина и ПЭГ молекулярной массой приблизительно 40 кДа, составляет 5 мг - 20 мг. Согласно определенным вариантам реализации доза составляет 10 мг. Согласно определенным вариантам реализации доза составляет 10 мг, 11 мг, 12 мг, 13 мг, 14 мг, 15 мг, 16 мг, 17 мг, 18 мг, 19 мг или 20 мг. Согласно определенным конкретным вариантам реализации доза составляет 15 мг. Согласно определенным вариантам реализации любую из вышеупомянутых доз вводят путем интравитреальной инъекции объемом от 90 до 110 микролитров, например, в объеме 100 микролитров. Согласно определенным вариантам реализации любую из вышеупомянутых доз вводят путем интравитреальной инъекции с применением иглы 27, 28, 29 или 30 калибра. В клинических исследованиях фазы 1b было установлено, что дозы вплоть до 20 мг (т.е. 5 мг, 10 мг и 20 мг) в объеме 100 микролитров, вводимые путем интравитреальной инъекции с применением иглы 29 калибра, хорошо переносились пациентами с ВМД. Согласно определенным вариантам реализации выбирают комбинацию дозы и калибра иглы, которая обеспечивает введение путем и/в/т инъекции в течение 10 секунд или менее. Согласно определенным вариантам реализации применяют комбинацию дозы и иглы, которая обеспечивает введение дозы путем и/в/т инъекции в течение 5-6 секунд или менее. Было установлено, что доза 15 мг в объеме 100 микролитров (150 мг/мл) приводит к получению композиции, которая характеризуется благоприятной вязкостью для введения путем интравитреальной инъекции в течение 5-6 секунд или менее через тонкостенную иглу 27 калибра.
[00449] Согласно определенным вариантам реализации дозу композиции, содержащей LACA, вводят путем и/в/т инъекции объемом более чем 100 микролитров. Например, можно применять объем 100-110 микролитров, 110-125 микролитров или 125-150 микролитров. Такие большие объемы могут позволить осуществлять введение более высокой дозы по сравнению с объемом инъекции 100 микролитров без увеличения времени, необходимого для доставки дозы, и/или без необходимости применения иглы меньшего калибра (большего диаметра). Такое увеличение суммарной дозы может быть пропорционально увеличению объема. Например, увеличение объема дозы на 50% обеспечит увеличение на 50% количества LACA, вводимого без увеличения времени, необходимого для доставки дозы, и/или без необходимости применения иглы меньшего калибра.
[00450] Согласно определенным вариантам реализации дозу композиции, содержащей LACA, вводят путем глазного введения (например, и/в/т инъекции) один раз в день, один раз в 6 недель или один раз в 2 месяца (т.е. через месяц). Согласно определенным вариантам реализации дозу композиции, содержащей LACA, вводят путем и/в/т инъекции один раз в 3 месяца, один раз в 4 месяца, один раз в 5 месяцев или один раз в 6 месяцев или менее часто, например, один раз в 9 месяцев, один раз в год). Таким образом, согласно некоторым вариантам реализации пациент может получать от 1 до 6 инъекций в год, как правило, через приблизительно равные интервалы времени. Согласно определенным вариантам реализации пациент изначально получает лечение ежемесячными инъекциями (например, в течение первых 3-6 месяцев или первых 6-12 месяцев) с последующим менее частым введением (например, один раз в 2, 3, 4, 5 или 6 месяцев или менее часто, например, один раз в 9 месяцев, один раз в год).
[00451] Согласно определенным вариантам реализации лечение LACA путем и/в/т инъекции согласно любому из вышеупомянутых схем введения можно продолжать бессрочно. Согласно определенным вариантам реализации пациент может получать лечение коротким курсом лечения (например, 1, 2, 3, 4, 5 или 6 и/в/т инъекций). Согласно определенным вариантам реализации короткого курса лечения может быть достаточно, чтобы остановить или по существу остановить прогрессирование нарушения (например, ВМД, например, ГА или ранней или промежуточной ВМД), так что дополнительное лечение не требуется. Например, короткого курса лечения LACA может быть достаточно для нарушения цикла, который поддерживает иммунный ответ против сетчатки или пигментного эпителия сетчатки.
[00452] Согласно определенным вариантам реализации LACA вводят с применением шприца с одной или более особенностями конструкции, которые снижают трение и/или требуемую силу при инъекции, такими как относительно короткий цилиндр и/или относительно больший размер плунжера. [00453] В экспериментах, проведенных с применением LACA, содержащих ПЭГ различных молекулярных масс, было определено, что раствор LACA, содержащего более низкомолекулярный ПЭГ (например, 10 кДа - 30 кДа), характеризуется сниженной вязкостью по сравнению с LACA, содержащим 40 кДа ПЭГ, при одинаковой концентрации в мг/мл. Меньшая вязкость может способствовать применению иглы более высокого номера калибра (например, 29 калибра вместо 27 калибра). Согласно определенным вариантам реализации LACA, содержащий полимер, например, ПЭГ, молекулярной массой менее 40 кДа, можно вводить с применением иглы с меньшим внутренним диаметром и/или большим номером калибра, чем LACA, содержащий полимер, например, ПЭГ, молекулярной массой 40 кДа или более. Согласно определенным вариантам реализации LACA, содержащий полимер, например, ПЭГ, молекулярной массой менее 40 кДа, можно вводить в концентрации от 80 мг/мл до 150 мг/мл, например, приблизительно 100 мг/мл или приблизительно 125 мг/мл. Согласно определенным вариантам реализации LACA, содержащий полимер, например, ПЭГ, молекулярной массой менее 40 кДа, можно вводить в концентрации от 150 мг/мл до 250 мг/мл. Согласно определенным вариантам реализации LACA, содержащий полимер, например, ПЭГ, молекулярной массой менее 40 кДа (например, 10 кДа - 35 кДа), можно вводить при более высокой концентрации, чем 250 мг/мл, например, вплоть до 300 мг/мл, 300 мг/мл - 400 мг/мл, 400 мг/мл - 500 мг/мл или более.
[00454] Согласно определенным вариантам реализации LACA, содержащий СКФ (например, ПЭГ, ПОЗ, полипептид или другой полимер) молекулярной массой менее приблизительно 40 кДа (например, 10 кДа - 35 кДа), и определенное количество фрагментов аналога компстатина (например, 1, 2, 3, 4), можно вводить приблизительно в той же дозе в молях, что и любое из количеств, описанных выше, в отношении LACA, содержащего СКФ молекулярной массой приблизительно 40 кДа, что приведет к получению меньшей дозы по массе, все еще содержащей приблизительно то же количество фрагментов аналога компстатина. Введение меньшего суммарного количества соединения на дозу (по массе) может позволить снизить объем введения дозы. Снижение объема введения дозы может позволить снизить количество инъекций (например, одна ежедневная инъекция вместо двух ежедневных инъекций согласно некоторым вариантам реализации) и/или может обеспечить уменьшение времени инъекции (длительности времени введения индивидуальной дозы). Меньшая общая доза (по массе) может позволить применять меньшую концентрацию (по массе) соединения в данном объеме, что приводит к снижению вязкости и позволяет применять иглы с меньшим внутренним диаметром и/или более короткое время инъекции. Согласно определенным вариантам реализации LACA, содержащий СКФ (например, ПЭГ, ПОЗ, полипептид или другой полимер) молекулярной массой менее приблизительно 40 кДа (например, 10 кДа - 30 кДа) и определенное количество фрагментов аналога компстатина (например, 1, 2, 3, 4), можно вводить при более высокой молярной дозе, чем LACA, содержащий СКФ молекулярной массой приблизительно 40 кДа, что приводит к введению большего количества фрагментов аналога компстатина на дозу. Согласно определенным вариантам реализации молярная доза может быть вплоть до в 1,2, 1,5, 2,0,2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5 или 5 раз большей в зависимости от, например, молекулярной массы СКФ.
[00455] Согласно определенным вариантам реализации LACA, содержащий СКФ (например, ПЭГ, ПОЗ, полипептид или другой полимер) молекулярной массой менее приблизительно 40 кДа (например, 10 кДа - 35 кДа) и определенное количество фрагментов аналога компстатина (например, 1,2,3,4), можно вводить в меньшей дозе (по массе) на единицу времени (например, более низкая ежедневная доза, более низкая еженедельная доза, более низкая ежемесячная доза и т.д.), приблизительно в той же дозе на единицу времени или в более высокой дозе на единицу времени, чем доза, описанная выше в отношении LACA, содержащего СКФ молекулярной массой приблизительно 40 кДа. Согласно определенным вариантам реализации предусмотрено, что доза (по массе) LACA, содержащего СКФ молекулярной массой менее приблизительно 40 кДа (например, 10 кДа - 30 кДа), может являться более низкой или высокой с кратностью вплоть до приблизительно 3 (например, приблизительно 1,1, 1,2, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0) по сравнению с ежедневной дозой LACA, содержащего 40 кДа СКФ.
[00456] Настоящее изобретение охватывает введение аналога компстатина в комбинации с дополнительной терапией. Такая дополнительная терапия может включать введение любого(ых) агента(ов) из используемых в данной области техники или потенциально подходящих для лечения субъекта, страдающего от указанного заболевания. Например, согласно некоторым вариантам реализации LACA, клеточно-реактивный аналог компстатина или аналог компстатина нацеленного действия вводят в комбинации с ингибитором С5 (например, экулизумабом или любым из других ингибиторов С5, упомянутых в настоящем документе или известных в данной области техники) пациенту, например, пациенту с ПНГ или с любым из других комплемент-опосредованных нарушений, упомянутых в настоящем документе. Согласно определенным вариантам реализации LACA, клеточно-реактивный аналог компстатина или аналог компстатина нацеленного действия вводят в комбинации с агентом против фактора роста сосудистого эндотелия (vascular endothelial growth factor, VEGF) субъекту с влажной ВМД. Агенты против VEGF включают антитела, которые связываются с VEGF, такие как ранибизумаб (Луцентис) и бевацизумаб (Авастин), полипептиды, содержащие растворимую часть рецептора VEGF, такие как афлиберцепт (Эйлеа, также известный как VEGF-Trap).
[00457] Если два или большее количество терапевтических средств (например, соединений или композиций) применяют или вводят «в комбинации» друг с другом, согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения они могут быть введены в одно время, на протяжении частично совпадающих периодов времени или последовательно (например, могут быть разделены во времени периодом протяженностью до 2 недель или более, например, разделены во времени периодом протяженностью до 4, 6, 8 или 12 недель). Они могут быть введены одним и тем же путем либо разными путями. Согласно некоторым вариантам реализации указанные соединения или композиции вводят с интервалом 48 часов. Согласно некоторым вариантам реализации аналог компстатина может быть введен до или после введения дополнительного(ых) соединения(ий), например, достаточно близко во времени, так что указанный аналог компстатина и дополнительное(ые) соединение(ия) присутствует(ют) в подходящих количествах в организме по меньшей мере однажды. Согласно некоторым вариантам реализации указанные соединения или композиции вводят достаточно близко во времени, так что не более чем 90% ранее введенной композиции метаболизируется до неактивных метаболитов или устраняется, например, выведением из организма, к моменту введения второго соединения или композиции.
[00458] Согласно некоторым вариантам реализации вводят композицию, содержащую и клеточно-реактивный аналог компстатина или аналог компстатина длительного действия, или нацеленного действия, и дополнительное соединение или соединения.
[00459] Согласно определенным вариантам реализации субъекта, который получает лечение или которому следует получать лечение аналогом компстатина с применением, например, ингаляционного введения или парентерального введения путем, например, подкожной, внутримышечной или внутривенной инъекции, вакцинируют против одного или более патогенов. Например, субъект может получать вакцину против Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae и/или Streptococcus pneumoniae. Согласно определенным вариантам реализации субъект вакцинирован против всех трех из данных микроорганизмов. Согласно определенным вариантам реализации субъект может получать вакцину по меньшей мере за 1, 2, 3, 4, 5 или 6 недель до первой дозы аналога компстатина. При необходимости субъект может получать одну или более дополнительных доз вакцины.
