СПОСОБ (ВАРИАНТЫ) ЗАХВАТА ПРЕДСТАВЛЯЮЩИХ ИНТЕРЕС ЧАСТИЦ ИЗ СМЕСИ
METHOD (VERSIONS) FOR CAPTURING PARTICLES OF INTEREST FROM MIXTURE

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к захвату представляющей интерес частицы, такой как вирусоподобная частица (например, рекомбинантно экспрессированной, самособирающейся VLP), из смеси. Изобретение предусматривает эффективный захват представляющих интерес частиц, количество которых можно увеличить до больших объемов для использования в коммерческом масштабе.
ВВЕДЕНИЕ
Революция в генетической инженерии развилась до разработки рекомбинантных белков, которые можно использовать в ряде различных применений, включая терапевтические средства для человека и животных. Существует значительно более 100 биотехнологически полученных терапевтических средств и вакцин, одобренных FDA США для медицинского применения, и более 1000 дополнительных лекарственных средств и вакцин находятся на различных этапах клинических испытаний. В настоящее время для получения рекомбинантных белков с различными степенями успеха используют клеточные экспрессирующие системы бактерий, дрожжей, насекомых, растений и млекопитающих. Хотя это развитие технологии произвело переворот в получении и доставке фармацевтических и терапевтических продуктов, все еще остались проблемы с очисткой молекул, которые можно получать. Например, очистка белка от бактерий требует лизиса клеток, что может требовать несколько этапов и очистки раствора от примесей. При этом хроматографические смолы, используемые в процессе очистки, склонны к забивке и клеточные экстракты могут требовать дополнительной очистки от примесей другими способами, такими как центрифугирование или фильтрация. Также могут требоваться несколько этапов очистки, которые занимают время, а также могут приводить к потере образца и снижению выходов. Очистка представляющего интерес белка может являться дорогостоящей и технически сложной. Переработка для выделения и очистки конечного продукта может составлять до 80 процентов всей стоимости.
Для очистки белков широко используют адсорбционную хроматографию с уплотненным слоем. Использование уплотненных слоев требует удаления неразрушенных клеток и коллоидального дебриса. Несмотря на частое игнорирование при разработке способа в лабораторных масштабах, удаление дебриса является одним из самых сложных действий для достижения высокой эффективности. Адсорбция в расширяющемся слое представляет собой недавно разработанный способ, который можно использовать для очистки растворимого белка, и предъявляет меньше требований к очистке от примесей по ходу процесса. В ней используют поток жидкости через структуру исходно уплотненного слоя с достижением контакта при высокой пористости для жидкости.
Одним из подходов для получения рекомбинантного белка, особенно иммуногенного рекомбинантного белка, такого как иммуногенный вирусный рекомбинантный белок, является использование вирусоподобных частиц (VLP). Многие вирусы содержат капсиды, которые могут собираться из индивидуально экспрессируемых структурных белков, как in vivo в клетке, где структурные белки и рекомбинантные белки экспрессируются в формирующихся VLP, так и вне клетки после выделения и очистки. Однако захват таких VLP в смеси, содержащей высокосуспендированные твердые вещества и частицы различных размеров, как правило, в ситуациях, относящихся к получаемым из растений материалам, является технически очень сложным. VLP могут являться иммуногенными при инъекции животным с индукцией продукции антител к вирусам, которые могут блокировать инфекцию. Таким образом, например, мыши, вакцинированные вирусоподобным частицами, продуцируемыми с белками штамма птиц H5N1, могут получать защиту от заражения летальными вирусами H5N1.
В индустрии остается необходимость в способе захвата представляющих интерес частиц с улучшенной эффективностью и выходом. Также остается необходимость в масштабировании такого способа для коммерческого уровня для захвата представляющих интерес частиц рентабельным способом.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение, по меньшей мере частично, основано на открытии того, что хроматография с адсорбцией в расширяющемся слое (EBA) является особенно эффективной для захвата представляющих интерес частиц из смеси. В определенных вариантах осуществления способ можно преимущественно использовать для захвата представляющих интерес частиц в одноэтапном способе связывания и элюции, который является масштабируемым до коммерческих уровней.
В основном аспекте предоставлен способ захвата представляющих интерес частиц из смеси, включающий использование расширяющегося слоя адсорбента.
В одном из вариантов осуществления способ включает этапы (a) предоставления расширяющегося слоя адсорбента; (b) приведения смеси в контакт с адсорбентом так, что составляющие смеси контактируют и взаимодействуют с расширяющимся слоем адсорбента; (c) необязательной отмывки адсорбента и (d) необязательной элюции представляющих интерес частиц из адсорбента.
В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления представляющая интерес частица представляет собой представляющую интерес биологическую частицу.
В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления представляющая интерес частица содержит по меньшей мере один белок.
В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления представляющая интерес частица содержит по меньшей мере два белка, по меньшей мере один из которых является представляющим интерес белком.
В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления представляющая интерес частица представляет собой вирусоподобную частицу.
В первом аспекте изобретения предоставлен способ захвата представляющих интерес вирусоподобных частиц из смеси, включающий использование расширяющегося слоя адсорбента, соответственно, где указанный способ включает этапы (a) предоставления расширяющегося слоя адсорбента; (b) приведения смеси в контакт с адсорбентом так, что вирусоподобные частицы в смеси связывают адсорбент; (c) необязательной отмывки адсорбента и (d) необязательной элюции вирусоподобных частиц из адсорбента.
В одном из вариантов осуществления этого первого аспекта изобретение дополнительно относится к способу по предшествующему варианту осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления, где вирусоподобные частицы содержат белок вируса гриппа, в частности гемагглютинин; соответственно подтип гемагглютинина выбран из группы, состоящей из H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 или H16, или комбинации двух или более из них.
В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления, включая вариант осуществления этого первого аспекта, адсорбент содержится в колонке.
В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления, включая вариант осуществления этого первого аспекта, смесь происходит или ее получают из растения.
В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления, включая вариант осуществления этого первого аспекта, растение представляет собой природное растение, мутантное растение, неприродное растение или трансгенное растение.
В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления смесь происходит или ее получают из листа растения.
В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления, включая вариант осуществления этого первого аспекта, смесь получают посредством гомогенизации растительного материала до контакта с адсорбентом. Таким образом, по этому варианту осуществления смесь представляет собой гомогенизированный растительный материал.
В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления, включая вариант осуществления этого первого аспекта, растение представляет собой растительную клетку, такую как растительная клетка, выращиваемая в культуре или вне растения, такая как выращиваемая in vitro растительная клетка или скопления клеток, таких как клетки моркови.
В одном из вариантов осуществления первого аспекта изобретения изобретение относится к способу по любому из предшествующих вариантов осуществления или комбинации предшествующих вариантов осуществления, где смесь содержит разрушенные клетки растения соответственно, где растение представляет собой растение табака, инфильтрированное молекулами нуклеиновой кислоты, транзиторно экспрессирующими белок в растении, где указанный белок находится в вирусоподобных частицах, более соответствующе, где смесь происходит или ее получают из надземных частей растения.
В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления, включая вариант осуществления этого первого аспекта, адсорбент содержит множество гранул.
В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления, включая вариант осуществления этого первого аспекта, гранулы представляют собой составные гранулы, содержащие инертный материал сердцевины.
В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления, включая вариант осуществления этого первого аспекта, гранулы содержат, состоят или, по существу, состоят из материала, выбранного из группы, состоящей из пластмасс, метакрилата, анионообменного материала, диэтиламиноэтила, катионообменного материала, полисахарида, диоксида кремния, поли(стиролдивинил)бензола, полиакриламида, керамики и их производных, или комбинации двух или более из них.
В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления, включая вариант осуществления этого первого аспекта, гранулы содержат, состоят или, по существу, состоят из полисахарида, соответственно, целлюлозы, агарозы, декстрана или их производных или комбинации из двух или более из указанного выше.
В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления, включая вариант осуществления этого первого аспекта, инертный материал сердцевины содержит, состоит или, по существу, состоит из материала, выбранного из группы, состоящей из кварца, диоксида кремния, сплава Nd-Fe-B, нержавеющей стали, оксида циркония, диоксида циркония, силикатов металлов, боросиликатов металлов, керамики, содержащей диборид титана, карбида титана, диборида циркония, карбида циркония, карбида вольфрама, карбида кремния, нитрида алюминия, нитрида кремния, нитрида титана, оксида иттрия, порошка металлического кремния и дисилицида молибдена; оксидов и сульфидов металлов, включая оксиды магния, алюминия, титана, ванадия, хрома, циркония, гафния, марганца, железа, кобальта, никеля, меди и серебра; оксид неметаллов; соли металлов, включая сульфат бария; металлические элементы, включая вольфрам, цирконий, титан, гафний, ванадий, хром, марганец, железо, кобальт, никель, индий, медь, серебро, золото, палладий, платину, рутений, осмий, родий и иридий и сплавы металлических элементов, такие как сплавы, формируемые между указанными металлическими элементами и их производными, или комбинации двух или более из них.
В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления, включая вариант осуществления этого первого аспекта, размер гранул составляет приблизительно от 5 мкм до 500 мкм или более.
В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления, включая вариант осуществления этого первого аспекта, размер гранул, которые связывают представляющие интерес частицы, составляет приблизительно от 25 мкм до 100 мкм, соответственно, приблизительно 50 мкм.
В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления, включая вариант осуществления этого первого аспекта, размер гранул, которые связывают материал, отличный от представляющей интерес частицы, например растительные материалы, составляет от приблизительно 125 мкм до 250 мкм, соответственно, приблизительно 150 мкм.
В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления, включая вариант осуществления этого первого аспекта, способ включает этап предварительного захвата, который включает использование дополнительного расширяющегося слоя адсорбента. Этот первый расширяющийся слой адсорбента содержит гранулы, соответственно, в диапазоне размеров, составляющем приблизительно от 125 мкм до 250 мкм, более соответственно, приблизительно 150 мкм.
В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления, включая вариант осуществления этого первого аспекта, адсорбент содержит лиганд.
В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления, включая вариант осуществления этого первого аспекта, лиганд содержит, состоит или, по существу, состоит из лиганда, выбранного из группы, состоящей из (i) бензиламина или его производного; (ii) алкиламина или его производного; (iii) алкениламина или его производного; (iv) алкиниламина или его производного; (v) алкоксиамина или его производного и (vi) амина моно- или бициклических ароматических или гетероароматических молекул или их производных, или комбинации двух или более из них.
В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления, включая вариант осуществления этого первого аспекта, лиганд содержит, состоит или, по существу, состоит из анионообменной смолы.
В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления, включая вариант осуществления этого первого аспекта, анионообменная смола содержит, состоит или, по существу, состоит или представляет собой ионообменную смолу на основе диэтиламиноэтилцеллюлозы, соответственно, ионообменной смолы на основе диэтиламиноэтилцеллюлозы-декстрана.
В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления, включая вариант осуществления этого первого аспекта, электропроводность смеси до контакта с адсорбентом составляет приблизительно от 1 мСм/см до 10 мСм/см, соответственно, от 2 мСм/см до 3 мСм/см.
В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления, включая вариант осуществления этого первого аспекта, pH смеси до контакта с адсорбентом составляет приблизительно от pH 6,0 до pH 8,0.
В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления, включая вариант осуществления этого первого аспекта, смесь для связывания представляющих интерес частиц вносят в колонку при линейной скорости потока в диапазоне приблизительно от 1 см/мин до 15 см/мин.
В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления, включая вариант осуществления этого первого аспекта, плотность адсорбента находится в диапазоне приблизительно от 1 г/мл до 20 г/мл.
В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления, включая вариант осуществления этого первого аспекта, степень расширения расширяющегося слоя находится в диапазоне приблизительно от 1 до 5.
В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления, включая вариант осуществления этого первого аспекта, указанный способ включает этап предварительного захвата до приведения смеси в контакт с адсорбентом.
В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления, включая вариант осуществления этого первого аспекта, этап предварительного захвата выбран из группы, состоящей из фильтрации, микрофильтрации, центрифугирования, декантации и седиментации, или комбинации двух или более из них.
В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления, включая вариант осуществления этого первого аспекта, этап предварительного захвата включает: (i) приведение материала в контакт с ионообменной смолой или (ii) кислотное осаждение и фильтрацию материала.
В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления, включая вариант осуществления этого первого аспекта, материал приводят в контакт с ионообменной смолой в режиме статического связывания или периодической инкубации.
В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления, включая вариант осуществления этого первого аспекта, элюат или одну или несколько его фракций, получаемых на этапе (d), подвергают этапу дальнейшей обработки.
В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления, включая вариант осуществления этого первого аспекта, этап последующей обработки выбран из группы, состоящей из очистки, фильтрации, микрофильтрации, центрифугирования, декантации и седиментации, или комбинации двух или более из них.
В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления, включая вариант осуществления этого первого аспекта, представляющая интерес частица содержит представляющий интерес белок.
В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления, включая вариант осуществления этого первого аспекта, представляющий интерес белок представляет собой антиген.
В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления, включая вариант осуществления этого первого аспекта, представляющий интерес белок представляет собой гемагглютинин.
В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления, включая вариант осуществления этого первого аспекта, гемагглютинин представляет собой подтип гемагглютинина, выбранный из группы, состоящей из H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 или H16, или комбинации двух или более из них.
В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления, включая вариант осуществления этого первого аспекта, коэффициент расширения расширяющегося слоя в течение этапа элюции составляет приблизительно от 0,5 до 5.
Во втором аспекте предоставлен способ захвата представляющих интерес частиц из смеси, включающий этапы (i) помещения в колонку расширяющегося слоя адсорбента, содержащего лиганд при высоте уплотненного слоя более 10 см, где плотность адсорбента составляет приблизительно от 1 г/мл до 20 г/мл, где степень расширения расширяющегося слоя составляет приблизительно от 1 до 5 и где средний размер частиц адсорбента составляет от приблизительно 5 мкм до приблизительно 500 мкм; (ii) уравновешивание материала смолы при pH в диапазоне pH приблизительно от 6,0 до 8,0; (iii) предоставления смеси, содержащей представляющие интерес частицы, где электропроводность указанной смеси составляет приблизительно от 1 мСм/см до 10 мСм/см; (iv) внесения смеси в колонку при скорости потока (например, линейной скорости потока) в диапазоне приблизительно от 1 см/мин до 15 см/мин для связывания представляющих интерес частиц; (v) отмывки нагруженной колонки с использованием буфера с pH в диапазоне pH приблизительно от 6,0 до 8,0; и (vi) элюции представляющих интерес связанных частиц из колонки в одной или нескольких фракциях.
В одном из вариантов осуществления этого второго аспекта представляющая интерес частица представляет собой вирусоподобную частицу (VLP) или тенеподобную частицу.
В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления этого второго аспекта смесь происходит или ее получают из растения.
В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления этого второго аспекта растение представляет собой природное растение, мутантное растение, неприродное растение или трансгенное растение.
В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления этого второго аспекта смесь происходит или ее получают из листа растения.
В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления этого второго аспекта представляющая интерес частица содержит представляющий интерес белок.
В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления этого второго аспекта представляющий интерес белок представляет собой антиген.
В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления этого второго аспекта представляющий интерес белок представляет собой гемагглютинин.
В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления этого второго аспекта гемагглютинин представляет собой подтип гемагглютинина, выбранный из группы, состоящей из H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 или H16, или комбинации двух или более из них.
В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления этого второго аспекта, размер гранул, которые связывают представляющую интерес частицу, составляет приблизительно от 25 мкм до 100 мкм, соответственно приблизительно 50 мкм.
В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления этого второго аспекта, размер гранул, которые связывают материал, отличный от представляющей интерес частицы, например растительные материалы, составляет приблизительно от 125 мкм до 250 мкм, соответственно приблизительно 150 мкм.
В одном из вариантов осуществления этого второго аспекта или комбинации указанных выше вариантов осуществления этого второго аспекта, предоставлен способ захвата из смеси представляющих интерес вирусоподобных частиц, включающий этапы
(i) помещения в колонку расширяющегося слоя адсорбента, содержащего диэтиламиноэтилцеллюлоза-декстран, где плотность адсорбента составляет приблизительно от 2,5 г/мл до 3,5 г/мл и где средний размер частиц адсорбента составляет приблизительно 50;
(ii) уравновешивание материала смолы при pH в диапазоне pH приблизительно от 6,0 до 8,0;
(iii) предоставления смеси, содержащей растительный материал табака, где электропроводность указанной смеси составляет приблизительно от 2 мСм/см до 3 мСм/см;
(iv) внесения смеси в колонку при скорости потока приблизительно 2,5 см/мин для связывания вирусоподобных частиц, и где степень расширения расширяющегося слоя в колонке составляет приблизительно 2;
(v) отмывки нагруженной колонки с использованием буфера с pH в диапазоне pH приблизительно от 6,0 до 8,0; и
(vi) элюции представляющих интерес связанных частиц из колонки в одной или нескольких фракциях.
В одном из вариантов осуществления способ по предыдущему варианту осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления этого второго аспекта, включает этап (iii), включающий (a) предоставление целых растений табака, транзиторно экспрессирующих белок, находящийся в вирусоподобных частицах; (b) разрушение клеток листьев и стеблей растений табака с получением растительного материала табака и (c) регуляцию pH и электропроводности смеси посредством разведения буфером или деионизированной водой.
В одном из вариантов осуществления способ по предшествующему варианту осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления этого второго аспекта до этапа (iv) включает этап, включающий фильтрацию смеси из этапа (iii) и приведение фильтрованной смеси из этапа (iii) в контакт с первым расширяющимся слоем адсорбентов, содержащим полиэтиленимин, где размер гранул составляет приблизительно 150 мкм, с удалением из смеси нежелательных веществ.
В третьем дополнительном аспекте предоставлен расширяющийся слой адсорбента, содержащий представляющие интерес частицы, обратимо связанные с ним.
В одном из вариантов осуществления этого третьего аспекта, адсорбент содержит множество гранул.
В одном из вариантов осуществления или комбинации указанных выше вариантов осуществления этого третьего аспекта, размер гранул, которые связывают представляющие интерес, частицы составляет приблизительно от 25 мкм до 100 мкм, соответственно, приблизительно 50 мкм.
В четвертом дополнительном аспекте предоставлено применение расширяющегося слоя адсорбента для захвата из смеси представляющих интерес частиц, конкретно, представляющих интерес вирусоподобных частиц, более конкретно, из смеси, которую получают из растения, транзиторно экспрессирующего белок, где указанный белок находится в вирусоподобных частицах.
В одном из вариантов осуществления этого четвертого аспекта частица представляет собой вирусоподобную частицу (VLP) или тенеподобную частицу.
Пятый аспект относится к расширяющемуся слою адсорбента, содержащему представляющие интерес частицы, соответственно, где с ним обратимо связаны представляющие интерес вирусоподобные частицы, в частности, где адсорбент находится в режиме хроматографии с расширяющимся слоем.
Шестой аспект относится к применению хроматографии с расширяющимся слоем для захвата представляющих интерес частиц, соответственно вирусоподобных частиц, из смеси.
Вариант(ы) осуществления и комбинации вариантов осуществления, описанные выше для основного и первого аспектов изобретения, также могут формировать варианты осуществления по меньшей мере второго, третьего, четвертого, пятого и шестого аспектов по настоящему изобретению.
ОПРЕДЕЛЕНИЯ
Технические термины и выражения, используемые в объеме настоящей заявки, в общем, следует понимать в значении, как правило, в котором их используют в технических областях растений и молекулярной биологии. Все из приводимых ниже определений применяются для всего содержания настоящей заявки. Слово "содержащий (включающий)" не исключает других элементов или этапов, а формы единственного числа не исключают множественного. Один этап может исполнять функции нескольких характеристик, указанных в формуле изобретения. Термины "по существу", "примерно", "приблизительно" и т.п. по отношению к параметру или значению, в частности, также определяют точный параметр или точное значение, соответственно. Термин "приблизительно" в отношении приведенного числового значения или диапазона относится к значению или диапазону, которые находятся в пределах 20%, в пределах 10% или в пределах 5% от приведенного значения или диапазона. Термины "миллионные доли" или "м.д." используют в настоящем документе взаимозаменяемо для обозначения меры чистоты представляющих интерес очищенных частиц или представляющих интерес очищенных белков. Единицы м.д. указывают на количество белка хозяина в нанограммах/миллилитр по отношению к представляющему интерес белку в миллиграммах/миллилитр, где белки находятся в растворе, где м.д. белка хозяина = (нг/мл белка хозяина)/(мг/мл представляющего интерес белка). Когда белки сушат, например, посредством лиофилизации, м.д. относится к (нг белка хозяина)/(мг представляющего интерес белка).
