МУТАНТНЫЕ ШТАММЫ MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE

1. Способ получения мутантного штамма Mycoplasma hyopneumoniae, отличающийся тем, что он включает в себя этап трансформации штамма M. hyopneumoniae посредством применения вектора-носителя, содержащего, по меньшей мере, одну экзогенную последовательность ДНК, которая является последовательностью, находящейся под контролем последовательности ДНК, имеющий степень идентичности с промоторной областью M. hyopneumoniae, по меньшей мере, 80%.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что экзогенная последовательность ДНК выбрана из группы, состоящей из гена устойчивости к антибиотику, гена, кодирующего рекомбиназу, гена, кодирующего транспозазу, последовательности-мишени для транспозазы, фрагмента ДНК Mhyo, фрагмента, который предпочтительно перегруппирован или рекомбинирован с одним или несколькими фрагментами ДНК, гена, кодирующего антигенный компонент микроорганизма, вызывающего заболевания свиней, и их комбинаций.
3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что экзогенная последовательность ДНК представляет собой ген устойчивости к антибиотику, комбинированный с геном, кодирующим антигенный компонент микроорганизма, вызывающего заболевания свиней, и при необходимости комбинированный с геном, кодирующим мембранный белок Mhyo.
4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что вектор-носитель представляет собой репликативный плазмидный вектор, который содержит:
1) последовательность ДНК, содержащую область oriC штамма Mycoplasma sp., и
2) экзогенную последовательность ДНК, содержащую маркерный ген, и при необходимости дополнительную экзогенную последовательность ДНК, которые находятся под контролем последовательности ДНК, имеющей степень идентичности, по меньшей мере, 80% с промоторной областью Mhyo.
5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что вектор-носитель представляет собой транспозонный вектор, который содержит:
1) последовательность ДНК, кодирующую транспозазу,
2) экзогенную последовательность ДНК, содержащую маркерный ген, и
3) при необходимости дополнительную экзогенную последовательность ДНК,
где последовательность ДНК, кодирующая транспозазу, и, по меньшей мере, одна экзогенная последовательность ДНК находятся под контролем последовательности ДНК, имеющей степень идентичности, по меньшей мере, 80%, с промоторной областью Mhyo.
6. Способ по п. 5, отличающийся тем, что вектор представляет собой плазмиду.
7. Способ по п. 4, отличающийся тем, что вектор содержит дополнительную экзогенную последовательность ДНК, кодирующую рекомбинантный белок, который индуцирует защитный ответ против заболеваний или патологических состояний, поражающих свиней, вызываемых микроорганизмами группы, состоящей из Actinobacillus sp., Brachyspira sp., Pasteurella multocida, Salmonella sp., Streptococcus sp., Isospora sp., Erysipelothrix rhusiopathiae, Leptospira sp., Staphylococcus sp., Haemophilus parasuis, Bordetella bronchiseptica, Clostridium sp., Mycoplasma sp., Lawsonia intracellularis, Escherichia coli, вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней, вируса свиного гриппа, вируса контагиозного гастроэнтерита, свиного парвовируса, вируса энцефаломиокардита, коронавируса, ротавируса, агента синдрома послеотъемного снижения веса у поросят, вируса классической чумы свиней, вируса африканской чумы свиней, калицивируса, вируса гепатита TTV и цирковируса свиней.
8. Способ по п. 7, отличающийся тем, что дополнительная экзогенная последовательность ДНК выбрана из группы, состоящей из последовательности ДНК, кодирующей белок капсида цирковируса свиней типа 2 (ЦВС-2), и последовательности ДНК, кодирующей белок, содержащий белок капсида цирковируса свиней типа 2 (ЦВС-2), дополнительно несущий аминокислоты MetSerGlySer на N-конце указанного белка, указанная дополнительная экзогенная последовательность ДНК, кодирующая белок капсида ЦВС-2, выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5.
