СРЕДСТВА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ КАРДИОПАТИИ
AGENT FOR CARDIOPATHY

Область техники
Настоящее изобретение относится к средствам для лечения инфаркта миокарда, содержащим ингибитор IL-6 в качестве активного ингредиента, и к применению таких средств. Кроме того, настоящее изобретение относится к средствам, подавляющим ремоделирование левого желудочка сердца после инфаркта миокарда, которые содержат ингибитор IL-6 в качестве активного ингредиента, и к применению таких средств.
Уровень техники
Инфаркт миокарда является одним из ишемических заболеваний сердца. Он представляет собой нарушение, которое вызывает некроз миокарда, где спазм венечной артерии сердца возникает вследствие атеросклероза и подобного расстройства, и кровоток в венечной артерии значительно снижается или останавливается. Расширение и/или ухудшение состояния пораженной инфарктом области является причиной осложнений, таких как сердечная недостаточность и/или вызванная ишемией тяжелая аритмия, и становится угрозой для жизни.
По мере того как инфаркт миокарда прогрессирует, клетки миокарда в пораженных инфарктом зонах отмирают и/или отторгаются и заменяются фиброзными тканями, такими как коллагеновое волокно. В такой зоне инфаркта наблюдается дефект сократительной способности, и такая зона не выдерживает внутрисердечного давления, которое повышается при сокращении сердца, и тогда фиброзная стенка понемногу расширяется. В результате для компенсации гипофункции возникает гипертрофия эндокардиальной полости в области, не пораженной инфарктом, и дилатация целого левого желудочка. Такое явление называют ремоделированием левого желудочка, и оно, как известно, в дальнейшем снижает функцию сердца и повышает болезненность и впоследствии смертность. Поэтому для улучшения прогноза инфаркта миокарда представляется важным подавить прогрессирование ремоделирования левого желудочка как можно раньше, и разработка эффективных способов лечения является желательной.
IL-6 является цитокином, названным стимулирующим В-клетки фактором 2 (BSF2), или интерфероном β2. IL-6 был открыт как фактор дифференцировки, принимающий участие в активации В-лимфоцитов (непатентный документ 1), и позже был найден как многофункциональный цитокин, который влияет на функцию различных клеток (непатентный документ 2). Было показано, что IL-6 вызывает созревание Т-лимфоцитов (непатентный документ 3).
IL-6 передает свою биологическую активность посредством двух типов белков на клетке. Одним из белков является рецептор IL-6, который представляет собой лигандсвязывающий белок, с которым связывается IL-6, и он имеет молекулярную массу приблизительно 80 кД (непатентные документы 4 и 5). Кроме мембраносвязанной формы, которая пронизывает мембрану и экспрессируется на клеточной мембране, рецептор IL-6 присутствует как растворимый рецептор IL-6, который в основном состоит из внеклеточной области мембраносвязанной формы.
Другим белком является мембранный белок gp130, который имеет молекулярную массу приблизительно 130 кД и вовлекается в передачу сигнала, не связанную с лигандом. Биологическая активность IL-6 передается в клетку посредством образования комплекса IL-6/рецептор IL-6, а затем связывания комплекса с gp130 (непатентный документ 6).
Ингибиторы IL-6 представляют собой вещества, которые ингибируют передачу биологической активности IL-6. К настоящему времени известны антитела против IL-6 (анти-IL-6-антитела), антитела против рецепторов IL-6 (антитела против рецептора IL-6), антитела против gp130 (анти-gp130-антитела), варианты IL-6, неполные пептиды IL-6 или рецепторов IL-6 и подобные им.
Имеется несколько сообщений относительно антител против рецептора IL-6 (непатентные документы 7 и 8; патентные документы 1-3). Известно гуманизированное РМ-1-антитело (патентный документ 4), которое было получено путем переноса в человеческое антитело гипервариабельного участка (CDR), антитела мыши РМ-1 (непатентный документ 9), которое является одним из антител против рецептора IL-6.
К настоящему времени исследователи сделали предположение, что IL-6 влияет на функцию и структуру сердца исходя из таких фактов, что IL-6 оказывает отрицательное влияние на сократимость сердечной мышцы (непатентный документ 10), что гипертрофия сердца развивается у мыши, у которой gp130 постоянно активируется вследствие повышенной экспрессии IL-6 и рецепторов IL-6 (непатентный документ 11), и так далее. После инфаркта миокарда IL-6 экспрессируется в левом желудочке, в частности в пограничной зоне инфаркта миокарда, связанного с реперфузией (непатентный документ 12), и уровень экспрессии связан с размером левого желудочка (LV) после инфаркта миокарда (непатентный документ 13). Кроме того, было показано, что клетки миокарда вырабатывают IL-6 при слабой нагрузке кислорода (непатентный документ 14) и что экспрессия цитокинов в немышечных клетках в процессе постинфарктного ремоделирования играет регулирующую роль в изменениях внеклеточного матрикса (непатентный документ 15). Кроме того, что касается связи между инфарктом миокарда и IL-6, показано, что система JAK/STAT, активированная IL-6, обладает защитным действием от инфаркта миокарда (непатентный документ 16).
С другой стороны, на основании эксперимента на IL-6-нокаут-мышах было показано, что недостаток IL-6 не оказывал влияния на размер пораженной инфарктом зоны, ремоделирование левого желудочка или тому подобное (непатентный документ 17). Как описано выше, роль IL-6 в развитии инфаркта миокарда и ремоделировании левого желудочка после инфаркта миокарда неизвестна.
Ссылки предшествующего уровня техники в данной области, относящиеся к настоящему изобретению, представлены ниже.
[Непатентный документ 1] Hirano, T. et al., Nature (1986) 324, 73-76
[Непатентный документ 2] Akira, S. et al., Adv. in Immunology (1993) 54, 1-78
[Непатентный документ 3] Lotz, M. et al., J. Exp. Med. (1988)167, 1253-1258
[Непатентный документ 4] Taga, T. et al., J. Exp. Med. (1987) 166, 967-981
[Непатентный документ 5] Yamasaki, K. et al., Science (1988) 241, 825-828
[Непатентный документ 6] Taga, T. et al., Cell (1989) 58, 573-581
[Непатентный документ 7] Novick, D. et al., Hybridoma (1991) 10, 137-146
[Непатентный документ 8] Huang, Y. W. et al., Hybridoma (1993) 12, 621-630
[Непатентный документ 9] Hirata, Y. et al., J. Immunol. (1989) 143, 2900-2906
[Непатентный документ 10] Finkel, M. S. et al., Science (1992) 257, 387-389
[Непатентный документ 11] Hirota, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92, 4862-4866
[Непатентный документ 12] Gwechenberger, M. et al., Circulation (1999) 99, 546-551
[Непатентный документ 13] Ono, K. et al., Circulation (1998) 98, 149-156
[Непатентный документ 14] Yamauchi-Takihara, K. et al., Circulation (1995) 91, 1520-1524
[Непатентный документ 15] Yue, P. et al., Am. J. Physiol. (1998) 275,H250-H258
[Непатентный документ 16] Negoro, S. et al., Cardiovasc. Res. (2000) 47, 797-805
[Непатентный документ 17] Fuchs M. et al., FASEB J. (2003) 17, 2118-2120
[Патентный документ 1] Международная публикация WO 95/09873
[Патентный документ 2] Французская патентная публикация No. FR 2694767
[Патентный документ 3] Патент США No. 5216128
[Патентный документ 4] Международная публикация WO 92/19759
Описание изобретения
[Проблемы, которые можно решить с помощью изобретения]
До настоящего времени полагали, что IL-6 принимает участие в развитии инфаркта миокарда и в последующем ремоделировании левого желудочка. Однако его конкретная роль не выяснена. Кроме того, не обнаружено, какого типа эффект введения ингибитора IL-6 можно продемонстрировать на инфаркте миокарда и на последующем ремоделировании левого желудочка.
Настоящее изобретение было выполнено в подобной ситуации, и целью настоящего изобретения было разработать средства для лечения инфаркта миокарда, содержащие ингибитор IL-6 в качестве активного ингредиента. Кроме того, настоящее изобретение относится к средствам, способствующим подавлению ремоделирования левого желудочка после инфаркта миокарда, содержащим ингибитор IL-6 в качестве активного ингредиента. Кроме того, к другим целям настоящего изобретения относится разработка способов лечения инфаркта миокарда и способов подавления ремоделирования левого желудочка, последующего за инфарктом миокарда, причем все способы включают стадию введения ингибитора IL-6 субъектам, у которых развился инфаркт миокарда.
[Средства решения проблем]
Для решения описанных выше проблем авторы настоящего изобретения исследовали влияние антител против рецептора IL-6 на улучшение состояния пораженной инфарктом зоны при инфаркте миокарда и на подавление ремоделирования левого желудочка после инфаркта миокарда.
Вначале авторы настоящего изобретения создали модели инфаркта миокарда путем лигирования левой нисходящей передней ветви сосудов у самцов мышей Balb/c. Затем 500 мкг антитела против рецептора IL-6 (MR16-1) вводили внутрибрюшинно мышам-моделям инфаркта миокарда.
В результате повышение активности миелопероксидазы (МРО) в зоне, пораженной инфарктом миокарда, было в значительной степени подавлено. Кроме того, была подавлена экспрессия хемотаксического белка-1 моноцита миокарда (МСР-1) как в зоне инфаркта, так и в области, не пораженной инфарктом, у мышей при введении антитела против рецептора IL-6. Кроме того, эхокардиографические и гистологические проверки обнаружили, что гипертрофия сердца была подавлена у мышей при введении антитела против рецептора IL-6.
Таким образом, вначале авторы настоящего изобретения обнаружили, что путем введения антитела против рецептора IL-6 можно улучшить состояние пораженной инфарктом зоны при инфаркте миокарда и подавить ремоделирование левого желудочка после инфаркта миокарда, и окончательно завершили настоящее изобретение.
