Клеточные популяции, выделяемые из пуповинно-плацентарного комплекса и перспективы их научно-практического использования

И I II II

тп

Обзоры

Клеточные популяции, выделяемые из пуповинно плацентарного комплекса и перспективы их научно практического использования

B.C. Мелихова, АА. Исаев

Институт Стволовых клеток человека, Москва

Cell Populations Isolated from Cord Blood and Placental Tissues:

Difficulties and Perspectives of Use

VS. Melikhova, AA. Isaev Human Stem Cell Institute. Moscow

С 1988 года пуповинная кровь является законным источником как гемопоэтических, так и других типов клеток.

В данном обзоре перечислены и охарактеризованы основные типы клеточных популяций, которые выделяют из пуповинной крови амниотической жидкости и тканей плаценты на данный момент В работе освящены этапы и способы использования тех или иных клеток, основные эксперименты, способы выделения и культивирования. Отдельные разделы обзора посвящены экспансии ГСК и ген-модифицированным клеткам.

Ключевые слова: пуповинная кровь, пупочный канатик, стволовые клетки.

Since 1988 cord blood is a legitimate source for hematopoeitic stem cell and many other cell types. In this review we list and characterize main cell types, isolated from cord blood as well as from placenta and amniotic fluid. Here we also summarize means of isolation, culture and use of these cell types. Focusing on umbilical cord blood cells, we discuss some of the challenges that stem cell therapy faces, including obtaining clinically relevant numbers of stem cells and the ability of stem cells to provide for permanent engraftment of multiple tissue types. We discuss possible solutions to these problems, such as in vitro stem cell expansion and the differentiation potential of tissue-specific stem cells.

Key words:: cord blood, umbilical cord, stem cells.

Стволовые клетки (CK) пуповинной крови (ПК) за последние 5 лет все чаще рассматривают как объективную альтер нативу другим источникам СК взрослых. Данное обстоятель ство обусловлено сообщениями о выделении, характеристике и экспансии in vitro все новых популяций СК из пуповинной крови, что позволяет расширить возможности их клиничес кого использования и банкирования.

Клеточные популяции, выделяемые

из пуповинной крови и пупочного канатика

Группа гемопоэтических клеток

Традиционно к этой популяции относят прежде всего CD34* клетки, однако помимо них данная группа включает и их более дифференцированные клеточные формы.

Предшественники лимфоцитов

В работе японских ученых описаны выделение и имму нофенотипическая характеристика Т регуляторных клеток человека. Клетки выделили после проведения совместного культивирования Т клеток ПК со стромальными клетками костного мозга мышей без добавления каких либо цито кинов. Полученные клетки имели иммунофенотип F0XP3*CD4*CD8*CD25* и обладали супрессорной активно стью в отношении аллогенных антигенпрезентирующих клеток в смешанной культуре лимфоцитов, где в качестве клеток активаторов использовали дендритные клетки, так же выделенные из ПК. Кроме того, после активации цито кинами они были способны продуцировать IL 10, а также обладали цитотоксической активностью [1].

Предшественники моноцитов

Авторы работы применили двухэтапную стратегию вы деления: выделив из пуповинной крови сначала CD34* клетки, подвергли их кратковременной экспансии в течение

3 10 дней. После того, как исследователям удалось добить ся 80 кратного увеличения общего числа клеток, они были помещены в дифференцировочную среду. Через 7 дней практически все клетки (98%) коэкспрессировали CD34 и CD38, т.е. происходило явное уменьшение количества чис той CD34*/lin фракции. Около 40% клеток экспрессирова ли CD14, и 20% CD16. CD14* фракцию моноцитов можно было разделить на субпопуляции: CD14*/CD16* и CD 14*/ CD16. Однако, выделенные CD14* клетки не пролифери ровали в культуре [2].

Другие авторы выделили клетки с иммунофенотипом CD34*/CD133* и подвергли генетическому микроанализу (55 тыс. генов), а также провели анализ генной экспрессии методом SAGE (Serial analysis of gene expression) (3). Выяс нилось, что с культивированием этого пула клеток связана экспрессия нескольких протоонкогенов. Кроме того, оказа лось, что экспрессия нескольких опухолевых супрессоров, наоборот, была подавлена (D0CK4 и SPARCL1). Для гибри дизации использовали также некультивированные свежевы деленные клетки. В целом 851 ген (синтез и процессинг РНК, метаболизм белков, синтез АТФ) оказался активирован, а экспрессия 991 других, наоборот подавлена (в основном регуляция транскрипции, внутриклеточный сигналинг). Выде ленные клетки подвергли экспансии в культуре (в присут ствии факторов роста и эстрадиола), при этом количество CD34*/CD133* клеток было максимальным на 7 й день (примерно в 10 раз по сравнению с исходным выделенным количеством). Эти клетки также были проанализированы с использованием генного чипирования, а результаты свиде тельствовали об активации групп генов, нарушение работы которых традиционно связано с развитием злокачественных новообразований. Например, группы генов, ответственных за апоптоз «молчали», тогда как работа Wnt, MEK/ERK и Notch сигнальных путей была нарушена. Аналогичные изменения

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, № 4, 2007

Обзоры

показаны при таких состояниях, как миелобластный лейкоз и Т клеточная лимфобластная лимфома. Таким образом, следует предположить, что in vitro экспансия CD34*/CD133* клеток ведет к началу их онкотрансформации.

Предшественники дендритных клеток

ПК имеет меньшее количество зрелых дендритных кле ток, чем кровь взрослых, эти клетки синтезируют меньшие количества а интерферона и фактора некроза опухолей. Однако, клетки из ПК обладают лучшей способностью к ак тивации Т регуляторных CD4* клеток. Таким образом, пред шественники дендритных клеток из ПК могут рассматривать ся как клетки, обеспечивающие микроокружение для созревания Т регуляторных клеток Этот факт в свою оче редь может объяснять невыраженный иммунный ответ при трансплантации клеток ПК [4].

