ФОРМИРОВАНИЕ КОНЪЮГИРОВАННОГО БЕЛКА ЭЛЕКТРОПРЯДЕНИЕМ
FORMATION OF CONJUGATED PROTEIN BY ELECTROSPINNING

Перекрестная ссылка на родственные заявки
По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной патентной заявки США с серийным № 61/619996, поданной 4 апреля 2012 года, включенной в данное описание посредством ссылки во всей своей полноте.
Предшествующий уровень техники
Конъюгированные белки, включая белково-полисахаридные конъюгаты, играют значительную роль в структуре и стабильности многих пищевых товаров. Одной реакцией, которая в особенности важна в пищевой промышленности, является реакция Майяра. Реакция Майяра представляет собой неферментативное химическое взаимодействие, включающее конденсацию аминогруппы и восстанавливающей группы. Реакция приводит к образованию промежуточных продуктов, которые позже могут полимеризоваться с образованием коричневых азотсодержащих соединений, известных как меланоидины.
Реакция Майяра имеет три основных стадии. На первой стадии образуется гликозиламин, который затем подвергается перегруппировке в соединение Амадори. На второй стадии аминогруппа утрачивается, и формируется карбонильный промежуточный продукт. Карбонильный промежуточный продукт подвергается дегидратации или расщеплению, с образованием карбонильных соединений с высокой реакционной способностью. На конечной стадии реакционноспособные карбонильные соединения взаимодействуют с другими компонентами пищевого продукта с образованием меланоидинов.
С продуктами реакции Майяра связаны такие позитивные характерные свойства, как аромат, вкус и цвет. Однако реакция также может привести к снижению питательной ценности, сокращению срока хранения и образованию нежелательных соединений, придающих неприятный привкус.
Поэтому контроль реакции Майяра является критически важным при разработке пищевых продуктов с улучшенной питательной ценностью. Предшествующие пути получения белковых конъюгатов не были эффективными по многочисленным причинам. Например, сухая инкубация, при которой используют процесс лиофилизации в комбинации с нагреванием, является медленной и не обеспечивает надлежащих выходов. Следовательно, существует потребность в более эффективных путях контроля образования конъюгированных белков.
Сущность изобретения
Описываемые в данном описании отличительные признаки в основном относятся к способам применения электропрядения для получения конъюгированных белков. Аспекты описываемых в данном описании отличительных признаков относятся к способам получения конъюгированных с декстраном белков молочной сыворотки.
Краткое описание фигур
Настоящее изобретение проиллюстрировано в качестве примера, но не ограничения сопроводительными фигурами, в которых сходные кодовые номера позиций обозначают подобные элементы, и в которых:
на фиг. 1 проиллюстрирован один пример устройства для электропрядения, в котором могут быть реализованы разнообразные признаки изобретения;
на фиг. 2 проиллюстрированы бусинки на волокнах с декстраном (70 кДа (тысяч Дальтон)) при концентрации 0,5 г/мл растворителя;
на фиг. 3 проиллюстрированы волокна, полученные из раствора декстрана (70 кДа) при концентрации 0,7 г/мл растворителя;
на фиг. 4 проиллюстрированы гладкие волокна, полученные из раствора декстрана (70 кДа) при концентрации 0,8 г/мл растворителя;
на фиг. 5 проиллюстрировано LM-изображение (в аналитическом микроскопе) изготовленных электропрядением волокон из чистого декстрана, полученных из водного раствора декстрана (40 кДа) при концентрации 1,0 г/мл;
на фиг. 6 проиллюстрировано LM-изображение изготовленных электропрядением волокон из чистого декстрана, полученных из водного раствора декстрана (100 кДа) при концентрации 0,6 г/мл;
на фиг. 7 проиллюстрирована вязкость смесей декстран-изолят сывороточного белка, полученных с различными декстранами при минимальной пригодной для электропрядения концентрации;
фиг. 8А-F. На фиг. 8А-8С проиллюстрировано полученные в сканирующем электронном микроскопе (SEM) изображения волокон, изготовленных электропрядением из декстрана-изолята сывороточного белка, полученных из декстранов с разнообразными молекулярными массами: 8А: 40 кДа, 8В: 70 кДа и 8С: 100 кДа. Диаметры волокон для волокон на фиг. 8А, 8В и 8С показаны на фиг. 8D, 8E и 8F, соответственно;
на фиг. 9 проиллюстрированы реологические кривые зависимости "напряжение-деформация" водных растворов декстрана при различных концентрациях;
на фиг. 10 проиллюстрировано влияние соотношения смеси на реологические характеристики смесей декстрана и сывороточного белка. Совокупное содержание твердого вещества составляло 0,6 г/мл для каждой смеси;
фиг. 11А-Н. На фиг. 11А-D проиллюстрированы SEM-изображения изготовленных электропрядением волокон, полученных из растворов декстрана при различных концентрациях (11А: 0,3 г/мл растворителя, 11В: 0,45 г/мл растворителя, 11С 0,6 г/мл растворителя и 11D: 0,7 г/мл растворителя). Условия электропрядения поддерживали постоянными при: напряжении, равном 20 кВ, дистанции электропрядения, равной 18 см, и величине расхода потока раствора, равной 12 мкл/мин. Диаметры волокон для волокон на фиг. 11А-D показаны на фиг. 11Е-Н, соответственно;
фиг. 12А-J. На фиг. 12А-Е проиллюстрированы SEM-изображения изготовленных электропрядением волокон, полученных из смесей с различными соотношениями смеси (по массе) декстрана (100 кДа) и изолята сывороточного белка (12А: 1:0, 12В: 0,8:0,2, 12С: 0,75:0,25, 12D: 0,67:0,33 и 12Е: 0,5:0,5). Концентрация всех смесей составляла 0,6 г/мл растворителя, и условия электропрядения поддерживали постоянными при: напряжении, равном 20 кВ, дистанции электропрядения, равной 18 см, и величине расхода потока раствора, равной 12 мкл/мин. Диаметры волокон для волокон на фиг. 12А-Е показаны на фиг. 12F-J, соответственно;
-1
на фиг. 13А показаны ИК-спектры (инфракрасные) смеси между порошком декстрана и порошком изолята сывороточного белка при различном соотношении смеси. На фиг. 13В показана взаимосвязь между содержанием изолята сывороточного белка и соотношением между пиками поглощения при волновых числах 1518 и 1004 см;
на фиг. 14 показан внешний вид изготовленных электропрядением пленок, подвергнутых отжигу при температуре 60°C и относительной влажности (RH) 74% в течение различных периодов времени;
на фиг. 15 проиллюстрированы ИК-спектры: а) WPI-декстрана в порошковой форме; b) пленки, изготовленной электропрядением WPI-декстрана, в состоянии сразу после прядения; с)-f) изготовленных электропрядением WPI-декстрана пленок после отжига при температуре 60°C и относительной влажности 74% в течение 2, 6, 20 и 48 часов, соответственно;
на фиг. 16 проиллюстрировано влияние продолжительности отжига на SDS-PAGE-профили (электрофореза в полиамидном геле (PAGE) в присутствии додецилсульфата натрия (SDS)) конъюгатов WPI-декстрана в присутствии 2-меркаптоэтанола. Полоска 1: раствор WPI; полоски 2-8: изготовленная электропрядением конъюгата WPI-декстрана (40 кДа) пленка, подвергнутая отжигу при температуре 60°C и относительной влажности 74% в течение 0, 2, 4, 6, 8, 16, 24 и 48 часов, соответственно;
на фиг. 17А и 17В проиллюстрированы SDS-PAGE-профили конъюгатов WPI-декстрана в присутствии 2-меркаптоэтанола. На фиг. 17А представлено пятно белка. На фиг. 17В представлено пятно гликопротеина. Полоски для обеих фиг. 17А и В представляют собой полоску 1: раствор WPI; полоски 2-5: изготовленная электропрядением конъюгата WPI-декстрана (40 кДа) пленка, подвергнутая нагреванию на 0, 8, 16 и 24 час, соответственно; полоски 6-9: изготовленная электропрядением конъюгата WPI-декстрана (100 кДа) пленка, подвергнутая нагреванию на 0, 8, 16 и 24 час, соответственно;
на фиг. 18А и 18В проиллюстрированы SDS-PAGE-профили конъюгатов WPI-декстрана (70 кДа): на фиг. 18А представлено белковое пятно. На фиг. 18В представлено пятно гликопротеина. Массовое соотношение между декстраном и WPI во всех изготовленных электропрядением пленках составляло 3:1. Полоска 1: маркер молекулярной массы белков (Protein Ladder); полоски 2-5: изготовленные электропрядением пленки, подвергнутые отжигу при температуре 60°С, относительной влажности 74% на 0, 8, 16, и 24 час, соответственно;
2
на фиг. 19 проиллюстрирована стандартная кривая готового геля TGX-типа (Precast gel), использованного для SDS-PAGE-гелей. Переменные ММ и d, показанные в уравнении, представляют молекулярную массу в кДа и дистанцию перемещения в %, соответственно (R=99,86%). Центральная линия и две внешних линии показывают прогнозированные значения и 95%-ной доверительный интервал, соответственно;
на фиг. 20А и 20В проиллюстрированы SDS-PAGE-профили конъюгатов WPI-декстрана (100 кДа), сформированных при различных значениях относительной влажности и продолжительностях отжига. Массовое соотношение между декстраном и WPI во всех изготовленных электропрядением пленках составляло 3:1. На фиг. 20А представлено белковое пятно. На фиг. 20В представлено пятно гликопротеина. Полоска 1: пленка в состоянии сразу после прядения; полоски 2-10: изготовленные электропрядением пленки, подвергнутые отжигу при температуре 60°С, но с различной относительной влажностью: полоски 2-4=0%-ная RH; полоски 5-7=44%-ная RH; полоски 8-10=74%-ная RH. Продолжительности отжига составляли 8 часов: полоски 2, 5 и 8; 16 часов: полоски 3, 6 и 9; и 24 часа полоски 4, 7 и 10. Полоска 0 представляет стандартный маркер молекулярных масс белков;
на фиг. 21А и 21В проиллюстрированы SDS-PAGE-профили конъюгатов WPI-декстрана (100 кДа) в условиях постоянной относительной влажности. Изготовленные электропрядением пленки были получены при различных соотношениях смеси между декстраном и WPI: полоски 1-4=1:2; полоски 5-8: 1:1; полоски 9-12: 2:1, соответственно. На фиг. 21А представлено белковое пятно. На фиг. 21В представлено пятно гликопротеина. Все изготовленные электропрядением пленки были подвергнуты отжигу при температуре 60°С и 74%-ной относительной влажности. Продолжительности отжига составляли: полоски 1, 5 и 9: пленки в состоянии сразу после прядения; полоски 2, 6 и 10: 8 часов; полоски 3, 7 и 11: 16 часов; полоски 4, 8 и 12: 24 часа. Полоска 0 представляет стандартный маркер молекулярных масс белков. Использованный краситель является специфичным к N-гликозидам, которые не присутствуют в белке или мальтодекстрине;
на фиг. 22А показаны УФ-спектры (ультрафиолетовые) поглощения изготовленных электропрядением образцов, полученных из смесей WPI и декстрана с 4 0 кДа, подвергнутых отжигу при температуре 60°С и 74%-ной относительной влажности, с различными продолжительностями отжига. На фиг. 22В показана взаимосвязь между пиком поглощения при длине волны 282 нм изготовленных электропрядением образцов и продолжительностью отжига (образцы WPI и декстрана с 40 кДа);
на фиг. 23А показаны УФ-спектры поглощения изготовленных электропрядением образцов, полученных из смесей WPI и декстрана с 70 кДа, подвергнутых отжигу при температуре 60°С и 74%-ной относительной влажности, с различными продолжительностями отжига. На фиг. 23В показана взаимосвязь между пиком поглощения при длине волны 282 нм изготовленных электропрядением образцов и продолжительностью отжига (образцы WPI и декстрана с 70 кДа);
на фиг. 24А и 24В показано влияние концентрации раствора на УФ-поглощение изготовленных электропрядением образцов, полученных из смесей WPI и декстрана со 100 кДа. На фиг. 24А представлена концентрация 5 мг/мл, и на фиг. 24В представлена концентрация 3 мг/мл;
на фиг. 25А и 25В показан пик поглощения при длине волны 282 нм изготовленных электропрядением образцов, полученных из смесей WPI и декстрана со 100 кДа при соотношении смеси 1:1 (фиг. 25А) и 2:1 (фиг. 25В);
на фиг. 26 показаны УФ-спектры поглощения изготовленных электропрядением образцов, полученных из смесей декстрана со 100 кДа и WPI при соотношении смеси 2:1;
на фиг. 27 показаны изготовленные электропрядением пленки, полученные из WPI и декстрана со 100 кДа при различных соотношениях смеси: А) 1:2; В) 1:1 и С) 2:1 (соотношение смеси между декстраном и WPI;
на фиг. 28А-С проиллюстрированы светлота (затемненные кружки) и желтизна (белые кружки) изготовленных электропрядением пленок, измеренные с использованием колориметра, при соотношениях смеси 1:2 (А), 1:1 (В) и 2:1 (С);
на фиг. 29А и В проиллюстрированы NIR-спектры (в ближней инфракрасной области) изготовленных электропрядением пленок из конъюгатов "WPI-декстран со 100 кДа".
