ШТАММ АЗОТФИКСИРУЮЩИХ БАКТЕРИЙ PSEUDOMONAS SP.  ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БИОПРЕПАРАТА ПРОТИВ ЗАБОЛЕВАНИЙ ПШЕНИЦЫ, ВЫЗЫВАЕМЫХ ФИТОПАТОГЕННЫМИ ГРИБАМИ, И ПОВЫШЕНИЯ УРОЖАЙНОСТИ
STRAIN OF NITROGEN-FIXING BACTERIA PSEUDOMONAS SP FOR OBTAINING BIOLOGICAL PRODUCT AGAINST DISEASES OF WHEAT CAUSED BY PHYTOPATHOGENIC FUNGI, AND INCREASE IN PRODUCTIVITY

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и касается штамма, который оказывает антагонистическое действие на возбудителей заболеваний пшеницы твердой головней и корневыми гнилями, обладающего нитрогеназной (способностью к фиксации атмосферного азота) и ростстимулирующей активностью. Новый штамм может быть реализован в микробиологической промышленности для получения биопрепарата для защиты сельскохозяйственных растений от болезней и повышения урожайности.
Известен штамм Pseudomonas sp. ЦМПМ В-348, используемый для получения препарата при защите злаковых от возбудителя обыкновенной корневой гнили Helminthosporium sativum [1]. Однако этот штамм неэффективен для подавления корневой гнили злаков, вызываемой комплексом грибов Fusarium spp. и Helminthosporium sativum.
Известны штаммы Pseudomonas putida, подавляющие рост фитопатогенного гриба Fusarium oxysporum [2] и Pseudomonas putida BKM B-1743 Д, подавляющий рост грибов рода Fusarium [3]. Недостатками известных штаммов является узкий спектр антагонистического действия.
Наиболее близкими к заявляемому является штаммы Pseudomonas aureofaciens ИБ 51 и Pseudomonas putida ИБ 17 [4, 5], обладающие способностью оказывать антагонистическое действие на возбудителей заболеваний пшеницы твердой головней и корневыми гнилями. Недостатком штаммов является их сравнительно невысокая антагонистическая активность и неспособность к фиксации атмосферного азота и синтезу ростстимулирующих веществ, т.е. отсутствие комплексности воздействия на фитопатогены и растения.
Технической задачей изобретения является выделение нового природного штамма с широким спектром антагонистического действия на возбудителей грибных заболеваний пшеницы, в том числе и твердой головни, обладающего нитрогеназной и ростстимулирующей активностью.
Поставленная задача достигается выявлением и использованием штамма Pseudomonas sp. ИБ-4, выделенного из образца пахотной почвы Республики Башкортостан. Штамм депонирован во Всероссийскую коллекцию микроорганизмов с регистрационным номером ВКМ В - 2830D.
1. Культурально-морфологические признаки.
2
4
4
4
2
4
3
3
1.1. На агаризованной питательной среде, имеющей состав, г/л: KHPO - 0,3; CaHPO - 0,2; MgSO - 0,3; KSO - 0,2; NaCl - 0,5; FeCl - 0,01; CaCO - 5,0; сахароза - 20 г; агар - 1,5%; смесь микроэлементов - 1 мл; дистиллированная вода до 1000 мл, рН 6,8-7,2 культура образует круглые колонии диаметром 3-4 мм, с гладкой блестящей поверхностью, выпуклые, прозрачные, с гладкими краями, мягкой тягучей консистенции. На 24 часу роста клетки - мелкие палочки 0,5×1,5 мкм, подвижные.
2
4
4
4
2
4
3
3
1.2. На жидкой питательной среде Федорова с мелассой, имеющей состав, г/л: KHPO - 0,3; CaHPO - 0,2; MgSO - 0,3; KSO - 0,2; NaCl - 0,5; FeCl - 0,01; СаСО - 5,0; меласса - 40 г; смесь микроэлементов - 1 мл; рН 6,8-7,0, выращивание при температуре 28°C и режиме аэрации-перемешивания 180 об/мин в течение 48 часов. Круглые колонии диаметром 0,5 см, выпуклые с ровными краями, слизистой консистенции.
1.3. На питательной среде КГА колонии круглые диаметром 6 мм, выпуклые, белого полупрозрачного цвета, консистенция тягучая мягкая. Пигмента не образуют. На 24 часу роста - мелкие подвижные палочки.
2. Физиолого-биохимические признаки.
Штамм является аэробным микроорганизмом, оптимальная температура роста 28°C.
Отношение к источникам углерода: очень хорошо усваивает глюкозу, сахарозу; хорошо усваивает маннит, мальтозу, ксилозу, сорбит, рамнозу, лактозу, декстрин, галактозу, маннозу, глицерин, фруктозу, этанол; слабо усваивает арабинозу, мезоинозитол.
