Способ профилактики кровотечений, вызванных применением антиагрегантов, в эксперименте
METHOD OF PREVENTION OF BLEEDING CAUSED BY THE APPLICATION OF ANTIAGREGANTS, EXPERIMENT STAGE

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной хирургии, и может быть использовано с целью профилактики кровотечения на фоне применения антиагрегантов.
Применение комбинации ацетилсалициловой кислоты и клопидогреля у большого числа кардиологических больных позволяет обеспечить более высокую эффективность в предупреждении серьезных кардиоваскулярных событий. Особенно выражены эти преимущества у больных с острым коронарным синдромом, а также у пациентов, которым проводится чрескожное коронарное вмешательство, особенно после стентирования коронарных сосудов. Однако у пациентов низкого риска (например, при стабильном течении сердечно-сосудистого заболевания) такая комбинация не является оправданной в связи с тем, что потенциальные преимущества перекрываются риском геморрагических осложнений (М. Коваль. Двойная антитромбоцитарная терапия - от неотложной терапии до длительного поддерживающего лечения / М. Коваль // Medicine Review. - 2008. - №3 (03). - С. 46-50).
Риск тяжелой кровопотери у пациентов, принимающих двойную антитромбоцитарную терапию, резко увеличивается при травмах или неотложных хирургических вмешательствах, выполненных по жизненным показаниям. Это связано с тем, что после отмены дезагрегантное действие аспирина и клопидогреля сохраняется около 5 суток. Поэтому в настоящее время является актуальным создание эффективных способов профилактики кровотечений, вызванных применением антиагрегантов, позволяющих быстро, с минимальным количеством побочных реакций снижать объем кровопотери.
9
9
Известен способ профилактики и лечения кровотечений, вызванных применением антиагрегантов путем трансфузии тромбоцитарной массы (Rossaint R. The European guideline on management of major bleeding and coagulopathy following trauma: fourthedition. / Rossaint R. Bouillon B, Cerny V, Coats TJ, Duranteau J,  E, Filipescu D, Hunt BJ, Komadina R, Nardi G, Neugebauer EA, Ozier Y, Riddez L, Schultz A, Vincent JL, Spahn DR. // Crit Care. - 2016 Apr, p. 35-41), которая содержит ресуспендированный осадок тромбоцитов в небольшом объеме плазмы. Стандартную дозу получают из 450 мл цельной крови с содержанием тромбоцитов не менее чем 55×10клеток. Этого для одной трансфузии недостаточно. Для эффективной терапии требуется 50-70×10 клеток крови на каждые 10 кг массы тела пациента. Необходимое для переливания тромбомассы количество клеток получают от 6-10 донорских доз крови.
Однако применение тромбоцитарной массы связано с риском, т.к. возникает вероятность заражения как вирусными гепатитами, так и вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ). Кроме того, наблюдаются побочные эффекты, такие как: лихорадочные и анафилактические реакции, которые обусловлены сенсибилизацией белками плазмы, в которой находятся тромбоциты (Akwaa, F. Treatment of bleeding complications when using oral anticoagulants for prevention of strokes. / F. Akwaa, A.C. Spyropoulos // Curr Treat Options Cardiovasc - 2013. - Vol. 15, №3. - P. 288-298).
Известен способ лечения кровотечений, вызванных применением антиагрегантов, путем применения этамзилата натрия. Этамзилат натрия вводят внутривенно в дозе 125-250 мг кратностью 3-4 раза в сутки. Известный препарат ингибирует эффекты простациклина, в связи с чем усиливается агрегация тромбоцитов, стимулирует ферментные реакции тромбоцитов, их новообразование из мегакариоцитов и выход из депо, усиливает реакцию освобождения тромбоцитов. Кроме того, этамзилата натрия умеренно ускоряет образование тканевого фактора (Черний В.И. Принципы интенсивной терапии нарушений в системе гемостаза при критических состояниях / Черний В.И. // «Медицина неотложных состояний», Журнал. - 2009, №5 - стр. 24).
Однако использование этамзилата натрия сопряжено с риском развития побочных реакций, таких как: выраженное снижение артериального давления, анафилактический шок, приступы удушья, астения, тромбоэмболия (Этамзилат (Etamsylate): инструкция, применение и формула // Код CAS 2624-44-4 // Регистр лекарственных средств, РЛС // 2016 г.), а также повышение концентрации креатинина сыворотки крови (Wiewiorka О. Strong negative interference of ethamsylate (Dicynone) in serum creatinine quantification via enzymatic assay using Trinder reaction. / Wiewiorka O, Dastych M,  Z. // Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation. - 2013. - Vol. 73 - Issue 5).
