Поиск пептидных маркеров гинекологических заболеваний в сыворотке крови с использованием МАЛДИ масс-спектрометрии

ГИНЕКОЛОГИЯ

ПОИСК ПЕПТИДНЫХ МАРКЕРОВ ГИНЕКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МАЛДИ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ

А.В. Сорокина, В.Е. Радзинский

Кафедра акушерства и гинекологии с курсом перинатологии Российский университет дружбы народов ул. Миклухо-Маклая, 8, медицинский факультет, 117198 Россия, Москва

Р.Х. Зиганшин, Г.П. Арапиди

Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова

Российской академии наук ул. Миклухо-Маклая, 16/10, 117997Россия, Москва

Проведено фракционирование сывороток крови практически здоровых женщин (33 пациента, средний возраст 49 лет) с подтвержденным диагнозом: рак яичников 1-4-й стадии (33 пациентки, средний возраст 51 год), аденомиоз (35 пациенток, средний возраст 40 лет), миома матки (17 пациенток, средний возраст 41 год) и гиперплазия эндометрия (23 пациентки, средний возраст 43 года) - на магнитных микрочастицах со слабой катионообменной поверхностью и последующее исследование полученных фракций времяпролетной МАЛДИ масс-спектрометрией. Анализ масс-спектрометрических данных с использованием классификационных алгоритмов (Генетический алгоритм и Обучаемая нейронная сеть) позволил построить математическую модель, способную со 100% специфичностью и чувствительностью отличать масс-спектрометрические (МС) профили образцов сыворотки крови пациенток с раком яичников от профилей образцов сыворотки крови практически здоровых женщин. В построенную классификационную модель вошли масс-спектрометрические пики со значениями m/z: 1570, 2068, 2114, 3138, 3263, 3524, 3536. Специфичность построенной модели по отношению к МС профилям образцов сыворотки крови пациенток с аденомиозом, миомой матки и гиперплазией эндометрия была 22,6, 41,2 и 45,5% соответственно.

Ключевые слова: аденомиоз, рак яичников, МАЛДИ масс-спектрометрия.

В последние годы частота эндометриоза, аденомиоза и рака яичников значительно возросла, контингент больных заметно «помолодел», что стало важной медицинской и социальной проблемой.

Частота эндометриоза составляет от 7 до 60%, аденомиоза - до 70-90% в структуре генитального эндометриоза, рака яичников - около 2% у женщин репродуктивного возраста. Несмотря на свою распространенность, данные заболевания являются патологиями с неустановленной этиологией и малоизученным патогенезом [1-3; 7; 10].

Биология эндометриоза и аденомиоза представляет интерес из-за инвазии и метастазирования, что сближает их с опухолью [2; 3; 8; 9; 11].

Если 15-20 лет назад изучение онкологических аспектов эндометриоза сводилось к возможности малигнизации эндометриоза и сосуществованию его и злокачественных опухолей половых органов, то в последнее время эти вопросы представляются более сложными.

Впервые о злокачественном превращении эндометриоза сообщил A. Sampson (1925). По данным ряда авторов, озлокачествление эндометриоза представляется редким явлением. С другой стороны, G.Smith (1937) в 22% дифференцированных карцином яичника установил связь с эндометриозом.

Возможность малигнизации овариального эндометриоза в настоящее время не вызывает сомнений, при этом частота малигнизации может достигать 23,9% [4; 5; 22]. Указывается, что в эндометриоидном очаге может развиться почти любой тип злокачественной опухоли. Считается, что малигни-зация эндометриоза тела матки происходит редко. Однако сочетание эндометриоза и злокачественных заболеваний женских половых органов, по данным нашей клиники, было установлено в 17,8%.

Исследованиями А.Е. Колосова (1985) установлена зависимость прогноза от гистологического строения эндометриоза яичников. Так, склонность к малигнизации более выражена при железисто-кистозном варианте.

Накопилась информация, свидетельствующая о повышенной склонности больных эндометриоидной болезнью к опухолевым процессам в молочных железах, эндометрии, толстой кишке и желудке.

Современные методы лечения онкологических заболеваний эффективны для пациентов на ранних стадиях. На сегодняшний день отсутствуют методы ранней диагностики как рака яичников, так и аденомиоза. Один из наиболее многообещающих подходов для решения этой проблемы сегодня предлагают высокопроизводительные и чувствительные методы клинической протеомики [12; 16-18; 20; 21].