10
Отношение к источникам азота: растет на безазотистых средах, сохраняя высокую продуктивность не менее 8·10 кл/мл.
Штамм хранится на косяках со средой Федорова в холодильнике с пересевом на свежие косяки через 2-4 месяца, а также в лиофильновысушенном состоянии.
Штамм идентифицирован по определителю Bergey Manual of Determinative Bacteriology.
Пример 1. Для сравнения продуктивности нового штамма Pseudomonas sp. ИБ-4 с известными штаммами Pseudomonas aureofaciens ИБ 51 и Pseudomonas putida ИБ 17 проводили выращивание в колбах на качалке при температуре 28-30°C в течение 48 ч в условиях аэрации на жидкой питательной среде LB следующего состава, г/л: пептон - 10,0; дрожжевой экстракт - 5,0; натрий хлористый - 10,0; вода водопроводная до 1 л. Результаты приведены в табл. 1 и свидетельствуют о более высокой продуктивности предлагаемого штамма, чем у штаммов по прототипу. Высокое значение продуктивности предлагаемого штамма отмечено и при культивировании на других питательных средах (табл. 2).
Пример 2. Изучение антагонистической активности нового штамма Pseudomonas sp. ИБ-4.
На чашки Петри с агаризованной средой КГА (картофель тертый 200 г; глюкоза 20 г; агар 20 г; вода водопроводная 1 л) высевают сплошным газоном суспензию спор грибного фитопатогена. Затем в эти же чашки уколом сажают бактерии штамма Pseudomonas sp. ИБ-4. Чашки инкубируют при 28°C в течение 3 суток. Учет проводят по зонам отсутствия или подавления роста гриба вокруг колонии штамма. Результаты приведены в табл. 3 и свидетельствуют о широком спектре и высокой величине антагонистического действия нового штамма.
4
9
Пример 3. Антагонистическое действие нового штамма против комплекса возбудителей корневых гнилей пшеницы испытывают в лабораторных условиях на пшенице сорта "Жница" с естественным уровнем заражения посевного материала, полученного в условиях опытного поля Института биологии УНЦ РАН. Посевной материал дополнительно инфицируют спорами фитопатогенных грибов Fusarium oxysporum и Bipolaris sorokiniana (титр споровой суспензии обоих патогенов составил 5·10КОЕ/мл). Семена пшеницы обрабатывают суспензией штамма (с титром 10КОЕ/мл) из расчета 1 мл суспензии на 1 кг семян. Семена переносят на увлажненную до полной влагоемкости полоску фильтровальной бумаги, поверх которой накладывают полоску полиэтилена, сворачивают в рулон, помещают вертикально в лабораторный стакан и оставляют при комнатной температуре. В контрольных опытах обработку семян осуществляют водопроводной водой. Эксперимент выполняют в четырехкратной повторности. Обработку результатов проводят через 7 дней. Эффективность штамма определяют при сопоставлении степени проявления корневых гнилей проростков пшеницы в опыте и контроле. Результаты приведены в табл.4.
9
Пример 4. Антагонистическое действие штамма против возбудителя твердой головни пшеницы испытывали на пшенице сорта "Жница", искусственно зараженной Tilletia caries, в условиях закрытого грунта в теплице. Заспорение спорами твердой головни осуществляли из расчета 1-2 г спор на 1 кг зерна. Семена пшеницы обрабатывали суспензией штамма (с титром 10 КОЕ/мл) из расчета 1 мл суспензии на 50 г семян и высаживали в вегетационные сосуды по 60 штук с учетом всхожести данного сорта пшеницы. В контрольных экспериментах обработку семян осуществляли водопроводной водой. Эксперименты выполняли в трехкратной повторности.
Эффективность штамма определяли при сопоставлении степени проявления заболевания растений твердой головней в опыте и контроле в период молочно-восковой спелости зерна. Результаты приведены в табл.5.
Как свидетельствуют результаты эксперимента, биологическая эффективность подавления твердой головни на пшенице у штамма Pseudomonas sp. ИБ-4 составляет 60,0%, при 52,7% у выбранного аналога.
Пример 5. Определение ростстимулирующей активности заявляемого штамма.
Некоторые микроорганизмы, обитающие в ризосфере растений, способны синтезировать цитокинины. Цитокинины представляют собой природные соединения, участвующие в гормональной регуляции онтогенеза растений, характеризующиеся способностью индуцировать деление растительных клеток и являющиеся наиболее активными среди открытых рострегулирующих веществ. Наличие цитокининов в культуральной жидкости обуславливает наличие ростстимулирующей активности микроорганизма. Образование заявляемым штаммом цитокининов с концентрацией 300 нг/мл культуральной жидкости обнаружено методом непрямого конкурентного иммуноферментного анализа [6].
