Биосенсор для определения наличия органических веществ в воде
BIOSENSOR FOR DETERMINING PRESENCE OF ORGANIC SUBSTANCES IN WATER

Изобретение относится к биотехнологии и охране окружающей среды в области контроля загрязненности воды (природной, промышленной, муниципальной) органическими веществами.
5
20
Одним из важных критериев, используемых для оценки качества воды, является содержание в ней окисляемых органических веществ - оно характеризуется параметрами химического потребления кислорода (ХПК) или биологического потребления кислорода (БПК). Стандартными критериями, применяемыми для количественной оценки органического загрязнения, является БПК - это количество кислорода, использованное микроорганизмами для окисления всех растворенных органических веществ в изолированном сосуде с образцом в течение 5 суток, показатель БПК - соответственно до 20 суток. Применяемые для этого БПК-анализаторы обладают высокой точностью, но процесс измерения с их помощью длителен, требует специализированного лабораторного оборудования и обученного персонала. Использование микробных биосенсоров позволяет проводить экспресс-анализ за счет быстрой метаболической реакции микроорганизмов на изменение концентрации ассимилируемых клетками веществ в исследуемой воде - время реакции на появление загрязнителя составляет не более десятков-сотен минут.
Биосенсоры, используемые для этих целей, как правило, функционируют на основе амперометрического электрода для определения концентрации кислорода, например электрода Кларка, с нанесенными на него клетками микроорганизмов (патент RU №129930, МПК C12Q 1/02 (2006.01), опубл. 10.07 2013). Определение органических веществ в водных растворах основано на измерении скорости повышения потребления кислорода адаптированными клетками штамма бактерий рецептора в результате активирующего действия органических веществ на метаболизм клеток рецептора, в основном на дыхательную цепь.
Известен биосенсор для определения загрязненности воды органическими веществами (патент RU №73975 МПК G01N 33/18 (2006.01), опубл. 10.06 2008). Устройство включает электрод Кларка, сопряженный с биорецептором, содержащим иммобилизованные на носителе клетки штамма дрожжей Arxula adeninivorans ВКМ Y-2676 или клетки штамма дрожжей Arxula adeninivorans ВГИ 78.
К недостатком устройства относится использование в качестве чувствительных к определяемым веществам клеток строго определенных штаммов дрожжей. Как и всякие чистые микробные культуры, они имеют определенный спектр усвояемых органических веществ, что сужает их чувствительность по отношению к широкому разнообразию органики в таком сложном и непредсказуемом по составу объекте, как сточные воды.
Наиболее близким аналогом является биосенсор для анализа органического вещества (патент CN №1211652 Electrochemical method for enrichment of microorganism, biosensor for analyzing organic substance and biochemical oxygen demand, заявл. 07.071999 г, опубл. 20.07.2005). Данное устройство является двухкамерным. В его анодном отсеке находится смешанная культура анаэробных бактерий. Они разлагают органические вещества, подающиеся в отсек в составе исследуемой жидкости. Полученные из молекул разлагаемой бактериями органики электроны через электрическую измерительную систему попадают далее на катод. Протоны, также образующиеся при разложении бактериями органических молекул, при этом диффундируют через селективную мембрану в катодный отсек. Величина электрического тока в данном устройстве пропорциональна количеству органических веществ в исследуемой пробе. Недостатком данного изобретения является его высокая стоимость, обусловленная наличием протонселективной мембраны, разделяющей биосенсор на камеры, сложность эксплуатации, т.к. через анодную камеру необходимо продувать газообразный азот, через катодную камеру - продувать воздух.
Техническим результатом заявляемого изобретения является упрощение применения биосенсора и снижение его стоимости.
Достижение технического результата обеспечивается использованием биосенсора для определения наличия органических веществ в воде, состоящего из пустотелого цилиндрического корпуса, в нижнем основании которого расположен анод, на который нанесены природные электрогенные анодофильные бактерии. На пустотелый цилиндрический корпус насажена пластина с отверстием, выполненная из материала, обеспечивающего плавучесть биосенсора, например пенопласта, и расположенная в верхней части цилиндра, так что обеспечено разделение фаз анализируемой жидкости, находящейся внутри цилиндра, и воздуха над катодом, расположенным в верхнем основании цилиндра. Анод и катод выполнены из углеродного войлока и через токоотводящие провода соединены с измерительным электронным блоком, измеряющим напряжение.
