Влияние комплекса иммуноактивных пептидов (тинростима) на систему гемостаза

Вестник ДВО РАН. 2009. № 3

УДК 612.017.1:547.964.4:577.15

Т А.КУЗНЕЦОВА, Н.Н.БЕСЕДНОВА, Л.М.ЭПШТЕЙН

Влияние комплекса иммуноактивных пептидов (тинростима) на систему гемостаза

Исследовано влияние тинростима на систему гемостаза. Установлено, что препарат в рабочих концентрациях in vitro не оказывает прямого влияния на факторы свертывания крови и систему фибринолиза, при многократном парентеральном введении in vivo вызывает гипокоагуляционные сдвиги и активирует систему фибринолиза. Профилактическое введение тинростима способствует снижению степени нарушений при экспериментальной ЛПС-индуцированной эндотоксинемии путем купирования явлений гиперкоагуляции.

Ключевые слова: пептиды, иммуномодуляторы, гемостаз, эндотоксин, липополисахарид.

Effect of immunoactive peptide complex (tinrostim) on the system of hemostasis. T.A.KUZNETSOVA, N.N.BESEDNOVA (Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Siberian Branch of Russian Academy of Medical Science, Vladivostok), L.M.EPSHTEIN (Pacific Research Fishery Economic Center).

Influence of immunoactive peptide complex from squid nerve tissue — tinrostim — on the system of hemostasis in vitro and in vivo has been investigated. It has been established that tinrostim in effective concentrations has no direct action on factors of the system of coagulation and system of fibrinolysis. Hypocoagulation changes and activation of the system of fibrinolysis were observed at parenteral (in vivo) inoculation of tinrostim to mice. Prophylactic parenteral inoculation of tinrostim to mice with experimental LPS-induced endotoxinemia facilitates the decrease of intensity of hypercoagulation and reduction of symptoms of disseminated intravascular coagulation syndrome.

Key words: peptides, immunomodulators, hemostasis, endotoxin, lipopolysaccharide

Механизмам иммуномодулирующего действия пептидов природного происхождения посвящено большое количество работ, в то же время их влияние на систему гемостаза изучено еще недостаточно. Установлено, что иммуномодуляторы пептидной природы из группы цитомединов - тималин и гепалин - непосредственно влияют на факторы свертывания крови и систему фибринолиза путем регуляции гомеостатических процессов с участием иммунной, нервной и эндокринной систем макроорганизма [4, 6-9, 11, 15]. Что касается тинростима - иммуномодулятора, проявляющего высокую эффективность в комплексном лечении иммунодефицитных состояний и ряда других заболеваний [3, 5], то его действие на систему гемостаза до настоящего времени не исследовано.

Тинростим - комплекс пептидов, выделенных из оптических ганглиев кальмара (84% низкомолекулярных пептидов с м.м. от 1 до 12,5 кДа и 16% свободных аминокислот, в основном аспарагиновой, глутаминовой и лизина; около 10% от общего количества аминокислот составляет таурин). Способ выделения тинростима - экстракция водорастворимых пептидов в слабокислых растворах с последующим их извлечением путем ступенчатой ультрафильтрации, позволяющей разделять и концентрировать пептидные компоненты в зависимости от их молекулярной массы [10]. Используется в качестве сырья для производства биологически активных добавок «Тинростим-СТ» и продуктов с заданными

КУЗНЕЦОВА Татьяна Алексеевна - кандидат медицинских наук, ведущий научный сотрудник, БЕСЕДНОВА Наталия Николаевна - академик РАМН, директор (НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН, Владивосток), ЭПШТЕЙН Леонид Менделевич - доктор биологических наук, главный научный сотрудник (ТИНРО-Центр, Владивосток), Владивосток. E-mail: niiem_vl@mail.ru

иммуномодулирующими свойствами (в соответствии с гигиеническим сертификатом № 1П-11/287 от 24 марта 1995 г., регистрационными удостоверениями № 0007000. Р.643.05.99 и № 77.99.04.928.Б.000663.08.03).

Цель работы - исследование влияния тинростима на систему гемостаза, в том числе возможности его применения для коррекции нарушений гемостаза при экспериментальной эндотоксинемии.

Гемостаз - биологическая система, обеспечивающая, с одной стороны, сохранение жидкого состояния циркулирующей крови, а с другой - предупреждение и купирование кровотечений. Первое осуществляется сосудисто-тромбоцитарным и коагуляционным гемостазом, отвечающим за свертывание крови, второе - противосвертывающими механизмами, к которым относится фибринолиз, или плазминовая система.