Подробное описание изобретения
В одном аспекте изобретения предоставлены способы получения конъюгированных белков в подходе с использованием электропрядения. В некоторых аспектах конъюгат представляет собой белково-углеводный конъюгат (т.е. белок, ковалентно связанный с одним или более углеводами). В некоторых аспектах конъюгат представляет собой белково-полисахаридный конъюгат (т.е. белок, ковалентно связанный с одним или многими полисахаридами). В конкретных аспектах полисахарид представляет собой декстран, и белок представляет собой изолят сывороточного белка (WPI).
а. Сывороточные белки молока и гликозилирование
Сывороточные белки молока представляют собой ключевые ингредиенты, используемые в самых разнообразных пищевых продуктах благодаря их превосходной функциональности (например, стабилизации пены и эмульсий), и высокому содержанию в них питательных веществ (например, высокому содержанию незаменимых аминокислот) [1].
Сывороточные белки молока легко денатурируются во время обработки пищевых продуктов вследствие возникающих в действительности условий окружающей среды, таких как высокая температура, давление и/или присутствие разнообразных кислот. Поэтому повышение стабильности сывороточных белков вызывало особый интерес у изготовителей пищевых продуктов, чтобы улучшить их применение в пищевых целях. Реакция гликозилирования между сывороточным белком и декстраном, протекающая с образованием оснований Шиффа в качестве промежуточных продуктов, была признана эффективным методом повышения термической стабильности белков [1] и улучшения характеристик эмульгирования [3, 4].
Образование белково-полисахаридных конъюгатов улучшает стабильность эмульсии при замораживании-оттаивании, даже после трех циклов замораживания-оттаивания при температуре -18°C в течение 22 часов и +40°C в течение 2 часов [5].
Нехимическое гликозилирование белка и полисахарида может быть проведено сухим нагреванием смеси белкового порошка и порошка, содержащего восстанавливающие сахара, при температуре около 60°C и относительной влажности по меньшей мере ~44%, в течение вплоть до 4 дней [6]. При использовании сухого нагревания, скорее, нежели с подведением теплоты непосредственно к WPI и декстрану в их исходной порошкообразной форме, сначала готовят растворы WPI и декстрана в жидкой форме, с последующей лиофильной сушкой для получения смеси в твердой форме, которая более пригодна для последующей реакции гликозилирования.
Альтернативный способ гликозилирования WPI состоит в нагревании растворов декстрана и изолята сывороточного белка при температуре 60°C и рН ~6,5 в течение 48 часов, так называемым влажным нагреванием. Например, см. опубликованную патентную заявку США 20090311407. Влажное нагревание обусловливает значительно более короткую продолжительность реакции, чем сухое нагревание, и возникающие в ходе процесса продукты реакции Майяра, которые образуют темные пигменты, получаются с меньшей легкостью, чем в методе сухого нагревания. Ни один из способов не соответствует широко распространенному применению вследствие связанных с этим затрат и ввиду того, что оба способа имеют низкие выходы (<5%).
ЭЛЕКТРОПРЯДЕНИЕ
Электропрядение представляет собой форму электроосаждения, и является универсальным способом, который может создавать волокна из синтетических и/или природных полимеров с использованием электрического поля, образуемого высоким напряжением (например, от 15 до 25 кВ). Электропрядение может быть игольным или безыгольным. Конкретная конфигурация электропрядения состоит из контейнера для раствора, оснащенного фильерой, сборной пластины, используемой для сбора осажденных волокон, и высоковольтного блока для генерирования электрических полей между фильерой и сборной пластиной. См. фиг. 1. Контейнер для раствора может представлять собой шприц, оборудованный электропроводной иглой, которая может быть использована как в качестве фильеры, так и в качестве электрода.
Расход потока раствора полимера можно регулировать с использованием шприцевого насоса. Когда раствор полимера электрически заряжается посредством электрода, форма капли раствора полимера на кончике фильеры будет преобразовываться в форму конуса Тейлора. Если напряжение является достаточно высоким, чтобы преодолеть силы поверхностного натяжения, из вершины конуса Тейлора будут выбрасываться тонкие струи полимера. Выброшенные струи полимера быстро высыхают вследствие малых размеров струи, и со сборной пластины могут быть собраны сухие твердые волокна. Средние диаметры изготовленных электропрядением волокон обычно составляют около нескольких сотен нанометров.
e
soln
Для успешного электропрядения целевого раствора с образованием волокон требуются взаимные сопряжения полимерных цепей. Взаимные сопряжения полимерных цепей предотвращают разрушение полимерных струй под действием электрических растягивающих сил во время электропрядения. Если концентрация полимера является слишком низкой, перекрывание полимерных цепей в растворе отсутствует. Когда концентрация повышается до критической концентрации, с*, инициируется переплетение цепей. Степень переплетения цепей зависит как от концентрации полимера, так и от молекулярной массы, (n), и может быть определена согласно уравнению 2.1 [12]:
,
w
е
где с представляет концентрацию полимера в растворе, M представляет молекулярную массу полимера в растворе, и М представляет молекулярную массу полимерного переплетения или среднюю молекулярную массу между местами связывания в переплетении.
Из уравнения 2.1 следует, что чем выше молекулярная масса полимера, тем ниже концентрация полимера, необходимая для поддержания постоянного числа переплетений, т.е. поддержания способности раствора к электропрядению.
БЕЛКИ И УГЛЕВОДЫ/ПОЛИСАХАРИДЫ
Сывороточный белок является ключевым ингредиентом в пищевых продуктах. Сывороточные белки обеспечивают хорошую стабильность пены и эмульсий и также имеют высокое содержание незаменимых аминокислот. Получение сывороточных белков известно в данной области. Как правило, молочные сливки центрифугируют для удаления сметаны или жира, затем осаждают казеин, обеспечивая возможность выделения сывороточных белков на дополнительных стадиях центрифугирования, фильтрования и/или ионного обмена. Типичный изолят сывороточного белка (WPI) может содержать β-лактоглобулин (~55%), α-лактальбумин (~25%), иммуноглобулин (~15%), бычий сывороточный альбумин (~4%) и лактоферрин (~2%).
В то время как WPI представляет собой предпочтительный целевой объект гликозилирования, для электропрядения могут быть выбраны самые разнообразные белки. В некоторых аспектах используют белок только одного типа. В других аспектах белок может представлять собой смесь одного или более белков.
Может быть применен любой растворимый белок животного или растительного происхождения, который может быть подвергнут электропрядению и конъюгированию (введен в реакцию с сахаридами). Пригодные белки включают белки растительного происхождения, белки животного происхождения и белки микробного происхождения. Например, пригодные белки растительного происхождения могут включать соевый (концентрат/изолят), гороховый (концентрат/изолят), пшеничный (глиадин, глютен), чечевичный, бобовый, кукурузный (зеин), овсяной, ячменный, амарантовый, рисовый, гречишный, спельтовый, льняного семени, киноа, ржаной, сорговый, тэффовый, подсолнечный, и ореховый (арахисовый, миндальный, пекановый). Пригодные белки животного происхождения могут включать молочный (сывороточный и казеин), рыбный белок, животный белок (говяжий, свиной, телячий, домашней птицы…) и яичный белок. Пригодные белки микробного происхождения могут включать белки морских водорослей, грибковые и бактериальные.
