Экспрессия раннего маркера активации CD8+-лимфоцитами у ВИЧ-инфицированных подростков

© КУРТАСОВА Л.М., ШМИДТ А.Р.

ЭКСПРЕССИЯ РАННЕГО МАРКЕРА АКТИВАЦИИ СБ8+-ЛИМФОЦИТАМИ У ВИЧ-ИНФИЦИРОВАННЫХ ПОДРОСТКОВ

Л.М. Куртасова, А.Р. Шмидт Красноярская государственная медицинская академия им. В.Ф. Войно-Ясенецкого, ректор - д. м. н, проф. И.П. Артюхов;

Краевой центр по профилактике и борьбе со СПИД, Красноярск, гл. врач -

заслуженый врач РФ, Л. А. Рузаева.

Резюме. Проведены наблюдения за 184 ВИЧ-инфицированными подростками. Изучена экспрессия СВ69-антигена на СВ 8+-лимфоцитах в ответ на неспецифический активатор ФГА. Выявлено, что у ВИЧ-инфицированных подростков значительно увеличено количество СВ8+СВ69+-лимфоцитов, которое негативно коррелирует с относительным и абсолютным содержанием СВ4+-клеток, установлена положительная корреляционная связь с концентрацией иммуноглобулина класса ^ О.

Ключевые слова: ВИЧ-инфекция, иммунофенотип, СВ69-антиген.

Известно, что функциональные особенности иммунной системы ВИЧ-инфицированных пациентов играют важную роль в оценке течения заболевания и его прогрессии. В настоящее время особый интерес представляет изучение функциональной активности лимфоцитов у ВИЧ-инфицированных пациентов на основании экспрессии различных мембранных рецепторов - СВ69, СВ38 и др. [5]. Исследование экспрессии СБ69-антигена, раннего маркера активации, Т-лимфоцитами в ответ на специфические и неспецифические стимулы позволяет судить о функциональных свойствах иммунокомпетентных клеток [7]. Показана эффективность использования данного маркера у больных сахарным диабетом 1 типа и системной красной волчанкой, в частности, у данных больных обнаруживается снижение числа активированных клеток по сравнению со здоровыми донорами [8].

Цитотоксические лимфоциты (ЦТЛ) играют важную роль в противовирусном Т-клеточном иммунном ответе. Они несут на поверхности мембраны гликопротеин CD8 и распознают пептидные антигены, в том числе и вирусные, представляемые молекулами главного комплекса гистосовместимости 1 класса [1].

Практически сразу после инфицирования ВИЧ инициируется мощный клеточный ответ, противовирусную активность которого преимущественно определяют ЦТЛ. Это достигается с помощью 2-х наиболее изученных механизмов. Первый заключается в прямом киллинге инфицированных клеток. В тоже самое время активация ЦТЛ ведет к синтезу растворимых противовирусных факторов, включающих хемокины, которые способны непосредственно ингибировать развитие инфекции. Активация CD8-клеток приводит к появлению ВИЧ-специфических ЦТЛ, которые могут дифференцироваться в зависимости от их эффекторных функций [1,2].

В связи с вышеизложенным целью данного исследования являлась оценка функционального состояния CD8-лимфоцитов на основании оценки экспрессии CD69-антигена в ответ на неспецифический активатор у ВИЧ-инфицированных пациентов.

Материалы и методы

Проведены наблюдения за 184 ВИЧ-инфицированными пациентами в возрасте 15 - 18 лет на базе Краевого центра по профилактике и борьбе со СПИД г. Красноярска. Диагноз верифицировали методом иммунного блоттинга. Исследование проводили до назначения специфической противовирусной терапии. Контрольную группу составили 30 здоровых подростков аналогичного возрастного диапазона.

Количественное определение популяций лимфоцитов осуществляли методом проточной цитометрии с использованием панели трехцветных моноклональных антител (CD3-FITC/CD4-PE/CD45-PerCP и CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PerCP). Определение концентрации иммуноглобулинов классов А, М и О проводили методом радиальной иммунодиффузии в геле [6]. Уровень

циркулирующих иммунных комплексов определяли в реакции с полиэтиленгликолем [4].

Для оценки экспрессии CD^-антигена, цельную гепаринизированную кровь, полученную путем венепункции из локтевой вены, инкубировали в суховоздушном термостате при 370 С в течении 4 часов в присутствии фитогемагглютинина (ФГА) в концентрации 10 мкг/мл. Далее кровь с активированными Т-лимфоцитами окрашивалась трехцветными антителами CD8-FITC/CD69-PE/CD3-PerCP (BD). Определяли количество CD3+/CD8+/CD69+

- клеток с помощью трехцветного цитометрического анализа в программе “CellQuest” на проточном цитометре “FACSCalibur” (“Becton Dickinson”).

