Сравнительная оценка применения различных видов эмбриональных гепатоцитов при лечении острой печеночной недостаточности

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА ПРИМЕНЕНИЯ РАЗЛИЧНЫХ ВИДОВ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ ГЕПАТОЦИТОВ ПРИ ЛЕЧЕНИИ ОСТРОЙ ПЕЧЕНОЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ

М.Д. УРАЗМЕТОВА, Ф.А. ХАДЖИБАЕВ, А.Г. МИРЗАКУЛОВ

COMPARATIVE ESTIMATION OF THE USE OF DIFFERENT TYPES OF EMBRYONAL HEPATOCYTES AT THE CURE OF ACUTE HEPATIC FAILURE

M.D. URAZMETOVA F.A. KHADJIBAEV, A.G. MIRZAKULOV

Республиканский научный центр экстренной медицинской помощи

Изучена динамика биохимических показателей на экспериментальной модели острой печеночной недостаточности, путем введения внутрибрюшинно раствора четыреххлористого углерода. В последующем выполнена трансплантация гепатоцитов крыс и человека. Показана динамика основных биохимических показателей крови при трансплантации эмбриональных гепатоцитов крыс и человека. Путем сопоставления указанных данных отмечена положительная динамика в лечении острой печеночной недостаточности, которая более выражена в группе с трансплантацией эмбриональных гепатоцитов крыс. Ключевые слова: острая печеночная недостаточность, гепатоциты, трансплантация, печень, биохимические показатели.

Dynamics of biochemical indicators on experimental model of an acute liver failure, by administration intraperitoneally of solution of four-chloride carboneum is studied. In the subsequent transplantation of hepatocytes of rats and the human is executed. Dynamics of the key biochemical indicators of a blood at transplantation of fetal hepatocytes of rats is shown and the human. By comparison of the specified data positive dynamics in treatment of an acute liver failure which is more expressed in group with transplantation of fetal hepatocytes of rats is noted.

Key-words: acute hepatic failure, hepatocytes, grafting, liver, biochemical indices

УДК:616.36-008.64-036.11-085

В настоящее время во всем мире отмечается неуклонный рост числа больных с заболеваниями печени. При этом различные патологии в большинстве случаев сопровождаются развитием серьезных осложнений вплоть до развития острой печеночной недостаточности (ОПН). К ОПН приводят разнообразные заболевания и состояния, сопровождающиеся массивным некрозом гепатоцитов: фульминантные формы вирусных гепатитов, лекарственная интоксикация, отравление ядами и алкоголем, сепсис, массивные ожоги, шок различной этиологии, надпочечниковая недостаточность, хирургические вмешательства, хирургические заболевания гепатобилиарной системы, метаболические нарушения и др. [1, 3, 4]. При этом в 15-20% случаях установить причину ОПН не представляется возможным. Это могут быть неустановленные инфекционные, ядовитые, аутоиммунные и метаболические дисфункции [6; 8].

Большинство клиницистов считают, что в основе патогенеза печеночной недостаточности лежит выраженный гуморальный и гипериммунный ответ, следствием чего является массивный некроз печеночных клеток. Его тяжесть напрямую зависит от того, какой процент гепатоцитов утратил свои функциональные и резервные возможности, а также от продолжительности периода, в течение которого происходила их гибель [5, 7].

Выполняемая при данной патологии трансплантация печени решает основную проблему дефицита печеночной ткани и ее функции, однако в свою очередь постоянное применение иммуносупрессоров, нехватка донорских органов, различные послеоперационные осложнения не могут обеспечить на должном уровне лечение больных с ОПН, число которых с каждым годом лишь возрастает. Трансплантация эмбриональных гепатоцитов выступает как альтернатива органной трансплантации. Данная методика позволяет не только

замещать утраченные клетки печени, но в то же время благодаря синтезу факторов роста и цитокинов способствует стабилизации структуры имеющихся клеток, а также стимулируют печеночную ткань к регенерации [2].