Показатели гемостаза in vivo изучали на мышах линии BALB/с. Смесь образцов плазмы крови получали от группы из 10-15 животных, эксперименты повторяли пятикратно. Для оценки влияния тинростима на систему гемостаза in vitro использовали пулированную плазму здоровых доноров. Тинростим вносили в плазму в концентрации от 1 до 1000 мкг/ мл плазмы в соотношении 1:10 и инкубировали 10 мин при комнатной температуре. Исследование проводили в сравнении с гепарином, который вносили в концентрации 1,0 Ед/мл плазмы (что соответствует 7,2 мкг/мл). Изучали показатели коагулограммы, относящиеся к базовым при оценке гемостаза, с применением наборов «Технология-Стандарт» (Барнаул) в соответствии с инструкцией [2]: активированное парциальное тромбопластиновое время (АПТВ) и протромбиновое время (ПВ) - для оценки внутреннего и внешнего механизмов свертывания соответственно, тромбиновое время (ТВ) - для оценки конечного этапа свертывания (превращение фибриногена в фибрин под влиянием тромбина); также определяли фибринолитическую активность (ФА) и уровень плазминогена. Измерения проводили на коагулометре CD-4 фирмы «DiaMed» (Швейцария) и фотометре RA-50 «Bayer Diagnostics» (Германия).

Эндотоксинемию воспроизводили путем внутрибрюшинного введения мышам линии ВАLB/c массой 20-25 г ЛПС (эндотоксина) в дозе LD100 (6,25 мг/кг ± 0,5), полученного в лаборатории химии углеводов ТИБОХ ДВО РАН из штамма Yersinia pseudotuberculosis № 598 IB-сероварианта методом O.Westphal, K.Jann [17].

Мышей содержали на стандартной диете в боксах с соблюдением правил и рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных работах [16]. Выведение животных из опыта осуществляли с использованием эфирного наркоза.

Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью пакета программы «Геостат» [13], «Биостат» (версия 4.03). Проверку нормальности распределения количественных признаков при малом числе наблюдений осуществляли с использованием W-критерия Шапиро-Уилка на основе регрессии порядковых статистик. Оценка значимости различий при нормальном распределении проводилась с использованием t-критерия Стьюдента (для независимых выборок), при ненормальном распределении количественных признаков использовали непараметрический Q-критерий Данна (для сравнения показателей с контрольной группой). Определялись также выборочные параметры: средняя арифметическая (М), средняя ошибка средней арифметической (m), медиана (Ме), объем анализируемой подгруппы (n), достигнутый уровень значимости (р). Критическое значение уровня значимости принималось равным 5% (р < 0,05).

В опытах in vitro при внесении в плазму тинростима в концентрациях 0,01-100 мкг/мл статистически значимых изменений не выявлено, внесение высоких концентраций приводило к удлинению временных показателей свертывания (табл. 1).

При исследовании показателей гемостаза in vivo тинростим вводили мышам линии BАLB/c внутрибрюшинно в дозе 0,005 мг/кг (0,1 мкг/мышь) 1- и 10-кратно. Через 15 мин после 1-кратного введения препарата изменений в системе гемостаза не выявлено, при

10-кратном введении время свертывания в АПТВ-, ПВ- и ТВ-тестах возрастало по отношению к контролю в 1,5; 1,2 и 1,6 раза соответственно (р < 0,05) (табл. 2).

Таким образом, тинростим в больших концентрациях проявляет противосвертываю-щую активность in vitro и вызывает гипокоагуляционные сдвиги при многократном парентеральном введении экспериментальным животным.

Таблица 1

Влияние тинростима на показатели свертывания крови и уровень плазминогена в плазме крови доноров in vitro

Концентрация препарата, мкг/мл Время свертывания плазмы крови, с Концентрация плазминогена, %

АПТВ ТВ ПВ

500 39,0 ± 0,05; р < 0,05 18,5 ± 0,6; р< 0,05 16,0 ± 0,4; р< 0,05 72,0 ± 4,4; р < 0,05

100 38,5 ± 0,3; р > 0,05 17,0 ± 0,8; р > 0,05 15,0 ±0,3; р > 0,05 90,0 ± 3,3; p > 0,05

10 35,5 ± 0,4; р > 0,05 15,5 ± 0,4; р > 0,05 15,0 ± 0,3; р > 0,05 90,0 ± 4,6; p > 0,05

1,0 35,0 ± 0,3; р > 0,05 16,5 ± 0,5; р > 0,05 14,0 ± 0,5; р > 0,05 96,0 ± 3,8; p > 0,05

