СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РИСКА РАЗВИТИЯ ХРОНИЧЕСКОЙ ПЛАЦЕНТАРНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ С СИНДРОМОМ ЗАДЕРЖКИ РОСТА ПЛОДА 2-3-ЕЙ СТЕПЕНИ У БЕРЕМЕННЫХ
METHOD FOR PREDICTION OF RISK OF DEGREE 2-3 CHRONIC PLACENTAL INSUFFICIENCY WITH FOETAL GROWTH DELAY SYNDROME IN PREGNANT WOMEN

Изобретение относится к области медицинской диагностики, может быть использовано для прогнозирования риска развития хронической плацентарной недостаточности с синдромом задержки роста плода 2-3-ей степени у беременных.
Плацентарная недостаточность (ПН) это синдром, обусловленный морфофункциональными изменениями в плаценте, при прогрессировании которых развивается синдром задержки роста плода (СЗРП) [Айламазян, Э.К. Акушерство: учебник для мед. вузов / Э.К. Айламазян. - 4-е изд., доп.- Санкт-Петербург: СпецЛит, 2003. - 529 с]. СЗРП определяется как отставание размеров плода от предполагаемых при данном сроке беременности или как масса плода при рождении ниже десятого процентиля для данного гестационного срока. Перинатальная смертность у женщин, перенесших плацентарную недостаточность, составляет среди доношенных новорожденных 10,3%, среди недоношенных - 49%. СЗРП занимает третье место в структуре причин перинатальной заболеваемости, в дальнейшем у детей с СЗРП отмечается отставание в физическом развитии (60%), его дисгармоничность (80%), задержка темпов психомоторного развития (42%) [Серов, В.Н. Критические состояния в акушерстве [Текст]: руководство для врачей / В.Н. Серов, С.А. Маркин. - Москва: Медиздат, 2003. - 704 с; Рыбкина, Н.Л. Недоношенные дети: фетоинфантильные потери, заболеваемость, гормональные особенности периода адаптации [Текст]: автореф. дис.(канд. мед. наук: 14.00.33 / Н.Л. Рыбкина; Казан, гос.мед. ун-т.- Казань, 2000. - 24 с].
Плацентарная недостаточность имеет мультифакториальную природу. Как свидетельствуют результаты ряда исследований, одним из факторов, приводящих к развитию плацентарной недостаточности и СЗРП, является врожденная тромбофилия. Под тромбофилией понимают патологическое состояние организма, характеризующееся повышенной склонностью к внутрисосудистому тромбообразованию вследствие наследственного или приобретенного нарушения системы гемостаза [Макацария, А.Д. Тромбозы и тромбоэмболии в акушерско-гинекологической клинике [Текст]: молекулярно-генетич. механизмы и стратегия профилактики тромбоэмболических осложнений: руководство для врачей / А.Д. Макацария, В.О. Бицадзе, С. В. Акиньшина. - Москва: Мед. информ. агентство, 2007. - 1064 с].
Фактор коагуляции VII (проконвертин) является одним из ключевых факторов в каскаде свертывания крови. Он относится к гликопротеинам, синтезируется в печени при участии витамина К. Молекулярная масса - 63000 кДа. Содержание в плазме крови 80-120% активности [Окороков А.Н., 2003]. Фактор VII участвует во внешнем пути активации свертывания крови. Этот путь включает тканевой фактор (TF), фактор VII и ионы Ca. Ген VII фактора расположен на длинном плече 13-й хромосомы (13q34). Обнаружено 5 вариантов полиморфизма гена фактора VII, которые обуславливают колебания его уровня в пределах 30%. Полиморфизм заключается в замене аргинина на глутамин в позиции 353 белковой цепи Arg353Gln (R353Q). Замена обусловлена точечной мутацией в позиции 10976 одного азотистого основания гуанина (G) на другое азотистое основание аденин (А), поэтому тот же самый полиморфизм может обозначаться как 10976G/A. Наличие гетерозиготного варианта 10976GA FVII приводит к снижению концентрации фактора VII в крови примерно на 25%, а наличие гомозиготного варианта 10976АА FVII - к снижению концентрации фактора примерно на 50% по сравнению с носителями варианта 10976GG FVII. Тип наследования - аутосомно-рецессивный. Распространенность в европейской популяции составляет 10-20%). [Макацария, А.Д. Тромбозы и тромбоэмболии в акушерско-гинекологической клинике [Текст]: молекулярно-генетич. механизмы и стратегия профилактики тромбоэмболических осложнений: руководство для врачей / А.Д. Макацария, В.О. Бицадзе, С.В. Акиньшина. - Москва: Мед. информ. агентство, 2007. - 1064 с; Окороков, А.Н. Диагностика болезней внутренних органов [Текст]: руководство для врачей: в 10 т./ А.Н. Окороков. - Москва: Мед. лит., 2001-2005. - Т.5: Диагностика болезней системы крови. Диагностика болезней почек. - Москва, 2003. - 512 с.: ил.].
