Влияние шунгита на численность бактериопланктона во время экспериментов In vitro

1С

ЗНиСО ноябрь №11

УДК 614.7

ВЛИЯНИЕ ШУНГИТА НА ЧИСЛЕННОСТЬ БАКТЕРИОПЛАНКТОНА ВО ВРЕМЯ ЭКСПЕРИМЕНТОВ IN VITRO

Г.А. Даллакян, И.В. Мошарова, В.В. Ильинский

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, Москва, Россия

Исследовали влияние шунгита на численность гетеротрофных бактерий в воде. Полученные результаты не подтвердили эффективность применения шунгита в широком диапазоне вносимых количеств (от 1 до 100 г/л) для обеззараживания воды от бактерий. При внесении шунгита в экспериментальные емкости численность микроорганизмов не только не снижалась, а напротив -возрастала. В наибольшей степени численность бактериопланктона увеличивалась при внесении шунгита в количестве 10 г/л.

Ключевые слова: шунгит, фуллерены, гетеротрофный бактериопланктон, антибиотики, водные микроорганизмы.

G.A. Dallakyan, I.V. Mosharova , V.V. Il'inskiy  INFLUENCE OF SCHUNGITE ON THE NUMBER OF BACTERIOPLANKTON DURING THE EXPERIMENTS IN VITRO

Lomonosov Moscow State University, Moscow, Russia.

We investigated the effect of shungite on the total number of heterotrophic bacteria in the experimental flasks. The obtained results didn't confirm the effectiveness of using shungite in a wide range of amounts (from 1 to 100 g/l) for disinfection of water from bacteria. When shungite was added to the water, the number of microorganisms didn't decrease, but on the contrary increased. The greatest number of bacterioplankton increased with the application of schungite in the amount of 10 g/l. Key words: Schungite, fullerenes, heterotrophic bacterioplankton, antibiotics, aquatic microorganisms

К числу важнейших факторов сохранения здоровья населения относится его обеспечение качественной водой. Технологии очистки воды постоянно совершенствуются, в том числе и с целью повышения ее бактериологической безопасности. Для обеспечения бактериологической безопасности воды, поступающей населению, строго контролируется уровень развития в ней микроорганизмов, в частности численность гетеротрофных бактерий, поскольку многие са-нитарно-показательные микроорганизмы являются представителями этой группы бактериопланктона. Обеззараживание воды проводится на станциях водоочистки с применением различных физических и химических методов (например, с использованием гипохлорита натрия, хлора, озона, ультразвука и пр.). Однако при прохождении воды через водопроводные коммуникации, велика вероятность ее повторного микробиологического загрязнения. Поэтому для улучшения качества воды и обеззараживания ее от микроорганизмов в домашних условиях широко рекомендуют использование различных фильтровальных систем и установок. В качестве агентов обеззараживания в таких фильтровальных установках применяют различные вещества, например, кокосовый активированный уголь, серебро, различные фильтрующие мембраны. В последнее время в качестве сорбционного агента для домашнего обеззараживания воды от бактерий и взвеси, а также для устранения ее жесткости часто предлагают использовать шунгит [1, 5, 6]. Широко рекламируется применение населением воды, настоянной на шунгите, в оздоровительных целях [9]. Однако достоверная научная информация о влиянии шунгита на водные микроорганизмы, а в частности на численность гетеротрофных бактерий в воде, в настоящее время практически отсутствует. Имеются лишь отдельные сообщения об изучении влияния шун-гита на водные микроорганизмы, а также о при-

менении этого минерала для обеззараживания воды от бактериальных клеток и фагов [5, 6].

Цель исследования - оценка влияния различных количеств шунгита на численность гетеротрофных бактерий в воде, а также на способность микроорганизмов к восстановлению численности после воздействия антибиотиков.

Материалы и методы. Для проведения экспериментов использовали шунгитовую крошку Зажогинского месторождения от компании «Арго», предварительно просеенную через фильтр с диаметром ячеи 0,5 мм для получения более однородной по размеру фракции. Затем шунгит обрабатывали согласно рекомендациям изготовителя: сначала его промывали холодной водопроводной водой, затем помещали в трехлитровую стеклянную банку с водой и выдерживали двое суток, после чего вновь промывали дистиллированной водой для удаления посторонних примесей. После такой предварительной обработки шунгит стерилизовали в автоклаве при 1 атмосфере в течение 30 мин.