0,1 35,5 ± 0,3; р > 0,05 15,0 ± 0,3; р > 0,05 12,5 ± 0,5; р > 0,05 93,0 ± 4,8; р > 0,05

0,01 34,5 ± 0,4; р > 0,05 14,5 ± 0,5; р > 0,05 13,0 ± 0,5; р > 0,05 -

Гепарин 735 ± 41; р < 0,05 405 ± 30; р < 0,05 393 ± 28; р < 0,05 -

Контроль 35,0±0,3 14,5 ± 0,5 13,5 ± 0,5 92,0 ± 3,5

Примечание. Здесь и в табл. 2: АПТВ - активированное парциальное тромбопластиновое время, ПВ - протром-биновое время, ТВ - тромбиновое время, уровень плазминогена. В скобках - индекс стимуляции, рассчитан как отношение показателей в опыте и контроле. Использован непараметрический Q-критерий Данна. Прочерк - исследование не проводилось.

Таблица 2

Влияние тинростима на показатели гемостаза у мышей in vivo

Показатель гемостаза Группа животных

Контрольная Тинростим 1-кр. ИС Тинростим 10-кр ИС

АПТВ, с 45,0 ± 1,2 48,0 ± 1,0 1,07 69,0 ± 3,3 1,5

p > 0,05 p < 0,05

ПВ, с 17,0 ± 0,7 17,0 ± 0,8 1,00 21,0 ± 0,8 1,2

p > 0,05 p < 0,05

ТВ, с 19,0 ± 0,8 20,0 ± 0,9 1,05 30,0 ± 1,2 1,6

p > 0,05 p < 0,05

ФА, мин 270,0 ± 17,9 270 ± 11 1,0 240 ± 8,9 0,9

p > 0,05 p < 0,05

ФГ, г/л 4,1 ± 0,2 4,0 ± 0,2 1,0 3,8 ± 0,1 0,9

p > 0,05 p > 0,05

Уровень плазминогена, % 75,0 ± 3,4 91,3 ± 2,6 1,2 112,0 ± 4,8 1,5

p > 0,05 р < 0,05

Примечание. ТВ - тромбиновое время, ФА - фибринолитическая активность, ФГ - уровень фибриногена; ИС - индекс стимуляции.

Влияние тинростима на систему фибринолиза исследовали в тестах in vitro и in vivo по уровню плазминогена1 и показателям ФА. Установлено, что внесение тинростима в концентрациях от 1 до 100 мкг/мл не оказывало существенного влияния на уровень основного компонента фибринолитической системы - плазминогена, при концентрации 250 мкг/мл уровень плазминогена снижался до 82,0 ± 4,6% по сравнению с 92,0 ± 3,5% в контроле (р > 0,05), при вдвое большей концентрации количество плазминогена снижалось незначительно - в 1,3 раза (р < 0,05) (см. табл. 1).

Парентеральное однократное введение тинростима мышам не приводило к статистически значимому по сравнению с контролем изменению времени лизиса сгустка и кон -центрации плазминогена в сыворотке крови. При многократном введении тинростима показатели активности фибринолитической системы были выражены в большей степени: наблюдалось снижение времени лизиса сгустка с 270 ± 19 мин в контрольной группе до 240 ± 8,9 мин в опытной (р < 0,05) и возрастание концентрации плазминогена с 75,0 ± 3,4% в контрольной до 112,0 ± 4,8% в опытной (р < 0,05) (см. табл. 2).

Возможность применения тинростима для коррекции нарушений гемостаза исследовали на модели эндотоксинемии, индуцированной липополисахаридом (ЛПС) псевдотуберкулезного микроба.

Мыши, получившие ЛПС в дозе LD100, составили первую группу. Животные опытных групп получали тинростим по лечебной схеме путем 3-кратного введения в дозе 0,005 мг/кг (0,1 мкг/мышь) подкожно одновременно с введением ЛПС и через 1 и 2 ч после его введения (группа 2а), а также по профилактической - ежедневное в течение 10 дней парентеральное введение до инъекции ЛПС (группа 2в). Третья группа - контрольная (животные, которым вводили 0,85%-ный раствор NaCl).

Через 4 ч после введения ЛПС у мышей начала развиваться гиперкоагуляция, выразившаяся в сокращении по сравнению с контролем (исходные показатели) времени свертывания крови в АПТВ- и ТВ-тестах, также снизилась ФА крови, о чем свидетельствует удлинение по сравнению с контролем времени спонтанного лизиса сгустка. Эти признаки характерны для начальной стадии ДВС-синдрома (диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови) - обязательного патогенетического компонента эндотоксинового шока.