Цель. Изучение влияния трансплантации различных видов эмбриональных гепатоцитов при лечении острой печеночной недостаточности в эксперименте.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Эксперимент выполнен на белых беспородных крысах, которые были разделены на следующие группы: а) здоровые крысы (контроль); б) 3 опытные группы: 1) крысы с моделью ОПН; 2) крысы с моделью ОПН, леченные трансплантацией эмбриональных гепатоцитов крыс; 3) крысы с моделью ОПН, леченные трансплантацией эмбриональных гепатоцитов человека. В наших опытах для лечения ОПН крыс использованы ткани культивированных фетальных гепатоцитов, полученные из печени плодов человека (самопроизвольные выкидыши) 18-22 недельного возраста и печени плодов крыс. Забор донорского материала проводился с соблюдением необходимых этических норм. Модель ОПН вызывали путем внутрибрюшинного введения раствора СС14. В опытной группе на следующие сутки после затравки производили внутрибрюшинное введение взвеси фетальных гепатоцитов, полученных из эмбрионов крыс и человека. У животных определяли в сыворотке крови биохимические показатели: мочевина, креатинин, билирубин, общий белок, глюкоза, аминотрансферазы, щелочная фосфатаза. Биохимические исследования проводили на анализаторе «У^гоб». Пробы крови проводились на 7 и 21 сутки формирования острой печеночной недостаточности во второй группе и на 7 и 21 сутки лечения эмбриональными гепатоцитами крыс и человека.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Результаты исследования выбранных нами биохимических показателей, отражающих белковосинтетиче-скую, дезинтоксикационную и регуляторную функцию пигментного обмена, представлены в таблицах 1 и 2.

Для нормального протекания важнейших метаболических процессов в гепатоцитах необходим гликолиз и белковый синтез.

Данные, полученные в ходе проведенного исследования, дают основания для утверждения, что гипогликемия у подвергнутых интоксикации СС14 крыс, проявляющаяся снижением глюкозы в крови в 1,9-1,7 раза на 7 и 21 сутки (Р1<0,001), связана с нарушением процессов гликогенолиза и глюконеогенеза в печени, а именно с ингибированием глюконеогенеза.

Аналогично этому, на 7 и 21 сутки ОПН нами еще наблюдалась гипопротеинемия (Р.^0,001), которая объясняется ингибированием белкового синтеза, учитывая, что печень является единственным местом синтеза альбумина в организме.

Одним из основных показателей активности патологического процесса в печени является цитолиз.

На 7 и 21 сутки исследования активность индикаторных ферментов в сыворотке крови животных подвергну-

тых токсическому воздействию СС14 была резко повышена: АсАТ повышалась соответственно в 5,2 и 3,5 раза (р<0,001), АлАТ - в 1,9 (Рг<0,001) и 1,3 раза (Р.=0,026) по сравнению с интактными животными. Достоверное повышение активности ЩФ при ОПН в эти сроки в 3,2 и 2,3 раза (Рг<0,001) и билирубина в 2,3 и 1,3 раза (Рг<0,001) указывало на холестаз вследствие массивного паренхиматозного некроза печени, что тем самым подтверждало адекватно воспроизведенную модель ОПН у крыс.

При этом уровень билирубина в крови превышал данные интактных животных в 1,4 раза и более, достигая в начале ОПН 6,22±0,26 мкмоль/л (Рг<0,001) и выше (при норме 2,73±0,13 мкмоль/л).

