Особенности проявления диморфизма Candida albicans у штаммов, выделенных от больных вагинальным кандидозом

ОСОБЕННОСТИ ПРОЯВЛЕНИЯ ДИМОРФИЗМА CANDIDA ALBICANS У ШТАММОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ОТ БОЛЬНЫХ ВАГИНАЛЬНЫМ КАНДИДОЗОМ

А.В. Проценко, И.В. Анохина, М.В. Далин, Э.Г. Кравцов

Кафедра микробиологии Российский университет дружбы народов Ул. Миклухо-Маклая, 8, 117198 Москва, Россия

При исследовании изолятов С. albicans от больных КВ и носителей установлено, что штаммы при манифестации инфекции активно размножаются при pH 6, в этой же зоне pH отмечается выраженное гифобразование, в то время как штаммы от кандидоносителей имеют максимум роста при pH 5 и при этих значениях pH не образуют герминативных трубок. Штаммы, выделенные от больных с КВ, обладают большей протеолитической активностью, чем штаммы от лиц с бессимптомным течение инфекции.

Актуальность проблемы.

Кандидозный вульвовагинит (КВ) считается одной из самых распространенных патологий в акушерско-гинекологической практике. Достаточно отметить, что около 76% женщин детородного возраста в анамнезе имели, по край ней мере, один эпизод вагинального кандидоза [3]. Являясь этиологическим фактором этой патологии, тем не менее дрожжеподобные грибы рода Candida обнаруживаются у 8-12 % здоровых женщин (кандидоносительство) [10]. Частота КВ в беременных составляет 15-25%. Зачастую при беременности показатель развития КВ возрастает, а к моменту родов достигает 40-50% [7; 8; 9; 10].

Основным источником обсеменения наружных половых органов у женщин является аутоинфекция, чаще всего из кишечника, либо с пораженных кандидозом рук (ин-гертриго, паронихии, онихии), реже заражение происходит от половых партнеров.

Клинически КВ характеризуется чувством зуда и жжения наружных половых органов, резко усиливающимся в предменструальном периоде и ослабевающим или полностью исчезающим в менструальном и постменструальном периоде.

Вторым симптомом являются выделения из влагалища (лейкорея, бели), которые различаются как по количеству, так и по качеству: могут быть беловатыми, кремовыми или сливкообразными, с наличием творожистых пленчатых комочков. При хроническом течении КВ выделения могут отсутствовать [2; 3].

КВ может быть причиной заражения новорожденного. За последние 5 лет случаи кандидоза у детей в постнатальном периоде участились более чем в 8 раз. Следует отметить, что инфицирование ребенка, как правило, происходит при манифестации инфекции у роженицы [1; 2].

Работы ряда авторов свидетельствуют о том, что штаммы грибов, выделенные от женщин с манифестной формой кандидоза, являются более вирулентными по сравнению со штаммами, изолированными от лиц с бессимтомным течением инфекции [3; 4; 5]. Причина этого остается не выясненной. J1.B. Артемовой была

предпринята попытка найти различия в генотипе таких изолятов [6]. Предполагалось, что кандиды, включающиеся в нормальные микробные ценозы, являются дефектными по генам вирулентности и не могут вызвать патологического процесса. Однако, используя праймеры, имеющие гены хитинсинтетазы и ген негативной регуляции гифообразования, автор обнаружила, что грибы, изолированные от лиц с манифестной и бессимптомной инфекцией по этим генетическим маркерам не отличаются. По всей вероятности, причину различий вирулентности этих штаммов следует искать на уровне фенотипических их вариаций.

Мы исходили из концепции Оллерта с соавторами [8], позволяющей представить патогенез вагинального кандидоза, схема которого приведена ниже (рис. 1).

Стадия 1: Колонизация

Адгезия на эпителии Начало питания

Стадия 2: Поверхностная инфекции

Пенетрация эпителия

Снижение протеинов хозяина

Стадия 3: Глубокое инфицирование

Пенетрация ткани Пргоникновение в сосуды Побег от иммунного ответа хозяина

Стадия 4: Дсссимннация инфекции

Адгезия на эпителии Инвазия других тканей хозяина

Активация системы свертывания крови

Рис. 1. Общая схема колонизации и инфицирования эпителиальных тканей, факторы вирулентности кандид

Кандиды в нормальном микробном ценозе влагалища адгезируются на поверхностных слоях эпителия, находясь при этом в динамическом равновесии с другими представителями микрофлоры. Это создает условия для длительной персистенции гриба. Дисбиотические нарушения изменяют адгезивные свойства, энзимный и антигенный профиль, что проявляется морфологически в виде образования морфологических герминативных трубок. Поверхностный процесс переходит в следующую стадию, когда проростковые трубки пенитрируют в слизисту ю, при этом в инвазии гриба принимают участие секретируемые аспартил протеиназы. В некоторых случаях возможен переход процесса в следующую стадию — генерализированной инфекции. Подобная ситуация может быть смоделирована. Известно, что дисбиоз влагалища сопровождается подавлением лактофлоры и, как следствие этого, повышением pH среды.

