ВАРИАНТЫ КАПСИДОВ АДЕНОАССОЦИИРОВАННОГО ВИРУСА И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ИНГИБИРОВАНИЯ АНГИОГЕНЕЗА
OPTIONS OF ADENO-ASSOCIATED VIRUS CAPSIDS AND THEIR USE FOR ANGIOGENESIS INHIBITION

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[001]
По настоящей заявке испрашивается приоритет временных заявок на патент США No. 62/590976, поданной 27 ноября 2017 г. и 62/664726, поданной 30 апреля 2018 г., полное содержание каждой из которых приведено в настоящем описании в качестве ссылки.
ВКЛЮЧЕНИЕ В КАЧЕСТВЕ ССЫЛКИ СПИСКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ, ПРЕДСТАВЛЕННОГО В ФОРМЕ ТЕКСТОВОГО ФАЙЛА
[002]
Список последовательностей представлен с настоящим описанием в форме текстового файла «090400-5010-WO-seq-listing.txt», созданного 26 ноября 2018 г. и имеющего размер 238 Кб. Полное содержание текстового файла приведено в настоящем описании в качестве ссылки.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
[003]
Изобретение, описанное в настоящем описании, относится, главным образом, к области вирионов аденоассоциированного вируса (AAV), содержащих варианты капсидных белков, и получения таких вариантов капсидов с использованием способов направленной эволюции.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[004]
Наследственные заболевания сетчатки включают большую группу гетерогенных генетических заболеваний, поражающих приблизительно 1 на 3000 человек (более 2 миллионов человек во всем мире), и являются основным источником тяжелой потери зрения или слепоты. Комплексные, многофакторные заболевания сетчатки, такие как влажная возрастная дегенерация желтого пятна (wAMD) и диабетическая ретинопатия (DR), затрагивают даже больше индивидуумов, где 1,7 миллионов американцев в настоящее время живут с тяжелой потерей центрального зрения, ассоциированной с wAMD, и почти одна треть взрослых в возрасте более 40 лет с диабетом имеют значительные нарушения зрения. Эти заболевания, как правило, ассоциированы с дисфункцией или гибелью одного или нескольких типов клеток сетчатки, в некоторых случаях, из-за отсутствия экспрессии или функции ключевого белка, например, RPE65 при LCA2, в других случаях, из-за мутаций генов, образующих токсичные продукты генов, например, доминантных мутаций, влияющих на сворачивания белка родопсина, или в других случаях, из-за изменений физиологии сетчатки, индуцированных эктопической экспрессией белка, например, VEGF при wAMD.
[005]
Одним способом удовлетворения этой большой неудовлетворенной медицинской необходимости является опосредованная аденоассоциированным вирусом (AAV) генотерапия, при которой рекомбинантный аденоассоциированный вирус (rAAV) используют для доставки гена в один или более типов клеток в сетчатке, например, для замены отсутствующего гена, для коррекции доминантно дефектного гена или для обеспечения матрицы для непрерывной белковой терапии. Хотя успехи клинической генотерапии на основе AAV растут, она все еще имеет недостатки, применительно к свойствам вирусного вектора, включая, например, нацеливание на желательные клетки сетчатки с высокой эффективностью. Например, идентифицировано и охарактеризовано множество гомологичных серотипов AAV приматов и множество серотипов нечеловекообразных приматов, где AAV2 является наиболее хорошо охарактеризованным среди серотипов AAV и первым предназначенным для адаптации в качестве носителя для доставки генов в глаз. Однако, не опубликовано, что эти AAV (включая AAV2) являются эффективными для трансдукции более глубоких типов клеток сетчатки при доставке посредством введения в стекловидное тело. Соответственно, в данной области существует необходимость в новых вариантах AAV с превосходной способностью к трансдукции, которые могут обеспечивать более эффективную доставку гена в клетки сетчатки для лечения заболевания глаз. В данной области существует необходимость в таких вариантах AAV, которые имеют улучшенный профиль трансдукции для сетчатки - в некоторых случаях, широкий, в других случаях, предпочтительный для конкретных типов клеток сетчатки, - по сравнению с AAV дикого типа и вариантами AAV, как известно в данной области.
[006]
rep
cap
aap
rep
cap
Природный AAV представляет собой одноцепочечный ДНК-вирус, содержащий три открытые рамки считывания, , и . Первый ген, , кодирует четыре белка, необходимые для репликации генома (Rep78, Rep68, Rep52 и Rep40), второй, , экспрессирует три структурных белка (VP1-3), которые собираются с формированием вирусного капсида, и третий экспрессирует активирующий сборку белок (AAP), необходимый для сборки капсида. AAV зависит от присутствия вируса-помощника, такого как аденовирус или вирус герпеса, для активной репликации. В отсутствие вируса-помощника, AAV переходит в латентное состояние, в котором его геном поддерживается эписомно или интегрирует в хромосому хозяина в локусе AAVS1.
[007]
in vitro
in vivo
cap
Способы направленной эволюции и  можно использовать для отбора вариантов AAV, обеспечивающих улучшение, по сравнению с современными векторами для доставки генов на основе AAV. Такие способы направленной эволюции известны в данной области и описаны, например, в Публикации PCT WO 2014/194132 и в Kotterman & Schaffer (Nature Review Genetics, AOP, published online 20 May 2014; doi: 10.1038/nrg3742), полное содержание обоих из которых приведено в настоящем описании в качестве ссылки. Направленная эволюция представляет собой способ конструирования капсида, имитирующий природную эволюцию посредством чередующихся циклов процессов внесения генетического разнообразия и отбора, таким образом, позволяя накопление преимущественных мутаций, все больше улучшающее функцию биомолекулы, такой как вирион на основе AAV. В этом способе, в гены  AAV дикого типа вносят разнообразие для получения больших геномных библиотек, которые упаковывают для получения библиотек вирусных частиц, и селективное давление прилагают для выделения уникальных вариантов с превосходными фенотипами, которые могут преодолевать барьеры для доставки генов.
[008]
Варианты AAV описаны, например, в Патентах США номера 9193956; 9;186;419; 8632764; 8663624; 8927514; 8628966; 8263396; 8734809; 8889641; 8632764; 8691948; 8299295; 8802440; 8445267; 8906307; 8574583; 8067015; 7588772; 7867484; 8163543; 8283151; 8999678; 7892809; 7906111; 7259151; 7629322; 7220577; 8802080; 7198951; 8318480; 8962332; 7790449; 7282199; 8906675; 8524446; 7712893; 6491907; 8637255; 7186522; 7105345; 6759237; 6984517; 6962815; 7749492; 7259151; и 6156303; публикациях заявок на патент США номера 2013/0295614; 2015/0065562; 2014/0364338; 2013/0323226; 2014/0359799; 2013/0059732; 2014/0037585; 2014/0056854; 2013/0296409; 2014/0335054 2013/0195801; 2012/0070899; 2011/0275529; 2011/0171262; 2009/0215879; 2010/0297177; 2010/0203083; 2009/0317417; 2009/0202490; 2012/0220492; 2006/0292117; и 2004/0002159; публикациях европейских заявок на патент номера 2692731 A1; 2383346 B1; 2359865 B1; 2359866 B1; 2359867 B1; и 2357010 B1; 1791858 B1; 1668143 B1; 1660678 B1; 1664314 B1; 1496944 B1; 1456383 B1; 2341068 B1; 2338900 B1; 1456419 B1; 1310571 B1; 1456383 B1; 1633772 B1; и 1135468 B1; и Международных публикациях (PCT) номера WO 2014/124282; WO 2013/170078; WO 2014/160092; WO 2014/103957; WO 2014/052789; WO 2013/174760; WO 2013/123503; WO 2011/038187; и WO 2008/124015; WO 2003/054197; однако ни в одной из этих ссылок не описаны варианты осуществления и/или признаки, и/или составы структур вариантов AAV, описанных в настоящем описании.
[009]
Содержание всех документов и ссылок, процитированных в настоящем описании и в процитированных Патентных документах, приведено в настоящем описании в качестве ссылки.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0010]
Настоящее изобретение относится к вариантам капсидных белков аденоассоциированного вируса (AAV), имеющим одну или более модификаций в аминокислотной последовательности, относительно исходного капсидного белка AAV, которые, когда они присутствуют в вирионе AAV, придают увеличенную инфекционность для одного или более типов клеток сетчатки, по сравнению с инфекционностью для клеток сетчатки вириона AAV, содержащего немодифицированный исходный капсидный белок AAV. Настоящее изобретение также относится к рекомбинантным вирионам AAV и их фармацевтическим композициям, содержащим вариант капсидного белка AAV, как описано в настоящем описании, к способам получения вариантов капсидных белков и вирионов rAAV, и к способам использования этих капсидных белков и вирионов rAAV в исследовательской и в клинической практике, например, в доставке последовательности нуклеиновой кислоты в одну или более клеток сетчатки для лечения нарушений и заболеваний сетчатки.
[0011]
В некоторых аспектах описания, настоящее изобретение относится к вариантам капсидных белков аденоассоциированного вируса (AAV), эти варианты капсидных белков AAV, имеют одну или более модификаций в аминокислотной последовательности, по сравнению с исходным капсидом AAV, которые, когда присутствуют в вирионе AAV, придают увеличенную инфекционность для одного или более типов клеток сетчатки (например, фоторецепторной клетки (например, палочек; колбочек), ганглионарной клетки сетчатки (RGC), глиальной клетки (например, глиальной клетки Мюллера, микроглиальной клетки), биполярной клетки, амакриновой клетки, горизонтальной клетки и/или клетки пигментного эпителия сетчатки (RPE)), по сравнению с инфекционностью для клеток сетчатки вириона AAV, содержащего исходный капсидный белок AAV, не содержащий модификацию аминокислотной последовательности.
[0012]
В некоторых аспектах, настоящее изобретение относится к вирионам рекомбинантного AAV (rAAV), эти вирионы rAAV содержат вариант капсидного белка, как описано в настоящем описании, где вирионы rAAV имеют увеличенную инфекционность для одного или более типов клеток сетчатки (например, фоторецепторной клетки (например, палочек; колбочек), ганглионарной клетки сетчатки (RGC), глиальной клетки (например, глиальной клетки Мюллера, микроглиальной клетки), биполярной клетки, амакриновой клетки, горизонтальной клетки и/или клетки пигментного эпителия сетчатки (RPE)), по сравнению с инфекционностью для клеток сетчатки вириона AAV, содержащего соответствующий немодифицированный исходный капсидный белок AAV. В некоторых вариантах осуществления, вирион rAAV имеет увеличенную инфекционность для всех клеток сетчатки, по сравнению с вирионом AAV, содержащим исходный капсидный белок AAV. В других вариантах осуществления, вирион rAAV имеет увеличенную инфекционность для конкретных типов клеток сетчатки, но не для других, по сравнению с вирионом AAV, содержащим исходный капсидный белок AAV. Другими словами, вирион rAAV имеет увеличенную инфекционность, которая является предпочтительной для конкретных типов клеток сетчатки, но не для других, например, rAAV имеет, предпочтительно, увеличенную инфекционность для одного или более типов клеток, выбранных из фоторецепторных клеток, ганглионарных клеток сетчатки, глиальных клеток, биполярных клеток, амакриновых клеток, горизонтальных клеток и/или клеток пигментного эпителия сетчатки (RPE), но не имеет увеличенную инфекционность для всех типов клеток.
[0013]
В некоторых вариантах осуществления, вирион rAAV содержит гетерологичную нуклеиновую кислоту. В некоторых таких вариантах осуществления, гетерологичная нуклеиновая кислота кодирует РНК, которая кодирует полипептид. В других таких вариантах осуществления, гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты кодирует РНК которая не кодирует полипептид, например, гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты кодирует средство для РНК-интерференции, направляющую РНК для нуклеазы и т.д.
[0014]
Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим рассматриваемые инфекционные вирионы rAAV и фармацевтически приемлемый носитель.
[0015]
in vivo
in vitro
Настоящее изобретение также относится к применению вириона rAAV, содержащего вариант капсидного белка, как описано в настоящем описании, в способе доставки гетерологичной нуклеиновой кислоты в клетку-мишень (такую как клетка сетчатки) посредством приведения клетки-мишени в контакт с вирионом rAAV. В некоторых вариантах осуществления, клетка-мишень находится , например, в глазу индивидуума, нуждающегося в лечении заболевания глаз. В других вариантах осуществления, клетка-мишень находится .
[0016]
Настоящее изобретение также относится к способам лечения заболевания глаз посредством введения субъекту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества вирионов rAAV, содержащих вариант капсидного белка, как описано в настоящем описании, или фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество вирионов rAAV.
[0017]
Настоящее изобретение также относится к выделенной нуклеиновой кислоте, содержащей последовательность, кодирующую вариант капсидного белка AAV, как описано в настоящем описании, и к клетке-хозяину, содержащей выделенную нуклеиновую кислоту. В других вариантах осуществления, выделенная нуклеиновая кислота и/или выделенная клетка-хозяин содержит rAAV.
[0018]
В некоторых аспектах, вариант капсидного белка AAV содержит вставку от приблизительно 5 аминокислот до приблизительно 20 аминокислот («гетерологичный пептид» или «пептидную вставку») в GH-петле капсидного белка, по сравнению с соответствующим исходным капсидным белком AAV, где вариант капсидного белка, когда присутствует в вирионе AAV, придает увеличенную инфекционность для клетки сетчатки по сравнению с инфекционностью для клетки сетчатки вириона AAV, содержащего соответствующий исходный капсидный белок AAV. В некоторых вариантах осуществления, пептид содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из QADTTKN (SEQ ID NO:13), ISDQTKH (SEQ ID NO:14), ASDSTKA (SEQ ID NO:15), NQDYTKT (SEQ ID NO:16), HDITKNI (SEQ ID NO:17), HPDTTKN (SEQ ID NO:18), HQDTTKN (SEQ ID NO:19), NKTTNKD (SEQ ID NO:20), ISNENEH (SEQ ID NO:21), QANANEN (SEQ ID NO:22), GKSKVID (SEQ ID NO:23), TNRTSPD (SEQ ID NO:24), PNSTHGS (SEQ ID NO:25), KDRAPST (SEQ ID NO:26), LAQADTTKNA (SEQ ID NO:27), LAISDQTKHA (SEQ ID NO:28), LGISDQTKHA (SEQ ID NO:29), LAASDSTKAA (SEQ ID NO:30), LANQDYTKTA (SEQ ID NO:31), LAHDITKNIA (SEQ ID NO:32), LAHPDTTKNA (SEQ ID NO:33), LAHQDTTKNA (SEQ ID NO:34), LANKTTNKDA (SEQ ID NO:35), LPISNENEHA (SEQ ID NO:36), LPQANANENA (SEQ ID NO:37), LAGKSKVIDA (SEQ ID NO:38), LATNRTSPDA (SEQ ID NO:39), LAPNSTHGSA (SEQ ID NO:40) и LAKDRAPSTA (SEQ ID NO:41). В некоторых вариантах осуществления, пептид в основном состоит из последовательности, выбранной из группы, состоящей из QADTTKN (SEQ ID NO:13), ISDQTKH (SEQ ID NO:14), ASDSTKA (SEQ ID NO:15), NQDYTKT (SEQ ID NO:16), HDITKNI (SEQ ID NO:17), HPDTTKN (SEQ ID NO:18), HQDTTKN (SEQ ID NO:19), NKTTNKD (SEQ ID NO:20), ISNENEH (SEQ ID NO:21), QANANEN (SEQ ID NO:22), GKSKVID (SEQ ID NO:23), TNRTSPD (SEQ ID NO:24), PNSTHGS (SEQ ID NO:25), KDRAPST (SEQ ID NO:26), LAQADTTKNA (SEQ ID NO:27), LAISDQTKHA (SEQ ID NO:28), LGISDQTKHA (SEQ ID NO:29), LAASDSTKAA (SEQ ID NO:30), LANQDYTKTA (SEQ ID NO:31), LAHDITKNIA (SEQ ID NO:32), LAHPDTTKNA (SEQ ID NO:33), LAHQDTTKNA (SEQ ID NO:34), LANKTTNKDA (SEQ ID NO:35), LPISNENEHA (SEQ ID NO:36), LPQANANENA (SEQ ID NO:37), LAGKSKVIDA (SEQ ID NO:38), LATNRTSPDA (SEQ ID NO:39), LAPNSTHGSA (SEQ ID NO:40) и LAKDRAPSTA (SEQ ID NO:41). В некоторых аспектах, вариант капсидного белка AAV содержит одну или более аминокислотных замен, по сравнению с соответствующим исходным капсидным белком AAV, где вариант капсидного белка, когда присутствует в вирионе AAV, придает увеличенную инфекционность для клетки сетчатки по сравнению с инфекционностью для клетки сетчатки вириона AAV, содержащего соответствующий исходный капсидный белок AAV.
[0019]
В родственных аспектах, вариант капсидного белка AAV содержит пептидную вставку и одну или более аминокислотных замен, по сравнению с соответствующим исходным капсидным белком AAV, где вариант капсидного белка, когда присутствует в вирионе AAV, придает увеличенную инфекционность для клетки сетчатки по сравнению с инфекционностью для клетки сетчатки вириона AAV, содержащего соответствующий исходный капсидный белок AAV.
[0020]
Настоящее изобретение относится также к варианту капсидного белка AAV, содержащему гетерологичный пептид LAISDQTKHA (SEQ ID NO:28) и замену P34A, относительно AAV2. В родственных вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к инфекционному рекомбинантному AAV, содержащему вариант капсидного белка AAV, по меньшей мере на 90% идентичный последовательности, указанной как SEQ ID NO:42, и гетерологичную нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность, кодирующую ингибитор VEGF, предпочтительно, ингибитор VEGFa, и к содержащей их фармацевтической композиции. В некоторых вариантах осуществления, гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая ингибитор VEGF, выбрана из последовательности, кодирующей афлиберцепт, ранибизумаб, одноцепочечный вариант ранибизумаба (sc-ранибизумаб LH или HL), бролуцизумаб, sc-ранибизумаб, слитый с доменом Fc IgG (sc-ранибизумаб-Fc), или бролуцизумаб, слитый с доменом Fc IgG (бролуцизумаб-Fc). В родственных вариантах осуществления, рекомбинантный AAV содержит гетерологичную нуклеиновую кислоту, содержащую две или более последовательностей, каждая из которых кодирует ингибитор VEGFa (например, первую последовательность, кодирующую афлиберцепт, и вторую последовательность, кодирующую бролуцизумаб). В предпочтительных вариантах осуществления, гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты имеет последовательность из любой из SEQ ID NO:65, 67, 69, 70, 72, 74, 76 или последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную ей. В других родственных вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к способу для лечения пациента с заболеванием глаз, ассоциированным с увеличенными внутриглазными уровнями VEGFa, включающему введение пациенту, предпочтительно, посредством инъекции в стекловидное тело, эффективного количества инфекционного рекомбинантного AAV, содержащего вариант капсидного белка AAV, по меньшей мере на 90% идентичный последовательности, указанной как SEQ ID NO:42, и гетерологичную нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность, кодирующую ингибитор VEGF.
[0021]
Настоящее изобретение относится также к варианту капсидного белка AAV, содержащему гетерологичный пептид LAISDQTKHA (SEQ ID NO:28) и аминокислотные замены N312K, N449D, N551S, I698V, и L735Q, относительно AAV2.
[0022]
Настоящее изобретение относится также к способам получения и/или доставки rAAV, содержащего вариант капсида AAV, как описано в настоящем описании. Кроме того, настоящее изобретение относится к наборам, содержащим rAAV, содержащий вариант капсида AAV, как описано в настоящем описании, и для использования в способах, описанных в настоящем описании.
[0023]
В других вариантах осуществления, вирион AAV, содержащий вариант капсидного белка, в предшествующих абзацах, может включать любой из предшествующих или описанных впоследствии вариантов осуществления. Действительно, понятно, что конкретные признаки изобретения, которые, для ясности, описаны в контексте отдельных вариантов осуществления, могут быть также представлены в комбинации в одном варианте осуществления. И наоборот, различные признаки изобретения, которые, для краткости, описаны в контексте одного варианта осуществления, могут быть также представлены по отдельности или в любой подходящей субкомбинации. Все комбинации вариантов осуществления, относящихся к изобретению, конкретно включены в изобретение и описаны в настоящем описании, точно также как если бы все без исключения комбинации были индивидуально и явно описаны. Кроме того, все субкомбинации различных вариантов осуществления и их элементов также конкретно включены в изобретение и описаны в настоящем описании, точно также как если бы все без исключения субкомбинации были индивидуально и явно описаны в настоящем описании.
[0024]
Сущность изобретения не предназначена ни для определения формулы изобретения, ни для ограничения объема изобретения каким-либо образом.
[0025]
Другие признаки и преимущества изобретения, описанного в настоящем описании, станут очевидными из следующих фигур, подробного описания и формулы изобретения.
[0026]
До ознакомления с описанием настоящих способов и композиций, следует понимать, что это изобретение не ограничено конкретными описанными способом или композицией, и таким образом, может иметь варианты. Следует понимать также, что терминология, используемая в настоящем описании, предназначена только для цели описания конкретных вариантов осуществления, и не предназначена для ограничения, поскольку объем настоящего изобретения ограничен только прилагаемой формулой изобретения.
[0027]
Описанное в настоящем описании изобретение проиллюстрировано на фигурах и в описании. Однако, в то время как конкретные варианты осуществления проиллюстрированы на фигурах, не существует намерения ограничения изобретения проиллюстрированными и/или описанными конкретными вариантом или вариантами осуществления. Вместо этого, описанное в настоящем описании изобретение предназначено для включения всех модификаций, альтернативных конструкций и эквивалентов, входящих в содержание и объем изобретения. Таким образом, фигуры предназначены для иллюстрации, а не для ограничения.
[0028]
Когда представлен диапазон значений, понятно, что каждое промежуточное значение, до десятой единицы нижнего предела, если контекст явно не требует иного, между верхним и нижним пределами этого диапазона, также конкретно описано. Каждый меньший диапазон между любым значением или промежуточным значением в указанном диапазоне и любым другим указанным или промежуточным значением в этом указанном диапазоне включен в изобретение. Верхний и нижний пределы этих меньших диапазонов могут быть, независимо, включены или исключены в диапазоне, и каждый диапазон, в котором любой, никакой или оба предела включены в меньшие диапазоны, также включен в изобретение, с учетом любого конкретно исключенного предела в указанном диапазоне. Когда указанный диапазон включает один или оба предела, диапазоны, исключающие любой или оба из этих включенных пределов, также включены в изобретение.
[0029]
Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют такое же значение, какое является общепринятым для специалиста в области, к которой относится это изобретение. Хотя любые способы и материалы, сходные или эквивалентные с описанными в настоящем описании, можно использовать в практике или тестировании настоящего изобретения, в настоящее время описаны некоторые потенциальные и предпочтительные способы и материалы. Содержание всех публикаций, упомянутых в настоящем описании, приведено в настоящем описании в качестве ссылки для раскрытия и описания способов и/или материалов, в связи с которыми процитированы публикации. Понятно, что настоящее описание имеет преимущество перед описанием в любой включенной публикации в той степени, в которой присутствует несоответствие.
[0030]
Как станет очевидным для специалиста в данной области при чтении этого описания, каждый из индивидуальных вариантов осуществления, описанных и проиллюстрированных в настоящем описании, имеет дискретные компоненты и признаки, которые можно легко отделять от признаков любого из нескольких других вариантов осуществления или комбинировать с ними, без отклонения от объема или содержания настоящего изобретения. Любой упомянутый способ можно осуществлять в порядке упоминания событий или в любом другом порядке, который является логически возможным.
[0031]
Следует отметить, что в настоящем описании и в прилагаемой формуле изобретения неконкретизированные и конкретизированные формы единственного числа включают объекты ссылки множественного числа, если контекст явно не требует иного. Таким образом, например, ссылка на «рекомбинантный вирион AAV» включает множество таких вирионов, и ссылка на «фоторецепторную клетку» включает ссылку на одну или более фоторецепторных клеток и ее эквивалентов, известных специалистам в данной области, и т.д. Кроме того, следует отметить, что пункты формулы изобретения могут быть составлены для исключения любого необязательного элемента. Таким образом, это утверждение предназначено, чтобы служить предшествующей основой для использования такой исключающей терминологии, как «единственно», «только» и т.п., в связи с перечислением элементов пункта формулы изобретения, или для использования «отрицательного» ограничения.
[0032]
Публикации, обсуждаемые в настоящем описании, представлены только по их описаниям до даты подачи настоящей заявки. Ничего в этом описании не следует рассматривать как допущение, что настоящее изобретение неправомочно датировать задним числом такую публикацию на основании предшествующего изобретения. Кроме того, представленные даты публикации могут отличаться от фактических дат публикации, которые могут нуждаться в независимом подтверждении.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0033]
Изобретение более понятно из следующего подробного описания при чтении в сочетании с сопровождающими чертежами. Файл патента или заявки содержит по меньшей мере один чертеж, выполненный в цвете. Копии публикации этого патента или патентной заявки с цветным чертежом(чертежами) будут представлены патентным ведомством после запроса и оплаты необходимой выплаты. Следует отметить, что, в соответствии с общепринятой практикой, различные признаки фигур приведены не в масштабе. Напротив, измерения различных признаков произвольно увеличены или уменьшены для ясности. В чертежи включены следующие фигуры.
[0034]
фигуре 1
cap
cap
in vitro
in vivo
cap
cap
Напоказаны варианты осуществления способа направленной эволюции. На стадии (a) показано получение библиотеки вирусных капсидов, включающее комбинации способов мутагенеза ДНК и генов . На стадии (b) показана упаковка вирусов таким образом, что каждая вирусная частица составлена из мутантного капсида, окружающего ген , кодирующий этот капсид, и очищена. Библиотеку капсидов затем подвергают селективному давлению  или . В этом аспекте способа направленной эволюции, представляющие интерес ткани или клеточный материал собирают для выделения вариантов AAV, которые успешно инфицировали эту мишень, и успешные вирусы выделяют. На стадии (c) показано обогащение успешных клонов со стадии 1 посредством повторяющегося отбора. На стадии (d) показано обогащение отобранных на стадии 2 генов , подвергнутых стадиям повторного внесения разнообразия и дополнительного отбора для повторяющегося увеличения приспособленности вируса. На стадии (e) показаны варианты, идентифицированные как лучшие в ходе стадий отбора вектора 1 и 2, которые можно промышленно получать в качестве рекомбинантных векторов AAV и характеризовать по уровню трансдукции различных типов клеток и тканей - мишеней. Благодаря характеру процесса направленной эволюции AAV, для вариантов, описанных в настоящем описании, уже показана способность к трансдукции клеток сетчатки и доставки генома (генома, кодирующего вариант гена ) в ходе процесса отбора.
[0035]
фигуре 2
На представлена схема фиксации образцов сетчатки, показывающая, где образцы, из которых амплифицированы вирусные геномы, собраны в пределах широкой области сетчатки.
[0036]
фигуре 3
На показана амплификация ПЦР вирусных геномов из ткани слоя ганглионарных клеток (GCL), внутреннего ядерного слоя (INL), фоторецепторного/внешнего ядерного слоя (ONL) и слоя пигментного эпителия сетчатки (RPE) из репрезентативного цикла отбора. Как в правый глаз (верхнее изображение), так и в левый глаз (нижнее изображение) инъецировали библиотеку. Отбирали образцы внутренней сетчатки (внутр.), средней сетчатки (средн.), и внешней/периферической сетчатки (внешн.). Полосы внутри красных рамок представляют успешную амплификацию вирусных геномов.
[0037]
фигуре 4A-4D
На показана частота мотивов в анализе секвенирования. На фигуре 4A представлен анализ секвенирования цикла 3. На фигуре 4B представлен анализ секвенирования цикла 4. На фигуре 4C представлен анализ секвенирования цикла 5. На фигуре 4D представлен анализ секвенирования цикла 6.
[0038]
фигуре 5
На представлена репрезентативная трехмерная модель AAV2, содержащего случайный гептамер после аминокислоты 587.
[0039]
фигуре 6A-6W
На представлено выравнивание SEQ ID NO:1-11 из AAV дикого типа, показывающее локализацию аминокислот между и среди принадлежащих к дикому типу (встречающихся в природе) серотипов AAV1, AAV2, AAV3A, AAV3B и AAV4-10.
[0040]
фигуре 7
11
На представлены флуоресцентные изображения глазного дна, полученные с использованием Heidelberg Spectralis™, для сетчатки африканской зеленой мартышки после введения в стекловидное тело 2×10 геномов вектора (гв) AAV2, доставляющего трансген GFP под контролем промотора CMV (AAV2.CMV.GFP). Изображения получали в исходной точке (A) и через 14 суток (B), 28 суток (C) и 42 суток (D) после инъекции.
[0041]
фигуре 8
11
На представлены флуоресцентные изображения глазного дна, полученные с использованием Heidelberg Spectralis™, для сетчатки африканской зеленой мартышки после введения в стекловидное тело 2×10 геномов вектора (гв) нового варианта AAV LAISDQTKHA+P34A, доставляющего трансген GFP под контролем промотора CMV (LAISDQTKHA+P34A.CMV.GFP). Изображения получали в исходной точке (A) и через 14 суток (B), 28 суток (C) и 42 суток (D) после инъекции.
[0042]
фигуре 9
11
12
На представлены флуоресцентные изображения глазного дна, полученные с использованием сетчатки яванских макаков после введения в стекловидное тело нового варианта AAV LAISDQTKHA+P34A, доставляющего трансген GFP под контролем промотора CAG (LAISDQTKHA+P34A.CAG.EGFP). (A) Изображение сетчатки обезьяны после инъекции в стекловидное тело 2×10 гв вектора, полученное через 14 суток (A1), 21 сутки (A2) и 28 суток (A3) после инъекции. (B) Изображение сетчатки обезьяны после инъекции в стекловидное тело 1×10 гв вектора, полученное через 14 суток (B1) и 21 сутки (B2) после инъекции.
[0043]
фигурах 10A-10E
12
На представлены результаты иммуногистохимического анализа сетчатки обезьяны после инъекции в стекловидное тело 1×10 гв нового варианта AAV LAISDQTKHA+P34A, доставляющего трансген GFP под контролем промотора CAG, проанализированной через три недели после инъекции. Все данные иммуногистохимии представлены рядом с соответствующим флуоресцентным изображением глазного дна, где красной рамкой обозначено, где приблизительно в сетчатке проведен анализ. Фигура 10A: Надежную трансдукцию пигментного эпителия сетчатки (RPE) и фоторецепторов наблюдали с использованием специфического для GFP антитела (красный). Иммуноокрашивание фоторецепторных колбочек с использованием антитела против M/L-опсина показано белым. Фигуры 10B и 10C: Надежную трансдукцию фоторецепторных палочек и колбочек (фигура 10B) и RPE (фигура 10C) наблюдали посредством прямой флуоресценции EGFP (зеленый) и посредством иммуногистохимии с использованием специфического для GFP антитела (красный). Меланосомы в RPE выглядят черными на изображении. Фигура 10D: Трансдукцию фоторецепторных колбочек (идентифицированную посредством M/L-опсина, белый) и ганглионарных клеток сетчатки (RGC) в фовее и поблизости, наблюдали посредством прямой флуоресценции EGFP (зеленый) и посредством иммуногистохимии с использованием специфического для GFP антитела (красный). Изображения на средних панелях представляют собой более высокое увеличение (63X) области, обозначенной белой рамкой на левой панели. Фигура 10E: Трансдукцию ганглионарных клеток сетчатки (RGC) и слоя ганглионарных клеток сетчатки наблюдали посредством прямой флуоресценции EGFP (правые панели, зеленый; нижняя правая панель представляет собой 63X увеличение верхней правой панели); на верхней левой панели показана область подсвечивания с высокой освещенностью.
[0044]
фигурах 11A-11F
in vitro
На представлены данные по трансдукции клеток пигментного эпителия сетчатки (RPE) человека  рекомбинантным AAV вирусом, содержащим новый вариант капсида AAV LAISDQTKHA+P34A и трансген GFP под контролем промотора CAG. Клетки, подвергнутые дифференцировке в клетки RPE из линии эмбриональных стволовых клеток человека (фигуры 11A и 11C) или из происходящих из фибробластов человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (FB-iPSC) (фигуры 11B и 11D), инфицировали с использованием нового варианта AAV LAISDQTKHA+P34A.CAG.GFP или контроля дикого типа AAV2.CAG.GFP. Фигуры 11A и 11B: Получение иммуфлуоресцентных изображений культур клеток через 7 суток после инфекции при MOI 500 показывает, что новый вариант капсида AAV (левые панели) трансдуцирует клетки RPE лучше, чем капсид AAV2 дикого типа (правые панели). Фигуры 11C и 11D: Количественная оценка процента положительных по GFP клеток RPE в каждой культуре посредством проточной цитометрии выявила, что новый вариант AAV капсида обеспечивает значимое, зависимое от дозы улучшение количества трансдуцированных клеток, по сравнению с капсидом AAV2 дикого типа, независимо от источника клеток. Фигуры 11E и 11F: Количественная оценка количества GFP в каждой культуре посредством Вестерн-блоттинга выявляет, что новый вариант AAV обеспечивает значимое улучшение экспрессии трансгена, по сравнению с капсидом дикого типа, независимо от источника клеток.
[0045]
фигурах 12A-12F
Напоказаны варианты осуществления белков против VEGF. На фиг. 12A показан дизайн афлиберцепта, который состоит из сигнального пептида Flt1 человека, домена 2 VEGFR1 и домена 3 VEGFR2, слитого с областью Fc IgG1 человека. На фиг. 12B-C показаны виды дизайна ранибизумаба, которые включают гибкий белковый линкер для перевода двухцепочечного антигенсвязывающего фрагмента (Fab) в одноцепочечный Fab (scFab). На фиг. 12B показана легкая-тяжелая (LH) форма, которая состоит из сигнального пептида легкой цепи каппа Ig человека, вариабельного легкого, константного легкого, вариабельного тяжелого и константного тяжелого 1 доменов ранибизумаба, связанных посредством гибкого пептида. На фиг. 12C показана тяжелая-легкая (HL) форма, которая является сходной, за исключением того, что сигнальный пептид происходит из тяжелой цепи IgG человека, и тяжелый и легкий домены расположены на противоположных сторонах от линкера, по сравнению с формой LH. На фиг. 12D показан дизайн бролуцизумаба, который включает вариабельный легкий и вариабельный тяжелый домены, связанных посредством гибкого пептида. На фиг. 12E показан дизайн sc-ранибизумаба LH-Fc, состоящий из формы scFab LH слитого с областью Fc IgG1 человека. На фиг. 12F показан дизайн бролуцизумаба-Fc, который состоит из бролуцизумаба, слитого с областью Fc IgG1 человека. Красные полосы представляют определяющие комплементарность области (CDR). Гены подвергали оптимизации по кодонному составу для улучшенной экспрессии в клетках человека и синтезировали в GeneArt или GenScript, и вставляли в вектор pAAV-CAG-SV40 pA между промотором CAG и полиA-сигналом SV40.
[0046]
фигурах 13A-B
На показан результат ELISA для детекции белков, связывающихся с VEGF. На фиг. 13A показано, что активность связывания VEGF детектирована в средах от клеток HEK293T, трансфицированных с использованием экспрессирующих афлиберцепт (SEQ ID NO:65) или одноцепочечный (sc) ранибизумаб (SEQ ID NO:67, 69 и 70) плазмид, но не от клеток после ложной трансфекции или трансфекции экспрессирующего GFP вектора. На фиг. 13B показано, что активность связывания VEGF детектирована в средах от клеток HEK293T, трансфицированных с использованием экспрессирующих афлиберцепт (SEQ ID NO:65), sc-ранибизумаб LH1 (SEQ ID NO:69) или бролуцизумаб (SEQ ID NO:74) плазмид, но не от клеток, трансфицированных экспрессирующим GFP вектором. Сигнал для бролуцизумаба является очень низким, наиболее вероятно, из-за плохого узнавания антителом для детекции. Планки погрешностей представляют стандартное отклонение для лунок после трансфекции в четырех повторах.
[0047]
фигурах 14A-B
На представлены репрезентативные Вестерн-блоты сред от клеток HEK293T, трансфицированных конструкциями против VEGF. На фиг. 14A показаны экспрессирующие афлиберцепт (SEQ ID NO:65) или sc-ранибизумаб (SEQ ID NO:67, 69 и 70) плазмиды. Клинические образцы как эйлеа, так и афлиберцепта, восстанавливаются до отдельных половин димера, с кажущейся молекулярной массой 58 кДа (включая гликозилирование). Клинический люцентис восстанавливается до отдельных легкой и тяжелой цепей по 24 кДа, в то время как белки sc-ранибизумаба не разделяются и мигрируют при приблизительно 48 кДа. Присутствует более высокое количество форм LH белка, по сравнению с формой HL белка, в соответствии с количественной оценкой белка, полученной посредством ELISA. На фиг. 14B показаны экспрессирующие афлиберцепт (SEQ ID NO:65), sc-ранибизумаб LH1 (SEQ ID NO:69) или бролуцизумаб (SEQ ID NO:74) плазмиды. Сигнал для бролуцизумаба является низким, наиболее вероятно, из-за плохого узнавания антителом для детекции. Белок мигрирует с корректной молекулярной массой 26 кДа. Отсутствовал сигнал в любом из образцов отрицательного контроля для ложной трансфекции или GFP.
[0048]
фигурах 15A-B
На показан результат конкурентного ELISA для детекции свободного VEGF после инкубации со средой от клеток HEK293T, трансфицированных конструкциями против VEGF. На фиг. 15A показаны экспрессирующие афлиберцепт (SEQ ID NO:65) или sc-ранибизумаб (SEQ ID NO:67, 69 и 70) плазмиды. Кривые ингибирования для четырех белков против VEGF из образцов после трансфекции являлись очень сходными с клиническими сравнительными белками эйлеа и люцентисом. Афлиберцепт и эйлеа конкурировали за VEGF более сильно, чем варианты sc-ранибизумаба и люцентис. Все три формы sc-ранибизумаба являлись почти идентичными. На фиг. 15B показаны экспрессирующие афлиберцепт (SEQ ID NO:65), sc-ранибизумаб LH1 (SEQ ID NO:69) или бролуцизумаб (SEQ ID NO:74) плазмиды. Не присутствовало активности конкуренции для образца отрицательного контроля GFP. Планки погрешностей представляют стандартное отклонение для лунок после трансфекции в двух повторах.
[0049]
фигуре 16
На показан результат анализа нейтрализации клеточного VEGF. В анализе используют клетки HEK293, экспрессирующие слитые белки рецептор VEGF/бета-галактозидаза, образующие активную бета-галактозидазу при связывании VEGF. Клетки инкубируют со смесями VEGF и различных разведений сред от клеток HEK293T, трансфицированных экспрессирующими афлиберцепт (SEQ ID NO:65) или sc-ранибизумаб (SEQ ID NO:69) плазмидами. Кривые ингибирования белков против VEGF из образцов после трансфекции показывают, что белки против VEGF нейтрализуют активность VEGF на уровнях, эквивалентных клиническим сравнительным белкам. Планки погрешностей представляют стандартное отклонение для лунок после анализа в двух повторах.
[0050]
фигуре 17A-B
На показан результат анализа нейтрализации клеточного VEGF, проведенного с использованием равных объемов среды от клеток HEK293T, трансфицированных с использованием плазмид против VEGF. На фиг. 17A показаны экспрессирующие GFP, афлиберцепт (SEQ ID NO:65), sc-ранибизумаб HL (SEQ ID NO:67) или sc-ранибизумаб LH1 (SEQ ID NO:69) плазмиды. Все оцененные конструкции против VEGF нейтрализовали VEGF. На фиг. 17B показаны экспрессирующие GFP, афлиберцепт (SEQ ID NO:65), sc-ранибизумаб LH1 (SEQ ID NO:69) и бролуцизумаб (SEQ ID NO:74) плазмиды. Все оцененные конструкции против VEGF нейтрализовали VEGF. Присутствовал слабый эффект матрицы для контрольного образца GFP при всех анализированных разведениях. Планки погрешностей представляют стандартное отклонение для лунок после трансфекции в двух повторах.
[0051]
фигуре 18
На показан результат ELISA для детекции VEGF в среде от клеток RPE, трансфицированных экспрессирующими афлиберцепт (SEQ ID NO:65) или sc-ранибизумаб (SEQ ID NO:67, 69, и 70) плазмидами. Наблюдали уменьшение уровней VEGF посредством как экспрессии афлиберцепта, так и экспрессии sc-ранибизумаба. Эффект на уровни VEGF всех трех форм sc-ранибизумаба являлся сходным. Планки погрешностей представляют стандартное отклонение для лунок после трансфекции в четырех повторах.
[0052]
фигуре 19
Напоказан результат ELISA для детекции VEGF в средах, собранных от клеток RPE через шесть или десять суток после трансдукции с использованием капсида R100 (имеющего аминокислотную последовательность, указанную как SEQ ID NO:42), экспрессирующего трансгены афлиберцепта (SEQ ID NO:65), sc-ранибизумаба (SEQ ID NO:67 и 69) или бролуцизумаба (SEQ ID NO:74). Эндогенный уровень VEGF, как показано в клетках, трансдуцированных контрольным вектором GFP, составлял 4500-8300 пг/мл. Трансдукция всеми векторами против VEGF приводила к не поддающимся детекции уровням VEGF в средах. Планки погрешностей представляют стандартное отклонение для лунок после трансфекции в четырех повторах.
[0053]
фигуре 20
Напоказан результат ELISA для детекции белков, которые связываются с VEGF в средах, собранных от клеток RPE через шесть или десять суток после трансдукции с использованием капсида R100 (имеющего аминокислотную последовательность, указанную как SEQ ID NO:42), экспрессирующего трансгены против VEGF. Активность связывания VEGF детектировали в средах от клеток, трансдуцированных экспрессирующими афлиберцепт (SEQ ID NO:65), sc-ранибизумаб (SEQ ID NO:67 и 69) или бролуцизумаб (SEQ ID NO:74) векторами, но не от клеток, трансдуцированных экспрессирующим GFP вектором. Сигнал для бролуцизумаба является очень низким, наиболее вероятно, из-за плохого узнавания антителом для детекции. Планки погрешностей представляют стандартное отклонение для лунок после трансфекции в четырех повторах.
[0054]
фигурах 21
Напредставлены репрезентативные Вестерн-блоты сред, собранных от клеток RPE через шесть или десять суток после трансдукции с использованием капсида R100 (имеющего аминокислотную последовательность, указанную как SEQ ID NO:42), экспрессирующего трансгены против VEGF. Клинические образцы как эйлеа, так и афлиберцепта (SEQ ID NO:65), восстанавливаются до отдельных половин димера, с кажущейся молекулярной массой 60 кДа (включая гликозилирование), как показано черной стрелкой. Не присутствовало полос с корректной подвижностью в образце отрицательного контроля GFP. Клинический люцентис восстанавливается до отдельных легкой и тяжелой цепей по 24 кДа, в то время как sc-ранибизумаб HL и LH (SEQ ID NO:67 и 69) не разделяются и мигрируют с кажущейся молекулярной массой 58 кДа, как показано серой стрелкой. Сигнал для бролуцизумаба (SEQ ID NO:74) является низким, наиболее вероятно, из-за плохого узнавания антителом для детекции. Белок мигрирует с корректной молекулярной массой 26 кДа, как показано заштрихованной стрелкой.
[0055]
фигуре 22
Напоказан результат конкурентного ELISA для детекции свободного VEGF после инкубации со средами, собранными от клеток RPE через шесть или десять суток после трансдукции с использованием капсида R100 (имеющего аминокислотную последовательность, указанную как SEQ ID NO:42), экспрессирующего трансгены против VEGF. Все конструкции против VEGF конкурировали за VEGF. Не присутствовало активности конкуренции для образца отрицательного контроля GFP. Уровни эндогенного VEGF являлись более высокими для наиболее низких разведений, из-за эндогенного VEGF, продуцированного клетками RPE. Планки погрешностей представляют стандартное отклонение для лунок после анализа в двух повторах.
[0056]
фигуре 23
Напоказан результат анализа нейтрализации клеточного VEGF, проведенного со средами, собранными от клеток RPE через шесть суток после трансдукции капсидом R100 (имеющим аминокислотную последовательность, указанную как SEQ ID NO:42) экспрессирующим трансгены против VEGF. Все оцененные конструкции против VEGF нейтрализовали VEGF. Не наблюдали нейтрализации VEGF для сред после контрольной трансдукции GFP. Планки погрешностей представляют стандартное отклонение для лунок после анализа в двух повторах.
ОПРЕДЕЛЕНИЯ
[0057]
Если не определено иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют такое же значение, какое является общепринятым для специалиста в области, к которой относится эта технология.
[0058]
rep
cap
cap
Аденоассоциированный вирус представляет собой непатогенный парвовирус, состоящий из одноцепочечного ДНК-генома 4,7 т.п.о. внутри безоболочечного, икосаэдрического капсида. Геном содержит три открытые рамки считывания (ORF), фланкированные инвертированными концевыми повторами (ITR), функционирующими в качестве вирусной точки начала репликации и сигнала упаковки. ORF  кодирует четыре неструктурных белка, играющие роли в вирусной репликации, регуляции транскрипции, сайт-специфической интеграции и сборке вириона. ORF  кодирует три структурных белка (VP 1-3), которые собираются с формированием 60-членного вирусного капсида. Наконец, ORF, присутствующая в качестве альтернативной рамки считывания внутри гена , образует активирующий сборку белок (AAP), вирусный белок, локализующий белки капсида AAV в ядрышке и функционирующий в процессе сборки капсида.
[0059]
Существует несколько природных (относящихся к «дикому типу») серотипов и более 100 известных вариантов AAV, каждый из которых отличается по аминокислотной последовательности, в частности, внутри гипервариабельных областей капсидных белков, и таким образом, по свойствам доставки их генов. Ни один AAV не был ассоциирован с каким-либо заболеванием человека, что делает рекомбинантный AAV привлекательным для клинических применений.
[0060]
Для целей описания в настоящем описании, термин «AAV» представляет собой сокращение для аденоассоциированного вируса, включая, без ограничения, сам вирус и его производные. За исключением случаев, когда указано иное, термин относится ко всем подтипам или серотипам и как к компетентным по репликации, так и к рекомбинантным формам. Термин «AAV» включает, без ограничения, AAV типа 1 (AAV-1 или AAV1), AAV типа 2 (AAV-2 или AAV2), AAV типа 3A (AAV-3A или AAV3A), AAV типа 3B (AAV-3B или AAV3B), AAV типа 4 (AAV-4 или AAV4), AAV типа 5 (AAV-5 или AAV5), AAV типа 6 (AAV-6 или AAV6), AAV типа 7 (AAV-7 или AAV7), AAV типа 8 (AAV-8 или AAV8), AAV типа 9 (AAV-9 или AAV9), AAV типа 10 (AAV-10 или AAV10, или AAVrh10), птичий AAV, бычий AAV, собачий AAV, козий AAV, лошадиный AAV, AAV приматов, не относящийся к приматам AAV и овечий AAV. «AAV приматов» относится к AAV, который инфицирует приматов, «не относящийся к приматам AAV» относится к AAV, который инфицирует не относящихся к приматам млекопитающих, «бычий AAV» относится к AAV, который инфицирует бычьих млекопитающих и т.д.
[0061]
Геномные последовательности различных серотипов AAV, так же как последовательности природных концевых повторов (TR), белков Rep и субъединиц капсида, известны в данной области. Такие последовательности можно обнаружить в литературе или в публичных базах данных, таких как GenBank. См., например, номера доступа в GenBank NC_002077.1 (AAV1), AF063497.1 (AAV1), NC_001401.2 (AAV2), AF043303.1 (AAV2), J01901.1 (AAV2), U48704.1 (AAV3A), NC_001729.1 (AAV3A), AF028705.1 (AAV3B), NC_001829.1 (AAV4), U89790.1 (AAV4), NC_006152,1 (AA5), AF085716.1 (AAV-5), AF028704.1 (AAV6), NC_006260.1 (AAV7), AF513851.1 (AAV7), AF513852.1 (AAV8) NC_006261.1 (AAV-8), AY530579.1 (AAV9), AAT46337 (AAV10) и AAO88208 (AAVrh10); содержание которых приведено в настоящем описании в качестве ссылки для описания последовательностей нуклеиновой кислоты и аминокислотных последовательностей AAV. См. также, например, Srivistava et al. (1983) J. Virology 45:555; Chiorini et al. (1998) J. Virology 71:6823; Chiorini et al. (1999) J. Virology 73: 1309; Bantel-Schaal et al. (1999) J. Virology 73:939; Xiao et al. (1999) J. Virology 73:3994; Muramatsu et al. (1996) Virology 221:208; Shade et. al. (1986) J. Virol. 58:921; Gao et al. (2002) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99: 11854; Moris et al. (2004) Virology 33:375-383; Международные патентные публикации WO 00/28061, WO 99/61601, WO 98/11244; и Патент США No. 6156303.
[0062]
Последовательности природных белков cap (капсидных), ассоциированных с серотипами AAV, известны в данной области и включают описанные в настоящем описании как AAV1 (SEQ ID NO:1), AAV2 (SEQ ID NO:2), AAV3A (SEQ ID NO:3), AAV3B (SEQ ID NO:4), AAV4 (SEQ ID NO:5), AAV5 (SEQ ID NO:6), AAV6 (SEQ ID NO:7), AAV7 (SEQ ID NO:8), AAV8 (SEQ ID NO:9), AAV9 (SEQ ID NO:10), AAV10 (SEQ ID NO:11) и AAVrh10 (SEQ ID NO:12). Термины «вариант капсидного белка AAV» или «вариант AAV» относятся к капсидному белку AAV, содержащему аминокислотную последовательность, включающую по меньшей мере одну модификацию или замену (включая делецию, вставку, точечную мутацию и т.д.), по сравнению с встречающейся в природе или относящейся к «дикому типу» последовательностью капсидного белка AAV, например, как указано в SEQ ID NO:1-12 в настоящем описании. Вариант капсидного белка AAV может иметь приблизительно 80% идентичности или более с аминокислотной последовательностью капсидного белка дикого типа, например, 85% идентичности или более, 90% идентичности или более, или 95% идентичности или более с аминокислотной последовательностью капсидного белка дикого типа, например, 98% или 99% идентичности с капсидным белком дикого типа. Вариант капсидного белка AAV может не являться капсидным белком дикого типа.
[0063]
Для целей по настоящему описанию, «вирион AAV» или «вирусная частица AAV» относится к вирусной частице, состоящей из по меньшей мере одного капсидного белка AAV и инкапсидированого полинуклеотида AAV.
[0064]
Для целей по настоящему описанию, термин «rAAV» представляет собой сокращение, которое относится к рекомбинантному аденоассоциированному вирусу. «Рекомбинантный», применительно к полинуклеотиду, означает, что полинуклеотид является продуктом различных комбинаций стадий клонирования, рестрикции или лигирования, и других способов, приводящих к получению конструкции, отличной от полинуклеотида, обнаруженного в природе. Рекомбинантный вирус представляет собой вирусную частицу, содержащую рекомбинантный полинуклеотид. Термины, соответственно, включают реплики исходной полинуклеотидной конструкции и потомство исходной вирусной конструкции.
[0065]
Термин «rAAV вектор» включает вирионы rAAV (т.е. вирусные частицы rAAV) (например, инфекционный вирион rAAV), которые по определению включают полинуклеотид rAAV; и также включает полинуклеотиды, кодирующие rAAV (например, одноцепочечный полинуклеотид, кодирующий rAAV (ss-rAAV); двухцепочечный полинуклеотид, кодирующий rAAV (ds-rAAV), например, плазмиды, кодирующие rAAV; и т.п.).
[0066]
Если вирион AAV содержит гетерологичный полинуклеотид (т.е. полинуклеотид, отличный от генома AAV дикого типа, например, трансген для доставки в клетку-мишень, средство для РНКи или средство на основе CRISPR для доставки в клетку-мишень и т.д.), его, как правило, обозначают как «рекомбинантный вирион AAV (rAAV)» или «вирусная частица rAAV». Как правило, гетерологичный полинуклеотид фланкирован по меньшей мере одной, и как правило, двумя, последовательностями инвертированного концевого повтора (ITR) AAV.
[0067]
rep
cap
rep
cap
Термин «упаковка» относится к серии внутриклеточных событий, приводящих к сборке и капсидированию частицы AAV. Гены «» и «» AAV относятся к полинуклеотидным последовательностям, кодирующим белки репликации и капсидирования аденоассоциированного вируса.  и  AAV обозначены в настоящем описании как «гены упаковки» AAV.
[0068]
Термин «вирус-помощник» для AAV относится к вирусу, позволяющему AAV (например, AAV дикого типа) подвергаться репликации и упаковке посредством клетки млекопитающего. Множество таких вирусов-помощников для AAV известны в данной области, включая аденовирусы, вирусы герпеса и поксвирусы, такие как вирус осповакцины. Аденовирусы включают ряд различных подгрупп, хотя аденовирус типа 5 из подгруппы C является наиболее общепринятым. Многочисленные аденовирусы, полученные от человека, не относящихся к человеку млекопитающих и птиц, известны и доступны из депозитариев, таких как ATCC. Вирусы семейства герпеса включают, например, вирусы простого герпеса (HSV) и вирусы Эпштейна-Барр (EBV), так же как цитомегаловирусы (CMV) и вирусы псевдобешенства (PRV); которые также доступны из депозитариев, таких как ATCC.
[0069]
Термин «функция(функции) вируса-помощника» относится к функции(функциям), кодированным в геноме вируса-помощника, которые позволяют репликацию и упаковку AAV (в сочетании с другими требованиями к репликации и упаковке, описанными в настоящем описании). Как описано в настоящем описании, «функцию вируса-помощника» можно обеспечивать рядом способов, включая предоставление вируса-помощника или предоставление, например, полинуклеотидных последовательностей, кодирующих необходимую функцию(функции), в транс-положении для клетки-продуцента. Например, плазмидным или другим экспрессирующим вектором, содержащим нуклеотидные последовательности, кодирующие один или более аденовирусных белков, трансфицируют клетку-продуцента, вместе с rAAV вектором.
