СРЕДСТВО ДЛЯ ВОССТАНОВЛЕНИЯ КРОВЕТВОРНОЙ ФУНКЦИИ ПРИ ТОКСИЧЕСКОЙ ГЕМОЛИТИЧЕСКОЙ АНЕМИИ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ
AGENT FOR RECOVERY OF HAEMATOGENIC FUNCTION IN CASE OF TOXIC HAEMOLYTIC ANAEMIA AND METHOD OF ITS PRODUCTION

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для получения лекарственного средства из растительного сырья, восстанавливающего функцию кроветворения при токсической гемолитической анемии.
2+
3+
3+
В медицинской практике для профилактики и лечения анемии используют неорганические соли железа, металлоорганические ферроцены F, хелатные соединения и сложные полинуклеарные гидроксидные комплексы Fe Их применяют как для обогащения пищевых продуктов, так и в качестве лекарственных препаратов. Имеется комплексный препарат на основе солей железа и углеводов (Патент №2198665). Известен железосодержащий препарат, включающий комплекс соединений цинка и железа с сахаром (Патент №2188022), комбинированный препарат, содержащий эритропоэтин и комплекс Fe (Патент №2188033). Антианемическое действие солей железа усиливается в сочетании с аскорбиновой кислотой (ферроплекс, фитин), алоэ, лимонной кислотой (ферроалоэ). Недостатком препаратов с неорганическими и органическими солями железа является их низкая биодоступность и токсичность при высокой дозе.
12
Известны препараты, содержащие биодоступное железо и аминокислотный ингредиент (Патент №2122406). Известны препараты на основе экстрактов печени (витогепат, сирепар). Для этих препаратов характерна терапевтическая эффективность за счет действия витамина В, биологической доступности железа и отсутствие побочных эффектов. Однако требуется высокая степень очистки препаратов от вредных примесей и микроорганизмов.
Наиболее близким в области профилактики и лечения анемии различной этиологии является крапива двудомная (Urtica dioica L.) (Полный справочник лекарственных растений. П.А.Косьев. Москва. 2001, стр.898). Однако в ней недостаточное количество хлорофиллов, что определяет малую кроветворную функцию при токсической гемолитической анемии.
Для подготовки растительного сырья известен способ получения высокодисперсных порошков из крапивы для производства напитков, вкусовых приправ, сухих концентратов, детского и диетического питания, а также в виде добавок в мороженое и кондитерские изделия (Заявка №93036480, 1997 г.). Он включает стадии сушки, охлаждения и измельчения частиц до размера 20-30 мкм. Известен способ получения крапивного порошкообразного полуфабриката с размерами 20-30 мкм, при котором зеленую массу сушат инфракрасными лучами и нагретым воздухом при температуре 60-80°С в слое 8-18 мм, что позволяет сохранить биологически активные вещества (Патент 2154957, РФ, 2000 г.).
Наиболее близким по техническому решению является способ получения порошков из растительного сырья, заключающийся в сушке, измельчении в вакууме и одновременном воздействии на сырье мелющими телами в вибрационном поле; вакуумирование осуществляют до остаточного давления не более 131,6 Па (Патент 2064477, РФ, 1996 г.). Однако измельчение сырья до микрометровых размеров частиц не позволяет в полной мере извлечь биологически активные вещества.
Задача изобретения - создание средства из растительного сырья, не обладающего побочным токсическим действием, восстанавливающего кроветворную функцию при токсической гемолитической анемии.
Сырьем являются листья и стебли крапивы двудомной, содержащие железо, значительные количества хлорофиллов, порфириное кольцо которых включает магний.
2
Технический результат получают благодаря тому, что после сушки крапивы ее измельчают в шаровых мельницах планетарного, виброцентробежного, роликового типов, обеспечивающих ускорение мелющих тел до 400 м/с. Механическую обработку проводят в среде аргона или азота для обеспечения сохранности хлорофиллов. В качестве исходного сырья используют сухие листья и стебли крапивы, влажность которых не более 4-6% мас. Избыточная влага способствует окислению целевых продуктов.
Содержание экстрактивных жирорастворимых веществ и хлорофиллов в измельченной крапиве определяется следующим образом. Измельченное сырье заливают хлороформом в соотношении порошок крапивы:растворитель 1:10, перемешивают в течение 30 минут. По окончании экстракции раствор фильтруют через плотные бумажные фильтры в мерные колбы. Фильтры промывают хлороформом. На спектрофотометре в диапазоне длин волн 400-700 нм в кюветах с толщиной слоя 10 мм проводят измерение оптической плотности экстрактов. Для определения содержания суммы хлорофиллов измеряют оптическую плотность экстрактов при длине волны 660 нм. Раствор сравнения - хлороформ. Содержание хлорофиллов (С), мкмоль/г (в пересчете на хлорофилл a) в абсолютно сухом сырье рассчитывают по формуле:
С=D·V·1000/е·m·(100-W),
где
D - оптическая плотность испытуемого экстракта;
V - объем раствора в мл;
4
е - коэффициент экстинции, л/моль· см хлорофилла a в хлороформе при длине волны 660 нм =9·10;
m - навеска сырья, г;
W - влажность образца, % отн., полученная при высушивании исследуемого образца в сушильном шкафу при температуре 105°С до постоянной массы.