Фактор V (проакцелерин) является предшественником активного фактора акцелерина. Относится к гликопротеинам глобулиновой фракции крови. Синтезируется в печени и мегакариоцитах. Молекулярная масса - 330000 дальтон. Содержание в плазме крови - 0,007-0,01 г/л или 70-150% активности. Минимальный уровень, необходимый для гемостаза - 10-25%. Ген фактора V располагается в хромосоме 1q21-25, состоит из 6672 пар оснований, включая нетранслируемый 3′-регион из 163 пар оснований и нетранслируемый 5′-регион из 97 или 103 пар оснований в зависимости от того, какой из двух транскрипционных инициирующих сайтов используется. Фактор V свертывания крови входит в состав протромбиназного комплекса, который возникает при активации свертывания крови по внешнему или внутреннему пути и состоит из активированного фактора X (фактор Xa), активированного фактора V (фактор Va) и ионов кальция, связанных с фосфолипидными (ФЛ) мембранами (как правило, это мембраны тромбоцитов). Функция протромбиназного комплекса заключается в отщеплении от молекулы протромбина пептидных фрагментов, превращающим протромбин в тромбин (фермент, осуществляющий полимеризацию фибрина из фибриногена). Фибрин является конечным продуктом свертывания крови. Ферментом, расщепляющим протромбин в протромбиназном комплексе, является фактор Xa, однако без участия фактора V эта реакция протекает очень медленно. Активированный фактор V, соединяясь с Xa на фосфолипидной поверхности, ускоряет реакцию образования тромбина в десятки тысяч раз. Самой частой причиной резистентности к активированному протеину C является лейденская мутация, когда активированный фактор V становится устойчивым к расщеплению активированным протеином C. Лейденская мутация V фактора свертывания крови характеризуется заменой нуклеотида гуанина (G) на нуклеотид аденин (А) в позиции 1691 (1691 G/A F V). Это приводит к замене аминокислоты аргинина на аминокислоту глутамин в позиции 506 в белковой цепи, являющейся продуктом этого. Мутация наследуется по аутосомно-доминантному принципу. Гетерозиготными носителями является в среднем 4-7% европейского населения. Повышенная склонность к тромбозам проявляется в состоянии гетерозиготности. Случаи гомозиготного носительства лейденской мутации в популяции встречаются крайне редко [Макацария, А.Д. Тромбозы и тромбоэмболии в акушерско-гинекологической клинике [Текст]: молекулярно-генетич. механизмы и стратегия профилактики тромбоэмболических осложнений: руководство для врачей / А.Д. Макацария, В.О. Бицадзе, С.В. Акиньшина. - Москва: Мед. информ. агентство, 2007. - 1064 с; Окороков, А.Н. Диагностика болезней внутренних органов [Текст]: руководство для врачей: в 10 т./ А.Н. Окороков. - Москва: Мед. лит., 2001-2005. - Т.5: Диагностика болезней системы крови. Диагностика болезней почек. - Москва, 2003. - 512 с.: ил.].