Сравнение изменений анализируемых метаболитов в разные сроки развития ОПН (7-е и 21-е сутки эксперимента), свидетельствовавшие о достоверном снижении их содержания в крови в среднем на 25,3% (по мочевине - на 14,4% (Р3=0,037), по АсАТ - на 32,6% (Р3=0,001), АлАТ - на 28,4% (Р3=0,009) по ЩФ - на 25,6% (Р3=0,049) по-видимому, можно рассматривать как проявление репаративных процессов, которые вели к восстановлению синтезирующей функции печени. Отмеченные выше изменения в организме экспериментальных животных по биохимическим параметрам

Таблица 1. Изменение биохимических показателей на 7 сутки после моделирования ОПН и лечения ЭГ крыс и человека

Показатели, ед

Исходные показатели

Группы крыс c ОПН и лечением

контрольная

1-опытная

2-опытная

4,72±0,47 P1<0,001 6,53±0,40 4,77±0,43

Глюкоза, ммоль/л 8,77±0,50 P1=0,049 P1=0,035 P1<0,001 P2=0,090

22,72±0,91 P1<0,001 26,71±1,35 23,74±0,71

Альбумин, г/л 39,81±1,21 P1<0,001 P1=0,023 P1<0,001 P^1,000

290,67±15,6 P1<0,001 233,14±13,5 257,27± 11,2

Аммиак, ммоль/л 161,19±7,22 P1<0,001 P1<0,001

P1=0,018 P21=0,167

125,78±5,70 P1<0,001 112,43±4,72 112,72±3,43

Креатинин, ммоль/л 84,10±2,33 P1<0,001 P1=0,110 P1<0,001 P21=0,717

6,22±0,26 P1<0,001 4,14±0,29 5,53±0,22

Билирубин общий, мкмоль/л 2,73±0,13 P1<0,001 P1=0,008

P2<0,001 P21<0,001

540,67±42,37 P1<0,001 378,21±42,07 446,72±41,43

АсАТ, и/л 104,46±4,88 P1<0,001 P2=0,029 P1<0,001 P21=0,059

233,61±16,04 P1<0,001 180,71±13,39 187,49±14,16

АлАТ, и/л 124,48±6,53 P1<0,001 P1<0,001

P2=0,030 P21=0,227

425,56±42,73 P1<0,001 268,86±13,47 325,38±33,12

Щелочная фосфатаза, и/л 134,98±12,43 P1<0,001 P2=0,006 P1=0,029 P21<0,001

Примечание: P1 - достоверность различий по сравнению с исходными показателями здоровых

Сравнительная оценка применения различных видов эмбриональных гепатоцитов при лечении острой печеночной недостаточности

Таблица 2. Изменение биохимических показателей на 21 сутки после моделирования ОПН и лечения ЭГ крыс и человека