[00460] Согласно определенным вариантам реализации субъект, который получает лечение или которому следует получать лечение аналогом компстатина с применением, например, ингаляционного введения или парентерального введения путем, например, подкожной, внутримышечной или внутривенной инъекции, может получать антибиотик, который, как ожидают, является эффективным для предотвращения или ограничения инфекции, вызванной одним или более патогенами, например, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae и/или Streptococcus pneumoniae. Согласно определенным вариантам реализации субъект может получать антибиотик в профилактических целях. Профилактическое введение может начаться до того, как субъект получил первую дозу аналога компстатина, или в любое время после этого. Средним специалистам в данной области техники известны подходящие антибиотики. Например,
Иллюстративные примеры
[00461] Пример 1: Получение пегилированных аналогов компстатина, по существу сохраняющих комплемент-ингибирующую активность
[00462] Синтезировали аналог компстатина с последовательностью аминокислот аналога компстатина SEQ ID NO: 28, но содержащий фрагмент AEEAc-Lys, расположенный в направлении С-конца от остатка Thr последовательности SEQ ID NO: 28 для последующего конъюгирования активированногосложным NHS-эфиром ПЭГ с аминогруппой боковой цепи Lys. Указанное соединение синтезировали с применением стандартных способов. Вкратце, аминокислоты (включая АЕЕАс) получали в виде Fmoc-защищенных аминокислот, отличающихся тем, что α-аминогруппу каждой аминокислоты защищают с помощью Fmoc. Функциональные группы боковых цепей также блокировали различными подходящими защитными группами. Синтез осуществляли твердофазным методом, описанным у Merrifield (J. Amer. Chem. Soc. 85, 2149 (1963)). Цепи собирали на твердой фазе, по завершении которой N-конец ацетилировали; затем пептид отщепляли от твердой фазы, одновременно снимали защиту ацидолизом с применением TFA и амидировали. Линейный пептид затем окисляли и очищали. Полученный аналог компстатина представлен следующим: Ac-Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-AEEAc-Lys-NH2 (SEQ ID NO: 51), сокращенно CA28-AEEAc-Lys. Отметим, что для краткости N-концевая ацетильная группа и С-концевые аминогруппы в аббревиатуре не указаны. Монофункциональный линейный активированный сложный NHS-эфир ПЭГ с молекулярными массами 30 кДа и 40 кДа (NOF America Corp. Уайт-Плейнс, Нью-Йорк, кат. №SUNBRIGHT ME-300GS и кат. №SUNBRIGHT ME-400GS), соответственно, соединяли с боковыми цепями лизина CA28-AEEAc-Lys с получением следующих аналогов компстатина длительного действия: CA28-AEEAc-Lys-(PEG30k) и CA28-AEEAc-Lys-(PEG40K), и очищали. Отметим, что число после термина «PEG» и перед буквой «k» представляет собой молекулярную массу указанного фрагмент ПЭГ в килодальтонах, и «k» представляет собой сокращение от «кДа»). CA28-AEEAc-Lys-(PEG30k) также называют СА28-1. CA28-AEEAc-Lys-(PEG40K) также называют СА28-2.
[00463] Ингибирующую активность синтезированных соединений оценивали путем измерения эффекта указанных соединений в отношении активации комплемента классическим путем с применением стандартного анализа ингибирования комплемента. В указанном протоколе измеряют отложение C3b в формате ELISA. Отложение C3b, мониторинг которого проводят указанным способом, опосредовано активированным классическим путем комплементом. Вкратце, 96-луночные планшеты покрывают БСА. Добавляют плазму человека, куриный овальбумин (OVA), поликлональные антитела против OVA и тестируемое соединение (называемое «лекарственным средством»), инкубируют, а затем добавляют чР-конъюгированное антитело против С3 человека. После дополнительного инкубирования добавляют субстрат и регистрируют сигнал. Детальная информация о протоколе приведена ниже:
[00464] Протокол анализа ингибирования классического пути комплемента
Материалы:
96-луночный планшет (полистироловый планшет, Thermo Scientific, 9205)
Куриный овальбумин (Sigma A5503-5G)
Антитело кролика против куриного овальбумина (Abeam ab1221)
Блокирующий буфер (буфер Startingblock, Thermo Scientific 37538)
Вероналовый буфер (концентрация 5Х, Lonza 12-624Е)
Плазма человека (собранная с добавлением лепирудина с конечной концентрацией 50 мкг/мл)
HRP-конъюгированное козье антитело против С3 человека, (MP Biomedicals, 55237)
Отмывочный буфер Tween-20 (0,05% Tween 20-ФСБ буфер)
ТМБ (Субстрат пероксидазы, BD 555214) - 1:1 смесь BD 51-2607KC и 51-2606KC.
2
4
1 M HSO
Протокол:
1. Добавить 100 мкл/лунку 1% куриного овальбумина (в ФСБ)
2. Инкубировать в течение ночи при 4°С или комнатной температуре в течение 1-2 ч.
3. Извлечь с помощью встряхивания и постукивания по планшету.
4. Блокировать добавлением 200 мкл блокирующего буфера
5. Инкубировать в течение 1 ч при комнатной температуре
6. Извлечь с помощью встряхивания и постукивания по планшету
7. Добавить 100 мкл поликлонального антитела против куриного овальбумина в разведении 1:1000 в блокирующем буфере
8. Инкубировать в течение 1 часа при комнатной температуре
9. Дважды промыть отмывочным буфером
++
10. Добавить по 50 мкл VB в лунки №2-12
++
11. Добавить 100 мкл лекарственного средства в начальном разведении (2Х в VB) в лунку 1.
12. Приготовить серийные разведения (1:2) указанного лекарственного средства из лунок 1-10 следующим образом:
a. Взять 50 мкл раствора из исходной лунки
b. Добавить указанный раствор в следующую лунку
c. Перемешать многократным пипетированием
d. Повторять до лунки №10
Примечание: из лунки №10 удалить 50 мкл и утилизировать.
13. Добавить 50 мкл плазмы в разведении 2Х (разведение 1:37,5 исходной плазмы) в лунки 1-11
14. Инкубировать в течение 1 часа
15. Промыть отмывочным буфером
16. Добавить 100 мкл чР-антитела против С3 в разведении 1/1000 в блокирующем буфере
17. Инкубировать в течение 1 часа
18. Промыть отмывочным буфером
19. Добавить по 100 мкл ТМБ во все лунки
20. Инкубировать в течение 5-10 мин в темноте
2
4
21. Добавить 50 мкл 1 М HSO
22. Произвести считывание планшета на 450 нм
++
VB
Формула:
Исходные растворы:
Для получения 50 мл рабочего буфера:
Взвесить 210 мг NaCl
Добавить 10 мл 5Х VB
2
Добавить 100 мкл CaCl (500Х)
Добавить 250 мкл MgCl (200Х)
2
Довести объем до 50 мл добавлением HO
Довести рН до 7,4
50
[00465] Данные анализировали с применением программного обеспечения GraphPad Prism5. Наборы данных для каждого эксперимента нормировали по проценту активации по сравнению с контролем со 100% активацией, соответствующим лунке, в которую не добавляют соединение. Значения концентраций лекарственного средства (значения X) логарифмически преобразовывали, и процент активации (Ра) (значения Y) переводили в процент подавления (Pi), используя следующую формулу: Pi=100-Pa (Yi=100-Ya). Строили график зависимости процента подавления от концентрации лекарственного средства; для аппроксимации полученного набора данных использовали сигмоидальную функцию зависимости доза-ответ [Y=Bottom+(Top-Bottom)/(1+10((Log ЕС-Х)))]. Значения IC получали, используя параметры аппроксимирующей функции.
50
[00466] Результаты приведены на фиг. 1, значения IC приведены в таблице 2 (в примере 2). Согласно приведенным данным, СА28-1 и СА28-2 проявляли активность, составляющую приблизительно 30% от активности СА28 в пересчете на моли.
[00467] Пример 2: Получение аналогов компстатина длительного действия, демонстрирующих повышенную молярную активность
8
[00468] ПЭГ с активированным сложным NHS-эфиром с 8 ветвями молекулярной массой 40 кДа (NOF America Corp. Уайт-Плейнс, Нью-Йорк, кат. №SUNBRIGHT HGEO-400GS; химическая формула: гексаглицерин окта(сукцинимидилоксиглутарил) полиоксиэтилен) присоединяли к боковой цепи лизина CA28-AEEAc-Lys с получением следующего аналога компстатина длительного действия: (CA28-AEEAc)-PEG40K, также называемого СА28-3.
-1
-1
50
50
50
Комплемент-подавляющую активность СА28-3 исследовали с применением описанного в примере 1 анализа. Результаты приведены на графике на фиг. 1, а значение IC50 приведено в таблице 2, и то, и другое - как функция от концентрации СА28. Концентрацию СА28 рассчитывали с применением коэффициента экстинкции СА28 при 283 нм (10208,14 л⋅моль⋅см). На основании другого анализа (поглощение УФ в зависимости от массы материала, и элементного CHN-анализа) было сделано заключение, что на молекулу СА28-3 приходится 7,5 фрагмента СА28. Таким образом, активность СА28-3 в пересчете на моли в 7,5 раз выше показанной на фиг. 1 и приведенной в таблице 2. Таким образом, значение IC в таблице 2 в 7,5 раза выше реального значения IC СА28-3 в пересчете на моли. При подсчете значение IC СА28-3 в пересчете на моли составляет приблизительно 0,26 (меньше, чем у исходного соединения СА28). На фиг. 2 представлен процент подавляющей активацию комплемента активности СА28 и аналогов компстатина длительного действия СА28-2 и СА28-3 как функция от концентрации СА28-3 (мкМ), т.е. активность СА28-3 была скорректирована с учетом того, что указанное соединение содержит 7,5 фрагментов СА28. В пересчете на моли комплемент-подавляющая активность СА28-3 выше, чем у СА28.
[00469] Растворимость СА28-1, CD28-2 и СА28-3 в воде в присутствии или при отсутствии разнообразных буферных веществ и/или вспомогательных веществ была, согласно наблюдениям, выше растворимости исходного соединения СА28.
[00470] Пример 3: Аналоги компстатина длительного действия, демонстрирующие существенное увеличение времени полужизни в плазме и Cmax
[00471] В данном примере описывается определение параметров фармакокинетики аналогов компстатина длительного действия СА28-2 и СА28-3 после введения яванским макакам.
[00472] Введение доз и получение образцов
[00473] СА28-2 и СА28-3 вводили в момент времени 0 путем внутривенной инъекций самкам яванского макака (три на группу, возраст 2-5 лет, 2,9-3,5 кг). Соединения вводили в количестве 50 мг/кг в 5% растворе декстрозы в воде в концентрации 25 мг/мл. Образцы крови (объемом ~1 мл каждый) собирали из бедренной вены в следующие моменты времени: до введения доз, через 5 мин, 15 мин, 30 мин, 1 час (ч), 4 ч, 8 ч, 24 ч, 48 ч, 96 ч (4 дня) и 192 ч (8 дней) после введения доз. Образцы собирали путем прямой венепункции, помещали в пробирку для сыворотки с красной крышкой, не содержащую антикоагулянта, и выдерживали при комнатной температуре в течение по меньшей мере 30 минут. Образцы крови центрифугировали при температуре 4°С при 3000×g в течение 5 минут. На протяжении всего процесса обработки образцы поддерживали в охлажденном состоянии. Образцы сыворотки собирали после центрифугирования и помещали в пробирки для образцов. Образцы хранили в морозильной камере, настроенной на поддержание температур от -60°С до -80°С. Все животные демонстрировали нормальную активность на протяжении всего исследования. У животных не было отмечено связанных с соединением нарушений на протяжении исследования.
4
4
4
[00474] Анализ образцов. Образцы плазмы, полученные согласно приведенному выше описанию, анализировали с помощью ЖХ/МС/МС с применением следующих способов определения концентрации соединения: 50 мкл образца смешивали с внутренним стандартом (CA28-AEEAc-Arg), затем добавляли 100 мкл 1 М NHOAc, рН 3,5 с НОАс и перемешивали. Затем добавляли 250 мкл ацетонитрила и перемешивали. Образец центрифугировали, супернатант переливали в другую пробирку и высушивали. Образец повторно растворяли и инжектировали в систему ЖХ/МС/МС. Подвижная фаза А была представлена 5 мМ NHOAc с 0,1% FA, Подвижная фаза В была представлена (АЦН:50 мМ NHOAc) в пропорции 90:10 с 0,1% FA. Использовали ЖХ колонку Intrada WP-RP 2×150 мм, 3 мкм. Количественное определение проводили на тройном квадрупольном масс-спектрометре Applied Biosystems API-4000 в режиме положительных ионов. Для фрагментирования соединения в источнике масс-спектрометра применяли индуцированную столкновениями диссоциацию (ДИС), ионы с m/z 144 отбирали по массе в Q1, фрагментировали, ионы с m/z 77 отбирали по массе в Q3 и детектировали. Данные обрабатывали с помощью программного обеспечения Analyst 1.4.2.