С учетом этого мы исследовали изменения показателей гемостаза под влиянием тин-ростима именно на данном отрезке времени. При введении тинростима по лечебной схеме животным с экспериментальной эндотоксинемией статистически значимых изменений исследованных показателей системы гемостаза не выявлено. Профилактическое введение тинростима способствовало восстановлению показателей АПТВ-, ПВ- и ТВ-тестов (р = 0,01; 0,05; 0,05 соответственно). Кроме того, наблюдалось восстановление значений ФА (390 ± 17,4 мин в опыте по сравнению с 533 ± 28 мин при введении ЛПС, р = 0,01). Отмеченные показатели под влиянием тинростима приближались к уровню контроля (3-я группа, см. рисунок).

Таким образом, профилактическое 10-кратное введение тинростима способствует снижению интенсивности гиперкоагуляционных изменений при экспериментальной эндо-токсинемии (купированию явлений гиперкоагуляции), что выражалось в восстановлении ряда показателей коагулограммы.

Результаты исследования позволяют заключить, что тинростим в диапазоне концентраций 0,01-100 мкг/мл in vitro не обладает антикоагулянтной активностью, т.е. не оказывает прямого влияния на факторы свертывания крови и систему фибринолиза. В больших концентрациях (500-1000 мкг/мл) препарат может непосредственно воздействовать на плазму крови, сгусток нитей фибрина и процессы фибринолиза. Этот эффект может

1 Плазминоген - профермент, который под действием активаторов плазминогена превращается в плазмин - се-риновую протеиназу, расщепляющую специфические связи в различных белковых субстратах, главным образом в фибрине и фибриногене. Полученные нами данные свидетельствуют об активации системы фибринолиза и повышении плазминового потенциала при многократном парентеральном введении тинростима.

О -I------------------------------------------------------------------------------------------1-----------------------------------------------------------------------------------1------------------------------------------------------------------------------------1- о

1 2 3

АПТВ 1=1 ТВ —ФА

Влияние тинростима на показатели системы гемостаза через 4 ч после ЛПС-индуцированной эндотоксинемии. Слева - показатели АПТВ- и ТВ-тестов (с), справа - показатели ФА (ч). 1 - группа животных, получивших ЛПС; 2 - группа животных, получивших тинростим по профилактической схеме и ЛПС; 3 - контрольная группа. Использован параметрический 1-критерий Стьюдента для независимых выборок; п = 5. р - статистическая значимость различий по отношению к 1-й группе

быть связан с его способностью ингибировать активность сериновых протеаз, каковыми являются факторы свертывания крови и ферменты плазминовой (фибринолитической) системы.

При однократном парентеральном введении тинростима экспериментальным животным показатели свертывания плазмы крови не изменялись, тогда как при многократном введении время свертывания крови в базовых коагуляционных тестах удлинялось, а также происходила активация системы фибринолиза, связанная с повышением потенциальной активности плазминовой системы. Проявление тинростимом антикоагулянтной активности при многократном парентеральном введении в макроорганизм свидетельствует о том, что, по-видимому, его действие на систему гемостаза намного сложнее, чем у антикоагулянтов прямого действия, и реализуется с участием нейроэндокринной и иммунной систем. Влияние последней осуществляется посредством регулирующего влияния на факторы гуморального и клеточного иммунитета. Как показано в работах [3, 5], тинростим оказывает влияние на функциональную активность лейкоцитов, макрофагов, продукцию про- и противовоспалительных цитокинов. Активация иммунокомпетентных клеток тинрости-мом сопровождается изменением активности лизосомальных и мембранных ферментов, усилением энергетического и окислительного метаболизма, синтетических и секреторных процессов. Поскольку факторы свертывания крови, по своей природе являющиеся белками и гликопротеидами, синтезируются гепатоцитами (в печени), а также лейкоцитами, макрофагами, клетками эндотелия [12], можно предполагать, что тинростим способен влиять на процессы синтеза, а также на активность факторов свертывания крови и других сериновых протеаз. Исследование механизмов влияния тинростима на систему гемостаза требует дальнейшего изучения.

Известно, что иммуномодуляторы пептидной природы из класса цитомединов (тима-лин, бурсилин, эпиталамин, вилон и другие) успешно применяются для коррекции нарушений иммунитета и гемостаза как при моделировании ряда патологических процессов в экспериментальных условиях, так и в клинической практике в комплексном лечении воспалительных и гнойно-септических состояний [1, 6, 7, 9].

