УЛУЧШЕННАЯ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНАЯ КОНСТРУКЦИЯ ТИПА НАНОЧАСТИЦЫ, ОБЛАДАЮЩАЯ ВЫСОКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТЬЮ, И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ
IMPROVED NANOPARTICLE TYPE OLIGONUCLEOTIDE STRUCTURE HAVING HIGH EFFICIENCY AND METHOD FOR PREPARING SAME

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к олигонуклеотидной конструкции, которая обладает высокой эффективностью, то есть является эффективной для лечения рака, инфекционных заболеваний и т.п.
Олигонуклеотидная конструкция в соответствии с настоящим изобретением представляет собой конструкцию, в которой гидрофильный материал и гидрофобный материал конъюгированы с обоими концами олигонуклеотида посредством простой ковалентной связи или опосредованной линкером ковалентной связи так, что олигонуклеотид, включенный в данную олигонуклеотидную конструкцию, эффективно доставляется в клетки, при этом конструкция может быть преобразована в форму наночастиц путем гидрофобных взаимодействий олигонуклеотидных конструкций в водном растворе.
Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей олигонуклеотидную конструкцию, способу получения олигонуклеотидной конструкции и технологии доставки олигонуклеотида с использованием олигонуклеотидной конструкции.
Сведения о предшествующем уровне техники
В настоящее время активно разрабатываются различные типы терапевтических агентов на основе олигонуклеотидов, таких как антисмысловые олигонуклеотиды (ASO), РНК-интерференция (далее в настоящем документе называемая как «RNAi»), микроРНК (miRNA) и т.п.
Антисмысловой олигонуклеотид (ASО), имеющий форму одиночной цепи РНК или ДНК может контролировать передачу информации от гена в белок путем изменения промежуточного метаболизма мРНК тем самым достигая желаемого контроля экспрессии целевого белка. В качестве таких олигонуклеотидов отбирают нуклеотидные последовательности, которые являются достаточно комплементарными и специфически гибридизуются с мишенью. Антисмысловой олигонуклеотид (ASO) последовательность-специфически присоединяется к целевому гену, не оказывая при этом влияния на экспрессию других генов, отличных от целевого гена. Таким образом, технология ASО является инструментом, полезным для анализа функций конкретного белка in vivo, и может быть использована для генной терапии определенных заболеваний (FASEBJ.9, 1288-1296, 1995).
miRNA (микроРНК) является представителем большой группы малых РНК, которые естественным образом продуцируется у субъекта, и по меньшей мере некоторые из которых контролируют экспрессию целевого гена. микроРНК образуется из одноцепочечных шпилечных предшественников транскриптов длиной приблизительно 70 нуклеотидов под действием рибонуклеазы «дайсер» (Ambros et al. 2003. current biology 13 (10): 807-818), при этом дайсер разрезает предшественник с образованием двухцепочечных микроРНК длиной 21-23 нуклеотида. Во многих случаях микроРНК транскрибирована из последовательностей ДНК, функции которых до сих пор не установлены. микроРНК не транслируется в белок, а напротив, микроРНК объединяются с определенными мРНК, которые блокируют трансляцию. Полагают, что микроРНК неправильно образуют пары оснований со своей мишенью для ингибирования трансляции.
После выявления роли РНК-интерференции (RNAi) было обнаружено, что RNAi последовательность-специфически воздействует на мРНК в различных видах клеток млекопитающих (Silence of the transcripts: RNA interference in medicine. J Mol Med, 2005, 83: 764-773). При доставке в клетку длинной цепи двухцепочечной РНК, доставленная двухцепочечная РНК превращается в малую интерферирующую РНК (далее в настоящем документе называемую «миРНК»), которая процессируется до 21-23 пар оснований (bp) эндонуклеазой, называемой «Дайсер». миРНК является короткой двухцепочечной РНК, имеющей от 19 до 27 оснований, и связывается с РНК-индуцированным комплексом сайленсинга (RISC), где руководящая (антисмысловая) цепь узнает и расщепляет целевую мРНК для последовательность-специфического ингибирования экспрессии целевого гена (Nucleic-acid therapeutics: basic principles and recent applications. Nature Reviews Drug Discovery. 2002. 1, 503-514).
Доставленная извне длинной цепи двухцепочечной РНК, присуща проблема, связанная с чрезмерным вызыванием неспецифической к последовательности иммунной реакции посредством экспрессии интерферонов в клетке млекопитающего; однако было обнаружено, что указанная проблема может быть разрешена с помощью короткоцепочечной миРНК (Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 2001. 411, 494-498).
Однако миРНК также может стимулировать врожденный иммунный ответ, генерированный посредством рецепторов, присутствующих в клетках, и, соответственно, во избежание этой проблемы менялась конкретная структура миРНК или создавались 2-метокси-заместители или 2-фтор-заместители.
4
Химически синтезированная миРНК представляет собой двухцепочечную миРНК длиной примерно от 19 до 27 пар оснований (bp) и содержит два выступающих нуклеотида на 3'-конце, и известно, что для проявления активности двухцепочечная миРНК имеет структуру, состоящую из 3-гидроксильной группы (ОН) и 5'-фосфатной группы (РО) (Effect of asymmetric terminal structures of short RNA duplexes on the RNA interference activity and strand selection. Nucleic Acids Res 1 October 2008: 812-5821). Известно, что имеющаяся в продаже и синтезированная миРНК имеет структуру, в которой на обоих концах присутствуют гидроксильные группы, и при доставке синтезированной миРНК в клетку 5'-конец миРНК фосфорилируется под действием киназы для проявления функций миРНК (siRNA function in RNAi: A chemical modification analysis. RNA 2003. 9: 1034-1048).
Bertrand et al. обнаружили, что на одном и том же целевом гене миРНК обладает эффектом более значительного ингибирования экспрессии мРНК in vitro и in vivo, по сравнению с антисмысловым олигонуклеотидом (ASO), и соответствующий эффект сохраняется в течение длительного времени (Comparison of antisense oligonucleotides and siRNAs in cell culture and in vivo. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002. 296: 1000-1004).
Кроме того, поскольку миРНК комплементарно связана с целевой мРНК для последовательность-специфического регулирования экспрессии целевого гена, механизм действия миРНК имеет то преимущество, что оказываемое направленное воздействие может быть значительно сильнее по сравнению с существующей медицинской продукцией на основе антител или низкомолекулярным лекарственным средством. (Progress Towards in Vivo Use of siRNAs. MOLECULAR THERAPY. 2006 13 (4): 664-670).
Даже если терапевтический агент на основе олигонуклеотида (миРНК, и т.п.) имеет превосходный эффект и различный диапазон применения, для разработки миРНК в качестве терапевтического агента необходима эффективная доставка миРНК в клетку-мишень путем улучшения стабильности миРНК и эффективности доставки миРНК в клетку (Harnessing in vivo siRNA delivery for drug discovery and therapeutic development. Drug Discov Today. 2006 Jan; 11 (1-2): 67-73).
В частности, поскольку олигонуклеотиды, такие как миРНК и т.п., не проходят через гидрофобный фосфолипидный бислой клетки вследствие их отрицательных зарядов, трудно осуществить их доставку в клетку посредством простой диффузии.
Для увеличения эффективности доставки олигонуклеотидов in vivo или in vitro разработаны различные виды материалов для доставки в клетку. Как правило, широко используются липосомы, катионные поверхностно-активные вещества и т.п. Кроме того, известны способы использования носителя, такие как способ упаковки гена в липосому путем слияния, способ использования катионного липида или катионного полимера и т.п., способ изменения химической структуры, то есть изменения объединенной основной структуры олигонуклеотида на метилфосфонат, пептид-нуклеиновую кислоту (PNA) и т.п., и способ использования конъюгата (Chemically modified siRNA: tools and applications. Drug Discov Today. 2008 Oct; 13 (19-20): 842-855; Mechanisms and strategies for effective delivery of antisense and siRNA oligonucleotides. Nucleic Acids Res. 2008 Jul; 36 (12): 4158-71).
Среди указанных способ использования наноносителя, а именно, способ использования различных полимеров, таких как липосома, катионный полимерный композит и т.п., предназначен для захвата олигонуклеотидов в наноноситель путем формирования наночастиц для доставки захваченных олигонуклеотидов в клетки. Среди способов использования наноносителя, главным образом, применяют способ использования полимерной наночастицы, полимерной мицеллы, липоплекса или т.п., при этом липоплекс состоит из катионного липида для взаимодействия с анионным липидом эндосомы клетки, вызывая тем самым дестабилизирующий эндосому эффект для доставки миРНК в клетку (Mechanism of oligonucleotide release from cationic liposomes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996 Oct 15; 93 (21): 11493-8).
В частности, известно, что когда олигонуклеотид представляет собой миРНК, то химические материалы, и т.п. соединенные с концевыми участками (смысловой) цепи переносимой миРНК могут обеспечить улучшенные фармакокинетические характеристики, что таким образом может привести к высокой эффективности in vivo (Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs. Nature. 2004 Nov 11; 432 (7014): 173-8). В настоящем документе стабильность миРНК может варьировать в зависимости от свойств химических материалов, присоединенных к концам смысловой («переносимой») или антисмысловой («направляющей») цепи миРНК. Например, миРНК, с которой конъюгировано полимерное соединение, такое как полиэтиленгликоль (PEG), взаимодействует с анионной фосфатной группой миРНК в присутствии катионных материалов с образованием комплекса, таким образом образуя носитель, способный улучшить стабильность миРНК (Local and systemic delivery of VEGF siRNA using polyelectrolyte complex micelles for effective treatment of cancer. J Control Release. 2008 Jul 14; 129 (2): 107-16). В частности, мицелла, состоящая из полимерных комплексов, характеризуется чрезвычайно малым размером, высокооднородным распределением и спонтанным образованием, тем самым являясь легкой в отношении управления качеством состава и обеспечения воспроизводимости по сравнению с другими системами, используемыми в качестве носителей для доставки лекарственных средств, такими как микросферы, наночастицы и т.п.
Кроме того, для улучшения эффективности внутриклеточной доставки миРНК разработана технология использования конъюгата миРНК, в котором гидрофильный материал, представляющий собой биосовместимый полимер (например, полиэтиленгликоль (PEG)), конъюгирован с миРНК посредством простой ковалентной связи или опосредованной линкером ковалентной связи для обеспечения стабильности миРНК и эффективной проницаемости клеточной мембраны (смотри публикацию корейского патента №883471). Однако химическое модифицирование миРНК и конъюгирование с полиэтиленгликолем (PEG) (пегилирование) все еще имеют недостатки, связанные с низкой стабильностью в живом организме и неравномерной доставкой в ткани-мишени.
Для устранения указанных недостатков была разработана конструкция, содержащая двухцепочечную олиго-РНК («двухцепочечная конструкция олиго-РНК»), в которой гидрофильный материал и гидрофобный материал присоединены к олигонулеотидам, в частности, двухцепочечной олиго-РНК, такой как миРНК, при этом двухцепочечная конструкция олиго-РНК формирует самособирающуюся наночастицу, названную Self-Assembled-Micelle-inhibitory-RNA (SAMiRNA™), за счет гидрофобного взаимодействия гидрофобного материала (смотри публикацию корейского патента №1224828), при этом технология SAMiRNA™ обладает преимуществом, состоящим в возможности получения гомогенных наночастиц чрезвычайно малого размера по сравнению с существующими технологиями доставки.
Конкретным примером технологии SAMiRNA™ является использование PEG (полиэтиленгликоля) в качестве гидрофильного материала, при этом PEG представляет собой синтетический полимер, используемый для увеличения растворимости фармацевтических средств, в частности, белка, и для контроля фармакокинетики. PEG представляет собой полидисперсный материал, как все синтетические полимеры, при этом полимер в одной партии состоит из суммы различного числа мономеров, молекулярная масса показана на кривой Гаусса, и индекс полидисперсности (Mw/Mn) выражает степень гомогенности материала. То есть, когда PEG имеет низкую молекулярную массу (от 3 до 5 кДа), индекс полидисперсности составляет около 1,01, а когда PEG имеет высокую молекулярную массу (20 кДа), индекс полидисперсности является высоким и составляет около 1,2, то есть при более высокой молекулярной массе гомогенность материала является сравнительно низкой (F.М. Veronese. Peptide and protein PEGylation: a review of problems and solutions. Biomaterials (2001) 22: 405-417).
Таким образом, при присоединении PEG к фармацевтическим средствам показатель полидисперсности PEG отражается на конъюгате, таким образом, затруднительно выполнить верификацию одного материала. В последнее время для решения этой проблемы возрастающей тенденцией является получение материалов с низким индексом полидисперсности путем синтеза PEG и улучшения способов очистки, но при этом все еще имеются проблемы, связанные с характеристикой полидисперсности материала, в частности, при присоединении PEG к материалу с низкой молекулярной массой имеются трудности, связанные с подтверждением присоединения и т.д. (Francesco M. Veronese and Gianfranco Pasut. PEGylation, successful approach to drug delivery. DRUG DISCOVERY TODAY (2005) 10 (21): 1451-1458).
Кроме того, размер наночастиц значительно влияет на эффективность доставки в клетку-мишень, при этом, когда размер наночастиц составляет 50 нм или меньше, наночастицы быстро удаляются из организма посредством экскреции, и когда размер наночастиц составляет 100 нм или более, наночастицы неравномерно доставляются в ткань, и эффект является сниженным. Таким образом, требуется формирование наночастиц, каждая из которых имеет предварительно установленный размер (Wim Н De Jong and Paul JA Borm. Int J Nanomedicine. 2008 June; 3 (2): 133-149.).