[0070]
Термин «инфекционные» вирус или вирусная частица представляет собой те, которые содержат компетентно собранный вирусный капсид и являются способными к доставке полинуклеотидного компонента в клетку, для которой вид вируса является тропным. Термин не обязательно включает какую-либо способность к репликации вируса. Анализы инфекционных вирусных частиц описаны в другом месте в настоящем описании и в литературе в данной области. Вирусную инфекционность можно выражать как соотношение инфекционных вирусных частиц к общему количеству вирусных частиц. Способы определения соотношения инфекционных вирусных частиц к общему количеству вирусных частиц известны в данной области. См., например, Grainger et al. (2005) Mol. Ther. 11: S337 (описывающий анализ инфекционного титра TCID50); и Zolotukhin et al. (1999) Gene Ther. 6:973. См. также примеры.
[0071]
Термин «тропизм», в рамках изобретения, относится к предпочтительному нацеливанию вируса (например, AAV) на клетки конкретного вида хозяина или на конкретные типы клеток внутри вида-хозяина. Например, вирус, который может инфицировать клетки сердца, легкого, печени и мышц, имеет более широкий (т.е. увеличенный) тропизм, по сравнению с вирусом, который может инфицировать только клетки легкого и мышц. Тропизм может также включать зависимость вируса от конкретных типов молекул поверхности клеток хозяина. Например, некоторые вирусы могут инфицировать только клетки с поверхностными гликозаминогликанами, в то время как другие вирусы могут инфицировать только клетки с сиаловой кислотой (такие зависимости можно тестировать с использованием различных линий клеток с недостаточностью конкретных классов молекул в качестве потенциальных клеток-хозяев для вирусной инфекции). В некоторых случаях, тропизм вируса описывает относительные предпочтения вируса. Например, первый вирус может являться способным инфицировать все типы клеток, но является намного более успешным в инфекции клеток с поверхностными гликозаминогликанами. Второй вирус можно рассматривать как имеющий сходный (или идентичный) тропизм с первым вирусом, если второй вирус также предпочитает такие же характеристики (например, второй вирус также является более успешным в инфекции клеток с поверхностными гликозаминогликанами), даже если абсолютные значения эффективности трансдукции не являются сходными. Например, второй вирус может являться более эффективным, чем первый вирус, в инфекции каждого данного тестированного типа клеток, но если относительные предпочтения являются сходными (или идентичными), второй вирус все еще можно считать имеющим сходный (или идентичный) тропизм с первым вирусом. В некоторых вариантах осуществления, тропизм вириона, содержащего рассматриваемый вариант капсидного белка AAV, не является измененным относительно природного вириона. В некоторых вариантах осуществления, тропизм вириона, содержащего рассматриваемый вариант капсидного белка AAV, увеличен (т.е. расширен) относительно природного вириона. В некоторых вариантах осуществления, тропизм вириона, содержащего рассматриваемый вариант капсидного белка AAV, уменьшен относительно природного вириона.
[0072]
2
4
12
Термин «компетентный по репликации» вирус (например, компетентный по репликации AAV) относится к фенотипически дикому типу вируса, который является инфекционным и является также способным к репликации в инфицированной клетке (т.е. в присутствии вируса-помощника или функций вируса-помощника). В случае AAV, компетентность по репликации, как правило, требует присутствия функциональных генов упаковки AAV. Как правило, векторы rAAV, как описано в настоящем описании, являются некомпетентными по репликации в клетках млекопитающих (особенно в клетках человека) из-за отсутствия одного или более генов упаковки AAV. Как правило, такие векторы rAAV лишены последовательностей любых генов упаковки AAV, чтобы минимизировать возможность того, что компетентные по репликации AAV образуются посредством рекомбинации между генами упаковки AAV и входящим rAAV вектором. Во многих вариантах осуществления, препараты rAAV вектора, как описано в настоящем описании, представляют собой препараты, которые, если вообще содержат, содержат мало компетентного по репликации AAV (rcAAV, также обозначенного как RCA) (например, менее чем приблизительно 1 rcAAV на 10 частиц rAAV, менее чем приблизительно 1 rcAAV на 10 частиц rAAV, менее чем приблизительно 1 rcAAV на 10 частиц rAAV, менее чем приблизительно 1 rcAAV на 10 частиц rAAV или отсутствие rcAAV).
[0073]
Термин «полинуклеотид» относится к полимерной форме нуклеотидов любой длины, включая дезоксирибонуклеотиды или рибонуклеотиды, или их аналоги. Полинуклеотид может содержать модифицированные нуклеотиды, такие как метилированные нуклеотиды и аналоги нуклеотидов, и может прерываться ненуклеотидными компонентами. Если они присутствуют, модификации структуры нуклеотида можно вводить до или после сборки полимера. Термин полинуклеотид, в рамках изобретения, обозначает взаимозаменяемо двух- и одноцепочечные молекулы. Если иное не указано или не является необходимым, любой вариант осуществления в настоящем описании, который содержит полинуклеотид, включает как двухцепочечную форму, так и каждую из двух комплементарных одноцепочечных форм, как известно, или как прогнозируют, составляющих двухцепочечную форму.
[0074]
Полинуклеотид или полипептид имеет определенный процент «идентичности последовательности» с другим полинуклеотидом или полипептидом, что означает, что, при выравнивании, этот процент оснований или аминокислот являются одинаковыми при сравнении двух последовательностей. Сходство последовательностей можно определят рядом различных способов. Для определения идентичности последовательностей, последовательности можно выравнивать с использованием способов и компьютерных программы, включая BLAST, доступных во всемирной сети web на ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/. Другим алгоритмом выравнивания является FASTA, доступный в пакете программного обеспечения Genetics Computing Group (GCG) из Madison, Wisconsin, USA, находящейся в полной собственности дочерней компании Oxford Molecular Group, Inc. Другие способы выравнивания описаны в Methods in Enzymology, vol. 266: Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis (1996), ed. Doolittle, Academic Press, Inc., подразделение Harcourt Brace & Co., San Diego, California, USA. Особенный интерес представляют программы выравнивания, допускающие пропуски в последовательности. Алгоритм Смита-Уотермана является одним из типов алгоритма, допускающего пропуски в выравнивании последовательностей. См. Meth. Mol. Biol. 70: 173-187 (1997). Также, программу GAP с использованием способа выравнивания Нидлмана и Вунша можно использовать для выравнивания последовательностей. См. J. Mol. Biol. 48: 443- 453 (1970).
[0075]
Термин «ген» относится к полинуклеотиду, осуществляющему функцию некоторого рода в клетке. Например, ген может содержать открытую рамку считывания, способную кодировать продукт гена. Одним из примеров продукта гена является белок, транскрибированный и транслированный с гена. Другим примером продукта гена является РНК, например, функциональный продукт РНК, например, аптамер, интерферирующая РНК, рибосомальная РНК (рРНК), транспортная РНК (тРНК), некодирующая РНК (нкРНК), направляющая РНК для нуклеаз и т.д., которая транскрибируется, но не транслируется.
[0076]
Термин «продукт экспрессии гена» или «продукт гена» представляет собой молекулу, образующуюся в результате экспрессии конкретного гена, как определено выше. Продукты экспрессии генов включают, например, полипептид, аптамер, интерферирующую РНК, матричную РНК (мРНК), рРНК, тРНК, некодирующую РНК (нкРНК) и т.п.
[0077]
Термин «средство на основе миРНК» («малая интерферирующая» или «короткая интерферирующая РНК» (или миРНК)) представляет собой РНК-дуплекс нуклеотидов, нацеленный на представляющий интерес ген («ген-мишень»). «РНК-дуплекс» относится к структуре, образованной посредством комплементарного образования пар между двумя областями молекулы РНК, формирующего область двухцепочечной РНК (dsРНК). миРНК является «нацеленной» на ген, в том смысле, что нуклеотидная последовательность дуплексной части миРНК является комплементарной нуклеотидной последовательности гена-мишени. В некоторых вариантах осуществления, длина дуплекса миРНК составляет менее 30 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления, дуплекс может иметь длину 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11 или 10 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления, длина дуплекса составляет 19-25 нуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления, опосредованное миРНК нацеливание на ген осуществляют с использованием направляемой ДНК РНК-интерференции (ddРНКи), представляющей собой способ выключения гена, в котором используют конструкции ДНК для активации эндогенных путей РНК-интерференции (РНКи) в клетке животного. Такие конструкции ДНК разрабатывают для экспрессии самокомплементарных двухцепочечных РНК, как правило, короткошпилечных РНК (кшРНК), которые после процессинга приводят к выключению гена или генов-мишеней. Можно осуществлять выключение любой РНК, включая эндогенные мРНК или вирусные РНК, посредством разработки конструкций для экспрессии двухцепочечной РНК, комплементарной желательной мРНК-мишени. Таким образом, часть РНК-дуплекса из средства на основе миРНК может составлять часть короткошпилечной структуры, обозначенной как кшРНК. В дополнение к дуплексной части, шпилечная структура может содержать часть петли, расположенную между двумя последовательностями, формирующими дуплекс. Длина петли может меняться. В некоторых вариантах осуществления, петля имеет длину 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13 нуклеотидов. Шпилечная структура может также содержать 3'- или 5'-выступающие части. В некоторых вариантах осуществления, выступающая часть представляет собой 3'- или 5'-выступающую часть длиной 0, 1, 2, 3, 4 или 5 нуклеотидов. Как правило, уровень продукта экспрессии (например, мРНК, полипептида и т.д.) гена-мишени уменьшают посредством средства на основе миРНК (например, миРНК, кшРНК и т.д.), содержащего специфические двухцепочечные нуклеотидные последовательности, которые являются комплементарными фрагменту длиной по меньшей мере 19-25 нуклеотидов (например, последовательности из 20-21 нуклеотидов) транскрипта гена-мишени, включая 5'-нетранслируемую (UT) область, ORF или 3'-UT область. В некоторых вариантах осуществления, малые интерферирующие РНК имеют длину приблизительно 19-25 н. См., например, в заявках PCT WO 00/44895, WO 99/32619, WO 01/75164, WO 01/92513, WO 01/29058, WO 01/89304, WO 02/16620 и WO 02/29858; и Публикации патента США No. 2004/0023390 описания технологии миРНК. миРНК и/или кшРНК могут быть кодированы последовательностью нуклеиновой кислоты, и последовательность нуклеиновой кислоты может также включать промотор. Последовательность нуклеиновой кислоты может также включать сигнал полиаденилирования. В некоторых вариантах осуществления, сигнал полиаденилирования представляет собой синтетический минимальный сигнал полиаденилирования.
[0078]
Термин «антисмысловая РНК» включает РНК, которая является комплементарной продукту экспрессии гена. Например, антисмысловая РНК, нацеленная на специфическую мРНК, представляет собой средство на основе РНК (или может представлять собой модифицированную РНК), которая является комплементарной мРНК, где гибридизация антисмысловой РНК с мРНК изменяет экспрессию мРНК (например, посредством изменения стабильности РНК, изменения трансляции РНК и т.д.). В «антисмысловую РНК» включены также нуклеиновые кислоты, кодирующие антисмысловую РНК.
[0079]
Применительно к «средствам на основе CRISPR/Cas9», термин «CRISPR» включает ассоциированные с короткими палиндромными повторами, расположенными кластерами, равномерно удаленными друг от друга/CRISPR системы (Cas), вовлеченные в обеспечение для бактерий и архей адаптивного иммунитета против вирусов и плазмид с использованием CRISPR РНК (crРНК) для направленного выключения проникающих нуклеиновых кислот. Белок Cas9 (или его функциональный эквивалент и/или вариант, т.е. подобный Cas9 белок) естественным образом имеет активность ДНК-эндонуклеазы, которая зависит от ассоциации белка с двумя природными или синтетическими молекулами РНК, называемыми crРНК и tracrРНК (также называемыми направляющими РНК). В некоторых случаях, две молекулы являются ковалентно связанными с образованием одиночной молекулы (также называемой одиночной направляющей РНК («онРНК»)). Таким образом, Cas9 или подобный Cas9 белок вступает в ассоциацию с РНК, нацеленной на ДНК (где термин включает как конфигурацию направляющей РНК из двух молекул, так и конфигурацию направляющей РНК из одиночной молекулы), которая активирует Cas9 или подобный Cas9 белок и направляет белок на последовательность нуклеиновой кислоты - мишень.
[0080]
Если Cas9 или подобный Cas9 белок сохраняет природную ферментную функцию, он может разрезать ДНК-мишень с образованием двухцепочечного разрыва, что может приводить к изменению генома (т.е. редактированию: делеции, вставке (когда присутствует донорный полинуклеотид), замене и т.д.), таким образом, к изменению экспрессии гена. Некоторые варианты Cas9 (где варианты включены в термин подобный Cas9) изменены таким образом, что они имеют уменьшенную активность разрезания ДНК (в некоторых случаях, они разрезают одну цепь вместо обеих цепей ДНК-мишени, в то время как, в других случаях, они обладают от сильно уменьшенной до отсутствующей активности разрезания ДНК). Подобные Cas9 белки с уменьшенной активностью разрезания ДНК (даже без активности разрезания ДНК) все еще можно нацеливать на ДНК-мишень для блокирования активности РНК-полимеразы. Альтернативно, Cas9 или подобный Cas9 белок можно модифицировать посредством слияния домена активации транскрипции VP64 с белком Cas9 и совместно доставлять слитый белок с белком-помощником MS2-P65-HSF1 и одиночной направляющей РНК, содержащей РНК-аптамеры MS2 в тетрапетле и стебле-петле, для формирования в клетке комплекса медиатора синергической активации (Cas9-SAM), который активирует транскрипцию. Таким образом, ферментно неактивные подобные Cas9 белки можно нацеливать на специфическую локализацию в ДНК-мишени посредством РНК, нацеленной на ДНК, чтобы блокировать или активировать транскрипцию ДНК-мишени. Термин «средства на основе CRISPR/Cas9», в рамках изобретения, включает все формы CRISPR/Cas9, как описано выше или как известно в данной области.
[0081]
Подробную информацию по средствам на основе CRISPR можно обнаружить, например, в (a) Jinek et. al., Science. 2012 Aug 17;337(6096):816-21: «A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity»; (b) Qi et al., Cell. 2013 Feb 28; 152(5): 1173-83: «Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression» и (c) Патентной заявке США номер 13/842859 и заявке PCT номер PCT/US13/32589; полное содержание всех из которых приведено в настоящем описании в качестве ссылки. Таким образом, термин «средство на основе CRISPR», в рамках изобретения, включает любое средство (или нуклеиновую кислоту, кодирующую такое средство), содержащее природные и/или синтетические последовательности, которые можно использовать в системе на основе Cas9 (например, Cas9 или подобный Cas9 белок; любой компонент РНК, нацеленной на ДНК, например, РНК, подобную crРНК, РНК, подобную tracrРНК, одиночную направляющую РНК и т.д.; донорный полинуклеотид; и т.п.).
[0082]
Под «нуклеазами с цинковыми пальцами» (ZFN) понимают искусственные ДНК-эндонуклеазы, полученные посредством слияния связывающего ДНК домена с цинковым пальцем с расщепляющим ДНК доменом. ZFN можно конструировать для нацеливания на желательные последовательности ДНК, и это позволяет нуклеазам с цинковыми пальцами расщеплять уникальные последовательности-мишени. При введении в клетку, ZFN можно использовать для редактирования ДНК-мишени в клетке (например, в геноме клетки) посредством индукции образования двухцепочечных разрывов. Более широкую информацию по использованию ZFN, см., например, в: Asuri et al., Mol Ther. 2012 Feb; 20(2):329-38; Bibikova et al. Science. 2003 May 2;300(5620):764; Wood et al. Science. 2011 Jul 15;333(6040):307; Ochiai et al. Genes Cells. 2010 Aug; 15(8):875-85; Takasu et. al., Insect Biochem Mol Biol. 2010 Oct; 40(10):759-65; Ekker et al, Zebrafish 2008 Summer; 5(2): 121-3; Young et al, Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 Apr 26;108(17):7052-7; Goldberg et al, Cell. 2010 Mar 5;140(5):678-91; Geurts et al, Science. 2009 Jul 24;325(5939):433; Flisikowska et al, PLoS One. 2011;6(6):e21045. doi: 10.1371/journal.pone.0021045. Epub 2011 Jun 13; Hauschild et al, Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 Jul 19;108(29): 12013-7; и Yu et al, Cell Res. 2011 Nov; 21(l 1): 1638-40; описание всех из которых, применительно к ZFN, приведено в настоящем описании в качестве ссылки. Термин «средство на основе ZFN» включает нуклеазу с цинковыми пальцами и/или полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую нуклеазу с цинковыми пальцами.
[0083]
Термин средства на основе «эффекторных нуклеаз, подобных активаторам транскрипции», или «TALEN», относится к эффекторным нуклеазам, подобным активаторам транскрипции (TALEN), которые представляют собой искусственные ДНК-эндонуклеазы, полученные посредством слияния эффекторного связывающего ДНК домена TAL (подобного активатору транскрипции) с расщепляющим ДНК доменом. TALEN можно быстро конструировать для связывания практически с любой желательной последовательностью ДНК, и после введения в клетку, TALEN можно использовать для редактирования ДНК-мишени в клетке (например, в геноме клетки) посредством индукции образования двухцепочечных разрывов. Более широкую информацию по использованию TALEN см., например, в: Hockemeyer et al. Nat Biotechnol. 2011 Jul 7;29(8):731-4; Wood et al. Science. 2011 Jul 15;333(6040):307; Tesson et al. Nat Biotechnol. 2011 Aug 5;29(8):695-6; и Huang et. al., Nat Biotechnol. 2011 Aug 5;29(8):699-700; описание всех из которых, применительно к TALEN, приведено в настоящем описании в качестве ссылки. Термин «средство на основе TALEN» включает TALEN и/или полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую TALEN.
[0084]
Термин «контрольный элемент» или «контрольная последовательность» относится к нуклеотидной последовательности, вовлеченной во взаимодействие молекул, вносящее вклад в функциональную регуляцию полинуклеотида, включая репликацию, дупликацию, транскрипцию, сплайсинг, трансляцию или деградацию полинуклеотида. Регуляция может влиять на частоту, скорость или специфичность процесса, и может являться усиливающей или ингибирующей по характеру. Контрольные элементы, известные в данной области, включают, например, последовательности для регуляции транскрипции, такие как промоторы и энхансеры. Промотор представляет собой область ДНК, способную, в определенных условиях, связываться с РНК-полимеразой и инициировать транскрипцию кодирующей области, обычно локализованной ниже (в направлении 3') от промотора. Промоторы могут являться действующими повсеместно, т.е. активными во множестве типов клеток, например, промоторы CAG или CMV; или специфическими для ткани или клетки, например, промотор rho, который является активным в палочках, или промотор опсина, который является активным в колбочках.
[0085]
Термин «оперативно связанный» или «функционально связанный» относится к непосредственному соседству генетических элементов, где элементы находятся в взаимосвязи, позволяющей им функционировать ожидаемым образом. Например, промотор является функционально связанным с кодирующей областью, если промотор помогает инициации транскрипции кодирующей последовательности. Могут присутствовать промежуточные остатки между промотором и кодирующей областью, при условии, что эта функциональная взаимосвязь сохраняется.
[0086]
Термин «экспрессирующий вектор» включает вектор, содержащий полинуклеотидную область, которая кодирует представляющий интерес полипептид, и которую используют для осуществления экспрессии белка в предназначенной клетке-мишени. Экспрессирующий вектор может также содержать контрольные элементы, функционально связанные с кодирующей областью, для облегчения экспрессии белка в мишени. Комбинацию контрольных элементов и гена или генов, с которыми они функционально связаны для экспрессии, иногда обозначают как «экспрессирующая кассета», большое количество которых являются известными и доступными в данной области или могут быть легко сконструированы из компонентов, доступных в данной области.
[0087]
Термин «гетерологичный» обозначает происходящий из молекулы, генотипически отличной от остальной молекулы, с которой его сравнивают. Например, полинуклеотид, введенный посредством способов генной инженерии в плазмиду или вектор, полученные из отличного вида, представляет собой гетерологичный полинуклеотид. Промотор, удаленный из своей природной кодирующей последовательности и функционально связанный с кодирующей последовательностью, связанным с которой его не обнаруживают в природе, представляет собой гетерологичный промотор. Таким образом, например, rAAV, включающий гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую продукт гетерологичного гена, представляет собой rAAV, включающий полинуклеотид, в норме не включенный в природный AAV дикого типа, и кодируемый продукт гетерологичного гена представляет собой продукт гена, в норме не кодируемый природным AAV дикого типа.
[0088]
Термины «генетическое изменение» и «генетическая модификация» (и их грамматические варианты), используют взаимозаменяемо в настоящем описании для обозначения процесса, в котором генетический элемент (например, полинуклеотид) вводят в клетку, отличного от митоза или мейоза. Элемент может являться гетерологичным для клетки, или может представлять собой дополнительную копию или улучшенный вариант элемента, уже присутствующего в клетке. Генетическое изменение можно осуществлять, например, посредством трансфекции с использованием рекомбинантной плазмиды или другого полинуклеотида посредством любого способа, известного в данной области, такого как электропорация, преципитация фосфатом кальция или приведение в контакт с комплексом полинуклеотид-липосома. Генетическое изменение можно также осуществлять, например, посредством трансдукции или инфекции с использованием ДНК- или РНК-вируса или вирусного вектора. Как правило, генетический элемент вводят в хромосому или в минихромосому в клетке; но любое изменение, которое изменяет фенотип и/или генотип клетки и ее потомства, включено в этот термин.
[0089]
in vitro
Применительно к модификации клетки, термин «генетически модифицированный» или «трансформированный», или «трансфицированный», или «трансдуцированный» посредством экзогенной ДНК (например, посредством рекомбинантного вируса) относится к ситуации, когда такая ДНК введена внутрь клетки. Присутствие экзогенной ДНК приводит к постоянному или временному генетическому изменению. Трансформирующая ДНК может являться или может не являться интегрированной (ковалентно связанной) в геноме клетки. «Клон» представляет собой популяцию клеток, полученную из отдельной клетки или общего предка посредством митоза. «Линия клеток» представляет собой клон первичной клетки, который является способным к стабильному росту  в течение многих поколений.
[0090]
in vitro
in vivo
В рамках изобретения, говорят, что клетка является «стабильно» измененной, трансдуцированной, генетически модифицированной или трансформированной с использованием генетической последовательности, если последовательность является доступной для осуществления своей функции во время длительного культивирования клетки  и/или в течение длительного периода времени . Как правило, такая клетка является «наследственно» измененной (генетически модифицированной) в том отношении, что введено генетическое изменение, которое также поддается наследованию потомством измененной клетки.
[0091]
Термины «полипептид», «пептид» и «белок» используют взаимозаменяемо в настоящем описании для обозначения полимеров аминокислот любой длины. Термины также включают аминокислотный полимер, который был модифицирован; например, посредством образования дисульфидной связи, гликозилирования, липидирования, фосфорилирования или конъюгации с метящим компонентом. Полипептиды, такие как антиангиогенные полипептиды, нейропротективные полипептиды, и т.п., при обсуждении в контексте доставки продукта гена субъекту-млекопитающему, и композиций для этого, относятся к соответствующему интактному полипептиду, или любому его фрагменту или генетически модифицированному производному, которые сохраняют желательную биохимическую функцию интактного белка. Подобным образом, ссылки на нуклеиновые кислоты, кодирующие антиангиогенные полипептиды, нуклеиновые кислоты, кодирующие нейропротективные полипептиды, и другие такие нуклеиновые кислоты для использования в доставке продукта гена субъекту-млекопитающему (которые можно обозначать как «трансгены» для доставки в клетку-реципиента), включают полинуклеотиды, кодирующие интактный полипептид или любой фрагмент или генетически модифицированное производное, имеющие желательную биохимическую функцию.
[0092]
В рамках изобретения, «выделенная» плазмида, нуклеиновая кислота, вектор, вирус, вирион, клетка-хозяин, белок или другое вещество относится к препарату вещества, лишенного по меньшей мере некоторых из других компонентов, которые также могут присутствовать там, где вещество или сходное вещество встречается в природе или откуда оно первоначально получено. Таким образом, например, выделенное вещество можно получать с использованием способа очистки для его обогащения из смеси источников. Обогащение можно измерять на абсолютной основе, такой как масса на объем раствора, или можно измерять в отношении второго, потенциально создающего помехи вещества присутствующего в смеси источников. Варианты осуществления с увеличивающимся обогащением по этому описанию имеют увеличенную степень выделения. Выделенные плазмида, нуклеиновая кислота, вектор, вирус, клетка-хозяин или другое вещество являются, в некоторых вариантах осуществления, очищенными, например, с чистотой от приблизительно 80% до приблизительно 90%, с чистотой по меньшей мере приблизительно 90%, с чистотой по меньшей мере приблизительно 95%, с чистотой по меньшей мере приблизительно 98% или с чистотой по меньшей мере приблизительно 99%, или более.
[0093]
В рамках изобретения, термины «лечение», «обработка» и т.п., относятся к получению желательного фармакологического и/или физиологического эффекта. Эффект может являться профилактическим в отношении полного или частичного предотвращения заболевания или его симптома, и/или может являться терапевтическим в отношении частичного или полного излечения заболевания и/или неблагоприятного эффекта, приписываемого заболеванию. «Лечение», в рамках изобретения, относится к любому лечению заболевания у млекопитающего, в частности, у человека, и включает: (a) предотвращение возникновения заболевания (и/или симптомов, вызванных заболеванием) у субъекта, который может иметь предрасположенность к заболеванию или риск получения заболевания, но еще не диагностирован как имеющий его; (b) ингибирование заболевания (и/или симптомов, вызванных заболеванием), т.е. остановку его развития; и (c) облегчение заболевания (и/или симптомов, вызванных заболеванием), т.е. вызов регрессии заболевания (и/или симптомов, вызванных заболеванием), т.е. смягчение заболевания и/или одного или более симптомов заболевания. Например, рассматриваемые композиции и способы могут быть направлены на лечение заболевания сетчатки. Неограничивающие способы оценки заболеваний сетчатки и их лечения включают измерение функции сетчатки и ее изменений, например, изменений остроты зрения (например, наилучшей корригированной остроты зрения [BCVA], способности к передвижению, навигации, обнаружения и различения объектов), изменений поля зрения (например, статической и кинетической периметрии поля зрения), клиническое обследование (например, осмотр с помощью щелевой лампы переднего и заднего сегмента глаза), измерение способности отвечать на электрофизиологические сигналы всех длин волн на свету и в темноте (например, все формы электроретинографии (ERG) [полноформатную, мультифокальную и паттерны], все формы индуцированного зрительного потенциала (VEP), электроокулографию (EOG), оценку цветного зрения, адаптации к темноте и/или контрастной чувствительности; измерение изменений анатомии или состояния здоровья с использованием анатомических и/или фотографических показателей, например, оптической когерентной томографии (OCT), фотографирования глазного дна, лазерной сканирующей офтальмоскопии с системой адаптивной оптики, флуоресценции и/или аутофлуоресценции; измерение подвижности глазного яблока и движения глаз (например, нистагма, предпочтительности и стабильности фиксации), измерение зарегистрированных исходов (сообщенных пациентом изменений в зрительно-опосредованных и незрительно-опосредованных поведении и деятельности, сообщенных пациентом исходов [PRO], основанных на опросниках оценок качества жизни, повседневной деятельности и показателей неврологической функции (например, функциональной магнитно-резонансной томографии (MRI)).
[0094]
Термины «индивидуум», «хозяин», «субъект» и «пациент» использованы взаимозаменяемо в настоящем описании, и обозначают млекопитающего, включая, но без ограничения, людей; нечеловекообразных приматов, включая обезьян; млекопитающих спортивных животных (например, лошадей); млекопитающих сельскохозяйственных животных (например, овец, коз и т.д.); млекопитающих домашних животных (собак, кошек и т.д.); и грызунов (например, мышей, крыс и т.д.).
[0095]
В некоторых вариантах осуществления, индивидуум представляет собой человека, ранее естественным образом подвергшегося воздействию AAV и в результате, являющегося носителем антител против AAV (т.е. нейтрализующих AAV антител). В некоторых вариантах осуществления, индивидуум представляет собой человека, которому ранее вводили AAV вектор (и который в результате может являться носителем антител против AAV), и который нуждается в повторном введении вектора для лечения другого состояния или для дополнительного лечения того же самого состояния. На основании положительных результатов в клинических исследованиях, включающих доставку генов посредством AAV, например, в печень, мышцу и сетчатку - все ткани, подверженные влиянию нейтрализующих антител против этого носителя - существует множество таких терапевтических применений/заболеваний-мишеней.
[0096]
Термин «эффективное количество», в рамках изобретения, представляет собой количество, достаточное для получения преимущественных или желательных клинических результатов. Эффективное количество можно вводить за одно или несколько введений. Для целей по настоящему описанию, эффективное количество соединения (например, инфекционного вириона rAAV) представляет собой количество, достаточное для облегчения, смягчения, стабилизации, обращения, предотвращения, замедления или задержки прогрессирования (и/или ассоциированных симптомов) конкретного состояния заболевания (например, заболевания сетчатки). Соответственно, эффективное количество инфекционного вириона rAAV представляет собой количество инфекционного вириона rAAV, которое является способным к эффективной доставке гетерологичной нуклеиновой кислоты в клетку-мишень (или клетки-мишени) индивидуума. Эффективные количества можно определять преклинически, посредством, например, детекции в клетке или ткани продукта гена (РНК, белка), кодированного гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, с использованием способов, хорошо известных в данной области, например, RT-ПЦР, Вестерн-блоттинга, ELISA, флуоресценции или других считываний репортера, и т.п. Эффективные количества можно определять клинически, посредством, например, детекции изменения начала или прогрессирования заболевания с использованием способов, известных в данной области, например, аутофлуоресценции глазного дна, ангиографии с флуоресцеином, OCT, микропериметрии, адаптивной оптики и т.д. и т.п., как описано в настоящем описании и как известно в данной области.
[0097]
Термин «клетка сетчатки» относится в настоящем описании к любому из типов клеток, составляющих сетчатку, такому как, без ограничения, ганглионарные клетки сетчатки (RG), амакриновые клетки, горизонтальные клетки, биполярные клетки, фоторецепторные клетки, глиальные клетки Мюллера, микроглиальные клетки и пигментный эпителий сетчатки (RPE). Термин «фоторецепторные клетки» относится в настоящем описании, без ограничения, к клеткам палочкам или «палочкам», и к клеткам колбочкам или «колбочкам». Термин «клетки Мюллера» или «глия Мюллера» относится к глиальным клеткам, поддерживающим нейроны в сетчатке позвоночных.
[0098]
in vitro
in vivo
in vivo
Термин «направленная эволюция» относится к способу конструирования капсида,  и/или , имитирующему природную эволюцию посредством чередующихся циклов процессов внесения генетического разнообразия и отбора, таким образом, накопления преимущественных мутаций, все больше улучшающего функцию биомолекулы. Направленная эволюция часто включает способ , обозначенный как «биопэннинг», для отбора вариантов AAV из библиотеки, где варианты имеют более эффективный уровень инфекционности для представляющего интерес типа клетки или ткани.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
[0099]
rep
cap
cap
Аденоассоциированные вирусы (AAV) представляют собой семейство парвовирусов с одноцепочечным ДНК-геномом 4,7 т.п.о., содержащимся внутри безоболочечного капсида. Вирусный геном природного AAV имеет 2 инвертированных концевых повтора (ITR) - функционирующих в качестве вирусной точки начала репликации и сигнала упаковки - фланкирующих 2 первичные открытые рамки считывания (ORF):  (кодирующую белки, функционирующие в вирусной репликации, регуляции транскрипции, сайт-специфической интеграции и сборке вириона) и . ORF  кодирует 3 структурных белка, которые собираются с формированием 60-членного вирусного капсида. Выделено множество природных вариантов и серотипов AAV, и ни один не был ассоциирован с заболеванием человека.
[00100]
rep
cap
in vitro
in vivo
Fields’ Virology
Proc Natl Acad Sci U S A
Science
Proc Natl Acad Sci U S A
Proc Natl Acad Sci U S A
Virology
Nature
Virology
Gene Ther
Рекомбинантные варианты AAV можно использовать в качестве векторов для доставки гена, где представляющий интерес маркер или терапевтический ген вставляют между ITR вместо  и . Показано, что эти векторы трансдуцируют как делящиеся, так и не делящиеся клетки  и , и могут обеспечивать стабильную экспрессию трансгена в течение нескольких лет в пост-митотической ткани. См., например, Knipe DM, Howley PM. . Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, USA, 2007; Gao G-P, Alvira MR, Wang L, Calcedo R, Johnston J, Wilson JM. Novel adeno-associated viruses from rhesus monkeys as vectors for human gene therapy.  2002; 99: 11854-9; Atchison RW, Casto BC, Hammon WM. Adenovirus-Associated Defective Virus Particles.  1965; 149: 754-6; Hoggan MD, Blacklow NR, Rowe WP. Studies of small DNA viruses found in various adenovirus preparations: physical, biological, and immunological characteristics.  1966; 55: 1467-74; Blacklow NR, Hoggan MD, Rowe WP. Isolation of adenovirus-associated viruses from man.  1967; 58: 1410-5; Bantel-Schaal U, zur Hausen H. Characterization of the DNA of a defective human parvovirus isolated from a genital site.  1984; 134: 52-63; Mayor HD, Melnick JL. Small deoxyribonucleic acid-containing viruses (picodnavirus group).  1966; 210: 331-2; Mori S, Wang L, Takeuchi T, Kanda T. Two novel adeno-associated viruses from cynomolgus monkey: pseudotyping characterization of capsid protein. 2004; 330: 375-83; Flotte TR. Gene therapy progress and prospects: recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors. 2004; 11: 805-10.
[00101]
cap
Длярекомбинантного AAV (обозначенного в настоящем описании просто как «AAV») получены многообещающие результаты в увеличивающихся количествах клинических исследований. Однако, существуют недостатки доставки генов, которые могут ограничивать полезность AAV, такие как иммунные ответы против капсида, низкая трансдукция конкретных тканей, невозможность направленной доставки в конкретные типы клеток и относительно низкая емкость переноса. Во многих ситуациях, существует недостаточное знание механизмов для эффективного расширения рационального дизайна с возможностью улучшения AAV. В качестве альтернативы, появилась направленная эволюция в качестве способа получения новых вариантов AAV, удовлетворяющих конкретным биомедицинским нуждам. В способах направленной эволюции используют способы внесения генетического разнообразия и отбора, чтобы позволять накопление преимущественных мутаций, все больше улучшающее функцию биомолекулы. В этом способе, в гены  AAV дикого типа вносят разнообразие несколькими способами для получения больших геномных библиотек, которые упаковывают для получения библиотек вирусных частиц, и затем селективное давление прилагают для выделения новых вариантов, которые могут преодолевать барьеры для доставки генов. Важно, что необязательно знать механистическую базу, лежащую в основе проблемы доставки гена, для направленной эволюции функции, что может, таким образом, ускорять разработку улучшенных векторов.
[00102]
cap
cap
in vitro
in vivo
cap
cap
cap
th
Как правило, варианты, описанные в настоящем описании, получены с использованием библиотеки и/или библиотек AAV. Такие библиотека или библиотеки AAV получена/получены посредством мутагенеза гена , гена, кодирующего структурные белки капсида AAV, посредством ряда способов направленной эволюции, известных и легко доступных специалисту в области генной инженерии вирусов. См., например, Bartel et al. Am. Soc. Gene Cell Ther. 15 Annu. Meet. 20, S140 (2012); Bowles, D. et al. J. Virol. 77, 423-432 (2003); Gray et al. Mol. Ther. 18, 570-578 (2010); Grimm, D. et al. J. Virol. 82, 5887-5911; Koerber, J. T. et al. Mol. Ther. 16, 1703-1709 (2008); Li W. et al. Mol. Ther. 16, 1252-1260 (2008); Koerber, J. T. et al. Methods Mol. Biol. 434, 161-170 (2008); Koerber, J. T. et al. Hum. Gene Ther. 18, 367-378 (2007); и Koerber, J. T. et al. Mol. Ther. 17, 2088-2095 (2009). Такие способы, без ограничения, являются следующими: i) ПЦР с пониженной точностью для введения случайных точечных мутаций в открытую рамку считывания (ORF)  AAV с предопределенной, модифицируемой частотой; ii) рекомбинация или «перетасовка ДНК» вирусов или  для получения случайных химер генов  AAV для получения библиотеки генов с множеством серотипов AAV; iii) вставки случайных пептидов в определенные участки капсида посредством лигирования вырожденных олигонуклеотидов в ORF; iv) определенные вставки кодирующих пептид последовательностей в случайные локализации в ORF  AAV посредством мутагенеза с использованием транспозонов; v) замена поверхностных петель капсидов AAV библиотеками пептидных последовательностей, разработанных биоинформатически, на основании уровня консервативности каждого положения аминокислоты среди природных серотипов и вариантов AAV, для получения библиотек «замены петель»; vi) случайная замена аминокислот в положениях вырожденности между серотипами AAV для получения библиотек предковых вариантов (Santiago-Ortiz et al., 2015); и комбинация таких способов.
[00103]
С использованием перетасовкиДНК получают химеры с комбинированием их исходных свойств уникальными и часто преимущественными способами; однако, некоторые могут являться неспособными к упаковке, что, фактически, уменьшает разнообразие библиотеки. Концентрирования разнообразия библиотеки достигают способами вставки пептидов, такими как, без ограничения, iii-iv) выше. Разнообразие библиотеки концентрируют также такими способами, как v) выше, и такое концентрирование направлено на множество гипервариабельных областей, лежащих на поверхности экспонированных петель капсида AAV. В то время как многими способами получают варианты капсидов с мутациями только в небольшой области капсида, эти способы можно объединять с дополнительными способами мутагенеза для модификации полного капсида.
[00104]
cap
in vitro
in vivo
После того, как библиотека или библиотеки AAV получена/получены, вирусы затем упаковывают таким образом, что каждая частица AAV состоит из мутантного капсида, окружающего ген , кодирующий этот капсид, и очищают. Варианты библиотеки затем подвергают селективному давлению способами  и/или , известными и легко доступным специалисту в области AAV. См., например, Maheshri, N. et al. Nature Biotech. 24, 198-204 (2006); Dalkara, D. et al. Sci. Transl. Med. 5, 189ra76 (2013); Lisowski, L. et al. Nature. 506, 382-286 (2013); Yang, L. et al. PNAS. 106, 3946-3951 (2009); Gao, G. et al. Mol. Ther. 13, 77-87 (2006); и Bell, P. et al. Hum. Gene. Ther. 22, 985-997 (2011). Например, без ограничения, варианты AAV можно отбирать с использованием i) аффинных колонок, посредством элюции с которых различных фракций получают варианты с измененными свойствами связывания; ii) первичных клеток - выделенных из образцов ткани или иммортализованных линий клеток, имитирующих поведение клеток в организме человека - посредством чего получают варианты AAV с увеличенной эффективностью и/или тканеспецифичностью; iii) моделей на животных - которые имитируют среду клинической генотерапии - посредством чего получают варианты AAV, успешно инфицировавшие ткань-мишень; iv) модели человеческих ксенотрансплантатов, посредством которых получают варианты AAV, инфицировавшие трансплантированные клетки человека; и/или комбинации способов их отбора.
[00105]
cap
После отбора вирусов, их можно выделять известными способами, такими как, без ограничения, опосредованная аденовирусом репликация, амплификация ПЦР, секвенирование нового поколения и клонирование, и т.п. Затем клоны вирусов обогащают посредством повторяющихся циклов способов отбора, и ДНК AAV выделяют для выделения представляющих интерес отобранных вариантов генов . Такие отобранные варианты можно подвергать дополнительным модификации или мутагенезу, и таким образом, они служат новой исходной точкой для дополнительных стадий отбора для ступенчатого увеличения приспособленности AAV вируса. Однако, в конкретных случаях, успешные капсиды получены без дополнительных мутаций.
[00106]
in vivo
Варианты AAV, описанные в настоящем описании, получены, по меньшей мере частично, с использованием способа направленной эволюции , такого как способы, описанные выше, включающие использование скрининга в сетчатке приматов после введения в стекловидное тело. Таким образом, варианты капсидов AAV, описанные в настоящем описании, содержат одну или более модификаций в аминокислотной последовательности, обеспечивающих более эффективную трансдукцию клеток сетчатки приматов, чем соответствующий исходный капсидный белок AAV. В рамках изобретения, «соответствующий исходный капсидный белок AAV» относится к капсидному белку AAV из того же серотипа AAV дикого типа или варианта серотипа AAV, что и рассматриваемый вариант капсидного белка AAV, но не содержащему одну или более модификаций аминокислотной последовательности рассматриваемого варианта капсидного белка AAV.
[00107]
Mol. Ther.
J. Virol.
Mol. Ther.
В некоторых вариантах осуществления, рассматриваемый вариант капсидного белка AAV содержит гетерологичный пептид от приблизительно 5 аминокислот до приблизительно 20 аминокислот, вставленный посредством ковалентной связи в петлю GH или петлю IV капсидного белка AAV, по сравнению с соответствующим исходным капсидным белком AAV. Под «петлей GH» или петлей IV капсидного белка AAV понимают доступную для растворителя часть, обозначаемую в данной области как петля GH или петля IV, капсидного белка AAV. Информацию о петле GH/петле IV капсида AAV, см., например, в van Vliet et al. (2006) 14:809; Padron et al. (2005) 79:5047; и Shen et al. (2007) 15:1955. Таким образом, например, участок вставки может находиться в пределах приблизительно аминокислот 411-650 капсидного белка VP1 AAV. Например, участок вставки может находиться в пределах аминокислот 571-612 VP1 AAV1, аминокислот 570-611 VP1 AAV2, в пределах аминокислот 571-612 VP1 AAV3A, в пределах аминокислот 571-612 VP1 AAV3B, в пределах аминокислот 569-610 VP1 AAV4, в пределах аминокислот 560-601 VP1 AAV5, в пределах аминокислот 571-612 VP1 AAV6, в пределах аминокислот 572-613 VP1 AAV7, в пределах аминокислот 573-614 VP1 AAV8, в пределах аминокислот 571-612 VP1 AAV9 или в пределах аминокислот 573-614 VP1 AAV10 VP1, или соответствующих аминокислот любого его варианта. Специалисту в данной области известно, на основании сравнения аминокислотных последовательностей капсидных белков из различных серотипов AAV, где участок вставки, «соответствующий аминокислотам AAV2», может находиться в капсидном белке из любого данного серотипа AAV. См. также на фигуре 6 выравнивание SEQ ID NO:1-11 из AAV дикого типа, показывающее локализацию аминокислот между и среди принадлежащих к дикому типу (встречающихся в природе) серотипов AAV1, AAV2, AAV3A, AAV3B и AAV4-10.
[00108]
В конкретных вариантах осуществления, участок вставки представляет собой одиночный участок вставки между двумя соседними аминокислотами, локализованный между аминокислотами 570-614 VP1 из любого серотипа AAV дикого типа или варианта AAV, например, участок вставки находится между двумя соседними аминокислотами, локализованными в пределах аминокислот 570-610, аминокислот 580-600, аминокислот 570-575, аминокислот 575-580, аминокислот 580-585, аминокислот 585-590, аминокислот 590-600, или аминокислот 600-614 VP1 из любого серотипа или варианта AAV. Например, участок вставки может находиться между аминокислотами 580 и 581, аминокислотами 581 и 582, аминокислотами 583 и 584, аминокислотами 584 и 585, аминокислотами 585 и 586, аминокислотами 586 и 587, аминокислотами 587 и 588, аминокислотами 588 и 589 или аминокислотами 589 и 590. The участок вставки может находиться между аминокислотами 575 и 576, аминокислотами 576 и 577, аминокислотами 577 и 578, аминокислотами 578 и 579 или аминокислотами 579 и 580. Участок вставки может находиться между аминокислотами 590 и 591, аминокислотами 591 и 592, аминокислотами 592 и 593, аминокислотами 593 и 594, аминокислотами 594 и 595, аминокислотами 595 и 596, аминокислотами 596 и 597, аминокислотами 597 и 598, аминокислотами 598 и 599 или аминокислотами 599 и 600. Например, участок вставки может находиться между аминокислотами 587 и 588 AAV2, между аминокислотами 590 и 591 AAV1, между аминокислотами 588 и 589 AAV3A, между аминокислотами 588 и 589 AAV3B, между аминокислотами 584 и 585 AAV4, между аминокислотами 575 и 576 AAV5, между аминокислотами 590 и 591 AAV6, между аминокислотами 589 и 590 AAV7, между аминокислотами 590 и 591 AAV8, между аминокислотами 588 и 589 AAV9, или между аминокислотами 588 и 589 AAV10.
[00109]
В некоторых вариантах осуществления, пептидная вставка, описанная в настоящем описании, имеет длину 5 аминокислот, 6 аминокислот, 7 аминокислот, 8 аминокислот, 9 аминокислот, 10 аминокислот, 11 аминокислот, 12 аминокислот, 13 аминокислот, 14 аминокислот, 15 аминокислот, 16 аминокислот, 17 аминокислот, 18 аминокислот, 19 аминокислот или 20 аминокислот. В другом варианте осуществления, пептидная вставка, описанная в настоящем описании, содержит от 1 до 4 спейсерных аминокислот на амино-конце (N-конце) и/или на карбокси-конце (C-конце) любой из пептидных вставок, описанных в настоящем описании. Иллюстративные спейсерные аминокислоты включают, без ограничения, лейцин (L), аланин (A), глицин (G), серин (S), треонин (T) и пролин (P). В конкретных вариантах осуществления, пептидная вставка содержит 2 спейсерные аминокислоты на N-конце и 2 спейсерные аминокислоты на C-конце. В других вариантах осуществления, пептидная вставка содержит 2 спейсерные аминокислоты на N-конце и 1 спейсерную аминокислоту на C-конце.
[00110]
Пептидные вставки, описанные в настоящем описании, ранее не были описаны и/или вставлены в капсид AAV. Без намерения быть связанными с теорией, присутствие любой из описанных пептидных вставок может действовать для уменьшения аффинности варианта капсида для гепаринсульфата, что, вероятно, уменьшает связывание с внеклеточным матриксом перед сетчаткой приматов. Кроме того, мотивы пептидной вставки, описанные в настоящем описании, могут обеспечивать улучшенную трансдукцию клеток сетчатки приматов посредством добавления домена для связывания рецептора на поверхности клеток.
[00111]
В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, пептидная вставка содержит аминокислотную последовательность по любой из формул ниже.
[00112]
В некоторых аспектах, пептидная вставка может представлять собой пептид длиной 7-10 аминокислот, формулы 1a:
1
2
1
2
3
4
5
6
7
3
YYXXXXXXXY,
1
3
где каждый из Y-Y, если присутствует, независимо выбран из Ala, Leu, Gly, Ser, Thr, Pro
1
X выбран из Gln, Asn, His, Ile и Ala
2
X выбран из Ala, Gln, Asp, Ser, Lys и Pro
3
X выбран из Asp, Ile, Thr и Asn
4
X выбран из Thr, Ser, Tyr, Gln, Glu и Ala
5
X выбран из Thr, Lys и Asn
6
X выбран из Lys, Asn и Glu
7
X выбран из Asn, Thr, Ile, His, Asp и Ala.
[00113]
В конкретных вариантах осуществления, пептидная вставка формулы 1a содержит аминокислотную последовательность, выбранную из QADTTKN (SEQ ID NO:13), ISDQTKH (SEQ ID NO:14), ASDSTKA (SEQ ID NO:15), NQDYTKT (SEQ NO:16), HDITKNI (SEQ ID NO:17), HPDTTKN (SEQ ID NO:18), HQDTTKN (SEQ ID NO:19), NKTTNKD (SEQ ID NO:20), ISNENEH (SEQ ID NO:21) и QANANEN (SEQ ID NO:22).
[00114]
В других аспектах, пептидная вставка может представлять собой пептид длиной 7-10 аминокислот, формулы 1b:
1
2
1
2
3
4
5
6
7
3
YYXXXXXXXY,
1
3
где каждый из Y-Y, если присутствует, независимо выбран из Ala, Leu, Gly, Ser, Thr, Pro
1
X выбран из Gln, Asn, His и Ile
2
X выбран из Ala, Gln, Asp и Ser
3
X выбран из Asp и Ile
4
X выбран из Thr, Tyr и Gln
5
X выбран из Thr и Lys
6
X выбран из Lys и Asn
7
X выбран из Asn, Thr, Ile и His
[00115]
В конкретных вариантах осуществления, пептидная вставка формулы 1b содержит аминокислотную последовательность, выбранную из QADTTKN (SEQ ID NO:13), ISDQTKH (SEQ ID NO:14), NQDYTKT (SEQ NO:16), HDITKNI (SEQ ID NO:17) и HQDTTKN (SEQ ID NO:19).
[00116]
В других аспектах, пептидная вставка может представлять собой пептид длиной 7-10 аминокислот, формулы 1c
1
2
1
2
3
4
3
YYXXAspXThrLysXY,
1
3
где каждый из Y-Y, если присутствует, независимо выбран из Ala, Leu, Gly, Ser, Thr, Pro
1
X выбран из Gln, Asn, His и Ile
2
X выбран из Ala, Gln и Ser
3
X выбран из Thr, Tyr и Gln
4
X выбран из Asn, Thr и His
[00117]
В конкретных вариантах осуществления, пептидная вставка формулы 1c содержит аминокислотную последовательность, выбранную из QADTTKN (SEQ ID NO:13), ISDQTKH (SEQ ID NO:14), NQDYTKT (SEQ NO:16) и HQDTTKN (SEQ ID NO:19).
[00118]
В других аспектах, пептидная вставка может представлять собой пептид длиной 7-10 аминокислот, формулы 1d:
1
2
1
2
3
4
3
YYXXAspXThrThrXY,
1
3
где каждый из Y-Y, если присутствует, независимо выбран из Ala, Leu, Gly, Ser, Thr, Pro
1
X выбран из Gln и Ile
2
X выбран из Ala и Ser
3
X выбран из Thr и Gln
4
X выбран из Asn и His
[00119]
В конкретных вариантах осуществления, пептидная вставка формулы 1d содержит аминокислотную последовательность, выбранную из QADTTKN (SEQ ID NO:13) и ISDQTKH (SEQ ID NO:14).
[00120]
В других аспектах, пептидная вставка может представлять собой пептид длиной 7-11 аминокислот, формулы Ie
1
2
1
2
3
4
3
YYXXAsnXAsnGluXY,
1
3
где каждый из Y-Y, если присутствует, независимо выбран из Ala, Leu, Gly, Ser, Thr, Pro
1
X выбран из Gln и Ile
2
X выбран из Ala и Ser
3
X выбран из Glu и Ala
4
X выбран из Asn и His
[00121]
В других вариантах осуществления, пептидная вставка формулы 1e содержит аминокислотную последовательность, выбранную из ISNENEH (SEQ ID NO:21) и QANANEN (SEQ ID NO:22).
[00122]
В другом варианте осуществления, пептидная вставка может представлять собой пептид длиной 7-11 аминокислот, формулы IIa:
1
2
1
2
3
4
3
YYXXDXTKXY,
1
3
где каждый из Y-Y, если присутствует, независимо выбран из Ala, Leu, Gly, Ser, Thr, Pro
1
X выбран из Q, N, A, H и I;
2
X выбран из Q, A, P и S;
3
X выбран из T, Y, S и Q; и
4
X выбран из T, N, A и H.
[00123]
1
2
3
4
В следующем варианте осуществления пептидной вставки из аминокислотной последовательности формулы XXDXTKX, пептидная вставка выбрана из группы, состоящей из QADTTKN (SEQ ID NO:13), ISDQTKH (SEQ ID NO:14), ASDSTKA, NQDYTKT (SEQ NO:16), HQDTTKN (SEQ ID NO:19) и HPDTTKN (SEQ ID NO:18).
[00124]
В некоторых таких вариантах осуществления, пептидная вставка может представлять собой пептид длиной 7-11 аминокислот, формулы IIb:
1
2
1
2
3
4
3
YYXXDXTKXY,
[00125]
1
3
где каждый из Y-Y, если присутствует, независимо выбран из Ala, Leu, Gly, Ser, Thr, Pro
1
X выбран из N, A и H;
2
X выбран из Q, P и S;
3
X выбран из T, Y и S; и
4
X выбран из T, N и A.
[00126]
1
2
3
4
В следующем варианте осуществления пептидной вставки из аминокислотной последовательности формулы XXDXTKX, пептидная вставка выбрана из группы, состоящей из ASDSTKA, NQDYTKT (SEQ NO:16), HQDTTKN (SEQ ID NO:19), и HPDTTKN (SEQ ID NO:18).
[00127]
В других вариантах осуществления, пептидная вставка содержит аминокислотную последовательность, выбранную из KDRAPST (SEQ ID NO:26), TNRTSPD (SEQ ID NO:24), PNSTHGS (SEQ ID NO:25) и GKSKVID (SEQ ID NO:23).
[00128]
В некоторых вариантах осуществления, пептидная вставка содержит аминокислотную последовательность, выбранную из ASDSTKA (SEQ ID NO:15), QANANEN (SEQ ID NO:22), QADTTKN (SEQ ID NO:13), ISDQTKH (SEQ ID NO:14), NQDYTKT (SEQ ID NO:16), HDITKNI (SEQ ID NO:17), HPDTTKN (SEQ ID NO:18), HQDTTKN (SEQ ID NO:19), NKTTNKD (SEQ ID NO:20), ISNENEH (SEQ ID NO:21), GKSKVID (SEQ ID NO:23), TNRTSPD (SEQ ID NO:24), PNSTHGS (SEQ ID NO:25) и KDRAPST (SEQ ID NO:26).
[00129]
1
3
В других предпочтительных вариантах осуществления, пептидная вставка имеет от 1 до 3 спейсерных аминокислот (Y-Y) на амино- и/или карбокси-конце аминокислотной последовательности, выбранной из QADTTKN (SEQ ID NO:13), ISDQTKH (SEQ ID NO:14), ASDSTKA (SEQ ID NO:15), NQDYTKT (SEQ ID NO:16), HDITKNI (SEQ ID NO:17), HPDTTKN (SEQ ID NO:18), HQDTTKN (SEQ ID NO:19), NKTTNKD (SEQ ID NO:20), ISNENEH (SEQ ID NO:21), QANANEN (SEQ ID NO:22), GKSKVID (SEQ ID NO:23), TNRTSPD (SEQ ID NO:24), PNSTHGS (SEQ ID NO:25) и KDRAPST (SEQ ID NO:26). В конкретных таких вариантах осуществления, пептидная вставка выбрана из группы, состоящей из: LAQADTTKNA (SEQ ID NO:27), LAISDQTKHA (SEQ ID NO:28), LGISDQTKHA (SEQ ID NO:29), LAASDSTKAA (SEQ ID NO:30), LANQDYTKTA (SEQ ID NO:31), LAHDITKNIA (SEQ ID NO:32), LAHPDTTKNA (SEQ ID NO:33), LAHQDTTKNA (SEQ ID NO:34), LANKTTNKDA (SEQ ID NO:35), LPISNENEHA (SEQ ID NO:36), LPQANANENA (SEQ ID NO:37), LAGKSKVIDA (SEQ ID NO:38), LATNRTSPDA (SEQ ID NO:39), LAPNSTHGSA (SEQ ID NO:40) и LAKDRAPSTA (SEQ ID NO:41).
