Способ клонального микроразмножения растений сем. Betulaceae
METHOD FOR CLONAL MICRO-REPRODUCTION OF BETULACEAE FAMILY PLANTS

Изобретение относится к биотехнологии и воспроизводству лесных древесных растений на искусственных питательных средах в стерильных условиях in vitro и может быть использовано в лесном хозяйстве для массового получения посадочного материала древесных растений сем. Betulaceae.
Известен способ клонального микроразмножения селекционного посадочного материала березы карельской, по которому в качестве экспланта используют проростки гибридных семян. Полученные проростки разрезают на черенки и высаживают на питательную среду Мурасиге-Скуга. На этой же среде проводят мультипликацию побегов, их укоренение и последующую высадку в грунт. Средний прирост к концу вегетационного периода составляет от 20 до 36 см в зависимости от срока высадки растений в грунт (патент РФ №206695, МПК А01Н 4/00, опубл. 27.09.1996 г.).
В указанном способе используются проростки гибридных семян, у которых возможно расщепление признаков в потомстве. Это означает, что часть клонов (не менее чем 10%) в дальнейшем не будет обладать признаками исходных растений. Кроме того, этот способ не подходит для многих других древесных растений, у которых уникальные свойства сохраняются не при семенном, а только при вегетативном размножении.
Наиболее близким к заявленному является способ клонального микроразмножения гибридов карельской березы, по которому в качестве исходных эксплантов используют верхушечные и пазушные почки. Рост каллуса и формирование микропобегов проводят на основной агаризованной питательной среде Мурасиге-Скуга, содержащей в качестве фитогормонов 80-120 мг/л лизина, 0,05-0,15 мг/л кинетина, 0,6-1,0 мг/л 6-бензиламинопурина (БАП) и 0,05-0.08 мг/л α-нафтилуксусной кислоты (НУК). В последующем удлинение побегов осуществляют на агаризованной питательной среде с уменьшенной вдвое концентрацией макросолей по Мурасиге-Скуга и с добавлением 0,6-1,0 мг/л БАП и 0,3-0,5 мг/л индолилуксусной кислоты (ИУК). Укоренение осуществляют на жидкой питательной среде Мурасиге-Скуга, содержащей дополнительно 0,4-0,6 мг/л ИМК и 0,1-0,3 мг/л НУК. Культуры выращивают при освещении лампами 10000 лк на 16-часовом фотопериоде при 25°С и относительной влажности воздуха 70%. Укорененные растения-регенеранты высаживают в почву в теплицу с последующей высадкой в открытый грунт. Указанный способ позволяет в течение 10-11 недель получить посадочный материал, при этом приживаемость растений составляет в среднем 76% (авторское свидетельство СССР №1752284, МПК А01Н 4/00, публ. 07.08.1992 г.).
Однако согласно данному способу индукцию микропобегов осуществляют из каллуса, что, с одной стороны, повышает коэффициент размножения, а с другой - при прохождении клетками стадии дедифференцировки в условиях in vitro не исключает процесс их полиплоидизации и анеуплоидизации, приводящих к сомаклональной изменчивости, в результате чего увеличивается вероятность получения генетически измененного клонового потомства. Для получения каллусной ткани используют дорогостоящие реактивы, например фитогормоны (лизин, НУК, ИУК, БАП, кинетин), кроме того, присутствие этапа каллусообразования удлиняет процесс в целом. Использование большого количества стеклянных сосудов малого объема повышает трудозатраты и требует увеличения площади стеллажей. Поэтому полный цикл получения посадочного материала является трудоемким, дорогостоящим и длительным. Недостатком является также необеспеченность микропобегов оптимальными условиями на этапе укоренения, поскольку при длительном нахождении в жидкой среде они испытывают гипоксию (недостаток кислорода), которая угнетает развитие растений и формирование корневой системы, снижая в дальнейшем их приживаемость.
Задачей настоящего изобретения является разработка экономичного способа клонального микроразмножения растений семейства Betulaceae, позволяющего получать одновременно большое количество высококачественных растений-регенерантов in vitro, сохраняющих ценные признаки исходных генотипов.
Техническим результатом изобретения является повышение скорости роста и развития микропобегов, активизация корнеобразования in vitro, увеличение приживаемости, а также удешевление процесса получения посадочного материала, соответствующего исходному генотипу.
