Влияние УФ-излучения на частоту сердечных сокращений личинок амфибий

Влияние УФ-излучения на частоту сердечных сокращений личинок амфибий

З.Г. Хабаева, А.К Бадтиев, Г.М.Чельдиева

К.б.н., доцент СОГУ З.Г. Хабаева

К.х.н., доцент СОГУ Г.М. Чельдиева

Представлены результаты исследований о влиянии УФ-излучения с длинами волн 280320 нм на частоту сердечных сокращений у амфибий вида Rana macrocnemis Boulenger, Rana ridibunda Pallas и Bufo viridis Laurenti. Установлено, что частоту сердечных сокращений личинок можно использовать как чувствительный показатель при оценке физиологического состояния эмбрионов амфибий.

К числу факторов внешней среды, оказывающих неоднозначное влияние на живые системы, относят ультрафиолетовое (УФ) излучение. Являясь составной частью естественного солнечного спектра, УФ-лучи наряду с другими видами неионизирующего излучения определяют природно-нерадиационный фон. Однако жизнеобеспечивающие пределы вариабельности УФ-облучения (УФО), как и любых других видов радиации, имеют ограниченные пределы. Достигнув определенного уровня, они могут проявлять вредное для биоты действие.

Начиная с 70-х годов XX в. в научной литературе активно обсуждается вопрос о повышении интенсивности УФ-излучения в природе в результате загрязнения окружающей среды и уменьшения толщины озонового слоя [9; 8; 14]. В связи с этим резко возрастает роль УФ-излу-чения, особенно средневолнового диапазона (УФ-В - 280-320 нм), как фактора, дестабилизирующего устойчивость живых систем.

Высказывается предположение о возможном влиянии УФ-В-излучения на снижение численности земноводных и появление у них уродств [4;

5; 6; 7; 10;11; 12; 13;15]. Такого рода данные определяют необходимость более тщательного изучения проблемы регулирующей роли УФ-В-излучения в жизнедеятельности биоты в современных экологических условиях.

Цель исследования заключается в изучении особенностей влияния ультрафиолетового излучения средневолнового диапазона, различной интенсивности, на частоту сердечных сокращений у трех видов амфибий.

В качестве объекта исследования использовали зародыши трех видов представителей класса Amphibia (земноводные) отряда Anura (бесхвостые амфибии) наиболее распространенных на территории Республики Северная Осетия-Алания: лягушки малоазиатской (Rana macrocnemis Boulenger), лягушки озерной (Rana ridibunda Pallas) и жабы зеленой (Bufo viridis Laurenti).

Сбор эмбрионального материала осуществляли в период икрометания в местах наибольшего распространения зародышей амфибий.

Взятие икры производили вместе с водой из водоемов и транспортировали в лабораторию. Здесь икру разделяли на небольшие порции по 30-50 икринок. В кладках малоазиатской и озерной лягушек отбирали икру одной стадии развития и из одной части кладки (верхнего, внутреннего или нижнего слоев). Из кладки жабы зеленой эмбрионы брали из одного участка шнура. В последующем биоматериал помещали в чашки Петри (диаметр 95 мм). В каждую чашку

Таблица 1

Количество опытов с физиологическим тестированием (оценка динамики ЧСС) зародышей амфибий

Стадии облучения зародышей Количество опытов Количество наблюдаемых эмбрионов в каждом опыте

Зигота 12 10

Дробление В 10

Бластула 19 10

Гаструла 25 10

Нейрула 19 10

наливали по 20 мл отстоянной более двух суток водопроводной воды комнатной температуры, которая предохраняла эмбрионы от перегрева. Эмбрионы лягушек малоазиатской и озерной в чашках Петри аккуратно расслаивали препаровальными иглами на монослой для равномерного облучения. Во всех случаях зародыши располагались таким образом, что их пигментированные анимальные полюса были обращены к облучателю. После облучения эмбрионов для предотвращения их пересыхания в каждую чашку доливали по 20 мл отстоянной воды.

