Полиморфизм гена hfe фактор риска возникновения рака эндометрия у женщин репродуктивного возраста

Полиморфизм гена ИГЕ - фактор риска возникновения рака эндометрия у женщин репродуктивного возраста

Иванова Т.И., Крикунова Л.И., Хорохорина В.А., Вербинская Н.И., Мкртчян Л.С., Рябченко Н.И., Замулаева И.А., Цыб А.Ф.

ФГБУ МРНЦ Минздравсоцразвития России, Обнинск

Проанализирована ассоциация между геном ИРЕ (гомозиготы и гетерозиготы по минорным аллелям 1870 и 845А) и риском развития рака эндометрия. Обследовано 160 женщин, больных раком эндометрия, 76 - с гиперплазией эндометрия и 112 здоровых женщин. Генотипи-ровали методом ПЦР/ПДРФ (полимеразная цепная реакция с последующей обработкой специфическими рестриктазами и определением длин фрагментов рестрикции). У пациенток с диагнозом «рак эндометрия» обнаружены значимые различия в частотах полиморфного варианта гена ИРЕ между женщинами репродуктивного (<48 лет) и старшего возраста при уровне значимости р=0,0005. Для женщин моложе 48 лет, имеющих минорные аллели 1870 и 845А гена ИРЕ, вероятность развития рака эндометрия повышена (ОЯ=2,61; 95 % С1 от

1,17 до 5,81, р=0,023).

Ключевые слова; полиморфизм, ген, аллели, рак эндометрия.

Введение

Дисбаланс железа является уникальным физиологическим свойством организма женщины, которое оказывает влияние на здоровье как до менопаузы, так во время и после неё. В частности, есть основания считать, что избыток железа, как и его дефицит способны провоцировать канцерогенез [10], поскольку избыток железа индуцирует окислительный стресс, а дефицит стимулирует ангиогенез [10, 19], создавая в злокачественных клетках оптимальные условия для роста и прогрессии опухоли.

Одним из основных регуляторов гомеостаза железа является белок HFE, поддерживающий количество железа в организме на стабильном уровне. Известно, что мутации HFE (в сайтах G845A и C187G) являются основной причиной наследственного нарушения метаболизма железа (гемохроматоза), поражающего ряд тканей и органов [6]. В широкомасштабных исследованиях показано, что биохимические показатели железа у здоровых женщин репродуктивного возраста значимо выше у носителей минорных аллелей G187, A845 гена HFE, чем в случае генотипа дикого типа [3, 11]. Всё это позволило предположить, что существует ассоциация между полиморфными вариантами HFE (G845A, C187G) и повышенным риском возникновения эстрогенозависимых раков, поскольку эти заболевания этиологически связаны с эндогенным окислительным стрессом, создаваемым в тканях метаболитами эстрогенов. Перегрузка железом, обусловленная мутациями HFE, может усилить этот стресс [20]. Действительно, ранее нами и другими авторами было показано, что эстрогенозависимые раки (рак яичников и рак молочной железы) ассоциированы с полиморфными сайтами G845A и C187G HFE [1, 9, 12]. Для гена HFE показана также положительная ассоциация с колоректальным раком [16, 17].

Иванова Т.И.* - в.н.с., к.б.н.; Крикунова Л.И. - зав. отделением, д.мн., проф.; Хорохорина В.А. - с.н.с., к.б.н.; Вербинская Н.И. - врач-радиолог, к.м.н.; Мкртчян Л.С. - с.н.с., к.м.н; Рябченко Н.И. - зав. лабораторией, д.б.н., проф.; Замулаева И.А. - зав. лабораторией, д.б.н., проф.; Цыб. А.Ф. - директор, академик РАМН. ФГБУ МРНЦ Минздравсоцразвития России.

‘Контакты: 249036, Калужская обл., Обнинск, ул. Королева, 4. Тел.: (48439) 9-71-64; e-mail: stasia14@yandex.ru.

Цель данной работы - выяснить роль мутаций ИРЕ 0845А и С1870 в предрасположенности к раку эндометрия (РЭ), который в подавляющем большинстве случаев является эстрогенозависимым и развивается на основе гиперплазии эндометрия (ГЭ) [5, 18]. Актуальность данной работы не вызывает сомнений, так как для спорадического рака эндометрия геномный профиль, то есть распределение БЫР-аллелей (однонуклеотидных полиморфизмов), характерных для данного заболевания, ещё не разработан, хотя ведутся широкомасштабные исследования [2, 4, 8, 14].

