СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ ИММУНИТЕТА ЖИВОТНОГО-КОМПАНЬОНА
METHOD OF INCREASING IMMUNITY OF COMPANION ANIMAL

Область техники, к которой относится изобретение
Осуществления настоящего изобретения относятся к способу повышения иммунитета животного-компаньона. Более конкретно, но не исключительно, осуществления настоящего изобретения относятся к способу введения животному-компаньону антиметаболита глюкозы для повышения иммунитета животного-компаньона.
Уровень техники
Биологические теории правильно предсказали открытие того, что ограничение приема калорий путем пищевой депривации замедляет некоторые нежелательные клеточные процессы у лабораторных животных, многие из которых связаны со старением и возрастными заболеваниями.
В частности, ограничение калорий, как было показано, последовательно увеличивает продолжительность жизни, приостанавливает возникновение и замедляет развитие опухолей и замедляет физиологическое старение во многих системах. Действительно, исследование, которое продолжалось более семидесяти лет, показало, что ограничение калорий является пищевым вторжением, которое последовательно продлевает жизнь у животных. См. Weindruch and Walford, «The Retardation of Aging and Disease by Dietary Restriction», Springfield, IL: Charles C. Thomas (1988); Yu, «Modulation of Aging Processes by Dietary Restriction», Boca Raton: CRC Press (1994) and Fishbein, «Biological Effects of Dietary Restriction», Springer, New York (1991). Такие влияния ограничения калорий на продолжительность жизни и развитие опухолей были много раз сообщены, начиная с ранних исследований McKay. См. McKay et al., «The Effect of Retarded Growth Upon the Length of Lifespan and Upon Ultimate Body Size», J. Nutr., Vol. 10, pp. 63-79 (1935). Действительно, за два последних десятилетия, возрождение интереса к ограничению калорий в геронтологии привело к общему принятию того, что такие диетологические манипуляции замедляют физиологическое старение во многих системах. См. Weindruch and Walford «The Retardation of Aging and Disease by Dietary Restriction», Springfield, IL: Charles C. Thomas (1988); Yu, «Modulation of Aging Processes by Dietary Restriction», Boca Raton: CRC Press (1994) и Fishbein, «Biological Effects of Dietary Restriction», Springer, New York (1991) и Masoro, E.J. «Overview of Caloric Restriction and Ageing», Mech. Aging Dev., Vol. 126, pp. 913-922 (2005).
Снижение уровней глюкозы и инсулина натощак и повышение чувствительности к инсулину являются легко измеримыми биомаркерами ограничения калорий. Грызуны с ограничением калорий проявляют более низкие уровни глюкозы и инсулина натощак, а пиковые уровни глюкозы и инсулина, которые достигаются при глюкозной нагрузке, снижены у тех, кто испытывал ограничение калорий. См. Kalant et al. «Effect of Diet Restriction on Glucose Metabolism and Insulin Responsiveness and Aging Rats», Mech. Aging Dev., Vol. 46, pp. 89-104 (1988). Также известно, что гиперинсулинемия является фактором риска, связанным с некоторыми такими болезненными процессами, включая сердечное заболевание и диабет (Balkau and Eschwege, Diabetes Obes. Metab. 1 (Suppl. 1): S23-31, 1999). Сниженные уровни инсулина и температура тела являются двумя из наиболее надежных факторов измененного метаболического профиля (Masoro et al., J. Gerontol. Biol. Sci. 47:B202-B208, 1992); Koizumi et al., J. Nutr. 117:361-367, 1987; Lane et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 93:4154-4164, 1996).
Антиметаболиты глюкозы, такие как 2-дезокси-D-глюкоза, являются соединениями, родственными глюкозе. Однако, ввиду структурных различий с глюкозой, такие соединения блокируют или ингибируют определенные аспекты углеводного обмена и поэтому могут симулировать эффект ограничения калорий (Rezek et al., J. Nutr. 106:143-157, 1972). Такие антиметаболиты вызывают ряд физиологических эффектов, включая снижение массы тела, снижение уровней инсулина в плазме крови, снижение температуры тела, замедление образования и роста опухолей и повышение концентрации циркулирующих глюкокортикоидных гормонов (обзор см. Roth et al., Ann. NY Acad. Sci. 928:305-315, 2001). Эти физиологические эффекты возникают в результате ингибирования углеводного обмена.
Как таковое, будет полезным использование антиметаболитов глюкозы в качестве компонентов для повышения иммунитета у млекопитающих. Взаимодействие между питанием и иммунным ответом было предметом интенсивных исследований в течение последних пяти десятилетий. Двунаправленное взаимодействие между питанием, иммунным ответом и инфекционными заболеваниями было предположено Scrimshaw (Schrimshaw NS, Taylor СЕ, Gordon JE. Interaction of nutrition and infection. Am J Med Sci 1959; 237:367-403) в 1950 гг. Впоследствии было признано, что истощенные субъекты были подвержены риску инфекции. Последующие исследования показали, что недостаток большинства микроэлементов влечет за собой снижение иммунной защиты. С другой стороны, другие исследования продемонстрировали, что добавление определенных питательных веществ выше пределов принятых требований может улучшить некоторые показатели иммунного ответа. Взятые вместе, эти данные вполне очевидно свидетельствуют о том, что питание может повлиять на иммунитет. Нарушение регуляции в функционировании иммунной системы является хорошо документированным следствием старения. Это нарушение регуляции может привести к увеличению случаев заболеваемости (болезни) и смертности (смерти). Клеточный иммунитет, в основном Т-клеток, очевидно, является компонентом иммунитета, который наиболее неблагоприятно сказывается с возрастом. См. обзор Pawelec (Pawelec G, Wagner W, Adibzadeh M, Engel A. T cell immunosenescence in vitro and in vivo. Exp Gerontol 1999; 34:419-29). Возрастная дисфункция Т-клеточного иммунитета была вовлечена как причина многих хронических дегенеративных заболеваний у пожилых людей, включая артрит, рак, аутоиммунные заболевания, а также повышенную восприимчивость к инфекционным заболеваниям. Существует много теорий, которые были выдвинуты, чтобы попытаться объяснить механизм(ы), ответственный за это снижение, но никакая теория не может в полной мере объяснить все наблюдаемые изменения. У собак старшего возраста, как сообщали, было показано снижение иммунного ответа по сравнению с молодыми собаками. Собаки старшего возраста также отличаются по характеру их иммунитета по сравнению с молодыми собаками. На основании этих наблюдений, процесс старения также приводит к нарушению регуляции иммунного ответа у собак, аналогично другим видам и дополнительно обеспечивает возможность модуляции питания этих или родственных видов.
Таким образом, было бы полезно обеспечить питание, например, антиметаболитами глюкозы, имеющими физиологическое воздействие на иммунитет, например, путем изменения пролиферативной способности Т и В иммунных клеток и изменения относительного распределения иммунного клеточного фенотипа, например. Также было бы полезно обеспечить композицию, содержащую такие компоненты антиметаболитов глюкозы. Соответственно, осуществления настоящего изобретения относятся к таким преимуществам.
