НОВЫЕ АНТИТЕЛА И НУКЛЕОТИДНЫЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ

1. Молекула антитела, которая специфически связывается с CTLA-4 и обладает улучшенным истощающим действием на CTLA-4-положительные клетки по сравнению с ипилимумабом.
2. Молекула антитела по п. 1, которая имеет улучшенное истощающее действие на CD4-положительные клетки по сравнению с ипилимумабом.
3. Молекула антитела по п. 1 или 2, которая имеет улучшенное истощающее действие на Treg по сравнению с ипилимумабом.
4. Молекула антитела по любому из пп. 1-3, которая, как считается, имеет улучшенное истощающее действие на CTLA-4-положительные клетки, CD4-положительные клетки и/или Treg по сравнению с ипилимумабом, если она дает улучшенное истощение
(i) тестирование АЗКЦ in vitro, которое проводят с применением линии клеток НК-92, стабильно трансфицированной для экспрессии аллеля CD16-158V вместе с GFP, при этом тестирование АЗКЦ включает следующие последовательные этапы
1) CTLA-4-положительные клетки, CD4-положительные клетки или Treg в качестве клеток-мишеней выделяют из периферической крови здоровых доноров;
2) затем клетки-мишени стимулируются CD3/CD28 и rhIL-2;
3) затем клетки-мишени предварительно инкубируют с молекулой антитела и затем смешивают с НК-клетками;
4) затем клетки-мишени инкубируют в среде RPMI 1640+GlutaMAX, содержащей 1 буфер HEPES, пируват натрия и FBS низкого IgG;
5) лизис определяют способом проточной цитометрии;
6) этапы 1-5 повторяются или выполняются параллельно с применением ипилимумаба вместо молекулы антитела на этапе 3; и
7) результаты лизиса молекулы антитела сравнивают с результатами лизиса ипилимумаба, и улучшенный лизис молекулы антитела по сравнению с ипилимумабом демонстрирует, что молекула антитела имеет улучшенное истощающее действие на CTLA-4-положительные клетки, CD4 положительные клетки и/или Treg; и/или
(ii) тестирование in vivo на модели PBMC-NOG/SCID, при этом тестирование in vivo включает следующие последовательные этапы
1) МКПК человека выделяют, промывают и ресуспендируют в стерильном ФСБ;
2) мышам NOG в/в вводят суспензию клеток с этапа 1);
3) селезенки мышей NOG выделяют и превращают в суспензию отдельных клеток;
4) суспензию клеток с этапа 3) ресуспендируют в стерильном ФСБ;
5) мышам SCID в/б вводят суспензию, полученную на этапе 4;
6) мышей SCID затем обрабатывают либо молекулой антитела, ипилимумабом, либо моноклональным антителом изотипического контроля;
7) собирают внутрибрюшинную жидкость у обработанных мышей SCID;
8) подмножества Т-клеток человека идентифицируются и количественно оцениваются с помощью FACS с применением следующих маркеров: CD45, CD4, CD8, CD25, CD127;
9) результаты идентификации и количественной оценки подмножеств Т-клеток от мышей, получавших молекулу антитела, сравнивают с результатами идентификации и количественной оценки подмножеств Т-клеток от мышей, получавших ипилимумаб, и с результатами идентификации и количественной оценки подмножества Т-клеток от мышей, обработанных моноклональными антителами изотипического контроля, и меньшее количество CTLA-4-положительных клеток, CD4-положительных клеток и/или Treg во внутрибрюшинной жидкости от мышей, обработанных исследуемой молекулой антитела, по сравнению с CTLA-4-положительными клетками, CD4-положительными клетками и/или Treg во внутрибрюшинной жидкости мышей, получавших ипилимумаб, демонстрирует, что молекула антитела имеет улучшенное истощающее действием на CTLA-4-положительные клетки, CD4-положительные клетки и/или Treg по сравнению с ипилимумабом.
5. Молекула антитела по любому из пп. 1-4, отличающаяся тем, что указанная молекула антитела выбрана из группы, состоящей из молекул антитела, содержащих 1-6 CDR, выбранных из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO 3, 6, 8, 10, 12 и 14.
6. Молекула антитела по любому из пп. 1-5, отличающаяся тем, что указанная молекула антитела выбрана из группы, состоящей из молекул антитела, содержащих 1-6 CDR: VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3, VL-CDR1, и VL-CDR3,
где VH-CDR1, если присутствует, выбран из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO 15, 22, 29 и 35;
где VH-CDR2, если присутствует, выбран из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 16, 23, 30 и 36;
где VH-CDR3, если присутствует, выбран из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO 17, 24, 31 и 37;
где VL-CDR1, если присутствует, выбран из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO 10 и 38;
где VL-CDR2, если присутствует, выбран из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO 18, 25, 32 и 39;
где VL-CDR3, если присутствует, выбран из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO 19, 26 и 40.
7. Молекула антитела по любому из пп. 1-6, отличающаяся тем, что указанная молекула антитела содержит 6 CDR, имеющих последовательности SEQ ID NO: 15, 16, 17, 10, 18 и 19 или 6 CDR, имеющих последовательности SEQ ID NO: 22, 23, 24, 10, 25 и 26.
8. Молекула антитела, которая специфически связывается с CTLA-4, отличающаяся тем, что указанные молекулы антитела содержат 6 CDR, имеющих последовательности SEQ ID NO: 15, 16, 17, 10, 18 и 19 или 6 CDR, имеющих последовательности SEQ ID NO: 22, 23, 24, 10, 25 и 26.