Затем в 3 стерильные стеклянные колбы объемом 250 мл вносили по 100 мл воды из функционирующего аквариума (модель природного водоема), после чего добавляли в них стерильную шунгитовую крошку в количествах 250 мг (или 1 г/л), 2,5 г (или 10 г/л) и 25 г (или 100 г/л).

Для определения численности гетеротрофных бактерий (ЧБ) использовали метод эпи-флуоресцентной микроскопии с окраской клеток водным раствором флуорохрома акридинового оранжевого [7].

Для оценки влияния шунгита на ЧБ после воздействия антибиотиков, использовали смесь двух антибиотиков: ванкомицина (100 мг/л) и пенициллина (5 мг/л) [11].

Результаты исследования. Эксперимент 1. Целью этого эксперимента было изучение влияния различных количеств шунгита (1, 10 и 100 г/л) на численность гетеротрофных бактерий в воде.

ноябрь №11 (2QE) ЗНиСО

17

Значение ЧБ в воде, взятой перед началом эксперимента из аквариума (11.01.2017), составляло (0,53 ± 0,01) млн кл./мл. Через сутки после начала эксперимента (12.01.2017) величина ЧБ в контрольной колбе (без добавления шунгита) увеличилась в 3 раза и достигла (1,54 ± 0,02) млн кл./мл. Наибольшее возрастание численности бактерий при сравнении трех вариантов опыта наблюдалось в колбе с содержанием шунгита 10 г/л, а наименьшее - в варианте с содержанием шунгита 100 г/л - (1,07 ± ± 0,01) млн кл./мл (рис. 1).

На второй день эксперимента численность бактерий в контрольном варианте хотя и увеличилась, но незначительно - до (1,73 ± ± 0,02) млн кл./мл. В то же время во всех трех вариантах опыта, в которых присутствовал шун-гит, произошло резкое возрастание ЧБ, причем особенно заметно рост численности микроорганизмов (до (3,39 ± 0,01) млн кл./мл) был выражен в колбе с содержанием шунгита 10 г/л (рис. 1).

3 2.5 2 1.5 1

0.5 0

Контроль -Шунгит 10 г/л

—Шунгит 1 г/л Шунгит 100 г/л

Старт

аквариумной воды для подтверждения его стимулирующего действия на этот показатель.

Величина ЧБ в исходной аквариумной воде, которая была разлита в колбы перед началом эксперимента, была близка к таковой в первом эксперименте и составляла (0,51 ± 0,01) млн кл./мл. Через сутки после начала эксперимента численность бактерий в контрольной колбе (вода без шунгита) увеличилась в 4,5 раза и составила (2,38 ± 0,02) млн кл./мл. В колбе с содержанием шунгита 10 г/л ЧБ через сутки возросла в 8 раз и составила (4,0 ± 0,01) млн кл/мл. Наибольшее возрастание численности бактерий в варианте с шунгитом наблюдалось, как и в первом опыте, на вторые сутки эксперимента. Величина ЧБ при этом достигла (10,65 ± 0,01) млн. кл/мл и более чем в 20 раз превысила значение ОЧБ, обнаруженное в контрольном варианте опыта (без шунгита). Кроме того, она почти в 3 раза превысила величину ЧБ, отмеченную в аналогичном варианте опыта в первом эксперименте - (3,39 ± 0,01) млн кл./мл. В то же время в контрольном варианте без шунгита численность микроорганизмов на вторые сутки составила всего (2,66 ± 0,01) млн кл./мл (рис. 2).

Контроль

Шунгит 10 г/л

Дни эксперимента

Рис. 1. Изменение численности бактериальных клеток в аквариумной воде в результате внесения различных количеств шунгита во время краткосрочного эксперимента in vitro

На пятый день эксперимента как в контроле, так и в трех опытных вариантах эксперимента с разным содержанием шунгита наблюдалось снижение ЧБ. В контрольном варианте без шунгита она снизилась до (0,81 ± 0,01) млн кл./мл и практически приблизилась к значению ЧБ в аквариумной воде, наблюдавшемуся до начала эксперимента. Во всех трех колбах с шунгитом численность бактерий также значительно снизилась по сравнению со значениями ЧБ, наблюдавшимися в них на третьи сутки, однако она все еще продолжала оставаться выше исходных значений ЧБ, наблюдавшихся в аквариумной воде до начала эксперимента (рис. 1). При этом наиболее высокие значения ЧБ (2,25 ± 0,004) млн кл./мл) были отмечены в варианте с содержанием шунгита 10 г/л.