Фактор II (протромбин) является гликопротеином, относящимся к α2-глобулинам с молекулярной массой 68000-72000 дальтон. Синтезируется в печени при участии витамина К. Содержание в плазме крови составляет около 0,1 г/л или 80-120% активности. Минимальный уровень, необходимый для гемостаза, - 20-40%. Ген протромбина располагается в одиннадцатой хромосоме и содержит 14 экзонов и 13 интронов. Под действием фактора Xa в составе протромбиназного комплекса происходит расщепление протромбина с образованием тромбина. Одной из наиболее частых причин врожденных тромбофилий является мутация гена протромбина 20210 G/A. Она характеризуется заменой нуклеотида гуанина (G) на нуклеотид аденин (А) в позиции 20210. Особенностью данной мутации является то, что замена нуклеотида происходит в 3′-нетранслируемом участке, располагающемся в конце ДНК-последовательности гена, который не транслируется. Это означает, что нуклеотидная последовательность измененного участка не участвует в кодировании аминокислотной последовательности гена протромбина. Поэтому никаких химических изменений самого протромбина при наличии данной мутации не возникает. Однако при наличии данной мутации обнаруживаются повышенные количества химически нормального протромбина. Уровень протромбина может быть в полтора-два раза выше, чем в норме. Мутация гена протромбина 20210 G/A наследуется по аутосомно-доминантному типу. Гетерозиготными носителями являются 2-3% представителей европейской расы. Среди наследственных тромбофилий данная мутация составляет 10-15%. Тромбофилия возникает даже у гетерозиготного носителя измененного гена. Гомозиготный вариант мутации является очень редкой находкой. Данная мутация является фактором риска всех осложнений, связанных с лейденской мутацией, таких как невынашивание беременности, плацентарная недостаточность, внутриутробная гибель плода, гестозы, отслойка плаценты. Риск тромбозов возрастает в десятки раз во время беременности [Макацария, А.Д. Тромбозы и тромбоэмболии в акушерско-гинекологической клинике [Текст: молекулярно-генетич. механизмы и стратегия профилактики тромбоэмболических осложнений: руководство для врачей / А.Д. Макацария, В.О. Бицадзе, С.В. Акиньшина. - Москва: Мед. информ. агентство, 2007. - 1064 с; Окороков, А.Н. Диагностика болезней внутренних органов [Текст]: руководство для врачей: в 10 т./ А.Н. Окороков. - Москва: Мед. лит., 2001-2005. - Т.5: Диагностика болезней системы крови. Диагностика болезней почек. - Москва, 2003. - 512 с.: ил.; Серов, В.Н. Критические состояния в акушерстве [Текст]: руководство для врачей / В.Н. Серов, С.А. Маркин. - Москва: Медиздат, 2003. - 704 с].
В изученной научно-медицинской и доступной патентной литературе авторами не было обнаружено способа прогнозирования риска развития хронической плацентарной недостаточности с синдромом задержки роста плода 2-3-ей степени у беременных на основе данных о генетических полиморфизмах 10976 G/A F VII, 20210G/A FII, 1691 G/A FV и их сочетании.
Для оценки сложившейся патентной ситуации был выполнен поиск по охранным документам за период с 1990 по 2012 гг. Анализ документов производился по направлению: способ прогнозирования риска развития плацентарной недостаточности с СЗРП на основе молекулярно-генетических данных в зависимости от полиморфных маркеров генов VII фактора коагуляции и в сочетании с V, II факторами коагуляции.
Известен патент РФ №2148256 по заявке РФ №99100806/14, 12.01.1999, опубл. 27.04.2000 г, на изобретение «Способ доклинического прогнозирования плацентарной недостаточности», включающий забор периферической венозной крови и определение содержания молекул средней массы при помощи спектрофотометра. При полученных показателях более 0,220; 0,230 и 0,240 усл.ед. соответственно в первом, во втором и в третьем триместрах беременности прогнозируют развитие плацентарной недостаточности.
Недостаток прототипа заключается в том, что он предусматривает прогнозирование плацентарной недостаточности при наличии беременности и не применим на прегравидарном этапе. Также в данном прототипе не учитывается возможность прогноза крайних степеней плацентарной недостаточности с СЗРП 2-3-ей степеней, которые обусловливают неблагоприятный перинатальный исход.
Задачей настоящего исследования является расширение арсенала способов диагностики, а именно создание способа прогнозирования развития плацентарной недостаточности с СЗРП 2-3-ей степени на основе данных о генетических полиморфизмах 10976 G/A F VII, 20210 G/A F II, 1691 G/A FV и их сочетании.
