Способ получения средства для лечения однокопытных животных при паразитозах
METHOD OF OBTAINING AGENT FOR THE TREATMENT OF SOLID-HOOFED ANIMALS WITH PARASITOSIS

Изобретение относится к сельскому хозяйству в частности к ветеринарной паразитологии для лечения однокопытных животных (лошади, мулы, ослы) при гельминтозах и энтомозах.
К паразитированию у лошадей приспособилось до 100 видов различных гельминтов, которые при определенных условиях локализации и интенсивности инвазии вызывают патологические процессы в организме. Паразитируя в различных органах и тканях животных используют его как среду обитания, питания и воспроизводства популяции. Они наносят большой вред дефинитивному хозяину, а также при миграции личинок в организме животных, могут служить воротами для инфекционных заболеваний. Наиболее широко распространены гельминты класса Nematoda, это параскариды (Parascaris equorum) семейства Ascaridae, Strongylata порядка 50 видов, (Alfortia edentatus, Delafondia vulgaris, Srongylus equinus) вызывают тяжелые заболевания, при определенных условиях с летальным исходом, трихонематиды - 37 видов, оксиурисы.
Также патогенными действиями обладают повсеместно распространенные хронические заболевания однокопытных гастрофилезы, вызываемые личинками различных видов желудочных оводов, относящихся к роду Gastrophilus и семейству Gastrophilidae.
По данным В.М. Ивашкина, Г.М. Двойноса [5, 6] В.А. Большаковой [3, 4], Л.А. Бундиной [2], Н.М. Понамарёва [8], Д.А. Смирнова [9], Б.Е. Айтуганова [1] и других исследователей в отдельных регионах до 90,0% лошадей всех возрастов инвазированы паразитами, но молодняк подвержен к заражению интенсивнее, болеет тяжелее и отмечается падеж. Обычно встречается смешанная инвазия, чем усугубляется патогенное действие на организм животных, отмечается падеж. В результате коневодству наносится большой экономический ущерб.
В настоящее время для борьбы с паразитарными заболеваниями широкое распространение получили препараты из группы авермектинов. Продукт ферментации гриба Streptomyces avermitillis - кристаллические вещества белого цвета, хорошо растворимые в органических растворителях и практически нерастворимые в воде. В практике применяют препараты, содержащие 1,0% действующее вещество (ДВ) в смеси глицерина, полипропиленгликоля, поливинилпиролидона, полиэтиленгликоля или этанола. Механизм действия заключается в том, что они стимулируют пресинаптическое выделение гамма-аминомаслянной кислоты (ГАМК) - нейромедиатора торможения. Подвергнутые воздействию ивермектина нематоды и эктопаразиты утрачивают способность к центральному управлению мышечной деятельностью - происходит их паралич и гибель. Соединения из группы авермектинов (ивермектин, аверсектин, моксидектин и т.д.), обладают высокой биологической активностью против нематод и в 10 раз превосходят по активности известные антигельминтики. Доза авермектинов для животных составляет 0,2 мг/кг живой массы, препараты обладают нематодоцидным, инсектицидным и акарицидным действиями.
При испытании инъекционных форм ивермектина P.A. Karns, D.G. Luther (1984) отмечали побочное действие у 366 из 3316 лошадей, которое выражалось отеком вентральной брюшной стенки у 10% леченых лошадей. У 15 лошадей отмечали отек на месте инъекции, у 11 - отек конечностей, у 4 - отек глаз, у 3 - колики, у 2 - лихорадку и одна лошадь пала [11].
В связи с проявлением побочных действий у лошадей из-за индивидуальной чувствительности и особым типом нервной системы, инъекционные формы авермектинов почти не применяют. Насильственная дача лекарственных форм в виде суспензий или растворов неприемлемы, так как они могут попасть в легкие из-за особенности носоглотки лошади. Поэтому для перорального применения лошадям ивермектины стали применять в форме пасты. Тем не менее, их применение для массовой дегельминтизации сдерживается высокой ценой.
Для лечения паразитозов лошадей применяют отечественные и зарубежные противопаразитарные препараты на основе ивермектина, это инъекционные растворы и пасты для лошадей [7, 8, 9, 10, 11, 12].
Ивермек - ЗАО «Нита-Фарм», (г. Саратов, Россия) 1%-й инъекционный раствор с добавлением 4% витамина Е.
Побочные действия. При повышенной индивидуальной чувствительности к ивермеку у некоторых животных наблюдается возбуждение, усиление саливации (у собак рвота), учащение дефекации и мочеиспускания, атаксия. Не подлежат обработке ослабленные, истощенные и больные инфекционными болезнями животные, а также самки в последнюю треть беременности. Собаки породы колли и шелти особенно чувствительны к препарату, возможен летальный исход.
Паста Алезан - производство НВЦ «Агроветзащита (АВЗ), Россия». Препарат содержит 10% празиквантела и 2,0% ивермектина, а также вспомогательные компоненты (сахароза, сантохин, сорбитол, поливинилпирролидон, желатин и дистиллированная вода). Шприц-дозатор в объеме 6 г., по цене 520 рублей. Недостатком препарата является высокая цена для массовой дегельминтизации (100-500) лошадей. Субстанции из группы авермектинов и празиквантела в составе пасты находятся в не растворенном виде, которые до 50,0% выводятся с фекалиями во внешнюю среду, так как авермектины пагубно влияют на жучков копрофагов и микроорганизмов, участвующих в разложении биологической массы. Пастбища бывают загрязнены не разложившими фекальными массами в течение выпасного сезона.
