СМЕШАННЫЕ КОБАЛЬТ(II)ОВЫЕ СОЛИ КЕТОКАРБОНОВЫХ И МЕРКАПТОКАРБОНОВЫХ КИСЛОТ ИЛИ ИХ ГИДРАТЫ, ИЛИ ИХ СОЛЬВАТЫ, СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЕ В КАЧЕСТВЕ АНТИДОТОВ ЦИАНИДОВ
MIXED COBALT (II) SALTS OF KETOCARBOXYLIC AND MERCAPTOCARBOXYLIC ACIDS AND HYDRATES THEREOF, OR SOLVATES THEREOF, METHODS FOR PRODUCTION AND USE THEREOF AS CYANIDE ANTIDOTES

Изобретение относится к области органической химии, в частности к новым химическим соединениям, конкретно к неописанным в литературе смешанным кобальт(П)овым солям кетокарбоновых и меркаптокарбоновых кислот общей формулы (I):
2
3
1
3
где R=Н, Alk, R′=Н, Alk, NH, NHCOCH, m=0-3, R″=H, Alk, COOH, n=0-3, где Alk=алкил C-C, или их гидратам, или их сольватам.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Основным представителем группы отравляющих веществ общеядовитого действия является синильная кислота (HCN, цианистоводородная кислота). Рассмотрим ее более подробно.
Синильная кислота впервые синтезирована шведским ученым Карлом Шееле в 1782 г. (считается, что через 4 года Шееле стал жертвой своего открытия, так как внезапно умер в своей лаборатории во время работы). Тогда же обнаружены ее ядовитые свойства. Еще в период наполеоновских войн синильной кислотой предлагали наполнять артиллерийские снаряды. Синильная кислота и ее соли впервые получили широкое применение в сельском хозяйстве в качестве средств борьбы с вредителями плодовых деревьев (1886 г.) и в промышленности для извлечения золота и серебра из руд (с конца XIX в. по настоящее время).
В качестве отравляющего вещества синильная кислота впервые применена 1 июля 1916 г. на р. Сомме французскими войсками против немецких. Выраженного боевого эффекта получить не удалось, так как относительная плотность паров HCN по воздуху меньше 1. Попытки утяжелить пары синильной кислоты путем добавления треххлористого мышьяка, хлорного олова и хлороформа также не привели к созданию боевых концентраций этих паров в атмосфере.
В годы второй мировой войны фашисты применяли синильную кислоту для массового уничтожения людей в газовых камерах, для чего использовали так называемые циклоны (метиловый «циклон А» и этиловый «циклон Б»), которые представляли собой эфиры цианмуравьиной кислоты).
По данным ВОЗ синильная кислота относится к веществам смертельного действия, причем основное боевое состояние синильной кислоты - пар.
Синильная кислота - бесцветная прозрачная жидкость с запахом горького миндаля (при малых концентрациях). Характерный запах ощущается при концентрации в воздухе 0,009 мг/л. Синильная кислота кипит при +25,7°C, замерзает при -13,4°C. Относительная плотность ее паров по воздуху равна 0,93. Пары синильной кислоты плохо поглощаются активированным углем, но хорошо сорбируются другими пористыми материалами.
Синильную кислоту можно рассматривать в качестве нитрила муравьиной кислоты, который существует в двух структурных формах, находящихся в равновесии:
Синильная кислота является очень слабой кислотой, так она может быть вытеснена из своих солей самыми слабыми кислотами (например, угольной):
Поэтому соли синильной кислоты хранят в герметически закрытой посуде.
При взаимодействии со щелочами синильная кислота образует соли, которые по токсичности мало уступают самой синильной кислоте, однако при другом способе введения.
Ниже рассматриваются некоторые химические свойства синильной кислоты, которые нам потребуются при рассмотрении ее антидотов.
Синильная кислота и ее соли взаимодействуют с коллоидной серой или веществами, ее выделяющими, образуя роданиды - нетоксичные продукты:
А с органическими соединениями серы тиоцианаты, которые значительно менее токсичны:
Взаимодействуя с альдегидами и кетонами, синильная кислота и ее соли образуют малотоксичные циангидрины:
Примерами такой реакции является детоксикация цианидов с помощью глюкозы.
Цианиды легко вступают в реакции комплексообразования с солями тяжелых металлов, например с сульфатами железа и меди, что используется при изготовлении химического поглотителя в фильтрующих противогазах. Реакции комплексообразования используются для целей индикации синильной кислоты и ее солей, а кобальтовая соль ЭДТА применяется в качестве антидота.
50
3
Основным путем проникновения паров синильной кислоты в организм является ингаляционный. Не исключается возможность проникновения яда через кожу при создании высоких концентраций паров HCN в атмосфере. Смертельное отравление солями синильной кислоты возможно при проникновении их в организм с зараженной водой или пищей в дозе 70 мг. По данным ВОЗ LD синильной кислоты - 2 г мин/м.
При действии цианидов в высоких концентрациях или больших дозах развивается молниеносная форма отравления. Пострадавший теряет сознание. Развиваются судороги. Кровяное давление после кратковременного подъема падает. Через несколько минут останавливается дыхание, а затем наступает остановка сердечной деятельности.
В относительно невысоких концентрациях HCN приводит к развитию интоксикации замедленной формы течения. Скрытого периода практически нет.
Пары синильной кислоты, поступая в организм с вдыхаемым воздухом, преодолевают легочные мембраны, попадают в кровь и кровью разносятся по органам и тканям. При этом происходит частичная детоксикация, главным образом, путем образования роданистых соединений (тиоцианатов), которые выводятся из организма в основном с мочой и частично со слюной. Фермент родоназа, принимающий участие в этой реакции, находится в митохондриях, главным образом в печени и почках:
В организме синильная кислота вступает во взаимодействие с цистином, цистеином, глутатионом, при этом образуются производные 2-иминотиазолидинкарбоновой кислоты.
В процессе обезвреживания цианидов в организме принимают участие углеводы, при этом образуются малотоксичные циангидрины. Возможно и окисление части синильной кислоты в циановую, которая затем гидролизуется с образованием аммиака и углекислоты.
Механизмы токсического действия цианидов
Установлено, что цианиды вследствие особого химического сродства к трехвалентному железу избирательно, хотя и обратимо взаимодействуют с цитохромоксидазой, нарушая активацию кислорода, вмешиваются в окислительно-восстановительные процессы в тканях. Таким образом, блокируя один из железосодержащих дыхательных ферментов, цианиды вызывают патологическое состояние, известное под названием тканевой или гистотоксической гипоксии, что проявляется удушьем, тяжелыми нарушениями работы сердца, судорогами, параличами.