[00475] Результаты. Концентрации в мкг/мл СА28-2 и СА28-3 в сыворотке в каждый момент времени приведены в таблице 3 ниже. Представлены данные для каждой из 3-х обезьян, получавших указанное соединение. Средние значения и стандартные отклонения легко рассчитать. Данные для всех животных хорошо согласуются. Для СА28 приведены уже имевшиеся данные, полученные в предыдущем исследовании, в котором СА28 внутривенно вводили яванским макакам. В данном исследовании СА28 определяли в образцах с применением ВЭЖХ.
[00476] Результаты для каждого соединения усредняли, полученный график представлен на фиг. 3. Значительное увеличение времени полужизни и Cmax по сравнению с СА28 наблюдалось и для СА28-2, и для СА28-3. Конечное время полужизни и для СА28-2, и для СА28-3 составляло приблизительно 4-4,5 дня. Исходя из указанных данных, внутривенное введение с интервалами приблизительно 1-2 недели, предположительно, будет обеспечивать постоянные уровни соединения и эффективно подавлять активацию комплемента у субъектов-людей, хотя интервалы введения доз могут быть и более короткими, и более длинными.
[00477] Пример 4: Аналог компстатина длительного действия, содержащий САЧ в качестве снижающего клиренс фрагмента
2
5
2
[00478] Лизины боковых цепей сывороточного альбумина человека (САЧ) преобразовывали в тиолы с применением 2-иминотиолана и проводили их реакцию с аналогом компстатина, содержащим малеимид в качестве реактивной функциональной группы: Ac-Ile-Cys*-Val-Trp(1-Me)-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-AEEAc-Lys-(C(=O)-(CH)-Mal)-NH (SEQ ID NO: 68). Комплемент-подавляющую активность (фиг. 4) полученного аналога компстатина длительного действия (СА28-4) исследовали in vitro согласно описанию в примере 1, а фармакокинетические свойства исследовали in vivo согласно описанию в примере 3. Параметры фармакокинетики СА28-4 после введения яванским макакам определяли согласно описанию в предыдущем примере. Результаты приведены на фиг. 5 (вместе с результатами для СА28, СА28-1, СА28-2 и СА28-3). Данные ФК для СА28-4 представлены в таблице 4.
[00479] Пример 5: Синтез и активность аналогов компстатина на основе ПЭГ при применении различных активированных NHS-ПЭГ
2
[00480] Аналог компстатина, имеющий последовательность аминокислот аналога компстатина, соответствующую последовательности SEQ ID NO: 28, но содержащий фрагмент AEEAc-Lys, расположенный в направлении С-конца от остатка Thr, соответствующий последовательности SEQ ID NO: 28, для целей последующей конъюгации активированных NHS-сложноэфирных ПЭГ с аминогруппой боковой цепи Lys синтезировали согласно описанию в примере 1. Полученный аналог компстатина представлен следующим: Ac-Ile-Cys*-Val-(1Me)Trp-Gln-Asp-Trp-Gly-Ala-His-Arg-Cys*-Thr-AEEAc-Lys-NH (SEQ ID NO: 51), сокращенно CA28-AEEAc-Lys. Монофункциональные линейные активированные ПЭГ с монометокси-сложным NHS- эфиром/карбонатом молекулярной массой 40 кДа, различающиеся химией присоединения NHS-карбоксилата (NOF America Corp. Уайт-Плейнс, Нью-Йорк, кат. №№. SUNBRIGHT ME-400CS, SUNBRIGHT МЕ-400GS, SUNBRIGHT ME-400HS, SUNBRIGHT ME-400TS), соединяли с боковой цепью лизина CA28-AEEAc-Lys амидной связью. (Остаток Lys представлен Lys15, так как линкер АЕЕАс содержит остаток аминокислоты.) Все соединения были ацетилированы на N-конце, амидированы на С-конце и циклизованы дисульфидной связью между Cys2 и Cys12. (Ацетилирование, амидирование и циклизацию проводили до соединения с ПЭГ.) Соединения получали в виде трифторацетатных солей и очищали. Указанные соединения представлены приведенными в следующей таблице (таблица 5). Буквенные обозначения CS, GS, HS и TS соответствуют разным линкерным фрагментам между фрагментом ПЭГ и NHS-фрагментом согласно более подробному описанию в таблице 5. Следует понимать, что различные названия и обозначения для каждого соединения могут использоваться взаимозаменяемо. Отметим, что СА28-2 (см. пример 1) идентичен CA28-2GS.
*АЕЕАс=8=Амино-3,6-диокса-октаноил;
Соединения получали в виде трифторацетатных солей, но могут быть использованы и другие противоионы.
[00481] Соединения анализировали путем ВЭЖХ с обращенной фазой. На фиг. 6 приведена репрезентативная хроматограмма одного из указанных соединений. Использовали колонку VariTide RPC. Элюент А: 0,1% ТФУ в воде; Элюент В: 0,1% ТФУ в 50% АЦН/40% воды. Скорость потока составляла 1,000 мл/мин. с градиентом от 0% В до 100% В на протяжении 40 минут. Пик со временем удерживания 33,68 минут соответствует пегилированному соединению и имеет относительную площадь 96,50%.
[00482] Ингибирующую активность указанных соединений оценивали путем измерения эффекта указанных соединений на активацию комплемента через классический путь с применением стандартного анализа ингибирования комплемента согласно описанию в примере 1. Результаты представлены на графике на фиг. 7. Указанные результаты представляют собой комбинацию результатов двух отдельных экспериментов. Соединения демонстрировали в значительной степени аналогичную комплемент-ингибирующую активность.
[00483] Пример 6: Синтез и активность бифункционализированных аналогов компстатина на основе ПЭГ
[00484] Бифункциональные линейные с активированным монометокси-NHS-сложным эфиром/карбонатом ПЭГ с молекулярной массой 40 кДа, различающиеся в отношении химии присоединения NHS-карбоксилата, получали от NOF America Corp. (Уайт-Плейнс, Нью-Йорк). Активированные ПЭГ соединяли с боковой цепью лизина CA28-AEEAc-Lys амидной связью таким образом, что с каждой цепью ПЭГ были соединены два фрагмента CA28-AEEAc-Lys. Все соединения были ацетилированы на N-конце и амидированы на С-конце фрагментов CA28-AEEAc-Lys и циклизованы дисульфидной связью между Cys2 и Cys12. (Ацетилирование, амидирование и циклизацию проводили до соединения с ПЭГ.) Соединения получали в виде ацетатных солей и очищали. Указанные соединения представлены соединениями, приведенными в следующей таблице (таблица 6).
[00485]
*АЕЕАс=8=Амино-3,6-диокса-октаноил;
Соединения получали в виде ацетатных целей, но могут быть использованы и другие противоионы.
[00486] Ингибирующую активность CA28-2GS-BF оценивали путем измерения эффекта указанного соединения на активацию комплемента через классический путь с применением стандартного анализа ингибирования комплемента согласно описанию в примере 1 и анализировали согласно описанию в примере 1. Результаты представлены на графике на фиг. 8. Согласно описанию выше, CA28-2GS-BF содержит два фрагмента аналога компстатина на молекулу. Хотя активность в пересчете на фрагмент аналога компстатина у CA28-2GS-BF ниже, чем активность индивидуальной молекулы СА28, активность указанных двух соединений в молярном выражении фактически идентична в широком диапазоне концентраций.
[00487] Пример 7: Подкожное введение бифункционализированного аналога компстатина на основе ПЭГ
[00488] В данном примере описано определение фармакокинетических показателей аналога компстатина длительного действия CA28-2GS-BF после введения яванским макакам либо путем однократной внутривенной (в/в) инъекции, либо путем многократного (один раз в день) подкожного введения в течение семи дней.
[00489] Введение доз и получение образцов CA28-2GS вводили в момент времени 0 путем внутривенной инъекции или многократных подкожных инъекций (ежедневно в течение семи дней) самцам яванского макака. В указанном исследовании использовали шесть ранее получавших терапию самцов яванского макака возрастом 1-5 лет, масса тела которых варьировала от 4,6 до 5,3 кг. На момент начала семидневного исследования животные были здоровы. Исследование не было слепым. Животные имели свободный доступ к воде и дважды в день получали коммерческий корм до начала исследования. Корм предоставлялся животным с применением устройства типовой конструкции (SOP) до начала исследования. Животных не ограничивали в пище. Животным вводили внутривенно и подкожно дозы в момент времени 0 в соответствующий день. Для подкожного введения использовали иглу калибра 22. Соединение вводили в концентрации 50 мкг/кг в 5% декстрозе в воде в концентрации 25 мг/мл. Пробы крови (~1 мл каждая) собирали из бедренной вены в следующие моменты времени: День 1: до введения препарата, 5 мин, 15 мин, 30 мин, 1 час (ч), 4 ч, 8 ч. Дни 2 - 9: 0 мин. День 16: Последний образец на основании введения дозы в 1 день. Каждый образец крови (~1,0 мл) собирали из бедренной или подкожной вены обезьяны путем прямой венепункции и помещали в пробирку для сыворотки с красной крышкой, не содержащую антикоагулянта, и выдерживали при комнатной температуре в течение по меньшей мере 30 минут. Образцы крови центрифугировали при температуре 4°С при 3000×g в течение 5 минут. Образцы поддерживали в охлажденном состоянии на всем протяжении обработки. Образцы сыворотки собирали после центрифугирования и помещали в пробирки для образцов. Образцы хранили в морозильной установке для поддержания температуры -60°С - -80°С. Образцы сыворотки и остатки дозирующих растворов для анализа транспортировали в замороженном состоянии на сухом льду.
[00490] Каждый участок подкожного введения осматривали для установления скорости абсорбции инъекционного объема, а также установления того, остается ли после введения состава уплотнение или оно полностью рассасывается. Участки введения доз осматривали при каждом отборе образцов и в дневное время в течение дней 2-7. Все дозы абсорбировались на протяжении исследования. На основании наблюдений установлено, что дозы абсорбировались в пределах 15 минут после введения. Все животные проявляли нормальную активность на протяжении всего исследования. У животных не отмечалось связанных с соединением аномалий на протяжении всего исследования.
[00491] Анализ образцов. Образцы плазмы, полученные согласно описанию выше, анализировали с применением ЖХ/МС/МС, усиленной ИСД (индуцированной столкновениями диссоциацией) способом, аналогичным описанному в примере 3.
[00492] Результаты. Зависимость концентрации CA28-2GS-BF в сыворотке от времени при введении в/в или подкожно согласно описанию выше представлена на графиках на фиг. 9. Точки данных соответствуют всем детектированным пегилированным соединениям СА28. Данные для СА28, представленные на фиг. 9, представляют собой ретроспективные данные, полученные в предыдущем исследовании, в ходе которого СА28 вводили внутривенно яванским макакам. В указанном исследовании СА28 детектировали в образцах с применением ВЭЖХ.
[00493] Пиковая концентрация в сыворотке, составляющая 500 мкг/мл (11 мкМ), достигалась путем подкожного введения CA28-2GS-BF. Конечное время полужизни CA28-2GS-BF составляло приблизительно 5 дней при введении либо в/в, либо подкожно. Результаты обобщены в таблицах ниже:
[00494] Пример 8: Ингибирование комплемент-опосредованного лизиса красных клеток крови от пациентов с ПНГ
[00495] Проводили модифицированный тест Хэма для измерения способности аналогов компстатина ингибировать комплемент-опосредованный лизис красных клеток крови от пациентов с ПНГ in vitro. Комплемент активировали подкисленной сывороткой с добавлением магния для лизиса пораженных ПНГ красных клеток. Проводили инкубирование в течение 90 минут. Данные регистрировали с применением проточной цитометрии пораженных ПНГ красных клеток с применением стандартных маркеров. В качестве контроля использовали термоинактивированную сыворотку (не вызывающую гемолиза). Подкисленная сыворотка без добавления ингибитора комплемента вызывает максимальный лизис. Эксперимент проводили с серийными двукратными разведениями аналогов компстатина СА28, СА28-2, CA28-2CS, CA28-2CS-BD, CA28-2GS, CA28-2GS-BF, CA28-2HS, CA28-2HS-BF, CA28-2TS, CA28-2GS-BF и СА28-3. Определяли концентрацию каждого соединения, необходимую для полной блокады гемолиза in vitro. Также красные клетки крови окрашивали для определения отложения фрагментов С3 с применением поликлональных антител против С3, которые не содержат каких-либо мостиков, обуславливающих агглютинацию (например, Ab4214 или Ab14396, оба коммерчески доступные в виде FITC-конъюгатов от Abeam, Кембридж, Великобритания), для измерения способности указанных соединений ингибировать отложение фрагментов С3 на красных клетках крови при ПНГ. Результаты сравнивали с полученными для экулизумаба с применением тех же анализов.