Таким образом, в настоящее время на рынке имеется острая потребность в новой концепции для разработки технологии доставки олигонуклеотидов, которая решает проблемы, связанные с характеристикой полидисперстности гидрофильных материалов, таких как PEG, и т.п., и при этом сохраняет превосходные эффекты SAMiRNA™, какие они есть, в соответствии с предшествующим уровнем техники.
Описание изобретения
Целью настоящего изобретения является обеспечение новой концепции для создания наночастиц, имеющих малый размер и улучшенную полидисперсность, и олигонуклеотидной конструкции, формирующей наночастицы.
Дополнительной целью настоящего изобретения является обеспечение способа получения олигонуклеотидной структуры и наночастиц, образованных олигонуклеотидной структурой, фармацевтической композиции, включающей олигонуклеотидную конструкцию, а также технологии для контроля экспрессии генов с ее использованием.
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что в случае использования технологии SAMiRNA™, представляющей собой существующие в настоящее время самособирающиеся наночастицы, когда гидрофильный материал олигонуклеотидной конструкции, образующий SAMiRNA™, представлена в виде блоков, базовая единица которых включает однородные мономеры (число мономеров равно m) с предварительно определенной молекулярной массой, и по необходимости линкер, и по необходимости используется соответствующее число таких блоков гидрофильных материалов, образованные нуклеотидной структурой наночастицы имеют чрезвычайно малый размер и значительно улучшенную полидисперсность по сравнению с существующими SAMiRNA™, обеспечивая осуществление настоящего изобретения.
Краткое описание чертежей
На фигуре 1 представлена схематическая диаграмма наночастицы, образованной олигонуклеотидными конструкциями, к которым присоединены гидрофильные материалы, все имеющие одинаковую молекулярную массу, в соответствии с настоящим изобретением.
На фигуре 2 представлен полный путь синтеза 3,4,6-триацетил-1-гекса(этиленгликоль)-N-ацетил-галактозамин-СРG (стекло с контролируемым размером пор).
На фигуре 3 представлен полный путь синтеза 2,3,4,6-триацетил-1-гекса(этиленгликоль)-N-манноза-СРG (стекло с контролируемым размером пор).
На фигуре 4 представлен полный путь синтеза 2,3,4,6-триацетил-1-гекса(этиленгликоль)-N-глюкоза-СРG (стекло с контролируемым размером пор).
На фигуре 5 представлены результаты ЯМР-анализа 1,3,4,6-тетраацетил-N-ацетил-галактозамина (соединение 1 фигуры 2).
1Н ЯМР (300 МГц, DMSO-d6); 7,91~7,86 (d, 1H), 5,66~5,61 (d, 1H), 5,28~5,25 (d, 1H), 5,10~5,03 (d, 1H), 4,25~4,19 (t, 1H), 4,15~3,94 (m, 3H), 2,12~2,10 (s, 3H), 2,04~2,02 (s, 3H), 2,00~1,98 (s, 3H), 1,91~1,89 (s, 3H), 1,78~1,76 (s, 3H)
На фигуре 6 представлены результаты ЯМР-анализа 3,4,6-триацетил-1-гекса(этиленгликоль)-N-ацетил-галактозамина (соединение 2 фигуры 2).
1Н ЯМР (300 МГц, CDCl3); 6,66~6,61 (d, 1Н), 5,33~5,29 (d, 1Н), 5,02~4,96 (d, 1Н), 4,80~4,75 (d, 1Н), 4,25~4,07 (m, 2Н), 3,93~3,79 (m, 2Н), 3,73~3,54 (m, 24Н), 2,16~2,14 (s, 3Н), 2,05~2,03 (s, 3Н), 1,99~1,97 (s, 6Н)
На фигуре 7 представлены результаты ЯМР-анализа 3,4,6-триацетил-1-[гекса(этиленгликоль)-N'-1',2'-пропандиол]-N-ацетил-галактозамина (соединение 3 фигуры 2).
1Н ЯМР (300 МГц, CDCl3); 1H ЯМР (300 МГц, CDCl3); 6,83~6,78 (d, 1Н), 6,10~6,08 (s, 1H), 5,33~5,29 (d, 1H), 5,00~4,94 (d, 1H), 4,82~4,77 (d, 1H), 4,22~4,08 (m, 4H), 3,94~3,85 (m, 2H), 3,83~3,74 (m, 1H), 3,66~3,52 (m, 24H), 3,40~3,24 (m, 2H), 2,18~2,16 (s, 6H), 2,05~2,03 (s, 3H), 2,00~1,98 (s, 3H)
На фигуре 8 представлены результаты ЯМР-анализа 3,4,6-триацетил-1-[гекса(этиленгликоль)-N'-1'-метокси(диметокситритил)-2'-пропанол]-N-ацетил-галактозамина (соединение 4 фигуры 2).
1Н ЯМР (300 МГц, DMSO-d6); 7,80~7,75 (d, 1Н), 7,40~7,20 (m, 9H), 7,00~6,98 (s, 1H), 6,90~6,85 (d, 4H), 5,22~5,20 (s, 1H), 5,00~4,87 (m, 2H), 4,58~4,55 (d, 1H), 4,04~4,02 (s, 4H), 3,94~3,82 (m, 1H), 3,74~3,72 (s, 6H), 3,51~3,49 (s, 24H), 3,18~3,12 (m, 1H), 2,94~2,85 (m, 2H), 2,11~2,09 (s, 3H), 2,00~1,98 (s, 3H), 1,90~1,88 (s, 3H), 1,78~1,76 (s, 3H)
На фигуре 9 представлены результаты ЯМР-анализа 3,4,6-триацетил-1-[гекса(этиленгликоль)-N'-1'-метокси(диметокситритил)-2'-пропокси(янтарная кислота)]-N-ацетил-галактозамина (соединение 5 фигуры 2).
1Н ЯМР (300 МГц, CDCl3); 7,43~7.38 (d, 2Н), 7,31~7,19 (m, 7Н), 6,84~6,79 (d, 4Н), 6,75~6,67 (t, 1Н), 5,52~4,89 (m, 1Н), 5,32~5,30 (s, 1Н), 5,21~5,19 (s, 1Н), 5,01~4,95 (d, 1Н), 4,81~4,76 (d, 1H), 4,30~4,08 (m, 3Н), 3,93-3,86 (m, 2Н), 3,79~3,77 (s, 6Н), 3,66~3,52 (m, 24Н), 3,36~3,32 (m, 1Н), 3,21~3,17 (d, 2Н), 2,75~2,56 (m, 4Н), 2,18~2,16 (s, 3Н), 2,04~2,01 (m, 6Н), 1,98~1,96 (s, 3Н)
На фигуре 10 представлена олигонуклеотидная конструкция, к которой присоединен лиганд, и в качестве примера моно-NAG-(Гексаэтиленгликоль)n-Олиго-Липид и структура введенного в нее липида.
(A) Олигонуклеотидная конструкция, к которой присоединен лиганд.
(B) Структура моно-NAG-(Гексаэтиленгликоль)n-Олиго-Липид.
1
На фигуре 11 представлены результаты масс-спектроскопии (MALDI-TOF MS) моно-NAG-(Гексаэтиленгликоль)-Олиго-Липид.
1
Молекулярная масса (моно-NAG-(Гексаэтиленгликоль)-Олиго-Липид (MW=7807,4)).
2
На фигуре 12 представлены результаты масс-спектроскопии (MALDI-TOF MS) моно-NAG-(Гексаэтиленгликоль)-Олиго-Липид.
2
Молекулярная масса (моно-NAG-(Гексаэтиленгликоль)-Олиго-Липид (MW=8152,7)).
3
На фигуре 13 представлены результаты масс-спектроскопии (MALDI-TOF MS) моно-NAG-(Гексаэтиленгликоль)-Олиго-Липид.
3
Молекулярная масса (моно-NAG-(Гексаэтиленгликоль)-Олиго-Липид (MW=8498,0)).
4
На фигуре 14 представлены результаты масс-спектроскопии (MALDI-TOF MS) моно-NAG-(Гексаэтиленгликоль)-Олиго-Липид.
4
Молекулярная масса (моно-NAG-(Гексаэтиленгликоль)-Олиго-Липид (MW=8843,3)).
На фигуре 15 представлен график, полученный путем измерения критической концентрации мицелл наночастиц (SAMiRNA) двухцепочечных структур олиго-РНК, к которым присоединены гидрофобные материалы, имеющие одинаковую молекулярную массу, в соответствии с настоящим изобретением.
На фигуре 16 представлен график, полученный путем измерения размера и индекса полидисперсности наночастиц (SAMiRNA) двухцепочечных структур олиго-РНК, к которым присоединены гидрофильные материалы, имеющие одинаковую молекулярную массу, в соответствии с настоящим изобретением.
(n означает число повторов мономера гидрофильного материала, и наночастицы двухцепочечной конструкции олиго-РНК, образованные соответствующей структурой.)
На фигуре 17 показана степень ингибирования экспрессии целевого гена в клеточных линиях, обработанных наночастицами (SAMiRNA) двухцепочечных структур олиго-РНК, к которым присоединены гидрофильные материалы, имеющие одинаковую молекулярную массу, в соответствии с настоящим изобретением.
(n означает число повторов мономера гидрофильного материала, и наночастицы двухцепочечной конструкции олиго-РНК, образованные соответствующей структурой.)
Наилучший способ осуществления изобретения
Олигонуклотид согласно настоящему изобретению представляет собой материал, состоящий из ДНК (деоксирибонуклеотида) или РНК (рибонуклеотида), и является антисмысловым одноцепочечным или двухцепочечным олигонуклеотидом, образованным за счет комплементарного связывания, малой интерферирующей РНК (миРНК), короткой шпилечной РНК (кшРНК), микроРНК, ингибитором микроРНК, аптамером и т.п., но настоящее изобретение ими не ограничивается.
В частности, когда олигонуклеотид в настоящем изобретении представляет собой двухцепочечный олигонуклеотид, его антисмысловая цепь это та цепь, которая комплементарно присоединяется к целевой мРНК в РНК-индуцированном комплексе сайленсинга (RISC) для разложения целевой мРНК, обладая тем самым активностью РНК-интерференции, а его смысловая цепь это цепь, имеющая комплементарную антисмысловой цепи последовательность. «Комплементарная» или «комплементарное связывание» в настоящем изобретении означает, что две последовательности связаны друг с другом с формированием двухцепочечной конструкции, при этом связывание не обязательно является связыванием с идеальным соответствием, и может также включать области несоответствия, в тех случаях, когда некоторые последовательности различаются.
Кроме того, в настоящем изобретении миметик микроРНК представляет собой двухцепочечную РНК, которая имеет последовательность и структуру существующей в природе микроРНК, то есть означает микроРНК в химически синтезированной форме. Ингибитор микроРНК означает химически синтезированный одноцепочечный олигонуклеотид, который комплементарно присоединен к существующей в природе микроРНК для ингибирования действия соответствующей микроРНК.
В иллюстративном варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает новую форму олигонуклеотидной конструкции, которая представлена следующей структурной формулой (1) или структурной формулой (2).
В структурных формулах (1) и (2) А представляет собой мономер гидрофильного материала, В представляет собой гидрофобный материал, J представляет собой линкер, который соединяет мономеры гидрофильного материала (сумма равна m) друг с другом, или линкер, который соединяет мономеры гидрофильного материала (сумма равна m) с олигонуклеотидами, X и Y, каждый, независимо представляют собой простую ковалентную связь или опосредованную линкером ковалентную связь, R представляет собой одноцепочечный или двухцепочечный олигонуклеотид, m представляет собой целое число от 1 до 15, и n представляет собой целое число от 1 до 10,
i
j
1
2
Q представляет собой (L-Z) или P-J-J,
L представляет собой лиганд, специфически связанный с рецептором, который способствует интернализации в клетку-мишень посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза (RME), и Z представляет собой линкер, который опосредует простую ковалентную связь или связь между мономером гидрофильного материала в блоке гидрофильного материала и лигандом,
i представляет целое число от 0 до 5, предпочтительно целое число от 0 до 3, и j означает 0 или 1, при условии, что когда i равно 0, j обязательно равно 0,
Р означает аминогруппу или полигистидиновую группу, и
1
2
J и J независимо представляют собой линкеры, которые опосредуют простую ковалентную связь или связь между аминогруппой или полигистидиновой группой и гидрофильным материалом.
m
m
В настоящем изобретении «блок гидрофильного материала» означает повторяющуюся единицу, представленную (A-J) или (J-A) в структурных формулах (1) и (2).
2
В структурных формулах (1) и (2) мономер гидрофильного материала А может быть любым из числа мономеров неионного гидрофильного полимера при условии, что он отвечает целям настоящего изобретения. Мономер гидрофильного материала А предпочтительно представляет собой мономер, выбранный из следующих соединений с (1) по (3), представленных в таблице 1, более предпочтительно мономер соединения (1), и G в соединении (1) может быть предпочтительно выбран из CH, О, S и NH.
