СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ СИСТЕМНЫМ ДЕЙСТВИЕМ, ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ, ФАРМКОМПОЗИЦИИ, СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ И ПРОФИЛАКТИКИ
AGENT OF SYSTEMIC ACTION, ITS APPLICATION, PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS, METHODS OF TREATMENT AND PREVENTION

Изобретение относится к микологии и медицине, в частности к полученным из штаммов грибов-продуцентов физиологически активным веществам, средствам на их основе и их применению.
Известен штамм гриба Fusarium sambucinum Fuckel var. ossicolum (Berk, et Curt.) Bulai (Всесоюзная коллекция промышленных микроорганизмов института ВНИИгенетика, коллекционный номер ВКПМ F-165), являющийся продуцентом белка пищевого или кормового назначения, продуктивность которого достаточно высока.
s
Штамм F. sambucinum Fuckel var. ossicolum (Berk et Curt) Bulai F-165 выделен в стадии активного роста в процессе непрерывного культивирования мицелия штамма F. sambucinum P-64 (Всесоюзная коллекция промышленных микроорганизмов института ВНИИгенетика, коллекционный номер ЦМПМ-Г-165).
Известен препарат «Милайф», полученный из штамма F. sambucinum var. ossicolum ВСБ-917 (ВКПМ F-169) и обладающий общеукрепляющим и адаптогенным действием, а также его применение при различных показаниях (см. патент RU 2040932).
При этом многократные попытки, предпринятые авторами по изучению активности препарата «Милайф» в отношении ряда возбудителей, в частности вирусов, представляющих собой огромную проблему для человечества, ввиду скорости их распространения и толерантности к известным методам лечения, не дали позитивных результатов.
Дальнейшие длительные исследования авторами штамма F. sambucinum F-165 привели к разработке средства нового состава и свойств, «HPM-7.0» (торговое наименование), обладающего широким спектром лечебно-профилактического действия, отличным от такового у средства "Милайф".
Сущность изобретения
В основу данного изобретения положено создание на основе штамма F. sambucinum F-165 средства, обладающего широким спектром системного физиологического действия, включающего, в частности, метаболическое, регенерирующее, иммуномодулирующее, противоопухолевое, противовирусное и антибактериальное свойства и не имеющего противопоказаний к применению.
6
9
Основу состава "HPM-7.0" составляет мицелий монокультуры гриба Fusarium sambucinum, штамм F-165, переработанный по уникальной отечественной технологии. Являясь препаратом растительного происхождения, состав "HPM-7.0" содержит разнообразный, уникальный и гармонизированный самой природой комплекс биологически активных веществ. С помощью уникальной технологии в составе "HPM-7.0" удалось собрать и сконцентрировать все самое ценное, содержащееся в биомассе мицелия. Так, например, препарат содержит 22 аминокислоты, в том числе незаменимые (триптофан, лизин, метионин). В его состав входят и ненасыщенные жирные кислоты, 50% из которых приходится на долю линоленовой кислоты. Состав характеризуется высоким для природных соединений содержанием коэнзимов Q, Q,
10
Q. Углеводы представлены гликанами и лентинаном, органическими кислотами, в том числе яблочной, лимонной, янтарной. Спектр витаминов включает все витамины группы B, фолиевую и никотиновую кислоты. Минеральный состав препаратов представлен 26 жизненно важными макро- и микроэлементами.
Широкое изучение применения препаратов "HPM-7.0" выявило множественные и разнородные лечебные свойства. С целью определения всего спектра лечебных возможностей препаратов "HPM-7.0" фирмой-производителем "ДИЖАФАРМ" был предпринят комплекс исследований в ведущих научных медицинских институтах России. Исследованиям был целенаправленно придан разноплановый характер. Открытые многочисленные эффекты оказались столь разнообразны, что не могли быть полностью и последовательно объяснены с позиций традиционных представлений медицинской биологии, физиологии и фармакологии.
В этой связи была сформулирована Концепция интегрирующих системных препаратов, к которым и была отнесен состав "HPM-7.0".
В соответствии с указанной Концепцией состав "HPM-7.0" оказывает на организм человека не специфичное узконаправленное, а интегрирующие и системное действие. Уникальный комплекс веществ запускает в действие всю защитную систему организма с целью восстановления его целостности. Роль препаратов "HPM-7.0" состоит в активации базовых информационных и энергетических процессов в направлении восстановления системности организма.
В соответствии с выдвинутой Концепцией важнейшая часть эффекта препарата состоит в восстановлении внутренних системных связей организма: в восстановлении их полномасштабности, интенсивности, в их взаимном уравновешивании и гармонизации, в возвращении всей суммы параметров организма к исходным. Поскольку восстанавливается вся системная иерархия организма, начиная с уровня синтеза наиболее простых химических соединений, образующих тело человека, т.е. с наноуровня, то всю группу разработанных медицинских лечебных технологий на основе состава "HPM-7.0", как и саму технологию производства этих препаратов, можно объединить одним названием "HPM-7.0-технологии" и отнести к группе нанотехнологий.
Установлено, что средство «HPM-7.0» обладает системным действием, по-видимому, за счет коррекции биопроцессов организма человека на наноуровне, что позволяет использовать его для профилактики и лечения состояний и заболеваний, связанных с накоплением в клетках экстрахромосомной ДНК, со снижением дефектных и увеличением точности репликации существующих ДНК-последовательностей.
