Способ получения биофунгицида
METHOD FOR BIOFUNGICIDE OBTAINING

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии, а именно к технологии получения биологических препаратов с фунгицидной активностью на основе живых микроорганизмов.
Использование в практике растениеводства биологических препаратов с различной активностью - важный шаг на пути к экологизации сельского хозяйства. Биологические средства защиты растений, такие как биофунгициды и биоинсектициды, привлекают к себе особенное внимание, поскольку позволяют существенно сократить или даже полностью отказаться от использования химических аналогов, что позволяет избегать проблем, связанных с появлением рас патогенов с множественной устойчивостью, снижением биоразнообразия почвенной микрофлоры, накоплением и миграцией токсичных ксенобиотиков в экосистемах и т.д. Однако использование биопрепаратов при возделывании культурных растений остается крайне низким. Это связано с недостаточной представленностью на рынке, недоверием со стороны потребителей, неудобством препаративной формы, что в свою очередь отражает и проблемы промышленного производства биопрепаратов.
Известен биопрепарат Фитоспорин для защиты растений от болезней (Патент РФ №2099947, опубл. 27.12.1997), при производстве которого суспензию бактериальных клеток Bacillus subtilis ВНИИСХМ 128 в физиологическом растворе смешивают с наполнителем, в качестве которого может выступать сыворотка крови крупного рогатого скота, молоко, обрат или сахарозожелатиновая смесь, разливают в стерильные ампулы и лиофильно высушивают. Недостатком данного способа является наличие этапа лиофильного высушивания, который приводит к существенному удорожанию конечного продукта. Кроме того, приготовление суспензии клеток в физиологическом растворе, которое предполагает их первоначальное отделение от среды культивирования, является не технологичным при производстве препарата в промышленных масштабах.
Известен способ получения препарата для борьбы с болезнями растений (Патент РФ №2069953, опубл. 10.12.1996) на основе штамма Pseudomonas sp., который заключается в выращивании биомассы бактерий, адсорбировании ее на основу из цеолита с размером частиц 10-30 мк с последующим высушиванием в естественных условиях. Выращивание Pseudomonas sp. проводят 23-27 часов в биологическом реакторе в жидкой среде при продувании стерильным воздухом. Кроме того, при осуществлении способа получения препарата может быть введен декстрин в количестве 0,5-1,5 вес. проц. Недостатком этого способа является необходимость больших площадей для высушивания препарата, в которых требуется обеспечивать асептические условия для предотвращения попадания и развития посторонней микрофлоры на остатках питательной среды, пока цеолит влажный.
Известен способ получения бактериального препарата на основе Bacillus subtilis (Патент РФ №2105562, опубл. 27.02.1998), предполагающий культивирование бактерий на поверхности полупроницаемой мембраны, расположенной на плотной питательной среде, до максимального накопления биомассы, а также перевод бактерий в споровую форму путем охлаждения клеток до температуры, не превышающей 10°С, и выдерживания их при этой температуре не менее суток, последующее смешение спор бактерий с наполнителем. Недостатком этого способа является сложность масштабирования технологии для получения больших объемов продукта.
Известен штамм бактерий Bacillus licheniformis (его варианты), обладающий бактерицидной и фунгицидной активностью, и препарат на основе этого штамма (Патент РФ №2440413, опубл. 20.01.2012). Способ получения препарата предполагает смешение биомассы бактерий в споровой форме с наполнителем, в качестве которого могут выступать вода или порошкообразный сорбент. Недостатками данного способа являются использование дорогостоящих компонентов питательной среды для наработки биомассы штамма, таких как пептон и дрожжевой экстракт; необходимость отделения споровой массы от среды культивирования и замена последней на воду или твердый наполнитель, при том что в первом случае срок хранения продукта в результате оказывается очень низким (1-2 суток в темном месте).
9
Известен штамм бактерий Bacillus amyloliquefaciens, обладающий фунгицидным и бактерицидным действием, и биологический препарат на его основе для защиты зерновых растений от заболеваний, вызываемых фитопатогенными грибами (Патент РФ №2528058, опубл. 10.09.2014). Способ получения указанного биопрепарата предполагает смешение активного начала в виде культуральной жидкости штамма с титром 2-3×10 КОЕ/мл и носителя в виде мелкодисперсных гранул диатомита в соотношении по объему 1:3 с последующим высушиванием. Недостатками этого способа являются длительность процесса культивирования микроорганизма (72 часа), высокий риск заражения при высушивании препарата после иммобилизации активного начала на носителе и необходимость для этого больших площадей.