[00496] Пример 9: Аналоги компстатина длительного действия у пациентов с ПНГ
[00497] Когорту субъектов, у которых диагностирована ПНГ, делили на 4 группы. Субъекты в Группах 1 и 2 получали лечение внутривенным введением СА28-2 или СА28-3, соответственно, в дозе, составляющей от 5 мг/кг и 20 мг/кг, с интервалами от 1 и 2 недель. Лечение необязательно начинали с введения с более короткими интервалами, и затем при поддерживающей терапии частоту снижали. Субъекты в Группе 3 получали лечение экулизумабом в соответствии с рекомендованной схемой введения. Группа 4 служила в качестве контрольной (без терапии ингибитором комплемента). Проводили мониторинг изменений в течение времени внутрисосудистого гемолиза (на основе измерений ЛДГ и/или мечения кКК (51)Cr), ретикулоцитоза (индикатора анемии), гематокрита, концентрации гемоглобина в крови, опсонизации эритроцитов (отложения продуктов активации С3, таких как C3b, на эритроцитах, которое может быть обнаружено с применением проточной цитометрии), симптомов ПНГ, необходимости переливания, случаев тромбоэмболии, связанного с гемолизом истощения оксида азота, показателей легочной гипертензии, качества жизни и выживаемости. Сравнивали результаты между группами и ретроспективные данные для контрольных пациентов с ПНГ, полученные при клинических исследованиях экулизумаба. Уменьшение персистентной анемии (о котором, например, свидетельствует снижение ретикулоцитоза, уменьшение признаков гемолиза, повышение гематокрита, повышение уровня гемоглобина), улучшение качества жизни, уменьшение симптомов ПНГ, снижение потребности в переливании, снижение частоты случаев тромбоэмболии, уменьшение связанного с гемолизом истощения оксида азота, уменьшение показателей легочной гипертензии, повышение качества жизни и/или повышение выживаемости, у субъектов, получающих СА28-2 (Группа 1) или СА28-3 (Группа 2), по сравнению с субъектами в группе 4, свидетельствует об эффективности.
[00498] Пример 10: Аналоги компстатина длительного действия у пациентов с ПНГ
[00499] Повторяли пример 9 с той разницей, что субъектами являлись индивидуумы с ПНГ, остающиеся зависимыми от переливаний, и/или содержание гемоглобина у которых продолжает оставаться ниже предельного значения (например, 9,0 г/дл), несмотря на лечение экулизумабом. Сравнивали результаты между группами.
[00500] Пример 11: Аналоги компстатина длительного действия у пациентов с аГУС
[00501] Когорту субъектов, у которых диагностирован аГУС, разделяли на 4 группы. Субъекты в Группах 1 и 2 получали лечение внутривенным введением СА28-2 или СА28-3, соответственно, в дозе, составляющей от 5 мг/кг до 20 мг/кг, с интервалами времени от 1 до 2 недель. Лечение необязательно начинали с введения с более короткими интервалами, и затем при поддерживающей терапии частоту снижали. Субъекты в Группе 3 получают лечение экулизумабом в соответствии с рекомендованной схемой введения. Проводили мониторинг изменений в течение времени внутрисосудистого гемолиза (на основе измерений ЛДГ), опсонизации эритроцитов (отложения продуктов активации С3, таких как C3b, на эритроцитах), симптомов аГУС, почечной функции, необходимость плазмообмена или диализа, качества жизни и выживаемости. Сравнивали результаты между группами и ретроспективные данные для контрольных пациентов с аГУС, полученные при клинических исследованиях экулизумаба. Уменьшение признаков гемолиза, улучшение качества жизни, уменьшение симптомов аГУС, уменьшение потребности в плазмообмене или диализе, повышение качества жизни и/или повышение выживаемости у субъектов, получающих СА28-2 или СА28-3, по сравнению с субъектами в группе 4 свидетельствуют об эффективности.
[00502] Пример 12: Примеры 8-11 повторяли с применением CA28-2GS-BF, CA28-2HS, CA28-2HS-BF, CA28-2TS и CA28-2GS-TS-BF.
[00503] Пример 14: Примеры 9-12 повторяли с применением CA28-2GS-BF, CA28-2HS, CA28-2HS-BF, CA28-2TS и CA28-2GS-TS-BF при ежедневном введении путем подкожной инъекции.
[00504] Пример 14: Примеры 8-11 повторяли с применением дополнительных аналогов компстатина длительного действия.
[00505] Пример 15: Примеры 8-11 повторяли с применением клеточно-реактивных аналогов компстатина.
[00506] Пример 16: Активация комплемент-ингибирующей активности аналога компстатина длительного действия
[00507] СА28 и CA28-AEEAc-Lys синтезировали согласно описанию выше. CA28-2TS-BF синтезировали с применением реактивного бифункционального ПЭГ TS-типа в отношении химии присоединения NHS-карбоксилата, который связывали с двумя молекулами CA28-AEEAc-Lys через первичный амин боковой цепи лизина. Ингибирующую активность СА28 и CA28-2TS-BF в отношении активации комплемента оценивали путем измерения эффекта указанных соединений на активацию комплемента через классический путь и через альтернативный путь с применением стандартных анализов ингибирования комплемента. Протокол анализа активации через классический путь описан в примере 1. В протоколе активации через альтернативный путь также измеряется отложение C3b в формате ELISA, и он описан ниже. Отложение C3b, мониторинг которого осуществляют с применением указанного способа, достигается за счет комплемента, активированного по альтернативному пути липополисахаридом (ЛПС). Вкратце, 96-луночные планшеты покрывают ЛПС. Добавляют тестируемое соединение (называемое «лекарственным средством») с последующим добавлением плазмы или сыворотки в качестве источника комплемента, и инкубируют. Затем добавляют чР-конъюгированное антитело против С3 человека. После дополнительного инкубирования добавляют субстрат и регистрируют сигнал. Подробное описание протокола приведено ниже:
[00508] Анализ активации комплемента через альтернативный путь на основе ELISA
Материалы:
96-луночный планшет для ELISA (Corning 3590)
ЛПС из Salmonella typhosa - Sigma L7136 (40 мкг/мл в ФСБ)
БСА 1% в ФСБ - Calbiochem #126626, разведение 1/30
2
Вероналовый буфер + 10 мМ MgCl + 10 мМ ЭГТК (VB-Mg ЭГТК)
Плазма человека (собранная с добавлением лепирудина с конечной концентрацией 5 мкг/мл)
чР-конъюгированные AT против С3 человека (поликлональные AT к C3-HRP Ab, Cappel 55237)
Отмывочный буфер Tween-20 (0,05% в ФСБ)
ТМБ (Субстрат пероксидазы) - смесь 1:1 BD 51-2607KC и 51-2606KC.
2
4
3 М HSO
Считывающее устройство для микропланшетов
Протокол:
1. Добавить по 50 мкл/лунку ЛПС в концентрации 40 мкг/мл (в ФСБ)
2. Инкубировать в течение 2 часов при комнатной температуре
3. Извлечь с помощью встряхивания и постукивания по планшету.
4. Блокировать добавлением 200 мкл 1% БСА/ФСБ
5. Инкубировать в течение 1 часа при комнатной температуре
6. Извлечь с помощью встряхивания и постукивания по планшету
7. Добавить по 50 мкл VB-Mg ЭГТК в лунки №2-12
8. Добавить 100 мкл лекарственного средства в первом разведении (2× в VB-Mg ЭГТК) в лунку 1.
9. Приготовить серийные разведения (1:2) лекарственного средства из лунок 1-10 следующим образом:
a. Взять 50 мкл раствора из исходной лунки
b. Добавить указанный раствор в следующую лунку
c. Перемешать многократным пипетированием
d. Повторять до лунки №10
Примечание: из лунки №10 удалить 50 мкл и утилизировать
10. Добавить по 50 мкл в разведении 2× в плазме в лунки 1-11
11. Инкубировать в течение 1 часа
12. Дважды промыть отмывочным буфером
13. Добавить по 50 мкл C3-HRP Ab в разведении 1/1000 в 1% БСА/ФСБ
14. Инкубировать в течение 1 часа
15. Добавить по 100 мкл ТМБ во все лунки
16. Инкубировать в течение 30 мин.
2
4
17. Добавить 50 мкл 3 М HSO
18. Произвести считывание планшета на 450 нм
Формула VB Mg ЭГТК
Барбитал
5 мМ
NaCl
72,5 мМ
MgCl2
10 мМ
ЭГТК
10 мМ
рН
7,3-7,4
Исходные растворы:
Для получения 20 мл рабочего буфера:
Взвесить 84 мг NaCl
Добавить 4 мл 5Х VB
Добавить 2 мл ЭДТК 10Х
Добавить 2 мл MgCl 10Х
2
Довести объем до 20 мл добавлением НО
Довести рН до 7,4
[00509] Результаты
[00510] На фиг. 10(A) представлен процент ингибирования классического пути активации комплемента за счет ингибирующей активности СА28 и CA28-2TS-BF как функция от молярной концентраций указанных соединений. На фиг. 10(B) представлен процент ингибирования альтернативного пути активации комплемента за счет ингибирующей активности СА28 и CA28-2TS-BF как функция от молярной концентраций указанных соединений. Необработанные данные приведены в таблице 9 ниже (4 повторности для каждого условия). Исходя из кривых ингибирования, представленных на фигурах, и лежащих в основе данных, комплемент-ингибирующая активность CA28-2TS-BF по меньшей мере равна активности СА28 в молярном выражении в пределах экспериментальной ошибки указанного анализа Указанные результаты дополнительно подтверждают пригодность аналогов компстатина длительного действия, описанных в настоящем документе, например, для терапевтического применения.
[00511]
[00512] Пример 17: Фармакокинетические свойства аналога компстатина длительного действия при внутривенном или подкожном введении
[00513] В данном примере описано определение фармакокинетических показателей аналога компстатина длительного действия CA28-2TS-BF после введения яванским макакам путем однократной внутривенной (в/в) инъекции, при однократном подкожном введении или подкожном введении один раз в день в течение семи дней. CA28-2TS-BF синтезировали с применением реактивного бифункционального ПЭГ TS-типа в отношении химии присоединения NHS-карбоксилата, который связывали с двумя молекулами CA28-AEEAc-Lys через первичный амин боковой цепи лизина.
[00514] Введение доз и получение образцов
[00515] CA28-2TS-BF вводили яванским макакам в момент времени 0 путем внутривенной инъекции в подкожную вену, или путем однократной подкожной инъекции или повторных подкожных инъекций (один раз в день в течение семи дней). В указанном исследовании использовали шесть ранее получавших терапию самок яванского макака (по три на группу) возрастом 2-5 лет, масса которых варьировала от 2,6 до 3,9 кг. На момент начала исследования животные были здоровы. Исследование не было слепым. Животные имели свободный доступ к воде и дважды в день получали коммерческий корм до начала исследования. Корм предоставлялся животным с применением устройства типовой конструкции (SOP) до начала исследования. Животных не ограничивали в пище. Животным вводили по 7 мкг/кг внутривенно или подкожно в момент времени 0 в соответствующий(ие) день(дни). Концентрация дозируемого соединения в растворе составляла 3,5 мг/мл для в/в введения и 25 мг/мл для подкожного введения. Объем дозы составлял 2 мл/кг для в/в введения и 0,28 мл/кг для подкожного введения. Для подкожного введения использовали иглу калибра 23G3/4. Соединение вводили в 5% декстрозе в воде.
[00516] Пробы крови (~0,5-1 мл) собирали из бедренной вены в следующие моменты времени: День 1: до введения препарата, 5 мин, 15 мин, 30 мин, 1 час (ч), 4 ч, 8 ч. Дни 2 - 9: 0 мин. День 15: Последний образец на основании введения дозы в 1 день. Каждый образец крови собирали из бедренной вены обезьяны путем прямой венепункции и помещали в пробирку для сыворотки с красной крышкой, не содержащую антикоагулянт, и выдерживали при комнатной температуре в течение по меньшей мере 30 минут. Образцы крови центрифугировали при температуре 4°С при 3000×g в течение 5 минут. Образцы поддерживали в охлажденном состоянии на всем протяжении обработки. Образцы сыворотки собирали после центрифугирования и помещали в пробирки для образцов. Образцы хранили в морозильной установке для поддержания температур от -60°С до -80°С. Образцы сыворотки и остатки дозирующих растворов для анализа транспортировали в замороженной состоянии на сухом льду.