Другой важной отличительной особенностью состава «HPM-7.О» является то, что средство может быть введено не только энтеральным, но и парентеральным, вагинальным, ректальным, наружным (например, в косметически-лечебных формах по уходу за кожей и полостью рта), оральным и прочим способом введения.
Примеры соответствующих лекарственных форм включают, не ограничиваясь ими ампулы для внутримышечного и внутривенного введения, ректальные и вагинальные суппозитории, гель и порошок для наружного применения, антисептические и косметические салфетки с пропиткой препаратом «HPM-7.0», таблетки, порошок, пастилки и прочее.
Любая из указанных лекарственных форм может быть получена по широко известным в области фармации методикам и в общем случае заключается в соединении путем смешения, растворения и прочего активного начала средства «HPM-7.0» с носителем, наполнителем или разбавителем и, необязательно, с другими целевыми добавками.
Выбор соответствующих носителей, наполнителей, разбавителей и целевых добавок для получения любой из указанных форм осуществляется специалистом на основании известных в области фармации принципов и правил.
Эффективное количество активного начала в лекарственной форме определяется в зависимости от пути введения, состояния или заболевания, которое следует лечить, степени его тяжести, веса и возраста пациента, и прочее. В общем случае дозы, эффективные для профилактики и лечения указанных состояний и заболеваний, могут варьировать в пределах от около 1 мкг до около 500 мг, соответственно, эффективное количество в единичной стандартной дозе лекарственного препарата может варьировать примерно в пределах от 1 мкг до 500 мг.
В частности, разовая доза при введении per os может, в частности, составлять от 10 мкг до 10 мг, суточная от 20 мкг до 200 мг в расчете на активное начало, средство «HPM-7.0».
При парентеральном введении разовая доза может, в частности, составлять от 1 мкг до 1 мг, суточная от 2 мкг до 6 мг; при вагинальном или ректальном введении разовая доза может, в частности, составлять от 5 мкг до 5 мг; суточная от 10 мкг до 30 мг.
Таким образом, изобретение касается средства «HPM-7.0», фармкомпозиций на его основе и его применения для коррекции биопроцессов организма человека на наноуровне, а также лечения и профилактики заболеваний, связанных с накоплением в клетках организма генетически избыточной (экстрахромосомной) ДНК и с увеличением дефектных и снижением точности репликации существующих ДНК-последовательностей.
Фиг.1: Спектр оптического поглощения в видимом диапазоне препарата «HPM-7», разведение 1:2.
Фиг.2: Спектр оптического поглощения в УФ-диапазоне препарата «HPM-7», разведение 1:100.
Фиг.3: Спектр оптического поглощения в УФ-диапазоне препарата «HPM-7».
Фиг.4: График кинетики деления популяции клеток MEF в присутствии «HPM-7».
По оси абсцисс - пассажи, по оси ординат - общее число клеток в популяции.
Ext M1 - концентрация «HPM-7» - 0.03%;
Ext М3 - концентрация «HPM-7» - 0.1%;
К - контроль (без «HPM-7»).
Фиг.5: Электрофореграмма препарата «HPM-7» в 10% ПААГ (29:1). Окрашивание этидия бромидом. Стрелками указаны дорожки, в которые были нанесены пробы.
Выявлена дополнительная высокомолекулярная фракция на старте, вероятно, за счет меньшей степени деградации ДНК.
2
ДНК - дважды депротеинизированная фракция препарата - «HPM-7»;
ДНК - депротеинизированная фракция препарата - «HPM-7»;
ДНК-0 - препарат - «HPM-7».
Фиг.6: Исследование влияния средства «HPM-7.0» на ПЦР.
Дорожки 1-6 - добавление в реакционную смесь ПЦР (1-й этап) депротеинизированной фракции «HPM-7.0» без добавления ДНК клеточной линии SW480.
Дорожки 7-12 - добавление в реакционную смесь ПЦР (1-й этап) депротеинизированной фракции «HPM-7.0» с добавлением ДНК клеточной линии SW480.
Дорожки 13-18 - добавление в реакционную смесь ПЦР (1-й этап) «HPM-7.0» в разведениях 1:100, 1:500, 1:1000 с добавлением ДНК клеточной линии SW480.
Дорожки 19-20 - контроль проведения ПЦР. Добавление в реакционную смесь ПЦР (1-й этап) ДНК клеточной линии SW480 без добавления средств «HPM-7.0».
I. ДНК, выделенная из «HPM-7».
II. ДНК, выделенная из «HPM-7» с добавлением ДНК клеточной линии SW480.
III. «HPM-7» с добавлением ДНК клеточной линии SW480.
Фиг.7-11: маммограммы динамики объемного образования правой молочной железы больной под шифром Я.И.Л., с ноября 2006 г. по июнь 2007 г.
Способ получения средства «HPM-7.0»
Процесс получения включает выращивание на стерилизованной среде мицелия гриба штамма F. sambucinum F-165 в ферментационных аппаратах, сгущение, выделение, очистку, концентрирование и сушку полученного средства.
В качестве источника углерода, азота, калия и фосфора для роста мицелия используют соответственно мелассу, сахар-сырец, сахарозу, глюкозу, барду, молочную сыворотку, соки корнеплодов и зеленой массы, азотнокислый аммоний и кислый фосфорнокислый калий и прочее.
