СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ БАКТЕРИЙ РОДА PSEUDOMONAS
METHOD OF IDENTIFYING PSEUDOMONAS BACTERIA

Изобретение относится к области микробиологии. Может быть использовано при бактериологических исследованиях по идентификации бактерий рода Pseudomonas и производстве питательных сред для этих исследований.
Известен способ идентификации бактерий рода Pseudomonas на основе их уникальной чувствительности к ионам бария. Явление избирательной барийчувствительности бактерий рода Pseudomonas впервые обнаружено нами (Сиволодский Е.П. Патент №1296577 Российской Федерации на изобретение "Средство для селективного подавления роста бактерий рода Pseudomonas", приоритет от 21 мая 1985 г., заявка №3900215\28-13, зарегистрировано в Государственном реестре изобретений 16.04.1993 г.). На основе избирательной барийчувствительности псевдомонад нами был разработан способ идентификации бактерий рода Pseudomonas (Сиволодский Е.П. Тест идентификации бактерий рода Pseudomonas. - Лабораторное дело. - 1988. - №11. - С.64-65). По этому способу использовали питательный агар из гидролизата рыбы производства Дагестанского НИИ питательных сред. Исследуемую культуру бактерий (часть колонии со среды первичного посева, бульонную или агаровую суточную культуры) наносили петлей радиальным штрихом на сектор питательного агара с хлоридом бария (2 г/л). Агаровую культуру брали в небольшом количестве и тщательно растирали, чтобы не осталось видимых следов. Таким же образом наносили исследуемую культуру на тот же питательный агар без хлорида бария (контроль). Посевы выращивали при 37°С в течение 18-24 ч, после чего учитывали результат: отсутствие роста бактерий на питательной среде с хлоридом бария при наличии их роста на контрольной среде указывало на принадлежность бактерий к роду Pseudomonas.
90
Исследованиями других авторов на широком наборе видов псевдомонад была подтверждена избирательная чувствительность к ионам бария бактерий рода Pseudomonas (Киприанова Е.А., Бойко О.И. Чувствительность к ионам бария и ЭДТА как таксономический маркер рода Pseudomonas. - Mикpoбиoлoгия. - 1992. - T.61. - №3. - C.508-513). Чyвcтвитeльнocть бактерий к хлориду бария и нитрату бария изучали на чашках с мясопептонным агаром (производитель не указан). Чашки засевали одномиллиардной суспензией суточных культур бактерий с помощью репликатора. Наличие или отсутствие роста бактерий учитывали после 24 ч инкубации при 28°С. Установлено, что для видов псевдомонад 1-й группы рРНК-гомологии (род Pseudomonas по современной классификации) МПК хлорида бария (г/л): P.aeruginosa 0,5-10,0; P.putida 0,5-5,0; P.fluorescens 0,5-5,0; P.fragi 5,0-10,0; при этом 90% штаммов псевдомонад подавлялись хлоридом бария в концентрациях до 5 г/л включительно (МПК -5 г/л). Прочие виды бактерий, относящиеся ранее к псевдомонадам, имели МПК хлорида бария 20-50 г/л. В монографии (Смирнов В.В., Киприанова Е.А. Бактерии рода Pseudomonas. - Киев: Наукова думка, 1990. - 264 с.) тест чувствительности к ионам бария в концентрации 10 г/л указан как ключевой для идентификации бактерий рода Pseudomonas, однако не указана питательная среда для его постановки.
Из приведенных аналогов выбран прототипом способ, используемый в статье Киприановой Е.А., Бойко О.И. (Микробиология. - 1992. - Т.61. - №3. - С.508-513), так как он наиболее близок к заявляемому способу по совокупности существенных признаков (посев из одномиллиардной суспензии бактерий, инкубация посевов при 28°С).
Недостатками прототипного способа и других аналогов являются:
- отсутствие стандартности исследования ввиду использования для определения барийчувствительности бактерий различных питательных сред из естественного сырья (гидролизатов рыбы, пептона) с неопределенным составом субстратов, связующих ионы бария, что обусловливает различную аналитическую чувствительность способа;
- необходимость стерилизации используемой питательной среды в паровом стерилизаторе при 121°С.