Термин "расширяющийся слой" относится к вариантам осуществления, где хроматографический процесс функционирует со слоями адсорбента с классифицируемыми (стратифицируемыми) диапазонами размеров, диапазонами плотностей или обоими, стабильно псевдоожиженными посредством направленного потока жидкости, соответственно восходящего потока жидкости, с минимальным аксиальным смешиванием адсорбентов, обеспечивая контакт жидких и твердых компонентов в жидкости с адсорбентами при прохождении через слой. Таким образом, жидкость проходит через слой почти в условиях поршневого вытеснения.
"Адсорбент" относится к любому веществу, которое может адсорбировать представляющие интерес частицы на своей поверхности посредством сил межмолекулярного взаимодействия. Как правило, связывание представляющих интерес частиц с адсорбентом является обратимым так, что их можно элюировать из адсорбента в требуемое время.
Как применяют в настоящем документе, термин "представляющая интерес частица" относится к молекулярной структуре, захват которой из смеси является желательным. В определенных вариантах осуществления представляющая интерес частица содержит один или несколько белков. В других вариантах осуществления представляющая интерес частица содержит один или более или два или более (например, множество) белков, по меньшей мере один из которых является представляющим интерес белком. В одном из вариантов осуществления частица для захвата представляет собой частицу, содержащую множество макромолекул биологического происхождения, и таким образом является представляющей интерес биологической частицей. В другом варианте осуществления частица для захвата представляет собой вирусоподобную частицу. В другом варианте осуществления частица для захвата представляет собой частицу-тень бактерии. Как применяют в настоящем документе, термин "захваченные представляющие интерес частицы" относится к препарату представляющих интерес частиц, в котором по меньшей мере приблизительно 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% по массе препарата представляют собой желаемые представляющие интерес частицы. В вариантах осуществления в способах по настоящему изобретению происходит захват по меньшей мере 50% общего количества представляющих интерес частиц, исходно присутствующих в смеси, включая по меньшей мере 60%, 70%, 80% или 90% представляющих интерес частиц. Можно достигать даже больших степеней захвата, таких как по меньшей мере 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98% или по меньшей мере 99%. Термин "очищенные представляющие интерес частицы" относится к препарату представляющих интерес частиц, в котором по меньшей мере приблизительно 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% по массе препарата представляют желаемые представляющие интерес частицы с оставшейся массой, в которую вносят вклад загрязняющие примеси или загрязнители, в частности другие белки, нуклеиновые кислоты, липиды или углеводы или их сочетание, такие как загрязняющие примеси или загрязнители, происходящие из клетки-хозяина, которые могут совместно очищаться с очищенными представляющими интерес частицами. В одном из вариантов осуществления захваченные или очищенные представляющие интерес частицы, по существу, не содержат загрязняющих макромолекул (за исключением растворителя). Частицы, описываемые в настоящем документе, можно характеризовать различными способами, известными в данной области, такими как электрораспыление-анализ дифференциальной подвижности (ES-DMA), фракционирование в асимметричном потоке при наличии поля с многоугловой детекцией рассеяния (AFFFF-MALS) и трансмиссионная электронная микроскопия (TEM). В одном из вариантов осуществления размер представляющей интерес частицы составляет менее чем приблизительно 1,0, 0,9, 0,8, 0,7, 0,6, 0,5, 0,4, 0,3, 0,2, 0,1, 0,09, 0,08, 0,07, 0,06, 0,05, 0,04 или 0,03 мкм в диаметре, например от 1,0 до 0,03, от 0,8 до 0,03, от 0,6 до 0,03, от 0,4 до 0,03, от 0,2 до 0,03, от 0,1 до 0,03, от 0,08 до 0,03, от 0,06 до 0,03, от 0,05 до 0,03 или от 0,04 до 0,03 мкм в диаметре.
Как применяют в настоящем документе, термины "вирусоподобная частица" (VLP), "вирусоподобные частицы" (VLP) или представляющая интерес VLP, относятся к молекулярным структурам, формирующимся посредством самосборки, и они содержат множество белков, содержащих по меньшей мере один представляющий интерес белок, и которые по меньшей мере по одному из свойств сходны с вирусом. Примечательно, что в отличие от вирусных частиц или вирионов, VLP не содержат геномных нуклеиновых кислот. VLP могут обладать различными мультимодальными распределениями по размерам, где на распределение по размерам можно воздействовать изменениями в способе получения. Например, распределение по размерам VLP, получаемых в растениях, может отличаться от распределения по размерам VLP, получаемых в других хозяевах. В вариантах осуществления средний диаметр VLP (например, VLP, захватываемых из растительного материала) может составлять 35 нм, 40 нм, 45 нм, 50 нм, 55 нм, 60 нм, 65 нм, 70 нм или 75 нм. В вариантах осуществления диаметр VLP, захватываемых (например, из растительного материала) способами по настоящему изобретению, находится в диапазоне от 35 нм до 75 нм; соответственно от 35 нм до 70 нм; более соответственно от 35 нм до 65 нм; еще более соответственно от 35 нм до 60 нм; особенно соответственно от 35 нм до 55 нм; еще более соответственно от 35 нм до 50 нм; еще более соответственно от 35 нм до 45 нм, наиболее соответственно от 35 нм до 40 нм.
Как применяют в настоящем документе, "смесь" содержит представляющие интерес частицы совместно с одним или несколькими материалами, которые являются нежелательными, такими как примеси или загрязнения. Термины "примесь" и "загрязнение" используют взаимозаменяемо для обозначения любого материала, отличного от представляющих интерес частиц, вне зависимости от того, происходят ли он из организма-хозяина, который желательно удалять из композиции, содержащей представляющие интерес частицы. Смесь можно получать непосредственно из организма-хозяина или клетки-хозяина, продуцирующих представляющие интерес частицы. Не предполагая ограничений, примеры смесей, которые можно обрабатывать способом по настоящему изобретению, включают сырье, материалы разрушенных клеток-хозяев, гомогенат тканей хозяина, лизат тканей хозяина, экстракт тканей хозяина, ферментационный бульон и супернатант культуры клеток-хозяев. Примеси в качестве неограничивающих примеров могут включать любые биологические макромолекулы, такие как белки, отличные от представляющих интерес белков, частицы, отличные от представляющих интерес частиц, которые могут содержать представляющий интерес белок, нуклеиновые кислоты (например, ДНК и РНК), липиды, полисахариды (например, крахмалы, целлюлоза), лигнин, фенольные смолы, углеводы и пигменты.
"Кондиционированная смесь" представляет собой смесь, полученную для этапа хроматографии, используемого в способе по изобретению, посредством подвергания смеси одному или нескольким из замены буфера, разбавления, добавления солей, титрования pH или комбинации указанного выше для установления pH, диапазона электропроводности, буферных условий или комбинации, соответственно, для достижения желаемых характеристик хроматографии. "Кондиционированная смесь" может представлять собой сырье, и ее можно использовать для стандартизированных условий загрузки на хроматографическую колонку.
Термин "представляющий интерес белок", который в настоящем документе используют взаимозаменяемо с термином "белок-мишень", относится к одному или нескольким рекомбинантно полученным белкам, которые присутствуют в представляющей интерес частице и которые можно захватывать с представляющей интерес частицей в виде несобранного белка, мультимерных форм белка или частично собранной частицы.
Термин "белок хозяина" относится к любым белкам, происходящим из клеток хозяина, продуцирующего представляющую интерес частицу(ы), содержащую белок-мишень, и включает любые белки, экспрессируемые с генома хозяина, или белки, экспрессируемые рекомбинантно и не являющиеся составляющими представляющей интерес частицы. Количество белка хозяина, присутствующее в смеси, содержащей по меньшей мере представляющие интерес частицы или представляющий интерес белок, предоставляет меру степени чистоты. Как правило, количество белка хозяина в смеси белков выражают в миллионных долях относительно количества представляющих интерес частиц или представляющего интерес белка в смеси.
Термин "захват" и его грамматические вариации используют в настоящем документе взаимозаменяемо для обозначения удержания или скапливания представляющих интерес частиц из смеси, приводящих к более высокой концентрации представляющих интерес частиц, чем концентрация в смеси. Захват представляющих интерес частиц из смеси может быть неполным. Захваченные представляющие интерес частицы могут представлять собой фракцию всех представляющих интерес частиц в смеси, такую как, но без ограничения, приблизительно 2%, 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80% или 90% или более.
Термины "чистота" и "изолят" и их грамматические вариации используют для обозначения отделения или удаления, полностью или частично, по меньшей мере одной примеси из смеси, что таким образом увеличивает уровень чистоты представляющих интерес частиц в композиции. Представляющий интерес белок можно очищать до достижения композиции, содержащей менее 100 м.д. белка хозяина и, соответственно, менее 90 м.д., менее 80 м.д., менее 70 м.д., менее 60 м.д., менее 50 м.д., менее 40 м.д., менее 30 м.д., менее 20 м.д., менее 10 м.д. или менее 5 м.д. белка хозяина, что, как правило, определяют посредством ELISA.
"Лиганд" можно использовать для захвата одной или нескольких представляющих интерес частиц или представляющих интерес белков, которые специфические его связывают. Соответственно, биологически специфический лиганд ковалентно связан с адсорбентом или твердой подложкой, которые формируют неподвижную фазу хроматографической системы, и доступен для представляющих интерес частиц или представляющего интерес белка, находящегося в подвижной фазе. Представляющие интерес частицы или представляющий интерес белок сохраняют свою специфическую аффинность связывания к лиганду на этапах хроматографии, тогда как другие растворенные компоненты и белки в смеси ощутимо или специфически не связываются с лигандом. Связывание представляющих интерес частиц или представляющего интерес белка с лигандом в неподвижной фазе позволяет загрязнениям или примесям в подвижной фазе проходить через расширяющийся слой, тогда как представляющие интерес частицы или представляющий интерес белок остаются специфически связанными с лигандом. Специфически связанные представляющие интерес частицы или белок можно элюировать из лиганда. В качестве примера, этого можно достичь с использованием низкого pH, высокого pH, низкого содержания солей, высокого содержания солей, конкурирующего лиганда или т.п. или даже комбинации одного или нескольких из них, и пропусканием через расширяющийся слой с элюирующим буфером.
Термины "специфическое связывание" и "специфичность связывания" описывают, как правило, специфические и обратимые взаимодействия между представляющей интерес частицей или представляющим интерес белком и лигандом. Лиганд может содержать химически модифицируемые группы, которые позволяют ему связываться с адсорбентом или твердой подложкой без разрушения его активности связывания. Как правило, аффинность лиганда к представляющей интерес частице или белку находится в диапазоне от 10E+4 до 10E+8 M в свободном растворе.
Термин "растение" относится к любому растению на любой стадии его жизненного цикла или развития и его потомству. Растение может быть природным, мутантным, неприродным или трансгенным растением. Растение может быть инфильтровано молекулами нуклеиновой кислоты, которые кодируют белок, и экспрессирующийся в инфильтрированном растении. Такое инфильтрированное растение не является трансгенным растением, так как вставки молекул нуклеиновой кислоты в геном растения и передачи потомству не требуются. Термин "растительная клетка" относится к структурной и физиологической единице растения. Растительная клетка может находиться в форме протопласта без клеточной стенки, выделенной одиночной клетки, культивируемой клетки, скопления двух или более клеток или в виде части организационной единицы более высокого порядка, такой как, но без ограничения, ткань растения, орган растения или все растение. Термин "растительный материал" относится к любому твердому материалу или жидкой композиции или их сочетанию, полученным или получаемым из растения, включая листья, стебли, корни, цветы или части цветка, плоды, пыльцу, яйцеклетки, зиготы, семена, побеги, секреты, экстракты, клеточные или тканевые культуры или любые другие части или продукты растений. В одном из вариантов осуществления растительный материал происходит или его получают из листа, такого как зеленый лист.
Если в настоящем документе предоставлены диапазоны, подразумевают, что предельные значения на нижней и верхней границах диапазона включены в указанный диапазон. Например, если предоставлен диапазон от 125 мкм до 250 мкм, подразумевается, что он включает предельные значения 125 мкм и 250 мкм соответственно.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
Изобретение относится к способам захвата представляющих интерес частиц из смеси посредством адсорбции в расширяющемся слое. Представляющая интерес частица содержит один или несколько представляющих интерес белков, один или несколько из которых может рекомбинантно продуцировать клетка-хозяин.
Адсорбция в расширяющемся слое (EBA) представляет собой однократное действие, сочетающее разделение твердых материалов-жидкостей и очистку продукта. Процесс функционирует со слоем адсорбентов различного размера, плотности или обоих, который расширяется при подаче восходящего потока жидкости. В различных вариантах осуществления колонка разработана так, чтобы избегать турбулентности и избыточного смешивания жидкостей, особенно обратного смешивания вдоль оси колонки, тогда как отдельные гранулы удерживаются в нефиксированном динамическом состоянии, незначительно перемещаясь только в локальном участке колонки. Расширяющиеся слои могут содержать небольшую зону смешивания в нижней части колонки, где входящая жидкость распределяется по всему поперечному сечению колонки; соответственно расширяющиеся слои, как правило, функционируют в условиях поршневого вытеснения. Процесс обеспечивает контакт и взаимодействие жидких и твердых компонентов в сырье с адсорбентами, таким образом обеспечивая характеристики мультистадийного хроматографического разделения в колонке. Расширение слоя позволяет твердым частицам в сырье дифференцированно проходить через слой, таким образом обеспечивая функцию очистки от примесей.
В традиционных способах хроматографии в уплотненном слое, где смола заключена между низом колонки и проточным адаптером, когда твердые частицы и клеточный дебрис не могут протечь через плотно упакованную смолу, происходит забивка. В отличие от этого поток жидкости при EBA подают снизу, и адаптер удерживают вдали от плоскости упакованной смолы, позволяя пространству с адсорбентами расширяться, таким образом создавая в них промежутки. Степень расширения слоя зависит от скорости потока смеси, вязкости смеси, а также плотности адсорбентов. Когда адсорбенты упакованы в колонке, они находятся близко друг к другу и оставляют мало пространства для маневра больших агрегатов и скоплений. Так как буфер подают снизу, адсорбенты становятся псевдоожиженными и формируют стабильный градиент концентраций, когда скорость седиментации адсорбентов равна скорости восходящего потока жидкости. Доступны различные форматы EBA, некоторые из которых включают средства фильтрации на уровне колонки и другие, которые не включают. В одном из вариантов осуществления колонка не содержит средств фильтрации на уровне колонки.
Слой может находиться в подходящем резервуаре, таком как колонка. В контексте настоящего изобретения термин "колонка" относится к контейнеру любого типа, который можно поставлять по меньшей мере с одним входом для ввода в колонку смеси и по меньшей мере с одним выходом для последующей элюции представляющих интерес частиц или представляющего интерес белка из смеси. В одном из вариантов осуществления резервуар имеет форму колонки. Как правило, колонки для адсорбции в расширяющемся слое функционируют в условиях поршневого вытеснения с минимальным противоточным смешиванием и турбулентностью в слое адсорбента. В соответствии с настоящим изобретением смесь вводят в колонку с расширяющимся слоем, содержащую адсорбент, где составляющие смеси контактируют и взаимодействуют с адсорбентами в колонке. Специалист в данной области может сконструировать колонку с определенным диаметром и высотой в зависимости от входного объема смеси.
Когда смесь вводят в колонку, твердые частицы и клеточный дебрис свободно проходят около адсорбентов и, в конечном счете, выходят сверху колонки. Как и в случае любого этапа хроматографии, как правило, адсорбент подвергают тщательному промыванию для ограничения неспецифических взаимодействий. При этом представляющие интерес частицы и представляющие интерес белки взаимодействуют с адсорбентами, связывают адсорбенты и удерживаются на колонке. Затем колонку можно оставить для уплотнения, поток обращают и представляющие интерес частицы можно элюировать из гранул, как и в традиционных способах.
Дополнительный аспект относится к расширяющемуся слою адсорбента, содержащему обратимо связанные с ним представляющие интерес частицы. Соответственно, адсорбент обладает одним или несколькими из свойств, описываемыми в настоящем документе для адсорбента. Дополнительный аспект относится к использованию расширяющегося слоя адсорбента или использованию хроматографии EBA для захвата представляющих интерес частиц из смеси.
Процесс захвата представляющих интерес частиц из смеси основан на адсорбции к материалу твердой фазы любого типа, любой формы и формата, который можно использовать в EBA. Кроме того, адсорбцию можно охарактеризовать по использованию характеристик селективных адсорбентов, химического состава лигандов или их сочетания, обеспечивающих специфическое связывание и последующую элюцию, по существу, только представляющих интерес частиц или, альтернативно, обеспечивающих групповое специфическое связывание нескольких биомолекулярных материалов с последующей селективной и последовательной элюцией представляющих интерес частиц из адсорбента.
В различных вариантах осуществления адсорбент находится в форме гранул. Гранулы могут являться однородными по размеру, плотности, массе или их комбинации, или они могут отличаться по размеру, плотности, массе или их комбинации. Один из вариантов осуществления относится к гранулам, однородным по размеру, но с различными плотностями или массами, или и плотностями, и массами. Эта схема может обеспечивать распределение гранул. Как правило, размер гранул находится в диапазоне от 5 мкм до 500 мкм. Подходящие размеры гранул могут находиться в диапазоне диаметров приблизительно от 5 мкм до 500 мкм, например приблизительно от 5 мкм до 400 мкм, или приблизительно от 5 мкм до 300 мкм, или приблизительно от 5 мкм до 200 мкм, приблизительно от 5 мкм до 100 мкм, приблизительно от 50 мкм до 400 мкм, или приблизительно от 50 мкм до 300 мкм, или приблизительно от 50 мкм до 200 мкм, или приблизительно от 50 мкм до 150 мкм, или от 50 мкм до 100 мкм, например приблизительно от 20 мкм до 80 мкм, приблизительно 150 мкм, приблизительно 100 мкм или приблизительно 50 мкм. Таким объемом могут обладать по меньшей мере приблизительно 70%, приблизительно 80%, приблизительно 90%, приблизительно 95%, приблизительно 96%, приблизительно 97%, приблизительно 98%, приблизительно 99% или 100% по объему отдельных гранул. Более крупные гранулы составляют более нижнюю часть псевдоожиженного слоя, тогда как менее крупные гранулы составляют более верхние части. Если гранулы являются слишком маленькими, расширение будет происходить со скоростями, сравнимыми со скоростью выхода загрязняющих частиц, снижая эффективность захвата. Подобным образом, если гранулы являются слишком большими, псевдоожижение требует более высокой скорости потока и связывание белков нарушается вследствие несоответствующей диффузии между гранулами. Гранулы могут принимать любую форму, такую как, но не ограничиваясь, по существу, сферическая, удлиненная, цилиндрическая, столбчатая или беспорядочная форма. В одном из вариантов осуществления гранулы являются сферическими. Специалист в данной области может выбрать подходящий размер, форму и пористость гранул в зависимости от используемого процесса.
В другом варианте осуществления размер гранул, которые захватывают представляющие интерес частицы, составляет приблизительно от 25 мкм до 125 мкм; соответственно приблизительно от 25 мкм до 100 мкм; более соответственно приблизительно от 25 мкм до 95 мкм; еще более соответственно приблизительно от 25 мкм до 90 мкм; конкретно, соответственно приблизительно от 30 мкм до 90 мкм; более конкретно, соответственно приблизительно от 30 мкм до 85 мкм; еще более конкретно, соответственно приблизительно от 35 мкм до 85 мкм; более соответственно приблизительно от 35 мкм до 80 мкм; более соответственно приблизительно от 40 мкм до 80 мкм; более соответственно приблизительно от 40 мкм до 75 мкм; более соответственно приблизительно от 45 мкм до 75 мкм; более соответственно приблизительно от 45 мкм до 70 мкм; более соответственно приблизительно от 40 мкм до 70 мкм; более соответственно приблизительно от 40 мкм до 65 мкм; более соответственно приблизительно от 45 мкм до 65 мкм; более соответственно приблизительно от 45 мкм до 60 мкм; более соответственно приблизительно от 45 мкм до 55 мкм; наиболее соответственно приблизительно 50 мкм.
В другом варианте осуществления размер гранул, которые захватывают материал, отличный от представляющих интерес частиц, например растительные материалы, составляет приблизительно от 130 мкм до 250 мкм; соответственно приблизительно от 135 мкм до 250 мкм; более соответственно приблизительно от 135 мкм до 225 мкм; более соответственно приблизительно от 135 мкм до 200 мкм; более соответственно приблизительно от 135 мкм до 175 мкм; более соответственно приблизительно от 135 мкм до 170 мкм; более соответственно приблизительно от 140 мкм до 170 мкм; более соответственно приблизительно от 140 мкм до 165 мкм; более соответственно приблизительно от 140 мкм до 160 мкм; более соответственно приблизительно от 145 мкм до 160 мкм; более соответственно приблизительно от 145 мкм до 145 мкм; наиболее соответственно приблизительно 150 мкм. Соответственно, эти гранулы можно использовать на этапе предварительного захвата с использованием расширяющегося слоя адсорбента.