Авторы предлагают эффективный способ профилактики кровотечений, вызванных применением антиагрегантов в эксперименте, позволяющий быстро с минимальным количеством побочных реакций, клинически значимо предотвращать кровопотерю путем применения фибрин-мономера, который является белком, получаемым из стерильной плазмы крови человека. Фибрин-мономер не является антидотом антиагрегантов и может быть использован в качестве системного гемостатического средства, не требует дополнительного использования тромбоцитарной массы. Фибрин-мономер обеспечивает быструю и стойкую остановку интраоперационного паренхиматозного кровотечения, что подтверждено в эксперименте на животных, а также «in vitro» при добавлении к человеческой плазме пациента, получающего антиагреганты, и приводит к быстрому формированию стойкого сгустка фибрина.
Фибрин-мономер является первым системным гемостатиком, который может использоваться с целью профилактики кровотечений, вызванных применением антиагрегантов, не являясь их антидотом и не действуя непосредственно на них.
Техническим результатом заявляемого изобретения является создание эффективного способа профилактики кровотечений, вызванных применением антиагрегантов перед хирургическими вмешательствами.
Технический результат достигается тем, что кроликам-самцам породы шиншилла за один час до хирургического вмешательства вводят раствор, содержащий фибрин-мономер в концентрации 11 мг/мл и мочевину в концентрации 150 мг/мл, при этом доза фибрин-мономера составляет 0,25 мг/кг.
Заявляемый способ проиллюстрирован фигурами 1 и 2 в виде таблиц.
На фиг. 1 представлен подбор эффективной и безопасной дозы фибрин-мономера.
На фиг. 2 проиллюстрированы показатели кровоточивости и системы гемостаза у животных контрольной и опытной групп.
На фигурах 1 и 2 данные представлены следующим образом:
1. , где  - выборочное среднее; m - стандартная ошибка выборочного среднего.
2. Объем кровопотери, % от ОЦК - часть потерянной крови от общего ее циркулирующего объема (ОЦК), выраженная в процентах.
3. Концентрация D-димеров в плазме крови, нг/мл - содержание продуктов деградации стабилизированного фибрина в плазме крови, являющихся маркерами образования фибрина и его растворения под действием плазмина.
4. АДФ-индуцированная агрегация тромбоцитов, % - агрегация тромбоцитов, при индукции АДФ.
5. p - уровень статистической значимости различий сравниваемых показателей.
6. n - количество животных в группе.
Способ осуществляют следующим образом.
В эксперименте используют кроликов-самцов породы шиншилла массой 2-4 кг. Для профилактики кровотечения используют производное фибриногена из плазмы крови человека - фибрин-мономер (ООО фирма «Технология-Стандарт»), представляющий собой лиофильно высушенный растворимый порошок белого цвета с мочевиной, расфасованный в пенициллиновом флаконе, закрытом резиновой пробкой и обжатом алюминиевым колпачком, в количестве 22 мг во флаконе, который готовят следующим образом: во флакон с лиофильно высушенным фибрин-мономером с мочевиной добавляли 2 мл стерильной дистиллированной воды для инъекций, перемешивают аккуратным покачиванием без образования пены до полного растворения вещества в течение от 2 до 3 минут. Полученный раствор содержал фибрин-мономер в концентрации 11 мг/мл и мочевину в концентрации 150 мг/мл.
В качестве контроля использовали раствор плацебо - раствор мочевины в концентрации 150 мг/мл, не содержащий активного вещества - фибрин-мономера. Во флакон с лиофильно высушенным раствором мочевины добавляют 2 мл стерильной дистиллированной воды для инъекций, перемешивают аккуратным покачиванием до полного растворения вещества в течение от 2 до 3 минут.
Наиболее эффективная дозировка фибрин-мономера была подобрана экспериментально. В эксперименте использовали 82 кролика-самца породы шиншилла. Все животные были поделены на 7 групп. Доза фибрин-мономера была подобрана из диапазона дозировок от 0,1 мг/кг до 5,0 мг/кг массы тела. Данные подтверждены фигурой 1.
