Средство, обладающее антиметастатической активностью и повышающее противометастатическое действие циклофосфана
MEANS FOR ANTIMETASTATIC ACTIVITY AND IMPROVED ANTIMETASTATIC ACTION OF CYCLOPHOSPHANE

Изобретение относится к области медицины, конкретно, к онкологии, и может быть использовано для подавления развития метастазов и повышения противометастатического действия циклофосфана при лечении онкологических больных.
Использование в лечении больных со злокачественными опухолями традиционных методов - химио-, лучевого, хирургического и их комбинаций - полной гарантии выздоровления не дает, поскольку результаты во многом определяются развитием метастатического процесса, чувствительностью метастазирующих клеток к антибластомным препаратам. Эффективно действующие на метастатические клетки опухоли лекарственные средства отсутствуют. Поэтому актуальным является поиск препаратов, ингибирующих процесс диссеминации и повышающих антиметастатическое действие цитостатиков, которые могут найти применение на всех этапах лечения онкологических пациентов.
Известны растительные средства для инъекций (галактозосодержащие пектины), полученные из корневищ аира болотного, обладающие антиметастатическим действием и повышающие противометастатическое действие цитостатиков [1]. Применение этих средств возможно в схемах химиотерапии онкологических больных только в стационарных условиях, учитывая внутривенный путь введения.
Близким по фармакологической эффективности к заявляемому средству является экстракт родиолы розовой жидкий [2], который относится к группе препаратов, оказывающих тонизирующее действие на ЦНС. К противопоказаниям для приема экстракта родиолы розовой относятся состояния возбуждения, головная боль, бессонница, гипертонические кризы, лихорадочные состояния больного [3]. Недостатком экстракта родиолы является ограничение при назначении больным с сопутствующими заболеваниями - гипертонической болезнью вследствие способности повышать кровяное давление и нервными расстройствами.
Растительное противометастатическое средство, содержащее вытяжку из надземной части (травы) аконита байкальского (Aconitum baikalense Steinb.) [4], имеет ограниченное применение вследствие наличия в его составе алкалоидов, угнетающих ЦНС. Нарушение функции сердечно-сосудистой системы при тяжелых отравлениях алкалоидами аконитов может привести к смерти от паралича сердца или остановки дыхания [5].
Также известно средство, обладающее противоопухолевой и антиметастатической активностью, повышающее противометастатическое действие циклофосфана на основе рябины обыкновенной [6]. Несмотря на сходство фармакологических эффектов экстрактов рябины обыкновенной и аронии черноплодной, несомненным преимуществом предлагаемого средства для ингибиции процесса метастазирования у онкологических больных нам представляется использование в качестве сырья для его изготовления плодов растения, широко внедренного в культуру различных регионов России как пищевого, декоративного и лекарственного кустарника.
Задачей, решаемой настоящим изобретением, является расширение арсенала средств растительного происхождения, ингибирующих развитие метастатического процесса и повышающих антиметастатическое действие циклофосфана для индивидуализации схем лечения и рационального выбора терапевтической тактики при злокачественных новообразованиях для улучшения качества и продления жизни онкологических больных. Богатая сырьевая база и низкая стоимость растительного сырья делают предлагаемое средство экономически доступным для большинства пациентов.
Для решения этой задачи используют жидкий экстракт плодов аронии черноплодной  полученный методом противоточной многоступенчатой реперколяции с законченным циклом [7]. Для получения экстракта использовали батарею из 5 перколяторов. Плоды аронии измельчали до размера частиц диаметром 0,5-1 мм. Экстракт готовили в соотношении 1:5 на 95%-ном подкисленном этиловом спирте. Подкисленный этиловый спирт готовили из расчета 6,49 г концентрированной кислоты хлористоводородной на 200 мл 95% спирта этилового.