Целью изобретения является повышение стандартности и упрощение исследования по идентификации бактерий рода Pseudomonas.
2
2
2
4
2
4
2
2
В соответствии с изобретением поставленная цель достигается тем, что исследуемые суточные агаровые культуры вносят по одной петле диаметром 2 мм в 0,2 мл стерильного 0,85% раствора хлорида натрия в лунке стерильного планшета, перемешивают и засевают по одной петле одномиллиардной взвеси бактерий радиальным штрихом на сектор питательной среды, содержащей ионы хлорида бария, и той же питательной среды без хлорида бария (контроль), при этом используют синтетическую питательную среду следующего состава ингредиентов, г/л: L-пролин - 1,0-3,0; L-глютамат натрия или L-глютамин - 1,0-3,0; NaCl - 5,0; MgCl·6HO - 0,05; KHPO - 0,05; KHPO - 0,1; агар бактериологический - 15,0; вода дистиллированная - 1 литр; pH - 7,2±0,2; суплемент хлорид бария (ВаСl·2НO) - 6,0-16,0; при этом ингредиенты, кроме хлорида бария, растворяют при нагревании, кипятят среду в течение 5 минут, разливают часть готовой среды в стерильные чашки Петри (контрольная питательная среда без ионов бария), в оставшуюся часть горячей питательной среды вносят расчетное количество хлорида бария по указанной прописи, перемешивают, разливают в стерильные чашки Петри (питательная среда с ионами бария); инкубируют посевы при 28°С в течение 24 ч, после чего идентифицируют бактерии рода Pseudomonas по отсутствию роста бактерий на питательной среде с ионами бария при наличии роста бактерий на той же среде без ионов бария, при этом наличие желто-зеленой флуоресценции газона бактерий и окружающей его питательной среды выявляет группу флуоресцирующих псевдомонад. При росте бактерий на обеих питательных средах они относятся к прочим родам; при отсутствии роста на обеих питательных средах бактерии относятся к ауксотрофным видам прочих родов бактерий.
Примечание. Биологический контроль качества питательной среды заявляемого способа проводят при первом изготовлении среды и изменении серии любого ее компонента. Для контроля применяют штамм Pseudomonas aeruginosa АТСС 27853, используемый в бактериологических лабораториях для контроля определения чувствительности псевдомонад к антибиотикам. Применяют среды с тремя концентрациями хлорида бария (0,5; 1,0; 2,0 г/л) и контрольную среду без хлорида бария. Методика приготовления синтетической питательной среды с ионами бария и без ионов бария, а также методика испытания бактерий указаны выше. Качество питательной среды соответствует требованиям, если контрольный штамм P.aeruginosa АТСС 27853 будет иметь при испытании МПК хлорида бария 1 г/л и на контрольной среде без хлорида бария наблюдается его пышный рост с продукцией флуоресцеина. Срок годности готовых питательных сред в чашках Петри 7 суток при хранении от +4 до +8°С.
Отличительный существенный признак способа - использование в качестве питательной среды для определения барийчувствительности синтетической питательной среды указанного выше состава, содержащей в качестве источника азота и углерода только аминокислоты L-пролин (1,0-3,0 г/л) и L-глютамат натрия или L-глютамин (1,0-3,0) при минимальном количестве солей и источник ионов бария хлорид бария в интервале 6,0-16,0 г/л.
Отличительный существенный признак способа не применялся в прототипе, аналогах и не известен из уровня техники.
