ИНДУКТОР ИММУНИТЕТА
IMMUNITY INDUCER

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[0001] Настоящее изобретение относится к новому индуктору иммунитета, пригодному в качестве активного ингредиента в средстве для лечения или предупреждения злокачественной опухоли.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0002]
Белок SCD1 (стеароил-коА-десатураза 1) представляет собой белок, который вносит двойную связь в положении C9-C10 насыщенной жирной кислоты.
[0003]
Полагают, что белок SCD1 ассоциирован с развитием злокачественной опухоли. Например, согласно непатентным документам 1 и 2, его экспрессия повышается при различных злокачественных опухолях, таких как рак печени, рак пищевода и рак ободочной и прямой кишки. Описано, что ингибирование функции SCD1 посредством миРНК и низкомолекулярного ингибиторного соединения препятствует пролиферации злокачественных клеток и индуцирует апоптоз и, таким образом, уменьшение образовавшейся опухоли.
[0004] С другой стороны, в патентном документе 1 описано, что белок SCD1 обладает активностью индукции иммунной системы против злокачественных клеток, и, таким образом, он является пригодным для лечения и/или предупреждения злокачественной опухоли. Однако в патентном документе 1 не описаны пептиды, которые связываются с молекулами MHC.
Список литературы
Патентные документы
[0005]
Патентный документ 1: WO 2012/157736
Непатентные документы
[0006]
Непатентный документ 1: Igal RA. Carcinogenesis. Sep; 31 (9): 1509-15 (2010)
Непатентный документ 2: Chen L. Sci. Rep. 6, 19665 (2016).
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
ТЕХНИЧЕСКАЯ ПРОБЛЕМА
[0007] Задачей настоящего изобретения является поиск нового полипептида, пригодного в качестве активного ингредиента в средстве для лечения или предупреждения злокачественной опухоли, и обеспечение применения полипептида в качестве индуктора иммунитета.
[0008] Другой задачей настоящего изобретения является предоставление выделенной антигенпредставляющей клетки, включающей комплекс полипептида и молекулы MHC, и выделенной T-клетки, которая селективно связывается с комплексом полипептида и молекулы MHC, а также средства для лечения или предупреждения злокачественной опухоли, включающего их.
РЕШЕНИЕ ПРОБЛЕМЫ
[0009] В результате интенсивных исследований авторы настоящего изобретения обнаружили, что белок SCD1 человека, имеющий аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 2, специфически экспрессируется в тканях или клетках злокачественной лимфомы, рака молочной железы, рака печени, рака предстательной железы, рака яичника, рака почки, рака ободочной и прямой кишки, рака желудка, злокачественной опухоли головного мозга, рака пищевода и рак легкого. Кроме того, авторы изобретения обнаружили, что пептидный фрагмент, присутствующий в конкретной области белка SCD1, обладает способностью (активность индукции иммунитета) активировать и увеличивать в количестве T-клетки, специфичные к этому полипептиду, посредством презентации антигенпредставляющими клетками, и что эта активность индукции иммунитета является пригодной для лечения или предупреждения злокачественной опухоли. Исходя из этих результатов, авторы изобретения обнаружили, что полипептид можно использовать в качестве активного ингредиента в средстве для индукции иммунитета для лечения и/или предупреждения злокачественной опухоли, и что антигенпредставляющие клетки, которые вступили в контакт с пептидом, и T-клетки, которые вступили в контакт с антигенпредставляющими клетками, также являются пригодными для лечения или предупреждения злокачественной опухоли, тем самым осуществив настоящее изобретение.
[0010] В частности, настоящее изобретение имеет следующие характеристики (1)-(12).
(1) Индуктор иммунитета, содержащий в качестве активного ингредиента по меньшей мере один полипептид, обладающий активностью индукции иммунитета и выбранный из группы полипептидов (a) или (b) ниже:
(a) полипептиды, состоящие из 7 или более последовательно расположенных аминокислот в области положений 34-50, положений 69-148, положений 178-195, положений 207-242, положений 247-280 и положений 296-332 аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 2;
(b) полипептиды, содержащие от одной до нескольких аминокислотных делеций, замен, инсерций или вставок в аминокислотной последовательности любого из полипептидов (a); или
in vivo
рекомбинантный вектор, содержащий по меньшей мере один полинуклеотид, кодирующий любой из полипептидов и способный экспрессировать полипептид .
(2) Индуктор иммунитета согласно (1), где полипептид, обладающий активностью индукции иммунитета, связывается с молекулой MHC класса I.
(3) Индуктор иммунитета согласно (2), где полипептид, обладающий активностью индукции иммунитета, представляет собой любой из полипептидов, выбранных из группы полипептидов (c)-(e) ниже:
(c) полипептиды, состоящие из аминокислотных последовательностей, соответствующих SEQ ID NO: 3-36;
(d) полипептиды, содержащие от одной до нескольких аминокислотных делеций, замен, инсерций или вставок в аминокислотной последовательности любого из полипептидов (c);
(e) полипептиды, каждый из которых содержит частичную последовательность любого из полипептидов (c) или (d).
(4) Индуктор иммунитета согласно (1), где полипептид, обладающий активностью индукции иммунитета, связывается с молекулой MHC класса II.
(5) Индуктор иммунитета согласно (4), где полипептид, обладающий активностью индукции иммунитета, представляет собой любой из полипептидов, выбранных из группы полипептидов (f)-(h) ниже:
(f) полипептиды, состоящие из аминокислотных последовательностей, соответствующих SEQ ID NO: 37-45;
(g) полипептиды, содержащие от одной до нескольких аминокислотных делеций, замен, инсерций или вставок в аминокислотной последовательности любого из полипептидов (f);
(h) полипептиды, каждый из которых содержит частичную последовательность любого из полипептидов (f) или (g).
(6) Индуктор иммунитета согласно любому из (1)-(5), который используют в качестве активного ингредиента в средстве для лечения или предупреждения злокачественной опухоли.
(7) Индуктор иммунитета согласно (6), где злокачественная опухоль представляет собой злокачественную опухоль, экспрессирующую белок SCD1.
(8) Индуктор иммунитета согласно (6) или (7), где злокачественная опухоль представляет собой злокачественную лимфому, рак молочной железы, рак печени, рак предстательной железы, рак яичника, рак почки, рак ободочной и прямой кишки, рак желудка, злокачественную опухоль головного мозга, рак пищевода или рак легкого.
(9) Индуктор иммунитета согласно любому из (1)-(8), дополнительно содержащий усилитель иммунитета.
(10) Выделенная антигенпредставляющая клетка, содержащая комплекс полипептида, обладающего активностью индукции иммунитета, согласно (1), (3) или (5), и молекулы MHC.
[0011] (11) Выделенная T-клетка, которая селективно связывается с комплексом полипептида, обладающего активностью индукции иммунитета, согласно (1), (3) или (5), и молекулы MHC.
(12) Полипептид, обладающий активностью индукции иммунитета и выбранный из группы полипептидов (a) или (b) ниже:
(a) полипептиды, обладающие активностью индукции иммунитета и состоящие из 7 или более последовательно расположенных аминокислот в области положений 34-50, положений 69-148, положений 178-195, положений 207-242, положений 247-280 и положений 296-332 в аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 2;
(b) полипептиды, содержащие от одной до нескольких аминокислотных делеций, замен, инсерций или вставок в аминокислотной последовательности любого из полипептидов (a).
(13) Средство для лечения или предупреждения злокачественной опухоли, содержащее в качестве активного ингредиента один или несколько агентов, выбранных из группы, состоящей из (i)-(iv) ниже:
(i) по меньшей мере один полипептид, обладающий активностью индукции иммунитета и выбранный из группы полипептидов (a) или (b) ниже:
(a) полипептиды, состоящие из 7 или более последовательно расположенных аминокислот в области положений 34-50, положений 69-148, положений 178-195, положений 207-242, положений 247-280 и положений 296-332 в аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 2,
(b) полипептиды, содержащие от одной до нескольких аминокислотных делеций, замен, инсерций или вставок в аминокислотной последовательности любого из полипептидов (a);
in vivo
(ii) рекомбинантный вектор, содержащий по меньшей мере один полинуклеотид, кодирующий любой из полипептидов и способный экспрессировать полипептид ;
(iii) выделенная антигенпредставляющая клетка, содержащая комплекс любого из полипептидов и молекулы MHC; и
(iv) выделенная T-клетка, которая является специфичной к любому из полипептидов.
(14) Средство для лечения или предупреждения злокачественной опухоли согласно (13), где полипептид, обладающий активностью индукции иммунитета, представляет собой по меньшей мере один из полипептидов выбранных из группы полипептидов (c)-(h) ниже:
(c) полипептиды, состоящие из аминокислотных последовательностей, соответствующих SEQ ID NO: 3-36;
(d) полипептиды, содержащие от одной до нескольких аминокислотных делеций, замен, инсерций или вставок в аминокислотной последовательности любого из полипептидов (c);
(e) полипептиды, каждый из которых содержит частичную последовательность любого из полипептидов (c) или (d);
(f) полипептиды, состоящие из аминокислотных последовательностей, соответствующих SEQ ID NO: 37-45;
(g) полипептиды, содержащие от одной до нескольких аминокислотных делеций, замен, инсерций или вставок в аминокислотной последовательности любого из полипептидов (f);
(h) полипептиды, каждый из которых содержит частичную последовательность любого из полипептидов (f) или (g).
(15) Средство для лечения или предупреждения злокачественной опухоли согласно (13) или (14), где злокачественная опухоль представляет собой злокачественную опухоль, экспрессирующую белок SCD1.
(16) Способ лечения или предупреждения злокачественной опухоли, включающий введение индивидууму, являющемуся животным, нуждающимся в этом, одного или нескольких средств, выбранных из группы, состоящей из (i)-(iv) ниже:
(i) по меньшей мере один полипептид, обладающий активностью индукции иммунитета и выбранный из группы полипептидов (a) или (b) ниже:
(a) полипептиды, состоящие из 7 или более последовательно расположенных аминокислот в области положений 34-50, положений 69-148, положений 178-195, положений 207-242, положений 247-280 и положений 296-332 в аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 2,
(b) полипептиды, содержащие от одной до нескольких аминокислотных делеций, замен, инсерций или вставок в аминокислотной последовательности любого из полипептидов (a);
in vivo
(ii) рекомбинантный вектор, содержащий по меньшей мере один полинуклеотид, кодирующий любой из полипептидов и способный экспрессировать полипептид ;
(iii) выделенная антигенпредставляющая клетка, содержащая комплекс любого из полипептидов и молекулы MHC; и
(iv) выделенная T-клетка, которая является специфичной к любому из полипептидов.
(17) Способ согласно (16), где полипептид, обладающий активностью индукции иммунитета, представляет собой любой из полипептидов, выбранных из группы полипептидов (c)-(h) ниже:
(c) полипептиды, состоящие из аминокислотных последовательностей, соответствующих SEQ ID NO: 3-36;
(d) полипептиды, содержащие от одной до нескольких аминокислотных делеций, замен, инсерций или вставок в аминокислотной последовательности любого из полипептидов (c);
(e) полипептиды, каждый из которых содержит частичную последовательность любого из полипептидов (c) или (d);
(f) полипептиды, состоящие из аминокислотных последовательностей, соответствующих SEQ ID NO: 37-45;
(g) полипептиды, содержащие от одной до нескольких аминокислотных делеций, замен, инсерций или вставок в аминокислотной последовательности любого из полипептидов (f);
(h) полипептиды, каждый из которых содержит частичную последовательность любого из полипептидов (f) или (g).
(18) Способ согласно (16) или (17), где злокачественная опухоль представляет собой злокачественную опухоль, экспрессирующую белок SCD1.
[0012]
Настоящая заявка охватывает содержание патентной заявки Японии № 2016-040364, по которой настоящей заявке испрашивается приоритет.
Эффекты изобретения
[0013] Настоящее изобретение относится к новому индуктору иммунитета, пригодному в качестве активного ингредиента в средстве для лечения или предупреждения злокачественной опухоли.
[0014] Кроме того, как конкретно показано в разделе "Примеры", приведенном ниже, полипептиды, используемые в рамках настоящего изобретения, могут индуцировать иммунные клетки, которые уничтожают злокачественные клетки, тем самым обеспечивая уменьшение размера или регрессию уже существующей злокачественной опухоли. Кроме того, пептиды, используемые в рамках настоящего изобретения, также могут усиливать индукцию иммунных клеток, которые уничтожают злокачественные клетки, и тем самым обеспечивать уменьшение размера или регрессию уже существующей злокачественной опухоли. Таким образом, полипептиды в соответствии с настоящим изобретением пригодны в качестве активного ингредиента в средстве для лечения или предупреждения злокачественной опухоли.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0015] [Фиг. 1] На фиг. 1 представлены паттерны экспрессии гена SCD1 в опухолевых тканях человека и линиях злокачественных клеток. Ссылочный номер 1 указывает не паттерн экспрессии гена SCD1 человека. Ссылочный номер 2 указывает на паттерн экспрессии гена GAPDH человека, который является геном домашнего хозяйства человека.
[Фиг. 2] На фиг. 2 показано, что CD8-положительные T-клетки, специфичные к каждому из полипептидов, состоящих из аминокислотных последовательностей, соответствующих SEQ ID NO: 3-23, распознают комплекс, состоящий из полипептида и HLA-A0201, и продуцируют IFN-γ. На фиг. 2, дорожки 4-24 по горизонтальной оси демонстрируют способность продуцировать IFN-γ у HLA-A0201-положительных CD8-положительных T-клеток в ответ на стимуляцию дендритными клетками, обработанными полипептидами, имеющими аминокислотные последовательности, соответствующие SEQ ID NO: 3-23, соответственно. Дорожка 1 демонстрирует результат, полученный, когда описанную выше обработку проводили без добавления какого-либо полипептида (имитация); дорожка 2 демонстрирует результат, полученный, когда описанную выше обработку проводили с добавлением отрицательного контрольного полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 46, который не входит в объем настоящего изобретения; дорожка 3 демонстрирует результат, полученный, когда описанную выше обработку проводили с добавлением полноразмерного белка SCD1, состоящего из аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 2.
[Фиг. 3] На фиг. 2 показано, что CD8-положительные T-клетки, специфичные к каждому из полипептидов, состоящих из аминокислотных последовательностей, соответствующих SEQ ID NO: 24-36, распознают комплекс, состоящий из полипептида и HLA-A24, и продуцируют IFN-γ. На фиг. 3, дорожки 4-16 по горизонтальной оси демонстрируют способность продуцировать IFN-γ у HLA-A24-положительных CD8-положительных T-клеток в ответ на стимуляцию дендритными клетками, обработанными полипептидами, имеющими аминокислотные последовательности, соответствующие SEQ ID NO: 24-36, соответственно. Дорожка 1 демонстрирует результат, полученный, когда описанную выше обработку проводили без добавления какого-либо полипептида (имитация); дорожка 2 демонстрирует результат, полученный, когда описанную выше обработку проводили с добавлением отрицательного контрольного полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 47, который не входит в объем настоящего изобретения; дорожка 3 демонстрирует результат, полученный, когда описанную выше обработку проводили с добавлением полноразмерного белка SCD1, состоящего из аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 2.
[Фиг. 4A] На фиг. 4A представлен график, демонстрирующий цитотоксическую активность против злокачественных клеток у CD8-положительных T-клеток, специфичных к каждому из полипептидов, состоящих из аминокислотных последовательностей, соответствующих SEQ ID NO: 3-23. На фиг. 4A, дорожки 4-24 по горизонтальной оси демонстрируют цитотоксическую активность против клеток U251 у HLA-A0201-положительных CD8-положительных T-клеток, индуцированную с использованием полипептидов, имеющих аминокислотные последовательности, соответствующие SEQ ID NO: 3-23, соответственно. Дорожка 1 демонстрирует цитотоксическую активность CD8-положительных T-клеток (имитация), индуцированную без добавления какого-либо полипептида; дорожка 2 демонстрирует цитотоксическую активность CD8-положительных T-клеток, индуцированную с использованием отрицательного контрольного полипептида (SEQ ID NO: 46); и дорожка 3 демонстрирует цитотоксическую активность CD8-положительных T-клеток, индуцированную с использованием полноразмерного белка SCD1, состоящего из аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 2.
[Фиг. 4B] На фиг. 4B представлен график, демонстрирующий цитотоксическую активность против злокачественных клеток у CD8-положительных T-клеток, специфичных к каждому из полипептидов, состоящих из аминокислотных последовательностей, соответствующих SEQ ID NO: 3-23. На фиг. 4B, дорожки 4-24 по горизонтальной оси демонстрируют цитотоксическую активность против клеток SK-Hep-1 у HLA-A0201-положительных CD8-положительных T-клеток, индуцированную с использованием полипептидов, имеющих аминокислотные последовательности, соответствующие SEQ ID NO: 3-23, соответственно. Дорожка 1 демонстрирует цитотоксическую активность CD8-положительных T-клеток (имитация), индуцированную без добавления какого-либо полипептида; дорожка 2 демонстрирует цитотоксическую активность CD8-положительных T-клеток, индуцированную с использованием отрицательного контрольного полипептида (SEQ ID NO: 46); и дорожка 3 демонстрирует цитотоксическую активность CD8-положительных T-клеток, индуцированную с использованием полноразмерного белка SCD1, состоящего из аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 2.
