Набор олигонуклеотидных праймеров и зондов для выявления Herpesvirus Saimiri в клеточных культурах методом ПЦР в реальном времени
SET OF OLIGONUCLEOTIDE PRIMERS AND PROBES FOR IDENTIFYING HERPESVIRUS SAIMIRI IN CELL CULTURES BY MEANS OF PCR IN REAL TIME

Herpesvirus Saimiri
Изобретение относится к области молекулярной биологии и может быть использовано в исследовательских целях для детекции в клеточных культурах или ином биоматериале латентной инфекции герпесвирусом .
Создание персонализированных генетически модифицированных лимфоидных линий для терапии онкологических заболеваний сопряжено с трудностями достижения эффективной трансдукции первичных культур Т-лимфоцитов и поддержания их стабильного роста. Решением проблемы может быть использование Гамма-2 герпесвируса Herpesvirus saimiri (HVS), способного инфицировать Т-лимфоциты человека и вызывать их иммортализацию с сохранением клеточного фенотипа и нормальной функциональной активности. Природным резервуаром вируса H. saimiri являются беличьи обезьяны (Saimiri sciureus), в которых вирус не вызывает каких-либо заболеваний. Заражение герпесвирусом обезьян других видов приводит к скорой гибели животных в результате развития лимфом.
Секвенирование генома вируса выявило схожесть H. saimiri с человеческим герпесвирусом Эпштейна-Барр. Генетический материал H. saimiri содержит единственный протяжённый кодирующий участок ДНК, включающий 76 открытых рамок считывания. Терминальная часть кодирующего региона ДНК является ключевой в реализации патогенности вируса и трансформации Т-лимфоцитов. На основании вариабельности данного участка выделяют три различных штамма H. saimiri A, B и С, где штамм С является наиболее онкогенным. Герпесвирус штамма С488 способен инфицировать и иммортализовать Т-лимфоциты человека. HVS персистирует в иммортализованных Т-лимфоцитах в латентной форме в виде внехромосомных ядерных кольцевых эписом с сохранением транскрипции несколько вирусных генов, в том числе гена Tip. Наработки вирулентных вирусных частиц клетками не происходит.
На данный момент для Т-лимфоцитов неизвестны случаи перехода инфекции из латентной в литическую, что делает этот метод сравнительно безопасным и удобным в использовании, например, при кокультивации трансдуцированных лимфоцитов с другими клетками или при реинфузии в организм. В лабораторной практике для наработки вирусных частиц и получения рекомбинантных производных герпесвируса целесообразно использовать другие человеческие клеточные линии, в том числе опухолевые, например, А549, и клеточные линии обезьян (ОМК, Vero), пермиссивные к инфекции HVS. Инфекция клеточной линии А549, как правило, протекает в латентной форме с периодическим переходом в литическую с образованием вирулентных вирусных частиц. Инфекция клеточных линий обезьян всегда литическая.  Клетки типа А549 удобно использовать при получении рекомбинантных вирусных частиц с заданными генетическими конструкциями для последующей доставки и экспрессии в Т-лимфоцитах. Для этого линию А549 инфицируют HSV и трансфицируют плазмидой, кодирующей целевую генетическую конструкцию, фланкированную последовательностями, гомологичными участкам генома герпесвируса. Латентно-заражённые рекомбинатным герпесвирусом клетки затем культивируют совместно с клеточными линиями обезьян, например, ОМК, что приводит к образованию высоких титров рекомбинатных вирусных частиц, пригодных для трансдукции Т-лимфоцитов. Необходимость контроля эффективности распространения в культуре латентной инфекции как на стадии получения латентно-инфицированных А549, так и при получении иммортализованных Т-лимфоцитов обусловило поиск способов и разработку материалов для осуществления диагностики герпесвирусной инфекции.
В лабораторной и клинической практике наиболее оптимальными способами определения инфекции являются иммуноферментный анализ и метод количественной полимеразной цепной реакции (кПЦР). Иммуноферментный анализ направлен на определение уровней белкового продукта экспрессии специфического для инфекционного агента гена, тогда как кПЦР позволяет определить количества присутствующей в пробе биоматериала мРНК, транскрибированной со специфического гена. Иммуноферментный анализ более трудоемок в исполнении и чаще используется для детекции секретируемых из клеток белков, нежели для внутриклеточных. Метод количественной ПЦР позволяет эффективно и быстро выявить наличие в пробе чужеродной мРНК и идеально подходит для диагностики латентной вирусной инфекции.
В качестве ближайшего аналога можно рассматривать  праймеры для амплификации нуклеотидных последовательностей вируса ORF71, ORF72 и ORF73 методом ПЦР /заявка EP1151122A1, C12N 15/86, опубл. 24.08.2000 г. Заявка описывает регуляторный участок нуклеотидной последовательности H. saimiri, ассоциированный с сохранением латентного состояния герпесвируса в клетке, но при этом не упоминаются какие-либо олигонуклеотидные последовательности к гену Tip (ORF1), а также их использование в целях диагностики герпесвирусом.
Технической проблемой, на решение которой было направлено заявленное изобретение, является эффективная и специфичная диагностика латентной инфекции H. saimiri штамма С488 в клеточных культурах.