4
2
4
Отличительный существенный признак не следует явным образом из уровня техники. Состав синтетической питательной среды заявляемого способа разработан на основании результатов наших экспериментов по изучению профилей утилизации 20 белковых аминокислот в качестве единственного источника азота и углерода псевдомонад, выполненных на 100 штаммах P.aeruginosa, 40 штаммах P.putida, 24 штаммах P.fluorescens, 5 штаммах P.alcaligenes, 5 штаммах P.pseudoalcaligenes, включая типовые штаммы, а также на типовых штаммах 8 других видов псевдомонад (P.clororaphis, P.aureofaciens, P.aurantiaca, P.stutzeri, P.mendocina, P.fragi, P.oryzih abitans, P.luteola). Результаты, еще неопубликованные, показали, что все виды и штаммы флуоресцирующих псевдомонад используют в качестве единственного источника азота и углерода L-глютаминовую кислоту (L-глютамат натрия), L-глютамин, L-пролин, в то время как некоторые виды и штаммы нефлуоресцирующих псевдомонад (P.stutzeri, P.alcaligenes, P.pseudoalcaligenes) вариабельны по этим аминокислотам, но при сочетании двух из них (L-пролина и L-глютамата натрия или L-глютамина) обеспечивается рост всех исследуемых штаммов псевдомонад. Это обеспечивает замену указанными аминокислотами минеральных источников азота в известных синтетических питательных средах, например NHHPO в среде Козера, используемой для выделения псевдомонад (Смирнов В.В., Киприанова Е.А. Бактерии рода Pseudomonas. - Киев: Наукова думка, 1990. - С.221), что снижает связывание ионов бария и повышает аналитическую чувствительность среды. Синтетическая питательная среда Козера вообще не пригодна для определения барийчувствительности псевдомонад, так как при любом органическом источнике углерода не обеспечивает роста всех видов и штаммов псевдомонад.
Отличительный существенный признак способа непосредственно определяет достижение поставленной цели:
1. Повышается стандартность исследования ввиду замены питательных сред прототипного способа и аналогов, содержащих гидролизаты или пептоны неопределенного состава, синтетической питательной средой точно воспроизводимого состава; достигается воспроизводимость показателей барийчувствительности псевдомонад и других бактерий, определяющих диагностически значимый интервал концентраций хлорида бария в питательной среде (6-16 г/л), при котором все штаммы псевдомонад подавляются и все штаммы прочих родов бактерий растут, при воспроизводимости роста всех штаммов псевдомонад на той же питательной среде без хлорида бария (контроль). Указанные характеристики питательной среды были воспроизводимы при трехкратном повторении (табл.1 и табл.2)
2. Исследование упрощается ввиду исключения стерилизации питательной среды заявляемого способа в паровом стерилизаторе при 121°С, так как синтетическая питательная среда заявляемого способа не допускает роста посторонних ауксотрофных бактерий, в том числе аэробных спорообразующих бактерий. Для изготовления и приготовления питательной среды достаточно кипятить (100°С) ее в течение 5 минут и сразу же добавить хлорид бария, что уничтожает все вегетативные формы бактерий. Возможно сохранение спор анаэробных и аэробных спорообразующих бактерий, однако споры анаэробов не прорастают в аэробных условиях исследования, споры аэробов рода Bacillus не прорастают, так как являются ауксотрофами и не могут расти на минимальной синтетической среде. Опыт использования питательной среды заявляемого способа, обеспложенной только кипячением в течение 5 минут, показал отсутствие прорастания среды посторонней микрофлорой во всех случаях инкубации посевов псевдомонад при экспериментах на средах с хлоридом бария и без хлорида бария в течение 24-48 ч при 28°С (200 чашек Петри) и инкубации незасеянной среды в чашках Петри при 28°С и 37°С в течение 7 суток (20 чашек). Питательная среда заявляемого способа, стерилизованная в паровом стерилизаторе при 121°С в течение 20 минут или обеспложенная кипячением в течение 5 минут, имеет одинаковые показатели барийчувствительности псевдомонад при обязательном условии внесения хлорида бария в горячую среду сразу после стерилизации или после кипячения.