[Фиг. 5A] На фиг. 5A представлен график, демонстрирующий цитотоксическую активность против злокачественных клеток у CD8-положительных T-клеток, специфичных к каждому из полипептидов, состоящих из аминокислотных последовательностей, соответствующих SEQ ID NO: 24-36. На фиг. 5A, дорожки 4-16 по горизонтальной оси демонстрируют цитотоксическую активность против клеток SW480 у HLA-A24-положительных CD8-положительных T-клеток, стимулированную с использованием полипептидов, имеющих аминокислотные последовательности, соответствующие SEQ ID NO: 24-36, соответственно. Дорожка 1 демонстрирует цитотоксическую активность CD8-положительных T-клеток (имитация), индуцированную без добавления какого-либо полипептида; ссылочный номер 2 демонстрирует цитотоксическую активность CD8-положительных T-клеток, индуцированную с использованием отрицательного контрольного полипептида (SEQ ID NO: 47); и дорожка 3 демонстрирует цитотоксическую активность CD8-положительных T-клеток, индуцированную с использованием белка SCD1, состоящего из аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 2.
[Фиг. 5B] На фиг. 5B представлена цитотоксическая активность против злокачественных клеток у CD8-положительных T-клеток, специфичных к каждому из полипептидов, состоящих из аминокислотных последовательностей, соответствующих SEQ ID NO: 24-36. Дорожки 4-16 по горизонтальной оси демонстрируют цитотоксическую активность против клеток ZR-75-1 у HLA-A24-положительных CD8-положительных T-клеток, стимулированную с использованием полипептидов, имеющих аминокислотные последовательности, соответствующие SEQ ID NO: 24-36, соответственно. Дорожка 1 демонстрирует цитотоксическую активность CD8-положительных T-клеток (имитация), индуцированную без добавления какого-либо полипептида; ссылочный номер 2 демонстрирует цитотоксическую активность CD8-положительных T-клеток, индуцированную с использованием отрицательного контрольного полипептида (SEQ ID NO: 47); и дорожка 3 демонстрирует цитотоксическую активность CD8-положительных T-клеток, индуцированную с использованием белка SCD1, состоящего из аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 2.
[Фиг. 6] На фиг. 6 представлен график, демонстрирующий, что CD4-положительные T-клетки, специфичные к каждому из полипептидов, состоящих из аминокислотных последовательностей, соответствующих SEQ ID NO: 37-45, распознают комплекс полипептида и HLA-DRB1*04 и продуцируют IFN-γ. На фиг. 6, дорожки 4-12 по горизонтальной оси демонстрируют способности продуцировать IFN-γ у HLA-DRB1*04-положительных CD4-положительных T-клеток в ответ на стимуляцию дендритными клетками, обработанными полипептидами, имеющими аминокислотные последовательности, соответствующие SEQ ID NO: 37-45, соответственно. Дорожка 1 демонстрирует результат для имитации, полученный, когда описанную выше обработку проводили без добавления какого-либо полипептида; дорожка 2 демонстрирует результат, полученный, когда описанную выше обработку проводили с добавлением отрицательного контрольного полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 48, который не входит в объем настоящего изобретения; и дорожка 3 демонстрирует результат, полученный, когда описанную выше обработку проводили с добавлением полноразмерного белка SCD1, состоящего из аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 2.
ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
[0016]
<Полипептид>
В рамках настоящего изобретения термин "полипептид" относится к молекуле, образованной путем формирования пептидной связи между множеством аминокислот. Полипептиды в соответствии с настоящим изобретением включают не только полипептидные молекулы, состоящие из большого количества аминокислот, но также малые молекулы (олигопептиды), состоящие из малого количества аминокислот.
[0017] Полипептид, составляющий индуктор иммунитета в соответствии с настоящим изобретением, может представлять собой, например, по меньшей мере один полипептид, обладающий активностью индукции иммунитета и выбранный из групп полипептидов (a) или (b) ниже:
(a) полипептиды, состоящие из 7 или более последовательно расположенных аминокислот в области положений 34-50 (17 аминокислот), положений 69-148 (80 аминокислот), положений 178-195 (18 аминокислот), положений 207-242 (36 аминокислот), положений 247-280 (34 аминокислоты) и положений 296-332 (37 аминокислот) в белке SCD1 человека, состоящем из аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 2, когда инициирующий метионин определяется как положение 1;
(b) полипептиды, содержащие от одной до нескольких аминокислотных делеций, замен, инсерций или вставок в аминокислотной последовательности любого из полипептидов (a).
[0018] В рамках настоящего изобретения выражение "состоящий из аминокислотной последовательности" означает, что аминокислотные остатки расположены в конкретном порядке. Таким образом, например, "полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 2", относится к полипептиду, который имеет аминокислотную последовательность Met Asp Pro Ala … (пропущено) … Tyr Lys Ser Gly, соответствующую SEQ ID NO: 2, и который имеет размер 359 аминокислотных остатков. Кроме того, в настоящем описании "полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 2" часто сокращенно обозначают, например, как "полипептид SEQ ID NO: 2". То же самое применимо для выражения "состоящий из последовательности оснований".
[0019] Термин "активность индукции иммунитета", как используют в рамках настоящего изобретения, относится к способности активировать и увеличивать в количестве T-клетки, которые отвечают на злокачественные клетки, экспрессирующие белок SCD1. В частности, активность индукции иммунитета означает, что способность продуцировать IFN-γ у цитотоксических T-клеток и/или хелперных T-клеток, стимулированных белком SCD1 или его частичным полипептидом, превышает таковую у нестимулированных контрольных T-клеток; цитотоксическая активность против злокачественных клеток, экспрессирующих белок SCD1, у цитотоксических T-клеток, стимулированных белком SCD1 или его частичным полипептидом, превышает таковую у нестимулированных контрольных T-клеток; цитотоксическая активность хелперных T-клеток, стимулированных белком SCD1 или его частичным полипептидом является усиленной по сравнению с таковой у нестимулированных контрольных T-клеток; или цитотоксические T-клетки или хелперные T-клетки, стимулированные белком SCD1 или его частичным полипептидом, пролиферируют в большей степени, чем нестимулированные контрольные T-клетки.
[0020] Пролиферация клеток может быть подтверждена посредством: визуального исследования; подсчета клеток под микроскопом; проточной цитометрии; количества тритированного тимидина, включенного в клетки из среды; и т.п. Кроме того, можно проводить измерение способности продуцировать IFN-γ, например, посредством известного анализа ELISPOT и т.п. В частности, как описано в разделе "Примеры" ниже, например, T-клетки сначала сокультивируют с полипептидом, чью активность индукции иммунитета намереваются оценить (белок SCD1 или его частичный полипептид в рамках настоящего изобретения), и антигенпредставляющими клетками, происходящими из мононуклеарных клеток периферической крови (далее обозначаемых как "PBMC"), чтобы позволить T-клеткам контактировать с антигенпредставляющими клетками, презентирующими полипептид, подлежащий оценке. Затем измеряют количество IFN-γ, продуцируемого T-клетками, с использованием антитела, специфичного к IFN-γ. Это позволяет измерить количество иммунных клеток в T-клетках. Затем активность индукции иммунитета можно оценивать на основе полученных таким образом результатов измерения.
in vitro
51
[0021] Цитотоксическую активность можно оценивать, например, посредством сокультивирования T-клеток с полипептидом, чью цитотоксическую активность намереваются оценить (в рамках настоящего изобретения он соответствует белку SCD1 или его частичному полипептиду), и антигенпредставляющими клетками, происходящими из PBMC, а затем анализа наличия у T-клеток способности подавлять пролиферацию опухолевых клеток или уничтожать опухолевые клетки (далее обозначаемой как "цитотоксическая активность") . Контакт между T-клетками и антигенпредставляющими клетками может быть достигнут путем сокультивирования обоих типов клеток в жидкой среде, как описано далее. Измерение цитотоксической активности можно проводить, например, известным способом, называемым анализом высвобождения Cr, описанным в Int. J. Cancer, 58: P 317, 1994.
[0022] Путем введения T-клеток, индуцированных, как описано выше, в имеющий злокачественную опухоль живой организм, размер опухоли может быть снижен или опухоль может регрессировать вследствие цитотоксической активности T-клеток. Таким образом, описанную выше активность индукции иммунитета также можно оценивать как способность подавлять пролиферацию злокачественных клеток или как способность вызывать уменьшение размера или исчезновение злокачественной ткани (опухоли) (далее называемая "противоопухолевой активностью").
[0023] В случаях, когда описанный выше полипептид используют для лечения или предупреждения злокачественной опухоли, предпочтительно проводят оценку активности индукции иммунитета с использованием цитотоксической активности или противоопухолевой активности в качестве показателя, но не ограничиваясь ими.
[0024] Поскольку полипептид размером приблизительно 7 или более аминокислотных остатков может включать эпитоп, такой полипептид может демонстрировать антигенность и иммуногенность и может обладать активностью индукции иммунитета, как хорошо известно в данной области, и, таким образом, его можно использовать в качестве индуктора иммунитета в соответствии с настоящим изобретением.
[0025] Таким образом, полипептид (a) представляет собой полипептид, состоящий из 7 или более последовательно расположенных аминокислот, предпочтительно 8, 9 или 10 или более последовательно расположенных аминокислот в области положений 34-50, положений 69-148, положений 178-195, положений 207-242, положений 247-280 и положений 296-332 аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 2, и обладающий активностью индукции иммунитета. Полипептид, в частности, предпочтительно имеет аминокислотную последовательность положений 34-50, положений 69-148, положений 178-195, положений 207-242, положений 247-280, положений 296-332 аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 2;
[0026] В качестве принципа индукции иммунитета посредством введения антигенного полипептида злокачественной опухоли, полипептид включается в антигенпредставляющую клетку, а затем деградируется на меньшие фрагменты пептидазами в клетке, а затем фрагменты антигенного пептида презентируются на поверхности антигенпредставляющей клетки. Известно, что цитотоксические T-клетки и т.п. распознают антигены, презентированные на клеточной поверхности, и селективно уничтожают злокачественные клетки, презентирующие эти антигены на клеточной поверхности. Кроме того, также известно, что хелперные T-клетки распознают антигены, презентированные на поверхности антигенпредставляющих клеток, и усиливают индукцию цитотоксических T-клеток, которые селективно уничтожают злокачественные клетки, презентирующие антигены на клеточной поверхности. Размер антигена, презентируемого на поверхности антигенпредставляющей клетки, является относительно небольшим и составляет приблизительно 7-30 аминокислот. Таким образом, с точки зрения возможности презентации полипептида на антигенпредставляющих клетках полипептид (a) предпочтительно имеет приблизительно от 7 до 30 последовательно расположенных аминокислот аминокислотной последовательности положений 34-50, положений 69-148, положений 178-195, положений 207-242, положений 247-280, положений 296-332 в аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 2. Является достаточным, чтобы полипептид состоял приблизительно из 8-30, приблизительно из 9-30 или приблизительно из 9-25 аминокислот. Эти относительно небольшие полипептиды могут быть презентированы непосредственно на поверхности антигенпредставляющих клеток без включения в клетки.
[0027] Кроме того, поскольку полипептид, включенный в антигенпредставляющую клетку, расщепляется в случайных участках пептидазами в клетке с образованием различных полипептидных фрагментов, а затем полученные полипептидные фрагменты презентируются на поверхности антигенпредставляющей клетки, введение крупного полипептида, такого как полипептид, имеющий аминокислотную последовательность положений 34-50, положений 69-148, положений 178-195, положений 207-242, положений 247-280, положений 296-332 в аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 2, неизбежно приводит к образованию полипептидных фрагментов, активных в отношении индукции иммунитета через антигенпредставляющие клетки, вследствие деградации полипептида в антигенпредставляющих клетках. Таким образом, крупный полипептид также может быть использован для индукции иммунитета через антигенпредставляющие клетки. Например, полипептид может состоять из 30 или более аминокислот, предпочтительно 40 или более, более предпочтительно 50 или более, и еще более предпочтительно 100 или более аминокислот.
[0028] Кроме того, полипептиды в соответствии с настоящим изобретением могут быть получены посредством проверки с использованием средства проверки, такого как HLA Peptide Binding Predictions (http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/index.html) в Bioinformatics & Molecular Analysis Selection (BIMAS), или SYFPEITHI, который может осуществлять поиск эпитопных пептидов, состоящих из 8-25, предпочтительно 9-24, и более предпочтительно 9-23 аминокислот и имеющих связывающие мотивы для молекул MHC класса I или молекул MHC класса II (HLA, у человека), описанных ниже, для проведения скрининга пептидов, которые могут представлять собой эпитопные пептиды. В частности, полипептид в соответствии с настоящим изобретением представляет собой полипептид, состоящий из 7 или более последовательно расположенных аминокислот в области положений 34-50, положений 69-148, положений 178-195, положений 207-242, положений 247-280 и положений 296-332 в аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 2. Примеры полипептида в соответствии с настоящим изобретением включают полипептиды, соответствующие SEQ ID NO: 3-45; и полипептиды, каждый из которых содержит частичную последовательность любого из полипептидов, состоящие из аминокислотных последовательностей, соответствующих SEQ ID NO: 3-45 и имеющих 10-30 аминокислотных остатков. Среди полипептидов, соответствующих SEQ ID NO: 3-45, и полипептидов, каждый из которых содержит частичную последовательность любого из полипептидов, состоящих из аминокислотных последовательностей, соответствующих SEQ ID NO: 3-45, и имеет 10-30 аминокислотных остатков, активность индукции иммунитета у полипептидов, соответствующих SEQ ID NO: 3-36, является следствием связывания с молекулами MHC класса I, и активность индукции иммунитета у полипептидов, соответствующих SEQ ID NO: 37-45, является следствием связывания с молекулами MHC класса II.
[0029] С другой стороны, полипептид (b) представляет собой полипептид, содержащий одну или несколько аминокислотных замен, делеций, инсерций или вставок в аминокислотной последовательности полипептида (a), и имеющий активность индукции иммунитета. Например, полипептиды в соответствии с настоящим изобретением включают полипептид, содержащий одну или несколько аминокислотных замен, делеций, инсерций или вставок в аминокислотной последовательности, соответствующей любой из SEQ ID NO: 3-45.
[0030] Термин "несколько", как используют в рамках настоящего изобретения, относится к целому числу от 2 до 10, предпочтительно к целому числу от 2 до 6, более предпочтительно к целому числу от 2 до 4, и еще более предпочтительно к целому числу от 2 до 3.
[0031] Главным образом, полагают, что модификация одной или нескольких аминокислот в полипептиде не влияет на функции исходного полипептида; полагают, что в некоторых случаях такая модификация даже усиливает желаемую функцию исходного полипептида. В действительности, известно, что модифицированный пептид, содержащий от одной до нескольких модификаций (а именно, замен, делеций, добавлений и/или инсерций) в исходной аминокислотной последовательности сохраняет биологическую активность исходного пептида (Mark et al., 1984, Proc Natl Acad Sci USA, 81: 5662-5666, Zoller and Smith, 1982, Nucleic Acids Res. 10: 6487-6500, Dalbadie-McFarland et al., 1982, Proc Natl Acad Sci USA. 79: 6409-6413). Таким образом, полипептид (b) также может демонстрировать активность индукции иммунитета, и, таким образом, его можно использовать для получения индуктора иммунитета в соответствии с настоящим изобретением.
[0032] 20 типов аминокислот, составляющих встречающиеся в природе белки, можно подразделить на группы аминокислот со сходными свойствами, например, такие как: нейтральные аминокислоты с боковыми цепями, имеющими низкую полярность (Gly, Ile, Val, Leu, Ala, Met и Pro); нейтральные аминокислоты, имеющие гидрофильные боковые цепи (Asn, Gln, Thr, Ser, Tyr и Cys); кислотные аминокислоты (Asp и Glu), основные аминокислоты (Arg, Lys и His); и ароматические аминокислоты (Phe, Tyr и Trp). Известно, что во многих случаях замены аминокислот в пределах одной группы не изменяют свойств полипептида. Таким образом, в случаях, когда аминокислотный остаток(и) в полипептиде (a) по настоящему изобретению является замещенным, замену(ы) предпочтительно проводят в пределах одной группы, поскольку это повышает вероятность сохранения активности индукции иммунитета.
[0033] Кроме того, полипептид (b) может представлять собой полипептид, который обладает идентичностью последовательности, составляющей 90% или более, предпочтительно 95% или более, более предпочтительно 98% или более, и еще более предпочтительно 99% или более или 99,5% или более с полипептидом, состоящим из 7 или более последовательно расположенных аминокислот в области положений 34-50, положений 69-148, положений 178-195, положений 207-242, положений 247-280, положений 296-332 в аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 2, например, с любым из полипептидов, состоящих из аминокислотных последовательностей, соответствующих SEQ ID NO: 3-45, и который обладает активностью индукции иммунитета.