При культивировании в течение 2 недель мононуклеарных клеток из ПК с фенотипом CD34* из них получили Т лимфо циты («незрелые» CD4*CD8*/CD4*CD8 и зрелые CD3*CD4* клетки), а также CD1a* дендритные клетки со стабильным уровнем экспрессии HLA DR. Количество клеток обоих ти пов сравнивали с количеством клеток, произошедших от некультивированных CD34* предшественников и от клеток, выделенных непосредственно из тимуса. Обе популяции были способны восстанавливать гемопоэз у сублетально облученных мышей NOD/SCID. Таким образом, исследова тели доказали, что предварительное культивирование CD34* предшественников не влияет на количество и функциональ ную активность их потомков Т лимфоцитов и дендритных клеток (5).

В другой работе, однако, предшественниками дендрит ных клеток называют клетки с фенотипом CD133*CD34 Lin* [6]. Точнее, исследователи доказали, что CD133*CD34, полу ченные в культуре, являются прямыми Lin* потомками клеток с фенотипом CD133*CD34*, которые способны дифферен цироваться в дендритные клетки, то есть CD133*CD34* дают начало CD133*CD34Lin* предшественникам дендритных клеток.

Мультипотентные мезенхимальные

стромальные клетки

Пуповинную кровь можно отнести к перспективному ис точнику мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК). Показано, что из ПК выделяется популяция фибробластоподобных адгезивных к пластику, способных к дивергентной дифференцировке клеток с иммунофеноти пом CD29*CD44*CD73*CD90*CD105VCD11 b CD34 CD45CD31 [7]. Анализ паттерна генной экспрессии (Affymetrix HG U133) свидетельствует об активности ге нов раннего и позднего эмбриогенеза, например, POU5F1/ 0СТ4, компонентов сигнального пути Wnt, GATA6, leukemia inhibitory factor (LIF), STAT3, SUZ12 (компонент белкового комплекса PRC1, группа белков Polycomb), фоллистатина, рецептора NOTCH2, а также генов «домашнего хозяйства» (homeobox genes) SIX1, PITX1, HOXD11, ННЕХ. Не выявле но экспрессии генов ангиогенеза или кардиомиогенных бел ков. Кроме того, исследователи доказали значительное уве личение уровня экспрессии генов SDF 1 и HGF. Первая молекула отвечает за направленную миграцию клеток, а фактор роста гепатоцитов снижает уровень апоптоза и яв ляется стимулятором процесса ангиогенеза. Исследователи предлагают использовать эти молекулы как маркеры ММСК из ПК.

Полученные результаты сравнивали с генной экспрес сией ММСК из костного мозга (КМ), культивируемых в ана

логичных условиях. Оказалось, что две популяции ММСК (из КМ и из ПК) демонстрируют значимые различия, а именно, в клетках из ПК был обнаружен повышенный уровень эксп рессии фоллистатина, при этом гены, кодирующие белки внеклеточного матрикса (ВКМ), были слабо экспрессиро ваны (например, коллаген VIII alpha 1), кроме того ММСК ПК были способны к более интенсивной пролиферации, чем клетки КМ.

ММСК были выделены из ПК не только человека, но из ПК таких видов как лошадь, овца и собака (8 10].

Стоит также упомянуть, что плюрипотентные фибробла стоподобные клетки из ПК часто называют Unrestricted somatic stem cells (USSCs), или соматические стволовые клетки с «неограниченным» потенциалом.

Продемонстрирована нейрональная дифференцировка ММСК из ПК (11 ]. Адгезивные клетки из ПК были помещены в нейрогенную среду, а через 1, 2 и 7 дней их анализировали на наличие нейрональных маркеров. Клетки экспрессировали белки нейрофиламентов (NF), кислый фибриллярный глиаль ный белок (GFAP).

Некоторые исследователи сообщают о дифференциров ке ММСК из ПК в кардиомиоциты [12]. При совместном культивировании человеческих ММСК из ПК с постнаталь ными кардиомиоцитами грызунов (обе группы клеток были разделены коллагеновой мембраной, чтобы избежать ели яния) было отмечено, что человеческие клетки (примерно 50%) начинали экспрессировать troponin I и connexin 43. Кроме того, клетки были способны генерировать сокраще ния. Таким образом исследователи предлагают рассматри вать ММСК из ПК в качестве источника кардиомиоцитов при заместительной клеточной терапии сердечно сосудистых заболеваний.

Также к ММСК можно отнести клетки, выделенные в 2005 году из перивазальной ткани пупочного канатика [13]. Их иммунофенотип CD45 CD34 SH2*SH3*Thy 1 *CD44*. Они были способны формировать колонии на пластике, эк а

перицитов, а также дифференцироваться в остеогенном и хондрогенном направлениях.

Предшественники эндотелиальных клеток

и эндотелиоциты

Часто пуповинную кровь, а также вену пупочного кана тика рассматривают как источник эндотелиальных клеток. Клеточная фракция HUVEC (эндотелий вены пупочного ка натика, human umbilical cord vein endothelial cells) является рутинновыделяемой группой эндотелиальных клеток чело века [14]. Показано, что эти клетки способны поддерживать гемопоэз, обеспечивая CD34* ГСК необходимым микроок ружением [15].

При сравнении эндотелиальных предшественников из пуповинной крови и эндотелия из стенки пупочной вены (HUVEC) оказалось, что HUVEC способны дифференцировать ся, давая начало более зрелым потомкам. Для них также был показан клональный рост и высокая способность к проли ферации, таким образом, не все исследователи рассматри вают HUVEC как фракцию полностью дифференцированных эндотелиоцитов [16].

Установлено, что так называемые «поздние» эндотели альные предшественники происходят от немногочисленной CD34*CD45 фракции, а не из CD34*CD45* пула клеток. При этом потомки CD34*CD45 клеток экспрессировали VEGFR2 и не экспрессировали CD133, тогда как потомки CD34*CD45* демонстрировали экспрессию CD 133 [17]. Кроме того, высокоочищенная фракция CD133* клеток

Обзоры

вообще не была способна давать начало эндотелиальным клеткам. Из этих данных ученые сделали вывод о том, что гемопоэтические предшественники, экспрессирующие CD133 и CD45, не могут быть источником «поздних» пред шественников эндотелия, как считалось ранее [16]. Поэто му исследователи предлагают использовать следующие признаки, на основе которых можно проводить выделение эндотелиальных предшественников из ПК: коэкспрессия CD31 и CD34, VEGFR2, способность к захвату липопротеинов низкой плотности, а также типичная «черепицеобразная» мор фология и способность к формированию сосудистых трубо чек in vitro.