Таким образом, в пятисуточном эксперименте все три исследованные нами концентрации шунгита (1, 10 и 100 г/л) продемонстрировали выраженное стимулирующее воздействие на численность гетеротрофного бактериоценоза аквариумной воды. В максимальной степени оно проявлялось на вторые сутки эксперимента в опыте с содержанием шунгита 10 г/л.

Эксперимент 2. Его целью было повторное изучение влияния шунгита в количестве 10 г/л на численность гетеротрофного бактериоценоза

Старт

Дни эксперимента

Рис. 2. Изменение численности бактериальных клеток в аквариумной воде под влиянием шунгита в количестве 10 г/л во время краткосрочного эксперимента in vitro

На третьи сутки эксперимента в обоих вариантах наблюдалось незначительное снижение численности микроорганизмов.

На пятые сутки эксперимента численность бактерий в варианте с шунгитом (10 г/л) еще несколько снизилась - до 8,07 млн кл./мл, однако она все еще превышала стартовое значение этого параметра (0,51 ± 0,01) млн кл./мл) почти в 16 раз. В контрольном варианте опыта численность бактерий в конце эксперимента составила (5,23 ± 0,02) млн кл./мл, т. е. она увеличилась в 10 раз по сравнению со значением ЧБ, определенным до начала эксперимента, чего не наблюдалось на пятые сутки в контрольном варианте первого эксперимента. Некоторое расхождение результатов первого и второго экспериментов по значениям ЧБ можно объяснить более высокой температурой аквариумной воды во второй половине марта (около 23 °С) по сравнению с температурой воды во время первого эксперимента - в январе (около 20 °С). Кроме того, известно, что интенсивность размножения гетеротрофных микроорганизмов в значительной мере зависит от доступ-

4

3.5

10

8

6

4

2 -

0

18

ЗНиСО ноябрь Ml

ности легкоокисляемого органического вещества. Его источником являются прижизненные выделения фитопланктона, численность которого в аквариуме увеличивается с наступлением весны. Несмотря на то, что эксперименты проводились при комнатных условиях, биологические и сезонные факторы очень существенно влияли на возрастание численности бак-териопланктона в марте по сравнению с январским экспериментом. Во втором эксперименте стимулирующий эффект от внесения шунгита в количестве 10 г/л на численность гетеротрофного бактериоценоза аквариумной воды полностью подтвердился и оказался даже более выраженным, чем в первом эксперименте. Эффект стимулирования особенно ярко был выражен на вторые сутки эксперимента. Таким образом, при благоприятных условиях среды шунгит может более интенсивно стимулировать рост численности бактерий.

Эксперимент 3. Его целью было оценить влияние шунгита, внесенного в количестве 10 г/л, на способность бактерий восстанавливать свою численность после действия антибиотиков.

Для проведения этого эксперимента нами были предварительно подобраны такие действующие концентрации двух антибиотиков -ванкомицина и пенициллина, которые оказывали выраженное бактериостатическое действие на гетеротрофный бактериоценоз. Они составили 100 мг/л и 5 мг/л соответственно. Через сутки после внесения смеси этих антибиотиков величина ЧБ в аквариумной воде с антибиотиками снизилась до (0,04 ± 0,001) млн кл./мл, т. е. более чем в 10 раз по сравнению со стартовыми значениями этого параметра (0,51 ± ± 0,01) млн кл./мл). В варианте «шунгит 10 г/л+ антибиотики» численность бактериальных клеток через сутки после внесения антибиотиков тоже снизилась и составила (0,3 ± 0,01) млн кл./мл, т. е. оказалась почти в 8 раз выше, чем в варианте «антибиотики» с внесением только антибиотиков без шунгита (рис. 3).