Анализ крови - это основной и наиболее распространенный метод медицинской диагностики на сегодняшний день. Сыворотка крови является сложным объектом для исследования методами масс-спектрометрии, так как содержит значительное количество высокомолекулярных белков, солей и липидов [6; 13-15; 19]. Перед масс-спектрометрическим исследо-

ванием образец сыворотки крови следует соответствующим образом подготовить.

Различные протеомные подходы для выявления потенциальных биомаркеров предполагают использование разных методов предварительного фракционирования образцов: SELDI, фракционирование на микроколонках, фракционирование на магнитных микрочастицах.

Сравнительное масс-спектрометрическое профилирование групп образцов сыворотки крови больных и здоровых доноров позволяет находить воспроизводимые отличия между группами. Для этого полученные масс-спек-трометрические данные анализируются с помощью специальных математических алгоритмов, строятся классификационные модели и оценивается их эффективность. Эти классификационные модели могут быть использованы в дальнейшем для диагностики.

Таким образом, целью данного исследования явилось определение новых маркеров рака яичников и аденомиоза для ранней диагностики этих заболеваний.

Материалы и методы. Клиническая характеристика больных. Нами было обследовано 35 больных аденомиозом (средний возраст 40 лет), 33 больных раком яичников (средний возраст 51 год), 17 пациенток с диагнозом миома матки (средний возраст 41 год), 23 пациентки с гиперплазией эндометрия (средний возраст 43 года) и 33 практически здоровых женщин (контрольная группа, средний возраст 49 лет). Диагнозы «аденомиоз», «миома матки» и «гиперплазия эндометрия» был установлен на основании данных гистероскопии и результатов морфологического исследования, диагноз «рак яичников» - на основании данных морфологического исследования.

Образцы сывороток крови. Сыворотки крови больных аденомиозом, миомой матки, пациенток с гиперплазией эндометрия и больных раком яичников были получены из ГКБ № 64 и № 29, НМХЦ им. Н.И. Пирогова Росз-драва поликлиники № 1, РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва. В качестве контроля были использованы образцы сывороток крови практически здоровых женщин (далее «контроль»), полученные из клинико-диагностической лаборатории ООО НПФ «Литех», Москва.

Протокол получения сыворотки крови. Кровь из вены (~4 мл) собирают в пробирку без антикоагулянта, инкубируют ее при комнатной температуре в течение 1 ч, центрифугируют при 1900 G (3000 об./мин.) в течение 15 мин. (при комнатной температуре), надосадочную жидкость (сыворотку) отбирают, переносят в две предварительно промаркированные пробирки типа эппендорф по 1 мл и замораживают при -70 оС.

Обработка образцов сыворотки крови. Для фракционирования образцов сывороток крови использовали набор для профилирования, содержащий магнитные микрочастицы со слабой катионообменной поверхностью MB-WCX производства компании Bruker Daltonics (Германия). Описание этого набора

для профилирования, а также рекомендованного для него протокола фракционирования можно найти на Интернет-странице компании www.bdal.de.

Фракционирование сывороток крови проводили на специализированном роботе ClinProt robot (Bruker Daltonics, Германия), по протоколу, рекомендованному производителем магнитных микрочастиц. Элюаты смешивали с раствором матрицы в соотношении 1:15 и наносили на 384-точечную масс-спектрометрическую мишень (MTP AnchorChip 600/384 TF) в четырех повторах. В качестве матрицы использовали смесь 2,5-дигидроксибензойной кислоты (0,3 мг/мл) и альфа-цианогидроксикоричной кислоты (0,24 мг/мл) в метанол/ацетонитрил 1:1.

Времяпролетная МАЛДИ масс-спектрометрия. Масс-спектры получали с использованием времяпролетного масс-спектрометра Ultraflex (Bruker Daltonics, Германия). Десорбцию образцов осуществляли иррадиацией азотным лазером (длина волны 337 нм), работающим при частоте 25 Гц. Для удаления пиков матрицы использовали максимальный уровень подавления сигнала вплоть до 500 Да. Спектры регистрировали в линейном режиме положительно заряженных ионов в диапазоне масс 0,6-12 кДа. Для калибровки использовали калибровочную смесь, содержащую пептиды и белки в диапазоне масс 1-17 кДа. Для увеличения чувствительности детекции избыток матрицы удаляли 8 импульсами лазера при мощности 60% с последующей аккумуляцией данных при мощности лазера 45%. Для каждого спектра суммировали результаты 720 лазерных импульсов (по 60 импульсов с 12 различных точек пятна). Суммировали спектры с отношением сигнал/шум > 5 и разрешением > 300.

