Влияние полисахаридов зостерана и хитозана на белоксинтезирующую функцию гепатоцитов

Влияние полисахаридов зостерана и хитозана на белоксинтезирующую функцию гепатоцитов

Сгребнева М.Н. (1) (sgr-marina@yandex.ru), Хасина Э.И. (1), Оводова Р.Г.

(1) Институт биологии моря ДВО РАН (2) Институт физиологии КомиЦентра УрО РАН

(3) Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН

Введение

В настоящее время в клинической и превентивной медицине широкое применение нашли препараты на основе полисахаридов, полученных из высших (пектины) и низших растений (альгинаты, каррагинаны), вторичного сырья животного происхождения (хитозан), грибов (крестин) и др. [20,21,24]. Опубликовано большое число работ, связанных с изучением их структуры, физико-химических свойств и различных аспектов физиологической активности [12]. Несмотря на различия в методах получения, химической структуре для полисахаридов свойственно близкое проявление физиологических эффектов: сорбции радионуклидов, тяжелых металлов, бактерий и бактериальных токсинов, нормализации липидного обмена при гиперлипидемии различной этиологии, активации секретирующей и моторной функции кишечника, регуляции иммунитета, модуляции эндокринной системы, оптимизации функционирования гепато-билиарной системы [9]. Полисахариды оказывают непосредственное влияние на структуру ткани и функции желудочно-кишечного тракта, печени, почек и других органов, что выявлено на биохимическом и морфологическом уровне. Кроме того, полисахариды влияют на ткани и системы органов, непосредственно с ними не контактирующих при пероральном, внутривенном, внутрибрюшинном, подкожном введении в организм. Наиболее изучены физиологические и метаболические аспекты влияния полисахаридов на печень на фоне патологии . Необходимость раскрытия фундаментальных основ, связанных с физиологическим действием полисахаридов в условиях нормы и заболевания различной этилогии, актуальна для их применения в практической медицине.

Ранее нами установлено, что такие полисахариды, как зостеран, пектин морских трав сем Zosteracea, и хитозан, гликозаминогликан животного происхождения, оптимизируют метаболизм в печени и повышают неспецифическую резистентность организма при гипоксии, физической нагрузке, токсическом гепататите [14-16]. Вместе с тем показано,

что при введении интактным животным препараты меняют эндокринно-метаболический статус организма, повышая его адаптационные возможности. Известно, что неспецифические механизмы резистентности органов и организма в целом реализуются прежде всего через энергетический и пластический обмены. Установленная гепатотропность полисахаридов требует уточнения механизмов их действия.

Целью настоящей работы явилось изучение влияния зостерана и хитозана на белоксинтезирующую функцию клеток паренхимы печени интактных животных.

Материалы и методы

Работа выполнена на половозрелых самцах мышей с исходной массой 20 - 25 г. Содержание, уход, эвтаназия животных осуществлялись в соответствии с требованиями Европейской конвенции по защите экспериментальных животных (86/609 EEC). В работе использовались следующие полисахариды растительного и животного происхождения: зостеран из морской травы Zostera marina L., содержащий 74.8% D-галактуроновой кислоты, со степенью этерификации - 5.7%, с характеристической вязкостью - 340 мл/г галактуронана, и хитозан из панциря камчатского краба Paralitodes camtchatica Tilsius, с молекулярной массой - 130 кДа, вязкостью - 160 мл/г, степень дезацетилирования - 96%, содержанием белка - 2%, неорганическим остатком - 1,7%.

В эксперименте было 3 группы животных: "интактная" (инт), "зостеран" (зост) и "хитозан" (хит), по 7 мышей в каждой. В течение 14 дней мышей групп "зост" и "хит" ежедневно однократно внутрижелудочно получали полисахариды в виде 1%-ного геля в дозе 100 мг/кг, животные интактной группы - равноценный объем физраствора. Через 24 ч после последнего введения препаратов животных декапитировали под легким эфирным наркозом. Материалом исследования служила печень животных.