Источником УФ-радиации служил настольный ртутно-кварцевый облучатель ОКН-11М с диапазоном длин волн излучения 280-320 нм. Освещенность действующего фактора на расстоянии 25 см от излучателя составляла 2,1х104 лк. Измерения проводили люксметром «Ю116».

Учитывая центральную роль температурного фактора в определении скорости зародышевого развития, облучение эмбрионов во всех экспериментальных сериях проводили в керамической раковине, используя проточную воду для предотвращения их перегрева. Температура, как в контрольных, так и опытных группах, поддерживалась на одном уровне (18-200 С). Продолжительность облучения была различной в разных экспериментальных сериях и составляла 30-180 с; 200-480 с и 600-900 с. Использовав формулу для расчета энергии излучения (освещенность х на площадь и время облучения), определили дозу облучения, которая при заданных параметрах и продолжительности УФО в 1 с. составила 2,1 Дж/см2.

Оценку физиологического состояния зародышей амфибий осуществляли на личиночной (30-31) стадии по частоте сердечных сокращений. Как известно, на личиночной стадии у амфибий начинают ветвиться зачатки жабр, видно движение крови в сосудах жаберных отростков, появляются ритмичные сердечные сокращения, которые хорошо определяются визуально [1]. С этой целью в каждом опыте из оставшихся в живых личинок отбирали 10 экземпляров (использован метод случайного отбора). Подсчет ЧСС проводили визуально под микроскопом МБС-1 при окуляре 8х и объективе 2х в 104 экспериментах у 1290 личинок.

Результаты экспериментов подвергали статистической обработке на персональном компьютере с использованием программы Primer of Biostatistics (Version 4.03 by Stanton A. Glantz, 1998). Рассчитывали среднюю арифметическую (M), стандартную ошибку среднего (m) и среднее квадратичное отклонение (д). Достоверность различий (P) исследуемых параметров определяли по f-критерию Стью-дента [2].

Исследования проводились с 2002 по 2007 гг. В период с 2002 по 2004 гг. в качестве объекта неионизирующего воздействия были использованы зародыши лягушки малоазиатской и жабы зеленой на разных стадиях развития: зигота; средняя и поздняя бластула; ранняя и поздняя гаструла; нейрула (табл. 2-5). В период работы с 2005 по 2007 гг. оценку состояния зародышевого развития в сходных условиях эксперимента осуществляли у жабы зеленой, лягушки озерной и лягушки малоазиатской (табл. 6-8).

Таблица 2

ЧСС личинок лягушки малоазиатской, подвергнутых УФ-воздействию на разных стадиях зародышевого развития

Стадия облучения Стат. показатели Время ультрафиолетового облучения в с

Контроль 30 60 90 120

Зигота n 10 10 10 10 10

M ± m 70,6 і 3,7 62,2 і 3,4 59,8 і 2,7 56,2 і 1,8 56,2 і 1,8

P - <0,05 <0,01 <0,01

Бластула 9-я стадия n 10 10 10 10 10

M ± m 80,8 і 1,9 69,4 і 1,2 63,8 і 2,2 64,8 і 1,5 62,6 і 1,5

P <0,01 <0,05 <0,01 <0,05

Бластула 10-я стадия n 10 10 10 10 10

M ± m 75,6 і 0,6 78,6 і 1,5 50 і 1,4 49,2 і 1,4 69,2 і 2,8

P - <0,01 <0,001 <0,05

Таблица 3

ЧСС личинок лягушки малоазиатской, подвергнутых УФ-воздействию ________ на разных стадиях зародышевого развития_______________________