Другие авторы считают предшественниками эндотелия (а также и ГСК) CD34*CD133* клетки [18]. На разных средах эта популяция формировала адгезивный монослой клеток, экспрессирующих VE cadherin*CD45 VEGFR2*, а также да вала начало неприкрепляющимся клеткам, формировавшим колонии на метилцеллюлозе и экспрессировавшим CD45*.

В работе японских ученых эндотелиальные предше ственники CD45 CD31*CD105*, составлявшие 2,7±1,0% от всей мононуклеарной фракции, выделяли на основании эк спрессии альдегиддегидрогеназы [19]. Выяснилось, что клетки с низким уровнем активности этого фермента обла дают большей способностью к миграции и пролиферации. В условиях гипоксии клетки первой субпопуляции демонстри ровали высокий уровень экспрессии мРНК hypoxia inducible factor proteins, VEGF, CXCR4, и GLUT 1. Кроме того, действие клеток с низкой активностью альдегиддегидрогеназы срав нивали с клетками HUVEC и клетками второй субпопуляции при проведении эксперимента по стимуляции ангиогенеза in vivo на модели приживления кожного лоскута. Клетки пер вой субпопуляции способствовали значительно более быст рому заживлению кожной раны, формируя под ней обширную сосудистую сеть. Авторы работы предлагают использовать активность альдегиддегидрогеназы в качестве специфичес кого признака эндотелиальных клеток ПК, поскольку она не изменяется в процессе культивирования.

Экспансия ex vivo

Применение СК из ПК у взрослых пациентов ограничено небольшим объемом образца крови, а значит и недостаточ ным количеством клеток для человека массой больше 40 кг [20]. Результатом этого является отложенное (замедленное) приживление трансплантата, кратко и долговременные риски инфекционных осложнений. Первые попытки осуще ствить увеличение количества клеток, прежде всего гемопо этических стволовых клеток (ГСК), привели к неизбежному наращиванию количества более дифференцированных кле ток в культуре. Следовательно, экспансия ex vivo не улучша ла эффективность приживления, т.к. увеличивался уровень апоптоза пересаженных клеток и снижался уровень засе ления костного мозга [21].

Будущее такого направления, как увеличение количества незрелых гемопоэтических предшественников, лежит в об ласти выделения этих клеток на основании их функциони рования, а не на основании их поверхностного фенотипа, что, кроме того, подразумевает учитывание влияния цитокинов и стромы в формировании и работы ниши ГСК [20].

Оптимизация культуральной среды

для ГСК

Для обеспечения пролонгированного культивирования (обычно, не более 3 недель) ГСК необходимо обеспечить несколько действующих факторов:

присутствие необходимых факторов роста в среде куль

тивирования;

присутствие стромального компонента (матрицы) для имитации ниши ГСК (лучшим фидером по прежнему счита ют ММСК костного мозга).

Популяцией, наиболее подходящей для длительного куль тивирования, называют CD133* клетки, которые являются менее дифференцированными, чем CD34* предшественни ки, кроме того, известно, что экспрессия CD34* в культуре крайне нестабильна [21, 22].

Оптимальный состав цитокинов в среде ГСК из ПК точно не определен. Однако в числе таких молекул называют SCF, FL (Flt3 ligand) и ТРО (тромбопоэтин, который по некото рым данным может заменить в среде IL 3, IL 6 и G CSF). На данный момент также проводятся эксперименты с ис пользованием знаний о сигнальных путях, регулирующих жизнедеятельность ГСК. Основным путем является Notch (задействован в процессе дифференцировки клеток в эмб риогенезе) при добавлении лигандов Notch;

Другим подходом может служит использование данных эпигенетики о поддержании самообновляющегося «юного» статуса ГСК. Так, в работе [23] предлагают использовать хроматин модифицирующие и гистон модифицирующие агенты для торможения транскрипции, что позволяет клет кам в культуре дольше поддерживать недифференцирован ное состояние.

Кроме того, опубликованы данные, которые свидетель ствуют о том, что материнская плазма или просто челове ческий альбумин, используемый при выделении CD34* кле ток, способствует обогащению этой фракции [24]. Во время выделения обогащенной CD34* фракции вместо фетальной бычьей сыворотки использовали плазму матери, при экс пансии клеток их количество увеличивалось в 1,8 раза.

Генетическая модификация клеток

Одно из направлений работы с клетками ПК составляют исследования генетически измененных in vitro клеток. Так, мононуклеарные клетки могут быть использованы в каче стве переносчиков гена VEGF для обеспечения терапевта ческого ангиогенеза [25]. В другой работе для трансфекции выбрали CD34* клетки, а низкоаффинный рецептор факта ра роста нервов использовался в качестве трансгена в рет ровирусном переносчике. Трансфицированные клетки при меняли для трех последовательных трансплантаций nod/scid мышам. При анализе поколений гемопоэтических клеток у этих животных была выявлена стабильная экспрессия трансгена уже в CD45* клетках (без нарушения способное та к длительному восстановлению гемопоэза) [26].

Вакцины на основе измененных дендритных клеток представляют особый интерес при поиске альтернативных способов лечения рака. Для того, чтобы выяснить, можно ли «нагрузить» дендритные клетки антигенами в иммуноте рапевтических целях, выделенные из ПК дендритные клет ки с помощью электропорации трансфицировали вектором, несущим EGFP [27]. Выяснилось, что клетки хорошо эксп рессируют трансген, однако процент HLA DR*/lin клеток (собственно антигенпрезентирующие дендритные клетки) не превысил 2,5%, что явно недостаточно для терапевтичес ких целей [27]. Кроме того, для этой процедуры применяют и лентивирусные вектора [28]. Так, клетки из ПК (обогащен ная CD34* фракция) трансфицировали самоинактивирую щимся лентивирусом, несущим ген р глобина (для терапии серповидноклеточной анемии и талассемии). В дальнейшем клетки пересаживали сублетально облученным мышам ли нии NOD/LtSz scid/scid. Полученные в течение 6 месяцев после трансплантации поколения клеток анализировали и

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, 1У< 4, 2007

Обзоры

обнаружили, что около половины эритроидных и миелоидных предшественников экспрессируют трансген. А эритроидные

р

Клетки, выделяемые из амниотической

жидкости, амниона и плаценты

Не так давно амниотическая жидкость и плацента также стали рассматриваться исследователями и клиницистами как источники клеток предшественников. Так, исследова тельской группой, возглавляемой признанным авторитетом в области тканевой инженерии Antony Atala, линии СК, об ладающих некоторыми признаками плюрипотентности, были выделены из амниотической жидкости (СКАЖ) человека. В течение последних нескольких лет разными лаборатория ми неоднократно сообщалось о выделении популяций стволо вых или прогениторных клеток из амниотической жидкости человека, аналогичных по свойствам ММСК костного мозга [29]. В данной работе популяция стволовых клеток близкая по свойствам к ЭСК, выделенная из амниотической жидкости была охарактиризована впервые.