Технический результат использования изобретения - получение критериев оценки риска развития хронической плацентарной недостаточности с синдромом задержки роста плода 2-3-ей степени у беременных и у небеременных пациенток на прегравидарном этапе.
В соответствии с поставленной задачей был разработан способ прогнозирования риска развития хронической плацентарной недостаточности с синдромом задержки роста плода 2-3-ей степени у беременных, включающий:
- забор периферической венозной крови;
- выделение ДНК из периферической венозной крови;
- анализ полиморфизмов генов факторов коагуляции 10976 G/A FVII, 1691 G/A FV, 20210 G/A FII;
- прогнозирование повышенного риска развития хронической плацентарной недостаточности с синдромом задержки роста плода 2-3-ей степени у беременных в случае выявления аллеля 10976G FVII, генотипа 10976GG FVII и низкого риска формирования данного осложнения беременности при выявлении следующих комбинаций: генотипа 20210GG FII и аллеля 10976А FVII; аллелей 20210G FII, 10976А FVII с генотипом 1691GGFV; аллелей 20210G FII и 10976А FVII.
Новизна и изобретательский уровень заключается в том, что из уровня техники не известна возможность прогноза риска развития хронической плацентарной недостаточности с синдромом задержки роста плода 2-3-ей степени у беременных по наличию генетических вариантов полиморфных факторов 10976 G/A F VII, 20210 G/A FII, 1691 G/A FV и их сочетанию.
Способ осуществляют следующим образом:
2
ДНК выделяют из образцов периферической венозной крови пациенток в 2 этапа. На первом этапе к 4 мл крови добавляют 25 мл лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% тритон Х-100, 5 мМ MgCl, 10 мМ трис-HCl (pH 7,6). Полученную смесь перемешивают и центрифугируют при 4°C, 4000 об/мин в течение 20 минут. После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 4 мл раствора, содержащего 25 мМ ЭДТА (рН 8,0) и 75 мМ NaCl, ресуспензируют. Затем прибавляют 0,4 мл 10% SDS, 35 мкл протеиназы К (10 мг/мл) и инкубируют образец при 37°C в течение 16 часов.
На втором этапе из полученного лизата последовательно проводят экстракцию ДНК равными объемами фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием при 4000 об/мин в течение 10 минут. После каждого центрифугирования производят отбор водной фазы. ДНК осаждают из раствора двумя объемами охлажденного 96% этанола. Сформированную ДНК растворяют в бидистиллированной, деионизованной воде и хранят при - 20°C.
Выделенную ДНК затем подвергают полимеразной цепной реакции с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров.
Анализ полиморфизмов 10976 G/A фактора коагуляции VII, 1691 G/A фактора коагуляции V, 20210 G/A фактора коагуляции II проводился методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК на амплификаторе IQ5 (Bio-Rad) с использованием готового набора реагентов производства ООО «Синтол» в соответствии с инструкцией производителя (см. таблицу).
Генотипирование осуществляется методом Tag Man зондов по данным величин RFU (уровень относительной флуоресценции) каждого зонда. Зонд с флуоресцентным красителем HEX соответствует аллелю А, зонд с красителем FAM - аллелю G.
Наборы, использованные для генотипирования ДНК-маркеров методом ПЦР
Ген
Полиморфизм
Название набора
Серия
Ген V фактора коагуляции (FV)
Набор реагентов для определения полиморфизма G1691A гена F5 (Factor Leiden) производства ООО «Синтол»
1691 G/A (rs 6025)
200312
Ген протромбина (FII)
Набор реагентов для определения полиморфизма G20210A гена F2 (Protrombin) производства ООО «Синтол»
200312
20210 G/A (rs 1799963)
Ген проконвертина (FVII)
Набор реагентов для определения полиморфизма Arg353Gln гена F7 производства ООО «Синтол»
090412
10976 G/A (rs 6046)
Изобретение охарактеризовано на следующих чертежах:
- фиг.1, где представлена дискриминация аллелей по локусу 10976 G/A фактора коагуляции VII, где ○ - гомозиготы 10976 GG FVII,  - гомозиготы 10976АА FVII, Δ - гетерозиготы 10976 GA FVII, ◇ - отрицательный контроль;
- фиг.2, где показано распределение аллеля 10976G FVII среди беременных с СЗРП различной степени тяжести и беременных контрольной группы;
- фиг.3, где представлено распределение генотипа 10976GG FVII среди беременных с СЗРП различной степени тяжести и беременных контрольной группы.
