СРЕДСТВО, ИНДУЦИРУЮЩЕЕ СОЗРЕВАНИЕ ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК
AGENT INDUCING MATURING OF DENDRITIC CELLS

Изобретение относится к медицине, конкретно к онкологии, и касается веществ, стимулирующих созревание дендритных клеток (DC).
Исследования показали, что использование дендритных клеток при лечении рака имеет обещающие результаты. Дендритные клетки - клетки иммунной защиты, являются потенциальными источниками антигенпрезентирующих клеток (АРС) и играют основную роль в регуляции иммунного ответа [Banchereau J., et al. Immunobiology of dendritic cells. Annu. Rev. Immunol. 2000. 18. 767-811].
Дендритные клетки существуют, по меньшей мере, в двух функционально и фенотипически разных стадиях развития и созревания. На первом этапе незрелые дендритные клетки (iDС) циркулируют в крови, затем проникают в периферические ткани, где приобретают способность к захвату и прессингу антигенов. В дальнейшем зрелые дендритные клетки (mDC) мигрируют в лимфатические узлы, презентируют пептидные фрагменты антигенов с молекулами Т-лимфоцитов, индуцируя иммунный ответ. Способность DC стимулировать Т-клетки зависит от их стадии созревания.
Когда дендритные клетки полностью созревают, они являются источником информации о содержании раковых клеток. Во многих типах рака дендритные клетки в раковой области являются незрелыми и не могут эффективно донести информацию о раковых клетках остаткам иммунной системы, в частности Т-лимфоцитам. Для того чтобы информация о раке была достоверной, DC клетки должны созреть - это является основным моментом. Поэтому получение большого числа зрелых DC клеток из циркулирующей крови пациентов больных раком представляется важным моментом в иммунотерапии рака.
Моноциты, культивированные с цитокинами (интерфероны, фактор некроза опухоли (TNF), ряд интерлейкинов, колонии-стимулирующий фактор (CSF)) дифференцируют в незрелые дендритные клетки. Созревание DC происходит после обработки их веществами, индуцирующими созревание дендритных клеток, такими как фактор некроза опухоли (TNF-α), γ-интерферон (IFN-γ), или CD40L (семейство фактора некроза опухоли) [Reis e Sousa С: Dendritic cells in a mature age. Nat. Rev. Immunol. 2006. 6(6). 476-483].
Известно использование в качестве агента созревания дендритных клеток бацилл Кальметта-Герена (BCG), соединения имидазохинолина, искусственного двунитевого полирибонуклеотида, а также липополисахарида [RU 2005121256 A, 2006.02.10].
Известно, что фукоидан из Fucus vesiculosus (Sigma) ингибирует связывание Т84 эпителиальных клеток к CD11b/CD18, очищенным из нейрофилов, а также увеличивает жизнеспособность DC, продуцирование IL-12 TNF-alpha, MHC I и II, CD54 и CD86. Также этот фукоидан уменьшает поглощение антигена и увеличивает рост аллогенных спленоцитов, проявляет иммуностимулирующий эффект и влияет на созревание DC по пути, включающему NF-kappa-B активацию [Kim, M.H., and Joo, H.G. Immunostimulatory effects of fucoidan on bone marrow-derived dendritic cells. Immunol. Lett. (2008), 115, 138-143].
Задача изобретения - расширение арсенала средств, индуцирующих созревание дендритных клеток.
Задача решена применением фукоидана из Fucus evanescens или полисахаридной композиции из Fucus evanescens, состоящей из фукоидана в количестве 60-80% и полиманнуроновой кислоты в количестве 20-40%, в качестве средства, индуцирующего созревание дендритных клеток.
Технический результат, обеспечиваемый изобретением, заключается в выраженном индуцирующем действии фукоидана из Fucus evanescens или полисахаридной композиции из Fucus evanescens на созревание дендритных клеток.
Фукоидан из Fucus evanescens, обозначенный далее «Fe», запатентован заявителем в качестве средства, обладающего антикоагулянтным и иммунотропным действием [RU 2247574 С2, 10.03.2005].
Полисахаридная композиция из Fucus evanescens, состоящая из фукоидана в количестве 60-80% и полиманнуроновой кислоты в количестве 20-40%, обозначенная далее «Fc», запатентована заявителем в качестве биологически активного продукта, являющегося дополнительным источником иммуноактивных полисахаридов и растворимых пищевых волокон, повышающих неспецифическую резистентность организма [RU 2315487 С1, 2008.01.27].
Заявляемое техническое решение является новым, т.к. в доступной патентной и научно-медицинской литературе не обнаружено описание применения продуктов Fe или Fc в качестве средства, индуцирующего созревание дендритных клеток.
Для специалиста явным образом не следует из уровня техники возможность применения Fe или Fc в качестве средства, индуцирующего созревание дендритных клеток.