Анализ масс-спектрометрических данных. Масс-спектрометрические данные анализировали с использованием компьютерной программы Clin-ProTools 2.1 (Bruker Daltonics, Германия). Математические модели для классификации масс-спектров смеси пептидов и белков, полученных после фракционирования образцов сыворотки крови, строили на основе Генетического алгоритма (ГА) и Обучаемой нейронной сети (Supervised Neural Network, ОНС).

Для построения классификационных моделей наборы масс-спектро-метрических профилей каждой из групп «контроль» и «рак яичников» разбивали на две подгруппы, одну пару использовали для построения классификационной модели, а вторую - для ее валидации. МС профили образцов сыворотки крови групп «аденомиоз», «миома матки» и «гиперплазия эндометрия» использовали для определения специфичности построенной модели по отношению к этим патологиям.

Результаты. Фракционирование сывороток крови с использованием магнитных микрочастиц MB-WCX. На основании масс-спектрометрического профилирования образцов сыворотки крови пациенток с раком яичников и практически здоровых доноров после их фракционирования на магнитных

микрочастицах со слабой катионообменной поверхностью (МБ^СХ) были построены классификационные модели с использованием обоих математических алгоритмов. При использовавшихся параметрах обработки масс-спектров в них воспроизводимо детектировали 165 пиков. После изучения вклада площадей отдельных пиков в классификационные модели 4 пика были выделены как наиболее значимые для специфичности и чувствительности моделей.

Для оценки достоверности построенных моделей были использованы образцы сыворотки крови групп «рак яичников» (16) и «контроль» (16), не использовавшихся для построения классификационных моделей. Значения чувствительности и специфичности построенных математических моделей классификации приведены в табл. 1.

Таблица 1

Значения чувствительности и специфичности, полученные при внешней валидации классификационных моделей масс-спектрометрических профилей образцов сыворотки крови пациенток с раком яичников и практически здоровых доноров

Генетический алгоритм Обучаемая нейронная сеть

чувствительность специфичность чувствительность специфичность

100% 100% 93% 100%

Примечание: чувствительность - процент правильно идентифицированных сывороток крови группы «рак яичников»; специфичность - процент правильно идентифицированных сывороток крови группы «контроль»

Анализ статистических диаграмм девиации площадей масс-спектро-метрических пиков у сравниваемых групп образцов позволил выявить 4 пика, пересечение диапазонов девиации площадей которых между группами составляет менее 50% (рис. 1). Подобные пики не соответствуют высокоспецифичным маркерам, поскольку при значениях их площадей, существенно отличающихся от среднего для группы, ни один из них не позволяет однозначно отнести образцы к конкретной экспериментальной группе. Однако сочетания таких пиков в классификационных моделях могут давать довольно высокие значения специфичности и чувствительности.

Масс-спектрометрические профили образцов сыворотки крови групп «рак яичников» и «контроль», фракционированных с использованием магнитных микрочастиц MB-WCX, представлены на рис. 2.

При проверке специфичности построенной модели по отношению к масс-спектрометрическим профилям образцов сыворотки крови пациенток с аденомиозом, миомой матки и гиперплазией эндометрия были получены значения 22,6, 41,2 и 45,5% соответственно.

Рис. 1

Рис. 2

Обсуждение результатов. Привлекательность использования плазмы (сыворотки) крови для диагностики различных заболеваний человека обу-

словлена, главным образом, тем обстоятельством, что она наиболее полно представляет фенотип человека, его состояние в конкретный момент времени. Еще одно немаловажное достоинство плазмы (сыворотки) крови - ее доступность, поскольку она является наиболее распространенным в медицинской практике первичным клиническим образцом.

На сегодняшний день нет однозначного ответа на вопрос, в какой связи находятся регистрируемые в сыворотке крови изменения пептидно-белковых паттернов с исследуемым патологическим процессом в организме. Предполагается, что эти изменения могут отражать реальные колебания концентраций белков и пептидов, напрямую ассоциированных с заболеванием, но, с другой стороны, нельзя исключить и возможность их возникновения, например, в результате вызванных патологией отклонений в процессах свертывания крови ex vivo при получении из нее сыворотки.