[00130]
В некоторых вариантах осуществления, рассматриваемый вариант капсидного белка AAV не включает никаких других модификаций аминокислотной последовательности, отличных от пептидной вставки от приблизительно 5 аминокислот до приблизительно 20 аминокислот в петле GH или петле IV. Например, в некоторых вариантах осуществления, рассматриваемый вариант капсидного белка AAV содержит пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из QADTTKN (SEQ ID NO:13), ISDQTKH (SEQ ID NO:14), ASDSTKA (SEQ ID NO:15), NQDYTKT (SEQ ID NO:16), HDITKNI (SEQ ID NO:17), HPDTTKN (SEQ ID NO:18), HQDTTKN (SEQ ID NO:19), NKTTNKD (SEQ ID NO:20), ISNENEH (SEQ ID NO:21), QANANEN (SEQ ID NO:22), GKSKVID (SEQ ID NO:23), TNRTSPD (SEQ ID NO:24), PNSTHGS (SEQ ID NO:25), KDRAPST (SEQ ID NO:26), LAQADTTKNA (SEQ ID NO:27), LAISDQTKHA (SEQ ID NO:28), LGISDQTKHA (SEQ ID NO:29), LAASDSTKAA (SEQ ID NO:30), LANQDYTKTA (SEQ ID NO:31), LAHDITKNIA (SEQ ID NO:32), LAHPDTTKNA (SEQ ID NO:33), LAHQDTTKNA (SEQ ID NO:34), LANKTTNKDA (SEQ ID NO:35), LPISNENEHA (SEQ ID NO:36), LPQANANENA (SEQ ID NO:37), LAGKSKVIDA (SEQ ID NO:38), LATNRTSPDA (SEQ ID NO:39), LAPNSTHGSA (SEQ ID NO:40) и LAKDRAPSTA (SEQ ID NO:41), и вариант капсида AAV не включает никаких других аминокислотных замен, вставок или делеций (т.е. вариант капсидного белка AAV содержит указанную вставку и является в ином отношении идентичным соответствующему капсидному белку AAV). Другими словами, вариант капсидного белка AAV, содержащий указанную вставку, является в ином отношении идентичным исходному капсидному белку AAV, в который вставлен пептид. В качестве другого примера, рассматриваемый вариант капсидного белка AAV содержит пептидную вставку, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из QADTTKN (SEQ ID NO:13), ISDQTKH (SEQ ID NO:14), ASDSTKA (SEQ ID NO:15), NQDYTKT (SEQ ID NO:16), HDITKNI (SEQ ID NO:17), HPDTTKN (SEQ ID NO:18), HQDTTKN (SEQ ID NO:19), NKTTNKD (SEQ ID NO:20), ISNENEH (SEQ ID NO:21), QANANEN (SEQ ID NO:22), GKSKVID (SEQ ID NO:23), TNRTSPD (SEQ ID NO:24), PNSTHGS (SEQ ID NO:25), KDRAPST (SEQ ID NO:26), LAQADTTKNA (SEQ ID NO:27), LAISDQTKHA (SEQ ID NO:28), LGISDQTKHA (SEQ ID NO:29), LAASDSTKAA (SEQ ID NO:30), LANQDYTKTA (SEQ ID NO:31), LAHDITKNIA (SEQ ID NO:32), LAHPDTTKNA (SEQ ID NO:33), LAHQDTTKNA (SEQ ID NO:34), LANKTTNKDA (SEQ ID NO:35), LPISNENEHA (SEQ ID NO:36), LPQANANENA (SEQ ID NO:37), LAGKSKVIDA (SEQ ID NO:38), LATNRTSPDA (SEQ ID NO:39), LAPNSTHGSA (SEQ ID NO:40) и LAKDRAPSTA (SEQ ID NO:41), где пептидная вставка локализована между аминокислотами 587 и 588 VP1 из капсида AAV2 или соответствующими аминокислотами VP1 из другого исходного AAV, например, между аминокислотами 588 и 589 VP1 из AAV1, AAV3A, AAV3B, AAV6 или AAV9, между аминокислотами 586 и 587 VP1 из AAV4, между аминокислотами 577 и 578 VP1 из AAV5, между аминокислотами 589 и 590 VP1 из AAV7, между аминокислотами 590-591 VP1 из AAV8 или AAV10 и т.д. где белковая последовательность варианта капсида AAV является в ином отношении идентичной последовательности соответствующего исходного капсидного белка AAV, например, любой из SEQ ID NO:1-12.
[00131]
В других вариантах осуществления, рассматриваемый вариант капсидного белка AAV, в дополнение к содержанию пептидной вставки, например, как описано в настоящем описании или как известно в данной области, в петле GH, содержит от приблизительно 1 до приблизительно 100 аминокислотных замен или делеций, например, от 1 до приблизительно 5, от приблизительно 2 до приблизительно 4, от приблизительно 2 до приблизительно 5, от приблизительно 5 до приблизительно 10, от приблизительно 10 до приблизительно 15, от приблизительно 15 до приблизительно 20, от приблизительно 20 до приблизительно 25, приблизительно 25-50, приблизительно 50-100 аминокислотных замен или делеций, по сравнению с исходным капсидным белком AAV. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления, рассматриваемый вариант капсидного белка содержит аминокислотную последовательность, имеющую идентичность последовательности 85% или более, 90% или более, 95% или более, или 98% или более, например, или 99% идентичности с соответствующим исходным капсидом AAV, например, капсидным белком дикого типа, как указано в SEQ ID NO:1-12.
[00132]
В следующем варианте осуществления, одна или несколько аминокислотных замен находятся в положении остатка(остатков) аминокислот 1, 15, 34, 57, 66, 81, 101, 109, 144, 164, 176, 188, 196, 226, 236, 240, 250, 312, 363, 368, 449, 456, 463, 472, 484, 524, 535, 551, 593, 698, 708, 719, 721, и/или 735 капсидного белка VP1 AAV2, как пронумеровано до вставки пептида, или соответствующих остатка(остатков) аминокислот другого капсидного белка AAV. В некоторых таких вариантах осуществления, одна или несколько аминокислотных замен выбраны из группы, состоящей из M1L, L15P, P34A, N57D, N66K, R81Q, Q101R, S109T, R144K, R144M, Q164K, T176P, L188I, S196Y, G226E, G236V, I240T, P250S, N312K, P363L, D368H, N449D, T456K, S463Y, D472N, R484C, A524T, P535S, N551S, A593E, I698V, V708I, V719M, S721L и L735Q капсидного белка VP1 AAV2, как пронумеровано до вставки пептида, или соответствующих остатка(остатков) аминокислот другого капсидного белка AAV.
[00133]
В предпочтительном варианте осуществления, настоящее изобретение относится к варианту капсидного белка AAV, содержащему a) пептидную вставку в GH-петле капсидного белка, где пептидная вставка содержит аминокислотную последовательность, выбранную из ISDQTKH (SEQ ID NO:14), LGISDQTKHA (SEQ ID NO:29) и LAISDQTKHA (SEQ ID NO:28), и b) одну или более из следующих аминокислотных замен, по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2 (SEQ ID NO:2) или соответствующую замену в другом исходном серотипе AAV (т.е. отличном от AAV2), где замененная аминокислота(аминокислоты) не встречаются в природе в соответствующих положениях: M1L, L15P, P34A, N57D, N66K, R81Q, Q101R, S109T, R144K, R144M, Q164K, T176P, L188I, S196Y, G226E, G236V, I240T, P250S, N312K, P363L, D368H, N449D, T456K, S463Y, D472N, R484C, A524T, P535S, N551S, A593E, I698V, V708I, V719M, S721L, L735Q и их комбинации. В некоторых вариантах осуществления, одна или несколько аминокислотных замен выбраны из группы, состоящей из: M1L+L15P+P535S, P34A, P34A+S721L, N57D, N66K, R81Q, Q101R, S109T, R144K, R144M, Q164K, Q164K+V708I, T176P, L188I, S196Y, G226E, G236V, I240T, N312K, N312K+N449D+D472N+N551S+I698V+L735Q, P363L, R484C+V708I, T456K и V708I. Предпочтительно, участок пептидной вставки локализован между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2 или в соответствующем положении в капсидном белке другого серотипа AAV.
[00134]
В особенно предпочтительном варианте осуществления, вариант капсида AAV содержит пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность ISDQTKH (SEQ ID NO:14), или содержащую, в основном состоящую из или состоящую из аминокислотной последовательности LAISDQTKHA (SEQ ID NO:28) или LGISDQTKHA (SEQ ID NO:29), между аминокислотами 587 и 588 VP1 из AAV2 или соответствующими аминокислотами из другого капсида AAV, и дополнительно содержит аминокислотную замену P34A в положении остатка 34, относительно аминокислотной последовательности капсида AAV2 (SEQ ID NO:2) или соответствующего остатка из другого капсида AAV. Вариант капсида AAV может иметь по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98%, или по меньшей мере приблизительно 99%, или большую, идентичность аминокислотной последовательности со всей длиной аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO:2, или с соответствующим исходным капсидом AAV. В особенно предпочтительном варианте осуществления, вариант капсида AAV имеет аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98% идентичность последовательности, или на 100% идентичную следующей аминокислотной последовательности:
A
LAISDQTKHA
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL (SEQ ID NO:42).
[00135]
В другом особенно предпочтительном варианте осуществления, вариант капсида AAV содержит пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность ISDQTKH (SEQ ID NO:14), или содержащую, в основном состоящую из или состоящую из аминокислотной последовательности LAISDQTKHA (SEQ ID NO:28) или LGISDQTKHA (SEQ ID NO:29), между аминокислотами 587 и 588 капсидного белка AAV2 или в соответствующем положении в капсидном белке другого серотипа AAV, и содержит аминокислотную замену N312K, по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2 (SEQ ID NO:2), или соответствующую замену в другом исходном серотипе AAV и необязательно, дополнительно содержит аминокислотные замены N449D, D472N, N551S, I698V и/или L735Q, по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2, или соответствующие замены в другом исходном серотипе AAV. В другом особенно предпочтительном варианте осуществления, вариант капсида AAV содержит пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность ISDQTKH (SEQ ID NO:14), или содержащую, в основном состоящую из или состоящую из аминокислотной последовательности LAISDQTKHA (SEQ ID NO:28) или LGISDQTKHA (SEQ ID NO:29), между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2 или в соответствующем положении в капсидном белке другого серотипа AAV, и содержит аминокислотные замены N312K, N449D, D472N, N551S, I698V и L735Q, по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2 (SEQ ID NO:2), или замены соответствующих остатков в другом исходном серотипе AAV. Вариант капсида AAV может иметь по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98%, или большую, идентичность аминокислотной последовательности со всей длиной аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO:2. В особенно предпочтительном варианте осуществления, вариант капсида AAV имеет аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98% идентичность последовательности, или на 100% идентичную следующей аминокислотной последовательности:
K
D
N
S
LAISDQTKHA
V
Q
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRN (SEQ ID NO:43).
[00136]
В другом варианте осуществления, настоящее изобретение относится к варианту капсидного белка AAV, содержащему a) пептидную вставку, локализованную между аминокислотами 588 и 589 VP1 из AAV1, AAV3A, AAV3B, AAV6 или AAV9, аминокислотами 586 и 587 из AAV4, аминокислотами 577 и 578 из AAV5, аминокислотами 589 и 590 из AAV7 или аминокислотами 590-591 из AAV8 или AAV10, где пептидная вставка содержит аминокислотную последовательность, выбранную из ISDQTKH (SEQ ID NO:14), LGISDQTKHA (SEQ ID NO:29) и LAISDQTKHA (SEQ ID NO:28), и b) замену валина на изолейцин в положении аминокислоты 709 из AAV3A или AAV3B, замену аланина на изолейцин в положении 709 из AAV1 или AAV6, замену аспарагина на изолейцин в положении аминокислоты 707 из AAV4 или аминокислоты 709 из AAV9, или замену треонина на изолейцин в положении аминокислоты 710 из AAV7 или аминокислоты 711 из AAV8 или AAV10, или замену глутамина на изолейцин в положении аминокислоты 697 из AAV5, и, необязательно, в ином отношении идентичному любой из SEQ ID NO: 1 и 3-12. В предпочтительных вариантах осуществления, вариант капсидного белка содержит a) пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность ISDQTKH (SEQ ID NO:14), или содержащую, в основном состоящую из или состоящую из аминокислотной последовательности LAISDQTKHA (SEQ ID NO:28) или LGISDQTKHA (SEQ ID NO:29), между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2, и b) аминокислотную замену валина на изолейцин в положении аминокислоты 708, по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2, где вариант капсидного белка содержит от 2 до 5, от 5 до 10 или от 10 до 15 аминокислотных замен.
[00137]
В другом варианте осуществления, вариант капсидного белка содержит a) пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность ISDQTKH (SEQ ID NO:14), или содержащую, в основном состоящую из или состоящую из аминокислотной последовательности LAISDQTKHA (SEQ ID NO:28) или LGISDQTKHA (SEQ ID NO:29), между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2, и b) аминокислотную замену валина на изолейцин в положении аминокислоты 708, по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2, и является в ином отношении идентичным с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO:2.
[00138]
В другом варианте осуществления, вариант капсидного белка содержит a) пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность ISDQTKH (SEQ ID NO:14), или содержащую, в основном состоящую из или состоящую из аминокислотной последовательности LAISDQTKHA (SEQ ID NO:28) или LGISDQTKHA (SEQ ID NO:29), между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2, и является в ином отношении идентичным с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO:2. В некоторых вариантах осуществления, вариант капсида AAV имеет аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98% идентичность последовательности, или на 100% идентичную следующей аминокислотной последовательности:
LGISDQTKHA
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL (SEQ ID NO:44).
[00139]
В предпочтительном варианте осуществления, настоящее изобретение относится к варианту капсидного белка AAV, содержащему a) пептидную вставку в GH-петле капсидного белка, где пептидная вставка содержит аминокислотную последовательность, выбранную из QADTTKN (SEQ ID NO:13) и LAQADTTKNA (SEQ ID NO:27), и b) одну или более из следующих аминокислотных замен, по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2 (SEQ ID NO:2), или соответствующую замену в другом исходном серотипе AAV (т.е. отличном от AAV2), где замененная аминокислота(аминокислоты) не встречаются в природе в соответствующих положениях: M1L, L15P, P34A, N57D, N66K, R81Q, Q101R, S109T, R144K, R144M, Q164K, T176P, L188I, S196Y, G226E, G236V, I240T, P250S, N312K, P363L, D368H, N449D, T456K, S463Y, D472N, R484C, A524T, P535S, N551S, A593E, I698V, V719M, S721L, L735Q и их комбинации, предпочтительно, выбранной из S109T, P250S, A524T, A593E, I698V, V708I и/или V719M. Участок пептидной вставки, предпочтительно, локализован между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2 или в соответствующем положении в капсидном белке другого серотипа AAV. В особенно предпочтительном варианте осуществления, вариант капсида AAV содержит пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность QADTTKN (SEQ ID NO:13), или содержащую, в основном состоящую из или состоящую из аминокислотной последовательности LAQADTTKNA (SEQ ID NO:27) между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2, или в соответствующем положении в капсидном белке другого серотипа AAV, и содержит аминокислотную замену I698V, по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2, или соответствующую замену в другом исходном серотипе AAV, где замененная аминокислота(аминокислоты) не встречаются в природе в соответствующем положении. Вариант капсида AAV может иметь по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98%, или большую, идентичность аминокислотной последовательности со всей длиной аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO:2. В некоторых вариантах осуществления, соответствующая аминокислотная замена представляет собой аминокислотную замену I699V, по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV3A, AAV3B или AAV9, замену I687V, по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV5, замену I700V замена, по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV7, замену I701V, по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV8 или AAV10. В особенно предпочтительном варианте осуществления, вариант капсида AAV имеет аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98% идентичность последовательности, или на 100% идентичную следующей аминокислотной последовательности:
LAQADTTKNA
V
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL (SEQ ID NO:45).
[00140]
В других предпочтительных вариантах осуществления, вариант капсида AAV содержит пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность QADTTKN (SEQ ID NO:13), или содержащую, в основном состоящую из или состоящую из аминокислотной последовательности LAQADTTKNA (SEQ ID NO:27), между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2 или в соответствующем положении в капсидном белке другого серотипа AAV, и содержит аминокислотную замену V719M и необязательно, замену V708I, по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2, или соответствующую замену в другом исходном серотипе AAV, где замененная аминокислота(аминокислоты) не встречаются в природе в соответствующем положении.
[00141]
В другом варианте осуществления, настоящее изобретение относится к варианту капсидного белка AAV, содержащему a) пептидную вставку, локализованную между аминокислотами 588 и 589 VP1 из AAV1, AAV3A, AAV3B, AAV6 или AAV9, аминокислотами 586 и 587 из AAV4, аминокислотами 577 и 578 из AAV5, аминокислотами 589 и 590 из AAV7, или аминокислотами 590-591 из AAV8 или AAV10, где пептидная вставка содержит аминокислотную последовательность, выбранную из QADTTKN (SEQ ID NO:13) и LAQADTTKNA (SEQ ID NO:27), и b) замену валина на изолейцин в положении аминокислоты 709 из AAV3A или AAV3B, замену аланина на изолейцин в положении 709 из AAV1 или AAV6, замену аспарагина на изолейцин в положении аминокислоты 707 из AAV4 или аминокислоты 709 из AAV9, или замену треонина на изолейцин в положении аминокислоты 710 из AAV7 или аминокислоты 711 из AAV8 или AAV10, или замену глутамина на изолейцин в положении аминокислоты 697 из AAV5. В другом варианте осуществления, настоящее изобретение относится к варианту капсидного белка AAV, содержащему a) пептидную вставку, локализованную между аминокислотами 588 и 589 VP1 из AAV1, AAV3A, AAV3B, AAV6 или AAV9, аминокислотами 586 и 587 из AAV4, аминокислотами 577 и 578 из AAV5, аминокислотами 589 и 590 из AAV7, или аминокислотами 590-591 из AAV8 или AAV10, где пептидная вставка содержит аминокислотную последовательность, выбранную из QADTTKN (SEQ ID NO:13) и LAQADTTKNA (SEQ ID NO:27), и b) аминокислотную замену серина на треонин в положении 109, по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV1, AAV3A, AAV3B, AAV4, AAV7, AAV8, AAV9 или AAV10, или в положении 108, по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV5 или AAV6. В предпочтительных вариантах осуществления, вариант капсида AAV содержит пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность QADTTKN (SEQ ID NO:13), или содержащую, в основном состоящую из или состоящую из аминокислотной последовательности LAQADTTKNA (SEQ ID NO:27), между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2, и содержит замену серина на треонин в положении аминокислоты 109 (S109T) или аминокислотную замену валина на изолейцин в положении аминокислоты 708 (V708I), по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2, где вариант капсидного белка содержит от 1 до 5, от 5 до 10 или от 10 до 15 аминокислотных замен и имеет, предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98%, или большую идентичность аминокислотной последовательности со всей длиной аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO:2. В других предпочтительных вариантах осуществления, вариант капсида AAV содержит пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность QADTTKN (SEQ ID NO:13), или содержащую, в основном состоящую из или состоящую из аминокислотной последовательности LAQADTTKNA (SEQ ID NO:27), между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2 или в соответствующем положении в капсидном белке другого серотипа AAV, и содержит замену серина на треонин в положении аминокислоты 109 и аминокислотную замену валина на изолейцин в положении аминокислоты 708, по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2.
[00142]
В другом варианте осуществления, вариант капсидного белка содержит a) пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность QADTTKN (SEQ ID NO:13), или содержащую, в основном состоящую из или состоящую из аминокислотной последовательности LAQADTTKNA (SEQ ID NO:27), между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2, и b) по меньшей мере одну аминокислотную замену, где аминокислотная последовательность варианта капсида не содержит аминокислотную замену валина на изолейцин в положении аминокислоты 708, по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2, и не содержит замену серина на треонин в положении аминокислоты 109, по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2.
[00143]
В другом варианте осуществления, вариант капсидного белка содержит a) пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность QADTTKN (SEQ ID NO:13), или содержащую, в основном состоящую из или состоящую из аминокислотной последовательности LAQADTTKNA (SEQ ID NO:27), между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2, и является в ином отношении идентичным с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO:2.
[00144]
В другом предпочтительном варианте осуществления, настоящее изобретение относится к варианту капсидного белка AAV, содержащему a) пептидную вставку в GH-петле капсидного белка, где пептидная вставка содержит аминокислотную последовательность, выбранную из HDITKNI (SEQ ID NO:17), IAHDITKNIA (SEQ ID NO:60) и LAHDITKNIA (SEQ ID NO:32), и b) одну или более из следующих аминокислотных замен, по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2 (SEQ ID NO:2), или соответствующую замену в другом исходном серотипе AAV (т.е. отличном от AAV2), где замененная аминокислота(аминокислоты) не встречаются в природе в соответствующих положениях: M1L, L15P, P34A, N57D, N66K, R81Q, Q101R, S109T, R144K, R144M, Q164K, T176P, L188I, S196Y, G226E, G236V, I240T, P250S, N312K, P363L, D368H, R389S, N449D, T456K, S463Y, D472N, R484C, A524T, P535S, N551S, A593E, I698V, V708I, V719M, S721L, L735Q и их комбинации. В некоторых вариантах осуществления, капсидный белок AAV содержит одну или более аминокислотных замен, выбранных из S109T, R389S, A593E и/или V708I. Предпочтительно, участок пептидной вставки локализован между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2 или в соответствующем положении в капсидном белке другого серотипа AAV. В одном предпочтительном варианте осуществления, вариант капсида AAV содержит пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность HDITKNI (SEQ ID NO:17), или содержащую, в основном состоящую из или состоящую из аминокислотной последовательности IAHDITKNIA (SEQ ID NO:60), или LAHDITKNIA (SEQ ID NO:32), между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2 и содержит аминокислотную замену S109T, по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2, или соответствующую замену в другом исходном серотипе AAV. Вариант капсида AAV может иметь по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98%, или большую идентичность аминокислотной последовательности со всей длиной аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO:2.
[00145]
В другом варианте осуществления, вариант капсида содержит a) пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность HDITKNI (SEQ ID NO:17), или содержащую, в основном состоящую из или состоящую из аминокислотной последовательности IAHDITKNIA (SEQ ID NO:60) или LAHDITKNIA (SEQ ID NO:32), между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2, и является в ином отношении идентичным с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO:2. В некоторых вариантах осуществления, вариант капсида AAV имеет аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98% идентичность последовательности, или на 100% идентичную следующей аминокислотной последовательности:
LAHDITKNIA
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL (SEQ ID NO:46).
[00146]
В других вариантах осуществления, вариант капсида содержит a) пептидную вставку, содержащую, в основном состоящую из или состоящую из аминокислотной последовательности LAHDITKNIA, между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2, и b) по меньшей мере одну аминокислотную замену, где аминокислотная последовательность варианта капсида не содержит аминокислотную замену валина на изолейцин в положении аминокислоты 708, по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2. В других вариантах осуществления, вариант капсида содержит a) пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность DITKNIA (SEQ ID NO:61), или содержащую, в основном состоящую из или состоящую из аминокислотной последовательности IAHDITKNIA (SEQ ID NO:60), или LAHDITKNIA (SEQ ID NO:32), между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2 и b) замену V708I, по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2. В других вариантах осуществления, вариант капсида содержит a) пептидную вставку содержащую, в основном состоящую из или состоящую из аминокислотной последовательности LAHDITKNIA (SEQ ID NO:32) между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2, и b) две или более аминокислотные замены, где аминокислотная последовательность варианта капсида содержит аминокислотную замену валина на изолейцин в положении аминокислоты 708, по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2.
[00147]
В другом предпочтительном варианте осуществления, настоящее изобретение относится к варианту капсидного белка AAV, содержащему a) пептидную вставку в GH-петле капсидного белка, где пептидная вставка содержит аминокислотную последовательность, выбранную из NQDYTKT (SEQ ID NO:16) и LANQDYTKTA (SEQ ID NO:31), и b) одну или более из следующих аминокислотных замен, по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2 (SEQ ID NO:2), или соответствующую замену в другом исходном серотипе AAV (т.е. отличном от AAV2), где замененная аминокислота(аминокислоты) не встречаются в природе в соответствующих положениях: M1L, L15P, P34A, N57D, N66K, R81Q, Q101R, S109T, R144K, R144M, Q164K, T176P, L188I, S196Y, G226E, G236V, I240T, P250S, P363L, D368H, N449D, T456K, S463Y, D472N, R484C, A524T, P535S, N551S, A593E, I698V, V708I, V719M, S721L, L735Q и их комбинации. В некоторых вариантах осуществления, капсидный белок AAV содержит одну или более аминокислотных замен, выбранных из S109T, S109T+S463Y, D368H и V708I. Предпочтительно, участок пептидной вставки локализован между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2 или в соответствующем положении в капсидном белке другого серотипа AAV. В одном предпочтительном варианте осуществления, вариант капсида AAV содержит пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность NQDYTKT (SEQ ID NO:16), или содержащую, в основном состоящую из или состоящую из аминокислотной последовательности LANQDYTKTA (SEQ ID NO:31), между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2 и содержит аминокислотную замену V708I, по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2 или соответствующую замену в другом исходном серотипе AAV. Вариант капсида AAV может иметь по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98%, или большую идентичность аминокислотной последовательности со всей длиной аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO:2. В другом варианте осуществления, вариант капсида содержит a) пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность NQDYTKT (SEQ ID NO:16), или содержащую, в основном состоящую из или состоящую из аминокислотной последовательности LANQDYTKTA (SEQ ID NO:31) между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2, и является в ином отношении идентичным с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO:2. В некоторых вариантах осуществления, вариант капсида AAV имеет аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98% идентичность последовательности, или на 100% идентичную следующей аминокислотной последовательности:
LANQDYTKTA
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL (SEQ ID NO:47).
[00148]
В других вариантах осуществления, вариант капсида содержит a) пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность NQDYTKT (SEQ ID NO:16), или содержащую, в основном состоящую из или состоящую из аминокислотной последовательности LANQDYTKTA (SEQ ID NO:31), между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2 и b) аминокислотную замену S109T, по сравнению с последовательностью из SEQ ID NO:2, и необязательно, аминокислотную замену S463Y, где вариант капсида имеет по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98% идентичность со всей длиной аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO:2. В родственных вариантах осуществления, вариант капсида содержит a) пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность NQDYTKT (SEQ ID NO:16), или содержащую, в основном состоящую из или состоящую из аминокислотной последовательности LANQDYTKTA (SEQ ID NO:31) между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2, и b) аминокислотную замену S109T, по сравнению с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2, и является в ином отношении идентичным с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO:2.
[00149]
В другом варианте осуществления, настоящее изобретение относится к варианту капсидного белка AAV, содержащему a) пептидную вставку, локализованную между аминокислотами 588 и 589 VP1 из AAV1, AAV3A, AAV3B, AAV6 или AAV9, аминокислотами 586 и 587 из AAV4, аминокислотами 577 и 578 из AAV5, аминокислотами 589 и 590 из AAV7, или аминокислотами 590-591 из AAV8 или AAV10, где пептидная вставка содержит аминокислотную последовательность, выбранную из NQDYTKT (SEQ ID NO:16) и LANQDYTKTA (SEQ ID NO:31), и b) аминокислотную замену аспарагина на лизин в положении 313, по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV1 или AAV6, или в положении 314, по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV9, или замену серина на лизин в положении 312 из AAV3A или AAV3B, или в положении 315 из AAV8 или AAV10, или замену аргинина на лизин в положении 303 из AAV4 или AAV5, или в положении 314 из AAV7. В другом варианте осуществления, вариант капсида содержит a) пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность NQDYTKT (SEQ ID NO:16), или содержащую, в основном состоящую из или состоящую из аминокислотной последовательности LANQDYTKTA (SEQ ID NO:31) между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2, и b) аминокислотную замену N312K, где вариант капсидного белка содержит от 1 до 5, от 5 до 10 или от 10 до 15 аминокислотных замен.
[00150]
В другом варианте осуществления, настоящее изобретение относится к варианту капсидного белка AAV, содержащему a) пептидную вставку в GH-петле капсидного белка, где пептидная вставка содержит аминокислотную последовательность, выбранную из PNSTHGS (SEQ ID NO:25) и LAPNSTHGSA (SEQ ID NO:40), и b) одну или более из следующих аминокислотных замен, по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2 (SEQ ID NO:2), или соответствующую замену в другом исходном серотипе AAV (т.е. отличном от AAV2), где замененная аминокислота(аминокислоты) не встречаются в природе в соответствующих положениях: M1L, L15P, P34A, N57D, N66K, R81Q, Q101R, S109T, R144K, R144M, Q164K, T176P, L188I, S196Y, G226E, G236V, I240T, P250S, N312K, P363L, D368H, N449D, T456K, S463Y, D472N, R484C, A524T, P535S, N551S, A593E, I698V, V708I, V719M, S721L, L735Q и их комбинации. Предпочтительно, участок пептидной вставки локализован между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2 или в соответствующем положении в капсидном белке другого серотипа AAV. В одном предпочтительном варианте осуществления, вариант капсида AAV содержит пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность PNSTHGS (SEQ ID NO:25), или содержащую, в основном состоящую из или состоящую из аминокислотной последовательности LAPNSTHGSA (SEQ ID NO:40), между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2, и содержит аминокислотную замену V708I, по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2, или соответствующую замену в другом исходном серотипе AAV. Вариант капсида AAV может иметь по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98%, или большую идентичность аминокислотной последовательности со всей длиной аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO:2. В другом варианте осуществления, вариант капсида содержит a) пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность PNSTHGS (SEQ ID NO:25), или содержащую, в основном состоящую из или состоящую из аминокислотной последовательности LAPNSTHGSA (SEQ ID NO:40), между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2, и является в ином отношении идентичным с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO:2. В некоторых вариантах осуществления, вариант капсида AAV имеет аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98% идентичность последовательности, или на 100% идентичную следующей аминокислотной последовательности:
LAPNSTHGSA
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL (SEQ IDNO:48).
[00151]
В другом варианте осуществления, настоящее изобретение относится к варианту капсидного белка AAV, содержащему a) пептидную вставку в GH-петле капсидного белка, где пептидная вставка содержит аминокислотную последовательность, выбранную из NKTTNKDA (SEQ ID NO:62) и LANKTTNKDA (SEQ ID NO:35), и b) одну или более из следующих аминокислотных замен, по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2 (SEQ ID NO:2) или соответствующую замену в другом исходном серотипе AAV (т.е. отличном от AAV2), где замененная аминокислота(аминокислоты) не встречаются в природе в соответствующих положениях: M1L, L15P, P34A, N57D, N66K, R81Q, Q101R, S109T, R144K, R144M, Q164K, T176P, L188I, S196Y, G226E, G236V, I240T, P250S, N312K, P363L, D368H, N449D, T456K, S463Y, D472N, R484C, A524T, P535S, N551S, A593E, I698V, V708I, V719M, S721L, L735Q и их комбинации. Предпочтительно, участок пептидной вставки локализован между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2 или в соответствующем положении в капсидном белке другого серотипа AAV. В одном предпочтительном варианте осуществления, вариант капсида AAV содержит пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность NKTTNKDA (SEQ ID NO:62), или содержащую, в основном состоящую из или состоящую из аминокислотной последовательности LANKTTNKDA (SEQ ID NO:35), между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2 и содержит аминокислотную замену N449D, по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2, или соответствующую замену в другом исходном серотипе AAV. Вариант капсида AAV может иметь по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98%, или большую идентичность аминокислотной последовательности со всей длиной аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO:2. В другом варианте осуществления, вариант капсида содержит a) пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность NKTTNKDA (SEQ ID NO:62), или содержащую, в основном состоящую из или состоящую из аминокислотной последовательности LANKTTNKDA (SEQ ID NO:35), между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2, и является в ином отношении идентичным с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO:2. В некоторых вариантах осуществления, вариант капсида AAV имеет аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98% идентичность последовательности, или на 100% идентичную следующей аминокислотной последовательности:
LANKTTNKDA
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL (SEQ ID NO:49).
[00152]
В другом варианте осуществления, настоящее изобретение относится к варианту капсидного белка AAV, содержащему a) пептидную вставку в GH-петле капсидного белка, где пептидная вставка содержит аминокислотную последовательность, выбранную из TNRTSPD (SEQ ID NO:24) и LATNRTSPDA (SEQ ID NO:39), и b) одну или более из следующих аминокислотных замен, по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2 (SEQ ID NO:2) или соответствующую замену в другом исходном серотипе AAV (т.е. отличном от AAV2), где замененная аминокислота(аминокислоты) не встречаются в природе в соответствующих положениях: M1L, L15P, P34A, N57D, N66K, R81Q, Q101R, S109T, R144K, R144M, Q164K, T176P, L188I, S196Y, G226E, G236V, I240T, P250S, N312K, P363L, D368H, N449D, T456K, S463Y, D472N, R484C, A524T, P535S, N551S, A593E, I698V, V719M, S721L, L735Q и их комбинации. Предпочтительно, участок пептидной вставки локализован между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2 или в соответствующем положении в капсидном белке другого серотипа AAV. В родственном варианте осуществления, настоящее изобретение относится к варианту капсидного белка AAV, содержащему a) пептидную вставку, локализованную между аминокислотами 588 и 589 VP1 из AAV1, AAV3A, AAV3B, AAV6 или AAV9, аминокислотами 586 и 587 из AAV4, аминокислотами 577 и 578 из AAV5, аминокислотами 589 и 590 из AAV7, или аминокислотами 590-591 из AAV8 или AAV10, где пептидная вставка содержит аминокислотную последовательность, выбранную из TNRTSPD (SEQ ID NO:24) и LATNRTSPDA (SEQ ID NO:39), и b) замену валина на изолейцин в положении аминокислоты 709 из AAV3A или AAV3B, замену аланина на изолейцин в положении 709 из AAV1 или AAV6, замену аспарагина на изолейцин в положении аминокислоты 707 из AAV4 или аминокислоты 709 из AAV9, или замену треонина на изолейцин в положении аминокислоты 710 из AAV7 или аминокислоты 711 из AAV8 или AAV10, или замену глутамина на изолейцин в положении аминокислоты 697 из AAV5. В других вариантах осуществления, вариант капсидного белка содержит a) пептидную вставку содержащую, в основном состоящую из или состоящую из аминокислотной последовательности LATNRTSPDA (SEQ ID NO:39) между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2, и b) аминокислотную замену валина на изолейцин в положении аминокислоты 708, по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2, где вариант капсидного белка содержит от 1 до 5, от 5 до 10 или от 10 до 15 аминокислотных замен. В другом варианте осуществления, вариант капсидного белка содержит a) пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность TNRTSPD (SEQ ID NO:24) между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2, и b) аминокислотную замену валина на изолейцин в положении аминокислоты 708, по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2. Вариант капсида AAV может иметь по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98%, или большую идентичность аминокислотной последовательности со всей длиной аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO:2.
[00153]
В другом варианте осуществления, вариант капсидного белка содержит a) пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность TNRTSPD (SEQ ID NO:24), или содержащую, в основном состоящую из или состоящую из аминокислотной последовательности LATNRTSPDA (SEQ ID NO:39), между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2 и является в ином отношении идентичным с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO:2. В некоторых вариантах осуществления, вариант капсида AAV имеет аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98% идентичность последовательности, или на 100% идентичную следующей аминокислотной последовательности:
LATNRTSPDA
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL (SEQ ID NO:50).
[00154]
В другом варианте осуществления, настоящее изобретение относится к варианту капсидного белка AAV, содержащему a) пептидную вставку в GH-петле капсидного белка, где пептидная вставка содержит аминокислотную последовательность, выбранную из GKSKVID (SEQ ID NO:23) и LAGKSKVIDA (SEQ ID NO:38), и b) одну или более из следующих аминокислотных замен, по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2 (SEQ ID NO:2), или соответствующую замену в другом исходном серотипе AAV (т.е. отличном от AAV2), где замененная аминокислота(аминокислоты) не встречаются в природе в соответствующих положениях: M1L, L15P, P34A, N57D, N66K, R81Q, Q101R, S109T, R144K, R144M, Q164K, T176P, L188I, S196Y, G226E, G236V, I240T, P250S, N312K, P363L, D368H, N449D, T456K, S463Y, D472N, R484C, A524T, P535S, N551S, A593E, I698V, V708I, V719M, S721L, L735Q и их комбинации. Предпочтительно, участок пептидной вставки локализован между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2 или в соответствующем положении в капсидном белке другого серотипа AAV. Вариант капсида AAV может иметь по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98%, или большую идентичность аминокислотной последовательности со всей длиной аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO:2. В некоторых вариантах осуществления, вариант капсида AAV содержит пептидную вставку, локализованную между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2, содержащую аминокислотную последовательность GKSKVID (SEQ ID NO:23), или содержащую, в основном состоящую из или состоящую из аминокислотной последовательности LAGKSKVIDA (SEQ ID NO:38), и является в ином отношении идентичным с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO:2. В других вариантах осуществления, вариант капсида AAV содержит a) пептидную вставку содержащую, в основном состоящую из или состоящую из аминокислотной последовательности LAGKSKVIDA (SEQ ID NO:38) между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2 и содержит по меньшей мере одну аминокислотную замену.
[00155]
В некоторых вариантах осуществления, вариант капсида AAV имеет аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98% идентичность последовательности, или на 100% идентичную следующей аминокислотной последовательности:
LAGKSKVIDA
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL (SEQ ID NO:51).
[00156]
В другом варианте осуществления, настоящее изобретение относится к варианту капсидного белка AAV, содержащему a) пептидную вставку в GH-петле капсидного белка, где пептидная вставка содержит аминокислотную последовательность, выбранную из ASDSTKA (SEQ ID NO:15) и LAASDSTKAA (SEQ ID NO:30), и b) одну или более из следующих аминокислотных замен, по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2 (SEQ ID NO:2), или соответствующую замену в другом исходном серотипе AAV (т.е. отличном от AAV2), где замененная аминокислота(аминокислоты) не встречаются в природе в соответствующих положениях: M1L, L15P, P34A, N57D, N66K, R81Q, Q101R, S109T, R144K, R144M, Q164K, T176P, L188I, S196Y, G226E, G236V, I240T, P250S, N312K, P363L, D368H, N449D, T456K, S463Y, D472N, R484C, A524T, P535S, N551S, A593E, I698V, V708I, V719M, S721L, L735Q и их комбинации. Предпочтительно, участок пептидной вставки локализован между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2 или в соответствующем положении в капсидном белке другого серотипа AAV. Вариант капсида AAV может иметь по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98% или большую идентичность аминокислотной последовательности со всей длиной аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO:2. В другом варианте осуществления, вариант капсида содержит пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность ASDSTKA (SEQ ID NO:15), или содержащую, в основном состоящую из или состоящую из аминокислотной последовательности LAASDSTKAA (SEQ ID NO:30), между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2, и является в ином отношении идентичным с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO:2. В некоторых вариантах осуществления, вариант капсида AAV имеет аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98% идентичность последовательности, или на 100% идентичную следующей аминокислотной последовательности:
LAASDSTKAA
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL (SEQ ID NO:52).
[00157]
В другом варианте осуществления, настоящее изобретение относится к варианту капсидного белка AAV, содержащему a) пептидную вставку в GH-петле капсидного белка, где пептидная вставка содержит аминокислотную последовательность, выбранную из KDRAPST (SEQ ID NO:26) и LAKDRAPTSA (SEQ ID NO:41), и b) одну или более из следующих аминокислотных замен, по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2 (SEQ ID NO:2), или соответствующую замену в другом исходном серотипе AAV (т.е. отличном от AAV2), где замененная аминокислота(аминокислоты) не встречаются в природе в соответствующих положениях: M1L, L15P, P34A, N57D, N66K, R81Q, Q101R, S109T, R144K, R144M, Q164K, T176P, L188I, S196Y, G226E, G236V, I240T, P250S, N312K, P363L, D368H, N449D, T456K, S463Y, D472N, R484C, A524T, P535S, N551S, A593E, I698V, V708I, V719M, S721L, L735Q и их комбинации. Предпочтительно, участок пептидной вставки локализован между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2 или в соответствующем положении в капсидном белке другого серотипа AAV. Вариант капсида AAV может иметь по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98% или большую идентичность аминокислотной последовательности со всей длиной аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO:2. В другом варианте осуществления, вариант капсида содержит пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность KDRAPST (SEQ ID NO:26), или содержащую, в основном состоящую из или состоящую из аминокислотной последовательности LAKDRAPTSA (SEQ ID NO:41) между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2, и является в ином отношении идентичным с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO:2. В некоторых вариантах осуществления, вариант капсида AAV имеет аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98% идентичность последовательности, или на 100% идентичную следующей аминокислотной последовательности:
LAKDRAPSTA
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL (SEQ ID NO:53).
[00158]
В другом варианте осуществления, настоящее изобретение относится к варианту капсидного белка AAV, содержащему a) пептидную вставку в GH-петле капсидного белка, где пептидная вставка содержит аминокислотную последовательность, выбранную из HQDTTKN (SEQ ID NO:19) и LAHQDTTKNA (SEQ ID NO:34), и b) одну или более из следующих аминокислотных замен, по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2 (SEQ ID NO:2) или соответствующую замену в другом исходном серотипе AAV (т.е. отличном от AAV2), где замененная аминокислота(аминокислоты) не встречаются в природе в одном или нескольких из соответствующих положений: M1L, L15P, P34A, N57D, N66K, R81Q, Q101R, S109T, R144K, R144M, Q164K, T176P, L188I, S196Y, G226E, G236V, I240T, P250S, N312K, P363L, D368H, N449D, T456K, S463Y, D472N, R484C, A524T, P535S, N551S, A593E, I698V, V708I, V719M, S721L, L735Q и их комбинации. Предпочтительно, участок пептидной вставки локализован между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2 или в соответствующем положении в капсидном белке другого серотипа AAV. Вариант капсида AAV может иметь по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98%, или большую идентичность аминокислотной последовательности со всей длиной аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO:2. В другом варианте осуществления, вариант капсида содержит пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность HQDTTKN (SEQ ID NO:19), или содержащую, в основном состоящую из или состоящую из аминокислотной последовательности LAHQDTTKNA (SEQ ID NO:34) между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2, и является в ином отношении идентичным с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO:2. В некоторых вариантах осуществления, вариант капсида AAV имеет аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98% идентичность последовательности, или на 100% идентичную следующей аминокислотной последовательности:
LAHQDTTKNA
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL (SEQ ID NO:54).
[00159]
В другом варианте осуществления, настоящее изобретение относится к варианту капсидного белка AAV, содержащему a) пептидную вставку в GH-петле капсидного белка, где пептидная вставка содержит аминокислотную последовательность, выбранную из ISNENEH (SEQ ID NO:21) и LPISNENEHA (SEQ ID NO:36), и b) одну или более из следующих аминокислотных замен, по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2 (SEQ ID NO:2), или соответствующую замену в другом исходном серотипе AAV (т.е. отличном от AAV2), где замененная аминокислота(аминокислоты) не встречаются в природе в одном или нескольких из соответствующих положений: M1L, L15P, P34A, N57D, N66K, R81Q, Q101R, S109T, R144K, R144M, Q164K, T176P, L188I, S196Y, G226E, G236V, I240T, P250S, N312K, P363L, D368H, N449D, T456K, S463Y, D472N, R484C, A524T, P535S, N551S, A593E, I698V, V708I, V719M, S721L, L735Q и их комбинации. Предпочтительно, участок пептидной вставки локализован между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2 или в соответствующем положении в капсидном белке другого серотипа AAV. Вариант капсида AAV может иметь по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98% или большую идентичность аминокислотной последовательности со всей длиной аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO:2. В другом варианте осуществления, вариант капсида содержит пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность ISNENEH (SEQ ID NO:21), или содержащую, в основном состоящую из или состоящую из аминокислотной последовательности LPISNENEHA (SEQ ID NO:36), между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2, и является в ином отношении идентичным с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO:2. В некоторых вариантах осуществления, вариант капсида AAV имеет аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98% идентичность последовательности, или на 100% идентичную следующей аминокислотной последовательности:
LPISNENEHA
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL (SEQ ID NO:55).
[00160]
В другом варианте осуществления, настоящее изобретение относится к варианту капсидного белка AAV, содержащему a) пептидную вставку в GH-петле капсидного белка, где пептидная вставка содержит аминокислотную последовательность, выбранную из QANANEN (SEQ ID NO:22) и LPQANANENA (SEQ ID NO:37), и b) одну или более из следующих аминокислотных замен, по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2 (SEQ ID NO:2), или соответствующую замену в другом исходном серотипе AAV (т.е. отличном от AAV2), где замененная аминокислота(аминокислоты) не встречаются в природе в соответствующих положениях: M1L, L15P, P34A, N57D, N66K, R81Q, Q101R, S109T, R144K, R144M, Q164K, T176P, L188I, S196Y, G226E, G236V, I240T, P250S, N312K, P363L, D368H, N449D, T456K, S463Y, D472N, R484C, A524T, P535S, N551S, A593E, I698V, V708I, V719M, S721L, L735Q и их комбинации. Предпочтительно, участок пептидной вставки локализован между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2 или в соответствующем положении в капсидном белке другого серотипа AAV. Вариант капсида AAV может иметь по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98% или большую идентичность аминокислотной последовательности со всей длиной аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO:2. В другом варианте осуществления, вариант капсида содержит пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность QANANEN (SEQ ID NO:22), или содержащую, в основном состоящую из или состоящую из аминокислотной последовательности LPQANANENA (SEQ ID NO:37), между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2, и является в ином отношении идентичным с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO:2. В некоторых вариантах осуществления, вариант капсида AAV имеет аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98% идентичность последовательности, или на 100% идентичную следующей аминокислотной последовательности:
LPQANANENA
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL (SEQ ID NO:56).
[00161]
В другом варианте осуществления, настоящее изобретение относится к варианту капсидного белка AAV, содержащему a) пептидную вставку в GH-петле капсидного белка, где пептидная вставка содержит аминокислотную последовательность, выбранную из HPDTTKN (SEQ ID NO:18) и LAHPDTTKNA (SEQ ID NO:33), и b) одну или более из следующих аминокислотных замен, по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2 (SEQ ID NO:2), или соответствующую замену в другом исходном серотипе AAV (т.е. отличном от AAV2), где замененная аминокислота(аминокислоты) не встречаются в природе в соответствующих положениях: M1L, L15P, P34A, N57D, N66K, R81Q, Q101R, S109T, R144K, R144M, Q164K, T176P, L188I, S196Y, G226E, G236V, I240T, P250S, N312K, P363L, D368H, N449D, T456K, S463Y, D472N, R484C, A524T, P535S, N551S, A593E, I698V, V708I, V719M, S721L, L735Q и их комбинации. Предпочтительно, участок пептидной вставки локализован между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2 или в соответствующем положении в капсидном белке другого серотипа AAV. Вариант капсида AAV может иметь по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98% или большую идентичность аминокислотной последовательности со всей длиной аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO:2. В другом варианте осуществления, вариант капсида содержит пептидную вставку, содержащую аминокислотную последовательность HPDTTKN (SEQ ID NO:18), или содержащую, в основном состоящую из или состоящую из аминокислотной последовательности LAHPDTTKNA (SEQ ID NO:33) между аминокислотами 587 и 588 капсида AAV2, и является в ином отношении идентичным с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO:2. В некоторых вариантах осуществления, вариант капсида AAV имеет аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98% идентичность последовательности, или на 100% идентичную следующей аминокислотной последовательности:
[00162]
LAHPDTTKNA
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL (SEQ ID NO:57).
[00163]
В нескольких аспектах, настоящее изобретение относится к варианту капсидного белка AAV, содержащему одну или более аминокислотных замен, по сравнению с соответствующим исходным капсидным белком AAV, где вариант капсидного белка, когда присутствует в вирионе AAV, придает увеличенную инфекционность для клетки сетчатки по сравнению с инфекционностью для клеток сетчатки вириона AAV, содержащего соответствующий исходный капсидный белок AAV.
[00164]
В некоторых вариантах осуществления, вариант капсидного белка AAV содержит аминокислотную замену P34A, по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2 (SEQ ID NO:2) или аминокислотную замену P33A, по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV5 (SEQ ID NO:6). В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, вариант капсидного белка содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98% или по меньшей мере приблизительно 99%, или большую, идентичность аминокислотной последовательности со всей длиной аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:6, и содержит аминокислотную замену P34A или P33A, по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2 или AAV5 соответственно. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, вариант капсидного белка содержит аминокислотную последовательность, содержащую аминокислотную замену P34A по сравнению с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO 2, и является в ином отношении идентичным с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO:2. В родственных вариантах осуществления, вариант капсидного белка содержит аминокислотную замену P34A, по сравнению с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2, где вариант капсидного белка содержит от 1 до 5, от 5 до 10 или от 10 до 15 аминокислотных замен, по сравнению с аминокислотной последовательностью капсидного белка AAV2, указанной в SEQ ID NO:2.
[00165]
В других вариантах осуществления вариант капсидного белка AAV содержит аминокислотную замену в положении аминокислоты 164, по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2 (SEQ ID NO:2) или в соответствующем положении другого исходного серотипа AAV (т.е. отличного от AAV2), где замененная аминокислота не встречается в природе в соответствующем положении. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, вариант капсидного белка содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98% или по меньшей мере приблизительно 99%, или большую, идентичность аминокислотной последовательности со всей длиной аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO 2, и содержит аминокислотную замену в положении аминокислоты 164, по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2 (SEQ ID NO:2). В некоторых вариантах осуществления, вирион rAAV содержит аминокислотную замену глутамина на лизин в положении аминокислоты 164, по сравнению с аминокислотной последовательностью из AAV1, AAV2 или AAV6, или в положении аминокислоты 165, по сравнению с аминокислотной последовательностью из AAV7, AAV8 или AAV10; или содержит замену серина на лизин в положении аминокислоты 160 из AAV5, или содержит замену аланина на лизин в положении аминокислоты 164 из AAV9. В родственных вариантах осуществления, вариант капсидного белка содержит аминокислотную замену в положении аминокислоты 164 (например, Q164K), по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2 (SEQ ID NO:2), где вариант капсидного белка содержит от 1 до 5, от 5 до 10 или от 10 до 15 аминокислотных замен, по сравнению с аминокислотной последовательностью капсидного белка AAV2, указанной в SEQ ID NO:2. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, вариант капсидного белка содержит аминокислотную последовательность, содержащую a аминокислотную замену Q164K по сравнению с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO:2, и является в ином отношении идентичным с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO:2. В других вариантах осуществления вариант капсидного белка содержит аминокислотные замены Q164K и V708I, по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2 (SEQ ID NO:2), или соответствующие замены в другом исходном серотипе AAV (т.е. отличного от AAV2), и имеет по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98%, или по меньшей мере приблизительно 99%, или большую, идентичность аминокислотной последовательности со всей длиной аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO:2.
[00166]
В других вариантах осуществления, вариант капсидного белка AAV содержит аминокислотную замену в положении аминокислоты 698, по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2 (SEQ ID NO:2) или в соответствующем положении другого исходного серотипа AAV (т.е. отличного от AAV2), где замененная аминокислота не встречается в природе в соответствующем положении. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, вариант капсидного белка содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98%, или по меньшей мере приблизительно 99%, или большую, идентичность аминокислотной последовательности со всей длиной аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO 2, и содержит аминокислотную замену в положении аминокислоты 698, по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2 (SEQ ID NO:2). В некоторых вариантах осуществления, вирион rAAV содержит аминокислотную замену изолейцина на валин в положении аминокислоты 698, по сравнению с аминокислотной последовательностью из AAV2, или в положении аминокислоты 699, по сравнению с аминокислотной последовательностью из AAV3A, AAV3B, или AAV9, или в положении аминокислоты 687 из AAV5, или в положении аминокислоты 700 из AAV7, или в положении аминокислоты 701 из AAV8 или AAV10. В родственных вариантах осуществления, вариант капсидного белка содержит аминокислотную замену в положении аминокислоты 699 (например, I698V), по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2 (SEQ ID NO:2), где вариант капсидного белка содержит от 1 до 5, от 5 до 10 или от 10 до 15 аминокислотных замен, по сравнению с аминокислотной последовательностью капсидного белка AAV2, указанной в SEQ ID NO:2. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, вариант капсидного белка содержит аминокислотную последовательность, содержащую аминокислотную замену I698V, по сравнению с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO:2 и является в ином отношении идентичным с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO:2.
[00167]
В других вариантах осуществления вариант капсидного белка AAV содержит аминокислотную замену в положении аминокислоты 109, по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2 (SEQ ID NO:2), или в соответствующем положении другого исходного серотипа AAV (т.е. отличного от AAV2). В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, вариант капсидного белка содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98% или по меньшей мере приблизительно 99%, или большую, идентичность аминокислотной последовательности со всей длиной аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO 2, и содержит аминокислотную замену в положении аминокислоты 109, по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2 (SEQ ID NO:2). В некоторых вариантах осуществления, вариант капсидного белка содержит аминокислотную замену серина на треонин в положении 109, по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV1, AAV3A, AAV3B, AAV4, AAV7, AAV8, AAV9 или AAV10, или в положении 108, по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV5 или AAV6. В родственных вариантах осуществления, вариант капсидного белка содержит аминокислотную замену S109T, по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2, где вариант капсидного белка содержит от 1 до 5, от 5 до 10 или от 10 до 15 аминокислотных замен. В других родственных вариантах осуществления, вариант капсидного белка содержит аминокислотную замену S109T и аминокислотную замену A593E, по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2. В некоторых вариантах осуществления вариант капсидного белка содержит аминокислотные замены S109T и A493V, и необязательно, A593E и/или V708I, по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2 (SEQ ID NO:2), или соответствующие замены в другом исходном серотипе AAV (т.е. отличного от AAV2) и имеет по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98% или по меньшей мере приблизительно 99%, или большую, идентичность аминокислотной последовательности со всей длиной аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO 2. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, вариант капсидного белка содержит аминокислотные замены S109T, A493V, A593E и V708I, по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2 (SEQ ID NO:2), или соответствующие замены в другом исходном серотипе AAV (т.е. отличного от AAV2) и имеет по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98%, или по меньшей мере приблизительно 99%, или большую, идентичность аминокислотной последовательности со всей длиной аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO 2. В других предпочтительных вариантах осуществления, вариант капсидного белка содержит аминокислотные замены S109T и V708I, по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2, и имеет по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98% или по меньшей мере приблизительно 99%, или большую, идентичность аминокислотной последовательности со всей длиной аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO 2, или является в ином отношении идентичным с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO:2.