Заявленный технический результат достигается тем, что в способе клонального микроразмножения растений сем. Betulaceae, включающем размещение верхушечных и боковых почек на агаризованной питательной среде Мурасиге-Скуга in vitro для индукции микропобегов, их элонгации и мультипликации с переносом на жидкую питательную среду для укоренения, согласно изобретению, индукцию микропобегов осуществляют из апикальной ткани вегетативных почек, индукцию, элонгацию и мультипликацию полученных микропобегов проводят на агаризованной питательной среде, содержащей минеральную основу по Мурасиге-Скуга и дополнительно включающей 0,25-2,0 мг/л БАП, 20000-3000 мг/л сахарозы, 6000 мг/л агара, а укоренение осуществляют путем одновременного размещения необходимого количества микропобегов в сосуде на перфорированной площадке, закрепленной выше уровня жидкой питательной среды, содержащей уменьшенную вдвое концентрацию макросолей по Мурасиге-Скуга, включающей дополнительно 0,2-0,6 мг/л ИМК и 15000-25000 мг/л сахарозы, и осуществляют в автоматическом режиме циклическое чередование процессов экспозиции микропобегов в воздушной среде, влажностью 80-90%, и погружения их в жидкую питательную среду на 1-3 мин 2-3 раза в сутки путем подъема ее уровня, с дополнительной аэрацией воздуха внутри сосуда по 2-4 минуты через равные промежутки времени от 10 до 15 раз в сутки в течение 16-часового фотопериода.
Предлагаемый способ клонального микроразмножения растений семейства Betulaceae реализуется следующим образом.
Берут верхушечные и боковые вегетативные почки у растений сем. Betulaceae с ауксибластов (молодые побеги текущего года), достигших длины от 1 до 3 см, стерилизуют с помощью антисептических и дезинфицирующих средств. Эксплант, взятый от ауксибласта на ранних этапах его развития, в значительной степени свободен от микрофлоры, что упрощает процесс его стерилизации. В стерильных условиях из них вычленяют апикальную недифференцированную ткань и размещают в небольших стеклянных сосудах, объемом 125 мл, на агаризованной питательной среде (по 15 мл в один сосуд), содержащей минеральную основу по Мурасиге-Скуга, куда дополнительно вносят 0,25-2,0 мг/л БАП, 25000-30000 мг/л сахарозы, 6000 мг/л агара (табл. 1, среда А). На этой среде в течение 2-3 недель индуцируют пазушные побеги. Использование минимального набора фитогормонов (только БАП) в питательной среде на побегообразование является не только экономически выгодным, но также препятствует формированию каллуса и способствует сохранению гарантированных признаков исходного генотипа. Затем осуществляют процесс элонгации и мультипликации путем черенкования полученных микропобегов на сегменты с размещением их на свежей питательной среде того же состава для последующей индукции на них побегов de novo. Мультипликацию микропобегов повторяют в зависимости от потребностей в объеме посадочного материала. Для процесса корнеобразования отбирают необходимое количество микропобегов, достигших длины 1,5-3,0 см, с хорошо развитыми листьями и одновременно общей массой размещают в стерильный сосуд, объемом 3,5 л, содержащий 0,5 л жидкой питательной среды. Микропобеги в сосуде размещают свободно на поверхности перфорированной площадки, которая закреплена выше уровня жидкой питательной среды. Размещение микропобегов без их индивидуальной фиксации в общем сосуде значительно сокращает временные затраты и экономит площадь рабочей поверхности, предназначенной для культивирования. Подготовленная для корнеобразования среда содержит уменьшенную вдвое концентрацию макросолей по Мурасиге-Скуга и дополнительно 0,2-0,6 мг/л ИМК и 15000-25000 мг/л сахарозы (табл. 1, среда Б). Исключение агара из среды на корнеобразование значительно удешевляет процесс получения растений-регенерантов. Укоренение микропобегов проводят на стеллажах при температуре 23-27°C, 16-часовом фотопериоде и освещенности общей интенсивности от 3000 до 10000 лк в течение 2-3 недель. Формирование корневой системы осуществляют при циклическом чередовании процессов экспозиции микропобегов в воздушной среде, влажностью 80%, и погружения их в жидкую питательную среду на 1-3 мин. Процесс повторяют 2-3 раза в сутки автоматически в соответствии с заданным интервалом времени. Погружение микропобегов обеспечивается путем подъема жидкой питательной среды до уровня, обеспечивающего их покрытие. При этом дополнительно проводят аэрацию воздуха внутри сосуда по 2-4 мин в автоматическом режиме через равные промежутки времени от 10 до 15 раз в сутки в течение 16-часового фотопериода. Заявляемый режим создает оптимальные условия для корнеобразования, обеспечивающие формирование не одного главного корня, а нескольких, причем с боковыми ответвлениями. Кроме того, наблюдается активизация роста и развития растений, благодаря чему они становятся более адаптированными, позволяющими в дальнейшем повысить их приживаемость в условиях ex vitro. Экспериментальным путем выявлено, что поднятие уровня жидкой питательной среды на 1-3 мин 2-3 раза в сутки с погружением в нее микропобегов достаточно для поглощения ими необходимого количества питательных веществ. При этом тургор тканей не снижается, а гипоксия практически исключается. Многократная аэрация внутри сосуда оптимизирует условия газообмена и способствует обновлению воздушной среды, препятствуя накоплению в ней этилена и других газов, которые оказывают в основном тормозящее влияние на процессы роста.
