Способ определения резистентности тромбоцитов к антиагрегантным препаратам у пациентов с ишемической болезнью сердца
METHOD FOR DETERMINING THROMBOCYTE RESISTANCE TO ANTIAGGREGANT PREPARATIONS IN PATIENTS WITH ISCHEMIC HEART DISEASE

Способ определения резистентности тромбоцитов к антиагрегантным препаратам у пациентов с ишемической болезнью сердца.
Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии, клинической лабораторной диагностике и гематологии, и может быть использовано для определения резистентности к антиагрегантным препаратам у пациентов с ишемической болезнью сердца, принимающих лекарственные средства группы антиагрегантов.
Известен способ выделения суспензии тромбоцитов из периферической венозной крови, забранной из локтевой вены утром, натощак в пластиковые пробирки, содержащие антикоагулянт (цитрат натрия 3,8%) в соотношении 1 часть антикоагулянта на 9 частей крови. Кровь тщательно перемешивают с антикоагулянтом путем плавного покачивания. Для получения обогащенной тромбоцитами плазмы, забранную кровь подвергают центрифугированию при 1500 об/мин в течение 7 минут и собирают надосадочный слой. Для получения бедной тромбоцитами плазмы, оставшуюся в пробирке кровь подвергают центрифугированию еще при 3000 об/мин в течение 15 минут и собирают надосадок. Для каждого образца крови пациента определяют экспериментальные значения светопропускания, что приводит к индивидуальной калибровке прибора, где богатая тромбоцитами плазма принимается за 0%, а бедная тромбоцитами плазма за 100% агрегации у данного пациента. Затем кювету с богатой тромбоцитами плазмой помещают в прибор, 2 мин прогревают при 37°С, опускают мешалку и начинают графическую регистрацию кривой светопропускания на лазерном агрегометре в течение 5 мин, на 10 сек исследования вносят индуктор агрегации коллаген в концентрации 2 мкмоль/л и в соотношении плазмы с индуктором 10:1, получают графически-зарегистрированную кривую светопропускания и по максимальной величине светопропускания судят о величине агрегации тромбоцитов в %.
Недостатком способа-прототипа является его невысокая чувствительность в выявлении резистентности тромбоцитов к антиагрегантным препаратам, в случае если пациенты с ишемической болезнью сердца принимают лекарственные средства группы антиагрегантов не менее 6 месяцев.
Данный способ является наиболее близким к заявленному по технической сущности и достигнутому результату и выбран в качестве прототипа.
Цель предлагаемого изобретения - повышение точности коллаген-индуцированной агрегации тромбоцитов пациентов с ишемической болезнью сердца на фоне приема лекарственных средств группы антиагрегантов не менее 6 месяцев (кардиомагнил 75 мг).
Поставленная цель достигается тем, что для выявления резистентности к антиагрегантным препаратам у больных с ишемической болезнью сердца, принимающих лекарственные средства группы антиагрегантов не менее 6 месяцев, проводят забор крови в пробирку с 3,8% цитратом натрия в соотношении 9:1, разделяют на плазму и эритроциты с получением богатой и бедной тромбоцитами плазмы путем центрифугирования при 1500 об/мин в течение 7 минут и центрифугирования, оставшейся в пробирке крови, при 3000 об/мин в течение 15 минут, собирают надосадок и определяют индивидуально пациенту значения светопропускания, с графической регистрацией в течение 5 мин и постоянным перемешиванием при 37°С, на 10 сек исследования вносят индуктор агрегации коллаген в концентрации 2 мкмоль/л и в соотношении богатой тромбоцитами плазмой с индуктором 10:1, затем добавляют к суспензии тромбоцитов индуктор агрегации тромбоцитов коллаген дополнительно в соотношении 2:1 по 2 мкмоль/л на 1, 2, 3 и 4 минутах графической регистрации агрегации тромбоцитов на лазерном агрегометре и получают значения агрегации тромбоцитов в диапазоне от 45 до 100%.
