СРЕДСТВО ДЛЯ БЛОКИРОВАНИЯ ЭФФЕКТОВ ЛИПОТЕЙХОЕВЫХ КИСЛОТ - АГОНИСТОВ ТОЛЛ-ПОДОБНОГО РЕЦЕПТОРА 2
MEANS FOR BLOCKING THE EFFECTS OF LIPOTEICHOIC ACIDS - TOLL-LIKE RECEPTOR 2 AGONISTS

Область применения
Изобретение относится к микробиологии, биотехнологии, фармакологии и медицине и касается потенциального применения средства, обладающего антагонистической активностью в отношении агонистов Толл-подобного рецептора 2 (TLR2). Указанное средство представляет собой липополисахарид фототрофной бактерии штамма Rhodobacter capsulatus PG, депонированного в ВКМ ИБФМ РАН (Свидетельство о депонировании штамма Rhodobacter capsulatus PG. Регистрационный номер ВКМ В-2381 Д, 21.12.2005), которое может быть использовано в медицине для блокирования активации внутриклеточных сигнальных путей лигандами TLR2 и синтеза провоспалительных цитокинов иммунными клетками.
Уровень техники
Липотейхоевые кислоты (ЛТК) представляют собой класс амфифильных ди- и триацелированных липопептидов, являющихся главными компонентами клеточной стенки грамположительных бактерий. Распознавая ЛТК TLR2 инициирует иммунные ответы клеток крови (Han S.H., Kim J.H., Martin М., Michalek S.M., Nahm M.H. Pneumococcal lipoteichoic acid (LTA) is not as potent as staphylococcal LTA in stimulating Toll-like receptor 2. Infect. Immun. 2003. 71, 5541-5548). ЛТК рассматривается как эквивалент ЛПС, ответственный за развитие септического шока, вызываемого грамположительными бактериями (Ginsburg L. Role of lipoteichoic acid in infection and inflammation. 2002. Lancet infect. Dis. 2, 171-179). Показано, что ЛТК Streptococcus pyogenes (Fieber C., Janos M., Koestler Т., Gratz N., Li X.-D., Castiglia V., Aberle M., Sauert M., Wegner M. et al. Innate immune response to Streptococcus pyogenes depends on the combined activation of TLR13 and TLR2. PLoS ONE. 2015. 10(3), e0119727), Staphylococcus aureus и Streptococcus pneumoniae связываются непосредственно с TLR2 (Im J., Choi H.S., Kim S.K., Woo S.S., Ryu Y.H., Kang S.S., Yun C.H., Han S.H. A food-born heterocyclic amine, 2-amino-l-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridine (PhIP), suppresses tumor necrosis factor-alpha expression in lipoteichoic acid-stimulated RAW 264.7 cells. 2009. Cancer Lett. 274, 109-117; Kang J.Y., Nan X., Jin M.S., Youn S.J., Ryu Y.H., Mah S., Han S.H., Lee H., Paik S.G., Lee J.O. Recognition of lipopeptide patterns by Toll-like receptor 2-Toll-like receptor 6 heterodimer. 2009. Immunity. 31, 873-884). ЛТК активируют внутриклеточный сигнальный каскад через TLR2, приводящий к активации транскрипционных факторов NF-κВ, и киназ PKC, PI3K, ERK, JNK и р38 сигнальных путей и к синтезу провоспалительных цитокинов и хемокинов (Su S-H., Hua K-F., Lee H., Chao L.K., Tan S-K., Lee H., Yang S-F., Hsu H-Y. LTA and LPS mediated activation of protein kinases in the regulation of inflammatory cytokines expression in macrophages. 2006. Clinica Chimica Acta. 374, 106-115).