В частности, из мономеров гидрофильного материала особенно подходящий для получения конструкции в соответствии с настоящим изобретением мономер соединения (1) может содержать различные введенные функциональные группы и обладать хорошей аффинностью in vivo, а также индуцировать лишь незначительный иммунный ответ, обладая, таким образом, превосходной биосовместимостью, и, кроме того, может увеличивать стабильность in vivo олигонуклеотида, включенного в конструкции в соответствии со структурными формулами (1) и (2), и эффективность доставки.
Гидрофильный материал в структурных формулах (1) и (2) предпочтительно имеет общую молекулярную массу от 1000 до 2000. Таким образом, например, когда гексаэтиленгликоль, представленный соединением (1), то есть материал, в котором G представляет собой О и m равно 6, используется в структурных формулах (1) и (2), молекулярная масса спейсера гексаэтиленгликоля составляет 344, при этом число повторов (n) предпочтительно равно от 3 до 5.
'm
m
В частности, в настоящем изобретении повторяющаяся единица гидрофильной группы, представленная (A-J) или (J-A') в структурных формулах (1) и (2), то есть блок гидрофильного материала, может быть использована по необходимости в подходящем количестве, представленном n. А, который представляет собой мономер гидрофильного материала, и J, который представляет собой линкер, включенный в каждый блок гидрофильного материала, могут быть независимо одинаковыми или отличаться друг от друга в каждом блоке гидрофильного материала. То есть, при использовании 3 блоков гидрофильного материала (n=3), мономер гидрофильного материала соединения (1) используется в первом блоке, мономер гидрофильного материала соединения (2) используется во втором блоке, мономер гидрофильного материала соединения (3) используется в третьем блоке, и т.д. То есть можно использовать различные мономеры гидрофильного материала для всех блоков гидрофильного материала, и любой мономер гидрофильного материала, выбранный из мономеров гидрофильного материала соединений с (1) по (3), можно также в равной степени использовать во всех блоках гидрофильного материала. Аналогичным образом, линкеры, которые опосредуют связывание мономера гидрофильного материала, могут быть также одинаковыми или отличаться друг от друга для всех блоков гидрофильного материала. Кроме того, m, представляющее собой число мономеров гидрофильного материала, может быть одинаковым или различаться для всех блоков гидрофильного материала. То есть 3 мономера гидрофильного материала (m=3) соединены в первом блоке гидрофильного материала, 5 мономеров гидрофильного материала (m=5) соединены во втором блоке гидрофильного материала, 4 мономера гидрофильного материала (m=4) соединены в третьем блоке гидрофильного материала, и т.д. То есть мономеры гидрофильного материала, имеющие различные количества, или имеющие одинаковое количество, могут быть использованы во всех блоках гидрофильного материала.
3
3
2
-
Кроме того, в настоящем изобретении линкер (J) предпочтительно выбран из группы, состоящей из РО, SO и СО, но настоящее изобретение ими не ограничивается. Специалисту в данной области будет очевидно, что может быть использован любой линкер в зависимости от используемого мономера гидрофильного материала, и т.п., при условии, что он отвечает целям настоящего изобретения.
Некоторые или все мономеры гидрофильного материала могут быть модифицированы таким образом, чтобы содержать функциональные группы, требующиеся для связывания по необходимости с другими материалам, такими как специфический к мишени лиганд и т.п.
Блок гидрофильного материала может быть присоединен к любому положению 3'-конца или 5'-конца одноцепочечного олигонуклеотида, и может быть присоединен к любому положению 3'-конца или 5'-конца смысловой цепи или антисмысловой цепи двухцепочечного олигонуклеотида.
12
50
Гидрофобный материал (В) в структурных формулах (1) и (2) служит для формирования наночастиц, образованных олигонуклеотидными конструкциями, имеющими формулы (1) и (2), посредством гидрофобного взаимодействия. Гидрофобный материал предпочтительно имеет молекулярную массу от 250 до 1000 и может включать производное стероида, производное глицерида, эфир глицерина, полипропиленгликоль, ненасыщенный или насыщенный С-С углеводород, диацилфосфатидилхолин, жирную кислоту, фосфолипид, липополиамин и т.п., но настоящее изобретение ими не ограничивается. Специалисту в данной области будет очевидно, что может быть использован любой гидрофобный материал при условии, что он отвечает целям настоящего изобретения.
12
50
Производное стероида может быть выбрано из группы, состоящей из холестерина, холестанола, холевой кислоты, формиата холестерила, формиата холестанила и амина холестерила, и производное глицерида может быть выбрано из моно-, ди- и триглицерида и т.п., при этом жирная кислота глицерида предпочтительно представляет собой ненасыщенную или насыщенную жирную кислоту от С до С.
24
В частности, из числа гидрофобных материалов предпочтительным является насыщенный или ненасыщенный углеводород или холестерин благодаря его способности легко присоединяться на стадии синтеза олигонуклеотидной конструкции в соответствии с настоящим изобретением, и наиболее предпочтительным является С углеводород, в частности, тетрадокозан, содержащий дисульфидную связь.
Гидрофобный материал присоединен к противоположному (дистальному) концу олигонуклеотида, присоединенного к блоку гидрофильного материала, и может быть присоединен к любому положению смысловой цепи или антисмысловой цепи двухцепочечного олигонуклеотида.
Олигонуклеотид (R) в настоящем изобретении может включать, без ограничения, двухцепочечную или одноцепочечную миРНК, или короткую шпилечную РНК (кшРНК), миметик антисмысловой микроРНК, ингибитор микроРНК, антисмысловые олигонуклеотиды (ASO) и т.п., и в частности, наиболее предпочтительной является двухцепочечная миРНК.
При использовании двухцепочечных олигонуклеотидов, таких как двухцепочечная миРНК, микроРНК и т.п., смысловая цепь и/или антисмысловая цепь двухцепочечного олигонуклеотида состоит из 15-40, предпочтительно 19-31 нуклеотидов, и в частности, предпочтительно присоединение, по меньшей мере, одной фосфатной группы, предпочтительно от одной до трех фосфатных групп к 5'-концу антисмысловой цепи.
3
3
2
Кроме того, олигонуклеотид содержит различные модификации для обеспечения устойчивости к действию нуклеазы и уменьшения стимуляции неспецифического иммунного ответа для улучшения стабильности in vivo, при этом модификация может представлять собой одну или более модификаций, выбранных из модификации, в которой группа -ОН при 2'-атоме углерода в структуре сахара в одном или нескольких нуклеотидах заменена на -СН(метил), -ОСН (метокси), -NH, -F(фтор), -O-2-метоксиэтил, -О-пропил, -O-2-метилтиоэтил, -О-3-аминопропил, -О-3-диметиламинопропил, -O-N-метилацетамидо или -О-диметиламидооксиэтил; модификации, в которой кислород в структуре сахара в нуклеотидах заменен на серу; и модификации нуклеотидными связями, то есть фосфоротиоатными или боранофосфатными, метил-фосфонатными связями, или может представлять собой модификацию пептидо-нуклеиновой кислотой (PNA), модификацию замкнутой нуклеиновой кислотой (LNA) или модификацию незамкнутой нуклеиновой кислотой (UNA) (Crooke et al., Ann. Rev. Med. Vol. 55: pp 61-65 2004, US 5,660,985, US 5,958,691, US 6,531,584, US 5,808,023, US 6,326,358, US 6,175,001 Braasch D.A. et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 14: 1139-1143, 2003; Chiu Y.L. et al., RNA, 9: 1034-1048, 2003; Amarzguioui M. et al., Nucleic Acid Res. 31: 589-595, 2003, Nucleic Acids Research, 2010, Vol. 38, No. 17 5761-5773, Nucleic Acids Research, 2011, Vol. 39, No. 5 1823-1832).
Между тем, ткань опухоли является плотной, имея ограничения диффузии по сравнению с нормальной тканью, при этом указанное ограничение диффузии влияет на продвижение продуктов, таких как питательные вещества, кислород и диоксид углерода, необходимых для роста опухоли, поэтому ограничение диффузии преодолевается путем формирования кровеносных сосудов вокруг опухоли посредством ангиогенеза. Кровеносные сосуды в опухолевой ткани, образованные путем ангиогенеза, имеют тонкую и дефектную структуру с просветом от 100 нм до 2 мкм в зависимости от типов опухолей. Таким образом, наночастицы легко проникают через эндотелий капилляров злокачественной ткани, имеющей тонкую и дефектную структуру кровеносных сосудов по сравнению с организованными капиллярами нормальной ткани, легко достигая интерстиции опухоли в процессе циркуляции крови. Кроме того, сосуды лимфатических узлов (лимфатический дренаж) не присутствуют в опухолевой ткани, поэтому лекарственные средства накапливаются, что указывает на эффект усиленного проникновения и удерживания (EPR). Это явление, в котором наночастицы доставляются специфическим к опухолевой ткани образом за счет этого эффекта, относится к пассивному направленному воздействию (пассивное нацеливание) (Nanoparticles for drug delivery in cancer treatment. Urol. Oncol. 2008 Jan-Feb; 26 (1): 57-64).
Активное нацеливание относится к тому случаю, когда нацеливающий фрагмент присоединен к наночастице, и сообщалось, что активное нацеливание способствует преимущественному накоплению наночастиц в ткани-мишени или улучшает интернализацию, когда наночастицы доставляются в клетку-мишень (Does a targeting ligand influence nanoparticle tumor localization or uptake Trends Biotechnol. 2008 Oct; 26 (10): 552-8. Epub 2008 Aug 21). Для активного нацеливания используют материалы (нацеливающий фрагмент), обладающие способностью связываться к углеводами, рецепторами, антигенами, которые являются специфическими для поверхности клетки-мишени или сверхэкспрессируются (Nanotechnology in cancer therapeutics: bioconjugated nanoparticles for drug delivery. Mol Cancer Ther 2006; 5 (8): 1909-1917).
Таким образом, когда в олигонуклеотидной конструкции, которая образует наночастицу, в соответствии с настоящим изобретением обеспечен нацеливающий фрагмент, то это эффективно стимулирует ее доставку в клетку-мишень, при этом доставка в клетку-мишень происходит даже при относительно низкой дозе, что обеспечивает сильный контроль экспрессии целевого гена и предотвращает неспецифическую доставку олигонуклеотида в другие органы и клетки.
i
j
Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает конструкции, представленные структурными формулами (3) и (4), в которых Q представляет собой (L-Z) в конструкциях в соответствии со структурными формулами (1) и (2), и в которые дополнительно включен лиганд (L), в частности, лиганд (L), специфически связанный с рецептором, который способствует интернализации в клетку-мишень посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза (RME).
Лиганд в структурных формулах (3) и (4) может быть предпочтительно выбран из группы, состоящей из специфического к целевому рецептору антитела или аптамера, пептида, который обладает свойствами RME для содействия интернализации в клетку специфическим к клетке-мишени образом; или фолата (как правило, фолат и фолиевая кислота используются взаимозаменяемо, и фолат в настоящем изобретении означает фолат в природном состоянии или в активированном состоянии в организме человека), химических веществ, таких как сахар, углевод и т.п., включая гексоамины, такие как N-ацетилгалактозамин (NAG) и т.п., глюкоза, манноза, но настоящее изобретение ими не ограничивается.
В частности, когда лиганд согласно настоящему изобретению представляет собой сахара, такие как N-ацетилгалактозамин (NAG), маннозу, глюкозу и т.п., соответствующий лиганд может не только дополнять и повышать гидрофильность, которая может быть сниженной в зависимости от числа повторов мономера в блоке гидрофильного материала, но также обеспечивать нацеливающий эффект наночастиц, образованных конструкциями в соответствии со структурными формулами (3) и (4) настоящего изобретения, таким образом, что наночастицы могут быть легко сформированы.
Лиганд может быть напрямую соединен с мономером гидрофильного материала в блоке гидрофильного материала посредством ковалентной связи, или может быть присоединен к мономеру гидрофильного материала в блоке гидрофильного материала посредством линкера (Z), опосредующего связывание лиганда. Для специалиста в данной области очевидно, что когда лиганд ковалентно связан с мономером гидрофильного материала в блоке гидрофильного материала посредством линкера (Z), может быть использован любой линкер при условии, что он отвечает целям настоящего изобретения. В частности, линкер предпочтительно имеет любую структуру, выбранную из соединений с (4) по (7), представленных в таблице 2 ниже.
В соединении (4) Т представляет собой соединение, в котором любое соединение, выбранное из соединений с (1) по (3), повторяется от 1 до 15 раз и, в частности, предпочтительно повторение соединения, представленного структурной формулой (1), от 1 до 15 раз. В соединении (4) Т присоединен к лиганду, и дистальный конец присоединен к мономеру гидрофильного материала в блоке гидрофильного материала или линкеру.
Кроме того, в соединениях с (5) по (7) левая сторона функциональной группы присоединена к лиганду, и правая сторона присоединена к мономеру гидрофильного материала в блоке гидрофильного материала, и n в соединении (5) равно 0 или 1. По меньшей мере одна функциональная группа, которая может быть присоединена к лиганду, включена в соединения с (5) по (7), таким образом, по меньшей мере одно связывание лиганда может улучшить эффективность доставки двухцепочечной конструкции олиго-РНК в соответствии с настоящим изобретением в целевую ткань.
В структурных формулах (3) и (4), когда оба i и j равны 0, обеспечена олигонуклеотидная конструкция, к которой лиганд на присоединен, и когда i равен 1 и j равен 0, обеспечена форма, в которой лиганд напрямую присоединен к мономеру гидрофильного материала в блоке гидрофильного материала, и когда i представляет собой целое число, равное 1 или более, и j равен 1, обеспечена опосредованная линкером форма, в которой лиганд присоединен к мономеру гидрофильного материала в блоке гидрофильного материала.