Статистическую значимость различий при сравнении двух несвязанных выборок анализировали с помощью критерия Манна-Уитни (U). Для оценки силы связи между признаками использован коэффициент ранговой корреляции Спирмена (r). Результаты исследования количественных параметров в группах сравнения представлены в виде медианы и интерквартильного интервала Me(LQ-UQ), где Мe - медиана, LQ - 25% процентиль, UQ - 75% процентиль. Расчеты проводили с использованием пакета прикладных программ «Statistica 6.0».

Результаты и обсуждение

Изучение иммунофенотипического спектра лимфоцитов периферической крови показало, что в группе ВИЧ-инфицированных достоверно повышено процентное содержание зрелых Т-лимфоцитов

Кроме того, установлено снижение количества CD^-клеток и увеличение числа CD^-лимфоцитов как по относительным, так и по абсолютным показателям по сравнению с параметрами контроля. Нарушение процентного соотношения CD4+/ CD^-клеток в группе ВИЧ-инфицированных приводило к

выраженному падению иммунорегуляторного индекса. Реакция гуморального звена иммунитета характеризовалась повышением концентрации ^ М и ^ О в сыворотке крови относительно показателей контрольной группы (табл. 1).

Процентное содержание CD8+CD69+-клеток в группе ВИЧ-инфицированных составило 12,26 (8,27 - 18,35)%, а в контрольной - 7,92 (7,12

- 8,98)%, р < 0,001. В результате проведенных нами исследований экспрессии CD69 антигена на CD8-лимфоцитах выявлено, что после неспецифической стимуляции клеток периферической крови у ВИЧ-инфицированных обнаружено увеличение относительного количества CD8+-лимфоцитов, экспрессирующих CD69+-антиген по сравнению с группой контроля.

Исходная группа обследованных ВИЧ-инфицированных пациентов была разделена на две подгруппы с низким (меньше 8,27%, п = 49) и высоким (больше 18,35%, п = 53) уровнями экспрессии CD69-антигена на CD8-клетках. Основой для разделения послужили значения экспрессии CD69-антигена CD8-лимфоцитами, выходящие за пределы интерквартильного интервала 25 - 75%.

Сравнительный анализ исследуемых параметров установил, что в группе ВИЧ-инфицированных с высоким содержанием CD8+CD69+-лимфоцитов достоверно снижено как относительное (22,88±1,13; 31,49±1,05; р < 0,001) так и абсолютное (442,59±31,10 и 553,50±31,02; р < 0,005) количество CD4-клеток по сравнению с пациентами, имеющих низкое содержание активированных CD8-лимфоцитов.

Корреляционный анализ полученных данных также показал, что уровни экспрессии CD8+CD69+-лимфоцитов у ВИЧ-инфицированных пациентов имеют обратную взаимосвязь с относительным (г = -0,38) и абсолютным (г = -0,27) количеством CD4-лимфоцитов (р < 0,001). Исходная группа ВИЧ-

инфицированных была разделена на 3 подгруппы в зависимости от содержания CD4-клеток согласно классификации ВИЧ-инфекции, CDC, ША (1994). Первую группу составили 112 пациентов с содержанием CD4-лимфоцитов больше 500 кл/мкл, вторую - 78 ВИЧ-инфицированных с количеством от 200 до 499 CD4-клеток/мкл и в третью - вошли 12 человек с уровнем CD4-лимфоцитов

менее 200 кл/мкл. На рисунке 1 показано, что по мере снижения CD4-клеток происходит увеличение количества CD8+CD69+-лимфоцитов в сравниваемых группах ВИЧ-инфицированных.

Кроме того, интересно отметить, что нами установлена статистически значимая положительная корреляционная связь между уровнями экспрессии CD^-антигена на CD8-лимфоцитах и концентрацией иммуноглобулина класса G (г = 0,13; p < 0,05). Роль гуморальных факторов иммунного ответа в прогрессировании ВИЧ-инфекции не так однозначна [3]. Однако, C.A. Sabine et al.[9] отмечают более высокий уровень суммарных IgG и IgA у ВИЧ-инфицированных гемофиликов с более быстрой прогрессией заболевания, причем, степень повышения концентрации этих иммуноглобулинов оказалась независимым от уровня виремии фактором прогрессии.

В то же время следует отметить отсутствие достоверной взаимосвязи между уровнями вирусной нагрузки и относительным содержанием CD8+CD69+-лимфоцитов в периферической крови исследуемой группы ВИЧ-инфицированных.

Таким образом, результаты проведенных исследований показали, что у пациентов с ВИЧ-инфекцией на фоне изменения фенотипического спектра циркулирующего пула лимфоцитов имеются функциональные изменения в ответе на неспецифический митогенный раздражитель, проявляющиеся увеличением относительного количества CD8-лимфоцитов, несущих CD69-антиген. Установлена достоверная взаимосвязь между иммунологическими маркерами прогрессии заболевания: отмечено, что по мере снижения CD4-клеток наблюдается увеличение числа активированных CD8-лимфоцитов, несущих CD^-антиген. ВИЧ-инфицированные с высоким уровнем CD8+CD69+-клеток имеют повышенные уровни Ig G.