Показатели, ед Исходные показатели (здоровые) Группы крыс c ОПН и лечением

контрольная

5,18±0,44 7,21±0,22 5,42±0,16

Глюкоза, ммоль/л 8,77±0,50 Р.<0,001 Р1=0,205 Р1<0,001

Р3=0,300 Р^0,001 Р1=0,151

26,47±1,04 28,39±0,93 28,12±0,75

Альбумин, г/л 39,81±1,21 Р1<0,001 Р1<0,001 Р1=0,009

Р3=0,008 Р^0,353 Р1=0,141

410,31±23,18 193,39±11,86 240,19±15,20

Аммиак, ммоль/л 161,19±7,22 Р1<0,001 Р1=0,052 Р1<0,001

Р3<0,001 Р^0,001 Р^0,001

108,81±5,77 100,74±4,16 104,31±2,82

Креатинин, мкмоль/л 84,10±2,33 Р1<0,001 Р1=0,006 Р1=0,009

Р3=0,162 Р^0,270 Р^0,806

5,50±0,45 3,49±0,19 3,54±0,28

Билирубин общий, мкмоль/л 2,73±0,13 Р1<0,001 Р1=0,003 Р1=0,663

Р3=0,107 Р^0,001 Р^0,001

364,63±31,46 262,85±27,39 268,98±30,82

АсАТ, и/л 104,46±4,88 Р1<0,001 Р1<0,001 Р1<0,001

Р^0,001 Р^0,004 Р^0,001

167,25±17,34 148,49±8,58 150,93±6,74

АлАТ, и/л 124,48±6,53 Р1=0,026 Р1=0,024 Р1=0,190

Р^0,009 Р^0,431 Р^0,227

316,81±24,85 192,74±12,39 239,45±10,24

Щелочная фосфатаза, и/л 134,98±12,43 Р1<0,001 Р1=0,003 Р1=0,149

Р^0,049 Р^0,001 Р^0,001

Примечание: P3- достоверность различий по сравнению с соответствующими данными крыс из таблицы 1 на 7 сутки исследования (Mann-Whitney Rank Sum Test Data).

указывали на обратимые нарушения функции печени и возможность ее восстановления с помощью выбранной нами терапии.

Таким образом, анализ клинических данных и биохимических анализов крови животных контрольной группы выявил достоверно значимые различия (Р.^0,05) по основным биохимическим показателям углеводного, белкового и липидного обменов в сравнении с данными интактных животных до начала эксперимента. Все выбранные нами биохимические параметры крови крыс при затравке СС14 в этой группе имели характеристику высокодостоверных (Рг<0,001) изменений, за исключением показателя АлАТ, изменение которого носило среднедостоверный характер (Рг= 0,026), но оставаясь все-таки менее уровня Р1<0,05, что говорит об адекватно воспроизведенной нами модели ОПН у экспериментальных животных с помощью СС14.

В следующей части экспериментов ставилась задача сравнительного изучения (по данным биохимических анализов крови) разных схем лечения ОПН с помощью эмбриональных гепатоцитов крыс и человека. В целом, подавляющее большинство биохимических параметров крови в опытных группах имели тенденцию к стойкой нормализации (р<0,05).

На 7 сутки в группе ОПН отмечается значимое снижение уровня глюкозы крови (4,72±0,47). В опытной группе с лечением эмбриональными гепатоцитами лучший эффект прослеживается при использовании фетальных клеток крыс (6,53±0,40), нежели человека (4,77±0,43). Та же закономерность прослежена на 21 сутки эксперимента: 7,21±0,22 у крыс и 5,42±0,16 у человека.

Белковосинтетическая функция печени подавляется при токсическом воздействии четыреххлористого углерода. В группах с лечением отмечается постепенная тенденция к восстановлению данного показателя. Однако на 7 сутки эксперимента к группе лечения эмбриональными гепатоцитами человека существенной разницы не прослежено: 22,72±0,91 в группе ОПН против 23,74±0,71 в группе эмбриональных гепатоцитов человека. Что же касается группы с эмбриональными гепатоцитами крыс изменения более существенны: 22,72±0,91 в группе ОПН против 26,71±1,35 в группе эмбриональных гепатоцитов крыс. На 21 сутки эксперимента показатели альбумина в обеих группах лечения практически сопоставимы друг с другом: 28,39±0,93 в группе эмбриональных гепатоцитов крыс и 28,12±0,75 в группе эмбриональных гепато-цитов человека.

Эффект от применения эмбриональных гепатоцитов можно также проследить на показателях цитолитиче-ского синдрома. Повышенный уровень креатинина на 7 сутки ОПН (125,78±5,70) в группе лечения также имеет тенденцию к снижению, хотя и не доходит до уровня нормальных значений в контрольной группе как на 7 сутки (112,43±4,72 у крыс и 112,72±3,43 у человека), так и на 21 сутки эксперимента (100,74±4,16 у крыс и 104,31±2,82 у человека). На 7 сутки после введения эмбриональных гепатоцитов крыс, уровень билирубина крови снизился в среднем до 4,14±0,29, а для эмбриональных гепато-цитов человека данный показатель составил в среднем 5,53±0,22. На 21 сутки после введения эмбриональных гепатоцитов крыс, уровень билирубина крови снизился в среднем до 3,49±0,19, а для эмбриональных гепато-цитов человека данный показатель составил в среднем 3,54±0,28. Соответственно в поздних сроках от времени введения эмбриональных гепатоцитов динамика билирубина не существенно отличается от вида введенных клеток.