1
2
Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает конструкции, в которых аминогруппа или полигистидиновая группа дополнительно введены в конец гидрофильного материала структур, представленных структурными формулами 1 и 2, в частности, дистальную концевую часть конца, присоединенного к миРНК, то есть конструкции, представленные структурными формулами 5 и 6, в которых Q представляет собой P-J-J в структурных формулах (1) и (2).
1
2
2-12
3
3
2
1
2
-
В структурных формулах (5) и (6) J и J представляют собой линкеры, и каждый независимо представляет собой простую ковалентную связь или предпочтительно выбран из группы, состоящей из С алкила, алкенила, алкинила, РО, SO и СО, но настоящее изобретение ими не ограничивается. Специалисту в данной области будет очевидно, что любой линкер может быть использован в качестве J и J при условии, что он отвечает целям настоящего изобретения в зависимости от используемого гидрофильного материала.
2
3
1
6
2
1
6
-
Предпочтительно, в случае введения аминогруппы, в структурной формуле (5) J предпочтительно представляет собой РО, и J предпочтительно представляет собой С-алкил, и в структурной формуле (6) J предпочтительно представляет собой простую ковалентную связь, и J предпочтительно представляет собой С-алкил, но настоящее изобретение ими не ограничивается.
2
3
1
2
1
-
Кроме того, когда введена полигистидиновая группа, в структурной формуле (5) J предпочтительно представляет собой РО, и J предпочтительно представляет собой соединение (8), и в структурной формуле (6) J предпочтительно представляет собой простую ковалентную связь, и J предпочтительно представляет собой соединение (8), но настоящее изобретение ими не ограничивается.
Соединение (8)
3
+
Аминогруппа в структурных формулах (5) и (6) может представлять собой первичную аминогруппу, вторичную аминогруппу или третичную аминогруппу, и особенно предпочтительной является первичная аминогруппа. Введенная аминогруппа может присутствовать в виде соли амина. Например, соль первичной аминогруппы может быть представлена в форме NH. Кроме того, полигистидиновая группа в структурных формулах (5) и (6) предпочтительно включает от 3 до 10 гистидинов, более предпочтительно от 5 до 8 гистидинов, и наиболее предпочтительно 6 гистидинов. В дополнение к гистидину может быть дополнительно включен, по меньшей мере, один цистеин.
Аминогруппа или полигистидиновая группа введена для облегчения выполнения межклеточного введения и выхода из эндосомы конструкции олиго-РНК, и сообщается о возможности введения аминогруппы и использования полигистидиновой группы для облегчения межклеточного введения и выхода из эндосомы носителей, таких как квантовые точки, дендример, липосома и т.п., и их эффекте.
В частности, известно, что первичная аминогруппа, находящаяся на конце или снаружи носителя, протонирована in vivo,и образует конъюгат с отрицательно заряженным геном путем электростатического взаимодействия, и выход из эндосомы легко осуществляется за счет внутренних третичных аминов, обладающих буферным эффектом при низком рН эндосомы, после введения в клетки, тем самым они способны защитить носитель от разложения в лизосоме (gene delivery and expression inhibition using a polymer-based hybrid material. Polymer Sci. Technol., Vol. 23, No. 3, pp 254-259).
Кроме того, известно, что гистидин, который является одной из не являющихся незаменимыми аминокислот, имеет имидазольное кольцо (pKa3 6,04) при остатке (-R), что увеличивает буферную емкость (буферность) в эндосоме и лизосоме, поэтому экспрессию гистидина можно использовать для увеличения эффективности выхода из эндосомы невирусных носителей генов, включая липосому (Novel histidine-conjugated galactosylated cationic liposomes for efficient hepatocyte selective gene transfer in human hepatoma HepG2 cells. J. Controlled Release 118, pp 262-270).
m
n
m
n
В структурных формулах с (1) по (6) в настоящем изобретении блок гидрофильного материала или гидрофобный материал присоединен к олигонуклеотиду посредством простой ковалентной связи или опосредованной линкером ковалентной связи (X или Y). Линкер, опосредующий ковалентную связь, ковалентно связан с блоком гидрофильного материала или гидрофобным материалом, представленным (A-J) или (J-A) в структурной формуле (1) и (2) на конце олигонуклеотида, и конкретным образом не ограничен при условии, что при необходимости связь, может быть разорвана в специфической среде. Таким образом, в качестве линкера может быть использовано любое соединение для связывания для активации олигонуклеотида и/или гидрофильного материала (или гидрофобного материала) для получения олигонуклеотидной конструкции. Ковалентная связь может представлять собой любую из нерасщепляемой связи или расщепляемой связи. В настоящем документе примеры нерасщепляемой связи могут включать амидную связь или фосфорную связь, и примеры расщепляемой связи могут включать дисульфидную связь, расщепляемую кислотой связь, сложноэфирную связь, ангидридную связь, биорасщепляемую связь или расщепляемую ферментами связь и тому подобное, но настоящее изобретение не обязательно ими ограничивается.
В структурных формулах с (1) по (6) настоящего изобретения при использовании двухцепочечного олигонуклеотида, в частности двухцепочечной олиго-РНК, связывания двухцепочечной олиго-РНК и блока гидрофильного материала и гидрофобного материала могут быть различными, как показано в структурных формулах с 7 по 18 таблицы 3 ниже.
В таблице 3 S означает смысловую цепь двухцепочечной олиго-РНК, AS означает антисмысловую цепь двухцепочечной олиго-РНК и pAS означает антисмысловую цепь, к которой присоединена фосфатная группа. Остальные А, В, X, Y, L, Z, n и m представляют собой такие же, как определено в структурных формулах (1) и (2).
В частности, олигонуклеотидная конструкция в соответствии с настоящим изобретением, представленная структурной формулой (4), предпочтительно имеет структуру, представленную структурной формулой (19) ниже:
Структурная формула (19)
В структурной формуле (19) А представляет собой мономер гидрофильного материала, В представляет собой гидрофобный материал, L представляет собой лиганд, специфически связанный с рецептором, который способствует интернализации в клетку-мишень посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза (RME), Z представляет собой линкер, который опосредует связь между мономером гидрофильного материала и лигандом, R представляет собой одноцепочечный или двухцепочечный олигонуклеотид, m представляет собой целое число от 1 до 15, n представляет собой целое число от 1 до 10, и А, В, L, R и т.п. являются такими же, как определено для структурной формулы (4) настоящего описания.
В частности, А представляет собой любой материал, выбранный из соединений с (1) по (3), представленных в таблице 1, и Z предпочтительно представляет собой соединение (4).
В другом аспекте настоящего изобретения обеспечена твердая подложка, представленная структурной формулой (20) ниже:
Структурная формула (20)
В структурной формуле (20) L является таким же, как определено в структурных формулах (3) и (4), и Т является таким же, как определено для соединения (4). Кроме того, один из С и D представляет собой твердую подложку, другой представляет собой диметокситритил, каждый из Е и F независимо представляет собой целое число от 1 до 10, и i равно 0 или 1.
В еще другом аспекте настоящего изобретения обеспечен способ получения олигонуклеотидных структур, представленных структурными формулами с (1) по (4) путем использования твердой подложки, представленной структурной формулой (20).
Способ предназначен для получения олигонуклеотидных структур, представленных структурными формулами с (1) по (4) с использованием твердой подложки, представленной структурной формулой (20) согласно настоящему изобретению, и когда олигонуклеотид является одноцепочечным, способ включает:
(1) ковалентное присоединение блока гидрофильного материала к твердой подложке, представленной структурной формулой (20) с повторами n раз;
(2) синтез одноцепочечного олигонуклеотида на твердой подложке, к которой присоединен блок гидрофильного материала;
(3) ковалентное присоединение гидрофобного материала к 5'-концу олигонуклеотида, к которому присоединен блок гидрофильного материала; и
(4) отделение олигонуклеотидной конструкции от твердой подложки.
В настоящем изобретении твердая подложка включает стекло с контролируемым размером пор (CPG), полистирол, силикагель, бумагу из целлюлозы и т.п., но настоящее изобретение ими не ограничивается. В случае, когда твердая подложка представляет собой CPG, диаметр предпочтительно составляет от 40 до 180 мкм, и размер пор предпочтительно составляет от 500 Å до 3000 Å.
Кроме того, когда олигонуклеотид олигонуклеотидной конструкции согласно настоящему изобретению представляет собой двухцепочечную РНК, двухцепочечный олигонуклеотид предпочтительно состоит из 19-31 нуклеотидов. Двухцепочечный олигонуклеотид, используемый в настоящем изобретении, может представлять собой двухцепочечный олигонуклеотид любого гена, который используется для генной терапии или генетического исследования, или который может быть использован для генной терапии или генетического исследования.
Настоящее изобретение обеспечивает двухцепочечные олигонуклеотидные (РНК) конструкции, представленные структурными формулами с (7) по (10) и с (13) по (16), представленные в таблице 3, и способ их получения. В частности, способ предназначен для получения олигонуклеотидных структур, представленных структурными формулами с (7) по (10) и с (13) по (16), с использованием твердой подложки, представленной структурной формулой (20) согласно настоящему изобретению, и когда олигонуклеотид является двухцепочечным, способ включает:
(1) ковалентное присоединение блока гидрофильного материала к твердой подложке, представленной структурной формулой (20) с повторами n раз;
(2) синтез двухцепочечной РНК, на твердой подложке, к которой присоединен блок гидрофильного материала;
(3) ковалентное присоединение гидрофобного материала к 5'-концу РНК, к которой присоединен блок гидрофильного материала; и
(4) отделение конструкции РНК-полимер и одноцепочечной РНК, содержащей комплементарную ей последовательность, от твердой подложки; и
(5) формирование двухцепочечного олигонуклеотида путем гибридизации конструкции РНК-полимер и одноцепочечной РНК, содержащей комплементарную ей последовательность.
Более предпочтительно способ включает:
(1) присоединение блока гидрофильного материала, на твердую подложку, представленную структурной формулой (20);
(2) повтор стадии (1) n-1 раз;
(3) синтез двухцепочечной РНК на твердой подложке, к которой присоединен блок гидрофильного материала;
(4) присоединение гидрофобного материала к 5'-концу одноцепочечной РНК;
(5) после завершения синтеза отделение и очистка конструкции РНК-полимер и одноцепочечной РНК, содержащей комплементарную ей последовательность, от твердой подложки; и
(6) получение двухцепочечной конструкции олиго-РНК путем гибридизации конструкции РНК-полимер и одноцепочечной РНК, содержащей комплементарную ей последовательность.
После стадии (5), указанной выше, после завершения процесса получения подтверждение получения желаемой конструкции РНК-полимер и одноцепочечной РНК может быть выполнено путем очистки реагента с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) и измерения молекулярной массы при помощи масс-спектрометра MALDI-TOF. В способе получения синтез одноцепочечной РНК, содержащей последовательность, комплементарную последовательности одноцепочечной РНК, синтезированной на стадии (3), может быть выполнен перед стадией (1) или на любой стадии с (1) по (5).
Кроме того, когда фосфатная группа присоединена к 5'-концу антисмысловой цепи, как показано в структурной формуле (8) или (14), фосфатная группа может быть присоединена к 5'-концу антисмысловой цепи до или после стадии (6) способа получения.
Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает двухцепочечные конструкции олиго-РНК, к которым присоединен лиганд, представленный структурными формулами (9), (10), (15) и (16), и способ их получения. В частности, способ получения двухцепочечных структур олиго-РНК с использованием твердой подложки, представленной структурной формулой (20), включает:
(1) ковалентное присоединение блока гидрофильного материала к твердой подложке, представленной структурной формулой (20) с повторами n раз;
(2) синтез двухцепочечной РНК, на твердой подложку, к которой присоединен лиганд-блок гидрофильного материала, синтезированный на стадии (1);
(3) ковалентное присоединение гидрофобного материала к 5'-концу полученного материала на стадии (2);
(4) после завершения синтеза отделение и очистка конструкции одноцепочечная РНК-полимер, к которой присоединен лиганд, и одноцепочечной РНК, содержащей комплементарную ей последовательность, от твердой подложки (CPG); и
(5) формирование двухцепочечной конструкции олиго-РНК путем гибридизации конструкции РНК-полимер, к которой присоединен лиганд, и одноцепочечной РНК, содержащей комплементарную ей последовательность.
После стадии (5), указанной выше, после завершения процесса получения подтверждение получения желаемой конструкции РНК-полимер, к которой присоединен лиганд, и одноцепочечной РНК может быть выполнено путем очистки реагента с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) и измерения молекулярной массы при помощи масс-спектрометра MALDI-TOF. В способе получения синтез одноцепочечной РНК, содержащей последовательность, комплементарную последовательности одноцепочечной РНК, синтезированной на стадии (3), может быть выполнен перед стадией (1) или на любой стадии с (1) по (4).
Кроме того, когда фосфатная группа присоединена к 5'-концу антисмысловой цепи, как показано в структурной формуле (10) или (16), фосфатная группа может быть присоединена к 5'-концу антисмысловой цепи до или после стадии (6) способа получения.