[0034] Как используют в рамках изобретения, термин "идентичность последовательностей" между аминокислотными последовательностями (или последовательностями оснований) относится к процентной величине, получаемой посредством: выравнивания двух аминокислотных последовательностей (или последовательностей оснований), подлежащих сравнению, так чтобы количество соответствующих аминокислотных остатков (или оснований) между аминокислотными последовательностями (или последовательностями оснований) максимизировалось; и деление количества несоответствующих аминокислотных остатков (или количества несоответствующих оснований) на общее количество аминокислотных остатков (или общее количество оснований). При выравнивании последовательностей при необходимости в одну или обе из двух последовательностей, подлежащих сравнению, вставляется пропуск(и). Такое выравнивание последовательностей можно проводить с использованием известной программы, такой как BLAST, FASTA или CLUSTAL W. В случаях, когда вставляется пропуск(и), описанное выше общее количество аминокислотных остатков представляет собой количество остатков, полученных путем подсчета одного пропуска как аминокислотного остатка. Когда подсчитанное таким образом общее количество аминокислотных остатков различается между двумя последовательностями, подлежащими сравнению, идентичность последовательностей (%) вычисляют делением количества соответствующих аминокислотных остатков на общее количество аминокислотных остатков в более длинной последовательности.
[0035] При использовании применительно к лечению или предупреждению злокачественной опухоли, полипептид в соответствии с настоящим изобретением должен экспрессироваться на поверхности клетки или экзосомы, предпочтительно в качестве комплекса пептида и любого из различных классов HLA. Таким образом, для полипептидов в соответствии с настоящим изобретением является предпочтительным выбор пептида, имеющего не только активность индукции иммунитета, но также высокую аффинность связывания с различными классами HLA. Для этой цели пептид можно модифицировать путем замены, инсерции, делеции и/или вставки его аминокислотного остатка(ов), с получением модифицированного пептида, имеющего улучшенную аффинность связывания. Поскольку закономерность последовательностей пептидов, презентируемых посредством связывания с различными классами HLA, известна, в дополнение к закономерности естественным образом презентируемых пептидов (J Immunol, 1994, 152: 3913; Immunogenetics, 1995, 41: 178; J Immunol, 1994, 155: 4307), является возможным внесение модификации на основе такой закономерности в иммуногенный пептид в соответствии с настоящим изобретением. Например, замена второй аминокислоты с N-конца лейцином или метионином, и/или замена аминокислоты на C-конце валином или лейцином может быть желательной для повышения аффинности связывания с HLA-A24. Таким образом, также в объем настоящего изобретения входит пептид, имеющий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 24-36, где вторая аминокислота с N-конца заменена лейцином или метионином, и/или аминокислота на C-конце заменена валином или лейцином.
[0036] Замены могут быть внесены не только на концевых аминокислотах, но также в потенциальном участке(ах) распознавания посредством TCR в пептидах. Несколько исследований продемонстрировали, что пептид с замененной аминокислотой имеет такую же или лучшую активность индукции иммунитета по сравнению с исходным пептидом, и примеры пептида с замененной аминокислотой включают CAP1, p53 (264-272), Her-2/neu (369-377) и gp100 (209-217) (Zaremba et al. 1997, Cancer Res. 57: 4570-4577, T. K. Hoffmann et al. 2002, J Immunol. 168 (3): 1338-47, S. O. Dionne et al. 2003, Cancer Immunol immunother. 52: 199-206, и S. O. Dionne et al. 2004, Cancer Immunology, Immunotherapy, 53: 307-314).
in vivo
[0037] В дополнение к описанным выше модификациям, также можно связывать полипептид в соответствии с настоящим изобретением с другим веществом(ами) при условии, что полученный связанный полипептид сохраняет требуемую активность индукции иммунитета исходного пептида. Примеры другого вещества включают, но не ограничиваются ими, пептиды, липиды, сахара и цепи сахаров, ацетильные группы и природные и синтетические полимеры. Пептид также может включать такую модификацию, как гликозилирование, окисление боковой цепи или фосфорилирование, при условии, что биологическая активность исходного пептида не снижается вследствие модификации. Эти типы модификаций можно проводить для сообщения дополнительных функций (таких как функция нацеливания и функция доставки) полипептиду, или для стабилизации полипептида. Например, в данной области известно внесение D-аминокислоты, миметика аминокислоты или неприродной аминокислоты в полипептид для повышения его стабильности ; и эту идею можно использовать для полипептидов в соответствии с настоящим изобретением. Стабильность полипептида можно исследовать несколькими способами. Например, стабильность можно исследовать с использованием пептидаз, а также различных типов биологических сред, таких как плазма и сыворотка человека (см., например, Verhoef et al., 1986, Eur J Drug Metab Pharmacokin, 11: 291-302).
[0038] Кроме того, полипептид в соответствии с настоящим изобретением может быть связан с другим пептидом(ами) через спейсер(ы) или линкер(ы). Примеры другого пептида включают, но не ограничиваются ими, эпитопные пептиды, происходящие из других полипептидов. Альтернативно два или более полипептидов в соответствии с настоящим изобретением могут быть связаны через спейсер(ы) или линкер(ы). Пептиды, подлежащие связыванию через спейсер(ы) или линкер(ы), могут быть одинаковыми или могут отличаться друг от друга. Типы спейсера или линкера конкретно не ограничены, и их примеры включают спейсеры или линкеры, состоящие из пептидов, более предпочтительно, спейсеры или линкеры, состоящие из пептидов, имеющих один или несколько участков расщепления, которые могут расщепляться ферментами, такими как пептидазы, протеазы и протеасомы. Линкер или спейсер может представлять собой, но не ограничиваться ими, например, AAY (P. M. Daftarian et al., J Trans Med, 2007, 5:26), AAA, NKRK (R. P. M. Sutmuller et al., J Immunol. 2000, 165: 7308-7315) или от одного до нескольких остатков лизина (S. Ota et al., 2002, Can Res. 62: 1471-1476, K. S. Kawamura et al., 2002, J Immunol. 168: 5709-5715). Настоящее изобретение предусматривает полипептид, связанный с другим пептидом(ами) через спейсер(ы) или линкер(ы).
[0039] В случаях, когда полипептиды в соответствии с настоящим изобретением содержат остатки цистеина, эти полипептиды имеют тенденцию к образованию димеров через дисульфидные связи между группами SH остатков цистеина. Таким образом, димеры этих полипептидов также являются полипептидами в соответствии с настоящим изобретением.
[0040] Полипептиды в соответствии с настоящим изобретением можно получать с использованием известных способов. Например, полипептиды можно синтезировать способом химического синтеза, таким как способ с Fmoc (способ с флуоренилметилоксикарбонилом) или способ с tBoc (способ с трет-бутилоксикарбонилом). Кроме того, их можно синтезировать общепринятыми способами с использованием различных типов коммерчески доступных устройств для синтеза пептидов.
[0041] Кроме того, представляющий интерес полипептид можно получать с использованием известных способов генной инженерии путем: получения полинуклеотида, кодирующего описанный выше полипептид; включения полинуклеотида в экспрессирующий вектор; введения вектора в клетку-хозяина; а затем позволения представляющему интерес полипептиду продуцироваться в клетке-хозяине. При получении представляющего интерес полипептида из клеток-хозяев полипептид можно очищать или выделять таким образом, чтобы полипептид по существу не включал другие встречающиеся в природе белки клетки-хозяина и их фрагменты, или другие произвольные химические вещества.
[0042] Полинуклеотид, кодирующий описанный выше полипептид, можно без труда получать известным способам генной инженерии или общепринятым способом с использованием коммерчески доступного устройства для синтеза нуклеиновых кислот. Например, ДНК, имеющую последовательность оснований SEQ ID NO: 1, можно получать путем проведения ПЦР с использованием хромосомной ДНК человека или библиотеки кДНК в качестве матрицы и пары праймеров, сконструированных для амплификации последовательности оснований, соответствующей SEQ ID NO: 1. Условия реакции для ПЦР могут быть установлены соответствующим образом и их примеры включают, но не ограничиваются ими, повторение цикла, состоящего из реакций при: 94°C в течение 30 секунд (денатурация), 55°C в течение от 30 секунд до 1 минуты (отжиг) и 72°C в течение 2 минут (удлинение), на протяжении 30 циклов, с последующей реакцией при 72°C в течение 1 минуты. Кроме того, желаемую ДНК можно выделять путем получения соответствующего зонда(ов) или праймера(ов) на основе информации о последовательности оснований, соответствующей SEQ ID NO: 1, и аминокислотной последовательности, и скрининг библиотеки кДНК человека и т.п. с использованием зонда(ов) или праймера(ов). Библиотеку кДНК предпочтительно получают из клетки, органа или ткани, экспрессирующих белок SEQ ID NO: 2. Описанные выше действия, такие как получение зонда(ов) или праймера(ов), конструирование библиотеки кДНК, скрининг библиотеки кДНК и клонирование представляющего интерес гена, известны специалистам в данной области и могут быть проведены способами, описанными, например, в Green, M. R. and Sambrook, J., 2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Fourth Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Current Protocolin Molecular Biology: www.currentprotocols.com; и т.п. Из полученной таким образом ДНК может быть получена ДНК, кодирующая полипептид (a). Кроме того, поскольку кодоны, кодирующие каждую аминокислоту, известны, последовательность оснований полинуклеотида, кодирующего конкретную аминокислотную последовательность, может быть без труда установлена. Таким образом, последовательность оснований полинуклеотида, кодирующего описанный выше полипептид (b), также может быть без труда установлена и, таким образом, такой полинуклеотид также может быть синтезирован с использованием коммерчески доступного устройства для синтеза нуклеиновых кислот в соответствии с общепринятым способом.
E. coli
Xenopus laevis
[0043] Клетка-хозяин может представлять собой любую клетку при условии, что она может экспрессировать описанный выше полипептид. Примеры прокариотических клеток включают, но не ограничиваются ими, ; и примеры эукариотических клеток включают, но не ограничиваются ими, культивируемые клетки млекопитающих, включая клетки почки обезьяны COS-1 и клетки яичника китайского хомячка CHO; почкующиеся дрожжи; делящиеся дрожжи; клетки тутового шелкопряда и яйцеклетки .
E. coli
[0044] В случаях когда в качестве клетки-хозяина используют прокариотическую клетку, то используют экспрессирующий вектор, содержащий ориджин, который позволяет его репликацию в прокариотической клетке, промотор, участок связывания рибосомы, участок клонирования ДНК, терминатор и т.д. Примеры экспрессирующего вектора для  включают систему pUC, pBluescript II, экспрессирующую систему pET и экспрессирующую систему pGEX. Полипептид, кодируемый ДНК, может быть экспрессирован в прокариотической клетке-хозяине путем включения ДНК, кодирующей описанный выше полипептид, в такой экспрессирующий вектор, трансформации прокариотической клетки-хозяина таким вектором, а затем культивирования полученного трансформанта. В этом способе полипептид также может быть экспрессирован в качестве белка, слитого с другим белком.
[0045] В случаях когда в качестве клетки-хозяина используют эукариотическую клетку, то используют экспрессирующий вектор для эукариотических клеток, содержащий промотор, участок сплайсинга, участок присоединения поли(A), и т.д. Примеры такого экспрессирующего вектора включают pKA1, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, вектор EBV, pRS, pcDNA3, pMSG и pYES2. Аналогично тому, как описано выше, полипептид, кодируемый ДНК, может быть экспрессирован в эукариотической клетке-хозяине путем включения ДНК, кодирующей описанный выше полипептид, в такой экспрессирующий вектор, трансформации эукариотической клетки-хозяина таким вектором, а затем культивирования полученного трансформанта. В случаях когда в качестве экспрессирующего вектора используют pIND/V5-His, pFLAG-CMV-2, pEGFP-N1, pEGFP-C1 и т.п. описанный выше полипептид может быть экспрессирован в качестве слитого белка, к которому добавлена любая из различных типов меток, таких как His-метка, FLAG-метка, myc-метка, HA-метка и GFP.
[0046] Введение экспрессирующего вектора в клетку-хозяина можно проводить известным способом, таким как электропорация, способ с фосфатом кальция, способ с липосомами и способ с DEAE-декстраном.
[0047] Представляющий интерес полипептид можно выделять и очищать из клеток-хозяев посредством комбинации известных способов разделения. Примеры известных способов разделения включают, но не ограничиваются ими: обработку денатурирующим средством, таким как мочевина, или поверхностно-активным веществом; обработку ультразвуковым излучением; расщепление ферментом; высаливание или фракционную преципитацию в растворителе; диализ; центрифугирование; ультрафильтрацию; гель-фильтрацию; SDS-PAGE; изоэлектрическое фокусирование; ионообменную хроматографию; гидрофобную хроматографию; аффинную хроматографию и обращено-фазовую хроматографию.
[0048] Полипептиды, получаемые описанным выше способом, также включают, как упоминалось выше, полипептиды в форме белка, слитого с другим произвольным белком. Их примеры включают слитые белки с глутатион S-трансферазой (GST) и слитые белки с His-меткой. Таким образом, такой полипептид в форме слитого белка также входит в объем настоящего изобретения. Кроме того, полипептид экспрессируемый в трансформированной клетке, может быть посттрансляционно модифицирован различными путями. Такой посттрансляционно модифицированный полипептид также входит в объем настоящего изобретения при условии, что он имеет активность индукции иммунитета. Примеры такой посттансляционной модификации включают: удаление N-концевого метионина; N-концевое ацетилирование; гликозилирование; ограниченную деградацию внутреклеточной протеазой; миристоилирование; изопренилирование и фосфорилирование.
[0049] <Индуктор иммунитета>
Регрессию уже существующей опухоли можно вызвать путем введения полипептида, обладающего активностью индукции иммунитета в соответствии с настоящим изобретением, или экспрессирующего вектора, содержащего ген, кодирующий полипептид, в живой организм, имеющий злокачественную опухоль. Кроме того, возникновение опухоли можно предотвратить путем введения описанного выше полипептида, обладающего активностью индукции иммунитета, или гена, кодирующего полипептид, в живой организм до возникновения злокачественной опухоли. Таким образом, полипептид в соответствии с настоящим изобретением или ген, кодирующий полипептид, можно использовать в качестве активного ингредиента в индукторе иммунитета.
[0050] Каждый из терминов "опухоль" и "злокачественная опухоль" используют в настоящем описании для обозначения злокачественного новообразования, и они используются взаимозаменяемо. В этом случае злокачественная опухоль, подлежащая лечению, предпочтительно представляет собой злокачественную опухоль, экспрессирующую белок SCD1, и более предпочтительно злокачественную лимфому, рак молочной железы, рак печени, рак предстательной железы, рак яичника, рак почки, рак ободочной и прямой кишки, рак желудка, злокачественную опухоль головного мозга, рак пищевода или рак легкого.
[0051] Животное-индивидуум предпочтительно является млекопитающим, более предпочтительно таким млекопитающим, как примат, животное-компаньон, домашнее животное или спортивное животное, еще более предпочтительно человек, собака или кошка, и особенно предпочтительно человек.
in vivo
[0052] Страдающий злокачественной опухолью индивидуум (пациент со злокачественной опухолью, когда индивидуумом является человек), подлежащий лечению, предпочтительно представляет собой страдающего злокачественной опухолью индивидуума, чьи злокачественные клетки экспрессируют белок SCD1 . В частности, предпочтительным является страдающий злокачественной опухолью индивидуум, подвергнутый скринингу способом обнаружения злокачественной опухоли, описанным в WO 2011/027807. В частности, страдающим злокачественной опухолью индивидуумом предпочтительно является индивидуум, подвергнутый скринингу на тот факт, что уровни экспрессии антител против белка SCD1, содержащегося в образце, полученном из живого организма индивидуума, являются более высокими, чем уровни экспрессии антител, содержащихся в образце, полученном от здорового индивидуума. Примеры образца, подлежащего применению для скрининга страдающих злокачественной опухолью индивидуумов, подлежащих лечению, включают жидкости организма, такие как кровь, сыворотка, плазма, асцитная жидкость и плевральный выпот; ткани и клетки. В случаях когда скрининг проводят путем количественного определения уровней экспрессии антител против белка SCD1, образец предпочтительно представляет собой сыворотку, плазму, асцитную жидкость или плевральный выпот.