м „ -О-Шунгит 10

г/л+антибиотики

- Антибиотики

-Контроль

Старт

Дни эксперимента

Рис. 3. Изменение численности бактериальных клеток в аквариумной воде под влиянием шунгита в количестве 10 г/л и антибиотиков во время краткосрочного эксперимента in vitro

В дальнейшем величина ЧБ в варианте «шунгит 10 г/л + антибиотики» последовательно, хотя и медленно, возрастала и в конце эксперимента, на шестые сутки, составила 0,81 млн кл./мл, что в 1,6 раза превысило ис-

ходное значение ЧБ, наблюдавшееся в самом начале эксперимента (0,51 ± 0,01) млн кл./мл). В то же время в варианте «антибиотики» величина ЧБ оставалась низкой и лишь к концу эксперимента несколько повысилась - до 0,26 млн кл./мл, что, однако, было практически в два раза ниже стартовой величины ОЧБ (0,51 ± 0,01) млн кл./мл).

По-видимому, внесение шунгита в количестве 10 г/л совместно с антибиотиками оказывает защитное действие на гетеротрофных бактерий, и это позволяет микроорганизмам сохранить более высокую численность по сравнению с тем вариантом опыта, в котором присутствовали только антибиотики и отсутствовал шунгит.

Таким образом, наши исследования не подтвердили эффективности применения шунгита в широком диапазоне вносимых количеств (от 1 до 100 г/л) для обеззараживания воды от гетеротрофных бактерий. Напротив, в экспериментах наблюдалось стимулирующее воздействие этого минерала на численность микроорганизмов в воде, причем при внесении его в количествах, различающихся на два порядка, - от 1 г/л до 100 г/л. Также наблюдалось защитное действие шунгита в количестве 10 г/л на бактерий, которые находились под прессом антибиотиков.

Бактериоценоз действующего аквариума для проведения экспериментов с шунгитом был выбран совсем не случайно. Известно, что функционирующий аквариум является близким аналогом природного водоема, в состав его бактериоценоза входят представители самых разнообразных физиологических групп бактерий, в том числе и санитарно-показательные микроорганизмы.

О благоприятном воздействии воды, пропущенной через шунгит, на многие организмы известно уже давно [8]. Шунгит - это минерал, основой которого является углерод, причем часто этот элемент присутствует в шунгитах в особом агрегатном состоянии, в виде глобул -фуллеренов [8, 12]. Впервые фуллерены были обнаружены в составе шунгитов в 1992 г. [12]. Известно, что фуллерены могут встраиваться в биологические мембраны, влиять на их структуру, изменять каталитическую активность мембранных ферментов [10, 11]. Недавно было показано, что с помощью шунгита можно инакти-вировать повреждающее воздействие синглет-ного кислорода на рост микроводорослей [4]. Также было показано влияние шунгита на защиту ракообразных и микроводорослей от токсического действия бихромата калия [2, 3]. Имеются отдельные сведения о применении шунгита для «улучшения качества» воды, в частности для ее обеззараживания от патогенных бактерий [5]. Возможно, способность шунгита к обеззараживанию воды от условно-патогенных бактерий, доложенная в работе [5], была связана с большой толщиной шунгитового слоя в использованном ими фильтре, тогда как в наших экспериментах поверхность шунгита, контактирующая с водой, условиями проведения эксперимента была ограничена. Обнаруженное нами стимулирующее влияние шунги-та, внесенного в экспериментальные емкости в

5

4

3

2

0

ноябрь №11 (20Е) ЗНиСО

19

количествах от 1 до 100 г/л, на развитие водного гетеротрофного бактериоценоза, можно объяснить положительным воздействием на бактерий фуллеренов, которые входят в состав шун-гита. Биологическая активность фуллеренов в отношении многих организмов в настоящее время детально исследуется [9, 10, 11, 12]. Было установлено, что механизмы биологического действия фуллеренов зависят от их агрегатного состояния [11, 12]. Проведенные к настоящему времени научные исследования показывают, что характер воздействия фуллеренов на биологические объекты зависит от способов получения и чистоты этих молекулярных соединений. Разнонаправленное действие фуллеренов на биологические объекты объясняется, как полагают, особыми свойствами водных сферических оболочек этих соединений [10, 12].