Известно, что амниотическая жидкость содержит гете рогенную популяцию клеток, полученных от зародыша и ам ниона. Исследователи выделяли с kit* клетки из амниоти ческой жидкости, которую обычно получают на сроках от 16 до 20 недель беременности для определения риска разви тия генетических заболеваний и пренатальной диагностики. Как правило, образец содержал 10 20 мл исследуемой жидкости. СКАЖ количественно представляли собой лишь 1 % от всех выделенных клеток жидкости. Через неделю мед ленной пролиферации в культуре они прикрепляются к пла стику и пассируются каждые 2 3 дня. Клетки обладают высо кой пролиферативной способностью и могут претерпевать до 250 делений без каких либо обнаруживаемых укорачива ний теломер. Кроме того, авторы культивировали клетки без фидера, что также является неоспоримым достоинством при рассмотрении возможности терапевтического использова ния. Способность клеток к клональному росту определяли после использования метода лимитирующих разведений. Фенотипически СКАЖ экспрессировали MHCI/HLAABC, CD29, CD44, CD73, CD90, CD105 и были негативны по эк спрессии антигенов маркеров гемопоэтического ряда CD34, CD133C, CD45.

Показано, что СКАЖ способны к дифференцировке в ткани всех трёх зародышевых листков. Используя специфи ческие дифференцировочные среды и условия культивиро вания удалось получить нестин позитивные клетки, а затем и дофаминэргические клетки и нейроны, несущие рецепто ры к глутамату. Эти клетки были способны выживать в латеральном желудочке мозга мышей, распространяясь по головному мозгу, и не вызывать опухолевого роста.

При определенных условиях СКАЖ также были способ ны формировать функциональные остеобласты, которые продуцировали остеоид при пересадке в альгинате/колла гене иммунодефицитным мышам. Из СКАЖ были получены

а

патоцитарный ядерный фактор, фактор роста гепатоцитов, а также секретирующие мочевину. Эти данные свидетель ствуют в пользу того, что из СКАЖ были получены предше ственники гепатоцитов. Кроме того, данные исследования свидетельствуют в пользу получения лейомиоцитов, адипо цитов и эндотелиальных клеток из СКАЖ.

Несмотря на то, что происхождение выделенных клеток остается неясным, исследователи предполагают, что клет ки происходят непосредственно от амниона, который, в свою очередь, берет начало от эпибласта дифференцирующейся

бластоцисты. Как следствие, именно эпибласту клетки СКАЖ могут быть обязаны своей мультипотентностью. СКАЖ экспрессируют ряд маркеров, использующихся для оценки плюрипотентности эмбриональных стволовых кле ток (ЭСК), таких как 0ct4 и SSEA4, однако не экспрессиру ют остальные характерные молекулы ЭСК. Интересно, что СКАЖ фенотипически (CD90*CD105*) и по культуральным свойствам (адгезия к пластику) очень похожи на ММСК, од нако отличаются экспрессией маркёров плюрипотентности, большим пролиферативным потенциалом и пластичностью. При проверке СКАЖ на туморогенность не было обнаруже но формирования тератом, в отличие ЭСК.

Таким образом, с kit* СКАЖ могут представлять собой онтогенетически промежуточный вариант между ЭСК и ство ловыми клетками взрослых и, соответственно, новый класс клеток с привлекательными свойствами пластичности широ кого диапазона без видимого риска формирования новооб разований. Очень важно, что СКАЖ можно культивировать без использования ксеногенного фидера, что должно уско рить их использование в клинике.

Весьма перспективным направлением может стать бан кирование гистосовместимых СКАЖ, а также их типирова ние и использование для аллогенных пересадок.

По другим данным, клетки из амниотической жидкости предлагают использовать для оптимизации регенерации почки [30]. Сообщается о выделении мультипотентных кле ток из амниотической жидкости человека на 12 18 й не деле гестации. In vitro клетки были помечены зеленым флуоресцентным белком и пересажены в почку эмбрионам мыши на 12,5 18 день пренатального развития. Систему поддерживали in vitro в течение 10 дней. С помощью мето дов прижизненной микроскопии, ПЦР, FISH была изучена интеграция и дифференцировка клеток человека в микро окружении эмбриональной почки мыши. По результатам ис следования оказалось, что человеческие клетки способ ны не только выживать в подобной системе, но и активно интегрироваться в развивающиеся почечные структуры (ка нальцы), сосуды, экспрессировать ранние маркеры клеток почечного эпителия.

В работе тайваньских исследователей проанализирова на способность клеток, выделенных из амниотической жид кости, активировать регенерацию седалищного нерва у крыс [31]. Им удалось доказать, что клетки секретируют нейро трофический фактор. Нарушение работы седалищного нерва проводили пережатием сосуда, снабжающего его кровью. Клетки, выделенные из амниотической жидкости крыс той же линии, были заключены в фибриновый гель и помещены в место повреждения. С помощью иммуносорбентного анали за и иммуноцитохимии была проанализирована экспрессия нейротрофического фактора. Регенерация нерва приводила к восстановлению локомоторной функции конечностей по допытных животных. На самих клетках была отмечена экс прессия следующих молекул: CD29*CD44*CD11 b*CD45, а также высокие уровни нейротрофического фактора, полу ченного из мозга (brain derived neurotrophic factor), ней ротрофического фактора, полученного из глии (glia cell line derived neurotrophic factor), фактора роста нервов и нейротрофина 3. Следовательно, СКАЖ можно рассматри вать как клеточный источник для лечения нейродегенера тивных заболеваний.