[00517] Каждый участок подкожного введения осматривали для установления скорости абсорбции инъекционного объема, а также установления того, остается ли после введения состава уплотнение или оно полностью рассасывается. Участки введения доз у животных, получавших подкожные инъекции, осматривали вечером каждого дня дозирования. На участках введения дозы не наблюдалось уплотнений, и доза полностью абсорбировалась к этому времени по оценке с помощью визуального осмотра. Всех животных осматривали дважды в день; животные проявляли нормальную активность на протяжении всего исследования. У животных не отмечалось связанных с соединением аномалий на протяжении всего исследования.
[00518] Анализ образцов. Образцы плазмы, полученные согласно описанию выше, анализировали с применением ЖХ/МС/МС, усиленной ИСД (индуцированной столкновениями диссоциацией), способом, аналогичным описанному в примере 3.
[00519] Результаты.
[00520] Концентрации CA28-2TS-BF в сыворотке в зависимости от времени при введении в/в или подкожно согласно описанию выше представлены на графиках на фиг. 11. Точки данных соответствуют всем детектированным пегилированным соединениям СА28. Данные для СА28, представленные на фиг. 11, представляют собой ретроспективные данные, полученные в предыдущем исследовании, в ходе которого СА28 вводили внутривенно яванским макакам. В указанном исследовании СА28 детектировали в образцах с применением ВЭЖХ/МС.
[00521] Пиковая концентрация в сыворотке, составляющая приблизительно 500 мкг/мл, достигалась путем подкожного введения CA28-2TS-BF один раз в день в течение 7 дней. Конечное время полужизни CA28-2TS-BF составляло приблизительно 8 дней при введении либо в/в, либо путем однократной подкожной инъекции. Необработанные данные приведены в таблицах 10(A) (в/в введение) и 10(B) (подкожное введение) ниже. (На фиг. 11 и в таблицах 10(A) и 10(B) день введения доз считается днем 0).
НПКО = ниже предела количественного определения.
[00522] Как отмечалось выше, CA28-2TS-BF синтезировали с применением реактивного бифункционального ПЭГ TS-типа, обеспечивающего образование карбамата после реакции с первичным амином лизина. CA28-2GS-BF синтезировали с применением реактивного бифункционального ПЭГ GS-типа в отношении химии присоединения NHS-карбоксилата, обеспечивающего образование амида после реакции с первичным амином лизина. Указанное соединение также содержит сложноэфирную связь, отсутствующую в CA28-2TS-BF. Следует отметить, что конечное время полужизни, составляющее приблизительно 8 дней, достигаемое при применении CA28-2TS-BF в указанном эксперименте, был заметно больше периода для CA28-2GS-BF, время полужизни которого, как было обнаружено, составляет приблизительно 5 дней в аналогичном эксперименте (см. пример 8).
[00523] Пример 18: Аналоги компстатина ингибируют отложение С3 на красных клетках крови пациентов с ПНГ и защищают от комплемент-опосредованного лизиса
2+
2+
2+
[00524] Проводили модифицированный тест Хэма для оценки способности аналогов компстатина защищать пораженные ПНГ кКК от комплемент-опосредованного лизиса. На клетки кКК от пациента с ПНГ которые воздействовали подкисленной сывороткой человека (в качестве источника компонентов комплемента) и магнием (Mg, необходим для активации альтернативного пути) при отсутствии ингибиторов комплемента или в присутствии варьирующих количеств аналогов компстатина СА28 или CA28-2GS-BF. Воздействие термоинактивированной сывороткой человека использовали в качестве контроля, соответствующего отсутствию значимого комплемент-опосредованного лизиса, поскольку комплемент инактивируется при нагревании. Воздействие подкисленной сывороткой человека и магнием (Mg) при отсутствии ингибиторов комплемента (панель, обозначенная как «Mg») использовали в качестве контроля, соответствующего максимальному лизису.
[00525] После инкубирования клетки окрашивали антителами против CD59 и C3d. Уровень Cd59 позволял классификацию пораженных ПНГ кКК как клетки типа I, типа II или типа III. Окрашивание в отношении C3d, продукта активации и расщепления С3, использовали в качестве маркера С3 и отложения продуктов активации (нагрузки) С3. Анализ с применением проточной цитометрии проводили для оценки CD59 и C3d на поверхностях кКК и количественного определения процентов клеток типа I, типа II и типа III, присутствующих в различных образцах.
2+
2+
[00526] Результаты эксперимента с разведениями, демонстрирующего эффект разных концентраций СА28 в отношении отложения С3 и процент клеток, представлены на фиг. 12(A). Результаты эксперимента с разведениями, демонстрирующего эффект разных концентраций CA28-2GS-BF в отношении отложения С3 и процент клеток, представлены на фиг. 12(B). Количественные результаты представлены в таблице 11 ниже. Клетки I типа (выделены оранжевым цветом на фиг. 12) содержат нормальные уровни CD59. Клетки III типа (выделены синим цветом на фиг. 12) по существу не содержат детектируемого CD59. Указанные клетки очень чувствительны к комплемент-опосредованному лизису. Уровни CD59 в клетках II типа (отмечены фиолетовым цветом на фиг. 12) снижены по сравнению с нормальными клетками или клетками I типа, и они обладают средней чувствительностью к комплемент-опосредованному лизису. При активации комплемента клетки III типа быстро подвергаются лизису. О снижении или отсутствии лизиса может свидетельствовать присутствие повышенного количества клеток III типа, на которое указывает более высокий процент клеток III типа на панели, где лизис отсутствует, по сравнению с панелью (в присутствии Mg (максимальный лизис)), как на фиг. 12(A), так и на 12(B). Другими словами, положительный контроль содержит относительно меньшее количество клеток III типа, чем отрицательный контроль. Клетки II типа могут в конечном итоге подвергаться лизису в присутствии активированного комплемента, однако перед этим могут аккумулировать значительное количество продуктов активации С3, таких как C3d. О снижении или отсутствии лизиса могут свидетельствовать повышенные уровни С3 или продуктов активации С3 на клетках II типа, на что указывает сравнение уровня C3d на клетках II типа на панели, где лизис отсутствует, с уровнем C3d на клетках II типа на панели с максимальным лизисом на обеих фигурах, фиг. 12(A) и фиг. 12(B). Другими словами, на клетках на панели с максимальным лизисом присутствует большее количество C3d, чем на клетках на панели, где лизис отсутствует. Клетки I типа содержат функциональный CD59; таким образом, они деактивируют конвертазу и, соответственно, не аккумулируют такие количества C3d, как клетки II типа. При этом количество C3d, которое они аккумулируют, может использоваться в качестве суррогатного индикатора уровня лизиса более уязвимых клеток (II и III типа). Соответственно, пониженное количество C3d на клетках I типа указывает на защиту от лизиса. Сдвиг относительных процентных долей клеток I, II и III типа относительно процентных долей на контрольных панелях с максимальным лизисом (Mg) в сторону процентных долей на контрольных панелях, где лизис отсутствует (термоинактивированная сыворотка), указывает на защиту от комплемент-опосредованного лизиса. Указанные процентные доли представлены в таблице ниже. Столбец, обозначенный «%С'3» в таблице 11, относится к проценту клеток, учтенных как «положительные» по С3 и продуктам активации С3 («нагрузка С3»). Как видно на фиг. 12(A) и (В) и из таблицы 11, СА28 и CA28-2GS-BF в протестированных концентрациях демонстрировали аналогичную защиту против лизиса пораженных ПНГ красных клеток при фактическом отсутствии нагрузки С3 пораженных ПНГ красных клеток при концентрации соединения 100 мкг/мл или более высоких концентрациях. Отметим, что процентные доли клеток III, II и I типа в присутствии 100 мкг/мл или более аналога компстатина по существу совпадали с процентными долями в контроле с отсутствием лизиса, указывая на полную защиту от комплемент-опосредованного лизиса по оценке с помощью указанного анализа. Концентрации ниже 100 мкг/мл, но выше 60 мкг/мл, например, по меньшей мере 70 мкг/мл, по меньшей мере 80 мг/мл или по меньшей мере 90 мкг/мл, но ниже 100 мкг/мл не тестировались в указанном эксперименте, но могут также обеспечить существенную защиту. 100 мкг/мл CA28-2GS-BF соответствует концентрации, составляющей приблизительно 2,5 мкМ, которая легко достижима in vivo согласно описанию в настоящем документе.
[00527]
[00528] Пример 19: Эффект аналога компстатина и Солириса на отложение С3 на красных клетках крови пациента с ПНГ
[00529] Проводили эксперимент, аналогичный описанному в примере 18, для дополнительной демонстрации защитного эффекта аналога компстатина CA28-2GS-BF и его сравнения с эффектом антитела против С5 Солириса. Модифицированный анализ Хэма согласно примеру 18 проводили с применением пораженных ПНГ кКК, инкубированных в присутствии активированного комплемента либо при отсутствии ингибитора комплемента (левая панель), либо в присутствии Солириса (средняя панель) или CA28-2GS-BF (50 мкг/мл) (правая панель). После окрашивания антитела с применением антител против CD59 и C3d проводили проточную цитометрию. Результаты представлены на фиг. 13. На указанной фигуре квадрант 1 (Q1) и квадрант 3 (Q3) соответствуют клеткам III типа. Квадрант 2 (Q2) и квадрант 4 (Q4) соответствуют клеткам I и II типа. Q1 и Q2 соответствуют клеткам со значительным и аномально высоким количеством отложения продукта активации С3 (например, C3d). Q3 и Q4 соответствуют клеткам без значительного отложения C3d или с несколько повышенным уровнем (правая часть Q4), но меньшим относительно клеток в Q2. Процент клеток в разных квадрантах приведен под каждой панелью на фиг. 13 и в таблице 12 ниже.
[00530]
[00531] Как видно, при отсутствии ингибиторов значительное большинство клеток располагаются в Q4 (I тип или II тип, с низкими уровнями отложения продуктов активации С3). Клетки III типа должны были, в основном, быть лизированы, таким образом, их процент (Q1 и Q3) невелик. Клетки в Q2, которые аккумулируют продукты отложения С3, в конечном итоге подвергаются лизису, таким образом, их количество остается относительно небольшим. В присутствии экулизумаба клетки III типа защищены от лизиса по меньшей мере изначально, но аккумулируют продукты активации С3 (например, C3d), что видно по высокому проценту клеток в Q1 по сравнению с панелью без ингибитора (36,79% относительно 0,09%). Относительное содержание клеток Q2+Q4 (I и II тип) ниже в результате повышенной выживаемости клеток III типа. Тем не менее, очевидно, что значительное отложение продуктов активации С3 (например, C3d) происходит на клетках III типа, что может в конечном итоге приводить к лизису или выведению (in vivo). На обработанных CA28-2GS-BF (правая панель) пораженных ПНГ кКК по существу не наблюдается отложение C3d независимо от того, относятся ли они к I, II или III типу, в отличие от результатов, полученных с экулизумабом. Процент клеток в Q1 и Q2 пренебрежимо мал. Наблюдается резкое увеличение процента клеток III типа (61,55%) по сравнению с результатами, полученными без ингибитора или с экулизумабом, что указывает (наряду с отсутствием отложения C3d) на повышенную защиту от лизиса за счет CA28-2GS-BF.