Результаты исследований во многом носят предварительный характер, а проведенные эксперименты требуют дальнейшего развития. Однако можно предположить, что полученных данных уже достаточно для того, чтобы рекомендовать с большой осторожностью относиться к широко рекламируемым, но не прошедшим серьезных исследований препаратам, особенно к тем, которые предлагаются в оздоровительных целях и для «улучшения» качества такого важного фактора для здоровья населения, как питьевая вода.

Выводы:

Результаты проведенных экспериментов in vitro позволяют сделать вывод о наличии стимулирующего влияния шунгита в количествах 1, 10 и 100 г/л на численность гетеротрофных бактерий в аквариумной воде.

В наибольшей степени численность бакте-риопланктона увеличивалась при внесении шунгита в количестве 10 г/л.

Внесение шунгита в количестве 10 г/л совместно с антибиотиками, по-видимому, защищает гетеротрофный бактериопланктон от воздействия антибиотиков.

Необходимо с большой осторожностью относиться к не прошедшим научных испытаний, но широко рекламируемым препаратам для оздоровительных целей населения, а также для улучшения качества воды.

ЛИТЕРАТУРА

1. Голдовская-Перистая Л.Ф. и др. О возможности использования природных материалов глины и шунгита для устранения повышенной жесткости питьевой воды / Л.Ф. Голдовская-Перистая, В.А. Перистый, А.В. Канищева [и др.] // Научные ведомости Белгородского гос. ун-та. Серия: Естественные науки. 2010. № 15(86). Вып. 12. С. 125-129.

2. Даллакян Г.А. и др. Инактивация токсического действия бихромата калия шунгитом в присутствии микроводорослей / Г.А. Даллакян, С.И. Погосян, В.И. Ипатова [и др.] // Токсикологический вестник. 2014. № 5. С. 39-44.

3. Даллакян Г.А. и др. Действие шунгита на ракообразных и его влияние на токсичность бихромата калия / Г.А. Далла-кян, Е.Ф. Исакова, Д.М. Гершкович // Токсикологический вестник. 2016. Т. 140. № 5. С. 53-58.

4. Даллакян Г.А. Рост популяции микроводорослей в условиях питательных сред, обогащенных синглетным кислородом / Г.А. Даллакян // Известия РАН. Серия биол. 1998. № 6. С. 751-753.

5. Дриаева М.Д и др. Изучение влияния свойств шунгита на микроорганизмы / М.Д. Дриаева, А.Я. Сыпченко, И.Ш. Тук-тамышев [и др.у // Вестник новых медицинских технологий. 2003. Т. 10, № 4, C. 60-61

6. Дюккиев Е.Ф., Калинин Ю.К. и др. Перспективы использования шунгитовых пород при водоочистке и водоподго-

товке // В кн.: Геология и охрана недр Карелии. Петрозаводск. 1992. С. 20-42.

7. Ильинский В.В. Гетеротрофный бактериопланктон // В кн. Практическая гидробиология: Учеб. для студ. биол. спец. университетов / Под ред. Федорова В.Д. и Капкова В.И. М.: ПИМ. 2006. С. 331-365.

8. Каленин Ю.К. Экологический потенциал шунгита // Наука в России. 2008. № 6. С. 39-44.

9. Осипов Э.В. Наномедицина и шунгит / Вильнюс. 2008. 57 с.

10. Пиотровский Л.Б. и др. Механизмы биологического действия фуллеренов - зависимость от агрегатного состояния / Л.Б. Пиотровский, М.Ю. Еропкин, Е.М. Еропкина [и др.] // Психофармакология и биологическая наркология. 2007. Т. 7. №. 2. С. 1548-1554.

11. Ширинкин С.В., Шапошников А.А., Волкова Т.О. и др. Гидра-тированный фуллерен как инструмент для понимания роли особых структурных свойств водной среды живого организма для его нормального функционирования // Научные ведомости белгородского государственного университета. Серия: медицина-фармация. 2015. Т. 31, № 16 (213). С. 20-30.