Сущность изобретения
Осуществления в данной заявке относятся к способу повышения иммунитета животного-компаньона. Способ может включать, в одном осуществлении, стадию, на которой вводят животному-компаньону антиметаболит глюкозы в количестве, эффективном для повышения иммунитета животного-компаньона. Антиметаболит глюкозы может быть выбран из группы, состоящей из 2-дезокси-D-глюкозы; 5-тио-D-глюкозы; 3-О-метилглюкозы; 1,5-ангидро-D-глюцитола; 2,5-ангидро-D-глюцитола; 2,5-ангидро-D-маннитола; манногептулозы и их смесей и комбинаций. Животное-компаньон может относиться к семейству собачьих или семейству кошачьих. В конкретных осуществлениях, антиметаболит глюкозы может быть манногептулозой. В конкретных осуществлениях, композиция может быть гранулой, которая может быть диетически сбалансированной и может содержать менее чем приблизительно 5% манногептулозы.
Способ может включать кормление от приблизительно 1 мг/кг до приблизительно 50 мг/кг манногептулозы животному-компаньону в день. Способ может также включать кормление от приблизительно 1 мг до приблизительно 1000 мг манногептулозы в день.
В определенных осуществлениях, способ повышения иммунитета животного-компаньона включает стадию, на которой вводят животному-компаньону антиметаболит глюкозы в количестве, эффективном для повышения иммунитета животного-компаньона, при этом повышение иммунитета включает улучшение способности иммунной системы животного-компаньона отвечать таким образом, что пролиферативная способность Т и В иммунных клеток отвечать на стимуляционное контрольное заражение изменяется после введения антиметаболита глюкозы.
В определенных осуществлениях, способ повышения иммунитета животного-компаньона включает стадию, на которой вводят животному-компаньону антиметаболит глюкозы в количестве, эффективном для повышения иммунитета животного-компаньона, при этом повышение иммунитета включает ослабление понижения иммунной системы путем ослабления связанного с возрастом возрастания CD 18+ клеток.
Краткое описание чертежей
ФИГ. 1 представляет собой график CD 18+ иммунных клеток для группы собак 1.
ФИГ. 2 представляет собой график CD 18+ иммунных клеток для группы собак 2.
ФИГ. 3 представляет собой график Т клеточной митогенной стимуляции для ConA для группы собак 1.
ФИГ. 4 представляет собой график Т клеточной митогенной стимуляции для ConA для группы собак 2.
ФИГ. 5 представляет собой график Т клеточной митогенной стимуляции для РНА для группы собак 1.
ФИГ. 6 представляет собой график Т клеточной митогенной стимуляции для РНА для группы собак 2.
ФИГ. 7 представляет собой график В клеточной митогенной стимуляции для PWM для группы собак 1.
ФИГ. 8 представляет собой график В клеточной митогенной стимуляции для PWM для группы собак 2.
ФИГ. 9 представляет собой график среднего уровня сыворотки 8-OHdG группы собак 1.
Подробное описание изобретения
Определения
Как используют в данной заявке, подразумевают, что единственное число, если его используют в формуле или в описании данной заявки, означает один или более заявленных или описанных объектов.
Как используют в данной заявке, термины «включать», «включает» и «включающий» подразумевают как неограничивающие.
Как используют в данной заявке, термин «множество» означает более одного.
Как используют в данной заявке, термины «животное» или «домашнее животное» означают домашнее животное, включая, но не ограничиваясь приведенным, домашних собак (семейство собачьих), кошек (семейство кошачьих), лошадей, коров, хорьков, кроликов, свиней, крыс, мышей, песчанок, хомяков, лошадей и тому подобное. Домашние собаки и домашние кошки являются конкретными примерами животных и упоминаются в данной заявке как «животные-компаньоны». Следует понимать, что в данном описании при использовании термина «животное», «домашнее животное» или «животное-компаньон», животное, домашнее животное или животное-компаньон находится не в болезненном состоянии, если не указано иное.
Как используют в данной заявке, термины «корм для животных», «композиция корма для животных», «гранулы корма для животных», «корм для домашних животных» или «композиция корма для домашних животных», все означают композицию, предназначенную для употребления животным. Корм для домашних животных может включать, без ограничения, диетически сбалансированные композиции, подходящие для ежедневного корма, а также добавки и/или лакомства, которые могут быть или могут не быть диетически сбалансированными.
Как используют в данной заявке, термин «диетически сбалансированный» означает, что композиция, такая как корм для домашних животных, имеет известные необходимые пищевые вещества для поддержания жизни в надлежащих количествах и пропорциях, исходя из рекомендаций признанных авторитетов, включая государственные органы, такие как, но не ограничиваясь приведенным, Центр ветеринарной медицины Управления по контролю за продуктами и лекарствами Соединенных Штатов (Unites States Food and Drug Administration's Center for Veterinarian Medicine), Ассоциация должностных лиц по контролю за кормами (American Feed Control Officials Incorporated), в области питания домашних животных, за исключением дополнительной нужды в воде.
Все дозы для приема внутрь в соответствии с настоящим изобретением приведены в расчете на килограмм массы тела млекопитающего, если не указано иное.
Следует понимать, что каждый максимальный численный предел, указанный в настоящем описании, включает каждый нижний численный предел, как если бы такие нижние численные пределы были явным образом описаны в данной заявке. Каждый минимальный численный предел, указанный в данном описании, будет включать каждый верхний численный предел, как если бы такие верхние численные пределы были явным образом указаны в данной заявке. Каждый числовой диапазон, указанный в данном описании, будет включать каждый более узкий интервал численных значений, попадающий в такой больший числовой диапазон, как если бы такие узкие диапазоны численных значений были все явным образом указаны в данной заявке.
Все перечисления элементов, таких как, например, перечисления ингредиентов, предназначены для и должны быть интерпретированы как группы Маркуша. Таким образом, все перечисления могут быть прочитаны и интерпретированы как элементы, «выбранные из группы, состоящей из»… перечисления элементов… «и их комбинаций и смесей».
Ссылки в данной заявке являются торговыми наименованиями компонентов, включая различные ингредиенты, которые используют в осуществлениях настоящего изобретения. Авторы настоящего изобретения не намерены ограничиваться материалами под определенными торговыми наименованиями. Материалы, соответствующие (например, полученные из другого источника под другим именем или номером) указанным под торговым наименованием, могут быть заменены и использованы в описании, приведенном в данной заявке.
Процессы, способы, композиции и аппараты в данной заявке могут включать, состоять по существу из или состоять из любых признаков или осуществлений изобретения, описанных в данной заявке.
При описании различных осуществлений данного раскрытия описаны различные осуществления или индивидуальные признаки. Как должно быть очевидно специалисту в данной области техники, все комбинации таких осуществлений и признаков возможны и могут привести к предпочтительным вариантам исполнениям изобретения. Хотя различные осуществления и индивидуальные признаки изобретения были проиллюстрированы и описаны, различные другие изменения и модификации могут быть выполнены без отступления от сущности и объема изобретения. Как также будет очевидно, все комбинации осуществлений и признаков, раскрытые в предшествующем описании, возможны и могут привести к предпочтительным вариантам исполнения изобретения.