Материалы и методы

Группу исследования составили 236 больных (160 РЭ и 76 ГЭ) в возрасте от 22 до 75 лет (табл. 1), находившихся на стационарном или амбулаторном лечении в отделении лучевых и комбинированных методов лечения гинекологических заболеваний ФГБУ МРНЦ Минздравсоц-развития России. Контрольную группу составили 112 здоровых женщин, не имевших в анамнезе гинекологических заболеваний. Клинико-морфологические показатели обследованных групп приведены в таблице 1. В момент взятия образцов периферической крови обследуемые лица подписывали форму информированного согласия на участие в исследовании, а врачом заполнялась анкета, включающая данные о возрасте, росте, весе, этнической принадлежности, диагнозе заболевания обследованных женщин. Исследование одобрено Этической комиссией МРНЦ.

У всех больных РЭ по данным биопсии диагностирована аденокарцинома. Значимых различий в возрасте между группами «контроль», «гиперплазия эндометрия» не обнаружено (р=0,689), в то время как между группами больных РЭ и здоровыми лицами различия значимы (р<0,0001). По индексу массы тела (ИМТ=т/И2) группа больных РЭ статистически значимо отличалась от групп «гиперплазия эндометрия» и «контроль» (р<0,0001). Это подтверждает ранее известный факт, что избыточный вес является фактором риска в развитии онкологических заболеваний у женщин. Значимых различий по ИМТ между группами «гиперплазия эндометрия» и «контроль» не обнаружено (р=0,689).

Таблица 1

Характеристика обследованных лиц по возрасту и индексу массы тела

Показатели Группы

контроль гиперплазия эндометрия рак эндометрия

n=112 n=76 n=160

Возраст (mean ± SD), лет Min - max Индекс массы тела 51,65 ± 13,05 22 - 87 28,29 ± 5,13 50,70 ± 10,19 22 - 72 28,63 ± 6,03 55,84 ± 9,60 20 - 75 33,03 ± 7,00

В работе были исследованы полиморфные сайты С1870 и 0845А гена ИРЕ, контролирующего содержание редокс-активного железа. Определялась частота генотипов ИРЕ у больных раком эндометрия и гиперплазией эндометрия, результаты сравнили с распределением генотипов у здоровых женщин.

Материалом для работы являлась ДНК клеток периферической крови. Для генотипирова-ния HFE использовали методику полимеразной цепной реакции с последующей обработкой специфическими рестриктазами и определением длин фрагментов рестрикции (ПЦР/ПДРФ). В ПЦР-реакцию брали 25 мкл реакционной смеси, состоящей из 50 нг ДНК, 0,5 мкмолей каждого праймера, 0,2 ммолей дезоксинуклеотидтрифосфатов, 1 Ед. ХотСтар ТагПолимеразы (Qiagen) с 1-однократным буфером. Амплификаты подвергали действию рестриктазы Rsal (Promega) для определения полиморфизма G845A и Bcll (Sigma) для C187G. Условия реакций соответствовали протоколам производителей ферментов рестрикции. Продукты рестрикции фракционировали посредством электрофореза в полиакриламидном геле.

Статистическая обработка

Статистический анализ проводили стандартными методами с помощью пакета программ «GraphPad Prism 5». Для обнаружения различий между выборками использовали непараметрические тесты: для двух независимых выборок - Манн-Уитни, при сравнении более чем двух независимых выборок - Крускал и Уоллис. При сравнении частот генотипов применялся точный двусторонний критерий Фишера. Вклады различных генотипов в заболеваемость определялись с помощью традиционного для исследований «случай-контроль» показателя «odd ratio» (OR - мера коррелятивной связи) и его 95 % доверительный интервал (CI).

OR = рбол (1 — Рздор) / Рздор (1 — Рбол),

где Рбол - частота генотипа среди больных, Рздор - частота генотипа среди здоровых. При отсутствии корреляций между генотипом и заболеванием OR=1. При OR>1 риск заболевания при данном генотипе повышен.

Результаты и обсуждение

Сопоставление частоты генотипов полиморфных сайтов C187G и G845A HFE у женщин с диагнозом ГЭ, РЭ и в контрольной группе представлено в таблице 2. Анализ данных, представленных в таблице, не выявил ассоциации изучаемых полиморфизмов с развитием ГЭ и РЭ.