Углеводы, имеющие восстанавливающие функциональные группы, могут быть использованы в условиях непосредственной обработки. В частности, подходящие углеводы либо имеют альдегидную группу, либо способны образовывать альдегид в растворе в результате изомеризации. Пригодные углеводы включают агар, агарозу, альгинат, альгиновую кислоту, альгуроновую кислоту, альфа-глюкан, амилопектин, амилозу, арабиногалактан, арабиноксилан, бета-глюкан, коллаген BioCell, каллозу, капсулан, каррагенан, целлодекстрин, целлулин, целлюлозу, хитин, хитиновые нанофибриллы, хитозан, хризоламинарин, курдлан, циклодекстрин, сефарозу DEAE, декстран, декстрин, экзополисахарид, альфа-циклодекстрин, Fibersol, фиколл, фруктан, фукоидан, галактоглюкоманнан, галактоманнан, геллановую камедь, глюкан, глюкоманнан, гликокаликс, гликоген, гидролизованный гуар, гуаровую камедь, гуммиарабик, гемицеллюлозу, гомополисахарид, гипромеллозу, икодекстрин, инулин, инулозу, кефиран, конжак, ламинарин, лентинан, леван, лихенин, камедь плодов рожкового дерева, MatrixDB, гемицеллюлозный полисахарид "смешанно-связанный глюкан" (mixed-linkage glucan (MLG)), модифицированный крахмал, растительный клей, камедь, окисленную целлюлозу, парамилон, пектиновую кислоту, пектин, пентастарч, плеуран, полидекстрозу, полигликольальгинат, полисахарид, полисахарид-пептид, порфиран, пуллулан, шизофиллан, сефарозу, синистрин, сизофиран, соевое волокно, сугаммадекс, негидролизуемые полимеры глюкозы, велановую камедь, ксантановую камедь, ксилан, ксилоглюкан, экстракты юкки или юкки/квилайи, и зимозан.
Особую категорию пригодных углеводов составляют полисахариды.
Такие сахариды, как полисахариды, представляют собой полимеры сахаридов. Олигосахариды представляют собой полимеры из 2-200 сахаридов. Полисахариды представляют собой более длинные полимеры, чем олигосахариды. Пригодными полисахаридами могут быть полимеры сахаридов числом от 201 до 2500.
Подходящие полисахариды включают декстраны. "Декстран" означает сложный разветвленный полисахарид, включающий многочисленные молекулярные фрагменты глюкозы, связанные в цепи с разнообразными длинами (например, от 10 до 150 кДа). Линейная цепь состоит из α1→6-гликозидных связей между молекулами глюкозы. Боковая цепь (ответвление) может содержать α1→4-связи, α1→2-связи и/или α1→3-связи.
Сахариды (типа сахаров), пригодные для конформации конъюгации, включают восстанавливающие моносахариды, такие как глюкоза, фруктоза, глицериновый альдегид и галактоза. Многие дисахариды, такие как лактоза и мальтоза, также имеют восстанавливающую форму, так как одна из двух структурных единиц может иметь открытоцепную форму с альдегидной группой. В полимерах глюкозы, таких как крахмал и производные крахмала, типа глюкозного сиропа, мальтодекстрина и декстрина, макромолекула начинается с восстанавливающего сахара, который представляет собой свободный альдегид. В большей степени гидролизованный крахмал содержит больше восстанавливающих сахаров. Процентное содержание восстанавливающих сахаров, присутствующих в этих производных крахмала, называется декстрозным эквивалентом (DE).
В некоторых вариантах осуществления углеводы, такие как декстраны, имеют молекулярную массу в диапазоне от около 10 кДа до около 500 кДа. В других вариантах осуществления декстраны имеют молекулярную массу в диапазоне от около 40 кДа до около 100 кДа или от около 70 кДа до около 100 кДа.
Термин "около", как использовано в данном описании, означает ±10% численного значения.
Любые пригодные способы электропрядения и устройства для них могут быть применены в той мере, насколько обеспечивается следующее: подача напряжения высокой мощности, резервуар для раствора полимера, электроды (один заземленный) и приемная пластина. Подходящие устройства для электропрядения включают, но не ограничиваются ими, Needle-less (безыгольное) и Near Field (ближнепольное).
Электропрядение создает существенные преимущества перед предшествующими способами формирования конъюгированных белков. Настоящий способ электропрядения облегчает гликозилирование в гораздо более коротких продолжительностях отжига и с увеличенным выходом.
В изготовленных электропрядением WPI-декстрановых волокнах, например, физическое состояние двух полимеров является таким, что большее число контактов молекулы с молекулой достигается по меньшей мере при трех обстоятельствах. Во-первых, полимеры распределяются более однородно, поскольку электропрядение обусловливает выравнивание молекул благодаря растягивающим и изгибающим перемещениям. Во-вторых, предотвращается разделение фаз вследствие быстрого испарения растворителя. Наконец, малые диаметры волокон проявляются в плотной упаковке волокон, составленных из молекул WPI и декстрана.
Таким образом, без намерения вдаваться в теорию, представляется, что процесс электропрядения побуждает молекулы эффективно выстраиваться в линию, и что это остается неизменным благодаря переплетениям полимерных цепей, приводя к особенно хорошему выходу и сокращению затрат.
Для оптимизации формирования волокон во время электропрядения могут варьироваться разнообразные параметры. Параметры, которые влияют на формирование волокон, включают концентрацию декстрана, вязкость смеси, соотношение "белок-полисахарид" в смеси, допустимую продолжительность отжига.
Приведенное ниже следующее описание сосредоточено на одном аспекте изобретения, а именно, на конъюгате "декстран-сывороточный белок". Должно быть понятно, что способ может быть распространен на любой пригодный белок и углевод.
i. Концентрация декстрана и формирование волокон
Декстран ответственен за пригодность к электропрядению смесей "декстран-сывороточный белок", вместе с тем одновременно служил в качестве восстанавливающего сахара реагента для формирования конъюгата.
Для формирования конъюгатов с белками использовали широкий круг декстранов с молекулярными массами от 10-440 кДа. Более низкие молекулярные массы обычно дают более высокие уровни конъюгатов. Для электропрядения высокие концентрации требуются, когда используют полимеры с низкой молекулярной массой. К сожалению, высокие концентрации приводят к высоковязким растворам, которые непригодны для электропрядения.
Способность декстрана образовывать волокна соотносится с концентрацией и размером декстрана. Все растворы декстрана (ММ=100 кДа) с концентрацией вплоть до 0,45 г/мл проявляли реологические свойства разжижения при сдвиговой нагрузке. Для декстрана с молекулярной массой 100 кДа получение гладких и непрерывных волокон требует концентрации 0,1 г/мл или выше, или 0,6 г/мл или выше. Таким образом, в некоторых аспектах для декстрана со 100 кДа смесь для электропрядения содержит по меньшей мере 0,6 г/мл, по меньшей мере 0,8 г/мл или по меньшей мере 1,0 г/мл декстрана. Верхний предел для декстрана может определяться вязкостью смеси и зависит от типа полимера, и является таким, как 5 г/мл.
Белок и полисахарид для электропрядения могут быть объединены в буфере. Например, смесь для электропрядения может быть приготовлена в фосфатном буфере. рН буфера составляет от 6,0 до 7,0; обычно рН буфера составляет 6,50±0,07.
ii. Вязкость
Вязкость является важным параметром для эффективного электропрядения. Когда вязкость слишком высока, это оказывает негативное влияние на эффективность электропрядения. Например, вязкость раствора, полученного из декстрана с 40 кДа, составляла около 1,8 Па·сек (Пуаз). Этот уровень вязкости был неблагоприятным по ряду причин. Во-первых, приготовление раствора было затруднительным, поскольку раствор становился "липким". Во-вторых, во время приготовления раствора образовывался толстый слой пены вследствие высокого содержания белка в смеси (0,25 г/мл растворителя). Растворитель может представлять собой любой подходящий растворитель, в котором может быть растворен полимер. В идеальном случае, растворитель должен быстро испаряться и не должен быть легковоспламеняющимся. Пригодным растворителем является вода. Поэтому требуется длительное время релаксации для удаления слоя пены из смеси. Более того, во время электропрядения быстро возникало засорение, приводящее к наименьшей наблюдаемой производительности.
Вязкость может быть измерена любым подходящим методом с использованием любых пригодных вискозиметров и реометров, таких, но без ограничения, как вискозиметр Брукфильда. Как правило, вязкость должна следовать желаемой реологической характеристике, и не ограничивается каким-нибудь единичным значением.
Напротив, раствор, приготовленный из декстрана со 100 кДа - испытанного декстрана с наибольшей молекулярной массой - имел наименьшую вязкость. Более низкая вязкость упрощает приготовление раствора, уменьшает образование слоя пены, сокращает частоту засорения.
Подходящая вязкость может быть получена с использованием декстранов с молекулярными массами свыше 40 кДа. Например, такие смеси могут содержать декстраны с молекулярными массами от 50 кДа до около 100 кДа. В вариантах осуществления для получения желаемых уровней вязкости могут быть использованы смеси декстранов с молекулярными массами от 50 кДа до около 100 кДа. В конкретных вариантах осуществления декстран имеет молекулярную массу около 100 кДа.
iii. Размер и формирование волокна
Представляется, что конъюгация полисахарида с белком стимулируется, когда сокращается или устраняется образование бусинок. Бусинки считаются дефектом и тем самым нежелательны. Предпочтительны волокна с малым количеством бусинок или вообще без них. В аспектах изобретения волокна не содержат бусинок, как определяется сканирующей электронной микроскопией.
Диаметр волокна может влиять на конъюгацию. Волокна с меньшими диаметрами обеспечивают плотную упаковку волокон, составленных из молекул WPI и декстрана. Конъюгация стимулируется плотной упаковкой молекул WPI и декстрана. В некоторых аспектах диаметр волокна в некоторых аспектах составляет около 100 нм и около 500 нм. В других аспектах диаметр волокна составляет около 100 нм и около 300 нм. В еще других аспектах диаметр волокна составляет от около 150 нм до около 250 нм. Диаметр волокна может быть измерен, как описано в примере 1.
iv. Соотношение смеси белка и декстрана
Содержание белка в волокне также влияет как на формирование волокон, так и на конъюгацию. Когда содержание белка в смеси возрастает, диаметр волокна сокращается. Например, см. пример 7. Когда содержание белка повышалось до 33% по массе или выше, образовывались бусинки. Таким образом, для сокращения или устранения образования бусинок на волокнах содержание белка в растворе смеси может составлять до 25% масс. Для получения таких уровней процентного содержания, соотношение смеси (масс./масс.) полисахарида к белку в водном растворе, используемом для злектропрядения, может быть таким, как в таблице 1.
