Определение микроэкологического статуса и диагностика инфекций организма человека с использованием метода хромато-масс-спектрометрии

УДК 57.083.332

Определение микроэкологического статуса и диагностика инфекций организма человека с использованием метода хромато-масс-спектрометрии

Е.Г. Струкова, А.А. Ефремов*, А.А. Гонтова, Г.А. Осипов, Н.И. Сарматова

Сибирский федеральный университет, Россия 660041, Красноярск, пр. Свободный, 79 1

Received 16.11.2009, received in revised form 7.12.2009, accepted 15.12.2009

Показана возможность использования метода хромато-масс-спектрометрии для оценки микроэкологического статуса организма человека по масс-спектрометрии микробных маркеров, в качестве которых выступают жирные кислоты, стерины, альдегиды. По анализу жирных кислот методом ХМСможно количественно определять наличие 57микроорганизмов в ротовой полости человека.

Ключевые слова: микроэкологический статус, метод определения микроэкологического статуса, ГХ-МС-метод.

Применяемые на сегодняшний день в клинической практике методы определения микроэкологического статуса организма человека, а также диагностики инфекций имеют определенные ограничения и недостатки. Например, существенным недостатком классического бактериологического исследования, помимо дороговизны и длительности (7-10 дней), является невозможность оценить роль некультивируемых микроорганизмов, прежде всего анаэробов в инфекционно-воспалительном процессе. Используемый в качестве дополнительного к классическому иммуно-серологический метод непрямой, поскольку выявляет не возбудителя, а иммунный ответ на него, который может иметь индивидуальные вариации.

Известные молекулярно-биологические методы, при несомненных преимуществах -прямое определение возбудителя, высокие специфичность и чувствительность, универсальность, скорость, возможность диагностики хронических и латентных инфекций, - имеют такие серьезные недостатки, как частые ложноположительные результаты и невозможность адекватной количественной оценки [1].

Из всего вышесказанного вытекает оче -видная востребованность в надежном количественном экспресс-методе диагностики дисбактериозов и определения возбудителей инфекции. Такими свойствами обладает метод масс-спектрометрии микробных маркеров (МСММ), основанный на количе-

* Corresponding author E-mail address: AEfremov@sfu-kras.ru

1 © Siberian Federal University. All rights reserved

ственном определении маркерных веществ микроорганизмов (жирных кислот, альдегидов, спиртов и стеринов) непосредственно в клиническом материале [1-3]. В этом принципиальное отличие метода, придающее ему качественно новое свойство - возможность разложения суперпозиции всего пула микробных маркеров, что позволяет оценить вклад от каждого из сотен видов микроорганизмов, которые обитают, например, в кишечнике. Метод является высокочувствительным, быстрым (2,5 ч на полный цикл исследования), универсальным, экономичным и имеет широкий диагностический спектр. Внедрение ГХ-МС дает возможность сократить время и стоимость исследования, минуя стадии повторных пересевов первичных колоний и тестовых ферментаций, которые особенно сложны, трудоемки и длительны для анаэробов. Метод позволяет не только определять маркерные вещества (жирные кислоты, альдегиды, спирты и стерины) в чистых культурах микроорганизмов, выделенных из клинического материала по известной технологии, но и количественно устанавливать состав микробного сообщества, который кроется за набором маркеров конкретной пробы. Материалом для исследования служат любые биологические жидкости (кровь, слюна, моча, ликвор и т.д.) [2].

К настоящему времени состав жирных кислот большинства микроорганизмов изучен, показана его воспроизводимость, доказана их родо- и видоспецифичность. Метод детектирования микроорганизмов по ЖК-маркерам сходен с генетическим анализом (ПЦР, определение последовательности нуклеотидов ^РНК и пр.), поскольку состав жирных кислот детерминирован в ДНК и воспроизводится путем репликации участка генома транспортными РНК и последующего

синтеза ЖК в митохондриях по матричным РНК. Другими словами, профиль ЖК так же консервативен, как и строение ДНК. Исследования в области бактериальной палеонтологии подтвердили постоянство состава ЖК отдельных микроорганизмов и пула их жирных кислот, в целом, с глубины времен в 2,5 млрд лет.