Суммируя приведенные данные можно заключить, что экспрессия раннего активационного маркера (CD69+) CD^-лимфоцитами периферической крови должна учитываться в комплексной оценке состояния иммунной системы у пациентов с ВИЧ-инфекцией.

ASSESSMENT OF EARLY ACTIVATION MARKER EXPRESSION ON

cd8+ t-cells in hiv-infected patients

L. M. Kurtasova, A.R. Shmidt

Krasnoyarsk state medical academy named in honour of V.F. Vojno-

Yasenetskij

Krasnoyarsk Regional center for Preventive and Elimination of AIDS

Whole-blood samples were obtained from 202 HIV-infected patients. We examined expression of CD69 activation marker on CD8-cells in response to phytohemagglutinin (PHA) stimulation. HIV-infected patients had significantly increased CD8+CD69+ levels. The expression of CD69-antigen on CD8-cells correlated inversely with percent and absolute count of CD4-lymphocyte. Also CD8+CD69+ levels correlated positively with concentration of IgG.

Литература

1. Бобкова М.Р. Иммунитет и ВИЧ-инфекция. - М.: Олимпия Пресс, 2006. -240с.

2. Рахманова А.Г. ВИЧ-инфекция. - С-Пб: 21 век, 2004. - 696 с.

3. Birch M.R.,Learmont J.C.,Dyer WB., et al. An examination of Sings of Disease Progression in Survivors of th Sydney Blood Bank Cohort (SBBC) // J. Clin. Virol. - 2001. - Vol. 22, №3. - P. 263-270.

4. Haskova V., Kaslik J., Riha J., et al. Simple method of circulating immune complex detection in human sera by polyethylene glycol precipitation // J. Immunol. - 1978. - Vol. 154. - P. 399-406.

5. Krowka, J.F. Cuevas B, Maron DC, et al. Expression of CD69 after in vitro stimulation: a rapid method for quantitating impaired lymphocyte responses in HIV-infected individuals // J. Acquir. Immune Defic. Syndr. Hum. Retrovirol. -1996. - Vol. 11, №1. - P. 95-104.

6. Manchini G., Carbonaro A.O., Haremans J.F. Immunochemical quantitation of antigens by single radial diffusion // Immunochemistry. - 1965. - Vol. 2, №3. - P. 235-255.

7. Messele T., Roos M. L., Hamann D., et al. Nonradioactive Techniques for Measurement of In Vitro T-Cell Proliferation: Alternatives to the [ H] Thymidine Incorporation Assay // Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. - 2000. -Vol. 7, № 4. - P. 687-692 .

8. Perfetto, S.P. Hickey TE, Blair PJ, et al. Measurement of CD69 induction in the assessment of immune function in asymptomatic HIV-infected individuals // Cytometry. - 1997. - Vol. 30. - P. 1-9.

9. Sabin CA, Devereux H, Phillips AN, et al. Immune markers and viral load after HIV-1 seroconversion as predictors of disease progression in a cohort of haemophilic men // AIDS. - 1998. - Vol. 12. - P. 1347-1352.

СБ8+СБ69+

Рис.1 Количество СВ8+СВ69+-лимфоцитов у ВИЧ-инфицированных с различным содержанием СВ4-клеток.

Таблица 1

Иммунологические показатели у ВИЧ-инфицированных пациентов

Параметры Иммунологические показатели в группах

Контрольная группа (п = 30) Me (LQ-UQ) ВИЧ- инфицированные (п = 184) Me ^-Щ) р

Лимфоциты, 109/л 2199,0 (1770,6-2507,1) 1756,0 (1439,3-2236,5) p<0,005

CD3+-клетки, % 73,0 (64,5-78,0) 79,7 (75,5-84,2) p<0,001

CD3+-клетки, 109/л 1391,5

CD4+-клетки, % 41,0 (38,0-47,0) 28,5 (22,1-34,3) p<0,001

CD4+-клетки, 109/л 797,0 (727,1-1060,8) 502,3 (340,1-631,8) p<0,001

CD8+-клетки, % 27,0 (21,0-29,0) 50,2 (44,6-56,2) p<0,001

CD8+-клетки, 109/л 539,0 (442,0-639,0) 820,5 (670,4-944,2) p<0,001

CD4+/CD8+ 1,65 (1,40-1,91) 0,57 (0,38-0,79) p<0,001

Ig A, г/л 1,62

^ M, г/л 1,46 (1,17-1,75) 1,87 (1,46-2,34) p<0,005

Ig ^ г/л 13,54 (10,64-15,48) 15,48 (12,41-19,15) p<0,005

ЦИК, у.е. 27 (20-38,5) 26 (20-40) %