СПОСОБ СТИМУЛЯЦИИ МОРФОГЕНЕЗА В КУЛЬТУРЕ ТКАНИ ЯЧМЕНЯ
METHOD FOR MORPHOGENESIS STIMULATION IN BARLEY TISSUE CULTURE

Изобретение относится к биотехнологии растений и может быть использовано в работах по клеточной и генной инженерии ячменя для повышения морфогенетического потенциала каллусной ткани.
in vitro
Каллусная культура - неорганизованная пролиферирующая ткань, состоящая из дедифференцированных клеток. При повышении концентрации цитокининов в питательной среде часть каллуса способна переходить к морфогенезу (регенерации), т.е. образованию и дифференцировке органов и тканей, которая происходит за счет процессов деления и дифференциации клеток [Лутова Л.А. Биотехнология высших растений / Л.А. Лутова // Изд-во СПб-университета, 2010. - 238 с.]. У ячменя морфогенетический потенциал каллусной ткани реализуется лишь в течение короткого времени (двух-четырех недель), что лимитирует манипуляции  для данной культуры и снижает выход растений-регенерантов, в особенности в работах по генетической трансформации, где увеличивается количество пассажей каллуса и имеют место факторы, дополнительно снижающие регенерационную способность. Это обусловливает необходимость поиска подходов к повышению морфогенетического потенциала в культуре ткани ячменя.
Известен способ получения растений-регенерантов при культивировании каллусной ткани на плотной питательной среде с минеральной основой по Мурасиге и Скугу (МС). Индукция морфогенеза осуществляется путем введения в среду фитогормонов - ауксинов и цитокининов в определенном соотношении, которое обусловлено видом культивируемого злака [Внучкова В.А. Методические указания по индукции каллуса и растений-регенерантов зерновых злаков при культивировании незрелых зерновок / М., 1987. - 22 с.]. Недостатком данного способа является высокая обусловленность выхода растений-регенерантов генотипическими особенностями донорного растения. Для повышения морфогенетической активности каллуса необходимо подбирать оптимальное соотношение фитогормонов практически для каждого генотипа (сорта), что делает процесс чрезмерно трудоемким и мало предсказуемым.
2+
2+
Известен способ стимуляции регенерации в каллусной культуре ячменя путем повышения в МС-среде концентрации ионов меди [Dahleen L.S. Improved plant regeneration from barley cultures callus by increased copper levels // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 1995. V. 43. P. 267-269]. Данный подход способствовал существенному повышению регенерации сорта Hector на среде с концентрацией ионов меди 50 mM и сорта Excel - на среде с концентрацией ионов Cu 5,0 mM. Недостатком способа также является необходимость подбора концентрации ионов Cu для каждого генотипа ячменя, т.к. авторы указывают оптимальную концентрацию меди для конкретного сорта.
in vitro
Известным способом повышения регенерации растений  является регуляция уровня эндогенного этилена за счет внесения в питательную среду 1-аминоциклопропан 1-карбоксильной кислоты - активатора продукции этилена либо блокирования продукции этилена нитратом серебра [Jha А.K., Dahleen S.L., Suttle J.C. Ethylene influences green plant regeneration from barley callus / Plant Cell Rep, 2007. V. 26. P. 285-290]. Недостатком такого подхода является то, что уровень эндогенного гормона обусловлен генотипом, поэтому одни сорта требуют внесения ингибитора, а другие - активатора продукции этилена. Инструментальное определение уровня этилена для каждого сортообразца затруднительно, поэтому данный способ неудобно применять на практике.
in vitro
Известен способ стимуляции морфогенеза в культуре каллусной ткани и получения растений-регенерантов путем введения ацетона (10-20 г/л) в состав среды МС для инициации каллуса и формирования регенерантов. Введение ацетона способствует процессу закладки меристематических зон в каллусе пшеницы и увеличению числа растений-регенерантов [Внучкова В.А. Способ получения растений-регенерантов  / Патент РФ №2027757, публикация заявки 27.01.1995, дата приоритета 04.08.1992]. Недостатками данного способа являются легкая воспламеняемость, летучесть и наркотическое действие ацетона, вследствие чего работа с ним должна проводиться в вытяжных шкафах, что осложняет обычный протокол работы с культурой ткани.