Дополнительные подробности в отношении содержания белка в пленках приведены в таблице 9.
Образование гликопротеина, измеренное гель-электрофорезом, стимулируется, когда соотношение "декстран:WPI" возрастает.
Таким образом, для достижения хороших формирования волокон и конъюгации соотношение смеси полисахарида к белку составляет более 2:1. В некоторых аспектах отношение составляет около 3:1, около 4:1, около 5:1, около 6:1, около 7:1, около 8:1, около 9:1, около 10:1, около 11:1, около 12:1. Соответственно, в конкретных аспектах диапазон соотношений может составлять от около 3:1 до около 10:1. В других аспектах отношение может составлять от около 3:1 до около 4:1.
v. Условия отжига
Электропрядение сближает молекулы друг с другом. Затем отжиг создает температуру, которая инициирует взаимодействие между молекулами. Отжиг, как применяемый в данном описании, представляет собой процесс конъюгации, в результате которого между белком и полисахаридом образуются ковалентные связи. Отжиг может быть усилен применением более длительного периода инкубации. Например, продолжительность отжига может иметь нижний предел 2 часа, 4 часа, 6 часов, 8 часов, 10 часов, 12 часов, 14 часов, 16 часов, 18 часов или 24 часа. Продолжительность отжига может иметь верхний предел 4 часа, 6 часов, 8 часов, 10 часов, 12 часов, 14 часов, 16 часов, 18 часов, 24 часа или 28 часов. Часто продолжительность отжига составляет от 2 часов до 4 часов. Цвет пленок становился слегка более темным, когда использовали более длительную продолжительность отжига, в особенности когда пленки подвергали отжигу в течение более 24 часов.
vi. Влияние величины декстрана на конъюгацию
Гликозилирование было более медленным, когда для получения изготовленной электропрядением пленки использовали декстран с молекулярной массой 100 кДа. Однако величина гликопротеинов, образованных между WPI и декстраном с 100 кДа, была больше, чем ~280 кДа, тогда как при формировании из WPI и декстрана с 40 и 70 кДа величины составляли свыше ~70 и ~200 кДа, соответственно.
vii. Влияние влажности на гликозилирование
Способы могут быть исполнены при конкретных уровнях влажности для стимулирования гликозилирования. Более высокая влажность может стимулировать гликозилирование, как определяется более интенсивной полосой гликопротеинов, наблюдаемой в геле с окрашенным гликопротеином. Гораздо меньшая интенсивность полос гликозилирования в геле с окрашенным гликопротеином наблюдалась, когда образцы были подвергнуты отжигу при низкой влажности. Усиленное гликозилирование было получено при 74%-ной относительной влажности (RH) (фиг. 20А и В; полоски 8-10), сравнительно с 0%-ной RH (фиг. 20А и В; полоски 2-4) и 44%-ной RH (фиг. 20А и В; полоски 5-7). Таким образом, в некоторых аспектах относительная влажность составляет по меньшей мере 44%. В других аспектах относительная влажность составляет от 45% до 75% или 65% и 75%; в других дополнительных аспектах относительная влажность составляет от 70% до 80%.
Температура обычно является примерно комнатной температурой; однако принимается во внимание любая подходящая температура от 10°C до 70°C.
а. Оценка конъюгации
Внешний вид WPI-декстрановых конъюгатов может отслеживаться любым подходящим методом. Например, гель-электрофорез может быть предпочтительным способом подтверждения присутствия гликопротеинов в подвергнутой отжигу пленке, изготовленной электропрядением. Метод FTIR (инфракрасной спектроскопии с преобразованием Фурье) не столь четко показывает разницу между ИК-спектрами пленок в состоянии сразу после прядения и подвергнутых отжигу пленок, и поэтому может быть менее полезным.
Содержание цитированных выше патентов, опубликованных заявок и журнальных статей включено в данное описание посредством ссылки.
Наряду с пунктами патентной формулы, изобретение также определяется следующими пунктами:
1. Способ получения углеводно-белкового волокна или частицы электропрядением, включающий стадии
приготовления водного раствора, включающего углевод и белок,
приложения к раствору напряжения от 15 до 25 кВ,
сбора волокна на сборной пластине.
2. Способ по пункту 1, в котором электропрядение является безыгольным.
3. Способ по пункту 1 или пункту 2, в котором углевод имеет альдегидную группу или образует альдегидную группу в результате изомеризации.
4. Способ по пункту 1 или пункту 2, в котором углевод представляет собой декстран.
5. Способ по пункту 4, в котором молекулярная масса декстрана составляет от около 10 кДа до около 500 кДа.
6. Способ по пункту 4, в котором декстран присутствует в концентрации от 0,1 г/мл до около 5,0 г/мл.
7. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором белок выбирают из белков микробного, животного, молочного или растительного происхождения.
8. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором белок представляет собой изолят сывороточного белка (WPI).
9. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором водный раствор включает углевод и белок в молярном соотношении (масс./масс.) от 50:1 до 1:50.
10. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором водный раствор включает углевод и белок в молярном соотношении (масс./масс.) от 3:1 до 1:10.
11. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором водный раствор включает декстран и WPI.
12. Способ по любому из предшествующих пунктов, дополнительно включающий стадию проведения инкубации волокна при относительной влажности по меньшей мере 45%, в течение до 24 часов, посредством чего формируется конъюгированная пленка.
13. Способ по пункту 12, в котором относительная влажность составляет от 65% до 75%.
14. Способ по пункту 12, в котором температура варьируется в диапазоне 10-70°C.
15. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором диаметр волокна составляет от около 100 нм до около 500 нм.
16. Способ по пункту 15, в котором диаметр волокна составляет от около 150 нм до около 250 нм.
17. Способ получения полисахаридно-белкового волокна электропрядением, включающий стадии
приготовления водного раствора, включающего декстран с молекулярной массой 100 кДа и изолят сывороточного белка, где декстран и изолят сывороточного белка присутствуют в молярном соотношении (масс./масс.) от 3:1 до 10:1,
приложения к раствору напряжения от 15 до 25 кВ, посредством чего создается волокно,
сбора волокна на сборной пластине, и
инкубации волокна при относительной влажности по меньшей мере 45% в течение от 4 до 24 часов, посредством чего формируется конъюгированная пленка.
18. Способ по пункту 17, в котором относительная влажность составляет от 65% до 75%.
19. Способ по пункту 17 или пункту 18, в котором инкубация занимает от 4 до 8 часов.
20. Способ по любому из пунктов 16-18, в котором температура варьируется в диапазоне 10-70°C.
21. Способ по любому из пунктов 16-18, в котором электропрядение является безыгольным.
ПРИМЕР 1
Материалы и способы
а. Декстраны
Декстраны со средней молекулярной массой около 40, 70 и 100 кДа, продуцированные бактериями штамма Leuconostoc spp., приобретали у фирмы Sigma-Aldrich (Штайнхайм, Германия). Изолят сывороточного белка BIPRO был поставлен фирмой Davisco Food International, Inc. Все материалы использовали без дополнительной очистки.
Декстрановый порошок и/или изолят сывороточного белка при разнообразных соотношениях смеси (1:0, 0,8:0,2, 0,75:25, 0,67:0,33 и 0,5:0,5 по массе) растворяли в 30 мМ растворе фосфатного буфера. Раствор перемешивали магнитной мешалкой в течение ночи при комнатной температуре (~22°C), для обеспечения полного растворения смеси. Вязкость, удельную электропроводность, плотность и рН раствора измеряли с использованием реометра (Physica, MCS 300, Эшленд, Вирджиния), микропроцессорного измерителя удельной электропроводности (WTW, LF537, Вайнхайм, Германия), денситометра (Anton Paar, DMA 35N, Грац, Австрия) и рН-метра (WTW, Inolab, Вайнхайм, Германия), соответственно. Конечный рН всех растворов составлял 6,50±0,07, что ранее сообщалось как надлежащая величина рН для формирования конъюгатов сывороточного белка-декстрана [7].
b. Электропрядение
Конструкция устройства для электропрядения показана на фиг. 1. Целевой раствор помещали в стеклянный шприц емкостью 10 мл, оснащенный иглой из нержавеющей стали (внутренний диаметр 0,9 мм). Затем шприц помещали в держатель шприца, смонтированный на шприцевом насосе (Harvard Apparatus 11P, Холлистон, Массачусетс). Кончик иглы соединяли с источником высокого напряжения постоянного тока (D.C.) (Gamma High Voltage, ES30P-5W, Ормонд Бич, Флорида). К сборной пластине из нержавеющей стали присоединяли заземленный электрод. Расстояние между кончиком иглы и сборной пластиной поддерживали равным 18 см. Расход потока раствора поддерживали постоянным при 12 мкл/мин. Раствор электрически заряжали при напряжении около +20 кВ. Собранные изготовленные электропрядением пленки замораживали при температуре -28°C перед последующими исследованиями.
Как правило, напряжение во время электропрядения составляло от 15 до 20 кВ, и не выше 25 кВ. Если напряжение будет слишком высоким, возникает дуговой разряд (искрение). Силу тока в амперах повышали, пока не было достигнуто формирование волокон.
с. Анализ морфологии
Изготовленные электропрядением волокна исследовали на предмет их морфологии с использованием сканирующего электронного микроскопа с полевой эмиссией ZEISS ORIGA системы CrossBeam с фокусированным ионным пучком (Оберкохен, Германия). Пленки сушили в вакууме и наносили покрытие из золота в течение около 4 минут. Средние диаметры изготовленных электропрядением волокон определяли анализом изображений с использованием прибора Image J (Национальный Институт здоровья, Бетесда, Мериленд).
d. Характеризация пленок методом FTIR
-1
-1
Изготовленные электропрядением волокна исследовали с применением инфракрасного спектрометра с преобразованием Фурье, оснащенного универсальной приставкой (Perkin Elmer, Spectrum 100, Бэконсфилд, Великобритания) для регистрации спектров нарушенного полного внутреннего отражения (ATP-FTIR). Инфракрасные спектры регистрировали в диапазоне волновых чисел 4000-650 см, с разрешением 4 см и при 10 сканированиях, в режиме пропускания.