[0053] Введение индуктора иммунитета в соответствии с настоящим изобретением можно проводить либо перорально, либо парентерально. Однако предпочтительными путями введения являются парентеральное введение, такое как внутримышечное введение, подкожное введение, внутривенное введение и внутриартериальное введение. В случаях когда индуктор иммунитета используют для лечения злокачественной опухоли, его можно вводить в регионарный лимфатический узел вблизи опухоли, подлежащей лечению, для повышения его активности, направленной против злокачественной опухоли. Индуктор иммунитета можно вводить в любой дозировке, эффективной для индукции иммунитета. Например, в случаях когда индуктор иммунитета используют для лечения или предупреждения злокачественной опухоли, средство можно вводить в количестве, эффективном для лечения или предупреждения злокачественной опухоли. Количество, эффективное для лечения или предупреждения злокачественной опухоли, можно выбирать соответствующим образом в зависимости от размера опухоли, симптомов, массы тела и объема животного-индивидуума и т.п. В случаях, когда животным-индивидуумом является человек, эффективное количество обычно составляет от 0,0001 до 1,000 мкг и предпочтительно от 0,001 до 1,000 мкг в сутки. Описанную выше дозировку можно вводить в виде однократной дозы или нескольких разделенных доз. Предпочтительно, чтобы описанная выше дозировка была разделена и вводилась несколько раз в сутки, и чтобы ее введение проводилось раз в несколько суток или несколько месяцев. Как конкретно описано в разделе "Примеры" ниже, индуктор иммунитета в соответствии с настоящим изобретением может вызывать регрессию уже образовавшейся опухоли. Таким образом, поскольку индуктор иммунитета может демонстрировать его активность, направленную против злокачественной опухоли, также против небольшого количества злокачественных клеток на ранних стадиях, развитие или рецидив злокачественной опухоли можно предупреждать с использованием средства до начала или после лечения злокачественной опухоли. Иными словами, индуктор иммунитета в соответствии с настоящим изобретением является пригодным как для лечения, так и для предупреждения злокачественной опухоли, и его можно использовать в качестве активного ингредиента в средстве для лечения или предупреждения злокачественной опухоли.
[0054] Индуктор иммунитета в соответствии с настоящим изобретением содержит в качестве активного ингредиента описанный выше полипептид в соответствии с настоящим изобретением, и может состоять из одного полипептида, или из комбинации множества полипептидов. Путем комбинирования множества полипептидов в соответствии с настоящим изобретением активность индукции иммунитета (активность индукции и активации цитотоксических T-клеток) каждого из полипептидов может быть усилена и может быть достигнуто более эффективное лечение или предупреждение злокачественной опухоли.
[0055] Индуктор иммунитета в соответствии с настоящим изобретением также можно использовать в комбинации с известным пептидом(ами), способным индуцировать цитотоксические T-клетки. Путем комбинирования полипептида(ов) в соответствии с настоящим изобретением с таким известным пептидом(ами), активность индукции иммунитета (активность индукции и активации цитотоксических T-клеток) каждого из полипептидов может быть усилена и может быть достигнуто более эффективное лечение или предупреждение злокачественной опухоли. Термин "комбинация", как используют в этом случае, включает случай, когда индуктор иммунитета в соответствии с настоящим изобретением и известный пептид(ы), способный индуцировать цитотоксические T-клетки, вводят по отдельности или одновременно. Выражение "вводить по отдельности", как используют в рамках изобретения, означает, что индуктор иммунитета в соответствии с настоящим изобретением и известный пептид(ы), способный индуцировать цитотоксические T-клетки, вводят по отдельности в различные моменты времени с определенным временным интервалом между ними. Порядок введения не ограничен. С другой стороны, выражение "вводить одновременно" означает, что индуктор иммунитета в соответствии с настоящим изобретением и известный пептид(ы), способный индуцировать цитотоксические T-клетки, смешивают заранее и вводят в форме смеси, или что индуктор иммунитета в соответствии с настоящим изобретением и известный пептид(ы), способный индуцировать цитотоксические T-клетки, вводят в отдельных формах, но в одно время, без какого-либо временного интервала.
in vivo
[0056] Индуктор иммунитета в соответствии с настоящим изобретением можно использовать в комбинации с другим усилителем иммунитета, способным усиливать иммунный ответ . Другой усилитель иммунитета может быть включен в индуктор иммунитета в соответствии с настоящим изобретением или он может быть введен пациенту в качестве отдельной композиции в комбинации с введением индуктора иммунитета в соответствии с настоящим изобретением.
Quillja saponaria
[0057] "Другой усилитель иммунитета" включает, например, адъювант. Адъювант может усиливать иммунный ответ путем обеспечения антигенного резервуара (внеклеточно или в макрофагах), активации макрофагов и стимуляции специфических лимфоцитов, усиливая активность, направленную против злокачественной опухоли. Таким образом, в случаях когда индуктор иммунитета в соответствии с настоящим изобретением используют в качестве активного ингредиента в средстве для лечения или предупреждения злокачественной опухоли, является предпочтительным, чтобы индуктор иммунитета дополнительно содержал адъювант, в дополнение к полипептиду в соответствии с настоящим изобретением в качестве активного ингредиента. В данной области известно множество типов адъювантов, и можно использовать любые из этих адъювантов. Конкретные примеры адъювантов включают MPL (SmithKline Beecham), аналоги липополисахарида Salmonlla minnesota Re 595, получаемого после очистки и кислотного гидролиза липополисахарида; QS21 (SmithKline Beecham), чистый сапонин QA-21, очищенный из экстракта ; DQS21, описанный в заявке PCT WO 96/33739 (SmithKline Beecham); QS-7, QS-17, QS-18 и QS-L1 (So, H. S., et al., "Molecules and cells", 1997, 7: 178-186); неполный адъювант Фрейнда; полный адъювант Фрейнда; витамин E; монтанид; квасцы; CpG-олигонуклеотиды (см., например, Kreig, A. M., et al., 1995, Nature 374: 546-549); поли-I:C и его производные (такие как поли-ICLC); и различные эмульсии типа "вода в масле", получаемые из биодеградируемых масел, таких как сквален и/или токоферол. Среди них предпочтительными являются неполный адъювант Фрейнда; монтанид; поли-I:C и его производные; и CpG-олигонуклеотиды. Соотношение при смешении описанного выше адъюванта и полипептида как правило составляет приблизительно от 1:10 до 10:1, предпочтительно приблизительно от 1:5 до 5:1, и более предпочтительно приблизительно 1:1. Однако адъювант не ограничивается описанными выше примерами и любой адъювант, известный в данной области, отличный от адъювантов, описанных выше, также можно использовать при введении индуктора иммунитета в соответствии с настоящим изобретением (см., например, Goding, "Monoclonal Antibodies: Principles and Practice", 2nd edition, 1986). Способы получения смеси или эмульсии индуктора иммунитета и адъюванта хорошо известны специалистам в области вакцинации.
[0058] Кроме того, в дополнение к описанным выше адъювантам, в качестве другого усилителя иммунитета можно использовать факторы, которые стимулируют иммунный ответ у индивидуума. Например, любой из различных типов цитокинов, обладающих свойством стимулировать лимфоциты и/или антигенпредставляющие клетки, можно использовать в качестве усилителя иммунитета в комбинации с индуктором иммунитета в соответствии с настоящим изобретением. Ряд таких цитокинов, способных усиливать иммунный ответ, известен специалистам в данной области и их примеры включают, но не ограничиваются ими, интерлейкин-12 (IL-12), GM-CSF, IL-18, интерферон-α (IFN-α), интерферон-β (IFN-β), интерферон-ω (IFN-ω), интерферон-γ (IFN-γ) и Flt3-лиганд, который, как было показано, усиливают защитное действие вакцин. Любые из таких факторов также можно использовать в качестве описанного выше усилителя иммунитета и можно вводить пациенту в комбинации с индуктором иммунитета в соответствии с настоящим изобретением, либо путем включения в индуктор иммунитета в соответствии с настоящим изобретением, либо в качестве отдельной композиции.
[0059] <Средство для лечения или предупреждения злокачественной опухоли>
Индуктор иммунитета в соответствии с настоящим изобретением можно использовать в качестве активного ингредиента в средстве для лечения или предупреждения злокачественной опухоли.
[0060] Средство для лечения или предупреждения злокачественной опухоли можно составлять путем смешения соответствующим образом индуктора иммунитета в соответствии с настоящим изобретением с добавкой(ами), такой как фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель и/или эксципиент, пригодный для каждой дозированной формы.
[0061] Способы составления и добавки, которые можно использовать, хорошо известны в области составления фармацевтических составов, и можно использовать любые способы и добавки. Конкретные примеры добавок включают, но не ограничиваются ими: разбавители, такие как физиологические буферные растворы; эксципиенты, такие как сахар, лактоза, кукурузный крахмал, фосфат кальция, сорбит и глицин; связующие вещества, такие как сироп, желатин, гуммиарабик, сорбит, поливинилхлорид и трагакант; и смазывающие вещества, такие как стеарат магния, полиэтиленгликоль, тальк и диоксид кремния. Примеры дозированной формы включают пероральные препараты, такие как таблетки, капсулы, гранулы, порошки и сиропы; и парентеральные препараты, такие как ингалируемые средства, инъекционные растворы, суппозитории и растворы. Эти составы можно изготавливать широко известными способами изготовления.
[0062] <Антигенпредставляющие клетки>
in vitro
Полипептид может презентироваться антигенпредставляющими клетками путем приведения описанного выше полипептида в контакт с антигенпредставляющими клетками . Иными словами, описанный выше полипептид (a) или (b) можно использовать в качестве средства для обработки антигенпредставляющих клеток. В качестве антигенпредставляющих клеток предпочтительно можно использовать дендритные клетки или B-клетки, имеющие молекулы MHC класса I и класса II. Различные молекулы MHC класса I и класса II были идентифицированы, и хорошо известны. Молекулы MHC человека называют HLA. Примеры молекул HLA класса I включают HLA-A, HLA-B и HLA-C; и их более конкретные примеры включают HLA-A1, HLA-A0201, HLA-A0204, HLA-A0205, HLA-A0206, HLA-A0207, HLA-A11, HLA-A24, HLA-A31, HLA-A6801, HLA-B7, HLA-B8, HLA-B2705, HLA-B37, HLA-Cw0401 и HLA-Cw0602. Примеры молекул HLA класса II включают HLA-DR, HLA-DQ и HLA-DP; и их более конкретные примеры включают HLA-DRB1*01, HLA-DRB1*03, HLA-DRB1*04, HLA-DRB1*0405, HLA-DRB1*07, HLA-DRB1*08, HLA-DRB1*11, HLA-DRB1*13, HLA-DRB1*15, HLA-DRB1*15, HLA-DQA1, HLA-DQB1 и HLA-DPB1.
[0063] Дендритные клетки или B-клетки, имеющие молекулы MHC класса I или молекулы MHC класса II, можно получать из крови и т.п. хорошо известным способом. Например, опухоль-специфические дендритные клетки можно индуцировать путем индукции дендритных клеток из костного мозга, пуповинной крови или периферической крови пациента с использованием гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF) и IL-3 (или IL-4), а затем добавления связанного с опухолью пептида в систему для культивирования.
2
[0064] Иммунный ответ, являющийся желательным для лечения злокачественной опухоли, можно индуцировать путем введения эффективного количества полученных таким образом дендритных клеток. Клетки, подлежащие введению, можно получать из костного мозга или пуповинной крови, полученных от здорового индивидуума, или костного мозга или периферической крови и т.п. самого пациента. Применение аутологичных клеток, полученных от самого пациента, является предпочтительным, поскольку они являются в высокой степени безопасными и, как можно ожидать, лишены серьезных побочных эффектов. Периферическая кровь или костный мозг могут быть из свежего образца, охлажденного образца или замороженного образца. Периферическую кровь можно получать культивированием цельной крови или культивированием отдельных лейкоцитарных компонентов отдельно, и последние являются более эффективными и, таким образом, предпочтительными. Кроме того, мононуклеарные клетки могут быть отделены от лейкоцитарных компонентов. В случаях когда клетки, подлежащие применению, представляют собой клетки, происходящие из костного мозга или пуповинной крови, все клетки, составляющие костный мозг, можно культивировать, или мононуклеарные клетки можно отделять от них и культивировать. Периферическая кровь, ее лейкоцитарные компоненты и клетки костного мозга содержат мононуклеарные клетки, гемопоэтические стволовые клетки и незрелые дендритные клетки, из которых происходят дендритные клетки, а также CD4-положительные клетки и т.п. Отсутствует конкретное ограничение способа получения цитокинов, подлежащих применению, и можно использовать любой цитокин, либо природный, либо рекомбинантный, при условии, что его безопасность и физиологический активность подтверждена. Является предпочтительным использованием препарата с гарантированным качеством для медицинского применения, в минимальном необходимом количестве. Концентрация добавляемого цитокина(ов) конкретно не ограничена при условии, что она может индуцировать дендритные клетки. Как правило, общая концентрация цитокина(ов) предпочтительно составляет приблизительно от 10 до 1000 нг/мл и более предпочтительно приблизительно от 20 до 500 нг/мл. Культивирование можно проводить с использованием хорошо известной среды, обычно используемой для культивирования лейкоцитов. Температура культивирования конкретно не ограничена при условии, что она может обеспечивать увеличение лейкоцитов в количестве; однако наиболее предпочтительной является температура приблизительно 37°C, которая представляет собой температуру организма человека. Кроме того, атмосферные условия в ходе культивирования конкретно не ограничены при условии, что они могут обеспечивать увеличение лейкоцитов в количестве; однако является предпочтительным пропускание 5% CO. Период времени культивирования конкретно не ограничен при условии, что требуемое количество клеток может индуцироваться в этот период. Культивирование обычно проводят в течение периода от 3 суток до 2 недель. Устройства, используемые для разделения и культивирования клеток, можно выбирать соответствующим образом. Предпочтительными являются устройства, безопасность которых для медицинского применения подтверждена и которые могут работать стабильно и просто. Что касается устройства для культивирования клеток, в частности, является возможным применение не только обычной емкости, такой как чашка Петри, колба или бутылка, но также многослойной емкости, многокамерной емкости, барабанного флакона, вращающегося флакона, емкости для культивирования типа мешка, колонки с полыми волокнами и т.п.
in vitro
in vitro
3
7
4
6
2
[0065] Процесс приведения описанного выше полипептида в контакт с антигенпредставляющими клетками  можно проводить хорошо известным способом. Например, его можно осуществлять путем культивирования антигенпредставляющих клеток в культуральной среде, содержащей описанный выше полипептид. Концентрация пептида в среде конкретно не ограничена и обычно составляет приблизительно от 1 до 100 мкг/мл, и предпочтительно приблизительно от 5 до 20 мкг/мл. Плотность клеток в ходе культивирования конкретно не ограничена и обычно она составляет приблизительно от 10 до 10 клеток/мл, и предпочтительно приблизительно от 5×10 до 5×10 клеток/мл. Культивирование предпочтительно проводят при 37°C в атмосфере 5% CO, в соответствии с общепринятым способом. Максимальная длина пептида, который может презентироваться на поверхности антигенпредставляющих клеток, обычно составляет приблизительно 30 аминокислотных остатков. Таким образом, в случаях когда антигенпредставляющие клетки приводят в контакт с полипептидом, полипептид можно получать так, чтобы его длина не превышала приблизительно 30 аминокислотных остатков, но конкретно не ограничивалась ей.
in vivo
in vitro
[0066] Путем культивирования антигенпредставляющих клеток с описанным выше полипептидом пептид включается в молекулы MHC антигенпредставляющих клеток и презентируется на поверхности антигенпредставляющих клеток. Таким образом, с использованием описанного выше полипептида можно получать выделенные антигенпредставляющие клетки, содержащие комплекс полипептида и молекулы MHC. Такие антигенпредставляющие клетки могут презентировать полипептид T-клеткам  или , индуцировать цитотоксические T-клетки или хелперные T-клетки, специфичные к полипептиду, и увеличивать эти клетки в количестве.
in vitro
2
[0067] Путем приведения полученных таким образом антигенпредставляющих клеток, содержащих комплекс описанного выше полипептида и молекулы MHC, в контакт с T-клетками , является возможной индукция цитотоксических T-клеток или хелперных T-клеток, специфичных к полипептиду, и обеспечение пролиферации этих клеток. Этого можно достигать сокультивированием антигенпредставляющих клеток и T-клеток в жидкой среде. Например, это можно осуществлять суспендированием антигенпредставляющих клеток в жидкой среде, помещением полученной суспензии в емкость, такую как лунки микропланшета, добавлением в нее T-клеток, а затем культивированием клеток. Соотношение смешения антигенпредставляющих клеток и T-клеток при сокультивировании этих клеток конкретно не ограничено, и обычно составляет приблизительно от 1:1 до 1:100 и предпочтительно приблизительно от 1:5 до 1:20 с точки зрения количества клеток. Плотность антигенпредставляющих клеток, подлежащих суспендированию в жидкой среде, конкретно не ограничена и обычно она составляет приблизительно от 100 до 10 миллионов клеток/мл, и предпочтительно приблизительно от 10000 до 1 миллионов клеток/мл. Сокультивирование предпочтительно проводят при 37°C в атмосфере 5% CO в соответствии с общепринятым способом. Период времени культивирования конкретно не ограничен, и обычно он составляет приблизительно от 2 суток до 3 недель, и предпочтительно приблизительно от 4 суток до 2 недель. Кроме того, сокультивирование предпочтительно проводят в присутствии одного или нескольких типов интерлейкинов, таких как IL-2, IL-6, IL-7 и/или IL-12. В таких случаях концентрация IL-2 или IL-7 обычно составляет, но не ограничивается этим, приблизительно от 5 до 20 Е/мл, концентрация IL-6 обычно составляет приблизительно от 500 до 2000 Е/мл и концентрация IL-12 обычно составляет приблизительно от 5 до 20 нг/мл. Описанное выше сокультивирование можно повторять один раз или несколько раз добавляя свежие антигенпредставляющие клетки. Например, удаление культурального супернатанта после сокультивирования и добавление свежей суспензии антигенпредставляющих клеток для дальнейшего проведения сокультивирования можно повторять один раз или несколько раз. Условия для каждого сокультивирования могут быть такими, как описано выше.
