ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS RECB-95 ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА БИОПРЕПАРАТА ЗАЩИТЫ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ ОТ СТРЕССОВ, СТИМУЛЯЦИИ ИХ РОСТА И ПОВЫШЕНИЯ УРОЖАЙНОСТИ
BACTERIAL STRAIN BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS RECB-95 FOR PRODUCTION OF BIOPREPARATION FOR PROTECTION OF AGRICULTURAL PLANTS FROM STRESSES, STIMULATION OF THEIR GROWTH AND INCREASE OF CROP CAPACITY

Изобретение относится к области сельскохозяйственной микробиологии и биотехнологии, в частности, к производству биологических препаратов для защиты растений от стрессов, и может быть использовано для создания биологических препаратов для повышения устойчивости к стрессам, стимуляции роста и повышения урожайности сельскохозяйственных культур.
Различные стрессы (абиотические, биотические и антропогенные) наносят значительный ущерб как урожайности, так и качественным характеристикам урожая сельскохозяйственных культур [1]. В контроле различных стрессов растений существенное значение имеют различные биопрепараты на основе различных микроорганизмов [2]. Известно, что биопрепараты оказывают положительное влияние на продуктивность и качественные характеристики сельскохозяйственных культур [3]. Для решения данной задачи наиболее часто используются биологические препараты на основе различных микроорганизмов. В качестве перспективных микроорганизмов в контроле стрессов выступают бактерии рода Bacillus [4], многие из которых повышают устойчивость растений к абиотическим стрессам и инфекционным болезням. Спорообразующие бактерии рода Bacillus имеют преимущество, поскольку их споры устойчивы при высоких температурах, неблагоприятных условиях внешней среды, что позволяяет создавать биопрепараты с продолжительными сроками хранения без потери активности [5]. В связи с этим, штаммы бактерий рода Bacillus являются перспективными для создания новых биопрепаратов для защиты растений от стрессов.
Известна большое количество штаммов бактерий рода Bacillus, обладающих способностью подавлять рост фитопатогенных грибов и стимулировать формирование урожая сельскохозяйственных культур. В частности, это Bacillus subtilis ВНИИСХМ 128 и биопрепарат Фитоспорин, созданный на основе этого штамма [6]; В. subtilis BZR 517 [7]; В. subtilis Б 93 ВИЗР [8], В. mojavensis Lhv-97 [9] и др.
Недостатком всех вышеперечисленных штаммов является недостаточная активность в отношении снижения негативного действия различных стрессов на растения и недостаточное изученное влияние на урожайность и качество сельскохозяйственных культур.
Наиболее близким к предлагаемому изобретению является штамм Bacillus amyloliquefaciens OPS-32, обладающий способностью подавлять развитие фитопатогенов, стимулировать рост растений, повышать доступность элементов питания из почвы и повышать урожайность [10]. Однако, для данного штамма не изучено влияние на устойчивость растений к абиотическим стрессам.
Задачей изобретения является выявление штамма, пригодного для получения биологического препарата с высокой активностью в повышении устойчивости растений к различным стрессам, повышающего урожайность сельскохозяйственных культур и качественные характеристики получаемой продукции, а также позволяющего расширить набор средств биологической защиты растений от действия различных стрессовых факторов.
Поставленная задача решается тем, что выделен штамм Bacillus amyloliquefaciens RECB-95B, пригодный для получения биопрепарата повышающий устойчивость к стрессам, увеличивающий урожайность и качество сельскохозяйственных культур. Новый штамм выделен из стеблей томатов и депонирован в Национальном Биоресурсном Центре Всероссийская, коллекция промышленных микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика под регистрационным номером ВКПМ В-13417.
Основными критериями отбора служили повышение засухоустойчивости растений, стимулирование ростовых процессов, подавление роста фитопатогенных грибов, положительное влияние на продуктивность растений и качество продукции, отсутствие патогенности к теплокровным животным и совместимость с другими микроорганизмами. Видовая принадлежность определялась с использованием молекулярно-генетических методов по последовательности нуклеотидов в 16S рРНК, а также амплификацией видо-специфичного фрагмента, характерного для бактерий вида Bacillus amyloliquefaciens в НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика.
Штамм характеризуется следующими морфолого-культуральными и физиолого-биохимическими признаками.
Клетки штамма представляют собой грамположительные аэробные спорообразующие прямые палочки с закругленными концами размером 1,5-2,5×0,5-0,7 мкм; располагаются, как правило, парами или одиночно, цепочки встречаются реже. При спорообразовании клетки не раздуваются, споры эллипсовидные, расположены центрально.
