РАСТИТЕЛЬНЫЕ ЭКСТРАКТЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В КАЧЕСТВЕ ФИТОХИМИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ
VEGETABLE EXTRACTS USED AS PHYTOCHEMICAL PREPARATIONS

(Vitis vinifera)
Настоящее изобретение относится к использованию семян винограда в качестве средств для лечения или предупреждения болезней растений, вызываемых патогенами, в особенности грибами и оомицетами.
Vitis vinifera
Соответственно, настоящее изобретение относится к фунгицидным композициям, включающим экстракты , применяемым с целью нанесения на растения, пораженные патогеном или чувствительные к поражению патогенном, в особенности грибом или оомицетом.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Известно множество заболеваний растений, вызываемых патогенами, такими как грибы, плесени, оомицеты, бактерии и вирусы. Многие из них, обычно ассоциированные с определенными климатическими условиями, благоприятствующими их проявлению и распространению, имеют драматические последствия, вызывая потери урожая сельскохозяйственных культур, что, в свою очередь, оказывает заметное и иногда даже катастрофическое влияние на состояние экономики сельскохозяйственной сферы, особенно если заболевание носит эпидемический характер.
Phytophthora infestans,
Исторически значимым известным примером такого рода заболевания растений, вызывающим опустошительные последствия, является инфекция картофеля (фитофтороз картофеля), вызванная которая стала причиной великого голода, поразившего Ирландию в конце 1840-х гг.
Plasmopara viticola,
Другой оомицет, вызывает так называемую ложную мучнистую росу, одну из наиболее распространенных серьезных инфекций, которая сопряжена с огромными потерями производителей вина и виноградарей, поскольку вызывает снижение как урожая винограда, так и качество получаемой продукции.
Erysiphe necator,
Uncinula necator.
Аналогичное заболевание винограда под названием настоящая мучнистая роса, вызывает гриб также известный как
Аналогичные инфекции поражают другие растения, такие как соя, подсолнечник, салат-латук, томаты, картофель, дуб, декоративные растения, фруктовые культуры, табак и тыква.
Обширный обзор по заболеваниям растений приведен в Европейском справочнике-руководстве по заболеваниям растений - European Handbook of Plant Diseases, ed. by I.M. Smith et al., 1988, Blackwell Scientific Publications.
Был предложен ряд природных и синтетических препаратов, которые в настоящее время доступны для лечения указанных выше заболеваний растений. Кроме солей или комплексов серы и меди, к ним относятся синтетические фунгициды для агрохимического применения, относящиеся к самым разным классам химических соединений (фениламиды, производные бензимидазола, дикарбоксимиды, карбаматы, карбонилаты, дитиокарбаматы, динитроанилины и т.п.). Применение указанных синтетических препаратов ограничено хорошо известным явлением резистентности, теми токсическими эффектами, которые могут вызывать указанные препараты в организме человека и животных, а также сопряженным с ними риском загрязнения окружающей среды.
В этой связи, усилия исследователей были сконцентрированы на разработке более благоприятных для окружающей среды фунгицидов, возможно, природного происхождения, которые могли бы заменить известные синтетические фунгициды или которые, по меньшей мере, могли бы использоваться в сочетании с ними для уменьшения явления резистентности и/или их вредного влияния на окружающую среду.
Известно, что некоторые масла, такие как эфирное масло корицы, масло розмарина и масло нима являются эффективными фунгицидами.
В патенте США No. 6174920 описывается также использование воска жожоба для борьбы с инфекциями, вызванными настоящей мучнистой росой.
Сообщалось также, в документе CA 2103014, что экстракт жожоба использовался в варианте предварительной обработки для предупреждения развития инфекции настоящей мучнистой росой на растениях винограда, а в патенте США 2007/0071831 описывается продукт для предупреждения и/или лечения инфекций, получаемый при частичной или полной нейтрализации осадка, образующегося в процессах производства вина.
В WO 2006/006878 описывается фунгицидная композиция, включающая обезвоженное жирное молоко, необязательно в сочетании с соевым маслом, оливковым маслом и кокосовым маслом, одним из них или несколькими из приведенного перечня.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Vitis vinifera
Было показано, что экстракты семян  или выжимок, содержащих семена, эффективны для борьбы с растительными патогенами, в особенности с грибами и оомицетами.
