Определение природных антиоксидантов в пиве

Определение природных антиоксидантов в пиве

И.И. Стрижаков, С.В. Румянцев

ОАО «Очаково»

А.Я. Яшин, Я.И. Яшин, Н.И. Черноусова

НПО «Химавтоматика»

Определение природных антиоксидантов в пищевых продуктах, напитках, лекарственных препаратах, биологически активных добавках в последнее десятилетие постоянно вызывает большой интерес. Это объясняется тем, что установлена прямая связь между возрастанием свободных радикалов в биологических жидкостях и возникновением заболеваний человека. Концентрация свободных радикалов (супероксидный радикал, пероксид водорода, гидроксил радикал и др.) возрастает в результате снижения активности естественной антиоксидантной системы человека, связанной с воздействием проникающей радиации, УФ-облучения, курения, алкоголизма, постоянных стрессов, инфекционных болезней, некачественного питания, некоторых лекарств. Под воздействием свободных радикалов повреждаются стенки сосудов, мембраны, окисляются липиды, что приводит к серьезным патологическим изменениям, в частности к сердечно-сосудистым, онкологическим и другим заболеваниям, а также к ускоренному старению организма человека.

Вредное воздействие свободных радикалов можно уменьшить за счет ежедневного употребления некоторых лекарственных растительных препаратов, биологически активных добавок, продуктов питания и напитков (чай, кофе, вино, пиво и др.), обладающих высокой антиоксидантной активностью. Основные природные антиокси-данты — витамины Е и С, флавоноиды, ароматические оксикислоты, антоциа-ны и др. Природные флавоноиды-анти-оксиданты в пиво поступают из хмеля, ячменного солода и из продуктов метаболизма дрожжей.

Определение полифенолов-антиоксидантов в пиве и его исходных продуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

В настоящее время общепринятый и самый удобный метод анализа полифенолов — высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) со

спектрофотометрическим или амперо-метрическим детекторами. С помощью метода ВЭЖХ в хмеле было разделено более 100 полифенольных соединений. В табл. 1 приведены основные группы полифенолов и их содержание в хмеле [1].

Таблица 1

Группа полифенолов Содержание в хмеле, мг/100 г

Гидроксибензойная кислота 1-10

Гидроксикоричная кислота 100-450

Проантоцианидины 100-600

Флаваноны 30-200

Флавонолы 1-10

Флавоноиды кверцетина 50-250

Флавоноиды кемферола 50-300

Пренилфлавоноиды 100-1000

Эти полифенолы регистрируются на длинах волн 265, 280, 310 и 360 нм. Состав полифенолов в хмеле зависит от его сорта и условий выращивания (климат, почва и пр.).

В работе [2] методом ВЭЖХ определены полифенольные соединения в обыкновенном хмеле (табл. 2). Как видно из таблицы, к основным фла-

Таблица 2

Компонент Содержание, г/кг хмеля

Сумма полифенольных соединений 28

Сумма флавоноидов по рутину 15

Флавонолы 1,6

Кверцетин 1,0

Кемпферол 0,6

Дигидрокверцетин 2,5

Ксантогумол 2,0

Изоксантогумол 0,05

Феруловая кислота 0,14

Хлорогеновая кислота 0,33

воноидам хмеля относятся пренили-рованные флавоноиды, кверцетин и кемферол. Пренилированные флаво-ноиды имеют замещенные группировки 3,3-диметилаллил (пренил), 1,1-ди-метилаллин, геранил и др. Из хмеля выделено девять пренилфлавоноидов: ксантогумол, диметилксантогумол, 3 '-геранилнарингенин, 5 '-пренилксан-тогумол, дегидроциклоксантогумол, изоксантогумол, 8-пренилнарингенин, 6-пренилнарингенин и др.

Из всех пренилфлавоноидов ксан-тогумол в хмеле составляет 80-90 %. Общее содержание ксантогумола в разных сортах хмеля колеблется в пределах 0,2-1 %. Этанол экстрагирует до 90 % пренилфлавоноидов, экстракт жидкого СО2 практически не содержат флавоноиды. Растворимость ксантогумола в воде 1,3 мг/л при 8 °С, в 50%-ном растворе этанола — 3,5 мг/л и в пиве — до 4 мг/л при 8 °С.