С нашей точки зрения, диагностическая ценность найденных сигнатур не зависит от природы их возникновения при условии строгой воспроизводимости их появления в сыворотке крови больных. Ранее было показано, что процедура получения сыворотки, а именно длительность временной задержки до отделения сыворотки от образовавшегося сгустка в процессе свертывания крови не влияет на ее масс-спектрометрический профиль.

Полученные результаты открывают новые перспективы для разработки методов ранней диагностики рака яичников, эндометриоза и аденомиоза, что особенно важно в условиях роста данных патологий за последние годы, а также выявления их в более молодом возрасте.

В наших ближайших планах стоит задача по построению более специфичной по отношению к раку яичников и другим гинекологическим заболеваниям классификационной модели, способной дифференцировать рак от гинекологических заболеваний не онкологической природы, а также идентификация потенциальных маркеров рака яичников и аденомиоза методом тандемной масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением, сопряженной с обращено-фазовой жидкостной нано-хроматографией.

ЛИТЕРАТУРА

[1] Адамян Л.В., Кулаков В.И., Андреева Е.Н. Эндометриозы. - 2-е изд. - М.: Медицина, 2006.

[2] Адамян Л..В., Андреева Е.Н. Генитальный эндометриоз: этиопатогенез, клиника, диагностика, лечение: Метод. пособ. для врачей. - М., 2001.

[3] Адамян Л..В., Спицын В.А., Андреева Е.Н. Генетические аспекты гинекологических заболеваний: Руководство для врачей. - М., ГЕОТАОР-Медиа, 2008.

[4] Баскаков В.П., Цвелев Ю.В., Дячук А.В. Вопросы этиологии и патогенеза эндометриоза (эндометриоидная болезнь и рак) // Мат-лы научно-практ. конф. «Новые подходы к скринингу, диагностике и лечению опухолей яичников». - Великий Новгород, 2001. - С. 76.

[5] Зиганшин Р.Х., Алексеев Д.Г., Арапиди Г.П., Иванов В. Т., Мошковский С.А., Говорун В.М. Поиск потенциальных биомаркеров рака яичников в сыворотке крови // Биомедицинская химия. - 2008. - Vol. 54. - С. 408-419.

[6] Ильина Е.Н., Говорун В.М. Масс-спектрометрия нуклеиновых кислот в молекулярной медицине // Биоорганическая химия. - 2009. - № 2. - Vol. 35. - С. 1-16.

[7] Ищенко А.И., Кудрина Е.А. Эндометриоз: современные аспекты. - М.: Медицинское информационное агенство, 2008. - С. 3-11.

[8] Коган Е.А., Демура Т.А., Низяева Н.В., Ежова Л.С., Унанян А.Л., Сидорова И.С. Экспрессия онкомаркеров в очагах аденомиоза: клинико-морфологическое и им-муногистохимическое исследование // Онкология. - 2009. - Т. 10. - С. 524-541.

[9] Сорокина А.В., Оразмурадов А.А., Паенди Ф.А. Генетические детерминанты аденомиоза с позиции доказательной медицины // Вестник РУДН. Сер. «Медицина. Акушерство и гинекология». - 2009. - № 5. - С. 197-206.

[10] Сорокина А.В., Тотчиев Г.Ф., Токтар Л.Р. Современные подходы к диагностике аденомиоза // Вестник РУДН. Сер. «Медицина. Акушерство и гинекология». -2010. - № 5. - С. 181.

[11] Радзинский В.Е., Сорокина А.В., Жилина Н.В., Морозов С.Г. Иммунологические детерминанты аденомиоза с позиции доказательной медицины // Вестник РУДН. Сер. «Медицина. Акушерство и гинекология». - 2010. - № 6. - С. 138-144.

[12] Anderson N.L., Anderson N.G. The human plasma proteome: History, Character, and

Diagnostic Prospects // Molecular & Cellular Proteomics. - 2002. - № 1. - Р. 845-867.

[13] Baumann S., Ceglarek U., Fiedler G.M., Lembcke J., Leichtle A., Thierya J. Standardized Approach to Proteome Profiling of Human Serum Based on Magnetic Bead Separation and Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry // Clinical Chemistry. - 2005. - Vol. 51. - P. 973-980.