В данной работе мы продемонстрируем возможности метода ХМС для оценки микроэкологического статуса и диагностики инфекций организма человека на примере мазка ротовой полости человека.

Известно, что бактериям свойственно большое разнообразие ЖК и жирных альдегидов. В настоящее время их насчитывают более двухсот пятидесяти. В организме человека их всего около двадцати пяти. Это обстоятельство определяет возможность родового или видового анализа инфекций и дисбиозов на преобладающем фоне биологической жидкости непосредственно в клиническом материале.

Наиболее часто встречающиеся в клинических пробах ЖК альдегиды и стерины перечислены в табл. 1 с отнесением к вероятным таксонам микроорганизмов [1-2].

Аналогичные зависимости обнаружены для гидроксикислот, спиртов, альдегидов и стеринов [1, 2, 4, 5].

Метод МСММ был применен нами для оценки микроэкологического статуса человека по количественному определению индивидуальных микробных сообществ ротовой полости практически здоровых лиц юношеского возраста обоего пола. Полученные в ходе исследования результаты сравнивались с аналогичными показателями баз данных, включающих сведения о составе жирных кислот штаммов бактерий, вирусов и микроскопических грибов [6, 7]. Материалом для исследования служили

Таблица 1. Высшие жирные кислоты в составе клеточной стенки с отнесением к микроорганизмам, у которых они наиболее часто встречаются*

№ Обозначение** Название Микроорганизмы

Жирные кислоты

1 С10 Декановая Streptococcus

2 i11 Изоундекановая Stenotrophomonas,

3 C12:0 Лауриновая Arcobacter,

4 iC 12 Изолауриновая Peptostreptococcus anaerobius

5 iC 13 Изотридекановая Stenotrophomonas maltophilia, Bacillus subtilis,

6 а13 Антеизотридекановая Bacillus cereus, Brevibacterium

7 13:0 Тридекановая Selenomonas

8 i14 Изомиристиновая Streptomyces, Bacillus, актинобактерии

9 14:1A9 9,10- тетрадеценовая Clostridium, Streptococcus pneumonia

10 14:1A11 11,12-тетрадеценовая Simonsiella, Nocardia, Kingella kingae

11 14:0 Миристиновая Lactobacillus, Helicobacter, Campylobacter, Streptococcus, Clostridium

12 2Me14 2-метил-тетрадекановая Mycobacterium gordonae

13 i15:1 Изопентадеценовая Flavobacterium

14 15:1A9 9,10-пентадеценовая Clostridium propionicum, Bacteroides hypermegas

15 i15 Изопентадекановая Propionibacterium, Bacteroides

16 а15 Антеизопентадекановая Staphylococcus, Bacillus, коринеформные бактерии

17 15:0 Пентадекановая Большинство видов микроорганизмов, минорный компонент, Selenomonas, Clostridium sporogenes, Bacteroides succinogenes, Bact. ruminicola, Pseudomonas stutzeri

18 i16:1 Изогексадеценовая Desulfovibrio

19 16:1A7 7,8-гексадеценовая Clostridium ramosum, Streptococcus

20 16:1A9 9,10-гексадеценовая Большинство видов микроорганизмов

21 16:1A11 11,12-гексадеценовая Ruminococcus

22 i16:0 Изопальмитиновая Streptomyces, Nocardiopsis,

23 10Ме16 10-метилгексадекановая Rhodococcus

24 16:0 Пальмитиновая Большинство видов микроорганизмов

25 i17:1 Изопентадеценовая Campylobacter mucosales

26 17:1 Гептадеценовая Mycobacterium, Candida albicans

27 i17:0 Изогептадекановая Bacillus, Propionibacterium, Prevotella

28 a17:0 Антеизогептадекановая Corynebacterium, Bacteroides, Nocardiopsis, Nocardia

