ОЛИГОНУКЛЕОТИД ИЛИ ЕГО ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ ГОМОЛОГ, СОДЕРЖАЩАЯ ЕГО КОМПОЗИЦИЯ И СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ B-КЛЕТОЧНОЙ ОПУХОЛИ
OLIGONUCLEOTIDE OR ITS FUNCTIONAL HOMOLOG, COMPOSITION CONTAINING IT AND METHOD OF TREATING OF B-LYMPHOID NEOPLASM

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Настоящее изобретение относится к олигонуклеотиду с последовательностью, показанной в SEQ ID NO:1, или к его функциональному гомологу, содержащей его композиции и способу лечения B-клеточной опухоли с использованием олигонуклеотида, основанному на индукции апоптоза Β-клеточных опухолевых клеток, на повышении экспрессии CD40 на Β-клеточных опухолевых клетках и на стимуляции образования Β-клеточными опухолевыми клетками IL-10. Для лечения Β-клеточной опухоли олигонуклеотид или его функциональный гомолог могут использоваться самостоятельно или в комбинации с химиотерапевтическими средствами, иммунотерапевтическими средствами и облучением.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Согласно системе классификации ВОЗ (American Journal of Surgical Pathology, 1997, 21(1): 114-121) лимфоидные злокачественные опухоли разделяют на три основных класса: B-клеточные опухоли, опухоли из Т-лимфоцитов/естественных киллеров (NK) и лимфому Ходжкина.
B-клеточные опухоли подразделяют на две группы: опухоль из предшественников B-лимфоцитов и опухоль из периферических B-лимфоцитов. Опухоль из предшественников B-лимфоцитов включает острый лимфобластный лейкоз из предшественников B-лимфоцитов (B-клеточный острый лимфобластный лейкоз, B-ОЛЛ)/лимфобластную лимфому (LBL). Опухоль из периферических B-лимфоцитов включает B-клеточный хронический лимфолейкоз (B-ХЛЛ), лимфому из малых лимфоцитов, B-клеточный пролимфоцитарный лейкоз, лимфо-плазмоцитарную лимфому/иммуноцитому, лимфому из клеток зоны мантии, фолликулярную лимфому, кожную фолликулярную лимфому, эстранодальную B-клеточную лимфому из клеток маргинальной зоны типа MALT, нодальную B-клеточную лимфому из клеток маргинальной зоны (+/- моноцитоподобные B-лимфоциты), лимфому из клеток маргинальной зоны селезенки (+/- ворсинчатые лимфоциты), волосатоклеточный лейкоз, плазмоцитому/плазмоклеточную миелому, диффузную B-крупноклеточную лимфому, медиастинальную (тимусную) B-крупноклеточную лимфому, внутрисосудистую B-крупноклеточную лимфому, первичную лимфому серозных оболочек и лимфому Беркитта.
B-клеточный хронический лимфолейкоз (B-ХЛЛ) и Β-клеточный острый лимфобластный/лимфоцитарный лейкоз (B-ОЛЛ) представлены двумя типами Β-клеточного лейкоза. Клетки B-ХЛЛ экспрессируют CD19, CD5 и CD23 (Nicholas Chiorazzi, M.D., et al. Ν Engl J Med 2005; 352:804-15). Клетки B-ОЛЛ экспрессируют маркеры CD19+CD10+.
Лимфома из малых лимфоцитов представляет собой B-клеточную опухоль. Моноклональная популяция Β-клеток в лимфоме из малых лимфоцитов экспрессирует CD19, CD5 и CD23 (Catherine Thieblemont, et al. Blood. 2004; 103:2727-2737).
B зависимости от диагностированной B-клеточной опухоли в настоящее время приходится выбирать между такими видами лечения, как химиотерапия, лучевая терапия и иммунотерапия.
CD40, экспрессируемый на клеточной поверхности нормальных Β-лимфоцитов и дендритных клеток, относится к семейству рецепторов фактора некроза опухоли (TNFR). CD40L (CD154), экспрессируемый на Τ-лимфоцитах, относится к семейству фактора некроза опухоли (Castle BE, et al. J Immunol 1993; 151: 1777-1788). Взаимодействие CD40L и CD40 способствует пролиферации, дифференцировке и представлению антигенов Β-лимфоцитов, дендритных клеток и моноцитов (Ranheim EA, et al. J Exp Med 1993; 177: 925-935; Yellin MJ, et al. J Immunol 1994; 153: 666-674; Banchereau J, et al. Anhu Rev Immunol 1994; 12: 881-922; M. von Bergwelt-Baildon MS, et al. Blood 2002; 99: 3319-3325).
CD40 также экспрессируется на Β-клеточных опухолевых клетках. Показано, что усиление экспрессии CD40 способствует апоптозу Β-клеточных опухолевых клеток (Peter Chu, et al. PNAS, March 19, 2002, vol. 99, no: 6 3854-3859; Frank Dicker, et al. BLOOD, 15 April 2005 Volume 105, Number 8: 3193-3198).
Эксперименты, проведенные и in vitro, и in vivo, показали, что стимуляция и повышение экспрессии CD40 приводит к ингибированию роста B-клеточных опухолевых клеток (Funakoshi et al., Blood 83: 2787-2794,1994; Murphy et al., Blood 86: 1946-1953, 1995; Eliopoulos, A. G., et al. 1996. Oncogene 13:2243; Hirano, A., et al. 1999. Blood 93:2999; Tong, A. W., Μ et al. 2001. Clin. Cancer Res. 7:691).
Сообщалось, что активация экспрессии CD40 на Β-клеточных опухолевых клетках повышает антигенность Β-клеточных опухолевых клеток и, следовательно, благоприятствует появлению цитотоксических Τ-лимфоцитов (CTL), направленных против этих клеток. CTL могут эффективно уничтожать опухолевые Β-клетки (Dilloo D, et al. Blood. 1997; 90:1927-1933; Kato K, et al. J Clin Invest. 1998; 101:1133-1141; Wierda WG, et al. Blood. 2000; 96:2917-2924; Takahashi S, et al. Hum Gene Ther. 2001; 12:659-670; Takahashi S, et al. Cancer Gene Ther. 2001; 8:378-387). B присутствии CD40L B-клетки хронического лимфолейкоза, экспрессирующие CD40, могут уничтожаться цитотоксическими Τ-лимфоцитами, несущими CD4 (Frank Dicker, et al. Blood, 15 April 2005 Vol. 105, Num 8: 3193-3198). Взаимодействие D40L и CD40 на клетках лимфомы Беркитта могло бы способствовать презентации клеткой опухолевых антигенов специфичным CTL (Khanna, R. et al. 1997. J. Immunol. 159:5782). Эксперименты in vivo и клинические испытания также продемонстрировали, что активация CD40 могла бы повышать иммуногенность клеток Β-клеточного хронического лимфолейкоза (B-ХЛЛ) и, следовательно, индуцировать образование CTL, специфично направленных против данных клеток (Kato, K., et al. 1998. J. Clin. Invest. 101:1133; Wierda, W. G., et al. 2000. Blood 96: 2917).