Точнее, настоящее изобретение относится:
[1] к средству для лечения инфаркта миокарда, содержащему ингибитор IL-6 в качестве активного ингредиента;
[2] к средству по п. [1], где ингибитор IL-6 представляет собой антитело, которое распознает IL-6;
[3] к средству по п. [1], где ингибитор IL-6 представляет собой антитело, которое распознает рецептор IL-6;
[4] к средству по п. [2] или [3], где антитело представляет собой моноклональное антитело;
[5] к средству по п. [2] или [3], где антитело представляет собой антитело против IL-6 человека или рецептора IL-6 человека;
[6] к средству по п. [2] или [3], где антитело представляет собой рекомбинантное антитело;
[7] к средству по п. [6], где антитело представляет собой химерное антитело, гуманизированное антитело или человеческое антитело;
[8] к средству для подавления ремоделирования левого желудочка после инфаркта миокарда, содержащему ингибитор IL-6 в качестве активного ингредиента;
[9] к средству по п. [8], где ингибитор IL-6 представляет собой антитело, которое распознает IL-6;
[10] к средству по п. [8], где ингибитор IL-6 представляет собой антитело, которое распознает рецептор IL-6;
[11] к средству по п. [9] или [10], где антитело представляет собой моноклональное антитело;
[12] к средству по п. [9] или [10], где антитело представляет собой антитело против IL-6 человека или рецептора IL-6 человека;
[13] к средству по п. [9] или [10], где антитело представляет собой рекомбинантное антитело;
[14] к средству по п. [13], где антитело представляет собой химерное антитело, гуманизированное антитело или человеческое антитело;
[15] к средству по любому из пп. от [8] до [14], которое используют для лечения инфаркта миокарда;
[16] к способу лечения инфаркта миокарда у субъекта, включающему стадию введения ингибитора IL-6 субъекту, у которого развился инфаркт миокарда;
[17] к способу подавления ремоделирования левого желудочка после инфаркта миокарда у субъекта, включающему стадию введения ингибитора IL-6 субъекту, у которого развился инфаркт миокарда;
[18] к способу по п. [16] или [17], где ингибитор IL-6 представляет собой антитело, которое распознает IL-6;
[19] к способу по п. [16] или [17], где ингибитор IL-6 представляет собой антитело, которое распознает рецептор IL-6;
[20] способу по п. [18] или [19], где антитело представляет собой моноклональное антитело;
[21] к способу по п. [18] или [19], где антитело представляет собой антитело против IL-6 человека или рецептора IL-6 человека;
[22] к способу по п. [18] или [19], где антитело представляет собой рекомбинантое антитело;
[23] к способу по п. [22], где антитело представляет собой химерное антитело, гуманизированное антитело или человеческое антитело;
[24] к применению ингибитора IL-6 для получения средства, предназначенного для лечения инфаркта миокарда;
[25] к применению ингибитора IL-6 для получения средства, предназначенного для подавления ремоделирования левого желудочка после инфаркта миокарда;
[26] к применению по п. [24] или [25], где ингибитор IL-6 представляет собой антитело, которое распознает IL-6;
[27] к применению по п. [24] или [25], где ингибитор IL-6 представляет собой антитело, которое распознает рецептор IL-6;
[28] к применению по п. [26] или [27], где антитело представляет собой моноклональное антитело;
[29] к применению по п. [26] или [27], где антитело представляет собой антитело против IL-6 человека или рецептора IL-6 человека;
[30] к применению по п. [26] или [27], где антитело представляет собой рекомбинантное антитело; и
[31] к применению по п. [30], где антитело представляет собой химерное антитело, гуманизированное антитело или человеческое антитело.
Наилучший способ выполнения изобретения
Авторы изобретения обнаружили, что улучшение состояния зоны поражения при инфаркте миокарда и подавление ремоделирования левого желудочка после инфаркта миокарда может быть достигнуто путем введения антитела против рецептора IL-6. Изобретение основано на полученных данных.
Настоящее изобретение относится к средствам для лечения инфаркта миокарда и средствам для подавления ремоделирования левого желудочка после инфаркта миокарда, содержащим ингибитор IL-6 в качестве активного ингредиента.
Употребляемый в описании термин “ингибитор IL-6” относится к веществу, которое блокирует опосредованную IL-6 передачу сигнала и ингибирует биологическую активность IL-6. Предпочтительно, ингибитор IL-6 является веществом, которое проявляет ингибиторную активность против связывания IL-6, рецептора IL-6 или gp130.
Ингибиторы IL-6 согласно изобретению включают в себя, но не ограничиваются ими, например, анти-IL-6-антитела, антитела против рецептора IL-6, анти-gp130-антитела, варианты IL-6, растворимые варианты рецептора IL-6 и неполные пептиды IL-6 или рецепторов IL-6 и низкомолекулярные соединения, которые проявляют подобные активности. Предпочтительные ингибиторы IL-6 согласно изобретению включают в себя антитела, которые распознают рецепторы IL-6.
Источник антитела не очень ограничен в настоящем изобретении; однако предпочтительно, если антитело продуцируется клетками млекопитающих и, более предпочтительно, клетками человека.
Анти-IL-6-антитело, используемое в настоящем изобретении, может быть получено в виде поликлонального или моноклонального антитела известными способами. В частности, моноклональные антитела, продуцируемые клетками млекопитающих, включают в себя антитела, синтезированные гибридомами, и антитела, продуцируемые клетками хозяина, трансформированными экспрессирующим вектором, который включает в себя ген антитела, генно-инженерными методами. Связываясь с IL-6, антитело предотвращает связывание IL-6 с рецептором IL-6 и блокирует передачу биологической активности IL-6 в клетку.
st
Такие антитела включают в себя МН166 (Matsuda, T. et al., Eur. J. Immunol. (1988) 18, 951-956), антитело SK2 (Sato, K. et al., труды 21 Annual Meeting of the Lapanese Society for Immunology (1991) 21, 166) и пр.
В основном гибридомы, продуцирующие анти-IL-6-антитело, могут быть получены известными методами следующим образом. Точнее, такие гибридомы могут быть получены при использовании IL-6 в качестве сенсибилизирующего антигена для осуществления иммунизации обычными методами иммунизации, слияния полученных иммунных клеток с известными родительскими клетками обычным методом слияния клеток и скрининга клеток, производящих моноклональное антитело, обычным методом скрининга.
Точнее, анти-IL-6-антитела могут быть получены следующим образом. Например, IL-6 человека, используемый в качестве сенсибилизирующего антигена для получения антитела, может быть получен при использовании гена IL-6 и/или аминокислотных последовательностей, описанных в публикациях Eur. J. Biochem. (1987) 168, 543-550; J. Immunol. (1988) 140, 1534-1541; и/или Agr. Biol. Chem. (1990) 54, 2685-2688.
После трансформации соответствующей клетки-хозяина известной экспрессирующей векторной системой, введенной с последовательностью гена IL-6, желаемый белок IL-6 очищают известным методом из хозяйской клетки или из культурального супернатанта. Полученный очищенный белок IL-6 может быть использован в качестве сенсибилизирующего антигена. Как вариант, слитый белок, составленный из белка IL-6 и другого белка, может быть использован в качестве сенсибилизирующего антигена.
Антитела против рецептора IL-6, используемые в настоящем изобретении, могут быть получены в виде поликлональных или моноклональных антител известными методами. В частности, антитела против рецептора IL-6, используемые в настоящем изобретении, предпочтительно являются моноклональными антителами, продуцируемыми клетками млекопитающих. Моноклональные антитела, продуцируемые клетками млекопитающих, включают в себя такие антитела, которые получают из гибридом, и такие антитела, которые получают из клеток-хозяев, трансформированных экспрессирующим вектором, содержащим ген антитела, генно-инженерными методами. Путем связывания с рецептором IL-6 антитело предотвращает связывание IL-6 с рецептором IL-6 и блокирует передачу биологической активности IL-6 в клетку.
Такие антитела включают в себя антитело MR16-1 (Tamura, T. еt al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90, 11924-11928); антитело PM-1 (Hirata, Y. et al., J. Immunol. (1989) 143, 2900-2906); антитело AUK12-20, антитело AUK64-7 и антитело AUK146-15 (WO 92/19759), и пр. Среди них антитело РМ-1 может служить примером предпочтительного моноклонального антитела против рецептора IL-6 человека, и антитело MR16-1 - примером предпочтительного моноклонального антитела против рецептора IL-6 мыши.
В сущности, гибридомы, продуцирующие моноклональное антитело против рецептора IL-6, могут быть получены известными методами следующим образом. Точнее, такие гибридомы могут быть получены при использовании рецептора IL-6 в качестве сенсибилизирующего антигена для осуществления иммунизации обычным методом иммунизации, слияния полученных иммунных клеток с известной родительской клеткой обычным методом слияния клеток и скрининга клеток, продуцирующих моноклональное антитело, обычным методом скрининга.
Точнее, антитела против рецептора IL-6 могут быть получены следующим образом. Например, рецептор IL-6 человека или рецептор IL-6 мыши, используемый в качестве сенсибилизирующего антигена для получения антитела, может быть получен при использовании генов рецептора IL-6 и/или аминокислотных последовательностей, описанных в публикации европейской патентной заявки No. EP 325474 и в публикации японской патентной заявки (Kokai) No. (JP-A) Hei 3-155795, соответственно.
Существует два типа белков-рецепторов IL-6, т.е. белок, экспрессируемый на клеточной мембране, и белок, отделенный от клеточной мембраны (растворимый рецептор IL-6) (Yasukawa, K. et al., J. Biochem. (1990) 108, 673-676). Растворимый рецептор IL-6 состоит главным образом из внеклеточной области связанного с клеточной мембраной рецептора IL-6 и отличается от мембраносвязанного рецептора IL-6 тем, что в нем отсутствует трансмембранная область или же как трансмембранная, так и внутриклеточная области. Любой рецептор IL-6 может быть использован в качестве белка-рецептора IL-6, поскольку он может быть использован как сенсибилизирующий антиген для получения антитела против рецептора IL-6, используемого в настоящем изобретении.
После трансформации соответствующей клетки-хозяина известной экспрессирующей векторной системой, введенной с последовательностью гена рецептора IL-6, желаемый белок-рецептор IL-6 очищают известным методом из хозяйской клетки или из культурального супернатанта. Полученный очищенный белок-рецептор IL-6 может быть использован в качестве сенсибилизирующего антигена. В качестве альтернативы, клетка, экспрессирующая рецептор IL-6 или слитый белок, составленный из белка-рецептора IL-6 и другого белка, может быть использована в качестве сенсибилизирующего антигена.