[00168]
В других вариантах осуществления, вариант капсидного белка AAV содержит аминокислотную замену в положении аминокислоты 593, по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2 (SEQ ID NO:2), или в соответствующем положении другого исходного серотипа AAV (т.е. отличного от AAV2). В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, вариант капсидного белка содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98%, или по меньшей мере приблизительно 99%, или большую, идентичность аминокислотной последовательности со всей длиной аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO 2, и содержит аминокислотную замену в положении аминокислоты 593, по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2 (SEQ ID NO:2). В некоторых вариантах осуществления, вариант капсидного белка содержит аминокислотную замену глицина на глутамат в положении аминокислоты 594, по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV1, AAV3A, AAV6 или AAV9, или в положении аминокислоты 583 из AAV5, или в положении аминокислоты 596 из AAV8 или AAV10, или аминокислотную замену аргинина на глутамат в положении аминокислоты 594 из AAV3B, или аминокислотную замену аспартата на глутамат в положении аминокислоты 592 из AAV4 или аминокислотную замену глутамина на глутамат в положении 595 из AAV7. В других вариантах осуществления, вариант капсидного белка содержит аминокислотную замену A593E, по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2, и не содержит одну или более из следующих аминокислотных замен, по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2: I19V, V369A, K26R, N215D, G355S, V46A и S196P. В родственных вариантах осуществления, вариант капсидного белка содержит аминокислотные замены A593E и N596D, по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2, и имеет по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98% или по меньшей мере приблизительно 99% идентичности со всей длиной аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO 2. В других вариантах осуществления, вариант капсида содержит аминокислотные замены A593E и N596D, по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2 и является в ином отношении идентичным с аминокислотной последовательностью AAV2. В других вариантах осуществления, вариант капсида содержит аминокислотные замены A593E и V708I, по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2, и имеет по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98% или по меньшей мере приблизительно 99% идентичности со всей длиной аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO 2. В других вариантах осуществления, вариант капсида содержит аминокислотные замены A593E и V708I, по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2 и является в ином отношении идентичным с аминокислотной последовательностью AAV2.
[00169]
В других вариантах осуществления вариант капсидного белка AAV содержит аминокислотную замену в положении аминокислоты 708, по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2 (SEQ ID NO:2) или в соответствующем положении другого исходного серотипа AAV (т.е. отличного от AAV2) где замененная аминокислота не встречается в природе в соответствующем положении. Предпочтительно, вирион rAAV не содержит замену пролина на серин в положении аминокислоты 250, по сравнению с AAV2, или соответствующей аминокислотой в другом исходном серотипе AAV. В некоторых вариантах осуществления, вариант капсидного белка содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98% или по меньшей мере приблизительно 99%, или большую, идентичность аминокислотной последовательности со всей длиной аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO 2, и содержит аминокислотную замену в положении аминокислоты 708, по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2 (SEQ ID NO:2). В предпочтительных вариантах осуществления, вариант капсидного белка содержит замену валина на изолейцин (V708I) в положении аминокислоты 708, по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2, и имеет по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98% или по меньшей мере приблизительно 99%, или большую, идентичность аминокислотной последовательности со всей длиной аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO 2, или является в ином отношении идентичным с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO:2, где вариант капсидного белка не содержит аминокислотную замену P250S. В некоторых вариантах осуществления, вариант капсидного белка содержит замену валина на изолейцин в положении аминокислоты 709 из AAV3A или AAV3B, замену аланина на изолейцин в положении 709 из AAV1 или AAV6, замену аспарагина на изолейцин в положении аминокислоты 707 из AAV4 или аминокислоты 709 из AAV9, или замену треонина на изолейцин в положении аминокислоты 710 из AAV7 или аминокислоты 711 из AAV8 или AAV10, или замену глутамина на изолейцин в положении аминокислоты 697 из AAV5. В родственных вариантах осуществления, вариант капсидного белка содержит аминокислотную замену V708I, по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2, где вариант капсидного белка содержит от 2 до 5, от 5 до 10 или от 10 до 15 аминокислотных замен, и где вариант капсидного белка не содержит аминокислотную замену P250S. В других вариантах осуществления, вариант капсидного белка содержит аминокислотную замену V708I и также содержит аминокислотную замену A593E и/или S109T, по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2. В других родственных вариантах осуществления, вариант капсида содержит аминокислотные замены V708I и A593E, по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2, где вариант капсидного белка является в ином отношении идентичным с аминокислотной последовательностью AAV2. В других родственных вариантах осуществления, вариант капсида содержит V708I и S109T аминокислотные замены, по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2, где вариант капсидного белка является в ином отношении идентичным с аминокислотной последовательностью AAV2. В других вариантах осуществления, вариант капсидного белка содержит аминокислотные замены V708I и V719M, по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2 и имеет по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98%, или по меньшей мере приблизительно 99%, или большую, идентичность аминокислотной последовательности со всей длиной аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO 2, или является в ином отношении идентичным с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO:2. В других вариантах осуществления, вариант капсидного белка содержит аминокислотные замены V708I и R733C, по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2, и имеет по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98% или по меньшей мере приблизительно 99%, или большую, идентичность аминокислотной последовательности со всей длиной аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO 2 или является в ином отношении идентичным с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO:2. В других вариантах осуществления, вариант капсидного белка содержит аминокислотные замены V708I и G727D, по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2, и имеет по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98% или по меньшей мере приблизительно 99%, или большую, идентичность аминокислотной последовательности со всей длиной аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO 2, или является в ином отношении идентичным с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO:2.
[00170]
В других вариантах осуществления, вариант капсидного белка AAV содержит аминокислотную замену в положении аминокислоты 196, по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2 (SEQ ID NO:2) или в соответствующем положении другого исходного серотипа AAV (т.е. отличного от AAV2), где замененная аминокислота не встречается в природе в соответствующем положении и является, необязательно, отличной от пролина. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, вариант капсидного белка содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98%, или по меньшей мере приблизительно 99%, или большую, идентичность аминокислотной последовательности со всей длиной аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO 2, и содержит аминокислотную замену в положении аминокислоты 196, по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2 (SEQ ID NO:2), и являющуюся, необязательно, отличной от замены S196P. В предпочтительных вариантах осуществления, вариант капсидного белка содержит аминокислотную замену серина на тирозин в положении аминокислоты 196 из AAV2 или AAV9, или в положении аминокислоты 197 из AAV7, AAV8 или AAV10, или в положении аминокислоты 186 из AAV5; или замену аланина на тирозин в положении аминокислоты 196 из AAV1 или AAV6; или замену метионина на тирозин в положении аминокислоты 191 из AAV4; или замену треонина на тирозин в положении аминокислоты 196 из AAV3A или AAV3B. В родственном варианте осуществления, вариант капсидного белка содержит аминокислотную последовательность, содержащую аминокислотную замену S196Y, по сравнению с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO:2, и является в ином отношении идентичным с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO:2. В родственных вариантах осуществления, вариант капсидного белка содержит аминокислотную замену в положении аминокислоты 196, отличную от замены S196P (например, содержит замену S196Y), по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2 (SEQ ID NO:2), где вариант капсидного белка содержит от 1 до 5, от 5 до 10 или от 10 до 15 аминокислотных замен, по сравнению с аминокислотной последовательностью капсидного белка AAV2, указанной в SEQ ID NO:2.
[00171]
В других вариантах осуществления, вариант капсидного белка AAV содержит аминокислотную замену в положении аминокислоты 175, по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2 (SEQ ID NO:2), или в соответствующем положении другого исходного серотипа AAV (т.е. отличного от AAV2), где замененная аминокислота не встречается в природе в соответствующем положении. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, вариант капсидного белка содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98% или по меньшей мере приблизительно 99%, или большую, идентичность аминокислотной последовательности со всей длиной аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO 2, и содержит аминокислотную замену в положении аминокислоты 175, по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2 (SEQ ID NO:2). В некоторых вариантах осуществления, вариант капсида содержит аминокислотную замену Q175H, по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2, как указано в SEQ ID NO:2, или замену глутамина на гистидин в соответствующем положении другого исходного серотипа AAV. В родственных вариантах осуществления, вариант капсидного белка содержит аминокислотную замену в положении аминокислоты 175 (например, Q175H), по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2 (SEQ ID NO:2), где вариант капсидного белка содержит от 1 до 5, от 5 до 10 или от 10 до 15 аминокислотных замен, по сравнению с аминокислотной последовательностью капсидного белка AAV2, указанной в SEQ ID NO:2.
[00172]
В других вариантах осуществления, вариант капсидного белка AAV содержит аминокислотную замену в положении аминокислоты 64, по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2 (SEQ ID NO:2) или в соответствующем положении другого исходного серотипа AAV (т.е. отличного от AAV2), где замененная аминокислота не встречается в природе в соответствующем положении. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, вариант капсидного белка содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98% или по меньшей мере приблизительно 99%, или большую, идентичность аминокислотной последовательности со всей длиной аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO 2, и содержит аминокислотную замену в положении аминокислоты 64, по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2 (SEQ ID NO:2). В некоторых вариантах осуществления, вирион rAAV содержит аминокислотную заменуP64S, по сравнению с аминокислотной последовательностью AAV2, как указано в SEQ ID NO:2, или замену пролина на серин в соответствующем положении другого исходного серотипа AAV. В родственных вариантах осуществления, вариант капсидного белка содержит аминокислотную замену в положении аминокислоты 64 (например, P64S), по сравнению с аминокислотной последовательностью капсида AAV2 (SEQ ID NO:2), где вариант капсидного белка содержит от 1 до 5, от 5 до 10 или от 10 до 15 аминокислотных замен, по сравнению с аминокислотной последовательностью капсидного белка AAV2, указанной в SEQ ID NO:2.
[00173]
В других вариантах осуществления, вариант капсидного белка AAV содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% идентичность с последовательностью капсида AAV дикого типа, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11 и 12, и также содержит i) одну или более аминокислотных замен, выбранных из группы, состоящей из P34A, S109T+V708I, A593E+N596D, V708I+V719M, V708I+G727D, S109T+A493V+A593E+V708I, V708I+R733C, Q164K и I698V, и/или (ii) пептидную вставку, выбранную из группы, состоящей из QADTTKN (SEQ ID NO:13), ISDQTKH (SEQ ID NO:14), ASDSTKA (SEQ ID NO:15), NQDYTKT (SEQ ID NO:16), HDITKNI (SEQ ID NO:17), PQANANEN (SEQ ID NO:63), TNRTSPD (SEQ ID NO:24), PNSTHGS (SEQ ID NO:25), KDRAPST (SEQ ID NO:26), HQDTTKN (SEQ ID NO:19), HPDTTKN (SEQ ID NO:18), NKTTNKD (SEQ ID NO:20), GKSKVID (SEQ ID NO:23), PISNENEH (SEQ ID NO:64), LAQADTTKNA (SEQ ID NO:27), LAISDQTKHA (SEQ ID NO:28), LGISDQTKHA (SEQ ID NO:29), LAASDSTKAA (SEQ ID NO:30), LAHDITKNIA (SEQ ID NO:32), LPQANANENA (SEQ ID NO:37), LANQDYTKTA (SEQ ID NO:31), LATNRTSPDA (SEQ ID NO:39), LAPNSTHGSA (SEQ ID NO:40), LAKDRAPSTA (SEQ ID NO:41), LAHQDTTKNA (SEQ ID NO:34), LAHPDTTKNA (SEQ ID NO:33), LANKTTNKDA (SEQ ID NO:35), LAGKSKVIDA (SEQ ID NO:38) и LPISNENEHA (SEQ ID NO:36). В некоторых вариантах осуществления, вариант капсида AAV содержит указанные одну или более аминокислотных замен и/или пептидных вставок и является в ином отношении идентичным последовательности, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-12.
[00174]
in silico
В некоторых вариантах осуществления, вариант капсидного белка AAV представляет собой предковый капсидный белок. Под предковым капсидным белоком понимают эволюционного предка капсидного белка, обнаруживаемого в природе в настоящее время, например, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV13, который получают  посредством случайной замены аминокислот в положениях вырожденности между капсидными белками AAV, обнаруживаемыми в природе в настоящее время. Один неограничивающий пример предкового капсида представлен ниже, где положения вырожденности (остатки 264, 266, 268, 448, 459, 460, 467, 470, 471, 474, 495, 516, 533, 547, 551, 555, 557, 561, 563, 577, 583, 593, 596, 661, 662, 664, 665, 710, 717, 718, 719, 723) отмечены как «X»:
[00175]
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEGAKTAPGKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPAGPSGLGSGTMAAGGGAPMADNNEGADGVGNASGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSXSXGXTNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTTNDGVTTIANNLTSTVQVFSDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLXRTQSTGGTAGXXELLFSQXGPXXMSXQAKNWLPGPCYRQQRVSKTLXQNNNSNFAWTGATKYHLNGRXSLVNPGVAMATHKDDEXRFFPSSGVLIFGKXGAGXNNTXLXNVMXTXEEEIKTTNPVATEXYGVVAXNLQSSNTAPXTGXVNSQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPPXXFXXAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYAKSXNVDFAVXXXGVYXEPRPIGTRYLTRNL (SEQ ID NO:58).
[00176]
В некоторых вариантах осуществления, предковый капсидный белок содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98% или по меньшей мере приблизительно 99%, или большую, идентичность аминокислотной последовательности со всей длиной аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO:58. В некоторых вариантах осуществления, предковый капсидный белок содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98% или по меньшей мере приблизительно 99%, или большую, идентичность аминокислотной последовательности со всей длиной аминокислотной последовательности AAV2, например, как указано в SEQ ID NO 2. В некоторых вариантах осуществления, предковый капсидный белок содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98% или по меньшей мере приблизительно 99%, или большую, идентичность аминокислотной последовательности со всей длиной аминокислотной последовательности из предковой последовательности, описанной в SEQ ID NO:58 или в SEQ ID NO:2, и содержит один или более аминокислотных остатков, выбранных из группы, состоящей из: аланина (A) в 264, аланина (A) в 266, серина (S) в 268, аланина (A) в 448, треонина (T) в 459, аргинина (R) в 460, аланина (A) в 467, серина (S) в 470, аспарагина (N) в 471, аланина (A) в 474, серина (S) в 495, аспарагина (D) в 516, аспарагина (D) в 533, глутамина (Q) в 547, аланина (A) в 551, аланина (A) в 555, глутаминовой кислоты (E) в 557, метионина (M) в 561, серина (S) в 563, глутамина (Q) в 577, серина (S) в 583, валина (V) в 593, треонина (T) в 596, аланина (A) в 661, валина (V) в 662, треонина (T) в 664, пролина (P) в 665, треонина (T) в 710, аспарагиновой кислоты (D) в 717, аспарагина (N) в 718, глутаминовой кислоты (E) в 719 и серина (S) в 723. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, вариант капсидного белка содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98%, или по меньшей мере приблизительно 99%, в некоторых случаях 100% идентичность аминокислотной последовательности со всей длиной следующей аминокислотной последовательности и содержит один или более аминокислотных остатков, выбранных из группы, состоящей из: аланина (A) в 264, аланина (A) в 266, серина (S) в 268, аланина (A) в 448, треонина (T) в 459, аргинина (R) в 460, аланина (A) в 467, серина (S) в 470, аспарагина (N) в 471, аланина (A) в 474, серина (S) в 495, аспарагина (D) в 516, аспарагина (D) в 533, глутамина (Q) в 547, аланина (A) в 551, аланина (A) в 555, глутаминовой кислоты (E) в 557, метионина (M) в 561, серина (S) в 563, глутамина (Q) в 577, серина (S) в 583, валина (V) в 593, треонина (T) в 596, аланина (A) в 661, валина (V) в 662, треонина (T) в 664, пролина (P) в 665, треонина (T) в 710, аспарагиновой кислоты (D) в 717, аспарагина (N) в 718, глутаминовой кислоты (E) в 719 и серина (S) в 723:
[00177]
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEGAKTAPGKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPAGPSGLGSGTMAAGGGAPMADNNEGADGVGNASGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSASAGSTNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTTNDGVTTIANNLTSTVQVFSDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLARTQSTGGTAGTRELLFSQAGPSNMSAQAKNWLPGPCYRQQRVSKTLSQNNNSNFAWTGATKYHLNGRDSLVNPGVAMATHKDDEDRFFPSSGVLIFGKQGAGANNTALENVMMTSEEEIKTTNPVATEQYGVVASNLQSSNTAPVTGTVNSQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPPAVFTPAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYAKSTNVDFAVDNEGVYSEPRPIGTRYLTRNL (SEQ ID NO:59).
[00178]
В других вариантах осуществления, вариант капсидного белка AAV содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98% идентичность с последовательностью капсида AAV дикого типа, выбранной из группы, состоящей из предкового варианта, описанного в настоящем описании как SEQ ID NO:58, содержит один или более аминокислотных остатков, выбранных из группы, состоящей из: аланина (A) в 264, аланина (A) в 266, серина (S) в 268, аланина (A) в 448, треонина (T) в 459, аргинина (R) в 460, аланина (A) в 467, серина (S) в 470, аспарагина (N) в 471, аланина (A) в 474, серина (S) в 495, аспарагина (D) в 516, аспарагина (D) в 533, глутамина (Q) в 547, аланина (A) в 551, аланина (A) в 555, глутаминовой кислоты (E) в 557, метионина (M) в 561, серина (S) в 563, глутамина (Q) в 577, серина (S) в 583, валина (V) в 593, треонина (T) в 596, аланина (A) в 661, валина (V) в 662, треонина (T) в 664, пролина (P) в 665, треонина (T) в 710, аспарагиновой кислоты (D) в 717, аспарагина (N) в 718, глутаминовой кислоты (E) в 719 и серина (S) в 723; и также содержит i) одну или более аминокислотных замен, выбранных из группы, состоящей из P34A, S109T+V708I, A593E+N596D, V708I+V719M, V708I+G727D, S109T+A493V+A593E+V708I, V708I+R733C, Q164K, и I698V, и/или (ii) пептидную вставку, выбранную из группы, состоящей из QADTTKN (SEQ ID NO:13), ISDQTKH (SEQ ID NO:14), ASDSTKA (SEQ ID NO:15), NQDYTKT (SEQ ID NO:16), HDITKNI (SEQ ID NO:17), PQANANEN (SEQ ID NO:63), TNRTSPD (SEQ ID NO:24), PNSTHGS (SEQ ID NO:25), KDRAPST (SEQ ID NO:26), HQDTTKN (SEQ ID NO:19), HPDTTKN (SEQ ID NO:18), NKTTNKD (SEQ ID NO:20), GKSKVID (SEQ ID NO:23), PISNENEH (SEQ ID NO:64), LAQADTTKNA (SEQ ID NO:27), LAISDQTKHA (SEQ ID NO:28), LGISDQTKHA (SEQ ID NO:29), LAASDSTKAA (SEQ ID NO:30), LAHDITKNIA (SEQ ID NO:32), LPQANANENA (SEQ ID NO:37), LANQDYTKTA (SEQ ID NO:31), LATNRTSPDA (SEQ ID NO:39), LAPNSTHGSA (SEQ ID NO:40), LAKDRAPSTA (SEQ ID NO:41), LAHQDTTKNA (SEQ ID NO:34), LAHPDTTKNA (SEQ ID NO:33), LANKTTNKDA (SEQ ID NO:35), LAGKSKVIDA (SEQ ID NO:38) и LPISNENEHA (SEQ ID NO:36). В некоторых вариантах осуществления, вариант капсида AAV содержит указанные одну или более аминокислотных замен и/или пептидных вставок и является в ином отношении идентичным SEQ ID NO:59.
[00179]
in vivo
in vitro
in vivo
Варианты AAV, описанные в настоящем описании, получали с использованием направленной эволюции , включающей использование скрининга сетчатки приматов после введения в стекловидное тело. В некоторых вариантах осуществления, варианты белков капсида, описанные в настоящем описании, когда присутствуют в вирионе AAV, обеспечивают более эффективную трансдукцию клеток сетчатки, по сравнению с трансдукцией клеток сетчатки вирионом AAV, содержащим соответствующий исходный капсидный белок AAV или AAV дикого типа. Например, в некоторых вариантах осуществления, варианты белков капсида, описанные в настоящем описании, когда присутствуют в вирионе AAV, обеспечивают более эффективную трансдукцию клеток сетчатки приматов, чем вирионы AAV, содержащие соответствующий исходный капсидный белок AAV или капсидный белок AAV дикого типа, например, клетки сетчатки поглощают больше вирионов AAV, содержащих рассматриваемый вариант капсидного белка AAV, чем вирионов AAV, содержащие исходный капсидный белок AAV или AAV дикого типа. В некоторых таких вариантах осуществления, для варианта вириона AAV или варианта rAAV показана по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 5 раз, по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере в 15 раз, по меньшей мере в 20 раз, по меньшей мере в 25 раз, по меньшей мере в 50 раз, или более чем в 50 раз, увеличенная трансдукция клетки сетчатки, по сравнению с трансдукцией клетки сетчатки вирионом AAV дикого типа или rAAV, содержащим соответствующий исходный капсидный белок AAV. В конкретных таких вариантах осуществления, варианты белков капсида, описанные в настоящем описании, когда присутствует в вирионе AAV, обеспечивают более широкую трансдукцию клеток сетчатки приматов, чем вирионы AAV, содержащие соответствующий исходный капсидный белок AAV или капсидный белок AAV дикого типа. Иными словами, вариант вириона AAV трансдуцирует типы клеток, не трансдуцируемые вирионами, содержащими соответствующий исходный капсидный белок AAV, и таким образом больше типов клеток сетчатки, чем соответствующий исходный вирион AAV. В некоторых вариантах осуществления, вариант вириона AAV предпочтительно трансдуцирует клетку сетчатки, например, рассматриваемый вирион rAAV инфицирует клетку сетчатки с в 2 раза, в 5 раз, в 10 раз, в 15 раз, в 20 раз, в 25 раз, в 50 раз, или более чем в 50 раз, более высокой специфичностью, чем другая клетка сетчатки или не относящаяся к сетчатке клетка, например, клетка вне глаза. В некоторых вариантах осуществления, трансдуцированная клетка сетчатки представляет собой фоторецепторную клетку (например, палочки; колбочки). В некоторых вариантах осуществления, клетка сетчатки представляет собой ганглионарную клетку сетчатки (RGC). В некоторых вариантах осуществления, клетка сетчатки представляет собой эпителиальную клетку сетчатки (клетку RPE). В некоторых вариантах осуществления, клетка сетчатки представляет собой глиальную клетку Мюллера. В некоторых вариантах осуществления, клетка сетчатки представляет собой микроглиальную клетку. В некоторых вариантах осуществления, клетка сетчатки представляет собой амакриновую клетку. В некоторых вариантах осуществления, клетка сетчатки представляет собой биполярную клетку. В некоторых вариантах осуществления, клетка сетчатки представляет собой горизонтальную клетку. Увеличения трансдукции клеток сетчатки, например, увеличенной эффективности трансдукции, более широкой трансдукции, более предпочтительной трансдукции и т.д. можно легко достигать  или  посредством любого количества известных в данной области способов для измерения экспрессии гена. Например, можно осуществлять упаковку AAV с геномом, содержащим экспрессирующую кассету, содержащую репортерный ген, например, флуоресцентный белок, под контролем повсеместно экспрессирующего или тканеспецифического промотора, и оценивать степень трансдукции посредством детекции флуоресцентного белка, например, посредством флуоресцентной микроскопии. В качестве другого примера, можно осуществлять упаковку AAV с геномом, содержащим снабженную штрих-кодом последовательность нуклеиновой кислоты, и оценивать степень трансдукции посредством детекции последовательности нуклеиновой кислоты, например, посредством ПЦР. В качестве другого примера, можно осуществлять упаковку AAV с геномом, содержащим экспрессирующую кассету, содержащую терапевтический ген, для лечения заболевания сетчатки, и оценивать степень трансдукции посредством детекции лечения заболевания сетчатки у пораженного пациента, которому вводили AAV.
[00180]
malattia levantanese
Офтальмологические заболевания, которые можно лечить с использованием варианта вектора или вириона rAAV, и/или способа, описанного в настоящем описании, включают, но без ограничения, моногенные заболевания, комплексные генетические заболевания, приобретенные заболевания и травматические повреждения. Примеры моногенных заболевания включают, но без ограничения, синдром Барде-Бидля; болезнь Баттена; кристаллиновую дистрофию Бьетти; хороидеремию; хориоретинальную атрофию; хориоретинальную дегенерацию; дистрофии колбочек или колбочек-палочек (аутосомно-доминантные, аутосомно-рецессивные, и X-сцепленные); наследственную стационарную ночную слепоту (аутосомно-доминантную, аутосомно-рецессивную и X-сцепленную); нарушения цветного зрения, включая ахроматопсию (включая ACHM2, ACHM3, ACHM4 и ACHM5), протанопию, дейтеранопию и тританопию; атаксию Фридрейха; врожденный амавроз Лебера (аутосомно-доминантный и аутосомно-рецессивный), включая, но без ограничения, LCA1, LCA2, LCA3, LCA4, LCA6, LCA7, LCA8, LCA12 и LCA15; наследственную оптическую нейропатию Лебера; макулодистрофию (аутосомно-доминантную и аутосомно-рецессивную), включая, но без ограничения, острую дегенерацию желтого пятна, вителлиформную макулодистрофию Беста, узорчатую дистрофию, макулодистрофию Северной Каролины, наследственные друзы, дистрофию глазного дна Сорсби,  и генетически определенную ретинопатию недоношенных; заболевание окулярно-ретинального развития; глазной альбинизм; атрофии зрительного нерва (аутосомно-доминантные, аутосомно-рецессивные и X-сцепленные); пигментный ретинит (аутосомно-доминантные, аутосомно-рецессивные, X-сцепленные и митохондриально наследуемые признаки), примеры которых включают RP1, RP2, RP3, RP10, RP20, RP38, RP40 и RP43; X-сцепленный ретиношизис; болезнь Штаргардта; и синдром Ашера, включая, но без ограничения, USH1B, USH1C, USH1D, USH1F, USH1G, USH2A, USH2C, USH2D и USH3. Примеры комплексных генетических заболеваний включают, но без ограничения, глаукому (открытоугольную, закрытоугольную, гипотензивную, нормотензивную, врожденную, неоваскулярную, пигментную, псевдоэксфолиативную); связанную с возрастом и другие формы дегенерации желтого пятна, как эксудативные, так и неэксудативные формы (аутосомно-доминантные и аутосомно-рецессивные), такие как острая дегенерация желтого пятна, вителлиформная дегенерация желтого пятна; ретинопатию недоношенных; и синдром Фогта-Коянаги-Харада (VKH). Примеры приобретенных заболеваний включают, но без ограничения, острую нейроретинопатию желтого пятна; переднюю ишемическую оптическую невропатию и заднюю ишемическую оптическую невропатию; болезнь Бехчета; окклюзию ветви вены сетчатки; хориоидальную неоваскуляризацию; диабетическую ретинопатию, включая пролиферативную диабетическую ретинопатию и ассоциированные осложнения; диабетический увеит; отек, такой как отек желтого пятна, кистоидный отек желтого пятна и диабетический отек желтого пятна; нарушения эпиретинальной мембраны; телеангиэктозию желтого пятна; мультифокальный хороидит; неретинопатическую диабетическую дисфункцию сетчатки; опухоли глаз; атрофии зрительного нерва; отслоение сетчатки; нарушения сетчатки, такие как окклюзия центральной вены сетчатки, пролиферативная витреоретинопатия (PVR), окклюзионное поражение артерий и вен сетчатки, окклюзию сосудов, увеальное заболевание сетчатки; увеальную эффузию; инфекционное и инфильтрирующее заболевание сетчатки; заболевания зрительного нерва, такие как приобретенная атрофия зрительного нерва. Примеры травматических повреждений включают, но без ограничения, гистоплазмоз; травму зрительного нерва; травму глаза, затрагивающую задний сегмент или участок глаза; травму сетчатки; вирусную инфекцию глаза; вирусную инфекцию зрительного нерва; состояние, затрагивающее задний сегмент глаза, которое вызывает или на которое влияет лазерная терапия глаза; состояния, затрагивающие задний сегмент глаза, которые вызывает или на которые влияет фотодинамическая терапия; фотокоагуляцию, радиационную ретинопатию; и симпатическую офтальмию.
[00181]
HH
В другом варианте осуществления, вариант капсида, описанный в настоящем описании, содержит гетерологичную нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую продукт гена, такой как, без ограничения, интерферирующая РНК, длинная некодирующая РНК, короткая некодирующая РНК, антисмысловая РНК, аптамер, полипептид, секретируемое антитело, одноцепочечное антитело, домен V, растворимый рецептор, аффитело, ноттин, дарпин, центурин, шаперон, сайт-специфическая нуклеаза, обеспечивающая сайт-специфический нокдаун функции гена или модифицированная сайт-специфическая нуклеаза, обеспечивающая геноспецифическую активацию транскрипции.
[00182]
HH
Вариант вириона rAAV, описанный в настоящем описании, содержит гетерологичную нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую продукт гена. В некоторых вариантах осуществления, продукт гена представляет собой интерферирующую РНК. В некоторых вариантах осуществления, продукт гена представляет собой длинную некодирующую РНК. В некоторых вариантах осуществления, продукт гена представляет собой короткую некодирующую РНК. В некоторых вариантах осуществления, продукт гена представляет собой антисмысловую РНК. В некоторых вариантах осуществления, продукт гена представляет собой аптамер. В некоторых вариантах осуществления, продукт гена представляет собой полипептид. В некоторых вариантах осуществления, продукт гена представляет собой секретируемое антитело. В некоторых вариантах осуществления, продукт гена представляет собой одноцепочечное антитело. В некоторых вариантах осуществления, продукт гена представляет собой домен V. В некоторых вариантах осуществления, продукт гена представляет собой растворимый рецептор. В некоторых вариантах осуществления, продукт гена представляет собой аффитело. В некоторых вариантах осуществления, продукт гена представляет собой ноттин. В некоторых вариантах осуществления, продукт гена представляет собой дарпин. В некоторых вариантах осуществления, продукт гена представляет собой центурин. В некоторых вариантах осуществления, продукт гена представляет собой шаперон. В некоторых вариантах осуществления, продукт гена представляет собой сайт-специфическую нуклеазу, обеспечивающую сайт-специфический нокдаун функции гена.
[00183]
Применения продукта гена включают, но без ограничения, увеличение уровня фактора в клетке, увеличение уровня фактора в соседней клетке посредством секреции фактора, уменьшение уровня фактора в клетке, или уменьшение уровня фактора в соседней клетке посредством секреции фактора. Продукт гена можно конструировать для дополнения уровня продукта дефектного или отсутствующего гена, уменьшения уровня продукта дефектного или отсутствующего гена, введения нового продукта поддерживающего гена, дополнения уровня продукта поддерживающего гена, уменьшения уровня продукта тормозящего гена, или как уменьшения уровня продукта тормозящего гена, так и введения или дополнения уровня продукта поддерживающего гена.
[00184]
C. elegans
Продукты генов, доставляемых посредством рассматриваемых вариантов AAV, можно использовать для изменения уровня продуктов генов или активности продуктов генов, напрямую или опосредованно связанных с заболеваниями и травмой сетчатки. Гены, продукты которых напрямую или опосредованно связаны с генетическими заболеваниями, включают, например, гены подобного фактору АДФ-рибозилирования белка 6 (ARL6); взаимодействующего с ББсомой белка 1 (BBIP1); белка 1 ББсомы (BBS1); белка 2 ББсомы (BBS2); белка 4 ББсомы (BBS4); белка 5 ББсомы (BBS5); белка 7 ББсомы (BBS7); белка 9 ББсомы (BBS9); белка 10 ББсомы (BBS10); белка 12 ББсомы (BBS12); центросомного белка 290 кДа (CEP290); белка 172 интрафлагеллярного транспорта (IFT172); белка 27 интрафлагеллярного транспорта (IFT27); инозитол-полифосфат-5-фосфатазы E (INPP5E); члена 13 подсемейства J калиевого канала внутреннего выпрямления (KCNJ13); подобного фактору транскрипции с лейциновой молнией белка-1 (LZTFL1); белка синдрома МакКьюсика-Кауфмана (MKKS); белка синдрома Меккеля типа 1 (MKS1); белка 3 нефронофтиза (NPHP1); серологически определенного антигена 8 рака толстого кишечника (SDCCAG8); содержащего трехкомпонентный мотив белка 32 (TRIM32); домена 8 тетратрикопептидного повтора (TTC8); белка болезни Баттена (CLN3); сопровождающего Rab белка 1 (CHM); (PRDM13); (RGR; (TEAD1); подобного взаимодействующему с арилуглеводородом рецептору белка 1 (AIPL1); otx-подобного фактора транскрипции фоторецепторов колбочко-палочкового гомеобокса (CRX); активирующего гуанилатциклазу белка 1A (GUCA1A); специфической для сетчатки гуанилатциклазы (GUCY2D); члена 3 семейства ассоциированных с мембраной белков транспорта фосфатидилинозитола (PITPNM3); проминина 1 (PROM1); периферина (PRPH); периферина 2 (PRPH2); регулирующего экзоцитоз синаптической мембраны белка 1 (RIMS1); семафорина 4A (SEMA4A); человеческого гомолога белка unc119  (UNC119); связывающего АТФ кассетного транспортера - сетчатки (ABCA4); домена 9 металлопептидазы ADAM (ADAM9); активирующего транскрипцию фактора 6 (ATF6); открытой рамки считывания 2 хромосомы 21 (C21orf2); открытой рамки считывания 37 хромосомы 8 (C8orf37); кальциевого канала; потенциалзависимого; субъединицы 4 альфа 2/дельта (CACNA2D4); родственного кадгерину члена семейства 1 (протокадгерина 21) (CDHR1); подобного церамид-киназе белка (CERKL); альфа-субъединицы управляемого цГМФ катионного канала фоторецепторных колбочек (CNGA3); субъединицы бета 3 управляемого циклическими нуклеотидами катионного канала колбочек (CNGB3); циклина M4 (CNNM4); связывающего нуклеотид гуанин белка (G-белка); полипептида 2 с активностью альфа-трансдукции (GNAT2); члена 2 подсемейства V калиевых каналов (KCNV2); фосфодиэстеразы 6C (PDE6C); фосфодиэстеразы 6H (PDE6H); центриольного белка B протеома центриоли 1 (POC1B); члена RAB28 семейства онкогенов RAS (RAB28); фактора транскрипции гомеобокса 2 сетчатки и передней нервной складки (RAX2); 11-цис-ретинол-дегидрогеназы 5 (RDH5); белка 1, взаимодействующего с регулятором ГТФазы при RP (RPGRIP1); члена 5 семейства подобных тубулин-тирозин-лигазе белков (TTLL5); субъединицы альфа-1 потенциалзависимого кальциевого канала L-типа (CACNA1F); регулятора ГТФазы при пигментном ретините (RPGR); (GNAT1); (PDE6B); (RHO); CABP4); GPR179); (GRK1); GRM6); LRIT3); SLC24A1); TRPM1); NYX); OPN1LW); OPN1MW); голубого конопсина (OPN1SW); фратаксина (FXN); (IMPDH1); (OTX2); CRB1); DTHD1GDF6); IFT140); IQCB1); LCA5); LRAT); NMNAT1); RD3); RDH12); RPE65); SPATA7); TULP1); митохондриальных генов (KSS, LHON, MT-ATP6, MT-TH, MT-TL1, MT-TP, MT-TS2, генов кодируемых митохондриями NADH дегидрогеназ [MT-ND]); (BEST1); C1QTNF5EFEMP1); ELOVL4); FSCN2); GUCA1B); HMCN1); IMPG1); RP1L1); TIMP3); DRAM2); MFN2); NR2F1); белка 1 атрофии зрительного нерва (OPA1); TMEM126A); TIMM8A); CA4); HK1); KLHL7); NR2E3); NRL); OR2W3); PRPF3); PRPF4); PRPF6); PRPF8); PRPF31); ROM1); белка 1 пигментного ретинита (RP1); RP9); SNRNP200); SPP2); TOPORS); ARL2BP); C2orf71); CLRN1); CNGA1); CNGB1); CYP4V2); DHDDS); DHX38); EMC1); EYS); FAM161A); GPR125); HGSNAT); IDH3B); IMPG2); KIAA1549); KIZ); MAK); MERTK); MVK); NEK2); NEUROD1); PDE6A); PDE6G); PRCD); RBP3); RLBP1); SLC7A14); USH2A); ZNF408); ZNF513); OFD1); RP2); ретиношизина (RS1); ABHD12); CDH23); CEP250); CIB2); DFNB31); GPR98); HARS); MYO7A); PCDH15); USH1C); USH1G); NDP); PGK1); CAPN5); FZD4); ITM2B); LRP5); MIR204); RB1); TSPAN12); C12orf65); CDH3); MFRP); OAT); PLA2G5); RBP4); RGS9); RGS9BP); ARMS2; ERCC6); FBLN5); HTRA1); TLR3); и TLR4).
[00185]
Гены, продукты которых индуцируют или стимулируют апоптоз, обозначены в настоящем описании как «проапоптотические гены», и продукты этих генов (мРНК; белок) обозначены как «продукты проапоптотических генов». Проапоптотические мишени включают, например, продукты генов Bax; продукты генов Bid; продукты генов Bak; продукты генов Bad; Bcl-2; Bcl-X1. Антиапоптотические продукты генов включают X-сцепленный ингибитор апоптоза.
[00186]
Гены, продукты которых индуцируют или стимулируют ангиогенез, обозначены в настоящем описании как «проангиогенные гены», и продукты этих генов (мРНК; белок) обозначены как «продукты проангиогенных генов». Проангиогенные мишени включают, например, фактор роста эндотелия сосудов (VEGFa, VEGFb, VEGFc, VEGFd); рецептор 1 фактора роста эндотелия сосудов (VEGFR1); рецептор 2 фактора роста эндотелия сосудов (VEGFR2); родственную Fms тирозинкиназу 1 (Flt1); фактор роста плаценты (PGF); тромбоцитарный фактор роста (PDGF); ангиопоэтины; sonic hedgehog. Гены, продукты которых ингибируют ангиогенез, обозначены в настоящем описании как «антиангиогенные гены», и продукты этих генов (мРНК; белок) обозначены как «продукты антиангиогенных генов». Продукты антиангиогенных генов включают эндостатин; тумстатин; ангиостатин; фактор пигментного эпителия (PEDF) и слитые белки или антитела, которые являются специфическими для проангиогенных мишеней и/или их рецепторов, например, слитые белки против VEGF sFLT1 или эйлеа, специфические для VEGF антитела люцентис™ и авастин™ и т.д.
[00187]
В некоторых вариантах осуществления, продукт(ы) гена, доставляемые посредством рассматриваемых вариантов AAV, действуют для ингибирования ангиогенеза. В конкретных предпочтительных вариантах осуществления, продукт(ы) гена, доставляемые посредством рассматриваемых вариантов AAV, действуют для ингибирования активности одного или более белков VEGF млекопитающих, выбранных из группы, состоящей из VEGFa, VEGFb, VEGFc, VEGFd и PGF. В особенно предпочтительных вариантах осуществления, продукт(ы) гена, доставляемые посредством рассматриваемых вариантов AAV, ингибируют активность VEGFa. VEGFa имеет 9 изоформ, образуемых посредством альтернативного сплайсинга, наиболее физиологически значимой из которых является VEGF165. Обнаружено, что уровни VEGFa увеличены в стекловидном теле пациентов с влажной связанной с возрастом дегенерацией желтого пятна, диабетическим отеком желтого пятна и окклюзией вен сетчатки. Продукт(ы) гена, которые ингибируют активность VEGFa в глазу, и которые, таким образом, являются эффективными для лечения пациентов с увеличенным уровнем VEGFa в стекловидном теле, включают, но без ограничения, афлиберцепт, ранибизумаб, бролуцизумаб, бевацизумаб и растворимую подобную fms тирозинкиназу 1 (sFLT1) (No. доступа в GenBank U01134). В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к инфекционному рекомбинантному вириону AAV (rAAV), содержащему (i) вариант капсидного белка AAV, как описано в настоящем описании, и (ii) гетерологичную нуклеиновую кислоту, содержащую множество последовательностей, каждая из которых кодирует отдельный ингибитор VEGFa.
[00188]
В одном предпочтительном варианте осуществления, продукт гена представляет собой афлиберцепт. Афлиберцепт (ЭЙЛЕА) представляет собой рекомбинантный слитый белок, содержащий внеклеточный домены рецепторов 1 и 2 VEGF человека, слитые с фрагментом Fc IgG1 человека. Афлиберцепт действует как растворимый рецептор-ловушка, который связывает VEGFa и PGF с большей аффинностью, чем природные рецепторы. Одобренная доза для инъекции афлиберцепта в стекловидное тело составляет 2,0 мг, его дозирование меняется в соответствии с показанием. Афлиберцепт показан для лечения неоваскулярной (влажной) связанной с возрастом дегенерации желтого пятна, отека желтого пятна после окклюзии вен сетчатки, диабетического отека желтого пятна и диабетической ретинопатии. В особенно предпочтительном варианте осуществления, настоящее изобретение относится к новой оптимизированной по кодонному составу последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей афлиберцепт (соответствующий фигуре 12A), содержащей или состоящей из:
[00189]
ATGGTTTCTTACTGGGACACCGGCGTGCTGCTGTGTGCCCTGCTTTCTTGTCTGCTGCTGACCGGCTCTAGCAGCGGCTCTGATACCGGCAGACCCTTCGTGGAAATGTACAGCGAGATCCCCGAGATCATCCACATGACCGAGGGCAGAGAGCTGGTCATCCCTTGCAGAGTGACAAGCCCCAACATCACCGTGACTCTGAAGAAGTTCCCTCTGGACACACTGATCCCCGACGGCAAGAGAATCATCTGGGACAGCCGGAAGGGCTTCATCATCAGCAACGCCACCTACAAAGAGATCGGCCTGCTGACCTGTGAAGCCACCGTGAATGGCCACCTGTACAAGACCAACTACCTGACACACAGACAGACCAACACCATCATCGACGTGGTGCTGAGCCCTAGCCACGGCATTGAACTGTCTGTGGGCGAGAAGCTGGTGCTGAACTGTACCGCCAGAACCGAGCTGAACGTGGGCATCGACTTCAACTGGGAGTACCCCAGCAGCAAGCACCAGCACAAGAAACTGGTCAACCGGGACCTGAAAACCCAGAGCGGCAGCGAGATGAAGAAATTCCTGAGCACCCTGACCATCGACGGCGTGACCAGAAGTGACCAGGGCCTGTACACATGTGCCGCCAGCTCTGGCCTGATGACCAAGAAAAACAGCACCTTCGTGCGGGTGCACGAGAAGGACAAGACCCACACCTGTCCTCCATGTCCTGCTCCAGAACTGCTCGGCGGACCTTCCGTGTTCCTGTTTCCTCCAAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCCCACGAGGATCCCGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTAGAGAGGAACAGTACAATAGCACCTACAGAGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCTCCTATCGAGAAAACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCTAGGGAACCCCAGGTTTACACACTGCCTCCAAGCAGGGACGAGCTGACAAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTCAAGGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAATGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACAACCCCTCCTGTGCTGGACAGCGACGGCTCATTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACAGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGTCTCCTGGCAAATGA (SEQ ID NO:65).
[00190]
В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей афлиберцепт, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98% или по меньшей мере приблизительно 99%, или большую, идентичность нуклеиновой кислоты со всей длиной последовательности нуклеиновой кислоты, указанной в SEQ ID NO:65, или с нуклеотидами 79-1377 из SEQ ID NO:65 (без подчеркнутых нуклеотидов, кодирующих сигнальную последовательность Flt1). В родственных вариантах осуществления, продукт(ы) гена, доставляемые посредством рассматриваемых варианта(вариантов) AAV, кодированы последовательностью нуклеиновой кислоты, состоящей из или содержащей последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO:65, или нуклеиновой кислоты, имеющей по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98% или по меньшей мере приблизительно 99% идентичность с ней. В других родственных вариантах осуществления, продукт(ы) гена, доставляемые посредством рассматриваемых вариантов AAV, содержат аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере приблизительно по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98%, по меньшей мере приблизительно 99% идентичность или 100% идентичность со следующей аминокислотной последовательностью:
[00191]
MVSYWDTGVLLCALLSCLLLTGSSSGSDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:66).
[00192]
В других родственных вариантах осуществления, вариант(ы) AAV содержат гетерологичную нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98%, по меньшей мере приблизительно 99% идентичность или 100% идентичность с аминокислотами 27-458 из SEQ ID NO:66 (соответствующими аминокислотной последовательности афлиберцепта без подчеркнутой последовательности сигнального пептида).
[00193]
В другом предпочтительном варианте осуществления, продукт гена представляет собой одноцепочечный вариант ранибизумаба (sc-ранибизумаб). Ранибизумаб (ЛЮЦЕНТИС) представляет собой фрагмент (Fab) моноклонального антитела IgG1, который связывает и блокирует все изоформы VEGFa. ЛЮЦЕНТИС экспрессируется в форме двух отдельных цепей (легкой и тяжелой), соединенных посредством дисульфидной связи между константным легким доменом (CL) и константным тяжелым доменом 1 (CH1). Одобренная доза ранибизумаба для введения в стекловидное тело составляет либо 0,3, либо 0,5 мг в 0,05 мл, в зависимости от показания. Ранибизумаб одобрен для лечения влажной связанной с возрастом дегенерации желтого пятна, отека желтого пятна после окклюзии вен сетчатки, диабетического отека желтого пятна и диабетической ретинопатии. В особенно предпочтительном варианте осуществления, настоящее изобретение относится к новой оптимизированной по кодонному составу последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей одноцепочечную тяжелую-легкую (HL) форму ранибизумаба (sc-ранибизумаб HL), соответствующую фигуре 12C, где последовательность нуклеиновой кислоты содержит или состоит из:
[00194]
ATGGACTGGACCTGGTCCATCCTGTTTCTGGTGGCTGCCGCCACAGGCACATACTCTGAAGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGCGGACTTGTTCAACCTGGCGGCTCTCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCTCTGGCTACGACTTTACCCACTACGGCATGAACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGCAAAGGCCTTGAATGGGTCGGATGGATCAACACCTACACCGGCGAGCCAACATACGCCGCCGACTTCAAGCGGAGATTCACCTTCAGCCTGGACACCAGCAAGAGCACCGCCTACCTCCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAAGTATCCCTACTACTACGGCACCAGCCACTGGTACTTCGACGTGTGGGGACAGGGCACACTGGTCACAGTGTCTAGCGCCTCTACAAAGGGCCCCAGCGTTTTCCCACTGGCTCCTAGCAGCAAGTCTACCTCCGGTGGAACAGCCGCTCTGGGCTGTCTGGTCAAGGACTACTTTCCCGAGCCTGTGACCGTGTCCTGGAATAGCGGAGCACTGACAAGCGGCGTGCACACCTTTCCAGCCGTGCTGCAAAGCAGCGGCCTGTACTCTCTGAGCAGCGTCGTGACAGTGCCAAGCAGCTCTCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAATGTGAACCACAAGCCTAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAACCCAAGAGCTGCGACAAGACACACCTCGGCGGAAGCTCTGGAAGCGGCTCTGGATCTACCGGCACAAGCTCTAGCGGAACAGGCACAAGCGCTGGCACAACCGGAACAAGCGCTTCTACATCTGGCTCTGGTTCTGGCGGAGGCGGAGGATCAGGTGGTGGTGGATCTGCTGGCGGAACAGCTACAGCTGGCGCCTCTTCTGGCAGCGACATTCAGCTGACACAGAGCCCTTCTAGCCTGAGCGCCTCTGTGGGCGACAGAGTGACCATCACATGTAGCGCCAGCCAGGACATCTCCAACTACCTGAACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCTAAGGTGCTGATCTACTTTACCAGCAGCCTGCACTCCGGCGTGCCCAGCAGATTTTCTGGATCTGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGACAATATCTAGCCTCCAGCCTGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTACAGCACCGTGCCTTGGACATTTGGCCAGGGCACAAAGGTGGAAATCAAGCGGACAGTGGCCGCTCCTAGCGTGTTCATCTTTCCACCTAGCGACGAGCAGCTGAAGTCTGGCACAGCCTCTGTCGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCAGAGAAGCCAAGGTGCAGTGGAAAGTGGACAACGCCCTCCAGTCCGGCAACAGCCAAGAGTCTGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGTCCAGCACACTGACACTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAAGTGTACGCCTGCGAAGTGACCCACCAGGGCCTTTCTAGCCCTGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGTTGA (SEQ ID NO:67).
[00195]
В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей sc-ранибизумаб HL, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98% или по меньшей мере приблизительно 99%, или большую, идентичность нуклеиновой кислоты со всей длиной последовательности нуклеиновой кислоты, указанной в SEQ ID NO:67, или с нуклеотидами 58-1575 из SEQ ID NO:67 (без подчеркнутых нуклеотидов, кодирующих сигнальную последовательность IGHV7-8 человека). В родственных вариантах осуществления, продукт(ы) гена, доставляемые посредством рассматриваемых варианта(вариантов) AAV кодированы последовательностью нуклеиновой кислоты, состоящей из или содержащей последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO:67, или нуклеиновой кислоты, имеющей по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98% или по меньшей мере приблизительно 99% идентичность с ней. В других родственных вариантах осуществления, продукт(ы) гена, доставляемые посредством рассматриваемых варианта(вариантов) AAV, содержат аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере приблизительно по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98%, по меньшей мере приблизительно 99% идентичность или 100% идентичность со следующей аминокислотной последовательностью:
[00196]
MDWTWSILFLVAAATGTYSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYDFTHYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPYYYGTSHWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHLGGSSGSGSGSTGTSSSGTGTSAGTTGTSASTSGSGSGGGGGSGGGGSAGGTATAGASSGSDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:68).
[00197]
В других родственных вариантах осуществления, вариант(ы) AAV содержат гетерологичную нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98%, по меньшей мере приблизительно 99% идентичность или 100% идентичность с аминокислотами 20-524 из SEQ ID NO:68 (соответствующими аминокислотной последовательности sc-ранибизумаба HL без подчеркнутой последовательности сигнального пептида).
[00198]
В другом особенно предпочтительном варианте осуществления, настоящее изобретение относится к новой оптимизированной по кодонному составу последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей одноцепочечную легкую-тяжелую (LH) форму ранибизумаба (sc-ранибизумаб LH), соответствующую фигуре 12B, где последовательность нуклеиновой кислоты содержит или состоит из:
[00199]
ATGGTCCTCCAGACACAGGTGTTCATCAGCCTGCTGCTGTGGATCTCTGGCGCCTACGGCGATATCCAGCTGACACAGAGCCCTAGCAGCCTGTCTGCCTCTGTGGGCGACAGAGTGACCATCACATGTAGCGCCAGCCAGGACATCAGCAACTACCTGAACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCTAAGGTGCTGATCTACTTTACCAGCAGCCTGCACAGCGGCGTGCCCAGCAGATTTTCTGGCTCTGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACAATATCTAGCCTCCAGCCTGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTACAGCACCGTGCCTTGGACATTTGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAGCGGACAGTGGCCGCTCCTAGCGTGTTCATCTTTCCACCTAGCGACGAGCAGCTGAAGTCTGGCACAGCCTCTGTCGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCAGAGAAGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTCCAGAGCGGCAATAGCCAAGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCTACCTACTCTCTGAGCAGCACACTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAAGTGTACGCCTGCGAAGTGACCCACCAGGGCCTTTCTAGCCCTGTGACCAAGAGCTTCAACAGAGGCGAGTGTGGCGGCAGCTCTGGAAGCGGATCTGGAAGCACAGGCACAAGCTCTAGCGGAACCGGAACAAGCGCTGGCACAACAGGCACATCTGCCAGCACAAGCGGTTCTGGTTCTGGCGGAGGCGGAGGATCTGGTGGTGGCGGATCTGCTGGCGGAACAGCTACAGCTGGTGCCTCTTCTGGATCCGAGGTGCAGCTGGTTGAATCTGGCGGTGGACTGGTTCAGCCAGGCGGATCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTACGATTTCACCCACTACGGCATGAACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGCAAAGGCCTTGAATGGGTCGGATGGATCAACACCTACACCGGCGAGCCAACATACGCCGCCGACTTCAAGCGGAGATTCACCTTCAGCCTGGACACCTCCAAGAGCACCGCCTACCTCCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAAGTATCCCTACTACTACGGCACCAGCCACTGGTACTTCGACGTGTGGGGACAGGGCACACTGGTCACAGTGTCTAGCGCCTCTACAAAGGGCCCCAGCGTTTTCCCACTGGCTCCTAGCAGCAAGAGCACATCAGGCGGAACTGCTGCCCTGGGCTGTCTGGTCAAGGACTACTTTCCTGAGCCTGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCACTGACATCTGGCGTGCACACCTTTCCAGCCGTGCTCCAAAGCAGCGGCCTGTATTCTCTGTCCAGCGTCGTGACAGTGCCTAGCAGCTCTCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAATGTGAACCACAAGCCTAGCAACACCAAGGTCGACAAGAAGGTGGAACCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACCTCTGA (SEQ ID NO:69).