Схема эксперимента
Первая группа состояла из 11 животных, которым внутривенно вводили плацебо в объеме 0,5 мл. Спустя один час после введения раствора плацебо проводили забор крови из краевой вены уха для оценки концентрации D-димеров в плазме крови. Описано, что увеличение концентрации D-димеров в плазме крови сопровождает венозный тромбоз и тромбоэмболию легочной артерии (Савельев B.C., Чазов Е.И., Гусев Е.И., Кириенко А.И. и др. Российские клинические рекомендации по диагностике, лечению и профилактике венозных тромбоэмболических осложнений // Флебология. - 2010. - Т. 4, №1. - выпуск 2. - С. 2-37). После этого животных наркотизировали и им выполняли срединную лапаротомию по белой линии живота под общим обезболиванием. В рану выводили левую долю печени и на ее диафрагмальной поверхности наносили стандартную по площади и глубине травму при помощи специального приспособления-ограничителя (металлической пластины с круглым отверстием в центре). Срезанный сегмент в вертикальной проекции имел вид круга или эллипса, его размеры и форма были постоянны (Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / под ред. Р.Ю. Хабриева. - 2 изд., перераб. и доп. - М.: ОАО - Издательство «Медицина», 2005. - 828 с.). Образовавшаяся кровоточащая рана с ровными краями и равномерной кривизной имела диаметр примерно 1,5 см, глубину примерно 0,5 см. После нанесения стандартной травмы замеряли объем кровопотери. Данный показатель определяли путем промакивания предварительно взвешенных сухих стерильных салфеток кровью из раны печени, до полной остановки кровотечения с формированием стабильного сгустка. Салфетки взвешивали на электронных весах сразу же после промакивания. Вес всех салфеток суммировали и учитывали объем потерянной крови. Объем кровопотери рассчитывали в процентах от общего ее циркулирующего объема.
Вторая группа состояла из 12 животных, которой внутривенно вводили фибрин-мономер в дозе 0,1 мг/кг.
Третья группа состояла из 15 животных, которым внутривенно вводили фибрин-мономер в дозе 0,25 мг/кг.
Четвертая группа состояла из 12 животных, которым внутривенно вводили фибрин-мономер в дозе 0,5 мг/кг.
Пятая группа состояла из 10 животных, которым внутривенно вводили фибрин-мономер в дозе 1,0 мг/кг.
Шестая группа состояла из 13 животных, которым вводили внутривенно вводили фибрин-мономер в дозе 2,5 мг/кг.
Седьмая группа состояла из 9 животных, которым внутривенно вводили фибрин-мономер в дозе 5,0 мг/кг.
Спустя один час после введения раствора фибрин-мономера у животных каждой из групп проводили забор крови из краевой вены уха для оценки концентрации D-димеров в плазме крови. После этого животных наркотизировали и им выполняли срединную лапаротомию по белой линии живота под общим обезболиванием с травмой печени и определением объема кровопотери по описанной выше схеме.
Как видно из фиг. 1, наиболее эффективными дозами фибрин-мономера для статистически значимого уменьшения кровопотери являются 0,25 мг/кг и 2,5 мг/кг (p<0,001 в обоих случаях). В то же время дозы фибрин-мономера выше 1,0 мг/кг обладают значительной тромбогенностью, которая оценивалась по нарастанию концентрации D-димеров в плазме крови, являющихся классическим маркером фибринообразования и фибринолиза. Таким образом, в качестве наиболее эффективной и безопасной для дальнейших экспериментов была выбрана доза фибрин-мономера 0,25 мг/кг.
Для исследования эффективности заявляемого способа все животные были разделены на две группы: первая группа - контрольная, состоящая из 9 животных, получала плавикс в сочетании с тромбо АСС и плацебо; вторая группа - опытная, состоящая из 9 животных, получала плавикс в сочетании с тромбо АСС и фибрин-мономером.
Схема эксперимента
1. За двое суток до эксперимента у животных контрольной группы из краевой вены уха забирали кровь (Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / под ред. Р.Ю. Хабриева - 2 изд., перераб. и доп. - М.: ОАО - Издательство «Медицина», 2005. - 828 с.) для исследования исходных показателей системы гемостаза. Специфичным тестом коагулограммы к действию антиагрегантов является индуцированная АДФ агрегация тромбоцитов (Баркаган З.С., Момот А.П. Диагностика и контролируемая терапия нарушений гемостаза. / М.: Изд-во: "Ньюдиамед-АО", 2001. - 296 с.). В день эксперимента животным контрольной группы энтерально вводили плавикс (Плавикс (Plavix) (Клопидогрел (Clopidogrel)), Sanofi-Winthrop Industrie (Франция)), регистрационный номер: П №015542/01) в дозе 8 мг на кг массы тела и тромбо АСС (тромбо АСС (Thrombo ASS) (Ацетилсалициловая кислота (Acetylsalicylic acid)), Lannacher Heilmittel GmbH (Австрия)), регистрационный номер: П №013722/01-2002) в дозе 2 мг на кг массы тела. Дозы плавикса и тромбо АСС являлись превышающими в полтора раза дозы для лечебного применения у человека при проведении аорто-коронарного шунтирования.