Острое поражение синильной кислотой может протекать в двух формах: замедленной и молниеносной. По степени тяжести замедленная форма поражения разделяется на легкую, среднюю и тяжелую.
Легкая степень поражения. При ингаляционном поражении ощущается характерный запах горького миндаля, появляются неприятный жгучий металлический вкус во рту, слабость, головокружение, головная боль, затем возникает тошнота, рвота, слюнотечение, онемение кончика языка и затруднение речи. Отмечается выраженная одышка с самого начала интоксикации.
Средняя степень поражения характеризуется тем, что к признакам, возникающим при легкой степени, присоединяются чувство страха смерти, состояние возбуждения. Дыхание становится поверхностным, видимые слизистые оболочки и кожа лица приобретают алую окраску, пульс редкий, напряженный, артериальное давление повышенное. На этом фоне могут наблюдаться клонические судороги и кратковременная утрата сознания.
Тяжелая степень поражения возникает после короткого скрытого периода (минуты) и имеет четыре стадии. Начальная стадия характеризуется субъективными ощущениями (неприятный жгучий горьковатый вкус во рту и характерный запах горького миндаля и др.), затрудняется речь. Возникает выраженная одышка. Наблюдаются гипертензия и тахикардия. Можно наблюдать покраснение конъюнктив.
Диспноэтическая стадия характеризуется значительнымим нарушениями дыхательной деятельности: выраженная одышка, мучительное удушье, затем сменяются брадипноэ с нарушением ритма и глубины дыхания. Нарастает слабость, общее беспокойство, возникает страх смерти. Нарушается, а затем утрачивается сознание. Отмечается мидриаз, появляется экзофтальм. Частота сердечных сокращений замедляется, пульс напряжен. Видимые слизистые оболочки и кожа алого цвета склеры инъецированы.
Судорожная стадия протекает на фоне тонических судорог. Сознание утрачивается, дыхание аритмичное, редкое. Пульс становится еще более редким. Артериальное давление повышено. Отчетливый мидриаз и экзофтальм. Приступы судорог чередуются с кратковременным периодом ремиссии.
Паралитическая стадия характеризуется тем, что судороги ослабевают, тонус мышц снижается, наступает состояние глубокой комы. Дыхание редкое, поверхностное, аритмичное, прерывистое, временами типа Чейна-Стокса. Пульс учащается, аритмичен, артериальное давление резко падает. Смерть наступает от сердечно-легочной недостаточности.
После перенесенного тяжелого отравления часто наблюдаются выраженные функциональные и глубокие структурные нарушения в нервной системе, лежащие в основе синдрома постинтоксикационной токсической энцефалопатии. Тяжелые поражения часто осложняются пневмонией и нарушениями со стороны сердечно-сосудистой системы.
Молниеносная (апоплексическая) форма развивается чрезвычайно быстро, в течение нескольких секунд. Проявляется потерей сознания, тахипноэ, тахикардией, аритмией и судорогами. Смерть отравленного наступает через несколько минут от остановки дыхания.
Механизмы действия антидотов
Метгемоглобинообразователи.
Основные антидоты цианидов относятся к метгемоглобинообразователям - азотистокислый натрий, амилнитрит, 4-диметиламинофенол (антициан) и др. Как и прочие метгемоглобинообразователи, эти вещества окисляют двухвалентное железо гемоглобина до трехвалентного состояния.
Основным механизмом токсического действия цианидов, попавших в кровь, является проникновение в ткани и взаимодействие с трехвалентным железом цитохромоксидазы, которая утрачивает при этом свою физиологическую активность. С железом, находящимся в двухвалентном состоянии (гемоглобин), эти токсиканты не реагируют. Если отравленному быстро ввести в необходимом количестве метгемоглобинообразователь, то образующийся метгемоглобин (железо трехвалентно) будет вступать в химическое взаимодействие с ядами, связывая их и препятствуя поступлению в ткани. Более того, концентрация свободных токсикантов в плазме крови понизится и возникнут условия для разрушения обратимой связи циан-иона с цитохромоксидазой.
Практически эта конкуренция может иметь значение при образовании достаточного количества метгемоглобина в крови:
Следует иметь в виду, что метгемоглобин не способен связываться с кислородом, поэтому необходимо применять строго определенные дозы метгемоглобинообразователей, так как при инактивации гемоглобина более чем на 25-30% развивается гемическая гипоксия.
Метгемоглобин связывает в первую очередь цианид, растворенный в крови. При снижении концентрации цианида в крови создаются условия для восстановления активности цитохромоксидазы и нормализации тканевого дыхания. Это обусловлено обратным током цианида из тканей в кровь - в сторону меньшей его концентрации. Образованный комплекс циан-метгемоглобин - соединение непрочное. Через 1-1,5 ч этот комплекс начинает постепенно распадаться с образованием гемоглобина и цианида. Поэтому возможен рецидив интоксикации. Однако процесс диссоциаций CNMtHb растянут во времени, что благоприятствует частичному обезвреживанию яда путем образования роданистых соединений. Этот процесс ускоряется, если в организм вводить препараты, содержащие серу.
Антидотный эффект диметиламинофенола обусловлен быстрым и стабильным образованием MtHb, стимуляцией угнетенного цианидом тканевого дыхания. Тиосульфат натрия потенцирует его антидотное действие.
Амилнитрит предназначен для оказания первой медицинской помощи.
2
Мощным метгемоглобинообразователем является нитрит натрия (NaNO). При оказании помощи отравленным нитрит натрия вводят внутривенно (медленно) в виде 1-2% раствора в объеме 10-20 мл.
Частичным метгемоглобинообразующим действием обладает метиленовый синий. Основное же действие этого препарата заключается в акцепции им водорода и активации тканевого дыхания. При этом восстановленный метиленовый синий способен окисляться кислородом, доставляемым кровью, с образованием конечного продукта окисления - воды. Препарат вводят внутривенно в виде 1% раствора в 25% растворе глюкозы по 50 мл.
Соли кобальта
Известно, что кобальт образует прочные связи с циан-ионом. Это дало основание испытать соли металла (в том числе хлорид кобальта) в качестве антидота при отравлении цианидами. В результате был получен положительный эффект. Однако неорганические соединения кобальта обладают высокой токсичностью, следовательно, малой терапевтической широтой, что делает сомнительной целесообразность их применения в клинической практике. Были испытаны и другие соединения кобальта, среди испытанных веществ были: ацетат, глюконат, глутамат, гистидинат кобальта и дикобальтовая соль ЭДТА. Наименее токсичной и наиболее эффективной оказалась дикобальтовая соль ЭДТА, которая выпускается в виде 15% раствора в 20% растворе глюкозы под названием келоцианор.