В процессе производства пива возможны значительные потери ксанто-гумола за счет адсорбции на микрочастицах (18-26 %) и на дрожжах (11-32 %). Таким образом, общее содержание всех флавоноидов может снизиться до 10 %.

Пренилфлавоноиды интенсивно изучаются в медицине, так как они показывают антиоксидантные, противовоспалительные, антиканцерогенные и антивирусные свойства. Ксантогумол, в частности, эффективен при остеопо-розах, подавляет окисление липопро-теинов низкой плотности, оказывает сильное цитотоксическое действие на раковые клетки разных органов человека при концентрациях от 0,1 до 100 мкг [3].

В работе [4] определены пренил-флавоноиды в разных сортах хмеля из Чехии урожая 2000-2002 гг. Для сравнения были проанализированы лучшие сорта хмеля из США, Германии, Англии, Словении и Польши. Экстракцию их хмеля проводили смесью растворителей диэтилового эфира и метанола, разделение осуществляли на колонке 250x4,6 мм с Nucleosil РК С18, 5 мк. Детектирование проводили на длине волны 370 нм, при этом а- и Р-горькие кислоты определяли на длине волны 314 нм. Наибольшее содержание ксантогумола среди всех чешских сортов хмеля имеет сорт «Агнус» — в среднем 1 % от массы и содержание а-горьких кислот в диапазоне от 9,6 до 16,2 % от массы сухого вещества.

В наборе немецких, американских, английских, польских и словенских сортов пива были все группы сортов — от ароматических до сортов с высоким содержанием а-кислот.

Таблица 3

Пиво Дата изготовления Производитель АОА, мг/мл

«Очаково Премиум» «Черное Легкое» 21.10.04 ЗАО МПБК «Очаково» 0,73

«Очаково Премиум» «Светлое» 16.11.04 ЗАО МПБК «Очаково» 0,64

Bavaria Pilsner 17.1004 ООО «Компания ПИТ» 0,53

«Ячменный колос» «Золотое» (бутылочное) 08.10.04 ЗАО МПБК «Очаково» 0,52

«Ячменный колос» «Золотое» (баночное) 09.11.04 ЗАО МПБК «Очаково» 0,52

«Крушовице Империал» 30.08.04 Королевский пивоваренный завод Крушовице А.О., Чешская Республика 0,52

«Очаково Оригинальное» (пластиковая бутылка) 22.11.04 ООО «Бахус» (филиал ЗАО МПБК «Очаково») 0,5

«Ячменный колос» «Золотое»(баночное) 05.10.04 ЗАО МПБК «Очаково» 0,5

«Очаково Оригинальное» (пластиковая бутылка) 15.11.04 ООО «Бахус» (филиал ЗАО МПБК «Очаково») 0,49

«Эфес Пилсенер» 27.10.04 ЗАО «Пивоварня Москва-Эфес» 0,33

«Балтика классическое» № 3 (бутылочное) Годен до 18.04.05 ОАО «Пивоваренная компания «Балтика» 0,32

«Клинское Люкс» 03.11.04 ОАО «САН Интербрю» 0,3

«Балтика классическое» №3 (баночное) Годен до 24.04.05 ОАО «Пивоваренная компания «Балтика» 0,28

«Невское Светлое» 19.04.04 ОАО «Вена» 0,24

Кроме традиционных были изучены и новые сорта: американские — Мил-лениум, Ньюпорт, немецкие — Мер-кур и Сапфир, английские — Пилот, и Пилигрим, польские — Зула и Юнга. Содержание ксантогумола в них составляло 0,20-1,09 % от сухой массы и зависело от года урожая и района выращивания.

В пиве содержатся также изофла-воноиды: генистеин (4', 5', 7'-три-гидроксиизофлавон), биохапин (5, 7 '-дигидрокса-4 '-метоксиизофлавон), дайдзеин (4', 7-дигидроксиизофлавон) и формононетин (7-гидрокси-4 '-метоксиизофлавон) [5]. Эти изофлавоны извлекаются из зерен и других частей растений. Они экстрагируются диэтило-вым эфиром и фракционируются тонкослойной хроматографией на силикагеле и затем разделяются на колонке в обра-щеннофазовом варианте жидкостной хроматографии. В 26 бутылках пива были проанализированы изофлавонои-ды с использованием ВЭЖХ. В отдельных образцах пива содержание суммы четырех изофлавоноидов было в пределах 1,26-29 нмоль/л. Больше всего в пиве содержится формоконетина — 0,19-14,99 нмоль/л, тогда как концентрация дайдзеина была в несколько раз ниже — 0,08-2,5 нмоль/л. Концентрации генистеина и биоханина сопоставимы в пределах 0,169-6,74 нмоль/л и 0,820-4,84 нмоль/л для генистеина и биоханина соответственно.