В еще другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ получения материала, представленного структурной формулой (21), и олигонуклеотидных структур, представленных структурными формулами с (1) по (4), с использованием материала. Структурная формула (21) отличается от структурной формулы (2) только в отношении заместителей С и D
Структурная формула (21)
В материале, представленном структурной формулой (21), один из С и D представляет собой диметокситритил, и другой представляет собой цианоэтилфосфор амидит.
Способ предназначен для получения олигонуклеотидных структур, представленных структурными формулами с (1) по (4), с использованием материала, представленного структурной формулой (21) согласно настоящему изобретению, и когда олигонуклеотид является одноцепочечным, способ включает:
(1) синтез одноцепочечного олигонуклеотида с использованием твердой подложки, предпочтительно CPG, к которой присоединена функциональная группа;
(2) ковалентное присоединение мономера гидрофильного материала к олигонуклеотиду, присоединенному к на твердой подложке, с повторами n-раз;
(3) ковалентное присоединение материала, представленного структурной формулой (21) к 5'-концу олигонуклеотида, к которому присоединен гидрофильный материал;
(4) отделение олигонуклеотидной полимерной конструкции от твердой подложки; и
(5) ковалентное присоединение гидрофобного материала посредством функциональной группы, присоединенной к 3'-концу олигонуклеотидной конструкции, полученной на стадии (4).
Кроме того, способ предназначен для получения олигонуклеотидных структур, представленных структурными формулами с (1) по (4), с использованием материала, представленного структурной формулой (21) согласно настоящему изобретению, и когда олигонуклеотид является двухцепочечным, способ включает:
(1) синтез одноцепочечного олигонуклеотида с использованием твердой подложки, предпочтительно CPG, к которой присоединена функциональная группа;
(2) ковалентное присоединение мономера гидрофильного материала к олигонуклеотиду, присоединенному к твердой подложке, с повторами n-раз;
(3) ковалентное присоединение материала, представленного структурной формулой (21) к 5'-концу олигонуклеотида, к которому присоединен гидрофильный материал;
(4) отделение конструкции РНК-полимер и одноцепочечной РНК, содержащей комплементарную ей последовательность, от твердой подложки;
(5) ковалентное присоединение гидрофобного материала посредством функциональной группы, присоединенной к 3'-концу олигонуклеотидной конструкции, полученной на стадии (4); и
(6) формирование двухцепочечной олигонуклеотидной конструкции путем гибридизации конструкции РНК-полимер и одноцепочечной РНК, содержащей комплементарную ей последовательность.
Кроме того, когда фосфатная группа присоединена к 5'-концу антисмысловой цепи, фосфатная группа может быть присоединена к 5'-концу антисмысловой цепи до или после стадии (6) способа получения.
В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает наночастицы, образованные олигонуклеотидными конструкциями, представленными любой из структурных формул с (1) по (6). Олигонуклеотид представляет собой амфипатическую конструкцию, содержащую гидрофобные материалы и гидрофильные материалы, при этом гидрофильная часть, состоящая из n блоков гидрофильного материала, обладает аффинностью посредством взаимодействия, такого как водородная связь и т.п., с молекулами воды, присутствующими в организме человека, и направлена наружу, и гидрофобные материалы направлены внутрь посредством гидрофобного взаимодействия между ними, формируя тем самым термодинамически стабильную наночастицу (SAMiRNA). То есть, гидрофобные материалы расположены в центре наночастицы, и блоки гидрофильного материала расположены в направлении наружу олигонуклеотида, с формированием наночастиц, которые защищают двухцепочечную олиго-РНК (смотри фигуру 1). Наночастицы, сформированные выше, улучшают внутриклеточную доставку олигонуклеотида и улучшают эффективность контроля экспрессии генов олигонуклеотида, который может быть использован для лечения заболеваний.
Кроме того, поскольку мономер гидрофильного материала находится в блоке гидрофильного материала и число его мономеров можно легко контролировать, и число подлежащих использованию блоков гидрофильного материала также можно легко контролировать, части гидрофильного материала, состоящие из n блоков гидрофильного материала во всех олигонуклеотидных конструкциях являются одинаковыми, благодаря чему олигонуклеотидная конструкция, содержащая часть гидрофильного материала, имеет некоторые преимущества, в том числе в том, что легче проводить анализ данного материала, и по сравнению с олигонуклеотидной структурой, содержащей гидрофильный материал, синтез которого включает дополнительный процесс очистки для достижения единообразной молекулярной массы, процесс синтеза предлагаемой конструкции является простым и затраты могут быть уменьшены.
Кроме того, так как размер наночастиц, образованных олигонуклеотидной структурой, можно регулировать путем контроля числа повторов блоков гидрофильного материала и мономеров гидрофильного материала в блоке гидрофильного материала, наночастицы, образованные на основе олигонуклеотида, могут иметь значительно воспроизводимую способность доставляться в клетку.
Кроме того, олигонуклеотид, к которому присоединен лиганд, при этом лиганд представляет собой сахара, такие как N-ацетил-галактозамин (NAG), манноза, глюкоза и т.п., и олигонуклеотидная конструкция представлена структурной формулой (1) или (2), может одновременно дополнять и повышать гидрофильность, которая будет снижена если число повторов блоков гидрофильного материала будет уменьшенным, стабилизируя тем самым формирование наночастиц. Наночастицы, к которым присоединен лиганд, образованный выше, могут характеризоваться улучшенной внутриклеточной доставкой олигонуклеотида и обеспечивать лучшую эффективность олигонуклеотида, который может быть использован для лечения заболеваний. Более конкретный синтез конструкции, а также характеристики, эффективность внутриклеточной доставки и эффекты наночастиц, образованных олигонуклеотидными конструкциями, будут описаны более подробно в следующих примерах.
Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает способ лечения с использованием олигонуклеотидных структур или наночастиц, образованных на основе олигонуклеотидных структур. В частности, способ лечения включает получение наночастиц, образованных нуклеотидными конструкциями, и введение наночастиц в организм животного.
Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию, включающую фармацевтически эффективное количество наночастиц, образованных олигонуклеотидными конструкциями.
Композиция согласно настоящему изобретению может быть получена путем дополнительного включения, по меньшей мере, одного вида фармацевтически приемлемого носителя для введения в дополнение к описанным выше эффективным компонентам для введения. Фармацевтически приемлемый носитель должен быть совместим с эффективными компонентами настоящего изобретения. Может быть использован один компонент, выбранный из солевого раствора, стерильной воды, раствора Рингера, буферного солевого раствора, раствора декстрозы, раствора мальтодекстрина, глицерина и этанола, или смесь двух или более из них. Кроме того, по необходимости могут быть добавлены другие общепринятые добавки, такие как антиоксидант, буфер, фунгистатическое вещество и тому подобное. Кроме того, композиция может быть получена в виде состава для инъекции, такого как водный раствор, суспензия, эмульсия и тому подобное, путем дополнительного добавления разбавителя, диспергирующего вещества, поверхностно-активного вещества, связующего вещества и скользящего вещества. Кроме того, соответствующие способы в данной области или способ, раскрытый в Remington's pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, или Easton PA, может быть предпочтительно использован для составления в зависимости от заболевания или компонента.
Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению может быть определена специалистами в данной области исходя из симптомов пациента и тяжести заболевания. Кроме того, композиция может быть составлена в различной форме, такой как порошок, таблетка, капсула, раствор, инъекция, мазь, сироп и тому подобное, и может быть обеспечена в виде единичной дозы или контейнере для множества доз, например, герметично запечатанной ампуле, бутылке и тому подобное.
Фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению можно вводить перорально или парентерально. Примеры путей введения фармацевтической композиции в соответствии с настоящим изобретением могут включать пероральное, внутривенное, внутримышечное, внутриартериальное, интрамедуллярное, интрадуральное, внутрисердечное, трансдермальное, подкожное, интраперитонеальное, интестинальное, сублингвальное или местное введение, но настоящее изобретение ими не ограничивается.
Кроме того, композиция согласно настоящему изобретению может быть формулирована в подходящую лекарственную форму путем использования известных технологий для клинического введения. Вводимое количество композиции согласно настоящему изобретению может изменяться в различных диапазонах в зависимости от массы тела, возраста, пола, состояния здоровья, диеты, времени приема, способа введения, скорости выведения из организма, тяжести заболевания пациента и тому подобное, и может быть легко определено специалистом в данной области.
Настоящее изобретение обеспечивает способ регулирования экспрессии генов in vivo или in vitro с использованием олигонуклеотидной конструкции. Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает способ регулирования экспрессии генов in vivo или in vitro с использованием наночастицы, содержащей олигонуклеотидную конструкцию.
Примеры
Далее в настоящем документе настоящее изобретение будет описано более подробно при обращении к следующим примерам. Эти примеры представлены только для иллюстрации настоящего изобретения, и специалисту в данной области будет очевидно, что объем настоящего изобретения не предполагается быть ограниченным этими примерами.
Пример 1. Получение (3' N-ацетил-галактозамина) CPG (стекло с контролируемым размером пор)
Для получения двухцепочечной конструкции олиго-РНК, к которой присоединен лиганд, получали N-ацетил-галактозамин CPG, который представляет собой материал лиганда и может быть присоединен к двухцепочечной конструкции олиго-РНК.
Пример 1-1. Получение реагента 1-гекса(этиленгликоль)-N-ацетил-галактозамина-CPG (стекло с контролируемым размером пор)
Для присоединения N-ацетил-галактозамина (NAG) к двухцепочечной конструкции олиго-РНК 1-гекса(этиленгликоль)-N-ацетил-галактозамин-CPG (стекло с контролируемым размером пор) получали, как показано на фигуре 2.
Пример 1-1-1. Получение 1,3,4,6-тетраацетила-NAG (соединение 1 фигуры 2)
Исходные материалы, гидрохлорид галактозамина (Sigma Aldrich, USA) (10 г, 46,37 ммоль), ацетонитрил (150 мл) и триэтиламин (556,48 мл) смешивали друг с другом и нагревали с обратным холодильником в течение 1 часа. Смесь медленно охлаждали до комнатной температуры, охлаждали до 0°С при помощи ледяной воды, и по каплям добавляли уксусный ангидрид (43,83 мл, 463,70 ммоль). После завершения добавления ледяную воду удаляли, и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 24 часов. После завершения реакции медленно добавляли насыщенный водный раствор бикарбоната натрия до достижения нейтрального значения рН. После достижения нейтрального значения рН смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов с получением твердого вещества, полученное твердое вещество фильтровали, и фильтрат последовательно промывали этилацетатом, дистиллированной водой и этилацетатом. Твердое вещество сушили в вакууме с получением 1,3,4,6-тетраацетила-NAG (9,792 г, 56%) (смотри фигуру 2).
Пример 1-1-2. Получение 3,4,6-триацетил-1-гекса(этиленгликоль)-N-ацетил-галактозамина (соединение 2 фигуры 2)
1,3,4,6-Тетраацетил-N-ацетил-галактозамин (6,77 г, 18,04 ммоль), полученный в примере 1-1-1, хлорид железа (III) (3,80 г, 23,45 ммоль) и метиленхлорид (200 мл) смешивали друг с другом и перемешивали при комнатной температуре. После перемешивания в течение 10 минут добавляли гекса(этиленгликоль) (5,90 мл, 4,82 ммоль) и нагревали с обратным холодильником в течение 2 часов. После завершения реакции смесь фильтровали через целит, и фильтрат промывали метиленхлоридом. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении, и добавляли этилацетат и дистиллированную воду для экстракции водного слоя. Полученный водный слой экстрагировали метиленхлоридом, и органический слой собирали и сушили над безводным сульфатом магния и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении и сушили в вакууме с получением 3,4,6-триацетил-1-гекса(этиленгликоль)-N-ацетил-галактозамина (2,24 г, 74,9%) (смотри фигуру 3).
Пример 1-1-3. Получение 3,4,6-триацетил-1-[гекса(этиленгликоль)-N'-1',2'-пропандиол]-N-ацетил-галактозамина (соединение 3 фигуры 2)
3,4,6-Триацетил-1-гекса(этиленгликоль)-N-ацетил-галактозамин (13,66 г, 22,33 ммоль), полученный в примере 1-1-2, добавляли в ацетонитрил (220 мл) и перемешивали. Затем в реакционную смесь добавляли NN'-дисукцинимидил-карбонат (9,15 г, 35,73 ммоль) и триэтиламин (9,90 мл, 71,46 ммоль), и перемешивали в течение 24 часов. 3-Амино-1,2-пропандиол (3,26 г, 35,73 ммоль) разбавляли N,N'-диметилформамидом (60 мл), добавляли триэтиламин (4,95 мл, 35,73 ммоль), после чего смесь добавляли в реакционный раствор и перемешивали в течение 24 часов. Смесь концентрировали при пониженном давлении и сушили в вакууме. Смесь разделяли на колонке, и полученный раствор концентрировали при пониженном давлении. Полученную смесь сушили в вакууме с получением 3,4,6-триацетил-1-[гекса(этиленгликоль)-N'-1',2'-пропандиол]-N-ацетил-галактозамина (9,23 г, 56,7%) (смотри фигуру 4).