29 17сус Циклогептадекановая сем. Enterobacteriaceae

30 17:0 Гептадекановая Большинство видов микроорганизмов, минорный компонент

31 18:4 Октадекатетраеновая Некоторые грибы и дрожжи

32 18:3 Линоленовая Грибы и дрожжи

33 18:2 Линолевая Грибы, дрожжи, простейшие

34 18:1A9 Олеиновая Все организмы

35 i18:1 H Enterococcus faecalis

36 18:1A11 Цис-вакценовая Lactobacillus, Streptococcus, Pseudomonas, Cardiobacterium hominis

37 18:0 Стеариновая Многие микроорганизмы

3S ilS Изооктадекановая Peptostreptococcus, Bifidobacterium, Nocardiopsis, Bacillus subtilis, Clostridium difficile

39 lQMelS 10-метил-октадекано-вая, (туберкулостеариновая) рр. Mycobacterium, Nocardia; вв. Corynebacterium bovis, C. гр. xerosis, C.urealyticum,

4Q 11Me18:1 11-метилоктадеценовая Afipia, Helicobacter mustelae

41 l9cyc Циклононадекановая Lactobacillus, Enterococcus, Pseudomonas, Brucella, Campylobacter, сем. Enterobacteriaceae, Helicobacter pylori

42 il9 Изононадекановая Bacillus subtilis, Bacteroides hypermegas

43 а19 Aнтеизононадекановая Staphylococcus

44 19:0 Нонадекановая Nitrobacter, Bacillus, Serratia; Burkholderia cepacia

45 i19:1 Изо-нонадеценовая Afipia

4б 20:1 Эйкозеновая Propionibacterium jensenii,, Streptococcus thermophilus, St. salivarius, St. mutans, Actinomyces

47 20:0 Эйкозановая Actinomyces

4S 20:1A11 11-эйкозеновая Streptococcus mutans

49 21:0 Бегеновая Francisella

5Q 22:6 Докозагексеновая грибы, эукариоты

51 22:0 Докозановая Francisella

52 C22:4 Aрахидоновая кислота Простейшие и высшие организмы

53 24:0 Тетракозановая Francisella, Mycobacterium, микроэукариоты

54 25:0 Пентакозановая Микроэукариоты

55 26:0 Гексакозановая Mycobacterium, микроэукариоты

* Вещества приведены в порядке возрастания числа атомов углерода в цепи молекулы, что соответствует хроматографическому времени удерживания

** Обозначения веществ: 17:1 - 17- число атомов углерода, цифра после двоеточия - число двойных связей; аД - в начале означает разветвление.

мазки со слизистой зева, взятые у 19 клинически здоровых людей в возрасте 18-20 лет. Материал собирали стерильным ватным тампоном, помещали в транспортную угольную среду Эймса и доставляли в лабораторию не позднее 24 ч. При подготовке к хромато-масс-спектрометрическому анализу пробу на ватном тампоне высушивают с добавлением равного по объему количества метанола и подвергают кислому метанолизу в 1М НС1 в метаноле. Метанолиз проводят в

0,4 мл реактива на 10 -15 мг сухого остатка в течение 1 ч при 80 °С. На этой стадии происходит освобождение жирных кислот и альдегидов из сложных липидов микроорганизмов и других клеток жидкости в виде

метиловых эфиров и диметилацеталей. Эти компоненты экстрагируют гексаном (400 мкл) в течение 5 мин, гексановый экстракт высушивают, а сухой остаток обрабатывают 20 мкл ^О-бис(триметил-силил)-трифторацетамида в течение 15 мин при 80 °С для получения триметилсилильных эфиров окси-кислот и стеролов. К реакционной смеси эфиров добавляют 80 мкл гек-сана, и 1-2 мкл раствора вводят в инжектор ГХ-МС системы.

Хроматограмма жирных кислот и других продуктов жизнедеятельности микробных сообществ приведена на рисунке, а ее обработка в пересчете на индивидуальные микробы - в табл. 2.