На мясо-пептонном агаре (МПА) через 2 суток образует округлые колонии с фестончатым краем и кратерообразным центром, 6-7 мм в диаметре; с преимущественно складчато-бороздчатой поверхностью (у «кратера» поверхность гладкая), матовые, непрозрачные, цвет - в основном молочно-белый, в бороздах - серовато-бежевый. Колонии имеют выпуклое основание, рельефные складки и значительно приподнятый центральный кратер; обладают вязкой, тягучей консистенцией, при этом имеют наружный мягкий кожистый слой, в агар не врастают.
На картофельно-глюкозном агаре (КГА) через 2 суток образует круглые колонии с фестончатым краем и центром в виде узкого конуса, 5-10 мм в диаметре, складчатые, матовые, непрозрачные, молочно-белого цвета. Колонии имеют плоское основание, рельефные складки и приподнимающийся центр; обладают вязкой, тягучей консистенцией, при этом имеют наружный мягкий кожистый слой, в агар не врастают.
Bacillus amyloliquefaciens RECB-95B является аэробной, хемоорганоге-теротрофной бактерией, не нуждающейся в факторах роста. Растет в диапазоне температур от 10 до 47°С с оптимальным диапазоном 28-32°С, при значениях рН среды от 4,5 до 8,5 с оптимумом 7,0-7,5, при концентрации хлорида натрия до 7%.
Проявляет активность триптофандеаминазы и желатиназы. Активность β-галактозидазы (ортонитрофенил-βD-галактопиранозидазы), аргининдигидролазы, лизиндекарбоксилазы, орнитиндекарбоксилазы, уреазы не выявлена. Не продуцирует индол и сероводород и не восстанавливает нитраты. Реакция Фогес-Проскауэра (продукция ацетоина) положительная.
В качестве источника углерода и энергии утилизирует D-глюкозу, D-фруктозу, D-ксилозу, D-рибозу, L-арабинозу, D-маннозу, D-маннит, инозит, D-сорбит, метил-αD-маннопиранозид, метил-αD-глюкопиранозид, D-мальтозу, D-целлобиозу, D-лактозу, амигдалин, арбутин, эскулин, салицин, D-мелибиозу, D-сахарозу, D-трегалозу, D-раффинозу, крахмал, гликоген, гентибиозу, глицерин, цитрат.
Не утилизирует эритритол, D-арабинозу, D-адонитол, D-галактозу, L-ксилозу, L-сорбозу, L-рамнозу, метил-βD-ксилопиранозид, дульцитол, N-ацетилглюкозамин, инулин, D-мелецитозу, ксилит, D-туранозу, D-ликсозу, D-тагатозу, D-фукозу, D-арабит, L-арабит, глюконат калия, 2-кетоглюконат калия, 5-кетоглюконат калия.
Штамм хранится при 4-6°С в пробирках с полужидким агаром в минеральной среде (состав: калия фосфат двузамещенный 5.8 г/л, калия фосфат однозамещенный 3 г/л, аммоний сернокислый 1 г/л, глицерин 2 г/л с добавлением 0,7% агара, рН среды 7,0-7,2) под вазелиновым маслом, которое наливается в пробирки по истечению 2-х суток роста культуры. В таких условиях срок хранения штамма без пересева составляет не менее 1 года.
9
Штамм хорошо растет на МПА, КингБ, среде LB, сусло-агаре (состав: концентрат сусла пивного неохмеленного, разбавленный дистиллированной водой до общей концентрации сахаров 10% (10° Баллинга), рН 7,0-7,2 с добавлением 2,0% агар-агара), среде Громыко, среде Гаузе №2 (состав: триптон - 2,5 г; пептон - 5,0 г; NaCI - 5,0 г; глюкоза - 10,0 г; агар-агар - 20 г; вода водопроводная - 1000 мл; рН - 7,0-7,4) и минеральной среде (состав: калия фосфат двузамещенный 5.8 г/л, калия фосфат однозамещенный 3 г/л, аммоний сернокислый 1 г/л, глицерин 10 г/л с добавлением 0,7% агара, рН среды 7,0-7,2). Ферментация осуществляется на смеси равных объемов мясо-пептонного бульона и 6°Б неохмеленного пивного сусла (рН 6,9-7,2) при 30°С до 95% спорообразования. Количество КОЕ составляет не менее 5×10 в 1 мл.
Исследование патогенности заявляемого штамма для теплокровных животных были проведены в ГБОУ ВПО Казанском Федеральном университете, в результате которых было получено заключение о том, что по показателям вирулентности, диссеминации, токсичности и токсигенности штамм Bacillus mojavensis PS17 не патогенен для теплокровных животных и удовлетворяет требованиям, предъявляемым к промышленным микроорганизмам.