Кусочки печени фиксировали в холодной смеси этанол-уксусная кислота (3:1), после чего из них готовили постоянные давленые препараты по методике А.П. Анисимова [1]. С целью выявления специфических ядрышковых белков препараты окрашивали 50% коллоидным раствором азотнокислого серебра по методике Н.Н. Мамаева с соавт. [10]. На полученных препаратах определяли площадь ядер гепатоцитов, в них - число и площадь ядрышек. Кроме того, для оценки доли ядрышек на единицу площади ядра рассчитывали ядерно-ядрышковое отношение (отношение площади ядра к суммарной площади ядрышек в этом же ядре) [13]. От каждого животного измеряли в среднем по 100 ядер.

Мазки изолированных клеток печени готовили по методике М.В. Кудрявцевой с соавт. [8] и фиксировали абсолютным метанолом в течение 15 мин. Препараты

окрашивали 0,03% раствором амидочерного 10Б в течение 1 ч [4]. Количество белка в цитоплазме рассчитывали как произведение оптической плотности и площади цитоплазмы для каждого класса плоидности. Плоидность ядер определяли по их площади [3]. Было измерено в среднем по 70 гепатоцитов от каждого животного.

Измерения проводили на аппаратно-программном комплексе автоматизированного определения морфометрических параметров клеток "МЕКОС-Ц1" (ЗАО «Медицинские компьютерные системы», Москва). С помощью специального программного обеспечения «МЕКОС-AgNOR» проводились ввод изображения в компьютер, выделение границ клеток, ядер и ядрышек и определение их морфометрических параметров. Достоверность различий между группами оценивали при помощи t-критерия Стьюдента с использованием программы для статистической обработки данных Statistica for Windows r.5.1 b (StatSoft Inc.).

Результаты

Подсчет числа ядрышек в ядрах гепатоцитов показал, что под влиянием зостерана и хитозана их число увеличивается по сравнению нормой на 33 и 13% соответственно (рис.1).

_й ^

К

О Ц

О

7 6 5 4 3 2 1 0

Рис. 1. Влияние зостерана и хитозана на число ядрышек в ядрах гепатоцитов мышей.

* - р < 0,05 при сравнении групп "инт" "зост", "инт" - "хит".

инт

зост

хит

группы животных

*

Как видно из рис. 2, суммарная площадь ядрышек и количество Ag-белков в них по-разному изменяются при действии полисахаридов: в группе "зостеран" они увеличиваются на 5 и 22% соответственно, в то время как в группе "хитозан" отмечается их достоверное снижение относительно нормы на 33 и 39% соответственно.

го

3

120

2 ^ 100

т 80

ф 60

3 л 40

СР

20

к

0

í

< 9

ш

о

«8 I £

70 60 50 40 30 20 10 0

б

инт зост хит группы животных

инт зост хит группы животных

Рис. 2. Влияние зостерана и хитозана на суммарную площадь ядрышек (а) и количество Л§-белков (б) в ядрах гепатоцитов мышей.

* - р < 0,05 при сравнении групп "инт" - "зост", "инт" - "хит".

Нами установлено, что под влиянием исследуемых полисахаридов в печени мышей происходит увеличение пула тетраплоидных клеток при одновременном уменьшении долигепатоцитов классов 8с и 16с. Это свидетельствует о замедлении процесса полиплоидизации гепатоцитов (таблица).

Распределение гепатоцитов по классам плоидности при действии полисахаридов застерана и хитозана

Группы животных Классы плоидности

4с 8с 16с

Интактная 55,7 ± 1,6 38,5 ± 1,7 5,1 ± 0,7

Зостеран 57,5 ± 2,5 35,1 ± 3,1 3,0 ±0,6

Хитозан 60,4 ± 3,9 32,6 ± 3,7 2,9 ± 0,8

а

Замедление процесса полиплоидизации сказывается на размере ядра. В группах животных, получавших препараты зостерана и хитозана, площадь ядра достоверно ниже нормы на 29 и 59% соответственно (рис. 3).

Информативным является показатель ядерно-ядрышкового отношения, отражающий "долю ядрышек" на единицу площади ядра. По отношению к норме этот показатель в гепатоцитах под влиянием зостерана снижается в 1,4 раза, хитозана - в 1,3 раза. В обеих группах мышей, получавших полисахариды, изменения достоверны (рис. 4).