Культивирование мицелия осуществляют в рабочем аппарате в течение примерно 23-27 часов, при непрерывной подаче воздуха и t° около 23-25°С. Материал считается готовым, когда концентрация сухих веществ мицелия в культуральной среде достигает примерно 40 г/л. Далее осуществляют сгущение культуральной среды, очистку, концентрирование и обезвоживание продукта в течение примерно 30 мин в режиме, щадящем в отношении сохранения биологической активности (t° до около +50°С). Полученный таким образом коричневый порошок, средство «HPM-7.0», анализируют. Установлено, что полученное средство «HPM-7.0» представляет собой низкомолекулярное пептидное соединение с диаметром от 1 до 50 нм.
Способ включает следующие стадии:
Сырая биомасса мицелия гриба Fusarium sambucinum Fuckel var. ossicola Bilai F-165, полученная после фильтрации на нутч-фильтре культуральной жидкости, подвергается промывке дистиллированной водой.
Хорошо отжатая биомасса замораживается в морозильной камере и через сутки размораживается при комнатной температуре, затем повторно замораживается. Таким образом, осуществляются трехкратная заморозка и размораживание.
После последней разморозки биомасса заливается дистиллированной водой в соотношении 1:1 и трижды гомогенизируется по 3 раза с интервалом в 20 сек.
Полученный гомогенат заливается в соотношении 1:3 спиртом (изопропиловым, изобутиловым, этиловым) и помещается на качалку на 12-16 часов для экстракции.
После экстракции однородную массу центрифугируют при 8000-12000 об/мин на центрифуге. Полученный супернатант собирают в отдельную емкость. Биомассу выбрасывают. Супернатант подвергают выпариванию на вакуумном-роторном испарителе при температуре, не превышающей 45°С. В концентрированную суспензию после выпаривания добавляют лактозу (1-2%) и лиофилизируют на сублимационной сушилке.
Результаты анализа состава «HPM-7.0» приведены в таблице А.
Таблица А
Химический состав и описание «HPM-7.0»
Показатель содержания
Ед. измерения
Объект анализа «HPM-7.0»
Общий белок
%
от около 55,8 до около 56,2
Сумма полисахаридов
%
от около 9,6 до около 14,6
Сумма липидов
%
от около 4,22 до около 7,59
Минеральные элементы
Натрий
%
от около 9,28 до около 9,78
Калий
%
от около 1,86 до около 1,87
Кальций
от около 1,53 до около 1,57
Магний
от около 2,28 до около 2,30
Железо
%
от около 2,9 до около 3
Цинк
%
от около 7,19 до около 7,36
Медь
от около 1,21 до около 1,3
Марганец
от около 0,21 до около 0,28
Кобальт
%
от около 0,14 до около 0,15
Никель
от около 0,21 до около 0,26
Хром
от около 0,12 до около 0,14
Молибдена
<sup>%</sup>
Следы
Витамины
Витамин B<sub>1</sub>
%
от около 0,033 до около 0,036
Витамин B<sub>2</sub>
%
от около 0,068-0,074
Витамин B<sub>3</sub> (Пантотеновая кислота)
%
от около 0,176 до около 0,189
Холин
%
Не обнаружен
Витамин PP (Ниацин)
%
от около 0,450 до около 0,466
Витамин B<sub>6</sub> (Пиридо около околоксин)
%
от около 0,052 до около 0,059
Витамин B<sub>c</sub> (Фолиевая кислота)
%
от около 0,023 до около 0,029
Витамин B<sub>12</sub>
%
от около 0,005 до около 0,0055
Витамин H (Биотин)
%
от около 0,0015 до около 0,0019
Определение содержания ДНК
Методы исследования
Расчет содержания ДНК выполнен при помощи спектрофлуориметрии на приборе DyNA Quant 200, Hoefer Pharmacia Biotech с использованием красителя Hoehst (Bisbenzimide H 33258). В качестве стандарта сравнения использовали раствор ДНК с известной концентрацией.
Результаты представлены на Фиг.1-3 и в Таблице В.
Таблица В
Разведение (~1:100)
Разведение (~1:400)
OD (<sub>230-длина волны)</sub>
1,810
0,551
OD (<sub>260-длина волны)</sub>
2,000
0, 613
OD (<sub>280-длина волны)</sub>
0,953
0,288
Спектры оптического поглощения в регистрирующем спектрофотометре снимали как в ультрафиолетовом, так и видимом диапазоне (см. Фиг.1-3). Показано, что соотношение оптического поглощения при длинах волн 260 нм и 280 нм составило 2,0, что свидетельствует о малом количестве белков или полипептидов в водорастворимой части средства «HPM-7.0». Такое соотношение характерно для нуклеиновых кислот или их фрагментов.
При малом разведении «HPM-7.0» (1:2) обнаружен пик оптического поглощения в районе 410 нм, что может быть отнесено к продуктам окисления хинонов, например убихинонов, которые содержатся в больших количествах в изучаемом виде гриба.
Соотношение оптического поглощения при длинах волн 260 нм/280 нм составило для «HPM-7.0» более 2,0, однако соотношение оптического поглощения при длинах волн 260 нм/230 нм составило всего около 1,1, что свидетельствует о наличии полисахаридов в составе средства (Фиг.2 и 3).