Осуществления настоящего изобретения
Осуществления настоящего изобретения относятся к композициям, содержащим компонент антиметаболита глюкозы, выбранный из группы, состоящей из 2-дезокси-D-глюкозы; 5-тио-D-глюкозы; 3-O-метилглюкозы; 1,5-ангидро-D-глюцитола; 2,5-ангидро-D-глюцитола; 2,5-ангидро-D-маннитола; манногептулозы и их смесей и комбинаций. Не имея желания быть связанными теорией, данные компоненты принимают как антиметаболиты глюкозы. В другом осуществлении, компоненты могут присутствовать в указанных композициях посредством компонента растительного материала, такого как авокадо, или другого обогащенного источника манногептулозы, такого как люцерна, инжир, примула и т.д.
Осуществления настоящего изобретения также относятся к способу повышения иммунитета млекопитающих. Такие способы относятся к введению указанному млекопитающему композиции, как описано в данной заявке, при этом композиция является эффективной при повышении иммунитета млекопитающего, независимо от возраста млекопитающего. В одном конкретном осуществлении, способ относится к улучшению способности иммунной системы реагировать, также называемому улучшением иммунного ответа у млекопитающего, такого как животное-компаньон, путем введения композиции, содержащей антиметаболит глюкозы. В другом конкретном осуществлении, способ относится к поддержанию и/или ослаблению понижения иммунной системы при старении млекопитающего, такого как животное-компаньон, путем введения композиции, содержащей антиметаболит глюкозы.
Иммунитет может быть разделен на врожденный и приобретенный иммунитет. Адаптивная ветвь иммунной системы представлена клеточным и гуморальным иммунитетом и может быть определена улучшенными Т- и В-клеточными ответами, которые можно измерить с помощью анализов, таких как, но не ограничиваясь приведенным, лимфопролиферативная реакция с меченым тритием тимидином. Врожденная ветвь иммунной системы представлена CD 18+ иммунными клетками, которые можно измерить с помощью анализов, таких как, но не ограничиваясь приведенным, изменение относительных и абсолютных процентов популяций белых кровяных телец, измеренное при помощи иммунофлуоресценции.
Дополнительно, повышение иммунитета может включать изменение пролиферативной способности Т и В иммунных клеток и изменения относительного распределения иммунноклеточного фенотипа, например.
Млекопитающие, описанные в данной заявке, могут включать позвоночных и беспозвоночных животных, таких как, например, насекомые (например, дрозофилы) и/или нематоды (например, Caenorbabditis elegans). Люди и домашние животные раскрыты в данной заявке.
Компоненты антиметаболитов глюкозы, как описано в данной заявке, включают 2-дезокси-D-глюкозу, 5-тио-D-глюкозу, 3-О-метилглюкозу, ангидросахара, включая 1,5-ангидро-D-глюцитол, 2,5-ангидро-D-глюцитол и 2,5-ангидро-D-маннитол, манногептулозу и их смеси и комбинации. Манногептулоза является одним конкретным антиметаболитом глюкозы. В одном осуществлении, манногептулоза может присутствовать в указанных композициях в качестве компонента растительного вещества, такого как авокадо, экстракт авокадо, мука из плодов авокадо, концентрат авокадо или другие обогащенные источники манногептулозы. Неограничивающие примеры обогащенных источников манногептулозы включают люцерну, инжир или примулу. Растительный материал может включать фрукты, семена (или косточки), ветви, листья или любые другие части соответствующих растений или их комбинации.
Авокадо (также обычно называют аллигаторной грушей, Aguacate или Palta) содержит чрезвычайно обогащенные источники манногептулозы, а также родственные сахара и другие углеводы. Авокадо представляет собой субтропическое вечнозеленое плодовое дерево, растущее наиболее успешно в районах Калифорнии, Флориды, Гавайев, Гватемалы, Мексики, Вест-Индии, Южной Африки и Азии.
Виды авокадо включают, например, Persea Americana и Persea nubigena, включая все сорта культурного растения в указанных иллюстративных видах. Сорта культурного растения могут включать 'Anaheim', 'Bacon', 'Creamhart', 'Duke', 'Fuerte', 'Ganter', 'Gwen', 'Hass', 'Jim', 'Lula', 'Lyon', 'Mexicola Grande', 'Murrieta Green', 'Nabal', 'Pinkerton', 'Queen', 'Puebla', 'Reed', 'Rincon', 'Ryan', 'Spinks', 'Тора Тора', 'Whitsell', 'Wurtz' и 'Zutano'. Плоды авокадо являются особенно предпочтительными для использования в настоящем изобретении, они могут содержать косточку или у них может быть удалена косточка или, по меньшей мере, частично удалена. Плоды Persea Americana являются особо предпочтительными для применения в данной заявке, а также плод сортов культурного растения, которые дают большие плоды (например, приблизительно 12 унций или более, если плод зрелый), таких как Anaheim, Creamhart, Fuerte, Hass, Lula, Lyon, Murrieta Green, Nabal, Queen, Puebla, Reed, Ryan и Spinks.
Растительный материал из люцерны, инжира или примулы также, как сообщают, обеспечивает относительно высокие уровни манногептулозы. Люцерну также называют Medicago sativa. Может быть также использован инжир или Ficus carica (включая фикус клубковатый или сикомор античный, например), а также примула, или Primula officinalis.
