СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ МИКОЗОВ У ЖИВОТНЫХ
METHOD OF PREPARING CULTURE MEDIUM FOR ISOLATING MYCOSIS CAUSATIVE AGENTS IN ANIMALS

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в диагностических целях для выделения и изучения свойств возбудителей микозов у животных.
Возбудителями микозов у животных могут быть различные совершенные грибы из класса фикомицетов - плесневые грибы, дрожжеподобные грибы, а также дерматомицеты (Ветеринарная микробиология и иммунология. / Под ред. Н.А.Радчука. - М.: Агропромиздат, 1991. - С.341).
По своим физиологическим свойствам они не требовательны к питательным средам, поэтому могут расти на простых искусственных средах, широко используемые в микробиологии - мясо-пептонном бульоне и мясо-пептонном агаре. Однако интенсивность их развития из споровой до вегетативной формы составляет несколько дней, поэтому при посеве патологического материала (пораженные волосы и чешуйки кожи) раньше вырастают различные сапротрофные бактерии (т.к. период деления многих из них составляет 15-30 мин), которые являются конкурентами и антагонистами грибов. Данное обстоятельство побуждает микробиологов использовать специальные среды.
Одной из наиболее близких сред к заявляемому способу (прототип) для выделения и выращивания возбудителей микозов человека и животных является среда Сабуро (Н.И.Розанов Микробиологическая диагностика заболеваний сельскохозяйственных животных / М.: Государственное из-во сельскохозяйственной литературы, 1952. - С.106;
Сергеев А.Ю., Сергеев Ю.В. Грибковые инфекции: Руководство для врачей / М.: ООО «Бином-пресс», 2004. - С.45-46), в которой смешивают глюкозу, ферментативный пептон, агар и растворяют в дистиллированной воде, фильтруют, фасуют и автоклавируют.
Достоинством известной среды является то, что за счет высокого содержания углевода в ней, а следовательно, высокой осмотичности, сдерживается рост бактериальной микрофлоры, в отличие от грибной, которая хорошо развивается.
Между тем среда Сабуро имеет недостатки, которые заключаются в следующем:
1. Приготовление среды связано со значительными временными затратами, поскольку смешанные ингредиенты сначала кипятятся до расплавления агара, затем среда фильтруется, разливается по флаконам (колбам) и автоклавируется. Весь цикл приготовления среды занимает 3-4 ч.
2. Поскольку среда не содержит специальных селективных добавок, а ее рН находится в пределах 6,5-7,5, то на ней все же через 18-24 ч развиваются бактерии, чаще всего это представители рода Bacillus, характеризующиеся малым временем генерации и образованием колоний большого размера, часто слизистых, быстро заполняющих поверхность агаровой пластинки и тем самым препятствующих росту грибов, активная вегетация которых начинается только на 3-4 сутки, а спороношение, по которому идентифицируются большинство микроскопических грибов, только на 5-7 сутки. В связи с этим известно, что для диагностики грибных болезней (Диагностика грибных болезней животных / Под ред. А.Х.Саркисова. - М.: Колос, 1971. - С.13) перед посевом пораженных волос или кожных корочек их предварительно обрабатывают в течение нескольких минут в 60° этиловом спирте, после чего промывают стерильной водой и подсушивают. Но для выделения дрожжеподобных грибов этот метод не годится, т.к. они чувствительны к спирту.
Техническим решением задачи является обеспечение сокращения времени приготовления среды, повышение ее селективных свойств и экономичности.
Поставленная задача достигается тем, что в способе приготовления питательной среды для выделения возбудителей микозов у животных, включающем смешивание ферментативного пептона, глюкозы, агара, их растворение в дистиллированной воде, нагрев смеси до кипения, согласно изобретению добавляют янтарную кислоту при следующем соотношении компонентов, мас.%:
ферментативный пептон
9-11
глюкоза
10-20
янтарная кислота
1-2
агар
14-16
дистиллированная вода
остальное,
затем полученную среду фильтруют через фильтр, вновь доводят до кипения, охлаждают и фасуют.