Электрофоретический анализ компонентов средства «HPM-7.0»
Измерения концентрации ДНК проводили на флуориметре DyNA Quant 200, Hoefer Pharmacia Biotech с использованием красителя Hoehst (Bisbenzimide H 33258). В качестве стандарта сравнения использовали раствор ДНК с известной концентрацией из клеточной линии Raji.
Результаты представлены на Фиг.5, из которых следует, что основу средства «HPM-7.0» составляют продукты деградации ДНК-фрагменты ДНК различной массы, имеющие размеры от тысяч до десятков пар нуклеотидов.
Полученное средство «HPM-7.0» представляет собой концентрат низкомолекулярных пептидных соединений и дефрагментированных ДНК гриба Fusarium sambucinum Fuckel var. Ossicola с диаметром не более чем от 1 до 50 нм.
Полученное таким образом средство «HPM-7.0» исследовали и испытывали на наличие биологической активности, данные о которой представлены ниже, и далее использовали для получения разнообразных лекарственных форм «HPM-7.0», включая такие формы как порошок и таблетки, гели, мази, спреи, ампулы, суппозитории и пр.
«HPM-7.0» - системное средство
Результаты проведенных исследований «HPM-7.0» (в частности, проведенных в НИИ детской гематологии МСРиЗ РФ Лаборатория молекулярной генетики, под руководством доктора медицинских наук, профессора Белохвостова А.С.) согласуются с концепцией системных средств принципиально нового вида. Одной из основ нового концептуального подхода является положение о нормализации системным средством функциональных многоуровневых связей различных систем и органов человеческого организма.
Системный препарат - препарат, восстанавливающий нарушение причинно-следственных связей в организме, возникающее под воздействием различных, в частности инфекционных, факторов (энтоэкологичная среда, радиация и т.п.), проявляющееся на фоне генетических предрасположенностей, приводящее к дисбалансу иммунно-гуморальной системы и дисрегуляции центральной нервной системы и сопровождающееся развитием стойких хронических заболеваний и преждевременным старением.
Установлено, что «HPM-7.0» обладает системным действием, по-видимому, за счет коррекции биопроцессов в организме человека на наноуровне, в частности, путем подавления дефектных и увеличения точности репликации существующих ДНК-последовательностей. Это позволяет использовать его для профилактики и лечения состояний и заболеваний, связанных с накоплением в клетках экстрахромосомной ДНК, с увеличением дефектных и снижением точности репликации существующих ДНК-последовательностей (Отчет ФГУ научно-клинического центра детской гематологии, онкологии и иммунологии Росздрава «Изучение состава и биологических свойств средства «HPM-7.0» и его компонентов», 12.04.2005 г.).
Саморегуляция и самовосстановление организма
Разнообразие биологически активных соединений, обнаруженных в составе «HPM-7.0», и их содержание, по-видимому, определяет мультивалентность влияния средства на нейро-эндокринно-иммунные процессы. «HPM-7.0» восстанавливает ранее нарушенные процессы нейрогуморальной регуляции и компенсирует затраты энергетических ресурсов клетки. Сбалансированный комплекс аминокислот, витаминов и макроэлементов, содержащийся в средстве, способствует нормализации нарушенного гомеостаза и восстановлению компенсаторных механизмов организма.
Токсичность
Токсикологические исследования проводились в лаборатории лекарственной токсикологии института экспериментальной кардиологии РКПНК МЗ РФ, под руководством д.м.н., профессора Арзамасцева Е.В.
Заключение
Токсикологические исследования средства «HPM-7.0» показали, что исследуемый состав является нетоксичным и хорошо переносится при ежедневном длительном назначении кроликам готовых лекарственных форм «HPM-7.0».
В частности, результаты проведенных исследований показали, что 3-месячное сублингвальное применение средства «HPM-7.0» в высоких дозах (50 мг/кг таблетки для сублингвального применения и 30 мг/кг суппозитории для интравагинального или ректального применения) хорошо переносились животными и не влияли на гематологические показатели и функциональное состояние основных органов и систем организма подопытных животных (по показателям использованных гематологических и биохимических тестов). Длительное сублингвальное, интравагинальное и ректальное назначение изучаемых лекарственных форм не оказывало также и местного раздражающего действия. Макро- и микроскопические исследования внутренних органов животных, получавших сублингвально, интравагинально и ректально готовые лекарственные формы в испытанных дозах 50 и 30 мг/кг, не выявили каких-либо патологических изменений, связанных с токсическим действием средства «HPM-7.0».
Рекомендовано клиническое испытание указанных готовых лекарственных форм «HPM-7.0».
I. Определение эффекта «HPM-7.0» на процессы клеточного старения и кинетику пролиферации
Установлено также, что средство «HPM-7.0» увеличивает пролиферативную активность (активность деления) в клетках, контролирует клеточный цикл и запускает ускоренную систему апоптоза в дефектных клетках, что ведет к замедлению накопления мутаций.
Методы исследования
Для определения эффекта «HPM-7.0» на процессы клеточного старения и кинетику пролиферации было использовано долговременное культивирование генетически подверженных старению фибробластов MEF (эмбрионы инбредных мышей линии SAMP1).
Результаты представлены на Фиг.4.
Из Фиг.4 видно, что на стадии экспоненциальной пролиферации «HPM-7.0» в концентрации 0,03% приводит к значительному ускорению пролиферации клеток MEF, т.е. оказывает протективное действие против преждевременного старения этих клеток.