12
Показана эффективность гидроксикобаламина для лечения отравлений цианистым калием, лечебный эффект препарата является результатом образования цианокобаламина (витамин В), Препарат весьма эффективен, малотоксичен, но очень дорог. Во Франции, США и Японии он выпускается в качестве антидота цианидов (одна доза препарата стоит более 2000 $).
Углеводы.
Выраженным антитоксическим действием обладает глюкоза, которая с синильной кислотой образует малотоксичный циангидрин. Кроме того, глюкоза оказывает благоприятное действие на дыхание, функцию сердца и увеличивает диурез. Такие метгемоглобинобразователи, как метиленовый синий и кобальтовая соль ЭДТА, вводятся в растворах глюкозы. Другие углеводы, которые содержат кетогруппу, например фруктоза, менее реакционноспособны.
Последнее время в качестве антидотов цианидов стали предлагаться другие активированные кетоны, которые исследуют в основном при пероральном способе введения. Более подробно они будут рассмотрены ниже.
Вещества, содержащие серу.
Установлено, что одним из путей превращения цианидов в организме является взаимодействие с органическими соединениями серы с образованием роданистых соединений. Образующиеся роданиды значительно менее токсичны, чем цианиды, и выводятся из организма с мочой. Истинный механизм до конца не установлен, но показано, что при введении тиосульфата натрия скорость выведения цианидов возрастает в 15-30 раз. Это послужило основой для предложения в качестве антидота тиосульфата натрия.
Возможно, что процесс идет через отщепление серы от гипосульфита, который в организме идет относительно медленно. Отщепившаяся сера вступает во взаимодействие с цианидом, образуя роданид.
Препарат вводят внутривенно в виде 30% раствора по 50 мл.
В качестве донаторов серы в организме могут быть такие соединения, как цистеин, цистин, глутатион и др.
Имеются сведения о благоприятном лечебном эффекте унитиола, который, не являясь донатором серы, активирует фермент родоназу, и, таким образом, ускоряется процесс детоксикации HCN.
Эффект антидотов усиливается при их использовании на фоне оксигенобаротерапии. В эксперименте показано, что кислород под давлением способствует более быстрому восстановлению активности цитохромоксидазы.
Таким образом, к моменту настоящего исследования практически только производные активированных альфа-кетокислот были описаны в качестве пероральных средств профилактики и лечения легкой и средней степени поражения цианидами. Альфа-кетокислоты являются промежуточными продуктами обмена аминокислот:
Альфа-кетоглутаровая кислота (КГК) - важный промежуточный продукт в процессах дыхания и обмена белков, жиров и углеводов в организмах животных, в том числе человека. КГК не токсична и может быть применена в достаточно больших дозах. В первом сообщений об исследовании КГК было установлено, что КГК и/или его комбинация с тиосульфатом натрия обладает слабым, но статистически достоверным эффектом при отравлении цианидами [1]. В конце прошлого века - начале этого века была подробно исследована антидотная активность как самой КГК, так и ее сочетаний с другими антидотами, в основном с тиосульфатом и нитритом натрия при различных способах введения [2-19].
50
Среди 13 исследованных карбонильных соединений самым эффективным оказалась КГК [16]. В 1997 г был получен патент на способ лечения отравлений цианидами с помощью 2-пропандиовой (мезоксалевой) кислоты [20]. В тексте к патенту указано, мезоксалевая кислота активна в низких дозах (в дозе 0,2 г/кг при внутрибрюшинном способе введения) профилактически защищает от СД цианидов. Продолжения работ по мезоксалевой кислоте не последовало, что, вероятно, связано с недостаточной стабильностью этой кислоты.
Было показано, что протекторный индекс КГК равен 5, а совместно с внутривенным введением тиосульфата натрия он достигает 100[2]. Высокая антидотная эффективность КГК подтверждена не только на грызунах, но и на собаках [5]. Показана дозовая и временная зависимости эффективности КГК, оптимальным временем перорального введения КГК является время за 60 минут до введения цианида [12].
При сочетанном применении КГК с N-ацетилцистеином удается избежать цитотоксичности и окислительного стресса, вызываемых цианидами [17,18].
50
Установлено, что КГК при пероральном способе введения крысам до введения цианогенов в дозах СД успешно защищает от отравления ацетонитрилом, акрилонитрилом, малононитрилом, пропионитрилом и нитропруссидом натрия [19].
Показано, что КГК по эффективности превышает такие антидоты, как аминопропиофенол, эдетат кобальта и тиосульфат натрия и равна по активности оксикобаламину; причем в комбинации с тиосульфатом натрия их эффективность еще увеличивается [10].
Таким образом, очевидно, что КГК обладает исключительно высокой антидотной активностью против цианидов и исследования в этом направлении представляются актуальными.
Описан синтез производных 3-меркаптопировиноградной кислоты [21] взаимодействием пировиноградной кислоты с сернистым натрием. Новые соединения при введении за 30 мин. До действия цианида имеют протекторный индекс 3,8-4,3. При внутрибрюшинном способе введения через 5 минут после введения цианида протекторный индекс составляет около 4. В этой работе впервые удалось сочетать в одном соединении 2 механизма действия: «скрытая» кетокислота и серосодержащее соединение, однако предложенные соединения малоустойчивы на воздухе.
В настоящей работе предложены соединения, в молекуле которых содержатся элементы, независимо друг от друга обладающие способностью превращать цианиды в менее токсичные производные (тиолы, кетокарбоновые кислоты и соли кобальта). Несомненным плюсом предлагаемых новых соединений является исключительно низкая токсичность при оральном способе введения, что позволяет быстро дезактивировать значительные количества цианидов. Особенным плюсом этих веществ является их сочетаемость с известными метгемоглобиообразователями.
Синтезированы новые химические соединения смешанные кобальт(II)овые соли кетокарбоновых и меркаптокарбоновых кислот общей формулы (I):
2
3
1
3
где R=Н, Alk, R′=Н, Alk, NH, NHCOCH, m=0-3, R″=H, Alk, COOH, n=0-3, где Alk=алкил C-C, или их гидратам, или их сольватам.
Предлагаемые соединения общей формулы (I) могут быть получены взаимодействием смеси эквинормальных водных растворов кетокарбоновой кислоты формулы(II):
и меркаптокарбоновой кислоты формулы (III):
с солью двухвалентного кобальта с легко отделяемым кислотным остатком, например основным карбонатом кобальта (II) или ацетатом кобальта (II), и целевой продукт выделяют в виде смешанной соли или ее гидрата, или ее сольвата.
В качестве соли двухвалентного кобальта удобно использовать основной карбонат кобальта (II), взятый в избыточном количестве. При этом не прореагировавший основной карбонат кобальта (II) отфильтровывают, а целевой продукт выделяют из водного раствора обычными методами.
