Способ оценки уровня резистентности организма детей I-II группы здоровья по вирусному компоненту микробиоты полости рта
METHOD FOR ASSESSING THE LEVEL RESISTANCE OF CHILDREN I-II OF THE HEALTH GROUP BY THE ORAL CAVITY MICROBIOTA VIRUS COMPONENT

Изобретение относится к области медицины, а именно к микробиологии, лабораторной диагностике и педиатрии, и может быть использовано для скрининговой оценки состояния резистентности организма детей, ассоциированной с наличием герпесвирусов в ротовой жидкости на донозологическом этапе при проведении диспансеризации с последующим формированием групп риска.
Многочисленные исследования последнего десятилетия подтверждают, что микробиота пищеварительного тракта является важным регулятором физиологических процессов, иммунной резистентности и поведения. Микробиом - это интегральная часть физиологии человека. Микробиота пищеварительного тракта, наиболее многочисленного по спектру и количеству представителей микроэкосистемы биотопа включает облигатную и факультативную микрофлору, которая представлена широким спектром микроорганизмов, включая бактерии, простейшие, грибы и вирусы. Микроорганизмы взаимодействуют друг с другом, как динамическая экосистема, состояние которой определяется состоянием локальной иммунной резистентности, а также действием целого ряда других эндогенных и экзогенных факторов [1-7].
Полость рта является входными воротами пищеварительной и бронхолегочной систем и определяет колонизационную резистентность и формирование микробиоты других биотопов и здоровья детей в целом. Из данных литературы и наших предшествующих исследований, следует, что микробиота полости рта отражает микробиоту пищеварительного тракта в целом и может рассматриваться как интегральный показатель здоровья человека. Кроме того, слюна является клинически информативной и доступной биологической жидкостью, которая содержит множество биомаркеров, отличающихся стабильностью, точностью обнаружения, включающую высокую чувствительность, специфичность и воспроизводимость анализов, простоту выполнения и экономическую эффективность клинико-диагностических алгоритмов [8-14].
Следует подчеркнуть, что сегодня большое внимание уделяется превентивной медицине, позволяющей выявлять проблему на донозологическом этапе при проведении диспансерного наблюдения, что оправдано с точки зрения личных, социальных и экономических аспектов. Это делает актуальным поиск биомаркеров, позволяющих оценить уровень резистентности и проведение объективных, в частности, лабораторных исследований [15-18].
Сегодня, комплексная оценка состояния здоровья детей проводится в соответствии с Инструкцией по комплексной оценке здоровья детей, утвержденной приказом Министерства здравоохранения Российской Федерации №621 от 30 декабря 2003 года (Приложение 1) и включает в себя 4 базовых критерия: 1) наличие или отсутствие функциональных нарушений и/или хронических заболеваний; 2) уровень функционального состояния основных систем организма; 3) степень сопротивляемости организма неблагоприятным внешним воздействиям; 4) уровень достигнутого развития и степень его гармоничности. В соответствии с этим документом регламентирована оценка уровня резистентности с определением высокой, средней, низкой и очень низкой степени, катамнестически, в частности, на основании перенесенных в течении года острых заболеваний, но в данном нормативном акте не определены параметры оценки объективных лабораторных критериев и возможность прогнозирования на следующий эпикризный срок.
Известен «Способ прогнозирования частоты развития у детей острых инфекционных заболеваний на первом году жизни» (Н.В. Бугрым, И.И. Логвинова, №2431147), заключающийся в определении на первые и пятые сутки после рождения ряда показателей иммунного статуса, включая абсолютное число лимфоцитов, носителей маркеров дифференцировки CD3, CD4, CD8, CD19, CD56, CD95, НСТсп, уровня фагоцитарного показателя, концентрациив сыворотке крови иммуноглобулинов класса А, М, G и далее определения индекса прогнозирования с использованием определенного уравнения множественной линейной регрессии, с последующим определением вероятности возникновения того или иного количества инфекционных заболеваний. Недостатками этого метода являются его инвазивность и невозможность учета социально-средовых факторов и особенностей онтогенеза ребенка в процессе его роста и развития на первом году жизни, а также отсутствие параметров для оценки микроэкологии, тесно взаимосвязанной с состоянием здоровья ребенка, особенно на первом году жизни.