REFERENCES

1. Goldovskaya-Peristaya L.F., Peristyi V.A., Kanishcheva A.A. et al. O vozmozhnosti ispolzovaniya prirodnykh materialov gliny i shungita dlya ustraneniya povyshennoy zhestkosti pityevoy vody [Possibility of using the natural materials of clay and shungite to eliminate the increased rigidity of drinking water]. Nauchnye ve-domosti Belgorod. gos. un-ta. Seriya: Estestvennye nauki, 2010, no. 15

2. Dallakyan G.A., Pogosyan S.I., Ipatova V.I. et al. Naktivatsiya toksicheskogo deystviya bikhromata kaliya shungitom v prisutstvii mikrovodorosley [Inactivation of bichromate potassium toxic activity with shungite in the presence of a microalgae]. Toksiko-logicheskiy vestnik, 2014, no. 5, pp. 39-44.

3. Dallakyan G.A., Isakova E.F., Gershkovitch D.M. Deystviye shungita na rakoobraznykh i ego vliyaniye na toksichnost bikhro-mata kaliya [Action of shungite on crustaceans and its effect on the toxicity of the bichromate potassium]. Toksikologicheskiy vestnik, 2016, vol. 140, no.5, pp. 53-58.

4. Dallakyan G.A. Rost populyatsii mikrovodorosley v usloviyakh pitatelnykh sred. obogashchennykh singletnym kislorodom [Growth of the microalgae population in the context of nutritious environments enriched by singlet oxygen]. Izvestiya Rossiyskoy Akademii Nauk. Seriya biol., 1998, no. 6, pp. 751-753.

5. Driaeva M.D., Sypchenko A.Y., Tuktamyshev I.Sh. et al. Rost populyatsii mikrovodorosley v usloviyakh pitatelnykh sred. obogashchennykh singletnym kislorodom [Examine the effects of shungite properties on micro-organisms]. Vestnik novych meditsin-skich technologiy, 2003, vol. 10, no. 4, pp. 60-61.

6. Dyukkiev E.F., Kalinin Yu.K. et al. Perspektivy ispolzovaniya shungitovykh porod pri vodoochistke i vodopodgotovke [Prospects for the use of shungite breeds in water purification and conditioning]. V kn.: Geologiya i ochrana nedr Karelii. Petrozavodsk, 1992, pp. 19-44.

7. Ilyinskiy V.V. Geterotrofnyy bakterioplankton [Heterotrophic bacterial plankton]. V kn.: Prakticheskaya gidrobiologiya: Ucheb. dlya stud. biol. spets. universitetov. Edited by Fedorov V.D., Kapkov V.I. Moscow. PIM, 2006, pp. 331-365.

8. Kalenin Yu.K. Ekologicheskiy potentsial shungita [Environmental potential of shungite]. Nauka v Rossii, no. 6. pp. 39^-4.

9. Osipov E.V. Nanomeditsina i shungit [Nanomedicine and Shung-ite].Vilnius, 2008, 57 p.

10. Piotrowskiy L.B., Eropkin M.Yu., Eropkina E.M. et al. Mekhanizmy biologicheskogo deystviya fullerenov - zavisimost ot agregatnogo sostoyaniya [Biological mechanisms of fullerenes - dependence on the aggregate state]. Psikhofarmakologiya i biologicheskaya narko-logiya. 2007, vol. 7, no.2, pp. 1548-1554.

11. Shirinkin S.V., Shaposhnikov A.A., Volkova T.O. et al. Gidratiro-vannyy fulleren kak instrument dlya ponimaniya roli osobykh strukturnykh svoystv vodnoy sredy zhivogo organizma dlya ego normalnogo funktsionirovaniya [Hydrated fullerene as a tool for understanding the role of the special structural properties of the aquatic environment of the living organism for its normal functioning]. Nauchnye vedomosti Belgorodskogo gosudarstvennogo uni-versiteta. Seriya: meditsina-pharmatsiya, 2015, vol. 31, no. 16

12. Buseck P.R., Tsipursky S.J., Hettich R. Fullerenes from the geological environment // Science. 1992. V. 257 (5067). P. 215-217.

13. Sherr, B., Sherr, E., Andrew T. et al. Trophic interactions between heterotrophic Protozoa and bacterioplankton in estuarine water analyzed with selective metabolic inhibitors // Marine Ecology -Progress Series. 1986. V. 32. P. 169-179.

Контактная информация:

Мошарова Ирина Викторовна, тел.: +7 (910) 474-97-17, е-mail: ivmpost@mail.ru

Contact information: Mosharova Irina, рhone: +7 (910) 474-97-17,

е-mail: ivmpost@mail.ru +-