Пример 1-1-4. Получение 3,4,6-триацетил-1-[гекса(этиленгликоль)-N'-1'-метокси(диметокситритил)-2'-пропанол]-N-ацетил-галактозамина (соединение 4 фигуры 2)
3,4,6-Триацетил-1-[гекса(этиленгликоль)-N'-1',2'-пропандиол]-N-ацетил-галактозамин (9,23 г, 12,67 ммоль, 1 экв.), полученный в примере 1-1-3, добавляли в метиленхлорид (120 мл) и перемешивали. В полученный раствор добавляли триэтиламин (5,27 мл, 38,00 ммоль, 3 экв.). Добавляли хлорид DMT (4,72 г, 13,93 ммоль), разбавленный в метиленхлориде (20 мл) и смесь перемешивали в течение 24 часов. Смесь концентрировали при пониженном давлении, экстрагировали этилацетатом, сушили над безводным сульфатом магния и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Смесь разделяли на колонке, и полученный раствор концентрировали при пониженном давлении. Полученную смесь сушили в вакууме с получением желаемого 3,4,6-триацетил-1-[гекса(этиленгликоль)-N'-1'-метокси(диметокситритил)-2'-пропанол]-N-ацетил-галактозамина (7,77 г, 59,5%).
Пример 1-1-5. Получение 3,4,6-триацетил-1-[гекса(этиленгликоль)-N'-1'-метокси(диметокситритил)-2'-пропокси (янтарная кислота)]-N-ацетил-галактозамина (соединение 5 фигуры 2)
3,4,6-Триацетил-1-[гекса(этиленгликоль)-N'-1'-метокси(диметокситритил)-2'-пропанол]-N-ацетил-галактозамин (7,72 г, 7,487 ммоль), полученный в примере 1-1-4, добавляли в пиридин (70 мл) и перемешивали. В полученную реакционную смесь добавляли уксусный ангидрид (3,75 г, 37,486 ммоль) и DMAP (0,46 г, 3,745 ммоль), и смесь перемешивали при температуре в интервале от 60°С до 70°С в течение 24 часов. Смесь концентрировали при пониженном давлении и сушили в вакууме. Смесь экстрагировали этилацетатом. Смесь сушили над безводным сульфатом магния и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Фильтрат разделяли на колонке, и полученный раствор концентрировали при пониженном давлении. Полученную смесь сушили в вакууме с получением желаемого 3,4,6-триацетил-1-[гекса(этиленгликоль)-N'-1'-метокси(диметокситритил)-2'-пропокси (янтарная кислота)]-N-ацетил-галактозамина (7,61 г, 89,9%).
Пример 1-1-6. Получение соединения CPG до кэппирования 3,4,6-триацетил-1-гекса (этиленгликоль)-N-ацетил галактозамина-CPG (соединение 7 фигуры 2)
3,4,6-Триацетил-1-[гекса(этиленгликоль)-N'-1'-метокси(диметокситритил)-2'-пропокси (янтарная кислота)]-N-ацетил-галактозамин (0,34 г, 0,30 ммоль), полученный в примере 1-1-5, добавляли в стекло с контролируемым размером пор, содержащее длинноцепочечный алкиламин (LCAA-CPG) (1000Å) (5 г), бис-2-оксо-3-оксазолидинил фосфоний хлорид (0,2 г, 0,45 ммоль), 1-гидроксибензотриазо (0,06 г, 0,45 ммоль) и метиленхлорид (50 мл). В реакционную смесь добавляли триэтиламин (0,03 мл, 2,25 ммоль). Реакция в смеси протекала в течение 24 часов. Смесь фильтровали и промывали метанолом. Смесь сушили с получением желаемого соединения CPG (4,91 г) до кэппирования 3,4,6-триацетил-1-гекса (этиленгликоль)-N-ацетил галактозамина-CPG.
Пример 1-1-7. Получение 3,4,6-триацетил-1-гекса(этиленгликоль)-N-ацетил-галактозамина-CPG (стекло с контролируемым размером пор)
Соединение CPG до кэппирования 3,4,6-триацетил-1-гекса (этиленгликоль)-N-ацетил галактозамина-CPG, полученное в примере 1-1-6, добавляли в пиридин (30 мл), уксусный ангидрид (6,02 мл, 63,70 ммоль) и 1-метилимидазол (5,08 мл, 63,70 ммоль), и реакция протекала в течение 24 часов. Смесь фильтровали и промывали метанолом. Фильтрат сушили в вакууме с получением желаемого соединения, 3,4,6-триацетил-1-гекса(этиленгликоль)-N-ацетил-галактозамина-СРG (стекло с контролируемым размером пор) (2,8 г).
Пример 2. Получение двухцепочечной конструкции олиго-РНК
Далее в настоящем документе для ингибирования сурвивина использовали двухцепочечную олиго-РНК к сурвивину. Сурвивин, который представляет собой белок, обычно экспрессирующийся в большинстве тестированных на сегодняшний день неопластических опухолях или трасформированных клеточных линиях, является важной мишенью для противораковой терапии (Survivin: a new target for anti-cancer therapy. Cancer Treat Rev. 2009 Nov; 35 (7): 553-62).
Двухцепочечная олиго-РНК к сурвивину согласно настоящему изобретению состоит из смысловой цепи, имеющей последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, и антисмысловой цепи, имеющей комплементарную смысловой цепи последовательность, и двухцепочечная олиго-РНК, используемая в качестве контрольной группы, состоит из смысловой цепи, имеющей последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, и антисмысловой цепи, имеющей комплементарную смысловой цепи последовательность. Нуклеотидные последовательности двухцепочечной олиго-РНК, используемые в примерах по настоящему изобретению, представляют собой следующие:
(SEQ ID NO: 1) 5'-AAG GAG AUC AAC AUU UUC A-3'
(SEQ ID NO: 2) 5'-CUU ACG CUG AGU ACU UCG A-3'
В двухцепочечной олиго-РНК единичную цепь двухцепочечной олиго-РНК синтезировали способом с использованием β-цианоэтилфосфорамидита для соединения фосфодиэфирной связи, образующей структуру основной цепи РНК (Polymer support oligonucleotide synthesis XVIII: use of beta-cyanoemyl-N,N-dialkylamino-/N-morpholinophosphoramidite of deoxynucleosides for the synthesis of DNA fragments simplifying deprotection and isolation of the final product. Nucleic Acids Res. 1984 Jun 11; 12(11): 4539-57).
Желаемая последовательность единичной цепи РНК может быть получена с помощью процесса синтеза на твердой подложке (CPG), содержащей присоединенный к ней нуклеозид, и повторения циклов, включающих деблокирование, связывание, кэппирование и окисление. Синтезатор РНК 384 (BIONEER, Korea) использовали для серий соответствующего процесса синтеза двухцепочечной олиго-РНК.
Для анализа физических свойств наночастицы, образованной двухцепочечной структурой олиго-РНК в соответствии с числом повторов мономера гидрофильного материала, образующего двухцепочечную конструкцию олиго-РНК, были получены следующие двухцепочечные конструкции олиго-РНК.
Двухцепочечные конструкции олиго-РНК, к которым присоединен лиганд, полученный в настоящем изобретении, имели конструкции, представленные ниже в таблице 4, соответственно.
4
3
3
24
-
-
В таблице 4 S представляет собой смысловую цепь двухцепочечной олиго-РНК; AS представляет собой антисмысловую цепь двухцепочечной олиго-РНК; РО представляет собой фосфатную группу; NAG представляет собой лиганд, N-ацетил-галактозамин; PEG представляет собой полидисперсный гидрофильный материал, а именно полиэтиленгликоль; гексаметиленгликоль-РО представляет собой мономер гидрофильного материала, в котором гексаэтиленгликоль присоединен посредством фосфатной группы (РО); нижний индекс представляет собой число повторов (n) мономера гидрофильного материала; С представляет собой гидрофобный материал и тетрадокозан, содержащий дисульфидную связь; и 5 и 3' означают производные конца двухцепочечной олиго-РНК.
4
Антисмысловая цепь двухцепочечной конструкции олиго-РНК имеет такую же структуру. Антисмысловую цепь двухцепочечной конструкции олиго-РНК получали указанным выше способом, в котором фосфодиэфирная связь, формирующая структуру основной цепи РНК, связана с использованием β-цианоэтилфосфорамидита. Затем, для присоединения фосфатной группы к 5'-концу, химический фосфорилирующий реагент (CPR), который представляет собой [3-(4,4'-диметокситритилокси)-2,2-дикарбоксиэтил]пропил-(2-цианоэтил)-(N,N-диизопропил)-фосфорамидит, использовали для получения антисмысловой цепи S-SAMiRNALP-PO, к которой фосфатная группа присоединена к 5'-концу. В иных случаях антисмысловую цепь, к которой присоединена фосфатная группа, получали путем извлечения единичной цепи РНК из CPG и обработки путем фосфорилирования киназой для присоединения фосфатной группы к 5'-концу.
В случае смысловой цепи двухцепочечной конструкции олиго-РНК SAMiRNA, смысловую цепь SAMiRNA, в которой NAG-PEG присоединен к 3'-концу, и тетрадокозан (С24) присоединен к 5'-концу, получали путем присоединения гидрофильного материала, а именно, полиэтиленгликоля-фосфорамидата (PEG-фосфорамидита, где PEG имеет молекулярную массу (Mn), равную 2000) посредством указанной выше реакции с использованием 3,4,6-триацетил-1-гекса(этиленгликоль)-N-ацетил-галактозамина-СРG, полученного в примере 1, в качестве подложки, синтеза РНК и присоединения тетрадокозана (С24), содержащего дисульфидную связь, к 5'-концу.
В случае смысловой цепи двухцепочечной конструкции олиго-РНК monoSAMiRNA (n=1), смысловую цепь monoSAMiRNA (n=1), в которой NAG-гексаэтиленгликоль присоединен к 3'-концу, и тетрадокозан присоединен к 5'-концу, получали путем синтеза РНК посредством указанной выше реакции с использованием 3,4,6-триацетил-1-гекса(этиленгликоль)-N-ацетил-галактозамина-СРG, полученного в примере 1, в качестве подложки, и дополнительно присоединения гидрофобного материала, а именно, тетрадокозана (С24), содержащего дисульфидную связь, к 5'-концу.
4
В случае смысловой цепи двухцепочечной конструкции олиго-РНК monoSAMiRNA (n=2), смысловую цепь monoSAMiRNA (n=2), в которой NAG-(-PO-гексаэтиленгликоль)] присоединен к 3'-концу, и тетрадокозан присоединен к 5'-концу, получали присоединения мономера гидрофильного материала, а именно, деметокситритил-гексаэтиленгликоль-фосфорамидата, посредством указанной выше реакции с использованием 3,4,6-триацетил-1-гекса(этиленгликоль)-N-ацетил-галактозамина-CPG, полученного в примере 1, в качестве подложки, синтеза РНК и дополнительно присоединения гидрофобного материала, а именно, тетрадокозана (С24), содержащего дисульфидную связь, к 5'-концу.
4
В случае смысловой цепи двухцепочечной конструкции олиго-РНК monoSAMiRNA (n=3), смысловую цепь monoSAMiRNA (n=3), в которой NAG-гексаэтиленгликоль-(-PO-гексаэтиленгликоль)2 присоединен к 3'-концу, и тетрадокозан присоединен к 5'-концу, получали путем непрерывного присоединения мономера гидрофильного материала, а именно, двух фосфорамидатов, деметокситритила-гексаэтиленгликоля, посредством указанной выше реакции с использованием 3,4,6-триацетил-1-гекса(этиленгликоль)-N-ацетил-галактозамина-СРG, полученного в примере 1, в качестве подложки, синтеза РНК и дополнительно присоединения гидрофобного материала, а именно, тетрадокозана (С24), содержащего дисульфидную связь, к 5'-концу.
4
2
В случае смысловой цепи двухцепочечной конструкции олиго-РНК monoSAMiRNA (n=4), смысловую цепь monoSAMiRNA (n=4), в которой NAG-гексаэтиленгликоль-(-РO-гексаэтиленгликоль) присоединен к 3'-концу, и тетрадокозан присоединен к 5'-концу, получали путем непрерывного присоединения мономера гидрофильного материала, а именно, трех фосфорамидатов, деметокситритила-гексаэтиленгликоля, посредством указанной выше реакции с использованием 3,4,6-триацетил-1-гекса(этиленгликоль)-N-ацетил-галактозамина-СРG, полученного в примере 1, в качестве подложки, синтеза РНК и дополнительно присоединения гидрофобного материала, а именно, тетрадокозана (С24), содержащего дисульфидную связь, к 5'-концу.
После завершения синтеза единичную цепь РНК и конструкцию РНК-полимер, полученную путем обработки 28% (об/об) раствором аммиака в водяной ванне при 60°С, отделяли от CPG и защитные группы удаляли с помощью реакции снятия защиты, соответственно. Единичную цепь РНК и конструкцию РНК-полимер, из которой были удалены защитные группы, обрабатывали N-метилпиролидоном, триэтиламином и триэтиламинтригидрофторидом в объемном соотношении 10:3:4 в печи при 70°С для удаления 2' TBDMS (трет-бутилдиметилсилил). Единичную цепь РНК, конструкцию РНК-полимер и конструкцию РНК-полимер, к которой присоединен лиганд, отделяли от реагентов путем HPLC и их молекулярную массу измеряли при помощи масс-спектрометра MALDI-TOF (SHIMADZU, Japan) для подтверждения соответствия основной последовательности и конструкции РНК-полимер тем, которые должны быть синтезированы (фигуры с 11 по 14). Затем, для получения каждой двухцепочечной конструкции олиго-РНК смысловую цепь и антисмысловую цепь в эквивалентном количестве смешивали друг с другом и помещали в буфер IX для гибридизации (30 мМ HEPES, 100 мМ ацетат калия, 2 мМ ацетата магния (рН от 7,0 до 7,5) с последующей реакцией в водяной ванне, имеющей постоянную температуру 90°С, в течение 3 минут, и затем реакции при 37°С, с получением тем самым желаемых SAMiRNA, monoSAMiRNA (n=1), monoSAMiRNA (n=2), monoSAMiRNA (n=3) и monoSAMiRNA (n=4) соответственно. С помощью электрофореза было подтверждено, что полученные двухцепочечные конструкции олиго-РНК были загибридизованы.