Известен «Способ оценки состояния здоровья человека при прогнозировании течения инфекционного заболевания» (С.С. Афанасьев, В.А. Алешкин, Е.А. Воропаева и др., №2595863), который состоит в том, что при прогнозировании течения инфекционного заболевания оценивают показатели микробиотопа слизистых открытых полостей и определяют на их основе степень нарушения микробиотопа слизистых открытых полостей как показатель степени нарушения микробиоценоза биотопа слизистых открытых полостей, в зависимости от полученного результата судят о состоянии здоровья человека и прогнозируют течение инфекционного заболевания. Достоинством этого метода является определение микробиоты открытых полостей, как интегрального показателя для оценки состояния здоровья, однако данный метод используется для прогнозирования течения инфекционного заболевания, вирусный компонент в данном методе у людей различных возрастных групп не определялся.
Известен «Способ диагностики уровня здоровья в критические периоды постнатального онтогенеза у детей и подростков» (М.А. Борисова, Ю.А. Алексеева, С.М. Кушнир, №2229846), позволяющий определить здоровье ребенка, в различные критические периоды (2-4, 6-8, 13-16 лет) постнатального онтогенеза. Проводится определение широкого спектра диагностических коэффициентов информативных факторов и критериев (отягощенные генеалогический, социально-средовой и биологический анамнез, уровеньфизического развития, отклонение НПР, уровень резистентности, особенности вегетативной регуляции, ряд биохимических показателей, включая определение кальция, калия, лактата и др.). По данным исследования подсчитывают диагностический коэффициент критического периода с помощью формулы, вычисляющей площадь трапеции. Способ позволяет упростить и повысить точность диагностики. Однако, этот метод не учитывает параметры, определяющие состояние микроэкологии, которое является важным интегральным показателем для оценки резистентности организма в целом.
Наиболее близким к заявленному авторами способу является «Способ прогнозирования риска снижения уровня резистентности организма к острым респираторным заболевания у детей в возрасте 3-7 лет по индексу авидности секреторного иммуноглобулина А» (Т.А. Федотова, С.В. Жуков, С.М. Кушнир, Л.К. Антонова, О.В. Калинина, №2445915), заключающийся в определении концентрации секреторного иммуноглобулина А методом иммуноферментного анализа и авидности антител. При значении индекса авидности менее 0,89 или более 0,27 ребенка относят в группу риска снижения уровня резистентности организма к острым респираторным заболеваниям, недостатком является отсутствие оценки микроэкологических параметров полости рта, необходимых для определения состояния резистентности у детей.
Недостатками прототипа являются, во-первых, то, что в данном способе ограничен возрастной контингент, это дети 3-7 лет, тогда как оценка резистентности должна проводиться и в другие возрастные периоды. Во-вторых, указанный способ, являясь неинвазивным подходом, ограничен определением показателя состояния локальной иммунной резистентности, секреторного иммуноглобулина А и его авидности, тогда как состояние микроэкосистемы является важным параметром для оценки состояния резистентности. В-третьих, риск снижения резистентности сопряжен с действием целого ряда экзогенных и эндогенных факторов, в частности, состоянием вирусного компонента микробиоты полости рта, ассоциированного с герпесвирусами.
При изучении научно-технической патентной информации идентичная совокупность существенных признаков, заявленная в изобретении, позволяющих провести оценку состояния резистентности у детей по вирусному компоненту микробиоты полости рта, нами не обнаружена.
Заявляемый способ решает задачу скрининговой оценки состояния резистентности организма детей, ассоциированной с наличием герпесвирусов в ротовой жидкости на донозологическом этапе при проведении диспансеризации с последующим формированием групп риска и разработкой методов превентивной коррекции.
Техническим результатом на достижение, которого направлено создание данного изобретения, является определение уровня резистентности организма детей I-II группы по вирусному компоненту микробиоты полости рта. Наличие представителей герпесвирусов в ротовой жидкости у детей отражают снижение общей резистентности, включая состояние локальной иммунной резистентности и бактериально-грибкового компонента, что позволяет отнести таких детей к группе риска.