е. SDS-PAGE-гели
2
3
Готовые гели TGX-типа (Tris-HCl Gel, линейный градиент 4-20%, 15 лунок) и растворы для окрашивания-обесцвечивания белковых гелей (Bio-Safe Coomassie Stain and Coomassie Destain) были приобретены у фирмы Bio-Rad Laboratories. Стандартный маркер молекулярных масс белков (PageRulerTM Plus Prestained Protein Ladder 26619, 10-250 кДа) и набор для окрашивания гликопротеинов (Pierce Glycoprotein Staining) приобретали у фирмы Thermo Scientific, Pierce Biotechnology (Германия). Стандартный маркер молекулярных масс белков выдерживали при температуре -28°C перед применением. Карбонат калия (КСО) и хлорид натрия (NaCl) были приобретены у фирмы Sigma-Aldrich (Штайнхайм, Германия).
f. Тепловая обработка
2
3
Примерно 5-10 мг изготовленных электропрядением пленок помещали в камеру с регулируемой влажностью. Камеру предварительно доводили до равновесного состояния в обогреваемом горячим воздухом стерилизаторе (Memmert, Model 400, Швабах, Германия), для обеспечения достижения в контрольном объеме равновесной температуры 60°C. Относительная влажность внутри контрольного объема составляла около 0% RH (с использованием силикагеля), 44% RH (с использованием насыщенного раствора KCO) или 74% RH (с использованием насыщенного раствора NaCl).
Отжиг обеспечивал конъюгацию белка и сахарида согласно реакции Майяра.
g. Анализ взаимодействия WPI-декстранового конъюгата исследованием SDS-PAGE
Буфер для образца готовили растворением всех химических соединений, перечисленных в таблице 2, в деионизированной дистиллированной воде до конечного объема 100 мл, и замораживанием при температуре -20°C перед применением.
Таблица 2Состав буфера для образца (200 мл)
Материал
Количество
Трис(гидроксиметил)аминометан
9,085 г
Соляная кислота (концентрированная)
1,250 г
Додецилсульфат натрия (SDS)
6,2 г
Глицерин 20%
40 мл
2-Меркаптоэтанол
6 мл
Бромфеноловый синий
0,4 г
Электродный буфер готовили растворением перечисленных в таблице 3 соединений в деионизированной дистиллированной воде до конечного объема 5000 мл. Буфер хранили при температуре 4°C перед применением.
Таблица 3Состав электродного буфера (1000 мл)
Материал
Количество
Трис(гидроксиметил)аминометан
3 г
Додецилсульфат натрия (SDS)10%
10 мл
Глицерин
14,4 г
Образцы для гель-электрофореза готовили с использованием модифицированного подхода, следуя методу, описанному ранее авторами Zhu и др. (2008). Сначала подвергнутые тепловой обработке пленки, изготовленные электропрядением, растворяли в деионизированной дистиллированной воде до концентрации 80 мкг (содержания белка)/15 мкл. Водный раствор центрифугировали при 16000 g в течение 15 минут при температуре 22°C. Супернатант собирали и дополнительно разводили буфером для образцов до конечной концентрации белка 40 мкг/15 мкл. Затем разведенный раствор нагревали при температуре 95°C на водяной бане в течение по меньшей мере 5 минут для разрушения дисульфидных связей и диссоциации белков (восстановительные условия). Затем раствор выдерживали при охлаждении.
h. Гель-электрофорез
SDS-PAGE выполняли на приборе Mini-PROTEAN Tetra Cell согласно Лэмли (Laemmli, 1970). Анализы восстанавливающим SDS-PAGE проводили на готовых TGX-гелях (Tris-HCl Gel, линейный градиент 4-20%, 15 лунок, Bio-Rad Laboratories). В каждую лунку помещали 10 мкл/лунка образца раствора. Электрофорез проводили в течение около 40 минут при постоянном напряжении 200 В при комнатной температуре. В одно и то же время обрабатывали два геля. После электрофореза в одном геле окрашивали белки, и в еще одном геле окрашивали гликопротеины, для детектирования присутствия WPI-декстрановых конъюгатов.
Для окрашивания белков окрашивали гели на белки и обесцвечивали с использованием Bio-Safe Coomassie Stain и Coomassie Destain (Bio-Rad Laboratories), соответственно. Процесс окрашивания проводили согласно инструкции изготовителя. Кратко, гели промыли избыточным количеством деионизированной дистиллированной воды и перенесли в контейнер для окрашивания, куда добавляли Bio-Safe Coomassie Stain, для полного покрытия геля, на время по меньшей мере 1 час. Затем гели подвергли обесцвечиванию в Coomassie Destain в течение ночи при комнатной температуре.
Для окрашивания гликопротеинов использовали набор Pierce Glycoprotein Staining (Thermo Scientific, Pierce Biotechnology). Гели фиксировали в 100 мл 50%-ного метанола в течение 30 минут и дважды промыли при осторожном перемешивании 100 мл 3%-ной уксусной кислоты в течение 10 минут. Затем гели погружали в окислительный раствор на 15 минут, промывали в 100 мл 3%-ной уксусной кислоты в течение 5 минут (3 раза), окрашивали реагентом для окрашивания гликопротеинов в течение 15 минут, и переносили в восстановительный раствор на 5 минут, при осторожном перемешивании. Наконец, гели промывали избыточным количеством 3%-ной уксусной кислоты, с последующим промыванием деионизированной дистиллированной водой.
i. Исследование развития цвета во время отжига с использованием спектроскопии в УФ и видимой областях спектра
Подвергнутые отжигу пленки, изготовленные электропрядением, растворяли в деионизированной дистиллированной воде до концентрации 5 мг/мл. Раствор энергично взбалтывали с созданием завихрения в течение около двух минут и оставляли спокойно выстаиваться в течение около двадцати минут, затем его снова взбалтывали с образованием завихрения, для обеспечения полного растворения. Все растворы использовали немедленно после приготовления.
j. УФ-спектроскопия
УФ-измерения проводили с использованием UV-VIS-NIR-спектрометра (в УФ-, видимой и ближней ИК-области спектра) с 60 мм внутренней интегрирующей сферой (PerkinElmer, Lambda 750S, Германия). 1 мл образца раствора помещали в полумикрокювету (Brand, PLASTIBRAND, Германия). Образец использовали для сканирования при длине волны от 250 до 350 нм, и присутствие конъюгатов наблюдали при длине волны около 280 нм.
k. NIR-спектры изготовленных электропрядением пленок в состоянии сразу после прядения и подвергнутых отжигу
-1
-1
NIR-спектры матов из ультратонких волокон до и после тепловой обработки исследовали с использованием UV-VIS-NIR-спектрометра) с 60 мм внутренней интегрирующей сферой (PerkinElmer, Lambda 750S, Германия). Спектры регистрировали в диапазоне волновых чисел 250-2500 см в режиме отражения, с разрешением 4 см.
ПРИМЕР 2
Получение волокон, изготовленных электропрядением из декстрана
Декстраны со средней молекулярной массой около 40, 70 и 100 кДа подвергали электропрядению и исследовали морфологию полученных волокон, как описано в примере 1
i. Декстран с молекулярной массой 70 кДа
Декстран (70 кДа) проявлял разнообразные морфологии в зависимости от концентрации. При концентрации 0,5 г/мл (~33% масс./масс.) главным образом образовывались бусинки с некоторыми короткими волокнами (фиг. 2). Повышение концентрации до 0,7 г/мл (~41% масс./масс.) привело к меньшему числу бусинок и непрерывным волокнам (фиг. 3). Дальнейшее повышение концентрации декстрана до 0,8 г/мл (~44% масс./масс.) привело к гладким волокнам (фиг. 4).
ii. Декстран с молекулярной массой 40 кДа
Для декстрана с 40 кДа минимальная пригодная для электропрядения концентрация повышалась до 1 г/мл растворителя (~50% масс./масс.). Морфология волокон была гладкой и непрерывной (фиг. 5). Условия электропрядения поддерживали постоянными при: напряжении, равном 20 кВ, дистанции электропрядения, равной 18 см, и расходе потока раствора, равном 12 мкл/мин.
iii. Декстран с молекулярной массой 100 кДа
Для декстрана со 100 кДа минимальную концентрацию декстрана снижали до 0,6 г/мл (~38% масс./масс.), с получением гладких волокон в таких же условиях электропрядения (фиг. 6).
На основе этих данных рассчитывали минимальную для электропрядения концентрацию растворов декстрана, как в таблице 4.
Таблица 4Минимальная для электропрядения концентрация растворов декстрана
Молекулярная масса декстрана (кДа)
Минимальная для электропрядения концентрация (г/мл растворителя)
40
1,0
70
0,8
100
0,6
ПРИМЕР 3
Анализ вязкости смесей "WPI-декстран"
Как правило, раствор полимера может быть подвергнут электропрядению только в пределах надлежащего диапазона вязкостей (1-20 Пуаз) [14]. Если вязкость является слишком высокой, может происходить засорение во время электропрядения [15]. Вязкость зависит от концентрации полимера и молекулярной массы полимера. Готовили смеси декстрана-изолята сывороточного белка, и исследовали вязкость смесей. Концентрация смеси зависела от молекулярной массы декстрана. Общая концентрация была такой же, как минимальная для электропрядения концентрация раствора декстрана, показанная в таблице 4.
Соотношение смеси между декстраном и изолятом сывороточного белка поддерживали постоянным при 3:1 (по массе). Составы смесей обобщены в таблице 5.
Таблица 5Составы смесей декстрана и изолята сывороточного белка
№
Молекулярная масса декстрана (кДа)
Общее содержание твердого вещества (г/мл растворителя)
Декстран
Изолят сывороточного белка
1
40
0,75
0,25
2
70
0,60
0,20
3
100
0,45
0,15
На фиг. 7 показана вязкость этих смесей. Вязкость смеси номер 1 составляла приблизительно 1,8 Пуаз (Па·сек), и была примерно в 2-5 раз выше, чем вязкость смесей номер 2 и 3, соответственно.
Высокая вязкость раствора, приготовленного из декстрана с 40 кДа, создает две проблемы. Во-первых, было затруднительным изготовление раствора и обращение с ним, поскольку раствор был не только вязким, но также очень липким. Во время растворения смеси образовывался толстый слой пены (~60% от общей высоты), вероятно, вследствие очень высокого содержания сывороточного белка в растворе. После перемешивания в течение ночи было необходимо оставлять раствор в вакуумной камере, для удаления воздуха с поверхности раздела "белок-воздух". Во-вторых, быстро происходило засорение во время электропрядения вследствие высокой вязкости раствора.
В результате, производительность была самой низкой в случае смеси, приготовленной из декстрана с наименьшей молекулярной массой. Соответственно, было более удобным изготовление и электропрядение смеси, полученной из декстрана с молекулярной массой 100 кДа, который имел наименьшую вязкость (около 0,4 Па·сек).