В другом варианте осуществления плотность частиц адсорбента может находиться в диапазоне от приблизительно 1 г/мл до 20 г/мл; более соответственно в диапазоне от приблизительно 2 г/мл до 20 г/мл; более соответственно в диапазоне от приблизительно 3 г/мл до 20 г/мл; более соответственно в диапазоне от приблизительно 4 г/мл до 20 г/мл; более соответственно в диапазоне от приблизительно 4 г/мл до 20 г/мл; более соответственно в диапазоне от приблизительно 5 г/мл до 20 г/мл; более соответственно в диапазоне от приблизительно 6 г/мл до 20 г/мл; более соответственно в диапазоне от приблизительно 7 г/мл до 20 г/мл; более соответственно в диапазоне от приблизительно 8 г/мл до 20 г/мл; более соответственно в диапазоне от приблизительно 9 г/мл до 20 г/мл; более соответственно в диапазоне от приблизительно 10 г/мл до 20 г/мл; более соответственно в диапазоне от приблизительно 11 г/мл до 20 г/мл; более соответственно в диапазоне от приблизительно 12 г/мл до 20 г/мл; более соответственно в диапазоне от приблизительно 13 г/мл до 20 г/мл; более соответственно в диапазоне от приблизительно 14 г/мл до 20 г/мл; более соответственно в диапазоне от приблизительно 14 г/мл до 19 г/мл; более соответственно в диапазоне от приблизительно 14 г/мл до 18 г/мл; более соответственно в диапазоне от приблизительно 14 г/мл до 17 г/мл; более соответственно в диапазоне от приблизительно 15 г/мл до 17 г/мл; наиболее соответственно 16 г/мл.
Настоящее изобретение не ограничено никаким материалом частиц для применения в качестве адсорбента, и специалисты в данной области могут выбирать подходящие материалы. В способах можно использовать новые комбинации различных гранул или новые комбинации функциональных групп или лигандов в одной и той же грануле. Гранулы могут являться, но не ограничиваясь этим, очень пористыми, макропористыми, немного пористыми, непористыми, гидрофильными, гидрофобными, высокозаряженными, немного заряженными, без заряда, жесткими или набухающими. Гранулы могут являться, но не ограничиваясь этим, гранулами из пластмассы, метакрилата, полисахаридов (таких как агароза и целлюлоза), диоксида кремния (например, стекло с контролируемым размером пор), поли(стиролдивинил)бензола, полиакриламида, керамики и производных любого из них. Дополнительные примеры включают сильные анионообменные материалы с высокой связывающей способностью, низкой связывающей способностью (например, Q), слабые анионообменные гранулы (например, диэтиламиноэтил (DEAE), ANX), строгие катионообменные материалы (например, SP) или слабые катионообменные материалы (например, CM).
Для усиления различия между скоростями адсорбентов и частиц в сырье в восходящем потоке можно использовать множество различных материалы адсорбентов. Для обработки высоковязкого сырья или для достижения высокой скорости потока желательно увеличение размера, плотности или обоих. В различных вариантах осуществления изобретения увеличение плотности можно осуществлять, используя высокоплотный пористый материал или покрывая высокоплотный непористый материал материалом, который является пористым. Гранулы, получаемые только из органического материала, обладают ограниченной плотностью и должны были бы иметь очень большие диаметры для общепринятых факторов хроматографии, таких как высокая скорость седиментации. Такие большие диаметры гранул приводят к большим длинам диффузионных путей, что вызывает существенное противодействие переносу вещества, снижая эффективность. Настоящее изобретение относится к применению составных гранул, содержащих инертный материал сердцевины, который является более плотным, чем органические материалы. В контексте настоящего изобретения термин "сердцевина" относится к непористой сердцевине, которая находится внутри гранул. Сердцевина не ограничивается расположением в центре гранул. Такие гранулы имеют преимущество наличия высокой плотности и размера гранул, подходящих для способов по изобретению. Плотность материалов может находиться в диапазоне от приблизительно 1,2 до приблизительно 4,0, например кварц (1,2), диоксид кремния (1,4-1,6), сплав Nd-Fe-B (1,8-2,1), нержавеющая сталь, карбид вольфрама (2,5-3,5), оксид циркония (3,2) или диоксид циркония (3,85). Пористый материал, который можно использовать для покрытия сердцевины, в качестве неограничивающих примеров включает агарозу, керамический гидроксиапатит, целлюлозу, гель оксида циркония, силикагель и сополимер гидроксиэтилметакрилата-этилендиметилакрилата. Дополнительными примерами подходящих непористых материалов сердцевины являются неорганические соединения, металлы, тяжелые металлы, простые не являющиеся металлами вещества, оксиды металлов, оксиды неметаллов, соли металлов и сплавы металлов. Примеры таких материалов сердцевины представляют собой силикаты металлов, боросиликаты металлов; керамику, содержащую диборид титана, карбид титана, диборид циркония, карбид циркония, карбид вольфрама, карбид кремния, нитрид алюминия, нитрид кремния, нитрид титана, оксид иттрия, порошок металлического кремния и дисилицид молибдена; оксиды и сульфиды металлов, включающих магний, алюминий, титан, ванадий, хром, цирконий, гафний, марганец, железо, кобальт, никель, медь и оксид серебра; оксиды неметаллов; соли металлов, включающие сульфат бария; металлические элементы, включающие вольфрам, цирконий, титан, гафний, ванадий, хром, марганец, железо, кобальт, никель, индий, медь, серебро, золото, палладий, платину, рутений, осмий, родий и иридий и сплавы металлических элементов, такие как сплавы, формируемые между указанными металлическими элементами, например нержавеющей сталью; кристаллические и аморфные формы углерода, включающие графит, технический углерод и древесный уголь. Подходящими непористыми материалами сердцевины являются гранулы карбида вольфрама, вольфрама, стали и титана, такие как гранулы из нержавеющей стали. Как правило, непористая сердцевина составляет максимально 70% общего объема частицы адсорбента, например максимально 60%, соответственно максимально 50%, соответственно максимально 40%, соответственно максимально 30%, соответственно максимально 20%, соответственно максимально 15%, соответственно максимально 10% и наиболее соответственно максимально 5%.
Широко используемым материалом для применения в качестве адсорбента является агароза, материал, который зарекомендовал себя как хорошо работающий при хроматографии в промышленном масштабе. Таким образом, в одном из вариантов осуществления адсорбент представляют собой агарозу или материал на основе агарозы. Макропористая структура (предпочтительно сильно поперечно связанных) агарозных матриксов комбинирует хорошую связывающую способность для больших молекул, таких как белки, с высокой химической и механической стабильностью. В другом варианте осуществления адсорбент представляет собой декстран или материал на основе декстрана. Высокая механическая стабильность является важным свойством матрикса для использования для снижения действия трения, когда гранулы свободно перемешаются. Вследствие структуры расширяющегося слоя способы предусматривают факторы, отличные от колоночной хроматографии, где агарозные гранулы могут быть меньшими или большими или различающимися по количеству перекрестных сшивок от стандартных гранул. Эти изменения или отсутствие изменений предусмотрены для всех структурных материалов из материалов слоя. Модифицированные агарозные матриксы могут являться менее хрупкими, чем неорганический материал, такой как некоторые стеклянные или керамические материалы.
По настоящему изобретению предусмотрена полидисперсность гранул в колонке. Размер и градиенты плотности располагают гранулы в конкретных положениях колонки или слоя. Более мелкие легкие гранулы перемешаются в одно положение, а более крупные тяжелые гранулы в другое. По настоящему изобретению предусмотрены полидисперсность или различие других характеристик гранул. Размер, плотность, способности к связыванию, размер пор исключения, различия материалов подложки представляют собой незначительную часть широкого спектра комбинаций компонентов и факторов, которые используют в способах по изобретению.
В определенных вариантах осуществления адсорбент содержит лиганд, подходящий для захвата представляющих интерес частиц. В определенных вариантах осуществления адсорбент содержит лиганд, подходящий для очистки представляющих интерес частиц или представляющего интерес белка.
2-12
2-12
Лиганды, которые можно использовать по настоящему изобретению в качестве неограничивающих примеров, включают: лиганды, которые содержат, состоят или, по существу, состоят из: (i) бензиламина или его производного; (ii) алкиламина, включая алкиламин, содержащий алкильную группу с 1-12 атомами углерода, которая может быть неразветвленной, или разветвленной, или циклической, такую как, например, метильная, этильная, пропильная, изопропильная, бутильная, изобутильная, трет-бутильная, пентильная, гексильная, гептильная, октильная, нонильная, децильная, ундецильная, додецильная, циклопентильная, циклогексильная или декалинильная, где указанная алкильная группа необязательно является замещенной по меньшей мере одной группой, отличающейся от кислотной группы; (iii) алкениламина, содержащего алкенильную группу, включая моно-, ди- или полиненасыщенную алкильную группу с 2-12 атомами углерода, которая может быть неразветвленной, разветвленной или циклической и в которой двойная связь(и) может находиться в любом месте цепи или цикла(ов), где указанная алкенильная группа необязательно является замещенной по меньшей мере одной группой, отличающейся от кислотной группы; (iv) алкиниламина, содержащего C-алкинильную группу, определенную, по существу, так же как для алкениламина, включая алкинильную группу, которая может быть замещена по меньшей мере одной группой, отличающейся от кислотной группы; (v) алкоксиамина с C-алкоксигруппой, которая необязательно является замещенной по меньшей мере одной группой, отличающейся от кислотной группы; и (vi) амина моно- или бициклических ароматических или гетероароматических групп, необязательно замещенных по меньшей мере одной группой, отличающейся от кислотной группы.
2-12
2-12
В дополнительном варианте осуществления лиганд, способный к захвату представляющих интерес частиц, таких как VLP, выбран из группы, состоящей из лиганда, содержащего, состоящего или, по существу, состоящего из (i) бензиламина или его производного; (ii) алкиламина, включая алкиламин, содержащий алкильную группу с 1-12 атомами углерода, которая может быть неразветвленной, или разветвленной, или циклической, такую как, например, метильная, этильная, пропильная, изопропильная, бутильная, изобутильная, трет-бутильная, пентильная, гексильная, гептильная, октильная, нонильная, додецильная, циклопентильная, циклогексильная или декалинильная, где указанная алкильная группа необязательно является замещенной по меньшей мере одной группой, отличающейся от кислотной группы; (iii) алкениламина, содержащего алкенильную группу, включая моно-, ди- или полиненасыщенную алкильную группу с 2-12 атомами углерода, которая может быть неразветвленной, разветвленной или циклической и в которой двойная связь(и) может находиться в любом месте цепи или цикла(ов), где указанная алкенильная группа необязательно является замещенной по меньшей мере одной группой, отличающейся от кислотной группы; (iv) алкиниламина, содержащего C-алкинильную группу, определенную, по существу, так же как для алкениламина, включая алкинильную группу, которая может быть замещена по меньшей мере одной группой, отличающейся от кислотной группы; (v) алкоксиамина с C-алкоксигруппой, которая необязательно является замещенной по меньшей мере одной группой, отличающейся от кислотной группы; и (vi) амина моно- или бициклических ароматических или гетероароматических групп, необязательно замещенных по меньшей мере одной группой, отличающейся от кислотной группы, или их сочетания.
В дополнительном варианте осуществления лиганд содержит, состоит или, по существу, состоит из ароматической или гетероароматической кислоты, выбранной из группы, состоящей из карбоновых кислот, сульфоновых кислот, фосфоновых кислот и бороновых кислот. Соответственно, лиганд выбран из группы, состоящей из 2-меркаптобензойной кислоты, 2-меркаптоникотиновой кислоты, 2-аминобензойной кислоты, 3-аминобензойной кислоты и 4-аминобензойной кислоты, 4-гидроксифенилмеркаптоуксусной кислоты, 4-гидроксифенилмеркаптопропионовой кислоты, 4-гидроксифенилмеркаптобутановой кислоты, 2,3-дигидроксибензойной кислоты, 2,4-дигидроксибензойной кислоты, 2,5-дигидроксибензойной кислоты, 2,6-дигидроксибензойной кислоты, 3,4-дигидроксибензойной кислоты, 3,5-дигидроксибензойной кислоты, меркаптобензимидазолсульфоновой кислоты, ортаниловой кислоты, метаниловой кислоты, сульфаниловой кислоты, 4-метиланилин-2-сульфоновой кислоты, 4-метоксианилин-2-сульфоновой кислоты, анилин-2,5-дисульфоновой кислоты, N-метилметаниловой кислоты, 7-амино-1-нафтол-3-сульфоновой кислоты, 1-нафтол-4-сульфоновой кислоты, 2-нафтол-6-сульфоновой кислоты и 2-гидрокси-3-нафтойной кислоты и 2-меркаптобензимидазолсульфоновой кислоты.
В дополнительном варианте осуществления лиганд содержит, состоит или, по существу, состоит из ароматических или гетероароматических групп (радикалов), выбранных из групп, состоящих из i) лигандов, содержащих следующие типы функциональных групп: бензойные кислоты, такие как 2-аминобензойные кислоты, 3-аминобензойные кислоты, 4-аминобензойные кислоты, 2-меркаптобензойные кислоты, 4-амино-2-хлорбензойная кислота, 2-амино-5-хлорбензойная кислота, 2-амино-4-хлорбензойная кислота, 4-аминосалициловые кислоты, 5-аминосалициловые кислоты, 3,4-диаминобензойные кислоты, 3,5-диаминобензойные кислоты, 5-аминоизофталевая кислота и 4-аминофталевые кислоты; коричные кислоты, такие как гидроксикоричные кислоты; никотиновые кислоты, такие как 2-меркаптоникотиновые кислоты; нафтойные кислоты, такие как 2-гидрокси-1-нафтойная кислота; хинолины, такие как 2-меркаптохинолин; тетразолуксусные кислоты, такие как 5-меркапто-1-тетразолуксусная кислота; тиадиазолы, такие как 2-меркапто-5-метил-1,3,4-тиадиазол; бензимидазолы, такие как 2-аминобензимидазол, 2-меркаптобензимидазол и 2-меркапто-5-нитробензимидазол; бензотиазолы, такие как 2-аминобензотиазол, 2-амино-6-нитробензотиазол, 2-меркаптобензотиазол и 2-меркапто-6-этоксибензотиазол; бензоксазолы, такие как 2-меркаптобензоксазол; тиофенолы, такие как тиофенол и 2-аминотиофенол; 2-(4-аминофенилтио)уксусная кислота; ароматические или гетероароматические сульфоновые кислоты и фосфоновые кислоты, такие как 1-амино-2-нафтол-4-сульфоновая кислота, и фенолы, такие как 2-амино-4-нитрофенол; ii) лигандов, содержащих 2-гидроксикоричные кислоты, 3-гидроксикоричную кислоту и 4-гидроксикоричную кислоту; iii) лигандов, содержащих карбоновую кислоту и аминогруппу в качестве заместителей, такую как 2-аминоникотиновая кислота, 2-меркаптоникотиновая кислота, 6-аминоникотиновая кислота и 2-амино-4-гидроксипиримидинкарбоновая кислота; iv) лигандов, содержащих радикалы, происходящие из бензольного кольца, конденсированного с гетероароматической циклической системой, например, лигандов, выбранных из бензимидазолов, таких как 2-меркаптобензимидазол и 2-меркапто-5-нитробензимидазол; бензотиазолов, таких как 2-амино-6-нитробензотиазол, 2-меркаптобензотиазол и 2-меркапто-6-этоксибензотиазол; бензоксазолов, таких как 2-меркаптобензоксазол; и v) лигандов, выбранных из группы тиофенолов, таких как тиофенол и 2-аминотиофенол.
Лиганд может обладать аффинностью к представляющей интерес частице или представляющему интерес белку. Таким образом, лиганд может быть способен к высокоспецифическому биологическому взаимодействию, такому как взаимодействие, которое может происходить между антигеном и антителом, ферментом и субстратом или рецептором и лигандом рецептора. Таким образом, лиганд может представлять собой антитело, антиген, фермент, субстрат фермента, рецептор, лиганд рецептора или аптамер и т.п. В одном из вариантов осуществления лиганд представляет собой антитело. Биологические лиганды можно использовать отдельно или в комбинации с одним или несколькими из химических лигандов, описываемых в настоящем документе. Биологический лиганд может содержать один или несколько из одинаковых или различных лигандов, необязательно в комбинации с одним или несколькими из химических лигандов, как описано в настоящем документе.
Как правило, адсорбент, содержащий лиганд, уравновешен до условий pH, при которых происходит оптимальное связывание представляющих интерес частиц. Как правило, этап уравновешивания проводят внося буфер при pH в диапазоне приблизительно 3-10, например в диапазоне приблизительно 5-7, соответственно, pH 7.
Как правило, гранулы, содержащие лиганды, содержат множество лигандов. В конкретном варианте осуществления гранулы содержат лиганд, как описано выше, в комбинации со вторым типом лиганда, где лиганд по изобретению составляет по меньшей мере приблизительно 30%, соответственно по меньшей мере приблизительно 50%, более соответственно по меньшей мере приблизительно 70% и наиболее соответственно по меньшей мере приблизительно 90% от общего количества лигандов. Такой разделяющий матрикс с комбинированными лигандами можно конструировать для конкретного случая, где элемент дополнительных взаимодействий улучшает его разделяющие свойства. Второй тип лиганда может содержать одну или несколько заряженных групп, таких как катионообменный материал, используемых для элюции соединения посредством отталкивания зарядов; гидрофобных групп; групп, способных к образованию водородных связей; аффинных групп или т.п. Таким образом, также предусмотрены комбинации различных лигандов, как описано в настоящем документе, которые способны связывать представляющие интерес частицы, которые могут присутствовать в равных соотношениях или в различных соотношениях.
В различных вариантах осуществления желательно осуществлять способы при скорости потока, превосходящей предельную скорость частиц в сырье, но не предельную скорость гранул. В одном из вариантов осуществления линейная скорость потока в расширяющемся слое составляет по меньшей мере приблизительно 2 см/мин, по меньшей мере приблизительно 3 см/мин, по меньшей мере приблизительно 4 см/мин, по меньшей мере приблизительно 5 см/мин, по меньшей мере приблизительно 6 см/мин, по меньшей мере приблизительно 7 см/мин, по меньшей мере приблизительно 8 см/мин, по меньшей мере приблизительно 10 см/мин, по меньшей мере приблизительно 12 см/мин, по меньшей мере приблизительно 15 см/мин, по меньшей мере приблизительно 20 см/мин, по меньшей мере приблизительно 25 см/мин, по меньшей мере приблизительно 30 см/мин, по меньшей мере приблизительно 40 см/мин, или по меньшей мере приблизительно 50 см/мин. В другом варианте осуществления линейная скорость потока находится в диапазоне приблизительно от 1 см/мин до 15 см/мин, например, приблизительно от 2 см/мин до 10 см/мин, или приблизительно от 2 см/мин до 9 см/мин, или приблизительно от 2 см/мин до 8 см/мин, или приблизительно от 3 см/мин до 8 см/мин, или приблизительно от 3,5 см/мин до 7,5 см/мин. В одном из вариантов осуществления скорость потока составляет приблизительно 3,8 см/мин. В другом варианте осуществления скорость потока составляет приблизительно 7,5 см/мин. Скорость потока можно измерять, собирая объем жидкости на выходе за определенный период времени.
В других вариантах осуществления введение сырья в расширяющийся слой можно проводить с линейной скоростью потока по меньшей мере приблизительно 150 см/час, например по меньшей мере приблизительно 180 см/час, по меньшей мере приблизительно 200 см/час, по меньшей мере приблизительно 210 см/час, по меньшей мере приблизительно 220 см/час, по меньшей мере приблизительно 230 см/час, по меньшей мере приблизительно 240 см/час, по меньшей мере приблизительно 250 см/час, по меньшей мере приблизительно 300 см/час, по меньшей мере приблизительно 400 см/час, по меньшей мере приблизительно 425 см/час, по меньшей мере приблизительно 450 см/час, по меньшей мере приблизительно 475 см/час, по меньшей мере приблизительно 500 см/час, или по меньшей мере приблизительно 600 см/час. В другом варианте осуществления введение сырья в расширяющийся слой можно проводить с линейной скоростью потока приблизительно от 200 до 500 см/час, например приблизительно от 300 до 500 см/час или приблизительно 400 см/час. В одном из вариантов осуществления скорость потока составляет приблизительно 228 см/час. В другом варианте осуществления скорость потока составляет приблизительно 450 см/час.