Паста Эквисект - производство «Фармбиомед, Россия», действующее вещество аверсектин С. Препарат содержит 1% действующего вещества аверсектина С. Препарат дают внутрь однократно из расчета 0,23 мг/кг массы животного (2 г пасты на 10 кг массы животного), шприц 14 г по цене 300 руб.
Недостатком препарата является то, что для обработки одной лошади массой до 600 кг необходимо израсходовать 3-4 шприца с препаратом на сумму 900-1200 рублей. Не удобно вводить лошади до 56 г пасты и экономически не выгодно для массовой дегельминтизации.
Импортные антигельминтные пасты для лошадей:
Эквалан - паста (Equalan, Франция), производство компании MERIAL. В качестве действующего вещества содержит 1,87% ивермектина. Шприц-дозатор 6,42 г по цене 994 руб. Препарат для массовой дегельминтизации лошадей экономически не выгоден.
Эквалан Дуо (Equalan Duo, Франция) - паста, в качестве действующего вещества содержит 15,5 мг/г ивермектина и 77,5 мг/г празиквантела.
Вспомогательные компоненты: двуокись титана - 0,155 г, антиоксидант (Е 320) - 0,02 г, краситель (Е 110) - 0,03 г и глицерин - до 7,74 г. Выпускают Эквалан расфасованным, одноразовые полипропиленовые шприцы 6,42 г, 1625 руб.
Недостатком препарата является высокая стоимость, также вспомогательные компоненты Е320 и краситель Е110 по своей сути являются канцерогенами, а последний может стать причинной возникновения аллергических реакций, кроме этого побочными эффектами являются: крапивница, ринит, хромосомные повреждения, опухание почек. А также пищевая добавка может стать причиной блуждающих болей в животе.
Интермектин Дуо паста (Intermedin Duo Paste, Канада) Содержит в 1 г: ивермектин 15.5 мг; празиквантел 77.5 мг; адсорбированный носитель 1 г. Используется перорально в дозе инвермектина 0,2 мг и празиквантела 1 мг на 1 кг массы тела, соответственно 1,29 г пасты на 100 кг массы тела при однократном использовании. Каждый аппликатор содержащий 7,74 г пасты, для обработки 600 кг массы тела. Цена 1150 руб.
Побочные действия. Вследствие использования препарата Intermedin Duo Paste у некоторых лошадей отмечают опухоли и раздражении ротовой полости, губ и языка и слюноотделение.
Бимектин паста (Bimectin Paste, Кембридж, Онтарио, Канада.). Бледно-желтая паста, содержащая 1,87% ивермектина для орального применения, в каждом шприце по 6,08 г, для дегельминтизации одной лошади весом 570 кг, что соответствует 200 мкг ивермектина на кг веса животного. Цена: 735 руб.
После применения Bimectin (ивермектина) у лошадей возможен отек и зуд требующие симптоматическое лечение.
Эквест-гель 2% (FORT DODGE Animal Health - США), 1 мл препарата содержит действующее вещество моксидектин - 19 мг, а в 1 шприце 241,5 мг моксидектина, препарата пролонгированного действия, защищает лошадей от реинвазии экто- и эндопаразитами в течение 3-х месяцев при стойловом и пастбищном содержании. Дозировка, 0,4 мг/кг моксидектина на кг живой массы, 1 шприц стоимостью 1450 руб. рассчитан на лошадь массой 525 кг. убой для пищевых целей разрешен через 3-х месяца после последнего введения препарата.
Недостатки макроцикличных лактонов (авермектинов):
1. индивидуальная чувствительность, у некоторых животных (овчарки породы Колли, породистые и спортивные лошади) после дегельминтизации отмечаются побочные действия и даже гибель.
2. Препараты из группы авермектинов в пищеварительном тракте лошадей (слепая кишка) снижают численность полезной кишечной микрофлоры и простейших одноклеточных организмов, которые играют большую роль в завершении процессов переваривания корма. Животные получают более 65% полноценного белка микробиального происхождения и 70,0% белка простейших. Кроме того, микроорганизмы синтезируют витамины группы В (тиамин, рибофлавин, никотиновую кислоту, фолиевую кислоту, биотин, цианкобаламин и др.).
3. Препараты долго не выводятся из организма обладая пролонгированным действием от 14 до 32 суток, их хорошо назначать молодым не продуктивным животным в летний период интенсивного инвазирования паразитами, продуктивным животным не дают, так как молоко и мясопродукты нельзя использовать в пищу течение указанного срока.
4. Фекалии от дегельминтизированных животных на пастбище в течение пастбищного сезона не разлагаются, так как часть препарата с фекалиями попадая во внешнюю среду губительно действует на жуков копрофагов и микроорганизмов. Пастбища бывают усеяны не разложившими фекалиями с пролысинами без травы.
5. Инъекционные препараты на основе ивермектина вызывают сильную боль и некроз тканей на месте инъекции появляются долго не рассасываемые уплотнения, иногда у коз отмечают падеж от болевого шока.
Однако препараты на основе макроцикличных лактонов очень востребованы в ветеринарной медицине, как активные противопаразитарные средства с широким спектром действия на эндо- и эктопаразитов и исследователи работают над устранением отмеченных недостатков.