ПРИМЕР 4
Анализ морфологии изготовленных электропрядением волокон
Волокна, изготовленные электропрядением декстрана-изолята сывороточного белка, получали, как описано в таблице 1, к которым добавляли изолят сывороточного белка в растворе декстрана при соотношении смеси 3:1 (декстран-изолят сывороточного белка). На фиг. 8 показаны избранные SEM-изображения волокон, изготовленных электропрядением декстрана-изолята сывороточного белка. Для всех образцов волокна были гладкими, и бусинки не наблюдались. См. фиг. 8А-С. Эти данные показали, что концентрация полимера в каждом растворе была выбрана надлежащим образом, и что введение изолята сывороточного белка в растворе декстрана при соотношении смеси 3:1 (декстран-изолят сывороточного белка) не оказывало негативного влияния на пригодность смеси к электропрядению.
Диапазон диаметров волокна соответственно фиг. 8А-С показан на фиг. 8А-F. Диаметры волокон из декстрана-изолята сывороточного белка, полученных из декстрана с 40, 70 и 100 кДа, составляли 410±180, 247±82, 173±72 нм, соответственно. Разница в диаметрах волокон может быть обусловлена различиями вязкостей растворов.
Вязкость смеси, полученной из декстрана с 40 кДа, была наивысшей вследствие большой минимально возможной для электропрядения концентрации. В случае смеси, приготовленной из декстрана с 40 кДа, наблюдалось проявление быстрого засорения и образования волокон с очень большим средним диаметром. Это могло быть следствием высокой вязкости. Напротив, приготовление смеси декстрана со 100 кДа/изолята сывороточного белка и обращение с нею были более простыми, смесь проявляла меньшую частоту засорения и давала волокна с меньшими диаметрами.
Соответственно, декстраны с молекулярными массами от 40 кДа до 100 кДа применимы для формирования волокон, причем предпочтительны декстраны со 100 кДа.
ПРИМЕР 5
Свойства смесей, содержащих декстран и WPI
Порошок декстрана и/или изолят сывороточного белка в различных соотношениях смеси (1:0, 0,8:0,2, 0,75:25, 0,67:0,33 и 0,5:0,5 по массе) растворяли в 30 мМ растворе фосфатного буфера. Раствор перемешивали магнитной мешалкой в течение ночи при комнатной температуре (~22°C), для обеспечения полного растворения смеси. Вязкость, удельную электропроводность, плотность и рН раствора измеряли с использованием реометра (Physica, MCS 300, Эшленд, Вирджиния), микропроцессорного измерителя удельной электропроводности (WTW, LF537, Вайнхайм, Германия), денситометра (Anton Paar, DMA 35N, Грац, Австрия) и рН-метра (WTW, Inolab, Вайнхайм, Германия), соответственно. Конечный рН всех растворов составлял 6,50±0,07.
Исследовали влияние концентрации декстрана и соотношения смеси между декстраном и изолятом сывороточного белка на свойства растворов и морфологию волокон.
На фиг. 9 показаны реологические характеристики водного раствора декстрана. Вязкость растворов, имеющих концентрации 0,7, 0,6, 0,45 и 0,3 г/мл растворителя, составляли приблизительно 1,4, 0,7, 0,3 и 0,1 Па·сек, соответственно. В таблице 6 показан коэффициент консистентности и показатель текучести всех растворов. Первые три раствора (с концентрациями 0,7, 0,6 и 0,45 г/мл растворителя) проявляли характеристики разжижения при сдвиговой нагрузке, как подтверждено показателем текучести, n<1. При концентрации 0,3 г/мл растворителя реологические характеристики раствора становились все более Ньютоновскими, что свидетельствует о значительном сокращении переплетений полимерных цепей.
Таблица 6Коэффициент консистентности и показатели текучести
№
Концентрация (г/мл растворителя)
k
n
1
0,70
2,398±0,314
0,92±0,02
0,60
0,844±0,039
0,97±0,01
3
0,45
0,305±0,087
0,98±0,03
4
0,30
0,075±0,002
1,01±0,01
Значения k и n представляют средние величины±стандартное отклонение в дубликатных измерениях.
Когда к раствору декстрана добавляли WPI, вязкость смеси значительно снижалась. На фиг. 10 показано влияние содержания WPI на вязкость смеси декстрана-изолята сывороточного белка, по сравнению с раствором чистого декстрана. Более высокое содержание WPI коррелирует с более низкой вязкостью смеси. Это могло быть обусловлено глобулярной структурой изолята сывороточного белка, снижающей степень переплетения цепей декстрана в смеси; и проявлялось в снижении вязкости смеси. Показатели текучести смесей сокращались по мере повышения содержания белка (таблица 7). При соотношении смеси 0,5:0,5 смесь представлялась имеющей Ньютоновские характеристики течения, подобно раствору декстрана, который имел наименьшую концентрацию в 0,3 г/мл растворителя.
Таблица 7Коэффициент консистентности (k) и показатель текучести (n) раствора декстрана и смеси декстран (100 кДа)-изолят сывороточного белка
№
Общее содержание твердого вещества (г/мл растворителя)
Соотношение смеси (декстран:WPI)
k
n
1
0,60
1:0
0,84±0,04
0,97±0,01
2
0,60
0,80:0,20
0,65±0,06
0,97±0,01
3
0,60
0,75:0,25
0,52±0,06
0,98±0,02
4
0,60
0,67:0,33
0,41±0,03
0,99±0,01
5
0,60
0,50:0,50
0,24±0,02
1,02±0,01
Значения k и n представляют средние величины±стандартное отклонение в дубликатных измерениях.
В отличие от вязкости, удельная электропроводность смесей повышалась по мере роста содержания белка (таблица 8). WPI имеет результирующий отрицательный заряд, поскольку величина рН смеси составляла около 6,5, и изоэлектрическая точка (pI) сывороточного белка составляла ~5,2. Полярная структура изолята сывороточного белка тем самым повышает общую подвижность ионов в смеси, приводя к более высокой удельной электрической проводимости.
Таблица 8Влияние содержания изолята сывороточного белка на удельную электрическую проводимость смесей
№
Соотношение смеси
Удельная электрическая проводимость* (мСм/см)
Декстран со 100 кДа
Изолят сывороточного белка (WPI)
1
1
0
0,64±0,06
2
0,80
0,20
0,92±0,00
3
0,75
0,25
1,09±0,03
4
0,67
0,33
1,26±0,02
5
0,50
0,50
1,51±0,03
*Приведенные значения представляют среднюю величину±стандартное отклонение в дубликатном измерении.
ПРИМЕР 6
Морфология волокон, изготовленных электропрядением из декстрана и смесей декстрана/WPI
а. Волокна только из декстрана
Волокна получали с использованием декстрана со 100 кДа при различных концентрациях. На фиг. 11 показано влияние концентрации декстрана с молекулярной массой 100 кДа на морфологию декстрановых волокон. При наименьшей концентрации (0,3 г/мл растворителя) формировались главным образом бусинки со средним диаметром 800 нм и немногие короткие волокна (фиг. 11А). Это свидетельствует о том, что имело место недостаточное переплетение полимерных цепей, как показано Ньютоновским характером течения, что проявлялось в характеристиках зависимости "сдвиговая нагрузка-деформация" или в показателе текучести раствора, которые обобщены в таблице 8. Повышение концентрации полимера до 0,45 г/мл растворителя заметно снизило формирование бусинок (фиг. 11В). Морфология стала более волокнистой со средним диаметром около 90 нм. Изредка наблюдались короткие волокна, показывая, что переплетение полимерных цепей все еще было слишком небольшим для образования непрерывных волокон. Гладкие и непрерывные волокна были сформированы, когда концентрация декстрана составляла 0,6 г/мл растворителя (фиг. 11С). Средний диаметр волокна был найден составляющим около 180 нм. Дальнейшее повышение концентрации декстрана до 0,7 г/мл растворителя привело к существенному увеличению среднего диаметра волокон до около 300 нм. (См. фиг. 11Е-Н). Эти данные подтверждают, что для декстрана со 100 кДа концентрация 0,6 г/мл растворителя является оптимальной.
b. Волокна из декстрана-WPI
Изолят сывороточного белка примешивали к раствору декстрана с концентрацией 0,6 г/мл при различных соотношениях смеси (см. таблицу 8). На фиг. 12 показано влияние содержания изолята сывороточного белка на морфологии изготовленных электропрядением волокон. Средний диаметр волокна слегка снизился от 192 нм (фиг. 12А и F) до 186 нм (фиг. 12В и G), когда соотношение смеси между декстраном и содержанием сывороточного белка изменялось от 1:0 до 0,8:0,2. Дальнейшее повышение содержания сывороточного белка в результате изменения соотношения смеси до 0,75:0,25 снизило средний диаметр волокна до около 161 нм (фиг. 12С и Н).
Снижение диаметра волокон обусловливается повышением удельной электрической проводимости и снижением вязкости смеси, когда содержание изолята сывороточного белка было более высоким, что благоприятствует растяжению полимерных струй во время электропрядения, приводя к более тонким волокнам.
Однако когда содержание сывороточного белка было равным или более высоким, чем 33%, на волокнах наблюдались бусинки (См. фиг. 12D и 12I, и 12Е и 12J), показывая, что вязкость смесей была слишком низкой. Соответственно, оптимальным является содержание сывороточного белка менее 33%.
ПРИМЕР 7
Анализ содержания белка в волокнах с использованием инфракрасного спектрометра с Фурье-преобразованием (FTIR)
-1
-1
-1
2
r
r
Измерения FTIR выполняли, как описано в примере 1. Регистрировали ИК-спектры смесей, имеющих различное количество декстрана (порошка) и изолята сывороточного белка (порошка) (фиг. 13В). Пик поглощения полосы "амид II" в области около 1520 см значительно возрастал с содержанием белка, и был использован в качестве показателя содержания белка в образце. Из каждого спектра рассчитывали соотношение между пиком поглощения при волновых числах около 1520 см и 1000 см, и данные повторно наносили на график на фиг. 13В. Интересно, что линейная зависимость между содержанием (ω) белка и соотношением (p) между двумя пиками поглощения была найдена как (R=94,00%): p=7834,0=ω. (уравнение 2.2).