В качестве кетокарбоновых кислот преимущественно используются тиогликолевая (меркаптоуксусная), или меркаптопропионовые кислоты, а также цистеин, или N-ацетилцистеин.
В качестве кетокарбоновых кислот целесообразно использовать, имеющиеся в организме кислоты, например мезоксалевая, пировиноградная, кетоглутаровая кислоты.
Предлагаемые соединения могут найти самое разнообразное применение, в частности они являются антидотами цианидов.
Предлагаемые соединения малотоксичны. Их преимуществом является возможность сочетания с метгемоглобинообразователями, которая позволяет увеличить время эффективного воздействия с цианидами.
Именно это дает существенные выгоды при оральном применении предлагаемых соединений, поэтому преимущественным является таблетируемая лекарственная форма.
Нижеследующие примеры иллюстрируют, но не ограничивают притязания заявителя.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ПРИМЕРЫ
Несмотря на то, что окисление двухвалентной соли кобальта в трехвалентную при работе в обычных условиях маловероятно, все процессы проводили в токе инертного газа (аргона) и использовали приготовленную воду - это деионизованная вода, обезгаженная кипячением в токе аргона и охлажденная в токе аргона.
Пример 1.
Кобальтовая(2+) соль меркаптоуксусной и пировиноградной кислот
3
2
2
В одногорлой круглодонной колбе емкостью 0,25 л смешивают 4,60 г (0,05 моля) тиогликолевой кислоты, 4,41 г (0,05 моля) пировиноградной кислоты и 100 мл воды. К этому раствору прибавляют при перемешивании в токе аргона 6,35 г (~0.051 моля) основного карбоната кобальта (2+) [2СоСО·3Со(ОН)·n НО] и полученную суспензию коричневого цвета нагревают на водяной бане с температурой 40-45°C до образования темно-коричневого раствора (примерно 15-20 минут), что сопровождалось выделением углекислого газа. Охлажденную в токе аргона реакционную смесь фильтруют через мембранный фильтр от небольшого количества не растворившегося остатка в одногорлую круглодонную колбу емкостью 0,5 л. Фильтрат темно-коричневого цвета упаривают досуха на роторном испарителе в вакууме водоструйного насоса и температуре бани ~45°C. Твердый остаток после упаривания сушат до постоянного веса в вакуум-эксикаторе над свежими порциями фосфорного ангидрида при остаточном давлении ~0,5 мм ртутного столба. Получают 11,9 г сухого твердого продукта темно-коричневого цвета, что соответствует количественному выходу целевой смешанной кобальтовой(2+) соли пировиноградной и тиогликолевой кислот в расчете на моногидрат.
5
6
5
2
Найдено, %: С 23,4; 23,2; Н 3,1; 3,2; S 12,9; 12,7. CHOSCo·HO. Вычислено, %: С 23,54; Н 3,16; S 13,03.
ИК-спектр (таблетка с KBr): 3415 и 3274 обр.см (валентные колебания ОН гидратной воды), 2919 обр.см (валентные колебания С-Н), 1704 обр.см (характеристическая частота колебаний кетонной карбонильной группы), 1601 обр.см (валентные колебания С-O карбоксилатных групп), 1394, 1372 и 1342 обр.см (деформационные колебания С-Н), 1224 и 1117 обр.см (деформационные колебания ОН гидратной воды), 795 обр.см (валентные колебания C-S).
Эти данные подтверждают строение кобальтовой(2+) соли меркаптоуксусной и пировиноградной кислот
Пример 2.
Кобальтовая(2+) соль меркаптоуксусной и α-кетоглутаровой кислот
В колбе емкостью 0,25 л растворяют 7,31 г (0,05 моля) α-кетоглутаровой кислоты в 100 мл воды и к полученному прозрачному бесцветному раствору прибавляют при перемешивании раствор 4,61 г (0,05 моля) тиогликолевой кислоты в 50 мл воды. В полученный гомогенный бесцветный раствор всыпают при перемешивании 8,84 г (~0,075 моля) основного карбоната кобальта(II). При этом наблюдалось вспенивание реакционной смеси (из-за выделения углекислого газа) с окрашиванием ее в темно-бурый цвет. Реакционную смесь нагревают на водяной бане с температурой ~50°C в течение получаса с периодическим помешиванием, после чего, не охлаждая, фильтруют ее через стеклянный пористый фильтр №4 в яйцевидную колбу емкостью 0,25 л. Небольшой осадок темно-бурого цвета на фильтре трижды промывают небольшими порциями (3×30 мл) воды. Объединенный фильтрат упаривают досуха на роторном испарителе в вакууме водоструйного насоса (температура бани ~45-50°C). Твердый остаток после упаривания сушат до постоянного веса в вакууме масляного насоса. Получают 17,94 г твердого кристаллического продукта темно-бурого (почти черного) цвета
14
14
14
2
2
Найдено, %: С 23,4; Н 3,2. CHOSCo·4HO. Вычислено, %: С 23,38; Н 3,08.
Эти данные подтверждают строение кобальтовой(2+) соли меркаптоуксусной и α-кетоглутаровой кислот:
ИК-спектр продукта не противоречит предложенной структуре
Пример 3
Кобальтовая(II) соль N-ацетил-L-цистеина и пировиноградной кислоты,
В колбу Эрленмейера емкостью 0,25 л загружают 8,16 г (0,050 моля) N-ацетил-L-цистеина и ~50 мл воды. При этом примерно половина взятого N-ацетил-L-цистеина переходит в раствор. К полученной суспензии добавляют 4,40 г (0,050 моля) пировиноградной кислоты и, прибавляя порциями воду до полного растворения оставшихся кристаллов N-ацетил-L-цистеина. К полученному бесцветному раствору добавляют при перемешивании 5,90 г (~0,05 моля) основного карбоната кобальта(II). Почти сразу после этого реакционная смесь стала пузыриться из-за интенсивного выделения углекислого газа и окрасилась в темно-бурый цвет. Для завершения реакции солеобразования реакционную смесь нагревают при перемешивании до ~50°C, после чего, не охлаждая, фильтруют через стеклянный пористый фильтр №4. Коричнево-фиолетовый осадок на фильтре трижды промыли водой(3×20 мл). Объединенный фильтрат упаривают досуха на роторном испарителе в вакууме водоструйного насоса температуре бани - 40°C. Остаток после упаривания сушат до постоянного веса в вакуум-эксикаторе (при остаточном давлении ~1 мм рт. ст.) над пятиокисью фосфора. Получили 16,30 г твердого порошкообразного темно-бурого продукта, который по результатам элементного анализа и ИК-спектроскопии был идентифицирован как моногидрат смешанной кобальтовой(II) соли N-ацетил-L-цистеина и пировиноградной кислоты,
8
11
6
2
Найдено, %: С 29,3; 29,5; Н 4,0; 4,2; N 4,0; 4,0; S 9,7; 9,6. CHNOSCo·HO. Вычислено, %: С 29,46; Н 4,02; N 4,29; S 9,83.