Анти-gp130-антитела, используемые в настоящем изобретении, могут быть получены в виде поликлональных или моноклональных антител известными методами. В частности, анти-gp130-антитела, используемые в настоящем изобретении, предпочтительно являются моноклональными антителами, продуцируемыми клетками млекопитающих. Моноклональные антитела, продуцируемые клетками млекопитающих, включают в себя антитела, полученные из гибридом, и антитела, полученные из клеток-хозяев, трансформированных экспрессирующим вектором, который содержит ген антитела, генно-инженерными методами. Путем связывания с gp130 антитело предотвращает связывание gp130 с комплексом IL-6/рецептор IL-6 и блокирует передачу биологической активности IL-6 в клетку.
Такие антитела включают в себя антитело АМ64 (JP-A Hei 3-219894); антитело 4B11 и антитело 2Н4 (патент США 5571513); антитело B-S12 и антитело В-Р8 (JP-A Hei 8-291199) и пр.
В сущности, гибридомы, продуцирующие моноклональное анти-gp130-антитело, могут быть получены известными методами следующим образом. Точнее, такие гибридомы могут быть получены при использовании gp130 в качестве сенсибилизирующего антигена для осуществления иммунизации обычным методом иммунизации, слияния полученных иммунных клеток с известной родительской клеткой обычным методом слияния клеток и скрининга продуцирующих моноклональное антитело клеток обычным методом скрининга.
Точнее, моноклональное антитело может быть получено следующим образом. Например, gp130, используемый в качестве сенсибилизирующего антигена для получения антитела, может быть получен при использовании гена gp130 и/или аминокислотной последовательности, описанной в публикации европейской патентной заявки No. EP 411946.
После трансформации соответствующей клетки-хозяина известной экспрессирующей векторной системой, введенной с последовательностью гена gp130, желаемый белок gp130 очищают известным методом из хозяйской клетки или из культурального супернатанта. Полученный очищенный белок gp130 может быть использован в качестве сенсибилизирующего антигена. В качестве альтернативы, клетка, экспрессирующая gp130 или слитый белок, составленный из белка gp130 и другого белка, может быть использована в качестве сенсибилизирующего антигена.
Виды млекопитающих, которые подвергают иммунизации сенсибилизирующим антигеном, не очень ограничены, но предпочтительно их выбирают с учетом совместимости с родительской клеткой, используемой для слияния клеток. Как правило, используют грызунов, таких как мыши, крысы и хомяки.
Иммунизацию животных сенсибилизирующим антигеном осуществляют известными методами. Например, в качестве обычного метода, иммунизацию выполняют путем инъекции млекопитающим сенсибилизирующего антигена внутрибрюшинно или подкожно. В частности, сенсибилизирующий антиген предпочтительно разбавляют или суспендируют в соответствующем количестве забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS), физиологического раствора или подобного раствора, смешивают с соответствующим количеством обычного адъюванта (например, полного адъюванта Фрейнда), эмульгируют и затем вводят млекопитающему несколько раз каждые 4-21 день. Кроме того, соответствующий носитель может быть использован для иммунизации сенсибилизирующим антигеном.
После такой иммунизации в сыворотке достигается повышенный уровень желаемого антитела, и затем иммунные клетки получают от млекопитающего для выполнения методики по слиянию клеток. Предпочтительные иммунные клетки, предназначенные для слияния клеток, включают в себя, в частности, клетки селезенки.
Относительно клеток миеломы млекопитающих, которые могут быть использованы в качестве родительской клетки, т.е. клетки-партнера, которую подвергают слиянию с описанными выше иммунными клетками, различные известные штаммы клеток, например, P3X63Ag8.653 (Kearney, J.F. et al., J. Immunol. (1979) 123, 1548-1550), P3X63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7), NS-1 (Kohler, G. and Milstein, C., Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511-519), MPC-11 (Margulies, D. H. et al., Cell (1976) 8, 405-415), SP2/0 Shulman, M. et al., Nature (1978) 276, 269-270), F0 (de St. Groth, S.F. et al., J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21), S194 (Trowbridge, I.S., J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323), R210 (Galfre, G. et al., Nature (1979) 277, 131-133), и пр. используют соответствующим образом.
В сущности, слияние описанной выше иммунной клетки и клетки миеломы может быть осуществлено известными методами, например, методом Milstein et al. (Kohler, G. and Milstein, C., Methods Emzymol. (1981) 73, 3-46), и подобным методом.
Точнее говоря, слияния клеток, описанного выше, достигают в обычной питательной культуральной среде в присутствии усиливающего слияние клеток средства. Например, полиэтиленгликоль (PEG), вирус Sendai (HVJ) и тому подобное используют в качестве усилителя слияния клеток. Для повышения эффективности слияния могут быть добавлены также вспомогательные средства, такие как диметилсульфоксид.
Отношение используемых иммунных клеток и клеток миеломы предпочтительно составляет, например, от 1 до 10 иммунных клеток на каждую клетку миеломы. Культуральная среда, используемая для описанного выше слияния клеток, представляет собой, например, культуральную среду RPMI1640 или MEM, которая подходит для пролиферации описанных выше миеломных клеток. Обычная культуральная среда, используемая для культивирования данного типа клеток, также может быть использована. Кроме того, добавки сыворотки, такой как фетальная телячья сыворотка (FCS), могут быть использованы в комбинации.
Что касается слияния клеток, представляющие интерес слитые клетки (гибридомы) образуются путем смешивания предопределенных количеств описанной выше иммунной клетки и миеломной клетки в указанной выше культуральной среде, и затем путем добавления и смешивания с раствором PEG в концентрации от 30 до 60% (масс./об.) (например, раствор PEG со средней молекулярной массой приблизительно от 1000 до 6000), предварительно нагретого приблизительно до 37°С. Затем, средства, усиливающие слияние клеток, и тому подобные, которые не желательны для роста гибридом, могут быть удалены путем повторения стадий последовательного добавления соответствующей культуральной среды и удаления супернатанта центрифугированием.
Описанные выше гибридомы подвергают отбору путем культивирования клеток в обычной избирательной культуральной среде, например, культуральной среде НАТ (культуральная среда, содержащая гипоксантин, аминоптерин и тимидин). Культивирование в культуральной среде НАТ продолжается в течение достаточного периода, обычно в течение от нескольких дней до нескольких недель, чтобы уничтожить клетки, отличные от представляющих интерес гибридом (не слитые клетки). Затем осуществляют метод серийных разведений для скрининга и клонирования гибридом, продуцирующих представляющее интерес антитело.
in vitro
Кроме метода иммунизации животного, отличного от человека, антигеном для получения описанных выше гибридом, желаемое человеческое антитело, которое проявляет способность к связыванию с желаемым антигеном или антиген-экспрессирующей клеткой, может быть получено путем сенсибилизации лимфоцита человека желаемым белком-антигеном или антиген-экспрессирующей клеткой и слияния сенсибилизированного В-лимфоцита с миеломной клеткой человека (например, U266) (см. публикацию японской патентной заявки (Kokoku) No. (JP-B) Hei 1-59878 (рассмотренная одобренная японская патентная заявка, опубликованная для опротестования). Кроме того, желаемое человеческое антитело может быть получено путем введения антигена или антиген-экспрессирующей клетки трансгенному животному, которое имеет набор генов антитела человека, и затем путем осуществления описанного выше метода (см. международные патентные заявки No. WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096 и WO 96/33735).
Полученные таким образом гибридомы, которые продуцируют моноклональные антитела, могут быть подвергнуты субкультивированию в обычной культуральной среде, и их можно хранить в жидком азоте в течение длительного периода.
Для получения моноклональных антител из описанных выше гибридом можно использовать следующие способы: (1) способ, в котором гибридомы культивируют обычными методами, и антитела получают в виде культурального супернатанта; (2) способ, в котором гибридомы быстро размножаются путем введения их совместимому с ними млекопитающему, и антитела получают в виде асцита; и так далее. Первый способ является предпочтительным для получения антител высокой чистоты, а последний способ является предпочтительным для продуцирования антител в большом масштабе.
Например, получение гибридом, продуцирующих антитело против рецептора IL-6, может быть осуществлено способом, описанным в японской патентной заявке JP-A Hei 3-139293. Получение может быть осуществлено способом, включающим в себя инъекцию гибридомы, продуцирующей антитело РМ-1, в абдоминальную полость мыши линии BALB/c, получение асцита и затем очистку антитела РМ-1 из асцита, или способом, включающим в себя культивирование гибридомы в соответствующей среде (например, среде RPMI1640, содержащей 10% фетальной коровьей сыворотки и 5% ВМ-Condimed H1 (Boehringer Mannheim); среде SFM для гибридом (GIBCO-BRL); среде PFHM-II (GIBCO-BRL) и т.д.) и затем получение антитела РМ-1 из культурального супернатанта.
Рекомбинантное антитело может быть использовано в качестве моноклонального антитела согласно изобретению, где антитело получают методом генетической рекомбинации путем клонирования гена антитела из гибридомы, внесения гена в соответствующий вектор и затем внесения вектора в организм хозяина (см. например, публикацию Borrebaeck, C.A.K. and Larrick, J.W., THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, опубликованную в Великобритании издательством MACMILLAN PUBLISHERS LTD., 1990).
Точнее, мРНК (mRNA), кодирующую вариабельную (V) область антитела, выделяют из клетки, которая продуцирует представляющее интерес антитело, такой как гибридома. Выделение мРНК может быть осуществлено путем получения тотальной РНК известными методами, такими как метод ультрацентрифугирования с использованием гуанидина (Chirgwin, J.M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299) и метод AGPC (Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159), и получения мРНК с использованием набора для очистки мРНК (Pharmacia) и подобными методами. В качестве альтернативы, мРНК может быть непосредственно получена при использовании набора для очистки QuickPrep мРНК (Pharmacia).