Новым в предлагаемом способе является то, что индуктор агрегации коллаген вносится дополнительно к богатой тромбоцитами плазме индуктор коллаген в соотношении 2:1 по 2 мкмоль/л на 1, 2, 3 и 4 минутах графической регистрации агрегации тромбоцитов на лазерном агрегометре и при значениях агрегации в диапазоне 45-100% выявляют резистентность к антиагрегантным препаратам у пациентов с ишемической болезнью сердца.
Преимуществом предлагаемого в качестве изобретения способа является то, что анализ показателей агрегации тромбоцитов под влиянием неоднократного и дополнительного внесения индуктора агрегации коллагена позволяет с высокой точность выявить предрасположенность к повышенной агрегации тромбоцитов у пациентов с ишемической болезнью сердца, развивающейся, несмотря на непрерывный прием лекарственных средств группы антиагрегантов. Выявление у пациентов с ИБС повышенной агрегации тромбоцитов имеет важное значение при подборе терапии, направленной на снижение тромбообразования и достижение стойкого антитромботического эффекта. В свою очередь, выявление резистентности тромбоцитов к лекарственному средству группы антиагрегантов (кардиомагнил) позволяет оптимизировать индивидуальный подбор терапии.
Существенные признаки изобретения проявляют в заявленной совокупности новые свойства, явным образом не вытекающие из уровня техники в данной области и не являющиеся очевидными для специалиста.
Идентичной совокупности признаков не обнаружено в проанализированной патентной и научно-медицинской литературе.
Предлагаемый в качестве изобретения способ может быть использован в практическом здравоохранении для повышения точности диагностики.
Исходя из вышеизложенного, следует считать предлагаемый в качестве изобретения способ соответствующим условиям охраноспособности «новизна», «изобретательский уровень» и «промышленная применимость».
Способ осуществляется следующим образом.
Пациенту с основным диагнозом ишемическая болезнь сердца, находящемуся на регулярной кардиоактивной и непрерывной антиагрегантной терапии не менее 6 месяцев (кардиомагнил 75 мг в сутки), с нормальными уровнями лейкоцитов, тромбоцитов, гематокрита, глюкозы, холестерина и триглицеридов, АЧТВ и фибриногена, забирают кровь из локтевой вены утром, натощак в пластиковые вакуумные пробирки, содержащие антикоагулянт (цитрат натрия 3,8%) в соотношении 1 часть антикоагулянта на 9 частей крови. Кровь тщательно перемешивают с антикоагулянтом путем плавного покачивания. Разделяют центрифугированием на плазму и эритроциты с получением богатой и бедной тромбоцитами плазмы. Для получения обогащенной тромбоцитами плазмы, забранную кровь подвергают центрифугированию при 1500 об/мин в течение 7 минут и собирают надосадочный слой. Для получения бедной тромбоцитами плазмы, оставшуюся в пробирке кровь подвергают центрифугированию еще при 3000 об/мин в течение 15 минут и собирают надосадочный слой. Определяют индивидуальные значения светопропускания, где богатую тромбоцитами плазму принимают за 0%, а бедную тромбоцитами плазму за 100% агрегации у данного пациента и проводят калибровку прибора. Затем кювету с богатой тромбоцитами плазмой помещают в прибор, 2 мин прогревают при 37°С, опускают мешалку и начинают графическую регистрацию кривой светопропускания на лазерном агрегометре в течение 5 минут и на 10 сек исследования вносят индуктор агрегации коллаген в концентрации 2 мкмоль/л и в соотношении богатой тромбоцитами плазмы с индуктором 10:1, по кривой светопропускания фиксируют максимальное значение величины агрегации, если значение находятся в диапазоне от 0 до 45%, то новую кювету с богатой тромбоцитами плазмой, помещают в прибор, 2 мин прогревают при 37°С, опускают мешалку и начинают графическую регистрацию кривой светопропускания в течение 5 мин, а коллаген вносят дополнительно к богатой тромбоцитами плазме в соотношении 2:1 по 2 мкмоль/л на 1, 2, 3 и 4 минутах исследования регистрации агрегации тромбоцитов, затем по кривой светопропускания фиксируют максимальные значения величины агрегации и при значениях агрегации в диапазоне 45-100% выявляют резистентность к антиагрегантным препаратам у пациентов с ишемической болезнью сердца.