Апробация способа проводилась в течение 4-х лет (2012-2015 гг.) в лабораторных условиях, полученные растения-регенеранты высаживали на экспериментальных участках.
Заявляемый способ предназначен для массового получения посадочного материала редких растений сем. Betulaceae, имеющих генетически обусловленные изменения в текстуре древесины (карельская береза Betula pendula Roth var. carelica (Merclin) Hamet-Ahti, ледяная береза - Ice birch), форме листовой пластинки (далекарлийская береза В. pendula Roth var. dalecarlica Schneid. (L. f.), береза иволистная, ольха мелкорезная Alnus incana f. angustissima Holmberg ex Hylander) или кроне (береза Юнга В. pendula Roth f. Youngii), и др., которые относятся к трудно укореняемым.
Пример 1. Материалом для размножения служили деревья карельской березы, зарегистрированные в республиканском реестре плюсовых деревьев Республики Карелия. Возраст деревьев от 15 до 63 лет. Для клонального микроразмножения в качестве экспланта использовали апикальную недифференцированную ткань верхушечных и боковых вегетативных почек, освобожденных от микрофлоры с помощью различных антисептических и дезинфицирующих веществ. Индукцию, элонгацию и мультипликацию микропобегов осуществляли на агаризованной питательной среде А (табл. 1). Микропобеги, достигшие примерно 2,0 см, одновременно, в варианте 1 - в количестве 11 шт., в варианте 2 в количестве - 352 шт. в асептических условиях размещали хаотично в стерильных сосудах на закрепленной перфорированной площадке. На дно сосуда наливали жидкую питательную среду для корнеобразования (табл. 1, среда Б) с добавлением 0,2 мг/л ИМК и 20000 мг/л сахарозы. Формирование корневой системы у микропобегов происходило на стеллажах при температуре 23-27°C, 16-часовом фотопериоде и освещенности общей интенсивности от 3000 до 10000 лк в течение 2-3 недель. В процессе укоренения в автоматическом режиме осуществляли циклическое чередование процесса экспозиции микропобегов в воздушной среде, влажностью 90%, и погружения их в жидкую питательную среду путем подъема ее уровня 2 раза в сутки на 1 мин, с дополнительной аэрацией воздуха внутри сосуда через равные промежутки времени по 4 мин 10 раз в сутки в течение 16-часового фотопериода.
Предложенный способ обеспечивает увеличение количества корней на 40-60%, т.к. происходит формирование не только одного главного корня, а нескольких, поскольку имеет место развитие бокового ветвления. При укоренении предлагаемым способом образование корней ускоряется на 2-4 дня. В предложенном способе приживаемость ех vitro растений-регенерантов составляет в среднем 84%, в известном способе - 76%. Прирост растений-регенерантов, полученных по предлагаемому способу, варьирует от 45 до 75 см. Предложенный способ позволяет проводить культивирование взрослых деревьев карельской березы в укороченные сроки от 7 до 8 недель, тогда как в известном способе требуется 10-11 недель. Данные по росту растений-регенерантов, развитию их корневой системы, приживаемости и длительности процесса культивирования приведены в табл. 2.