Кроме того, такие клетки уже предлагают использовать в пренатальной тканевой инженерии клапанов сердца [33]. Выделенные на магнитных сферах из амниотической жид кости CD133* клетки претерпевали экспансию и дифферен цировку. После чего CD133 клетки (которые образовались за время культивирования) были посажены на матрицы

Обзоры

носители, по форме повторяющие клапаны сердца. Матри ца представляла собой быстро деградируемый полимер. За тем на полученные образцы наносили CD133* клетки и вы держивали в культуральной системе с пульсирующей струей. В системе биоискусственного трансплантата происходила эндотелизация поверхности и синтез белков внеклеточного матриска. В одной из последних работ лидирующей в этом направлении группы американского тканевого инженера Antony Atala сообщается о хондрогенной дифференциров ке клеток СКАЖ [33]. Для восстановления поврежденной хрящевой ткани, как правило, требуется значительное ко личество клеток. Был проанализирован хондрогенный по тенциал человеческих СКАЖ в суспензии и альгинатной капле. Клетки подвергли экспансии в различных средах в течение трех недель. После этого был зафиксирован по вышенный уровень экспрессии сульфатированных глико заминогликанов и коллагена II типа. Однако, по сравнению с ММСК, клетки СКАЖ секретировали меньшее количество белков внеклеточного матрикса.

В другой работе сообщается о том, что клетки из амниона способны дифференцироваться в гепатоциты [34]. В работе проанализировали экспрессию генов, характерных для гепа

а

а

дали накопление гликогена в этих клетках.

Данной популяции клеток также приписывают иммуно модулирующие свойства [35]. При сравнение иммуномоду лирующего потенциала клеток из амниона, амниотической жидкости и фибробластов подкожной клетчатки оказалось,

что все три типа клеток оказывают ингибирующее действие в экспериментах с лимфоцитами периферической крови и системе «^апвдаеН», что доказывает механизм подавления пролиферации лимфоцитов посредством межклеточных контактов.

Несмотря на то, что была показана способность клеток из амниотической жидкости дифференцироваться в эндо телий [36], при их введении крысам с инфарктом миокарда не было отмечено никакого значимого улучшения работы сердца, а пересаженные клетки быстро гибли [37].

Плацента также рассматривается как источник СК [38, 39]. Показано, что плацента содержит большое количество различных популяций клеток предшественников. Например, в работе японских ученых эти клетки характеризовала экс прессия таких маркеров как ББЕА 3, ББЕА 4, ТЯА 1 60 и ТЯА 181. Однако такие клетки были в стенке амниона, а не в хорио децидуальной оболочке (которая содержит клетки гемопоэтического ряда, а также клетки трофобласта).

Сообщается о получении инсулинпродуцирующих клеток из плаценты. Выделенные клетки культивировали в монослое в среде без сыворотки с добавлением факторов роста, через 4 недели клетки формировали сфероиды. ПЦР выявила эксп рессию мРНК генов Рс1х1, Бох17 и Роха2. С помощью имму ноферментного анализа была зафиксирована секреция ин сулина. А при пересадке данных сфероидов мышам со стрептозотоцин индуцированным диабетом происходило вое становление нормального уровня глюкозы в крови подопыт ных мышей. Авторы работы рекомендуют рассматривать клет ки из плаценты в качестве кандидатов для борьбы с диабетом.

Спектр клеток, выделяемых из пуповинной крови, плаценты и амниотической жидкости

Источник Тип клеток Иммунофенотип Фаза изучения или использования Ссылка

ПК Предшественники Т-лимфоцитов FOXP3+CD4+CD8+ CD25C Исследования in vivo [1]

ПК Предшественники моноцитов CD34CCD16C Исследования in vitro [2]

ПК Предшественники дендритных клеток CD4+CD8+CD1a+/CD4+ CD8CD1a+HLA-DR+ Доклинические исследования [4, S]

ПК ММСК CD29+CD44+CD73+ CD90+CD10S+CD11b- CD34CD4SCD31- Доклинические исследования [7-10]

Сосуды пупочного канатика Клетки периваскулярного окружения пупочного канатика CD45CD34SH2+SH3+ Thy-1CCD44C Исследования in vitro [13]

Вена пупочного канатика НиУЕС (эндотелий вены пупочного канатика) CD31CVon Willebrandt+VEGF-R2+ Исследования in vitro [14, 15, 17]

Вена пупочного канатика Предшественники эндотелиоцитов VE-cadherin+CD45~ VEGF-R2C Исследования in vivo [18, 19]

Амниотическая жидкость Стволовые клетки амниотической жидкости c-kitCMHC-l/HLA-ABCC, CD29C CD44+CD73+CD90+ CD10S+CD34CD133-CD4S- Доклинические исследования [30-34]

Плацента Стволовые клетки плаценты SSEA-3, SSEA-4, TRA 1-60 и TRA 1-81 Исследования in vitro [39, 40, 42]

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, 1У< 4, 2007

Обзоры

На последней конференции по вопросам номенклатуры, фенотипирования клеток из плацентарных тканей и этичес ких проблем их использования в 2007 году постановили [40]:

1. Клетки из всех плацентарных тканей следует назы вать мезенхимальными стромальными клетками.

2. Основные критерии их определения: способность прикрепляться к пластику; формирование фибробластоподобных колоний; специфический паттерн экспрессии поверхностных

антигенов (CD90\CD105\CD73* и CD45/CD34/CD14/ HLADR);

дифференцировочный потенциал способность диф ференцироваться в клетки остеогенного, хондрогенного, адипогенного и эндотелиального ряда.