о~ХоЛ~о~)

Факторы вирулентности

Адгезины

Гидролитические энзимы Г ифобразование Фенолитическое переключение Молекулярная мимикрия

Гидролитические энзимы Г'ифобразование

Гидролитические энзимы Г ифобразование

Адгезины

Гидролитические энзимы

Г ифобразование

Фенолитическое

переключение

Антиоксиданты

Иммуномодуляторы

В свою очередь pH является одним из факторов регуляции морфогенеза. Следовательно, при культивировании сравниваемых штаммов не средах одинакового состава, но с различными значениями pH можно оценить в определенной степени патогенный потенциал сравниваемых культур.

В связи с вышеизложенным целью настоящей работы было выявление особенностей реализации патогенных свойств С.albicans выделенных ог лиц с манифес-ным и бессимтомным течением инфекции.

При этом решались следующие задачи: проводили сравнительное изучение культур, по интенсивности размножения при разных pH; изучали активность перехода из дрожжевой формы в мицелиальную; анализировали способность штаммов секретировать аспартил протеиназы.

Материалы и методы.

Материал для исследования был собран на базе родильного дома № 29 г. Москвы. За период с января 2005 по сентябрь 2006 г. было обследовано 5222 пациенток, грибы рода Candida были выявлены у 1448, что составило 27% от общего числа обследованных.

Видовой состав выделенных культур был представлен следующим образом: всего — 1448 штаммов, из них: С.albicans — 1363 штамма (94%), C.tropicalis — 57 штаммов (4%), C.glabrata — 28 штамма (2%).

Для исследования было выбрано 57 изолятов, что составило основную коллекцию из них: C.albicans — 45 штаммов (95%), C.glabrata — 12 штаммов (5%).

На основании клинических исследований данные изоляты были распределены на 3 группы: I группа — изоляты от пациенток с кандидоносительством (19 чел.), II группа — изоляты от пациенток с кандидозной моноинфекцией влагалища (11 чел.) и Щ группа — изоляты от пациенток со смешанной бактериально-грибковой инфекцией влагалища с преобладанием аэробного типа условно-патогенных бактерий (26 чел.). Штаммы от пациенток III группы разделили на две подгруппы: III А — с бессимптомной формой бактериально — грибковой инфекции (25 чел.) и III Б — с манифестной формой (1 чел.).

Рост культуры грибов вила С. albicans при различных pH Рост штаммов Candida albicans выделенных от

больных вагинальным кандиаозом и носителей при различных pH

а)

а)

JpH

Процент ироросткоаых трубок при различных pH

рн

б)

б)

Рис. 2.

Рис. 3.

Культуры засевали на среду, содержащую 0,5% бычьего сывороточного альбумина и 4% глюкозы с различными значениями pH — от 3 до 7. Посевы инкубировали при г 37°С в течение четырех суток. Затем производили морфометрию, которая

включала подсчет общего количества клеток по Виноградову и определение процента клеток, образующих герминативные трубки. Процесс подсчета осуществлялся путем переноса изображения в электронный формат (Quick Time Movie) и последующей компьютерной его обработки.

На рис. 2 а показано, накопление биомассы грибов при различных значениях pH. Эти данные были получены при анализе общей выборки, т.е. основной коллекции штаммов. Из приведенной диаграммы следует, что оптимум роста культур находится в зоне pH 5 , повышение pH до 7 значительно подавляет размножение грибов.

Гифообразование грибов при различных значениях pH представлено на рис. 2 6. Из приведенной диаграммы следует, что переход дрожжевой формы в мицелиальную активируется со значений pH 5 и достигает максимума при pH 7. При анализе аналогичных показателей в группах штаммов, полученных от больных КВ и в группе с бессимптомным течением инфекции, можно отметить существенные различия (рис. 3).

Максимум накопления биомассы изолятов C.albicans от больных КВ отмечается при pH 6, (т.е. сдвигается в щелочную зону), а в группе штаммов, выделенных от пациенток с бессимптомным течением кандидозной инфекции, остается в зоне pH 5. При этом максимум образования герминативных трубок у штаммов, выделенных от больных, совпадает с максимумом накопления биомассы, в то время как в альтернативной группе в зоне оптимального роста культуры, т.е. при pH 5 переход дрожжевой формы в мицелиальную снижен и активируется только при значительном защелачивании среды, когда размножение гриба подавляется.

На следующем этапе мы проводили сравнение штаммов Candida albicans, выделенных от больных КВ и лиц с бессимптомной кандидозной инфекцией, по активности фермента агрессии — аспартил протеиназы. С этой целью на плотную среду, содержащую бычий сывороточный альбумин, делали посев уколом двухсуточной культуры. После инкубации через 4 суток производили окраску амидошварцем. Измеряли диаметр зоны протеолиза (рис. 4).