Кроме того, при получении сухих биопрепаратов в виде мелкодисперсных порошков приходится сталкиваться с тем, что продукт сильно пылит. Это требует принятия дополнительных мер для обеспечения безопасности сотрудников, в первую очередь, предотвращение возможности вдыхания и оседания частиц на слизистых оболочках; а также профилактику и контроль распространения микроорганизма вместе с пылевыми частицами по всем производственным помещениям. С этим связано то, что все порошкообразные препараты имеют 3 класс опасности, даже если микроорганизмы в его составе признаны непатогенными.
Жидкие биопрепараты, представляющие собой суспензию вегетативных клеток или спор микроорганизма в среде культивирования, обогащенной метаболитами этого микроорганизма, лишены данного существенного недостатка.
Известны способы получения препарата Фитоспорин (Патент РФ №2128914 и №2128915, опубл. 20.04.1999) из бактерий рода Bacillus, включающие засев питательной среды маточной культурой, жидкостное культивирование в среде, содержащей минеральные соли и пептон, при постоянной аэрации и отделении целевого продукта, содержащего культуральную жидкость со споровой биомассой. Недостатками этого способа является использование дорогостоящего сырья - пептона, необходимость добавления в культуральную жидкость гуми или сульфита натрия для стабилизации биомассы, недостаточный срок хранения получаемого продукта. Известен также иной способ получения препарата Фитоспорин (Патент РФ №2129004, опубл. 20.04.1999), отличающийся от вышеописанных тем, что в процессе культивирования сливают половину объема культуральной жидкости и добавляют в том же объеме свежую питательную среду и вновь культивируют до восстановления концентрации спор, повторно сливают половину объема культуральной жидкости и добавляют в том же объеме свежую питательную среду и после отделения целевого продукта его смешивают со стабилизатором. Недостатком этого способа, помимо тех же недостатков, что и для ранее описанных способов производства препарата Фитоспорин, является неодинаковость сливаемых в процессе одного культивирования продуктов, в первую очередь, по соотношению покоящихся и вегетативных клеток, что может привести к существенному варьированию свойств у разных партий продукта.
Известен штамм бактерий Bacillus mucilaginosus, обладающий широким спектром фунгицидного действия, и биопрепарат на его основе (Патент РФ №2289621, опубл. 20.12.2006), в качестве способа получения которого предложена двухступенчатая ферментация, при этом первую ферментацию проводят на жидкой питательной среде Эшби с добавлением NH4NO3 в течение 24-36 часов, а вторую - на среде Сурмана с мелассой в течение 48-60 часов; ферментации ведут при температуре 29±1°С, непрерывном перемешивании и аэрации, равной 1 объем воздуха / 1 объем питательной среды в минуту, посевную культуру засевают из расчета 5-10% от объема питательной среды. Недостатком данного способа является то, что продукт, получаемый в результате его осуществления, имеет низкий титр 120-180 млн спор/мл и недостаточно длительный срок хранения.
Известен способ получения биопрепарата для защиты растений от болезней, стимуляции корнеобразования и роста сельскохозяйственных и декоративных культур (Патент РФ №2267531, опубл. 10.01.2006), включающий культивирование штамма бактерий Pseudomonas putida ВСБ-692 в жидкой питательной среде, содержащей источники углерода, азота, фосфора и микроэлементов, в условиях аэрации и перемешивания, отличающийся тем, что в питательную среду вводят в качестве источника углерода гидрол, а в качестве источника азота - кукурузный экстракт, при этом продолжительность ферментации составляет 30-36 часов. Недостатком данного способа является большая продолжительность культивирования, а также зависимость производства от наличия гидрола, который крайне слабо представлен на российском рынке. Кроме того, ничего не известно о титре и сроке хранения получаемого продукта.
Известна группа изобретений, описывающих препараты и способы их получения, действующим началом которых является совокупность различных видов и штаммов микроорганизмов (Патенты РФ №2170510, №2313941, №2314693, №2576197). Основным недостатком является высокая сложность и затратность промышленного производства, требующая проведения множества параллельных ферментаций (по количеству микроорганизмов в препарате) различной длительности при необходимости их более или менее одновременного завершения для получения конечного продукта.
Известен способ производства микробиологических препаратов (Патент РФ №2077204, опубл. 20.04.1997), который предусматривает подготовку посевной культуры микроорганизма из штамма продуцента и питательной среды, содержащей водорастворимые углеводы, источник органического азота, соли и воду, в которой содержание водорастворимых углеводов не менее 2% по массе, аминного азота не менее 0,0005% по массе, всего углеводов не более 18% по массе, общего азота не более 2,7% по массе, внесение посевной культуры в питательную среду, ее культивирование и выделение целевого продукта из культуральной жидкости. Недостатком данного способа является то, что после окончания культивирования получаемый продукт требует дополнительных модификаций, например экструдирование, гранулирование и сушка, концентрирование культуральной жидкости, введение дополнительных компонентов, таких как глицерин, полиэтиленоксид, поливинилпирролидон, зерновая основа, цеолит, монтмориллонит, палыгорскит, биогумус.