Через час после приема антиагрегантов внутривенно вводили плацебо в объеме 0,5 мл. Спустя один час после введения раствора плацебо проводился забор крови из краевой вены уха для оценки системы гемостаза животных. После забора крови животных наркотизировали и им выполняли срединную лапаротомию по белой линии живота под общим обезболиванием. В рану выводили левую долю печени и на ее диафрагмальной поверхности наносили стандартную по площади и глубине травму при помощи специального приспособления-ограничителя (металлической пластины с круглым отверстием в центре). Срезанный сегмент в вертикальной проекции имел вид круга или эллипса, его размеры и форма были постоянны (Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Под ред. Р.Ю. Хабриева, 2 изд., перераб. и доп.; М.; ОАО «Издательство «Медицина», 2005. - 828 с.). Образовавшаяся кровоточащая рана с ровными краями и равномерной кривизной имела диаметр примерно 1,5 см, глубину примерно 0,5 см.
После нанесения стандартной травмы замеряли объем кровопотери. Данный показатель определяли путем промакивания предварительно взвешенных сухих стерильных салфеток кровью из раны печени, до полной остановки кровотечения с формированием стабильного сгустка. Салфетки взвешивали на электронных весах сразу же после промакивания. Вес всех салфеток суммировали и учитывали объем потерянной крови. Объем кровопотери рассчитывали в процентах от общего ее циркулирующего объема.
2. За двое суток до эксперимента у животных контрольной группы из краевой вены уха забирали кровь (Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / под ред. Р.Ю. Хабриева. - 2 изд., перераб. и доп. - М.: ОАО - Издательство «Медицина», 2005. - 828 с.) для исследования исходных показателей системы гемостаза. Специфичным тестом коагулограммы к действию антиагрегантов является индуцированная АДФ агрегация тромбоцитов (Баркаган З.С., Момот А.П. Диагностика и контролируемая терапия нарушений гемостаза. / М., Изд-во: "Ньюдиамед-АО", 2001. - 296 с.). В день эксперимента животным контрольной группы энтерально вводили плавикс (Плавикс (Plavix) (Клопидогрел (Clopidogrel)), Sanofi-Winthrop Industrie (Франция)), регистрационный номер: П №015542/01) в дозе 8 мг на кг массы тела и тромбо АСС (тромбо АСС (Thrombo ASS) (Ацетилсалициловая кислота (Acetylsalicylic acid)), Lannacher Heilmittel GmbH (Австрия)), регистрационный номер: П №013722/01-2002) в дозе 2 мг на кг массы тела. Дозы плавикса и тромбо АСС являлись превышающими в полтора раза дозы для лечебного применения у человека при проведении аорто-коронарного шунтирования.
Через час после приема антиагрегантов внутривенно вводили фибрин-мономер в дозе 0,25 мг/кг. Спустя один час после введения раствора фибрин-мономера животных наркотизировали и им выполняли срединную лапаротомию по белой линии живота под общим обезболиванием. В рану выводили левую долю печени и на ее диафрагмальной поверхности наносили стандартную по площади и глубине травму при помощи специального приспособления-ограничителя (металлической пластины с круглым отверстием в центре). Срезанный сегмент в вертикальной проекции имел вид круга или эллипса, его размеры и форма были постоянны (Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Под ред. Р.Ю. Хабриева, 2 изд., перераб. и доп.; М.; ОАО «Издательство «Медицина», 2005, - 828 с.). Образовавшаяся кровоточащая рана с ровными краями и равномерной кривизной имела диаметр примерно 1,5 см, глубину примерно 0,5 см.
После нанесения стандартной травмы замеряли объем кровопотери. Данный показатель определяли путем промакивания предварительно взвешенных сухих стерильных салфеток кровью из раны печени, до полной остановки кровотечения с формированием стабильного сгустка. Салфетки взвешивали на электронных весах сразу же после промакивания. Вес всех салфеток суммировали и учитывали объем потерянной крови. Объем кровопотери рассчитывали в процентах от общего ее циркулирующего объема.
Эффективность заявляемого способа проиллюстрирована фиг. 2, в которой приведены сравнительные данные объем кровопотери, концентрации D-димеров и системы гемостаза, позволяющие продемонстрировать, что объем кровопотери (в % от объема циркулирующей крови) в опытной группе по сравнению с контрольной был ниже в 5,2 раза (p<0,001).
По представленным данным при сравнении показателей системы гемостаза в обеих группах животных был продемонстрирован эффект действия антиагрегантов в виде снижения АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов, что соответствовало описанным ранее изменениям в системе гемостаза плазмы крови человека (Момот А.П. Мониторинг использования дабигатрана в качестве средства профилактики тромбоэмболических осложнений после артропластики тазобедренного сустава / А.П. Момот, Е.В. Григорьев, Л.П. Цывкина // Клиническая лабораторная диагностика: Научно-практический журнал. - 2012. - №5. - С. 40-42. - ISSN 0869-2084).
Таким образом, заявляемый способ обладает высокой эффективностью, позволяет не только снижать объем кровопотери, но и не повышает вероятность возникновения тромбозов с минимальным количеством побочных реакций.