Техническим результатом изобретения является разработанный  набор олигонуклеотидов для детекции и количественной оценки присутствия генетического материала Herpesvirus Saimiri штамма С488, либо его модифицированных производных (латентной инфекции) в клеточных культурах, включающий праймеры и флуоресцентномеченные зонды следующих нуклеотидных последовательностей: SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6. Количественное определение уровней заражения HVS достигается за счёт использования флуоресцентномеченного зонда, позволяющего проводить контроль динамики накопления флуоресцентного продукта реакции в режиме реального времени. Зондом (проба, probe) в методике ПЦР в реальном времени называют олигонуклеотид, к которому присоединены молекула флуорофора (карбоксифлуоресцеин (FAM)) и молекула гасителя флуоресценции (Black Hole Quenchers (BHQ)). В качестве мишени, к которой подобраны праймеры и зонды, использован вирусный ген Tip, транскрипция с которого сохраняется при латентном инфицировании клеток H. saimiri.
Проведенные исследования патентной литературы позволили заключить, что заявленный технический результат не имеет полных аналогов и обладает конкурентными преимуществами.
Разработанный набор олигонуклеотидов применяют следующим образом. Собирают образцы клеточных культур, инфицированных вирусом, выделяют и очищают РНК из образцов. Получение чистого препарата РНК включает стадии лизиса клеток, фенол-хлороформной экстракции РНК и ее очистки от солей и белков. Использование специальных коммерчески доступных колонок является альтернативным, удобным и эффективным вариантом получения чистого препарата РНК. Далее РНК переводят в форму кДНК путём постановки реакции обратной транскрипции с использованием праймера олиго-(дТ)18. Полученную кДНК используют для проведения количественной ПЦР. Для этого часть кДНК (нг) смешивают с набором олигонуклеотидов SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, либо с набором олигонуклеотидов SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6. Для получения более достоверного результата следует проводить обе реакции параллельно. Помимо набора праймеров (конечная концентрация 500 нМ) в реакционную смесь добавляют реакционный буфер (5 мкл, 10х), Taq-полимеразу (до 5 мкл), дезоксирибонуклеотидтрифосфаты четырёх типов (20 мМ) и бидистиллированную воду (до конечного объема 50 мкл). Пробирки помещают в амплификатор ПЦР-РВ и запускают следующий протокол:
1. первичная денатурация 95 градусов - 2 минуты
2. денатурация 95 градусов - 30 сек
3. отжиг праймеров 55 градусов - 30 сек
4. элонгация 72 градуса - 40 сек.
Стадии 2-4 повторяются 40 раз (40 циклов). Детекцию флуоресценции прибором выставляют на стадии отжига праймеров. После снятия кривых накопления продукта реакции производят анализ результатов ПЦР с использованием порогового метода. Для сравнения в качестве контрольного значений используют данные, получаемые с кДНК неинфицированных нативных клеток.
Последовательности
Последовательность 1: "1"
Длина
Тип молекулы
Организм
Содержит фрагменты ДНК и РНК
Пропущенная последовательность
20
DNA
synthetic construct
Нет
Нет
Характеристики
Ключ характеристики
Местоположение характеристики
Квалификаторы
source
1..20
mol_type = other DNAorganism = synthetic construct
Последовательность
--->
gttgctgaca agtcacgttt                          20
<---
Последовательность 2: "2"
Длина
Тип молекулы
Организм
Содержит фрагменты ДНК и РНК
Пропущенная последовательность
22
DNA
synthetic construct
Нет
Нет
Характеристики
Ключ характеристики
Местоположение характеристики
Квалификаторы
source
1..22
mol_type = other DNAorganism = synthetic construct
Последовательность
--->
tcctccgact tgtgtcgcac ca                       22
<---
Последовательность 3: "3"
Длина
Тип молекулы
Организм
Содержит фрагменты ДНК и РНК
Пропущенная последовательность
20
DNA
synthetic construct
Нет
Нет
Характеристики
Ключ характеристики
Местоположение характеристики
Квалификаторы
source
1..20
mol_type = other DNAorganism = synthetic construct
Последовательность
--->
aacttttgaa gacgcaaggg                          20
<---
Последовательность 4: "4"
Длина
Тип молекулы
Организм
Содержит фрагменты ДНК и РНК
Пропущенная последовательность
20
DNA
synthetic construct
Нет
Нет
Характеристики
Ключ характеристики
Местоположение характеристики
Квалификаторы
source
1..20
mol_type = other DNAorganism = synthetic construct
Последовательность
--->
cgcaccattc cttttccttg                          20
<---
Последовательность 5: "5"
Длина
Тип молекулы
Организм
Содержит фрагменты ДНК и РНК
Пропущенная последовательность
24
DNA
synthetic construct
Нет
Нет
Характеристики
Ключ характеристики
Местоположение характеристики
Квалификаторы
source
1..24
mol_type = other DNAorganism = synthetic construct
Последовательность
--->
gcacgttctg aggcctgtat gtgc                     24
<---
Последовательность 6: "6"
Длина
Тип молекулы
Организм
Содержит фрагменты ДНК и РНК
Пропущенная последовательность
20
DNA
synthetic construct
Нет
Нет
Характеристики
Ключ характеристики
Местоположение характеристики
Квалификаторы
source
1..20
mol_type = other DNAorganism = synthetic construct
Последовательность
--->
cccgtcaagc agttatagca                          20
<---