2500

S. 1500

* 1000

! 500

g 0 с

f

Рис.3. Влияние зостерана и хитозана на среднюю площадь ядер гепатоцитов мышей.

* - p < 0,05 при сравнении групп "инт" -"зост", "инт" - "хит".

инт

зост

хит

группы животных

*

ф

о m

0

3 _û CP

rç

CD

1 Œ Ф

К

25 20 15 10

инт зост хит группы животных

Рис.4. Влияние зостерана и хитозана на ядерно-ядрышковое отношение в гепатоцитах мышей.

* - р < 0,05 при сравнении групп "инт" " зост", " инт" - " хит".

*

*

5

0

На рис.5 представлены данные об изменении содержания белка в цитоплазме гепатоцитов животных исследуемых групп в каждом классе плоидности. Под влиянием полисахаридов нами отмечалось увеличение содержания белка в клетках печени. Так, в группе "зостеран" в тетраплоидных клетках количество белка увеличивается - на 29%, в октаплоидных - на 30%, в клетках класса 16с - на 18%. Аналогичные результаты получены и для животных, получавших хитозан. В классе плоидности 4с содержание белка превышает норму на 28%, в классе 8с - на 18%, в классе 16с - на 9%. Данная разница в количестве белка во всех классах плоидности кроме 16с в гепатоцитах мышей обеих групп, получавших препараты зостерана и хитозана, по сравнению с нормой достоверна.

250 200 150 100 50 0

500 400 300 200 100 0

б

инт

зост

хит

инт

зост

хит

800 700 600 500 400 300 200 100 0

в

инт

зост

хит

Рис. 5. Влияние зостерана и хитозана на содержание белка в цитоплазме гепатоцитов разных классов плоидности у мышей (а - 4с, б - 8с, в - 16с).

По горизонтали - группы животных, по вертикали - количество белка, усл.ед. * - р < 0,05 при сравнении групп "инт" -"зост", "инт" - "хит".

а

*

*

*

Обсуждение

Известно, что в условиях физиологической нормы процесс полиплоидизации происходит вследствие конкуренции между ауто- и гетеросинтезами, когда клеткам не хватает пластических и энергетических запасов для полноценного митоза [3]. Введение полисахаридов вызывает смещение гомеостаза в печени, в ответ происходит мобилизация адаптационных процессов, которая выражается в повышении синтетического потенциала гепатоцитов[11]. В них усиливается синтез белков, в том числе и тех, что необходимы для полноценного прохождения митоза. В этих условиях тетраплоидные клетки мышей, самые молодые, делятся с образованием одноядерных клеток того же класса плоидности, и численность их популяции нарастает при одновременном снижении по сравнению с нормой доли гепатоцитов классов плоидности 8с и 16с. Таким образом, происходит замедление полиплоидизации, что и было обнаружено в проведенной работе. Наши результаты согласуются с данными В.Б.Дуркиной и соавт [5], которые показали, что при введении зостерана в течение 28 дней наблюдается достоверное перераспределение клеток печени по классам плоидности.

Вследствие замедления полиплоидизации снижается средняя площадь ядра, суммарная площадь ядрышек и абсолютное количество Ag-белков в группах "зостеран" и "хитозан". Однако их относительное количество (количество Ag-белков на единицу площади ядра), напротив, увеличивается, поскольку уменьшается ядерно-ядрышковое отношение в клетках печени мышей этих групп. Увеличение числа ядрышек в ядрах гепатоцитов животных, получавших полисахариды, при одновременном снижении среднего уровня плоидности говорит об активации латентных ядрышкообразующих районов хромосом, то есть наблюдается их переход к более активному функциональному состоянию. Как установлено ранее [17,18], исследуемые нами суммарная площадь ядрышек и количество аргентофильных белков в них хорошо коррелирует с числом и суммарной площадью гранул серебра в ядре, с активностью РНК-полимеразы I. Эти параметры используются для оценки белоксинтезирующей активности клеток, поскольку они тесно связаны с изменениями, происходящими в клетках при различных физиологических и патологических процессах [7,10].