Стадия облучения Стат. показатели Время ультрафиолетового облучения в с

Контроль 150 180 300 600

Зигота п 10 10 10 10 10

М ± т 70,6 ± 3,7 51,2 ± 1,5 46,4 ± 1,2 45,6 ± 0,8 50,8 ± 1,3

Р <0,001 <0,001 <0,001 <0,001

Бластула 9-я стадия п 10 10 10 10 10

М ± т 80,8 ± 1,9 59,6 ± 1,9 70,6 ±0,8 67 ± 1,5 70,6 ± 1,5

Р <0,01 <0,001 <0,001 <0,001

Бластула 10-я стадия п 10 10 10 10

М ± т 75,6 ± 0,6 63 ± 1,9 70,9 ±5,1 73,4 ± 3,2

Р <0,01 - -

Таблица 4

ЧСС личинок лягушки малоазиатской, подвергнутых УФ-воздействию на разных стадиях зародышевого развития

Стадия облучения Стат. показатели Время ультрафиолетового облучения, с

Контроль 30 60 180 300

Г аструла п 10 10 10 10 10

М ± т 74,6 ± 1,3 50,2 ± 1,7 53,4 ±2,3 58,8 ±2,2 46,8 ±0,9

Р <0,001 <0,001 <0,001 <0,001

Г аструла 11-я стадия п 10 10 10 10

М ± т 74,6 ± 1,6 50,4 ± 1,7 53,4 ± 2,3 58,8 ±2,2

Р <0,001 <0,001 <0,001

Г аструла 12-я стадия п 10 10 10 10

М ± т 69,9 ± 1,3 49,6 ± 1,9 54,6 ± 2,5 59,9 ±2,3

Р <0,05 <0,1

Г аструла 17-я стадия п 10 10 10 10 10

М ± т 82,1 ±4,7 79,4 ± 1,9 79,4 ± 2,4 80 ± 1,3 82,5 ± 3

Р <0,01 <0,1 - -

Г аструла 17-я стадия п 10 10 10 10 10

М ± т 82 ± 1,6 66 ± 2,3 70 ± 1,7 69 ± 1,7 77,6 ±2,2

Р <0,05 <0,05 <0,001 <0,001

Г аструла 17-я стадия п 10 10 10 10

М ± т 74 ± 1,7 67,8 ± 1,2 68,4 ± 1,2 67,4 ± 3,2

Р - - -

Таблица 5

ЧСС личинок жабы зеленой, подвергнутых УФ-воздействию на разных стадиях зародышевого развития

Стадия облучения Стат. показатели Время ультрафиолетового облучения, с

Контроль 30 60 180 300

Нейрула 20-я стадия п 10 10 10 10 10

М ± т 72,6 ±2,1 79,4 ± 1,9 79,4 ±6,8 80 ± 1,3 82,5 ± 3

Р <0,05 - -

Нейрула 25-я стадия п 10 10 10 10

М ± т 82 ±4 92,4 ± 1,1 89 ± 1,9 94,2 ± 1,1

Р <0,001 <0,001 <0,001

Нейрула 28-я стадия п 10 10 10 10 10

М ± т 79 ± 0,6 67,6 ±2,3 70 ± 1,7 69 ± 1,7 77,6 ±2,2

Р <0,05 <0,05 <0,05 -

Обобщение результатов, представленных в таблицах 2-5, позволило выделить несколько фактов. В контроле обнаружены сопоставимые показатели частоты сердечных сокращений ли-

чинок: пределы их вариабельности составили от 70,6-80,8 уд/мин. Не обнаружены статистически значимые различия в ЧСС в зависимости от вида амфибий (лягушка-жаба). Более того, у

Таблица 6

ЧСС личинок лягушки малоазиатской, подвергнутых УФ воздействию на разных стадиях зародышевого развития

Стадии облучения Стат. показатели Длительность ультрафиолетового облучения в с.

