КУЛЬТУРЫ β-КЛЕТОК ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ЖИВОТНЫХ ИСТОЧНИК МАТЕРИАЛА ДЛЯ КСЕНОГЕННОЙ ТРАНСПЛАНТАЦИИ В ТЕРАПИИ САХАРНОГО ДИАБЕТА ДОМАШНИХ ЖИВОТНЫХ

5. Давыдовский И.В. Проблема причинности в медицине. Этиология. - М.: Медгиз, 1962. - 175 с.

6. Синещеков А.Д. Биохимия питания сельскохозяйственных животных. - М.: Колос, 1965. - 399 с.

7. Горленко М.В., Кожевин П.А. Мультисубстратное тестирование природных микробных сообществ. - М.: МАКС Пресс, 2005. - 88 с.

8. Garland J.L., Mills A.L. Classification and characterization of heterotropic microbial communities on the basis of patterns of community levelsole-carbon-sourse utilization//Appl. Environ. Microbiol. - 1991. -Vol.57. - P.2351-2359.

STIMULATIVE AND INHIBITIVE EFFECT OF THE NATRIUM HYPOCLORITE ON THE MICROBIOM

AND SOMATIC CELLS OF THE MICE ORGANISM

D.D. Gomboev

Summary. The aim of the research was to determine the conditions of predominance of stimulatory and inhibitory action of sodium hypochlorite on the microbial and somatic cells of animals. With insufficient amounts of protein (peptone) - breeding in 5 and 10 times the standard environment MPA hypochlorite inhibited the growth of test culture E.coli. Constant hypochlorite watering of mice by the end of 1.3 weeks influenced on the weight which decreased from 25 to 19,1 ± 0,5 g. The muscle strength and functional activity of the intestinal microflora also decreased. Watering hypochlorite twice a week did not affect the microflora, but increased the secretion and activity of lymphoid cells of submucosal layer of the intestine. Thus, the basic condition for the small increase of microorganisms by the action of sodium hypochlorite, is a small concentration of protein in the culture medium. After constant hypochlorite watering the inhibition of normal intestinal microflora occures, disbiotic phenomenon develops. Twice a week hypochlorite watering helps to increase the functional activity of intestinal microflora and intestinal syncytium.

Key words: natrium’s hypochlorite, active oxygenium’s forms, simbiothic microflora, multisubstration test.

УДК. 576.3/.7.086.83:612.014

КУЛЬТУРЫ в-КЛЕТОК ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ЖИВОТНЫХ - ИСТОЧНИК МАТЕРИАЛА ДЛЯ КСЕНОГЕННОЙ ТРАНСПЛАНТАЦИИ В ТЕРАПИИ САХАРНОГО ДИАБЕТА ДОМАШНИХ ЖИВОТНЫХ

И.К. АБДРАХМАНОВ, кандидат биологических наук, докторант

ВНИИ экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко

Н.Б. САВЕНКО, кандидат биологических наук ОАО «РосНТЦагроЧС»

E-mail: abdrakhman@mail.ru

Резюме. Трансплантация в-клеток поджелудочной железы - альтернативный метод лечения инсулинозависимого сахарного диабета. Ксеногенная трансплантация в гуманной медицине признана наиболее приемлемым методом, так как позволяет использовать максимальное количество функционирующих в-клеток. Однако в связи с отсутствием сведений по лечению диабета у мелких домашних животных, использование для трансплантации материала от аллоген-ного донора может оказать более существенное влияние на течение заболевания.

В статье даны морфологические и функциональные характеристики в-клеток из поджелудочной железы плодов кролика, собаки и кошки.

Клетки плодов собаки, по сравнению с кроличьими и кошачьими, характеризовались самой низкой адгезией, повышенные адгезивные свойствами отмечены у культуры в-клеток кошек. Уровень продукции инсулина (в кондиционированных средах) в-клетками кролика на 3...4 сут. культивирования составил 38...80 мкИЕ/мл, собаки - 52. 84 мкИЕ/мл, кошки - 37.77 мкИЕ/мл.

По степени выраженности стимулирующего эффекта глюкозой на продукцию инсулина в-клетки всех изученныхживотных идентичны. Наибольшая разница между пиковыми концентрациями инсулина не превышала 10 %, попадая в пределы погрешности.

Сроки жизни культуры в-клеток поджелудочной железы плодов кошек (8.10 сут.) заметно короче, чем у кролика (16.18 сут.) и собаки (14.18 сут.).

По доле выхода секреторных клеток, сроку их жизни и степени чистоты клеточного материала, наиболее приемлемы для трансплантации поджелудочные железы плодов кролика.