Пример 2. Исходные деревья далекарлийской березы произрастают на экспериментальных участках вблизи г. Петрозаводска. Экспланты в виде апикальной ткани вегетативных почек размещали на агаризованной среде А (табл. 1) и индуцировали пазушные побеги, как в примере 1. Элонгацию и мультипликацию проводили на свежей среде того же состава. Затем микропобеги в количестве 44 штук одновременно свободно размещали в сосуде на перфорированной площадке, закрепленной выше жидкой питательной среды Б (табл. 1). Формирование корневой системы у микропобегов проводили на стеллажах при тех же условиях освещения, как описаны в примере 1. При этом в автоматическом режиме осуществляли циклическое чередование процессов экспозиции микропобегов в воздушной среде, влажностью 80%, и погружения их в жидкую питательную среду на 2 мин 3 раза в сутки путем подъема ее уровня, обеспечивающего покрытие растений. При этом проводили дополнительную аэрацию воздуха внутри сосуда по 3 мин через равные промежутки времени 12 раз в сутки в течение 16-часового фотопериода. Экспериментальные данные по росту растений-регенерантов, развитию их корневой системы, приживаемости и длительности процесса культивирования приведены в таблице 2. Длина стебля полученных растений-регенерантов варьировала от 1,8 до 4,8 см и в среднем составила 3,1 см. Корневая система представлена не одним главным корнем, а 4 и даже 8, с боковым ветвлением, приживаемость составляет 89%.
Пример 3. Материалом для укоренения служили микропобеги ольхи мелкорезной. Индукцию, элонгацию и мультипликацию эксплантов осуществляли, как описано в примере 1, на аналогичной питательной агаризованной среде А (табл. 1). Затем полученные множественные побеги в количестве 63 шт. отделяли и одновременно размещали в общем сосуде на перфорированной площадке, закрепленной выше уровня жидкой питательной среды Б (табл. 1). Формирование корневой системы у микропобегов проводили при циклическом чередовании процессов экспозиции микропобегов в воздушной среде, влажностью 85%, и последующего погружения их в жидкую питательную среду на 3 мин 2 раза в сутки путем подъема ее уровня, обеспечивающего покрытие растений. При этом обеспечивали дополнительную аэрацию воздуха внутри сосуда по 2 мин через заданные равные промежутки времени 15 раз в сутки в течение 16-часового фотопериода. При увеличении частоты и длительности времени подъема уровня жидкой питательной среды у микропобегов наблюдается витрификация побегов, что препятствует их дальнейшему росту и развитию. Данные по росту растений-регенерантов, развитию их корневой системы, приживаемости и длительности процесса культивирования приведены в таблице 2. Анализ представленных результатов показывает, что совместное культивирование по заявленному режиму на этапе укоренения позволяет значительно сократить временные и трудовые затраты. Растения-регенеранты имели до 4-х корней, длиной до 3,7 см. Укоренение составило 75,2%, приживаемость 82%, общая длительность культивирования составила 7-9 недель.
Таким образом, применение предлагаемого способа клонального микроразмножения позволяет значительно сократить использование дорогостоящих реактивов, таких как фитогормоны и агар, что значительно удешевляет культивирование растений in vitro и исключает этап каллусообразования, приводящий к генетическому изменению клонового потомства. Создание оптимальных условий при укоренении микропобегов за счет особого режима кратковременного погружения растений в жидкую питательную и последующего длительного их экспонирования в воздушной среде с высокой влажностью обеспечивает ускоренное формирование корневой системы у микропобегов при сокращении сроков культивирования на 2-3 недели и составляющих 7-8 недель. Высота растений в первый год после их высадки в почву составила от 35 до 75 см. Активизация корнеобразования дает возможность ускорить процесс формирования корневой системы, увеличить количество и длину корней, что способствует повышению жизнеспособности растений, обеспечивающей увеличение их приживаемости до 83% при высадке в грунт. Важным преимуществом предлагаемого способа по сравнению с известными является возможность получать одновременно массовое количество высококачественных растений-регенерантов ценных представителей семейства Betulaceae при экономии средств и снижении трудозатрат, что позволяет широко использовать его в практике лесного хозяйства.