Осуществление. Ротовая жидкость собирается утром, натощак, до проведения гигиенического ухода за полостью рта в стерильные одноразовые пластиковые пробирки с реагентом для транспортировки и хранения клинического материала «Транспортная среда с муколитиком», утвержденным ФГУН Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора. Процедура взятия и хранения клинического материала проводится в соответствии с методическими рекомендациями «Взятие, транспортировка, хранение клинического материала для ПЦР-диагностики» ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, М., 2008 г. Ротовая жидкость доставляется в молекулярно-генетическую лабораторию в течение суток. Далее в лаборатории проводится исследование ротовой жидкости методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Для амплификации нуклеиновых кислот используют комплекты реагентов "АмплиСенс EBV/CMV/HHV6-скрин-FL» (набор реагентов для амплификации ДНК вируса Эпштейна-Барр, цитомегаловируса и вируса герпеса человека 6типа), «АмплиСенс HSV-typing-FL» (набор реагентов для амплификации ДНК вирусов простого герпеса и генотипирования 1 и 2 типов) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени» ФГУН Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора и амплификатор AppliedBioSystem.
В рамках проведения научно-исследовательской работы было обследовано 127 детей различных возрастных групп, которые были статистически сопоставимы по возрасту и полу. Все обследованные добровольцы были клинически здоровы и относились к I-II группе здоровья согласно Приказу Минздрава РФ №621 от 30.12.2003. Все лица были осмотрены педиатром, терапевтом и узкими специалистами (стоматолог, отоларинголог, хирург, эндокринолог), проведены ряд функциональных исследований (антропометрия, физиометрия, соматоскопия, кардио-респираторные нагрузочные пробы, спирография, УЗИ щитовидной железы и органов брюшной полости, 12-канальная ЭКГ, энцефалография).
Для исследования бактериальной составляющей микробиоты полости рта проводилось определение качественного и количественного состава микрофлоры ротовой жидкости, являющейся интегральной средой этого биотопа с использованием классических методик, позволяющих выделить известных представителей индигенной, факультативной и транзиторной микрофлоры. При изучении бактериального компонента микробиоты полости рта были выделены три микроэкологических варианта нормомикробиоты, которые характеризуются различным сочетанием индигенной и факультативной микрофлоры. Методика определения варианта микробиоты является объектом интеллектуальной собственности (патент №2602697), где наиболее оптимальным является первый, а более неблагоприятным - третий вариант микробиоты.
Для определения состояния иммунной резистентности в ротовой жидкости были исследованы уровни лизоцима (турбидиметрия), секреторного IgA иавидности антител с использованием иммуноферментного анализа («Вектор-Бест»).
Сопоставляя результаты молекулярно-генетического исследования вирусного компонента полости рта у лиц с различными вариантами бактериальной микрофлоры, выявлено, что вируспозитивные образцы составили 29,4%, 42,2% и 85,3% соответственно для первого, второго и третьего варианта нормомикробиоты. Частота выявления ДНК вируса Эпштейна-Барр и вируса герпеса 6 типа была достоверно выше у лиц с третьим вариантом по сравнению с первым вариантом микробиоты (р≤0,05). Ассоциации вирусов были выявлены чаще у лиц с третьим вариантом нормомикробиоты. Это показывает, что при нарастании микроэкологических изменений в бактериальном звене, характеризующихся увеличением количества УПМ на фоне снижения облигатной микрофлоры, происходит достоверное увеличение частоты выявления вирусов (табл. 1).
Исследование показателей иммунной резистентности полости рта в аспекте бактериально-вирусных вариантов нормомикробиоценоза показало, что у лиц с третьим вариантом микробиоты пищеварительного тракта наблюдалось увеличение концентрации секреторного IgA в ротовой жидкости по сравнению со вторым и особенно первым вариантом микробиоты. Однако это сопровождалось снижением авидности антител, их функциональной активности у лиц с третьим вариантом микробиоты пищеварительного тракта, и снижением уровня лизоцима, что свидетельствует об изменениях неспецифической иммунной реактивности и указывает на тесную динамическую взаимосвязь микроэкологии и резистентности полости рта у здоровых людей (табл. 2).