Echerichia coli
кДНК V-области антитела синтезируют из полученной мРНК, используя обратную транскриптазу. Синтез кДНК может быть достигнут при использовании набора для синтеза первой нити кДНК, содержащего обратную транскриптазу AMV (AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit), и так далее. Кроме того, для синтеза и амплификации кДНК может быть использован 5′-RACE-метод (Frohman, M.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 8998-9002; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932) с помощью набора 5′-Ampli FINDER RACE (Clontech) и ПЦР (PCR). Представляющий интерес фрагмент ДНК очищают из полученных продуктов ПЦР и затем “сшивают” с вектором ДНК. Затем рекомбинантный вектор получают при использовании описанной выше ДНК и вносят в  или подобную бактерию, и колонии отбирают для получения желаемого рекомбинантного вектора. Нуклеотидная последовательность желаемой ДНК может быть подтверждена, например, дидезокси-методом.
После получения ДНК, кодирующей V-область представляющего интерес антитела, ее сшивают с ДНК, которая кодирует константную область (C-область) желаемого антитела, и вводят в экспрессирующий вектор. В качестве альтернативы, ДНК, кодирующая V-область антитела, может быть введена в экспрессирующий вектор, содержащий ДНК, кодирующую С-области антитела.
Для получения антитела, которое предполагают использовать в настоящем изобретении, как описано ниже, ген антитела вводят в экспрессирующий вектор таким образом, что он экспрессируется под контролем регулирующей экспрессию области, например энхансера и промотора. Затем антитело может быть экспрессировано посредством трансформации клетки-хозяина данным экспрессирующим вектором.
В настоящем изобретении для снижения гетерологичной антигенности против человека и тому подобного могут быть использованы искусственно модифицированные рекомбинантные антитела, например химерные антитела, гуманизированные антитела или человеческие антитела. Указанные модифицированные антитела могут быть получены известными методами.
Химерное антитело может быть получено путем лигирования ДНК, кодирующей V-область антитела, полученной, как описано выше, с ДНК, кодирующей С-область антитела человека, введения ДНК в экспрессирующий вектор и внесения вектора хозяину для продуцирования антитела (см. публикацию европейской патентной заявки No. EP 125023; публикацию международной патентной заявки No. WO 92/19759). Данный известный метод может быть использован для получения химерных антител, используемых в настоящем изобретении.
Гуманизированные антитела также называют реконструированными человеческими антителами, и они представляют собой антитела, где гипервариабельные участки (CDR) антитела млекопитающего, отличного от человека (например, антитела мыши), переносят в CDR антитела человека. Общие способы данной рекомбинации генов также известны (см. публикацию европейской патентной заявки No. EP 125023, публикацию международной патентной заявки No. WO 92/19759).
Конкретнее, последовательность ДНК, сконструированную таким образом, что CDR антитела мыши сшивают с каркасными областями (FR) антитела человека, синтезируют посредством PCR из нескольких олигонуклеотидов, которые должны быть синтезированы с таким расчетом, чтобы содержать перекрывающиеся части на их концах. Полученную ДНК сшивают с ДНК, кодирующей С-область антитела человека, и затем вносят в экспрессирующий вектор. Экспрессирующий вектор вносят в клетки хозяина для продуцирования гуманизированного антитела (см. публикацию европейской патентной заявки No. EP 125023, публикацию международной патентной заявки No. WO 92/19759).
FR антитела человека, которые подвергают сшиванию через CDR, выбирают с таким расчетом, что CDR образуют подходящий антигенсвязывающий участок. Аминокислота(ы) в FR вариабельных областей антитела может быть заменена при необходимости так, что CDR реконструированного антитела человека образуют соответствующий антигенсвязывающий участок (Sato, K. et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856).
С-области антитела человека используют для получения химерных и гуманизированных антител, и они включают в себя Сγ. Например, могут быть использованы Сγ1, Сγ2, Сγ3 или Сγ4. Кроме того, для улучшения стабильности антитела или его продуцирования, С-области антитела человека могут быть модифицированы.
Химерные антитела состоят из вариабельной области антитела, продуцируемого млекопитающими, отличными от человека, и продуцируемого из С-области человеческого антитела; и гуманизированные антитела состоят из CDR антитела, продуцируемого млекопитающими, отличными от человека, и каркасных областей и С-областей, полученных из антитела человека. Оба имеют пониженную антигенность в организме человека, и поэтому они являются пригодными в качестве антител для использования в настоящем изобретении.
Предпочтительные отдельные примеры гуманизированных антител, используемых в настоящем изобретении, включают в себя гуманизированное антитело РМ-1 (см. публикацию международной патентной заявки WO 92/19759).
Кроме того, в дополнение к описанному методу получения человеческого антитела, способы получения человеческих антител “пэннинг”-методом с использованием библиотеки антител человека также известны. Например, возможно экспрессировать вариабельные области антител человека на поверхности фагов в виде одноцепочечных антител (scFv) методом фагового дисплея, и затем выбрать антигенсвязывающие фаги. Путем анализа генов выбранных фагов можно определить последовательности ДНК, кодирующие вариабельные области антитела человека, которые связываются с антигеном. Как только последовательность scFv ДНК, связывающаяся с антигеном, найдена, соответствующий содержащий указанную последовательность экспрессирующий вектор может быть сконструирован для получения антитела человека. Указанные методы уже известны, и публикации WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438 и WO 95/15388 могут быть использованы в качестве ссылки.
Описанный выше сконструированный ген антитела может быть подвергнут экспрессии обычными методами. В случае, когда используют клетку млекопитающего, ген антитела может быть экспрессирован при использовании ДНК, в которой ген антитела, который должен быть экспрессирован, функционально сшит с обычно используемым промотором и сигнальной областью полиаденилирования в прямом направлении гена антитела или вектором, содержащим ДНК. Примеры системы промотор/энхансер включают в себя предранний промотор/энхансер цитомегаловируса человека.
Кроме того, другие промоторы/энхансеры, которые могут быть использованы для экспрессии антитела, которое предполагается использовать в настоящем изобретении, включают в себя вирусные промоторы/энхансеры из ретровируса, вируса полиомы, аденовируса, обезьяньего вируса SV40 и подобных вирусов; и продуцируемые клеткой млекопитающего промоторы/энхансеры, такие как фактор элонгации 1α человека (HEF1α).
Так, например, когда используют промотор/энхансер вируса SV40, экспрессия может быть легко осуществлена способом Mulligan et al. (Mulligan, R.C. et al., Nature (1979) 277, 108-114). В качестве альтернативы, в случае промотора/энхансера HEF1α, может быть использован способ Mizushima et al. (Mizushima, S. and Nagata S., Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322).
E. coli
В случае использования  ген антитела может быть экспрессирован с помощью функционального сшивания обычно используемого промотора, сигнальной последовательности для секреции антитела и гена антитела, который должен быть экспрессирован. Примеры промотора включают в себя промотор lacZ, промотор araB и пр. В случае использования промотора lacZ экспрессия может быть осуществлена методом Ward et al. (Ward, E.S. et al., Nature (1989) 341, 544-546; Ward, E.S. et al., FASEB J. (1992) 6, 2422-2427); и промотор araB может быть использован методом Better et al. (Better, M. et al., Science (1988) 240, 1041-1043).
E. Coli
В случае, когда антитело продуцируется в периплазме , сигнальная последовательность pel B (Lei, S.P. et al., J. Bacteriol. (1987) 169, 4379-4383) может быть использована в качестве сигнальной последовательности для секреции антитела. Антитело, продуцируемое в периплазме, выделяют и затем используют после соответствующего “рефолдинга” структуры антитела (см. WO 96/30394).
E. Coli
В качестве сайта инициации репликации используют такие, которые получены из SV40, вируса полиомы, аденовируса, вируса папилломы крупного рогатого скота (BVR) и пр. Кроме того, для увеличения числа копий гена в системе клетка-хозяин экспрессирующий вектор может содержать ген аминогликозидфосфотрансферазы (АРН), ген тимидинкиназы (ТК), ген ксантин-гуанинфосфорибозилтрансферазы  (Ecogpt), ген дигидрофолатредуктазы (dhfr) или подобный ген в качестве селективного маркера.
in vitro
in vivo
In vitro
Любая продуцирующая система может быть использована для получения антител, которые надлежит использовать в настоящем изобретении. Продуцирующие системы для получения антител включают и  продуцирующие системы. продуцирующие системы включают в себя системы, утилизирующие клетки эукариот или клетки прокариот.
Xenopus;
Nicotiana tabacum,
Saccharomyces (
S. cerevisiae)
Aspergillus (
A. Niger
Продуцирующие системы, в которых используются клетки эукариот, включают в себя системы с использованием клеток животных, клеток растений или клеток грибов. Такие животные клетки включают в себя (1) клетки млекопитающих, например СНО, COS, миеломы, печени хомячков (ВНК), HeLa, Vero и пр.; (2) клетки амфибий, например ооцит  и (3) клетки насекомых, например sf9, sf21, Tn5 и пр. Известные растительные клетки включают в себя клетки, полученные из которые могут быть культивированы в виде каллюса. Известные клетки грибов включают в себя дрожжи, такие как например, , плесневые грибы, такие как например, ) и пр.
E. coli
Bacillus subtilis.
Продуцирующие системы, в которых используются клетки прокариот, включают в себя системы с использованием бактериальных клеток. Известные бактериальные клетки включают в себя и
in vitro.
in vivo.
Антитела могут быть получены путем внесения представляющего интерес гена антитела в эти клетки посредством трансформации и культивирования трансформированных клеток  Культивирование осуществляют известными методами. Например, DMEM, MEM, RPMI1640, IMDM могут быть использованы в качестве культуральной среды, и добавки сыворотки, такой как FCS, могут быть использованы в комбинации. Кроме того, клетка с внесенным геном антитела может быть перенесена в абдоминальную или пр. полость животного для продуцирования антитела
in vivo
С другой стороны, продуцирующие системы  включают в себя системы, в которых используются животные или растения. Продуцирующие системы с использованием животных включают в себя системы, в которых используются млекопитающие или насекомые.
Млекопитающие, которые могут быть использованы, включают в себя коз, свиней, овец, мышей, крупный рогатый скот и пр. (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Application, 1993). Насекомые, которые могут быть использованы, включают в себя также тутовый шелкопряд. В случае использования растений применяют, например, табак.