Зависимость оставалась линейной вплоть до концентрации белка 30% масс. Когда содержание сывороточного белка достигало 50%, наблюдалась нелинейная зависимость. Однако, поскольку целевое значение содержания белка, использованное в этом исследовании, составляло около 25% масс., уравнение 2.2 по-прежнему было действительным для количественного анализа.
В таблице 9 показаны значения содержания белка в изготовленных электропрядением пленках, полученных из смесей декстрана-изолята сывороточного белка при различном соотношении смеси. Рассчитанное значение не очень сильно отличалось от соотношения смеси, показывая, что полисахарид и белок подверглись электропрядению одновременно. Это свидетельствует о том, что как белок, так и полисахарид одновременно присутствовали в изготовленных электропрядением волокнах при концентрациях, желательных для последующей реакции образования конъюгата.
Таблица 9Анализ содержания изолята сывороточного белка в изготовленных электропрядением пленках, полученных из декстрана-изолята сывороточного белка при различном соотношении смеси
№
Соотношение смеси
Изолят сывороточного белка* (мас.%)
Декстран со 100 кДа
Изолят сывороточного белка (WPI)
1
1
0
0,20±0,01
2
0,80
0,20
0,22±0,01
3
0,75
0,25
0,32±0,03
*Приведенные значения представляют среднюю величину±стандартное отклонение в дубликатном измерении.
ПРИМЕР 8
Анализ формирования WPI-декстрановых конъюгатов
Хотя WPI-белок был связан с декстрановыми волокнами, авторам настоящего изобретения было необходимо подтвердить, что происходила конъюгация, т.е. образование ковалентных связей. Соответственно, авторы настоящего изобретения исследовали условия, где формируются конъюгаты между WPI и декстраном, и изучили, как молекулярная масса декстрана, влажность во время отжига и соотношение смеси между WPI и декстраном влияют на образование WPI-декстрановых конъюгатов.
Для подтверждения присутствия гликопротеинов в подвергнутых отжигу пленках, изготовленных электропрядением, использовали гель-электрофорез, и для исследования развития цвета во время отжига и для получения NIR-спектров изготовленных электропрядением пленок использовали UV-VIS-NIR-спектрометр.
ПРИМЕР 9
Внешний вид подвергнутых тепловой обработке пленок
На фиг. 14 показан внешний вид изготовленных электропрядением пленок в состоянии сразу после прядения и подвергнутых отжигу. Цвет пленок в состоянии сразу после прядения был белым при более низких плотностях, тогда как подвергнутые отжигу образцы имели повышенную плотность и были слегка более желтоватыми (фиг. 14). После отжига запах не обнаруживался, показывая, что продукты реакции Майяра с низкой молекулярной массой не образовывались. Цвет пленок становился более желтым по мере увеличения продолжительностей отжига.
ПРИМЕР 10
Анализ формирования конъюгатов
-1
Первоначальные подходы к выявлению гликозилированных белков путем регистрации ИК-спектров были малоуспешными. Авторы настоящего изобретения ожидали значительного изменения характеристик оптической плотности в ИК-спектрах WPI-декстрановых конъюгатов в области около 1630-1640 см вследствие растягивающих (валентных) колебаний N=С-связей (образование оснований Шиффа в качестве продуктов реакции Майяра) [16, 17]. Однако ИК-спектры, полученные на смеси порошка WPI-декстрана и на изготовленных электропрядением пленках, которые были подвергнуты отжигу при температуре 60°C и 74%-ной относительной влажности, не проявляли существенных различий. См. фиг. 15. Это могло быть обусловлено тем, что способ был недостаточно чувствительным для детектирования присутствия WPI-декстрановых конъюгатов в подвергнутых отжигу пленках, изготовленных электропрядением, в сравнении с присутствием непрореагировавших декстрана и WPI.
Поэтому конъюгацию оценивали с использованием гель-электрофореза, как описано в примере 1, который является более эффективным в обнаружении формирования гликопротеинов в образцах.
Авторы настоящего изобретения выбрали декстран с 40 кДа, поскольку сообщалось, что декстраны с меньшей молекулярной массой могут облегчать формирование WPI-декстрановых конъюгатов лучше, чем декстраны с более высокой молекулярной массой [1], давая возможность авторам настоящего изобретения подтвердить эффективность способа до применения целевого декстрана (100 кДа). На фиг. 16 показана картина SDS-PAGE для конъюгатов "WPI-декстран-40 кДа", которые были подвергнуты отжигу при температуре 60°C в течение до 48 часов. Неожиданно оказалось, что конъюгаты "WPI-декстран 40 кДа" образовывались в образце, который был подвергнут отжигу столь непродолжительно, как в течение 2 часов (полоска 3).
После того, как гликозилирование было подтверждено для волокон из декстрана-40 кДа и WPI, получали электропрядением пленки из смеси WPI и декстрана-100 кДа. Пленки подвергали отжигу, и готовили растворы образцов с использованием таких же условий, как для образцов WPI-декстрана-40 кДа. Затем на приготовленных образцах проводили эксперимент с использованием гель-электрофореза. В тот же гель вводили образцы, изготовленные из ранее подвергнутых отжигу, изготовленных электропрядением, пленок WPI-декстрана-40 кДа, для их сравнения с растворами, полученными из подвергнутого отжигу WPI-декстрана-100 кДа. Картины SDS-PAGE WPI-декстрановых конъюгатов показаны на фиг. 17. На фиг. 17А и 17В показаны изображения гелей с окрашиванием белка и окрашиванием гликопротеина, соответственно. Эксперименты на обоих гелях проводили в одно и то же время.
Для образцов, приготовленных из декстрана-40 кДа, результаты были подобны тем, которые показаны на фиг. 16. Полосы WPI значительно сократились после того, как пленка была подвергнута отжигу в течение 8 часов (полоска 3). При более длительной продолжительности отжига (полоска 4 и 5: 16 и 24 часа, соответственно) полоса соединений с более высокой молекулярной массой становилась более интенсивной. Это свидетельствует о том, что гликозилирование с участием белка и декстрана усиливается при более длительной продолжительности отжига (фиг. 17В).
Картины SDS-PAGE изготовленных электропрядением пленок, полученных из декстрана-100 кДа (полоски 6-9), показывают сходное поведение с теми, которые получены из декстрана-40 кДа (полоски 2-5), но с меньшей интенсивностью и более высоким местоположением в геле. Авторы настоящего изобретения полагают, что больший размер декстрана-100 кДа уменьшал подвижность молекул или сокращал число точек контакта между молекулами (оба фактора, которые облегчают реакцию). Таким образом, очевидно, что реакция была менее эффективна, чем реакция с более мелким декстраном-40 кДа. Тем не менее, из фиг. 17В ясно, что конъюгаты образуются, и что их величина была гораздо больше, чем величина конъюгатов WPI-декстрана-40 кДа.
На фиг. 18А и В показаны SDS-PAGE-профили конъюгатов WPI-декстрана (70 кДа). Как и до этого, гликопротеиновая полоса становилась более интенсивной при более продолжительном отжиге. Интенсивность полосы была меньше, чем для образца, полученного из декстрана-40 кДа, но больше, чем для образца, изготовленного из декстрана-100 кДа. В тот же гель также помещали стандартный маркер молекулярных масс белков, для построения стандартной кривой молекулярных масс для мини-геля нанесением на график дистанций перемещения относительно белков с известными молекулярными массами (фиг. 3.6). Таким образом, гликопротеины, обнаруженные в изготовленных электропрядением пленках, полученных из декстрана 40 кДа, 70 кДа и 100 кДа, могли быть оценены как имеющие молекулярные массы >70 кДа, >200 кДа и >280 кДа, соответственно.
На фиг. 20А и В показано влияние влажности на гликозилирование. Была гораздо меньшая интенсивность полос гликозилирования в геле с окрашенным гликопротеином, когда образцы подвергали отжигу при низкой влажности (0% RH и 44% RH). Усиленное гликозилирование наблюдалось при 74% RH (см. полоски 8-10).
Полимерные молекулы в изготовленных электропрядением волокнах хорошо переплетены, и, вследствие чего, подвижность молекул ограничена. Повышенная влажность может увеличивать гибкость цепей, приводя к более интенсивным взаимодействиям и тем самым большему формированию WPI-декстрановых конъюгатов.
Два основных компонента в изоляте сывороточного белка, использованном в этом эксперименте, β-лактоглобулин и α-лактальбумин, имеют молекулярную массу около 18 и 14 кДа, соответственно. Это согласуется с четырьмя полосами, найденными в области около 14, 18, 30 и 36 кДа, которые могли быть приписаны мономерам и димерам двух основных компонентов в WPI (фиг. 18А). Полоса в области около 60 кДа была отнесена на счет бычьего сывороточного альбумина (BSA) [7, 19].
Присутствие этих основных полос во всем геле с окрашенным белком означает, что непрореагировавший WPI остается в изготовленной электропрядением пленке даже после отжига в течение 24 часов. Этим подразумевается, что соотношение смеси между декстраном и WPI может быть скорректировано с повышением доли декстрана или сокращением доли WPI в растворах-предшественниках. Таким образом, изготовленные электропрядением пленки были получены из WPI и декстрана со 100 кДа при различных молярных соотношениях. На фиг. 21 показана картина SDS-PAGE для этих изготовленных электропрядением пленок. В геле с окрашенным гликопротеином было подтверждено присутствие гликопротеиновых полос во всех подвергнутых отжигу изготовленных электропрядением пленках (полоски 2-4, 6-8, 10-12), но не в пленках в состоянии сразу после прядения (полоска 1, 5 и 9). Интенсивность гликопротеиновых полос изменялась в следующем порядке: полоски 10-12 > полоски 6-8 > полоски 2-4. Однако не было существенной разницы в интенсивности полос малых молекул (β-лактоглобулин, α-лактальбумин и BSA). Могло быть возможным, что оптимальное соотношение смеси между декстраном-100 кДа и WPI может быть выше, чем 2:1, использованного в этом исследовании осуществимости способа.
ПРИМЕР 11
Развитие цвета во время отжига
Для отслеживания развития цвета подвергаемых отжигу изготовленных электропрядением пленок в зависимости от времени регистрировали спектры поглощения с использованием UV-VIS-NIR-спектрометра. На фиг. 22А и 22В показаны УФ-спектры поглощения изготовленных электропрядением пленок, полученных из декстрана-40 кДа, подвергнутых отжигу в течение различных периодов времени. Спектры показывают только один четкий пик поглощения в области около 280 нм, которая имеет такую же длину волны, которая была использована для обнаружения остаточного белка в образцах [20, 21]. Результат показывает, что пик поглощения возрастают с увеличением продолжительности отжига.