[0068] Описанная выше сокультура позволяет индукцию и пролиферацию цитотоксических T-клеток и хелперных T-клеток, специфичных к полипептиду. Таким образом, с использованием описанного выше полипептида можно получать выделенные T-клетки, которые селективно связываются с комплексом полипептида и молекулы MHC.
in vivo
[0069] Как описано в разделе "Примеры" ниже, ген (ген SCD1), кодирующий белок SCD1, экспрессируется специфически в каждых из: тканей злокачественной лимфомы, клеток злокачественной лимфомы, тканей рака молочной железы, клеток рака молочной железы, тканей рака печени, клеток рака печени, тканей рака предстательной железы, клеток рака предстательной железы, тканей рака яичника, клеток рака яичника, тканей рака почки, клеток рака почки, тканей рака ободочной и прямой кишки, клеток рака ободочной и прямой кишки, тканей рака желудка, клеток рака желудка, тканей злокачественной опухоли головного мозга, клеток злокачественной опухоли головного мозга, тканей рака пищевода, клеток рака пищевода, тканей рака легкого и клеток рака легкого. Таким образом, считается, что значительно большее количество белка SCD1 присутствует в клетках этих типов злокачественной опухоли, чем в нормальных клетках. Когда цитотоксические T-клетки или хелперные T-клетки, полученные, как как описано выше, вводят в живой организм, в то время как часть белка SCD1, присутствующего в злокачественных клетках, презентируется молекулами MHC на поверхности злокачественных клеток, презентированный таким образом белок служит маркером, позволяющим цитотоксическим T-клеткам повреждать злокачественные клетки или усиливающим цитотоксическую активность цитотоксических T-клеток. Поскольку антигенпредставляющие клетки, презентирующие описанный выше полипептид, могут индуцировать и увеличивать в количестве цитотоксические T-клетки и хелперные T-клетки, специфичные к полипептиду, также , введение антигенпредставляющих клеток в живой организм также может позволить цитотоксическим T-клеткам повреждать злокачественным злокачественные клетки или может усилить цитотоксическую активность цитотоксических T-клеток. Иными словами, цитотоксические T-клетки и хелперные T-клетки, а также антигенпредставляющие клетки, полученные с использованием описанного выше полипептида, также являются пригодными в качестве средств для лечения или предупреждения злокачественной опухоли, как и индуктор иммунитета в соответствии с настоящим изобретением.
[0070] В случае введения описанных выше выделенных антигенпредставляющих клеток или выделенных T-клеток в живой организм, эти клетки предпочтительно получают путем обработки антигенпредставляющих клеток или T-клеток, полученных от пациента, подлежащего лечению, полипептидом (a) или (b), как описано выше, во избежание иммунного ответа в живом организме, который атакует эти клетки как чужеродные вещества.
[0071] Средство для лечения или предупреждения злокачественной опухоли, содержащее в качестве активного ингредиента антигенпредставляющие клетки или выделенные T-клетки, предпочтительно вводят посредством парентерального введения, такого как внутривенное или внутриартериальное введение. Дозировку выбирают соответствующим образом в зависимости от симптомов, цели введения и т.п. Дозировка обычно составляет от одной до 10 триллионов клеток, и предпочтительно от 1 миллиона до 1 миллиарда клеток, и это количество предпочтительно вводит один раз в несколько суток или несколько месяцев. Состав может представлять собой, например, суспензию клеток в физиологическим забуференном солевом растворе, и состав можно использовать в комбинации с другим средством(ами) против злокачественной опухоли, цитокином(ами) и/или т.п. Кроме того, также в состав можно добавлять одну, две или более добавок, известных в области составления фармацевтических составов.
[0072] <Генная вакцина>
Индукцию иммунитета, а именно, индукцию продукции антител или цитотоксических T-клеток в организме животного-индивидуума, также можно осуществлять, позволяя полинуклеотиду, кодирующему полипептид (a) или (b), экспрессироваться в живом организме. Это обеспечивает эффект, эквивалентный эффекту, который обеспечивается введением полипептида. Иными словами, индуктор иммунитета в соответствии с настоящим изобретением может содержать в качестве активного ингредиента рекомбинантный вектор, который содержит полинуклеотид, кодирующий описанный выше полипептид (a) или (b), и который может экспрессировать полипептид в живом организме. Такой рекомбинантный вектор, способный экспрессировать антигенный полипептид, который представлен в разделе "Примеры" ниже, также называют "генной вакциной".
[0073] Вектор, подлежащий применению для получения генной вакцины, конкретно не ограничен при условии, что он может экспрессировать полипептид в клетке животного-индивидуума (предпочтительно, в клетке млекопитающего). Вектор может представлять собой либо плазмидный вектор, либо вирусный вектор, и можно использовать любой вектор, известный в области генных вакцин. Полинуклеотид, такой как ДНК или РНК, кодирующий описанный выше полипептид можно без труда получать, как описано выше, общепринятым способом. Кроме того, полинуклеотид можно включать в вектор с использованием способа, хорошо известного специалистам в данной области.
[0074] Генную вакцину предпочтительно вводят парентеральным путем введения, таким как внутримышечное, подкожное, внутривенное или внутриартериальное введение. Дозировка генной вакцины может быть выбрана соответствующим образом в зависимости от типа антигена и т.п., и обычно она составляет приблизительно от 0,1 мкг до 100 мг, и предпочтительно приблизительно от 1 мкг до 10 мг в единицах массы генной вакцины на 1 кг массы тела.
[0075] Способ с использованием вирусного вектора может представлять собой, например, способ, в котором полинуклеотид, кодирующий описанный выше полипептид, встраивают в РНК-вирус или ДНК-вирус, такой как ретровирус, аденовирус, аденоассоциированный вирус, вирус герпеса, вирус коровьей оспы, поксвирус, вирус полиомиелита или вирус Синдбис, а затем животное-индивидуума инфицируют полученным вирусом. В частности, особенно предпочтительным является способ с использованием ретровируса, аденовируса, аденоассоциированного вируса, вируса коровьей оспы и т.п.
[0076] Примеры других способов включают способ, в котором экспрессирующую плазмиду прямо вводят внутримышечно (способ с ДНК-вакциной), способ с липосомами, способ с липофектином, способ микроинъекции, способ с фосфатом кальция и способ электропорации. Среди них особенно предпочтительным является способ с ДНК-вакциной и способ с липосомами.
in vivo
ex vivo
ex vivo
in vivo
[0077] Способы, позволяющие гену, кодирующему полипептид, используемый в рамках настоящего изобретения, действительно выступать в качестве фармацевтического препарата, включают: способ , включающий введение гена прямо в организм индивидуума; и способ , включающий сбор определенного типа клеток из животного-индивидуума и введение гена в клетки  с последующим возвращением клеток в организм животного-индивидуума. Среди них предпочтительным является способ .
in vivo
in vivo
[0078] В случаях когда ген вводят способом , ген можно вводить соответствующим путем введения в зависимости от заболевания, подлежащего лечению, симптомов и т.п. Например, ген можно вводить внутривенным, внутриартериальным, подкожным, внутримышечным путем введения и т.п. В случае введения гена способом , ген можно составлять в виде дозированной формы, такой как раствор; но обычно его составляют в качестве инъекционного раствора и т.п., содержащего ДНК, кодирующую описанный выше пептид в соответствии с настоящим изобретением, в качестве активного ингредиента. При необходимости в нее можно добавлять обычно используемый носитель(и). В случае использования липосомы или липосомы для слияния с мембраной (вирус Сендай (HVJ)-липосома и т.п.), содержащей ДНК, липосома может быть составлена в виде липосомального препарата, такого как суспензия, замороженный препарат или концентрированный на центрифуге замороженный препарат.
[0079] В рамках настоящего изобретения "последовательность оснований, соответствующая SEQ ID NO: 1," включает не только последовательность оснований, фактически соответствующую SEQ ID NO: 1, но также последовательность, комплементарную ей. Таким образом, "полинуклеотид, имеющий последовательность оснований, соответствующую SEQ ID NO: 1," включает одноцепочечный полинуклеотид, имеющий последовательность оснований, фактически соответствующую SEQ ID NO: 1, одноцепочечный полинуклеотид, имеющий последовательность оснований, комплементарную ему, и двухцепочечный полинуклеотид, состоящий из этих одноцепочечных полинуклеотидов. Когда получают полинуклеотид, кодирующий полипептид, используемый в рамках настоящего изобретения, любую из этих последовательностей оснований можно выбрать в качестве подходящей, и этот выбор могут без труда осуществить специалисты в данной области.
Примеры
[0080] Настоящее изобретение более конкретно описано ниже с помощью примеров.
[0081] <Пример 1: Анализ экспрессии в различных тканях>
(1) Анализ экспрессии гена SCD1 в различных линиях злокачественных клеток
6
Последовательность генов (SEQ ID NO: 1), кодирующую аминокислотную последовательность белка SCD1 человека, получают из Gene Bank. Экспрессию полученного таким образом гена в различных типах клеточных линий человека анализировали посредством ОТ-ПЦР (ПЦР с обратной транскрипцией). Реакцию обратной транскрипции проводили следующим образом. В частности, из от 50 до 100 мг каждой ткани или от 5 до 10×10 клеток каждой клеточной линии экстрагировали тотальную РНК с использованием реагента TRIZOL (произведенного Life Technologies, Inc.) в соответствии с протоколом, описанным в прилагаемых инструкциях. Полученную таким образом тотальную РНК использовали для синтеза кДНК с использованием системы для ОТ-ПЦР Superscript First-Strand Synthesis System for RT-PCR (произведенной Life Technologies, Inc.) в соответствии с протоколом, описанным в прилагаемых инструкциях. В качестве кДНК нормальных тканей человека (головной мозг, гиппокамп, яичко, толстый кишечник и плацента) использовали кДНК Gene Pool cDNA (произведенную Life Technologies, Inc.), кДНК QUICK-Clone cDNA (произведенную Clontech Laboratories, Inc.) и библиотеку Large-Insert cDNA Library (произведенную Clontech Laboratories, Inc.). Реакцию ПЦР проводили следующим образом с использованием праймеров, специфичных к полученному гену (последовательности оснований праймеров представлены в SEQ ID NO: 49 и 50). В частности, реагенты и прилагаемый буфер добавляли для получения смеси, имеющей общий объем 25 мкл и содержащей 0,25 мкл образца, полученного посредством реакции обратной транскрипции, по 2 мкМ каждого из описанных выше праймеров, по 0,2 мМ каждого из dNTP и 0,65 Е полимеразы ExTaq (произведенной Takara Shuzo Co., Ltd.). Затем реакцию проводили с использованием термоциклера (произведенного Bio-Rad laboratories Inc.) путем повторения цикла, состоящего из реакций при 94°C в течение 30 секунд, 55°C в течение 30 секунд и 72°C в течение 1 минуты, в течение 30 раз. В то же время в качестве контроля для сравнения использовали праймеры, специфичные к GAPDH, который является геном домашнего хозяйства (последовательности оснований праймеров GAPDH человека представлены в SEQ ID NO: 51 и 52).
[0082] В результате, как показано на фиг. 1, экспрессия гена SCD1 человека была обнаружена в большинстве линий злокачественных клеток, а именно, в клеточных линиях злокачественной лимфомы, рака молочной железы, рака печени, рака предстательной железы, рака яичника, рака почки, рака ободочной и прямой кишки, рака желудка, злокачественной опухоли головного мозга, рака пищевода и рака легкого.
[0083] (2) Экспрессия белка SCD1 в ткани злокачественной опухоли человека (иммуногистохимическое окрашивание)
Иммуногистохимическое окрашивание проводили на 72 образцах тканей злокачественных опухолей в залитой параффином матрице с множеством тканей злокачественной опухоли (произведенной Biomax Inc.). Матрицу тканей злокачественных опухолей человека обрабатывали при 60°C в течение 3 часов и помещали в емкость для окрашивания, заполненную ксилолом, и замену ксилола свежим проводили раз в 5 минут всего 3 раза. Затем то же действие проводили с использованием этанола и PBS-T вместо ксилола. Матрицу тканей злокачественных опухолей человека помещали в емкость для окрашивания, заполненную 10 мМ цитратным буферным раствором (pH 6,0), содержащим 0,05% Tween 20, обрабатывали при 125°C в течение 5 минут, а затем оставляли стоять при комнатной температуре в течение 40 минут или более. Избыток влаги вокруг срезов тканей вытирали посредством Kimwipes, срезы тканей обводили с использованием DAKOPEN и к ним добавляли достаточное количество Peroxidase Block (произведенного DAKO). Матрице позволяли стоять при комнатной температуре в течение 5 минут, а затем матрицу помещали в емкость для окрашивания, заполненную PBS-T, и замену PBS-T свежим проводили каждые 5 минут всего 3 раза. На матрицу наносили раствор PBS-T, содержавший 10% FBS, в качестве блокирующего раствора, и матрицу оставляли стоять во влажной камере при комнатной температуре в течение 1 часа. Затем коммерчески доступное поликлональное антитело кролика (произведенное Sigma-Aldrich Co. LLC.), которое реагирует с белком SCD1, разбавляли раствором PBS-T, содержавшим 5% FBS, до концентрации 10 мкг/мл, и полученный раствор наносили на матрицу, а затем матрице позволяли стоять в течение ночи во влажной камере с контролируемой температурой 4°C. После промывания матрицы PBS-T в течение 10 минут 3 раза к ней капельно добавляли достаточное количество меченного пероксидазой конъюгированного с полимером реагента (произведенного DAKO), и матрицу оставляли стоять во влажной камере при комнатной температуре в течение 30 минут. После промывания матрицы PBS-T в течение 10 минут 3 раза на нее наносили раствор для развития окраски DAB (произведенный DAKO) и матрицу оставляли стоять при комнатной температуре в течение приблизительно 10 минут. После этого раствор для развития окраски сливали и матрицу промывали PBS-T в течение 10 минут 3 раза, а затем ополаскивали дистиллированной водой. Затем матрицу последовательно погружали в растворы 70%, 80%, 90%, 95% и 100% этанола на 1 минуту каждый раз, а затем оставляли стоять в течение ночи, погруженными в ксилол. Предметное стекло матрицы извлекали, заливали средой Glycergel Mounting Medium (произведенной DAKO), а затем визуально исследовали.
[0084] В результате, наблюдали выраженную экспрессию белка SCD1 в большинстве исследованных тканей злокачественных опухолей, а именно: злокачественной лимфомы, рака молочной железы, рака печени, рака предстательной железы, рака яичника, рака почки, рака ободочной и прямой кишки, рака желудка, злокачественной опухоли головного мозга, рака пищевода и рака легкого.
[0085] <Пример 2: Индукция реактивных в отношении пептидного эпитопа CD8-положительных T-клеток>
(1) Прогнозирование пептидных мотивов, которые связываются с HLA-A0201 и HLA-A24
Информация, касающаяся аминокислотной последовательности белка SCD1 человека, соответствующего SEQ ID NO: 2, была получена из GenBank. Для прогнозирования мотивов, связываемых HLA-A0201 и HLA-A24, аминокислотную последовательность белка SCD1 человека анализировали с использованием компьютерной программы для прогнозирования с использованием известного программного обеспечения BIMAS (доступной на http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/). В результате был отобран 21 тип полипептидов, состоящих из аминокислотных последовательностей, соответствующих SEQ ID NO: 3-23, которые, как ожидалось, были способны связываться с молекулой HLA-A0201; и 13 типов полипептидов, состоящих из аминокислотных последовательностей, соответствующих SEQ ID NO: 24-36, которые, как ожидалось, были способны связываться с молекулой HLA-A24. Все отобранные полипептиды синтезировали в Greiner Japan Co. Ltd., предоставляющей услуги по синтезу пептидов на заказ. Качество синтезированных полипептидов было подтверждено анализом ВЭЖХ и масс-спектрометрией.
[0086] (2) Индукция реактивных в отношении пептидного эпитопа CD8-положительных T-клеток
2
Периферическую кровь выделяли из крови HLA-A0201-положительного здорового индивидуума. Периферическую кровь наслаивали на среду для разделения лимфоцитов (OrganonpTeknika Corporation, Durham, NC), а затем центрифугировали при 1500 об/мин при комнатной температуре в течение 20 минут. PBMC-содержавшую фракцию собирали и промывали 3 раза (или более) холодным фосфатным солевым буфером для получения PBMC. Полученные таким образом PBMC суспендировали в 20 мл среды AIM-V (произведенной Life Technologies, Inc.), и им позволяли прикрепляться к культуральному флакону (произведенному Falcon Plastics Co.) в течение 2 часов в условиях 37°C и 5% CO. Не прикрепляющиеся клетки использовали для получения T-клеток, и прикрепляющиеся клетки использовали для получения дендритных клеток.