Ген антитела вносят в указанное животное или растение, и антитело продуцируется в организме животных или в растениях и затем извлекается. Например, ген антитела получают как слитый ген путем введения гена в середину гена, кодирующего белок, такой как β-казеин козы, который единственно продуцируется в молоке. Фрагмент ДНК, содержащий слитый ген, в который встроен ген антитела, инъецируют в козий эмбрион, и такой эмбрион переносят в организм самки козы. Желаемое антитело получают из молока, вырабатываемого трансгенным животным, родившимся от козы, которой подсадили эмбрион, или вырабатываемого потомством животного. Для повышения количества молока, содержащего желаемое антитело, вырабатываемое трансгенным животным, для трансгенной козы могут соответствующим образом быть использованы гормоны (Ebert, K.M. et al., Bio/Technology (1994) 12, 699-702).
Agrobacterium tumefaciens.
Nicotiana tabacum)
Кроме того, при использовании шелкопряда его инфицируют бакуловирусом, введенным с геном желаемого антитела, и желаемое антитело получают из жидкости организма этого шелкопряда (Maeda, S. et al., Nature (1985) 315, 592-594). Кроме того, когда используют табак, ген желаемого антитела вводят в экспрессирующий вектор растения (например, pMON530), и вектор вносят в бактерию, такую как  Указанную бактерию используют для инфицирования табака (например, , чтобы получить желаемое антитело из листьев этого табака (Julian, K.-C. Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-138).
in vitro
in vivo
В случае, когда антитело продуцируется в продуцирующих системахили, как описано выше, ДНК, кодирующие тяжелую цепь (Н-цепь) и легкую цепь (L-цепь) антитела, могут быть встроены в отдельные экспрессирующие векторы, с последующей одновременной трансформацией хозяина векторами. В качестве альтернативы, ДНК могут быть встроены в единственный экспрессирующий вектор для трансформации хозяина (см. публикацию международной патентной заявки No. WO 94/11523).
Антитела, используемые в изобретении, могут представлять собой фрагменты антител или их модифицированные продукты в тех случаях, когда они могут быть подходящим образом использованы в настоящем изобретении. Например, фрагменты антитела включают в себя Fab, F(ab′)2, Fv и одноцепочечный фрагмент Fv (scFv), в котором Fv H- и L-цепей связаны через соответствующий линкер.
Точнее, фрагменты антитела продуцируются при обработке антитела ферментом, например, папаином или пепсином, или, в качестве альтернативы, гены, кодирующие указанные фрагменты, конструируют, вносят в экспрессирующие векторы, которые экспрессируются в соответствующей клетке хозяина (см. например, Сo, M.S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Better, M. & Horwitz, A.H., Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496; Plueckthun, A. & Skerra, A., Methods in Enzymology (1989) 178, 497-515; Lamoyi, E., Methods in Enzymology (1989) 121, 652-663; Rousseaux, J. et al., Methods in Enzymology (1989) 121, 663-666; Bird, R.E. et al., TIBTECH (1991) 9, 132-137).
Фрагмент scFv может быть получен путем связывания Н-цепи V-области и L-цепи V-области антитела. Во фрагменте scFv, Н-цепь V-области и L-цепь V-области связаны через линкер, предпочтительно через пептидный линкер (Huston, J.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 5879-5883). V-области H- и L-цепей в scFv могут быть получены из любого из антител, описанных выше. Пептидные линкеры для связывания V-областей включают в себя, например, произвольный одноцепочечный пептид, состоящий из 12-19 аминокислотных остатков.
ДНК, кодирующая scFv, может быть получена с использованием ДНК, кодирующей Н-цепь или ее V-область, и ДНК, кодирующей L-цепь или ее V-область описанных выше антител, в качестве матрицы, амплификации методом ПЦР части ДНК, которая кодирует желаемую аминокислотную последовательность в матричной последовательности в присутствии праймеров, обозначающих концы части, и последующей амплификации амплифицированной части ДНК с ДНК, кодирующей часть пептидного линкера, и пары праймеров, которые связывают оба конца линкера с Н-цепью и L-цепью.
Кроме того, после получения ДНК, кодирующей scFv, экспрессирующий вектор, содержащий ДНК, и хозяина, трансфоримированного вектором, можно получить обычными методами. Кроме того, scFv может быть получен обычными методами с использованием хозяина.
Аналогично описанным выше способам, указанные фрагменты антител могут быть продуцированы хозяином путем получения и экспрессии их генов. Употребляемый в описании термин “антитела” охватывает указанные фрагменты антител.
В качестве модифицированного антитела может быть использовано антитело, связанное с различными молекулами, такими как полиэтиленгликоль (ПЭГ) (PEG). Употребляемый в описании термин “антитело” охватывает указанные модифицированные антитела. Данные модифицированные антитела могут быть получены путем химической модификации полученных антител. Такие методы уже созданы в данной области.
Описанные выше продуцированные и экспрессированные антитела могут быть выделены из внутренней или внешней части клетки или из организма хозяина и очищены до гомогенного состояния. Выделение и/или очистка антител, используемых в настоящем изобретении, может быть осуществлена путем аффинной хроматографии. Колонки, которые можно использовать для аффинной хроматографии, включают в себя, например, колонку с протеином А и колонку с протеином G. Носители, используемые для колонки с протеином А, включают в себя, например, HyperD, POROS, SepharoseF.F и пр. Кроме указанных выше методов, другие методы, используемые для выделения и/или очистки простых белков, могут быть использованы без каких-либо ограничений.
В качестве примера, антитела, используемые в настоящем изобретении, могут быть выделены и/или очищены путем соответствующего выбора и комбинирования методов хроматографии, кроме аффинной хроматографии, фильтрации, ультрафильтрации, высаливания, диализа и пр. Хроматографии включают в себя, например, ионообменную хроматографию, гидрофобную хроматографию, гель-фильтрацию и пр. Указанные типы хроматографий могут быть использованы в высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ, HPLC). В качестве альтернативы может быть использована ВЭЖХ с обращенной фазой.
Концентрацию антител, получение которых описано выше, можно определить путем измерения абсорбции, методом ELISA или тому подобное. Точнее, абсорбцию определяют путем разбавления соответствующим образом раствора антител PBS(-), измерения абсорбции при 280 нм и расчета концентрации (1,35 OD = 1 мг/мл). В качестве альтернативы, когда используют метод ELISA, измерение можно осуществлять следующим образом. Точнее, 100 мкл козьего антитела против человеческого IgG (TAG), разведенного до концентрации 1 мкг/мл 0,1 М бикарбонатным буфером (рН 9,6), помещают в 96-луночный планшет (Nunc) и инкубируют в течение ночи при 4°С для иммобилизации антитела. После блокировки, 100 мкл соответствующим образом разведенного антитела согласно изобретению или соответствующим образом разведенного образца, содержащего антитело, и IgG человека (CAPPEL) добавляют в качестве стандарта и инкубируют в течение одного часа при комнатной температуре.
После промывки 100 мкл 5000× разведенного анти-IgG человека, меченного щелочной фосфатазой (BIO SOURCE), добавляют и инкубируют в течение одного часа при комнатной температуре. После другой промывки добавляют раствор субстрата и инкубируют, и измеряют абсорбцию при 405 нм, используя аппарат для считывания микропланшетов, модель 3550 (Bio-Rad), для расчета концентрации представляющего интерес антитела.
Варианты IL-6, используемые в настоящем изобретении, представляют собой вещества, которые проявляют способность к связыванию с рецептором IL-6 и которые не передают биологическую активность IL-6. То есть, варианты IL-6 конкурируют с IL-6 за связывание с рецепторами IL-6, но не передают биологическую активность IL-6, следовательно, блокируют передачу сигнала, опосредованную IL-6.
Варианты IL-6 продуцируются путем введения мутации(й) через замену аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности IL-6. Источник IL-6, используемого в качестве основы вариантов IL-6, не ограничен; однако предпочтительным является IL-6 человека, если учесть его антигенность и пр.
Конкретнее, замену аминокислоты осуществляют путем прогнозирования вторичной структуры аминокислотной последовательности IL-6, используя известные программы моделирования молекул (например, WHATIF; Vriend et al., J. Mol. Graphics (1990) 8, 52-56), и последующей оценки влияния замененного аминокислотного остатка(ов) целой молекулой. После выявления соответствующего аминокислотного остатка, который подвергается замене, осуществляют общепринятые методы ПЦР, используя нуклеотидную последовательность, кодирующую ген IL-6 человека в качестве матрицы, для введения мутаций таким образом, что аминокислоты заменяются и, тем самым, получают ген, кодирующий вариант IL-6. При необходимости, данный ген вносят в соответствующий экспрессирующий вектор, и вариант IL-6 можно получить при использовании описанных выше способов экспрессии, продуцирования и очистки рекомбинантных антител.
Отдельные примеры вариантов IL-6 описаны в публикациях Brakenhoff et al., J. Biol. Chem. (1994) 269, 86-93, Savino et al., EMBO J. (1994) 13, 1357-1367, WO 96/18648 и WO 96/17869.
Неполные пептиды IL-6 и неполные пептиды рецепторов IL-6, которые предполагается использовать в настоящем изобретении, представляют собой вещества, которые проявляют способность к связыванию с рецепторами IL-6 и IL-6, соответственно, и которые не переносят биологическую активность IL-6. А именно, при связывании и захвате рецептора IL-6 или IL-6, неполный пептид IL-6 или неполный пептид рецептора IL-6 специфическим образом предотвращает связывание IL-6 с рецептором IL-6. В результате биологическая активность IL-6 не передается, и, следовательно, опосредованная IL-6 передача сигнала блокируется.
Неполные пептиды IL-6 или рецептора IL-6 представляют собой пептиды, содержащие частично или полностью аминокислотную последовательность области IL-6 или аминокислотную последовательность рецептора IL-6, которая вовлекается в связывание IL-6 и рецептора IL-6. Обычно такие пептиды содержат от 10 до 80, предпочтительно, от 20 до 50, более предпочтительно, от 20 до 40 аминокислотных остатков.
Неполные пептиды IL-6 или неполные пептиды рецептора IL-6 могут быть получены общеизвестными методами, например, генно-инженерными методами или с помощью пептидного синтеза, путем определения области IL-6 или аминокислотной последовательности рецептора IL-6, которая вовлекается в связывание IL-6 и рецептора IL-6, и использования частичной или полной аминокислотной последовательности определенной области.
При получении неполного пептида IL-6 или неполного пептида рецептора IL-6 генно-инженерным методом последовательность ДНК, кодирующую желаемый пептид, встраивают в экспрессирующий вектор, и затем пептид может быть получен описанными выше способами для экспрессии, продуцирования и очистки рекомбинантных антител.