[00200]
В другом особенно предпочтительном варианте осуществления, настоящее изобретение относится к новой оптимизированной по кодонному составу последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей одноцепочечную легкую-тяжелую (LH) форму ранибизумаба (sc-ранибизумаб LH), соответствующую фигуре 12B, где последовательность нуклеиновой кислоты содержит или состоит из:
[00201]
ATGGTGCTCCAGACCCAGGTGTTTATTTCACTGCTGCTGTGGATTAGCGGGGCTTACGGAGACATTCAGCTGACCCAGAGTCCTTCATCTCTGAGCGCCTCCGTGGGCGACAGGGTGACCATCACATGCTCTGCCAGCCAGGATATCTCCAACTATCTGAATTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCTAAGGTGCTGATCTATTTCACCAGCTCCCTGCACAGCGGAGTGCCATCCCGCTTCTCCGGCTCTGGCAGCGGCACCGACTTTACCCTGACAATCTCTAGCCTCCAGCCAGAGGATTTCGCCACATACTATTGCCAGCAGTACAGCACCGTGCCCTGGACATTTGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAGCGGACAGTGGCCGCCCCAAGCGTGTTCATCTTTCCCCCTAGCGACGAGCAGCTGAAGTCTGGCACCGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTGAACAATTTCTATCCCAGAGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAGTCCGGCAATTCTCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACTCCAAGGATTCTACATACAGCCTGTCCTCTACCCTGACACTGTCCAAGGCCGACTATGAGAAGCACAAGGTGTACGCATGCGAGGTGACCCACCAGGGCCTGAGCTCCCCAGTGACAAAGAGCTTTAACAGGGGAGAGTGTGGAGGATCTAGCGGATCCGGATCTGGAAGCACCGGCACATCCTCTAGCGGAACCGGCACAAGCGCCGGCACCACAGGCACCTCCGCCTCTACAAGCGGCAGCGGATCTGGCGGAGGAGGAGGATCCGGAGGAGGAGGATCTGCCGGCGGCACCGCCACAGCCGGCGCCTCCTCTGGCTCCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGAGGAGGCCTGGTGCAGCCTGGAGGCTCCCTGAGGCTGTCTTGCGCAGCAAGCGGCTATGATTTCACCCACTACGGAATGAACTGGGTGCGCCAGGCACCTGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGGGCTGGATCAATACCTATACAGGCGAGCCAACCTACGCCGCCGACTTTAAGCGGAGATTCACATTTTCCCTGGATACCAGCAAGTCCACAGCCTACCTCCAGATGAACAGCCTGAGGGCAGAGGACACCGCCGTGTACTATTGCGCCAAGTATCCTTACTATTACGGCACAAGCCACTGGTACTTCGACGTGTGGGGACAGGGCACCCTGGTGACAGTGAGCTCCGCCAGCACCAAGGGCCCATCCGTGTTTCCTCTGGCCCCATCTAGCAAGTCTACCAGCGGAGGAACAGCCGCCCTGGGATGTCTGGTGAAGGACTACTTCCCAGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAATTCTGGCGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACATTTCCCGCCGTGCTCCAGTCCTCTGGCCTGTATAGCCTGAGCTCCGTGGTGACCGTGCCTTCTAGCTCCCTGGGCACCCAGACATACATCTGTAACGTGAATCACAAGCCTTCAAATACCAAAGTCGATAAAAAAGTGGAACCAAAATCCTGTGATAAAACCCATCTGTGA (SEQ ID NO:70).
[00202]
В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей sc-ранибизумаб LH, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98% или по меньшей мере приблизительно 99%, или большую, идентичность нуклеиновой кислоты со всей длиной последовательности нуклеиновой кислоты, указанной в SEQ ID NO:69 или SEQ ID NO:70, или с нуклеотидами 61-1578 из SEQ ID NO:69 или SEQ ID NO:70 (без подчеркнутых нуклеотидов, кодирующих сигнальную последовательность Ig каппа). В родственных вариантах осуществления, продукт(ы) гена, доставляемые посредством рассматриваемых варианта(вариантов) AAV, кодированы последовательностью нуклеиновой кислоты, состоящей из или содержащей последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO:69 или SEQ ID NO:70, или нуклеиновой кислоты, имеющей по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98% или по меньшей мере приблизительно 99% идентичность с ней. В других родственных вариантах осуществления, продукт(ы) гена, доставляемые посредством рассматриваемых варианта(вариантов) AAV, содержат аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере приблизительно по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98%, по меньшей мере приблизительно 99% идентичность или 100% идентичность со следующей аминокислотной последовательностью:
[00203]
MVLQTQVFISLLLWISGAYGDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGSSGSGSGSTGTSSSGTGTSAGTTGTSASTSGSGSGGGGGSGGGGSAGGTATAGASSGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYDFTHYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPYYYGTSHWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHL (SEQ ID NO:71).
[00204]
В других родственных вариантах осуществления, вариант(ы) AAV содержат гетерологичную нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98%, по меньшей мере приблизительно 99% идентичность или 100% идентичность с аминокислотами 21-525 из SEQ ID NO:71 (соответствующими аминокислотной последовательности sc-ранибизумаба LH без подчеркнутой последовательности сигнального пептида).
[00205]
В другом предпочтительном варианте осуществления, настоящее изобретение относится к новой последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей одноцепочечную легкую-тяжелую (LH) форму ранибизумаба, слитого с областью Fc IgG1 человека (sc-ранибизумаб-Fc), соответствующую фигуре 12E, где последовательность нуклеиновой кислоты содержит или состоит из:
[00206]
ATGGTCCTCCAGACACAGGTGTTCATCAGCCTGCTGCTGTGGATCTCTGGCGCCTACGGCGATATCCAGCTGACACAGAGCCCTAGCAGCCTGTCTGCCTCTGTGGGCGACAGAGTGACCATCACATGTAGCGCCAGCCAGGACATCAGCAACTACCTGAACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCTAAGGTGCTGATCTACTTTACCAGCAGCCTGCACAGCGGCGTGCCCAGCAGATTTTCTGGCTCTGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACAATATCTAGCCTCCAGCCTGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTACAGCACCGTGCCTTGGACATTTGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAGCGGACAGTGGCCGCTCCTAGCGTGTTCATCTTTCCACCTAGCGACGAGCAGCTGAAGTCTGGCACAGCCTCTGTCGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCCAGAGAAGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTCCAGAGCGGCAATAGCCAAGAGAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCTACCTACTCTCTGAGCAGCACACTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAAGTGTACGCCTGCGAAGTGACCCACCAGGGCCTTTCTAGCCCTGTGACCAAGAGCTTCAACAGAGGCGAGTGTGGCGGCAGCTCTGGAAGCGGATCTGGAAGCACAGGCACAAGCTCTAGCGGAACCGGAACAAGCGCTGGCACAACAGGCACATCTGCCAGCACAAGCGGTTCTGGTTCTGGCGGAGGCGGAGGATCTGGTGGTGGCGGATCTGCTGGCGGAACAGCTACAGCTGGTGCCTCTTCTGGATCCGAGGTGCAGCTGGTTGAATCTGGCGGTGGACTGGTTCAGCCAGGCGGATCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCAGCGGCTACGATTTCACCCACTACGGCATGAACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGCAAAGGCCTTGAATGGGTCGGATGGATCAACACCTACACCGGCGAGCCAACATACGCCGCCGACTTCAAGCGGAGATTCACCTTCAGCCTGGACACCTCCAAGAGCACCGCCTACCTCCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAAGTATCCCTACTACTACGGCACCAGCCACTGGTACTTCGACGTGTGGGGACAGGGCACACTGGTCACAGTGTCTAGCGCCTCTACAAAGGGCCCCAGCGTTTTCCCACTGGCTCCTAGCAGCAAGAGCACATCAGGCGGAACTGCTGCCCTGGGCTGTCTGGTCAAGGACTACTTTCCTGAGCCTGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGAGCACTGACATCTGGCGTGCACACCTTTCCAGCCGTGCTCCAAAGCAGCGGCCTGTATTCTCTGTCCAGCGTCGTGACAGTGCCTAGCAGCTCTCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAATGTGAACCACAAGCCTAGCAACACCAAGGTCGACAAGAAGGTGGAACCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGTCCTCCATGTCCTGCTCCAGAACTGCTCGGCGGACCTTCCGTGTTCCTGTTTCCTCCAAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCCCACGAGGATCCCGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTAGAGAGGAACAGTACAATAGCACCTACAGAGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCTCCTATCGAGAAAACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCTAGGGAACCCCAGGTTTACACACTGCCTCCAAGCAGGGACGAGCTGACAAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTCAAGGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAATGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACAACCCCTCCTGTGCTGGACAGCGACGGCTCATTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACAGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGTCTCCTGGCAAATGAGCCACGCGTAACACGTGCATGCGAGAGATCTGA (SEQ ID NO:72).
[00207]
В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей sc-ранибизумаб-Fc, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98% или по меньшей мере приблизительно 99%, или большую, идентичность нуклеиновой кислоты со всей длиной последовательности нуклеиновой кислоты, указанной в SEQ ID NO:72, или с нуклеотидами 61-2277 из SEQ ID NO:72 (без подчеркнутых нуклеотидов, кодирующих сигнальную последовательность Ig каппа). В родственных вариантах осуществления, продукт(ы) гена, доставляемые посредством рассматриваемых вариантов AAV, кодированы последовательностью нуклеиновой кислоты, состоящей из или содержащей последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO:72, или нуклеиновой кислоты, имеющей по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98% или по меньшей мере приблизительно 99% идентичность с ней. В других родственных вариантах осуществления, продукт(ы) гена, доставляемые посредством рассматриваемых варианта(вариантов) AAV, содержат аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере приблизительно по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98%, по меньшей мере приблизительно 99% идентичность или 100% идентичность со следующей аминокислотной последовательностью:
[00208]
MVLQTQVFISLLLWISGAYGDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGSSGSGSGSTGTSSSGTGTSAGTTGTSASTSGSGSGGGGGSGGGGSAGGTATAGASSGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYDFTHYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPYYYGTSHWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHLDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 73).
[00209]
В других родственных вариантах осуществления, вариант(ы) AAV содержат гетерологичную нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98%, по меньшей мере приблизительно 99% идентичность или 100% идентичность с аминокислотами 21-752 из SEQ ID NO:73 (соответствующими аминокислотной последовательности sc-ранибизумаба-Fc без подчеркнутой последовательности сигнального пептида)
[00210]
В другом предпочтительном варианте осуществления, продукт гена представляет собой бролуцизумаб. Бролуцизумаб (RTH258) представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), который связывает и блокирует все изоформы VEGFa. Бролуцизумаб в настоящее время проходит клинические исследования фазы III, оценивающие дозы 3 мг и 6 мг для лечения влажной связанной с возрастом дегенерации желтого пятна. В особенно предпочтительном варианте осуществления, настоящее изобретение относится к новой оптимизированной по кодонному составу последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей бролуцизумаб (соответствующий фигуре 12D), где последовательность нуклеиновой кислоты содержит или состоит из:
[00211]
ATGGTCCTCCAGACACAGGTGTTCATCAGCCTGCTGCTGTGGATCTCTGGCGCCTATGGCGAGATCGTGATGACACAGAGCCCCAGCACACTGTCTGCCAGCGTGGGAGACAGAGTGATCATCACATGCCAGGCCAGCGAGATCATCCACAGCTGGCTGGCTTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTACCTGGCCTCTACACTGGCCAGCGGAGTGCCTAGCAGATTTTCTGGCTCTGGATCTGGCGCCGAGTTCACCCTGACAATCTCTAGCCTCCAGCCTGACGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGAACGTGTACCTGGCCAGCACCAACGGCGCCAATTTTGGCCAGGGCACCAAGCTGACAGTGCTTGGCGGAGGCGGAGGTTCTGGTGGCGGAGGAAGTGGCGGCGGAGGATCAGGCGGTGGTGGATCTGAAGTGCAGCTGGTGGAATCAGGCGGAGGACTGGTTCAACCTGGCGGCTCTCTGAGACTGAGCTGTACCGCCTCTGGCTTCTCCCTGACCGACTACTACTACATGACCTGGGTCCGACAGGCCCCTGGCAAAGGACTTGAGTGGGTCGGATTCATCGACCCCGACGACGATCCTTACTACGCCACATGGGCCAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTCCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGTGCCGGCGGAGATCACAATAGCGGCTGGGGACTCGATATCTGGGGCCAGGGAACACTGGTCACCGTGTCTAGTTGA (SEQ ID NO:74).
[00212]
В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей бролуцизумаб, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98%, или по меньшей мере приблизительно 99% или большую, идентичность нуклеиновой кислоты со всей длиной последовательности нуклеиновой кислоты, указанной в SEQ ID NO:74, или с нуклеотидами 61-816 из SEQ ID NO:74 (без подчеркнутых нуклеотидов, кодирующих сигнальную последовательность Ig каппа). В родственных вариантах осуществления, продукт(ы) гена, доставляемые посредством рассматриваемых вариантов AAV, кодированы последовательностью нуклеиновой кислоты, состоящей из или содержащей последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO:74, или нуклеиновой кислоты, имеющей по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98%, или по меньшей мере приблизительно 99% идентичность с ней. В других родственных вариантах осуществления, продукт(ы) гена, доставляемые посредством рассматриваемых вариантов AAV, содержат аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере приблизительно по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98%, по меньшей мере приблизительно 99% идентичность или 100% идентичность со следующей аминокислотной последовательностью:
[00213]
MVLQTQVFISLLLWISGAYGEIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASEIIHSWLAWYQQKPGKAPKLLIYLASTLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQNVYLASTNGANFGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLTDYYYMTWVRQAPGKGLEWVGFIDPDDDPYYATWAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGDHNSGWGLDIWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:75).
[00214]
В других родственных вариантах осуществления, вариант(ы) AAV содержат гетерологичную нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98%, по меньшей мере приблизительно 99% идентичность или 100% идентичность с аминокислотами 21-271 из SEQ ID NO:75 (соответствующими аминокислотной последовательности бролуцизумаба без подчеркнутой последовательности сигнального пептида).
[00215]
В другом предпочтительном варианте осуществления, настоящее изобретение относится к новой последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей бролуцизумаб, слитый с областью Fc IgG1 человека (бролуцизумаб-Fc), соответствующий фигуре 12F, где последовательность нуклеиновой кислоты содержит или состоит из:
[00216]
ATGGTCCTCCAGACACAGGTGTTCATCAGCCTGCTGCTGTGGATCTCTGGCGCCTATGGCGAGATCGTGATGACACAGAGCCCCAGCACACTGTCTGCCAGCGTGGGAGACAGAGTGATCATCACATGCCAGGCCAGCGAGATCATCCACAGCTGGCTGGCTTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTACCTGGCCTCTACACTGGCCAGCGGAGTGCCTAGCAGATTTTCTGGCTCTGGATCTGGCGCCGAGTTCACCCTGACAATCTCTAGCCTCCAGCCTGACGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGAACGTGTACCTGGCCAGCACCAACGGCGCCAATTTTGGCCAGGGCACCAAGCTGACAGTGCTTGGCGGAGGCGGAGGTTCTGGTGGCGGAGGAAGTGGCGGCGGAGGATCAGGCGGTGGTGGATCTGAAGTGCAGCTGGTGGAATCAGGCGGAGGACTGGTTCAACCTGGCGGCTCTCTGAGACTGAGCTGTACCGCCTCTGGCTTCTCCCTGACCGACTACTACTACATGACCTGGGTCCGACAGGCCCCTGGCAAAGGACTTGAGTGGGTCGGATTCATCGACCCCGACGACGATCCTTACTACGCCACATGGGCCAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTCCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGTGCCGGCGGAGATCACAATAGCGGCTGGGGACTCGATATCTGGGGCCAGGGAACACTGGTCACCGTGTCTAGTGACAAGACCCACACCTGTCCTCCATGTCCTGCTCCAGAACTGCTCGGCGGACCTTCCGTGTTCCTGTTTCCTCCAAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCCCACGAGGATCCCGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTAGAGAGGAACAGTACAATAGCACCTACAGAGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCTCCTATCGAGAAAACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCTAGGGAACCCCAGGTTTACACACTGCCTCCAAGCAGGGACGAGCTGACAAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTCAAGGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAATGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACAACCCCTCCTGTGCTGGACAGCGACGGCTCATTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACAGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGTCTCCTGGCAAATGAGCCACGCGTAACACGTGCATGCGAGAGATCTGA (SEQ ID NO:76).
[00217]
В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей бролуцизумаб-Fc, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98% или по меньшей мере приблизительно 99%, или большую, идентичность нуклеиновой кислоты со всей длиной последовательности нуклеиновой кислоты, указанной в SEQ ID NO:76, или с нуклеотидами 61-1530 из SEQ ID NO:76 (без подчеркнутых нуклеотидов, кодирующих сигнальную последовательность Ig каппа). В родственных вариантах осуществления, продукт(ы) гена, доставляемые посредством рассматриваемых вариантов AAV, кодированы последовательностью нуклеиновой кислоты, состоящей из или содержащей последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO:76, или нуклеиновой кислоты, имеющей по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98%, или по меньшей мере приблизительно 99% идентичность с ней. В других родственных вариантах осуществления, продукт(ы) гена, доставляемые посредством рассматриваемых варианта(вариантов) AAV, содержат аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере приблизительно по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98%, по меньшей мере приблизительно 99% идентичность или 100% идентичность со следующей аминокислотной последовательностью.
[00218]
MVLQTQVFISLLLWISGAYGEIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASEIIHSWLAWYQQKPGKAPKLLIYLASTLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQNVYLASTNGANFGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLTDYYYMTWVRQAPGKGLEWVGFIDPDDDPYYATWAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAGGDHNSGWGLDIWGQGTLVTVSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 77).
[00219]
В других родственных вариантах осуществления, вариант(ы) AAV содержат гетерологичную нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98%, по меньшей мере приблизительно 99% идентичность или 100% идентичность с аминокислотами 21-498 из SEQ ID NO:77 (соответствующей аминокислотной последовательности бролуцизумаба-Fc без подчеркнутой последовательности сигнального пептида).
[00220]
В особенно предпочтительных вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к инфекционному рекомбинантному вириону AAV (rAAV), содержащему вариант капсидного белка AAV, содержащий пептидную вставку в GH-петле капсидного белка, по сравнению с соответствующим исходным капсидным белком AAV, где пептидная вставка содержит аминокислотную последовательность ISDQTKH (SEQ ID NO:14) или LAISDQTKHA (SEQ ID NO:28), и гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, ингибирующий активность VEGF, предпочтительно VEGFa, где вариант капсидного белка придает увеличенную инфекционность для клетки сетчатки, по сравнению с инфекционностью соответствующего исходного капсидного белка AAV для клетки сетчатки. В некоторых вариантах осуществления, участок вставки находится между аминокислотами, соответствующими аминокислотам 587 и 588 VP1 из AAV2 (SEQ ID NO:2), или в соответствующем положении в капсидном белке другого серотипа AAV. Предпочтительно, вариант капсидного белка AAV также содержит аминокислотную замену P34A, относительно VP1 капсида AAV2 (SEQ ID NO:2), или соответствующую замену в другом серотипе AAV.
[00221]
В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к вириону rAAV, содержащему вариант капсидного белка AAV, содержащий (i) пептидную вставку между аминокислотами, соответствующими аминокислотам 587 и 588 VP1 из AAV2 (SEQ ID NO:2), или в соответствующем положении в капсидном белке другого серотипа капсидного белка AAV, по сравнению с соответствующим исходным капсидным белком AAV, и (ii) аминокислотную замену P34A, относительно VP1 капсида AAV2 (SEQ ID NO:2), или соответствующую замену в другом серотипе AAV, и гетерологичную нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность, кодирующую афлиберцепт. В предпочтительных вариантах осуществления, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая афлиберцепт, состоит из или содержит последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO:65 или нуклеиновой кислоты, имеющей по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98% или по меньшей мере приблизительно 99% идентичность с ней. В особенно предпочтительном варианте осуществления, настоящее изобретение относится к вириону rAAV, содержащему вариант капсидного белка AAV, имеющий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную, по меньшей мере на 95% идентичную или по меньшей мере на 99% идентичную последовательности, указанной как SEQ ID NO:42, и гетерологичную нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO:65, где вариант капсидного белка придает увеличенную инфекционность для клетки сетчатки, по сравнению с инфекционностью соответствующего исходного капсидного белка AAV для клетки сетчатки. В других родственных вариантах осуществления, гетерологичная нуклеиновая кислота дополнительно содержит одну или более последовательностей, каждая из которых кодирует дополнительный ингибитор VEGFa, предпочтительно, выбранный из ранибизумаба, sc-ранибизумаба HL, sc-ранибизумаба LH, sc-ранибизумаба-Fc, бролуцизумаба и бролуцизумаба-Fc. В родственных вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей такой rAAV. В других родственных вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к способу лечения ассоциированного с VEGFa заболевания глаз, включающему введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества вириона rAAV, содержащего вариант капсидного белка AAV, имеющий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную последовательности, указанной как SEQ ID NO:42, и гетерологичную нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO:65 и необязательно, одну или более дополнительных последовательностей нуклеиновой кислоты, где каждая кодирует отдельный ингибитор VEGFa. rAAV можно вводить посредством субретинальной, супрахориоидальной, местной, интракамеральной инъекции или инъекции в стекловидное тело, но предпочтительно, его вводят посредством инъекции в стекловидное тело. В некоторых вариантах осуществления, ассоциированное с VEGFa заболевание глаз выбрано из влажной (неоваскулярной, эксудативной) связанной с возрастом дегенерации желтого пятна; отека желтого пятна после окклюзии вен сетчатки; неоваскуляризации сетчатки в результате окклюзии вен сетчатки; диабетического отека желтого пятна, диабетической ретинопатии (включая все стадии непролиферативной диабетической ретинопатии и пролиферативной диабетической ретинопатии), миопической дегенерации желтого пятна, окклюзии ветви вены сетчатки, окклюзии гемиретинальной вены и окклюзии центральной вены сетчатки; ретинопатии недоношенных; идиопатической хориоидальной неоваскуляризации; миопической дегенерации желтого пятна и вторичной ретинальной и хориоидальной неоваскуляризации; телеангиэктозии сетчатки; неоваскулярной глаукомы; геморрагии стекловидного тела; ретинальной и хориоидальной неоваскуляризации, вторичной по отношению к заболеваниям сетчатки, включая, но без ограничения, увеит, травму, дегенеративные нарушения сетчатки, генетическое заболевание сетчатки и/или хороида, опухоли глаза, неоваскуляризацию роговицы и радужной оболочки глаза. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, ассоциированное с VEGFa заболевание глаз выбрано из влажной (неоваскулярной, эксудативной) связанной с возрастом дегенерации желтого пятна; диабетического отека желтого пятна; отека желтого пятна после окклюзии вен сетчатки; диабетической ретинопатии; и миопической хориоидальной неоваскуляризации.
[00222]
В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к вириону rAAV, содержащему вариант капсидного белка AAV, содержащий (i) пептидную вставку между аминокислотами, соответствующими аминокислотам 587 и 588 VP1 из AAV2 (SEQ ID NO:2), или в соответствующем положении в капсидном белке другого серотипа капсидного белка AAV, по сравнению с соответствующим исходным капсидным белком AAV, и (ii) аминокислотную замену P34A, относительно VP1 капсида AAV2 (SEQ ID NO:2), или соответствующую замену в другом серотипе AAV, и гетерологичную нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую ранибизумаб, sc-ранибизумаб HL, sc-ранибизумаб LH или sc-ранибизумаб-Fc. В предпочтительных вариантах осуществления, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая sc-ранибизумаб, состоит из или содержит последовательность нуклеиновой кислоты, указанную в любой из SEQ ID NO:67, 69, 70 и 72, или имеет по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98%, или по меньшей мере приблизительно 99% идентичность с ней. В особенно предпочтительном варианте осуществления, настоящее изобретение относится к вириону rAAV, содержащему вариант капсидного белка AAV, имеющий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную, по меньшей мере на 95% идентичную или по меньшей мере на 99% идентичную последовательности, указанной как SEQ ID NO:42, и гетерологичную нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность нуклеиновой кислоты из любой из SEQ ID NO: 67, 69, 70 и 72, где вариант капсидного белка придает увеличенную инфекционность для клетки сетчатки по сравнению с инфекционностью соответствующего исходного капсидного белка AAV для клетки сетчатки. В других родственных вариантах осуществления, гетерологичная нуклеиновая кислота дополнительно содержит одну или более дополнительных последовательностей нуклеиновой кислоты, каждая из которых кодирует отдельный ингибитор VEGFa, предпочтительно, выбранный из афлиберцепта, бролуцизумаба и бролуцизумаба-Fc. В родственных вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей такой rAAV. В других родственных вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания глаз, ассоциированного с увеличенным уровнем внутриглазного VEGFa, включающему введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества вириона rAAV, содержащего вариант капсидного белка AAV, имеющий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную последовательности, указанной как SEQ ID NO:42, и гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую последовательность нуклеиновой кислоты из любой из SEQ ID NO: 67, 69, 70 и 72. Предпочтительно, rAAV вводят посредством инъекции в стекловидное тело. В некоторых вариантах осуществления, ассоциированное с VEGFa заболевание глаз выбрано из влажной (неоваскулярной, эксудативной) связанной с возрастом дегенерации желтого пятна; отека желтого пятна после окклюзии вен сетчатки; неоваскуляризации сетчатки в результате окклюзии вен сетчатки; диабетического отека желтого пятна, диабетической ретинопатии (включая все стадии непролиферативной диабетической ретинопатии и пролиферативной диабетической ретинопатии), миопической дегенерации желтого пятна, окклюзии ветви вены сетчатки, окклюзии гемиретинальной вены и окклюзии центральной вены сетчатки; ретинопатии недоношенных; идиопатической хориоидальной неоваскуляризации; миопической дегенерации желтого пятна и вторичной ретинальной и хориоидальной неоваскуляризации; телеангиэктозии сетчатки; неоваскулярной глаукомы; геморрагии стекловидного тела; ретинальной и хориоидальной неоваскуляризации, вторичной по отношению к заболеваниям сетчатки, включая, но без ограничения, увеит, травму, дегенеративные нарушения сетчатки, генетическое заболевание сетчатки и/или хороида, опухоли глаза, неоваскуляризацию роговицы и радужной оболочки глаза. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, ассоциированное с VEGFa заболевание глаз выбрано из влажной (неоваскулярной, эксудативной) связанной с возрастом дегенерации желтого пятна; диабетического отека желтого пятна; отека желтого пятна после окклюзии вен сетчатки; диабетической ретинопатии; и миопической хориоидальной неоваскуляризации.
[00223]
В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к вириону rAAV, содержащему вариант капсидного белка AAV, содержащий (i) пептидную вставку между аминокислотами, соответствующими аминокислотам 587 и 588 VP1 из AAV2 (SEQ ID NO:2), или в соответствующем положении в капсидном белке другого серотипа капсидного белка AAV, по сравнению с соответствующим исходным капсидным белком AAV, и (ii) аминокислотную замену P34A, относительно VP1 капсида AAV2 (SEQ ID NO:2), или соответствующую замену в другом серотипе AAV, и гетерологичную нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую бролуцизумаб или бролуцизумаб-Fc. В предпочтительных вариантах осуществления, нуклеотидная последовательность, кодирующая бролуцизумаб или бролуцизумаб-Fc, состоит из или содержит последовательность нуклеиновой кислоты, указанную в SEQ ID NO:74 или SEQ ID NO:76, или имеет по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98%, или по меньшей мере приблизительно 99% идентичность с ней. В особенно предпочтительном варианте осуществления, настоящее изобретение относится к вириону rAAV, содержащему вариант капсидного белка AAV, имеющий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную, по меньшей мере на 95% идентичную или по меньшей мере на 99% идентичную последовательности, указанной как SEQ ID NO:42, и гетерологичную нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO:74 или SEQ ID NO:76, где вариант капсидного белка придает увеличенную инфекционность для клетки сетчатки, по сравнению с инфекционностью соответствующего исходного капсидного белка AAV для клетки сетчатки. В других родственных вариантах осуществления, гетерологичная нуклеиновая кислота дополнительно содержит одну или более нуклеотидных последовательностей, каждая из которых кодирует отдельный ингибитор VEGFa, предпочтительно, выбранный из афлиберцепта, ранибизумаба, sc-ранибизумаба HL, sc-ранибизумаба LH и sc-ранибизумаба-Fc. В родственных вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей такой rAAV. В других родственных вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания глаз, ассоциированного с увеличенным уровнем внутриглазного VEGFa, включающему введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества вириона rAAV, содержащего вариант капсидного белка AAV, имеющий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную последовательности, указанной как SEQ ID NO:42, и гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO:74 или SEQ ID NO:76. Предпочтительно, rAAV вводят посредством инъекции в стекловидное тело. В некоторых вариантах осуществления, ассоциированное с VEGFa заболевание глаз выбрано из влажной (неоваскулярной, эксудативной) связанной с возрастом дегенерации желтого пятна; отека желтого пятна после окклюзии вен сетчатки; неоваскуляризации сетчатки в результате окклюзии вен сетчатки; диабетического отека желтого пятна, диабетической ретинопатии (включая все стадии непролиферативной диабетической ретинопатии и пролиферативной диабетической ретинопатии), миопической дегенерации желтого пятна, окклюзии ветви вены сетчатки, окклюзии гемиретинальной вены и окклюзии центральной вены сетчатки; ретинопатии недоношенных; идиопатической хориоидальной неоваскуляризации; миопической дегенерации желтого пятна и вторичной ретинальной и хориоидальной неоваскуляризации; телеангиэктозии сетчатки; неоваскулярной глаукомы; геморрагии стекловидного тела; ретинальной и хориоидальной неоваскуляризации, вторичной по отношению к заболеваниям сетчатки, включая, но без ограничения, увеит, травму, дегенеративные нарушения сетчатки, генетическое заболевание сетчатки и/или хороида, опухоли глаза, неоваскуляризацию роговицы и радужной оболочки глаза. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, ассоциированное с VEGFa заболевание глаз выбрано из влажной (неоваскулярной, эксудативной) связанной с возрастом дегенерации желтого пятна; диабетического отека желтого пятна; отека желтого пятна после окклюзии вен сетчатки; диабетической ретинопатии; и миопической хориоидальной неоваскуляризации.
[00224]
Гены, продукты которых функционируют как иммуномодуляторы, например, факторы комплемента, toll-подобные рецепторы, называют «иммуномодулирующими генами». Иллюстративные иммуномодулирующие гены включают гены цитокинов, хемокинов и слитых белков или антител, специфических для них, и/или их рецепторов, например, слитого белка против IL-6 рилонацепта™, специфического для фактора комплемента H антитела лампамизумаба и т.д. Гены, продукты которых функционируют как нейропротективные факторы, например, рецептор тромбоцитарного фактора роста (PDGFR); глиальный нейротрофический фактор (GDNF); происходящий из палочек фактор жизнеспособности колбочек (RdCVF); фактор роста фибробластов (FGF); нейртурин (NTN); цилиарный нейротрофический фактор (CNTF); фактор роста нервов (NGF); нейтрофин-4 (NT4); нейротрофический фактор головного мозга (BDNF); эпидермальный фактор роста. Гены, продукты которых функционируют как способные отвечать на свет опсины, например, опсин; родопсин; канальный родопсин; галородопсин.
[00225]
В некоторых случаях, продуктом представляющего интерес гена является сайт-специфическая эндонуклеаза, обеспечивающая сайт-специфический нокдаун функции гена, например, где эндонуклеаза осуществляет нокаут аллеля, ассоциированного с заболеванием сетчатки. Например, когда доминантный аллель кодирует дефектную копию гена, который, когда принадлежит к дикому типу, кодирует структурный белок сетчатки и/или обеспечивает нормальную функцию сетчатки, сайт-специфическая эндонуклеаза может быть нацелена на дефектный аллель и осуществлять нокаут дефектного аллеля.
[00226]
Nature
В дополнение к нокауту дефектного аллеля, сайт-специфическую нуклеазу можно также использовать для стимуляции гомологичной рекомбинации с донорной ДНК, которая кодирует функциональную копию белка, кодированного дефектным аллелем. Таким образом, например, рассматриваемый вирион rAAV можно использовать для доставки сайт-специфической эндонуклеазы, которая осуществляет нокаут дефектного аллеля, и можно использовать для доставки функциональной копии дефектного аллеля, приводящей к репарации дефектного аллеля, таким образом, обеспечивая продукцию функционального белка сетчатки (например, функционального ретиношизина, функционального RPE65, функционального периферина и т.д.). См., например, Li et al. (2011) 475:217. В некоторых вариантах осуществления, вирион rAAV, описанный в настоящем описании, содержит гетерологичную нуклеотидную последовательность, кодирующую сайт-специфическую эндонуклеазу; и гетерологичную нуклеотидную последовательность кодирующую функциональную копию дефектного аллеля, где функциональная копия кодирует функциональный белок сетчатки. Функциональный белки сетчатки включают, например, ретиношизин, RPE65, белок-1, взаимодействующий с регулятором ГТФазы при пигментном ретините (RGPR), периферин, периферин-2 и т.п.
[00227]
Сайт-специфические эндонуклеазы, пригодные для использования, включают, например, мегануклеазы; нуклеазы с цинковыми пальцами (ZFN); эффекторные нуклеазы, подобные активаторам транскрипции (TALEN); и ассоциированные с короткими палиндромными повторами, расположенными кластерами, равномерно удаленными друг от друга/CRISPR (Cas), где такие сайт-специфические эндонуклеазы не встречаются в природе и являются модифицированными для нацеливания на специфический ген. Такие сайт-специфические нуклеазы можно конструировать для разрезания в специфических локализациях в геноме, и затем посредством соединения негомологичных концов можно осуществлять репарацию разрыва, в то же время, с вставкой или делецией нескольких нуклеотидов. Такие сайт-специфические эндонуклеазы (также обозначенные как вносящие «инделы») затем осуществляют сдвиг белка из рамки считывания и эффективный нокаут гена. См., например, Публикацию патента США No. 2011/0301073.
[00228]
Journal of Virology
Gene
Molecular Therapy
Gene
Gene
PNAS
FEBS Letters
Ophthalmol. Vis. Sci.
J. Gene Med.
Exp Eye Res.
PNAS
Gene Therapy
The Journal of Neuroscience
Gene Therapy
PNAS
Biochemistry and Molecular Biology
Human Gene Therapy
Gene Therapy
Journal of Biological Chemistry
Molecular and Cellular Biochemistry
The Journal of Biological Chemistry
Journal of Biological Chemistry
EMBO Molecular Medicine
SB
В некоторых вариантах осуществления варианта rAAV вектора, описанного в настоящем описании, нуклеотидная последовательность, кодирующая продукт представляющего интерес гена, является функционально связанной с конститутивным промотором. Пригодные конститутивные промоторы включают например, промотор цитомегаловируса (CMV) (Stinski et al. (1985)  55(2): 431-441), ранний энхансер CMV/промотор β-актина курицы (CBA)/интрон β-глобина кролика (CAG) (Miyazaki et al. (1989) 79(2): 269-277, CB (Jacobson et al. (2006)  13(6): 1074-1084), промотор фактора элонгации 1α человека (EF1α) (Kim et al. (1990) 91(2): 217-223), промотор фосфоглицераткиназы (PGK) человека (Singer-Sam et al. (1984) 32(3): 409-417, промотор тяжелой цепи митохондриального генома (Loderio et al. (2012)  109(17): 6513-6518), промотор убиквитина (Wulff et al. (1990) 261: 101-105). В других вариантах осуществления, нуклеотидная последовательность, кодирующая продукт представляющего интерес гена, является функционально связанной с индуцируемым промотором. В некоторых случаях, нуклеотидная последовательность, кодирующая продукт представляющего интерес гена, является функционально связанной с тканеспецифическим или специфическим для типа клеток регуляторным элементом. Например, в некоторых случаях, нуклеотидная последовательность, кодирующая продукт представляющего интерес гена, является функционально связанной со специфическим для фоторецептора регуляторным элементом (например, специфическим для фоторецептора промотором), например, регуляторным элементом, обеспечивающим избирательную экспрессию функционально связанного гена в фоторецепторной клетке. Пригодные специфические для фоторецептора регуляторные элементы включают, например, промотор родопсина; промотор киназы родопсина (Young et al. (2003) 44:4076); промотор гена бета-фосфодиэстеразы (Nicoud et al. (2007) 9:1015); промотор гена пигментного ретинита (Nicoud et al. (2007) выше); энхансер гена межфоторецепторного ретинол-связывающего белка (IRBP) (Nicoud et al. (2007) выше); промотор гена IRBP (Yokoyama et al. (1992) 55:225), промотор гена опсина (Tucker et al. (1994)  91:2611-2615), промотор гена ретиношизина (Park et al. (2009) 16(7): 916-926), промотор гена белка с гомеодоменом CRX (Furukawa et al. (2002)  22(5): 1640-1647), промотор гена полипептида 1 связывающего нуклеотид гуанин белка с активностью альфа-трансдукции (GNAT1) (Lee et al. (2010)  17:1390-1399), промотор гена нейтрального специфического для сетчатки белка с лейциновой молнией (NRL) (Akimoto et al. (2006)  103(10): 3890-3895), промотор аррестина колбочек человека (hCAR) (Li et al. (2002)  43: 1375-1383), и промоторы PR2.1, PR1.7, PR1.5 и PR1.1 (Ye et al. (2016) 27(1): 72-82)). В некоторых случаях, нуклеотидная последовательность, кодирующая представляющий интерес продукт гена, является функционально связанной со специфическим для клеток пигментного эпителия сетчатки (RPE) регуляторным элементом (например, специфическим для RPE промотором), например, регуляторным элементом, обеспечивающим избирательную экспрессию функционально связанного гена в клетке RPE. Пригодные специфические для RPE регуляторные элементы включают, например, промотор гена RPE65 (Meur et al. (2007) 14: 292-303), промотор гена клеточного связывающего ретинальдегид белка (CRALBP) (Kennedy et al. (1998)  273: 5591-5598), промотор гена фактора пигментного эпителия (PEDF, также называемого серпин F1) (Kojima et al. (2006)  293(1-2): 63-69) и промотор гена вителлиформной макулодистрофии (VMD2) промотор (Esumi et al. (2004)  279(18): 19064-19073). В некоторых случаях, нуклеотидная последовательность, кодирующая представляющий интерес продукт гена, является функционально связанной со специфическим для клеток глии Мюллера регуляторным элементом (например, специфическим для клеток глии промотором), например, регуляторным элементом, обеспечивающим избирательную экспрессию функционально связанного гена в глиальной клетке сетчатки. Пригодные специфические для глии регуляторные элементы включают, например, промотор глиального фибриллярного кислого белка (GFAP) (Besnard et al. (1991) 266(28): 18877-18883). В некоторых случаях, нуклеотидная последовательность, кодирующая представляющий интерес продукт гена, является функционально связанной со специфическим для биполярной клетки регуляторным элементом (например, специфическим для биполярной клетки промотором), например, регуляторным элементом, обеспечивающим избирательную экспрессию функционально связанного гена в биполярной клетке. Пригодные специфические для биполярной клетки регуляторные элементы включают, например, промотор GRM6 (Cronin et al. (2014) 6(9): 1175-1190).
[00229]
Для целей по изобретению, настоящее изобретение относится к выделенной нуклеиновой кислоте, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант капсидного белка AAV, как описано выше. Выделенная нуклеиновая кислота может представлять собой AAV вектор, например, рекомбинантный AAV вектор.
[00230]
Настоящее изобретение относится также к способу лечения заболевания сетчатки, включающему введение нуждающемуся в этом индивидууму эффективного количества варианта вириона rAAV, содержащего представляющий интерес трансген, как описано выше и описано в настоящем описании. Специалист в данной области может легко определять эффективное количество рассматриваемого вириона rAAV и то, что заболевание подвергали лечению, посредством тестирования изменения одного или более функциональных или анатомических параметров, например, остроты зрения, поля зрения, способности отвечать на электрофизиологические сигналы на свету и в темноте, цветного зрения, контрастной чувствительности, анатомии, состояния и сосудистой сети сетчатки, подвижности глазного яблока, предпочтительности и стабильности фиксации.
[00231]
Неограничивающие способы оценки функции сетчатки и ее изменений включают оценку остроты зрения (например, наилучшей корригированной остроты зрения [BCVA], способности к передвижению, навигации, обнаружения и различения объектов), оценку поля зрения (например, статической и кинетической периметрии поля зрения), проведение клинического обследования (например, осмотра с помощью щелевой лампы переднего и заднего сегмента глаза), оценку способности отвечать на электрофизиологические сигналы всех длин волн на свету и в темноте (например, все формы электроретинографии (ERG) [полноформатную, мультифокальную и паттерны], все формы индуцированного зрительного потенциала (VEP), электроокулографию (EOG), оценку цветного зрения, адаптации к темноте и/или контрастной чувствительности). Неограничивающие способы оценки анатомии и состояния здоровья сетчатки, и их изменений включают оптическую когерентную томографию (OCT), фотографирование глазного дна, лазерную сканирующую офтальмоскопию с системой адаптивной оптики (AO-SLO), флуоресценцию и/или аутофлуоресценцию; измерение подвижности глазного яблока и движения глаз (например, нистагма, предпочтительности и стабильности фиксации), измерения зарегистрированных исходов (сообщенных пациентом изменений в зрительно-опосредованных и незрительно-опосредованных поведении и деятельности, сообщенных пациентом исходов [PRO], основанных на опросниках оценок качества жизни, повседневной деятельности и показателей неврологической функции (например, функциональной магнитно-резонансной томографии (MRI)).
[00232]
8
15
8
15
В некоторых вариантах осуществления, эффективное количество рассматриваемого вириона rAAV приводит к уменьшению скорости потери функции сетчатки, анатомической целостности или состояния здоровья сетчатки, например, к уменьшению, в 2 раза, в 3 раза, в 4 раза или в 5 раз, или более, скорости потери, и таким образом, прогрессирования заболевания, например, к уменьшению, в 10 раз или более, скорости потери, и таким образом, прогрессирования заболевания. В некоторых вариантах осуществления, эффективное количество рассматриваемого вириона rAAV приводит к повышению зрительной функции, функции сетчатки, к улучшению анатомии или состояния здоровья сетчатки, и/или к улучшению подвижности глазного яблока и/или к улучшению неврологической функции, например, к улучшению, в 2 раза, в 3 раза, в 4 раза или в 5 раз, или более функции сетчатки, анатомии или состояния здоровья сетчатки, и/или к улучшению подвижности глазного яблока, например, к улучшению, в 10 раз или более, функции сетчатки, анатомии или состояния здоровья сетчатки, и/или к улучшению подвижности глазного яблока. Как понятно специалисту в данной области, доза, необходимая для достижения желательного эффекта лечения, как правило, может лежать в диапазоне от 1×10 до приблизительно 1×10 рекомбинантных вирионов, как правило, как правило, обозначаемых для специалиста в данной области, как от 1×10 до приблизительно 1×10 «геномов вектора».
[00233]
Рассматриваемый вирион rAAV можно вводить посредством внутриглазной инъекции, например, посредством инъекции в стекловидное тело, инъекции субретинальной инъекции, посредством супрахориоидальной инъекции или посредством любого удобного способа или пути введения, который может обеспечивать доставку вириона rAAV в глаз. Другие удобные способы или пути введения включают, без ограничения, внутривенные, внутриартериальные, периокулярные, интракамеральные, субконъюктивальные инъекции и инъекции в субтеноново пространство, и местное и интраназальное введение. При введении посредством инъекции в стекловидное тело, рассматриваемый вирион rAAV является способным продвигаться через стекловидное тело и пересекать внутреннюю пограничную мембрану (также обозначенную в настоящем описании как внутренняя ограничивающая мембрана, или «ILM»; тонкую, прозрачную бесклеточную мембрану на поверхности сетчатки, формирующую границу между сетчаткой и стекловидным телом, образованную астроцитами и окончаниями отростков клеток Мюллера), и/или продвигаться через слои сетчатки более эффективно, по сравнению со способностью вириона AAV, содержащего соответствующий исходный капсидный белок AAV.
[00234]
in vivo
ex vivo
Вариант капсидного белка, описанный в настоящем описании, является выделенным, например, очищенным. В некоторых вариантах осуществления, вариант капсидного белка, описанный в настоящем описании, включен в AAV вектор или в рекомбинантный вирион AAV (rAAV). В других вариантах осуществления, такие варианты AAV векторов и/или варианты вирионов AAV используют в способе  или  лечения заболевания глаз в сетчатке приматов.
[00235]
in vitro
Настоящее изобретение, кроме того, относится к клеткам-хозяевам, таким как, без ограничения, выделенные (генетически модифицированные) клетки-хозяева, содержащие рассматриваемую нуклеиновую кислоту. Клетка-хозяин по изобретению, описанному в настоящем описании, может представлять собой выделенную клетку, такую как клетка из культуры клеток . Такую клетку-хозяина можно использовать для продукции рассматриваемого варианта вириона rAAV, как описано в настоящем описании. В одном варианте осуществления, такая клетка-хозяин является стабильно генетически модифицированной с использованием нуклеиновой кислоты. В других вариантах осуществления, клетка-хозяин является временно генетически модифицированной с использованием нуклеиновой кислоты. Такую нуклеиновую кислоту вводят стабильно или временно в клетку-хозяина, с использованием разработанных способов, включая, но без ограничения, электропорацию, преципитацию фосфатом кальция, опосредованную липосомами трансфекцию, и т.п. Для стабильной трансформации, нуклеиновая кислота, как правило, дополнительно включает селективный маркер, например, любой из нескольких хорошо известных селективных маркеров, таких как устойчивость к неомицину, и т.п. Такую клетку-хозяина получают посредством введения нуклеиновой кислоты в любую из множества клеток, например, клеток млекопитающих, включая, например, клетки мыши и клетки примата (например, клетки человека). Иллюстративные клетки млекопитающих включают, но без ограничения, первичные клетки и линии клеток, где иллюстративные линии клеток включают, но без ограничения, клетки 293, клетки COS, клетки HeLa, клетки Vero, фибробласты мыши 3T3, фибробласты C3H10T1/2, клетки CHO и т.п. Иллюстративные клетки-хозяева включают, без ограничения, клетки HeLa (например, Американская коллекция типовых культур (ATCC) No. CCL-2), клетки CHO (например, ATCC No. CRL9618, CCL61, CRL9096), клетки 293 (например, ATCC No. CRL-1573), клетки Vero, клетки NIH 3T3 (например, ATCC No. CRL-1658), клетки Huh-7 клетки, клетки BHK (например, ATCC No. CCL10), клетки PC12 (ATCC No. CRL1721), клетки COS, клетки COS-7 (ATCC No. CRL1651), клетки RAT1, клетки L мыши (ATCC No. CCLI.3), клетки эмбриональной почки человека (HEK) (ATCC No. CRL1573), клетки HLHepG2 и т.п. Клетку-хозяина можно также получать с использованием бакуловируса для инфекции клеток насекомых, таких как клетки Sf9, продуцирующих AAV (см., например, Патент США No. 7271002; Патентную заявку США сер. No. 12/297958). В некоторых вариантах осуществления, генетически модифицированная клетка-хозяин включает, в дополнение к нуклеиновой кислоте, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант капсидного белка AAV, как описано выше, нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую один или более белков rep AAV. В других вариантах осуществления, клетка-хозяин дополнительно содержит вариант rAAV вектора. Вариант вириона rAAV можно получать с использованием таких клеток-хозяев. Способы получения вириона rAAV описаны, например, в Публикации патента США No. 2005/0053922 и Публикации патента США No. 2009/0202490.
[00236]
th
rd
8
15
8
15
Настоящее изобретение, кроме того, относится к фармацевтической композиции, содержащей: a) вариант вириона rAAV, как описано выше и описано в настоящем описании; и b) фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель, наполнитель или буфер. В некоторых вариантах осуществления, фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель, наполнитель или буфер является пригодным для пациента-человека или не относящегося к человеку пациента. Такие наполнители, носители, разбавители и буферы включают любое лекарственное средство, которое можно вводить без избыточной токсичности. Фармацевтически приемлемые наполнители включают, но без ограничения, жидкости, такие как вода, солевой раствор, глицерин и этанол. Фармацевтически приемлемые соли могут включать, например, соли неорганических кислот, такие как гидрохлориды, гидробромиды, фосфаты, сульфаты и т.п.; и соли органических кислот, такие как ацетаты, пропионаты, малонаты, бензоаты и т.п. Кроме того, вспомогательные вещества, такие как увлажнители или эмульгаторы, поверхностно-активные вещества, забуферивающие pH вещества, и т.п., могут присутствовать в таких носителях. Широкое множество фармацевтически приемлемых наполнителей известно в данной области, и нет необходимости подробно обсуждать их в настоящем описании. Фармацевтически приемлемые наполнители подробно описаны в множестве публикаций, включая, например, A. Gennaro (2000) «Remington: The Science and Practice of Pharmacy», 20th edition, Lippincott, Williams, & Wilkins; Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (1999) H. C. Ansel et al., eds., 7 ed., Lippincott, Williams, & Wilkins; и Handbook of Pharmaceutical Excipients (2000) A. H. Kibbe et al., eds., 3ed. Amer. Pharmaceutical Assoc. В некоторых аспектах по настоящему изобретению, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей от приблизительно 1×10 до приблизительно 1×10 рекомбинантных вирусов или от 1×10 до приблизительно 1×10 геномов вектора, где каждый указанный рекомбинантный вирус содержит геном, кодирующий один или более продуктов генов.
[00237]
Некоторые варианты осуществления изобретения проиллюстрированы в следующих пунктах 1-36:
1. Вариант капсидного белка аденоассоциированного вируса (AAV), содержащий пептидную вставку в GH-петле капсидного белка, по сравнению с соответствующим исходным капсидным белком AAV, где пептидная вставка содержит аминокислотную последовательность ISDQTKH (SEQ ID NO:14) и где вариант капсидного белка придает увеличенную инфекционность для клетки сетчатки, по сравнению с инфекционностью соответствующего исходного капсидного белка AAV для клетки сетчатки.
1
2
3
1
3
2. Вариант капсидного белка AAV по пункту 1, где пептидная вставка содержит аминокислотную последовательность YYISDQTKHY, где каждый из Y-Y независимо выбран из Ala, Leu, Gly, Ser, Thr и Pro.
3. Вариант капсидного белка AAV по пункту 2, где пептидная вставка содержит аминокислотную последовательность LAISDQTKHA (SEQ ID NO:28).
4. Вариант капсидного белка AAV по любому из пунктов 1-3, где участок вставки находится между аминокислотами, соответствующими аминокислотам 587 и 588 VP1 из AAV2 (SEQ ID NO:2), или в соответствующем положении в капсидном белке другого серотипа AAV.
5. Вариант капсидного белка AAV по любому из пунктов 1-4, где капсидный белок содержит одну или более аминокислотных замен, относительно VP1 капсида AAV2 (SEQ ID NO:2), или одну или более соответствующих замен в другом серотипе AAV.
6. Вариант капсидного белка AAV по любому из пунктов 1-5, где капсидный белок содержит аминокислотную замену P34A, относительно VP1 капсида AAV2 (SEQ ID NO:2), или соответствующую замену в другом серотипе AAV.
7. Вариант капсидного белка AAV по любому из пунктов 1-6, где капсидный белок содержит (i) аминокислотную последовательность ISDQTKH (SEQ ID NO:14) и (ii) аминокислотную замену P34A и является по меньшей мере на 90% идентичным, по меньшей мере на 95% идентичным или по меньшей мере 99% идентичным последовательности, указанной как SEQ ID NO:42.
8. Вариант капсидного белка AAV по пункту 7, где капсидный белок в основном состоит из аминокислотной последовательности, указанной как SEQ ID NO:42.
9. Рекомбинантный вирион AAV (rAAV), содержащий вариант капсидного белка AAV по любому из пунктов 1-8 и гетерологичную нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую продукт гена.
10. rAAV по пункту 9, где продукт гена представляет собой полипептид.
11. rAAV по пункту 10, где гетерологичная нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, который ингибирует активность фактора роста эндотелия сосудов (VEGF).
12. rAAV по пункту 11, где нуклеотидная последовательность кодирует слитый белок.
13. rAAV по пункту 12, где нуклеотидная последовательность кодирует афлиберцепт (эйлеа).
14. rAAV по пункту 13, где нуклеотидная последовательность является по меньшей мере на 90% идентичной, по меньшей мере на 95% идентичной или по меньшей мере на 99% идентичной с последовательностью нуклеиновой кислоты, указанной как SEQ ID NO: 65, или с нуклеотидами 79-1377 из SEQ ID NO:65, и предпочтительно, кодирует аминокислотную последовательность, указанную как SEQ ID NO:66, или аминокислоты 27-458 из SEQ ID NO:66.
15. rAAV по пункту 11, где нуклеотидная последовательность кодирует моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.
16. rAAV по пункту 15, где нуклеотидная последовательность кодирует ранибизумаб (люцентис).
17. rAAV по пункту 15, где нуклеотидная последовательность (i) содержит последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную, по меньшей мере на 95% идентичную или по меньшей мере на 99% идентичную с последовательностью из SEQ ID NO:67 (sc-ранибизумаб HL), или с нуклеотидами 58-1575 из SEQ ID NO:67, и кодирует аминокислотную последовательность, указанную как SEQ ID NO:68, или (ii) кодирует аминокислотную последовательность из аминокислот 20-524 из SEQ ID NO:68.
18. rAAV по пункту 15, где нуклеотидная последовательность (i) имеет последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную, по меньшей мере на 95% идентичную или по меньшей мере на 99% идентичную последовательности из SEQ ID NO:69 (sc-ранибизумаба LH1) или SEQ ID NO:70 (sc-ранибизумаба LH2), или с нуклеотидами 61-1578 из SEQ ID NO:69 или SEQ ID NO:70, и кодирует аминокислотную последовательность, указанную как SEQ ID NO:71, или (ii) кодирует аминокислотную последовательность из аминокислот 21-525 из SEQ ID NO:71.
19. rAAV по пункту 15, где нуклеотидная последовательность (i) имеет последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную, по меньшей мере на 95% идентичную или по меньшей мере на 99% идентичную с последовательностью из SEQ ID NO:72 (sc-ранибизумаба-Fc) или с нуклеотидами 61-2277 из SEQ ID NO:72, и кодирует аминокислотную последовательность, указанную как SEQ ID NO:73, или (ii) кодирует аминокислотную последовательность из аминокислот 21-752 из SEQ ID NO:73.
20. rAAV по пункту 15, где нуклеотидная последовательность кодирует бролуцизумаб.
21. rAAV по пункту 20, где нуклеотидная последовательность имеет последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную, по меньшей мере на 95% идентичную или по меньшей мере на 99% идентичную с последовательностью нуклеиновой кислоты, указанной как SEQ ID NO:74, или с нуклеотидами 61-816 из SEQ ID NO:74, и предпочтительно, кодирует аминокислотную последовательность, указанную как SEQ ID NO:75, или аминокислотную последовательность из аминокислот 21-271 из SEQ ID NO:75.
