УСТРОЙСТВО ДЛЯ АВТОМАТИЗИРОВАННОГО ВЫДЕЛЕНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

Полезная модель относится к области молекулярной биологии, биотехнологии, микробиологии и медицине и касается устройства для автоматизированного выделения нуклеиновых кислот (НК), в котором осуществляются все стадии выделения и очистки НК из биологических образцов. Процедура выделения и очистки НК выполняется внутри картриджа, изолированного от внешней среды, что сводит к минимуму риск заражения персонала. Полученную очищенную ДНК можно непосредственно использовать для проведения ПЦР.
Выделение и очистка нуклеиновых кислот (НК) из биологического материала (животные и растительные клетки, ткани, физиологические жидкости (кровь, слюна и др.)), а также из образцов почв, пищевых продуктов, воды и др. является необходимой стадией при проведении широкого круга исследований в разных областях науки, включая молекулярно-генетические исследования, а также в клинической диагностике, фармакологии, медицине, биотехнологии, охране окружающей среды и др. Современные требования к лабораторным методам выделения НК включают быстроту и эффективность проведения всех этапов выделения и безопасность выполнения процедуры для персонала, универсальность протокола для получения очищенной ДНК и РНК из различных биологических образцов. Возрастают требования к чистоте получаемых препаратов и воспроизводимости процедуры выделения.
Выделение и очистка НК в биохимических лабораториях и медицинских центрах в настоящее время производится, в основном, в ручном режиме. Первым этапом выделения является разрушение клеточных стенок или вирусного капсида (лизис), после которого необходимо проводить отделение белков и нерастворимых частиц. Большинство методик выделения НК включает несколько стадий центрифугирования, что является одной из наиболее трудоемких процедур, которые приводят также к уменьшению выхода НК за счет больших потерь при отборе супернатанта после центрифугирования. В некоторых методах выделения и очистки НК используются токсичные органические растворители, такие, как фенол, хлороформ и др., что требует дополнительных мер защиты персонала лабораторий. Кроме того, при работе с патогенными микроорганизмами и вирусами существует риск заражения персонала.
Таким образом, недостатками ручных процедур являются трудоемкость, недостаточно высокий выход НК, частое использование токсичных органических растворителей, риск заражения персонала при работе с патогенными микроорганизмами. Поэтому, в данной области существует острая потребность в разработке устройства для автоматизированного выделения НК, которое позволяло бы быстро получать высокоочищенные НК с высоким выходом и исключило или свело к минимуму контакт персонала с патогенным или инфекционным материалом.
В настоящее время существует ряд автоматизированных устройств для обработки биологических образцов и выделения НК. Роботизированные системы COBAS AmpliPrep компании Roche Diagnostics (США/Швейцария), Thermo′s KingFisher компании Thermo Electron (США), QIAsymphony SP и BioRobot MDx компании Qiagen (Германия), предназначенные для выделения и очистки ДНК и РНК из биологических жидкостей, таких как сыворотка и плазма крови, слюна, моча, основаны на применении технологии, использующей магнитные частицы. Все эти системы позволяют одновременно обрабатывать несколько биологических образцов, например, 24 образца физиологических жидкостей в устройстве Thermo′s KingFisher, 96 образцов для выделения вирусных НК или геномной ДНК из образцов крови в приборе QIAsymphony SP. Система QIAsymphony SP включает картриджи, заполненные необходимыми реагентами, дозированно подаваемые для обработки образца. Картриджи в процессе выделения открываются автоматически, что сводит к минимуму риск заражения или контаминации.
Известны также рабочие станции для автоматической экстракции и очистки НК, которые с использованием роботов воспроизводят ручные способы выделения НК, включающие последовательное перемещение пробирок, фильтрацию, дозирование реагентов. Например, компанией Bioneer Corp.заявлено устройство для автоматической очистки ДНК (Automatic DNA purification apparatus, патент WO/2001/025482), состоящее из многочисленных контейнеров для растворов, каналов для прохождения жидкостей, регулируемых клапанами, вакуумного блока, штативов, шприцов для точного количественного введения и отсасывания жидкостей.