2.ІЄ+07

'lf-07

1еЮ7

І15

tic ffi-ii.cxo*av*srvtrvs

16:0

/

17:0

18:0

b-Sitosterol

Рис. Типичная хроматограмма жирных кислот мазка ротовой полости здорового человека по выделенным ионам

По результатам проведенной серии анализов установлено, что нормальная микрофлора ротовой полости здоровых молодых людей возраста 18-20 лет, проживающих в Красноярске, выглядит следующим образом: преобладают такие группы микроорганизмов, как Streptococcus, Mycobacterium/Candida, Actinomyces viscosus, микроскопические грибы, ситостерол.

По литературным данным общая обсе-мененность микробных сообществ должна составлять 6І68 кл/г*105. A по результатам полученных экспериментов практически у 16 пациентов значение общей обсемененно-сти превышает эту величину в 2 раза, варьирует от 6807 до І6233 кл/г*105.

Интересно отметить, что после курса масляных ингаляций 3 %-м пихтовым маслом картина миклофлоры через 2 ч воздействия изменилась, отмечено существенное подавление роста Streptococcus, Clostridium ramosum, Lactobacillus, Clostridium perfringens, Nocardia asteroides, цитоме-галовируса, микра грибов, ситостерола, Actinomycetes 10Me14. Неизменным осталось количество Peptostreptococcus anaerobius, Clostridium/Str. Pneumonia, Cl.difficile, Prevotella, Staphylococcus, Enterococcus, Streptococcus mutans, Herpes, E.lentum 7741 (группа В), Actinomyces viscosus.

Из полученных результатов можно сделать вывод, что эфирное масло нормализует

Таблица 2. Результаты исследования микробных маркеров в мазке зева методом хромато-масс-спектрометрии, проба до и после обработки эфирным маслом

кп/гх10*5

№ Микроорганизм После ИНІ До инг ал

1 Streptococcus 201 222

2 Eubacterium lentum (группа А) 0 0

3 Bacillus cereus 0 0

4 Р eptostreptococcus anaerobius 57 74

5 Clostridrum'Str. pneumonia 37 13

б Nocardia. 14:1 dll 0 0

7 P eptostreptococcus anaerobius 0 0

8 MoraxeEa'N eisseria 10 0

9 Pseudomonas aeruginosa 14 18

10 Propionibactermm 0 0

11 Bacillus megaterium 0 0

12 Clostridium propiomcum 70 58

13 Stenotrophomonas maltophilia 0 0

14 Selenomonas 0 0

15 Актин омидеты 62 77

16 P seudonocardia 42 56

17 Streptomvces 61 25

18 Clostridium ramosum 200 613

19 Б usobacterium/Haemophyhis 13 14

20 Alcaligenes 20 22

21 Репер 0 0

22 Havobacterium 0 0

23 Rhodococcus 331 345

24 Staphylococcus intennedhis 28 36

25 Porphyromonas 0 0

26 Corinefonn CDC-group XX 286 282

27 Lactobacillus 1200 1405

28 Campylobacter mucosaHs 0 0

29 Mycobacterium' С andida 560 620

30 E.coli 0 0

31 Eubacterium moniliforme sbsp 0 0

32 Cl.difficile 212 209

33 Actmomadura 0 0

34 Prevotella 78 33

35 Eubacterium moniliforme. E.nodat 0 980

36 Bacteroides fragilis 0 0

37 Staphylococcus 192 180

38 Bifidobacterium 0 0

39 Helicobacter pylori, hi 8 112 67

40 Clostridium perfringens 513 892

41 Enterococcus 201 175

42 Eubacterium 31 21

43 Propionibactermm freudenreichii 0 0

44 Streptococcus mutans 431 434

45 Нефез 65 65

46 Микр грибы, кампестерол 77 64

47 Nocardia asteroides 43 93

48 Цитом егаловирус 133 246

49 Микр грибы, ситостсерол 1356 5618

50 Propionibacterium acnes 0 0

51 Ruminicoccus 0 0

52 Actinomycetes 10Mel4 113 123

53 E.lentum 7741 [группа В) 14 42

54 Enterococcus 0 0

55 Actinomyces \iscosus 1372 1372

56 Eubacterium spp. 0 0

57 ASpia. Helicobacter mustelae 0 0

Сумма 8137 14493

микрофлору ротовой полости, в отличие от антибиотиков не угнетает общий рост микрофлоры, действует более мягко, не раздражая слизистую [8, 9].