Было открыто, что конкретные уровни компонента, выбранного из 2-дезокси-D-глюкозы; 5-тио-D-глюкозы; 3-О-метилглюкозы; 1,5-ангидро-D-глюцитола; 2,5-ангидро-D-глюцитола; 2,5-ангидро-D-маннитола; манногептулозы и их смесей и комбинаций, могут быть использованы в данной заявке. В частности, было найдено, что относительно низкие уровни, а также относительно высокие дозы компонента, являясь полезными, могут обеспечивать менее чем оптимальную эффективность для желательных целей. Дозировка будет зависеть от используемого компонента антиметаболита глюкозы и будет варьироваться в зависимости от размера и состояния млекопитающего, которому антиметаболит глюкозы должен быть введен. Дозировка в диапазоне от приблизительно 0,0001 или приблизительно 0,001 грамм/кг до приблизительно 1 г/кг может быть полезной в некоторых осуществлениях. Как используют в данной заявке, если используют дозировку в мг/кг, то «мг» относится к уровню компонента, такого как манногептулоза, а «кг» относится к килограммам массы тела млекопитающего, такого как собака или кот. Дозировка в нижнем диапазоне также может быть приемлемой при использовании 2-дезокси-D-глюкозы у крупных животных. Более высокие дозы, особенно соединений, таких как 5-тио-D-глюкоза или маннитол, также могут быть легко переносимыми. В одном осуществлении, дозировка компонента, который дают на млекопитающему на ежедневной основе, может составлять от приблизительно 0,1, 0,5, 1, 2 или 5 мг/кг до приблизительно 15, 20, 50, 100, 150 или 200 мг/кг, и все комбинации этих диапазонов, при этом «мг» относится к уровню компонента и «кг» относится к килограммам массы тела млекопитающего. В одном осуществлении, дозировка для млекопитающего, на ежедневной основе, может составлять от приблизительно 1 мг/кг до приблизительно 15 мг/кг, от приблизительно 2 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг или от приблизительно 2 мг/кг до приблизительно 5 мг/кг. В одном осуществлении, дозировка для млекопитающего, на ежедневной основе, может составлять от приблизительно 1 мг/кг до приблизительно 5 мг/кг, от приблизительно 1,5 мг/кг до приблизительно 5 мг/кг, от приблизительно 2 мг/кг до приблизительно 5 мг/кг, или приблизительно 2 мг/кг. В определенных осуществлениях, такие количества могут преобразовываться в композиции, содержащие менее чем приблизительно 5%, или менее чем приблизительно 2%, или от приблизительно 0,0001% до приблизительно 0,5%, или от приблизительно 0,1% до приблизительно 10%, или от приблизительно 0,1% до приблизительно 5% компонента, все по массе композиции. Все диапазоны между ними предусмотрены. Уровень компонента может быть определен специалистом в данной области техники на основании различных факторов, например формы композиции (например, сухая композиция, полувлажная композиция, влажная композиция или добавка, либо любая другая форма или их смеси). Специалист в данной области техники сможет использовать предпочтительные дозировки и определять оптимальный уровень компонентов в данной композиции.
Аналогичным образом, может быть обеспечено общее количество дозы компонента на ежедневной основе, предоставляемое млекопитающему. Такая суточная доза может составлять от приблизительно 0,1 мг в день до приблизительно 1000 мг в день. Такие суточные дозы могут зависеть от размера млекопитающего, которое потребляет композиции. Например, в одном осуществлении, крупные млекопитающие могут потреблять больше, чем мелкие млекопитающие. Естественно, это согласуется с дозировкой, описанной в данной заявке в отношении дозирования количества на единицу массы млекопитающего. Таким образом, в одном осуществлении, по мере увеличения млекопитающего в размерах большее количество композиции может быть введено.
Соответственно, в одном осуществлении, такая суточная доза может соответствовать дозировке на ежедневной основе на массу млекопитающих, как описано в данной заявке. В частности, суточные дозы могут варьироваться, в некоторых осуществлениях, от приблизительно 0,1 мг в день до приблизительно 1000 мг в день, или даже больше, в зависимости от размера млекопитающих и суточных доз, как описано выше. В других вариантах, суточная доза может составлять от приблизительно 1 мг в день до приблизительно 500 мг в день, или от приблизительно 1 мг в день до приблизительно 200 мг в день, или от приблизительно 1 мг в день до приблизительно 100 мг в день, или от приблизительно 5 мг день в день до приблизительно 100 мг в день, или от приблизительно 5 мг в день до приблизительно 80 мг в день, или от приблизительно 10 мг в день до приблизительно 50 мг в день, или приблизительно 40 мг в день. Все диапазоны между ними также предусмотрены.
Аналогично, если экстракт и муку грубого помола из растительных веществ используют в композициях в данной заявке, уровни экстракта или муки грубого помола могут зависеть от уровня эффективного компонента в таком экстракте или муке грубого помола. В настоящем изобретении были найдены экстракты и/или мука грубого помола, которые содержат от приблизительно 0,5% до приблизительно 99% компонента антиметаболита глюкозы, альтернативно от приблизительно 0,5% до приблизительно 75% компонента антиметаболита глюкозы, альтернативно от приблизительно 0,5% до приблизительно 50% компонента антиметаболита глюкозы, альтернативно от приблизительно 0,5% до приблизительно 25% компонента антиметаболита глюкозы, все по массе экстракта или муки грубого помола. В данном изобретении были найдены экстракты и/или мука грубого помола, в которых компонент антиметаболита глюкозы может составлять от приблизительно 0, 5, 1, 2, 5 или 10% до приблизительно 15, 25, 50 или 75% по массе экстракта и/или муки грубого помола.
Соответственно, осуществления настоящего изобретения направлены на композицию, предназначенную для проглатывания млекопитающим. Композиции включают продукты, предназначенные для поставки необходимых потребностей в корме, а также лакомств (например, печенья) или других пищевых добавок. Необязательно, композиция в данной заявке может быть сухой композицией (например, гранулы), полувлажной композицией, влажной композицией или любой их смесью. Альтернативно или дополнительно, композиция является добавкой, такой как соус, питьевая вода, йогурт, порошок, суспензия, жевательная резинка, лакомство (например, печенье) или любой другой формой поставки.
Кроме того, в одном осуществлении композиция может быть диетически сбалансированной, например гранулы корма для домашних животных. В другом осуществлении, композиция не является диетически сбалансированной, например добавка, лакомство или другая форма поставки для домашнего животного.
Композиции, используемые в данной заявке, могут необязательно содержать один или более дополнительных компонентов. Другие компоненты являются полезными для включения в композиции, используемые в данной заявке, но являются необязательными для целей настоящего изобретения. В одном осуществлении, композиции могут содержать, в пересчете на сухое вещество, от приблизительно 10% до приблизительно 90% неочищенного белка, альтернативно от приблизительно 20% до приблизительно 50% неочищенного белка, альтернативно от приблизительно 20% до приблизительно 40% неочищенного белка, по массе композиции, или альтернативно от приблизительно 20% до приблизительно 35% неочищенного белка, по массе композиции. Материал неочищенного белка может содержать белки на растительной основе, такие как соевые бобы, зерновые (кукуруза, пшеница и т.д.), хлопковое масло и арахис, или белки на животной основе, такие как казеин, альбумин и мясной белок. Неограничивающие примеры мясного белка, используемые в данной заявке, включают источник белка, выбранный из группы, включающей говядину, свинину, баранину, птицу, рыбу и их смеси.
Дополнительно, композиции могут содержать, в пересчете на сухое вещество, от приблизительно 5% до приблизительно 40% жира, альтернативно от приблизительно 10% до приблизительно 35% жира, по массе композиции.
Осуществления изобретения, относящиеся к композициям в соответствии с настоящим изобретением, могут дополнительно содержать источник углеводов. В одном осуществлении, композиции могут содержать от приблизительно 35%, по массе композиции, до приблизительно 50%, по массе композиции, источника углеводов. В других осуществлениях, композиция может содержать от приблизительно 35% до приблизительно 45%, по массе композиции, или от приблизительно 40% до 50%, по массе композиции, источника углеводов. Зерна или зерновые, такие как рис, кукуруза, майло, сорго, ячмень, пшеница и тому подобное, являются иллюстративными источниками углеводов.