Вместе взятые, эти данные указывают на то, что повышение экспрессии CD40 на Β-клеточных опухолевых клетках может стимулировать противоопухолевый иммунитет, направленный против B-клеточной опухоли. Противоопухолевый иммунитет включает в себя следующее, но не ограничен перечисленным:
1. Активацию апоптоза Β-клеточных опухолевых клеток;
2. Ингибирование роста B-клеточных опухолевых клеток;
3. Усиление иммуногенности B-клеточных опухолевых клеток и, тем самым, создание поколения CTL, специфично направленных против этих клеток.
Интерлейкин-10 (IL-10) является гомодимерным цитокином, который синтезируется определенными Τ-клетками, моноцитами, макрофагами и некоторыми опухолевыми клетками, происходящими от Β-клеток, Τ-клеток или NK-клеток (Kitabayashi et al., 1995; Masood et al., 1995; Sjoberg et al., 1996; Beatty et al., 1997; Boulland et al., 1998; Jones et al., 1999). Активность IL-10 опосредована его специфическим рецептором, находящимся на поверхности клетки. Рецептор экспрессируется на антигенпредставляющих клетках, лимфоцитах, а также на клетках B-клеточного хронического лимфолейкоза (B-ХЛЛ). Обнаружено, что добавление экзогенного IL-10 ингибирует пролиферацию клеток B-ХЛЛ, недавно выделенных [из крови] больных (Jesper Jurlander, Chun-Fai Lai, Jimmy Tan, et al. Characterization of interleukin-10 receptor expression on B-cell chronic lymphocytic leukemia cells. Blood, Vol. 89, No. 11 (June 1), 1997: pp. 4146-4152). Также сообщалось, что IL-10 ингибирует пролиферацию клеток B-ХЛЛ и повышает апоптоз клеток B-ХЛЛ (Anne-Catherine Fluckiger, Isabelle Durand, and Jacques Banchereau. Interleukin 10 Induces Apoptotic Cell Death of B-Chronic Lymphocytic Leukemia Cells. J. Exp. Med. Volume 179, January 1994, 91-99). Иммуностимулирующие противоопухолевые свойства IL-10 обсуждаются в обзоре, авторы которого предполагают, что гиперэкспрессия IL-10 в микроокружении опухоли может катализировать отторжение опухоли иммунной системой (Simone Mocellin, Francesco M. Marincola and Howard A. Young. Interleukin-10 and the immune response against cancer: a counterpoint. Journal of Leukocyte Biology. 2005; 78:1043-1051).
B настоящем изобретении авторами предложен олигонуклеотид и способ лечения B-клеточной опухоли при помощи использования олигонуклеотида согласно изобретению. Олигонуклеотид вызывает апоптоз B-клеточных опухолевых клеток, повышает экспрессию CD40 на Β-клеточных опухолевых клетках и стимулирует образование Β-клеточными опухолевых клетками IL-10 - все эти эффекты содействуют лечению B-клеточной опухоли.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Первый вариант осуществления настоящего изобретения относится к олигонуклеотиду с последовательностью 5'-TCGTCGACGTCGTTCGTTCTC-3' (сконструированному как Олиго-2 или обозначаемому SEQ ID NO:1) или его функциональному гомологу. Олигонуклеотид или его функциональный гомолог может иметь модификацию фосфатного остова, которая представляет собой фосфортиоатную или фосфордитиоатную модификацию, частичную или полную. Олигонуклеотид или его функциональный гомолог могут иметь химические модификации или замены на редкие основания. Олигонуклеотид или его функциональный гомолог могут быть функциональной частью любого другого олигонуклеотида или фрагмента ДНК или могут быть клонированы в плазмиду, бактериальный вектор, вирусный вектор или ДНК-вакцину соответственно. Олигонуклеотид с последовательностью SEQ ID NO:1 может быть модифицирован путем добавления одного основания и более (предпочтительно 1-10 оснований) к каждому концу или путем изменения оснований. Специалистам в данной области решать, использовать ли олигонуклеотид с последовательностью SEQ ID NO:1 или его функциональный гомолог или фрагмент ДНК, одноцепочечный или двухцепочечный, содержащий одну и более копий олигонуклеотида с последовательностью (SEQ ID NO:1), чтобы достичь цели настоящего изобретения на основе суммы знаний, накопленных в данной области, и идеи настоящего изобретения.
Второй вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу лечения Β-клеточных опухолей у субъекта с применением олигонуклеотида или его функционального гомолога согласно изобретению или композиции, содержащей вышеупомянутое. Субъектом является человек или животное. B-клеточные опухоли включают в себя, но не ограничены Β-клеточным лейкозом, Β-клеточной лимфомой и миеломой.
Третий вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу лечения B-клеточной опухоли с использованием олигонуклеотида или его функционального гомолога согласно изобретению или композиции, содержащей вышеупомянутое, путем активации апоптоза B-клеточных опухолевых клеток.
Четвертый вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу лечения B-клеточной опухоли с использованием олигонуклеотида или его функционального гомолога согласно изобретению или композиции, содержащей вышеупомянутое, путем повышения экспрессии CD40 на Β-клеточных опухолевых клетках.
Пятый вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу лечения B-клеточной опухоли с использованием олигонуклеотида или его функционального гомолога согласно изобретению или композиции, содержащей вышеупомянутое, путем стимуляции образования IL-10 Β-клеточными опухолевыми клетками.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к композиции, содержащей терапевтически эффективное количество олигонуклеотида или его функционального гомолога согласно изобретению в чистом виде или в составе или в сочетании с фармацевтически приемлемыми носителями. Композицию можно вводить посредством энтерального, парентерального и местного введения или путем ингаляции.