ИК-спектр (Таблетка с KBr): 3385 обр.см (валентные колебания NH амидной группы N-ацетилцистеина), 3274 обр.см (валентные колебания ОН гидратной воды), ~2920 обр.см (валентные колебания С-Н), ~2650 обр.см (валентные колебания SH), 1764 обр.см (валентные колебания С=O), 1701 обр.см (характеристическая частота колебаний кетонного карбонила), 1608 обр.см. (наложение валентных колебаний С=O карбоксилатной группы и полосы Амид I 1540 обр.см (полоса Амид II - деформационные колебания NH амидной группы N-ацетилцистеинового остатка), 1401, 1372 и 1342 обр.см (деформационные колебания С-Н), 1224,1200 и 1109 обр.см (валентные колебания С-O и деформационные колебания О-Н гидратной воды), ~795 обр.см (валентные колебания C-S).
Пример 4
Кобальтовая(2+) соль α-кетоглутаровой кислоты и L-цистеина
3
2
2
В одногорлой круглодонной колбе емкостью 0,5 л смешивают в сухом состоянии 6,00 г (0,0495 моля) L-цистеина и 7,24 г (0,0495 моля) α-кетоглутаровой кислоты и к этой смеси добавляют при помешивании 150 мл подготовленной воды. Полученная суспензия довольно быстро растворяется с образованием прозрачного, слегка желтоватого раствора. В этот раствор всыпают при перемешивании в токе аргона 6,35 г (~0,051 моля) основного карбоната кобальта(2+) [2СоСО·3Со(ОН)·n HO] и получаемую при этом суспензию коричневого цвета нагревают на водяной бане с температурой ~50°C в течение 20-30 минут до образования коричневого раствора с небольшим количеством не растворившегося коричневого остатка. Раствор охлаждают в токе аргона до комнатной температуры и фильтруют через мембранный фильтр в круглодонную колбу емкостью 0,5 л. Остаток на фильтре трижды промывают подготовленной водой (3×50 мл) и объединенный фильтрат упаривают досуха на роторном испарителе в вакууме водоструйного насоса при остаточном давлении ~10 мм рт. столба и температуре бани ~40°C. В остатке получают твердое вещество коричневого цвета с легким фиолетовым оттенком, которое досушивают до постоянного веса в вакуум-эксикаторе при остаточном давлении ~0,5 мм ртутного столба над пятиокисью фосфора. Получают 16,49 г твердого порошкообразного продукта коричневого цвета, что соответствует количественному выходу кобальтовой(2+) соли α-кетоглутаровой кислоты и L-цистеина в пересчете на семигидрат.
8
11
7
2
Найдено, %: С 28,3; 28,4; Н 3,6; 3,6; N 4,0; 4,1. CHNOSCo·0,5HO. Вычислено, %: С 28,84; Н 3,63; N 4,20.
3
2
ИК-спектр продукта (Таблетка с KBr): 3442 и 3335 обр.см (валентные колебания ОН-группы гидратной воды), 3162 обр.см (валентные колебания NH3), 2963 обр.см (валентные колебания С-Н связи), 2563 обр.см (валентные колебания SH), 1704 обр.см (характеристическая частота колебаний кетонной карбонильной группы С=O), 1603 и 1635 обр.см (полосы поглощения ионизованной карбоксильной группы), 1588 обр.см (деформационные колебания NH - аминокислотная полоса 1), 1431, 1406 и 1366 обр.см (деформационные колебания СН-группы), 1272, 1237 и 1194 обр.см (валентные колебания С-O в карбоксилатной группе и валентные колебания C-N), 877 и 829 обр.см (деформационные колебания гидратной О-Н группы), 633 обр.см (валентные колебания C-S).
Эти данные подтверждают строение семигидрата кобальтовой(2+) соли α-кетоглутаровой кислоты И L-цистеина формулы
Пример 5.
Кобальтовая(2+) соль пировиноградной кислоты и 2-меркаптопропионовой кислоты
3
2
2
В одногорлой круглодонной колбе емкостью 0,25 л растворяют 5,57 г грамма (0,050 моля) 2-меркаптопропионовой кислоты в 50 мл подготовленной воды, К полученному прозрачному раствору прибавляют 4,40 г (0,050 моля) пировиноградной кислоты и к этой смеси добавляют при помешиваний 75 мл подготовленной воды. В этот раствор всыпают при перемешивании в токе аргона 6,50 г (~0,052 моля) основного карбоната кобальта(2+) [2СоСО·3Со(ОН)·n НО]. При этом реакционная смесь сразу же окрасилась в коричневый цвет с одновременным вспениванием из-за выделения углекислого газа, активная фаза которого продолжалась около 10 минут. После перемешивания реакционной смеси при комнатной температуре в токе аргона в течение 30 мин фильтруют ее через стеклянный пористый фильтр №3. Серо-коричневый с фиолетовым оттенком осадок на фильтре представляет собой избыточный основной карбонат кобальта, не вступивший в реакцию. Полученный фильтрат темно-коричневого (почти черного) цвета упарили досуха на роторном испарителе в вакууме водоструйного насоса (при остаточном давлении 10 мм рт. столба и температуре бани 40-50°C). Остаток после упаривания сушили до постоянного веса в вакуум-эксикаторе (при остаточном давлении 1 мм рт. столба) над пятиокисью фосфора. Получили 14,2 г продукта, который по выходу, данным элементного анализа и ИК-спектроскопии был идентифицирован как дигидрат целевой смешанной комплексной кобальтовой(II) соли 2-меркаптопропионовой и пировиноградной кислот.
6
8
5
2
Найдено, %: С 25,3; 25,4; Н 3,8; 3,9; S 11,3; 11,1; Со 20,5; 20,2. CHOSCo·2HO. Вычислено, %: С 25,10; Н 4,21; S 11,17; Со 20,52.
ИК-спектр продукта (таблетка с KBr): 3393 обр.см (валентные колебания О-Н гидратной воды), 2987 и 2933 обр.см (валентные колебания С-Н), 1760 обр.см (валентные колебания С=O кетогруппы), 1590 обр.см (асимметричные и симметричные валентные колебания С-O карбоксилатной группы); 1453,1401 и 1374 обр.см (деформационные колебания С-Н); 1280,1224,1158 и 1076 обр.см (деформационные колебания ОН и валентные колебания С-О); 729,660 и 585 обр.см (валентные колебания C-S). Как видно из спектра, отсутствие выраженной полосы поглощения в области 2550-2600 обр.см скорее всего указывает на то, что в образовании смешанного кобальтового(II) комплекса активно участвует меркаптогруппа тиогликолевой кислоты.