Ключевые слова: сахарный диабет, ксенотрансплантация, р-клетки поджелудочной железы, эндокринология

Развитие клеточных технологий открыло широкие возможности для альтернативного лечения инсулинозависимого сахарного диабета. Уже около 10 лет в гуманной медицине для восстановления панкреатической функции у больных сахарным диабетом I типа используют трансплантацию р-клеток поджелудочной железы, что предотвращает развитие тяжёлых гипогликемий и таких осложнений, как ангио-, нефро- и ретинопатии [3].

По происхождению клеточного материала выделяют три группы методов: аутотрансплантацию, аллотрансплантацию и ксенотрансплантацию.

Экспериментально установлено, что аутотрансплантация панкреатических островков после панкреатэктомии позволяет добиться эугликемии и нормализации клинических показателей при пересадке более 250 тыс. островков. Однако из-за того, что количество получаемого клеточного материала ограниченно, этот метод как перспективный не рассматривают [20].

Приоритетной в связи с идентичностью клеточного материала донора и реципиента, считают аллотрансплантацию р-клеток,. При этом происходит синтез инсулина, что обеспечивает максимальную компенсацию сахарного диабета и минимизирует риск развития осложнений [8, 19]. Как и при любой аллотрансплантации, пересаженные островки подвергаются реакции отторжения [15, 10]. Для предотвращения этого процесса сегодня используют иммуносупрессивные препараты. Однако современные протоколы их применения не совершенны, основаны на использовании кортикостероидов, циклоспорина и такролима, и обладают выраженным диабетогенным эффектом [18, 21]. Более широкие возможности для клеточной трансплантации может открыть появление иммуносупрессоров нового поколения.

Перечисленные проблемы привели к развитию альтернативного метода - ксенотрансплантации, который позволяет добиваться адекватного эндокринного эффекта [1, 4].

В качестве наиболее перспективных ксеногенных доноров для трансплантации долгое время рассматривали свиней [16, 22]. Одна из причин, сдерживающих клиническое применение их р-клеток, - наличие эндогенного ретровируса (PERV), который потенциально может инфицировать клеточные линии человека [9, 13]. Однако на сегодняшний день сведения о заболеваниях пациентов, перенесших ксенотрансплантацию свиных р-клеток, отсутствуют. Серологические исследования, проведенные через 4.. .7 лет после ксенотрансплантации свиных островков, не обнаружили маркёрных генов PERV инфекции у реципиентов [13, 14].

В экспериментах на животных с индуцированным сахарным диабетом было показано, что при использовании предварительно культивированных р-клеток длительная ремиссия диабетического статуса может быть достигнута и без иммуносупрессии [2, 6]. Кроме того, ксеногенные р-клетки не подвергаются аутоиммунному повреждению, что характерно для аллотрансплантации [11].

В последние годы в качестве наиболее подходящего ксеногенного донорского материала рассматривают клетки поджелудочной железы плодов кроликов [5] или новорожденных крольчат [7]. Это позволяет значительно увеличить количество клиническихтрансплантаций, вследствие биодоступности материала и возможности его получения в достаточных количествах [7].

В прикладной ветеринарии метод лечения сахарного диабета I типа путем трансплантации р-клеток ранее не использовали. Очевидно, что для ветеринарных целей необходимо разрабатывать методы выделения р-клеток домашних животных. Можно предположить, что использование донорских р-клеток внутри вида приведет к улучшению результатов трансплантации.

Целью наших исследований было выделение р-кле-ток поджелудочной железы кроликов, собак и кошек и сравнение свойств их культур в качестве материала для ксеногенной трансплантации.

Условия, материалы и методы. Работа выполнена в отделе клеточной биотехнологии ВНИИ экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко. В качестве объектов в эксперименте использовали плоды кроликов на 26 сутки гестации (68 плодов от 10 крольчих), плоды собак на 38.56 сутки (15 плодов от 3 сук) и плоды кошек на 42.50 сутки гестации (12 плодов от 3 кошек). Животным-донорам удаляли беременную

матку исключительно по медицинским показаниям под общей анестезией. Выделение в-клеток проводили по методике, описанной Feldman et al. (1975), оптимизированной нами ранее.

Полученные клеточные культуры оценивали по цитологическим признакам, цитохимическому выявлению внутриклеточного инсулина [12], иммуно-цитохимическому окрашиванию антителами против инсулина [17]. Содержание инсулина в культуральной среде определяли радиоиммунным методом. Кроме того, был проведен ряд тестов по стимуляции в-клеток глюкозой для определения уровня продукции инсулина в культуральной среде, что служит необходимым условием функционирования в организме при трансплантации [10].