Еще один вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу лечения Β-клеточных опухолей, предусматривающему введение терапевтически эффективного количества олигонуклеотида или его функционального гомолога согласно изобретению или композиции, содержащей вышеупомянутое и по меньшей мере одно средство, направленное против B-клеточных опухолей, включая химиотерапевтические средства, иммунотерапевтические средства и средства, используемые в лучевой терапии.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фиг.1 - апоптоз клеток B-ХЛЛ, вызванный Олиго-2 (дозировка).
Клетки B-ХЛЛ культивировали в среде, содержащей 10% сыворотки человека группы AB, отдельно или вместе с различным количеством Олиго-2. На 7-й день клетки окрашивали TMRE. Число жизнеспособных клеток B-ХЛЛ вычисляли как процентное содержание TMRE-положительных клеток.
Фиг.2 - влияние Олиго-2 на повышение экспрессии CD40 на клетках B-ХЛЛ.
Клетки B-ХЛЛ инкубировали отдельно или вместе с Олиго-2 в течение 7 дней и затем окрашивали антителом FITC-CD40 для анализа на экспрессию CD40, в котором использовали проточную цитометрию. На уровень экспрессии указывало число MFI.
Фиг.3 - влияние Олиго-2 на повышение экспрессии CD40 на клетках лимфомы из малых лимфоцитов.
Клетки лимфомы из малых лимфоцитов инкубировали отдельно или вместе с Олиго-2. На 7-й день клетки окрашивали антителом FITC-CD40 для анализа на экспрессию CD40, в котором использовали проточную цитометрию. На уровень экспрессии указывало число MFI.
Фиг.4 - апоптоз клеток B-ОЛЛ, вызванный Олиго-2.
Клетки B-ОЛЛ инкубировали отдельно или вместе с Олиго-2. На 3-й, 5-й и 7-й дни инкубации клетки окрашивали TMRE, затем выполняли проточную цитометрию. Число жизнеспособных клеток B-ОЛЛ вычисляли по процентному содержанию TMRE-положительных клеток.
Фиг.5 - повышение экспрессии CD40 на клетках B-ОЛЛ, вызванное Олиго-2.
Клетки B-ОЛЛ культивировали отдельно или вместе с 1 мкг/мл Олиго-2. На 3-й, 5-й и 7-й дни культивирования клетки окрашивали меченными FITC моноклональными антителами к CD40 для определения экспрессии CD40 методом проточной цитометрии. На уровень экспрессии указывало число MFI.
Фиг.6 - образование интерлейкина-10 клетками B-ХЛЛ, индуцированное Олиго-2.
Клетки B-ХЛЛ культивировали отдельно или вместе с Олиго-2 в среде, не содержащей сыворотки. Супернатанты собирали в указанный момент и определяли в них IL-10, используя набор для ELISA.
Фиг.7 - влияние Олиго-2 на пролиферацию нормальных PBMC человека.
3
Нормальные PBMC человека культивировали с Олиго-2, 2216 или 2006 в течение 36 часов, затем в них включали меченный [H] тимидин, чтобы соответственно определить пролиферацию клеток. Анализировали 5 проб крови. Пролиферацию клеток выражали в виде SI.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Определения
B данном изобретении следующие термины должны иметь приведенные ниже значения.
«Олигонуклеотид» означает множество нуклеотидов (то есть молекул, содержащих сахар (например, дезоксирибозу), связанный с фосфатной группой и с органическим основанием, которое может подвергаться замене). Существует четыре органических основания: цитозин (C), тимин (T), аденин (A) и гуанин (G). Олигонуклеотид может синтезироваться посредством автоматизированного синтезатора олигонуклеотидов, который имеется на рынке, или может быть получен из существующих последовательностей нуклеиновой кислоты с использованием известных методов.
«Модификация остова» олигонуклеотида должна означать, что у олигонуклеотида есть фосфатный остов, модифицированный фосфортиоатом (то есть по меньшей мере один из атомов кислорода фосфата замещен серой), или другой модифицированный остов. «Химическая модификация» олигонуклеотида должна означать модификацию путем использования активных групп нуклеотида или путем создания аналогов нуклеотида. Модификации могут происходить или во время синтеза олигонуклеотида, или после него. Во время синтеза модифицированные основания (включая, без ограничения, аналоги тимидина) могут включаться во внутренние области молекулы или в 5'-конец. После синтеза модификацию можно выполнить с использованием активных групп (с помощью аминного модификатора, посредством 3'- или 5'-гидроксильных групп или посредством фосфатной группы).
«B-клеточная опухоль» должна означать заболевания, возникающие вследствие патологической пролиферации клеток Β-лимфоцитарной линии. B-клеточные опухоли можно разделить на Β-клеточный лейкоз, Β-клеточную лимфому и миелому (плазмоцитому/миелому из плазматических клеток). B-клеточный лейкоз включает в себя B-клеточный хронический лимфолейкоз (B-ХЛЛ), острый лимфобластный лейкоз из предшественников B-клеток (B-клеточный острый лимфолейкоз, B-ОЛЛ), B-клеточный пролимфоцитарный лейкоз и волосатоклеточный лейкоз. B-клеточная лимфома включает в себя лимфому из малых лимфоцитов, лимфо-плазмоцитарную лимфому/иммуноцитому, лимфому из клеток зоны мантии, фолликулярную лимфому, кожную фолликулярную лимфому, эстранодальную B-клеточную лимфому из клеток маргинальной зоны типа MALT, нодальную B-клеточную лимфому из клеток маргинальной зоны (+/- моноцитоподобные B-лимфоциты), лимфому из клеток маргинальной зоны селезенки (+/- ворсинчатые лимфоциты), диффузную B-крупноклеточную лимфому, медиастинальную (тимусную) B-крупноклеточную лимфому, внутрисосудистую B-крупноклеточную лимфому, первичную лимфому серозных оболочек и лимфому Беркитта. «Субъект» должен означать млекопитающее, включая, без ограничения, человека, обезьяну, собаку, кошку, лошадь, корову, свинью, козу, овцу, мышь и крысу. Олигонуклеотид согласно изобретению можно вводить субъекту с Β-клеточной опухолью.