Отличительным признаком заявляемого устройства является наличие пластины, выполненной из материала, обеспечивающего плавучесть, с отверстием, через которое она насажена на пустотелый цилиндрический корпус. Кроме того, применены электрогенные анодофильные бактерии, способные прикрепляться к поверхности электрода и передавать электроны из своих дыхательных цепей непосредственно на анод как на конечный акцептор.
В устройстве использовано естественное сообщество природных электрогенных анодофильных бактерий неопределенного систематического состава, формирующих биопленку на поверхности углеродного анода при его погружении в иловые отложения водоема.
Предлагаемый биосенсор не имеет в своей конструкции протонселективной мембраны, ее роль выполняет слой воды, разделяющий катод и анод. На аноде микроорганизмы ассимилируют органические вещества из воды, при этом свободные протоны диффундируют к катоду, где окисляются кислородом до воды (Logan В.Е. Microbial Fuel Cells. John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, NJ. 2008. 200 P.).
На фиг. 1 представлена схема биосенсора. На фиг. 2 - графики электрогенеза биосенсоров при наличии/отсутствии анодофильных электрогенных микроорганизмов на аноде, при наличии/отсутствии в воде глюкозо-глутаматной смеси, где кривая I - средняя величина напряжения биосенсоров с биопленкой бактерий на аноде, кривая II - величина напряжения биосенсора без биопленки бактерий на аноде. На фиг. 3 - график электрогенеза биосенсоров при наличии или отсутствии в воде ГМФ-агара как источника органических веществ, где кривая I - зафиксированное напряжение, создаваемое биосенсором при наличии в воде органических веществ ГМФ-агара; кривая II - без органических веществ в воде. На фиг. 4 - график электрогенеза в образцах воды с прямым поступлением сточных вод сахарного завода и водоеме без прямого попадания сточных вод, где кривая I - зафиксированное напряжение на биосенсоре в образце воды из водоема с прямым попаданием сточных вод завода, кривая II - в образце из водоема без прямого попадания сточных вод.
Биосенсор для определения наличия органических веществ в воде состоит из пустотелого цилиндрического корпуса 1, в нижнем основании которого расположен анод 2, на который нанесены природные электрогенные анодофильные бактерии, образующие биопленку 3. На пустотелый цилиндрический корпус 1 насажена пластина 4 с отверстием, анализируемая жидкость 5, находящаяся внутри цилиндрического корпуса 1 между анодом 2 и катодом 6, расположенным в верхнем основании цилиндрического корпуса 1. Анод 2 и катод 6 выполнены из углеродного войлока и через токоотводящие провода 7 соединены с измерительным электронным устройством 8, измеряющим напряжение.
Электронный блок 8 включает в себя микроконтроллер Arduino nano v3 (на чертеже не обозначен). В электрическую цепь включена нагрузка в виде резистора 9 сопротивлением 1000 Ом.
Определение наличия в воде органических веществ основано на измерении электрогенной активности бактерий, находящихся в биопленке 3 на аноде 2, и зависит от количества ассимилируемой ими органики в исследуемом водном образце.
Для работы биосенсора необходимо наличие электрогенных анодофильных бактерий на аноде 2. Для этого цилиндрический корпус 1 с установленным в его нижнем основании анодом 2 из углеродного войлока погружают вертикально в емкость с отобранными естественными иловыми отложениями из водоема, покрытыми слоем воды толщиной до 5 см, так чтобы анод 2 был погружен в ил на глубину не менее 5 см, а катод 6 находился на границе раздела фаз вода-воздух. На аноде 2 образуется электрохимически активная биопленка 3 из электрогенных анодофильных микроорганизмов из иловых отложений, способных к анаэробному метаболизму. Биосенсор находится в емкости с иловыми отложениями от 1 до 7 суток, затем его извлекают и избыток ила, непрочно связанный с углеродным войлоком анода 2 и цилиндрическим корпусом 1, аккуратно отмывают при неоднократном погружении его в объем с чистой водопроводной водой. В результате на аноде 2 остается только биопленка 3, выполняющая далее функцию биорецептора в биосенсоре.