Целью настоящего изобретения является разработка высокоэффективного, безопасного для применения антипаразитарного средства экономически приемлемого для массовой дегельминтизации прирученных хозяйственных, породистых и спортивных лошадей.
Сущность изобретения заключается в разработке высокоэффективного средства на основе ивермектина для ветеринарной практики с целевыми добавками, которые смогут оказать положительный эффект по снятию побочных действий, так как это важно для ветеринарных врачей, которые предостерегаются дегельминтизировать породистых и спортивных лошадей из-за возможного проявления побочного эффекта. Немаловажное значение имеет и стоимость препарата, при обработке большого количества лошадей, а также предотвращение от загрязнения окружающую среду химиопрепаратами выделяемыми с фекалиями.
Предлагаемое средство состоит из действующего вещества ивермектина и целевых добавок: полиэтиленгликоля-400 (ПЭГ-400); низкомоллекулярного поливинилпирролидона-17 (ПВП); пропиленгликоля; сахарозы чда; воды очищенной; альгината натрия; арабиногалактана (АГ).
Технический результат изобретения, заключается в повышении антипаразитарной эффективности средства за счет образования растворимого межмолекулярного комплекса, который обеспечивает доставку препарата в организм паразита при питании в следствие чего происходит блокировка нервной системы и углеводного обмена паразита, вызывает его гибель. Экономическая эффективность обеспечивается применением отечественных недорогих наполнителей и для удобства введения пасты животным в использовании в качестве дозатора полиэтиленовых разовых шприцов емкостью 10-20 мл.
Отличительная характеристика разработанной нами пасты состоит в том, что:
- выявлена растворимость ивермектина в полиэтиленгликоле 400 при нагревании до 40-50°C.
- учитывалось питание гельминтов при паразитировании в пищеварительном тракте, им необходимы углеводы и для максимальной доставки препарата в организм паразита в сироп из сахарозы добавляли растворимый межмолекулярный комплекс субстанции ивермектина (ДВ) с полимерными наполнителями (ПВП и АГ) и тщательно смешивали. При этом происходит адресная доставка молекул препарата к паразитам Drug Delivery Systems (DDS). В результате углеводы со встроенным комплексом попадая в организм паразита при питании, блокируют нервную систему и углеводный обмен, вызывая паралич паразитов. Это эффективный метод совершенствования лекарственных средств с использованием межмолекулярных/супрамолекулярных комплексов лекарственных веществ с олигосахаридами - циклодекстринами (ЦД) типа «гость-хозяин».
- в противопаразитарной пасте действующее вещество ивермектин находится в растворимой форме по сравнению с прототипами, обеспечивая лучшую биологическую доступность к тканевым паразитам и личинкам.
Перечисленные положительные признаки средства, в соответствие технического решения критерию «новизна» позволяет сделать вывод о соответствии технического решения критерию «существенные отличия».
Выбирая компоненты и смешивая их в разных соотношениях нами найден оптимальный фармакопейный состав, требуемый к приготовлению лекарственной формы в виде пасты, где учитывались: консистенция; запах; вкус; pH; устойчивость и сохранность.
Препарат, согласно изобретению, иллюстрируется следующими примерами.
1. Полиэтиленгликоль (ПЭГ) - это добавка в пищу Е-1521, которая используется в качестве влагоудерживающего вещества, пеногасителя. Основные свойства полиэтиленгликоля - повышение растворимости субстанций и их концентрации [12].
2. Поливинилпирролидон (ПВП) используется в качестве связующего вещества во многих фармацевтических таблетках, он легко растворяется в воде и спирте, а также за счет образования водорастворимых комплексов улучшает растворимость и биодоступность химиотерапевтических средств [13].
3. Натрия альгинат - полисахарид природного происхождения, по химическому строению является солью альгиновой кислоты. Он обладает ценным качеством придавать вязкость и структурность жидким средам. Как загуститель натрия альгинат применяют также в производстве плавленых сыров, кетчупа, мороженого, творожных изделий, мясных консервов пищевая добавка Е-401 [14].
4. Каолин или белая глина. Благодаря содержанию кальция, магния и алюминия она благотворно действует на весь организм. Она применяется не только для лечения широкого спектра заболеваний, но и в косметических целях.
5. Арабиногалактан «Лавитол (дигидрокверцетин)» - галактансодержащий полисахарид высших растений является иммуномодулятором. Увеличивает срок хранения. Прекрасный стабилизатор и загуститель, применяется с целью повышения стойкости. Значительно снижает токсичность и повышает эффективность лекарственных средств. Обладает общей высокой биологической активностью: гепатопротекторной, антимутагенной, митогенной - он стимулирует размножение клеток селезенки и костного мозга, оказывает заметное гастропротекторное действие, является иммуномодулятором. Арабиногалактан обладает свойствами пробиотика, избирательно стимулирующий рост и активность нормальной микрофлоры кишечника, являясь пищей для бифидобактерий и лактобацилл (пробиотиков). Обладает высокой мембранотропной активностью, обеспечивающей адресную доставку лекарственных средств, таким образом, его можно использовать для повышения всасываемости лекарственных средств, характеризующихся низкой биодоступностью [10, 15].
6. Пропиленгликоль - бесцветное органическое соединение, почти без запаха, прозрачное, вязкое со слабо выраженным сладким вкусом. Пищевой пропиленгликоль используется в качестве добавки Е-1520, которая является растворителем и консервантом пищевых продуктов, а также используется в кормах для животных [16].