II. Исследование влияния средства «HPM-7.0» на ПЦР
Описание эксперимента
Для исследования влияния средства «HPM-7.0» на полимеразную цепную реакцию использовали двухэтапную схему анализа гена k-ras.
Первый этап в данной схеме - ПЦР гена k-ras с использованием праймеров, вносящих в ампликоны сайты рестрикции для рестриктазы BstN I на 5ґ- и 3ґ-концах ампликонов, а второй - обработка продуктов первого этапа указанной рестриктазой.
При наличии в исходной последовательности (матрице) мутаций в 12-м кодоне (1-й экзон) гена, рестриктаза расщепляет ампликон только по 3ґ-концу, образуя детектируемый фрагмент длиной 143 нуклеотида. В случае последовательности «дикого типа» рестриктаза расщепляет ампликон по 5ґ- и 3ґ-концам, образуя детектируемый фрагмент длиной 114 нуклеотидов.
В опыте использовали ДНК клеточной линии SW480 (рак толстой кишки человека), имеющей гомозиготную мутацию в 12-м кодоне гена k-ras.
Объем реакционной смеси - 25 мкл, испытуемую пробу добавляли в объеме 3 мкл.
На Фиг.6:
Дорожки 1-6 - добавление в реакционную смесь ПЦР (1-й этап) депротеинизированной фракции «HPM-7.0» без добавления ДНК клеточной линии SW480.
Дорожки 7-12 - добавление в реакционную смесь ПЦР (1-й этап) депротеинизированной фракции «HPM-7.0» с добавлением ДНК клеточной линии SW480.
Дорожки 13-18 - добавление в реакционную смесь ПЦР (1-й этап) «HPM-7.0» в разведениях 1:100, 1:500, 1:1000 с добавлением ДНК клеточной линии SW480.
Дорожки 19-20 - контроль проведения ПЦР. Добавление в реакционную смесь ПЦР (1-й этап) ДНК клеточной линии SW480 без добавления средств «HPM-7.0».
В результате эксперимента показано, что при добавлении «HPM-7.0» в разведениях от 1:100 до 1:1000 в реакционную смесь ПЦР увеличивалась амплификация фрагмента гена k-ras, по сравнению с контролем (без добавления «HPM-7.0»). При добавлении в реакционную смесь ПЦР депротеинизированной фракции «HPM-7.0» также наблюдали увеличение амплификации фрагмента гена k-ras по сравнению с контролем. Однако кроме специфического продукта наблюдали дополнительные (неспецифические) фракции. При добавлении депротеинизированной фракции «HPM-7.0» в разведении 1:10 количество неспецифических фракций было максимальным, тогда как при больших разведениях количество неспецифических фрагментов уменьшалось вплоть до их исчезновения при разведении 1:500.
Выводы
«HPM-7.0» корригирует биопроцессы в организме на наноуровне. Данные по усилению выхода ДНК из клеток под воздействием «HPM-7.0» позволяют предположительно связать с этим эффектом лечебное действие средства, что открывает новые области применения средств на основе «HPM-7.0».
В частности, это позволяет применять средство «HPM-7.0» для профилактики онкопроцесса и для подавления прогрессии злокачественных клеток при онкозаболеваниях, а также при преждевременном старении и пр.
III. Противовирусная и антибактериальная активность средства «HPM-7.0»
Исследованиями, проведенными в институте ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского, НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н.Габричевского и НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи, доказано непрямое и прямое противовирусное, а также антибактериальное действие средства (применялись стандартные методики исследования, используемые при проведении исследований in vitro и in vivo, принятых в указанных специализированных НИИ) при инфекциях: ВИЧ, вирусном гепатите С, вирусе бешенства, желтой лихорадке, вирусе восточного энцефаломиелита лошадей (данный вирус по своим вирусоспецифическим свойствам сходен с вирусом, вызывающим клещевой энцефалит), герпетической (в том числе генитальной форме), цитомегаловирусной, папилломовирусной, гриппозной (в т.ч. вирус H5N1) инфекциях.
В частности, обнаружено, что противовирусное действие полученного средства «HPM-7.0» проявляется при ВИЧ (отчет ГУ НИИ вирусологии им. Д.Н.Ивановского «Исследование активности средства «HPM-7.0» в отношении вируса иммунодефицита», 12.01.2007 г.), вирусе бешенства (отчет ГУ НИИ вирусологии им. Д.Н.Ивановского «Об исследовании противовирусной активности средства «HPM-7.0» у мышей массой 12-14 г, зараженных внутримышечно уличным вирусом бешенства штамма «Як», 22.06.06 г.), желтой лихорадке (отчет ГУ НИИ вирусологии им. Д.Н. Ивановского «Изучение противовирусной активности средства «НРМ-7.0» при экспериментальной инфекции, вызванной вирусом желтой лихорадки на мышах (штамм 17-D)», 22.06.06), а также вирусном гепатите С (отчет ГУ НИИ вирусологии им. Д.Н. Ивановского «Действие средства «HPM-7.0» на инфекционные свойства цитопатогенного варианта вируса гепатита С», 20.08.06 г.), герпетической инфекции, в том числе в генитальной форме (отчет ГУ НИИ вирусологии им. Д.Н.Ивановского «Исследование противовирусной эффективности средства «HPM-7.0» на модели экспериментальной герпесвирусной инфекции гениталий у самцов морских свинок», 17.06.2006 г.), гриппозной инфекции, включая вирус H5N1 (отчет ГУ НИИ вирусологии им. Д.Н.Ивановского «Действие средства «HPM-7.0» на инфекционные свойства высокопатогенного штамма гриппа А птиц (H5N1), 17.06.2006 г.), и других вирусных инфекций.