Измельченные плоды аронии загружали в первый перколятор и непрерывным потоком подавали экстрагент. Настаивание проводили в течение 24 часов при комнатной температуре. Полученное из первого перколятора извлечение подавали во второй перколятор, содержащий аналогичное количество измельченного сырья, и доводили объем экстрагента до «зеркала». С остальными перколяторами работали по той же схеме: для заполнения каждого последующего перколятора использовали вытяжку из предыдущего. С последнего перколятора сливали первую порцию готового продукта.
Готовый экстракт отстаивали при температуре не выше +10°C не менее 2 сут до получения прозрачной жидкости, затем фильтровали и хранили при температуре не выше +5°C в защищенном от света месте.
Стандартизацию готового экстракта проводили по органолептическим показателям (цвет, запах, вкус), сухому остатку и содержанию действующих веществ [8]. Экстракт на 95% подкисленном спирте представляет собой рубиново-красную жидкость с легким фруктовым запахом терпко-вяжущего вкуса. Сухой остаток жидкого экстракта плодов аронии черноплодной, определяемый с помощью весового влагомера MS-70 («AND», Япония), составляет 15±0,27%.
Для стандартизации жидкого экстракта по содержанию действующих веществ использовали принцип сквозной стандартизации: лекарственное растительное сырье - субстанция - лекарственная форма. Стандартизовали экстракт по содержанию суммы антоцианов, используя разработанный нами метод прямой спектрофотометрии [9]. Содержание суммы антоцианов в пересчете на цианид-3-о-глюкозид составляет 5,83±0,27%.
Новым в предлагаемом изобретении является то, что для получения жидкого экстракта, обладающего антиметастатическим действием и способностью повышать противометастатическую активность циклофосфана, используются в качестве сырья плоды аронии черноплодной .
Данные существенные признаки не выявлены из научно-медицинской и патентной литературы. Они явным образом не следуют из уровня техники и не очевидны для специалистов. Предлагаемое в качестве изобретения средство может быть использовано в клинической онкологии. Данное средство прошло экспериментальное исследование в лаборатории онкофармакологии НИИФиРМ им. Е.Д. Гольдберга, Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук и на кафедре фармакогнозии с курсами ботаника и экологии ФГБОУ ВО СибГМУ Минздрава России.
Новые свойства жидкого экстракта плодов аронии были обнаружены экспериментальным путем. Изучение проведено на мышах-самках линии C57BL/6 массой 20-22 г в возрасте 3 мес. В качестве модели экспериментального злокачественного роста использовали гематогенно метастазирующую карциному легких Льюис, перевиваемую внутримышечно по 5 млн опухолевых клеток на мышь.
Для проведения эксперимента животные были распределены на группы:
1. Контроль - животные с опухолью, которым зондом в желудок вводили по 0,2 мл дистиллированной воды, начиная с 7 сут после перевивки в течение 12 сут. На 11 сут после перевивки опухоли животным однократно внутрибрюшинно вводили по 0,1 мл физиологического раствора.
2. Циклофосфан (ЦФ) - животные с опухолью, которым зондом в желудок вводили по 0,2 мл дистиллированной воды, начиная с 7 сут после перевивки в течение 12 сут. На 11 сут после перевивки опухоли мышам вводили однократно внутрибрюшинно ЦФ в дозе 125 мг/кг в 0,1 мл воды для инъекций.
3. Жидкий экстракт плодов аронии (1 мл/кг) - животные с опухолью, которым вводили зондом в желудок жидкий экстракт плодов аронии в дозе 1 мл/кг, начиная с 7 сут после перевивки в течение 12 сут. На 11 сут после перевивки опухоли животным однократно внутрибрюшинно вводили 0,1 мл физиологического раствора.
4. Жидкий экстракт плодов аронии (5 мл/кг) - животные с опухолью, которым вводили зондом в желудок жидкий экстракт плодов аронии в дозе 5 мл/кг, начиная с 7 сут после перевивки в течение 12 сут. На 11 сут после перевивки опухоли животным однократно внутрибрюшинно вводили 0,1 мл физиологического раствора.