«Средство, направленное против B-клеточной опухоли» должно означать средство, используемое для лечения B-клеточной опухоли у субъекта. Средство включает в себя олигонуклеотид согласно изобретению, химиотерапевтические средства, иммунотерапевтические средства и средства, используемые в лучевой терапии. Олигонуклеотид согласно изобретению можно вводить перед, одновременно или после введения одного и более других средств, направленных против B-клеточной опухоли, чтобы достичь синергизма в лечении Β-клеточной опухоли.
«Химиотерапевтические средства» должны означать химиотерапевтические средства, которыми лечат B-клеточную опухоль в комбинации с олигонуклеотидом согласно изобретению. Олигонуклеотид согласно изобретению можно использовать в лечении Β-клеточных опухолей с одним химиотерапевтическим средством и более. Химиотерапевтические средства включают в себя, но не ограничены алкилирующими средствами, такими как циклофосфамид или хлорамбуцил, алкалоидами барвинка (например, винкристином и винбластином), прокарбазином, метотрексатом, преднизоном, антрациклином, L-аспарагиназой, аналогами пуринов (например, флударабина монофосфатом, 2-хлордезоксиаденозином и пентостатином), цитозином, арабинозидом, цисплатином, этопозидом и ифосфамидом. Олигонуклеотид согласно изобретению также может использоваться в химиотерапии вместе с одной и более комбинациями химиотерапевтических средств. Комбинации включают, но не ограничены CVP (циклофосфамид, винкристин и преднизон), CHOP (CVP и доксорубицин), C-MOPP (циклофосфамид, винкристин, преднизон и прокарбазин), CAP-BOP (CHOP плюс прокарбазин и блеомицин), m-BACOD (CHOP плюс метотрексат, блеомицин и лейковорин), ProMACE-MOPP (преднизон, метотрексат, доксорубицин, циклофосфамид, этопозид и лейковорин плюс стандартный MOPP), ProMACE-CytaBOM (преднизон, доксорубицин, циклофосфамид, этопозид, цитарабин, блеомицин, винкристин, метотрексат и лейковорин), MACOP-B (метотрексат, доксорубицин, циклофосфамид, винкристин, фиксированная доза преднизона, блеомицин и лейковорин), IMVP-16 (ифосфамид, метотрексат и этопозид), MIME (метил-gag, ифосфамид, метотрексат и этопозид), DHAP (дексаметазон, высокая доза цитарабина и цисплатин), ESHAP (этопозид, метилпреднизолон, высокая доза цитарабина, цисплатин), CEPP(B) (циклофосфамид, этопозид, прокарбазин, преднизон и блеомицин), CAMP (ломустин, митоксантрон, цитарабин и преднизон), CHOP плюс блеомицин, метотрексат, прокарбазин, мустарген, цитозин-арабинозид и этопозид, MOPP (мехлорэтамин (мустарген), винкристин (Онковин), прокарбазин и преднизон), ABVD (например, адриамицин, блеомицин, винбластин и дакарбазин), ChlVPP (хлорамбуцил, винбластин, прокарбазин и преднизон), CABS (ломустин, доксорубицин, блеомицин и стрептозоцин), MOPP плюс ABVD, MOPP плюс ABV (доксорубицин, блеомицин и винбластин) или BCVPP (кармустин, циклофосфамид, винбластин, прокарбазин и преднизон) и CAP (циклофосфамид, доксорубицин и преднизон).
«Иммунотерапевтические средства» должны означать иммунотерапевтические средства, которыми лечат B-клеточную опухоль в комбинации с олигонуклеотидом согласно изобретению. Олигонуклеотид согласно изобретению можно использовать в лечении Β-клеточных опухолей вместе с одним и более иммунотерапевтическими средствами. Иммунотерапевтические средства включают в себя, но не ограничены антителами к CD20. Антитело к CD20 включает иммуноглобулины и его фрагменты, которые способны специфически реагировать с белком CD20, находящимся на поверхности B-клеточных опухолевых клеток. Антитела к CD20 могут быть поликлональными и моноклональными антителами, химерными антителами, биспецифичными антителами и гуманизированными антителами. «CD20» является белком мебраны B-клеток (Tedder et al., Immunology Today 15: 450-454 (1994)), его экспрессируют и нормальные, и опухолевые B-клетки (John C. Byrd, et al. J Clin Oncol 2001; 19: 2165-2170; Huhn D, et al. Blood 2001, 98:1326-1331).
«Фармацевтически приемлемый носитель» означает один и более твердых или жидких наполнителей, разбавителей или инкапсулирующих веществ, которые подходят для введения олигонуклеотида согласно изобретению субъекту. Носитель может быть органическим, неорганическим, природным или синтетическим. Носитель включает все без исключения растворы, разбавители, растворители, дисперсионные среды, липосомы, эмульсии, покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства, изотонические средства и средства, замедляющие всасывание, и любой другой носитель, подходящий для введения олигонуклеотида согласно изобретению, и их применение известно в данной области.
«Терапевтически эффективное количество» олигонуклеотида согласно изобретению должно относиться к дозе, используемой, чтобы достичь желаемого результата лечения B-клеточной опухоли у субъекта. Доза может быть определена стандартными методами, известными специалистам в данной области, и может меняться, в зависимости от факторов, включающих, но не ограниченных размером, или/и общим состоянием здоровья субъекта, или тяжестью заболевания. Введение олигонуклеотида согласно изобретению может быть выполнено в виде однократного или многократного лечебного воздействия. Дозы олигонуклеотида согласно изобретению для введения субъекту составляют приблизительно от 1 мкг до 100 мг на введение. Однако для лечения Β-клеточной опухоли можно использовать дозы, в 10-1000 раз превышающие описанные выше дозы. Режим введения может корректироваться специалистами для обеспечения оптимального терапевтического эффекта.
«Путь» введения олигонуклеотида согласно изобретению должен означать энтеральное, парентеральное и местное введение или ингаляцию. Термин «энтеральное», который используется в данном документе, включает в себя пероральное, желудочное, кишечное и ректальное введение. Термин «парентеральное» включает в себя внутривенное, интраперитонеальное, внутримышечное, подкожное, ректальное или влагалищное введение. Термин «местное» означает нанесение олигонуклеотида снаружи на эпидермис, введение в полость рта и в ухо, глаз и нос.