Компанией Corbett Technologies (Австралия) разработана настольная рабочая станция "X-tractor GeneTM System" для экстракции НК из образцов объемом до 200 мкл, полностью воспроизводящая ручное выделение НК.
Компанией Isis Pharmaceuticals, США запатентована полностью автоматизированная система-робот для идентификации биологически-опасных агентов (Automatic identification of bioagents, патент WO/2005/009202). Система состоит из двух блоков, разделенных воздушным шлюзом, в первом из которых проводится выделение и очистка ДНК, а во втором - ПЦР для идентификации агента.
Все эти устройства являются сложными конструкциями, основанными на применении робототехники, недостатками которых является их громоздкость, высокая стоимость (более 70 тыс. долл. США), дороговизна проведения анализов и эксплуатации, что делает невозможным их использования в небольших лабораториях и центрах. Кроме того, они являются закрытыми системами, не допускающими вмешательство оператора в ход процесса. При эксплуатации таких систем необходимы постоянные закупки реагентов данной фирмы, которые предназначены для данного конкретного прибора
Другой класс установок для автоматизированного выделения НК включает более простые и дешевые устройства, которые позволяют хотя бы частично автоматизировать процесс.
Фирмой Millipore Corporation (США) запатентовано устройство для выделения НК из клеток, вирусных частиц и микоплазмы, состоящее из системы фильтрующих элементов (пористых мембран), через которые последовательно пропускают образец (Filter device for the isolation of a nucleic acid, EP 183242 A2). На первой мембране осуществляется лизис клеток; полученный лизат поступает на стекловолоконный фильтр для последующей очистки и элюции НК. Фильтрующие мембраны соединены системой клапанов. Устройство может быть как одноразового, так и многоразового использования. Для одновременной обработки нескольких образцов несколько фильтрующих устройств могут быть собраны в кассету. Недостатками данного устройства являются необходимость ручного введения реагентов и наличие стадий центрифугирования.
Запатентовано устройство для выделения НК (Nucleic acid isolation, WO/2005/012521, Invitrogen Corp., США), представляющее собой картридж, состоящий из пробирки, соединенной с фильтрующим элементом и далее с колонкой для очистки НК. Фильтрующий элемент содержит несколько слоев фильтров, колонка включает носитель, способный связывать НК, например носитель с переменным зарядом. Манипуляции с образцом осуществляются с помощью шприца или насоса. Недостатком данного устройства является необходимость предварительной ручной обработки образца перед введением его в картридж: проведение лизиса клеток, разбавление сыворотки крови и т.п.
Описан ряд микрофлюидных устройств для получения очищенных нуклеиновых кислот, содержащих сеть микроканалов диаметром 100 мкм и менее, через которые пропускаются биологические образцы и растворы реагентов. В состав микрофлюидных систем входят также перемешивающие устройства, микродозаторы, микронасосы, фильтры и др.
Запатентованы микрофлюидное устройство для очистки ДНК при взаимодействии образца с диатомитом (Purification and amplification of nucleic acids in a microfluidic device, WO/2008/002725, Bio-Rad, США), микрофлюидное устройство для выделение геномной ДНК из лейкоцитов человека, в котором ДНК из образца связывается с поверхностью канала, модифицированного ДНК-связывающим реагентом (DNA purification and analysis on nanoengineered surfaces, WO/2006/081324); микрочип, в котором очистка ДНК происходит путем последовательного прохождения через серию хроматографических микроколонок, селективно сорбирующих примесные вещества, такие как белки, пептиды, липиды, лектины и др., а последняя колонка селективно связывает ДНК (DNA purification in a multi-stage, multi-phase microchip, WO/2008/058204). Недостатком таких устройств является низкий выход НК, а также необходимость ручного введения реагентов на разных стадиях выделения и очистки.