5. ЦФ + жидкий экстракт плодов аронии (1 мл/кг) - животные с опухолью, которым вводили зондом в желудок жидкий экстракт плодов аронии в дозе 1 мл/кг, начиная с 7 сут после перевивки в течение 12 сут. На 11 сут после перевивки опухоли мышам вводили однократно внутрибрюшинно ЦФ в дозе 125 мг/кг в 0,1 мл воды для инъекций.
6. ЦФ + жидкий экстракт плодов аронии (5 мл/кг) - животные с опухолью, которым вводили зондом в желудок жидкий экстракт плодов аронии в дозе 5 мл/кг, начиная с 7 сут после перевивки в течение 12 сут. На 11 сут после перевивки опухоли мышам вводили однократно внутрибрюшинно ЦФ в дозе 125 мг/кг в 0,1 мл воды для инъекций.
По окончании эксперимента (21 сут) животных умерщвляли, соблюдая «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденные Министерством здравоохранения РФ. Проводили вскрытие животных, ревизию внутренних органов, выделение опухоли, подсчет метастазов в легких. Эффективность проведенных курсов лечения оценивали по противоопухолевому и противометастатическому действию препаратов, определяя массу опухоли, процент торможения ее роста, частоту метастазирования, количество и площадь метастазов в легких, высчитывали индекс ингибиции метастазирования (ИИМ, %) [10, 11].
Обработку полученных результатов проводили с использованием непараметрических критериев Вилкоксона-Манна-Уитни (U) и углового преобразования Фишера (ϕ). Различия считали достоверными при Р<0,05 [12].
Для выявления фармакологического действия жидкого экстракта плодов аронии на развитие процесса метастазирования карциномы легких Льюис и антиметастатическое действие циклофосфана у мышей линии C57BL/6 был поставлен следующий эксперимент.
Пример
В эксперименте обнаружено, что у мышей-самок линии C57BL/6 с карциномой легких Льюис, получавших жидкий экстракт плодов аронии в дозах 1 и 5 мл/кг, масса легких с метастазами и площадь метастатического поражения оказалась достоверно (в 1,4 и 1,2 раза; и в 2,7 и 1,7 раза) меньше контрольного значения соответственно (таблица).
После введения животным циклофосфана снизилось количество и площадь (в 1,9 и 11,3 раза; Р<0,01) метастазов, масса легких уменьшилась в 1,2 раза (Р<0,05), однако опухоль метастазировала, как и в контроле, в 100% случаев; индекс ингибирования метастазирования составил 48% (таблица).
В то же время у животных, получавших комбинированное лечение, выявлено повышение противометастатического действия цитостатика. Так, при добавлении в схему химиотерапии экстракта плодов аронии в дозе 1 мл/кг достоверно снизилось количество и площадь метастазов (в 2,0 и 3,4 раза, Р<0,05) по сравнению с этими показателями у мышей, получавших только цитостатик, ИИМ повысился до 80% против 48% (таблица). В случае введения в схему цитостатического лечения экстракта плодов аронии в дозе 5 мл/кг все показатели процесса диссеминации также снизились по сравнению с таковыми у животных, получавших монохимиотерапию: количество и площадь метастазов оказались меньше в 2,0 и 12,6 раза, (Р<0,01); ИИМ в данной группе достиг максимальных значений и составил 98% (таблица).
Частота метастазирования в обеих группах комбинированного лечения оказалась достоверно меньше соответствующего контрольного показателя и составила 80% (1 мл/кг) и 50% (5 мл/кг) против 100% у леченных только цитостатиком животных (таблица).
Достоверного влияния жидкого экстракта плодов аронии в обеих изучаемых дозах на первичный опухолевый узел не выявлено. При введении в схему химиотерапии жидкого экстракта плодов аронии не обнаружено его достоверного влияния на рост основной опухоли.