В большинстве приведенных работ клетки выделяют еле дующим образом. Для выделения эпителиальных клеток ам ниотическую мембрану отделяют и диссоциируют с помощью трипсина или других ферментов. Именно такие клетки ха рактеризуются экспрессией ABCG2/BCRP, CD9, CD24, Е кадгерина, а и р интегринов, с met [HGF receptor], SSEA 3 и 4 TRA 1 60 и 1 81 [41]. Отдельно выделяют клетки хориона (первого или третьего триместров). При этом клет ки хориона также выделяют с помощью ферментативной диссоциации. Фенотипическим признаком, отличающим мезенхимальные стромальные клетки амниона от таковых

а

клетках амниона он присутствует [42]. Существует работа, показывающая значительную способность клеток к при живлению в организме свиньи и крысы [43]. Так, был про демонстрирован донорский химеризм в мозге, легких, костном мозге, тимусе, селезенке, почках и печени после трансплантации человеческих клеток амниона и хориона. Мигрирующие клетки имели следующий фенотип: L selectin, VLA 5, CD29, Р selectin Ligand 1, а также экспрессировали матриксные металлопротеиназы (ММР 2 and ММР 9).

Доклинические модели:

1. Регенерация печени [41 ].

2. Регенерация сердечной мышечной ткани [44]. Совме стное культивирование с кардиомиоцитами грызунов спо собствовало кардиомиогенной дифференцировке СКАЖ. Кроме того, клетки были способны интегрироваться в мио кард и выживать как минимум в течение 2 месяцев после трансплантации.

3. Нейродегенеративные заболевания. На крысиной мо дели болезни Паркинсона СКАЖ способствовали выживанию нейронов черной субстанции мозга [45]. В другой работе клетки также пересаживали в поврежденный спинной мозг приматов, где они противостояли гибели моторных нейро нов и способствовали формированию новых аксонов [46].

Таким образом, все приведенные данные свидетельству ют в пользу того, что комплекс тканей плаценты обладает большим количеством групп предшественников, хотя и не достаточно изученных, однако имеющих регенеративный потенциал, что было доказано в ходе доклинических иссле дований.

Возможности тканевой инженерии

с использованием клеток

из пуповинно плацентарного комплекса

В 2006 году была опубликована работа, в которой груп пой исследователей из Швейцарии было описано получение клапана сердца с использованием клеток, выделенных из ПК и «вартонова студня» [47].

Клетки из обоих источников были последовательно поме щены на биодеградируемый матрикс и подвергнуты культи

вированию в биомиметической системе (система, по основ ным химическим и физическим показательям приближенная к таковым в организме млекопитающих). Клетки, выделен ные из «вартонова студня» (Wharton's Jelly), по экспрессии поверхностных маркеров можно было охарактеризовать как миофибробласты, фибробласты и эндотелиальные клетки. Матрица для заселения была представлена сеткой из по лигликолиевой кислоты толщиной 1 мм. Матрицы были при креплены к кольцевым опорам, миофибробласты были по мещены на матрицы с помощью фибрина. Одна конструкция была помещена в биореактор, повторяющий условия тока крови в работающем сердце (перфузия и механическое на пряжение), а вторая оставлена в статических условиях. Через 14 дней те же конструкции были дополнительно заселены эн дотелиальными клетками из ПК и помещены на 48 часов в обычный инкубатор, а затем еще на 5 дней в биореактор. Полученные тканеинженерные клапаны были проанализи рованы. При этом выяснилось, что образцы, помещенные в статические условия, не демонстрировали собственно тка необразования, клетки хоть и присутствовали на носителях в большом количестве, но не секретировали белки ВКМ и не формировали никаких структур. При анализе образцов, помещенных в биореактор, оказалось, что происходит фор мирование нескольких хорошо выраженных слоев клеток (эндотелий, миофибробласты, слой белков ВКМ коллаген, гликозаминогликаны и фибробласты между ними), более того, полученные конструкции обладали упругостью и спо собностью к противостоянию механическому стрессу (хотя она и не достигла физиологических значений). Данный эксперимент может лечь в основу новых разработок при борьбе с врожденными пороками развития сердечно сосу диетой системы.

Другим примером может служить совместная работа американских и немецких ученых, направленная на заме щение дефекта бедренной кости значительного размера с использованием ММСК из ПК [48]. ММСК были заселены в р

р

сам линии nude с дефектом бедренной кости размером 4 мм. Через 10 недель исследователи оценивали количество вы живших клеток, их миграцию, интенсивность остеогенеза с помощью рентгенографии и иммуногистохимического ана лиза. По результатам эксперимента оказалось, что челове

р

кальций фосфата) и мигрируют на края опила кости животного, выживая вплоть до 4 й недели наблюдения. Од нако на следующих сроках человеческие клетки распозна ются и уничтожаются организмом хозяина. Несмотря на это, темпы регенерации кости были гораздо более интенсивны ми по сравнению с контрольными животными (использовали только матрицу без клеток).

Таким образом, клетки из пуповинно плацентарного ком плекса могут служить биоактивным компонентом и при мо делировании и разработке остеогенных тканеинженерных конструкций. Также сообщается об успешном использова нии мононуклеарных клеток ПК на коллагеновых матрицах при преодолении последствий экспериментального инфаркта миокарда у мышей [49]. Кроме того, для тканевой инженерии хрящевой ткани также используют ММСК ПК [50].

Однако одним из наиболее перспективных направлений является использование клеток ПК и самой пупочной вены при моделировании сосудов [51, 52]. Исследователи пред лагают использовать не только собственно эндотелий со судов, но и сами изолированные сосуды целиком для после дующего формирования сосудов разного диаметра и длины с последующей возможностью сосудистой пластики. В работе

I I I I I

I I I

Обзоры

французской исследовательской группы был сконструирован сосуд с использованием эндотелиальных и гладкомышеч ных клеток из вены пупочного канатика. Эта конструкция была способна отвечать на присутствие эндотелинов фак торов, обуславливающих сужение просвета сосуда, что де лает такие искусственные сосуды привлекательными кан дидатами для испытания вазоактивных препаратов [53].

Заключение

С каждым годом растет количество различных популя ций, выделяемых из клеток ПК или собственно пупочного

канатика. Однако явно можно проследить три основные тен денции попытки экспансии гемопоэтических клеток (ко торые обусловлены как правило малым объемом образца), попытки выделения и дифференцировки ММСК из ПК, по пытки сделать все этапы процессинга максимально ауто генными (отказ от использования реактивов животного про исхождения), а также осуществление первых успешных попыток использования клеток ПК в тканевой инженерии. По этому банкирование и отстроченное использование клеток пуповинно плацентарного комплекса в случае необходимо сти будут становиться все более и более востребованными.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Nakamura S., Suzuki М., Sugimoto A. et al. IL 2 independent generation of FOXP3-CD4-CD8-CD25-cytotoxic regulatory T cell lines from human umbilical cord blood. Experim. Hematology 2007; 35: 287 96.