Дополнительными техническими результатами способа, обусловленными его отличительным признаком, являются:
- повышение аналитической чувствительности заявляемого способа в сравнении с прототипом и другими аналогами - минимальная подавляющая рост концентрация хлорида бария для 90% изученных штаммов псевдомонад на питательной среде заявляемого способа равна 2 г/л (МПК90 - 2 г/л) при диапазоне подавляющих концентраций хлорида бария для видов псевдомонад 0,5-6 г/л (табл.1); на мясопептонном агаре прототипного способа МПК90 - 5 г/л хлорида бария при диапазоне МПК хлорида бария для видов псевдомонад 0,5-10 г/л; на питательном агаре для культивирования микроорганизмов (ГРМ - агар) производства научно-производстенного центра генно-инженерных препаратов г.Оболенск МПК90 - 4 г/л при диапазоне МПК 2-6 г/л (табл.1); на питательной среде Мюллера - Хинтона для определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам (производства фирмы Hi - Меdia, Индия) МПК90 - 6 г/л при диапазоне МПК 2-10 г/л (табл.1); на питательной среде для определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам (среда АГВ) производства НПО Питательные среды г.Махачкала МПК90 - 10 г/л при диапазоне МПК хлорида бария 8-14 г/л;
- выявление синтеза флуоресцеина у 86,1% штаммов флуоресцирующих видов псевдомонад на контрольной среде заявляемого способа (без хлорида бария), что исключает необходимость данного исследования при дальнейшей видовой идентификации псевдомонад (табл.1);
- выявление ауксотрофных штаммов прочих родов бактерий, которые не растут на контрольной среде заявляемого способа (без хлорида бария), что исключает необходимость проведения данного исследования при дальнейшей видовой идентификации прочих родов бактерий (табл.2).
7
Существенными признаками заявляемого способа являются также посевная доза исследуемой культуры, температура и время инкубации. При посеве на питательную среду заявляемого способа 1 петли диаметром 2 мм взвеси бактерий, полученной при разведении одной петли суточной агаровой культуры в 0,2 мл 0,85% раствора хлорида натрия, обеспечивается посевная доза 1-2·10 КОЕ, что достаточно для пышного роста всех штаммов псевдомонад на контрольной среде (без хлорида бария) и роста всех штаммов прочих родов бактерий (кроме ауксотрофов). Инкубацию посевов следует проводить при 28°С, так как этот режим обеспечивает рост всех видов псевдомонад и прочих родов бактерий; инкубация при 35-37°С подавляет рост некоторых видов психротрофных псевдомонад и значительно угнетает продукцию флуоресцеина псевдомонадами. Посевы бактерий достаточно инкубировать в течение 24 ч, что обеспечивает рост всех штаммов бактерий.
Примеры, подтверждающие возможность осуществления способа
Пример 1. Исследуемый материал - суточные агаровые культуры бактерий №1 и №2, выделенные от больных с раневой инфекцией, вносят по одной петле диаметром 2 мм в лунки стерильного планшета, содержащие по 0,2 мл 0,85% раствора хлорида натрия, перемешивают, засевают по одной петле взвеси бактерий радиальным штрихом на сектора контрольной питательной среды с L-пролином 1 г/л и L-глютаматом натрия 1 г/л (остальной состав и методика приготовления среды по примечанию к примеру 1) и сектора питательной среды того же состава, содержащей дополнительно хлорид бария 6 г/л (среда с ионами бария), инкубируют посевы в течение 24 ч при 28°С, после чего учитывают рост бактерий на средах и идентифицируют культуры: отсутствие роста бактерий культуры №1 на питательной среде с ионами бария при наличии их роста на контрольной среде без ионов бария с появлением желто-зеленой флуоресценции газона бактерий и окружающей его среды указывает на принадлежность бактерий культуры №1 к роду Pseudomonas группе флуоресцирующих видов псевдомонад; наличие роста бактерий культуры №2 на обеих питательных средах указывает, что она принадлежит к другим родам бактерий. Посторонней микрофлоры на питательных средах не обнаружено.
2
2
2
4
2
4
Примечание к примеру 1. Методика приготовления питательной среды заявляемого способа. В 1 л дистиллированной воды вносят сухую смесь ингредиентов, содержащую (г/л): L-пролин - 1,0; L-глютамат натрия - 1,0; NaCl - 5,0; MgCl·6HO - 0,05; КНРO - 0,05; КНРO - 0,1; агар бактериологический - 15,0; pH - 7,2±0,2; растворяют при нагревании до кипения, кипятят в течение 5 минут, разливают часть среды в стерильные чашки Петри (контрольная среда без ионов бария), в оставшуюся часть горячей среды вносят хлорид бария из расчета 6 г/л, перемешивают, разливают в стерильные чашки Петри (питательная среда с ионами бария). Питательные среды в чашках Петри пригодны к использованию в течение 7 суток при хранении от +4 до +8°С. Контроль новой партии питательной среды - обнаружение у контрольного штамма P.aeruginosa АТСС 27853 МПК хлорида бария 1 г/л и продукции флуоресцеина на контрольной среде без хлорида бария при изучении по методике примера 1.