Таким образом, в эксперименте на мышах-самках линии C57BL/6 с перевитой карциномой легких Льюис показана способность жидкого экстракта плодов аронии черноплодной ингибировать развитие метастазов и повышать антиметастатическое действие циклофосфана.
Список использованной литературы
1. Пат. 2471496 Российская Федерация, МПК A61K 36/882, A61P 35/00. Средства, повышающие противоопухолевую и антиметастатическую активность цитостатических препаратов / Сафонова Е.А., Разина Т.Г., Гурьев A.M., Зуева Е.П., Ефимова Л.А., Лопатина К.А., Юсубов М.С., Белоусов М.В.: заявитель и патентообладатель: Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт фармакологии Сибирского отделения РАМН (RU), Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Сибирский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и социального развития России" (RU), Общество с ограниченной ответственностью "Инновационные коммуникации" (RU). - №2011146756/15, заявл. 17.11.2011; опубл. 10.01.2013.
2. Пат. 2023446 Российская Федерация, МПК А61К 35/78. Антиметастатическое средство / Яременко К.В., Дементьева Л.А., Саратиков А.С.: заявитель и патентообладатель: Научно-исследовательский институт фармакологии Томского научного центра РАМН (RU). - №4082815/14; заявл. 13.05.1993; опубл. 30.11.1994.
3. Машковский М.Д. Лекарственные средства. М., 2014. - С. 130.
4. Пат. 2189832 Российская Федерация, МПК A61K 35/78 Средство, обладающее противометастатической активностью / Пашинский В.Г., Семенов А.А., Поветьева Т.Н., Погодаева Н.Н., Жапова Цымжит, Карпова Г.В., Боровская Т.Г., Фомина Т.Н., Ветошкина Т.В., Воронова О.Л., Харужая Т.Г.: заявитель и патентообладатель: Научно-исследовательский институт фармакологии Томского научного центра СО РАМН (RU), Пашинский В.Г., Семенов А.А., Поветьева Т.Н., Погодаева Н.Н., Жапова Цымжит. - №2001121507/14, заявл 31.07.2001; опубл. 27.09.2002.
5. Зориков П.С. Ядовитые растения леса: учебное пособие. Владивосток: Дальнаука, 2005. - С. 9-10.
6. Пат. 2578457 Российская Федерация, МПК A61K 36/73, A61P 35/00. Средство, обладающее противоопухолевой и антиметастатической активностью, повышающее противометастатическое действие циклофосфана / Разина Т.Г., Зуева Е.П., Калинкина Г.И., Исайкина Н.В., Андреева В.Ю., Рыбалкина О.Ю., Крылова С.Г., Амосова Е.Н., Лопатина К.А., Сафонова Е.А., Галиулина А.В.: заявитель и патентообладатель: Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт фармакологии и регенеративной медицины имени Е.Д. Гольдберга" (RU). - №2015103700/15, заявл. 04.02.2015; опубл. 27.03.2016.
7. Меньшутина Н.В. и др. Инновационные технологии и оборудование фармацевтического производства. - Т. 2. - М.: БИНОМ, 2013. - 480 с.
8. Государственная фармакопея РФ. XIII изд., - Т. 2. - М.: 2015. - С. 134-138.
9. Методика определения антоцианов в плодах аронии черноплодной / В.Ю. Андреева, Г.И. Калинкина, Н.Э. Коломиец и др. // Фармация. - 2013. - №3. - С. 19-21.
10. Архипов С.А., Юнкер В.М. Изменение интенсивности метастазирования в легкие перевиваемых опухолей мышей в зависимости от величины перевивочной дозы опухолевых клеток // Исследование по индукции и метастазированию опухолей у экспериментальных животных. - Новосибирск, 1984. - С. 14-32.
11. Софьина З.П. и др. Экспериментальная оценка противоопухолевых препаратов в СССР и США. - М.: Медицина, 1980. - С. 131.
12. Гублер Е.В. Вычислительные методы анализа и распознавания патологических процессов. - Л.: Медицина, 1978. - С. 210-211.