2. Stec М., Weglarczyk K., Baran J. et al. Expansion and differentiation of CD14~CD16and CD14~CD16~ human monocyte subsets from cord blood

CD34! hematopoietic progenitors. J. of Leukocyte Biol. 2007; 82:594 602.

3. Qkamoto O.K., Carvalho A. C., Marti L.C., et al. Common molecular pathways involved in human CD133~/CD34_ progenitor cell expansion and cancer. Cancer Cell International 2007; 7:11 7.

4. Encabo A., Solves P., Carbonell Uberos F., Micana M.D. The functional immaturity of dendritic cells can be relevant to increased tolerance associated with cord blood transplantation. Transfusion 2007; 47(2): 272 9.

5. Kobari L., Giarrattana М. C., Glukman J. C. et al. Ex Vivo Expansion Does Not Alter the Capacity of Umbilical Cord Blood CD34_ Cells to Generate Functional T Lymphocytes and Dendritic Cells. Stem Cells 2006; 24:2150 57.

6. Goussetis E., Theodosaki М., Paterakis G. et al. In Vitro Identification of a Cord Blood CD133~CD34 Lin- Cell Subset that Gives Rise to Myeloid Dendritic Precursors. Stem Cells 2006; 24: 1137 40.

7. Markov V., Kenro K., Mahlet G. T. et al. Identification of Cord Blood Derived Mesenchymal Stem/Stromal Cell Populations with Distinct Growth Kinetics, Differentiation Potentials, and Gene Expression Profiles. Stem Cells and Development 2007; 16: 53 73.

8. Koch T.G., Heerkens T., Thomsen P. D. et al. Isolation of mesenchymal stem cells from eguine umbilical cord Blood. BMC Biotechnology 2007; 7: 26 31.

9. Fuchs J.R., Hannouche D., Terada S., Zand S., Vacanti J.P., Fauza D.O. Cartilage engineering from ovine umbilical cord blood mesenchymal progenitor cells. Stem Cells 2005; 23(7): 958 64.

10. Lim J H., Byeon Y E., Ryu H H. et al. Transplantation of canine umbilical cord blood derived mesenchymal stem cells in experimentally induced spinal cord injured dogs. J. Vet. Sci. 2007; 8(3): 275 82.

11. Wang T.T., Tio М., Lee W. et al. Neural differentiation of mesenchymal like stem cells from cord blood is mediated by PKA. Biochem. and Biophys. Res.

Commun. 2007; 357:1021 27.

12. Nishiyama N., Miyoshi S., Hida N. et al. The Significant Cardiomyogenic Potential of Human Umbilical Cord Blood Derived Mesenchymal Stem Cells In Vitro. Stem Cells 2007; 25: 2017 24.

13. Sarugaser R., Lickorish D.,Baksh D. et al. Human Umbilical Cord Perivascular (HUCPV) Cells: A Source of Mesenchymal Progenitors. Stem Cells 2005; 23: 220 9.

14. Baudin B., Bruneel A., Bosselut N. et al. A protocol for isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells. Nature Protocols 2007; 2 (3): 481 85.

15. Yildirim A. M., Boehmler L., Kanz S. et al. Expansion of cord blood CD34~ hematopoietic progenitor cells in coculture with autologous umbilical vein endothelial cells (HUVEC) is superior to cytokine supplemented liguid culture. Bone Marrow Transplantation 2005; 36: 71 9.

16. Ingram D.A., Mead L.E., Moore D.B. et al. Vessel wall derived endothelial cells rapidly proliferate because they contain a complete hierarchy of endothelial progenitor cells. Blood 2005; 105 (7): 2783 6.

17. Timmermans F., Hauwermeiren F., Smedt M. et al. Endothelial Outgrowth Cells Are Not Derived From CD133~ Cells or CD451 Hematopoietic Precursors. Arterioscler Thromb Vase. Biol. 2007; 27:1572 9.

1 8. Wu X., Lensch M. W., Wylie Sears J. et al. Hemogenic Endothelial Progenitors Cells Isolated from Human Umbilical Cord Blood. Stem Cells 2007; 25(11): 2770 6.

19. Nagano M., Yamashita T., Hamada H. et al. Identification of functional endothelial progenitor cells suitable for the treatment of ischemic tissue using human umbilical cord blood. Blood 2007; 110: 151 60.

20. Hofmeister C.,C., Zhang J., Knight K. L. et al. Ex vivo expansion of umbilical cord blood stem cells for transplantation: growing knowledge from the hematopoietic niche. Bone Marrow Transplantation 2007; 39: 11 23.

21. Sato T., Laver J.H., Ogawa M. Reversible expression of CD34 by murine hematopoietic stem cells. Blood 1999; 94: 2548 54.

22. Gallacher L., Murdoch B., Wu D.M. et al. Isolation and characterization of human CD34[ )Lin[) and CD34[»]Lin[) hematopoietic stem cells using cell surface markers AC133 and CD7. Blood 2000; 95: 2813 20.

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, 1У< 4, 2007

Обзоры

23. Araki H., Mahmud N., Milhem M. et al. Expansion of human umbilical cord blood SCO repopulating cells using chromatin modifying agents. Exp. Hematol. 2006; 34:140 9.

24. Kwok Y. K., Tang M. H. Y., Law H. K. W. et al. Maternal plasma or human serum albumin in wash buffer enhances enrichment and ex vivo expansion of human umbilical cord blood CD34~ cells. British J. of Haematol. 2007; 137: 468 74.

25. Ikeda Y., Fukuda N., Wada M. et al. Development of Angiogenic Cell and Gene Therapy by Transplantation of Umbilical Cord Blood with Vascular Endothelial Growth Factor Gene. Hypertens Res. 2004; 27:119 28.