Пример 6. Штамм Pseudomonas sp. ИБ-4 обладает нитрогеназной активностью (определяли ацетиленовым методом), сопоставимой по величине с активностями азотфиксирующих микроорганизмов рода Azotobacter (табл. 6), предлагаемых для использования под различные сельскохозяйственные культуры [7-10].
Таким образом, выделен новый штамм Pseudomonas sp. ИБ-4 с широким спектром и величиной антагонистического действия на возбудителей грибных заболеваний пшеницы, в том числе против возбудителя твердой головни Tilletia caries, обладающий высокой продуктивностью, нитрогеназной и ростстимулирующей активностью, что в целом позволяет увеличить урожай в 1,84 раза.
Таблица 1
Продуктивность штамма Pseudomonas sp. ИБ-4 на среде LB
Штамм
Время ферментации, ч
Число жизнеспособных клеток (КОЕ), млрд/мл
Pseudomonas sp. ИБ-4
48
10
ИБ 51 (по прототипу)
48
1
ИБ 17 (по прототипу)
48
1
Таблица 2
Титр микроорганизмов Pseudomonas sp. ИБ-4 при культивировании на различных питательных средах (КОЕ), млрд/мл
Питательная среда
Время ферментации, ч
24
36
48
КГА
0,1
2,2
21
Федорова
0,4
2,8
33
С-40
0,4
5,5
95
Таблица 3
Антагонистическое действие штаммов Pseudomonas sp. ИБ-4 и штаммов по прототипу на грибные фитопатогены
Вид фитопатогенных грибов
Диаметр зоны подавления роста гриба, мм
Штаммы
Pseudomonas sp. ИБ-4
ИБ 51
ИБ 17
Fusarium culmorum
29
9
14
Fusarium gibbosum
28
35
12
Fusarium graminesrum
28
7
26
Fusarium nivale
33
31
12
Fusarium semitectum
32
9
26
Fusarium solani
18
9
12
Bipolaris sorokiniana
49
55
22
Penicillium funiculosum
33
31
14
Fusarium oxysporum
32
29
-
Alternaria altemata
48
19
18
Таблица 4
Эффективность нового штамма Pseudomonas sp. ИБ-4 против корневых гнилей пшеницы
Варианты опытов
Развитие болезни проростков пшеницы, %
Altemaria + Penicillium
Bipolaris sorokiniana
Fusarium oxysporum
Контроль
28,0
6,3
2,2
ИБ 51 (Прототип)
16,0
4,3
0,0
ИБ 17 (Прототип)
16,0
4,8
0,7
Paenibacillus sp. ИБ-1
12,0
4,0
0,0
Таблица 5
Эффективность нового штамма Pseudomonas sp. ИБ-4 против твердой головни пшеницы
Варианты опытов
Пораженность твердой головней, %
Биологическая эффективность подавления болезни, %
Вес валового урожая по отношению к контролю, %
Контроль
55,0
-
100,00
ИБ 51 (Прототип)
26,0
52,7
173,5
Paenibacillus sp. ИБ-1
22,0
60,0
184,0
Таблица 6
Нитрогеназная активность предлагаемого штамма Pseudomonas sp. ИБ-4 и свободноживущих азотфиксаторов
Культура
Нитрогеназная активность, мкг N<sub>2</sub>/мл/час
Pseudomonas sp. ИБ-4
0,68
Azotobacter chroococcum В 35 [8]
0,26
Azotobacter chroococcum Ш 25 [9]
0,45
Azotobacter chroococcum Ц 40 [10]
0,11
Azotobacter chroococcum Б 1 [11]
0,22
Список литературы
1. Авторское свидетельство СССР 1464468, кл. A01N 63/00, 1988.
2. Патент США 4714614, кл. 424-93, 1987.
3. Патент RU 1805849, кл. A01N 63/00, 1993.
4. Патент RU №2203945, кл. C12N 1/20, 2003.
5. Патент RU №2213774, кл. C12N 1/20, 2003.
6. Кудоярова Г.Р., Веселов С.Ю., Каравайко Н.Н., Гюли-заде В.З., Чередова Е.П., Мустафина А.Р., Мошков И.Е., Кунаева О.Н. Иммуноферментная система для определения цитокининов // Физиология растений. - 1990. - Т.37, вып.1. - С.193-199.
7. Патент RU №2074159, кл. C05F 11/08, 1997.
8. Патент RU №2074158, кл. C05F 11/08, 1997.
9. Патент RU №2074157, кл. C05F 11/08, 1997.
10. Патент RU №2076088, кл. C05F 11/08, 1997.