Композиции также могут содержать другие вещества, такие как, но не ограничиваясь приведенным, сухая сыворотка и другие молочные побочные продукты, свекловичный жом, целлюлоза, волокна, рыбий жир, льняное масло, витамины, минералы, ароматизаторы, антиоксиданты и таурин.
Композиции также могут содержать другие необязательные ингредиенты. Необязательные ингредиенты могут включать пробиотические компоненты (бифидобактерии и/или Lactobacillus) и пребиотические (фруктоолигосахариды) компоненты. Примеры и количества пробиотических компонентов и пребиотических компонентов, которые могут быть включены, раскрыты в публикации США №2005/0158294, например. Другие необязательные ингредиенты, которые могут быть включены, представляют собой омега-6 и омега-3 жирные кислоты, карнитин, гексаметафосфат, глюкозамин, хондроитинсульфат, каротиноиды, включая бета-каротин, витамин Е и лютеин, и те ингредиенты, которые приведены в Таблице 1 ниже.
Иммунитет
Как описано в данной заявке, композиции могут быть полезны для повышения иммунитета у млекопитающих, в частности животных-компаньонов. Что касается иммунитета, CD 18 является пан-лейкоцитарным маркером клеточной поверхности, который, как было показано, увеличивается с возрастом и при воспалении (Valente. Immunologic function in the elderly after injury- the neutrophil and innate immunity; J Trauma. 2009; 67(5):968-74). Лейкоциты играют важную роль в патогенезе повреждения тканей вследствие воспаления. В месте повышенного взаимодействия лейкоцитов и эндотелиальных клеток лейкоциты в микроциркуляции взаимодействуют с адгезивными молекулами на эндотелиальных клетках, что приводит к прокручиванию, адгезии и миграции. Лейкоциты затем высвобождают цитокины и продуцируют протеазы и виды супероксидных радикалов, которые также участвуют в воспалительном каскаде. Именно эти реакции лейкоцитов вызывают повреждение воспалительных тканей и эндотелиальных клеток. Экспрессия CD lib/CD 18 (CR3), которая связана с фагоцитарным продуцированием реакционноспособных кислородных промежуточных соединений (ROI), как описано выше, повышающе регулирована в моноцитах пожилых субъектов, по сравнению с молодыми субъектами. Кроме того, аутоиммунность отчасти является следствием CD11a/CD18 сверхэксперессии гетеродимерного 62 интегринового лимфоцитарного функционального антигена-1 (LFA-1). В результате увеличение CD11a/CD18 антигенной плотности на лимфоцитах было обсуждено как результат в механизме, приводящем к сниженному лимфоцитарному пролиферативному ответу in vitro и к другим иммунологическим дисфункциям, как сообщали для пожилых субъектов (Chiricolo М, Morini МС, Mancini R, Beltrandi Е, Belletti D, Conte R. Cell adhesion molecules CD11a and CD18 in blood monocytes in old age and the consequences for immunological dysfunction. Gerontology. 1995; 41(4):227-34). В результате всех данных сообщенных негативных эффектов CD18 сверхэкспрессии, наблюдаемой в пожилом возрасте, будет желательным уменьшать/ослаблять связанное с возрастом возрастание CD 18 с антиметаболитами глюкозы, и, в частности, манногептулозой, как показано в данной заявке для животных-компаньонов, таких как собаки, как представлено в данной заявке.
Как показано на ФИГ.1, при анализе возраста, у собак, которых кормили тестовым питанием, разработанным для обеспечения 2 миллиграмм манногептулозы на килограмм массы тела животного, наблюдалось значительное ослабление в возрастании CD18+ иммунных клеток по сравнению с контрольной группой с тем же рационом. Возрастание CD 18+ иммунных клеток, как полагают, является результатом механизма, приводящего к сниженному лимфоцитарному пролиферативному ответу in vitro и другим иммунологическим дисфункциям, о которых сообщалось у пожилых субъектов, поэтому ослабление этого возрастания будет считаться иммунологически полезным указанному млекопитающему.
Как показано на ФИГ.2, при анализе возраста, у собак, которых кормили тестовым питанием с манногептулозой, наблюдали тенденцию к ослаблению возрастания CD18+ иммунных клеток по сравнению с контрольной группой с тем же рационом. Возрастание CD18+ иммунных клеток, как полагают, является результатом механизма, приводящего к сниженному лимфоцитарному пролиферативному ответу in vitro и другим иммунологическим дисфункциям, о которых сообщалось у пожилых субъектов, поэтому ослабление этого возрастания будет считаться иммунологически полезным указанному млекопитающему.
Собаки с ФИГ.1, относящиеся к группе собак 1, представляют старшую группу собак, чем собаки с ФИГ.2, относящиеся к группе собак 2, на приблизительно два года.
Конканавалин А (CoA) проявляет митогенную активность, особенно с Т-лимфоцитами (Ruscetti and Chervenick 1975; Novogrodsky and Katchalski 1971; Perlmann et al. 1970). Фитогемагглютинин (PHA), экстракт лектина красной фасоли обыкновенной (Phaseolus vulgaris), имеет мощную, Т-клеточную митогенную активность (Hammerstrom, S. et al. (1982) Proc. Nail. Acad. Sci. USA 79, 1611-1615). Митоген лаконоса (PWM), полученный из Phytolacca Americana, является В клеточным митогеном (Schreck et al., Annals of Clinical and Laboratory Science, Vol 12, Issue 6, 455-462). Вместе эти три митогена используют для стимуляции иммунных клеток in vitro в анализе лимфоцитарного бластогенеза, хорошо принятом индикаторе иммунного ответа in vivo. Многие исследования показали, что данный анализ чувствителен к связанному с возрастом снижению ответа иммунной системы (Goldrosen et al., 1977 - Journal of surgical oncology 9:229-234). Низкая пролиферативная способность указывает на то, что иммунные клетки не могут стать активированными и размножаться как эффективные (ключевая стадия в процессе установления эффективного иммунного ответа). Такая сниженная пролиферативная способность была отнесена к повышенной заболеваемости и смертности, которые наблюдают в пожилом возрасте, и поэтому является важным индикатором иммунной способности.
Данные CoA, РНА и PWM показаны на ФИГ.3-8 для двух групп собак.
Для CoA, ФИГ.3 и 4 указывают на полезное влияние манногептулозы на Т-клеточную пролиферативную способность. Все исходные значения являются подобными (р>0,05), и либо численно, статистически имеют тенденцию или статистически выше для собак, получавших питание, содержащее манногептулозу, по сравнению с контрольным питанием. Взятые вместе, эти наблюдения подтверждают вывод о том, что манногептулоза является полезной в этом отделе иммунной клеточной популяции. Реактивность Т-клеток снижается с возрастом и является основным фактором, способствующим повышенной заболеваемости и смертности, которые наблюдаются с возрастом. Поэтому изменение или смягчение этого эффекта положительно влияет на здоровье и иммунный ответ у собак. Таким образом, ФИГ.3 и 4 показывают, что собаки, которых кормили тестовым питанием, содержащим манногептулозу, имели статистические тенденции или статистическое улучшение Т-клеточной митогенной стимуляции для CoA. Это увеличение указывает на то, что Т-клетки собак, получавших питание, содержащее манногептулозу, могут лучше отвечать на контрольное заражение по сравнению с Т-клетками собак, получавших контрольное питание.