Более подробно сущность описываемого изобретения раскрывается в приведенных ниже примерах.
Пример 1. Исследование антагонистической активности штамма Bacillus amyloliquefaciens RECB-95B.
Для выявления антагонизма изучаемого штамма к фитопатогенным микроорганизмам использовали конфронтационный метод. В центр чашек Петри со средой Кинг Б выкладывали блок с мицелием тестируемого гриба, на расстоянии 2-3 см уколом высевали штамм Bacillus amyloliquefaciens RECB-95, в качестве негативного контроля использовали штамм Pseudomonas putida PCL1760, который высевался также уколом, который не выделяет какие-либо антагонистические вещества, подавляющие развитие микромицетов (фиг. 1-6). Чашки Петри помещали на 48-72 часа в термостаты при температуре 25°С для того, чтобы микромицеты и бактерии могли развиваться. Наблюдения проводили на 2-5 сутки в зависимости от скорости роста фитопатогена.
Результаты определения антагонистической активности штамма Bacillus amyloliquefaciens RECB-95B представлены на фиг. 1-6. На которой в качестве вариантов указаны: 1) - штамм Bacillus amyloliquefaciens RECB-95B, 2) Pseudomonas putida PCL1760. В качестве тест культуры микромицетов использованы: фиг. 1 - Aspergillus flavus, фиг. 2 - Penicillum sp., фиг. 3 - Fusarium equisety, фиг. 4 - Fusarium oxysporum ZUM2407, фиг. 5 - Fusarium sporotrichoides, фиг. 6 - Trichoderma asperellum RECB-74F.
Согласно представленной информации, штамм Bacillus amyloliquefaciens RECB-95B является активным антагонистом и обладает широким спектром фунгицидной активности, т.к. все использованные в исследовании микромицеты проявили чувствительность к антагонистичному штамму.
Пример 2. Лабораторные испытания фитотоксичности и ростостимулирующей активности штамма Bacillus amyloliquefaciens RECB-95B.
Для испытания стимулирующих свойств штамма Bacillus amyloliquefaciens RECB-95B были использованы зерна пшеницы сорта «Сим-бирцит». Для этого зерна замачивали в суспензии клеток, выращенной на богатой среде LB, которая состоит из 10 г/л бактотриптона, 5 г/л дрожжевого экстракта и 10 г/л хлорида натрия. Готовую среду стерилизовали 40 минут при 110°С. после замачивания семена выкладывали в кювету на фильтровальную бумагу, смоченную водопроводной водой. Семена проращивали 7 дней при температуре 23°С при длине светового дня 16 часов. Растения собирали и измеряли длину корней. По результатам экспериментов было показано, что штамм Bacillus amyloliquefaciens RECB-95B увеличивал длину стеблей и корней пшеницы (Табл. 1).
Пример 3. Оценка влияния Bacillus amyloliquefaciens RECB-95B на устойчивость растений к засухе.
Для оценки влияния Bacillus amyloliquefaciens на засухоустойчивость проводили вегетационные опыты. Объект исследований - яровой ячмень сорта Раушан. Семена ярового ячменя обрабатывали опытными препаратами изучаемых штаммов из расчета 1,0 л/т.Для проращивания семян ячменя использовали сосуды объемом 5 л. Сосуды предварительно взвешивали, добавляли на дно сосуда керамзит под углом в 45°, доведя керамзитом вес каждого сосуда до 500 г. В каждый сосуд раскладывали по 3,05 кг песка, увлажнив его в отдельной емкости раствором Кнопа до 50%. Семена высевались на глубину 1,5-2 см, в 27 вариантах по 35 семян на каждый сосуд (семена предварительно проращивали в чашках Петри на дистиллированной воде в течение суток и для посадки отбирали только нормально проросшие). После окончания посадки взвешивали сосуды и закрывали их сверху пищевой пленкой до появления всходов. В качестве контроля выступали не обработанные семена, стандартом был биофунгицид Ризоплан.
Для оценки влияния препаратов на засухоустойчивость определяли содержание в листьях пролина. Пролин является одним из наиболее многофункциональных стрессовых метаболитов растений. Повышенный уровень пролина в растениях часто связывают с засухоустойчивостью [11]. Кроме того, пролин выполняет шаперонную, антиоксидантную, сигнально-регуляторную и иные функции [12]. При действии стрессоров создаются условия для наиболее выраженного проявления указанных эффектов пролина [13]. Содержание свободного пролина определяли по методике Бейтса и соавт. [14].
Результаты определения содержания пролина в листьях показывают, что использование Bacillus amyloliquefaciens RECB-95B приводит к значительному увеличению показателя как в сравнении с контролем, так и у уровню стандартного биофунгицида.