Биосенсор работает следующим образом.
Перед исследованием изучаемого образца воды цилиндрический корпус 1 биосенсора заполняют водой путем его погружения в емкость с водой, не содержащей органического загрязнения, например водопроводную воду, предварительно прокипяченную и отфильтрованную для удаления хлора и избытка солей, так что пластина 4 с отверстием обеспечивает положение катода 6, находящегося внутри цилиндрического корпуса 1, на уровне раздела фаз анализируемая вода - воздух. После погружения между анодом 2 и катодом 6 электронным блоком 8 фиксируют электрическое напряжение. Далее воду в цилиндрическом корпусе 1 заменяют на исследуемую с возможным наличием органических веществ путем погружения в емкость с анализируемой водой 5, которая через анод проникает в корпус 1.
Анодофильные электрогенные бактерии биопленки 3 ассимилируют содержащиеся в воде органические вещества, при разложении которых освобождаются протоны и электроны. Электроны перемещаются от клеток бактерий биопленки 3 на анод 2, по токоотводящим проводам 7 через измерительный электронный блок 8 к катоду 6. Протоны диффундируют в водной среде 5 внутри цилиндрического корпуса 1 от анода 2 к катоду 6. Направленный поток электронов и протонов в биосенсоре достигается путем расположения катода 6 относительно анода 2 в более окислительной среде на границе раздела фаз вода - воздух. На катоде 6 происходит окисление протонов кислородом воздуха при участии электронов поступивших от анода 2.
Электронный блок 8 автоматически регистрирует напряжение на резисторе 9. Сопротивление резистора 9 составляло 1000 Ом, сила тока зависит от количества электронов, поступающих от биопленки 3 анодофильных электрогенных бактерий через анод 2. Измерение напряжения начинают через 15 минут после погружения устройства в образец исследуемой воды и заполнения ею цилиндрического корпуса 1. Измерение проводится на протяжении 3-6 часов с замерами не реже 1 раза в 60 минут при отсутствии вибраций, перемешивания исследуемой воды, при постоянной температуре. Содержание органических веществ в исследуемой воде проводится согласно предварительно построенному калибровочному графику. После окончания измерения биосенсор промывается чистой водой от остатков органических веществ исследуемой воды.
полн
Для построения калибровочного графика устройство помещают в образцы воды с известным содержанием органических веществ, регистрируют величину напряжения при различных концентрациях органических веществ согласно последовательности действий, описанных выше. Полученные значения используются для построения графика. В качестве органических веществ используют глюкозо-глутаматная смесь (ГГС), традиционно принятую в практике БПК (ХПК)-метрии в качестве стандарта для калибровки аналитических устройств (Природоохранный нормативный документ федерального уровня ПНД Ф 14. 1:2:3:4.1 23-97 Количественный химический анализ вод. Методика выполнения измерений биохимической потребности в кислороде после n-дней инкубации (БПК) в поверхностных пресных, подземных (грунтовых), питьевых, сточных и очищенных сточных водах. М.: 1997, 25 с.).
Пример
Для изготовления биосенсора из полой трубы на основе поливинилхлоридного пластика диаметром 2 см вырезают цилиндр корпуса 1 биосенсора длиной 10 см. Из углеродного войлока вырезают два диска, соответствующих диаметру цилиндрического корпуса 1 и выполняющих в дальнейшем функцию анода 2 и катода 6. К каждому из них прикреплены электропроводящие провода 7 в изоляции длиной 50 см. На верхнее основание цилиндрического корпуса 1 биосенсора насаживается пластина 4 размером 5×5 см из пенопласта со сквозным отверстием в центре диаметром 2 см, так что катод 6 находится в отверстии пластины 4. В качестве электронного блока 8 использовали микроконтроллер Arduino nano v3. Для обработки результатов измерений - программные средства Arduino IDE.