«Фармацевтическая композиция» должна означать композицию, содержащую терапевтически эффективное количество олигонуклеотида согласно изобретению в чистом виде или вместе с фармацевтически приемлемым носителем. Композиция включает в себя, но не ограничена водными или солевыми растворами, частицами, аэрозолями, пилюлями, гранулами, порошками, таблетками, покрытыми оболочкой таблетками, (микро)капсулами, суппозиториями, сиропами, эмульсиями, суспензиями, кремами, каплями и другими фармацевтическими композициями, подходящими для применения, наряду с рядом других систем введения препаратов. Композиции подходят для инъекции, перорального, буккального, ректального и влагалищного введения, ингаляции и применения в виде депо. Во всех случаях композиция должна быть стерильной и стабильной в условиях изготовления и хранения и защищена от микробного загрязнения. Композиция для инъекций будет включать в себя водные растворы или дисперсию и порошки для немедленного изготовления растворов или дисперсии, пригодной для инъекции. «Порошок» согласно изобретению относится к композиции, которая содержит тонкодиспергированные твердые частицы, содержащие олигонуклеотид согласно изобретению. Перед применением в состав порошка могут быть введены другие фармацевтически приемлемые носители (например, вода, PBS, физиологический раствор и другие фармацевтически приемлемые буферы). Растворы могут быть получены путем объединения олигонуклеотида с одним и более подходящими растворителями и другими необходимыми ингредиентами. Дисперсия может быть получена путем объединения олигонуклеотида и растворителя, который содержит дисперсионную среду (например, глицерин, жидкие полиэтиленгликоли и масла) и другие необходимые ингредиенты. Состав композиции для перорального приема будет содержать съедобные носители, чтобы сформировать таблетки, пилюли, драже, капсулы, жидкости, гели, сиропы, взвеси, суспензии и тому подобное. Композиция для буккального введения будет представлять собой таблетки или пастилки, полученные обычным способом. Композиция для ингаляции будет представлять собой аэрозоль, выдавливаемый из баллончика, находящегося под давлением, или распылителя, или сухой порошок и может быть выбрана специалистом. Из олигонуклеотида также могут быть получены фармацевтические приемлемые композиции для ректального или влагалищного введения или для применения в качестве депо. Олигонуклеотид согласно изобретению может использоваться в композиции самостоятельно или в комбинации еще с одним или более средствами, включая, но не ограничиваясь химиотерапевтическими средствами, иммунотерапевтическими средствами и лигандом, распознаваемым специфическим рецептором или молекулой клетки-мишени. Олигонуклеотид согласно изобретению в комбинации с другим средством может представлять собой отдельные композиции и использоваться следующим образом: (1) перед введением олигонуклеотид смешивают со вторым средством; (2) олигонуклеотид и второе средство вводят субъекту в разное время; (3) олигонуклеотид и второе средство вводят в различные части организма субъекта. Кроме того, композиция может содержать плазмиду, бактериальные векторы, вирусные векторы и вакцины на основе нуклеиновой кислоты, несущей последовательность олигонуклеотида согласно изобретению.
ПРИМЕРЫ
Следующие примеры являются иллюстративными и не должны рассматриваться как ограничивающие объем настоящего изобретения. При этом предусмотрены различные вариации изобретения, предложенные специалистами, в рамках объема, охватываемого настоящим изобретением.
Пример 1. Синтез олигонуклеотида
Олигонуклеотид с последовательностью 5'-TCGTCGACGTCGTTCGTTCTC-3' (сконструированный как Олиго-2, SEQ ID NO:1) был сконструирован и синтезирован.
Для анализа функции Олиго-2 также синтезировали два контрольных олигонуклеотида: 2006 с последовательностью 5′-tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt-3' (SEQ ID NO:2) и 2216 с последовательностью 5'-gggggacgatcgtcgggggg-3' (SEQ ID NO:3). Три олигонуклеотида синтезировали в Sangon Biotech Company (Шанхай, Китай), проверили на эндотоксин, используя анализ лизата амебоцита Limulus (Associates of Cape Cod, Inc); манипуляции с ними производили с использованием апирогенных реактивов. 2006 (J Immunol 2000; 164:1617) - хорошо изученный олигонуклеотид, который сильно активирует нормальные Β-клетки. 2216 (Eur J Immunol 2001; 31:2154) - другой хорошо изученный олигонуклеотид, который вызывает образование большого количества интерферона типа I в плазмацитоидных дендритных клетках.
Способы синтеза олигонуклеотида известны специалистам в данной области; обычно, помимо прочего, используют твердофазный синтез. Конкретно, твердый носитель, используемый в процессе синтеза, представляет собой шарик из стекла с контролируемым размером пор (CPG). У шарика имеется поверхность с порами и каналами, внутри которых происходит присоединение защищенного нуклеотида. Синтез олигонуклеотида начинается с нуклеотидов, расположенных с 3′-конца, и проходит через ряд циклов, состоящих из пяти стадий, которые повторяются до тех пор, пока не будет присоединен нуклеотид 5′-конца. Этими стадиями являются снятие защиты, активация, связывание, кэппирование и стабилизация.
Стадия 1. Снятие защиты
Защитную группу в защищенном нуклеозиде, прикрепленном к шарику из CPG (стекло с контролируемым размером пор), удаляют трихлоруксусной кислотой (TCA), оставляя реакционноспособную 5′-гидроксильную группу.
Стадия 2. Активация
На этой стадии тетразол вступает в реакцию с нуклеозидом, связанным с фосфорамидатом, образуя промежуточное соединение тетразолилфосфорамидат.
Стадия 3. Связывание
Промежуточное соединение тетразолилфосфорамидат реагирует с гидроксильной группой реципиента, и образуется связь 5' к 3'. Тетразол регенерируется, и способ продолжается.
Стадия 4. Кэппирование
B этой стадии используют ацетилирующий реактив, состоящий из уксусного ангидрида и N-метилимидазола, чтобы заблокировать реакционноспособную гидроксильную группу на ближайших к 5′-концу олигонуклеотидах, чтобы обеспечить прохождение реакции связывания.
Стадия 5. Стабилизация
Как только стадия кэппирования выполнена, последней стадией в цикле является стадия окисления, которая стабилизирует фосфатную связь между растущей цепью олигонуклеотида и последним добавленным основанием. Эту стадию выполняют в присутствии йода в качестве мягкого окислителя в тетрагидрофуране (THF) и воде.
После этой заключительной стадии цикл повторяется для каждого нуклеотида в последовательности. После завершения синтеза одноцепочечную молекулу ДНК очищают такими способами, как хроматография на гидроксиапатите, электрофорез в полиакриламидном геле, ВЭЖХ, C18 и OPC.