Подобная закономерность прослежена также по динамике аминотрансфераз и щелочной фосфатазы при развитии ОПН, а также на фоне лечения эмбриональными гепатоцитами крыс и человека.

ВЫВОДЫ:

1. Анализ сывороток крови животных опытных групп выявил достоверно значимые различия по основным биохимическим показателям в сравнении с данными контрольных групп (р<0,05).

2. У животных с ОПН токсического генеза (СС14) использование эмбриональных гепатоцитов крыс и человека сопровождается положительной динамикой био-

химических показателей, способствует уменьшению проявлений печеночной недостаточности.

3. Терапия острой печеночной недостаточности эмбриональными гепатоцитами крыс была более эффективной, нежели использование эмбриональных гепато-цитов человека.

ЛИТЕРАТУРА

1. Исраилова В. К., Айткожин Г. К. Современные представления о печеночной недостаточности и методы ее лечения // Вестн. КАЗМНУ. - 2012. - № 1. - С. 36-44.

2. Онищенко Г. Г. Ситуация и меры борьбы с вирусными гепатитами в Российской Федерации // Мед. каф. - 2002. - № 2. - C. 18-22.

3. Пасечник И. Н., Кутепов Д. Е. Печеночная недостаточность: современные методы лечения. - М.: Медицина, 2009. - 240 с.

4. Aithal G. P., Watkins P. B., Andrade R. J. Case definition and phenotype standardization in drug-induced liver injury // Clin. pharm. and therap. - 2011. - Vol. 89. - P. 806-815.

5. Bantel H., Schulze-Osthoff K. Mechanisms of cell death in acute liver failure // Front. Physiol. - 2012. - Vol. 79. - P. 56-64.

6. Karkhanis J., Lee W. M., Brown R. S. Steroid use in drug induced and cryptogenic causes of acute liver failure // AASLD. - 2008. - Vol. 48. - № 4. - Р. 446-447.

7. Kora S. A., Doddamani G. B., Doddamani U. Subacute Hepatic Faiilure // J. of Clin. and Diagn. Res.. - 2011. -Vol. 5. - № 1. - P. 134-137.

8. Pathikonda M., Munoz S. Acute Liver Failure // Ann. of Hepatol. - 2010. - Vol. 9. - № 1. - P. 7-14.

УТКИР ЖИГАР ЕТИШМОВЧИЛИГИНИ ДАВОЛАШДА ЭМБРИОНАЛ ГЕПАТОЦИТЛАРНИНГ Х.АР ХИЛ ТУРЛАРИНИ К^ЛЛАШНИ КИЁСИЙ БАХ.ОЛАШ М.Д. Уразметова, Ф.А. Хаджибаев, А.Г. Мирзакулов Республика шошилинч тиббий ёрдам илмий маркази

СС14 эритмаси корин бушлирига юборилгандан кейин уткир жигар етишмовчилиги ривожланадиган эксперимен-тал моделида биокимёвий курсаткичларнинг динамикаси урганилган. Кейинчалик каламуш ва одам гепатоцитларнинг трансплантацияси бажарилган. Каламуш ва одам гепатоцитларнинг трансплантацияси натижасида асосий биокимёвий курсаткичларнинг динамикаси курсатилган. Ушбу маълумотларнинг так;к;ослаб чик;к;анда уткир жигар етишмовчи-лигини даволашда ижобий динамика купрок каламуш гепатоцитларнинг трансплантациясида кузатилган.

Калит сузлар: уткир жигар етишмовчилиги, гепатоцитлар, трансплантация, жигар, биохимик курсаткичлар.

Контакт:

Мирзакулов А.Г., МНС отдела экстренной хирургии, e-mail: akmalka84@mail.ru Тел.: +99894-6398024