[00532] Пример 20: Клинические исследования фазы 1 аналога компстатина длительного действия у здоровых субъектов
[00533] Два рандомизированных, двойных слепых, плацебо-контролируемых клинических исследования фазы 1 аналога компстатина длительного действия, содержащего линейный 40 кДа ПЭГ и два фрагмента аналога компстатина (каждый из которых присоединен к каждому концу линейного ПЭГ), каждый содержащий пептид с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 28, удлиненной на С-конце фрагментом, содержащим AEEAc-Lys, для присоединения фрагмента ПЭГ, были начаты для оценки безопасности, переносимости, фармакокинетики и фармакодинамики: исследование однократных нарастающих доз (single ascending doses, SAD) и многократных нарастающих доз (multiple ascending doses, MAD). В примерах 20-26 данное соединение для удобства называют LACA-40. В исследовании однократных нарастающих доз здоровых субъектов рандомизировали в одну из шести когорт с дозами, варьирующими от 45 мг до 1440 мг (45, 90, 180, 360, 720 или 1440 мг) в 5% декстрозе. LACA-40 вводили подкожной инъекцией в первый день исследования с последующими 29 или 43 днями наблюдения в зависимости от уровня введенной дозы. Каждая когорта включала 4 субъекта, которые получали лекарственное средство, и 1 или 2 субъекта, которые получали плацебо. В исследовании многократных нарастающих доз LACA-40 вводили подкожной инъекцией здоровым субъектам ежедневно в течение 28 последовательных дней с последующими 56 днями наблюдения после последнего введения дозы. Субъекты были включены в одну из четырех когорт с дозами, варьирующими от 30 мг до 270 мг/день (30, 90, 180 или 270 мг/день). Каждая когорта включала 4 субъектов, которые получали лекарственное средство, и 1 субъекта, который получал плацебо. Безопасность оценивали посредством интенсивного клинического наблюдения. Серийный забор крови проводили для определения концентраций LACA-40 в сыворотке. Образцы крови также отбирали для определения соответствующих маркеров активности комплемента (С3, СН50 и АР50). У последних когорт измеряли дополнительные соответствующие маркеры ФД (фармакодинамики; интактные С3, iC3b, С3а, С4а и С5а). До введения многократных доз субъекты получали вакцинации против Neisseria meningitides, Streptococcus pneumoniae и Haemophilus influenzae типа В (Hib).
[00534] Результаты
[00535] Когда в сумме 24 здоровых субъекта получили однократные дозы LACA-40 в дозах вплоть до 1440 мг в исследовании фазы 1 однократных нарастающих доз и в сумме 16 здоровых субъектов получили многократные дозы LACA-40 в течение 28 последовательных дней в дозах вплоть до 270 мг/день в исследовании многократных нарастающих доз, 11 здоровых субъектов получили одно- или многократные введения плацебо в исследованиях, анализ позволил установить, что LACA-40 хорошо переносился в обоих исследованиях при отсутствии серьезных нежелательных явлений или нежелательных явлений, возникших после начала лечения, приводящих к прекращению исследования лекарственного средства, или зарегистрированных тяжелых нежелательных явлений. Кроме того, в каждом исследовании при изучении лабораторных данных, основных показателей жизненно-важных функций, физикальных исследований или результатов электрокардиографии сигналы безопасности, имеющие клиническую значимость, отсутствовали.
[00536] Фармакокинетика LACA-40 соответствовала прогнозам, составленным на основании доклинических данных, при этом между пациентами наблюдалась незначительная вариабельность.
[00537] В исследовании многократных нарастающих доз было установлено, что концентрации LACA-40 в плазме увеличивались линейным образом с увеличением дозы, достигая максимальной концентрации в дни с 14 по 28. Концентрации в сыворотке после 28 дней ежедневного введения доз являлись близкими к состоянию равновесия.
[00538] В обоих исследованиях было установлено дозозависимое увеличение уровня С3, что свидетельствует о связывании LACA-40 с С3.
[00539] В исследовании однократных нарастающих доз после однократной дозы 1440 мг LACA-40 наблюдалось снижение гемолитической активности, опосредованной альтернативным путем (АР50).
[00540] В третьей когорте исследования многократных нарастающих доз LACA-40 с уровнем дозы 180 мг/день уже через семь дней после начала лечения наблюдалось снижение индуцированного сывороткой гемолиза ex vivo, которое продолжалось в течение лечения и достигло максимума более чем 80% у двух из четырех субъектов и более чем 60% у других двух субъектов (фиг. 14). В четвертой когорте исследования многократных нарастающих доз LACA-40 с уровнем дозы 270 мг/день уже через семь дней после начала лечения наблюдалось снижение индуцированного сывороткой гемолиза ex vivo, которое продолжалось в течение лечения и достигло максимума более чем 80% у трех из четырех субъектов. Результат для четвертого субъекта представляет собой выпадающее значение: у него наблюдалось снижение приблизительно на 40% относительно исходного уровня.
2+
[00541] Процент ингибирования индуцированного сывороткой гемолиза ex vivo определяли на основе стандартного анализа гемолиза эритроцитов кролика, когда комплемент активируется альтернативным путем (АР). Эритроциты кролика являются спонтанными активаторами АР человека. В анализе используется факт, что, когда эритроциты кролика инкубируют в сыворотке с добавлением EGTA для хелатирования Са (чтобы ингибировать активацию комплемента классическим путем и путем лектина), образуется АР-конвертаза, приводящая к активации С3 и последующему лизису эритроцитов, который можно обнаружить посредством обнаружения свободного гемоглобина методом спектрофотометрии. Следует отметить, что данный анализ, вероятно, занижает фактический процент ингибирования гемолиза, поскольку в образце отрицательного контроля отсутствует сыворотка, тогда как в образцах от субъектов присутствует сыворотка и вносит вклад в поглощение исходного уровня в данных образцах.
[00542] Следует отметить, что в клинических исследованиях экулизумаба, ингибитора комплемента, который связывается с С5, на пациентах с ПНГ 80% ингибирования индуцированного сывороткой гемолиза ex vivo (с применением сыворотки от пациентов с ПНГ), как было показано, приносит значительную пользу при лечении ПНГ (Hillmen, P., et al., N Engl J Med 2004; 350:552-9). Настоящий пример в этой связи подтверждает, что фармакологически значимые уровни ингибирования комплемента были достигнуты по меньшей мере при дозе LACA-40 180 мг/день. Настоящий пример также подтверждает, что фармакологические дозы LACA-40 являлись безопасными и хорошо переносимыми, что профиль фармакокинетики/фармакодинамики LACA-40 (ФК/ФД) подтверждает целесообразность ежедневного п/к введения, и что ежедневные дозы LACA-40 180 мг и 270 мг в значительной степени снижали гемолитическую активность уже через семь дней после начала введения доз, и данное ингибирование сохранялось в течение всего периода введения доз.
[00543] Согласно одному аспекту данные о ФК из этих исследований использовали для разработки модели ФК/ФД, которую можно применять для облегчения выбора дозы у пациентов с ПНГ или у других пациентов, которым вводят LACA-40.
[00544] В настоящем описании изобретения предусмотрено, что более низкие дозы LACA-40 могут также быть эффективными при ПНГ. Например, в анализе индуцированного сывороткой гемолиза ex vivo измеряют исключительно лизис, вызванный МАК, который отражает внутрисосудистый гемолиз. LACA-40 (и определенные другие соединения, описанные в настоящем документе) защищают клетки от МАК, а также от опсонизации фрагментами С3, например, C3b, которые являются причиной внесосудистого гемолиза и потенциальной дисфункции, которую не облегчает экулизумаб. Вследствие этого, не опираясь на конкретную теорию, в настоящем описании изобретения представлено, что при лечении ПНГ согласно некоторым вариантам реализации можно достичь эффективности даже с дозами, которые являются более низкими, чем требуется для ингибирования 80% индуцированного сывороткой гемолиза ex vivo, по меньшей мере отчасти в связи с ингибированием внесосудистого гемолиза.
[00545] Таким образом, помимо прочего, в настоящем примере продемонстрировано, что при подкожном введении доз (например, ежедневном подкожном введении доз в течение соответствующего периода времени, например, в течение по меньшей мере одного дня, 2 дней, 3 дней, 4 дней, 5 дней, 6 дней, 1 недели, 2 недель, 3 недель, 4 недель или более) аналога компстатина длительного действия, содержащего линейный 40 кДа ПЭГ и два фрагмента аналога компстатина, можно достичь действенных эффектов. Настоящий пример конкретно демонстрирует действенные эффекты, которые были достигнуты с ежедневной дозой 180 мг/день, и конкретно предусматривает, что как более высокая, так и более низкая дозы вполне могут быть пригодными в соответствующих обстоятельствах. Настоящий пример также конкретно демонстрирует действенные эффекты, которые были достигнуты с ежедневной дозой 270 мг/день, и конкретно предусматривает, что как более высокая, так и более низкая дозы вполне могут быть пригодными в соответствующих обстоятельствах.
[00546] Более того, в свете конкретной демонстрации эффективных результатов, которые были достигнуты с предложенными схемами введения LACA-40, настоящий пример подтверждает конкретную применимость аналогов компстатина длительного действия и, в особенности, аналогов, содержащих по меньшей мере два фрагмента аналога компстатина, и/или аналогов, содержащих фрагмент ПЭГ с молекулярной массой приблизительно 40 кДа (например, в диапазоне от приблизительно 10 кДа до приблизительно 50 кДа, конкретно включая молекулярную массу приблизительно 20 кДа, 30 кДа, 40 кДа и т.д.), в таких схемах.
[00547] В качестве альтернативы или дополнительно, в настоящем примере продемонстрирована конкретная применимость аналогов компстатина длительного действия, которые характеризуются суммарной молекулярной массой не более чем приблизительно 50 кДа, в схемах введения, описанных в настоящем документе (см. выше).
[00548] Пример 21: Клиническое исследование фазы Ib LACA-40 у субъектов с ПНГ
3
[00549] Клиническое исследование фазы Ib одно- и многократных нарастающих доз LACA-40 инициировали для оценки безопасности, переносимости, ФК и ФД LACA-40 в сочетании с экулизумабом (Солирисом) у взрослых пациентов с ПНГ. В данном клиническом исследовании подкожные дозы LACA-40 в 5% декстрозе вводили пациентам с ПНГ, все из которых получали сопутствующую терапию экулизумабом. Для участия в исследовании возраст пациентов должен был составлять по меньшей мере 18 лет, масса - более 55 кг, пациенты должны были получать лечение экулизумабом в течение по меньшей мере 3 месяцев, характеризоваться уровнем гемоглобина <10 г/дл при скрининге или получить по меньшей мере одно переливание крови в течение 12 месяцев до скрининга, характеризоваться числом тромбоцитов >30000/мм и абсолютным числом нейтрофилов >500 клеток/мкл. До введения доз все субъекты начинали профилактический пероральный прием антибиотиков и получали вакцинацию против Neisseria meningitides. Субъектов в когортах 3 и 4 также вакцинировали против Streptococcus pneumoniae и Haemophilus influenzae типа В (Hib).
[00550] Каждая из первых двух когорт состояла из двух пациентов, которые получали однократную дозу LACA-40 с последующими по меньшей мере 28 днями наблюдения. Если после данного периода наблюдения делали заключение, что однократная доза хорошо переносилась, пациент затем получал схему с ежедневной подкожной дозой LACA-40 в течение дополнительных 28 последовательных дней. Третья и четвертая когорты состояли из двух и шести пациентов, соответственно, которые получали подкожные дозы LACA-40 ежедневно в течение 28 последовательных дней. Исследуемые дозы являлись следующими:
Когорта 1: Однократная п/к доза 25 мг LACA-40 и повторяющиеся п/к дозы 5 мг/день
Когорта 2: Однократная п/к доза 50 мг LACA-40 и повторяющиеся п/к дозы 30 мг/день
Когорта 3: Повторяющиеся п/к дозы 180 мг/день LACA-40
Когорта 4: Повторяющиеся п/к дозы 270 мг/день LACA-40
[00551] Безопасность оценивали посредством клинического наблюдения, и все лекарственные средства вводили квалифицированные медсестры дома у субъектов или в клинике. Серийные образцы сыворотки крови отбирали для определения концентраций LACA-40. Оценивали фармакодинамическую (ФД) активность и сигналы эффективности, включая уровни лактатдегидрогеназы (ЛДГ), гемоглобина, распределение клона кКК ПНГ, требования к переливанию крови, уровни комплемента, отложение фрагмента С3 на кКК и ретикулоцитах.
[00552] Результаты
[00553] Когда введение доз первым трем когортам было завершено, анализ позволил установить, что LACA-40 хорошо переносился; было зарегистрировано одно тяжелое нежелательное явление, которое было оценено как, вероятно, не связанное с введением LACA-40.
[00554] Когда введение доз двум субъектам было завершено с фармакологически активной дозой 180 мг, у обоих субъектов наблюдалось клиническое улучшение и соответствующие изменения биомаркеров крови. Уровни гемоглобина увеличились у обоих субъектов в течение первых двух недель лечения и оставались стабильными до окончания лечения в день 28. Уровень ЛДГ являлся стабильным при ~1,5х ВГН (верхней границы нормы) у одного субъекта и понизился с 1,5х ВГН до пределов нормального диапазона у другого субъекта. Соотношение кКК III типа (CD59-отрицательных) у обоих субъектов увеличилось приблизительно вдвое, повысившись с 22,3% до 52% и с 32,5% до 62,5% с дня 1 до дня 29, соответственно. Требования к переливанию кКК также снизились в течение периода введения доз по сравнению с недавними данными анамнеза. Связанные с лечением серьезные нежелательные явления не были зарегистрированы, и связанные с лечением нежелательные явления, приводящие к прекращению лечения, отсутствовали. Переходили к введению доз когорте 4 (270 мг ежедневно).