Пример 6.
Кобальтовая(II) соль пировиноградной кислоты и 3-меркаптопропионовой кислоты (1е).
Получают аналогично примеру 1 из 12,67 г (~0,1 моля) кобальта углекислого основного водного 9,00 г (0,10 моля) пировиноградной кислоты и 10,72 г 3-меркаптопропионовой кислоты (0,10 моля). Получили 24,98 г твердого порошкообразного (после измельчения кусочков в фарфоровой ступке) продукта, который по выходу, результатам элементного анализа и ИК-спектроскопии соответствует формуле:
6
8
5
Найдено (%): С 28,96; 29,02; Н 3,34; 3,33; S 12,97; 13,23. CHOSCo. Вычислено (%): С 28,70; Н 3,21; S 12,77.
ИК-спектр продукта (таблетка с KBr): 3429 обр.см (валентные колебания О-Н гидратной воды), 2937 обр.см (валентные колебания С-Н), 1702 обр.см (валентные колебания С=O кетогруппы), 1599 обр.см (асимметричные и симметричные валентные колебания С-O карбоксидатной группы); 1402 и 1360 обр.см (деформационные колебания С-Н);,1141 обр.см (деформационные колебания ОН и валентные колебания С-О); 660 обр.см (валентные колебания C-S), 2554 обр.см (валентные колебания SH).
Пример 7.
В качестве примера подробно описаны эксперименты с кобальтовой(2+) солью меркаптоуксусной и пировиноградной кислот (Пример №1).
Все предлагаемые соединения обладают низкой токсичностью.
Определение показателей острой токсичности кобальтовой(2+) соли меркаптоуксусной и пировиноградной кислот (I) включало эксперименты на крысах и кроликах обоего пола.
Проведенные экспериментальные исследования показали, что антидот I при остром введении экспериментальным животным оказывает токсическое действие в дозах 2000-5000 мг/кг у крыс и 1000-3000 мг/кг у кроликов.
50
Величины ЛД при внутрижелудочном введении колеблются от 3000±460 мг/кг (крыс самцы) до 3100±350 мг/кг (крысы самки) и от 1500±120 мг/кг (кролики самцы) до 1800±220 мг/кг (кролики самки).
Гибель животных при внутрижелудочном введении наблюдалась в течение суток от момента введения при явлениях гиподинамии, заторможенности, одышки, вялости, атаксии, кратковременных судорог в атональной стадии и паралича.
У большинства переживших интоксикацию животных в первые сутки отмечались заторможенность, вялость, снижение потребления корма и воды, диарея. В дальнейшем каких-либо заметных нарушений состояния или поведения животных опытных групп по сравнению с контролем не отмечалось на протяжении всего периода наблюдения. Клиническая картина интоксикации у всех опытных групп была одинаковой. Половых различий в течение интоксикации не отмечалось.
По данным вскрытия и макроскопического исследования острое внутрижелудочное введение лекарственной формы антидота цианидов в нелетальных дозах не вызывает макроскопических изменений внутренних, эндокринных органов и головного мозга подопытных белых крыс и кроликов, а также не сопровождается изменениями слизистой оболочки желудка и кишечника.
Вскрытие погибших крыс и кроликов выявило венозное полнокровие внутренних органов, субплевральные и субдуральные кровоизлияния, а также мелкие кровоизлияния в продолговатом мозге и полушариях коры.
50
Таким образом, результаты токсикометрии, данные наблюдений за экспериментальными животными на протяжении 14 дней в постинтоксикационном периоде острого отравления, а также данные некропсии позволяют отнести исследуемый антидот (I) к IV классу малотоксичных лекарственных веществ [22], так как ЛД при внутрижелудочном введении антидота крысам находится в диапазоне 500 - 5000 мг/кг.
50
99
Установлено, что при одновременном введении с ядом (цианидом натрия) в дозах ЛД и ЛД антидот снимал ведущие симптомы интоксикации на 75-100% и предотвращал гибель животных. Индекс защиты (ИЗ) и антидотная мощность (AM) при внутрижелудочном введении антидота в дозе 300 мг/кг сразу после отравления цианидом натрия составили 1.40 и 1.08 соответственно.
Профилактическое введение антидота за 30 минут до яда в 1.8 раз увеличивало эти показатели, что соответствовало И3 - 2.5, AM - 1.9.
99
Показано, что продолжительность профилактического лечебного действия антидота находится в диапазоне 30-60 мин, в течение которого ослаблялись симптомы отравления, и выживало большинство пораженных животных при тяжелой степени отравления в дозе ЛД. При исследовании влияния антидота на потребление кислорода организмом и внешнее дыхание при отравлении крыс цианидом натрия показало, что введение крысам антидота в испытанных дозах ослабляло характерный для токсического действия цианидов эффект, состоявший в нарушении способности организма утилизировать кислород.
В опытах на грызунах (крысы обоего пола) антидот (I) цианидов вводился внутрижелудочно атравматичным железным зондом в виде водного раствора ежедневно на протяжении 5 суток в 3 дозах: эффективной для грызунов - 300 мг/кг; максимальной, не вызывающей гибель при однократном применении, - 1000 мг/кг и промежуточной - 500 мг/кг.
50
50
В ходе эксперимента наблюдалась гибель подопытных животных, что свидетельствует о Наличии возможных кумулятивных свойств. В ходе эксперимента крысы третьей экспериментальной группы получили суммарно 5000 мг/кг препарата. Отношение предполагаемой ЛД при повторных введениях (3000 мг/кг) к ЛД при однократном введении (2500 мг/кг) составляет более 1,2, что свидетельствует о слабой кумуляции [23].
При максимальной дозе 1000 мг/кг у большинства кроликов отмечалась заторможенность, вялость, снижение потребления корма, воды и диарея. Введение антидота в дозах 300 и 500 мг/кг не влияло на внешний вид, общее состояние и поведение животных. У некоторых животных к шестым суткам исследования отмечался жидкий стул. В восстановительный период негативных явлений со стороны желудочно-кишечного тракта не наблюдалось, общее состояние или поведение животных по сравнению с контролем не отмечалось. Животные незначительно отставали в весе на 6 сутки исследования, однако в конце периода восстановления на 28 сутки вес опытных групп практически не отличался от веса контрольных животных. Половых различий при этом также не наблюдалось.
Животные опытных групп во время введения препарата потребляли корм в меньшем, а воду в большем количестве, чем в контрольных группах. В восстановительном периоде кормо- и водопотребление между всеми экспериментальными группами было одинаково. Половых различий или различий, связанных с уровнем дозирования, не наблюдалось.