Фукоиданы - это семейство высокосульфатированных гомо- и гетерополисахаридов бурых водорослей, имеющих L-фукозу в качестве основной структурной единицы, но отличающиеся друг от друга физико-химическими свойствами, моносахаридным составом, молекулярными массами и иными характеристиками. Это семейство может пополняться все новыми и новыми соединениями, полученными из разных видов бурых водорослей, с присущими только им физико-химическими и иными характеристиками, и обладающими определенными биологически активными свойствами.
Установлено, что проявление биологической активности у какого-либо конкретного фукоидана из определенного вида водоросли не предполагает, что данная биологическая активность будет проявляться и у фукоиданов, выделенных из других видов водорослей. Это подтверждается, например, исследованиями по установлению взаимосвязи между структурой фукоиданов из различных источников и их биологической активностью [Cumashi, A., Ushakova, N. A. et. al. (2007) A comparative study of the anti-inflammatory, anticoagulant, antiangiogenic, and antiadhesive activities of nine different fucoidans from brown seaweeds. Glycobiology 17, 541-552].
Авторами вышеупомянутой статьи показано, что из девяти исследованных фукоиданов только пять проявляют ингибирование тромбиновой активности. Было также показано, что фукоиданы уменьшают содержание лейкоцитов при перитоните у крыс. Возможный механизм этого действия - ингибирование Р-селектин связывающей активности. При этом активность фукоиданов уменьшалась в следующем ряду: L. saccharina, L. digitata, F. evanescens, F. serratus, F. distichus, F. spiralis, A. nodosum. Фукоиданы из Cladosiphon okamuranus и Fucus vesiculosus не проявили ингибирование Р-селектин связывающей активности.
Таким образом, предлагаемое техническое решение соответствует критерию «изобретательский уровень».
Фукоидан из Fucus vesiculosus (Sigma), обозначенный далее «Fv», является негомогенным продуктом. Он содержит смесь фукоиданов и уроновых кислот, а также примеси неуглеводной природы [Fitton, J.H. Fucoidans: healthful saccharides from the sea. GlycoScience&Nutrition (2005), 6, 1-6]. Это обстоятельство не позволяет сделать однозначный вывод о том, что именно фукоидан, а не другой компонент этой смеси, индуцирует созревание дендритных клеток.
Препараты Fe и Fc имеют стандартизированный состав и, следовательно, оказывают направленное биологическое действие. Они не содержат полисахариды другой природы, липиды и сохраняют свои свойства длительное время (3 года). Все эти преимущества открывают возможность для применения фукоидана из Fucus evanescens или полисахаридной композиции из Fucus evanescens в качестве средства, индуцирующего созревание дендритных клеток.
Изобретение иллюстрируется следующими чертежами:
На фиг.1 представлена индукция созревания дендритных клеток под действием препаратов Fe и Fc. Fv - препарат сравнения; липополисахарид (LPS) - положительный контроль.
На фиг.2 представлен дозозависимый эффект, оказываемый Fc на созревание дендритных клеток.
На фиг.3 представлена диаграмма индукции маркеров дендритных клеток под действием Fc и LPS.
На фиг.4 представлена диаграмма индукции маркеров дендритных клеток с использованием методов электронной микроскопии с использованием PI-коньюгированных CD-80 антител и FITC-коньюгированных MHC-II антител.
На фиг.5 представлена фагоцитарная активность дендритных клеток под действием Fc и LPS.
На фиг.6 представлена экспрессия цитокинов в дендритных клетках, обработанных Fc и LPS.
На фиг.7 представлена экспрессия IFN-γ в смешанной культуре лимфоцитов под действием Fc и LPS.
На фиг.8 представлена стимуляция роста Т клеток под действием дендритных клеток, обработанных Fc и LPS.
Изобретение иллюстрируется примером.
Принятые сокращения
TNF-α
Фактор некроза опухоли
IFN-γ
γ-интерферон
CD40L
Семейство фактора некроза опухоли
iDC
Незрелые дендритные клетки
mDC
Зрелые дендритные клетки
BCG
Бациллы Кальметта-Герена
LPS
Липополисахарид
CD1
Кластер дифференциации 1
CD3
Кластер дифференциации 3
CD14
Кластер дифференциации 14
CD40
Кластер дифференциации
CD80
Кластер дифференциации
CD86
Кластер дифференциации
GM-CSF
Гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор
BSA
Альбумин
FITC
Флюоресцеининизотиоцианатом
РЕ
Фикоэритрин
MHC-II
Главный комплекс гистосовместимости
CCR7
Хемокиновый рецептор 7
IL-4
Интерлейкин-4
IL-10
Интерлейкин 10
IL-12
Интерлейкин 12
PBS
Фосфатный буфер
Получение дендритных клеток
Моноциты были очищены из клеток периферической крови селекции с использованием суперпарамагнитного носителя MACS (Miltenyi Biotec., Bergisch Gladbach, Germany), коньюгированного с антителами к CD 14 (кластер дифференциации 14). Чистота моноцитов, определенная проточным цитометром, более 95%. Моноциты были культивированы в среде, содержащей рекомбинантные GM-CSF (800 ед/мл) (Novartis, Munich, Germany) с IL-4 (125 ед/мл) (Strathmann Biothec., Hamburg, Germany) на протяжении 6 дней для генерации DC. Дифференциация моноцитов была тестирована экспрессией CD1 и CD 14.