Пример 2. Апоптоз клеток B-ХЛЛ человека, вызванный Олиго-2
1. Получение клеток B-ХЛЛ человека
Пробы крови у не получавших лечения больных (The First Hospital, Университет Цзилиня, Китай) B-ХЛЛ (подтвержденного морфологически) брали после получения письменного информированного согласия. Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) выделяли центрифугированием в градиенте плотности Ficoll-Paque (Pharmacia). Содержавшиеся в PBMC CD5+CD19+CD23+ клетки B-ХЛЛ очищали, используя набор для выделения B-клеток (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Германия), до>95% CD5+CD19+CD23+ клеток (клетки B-ХЛЛ). Клетки получали согласно руководству Miltenyi Biotec.
2. Апоптоз клеток B-ХЛЛ человека, вызванный Олиго-2
6
Клетки B-ХЛЛ инкубировали с Олиго-2, или 2006, или 2216 при конечной концентрации 3 мкг/мл в среде RPMI-1640, содержащей 10% сыворотки человека группы AB (HyClone), по 10 клеток/лунку в 48-луночных планшетах. Олиго-2, 2006 или 2216 разбавляли не содержащей сыворотки средой RPMI-1640 (HyClone). Равный объем разбавителя (не содержащей сыворотки среды RPMI-1640 (HyClone)) использовали в качестве контроля (среда).
На 3-й, 5-й и 7-й дни после инкубации клетки считали и окрашивали сложным этиловым эфиром тетраметилродамина (TMRE) (Molecular Probes Inc) (Lena Thyrell, et al. The Journal of Biological Chemistry Vol. 279, No. 23, Issue of June 4, pp. 24152-24162, 2004) в течение 10 минут. TMRE-положительные (жизнеспособные) и TMRE-отрицательные (апоптотические) клетки B-ХЛЛ определяли методом проточной цитометрии (B.D. FACS Aria). Число жизнеспособных клеток B-ХЛЛ вычисляли, умножая общее число клеток на процентное содержание TMRE-положительных клеток в каждый момент времени. Эксперимент повторяли с десятью пробами крови, полученными от больных B-ХЛЛ, и усредненный результат (n=10) показал, что Олиго-2 значительно стимулировал апоптоз клеток B-ХЛЛ (таблица 1), и эффект, вызванный Олиго-2, был приблизительно в 2 сильнее, чем вызванный 2006. Кроме того, наблюдалось также дозозависимое влияние Олиго-2 и 2006 на апоптоз клеток B-ХЛЛ. Результат показал, что Олиго-2 в различных дозах в диапазоне 0,1-10 мкг/мл явно стимулировал апоптоз клеток B-ХЛЛ (фиг.1). Для сравнения: стимулирующий апоптоз эффект, который вызывал Олиго-2 в дозе 1 мкг/мл, был примерно в 3 раза сильнее, чем эффект, вызванный 2006. Взятые вместе, эти результаты показывают, что Олиго-2 может быть использован для лечения B-ХЛЛ за счет стимуляции апоптоза клеток B-ХЛЛ.
Таблица 1
Апоптоз клеток B-ХЛЛ, вызванный Олиго-2 (кинетика)
Жизнеспособные клетки B-ХЛЛ (%) (n=10)
Группа
Время инкубации (дни)
3
5
7
Среда
82,2±12,2
79,5±9,25
81,3±11,0
2216
67,7+18,2
57,7±16,7
50,7±13,5
2006
66,5±12,1
44,4±15,0
40,2±10,8
Олиго-2
45,5±9,5
17,6±5,6
14,2±3,1
Пример 3. Повышение экспрессии CD40 на клетках B-ХЛЛ человека, вызванное Олиго-2
1. Получение клеток B-ХЛЛ человека
Клетки B-ХЛЛ человека выделяли от больных B-ХЛЛ, используя процедуры, описанные в примере 2.
2. Повышение экспрессии CD40 на клетках B-ХЛЛ человека, вызванное Олиго-2
6
Клетки B-ХЛЛ инкубировали с Олиго-2, или 2006, или 2216 при конечной концентрации 3 мкг/мл в среде RPMI-1640, содержащей 10% сыворотки человека группы AB (HyClone), по 10 клеток/лунку в 48-луночных планшетах. Олиго-2, 2006 или 2216 разбавляли не содержащей сыворотки средой RPMI-1640 (HyClone). Равный объем разбавителя (не содержащей сыворотки среды RPMI-1640 (HyClone)) использовали в качестве контроля (среда).
На 7-й день после инкубации клетки считали и окрашивали антителом FITC-CD40 (Becton Dickinson) (Molecular Probes Inc) (Lena Thyreli, et al. The Journal of Biological Chemistry Vol. 279, No. 23, Issue of June 4, pp. 24152-24162, 2004) в течение 10 минут. Окрашенные CD40 клетки B-ХЛЛ определяли методом проточной цитометрии (B.D. FACS Aria). Результат (фиг.2) показал, что Олиго-2 значительно повышает экспрессию CD40 на клетках B-ХЛЛ - это указывает на то, что Олиго-2 может быть использован для лечения B-ХЛЛ за счет повышения экспрессии CD40 на клетках. Повышение экспрессии CD40 способствует апоптозу клеток B-ХЛЛ, ингибирует рост клеток B-ХЛЛ и делает клетки B-ХЛЛ более иммуногенными, стимулирующими образование CTL, специфически направленных против клеток B-ХЛЛ. Эксперимент повторяли по меньшей мере с десятью пробами крови от больных B-ХЛЛ, что давало схожие результаты.
Пример 4. Апоптоз клеток лимфомы из малых лимфоцитов человека, вызванный Олиго
2
-
1. Получение клеток лимфомы из малых лимфоцитов человека
Клетки лимфомы из малых лимфоцитов выделяли из биоптатов лимфатических узлов от больных (The First Hospital, Университет Цзилиня, Китай) лимфомой из малых лимфоцитов (подтвержденной морфологически) после получения письменного информированного согласия. Биоптаты измельчали шероховатыми поверхностями предметных стекол, чтобы высвободить клетки в 5 мл среды RPMI-1640, содержащей 10% сыворотки человека группы AB (HyClone), в 6-сантиметровом культуральном планшете. Высвобожденные клетки фильтровали через сетку из нержавеющей стали и собирали в коническую пробирку объемом 50 мл, содержащую 15 мл среды RPMI-1640 без добавления сыворотки (HyClone). Пробирку центрифугировали при 300g в течение 10 минут и затем супернатант отбрасывали. CD5+CD19+CD23+ клетки лимфомы из малых лимфоцитов очищали, используя набор для выделения B-клеток (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Германия), до >95% CD5+CD19+CD23+ клеток (клеток лимфомы из малых лимфоцитов). Клетки получали согласно руководству Miltenyi Biotec.