Степень расширения слоя можно измерять с использованием формулы: высота0/высота1, где высота1 представляет собой высоту слоя в режиме уплотненного слоя без потока через колонку, а высота0 представляет собой высоту слоя в режиме расширения с потоком через колонку. В одном из вариантов осуществления степень расширения находится в диапазоне от 1 до 5, например от 1 до 4, или от 1 до 3, или от 1 до 2, например 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8 или 1,9. Для некоторых вариантов осуществления степень расширения максимально составляет приблизительно 1,2. В другом варианте осуществления скорость потока составляет приблизительно 5 см/мин, а степень расширения составляет от 1 до 2, например 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8 или 1,9; соответственно 1,2. В другом варианте осуществления скорость потока составляет приблизительно 6 см/мин, а степень расширения составляет от 1 до 2, например 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8 или 1,9; соответственно 1,2. В другом варианте осуществления скорость потока составляет приблизительно 7 см/мин, а степень расширения составляет от 1 до 2, например 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8 или 1,9; соответственно 1,2. В другом варианте осуществления скорость потока составляет приблизительно 8 см/мин, а степень расширения составляет от 1 до 2, например 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8 или 1,9; соответственно 1,2. В другом варианте осуществления скорость потока составляет приблизительно 9 см/мин, а степень расширения составляет от 1 до 2, например 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8 или 1,9; соответственно 1,2. В другом варианте осуществления скорость потока составляет приблизительно 10 см/мин, а степень расширения составляет от 1 до 2, например 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8 или 1,9; соответственно 1,2. В другом варианте осуществления скорость потока составляет приблизительно 4 см/мин (например, приблизительно 3,8 см/мин), а степень расширения составляет от 1 до 2, например 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8 или 1,9; соответственно 1,2. В другом варианте осуществления скорость потока составляет приблизительно 8 см/мин (например, приблизительно 7,8 см/мин), а степень расширения составляет от 1 до 2, например 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8 или 1,9; соответственно 1,2.
Использование расширяющегося слоя адсорбента, связанного с лигандом, для захвата представляющих интерес частиц из смеси может включать этапы первоначального предоставления смеси, содержащей один или несколько видов представляющих интерес частиц. Смесь может иметь определенный pH или pH смеси можно доводить до получения желаемого pH. Смесь приводят в контакт с расширяющимся слоем адсорбента и, необязательно, отмывают одним или несколькими буферами. Один или несколько видов представляющих интерес частиц могут обратимо связываться с адсорбентом, или они могут оставаться несвязанными. Затем адсорбент можно отмывать буфером с получением фракции, содержащей несвязанный материал. Затем адсорбент можно отмывать по меньшей мере одним элюирующим буфером с получением по меньшей мере одного элюата, содержащего один или несколько видов представляющих интерес частиц, которые были обратимо связаны с адсорбентом. Этап отмывки, этап элюции или оба можно проводить с буферами с более высоким pH, чем pH смеси, которую исходно приводили в контакт с адсорбентом. Буфер(ы) могут содержать одно или несколько дополнительных соединений, таких как один или несколько детергентов. Перед каждым этапом элюции адсорбент можно отмывать буфером. Фракции, содержащие несвязанный материал или представляющие интерес частицы или обе, получаемые на этапе элюции, можно подвергать последующей дополнительной обработке, как описано в настоящем документе, включая, без ограничения, хроматографию, иммуноаффинную очистку, фильтрацию, микрофильтрацию, центрифугирование, декантацию, седиментацию и т.п. или комбинацию из двух или более из указанных выше способов.
Степень расширения слоя в течение этапа элюции находится в диапазоне от 0,5 до 5, например от 1 до 4 или от 1 до 3 или от 1 до 2, например 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8 или 1,9. Для некоторых вариантов осуществления степень расширения максимально составляет приблизительно 1,2.
В одном из вариантов осуществления из смеси можно захватывать два или более видов представляющих интерес частиц, используя два или более различных адсорбента, где один или несколько, например, все адсорбенты находятся в режиме расширяющегося слоя. Таким образом, настоящее изобретение относится к применению для захвата представляющих интерес частиц двух или более, трех или более, четырех или более или пяти или более различных адсорбентов.
В дополнительном аспекте изобретение относится к способу захвата представляющих интерес частиц из смеси, где способ включает приведения смеси в контакт с расширяющимся слоем адсорбента в условиях, где представляющие интерес частицы связываются с адсорбентом, и изменение условий так, что представляющие интерес частицы элюируют из адсорбента. В вариантах осуществления этим способом захватывают по меньшей мере 50% общего количества представляющих интерес частиц, исходно присутствующих в смеси, включая по меньшей мере 60%, 70%, 80% или 90% представляющих интерес частиц. Можно достигать даже больших показателей захвата, например по меньшей мере 92,5%, 95%, 96%, 97%, 98% или по меньшей мере 99%.
Далее описаны дополнительные варианты осуществления настоящего изобретения. Перед захватом клетки-хозяева, содержащие представляющие интерес частицы, можно лизировать, гомогенизировать, размалывать, растирать, толочь, высушивать (например, лиофилизировать), экструдировать или подвергать комбинации из двух или более из указанного выше. Также можно использовать другие известные способы, уменьшающие размер исходного материала, разрушающие клетку(и) или высвобождающие содержимое клетки(ок). Если клетка-хозяин представляет собой растительную клетку-хозяина, тогда клетки можно разрушать или гомогенизировать известными в данной области способами, такими как, но без ограничений, винтовой пресс (например, винтовой пресс Vincent CP-4 приблизительно при 15 кг/час - 20 кг/час с использованием давления на конусе по меньшей мере 310,28 кПа), резчик пасты, или одно или несколько устройств, широко используемых в производстве табака (например, экструдер). Полученный экстракт собирают и, необязательно, хранят. Когда в исходном материале преобладают зеленые листья, его также обозначают как зеленый сок или зеленый экстракт. Такой экстракт содержит не только содержимое межклеточного пространства (т.е. апопласта), но также внутриклеточное содержимое клеток. В одном из вариантов осуществления экстракт можно дополнительно обрабатывать, добавляя одно или несколько химических веществ или композиций и т.п. Таким образом, в одном из вариантов осуществления к экстракту можно добавлять метабисульфит натрия. Этот этап является необязательным, так как представляющие интерес частицы клетки могут секретировать.
Электропроводность экстракта можно измерять известными в данной области способами, такими как посредством использования устройства Condutimeter Multi 350i/set. Если электропроводность находится вне желаемого диапазона, тогда экстракт перед использованием можно разбавлять деионизированной водой. Например, замечено, что гомогенизация стеблей и листьев табака приводит к получению растительного материала с электропроводностью приблизительно 20 мСм/см. Это значение регулярно наблюдали у гомогенизированных растительных материалов, получаемых из N. tabacum и N. bentamiana. По одному из вариантов осуществления электропроводность должна находиться в диапазоне от 1 мСм/см до 10 мСм/см; соответственно от 2 мСм/см до 8 мСм/см; соответственно от 3 мСм/см до 7 мСм/см; соответственно от 4 мСм/см до 6 мСм/см, например, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8 или 5,9 мСм/см. По другому варианту осуществления, электропроводность должна находиться в диапазоне от 1 мСм/см до 5 мСм/см, соответственно, от 2 мСм/см до 3 мСм/см, например, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8 или 2,9 мСм/см. В другом варианте осуществления pH экстракта составляет приблизительно от pH 6,0 до 8,0, соответственно приблизительно pH 7,0.
Желательным может являться проведение перед захватом предварительной обработки. В случае, когда представляющие интерес частицы находятся в экстракте растения, предпочтительным может являться удаление некоторых макромолекул растительного происхождения, которые вызывают забивку и блокирование в течение процесса захвата. По одному из вариантов осуществления для связывания нежелательных макромолекул растительного происхождения используют ионообменное вещество, такое как ионообменное вещество полиэтиленимин (PEI). Этот этап можно проводить в режиме периодической инкубации, соответственно в первой колонке, и элюированный материал, получаемый из нее, необязательно приводят в контакт со второй колонкой, содержащей расширяющийся слой. Соответственно, средний размер частиц адсорбента ионообменного вещества, используемого на этом этапе предварительного захвата, составляет приблизительно от 100 мкм до 200 мкм, соответственно, приблизительно 150 мкм при pH приблизительно 7. Как правило, ионообменное вещество уравновешивают подходящим буфером, таким как 0,5 М буфер Tris/HCl с pH 7 с последующим 10 мМ буфером Tris/HCl с pH 7,0. Предусмотрены другие этапы предварительного захвата, которые могут включать фильтрацию, микрофильтрацию, центрифугирование (например, низкоскоростное центрифугирование), декантацию или седиментацию или комбинацию из двух или более из этих способов.
По другому варианту осуществления этап предварительного захвата включает использование расширяющегося слоя адсорбента. Соответственно, размер гранул, используемых на этапе предварительного захвата, составляет приблизительно от 130 мкм до 250 мкм; соответственно приблизительно от 135 мкм до 250 мкм; более соответственно приблизительно от 135 мкм до 225 мкм; более соответственно приблизительно от 135 мкм до 200 мкм; более соответственно приблизительно от 135 мкм до 175 мкм; более соответственно приблизительно от 135 мкм до 170 мкм; более соответственно приблизительно от 140 мкм до 170 мкм; более соответственно приблизительно от 140 мкм до 165 мкм; более соответственно приблизительно от 140 мкм до 160 мкм; более соответственно приблизительно от 145 мкм до 160 мкм; более соответственно приблизительно от 145 мкм до 145 мкм; наиболее соответственно приблизительно 150 мкм. Соответственно, эти гранулы можно использовать на этапе предварительного захвата с использованием расширяющегося слоя адсорбента. Таким образом, дополнительный аспект изобретения относится к способу захвата представляющих интерес частиц из смеси, включающему этапы (a) предоставления первого расширяющегося слоя адсорбента; (b) приведения смеси в контакт с первым адсорбентом в таких условиях, что нежелательные материалы в смеси связываются с первым адсорбентом; (c) предоставления второго расширяющегося слоя адсорбента; (d) приведения представляющих интерес частиц после этапа (b) в контакт со вторым адсорбентом в таких условиях, что представляющие интерес частицы связываются со вторым адсорбентом; (e) необязательной отмывки второго адсорбента; (f) необязательной элюции представляющих интерес частиц из второго адсорбента и (g) необязательного повторения этапов (a)-(f) один или несколько дополнительных раз.
В одном из вариантов осуществления адсорбент, используемый в режиме расширяющегося слоя, представляет собой анионообменную смолу, такую как ионообменная смола на основе диэтиламиноэтилцеллюлозы, соответственно, ионообменная смола на основе диэтиламиноэтилцеллюлозы-декстрана. Как правило, смолу уравновешивают буфером до pH приблизительно от pH 6,0 до 8,0; соответственно pH 7,0, с использованием, например, 0,5 M буфера Tris/HCl с pH7 с последующим 10 мМ Tris/HCl с pH 7,0. В одном из вариантов осуществления средний размер частиц адсорбента составляет приблизительно от 25 мкм до 200 мкм; соответственно приблизительно от 25 мкм до 75 мкм и наиболее соответственно приблизительно 50 мкм. Если способ проводят в колонке с расширяющимся слоем, тогда специалист поймет, что можно использовать колонки различных размеров. В одном из вариантов осуществления диаметр колонки составляет 1 см с высотой колонки приблизительно 70 см и высотой слоя приблизительно 15 см. Это использование более крупных колонок, таких как колонки, которые можно использовать в промышленном масштабе, также включено в настоящее изобретение. Например, размер колонок может находиться в диапазоне приблизительно от 1 см в диаметре по меньшей мере до 1500 см в диаметре, например, приблизительно до 10 см в диаметре, приблизительно до 100 см в диаметре, приблизительно до 250 см в диаметре, приблизительно до 500 см в диаметре, приблизительно до 750 см в диаметре, приблизительно до 1000 см в диаметре, приблизительно до 1250 см в диаметре, приблизительно до 1500 см в диаметре, приблизительно до 1750 см в диаметре или по меньшей мере приблизительно до 2000 см в диаметре. Другие диаметры включают диаметр 2 см, диаметр 10 см, диаметр 45 см и диаметр 150 см. Супернатант вносят в колонку при желаемой скорости потока, как описано в настоящем документе, и после загрузки колонку, как правило, отмывают отмывочным буфером с pH приблизительно от pH 6,0 до 8,0, соответственно pH 7,0, таким как 10 мМ Tris/HCl с pH 7,0. Затем связанный материал можно элюировать подходящим элюирующим буфером, который, как правило, имеет более высокий или низкий pH, чем отмывочный буфер. В одном из вариантов осуществления отмывочный буфер содержит 50 мМ Tris/HCl и 1 M NaCl с pH 9,0. Соответственно, элюат собирают в одной фракции и pH при элюции доводят до pH 7, добавляя в пробирку до сбора элюата такой буфер, как 1 M раствор Tris/HCl с pH 6,5.
В соответствии с еще одним рабочим режимом связывание и элюцию представляющих интерес частиц, находящихся в экстракте растения, проводят с использованием ионообменного вещества DEAE после предварительного захвата ионообменным веществом PEI.
В другом варианте осуществления экстракт предварительно не обрабатывают так, что представляющие интерес частицы можно выделять в одноэтапном процессе связывания и элюции. Этот рабочий режим особенно подходит для захвата представляющих интерес частиц в большом масштабе с использованием адсорбции в расширяющемся слое. Таким образом, этим способом можно обрабатывать экстракты в объеме по меньшей мере 100 литров (например, по меньшей мере 250 литров, по меньшей мере 500 литров, по меньшей мере 750 литров, по меньшей мере 1000 литров, по меньшей мере 1250 литров, по меньшей мере 1500 литров, по меньшей мере 1750 литров, и по меньшей мере 2000 литров).
В одном из вариантов осуществления состав гранул основан на агарозе, такой как поперечно сшитая эпихлоргидрином агароза (например, при 4% масс./об.). Гранула может содержать сердцевину другого состава относительно остальной части гранулы, такую как сердцевина из карбида вольфрама. Подходящим лигандом является ионообменное вещество DEAE, как правило, со средним диаметром приблизительно 50 мкм. Средняя плотность частиц адсорбента составляет, соответственно, приблизительно 16 кг/л. Подходящий диаметр колонки составляет приблизительно 45 см со свободным объемом в осажденном состоянии, составляющем приблизительно 40% от объема, заполненного адсорбентом. В одном из вариантов осуществления колонку уравновешивали 0,5 M буфером Tris-Cl, pH7 с последующим 10 мМ буфером Tris-Cl, pH7. Соответственно, загрузку экстракта производили, закачивая экстракт вверх при скорости потока, как описано в настоящем документе. Как правило, коэффициент расширения находится в диапазоне 2,0-2,5, а не связавшийся материал отмывают 10 мМ Tris/HCl, pH7 при том же коэффициенте расширения. После этапа хроматографии EBA представляющие интерес частицы можно элюировать 50 мМ Tris-Cl и 1M NaCl, pH9 при коэффициенте расширения приблизительно 1,2. Элюированные фракции можно нейтрализовать добавлением в контейнер перед сбором на пике элюции 1M Tris/HCl, pH 6,5. Фракции, содержащие или включающие представляющие интерес частицы, можно собирать для дальнейшего захвата и очистки.
Средняя плотность гранул может составлять приблизительно от 1 г/мл до 20 г/мл, линейная скорость потока может составлять по меньшей мере приблизительно 150 см/час, степень расширения расширяющегося слоя может составлять приблизительно от 1 до 5.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения адсорбент необязательно можно отмывать или уравновешивать или и отмывать, и уравновешивать одним или несколькими отмывочными буферами и уравновешивающими буферами, соответственно. Смесь, наносимая на адсорбент, может представлять собой кондиционированную смесь. В случае, когда адсорбент не содержат в колонке, он может представлять собой твердую фазу, такую как для адсорбции на мембране, например мембранный фильтр, волокна или слои, с которыми связан лиганд.
Таким образом, дополнительный аспект относится к способу захвата представляющих интерес частиц из смеси, включающему этапы (i) предоставления расширяющегося слоя адсорбента, содержащего лиганд в колонке при высоте уплотненного слоя приблизительно 10 см, где плотность адсорбента составляет приблизительно от 1 г/мл до 20 г/мл, где степень расширения расширяющегося слоя составляет приблизительно от 1 до 5 и где средний размер частицы адсорбента составляет приблизительно от 25 мкм до приблизительно 200 мкм; (ii) уравновешивания материала смолы при pH в диапазоне приблизительно от pH 6,0 до 8,0; (iii) предоставления смеси, содержащей представляющие интерес частицы, где электропроводность указанной смеси составляет приблизительно от 1 мСм/см до 10 мСм/см; (iv) внесения смеси в колонку при линейной скорости потока в диапазоне приблизительно от 1 см/мин до 15 см/мин со связыванием представляющих интерес частиц; (iv) отмывки загруженной колонки с использованием буфера с pH в диапазоне приблизительно от pH 6,0 до 8,0 и (v) элюции связанных представляющих интерес частиц из колонки в одной или нескольких фракциях.
Как указано в настоящем документе, "буфер" представляет собой раствор, противостоящий изменениям pH при добавлении кислоты или основания посредством действия составляющих его кислотно-основных конъюгатов. В зависимости от желаемого pH буфера и конкретного этапа в процессе захвата можно использовать различные буферы. Неограничивающие примеры составляющих буферов, которые можно использовать для желательного контроля диапазона pH для способа по изобретению, включают ацетатные, цитратные, гистидиновые, фосфатные, аммонийные буферы, такие как ацетат аммония, сукцинат, MES, CHAPS, MOPS, MOPSO, HEPES, Tris и т.п., а также их комбинации TRIS-яблочная кислота-NaOH, малеат, хлорацетат, формиат, бензоат, пропионат, пиридин, пиперазин, ADA, PIPES, ACES, BES, TES, трицин, бицин, TAPS, этаноламин, CHES, CAPS, метиламин, пиперидин, борная кислота, угольная кислота, молочная кислота, бутандиовая кислота, диэтилмалоновая кислота, глицилглицин, HEPPS, HEPPSO, имидазол, фенол, POPSO, сукцинат, TAPS, бензиламин, триметил-, или диметил-, или этил- или фениламин, этилендиамин или морфолин. По мере необходимости в буфере могут присутствовать дополнительные компоненты (добавки), например, можно использовать соли для регуляции ионной силы буфера, такие как хлорид натрия, сульфат натрия и хлорид калия; и другие добавки, такие как аминокислоты (такие как глицин и гистидин), хаотропные средства (такие как мочевина), спирты (такие как этанол, маннит, глицерин и бензиловый спирт), детергенты (см. выше.) и сахара (такие как сахароза, маннит, мальтоза, трегалоза, глюкоза и фруктоза). Составляющие буферов и добавки и используемые концентрации могут варьировать в соответствии с типом хроматографии, применяемой по изобретению.
Термин "детергент" относится к ионным, цвиттер-ионным и неионным поверхностно-активным веществам, которые пригодны для предотвращения агрегации белков и для предотвращения неспецифического взаимодействия или связывания загрязняющих веществ с представляющим интерес белком и которые могут присутствовать в различных буферах, используемых в настоящем изобретении, включая очищающие, уравновешивающие, загрузочные, постзагрузочные отмывочные, элюционные или счищающие буферы. В конкретных вариантах осуществления детергент добавляют к отмывочному буферу. Примеры детергентов, которые можно использовать по изобретению, в качестве неограничивающих примеров включают полисорбаты (например, полисорбаты 20 или 80); полоксамеры (например, полоксамер 188); Triton; додецилсульфат натрия (SDS); лаурилсульфат натрия; октилгликозид натрия; лаурил-, миристил-, линолеил- или стеарилсульфобетаин; лаурил-, миристил-, линолеил- или стеарилсаркозин; линолеил-, миристил- или цетилбетаин; лауроамидопропил-, кокамидопропил-, линолеиламидопропил-, миристамидопропил-, пальмидопропил- или изостеарамидопропилбетаин (например, лауроамидопропил); миристамидопропил-, пальмидопропил- или изостеарамидопропилдиметиламин; метилкокоил натрия или двунатриевый метилолеилтаурат; серия MONAQUAT™ (Mona Industries, Inc., Paterson, NJ.); Igepal CA-630, Плюроник, Triton, BRIJ, Atlas G2127, Genapol, HECAMEG, LUBROL PX, MEGA, NP, THESIT, TOPPS, CHAPS, CHAPSO, DDMAU, EMPIGEN BB, AWITTERGENT и C12E8. Детергент можно добавлять в любой рабочий буфер, а также можно включать в подаваемый материал, содержащий представляющие интерес молекулы. Детергенты могут присутствовать в любом количестве, пригодном для использования в способах, описываемых в настоящем документе, например, приблизительно от 0,001% до приблизительно 20% и, как правило, приблизительно от 0,01% до приблизительно 1%. В конкретном варианте осуществления используют полисорбат 80 в отмывочном буфере для CEXC.
Эффективность хроматографии можно контролировать с использованием различных способов, хорошо известных в данной области, таких как измерение поглощения УФ при 280 нм и 600 нм, электропроводности или pH или их комбинация.