Пример 2. Исследуемый материал - суточную агаровую культуру бактерий №3, выделенную из пищевых продуктов, вносят петлей диаметром 2 мм в лунку планшета, содержащую 0,2 мл 0,85% раствора хлорида натрия, перемешивают, засевают по одной петле взвеси бактерий радиальным штрихом на сектор контрольной питательной среды с L-пролином 3 г/л и L-глютаматом натрия 3 г/л (остальной состав и методика приготовления среды по примечанию к примеру 1) и на сектор среды того же состава, содержащей дополнительно хлорид бария 16 г/л (среда с ионами бария); инкубируют посевы в течение 24 ч при 28°С, после чего учитывают рост бактерий и идентифицируют культуру: отсутствие роста бактерий культуры №3 на питательной среде с ионами бария при наличии их роста на контрольной среде без ионов бария указывает на принадлежность бактерий культуры №3 к роду Pseudomonas. Посторонней микрофлоры на питательных средах не обнаружено.
Пример 3. Исследуемый материал - суточные агаровые культуры бактерий №4 и №5, выделенных из воды реки Невы, вносят петлей диаметром 2 мм в лунки планшета, содержащие по 0,2 мл 0,85% раствора хлорида натрия, перемешивают, засевают по одной петле взвеси бактерий радиальным штрихом на сектора контрольной питательной среды с L-пролином 1 г/л и L-глютамином 1 г/л (остальной состав и методика приготовления среды по примечанию к примеру 1) и на сектора питательной среды того же состава, содержащей дополнительно хлорид бария 6 г/л (питательная среда с ионами бария), инкубируют посевы в течение 24 ч при 28°С, после чего учитывают рост бактерий и идентифицируют культуры: отсутствие роста бактерий культуры №4 на питательной среде с ионами бария при наличии их роста на контрольной среде без ионов бария указывает на принадлежность бактерий культуры №4 к роду Pseudomonas; отсутствие роста бактерий культуры №5 на обеих питательных средах указывает, что она является ауксотрофным видом других родов бактерий. Посторонней микрофлоры на питательных средах не обнаружено.
Пример 4. Исследуемый материал - суточную агаровую культуру бактерий №6, выделенную из отделяемого раны, вносят петлей диаметром 2 мм в лунку планшета, содержащего 0,2 мл 0,85% раствора хлорида натрия, перемешивают, засевают по одной петле взвеси бактерий радиальным штрихом на сектор контрольной питательной среды с L-пролином 3 г/л и L-глютамином 3 г/л (остальной состав и методика приготовления среды по примечанию к примеру 1) и на сектор среды того же состава, содержащей дополнительно хлорид бария 16 г/л (питательная среда с ионами бария), инкубируют посевы в течение 24 ч при 28°С, после чего учитывают рост бактерий и идентифицируют культуру: отсутствие роста бактерий культуры №6 на питательной среде с ионами бария при наличии их роста на контрольной среде без ионов бария с появлением желто-зеленой флуоресценции газона бактерий и окружающей его среды указывает на принадлежность бактерий культуры №6 к роду Pseudomonas группе флуоресцирующих видов псевдомонад. Посторонней микрофлоры на питательных средах не обнаружено.
Таким образом, при всех предельных концентрациях ингредиентов питательной среды заявляемого способа получены четкие достоверные результаты родовой идентификации бактерий Pseudomonas, выявления продукции флуоресцеина псевдомонадами, выявления ауксотрофности у прочих родов бактерий при отсутствии роста на средах посторонней микрофлоры.
Синтетическая питательная среда заявляемого способа стандартна по составу, позволяет получать воспроизводимые результаты идентификации псевдомонад с более высокой аналитической чувствительностью, чем другие среды этого предназначения, более проста по методике приготовления.