[00555] Когда введение доз трем субъектам в течение 28 дней введения доз с п/к LACA-40 270 мг/день было завершено, у всех трех субъектов наблюдалось аналогичное клиническое улучшение, связанное с соответствующими изменениями биомаркеров крови. Уровни Hb повысились, уровни ЛДГ снизились, уровни ретикулоцитов снизились, и процент кКК ПНГ III типа увеличился. На основании оценки профиля риск/польза была одобрена поправка к протоколу, которая позволяла непрерывное продолжение введения доз в когорте 270 мг/день в течение дополнительных 56 дней в течение в сумме 84 дней лечения помимо продолжающейся терапии экулизумабом. Ни одному из трех субъектов не требовалось переливание кКК с момента начала лечения LACA-40.
[00556] Полученные данные подтверждают, что фармакологические дозы LACA-40 являются безопасными и хорошо переносимыми у субъектов с ПНГ, и ежедневное п/к введение доз LACA-40 обеспечивает продолжительное ингибирование гемолитической активности у пациентов с ПНГ. Полученные данные также подтверждают, что ингибирование С3 обеспечивает клиническую пользу субъектам с ПНГ, которые характеризуются субоптимальным ответом на лечение против С5 (например, лечение экулизумабом).
[00557] Таким образом, в настоящем описании изобретения предусмотрено подкожное введение доз (например, ежедневное подкожное введение доз в течение соответствующего периода времени, например, в течение по меньшей мере одного дня, 2 дней, 3 дней, 4 дней, 5 дней, 6 дней, 1 недели, 2 недель, 3 недель, 4 недель или более, например, продолжающееся в течение месяцев или лет) аналога компстатина длительного действия, содержащего линейный 40 кДа ПЭГ и два фрагмента аналога компстатина, будь то в качестве монотерапии или в комбинации с другой терапией (например, терапией экулизумабом).
[00558] Пример 22: Клиническое исследование фазы 1b LACA-40 у пациентов с ПНГ
[00559] Открытое клиническое исследование фазы 1b LACA-40 у не получавших лечение пациентов с ПНГ проводили для оценки безопасности, ФК, ФД и предварительной эффективности повторяющихся доз LACA-40. Пациенты мужского и женского пола, которым был поставлен диагноз гемолитической ПНГ, удовлетворяли критериям включения. Требовалось, чтобы субъектам проводили переливание крови в течение предшествующих 12 месяцев, и уровни лактатдегидрогеназы (ЛДГ) > в 2 раза превышали верхнюю границу нормы (ВГН). До введения доз субъектов вакцинировали против Neisseria meningitides, Streptococcus pneumoniae и Haemophilus influenzae типа В (Hib), и субъекты начинали профилактический пероральный прием антибиотиков. Дозы LACA-40 в 5% декстрозе вводили подкожной инъекцией в течение по меньшей мере 28 дней и вплоть до 84 последовательных дней. (Термин «не получавшие лечения» в данном контексте означает пациентов, которые ранее не получали лечение ингибитором комплемента). В исследование включали две когорты по 3 пациента в каждой. Исследовали дозы 180 мг/день для первой когорты и 270 мг/день для второй когорты. Дозы вводили в объеме 1,8 мл в виде однократной ежедневной инъекции или в виде 2 ежедневных инъекций по 0,9 мл. Первичная конечная точка оценки эффективности для исследования представляла собой изменение уровня ЛДГ как показателя внутрисосудистого гемолиза. Другие измеряемые соответствующие маркеры эффективности включали гемоглобин, распределение клона кКК ПНГ, суммарную гемолитическую активность комплемента (СН50), опосредованную альтернативным путем гемолитическую активность (АР50), требования к переливанию, число ретикулоцитов и отложение фрагментов С3 на клетках крови (в качестве показателя возможности внесосудистого гемолиза). Измерение отложения фрагментов С3 проводили методом проточной цитометрии, например, как описано выше. Применяли антитело, перекрестно-реактивное с C3b, С3с и C3d.
[00560] Результаты
[00561] Когорта 1
[00562] После комплектации когорты 1 два субъекта получали дозы LACA-40 180 мг в течение 28 дней, и один субъект отозвал информированное согласие в связи с реакцией после первой дозы. У обоих субъектов, которые получали лечение в течение 28 дней, наблюдалось заметное снижение уровней ЛДГ, с 2078 Ед./л до 1082 Ед./л и с 1325 Ед./л до 709 Ед./л (норма 100-250 Ед./л) с дня 1 по день 29, соответственно. Ни один из субъектов не достиг критерия для продолжения части 2 исследования.
[00563] Уровни гемоглобина (Hb) на скрининге были ниже 80 г/л, и оба субъекта получили переливание за 3 недели до введения доз LACA-40. Уровни Hb у обоих субъектов поддерживались на уровне 80 г/л, и ни одному из субъектов не требовалось переливание в течение периода введения доз. Оба субъекта получили переливание в течение 4 недель после прекращения лечения LACA-40.
[00564] Фракция кКК III типа (CD59-отрицательные) у обоих субъектов увеличилась приблизительно втрое, увеличившись с 5,1% и 13,4% в день 1 до 17,4% и 37,6% в день 29, соответственно.
[00565] У обоих субъектов, которые завершили 28 дней введения доз, LACA-40 оказался безопасным и хорошо переносимым. У третьего субъекта через 5-6 часов после получения 1-ой дозы LACA-40 развилась тошнота, рвота и сыпь. Данное явление было зарегистрировано как серьезное нежелательное явление, возможно, связанное с LACA-40. Для обоснования продолжения исследования данную реакцию дополнительно исследовали с изучением реактивности клеток in vitro и проведением кожной инъекционной пробы с LACA-40 и 40 кДа ПЭГ. Исследование позволило сделать заключение, что доказательства активации Т-клеток отсутствовали, и кожная проба была отрицательной. Вследствие этого возвращение субъекта в исследование было признано безопасным с медицинской точки зрения. Однако субъект отозвал информированное согласие по личным обстоятельствам.
[00566] Когорта 2
[00567] После того как два субъекта завершили период лечения 270 мг/день LACA-40, вводимого путем п/к инъекции, в течение 28 дней у обоих субъектов наблюдалось заметное снижение уровней ЛДГ до в пределах 2-кратной верхней границы нормы и увеличение процента кКК ПНГ III типа. После анализа всех данных субъекты в данной когорте соответствовали критериям для продолжения ежедневного приема LACA-40, если наблюдалась клиническая польза и если продолжение приема запрашивалось исследователем. Оба получавших лечение субъекта соответствовали ранее определенному критерию для продолжения введения доз до 84 дней. Один субъект покинул исследование по личным обстоятельствам. Другой субъект продолжал прием доз, и у него продолжало наблюдаться устойчивое снижение ЛДГ при исследовании в день 57. Введение доз следующему субъекту в когорте 2 было отложено.
[00568] В заключение, LACA-40, вводимый ежедневно, был безопасным и хорошо переносился и привел к устойчивому подавлению гемолиза у пациентов с ПНГ, которые не получали экулизумаб.
[00569] Дополнительно, в настоящем описании изобретения конкретно предложено определенное понимание, относящееся, в частности, к определенным желательным характеристикам устройств (например, к калибру иглы, диаметру отверстия и/или толщине стенок иглы и т.д.), в особенности подходящих для доставки определенных композиций LACA, включая, в частности, определенные композиции LACA-40, описанные в настоящем документе (см. выше).
[00570] Пример 23: Доклинические исследования интравитреального LACA-40
[00571] Доклинические исследования на обезьянах проводили для оценки безопасности и фармакологии LACA-40 при интравитреальной инъекции. Интравитреально вводимый LACA-40 у яванских макаков поступает в сосудистое русло, а затем поступает далее и/или медленно выводится из организма. Результаты токсикокинетических анализов концентраций LACA-40 в стекловидном теле и сыворотке после повторных интравитреальных инъекций в течение девяти месяцев в дозах вплоть до 24,8 мг/глаз в 5% декстрозе в объемах 50 или 100 мкл/глаз свидетельствовали, что в течение многократных инъекций наблюдалось незначительное внутриглазное или сывороточное накопление лекарственного средства. Кроме того, в ходе полного токсикологического анализа, включавшего офтальмологическое обследование с помощью непрямой и щелевой лампы, спектральную оптическую когерентную томографию, электроретинографию и глазную тонометрию и гистопатологическое исследование обоих глаз и приблизительно 50 дополнительных тканей от каждой обезьяны, не было выявлено свидетельств LACA-40-опосредованных изменений при любой из исследованных доз.
[00572] Оценка профиля фармакокинетики однократной интравитреальной дозы LACA-40 (10 мг/глаз в оба глаза) на обезьянах позволила определить период полужизни в стекловидном теле, составляющий приблизительно 3,2 дня. После интравитреальной инъекции концентрации LACA-40 в сыворотке увеличились до дня 7 после введения дозы, а затем снизились с кажущимся периодом полужизни 10,4 дня.
[00573] Помимо прочего, в настоящем описании изобретения предусмотрены схемы введения аналога компстатина длительного действия, содержащего линейный 40 кДа ПЭГ и два фрагмента аналога компстатина, причем в указанных схемах введения время введения индивидуальной дозы выбирают специфичным образом, чтобы обеспечить желаемый характер ФК с учетом периода полужизни LACA-40, описанного в настоящем документе.
[00574] Пример 24: Клиническое исследование фазы 1b однократных нарастающих доз LACA-40 у субъектов с ВМД

[00575] Открытое клиническое исследование фазы 1 однократных нарастающих доз LACA-40 у пациентов с влажной ВМД и получающих терапию против VEGF (более конкретно, Луцентис, Эйлеа или Авастин), инициировали для оценки безопасности, переносимости и ФК LACA-40. В данном исследовании пациенты получали однократную дозу LACA-40 путем интравитреальной инъекции с последующими 113 днями наблюдения. Изначально планировалось включить в исследование девять пациентов, в три когорты по три пациента в каждой, в дозах 5 мг, 10 мг и 20 мг LACA-40 в 5% декстрозе в объеме 100 микролитров. После завершения включения пациентов во все три когорты третья когорта была увеличена с трех пациентов до суммарно 12 пациентов. LACA-40 хорошо переносился изначальными девятью пациентами, и серьезные нежелательные явления не были зарегистрированы.
[00576] В настоящем описании изобретения предложены схемы введения, согласно которым аналог компстатина длительного действия, содержащий линейный 40 кДа ПЭГ и два фрагмента аналога компстатина, вводят путем интравитреальной инъекции. Согласно определенным вариантам реализации аналог компстатина длительного действия, содержащий линейный 40 кДа ПЭГ и два фрагмента аналога компстатина, вводят в виде монотерапии; согласно некоторым вариантам реализации его вводят в комбинации с другой терапией (например, терапией против VEGF), так что на пациента одновременно воздействуют обе терапии.
[00577] В настоящем примере конкретно описаны и обоснованы схемы введения, при которых аналог компстатина длительного действия, содержащий линейный 40 кДа ПЭГ и два фрагмента аналога компстатина, вводят путем интравитреальной инъекции субъектам, получающим терапию против VEGF. Согласно определенным вариантам реализации субъекты, получающие лечение как терапией против VEGF, так и терапией LACA-40, получали дозы агента против VEGF с более длительными интервалами, чем таковые, применяемые для сопоставимых по другим параметрам субъектов, не получающих терапию LACA-40. Было разработано множество агентов против VEGF (их обзор представлен, например, в публикации Lanzetta Br J Opthamol 97:1497, 2013). Например, описанные в литературе схемы введения для определенных агентов против VEGF включают интравитреальные инъекции ранибизумаба 0,5 мг или бевацизумаба 1,25 мг, вводимые каждые 4 недели (q4) или по необходимости; согласно некоторым вариантам реализации такие схемы выступают соответствующими эталонными схемами, по сравнению с которыми оценивают схемы комбинированной терапии против VEGF, описанные в настоящем документе.
[00578] В свете описания изобретения, представленного в настоящем документе, в том числе в данном примере, специалистам в данной области техники очевидно, что предложены определенные схемы комбинированной терапии, например, согласно которым каждый из LACA-40 и агента против VEGF вводят интравитреальным способом; согласно некоторым вариантам реализации LACA-40 и агент против VEGF можно вводить совместно в однократной инъекции для определенных (хотя и не обязательно всех) доз. Согласно определенным вариантам реализации в выбранный период времени вводят меньшее количество доз агента против VEGF, чем вводили бы при отсутствии введения LACA-40.