Захват желаемых представляющих интерес частиц можно контролировать с использованием подходящего анализа, специфичного для представляющего интерес белка. Для определения общего содержания белка во фракциях можно использовать такие анализы, как хорошо известный анализ по Брэдфорду. Для определения чистоты можно использовать SDS-PAGE. Для идентификации и характеристики представляющего интерес белка можно использовать вестерн-блоттинг. Также можно использовать способы измерения активности белка, такие как анализ гемагглютинина, как описано в настоящем документе.
По другому варианту осуществления расширяющийся слой и колонку после использования очищают и восстанавливают. Таким образом, например, после элюции, смолу очищают и восстанавливают посредством отмывки 0,5 M NaOH, с последующей дистиллированной водой. Повторное уравновешивание можно проводить с использованием 10 мМ буфера Tris-Cl, pH7.
Таким образом, аспекты настоящего изобретения относятся к захвату представляющих интерес частиц из растения. Таким образом, один аспект относится к способу захвата представляющих интерес частиц из растения, растительной клетки или экстракта растения, включающему использование расширяющегося слоя или хроматографии EBA. По одному из вариантов осуществления этот способ включает этапы (a) предоставления расширяющегося слоя адсорбента, соответственно, адсорбента на основе DEAE; (b) приведения растительного материала в контакт с адсорбентом; (c) необязательной промывки адсорбента и (d) необязательной элюции представляющих интерес частиц из адсорбента. Соответственно, электропроводность экстракта растения до контакта с адсорбентом составляет от 1 мСм/см до 10 мСм/см, соответственно от 2 мСм/см до 3 мСм/см. Соответственно адсорбент содержит множество гранул, таких как гранулы, содержащие агарозу и лиганд, подходящий для связывания представляющих интерес частиц. Средний размер гранул может составлять приблизительно 50 мкм. Соответственно лиганд содержит, состоит или, по существу, состоит из анионообменной смолы, такой как ионообменная смола на основе диэтиламиноэтилцеллюлозы, соответственно ионообменной смолы на основе диэтиламиноэтилцеллюлозы-декстрана. Соответственно средняя плотность гранул составляет приблизительно от 1 г/мл до 20 г/мл. Соответственно линейная скорость потока составляет по меньшей мере приблизительно 150 см/час. Соответственно степень расширения расширяющегося слоя составляет приблизительно от 1 до 5.
Как правило, VLP антигенно сходны с вирионами, продуцируемыми при инфекции, но в них отсутствует генетическая информация, достаточная для репликации, и, таким образом, как правило, они неинфекционны. VLP могут являться морфологически сходными с вирионами, продуцируемыми при инфекции, но это не всегда так. VLP, такие как получаемые из растений VLP, могут иметь значительное распределение по размерам и могут по форме отличаться от вирионов, продуцируемых при инфекции, например, они могут быть менее сферическими, более вытянутыми по оси или расплющенного вида. Таким образом, VLP иногда могут выглядеть как деформированные вирусы, что делает сложным их захват.
VLP продуцируют из компонентов широкого спектра семейств вирусов, включая Parvoviridae (например, аденоассоциированный вирус), Retroviridae (например, ВИЧ) и Flaviviridae (например, вирус гепатита C). VLP можно получать во множестве систем культур клеток, включая линии клеток млекопитающих, линии клеток насекомых, дрожжи и растительные клетки. В определенных вариантах осуществления один или несколько видов молекул белка, присутствующих в VLP, можно модифицировать относительно природной последовательности. VLP можно получать в подходящих клетках-хозяевах, включая клетки млекопитающих, клетки бактерий, клетки растений и клетки насекомых. В одном из вариантов осуществления VLP получают в клетках растений. Часто VLP получают в больших количествах посредством гетерологической экспрессии. VLP можно выделять из хозяина или клетки-хозяина в виде интактных структур. VLP можно оценивать на структуру и размер, например, посредством иммунологического анализа, функциональных анализов (например, агглютинации), электронной микроскопии или посредством эксклюзионной хроматографии.
VLP могут содержать один или более или два или более различных представляющих интерес белка. Белки могут быть различного биологического происхождения, но по меньшей мере один из них является вирусного происхождения. Для VLP, содержащих молекулы белка более одного вида, молекулы белка могут происходить из того же вида вируса, или они могут содержать белок другого вида, рода, подсемейства или семейства вирусов. VLP могут дополнительно содержать другие типы молекул, которые не являются белковыми, такие как, но не ограничиваясь ими, липиды и углеводы.
В одном из вариантов осуществления VLP представляет собой мультимерную сборку мономерных единиц представляющего интерес белка. В различных вариантах осуществления представляющий интерес белок представляет собой вирусный белок, такой как, но без ограничений, белок капсида. Большинство вирусных структур основаны на структуре их капсидов, и они могут находиться в спиральной, икосаэдрической или изометрической или оболочечной формах. Спиральной симметрией обладают белковые субъединицы, расположенные по окружности вируса, формируя диск. Икосаэдрически симметричные капсиды формируют квазисферическую структуру и вместе с оболочечными вирусами белковые субъединицы экспонированы во внешнее окружение. В различных вариантах осуществления VLP содержит капсиды, включая от трех до приблизительно 200 капсидов. В одном из вариантов осуществления VLP содержит по меньшей мере 30, по меньшей мере 50, по меньшей мере 60, по меньшей мере 90 или по меньшей мере 120 капсидов. В другом варианте осуществления каждая VLP содержит по меньшей мере 150 капсидов, по меньшей мере 160, по меньшей мере 170 или по меньшей мере 180 капсидов. В других вариантах осуществления представляющий интерес белок может представлять собой белок вирусного матрикса или вирусный гликопротеин и т.п.
В одном из вариантов осуществления VLP экспрессируется в виде икосаэдрической структуры. В другом варианте осуществления VLP экспрессируется с такой же геометрией, как и природный вирус, из которого происходит последовательность капсида. В другом варианте осуществления геометрия VLP не является идентичной природному вирусу. В одном из вариантов осуществления по меньшей мере один из капсидов содержит по меньшей мере один представляющий интерес белок.
В одном из вариантов осуществления VLP, захваченный при применении настоящего изобретения, можно использовать для получения фармацевтической композиции, включая в качестве неограничивающих примеров вакцину, такую как вакцина против гриппа или птичьего гриппа. Такую вакцину можно вводить человеку или животному для предотвращения инфекции патогенным микроорганизмом, таким как, но не ограничиваясь ими, вирусы, бактерии, простейшие, круглые черви, паразиты, или для лечения инфекции таким патогенным микроорганизмом.
Представляющая интерес частица может представлять собой частицу-тень бактерии. Этот тип частиц представляет собой пустую оболочку бактериальной клетки такой бактерии, как грамотрицательная бактерия. Как правило, их получают посредством контролируемой гетерологической экспрессии гена, контролирующего частичный лизис бактерий, в частности грамотрицательных бактерий. Например, литический ген может представлять собой ген E бактериофага PhiX174, кодирующий полипептид, который встраивается в комплекс оболочки клетки грамотрицательных бактерий и приводит к формированию трансмембранной канальной структуры через внутреннюю и наружную мембраны. В зависимости от используемых условий лизиса внутренний диаметр этой канальной структуры может находиться в диапазоне приблизительно 20 нм - 400 нм, в частности 40 нм - 200 нм или 500 нм - 1000 нм. Цитоплазматические компоненты высвобождаются посредством этой канальной структуры, где получают комплекс пустой оболочки клетки с интактной морфологией, так называемую тень бактерии. Использование теней бактерий описано в W091/13555 и W093/01791. Частица-тень бактерии может представлять собой рекомбинантную частицу-тень. Частица-тень бактерии может представлять собой рекомбинантную частицу-тень, экспонирующую на своей поверхности один или несколько представляющих интерес белков, таких как вакцинный антиген.
Этим способом можно получать по меньшей мере 0,1 г/л белка в форме VLP. В другом варианте осуществления этим способом получают от 0,1 г/л до 10 г/л белка в форме VLP. В других вариантах осуществления этим способом получают по меньшей мере приблизительно 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 или 1,0 г/л белка в форме VLP. В одном из вариантов осуществления общее количество получаемых VLP составляет по меньшей мере 1,0 г/л.
Часть экспрессируемого вирусного капсида, функционально связанная с представляющим интерес белком, может формироваться в клетке в нерастворимый агрегат. В одном из вариантов осуществления представляющий интерес белок ренатурируют из нерастворимого агрегата, как описано в настоящем документе.
В одном из вариантов осуществления белок, функционально связанный с последовательностью вирусного капсида, содержит по меньшей мере две аминокислоты. В другом варианте осуществления белки содержат по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять, или по меньшей мере шесть аминокислот. В другом варианте осуществления длина белков составляет по меньшей мере семь, по меньшей мере восемь, по меньшей мере девять, по меньшей мере десять, или по меньшей мере 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 или 1000 или более аминокислот. В одном из вариантов осуществления молекулярная масса белка составляет по меньшей мере 25 кДа, 50 кДа, 100 кДа или 150 кДа или более.
Представляющий интерес белок может представлять собой гетерологичный белок, который не происходит из вируса и, необязательно, не происходит из того же вида, как клетка-хозяин.
Представляющий интерес белок может представлять собой функциональный белок; структурный белок; антиген; иммуноген; токсин; противомикробный белок, терапевтический белок или профилактический белок, пригодные для лечения или предотвращения или и для лечения, и для предотвращения заболеваний людей или животных. Также предусмотрены фрагменты, слитые белки, предшественники или конкатемеры белков, описываемых в настоящем документе. Неограничивающие примеры функциональных белков в качестве неограничивающих примеров включают иммуноактивные белки (например, антигенные белки, аллергенные белки, иммунорегуляторы, иммуномодуляторы); сигнальные белки и белки передачи сигнала и ингибирующие белки (например, токсические, биоцидные или биостатические белки, такие как белки, токсины и противомикробные белки). Структурные белки в качестве неограничивающих примеров включают, аптамеры; белки фолдинга, белки, способствующие адгезии, поверхностные белки, микроструктурные и наноструктурные архитектурные белки и предактивирующие белки. Каталитические белки включают, например, модифицирующие РНК белки; каталитические белки тРНК-синтетаз; инактивирующие рибозимы белки и вирусные каталитические белки. Представляющий интерес белок может представлять собой эпитоп, гаптен, связанный белок (например, антигенные вирусные белки; связанные с вирусами белки, идиотипические домены антител; белки клеточной поверхности; антигенные белки, происходящие от человека, животных, одноклеточных организмов, растений, грибов, бактерий или архей; аллергенные белки и десенсибилизирующие аллергены белки).
Также белок может представлять собой иммунорегулятор или иммуномодулятор (например, интерфероны, интерлейкины, иммунодепрессанты и иммуностимуляторы); антитело (например, одноцепочечные антитела; фрагменты и конструкции одноцепочечных антител, например, молекулы одноцепочечных Fv; молекулы легких цепей антител, молекулы тяжелых цепей антител, молекулы легких и тяжелых цепей антител с удаленными доменами; домены и молекулы одноцепочечных антител, например, домены CH1, CH1-3, CH3, CH1-4, CH4, VHCH1, CL, CDR1 или FR1-CDR1-FR2; паратопические пептиды; микроантитела); другой связывающий белок (например, аптамеры, внутриклеточные рецепторные белки и рецепторные белки клеточной поверхности, фрагменты рецепторов).
Белок может представлять собой субстрат фермента или ингибитор фермента или лиганд рецептора клеточной поверхности, агонист и антагонист, гормон, цитокин, хемокин, вирокин и белок гормонов высвобождения и ингибирования высвобождения вироцепторов, нейромедиатор или блокатор каналов, токсин или предшественник токсина. Белок также может представлять собой относящийся к метаболизму и расщеплению белок, белок, модулирующий или опосредующий клеточную адгезию, белок внеклеточного матрикса, нейропротектор или способствующий миелинизации белок или ингибирующий агрегацию белок. Представляющий интерес белок может представлять собой секретируемый белок.
Кодирующая последовательность белка может представлять собой природную кодирующую последовательность, но более типично является кодирующей последовательностью, которую выбрали, улучшили или оптимизировали для применения в выбранной экспрессирующей клетке-хозяине, например, посредством синтеза гена, отражающего предпочтительное использование кодонов вида-хозяина или посредством включения сигнального пептида.
В одном из вариантов осуществления представляющий интерес белок представляет собой антиген, который можно использовать в вакцине или вакцинной композиции. Соответственно, вакцина также содержит фармацевтически приемлемый носитель или адъювант или оба. Предусмотрено, что вакцины являются профилактическими или терапевтическими. "Профилактическое" лечение представляет собой лечение, проводимое индивидууму, у которого не выявляют признаков заболевания или выявляют только ранние признаки, с целью снижения риска развития патологии. Вакцину можно вводить в качестве профилактического лечения для снижения вероятности развития патологии или минимизации тяжести патологии, если она разовьется. "Терапевтическое" лечение представляет собой лечение, проводимое индивидууму, у которого выявляют признаки или симптомы патологии, с целью уменьшения или устранения этих признаков или симптомов. Признаки или симптомы могут быт биохимическими, клеточными, гистологическими, функциональными, субъективными или объективными.
В одном из вариантов осуществления антиген представляет собой гемагглютинин (HA) или его фрагмент или производное. HA представляет собой гликопротеин вирусной поверхности, содержащий приблизительно 560 аминокислот. Он отвечает за адгезию вируса и его проникновение в клетку-хозяина на ранних стадиях инфекции. Существует по меньшей мере 16 известных подтипов HA, классифицируемых как подтипы H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 или H16. Гемагглютинин находится на поверхности вирусов гриппа, а также множества других бактерий и вирусов. В настоящее время наиболее значимыми причинами инфекций вирусом гриппа у людей являются вирусы, относимые к подтипам H1N1 и H3N2 вируса гриппа типа A. Однако штаммы вируса гриппа, которые могут вызывать пандемическую инфекцию, представляют собой, например, подтип H5N1, от которого типичные вакцины против вируса гриппа не защищают. Также пандемическим потенциалом обладают подтипы H2, H7 и H9. Высокопатогенные вирусы птичьего гриппа способны вызывать тяжелое респираторное заболевание и смерть у птиц. Этот признак известен только для HA подтипов H5 и H7. Вследствие способности некоторых птичьих вирусов передаваться людям, они также относятся к здоровью человека. Патогенность вирусов птичьего гриппа представляет собой полигенное свойство, но показано, что белку HA принадлежит первичная роль при инфекции. Белок HA можно экспрессировать в мономерной, димерной или тримерной формах. Любые подтипы и варианты HA, а также мономерные, димерные или тримерные формы любых HA могут являться представляющим интерес белком и находиться в VLP, описываемых в настоящем документе.
Белок гемагглютинин можно детектировать посредством ELISA стандартными способами, которые могут включать использование антител. Способы измерения активности гемагглютинации хорошо известны в данной области и включают инкубацию с эритроцитами, как описано в W02004/098533.
Как правило, хозяином для продукции представляющих интерес частиц является хозяин, у которого вирусный белок не поддерживает репликации или инфекции клетки. В одном из вариантов осуществления вирусный белок получают из вируса, который не инфицирует клетки вида, из которого происходит клетка-хозяин. Например, в одном из вариантов осуществления виды вирусов инфицируют млекопитающих, а для экспрессирующей системы используют растительную клетку-хозяина. Клетку-хозяина можно модифицировать для улучшения сборки представляющих интерес частиц. Например, клетку-хозяина можно модифицировать для включения шапероновых белков, которые способствуют формированию представляющих интерес частиц из экспрессируемых вирусных белков. В другом варианте осуществления клетку-хозяина модифицируют с включением репрессорного белка для более эффективной регуляции экспрессии капсида для обеспечения регулируемого формирования представляющих интерес частиц.
Клетки-хозяева включают клетки бактерий, дрожжей, водорослей, насекомых, млекопитающих и растений.
В некоторых вариантах осуществления изобретения бактериальная клетка-хозяин принадлежит роду Agrobacterium, например A. radiobacter, A. rhizogenes и A. rubi. В некоторых вариантах осуществления изобретения бактериальная клетка-хозяин принадлежит роду Arthrobacter, например A. aurescens, A. citreus, A. globformis, A. hydrocarboglutamicus, A. mysorens, A. nicotianae, A. paraffineus, A. protophonniae, A. roseoparqffinus, A. sulfureus и A. ureafaciens. В некоторых вариантах осуществления изобретения бактериальная клетка-хозяин принадлежит роду Bacillus, например B. thuringiensis, B. anthracis, B. megaterium, B. subtilis, B. lentos, B. circulans, B. pumilus, B. lautus, B. coagulans, B. brevis, B. firmus, B. alkaophius, B. licheniformis, B. clausii, B. stearothermophilus, B. halodurans и B. amyloliquefaciens. В конкретных вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой промышленный штамм Bacillus, включая в качестве неограничивающих примеров B. subtilis, B. pumilus, B. licheniformis, B. megaterium, B. clausii, B. stearothermophilus и B. amyloliquefaciens. В некоторых вариантах осуществления бактериальная клетка-хозяин принадлежит роду Clostridium, например C. acetobutylicum, C. tetani E88, C. lituseburense, C. saccharobutylicum, C. perfringens и C. beijerinckii. В некоторых вариантах осуществления бактериальная клетка-хозяин принадлежит роду Corynebacterium, например C. glutamicum и C. acetoacidophilum. В некоторых вариантах осуществления бактериальная клетка-хозяин принадлежит роду Escherichia, например, E. coli. В некоторых вариантах осуществления бактериальная клетка-хозяин принадлежит роду Erwinia, например E. uredovora, E. carotovora, E. ananas, E. herbicola, E. punctata и E. terreus. В некоторых вариантах осуществления бактериальная клетка-хозяин принадлежит роду Pantoea, например P. citrea и P. agglomerans. В некоторых вариантах осуществления бактериальная клетка-хозяин принадлежит роду Pseudomonas, например, P. putida, P. aeruginosa и P. mevalonii. В некоторых вариантах осуществления бактериальная клетка-хозяин принадлежит роду Streptococcus, например S. equisimiles, S. pyogenes и S. uberis. В некоторых вариантах осуществления бактериальная клетка-хозяин принадлежит роду Streptomyces, например S. ambofaciens, S. achromogenes, S. avermitilis, S. coelicolor, S. aureofaciens, S. aureus, S. fungicidicus, S. griseus и S. lividans. В некоторых вариантах осуществления бактериальная клетка-хозяин принадлежит роду Zymomonas, например Z. mobilis и Z. lipolytica. Вследствие высокого потенциала быстрых, эффективных, недорогих и обильных выходов рекомбинантных белков, бактерии исследовали в качестве клеток-хозяев в экспрессирующих системах для получения представляющих интерес частиц, таких как VLP. Исследователи показали, что конкретные вирусные капсиды дикого типа без вставок рекомбинантных белков можно транзиторно экспрессировать в нетропических энтеробактериях. Также исследователи показали, что эти капсиды могут собираться in vivo и in vitro, с формированием представляющих интерес частиц, таких как VLP.
Дрожжевая клетка-хозяин может представлять собой клетку родов, но не ограничиваясь ими, Candida, Hansenula, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Pichia, Kluyveromyces и Yarrowia. В некоторых вариантах осуществления изобретения дрожжевая клетка представляет собой Hansenula polymorpha, Saccharomyces cerevisiae, Saccaromyces carlsbergensis, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces kluyveri, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia kodamae, Pichia membranaefaciens, Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia quercuum, Pichia pijperi, Pichia stipitis, Pichia methanolica, Pichia angusta, Kluyveromyces lactis, Candida albicans и Yarrowia lipolytica.
Грибная клетка-хозяин может представлять собой клетку родов, но не ограничиваясь ими, Achlya, Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Cephalosporium, Chrysosporium, Cochliobolus, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Coprinus, Coriolus, Diplodia, Endothis, Fusarium, Gibberella, Gliocladium, Humicola, Hypocrea, Myceliophthora, Mucor, Neurospora, Penicillium, Podospora, Phlebia, Piromyces, Pyricularia, Rhizomucor; Rhizopus, Schizophyllum, Scytalidium, Sporotrichum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Trametes, Tolypocladium, Trichoderma, Verticillium, Volvariella или их телеоморфы или анаморфы и синонимы или таксономические эквиваленты.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, клетка-хозяин представляет собой клетку водоросли, такую как Chlamydomonas (например, C. Reinhardtii) и Phormidium (P. sp. ATCC29409).
Примеры клеток-хозяев насекомых включают линию клеток Lepidoptora, такую как Spodoptera frugiperda (Sf9 или Sf21) или клетки Trichoplusioani (High Five).
