СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ИМПЛАНТАЦИИ В ПРОГРАММАХ ВРТ У ЖЕНЩИН СТАРШЕГО РЕПРОДУКТИВНОГО ВОЗРАСТА С ТРУБНО-ПЕРИТОНЕАЛЬНЫМ ФАКТОРОМ БЕСПЛОДИЯ
METHOD FOR PREDICTION OF IMPLANTATION IN PROGRAMS OF ANCILLARY REPRODUCTIVE TECHNOLOGY IN WOMEN OF SENIOR REPRODUCTIVE AGE WITH TUBOPERITONEAL INFERTILITY FACTOR

Изобретение относится к области медицины, в частности к патологической анатомии и гинекологии, и может быть использовано в сфере вспомогательных репродуктивных технологий у женщин старшего репродуктивного возраста при бесплодии трубного происхождения для оценки имплантационных возможностей эндометрия.
Изобретение обеспечивает возможность коррекции подготовки пациенток к вспомогательным репродуктивным технологиям (ВРТ) с целью повышения их эффективности.
Согласно докладу ВОЗ, бесплодие является одним из пяти значимых нарушений здоровья у лиц моложе 50 лет (наряду с депрессией, нарушениями зрения, непредумышленными травмами и алкоголизмом) и приводит к серьезным демографическим и социальным последствиям. По данным статистики 20-60% приходится на долю трубно-перитонеального фактора бесплодия. Самым эффективным методом терапии которого является экстракорпоральное оплодотворение. Кроме того, одним из главных и независимых факторов, влияющих на исход ВРТ и определяющих благополучие репродуктивной функции является возраст женщины. Снижение естественной фертильности наблюдается после 36 лет. Наиболее низкая эффективность лечения прогнозируется у пациенток старше 40 лет. По данным отчета 2017 регистра ВРТ частота наступления беременности в группе женщин старше 40 лет ниже в 2,5 раза (ЭКО - 13,6%, ИКСИ - 12%), а частота завершения беременности родами ниже в 3 раза (ЭКО - 7,9%, ИКСИ - 6,7%). Однако, число женщин старшего репродуктивного возраста, обратившихся в клиники ВРТ, неуклонно растет.
Нерешенной проблемой при лечении бесплодия является нарушение имплантации. Негативный вклад нарушений морфофункционального состояния эндометрия в эффективность программ ВРТ продемонстрирован многими исследованиями (Н. Achache, A. Revel, 2006; Е.П. Келлет и др., 2010; К.Ю. Боярский, С.Н. Гайдуков, Н.А. Пальченко, 2013 Регистр ВРТ РАРЧ. Отчет за 2017 год).
Неотъемлемым компонентом поддержки репродуктивного здоровья женщины является витамин Д, так как участвует в регулировании овуляции, функций эндометрия и яичников, поддерживает высокую чувствительность этих тканей к половым гормонам. Рецепторы витамина D (VDR), помимо классических органов-мишеней (кости, кишечник), широко распространены и в других тканях, в том числе репродуктивной системы: яичниках, миометрии, эндометрии, что не исключает их важную роль в рецептивности последнего (Wagner C.L., Taylor S.N., Dawodu A., et al., 2012; Franasiak JM, Molinaro ТА, Dubell EK, ., et al., 2015; Громова О.А., Торшин И.Ю., Джиджихия Л.К., Гоголева И.В., 2016).
Исследования последних лет позволили расширить знания, касающиеся особенностей морфофункционального состояния имплантационного эндометрия: стало доступным определение доли клеток поверхностного эпителия с наличием зрелых пиноподий, исследование экспрессии стероидных рецепторов и ряда цитокинов и факторов роста, являющихся ключевыми маркерами имплантации. Однако, поиск маркеров рецептивности эндометрия, позволяющих на практике оценивать степень повреждения эндометрия, а также служить основой для разработки тактики прегравидарной подготовки необходимо продолжить.