7. Натривая соль карбоксиметилцеллюлозы (Na КМЦ) - используется в пищевой и фармацевтической промышленности как эмульгатор, стабилизатор и загуститель. Являясь по своей сути нерастворимым полисахаридом, то есть, пищевым волокном, он способен стимулировать работу желудочно-кишечного тракта. При производстве лекарств особенно велико значение КМЦ при создании разнообразных мазей, поскольку придает им нужную консистенцию и позволяет «держать форму» на протяжении долгого времени. С точки зрения здоровья, основным достоинством КМЦ является ее нейтральность и безвредность [17].
Примеры конкретного исполнения:
Пример 1. Приготовление препарата из расчета 100 г готового продукта. Компоненты препарата закладываются в водяную баню в определенной последовательности с соблюдением данных условий.
Рецепт 1. Смесь полиэтиленглюколя-400 - 7 г и пропиленглюколя - 20 г нагревали в водяной бане до 50°C, добавляли 1 г порошка ПВП-17 тщательно перемешивая миксером до полного растворения (5 мин.), далее добавляли 2 г ивермектина при постоянном перемешивании в течение 5 мин до растворения последнего, что отмечено впервые. В результате образуется межмолекулярный комплекс ивермектина на основе растворимых полимеров. В этот раствор добавили еще 40 г пропиленглюколя и 3 г альгината натрия для увеличения массы компонентов. В полученную суспензию постепенно перемешивая добавляли в качестве загустителя 27 г белой пищевой глины до получения пасты приемлемой композиции.
Соотношение компонентов ПЭГ-400; пропиленглюколь; ивермектин; альгината Na; белая глина, соответственно: 7:60:1:2:3:27. В полученном продукте находится большое количество пропиленгликоля 60 г на 100 г массы продукта, это может оказать вредное воздействие на животных, и возможно служить замечанием при регистрации препарата, поэтому его заменили на NaКМЦ.
Рецепт №2.
1-я стадия 7 г ПЭГ-400 и 30 г пропиленгликоля подогреваем до 50°C в водяной бане или на электрической плитке в эмалированной кастрюле, в данный раствор добавляем 3 г порошка ПВП-17 перемешивая миксером в течение 5 минут до полного растворения, в эту смесь добавляем 2 г порошка субстанции ивермектина перемешивая до его растворения (5 мин.). Получаем растворимый комплекс ивермектина на основе водорастворимых полимеров. (ПЭГ-400, пропиленгликоль, ПВП-17, ивермектин - 7,0:30,0:3,0:2,0 - 42%).
2-я стадия В отдельную посуду заливаем 18 г воды подогреваем до 50°C и добавляем 2 г NaКМЦ, перемешиваем до получения стойкой суспензии (вода, NaКМЦ, белая глина - 18,0:2,0 - 20%).
3-я стадия Полученную суспензию NaКМЦ, добавляем в раствор комплекса ивермектина на основе полимеров перемешивая миксером. В результате образуется белый осадок ивермектина частично выпадающего в осадок, что не желательно. При добавлении загустителя в виде белой глины 38 г в пасте образуются пузыри газа, которые необходимо удалять в промышленном производстве с помощью вакуума (белая глина- 38,0%). Поэтому NaКМЦ, как загуститель и эмульгатор заменили на альгинат натрия, а воду на сахарный сироп, при добавлении которого образуется устойчивая суспензия.
Соотношение продукта по рецепту №2 ПЭГ-400; пропиленгликоль; ПВП-17; ивермектин; вода; NaКМЦ; белая глина составляет: 7,0:30,0:3,0:2,0:2,0:38,0.
Рецепт 3.
1-я стадия. Отдельно готовим сахарный сироп в эмалированной посуде, в которую заливаем 12 г воды, подогреваем его в водяной бане до 50°C и высыпаем в нее 8 г сахарозы и 0,3 г альгината натрия, перемешиваем 10 минут до получения сиропа. Если выпарилась вода добавляем воду до 20 г (вода, сахароза, альгинат натрия: - 12,0:8,0:0,3).
2-я стадия. Отдельно готовим раствор комплекса ивермектина. В эмалированную посуду заливаем 7 г ПЭГ-400, 33 г пропиленгликоля и при температуре +50°C добавляем 3 г порошка ПВП-17 перемешиваем миксером в течение 5 минут до полного растворения, затем добавляем 2 г ивермектина, также перемешиваем до получения однородного раствора. В результате получается раствор межмолекулярного комплекса ивермектина на основе полимеров (ПЭГ-400, пропиленгликоль, ПВП-17, ивермектин: - 7,0:33,0:3,0:2,0).
3-я стадия. В полученный раствор молекулярного комплекса ивермектина добавляем продукт 1-й стадии (сахарный сироп с альгинатом натрия) в 3-4 приема. В результате перемешивания образуется стойкая суспензия белого цвета. В полученную суспензию продукта третьей стадии добавляем загустители в виде белой глины и арабиногалактана (14,7:20,0) - 34,7% при перемешивании до получения композиции в виде стойкой пасты, светло-бежевого цвета.