Прототипом изобретения является способ стимуляции морфогенеза в культуре ткани ячменя, при котором среду для пролиферации каллуса или среду для индукции морфогенеза готовят полужидкой (4 г/л агара) с добавлением 5 об. % перфтордекалина (ПФД) и культивируют каллус при постоянном встряхивании (180 об/мин) до появления листовых инициалий [Широких И.Г., Бакулина А.В., Баталова Г.А. Индукция морфогенеза в каллусной ткани ячменя // Доклады РАСХН. 2014. №3. С. 6-10]. Погружение каллусной ткани в питательную среду, содержащую ПФД с газотранспортной функцией, способствовало увеличению доли морфогенного каллуса в каллусной культуре ячменя, а также, по данным гистологической оценки каллуса, стимулировало в ней закладку элементов проводящей системы и эпидермы листовой ткани. Однако активизация морфогенетических процессов в присутствии ПФД не привела к существенному увеличению выхода растений-регенерантов ячменя. Причиной тому, по-видимому, явились возникающие в процессе высокой интенсивности встряхивания механические повреждения каллусной ткани.
Задачей изобретения является разработка способа увеличения частоты регенерации в каллусной культуре ячменя на основе ПФД путем снижения механического воздействия на культивируемый каллус.
Поставленная задача решается тем, что культивирование каллуса проводят в полужидкой МС-среде с добавлением ПФД при постоянном встряхивании с интенсивностью перемешивания 125 об/мин.
Сущность изобретения
10
18
Перфтордекалин (ПФД, химическая формула - CF), ТУ 95-1233 -бесцветная негорючая жидкость без запаха, относящаяся к перфторорганическим соединениям (ПФОС). ПФОС характеризуются высокой химической и биологической устойчивостью, отсутствием токсичности для живых организмов, большой способностью растворять газы (растворяют до 50 об. % кислорода и до 200 об. % углекислого газа) и модифицировать мембраны клеток, облегчая транспорт веществ через них [Иваницкий Г.Р. Биофизика на пороге нового тысячелетия: перфторуглеродные среды и газотранспортные кровезаменители. / Биофизика. 2001. №1. С. 5-33]. Благодаря уникальным свойствам ПФОС были использованы в качестве газотранспортных элементов при глубинном культивировании микроорганизмов [Пименов Е.В., Бакулин М.К., Плетнева А.Ю., Грудцина А.С. Способ культивирования клеток микроорганизмов // Патент РФ №2005139679. Публикация заявки 27.06.2007, дата приоритета 19.12.2005]. Добавление ПФОС и, в частности, перфтордекалина способствовало ускорению роста, увеличению биомассы, интенсификации процессов биосинтеза у различных групп прокариот и некоторых эукариот (простейшие и микромицеты) [Бакулин М.К., Дармова С.В., Бакулин В.М. Теория и практика использования перфторуглеродов «голубой крови» при глубинном культивировании биодеструкторов / Теоретическая и прикладная экология. 2010. №4. С. 4-8].
В изобретении погружение каллусов в полужидкую среду с добавлением ПФД стимулируют процессы морфогенеза в каллусной ткани за счет газотранспортной функции ПФД, увеличения площади соприкосновения со средой и возрастания диффузии в клетки компонентов питательной среды и уменьшения механического повреждения каллуса посредством снижения интенсивности встряхивания. В сравнении с прототипом способ позволяет стимулировать морфогенез в каллусе ячменя не только на уровне его гистологического строения (стимуляция закладки в каллусе меристематических зон), но и обеспечивает достоверное увеличение частоты регенерации.
Условиями достижения технического эффекта является использование ПФД в концентрации не более 5% от объема питательной среды. При внесении ПФД в полужидкую (4 г/л агара) среду культивирование следует проводить при постоянном встряхивании (125 об/мин) в течение 2-3 недель до появления листовых инициалий.
Технический эффект изобретения заключается в увеличении выхода растений-регенерантов за счет интенсификации закладки в каллусной ткани ячменя меристематических зон.
Описание изобретения
С целью увеличения выхода растений-регенерантов каллусную ткань ячменя, индуцированную на среде МС в присутствии 2 мг/л дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д), культивируют в МС-среде со сниженной концентрацией агара (4 г/л) и модифицированной добавлением ПФД с фитогормональным составом, зависящим от возраста каллуса. Для каллуса в возрасте 2-3 недель в среду МС вносят 1 мг/л 2,4-Д (среда для пролиферации каллуса), для каллуса в возрасте 6-7 недель - 1 мг/л кинетина, 0,5 мг/л нафтил- или индолилуксусной кислоты, 0,1 мг/л гибберелловой кислоты (среда для индукции морфогенеза). Нестерильную среду разливают в культивационные сосуды (пробирки или колбы) и в каждый вносят ПФД из расчета 5% от объема МС-среды. Стерилизуют среду 25 мин автоклавированием при давлении насыщенного пара 0,11 МПа. Стерильную питательную среду используют для культивирования каллуса. Каллусную ткань погружают в МС-среду, при этом ПФД оседает на дне культивационных сосудов, поэтому перед помещением на шейкер их встряхивают, чтобы пузырьки ПФД равномерно распределились в толще среды. Каллусные культуры выращивают в течение 2-3 недель до появления листовых инициалей при непрерывном встряхивании (125 об/мин), температуре 20±2 / 16±2°С (день / ночь), освещенности 4000 лк, продолжительности фотопериода 16 ч. Для регенерации растений каллусную ткань переносят на плотную МС-среду (7 г/л агара).