Описано микрофлюидное устройство и метод концентрирования и очистки НК из биологических образцов (Methods for nucleic acid isolation and kits using a microfluidic device and concentration step, WO/2005/068627, 3M Innovative Properties company, США), включающее резервуар для загрузки образца и камеры для обработки и перемешивания, соединенные каналами и клапанами. Образец после загрузки подвергается действию лизирующего раствора, переходит далее в камеру для обработки, где проходит несколько стадий концентрирования и разбавления, а также дополнительный лизис и удаление раствора, содержащего ингибиторы, которые мешают проведению ПНР с полученной ДНК. Недостатком данной системы является возможность лишь частичной очистки НК, в основном, от ингибиторов ПЦР.
Предложено монолитное микрофлюидное устройство для экстракции ДНК и РНК, в основном, из образцов крови (Nucleic acid purification chip, WO/2005/066343, Сингапур), состоящее из субстрата на основе кремния, входных и выходных отверстий для введения и выведения образца крови, а также буферов для обработки образца в объеме нескольких микролитров, микромешалки, камеры для лизиса, камеры, содержащей ДНК-связывающий материал и систему клапанов. Устройство позволяет выделять НК только из образца определенного типа (кровь).
Примером более сложной микрофлюидной системы является система, представляющая собой совокупность модулей, в первом из которых происходит связывание и очистка целевого продукта (НК), а второй модуль является собственно микрофлюидным устройством, осуществляющим детекцию и анализ полученного продукта (Microfluidic devices, WO/2008/030631, Microchip biotechnologies, США). Лизис клеток осуществляется обработкой ультразвуком в проточном режиме. Очистка ДНК осуществляется путем взаимодействия с магнитными частицами, содержащими аффинный носитель. Магнитное поле создается вращающимся магнитным блоком.
Фирмой Siemens (Германия) предложен плоский картридж (карта) для автоматического анализа ДНК или белков, содержащий систему микроканалов и микрополостей, формирующих емкости для содержащихся в них сухих реагентов, а также способ его изготовления методом литья под давлением (Arrangement for integrated and automated DNA or protein analysis in a single-use cartridge, method for producing such a cartridge and operating method for DNA or protein analysis using such a cartridge, WO/2006/042838). Сухие реагенты вносятся в открытые каналы, которые после этого заклеиваются пленкой. Картридж является одноразовым устройством. Образец вносится в готовый к анализу картридж, и результаты получают в полностью автоматическом режиме при помещении картриджа в считывающее устройство.
Описан также ряд микрофлюидных аппаратов, в которых одновременно производится выделение ДНК и ее ПЦР-амплификация, а в ряде устройств и последующая детекция. Примером такой системы может служить устройство для выделения и амплификации ДНК из биологических жидкостей фирмы Micronics (США) (Method and system for microfluidic manipulation, amplification and analysis of fluids, for example, bacteria assays and antiglobulin testing, WO/2004/065010, патент США 7,416,892). Устройство представляет собой одноразовую микрофлюидную карту и предназначено для анализа бактерий в биологических жидкостях и диагностики некоторых заболеваний. Карта имеет встроенную фильтрующую мембрану, на которой задерживаются клетки, которые далее подвергаются лизису. Через мембрану последовательно пропускают серию растворов: растворы для отмывки, растворы, содержащие ферменты, растворы для амплификации и детекции. Проводится ПЦР-амплификация полученной ДНК в соответствующем температурном режиме, а далее ПЦР-продукт смывается с мембраны и передается на детектирующий элемент.
Описана микрофлюидная система («лаборатория-на-чипе») для детекции некоторых возбудителей инфекционных заболеваний (Университет Пенсильвании, США), состоящая из коллектора образца (слюны), одноразовой пластиковой кассеты (микрофлюидный чип) для обработки образца, включающей систему для проведения лизиса, экстракции НК, ПЦР, мечения ПЦР-продукта, и управляющей платформы-контроллера для управления подачей реагентов, температурой, клапанами, а также лазерного сканера для считывания результатов (Z. Chen, M.G. Mauk, J. Wang, W.R. Abrams, P.L. Corstjens, R.S. Niedbala, D. Malamud, H.H. Bau, A microfluidic system for saliva-based detection of infectious diseases. Ann. NY Acad. Sci., 2007, v. 1098, p.429-436).