Аналогично CoA, РНА ответы показаны на ФИГ.5 и 6 и указывают на полезное влияние манногептулозы на способность отдела Т клеток отвечать на митогенную стимуляцию. Все исходные значения являются подобными (р>0,05), а в период лечения все данные для РНА-стимулированных Т-клеток либо численно, статистически имеют тенденцию, или статистически выше для собак, получавших манногептулозу, по сравнению с контролем. Взятые вместе со свидетельством, показанным для CoA, эти наблюдения подтверждают вывод о полезном эффекте манногептулозы на отдел Т-клеток иммунной клеточной популяции. Хорошо известно, что реактивность Т-клеток снижается с возрастом и является основным фактором, способствующим повышенной заболеваемости и смертности, которые наблюдаются с возрастом. Поэтому изменение или смягчение этого эффекта положительно влияет на иммунный ответ, здоровье и благополучие собак. ФИГ.5 и 6 выше показывают, в равной степени, что собаки, которым давали тестовое питание, содержащее манногептулозу, имели либо статистические тенденции, либо статистическое улучшение Т-клеточной митогенной стимуляции для РНА. Это увеличение означает, что Т-клетки собак, получавших питание, содержащее манногептулозу, могут лучше отвечать на контрольное заражение по сравнению с Т-клетками собак, получавших контрольное питание.
Результаты, показанные на ФИГ.7 и 8, указывают на полезный эффект кормления манногептулозой на В-клеточную пролиферативную способность у собак, показанный как PWM на фигурах. Все исходные данные являются статистически подобными и, если наблюдается значительный положительный эффект, то это является результатом кормления манногептулозой. Также известно, что реактивность В-клеток уменьшается с возрастом и также является другим фактором, способствующим повышенной заболеваемости и смертности, которые наблюдаются с возрастом. Поэтому изменение или смягчение этого эффекта положительно влияет на иммунный ответ, здоровье и благополучие собак. ФИГ.7 и 8 выше показывают, в равной степени, что собаки, которым давали тестовое питание, содержащее манногептулозу, имели либо статистические тенденции, либо статистическое улучшение В-клеточной митогенной стимуляции для PWM. Это увеличение указывает на то, что В-клетки собак, которых кормили питанием, содержащим манногептулозу, могут лучше отвечать на контрольное заражение по сравнению с В-клетками собак, получавших контрольное питание.
8-Оксо-2'-дезоксигуанозин (8-OHdG) является окисленным производным дезоксигуанозина. 8-OHdG является одним из основных продуктов окисления ДНК. Как часть иммунного ответа, Т- и В-клетки должны пролиферировать (становиться активированными и делиться). Ключевой стадией устойчивой пролиферации является репликации ДНК. Если клетки имели поврежденные ДНК или должны восстановить ДНК, то данная критическая стадия может быть затруднена. Как показано на ФИГ.9, собаки, которых кормили тестовым питанием, содержащим манногептулозу, имели значительно более низкий уровень 8-OHdG в сыворотке по сравнению с собаками, которых кормили контрольным питанием. Путем снижения повреждения ДНК у собак, которых кормили манногептулозой, репликация иммунных клеток может быть облегчена, помогая запустить ключевую стадию каскада активации иммунной системы.
В качестве резюме, Таблица 1 приведена ниже. В Таблице 1 показана конкретная реакция в первом столбце. Второй столбец под названием «общее старение» указывает, что происходит с маркером, когда происходит старение у многих видов. Третий столбец относится к собакам и соответствует второму столбцу общего старения многих видов и, следовательно, указывает, что без манногептулозы признаки общего старения у собак будут продолжаться. Однако, в четвертом столбце, показаны маркеры для старения, когда собаки потребляют питание, содержащее манногептулозу. Как можно видеть, ответы Т-клеточной пролиферации и В-клеточной пролиферации увеличиваются, когда собаки потребляют питание, содержащее манногептулозу, в то время как ответы Т-клеточной пролиферации и В-клеточной пролиферации, как правило, уменьшаются с возрастом. То же самое верно для CD 18+ клеток и повреждения ДНК, поскольку потребление питания, содержащего манногептулозу, будет снижать эти маркеры в отличие от их типичного увеличения с возрастом. Таким образом, питание, содержащее манногептулозу, может оказать положительное влияние на иммунный ответ, особенно путем ослабления понижения иммунного ответа, по мере старения собаки и повышения способности иммунной системы реагировать при контрольном заражении.
Таблица 1
Общее старение
без МГ
С МГ
Т-клеточная
↓
↓
↑
пролиферация
В-клеточная
↓
↓
↑
пролиферация
% CD18+ клетки
↑
↑
↓
Повреждение ДНК
↑
↑
↓
В другом осуществлении, представлено изделие. Изделие может включать упаковку. Может быть использована любая стандартная упаковка, которую используют для доставки и продажи композиции, как описано в данной заявке. Упаковка может содержать композиции, описанные в данной заявке, например композиции, содержащие манногептулозу или любые другие антиметаболиты глюкозы. Композиции могут быть диетически сбалансированными композициями корма для животных. Упаковка может включать конкретные заявления о полезном эффекте, написанные на упаковке. Конкретные заявления о полезном эффекте могут относиться к преимуществам, которые предоставляются потребителю композиции. Конкретные заявления о полезном эффекте могут относиться к повышению иммунитета при потреблении композиции. Например, конкретные заявления о полезном эффекте могут относиться к улучшению способности иммунной системы животного-компаньона реагировать при введении композиции животному-компаньону. Другой пример включает конкретные заявления о полезных эффектах, которые могут относиться к поддержанию и/или ослаблению понижения иммунной системы при старении животного-компаньона, если композицию вводят стареющему животному-компаньону. Таким образом, представлено изделие, в котором изделие включает упаковку, которая вмещает композицию для животного-компаньона, при этом упаковка содержит заявление о полезных эффектах, которое относится к повышению иммунитета животного-компаньона, если животное-компаньон потребляет композицию для животного-компаньона, содержащуюся в упаковке.
Примеры
Следующие примеры приведены для иллюстрации осуществлений настоящего изобретения и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения каким-либо образом.
Получение муки из плодов авокадо, содержащей манногептулозу
Свежие авокадо (Lula variety) получали от Fresh King Incorporated (Homestead, FL). Авокадо вручную разделяли и вынимали и отбрасывали косточки. Оставшуюся кожицу и мякоть размалывали при помощи устройства Hobart Commercial Food Preparation (серийный номер 11-10410235), используя сито 12¼. Размолотое авокадо затем переносили в сушилку Edwards Freeze (Super Modulyo Model, Crawely, Sussex, England). Лиофильную сушилку устанавливали при -20°C в течение первых 24 часов, -5°C в течение последующих 24 часов и 5°C в течение последних 72 часов. После удаления из лиофильной сушилки муку размалывали в порошок при помощи мельницы Straub (модель 4Е, Philadelphia, РА). Муку из плодов авокадо анализировали и было обнаружено, что она содержит приблизительно 10,35% манногептулозы, по массе муки. Необходимо отметить, что количество манногептулозы, обнаруженной в авокадо, варьируется в зависимости от определенного вида и состояния зрелости.