Результаты и обсуждение. К 7 суткам культивирования мы установили увеличение размеров колоний в-клеток плодов кролика и формирование плотных многослойных конгломератов. По их краям наблюдали уплотненную зону роста фибробластов. Начиная с 10.12 дневного срока в культурах отмечены инволютивные изменения. При окрашивании альдегид-фуксином установлена специфическая пурпурная зернистость цитоплазмы в значительной части колоний клеток эпителиоподобной морфологии. Фибробласты при этом не прокрашивались. На протяжении всего срока культивирования интенсивность окрашивания существенно не менялась. Доля клеток со специфической зернистостью в колониях эпителиоподобных клеток превышала 90 %.

При иммуноцитохимическом окрашивании культуры клеток, выделенных из поджелудочной железы кролика, на инсулин с использованием флуоресцирующего красителя (FITC) наблюдалось специфическое желтозеленое «свечение» колоний, прикрепившихся к стеклу; а при использовании антител, меченных пероксидазой хрена - специфическое окрашивание секреторных клеток.

Клетки плодов собаки, по сравнению с кроличьими и кошачьими, характеризовались самой низкой адгезией. В таких культурах отмечено наибольшее количество плавающих клеток (одиночных и группами). Клетки, идентифицированные как в-клетки по продукции инсулина, были округлыми с зернистой вакуолизированной цитоплазмой. Основная их особенность - формирование крупных многослойных плавающих колоний. Однако к 7.10 сут. культивирования клетки замедляли рост, наблюдались признаки их дегенерации. К 14 сут. в культуре не оставалось ни одной живой секреторной клетки.

Клеточные культуры поджелудочной железы плодов кошек отличались повышенными адгезивными свойствами: в суспензии не было отмечено плавающих клеток. К 7 сут. культивирования во всех флаконах формировался плотный монослой фибробластов, в котором можно было визуально выделить небольшие колонии мелких эпителиальных клеток с высокой адгезией. В культуральной жидкости плавающих в-клеток не наблюдали. К этому сроку среда закислялась, рост клеток прекращался. При замене культуральной среды без пересева клеток дегенерация монослоя полностью происходила к 10 сут. Такой характер роста позволил заключить, что в-клетки плодов кошки во время культивирования подвергаются вытеснению фибробластами. Одной из причин этого явления может быть высокая адгезивная способность клеток, которая не позволяет их очистить. С другой стороны, можно предположить,

раннюю дегенерацию таких клеток, что делает их непригодными для дальнейшего культивирования и трансплантации.

Уровень продукции инсулина(в кондиционированных средах) р-клетками кролика на 3.4 сут. культивирования составил 38.80 мкИЕ/мл, собак - 52.84 мкИЕ/ мл, кошек - 37.77 мкИЕ/мл.

По степени выраженности стимулирующего эффекта глюкозой на продукцию инсулина р-клетки кролика, собаки и кошки оказались идентичными. Наибольшая разница между его пиковыми концентрациями не превышала 10 %, попадая в предел погрешности. Способность выделенных клеток реагировать на введение повышенных доз глюкозы

выбросом инсулина, доказывает функциональные особенности р-клеток.

Выводы. Таким образом, культуры клеток, полученные из поджелудочной железы кошек, отличаются от культур клеток собак и кроликов высокой адгезивной способностью и низким уровнем выхода секреторных клеток. Сроки жизни культуры р-клеток плода поджелудочной железы кошек составляет 8.10 сут., что заметно меньше, чем у клеток кроликов (16.18 сут.) и собак (14.18 сут.).

По доле выхода секреторных клеток, сроку их жизни и степени чистоты клеточного материала, наиболее приемлемый материал для трансплантации - поджелудочные железы плодов кролика.

Литература.

1. Беникова Е.А., Турчин И.С., Белякова Л.С. и др. Опыт лечения детей, страдающих сахарным диабетом, при помощи алло- и ксенотрансплнтации культуры островковых клеток поджелудочной железы // Проблемы эндокринологии. - №2. -1987. - С. 19-22.

2. Блюмкин В. Н., Скалецкий Н.Н., Попов В.Л. и др. Внеселезеночная трансплантация культур островковых клеток поджелудочной железы плодов человека крысам с экспериментальным сахарным диабетом // Бюл. Эксп. Биол. и мед. - 1983. - № 5. - С. 89-91.

3. Дедов И.И., Балаболкин М.И., Клебанова Е.М. Современные аспекты трансплантации островков поджелудочной железы при сахарном диабете // 3-й Всероссийский диабетологический конгресс. - Москва, 2004 г.

4. Комиссаренко В.П., Турчин И.С., Комиссаренко И.В. и др. Трансплантация культуры островковых клеток поджелудочных желез плодов человека и животных как метод лечения сахарного диабета // Врач. Дело. - 1983. - №4. - С. 52-56.