Фирмой Canon U.S. Life Sciences, США предложено устройство для анализа геномной ДНК, состоящее из картриджа, в котором проводится выделение ДНК, инжектора, с помощью которого ДНК передается на микрофлюидный чип, включающий зону для ПЦР-амплификации, зону для детекции и зону для анализа ДНК (Method and molecular diagnostic device for detection, analysis and identification of genomic DNA, WO 2007028084). Выделение ДНК происходит в реакционной камере с использованием магнитных частиц или материалов, меняющих свойства под действием электрического заряда.
Предложен полностью автоматизированный портативный микрофлюидный чип для обнаружения патогенных микроорганизмов методом ПЦР с детекцией в реальном времени (Real-time PCR detection of microorganisms using an integrated microfluidic platform, WO/2006/085948, Cornell Research Foundation, США). Микрочип включает модуль для лизиса очистки ДНК, который с помощью микроканалов соединен с модулем для ПЦР-детекции. Детекция осуществляется методом ПЦР в реальном времени с использованием флуоресцентного красителя. Устройство можно использовать как в лабораториях, так и в полевых условиях.
Таким образом, в настоящее время разработан ряд устройств для автоматического выделения и очистки НК, включающий сложные роботизированные системы, в том числе устройства для одновременно выделения ДНК и ее ПЦР-амплификации, и более простые и дешевые аппараты. Автоматические роботизированные системы дороги, громоздки и сложны в использовании, а более простые системы либо требуют дополнительной ручной обработки образца, либо осуществляют неполную очистку НК, либо выход НК недостаточен, либо они предназначены для выделения ДНК из образца определенного типа, например, только из крови, слюны и др., либо проводят анализ образца на наличие одного конкретного заболевания. Не существует универсального устройства, которое позволяет быстро, воспроизводимо и с высоким выходом выделять НК из биологических образцов в полностью автоматическом режиме.
В данной области существует острая потребность в разработке устройства для автоматизированного выделения НК, который бы выгодно отличался от известных из уровня техники решений простотой проведения анализа, высоким выходом НК и невысокой стоимостью. Чрезвычайно важно проведение всех операций выделения и очистке в автоматическом режиме, чтобы полностью исключить контакт персонала с патогенными и инфицированными образцами.
Предлагаемая полезная модель позволяет проводить в автоматическом режиме все стадии выделения и очистки НК, включая лизис клеток, микроорганизмов и вирусных частиц, очистку и элюцию НК. Полностью исключен контакт персонала с биологическим образцом. Процедура выделения и очистки НК происходит быстро (около 40 мин) и с высоким выходом (более 90%). Полученную ДНК можно использовать для проведения ПЦР.
На Фиг.1 представлена фотография полезной модели-устройства для автоматизированного выделения НК из биологических образцов. Картридж (1) помещают в управляющую установку-контроллер (2). Процедура выделения и очистки НК с использованием устройства управляется компьютером (3).
На Фиг.2 представлена принципиальная схема картриджа для автоматизированного выделения НК с обозначением резервуаров с необходимыми реагентами.
1 - приемная камера для образца;
2 - резервуар для лизирующего буфера, содержащего лизоцим. Раствор в резервуаре нагревается при использовании нагревательного элемента и перемешивается электромагнитной мешалкой;
3 - резервуар для лизирующего буфера, содержащего хаотропный агент, протеиназу К, детергент. Раствор в резервуаре нагревается при использовании нагревательного элемента и перемешивается электромагнитной мешалкой;
4 - резервуар, содержащий этанол;
5 - резервуар для промывочного буфера, содержащего хаотропный агент. Раствор в резервуаре нагревается при использовании нагревательного элемента и перемешивается электромагнитной мешалкой;
6 - резервуар, содержащий растворитель для промывочного буфера (смесь этанол-вода);
7 - резервуар, содержащий этанол;
8 - микроколонка с твердофазным сорбентом для связывания нуклеиновых кислот;
9 - резервуар для раствора для элюции НК с микроколонки (вода);
10 - резервуар для сбора очищенной НК;
11 - резервуар для сбора отходов;
а-m - клапаны, регулирующие перемещение реакционных смесей и реагентов в каналах и резервуарах картриджа. Управляются установкой-контроллером.