Соответственно, настоящее изобретение относится к фитофармацевтическим композициям, включающим экстракт семян Vitis vinifera или выжимок, содержащих семена, в качестве активного ингредиента.
Настоящее изобретение имеет большую значимость для экономики во всем мире за счет повторного использования отходов винной промышленности, а также с учетом существующего возрастания стоимости, связанного с восстановлением, дистилляцией, выделением тепла при сжигании биомассы или в процессе компостирования, что всегда возможно после экстракции.
Композиции по настоящему изобретению используются для лечения и/или предупреждения инфекции патогенными организмами растений, включая виноградник и другие культурные растения, подверженные инфекции такими патогенами.
Настоящее изобретение также относится к способу профилактики или лечения инфекций растения, вызванных грибами или оомицетами, включающему нанесение эффективного количества экстракта семян Vitis vinifera или выжимок, содержащих семена, на обрабатываемые растения.
Приведенные ниже результаты экспериментальных тестов показывают удивительную активность экстрактов семян Vitis vinifera против двух наиболее распространенных патогенов виноградников, а именно: Plasmopara viticola и Erysphe necator. Однако, следует понимать, что настоящее изобретение не ограничивается лечением инфекций виноградника, вызванных только этими двумя патогенами, а применимо к множеству других грибов и оомицетов, поражающих другие растения, представляющие интерес.
Ниже приводится перечень возможных патогенов, которые поражают представляющие интерес растения.
1
Oidium
-
Erysiphe necator = Uncinula necator
(виноградник)
Erysiphe graminis
(зерновые)
Podosphaera leucotricha
(древесные растения, фруктовые деревья)
Sphaerotheca pannosa
(розы)
2 - Возбудители ложной мучнистой росы
Plasmopara viticola
(виноград)
Plasmopara helianthi
(подсолнечник)
Phytophthora infestans
(картофель)
Phytophthora parasitica
(томаты)
3 - Парша фруктовых деревьев
Venturia inaequalis
(парша яблони)
Venturia pirina
(парша персика)
- Курчавость листьев персика
4
Taphrina deformans
5 - Септориоз
Septoria nodorum
Septoria tritici
и (зерновые)
Septoria sp.
(рапс)
6 - Ржавчинные грибы
Puccinia graminis, Puccinia recondita
Puccinia striiformis
и (зерновые)
7
Поражение головней
-
Ustilago tritici
(пшеница)
Ustilago maydis
(кукуруза)
Ustilago hordei
(ячмень)
8 - Твердая головня пшеницы
Tilletia tritici, Tilletia caries
Tilletia foetida
и (зерновые)
9 - Гниль ветвей
Phoma lingam
(крестоцветные, рапс)
Rhizoctonia solani
(картофель)
Sclerotinia sclerotiorum
(томаты)
10 - Антракноз
Colletotrichwn gloeosporioides
(горох)
Colletotrichum lindemuthianum
(бобы)
11
Серая гниль
-
Botrytis cinerea
(виноградник)
Особенно интересным является обнаруженный для экстрактов по настоящему изобретению их эффект против патогенов, перечисленных в пунктах 1, 2, 3, 4, 9, 10 и 11.
Vitis vinifera,
Phytophthora infestans,
Примером другого патогена, который может эффективно контролироваться экстрактом является, в частности, как возбудитель, поражающий различных представителей семейства Solanaceae, таких как картофель, томаты, а также ряд декоративных растений.
Vitis vinifera
Экстракты семян или выжимок, содержащих семена, по настоящему изобретению могут быть получены при экстрагировании и очистке свежих или высушенных семян или выжимок, содержащих семена, с использованием различных растворителей, таких как вода, ацетон, этилацетат, этанол, бутанол или их смеси, в разных условиях экстрагирования и с использованием разных методик.
Известно и коммерчески доступно множество такого рода экстрактов. Например, экстракт семян винограда, полученный при их экстракции смесью вода-этанол, как описано в WO 2007/017037.