Контроль 180 240 300 420

Зигота п 10 10 10 10

М ± т 88,8 ± 1,5 78,8 ±2,1 76 ±2,1 72 ± 1,9

Р <0,001 <0,001 <0,001

Дробление, 3-я стадия п 10 10 10 10 10

М ± т 76,3 ±2,1 80,3 ±2,3 79,3 ±2,5 88 ± 2,6 80,3 ±3,1

Р 0,217 0,386 <0,005 0,297

Дробление, 4-я стадия п 10 10 10 10 10

М ± т 68 ± 1,7 59,2 ± 1,1 58,8 ± 0,8 60 ± 1,4 55,2 ± 1,3

Р <0,001 <0,001 <0,005 <0,001

Бластула, 10-я стадия п 10 10 10 10 10

М ± т 77,6 ±2,6 64,4 ± 2,4 59,2 ± 3,3 66,2 ± 3,0 67,6 ± 2,63

Р <0,005 <0,001 <0,01 <0,01

Гаструла, 17-я стадия п 10 10 10 10 10

М ± т 80,4 ± 3,0 62,8 ± 1,6 62,4 ± 2,5 64,8 ± 3,3 70,2 ± 2,7

Р <0,001 <0,001 <0,005 <0,05

Нейрула, 20-я стадия п 10 10 10 10

М ± т 80 ±2,5 70,8 ± 1,9 70 ± 1,8 68 ± 1,8

Р <0,01 <0,01 <0,001

Нейрула, 20-я стадия п 10 10 10 10 10

М ± т 80 ± 1,7 65,4 ± 2,3 69,8 ±2,2 63,6 ±2,0 68,2 ± 2,0

Р <0,001 <0,01 <0,001 <0,001

Нейрула, 23-я стадия п 10 10 10 10 10

М ± т 68,3 ± 1,7 59,2 ± 2,5 59,3 ± 1,8 58,4 ± 1,2 57,6 ± 0,9

Р <0,01 <0,005 <0,001 <0,001

Таблица 7

ЧСС личинок лягушки озерной, подвергнутых УФ-воздействию на разных стадиях зародышевого развития

Стадии облучения Стат. показатели Длительность ультрафиолетового облучения в с

Контроль 180 240 300 420

Дробление, 7-я стадия п 10 10 10 10 10

М ± т 96,8 ±2,8 76 ± 2,6 78 ±2,5 86,5 ± 3,0 78 ± 3,6

Р <0,001 <0,001 <0,05 <0,001

Нейрула, 21-я стадия п 10 10 10 10 10

М ± т 100,4 ±2,8 90 ± 1,9 84 ± 3,8 82,1 ±2,2 80 ± 5,5

Р <0,01 <0,005 <0,001 0,005

Таблица 8

ЧСС личинок жабы зеленой, подвергнутых УФ-воздействию на разных стадиях зародышевого развития

Стадии облучения Стат. показатели Длительность ультрафиолетового облучения в с

Контроль 180 240 300 420

Бластула, 10-я стадия п 10 10 10 10

М ± т 100,4 ±2,7 90,6 ± 3,2 92,4 ± 1,5 91,6 ± 1,7

Р <0,05 <0,01 <0,01

Г аструла, 17-я стадия п 10 10 10 10 10

М ± т 92,8 ± 1,4 81,6 ± 1,3 77,2 ± 1,6 91,6 ± 1,8 84 ± 1,8

Р <0,001 <0,001 <0,613 <0,005

Нейрула, 20-я стадия п 10 10 10 10 10

М ± т 97,6 ± 1,1 89,6 ±2,2 91 ±2,3 86,4 ±2,1 86,4 ± 2,9

Р <0,005 <0,05 <0,001 <0,005

лягушек в контроле обнаружены выраженные различия только в опытах, в которых использовались зародыши на стадии зиготы и ранней бластулы. Однако в опытных сериях направленность изменений ЧСС определялась уже видом амфибий. Так, у малоазиатской лягушки УФ-об-лучение во всех группах вызвало понижение ЧСС (р<0,05-<0,001). Интересно отметить, что такого рода изменения ЧСС наблюдались при использовании даже низких доз воздействия ультрафиолета (от 30 до 180 с.). У зародышей жаб, облученных на стадии нейрулы, 30- и 60секундное облучение не вызвало каких-либо изменений ЧСС, а 180- и 300-секундное облучение определило повышение данного показателя (р<0,05-<0,001).