Фиг.3 представляет конструктивные элементы картриджа.
А - верхняя панель (крышка), оргстекло, 2 мм. На верхней панели расположены:
1 - отверстия для поршней (16 шт.);
2 - отверстие для приемной камеры образца;
3 - отверстия для фиксирующих винтов (4 шт.);
П1 - прокладка, силикон, 2 мм;
П2 - прокладка, полиэтилен, пленка, 50 мкм;
Б - основная рабочая платформа, оргстекло, 8 мм;
П3 - прокладка, полиэтилен, пленка, 50 мкм;
П4 - прокладка, силикон, 2 мм;
В - нижняя панель (крышка), оргстекло, 2 мм.
Фиг.4 представляет фотографию управляющей установки-контроллера (без картриджа).
1 - блок соленоидов для управления клапанами картриджа;
2 - блок поршней;
3 - блок галогенных ламп нагревателя;
4 - направляющие салазки для помещения картриджа в управляющую установку-контроллер;
5 - блок электромагнитных мешалок;
6 - компрессор;
7 - блок электронного управления.
На Фиг.5 представлена схематическая диаграмма устройства клапана.
1 - соленоид постоянного тока;
2 - поршень;
3 - запорная головка клапана;
А - верхняя панель картриджа (см. Фиг.3);
П1 - прокладка между верхней панелью и основной рабочей платформой картриджа, силикон (см. Фиг.3);
П2 - прокладка между верхней панелью и основной рабочей платформой картриджа, полиэтилен (см. Фиг.3);
Б - основная рабочая платформа картриджа (см. Фиг.3);
IN - входной канал;
OUT - выходной канал.
Фиг.6 представляет результаты выделения НК из бактериальных клеток.
s
А. Грам-положительные бактериальные клетки Bacillus thuringiensis (10 клеток/мл).
Электрофорез в 1% агарозном геле. Дорожки:
1 - ДНК Bacillus thuringiensis;
2 - ДНК, выделенная из клеток Bacillus thuringiensis, ручным методом;
3 - ДНК, выделенная из клеток Bacillus thuringiensis, с использованием устройства для автоматизированного выделения нуклеиновых кислот;
4 - маркер λ/Hind III.
Б. Грам-отрицательные бактериальные клетки Escherichia coli. Выделение НК из ночной культуры клеток. Электрофорез в 1% агарозном геле. Дорожки:
1 - маркер λ/Hind III;
2 - НК, выделенные из клеток E.coli, ручным методом;
3, 4 - НК, выделенные из клеток E.coli, с использованием устройства для автоматизированного выделения нуклеиновых кислот.
Фиг.7 представляет результаты проведения ОТ-ПЦР с РНК бактериофага MS2 с использованием РНК, выделенной различными методами. ПЦР проводили с праймерами, комплементарными участку последовательности Coat протеина.
1 - РНК бактериофага MS2, выделенная ручным методом;
2, 3 - РНК бактериофага MS2, выделенная с использованием устройства для автоматизированного выделения нуклеиновых кислот;
4 - положительный контроль реакции;
5 - отрицательный контроль реакции;
6 - маркер λ/Hind III.
Устройство для автоматизированного выделения нуклеиновых кислот из биологических образцов состоит из картриджа, содержащего резервуары с реагентами для лизиса клеток, микроорганизмов и вирусных частиц, очистки и элюции нуклеиновых кислот, каналы, микроколонки и клапаны, и управляющей установки-контроллера, осуществляющей подачу давления, нагрев, перемешивание реагентов в индивидуальных резервуарах картриджа, а также перемещение реакционных смесей и растворов (Фиг.1).