Новизна заявляемого предложения состоит в том, что разработана специальная питательная среда для выделения из патологического материала возбудителей микозов животных. Предварительной обработки патматериала спиртом не требуется, т.к. селективность в отношении микроскопических грибов обеспечивается за счет ввода янтарной кислоты, которая подавляет рост сопутствующей бактериальной флоры (бациллы, стафилококки, энтеробактерии, псевдомонады и др.). Бактерии на данной среде не растут в связи с тем, что рН среды находится в пределах 3,8-4,0, что не приемлемо для них, но для грибов кислая среда даже предпочтительней. Кроме того, янтарная кислота обеспечивает не только селективность за счет снижения рН среды, но и является активным стимулятором роста для грибов, поскольку относится к эрготропным веществам, участвующим в энергетическом обмене (цикле Кребса) эукариотических клеток. Приготовление среды исключает автоклавирование, т.к. кипячение обеспечивает полностью стерильность среды, что сокращает не только время получения среды, но и энергозатраты, а следовательно, является экономически более целесообразной.
Сущность изобретения поясняется фото, где на фото 1 представлен рост грибов на заявляемой питательной среде, где выросли только Aspergillus niger и Trichophyton rubrum; на фото 2 - рост грибов на среде Сабуро: помимо гриба Microsporum на среде выросли колонии бацилл (белого цвета) и микрококков (желтого цвета).
Способ приготовления питательной среды для выделения возбудителей микозов у животных осуществляется следующим образом.
Сухие ингредиенты среды растворяют в теплой воде и доводят до кипения, после расплавления агара среду фильтруют через ватно-марлевый фильтр, повторно доводят до кипения, а затем охлаждают до 45-50°С и разливают в стерильные чашки Петри. Готовая среда прозрачна, светло-желтого цвета.
На данной среде хорошо растут грибы из рода Candida, Microsporum, Trichophyton, Aspergilus, Mucor, Penicillum, Altemaria и др. Результаты сравнительного анализа заявляемого изобретения и аналога представлены в таблице, из которой видно, что заявляемая среда более выгодно отличается от аналога, т.к. на ней микроскопические грибы дают видимый рост и спорообразование в более ранние сроки, на ней полностью подавляется развитие сапротрофных бактерий, время приготовления среды в 5 раз короче, чем аналога. Кроме того, следует отметить, что в предлагаемой среде содержание глюкозы в 2 раза меньше, а следовательно, это также уменьшает стоимость среды. Данные обстоятельства позволяют считать заявляемую питательную среду как патентоспособную.
Таблица.
Качественные характеристики сред для выделения грибов
Показатель
Заявляемая среда
Среда Сабуро (аналог)
Время приготовления 1 л среды, включая розлив в чашки Петри
1 ч
5 ч
Образование видимого роста плесневых грибов и дерматомицетов
Через 24-36 ч
Через 48-72 ч
Образование конидий (спороношение)
Через 68-80 ч
Через 96-168 ч
Наличие сопутствующего роста сапротрофных бактерий
Отсутствует
Имеется
Требуется внесение в среду антибиотиков или обработка патматериала спиртом
Не требуется
Требуется
Пример конкретного осуществления приготовления среды: 10 г ферментативного пептона, который выпускает НПО «Питательные среды», г.Махачкала в соответствии с ГОСТом 13805-76, 15 г глюкозы, 1,5 г янтарной кислоты и 15 г агара растворяют в теплой дистиллированной воде, объем которой увеличивают до 100 мл, доводят до кипения и расплавления агара, затем фильтруют через ватно-марлевый фильтр и вновь доводят до кипения, после чего среду охлаждают до 45-50°С и разливают по чашкам Петри.
Количественное значение ввода в среду глюкозы и янтарной кислоты было подобрано экспериментально. При вводе янтарной кислоты в количестве 0,5-0,8 г на среде вырастали не только грибы, но и появлялись колонии бактерий. При увеличении ввода янтарной кислоты в количестве 2,2-2,5 г задерживался рост самих грибов. При уменьшении количества глюкозы до 5-8 г рост грибов замедлялся, а при увеличении ввода до 3-4 г - никак не сказывалось на ростовых характеристиках среды. Готовая для употребления (разлитая в чашки Петри) среда может храниться без изменения своих свойств в условиях холодильника в течение 10-15 дней, а разлитая в стерильные флаконы - до 6 месяцев.
Удовлетворительного результата добиваемся за счет оптимизации количественного ввода в среду янтарной кислоты. На полученной среде плесневые грибы и дерматомицеты дают видимый рост уже через 24-36 ч инкубации при комнатной температуре, а дрожжеподобные грибы через 12-20 ч при температуре 37°С. Окончательную оценку выросших колоний и идентификацию плесневых грибов и дерматомицетов можно осуществлять через 68-80 ч.