Использование растворителей, таких как вода и этанол, является, разумеется, предпочтительным, в связи с низкой стоимостью и низкой токсичностью таких растворителей. Было также обнаружено, что экстракт, особенно хорошо подходящий для использования по настоящему изобретению, может быть получен по способу, включающему:
- экстракцию семян винограда горячей водой;
- удаление водонерастворимой фракции;
- очистку на колонке, содержащей адсорбирующую смолу;
- концентрирование;
- распылительную сушку.
Экстракт, получаемый в рамках указанного способа, характеризуется содержанием катехина и эпикатехина от 5 до 30% (ВЭЖХ), общим содержанием полифенолов в диапазоне от 90 до 110% (спектрофотометрический метод Фолина-Чиокалто). Указанный экстракт является новым и представляет собой другой объект настоящего изобретения.
Vitis vinifera
Экстракты семян могут использоваться в качестве таковых, при проведении соответствующего растворения или суспендирования в носителе, подходящем для нанесения на растение, или они могут далее изготавливаться в виде композиции в сочетании с подходящими эксципиентами, такими как, например, увлажняющие добавки, вспомогательное вещество, или с другими активными ингредиентами, например известными фунгицидами, соединениями меди, маслами и т.п.
V. vinifera
Количество экстракта семян в композиции может варьировать от 5 до 25 г/л, но указанный диапазон следует корректировать в контексте его функции в указанной композиции, с учетом подлежащего обработке патогена, растения, которое необходимо защитить, и методики обработки.
Указанная композиция может наноситься на растение с использованием любой подходящей методики, например, путем опрыскивания из стандартных устройств, и такая обработка может проводиться еженедельно или в соответствии с тем планом, который будет разработан и принят специалистом с учетом ряда факторов, таких как климатические условия, длительность инфекции, вирулентность инфицирующего организма, применение других фитохимических средств и т.п.
Vitis vinifera
В качестве примера, в случае поражения растений ложной мучнистой росой, можно отметить, что экстракт семян в типичном случае распыляют на листья и под листья в количестве, варьирующем от 0,1 до 10 г на растение и на обработку, один раз в одну-три недели, от ранней весны до позднего лета, даже до периода сбора урожая. Точное количество будет, разумеется, зависеть от плотности растений, которая варьирует от географической зоны и от сорта винограда, так, например, около 3000 растений/га произрастает в Тоскане, примерно 7500 растений/га в Шампани и примерно 1000 растений/га в Бургундии. Кроме того, общий объем раствора «готового для использования», который распыляется на растения, также может варьировать в зависимости от используемого продукта и технологии обработки: от 300 до 750 литров/га, что эквивалентно 5 г/л × 300 л/га/10000/растений/га = 0,15 г/растение и до максимального количества, составляющего 25 г/л × 750 л/га, что эквивалентно 3000 растений/га = 6,25 г/растение.
Ниже настоящее изобретение более подробно иллюстрируется приведенными примерами.
Пример 1 - Получение водного экстракта семян Vitis vinifera: VITIVAC
1000 г сухих семян винограда заливают горячей водой при температуре 75°C. Оставляют на 4 часа в статическом экстракторе с рубашкой или в реакторе с рубашкой, снабженном мешалкой.
Затем биомассу экстрагируют при пропускании через нее горячей воды при температуре 75°C, выделенный экстракт выгружают в непрерывном режиме до достижения полного объема 7,5 литров. Скорость перколяции в идеале составляет примерно 1 литр в час.
Все выделенные экстракты охлаждают до температуры 20°C и фильтруют через фильтр с размером пор 50 микрон для удаления частиц соответствующего размера.
Далее водный раствор вносят в непрерывном режиме через верх хроматографической колонки, содержащей 1 литр смолы Амберлит (Rhom and Haas AMBERLITE XAD 7HP) или эквивалентную смолу, предварительно восстановленную (регенерированную) и заполненную водой. Отслеживают проводимость воды, выходящей из нижней части колонки.
В конце стадии фиксации смолу промывают с использованием в идеале 4 литров воды и затем элюируют в непрерывном режиме с использованием 4 литров 70% (объем/объем) этанола и последовательно промывают еще 4 литрами воды. Отслеживают проводимость воды, выходящей из нижней части колонки.