Рассмотрим использование биосенсора.
Пример 2
Исследовано четыре биосенсора (обозначим их - А, В, С, D), изготовленных, как описано выше. Они были погружены в общий сосуд с водопроводной водой - первое действие. Зарегистрирована электронным устройством 8 величина напряжения - она находилась у всех четырех в диапазоне 0,05-0,08 мВ. Три биосенсора: А, В, С, помещали в ил для образования на аноде 2 биопленки 3 анодофильных электрогенных бактерий. Четвертый биосенсор - D не погружали и далее использовали в качестве абиогенного контроля. Все четыре биосенсора были опущены в исследуемую воду - действие второе. В точке 2 на фиг. 2 отмечено среднее значение напряжение для биосенсоров А, В, С и значение, зафиксированное на биосенсоре D.
2
3
В сосуд с водой внесена глюкозо-глутаматная смесь (ГГС) - третье действие, Концентрация глюкозы и глутамата соответствовала уровню органического загрязнения среды в 205 мг О/дм. Измеряли напряжение каждый час в течение шести часов, на фиг. 2 этим действиям соответствуют точки с третьей по восьмую. Напряжение биосенсоров А, В, С выросло с 0,20 мВ до 0,28 мВ. Напряжение биосенсора D колебалось в пределах 0,01-0,04 мВ. Девятое действие - замена исследуемой воды на водопроводную. Как видно из графика I, среднее значение напряжения на биосенсорах А, В, С, значительно снизилось, приближаясь к показаниям биосенсора D на графике II.
Таким образом, биосенсоры А, В, С, содержащие на аноде 2 в качестве биорецептора биопленку электрогенных анодофильных бактерий 3, были способны реагировать изменением напряжения на наличие или отсутствие в исследуемой воде органических веществ. Биосенсор D без наличия биопленки анодофильных электрогенных бактерий в качестве биорецептора не демонстрировал такой реакции.
Пример 3
Исследовано 6 биосенсоров описанной выше конструкции с биопленкой 3 на аноде 2. Они были помещены по 3 штуки в два одинаковых сосуда с водопроводной водой, зафиксированы исходные (фоновые) значения их напряжений. В один из них была внесена сложная смесь органических веществ в виде питательного ГМФ-агара в концентрации 0,3 г/л, биоразлагаемая фракция которого (составляет 42%) представлена гидролизатом мяса ферментативным (опыт). В другом вода осталась без изменений(контроль). Измеряли напряжение с периодичностью 1 раз в час на протяжении 3 часов на каждом из биосенсоров. Результаты в виде усредненных значений напряжений приведены на фигуре 3. В опыте напряжение биосенсоров (кривая I) возрастало более активно от 0,09 до 0,62 мВ по сравнению с контролем (кривая II).
Пример 4
Исследовано 2 биосенсора описанной выше конструкции с биопленкой 3 на аноде 2.
Один биосенсор был использован для оценки загрязнения органическими веществами сточных вод сахарного завода в принимающем их техническом водоеме (фиг. 4, кривая I). Вторым для сравнения исследовалась вода в другом водоеме после фильтрации ее из первого водоема (фиг. 4, кривая II). На кривой I величина напряжения биосенсора составила 0,32-0,34 мВ, а на кривой II - 0,11-0,15 мВ. Загрязненность воды в обоих водоемах определили стандартным методом спектрофотометрического определения ХПК по ГОСТ Р 52708-2007. В первом и втором водоемах величина ХПК составляла соответственно 178 и 27 мг/л. В результате определения с помощью биосенсора и с помощью стандартного метода показали факт превышения органического загрязнения воды из первого водоема над загрязнением воды из второго водоема.
Таким образом, предлагаемый биосенсор для определения содержания в воде органических веществ позволяет оценить уровень органического загрязнения воды, имея при этом более простую и дешевую конструкцию по сравнению с прототипом.