Для получения неполного пептида IL-6 или неполного пептида рецептора IL-6 посредством пептидного синтеза, могут быть использованы общепринятые способы синтеза, например, способы твердофазного синтеза или способы синтеза в жидкой фазе.
Точнее, синтез может быть осуществлен следующим способом, описанным в публикации “Continuation of Development of Pharmaceuticals, Vol. 14, Peptide Synthesis (in Japanese) (ed. Haruaki Yajima, 1991, Hirokawa Shoten)”. В качестве способа твердофазного синтеза может быть использован, например, следующий способ: аминокислоту, соответствующую С-концу синтезируемого пептида, связывают с носителем, который не растворяется в органических растворителях, затем удлиняют пептидную цепь путем поочередного повторения (1) реакции конденсации аминокислот, у которых α-аминогруппы и функциональные группы разветвленной цепи защищают соответствующими защитными группами поочередно, в направлении от С-конца к N-концу; и (2) реакции удаления защитных групп от α-аминогрупп связанной со смолой аминокислоты или пептида. Твердофазный пептидный синтез классифицируется на Вос-метод и Fmoc-метод на основании типа используемой защитной группы.
После осуществления синтеза представляющего интерес белка, как описано выше, проводят реакцию снятия защиты и отщепления пептидной цепи от носителя. Для осуществления реакции отщепления пептидной цепи в основном используют фтористый водород или трифторметансульфокислоту для Вос-метода и ТФУ - для Fmoc-метода. Согласно Вос-методу, например, описанную выше смолу с защищенным пептидом обрабатывают фтористым водородом в присутствии анизола. Затем пептид извлекают путем удаления защитной группы и отщепления пептида от носителя. Неочищенный пептид может быть получен путем лиофилизации извлеченного пептида. С другой стороны, в Fmoc-методе, например, реакцию снятия защиты и реакцию отщепления пептидной цепи от носителя можно проводить в ТФУ подобным описанному выше способом.
Полученный неочищенный пептид может быть выделен и/или очищен путем ВЭЖХ. Элюцию можно проводить в оптимальных условиях, используя систему растворителей вода-ацетонитрил, которую обычно используют для очистки белков. Фракции, соответствующие пикам полученного хроматографического профиля, собирают и лиофилизируют. Таким образом, очищенные пептидные фракции идентифицируют по молекулярной массе посредством масс-спектрального анализа, анализа аминокислотного состава, анализа аминокислотной последовательности или пр.
Отдельные примеры неполных пептидов IL-6 или неполных пептидов рецептора IL-6 описаны в патентах JP-A Hei 2-188600, JP-A Hei 7-324097, JP-A Hei 8-311098 и публикации патентной заявки США No. US 5210075.
Антитела, используемые в настоящем изобретении, также могут быть конъюгированными с антителами, которые связаны с различными молекулами, такими как полиэтиленгликоль (ПЭГ), радиоактивными веществами и токсинами. Такие конъюгированные антитела могут быть получены путем химической модификации полученных антител. Способы модификации антител уже установлены в данной области. “Антитела” согласно настоящему изобретению охватывают указанные конъюгированные антитела.
Средства для лечения инфаркта миокарда и средства для подавления ремоделирования левого желудочка после инфаркта миокарда в настоящем изобретении могут быть использованы для терапии инфаркта миокарда.
Употребляемый в описании термин “лечение инфаркта миокарда” означает подавление или предотвращение симптомов инфаркта миокарда и сердечной недостаточности и вызванной ишемией тяжелой аритмии, которые представляют собой осложнения инфаркта миокарда.
Симптомы, осложняющие инфаркт миокарда, включают в себя аритмию (экстрасистола, фибрилляция желудочков и атриовентрикулярная блокада), сердечную недостаточность, разрыв папиллярной мышцы, разрыв сердца, аневризму желудочка (которая образуется в верхушке сердца в результате инфаркта в передней нисходящей ветви левой венечной артерии) и постинфарктный синдром. “Средства для лечения инфаркта миокарда” согласно настоящему изобретению могут подавлять или предотвращать симптомы, описанные выше.
В то же время употребляемый в описании термин “подавление ремоделирования левого желудочка после инфаркта миокарда” означает подавление или предотвращение миокардиальной гипертрофии (расширение целого левого желудочка), возникающей, чтобы компенсировать ухудшение функции пораженной инфарктом зоны.
Гипертрофия миокарда возникает, когда клетки мышцы сердца в зонах, пораженных инфарктом, замещаются фиброзной тканью, такой как коллагеновые волокна, в результате некроза и/или эксфолиации клеток, и фиброзная ткань понемногу разрастается. Таким образом, подавление и предотвращение “замещения зоны инфаркта коллагеновыми волокнами” и “разрастания фиброзной ткани”, т.е. улучшение состояния зоны поражения сердца, также включено в значение “подавление ремоделирования левого желудочка после инфаркта миокарда”, описанное выше.
Подавляются ли симптомы инфаркта миокарда и ремоделирования левого желудочка после инфаркта миокарда или не подавляются, можно определить по активности миелопероксидазы (МРО) в зонах сердечной мышцы, пораженных и не пораженных инфарктом, в качестве индикатора. МРО является ферментом, присутствующим во внутриклеточных гранулах нейтрофилов, и его активность, как известно, значительно увеличивается при заболеваниях венечных артерий. Активность МРО повышается, по мере того как зоны инфаркта распространяются, и ухудшается их состояние (некроз и пр.). То есть когда активность МРО подавляется при введении средства согласно настоящему изобретению, можно считать, что симптомы инфаркта миокарда и ремоделирования левого желудочка после инфаркта миокарда подавляются. Активность МРО можно определять известными методами, которые включают в себя, например, методы измерения, описанные в примерах.
Альтернативно, подавляются ли симптомы инфаркта миокарда и ремоделирования левого желудочка после инфаркта миокарда или не подавляются, можно определить по экспрессии МСР-1 (хемоаттрактантный белок-1 моноцитов) как индикатора в пораженных и не пораженных инфарктом зонах сердечной мышцы. МСР-1 является хемокином, который может вызвать сердечную недостаточность, способствуя притоку макрофагов к сердечной мышце и усиливая экспрессию воспалительных цитокинов. Известно, что МСР-1 активирует воспаление и вызывает фиброз сердечной мышцы и околососудистых тканей. Распространение и/или ухудшение (некроз и пр.) состояния пораженной инфарктом зоны повышает экспрессию МСР-1. Точнее, можно считать, что когда экспрессия МСР-1 подавляется, симптомы инфаркта миокарда и ремоделирования левого желудочка после инфаркта миокарда подавляются. Экспрессию МСР-1 можно измерить известными методами, используемыми для измерения белковой экспрессии, включая, например, вестерн-блоттинг и метод ELISA.
Фразы “подавление активности МРО” и “подавление экспрессии МСР-1” также означают “улучшение состояния зоны инфаркта”, как описано выше.
Кроме того, подавление симптомов инфаркта миокарда и ремоделирования левого желудочка после инфаркта миокарда можно определить по измерению конечно-диастолического размера и фракции выброса левого желудочка посредством эхокардиографии или путем количественной оценки степени фиброза миокарда и гипертрофии кардиомиоцитов при гистологической проверке тканей сердца. Такие измерения можно осуществлять известными методами. Такие методы включают в себя, например, описанные в примерах методы.
3
125
125
В настоящем изобретении способность ингибиторов IL-6 тормозить передачу сигнала IL-6 можно оценить обычными способами. Точнее, IL-6 добавляют к культурам IL-6-зависимых линий клеток миеломы человека (S6B45 KPMM2), линии клеток КТ-3 Т-клеточной лимфомы Леннерта человека или IL-6-зависимой клеточной линии МН60.BSF2; и потребление Н-тимидина IL-6-зависимыми клетками измеряют в присутствии ингибитора IL-6. Как вариант, клетки U266, экспрессирующие рецептор IL-6, культивируют, и к культуре добавляют I-меченный IL-6 и ингибитор IL-6 одновременно; и затем I-меченный IL-6, связанный с экспрессирующими рецептор IL-6 клетками, определяют количественно. Кроме группы ингибиторов IL-6, отрицательную контрольную группу, не содержащую ингибитор IL-6, включают в систему для анализа, описанную выше. Способность ингибитора IL-6 ингибировать IL-6 можно оценить при сравнении результатов обеих групп.
Как показано в примерах ниже, введение антитела против рецептора IL-6, как обнаружено, подавляет симптомы инфаркта миокарда и ремоделирования левого желудочка после инфаркта миокарда. Полученные данные указывают на то, что ингибиторы IL-6, такие как антитела против рецептора IL-6, пригодны в качестве средств, используемых для лечения инфаркта миокарда, и средств, используемых для подавления ремоделирования левого желудочка после инфаркта миокарда.
Субъектами, которым предполагается вводить средства согласно изобретению для лечения инфаркта миокарда и средства согласно изобретению для подавления ремоделирования левого желудочка после инфаркта миокарда, являются млекопитающие. Млекопитающие предпочтительно являются человеком.
Средства согласно изобретению для лечения инфаркта миокарда и средства согласно изобретению для подавления ремоделирования левого желудочка после инфаркта миокарда могут быть введены в виде фармацевтических препаратов и могут быть введены системно или локально путем перорального или парентерального введения. Например, могут быть выбраны внутривенная инъекция, такая как капельное внутривенное вливание, внутримышечная инъекция, внутрибрюшинная инъекция, подкожная инъекция, суппозиторий, клизма, пероральные таблетки или пр. Соответствующий способ введения может быть выбран в зависимости от возраста больного и симптомов. Эффективную дозу на одно введение выбирают в области от 0,01 до 100 мг/кг массы тела. Альтернативно, доза может быть выбрана в диапазоне от 1 до 1000 мг/пациента, предпочтительно в диапазоне от 5 до 50 мг/пациента. Предпочтительная доза и способ введения являются следующими: например, при использовании антитела против рецептора IL-6, эффективная доза составляет такое количество, при котором свободное антитело присутствует в крови. Точнее, дозу от 0,5 до 40 мг/кг массы тела/месяц (четыре недели), предпочтительно от 1 до 20 мг/кг массы тела/месяц вводят посредством внутривенной инъекции, такой как капельное внутривенное вливание, подкожная инъекция или пр., от одного раза до нескольких раз в месяц, например, дважды в неделю, один раз в неделю, один раз каждые две недели или один раз каждые четыре недели. Режим введения можно корректировать, например, путем увеличения интервала введения, составляющего интервал от двух раз в неделю или одного раза в неделю до одного раза каждые две недели, одного раза каждые три недели или одного раза каждые четыре недели, при этом контролируя состояние после трансплантации и изменения тестируемых величин в крови.