На момент подачи заявки из свободных источников было известно о следующих наиболее близких аналогах:
Из патента RU 2706683, 05.06.2019 г. (Чистякова Г.Н., Гришкина А.А., Ремизова И.И., Данькова И.В. ФГБУ «НИИ ОММ» Минздрава России) известен способ прогнозирования готовности эндометрия к успешной имплантации эмбриона у женщин с маточной формой бесплодия с использованием компьютерной морфометрии.
Для этого на микрофотографии гистологического препарата измеряют площадь и высоту пиноподий, а также площадь сосудов. На основании этих параметров вычисляют прогностический индекс (PI) по разработанной формуле. При значениях PI более 0 прогнозируют высокий риск репродуктивных неудач при осуществлении вспомогательных репродуктивных технологий. При значениях PI менее 0 прогнозируют готовность эндометрия к успешной имплантации эмбриона. Способ обеспечивает высокую эффективность прогнозирования репродуктивных удач или неудач за счет объективной оценки рецептивности эндометрия. Недостатком метода является необходимость определения нескольких параметров (площадь клеток, имеющих пиноподий, высота пиноподий, средняя площадь капилляров), использование математического моделирования для расчета прогностического индекса, затрудняющим его применение в широкой клинической практике.
Из патента RU 2651762, 14.06.2017 г. (Мелкозерова О.А., Башмакова Н.В., Есарева А.В., Чистякова Г.Н., Барлит О.Г., Гиниятова А.А., ФГБУ «НИИ ОММ» Минздрава России) известен способ оценки рецептивности эндометрия в период «имплантационного окна».
1
2
3
4
5
6
7
1
2
3
4
5
6
7
Основан на оценке рецептивности эндометрия в период «имплантационного окна» методом иммуногистохимии с использованием двухэтапного стрептавидин-биотин-пероксидазного метода с демаскировкой антигена и с применением стандартных наборов моноклональных и поликлональных антител к следующим маркерам: ERα в строме, PR в строме, р53 в железах, bcl 2 в строме, CD95 в строме, Ki67 в строме, LIFR в железах, LIF в железах эндометрия. Используя полученные результаты, рассчитывают прогноз рецептивности эндометрия по формуле: d=-1,389x+0,022х-0,044х-0,019х+0,041х+0,006х+0,015х-3,248, где x - индекс ER/PR в строме эндометрия (баллы H-score для определения ядерной экспрессии ER и PR), х - р53 в железах эндометрия (% окрашенных ядер в поле зрения), x - bcl 2 в стромеэндометрия (% окрашенных ядер в поле зрения), х - CD95+ в строме эндометрия (% окрашенных клеток), x - Ki67 в строме эндометрия (% окрашенных ядер в поле зрения), x - LIF-R в железах эндометрия (баллы H-score), x - LIF в железах эндометрия (баллы Н-score). При значениях d>0 эндометрий характеризуется как рецептивный, при d≤0 эндометрий характеризуется как нерецептивный. Способ позволяет определять восприимчивость эндометрия в период «имплантационного окна», повышая успешность имплантации.
Недостатком данной методики является определение большого количества маркеров, значительно повышающее стоимость и продолжительность исследования, сложность предлагаемой формулы для рутинной практики.
Из патента RU 2617515, 22.04.2016 г. (Демура Т.А., Савельева Е.М., Перминова С.Г., ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова» Минздрава РФ) известен способ прогнозирования рецептивности эндометрия на основании оценки экспрессии GnRG и GnRGR в "окно имплантации" в эндометрии женщин бесплодием и неудачными попытками программы ЭКО. Прогностически неблагоприятными показателями рецептивности эндометрия считают отставание секреторной трансформации эндометрия, снижение количества клеток, содержащих зрелые пиноподий в поверхностном эпителии, менее чем 20%, а также низкую экспрессию (<2 баллов) GnRG и GnRGR.
Недостатками исключение из исследования женщин старше 38 лет, субъективность подсчета клеток, имеющих пиноподий.