Определение влияния изучаемого штамма на засухоустойчивость проводилась по прорастанию обработанных семян ярового ячменя в растворах сахарозы с разным осмотическим давлением [15]. Контрольные и обработанные семена раскладывались на фильтровальной бумаге в чашках Петри смоченные растворами сахарозы с разным осмотическим давлением - 0 (чистая вода) атм., 1,12 атм. (0,05 н. раствор сахарозы), 2,24 атм. (0,1 н раствор сахарозы), 4,48 атм. (0,2 н раствор сахарозы), 8,96 атм. (0,4 н раствор) и 11,2 атм. (0,5 н раствор) Через 7 дней определяли всхожесть. Повторность опыта - трехкратная. Результаты представлены в таблице 3.
Результаты определения показали, что использование Bacillus amyloliquefaciens RECB-95B оказывает положительное влияние на прорастание семян даже в условиях сильного осмотического стресса (моделирования засухи).
Пример 4. Оценка эффективности обработки растений яровой пшеницы штаммом Bacillus amyloliquefaciens RECB-95B в полевых условиях.
Полевые опыты проводились в 2018 году на опытных полях Казанского государственного аграрного университета. Объектом исследования выступала яровая пшеница сорта Йолдыз. Эффективность обработки штаммом Bacillus amyloliquefaciens RECB-95B определялась при обработке семян. Препарат на основе изучаемого штамма применялся в нормах 0,5 л/т, 1,0 л/т 1,5 л/т и 2,0 л/т семян. Контролем был вариант без обработки, а в качестве стандарта применяли биофунгицид Ризоплан (0,5 л/т). Расход рабочей жидкости при обработке семян - 10 л/т.
Результаты оценки влияния обработки семян на полевую всхожесть показали, что применение Bacillus amyloliquefaciens RECB-95B с нормами 1,5 и 2,0 л/т стимулирует прорастание семян яровой пшеницы в полевых условиях (табл. 4).
Использование Bacillus amyloliquefaciens RECB-95B с нормами 0,5 л/т, 1,0 и 1,5 л/т существенно снизило поражение растений яровой пшеницы корневыми гнилями, превосходя по эффективности стандартный биофунгицид (табл. 5).
Применение для обработки семян яровой пшеницы препарата на основе Bacillus amyloliquefaciens RECB-95B, в зависимости от нормы расходы, увеличивает урожайность на 0,42-0,89 т/га (табл. 6). По своему влиянию на урожайность полученный штамм превосходит показатели стандартного биофунгицида Ризоплана.
Пример 5. Оценка эффективности обработки семян ярового ячменя штаммом Bacillus amyloliquefaciens RECB-95B в полевых условиях.
Полевые опыты проводились в 2018 году на опытных полях Казанского государственного аграрного университета. Объектом исследования выступала яровой ячмень сорта Раушан. Эффективность обработки штаммом Bacillus amyloliquefaciens RECB-95B определялась при обработке семян. Препарат на основе изучаемого штамма применялся в нормах 0,5 л/т, 1,0 л/т 1,5 л/т и 2,0 л/т семян. Контролем был вариант без обработки, а в качестве стандарта применяли биофунгицид Ризоплан (0,5 л/т). Расход рабочей жидкости при обработке семян - 10 л/т.
Во всех вариантах с применением Bacillus amyloliquefaciens RECB-95B повышалась содержание пролина, что свидетельствует о повышении засухоустойчивости растений (табл. 7).
Минимальные значения поражения растений корневыми гнилями были при применении Bacillus amyloliquefaciens RECB-95B с нормами 1,0 и 2,0 л/т (табл. 8).
Наибольшая урожайность ярового ячменя была при применении Bacillus amyloliquefaciens RECB-95B (1,5 л/т). Прибавка составила - 0,99 т/га (табл. 9).
Применение Bacillus amyloliquefaciens RECB-95B (за исключением нормы 1,5 л/т) привело к росту и содержания белка в зерне ячменя (табл. 10).
Таким образом, технический результат заявляемого изобретения - стимуляция роста сельскохозяйственных растений и защита их от стрессов, следствием чего является повышение их урожайности и качественных характеристик. Он достигается тем, что в качестве средства для обработки растений используется штамм бактерии Bacillus amyloliquefaciens RECB-95B, обладающий комплексом полезных свойств, таких как способность повышать устойчивость растений к засухе, подавлять рост фитопатогенных грибов, стимулировать рост проростков, увеличивать урожайность и качество сельскохозяйственных культур.
Изобретение создано при финансовой поддержке Минобрнауки России в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014-2020 годы» по соглашению №14.610.21.0017 от 03 октября 2017 г., уникальный идентификатор проекта RFMEFI61017X0017.