22. rAAV по пункту 15, где нуклеотидная последовательность (i) имеет последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную, по меньшей мере на 95% идентичную или по меньшей мере на 99% идентичную с последовательностью из SEQ ID NO:76 (бролуцизумаба-Fc) или с нуклеотидами 61-1530 из SEQ ID NO:76, и кодирует аминокислотную последовательность, указанную как SEQ ID NO:77, или (ii) кодирует аминокислотную последовательность из аминокислот 21-498 из SEQ ID NO:77.
23. rAAV по пункту 11, где гетерологичная нуклеиновая кислота содержит (i) последовательность, кодирующую афлиберцепт, предпочтительно, где последовательность, кодирующая афлиберцепт, является по меньшей мере на 90% идентичной, по меньшей мере на 95% идентичной или по меньшей мере на 99% идентичной последовательности нуклеиновой кислоты, указанной как SEQ ID NO: 65, и кодирует аминокислотную последовательность, указанную как SEQ ID NO:66, и (ii) последовательность, кодирующую бролуцизумаб, предпочтительно, где последовательность, кодирующая бролуцизумаб, является по меньшей мере на 90% идентичной, по меньшей мере 95% идентичной или по меньшей мере 99% идентичной последовательности нуклеиновой кислоты, указанной как SEQ ID NO: 74 или SEQ ID NO:76, и предпочтительно, кодирует аминокислотную последовательность, указанную как SEQ ID NO:75 или SEQ ID NO:77.
24. rAAV по любому из пунктов 9-23, где нуклеотидная последовательность, кодирующая продукт гена, является функционально связанной с последовательностью для контроля экспрессии.
25. Фармацевтическая композиция, содержащая rAAV по любому из пунктов 11-24 и a фармацевтически приемлемый носитель.
26. Способ доставки ингибитора VEGF в клетку сетчатки, хориоидальную клетку, хрусталиковую клетку, реснитчатую клетку, клетку радужной оболочки, клетку зрительного нерва и/или клетку роговицы у субъекта, включающий введение субъекту вириона rAAV по любому из пунктов 11-24 или фармацевтической композиции по пункту 24.
27. Способ по пункту 26, где вирион rAAV или фармацевтическую композицию вводят в стекловидное тело субъекта.
28. Способ лечения ассоциированного с VEGFa заболевания глаз, выбранного из влажной (неоваскулярной, эксудативной) связанной с возрастом дегенерации желтого пятна; отека желтого пятна после окклюзии вен сетчатки; неоваскуляризации сетчатки в результате окклюзии вен сетчатки; диабетического отека желтого пятна, диабетической ретинопатии (включая все стадии непролиферативной диабетической ретинопатии и пролиферативной диабетической ретинопатии); миопической дегенерации желтого пятна; окклюзии ветви вены сетчатки, окклюзии гемиретинальной вены и окклюзии центральной вены сетчатки; ретинопатии недоношенных; идиопатической хориоидальной неоваскуляризации; миопической дегенерации желтого пятна и вторичной ретинальной и хориоидальной неоваскуляризации; телеангиэктозии сетчатки; неоваскулярной глаукомы; геморрагии стекловидного тела; ретинальной и хориоидальной неоваскуляризации, вторичной по отношению к заболеваниям сетчатки, включая, но без ограничения, увеит, травму, дегенеративные нарушения сетчатки, генетическое заболевание сетчатки и/или хороида, опухоли глаза, неоваскуляризацию роговицы и радужной оболочки глаза, у субъекта, нуждающегося в таком лечении, посредством введения субъекту эффективного количества rAAV по любому из пунктов 11-24 или фармацевтической композиции по пункту 25.
29. Способ по пункту 28, где ассоциированное с VEGFa заболевание глаз выбрано из влажной (неоваскулярной, эксудативной) связанной с возрастом дегенерации желтого пятна; диабетического отека желтого пятна; отека желтого пятна после окклюзии вен сетчатки; диабетической ретинопатии; и миопической хориоидальной неоваскуляризации.
30. Способ по любому из пунктов 26-29, где rAAV содержит капсидный белок, в основном состоящий из аминокислотной последовательности, указанной как SEQ ID NO:42, и гетерологичную нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность, кодирующую афлиберцепт, предпочтительно, где последовательность, кодирующая афлиберцепт, имеет последовательность, указанную в SEQ ID NO:65.
31. Способ по любому из пунктов 26-29, где rAAV содержит капсидный белок, в основном состоящий из аминокислотной последовательности, указанной как SEQ ID NO:42, и гетерологичную нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность, кодирующую ранибизумаб, sc-ранибизумаб HL, sc-ранибизумаб LH, или sc-ранибизумаб-Fc, предпочтительно, где последовательность, кодирующая sc-ранибизумаб HL, sc-ранибизумаб LH, или sc-ранибизумаб-Fc, имеет последовательность, указанную в любой из SEQ ID NO:67, 69, 70 и 72.
32. Способ по любому из пунктов 26-29, где rAAV содержит капсидный белок, в основном состоящий из аминокислотной последовательности, указанной как SEQ ID NO:42, и гетерологичную нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность, кодирующую бролуцизумаб или бролуцизумаб-Fc, предпочтительно, где последовательность, кодирующая бролуцизумаб или бролуцизумаб-Fc, имеет последовательность, указанную в SEQ ID NO:74 или SEQ ID NO:76.
33. Способ по любому из пунктов 28-32, где rAAV или фармацевтическую композицию вводят в стекловидное тело субъекта.
34. Способ по любому из пунктов 26-33, где субъект представляет собой человека.
35. Выделенная нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую вариант капсидного белка AAV по любому из пунктов 1-8.
36. Выделенная, генетически модифицированная клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту по пункту 35.
ПРИМЕРЫ
[00238]
Следующие примеры приведены таким образом, чтобы обеспечить специалиста в данной области полным раскрытием и описанием того, как осуществлять и использовать настоящее изобретение, и не предназначены ни для ограничения объема того, что авторы настоящего изобретения рассматривают как свое изобретение, ни для представления того, что эксперименты ниже представляют собой все или единственные проведенные эксперименты. Предприняты усилия для обеспечения точности, применительно к используемым числам (например, количествам, температуре и т.д.), но следует учитывать некоторые экспериментальные ошибки и отклонения. Если не указано иное, части представляют собой части по массе, молекулярная масса представляет собой средневесовую молекулярную массу, температура приведена в градусах Цельсия, и давление является атмосферным или около того.
[00239]
Общие способы молекулярной и клеточной биохимии можно обнаружить в таких стандартных руководствах, как Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Sambrook et al., Harbor Laboratory Press 2001); Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed. (Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons 1999); Protein Methods (Bollag et al., John Wiley & Sons 1996); Nonviral Vectors for Gene Therapy (Wagner et al. eds., Academic Press 1999); Viral Vectors (Kaplift & Loewy eds., Academic Press 1995); Immunology Methods Manual (I. Lefkovits ed., Academic Press 1997); и Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology (Doyle & Griffiths, John Wiley & Sons 1998), содержание которых приведено в настоящем описании в качестве ссылки. Реагенты, клонирующие векторы и наборы для генетической манипуляции, на которые ссылаются в настоящем описании, являются доступными от коммерческих поставщиков, таких как BioRad, Stratagene, Invitrogen, Sigma-Aldrich и ClonTech.
[00240] Пример 1
[00241]
macaca fascicularis
Инъекция в стекловидное тело и сбор тканей. Одному самцу яванского макака () в возрасте 4-10 лет и массой по меньшей мере 4 кг вводили дозы посредством инъекции в стекловидное тело через склеру (приблизительно на 3 мм позади лимба с использованием способа и устройства для доставки, пригодного для использования для человека). Животное подвергали анестезии и вводили местный анестетик. 100 мкл библиотеки вводили в каждый глаз.
[00242]
Эвтаназию проводил квалифицированный ветеринар с использованием 100 мг/кг пентобарбитала натрия на сутки 14±3. Глаза вырезали и сохраняли при 4°C до нарезки.
[00243]
Нарезка тканей. Глаза разрезали вдоль границы между зрительной и слепой частями сетчатки с использованием скальпеля, и передний сегмент удаляли. Разрезы для выхода скальпеля выполняли в сетчатке вокруг фовеи, чтобы позволить фиксацию сетчатки, и стекловидное тело извлекали. Шесть образцов сетчатки из каждого квадранта (переднего, заднего, назального и височного) собирали, как показано на фигуре 2, и выделяли клеточный материал, соответствующий клеткам RPE, фоторецепторам, биполярным клеткам, амакриновым клеткам, горизонтальным клеткам и/или ганглионарным клеткам.
[00244]
cap
cap
in vivo
.
cap
Направленная эволюция. Способ направленной эволюции показан на фигуре 1A-1E. Кратко, получают библиотеку вирусных капсидов, содержащую 20+ запатентованных комбинаций способов мутагенеза ДНК и генов  (фигура 1A). Затем вирусы упаковывают (фигура 1B) - таким образом, что каждая частица состоит из мутантного капсида, окружающего ген , кодирующий этот капсид, - и очищают. Библиотеку капсидов подвергают селективному давлению . Представляющие интерес ткань или клеточный материал собирают для выделения вариантов AAV, которые успешно инфицировали эту мишень, и успешные вирусы выделяютУспешные клоны обогащают посредством повторяющегося отбора (стадия 1 - фигура 1D). Отобранные гены затем подвергают запатентованному повторному внесению разнообразия и обогащают посредством дополнительных стадий отбора для повторяющегося увеличения приспособленности вируса (стадия 2 - фигура 1D). Для вариантов, идентифицированных в ходе стадий отбора вектора 1 и 2, показана способность к трансдукции клеток сетчатки приматов (фигура 1E).
[00245]
Успешное выделение геномов капсидов AAV: циклы 1-6. Капсиды, выделенные из каждого цикла отбора, использовали для упаковки библиотеки, инъецируемой для инициации последующего цикла отбора. Выделение генов капсидов из ткани представляет успешную интернализацию библиотеки векторов в представляющую интерес ткань. После цикла 4, проводили повторное внесение разнообразия в библиотеку перед упаковкой библиотеки и инъекции для цикла 5. Выделение вирусных геномов из RPE, PR, внутреннего ядерного слоя (INL) и слоя ганглионарных клеток (GCL) ткани сетчатки из репрезентативного цикла отбора показано на фигуре 3. Полосы внутри рамок представляют успешное выделение вирусных геномов.
[00246]
Анализ секвенирования: циклы 3-6. В ходе циклов 3-6, проводили секвенирование индивидуальных клонов в библиотеке для определения частоты вариантов внутри популяции. Варианты оценивали по присутствию мотивов в данных секвенирования. Варианты группировали по мотивам на основании присутствия унифицирующего варианта (например, специфической точечной мутации или специфической последовательности пептидной вставки в постоянной локализации внутри капсида), встречающегося в множестве последовательностей. Мотивы, представляющие по меньшей мере 5% от секвенированной популяции в двух или более циклах отбора, или по меньшей мере 10% от секвенированной популяции в одном или нескольких циклах отбора, представлены на фигуре 4A (цикл 3 анализа секвенирования), 4B (цикл 4 анализа секвенирования), 4C (цикл 5 анализа секвенирования) и 4D (цикл 6 анализа секвенирования).
[00247]
Несколько репрезентативных клонов, идентифицированных как придающие увеличенную инфекционность для клеток сетчатки, перечислены в таблице 1 ниже (каждый клон содержит идентифицированные замену(замены) и/или пептидную вставку и является в ином отношении идентичным SEQ ID NO:2; цикл отбора, количество последовательностей и частота (в скобках) перечислены для каждого клона):
Таблица 1. Аминокислотная последовательность капсидного белка VP1 AAV, придающего увеличенную инфекционность для одной или нескольких клеток сетчатки. Замены, перечисленные в столбце 2, основаны на аминокислотной последовательности AAV2 дикого типа, т.е. в отсутствие вставленного пептида.
<b>Вставка</b>
<b>Замена</b>
<b>Вся сетчатка</b>
<b>RPE</b>
<b>Фоторецептор</b>
588~LAISDQTKHA~ (SEQ ID NO:28)
Нет
Цикл 4, 5, 6
Цикл 3, 5, 6
Цикл 4, 5
588~LAISDQTKHA~ (SEQ ID NO:28)
+M1L+L15P +P535S
Цикл 61 (1,61%)
588~LAISDQTKHA~ (SEQ ID NO:28)
+P34A
Цикл 51 (1,89%)
588~LAISDQTKHA~ (SEQ ID NO:28)
+P34A+S731L
Цикл 51 (1,82%)
588~LAISDQTKHA~ (SEQ ID NO:28)
+N57D
Цикл 41 (1,33%)
588~LAISDQTKHA~ (SEQ ID NO:28)
+N66K
Цикл 51 (1,82%)
588~LAISDQTKHA~ (SEQ ID NO:28)
+R81Q
Цикл 61 (1,61%)
588~LAISDQTKHA~ (SEQ ID NO:28)
+Q101R
Цикл 41 (2,27%)
588~LAISDQTKHA~ (SEQ ID NO:28)
+S109T
Цикл 31 (1,85%)
588~LAISDQTKHA~ (SEQ ID NO:28)
+R144K
Цикл 51 (1,82%)
588~LAISDQTKHA~ (SEQ ID NO:28)
+R144M
Цикл 51 (1,82%)
588~LAISDQTKHA~ (SEQ ID NO:28)
+Q164K
Цикл 41 (2,27%)
588~LAISDQTKHA~ (SEQ ID NO:28)
+Q164K+V708I
Циклы 3 и 42 (3,7%)1 (1,33%)
588~LAISDQTKHA~ (SEQ ID NO:28)
+T176P
Цикл 41 (1,33%)
588~LAISDQTKHA~ (SEQ ID NO:28)
+L188I
Цикл 51 (2,27%)
588~LAISDQTKHA~ (SEQ ID NO:28)
+S196Y
Цикл 41 (1,33%)
588~LAISDQTKHA~ (SEQ ID NO:28)
+G226E
Цикл 41 (2,27%)
588~LAISDQTKHA~ (SEQ ID NO:28)
+G236V
Цикл 41 (1,33%)
588~LAISDQTKHA~ (SEQ ID NO:28)
+I240T
Цикл 31 (1,85%)
588~LAISDQTKHA~ (SEQ ID NO:28)
+N312K
Цикл 41 (1,33%)
588~LAISDQTKHA~ (SEQ ID NO:28)
+P363L
Цикл 61 (1,61%)
588~LAISDQTKHA~ (SEQ ID NO:28)
+T456K
Цикл 61 (1,61%)
588-LAISDQTKHA~ (SEQ ID NO:28)
+I698V
Цикл 51 (1,89%)
588-LAISDQTKHA~ (SEQ ID NO:28)
+V708I
Цикл 4, 5, 6
Цикл 3, 4, 5
Цикл 4, 5
588~LAISDQTKHA~ (SEQ ID NO:28)
+V708I+R484C
Цикл 51 (2,27%)
588~LAISDQTKHA~ (SEQ ID NO:28)
N312K+N449D+N551S+I698V+L735Q
Сконструированный
Сконструированный
588~LGISDQTKHA~ (SEQ ID NO:29)
Нет
Цикл 51 (1,89%)
588~LAQADTTKNA~ (SEQ ID NO:27)
Нет
Цикл 3, 4, 5, 6
Цикл 3, 4, 5
Цикл 4, 5
588~LAQADTTKNA~ (SEQ ID NO:27)
+E36D
Цикл 51 (2,27%)
588~LAQADTTKNA~ (SEQ ID NO:27)
+P250S
Цикл 61 (1,61%)
588~LAQADTTKNA~ (SEQ ID NO:27)
+A524T
Цикл 31 (1,85%)
588~LAQADTTKNA~ (SEQ ID NO:27)
+A593E
Цикл 41 (1,33%)
588~LAQADTTKNA~ (SEQ ID NO:27)
+I698V
Циклы 5 и 61 (1,61%)1 (1,89%)
588~LAQADTTKNA~ (SEQ ID NO:27)
+V708I
Цикл 3, 4, 5, 6
Цикл 3, 4, 5
588~LAQADTTKNA~ (SEQ ID NO:27)
+V708I+V719M
Циклы 3 и 41 (2,08%)2 (4,55%)
588~LAQADTTKNA~ (SEQ ID NO:27)
+V719M
Цикл 41 (2,27%)
588~LAHQDTTKNA~ (SEQ ID NO:34)
Нет
Цикл 52 (3,77%)
588~LANQDYTKTA~ (SEQ ID NO:31)
Нет
Циклы 3, 4 и 55 (9,26%)1 (1,33%)3 (5,66%)
Циклы 3, 4 и 52 (4,17%)2 (4,55%)2 (2,27%)
Цикл 51 (1,82%)
588~LANQDYTKTA~ (SEQ ID NO:31)
+S109T+S463Y
Цикл 31 (1,85%)
588~LANQDYTKTA~ (SEQ ID NO:31)
+D368H
Цикл 31 (1,85%)
588~LANQDYTKTA~ (SEQ ID NO:31)
+V708I
Цикл 41 (1,33%)
Цикл 31 (2,08%)
588~LAHDITKNIA~ (SEQ ID NO:32)
Нет
Циклы 3, 4 5 и 61 (1,85%)1 (1,33%)1 (1,89%)2 (3,23%)
588~LAHDITKNIA~ (SEQ ID NO:32)
+S109T
Цикл 41 (1,33%)
588~LAHDITKNIA~ (SEQ ID NO:32)
+R389S
Цикл 51 (1,89%)
588~LAHDITKNIA~ (SEQ ID NO:32)
+A593E
Цикл 31 (1,85%)
588~LAHDITKNIA~ (SEQ ID NO:32)
+V708I
Цикл 4, 5
588~IAHDITKNIA~ (SEQ ID NO: 60)
+V708I
Цикл 31 (2,08%)
588~LAPNSTHGSA~ (SEQ ID NO:40)
+V708I
Цикл 31 (1,85%)
588~LANKTTNKDA~ (SEQ ID NO:35)
Нет
Цикл 51 (2,27%)
588~LANKTTNKDA~ (SEQ ID NO:35)
+N449D
Цикл 41 (2,17%)
588~LAHPDTTKNA~ (SEQ ID NO:33)
Цикл 61 (1,61%)
588~LATNRTSPDA~ (SEQ ID NO:39)
Цикл 61 (1,61%)
588~LPQANANENA~ (SEQ ID NO:37)
Цикл 51 (1,89%)
588~LAASDSTKAA~ (SEQ ID NO:30)
Циклы 3 и 41 (1,85%)1 (1,33%)
588~LAKDRAPSTA~ (SEQ ID NO:41)
Цикл 31 (1,85%)
588~LPISNENEHA~ (SEQ ID NO:36)
Цикл 41 (2,17%)
588~LAGKSKVIDA~ (SEQ ID NO:38)
Цикл 51 (1,82%)
НЕТ
P34A
Цикл 51 (1,89%)
Циклы 4, 53 (6,82%)1 (2,27%)
Цикл 41 (2,17%)
НЕТ
P64S
Цикл 31 (1,85%)
Цикл 41 (2,27%)
НЕТ
S109T
Цикл 42 (2,67%)
Циклы 3, 4, 54 (8,33%)1 (2,27%)1 (2,27%)
НЕТ
S109T+P8L
Цикл 31 (2,08%)
НЕТ
S109T+Q120R
Цикл 31 (2,08%)
НЕТ
S109T+A493V+A593E+V708I
Цикл 31 (1,85%)
НЕТ
Q164K
Циклы 4 и 52 (2,67%)1 (1,89%)
Цикл 41 (2,27%)
НЕТ
Q175H
Цикл 31 (1,85%)
Цикл 41 (2,17%)
НЕТ
S196Y
Цикл 31 (1,85%)
Цикл 41 (2,27%)
НЕТ
A593E
Циклы 3, 4, 53 (5,56%)7 (9,33%)1 (1,89%)
Циклы 3, 4, 512 (25%)7 (15,9%)14(31,8%)
Цикл 41 (2,17%)
НЕТ
A593E+Q464R
Цикл 31 (2,08%)
НЕТ
A593E+N596D
Цикл 41 (2,27%)
НЕТ
A593E+N596D+T491A
Цикл 32 (4,17%)
НЕТ
A593E+V708I
Циклы 3, 42 (3,7%)2 (2,67%)
Циклы 3, 4, 54 (8,33%)1 (2,27%)1 (2,27%)
НЕТ
I698V
Цикл 51 (1,89%)
Цикл 51 (2,27%)
НЕТ
V708I
Циклы 3, 4,2 (3,7%)5 (6,67%)
Циклы 3, 4, 51 (2,08%)4 (9,09%)4 (9,09%)
НЕТ
V708I+V719M
Цикл 42 (4,55%)
НЕТ
V708I+G727D
Цикл 51 (2,27%)
НЕТ
V708I+R733C
Цикл 41 (2,17%)
[00248]
В качестве капсида, имеющего увеличенную инфекционность для одной или нескольких клеток сетчатки, идентифицирован клон, имеющий следующую предковую последовательность VP1 капсида:
[00249]
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEGAKTAPGKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPAGPSGLGSGTMAAGGGAPMADNNEGADGVGNASGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSASAGSTNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTTNDGVTTIANNLTSTVQVFSDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLARTQSTGGTAGTRELLFSQAGPSNMSAQAKNWLPGPCYRQQRVSKTLSQNNNSNFAWTGATKYHLNGRDSLVNPGVAMATHKDDEDRFFPSSGVLIFGKQGAGANNTALENVMMTSEEEIKTTNPVATEQYGVVASNLQSSNTAPVTGTVNSQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPPAVFTPAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYAKSTNVDFAVDNEGVYSEPRPIGTRYLTRNL. (SEQ ID NO:59).
[00250]
Этот вариант предкового капсида эволюционировал из предкового капсида SEQ ID NO:58, в котором положения вырожденности (остатки 264, 266, 268, 448, 459, 460, 467, 470, 471, 474, 495, 516, 533, 547, 551, 555, 557, 561, 563, 577, 583, 593, 596, 661, 662, 664, 665, 710, 717, 718, 719, 723) эволюционировали для содержания аланина (A) в 264, аланина (A) в 266, серина (S) в 268, аланина (A) в 448, треонина (T) в 459, аргинина (R) в 460, аланина (A) в 467, серина (S) в 470, аспарагина (N) в 471, аланина (A) в 474, серина (S) в 495, аспарагина (D) в 516, аспарагина (D) в 533, глутамина (Q) в 547, аланина (A) в 551, аланина (A) в 555, глутаминовой кислоты (E) в 557, метионина (M) в 561, серина (S) в 563, глутамина (Q) в 577, серина (S) в 583, валина (V) в 593, треонина (T) в 596, аланина (A) в 661, валина (V) в 662, треонина (T) в 664, пролина (P) в 665, треонина (T) в 710, аспарагиновой кислоты (D) в 717, аспарагина (N) в 718, глутаминовой кислоты (E) в 719 и серина (S) в 723.
[00251]
Варианты вириона AAV, описанные в настоящем описании, могут включать целесообразные параметры, признаки, модификации, преимущества и варианты рационального дизайна, ясно очевидные специалисту в области конструирования вирусных векторов AAV.
[00252] Пример 2
[00253]
in vivo
Направленную эволюцию использовали для открытия новых вариантов аденоассоциированного вируса (AAV) с превосходной доставкой гена в клетки сетчатки после введения в стекловидное тело (IVT), способом введения со значительными преимуществами над другими способами доставки гена в глаз человека (пример 1). Тропизм клеток после введения в стекловидное тело нового варианта AAV, содержащего замену P34A и пептид LAISDQTKHA (SEQ ID NO:28), вставленный в положении аминокислоты 588 (LAISDQTKHA+P34A; SEQ ID NO:42), оценивали  у нечеловекообразных приматов (NHP) в качестве репрезентативного примера способности содержащих ISDQTKH (SEQ ID NO:14) вариантов AAV к трансдукции клеток сетчатки.
[00254]
10
12
Рекомбинантные вирионы AAV, содержащие либо капсид AAV2, либо новый вариант капсида LAISDQTKHA+P34A (SEQ ID NO:42), и геном, содержащий трансген зеленого флуоресцентного белка (GFP), функционально связанный с промотором CMV (AAV2.CMV.GFP и LAISDQTKHA+P34A.CMV.GFP, соответственно) или промотором CAG (AAV2.CAG.EGFP и LAISDQTKHA+P34A.CAG.EGFP, соответственно), получали с использованием стандартных способов. Африканским зеленым мартышкам (фигуры 7, 8) или яванским макакам (фигура 9) инъецировали в стекловидное тело различные дозы вектора в диапазоне от 4×10 гв до 1×10 гв на глаз (см. подробности в подписях к фигурам), и трансдукцию клеток сетчатки оценивали при жизни посредством получения флуоресцентных изображений глазного дна с использованием Heidelberg Spectralis™.
[00255]
Доставкав стекловидное тело AAV, содержащих новый вариант LAISDQTKHA+P34A (SEQ ID NO:42), приводила к более широкой и более надежной экспрессии трансгена в сетчатке NHP, чем AAV2 (фигуры 7-9). Изображения выявили, чтоновый вариант AAV капсида обеспечивает надежную экспрессию в центре фовеи (в области, богатой колбочками); в парафовеальном кольце (в области, богатой ганглионарными клетками сетчатки) и на периферии (в области, богатой многими типами клеток, включая палочки, глиальные клетки Мюллера, амакриновые клетки, биполярные клетки), настолько рано, как через 2 недели после инъекции. В отличие от этого, и в соответствии с результатами, опубликованными другими авторами, AAV2 дикого типа обеспечивает более слабую экспрессию, присутствующую в первую очередь в парафовеальном кольце, и ее можно детектировать только в более поздние временные точки. Иммуногистохимический анализ различных областей сетчатки, проведенный через 3 недели после инъекции, подтвердил, что множество типов клеток сетчатки, включая клетки пигментного эпителия сетчатки, фоторецепторные палочки и колбочки, и ганглионарные клетки сетчатки, были успешно трансдуцированы в сетчатке (фигуры 10A-10E).
[00256]
Это исследование иллюстрирует превосходную доставку гена посредством содержащего ISDQTKH варианта, после клинически предпочтительного способа введения, по сравнению с клинически значимым AAV2. Сходная эффективность является достижимой с использованием других вариантов, содержащих этот мотив пептидной вставки. Подобным образом, сходная эффективность является достижимой с использованием других вариантов, описанных в настоящем описании, идентифицированных с использованием такого же способа направленной эволюции.
[00257] Пример 3
[00258]
in vitro
Клеточный тропизм нового варианта AAV LAISDQTKHA+P34A (SEQ ID NO:42) для клеток пигментного эпителия сетчатки (RPE) и фоторецепторных (PR) клеток оценивали  с использованием клеток RPE и клеток PR, полученных из происходящих из фибробластов индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (FB-iPSC) человека или эмбриональных стволовых клеток (ESC) человека.
[00259]
Вирионы AAV, содержащие либо капсид AAV2, либо новый вариант капсида LAISDQTKHA+P34A (SEQ ID NO:42), и геном, содержащий трансген зеленого флуоресцентного белка (EGFP), функционально связанный с промотором CAG (AAV2.CAG.EGFP и LAISDQTKHA+P34A.CAG.EGFP, соответственно), получали с использованием стандартных способов. Культуры клеток RPE человека получали из линии эмбриональных стволовых клеток человека ESI-017 или происходящих из фибробластов индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (FB-iPSC) человека с использованием 45-суточного способа дифференцировки. Созревание до клеток RPE подтверждали посредством детекции экспрессии маркеров зрелых RPE, включая RPE65 и BEST1; синтеза VEGF и PEDF; и способности к фагоцитозу внешних сегментов палочек. Культуры PR получали посредством многоступенчатой парадигмы формирования глазного бокала и подтверждали, что они содержат PR, посредством детекции экспрессии рековерина и S-опсина через 179 суток в культуре.
[00260]
По сравнению с AAV2, LAISDQTKHA+P34A (SEQ ID NO:42) обеспечивал значимо более высокую эффективность трансдукции и экспрессии трансгена в культурах RPE человека через семь суток после инфекции, как определено посредством иммунофлуоресценции (фигуры 11A-B), проточной цитометрии (увеличение в 2,7 раз; фигуры 11C-D) и анализа Вестерн-блоттинга (фигуры 11E-F). Подобным образом, надежной трансдукции и экспрессии достигали с использованием LAISDQTKHA+P34A.CAG.EGFP в культурах PR человека через 32 суток после инфекции. Это исследование иллюстрирует превосходную способность содержащих ISDQTKH (SEQ ID NO:14)- вариантов к доставке генов в клетки сетчатки.
[00261] Пример 4
[00262]
E. coli
Дизайн и конструирование векторов, экспрессирующих белки против VEGF. Аминокислотная последовательность афлиберцепта состоит из сигнального пептида Flt1 человека, домена 2 VEGFR1 и домена 3 VEGFR2, слитого с областью Fc IgG1 человека (фигура 12A; SEQ ID NO:66). Аминокислотные последовательности легких и тяжелых цепей ранибизумаба соединяли посредством гибкого белкового линкера для перевода двухцепочечного антигенсвязывающего фрагмента (Fab) в одноцепочечный Fab (scFab). Легкая-тяжелая (LH) форма состоит из сигнального пептида легкой цепи каппа Ig человека, вариабельного легкого, константного легкого, вариабельного тяжелого и константного тяжелого 1 доменов ранибизумаба, связанных посредством гибкого пептида (фигура 12B; SEQ ID NO:71). Тяжелая-легкая (HL) форма является сходной, за исключением того, что сигнальный пептид происходит из тяжелой цепи IgG человека, и тяжелый и легкий домены находятся на противоположных сторонах линкера, по сравнению с формой LH (фигура 12C; SEQ ID NO:68). Дизайн бролуцизумаба включает вариабельный легкий и вариабельный тяжелый домены, связанные посредством гибкого пептида, с сигнальным пептидом легкой цепи каппа Ig человека для секреции из клеток млекопитающих (фигура 12D; SEQ ID NO:75). Открытые рамки считывания подвергали оптимизации по кодонному составу для улучшенной экспрессии в клетках человека и синтезировали в GeneArt или GenScript, и предоставляли в стандартном плазмидном клонирующем векторе. Представляющую интерес ДНК вырезали из этой плазмиды с использованием рестрикционных ферментов PstI и BglII, и вставляли в плазмиду pAAV-CAG-SV40 pA между промотором CAG и полиA-сигналом SV40. Дизайн sc-ранибизумаба-Fc состоит из формы LH sc-ранибизумаба, слитой с областью Fc IgG1 человека из дизайна афлиберцепта (фигура 12E; SEQ ID NO:73). Дизайн бролуцизумаба-Fc состоит из бролуцизумаба, слитого с областью Fc IgG1 человека из дизайна афлиберцепта (фигура 12F; SEQ ID NO:77). Области sc-ранибизумаба LH, бролуцизумаба и Fc амплифицировали посредством ПЦР из исходных клонирующих векторов, с удлинениями, содержащими участок для рестрикционного фермента типа IIS BsmBI на 3’-конце (sc-ранибизумаб LH и бролуцизумаб) или 5’-конце (Fc). Полученные продукты ПЦР расщепляли с использованием рестрикционных ферментов PstI и BsmBI (sc-ранибизумаб LH и бролуцизумаб) или BsmBI и BglII (Fc), и вставляли в плазмиду pAAV-CAG-SV40 pA между промотором CAG и полиA-сигналом SV40. Реакции лигирования использовали для трансформации , и положительные клоны идентифицировали посредством рестрикционного расщепления. Затем клоны выращивали в более крупном масштабе, и плазмидную ДНК очищали с использованием набора Qiagen Endo-Free Maxiprep. Идентичность плазмид верифицировали посредством рестрикционного расщепления и секвенирования. Плазмида pAAV-CAG-SV40 полиA содержит инвертированные концевые повторы (ITR) AAV2, позволяющие упаковку последовательностей против VEGF в капсиды AAV и доставку в представляющие интерес клетки в сетчатке посредством введения в стекловидное тело.
[00263]
Клетки HEK293T подвергали ложной трансфекции или трансфекции плазмидой, содержащей трансген либо GFP, либо белка против VEGF (sc-RNBZ HL (SEQ ID NO:67), sc-RNBZ LH1 (SEQ ID NO:69) и sc-RNBZ-LH2 (SEQ ID NO:70), AFLB (SEQ ID NO:65), BRO (SEQ ID NO:74)) под контролем промотора CAG, с использованием реагента для трансфекции FuGene6, в двух отдельных экспериментах. Среды собирали через 48 час после трансфекции и анализировали с использованием набора для ELISA афлиберцепта (Eagle Biosciences, Immunoguide IG-AA115). Белки против VEGF детектировали посредством HRP-антитела против Fc IgG, предоставленного в наборе в качестве реагента (ложная, GFP и AFLB) или HRP-антитела против H+L IgG (sc-RNBZ HL, sc-RNBZ LH1 и sc-RNBZ LH2). Концентрации рассчитывали относительно клинических эйлеа (ложная, GFP и AFLB) или люцентиса (sc-RNBZ HL, sc-RNBZ LH1, sc-RNBZ LH2 и BRO). В первом из двух экспериментов, экспрессия афлиберцепта составляла приблизительно 15 мкг/мл, и экспрессия sc-ранибизумаба лежала в диапазоне от 1,6 до 2,8 мкг/мл, где формы LH экспрессировались в сходных концентрациях, и форма HL экспрессировалась в приблизительно в два раза более низкой концентрации (фигура 13A). Во втором эксперименте, экспрессия афлиберцепта составляла приблизительно 50 мкг/мл, и экспрессия sc-ранибизумаба LH1 составляла приблизительно 4,0 мкг/мл (фигура 13B). Сигнал для бролуцизумаба являлся очень низким, наиболее вероятно, из-за плохого узнавания антителом для детекции. Активность связывания VEGF не детектирована в средах после ложной трансфекции или трансфекции GFP.
[00264] Пример 5
[00265]
Для непосредственной визуализации белков против VEGF и подтверждения размера белков, проводили анализ Вестерн-блоттинга сред от клеток, трансфицированных с использованием плазмид для экспрессии GFP, афлиберцепта (SEQ ID NO:65), sc-ранибизумаба (SEQ ID NO:67, 69 и 70) или бролуцизумаба (SEQ ID NO:74) (фигура 14). Среды от трансфицированных клеток HEK293T разделяли в геле Bolt 4-12% Bis-Tris Plus (Invitrogen, кат.# NW04122BOX), и разделенные белки переносили на нитроцеллюлозу с использованием устройства iBlot2. Блот анализировали с использованием зонда конъюгированного с HRP антитела козы против Fc IgG человека (Thermo, кат.# 31413, левая панель) или антитела козы против Fab IgG человека (Thermo, кат.# 31482, правая панель), с использованием устройства iBind Flex, и визуализировали с использованием хемилюминесцентного субстрата SuperSignal West Dura (Thermo кат.# 34076). Изображения получали с использованием устройства для визуализации iBright FL1000.
[00266]
Образец афлиберцепта казался сходным с клиническим сравнительным белком эйлеа. Не присутствовало сигнала в образцах отрицательного контроля. Клинический сравнительный белок люцентис восстанавливается до отдельных легкой и тяжелой цепей по 24 кДа, в то время как белки sc-ранибизумаба мигрируют при приблизительно 48 кДа, из-за существования полипептидного линкера, связывающего легкие и тяжелые цепи в один белок. Присутствует большее количество формы LH белка, по сравнению с формой HL белка, в соответствии с количественной оценкой белка, полученной посредством ELISA (фигура 13A). Сигнал для бролуцизумаба является низким, наиболее вероятно, из-за плохого узнавания антителом для детекции. Белок мигрирует с корректной молекулярной массой 24 кДа.
[00267] Пример 6
[00268]
В качестве дополнительного способа для определения активности связывания VEGF, проводили конкурентный ELISA VEGF (фигура 15). Клинические сравнительные белки эйлеа или люцентис и среды от трансфицированных клеток HEK293T инкубировали с 13 пМ VEGF при комнатной температуре в течение ночи. В образцах анализировали свободный VEGF с использованием набора Quantikine VEGF ELISA (R&D Systems, кат.# DVE00). В первом из двух экспериментов, кривые ингибирования для четырех белков против VEGF из образцов после трансфекции являлись очень сходными с клиническими эйлеа и люцентисом. Афлиберцепт и эйлеа конкурировали за VEGF более сильно, чем варианты sc-ранибизумаба и люцентис (фигура 15A). Все три формы sc-ранибизумаба (SEQ ID NO:67, 69 и 70) являлись почти идентичными. Во втором эксперименте, все конструкции против VEGF конкурировали за VEGF (фигура 15B). Не присутствовало активности конкуренции для образца отрицательного контроля GFP.
[00269] Пример 7
[00270]
Для подтверждения того, что белки против VEGF, экспресссируемые в трансфицированных клетках, блокируют связывание VEGF с его рецептором и таким образом, его функцию, равные концентрации клинических сравнительных белков и сред от трансфицированных клеток HEK293T смешивали с 20 нг/мл VEGF и помещали к клеткам PathHunter KDR (DiscoverX 93-0996Y1). Эти клетки экспрессируют слитые белки рецептор VEGF/бета-галактозидаза, образующие активную бета-галактозидазу при связывании с VEGF. Клетки лизировали через 22 час и анализировали по активности бета-галактозидазы. Кривые ингибирования белков белки против VEGF из образцов после трансфекции являются эквивалентными кривым для клинических сравнительных белков, показывая, что экспрессированные белки блокируют функцию VEGF в анализе на основе клеток (фигура 16). В двух последующих экспериментах, анализ нейтрализации клеточного VEGF проводили также с использованием равных объемов сред от клеток HEK293T, трансфицированных с использованием конструкций против VEGF. В первом из этих экспериментов, оценивали плазмиды для экспрессии GFP, афлиберцепта (SEQ ID NO:65), sc-ранибизумаба HL (SEQ ID NO:67) или sc-ранибизумаба LH1 (SEQ ID NO:69). Все оцененные конструкции против VEGF нейтрализовали VEGF (фигура 17A). Форма sc-ранибизумаб LH нейтрализовала VEGF более сильно, чем форма sc-ранибизумаб HL. Во втором эксперименте, плазмиды для экспрессии GFP, афлиберцепта (SEQ ID NO:65), sc-ранибизумаба LH1 (SEQ ID NO:69) или бролуцизумаба (SEQ ID NO:74) смешивали с 8 нг/мл VEGF и помещали в клетки PathHunter KDR (DiscoverX 93-0996Y1). Клетки лизировали через 18 час и анализировали по активности бета-галактозидазы. Снова, все оцененные конструкции против VEGF нейтрализовали VEGF (фигура 17B). Присутствовал слабый эффект матрицы для контрольного образца GFP при всех анализированных разведениях.
[00271] Пример 8
[00272]
Клетки пигментного эпителия сетчатки (RPE) подвергали ложной трансфекции или трансфекции с использованием плазмиды, содержащий либо трансген GFP, либо трансген против VEGF под контролем промотора CAG, с использованием реагента для трансфекции FuGeneHD. Среды собирали через 48 час после трансфекции. Эффективность трансфекции для клеток RPE являлась необычайно низкой, как доказано по количеству экспрессирующих GFP клеток (данные не представлены), и таким образом, активность связывания VEGF не поддавалась детекции в средах после этих трансфекций. Общую концентрацию VEGF в средах оценивали для определения того, могут ли низкие концентрации средств против VEGF уменьшать секрецию VEGF в RPE. Среды собирали через 48 час после трансфекции и анализировали с использованием набора Quantikine VEGF ELISA (R&D Systems, кат.# DVE00). Наблюдали сильное уменьшение уровней VEGF после экспрессии афлиберцепта (SEQ ID NO:65) и уменьшение уровней VEGF после экспрессии sc-ранибизумаба (SEQ ID NO:67, 69 и 70) (фигура 18). Эффект на уровни VEGF всех трех форм sc-ранибизумаба являлся сходным. После доставки посредством более эффективной трансдукции AAV, трансгены против VEGF приводили к получению более высоких концентраций белков против VEGF, что оценивали количественно посредством набора для ELISA афлиберцепта.
[00273] Пример 9
[00274]
Плазмиды для экспрессии AAV, несущие гены для афлиберцепта (SEQ ID NO:65), sc-ранибизумаба (SEQ ID NO:67 и 69) или бролуцизумаба (SEQ ID NO:74), использовали для упаковки вирусной ДНК в вариант капсида R100 (имеющий аминокислотную последовательность, указанную как SEQ ID NO:42). Зрелые клетки RPE трансдуцировали через 30 суток после рассева в 12-луночные планшеты при MOI 5000 этих векторов в объеме 1,0 мл сред X-Vivo10. Среду меняли через трое суток после трансдукции, собирали и меняли через шесть суток после трансдукции, и снова собирали и меняли через десять суток после трансдукции.
[00275]
Общую концентрацию VEGF в средах анализировали с использованием набора Quantikine VEGF ELISA (R&D Systems кат.# DVE00) для определения эффекта трансдукции с использованием векторов против VEGF на уровень свободного поддающегося детекции эндогенного VEGF, секретированного клетками RPE в среду (фигура 19). Эндогенный уровень VEGF, как показано по клеткам, трансдуцированным контрольным вектором с GFP, составлял 4500 пг/мл в образце через 6 суток и 8300 пг/мл в образце через 10 суток. Трансдукция с использованием всех векторов против VEGF приводила к уровням VEGF в средах, от низких до не поддающихся детекции. Является вероятным, что количество VEGF, секретированного клетками RPE, не изменялось, но скорее, что VEGF в средах был связан белками против VEGF, так что не поддавался детекции посредством ELISA. Дополнительные эксперименты, включая Вестерн-блоттинг, можно проводить для определения общего количества связанного и несвязанного VEGF.
[00276]
Среды после трансдукций RPE также анализировали с использованием набора для ELISA афлиберцепта (Eagle Biosciences, Immunoguide IG-AA115). Белки против VEGF детектировали с использованием HRP-антитела против IgG H+L (ThermoFisher, кат.# 31410). Концентрации рассчитывали относительно клинических эйлеа (AFLB и GFP) или люцентиса (sc-RNBZ HL, sc-RNBZ LH1 и BRO). Экспрессия афлиберцепта (SEQ ID NO:65) составляла приблизительно 1800 нг/мл в образце через 6 суток и 2800 нг/мл в образце через 10 суток. Экспрессия sc-ранибизумаба лежала в диапазоне от 700 нг/мл для HL (SEQ ID NO:67) в образце через 6 суток до 1700 нг/мл для LH (SEQ ID NO:69) в образце через 10 суток (фигура 20). Сигнал для бролуцизумаба (SEQ ID NO:74) являлся очень низким, наиболее вероятно, из-за плохого узнавания антителом для детекции. Активность связывания VEGF не детектирована в средах после трансдукции GFP.
[00277] Пример 10
[00278]
Для непосредственной визуализации белков против VEGF и подтверждения размера белков, проводили анализ Вестерн-блоттинга сред от трансдуцированных клеток RPE (фигура 21). Равные объемы сред для суток 6 и суток 10 разделяли в гелях Bolt 4-12% Bis-Tris Plus (Invitrogen, кат.# NW04122BOX), и разделенные белки переносили на нитроцеллюлозу с использованием устройства iBlot2. Блот анализировали с использованием зонда конъюгированного с HRP антитела козы против Fc IgG человека (Thermo, кат.# 31413, левая панель) или антитела козы против Fab IgG человека (Thermo, кат.# 31482, правая панель), с использованием устройства iBind Flex, и визуализировали с использованием хемилюминесцентного субстрата SuperSignal West Dura (Thermo, кат.# 34076). Изображения получали с использованием устройства для визуализации ChemiDoc MP.
[00279]
Образцы афлиберцепта (SEQ ID NO:65) казались сходными с клиническим сравнительным белком эйлеа (черная стрелка). Не присутствовало полос с корректной подвижностью в образце отрицательного контроля GFP. Клинический люцентис восстанавливается до отдельных легкой и тяжелой цепей по 24 кДа, в то время как sc-ранибизумаб HL (SEQ ID NO:67) и LH (SEQ ID NO:69) не разделяются и мигрируют с кажущейся молекулярной массой 58 кДа, как показано серой стрелкой. Сигнал для бролуцизумаба (SEQ ID NO:74) является низким, наиболее вероятно, из-за плохого узнавания антителом для детекции. Белок мигрирует с корректной молекулярной массой 26 кДа, как показано заштрихованной стрелкой. Уровни белка являются почти сходными в образцах через 6 и 10 суток.
[00280] Пример 11
[00281]
В качестве дополнительного способа для определения активности связывания VEGF, проводили конкурентный ELISA VEGF (фигура 22). Равные объемы сред от трансдуцированных клеток RPE инкубировали с 13 пМ VEGF при комнатной температуре в течение ночи. В образцах анализировали свободный VEGF с использованием набора Quantikine VEGF ELISA (R&D Systems, кат.# DVE00). Среды от клеток, трансдуцированных с использованием всех конструкций против VEGF, конкурировали за VEGF. Результаты являлись сходными для образцов через 6 и 10 суток. Не присутствовало активности конкуренции для образца отрицательного контроля GFP. Уровни свободного VEGF были выше для самых низких разведений, из-за эндогенного VEGF, продуцированного клетками RPE.
[00282] Пример 12
[00283]
Для сравнения активности нейтрализации VEGF белкиов против VEGF, экспрессированных в клетках RPE с вирусных векторов, равные объемы сред от трансдуцированных клеток RPE смешивали с 8 нг/мл VEGF и помещали к клеткам PathHunter KDR (DiscoverX 93-0996Y1) (фигура 23). Клетки лизировали через 18 час и анализировали по активности бета-галактозидазы. Среды от клеток, трансдуцированных с использованием всех конструкций против VEGF, нейтрализовали VEGF. Не присутствовало нейтрализации VEGF, наблюдаемой для сред после контрольной трансдукции GFP.
[00284]
Предшествующее просто иллюстрирует принципы изобретения. Понятно, что специалист в данной области способен разрабатывать различные аранжировки, которые, хотя и не описаны или не показаны в настоящем описании в явной форме, воплощают принципы изобретения и включены в его содержание и объем. Кроме того, все примеры и условные формулировки, процитированные в настоящем описании, принципиально предназначены, чтобы помочь читателю в понимании принципов изобретения и концепций, представленных авторами настоящего изобретения для развития уровня техники, и их следует рассматривать как не налагающие ограничения на такие конкретно процитированные примеры и условия.
[00285]
Кроме того, все утверждения в настоящем описании, перечисляющие принципы, аспекты и варианты осуществления изобретения, так же как их конкретные примеры, предназначены для включения как структурных, так и функциональных их эквивалентов. Кроме того, подразумевают, что такие эквиваленты включают как известные в настоящее время эквиваленты, так и эквиваленты, которые будут разработаны в будущем, т.е. любые элементы, разработанные для осуществления такой же функции, вне зависимости от структуры. Объем настоящего изобретения, таким образом, не ограничен иллюстративными вариантами осуществления, показанными и описанными в настоящем описании. Вместо этого, объем и содержание настоящего изобретения заключены в прилагаемой формуле изобретения.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  4D Molecular Therapeutics Inc.