Примеры клеток-хозяев млекопитающих включают линии клеток яичника китайского хомячка (CHO) (например, CHO-K1; ATCC CCL-61), линии клеток зеленых мартышек (COS) (например, COS 1 (ATCC CRL-1650), COS 7 (ATCC CRL-1651)); клетки мышей (например, NS/О), линии клеток почки детеныша хомячка (BHK) (например, ATCC CRL-1632 или ATCC CCL-10) и клетки человека (например, HEK 293 (ATCC CRL-1573)).
В одном из вариантов осуществления хозяином является растение, и клетка-хозяин представляет собой растительную клетку. Растительные клетки можно получать или они получаемы из растений, или они могут представлять собой культивируемые растительные клетки, которые культивируют вне растений. Таким образом, в одном из вариантов осуществления растение представляет собой растительную клетку, такую как растительные клетки, выращиваемые в культуре или вне растения, такие как выращиваемые in vitro растительные клетки или скопления клеток. Неограничивающие примеры растений включают однодольные растения и двудольные растения, такие как сельскохозяйственные культуры, декоративные растения и неодомашненные или дикорастущие растения. Дополнительные примеры включают растения коммерческого или сельскохозяйственного значения, такие как сельскохозяйственные культуры (особенно сельскохозяйственные культуры, используемые для получения пищи для человека или корма для животных), деревья для получения древесины или древесной массы, овощные растения, фруктовые растения и декоративные растения.
Неограничивающие примеры растений включают зерновые сельскохозяйственные культуры (такие как пшеница, овес, ячмень, кукуруза, рожь, тритикале, рис, просо, сорго, киноа, амарант и гречиха); кормовые сельскохозяйственные культуры (такие как кормовые травы и кормовые двудольные растения, включая люцерну, горошек, клевер и т.п.); маслосеменные сельскохозяйственные культуры (такие как хлопок, сафлор, подсолнечник, соя, канола, рапс, лен, арахис и масличная пальма); древесный орех (такой как грецкий орех, кешью, фундук, пекан, миндаль и т.п.); сахарный тростник, кокос, финиковую пальму, маслину, сахарную свеклу, чай и кофе; деревья для получения древесины или древесной массы; овощные сельскохозяйственные культуры, такие как бобовые (например, бобы, горох, чечевица, люцерна, арахис), салат-латук, спаржа, артишок, сельдерей, морковь, редис, различные капустные (например, кочанная капуста, огородная капуста, горчица и другие листовые капустные, брокколи, цветная капуста, брюссельская капуста, турнепс, кольраби), тыквенные (например, огурец, дыня, летние сорта тыквы, зимние сорта тыквы), луковые (например, лук, чеснок, лук-порей, лук-шалот, лук-резанец), представители пасленовых (например, томаты, баклажан, картофель, перец, физалис) и представители маревых (например, свекла, мангольд, шпинат, киноа, амарант); фруктовые сельскохозяйственные культуры, такие как яблоко, груша, цитрусовые (например, апельсин, лайм, лимон, грейпфрут и другие), костянки (например, абрикос, персик, слива, нектарин), банан, ананас, виноград, киви, папайя, авокадо и ягоды; и декоративные растения, включая декоративные цветущие растения, декоративные деревья и кустарник, декоративные почвопокровные растения и декоративные травы. Дополнительные примеры двудольных растений в качестве неограничивающих примеров включают канолу, хлопок, картофель, киноа, амарант, гречиху, сафлор, сою, сахарную свеклу и подсолнечник, более соответственно сою, канолу и хлопок. Дополнительные примеры однодольных растений в качестве неограничивающих примеров включают пшеницу, овес, ячмень, кукурузу, рожь, тритикале, рис, декоративные и кормовые травы, сорго, просо и сахарный тростник. Растения в качестве хозяев для продукции рекомбинантных белков содержат уникальный набор загрязняющих веществ, которые можно удалять при захвате и очистке представляющих интерес частиц. Кроме того, твердые вещества растений, которые требуют раннего удаления после экстракции, как правило, присутствуют в более высоких концентрациях, в более широком диапазоне размеров и являются более плотными, чем традиционный дебрис культур клеток бактерий и млекопитающих. Типичная схема обработки и очистки растений состоит из выделения ткани растения, содержащей рекомбинантный белок, фракционирования ткани вместе с уменьшением размера частиц, экстракции белка-мишени в водную среду, очистки неочищенного экстракта от примесей и, в заключение, очистки продукта. Таким образом, улучшение захвата представляющих интерес частиц из растительных клеток благоприятно влияет на общую стоимость получения.
Растительный материал, пригодный для использования по настоящему изобретению, может представлять собой или его можно получать из однодольных или двудольных растений или систем клеток растений, включая виды из одного из следующих семейств: Acanthaceae, Alliaceae, Alstroemeriaceae, Amaryllidaceae, Apocynaceae, Arecaceae, Asteraceae, Berberidaceae, Bixaceae, Brassicaceae, Bromeliaceae, Cannabaceae, Caryophyllaceae, Cephalotaxaceae, Chenopodiaceae, Colchicaceae, Cucurbitaceae, Dioscoreaceae, Ephedraceae, Erythroxylaceae, Euphorbiaceae, Fabaceae, Lamiaceae, Linaceae, Lycopodiaceae, Malvaceae, Melanthiaceae, Musaceae, Myrtaceae, Nyssaceae, Papaveraceae, Pinaceae, Plantaginaceae, Poaceae, Rosaceae, Rubiaceae, Salicaceae, Sapindaceae, Solanaceae, Taxaceae, Theaceae или Vitaceae.
Подходящие виды могут включать представителей родов Abelmoschus, Abies, Acer, Agrostis, Allium, Alstroemeria, Ananas, Andrographis, Andropogon, Artemisia, Arundo, Atropa, Berberis, Beta, Bixa, Brassica, Calendula, Camellia, Camptotheca, Cannabis, Capsicum, Carthamus, Catharanthus, Cephalotaxus, Chrysanthemum, Cinchona, Citrullus, Coffea, Colchicum, Coleus, Cucumis, Cucurbita, Cynodon, Datura, Dianthus, Digitalis, Dioscorea, Elaeis, Ephedra, Erianthus, Erythroxylum, Eucalyptus, Festuca, Fragaria, Galanthus, Glycine, Gossypium, Helianthus, Hevea, Hordeum, Hyoscyamus, Jatropha, Lactuca, Linum, Lolium, Lupinus, Lycopersicon, Lycopodium, Manihot, Medicago, Mentha, Miscanthus, Musa, Nicotiana, Oryza, Panicum, Papaver, Parthenium, Pennisetum, Petunia, Phalaris, Phleum, Pinus, Poa, Poinsettia, Populus, Rauwolfia, Ricinus, Rosa, Saccharum, Salix, Sanguinaria, Scopolia, Secale, Solanum, Sorghum, Spartina, Spinacea, Tanacetum, Taxus, Theobroma, Triticosecale, Triticum, Uniola, Veratrum, Vinca, Vitis и Zea.
Подходящие виды могут включать виды Panicum, виды Sorghum, виды Miscanthus, виды Saccharum, виды Erianthus, виды Populus, Andropogon gerardii (бородач), Pennisetum purpureum (слоновая трава), Phalaris arundinacea (красный канареечник), Cynodon dactylon (бермудская трава), Festuca arundinacea (высокая овсяница), Spartina pectinata (перистая спартина), Medicago sativa (люцерна), Arundo donax (арундо тростниковый), Secale cereale (рожь), виды Salix (ива), виды Eucalyptus (эвкалипт), Triticosecale (тритикале - пшеница×рожь), бамбук, Helianthus annuus (подсолнечник), Carthamus tinctorius (сафлор), Jatropha curcas (ятрофа), Ricinus communis (клещевина), Elaeis guineensis (пальма), Linum usitatissimum (лен), Brassica juncea, Beta vulgaris (сахарная свекла), Manihot esculenta (маниок), Lycopersicon esculentum (томат), Lactuca sativa (салат-латук), Musa paradisiaca (банан), Solanum tuberosum (картофель), Brassica oleracea (брокколи, цветная капуста, брюссельская капуста), Camellia sinensis (чай), Fragaria ananassa (земляника), Theobroma cacao (какао), Coffea arabica (кофе), Vitis vinifera (виноград), Ananas comosus (ананас), Capsicum annum (острый и сладкий перец), Allium cepa (лук), Cucumis melo (дыня), Cucumis sativus (огурец), Cucurbita maxima (тыква), Cucurbita moschata (тыква), Spinacea oleracea (шпинат), Citrullus lanatus (арбуз), Abelmoschus esculentus (окра), Solanum melongena (баклажан), виды Rosa (роза), Dianthus caryophyllus (гвоздика), виды Petunia (петуния), Poinsettia pulcherrima (пуансетия), Lupinus albus (люпин), Uniola paniculata (овес), полевица (виды Agrostis), Populus tremuloides (осина), виды Pinus (сосна), виды Abies (ель), виды Acer (клен), Hordeum vulgare (ячмень), Poa pratensis (мятлик), Lolium spp. (плевел) и Phleum pratense (тимофеевка), Panicum virgatum (просо прутьевидное), Sorghum bicolor (сорго, суданская трава), Miscanthus giganteus (мискантус), вид Saccharum (сахарный тростник), Populus balsamifera (тополь), Zea mays (кукуруза), Glycine max (соя), Brassica napus (канола), Triticum aestivum (пшеница), Gossypium hirsutum (хлопок), Oryza sativa (рис), Helianthus annuus (подсолнечник), Medicago sativa (люцерна), Beta vulgaris (сахарная свекла) или Pennisetum glaucum (африканское просо).
Растительный материал может представлять собой или его можно получать из природных, мутантных, неприродных или трансгенных растений табака, включая растения рода Nicotiana, различных видов Nicotiana, включая N. benthamiana и N. tabacum (например, LA B21, LN KY171, Tl 1406, Basma, Galpao, Perique, Beinhart 1000-1 и Petico). Другие виды включают N. acaulis, N. acuminata, N. acuminata var. multiflora, N. africana, N. alata, N. amplexicaulis, N. arentsii, N. attenuata, N. benavidesii, N. rustica, N. bigelovii, N. bonariensis, N. cavicola, N. clevelandii, N. cordifolia, N. corymbosa, N. debneyi, N. excelsior, N. forgetiana, N. fragrans, N. glauca, N. glutinosa, N. goodspeedii, N. gossei, N. hybrid, N. ingulba, N. kawakamii, N. knightiana, N. langsdorffii, N. linearis, N. longiflora, N. maritima, N. megalosiphon, N. miersii, N. noctiflora, N. nudicaulis, N. obtusifolia, N. occidentalis, N. occidentalis subsp. hesperis, N. otophora, N. paniculata, N. pauciflora, N. petunioides, N. plumbaginifolia, N. quadrivalvis, N. raimondii, N. repanda, N. rosulata, N. rosulata subsp. ingulba, N. rotundifolia, N. setchellii, N. simulans, N. solanifolia, N. spegazzinii, N. stocktonii, N. suaveolens, N. sylvestris, N. tabacum. N. thyrsiflora, N. tomentosa, N. tomentosiformis, N. trigonophylla, N. umbratica, N. undulata, N. velutina, N. wigandioides и N. x sanderae.
Также предусмотрено использование растительного материала, происходящего или получаемого из культиваров или элитных культиваров. Неограничивающие примеры сортов или культиваров представляют собой: BD 64, CC 101, CC 200, CC 27, CC 301, CC 400, CC 500, CC 600, CC 700, CC 800, CC 900, Coker 176, Coker 319, Coker 371 Gold, Coker 48, CD 263, Denzizli, DF911, табак Galpao, GL 26H, GL 350, GL 600, GL 737, GL 939, GL 973, HB 04P, K 149, K 326, K 346, K 358, K394, K 399, K 730, KDH 959, KT 200, KT204LC, KY10, KY14, KY 160, KY 17, KY 171, KY 907, KY907LC, KTY14xL8 LC, Karabaglar, Little Crittenden, McNair 373, McNair 944, msKY 14xL8, Narrow Leaf Madole, NC 100, NC 102, NC 2000, NC 291, NC 297, NC 299, NC 3, NC 4, NC 5, NC 6, NC7, NC 606, NC 71, NC 72, NC 810, NC BH 129, NC 2002, Neal Smith Madole, OXFORD 207, табак 'Perique', PVH03, PVH09, PVH19, PVH50, PVH51, R 610, R 630, R 7-11, R 7-12, RG 17, RG 81, RG H51, RGH 4, RGH 51, RS 1410, Speight 168, Speight 172, Speight 179, Speight 210, Speight 220, Speight 225, Speight 227, Speight 234, Speight G-28, Speight G-70, Speight H-6, Speight H20, Speight NF3, TI 1406, TI 1269, TN 86, TN86LC, TN 90, TN 97, TN97LC, TN D94, TN D950, TR (Tom Rosson) Madole, Turkish Samson, VA 309, VA359, DAC, Mata, Fina, P02, BY-64, AS44, RG17, RG8, HB04P, Basma Xanthi BX 2A, Coker 319, Hicks, McNair 944 (MN 944), Burley 21, K149, Yaka JB 125/3, Kasturi Mawar, NC 297, Coker 371 Gold, P02, Wislica, Simmaba, Turkish Samsun, AA37-1, B13P, F4 после скрещивания BU21 x Hoja Parado line 97, Samsun или P01. Неограничивающие примеры культиваров N. tabacum представляют собой AA 37-1, B 13P, Xanthi (Mitchell-Mor), KTRD#3 Hybrid 107, Bel-W3, 79-615, Samsun Holmes NN, KTRDC#2 Hybrid 49, KTRDC#4 Hybrid 110, Burley 21, BY-64, KTRDC#5 KY 160 SI, KTRDC#7 FCA, KTRDC#6 TN 86 SI, Coker 371 Gold, K 149, K 326, K 346, K 358, K 394, K 399, K 730, KY 10, KY 14, KY 160, KY 17, KY 8959, KY 9, KY 907, MD 609, McNair 373, NC 2000, PG 01, PG 04, M066, P01, P02, P03, RG 11, RG 17, RG 8, Speight G-28, TN 86, TN 90, VA 509, AS44, Banket A1, Basma Drama B84/31, Basma I Zichna ZP4/B, Basma Xanthi BX 2A, Batek, Besuki Jember, C104, Coker 319, Coker 347, Criollo Misionero, DAC Mata Fina, Delcrest, Djebel 81, DVH 405, Galpão Comum, HB04P, Hicks Broadleaf, Kabakulak Elassona, Kasturi Mawar, Kutsage E1, KY 14xL8, KY 171, LA BU 21, McNair 944, NC 2326, NC 71, NC 297, NC 3, PVH 03, PVH 09, PVH 19, PVH 2110, Red Russian, Samsun, Saplak, Simmaba, Talgar 28, Turkish Samsun, Wislica, Yayaldag, NC 4, TR Madole, Prilep HC-72, Prilep P23, Prilep PB 156/1, Prilep P12-2/1, Yaka JK-48, Yaka JB 125/3, TI-1068, KDH-960, TI-1070, TW136, Samsun NN, Izmir, Basma, TKF4028, L8, TKF2002, TN90, GR141, Basma xanthi, GR149, GR153, Petit Havana или Xanthi NN.
Система транзиторной экспрессии особенно подходит для получения растений, которые используют в способах по изобретению. Такая система транзиторной экспрессии, соответственно используемая с различными видами Nicotiana и сортами N. tabacum, включает инфильтрацию суспензии генетически сконструированной Agrobacterium tumefaciens в листья целых растений известным в данной области физическим способом (например, применение вакуума или давления, большего, чем атмосферное давление) и использование способности Agrobacterium переносить молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие представляющий интерес белок в растительные клетки, как правило, экспрессирующую конструкцию, которая может реплицироваться в Agrobacterium. Количество копий экспрессирующей конструкции в инфильтрированной растительной клетке выше, чем количество, используемое для получения трансгенного растения. Транзиторная экспрессия, которую используют для получения растений, используемых по изобретению, характеризуется отсутствием необходимости интеграции экспрессирующей конструкции в геном растения, хотя инфильтрация Agrobacterium может приводить к интеграции. Таким образом, большинство инфильтрированных растительных клеток не содержат геном, содержащий интегрированную экспрессирующую конструкцию. И при этом транзиторная экспрессия не требует переноса экспрессирующей конструкции в растения-потомки. Как правило, в период в пределах от 2 до 15 суток или, соответственно, от 4 до 6 суток после инфильтрации, рекомбинантный белок накапливается в инфильтрированных растительных клетках и формирует вирусоподобные частицы. В этот момент биомассу, в частности инфильтрированные листья, можно собирать и обрабатывать с выделением частиц. Таким образом, растительный материал можно получать из растения (такого как сорта Nicotiana benthamiana или Nicotiana tabacum), транзиторно экспрессирующего белок, находящийся в вирусоподобных частицах, соответственно растения, которое инфильтрировано клетками Agrobacterium, содержащими экспрессирующую конструкцию, кодирующую белок и обеспечивающую транзиторную экспрессию белка в инфильтрированной растительной клетке.
Использование растительных материалов в качестве сырья обеспечивает дополнительные сложности вследствие высокого содержания твердых веществ, например, более чем 5%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% или 20% масс./масс. Сырье может содержать высокую концентрацию материала, который является большим по размеру, чем материал, находящийся в супернатанте клеточной культуры, например, представляющие интерес частицы в диапазонах от 10E-4 до 10E-2, от 10E-4 до 10E-1, от 10E-3 до 10E-1, от 10E-4 до 1 мм, от 10E-3 до 1 мм или от 10E-2 до 1 мм. Сырье представляет собой химический комплекс, как правило, содержащий липиды, крахмалы, лигнины, фенольные соединения и пигменты. Низкий выход рекомбинантного белка в растении относительно клеточной культуры требует загрузки больших объемов сырья.
Если смесь происходит или ее получают из растения, тогда она может находиться в форме экстракта сока растения. Как применяют в настоящем документе, термин "экстракт сока растения" относится к жидкому материалу, получаемому из растения, содержащего хлорофилл. Экстракт сока растения может представлять собой кондиционированный экстракт сока растения.
Хотя специалист понимает, что представляющий интерес белок может содержаться в одном или нескольких видах представляющих интерес частиц, для некоторых вариантов осуществления может быть желательным выделять или очищать представляющий интерес белок из представляющих интерес частиц. Таким образом, способы, описываемые в настоящем документе, могут включать необязательный дополнительный этап очистки белка из представляющих интерес частиц. Таким образом, представляющий интерес белок, содержащийся в представляющих интерес частицах, можно очищать до значительной степени чистоты стандартными способами, хорошо известными в данной области, включая в качестве неограничивающих примеров осаждение сульфатом аммония или этанолом, экстракцию кислотой, анионо- или катионообменную хроматографию, хроматографию на фосфоцеллюлозе, хроматографию на основе гидрофобных взаимодействий, аффинную хроматографию, хроматографию с никелем, хроматографию на гидроксиапатите, хроматографию с обращенной фазой, хроматографию с лектином, препаративный электрофорез, солюбилизацию в детергенте, селективное осаждение с такими веществами как для колоночной хроматографии, способы иммуноаффинной очистки и другие. Например, белки с установленными свойствами молекулярной адгезии могут обратимо связывать лиганд. С применением подходящего лиганда белок можно селективно адсорбировать на очищающую колонку, а затем высвобождать из колонки в относительно чистой форме. Кроме того, белок можно очищать с использованием иммуноаффинных колонок или Ni-NTA колонок.
Также следует понимать, что способы по изобретению могут включать дополнительные этапы переработки материала до или после контакта с расширяющимся слоем. Таким образом, способы, описываемые в настоящем документе, могут включать дополнительные предварительные или последующие этапы обработки. Таким образом, в одном из вариантов осуществления способ включает необязательный дополнительный этап обработки материала до или после контакта с расширяющимся слоем. В другом варианте осуществления способ включает необязательный дополнительный этап обработки представляющих интерес частиц после их элюции из адсорбента. Таким образом, в качестве примера, материал можно подвергать осаждению сульфатом аммония или этанолом, экстракции кислотой, анионо- или катионообменной хроматографии, хроматографии на фосфоцеллюлозе, хроматографии на основе гидрофобных взаимодействий, аффинной хроматографии, хроматографии с никелем, хроматографии на гидроксиапатите, хроматографии с обращенной фазой, хроматографии с лектином, препаративному электрофорезу, солюбилизации в детергенте, селективному осаждению с такими веществами как для колоночной хроматографии, способам иммуноаффинной очистки, фильтрации, микрофильтрации, центрифугированию, декантации или седиментации или комбинации указанного выше.