Таблица 2

Частоты генотипов в группах женщин с диагнозом «рак эндометрия», «гиперплазия эндометрия» и в группе здоровых лиц

Сайты Генотипы Число случаев

рак эндометрия гиперплазия эндометрия контроль

HFE G/G 147

rs 18СС5В2 G/A 12

G845A A/A 1

HFE C/C 124

rs 1Ї99945 C/G 3С

C187G G/G В

Учитывая, что физиологические изменения, связанные с менопаузой, наступают в среднем около 48 лет, мы разделили исследуемые группы на две подгруппы: женщины репродуктивного возраста (моложе 48 лет) и старше. В результате анализа обнаружены статистически зна-

5В

чимые различия между частотами минорных генотипов (гомозиготы и гетерозиготы по минорным аллелям 187G и 845A гена HFE) в возрастных подгруппах больных РЭ при уровне значимости р=0,0005. Среди здоровых и больных гиперплазией эндометрия женщин различия между двумя возрастными подгруппами не были статистически значимыми. Сравнение частоты минорных и диких генотипов (гомозиготы по аллелям дикого типа С187 и G845) гена HFE в пределах каждой возрастной подгруппы показано в таблице 3.

Таблица 3

Частота полиморфных генотипов HFE (сумма гомо- и гетерозиготных носителей G187, A845) в двух возрастных подгруппах здоровых и больных (рак эндометрия, гиперплазия эндометрия) женщин

Генотип* Рак эндометрия р

< 48 лет >48 лет

mut HFE wt HFE 18 (56 %) 14 (44 %) 30 (23 %) 98 (77 %) 0,0005

Г иперплазия эндометрия

mut HFE wt HFE 13 (37 %) 22 (63 %) 17 (41 %) 24 (59 %) 0,8149

Здоровые

mut HFE wt HFE 17(37 %) 29 (63 %) %) %) %% 00 00 Is- 06 24 0,5415

*mut - полиморфный, wt - дикий.

Так как частота минорных генотипов HFE в возрастных подгруппах здоровых лиц статистически значимо не отличалась, эти подгруппы были объединены. В возрастных подгруппах больных ГЭ наблюдалась сходная картина, поэтому эти подгруппы были также объединены между собой. Сравнение пропорций мутантных генотипов HFE в пределах возрастных подгрупп больных раком эндометрия с группой здоровых женщин и группой больных гиперплазией эндометрия женщин показано в таблице 4.

Таблица 4

Сравнение частоты полиморфных генотипов НЕЕ в двух возрастных группах больных раком эндометрия, больных гиперплазией эндометрия и здоровых лиц

Показатели межгрупповых различий Рак эндометрия <48 лет Рак эндометрия >48 лет Г иперплазия эндометрия Здоровые

Процент минорных 56 23 39 33

генотипов HFE

(число минорных генотипов/сумма минорных и диких генотипов) р 0,0230 0,1485 0,4408

оя 2,61 0,63 1,30

95 % С1 ОЯ 1,17 - 5,81 0,36 - 1,12 0,71 - 2,38

На основании данных, представленных в таблице 4, можно сделать вывод, что для женщин репродуктивного возраста носительство полиморфного варианта гена HFE является фактором повышенного шанса возникновения РЭ (014=2,61). Для больных РЭ старшей возрастной подгруппы ассоциаций с повышенной вероятностью возникновения заболевания, связанного с носительством полиморфного варианта гена HFE, не обнаружено. У женщин с ГЭ частота му-

тантных генотипов оказалась выше по сравнению с контролем и больными раком эндометрия старшей возрастной группы, для которых различия оказались значимы (0,0256). Между больными гиперплазией эндометрия и пациентками с диагностированным до 48 лет раком эндометрия, а также контрольной группой значимых различий в распределении частот генотипов не обнаружено (0,1387 и 0,4408 соответственно).