4
2
4
3
10
Известен биопрепарат для стимуляции роста и защиты растений от болезней, повышения урожайности и почвенного плодородия (Патент РФ №2478290, опубл. 10.04.2013), который получают путем культивирования штамма Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-11008 на питательной среде на основе отходов зернового производства следующего состава (г/л): отруби пшеничные - 40,0; кукурузный экстракт - 0,5; MgSO - 0,9; KHPO - 0,5; СаСО - 1,0; рН 7,0±0,2. При этом достигается высокий уровень спорообразования (не менее 94%), а также высокий титр культуры 1,24-1,28×10 КОЕ/мл. После окончания процесса культивирования в препарат добавляют гуматы в количестве 1,0 об. %. Недостатком этого способа является высокое содержание остаточного сахара и аминного азота в среде к концу выращивания, которое составляет порядка 14 и 2% соответственно от исходного уровня. С одной стороны, это увеличивает вероятность развития в препарате посторонней микрофлоры в процессе хранения, а с другой - может привести к активации и прорастанию спор самого штамма В. amyloliquefaciens ВКПМ В-11008 при хранении. Кроме того, продукт, получаемый по данному способу, несмотря на высокий титр, предполагает его применение в высоких дозировках - 1,5 л/т для предпосевной обработки семян.
Задачей заявляемого изобретения является разработка высокопроизводительного способа промышленного получения нового эффективного биофунгицида, при использовании которого может быть достигнут технический результат, заключающийся в существенном снижении затрат на производство, использовании легкодоступного дешевого сырья, получении качественного продукта с высоким сроком хранения без внесения дополнительных ингредиентов.
1
1
Технический результат достигается тем, что в качестве действующего начала для биофунгицида используется штамм бактерии Bacillus amyloliquefaciens OPS-32 (регистрационный номер ВКПМ: В-12464), а в качестве основы для питательной среды используются отходы спиртовой или пивоваренной промышленности, такие как послеспиртовая барда нативная или фильтрованная, или продукты переработки послеспиртовой барды, такие как DDG (Dried Distillers Grains) и DDGS (Dried Distillers Grains with Solubles)( И.Н. Кузнецов, Н.С. Ручай. Анализ мирового опыта в технологии переработки послеспиртовой барды // Труды БГТУ. Серия IV. Химия, технология органических веществ и биотехнология. Выпуск XVIII. - 2010. - №4. - с. 294-301.), или сухая, в том числе гранулированная, пивная дробина. В случае использования сухого сырья в питательную среду также вводится патока, или гидрол (кормовая патока), или меласса, или солодовый экстракт в количестве не более 2% по массе. Введение других дополнительных компонентов в питательную среду не требуется, так как указанное сырье полностью обеспечивает потребности микроорганизма в источниках углерода, азота, фосфора, калия, магния и микроэлементов. Кроме того, маточная культура вносится в стартовый ферментер в количестве 0,1-0,15% и, таким образом, позволяет исключить 2 стадии процесса культивирования (выращивание культуры в ферментерах с объемом в 100 и в 10 раз меньше), что сокращает производственные затраты и время культивирования. Получаемый по предлагаемому способу биофунгицид эффективен при низких нормах расхода порядка 0,4 л/т для предпосевной обработки семян и 0,4 л/га для опрыскивания вегетирующих растений.
9
Способ получения биофунгицида заключается в следующем. Первоначально бактерии выращивают в пробирках на скошенном картофельно-глюкозном агаре при 30°С в течение 7 суток. За это время большая часть клеток штамма переходит в споровое состояние, благодаря чему культуру можно использовать в качестве посевного материала в течение года. Далее готовят маточную культуру, для чего в пробирку с посевным материалом наливают 8-10 мл стерильного физиологического раствора или стерильной воды, делают смыв и распределяют его по колбам с питательной средой того же состава, что будет использоваться на последующих этапах процесса. Маточную культуру выращивают при 30°С на качалке в течение 8-10 часов до окончания экспоненциальной - начала стационарной фазы развития культуры. Затем маточной культурой засевают стартовый ферментер в количестве 0,1-0,15% от объема питательной среды, культивируют при 30°С, аэрации 0,6-1,0 л воздуха на 1 л питательной среды в минуту и скорости перемешивания 200-250 об/мин до окончания экспоненциальной - начала стационарной фазы развития культуры в течение 10-12 часов. После этого культуру переливают в финишный ферментер в количестве 10% от объема питательной среды, в котором культивирование проводят при 30°С, аэрации 0,3-0,5 л воздуха на 1 л питательной среды в минуту и скорости перемешивания 110-150 об/мин в течение 16-18 часов, достигая при этом титра не менее 5×10 КОЕ/мл и спорообразования не менее 95%. Полученный продукт разливают по канистрам и хранят при температуре +2 - +30°С в течение 1 года.