В изобретении использованы листья и стебли крапивы двудомной (Urtica dioica L).
В таблице 1 приведены экспериментальные данные по измельчению листьев крапивы до различных размеров частиц с целью повышения в целевом продукте содержания биологически активных веществ - хлорофиллов.
Пример 1. Листья и стебли крапивы предварительно сушат до влажности 4% мас., измельчают в мельнице до размера частиц 20 мкм. Для определения экстрактивных веществ и содержания хлорофиллов взвешивают 100 г порошка крапивы.
Для определения содержания экстрактивных веществ измельченное сырье заливают хлороформом в соотношении порошок крапивы: растворитель 1:10, перемешивают в течение 30 минут. По окончании экстракции раствор фильтруют через плотные бумажные фильтры в мерные колбы. Фильтры промывают хлороформом. Фильтрат упаривают на роторном испарителе при остаточном давлении 0,1-0,5 Па и температуре 30°С, высушивают до постоянного веса и взвешивают. Данные приведены в таблице 1. Содержание экстрактивных веществ увеличилось в 100 раз по сравнению с необработанным сырьем (пример 11). Количество хлорофиллов повышается незначительно.
2
Пример 2. Листья и стебли крапивы предварительно сушат до влажности 4% мас. Сырье в количестве 1 кг помещают в мельницу планетарного типа АГО и измельчают до размера частиц 50 нм. Диспергирование проводят в воздушной среде. Ускорение мелющих тел - шаров 300 м/с. Выход экстрактивных веществ и содержание хлорофиллов определяют по методике, приведенной в примере 1. Выход экстрактивных веществ приведен в табл.1.
2
Пример 3. Листья и стебли крапивы предварительно сушат до влажности 6% мас. Сырье в количестве 1 кг помещают в мельницу планетарного типа АГО. Измельчение проводят в воздушной среде до размера частиц 50 нм при ускорении мелющих тел - шаров 300 м/с. Выход экстрактивных веществ и содержание хлорофиллов определяют по методике, приведенной в примере 1. В табл.1 показано увеличение выхода экстрактивных веществ более чем в 100 раз и при этом, соответственно, повышается количества хлорофиллов.
Пример 4. Аналогичен примеру 3, но сырье измельчают до размера 90 нм. Результаты приведены в табл.1.
Пример 5. Листья и стебли крапивы предварительно сушат до влажности 10% мас. Сырье в количестве 1 кг помещают в мельницу типа АГО. Диспергирование проводят в воздушной среде до размера частиц 90 мкм. Выход экстрактивных веществ и содержание хлорофиллов определяют по методике, приведенной в примере 1. В табл.1 показано, что увеличение влажности сырья приводит к снижению выхода хлорофиллов.
Пример 6. Аналогичен примеру 1, но измельчение проводят в среде аргона. Результаты приведены в табл.1.
2
Пример 7. Листья и стебли крапивы предварительно сушат до влажности 4% мас. Сырье в количестве 1 кг помещают в мельницу планетарного типа АГО. Диспергирование проводят в среде аргона до размера частиц 90 нм при ускорении мелющих тел - шаров 400 м/с. Выход экстрактивных веществ и содержание хлорофиллов определяют по методике, приведенной в примере. В табл.1 отмечен максимальный выход экстрактивных веществ и хлорофиллов.
2
Пример 8. Листья и стебли крапивы предварительно сушат до влажности 4% мас. Сырье в количестве 1 кг помещают в мельницу виброцентробежного типа. Измельчение проводят в среде аргона до размера частиц 90 нм при ускорении мелющих тел - шаров 400 м/с. Выход экстрактивных веществ и содержание хлорофиллов определяют по методике, приведенной в примере 1. В табл.1 приведен выход экстрактивных веществ и хлорофиллов.
Пример 9. Листья и стебли крапивы предварительно сушат до влажности 4% мас. Сырье в количестве 1 кг помещают в мельницу роликового типа. Измельчение проводят в среде аргона до размера частиц 90 нм при помощи металлических роликов, укрепленных на вращающемся роторе. Выход экстрактивных веществ и содержание хлорофиллов определяют по методике, приведенной в примере 1. В табл.1 приведен выход экстрактивных веществ и хлорофиллов.
Пример 10. Аналогичен примеру 5, но измельчение проводят в среде аргона. Результаты приведены в табл.1.