[0087] Прикрепляющиеся клетки культивировали в среде AIM-V в присутствии IL-4 (1000 Е/мл) и GM-CSF (1000 Е/мл). Через шесть суток среду заменяли средой AIM-V, дополненной IL-4 (1000 Е/мл), GM-CSF (1000 Е/мл), IL-6 (1000 Е/мл, произведенный Genzyme Corporation), IL-1β (10 нг/мл, произведенный Genzyme Corporation) и TNF-α (10 нг/мл, произведенный Genzyme Corporation), и клетки культивировали в течение других 2 суток. Полученную популяцию не прикрепляющихся клеток использовали в качестве дендритных клеток.
6
5
6
5
5
2
2
[0088] Полученные таким образом дендритные клетки суспендировали в среде AIM-V при плотности клеток 1×10 клеток/мл. Каждый из пептидов, отобранных, как описано выше в (1) и предположительно способных связываться с молекулой HLA-A0201, добавляли к клеткам в концентрации 10 мкг/мл, а затем проводили культивирование в течение 4 часов в условиях 37°C и 5% CO с использованием 96-луночного планшета. После культивирования клетки облучали рентгеновским излучением (3000 рад), промывали средой AIM-V, суспендировали в среде AIM-V, содержавшей 10% сыворотку AB человека (произведенную Nabi Biopharmaceuticals Inc.), IL-6 (1000 Е/мл) и IL-12 (10 нг/мл, произведенный Genzyme Corporation), а затем помещали в лунки 24-луночного планшета в количестве 1×10 клеток на лунку. Далее полученную популяцию T-клеток добавляли в лунки в количестве 1×10 клеток на лунку, и клетки культивировали в условиях 37°C и 5% CO. Через семь суток дендритные клетки, полученные так же, как описано выше, путем обработки каждого пептида и последующего облучения рентгеновским излучением суспендировали (плотность клеток: 1×10 клеток/мл) в среде AIM-V, содержавшей 10% сыворотку AB человека (произведенную Nabi Biopharmaceuticals Inc.), IL-7 (10 Е/мл, произведенный Genzyme Corporation) и IL-2 (10 Е/мл, произведенный Genzyme Corporation), и полученную суспензию добавляли в лунки 24-лунчоного планшета в количестве 1×10 клеток на лунку, а затем клетки далее культивировали. Те же методики повторяли 4 раза с интервалами 7 суток, а затем собирали стимулированные T-клетки. После этого индукцию CD8-положительных T-клеток подтверждали проточной цитометрией.
[0089] Далее проводили ту же обработку, которая описана выше, с использованием в качестве отрицательного контроля пептида (SEQ ID NO: 46), имеющего последовательность, не входящую в объем настоящего изобретения; и с использованием в качестве сравнительных примеров белка SCD1, полученного согласно примеру 3 WO 2012/157736 и состоящего из аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 2.
[0090] Попытку индукции реактивных в отношении пептидного эпитопа CD8-положительных T-клеток также предпринимали для пептидов, предположительно способных связываться с молекулой HLA-A24, аналогично тому, как описано выше, с использованием дендритных клеток и популяции T-клеток, индуцированных из периферической крови положительного по HLA-A24 здорового индивидуума. Далее проводили ту же обработку, которая описана выше, с использованием в качестве отрицательного контроля пептида (SEQ ID NO: 47), имеющего последовательность, не входящую объем настоящего изобретения; и с использованием в качестве сравнительного примера белка SCD1, состоящего из аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 2.
[0091] <Пример 3: Определение антигенных эпитопов цитотоксических T-клеток>
(1) Способность продуцировать IFN-γ
2
4
3
Для исследования специфичности репрезентативных T-клеток, индуцированных согласно примеру 2 (2), в отношении соответствующих эпитопных пептидов и белка, дендритные клетки, экспрессирующие молекулу HLA-A0201, обрабатывали различными типами полипептидов. Дендритные клетки получали культивированием в среде AIM-V, дополненной каждым полипептидом в концентрации 10 мкг/мл в условиях 37°C и 5% CO в течение 4 часов. В качестве различных типов полипептидов использовали соответствующие полипептиды, соответствующие аминокислотным последовательностям SEQ ID NO: 3-23 и предположительно способные быть связанными молекулой HLA-A0201, отрицательный контрольный полипептид (SEQ ID NO: 46) и белок SCD1, состоящий из аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 2. К 5×10 дендритных клеток, которые были обработаны каждым пептидом, добавляли 5×10 T-клеток, и клетки культивировали в течение 24 часов в среде AIM-V, содержавшей 10% сыворотку AB человека в 96-луночном планшете. Каждый супернатант после культивирования собирали и количество продуцированного IFN-γ количественно определяли посредством ELISA.
[0092] В результате наблюдали заметно более высокую продукцию IFN-γ в супернатантах, соответствующих дорожкам 4-24, где использовались дендритные клетки, обработанные полипептидами, имеющими аминокислотные последовательности, соответствующие SEQ ID NO: 3-23, по сравнению с супернатантами, соответствующими дорожкам 1 и 2, где использовались дендритные клетки, которые не обрабатывали никаким полипептидом, и дендритные клетки, обработанные отрицательным контрольным полипептидом, соответственно (фиг. 2). Эти результаты показали, что пептиды SEQ ID NO: 3-23 представляют собой пептиды эпитопов T-клеток, обладающие способностью стимулировать пролиферацию HLA-A0201-положительных CD8-положительных T-клеток и индуцировать продукцию IFN-γ. Кроме того, также было показано, что количества IFN-γ, продуцированного T-клетками, стимулированными этими пептидами, были значительно более высокими, чем количества IFN-γ, продуцированного T-клетками, стимулированными полноразмерным белком SCD1 (дорожка 3), состоящим из аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 2. Иными словами, эти результаты указывают на то, что полипептиды SEQ ID NO: 3-23 имеют значительно более высокую активность индукции иммунитета. Кроме того, хотя последовательности SEQ ID NO: 3-23, имеющие описанную выше активность индукции иммунитета, включены в аминокислотную последовательность полноразмерного белка SCD1, соответствующего SEQ ID NO: 2, количество IFN-γ, продуцированного T-клетками, стимулированными полноразмерным белком SCD1 SEQ ID NO: 2, было низким. Полагают, что причина этого состоит в том, что полноразмерный белок SCD1 не продемонстрировал достаточной активности индукции иммунитета, поскольку аминокислотная последовательность полноразмерного белка SCD1 также включает ряд последовательностей, которые ингибируют активность индукции иммунитета.
[0093] Кроме того, для исследования специфичности каждых из реактивных в отношении пептидного эпитопа CD8-положительных T-клеток, индуцированных согласно примеру 3 (2), с использованием полипептидов, имеющих аминокислотные последовательности, соответствующие SEQ ID NO: 24-36, с пептидными эпитопами, измеряли количество IFN-γ, продуцированного T-клетками, против дендритных клеток, экспрессирующих молекулу HLA-A24, причем дендритные клетки были обработаны каждым из: полипептидов SEQ ID NO: 24-36 (дорожки 4-16); отрицательным контрольным полипептидом, имеющим аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 47; и полноразмерным белком SCD1, имеющим аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 2; посредством ELISA, аналогично тому, как описано выше.
[0094] В результате, наблюдали значительно более высокую продукцию IFN-γ в культуральных супернатантах, соответствующих дорожкам 4-16, где использовались дендритные клетки, обработанные полипептидами SEQ ID NO: 24-36, по сравнению с супернатантами, соответствующими дорожкам 1 и 2, где использовались дендритные клетки, не обработанные никаким полипептидом, и дендритные клетки, обработанные отрицательным контрольным полипептидом, соответственно (фиг. 3).
[0095] Эти результаты показали, что полипептиды SEQ ID NO: 24-36 представляют собой эпитопные пептиды T-клеток, обладающие способностью специфически стимулировать пролиферацию HLA-A24-положительных CD8-положительных T-клеток и индуцировать продукцию IFN-γ. Кроме того, также было обнаружено, что количества IFN-γ, продуцированного T-клетками, стимулированными этими полипептидам, были значительно более высокими, чем количества IFN-γ, продуцированного T-клетками, стимулированными полноразмерным белком SCD1, имеющим аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 2. Полагают, что причиной этого является то, что полноразмерный белок SCD1 не демонстрирует достаточную активность индукции иммунитета по причине, которая описана выше.
[0096] (2) Анализ цитотоксичности
Затем исследовали следующее: презентируются ли полипептиды, имеющие аминокислотные последовательности, соответствующие SEQ ID NO: 3-23, которые используют в рамках настоящего изобретения, молекулами HLA-A0201 на опухолевых клетках, которые являются HLA-A0201-положительными и которые экспрессируют белок SCD1 человека; могут ли CD8-положительные T-клетки, стимулированные полипептидами в соответствии с настоящим изобретением, повреждать опухолевые клетки, которые являются HLA-A0201-положительными и которые экспрессируют белок SCD1 человека; и, кроме того, имеют ли описанные выше CD8-положительные T-клетки значительно более высокую способность повреждать опухолевые клетки по сравнению с CD8-положительными T-клетками, стимулированными белком SCD1.
6
3
4
2
[0097] Каждую из клеточных линий, в которых была подтверждена экспрессия белка SCD1 человека, а именно: клетки клеточной линии глиомы (злокачественной опухоли головного мозга) человека U251; клетки клеточной линии лейкоза THP1; клеточную линию рака печени SK-Hep-1; клеточную линию рака молочной железы MCF7; клеточную линию рака яичника OVCAR3; клеточную линию рака почки A498; клеточную линию рака ободочной и прямой кишки HCT116; клеточную линию рака желудка AGS; и клеточную линию рака легкого NCI-H522 (приобретенную от JCRB, RIKEN и ATCC); собирали в 50-мл центрифужную пробирку в количестве 10 клеток каждой. После добавления в нее 100 мкКи хрома 51 клетки инкубировали при 37°C в течение 2 часов. После этого каждый тип клеток промывали 3 раза средой RPMI (произведенной Gibco Brl Co.), содержавшей 10% эмбриональную телячью сыворотку (далее обозначаемую как FBS; произведенную Gibco Brl Co.) и помещали в лунки 96-луночного планшета с V-образным дном в количестве 10 клеток на лунку. В каждую лунку далее добавляли 5×10 клеток HLA-A0201-положительных CD8-положительных T-клеток, суспендированных в среде RPMI, содержавшей 10% FBS, причем эти клетки были индуцированы посредством стимуляции каждым из: полипептидов, имеющих аминокислотные последовательности, соответствующие SEQ ID NO: 3-23, отрицательных контрольных полипептидов (SEQ ID NO: 46) и полноразмерного белка SCD1, имеющего аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 2; а затем проводили культивирование в течение 4 часов в условиях 37°C и 5% CO. После культивирования измеряли количество хрома 51, высвободившегося из поврежденных опухолевых клеток в каждый культуральный супернатант, после чего вычисляли цитотоксическую активность CD8-положительных T-клеток, индуцированных стимуляцией каждым из полипептидов и белком.
[0098] В результате было обнаружено, что HLA-A0201-положительные CD8-положительные T-клетки, индуцированные стимуляцией полипептидами, имеющими аминокислотные последовательности, соответствующие SEQ ID NO: 3-23 демонстрируют в значительной степени высокую цитотоксическую активность против всех из описанных выше клеток. В качестве репрезентативных примеров цитотоксическая активность против клеток U251 и клеток SK-Hep-1 представлена на фиг. 4A и фиг. 4B, соответственно. Можно видеть, что CD8-положительные T-клетки, стимулированные полипептидами, имеющими аминокислотные последовательности, соответствующие SEQ ID NO: 3-23 (дорожки 4-24, соответственно) демонстрируют значительно более высокую цитотоксическую активность против клеток U251 и клеток SK-Hep-1 по сравнению с CD8-положительными T-клетками (дорожка 3), стимулированными полноразмерным белком SCD1. С другой стороны, CD8-положительные T-клетки, индуцированные отрицательным контрольным полипептидом (дорожка 2) не продемонстрировали никакой цитотоксической активности, и этот результат был практически таким же, как и в случае имитации (дорожка 1). Эти результаты указывают на то, что каждый из полипептидов SEQ ID NO: 3-23, использованных в рамках настоящего изобретения, презентируется молекулами HLA-A0201 не опухолевых клетках, которые являются HLA-A0201-положительными и которые экспрессируют полипептид SCD1 человека, и, кроме того, что полипептиды в соответствии с настоящим изобретением обладают способностью индуцировать CD8-положительные цитотоксические T-клетки, способные повреждать такие опухолевые клетки. Кроме того, независимо от того факта, что аминокислотная последовательность полноразмерного белка SCD1 включает последовательности SEQ ID NO: 3-23, CD8-положительные T-клетки, стимулированные полноразмерным белком SCD1, демонстрировали значительно более низкую цитотоксическую активность по сравнению с CD8-положительными T-клетками, стимулированными полипептидами, имеющими аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 3-23 (дорожки 3, 4-24). Полагают, что причиной этого является то, что белок SCD1 не индуцировал T-клетки, обладающие высокой цитотоксической активностью, поскольку аминокислотная последовательность белка SCD1 включает ряд последовательностей, которые ингибируют активность индукции иммунитета.
[0099] Аналогично, исследовали, презентируются ли полипептиды SEQ ID NO: 24-36, молекулами HLA-A24 на опухолевых клетках, которые являются HLA-A24-положительными и которые экспрессируют белок SCD1 человека; могут ли CD8-положительные T-клетки, стимулированные полипептидами в соответствии с настоящим изобретением, повреждать опухолевые клетки, которые являются HLA-A24-положительными и которые экспрессируют белок SCD1 человека; и, кроме того, имеют ли описанные выше CD8-положительные T-клетки значительно более высокую способность повреждать опухолевые клетки по сравнению с CD8-положительными T-клетками, стимулированными белком SCD1.
[0100] Хрому 51 позволяли включаться в клеточные линии, которые являются HLA-A24-положительными и которые экспрессируют белок SCD1 человека, а именно: клеточную линию глиомы человека KNS-42; клеточную линию рака печени SK-Hep1; клеточную линию рака почки Caki1; клеточную линию рака ободочной и прямой кишки SW480; клеточную линию рака желудка MKN45; клеточную линию рака предстательной железы PC3; клеточную линию рака молочной железы ZR75-1 (приобретенную от JCRB, RIKEN и ATCC). Каждый тип клеток культивировали с HLA-A24-положительными CD8-положительными T-клетками, индуцированными посредством стимуляции каждым из: полипептидов, имеющих аминокислотные последовательности, соответствующие SEQ ID NO: 24-36; отрицательного контрольного полипептида (SEQ ID NO: 47) и полноразмерного белка SCD1, и измеряли количество хрома 51, высвободившегося из поврежденных клеток в каждый культуральный супернатант.
[0101] В результате было выявлено, что HLA-A24-положительные CD8-положительные T-клетки, стимулированные полипептидами, имеющими аминокислотные последовательности, соответствующие SEQ ID NO: 24-36, демонстрируют примечательную высокую цитотоксическую активность, которая значительно превышала прогнозируемый в целом диапазон против всех использованных типов злокачественных клеток. В качестве репрезентативных примеров цитотоксическая активность против клеток SW480 и клеток ZR75-1 представлена на фиг. 5A и фиг. 5B, соответственно. Можно видеть, что CD8-положительные T-клетки, стимулированные полипептидами, имеющими аминокислотные последовательности, соответствующие SEQ ID NO: 24-36 (дорожки 4-16, соответственно), демонстрируют значительно более высокую цитотоксическую активность против клеток SW480 и клеток ZR75-1 по сравнению с CD8-положительными T-клетками (дорожка 3), стимулированными полноразмерным белком SCD1. С другой стороны, CD8-положительные T-клетки, индуцированные отрицательным контрольным полипептидом (дорожка 2), не продемонстрировали никакой цитотоксической активности, и этот результат был приблизительно таким же, как и для имитации (дорожка 1). Таким образом, можно видеть, что каждый из полипептидов SEQ ID NO: 24-36 презентируется молекулами HLA-A24 на клетках, которые являются HLA-A24-положительными и которые экспрессируют белок SCD1 человека, и эти результаты указывают на то, что полипептиды в соответствии с настоящим изобретением обладают способностью индуцировать CD8-положительные цитотоксические T-клетки, способные повреждать такие клетки.
[0102] С другой стороны, когда описанные выше злокачественные клетки подвергали воздействию полипептидов, соответствующих аминокислотным последовательностям SEQ ID NO: 3-36, и полноразмерного белка SCD1, состоящего из аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 2, злокачественные клетки вообще не уничтожались. Это подтверждало тот факт, что эти полипептиды не обладают активностью прямого уничтожения злокачественных клеток.
4
3
[0103] Цитотоксическую активность определяли, как описано выше, путем смешения 5×10 CD8-положительных T-клеток, стимулированных и индуцированных каждым из полипептидов, использованных в рамках настоящего изобретения, и 1×10 каждого типа опухолевых клеток, в которые включался хром 51; культивирования каждой смеси клеток в течение 4 часов; определение количества хрома 51, высвободившегося в каждую культуральную среду после культивирования; и вычисления цитотоксической активности CD8-положительных T-клеток против каждого типа опухолевых клеток (называемых клетками-мишенями) по следующей формуле*
[0104] *Формула: цитотоксическая активность (%) = количество хрома 51, высвободившегося из клеток-мишеней при добавлении CD8-положительных T-клеток/количество хрома 51, высвободившегося из клеток-мишеней при добавлении 1Н хлористоводородной кислоты ×100.