Соотношение продукта по рецепту №3 сахарный сироп - (сахароза, вода и альгинат натрия - 8:12:0,3) - 20,3%; раствор межмолекулярного комплекса ивермектина на основе полимеров - (ПЭГ-400; пропиленгликоль; ПВП-17; ивермектин - 7,0:33,0:3,0:2,0) - 45,0%; загустители - (белая глина, арабиногалактан - 14,7:20,0) - 34,7%, соответственно составляет в, %: 20,3:45:34,7%.
При разработке пасты рецепт №2 нами было отмечено, что при восполнении выпаренной воды готовя раствор из комплекса (ПЭГ-400, пропиленгликоль, ПВП-17, ивермектин), ивермектин частично выпадал в осадок. Для проверки пасты приготовленную по рецепту №3 на устойчивую растворимость ДВ, в мерные стаканы налили воду и искусственный желудочный сок в каждый по 100 мл, добавили по 1 г пасты и тщательно перемешали. В результате получились стойкие суспензии без осадка.
Таким образом полученная паста по рецепту №3 соответствует той лекарственной форме, к которой мы стремились, где имеется стойкая консистенция, при пероральном введении в отличие от других паст она слегка прилипает и растекается по ротовой полости и животному приходится его съесть, имеет легкий хвойный запах, сладкий вкус, устойчивую сохранность, субстанция ивермектина не выпадает в осадок и не расслаивается при хранении. В г пасты содержится 20 мг ивермектина (ДВ).
Антипаразитарная паста №3 представляет собой густую липкую консистенцию светло-бежевого цвета, содержит 2,0% ивермектина и 98,0% формирующих компонентов. В лабораторных условиях можно приготовить до 5 кг пасты. Для удобства применения паста упаковывается в приспособленные одноразовые шприцы-дозаторы емкостью 10-20 мл.
Чтобы можно было свободно заполнить шприц пастой, канюлю на его конце расширяют сверлом, а приложенную к шприцу иголку отламывают у основания и шлифуют. После наполнения шприца пастой до нужного объема, отшлифованное основание бывшей иголки используем, как уплотнительный колпачок.
Промышленная применимость
Технологический процесс производства антипаразитарной пасты состоит из двух стадий, основанных на приготовлении 40% раствора сахарозы в очищенной воде. Далее, в одном смесителе, путем приготовления раствора ивермектина и последовательного добавления других компонентов при постепенном перемешивании до образования однородной пасты.
Из расчета приготовления 100 кг готового продукта, компоненты препарата закладываются в реактор в строго определенной последовательности с соблюдением данных условий.
1. В реактор №1 помещают сахарозу, очищенную воду для приготовления 40% сахарного сиропа и альгинат натрия. Далее перемешивают при температуре около 50°C до полного растворения сахара. Загрузку производят в соответствии с отпущенным количеством компонентов и с учетом Красх + 1,004 (коэффициент на потери препаратов).
Схема приготовления сахарного сиропа (стадия 1)
2. В реактор №2 помещают полиэтиленгликоль 400, пропиленгликоль, поливинилпирролидон и перемешивают при температуре не более 50°C до полного растворения. Затем добавляют субстанцию ивермектина и продолжают перемешивать до растворения последнего. Обогрев реактора прекращают и постепенно, в 4 приема добавляют полученный в первом реакторе сахарный сироп при постоянном перемешивании. Образуется устойчивая суспензия белого цвета. В последнюю очередь, при перемешивании, добавляют в 3-4 приема белую глину и арабиногалактан. Растворение компонентов происходит при перемешивании и температуре 40-50°C. Дальнейшее перемешивание происходит при температуре 20-40°C в течении 20-30 минут до получения однородной пластичной пасты светло-бежевого цвета.
Получение раствора ивермектина (стадия 2)
Дальнейшую работу по испытанию проводили с антипаразитарной пастой полученной по рецепту №3 под условным названием Эквиверм.
Доклинические и производственные испытание антипаразитарного средства на основе ивермектина (Эквиверм).
Фармакотоксикологические исследования пасты эквиверм проводили согласно «Методическим рекомендациям по доклиническому изучению репродуктивной токсичности фармакологических средств», одобренные фармакологическим комитетом Минздрава России (протокол №8 от 3 июля 1997) и утвержденные Минздравом России 18 декабря 1997 [7].
Пример 2. Острую пероральную токсичность изучали на крысах и мышах обоего пола массой 160-180 г и 18-20 г соответственно. На каждую дозу было использовано по 10 мышей и 6 крыс.
Пасту вводили однократно с помощью желудочного зонда в дозах 5000; 10000 и 15000 мг/кг.
В результате ни в одной опытной группе падеж не регистрировали, кроме того, симптомов интоксикации не наблюдали за весь период наблюдений (14 суток).
50
Необходимо отметить, что дозу 15000 мг/кг вводили животным в два этапа равными порциями с интервалом не более 10 минут. Сразу после введения у животных отмечали временное угнетение, связанное с большим объем вводимого вещества. Доза 15000 мг/кг является максимально возможной для перорального введения крысам и мышам обоего пола. В связи с этим, LD тестируемой пасты будет превышать эту дозу.
50
По оценке острой пероральной токсичности, паста относится к 4 классу опасности, согласно ГОСТ 12.1.007-76, и ее LD будет составлять более 15000 мг/кг. Препарат не обладает видовой и половой чувствительностью.
Несмотря на то, что эквиверм предназначен для перорального применения, в целях безопасности работающего с ней персонала, необходимо оценить ее влияние на кожу.