Разнонаправленные изменения суммарной площади ядрышек и количества Ag-белков в группах "зостеран" и "хитозан" могут быть объяснены разной скоростью действия данных полисахаридов на клетки паренхимы печени. При введении зостерана в течение двух недель значения всех рассматриваемых морфофункциональных параметров ядрышек и количество белка в цитоплазме достоверно увеличиваются по сравнению с нормой. В группе же "хитозан" гепатоциты, по-видимому, зафиксированы на той стадии физиологического действия полисахарида, когда активация латентных ядрышкообразующих районов началась, но уровень их функциональной активности еще не достиг своего максимума. Кроме того, возможно, что некоторые из вновь образованных ядрышек еще настолько малы, что уровень сродства ядрышковых белков к серебру не достигает той величины, когда ядрышки будут визуально определяться. Однако зафиксированное на фоне хитозана увеличение числа ядрышек и доли Ag-белков на единицу площади ядра вызвает достоверное повышение количества белка в цитоплазме. Некоторое отличие в действии хитозана и зостерана на суммарную площадь ядрышек и абсолютное количество Ag-белков в них может быть объяснено разной структурой и физико-химическими свойствами исследуемых полисахаридов. Известно, что степень накопления полисахаридов в тканях, зависящая от ионизированности молекул, различна, и, соответственно, отличается их проникновение во внутриклеточные области [6].

Все приведенные выше факты свидетельствуют об интенсификации полисахаридами синтеза белка в цитоплазме. Известно, что под влиянием полисахаридов (пектинов), вводимых животным с диетой в течение 2-4 недель, увеличивается содержание белка в эпителиальных клетках тощей и подвздошной кишок [19,23]. Ранее показано, что 90-95% меченой 14С-галактуроновой кислоты пектина обнаруживается в белках и липидах через 18 часов после введения [22].

Повышение синтеза белков ведет к накоплению пластического материала, усиленная наработка ферментов - к увеличению уровня их активности в целом. Подобная интенсификация метаболических процессов способствует увеличению резистентности гепатоцитов и оптимальному развитию клеточных и внутриклеточных механизмов регенерации ткани при патологии [2]. Нами ранее установлено, что исследуемые полисахариды оптимизируют энергообеспечение и модулируют гормональный статус организма в условиях нормы и патологии, что находится в прямой взаимосвязи с пластическим метаболизмом [15,16]. Однако молекулярные механизмы биосинтеза белка в тканях (транскрипции, синтеза рибосом и т.д.) под влиянием полисахаридов требуют дальнейшего изучения.

ЛИТЕРАТУРА

1. Анисимов А.П. Простой способ получения постоянных давленых препаратов с использованием целлофана // Цитология. 1992. Т. 34, № 11/12. С. 110 - 112.

2. Батыршина Г.Ф. Перспективы применения антиоксидантов при репаративной регенерации // Морфология. 2000. Т. 117, № 3. С. 19 - 20.

3. Бродский В.Я., Урываева И.В. Клеточная полиплоидия. Пролиферация и дифференцировка. 1981. М.: Наука. 264 с.

4. Брумберг В.А., Певзнер Л.З. О применении амидочерного для цитофотометрического исследования клеточных белков // Цитология. 1972. Т. 14, № 5. С. 674 - 676.

5. Дуркина В.Б., Тюпелеев П.А., Янкина Т.А., Гаркуша А.А. Исследование гепатопротекторных свойств зостерина на модели алиментарного ожирения // Дальневост. мед. журн. 2000. № 2. С. 31 - 34.

6. Кайшева Н.Ш., Мыкоц Л.П., Василенко Ю.К. Исследование процессов распределения полисахаридов в полярных и неполярных системах и тканях организма // Хим.-фарм. журн. 2004. Т.38, № 1. С. 31 - 34.

7. Каралова Е.М., Аброян Л.О., Акопян Л.О., Карагезян К.Г., Магакян Ю.А. Поведение ядер и ядрышкообразующих районов хромосом лимфоцитов на разных стадиях развития периодической болезни // Цитология. 2004. Т.46, №4. С.376 - 380.