9. Способ по п. 4, отличающийся тем, что дополнительная экзогенная последовательность ДНК представляет собой ген Mhyo, находящийся в обратной ориентации по отношению к промоторной области Mhyo.
10. Способ по п. 1, отличающийся тем, что промоторная область Mhyo содержит промоторную область гена белка Mhyo, выбранного из группы, состоящей из белков P36, P46, P65, P76, P97, P102, P146 и P216.
11. Способ по п. 5, отличающийся тем, что вектор содержит последовательность ДНК, кодирующую транспозазу, последовательность ДНК, кодирующую маркерный ген, при необходимости фланкированный последовательностями loxP, и последовательность ДНК, кодирующую белок капсида ЦВС-2, указанная последовательность ДНК, кодирующая белок капсида ЦВС-2, определена последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 4, которая слита с последним основанием гена, кодирующего мембранный белок P46 Mhyo, и SEQ ID NO: 3, которая вставлена между аминокислотами 92 и 93 белка P46 Mhyo, где каждая из этих последовательностей ДНК находится под контролем промоторной области Mhyo, выбранной из промоторной области белка P97 или белка P46 Mhyo, SEQ ID NO: 5 предпочтительно находится под контролем промоторной области белка P97, а SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4 предпочтительно находятся под контролем промоторной области белка P46.
12. Способ по п. 1, отличающийся тем, что этап трансформации бактерий осуществляется путем инкубации этой бактерии в присутствии соли, содержащей двухвалентные ионы, воздействия смеси полиэтиленгликоля или электропорации.
13. Способ по п. 12, отличающийся тем, что этап трансформации бактерий осуществляется путем электропорации.
14. Способ по п. 13, отличающийся тем, что перед проведением электропорации суспензию бактерий Mhyo подвергают инкубации в буфере для электропорации с хелатирующим агентом, имеющим двухвалентный ион.
15. Репликативный плазмидный вектор, отличающийся тем, что он содержит:
1) последовательность ДНК, содержащую область oriC штамма Mycoplasma sp., и
2) экзогенную последовательность ДНК, содержащую маркерный ген, и при необходимости дополнительную экзогенную последовательность ДНК, которые находятся под контролем последовательности ДНК, имеющей степень идентичности, по меньшей мере, 80% с промоторной областью Mhyo.
16. Транспозонный вектор, отличающийся тем, что он содержит:
1) последовательность ДНК, кодирующую транспозазу,
2) экзогенную последовательность ДНК, содержащую маркерный ген, и
3) при необходимости дополнительную экзогенную последовательность ДНК,
где последовательность ДНК, кодирующая транспозазу, и, по меньшей мере, одна экзогенная последовательность ДНК находятся под контролем последовательности ДНК, имеющей степень идентичности, по меньшей мере, 80% с промоторной областью Mhyo.
17. Вектор по п. 15, отличающийся тем, что он содержит дополнительную экзогенную последовательность ДНК, кодирующую рекомбинантный белок, который индуцирует защитный ответ против заболеваний или патологических состояний, поражающих свиней, вызываемых микроорганизмами группы, состоящей из Actinobacillus sp., Brachyspira sp., Pasteurella multocida, Salmonella sp., Streptococcus sp., Isospora sp., Erysipelothrix rhusiopathiae, Leptospira sp., Staphylococcus sp., Haemophilus parasuis, Bordetella bronchiseptica, Clostridium sp., Mycoplasma sp., Lawsonia intracellularis, Escherichia coli, вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней, вируса свиного гриппа, вируса контагиозного гастроэнтерита, свиного парвовируса, вируса энцефаломиокардита, коронавируса, ротавируса, агента синдрома послеотъемного снижения веса у поросят, вируса классической чумы свиней, вируса африканской чумы свиней, калицивируса, вируса гепатита TTV и цирковируса свиней.