В настоящем изобретении средства для лечения инфаркта миокарда и средства для подавления ремоделирования левого желудочка после инфаркта миокарда могут содержать фармацевтически приемлемые носители, такие как консерванты и стабилизаторы. “Фармацевтически приемлемые носители” относятся к веществам, которые могут быть введены вместе с описанным выше средством и могут или не могут сами оказывать описанный выше эффект подавления симптомов инфаркта миокарда и ремоделирования левого желудочка после инфаркта миокарда. Как вариант, носители могут представлять собой вещества, которые не оказывают эффект подавления симптомов инфаркта миокарда и ремоделирования левого желудочка после инфаркта миокарда, но продуцируют аддитивный или синергический стабилизирующий эффект при использовании в комбинации с ингибитором IL-6.
Такие фармацевтически приемлемые вещества включают в себя, например, стерильную воду, физиологический раствор, стабилизаторы, наполнители, буферы, консерванты, детергенты, хелатирующие средства (ЭДТА и пр.) и связующие вещества.
В настоящем изобретении, детергенты включают в себя неионные детергенты, и к типичным примерам таких детергентов относятся сложные эфиры жирных кислот и сорбитана, такие как сорбитанмонокаприлат, сорбитанмонолаурат и сорбитанмонопальмитат; сложные эфиры жирных кислот и глицерина, такие как глицерилмонокаприлат, глицерилмономиристат и глицерилмоностеарат; сложные эфиры жирных кислот и полиглицеринов, такие как декаглицерилмоностеарат, декаглицерилдистеарат и декаглицерилмонолинолеат; сложные эфиры полиоксиэтиленсорбитана и жирных кислот, такие как полиоксиэтиленсорбитанмонолаурат, полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат, полиоксиэтиленсорбитанмоностеарат, полиоксиэтиленсорбитанмонопальмитат, полиоксиэтиленсорбитантриолеат и полиоксиэтиленсорбитантристеарат; сложные эфиры полиоксиэтиленсорбита и жирных кислот, такие как полиоксиэтиленсорбиттетрастеарат и полиоксиэтиленсорбиттетраолеат; сложные эфиры полиоксиэтиленглицерина и жирных кислот, такие как полиоксиэтиленглицерилмоностеарат; полиэтиленгликолевые сложные эфиры жирных кислот, такие как полиэтиленгликольдистеарат; полиоксиэтиленалкиловые простые эфиры, такие как полиоксиэтиленлауриловый эфир; полиоксиэтилен-полиоксипропиленалкиловые простые эфиры, такие как полиоксиэтилен-полиоксипропиленгликоль, полиоксиэтилен-полиоксипропиленпропиловый эфир и полиоксиэтилен-полиоксипропиленцетиловый эфир; полиоксиэтиленовые простые эфиры алкилфенолов, такие как полиоксиэтиленовый эфир нонилфенола; полиоксиэтиленовые производные отвержденных касторовых масел, такие как полиоксиэтиленовое производное касторового масла и полиоксиэтиленовое производное отвержденного касторового масла (полиоксиэтиленовое гидрогенизированное касторовое масло); полиоксиэтиленовые производные пчелиного воска, такие как полиоксиэтиленсорбит пчелиного воска; полиоксиэтиленовые производные ланолина, такие как полиоксиэтиленланолин; и полиоксиэтиленовые производные амидов жирных кислот и пр. с HLB от 6 до 18, такие как амид полиоксиэтиленстеариновой кислоты.
Детергенты также включают в себя анионные детергенты, и к типичным примерам таких детергентов относятся, например, алкилсульфаты, содержащие алкильную группу с 10-18 атомами углерода, такие как цетилсульфат натрия, лаурилсульфат натрия и олеилсульфат натрия; сульфаты полиоксиэтиленалкиловых простых эфиров, в которых алкильная группа содержит от 10 до 18 атомов углерода, и среднее число молей добавленной окиси этилена составляет от 2 до 4, такие как полиоксиэтиленлаурилсульфат натрия; соли алкилсульфосукцинатного сложного эфира, содержащие алкильную группу с 8-18 атомами углерода, такие как натриевая соль лаурилсульфосукцинатного эфира; природные детергенты, например лецитин; глицерофосфолипиды; сфингофосфолипиды, такие как сфингомиелин; и сложные эфиры сахарозы и жирных кислот, в которых жирные кислоты содержат от 12 до 18 атомов углерода.

Один, два или более детергентов, описанных выше, можно комбинировать и добавлять к средствам согласно изобретению. Детергенты, которые предпочтительно используют в препаратах согласно изобретению, включают в себя полиоксиэтиленовые эфиры сорбитана и жирной кислоты, такие как полисорбаты 20, 40, 60 и 80. Полисорбаты 20 и 80 являются особенно предпочтительными. Полиоксиэтиленполиоксипропиленгликоли, такие как полоксамер (Pluronic F-68 и пр.), также являются предпочтительными.
Количество добавленного детергента изменяется в зависимости от типа используемого детергента. В случае использования полисорбата 20 или 80 его количество заключено в основном в диапазоне от 0,001 до 100 мг/мл, предпочтительно, в диапазоне от 0,003 до 50 мг/мл, более предпочтительно, в диапазоне от 0,005 до 2 мг/мл.
В настоящем изобретении буферы включают в себя фосфат, цитратный буфер, уксусную кислоту, яблочную кислоту, винную кислоту, янтарную кислоту, молочную кислоту, фосфат калия, глюконовую кислоту, каприновую кислоту, дезоксихолевую кислоту, салициловую кислоту, триэтаноламин, фумаровую кислоту и другие органические кислоты; и углекислотный буфер, трис-буфер, гистидиновый буфер и имидазольный буфер.
Жидкие препараты могут быть приготовлены путем растворения средств в водных буферных растворах, известных в области приготовления жидких препаратов. Концентрация буфера составляет в основном от 1 до 500 мМ, предпочтительно, от 5 до 100 мМ, более предпочтительно, от 10 до 20 мМ.
Средства согласно изобретению также могут содержать другие низкомолекулярные полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин и иммуноглобулин; аминокислоты; сахара и углеводы, такие как полисахариды и моносахариды, сахарные спирты и пр.
В данном описании аминокислоты включают в себя основные аминокислоты, например, аргинин, лизин, гистидин и орнитин, и неорганические соли указанных аминокислот (предпочтительно хлористоводородные соли и фосфатные соли, а именно, фосфаты аминокислот). При использовании свободных аминокислот рН доводят до предпочтительной величины путем добавления соответствующих физиологически приемлемых для забуферивания веществ, например, неорганических кислот, в частности, хлористоводородной кислоты, фосфорной кислоты, серной кислоты, уксусной кислоты и муравьиной кислоты и их солей. В данном случае использование фосфата является особенно благоприятным, поскольку он дает вполне стабильные лиофилизированные продукты. Фосфат особенно предпочтителен, когда препараты не содержат в значительной степени органические кислоты, такие как яблочная кислота, винная кислота, лимонная кислота, янтарная кислота и фумаровая кислота, или не содержат соответствующие анионы (ион малата, ион тартрата, ион цитрата, ион сукцината, ион фумарата и пр.). Предпочтительными аминокислотами являются аргинин, лизин, гистидин и орнитин. Можно использовать также кислые аминокислоты, например, глутаминовую кислоту и аспарагиновую кислоту и их соли (предпочтительно натриевые соли); нейтральные аминокислоты, например, изолейцин, лейцин, глицин, серин, треонин, валин, метионин, цистеин и аланин; и ароматические аминокислоты, например, фенилаланин, тирозин и триптофан и их производные, N-ацетилтриптофан.
В данном изобретении сахара и углеводы, такие как полисахариды и моносахариды, включают в себя, например, декстран, глюкозу, фруктозу, лактозу, ксилозу, маннозу, мальтозу, сахарозу, трегалозу и раффинозу.
В настоящем изобретении сахарные спирты включают в себя, например, маннит, сорбит и инозит.
В случае приготовления агентов согласно изобретению в виде водных растворов для инъекции, их можно смешивать, например, с физиологическим раствором и/или изотоничным раствором, содержащим глюкозу или другие вспомогательные средства (такие как D-сорбит, D-манноза, D-маннит и хлорид натрия). Водные растворы могут быть использованы в комбинации с соответствующими стабилизаторами, такими как спирты (этанол и пр.), многоатомные спирты (пропиленгликоль, PEG, и пр.) или неионные детергенты (полисорбат 80 и НСО-50).
Такие агенты также могут содержать, при необходимости, разбавители, солюбилизирующие средства, регулирующие рН вещества, успокаивающие средства, серосодержащие восстановители, антиоксиданты и пр.
В данном изобретении серосодержащие восстановители включают в себя, например, соединения, содержащие сульфгидрильные группы, такие как N-ацетилцистеин, N-ацетилгомоцистеин, липоевую кислоту, тиодигликоль, тиоэтаноламин, тиоглицерин, тиосорбит, тиогликолевую кислоту и их соли, тиосульфат натрия, глутатион и тиоалкановые кислоты, имеющие от 1 до 7 атомов углерода.