Из патента RU 2617061, 16.12.2015 г., известен способ оценки готовности женщин с хроническим эндометритом к экстракорпоральному оплодотворению. У женщин с хроническим эндометритом на 19-21 день менструального цикла, предшествующего проведению программы ЭКО, получают смыв из полости матки, в котором методом твердофазного иммуноферментного анализа определяют содержание альфа-2-макроглобулина (а2-МГ) и при содержании а2-МГ равном или более 4,5 мг/л оценивают готовность женщин к ЭКО как низкую, рекомендуют дополнительное лечение и перенос сроков ЭКО, а при содержании а2-МГ менее 4,5 мг/л оценивают готовность женщин к ЭКО как высокую и рекомендуют инициацию программы ЭКО. Осуществление изобретения обеспечивает неинвазивный способ оценки готовности к ЭКО, позволяющий повысить эффективность ЭКО за счет выбора оптимального периода начала программы.
Недостатками способа являются отсутствие гистологического исследования эндометрия для верификации точного диагноза, а также способ не предназначен для определения рецептивности эндометрия в полном смысле этого слова, а лишь прогнозирует эффективность ЭКО в последующем цикле.
Из патента RU 2580629, 15.05.2015 г. (Коган Е.А., Демура Т.А., Сеидова Л.А., Перминова С.Г. ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова» Минздрава РФ) известен способ прогнозирования рецептивности эндометрия на основании оценки уровня экспрессии и внутриклеточной локализации эзрина в эндометрии женщин с бесплодием и повторными неудачами программы ЭКО. Показано, что в период «окна имплантации» рецепторный эндометрий характеризуется средней стадией фазы секреции, зрелыми пиноподиями более чем на 20% поверхностного эпителия и высоким уровнем экспрессии эзрина и в эпителии, и пиноподиях. Изобретение позволяет прогнозировать наступления беременности в программах экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) и естественных циклах у женщин с бесплодием. Недостатком метода является исключение из исследования женщин старшего репродуктивного возраста, проведение исследования без учета фактора бесплодия.
Из патента RU 2562559, 27.05.2014 г. (Айламазян Э.К., Ниаури Д.А., Коган И.Ю., Джемлиханова Л.Х., Гзгзян A.M., Шарфи Ю.Н. ФГБУ «НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отто» Северо-Западного отделения РАМН») известен способ прогнозирования рецептивности эндометрия в циклах ЭКО на основании определения оптической плотности экспрессии лейкемия ингибирующего фактора (LIF) в поверхностном и железистом эпителии эндометрия в период окна имплантации в цикле, предшествующем проведению экстракорпорального оплодотворения, и содержания сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) в цервикальной слизи в день трансвагинальной пункции фолликулов, систолодиастолическое отношение (S/D) и индекс резистентности (IR) спиральных артерий в день введения триггера овуляции.
Недостатком метода является его проведение непосредственно в цикле программы ВРТ, что не позволяет заранее прогнозировать исход протокола.
Из патента РФ №2553340, 21.04.2014 г. (Аскольская С.И., Коган Е.А., Чупрынин В.Д., Бурыкина П.Н., Демура Т.А., Попов Ю.В. ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова» Минздрава РФ) известен способ диагностирования нарушения рецептивности эндометрия у пациенток с миомой матки и бесплодием. Способ заключается в определении количества пиноподий в поверхностном эпителии, уровня экспрессии рецепторов прогестерона и эстрогена-альфа в строме эндометрия, их соотношения, а также уровня экспрессии имплантационного фактора LIF на 21-24 день менструального цикла методом ИФА. Нарушение фертильности, связанное с миомой матки, диагностируется при количестве пиноподий менее 35%, уровне соотношения экспрессии прогестероновых и эстрогеновых рецепторов в строме эндометрия менее 3,5, а также уровне экспрессии LIF менее 2 баллов. Данный метод предусмотрен только для пациенток, планирующих беременность, с миомой матки, не деформирующей полость матки и размерами миоматозных узлов до 5,0 см в диаметре.
Описанный способ основан на методах морфологического и иммуногистохимического исследования тканей эндометрия, полученных путем пайпель-биопсии.
Недостатком данного способа диагностики является отсутствие интегрального критерия оценки нарушения фертильности. Не понятной остается интерпретация результатов, когда изменены не все показатели.