Таким образом, в ходе проведенного исследования была выявлена взаимосвязь между бактериально-грибковым и вирусным компонентом микробиоты полости рта, а также параметрами локальной иммунной резистентности. По результатам проведенного исследования была создана база данных, включающая клинико-анамнестические, молекулярно-генетические и бактериологические, биохимические показатели, где наиболее значимым дляоценки резистентности организма детей является вирусный компонент, ассоциированный с представителями герпесвирусов.
На основании количества представителей герпесвирусов нами были выделены три степени резистентности организма у детей: низкая, средняя, высокая.
При отсутствии в микробиоте полости рта представителей герпесвирусов у детей I-II группы здоровья определяют высокий уровень резистентности.
При наличии ДНК одного представителя герпесвируса у ребенка I-II группе здоровья определяют средний уровень резистентности, что требует более частого диспансерного наблюдения.
Определение в вирусном компоненте микробиоты полости рта ДНК двух и более герпесвирусов у детей I-II группы здоровья соответствует низкому уровню резистентности, что требует использование рациональных методов превентивной коррекции (табл. 3).
Новыми, ранее не известными признаками заявленного способа оценки уровня резистентности организма здоровых детей по вирусному компоненту микробиоты полости рта являются:
1) скрининговая оценка уровня резистентности организма детей по вирусному компоненту микробиоты полости рта.
2) описаны качественные и количественные параметры вирусного компонента микробиоты полости рта, ассоциированного с герпесвирусами на донозологическом этапе при проведении диспансеризации с последующим формированием групп риска.
Сущность заявляемого способа поясняется следующими примерами:
Пример 1. У ребенка I группы здоровья, 8 лет при профилактическом осмотре был осуществлен забор ротовой жидкости, проведено молекулярно-генетическое исследование ротовой жидкости в ходе которого ДНК вируса Эпштейна-Барр, цитомегаловируса, герпеса 6 типа, вирусов простого герпеса 1 и 2 типов не обнаружена. Ребенок имеет высокий уровень резистентности, диспансерное наблюдение соответственно возрасту, рекомендуется повторить молекулярно-генетическое исследование через 12 месяцев.
Пример 2. У ребенка I группы здоровья, 6 лет при профилактическом осмотре был осуществлен забор ротовой жидкости, проведено молекулярно-генетическое исследование ротовой жидкости на наличие ДНК вируса Эпштейна-Барр, цитомегаловируса, герпеса 6 типа, вирусов простого герпеса 1 и 2 типов. В ротовой жидкости выявлена ДНК вируса Эпштейна-Барр. Ребенок имеет средний уровень резистентности, рекомендуется повторить молекулярно-генетическое исследование через 6 месяцев, рекомендовать методы поддержания резистентности организма.
Пример 3. У ребенка II группы здоровья, 12 лет при профилактическом осмотре был осуществлен забор ротовой жидкости, проведено молекулярно-генетическое исследование ротовой жидкости на наличие ДНК вируса Эпштейна-Барр, цитомегаловируса, герпеса 6 типа, вирусов простого герпеса 1 и 2 типов. В ротовой жидкости выявлена ДНК вируса Эпштейна-Барр и герпеса 6 типа. Ребенок имеет низкий уровень резистентности и относится к группе риска, рекомендуется повторный осмотр педиатра через 3 месяца, повторить молекулярно-генетическое исследование через 6 месяцев, рекомендовать методы поддержания поддержания локальной иммунной и микроэкологической резистентности.
Выявление низкого, среднего и высокого уровня резистентности организма детей требует различного подхода при проведении диспансеризации с последующим назначением коррекционных профилактических мероприятий.
Список литературы
1. Шендеров Б.А. Микробная экология человека и ее роль в поддержании здоровья. Метаморфозы, 2014, №5, С. 72-80.
2. Buccigrossi V, Nicastro Е, Guarino A. Functions of intestinal microflora in children. Curr. Opin. Gastroenterol, Jan 2013, vol. 29(1), pp. 31-39.
3. Щеплягина Л.А., Круглова И.В., Перцева В.А. Секреторный иммунитет кишечника у детей раннего возраста. Consilium medicum, 2011, №3, С. 9-11.