2. Апоптоз клеток лимфомы из малых лимфоцитов, вызванный Олиго-2
6
Клетки лимфомы из малых лимфоцитов инкубировали с Олиго-2, или 2006, или 2216 в конечной концентрации 3 мкг/мл в RPMI-1640, содержащей 10% сыворотки человека группы AB (HyClone), по 10 клеток/лунку в 48-луночных планшетах. Олиго-2, 2006 или 2216 разбавляли не содержащей сыворотки средой RPMI-1640 (HyClone). Равный объем разбавителя (не содержащей сыворотки среды RPMI-1640 (HyClone)) использовали в качестве контроля (среда).
На 3-й, 5-й и 7-й день после инкубации клетки считали и окрашивали сложным этиловым эфиром тетраметилродамина (TMRE) (Molecular Probes Inc) (Lena Thyrell, et al. The Journal of Biological Chemistry Vol. 279, No. 23, Issue of June 4, pp. 24152-24162, 2004) в течение 10 минут. TMRE-положительные (жизнеспособные) и TMRE-отрицательные (апоптотические) клетки лимфомы из малых лимфоцитов определяли методом проточной цитометрии (B.D. FACS Aria). Число жизнеспособных клеток лимфомы из малых лимфоцитов вычисляли, умножая общее число клеток на процентное содержание TMRE-положительных клеток в каждый момент времени. Эксперимент повторяли с пятью пробами от больных лимфомой из малых лимфоцитов, и усредненный результат (n=5) показал, что Олиго-2 значительно стимулирует апоптоз клеток лимфомы из малых лимфоцитов (таблица 2), это указывает на то, что Олиго-2 может быть использован для лечения лимфомы из малых лимфоцитов путем стимуляции апоптоза клеток лимфомы из малых лимфоцитов.
Таблица 2
Апоптоз клеток лимфомы из малых лимфоцитов, вызванный Олиго-2
Жизнеспособные клетки лимфомы из малых лимфоцитов (%) n=5
Группа
Время инкубации (дни)
3
5
7
Среда
81,2±7,7
78,4±9,1
77,1±13,2
2216
68,5±15,0
58,7±12,3
52,1±10,2
2006
67,6+10,3
45,3±8,9
41,1±8,2
Олиго-2
60,3±12,2
23,2+5,6
15,5±6,2
Пример 5. Повышение экспрессии CD40 клетками лимфомы из малых лимфоцитов, вызванное Олиго-2
1. Получение клеток лимфомы из малых лимфоцитов человека
Клетки лимфомы из малых лимфоцитов человека получали от больных, используя процедуры, описанные в примере 4.
2. Повышение экспрессии CD40 клетками лимфомы из малых лимфоцитов, вызванное Олиго-2
6
Клетки лимфомы из малых лимфоцитов инкубировали с Олиго-2, или 2006, или 2216 в конечной концентрации 3 мкг/мл в среде RPMI-1640, содержащей 10% сыворотки человека группы AB (HyClone), по 10 клеток/лунку в 48-луночных планшетах. Олиго-2, 2006 или 2216 разбавляли не содержащей сыворотки средой RPMI-1640 (HyClone). Равный объем разбавителя (не содержащей сыворотки среды RPMI-1640 (HyClone)) использовали в качестве контроля (среда).
На 7-й день после инкубации клетки считали и окрашивали антителом FITC-CD40 (Becton Dickinson) (Molecular Probes Inc) (Lena Thyrell, et al. The Journal of Biological Chemistry Vol. 279, No. 23, Issue of June 4, pp. 24152-24162, 2004) в течение 10 минут. Окрашенные CD40 клетки лимфомы из малых лимфоцитов определяли методом проточной цитометрии (B.D. FACS Aria). Результат (фиг.3) показал, что Олиго-2 значительно повышает экспрессию CD40 на клетках лимфомы из малых лимфоцитов, это указывает на то, что Олиго-2 может использоваться для лечения лимфомы из малых лимфоцитов путем повышения экспрессии CD40 на клетках. Повышение экспрессии CD40 способствует апоптозу клеток лимфомы из малых лимфоцитов, ингибирует рост клеток лимфомы из малых лимфоцитов и делает клетки лимфомы из малых лимфоцитов более иммуногенными, стимулируя образование CTL, специфичных в отношении данных клеток. Эксперимент повторяли с пятью пробами, что дало сходные результаты.
Пример 6. Апоптоз клеток Β-клеточного острого лимфобластного/лимфоцитарного лейкоза человека (B-ОЛЛ), вызванный Олиго-2
1. Получение клеток B-ОЛЛ человека
Пробы крови от не получавших лечения больных B-ОЛЛ (подтвержденного морфологически) (The First Hospital, Университет Цзилиня, Китай) брали после получения письменного информированного согласия. PBMC выделяли центрифугированием в градиенте плотности Ficoll-Paque (Pharmacia). CD19+CD10+ клетки B-ОЛЛ, содержащиеся в PBMC, очищали, используя набор для выделения B-клеток (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Германия), до >95% CD19+CD10+ клеток (клетки B-ОЛЛ). Клетки получали в соответствии с руководством Miltenyi Biotec.
2. Апоптоз B-ОЛЛ клеток, вызванный Олиго-2
6
Клетки B-ОЛЛ инкубировали с Олиго-2, или 2006, или 2216 в конечной концентрации 3 мкг/мл в среде RPMI-1640, содержащей 10% сыворотки человека группы AB (HyClone), по 10 клеток/лунку в 48-луночных планшетах. Олиго-2, 2006 или 2216 разбавляли не содержащей сыворотки средой RPMI-1640 (HyClone). Равный объем разбавителя (не содержащей сыворотки среды RPMI-1640 (HyClone)) использовали в качестве контроля (среда).