Возможность осуществления изобретения показана следующими примерами.
Пример 1, демонстрирующий повышение количества меристематических зон в каллусе ячменя при добавлении ПФД.
Каллусную ткань ячменя со сниженной регенерационной способностью (использовали каллусные линии после 30 дней культивирования на среде с антибиотиками, возраст каллуса 7 недель) помещали в пробирки с полужидкой МС-средой, содержащей 1 мг/л кинетина, 0,5 мг/л индолилуксусной кислоты (ИУК), 0,1 мг/л гибберелловой кислоты (ГК) и ПФД в количестве 5 об. %. Через 3 недели культивирования каллус микроскопировали, определяя частоту встречаемости различных гистологических структур и некрозов в каллусе ячменя в контроле и при добавлении ПФД (табл. 1). Статистическую обработку данных микроскопии проводили стандартными методами [Урбах В.Ю. Биометрические методы / М.: Наука, 1964. 415 с.] с использованием пакета программ Microsoft Excel 2007.
Таблица 1. Частоты встречаемости (%) гистологических структур и некрозов в каллусе разных генотипов ячменя в зависимости от добавления ПФД в питательную среду
*Достоверные отличия от контроля при α=0,05
Основным положительным эффектом добавления ПФД в питательную среду для регенерации каллуса ячменя явилось увеличение закладки меристематических зон. Частота встречаемости меристематических клеток у генотипа Белгородский 100 увеличилась в сравнении с контролем на 26,0%, у генотипа Купец - на 14,0%. У сорта Купец добавление ПФД приводило также к достоверному увеличению частоты встречаемости эпидермиса листьев. Наряду с увеличением морфогенетической активности, ПФД способствовал уменьшению некротизации каллуса у сорта Белгородский 100. Таким образом, гистологическая оценка каллусной ткани ячменя после воздействия ПФД (5 об. %) подтвердила наличие в ней изменений, способствующих повышению морфогенетического потенциала каллуса.
Пример 2, демонстрирующий увеличение частоты регенерации в каллусной ткани ячменя в результате добавления в среду ПФД на стадии пролиферации.
Каллусную ткань двух генотипов ячменя в возрасте 2-3 недель пассировали в полужидкую МС-среду, содержащую 1 мг/л 2,4-Д и ПФД в количестве 5 об. %, и культивировали на шейкере (125 об/мин) в течение 3 недель. Для индукции морфогенеза каллус переносили на плотную МС-среду с 1 мг/л кинетина, 0,5 мг/л ИУК, 0,1 мг/л ГК. По окончании культивирования определяли частоту регенерации в каллусной культуре (табл. 2).
Таблица 2. Увеличение частоты регенерации (%) у двух генотипов ячменя при добавлении ПФД (5 об. %) в среду для пролиферации каллуса
У обоих исследованных сортов в среде с добавлением ПФД, при выращивании каллуса на шейкере (125 об/мин), на этапе морфогенеза происходило увеличение частоты регенерации в сравнении с каллусом, выращенным в контрольных условиях.
Пример 3, демонстрирующий стимуляцию регенерационной способности каллусной культуры ячменя в результате добавления ПФД на стадии морфогенеза.
Каллусную ткань ячменя, полученную по стандартной схеме культивирования, на стадии морфогенеза переносили в полужидкую МС-среду с 1 мг/л кинетина, 0,5 мг/л ИУК, 0,1 мг/л ГК и ПФД в количестве 2 и 5 об. %. После двух недель глубинного культивирования каллус пересаживали на плотную МС-среду того же гормонального состава, по окончании культивирования учитывали выход растений-регенерантов (табл. 3).
Таблица 3. Влияние ПФД на выход растений-регенерантов и частоту регенерации каллуса ячменя
*Достоверные отличия от контроля при α=0,05
Способ поясняется чертежом (А, Б).
Добавление в полужидкую среду для морфогенеза ПФД и культивирование каллуса на шейкере (125 об/мин) способствовало повышению частоты регенерации у исследованных генотипов ячменя. Достоверные отличия от контроля обеспечила концентрация ПФД 5 об. %. На чертеже (Б) показан общий вид формирующегося в каллусной ткани растения-регенеранта.
Таким образом, приведенные примеры показывают, что предлагаемый способ стимуляции морфогенеза в каллусной культуре ячменя с использованием ПФД 5 об. % при постоянном встряхивании (125 об/мин) усиливает закладку меристематических зон, повышает морфогенетический потенциал у культур со сниженной регенерационной способностью, увеличивает выход растений-регенерантов в каллусной ткани ячменя.
.