Как видно из примеров, механическая обработка в мельницах с измельчением сырья до размера частиц 50-90 нм позволяет в полной мере разрушить межмолекулярные и межагрегативные связи в комплексах органоминеральных компонентов и перевести в свободное состояние биологически активные вещества, обеспечивающие противоанемический эффект. Выход хлорофиллов возрастает в 3-4 раза по сравнению с измельченной до 1 мм крапивой. Снижение содержания влаги в сырье и создание инертной среды в зоне механообработки обеспечивает сохранность биологически активных веществ.
Исследование по влиянию суспензии нанодиспергированной крапивы двудомной (Urtica dioica L.) на нарушение кроветворения при токсической гемолитической анемии проводили на 50 белых беспородных мышах-самцах массой 18-22 г. В эксперименте использовали водные суспензии наноизмельченных листьев крапивы двудомной. В качестве препаратов сравнения использовали железа закисного сульфат, вводимый в течение 10 дней внутрижелудочно в суточной дозе 50 мг/кг, и суспензию листьев крапивы, измельченных до 1 мм. Исследуемые препараты крапивы вводили животным через зонд в желудок курсами, в дозе 100 мг/кг в объеме 0,2 мл на мышь массой 20 г один раз в день в течение 10 суток. Контрольным животным вводили внутрижелудочно соответствующий объем воды очищенной.
Моделью токсической анемии в наших опытах являлась анемия, возникшая при отравлении свинцом. Эта модель представляет специальный интерес, так как свинцовая анемия встречается как профессиональное заболевание человека и методы ее лечения, найденные в опытах на экспериментальных животных, с наибольшим основанием могут быть введены в практику. Ацетат свинца вводили в водном растворе в вену в суточной дозе 2 мг/кг в течение 3 дней подряд. На 10 сутки от начала эксперимента (на 7 сутки после последней инъекции ацетата свинца) животных декапетировали и исследовали кровь на содержание эритроцитов, гемоглобина, лейкоцитов и определяли протромбиновое время.
t
u
Результаты исследований обрабатывали, используя параметрический (t-критерий Стьюдента) и непараметрический (U-критерий Манна-Уитни) методы с определением средней арифметической (X) и ее стандартной ошибки (m). Значимость различий считали достоверной при P, P<0,05 [1, 2]. Расчеты проводили с использованием программы Statistica 6.0 для Windows.
В табл.2 приведены результаты экспериментов, подтверждающие, что у животных, отравленных ацетатом свинца, количество эритроцитов снижалось в 1,7 раза, лейкоцитов - в 2,5 раза. Содержание гемоглобина было меньше нормы в 1,5 раза. Протромбиновое время увеличивалось в 2 раза.
У животных, получавших в качестве терапии суспензию листьев нанодиспергированной крапивы, количество эритроцитов возрастало в 1,5 раза, лейкоцитов - в 1,7 раза по с равнению с нелеченными животными. Содержание гемоглобина было увеличено в 1,3 раза. Скорость свертываемости крови становилась больше в 1,6 раза (табл.2).
У животных, получавших в качестве терапии суспензию листьев крапивы, измельченных до 1 мм, содержание лейкоцитов было в 1,4 раза больше, чем у нелеченных животных, количество эритроцитов становилось больше на 13%, гемоглобина - на 16%. Протромбиновое время сокращалось в 1,3 раза (табл.2).
Железа закисного сульфат также оказал положительное лечебное влияние, количество эритроцитов увеличивалось в 1,5 раза, лейкоцитов - в 1,6 раза, по с равнению с нелеченными животными. Содержание гемоглобина было увеличено в 1,3 раза. Скорость свертываемости крови становилась больше в 1,6 раза (табл.2).
Таким образом, водная суспензия листьев нанодиспергированной крапивы обладает положительным стимулирующим влиянием на функцию кроветворения, препятствует развитию нарушений кроветворения, вызванных гемолитическим токсином (ацетат свинца), и не уступает препарату сравнения - железу закисному сульфату.
Таблица 1Влияние условий нанодиспергирования на выход экстрактивных веществ из листьев крапивы
№
Влажность сырья, % мас.
Среда
Размеры частиц сырья
Содержание экстрактивных веществ, %
Содержание хлорофиллов, мкмоль/г
1
4
Воздух
20 мкм
13,5
0,0188
2
4
Воздух
50 нм
22,7
0,047
3
6
Воздух
50 нм
20,0
0,0487
4
6
Воздух
90 нм
21,1
0,0393
5
10
Воздух
90 нм
18,1
0,0352
6
4
Аргон
20 мкм
16,4
0,0255
7
4
Аргон
50 нм
30,8
0,0713
8
6
Аргон
50 нм
29,3
0,069
9
6
Аргон
90 нм
29,0
0,0513
10
10
Аргон
90 нм
10,5
0,0317