Определение антиоксидантной активности пива — суммарного содержания антиоксидантов

Пиво обладает сравнительно высокой антиоксидантной способностью за счет присутствия в нем флавоноидов, оксикислот, витамина С и др. Величина антиоксидантной способности пива — на уровне белого вина и коньяка [6] и только в три раза меньше, чем у красного вина [3]. В работе [3] была измерена антиоксидантная активность пива, произведенного из разных сортов хмеля. В зависимости от сорта хмеля антиоксидантная активность изменялась в пределах 10-15 %. Наибольшей антиоксидантной активностью обладали черные сорта пива, наименьшей — безалкогольное пиво. В этой работе по нашим сведениям ошибочно принимается, что большинство антиоксидантов в пиве обязано своим происхождением солоду и в меньшей степени — хмелю.

В работе [7] показано, что при потреблении пива антиоксидантная емкость плазмы человека повышается уже через 1 ч. Благодаря в основном антиоксидантной активности пиво обладает лечебным действием. Пиво

может уменьшать нарушения ДНК, вызываемые гетероциклическими ароматическими аминами [8], которые образуются в процессе приготовления пищи, особенно мяса при его поджаривании, в результате реакций между свободными аминокислотами, сахарами, креатином и креатинином. Несмотря на то, что гетероциклических аминов образуется мало, в пределах 0,1-50 ррЬ (исследования Ливерпульской национальной лаборатории им. Лоуренса), они, как сильные мутагены и канцерогены, могут разрушать ДНК и вызывать онкологические заболевания. В работе [7] исследовано потребление обычного пива, безалкогольного пива и водного раствора этанола (4,5 об. %) на содержание антиоксидантного статуса человека. В плазме 14 здоровых людей были определены ВЭЖХ профили некоторых фенольных кислот (кофейной, siпapic, сиреневой и ванильной). Плазму собирали перед употреблением напитков, через 1 и 2 ч после употребления. Употребление пива значительно повышало антиоксидант-ную емкость плазмы. Содержание всех фенольных кислот повышалось в плазме (измерено ВЭЖХ) через 1 ч после употребления на 20%, через 2 ч после употребления — на 40 %. Содержание глюкозы, общего холестерина, триглицеридов, мочевой кислоты и антиоксидантов плазмы а-токоферола и глутатиона остается в плазме неизменным.

При употреблении безалкогольного пива антиоксидантная емкость плазмы повышалась незначительно. По-видимому, это связано с тем, что при удалении спирта из пива удаляются и фенольные кислоты. При потреблении раствора этанола (4,5 об. %) антиок-сидантная емкость плазмы не изменялась.

Мы измерили антиоксидантную активность образцов пива ОАО «Очаково», а также других производителей (табл. 3). Измерения проводили на приборе «ЦветЯуза-01-АА», который представляет собой инжекционно-проточную систему, состоящую из емкости для подвижной фазы-растворителя, насоса, шестиходового крана-дозатора, амперометрического детектора. Последний состоит из термоста-тируемой амперометрической ячейки со сменными рабочими электродами, усилителя тока, аналого-цифрового преобразователя и программного обеспечения.

Прибор управляется компьютером. На приборе можно проводить прямые количественные определения содержания антиоксидантов в исследуемых пробах. Амперометрический детектор может работать в трех режимах: постоянном потенциале, импульсных потенциалах и при сканировании потенциалов во всем диапазоне, снимая вольтамперограмму. Меняя величину приложенного потенциала, можно определять не только суммарную антиоксидантную активность, но и

2 • 2006

87

активность отдельных классов анти-оксидантов.

Амперометрический детектор работает в окислительном режиме при положительных потенциалах, при этом регистрируются селективно только соединения, способные окисляться (в основном полифенолы). Рабочий электрод выполнен из стеклоуглеро-да, который наиболее чувствителен при определении полифенольных соединений. Подробно описание прибора приведено в работах [9-11]. Прибор прошел Госиспытания и включен в Государственный реестр средств измерений № 20706-05. На Международной выставке «Химия-2005» он награжден дипломом первой степени и золотой медалью.