Проводя исследования с 2004 по 2007 гг., мы увеличили дробность верхней границы дозы облучения - 120, 180, 200, 240, 300, 420, 480 с (табл. 6-8).

Результаты, представленные в таблицах 6-8 отдельно по каждому виду амфибий, свидетельствуют о достоверном понижении ЧСС практически во всех опытах.

Полученные результаты свидетельствуют об информативности данного функционального показателя даже в тех случаях, когда по морфологическим параметрам воздействие УФ-облу-чения не регистрировалось. Последующие исследования не только подтвердили данный факт, но и позволили выявить особенности динамики ЧСС в зависимости от вида амфибий. Из таблиц 2-4, 6-7видно, что практически во всех случаях облучение ультрафиолетом, не зависимо от дозы и стадии, на которой было осуществлено воздействие, вызывало у зародышей лягушек понижение ЧСС. Результаты были статистически достоверны. В аналогичных условиях наблюдения соответствующие дозы УФ-облучения у жаб могли вызывать как повышение, так и понижение ЧСС (табл. 5, 8).

Обобщение представленных выше данных позволило выделить ряд общих закономерностей по динамике ЧСС у зародышей амфибий. К их числу следует отнести:

широкие пределы вариабельности ЧСС в контрольной группе с достоверным уровнем различий среднестатистических показателей как в пределах одной кладки, так и между различными кладками;

отсутствие линейной связи между дозой УФ-облучения и изменением ЧСС;

зависимость направленности динамики ЧСС в зависимости от вида амфибий; при этом у лягушек УФО вызывало статистически значи-

мое понижение ЧСС практически во всех опытах независимо от дозы облучения, а у жаб в сходных условиях наблюдения происходило как повышение, так и понижение ЧСС.

В литературе мы не нашли каких-либо данных относительно динамики ЧСС зародышей амфибий в условиях ультрафиолетового воздействия. По этой причине полученные результаты были рассмотрены в рамках существующих представлений об адаптивных изменениях деятельности сердечно-сосудистой системы бесхвостых амфибий при воздействии различного рода раздражителей. В частности, приспособление к гипоксии у них осуществляется путем снижения кислородного запроса. Такой физиологический механизм описан как при адаптации к высокогорью, так и при адаптации к нырянию [3]. Сердечно-сосудистыми приспособлениями служат брадикардия, сужение кожных капилляров, сужение кровеносных сосудов, снабжающих скелетную мускулатуру, уменьшение легочно-кожного кровотока. Брадикардия наряду с другими функциональными изменениями организма выступает в качестве компенсаторного механизма, обеспечивающего переход организма на новый уровень функционирования в измененных условиях среды или поведенческих реакций. Указанные изменения есть результат адаптации организма к уменьшению возможности получения кислорода в течение длительных периодов пребывания под водой или в условиях высокогорья. Исходя из такого рода предположений, мы посчитали возможным рассматривать снижение ЧСС у лягушек на фоне УФ-воздействия как результат включения адаптивных механизмов, обеспечивающих реализацию приспособительных механизмов организма в условиях воздействия раздражителя, выходящего за рамки адекватного, но еще не экстремального. Интересны в этой связи различия в направленности изменений ЧСС, обусловленных УФ, у лягушек и жаб. Как видно из представленных выше данных, зародыши жаб оказались более чувствительны к воздействию УФ по сравнению с лягушками: при одной и той же длительности действующего фактора процент гибели и выраженность дефектов развития была выше у жаб. В таком случае повышение ЧСС у части зародышей жаб, оставшихся в живых после облучения, можно рассматривать как проявление напряженности защитно-компенсаторных механизмов, обусловленных действием экстремального раздражителя.