18. Вектор по п. 17, отличающийся тем, что дополнительная экзогенная последовательность ДНК выбрана из группы, состоящей из последовательности ДНК, кодирующей белок капсида цирковируса свиней типа 2 (ЦВС-2), и последовательности, кодирующей белок, содержащий белок капсида цирковируса свиней типа 2 (ЦВС-2), дополнительно несущий аминокислоты MetSerGlySer на N-конце указанного белка, указанная дополнительная экзогенная последовательность ДНК, кодирующая белок капсида ЦВС-2, выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5.
19. Вектор по п. 15, отличающийся тем, что промоторная область Mhyo содержит промоторную область гена белка Mhyo, выбранного из группы, состоящей из белков P36, P46, P65, P76, P97, P102, P146 и P216.
20. Вектор по п. 16, отличающийся тем, что он содержит последовательность ДНК, кодирующую транспозазу, последовательность ДНК, кодирующую маркерный ген, при необходимости фланкированный последовательностями loxP, и последовательность ДНК, кодирующую белок капсида ЦВС-2, указанная последовательность ДНК, кодирующая белок капсида ЦВС-2, определена последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 4, которая слита с последним основанием гена, кодирующего мембранный белок P46 Mhyo, и SEQ ID NO: 3, которая вставлена между аминокислотами 92 и 93 белка P46 Mhyo, где каждая из этих последовательностей ДНК находится под контролем промоторной области Mhyo, выбранной из промоторной области белка P97 или белка P46 Mhyo, SEQ ID NO: 5 предпочтительно находится под контролем промоторной области белка P97, а SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4 предпочтительно находятся под контролем промоторной области белка P46.
21. Мутантный штамм Mhyo, получаемый способом по п. 1.
22. Мутантный штамм Mhyo, отличающийся тем, что он содержит, по меньшей мере, одну экзогенную последовательность ДНК, стабильно включенную в его геном или в цитозоль.
23. Мутантный штамм Mhyo по п. 21, который представляет собой мутантный штамм Mhyo, депонированный в коллекции DSMZ Лейбниц-института и выбран из мутантного штамма Mhyo с регистрационным номером DSM 26020, мутантного штамма Mhyo с регистрационным номером DSM 26027, мутантного штамма Mhyo с регистрационным номером DSM 26033, мутантного штамма Mhyo с регистрационным номером DSM 26034 и мутантного штамма Mhyo с регистрационным номером DSM 26049.
24. Вакцина для защиты свиней от энзоотической пневмонии свиней, вызываемой Mhyo, и при необходимости от другого заболевания или дополнительных патологических состояний, поражающих свиней, содержащая иммунологически эффективное количество мутантного штамма Mhyo по п. 21.
25. Вакцина по п. 24, отличающаяся тем, что она объединена с дополнительной вакцинной или антигенной композицией.
26. Набор для вакцинации свиней против инфекции или заболевания, вызываемого Mhyo, и при необходимости против другого заболевания или патологических состояний, вызываемых микроорганизмами, поражающими свиней, включающий в себя контейнер, содержащий иммунологически эффективное количество мутантного штамма по п. 21.
27. Способ по п. 5, отличающийся тем, что вектор содержит дополнительную экзогенную последовательность ДНК, кодирующую рекомбинантный белок, который индуцирует защитный ответ против заболеваний или патологических состояний, поражающих свиней, вызываемых микроорганизмами группы, состоящей из Actinobacillus sp., Brachyspira sp., Pasteurella multocida, Salmonella sp., Streptococcus sp., Isospora sp., Erysipelothrix rhusiopathiae, Leptospira sp., Staphylococcus sp., Haemophilus parasuis, Bordetella bronchiseptica, Clostridium sp., Mycoplasma sp., Lawsonia intracellularis, Escherichia coli, вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней, вируса свиного гриппа, вируса контагиозного гастроэнтерита, свиного парвовируса, вируса энцефаломиокардита, коронавируса, ротавируса, агента синдрома послеотъемного снижения веса у поросят, вируса классической чумы свиней, вируса африканской чумы свиней, калицивируса, вируса гепатита TTV и цирковируса свиней.