4. Irschick EU, Philipp S, Shahram F, Schirmer M, Sedigh M, Ziaee N, Gassner C, Schennach H, Meyer M, Larcher C, Herold M, Schoenitzer D, Fuchs D, Schoen-bauer M, Maass M, Huemer HP, Davatchi F. Investigation of bacterial and viral agents and immune status in Behcet's disease patients from Iran. - Int J Rheum Dis - August 1, 2011; 14(3); 298-310
5. Ly M, Abeles SR, Boehm TK, Robles-Sikisaka R, Naidu M, Santiago-Rodriguez T, Pride DT. Altered oral viral ecology in association with periodontal disease. - MBio - January 1, 2014; 5 (3); 1133-14
6. Sassone-Corsi M, Raffatellu M. No vacancy: how beneficial microbes cooperate with immunity to provide colonization resistance to pathogens. J. Immunol, May 2015, 194 (9), pp. 4081-4088.
7. Taspinar M, Cetin N, Gerceker D, Karasartova D, Turegun B, Ozturk S, Sahin F. HHV-6 is ubiquitously found using Western blot in tonsils and adenoid tissues of healthy people. New Microbiol, July 2013, 36 (3), pp. 251-257.
8. Ронь Г.И., Балян Л.Н. Экологическая система и иммунитет полости рта. Проблемы стоматологии, 2012, №2, С. 8-12.
9. Robles-Sikisaka R, Ly М, Boehm Т, Naidu М, Salzman J, Pride DT. Association between living environment and human oral viral ecology. ISME J, September 2013, 7 (9), pp. 1710-1734.
10. Pinheiro Rdos S, Ferreira Dde C,  F, Santos NS, Souza IP, Castro GF. Current status of herpesvirus identification in the oral cavity of HIV-infected children. Rev. Soc. Bras. Med. Trop., January 2013, 46 (1), pp. 15-24.
11. Bezerra TM, Ferreira DC, Carmo FL, Pinheiro R, Leite DC, Cavalcante FS, Belinho RA, Peixoto RS, Rosado AS, dos Santos KR, Castro GF. Herpesvirus in the oral cavity of children with leukaemia and its impact on the oral bacterial community profile. J. Clin. Pathol., March 2015, 68 (3), pp.222-230.
12. Кочурова E.B., Козлов С.В. Диагностические возможности слюны. Клиническая лабораторная диагностика, №1, 2014, С. 13-15
13. Михайлова Е.С, Самоукина A.M., Чернин В.В., Жмакин И.А. Микробиоценоз полости рта как отражение микробиоценоза кишечника. Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология, 2016, №2, выпуск 186, С. 111-115
14. Богатов В.В., Червинец В.М., Самоукина A.M., Насонова М.В., Лебедев С.Н. Роль вирусов с онкогенным потенциалом и их ассоциаций в генезе новообразований челюстно-лицевой области. Стоматология, 2015, №1, Том 94, С. 23-24.
15. Самоукина A.M., Алексеева Ю.А., Михайлова Е.С., Денисова Е.В., Жуков С.В. Взаимосвязь микробиоты различных биотопов у детей в норме и при патологических состояниях // Современные проблемы науки и образования. - 2018. - №2; URL: http://www.science-education.ru/article/view?id=27537 (дата обращения: 26.04.2018).
16. Самоукина A.M., Насонова М.В., Михайлова Е.С., Алексеева Ю.А., Веселова Н.А. Бактериально-вирусные ассоциации полости рта у здоровых людей и при новообразованиях челюстно-лицевой области. Лечение и профилактика, выпуск «Инфекционные болезни», 2016, №4 (20), С. 29-34
17. Давыдов Б.Н., Самоукина A.M., Михайлова Е.С., Гаврилова О.А., Алексеева Ю.А. Варианты микрофлоры ротовой жидкости у практически здоровых детей и подростков. Стоматология, 2017, №1, Том 96, С. 56-59
18. Самоукина A.M., Михайлова Е.С., Чернин В.В., Алексеева Ю.А Микробиота пищеварительного тракта как системный фактор оценки здоровья человека и проведения превентивной коррекции. Лечение и профилактика, 2015, №3 (15), С. 23-28.