Наиболее близким к предлагаемому является способ из патента RU 2636527, 28.10.2016 г (Бурменская О.В., Трофимова Д.Ю., Смольникова В.Ю., Корнеева И.Е., Межевитинова Е.А.Ю., Донников А.Е., Сухих Г.Т. ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова» Минздрава РФ) известен способ определения персонального "окна имплантации" у женщин на основе анализа транскрипционного профиля генов.
Способ определения персонального «окна имплантации» у женщин включает измерение уровней экспрессии мРНК функциональных генов человека РАЕР, DPP4, HLA-DOB, MSX1 в образцах тканей эндометрия, полученных путем пайпель-биопсии на 7-8 день после пика лютеинизирующего гормона. Далее полученные значения уровней экспрессии мРНК используют для вычисления индекса рецептивности эндометрия. Если значение индекса рецептивности эндометрия менее или равно пороговому значению, делают заключение о несоответствии эндометрия стадии «окна имплантации»; если значение индекса рецептивности эндометрия больше порогового значения, делают заключение о соответствии эндометрия стадии «окна имплантации», при этом пороговое значение определяют исходя из экспериментальных данных с помощью ROC-анализа.
Недостатком данного метода является исключение из исследования женщин старше 39 лет, измерение уровней экспрессии нескольких мРНК генов.
Задачей изобретения является разработка способа прогнозирования имплантации и наступления клинической беременности в программах ВРТ методом иммуногистохимического исследования эндометрия с разработкой референсных значений для экспрессии VDR рецепторов в строме эндометрия у женщин старшего репродуктивного возраста с трубно-перитонеальным фактором бесплодия.
Техническим результатом предлагаемого способа является прогнозирование вероятной имплантации и наступления клинической беременности в программах вспомогательных репродуктивных технологий.
Технический результат достигается тем, что способ диагностики вероятной имплантации включает исследование эндометрия на экспрессию VDR рецепторов в строме эндометрия.
Отличие способа заключается в том, что проводят определение экспрессию VDR рецепторов в строме эндометрия методом иммуногистохимии с помощью поликлональных антител эндометрия, полученного методом пайпель-биопсии на 18-22 день менструального цикла. Если значение экспрессии равно или более порогового параметра 8,7, делают заключение о неблагоприятном прогнозе для имплантации; если значение экспрессии меньше порогового параметра, делают заключение о соответствии эндометрия благоприятному прогнозу имплантации, пороговое значение определили на основе экспериментальных данных с помощью ROC-анализа.
Осуществление изобретения.
С целью разработки референсных значений для экспрессии VDR рецепторов в строме эндометрия нами был проведен ROC-анализ на основе проспективного когоротного исследования женщин (n=68) старшего репродуктивного возраста (с 36 до 44 лет) с трубно-перитонеальным бесплодием при подготовке к ВРТ, в ходе которого была определена точка разделения (cut-off) для экспрессии VDR в строме эндометрия у женщин с успешной имплантацией и наступлением клинической беременности и у женщин с отсутствием имплантации и клинической беременности.
В период предполагаемого окна имплантации (на 18-22 день менструального цикла) проводят пайпель-биопсию эндометрия в цикле, предшествующем проведению ЭКО. Полученные образцы эндометрия обрабатывают по стандартной методике с получением парафиновых блоков. ИГХ проводят на депарафинизированных и дегидратированных срезах толщиной 5 мкм с использованием авидин-биотинового иммунопероксидазного метода.
Иммуногистохимическое исследование биоптатов эндометрия, проводилось с применением стандартных наборов поликлональных антител фирмы GeneTex, США (кроличьи поликлональные антитела Vitamin D receptor).
Для визуализации первичных антител использовали систему детекции N-Histofine DAB (nichirei biosciences ins. Japan).
Морфологическое исследование проводилось с использованием микроскопа Primo Star производство Karl Zeiss. Диапазон рабочих увеличений 200-400. Фотографирование производилось с помощью цветной камеры Pixera Pro 150ES (переходник 0,5х). Для оценки морфофункционального состояния использовалось лицензированное программное обеспечение «Морфология 5.2.».