Пример 3. Параметры острой накожной токсичности проводили на 24 крысах-самцах массой 200-220 г. На каждую дозу использовали 6 крыс, руководствуясь "Методическими указаниями к постановке исследований по изучению раздражающих свойств и обоснованию предельно допустимых концентраций избирательно действующих раздражающих веществ в воздухе и рабочей зоны", 1980. Пасту эквиверм наносили на выстриженную часть кожи в дозах 2000; 5000 и 12500 мг/кг. Симптомов интоксикации и падежа животных не регистрировали. Дозу 12500 мг/кг наносили равными порциями в два этапа, поскольку она является максимально возможной для нанесения на кожу.
50
50
В связи с этим LD пасты при нанесении на кожу составляет более 12500 мг/кг. При однократной аппликации паста не вызывает раздражающего действия. LD при нанесении на кожу составляет более 12500 мг/кг, что соответствует 4 классу опасности по ГОСТ 12.1.007-76.
Паста не проявляет раздражающего действия при однократном нанесении на не поврежденную кожу крыс (0 баллов).
Пример 4. Изучение фармакокинетики антипаразитарной пасты.
В Московской области были отобраны 5 лошадей для изучения фармакокинетики антипаразитарной пасты в плазме крови, которым перорально из шприца-дозатора вводили противопаразитарную пасту из расчета 0,2 мг/кг массы животного и далее проводили отбор крови из яремной вены через 1; 4; 8; 12; 18; 24; 36; 48; 60; 72; 84; 96; 108; 120 часов объемом 20 мл для последующего определения ивермектина в плазме крови лошадей, методом жидкостной хроматографии высокого давления, с ультрафиолетовым детектированием используя методику Р.К. Sanyal (1994).
Разработан валидированный метод определения ивермектина в сыворотке крови лошадей позволяет определять данный аналит в очень низких концентрациях (значение LOD - составляет 0,03 нг/мл, LOQ - 0,09 нг/мл).
По результатам анализа проб, ивермектин всасывается в пищеварительном тракте лошадей после перорального введения и достигает определяемых концентраций в сыворотке крови уже через 1-2 часа после перорального введения антипаразитарной пасты - порядка 0,2 нг/мл. Максимальную концентрацию 0,84 нг/мл регистрировали через 7 часов, а к 4 суткам уровень ивермектина постепенно снижался до 0,2 нг/мл.
Таким образом, полученные нами результаты показали, что после перорального введения антипаразитарной пасты на основе ивермектина достаточно хорошо всасывается и поступает в системный кровоток, где циркулирует на протяжении 4 суток. Спустя две недели после применения препарата определяются лишь следовые количества ивермектина.
Пример 5. Влияние антипаразитарной пасты на организм лошадей
Для определения влияния антипаразитарной пасты на организм лошадей были сформированы 3 группы по пять лошадей в каждой. Первой группе лошадей вводили препарат в дозе 0,2 мг/кг; 2-й - 0,6 и 3-й - 1,0 мг/кг.
Проведение клинического состояния и взятие крови для гематологических и биохимических исследований проводили до и через 1; 3 и 5 суток после дачи препарата.
Таким образом, при изучении влияния антипаразитарной пасты на организм лошадей установлено, что в терапевтической, 3 и 5 раз увеличенной дозе на показатели клинического состояния лошадей не отмечено отрицательного действия. Температура, пульс и дыхание находились в пределах нормы и не отличались от животных контрольной группы, а также не оказывает отрицательного влияния на гематологические и биохимические показатели сыворотки крови лошадей.
Клинические испытания антипаразитарной пасты Эквиверм
Для клинических испытаний были подготовлены одноразовые шприцы-дозаторы с антипаразитарной пастой, объемом 10 мл, рассчитанные на обработку 300 лошадей живой массой 500 кг.
Пример 6. Опыт 1. Испытание эффективности опытного образца антипаразитарной пасты проводили в хозяйстве Московской области на 20 рысаках в возрасте 4-5 лет.
Для определения степени инвазированности лошадей нематодами исследовали пробы фекалий методом Фюллеборна с использованием раствора аммиачной селитры с целью обнаружения яиц гельминтов, при этом по яйцам ставили общий диагноз на стронгилятоз и пробы фекалий исследовали не позднее одних суток. Подсчет яиц в г/фекалий проводили в счетной камере ВИГИС. Для диагностики оксиуроза брали кусочки прозрачной клейкой ленты (Скотч) с отпечатками перианальных складок переносили на предметное стекло и исследовали на наличие яиц оксиурид.
Лошадям подопытных групп спонтанно инвазированных сронгилятами, параскаридами и оксиуридами, антипаразитарную пасту вводили перорально по беззубому краю из шприца-дозатора в дозе 0,2 мг/кг по ДВ однократно в расчете 1 мл на 100 кг массы животного (1 г пасты соответствует 1 мл).
При предварительном исследованных 20 проб фекалий лошадей, во всех пробах были обнаружены яйца стронгилят в среднем 174,0±8,7 экз. яиц/гол., у 8-ми молодых животных обнаружили яйца параскарид в среднем 347,1±43,4 экз./гол., яйца оксиурид не обнаружено.
В результате получена 100%-я эффективность антипаразитарной пасты на основе ивермектина в дозе 0,2 мг/кг против стронгилят и параскарид.