28. Способ по п. 27, отличающийся тем, что дополнительная экзогенная последовательность ДНК выбрана из группы, состоящей из последовательности ДНК, кодирующей белок капсида цирковируса свиней типа 2 (ЦВС-2), и последовательности, кодирующей белок, содержащий белок капсида цирковируса свиней типа 2 (ЦВС-2), дополнительно несущий аминокислоты MetSerGlySer на N-конце указанного белка, указанная дополнительная экзогенная последовательность ДНК, кодирующая белок капсида ЦВС-2, выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5.
29. Вектор по п. 16, отличающийся тем, что он содержит дополнительную экзогенную последовательность ДНК, кодирующую рекомбинантный белок, который индуцирует защитный ответ против заболеваний или патологических состояний, поражающих свиней, вызываемых микроорганизмами группы, состоящей из Actinobacillus sp., Brachyspira sp., Pasteurella multocida, Salmonella sp., Streptococcus sp., Isospora sp., Erysipelothrix rhusiopathiae, Leptospira sp., Staphylococcus sp., Haemophilus parasuis, Bordetella bronchiseptica, Clostridium sp., Mycoplasma sp., Lawsonia intracellularis, Escherichia coli, вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней, вируса свиного гриппа, вируса контагиозного гастроэнтерита, свиного парвовируса, вируса энцефаломиокардита, коронавируса, ротавируса, агента синдрома послеотъемного снижения веса у поросят, вируса классической чумы свиней, вируса африканской чумы свиней, калицивируса, вируса гепатита TTV и цирковируса свиней.
30. Вектор по п. 29, отличающийся тем, что дополнительная экзогенная последовательность ДНК выбрана из группы, состоящей из последовательности ДНК, кодирующей белок капсида цирковируса свиней типа 2 (ЦВС-2), и последовательности, кодирующей белок, содержащий белок капсида цирковируса свиней типа 2 (ЦВС-2), дополнительно несущий аминокислоты MetSerGlySer на N-конце указанного белка, указанная дополнительная экзогенная последовательность ДНК, кодирующая белок капсида ЦВС-2, выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5.
31. Вектор по п. 16, отличающийся тем, что промоторная область Mhyo содержит промоторную область гена белка Mhyo, выбранного из группы, состоящей из белков P36, P46, P65, P76, P97, P102, P146 и P216.
32. Способ лечения энзоотической пневмонии свиней, вызываемой Mhyo, и при необходимости другого заболевания или дополнительных патологических состояний, поражающих свиней, путем введения мутантного штамма Mhyo по любому из пп. 21, 22 или 23.
33. Способ по п. 6, отличающийся тем, что дополнительная экзогенная последовательность ДНК представляет собой ген Mhyo, находящийся в обратной ориентации по отношению к промоторной области Mhyo.
34. Способ по п. 6, отличающийся тем, что вектор содержит последовательность ДНК, кодирующую транспозазу, последовательность ДНК, кодирующую маркерный ген, при необходимости фланкированный последовательностями loxP, и последовательность ДНК, кодирующую белок капсида ЦВС-2, указанная последовательность ДНК, кодирующая белок капсида ЦВС-2, определена последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 4, которая слита с последним основанием гена, кодирующего мембранный белок P46 Mhyo, и SEQ ID NO: 3, которая вставлена между аминокислотами 92 и 93 белка P46 Mhyo, где каждая из этих последовательностей ДНК находится под контролем промоторной области Mhyo, выбранной из промоторной области белка P97 или белка P46 Mhyo, SEQ ID NO: 5 предпочтительно находится под контролем промоторной области белка P97, а SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4 предпочтительно находятся под контролем промоторной области белка P46.