В настоящее время не вызывает сомнений, что железо является главным металлом, приводящим к накоплению активных форм кислорода в ходе окислительно-восстановительных реакций катехоловых эстрогенов и реакции Фентона [13, 15]. Окислительно-восстановительные реакции катехоловых эстрогенов усиливаются в присутствии Рэ3+. Катехоловые эстрогены восстанавливают трёхвалентное железо до двухвалентного, которое в свою очередь приводит к инициации перекисного окисления липидов в присутствии кислорода. Ранее было показано, что эстрогеновые метаболиты способны высвобождать ионы Рэ2+ из ферритина, в результате чего в ткани появляются дополнительные свободные радикалы. На модели индукции рака прямой кишки эстрогенами у хомяков было показано, что повышенное содержание железа в диете приводит к ускорению эстрогенозависимого канцерогенеза [20]. Таким образом, в репродуктивном возрасте сочетание высокого уровня эстрогенов с дисбалансом железа может привести к развитию эстрогенозависимых заболеваний, в том числе раку эндометрия.

Недавно канадскими учёными было исследовано влияние полиморфизма HFE на предрасположенность к раку эндометрия [7]. Работа была проведена на 113 пациентках с диагнозом «рак эндометрия» в возрасте от 31 до 83 лет без учёта разницы физиологических особенностей между женщинами репродуктивного возраста и старше. На такой суммарной выборке ассоциации между полиморфизмом HFE и раком эндометрия не выявлено. Нами обнаружена существенная неоднородность в распределении генотипов HFE в двух возрастных подгруппах больных раком эндометрия. Это показывает, что обобщённая для всех возрастов оценка риска возникновения рака эндометрия, связанная с носительством мутантного гена HFE, была бы ошибочной. По нашим данным для женщин репродуктивного возраста носительство полиморфного варианта гена HFE является фактором повышенного риска возникновения рака эндометрия.

Выводы

1. Риск развития рака эндометрия повышен для женщин моложе 48 лет, имеющих хотя бы один минорный аллель 187G или 845A гена HFE.

2. У больных раком эндометрия обнаружены значимые различия в частотах полиморфного варианта гена HFE между женщинами репродуктивного и старшего возраста.

Настоящее исследование поддержано Министерством образования и науки Российской Федерации в рамках Государственного контракта № 16.512.11.2096 «Разработка метода диагностики гиперпролиферативных заболеваний органов женской репродуктивной системы на основе интеграции молекулярно-генетических и клинико-радиологических методов».

Литература

1. Кондрашова Т.В., Иванова Т.И., Жарикова И.А. и др. Полиморфизм гена гемохроматоза (HFE) и риск рака молочной железы //Молекулярный полиморфизм человека /Под ред. С.Д. Варфоломеева. М.: РУДН, 2007. Т. 1. С. 383-39В.

2. Berstein L., Zimarina T., Imyanitov E. et al. Hormonal imbalance in two types of endometrial cancer and genetic polymorphism of steroidogenic enzymes //Maturitas. 200В. V. 54, N 4. P. 352-355.

3. Blanco-Rojo R., Baeza-Richer C., Lopez-Parra A.M. et al. Four variants in transferrin and HFE genes as potential markers of iron deficiency anaemia risk: an association study in menstruating women //Nutrition & Metabolism. 2011. V. 8. Р. В9.

4. Doherty J.A., Weiss N.S., Freeman R.J. et al. Genetic factors in catechol estrogen metabolism in relation to the risk of endometrial cancer //Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 2005. V. 14, N 2. P. 357-3ВВ.

5. Emons G., Fleckenstein G., Hinney B. et al. Hormonal interactions in endometrial cancer //Endocr. Relat. Cancer. 2000. V. 7, N 4. P. 227-242.

В. Feder J.H., Gnirke A., Thomas W. et al. A novel MHC class I-like gene is mutated in patients with heredi-

tary haemochromatosis //Nature Genet. 199В. V. 13. P. 399-408.

7. Gannon P.O., Medelci S., Le Page C. et al. Impact of hemochromatosis gene (HFE) mutations on epithelial ovarian cancer risk and prognosis //Int. J. Cancer. 2011. V. 128, N 10. P. 232В-2334.

8. Gayther S.A., Pharoah P.D.P. The inherited genetics of ovarian and endometrial cancer //Current Opinion in Genetics & Development. 2010. V. 20, N 3. P. 231-238.

9. Gunel-Ozcan A., Alyilmaz-Bekmez S., Guler E.N., Guc D. HFE H63D mutation frequency shows an increase in Turkish women with breast cancer //BMC Cancer. 200В. V. В. P. 1-7; http://www.biomedcentral.com/1471-2407/В/37.