У больных с ишемической болезнью сердца, принимающих лекарственные средства группы антиагрегантов, агрегация тромбоцитов снижалась до 7-15% (р<0,001) по сравнения с нормативными значениями, которые составляют 45-60%. При этом значения агрегации тромбоцитов при дополнительном внесении индуктора агрегации коллагена в соотношении 2:1 по 2 мкмоль/л на 1, 2, 3 и 4 минутах регистрации агрегации тромбоцитов, приводила к повышению показателя агрегации от 55% до 85% (р<0,001), что свидетельствует о развитии резистентности тромбоцитов к лекарственному средству группы антиагрегантов (кардиомагнил).
Изменение при сердечно-сосудистых заболеваниях в условиях системного атеросклероза приводят к напряжению регуляторных механизмов различных систем, включая систему гемостаза. Нарушение функции эндотелия приводит к преобладанию вазоконстрикции, повышенному тромбообразованию, развитию воспаления и пролиферации в сосудистой стенке и дальнейшему прогрессированию атеросклероза [1, 4, 7]. Наличие резистентности тромбоцитов к антиагрегантным препаратам у пациентов с ишемической болезнью сердца принимающих лекарственные средства группы антиагрегантов не менее 6 месяцев не выявляется с помощью общепринятого метода способа-прототипа определения агрегации тромбоцитов, а выявляется только в условиях дополнительного и неоднократного внесения индукторов коллагена в соотношении 2:1 по 2 мкмоль/л на 1, 2, 3 и 4 минутах.
Пример 1.
Больная М., 54 года, находящая на стационарном лечении в отделения ишемической болезни сердца НИИ кардиологии, Томский НИМЦ.
Основной диагноз: ИБС. Стенокардия напряжения, ФК III.
Фоновое: Гипертоническая болезнь III стадия, риск 4. Атеросклероз, подтвержденный УЗИ-исследованием: коронарных артерий до 40%, сонных артерий до 20%. Дислипидэмия. Ожирение I ст.
Непрерывно принимала лекарственное средство группы антиагрегантов (кардиомагнил 75 мг/сут) в течение не менее 6 месяцев.
По данным однофотонной эмиссионной компьютерной томографии миокарда с 99 мТс-технетрилом, выявлено наличие стресс-индуцированной ишемии в средних отделах задней стенки, в средних отделах передне-боковой области и базальных отделах задне-боковой области левого желудочка.
При исследовании агрегации тромбоцитов на фоне коллагена в концентрации 2 мкмоль/л, внесенного на 10 секунде исследования в соотношении с богатой тромбоцитами плазмой 1:10, получено значение агрегации равное 7,55% и выявлено снижение степени агрегации тромбоцитов. С целью определения чувствительности к проводимой терапии было выполнено исследование агрегации тромбоцитов на фоне дополнительного внесения коллагена к суспензии тромбоцитов по 2 мкмоль/л на 1, 2, 3 и 4 минутах в соотношении 1:2. В таких условиях значение агрегации тромбоцитов на фоне индукции коллагеном повысилось и составило 68,2%, что превышает нормативные значения коллаген-индуцированной агрегации, которые находятся в диапазоне 45-60%. Данные показатели позволили выявить наличие резистентности тромбоцитов к лекарственному средству группы антиагрегантов (кардиомагнил).
Пример 2.
Больная 3., 58 лет, находящая на стационарном лечении в отделения ишемической болезни сердца НИИ кардиологии, Томский НИМЦ.
Основное заболевание: ИБС. Стенокардия напряжения, ФК III.
Фоновое: Гипертоническая болезнь III стадия, риск 4. Стентирование коронарных артерий от 2011 г. Атеросклероз, подтвержденный УЗИ-исследованием: коронарных артерий до 75%, сонных артерий до 60%. Дислипидемия. Ожирение III ст.
Непрерывно принимала лекарственное средство группы антиагрегантов (кардиомагнил 75 мг/сут) в течение не менее 6 месяцев.
По данным однофотонной эмиссионной компьютерной томографии миокарда с 99 мТс-технетрилом значимой стресс-индуцированной ишемии на момент исследования не выявлено.