Анализ фенотипа дендритных клеток
6
Клетки (1×10) были собраны, отмыты фосфатным буфером (PBS), содержащим альбумин (BSA), и помечены FITC (флюоресцеининизотиоцианатом) и РЕ (фикоэритрин)-конъюгированными антителами инкубацией на льду в течение 30 мин с последующей отмывкой в PBS. Жизнеспособные клетки были анализированы на FACSCalibur проточном цитометре (Beckton Dickinson, Franklin lakes, NJ). Соответствующие антитела были использованы как контроль для неспецифического окрашивания. Препараты Fv и Fc увеличивали уровень экспрессии кластеров дифференциации CD40, CD80, CD83 в дендритных клетках подобно LPS. Однако Fe имел меньший эффект на экспрессию маркеров дендритных клеток, чем Fv и Fc. Экспрессия MHC-II (главного комплекса гистосовместимости) не увеличивалась под действием фукоиданов (Фиг.1). Экспрессия CD80, CD83 в iDC увеличивалась в зависимости от дозы Fc (Фиг.2). Кроме того, Fc увеличивал экспрессию CD80, CD83, CD86 и CCR7 (хемокинового рецептора 7) в дендритных клетках (Фиг.3).
Конфокальная микроскопия
Клетки были фиксированы в течение 15 мин в 3% растворе параформальдегида в PBS, инкубированы 10 мин в 0.1% растворе Triton X-100 в PBS. Слайды были инкубированы в блокирующем буфере при 25°С в течение часа. После промывки (3 раза, PBS), клетки были инкубированы при 4°С в течение часа с РЕ-коньюгированными антителами против CD-89 или MHC-II и вновь отмыты с PBS. Образцы были анализированы с использованием микроскопии (Carl Zeiss LSM 510). Обработка дендритных клеток препаратом Fc в течение двух дней индуцирует типичные морфологические изменения при созревании дендритных клеток (Фиг.4). Иммуногистохимический анализ показал, что иммунореактивность CD86 и MHC-II значительно увеличивается после двух дней культивирования с фукоиданом Fc и липополисахаридом.
Фагоцитарная активность
5
Для анализа эндоцитоза 1×10 клеток были инкубированы с 1 мг/мл FITC-декстран (42 кДа) при 37°С в течение часа. Клетки были отмыты дважды с холодным HBSS, инкубированы и анализированы на проточном цитометре. Параллельный эксперимент был проведен при 4°С.
FITC-декстран был тестирован на его способность проникать в клетки. Фагоцитарная активность DC, обработанных Fc, была выше чем в контроле (Фиг.5).
Анализ цитокинов
Клетки были инкубированы в среде RPMI-1640, содержащей Fc (50 мкг/мл) или LPS (1 мкг/мл) в течение 24 ч, в присутствии или в отсутствие Т-клеток. Профили секреции цитокинов IL-10, IL-12, TNF-a, IFN-γ в растворах были измерены в трех независимых экспериментах с использованием ELISA наборов (R&D System), чувствительность ≥ 5 пкг/мл. Стандартные цитокины были использованы в качестве контролей. Уровень экспрессии иммуносупрессора IL-10 по сравнению с контролем увеличивался в клетках, обработанных Fc или LPS. Однако экспрессия IL-12 (p70) в клетках, обработанных Fc, была ниже чем при стимуляции липополисахаридом (Фиг.6). Fc стимулировал способность DCs экспрессировать TNF-α, и уровень экспрессии сопоставим с уровнем, полученным при обработке LPS. Экспрессия IFN-γ в Т-клетках увеличивалась, когда дендритные клетки с Т-клетками в соотношении 1:25 были обработаны Fc или LPS (Фиг.7).
Определение функциональной активности дендритных клеток (смешанная культура лимфоцитов)
5
3
2
Т-клетки были очищены из периферической крови здоровых добровольцев, и чистота была тестирована окрашиванием с FITC-коньюгированными CD3 антителами. Fc или LPS обработанные дендритные клетки были обработаны с 50 мкг/мл митомицина С в течение 1 ч и затем 1×10 Т-клеток были добавлены в 96 луночные планшеты. Клетки были культивированы в течение 5 дней при 37°С, 5% СO и затем добавлен 1 мкКи [H]тимидин (NEN-DuPont, Boston, MA). Радиоактивность собранных клеток была измерена через 18 ч. Тестирование дендритных клеток на их способность поддерживать активацию Т-клеток показало, что они стимулировали пролиферацию Т-клеток, при культивировании в течение 5 дней в соотношении (T:DC=1:25) (Фиг.8).