[14] Geho D.H., Liotta L.A., Petricoin E.F., Zhao W., Araujo R.P. The amplified peptidome: the new treasure chest of candidate biomarkers // Current Opinion in Chemical Biology. - 2006. - Vol. 10. - P. 50-55.

[15] Hammer B., Strickert M., Villmann T. Supervised Neural Gas with General Similarity Measure // Neural Processing Letters. - 2005. - Vol. 21. - P. 21-44.

[16] Nossov V., Amneus M., Su F., Lang J., Janco J.M.T., Reddy S.T., Farias-Eisner R. The early detection of ovarian cancer: from traditional methods to proteomics. Can we really do better than serum CA-125? // American Journal of Obstetrics & Gynecology. - 2008. -№ 9. - P. 216-223.

[17]Petricoin E.F., Ardekani A.M., Hitt B.A., Levine P.J., Fusaro V.A., Steinberg S.M., Mills G.B., Simone C., Fishman D.A., Kohn E.C., Liotta L.A. Use of proteomic patterns in serum to identify ovarian cancer // Lancet. - 2002. - Vol. 359. - P. 572-577.

[18] Sen-Yung Hsieh, Ren-Kung Chen, Yi-Hsin Pan andHai-Lun Lee. Systematical evaluation of the effects of sample collection procedures on low-molecular-weight serum/plasma proteome profiling // Proteomics. - 2006. - № 6. - Р. 3189-3198.

[19] Tammen H., Schulte I., Hess R., Menzel C., Kellmann M., Mohring T., Schulz-Knappe P. Peptidomic analysis of human blood specimens: comparison between plasma specimens and serum by differential peptide display // Proteomics. - 2005. - № 5. - Р. 3414-3436.

[20] Tiss A., Smith C., Camuzeaux S., KabirM., Gayther S., Menon U., WaterfieldM., Timms J., Jacobs I., Cramer R. Serum Peptide Profiling using MALDI Mass Spectrometry: Avoiding the Pitfalls of Coated Magnetic Beads using Well-established ZipTip Technology // Proteomics. - 2007. - № 7. - Р. 77-89.

[21] West-Norager M., Kelstrup C.D., Schou C., Hogdall E.V., Hogdall C.K., Heegaard N.H. Unravelling in vitro variables of major importance for the outcome of mass spectromet-ry-based serum proteomics // Journal of Chromatography B. - 2007. - Vol. 847. -P. 30-37.

[22] Zhang Z., Bast R.C.Jr, Yu Y. Three biomarkers identified from serum proteomic analysis for the detection of early stage ovarian cancer // Cancer Res. - 2004. - Vol. 64. -P.5882-5890.

THE SEARCH OF POTENTIAL SERUM BIOMARKERS OF SOCIAL-IMPORTANT DISEASES WITH MALDI-TOF MASS SPECTROMETRY

A.V. Sorokina, V.E. Radzinsky

Department of Obstetrics and Gynecology with the course of Perinatology People's Friendship University of Russia M.-Maklaya Str., 8, Medical faculty, 117198 Russia, Moscow

R.H. Ziganshin, G.P. Arapidi

Shemyakin and Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry Russian Academy of Sciences M.-Maklaya Str., 16/10, 117997Russia, Moscow

Fractionation of blood serum samples from 33 healthy donors (average age of 49), 33 ovarian-cancer patients (average age of 51, diagnosed stages I-IV), 35 patients with adenomyosis (average age of 40), 17 patients with hysteromyoma, and 23 patients with endometrial hyperplasia (average age of 43) using magnetic beads with weak cation-exchange surface (MB-WCX) and subsequent MALDI-TOF MS analyses of obtained fractions have been done. MS data analyses using different classification algorithms (Genetic algorithm and Supervised Neural Network) allowed generating classification model showing 100% specificity and sensitivity in capacity of differentiating of MS profiles of serum samples from healthy donors and patients with ovarian cancer. In this classification model were included MS peaks with the following m/z values: 1570, 2068, 2114, 3138, 3263, 3524, 3536. The specificity of generated classification model towards MS profiles of serum samples from patients with adenomyosis, hysteromyoma, and endometrial hyperplasia, were 22,6, 41,2 and 45,5%, consequently.

Key words: adenomyosis, ovarian cancer, MALDI-TOF Mass Spectrometry.