Собирают полученный этанольный раствор, концентрируют его в вакууме и промывают водой для удаления этанола.
Затем раствор концентрируют в вакууме и подвергают распылительной сушке при температуре ниже 85°C.
Полученный порошок смешивают, проверяют и упаковывают в воздухонепроницаемые непрозрачные пакеты.
Стандартный выход составляет 93 г, что соответствует выходу 9,30% вес. от исходного материала. Однако этот выход может варьировать в зависимости от используемой биомассы.
Данный продукт характеризуется содержанием катехина (катехин + эпикатехин) по данным ВЭЖХ 8,5%, а общее содержание полифенолов составляет 98%.
Пример 2 - Фунгицидная активность экстракта семян Vitis vinifera: VITIVAC
Растения
Vitis vinifera
2
Использовались семена сорта Шардонне (Shardonnay) для исследования действия (эффекта) фунгицидов на ложную мучнистую росу. Растения выращивали из семян (одно растение на 0,1-1 вегетационный сосуд) и помещали в ростовую камеру (в условия 23°C день/19°C ночь, 100-120 мкЕ/м/с, 16-часовой световой период). Саженцы обрабатывали удобрениями два раза в неделю с использованием 0,1 литра N-P-K удобрения с концентрацией 0,2 г/л (20-20-20). Для исследования биологической активности VITIVAC использовали восьминедельные саженцы по меньшей мере с четырьмя полностью распустившимися листьями.
Патоген
Plasmopara viticola
2
5
Изолят Pv1, полученный в 2007 г. из инфицированных растений в винограднике, расположенном в Шампани (Champagne), Франция, поддерживали на срезанных листьях растений сорта Шардонне с дезинфицированной поверхностностью. Листья помещали в чашке Петри и ставили в ростовую камеру (23°C день/19°C ночь, 100-120 мкЕ/мс, 16-часовой световой период). Инокулят получали из листьев со свежими спорами через 8-12 дней после инокуляции. Спорангии суспендировали в дистиллированной воде при температуре 4°C и корректировали их количество по гемоцитометру до концентрации 5×10 спорангий/мл воды.
Фунгицидная обработка
Природный продукт, полученный по процедуре, описанной в примере 1 (VITIVAC), использовали в количестве 25 г/л в ходе всех экспериментальных работ. Эффективность VITIVAC сравнивали с эффективностью эталонной фунгицидной смеси Fosetyl-Al (500 г/кг) + Folpel (250 г/кг), при использовании ее в количестве 4,0 кг готового продукта/га (Mikal Flash WG, Bayer CropScience).
Листья «Шардонне» с дезинфицированной поверхностью помещали абаксиальной стороной вверх в пластиковые чашки Петри диаметром 14 см, где каждая чашка содержала фильтровальную бумагу, увлажненную 8 мл воды. Листья обрабатывали лабораторным опрыскивателем (Euro-Pulve) с одним конусовидным соплом (Teejet XR 110015 VS) при давлении воздуха 2 бара. Фунгицидные препараты наносили в объеме 400 и 720 л/га, применительно к Mikal Flash и VITIVAC, соответственно. Каждый тест повторяли 3 раза. Полученные данные подвергали статистической обработке с использованием для оценки критерия Ньюмана-Кеулса (XLS-Stat, Addinsoft).
2
Обработанные листья помещали в ламинарный (воздушный) поток на 30 минут для высушивания фунгицида, нанесенного на абаксиальную сторону листьев. После сушки чашки Петри, содержавшие обработанные и необработанные (контрольные) листья, выдерживали в ростовой камере (23°C - день/19°C - ночь, 100-120 мкЕ/мс, 16-часовой световой период) в течение 24 часов.
Plasmopara viticola
Инокуляция
5
2
Вырезали пробковым сверлом из обработанных и необработанных (контрольных) листьев десять листовых дисков (каждый по 10 мм в диаметре) и помещали абаксиальной стороной вверх в пластиковые чашки Петри диаметром 9 см, содержащие фильтровальную бумагу, смоченную 4 мл стерильной дистиллированной воды. В диски инокулировали по одной капле (20 мкл) инокулята (5×10 спорангий/мл). После инокуляции чашки Петри, содержавшие 10 листовых дисков, инкубировали при температуре 19°C в течение 24 часов в темноте и снова выдерживали в ростовой камере (23°C- день/19°C - ночь, 100-120 мкЕ/мс, 16-часовой световой период) для развития инфекции. В конце эксперимента чашки Петри выдерживали при температуре 19°C в течение 24 часов в темноте для индукции споруляции.