Концентрацию WPI поддерживали постоянной в каждом образце раствора; поэтому усиление поглощения может быть обусловлено увеличением размеров гликопротеинов сравнительно с нативными молекулами WPI. Это свидетельствует о том, что более длительная продолжительность отжига содействует большему формированию гликопротеинов. График зависимости между пиком поглощения и продолжительностью отжига выглядит похожим на сигмоидальную кривую. В начале отжига молекулы декстрана и WPI могли нуждаться в периодах релаксации для повторного выравнивания относительно друг друга, тем самым было только незначительное усиление формирования гликопротеина (0-4 часа). После этого начального периода релаксации гликозилирование может протекать с более высокой скоростью, начиная от 4 часов до 24 часов). Между 24 часами и 48 часами скорость гликозилирования снижается, вероятно, вследствие сокращения числа реакционных центров. Подобные тенденции также наблюдались в изготовленных электропрядением пленках, полученных из декстрана с 70 кДа (фиг. 23А и 23В).
Напротив, изготовленные электропрядением пленки, полученные из декстрана со 100 кДа-WPI при соотношении смеси 1:2, проявляли необычную флуктуацию в УФ-поглощении (фиг. 24А). Результаты экспериментов с гель-электрофорезом подтвердили, что имело место увеличение содержания гликопротеинов с течением времени, независимо от размера декстрана; таким образом, флуктуация могла быть обусловлена самим измерением. Поскольку все растворы были приготовлены с такой же концентрацией, как растворы, приготовленные из изготовленных электропрядением пленок, полученных из декстрана с 40 кДа и декстрана с 70 кДа, авторы настоящего изобретения предполагают, что более крупные молекулы декстрана и/или гликопротеины могут препятствовать поглощению света.
Поэтому готовили растворы с более низкими концентрациями, от 5 до 3 мг/мл. Предполагалось, что мешающее влияние размера молекул на поглощение света будет снижено. На фиг. 24В показана тенденция, подобная фиг. 22В и 23В. Однако, когда соотношение смеси между декстраном-100 кДа и WPI повышали до 1:1, мешающее влияние проявлялось вновь (фиг. 25А). И увеличение соотношения смеси до 2:1 было результатом еще больших помех (фиг. 25В). При каждом измерении наблюдались высокие уровни шума (фиг. 26). Эти результаты контрастировали с результатами гель-электрофореза или даже простыми визуальными наблюдениями (фиг. 27), что свидетельствовало об образовании окрашенного продукта.
ПРИМЕР 12
Колориметрический анализ
Готовили подвергнутую отжигу изготовленную электропрядением пленку, содержащую WPI-декстрановые волокна, и проводили отжиг, как описано выше. Для оценки развития цвета подвергнутых отжигу изготовленных электропрядением пленок, которые были получены из декстрана со 100 кДа, использовали колориметр. Как и ожидалось, светлота образца снижалась, тогда как желтизна усиливалась по мере увеличения продолжительности отжига (фиг. 28А-С). Лучшей является меньшая цветность, например, меньшая желтизна или коричневый оттенок. В идеальном случае, пленки являются бесцветными. Реакции следует останавливать после реакции образования оснований Шиффа во избежание окрашивания.
ПРИМЕР 13
Анализ NIR-спектров
Регистрировали NIR-спектры изготовленных электропрядением пленок, полученных из WPI и декстрана со 100 кДа и подвергнутых отжигу при различной продолжительности (фиг. 29А и В). Авторы настоящего изобретения не обнаружили нового пика поглощения в диапазоне от 2000 до 2300 нм, которые были отнесены на счет вторичных структур белковых молекул [20, 22]. Это могло свидетельствовать о том, что существенного изменения вторичных структур белков во время отжига при температуре 60°C не происходило. Этот результат согласуется с FTIR-спектрами изготовленных электропрядением пленок в состоянии сразу после прядения и подвергнутых отжигу (фиг. 15). Наблюдаемый пик проявлялся в области около 1400 нм, который может быть приписан первому обертону валентных колебаний связей О-Н вследствие присутствия воды во время отжига в среде с высокой влажностью, и валентным колебаниям связей N-Н в белковых молекулах [20, 23]. В целом же, отражательная способность подвергнутых отжигу изготовленных электропрядением пленок сдвигалась в сторону понижения. Это было обусловлено тем, что подвергнутые отжигу изготовленные электропрядением пленки становились слегка меньшей светлоты при более длительной продолжительности отжига; это приводило в более высокой способности поглощать свет. Все спектры подвергнутых отжигу изготовленных электропрядением пленок показывают меньшие значения коэффициента отражения (или более высокую оптическую плотность) в области около 280 нм, в сравнении с пленками в состоянии сразу после прядения. Как правило, чем темнее пленка, тем более проблематичной является пленка, и проведение FTIR-анализа является затруднительным.
В качестве еще одного примера, каждый из признаков приведенных выше иллюстративных примеров может быть использован по отдельности или в комбинации или субкомбинации с элементами других примеров. Например, любые из описанных выше систем и способов или их частей, могут быть объединены с другими способами и системами или их частями, описанными выше. Например, специалисту с данной области будет понятно, что стадии, проиллюстрированные на иллюстративных фигурах, могут быть выполнены в ином порядке, нежели указанный, и что одна или более проиллюстрированных стадий необязательно могут быть в соответствии с аспектами изобретения. Также будет принято во внимание и понятно, что модификации могут быть сделаны не отходя от подлинного существа и объема настоящего изобретения. Тем самым описание должно толковаться как иллюстративное, но не ограничивающее настоящее изобретение.
Источники информации
1. Jiménez-Castaño, L., M. Villamiel, и R. López-Fandiño, Glycosylation of individual whey proteins by Maillard reaction using dextran of different molecular mass. Food Hydrocolloids, 2007. 21(3): p. 433-443.
2. Livney, Y.D., Milk proteins as vehicles for bioactives. Current Opinion in Colloid and Interface Science, 2010. 15(1-2): p. 73-83.
3. Zhu, D.A.N., S. Damodaran, and J.A. Lucey, Physicochemical and emulsifying properties of whey protein isolate (WPI)-dextran conjugates produced in aqueous solution. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2010. 58(5): p. 2988-2994.
4. Kato, A., K. Minaki, and K. Kobayashi, Improvement of emulsifying properties of egg white proteins by the attachment of polysaccharide through maillard reaction in a dry state. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1993. 41(4): p. 540-543.
5. Xu, D., et al., The effect of whey protein isolate-dextran conjugates on the freeze-thaw stability of oil-in-water emulsion. Journal of Dispersion Science and Technology, 2011, 32(1): p. 77-83.
6. Jiménez-Castaño, L., et al., Effect of the dry-heating conditions on the glycosylation of β-lactoglobulin with dextran through the Maillard reaction. Food Hydrocolloids, 2005. 19(5): p. 831-837.
7. Zhu, D., S. Damodaran, and J.A. Lucey, Formation of whey protein isolate (WPI)-dextran conjugates in aqueous solutions. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2008. 56(16): p. 7113-7118.
8. Akhtar, M. and E. Dickinson, Emulsifying properties of whey protein-dextran conjugates at low pH and different salt concentrations. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2003. 31(1-4): p. 125-132.
9. Lillard, J.S., D.A. Clare, and C.R. Daubert, Glycosylation and expanded utility of a modified whey protein ingredient via carbohydrate conjugation at low pH. Journal of Dairy Science, 2009. 92(1): p. 35-48.
10. Nie, H., et al., Effect of poly(ethylene oxide) with different molecular weights on the electrospinnability of sodium alginate. Polymer, 2009. 50(20): p. 4926-4934.
11. Jiang, H., et al., Optimization and characterization of dextran membranes prepared by electrospinning. Biomacromolecules, 2004. 5(2): p. 326-333.
12. Shenoy, S.L., et al., Role of chain entanglements on fiber formation during electrospinning of polymer solutions: Good solvent, non-specific polymer-polymer interaction limit. Polymer, 2005. 46(10): p. 3372-3384.
13. Ritcharoen, W., et al., Electrospun dextran fibrous membranes. Cellulose, 2008, 15(3): p. 435-444.
14. Deitzel, J.M., et al., The effect of processing variables on the morphology of electrospun nanofibers and textiles. Polymer, 2001. 42(1): p. 261-272.
15. Kanjanapongkul, K., S. Wongsasulak, and T. Yoovidhya, Investigation and prevention of clogging during electrospinning of zein solution. Journal of Applied Polymer Science, 2010. 118(3): p. 1821-1829.
16. Keypour, H, S. Salehzadeh, and R.V. Parish, Synthesis of two potentially heptadentate (N403) Schiff-base ligands derived from condensation of tris(3-aminopropyl)-amine and salicylaldehyde or 4-hydroxysalicylaldehyde. Nickel(II) and copper(II) complexes of the former ligand. Molecules, 2002. 7(2): p. 140-144.
17. Amsden, J.J., et al., Different structural changes occur in blue- and green-proteorhodopsins during the primary photoreaction. Biochemistry, 2008. 47(44): p. 11490-11498.
18. Etzel, M.R. and T. Bund, Monoliths for the purification of whey protein-dextran conjugates. Journal of Chromatography A, 2011. 1218(17): p. 2445-2450.
19. Patel, H.A., et al., Methods to determine denaturation and aggregation of proteins in low-, medium- and high-heat skim milk powders. Dairy Science and Technology, 2007. 87(4-5): p. 251-268.
20. Aït Kaddour, A., et al., Physico-chemical description of bread dough mixing using two-dimensional near-infrared correlation spectroscopy and moving-window two-dimensional correlation spectroscopy. Journal of Cereal Science, 2008. 48(1): p. 10-19.
21. Pan, B., et al., Study on interaction between gold nanorod and bovine serum albumin. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects, 2007. 295(1-3): p. 217-222.
22. Izutsu, K.I., et al., Near-infrared analysis of protein secondary structure in aqueous solutions and freeze-dried solids. Journal of Pharmaceutical Sciences, 2006. 95(4): p. 781-789.
23. Segtnan, V.H. and T. Isaksson, Temperature, sample and time dependent structural characteristics of gelatine gels studied by near infrared spectroscopy. Food Hydrocolloids, 2004. 18(1): p.
Содержание цитированных выше патентов, опубликованных заявок и журнальных статей включено в данное описание посредством ссылки.