Опыт 2. Во втором опыт для определения терапевтической дозы препарата было исследовано 54 беспородных лошадей разных возрастов и пола в Южном Федеральном округе принадлежащие частному предпринимателю.
Подбор животных в опыт и определение эффективности препарата проводили по примеру опыта 1.
По данным копроовоскопии из 54 исследованных проб фекалий лошадей у всех были обнаружены яйца стронгилят в среднем 274,0±54,88 экз. яиц/гол., у 20-ти молодых животных обнаружили яйца параскарид в среднем 447,1±37,2 экз./гол., у 21 животных яйца оксиурид от 7 до 16 экз. Из инвазированных одновременно стронгилятами, параскаридами и оксиурами лошадей были сформированы по принципу аналогов 4 подопытные группы по 5 животных в каждой. Первой группе пасту эквиверма вводили в дозе 0,1 мг/кг; второй - 0,15; третьей - 0,2 мг/кг; 4-й группе для сравнения (контроль) вводили пасту Эквисект производства «Фармбиомед, Россия» из расчета 0,23 мг/кг массы животного (2 г пасты на 100 кг массы животного) согласно инструкции по его применению.
В результате антипаразитарная паста эквиверм в дозах 0,1-0,2 мг/кг оказала 100%-ю эффективность против стронгилят и оксиурисов. Против параскарид в дозе 0,1 мг/кг из 5-ти животных 3 были свободными от яиц, экстенсэффективность составила 60,0%, а процент снижения яиц в среднем г/фек. составило 58,6%. В дозе 0,15 мг/кг из 5-ти животных 4 полностью освободились от яиц параскарид (ЭЭ=80,0%), а количество яиц в г/фек. снизилось до 99,7%. В дозе 0,2 мг/кг препарат оказал 100%-ю эффективность против стронгилят, параскарид и оксиурисов.
Эквисект в дозе 0,23 мг/кг показал 100%-ю эффективность против оксиурисов, против параскарид (из 5-ти животных 3 полностью освободились от яиц, ЭЭ=60%), а среднее количество яиц снизилось от 460,3 до 22,4 в г/фек. т.е. на 95,1%. Против стронгилят (из 5-ти животных 4 освободились стронгилят, ЭЭ=99,7), а среднее количество яиц снизилось от 280,5 до 0,8 в г/фек., на 99,8%
Основные нематоды, паразитирующие в пищеварительном тракте, почти всегда встречаются у животных в виде смешанной инвазии. Некоторые из них проявляют более высокую устойчивость к антипаразитарным препаратам. Так как, животные бывают заражены в виде смешанной инвазии, а эквиверм в дозе 0,2 мг/кг проявил 100%-ю эффективность против основных паразитов пищеварительного тракта, то она принята нами, как терапевтическая (результаты отражены в табл. 2, приложения).
Опыт 3. Для подтверждения наших данных была создана комиссия из ведущих ученых и ветеринарных специалистов. Эффективность антипаразитарной пасты на основе ивермектина в комиссионном опыте отражены в табл. 3, из которой видно, что по данным копроовоскопических исследований проб фекалий все 14 лошадей были инвазированы стронгилятами при среднем количестве яиц в г/фек. экз., 652,4±46,6 экз., из них 5 - параскаридами - 315,2±22,5 экз. и по данным отпечатков с перианальных складок в 7 пробах обнаружили яйца оксиур в среднем 8,4±0,6 экз.
После дегельминтизации антипаразитарной пастой на основе ивермектина в рекомендуемой нами терапевтической дозе 0,2 мг/кг, в расчете 1 мл пасты на 100 кг массы животного, получена 100%-я эффективность против стронгилят, оксиурисов и параскарид. Побочные действия после дачи препарата не отмечены (результаты отражены в табл. 3, приложения).
Опыт 4. Для определения эффективности эквиверма против личинок оводов, локализирующих в пищеварительном тракте лошадей было подобрано 20 лошадей, которых распределили на 2 равноценные группы.
Первая группа животных была дегельминтизирована пастой эквиверм в терапевтической дозе 0,2 мг/кг, вторая - служила контролем и препарат не получали. Через сутки после дегельминтизации от каждой лошади первой группы были собраны испражнения и тщательно промыты в ведре с водой. В результате в 7 пробах из 10 были обнаружены от 33 до 120 экз. розовато-красных личинок Gasterophilus spp. В промытых испражнениях от контрольных животных, личинок гастерофилюсов не обнаружили. Далее лошади контрольной группы были дегельминтизированы пастой эквиверм и от 8-ми испражнениях были обнаружены 935 личинок оводов в среднем на животное 116,9 экз., что подтверждает о высокой экстенс-инвазированности (ЭИ=75,0%) лошадей личинками оводов в Южном федеральном округе и эффективности пасты эквиверма против них. Так как личинок кишечных оводов не диагностируют по данным копроовоскопии, то необходимо проводить профилактические дегельминтизации в летний период при инвазировании лошадей личинками оводов (Gasterophilus spp) пищеварительного тракта.
Расчетные данные стоимости компонентов препарата на 100 г отражены в таблице №4, из которой следует, что стоимость компонентов для приготовления 100 г препарата составляют 94,5 рублей, 100 г препарата хватает на 20 доз (100÷5=20 г) в расчете 5 г (5 мл) препарата на животное массой 500 кг и стоит это (94,5 руб.÷20 г) 4,7 руб., плюс одноразовый шприц 5 рублей. В итоге стоимость одного шприца-дозатора рассчитанного на обработку лошади массой 500 кг составляет 9,7 рублей без коммерческих надбавок, что намного ниже стоимости его прототипов.