Рис. 4. Зоны протеолиза 0,5% бычьего Рис. 5. Активность протеаз, выделенных

сывороточного альбумина вокруг коло- от больных вагинальным кандидозом

ний С. albicans. Окраска амидошварц и носителей кандидозной инфекции

Средний диаметр зоны протеолиза при посеве штаммов, выделенных от больных с манифестной формой КВ, составил 3,51 мм ± 0,28, а от больных с бессимптомным течение КВ — 2,6 мм ± 0,26.

Из диаграммы, приведенной на рис. 5, следует, что протеолитическая активность штаммов, выделенных от женщин с манифестной формой вагинального кан-дидоза, существенно выше, чем у штаммов от здоровых женщин.

РОССИЙСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ДРУЖБЫ НАРОДОВ НАУЧНАЯ БИБЛИОТЕКА

Таким образом, несмотря на то, что в ранее проведенных исследованиях [6] не удалось обнаружить генетических различий у изолятов от больных КВ и носителей кандидозной инфекции, на фенотипическом уровне эти различия достаточно четко проявляются. Можно считать, что более высокая вирулентность штаммов от лиц с манифестной формой заболевания связана с совпадением интенсивного размножения и выраженным морфогенезом. Кроме того, данные изоляты способны в большей степени экспрессировать такой фактор вирулентности, как протеолитические ферменты.

Таким образом, на основании проведенных исследований можно прийти к заключению, что оптимальные условия для проявления инвазивных свойств возбудителя КВ могут возникнуть при дисбиозе влагалища, при котором pH среды смещается в сторону увеличения. Именно по этой причине обострение хронической инфекции можно наблюдать в конце менструального цикла или в результате снижения уровня лактофлоры в период беременности.

ЛИТЕРАТУРА

1. Герасимова Н.М., Кениксфест Ю.В., Кохан М.М. и др. Тактика врача при урогенитальном кандидозе у беременных и кандидозе кожи и слизистых у новорожденных детей (терапевтические и профилактические аспекты) // Вестн. дерматол. и венерол. — 2005. — № 3. — С. 68-73.

2. Колбин А.С., Шабалов Н.П., Климко Н.Н. Кандидоз у новорожденных с очень низкой массой тела при рождении // Клин, микробиол. и антимикроб, химиотер. — 2005. — № 7 (2). — С. 189-96.

3. Linda О. Eckert. Clinical practice The new england journal о f medicine Acute Vulvovaginitis.

4. Hillier S. L., M. A. Krohn, R. P. Nugent, and R. S. Gibbs. 1992. Characteristics of three vaginal flora patterns assessed by gram-stain among pregnant women // Am. J. Obstet. Gynecol. — Vol. 166. — P. 938-944.

5. Larsen, B., and R. P. Galask. 1980. Vaginal microbial flora: practical and theoretic relevance // Obstet. Gynecol. — Vol. 55. — P. 100-113.

6. Артемова Л.В. Диагностическая значимость ПЦР в расшифровке этиологии инфекции, вызванных условно патогенными возбудителями: Дис... канд. биол. наук // РУДН. М., 2005.

7. Eckert LO, Hawes SE, Stevens CE, Koutsky LA, Eschenbach DA, Holmes KK. Vulvovaginal candidiasis: clinical manifestations, risk factors, management algorithm // Obstet Gynecol. — 1998. Vol. 92. — P. 757-765.

8. Ollert, M. W., So" hnchen, R., Korting, H. C., Ollert, U., Bra" utigam, S. & Bra" utigam, W. (1993). Mechanisms of adherence of Candida albicans to cultured human epidermal keratinocytes // Infect. Immun. — Vol. 61. — P. 4560-4568.

9. Barbone F, Austin H, Louv WC, Alexander WJ. A follow-up study of methods of contraception, sexual activity, and rates of trichomoniasis, candidiasis, and bacterial vaginosis // Am. J. Obstet. Gynecol. — 1990. — Vol. 163. — P. 510-514.

10. Odds, F. C. 1994. Candida species and virulence // ASM News. — Vol. 60. — P. 313-318.

PECULIARITIES OF DEMORFISM OF CANDIDA ALBICANS VULVOVAGINAL CANDIDIASIS STRAINS

A.V. Protsenko, I.V. Anokhina, M.V. Dalin, E.G. Kravtsov

The Department of Microbiology Peoples’ Friendship University of Russia Miklukho-Maklaya st., 8, 117198 Moscow, Russia

The isolates of C. albicans that had been taken from patients with acute vulvovaginal candidiasis were researched and the following was determined. The acute vulvovaginal candidiasis strains were growing very fast in pH 6, and had a very high production of the germ — tubes. The strains that had been taken from asymptomatic patients had maximum growth in pH5 and showed no significant germ — tube production at this pH level. The acute vulvovaginal candidiasis strains had higher photolytic activity than asymptomatic ones.