Картридж содержит приемную камеру для ввода биологического образца, резервуары с сухими реакционными смесями буферов для лизиса и буфера для промывки, микроколонку с твердофазным сорбентом для связывания нуклеиновых кислот, резервуары для этанола, смеси вода-этанол и воды для растворения сухих компонентов промывочного буфера, промывки микроколонки и элюции нуклеиновых кислот, связавшихся с твердофазным сорбентом в микроколонке, выходной порт, совместимый со стандартной микропробиркой, резервуар для сбора отходов реакций (Фиг.2). В процессе изготовления в резервуар 2 объемом 1,5 мл помещают сухую смесь реагентов для лизирующего буфера, содержащую лизоцим, в резервуар 3 объемом 1,5 мл - сухую смесь реагентов для лизирующего буфера, содержащую хаотропный агент, протеиназу К и детергент, в резервуар 5 объемом 1,0 мл - сухую смесь реагентов для промывочного буфера, содержащую хаотропный агент; микроколонку 8 заполняют твердофазным сорбентом для связывания нуклеиновых кислот, резервуар 4 объемом 0,5 мл и резервуар 7 объемом 1,0 мл - этанолом, резервуар 6 объемом 0,5 мл - смесью этанол-вода, резервуар 9 объемом 0,2 мл - водой. Объем резервуара для сбора отходов реакций составляет 5,0 мл.
Картридж содержит только резервуары с реагентами и клапаны для коммутации газожидкостных потоков, в то время как все необходимые электромагнитные компоненты, осуществляющие подачу давления, перемещение реакционных смесей и реагентов в резервуарах картриджа, нагрев и перемешивание в индивидуальных резервуарах картриджа, размещены в управляющей установке-контроллере. Управляющая установка-контроллер обеспечивает заданные скорости перемещения реакционных смесей и реагентов в резервуарах картриджа, температурно-временные режимы инкубации и перемешивания реакционных смесей в отдельных резервуарах картриджа.
Готовый к работе картридж помещают в управляющую установку-контроллер. Ввод картриджа происходит вдоль верхних и нижних направляющих салазок (см. Фиг.4), которые обеспечивают его точное позиционирование.
Биологический образец помещают в приемную камеру картриджа, и далее все стадии лизиса клеток, микроорганизмов и вирусных частиц, очистки и элюции нуклеиновых кислот осуществляются последовательно в резервуарах картриджа, изолированных от внешней среды. Процедура выделения и очистки НК с использованием данного устройства управляется компьютером.
После введения биологического образца в приемную камеру картриджа осуществляются последовательные стадии его обработки. Процедура выделения и очистки НК состоит из следующих стадий (Фиг.2):
а) лизис клеток, микроорганизмов и вирусных частиц с использованием лизирующего буфера, содержащего лизоцим.
Биологический образец (100-500 мл) помещают в приемную камеру 1 с помощью пипетки или любого дозирующего устройства. Открывается клапан а, и образец поступает в резервуар 2. Клапан b и остальные клапаны закрыты. В резервуаре 2 происходит растворение сухой реакционной смеси для лизирующего буфера, содержащего лизоцим, причем растворителем является жидкий биологический образец. Растворение сухой реакционной смеси буфера для лизиса, содержащего лизоцим, и разрушение компонентов клеточной стенки микроорганизмов и вирусного капсида после поступления биологического образца из приемной камеры в резервуар 2 происходят одновременно при интенсивном перемешивании и нагревании до температуры 37°С в течение 10 мин.
Перемешивание осуществляется блоком электромагнитных мешалок, а нагревание - блоком галогенных ламп нагревателя, входящих в состав управляющей установки-контроллера.
В качестве лизирующего буфера, содержащего лизоцим, используют, например, 10 мМ трис-НС1 буфер, содержащий 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты и 50 мг/мл лизоцима, рН 8,0.
б) лизис клеток, микроорганизмов и вирусных частиц с использованием лизирующего буфера, содержащего хаотропный агент, протеиназу К, детергент.