Получение экстракта авокадо
Экстракт авокадо, содержащий повышенные уровни манногептулозы, получают в соответствии со следующим необязательным процессом и используют в композициях в соответствии с осуществлениями настоящего изобретения.
Обеспечивают цельные плоды авокадо (приблизительно 900 килограмм). Плоды разрезают и удаляют косточку, частично или полностью, обеспечивая приблизительно 225 килограмм половинок авокадо с удаленными косточками. Сырые авокадо погружают в дезинтегратор, после некоторого перемешивания дополнительно добавляют воду (приблизительно 3000 килограмм) и CELLUBRIX (коммерчески доступный от Novozymes A/S) (приблизительно 1 литр). Смесь дополнительно перемешивают и одновременно нагревают до приблизительно 66°C. После окончания загрузки добавляют еще CELLUBRIX (приблизительно 1 литр) и всю смесь выдерживают при перемешивании в течение приблизительно 12 часов при контролируемом рН приблизительно 5,5. Температуру затем дополнительно повышают до приблизительно 80°C и потом выдерживают в течение, по меньшей мере, приблизительно 2 часов. Полученную в результате переваренную растительную смесь затем фильтруют при 80°C с получением углеводного экстракта в качестве фильтрата. Углеводный экстракт потом упаривают в упрощенной системе рециркуляции при 80°C, под вакуумом, с получением углеводного экстракта, имеющего от приблизительно 10% до приблизительно 20% твердых веществ и pH приблизительно 5,5. Затем экстракт дополнительно концентрируют, используя сушилку Refractance Window, с обеспечением приблизительно 100 кг экстракта в виде кристаллов или порошка (выход приблизительно 11% углеводного экстракта, исходя из исходной массы цельных плодов авокадо, который анализируют в виде выхода от приблизительно 0,25% до приблизительно 4,5% манногептулозы, исходя из исходной массы цельных плодов авокадо). Следует отметить, что количество манногептулозы, найденное в авокадо, варьируется в зависимости от конкретного вида и степени зрелости плода. Экстракт может быть использован в композициях в соответствии с осуществлениями настоящего изобретения.
Композиции в виде гранул
Таблица 1 иллюстрирует две композиции в виде гранул, имеющие следующие компоненты в примерных указанных количествах, которые получают с использованием методов, которые являются стандартными в данной области техники, включая экструзию, и дают собакам и/или кошкам в качестве ежедневного корма
Таблица 2
Компонент
Количество компонента,указанное, как мас.%
Количество компонента, указанное, как мас.%
Экстракт авокадо*
0,02
0,01
Куриная мука, мука из
44
47
куриных субпродуктов,
рыбная мука и яйца
Куриный жир
8
6
Свекловичный жом
2
3
Соли
2,5
2
Витамины и минералы**
1
1
Незначительные добавки***
3,5
4
Зерна (кукуруза, сорго, овес, рис, пшеница)
Остаток
Остаток
*Авокадо может быть заменен другими растительными веществами, имеющими повышенное содержание манногептулозы. Включение источника манногептулозы вероятно заменяет такое же количество источника зерна в композиции.
**Витамины и минералы могут включать: витамин Е, бета-каротин, витамин А, аскорбиновую кислоту, пантотенат кальция, биотин, витамин В12, витамин В1, ниацин, витамин В2, витамин В6, витамин D3, витамин D2, фолиевую кислотцу, хлорид холина, инозит, карбонат кальция, фосфат дикальция, хлорид калия, хлорид натрия, оксид цинка, оксид марганца, сульфат меди, оксид марганца, сульфат железа, йодид калия, карбонат кобальта.
***Незначительные добавки могут включать: рыбий жир, льняное семя, льняную муку, целлюлозу, ароматизаторы, антиоксиданты, таурин, дрожжи, карнитин, хондроитин сульфат, глюкозамин, лютеин, экстракт розмарина.
Введение
Восемьдесят (n=80) лабрадоров были рандомизированы по возрасту, полу и одному помету, чтобы получать либо полное, либо диетически сбалансированное контрольное питание, аналогичное Eukanuba Senior Large Breed или экспериментальным питаниям, которые идентичны с контрольным питанием, кроме включения манногептулозы, как описано ниже. Собаки были разделены на две группы исследования.
Исследование 1: всего 39 старших лабрадоров-ретривер кормили диетически сбалансированной композицией, обеспечивающей манногептулозу в количестве 0 или приблизительно 2 мг/кг массы тела собаки. Средний возраст собаки (12 кастрированных самцов, 27 стерилизованных самок) в начале 4-летнего исследования составлял 6,7 лет с диапазоном от 5,1 до 8,2 лет для самых молодых и старых собак в группе, соответственно. Контрольную композицию подавали в качестве диетически сбалансированной композиции, и она не содержала манногептулозы (0 мг/кг), экстракта авокадо, муки из плодов авокадо или концентрата авокадо. Тестируемая композиция являлась диетически сбалансированной контрольной композицией, полученной из экстракта авокадо, из плодов авокадо или концентрата авокадо, чтобы обеспечить манногептулозу в дозе приблизительно 2 мг/кг массы тела собаки. Старшим собакам давали половину их суточного распределения еды в 07:30 и 14:30 каждый день. Собак кормили для поддержания массы тела и показателя конституции (BCS) в пределах 2-4 баллов. Если были внесены пищевые коррективы, они были сделаны на ежеквартальной основе. Всех собак не кормили в течение ночи и утренние блюда удерживали, пока не отбирали кровь для всех иммунных измерений. Воду давали неограниченно.
Исследование 2: Всего 41 молодых лабрадоров-ретривер кормили диетически сбалансированной композицией, обеспечивающей манногептулозу в количестве 0 или приблизительно 2 мг/кг массы тела собаки. Средний возраст собаки (12 кастрированных самцов, 29 стерилизованных самок) в начале 36-месячного исследования составлял 4,0 года с диапазоном от 2,0 до 6,1 лет для самых молодых и старых собак в группе, соответственно. Контрольную композицию подавали в качестве диетически сбалансированной композиции (Eukanuba Senior Maintenance Formula), и она не содержала манногептулозы (0 мг/кг), экстракта авокадо, муки из плодов авокадо или концентрата авокадо. Тестируемая композиция являлась диетически сбалансированной контрольной композицией, полученной из экстракта авокадо, муки из плодов авокадо или концентрата авокадо, чтобы обеспечить манногептулозу в дозе приблизительно 2 мг/кг массы тела собаки. Молодым собакам давали половину их суточного распределения еды в 07:30 и 14:30 каждый день. Собак кормили для поддержания массы тела и показателя конституции (BCS) в пределах 2-4 баллов. Если были внесены пищевые коррективы, они были сделаны на ежеквартальной основе. Однако всех собак не кормили в течение ночи и утренние блюда удерживали, пока не отбирали кровь для всех иммунных измерений. Воду давали неограниченно.