Способы подготовки питательной среды для реализации способа
Вариант 1
Питательную среду готовят из нативной жидкой фильтрованной или нефильтрованной барды. Для этого рН барды доводят до значения 8,0 посредством NaOH или КОН и стерилизуют в колбах или в ферментерах при 121°С в течение 1 часа. В процессе стерилизации рН барды снижается до 6,5-7,0. После остывания среда готова для использования. При культивировании Bacillus amyloliquefaciens OPS-32 титр получаемого продукта 10-20 млрд КОЕ/мл. В данном варианте предпочтительно использовать фильтрованную барду, так как при использовании нефильтрованной барды из-за крупных взвешенных частиц, забивающих форсунки опрыскивателей, получаемый продукт оказывается непригоден для опрыскивания растений по вегетации.
Недостатком нативной жидкой барды является ее малый срок хранения (1 сутки), что при нерегулярной работе российских спиртзаводов может привести к проблемам с поставками сырья.
Вариант 2
В качестве основы питательной среды используют гранулированную барду, полученную по технологии переработки сухой барды в продукт DDGS. Для этого барду в количестве 3-10% по массе заливают водой и вываривают в варочном котле в течение 1 часа, после чего фильтруют с помощью нутч-фильтра или отделяют отвар от крупных взвешенных частиц на сепараторе. К полученному отвару добавляют патоку, или гидрол, или мелассу, или солодовый экстракт в количестве 1,5%, рН доводят до значения 8,0. Стерилизуют при 121°С в течение 1 часа. Титр получаемого продукта составляет 5-6 млрд КОЕ/мл.
Вариант 3
В качестве основы питательной среды используют сухую рассыпчатую барду, полученную по технологии укороченной схемы переработки сухой барды в продукт DDG. Питательную среду готовят, как описано в варианте 2, но количество барды увеличивается до 5-20% по массе, а патоки, или гидрола, или мелассы, или солодового экстракта - до 2%. Титр получаемого продукта составляет 5,5-7 млрд КОЕ/мл.
Вариант 4
В качестве основы питательной среды используют сухую гранулированную или рассыпчатую пивную дробину. Питательную среду готовят, как описано в варианте 2, но количество пивной дробины составляет 7-15%, а патоки, или гидрола, или мелассы, или солодового экстракта - 2%. Титр получаемого продукта составляет 5,5-7 млрд КОЕ/мл.
Поскольку при культивировании штамма Bacillus amyloliquefaciens OPS-32 на описанных питательных средах достигается высокий уровень спорообразования в культуре (не менее 95%), а к концу культивирования в среде не остается легкодоступных растворимых сахаров, введение в продукт дополнительных компонентов для стабилизации биомассы или увеличения срока хранения препарата не требуется.
Эффективность биофунгицида, получаемого по предлагаемому способу, иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1
Эффективность биофунгицида, полученного по предлагаемому способу, проверяли в мелкоделяночном опыте на яровом ячмене сорта Авторитет в Рамонском районе Воронежской области на опытных полях ФГБНУ «ВНИИЗР» в 2015 году. Схема обработки растений была следующей:
Оценивали эффективность нового биофунгицида против гельминтоспориозно-фузариозных корневых гнилей (возбудители Bipolaris sorokiniana + Fusarium spp.) и сетчатой пятнистости (возбудитель Drechslera teres). Результаты представлены в таблице 1.
Таким образом, новый биофунгицид, полученный по предлагаемому способу, при использовании в низких дозировках эффективен против корневых гнилей и сетчатой пятнистости ячменя, способствует повышению урожайности растений, превышая по этим показателям известный препарат Фитоспорин-М, П, имеющий более высокие нормы расхода.
Пример 2
Испытания эффективности биофунгицида, полученного по предлагаемому способу, проводили в мелкоделяночном эксперименте на растениях гороха посевного сорта Ватан в Лаишевском районе республики Татарстан на опытных полях ФГБНУ ТатНИИСХ в 2016 году. Схема обработки растений была следующей:
Оценивали эффективность нового биофунгицида против корневых гнилей растений на различных этапах вегетации, а также влияние на урожайность растений. Результаты представлены в таблице 2.
Таблица 2. Влияние нового биофунгицида на пораженность растений гороха корневыми гнилями и урожайность
Приведенные результаты свидетельствуют об эффективности применения нового биофунгицида, полученного по предлагаемому способу, в качестве средства, сдерживающего развитие корневых гнилей гороха и повышающего его урожайность.