Из табл. 3 видно, что наибольшая антиоксидантная активность — у темного сорта пива. Антиоксидантная активность пива в основном связана с сортом хмеля (табл. 4).

Таблица 4

Сорт хмеля АОА, мг/г

Крылатский 15,2

Михайловский 14,5

Подвязный 14,1

Челенджер 13,2

Истринский 12,2

Ранний 11,7

Дикий 11,7

Сумерь 11,6

Перед измерениями строится гра-дуировочный график зависимости сигналов кверцетина (площади пиков) от его концентрации. При этих условиях дозируется проба пива, измеряется площадь пика и по графику определяется, какому количеству кверцетина это соответствует. Значение антиок-сидантной емкости 0,73 мг/мл означает, что 1 мл пива по антиоксидантной активности равноценен 0,73 мг квер-цетина. Кверцетин (чистый фирмы «Флука») — известный и распространенный антиоксидант. Такая оценка антиоксидантной емкости (активности) в настоящее время общепринята.

До сих пор многие производители пива считают нежелательным присутствие больших количеств полифенолов в солоде ячменя или хмеле, так как они приводят к необратимому помутнению бутылочного пива. Для достижения высокой физической стабильности они предпочитают частично удалить полифенолы. Для этих целей культивируются специальные сорта ячменя, не содержащие проантоциа-нидины, такие, как Саттап^ или осуществляется удаление полифенолов за

счет адсорбции при фильтрации через поливинилполипирролидон.

Однако, с другой стороны, в настоящее время ведутся интенсивные исследования по поиску природных ан-тиоксидантов в растениях, зернах, чае и др. Влияние этих природных антиок-сидантов, а это в основном полифенолы, используется двояко. Во-первых, для защиты пищевых продуктов, например жиров, от окисления и порчи их вкусовых качеств. Во-вторых, и это, пожалуй, самое главное, — полифенолы — антиоксиданты захватывают свободные радикалы в биологических жидкостях человека и защищают его от опасных онкологических, сердечно-сосудистых и других заболеваний. Особенно интересны антиоксиданты, присутствующие в красном вине, зеленом чае и розмарине. В связи с этим возникает вопрос: как целесообразнее использовать большое содержание полифенолов в хмеле (4-6 мас.%).

А. Форстером (Joh. Barth and Sohn, Нюрнберг, Германия) были выбраны оптимальные технологические условия (в частности, время кипячения), при которых образцы пива не изменяли прозрачность во времени даже при добавлении больших концентраций полифенолов. В Германии разработан сорт пива «Ксант» с повышенным содержанием антиоксидантов. Несомненно, что в ближайшие годы это направление будет интенсивно развиваться, и полезность пива значительно возрастет, так как будут созданы образцы пива с высокой антиоксидант-ной активностью, близкой к красному вину.

ЛИТЕРАТУРА

1. Forster A., Beck B., Schidt R.//Hopfenrundsch-au International. 1999. Р. 68-74.

2. Алексеева М.А., Эллер К.И., Арзамасцев А.П.//Химико-фармацевтический журнал. 2004. Т. 38. № 12. С. 82-85.

3. Рацек Я., Голичек В., Пруха П., Винсон Д.А. //Пиво и жизнь. 2003. С. 10-12.

4. Крофта К.//Пиво и жизнь. 2003. С. 1-14.

5. Lapcik O., Hill M., HamplR., Wahala K.//Ster-oids. 1998. V. 63. P. 14.

6. Pellegrini N., Serafini M., Colombi B. et. al.// J Nutr. 2003. V. 133. P. 2812-19.

7. Chiselli A., Natella F., Guidi A. et. a.//J Nutr. Biochem. 2000. V. 11. № 2. P. 76-80.

8. AdamsonR.H., Thorgeirsson U.P.//Advances in Experimental Medicine and Biology. 1995. V. 369. P. 211-220.

9. Яшин А.Я., Яшин Я.И., Черноусова Н.И., Пахомов В.П.//Пиво и напитки. 2004. № 6. C. 44-46.

10. Яшин А.Я., Яшин Я.И.//Приборы и автоматизация. 2004. № 11. C. 45-48.

11. Яшин А.Я., Яшин Я.И., Черноусова Н.И., Пахомов В.П. — М.: НПО «Химавтомати-ка», 2005. &