На 3-й, 5-й и 7-й день после инкубации клетки считали и окрашивали сложным этиловым эфиром тетраметилродамина (TMRE) (Molecular Probes Inc) (Lena Thyrell, et al. The Journal of Biological Chemistry Vol. 279, No. 23, Issue of June 4, pp. 24152-24162, 2004) в течение 10 минут. TMRE-положительные (жизнеспособные) и TMRE-отрицательные (апоптотические) клетки B-ОЛЛ определяли методом проточной цитометрии (B.D. FACS Aria). Число жизнеспособных клеток B-ОЛЛ вычисляли, умножая общее число клеток на процентное содержание TMRE-положительных клеток в каждый момент времени. Результат показал, что Олиго-2 значительно стимулирует апоптоз клеток B-ОЛЛ (фиг.4), демонстрируя, что Олиго-2 может быть использован для лечения B-ОЛЛ путем стимуляции апоптоза клеток B-ОЛЛ. Эксперимент провели с десятью пробами крови от больных B-ОЛЛ, что дало сходные результаты.
Пример 7. Повышение экспрессии CD40 на B-ОЛЛ клетках, вызванное Олиго-2
1. Получение клеток B-ОЛЛ человека
Клетки B-ОЛЛ человека выделяли из проб крови больных, используя процедуры, описанные в примере 6.
6
Клетки B-ОЛЛ инкубировали с Олиго-2 или 2216 в конечной концентрации 3 мкг/мл в среде RPMI-1640, содержащей 10% сыворотки человека группы AB (HyClone), по 10 клеток/лунку в 48-луночных планшетах. Олиго-2 или 2216 разбавляли не содержащей сыворотки средой RPMI-1640 (HyClone). Равный объем разбавителя (не содержащей сыворотки среды RPMI-1640 (HyClone)) использовали в качестве контроля (среда).
На 3-й, 5-й, 7-й день после инкубации клетки считали и окрашивали FITC-CD40-антителом (Becton Dickinson) (Molecular Probes Inc) (Lena Thyrell, et al. The Journal of Biological Chemistry Vol. 279, No. 23, Issue of June 4, pp. 24152-24162, 2004) в течение 10 минут. Окрашенные CD40 клетки B-ОЛЛ определяли методом проточной цитометрии (B.D. FACS Aria). Результат (фиг.5) показал, что Олиго-2 значительно повышает экспрессию CD40 на клетках B-ОЛЛ, это указывает на то, что Олиго-2 может быть использован для лечения лимфомы из малых лимфоцитов путем повышения экспрессии CD40 на клетках. Повышение экспрессии CD40 способствует апоптозу клеток B-ОЛЛ, ингибирует рост клеток B-ОЛЛ и делает клетки B-ОЛЛ более иммуногенными, стимулируя образование CTL, специфически направленных против клеток B-ОЛЛ. Эксперимент повторяли с десятью пробами, полученными от больных B-ОЛЛ, что дало сходные результаты.
Пример 8. Образование IL-10 клетками B-ХЛЛ, индуцированное Олиго-2
1. Получение клеток B-ХЛЛ человека
Клетки B-ХЛЛ человека выделяли от больных B-ХЛЛ, используя процедуры, описанные в примере 2.
2. Образование IL-10 клетками B-ХЛЛ, индуцированное Олиго-2
6
Клетки B-ХЛЛ культивировали с Олиго-2 в конечной концентрации 3 мкг/мл в среде RPMI-1640 (HyClone), не содержащей сыворотки, по 10 клеток/лунку в 48-луночных планшетах, в трех параллельных пробах. Олиго-2 разбавляли не содержащей сыворотки средой RPMI-1640 (HyClone). B качестве контроля использовали равный объем разбавителя (не содержащей сыворотки среды RPMI-1640 (HyClone)) (среда). Супернатанты культуры собирали через 72 часа или в указанные моменты времени и определяли в них содержание IL-10 с помощью системы Fluorokine MAP Immunoarray (R&D Systems). Полученные данные показали, что стимуляция Олиго-2 приводила к образованию высокого уровня IL-10 клетками B-ХЛЛ (фиг.6). Резкое увеличение образования IL-10 обнаруживалось через 6 часов, достигало максимума через 24 часа и оставалось высоким свыше 72 часов культивирования. Кроме того, полученные данные дополнительно показали, что добавление экзогенного rh-IL-10 (Schering Corp) в культуры клеток B-ХЛЛ приводило к зависимому от дозы появлению IL-10 апоптотических клеток B-ХЛЛ, что специфически блокировалось антителом против IL-10 (R&D Systems). Эти данные показали, что Олиго-2 может быть использован для лечения B-ХЛЛ путем стимуляции образования IL-10, что вызывает апоптоз клеток B-ХЛЛ по аутокринному механизму. Эксперимент повторяли, используя по меньшей мере десять проб больного B-ХЛЛ.
Пример 9. Влияние Олиго-2 на пролиферацию нормальных PBMC человека
PBMC человека выделяли из лейкоконцентратов здоровых доноров (Центр Крови Области Цзилиня, Китай) центрифугированием в градиенте плотности Ficoll-Hypaque (Pharmacia). Жизнеспособность PBMC, определяемая вытеснением трипанового синего, составляла 95-99%.
5
3
PBMC (6×10/лунку) высевали в 96-луночные планшеты с U-образным дном (Costar) и культивировали в отдельности или вместе с Олиго-2 (6 мкг/мл), в 3 повторах, в течение 36 часов, после чего следовала пульсирующая обработка [H] тимидином (New England Nuclear, Бостон, МА) длительностью 16 часов. Клетки собирали на фильтрах из стекловолокна и определяли с помощью сцинтилляционного счетчика. Пролиферацию клеток выражали как SI (индекс стимуляции) (по трем лункам). Приведены данные, полученные на пяти нормальных пробах крови. Для контроля использовали 2006 и 2216. Результаты показали, что Олиго-2, безусловно, стимулирует пролиферацию PBMC (фиг.7), это указывает на то, что Олиго-2 вместо стимуляции апоптоза стимулирует пролиферацию нормальных PBMC человека и не токсичен для культивируемых клеток.
Для специалистов в данной области, ознакомившихся с подробным описанием изобретения и ссылками на предпочтительные варианты осуществления, будет очевидно, что возможны модификации и изменения в объеме заявленного изобретения, который определен прилагаемой далее формулой изобретения.