Литература

1. Дабагян Н.В., Слепцова Л.А. Травяная лягушка Rana temporaria L.//Объекты биологии развития. - М.: Наука, 1975. С. 442-462.

2. Плохинский Н.А. Биометрия//Издательство Московского университета, 1970. 368 с.

3. Слоним А.Д. Пойкилотермные организмы в горах // Экологическая физиология животных. Часть III. Физиология животных в различных физико-географических зонах - Л.: Наука, 1982. С. 354-361.

4. Anzalone C.R., Kats L.B., Gordon M.S. Effects of solar UV-B radiation on embryonic development in Hyla cadaverian, Hyla regilla, and Taricha torosa. Conserv. Biol, 1998. 12: p. 646-653.

5. Blaustein A.R. Chicken little or Nero's fiddle? A perspective on declining amphibian populations// Herpetologica, 1994. 50: p 85-97.

6. Blaustein A.R., Hoffman P.D., Hokit D.G. et al. UV repair and resistance to solar UV-B in amphibian eggs: a link to population declines? // Proc Nat Acad Sci USA, 1994. 91: p 1791-1795.

7. Blaustein, A.R., Belden L.K. Amphibian defenses against ultraviolet-B radiation//Evolution and Development, 2003. 5: p 89-97.

8. Hader D.P. The Effects of Ozone Depletion on Aquatic Ecosystems // Austin, TX: R. G. Landes; 1997.

9. Kerr J.B., McElroy C.J. Evidence for large upward trends of ultraviolet-b radiation linked to ozone depletion // Science, 1993. 262: p 10321034.

10. Oromi N., Marquis O., Miaud C. et al. Influence of ambient ultraviolet radiation on Bufo calamita egg development in a semiarid zone (Catalonia, Spain) J. Environ. Biol., 2008. 29(1): p 135-137.

11. Ovaska K., Davis T.M. UV-B Induced Damage to the Skin and Ocular System of Amphibians//Biol. Bull. 2000. 199: p 187-188.

12. Pahkala M., Laurila A., Merila J. Carryover effects of ultraviolet-B radiation on larval fitness in Rana temporaria. Proceedings of the Royal Society of London, 2001. B 268: p 16991706.

13. Pounds J.A., FogdenM.P.L., Savage J.M. et

al. Tests of null models for amphibian declines on a tropical mountain//Conservation Biology, 1997. 11: p 1307-1322.

14. Schindler D.W., Curtis P.J., Parker B.R. et

al. Consequences of climate warming and lake acidification bor UV-B penetration in North American boreal lakes//Nature, 1996. 379: p 705-708.

15. Stebbins R.C., Cohen N.W. A Natural History of Amphibians. Princeton: Princeton Univ. Press; 1995.

ОБЪЯВЛЕНИЕ

Учреждение Российской академии наук Центр геофизических исследований Владикавказского научного центра РАН и Правительства Республики Северная Осетия-Алания

ОБЪЯВЛЯЕТ ПРИЕМ В АСПИРАНТУРУ НА 2009 ГОД

С ОТРЫВОМ ОТ ПРОИЗВОДСТВА (за счет средств федерального бюджета) по специальностям:

25.00.10 - геофизика, геофизические методы поисков полезных ископаемых - 1 место;

25.00.36 - геоэкология - 1 место.

БЕЗ ОТРЫВА ОТ ПРОИЗВОДСТВА по специальности:

25.00.36 - геоэкология - 1 место.

Заявления и документы принимаются по адресу:

г. Владикавказ, ул. Маркова, 93 а, ЦГИ ВНЦ РАН и РСО-А, отдел аспирантуры (2-й этаж), тел.: 8(8672) 76-40-84, тел./факс 76-40-56.