<120>  ВАРИАНТЫ КАПСИДОВ АДЕНОАССОЦИИРОВАННОГО ВИРУСА
И ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ИНГИБИРОВАНИЯ АНГИОГЕНЕЗА
<130>  090400-5010 WO
<150>  US 62/590976
<151>  2017-11-27
<150>  US 62/664726
<151>  2018-04-30
<160>  77
<170>  PatentIn версии 3.5
<210>  1
<211>  736
<212>  белок
<213>  Аденоассоциированный вирус 1
<400>  1
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser
1               5                   10                  15
Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Asp Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro
20                  25                  30
Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro
35                  40                  45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50                  55                  60
Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65                  70                  75                  80
Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala
85                  90                  95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100                 105                 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115                 120                 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130                 135                 140
Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Ile Gly
145                 150                 155                 160
Lys Thr Gly Gln Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165                 170                 175
Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro Pro
180                 185                 190
Ala Thr Pro Ala Ala Val Gly Pro Thr Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly
195                 200                 205
Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ala
210                 215                 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile
225                 230                 235                 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245                 250                 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Ala Ser Thr Gly Ala Ser Asn Asp Asn His
260                 265                 270
Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe
275                 280                 285
His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn
290                 295                 300
Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln
305                 310                 315                 320
Val Lys Glu Val Thr Thr Asn Asp Gly Val Thr Thr Ile Ala Asn Asn
325                 330                 335
Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Ser Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro
340                 345                 350
Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala
355                 360                 365
Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly
370                 375                 380
Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro
385                 390                 395                 400
Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe
405                 410                 415
Glu Glu Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp
420                 425                 430
Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Asn Arg
435                 440                 445
Thr Gln Asn Gln Ser Gly Ser Ala Gln Asn Lys Asp Leu Leu Phe Ser
450                 455                 460
Arg Gly Ser Pro Ala Gly Met Ser Val Gln Pro Lys Asn Trp Leu Pro
465                 470                 475                 480
Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Lys Thr Asp Asn
485                 490                 495
Asn Asn Ser Asn Phe Thr Trp Thr Gly Ala Ser Lys Tyr Asn Leu Asn
500                 505                 510
Gly Arg Glu Ser Ile Ile Asn Pro Gly Thr Ala Met Ala Ser His Lys
515                 520                 525
Asp Asp Glu Asp Lys Phe Phe Pro Met Ser Gly Val Met Ile Phe Gly
530                 535                 540
Lys Glu Ser Ala Gly Ala Ser Asn Thr Ala Leu Asp Asn Val Met Ile
545                 550                 555                 560
Thr Asp Glu Glu Glu Ile Lys Ala Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Arg
565                 570                 575
Phe Gly Thr Val Ala Val Asn Phe Gln Ser Ser Ser Thr Asp Pro Ala
580                 585                 590
Thr Gly Asp Val His Ala Met Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp Gln
595                 600                 605
Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His
610                 615                 620
Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu
625                 630                 635                 640
Lys Asn Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala
645                 650                 655
Asn Pro Pro Ala Glu Phe Ser Ala Thr Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr
660                 665                 670
Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln
675                 680                 685
Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Val Gln Tyr Thr Ser Asn
690                 695                 700
Tyr Ala Lys Ser Ala Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Asn Asn Gly Leu
705                 710                 715                 720
Tyr Thr Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Pro Leu
725                 730                 735
<210>  2
<211>  735
<212>  белок
<213>  Аденоассоциированный вирус 2
<400>  2
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser
1               5                   10                  15
Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro
20                  25                  30
Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro
35                  40                  45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50                  55                  60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65                  70                  75                  80
Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85                  90                  95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100                 105                 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115                 120                 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130                 135                 140
Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly
145                 150                 155                 160
Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165                 170                 175
Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro
180                 185                 190
Ala Ala Pro Ser Gly Leu Gly Thr Asn Thr Met Ala Thr Gly Ser Gly
195                 200                 205
Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser
210                 215                 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Met Gly Asp Arg Val Ile
225                 230                 235                 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245                 250                 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr
260                 265                 270
Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His
275                 280                 285
Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp
290                 295                 300
Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val
305                 310                 315                 320
Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu
325                 330                 335
Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr
340                 345                 350
Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp
355                 360                 365
Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser
370                 375                 380
Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser
385                 390                 395                 400
Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe Glu
405                 410                 415
Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg
420                 425                 430
Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr
435                 440                 445
Asn Thr Pro Ser Gly Thr Thr Thr Gln Ser Arg Leu Gln Phe Ser Gln
450                 455                 460
Ala Gly Ala Ser Asp Ile Arg Asp Gln Ser Arg Asn Trp Leu Pro Gly
465                 470                 475                 480
Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Ser Ala Asp Asn Asn
485                 490                 495
Asn Ser Glu Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly
500                 505                 510
Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys Asp
515                 520                 525
Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Gln Ser Gly Val Leu Ile Phe Gly Lys
530                 535                 540
Gln Gly Ser Glu Lys Thr Asn Val Asp Ile Glu Lys Val Met Ile Thr
545                 550                 555                 560
Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr
565                 570                 575
Gly Ser Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg Gly Asn Arg Gln Ala Ala Thr
580                 585                 590
Ala Asp Val Asn Thr Gln Gly Val Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp
595                 600                 605
Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr
610                 615                 620
Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys
625                 630                 635                 640
His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn
645                 650                 655
Pro Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr Gln
660                 665                 670
Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys
675                 680                 685
Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr
690                 695                 700
Asn Lys Ser Val Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val Tyr
705                 710                 715                 720
Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu
725                 730                 735
<210>  3
<211>  736
<212>  белок
<213>  Аденоассоциированный вирус 3A
<400>  3
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser
1               5                   10                  15
Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Val Pro Gln Pro
20                  25                  30
Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Arg Arg Gly Leu Val Leu Pro
35                  40                  45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50                  55                  60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65                  70                  75                  80
Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85                  90                  95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100                 105                 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Ile Leu Glu Pro
115                 120                 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Gly
130                 135                 140
Ala Val Asp Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Val Gly
145                 150                 155                 160
Lys Ser Gly Lys Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165                 170                 175
Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro Pro
180                 185                 190
Ala Ala Pro Thr Ser Leu Gly Ser Asn Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly
195                 200                 205
Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser
210                 215                 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile
225                 230                 235                 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245                 250                 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr
260                 265                 270
Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His
275                 280                 285
Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp
290                 295                 300
Gly Phe Arg Pro Lys Lys Leu Ser Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val
305                 310                 315                 320
Arg Gly Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu
325                 330                 335
Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr
340                 345                 350
Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp
355                 360                 365
Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser
370                 375                 380
Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser
385                 390                 395                 400
Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Thr Phe Glu
405                 410                 415
Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg
420                 425                 430
Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Asn Arg Thr
435                 440                 445
Gln Gly Thr Thr Ser Gly Thr Thr Asn Gln Ser Arg Leu Leu Phe Ser
450                 455                 460
Gln Ala Gly Pro Gln Ser Met Ser Leu Gln Ala Arg Asn Trp Leu Pro
465                 470                 475                 480
Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Leu Ser Lys Thr Ala Asn Asp Asn
485                 490                 495
Asn Asn Ser Asn Phe Pro Trp Thr Ala Ala Ser Lys Tyr His Leu Asn
500                 505                 510
Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys
515                 520                 525
Asp Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Met His Gly Asn Leu Ile Phe Gly
530                 535                 540
Lys Glu Gly Thr Thr Ala Ser Asn Ala Glu Leu Asp Asn Val Met Ile
545                 550                 555                 560
Thr Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln
565                 570                 575
Tyr Gly Thr Val Ala Asn Asn Leu Gln Ser Ser Asn Thr Ala Pro Thr
580                 585                 590
Thr Gly Thr Val Asn His Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp Gln
595                 600                 605
Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His
610                 615                 620
Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu
625                 630                 635                 640
Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Met Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala
645                 650                 655
Asn Pro Pro Thr Thr Phe Ser Pro Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr
660                 665                 670
Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln
675                 680                 685
Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn
690                 695                 700
Tyr Asn Lys Ser Val Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val
705                 710                 715                 720
Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu
725                 730                 735
<210>  4
<211>  736
<212>  белок
<213>  Аденоассоциированный вирус 3B
<400>  4
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser
1               5                   10                  15
Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Val Pro Gln Pro
20                  25                  30
Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Arg Arg Gly Leu Val Leu Pro
35                  40                  45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50                  55                  60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65                  70                  75                  80
Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85                  90                  95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100                 105                 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Ile Leu Glu Pro
115                 120                 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130                 135                 140
Pro Val Asp Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Val Gly
145                 150                 155                 160
Lys Ser Gly Lys Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165                 170                 175
Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro Pro
180                 185                 190
Ala Ala Pro Thr Ser Leu Gly Ser Asn Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly
195                 200                 205
Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser
210                 215                 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile
225                 230                 235                 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245                 250                 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr
260                 265                 270
Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His
275                 280                 285
Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp
290                 295                 300
Gly Phe Arg Pro Lys Lys Leu Ser Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val
305                 310                 315                 320
Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu
325                 330                 335
Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr
340                 345                 350
Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp
355                 360                 365
Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser
370                 375                 380
Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser
385                 390                 395                 400
Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Thr Phe Glu
405                 410                 415
Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg
420                 425                 430
Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Asn Arg Thr
435                 440                 445
Gln Gly Thr Thr Ser Gly Thr Thr Asn Gln Ser Arg Leu Leu Phe Ser
450                 455                 460
Gln Ala Gly Pro Gln Ser Met Ser Leu Gln Ala Arg Asn Trp Leu Pro
465                 470                 475                 480
Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Leu Ser Lys Thr Ala Asn Asp Asn
485                 490                 495
Asn Asn Ser Asn Phe Pro Trp Thr Ala Ala Ser Lys Tyr His Leu Asn
500                 505                 510
Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys
515                 520                 525
Asp Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Met His Gly Asn Leu Ile Phe Gly
530                 535                 540
Lys Glu Gly Thr Thr Ala Ser Asn Ala Glu Leu Asp Asn Val Met Ile
545                 550                 555                 560
Thr Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln
565                 570                 575
Tyr Gly Thr Val Ala Asn Asn Leu Gln Ser Ser Asn Thr Ala Pro Thr
580                 585                 590
Thr Arg Thr Val Asn Asp Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp Gln
595                 600                 605
Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His
610                 615                 620
Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu
625                 630                 635                 640
Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Met Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala
645                 650                 655
Asn Pro Pro Thr Thr Phe Ser Pro Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr
660                 665                 670
Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln
675                 680                 685
Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn
690                 695                 700
Tyr Asn Lys Ser Val Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val
705                 710                 715                 720
Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu
725                 730                 735
<210>  5
<211>  734
<212>  белок
<213>  Аденоассоциированный вирус 4
<400>  5
Met Thr Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser Glu
1               5                   10                  15
Gly Val Arg Glu Trp Trp Ala Leu Gln Pro Gly Ala Pro Lys Pro Lys
20                  25                  30
Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro Gly
35                  40                  45
Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro Val
50                  55                  60
Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp Gln
65                  70                  75                  80
Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala Asp
85                  90                  95
Ala Glu Phe Gln Gln Arg Leu Gln Gly Asp Thr Ser Phe Gly Gly Asn
100                 105                 110
Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro Leu
115                 120                 125
Gly Leu Val Glu Gln Ala Gly Glu Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg Pro
130                 135                 140
Leu Ile Glu Ser Pro Gln Gln Pro Asp Ser Ser Thr Gly Ile Gly Lys
145                 150                 155                 160
Lys Gly Lys Gln Pro Ala Lys Lys Lys Leu Val Phe Glu Asp Glu Thr
165                 170                 175
Gly Ala Gly Asp Gly Pro Pro Glu Gly Ser Thr Ser Gly Ala Met Ser
180                 185                 190
Asp Asp Ser Glu Met Arg Ala Ala Ala Gly Gly Ala Ala Val Glu Gly
195                 200                 205
Gly Gln Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ala Ser Gly Asp Trp His Cys
210                 215                 220
Asp Ser Thr Trp Ser Glu Gly His Val Thr Thr Thr Ser Thr Arg Thr
225                 230                 235                 240
Trp Val Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu Tyr Lys Arg Leu Gly Glu
245                 250                 255
Ser Leu Gln Ser Asn Thr Tyr Asn Gly Phe Ser Thr Pro Trp Gly Tyr
260                 265                 270
Phe Asp Phe Asn Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln
275                 280                 285
Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp Gly Met Arg Pro Lys Ala Met Arg Val
290                 295                 300
Lys Ile Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Thr Ser Asn Gly Glu
305                 310                 315                 320
Thr Thr Val Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Ile Phe Ala Asp
325                 330                 335
Ser Ser Tyr Glu Leu Pro Tyr Val Met Asp Ala Gly Gln Glu Gly Ser
340                 345                 350
Leu Pro Pro Phe Pro Asn Asp Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr
355                 360                 365
Cys Gly Leu Val Thr Gly Asn Thr Ser Gln Gln Gln Thr Asp Arg Asn
370                 375                 380
Ala Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly
385                 390                 395                 400
Asn Asn Phe Glu Ile Thr Tyr Ser Phe Glu Lys Val Pro Phe His Ser
405                 410                 415
Met Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile
420                 425                 430
Asp Gln Tyr Leu Trp Gly Leu Gln Ser Thr Thr Thr Gly Thr Thr Leu
435                 440                 445
Asn Ala Gly Thr Ala Thr Thr Asn Phe Thr Lys Leu Arg Pro Thr Asn
450                 455                 460
Phe Ser Asn Phe Lys Lys Asn Trp Leu Pro Gly Pro Ser Ile Lys Gln
465                 470                 475                 480
Gln Gly Phe Ser Lys Thr Ala Asn Gln Asn Tyr Lys Ile Pro Ala Thr
485                 490                 495
Gly Ser Asp Ser Leu Ile Lys Tyr Glu Thr His Ser Thr Leu Asp Gly
500                 505                 510
Arg Trp Ser Ala Leu Thr Pro Gly Pro Pro Met Ala Thr Ala Gly Pro
515                 520                 525
Ala Asp Ser Lys Phe Ser Asn Ser Gln Leu Ile Phe Ala Gly Pro Lys
530                 535                 540
Gln Asn Gly Asn Thr Ala Thr Val Pro Gly Thr Leu Ile Phe Thr Ser
545                 550                 555                 560
Glu Glu Glu Leu Ala Ala Thr Asn Ala Thr Asp Thr Asp Met Trp Gly
565                 570                 575
Asn Leu Pro Gly Gly Asp Gln Ser Asn Ser Asn Leu Pro Thr Val Asp
580                 585                 590
Arg Leu Thr Ala Leu Gly Ala Val Pro Gly Met Val Trp Gln Asn Arg
595                 600                 605
Asp Ile Tyr Tyr Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr Asp
610                 615                 620
Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Ile Gly Gly Phe Gly Leu Lys His
625                 630                 635                 640
Pro Pro Pro Gln Ile Phe Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn Pro
645                 650                 655
Ala Thr Thr Phe Ser Ser Thr Pro Val Asn Ser Phe Ile Thr Gln Tyr
660                 665                 670
Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Gln Ile Asp Trp Glu Ile Gln Lys Glu
675                 680                 685
Arg Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Val Gln Phe Thr Ser Asn Tyr Gly
690                 695                 700
Gln Gln Asn Ser Leu Leu Trp Ala Pro Asp Ala Ala Gly Lys Tyr Thr
705                 710                 715                 720
Glu Pro Arg Ala Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr His His Leu
725                 730
<210>  6
<211>  724
<212>  белок
<213>  Аденоассоциированный вирус 5
<400>  6
Met Ser Phe Val Asp His Pro Pro Asp Trp Leu Glu Glu Val Gly Glu
1               5                   10                  15
Gly Leu Arg Glu Phe Leu Gly Leu Glu Ala Gly Pro Pro Lys Pro Lys
20                  25                  30
Pro Asn Gln Gln His Gln Asp Gln Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro Gly
35                  40                  45
Tyr Asn Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Arg Gly Glu Pro Val
50                  55                  60
Asn Arg Ala Asp Glu Val Ala Arg Glu His Asp Ile Ser Tyr Asn Glu
65                  70                  75                  80
Gln Leu Glu Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala Asp
85                  90                  95
Ala Glu Phe Gln Glu Lys Leu Ala Asp Asp Thr Ser Phe Gly Gly Asn
100                 105                 110
Leu Gly Lys Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro Phe
115                 120                 125
Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Thr Gly Lys Arg Ile
130                 135                 140
Asp Asp His Phe Pro Lys Arg Lys Lys Ala Arg Thr Glu Glu Asp Ser
145                 150                 155                 160
Lys Pro Ser Thr Ser Ser Asp Ala Glu Ala Gly Pro Ser Gly Ser Gln
165                 170                 175
Gln Leu Gln Ile Pro Ala Gln Pro Ala Ser Ser Leu Gly Ala Asp Thr
180                 185                 190
Met Ser Ala Gly Gly Gly Gly Pro Leu Gly Asp Asn Asn Gln Gly Ala
195                 200                 205
Asp Gly Val Gly Asn Ala Ser Gly Asp Trp His Cys Asp Ser Thr Trp
210                 215                 220
Met Gly Asp Arg Val Val Thr Lys Ser Thr Arg Thr Trp Val Leu Pro
225                 230                 235                 240
Ser Tyr Asn Asn His Gln Tyr Arg Glu Ile Lys Ser Gly Ser Val Asp
245                 250                 255
Gly Ser Asn Ala Asn Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr
260                 265                 270
Phe Asp Phe Asn Arg Phe His Ser His Trp Ser Pro Arg Asp Trp Gln
275                 280                 285
Arg Leu Ile Asn Asn Tyr Trp Gly Phe Arg Pro Arg Ser Leu Arg Val
290                 295                 300
Lys Ile Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Val Gln Asp Ser Thr
305                 310                 315                 320
Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp
325                 330                 335
Asp Asp Tyr Gln Leu Pro Tyr Val Val Gly Asn Gly Thr Glu Gly Cys
340                 345                 350
Leu Pro Ala Phe Pro Pro Gln Val Phe Thr Leu Pro Gln Tyr Gly Tyr
355                 360                 365
Ala Thr Leu Asn Arg Asp Asn Thr Glu Asn Pro Thr Glu Arg Ser Ser
370                 375                 380
Phe Phe Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Lys Met Leu Arg Thr Gly Asn
385                 390                 395                 400
Asn Phe Glu Phe Thr Tyr Asn Phe Glu Glu Val Pro Phe His Ser Ser
405                 410                 415
Phe Ala Pro Ser Gln Asn Leu Phe Lys Leu Ala Asn Pro Leu Val Asp
420                 425                 430
Gln Tyr Leu Tyr Arg Phe Val Ser Thr Asn Asn Thr Gly Gly Val Gln
435                 440                 445
Phe Asn Lys Asn Leu Ala Gly Arg Tyr Ala Asn Thr Tyr Lys Asn Trp
450                 455                 460
Phe Pro Gly Pro Met Gly Arg Thr Gln Gly Trp Asn Leu Gly Ser Gly
465                 470                 475                 480
Val Asn Arg Ala Ser Val Ser Ala Phe Ala Thr Thr Asn Arg Met Glu
485                 490                 495
Leu Glu Gly Ala Ser Tyr Gln Val Pro Pro Gln Pro Asn Gly Met Thr
500                 505                 510
Asn Asn Leu Gln Gly Ser Asn Thr Tyr Ala Leu Glu Asn Thr Met Ile
515                 520                 525
Phe Asn Ser Gln Pro Ala Asn Pro Gly Thr Thr Ala Thr Tyr Leu Glu
530                 535                 540
Gly Asn Met Leu Ile Thr Ser Glu Ser Glu Thr Gln Pro Val Asn Arg
545                 550                 555                 560
Val Ala Tyr Asn Val Gly Gly Gln Met Ala Thr Asn Asn Gln Ser Ser
565                 570                 575
Thr Thr Ala Pro Ala Thr Gly Thr Tyr Asn Leu Gln Glu Ile Val Pro
580                 585                 590
Gly Ser Val Trp Met Glu Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp
595                 600                 605
Ala Lys Ile Pro Glu Thr Gly Ala His Phe His Pro Ser Pro Ala Met
610                 615                 620
Gly Gly Phe Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Met Met Leu Ile Lys Asn
625                 630                 635                 640
Thr Pro Val Pro Gly Asn Ile Thr Ser Phe Ser Asp Val Pro Val Ser
645                 650                 655
Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Thr Val Glu Met Glu
660                 665                 670
Trp Glu Leu Lys Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln
675                 680                 685
Tyr Thr Asn Asn Tyr Asn Asp Pro Gln Phe Val Asp Phe Ala Pro Asp
690                 695                 700
Ser Thr Gly Glu Tyr Arg Thr Thr Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu
705                 710                 715                 720
Thr Arg Pro Leu
<210>  7
<211>  736
<212>  белок
<213>  Аденоассоциированный вирус 6
<400>  7
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser
1               5                   10                  15
Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Asp Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro
20                  25                  30
Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro
35                  40                  45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50                  55                  60
Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65                  70                  75                  80
Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala
85                  90                  95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100                 105                 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115                 120                 125
Phe Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130                 135                 140
Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Ile Gly
145                 150                 155                 160
Lys Thr Gly Gln Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165                 170                 175
Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro Pro
180                 185                 190
Ala Thr Pro Ala Ala Val Gly Pro Thr Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly
195                 200                 205
Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ala
210                 215                 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile
225                 230                 235                 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245                 250                 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Ala Ser Thr Gly Ala Ser Asn Asp Asn His
260                 265                 270
Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe
275                 280                 285
His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn
290                 295                 300
Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln
305                 310                 315                 320
Val Lys Glu Val Thr Thr Asn Asp Gly Val Thr Thr Ile Ala Asn Asn
325                 330                 335
Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Ser Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro
340                 345                 350
Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala
355                 360                 365
Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly
370                 375                 380
Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro
385                 390                 395                 400
Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe
405                 410                 415
Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp
420                 425                 430
Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Asn Arg
435                 440                 445
Thr Gln Asn Gln Ser Gly Ser Ala Gln Asn Lys Asp Leu Leu Phe Ser
450                 455                 460
Arg Gly Ser Pro Ala Gly Met Ser Val Gln Pro Lys Asn Trp Leu Pro
465                 470                 475                 480
Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Lys Thr Asp Asn
485                 490                 495
Asn Asn Ser Asn Phe Thr Trp Thr Gly Ala Ser Lys Tyr Asn Leu Asn
500                 505                 510
Gly Arg Glu Ser Ile Ile Asn Pro Gly Thr Ala Met Ala Ser His Lys
515                 520                 525
Asp Asp Lys Asp Lys Phe Phe Pro Met Ser Gly Val Met Ile Phe Gly
530                 535                 540
Lys Glu Ser Ala Gly Ala Ser Asn Thr Ala Leu Asp Asn Val Met Ile
545                 550                 555                 560
Thr Asp Glu Glu Glu Ile Lys Ala Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Arg
565                 570                 575
Phe Gly Thr Val Ala Val Asn Leu Gln Ser Ser Ser Thr Asp Pro Ala
580                 585                 590
Thr Gly Asp Val His Val Met Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp Gln
595                 600                 605
Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His
610                 615                 620
Thr Asp Gly His Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu
625                 630                 635                 640
Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala
645                 650                 655
Asn Pro Pro Ala Glu Phe Ser Ala Thr Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr
660                 665                 670
Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln
675                 680                 685
Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Val Gln Tyr Thr Ser Asn
690                 695                 700
Tyr Ala Lys Ser Ala Asn Val Asp Phe Thr Val Asp Asn Asn Gly Leu
705                 710                 715                 720
Tyr Thr Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Pro Leu
725                 730                 735
<210>  8
<211>  737
<212>  белок
<213>  Аденоассоциированный вирус 7
<400>  8
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser
1               5                   10                  15
Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Asp Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro
20                  25                  30
Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asn Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro
35                  40                  45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50                  55                  60
Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65                  70                  75                  80
Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala
85                  90                  95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100                 105                 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115                 120                 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Ala Lys Lys Arg
130                 135                 140
Pro Val Glu Pro Ser Pro Gln Arg Ser Pro Asp Ser Ser Thr Gly Ile
145                 150                 155                 160
Gly Lys Lys Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln
165                 170                 175
Thr Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro
180                 185                 190
Pro Ala Ala Pro Ser Ser Val Gly Ser Gly Thr Val Ala Ala Gly Gly
195                 200                 205
Gly Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn
210                 215                 220
Ala Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val
225                 230                 235                 240
Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His
245                 250                 255
Leu Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Glu Thr Ala Gly Ser Thr Asn Asp Asn
260                 265                 270
Thr Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg
275                 280                 285
Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn
290                 295                 300
Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Lys Leu Arg Phe Lys Leu Phe Asn Ile
305                 310                 315                 320
Gln Val Lys Glu Val Thr Thr Asn Asp Gly Val Thr Thr Ile Ala Asn
325                 330                 335
Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Ser Asp Ser Glu Tyr Gln Leu
340                 345                 350
Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro
355                 360                 365
Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn
370                 375                 380
Gly Ser Gln Ser Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe
385                 390                 395                 400
Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Glu Phe Ser Tyr Ser
405                 410                 415
Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu
420                 425                 430
Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ala
435                 440                 445
Arg Thr Gln Ser Asn Pro Gly Gly Thr Ala Gly Asn Arg Glu Leu Gln
450                 455                 460
Phe Tyr Gln Gly Gly Pro Ser Thr Met Ala Glu Gln Ala Lys Asn Trp
465                 470                 475                 480
Leu Pro Gly Pro Cys Phe Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Leu Asp
485                 490                 495
Gln Asn Asn Asn Ser Asn Phe Ala Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His
500                 505                 510
Leu Asn Gly Arg Asn Ser Leu Val Asn Pro Gly Val Ala Met Ala Thr
515                 520                 525
His Lys Asp Asp Glu Asp Arg Phe Phe Pro Ser Ser Gly Val Leu Ile
530                 535                 540
Phe Gly Lys Thr Gly Ala Thr Asn Lys Thr Thr Leu Glu Asn Val Leu
545                 550                 555                 560
Met Thr Asn Glu Glu Glu Ile Arg Pro Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu
565                 570                 575
Glu Tyr Gly Ile Val Ser Ser Asn Leu Gln Ala Ala Asn Thr Ala Ala
580                 585                 590
Gln Thr Gln Val Val Asn Asn Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp
595                 600                 605
Gln Asn Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro
610                 615                 620
His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly
625                 630                 635                 640
Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro
645                 650                 655
Ala Asn Pro Pro Glu Val Phe Thr Pro Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile
660                 665                 670
Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu
675                 680                 685
Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser
690                 695                 700
Asn Phe Glu Lys Gln Thr Gly Val Asp Phe Ala Val Asp Ser Gln Gly
705                 710                 715                 720
Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn
725                 730                 735
Leu
<210>  9
<211>  738
<212>  белок
<213>  Аденоассоциированный вирус 8
<400>  9
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser
1               5                   10                  15
Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro
20                  25                  30
Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro
35                  40                  45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50                  55                  60
Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65                  70                  75                  80
Gln Gln Leu Gln Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala
85                  90                  95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100                 105                 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115                 120                 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130                 135                 140
Pro Val Glu Pro Ser Pro Gln Arg Ser Pro Asp Ser Ser Thr Gly Ile
145                 150                 155                 160
Gly Lys Lys Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln
165                 170                 175
Thr Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro
180                 185                 190
Pro Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Pro Asn Thr Met Ala Ala Gly Gly
195                 200                 205
Gly Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser
210                 215                 220
Ser Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val
225                 230                 235                 240
Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His
245                 250                 255
Leu Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Gly Thr Ser Gly Gly Ala Thr Asn Asp
260                 265                 270
Asn Thr Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn
275                 280                 285
Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn
290                 295                 300
Asn Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Ser Phe Lys Leu Phe Asn
305                 310                 315                 320
Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Gln Asn Glu Gly Thr Lys Thr Ile Ala
325                 330                 335
Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln
340                 345                 350
Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe
355                 360                 365
Pro Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn
370                 375                 380
Asn Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr
385                 390                 395                 400
Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Thr Tyr
405                 410                 415
Thr Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser
420                 425                 430
Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu
435                 440                 445
Ser Arg Thr Gln Thr Thr Gly Gly Thr Ala Asn Thr Gln Thr Leu Gly
450                 455                 460
Phe Ser Gln Gly Gly Pro Asn Thr Met Ala Asn Gln Ala Lys Asn Trp
465                 470                 475                 480
Leu Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Thr Gly
485                 490                 495
Gln Asn Asn Asn Ser Asn Phe Ala Trp Thr Ala Gly Thr Lys Tyr His
500                 505                 510
Leu Asn Gly Arg Asn Ser Leu Ala Asn Pro Gly Ile Ala Met Ala Thr
515                 520                 525
His Lys Asp Asp Glu Glu Arg Phe Phe Pro Ser Asn Gly Ile Leu Ile
530                 535                 540
Phe Gly Lys Gln Asn Ala Ala Arg Asp Asn Ala Asp Tyr Ser Asp Val
545                 550                 555                 560
Met Leu Thr Ser Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr
565                 570                 575
Glu Glu Tyr Gly Ile Val Ala Asp Asn Leu Gln Gln Gln Asn Thr Ala
580                 585                 590
Pro Gln Ile Gly Thr Val Asn Ser Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val
595                 600                 605
Trp Gln Asn Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile
610                 615                 620
Pro His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe
625                 630                 635                 640
Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val
645                 650                 655
Pro Ala Asp Pro Pro Thr Thr Phe Asn Gln Ser Lys Leu Asn Ser Phe
660                 665                 670
Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu
675                 680                 685
Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr
690                 695                 700
Ser Asn Tyr Tyr Lys Ser Thr Ser Val Asp Phe Ala Val Asn Thr Glu
705                 710                 715                 720
Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg
725                 730                 735
Asn Leu
<210>  10
<211>  736
<212>  белок
<213>  Аденоассоциированный вирус 9
<400>  10
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser
1               5                   10                  15
Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Gln Pro
20                  25                  30
Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro
35                  40                  45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50                  55                  60
Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65                  70                  75                  80
Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85                  90                  95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100                 105                 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro
115                 120                 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130                 135                 140
Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ala Gly Ile Gly
145                 150                 155                 160
Lys Ser Gly Ala Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165                 170                 175
Gly Asp Thr Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro Pro
180                 185                 190
Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Leu Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly
195                 200                 205
Ala Pro Val Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser Ser
210                 215                 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile
225                 230                 235                 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245                 250                 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Ser Thr Ser Gly Gly Ser Ser Asn Asp Asn
260                 265                 270
Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg
275                 280                 285
Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn
290                 295                 300
Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile
305                 310                 315                 320
Gln Val Lys Glu Val Thr Asp Asn Asn Gly Val Lys Thr Ile Ala Asn
325                 330                 335
Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Asp Tyr Gln Leu
340                 345                 350
Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Glu Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro
355                 360                 365
Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asp
370                 375                 380
Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe
385                 390                 395                 400
Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Glu
405                 410                 415
Phe Glu Asn Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu
420                 425                 430
Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser
435                 440                 445
Lys Thr Ile Asn Gly Ser Gly Gln Asn Gln Gln Thr Leu Lys Phe Ser
450                 455                 460
Val Ala Gly Pro Ser Asn Met Ala Val Gln Gly Arg Asn Tyr Ile Pro
465                 470                 475                 480
Gly Pro Ser Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Val Thr Gln Asn
485                 490                 495
Asn Asn Ser Glu Phe Ala Trp Pro Gly Ala Ser Ser Trp Ala Leu Asn
500                 505                 510
Gly Arg Asn Ser Leu Met Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys
515                 520                 525
Glu Gly Glu Asp Arg Phe Phe Pro Leu Ser Gly Ser Leu Ile Phe Gly
530                 535                 540
Lys Gln Gly Thr Gly Arg Asp Asn Val Asp Ala Asp Lys Val Met Ile
545                 550                 555                 560
Thr Asn Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Ser
565                 570                 575
Tyr Gly Gln Val Ala Thr Asn His Gln Ser Ala Gln Ala Gln Ala Gln
580                 585                 590
Thr Gly Trp Val Gln Asn Gln Gly Ile Leu Pro Gly Met Val Trp Gln
595                 600                 605
Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His
610                 615                 620
Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Met
625                 630                 635                 640
Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala
645                 650                 655
Asp Pro Pro Thr Ala Phe Asn Lys Asp Lys Leu Asn Ser Phe Ile Thr
660                 665                 670
Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln
675                 680                 685
Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn
690                 695                 700
Tyr Tyr Lys Ser Asn Asn Val Glu Phe Ala Val Asn Thr Glu Gly Val
705                 710                 715                 720
Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu
725                 730                 735
<210>  11
<211>  738
<212>  белок
<213>  Аденоассоциированный вирус 10
<400>  11
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser
1               5                   10                  15
Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Asp Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro
20                  25                  30
Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro
35                  40                  45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50                  55                  60
Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65                  70                  75                  80
Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala
85                  90                  95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100                 105                 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115                 120                 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130                 135                 140
Pro Val Glu Pro Ser Pro Gln Arg Ser Pro Asp Ser Ser Thr Gly Ile
145                 150                 155                 160
Gly Lys Lys Gly Gln Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln
165                 170                 175
Thr Gly Glu Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro
180                 185                 190
Pro Ala Gly Pro Ser Gly Leu Gly Ser Gly Thr Met Ala Ala Gly Gly
195                 200                 205
Gly Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser
210                 215                 220
Ser Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val
225                 230                 235                 240
Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His
245                 250                 255
Leu Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Gly Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Asp
260                 265                 270
Asn Thr Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn
275                 280                 285
Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn
290                 295                 300
Asn Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Ser Phe Lys Leu Phe Asn
305                 310                 315                 320
Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Gln Asn Glu Gly Thr Lys Thr Ile Ala
325                 330                 335
Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln
340                 345                 350
Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe
355                 360                 365
Pro Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn
370                 375                 380
Asn Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr
385                 390                 395                 400
Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Glu Phe Ser Tyr
405                 410                 415
Thr Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser
420                 425                 430
Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu
435                 440                 445
Ser Arg Thr Gln Ser Thr Gly Gly Thr Gln Gly Thr Gln Gln Leu Leu
450                 455                 460
Phe Ser Gln Ala Gly Pro Ala Asn Met Ser Ala Gln Ala Lys Asn Trp
465                 470                 475                 480
Leu Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Leu Ser
485                 490                 495
Gln Asn Asn Asn Ser Asn Phe Ala Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His
500                 505                 510
Leu Asn Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Val Ala Met Ala Thr
515                 520                 525
His Lys Asp Asp Glu Glu Arg Phe Phe Pro Ser Ser Gly Val Leu Met
530                 535                 540
Phe Gly Lys Gln Gly Ala Gly Arg Asp Asn Val Asp Tyr Ser Ser Val
545                 550                 555                 560
Met Leu Thr Ser Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr
565                 570                 575
Glu Gln Tyr Gly Val Val Ala Asp Asn Leu Gln Gln Ala Asn Thr Gly
580                 585                 590
Pro Ile Val Gly Asn Val Asn Ser Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val
595                 600                 605
Trp Gln Asn Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile
610                 615                 620
Pro His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe
625                 630                 635                 640
Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val
645                 650                 655
Pro Ala Asp Pro Pro Thr Thr Phe Ser Gln Ala Lys Leu Ala Ser Phe
660                 665                 670
Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu
675                 680                 685
Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr
690                 695                 700
Ser Asn Tyr Tyr Lys Ser Thr Asn Val Asp Phe Ala Val Asn Thr Glu
705                 710                 715                 720
Gly Thr Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg
725                 730                 735
Asn Leu
<210>  12
<211>  738
<212>  белок
<213>  Аденоассоциированный вирус rh10
<400>  12
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser
1               5                   10                  15
Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro
20                  25                  30
Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro
35                  40                  45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50                  55                  60
Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65                  70                  75                  80
Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala
85                  90                  95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100                 105                 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115                 120                 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130                 135                 140
Pro Val Glu Pro Ser Pro Gln Arg Ser Pro Asp Ser Ser Thr Gly Ile
145                 150                 155                 160
Gly Lys Lys Gly Gln Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln
165                 170                 175
Thr Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro
180                 185                 190
Pro Ala Gly Pro Ser Gly Leu Gly Ser Gly Thr Met Ala Ala Gly Gly
195                 200                 205
Gly Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser
210                 215                 220
Ser Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Gly Val
225                 230                 235                 240
Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His
245                 250                 255
Leu Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Gly Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Asp
260                 265                 270
Asn Thr Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn
275                 280                 285
Arg Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn
290                 295                 300
Asn Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Ser Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn
305                 310                 315                 320
Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Gln Asn Glu Gly Thr Lys Thr Ile Ala
325                 330                 335
Asn Asn Leu Thr Ser Thr Ile Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln
340                 345                 350
Leu Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe
355                 360                 365
Pro Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn
370                 375                 380
Asn Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr
385                 390                 395                 400
Phe Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Glu Phe Ser Tyr
405                 410                 415
Gln Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser
420                 425                 430
Leu Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu
435                 440                 445
Ser Arg Thr Gln Ser Thr Gly Gly Thr Ala Gly Thr Gln Gln Leu Leu
450                 455                 460
Phe Ser Gln Ala Gly Pro Asn Asn Met Ser Ala Gln Ala Lys Asn Trp
465                 470                 475                 480
Leu Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Leu Ser
485                 490                 495
Gln Asn Asp Asn Ser Asn Phe Ala Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His
500                 505                 510
Leu Asn Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Val Ala Met Ala Thr
515                 520                 525
His Lys Asp Asp Glu Glu Arg Phe Phe Pro Ser Ser Gly Val Leu Met
530                 535                 540
Phe Gly Lys Gln Gly Ala Gly Lys Asp Asn Val Asp Tyr Ser Ser Val
545                 550                 555                 560
Met Leu Thr Ser Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr
565                 570                 575
Glu Gln Tyr Gly Val Val Ala Asp Asn Leu Gln Gln Gln Asn Ala Ala
580                 585                 590
Pro Ile Val Gly Ala Val Asn Ser Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val
595                 600                 605
Trp Gln Asn Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile
610                 615                 620
Pro His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe
625                 630                 635                 640
Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val
645                 650                 655
Pro Ala Asp Pro Pro Thr Thr Phe Ser Gln Ala Lys Leu Ala Ser Phe
660                 665                 670
Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu
675                 680                 685
Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr
690                 695                 700
Ser Asn Tyr Tyr Lys Ser Thr Asn Val Asp Phe Ala Val Asn Thr Asp
705                 710                 715                 720
Gly Thr Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg
725                 730                 735
Asn Leu
<210>  13
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  гетерологичная пептидная вставка
<400>  13
Gln Ala Asp Thr Thr Lys Asn
1               5
<210>  14
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  гетерологичная пептидная вставка
<400>  14
Ile Ser Asp Gln Thr Lys His
1               5
<210>  15
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  гетерологичная пептидная вставка
<400>  15
Ala Ser Asp Ser Thr Lys Ala
1               5
<210>  16
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  гетерологичная пептидная вставка
<400>  16
Asn Gln Asp Tyr Thr Lys Thr
1               5
<210>  17
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  гетерологичная пептидная вставка
<400>  17
His Asp Ile Thr Lys Asn Ile
1               5
<210>  18
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  гетерологичная пептидная вставка
<400>  18
His Pro Asp Thr Thr Lys Asn
1               5
<210>  19
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  гетерологичная пептидная вставка
<400>  19
His Gln Asp Thr Thr Lys Asn
1               5
<210>  20
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  гетерологичная пептидная вставка
<400>  20
Asn Lys Thr Thr Asn Lys Asp
1               5
<210>  21
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  гетерологичная пептидная вставка
<400>  21
Ile Ser Asn Glu Asn Glu His
1               5
<210>  22
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  гетерологичная пептидная вставка
<400>  22
Gln Ala Asn Ala Asn Glu Asn
1               5
<210>  23
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  гетерологичная пептидная вставка
<400>  23
Gly Lys Ser Lys Val Ile Asp
1               5
<210>  24
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  гетерологичная пептидная вставка
<400>  24
Thr Asn Arg Thr Ser Pro Asp
1               5
<210>  25
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  гетерологичная пептидная вставка
<400>  25
Pro Asn Ser Thr His Gly Ser
1               5
<210>  26
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  гетерологичная пептидная вставка
<400>  26
Lys Asp Arg Ala Pro Ser Thr
1               5
<210>  27
<211>  10
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  гетерологичная пептидная вставка
<400>  27
Leu Ala Gln Ala Asp Thr Thr Lys Asn Ala
1               5                   10
<210>  28
<211>  10
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  гетерологичная пептидная вставка
<400>  28
Leu Ala Ile Ser Asp Gln Thr Lys His Ala
1               5                   10
<210>  29
<211>  10
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  гетерологичная пептидная вставка
<400>  29
Leu Gly Ile Ser Asp Gln Thr Lys His Ala
1               5                   10
<210>  30
<211>  10
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  гетерологичная пептидная вставка
<400>  30
Leu Ala Ala Ser Asp Ser Thr Lys Ala Ala
1               5                   10
<210>  31
<211>  10
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  гетерологичная пептидная вставка
<400>  31
Leu Ala Asn Gln Asp Tyr Thr Lys Thr Ala
1               5                   10
<210>  32
<211>  10
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  гетерологичная пептидная вставка
<400>  32
Leu Ala His Asp Ile Thr Lys Asn Ile Ala
1               5                   10
<210>  33
<211>  10
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  гетерологичная пептидная вставка
<400>  33
Leu Ala His Pro Asp Thr Thr Lys Asn Ala
1               5                   10
<210>  34
<211>  10
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  гетерологичная пептидная вставка
<400>  34
Leu Ala His Gln Asp Thr Thr Lys Asn Ala
1               5                   10
<210>  35
<211>  10
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  гетерологичная пептидная вставка
<400>  35
Leu Ala Asn Lys Thr Thr Asn Lys Asp Ala
1               5                   10
<210>  36
<211>  10
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  гетерологичная пептидная вставка
<400>  36
Leu Pro Ile Ser Asn Glu Asn Glu His Ala
1               5                   10
<210>  37
<211>  10
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  гетерологичная пептидная вставка
<400>  37
Leu Pro Gln Ala Asn Ala Asn Glu Asn Ala
1               5                   10
<210>  38
<211>  10
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  гетерологичная пептидная вставка
<400>  38
Leu Ala Gly Lys Ser Lys Val Ile Asp Ala
1               5                   10
<210>  39
<211>  10
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  гетерологичная пептидная вставка
<400>  39
Leu Ala Thr Asn Arg Thr Ser Pro Asp Ala
1               5                   10
<210>  40
<211>  10
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  гетерологичная пептидная вставка
<400>  40
Leu Ala Pro Asn Ser Thr His Gly Ser Ala
1               5                   10
<210>  41
<211>  10
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  гетерологичная пептидная вставка
<400>  41
Leu Ala Lys Asp Arg Ala Pro Ser Thr Ala
1               5                   10
<210>  42
<211>  745
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант капсида AAV
<400>  42
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser
1               5                   10                  15
Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro
20                  25                  30
Lys Ala Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro
35                  40                  45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50                  55                  60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65                  70                  75                  80
Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85                  90                  95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100                 105                 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115                 120                 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130                 135                 140
Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly
145                 150                 155                 160
Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165                 170                 175
Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro
180                 185                 190
Ala Ala Pro Ser Gly Leu Gly Thr Asn Thr Met Ala Thr Gly Ser Gly
195                 200                 205
Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser
210                 215                 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Met Gly Asp Arg Val Ile
225                 230                 235                 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245                 250                 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr
260                 265                 270
Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His
275                 280                 285
Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp
290                 295                 300
Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val
305                 310                 315                 320
Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu
325                 330                 335
Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr
340                 345                 350
Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp
355                 360                 365
Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser
370                 375                 380
Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser
385                 390                 395                 400
Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe Glu
405                 410                 415
Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg
420                 425                 430
Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr
435                 440                 445
Asn Thr Pro Ser Gly Thr Thr Thr Gln Ser Arg Leu Gln Phe Ser Gln
450                 455                 460
Ala Gly Ala Ser Asp Ile Arg Asp Gln Ser Arg Asn Trp Leu Pro Gly
465                 470                 475                 480
Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Ser Ala Asp Asn Asn
485                 490                 495
Asn Ser Glu Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly
500                 505                 510
Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys Asp
515                 520                 525
Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Gln Ser Gly Val Leu Ile Phe Gly Lys
530                 535                 540
Gln Gly Ser Glu Lys Thr Asn Val Asp Ile Glu Lys Val Met Ile Thr
545                 550                 555                 560
Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr
565                 570                 575
Gly Ser Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg Gly Asn Leu Ala Ile Ser Asp
580                 585                 590
Gln Thr Lys His Ala Arg Gln Ala Ala Thr Ala Asp Val Asn Thr Gln
595                 600                 605
Gly Val Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln
610                 615                 620
Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His Pro
625                 630                 635                 640
Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile
645                 650                 655
Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn Pro Ser Thr Thr Phe Ser
660                 665                 670
Ala Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val
675                 680                 685
Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp
690                 695                 700
Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr Asn Lys Ser Val Asn Val
705                 710                 715                 720
Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile
725                 730                 735
Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu
740                 745
<210>  43
<211>  745
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант капсида AAV
<400>  43
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser
1               5                   10                  15
Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro
20                  25                  30
Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro
35                  40                  45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50                  55                  60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65                  70                  75                  80
Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85                  90                  95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100                 105                 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115                 120                 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130                 135                 140
Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly
145                 150                 155                 160
Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165                 170                 175
Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro
180                 185                 190
Ala Ala Pro Ser Gly Leu Gly Thr Asn Thr Met Ala Thr Gly Ser Gly
195                 200                 205
Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser
210                 215                 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Met Gly Asp Arg Val Ile
225                 230                 235                 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245                 250                 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr
260                 265                 270
Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His
275                 280                 285
Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp
290                 295                 300
Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Lys Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val
305                 310                 315                 320
Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu
325                 330                 335
Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr
340                 345                 350
Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp
355                 360                 365
Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser
370                 375                 380
Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser
385                 390                 395                 400
Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe Glu
405                 410                 415
Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg
420                 425                 430
Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr
435                 440                 445
Asp Thr Pro Ser Gly Thr Thr Thr Gln Ser Arg Leu Gln Phe Ser Gln
450                 455                 460
Ala Gly Ala Ser Asp Ile Arg Asn Gln Ser Arg Asn Trp Leu Pro Gly
465                 470                 475                 480
Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Ser Ala Asp Asn Asn
485                 490                 495
Asn Ser Glu Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly
500                 505                 510
Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys Asp
515                 520                 525
Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Gln Ser Gly Val Leu Ile Phe Gly Lys
530                 535                 540
Gln Gly Ser Glu Lys Thr Ser Val Asp Ile Glu Lys Val Met Ile Thr
545                 550                 555                 560
Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr
565                 570                 575
Gly Ser Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg Gly Asn Leu Ala Ile Ser Asp
580                 585                 590
Gln Thr Lys His Ala Arg Gln Ala Ala Thr Ala Asp Val Asn Thr Gln
595                 600                 605
Gly Val Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln
610                 615                 620
Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His Pro
625                 630                 635                 640
Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile
645                 650                 655
Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn Pro Ser Thr Thr Phe Ser
660                 665                 670
Ala Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val
675                 680                 685
Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp
690                 695                 700
Asn Pro Glu Val Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr Asn Lys Ser Val Asn Val
705                 710                 715                 720
Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile
725                 730                 735
Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Gln
740                 745
<210>  44
<211>  745
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант капсида AAV
<400>  44
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser
1               5                   10                  15
Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro
20                  25                  30
Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro
35                  40                  45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50                  55                  60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65                  70                  75                  80
Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85                  90                  95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100                 105                 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115                 120                 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130                 135                 140
Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly
145                 150                 155                 160
Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165                 170                 175
Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro
180                 185                 190
Ala Ala Pro Ser Gly Leu Gly Thr Asn Thr Met Ala Thr Gly Ser Gly
195                 200                 205
Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser
210                 215                 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Met Gly Asp Arg Val Ile
225                 230                 235                 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245                 250                 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr
260                 265                 270
Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His
275                 280                 285
Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp
290                 295                 300
Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val
305                 310                 315                 320
Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu
325                 330                 335
Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr
340                 345                 350
Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp
355                 360                 365
Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser
370                 375                 380
Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser
385                 390                 395                 400
Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe Glu
405                 410                 415
Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg
420                 425                 430
Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr
435                 440                 445
Asn Thr Pro Ser Gly Thr Thr Thr Gln Ser Arg Leu Gln Phe Ser Gln
450                 455                 460
Ala Gly Ala Ser Asp Ile Arg Asp Gln Ser Arg Asn Trp Leu Pro Gly
465                 470                 475                 480
Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Ser Ala Asp Asn Asn
485                 490                 495
Asn Ser Glu Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly
500                 505                 510
Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys Asp
515                 520                 525
Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Gln Ser Gly Val Leu Ile Phe Gly Lys
530                 535                 540
Gln Gly Ser Glu Lys Thr Asn Val Asp Ile Glu Lys Val Met Ile Thr
545                 550                 555                 560
Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr
565                 570                 575
Gly Ser Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg Gly Asn Leu Gly Ile Ser Asp
580                 585                 590
Gln Thr Lys His Ala Arg Gln Ala Ala Thr Ala Asp Val Asn Thr Gln
595                 600                 605
Gly Val Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln
610                 615                 620
Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His Pro
625                 630                 635                 640
Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile
645                 650                 655
Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn Pro Ser Thr Thr Phe Ser
660                 665                 670
Ala Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val
675                 680                 685
Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp
690                 695                 700
Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr Asn Lys Ser Val Asn Val
705                 710                 715                 720
Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile
725                 730                 735
Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu
740                 745
<210>  45
<211>  745
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант капсида AAV
<400>  45
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser
1               5                   10                  15
Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro
20                  25                  30
Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro
35                  40                  45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50                  55                  60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65                  70                  75                  80
Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85                  90                  95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100                 105                 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115                 120                 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130                 135                 140
Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly
145                 150                 155                 160
Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165                 170                 175
Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro
180                 185                 190
Ala Ala Pro Ser Gly Leu Gly Thr Asn Thr Met Ala Thr Gly Ser Gly
195                 200                 205
Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser
210                 215                 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Met Gly Asp Arg Val Ile
225                 230                 235                 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245                 250                 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr
260                 265                 270
Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His
275                 280                 285
Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp
290                 295                 300
Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val
305                 310                 315                 320
Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu
325                 330                 335
Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr
340                 345                 350
Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp
355                 360                 365
Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser
370                 375                 380
Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser
385                 390                 395                 400
Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe Glu
405                 410                 415
Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg
420                 425                 430
Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr
435                 440                 445
Asn Thr Pro Ser Gly Thr Thr Thr Gln Ser Arg Leu Gln Phe Ser Gln
450                 455                 460
Ala Gly Ala Ser Asp Ile Arg Asp Gln Ser Arg Asn Trp Leu Pro Gly
465                 470                 475                 480
Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Ser Ala Asp Asn Asn
485                 490                 495
Asn Ser Glu Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly
500                 505                 510
Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys Asp
515                 520                 525
Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Gln Ser Gly Val Leu Ile Phe Gly Lys
530                 535                 540
Gln Gly Ser Glu Lys Thr Asn Val Asp Ile Glu Lys Val Met Ile Thr
545                 550                 555                 560
Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr
565                 570                 575
Gly Ser Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg Gly Asn Leu Ala Gln Ala Asp
580                 585                 590
Thr Thr Lys Asn Ala Arg Gln Ala Ala Thr Ala Asp Val Asn Thr Gln
595                 600                 605
Gly Val Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln
610                 615                 620
Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His Pro
625                 630                 635                 640
Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile
645                 650                 655
Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn Pro Ser Thr Thr Phe Ser
660                 665                 670
Ala Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val
675                 680                 685
Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp
690                 695                 700
Asn Pro Glu Val Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr Asn Lys Ser Val Asn Val
705                 710                 715                 720
Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile
725                 730                 735
Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu
740                 745
<210>  46
<211>  745
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант капсида AAV
<400>  46
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser
1               5                   10                  15
Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro
20                  25                  30
Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro
35                  40                  45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50                  55                  60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65                  70                  75                  80
Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85                  90                  95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100                 105                 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115                 120                 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130                 135                 140
Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly
145                 150                 155                 160
Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165                 170                 175
Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro
180                 185                 190
Ala Ala Pro Ser Gly Leu Gly Thr Asn Thr Met Ala Thr Gly Ser Gly
195                 200                 205
Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser
210                 215                 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Met Gly Asp Arg Val Ile
225                 230                 235                 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245                 250                 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr
260                 265                 270
Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His
275                 280                 285
Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp
290                 295                 300
Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val
305                 310                 315                 320
Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu
325                 330                 335
Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr
340                 345                 350
Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp
355                 360                 365
Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser
370                 375                 380
Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser
385                 390                 395                 400
Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe Glu
405                 410                 415
Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg
420                 425                 430
Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr
435                 440                 445
Asn Thr Pro Ser Gly Thr Thr Thr Gln Ser Arg Leu Gln Phe Ser Gln
450                 455                 460
Ala Gly Ala Ser Asp Ile Arg Asp Gln Ser Arg Asn Trp Leu Pro Gly
465                 470                 475                 480
Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Ser Ala Asp Asn Asn
485                 490                 495
Asn Ser Glu Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly
500                 505                 510
Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys Asp
515                 520                 525
Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Gln Ser Gly Val Leu Ile Phe Gly Lys
530                 535                 540
Gln Gly Ser Glu Lys Thr Asn Val Asp Ile Glu Lys Val Met Ile Thr
545                 550                 555                 560
Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr
565                 570                 575
Gly Ser Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg Gly Asn Leu Ala His Asp Ile
580                 585                 590
Thr Lys Asn Ile Ala Arg Gln Ala Ala Thr Ala Asp Val Asn Thr Gln
595                 600                 605
Gly Val Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln
610                 615                 620
Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His Pro
625                 630                 635                 640
Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile
645                 650                 655
Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn Pro Ser Thr Thr Phe Ser
660                 665                 670
Ala Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val
675                 680                 685
Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp
690                 695                 700
Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr Asn Lys Ser Val Asn Val
705                 710                 715                 720
Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile
725                 730                 735
Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu
740                 745
<210>  47
<211>  745
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант капсида AAV
<400>  47
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser
1               5                   10                  15
Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro
20                  25                  30
Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro
35                  40                  45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50                  55                  60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65                  70                  75                  80
Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85                  90                  95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100                 105                 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115                 120                 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130                 135                 140
Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly
145                 150                 155                 160
Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165                 170                 175
Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro
180                 185                 190
Ala Ala Pro Ser Gly Leu Gly Thr Asn Thr Met Ala Thr Gly Ser Gly
195                 200                 205
Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser
210                 215                 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Met Gly Asp Arg Val Ile
225                 230                 235                 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245                 250                 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr
260                 265                 270
Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His
275                 280                 285
Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp
290                 295                 300
Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val
305                 310                 315                 320
Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu
325                 330                 335
Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr
340                 345                 350
Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp
355                 360                 365
Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser
370                 375                 380
Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser
385                 390                 395                 400
Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe Glu
405                 410                 415
Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg
420                 425                 430
Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr
435                 440                 445
Asn Thr Pro Ser Gly Thr Thr Thr Gln Ser Arg Leu Gln Phe Ser Gln
450                 455                 460
Ala Gly Ala Ser Asp Ile Arg Asp Gln Ser Arg Asn Trp Leu Pro Gly
465                 470                 475                 480
Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Ser Ala Asp Asn Asn
485                 490                 495
Asn Ser Glu Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly
500                 505                 510
Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys Asp
515                 520                 525
Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Gln Ser Gly Val Leu Ile Phe Gly Lys
530                 535                 540
Gln Gly Ser Glu Lys Thr Asn Val Asp Ile Glu Lys Val Met Ile Thr
545                 550                 555                 560
Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr
565                 570                 575
Gly Ser Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg Gly Asn Leu Ala Asn Gln Asp
580                 585                 590
Tyr Thr Lys Thr Ala Arg Gln Ala Ala Thr Ala Asp Val Asn Thr Gln
595                 600                 605
Gly Val Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln
610                 615                 620
Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His Pro
625                 630                 635                 640
Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile
645                 650                 655
Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn Pro Ser Thr Thr Phe Ser
660                 665                 670
Ala Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val
675                 680                 685
Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp
690                 695                 700
Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr Asn Lys Ser Val Asn Val
705                 710                 715                 720
Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile
725                 730                 735
Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu
740                 745
<210>  48
<211>  745
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант капсида AAV
<400>  48
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser
1               5                   10                  15
Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro
20                  25                  30
Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro
35                  40                  45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50                  55                  60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65                  70                  75                  80
Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85                  90                  95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100                 105                 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115                 120                 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130                 135                 140
Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly
145                 150                 155                 160
Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165                 170                 175
Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro
180                 185                 190
Ala Ala Pro Ser Gly Leu Gly Thr Asn Thr Met Ala Thr Gly Ser Gly
195                 200                 205
Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser
210                 215                 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Met Gly Asp Arg Val Ile
225                 230                 235                 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245                 250                 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr
260                 265                 270
Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His
275                 280                 285
Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp
290                 295                 300
Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val
305                 310                 315                 320
Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu
325                 330                 335
Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr
340                 345                 350
Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp
355                 360                 365
Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser
370                 375                 380
Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser
385                 390                 395                 400
Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe Glu
405                 410                 415
Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg
420                 425                 430
Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr
435                 440                 445
Asn Thr Pro Ser Gly Thr Thr Thr Gln Ser Arg Leu Gln Phe Ser Gln
450                 455                 460
Ala Gly Ala Ser Asp Ile Arg Asp Gln Ser Arg Asn Trp Leu Pro Gly
465                 470                 475                 480
Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Ser Ala Asp Asn Asn
485                 490                 495
Asn Ser Glu Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly
500                 505                 510
Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys Asp
515                 520                 525
Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Gln Ser Gly Val Leu Ile Phe Gly Lys
530                 535                 540
Gln Gly Ser Glu Lys Thr Asn Val Asp Ile Glu Lys Val Met Ile Thr
545                 550                 555                 560
Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr
565                 570                 575
Gly Ser Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg Gly Asn Leu Ala Pro Asn Ser
580                 585                 590
Thr His Gly Ser Ala Arg Gln Ala Ala Thr Ala Asp Val Asn Thr Gln
595                 600                 605
Gly Val Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln
610                 615                 620
Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His Pro
625                 630                 635                 640
Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile
645                 650                 655
Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn Pro Ser Thr Thr Phe Ser
660                 665                 670
Ala Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val
675                 680                 685
Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp
690                 695                 700
Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr Asn Lys Ser Val Asn Val
705                 710                 715                 720
Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile
725                 730                 735
Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu
740                 745
<210>  49
<211>  745
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант капсида AAV
<400>  49
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser
1               5                   10                  15
Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro
20                  25                  30
Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro
35                  40                  45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50                  55                  60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65                  70                  75                  80
Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85                  90                  95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100                 105                 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115                 120                 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130                 135                 140
Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly
145                 150                 155                 160
Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165                 170                 175
Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro
180                 185                 190
Ala Ala Pro Ser Gly Leu Gly Thr Asn Thr Met Ala Thr Gly Ser Gly
195                 200                 205
Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser
210                 215                 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Met Gly Asp Arg Val Ile
225                 230                 235                 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245                 250                 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr
260                 265                 270
Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His
275                 280                 285
Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp
290                 295                 300
Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val
305                 310                 315                 320
Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu
325                 330                 335
Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr
340                 345                 350
Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp
355                 360                 365
Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser
370                 375                 380
Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser
385                 390                 395                 400
Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe Glu
405                 410                 415
Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg
420                 425                 430
Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr
435                 440                 445
Asn Thr Pro Ser Gly Thr Thr Thr Gln Ser Arg Leu Gln Phe Ser Gln
450                 455                 460
Ala Gly Ala Ser Asp Ile Arg Asp Gln Ser Arg Asn Trp Leu Pro Gly
465                 470                 475                 480
Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Ser Ala Asp Asn Asn
485                 490                 495
Asn Ser Glu Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly
500                 505                 510
Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys Asp
515                 520                 525
Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Gln Ser Gly Val Leu Ile Phe Gly Lys
530                 535                 540
Gln Gly Ser Glu Lys Thr Asn Val Asp Ile Glu Lys Val Met Ile Thr
545                 550                 555                 560
Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr
565                 570                 575
Gly Ser Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg Gly Asn Leu Ala Asn Lys Thr
580                 585                 590
Thr Asn Lys Asp Ala Arg Gln Ala Ala Thr Ala Asp Val Asn Thr Gln
595                 600                 605
Gly Val Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln
610                 615                 620
Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His Pro
625                 630                 635                 640
Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile
645                 650                 655
Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn Pro Ser Thr Thr Phe Ser
660                 665                 670
Ala Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val
675                 680                 685
Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp
690                 695                 700
Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr Asn Lys Ser Val Asn Val
705                 710                 715                 720
Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile
725                 730                 735
Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu
740                 745
<210>  50
<211>  745
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант капсида AAV
<400>  50
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser
1               5                   10                  15
Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro
20                  25                  30
Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro
35                  40                  45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50                  55                  60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65                  70                  75                  80
Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85                  90                  95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100                 105                 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115                 120                 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130                 135                 140
Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly
145                 150                 155                 160
Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165                 170                 175
Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro
180                 185                 190
Ala Ala Pro Ser Gly Leu Gly Thr Asn Thr Met Ala Thr Gly Ser Gly
195                 200                 205
Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser
210                 215                 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Met Gly Asp Arg Val Ile
225                 230                 235                 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245                 250                 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr
260                 265                 270
Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His
275                 280                 285
Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp
290                 295                 300
Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val
305                 310                 315                 320
Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu
325                 330                 335
Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr
340                 345                 350
Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp
355                 360                 365
Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser
370                 375                 380
Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser
385                 390                 395                 400
Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe Glu
405                 410                 415
Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg
420                 425                 430
Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr
435                 440                 445
Asn Thr Pro Ser Gly Thr Thr Thr Gln Ser Arg Leu Gln Phe Ser Gln
450                 455                 460
Ala Gly Ala Ser Asp Ile Arg Asp Gln Ser Arg Asn Trp Leu Pro Gly
465                 470                 475                 480
Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Ser Ala Asp Asn Asn
485                 490                 495
Asn Ser Glu Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly
500                 505                 510
Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys Asp
515                 520                 525
Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Gln Ser Gly Val Leu Ile Phe Gly Lys
530                 535                 540
Gln Gly Ser Glu Lys Thr Asn Val Asp Ile Glu Lys Val Met Ile Thr
545                 550                 555                 560
Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr
565                 570                 575
Gly Ser Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg Gly Asn Leu Ala Thr Asn Arg
580                 585                 590
Thr Ser Pro Asp Ala Arg Gln Ala Ala Thr Ala Asp Val Asn Thr Gln
595                 600                 605
Gly Val Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln
610                 615                 620
Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His Pro
625                 630                 635                 640
Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile
645                 650                 655
Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn Pro Ser Thr Thr Phe Ser
660                 665                 670
Ala Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val
675                 680                 685
Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp
690                 695                 700
Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr Asn Lys Ser Val Asn Val
705                 710                 715                 720
Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile
725                 730                 735
Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu
740                 745
<210>  51
<211>  745
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант капсида AAV
<400>  51
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser
1               5                   10                  15
Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro
20                  25                  30
Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro
35                  40                  45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50                  55                  60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65                  70                  75                  80
Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85                  90                  95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100                 105                 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115                 120                 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130                 135                 140
Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly
145                 150                 155                 160
Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165                 170                 175
Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro
180                 185                 190
Ala Ala Pro Ser Gly Leu Gly Thr Asn Thr Met Ala Thr Gly Ser Gly
195                 200                 205
Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser
210                 215                 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Met Gly Asp Arg Val Ile
225                 230                 235                 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245                 250                 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr
260                 265                 270
Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His
275                 280                 285
Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp
290                 295                 300
Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val
305                 310                 315                 320
Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu
325                 330                 335
Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr
340                 345                 350
Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp
355                 360                 365
Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser
370                 375                 380
Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser
385                 390                 395                 400
Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe Glu
405                 410                 415
Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg
420                 425                 430
Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr
435                 440                 445
Asn Thr Pro Ser Gly Thr Thr Thr Gln Ser Arg Leu Gln Phe Ser Gln
450                 455                 460
Ala Gly Ala Ser Asp Ile Arg Asp Gln Ser Arg Asn Trp Leu Pro Gly
465                 470                 475                 480
Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Ser Ala Asp Asn Asn
485                 490                 495
Asn Ser Glu Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly
500                 505                 510
Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys Asp
515                 520                 525
Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Gln Ser Gly Val Leu Ile Phe Gly Lys
530                 535                 540
Gln Gly Ser Glu Lys Thr Asn Val Asp Ile Glu Lys Val Met Ile Thr
545                 550                 555                 560
Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr
565                 570                 575
Gly Ser Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg Gly Asn Leu Ala Gly Lys Ser
580                 585                 590
Lys Val Ile Asp Ala Arg Gln Ala Ala Thr Ala Asp Val Asn Thr Gln
595                 600                 605
Gly Val Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln
610                 615                 620
Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His Pro
625                 630                 635                 640
Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile
645                 650                 655
Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn Pro Ser Thr Thr Phe Ser
660                 665                 670
Ala Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val
675                 680                 685
Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp
690                 695                 700
Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr Asn Lys Ser Val Asn Val
705                 710                 715                 720
Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile
725                 730                 735
Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu
740                 745
<210>  52
<211>  745
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант капсида AAV
<400>  52
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser
1               5                   10                  15
Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro
20                  25                  30
Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro
35                  40                  45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50                  55                  60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65                  70                  75                  80
Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85                  90                  95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100                 105                 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115                 120                 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130                 135                 140
Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly
145                 150                 155                 160
Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165                 170                 175
Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro
180                 185                 190
Ala Ala Pro Ser Gly Leu Gly Thr Asn Thr Met Ala Thr Gly Ser Gly
195                 200                 205
Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser
210                 215                 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Met Gly Asp Arg Val Ile
225                 230                 235                 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245                 250                 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr
260                 265                 270
Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His
275                 280                 285
Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp
290                 295                 300
Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val
305                 310                 315                 320
Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu
325                 330                 335
Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr
340                 345                 350
Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp
355                 360                 365
Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser
370                 375                 380
Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser
385                 390                 395                 400
Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe Glu
405                 410                 415
Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg
420                 425                 430
Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr
435                 440                 445
Asn Thr Pro Ser Gly Thr Thr Thr Gln Ser Arg Leu Gln Phe Ser Gln
450                 455                 460
Ala Gly Ala Ser Asp Ile Arg Asp Gln Ser Arg Asn Trp Leu Pro Gly
465                 470                 475                 480
Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Ser Ala Asp Asn Asn
485                 490                 495
Asn Ser Glu Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly
500                 505                 510
Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys Asp
515                 520                 525
Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Gln Ser Gly Val Leu Ile Phe Gly Lys
530                 535                 540
Gln Gly Ser Glu Lys Thr Asn Val Asp Ile Glu Lys Val Met Ile Thr
545                 550                 555                 560
Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr
565                 570                 575
Gly Ser Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg Gly Asn Leu Ala Ala Ser Asp
580                 585                 590
Ser Thr Lys Ala Ala Arg Gln Ala Ala Thr Ala Asp Val Asn Thr Gln
595                 600                 605
Gly Val Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln
610                 615                 620
Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His Pro
625                 630                 635                 640
Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile
645                 650                 655
Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn Pro Ser Thr Thr Phe Ser
660                 665                 670
Ala Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val
675                 680                 685
Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp
690                 695                 700
Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr Asn Lys Ser Val Asn Val
705                 710                 715                 720
Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile
725                 730                 735
Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu
740                 745
<210>  53
<211>  745
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант капсида AAV
<400>  53
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser
1               5                   10                  15
Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro
20                  25                  30
Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro
35                  40                  45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50                  55                  60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65                  70                  75                  80
Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85                  90                  95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100                 105                 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115                 120                 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130                 135                 140
Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly
145                 150                 155                 160
Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165                 170                 175
Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro
180                 185                 190
Ala Ala Pro Ser Gly Leu Gly Thr Asn Thr Met Ala Thr Gly Ser Gly
195                 200                 205
Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser
210                 215                 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Met Gly Asp Arg Val Ile
225                 230                 235                 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245                 250                 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr
260                 265                 270
Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His
275                 280                 285
Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp
290                 295                 300
Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val
305                 310                 315                 320
Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu
325                 330                 335
Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr
340                 345                 350
Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp
355                 360                 365
Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser
370                 375                 380
Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser
385                 390                 395                 400
Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe Glu
405                 410                 415
Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg
420                 425                 430
Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr
435                 440                 445
Asn Thr Pro Ser Gly Thr Thr Thr Gln Ser Arg Leu Gln Phe Ser Gln
450                 455                 460
Ala Gly Ala Ser Asp Ile Arg Asp Gln Ser Arg Asn Trp Leu Pro Gly
465                 470                 475                 480
Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Ser Ala Asp Asn Asn
485                 490                 495
Asn Ser Glu Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly
500                 505                 510
Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys Asp
515                 520                 525
Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Gln Ser Gly Val Leu Ile Phe Gly Lys
530                 535                 540
Gln Gly Ser Glu Lys Thr Asn Val Asp Ile Glu Lys Val Met Ile Thr
545                 550                 555                 560
Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr
565                 570                 575
Gly Ser Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg Gly Asn Leu Ala Lys Asp Arg
580                 585                 590
Ala Pro Ser Thr Ala Arg Gln Ala Ala Thr Ala Asp Val Asn Thr Gln
595                 600                 605
Gly Val Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln
610                 615                 620
Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His Pro
625                 630                 635                 640
Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile
645                 650                 655
Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn Pro Ser Thr Thr Phe Ser
660                 665                 670
Ala Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val
675                 680                 685
Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp
690                 695                 700
Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr Asn Lys Ser Val Asn Val
705                 710                 715                 720
Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile
725                 730                 735
Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu
740                 745
<210>  54
<211>  745
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант капсида AAV
<400>  54
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser
1               5                   10                  15
Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro
20                  25                  30
Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro
35                  40                  45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50                  55                  60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65                  70                  75                  80
Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85                  90                  95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100                 105                 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115                 120                 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130                 135                 140
Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly
145                 150                 155                 160
Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165                 170                 175
Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro
180                 185                 190
Ala Ala Pro Ser Gly Leu Gly Thr Asn Thr Met Ala Thr Gly Ser Gly
195                 200                 205
Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser
210                 215                 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Met Gly Asp Arg Val Ile
225                 230                 235                 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245                 250                 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr
260                 265                 270
Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His
275                 280                 285
Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp
290                 295                 300
Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val
305                 310                 315                 320
Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu
325                 330                 335
Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr
340                 345                 350
Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp
355                 360                 365
Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser
370                 375                 380
Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser
385                 390                 395                 400
Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe Glu
405                 410                 415
Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg
420                 425                 430
Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr
435                 440                 445
Asn Thr Pro Ser Gly Thr Thr Thr Gln Ser Arg Leu Gln Phe Ser Gln
450                 455                 460
Ala Gly Ala Ser Asp Ile Arg Asp Gln Ser Arg Asn Trp Leu Pro Gly
465                 470                 475                 480
Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Ser Ala Asp Asn Asn
485                 490                 495
Asn Ser Glu Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly
500                 505                 510
Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys Asp
515                 520                 525
Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Gln Ser Gly Val Leu Ile Phe Gly Lys
530                 535                 540
Gln Gly Ser Glu Lys Thr Asn Val Asp Ile Glu Lys Val Met Ile Thr
545                 550                 555                 560
Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr
565                 570                 575
Gly Ser Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg Gly Asn Leu Ala His Gln Asp
580                 585                 590
Thr Thr Lys Asn Ala Arg Gln Ala Ala Thr Ala Asp Val Asn Thr Gln
595                 600                 605
Gly Val Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln
610                 615                 620
Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His Pro
625                 630                 635                 640
Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile
645                 650                 655
Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn Pro Ser Thr Thr Phe Ser
660                 665                 670
Ala Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val
675                 680                 685
Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp
690                 695                 700
Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr Asn Lys Ser Val Asn Val
705                 710                 715                 720
Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile
725                 730                 735
Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu
740                 745
<210>  55
<211>  745
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант капсида AAV
<400>  55
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser
1               5                   10                  15
Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro
20                  25                  30
Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro
35                  40                  45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50                  55                  60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65                  70                  75                  80
Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85                  90                  95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100                 105                 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115                 120                 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130                 135                 140
Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly
145                 150                 155                 160
Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165                 170                 175
Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro
180                 185                 190
Ala Ala Pro Ser Gly Leu Gly Thr Asn Thr Met Ala Thr Gly Ser Gly
195                 200                 205
Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser
210                 215                 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Met Gly Asp Arg Val Ile
225                 230                 235                 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245                 250                 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr
260                 265                 270
Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His
275                 280                 285
Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp
290                 295                 300
Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val
305                 310                 315                 320
Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu
325                 330                 335
Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr
340                 345                 350
Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp
355                 360                 365
Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser
370                 375                 380
Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser
385                 390                 395                 400
Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe Glu
405                 410                 415
Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg
420                 425                 430
Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr
435                 440                 445
Asn Thr Pro Ser Gly Thr Thr Thr Gln Ser Arg Leu Gln Phe Ser Gln
450                 455                 460
Ala Gly Ala Ser Asp Ile Arg Asp Gln Ser Arg Asn Trp Leu Pro Gly
465                 470                 475                 480
Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Ser Ala Asp Asn Asn
485                 490                 495
Asn Ser Glu Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly
500                 505                 510
Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys Asp
515                 520                 525
Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Gln Ser Gly Val Leu Ile Phe Gly Lys
530                 535                 540
Gln Gly Ser Glu Lys Thr Asn Val Asp Ile Glu Lys Val Met Ile Thr
545                 550                 555                 560
Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr
565                 570                 575
Gly Ser Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg Gly Asn Leu Pro Ile Ser Asn
580                 585                 590
Glu Asn Glu His Ala Arg Gln Ala Ala Thr Ala Asp Val Asn Thr Gln
595                 600                 605
Gly Val Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln
610                 615                 620
Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His Pro
625                 630                 635                 640
Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile
645                 650                 655
Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn Pro Ser Thr Thr Phe Ser
660                 665                 670
Ala Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val
675                 680                 685
Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp
690                 695                 700
Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr Asn Lys Ser Val Asn Val
705                 710                 715                 720
Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile
725                 730                 735
Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu
740                 745
<210>  56
<211>  745
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант капсида AAV
<400>  56
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser
1               5                   10                  15
Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro
20                  25                  30
Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro
35                  40                  45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50                  55                  60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65                  70                  75                  80
Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85                  90                  95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100                 105                 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115                 120                 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130                 135                 140
Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly
145                 150                 155                 160
Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165                 170                 175
Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro
180                 185                 190
Ala Ala Pro Ser Gly Leu Gly Thr Asn Thr Met Ala Thr Gly Ser Gly
195                 200                 205
Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser
210                 215                 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Met Gly Asp Arg Val Ile
225                 230                 235                 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245                 250                 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr
260                 265                 270
Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His
275                 280                 285
Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp
290                 295                 300
Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val
305                 310                 315                 320
Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu
325                 330                 335
Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr
340                 345                 350
Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp
355                 360                 365
Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser
370                 375                 380
Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser
385                 390                 395                 400
Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe Glu
405                 410                 415
Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg
420                 425                 430
Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr
435                 440                 445
Asn Thr Pro Ser Gly Thr Thr Thr Gln Ser Arg Leu Gln Phe Ser Gln
450                 455                 460
Ala Gly Ala Ser Asp Ile Arg Asp Gln Ser Arg Asn Trp Leu Pro Gly
465                 470                 475                 480
Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Ser Ala Asp Asn Asn
485                 490                 495
Asn Ser Glu Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly
500                 505                 510
Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys Asp
515                 520                 525
Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Gln Ser Gly Val Leu Ile Phe Gly Lys
530                 535                 540
Gln Gly Ser Glu Lys Thr Asn Val Asp Ile Glu Lys Val Met Ile Thr
545                 550                 555                 560
Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr
565                 570                 575
Gly Ser Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg Gly Asn Leu Pro Gln Ala Asn
580                 585                 590
Ala Asn Glu Asn Ala Arg Gln Ala Ala Thr Ala Asp Val Asn Thr Gln
595                 600                 605
Gly Val Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln
610                 615                 620
Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His Pro
625                 630                 635                 640
Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile
645                 650                 655
Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn Pro Ser Thr Thr Phe Ser
660                 665                 670
Ala Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val
675                 680                 685
Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp
690                 695                 700
Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr Asn Lys Ser Val Asn Val
705                 710                 715                 720
Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile
725                 730                 735
Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu
740                 745
<210>  57
<211>  745
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариант капсида AAV
<400>  57
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Thr Leu Ser
1               5                   10                  15
Glu Gly Ile Arg Gln Trp Trp Lys Leu Lys Pro Gly Pro Pro Pro Pro
20                  25                  30
Lys Pro Ala Glu Arg His Lys Asp Asp Ser Arg Gly Leu Val Leu Pro
35                  40                  45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50                  55                  60
Val Asn Glu Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65                  70                  75                  80
Arg Gln Leu Asp Ser Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala
85                  90                  95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100                 105                 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115                 120                 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Pro Val Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130                 135                 140
Pro Val Glu His Ser Pro Val Glu Pro Asp Ser Ser Ser Gly Thr Gly
145                 150                 155                 160
Lys Ala Gly Gln Gln Pro Ala Arg Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr
165                 170                 175
Gly Asp Ala Asp Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Gln Pro Pro
180                 185                 190
Ala Ala Pro Ser Gly Leu Gly Thr Asn Thr Met Ala Thr Gly Ser Gly
195                 200                 205
Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn Ser
210                 215                 220
Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Met Gly Asp Arg Val Ile
225                 230                 235                 240
Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu
245                 250                 255
Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Gln Ser Gly Ala Ser Asn Asp Asn His Tyr
260                 265                 270
Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg Phe His
275                 280                 285
Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn Asn Trp
290                 295                 300
Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile Gln Val
305                 310                 315                 320
Lys Glu Val Thr Gln Asn Asp Gly Thr Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu
325                 330                 335
Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Glu Tyr Gln Leu Pro Tyr
340                 345                 350
Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro Ala Asp
355                 360                 365
Val Phe Met Val Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn Gly Ser
370                 375                 380
Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser
385                 390                 395                 400
Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr Phe Glu
405                 410                 415
Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu Asp Arg
420                 425                 430
Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser Arg Thr
435                 440                 445
Asn Thr Pro Ser Gly Thr Thr Thr Gln Ser Arg Leu Gln Phe Ser Gln
450                 455                 460
Ala Gly Ala Ser Asp Ile Arg Asp Gln Ser Arg Asn Trp Leu Pro Gly
465                 470                 475                 480
Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Ser Ala Asp Asn Asn
485                 490                 495
Asn Ser Glu Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu Asn Gly
500                 505                 510
Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys Asp
515                 520                 525
Asp Glu Glu Lys Phe Phe Pro Gln Ser Gly Val Leu Ile Phe Gly Lys
530                 535                 540
Gln Gly Ser Glu Lys Thr Asn Val Asp Ile Glu Lys Val Met Ile Thr
545                 550                 555                 560
Asp Glu Glu Glu Ile Arg Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Gln Tyr
565                 570                 575
Gly Ser Val Ser Thr Asn Leu Gln Arg Gly Asn Leu Ala His Pro Asp
580                 585                 590
Thr Thr Lys Asn Ala Arg Gln Ala Ala Thr Ala Asp Val Asn Thr Gln
595                 600                 605
Gly Val Leu Pro Gly Met Val Trp Gln Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln
610                 615                 620
Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His Thr Asp Gly His Phe His Pro
625                 630                 635                 640
Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile
645                 650                 655
Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala Asn Pro Ser Thr Thr Phe Ser
660                 665                 670
Ala Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val
675                 680                 685
Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp
690                 695                 700
Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn Tyr Asn Lys Ser Val Asn Val
705                 710                 715                 720
Asp Phe Thr Val Asp Thr Asn Gly Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile
725                 730                 735
Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu
740                 745
<210>  58
<211>  737
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Предковый капсидный белок
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (264)..(264)
<223>  Xaa может представлять собой любую природную аминокислоту
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (266)..(266)
<223>  Xaa может представлять собой любую природную аминокислоту
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (268)..(268)
<223>  Xaa может представлять собой любую природную аминокислоту
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (448)..(448)
<223>  Xaa может представлять собой любую природную аминокислоту
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (459)..(460)
<223>  Xaa может представлять собой любую природную аминокислоту
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (467)..(467)
<223>  Xaa может представлять собой любую природную аминокислоту
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (470)..(471)
<223>  Xaa может представлять собой любую природную аминокислоту
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (474)..(474)
<223>  Xaa может представлять собой любую природную аминокислоту
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (495)..(495)
<223>  Xaa может представлять собой любую природную аминокислоту
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (516)..(516)
<223>  Xaa может представлять собой любую природную аминокислоту
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (533)..(533)
<223>  Xaa может представлять собой любую природную аминокислоту
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (547)..(547)
<223>  Xaa может представлять собой любую природную аминокислоту
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (551)..(551)
<223>  Xaa может представлять собой любую природную аминокислоту
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (555)..(555)
<223>  Xaa может представлять собой любую природную аминокислоту
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (557)..(557)
<223>  Xaa может представлять собой любую природную аминокислоту
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (561)..(561)
<223>  Xaa может представлять собой любую природную аминокислоту
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (563)..(563)
<223>  Xaa может представлять собой любую природную аминокислоту
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (577)..(577)
<223>  Xaa может представлять собой любую природную аминокислоту
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (583)..(583)
<223>  Xaa может представлять собой любую природную аминокислоту
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (593)..(593)
<223>  Xaa может представлять собой любую природную аминокислоту
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (596)..(596)
<223>  Xaa может представлять собой любую природную аминокислоту
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (661)..(662)
<223>  Xaa может представлять собой любую природную аминокислоту
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (664)..(665)
<223>  Xaa может представлять собой любую природную аминокислоту
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (710)..(710)
<223>  Xaa может представлять собой любую природную аминокислоту
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (717)..(719)
<223>  Xaa может представлять собой любую природную аминокислоту
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (723)..(723)
<223>  Xaa может представлять собой любую природную аминокислоту
<400>  58
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser
1               5                   10                  15
Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Asp Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro
20                  25                  30
Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro
35                  40                  45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50                  55                  60
Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65                  70                  75                  80
Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala
85                  90                  95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100                 105                 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115                 120                 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130                 135                 140
Pro Val Glu Pro Ser Pro Gln Arg Ser Pro Asp Ser Ser Thr Gly Ile
145                 150                 155                 160
Gly Lys Lys Gly Gln Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln
165                 170                 175
Thr Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro
180                 185                 190
Pro Ala Gly Pro Ser Gly Leu Gly Ser Gly Thr Met Ala Ala Gly Gly
195                 200                 205
Gly Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn
210                 215                 220
Ala Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val
225                 230                 235                 240
Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His
245                 250                 255
Leu Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Xaa Ser Xaa Gly Xaa Thr Asn Asp Asn
260                 265                 270
His Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg
275                 280                 285
Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn
290                 295                 300
Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile
305                 310                 315                 320
Gln Val Lys Glu Val Thr Thr Asn Asp Gly Val Thr Thr Ile Ala Asn
325                 330                 335
Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Ser Asp Ser Glu Tyr Gln Leu
340                 345                 350
Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro
355                 360                 365
Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn
370                 375                 380
Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe
385                 390                 395                 400
Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr
405                 410                 415
Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu
420                 425                 430
Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Xaa
435                 440                 445
Arg Thr Gln Ser Thr Gly Gly Thr Ala Gly Xaa Xaa Glu Leu Leu Phe
450                 455                 460
Ser Gln Xaa Gly Pro Xaa Xaa Met Ser Xaa Gln Ala Lys Asn Trp Leu
465                 470                 475                 480
Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Leu Xaa Gln
485                 490                 495
Asn Asn Asn Ser Asn Phe Ala Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu
500                 505                 510
Asn Gly Arg Xaa Ser Leu Val Asn Pro Gly Val Ala Met Ala Thr His
515                 520                 525
Lys Asp Asp Glu Xaa Arg Phe Phe Pro Ser Ser Gly Val Leu Ile Phe
530                 535                 540
Gly Lys Xaa Gly Ala Gly Xaa Asn Asn Thr Xaa Leu Xaa Asn Val Met
545                 550                 555                 560
Xaa Thr Xaa Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu
565                 570                 575
Xaa Tyr Gly Val Val Ala Xaa Asn Leu Gln Ser Ser Asn Thr Ala Pro
580                 585                 590
Xaa Thr Gly Xaa Val Asn Ser Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp
595                 600                 605
Gln Asn Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro
610                 615                 620
His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly
625                 630                 635                 640
Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro
645                 650                 655
Ala Asn Pro Pro Xaa Xaa Phe Xaa Xaa Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile
660                 665                 670
Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu
675                 680                 685
Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser
690                 695                 700
Asn Tyr Ala Lys Ser Xaa Asn Val Asp Phe Ala Val Xaa Xaa Xaa Gly
705                 710                 715                 720
Val Tyr Xaa Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn
725                 730                 735
Leu
<210>  59
<211>  737
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Предковый вариант капсида
<400>  59
Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser
1               5                   10                  15
Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Asp Leu Lys Pro Gly Ala Pro Lys Pro
20                  25                  30
Lys Ala Asn Gln Gln Lys Gln Asp Asp Gly Arg Gly Leu Val Leu Pro
35                  40                  45
Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Phe Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro
50                  55                  60
Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp
65                  70                  75                  80
Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Arg Tyr Asn His Ala
85                  90                  95
Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Gln Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly
100                 105                 110
Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro
115                 120                 125
Leu Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg
130                 135                 140
Pro Val Glu Pro Ser Pro Gln Arg Ser Pro Asp Ser Ser Thr Gly Ile
145                 150                 155                 160
Gly Lys Lys Gly Gln Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln
165                 170                 175
Thr Gly Asp Ser Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Leu Gly Glu Pro
180                 185                 190
Pro Ala Gly Pro Ser Gly Leu Gly Ser Gly Thr Met Ala Ala Gly Gly
195                 200                 205
Gly Ala Pro Met Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Asn
210                 215                 220
Ala Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Thr Trp Leu Gly Asp Arg Val
225                 230                 235                 240
Ile Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His
245                 250                 255
Leu Tyr Lys Gln Ile Ser Ser Ala Ser Ala Gly Ser Thr Asn Asp Asn
260                 265                 270
His Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg
275                 280                 285
Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn
290                 295                 300
Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile
305                 310                 315                 320
Gln Val Lys Glu Val Thr Thr Asn Asp Gly Val Thr Thr Ile Ala Asn
325                 330                 335
Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Ser Asp Ser Glu Tyr Gln Leu
340                 345                 350
Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Gln Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro
355                 360                 365
Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asn
370                 375                 380
Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe
385                 390                 395                 400
Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Thr Phe Ser Tyr Thr
405                 410                 415
Phe Glu Asp Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu
420                 425                 430
Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ala
435                 440                 445
Arg Thr Gln Ser Thr Gly Gly Thr Ala Gly Thr Arg Glu Leu Leu Phe
450                 455                 460
Ser Gln Ala Gly Pro Ser Asn Met Ser Ala Gln Ala Lys Asn Trp Leu
465                 470                 475                 480
Pro Gly Pro Cys Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Lys Thr Leu Ser Gln
485                 490                 495
Asn Asn Asn Ser Asn Phe Ala Trp Thr Gly Ala Thr Lys Tyr His Leu
500                 505                 510
Asn Gly Arg Asp Ser Leu Val Asn Pro Gly Val Ala Met Ala Thr His
515                 520                 525
Lys Asp Asp Glu Asp Arg Phe Phe Pro Ser Ser Gly Val Leu Ile Phe
530                 535                 540
Gly Lys Gln Gly Ala Gly Ala Asn Asn Thr Ala Leu Glu Asn Val Met
545                 550                 555                 560
Met Thr Ser Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu
565                 570                 575
Gln Tyr Gly Val Val Ala Ser Asn Leu Gln Ser Ser Asn Thr Ala Pro
580                 585                 590
Val Thr Gly Thr Val Asn Ser Gln Gly Ala Leu Pro Gly Met Val Trp
595                 600                 605
Gln Asn Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro
610                 615                 620
His Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly
625                 630                 635                 640
Leu Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro
645                 650                 655
Ala Asn Pro Pro Ala Val Phe Thr Pro Ala Lys Phe Ala Ser Phe Ile
660                 665                 670
Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu
675                 680                 685
Gln Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser
690                 695                 700
Asn Tyr Ala Lys Ser Thr Asn Val Asp Phe Ala Val Asp Asn Glu Gly
705                 710                 715                 720
Val Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn
725                 730                 735
Leu
<210>  60
<211>  10
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Гетерологичная пептидная вставка
<400>  60
Ile Ala His Asp Ile Thr Lys Asn Ile Ala
1               5                   10
<210>  61
<211>  7
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Гетерологичная пептидная вставка
<400>  61
Asp Ile Thr Lys Asn Ile Ala
1               5
<210>  62
<211>  8
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Гетерологичная пептидная вставка
<400>  62
Asn Lys Thr Thr Asn Lys Asp Ala
1               5
<210>  63
<211>  8
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Гетерологичная пептидная вставка
<400>  63
Pro Gln Ala Asn Ala Asn Glu Asn
1               5
<210>  64
<211>  8
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Гетерологичная пептидная вставка
<400>  64
Pro Ile Ser Asn Glu Asn Glu His
1               5
<210>  65
<211>  1377
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  оптимизированная по кодонному составу последовательность,
кодирующая афлиберцепт
<400>  65
atggtttctt actgggacac cggcgtgctg ctgtgtgccc tgctttcttg tctgctgctg       60
accggctcta gcagcggctc tgataccggc agacccttcg tggaaatgta cagcgagatc      120
cccgagatca tccacatgac cgagggcaga gagctggtca tcccttgcag agtgacaagc      180
cccaacatca ccgtgactct gaagaagttc cctctggaca cactgatccc cgacggcaag      240
agaatcatct gggacagccg gaagggcttc atcatcagca acgccaccta caaagagatc      300
ggcctgctga cctgtgaagc caccgtgaat ggccacctgt acaagaccaa ctacctgaca      360
cacagacaga ccaacaccat catcgacgtg gtgctgagcc ctagccacgg cattgaactg      420
tctgtgggcg agaagctggt gctgaactgt accgccagaa ccgagctgaa cgtgggcatc      480
gacttcaact gggagtaccc cagcagcaag caccagcaca agaaactggt caaccgggac      540
ctgaaaaccc agagcggcag cgagatgaag aaattcctga gcaccctgac catcgacggc      600
gtgaccagaa gtgaccaggg cctgtacaca tgtgccgcca gctctggcct gatgaccaag      660
aaaaacagca ccttcgtgcg ggtgcacgag aaggacaaga cccacacctg tcctccatgt      720
cctgctccag aactgctcgg cggaccttcc gtgttcctgt ttcctccaaa gcctaaggac      780
accctgatga tcagcagaac ccctgaagtg acctgcgtgg tggtggatgt gtcccacgag      840
gatcccgaag tgaagttcaa ttggtacgtg gacggcgtgg aagtgcacaa cgccaagacc      900
aagcctagag aggaacagta caatagcacc tacagagtgg tgtccgtgct gaccgtgctg      960
caccaggatt ggctgaacgg caaagagtac aagtgcaagg tgtccaacaa ggccctgcct     1020
gctcctatcg agaaaaccat ctccaaggcc aagggccagc ctagggaacc ccaggtttac     1080
acactgcctc caagcaggga cgagctgaca aagaaccagg tgtccctgac ctgcctggtc     1140
aagggcttct acccttccga tatcgccgtg gaatgggaga gcaatggcca gcctgagaac     1200
aactacaaga caacccctcc tgtgctggac agcgacggct cattcttcct gtacagcaag     1260
ctgacagtgg acaagagcag atggcagcag ggcaacgtgt tcagctgctc cgtgatgcac     1320
gaggccctgc acaaccacta cacccagaag tccctgagcc tgtctcctgg caaatga        1377
<210>  66
<211>  458
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Афлиберцепт
<400>  66
Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser
1               5                   10                  15
Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Ser Ser Gly Ser Asp Thr Gly Arg Pro
20                  25                  30
Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu
35                  40                  45
Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr
50                  55                  60
Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys
65                  70                  75                  80
Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr
85                  90                  95
Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His
100                 105                 110
Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile
115                 120                 125
Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu
130                 135                 140
Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile
145                 150                 155                 160
Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu
165                 170                 175
Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe
180                 185                 190
Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu
195                 200                 205
Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr
210                 215                 220
Phe Val Arg Val His Glu Lys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
225                 230                 235                 240
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
245                 250                 255
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
260                 265                 270
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
275                 280                 285
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
290                 295                 300
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
305                 310                 315                 320
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
325                 330                 335
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
340                 345                 350
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
355                 360                 365
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
370                 375                 380
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
385                 390                 395                 400
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
405                 410                 415
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
420                 425                 430
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
435                 440                 445
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450                 455
<210>  67
<211>  1575
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  оптимизированная по кодонному составу последовательность,
кодирующая одноцепочечный тяжелый-легкий ранибизумаб
<400>  67
atggactgga cctggtccat cctgtttctg gtggctgccg ccacaggcac atactctgaa       60
gtgcagctgg tggaatctgg cggcggactt gttcaacctg gcggctctct gagactgagc      120
tgtgccgcct ctggctacga ctttacccac tacggcatga actgggtccg acaggcccct      180
ggcaaaggcc ttgaatgggt cggatggatc aacacctaca ccggcgagcc aacatacgcc      240
gccgacttca agcggagatt caccttcagc ctggacacca gcaagagcac cgcctacctc      300
cagatgaaca gcctgagagc cgaggacacc gccgtgtact actgcgccaa gtatccctac      360
tactacggca ccagccactg gtacttcgac gtgtggggac agggcacact ggtcacagtg      420
tctagcgcct ctacaaaggg ccccagcgtt ttcccactgg ctcctagcag caagtctacc      480
tccggtggaa cagccgctct gggctgtctg gtcaaggact actttcccga gcctgtgacc      540
gtgtcctgga atagcggagc actgacaagc ggcgtgcaca cctttccagc cgtgctgcaa      600
agcagcggcc tgtactctct gagcagcgtc gtgacagtgc caagcagctc tctgggcacc      660
cagacctaca tctgcaatgt gaaccacaag cctagcaaca ccaaggtgga caagaaggtg      720
gaacccaaga gctgcgacaa gacacacctc ggcggaagct ctggaagcgg ctctggatct      780
accggcacaa gctctagcgg aacaggcaca agcgctggca caaccggaac aagcgcttct      840
acatctggct ctggttctgg cggaggcgga ggatcaggtg gtggtggatc tgctggcgga      900
acagctacag ctggcgcctc ttctggcagc gacattcagc tgacacagag cccttctagc      960
ctgagcgcct ctgtgggcga cagagtgacc atcacatgta gcgccagcca ggacatctcc     1020
aactacctga actggtatca gcagaagccc ggcaaggccc ctaaggtgct gatctacttt     1080
accagcagcc tgcactccgg cgtgcccagc agattttctg gatctggctc cggcaccgac     1140
ttcaccctga caatatctag cctccagcct gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag     1200
tacagcaccg tgccttggac atttggccag ggcacaaagg tggaaatcaa gcggacagtg     1260
gccgctccta gcgtgttcat ctttccacct agcgacgagc agctgaagtc tggcacagcc     1320
tctgtcgtgt gcctgctgaa caacttctac cccagagaag ccaaggtgca gtggaaagtg     1380
gacaacgccc tccagtccgg caacagccaa gagtctgtga ccgagcagga cagcaaggac     1440
tccacctaca gcctgtccag cacactgaca ctgagcaagg ccgactacga gaagcacaaa     1500
gtgtacgcct gcgaagtgac ccaccagggc ctttctagcc ctgtgaccaa gagcttcaac     1560
cggggcgagt gttga                                                      1575
<210>  68
<211>  524
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  одноцепочечный тяжелый-легкий ранибизумаб
<400>  68
Met Asp Trp Thr Trp Ser Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly
1               5                   10                  15
Thr Tyr Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20                  25                  30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Asp Phe
35                  40                  45
Thr His Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50                  55                  60
Glu Trp Val Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala
65                  70                  75                  80
Ala Asp Phe Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser
85                  90                  95
Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100                 105                 110
Tyr Tyr Cys Ala Lys Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser His Trp Tyr
115                 120                 125
Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
130                 135                 140
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
145                 150                 155                 160
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
165                 170                 175
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
180                 185                 190
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
195                 200                 205
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
210                 215                 220
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val
225                 230                 235                 240
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Leu Gly Gly Ser Ser Gly Ser
245                 250                 255
Gly Ser Gly Ser Thr Gly Thr Ser Ser Ser Gly Thr Gly Thr Ser Ala
260                 265                 270
Gly Thr Thr Gly Thr Ser Ala Ser Thr Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gly
275                 280                 285
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Gly Gly Thr Ala Thr Ala
290                 295                 300
Gly Ala Ser Ser Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser
305                 310                 315                 320
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser
325                 330                 335
Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
340                 345                 350
Ala Pro Lys Val Leu Ile Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val
355                 360                 365
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
370                 375                 380
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
385                 390                 395                 400
Tyr Ser Thr Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
405                 410                 415
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
420                 425                 430
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
435                 440                 445
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
450                 455                 460
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
465                 470                 475                 480
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
485                 490                 495
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
500                 505                 510
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
515                 520
<210>  69
<211>  1578
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  оптимизированная по кодонному составу последовательность,
кодирующая одноцепочечный легкий-тяжелый ранибизумаб
<400>  69
atggtcctcc agacacaggt gttcatcagc ctgctgctgt ggatctctgg cgcctacggc       60
gatatccagc tgacacagag ccctagcagc ctgtctgcct ctgtgggcga cagagtgacc      120
atcacatgta gcgccagcca ggacatcagc aactacctga actggtatca gcagaagccc      180
ggcaaggccc ctaaggtgct gatctacttt accagcagcc tgcacagcgg cgtgcccagc      240
agattttctg gctctggcag cggcaccgac ttcaccctga caatatctag cctccagcct      300
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag tacagcaccg tgccttggac atttggccag      360
ggcaccaagg tggaaatcaa gcggacagtg gccgctccta gcgtgttcat ctttccacct      420
agcgacgagc agctgaagtc tggcacagcc tctgtcgtgt gcctgctgaa caacttctac      480
cccagagaag ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tccagagcgg caatagccaa      540
gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggac tctacctact ctctgagcag cacactgacc      600
ctgagcaagg ccgactacga gaagcacaaa gtgtacgcct gcgaagtgac ccaccagggc      660
ctttctagcc ctgtgaccaa gagcttcaac agaggcgagt gtggcggcag ctctggaagc      720
ggatctggaa gcacaggcac aagctctagc ggaaccggaa caagcgctgg cacaacaggc      780
acatctgcca gcacaagcgg ttctggttct ggcggaggcg gaggatctgg tggtggcgga      840
tctgctggcg gaacagctac agctggtgcc tcttctggat ccgaggtgca gctggttgaa      900
tctggcggtg gactggttca gccaggcgga tctctgagac tgtcttgtgc cgccagcggc      960
tacgatttca cccactacgg catgaactgg gtccgacagg cccctggcaa aggccttgaa     1020
tgggtcggat ggatcaacac ctacaccggc gagccaacat acgccgccga cttcaagcgg     1080
agattcacct tcagcctgga cacctccaag agcaccgcct acctccagat gaacagcctg     1140
agagccgagg acaccgccgt gtactactgc gccaagtatc cctactacta cggcaccagc     1200
cactggtact tcgacgtgtg gggacagggc acactggtca cagtgtctag cgcctctaca     1260
aagggcccca gcgttttccc actggctcct agcagcaaga gcacatcagg cggaactgct     1320
gccctgggct gtctggtcaa ggactacttt cctgagcctg tgaccgtgtc ctggaacagc     1380
ggagcactga catctggcgt gcacaccttt ccagccgtgc tccaaagcag cggcctgtat     1440
tctctgtcca gcgtcgtgac agtgcctagc agctctctgg gcacccagac ctacatctgc     1500
aatgtgaacc acaagcctag caacaccaag gtcgacaaga aggtggaacc caagagctgc     1560
gacaagaccc acctctga                                                   1578
<210>  70
<211>  1578
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  оптимизированный по кодонному составу одноцепочечный
легкий-тяжелый ранибизумаб
<400>  70
atggtgctcc agacccaggt gtttatttca ctgctgctgt ggattagcgg ggcttacgga       60
gacattcagc tgacccagag tccttcatct ctgagcgcct ccgtgggcga cagggtgacc      120
atcacatgct ctgccagcca ggatatctcc aactatctga attggtacca gcagaagccc      180
ggcaaggccc ctaaggtgct gatctatttc accagctccc tgcacagcgg agtgccatcc      240
cgcttctccg gctctggcag cggcaccgac tttaccctga caatctctag cctccagcca      300
gaggatttcg ccacatacta ttgccagcag tacagcaccg tgccctggac atttggccag      360
ggcaccaagg tggagatcaa gcggacagtg gccgccccaa gcgtgttcat ctttccccct      420
agcgacgagc agctgaagtc tggcaccgcc agcgtggtgt gcctgctgaa caatttctat      480
cccagagagg ccaaggtgca gtggaaggtg gataacgccc tccagtccgg caattctcag      540
gagagcgtga ccgagcagga ctccaaggat tctacataca gcctgtcctc taccctgaca      600
ctgtccaagg ccgactatga gaagcacaag gtgtacgcat gcgaggtgac ccaccagggc      660
ctgagctccc cagtgacaaa gagctttaac aggggagagt gtggaggatc tagcggatcc      720
ggatctggaa gcaccggcac atcctctagc ggaaccggca caagcgccgg caccacaggc      780
acctccgcct ctacaagcgg cagcggatct ggcggaggag gaggatccgg aggaggagga      840
tctgccggcg gcaccgccac agccggcgcc tcctctggct ccgaggtgca gctggtggag      900
tctggaggag gcctggtgca gcctggaggc tccctgaggc tgtcttgcgc agcaagcggc      960
tatgatttca cccactacgg aatgaactgg gtgcgccagg cacctggcaa gggcctggag     1020
tgggtgggct ggatcaatac ctatacaggc gagccaacct acgccgccga ctttaagcgg     1080
agattcacat tttccctgga taccagcaag tccacagcct acctccagat gaacagcctg     1140
agggcagagg acaccgccgt gtactattgc gccaagtatc cttactatta cggcacaagc     1200
cactggtact tcgacgtgtg gggacagggc accctggtga cagtgagctc cgccagcacc     1260
aagggcccat ccgtgtttcc tctggcccca tctagcaagt ctaccagcgg aggaacagcc     1320
gccctgggat gtctggtgaa ggactacttc ccagagcccg tgaccgtgtc ctggaattct     1380
ggcgccctga cctccggcgt gcacacattt cccgccgtgc tccagtcctc tggcctgtat     1440
agcctgagct ccgtggtgac cgtgccttct agctccctgg gcacccagac atacatctgt     1500
aacgtgaatc acaagccttc aaataccaaa gtcgataaaa aagtggaacc aaaatcctgt     1560
gataaaaccc atctgtga                                                   1578
<210>  71
<211>  525
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  одноцепочечный легкий-тяжелый ранибизумаб
<400>  71
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1               5                   10                  15
Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
20                  25                  30
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp
35                  40                  45
Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
50                  55                  60
Lys Val Leu Ile Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser
65                  70                  75                  80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
85                  90                  95
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser
100                 105                 110
Thr Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
115                 120                 125
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
130                 135                 140
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
145                 150                 155                 160
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
165                 170                 175
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
180                 185                 190
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
195                 200                 205
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
210                 215                 220
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Ser Ser Gly Ser
225                 230                 235                 240
Gly Ser Gly Ser Thr Gly Thr Ser Ser Ser Gly Thr Gly Thr Ser Ala
245                 250                 255
Gly Thr Thr Gly Thr Ser Ala Ser Thr Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gly
260                 265                 270
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Gly Gly Thr Ala Thr Ala
275                 280                 285
Gly Ala Ser Ser Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
290                 295                 300
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
305                 310                 315                 320
Tyr Asp Phe Thr His Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
325                 330                 335
Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro
340                 345                 350
Thr Tyr Ala Ala Asp Phe Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr
355                 360                 365
Ser Lys Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
370                 375                 380
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser
385                 390                 395                 400
His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
405                 410                 415
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser
420                 425                 430
Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
435                 440                 445
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
450                 455                 460
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
465                 470                 475                 480
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln
485                 490                 495
Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
500                 505                 510
Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Leu
515                 520                 525
<210>  72
<211>  2277
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность, кодирующая одноцепочечный
легкий-тяжелый ранибизумаб-Fc
<400>  72
atggtcctcc agacacaggt gttcatcagc ctgctgctgt ggatctctgg cgcctacggc       60
gatatccagc tgacacagag ccctagcagc ctgtctgcct ctgtgggcga cagagtgacc      120
atcacatgta gcgccagcca ggacatcagc aactacctga actggtatca gcagaagccc      180
ggcaaggccc ctaaggtgct gatctacttt accagcagcc tgcacagcgg cgtgcccagc      240
agattttctg gctctggcag cggcaccgac ttcaccctga caatatctag cctccagcct      300
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag tacagcaccg tgccttggac atttggccag      360
ggcaccaagg tggaaatcaa gcggacagtg gccgctccta gcgtgttcat ctttccacct      420
agcgacgagc agctgaagtc tggcacagcc tctgtcgtgt gcctgctgaa caacttctac      480
cccagagaag ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tccagagcgg caatagccaa      540
gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggac tctacctact ctctgagcag cacactgacc      600
ctgagcaagg ccgactacga gaagcacaaa gtgtacgcct gcgaagtgac ccaccagggc      660
ctttctagcc ctgtgaccaa gagcttcaac agaggcgagt gtggcggcag ctctggaagc      720
ggatctggaa gcacaggcac aagctctagc ggaaccggaa caagcgctgg cacaacaggc      780
acatctgcca gcacaagcgg ttctggttct ggcggaggcg gaggatctgg tggtggcgga      840
tctgctggcg gaacagctac agctggtgcc tcttctggat ccgaggtgca gctggttgaa      900
tctggcggtg gactggttca gccaggcgga tctctgagac tgtcttgtgc cgccagcggc      960
tacgatttca cccactacgg catgaactgg gtccgacagg cccctggcaa aggccttgaa     1020
tgggtcggat ggatcaacac ctacaccggc gagccaacat acgccgccga cttcaagcgg     1080
agattcacct tcagcctgga cacctccaag agcaccgcct acctccagat gaacagcctg     1140
agagccgagg acaccgccgt gtactactgc gccaagtatc cctactacta cggcaccagc     1200
cactggtact tcgacgtgtg gggacagggc acactggtca cagtgtctag cgcctctaca     1260
aagggcccca gcgttttccc actggctcct agcagcaaga gcacatcagg cggaactgct     1320
gccctgggct gtctggtcaa ggactacttt cctgagcctg tgaccgtgtc ctggaacagc     1380
ggagcactga catctggcgt gcacaccttt ccagccgtgc tccaaagcag cggcctgtat     1440
tctctgtcca gcgtcgtgac agtgcctagc agctctctgg gcacccagac ctacatctgc     1500
aatgtgaacc acaagcctag caacaccaag gtcgacaaga aggtggaacc caagagctgc     1560
gacaagaccc acacctgtcc tccatgtcct gctccagaac tgctcggcgg accttccgtg     1620
ttcctgtttc ctccaaagcc taaggacacc ctgatgatca gcagaacccc tgaagtgacc     1680
tgcgtggtgg tggatgtgtc ccacgaggat cccgaagtga agttcaattg gtacgtggac     1740
ggcgtggaag tgcacaacgc caagaccaag cctagagagg aacagtacaa tagcacctac     1800
agagtggtgt ccgtgctgac cgtgctgcac caggattggc tgaacggcaa agagtacaag     1860
tgcaaggtgt ccaacaaggc cctgcctgct cctatcgaga aaaccatctc caaggccaag     1920
ggccagccta gggaacccca ggtttacaca ctgcctccaa gcagggacga gctgacaaag     1980
aaccaggtgt ccctgacctg cctggtcaag ggcttctacc cttccgatat cgccgtggaa     2040
tgggagagca atggccagcc tgagaacaac tacaagacaa cccctcctgt gctggacagc     2100
gacggctcat tcttcctgta cagcaagctg acagtggaca agagcagatg gcagcagggc     2160
aacgtgttca gctgctccgt gatgcacgag gccctgcaca accactacac ccagaagtcc     2220
ctgagcctgt ctcctggcaa atgagccacg cgtaacacgt gcatgcgaga gatctga        2277
<210>  73
<211>  752
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  одноцепочечный легкий-тяжелый ранибизумаб, слитый с Fc
<400>  73
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1               5                   10                  15
Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
20                  25                  30
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp
35                  40                  45
Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
50                  55                  60
Lys Val Leu Ile Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser
65                  70                  75                  80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
85                  90                  95
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser
100                 105                 110
Thr Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
115                 120                 125
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
130                 135                 140
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
145                 150                 155                 160
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
165                 170                 175
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
180                 185                 190
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
195                 200                 205
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
210                 215                 220
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Ser Ser Gly Ser
225                 230                 235                 240
Gly Ser Gly Ser Thr Gly Thr Ser Ser Ser Gly Thr Gly Thr Ser Ala
245                 250                 255
Gly Thr Thr Gly Thr Ser Ala Ser Thr Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gly
260                 265                 270
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Gly Gly Thr Ala Thr Ala
275                 280                 285
Gly Ala Ser Ser Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
290                 295                 300
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
305                 310                 315                 320
Tyr Asp Phe Thr His Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
325                 330                 335
Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro
340                 345                 350
Thr Tyr Ala Ala Asp Phe Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr
355                 360                 365
Ser Lys Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
370                 375                 380
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser
385                 390                 395                 400
His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
405                 410                 415
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser
420                 425                 430
Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
435                 440                 445
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
450                 455                 460
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
465                 470                 475                 480
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln
485                 490                 495
Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
500                 505                 510
Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Leu Asp Lys Thr
515                 520                 525
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
530                 535                 540
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
545                 550                 555                 560
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
565                 570                 575
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
580                 585                 590
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
595                 600                 605
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
610                 615                 620
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
625                 630                 635                 640
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
645                 650                 655
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
660                 665                 670
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
675                 680                 685
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
690                 695                 700
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
705                 710                 715                 720
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
725                 730                 735
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
740                 745                 750
<210>  74
<211>  816
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  оптимизированная по кодонному составу последовательность,
кодирующая бролуцизумаб
<400>  74
atggtcctcc agacacaggt gttcatcagc ctgctgctgt ggatctctgg cgcctatggc       60
gagatcgtga tgacacagag ccccagcaca ctgtctgcca gcgtgggaga cagagtgatc      120
atcacatgcc aggccagcga gatcatccac agctggctgg cttggtatca gcagaagcct      180
ggcaaggccc ctaagctgct gatctacctg gcctctacac tggccagcgg agtgcctagc      240
agattttctg gctctggatc tggcgccgag ttcaccctga caatctctag cctccagcct      300
gacgacttcg ccacctacta ctgccagaac gtgtacctgg ccagcaccaa cggcgccaat      360
tttggccagg gcaccaagct gacagtgctt ggcggaggcg gaggttctgg tggcggagga      420
agtggcggcg gaggatcagg cggtggtgga tctgaagtgc agctggtgga atcaggcgga      480
ggactggttc aacctggcgg ctctctgaga ctgagctgta ccgcctctgg cttctccctg      540
accgactact actacatgac ctgggtccga caggcccctg gcaaaggact tgagtgggtc      600
ggattcatcg accccgacga cgatccttac tacgccacat gggccaaggg cagattcacc      660
atcagccggg acaacagcaa gaacaccctg tacctccaga tgaacagcct gagagccgag      720
gacaccgccg tgtactattg tgccggcgga gatcacaata gcggctgggg actcgatatc      780
tggggccagg gaacactggt caccgtgtct agttga                                816
<210>  75
<211>  271
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Бролуцизумаб
<400>  75
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1               5                   10                  15
Gly Ala Tyr Gly Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser
20                  25                  30
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Ile Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Ile
35                  40                  45
Ile His Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
50                  55                  60
Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser
65                  70                  75                  80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ala Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser
85                  90                  95
Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Tyr
100                 105                 110
Leu Ala Ser Thr Asn Gly Ala Asn Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Thr
115                 120                 125
Val Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
130                 135                 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly
145                 150                 155                 160
Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser
165                 170                 175
Gly Phe Ser Leu Thr Asp Tyr Tyr Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala
180                 185                 190
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Phe Ile Asp Pro Asp Asp Asp
195                 200                 205
Pro Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
210                 215                 220
Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu
225                 230                 235                 240
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Gly Gly Asp His Asn Ser Gly Trp
245                 250                 255
Gly Leu Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
260                 265                 270
<210>  76
<211>  1530
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Бролуцизумаб, слитый с Fc
<400>  76
atggtcctcc agacacaggt gttcatcagc ctgctgctgt ggatctctgg cgcctatggc       60
gagatcgtga tgacacagag ccccagcaca ctgtctgcca gcgtgggaga cagagtgatc      120
atcacatgcc aggccagcga gatcatccac agctggctgg cttggtatca gcagaagcct      180
ggcaaggccc ctaagctgct gatctacctg gcctctacac tggccagcgg agtgcctagc      240
agattttctg gctctggatc tggcgccgag ttcaccctga caatctctag cctccagcct      300
gacgacttcg ccacctacta ctgccagaac gtgtacctgg ccagcaccaa cggcgccaat      360
tttggccagg gcaccaagct gacagtgctt ggcggaggcg gaggttctgg tggcggagga      420
agtggcggcg gaggatcagg cggtggtgga tctgaagtgc agctggtgga atcaggcgga      480
ggactggttc aacctggcgg ctctctgaga ctgagctgta ccgcctctgg cttctccctg      540
accgactact actacatgac ctgggtccga caggcccctg gcaaaggact tgagtgggtc      600
ggattcatcg accccgacga cgatccttac tacgccacat gggccaaggg cagattcacc      660
atcagccggg acaacagcaa gaacaccctg tacctccaga tgaacagcct gagagccgag      720
gacaccgccg tgtactattg tgccggcgga gatcacaata gcggctgggg actcgatatc      780
tggggccagg gaacactggt caccgtgtct agtgacaaga cccacacctg tcctccatgt      840
cctgctccag aactgctcgg cggaccttcc gtgttcctgt ttcctccaaa gcctaaggac      900
accctgatga tcagcagaac ccctgaagtg acctgcgtgg tggtggatgt gtcccacgag      960
gatcccgaag tgaagttcaa ttggtacgtg gacggcgtgg aagtgcacaa cgccaagacc     1020
aagcctagag aggaacagta caatagcacc tacagagtgg tgtccgtgct gaccgtgctg     1080
caccaggatt ggctgaacgg caaagagtac aagtgcaagg tgtccaacaa ggccctgcct     1140
gctcctatcg agaaaaccat ctccaaggcc aagggccagc ctagggaacc ccaggtttac     1200
acactgcctc caagcaggga cgagctgaca aagaaccagg tgtccctgac ctgcctggtc     1260
aagggcttct acccttccga tatcgccgtg gaatgggaga gcaatggcca gcctgagaac     1320
aactacaaga caacccctcc tgtgctggac agcgacggct cattcttcct gtacagcaag     1380
ctgacagtgg acaagagcag atggcagcag ggcaacgtgt tcagctgctc cgtgatgcac     1440
gaggccctgc acaaccacta cacccagaag tccctgagcc tgtctcctgg caaatgagcc     1500
acgcgtaaca cgtgcatgcg agagatctga                                      1530
<210>  77
<211>  498
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Бролуцизумаб, слитый с Fc
<400>  77
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1               5                   10                  15
Gly Ala Tyr Gly Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser
20                  25                  30
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Ile Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Ile
35                  40                  45
Ile His Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
50                  55                  60
Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser
65                  70                  75                  80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ala Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser
85                  90                  95
Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Tyr
100                 105                 110
Leu Ala Ser Thr Asn Gly Ala Asn Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Thr
115                 120                 125
Val Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
130                 135                 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly
145                 150                 155                 160
Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser
165                 170                 175
Gly Phe Ser Leu Thr Asp Tyr Tyr Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala
180                 185                 190
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Phe Ile Asp Pro Asp Asp Asp
195                 200                 205
Pro Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
210                 215                 220
Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu
225                 230                 235                 240
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Gly Gly Asp His Asn Ser Gly Trp
245                 250                 255
Gly Leu Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Asp
260                 265                 270
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
275                 280                 285
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
290                 295                 300
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
305                 310                 315                 320
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
325                 330                 335
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
340                 345                 350
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
355                 360                 365
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
370                 375                 380
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
385                 390                 395                 400
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
405                 410                 415
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
420                 425                 430
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
435                 440                 445
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
450                 455                 460
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
465                 470                 475                 480
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
485                 490                 495
Gly Lys
<---