9. Молекула антитела по любому из пп. 1-8, отличающаяся тем, что указанная молекула антитела содержит вариабельную тяжелую цепь, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 20 и 27 и/или вариабельную легкую цепь, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 21 и 28.
10. Молекула антитела по любому из пп. 1-9, отличающаяся тем, что указанная молекула антитела содержит константный участок тяжелой цепи последовательности SEQ ID NO: 43 и/или константный участок легкой цепи последовательности SEQ ID NO: 44.
11. Молекула антитела по любому из пп. 1-6, отличающаяся тем, что указанная молекула антитела представляет собой молекулу антитела, которая способна конкурировать за связывание с CTLA-4 с молекулой антитела, как определено в любом из пп. 7-10.
2
12. Молекула антитела по любому из пп. 1-11, отличающаяся тем, что указанная молекула антитела выбрана из группы, состоящей из полноразмерного антитела, химерного антитела, одноцепочечного антитела, Fab, Fv, scFv, Fab' и (Fab').
13. Молекула антитела по любому из пп. 1-13, которая связывается с CTLA-4 человека (hCTLA-4), и/или с CTLA-4 яванского макака (cmCTLA-4), и/или с CTLA-4 мыши (mCTLA-4).
14. Молекула антитела по любому из пп. 1-13, которая не связывается с CD28 человека.
15. Молекула антитела по любому из пп. 1-14, отличающаяся тем, что указанная молекула антитела выбрана из группы, состоящей из антитела IgG человека, гуманизированного антитела IgG и антитела IgG человеческого происхождения.
16. Молекула антитела по п. 15, отличающаяся тем, что указанная молекула антитела представляет собой антитело IgG1 человека.
17. Молекула антитела по любому из пп. 1-16, отличающаяся тем, что указанная молекула антитела представляет собой моноклональное антитело.
18. Изолированная нуклеотидная последовательность, кодирующая молекулу антитела, как определено в любом из пп. 1-17.
19. Выделенная нуклеотидная последовательность по п. 18, содержащая или состоящая из последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID 45-52.
20. Плазмида, содержащая нуклеотидную последовательность по п. 18 или 19.
21. Вирус, содержащий нуклеотидную последовательность, определенную в п. 18 или 19, или плазмиду, определенную в п. 20.
22. Вирус по п. 21, который представляет собой онколитический вирус и предпочтительно онколитический поксвирус.
23. Вирус по п. 22, отличающийся тем, что указанный поксвирус принадлежит к подсемейству Chordopoxviridae, более предпочтительно к роду Orthopoxvirus, предпочтительно выбранному из группы, состоящей из вируса осповакцины, коровьей оспы, вируса оспы канареек, вируса эктромелии и вируса миксомы.
24. Вирус по п. 23, отличающийся тем, что указанный онколитический вирус представляет собой вирус осповакцины, дефектный по активности как тимидинкиназы (TK), так и/или рибонуклеотидредуктазы (RR), и содержащий нуклеотидные последовательности, кодирующие последовательности SEQ ID NO: 20 и ID NO: 21 или последовательности SEQ ID NO: 53 и ID NO: 54.
25. Вирус по п. 24, отличающийся тем, что указанный онколитический вирус осповакцины дополнительно содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую GM-CSF, с особым предпочтением GM-CSF человека (например, имеющего последовательность SEQ ID NO: 55 или последовательность SEQ ID NO: 56) или GM-CSF мыши (например, имеющий последовательность SEQ ID NO: 57 или последовательность SEQ ID NO: 58).
26. Вирус по любому из пп. 21-25, отличающийся тем, что кассета, кодирующая тяжелую цепь, вставляется в J2R локус, а кассета, кодирующая легкую цепь, вставляется в I4L локус.
27. Клетка, содержащая нуклеотидную последовательность, как определено в п. 18 или 19, или плазмиду, как определено в п. 20, или вирус, как определено в любом из пп. 21-26.
28. Молекула антитела по любому из пп. 1-17, нуклеотидная последовательность по п. 18 или 19, плазмида по п. 20, вирус по любому из пп. 21-26 или клетка по п. 27 для применения в медицине.
29. Молекула антитела по любому из пп. 1-17, нуклеотидная последовательность по п. 18 или 19, плазмида по п. 20, вирус по любому из пп. 21-26 или клетка по п. 27 для применения при лечении рака.
30. Применение молекулы антитела по любому из пп. 1-17, нуклеотидной последовательности по п. 18 или 19, плазмиды по п. 20, вируса по любому из пп. 21-26 или клетки по п. 27 для производства фармацевтической композиции для применения при лечении рака.
31. Фармацевтическая композиция, содержащая или состоящая из молекулы антитела, как определено в любом из пп. 1-17, нуклеотидной последовательности по п. 18 или 19, плазмиды по п. 20, вируса по любому из пп. 21-26 или клетки по п. 27 и, необязательно, фармацевтически приемлемого разбавителя, носителя, наполнителя и/или наполнителя.
32. Фармацевтическая композиция по п. 31 для применения при лечении рака.
33. Способ лечения рака у субъекта, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества молекулы антитела, как определено в любом из пп. 1-17, нуклеотидной последовательности по п. 18 или 19, плазмиды по п. 20, вируса по любому из пп. 21-26, клетки по п. 27 или фармацевтической композиции по п. 31.
34. Молекула антитела для применения по п. 24, нуклеотидная последовательность для применения по п. 29, плазмида для применения по п. 29, вирус для применения по п. 29, клетка для применения по п. 29, применение по п. 30, фармацевтическая композиция по п. 32 или способ по п. 33, при этом рак представляет собой солидный рак.