Заключение. Разработанная на основе субстанции ивермектина антипаразитарная паста под условным названием «Эквиверм» для лечения однокопытных животных (лошади, ослы, мулы) от личиночных и половозрелых стадий паразитов пищеварительного тракта, представляет собой густую липкую пасту светло-коричневого цвета, содержит 2% ивермектина и 98,0% формирующих компонентов. Паста имеет стойкую консистенцию, при пероральном введение в отличии от других паст она слегка прилипает и растекается по ротовой полости и животное вынужденно его съесть, имеет легкий хвойный запах, сладкий вкус, имеет хорошую сохранность, субстанция ивермектина не выпадает в осадок и не расслаивается при хранении. В г пасты содержится 20 мг ивермектина (ДВ), что соответствует 1 мл. Для удобства применения паста упаковывается в одноразовые шприцы-дозаторы емкостью 10-20 мл.
Доклинические испытания показали, что препарат относится к 4 классу опасности, согласно ГОСТ 12.1.007-76, не проявляет раздражающего действия на не поврежденную кожу крыс, не обладает видовой и половой чувствительностью и эмбриотропной активностью.
Данные изучения фармакокинетики показали, что после перорального введения антипаразитарной пасты на основе ивермектина достаточно хорошо всасывается и поступает в системный кровоток, где циркулирует на протяжении 4 суток. Спустя две недели после применения препарата определяются лишь следовые количества ивермектина. Это позволяет 2 раза сократить срок убоя животных на мясо в отличие от прототипов эквиверма, метаболиты ивермектина которых выводятся из организма животных в течение 21-30 суток.
При изучении влияния антипаразитарной пасты на организм лошадей установлено, что в терапевтической, 3 и 5 раз увеличенной дозе на показатели клинического состояния лошадей не отмечено отрицательного действия, а также влияния на гематологические и биохимические показатели крови лошадей.
Клинические испытания показали, что препарат в дозе 0,1 мг/кг в отличие от прототипов проявил против стронгилят и оксиурисов и дозе 0,2 мг/кг против параскарид и личинок гастерофилюсов 100%-ю эффективность. Комиссионное испытание эквиверма в установленной нами терапевтической дозе 0,2 мг/кг подтвердило его высокую эффективность и безопасность применения против основных паразитов лошадей.
Себестоимость шприца-дозатора с антипаразитарной пастой Эквиверм, рассчитанное на обработку животного массой 500 кг, составляет 9,7 рублей без надбавок, что намного дешевле прототипов.
Литература.
1. Айтуганов Б.Е. Эпизоотология и усовершенствование терапии нематодозов лошадей при табунном содержании в условиях Западного Казахстана: Дис.…канд. вет. наук. - М. 2007. - 179 с.
2. Бундина Л.А. Пробстмариоз лошадей в Европейской части России: Автореф. Дис.…канд. вет.наук. - М., 1994. - 24 с.
3. Большакова В.А. Нематодозы пищеварительного канала лошадей Республики Саха (Якутия) и усовершенствование мер борьбы с ними: Автореф. Дис.…канд. вет. наук. - М.,1994. - 25 с.
4. Большакова В.А. Гельминтологическая ситуация конепоголовья в некоторых хозяйствах Республики Саха (Якутия) // Сб. матер. научн. конфер., посвящ. 10-летию Якутского с-х ин-та. - Якутск, 1995. - С. 53-54.
5. Двойнос Г.М. Стронгилиды (Nematoda: Stronygidae) домашних и диких лошадей: Автореф. дис.…док. биол. Наук. - Киев, 1993. - 39 с.
6. Ивашкин В.М., Двойнос г.м. определитель гельминтов лошадей. - Киев, 1984. - 163 с.
7. Методические рекомендации по доклиническому изучению репродуктивной токсичности фармакологических средств, одобренные фармакологическим комитетом Минздрава России (протокол №8 от 3 июля 1997) и утвержденные Минздравом России 18 декабря 1997.
8. Понамарев Н.М. Эпизоотология и терапия основных гельминтозов в Западной Сибири: Автореф. дис.…докт. вет. наук. - 1999. - 47 с.
9. Смирнов Д.А. Паразитофауна и меры борьбы с основными гельминтозами лошадей в центральном районе Нечерноземной зоны РФ6 Автореф. дис.…канд. вет. наук. - Иваново, 2003. - 18 с.
10. Медведева Е.Н., Бабкин В.А. и др. Арабиногалактан лиственницы - свойства и перспективы использования // Химия растительного сырья. 2003. №1. С. 27.
11. http://dommedika.com/farmakology/93.html Dommedika].
12. (Источник: http://www.neboleem.net/polijetilenglikol.php).
13. (Источник: http://www.neboleem.net/polivinilpirrolidon.php).
14. Источник: http://www.neboleem.net/natrija-alginat.php
15. http://arabinogalactan.ru/catalog/svojstva.
16. Источник: http://www.neboleem.net/propilenglikol.php.
17. Источник: http://www.baobablife.net/jeunesse-global/reserve-with-resveratrol/sostav/carboxymethyl-cellulose/.
Приложение
Рецепт 2.
Рецепт №3