8. Кудрявцева М.В., Завадская Е.Э., Скорина А.Д., Смирнова С.А., Кудрявцев Б.Н. Метод получения изолированных клеток печени человека из материала прижизненных пункционных биопсий // Лаб. дело. 1983. № 9. С. 21 - 22.

9. Лазарева Е.Б., Меньшиков Д.Д. Опыт и перспективы использования пектинов в лечебной практике // Антибиотики и химиотерапия. 1999. Т. 44, № 2. С. 37 - 40.

10. Мамаев Н.Н., Гудкова А.Я., Аминева Х.К., Ковалева О.В., Алмазов В.А. Метод оценки белоксинтезирующей функции кардиомиоцитов человека // Арх. анат. гистол. эмбриол. 1989. Т. 96, № 5. С. 69 - 72.

11. Меерсон Ф.З. Общий механизм адаптации и роль в нем стресс-реакции, основные стадии процесса // Физиология адаптационных процессов / Отв. ред. П.Г. Костюк. М.: Наука, 1986. С. 77 - 123.

12. Оводов Ю.С. Полисахариды цветковых растений: структура и физиологическая активность // Биоорг. химия. 1998. Т. 24, № 7. С. 483 - 501.

13. Хайдарова Т.Г., Калашник Н.А. Ядрышковые организаторы хромосом как адаптивные элементы хвойных видов // Цитология. 1999. Т.41, № 12. С. 1086.

14. Хасина Э.И., Бездетко Г.Н., Янькова В.И. Протективное действие зостерина при экспериментальним токсическом поражении печени // Бюл. СО РАМН. 1998. № 1. С. 51 - 55.

15. Хасина Э.И., Сгребнева М.Н., Ермак И.М., Горбач В.И. Хитозан и неспецифическая резистентность организма // Вестник ДВО. 2005. № 1 (в печати).

16. Хасина Э.И., Требухов Е.Е., Золотухина О.Н. Оптимизация физической работоспособности зостерином // Дальневост. мед. журн. 2001. № 2. С. 45 - 48.

17. Штейн Г.И., Кудрявцева М.В., Кудрявцев Б.Н. Изменение морфометрических параметров окрашенных серебром ядрышек гепатоцитов крыс при циррозе печени и в процессе ее реабилитации // Цитология. 1999. Т. 41, № 7. С. 574 - 580.

18. Derenzini M., Trere D., Pession A., Montarano L., Sirri V., Ochs R.L. Nucleolar functions and size in cancer cells // Amer. J. Pathol. 1998. Vol. 152. P. 1291 - 1297.

19. Fukunaga T., Sasaki M., Araki Y., Okamoto T., Yasuoka T., Tsujikawa T., Fujiyama Y., Bamba T. Effects of the soluble fibre pectin on intestinal proliferation, fecal short chain fatty acid production and microbial population // Digestion. 2003. Vol. 67. P. 42 - 49.

20. Koide S.S. Chitin-chitosan: properties, benefits and risks // Nutr.Res. 1998. Vol. 18, № 6. P. 1091 - 1101.

21. Ning L., Mei Z., Yuan C. Enhancement of the antioxidative potential of heart, liver, spleen and kidney cells and erythrocytes of mice by the polysaccharide krestin // Med. Sci. Res. 1996. Vol. 24, Iss 9. P. 615 - 616.

22. McDougall G.J., Morrison I.M., Stewart D., Hillman J.R. Plant cell walls as dietary fibre: range, structure, processing and function // J. Sci. Food Agric. 1996. Vol.70. P. 133-150.

23. Oku-T. Reversible cecal and colonic enlargement induce by dietary fiber in rats // Nutr. Res. 1995. Vol. 15, Iss 9. P. 1355 - 1366.

24. Thakur B.R., Singh R.K., Handa A.K. Chemistry and uses of pectin - a review // Critical Rev. Food Sci. Nutr. 1997. Vol. 37, № 1. P. 47 - 73.