Результаты проведенных исследований позволили придти к следующим выводам:
1. Средство «HPM-7.0» дает возможность «охранным» системам организма обнаружить инфекционный агент в любой форме (активной или латентной), где бы тот не находился (вне- или внутриклеточно), добиваясь тем самым активации всей сложной цепочки реакций, направленных на ликвидацию инфекционного процесса в организме и выработку иммунитета к данному возбудителю.
2. Средство «HPM-7.0» непосредственно воздействует на возбудителя, либо разрушая его нуклеопротеид, либо снижая его патологическую активность (уничтожая пепломеры гемагглютинина и нейроаминидазы).
IV. Активность средства «HPM-7.0» по отношению к вирусу иммунодефицита человека
Актуальнейшей проблемой современной медицины является борьба с ВИЧ-инфекцией.
Несмотря на создание за короткий срок десятков новых средств, активных в отношении ВИЧ, сложная природа вируса позволяет ему различными способами адаптироваться к действию лекарств. Появляются резистентные штаммы вирусов, что требует увеличения доз средств, а также применения их комбинаций. Учитывая то, что большинство применяемых медикаментозных средств в разной степени токсичны для человека и часто вызывают побочные эффекты, актуальным остается поиск новых средств, менее токсичных и желательно активных в отношении разных вирусов одновременно.
Немаловажным моментом является цена и, соответственно, доступность средств для широких слоев населения.
К особенностям СПИДа относится то, что это, по-видимому, первый в истории медицины приобретенный иммунодефицит, связанный с конкретным возбудителем и характеризующийся эпидемическим распространением. Вторая его особенность - почти "прицельное" поражение Т-хелперов. Третья особенность - это первое эпидемическое заболевание человека, вызванное ретровирусами. В-четвертых, СПИД по клиническим и лабораторным особенностям не похож ни на какие другие приобретенные иммунодефициты.
Клетки, ткани и органы, которые поражает вирус иммунодефицита человека
Проникая в кровяное русло, вирус иммунодефицита человека инфицирует активированные CD4+ Т-лимфоциты, а также моноциты, макрофаги и родственные им клетки, экспрессирующие CD4-подобные молекулы. Инфицирование также возможно при фагоцитозе иммунных комплексов ВИЧ+Ат (антитело). Основной резервуар вируса иммунодефицита человека - это лимфоидная ткань. В центральной нервной системе поражаются клетки микроглии. Поражаются также клетки эпителия кишечника (в данном случае рецепторами для проникновения вируса иммунодефицита человека служат мембранные гликолипиды).
Средство «HPM-7.0» позволяет индуцировать клеточный и гуморальный иммунитет за счет увеличения цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ), которые узнают презентированные антигены за счет восстановления функции белков основного комплекса гистосовместимости (MNS - major histocompatibility complex) и лизируют инфицированные клетки, даже если вирус находится в латентной форме. «HPM-7.0» способствует элиминации образования вируса за счет устранения клеток, продуцирующих вирус.
Средство «HPM-7.0» не позволяет вирусу приобретать свойства резистентности и эволюционировать.
Подтверждением сказанному являются две научно-исследовательские работы, проведенные в лаборатории вирусов иммунодефицита испытательного Центра по экспертной оценке противовирусных и дезинфекционных средств ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН, под руководством доктора медицинских наук, профессора Носик Д.Н., результаты которых приведены далее.
1. Исследование активности средства «HPM-7.0» в отношении вируса иммунодефицита человека.
Материалы и методы
КЛЕТКИ. Использовали перевиваемые лимфобластоидные клетки человека МТ-4 из коллекции культур клеток человека ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН. Клетки культивировали в среде RPMI 1640 (производства ГУ НИИ полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН) с 10% сыворотки эмбрионов коров (производства ГУ НИИ полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН), 100 мкг/мл гентамицина (Фармахим, Болгария).
ВИРУСЫ. В качестве источника вируса использовали штамм ВИЧ-1 BRU из коллекции штаммов вирусов иммунодефицита человека ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН.
СРЕДСТВА. Исследовали средство «HPM-7.0» в виде порошка, предоставленного фирмой «Дижа-фарм».
В качестве антиретровирусного референс-средства использовали средство Ретровир (азидотимидин) производства ГлаксоСмитКляйн (Бельгия).
2
Структура исследования: К клеткам добавляли (по различным схемам) исследуемое средство и инфицировали вирусом в дозе 0,05 ТЦИДSoI клетка. Инкубировали культуры клеток при 37°С в атмосфере с 5% CO и 98% влажности 5-6 дней. Учет результатов проводили окрашиванием клеток с помощью окраски тетразолиевым красителем (метод МТТ) (Сигма, США), спектрофотометрией и методом иммуноферментного анализа с использованием коммерческих иммуноферментных наборов фирмы Биорад Органон Техника (Нидерланды).
Результаты исследования приведены далее в Таблицах 1-4. Полученные данные позволяют сделать вывод, что при лечебно-профилактической схеме применение средства «HPM-7.0» снижает уровень антигена вируса иммунодефицита человека в культуральной жидкости зараженных клеток человека, а также повышает их жизнеспособность.