На фиг.1 две полосы, вертикальная и горизонтальная, делят график на четыре секции: одна для каждого гомозиготного состояния, одна для гетерозиготного состояния и секция без реакции. Присвоение генотипов неизвестным образцам определяется вычерчиванием RFU для одного флуорофора (на оси x) относительно RFU для другого флуорофора (на оси y) на диаграмме дискриминации аллелей.
- Если значения RFU неизвестного образца находятся выше горизонтальной полосы и правее вертикальной полосы, генотип гетерозиготен (GA).
- Если значения RFU неизвестного образца находятся выше горизонтальной полосы и левее вертикальной полосы, генотип гомозиготен по аллелю A (RFU аллеля А отложены по оси y).
- Если значения RFU неизвестного образца находятся ниже горизонтальной полосы и правее вертикальной, генотип гомозиготен по аллелю G (RFU аллеля G отложены по оси x).
- Если значения RFU неизвестного образца находятся ниже горизонтальной полосы и левее вертикальной, определение генотипа невозможно (в данном случае неопределенный образец - отрицательный контроль).
Возможность использования предложенного способа для оценки риска развития хронической плацентарной недостаточности с СЗРП 2-3-ей степени у беременных подтверждает анализ результатов наблюдений 250 пациенток с плацентарной недостаточностью и СЗРП и 247 беременных контрольной группы. В исследуемую группу включались индивидуумы русской национальности, являющиеся уроженками Центрального Черноземья России и не имеющие родства между собой. Клиническое и лабораторное обследование беременных проводилось на базе перинатального центра Белгородской областной клинической больницы Святителя Иоасафа. Диагностика синдрома внутриутробной задержки роста плода проводилась на основании клинических данных - соответствие высоты стояния дна матки (ВДМ) гестационному сроку. Отставание размеров ВДМ на 2 см и более по сравнению с нормой или отсутствие роста этого показателя в течение 2-3 недель при динамическом наблюдении позволяли заподозрить СЗРП. Данные клинического обследования подтверждались результатами ультразвуковой фетометрии с определением бипариетального размера головки плода, окружностей грудной клетки и живота, длины плечевой и бедренной костей. Полученные при ультразвуковом исследовании фетометрические показатели сравнивались с номограммами F. Hadlock и гестационным сроком, что позволяло подтвердить наличие СЗРП, его степень выраженности и форму СЗРП.
Из 250 беременных с плацентарной недостаточностью 133 (53,20%) пациентки имели СЗРП легкой степени тяжести, 107 (46,80%) индивидуумов - СЗРП 2-ой и 3-ей степени тяжести. Типирование молекулярно-генетических маркеров осуществлялось в лаборатории «Молекулярной генетики человека» медицинского факультета Белгородского государственного национального исследовательского университета.
2
cor
cor
Формирование базы данных и статистические расчеты осуществлялись с использованием программы «STATISTICA 6.0». Ассоциации аллелей и генотипов изученных ДНК-маркеров с развитием плацентарной недостаточности с СЗРП 2-3-ей степени оценивали с помощью анализа таблиц сопряженности 2×2 с расчетом критерия χ с поправкой Йетса на непрерывность и отношения шансов (OR) с 95% доверительными интервалами (CI). С целью минимизации ошибок 1-го рода, связанных с получением ложноположительных результатов при проведении множественных сравнений, вводили поправку Бонферрони - производили перерасчет уровня значимости p для множественных парных сравнений по формуле: p=p×n, где p - полученный уровень статистической значимости, n - количество парных сравнений. За статистически значимый уровень принимали p≤0,05. Изучение роли комбинаций генетических вариантов факторов коагуляции 1691 G/A FV, 20210 G/A FII, 10976 G/A FVII в формирование плацентарной недостаточности с СЗРП 2-3-ей степени проводилось с помощью программного обеспечения APSampler [http://sources.redhat.com/cygwin/], использующего метод Монте-Карло марковскими цепями и байесовскую непараметрическую статистику [Favorov А.V. et al., 2005].