26. Gammaitoni L., Lucchi S., Bruno S. et al. Serial Transplantations in Nonobese Diabetic/Severe Combined Immunodeficiency Mice of Transduced Human CD34 i Cord Blood Cells: Efficient Oncoretroviral Gene Transfer and Ex Vivo Expansion Under Serum Free Conditions. Stem Cells 2006; 24:1201 12.

27. Markowicz S., Niedzielska J., Kruszewski M. et al. Nonviral transfection of human umbilical cord blood dendritic cells is feasible, but the yield of dendritic cells with transgene expression limits the application of this method in cancer immunotherapy. Acta Biochimica Polonica 2006; 53 [1): 203 11.

28. Imren S., Fabry M. E., Westerman K. A. et al. High level p globin expression and preferred intragenic integration after lentiviral transduction of human cord blood stem cells. J. Clin. Invest. 2004; 114: 953 62.

29. De Coppi P., Bartsch Jr.G., Siddigui M. et al. Isolation of amniotic stem cell lines with potential for therapy. Nat. Biotech. 2007; 25:100 6.

30. Perin L., Giuliani S., Jin D. et al. Renal differentiation of amniotic fluid stem cells. Cell Pro I if. 2007; 40 (6): 936 48.

31. Pan H.C., Cheng F.C., Chen C.J. et al. Post injury regeneration in rat sciatic nerve facilitated by neurotrophic factors secreted by amniotic fluid mesenchymal stem cells. J. Clin. Neurosci. 2007; 14(11):1089 98.

32. Schmidt D., Achermann J., Qdermatt B. et al. Prenatally fabricated autologous human living heart valves based on amniotic fluid derived progenitor cells as single cell source. Circulation 2007; 11(116):64 70.

33. Kolambkar Y. M., Peister A., Soker S. et al. Chondrogenic differentiation of amniotic fluid derived stem cells. J. Mol. Histol. 2007; 38(5): 405 13.

34. Tamagawa T., Oi S., Ishiwata I., Ishikawa H. et al. Differentiation of mesenchymal cells derived from human amniotic membranes into hepatocyte like cells in vitro. Hum. Cell 2007; 20[3):77 84.

35. Wolbank S., Peterbauer A., Fahrner M. et al. Dose dependent immunomodulatory effect of human stem cells from amniotic membrane: a comparison with human mesenchymal stem cells from adipose tissue.Tissue Eng. 2007; 13[6):1173 83.

36. Alviano F., Fossati V., Marchionni C. et al. Term Amniotic membrane is a high throughput source for multipotent Mesenchymal Stem Cells with the ability to differentiate into endothelial cells in vitro. BMC Dev. Biol. 2007; 7:11 8.

37. Chiavegato A., Bollini S., Pozzobon M. et al. Human amniotic fluid derived stem cells are rejected after transplantation in the myocardium of normal, ischemic, immuno suppressed or immuno deficient rat. J. Mol. Cell. Cardiol. 2007; 42 [4):746 59.

38. Miki T., Mitamura K., Ross M.A. et al. Identification of stem cell marker positive cells by immunofluorescence in term human amnion. J. Reprod. Immunol. 2007; 75 [2):91 6.

39. Chang C.M., Kao C.L., Chang Y.L. et al. Placenta derived multipotent stem cells induced to differentiate into insulin positive cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2007; 357(2): 414 20.

40. Parolini 0., Alviano F., Bagnara G. P. Isolation and Characterization of Cells from Human Term Placenta: Outcome of the First International Workshop on Placenta Derived Stem Cells. Stem Cells Express, published online November 1, 2007

41. Portmann Lanz C.B., Schoeberlein A., Huber A. et al. Placental mesenchymal stem cells as potential autologous graft for pre and perinatal neuroregeneration. Am. J. Obstet. Gynecol. 2006; 194: 664 73.

42. Zhang X., Mitsuru A., Igura K. et al. Mesenchymal progenitor cells derived from chorionic villi of human placenta for cartilage tissue engineering. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2006; 340: 944 52.

43. Bailo M., Soncini M., Vertua E. et al. Engraftment potential of human amnion and chorion cells derived from term placenta. Transplantation 2004; 78: 1439 48.

44. Alviano F., Fossati V., Marchionni C. et al. Term Amniotic membrane is a high throughput source for multipotent Mesenchymal Stem Cells with the ability to differentiate into endothelial cells in vitro. BMC Dev. Biol 2007; 7:1119.

45. Kakishita K., Nakao N., Sakuragawa N. et al. Implantation of human amniotic epithelial cells prevents the degeneration of nigral dopamine neurons in rats with 6 hydroxydopamine lesions. Brain Res. 2003; 980: 48 56.

46. Sankar V., Muthusamy R. Role of human amniotic epithelial cell transplantation in spinal cord injury repair research. Neuroscience 2003; 118:11 7.

47. Schmidt D., Mol A., Qdermatt B. et al. Engineering of Biologically Active Living Heart Valve Leaflets Using Human Umbilical Cord Derived Progenitor Cells. Tissue Engineering 2006; 12(11): 3223 3232.

48. Jnger M., Degistirici 0., Knipper A. et al. Bone Healing and Migration of Cord Blood Derived Stem Cells Into a Critical Size Femoral Defect After Xenotransplantation. J. Bone Miner. Res. 2007; 22: 1224 33.

49. Cortes Morichetti M., Frati G., Schussler 0. et al. Association Between a Cell Seeded Collagen Matrix and Cellular Cardiomyoplasty for Myocardial Support and Regeneration. Tissue Engineering 2007 (In press).

50. Kunisaki S.M, Fuchs J. R., Shaun A. Steigman A. et al. Comparative Analysis of Cartilage Engineered from Different Perinatal Mesenchymal Progenitor Cells. Tissue Engineering 2007 (In Press).

51. Hoenika M., Lehle K., Jacobs V. R. et al. Properties of the Human Umbilical Vein as a Living Scaffold for a Tissue Engineered Vessel Graft. Tissue Engineering 2007; 13(1) 219 29.

52. Laflamme K., Roberge C.J., Pouliot S. et al. Tissue Engineered Human Vascular Media Produced in Vitro by the Self Assembly Approach Present Functional Properties Similar to Those of Their Native Blood Vessels. Tissue Engineering 2006; 1 2(8): 2275 81.

Поступила 15,11,2007

А