Кроме того, антиоксиданты в настоящем изобретении включают в себя, например, эриторбовую кислоту, дибутилгидрокситолуол, бутилгидроксианизол, α-токоферол, токоферолацетат, L-аскорбиновую кислоту и ее соли, пальмитат L-аскорбиновой кислоты, стеарат L-аскорбиновой кислоты, бисульфит натрия, сульфит натрия, триамилгаллат, пропилгаллат и хелатирующие средства, такие как этилендиаминтетраацетат динатрия (ЭДТА), пирофосфат натрия и метафосфат натрия.
th
При необходимости, указанные агенты могут быть заключены в микрокапсулы (микрокапсулы гидроксиметилцеллюлозы, желатина, поли[метилметакриловой кислоты] и т.п.) или приготовлены в виде коллоидных систем для доставки лекарственных средств (липосома, микросферы альбумина, микроэмульсия, наночастицы, нанокапсулы и т.п.) (см. “Remington′s Pharmaceutical Science 16 edition”, Oslo Ed., 1980, и пр.). Кроме того, способы приготовления таких агентов в виде препаратов пролонгированного действия также известны и применимы к настоящему изобретению (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 1981, 15: 167-277; Langer, Chem. Tech. 1982, 12: 98-105; патент США No. 3773919; европейская патентная заявка No. (EP) 58481; Sidman et al., Biopolymers 1983, 22: 547-556; и европейская патентная заявка ЕР 133988).
Используемые фармацевтически приемлемые носители соответствующим образом выбирают из описанных выше носителей или комбинируют, в зависимости от типа дозированной формы, но они не ограничены приведенными в описании носителями.
Настоящее изобретение относится к способам лечения инфаркта миокарда у субъектов и способам подавления ремоделирования левого желудочка после инфаркта миокарда, включающим в себя стадию введения ингибитора IL-6 субъектам, у которых развился инфаркт миокарда.
В данном описании термин “субъект” относится к организмам и частям тела организмов, которым предполагается вводить средство согласно изобретению для лечения инфаркта миокарда или средство согласно изобретению для подавления ремоделирования левого желудочка после инфаркта миокарда. Также организмы включают животных (например, человека, виды домашних животных и диких животных), но не ограничены ими.
“Части тела организмов” не ограничены перечисленным, но предпочтительно включают в себя сердце, сердечную мышцу и пораженные и не пораженные инфарктом зоны при инфарктах миокарда.
В данном описании “введение” включает в себя пероральное и парентеральное введения. Пероральное введение включает, например, введение пероральных средств. Такие пероральные средства включают, например, гранулу, порошок, таблетку, капсулу, раствор, эмульсию и суспензию.
Парентеральное введение включает, например, инъекции. Такие инъекции включают, например, подкожную инъекцию, внутримышечную инъекцию и внутрибрюшинную инъекцию. В то же время эффекты способов согласно изобретению могут быть достигнуты с помощью внесенных генов, содержащих олигонуклеотиды, которые должны быть введены живым организмам с помощью методов генной терапии. С другой стороны, [лекарственные] средства согласно изобретению могут быть введены местно в предназначенные для лечения зоны. Например, такие средства могут быть введены путем локальной инъекции во время операции, с помощью катетеров или путем направленного трансгеноза ДНК, кодирующей пептид согласно изобретению. Такие средства согласно изобретению могут быть введены наряду с проведением лечения инфарктов миокарда, например, путем катетеризации (чрескожная транслюминальная коронарная ангиопластика (РТСА) и чрескожное вмешательство на коронарных сосудах (PCI)), чрескожной транслюминальной коронарной реканализации (PTCR), аортокоронарного шунта (CABG) и пр.
При осуществлении способов настоящего изобретения [терапевтические] средства согласно изобретению могут быть введены как часть фармацевтической композиции в комбинации по меньшей мере с одним известным химиотерапевтическим средством. Как вариант, средства согласно изобретению могут быть введены в комбинации по меньшей мере с одним известным иммуносупрессором. В одном варианте осуществления изобретения [терапевтические] средства согласно изобретению и известные химиотерапевтические средства могут быть введены практически одновременно.
Все ссылки предшествующего уровня техники, цитируемые в описании, включены посредством ссылки.
[Примеры]
Как указано ниже, настоящее изобретение будет более точно описано со ссылкой на примеры, но они не должны рассматриваться как ограничивающие изобретение.
[Пример 1] Получение модели инфаркта миокарда мыши
Мышам линии Balb/c (от 25 до 30 г) вводили в трахею трубку. Мышей держали на аппарате искусственного дыхания и проводили анестезию посредством ингаляции от 0,5 до 1,0% изофлурана. Грудная клетка слева была открыта. После лигирования левой передней нисходящей венечной артерии грудную клетку закрывали. Мышей разделяли на группу с введенным антителом MR16-1 (MR16-1-группа) и на необработанную группу (контрольная группа). Группу, обрабатываемую MR16-1, подвергали внутрибрюшинному введению MR16-1 в дозе 500 мкг/организм.
[Пример 2] Измерение активности МРО
4
4
2
2
Сердца извлекали из мышей через два дня после создания модели инфарктов миокарда (или коронарного лигирования). Сердца разделяли на пораженную инфарктом зону и на область сердца, не пораженную инфарктом, и измельчали. Затем измельченную сердечную мышцу объединяли с 10 объемами 50 мМ КРО-буфера (рН 6,0), содержащего 0,5% гексадецилтриметиламмонийбромида. Измельченную мышцу гомогенизировали (POLYTRON, KINEMATICAAG, Luzern, Switzerland) и затем подвергали действию ультразвука. Полученный экстракт центрифугировали при 13000 об/мин в течение 10 минут при 4°С. После этого 50 мкл образовавшегося супернатанта смешивали с 1,45 мл раствора субстрата (50 мМ КРО (рН 6,0), 0,167 мг/мл о-дианизидиндигидрохлорида и 0,005% НО), изменения окрашивания раствора субстрата контролировали путем измерения абсорбции при 460 нм (коэффициент поглощения = 2,655).
В результате было показано, что активности МРО сердечной мышцы не различались в области сердечной мышцы, не пораженной инфарктом, и сердечной мышцей ложно оперированной группы, но в зоне инфаркта активность увеличивалась в значительной степени, примерно в четыре раза (риск, не связанный с ненадежностью процедур контроля, 0,037 ± 0,006; риск, связанный с ненадежностью процедур контроля, 0,122 ± 0,035; р<0,01). В то же время указанное повышение активности МРО в пораженной инфарктом зоне в значительной степени подавлялось в группе с введенным антителом MR16-1 (риск, связанный с использованием MR16-1, 0,034 ± 0,008; р<0,05 против риска, связанного с ненадежностью процедур контроля).
[Пример 3] Анализ экспрессии МСР-1
TM
Сердца извлекали из мышей через два дня после создания модели инфаркта миокарда. Сердца разделяли на пораженную инфарктом зону и на область, не пораженную инфарктом, и измельчали. Затем измельченную сердечную мышцу смешивали с буфером для лизиса (2× PBS, 1% NP-40, 0,5% дезоксихолата натрия, 0,1% додецилсульфата натрия, 1 мМ PMSF, 1% коктейля из протеазных ингибиторов (Nacalai Tesque) и гомогенизировали. Экстракт центрифугировали при 13000 об/мин в течение 10 минут при 4°С. Полученный супернатант использовали в качестве полного клеточного лизата для оценки концентрации белка методом Лоури. Равные объемы белкового раствора разделяли на 12% полиакриламидном геле, и белки переносили на мембрану Immun-Blot PVDF. Затем мембрану инкубировали с анти-МСР-1-антителом (1:30; IBL Co.) в качестве первого антитела при 4°С в течение ночи, и затем инкубировали с анти-кроличьим IgG козы (1:400; Cell Signaling) в качестве второго антитела при комнатной температуре в течение 2 часов. Экспрессию МСР-1 определяли хемилюминесценцией, используя ECL (Amersham Bioscience, Buckinghamshire, U.K.). Анализ изображений на фотографии осуществляли с помощью компьютерной программы (Scion Image Frame Grabber Status).
Результат показал, что экспрессия МСР-1 сердечной мышцы увеличивалась как в зоне инфаркта, так и в не пораженной инфарктом области в контрольной группе, но была намного выше в зоне поражения. С другой стороны, увеличение экспрессии МСР-1 подавлялось в обеих зонах в группе с введенным антителом MR16-1.
[Пример 4] Эхокардиография
Через четыре недели после создания модели инфаркта миокарда сердца проверяли эхокардиографическим методом под анестезией для определения конечно-диастолического диаметра и фракции укорочения (FS) левого желудочка.
Результат эхокардиографии через четыре недели после создания модели инфаркта миокарда показал, что конечно-диастолический диаметр левого желудочка в контрольной группе был значительно увеличен по сравнению с ложно оперированной группой. Указанное увеличение (диаметра левого желудочка) значительно подавлялось при введении MR16-1. Кроме того, хотя FS снижалась после инфаркта миокарда (созданный), она в значительной степени улучшалась при введении MR16-1 (контрольная группа 18,5 ± 2,9% против MR16-1-группы 28,5 ± 1,8%; р<0,05).
[Пример 5] Гистологическая оценка
Сердца извлекали из мышей через два дня после создания модели инфаркта миокарда, фиксировали 4% параформальдегид-фосфатным буфером и затем заливали в парафин. Сердца рассекали и затем окрашивали трихромом Masson для количественной оценки степени фиброза сердца и гипертрофии кардиомиоцитов по короткой оси сечения сердечной мышцы в области, не пораженной инфарктом.
В результате гипертрофия кардиомиоцитов и стромальный фиброз были обнаружены в области, не пораженной инфарктом, в контрольной группе. В отличие от этого, указанные симптомы подавлялись в группе с введенным антителом MR16-1.
Промышленная применимость
Развитие инфаркта миокарда и/или ухудшение состояния могут вызвать осложнения, такие как сердечная недостаточность и/или индуцированная ишемией тяжелая аритмия, которые увеличивают опасность для жизни. Средства согласно изобретению, предназначенные для лечения инфаркта миокарда, средства для подавления ремоделирования левого желудочка после инфаркта миокарда и способы лечения или предотвращения инфаркта миокарда могут подавлять симптомы, осложняющие инфаркт миокарда, и могут способствовать эффективному лечению.
Степень распространенности ремоделирования левого желудочка после инфаркта миокарда, как полагают, также связана с размером пораженной зоны и представляется важным фактором для улучшения состояния и предотвращения увеличения пораженного инфарктом участка на ранней стадии возникновения инфаркта миокарда. Кроме осложняющих инфаркт миокарда симптомов, ремоделирование левого желудочка может быть подавлено путем введения средства согласно изобретению, содержащего ингибитор IL-6 в качестве активного ингредиента, больному на ранней стадии развития инфаркта миокарда.