Полученные нами результаты опытов по применению тинростима при экспериментальной эндотоксинемии открывают аналогичные перспективы. В частности, профилактическое

(многократное) введение тинростима животным на фоне экспериментальной эндотокси-немии оказывает выраженный корригирующий эффект на показатели системы гемостаза, проявляющийся в замедлении процессов гиперкоагуляции и повышении фибринолити-ческой активности крови. Таким образом, тинростим способен предотвращать развитие ДВС-синдрома или ослаблять его течение в условиях экспериментальной эндотоксинемии.

ЛИТЕРАТУРА

1. Абдулаев Р.А., Абдуллаев Х.Р., Витковский Ю.А. и др. Влияние тималина, эпиталамина и вилона на иммунитет и гемостаз у больных с перитонитом и парапроктитом // Int. J. Immunoreh. 2001. Vol. 3, N 1. С. 100.

2. Баркаган З.С., Момот А.П. Диагностика и контролируемая терапия нарушений гемостаза. М.: Ньюдиамед, 2001. 296 с.

3. Беседнова Н.Н., Эпштейн Л.М. Иммуноактивные пептиды из гидробионтов и наземных животных. Владивосток: ТИНРО-Центр, 2004. 248 с.

4. Витковский Ю.А. Влияние полипептидов печени на иммунитет, гемостаз и неспецифическую резистентность организма в эксперименте: автореф. дис. ... канд. мед. наук. М., 1990. 16 с.

5. Запорожец Т.С. Клеточные и молекулярные механизмы иммуномодулирующего действия биополимеров морских гидробионтов: дис. ... д-ра мед. наук. Владивосток, 2006. 350 с.

6. Кузник Б. И., Патеюк А.В., Баранчугова Л.М. и др. Влияние пептидов LYS-GLU-ASP-ALA и ALA-GLU-ASP-GLU на иммунитет, гемостаз и морфологическую структуру тимуса и бурсы цыплят, гипофизэктомированных в критический и некритический сроки жизни // Иммунология. 2007. № 2. С. 79-85.

7. Кузник В.И., Витковский Ю.А., Сазоненко В.А. и др. Влияние тималина на иммунитет, гемостаз и уровень провоспалительных и противовоспалительных цитокинов при ожоговой болезни // Гематология и трансфузиология. 2002. Т. 47, № 1. С. 17-21.

8. Кузник Б.И., Патеюк А.В., Джулай М.А. и др. Пептидные механизмы регуляции иммунитета и гемостаза // Аллергол. и иммунол. 2005. Т. 6, № 2. С. 160-161.

9. Кузник Б.И., Морозов В. Г., Хавинсон В.Х. Цитомедины: 25-летний опыт экспериментальных и клинических исследований. СПб.: Наука, 1998. 310 с.

10. Пат. 2222337 РФ. МКИ С1 7 А61К35/30, А61К35/60, А23L1/333. Способ получения иммуностимулятора / Л.М.Эпштейн, ГА.Боровская, Н.Н.Ковалев и др.; заявитель и патентообладатель Тихоокеанский рыбохозяйственный научный центр (ТИНРО-Центр). № 2002117863/13; заяв. 2004.07.03; опубл. 2004.01.27, Бюл. № 3. 3 с.: ил.

11. Патеюк А.В. Роль пептидных факторов гипофиза, тимуса и сумки Фабрициуса в регуляции иммунитета и гемостаза: автореф. дис. ... д-ра мед. наук. Чита, 2004. 43 с.

12. Покровский В.М., Коротько ГФ. Физиология человека. Изд. 2-е., перераб.и доп. М.: Медицина, 2003. 656 с.

13. Смолин В.А. Математическое моделирование в геологии и геофизике (статистика). Владивосток, 2007. 230 с.

14. Цепелев В.Л. Механизмы действия регуляторных пептидов при иммунодефицитных состояниях и воспалении: автореф. дис. ... д-ра мед. наук. Чита, 2003. 41 с.

15. Чиркунов А. В. Влияние тималина, тимогена и вилона на некоторые показатели иммунитета и гемостаза: дис. ... канд. мед. наук. Чита, 2000. 141 с.

16. European Convention for the Protection of Vertebrate Animals used for Experimental and Other Scientific Purposes Strasbourg, 18.III.1986.-URL. - http://conventions.coe.int/Treaty/Rus/Treaties/Html/123

17. Westphal O., Jann K. Bacterial lipopolysaccharides. Extraction with phenol-water and further applications of the procedures // Methods in carbohydrate chemistry / ed. by B.L.Whistler. N.Y.: Acad. Press, 1965. Vol. 5. Р 83-91.