Результаты реакции VDR рецепторов идентифицировались по окрашиванию клеток стромы с оценкой процента окрашенных клеток.
Рассчитывают экспрессию VDR рецепторов в строме эндометрия. Пороговое значение экспрессии VDR рецепторов в строме эндометрия в точке cut-off составило значение 8,7. При значении порогового параметра менее 8,7 эндометрий характеризуется как рецептивный, благоприятный для имплантации; при значении равно и более 8,7 порогового параметра эндометрий характеризуется как нерецептивный, неблагоприятный для имплантации, т.к. при значении равно и более порогового параметра 8,7 не наблюдалось ни одного случая имплантации эмбриона.
При статистической обработке полученных данных (ROC-анализ) была определена площадь под ROC-кривой, которая соответствует взаимосвязи прогноза имплантации (наступления клинической беременности) и экспрессии VDR рецепторов в строме и составила 0,734±0,064; ДИ 95%: 0,608-0,859 (рис. 1).
Чувствительность и специфичность метода составила 98% и 78% соответственно.
Полученные результаты исследования позволяют расширить спектр маркеров рецептивности эндометрия при бесплодии трубного происхождения у женщин старшего репродуктивного возраста.
Выявленное референсное значение экспрессии VDR рецепторов в строме эндометрия в «окно имплантации» при трубно-перитонеальном факторе бесплодия у женщин старшего репродуктивного возраста, открывает перспективы для разработки новых подходов к патогенетической подготовке слизистой тела матки к имплантации бластоцисты.
Клинические примеры (таблица 1):
Пример 1. Пациентка Б. 38 лет, первичное бесплодие в течение 18 лет. Соматически-узловой нетоксический зоб. Эутиреоз. Менархе с 13 лет, цикл 28 дней, регулярный, продолжительность менструаций 3-4 дня, характер менструаций умеренный. АМГ - 3,67 нг/мл, ФСГ 9,3 мМЕ/мл. По данным иммуногистохимии экспрессия VDR рецепторов в строме эндометрия 4,849. Протокол стимуляции короткий с агонистами длительностью 10 дней, курсовая доза гонала 1200 ME и менопура 1500 ME. Получено 11 ооцитов, ЭКО, 11 эмбрионов, перенос 2 эмбрионов отличного качества на 5 сутки. ХГЧ 1062,8 мМЕ/мл. По данным УЗИ в полости матки плодное яйцо.
Пример 2. Пациентка В. 39 лет, вторичное бесплодие 8 лет. В анамнезе 1 беременность, 1 своевременные роды без осложнений. Соматически-здорова. Менархе с 12 лет, цикл 26 дней, регулярный, продолжительность менструаций 3-4 дня, характер менструаций умеренный. АМГ - 2,24 нг/мл, ФСГ 8,75 мМЕ/мл. По данным иммуногистохимии экспрессия VDR рецепторов в строме эндометрия 7,086. Протокол стимуляции длинный с половинными дозами агонистов, длительность стимуляции 10 дней, курсовая доза фоллитропа 1500 МЕ и менопура 750 ME. Получено 8 ооцитов, ЭКО/ИКСИ, 8 эмбрионов, перенос 1 эмбриона отличного качества на 5 сутки. Толщина эндометрия 10 мм. ХГЧ 1952 мМЕ/мл. По данным УЗИ в полости матки плодное яйцо.
Пример 3. Пациентка К. 41 год, вторичное бесплодие 8 лет. Соматически-здорова. Менархе с 12 лет, цикл 30 дней, регулярный, продолжительность менструаций 4 дня, характер менструаций умеренный. АМГ - 1,1 нг/мл, ФСГ 12,1 мМЕ/мл. По данным иммуногистохимии экспрессия VDR рецепторов в строме эндометрия 7,839. Протокол стимуляции длинный с агонистами, длительность стимуляции 11 дней, курсовая доза гонала 1650 ME и мериоферт (75 ME ФСГ + 75 ME ЛГ) 750 ME. Получено 7 ооцитов, ЭКО, 5 эмбрионов, перенос 2 эмбриона отличного качества на 5 сутки. Толщина эндометрия 10 мм. ХГЧ 1000 мМЕ/мл. По данным УЗИ в полости матки плодное яйцо.