Исследование цитотоксического действия средства
Таблица 1
Исследование цитотоксичности средства на модели лимфобластоидных клеток человека
Концентрация HPM-7.0, мкг/мл
Количество жизнеспособных клеток по сравнению с контролем клеток, %
0,5
60,6
1,0
52,3
5,0
44,7
10,0
40,5
15,0
15,6
25,0
4,3
50,0
0
Полученные данные (Таблица 1) показали что при концентрации 0,5-1,0 мкг/мл средства обнаружено 60,6-52,3% жизнеспособных клеток по сравнению с контролем интактных клеток, что свидетельствует о цитопротективной способности препарата «HPM-7.0» в дозе 0,5-1,0 мкг/мл.
Исследование противовирусного действия средства
Таблица 2
Исследование противовирусной активности средства «HPM-7.0» на модели клеток человека, инфицированных ВИЧ-1
Условия опыта
Жизнеспособные клетки, %<sup>*</sup>
Без вируса (токсичность)
Внесение «НРМ-7.0» в клетки
2 ч до вируса
Одновременно
2 ч после вируса
Средство (фильтр 0,45µ) 1,0 мкг/мл
51,9
49,4
41,7
18,8
Средство (фильтр 0,22µ) 1,0 мкг/мл
58,9
42,2
37,0
24,7
Средство (фильтр 0,45µ) 5,0 мкг/мл
19,5
22,7
22,5
0
Средство (фильтр 0,22µ) 5,0 мкг/мл
0
0
0
0
<sup>*</sup>Процент жизнеспособных клеток по сравнению с контролем интактных клеток.
Дальнейшие исследования с фильтрацией препарата через мембранные фильтры с диаметром пор 0,45 и 0,22 микрон (Миллипор, США) показали наибольшую активность препарата при профилактическом применении в дозе 1,0 мкг/мл за 2 ч до инфицирования: 42,2-49,4% жизнеспособных клеток. Данные результаты свидетельствуют о профилактическом эффекте препарата в отношении вируса иммунодефицита.
Таблица 3
Исследование противовирусной активности средства «НРМ-7.0» на модели клеток человека, инфицированных ВИЧ-1 - определение уровня антигена вируса методом иммуноферментного анализа
Условия опыта
Снижение антигена вируса, %
Внесение «НРМ-7.0» в клетки
2 ч до вируса
Одновременно
2 ч после вируса
Средство (фильтр 0,45 µ) 1,0 мкг/мл
64,9
58,6
30,6
Средство (фильтр 0,22 µ) 1,0 мкг/мл
65,5
53, 6
19,4
Средство (фильтр 0,45 µ) 2,5 мкг/мл
71,8
61,9
44,8
Средство (фильтр 0,22 µ) 2,5 мкг/мл
78,2
68,6
39,7
Снижение уровня антигена вируса в культуральной жидкости зараженных клеток на 64,9-65,5% свидетельствует о лечебном эффекте препарата.
Таблица 4
Исследование противовирусной активности средства «HPM-7.0» (внесение средства в клетки за 48 ч до инфицирования) на модели клеток человека, инфицированных ВИЧ-1
Условия опыта/концентрация, мкг/мл
Без вируса (токсичность)
Внесение в клетки вируса
Жизнеспособность клеток, %
Количество клеток × 10<sup>3</sup>/мл
Жизнеспособность клеток, %
Количество клеток × 10<sup>3</sup>/мл
Защита клеток, %
Контроль клеток
88,6
1000
-
-
-
Контроль вируса
-
-
41,2
340
-
Средство 1,0
72,3
800
67,7
750
62,1
Средство 2,5
60,4
620
54,6
590
42,4
Средство 5, 0
26,6
330
22,8
390
0
Средство 7,5
18,2
260
14,9
100
0
Введение препарата за 48 ч до инфицирования клеток обеспечивало защиту клеток при концентрации препарата 1,0 мкг/мл - 62,1%. Данные результаты свидетельствуют о профилактическом эффекте препарата в отношении вируса иммунодефицита.
2. Лечебное действие средства «HPM-7.0»
Исследование образцов материала, полученных от ВИЧ-инфицированных лиц
ВИЧ-инфицированные пациенты принимали средство «НРМ-7.0» после еды, сублигвально в течение периода времени от одного до нескольких месяцев в прогрессирующих дозах, варьирующих от 10 мкг × 2 раза в день до 20 мг × 6 раз в день. Прием средства «HPM-7.0» продолжали до лабораторного подтверждения полной элиминации ВИЧ и затем еще 2 месяца профилактического приема с ежемесячным лабораторным контролем.
Прием средства «HPM-7.0» сопровождали физическими нагрузками (велотренажер, беговая дорожка, бассейн и т.п.) и курсами средства, направленного на восстановление биоценоза кишечника (например, флорин форте).
Результаты исследований
А) Исследование образцов крови больной (шифр Я.И.Л.) методом полимеразной цепной реакции и иммунофлюоресценции.
Таблица 5
Образец
ПЦР<sup>*</sup>, количество РНК копий/мл
Т4- лимфоциты/мм<sup>3</sup>
T8-лимфоциты/мм<sup>3</sup>
T-индекс
ИФ<sup>**</sup>, %
№0 (05.10.06) - до приема средства
586000
215
512
0,6
н.и.