На фиг.2 видно, что пациентки с плацентарной недостаточностью и синдромом задержки роста плода 2-3-ей степени имеют наибольшую частоту аллеля 10976G FVII (92,99%) по сравнению с контрольной группой - 77,07% (χ2=18,90; OR=3,45; 95% CI 1,90-6,39; р=0,001) и группой беременных с СЗРП легкой степени тяжести - 85,16% (χ2=6,39; р=0,01).
Фиг.3 показывает, что в группе беременных с СЗРП 2-ой и 3-ей степеней тяжести, наблюдается высокая распространенность генотипа 10976GG FVII (85,98%) в сравнении с женщинами контрольной группы - 56,10% (χ2=26,80; OR=4,80; 95% CI 2,51-9,29; р=0,001; pcor=0,003) и беременными с СЗРП легкой степени тяжести - 71,09% (χ2=6,66; р=0,01; pcor=0,03).
С помощью биоинформационных исследований выявлен ряд протективных комбинаций изучаемых генетических маркеров факторов коагуляции в отношении развития плацентарной недостаточности с СЗРП 2-3-ей степени тяжести. Так, сочетание генотипа 20210GG FII и аллеля 10976А FVII среди беременных с СЗРП средней и тяжелой степени встречается в 13,08%, по сравнению с 46,82% контрольной группы (р=0,0000001, pcor=0,0000006, OR=0,17, 95% CI 0,09-0,32). Распространенность сочетания аллелей 20210G FII, 10976А FVII с генотипом 1691GG FV в группе беременных с СЗРП средней и тяжелой степени составляет 13,21% по сравнению с 46,99% у беременных без СЗРП (р=0,0000002, pcor=0,0000024, OR=0,17, 95% CI 0,09-0,33). Комбинация аллелей 20210G FII и 10976A FVII среди пациенток с СЗРП средней и тяжелой степени составила 14,02%, тогда как в контрольной группе этот показатель равен 47,40% (р=0,0000003, pcor=0,000012, OR=0,18, 95% CI 0,10-0,33).
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о вовлеченности генетического полиморфизма 10976 G/A FVII фактора коагуляции в формирование плацентарной недостаточности с СЗРП 2-3-ей степени. Маркером развития плацентарной недостаточности с СЗРП 2-3-ей степени является аллель 10976G FVII (OR=3,45) и генотип 10976GG FVII (OR=4,80).
Протективную роль в отношении развития плацентарной недостаточности с СЗРП 2-3-ей степени выполняют комбинации аллеля 10976А FVII с генотипом 20210GG FII (OR=0,17); аллелей 10976А FVII и 20210G FII с генотипом 1691GG FV (OR=0,17); аллелей 10976А FVII и 20210G FII (OR=0,18).
Использование данного способа позволяет прогнозировать риск возникновения плацентарной недостаточности с СЗРП 2-3-ей степени у беременных и на основании этого определять комплекс мероприятий прегравидарной подготовки и тактику ведения беременных пациенток. Беременным при выявлении генетического фактора риска развития плацентарной недостаточности с СЗРП 2-3-ей степени (аллель 10976G FVII и генотип 10976GG FVII) следует рекомендовать динамический контроль внутриутробного роста плода (регулярное посещение врача акушера-гинеколога с измерением высоты стояния дна матки и ультразвуковым определением фетометрических показателей, определением внутриутробного состояния плода по данным допплерометрии и кардиотокографии) с целью ранней диагностики и своевременного патогенетического лечения плацентарной недостаточности и СЗРП (низкомолекулярные гепарины), а также выбора оптимального срока и способа родоразрешения. При проведении прегравидарной подготовки у женщин группы риска по развитию плацентарной недостаточности с СЗРП с учетом выявленных генетических маркеров - назначение патогенетически обоснованной антикоагулянтной терапии.
При наличии комбинации аллеля 10976А FVII с генотипом 20210GG FII; аллелей 10976А FVII и 20210G FII с генотипом 1691GG FV; аллеля 10976А FVII с аллелем 20210G FII риск развития плацентарной недостаточности с СЗРП 2-3-ей степени следует считать низким.