[0105] <Пример 4: Индукция CD4-положительных T-клеток, реактивных в отношении пептидных эпитопов, происходящих из пептида, происходящего из белка SCD1>
Для прогнозирования антигенных эпитопов CD4-положительных T-клеток аминокислотную последовательность белка SCD1 человека анализировали с использованием компьютерной программы для прогнозирования с использованием алгоритма SYFPEITHI (от Rammensee), и было выбрано 9 типов пептидов, соответствующих SEQ ID NO: 37-45 и предположительно являющихся пептидами, связываемыми HLA класса II. Все отобранные пептиды синтезировались в Greiner Japan Co. Ltd., предоставляющей услуги по синтезу пептидов на заказ.
2
[0106] Периферическую кровь выделяли из крови HLA-DRB1*04-положительного здорового индивидуума. Периферическую кровь наслаивали на среду для разделения лимфоцитов (OrganonpTeknika Corporation, Durham, NC), а затем центрифугировали при 1500 об/мин при комнатной температуре в течение 20 минут. PBMC-содержавшую фракцию собирали и промывали 3 раза (или более) холодным фосфатным солевым буфером для получения PBMC. Полученные таким образом PBMC суспендировали в 20 мл среды AIM-V (произведенной Life Technologies, Inc.), и им позволяли прикрепляться к культуральному флакону (произведенному Falcon Plastics Co.) в течение 2 часов в условиях 37°C и 5% CO. Не прикрепляющиеся клетки использовали для получения T-клеток, и прикрепляющиеся клетки использовали для получения дендритных клеток.
[0107] Прикрепляющиеся клетки культивировали в среде AIM-V в присутствии IL-4 (1000 Е/мл) и GM-CSF (1000 Е/мл). Через шесть суток среду заменяли средой AIM-V, дополненной IL-4 (1000 Е/мл), GM-CSF (1000 Е/мл), IL-6 (1000 Е/мл, произведенный Genzyme Corporation), IL-1β (10 нг/мл, произведенный Genzyme Corporation) и TNF-α (10 нг/мл, произведенный Genzyme Corporation), и клетки культивировали в течение других 2 суток. Полученную популяцию не прикрепляющихся клеток использовали в качестве дендритных клеток.
6
5
6
5
2
2
[0108] Полученные таким образом дендритные клетки суспендировали в среде AIM-V при плотности клеток 1×10 клеток/мл. Каждый из полипептидов SEQ ID NO: 37-45, отрицательного контрольного полипептида (SEQ ID NO: 48) и белка SCD1, состоящего из аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 2, добавляли к клеткам в концентрации 10 мкг/мл, а затем проводили культивирование в течение 4 часов в условиях 37°C и 5% CO с использованием 96-луночного планшета. После культивирования клетки облучали рентгеновским излучением (3000 рад), промывали средой AIM-V, суспендировали в среде AIM-V, содержавшей 10% сыворотку AB человека (произведенную Nabi Biopharmaceuticals Inc.), IL-6 (1000 Е/мл) и IL-12 (10 нг/мл, произведенный Genzyme Corporation), а затем помещали в лунки 24-луночного планшета в количестве 1×10 клеток на лунку. Далее полученную популяцию T-клеток добавляли в лунки в количестве 1×10 клеток на лунку, и клетки культивировали в условиях 37°C и 5% CO. Через семь суток каждый культуральный супернатант сливали. Затем дендритные клетки, обработанные каждым пептидом, полученным, как описано выше, или белком SCD1, с последующим облучением рентгеновским излучением суспендировали в среде AIM-V, содержавшей 10% сыворотку AB человека (произведенную Nabi Biopharmaceuticals Inc.) и IL-2 (10 Е/мл, произведенный Genzyme Corporation) и полученную суспензию добавляли в лунки 24-лунчоного планшета в количестве 1×10 клеток на лунку, а затем клетки далее культивировали. Те же методики повторяли 4 раза с интервалами 7 суток, а затем собирали стимулированные T-клетки. После этого индукцию CD8-положительных T-клеток подтверждали проточной цитометрией. В результате подтверждали пролиферацию индуцированных T-клеток в каждой лунке.
[0109] <Пример 5: Определение происходящих из белка SCD1 антигеных эпитопов хелперных T-клеток, которые стимулируют HLA-DRB1*04-положительные CD4-положительные T-клетки>
2
4
4
Для исследования специфичности соответствующих CD4-положительных T-клеток, индуцированных согласно приведенному выше примеру 4, в отношении соответствующих пептидов и белков, PBMC, экспрессирующие молекулы HLA-DRB1*04, обрабатывали различными типами полипептидов. PBMC получали культивированием в среде AIM-V, дополненной каждым из полипептидов в концентрации 10 мкг/мл, в условиях 37°C и 5% CO в течение 4 часов. В качестве различных типов полипептидов использовали полипептиды, соответствующие аминокислотным последовательностям SEQ ID NO: 37-45, отрицательный контрольный полипептид (SEQ ID NO: 48) и полноразмерный белок SCD1, состоящий из аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 2. К 5×10 PBMC, которые были обработаны каждым пептидом, добавляли 5×10 CD4-положительных T-клеток, и клетки культивировали в течение 24 часов в среде AIM-V, содержавшей 10% сыворотку AB человека в 96-луночном планшете. Каждый супернатант после культивирования собирали и количество продуцированного IFN-γ определяли посредством ELISA.
[0110] В результате продукция IFN-γ в количестве 1000 пг/мл или более была подтверждена в культуральных супернатантах в лунках с PBMC, обработанными соответствующими пептидами SEQ ID NO: 37-45. С другой стороны, продукция IFN-γ практически не наблюдалась в культуральных супернатантах в лунке с PBMC, обработанными отрицательным контрольным полипептидом и в лунке с дендритными клетками отдельно (имитация), не обработанными никаким полипептидом. Таким образом, было обнаружено, что полипептиды соответствующие аминокислотным последовательностям SEQ ID NO: 37-45, представляют собой эпитопные пептиды T-клеток, обладающие способностью специфически стимулировать и увеличивать в количестве HLA-DRB1*04-положительные CD4-положительные T-клетки и индуцировать продукцию IFN-γ. Кроме того, независимо от того факта, что аминокислотная последовательность полноразмерного белка SCD1 включает описанные выше последовательности SEQ ID NO: 37-45, обладающие активностью индукции иммунитета, количество IFN-γ, продуцированного в культуральном супернатанте в лунке с клетками PBMC, обработанными полноразмерным белком SCD1, было чрезвычайно низким. Полагают, что причина этого состоит в том, что белок SCD1 не демонстрировал достаточную активность индукции иммунитета, поскольку аминокислотная последовательность белка SCD1 включает ряд последовательностей, которые ингибируют активность индукции иммунитета.
2
2
5
4
4
[0111] Затем исследовали, являются ли полипептиды SEQ ID NO: 37-45, обладающие способностью стимулировать пролиферацию HLA-DRB1*04-положительных T-клеток, эпитопами, которые естественным образом процессируются из белка SCD1 в антигенпредставляющих клетках и презентируются HLA-DR. Лизат клеток HEK293 (приобретенных от ATCC), временно экспрессирующих белок SCD1, добавляли к незрелым дендритным клеткам для обеспечения расщепления белка и созревания дендритных клеток. Затем проводили исследование стимулируются ли T-клетки, стимулированные каждым из полипептидов SEQ ID NO: 37-45, отрицательным контрольным полипептидом и белком SCD1, полученными дендритными клетками. Периферическую кровь выделяли из крови HLA-DRB1*04-положительного здорового индивидуума. Периферическую кровь наслаивали на среду для разделения лимфоцитов (OrganonpTeknika Corporation, Durham, NC), а затем центрифугировали при 1500 об/мин при комнатной температуре в течение 20 минут. Промежуточную фазу, содержавшую PBMC, собирали и промывали 3 раза (или более) холодным фосфатным солевым буфером для получения PBMC. Полученные таким образом PBMC суспендировали в 20 мл среды AIM-V (произведенной Life Technologies, Inc.), и им позволяли прикрепляться к культуральному флакону (произведенному Falcon Plastics Co.) в течение 2 часов в условиях 37°C и 5% CO. Прикрепляющиеся клетки культивировали в среде AIM-V в присутствии IL-4 (1000 Е/мл) и GM-CSF (1000 Е/мл) в течение 6 суток для получения незрелых дендритных клеток. Описанный выше лизат добавляли к 5×10 незрелых дендритных клеток, а затем проводили культивирование в среде AIM-V, дополненной IL-4 (1000 Е/мл), GM-CSF (1000 Е/мл), IL-6 (1000 Е/мл), IL-1β (10 нг/мл) и TNF-α (10 нг/мл) в течение 2 суток. Культивированные дендритные клетки облучали рентгеновским излучением (3000 рад), промывали средой AIM-V, суспендировали в среде AIM-V, содержавшей 10% сыворотку AB человека, а затем помещали в лунки 96-луночного планшета в количестве 3,3×10 клеток на лунку. В каждую лунку добавляли 5×10 T-клеток, стимулированных каждым из полипептидов SEQ ID NO: 37-45, отрицательный контроль полипептид и блок SCD1, и клетки культивировали в условиях 37°C и 5% CO в течение 24 часов. Каждый супернатант после культивирования собирали и количество продуцированного IFN-γ количественно определяли посредством ELISA.
[0112] В результате, как показано на фиг. 6, было обнаружено, что T-летки, соответствующие дорожкам 4-12, которые стимулировали полипептидами SEQ ID NO: 37-45, соответственно, продуцировали IFN-γ в ответ на стимуляцию дендритными клетками, к которым был добавлен белок SCD1. С другой стороны, продукцию IFN-γ практически не наблюдали в T-клетках, соответствующих дорожке 2, стимулированных отрицательным контрольным полипептидом, и в T-клетках, соответствующих дорожке 1, не стимулированных никаким полипептидом. Таким образом, было обнаружено, что полипептиды SEQ ID NO: 37-45 являются эпитопами, которые естественным образом процессируются из белка SCD1 в антигенпредставляющих клетках и презентируются HLA-DR. Кроме того, продукция IFN-γ в T-клетках, соответствующих дорожке 3, обработанных полноразмерным белком SCD1, была чрезвычайно низкой также и в этом эксперименте. Полагают, что причина этого состоит в том, что белок SCD1 не демонстрировал достаточную активность индукции иммунитета, поскольку аминокислотная последовательность белка SCD1 включает ряд последовательностей, которые ингибируют активность индукции иммунитета.
Промышленная применимость
[0113] Индуктор иммунитета в соответствии с настоящим изобретением, содержащий полипептид, который демонстрирует противоопухолевую активность против различных типов злокачественных опухолей, является пригодным для лечения или предупреждения злокачественной опухоли, или для обнаружения злокачественной опухоли.
[0114] Все публикации, патенты и патентные заявки, цитированные в настоящем описании, включены в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ:
<110>  TORAY INDUSTRIES, INC.
<120>  Индуктор иммунитета
<130>  PH-6814-PCT
<150>  JP 2016-040364
<151>  2016-03-02
<160>  52
<170>  PatentIn version 3.1
<210>  1
<211>  5473
<212>  ДНК
<213>  Homo sapiens
<220>
<221>  CDS
<222>  (491)..(1570)
<223>
<400>  1
ggcaggacga ggtggcacca aattcccttc ggccaatgac gagccggagt ttacagaagc     60
ctcattagca tttccccaga ggcaggggca ggggcagagg ccgggtggtg tggtgtcggt    120
gtcggcagca tccccggcgc cctgctgcgg tcgccgcgag cctcggcctc tgtctcctcc    180
ccctcccgcc cttacctcca cgcgggaccg cccgcgccag tcaactcctc gcactttgcc    240
cctgcttggc agcggataaa agggggctga ggaaataccg gacacggtca cccgttgcca    300
gctctagcct ttaaattccc ggctcgggga cctccacgca ccgcggctag cgccgacaac    360
cagctagcgt gcaaggcgcc gcggctcagc gcgtaccggc gggcttcgaa accgcagtcc    420
tccggcgacc ccgaactccg ctccggagcc tcagccccct ggaaagtgat cccggcatcc    480
gagagccaag atg ccg gcc cac ttg ctg cag gac gat atc tct agc tcc       529
Met Pro Ala His Leu Leu Gln Asp Asp Ile Ser Ser Ser
1               5                   10
tat acc acc acc acc acc att aca gcg cct ccc tcc agg gtc ctg cag      577
Tyr Thr Thr Thr Thr Thr Ile Thr Ala Pro Pro Ser Arg Val Leu Gln
15                  20                  25
aat gga gga gat aag ttg gag acg atg ccc ctc tac ttg gaa gac gac      625
Asn Gly Gly Asp Lys Leu Glu Thr Met Pro Leu Tyr Leu Glu Asp Asp
30                  35                  40                  45
att cgc cct gat ata aaa gat gat ata tat gac ccc acc tac aag gat      673
Ile Arg Pro Asp Ile Lys Asp Asp Ile Tyr Asp Pro Thr Tyr Lys Asp
50                  55                  60
aag gaa ggc cca agc ccc aag gtt gaa tat gtc tgg aga aac atc atc      721
Lys Glu Gly Pro Ser Pro Lys Val Glu Tyr Val Trp Arg Asn Ile Ile
65                  70                  75
ctt atg tct ctg cta cac ttg gga gcc ctg tat ggg atc act ttg att      769
Leu Met Ser Leu Leu His Leu Gly Ala Leu Tyr Gly Ile Thr Leu Ile
80                  85                  90
cct acc tgc aag ttc tac acc tgg ctt tgg ggg gta ttc tac tat ttt      817
Pro Thr Cys Lys Phe Tyr Thr Trp Leu Trp Gly Val Phe Tyr Tyr Phe
95                  100                 105
gtc agt gcc ctg ggc ata aca gca gga gct cat cgt ctg tgg agc cac      865
Val Ser Ala Leu Gly Ile Thr Ala Gly Ala His Arg Leu Trp Ser His
110                 115                 120                 125
cgc tct tac aaa gct cgg ctg ccc cta cgg ctc ttt ctg atc att gcc      913
Arg Ser Tyr Lys Ala Arg Leu Pro Leu Arg Leu Phe Leu Ile Ile Ala
130                 135                 140
aac aca atg gca ttc cag aat gat gtc tat gaa tgg gct cgt gac cac      961
Asn Thr Met Ala Phe Gln Asn Asp Val Tyr Glu Trp Ala Arg Asp His
145                 150                 155
cgt gcc cac cac aag ttt tca gaa aca cat gct gat cct cat aat tcc     1009
Arg Ala His His Lys Phe Ser Glu Thr His Ala Asp Pro His Asn Ser
160                 165                 170
cga cgt ggc ttt ttc ttc tct cac gtg ggt tgg ctg ctt gtg cgc aaa     1057
Arg Arg Gly Phe Phe Phe Ser His Val Gly Trp Leu Leu Val Arg Lys
175                 180                 185
cac cca gct gtc aaa gag aag ggg agt acg cta gac ttg tct gac cta     1105
His Pro Ala Val Lys Glu Lys Gly Ser Thr Leu Asp Leu Ser Asp Leu
190                 195                 200                 205
gaa gct gag aaa ctg gtg atg ttc cag agg agg tac tac aaa cct ggc     1153
Glu Ala Glu Lys Leu Val Met Phe Gln Arg Arg Tyr Tyr Lys Pro Gly
210                 215                 220
ttg ctg atg atg tgc ttc atc ctg ccc acg ctt gtg ccc tgg tat ttc     1201
Leu Leu Met Met Cys Phe Ile Leu Pro Thr Leu Val Pro Trp Tyr Phe
225                 230                 235
tgg ggt gaa act ttt caa aac agt gtg ttc gtt gcc act ttc ttg cga     1249
Trp Gly Glu Thr Phe Gln Asn Ser Val Phe Val Ala Thr Phe Leu Arg
240                 245                 250
tat gct gtg gtg ctt aat gcc acc tgg ctg gtg aac agt gct gcc cac     1297
Tyr Ala Val Val Leu Asn Ala Thr Trp Leu Val Asn Ser Ala Ala His
255                 260                 265
ctc ttc gga tat cgt cct tat gac aag aac att agc ccc cgg gag aat     1345
Leu Phe Gly Tyr Arg Pro Tyr Asp Lys Asn Ile Ser Pro Arg Glu Asn
270                 275                 280                 285
atc ctg gtt tca ctt gga gct gtg ggt gag ggc ttc cac aac tac cac     1393
Ile Leu Val Ser Leu Gly Ala Val Gly Glu Gly Phe His Asn Tyr His
290                 295                 300
cac tcc ttt ccc tat gac tac tct gcc agt gag tac cgc tgg cac atc     1441
His Ser Phe Pro Tyr Asp Tyr Ser Ala Ser Glu Tyr Arg Trp His Ile
305                 310                 315
aac ttc acc aca ttc ttc att gat tgc atg gcc gcc ctc ggt ctg gcc     1489
Asn Phe Thr Thr Phe Phe Ile Asp Cys Met Ala Ala Leu Gly Leu Ala
320                 325                 330
tat gac cgg aag aaa gtc tcc aag gcc gcc atc ttg gcc agg att aaa     1537
Tyr Asp Arg Lys Lys Val Ser Lys Ala Ala Ile Leu Ala Arg Ile Lys
335                 340                 345
aga acc gga gat gga aac tac aag agt ggc tga gtttggggtc cctcaggttc   1590