10. Huang X. Does iron have a role in breast cancer? //Lancet Oncol. 2009. V. 9. P. 803-808.

11. Jackson H.A., Carter K., Darke C. et al. HFE mutations, iron deficiency and overload in 10,500 blood donors //Br. J. Haematol. 2001. V. 114, N 2. P. 474-484.

12. Kondrashova T.V., Ivanova T.I., Krikunova L.I. et al. Frequency of hemochromatosis gene (HFE) mutations in russian healthy women and patients with estrogen-dependent cancer //Biochimica et Biophysica Acta (BBA)/Molecular Basis of Disease. 2005. V. 17В2, N 1. Р. 59-В5.

13. Markides C.S., Roy D., Liehr J.G. Concentration dependence of prooxidant and antioxidant properties of catecholestrogens //Arch. Biochem. Biophys. 1998. V. 3В0. Р.105.

14. Meyer L.A., Westin S.N., Lu K.H., Milam M.R. Genetic polymorphisms and endometrial cancer risk

//Expert Rev. Anticancer Ther. 2008. V. 8, N 7. Р. 1159-11В7.

15. Okoh V., Deoraj A., Roy D. Estrogen-induced reactive oxygen species - mediated signaling contribute to breast cancer //Biochim. Biophys. Acta. 2011. V. 1815. P. 115-133.

1В. Osborne N.J., Gurrin L.C., Allen K.J. et al. HFE C282Y homozygotes are at increased risk of breast and

colorectal cancer //Hepatology. 2010. V. 51, N 4. P. 1311-1318.

17. Shaheen N.J., Silverman L.M., Keku T. et al. Association between hemochromatosis (HFE) gene mutation carrier status and the risk of colon cancer //J. Natl. Cancer Inst. 2003. V. 95, N 2. P. 154-159.

18. Sherman M.E. Theories of endometrial carcinogenesis: a multidisciplinary approach //Mod. Pathol. 2000. V. 13, N 3. P. 295-308.

19. Stevens R.G., Graubard B.I., Micozzi M.S. et al. Moderate elevation of body iron level and increased risk

of cancer occurrence and death //Int. J. Cancer. 1994. V. 5В. Р. 3В4-3В9.

20. Wyllie S., Liehr J.G. Enhancement of estrogen-induced renal tumorigenesis in hamsters by dietary iron

//Carcinogenesis. 1998. V. 19, N 7. Р. 1285-1290.

Polymorphism of the gene HFE is a risk factor for endometrial cancer in women of reproductive age

Ivanova T.I., Krikunova L.I., Khorokhorina V.A., Verbinskaya N.I., Mkrtchyan L.S., Ryabchenko N.I., Zamulaeva I.A., Tsyb A.F.

Medical Radiological Research Center of the Russian Ministry of Health and Social Development, Obninsk

The association between polymorphisms in the HFE gene (homozygous and heterozygous for minor alleles 187G u 845A) and endometrial cancer risk is analyzed in 236 cases (160 endometrial cancer + 76 endometrial hyperplasia) and 112 healthy women. Genotyping was performed with PCR/RFLP assay (the PCR products are digested using appropriate restriction endonucleases and the resulting restriction fragments are separated according to their lengths by gel electrophoresis). A significant difference was observed in frequencies of polymorphic HFE alleles between the women of reproductive age and the elderly subjects (p=0,0005). The endometrial cancer risk increased for women of reproductive age with a minor alleles 187G or 845A HFE gene.

Keywords: polymorphism, gene, alleles, endometrial cancer.

Ivanova T.I.* - Leading Researcher, C. Sc., Biol.; Krikunova L.I. - Head of Dep., MD, Prof.; Khorokhorina V.A. - Senior Researcher,

C. Sc., Biol.; Verbinskaya N.I. - Radiologist, C. Sc., Med.; Mkrtchyan L.C. - Senior Researcher, C. Sc., Med.; Ryabchenko N.I. - Head of Dep.,

D. Sc., Biol., Prof.; Zamulaeva I.A. - Head of Lab., D. Sc., Biol., Prof.; Tsyb A.F. - Director, Academician of RAMS. MRRC.

‘Contacts: 4 Korolyov str., Obninsk, Kaluga region, Russia, 249036. Tel.: (48439) 9-71-64; e-mail: stasia14@yandex.ru.