№1 (05.12.06)
183000
508
424
1,2
н.и.
№2 (20.12.06)
27000
282
353
0,8
н.и.
№3 (17.01.07)
18000
297
297
1,0
н.и.
№4 (06.02.07)
17000
348
312
1,1
12
№5 (26.02.07)
18000
452
339
1,3
14
№6 (12.03.07)
15000
521
520
1,0
12
№7 (26.03.07)
23000
578
448
1,3
7
№8 (09.04.07)
9000
489
406
1,2
5
<sup>*</sup> ПЦР - полимеразная цепная реакция (определение РНК ВИЧ);
<sup>**</sup> ИФ - реакция непрямой иммунофлюоресценции, % клеток, экспрессирующих антиген ВИЧ; н.и. - не исследовали.
Таблица 6
Исследование образцов крови больной (шифр И.Т.Б.) методом полимеразной цепной реакции и иммунофлюоресценции
Образец
ПЦР<sup>*</sup>, количество РНК копий/мл
Т4-лимфоциты/мм<sup>3</sup>
T8-лимфоциты/мм<sup>3</sup>
Т-индекс
ИФ<sup>**</sup>, %
№0 (05.10.06) - до приема средства
375000
361
458
0,55
н.и.
№1 (05.12.06)
25 000
452
382
1,2
н.и.
№2 (20.12.06)
22 000
424
472
0,9
н.и.
№3 (17.01.07)
10 000
409
424
1.0
54
№4 (06.02.07)
4 400
480
405
1,2
28
№5 (26.02.07)
16 000
593
635
0,9
23
№6 (12.03.07)
10 000
607
537
1,1
16
№7 (26.03.07)
9 000
579
409
1,4
10
№8 (09.04.07)
3000
524
415
1,5
6
<sup>*</sup> ПЦР - полимеразная цепная реакция (определение РНК ВИЧ);
<sup>**</sup> ИФ - реакция непрямой иммунофлюоресценции, % клеток, экспрессирующих антиген ВИЧ; н.и. - не исследовали.
Вышеприведенные данные позволяют сделать вывод, что применение средства «HPM-7.0» приводит к снижению уровня вирусной нагрузки (ПЦР, РНК вируса) с 375000 копий/мл до 9000 копий/мл у пациента с шифром И.Т.Б и с 586000 копий/мл до 3000 копий/мл у пациента с шифром Я.И.Л, что подтверждает высокую противовирусную активность действия «HPM-7.0». Помимо этого приведенные результаты подтверждают тот факт, что противовирусное действие препарата «HPM-7.0» затрагивает не только вирус ВИЧ, поразивший лимфоидные клетки, но и вирус ВИЧ, разместившийся в клетках-«резервуарах» других органов и систем организма (печень, почки, мышцы и т.д.).
Б) У больной под шифром Я.И.Л. с момента обнаружения ВИЧ-инфицирования (в ноябре 2006 г.) диагностировали объемное образование правой молочной железы. Данный диагноз после проведения игольной биопсии и маммографии верифицирован в рак. Специализированного противоопухолевого лечения кроме приема средства «HPM-7.0» не проводилось.
В результате за период с ноября 2006 г. по июнь 2007 г. наблюдалась четкая положительная динамика, в виде уменьшения объемного образования, с более четкими краями (см. Фиг.7-11).
V. Микробиоцинозный (профилактический) эффект средства «HPM-7.0»
Форма, дозы:
1. Суппозиторий - 200 мкг для вагинального или ректального применения,
2. Гель - 250 мкг для наружного применения.
Микробицид - вещество в виде геля, свечи или вагинальной таблетки, которое может защитить от ВИЧ и других инфекций, передающихся половым путем (вместо или в дополнение к презервативу). Микробицидный гель или свеча (суппозиторий) являются одним из средств защиты от инфекции для мужчин и женщин, которые при наружном нанесении или введении во влагалище препятствуют инфицированию, образуя пленку, которая выделяет вещества, уничтожающие болезнетворные вирусы и бактерии.
Созданный на основе средства «HPM-7.0» микробицид в виде суппозитория для ректального и вагинального применения является лечебно-профилактическим средством урогенитальных инфекций, передающихся половым путем.
Заключение
Данные проведенных исследований позволяют говорить о том, что средство «HPM-7.0», полученное из мицелия гриба Fusarium sambucinum Fuckel var. Ossicolum (Berk.et Curt) Bilai (ВКПМ F-165), обладает системным действием, по-видимому, обеспечивая снижение числа генетических мутаций и/или их предотвращение, за счет снятия «маскировки» с мутированной или видоизмененной клетки (например, клетки, пораженной вирусом или измененной радиационным воздействием и т.п.), что позволяет иммуннокомпетентной системе ликвидировать имеющуюся хроническую патологию.
Так как «HPM-7.0» является нетоксичным биологическим продуктом, его применение возможно для профилактики и лечения заболеваний, связанных с дисбалансом биопроцессов организма человека на наноуровне, в частности с накоплением в клетках организма генетически избыточной (экстрахромосомной) ДНК, и с увеличением дефектных и снижением точности репликации существующих ДНК-последовательностей, таких, например, как иммунодефицитные состояния, связанные, в частности, с вирусной и/или бактериальной инфекцией, различных стадий синдрома приобретенного иммунодефицита, онкопроцесса, процесса старения, у лиц разного возраста, с имеющейся различной сопутствующей патологией.