5. Леонович С.И., Слука Б.А., Игнатович И.Н., Горанов В.А., Трансплантация культуры островковых клеток поджелудочной железы в красный костный мозг. //Белорусский медицинский журнал. - 2004. -№1. - с.44.

6. Скалецкий Н.Н., Кирсанова Л.А., Баранова Н.В. идр. Получение культур островковыхклетокдля трансплантации: новые подходы и новое качество // Вестник трансплантологии и искусственных органов. - 2002. - №3. - С. 86.

7. Шумаков В. И., Блюмкин В. Н., Скалецкий Н. Н. и др., Трансплантация островковых клеток поджелудочной железы. Москва. - Канон.- 1995.-384с.

8. Шумаков В.И., Скалецкий Н.Н. Трансплантация островковых и других эндокринных клеток // В кн.: Трансплантология — руководство. - Тула: Репроникс Лтд, 1995. - С. 317-331.

9. Appel J.Z., Alwayn J.P.N., Cooper D.K.C. Xenotransplantation: the challenge to current psychological attitudes // Progress in Transplantation. - 2000. - Vol. 10. - №4. - pp. 217-225.

10. Bosco D., Meda P. Actively synthesizing beta-cells secrete preferentially after glucose stimulation // Endocrinology. - 1991. - Dec. - 129(6):3157-66.

11. Chu G., Markmann J.F., Ahn M. Xenogenic but not allogenic pancreatic islet graft survival in recipients lacking humoral immunity and major histocompatibility complex class II antigens// Trans. Proc. - 1997. - Vol. 29. - Issue 1-2. - pp. 625-627.

12. Drury, R.A.B., Wallington, E.A.(1980). Carleton's histological technique Ed. 5 Oxford University Press, Oxford, UK.

13. Groth C.G., Korsgren O. et al. Transplantation of porcine fetal pancreas to diabetic patients // Lancet. - 1994. - Vol. 344. - № 8934. - pp. 1402-1404.

14. Heneine W., Tibell A. et al. No evidence of infection with endogenous retrovirus in recipients of porcine islet-cell xenografts // Lancet. - 1998. - Vol. 352. - Issue 9129. - pp. 695-699.

15. Liu E.H., Herold K.C. Transplantation of the islets of Langerhans: new hope for treatment of type 1 diabtes mellitus// TEM-2000. - Vol ll. - №9. - pp. 379-382.

16. Rayat G.R., Rajotte R.V., Korbutt G.S. Potential application of neonatal porcine islets as treatment for type 1 diabetes: a review //Ann NY Acad. SCI. - 1999. - №875. - pp. 175-188.

17. Rieneck K., Bovin L.F., Josefsen K. Massive parallel gene expression profiling of RINm5F pancreatic islet beta-cells stimulated with interleukin-1beta//APMIS. - 2000. - Dec. - 108(12):855-72.

18. Shapiro J., Jordan M.L. et al. A prospective randomized trial of FK506/prednizolone vs 506/azathioprine/prednizolone in renal transplant patients// Transp. Proc. - 1995. - №27. - pp. 814-817.

19. Shapiro J. Eighty years after insulin: parallels with modern islets transplantation // Can. Med. Assoc.J. - 2002. - Vol 167. -№12. - pp. 1398-1400.

20. Stevens R.B., Matsumoto S., Marsh C.L. Is islet transplantation a realistic therapy for the treatment of type 1 diabetes in the near future // Clinical Diabetes. - 200l. - №19. - pp. 51-60.

21. Todo S., Fung J.J. et al. Liver, kidney and thoracic organ transplantation under FK506///Ann. Surg. - 1990. - №212. - pp. 295-305.

22. Weiss R. A. Xenotrsnsplantation //BMJ. - 1998. - №317. - pp. 931-934.

CULTURE p-CELLS OF THE PANCREAS OF ANIMALS - THE SOURCE FOR XENOGENEIC TRANSPLANTATION TO THE TREATMENT OF DOMESTIC ANIMALS WITH DIABETES MELLITUS.

I.K. Abdrakhmanov, N.B. Savenko

Summary. Transplantation of p-cells of the pancreas is an alternative method for treatment of diabetes mellitus. Xenogeneic transplantation is recognized as the most appropriate method in human medicine because it allows to use the maximum number of functioning p-cells. However, due to absence of data on treatment of diabetes of small domestic animals, the use of allogenic material for transplantation may have a significant effect on the disease.

This article describes the experience of isolation of p-cells of the pancreas from rabbit, dog and cat fetuses. Morphological and functional characteristics of the obtained cells are given.

Key words: pancreatic diabetes, xenotransplantation, pancreas cells, endocrinology