Проведенная оценка микрофлоры зева здоровых лиц юношеского возраста показала широкий диапазон аэробных и анаэробных микроорганизмов, общее количество которых превышает норму, принятую для здоровых людей средней полосы России. Следовательно, метод газовой хроматографии - масс-спектрометрии позволяет

изучить видовой состав микроорганизмов, населяющих микробиоценозы человека различных биосубстратов. Полученные результаты исследования состава микробных маркеров в мазке зева практически здоровых лиц юношеского возраста дадут возможность использовать эти данные в качестве контрольных значений в дальнейших исследованиях, а также решать вопросы профилактики, выявляя носительство патогенной микрофлоры и формируя группы риска по развитию определенных заболеваний.

Работа выполнена при финансовой поддержке НИР № 1.3.09, проводимой по заданию Федерального агентства по образованию.

Список литературы

1. Минорные жирные кислоты биологических жидкостей урогенитальных органов и их значимость в диагностике воспалительных процессов / Крымцева Т.А., Осипов ГА., Бойко Н.Б., Соколов Я.А., Демина А.М., Радюшина Т.В., Осипов Д.Г // Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунобиологии. 2003. № 2. С. 92-101.

2. Осипов Г. А., Парфенов А.И., Верховцева Н.В., Ручкина И.Н. и др. Клиническое значение исследования микроорганизмов слизистой оболочки кишечника культуральнобиохимическим и хромато-масс-спектрометрическим методами //Эксперим. и клинич. гастроэнтерология. 2003. №4. С.59-62.

3. Митрука Б.М. Применение газовой хроматографии в микробиологии и медицине. М.: Химия, 1980. 256 с.

4. Осипов Г.А. Способ определения родового (видового) состава ассоциации микроорганизмов // Патент РФ № 2086642. C12N 1/00, 1/20, C12Q 1 /4. Приоритет от 24 дек.1993 г.

5. Осипов Г.А., Демина А.М. Хромато-масс-спектрометрическое обнаружение микроорганизмов в анаэробных инфекционных процессах // Вестник РАМН. 1996. Т.13. №2. С. 52-59.

6. Воробьев А.А. Основы микробиологии, вирусологии и иммунологии: учебник. М., 2001. 224с.

7. Koroch A.R., Juliana H.R. Bioactivity of essential oils and their components // Flavours and Fragrances. 2005.

8. Стецюк О.У Зависимость фармокодинамических параметров антибиотиков от условий определения чувствительности бактериальных возбудителей внебольничных и госпитальных инфекций: дисс. ... канд. биол. наук. Смоленск, 2000.

9. Хуснутдинова Л.М. Микрофлора слизистой оболочки миндалин человека в норме при патологии // Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунобиологии. 2006. №1. С.60-63.

Definition of the Microecological Status and Diagnosis of the Human’s Infections, using the Method of Chromatography-Mass Spectrometry

Elens G. Strukova, Alexandr A. Efremov, Anna A. Gontova, Georgiy A. Osipov and Natalia I. Sarmatova

Siberian Federal University, 79 Svobodny, Krasnoyarsk, 660041 Russia

It was shown the possibility of using the method of chromatography-mass spectrometry to estimate microecological status of the human by the method of mass spectrometry microbial markers, which are mainly fatty acids, sterols, aldehydes. For analysis offatty acids by CMS it is possible quantify the presence of 57 microorganisms in the human oral cavity.

Keywords: microecological status, method of mass spectrometry microbial markers, GC-MS-method.