Journal of Phytopathology
Через десять дней после инокуляции определяли количество листовых дисков, в которых были видны признаки развития ложной мучнистой росы, в каждом из исследованных вариантов (частота инфекции). Затем оценивали по шкале 0-4 признаки поражения ложной мучнистой росой, сопровождаемого белесыми спорангиями, как это было описано Reuveni (Relationship between leaf age, peroxidase and b 1-3 glucanase activity and resistance to downy mildew in s, 1998. 146, 525-530): 0: нет поражений; 1: инфекция и споруляция наблюдаются в 1-10% зон листового диска; 2: 11-25%; 3: 26-50%; 4: >50% (интенсивность инфекции). Подсчитывали количество спорангиев, образуемых на листовых дисках. Спорангии вымывали из 10 листовых дисков заданным объемом стерильной дистиллированной воды, содержащей 0,01% Твин 80, и подсчитывали на гемоцитометре (шесть подсчетов на 10 листовых дисков). Определяли также количество спорангиев, образованных на квадратный сантиметр площади листового диска (интенсивность споруляции). Эксперимент проводили один раз и брали по три чашки Петри на каждую обработку.
Plasmopara viticola
(1)
Результаты наблюдения спустя 10 дней после инокуляции
Вариант обработки
Частота инфекции<sup>α</sup> (эффективность, % от Те)
Интенсивность инфекции<sup>β</sup> (эффективность, % от Те)
Интенсивность споруляции(спороцисты/см<sup>2</sup>) (эффективность, % от Те)
эталонный растворSolution
1+/-0
2,6+/-0
3,22,10<sup>5</sup>+/-0,60,10<sup>5</sup>
1TV1
0,5+/-0,1(50%)
1,1+/-0,2(58%)
0,75,10<sup>5</sup>+/-0,30,10<sup>5</sup> (77%)
ITV2
0,5+/-0(50%)
0,65+/-0,05 (75%)
1,21,10<sup>5</sup>+/-0,03,10<sup>5</sup> (62%)
Экстрактсогласно патенту США2007/0071831
0,7+/-0(30%)
1,4+/-0,1(46%)
1,84,10<sup>5</sup>+/-033,10<sup>5</sup>(43%)
Lieboost
0,7+/-0,1(30%)
1,25+/-0,15(52%)
1,07,10<sup>5</sup>+/-0,14,10<sup>5</sup> (67%)
V1TIVAC
0+/-0(100%)
0+/-0(100%)
0+/-0(100%)
Mikal
0+/-0(100%)
0+/-0(100%)
0+/-0(100%)
<sup>α</sup> - Частота инфекции: количество контаминированных инокулированных дисков/общее число дисков (10).
<sup>β</sup><i></i>- Интенсивность инфекции: произвольная шкала (от 0 до 4), отражающая интенсивность инфекции каждого листового диска.
Результаты приведены в прилагаемой таблице.
Erysiphe necator.
Erysiphe necator
(P. viticola)
2
Аналогичные благоприятные результаты были получены при обработке листьев, инфицированных Процедура обработки была практически такой же, за исключением того, что инфекция была индуцирована при встряхивании контаминированных листьев над чашками Петри. В этом случае, обработка по настоящему изобретению была особенно эффективной с точки зрения снижения интенсивности споруляции, определяемой как количество конидий на единицу площади (см).
Приведенные ниже данные являются репрезентативными примерами фитофармацевтических композиций.
<b><u>Пример 3</u></b>
Экстракт <i>Vitis vinifera</i>
г
250
Soquabiol
мл
200
Деионизированная вода
л
100
<b><u>Пример 4</u></b>
Экстракт <i>Vitis vinifera</i>
г
500
Sticman 
мл
40
Деионизированная вода
л
100