При исследовании агрегации тромбоцитов на фоне коллагена в концентрации 2 мкмоль/л и соотношении с богатой тромбоцитами плазмой 1:10, внесенного на 10 секунде исследования, получено значение агрегации равное 5,01% и выявлено снижение степени агрегации тромбоцитов. С целью определения чувствительности к проводимой терапии было выполнено исследование агрегации тромбоцитов на фоне дополнительного внесения коллагена к суспензии тромбоцитов по 2 мкмоль/л на 1, 2, 3 и 4 минутах и в соотношении 1:2.
В таких условиях агрегация тромбоцитов на фоне индукции коллагеном повысилась незначительно и составила 17,9%, что не превышает нормативные значения коллаген-индуцированной агрегации. Данные показатели указывают на эффективную антиагрегантную терапию.
Пример 3.
Больная П., 63 года, находящаяся на стационарном лечении в отделения ишемической болезни сердца НИИ кардиологии, Томский НИМЦ.
Основное заболевание: ИБС. Стенокардия напряжения, ФК III.
Фоновое: Гипертоническая болезнь III стадия, риск 4. Стентирование коронарных артерий от 2015 г. Атеросклероз, подтвержденный УЗИ-исследованием: коронарных артерий до 75%, сонных артерий до 20%. Дислипидемия. Ожирение 1 ст. Непрерывно принимала лекарственное средство группы антиагрегантов (кардиомагнил 75 мг/сут) в течение не менее 6 месяцев.
По данным однофотонной эмиссионной компьютерной томографии миокарда с 99 мТс- технетрилом выявлено наличие стресс-индуцированной ишемии апикальных и средних отделов передней стенки левого желудочка.
При исследовании агрегации тромбоцитов на фоне коллагена в концентрации 2 мкмоль/л, внесенного на 10 секунде исследования в соотношении с богатой тромбоцитами плазмой 1:10, получено значение агрегации равное 12,3% и выявлено снижение степени агрегации тромбоцитов. С целью определения чувствительности к проводимой терапии было выполнено исследование агрегации тромбоцитов на фоне дополнительного внесения коллагена к суспензии тромбоцитов по 2 мкмоль/л на 1, 2, 3 и 4 минутах и в соотношении 1:2. В таких условиях агрегация тромбоцитов на фоне индукции коллагеном повысилась и составила 75,8%, что превышает нормативные значения коллаген-индуцированной агрегации. Данные показатели позволили выявить наличие резистентности тромбоцитов к лекарственному средству группы антиагрегантов (кардиомагнил).
Предлагаемый способ апробирован на 38 пациентах с ишемической болезнью сердца и позволяет с высокой точностью выявлять резистентность тромбоцитов к лекарственному средству группы антиагрегантов (кардиомагнил). Выявление у пациентов с ИБС повышенной агрегации тромбоцитов имеет важное значение при подборе терапии, направленной на снижение тромбообразования и достижение стойкого антитромботического эффекта, что позволяет оптимизировать индивидуальный подбор терапии.
Список использованных источников
1. Антритромботическая терапия у больных со стабильными проявлениями атеротромбоза. Кардиоваскулярная терапия и профилактика. 2009; 8(6)
2. Комаров, А.Л., Панченко Е.П. Ацетилсалициловая кислота основа антитромботической терапии у больных атеротромбозом. Российский медицинский журнал. 2006; 4:201-207.
3. Оганов, Р.Г. Профилактика сердечно-сосудистых заболеваний - реальный путь улучшения демографической ситуации в России. Кардиология. 2007; 1: 4-7.
4. Antithrombotic Trialists' Collaboration. Collaborative meta-analysis of randomised trials of antiplatelet therapy for the prevention of death, myocardial infarction, and stroke in high risk patients. BMJ 2002; 324: 71-86
5. Born GV. Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal. Nature 1962;194:927-9.
6. Gachet C., Aleil B. Testing antiplatelet therapy., Eur Heart Jour. Supplements, 2008; 10 (Suppi A):A28-A34
7. Craft R.M., Chavez J.J., Bresee S.J. et al. A novel modification of the thrombelastograph assay, isolating platelet function, correlates with optical platelet aggregation. J Lab Clin Med 2004; 143: 301-9.