Arg Thr Gly Asp Gly Asn Tyr Lys Ser Gly
350                 355
ctttttcaaa aaccagccag gcagaggttt taatgtctgt ttattaacta ctgaataatg   1650
ctaccaggat gctaaagatg atgatgttaa cccattccag tacagtattc ttttaaaatt   1710
caaaagtatt gaaagccaac aactctgcct ttatgatgct aagctgatat tatttcttct   1770
cttatcctct ctctcttcta ggcccattgt cctccttttc actttattgc tatcgccctc   1830
ctttccctta ttgcctccca ggcaagcagc tggtcagtct ttgctcagtg tccagcttcc   1890
aaagcctaga caacctttct gtagcctaaa acgaatggtc tttgctccag ataactctct   1950
ttccttgagc tgttgtgagc tttgaagtag gtggcttgag ctagagataa aacagaatct   2010
tctgggtagt cccctgttga ttatcttcag cccaggcttt tgctagatgg aatggaaaag   2070
caacttcatt tgacacaaag cttctaaagc aggtaaattg tcgggggaga gagttagcat   2130
gtatgaatgt aaggatgagg gaagcgaagc aagaggaacc tctcgccatg atcagacata   2190
cagctgccta cctaatgagg acttcaagcc ccaccacata gcatgcttcc tttctctcct   2250
ggctcggggt aaaaagtggc tgcggtgttt ggcaatgcta attcaatgcc gcaacatata   2310
gttgaggccg aggataaaga aaagacattt taagtttgta gtaaaagtgg tctctgctgg   2370
ggaagggttt tcttttcttt ttttctttaa taacaaggag atttcttagt tcatatatca   2430
agaagtcttg aagttgggtg tttccagaat tggtaaaaac agcagctcat agaattttga   2490
gtattccatg agctgctcat tacagttctt tcctctttct gctctgccat cttcaggata   2550
ttggttcttc ccctcatagt aataagatgg ctgtggcatt tccaaacatc caaaaaaagg   2610
gaaggattta aggaggtgaa gtcgggtcaa aaataaaata tatatacata tatacattgc   2670
ttagaacgtt aaactattag agtatttccc ttccaaagag ggatgtttgg aaaaaactct   2730
gaaggagagg aggaattagt tgggatgcca atttcctctc cactgctgga catgagatgg   2790
agaggctgag ggacaggatc tataggcagc ttctaagagc gaacttcaca taggaaggga   2850
tctgagaaca cgttgccagg ggcttgagaa ggttactgag tgagttattg ggagtcttaa   2910
taaaataaac tagatattag gtccattcat taattagttc cagtttctcc ttgaaatgag   2970
taaaaactag aaggcttctc tccacagtgt tgtgcccctt cactcatttt tttttgagga   3030
gaagggggtc tctgttaaca tctagcctaa agtatacaac tgcctggggg gcagggttag   3090
gaatctcttc actaccctga ttcttgattc ctggctctac cctgtctgtc ccttttcttt   3150
gaccagatct ttctcttccc tgaacgtttt cttctttccc tggacaggca gcctcctttg   3210
tgtgtattca gaggcagtga tgacttgctg tccaggcagc tccctcctgc acacagaatg   3270
ctcagggtca ctgaaccact gcttctcttt tgaaagtaga gctagctgcc actttcacgt   3330
ggcctccgca gtgtctccac ctacacccct gtgctcccct gccacactga tggctcaaga   3390
caaggctggc aaaccctccc agaaacatct ctggcccaga aagcctctct ctccctccct   3450
ctctcatgag gcacagccaa gccaagcgct catgttgagc cagtgggcca gccacagagc   3510
aaaagagggt ttattttcag tcccctctct ctgggtcaga accagagggc atgctgaatg   3570
ccccctgctt acttggtgag ggtgccccgc ctgagtcagt gctctcagct ggcagtgcaa   3630
tgcttgtaga agtaggagga aacagttctc actgggaaga agcaagggca agaacccaag   3690
tgcctcacct cgaaaggagg ccctgttccc tggagtcagg gtgaactgca aagctttggc   3750
tgagacctgg gatttgagat accacaaacc ctgctgaaca cagtgtctgt tcagcaaact   3810
aaccagcatt ccctacagcc tagggcagac aatagtatag aagtctggaa aaaaacaaaa   3870
acagaatttg agaaccttgg accactcctg tccctgtagc tcagtcatca aagcagaagt   3930
ctggctttgc tctattaaga ttggaaatgt acactaccaa acactcagtc cactgttgag   3990
ccccagtgct ggaagggagg aaggcctttc ttctgtgtta attgcgtaga ggctacaggg   4050
gttagcctgg actaaaggca tccttgtctt ttgagctatt cacctcagta gaaaaggatc   4110
taagggaaga tcactgtagt ttagttctgt tgacctgtgc acctacccct tggaaatgtc   4170
tgctggtatt tctaattcca caggtcatca gatgcctgct tgataatata taaacaataa   4230
aaacaacttt cacttcttcc tattgtaatc gtgtgccatg gatctgatct gtaccatgac   4290
cctacataag gctggatggc acctcaggct gagggcccca atgtatgtgt ggctgtgggt   4350
gtgggtggga gtgtgtctgc tgagtaagga acacgatttt caagattcta aagctcaatt   4410
caagtgacac attaatgata aactcagatc tgatcaagag tccggatttc taacagtcct   4470
tgctttgggg ggtgtgctga caacttagct caggtgcctt acatcttttc taatcacagt   4530
gttgcatatg agcctgccct cactccctct gcagaatccc tttgcacctg agaccctact   4590
gaagtggctg gtagaaaaag gggcctgagt ggaggattat cagtatcacg atttgcagga   4650
ttcccttctg ggcttcattc tggaaacttt tgttagggct gcttttctta agtgcccaca   4710
tttgatggag ggtggaaata atttgaatgt atttgattta taagtttttt tttttttttt   4770
gggttaaaag atggttgtag catttaaaat ggaaaatttt ctccttggtt tgctagtatc   4830
ttgggtgtat tctctgtaag tgtagctcaa ataggtcatc atgaaaggtt aaaaaagcga   4890
ggtggccatg ttatgctggt ggttaaggcc agggcctctc caaccactgt gccactgact   4950
tgctgtgtga ccctgggcaa gtcacttaac tataaggtgc ctcagttttc cttctgttaa   5010
aatggggata ataatactga cctacctcaa agggcagttt tgaggcatga ctaatgcttt   5070
ttagaaagca ttttgggatc cttcagcaca ggaattctca agacctgagt attttttata   5130
ataggaatgt ccaccatgaa cttgatacgt ccgtgtgtcc cagatgctgt cattagtcta   5190
tatggttctc caagaaactg aatgaatcca ttggagaagc ggtggataac tagccagaca   5250
aaatttgaga atacataaac aacgcattgc cacggaaaca tacagaggat gccttttctg   5310
tgattgggtg ggattttttc cctttttatg tgggatatag tagttacttg tgacaagaat   5370
aattttggaa taatttctat taatatcaac tctgaagcta attgtactaa tctgagattg   5430
tgtttgttca taataaaagt gaagtgaatc tgattgcaaa aaa                     5473
<210>  2
<211>  359
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  2
Met Pro Ala His Leu Leu Gln Asp Asp Ile Ser Ser Ser Tyr Thr Thr
1               5                   10                  15
Thr Thr Thr Ile Thr Ala Pro Pro Ser Arg Val Leu Gln Asn Gly Gly
20                  25                  30
Asp Lys Leu Glu Thr Met Pro Leu Tyr Leu Glu Asp Asp Ile Arg Pro
35                  40                  45
Asp Ile Lys Asp Asp Ile Tyr Asp Pro Thr Tyr Lys Asp Lys Glu Gly
50                  55                  60
Pro Ser Pro Lys Val Glu Tyr Val Trp Arg Asn Ile Ile Leu Met Ser
65                  70                  75                  80
Leu Leu His Leu Gly Ala Leu Tyr Gly Ile Thr Leu Ile Pro Thr Cys
85                  90                  95
Lys Phe Tyr Thr Trp Leu Trp Gly Val Phe Tyr Tyr Phe Val Ser Ala
100                 105                 110
Leu Gly Ile Thr Ala Gly Ala His Arg Leu Trp Ser His Arg Ser Tyr
115                 120                 125
Lys Ala Arg Leu Pro Leu Arg Leu Phe Leu Ile Ile Ala Asn Thr Met
130                 135                 140
Ala Phe Gln Asn Asp Val Tyr Glu Trp Ala Arg Asp His Arg Ala His
145                 150                 155                 160
His Lys Phe Ser Glu Thr His Ala Asp Pro His Asn Ser Arg Arg Gly
165                 170                 175
Phe Phe Phe Ser His Val Gly Trp Leu Leu Val Arg Lys His Pro Ala
180                 185                 190
Val Lys Glu Lys Gly Ser Thr Leu Asp Leu Ser Asp Leu Glu Ala Glu
195                 200                 205
Lys Leu Val Met Phe Gln Arg Arg Tyr Tyr Lys Pro Gly Leu Leu Met
210                 215                 220
Met Cys Phe Ile Leu Pro Thr Leu Val Pro Trp Tyr Phe Trp Gly Glu
225                 230                 235                 240
Thr Phe Gln Asn Ser Val Phe Val Ala Thr Phe Leu Arg Tyr Ala Val
245                 250                 255
Val Leu Asn Ala Thr Trp Leu Val Asn Ser Ala Ala His Leu Phe Gly
260                 265                 270
Tyr Arg Pro Tyr Asp Lys Asn Ile Ser Pro Arg Glu Asn Ile Leu Val
275                 280                 285
Ser Leu Gly Ala Val Gly Glu Gly Phe His Asn Tyr His His Ser Phe
290                 295                 300
Pro Tyr Asp Tyr Ser Ala Ser Glu Tyr Arg Trp His Ile Asn Phe Thr
305                 310                 315                 320
Thr Phe Phe Ile Asp Cys Met Ala Ala Leu Gly Leu Ala Tyr Asp Arg
325                 330                 335
Lys Lys Val Ser Lys Ala Ala Ile Leu Ala Arg Ile Lys Arg Thr Gly
340                 345                 350
Asp Gly Asn Tyr Lys Ser Gly
355
<210>  3
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  3
Lys Leu Glu Thr Met Pro Leu Tyr Leu
1               5
<210>  4
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  4
Tyr Leu Glu Asp Asp Ile Arg Pro Asp Ile
1               5                   10
<210>  5
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  5
Tyr Val Trp Arg Asn Ile Ile Leu Met
1               5
<210>  6
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  6
Ile Leu Met Ser Leu Leu His Leu Gly Ala
1               5                   10
<210>  7
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  7
Leu Leu His Leu Gly Ala Leu Tyr Gly Ile
1               5                   10
<210>  8
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  8
Ala Leu Tyr Gly Ile Thr Leu Ile Pro Thr
1               5                   10
<210>  9
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  9
Thr Leu Ile Pro Thr Cys Lys Phe Tyr Thr
1               5                   10
<210>  10
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  10
Trp Leu Trp Gly Val Phe Tyr Tyr Phe Val
1               5                   10
<210>  11
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  11
Gly Val Phe Tyr Tyr Phe Val Ser Ala Leu
1               5                   10
<210>  12
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  12
Arg Leu Trp Ser His Arg Ser Tyr Lys Ala
1               5                   10
<210>  13
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  13
Arg Leu Pro Leu Arg Leu Phe Leu Ile
1               5
<210>  14
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  14
Arg Leu Phe Leu Ile Ile Ala Asn Thr
1               5
<210>  15
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  15
Phe Leu Ile Ile Ala Asn Thr Met Ala
1               5
<210>  16
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  16
Trp Leu Leu Val Arg Lys His Pro Ala Val
1               5                   10
<210>  17
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  17
Gly Leu Leu Met Met Cys Phe Ile Leu
1               5
<210>  18
<211>  11
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  18
Leu Leu Met Met Cys Phe Ile Leu Pro Thr Leu
1               5                   10
<210>  19
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  19
Phe Val Ala Thr Phe Leu Arg Tyr Ala Val
1               5                   10
<210>  20
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  20
Val Val Leu Asn Ala Thr Trp Leu Val
1               5
<210>  21
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  21
Trp Leu Val Asn Ser Ala Ala His Leu
1               5
<210>  22
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  22
His Ile Asn Phe Thr Thr Phe Phe Ile
1               5
<210>  23
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  23
Phe Ile Asp Cys Met Ala Ala Leu Gly Leu
1               5                   10
<210>  24
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  24
Lys Phe Tyr Thr Trp Leu Trp Gly Val Phe
1               5                   10
<210>  25
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  25
Thr Trp Leu Trp Gly Val Phe Tyr Tyr Phe
1               5                   10
<210>  26
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  26
Phe Tyr Tyr Phe Val Ser Ala Leu Gly Ile
1               5                   10
<210>  27
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  27
Ser Tyr Lys Ala Arg Leu Pro Leu Arg Leu
1               5                   10
<210>  28
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  28
Phe Phe Ser His Val Gly Trp Leu Leu
1               5
<210>  29
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  29
Leu Met Met Cys Phe Ile Leu Pro Thr Leu
1               5                   10
<210>  30
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  30
Pro Trp Tyr Phe Trp Gly Glu Thr Phe
1               5
<210>  31
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  31
Arg Tyr Ala Val Val Leu Asn Ala Thr Trp
1               5                   10
<210>  32
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  32
Gly Tyr Arg Pro Tyr Asp Lys Asn Ile
1               5
<210>  33
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  33
Gly Phe His Asn Tyr His His Ser Phe
1               5
<210>  34
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  34
Asn Tyr His His Ser Phe Pro Tyr Asp Tyr
1               5                   10
<210>  35
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  35
Asp Tyr Ser Ala Ser Glu Tyr Arg Trp
1               5
<210>  36
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  36
Arg Trp His Ile Asn Phe Thr Thr Phe
1               5
<210>  37
<211>  24
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  37
Val Glu Tyr Val Trp Arg Asn Ile Ile Leu Met Ser Leu Leu His Leu
1               5                   10                  15
Gly Ala Leu Tyr Gly Ile Thr Leu
20
<210>  38
<211>  18
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  38
Trp Gly Val Phe Tyr Tyr Phe Val Ser Ala Leu Gly Ile Thr Ala Gly
1               5                   10                  15
Ala His
<210>  39
<211>  20
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  39
Thr Ala Gly Ala His Arg Leu Trp Ser His Arg Ser Tyr Lys Ala Arg
1               5                   10                  15
Leu Pro Leu Arg
20
<210>  40
<211>  15
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  40
His Arg Ser Tyr Lys Ala Arg Leu Pro Leu Arg Leu Phe Leu Ile
1               5                   10                  15
<210>  41
<211>  16
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  41
Pro Leu Arg Leu Phe Leu Ile Ile Ala Asn Thr Met Ala Phe Gln Asn
1               5                   10                  15
<210>  42
<211>  15
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  42
His Val Gly Trp Leu Leu Val Arg Lys His Pro Ala Val Lys Glu
1               5                   10                  15
<210>  43
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  43
Ala Glu Lys Leu Val Met Phe Gln Arg Arg Tyr Tyr Lys Pro Gly Leu
1               5                   10                  15
Leu
<210>  44
<211>  16
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  44
Asn Ala Thr Trp Leu Val Asn Ser Ala Ala His Leu Phe Gly Tyr Arg
1               5                   10                  15
<210>  45
<211>  12
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  45
Ala Ser Glu Tyr Arg Trp His Ile Asn Phe Thr Thr
1               5                   10
<210>  46
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственный
<220>
<223>  Контрольный пептид A2
<400>  46
Ser Leu Tyr Asn Thr Tyr Ala Thr Leu
1               5
<210>  47
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственный
<220>
<223>  контрольный пептид A24
<400>  47
Arg Tyr Leu Arg Asp Gln Gln Leu Leu
1               5
<210>  48
<211>  18
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственный
<220>
<223> Вспомогательный контрольный пептид
<400>  48
Tyr Val Asp Arg Phe Phe Lys Thr Leu Arg Ala Glu Gln Ala Thr Gln
1               5                   10                  15
Asp Val
<210>  49
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственный
<220>
<223>  смысловой праймер
<400>  49
gatgatgtgc ttcatcctgc                                                 20
<210>  50
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственный
<220>
<223>  антисмысловой праймер
<400>  50
tgtggtgaag ttgatgtgcc                                                 20
<210>  51
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственный
<220>
<223>  Праймер для GAPDH
<400>  51
gggctgcttt taactctg                                                   18
<210>  52
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственный
<220>
<223>  Праймер для GAPDH
<400>  52
ccaggaaatg agcttgac                                                   18
<---