3
"Катионообменная смола" является отрицательно заряженной и содержит свободные катионы для обмена с катионами в водном растворе, проходящем над или через адсорбент или твердую фазу. Можно использовать любой отрицательно заряженный лиганд, подходящий для формирования катионообменной смолы, например карбоксилат, сульфонат и другие, как описано ниже. Коммерчески доступные катионообменные смолы в качестве неограничивающих примеров включают, например, смолы с группой на основе сульфоната (например, MonoS, MiniS, Source 15S и 30S, SP Sepharose Fast Flow™, SP высокоэффективная сефароза из GE Healthcare, Toyopearl SP-650S и SP-650M из Tosoh, Macro-Prep High S из BioRad, Ceramic HyperD S, Trisacryl M и LS SP и Spherodex LS SP из Pall Technologies); группой на основе сульфоэтила (например, Fractogel SE из EMD, Poros S-10 и S-20 из Applied Biosystems); группой на основе сульфопропила (например, TSK Gel SP 5PW и SP-5PW-HR из Tosoh, Poros HS-20 и HS 50 из Applied Biosystems); группой на основе сульфоизобутила (например, Fractogel EMD SO из EMD); группой на основе сульфоксиэтила (например, SE52, SE53 и Expression S из Whatman), группой на основе карбоксиметила (например, CM Sepharose Fast Flow из GE Healthcare, Hydrocell CM из Biochrom Labs Inc., Macro-Prep CM из BioRad, Ceramic HyperD CM, Trisacryl M CM, Trisacryl LS CM из Pall Technologies, Matrx Cellufme C500 и C200 из Millipore, CM52, CM32, CM23 и Express-Ion C из Whatman, Toyopearl CM-650S, CM-650M и CM-650C их Tosoh); группами на основе сульфоновой и карбоновой кислот (например, BAKEPVBOND Carboxy-Sulfon из J.T. Baker); группой на основе карбоновой кислоты (например, WP CBX из J.T. Baker, DOWEX MAC-3 из Dow Liquid Separations, Amberlite Weak Cation Exchangers, DOWEX Weak Cation Exchanger и Diaion Weak Cation Exchangers из Sigma-Aldrich и Fractogel EMD COO- из EMD); группой на основе сульфоновой кислоты (например, Hydrocell SP из Biochrom Labs Inc., DOWEX Fine Mesh Strong Acid Cation Resin из Dow Liquid Separations, UNOsphere S, WP Sulfonic из J. T. Baker, мембрана Sartobind S из Sartorius, Amberlite Strong Cation Exchangers, DOWEX Strong Cation and Diaion Strong Cation Exchanger из Sigma-Aldrich) и группой на основе ортофосфата (например, PI 1 из Whatman).
"Анионообменная смола" является положительно заряженной, таким образом она содержит один или несколько положительно заряженных лигандов, связанных с ней. Можно использовать любой положительно заряженный лиганд, связанный с адсорбентом или твердой фазой, подходящий для формирования анионообменной смолы, такой как четвертичные аминогруппы. Коммерчески доступные анионообменные смолы включают DEAE-целлюлозу, Poros PI 20, PI 50, HQ 10, HQ 20, HQ 50, D 50 из Applied Biosystems, Sartobind Q из Sartorius, MonoQ, MiniQ, Source 15Q и 30Q, Q, DEAE и ANX Sepharose Fast Flow, Q высокоэффективную сефарозу, QAE SEPHADEX™ и FAST Q SEPHAROSE™ (GE Healthcare), WP PEI, WP DEAM, WP QUAT из J.T. Baker, Hydrocell DEAE и Hydrocell QA из Biochrom Labs Inc., UNOsphere Q, Macro-Prep DEAE и Macro-Prep High Q из Biorad, ceramic HyperD Q, ceramic HyperD DEAE, Trisacryl M и LS DEAE, Spherodex LS DEAE, QMA Spherosil LS, QMA Spherosil M и Mustang Q из Pall Technologies, анионные смолы DOWEX Fine Mesh Strong Base Type I и Type II и DOWEX MONOSPHER E 77, анион слабого основания из Dow Liquid Separations, мембрану Intercept Q, Matrex Cellufme A200, A500, Q500 и Q800 из Millipore, Fractogel EMD TMAE, Fractogel EMD DEAE и Fractogel EMD DMAE из EMD, слабые и сильные анионообменные материалы типов I и II Amberiite, слабые и сильные анионообменные материалы типов I и II DOWEX, слабые и сильные анионообменные материалы типов I и II Diaion, Duolite из Sigma-Aldrich, гель Q TSK и DEAE 5PW и 5PW-HR, Toyopearl SuperQ-650S, 650M и 650C, QAE-550C и 650S, DEAE-650M и 650C из Tosoh, QA52, DE23, DE32, DE51, DE52, DE53, Express-Ion D и Express-Ion Q из Whatman.
Также предусмотрено использование тиофильной хроматографии, которая также известна как тиофильная адсорбционная хроматография. Термин "тиофильный" относится к селективности, которой белки обладают в отношении сульфоновых групп, которые находятся в непосредственной близости к тиоэфирным группам. Это представляет собой тип неафинной хроматографии, при которой для выделения белка представляющий интерес белок, содержащий тиофильные области и ароматические аминокислотные остатки, связывается с содержащим серу лигандом. Тиофильный гель можно получать восстанавливя дивинилсульфон (связанный с сефарозой 4B) β-меркаптоэтанолом. Тиофильная адсорбционная хроматография основана на донорно-акцепторных свойствах в отношении электрона и отличается от хроматографии на основе гидрофобности. Гидрофобные ассоциации и ионные взаимодействия не происходят у тиофильных сорбентов, так как тиоэтилсульфоновые структуры не обладают выраженной гидрофобностью или ионным зарядом. Примеры коммерчески доступных смол для тиофильной хроматографии включают Fractogel EMD TA (Merck; Rahway, NJ), смолы Uniflow и Superflow (Clontech) и T-Gel (Pierce).
Термин "аффинная хроматография" относится к способу разделения, при котором представляющий интерес белок обратимо и специфически связывается с биологически специфическим лигандом, как правило, на основании комбинации пространственной комплементарности и одного или нескольких типов химических взаимодействий, например, электростатических сил, образования водородных связей, гидрофобных сил и сил Ван-дер-Ваальса, в участке связывания. Эти взаимодействия не происходят вследствие общих свойств молекулы, таких как изоэлектрическая точка, гидрофобность или размер, но являются результатом специфических взаимодействий между представляющим интерес белком и лигандом, например, связывание иммуноглобулина с эпитопом, связывание белка A с иммуноглобулином, взаимодействия между модификатором биологического ответа и его рецептором на клеточной поверхности. Во многих случаях биологически специфический лиганд также представляет собой белок или полипептид и его можно иммобилизовать на твердой фазе, такой как гранула.
По настоящему документу предусмотрена ионообменная смола со "смешанным режимом", и она относится к твердой фазе, ковалентно модифицированной катионными, анионными или гидрофобными группами. Примеры ионообменных смол со смешанным режимом включают BAKERBOND ABX™ (J. T. Baker; Phillipsburg, NJ), керамический гидроксиапатит типов I и II и фторидный гидроксиапатит (BioRad; Hercules, CA) и MEP и MBI HyperCel (Pall Corporation; East Hills, NY).
Термин "гидрофобная хроматография с индукцией заряда" (или "HCIC") представляет собой хроматографический процесс со смешанным режимом, в котором представляющий интерес белок в смеси связывается с ионизируемым лигандом посредством умеренных гидрофобных взаимодействий в отсутствие добавляемых солей (например, лиотропной соли). Смешанный режим относится к одному режиму для связывания и другому режиму для элюции. Например, твердая фаза, пригодная для HCIC, для возможностей ее разделения содержит лиганд, обладающий комбинированными свойствами тиофильного эффекта (т.е. использования свойств тиофильной хроматографии), гидрофобности и ионизируемой группы. Таким образом, адсорбент, используемый в способе по изобретению, содержит лиганд, который является ионизируемым и умеренно гидрофобным при нейтральном (физиологическом) или слабо кислотном pH, например приблизительно от pH 5 до 10, предпочтительно приблизительно от pH 6 до 9,5. В этом диапазоне pH лиганд преимущественно является незаряженным и связывает представляющий интерес белок посредством умеренных неспецифических гидрофобных взаимодействий. При снижении pH лиганд приобретает заряд, и гидрофобное связывание нарушается вследствие отталкивания электростатических зарядов в направлении растворенного вещества вследствие сдвига pH. Примеры подходящих для применения в HCIC лигандов включают любую ионизируемую ароматическую или гетероциклическую структуру (например, структуру с пиридиновой структурой, такую как 2-аминометилпиридин, 3-аминометилпиридин и 4-аминометилпиридин, 2-меркаптопиридин, 4-меркаптопиридин или 4-меркаптоэтилпиридин), меркаптокислоты, меркаптоспирты, меркаптометилимидазол, 2-меркаптобензимидазол, аминометилбензимидазол, гистамин, меркаптобензимидазол, диэтиламинопропиламин, аминопропилморфолин, аминопропилимидазол, аминокапроновая кислота, нитрогидроксибензойная кислота, нитротирозин/этаноламин, дихлорсалициловая кислота, дибромтирамин, хлоргидроксифенилуксусная кислота, гидроксифенилуксусная кислота, тирамин, тиофенол, глутатион, бисульфат и красители, включая их производные.
cat
m
cat
m
cat
m
cat
m
Один или несколько белков, экспрессируемых в представляющих интерес частицах, могут обладать специфической активностью в размере по меньшей мере 20%, 30% или 40%, и, соответственно, по меньшей мере 50%, 60% или 70%, а наиболее соответственно, по меньшей мере 80%, 90% или 95% от активности нативного белка, из которого получена последовательность. Кроме того, субстратная специфичность (k/K) необязательно, по существу, сходна с нативным белком. Как правило, k/K составляет по меньшей мере 30%, 40% или 50% от k/K нативного белка; а более соответственно по меньшей мере 60%, 70%, 80% или 90%. Способы оценки и количественного определения белка и активности и субстратной специфичности (k/K) белка хорошо известны специалистам в данной области.
Активность рекомбинантного белка можно сравнивать с ранее установленной стандартной активностью нативного белка. Альтернативно, активность рекомбинантного белка можно определять в одновременном или, по существу, одновременном сравнительном анализе с нативным белком. Например, для определения любого детектируемого взаимодействия между рекомбинантным белком и мишенью, например между экспрессируемым ферментом и субстратом, между экспрессируемым гормоном и рецептором гормона, между экспрессируемым антителом и антигеном и т.д. можно использовать анализ in vitro. Такая детекция может включать измерение калориметрических изменений, изменений пролиферации, гибели клеток, подавление клеток, изменение радиоактивности, изменения растворимости, изменения молекулярной массы, как измеряют посредством электрофореза в геле или гель-эксклюзионными способами, показателей фосфорилирования, анализы специфичности антител, такие как анализы ELISA и т.д. Кроме того, анализы in vivo в качестве неограничивающих примеров включают анализы с детекцией физиологического действия продуцируемого белка в сравнении с физиологическим действием нативного белка, например индукции иммунного ответа или воспаления. Как правило, для определения активных свойств представляющей интерес частицы можно использовать любой анализ in vitro или in vivo. Альтернативно, белки, продуцируемые по настоящему изобретению, можно анализировать на способность стимулировать или ингибировать взаимодействие между белком и молекулой, которая в норме взаимодействует с белком, например субстратом. Как правило, такие анализы включают этапы комбинирования белка с молекулой субстрата в условиях, обеспечивающих их взаимодействие, и детекцию биохимических следствий взаимодействия.
Если экспрессируемый белок экспрессируется в виде нерастворимого белка, тогда его можно ренатурировать или подвергать рефолдингу с получением конформаций вторичной и третичной структур белка. Этапы рефолдинга белка по мере необходимости можно использовать в завершающей конфигурации рекомбинантного продукта. Рефолдинг и ренатурацию можно проводить с использованием средства, для которого в данной области известно, что оно способствует диссоциации/ассоциации белков. Например, белок можно инкубировать с дитиотреитолом с последующей инкубацией с окисленной двунатриевой солью глутатиона с последующей инкубацией с буфером, содержащим средством для рефолдинга, такое как мочевина.
Рекомбинантный белок также можно ренатурировать, например, посредством его диализа против фосфатно-солевого буфера (PBS) или 50 мМ буфера ацетата Na, pH 6 с 200 мМ NaCl. Альтернативно, белок можно ренатурировать при иммобилизации на колонке, такой как Ni NTA колонка с использованием линейного градиента мочевины 6 M - 1 M в 500 мМ NaCl, 20% глицерине, 20 мМ Tris/HCl pH 7,4, содержащем ингибиторы протеаз. Ренатурацию можно проводить в течение периода 1,5 часов или более. После ренатурации белки можно элюировать, добавляя 250 мМ имидазол. Имидазол можно удалять посредством конечного этапа диализа против PBS или 50 мМ буфера ацетата натрия pH 6 с 200 мМ NaCl. Очищенный белок можно хранить при 4°C или замороженным при -80°C.
Составы представляющих интерес частиц с желаемой степенью чистоты, полученные или получаемые по настоящему изобретению, можно получать для хранения при смешивании с необязательными фармацевтически приемлемыми носителями, эксципиентами или стабилизаторами (см. Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)) в форме лиофилизированных составов или водных растворов. Приемлемые носители, эксципиенты или стабилизаторы являются нетоксичными для реципиентов при используемых дозах и концентрациях и включают буферы, такие как фосфат, цитрат и другие органические кислоты; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как октадецилдиметилбензилхлорид аммония; хлорид гексаметония; хлорид бензалкония, хлорид бензетония; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехол; резорцинол; циклогексанол; 3-пентанол и м-крезол); низкомолекулярные (менее чем приблизительно 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие средства, такие как ЭДТА; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; формирующие соли противоионы, такие как натрий; комплексные соединения с металлами (например, комплексы Zn-белок) или неионные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN™, PLURONICS™ или полиэтиленгликоль (PEG).
Далее изобретение будет описано в приведенных ниже примерах, которые не предназначены для ограничения объема изобретения, описанного в формуле изобретения.
ПРИМЕРЫ
Приведенные ниже примеры предоставлены в качестве иллюстрации, а не для ограничения. Если не указано иначе, в настоящем изобретении используют общепринятые технологии и способы биохимии, молекулярной биологии и биологии растений.
Пример 1. Транзиторная экспрессия подобных вирусу гриппа частиц в Nicotiana benthamiana
Подобные вирусу гриппа частицы получают в растениях Nicotiana benthamiana, как описано в D'Aoust, M.-A., Lavoie, P.-O., Couture, M.M.-J., Trepanier, S., Guay, J.-M., Dargis, M., Mongrand, S., Landry, N., Ward, B.J., Vezina, L.-P. Influenza virus-like particles produced by transient expression in Nicotiana benthamiana induce a protective immune response against a lethal viral challenge. Plant Biotechnology Journal 6 (2008) 930-940.
Пример 2. Детекция гемагглютинина
Гемагглютинацию определяют посредством инкубации с эритроцитами, как описано в WO2004/098533. Белок гемагглютинин детектируют посредством ELISA стандартными способами. Для детекции белка гемагглютинина H5 используют антитело кролика к H5 из Immunetech (номер по каталогу IT-003-005V) и меченное пероксидазой хрена вторичное антитело из Jackson (номер по каталогу 11-035-046).
Пример 3. Экстракция N. benthamiana
Растения N. benthamiana, инфильтрированные как описано в примере 1 и в D'Aoust et al. (2008, выше), инкубируют в теплице в течение 6 суток перед сбором. После сбора листьев биомассу выдерживают в течение ночи при 4°C в темноте и гомогенизируют с использованием винтового пресса (Vincent CP-4) при 15-20 кг/час с использованием давления на конусе по меньшей мере 310,28 кПа. Собирают экстракт зеленого сока и к зеленому соку добавляют метабисульфит натрия до конечной концентрации 10 мМ. Измеряют электропроводность и, если необходимо, экстракт перед использованием в экспериментах по захвату разбавляют водой.
Пример 4. Лиганды для связывания вирусоподобных частиц из экстрактов сока растений
Экстракт. Экстракт зеленого сока N. benthamiana, содержащий вирусоподобные частицы с гемагглютинином H5 (D'Aoust et al. (2008), выше), получали с использованием винтового пресса, как описано в примере 3. Экстракт зеленого сока разбавляли в 5 раз деионизированной водой с конечным pH 7 и измеряли электропроводность. Электропроводность составляла 5,6 мСм/см. На связывание тестировали четыре различных лиганда: ионообменное вещество диэтиламиноэтил (DEAE), ионообменное вещество DEAE на основе декстрана, хлорметил-2-бензимидазол на основе декстрана и лиганд гидрохлорид 1-(2-хлорэтил)пиперидина на основе декстрана. Используемое отношение различных адсорбентов к образцу составляло 1:5. После периодической инкубации в статическом режиме собирали супернатант и измеряли гемагглютинацию способом из примера 2.
Результаты. Количество гемагглютинина в супернатанте, как измеряли с использованием анализа гемагглютинации, после инкубации с DEAE, DEAE на основе декстрана, хлорметил-2-бензимидазолом на основе декстрана и лигандом гидрохлоридом 1-(2-хлорэтил)пиперидина на основе декстрана, а также связанного с лигандом, приведено в таблице 1. В этом эксперименте вирусоподобные частицы, содержащие гемагглютинин, в экстракте сока зеленого растения, лучше всего связывались с ионообменным адсорбентом на основе DEAE.
Таблица 1Отношение различных адсорбентов к экстракту зеленого сока, содержащему вирусоподобные частицы с гемагглютинином, и активность гемагглютинации (% от исходного экстракта) супернатантов и связанных материалов после инкубации экстракта с различными адсорбентами в статическом режиме
Лиганд
Отношение
Гемагглютинация (% от исходного экстракта)
Супернатант
Связанные материалы
DEAE
1:5
13
87
DEAE на основе декстрана
1:5
13
87
Хлорметил-2-бензимидазол на основе декстрана
1:5
67
33
Гидрохлорид 1-(2-хлорэтил)пиперидина на основе декстрана
1:5
67
33
Пример 5. Влияние электропроводности на связывание с ионообменным веществом DEAE
Для исследования того, при какой величине электропроводности вирусоподобные частицы в экстракте зеленого сока все еще могут связывать ионообменное вещество DEAE, измеряли влияние электропроводности экстракта зеленого сока, содержащего вирусоподобные частицы с гемагглютинином H5, как получено в соответствии с описанием в примерах 1 и 3, на связывание вирусоподобных частиц с лигандом DEAE в режиме статического связывания.
Ионообменное вещество DEAE уравновешивали 5 объемами слоя 0,5 M буфером Tris/HCl, pH 7 с последующими 10 объемами слоя 2 мМ NaCl, pH 7. Экстракт зеленого сока разбавляли в 2,5, 3, 3,4, 4, 5, 6 и 7 раз деионизированной воде и pH доводили до 7. Измеряли электропроводность различных разведенных экстрактов зеленого сока и экстракты инкубировали в течение 2 час при статическом связывании/периодическом режиме с ионообменным веществом DEAE. Различные электропроводности приведены в таблице 2. Отношение каждой соответствовало 1:1 с неразведенным экстрактом. После периодической инкубации супернатанты собирали и измеряли гемагглютинацию способом из примера 2. Результаты приведены в таблице 2. В этом эксперименте связывание вирусоподобных частиц в экстракте зеленого сока было одинаково эффективным при низкой и высокой электропроводности и в сильно и слабо разбавленных экстрактах зеленого сока.
Таблица 2Связывание гемагглютинина с ионообменным веществом DEAE при различной электропроводности экстракта зеленого сока в статическом режиме
Разбавление
Электропроводность(мСм/см)
Гемагглютинация (%)
Супернатант
Связанный материал
7
3,52
9
91
6
4,51
9
91
5
5,47
9
91
4
6,34
9
91
3,4
7,04
9
91
3
8,31
9
91
2,5
9,41
9
91
Пример 6. Двухэтапный процесс захвата для получаемых из растений вирусоподобных частиц
Двухэтапный процесс. Для экстракта сока зеленого растения, полученного способом, описанным в примере 3, используют предварительный захват, так как экстракт и особенно любой материал в экстракте, обеспечивающий зеленую окраску, прилипает к большинству лигандов и вызывает забивку и блокировку колонки. С этой целью проводили двухэтапный процесс захвата для получаемых из растений вирусоподобных частиц. Процесс включал
Этап 1, связывание примесей и материалов, определяющих зеленую окраску экстракта сока зеленого растения в режиме статического связывания/периодической инкубации с использованием ионообменного вещества полиэтиленимина (PEI) со средним размером частицы 150 мкм при pH 7;
Этап 2, связывание вирусоподобных частиц из супернатанта после этапа 1 в режиме адсорбции в расширяющемся слое с использованием ионообменного вещества DEAE со средним размером частиц 50 мкм при pH 7.