Через открытый клапан b (остальные клапаны закрыты) реакционная смесь поступает в резервуар 3. В резервуаре 3 происходит растворение сухой реакционной смеси для лизирующего буфера, содержащего хаотропный агент, протеиназу К, детергент, причем растворителем является жидкий биологический образец, поступивший из резервуара 2 и обработанный буфером для лизиса, содержащего лизоцим. Растворение сухой реакционной смеси буфера для лизиса, содержащего хаотропный агент, протеиназу К, детергент, и окончательное разрушение клеток, микроорганизмов и вирусов с высвобождением нуклеиновых кислот происходят одновременно при интенсивном перемешивании и нагревании до температуры 55°С в течение 10 мин.
Во время осуществления процедуры лизиса в резервуаре 3 растворитель для промывочного буфера (смесь этанол-вода) из резервуара 6 поступает в резервуар 5, содержащий сухую реакционную смесь промывочного буфера, в состав которой входит хаотропный агент (клапан е открыт, клапан f закрыт). Растворение сухой реакционной смеси буфера для промывки происходит в резервуаре 5 при перемешивании и нагревании до температуры 55°С.
Перемешивание осуществляется блоком электромагнитных мешалок, а нагревание - блоком галогенных ламп нагревателя, входящих в состав управляющей установки-контроллера.
В качестве хаотропного агента, входящего в состав одного из буферов для лизиса и буфера для промывки, используют гуанидинтиоцианат или гуанидингидрохлорид, в качестве детергента - Тритон Х-100 или N-лаурилсаркозил.
В качестве лизирующего буфера, содержащего хаотропный агент, протеиназу К, детергент, используют, например, 10 мМ трис-НС1 буфер, содержащий 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты, 4,5 М гуанидингидрохлорида, 1 мг/мл протеиназы К, 0,5% Тритон Х-100, рН 8,0.
в) добавление этанола к полученному лизату биологического образца.
С целью создания оптимальных условий связывания нуклеиновых кислот с твердофазным сорбентом к лизату биологического образца, полученному после обработки вторым лизирующим буфером, в резервуар 3 добавляют этанол из резервуара 4 (клапан с открыт, остальные клапаны закрыты).
г) связывание нуклеиновых кислот на микроколонке, содержащей твердофазный сорбент.
Реакционная смесь из резервуара 3 после лизиса и добавления этанола, содержащая нуклеиновые кислоты и белки, поступает на микроколонку 8 с твердофазным сорбентом. Нуклеиновые кислоты сорбируются на сорбенте, а вещества, не связавшиеся с носителем проходят в резервуар для сбора отходов 11 (клапаны d, h, k и m открыты, клапаны l, g, f, i и j закрыты).
Твердофазный сорбент выбирают из группы сорбентов, включающей силикагели, стекловолоконные фильтры, химически модифицированное стекло.
д) отмывка нуклеиновых кислот от белков и кристаллов соли на микроколонке, содержащей твердофазный сорбент, с использованием промывочного буфера и этанола;
Для отмывки твердофазного сорбента от белков на микроколонку подается промывочный буфер из резервуара 5; промывочный раствор проходит в резервуар для сбора отходов 11 (клапаны f, h, k и m открыты, клапаны l, g, d, i и j закрыты).
Для отмывки твердофазного сорбента от кристаллов соли на микроколонку подается этанол из резервуара 7; промывочный раствор проходит в резервуар для сбора отходов 11 (клапаны g, h, k и m открыты, клапаны l, f, d, i и j закрыты).
е) элюция нуклеиновых кислот с микроколонки.
После промывки носителя нуклеиновые кислоты элюируют пропусканием через микроколонку раствора для элюции НК (вода) из резервуара 9 (клапаны i, h, j открыты, клапаны l, g, f, d, k и m закрыты). НК поступают в резервуар для сбора очищенной НК 10.
Выходной порт картриджа совместим со стандартной микропробиркой объемом 0,2 мл, которую можно использовать для проведения ПЦР.
Растворение сухих реакционных смесей обоих буферов для лизиса и буфера для промывки происходит при нагревании и перемешивании с помощью устройств, входящих в состав управляющей установки-контроллера. Все клапаны, регулирующие перемещение реакционных смесей и реагентов в каналах и резервуарах картриджа (клапаны а-m на Фиг.2) управляются установкой-контроллером.