[00579] Пример 25: Клиническое исследование фазы 2 однократных нарастающих доз LACA-40 у субъектов с географической атрофией
2
2
[00580] Проводили рандомизированное, односторонне-слепое, плацебо-контролируемое клиническое исследование LACA-40 у пациентов с ГА. В исследование включали приблизительно 240 пациентов. Пациентам в исследовании был поставлен диагноз ГА макулы, обусловленной возрастной дегенерацией макулы, который подтверждали за 14 дней до рандомизации в центральном считывающем центре с применением изображений автофлуоресценции глазного дна (Fundus Autofluorescence), а также следующих критериев: суммарная площадь ГА, определенная в ходе скрининга изображений FAF, должна составлять ≥2,5 мм и ≥17,5 мм (1 и 7 площадей диска [DA], соответственно).
3
[00581] Пациентов рандомизировали в соотношении 2:2:1:1, и пациенты получали LACA-40 ежемесячно, LACA-40 один раз в два месяца, инъекцию плацебо ежемесячно или инъекцию плацебо один раз в два месяца. Пациенты в группах LACA-40 получали дозу 15 мг LACA-40, которую инъецировали в жидкую часть стекловидного тела в объеме 0,1 см ежемесячно или один раз в два месяца в течение 12 месяцев с последующими шестью месяцами наблюдения после окончания лечения. В когортах, получавших инъекции плацебо, пациенты получали имитацию инъекции. Оценивали безопасность, переносимость, ФК и доказательства активности многократных интравитреальных инъекций LACA-40 у пациентов с ГА в по меньшей мере одном глазу. Первичная конечная точка оценки эффективности представляла собой изменение размера поражения ГА от исходного уровня до месяца 12. Дизайн исследования был разработан для обнаружения снижения роста размера поражения по меньшей мере на 30% между группами LACA-40 и плацебо-контролируемыми группами от исходного уровня к месяцу 12. Первичная конечная точка оценки безопасности представляла собой количество и тяжесть местных и системных нежелательных явлений, возникших после начала лечения
[00582] Пример 26: Клиническое исследование фазы 2 однократных нарастающих доз LACA-40 у субъектов с промежуточной ВМД
[00583] Проводили рандомизированное, односторонне-слепое, плацебо-контролируемое клиническое исследование LACA-40 у пациентов с промежуточной ВМД. Пациентам в исследовании был поставлен диагноз промежуточной возрастной дегенерации макулы. Целью исследования являлась оценка того, способен ли LACA-40 предотвратить прогрессирование от промежуточной ВМД к ГА или влажной ВМД.
3
[00584] Пациентов рандомизировали в соотношении 2:2:1:1, и пациенты получали LACA-40 ежемесячно, LACA-40 один раз в два месяца, инъекцию плацебо ежемесячно или инъекцию плацебо один раз в два месяца. Пациенты в группах LACA-40 получали дозу 15 мг LACA-40, которую инъецировали в жидкую часть стекловидного тела в объеме 0,1 см ежемесячно или один раз в два месяца в течение по меньшей мере 12 месяцев с последующими шестью месяцами наблюдения после окончания лечения. В когортах, получавших инъекции плацебо, пациенты получали имитацию инъекции. Оценивали безопасность, переносимость и доказательства активности многократных интравитреальных инъекций LACA-40 у пациентов с промежуточной ВМД по меньшей мере в одном глазу. Конечные точки оценки эффективности включали частоту прогрессирования от промежуточной ВМД к ГА и/или влажной ВМД со снижением частоты у пациентов, получавших лечение LACA-40, по сравнению с пациентами, которые получали инъекции плацебо, что обеспечивало доказательства эффективности, и изменение количества и/или объема высокого риска друзов и общего количества и/или объема друзов. Большее снижение количества, объема и/или скорости роста друзов у пациентов, получавших лечение LACA-40, по сравнению с пациентами, которые получали инъекции плацебо, обеспечивает доказательство эффективности. Первичная конечная точка оценки безопасности представляла собой количество и тяжесть местных и системных нежелательных явлений, возникших после начала лечения.
[00585] Пример 27: Доклинические исследования ингаляционного СА28
[00586] Ингаляционные исследования однократной дозы или повторяющегося введения доз проводили на собаках и яванских макаках. У всех животных в наивысших исследованных ингаляционных дозах явления, связанные с приемом лекарственного средства, отсутствовали. Данные дозы составляли 25 мг/кг/д в исследовании повторяющихся доз длительностью 7 дней на собаках, 80 мг/кг в исследовании однократной дозы на обезьянах и 30 мг/кг/день в исследовании повторяющихся доз длительностью 14 дней на обезьянах.
[00587] Для исследования фармакологического эффекта СА28 in vivo у яванских макаков по сравнению с кортикостероидами применяли кожную пробу Ascaris suum. Дозы небулизированного СА28 20 мг/день или 15 мг/кг/д (в течение 14 последовательных дней) оказывали фармакологический эффект в отношении контроля уровней воспалительных цитокинов в легких (которые измеряли в бронхоальвеолярной промывной жидкости) после стимуляции аллергеном как в течение периода лечения длительностью 14 дней, так и в течение 28 дней после прекращения лечения после вымывания лекарственного средства.
[00588] Пример 28: Клиническое исследование фазы 1 одно- и многократных нарастающих доз ингаляционного СА28 у здоровых субъектов

[00589] Проводили открытое, рандомизированное, плацебо-контролируемое клиническое исследование фазы 1 одно- и многократных нарастающих доз ежедневного применения небулизированного состава аналога компстатина (СА28) для оценки безопасности, переносимости и ФК одно- и многократных ингаляционных доз лекарственного средства у здоровых добровольцев. Раствор СА28 в (2% глицероле) или плацебо (в 2% глицероле) вводили при помощи струйного распылителя PARI LC Sprint с прерывателем воздушного потока, нагнетаемого компрессором PARI TurboBOY S. В части исследования однократных нарастающих доз 16 субъектов включали в четыре когорты по четыре субъекта в каждой. Данным субъектам вводили однократную дозу СА28 в дозах, варьирующих от 20 мг до 350 мг (20, 60, 150 или 350 мг), и наблюдали за субъектами в течение 14 дней после лечения. В данной части исследования СА-28 хорошо переносился, и серьезные нежелательные явления не были зарегистрированы.
[00590] Четырех субъектов включали в первую когорту части исследования многократных нарастающих доз. Данные субъекты получали лечение дозой 60 мг/день лекарственного средства в течение 14 последовательных дней. Однако после девяти дней лечения дозой 60 мг/день у одного субъекта развились признаки и симптомы, указывающие на потенциальную бактериальную инфекцию, которую посчитали, возможно, связанной с фармакологией лекарственного средства. Исследование было приостановлено, а затем возобновлено у субъектов, получающих 30 мг/день. У другого субъекта развились признаки и симптомы, указывающие на потенциальную бактериальную инфекцию, которую посчитали, возможно, связанной с фармакологией лекарственного средства, через 10 дней лечения в дозе 30 мг/день. Затем исследование было прекращено.
[00591] Оба субъекта отвечали в течение часов на лечение антибиотиками первой линии, что свидетельствует о бактериальном патогенезе. В данном исследовании субъектов вакцинировали против Neisseria meningitides и тщательно наблюдали за признаками инфекций. Несмотря на то, что все культуры бактерий являлись отрицательными, считают, что Haemophilus influenzae или Streptococcus pneumoniae, возможно, были причастны к наблюдавшимся эпизодам лихорадки, поскольку известно, что индивидуумы, страдающие от недостатка С3, подвержены повышенному риску инфекции Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae и Streptococcus pneumoniae. Вакцины против данных трех патогенов доступны, и считается, что риск инфекции можно устранить посредством вакцинации, возможно, с добавлением профилактических антибиотиков (например, пенициллина V).
*****
[00592] Специалистам в данной области техники известны многие эквиваленты конкретных вариантов реализации настоящего изобретения, описанных в настоящей заявке, либо такие эквиваленты могут быть выявлены с применением не более чем рутинных экспериментов. Предполагается, что объем настоящего изобретения не ограничен приведенным выше описанием и отражен в прилагаемой формуле изобретения. Следует иметь в виду, что настоящее изобретение никоим образом не зависит от конкретных результатов, полученных в любом конкретном примере или в любом конкретном варианте реализации. Употребление существительных в единственном числе и термина «указанный/ые» может подразумевать «один/одна или большее количество, чем один/одна», если иное не указано или не очевидно из контекста. Подразумевается, что пункты формулы изобретения или описание, включающие союз «или» между одним или большим количеством представителей группы, удовлетворены, если присутствует(ют), использует(ют)ся или иным образом связан(ы) с определенным продуктом или процессом один, более чем один или все представители указанной группы, если иное не указано или не очевидно из контекста. Настоящее изобретение включает варианты реализации, в которых присутствует, используется или иным образом связан с определенным продуктом или процессом ровно один представитель указанной группы. Например, без ограничения, следует понимать, что в тех случаях, когда в формуле изобретения или в описании указано, что остаток в конкретном положении может быть выбран из конкретной группы аминокислот или аналогов аминокислот, настоящее изобретение включает индивидуальные варианты реализации, в которых остаток в указанном положении представляет собой любую(ой) из перечисленных аминокислот или аналогов аминокислот. Настоящее изобретение также включает варианты реализации, в которых присутствует(ют), использует(ют)ся или иным образом связан(ы) с определенным продуктом или процессом более чем один либо все представители указанной группы. Кроме того, следует понимать, что настоящее изобретение охватывает все варианты, комбинации и пермутации, в которых одно или более ограничений, элементов, условий, описательных терминов и т.п., из одного или более из приведенных пунктов формулы или приведенного выше описания введен в другой пункт формулы. Например, любой пункт формулы, зависимый от другого пункта формулы, может быть модифицирован таким образом, чтобы включать один или более элементов, ограничений, условий или описательных терминов, присутствующих в любом другом пункте формулы, зависимом от того же основного пункта. Кроме того, в тех случаях, когда в формуле изобретения упоминается композиция, следует понимать, что в объем настоящего изобретения включены способы введения указанной композиции, соответствующие любому из описанных в настоящей заявке способов, и способы применения указанной композиции для любой из описанных в настоящей заявке целей; в объем настоящего изобретения включены и способы получения композиции в соответствии с любым из способов получения, описанных в настоящей заявке, если не указано иное, или если специалисту в данной области техники не очевидно, что возникнет противоречие или несоответствие. Способы лечения субъекта могут включать этап обеспечения субъекта, нуждающегося в таком лечении (например, субъекта, который перенес заболевание, либо субъекта, у которого имеется повышенный риск заболевания), этап диагностирования заболевания у субъекта и/или этап выбора субъекта для лечения клеточно-реактивным аналогом компстатина. В тех случаях, когда элементы представлены в виде списков, следует понимать, что также раскрыта каждая подгруппа указанных элементов, и что из указанной группы может (могут) быть удален(ы) любой(ые) элемент(ы). Для краткости только некоторые из указанных вариантов реализации конкретно представлены в настоящей заявке, однако настоящее изобретение включает все подобные варианты реализации. Следует также понимать, что, в общем случае, если сказано, что настоящее изобретение или аспекты настоящего изобретения включает(ют) конкретные элементы, свойства и т.п., определенные варианты реализации настоящего изобретения или аспекты настоящего изобретения состоят, либо состоят по существу, из таких элементов, свойств и т.п. Описания различных заболеваний, нарушений и состояний в различных разделах настоящей заявки приведены для удобства и не подразумевают ограничения настоящего изобретения.
[00593] При указании диапазонов включены предельные значения. Кроме того, следует понимать, что если иное не указано или не очевидно из контекста и для специалиста в данной области техники, под значениями, выраженными через диапазоны, согласно разным вариантам реализации настоящего изобретения может подразумеваться любое конкретное значение или поддиапазон в пределах указанных диапазонов, до десятых долей единиц нижней границы указанного диапазона, если из контекста явно не следует иное. Любой конкретный вариант реализации, аспект, элемент, признак и т.п. настоящего изобретения может быть явным образом исключен(а) из формулы изобретения, даже если такое исключение не приведено в настоящей заявке явным образом. Например, любой аналог компстатина, функциональная группа, соединяющая часть, снижающего клиренс фрагмента, заболевание или показание могут быть явным образом исключены.