Схема эксперимента. Получали экстракт N. benthamiana, как описано в пример 3, и перед использованием фильтровали и разбавляли в 5 раз деионизированной водой. Конечный pH составлял 7, а общий объем для инкубации на этапе 1 составлял 150 мл. Электропроводность составляла 5,3 мСм/см. Уравновешивание ионообменного вещества PEI проводили 5 объемами слоя 0,5 M буфером Tris/HCl с pH 7 с последующими 10 объемами слоя 10 мМ буфера Tris/HCl с pH 7,0. Отношение адсорбента PEI к экстракту зеленого сока в статическом режиме составляло 1:15. Всего использовали 9,5 мл адсорбента PEI. Инкубацию проводили в течение 30 мин при комнатной температуре и после инкубации для этапа 2 собирали 140 мл супернатанта. На этапе 2 120 мл супернатанта после этапа 1 доводили до pH 7,0 и обрабатывали в режиме адсорбции в расширяющемся слое. Электропроводность составляла 5,4 мСм/см, а уравновешивание ионообменного вещества DEAE, используемого в режиме расширяющегося слоя, проводили 5 объемами слоя 0,5 M буфера Tris/HCl с pH7 с последующими 10 объемами слоя 10 мМ Tris/HCl с pH 7,0. Всего использовали 12 мл адсорбента DEAE. Диаметр колонки с расширяющимся слоем составлял 1 см с высотой колонки 70 см. Высота слоя составляла 15 см. Отношение адсорбента DEAE к образцу составляло 1:10. Супернатант после этапа 1 наносили на колонку при скорости потока 3,8 см/мин и после загрузки колонку отмывали отмывочным буфером, содержащим 10 мМ Tris/HCl pH 7,0. Связанный материал элюировали с использованием элюирующего буфера, содержащего 50 мМ Tris/HCl и 1 M NaCl, pH 9,0. Проходящие и отмывочные фракции собирали объемами по 25 мл. Элюат собирали в одну фракцию и pH при элюции доводили до pH 7, добавляя в пробирку до сбора элюата 1/10 объема 1 M раствора Tris/HCl, pH 6,5.
Детекция гемагглютинина. Количество белка гемагглютинина определяли для фильтрованного экстракта зеленого сока N. benthamiana до проведения этапа 1, супернатанта после инкубации в статическом режиме, протекающего потока, смыва и элюата после адсорбции в режиме расширяющегося слоя и элюции, как описано в примере 2. Общее содержание белка в экстрактах и фракциях определяли с использованием стандартных протоколов.
Результаты. Количество гемагглютинина, как измеряли с использованием анализа гемагглютинации в фильтрованном экстракте зеленого сока, исходном веществе для инкубации в статическом режиме с ионообменным веществом PEI, супернатанте, получаемом при инкубации экстракта с ионообменным веществом PEI, исходном веществе для адсорбции в расширяющемся слое с использованием ионообменного вещества DEAE, проходящего потока и элюата после элюции с колонки с расширяющимся слоем, приведено в таблице 3 совместно с общим содержанием белка в указанных фракциях и образцах. В этом эксперименте большинство материалов, вызывающих зеленую окраску и забивку колонки, удаляли на этапе 1 с использованием адсорбента PEI без потери белка гемагглютинина, и вирусоподобные частицы, содержащие белок гемагглютинин, захватывались при адсорбции в режиме расширяющегося слоя с использованием ионообменного вещества DEAE.
Таблица 3Активность гемагглютинации (% от исходного экстракта) и общее содержание белка (мг/мл) для различных экстрактов и фракций этапов 1 и 2. Н.о., не определено
Фракция
Этап 1 разведенный экстракт
Этап 1 Исходный материал PEI
Этап 1Супер-натантпосле PEI
Этап 2 Исходный материал DEAE
Этап 2 Проходящий поток+фракции смыва
Этап 2 Элюат из DEAE
Анализ
Гемагглюти-нация (в %)
100
100
100
100
0
67
Общий (в мг/мл)
0,22
0,25
0,14
0,14
н.о.
0,06
Пример 7. Оптимизация условий элюции для ионообменного вещества DEAE
Схема эксперимента. Связывание и элюцию вирусоподобных частиц, присутствующих в экстракте сока зеленого растения, получаемого способом, описанным в примере 3, с применением ионообменного вещества DEAE в режиме уплотненного слоя и последующим предварительным захватом ионообменным веществом PEI, как описано в примере 6, тестировали с использованием элюирующего буфера, содержащего 50 мМ Tris/HCl, pH 8,5, к которому добавляли 1 M NaCl, 0,8 M NaCl, 0,6 M NaCl, 0,4 M NaCl, 0,2 M NaCl или 0,1 M NaCl. Перед загрузкой экстракта экстракт сока зеленого растения разбавляли в 5 раз деионизированной водой и pH доводили до pH 7. Электропроводность составляла 5,1 мСм/см. Сначала фильтрованный экстракт сока зеленого растения инкубировали с ионообменным веществом PEI со средним размером частиц 150 мкм в режиме периодической инкубации при отношении экстракта к лиганду 15:1 в течение 30 мин, как описано для этапа 1 примера 6. Средний размер частиц используемого ионообменного вещества DEAE составлял 50 мкм, а отношение супернатанта к адсорбенту составляло 5:1. Количество белка гемагглютинина измеряли, как описано в примере 2. Относительные количества гемагглютинина в проходящем потоке и смыве, связанного с ионообменным веществом DEAE и в элюате, приведены в таблице 4. В этом эксперименте использование элюирующего буфера, содержащего 0,4, 0,6, 0,8 или 1,0 M NaCl, приводило к сходному захвату вирусоподобных частиц, как измеряли с использованием анализа гемагглютинации.
Таблица 4Относительная активность гемагглютинации в проходящем потоке и смыве связанной фракции и элюируемой фракции с использованием различных элюирующих буферов в режиме уплотненного слоя с использованием ионообменного вещества DEAE
Элюирующий 50 мМ буфер Tris/HCl, pH 8,5 плюс
Относительная активность гемагглютинации (%)
Проходящий поток и смыв
Связанная фракция
Элюат
1 M NaCl
0
100
67
0,8 M NaCl
0
100
67
0,6 M NaCl
0
100
67
0,4 M NaCl
0
100
67
0,2 M NaCl
0
100
45
0,1 M NaCl
0
100
9
Пример 8. Кривая прохождения при адсорбции в режиме расширяющегося слоя при различных скоростях потока
Связывание вирусоподобных частиц, присутствующих в экстракте сока зеленого растения и полученных способом, описанным в примере 3, измеряли при скоростях потока 228 см/час и 450 см/час в одноэтапном процессе связывания при адсорбции в режиме расширяющегося слоя. Использовали ионообменное вещество DEAE, которое уравновешивали с использованием 5 объемов слоя 0,5 M буфера Tris/HCl pH 7 и 10 объемов слоя 10 мМ Tris, pH 7. Средний размер частиц используемого ионообменного вещества DEAE составлял 50 мкм. Отношение адсорбента к экстракту сока зеленого растения всегда составляло 1:20. Высота слоя составляла 50 см и колонка содержала 39,3 мл адсорбента с ионообменным веществом DEAE. Экстракты сока зеленых растений разбавляли в 5 раз в деионизированной воде и перед загрузкой измеряли электропроводность. Отмывочный буфер представлял собой 10 мМ Tris, pH 7,0, а элюирующий буфер - 50 мМ Tris/HCl; 1 M NaCl, pH 9,0.
Электропроводность экстракта зеленого сока, загружаемого при 228 см/час, составляла 4,96 мСм/см. Всего загрузили 786 мл при скорости потока 3,8 см/мин, эквивалентной 228 см/час. Отмывку и элюцию также проводили при скорости потока 3,8 см/мин.
Электропроводность экстракта зеленого сока, загружаемого при 450 см/час, составляла 4,61 мСм/см. Всего загрузили 786 мл при скорости потока 7,6 см/мин, эквивалентной 450 см/час. Отмывку проводили при 7,6 см/мин, а элюцию при 3,8 см/мин.
Проходящий поток и смыв собирали в 4 фракции. Элюат нейтрализовали до pH 7, добавляя в контейнер перед сбором элюируемой фракции 1/10 объема 1 M буфера Tris/HCl, pH 6,5. Элюат собирали для одного пика.
Количество гемагглютинина измеряли способом, описанным в примере 2.
Общее содержание белка измеряли способом Брэдфорда.
Результаты анализа гемагглютинации для обеих скоростей потока для проходящих фракций 1 до 3, комбинированных проходящей фракции и фракции смыва и для комбинированных проходящего потока и смыва и элюата приведены в таблице 5. Результаты определения общего белка во вводимом экстракте, общем проходящем потоке и смыве и элюате по Брэдфорду представлены в таблице 6. В этом эксперименте скорость потока загрузки экстракта, составляющая 450 см/час, была наилучшей и приводила к 45% восстановлению гемагглютинирующей активности относительно вводимого экстракта зеленого сока при одноэтапном процессе связывания и элюции.
Таблица 5Относительная активность гемагглютинации C/C<sub>0</sub> (в %), где C представляет собой активность гемагглютинации выходящей фракции (проходящий поток от 1 до 3, комбинированный проходящий поток и смыв 4, общий проходящий поток и смыв или элюат), а C<sub>0</sub> - вводимый раствор, принимаемый за 100%
Фракция
Проходя-щий поток 1
Проходя-щий поток 2
Проходя-щий поток 3
Проходя-щий поток и смыв 4
Общий проходя-щий поток и смыв
Элюат
Скорость потока (см/час)
228
0
0
20
22
13
45
450
0
0
0
55
20
45
Таблица 6Общее содержание белка различных фракций, загружаемых и элюируемых при различных скоростях потока
Скорость потока (см/час)
Общий белок (мг/мл)
Вводимый экстракт
Общий проходящийпоток и смыв
Элюат
228
0,11
0,05
0,15
450
0,11
0,03
0,19
Пример 9. Кривая прохождения предварительно обработанного образца при скорости потока 450 см/час
Связывание вирусоподобных частиц, присутствующих в предварительно обработанном экстракте сока зеленого растения и полученных способом, описанным в примере 3, измеряли при скорости потока 450 см/час в одноэтапном процессе связывания при адсорбции в режим расширяющегося слоя, по существу, как описано в примере 8. Все экспериментальные условия были сходными с условиями, используемыми в примере 8, за исключением того, что электропроводность исходного экстракта после разбавления составляла 5,36 мСм/см и экстракт до применения в одноэтапном процессе связывания при адсорбции в режим расширяющегося слоя осаждали кислотой и фильтровали. Проводили два независимых эксперимента.
Результаты анализа гемагглютинации для обоих экспериментов для проходящих фракций 1 до 3, комбинированных проходящих фракций и фракции смыва и для комбинированного проходящего потока и смыва и элюата приведены в таблице 7. Результаты определения общего белка во вводимом экстракте, общем проходящем потоке и смыве и элюате по Брэдфорду представлены в таблице 8. В этом эксперименте захват вирусоподобных частиц из экстрактов сока зеленых растений, как измеряли с использованием анализа гемагглютинации, в одноэтапном процессе связывания и элюции составлял 100%.
Таблица 7Относительная активность гемагглютинации C/C<sub>0</sub> (в %), где C представляет собой активность гемагглютинации выходящей фракции (проходящий поток от 1 до 3, комбинированный проходящий поток и смыв 4, общий проходящий поток и смыв или элюат), а C<sub>0</sub> - вводимый раствор, принимаемый за 100%. Скорость потока составляла 450 см/час
Фракция
Прохо-дящий поток 1
Прохо-дящий поток 2
Прохо-дящий поток 3
Прохо-дящий поток и смыв 4
Общий прохо-дящий поток и смыв
Элюат
Экспери-мент
1
0
0
0
0
0
100
2
0
0
0
0
0
100
Таблица 8Общее содержание белка различных фракций, загружаемых и элюируемых при скорости потока 450 см/час. Н.о., не определяли
Эксперимент
Общий белок (мг/мл_)
Вводимый экстракт
Общий проходящий поток и смыв
Элюат
1
0,07
0,02
0,16
2
н.о.
н.о.
н.о.
Пример 10. Захват вирусоподобных частиц в большом масштабе с использованием хроматографии с расширяющимся слоем
Экстракт. 7500 растений N. benthamiana инфильтрируют, как описано (D'Aoust et al. (2008), выше), с получением 250 кг сырой биомассы, содержащей вирусоподобные частицы с гемагглютинином H5. После инфильтрации растения перед сбором инкубируют в теплице в течение 6 суток. После сбора листьев биомассу выдерживают в течение ночи при 4°C в темноте и гомогенизируют с использованием винтового пресса (Vincent CP-4) при 15-20 кг/час с использованием давления на конусе по меньшей мере 310,28 кПа, по существу, как описано в примере 3. Зеленый сок собирают и к зеленому соку добавляют метабисульфит натрия до конечной концентрации 10 мМ. Измеряют электропроводность и экстракт перед использованием разбавляют водой до конечной электропроводности приблизительно 10. Экстракт выдерживают при комнатной температуре. Общий объем после разбавления составляет приблизительно 1250 л экстракта.
Свойства колонки. Состав гранул: поперечно сшитая эпихлоргидрином агароза (4% масс./об.). Сердцевина: карбид вольфрама (занимающий приблизительно 10-15% объема гранулы). Лиганд: ионообменное вещество DEAE. Средний диаметр частиц: 50 мкм. Средняя плотность частиц адсорбента: 16 кг/л. Диаметр колонки: 45 см. Свободный объем в осажденном состоянии: приблизительно 40% от объема заполненного адсорбентом. Общий объем: в колонку диаметром 45 см добавляют 63 л материала адсорбента. Колонку уравновешивали 5 объемами колонки 0,5 M буфером Tris-Cl, pH 7 с последующими 10 объемами колонки 10 мМ буфера Tris-Cl, pH 7.
Загрузка. Загрузку проводят посредством закачивания в восходящем направлении 1250 л экстракта при скорости потока 450 см/час, эквивалентной 653 л/час, по существу, как описано в примерах 8 и 9. Коэффициент расширения удерживают при 2,0-2,5 и несвязанный материал отмывают 10 мМ Tris/HCl, pH7 при том же коэффициенте расширения.
Элюция. Подобные вирусу гриппа частицы восстанавливают посредством элюции 50 мМ Tris-Cl и 1M NaCl, pH9 при коэффициенте расширения 1,2. Элюируемые фракции нейтрализуют добавлением в контейнер перед сбором пика элюции 1/10 объема 1M Tris/HCl, pH 6,5. Фракции, содержащие вирусоподобные частицы, содержащие гемагглютинин, как измеряют способом из примера 2, объединяют для дальнейшего захвата и очистки.
Контроль эффективности. Эффективность хроматографии контролируют посредством измерения поглощения УФ при 280 нм и 600 нм, электропроводности и pH. Захват вирусоподобных частиц, содержащих гемагглютинин H5, количественно измеряют посредством ELISA и гемагглютинации, как описано в примере 2 или в соответствии с D'Aoust et al. (2008, выше). Для определения общего содержания белка во фракциях используют анализ по Брэдфорду. Для определения чистоты используют SDS-PAGE, а для идентификации и характеристики используют Вестерн-блоттинг с использованием специфичных к гемагглютинину H5 антител, как описано в примере 2 и в D'Aoust et al. (2008, выше).
Пример 11. Очистка и восстановление колонки с расширяющимся слоем
После элюции смолу очищают и восстанавливают посредством отмывки 4 объемами колонки 0,5 M NaOH с последующими 4 объемами колонки дистиллированной воды. Повторное уравновешивание проводят в 10 мМ буфере Tris-Cl, pH7.
Пример 12. Дополнительная оптимизация
Растения N. benthamiana, экспрессирующие H5-VLP, собранные через шесть суток после агроинфильтрации, выдерживают в течение ночи при 4°C в темноте. Растительную биомассу, включая листья и стебли, гомогенизируют с использованием винтового пресса (Green Star Corrupad, GS 1000, Korea Co.). Добавляют MBS до конечной концентрации 10 мМ во избежание окисления образца. Необработанный сок, получаемый после винтового пресса, быстро доводят до pH 5,3 с использованием 20% разбавленной уксусной кислоты. Экстракт оставляют при комнатной температуре в течение 20-30 мин без перемешивания для частичной очистки от примесей. Проводят фильтрацию через фильтровальную бумагу Whatman, предварительно покрытую Celpure P300 (10% взвесь Celpure P300 в 10 мМ MBS) высотой 3 мм. Поддерживали пониженное давление при 50,8 кПа. К экстракту добавляют Celpure P300 (10%) и перемешивают в течение 1 минуты. В заключение экстракт осторожно фильтруют, порционно добавляя взвесь экстракт-Celpure (не более чем 2 см жидкой фазы над фильтровальным слоем). Выбраны четыре потенциальных абсорбента, и их условия связывания оптимизируют в условиях статического связывания в периодическом режиме. Результаты в таблице 9 демонстрируют, что на связывающую способность ионообменных адсорбентов влияют два фактора: (i) низкая ионная сила (2,3 мСм/см или менее) и таким образом (ii) большой объем экстракта растения на единицу массы адсорбента (1 г адсорбента на 20 мл экстракта).
Дополнительные эксперименты проводят в периодическом режиме в условиях статического связывания для исследования размера гранул и встраивания в процесс начального этапа отрицательной абсорбции. В одном из экспериментов первый этап отрицательной абсорбции используют с использованием частиц, содержащих лиганд полиэтиленимин (PEI) с размерами в диапазоне менее 250 мкм, и за ним следует второй этап положительной абсорбции на частицы PEI с размерами <50 мкм. Показано, что из очищаемых экстрактов с использованием PEI со средним размером частиц 150 мкм можно удалить >50% растворимых белковых примесей и окраски, и что H5-VLP абсорбируются только на абсорбенты с малым размером частиц. Разбавление экстракта также оптимизировали до отношения от 1:10 до 1:20, где абсорбируются 100% H5, тогда как при отношении 1:40 связываются только 70% H5. Однако хотя PEI можно рассматривать как хороший абсорбент, элюция H5-VLP's была менее оптимальной.
В другом эксперименте в периодическом режиме в условиях статического связывания для оптимизации в одноэтапных и двухэтапных способах используют DEAE-декстран. Показано, что на ионообменные гранулы с DEAE со средними размерами приблизительно 50 мкм можно абсорбировать приблизительно 87% H5-VLP. Однако в одноэтапном процессе связывания элюция VLP является плохой. Во втором эксперименте используют первый этап отрицательной абсорбции с использованием гранул PEI, за которым следует второй этап положительной абсорбции с использованием гранул DEAE-декстран, где элюируют и восстанавливают 17% VLP.
Затем проводят дальнейшие эксперименты с использованием двухэтапного процесса. В одном из экспериментов гомогенизированный растительный материал (также обозначаемый как зеленый сок) разбавляют в пять раз водой, что приводит к электропроводности 5,9 мСм/см и фильтруют с использованием Celpure 3000. В качестве адсорбента используют ионообменную смолу PEI при отношении 1 г адсорбента на 15 мл зеленого сока с удалением пигментов и примесей из растительного материала. Средний размер частиц ионообменной смолы PEI составляет 150 мкм при pH7. Второй этап включает запуск полученных таким образом материалов табака в режиме расширяющегося слоя в условиях потока с использованием ионообменного вещества DEAE со средним размером частиц приблизительно 50 мкм, высотой слоя 15 см, скоростью потока 3,8 см/мин и элюирующим буфером (50 мМ Tris и 1 M NaCl pH9). Собирают проходящий поток и смыв и смолу, содержащую VLP, нейтрализуют до pH7, добавляя до сбора элюата в виде одного пика 1/10 объема 1M Tris/HCl pH6,5. Элюат обеспечивает выход гемагглютинина с 67% (относительно 100% в исходном веществе). В другом эксперименте гомогенизированный растительный материал используют без фильтрации и, используя двухэтапный процесс в тех же условиях, в элюате восстанавливают 22% общего гемагглютинина, но 13% детектируют в проходящем потоке и фракции смыва.
Все публикации, указанные в приведенном выше описании, включены в настоящий документ в качестве ссылки. Специалистам в данной области очевидны различные модификации и вариации изобретения без отклонения от объема и сущности изобретения. Хотя изобретение описано в отношении соответствующих вариантов осуществления, следует понимать, что изобретение, как приведено в формуле изобретения, не следует ненадлежащим образом ограничивать такими конкретными вариантами осуществления. Фактически, подразумевается, что различные модификации описанных способов осуществления изобретения, которые очевидны специалистам в клеточной биологии, молекулярной биологии и биологии растений или связанных областях, находятся в объеме приведенной ниже формулы изобретения.
Таблица 9
СвязанныеVLP/H5(%) (*)
Отношение адсорбента к экстракту
Проводимость
pH
Ионообменное вещество Fast Line SP
70
1:20
2,39
5
Ионообменное вещество QAE на основе декстрана
96
1:20
2,3
7
Ионообменное вещество Fast Line PEI
100%
1:20
2,3
7
Ионообменное вещество DEAE
100%
1:20
2,2
7