Картридж состоит из нескольких конструктивных элементов: основная рабочая платформа, содержащая резервуары с реагентами, каналы, микроколонку и резервуар для сбора отходов реакций, верхняя и нижняя панели (крышки), эластичные прокладки (Фиг.3). Материал основной рабочей платформы и верхней и нижней панелей картриджа выбирают из группы полимеров, не сорбирующих нуклеиновые кислоты, включающей оргстекло, полипропилен, поликарбонат. Материал прокладок картриджа выбирают из группы эластичных материалов, не сорбирующих НК, включающей силикон, полиэтилен.
Например, в одном из воплощений основная рабочая платформа и верхняя и нижняя панели картриджа сделаны из оргстекла (Акрима 72), толщина 8 мм и 2 мм соответственно, эластичные прокладки - из силикона Силастик Т4, толщина 2 мм, и полиэтиленовой пленки универсальной, сорт Н, толщина 50 мкм.
Элементы картриджа скреплены между собой 4 фиксирующими винтами, расположенными по краям панелей. На верхней панели расположены 16 отверстий для поршней клапанов, отверстие для приемной камеры образца, 4 отверстия для фиксирующих винтов (см. Фиг 3). Линейные размеры картриджа (длина×ширина×высота) составляют 94×64×40 мм.
Управляющая установка-контроллер содержит блок соленоидов для управления клапанами картриджа, блок поршней, блок нагревателей, блок электромагнитных мешалок, компрессор и блок электронного управления (Фиг.4). Коммутация воздушных и жидкостных потоков в картридже осуществляется 16 клапанами с электрическим управлением. После помещения картриджа в блок управления и срабатывания запорного механизма картридж занимает положение, при котором штоки всех 16 соленоидов оказываются точно над соответствующими запорными головками клапанов картриджа.
Перемещение реакционных смесей и реагентов в резервуарах картриджа осуществляется подачей давления в соответствующие резервуары с помощью компрессора по системе каналов, причем перераспределение давления по резервуарам и потоки жидкостей по каналам организованы системой клапанов, выполненных с использованием эластичной прокладки картриджа. Компрессор представляет собой мембранный либо плунжерный насос, способный создавать избыточное давление воздуха до 2 атм.
Диаграмма устройства клапана приведена на Фиг.5. Клапан состоит из соленоида, поршня и запорной головки. Поршень обеспечивает необходимое давление на запорную головку клапана, удерживая клапан в закрытом положении. При подаче напряжения на обмотку соленоида поршень поднимается, освобождая запорную головку клапана, и клапан открывается. Клапан вмонтирован в основную рабочую платформу картриджа (Б), в которой проделаны два отверстия 0,8 мм в диаметре для входа и выхода (IN и OUT). Между основной рабочей платформой (Б) и верхней панелью (А) находятся эластичные прокладки П1 и П2, которые обеспечивают открытие и закрытие клапана и, соответственно, возможность перетекания жидкости из резервуаров картриджа.
Для формирования рабочих поверхностей клапанов используют, например, полиэтилен и тефлон.
4
Представленная полезная модель позволяет проводить выделение и очистку НК из биологического образца (кровь, плазма, слюна, культуральные жидкости), содержащего 10 или более клеток, бактерий и/или вирусных частиц. Результаты выделения НК из бактериальных клеток и вирусных частиц представлены на Фиг.6 и 7. Полезная модель позволяет проводить выделение НК клеток микроорганизмов и/или вирусов в автоматическом режиме с низкими потерями, низкой себестоимостью, малым временем, необходимым для получения результата. Способ не требует дорогостоящего оборудования и высококвалифицированного персонала. Полученный препарат НК может быть использован без дополнительной очистки непосредственно в амплификации (Фиг.7) или гибридизации НК с целью непосредственной идентификации инфекционного агента в исследуемом образце или для проведения дальнейшего молекулярно-генетического анализа.