Пример 3. Анализ физических свойств наночастиц, состоящих из monoSAMiRNA
Наночастица, а именно, мицелла, образована путем гидрофобного взаимодействия между гидрофобными материалами, присоединенными к концам двухцепочечной олиго-РНК monoSAMiRNA, полученной в примере 2 (смотри фигуру 1).
Формирование наночастицы (SAMiRNA), состоящей из соответствующих monoSAMiRNA, подтверждали путем анализа размера наночастицы и значения критической концентрации мицелл (CMC) в соответствии с числом повторов мономеров гидрофильного материала monoSAMiRNA и трансмиссионного электронного микроскопа (ТЕМ).
Пример 3-1. Измерение критической концентрации мицелл (CMC) наночастицы, состоящей из monoSAMiRNA
Амфифильный материал, содержащий как гидрофобные группы, так и гидрофильные группы в одной молекуле, может представлять собой поверхностно-активное вещество, при растворении которого в водном растворе его гидрофобные группы движутся в направлении центральной части для предотвращения контакта гидрофобных групп с водой, и его гидрофильные группы движутся в направлении наружу с формированием мицеллы. В настоящем документе концентрация, при которой происходит первичное образование мицеллы, называется критической концентрацией мицелл (CMC). Способ измерения CMC с использованием флуоресцентного пигмента основан на свойствах флуоресцентного пигмента, состоящих в том, что крутизна кривой графика интенсивности флуоресценции быстро изменяется до/после формирования мицеллы. Для измерения CMC наночастицы, состоящей из monoSAMiRNA, в качестве флуоресцентного пигмента готовили 0,04 мМ DPH (1,6-дифенил-1,3,5-гексатриен, SIGMA, USA). 1 нмоль/мкл monoSAMiRNA (n=1) разбавляли от концентрации 0,0977 мкг/мл до максимальной концентрации 50 мкг/мл DPBS для каждой стадии для приготовления образцов monoSAMiRNA (n=1), имеющих общий объем 180 мкл. В приготовленные образцы добавляли, соответственно, 20 мкл 0,04 мМ DPH и метанол, который является растворителем DPH для контрольной группы, хорошо перемешивали, и обрабатывали с помощью ультразвукового диспергатора (Wiseclean: DAIHAN, Korea) таким образом, чтобы размер наночастиц был однородным (700 Вт; амплитуда: 20%). После протекания реакции в гомогенизированных образцах при комнатной температуре и отсутствии света в течение примерно 24 часов измеряли величину интенсивностей флуоресценции (возбуждение: 355 нм, испускание: 428 нм, верхнее считывание). Для подтверждения величин относительной флуоресценции из измеренных значений интенсивности флуоресценции, измеряли значение интенсивности флуоресценции образца, содержащего DPH - значение интенсивности флуоресценции содержащего только метанол образца (ось Y) при такой же концентрации и представляли в виде графика относительно значения log обработанной концентрации monoSAMiRNA (n=1) (ось X). MonoSAMiRNA (n=2) и monoSAMiRNA (n=3) измеряли таким же способом, как описано выше.
Измеренная величина флуоресценции для каждой концентрации быстро возрастала по мере движения из области низкой концентрации в область высокой концентрации, при этом концентрация в быстро возросшей точке представляет собой концентрацию CMC. Таким образом, при построении линий тренда путем деления области низкой концентрации, в которой величина флуоресценции не увеличена, и области высокой концентрации, в которой величина флуоресценции увеличена, на несколько участков, значение X в точке пересечения двух линий тренда представляет собой концентрацию CMC. Наблюдалось, что измеренное значение CMC наночастицы, состоящей из monoSAMiRNA (n=1), являлось сравнительно высоким и составило 0,83 мкг/мл, и измеренное значение CMC наночастицы, состоящей из monoSAMiRNA (n=2), являлось значительно низким и составило 0,33 мкг/мл. Наблюдалось, что измеренное значение CMC наночастицы, состоящей из monoSAMiRNA (n=3), составило 0,58 мкг/мл, и измеренное значение CMC наночастицы, состоящей из monoSAMiRNA (n=4), составило 0,44 мкг/мл (фигура 15). Таким образом, было получено подтверждение того, что мицелла может быть правильно сформирована наночастицей, состоящей из monoSAMiRNA, даже при значительно низкой концентрации.
Пример 3-2. Получение наночастиц. состоящих из monoSAMiRNA
Для получения гомогенизированных наночастиц monoSAMiRNA (n=1) растворяли в 1,5 мл DPBS (фосфатно-буферный солевой раствор Дульбекко) при концентрации 50 мкг/мл, и полученную смесь сушили путем лиофилизации в условиях -75°С и 5 мм.рт.ст (Torr) в течение 48 часов. MonoSAMiRNA (n=2), monoSAMiRNA (n=3) и monoSAMiRNA (n=4) измеряли таким же способом, как описано выше.
Пример 3-3. Измерение размера и индекса полидисперсности (PDD наночастицы. состоящей из monoSAMiRNA
Размер наночастицы определяли путем измерения зета-потенциала. В частности, размер гомогенизированной наночастицы, полученной в примере 3-2, определяли путем измерения зета-потенциала (Nano-ZS, MALVERN, England) в условиях, в которых индекс преломления к материалу равен 1,459, индекс поглощения равен 0,001, температура растворителя: DPBS составляет 25°С и соответствующие вязкость и индекс преломления составляют 1.0200 и 1,335 соответственно. Измерение, проводимое путем измерения размера, включало 15 повторов и затем шесть повторов. MonoSAMiRNA (n=1), monoSAMiRNA (n=2), monoSAMiRNA (n=3) и monoSAMiRNA (n=4) измеряли таким же способом, как описано выше.
Было подтверждено, что размер наночастицы, состоящей из monoSAMiRNA (n=1), равен 111 нм, и значение PDI наночастицы, состоящей из monoSAMiRNA (n=1), равно 0,19. Было подтверждено, что размер наночастицы, состоящей из monoSAMiRNA (n=2), равен примерно 86 нм, и ее значение PDI равно 0,25, размер наночастицы, состоящей из monoSAMiRNA (n=3), равен примерно 80 нм, и ее значение PDI равно 0,30, и размер наночастицы, состоящей из monoSAMiRNA (n=4), равен примерно 83 нм, и ее значение PDI равно 0,26 (фигура 16). По мере уменьшения значения PDI соответствующие частицы становятся однородно распределенными, и таким образом, следует понимать, что наночастица согласно настоящему изобретению имеет в значительной степени однородный размер.
Пример 3-4. Исследование наночастицы. состоящей из monoSAMiRNA. методом просвечивающей электронной микроскопии (ТЕМ)
Наночастицу, состоящую из monoSAMiRNA, исследовали методом просвечивающей электронной микроскопии (ТЕМ) для подтверждения ее формы. В частности, S-SAMiRNA растворяли в DPBS до конечной концентрации 100 мкг/мл и обрабатывали ультразвуковым диспергатором (Wiseclean: DAIHAN, Korea) с получением наночастиц однородного размера (700 Вт; амплитуда: 20%). Наночастицу, состоящую из S-SAMiRNA, исследовали с использованием материала, обладающего высокой электронной плотностью, методом негативного окрашивания. Было подтверждено, что исследуемая методом ТЕМ наночастица имела размер, сходный с размером наночастицы, измеренным в примере 3-2.
Пример 4. Ингибирование экспрессии целевого гена в опухолевой клеточной линии с использованием наночастицы. состоящей из monoSAMiRNA
Экспрессию гена сурвивина трансфицированной опухолевой клеточной линии анализировали путем использования наночастицы, состоящей из monoSAMiRNA, полученной в примере 3-2.
Пример 4-1. Культура опухолевой клеточной линии
2
Клетки рака шейки матки человека (HeLa), полученные от Американской коллекции типовых культур (American type Culture Collection, АТСС), культивировали в культуральной среде ЕМЕМ (ATCC-formulated eagle's minimum essential medium, США), содержащей 10% (об/об) фетальной бычьей сыворотки, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, в условиях 37°С и 5% (об/об) СО.
Пример 4-2. Трансформация опухолевой клеточной линии с использованием наночастицы. состоящей из monoSAMiRNA
5
2
2
1×10 клеток клеточной линии фибробластов, культивированных в примере 4-1, культивировали в среде ЕМЕМ в течение 18 часов в 12-луночном планшете в условиях 37°С и 5% (об/об) СО, и среду удаляли, и в каждую лунку вносили такое же количество среды Opti-MEM (GIBCO, США). 100 мкл среды Opti-MEM, и SAMiRNA и monoSAMiRNA, полученные в примере 3-2, добавляли в DPBS при концентрации 50 мкг/мл, и полученную смесь сушили лиофилизацией в условиях -75°С и 5 мм рт.ст. (Torr) в течение 48 часов таким же способом, как описано в примере 3-1, с получением гомогенизированных наночастиц. Затем каждую лунку, содержащую опухолевую клеточную линию с внесенной средой Opti-MEM, обрабатывали раствором для трансфекции при концентрации 200 нМ, и культивировали в условиях 37°С и 5% (об/об) СО в течение в общей сложности 48 часов.
Пример 4-3. Сравнительный количественный анализ мРНК гена сурвивина
кДНК синтезировали путем экстракции общей РНК из трансфицированной клеточной линии, полученной в примере 4-2 выше, и величину экспрессии мРНК сурвивина определяли путем сравнительного количественного анализа методом PCR в режиме реального времени в соответствии со способом, описанным в публикации корейского патента №10-2009-0042297 (смотри фигуру 17). Sur584 означает SAMiRNA имеющую последовательность двухцепочечной олиго-РНК (SEQ ID NO: 1), специфической к целевому гену сурвивину для каждой конструкции SAMiRNA, и CONT означает SAMiRNA, имеющую последовательность контрольной группы (SEQ ID NO: 2), которая не нарушает экспрессии целевого гена. Степень ингибирования экспрессии мРНК целевого гена рассчитывали с использованием величины экспрессии целевого гена образца, обработанного Sur584, относительно величины экспрессии целевого гена образца, обработанного CONT, путем сравнительного количественного анализа. Все из monoSAMiRNA (n = от 1 до 4), включая сурвивин-специфическую двухцепочечную олиго-РНК, обладали эффектом ингибирования экспрессии целевого гена, и наблюдалось, что monoSAMiRNA (n=2), содержащая два или более блоков гидрофильного материала, обеспечила сохранение высокого эффекта ингибирования экспрессии целевого гена (ингибирование экспрессии около 75% или более).
Пример 5. Получение двухцепочечной олигонуклеотидной конструкции, в которую аминогруппа и/или гистидиновая группа введена в гидрофильный материал
Пример 5.1. Получение SAMiRNA. содержащей этиленгликоль в качестве мономера гидрофильного материала
24
В случае двухцепочечной олигонуклеотидной конструкции, включающей этиленгликоль, в частности, гексаметиленгликоль в качестве мономера гидрофильного материала, и тетрадокозан С в качестве гидрофобного материала в настоящем изобретении, двухцепочечная олигонуклеотидная конструкция может быть представлена ниже структурной формулой (22):
Структурная формула (22)
24
В структурной формуле (22) С представляет собой тетрадокозан, который представляет собой гидрофобный материал, и n представляет собой повторяющуюся единицу гексаэтиленгликоля и является таким же, как определено для структурной формулы (1) или (2).
4
В данном примере получали двухцепочечную конструкцию олиго-РНК ([гeкcaэтилeнгликoль]-SAMiRNA), представленную ниже структурной формулой (23), в которой n равно 4:
Структурная формула (23)
Структурная формула (23), в частности, представлена ниже структурной формулой (24):
Структурная формула (24)
24
В структурных формулах (23) и (24) S представляет собой смысловую цепь миРНК; AS представляет собой антисмысловую цепь миРНК; гексаэтиленгликоль представляет собой гидрофильный материал; С представляет собой гидрофобный материал и тетрадокозан, содержащий дисульфидную связь; и 5' и 3' означают направления конца двухцепочечной олиго-РНК.
Смысловую цепь миРНК структурных формул (23) и (24) получали путем синтеза n гексаэтиленгликолей, имеющих форму β-цианоэтилфосфорамидита на основе 3' Uny-CPG, полученной в примере 1 публикации корейского патента №10-2012-0119212 в качестве подложки, и синтеза смысловой цепи конструкции олиго-РНК-гидрофильный материал, к которой присоединен гексаэтиленгликоль к 3'-концу описанным выше способом, в котором фосфодиэфирная связь, формирующая структуру основной цепи РНК, связана путем использования РНК β-цианоэтилфосфорамидита и присоединения тетрадокозана, содержащего дисульфидную связь, к 5'-концу, с получением тем самым смысловой цепи желаемой конструкции РНК-полимер. Что касается антисмысловой цепи, которую гибридизуют со смысловой цепью, антисмысловую цепь, имеющую комплементарную смысловой цепи последовательность, получали с помощью описанной выше реакции.