Существенных изменений со стороны выделительной функции почек при введении антидота белым крысам не наблюдалось.
Данные измерения ректальной температуры свидетельствуют об отсутствии различий у животных из опытных и контрольной групп.
При исследовании структуры поведения крыс в «открытом поле» На дозе 300 мг/кг отмечается достоверно значимое увеличение латентного периода, при этом все остальные показатели остаются без изменений. На дозах 500 и 1000 мг/кг наблюдается общее снижение активности животных, оцениваемой по длительности латентного периода, количеству вертикальных стоек, пересечений и заглядываний по сравнению с фоновыми данными и контролем, при этом на максимальной дозе эти изменения являлись достоверно значимыми. В конце восстановительного периода в структуре поведения достоверно значимых изменений в опытных группах не отмечено.
У экспериментальных животных при введении антидота в дозе 300 мг/кг через 6 дней после начала введения отмечено некоторое снижение спонтанной двигательной активности (СДА) по сравнению с животными контрольной группы. При дозах 500 и 1000 мг/кг снижение СДА было достоверно значимым. Наблюдаемое влияние антидота на СДА носило дозовозависимый характер. В конце восстановительного периода СДА в опытных группах не отличалась от фоновых величин.
Исследуемый антидот не вызывал изменений как ЧСС, так и характера ЭКГ.
На 6 сутки исследования у подопытных животных применение антидота не вызывало достоверно значимых патологических гематологических изменений, кроме незначительного увеличения гематокрита и продолжительности свертывания крови у животных Получавших дозу 1000 мг/кг. Половых различий не выявлено. На 28 день исследования достоверных отличий между показателями контрольной и опытных групп не зафиксировано.
Как видно из представленных выше данных, как у самцов, так и у самок опытных групп на дозах 300, 500 и 1000 мг/кг через 5 дней непрерывного применения препарата биохимические показатели не выходили за пределы физиологической нормы по сравнению с фоном и контролем. Исключение составлял показатель протромбинового времени, который достоверно возрастал на 6 сутки при введении 1000 мг/кг как крысам самцам, так и самкам. На 28 сутки наблюдения достоверные отличия между исследуемыми группами по всем показателям отсутствовали.
Таким образом, в конце периода наблюдения периферическая кровь крыс всех экспериментальных групп по своему количественному и качественному составу соответствовала видовой физиологической норме.
Данные вскрытия и макроскопического исследования показали, что достоверные отличия в массовых коэффициентах органов крыс всех экспериментальных групп отсутствуют как на 6 сутки, так и на 28 сутки восстановительного периода.
У погибших крыс, получавших дозу 1000 мг/кг, головной мозг был отечен, извилины сглажены, борозды уплощены. На всем протяжении распределение серого и белого вещества головного мозга было правильное с сохранением топографоанатомических взаимоотношений. Отмечалось выраженное полнокровие сосудистого русла. В остальном некропсия крыс этой группы не отличалась от некропсии умерщвленных животных,
В конце восстановительного периода (на 28 сутки) данные некропсии крыс, получавших дозы 300, 500 и 1000 мг/кг, не отличались от результатов контрольных животных.
По результатам некропсии и гистологического исследования ежедневное пероральное введение лекарственной формы антидота цианидов в дозах 300, 500 и 1000 мг/кг в течение 5 суток крысам обоего пола не вызывает раздражения, воспаления или деструкции тканей желудочно-кишечного тракта, а также не сопровождается развитием дистрофических, деструктивных, очаговых склеротических изменений в паренхиматозных клетках и строме внутренних органов.
Таким образом, применение пероральной лекарственной формы антидота цианидов у крыс обоих полов внутрижелудочно один раз в сутки в течение 5 дней в дозах 300 и 500 мг/кг существенно не влияет на внешний вид, общее состояние и поведение животных, не оказывает негативного влияния на биохимические параметры крови и основные физиологические функции организма, не вызывает патоморфологических изменений, что свидетельствует о хорошей переносимости и малой токсичности препарата.
Изменения, происходящие при введении максимальной дозы антидота - 1000 мг/кг, кратковременны и не регистрируются после восстановительного периода.
В опытах на кроликах показано, что подострое внутрижелудочное введение лекарственной формы антидота кроликам обоих полов один раз в сутки в течение 5 дней в дозах 40 и 200 мг/кг не влияло на внешний вид, общее состояние и поведение животных. Однако у некоторых животных к шестым суткам исследования отмечался жидкий стул. В восстановительный период негативных явлений со стороны желудочно-кишечного тракта не наблюдалось. На максимальной дозе, 500 мг/кг, у большинства кроликов отмечалась заторможенность, вялость, снижение потребления корма, воды и диарея. В восстановительный период каких-либо заметных нарушений состояния или поведения по сравнению с контролем не отмечалось.
50
50
50
50
Следует отметить, что в ходе эксперимента при 5-дневном введении препарата наблюдалась гибель подопытных животных на максимальной дозе, что свидетельствует о наличии возможных кумулятивных свойств у антидота. В ходе эксперимента кролики третьей экспериментальной группы получили суммарно 2500 мг/кг препарата. Отношение предполагаемой ЛД при повторных введениях (2000 мг/кг) к ЛД при однократном введении (1650 мг/кг - среднее между ЛД кроликов самцов и ЛД кроликов самок) составляет более 1,2, что свидетельствует о слабой кумуляции [23].
Животные, получавшие антидот, незначительно отставали в весе на 6 сутки исследования, однако в конце периода восстановления на 28 сутки вес кроликов опытных групп практически не отличался от веса контрольных животных. Половых различий при этом также не наблюдалось.
Животные опытных групп во время введения препарата потребляли корм в меньшем, а воду в большем количестве, чем в контрольных группах. В восстановительном периоде кормо- и водопотребление между всеми экспериментальными группами было одинаково. Подовых различий или различий, связанных с уровнем дозирования, не наблюдалось.
Данные измерения ректальной температуры свидетельствуют об отсутствии различий регистрируемого показателя у животных опытных и контрольных групп.
Существенных изменений со стороны выделительной функции почек при введении образца антидота кроликам не наблюдалось.
В дозе 500 мг/кг антидот вызывал у кроликов достоверно значимое увеличение частоты сердечных сокращений, снижение вольтажа зубцов Р и R, а также снижение интервалов PQ и QT. Максимальные изменения наблюдались через 30-120 минут после введения антидота. На шестые сутки и в конце восстановительного периода значимые различия между контрольными и опытными группами, также как и половые различия не зафиксированы. Дозы 40 и 200 мг/кг не влияли на частоту сердечных сокращений и характер электрокардиограммы кроликов.