Пример 4. Пациентка И. 39 лет, вторичное бесплодие 10 лет. В анамнезе лапароскопия, 2 стороняя тубэктомия (2 сторонний сактосальпинкс), секторальная резекция левой молочной железы (фиброаденома). Менархе с 11 лет, цикл 28 дней, регулярный, продолжительность менструаций 5 дней, характер менструаций умеренный. АМГ - 0,8 нг/мл, ФСГ 10,1 мМЕ/мл. Раннее 3 безуспешные попытки ЭКО. Ответ бедный. Рекомендована программа с ДО. По данным иммуногистохимии экспрессия VDR рецепторов в строме эндометрия 4,894. После медикаментозной подготовки эндометрия перенос 2 эмбрионов хорошего качества. Толщина эндометрия 7,9 мм. ХГЧ 1682 мМЕ/мл. По данным УЗИ в полости матки дихориальная, диамниотическая двойня.
Пример 5. Пациентка Р. 42 г, вторичное бесплодие 10 лет. В анамнезе 1 медаборт по желанию женщины, Лапароскопия. Кистэктомия слева (разрыв кисты). Соматически здорова. Менархе с 13 лет, цикл 25 дней, регулярный, продолжительность менструаций 3 дня, характер менструаций умеренный. АМГ - 0,25 нг/мл, ФСГ 18,5 мМЕ/мл. Раннее 1 безуспешная попытка ЭКО. Ответ бедный. Рекомендована программа с ДО. По данным иммуногистохимии экспрессия VDR рецепторов в строме эндометрия 0,735. После медикаментозной подготовки эндометрия перенос 2 эмбрионов хорошего и отличного качества. Толщина эндометрия 10,3 мм. ХГЧ 2425,5 мМЕ/мл. По данным УЗИ в полости матки дихориальная, диамниотическая двойня.
Пример 6. Пациентка К. 39 лет, первичное бесплодие 6 лет. Соматически здорова. Менархе с 14 лет, цикл 29 дней, регулярный, продолжительность менструаций 7 дней, характер менструаций умеренный. АМГ - 1,44 нг/мл, ФСГ - 6,94 мМЕ/мл. Попытка ЭКО первая. По данным иммуногистохимии экспрессия VDR рецепторов в строме эндометрия 9,795. Протокол с антагонистами, длительность стимуляции 13 дней, курсовая доза гонала 2025 ME, мериоферта 900 ME. Получено 3 ооцита, ЭКО, 3 эмбриона. Перенесено на 5 сутки 2 эмбриона хорошего качества. Толщина эндометрия 9 мм. ХГЧ через 14 дней менее 0,1 мМЕ/мл, плодное яйцо в полости матки не обнаружено.
Пример 7. Пациентка К. 41 год, первичное бесплодие 10 лет. Сопутствующее заболевание: миома тела матки. Соматическая патология: АИТ. Эутиреоз. Хр. тонзиллит, стадия ремиссии. Менархе с 14 лет, цикл 27 дней, регулярный, продолжительность менструаций 5 дней, характер менструаций умеренный. АМГ - 4,24 нг/мл, ФСГ - 4,95 мМЕ/мл. Попытка ЭКО первая. По данным иммуногистохимии экспрессия VDR рецепторов в строме эндометрия 9,47. Протокол длительный модернизированный с половинными дозами агонистов, длительность стимуляции 10 дней, курсовая доза фоллитропа 1500 ME и менопура 750 ME. Получено 6 ооцитов, ЭКО, 5 эмбрионов. Перенесен на 5 сутки 1 эмбрион хорошего качества. Толщина эндометрия 13 мм. ХГЧ через 14 дней менее 1,0 мМЕ/мл. При УЗИ плодное яйцо в полости матки не обнаружено.