После завершения синтеза единичную цепь РНК и конструкцию РНК-полимер, синтезированную путем обработки 28% (об/об) раствором аммиака в водяной ванне при 60°С, отделяли от CPG и защитные группы удаляли с помощью реакции снятия защиты, соответственно. Единичную цепь РНК и конструкцию РНК-полимер, из которой удалены защитные группы, обрабатывали N-метилпирролидоном, триэтиламином и триэтиламинтригидрофторидом в объемном соотношении 10:3:4 в печи при 70°С для удаления 2' TBDMS (трет-бутилдиметилсилил).
РНК продукта реакции отделяли и очищали путем HPLC на жидкостном хроматографе LC918 (Japan Analytical Industry, Japan), оснащенном колонкой Daisogel C18 (Daiso, Japan) и подтверждали соответствие очищенной РНК целевой нуклеотидной последовательности при помощи масс-спектрометра MALDI-TOF (SHIMADZU, Japan). Затем, для получения каждой двухцепочечной конструкции олиго-РНК смысловую цепь и антисмысловую цепь в эквивалентном количестве смешивали и помещали в буфер IX для гибридизации (30 мМ HEPES, 100 мМ ацетат калия, 2 мМ ацетат магния (рН от 7,0 до 7,5)) с последующей реакцией в водяной ванне при постоянной температуре 90°С в течение 3 минут и повторной реакцией при 37°С с получением тем самым каждой двухцепочечной конструкции олиго-РНК, содержащей миРНК, имеющую последовательность сурвивина в качестве смысловой цепи. С помощью электрофореза подтверждали, что полученные двухцепочечные конструкции олиго-РНК были загибридизованы.
Пример 5.2. Получение SAMiRNA, включающей этиленгликоль, в которую введена аминогруппа, в качестве мономера гидрофильного материала
Получали двухцепочечную конструкцию олиго-РНК, представленную ниже структурной формулой (25), в которой аминогруппа введена в гидрофильный материал.
Структурная формула (25)
Структурная формула (25), в частности, представлена ниже структурной формулой (26):
Структурная формула (26)
6
4
24
В структурных формулах (25) и (26) S представляет собой смысловую цепь миРНК; AS представляет собой антисмысловую цепь миРНК; гексаэтиленгликоль представляет собой гидрофильный материал; С представляет собой линкер, содержащий 6 атомов углерода, соединяющих [этиленгликоль] и амин, С представляет собой гидрофобный материал и тетрадокозан, содержащий дисульфидную связь; и 5' и 3' означают направления конца двухцепочечной олиго-РНК.
Кроме того, блок гидрофильного материала соединен с фосфатной группой на 3'-конце смысловой цепи миРНК.
Смысловую цепь миРНК структурных формул (25) и (26) получали путем синтеза 4 гексаэтиленгликолей, имеющих форму β-цианоэтилфосфорамидита, нагруженных на CPG, включая производное 3'-сукцинимида, в качестве подложки, и синтеза смысловой цепи конструкции олиго-РНК-гидрофильный материал, к которой гексаэтиленгликоль присоединен к 3'-концу описанным выше способом, в котором фосфодиэфирная связь, формирующая структуру основной цепи РНК, связана путем использования РНК β-цианоэтилфосфорамидита и присоединения тетрадокозана, содержащего дисульфидную связь, к 5'-концу, с получением тем самым смысловой цепи желаемой конструкции РНК-полимер. В отношении антисмысловой цепи, которую гибридизуют со смысловой цепью, антисмысловую цепь, имеющую комплементарную смысловой цепи последовательность, получали с помощью описанной выше реакции.
После завершения синтеза единичную цепь РНК и конструкцию РНК-полимер, полученную путем обработки 28% (об/об) раствором аммиака в водяной ванне при 60°С, отделяли от CPG и защитные группы удаляли с помощью реакции снятия защиты, соответственно. Единичную цепь РНК и конструкцию РНК-полимер, каждую, из которой были удалены защитные группы, обрабатывали N-метилпиролидоном, триэтиламином и триэтиламинтригидрофторидом в объемном соотношении 10:3:4 в печи при 70°С для удаления 2' TBDMS (трет-бутилдиметилсилил).
РНК продукта реакции отделяли и очищали путем HPLC на жидкостном хроматографе LC918 (Japan Analytical Industry, Japan), оснащенном колонкой Daisogel C18 (Daiso, Japan) и подтверждали соответствие очищенной РНК целевой нуклеотидной последовательности при помощи масс-спектрометра MALDI-TOF (SHIMADZU, Japan). Затем, для получения каждой двухцепочечной конструкции олиго-РНК смысловую цепь и антисмысловую цепь в эквивалентном количестве смешивали и помещали в буфер IX для гибридизации (30 мМ HEPES, 100 мМ ацетат калия, 2 мМ ацетат магния (рН от 7,0 до 7,5)) с последующей реакцией в водяной ванне при постоянной температуре 90°С в течение 3 минут и повторной реакции при 37°С с получением тем самым каждой двухцепочечной конструкции олиго-РНК, содержащей миРНК, имеющей последовательность сурвивина в качестве смысловой цепи (далее в настоящем документе называемую как SAMiRNA-сурвивин, соответственно). С помощью электрофореза подтверждали, что полученная двухцепочечная конструкция олиго-РНК была загибридизована.
Пример 5.3. Получение SAMiRNA, включающей этиленгликоль, с введенной полигистидиновой группой, в качестве мономера гидрофильного материала
Получали двухцепочечную конструкцию олиго-РНК, представленную ниже структурной формулой (27), в которой пептид введен в гидрофильный материал.
Структурная формула (27)
В структурной формуле (27) Н представляет собой гистидин, и С представляет собой цистеин.
Структурная формула (27), в частности, представлена ниже структурной формулой (28):
Структурная формула (28)
4
24
В структурных формулах (27) и (28) S представляет собой смысловую цепь миРНК; AS представляет собой антисмысловую цепь миРНК; [этиленгликоль] представляет собой гидрофильный материал; линкер представляет собой связь между пептидом и SAMiRNA, пептид представляет собой пептид, состоящий из последовательности ННННННС; С представляет собой гидрофобный материал и тетрадокозан, содержащий дисульфидную связь; и 5' и 3' означают направления конца двухцепочечной олиго-РНК.
Кроме того, блок гидрофильного материала соединен с фосфатной группой на 3'-конце смысловой цепи миРНК.
Смысловую цепь миРНК с структурных формулах (27) и (28) получали путем соединения линкера, содержащего функциональную группу (например: NHSester), присоединенную к аминам, и функциональную группу (например: малеимид), присоединенную к тиолу (-SH) пептида, с олигонуклеотидом, представленным структурными формулами (25) и (26) примера 5-2. В частности, линкер присоединяли к олигонуклеотиду, имеющему конструкцию согласно структурным формулам (25) и (26), и затем очищали при помощи HPLC или смолы. Пептид присоединяли к очищенному олигонуклеотиду и очищали с помощью HPLC с получением тем самым смысловой цепи миРНК. В отношении антисмысловой цепи, которую гибридизуют со смысловой цепью, антисмысловую цепь, имеющую комплементарную смысловой цепи последовательность, получали с помощью описанной выше реакции. РНК продукта реакции отделяли и очищали путем HPLC на жидкостном хроматографе LC918 (Japan Analytical Industry, Japan), оснащенном колонкой Daisogel C18 (Daiso, Japan), и подтверждали соответствие очищенной РНК целевой нуклеотидной последовательности при помощи масс-спектрометра MALDI-TOF (SHIMADZU, Japan). Затем, для получения каждой двухцепочечной конструкции олиго-РНК смысловую цепь и антисмысловую цепь в эквивалентном количестве смешивали и помещали в буфер IX для гибридизации (30 мМ HEPES, 100 мМ ацетат калия, 2 мМ ацетат магния (рН от 7,0 до 7,5)) с последующей реакцией в водяной ванне при постоянной температуре 90°С в течение 3 минут и повторной реакции при 37°С с получением тем самым каждой двухцепочечной конструкции олиго-РНК, содержащей миРНК, имеющую последовательность сурвивина в качестве смысловой цепи (далее в настоящем документе называемую как SAMiRNA-сурвивин, соответственно). С помощью электрофореза подтверждали, что полученная двухцепочечная конструкция олиго-РНК была загибридизована.
Пример 6. Ингибирование экспрессии целевого гена в клеточной линии HeLa с использованием наночастиц, образованных двухцепочечной структурой олиго-полимер (гексаэтиленгликоль-SAMiRNA
Клеточную линию рака шейки матки (HeLa) трансформировали с использованием наночастиц, образованных Гексаэтиленгликоль-SAMiRNA, включающей последовательности миРНК, которые могут уменьшать величину экспрессии сурвивина, и экспрессию целевого гена анализировали в трансформированной клеточной линии рака шейки матки (HeLa) на уровне РНК.
Пример 6-1. Культура клеточной линии рака шейки матки человека
Клетки рака шейки матки человека (HeLa), полученные от Американской коллекции типовых культур (American type Culture Collection, АТСС), культивировали в таких же условиях, как описано в примере 5-1.
Пример 6-2. Трансфекция Гексаэтиленгликоль-SAMiRNA, в которую введена аминогруппа, в клеточную линию рака шейки матки человека
5
2
2
0.8×10 клеток клеточной линии рака шейки матки (HeLa), культивированных в примере 6-1, культивировали в среде ЕМЕМ в течение 18 часов в 12-луночном планшете в условиях 37°С и 5% (об/об) СО, и среду удаляли, и в каждую лунку вносили такое же количество среды Opti-MEM (GIBCO, США). Полученную смесь сушили лиофилизацией при -75°С и 5 мм рт.ст. (Torr) в течение 48 часов таким же способом, как описано в примере 5-1, с получением однородных наночастиц. Добавляли гексаэтиленгликоль-SAMiRNA, полученную в примере 5-1, и растворяли в DPBS при концентрации 50 мкг/мл, и обрабатывали в среде Opti-MEM (1 мл) в соответствии с концентрациями 50, 100 и 200 нМ. Вносили среду Opti-MEM, содержащую гексаэтиленгликоль-SAMiRNA, и обрабатывали в каждой лунке опухолевой клеточной линии в соответствии с концентрацией, и полученный продукт культивировали в условиях 37°С и 5% (об/об) СО в течение в общей сложности 24 часов и 48 часов.
Пример 6-3. Сравнительный количественный анализ мРНК целевого гена
кДНК получали путем экстракции общей РНК из трансфицированной клеточной линии, полученной в примере 6-2, таким же способом, как описано в примере 4-3, и величину экспрессии мРНК целевого гена измеряли путем сравнительного количественного анализа методом PCR в режиме реального времени. Наблюдалось, что величина ингибирования экспрессии целевого гена после обработки гексаэтиленгликоль-SAMiRNA, в которую была введена аминогруппа, очевидным образом подтверждала эффективность гексаэтиленгликоль-SAMiRNA с введенной аминогруппой по сравнению с контрольной группой гексаэтиленгликоль-SAMiRNA (фигура 18).
Благоприятные эффекты
Олигонуклеотидная конструкция в соответствии с настоящим изобретением может содержать все части из одного и того же гидрофильного материала, благодаря чему могут быть значительно снижены проблемы, связанные с контролем качества и т.п., вызванные показателем полидисперсности, возникающие, когда гидрофильный материал, присоединенный к олигонуклеотиду, представляет собой синтетический полимер. Кроме того, по сравнению с существующим в настоящее время процессом очистки с использованием полидисперсных гидрофильных материалов, способ получения олигонуклеотидной конструкции в соответствии с настоящим изобретением может быть более простым, можно уменьшить затраты на синтез, и можно легко выполнить анализ материала олигонуклеотидной конструкции. Кроме того, размер наночастиц можно регулировать путем контроля числа повторов блоков гидрофильного материала и мономеров гидрофобного материала в каждом блоке гидрофильного материала.
В частности, когда в олигонуклеотидной конструкции в соответствии с настоящим изобретением лиганд дополнительно присоединен к рецептору, который способствует интернализации в клетку-мишень посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза (RME), доставка в клетку-мишень осуществляется более эффективно. Кроме того, когда лиганд представляет собой сахар, вместе с нацеливающим эффектом наночастиц, гидрофильность, которая уменьшается в зависимости от числа повторов блоков гидрофильного материала, может содействовать улучшению внутриклеточной доставки олигонуклеотида и повышению эффективности олигонуклеотида с точки зрения контроля экспрессии генов.
Кроме того, после поглощения клеткой олигонуклеотидной конструкции олигонуклеотид может легко выходить из эндосомы и может обладать эффектом ингибирования расщепления лизосомой, таким образом, может быть получен более высокий лечебный эффект путем введения аминогруппы или полигистидиновых групп в блок гидрофильного материала.
Исходя из указанного выше специалисту в области, к которой относится настоящее изобретение, будет понятно, что настоящее изобретение может быть воплощено в других конкретных вариантах осуществления без изменения его технической сущности или существенных признаков. В этом отношении должно быть понятно, что указанные выше примеры во всех аспектах являются иллюстративными, но не ограничивающими. Объем настоящего изобретения должен рассматриваться как включающий смысл и объем прилагаемых пунктов формулы изобретения, и все изменения и модифицированные формы, которые получены скорее из его эквивалентной концепции, чем подробного описания.