Следует отметить, что у подопытных животных на 6 сутки исследования не отмечалось достоверно значимых патологических гематологических изменений, кроме незначительного увеличения гематокрита и скорости оседания эритроцитов у животных, получавших дозу 500 мг/кг. Половых различий не выявлено.
На 28 день исследования достоверных отличий между показателями контрольной и опытных групп не зафиксировано. Таким образом, в конце периода наблюдения периферическая кровь кроликов всех экспериментальных групп по своему количественному и качественному составу соответствовала видовой физиологической норме.
У кроликов опытных групп на дозах 40, 200 и 500 мг/кг через 5 дней непрерывного применения препарата биохимические показатели периферической крови не выходили за пределы физиологической нормы по сравнению с фоном и контролем. Исключение составлял показатель протромбинового времени, который достоверно возрастал на 6 сутки при введении 500 мг/кг как кроликам самцам, так и самкам. На 28 сутки исследования достоверные отличия между исследуемыми группами по всем показателям отсутствовали.
Данные вскрытия и макроскопического исследования показали, что достоверные отличия в массовых коэффициентах органов кроликов всех экспериментальных групп отсутствуют как на 6 сутки, так и на 28 сутки восстановительного периода.
У погибших кроликов, получавших дозу 500 мг/кг, при просмотре гистологических препаратов головного мозга наблюдались неравномерные дистрофические изменения нейронов в сочетании с неравномерным периваскулярным и перицеллюлярным отеком. Отмечалось выраженное полнокровие сосудистого русла, в сочетании с многофокусными расстройствами кровообращения - микрокровоизлияниями - на различных этапах прогрессии. В остальном данные некропсии кроликов этой группы не отличались от данных, полученных при исследовании органов умерщвленных животных.
При просмотре гистологических препаратов органов контрольных животных и органов животных, получавших препарат в дозах 40, 200 и 500 мг/кг, после восстановительного периода, на 28 день исследования, различий между группами не обнаружено.
Изменения, происходящие при введении максимальной дозы антидота - 500 мг/кг, кратковременны и не регистрируются после восстановительного периода.
По результатам некропсии и гистологического исследования ежедневное пероральное введение лекарственной формы антидота цианидов в дозах 40, 200 и 500 мг/кг в течение 5 суток кроликам обоего пола не вызывает раздражения, воспаления или деструкции тканей желудочно-кишечного тракта, а также не сопровождается развитием дистрофических, деструктивных, очаговых склеротических изменений в паренхиматозных клетках и строме внутренних органов.
Таким образом, введение антидота цианидов кобальтовой(2+) соли меркаптоуксусной и пировиноградной кислот (I) кроликам обоих полов внутрижелудочно, один раз в сутки в течение 5 дней, в дозах 40 и 200 мг/кг не влияет на внешний вид, общее состояние и поведение животных, не оказывает негативного влияния на биохимические параметры крови и основные физиологические функции организма, не вызывает патоморфологических изменений, что свидетельствует о хорошей переносимости и малой токсичности препарата.
Еще одним доказательством исключительно низкой токсичности предлагаемых соединений является сравнение относительной токсичности приходящейся на ион кобальта Со++. В неорганических соединениях кобальта(2+) в опытах на мышах и крысах при пероральном способе введения токсичность в расчете на ион кобальта составляет 30÷80 мг/кг, в солях аминокислот - до 150 мг/кг. Учитывая, что токсичность предлагаемых соединений в опытах на крысах составляет 3000 мг/кг, молекулярная масса антидота(I) 255, то на ион кобальта приходится примерно 700 мг/кг, что токсичность существенно ниже всех описанных в литературе соединений кобальта.
ЛИТЕРАТУРА
1. C. Schwartz, R.L. Morgan, L.M. Way et al., Toxicol. Appl. Pharmacol., v. 50, p. 437-441, 1979.
2. S.J. Moore, J.C. Norris, K.H. Ing et al., Toxicol. Appl. Pharmacol., v. 82, p. 40-44, 1986.
3. R. Bhattacharya, R. Vijayaraghavan, Biomed. Environ. Sci., v. 4, p. 452-460, 1991.
4. H.A. Yamamoto, Toxicol., v. 61, p. 221-228,1990.
5. J.C. Norris, W.A. Utley, A.S. Hume, Toxicol., v. 62, p. 275-283, 1990.
6. R.R. Dalvi, S.G. Sawant, P.S. Terse, Vet. Res. Comm., v. 14, p. 411-414, 1990.
7. G. Delhumeau, A.M. Cruz-Mendoza, C.G. Lojero, Toxicol. Appl. Pharmacol., v. 126, p. 345-351, 1994.
8. A.S. Hume, J.R. Mozino, V.L. Bryon et al., Clinical Toxicol., v. 33, p. 721-724, 1995.
9. A.S. Hume, S.J. Moore, A.T. Hume, Toxicologist, v. 3, p. 98, 1996.
10. A.S. Hume, J.R. Mozino, L.A. Chaney, Toxicol. Lett., v. 95 (Suppl. 1), p. 84, 1998.
11. R. Bhattacharya, Indian J Pharm., v. 32, p. 94-101, 2000.
12. R. Bhattacharya, R. Vijayaraghavan, Hum. Exp. Toxicol, v. 21, p. 297-303, 2002.
13. R.K. Tulsawani, M. Debnath, S.C. Pant et al., Chem. Biol. Interact., v. 156, p. 1-12, 2005.
14. R.K. Tulsawani, R. Bhattachafya, Biomed. Environ. Sci, v. 19, p. 61-66, 2006.
15. R.K. Tulsawani, D. Kumar, R. Bhattacharya, Biomed. Environ. Sci., v. 20, p. 56-63, 2007.
16. R. Bhattaeharya, R.K. Tulsawani, Drug Chem. Toxicol., v. 31, p. 149-161, 2008.
17. R.M. Satpute, J. Hariharakrishnan, R. Bhattacharya, Neurotoxicol., v. 29, p. 170-178, 2008.
18. J. Hariharakrishnan, R.M. Satpute, G.B.K.S. Prasad et al., Toxicol. Lett., v. 185, p. 132-141, 2009.
19. R. Bhattacharya, R.M. Satpute, J. Hariharakrishnan, Food Chem. Toxicol., v. 47, p. 2314-2320, 2009.
20. Патент США №5674904, кл. 514/574, опублик. 07.10.1997г.
21. H.T. Hagasawa, D.J.W. Goon, D.L. Crankshaw et al., J Med. Chem., v. 50, p. 6462-6464, 2007.
22. H. Hodge et al., Clinical Toxicology of Commercial Products. Acute Poisoning. Ed. IV, Baltimore, 1975, 427 р.
23. Методические указания по изучению общетоксического действия фармакологических веществ, цитируется по кн. «Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ». М.: Медицина, 2005, с. 41-53.