Способы
Материалы и способы бластогенеза:
Цельную кровь собак собирали в гепариновые пробирки и центрифугировали при 600 об/мин в течение 10 минут. Лейкоцитарные пленки переносили в новую стерильную полипропиленовую пробирку и разбавляли до 13 мл PBS. Эту смесь крови затем наслаивали на 9 мл Histopaque 1.077 при комнатной температуре и центрифугировали в течение 30 минут при 500 об/мин. РВМС слой удаляли из градиента и промывали PBS. Оставшиеся эритроциты удаляли при помощи лизисного буфера АСК (NH4CL - 155 мМ, EDTA - 0,1 мМ, КНСО3 - 10 мМ, рН 7,4) и РВМС снова промывали PBS. Количество клеток определяли на счетчике Z2 Coulter (Beckman Coulter).
∧
Митогены приобретали от Sigma и разбавляли в полной среде (RPMI с 10% FBS и 1% PenStrep). Разбавленные митогены добавляли в лунки планшета для культивирования тканей на 96 лунок при следующих концентрациях: Конкавалин А 2,5 мкг/мл, 5 мкг/мл и 10 мкг/мл. РНА 2,5 мкг/мл, 10 мкг/мл и 20 мкг/мл. Миоген лаконоса 0,25 мкг/мл, 1 мкг/мл и 5 мкг/мл. РВМС в полной среде также добавляли в каждую лунку при 2×105 клеток на лунку. Общий объем каждой лунки составлял 200 мкл. Планшеты потом инкубировали при 37 градусах в 5% CO2 всего в течение 72 часов. При 52 часов (+1-2 часа) клетки активировали 1 мкКюри на лунку 3Н-тимидином. Клетки собирали и определяли радиоактивность путем жидкостной сцинтилляции.
Анализ 8-OHDG:
Анализ проводили для проб собачьей сыворотки, отделенной от цельной крови. Количество 8-OHDG определяли количественно при помощи коммерчески доступного набора ELISA от Oxis Health Products, номер в каталоге 21026.
Доведите все реактивы и пробы до комнатной температуры перед применением.
1. Восстановите первичное антитело буфером разведения для первичного антитела.
2. Добавьте 50 мл пробы или стандарта на лунку. Для предотвращения влияния соседнего сообщества не используйте самые дальние ряды (ряды А и Н).
3. Добавьте 50 мл восстановленного первичного антитела во все лунки, кроме холостой. Плотно закройте планшет уплотнителем планшета. Встряхните планшет из стороны в сторону для полного перемешивания. Инкубируйте при 37°C в течение 1 часа.
4. Вылейте содержимое планшета. Отмеряйте пипеткой 250 мл разбавленного промывочного буфера в каждую лунку. Тщательно промойте путем перемешивания, размещения промывочного буфера. Переверните пластины и промокните чистым бумажным полотенцем, чтобы удалить оставшийся промывочный буфер. Повторите промывание два раза.
5. Восстановите вторичное антитело буфером разведения для вторичного антитела.
6. Добавьте 100 мл восстановленного вторичного антитела на лунку. Плотно закройте планшет уплотнителем планшета. Встряхните планшет из стороны в сторону для полного перемешивания. Инкубируйте при 37°C в течение 1 часа.
7. Разбавьте хромоген 100 объемами буфера для разбавления хромогена.
8. Повторите стадию 4.
9. Добавьте 100 мл разбавленного хромогена на лунку. Встряхните планшет из стороны в сторону для полного перемешивания. Инкубируйте при комнатной температуре в темноте в течение 15 минут.
10. Добавьте 100 мл стоп-реагента, перемешайте, подождите 3 минуты и зарегистрируйте поглощение при 450 нм.
Проточная цитометрия - способ CD18:
Цельную кровь собак отбирали в пробирки EDTA и центрифугировали при 400 об/мин в течение 30 минут. Лейкоцитарную пленку переносили в новую стерильную полипропиленовую пробирку и разбавляли 2 мл PBS. Эритроциты подвергали лизису путем добавления 5 мл H2O в течение одной минуты и останавливали 5 мл 2Х холодного PBS. Клетки центрифугировали при 300 об/мин в течение 10 минут до осадка. Стадию лизиса повторяли до получения сгустка клеток белого цвета. Затем клетки повторно суспендировали в 0,8 мл FACS промывном буфере (PBS с 1% FBS и 0,02% NaN3). 100 мкл клеточной суспензии отбирали как аликвоту в каждую FACS пробирку для окрашивания.
Окрашивающие антитела приобретали у Serotec. Первичное антитело: мышиное антисобачье CD 18 (MCA 1780) использовали при 1:10 разведении. Вторичное антитело: козлиное антимышиное IgG (H&L) FITC (STAR117F) использовали при 1:50 разведении. Негативное контрольное антитело: мышиное IgG1 FITC/Rat IgG2a RPE (DC050) использовали при 1:10 разведении. Клетки инкубировали с каждым антителом в течение 30 минут на льду, промывали FACS промывным буфером и затем фиксировали 4% формалином перед анализом. Клеточные популяции анализировали на проточном цитометре FACScan (Becton Dickinson) при помощи программного обеспечения CellQuest Pro.
Размеры и значения, описанные в данной заявке, не должны быть истолкованы как строго ограниченные точными численными значениями, которые указаны. Вместо этого, если не указано иное, каждый такой размер предназначен для обозначения как процитированного значения, так и функционально эквивалентного диапазона, охватывающего данное значение. Например, размер, описанный как «40 мм», предназначен для обозначения «приблизительно 40 мм».
Каждый документ, процитированный в данной заявке, включая любые перекрестные ссылки или родственные патенты или заявки, включен в данную заявку путем ссылки во всей ее полноте, если нет выраженных исключений или иных ограничений. Цитирование любого документа не должно быть истолковано как допущение того, что он представляет собой уровень техники в отношении любого изобретения, раскрытого или заявленного в данной заявке, или что он отдельно или в любой комбинации с любой другой ссылкой или ссылками описывает, предполагает, или раскрывает любое такое изобретение. Дополнительно в той степени, что любое значение или определение термина в данном письменном документе противоречит какому-либо значению или определению в документе, включенном путем ссылки, значение или определение, присвоенные термину в данном письменном документе, будут определяющими.
В то время как конкретные осуществления в соответствии с настоящим изобретением были проиллюстрированы и описаны, специалистам в данной области техники будет очевидно, что различные другие изменения и модификации могут быть выполнены, не выходя за суть и объем настоящего изобретения. Поэтому формула настоящего изобретения, которая прилагается, предназначена для охватывания всех таких изменений и модификаций, которые входят в объем настоящего изобретения.