ЛПС из целого ряда грамотрицательных не энтеробактериальных организмов активируют клетки миелоидной линии через TLR2. Отличительными особенностями состава липидов А этих ЛПС являются: фосфорилированные диглюкозамины, отличная от энтеробактериальных ЛПС длина углеводородных цепей жирнокислотных остатков, а также наличие разветвленных ацильных цепей (Erridge С, Pridmore A., Eley A., Stewart J., Poxton I.R. Lipopolysaccharides of Bacteroides fragilis, Chlamydia trachomatis and Pseudomonas aeruginosa signal via toll-like receptor 2. 2004. J. Med. Microbiol. 53(Pt 8), 735-740). Фототрофная бактерия Rhodobacter capsulatus относится к грамотрицательным бактериям (Katzke N., Bergmann R., Jaeger K.-E., Drepper T. Heterologous high-level gene expression in the photosynthetic bacterium Rhodobacter capsulatus. 2012. Methods Mol. Biol. 824, 251-69). Ранее показана антагонистическая активность Е5531 - синтетического аналога липида А из R. capsulatus против активации клеток токсичными ЛПС и ЛТК (Kawata Т., Bristol J.R., Rossignol D.P., Rose J.R., Kobayashi S., Yokohama H., Ishibashi A., Christ W.J., Katayama K., Yamatsu I., Y.Kishi. E5531, a synthetic non-toxic lipid A derivative blocks the immunobiological activities of lipopolysaccharide. 1999. Br. J. Pharmacol. 127, 853-862). Известно использование штамма R. capsulatus PG в качестве продуцента липополисахарида - антагониста эндотоксинов (Прохоренко И.Р., Грачев С.В., Зубова С.В. Штамм Rhodobacter capsulatus PG - продуцент липополисахарида, антагониста эндотоксинов. Патент на изобретение RU 2392309, 24.11.2008). Ранее на клетках крови нами показано, что ЛПС R. capsulatus PG проявляет антагонистический эффект против эффектов токсичных ЛПС в подавлении синтеза TNF-α, IL-1β и IL-6 [Кабанов Д.С., Серов Д.А., Зубова С.В., Грачев С.В., Прохоренко И.Р. Динамика подавления эффектов эндотоксинов липополисахаридом из Rhodobacter capsulatus PG. 2016. Биохимия. 81(3), 401-409). Структура нетоксичного липида А ЛПС R. capsulatus включает в дисахаридную основу дифосфорилэтиламин при С-1 и фосфорилэтиламин при С-4', а так же ненасыщенную жирную кислоту (12:1) (Krauss J.H., Seydel U., Weckesser J., Mayer H. Structural analysis of the nontoxic lipid A of Rhodobacter capsulatus 37b4. 1989. Eur. J. Biochem. 180(3), 519-526) (Фиг. 1). Ряд элементов структуры липида A R. capsulatus PG идентичны таковым липидов А грамотрицательных бактерий, активирующих клетки крови человека к синтезу провоспалительных цитокинов через TLR2.
Задачей изобретения является расширение ассортимента и доступности препаратов на основе нетоксичного липополисахарида, продуцируемого штаммом фототрофной бактерии Rhodobacter capsulatus PG, для блокирования активации внутриклеточных сигнальных путей лигандами TLR2 и синтеза провоспалительных цитокинов иммунными клетками.
Поставленная задача решается применением нетоксичного липополисахарида, продуцируемого штаммом фототрофной бактерии Rhodobacter capsulatus PG, депонированным в ВКМ ИБФМ РАН под номером В-2381 Д, в качестве нетоксичного блокирующего фактора, защищающего от эффектов липотейхоевой кислоты Streptococcus pyogenes - агониста TLR2.
Перечень чертежей
Фиг. 1. Активное начало ЛПС из Rhodobacter capsulatus.
Фиг. 2. Индукция синтеза TNF-α после активации клеток цельной крови ЛПС R. capsulatus PG и/или ЛТК S. pyogenes, n=7. *р<0.05.
Фиг. 3. Индукция синтеза IL-6 после активации клеток цельной крови ЛПС R. capsulatus PG и/или ЛТК S. pyogenes,, n=7. *р<0.05.
Фиг. 4. Индукция синтеза IL-1β после активации клеток цельной крови ЛПС R. capsulatus PG и/или ЛТК S. pyogenes, n=7. *р<0.05.
Фиг. 5. Индукция синтеза IL-8 после активации клеток цельной крови ЛПС R. capsulatus PG и/или ЛТК S. pyogenes, n=7. *р<0.05.
Фиг. 6. Индукция синтеза IFN-γ после активации клеток цельной крови ЛПС R. capsulatus PG и/или ЛТК S. pyogenes, n=7. *р<0.05.
Описание изобретения
На основании структурных особенностей липида А мы предположили, что ЛПС R. capsulatus PG может конкурировать с ЛТК S. pyogenes за TLR2, блокируя активацию клеток крови к синтезу провоспалительных цитокинов.
Исследования проводились на цельной крови условно здоровых добровольцев обоих полов в возрасте 25-30 лет, не имеющих клинико-лабораторных признаков тяжелых хронических заболеваний и не использовавших медикаментозную терапию в течение последних 3-х месяцев. Забор крови проводился по информированному согласию в клинических условиях в вакутейнеры (Becton Dickinson and Company, United Kingdom), обработанные гепарином (17 u/ml).
2
2
Для исследования эффекта ЛПС и ЛТК на синтез цитокинов кровь (100 μl) разводили RPMI 1640 (1:10) и инкубировали с ЛПС R. capsulatus PG (1000 ng/ml) или ЛТК 5. pyogenes (1000 ng/ml) в течение 6 или 24 ч при 37°С и 5% CO. Для определения антагонистического эффекта ЛПС R. capsulatus PG в отношении ЛТК S. pyogenes кровь прединкубировали в течение 30 min с ЛПС R. capsulatus PG перед добавлением ЛТК S. pyogenes и инкубировали в течение 6 или 24 ч при 37°С и 5% СО. После инкубации клетки крови осаждали центрифугированием (300 g, 10 min). Супернатанты отбирали и хранили при -20°С до процедуры определения содержания цитокинов.
Содержание цитокинов в образцах определяли с помощью наборов для иммуноферментного определения TNF alpha, IL-6, IL-1β, IL-8 и IFN-γ согласно протоколу производителя (ВЕКТОР-БЕСТ, Новосибирск). Оптическую плотность образцов определяли на анализаторе STAT FAX 3200 (Awareness Technology Inc., USA) при длине волны 450 nm. Количественную оценку цитокинов проводили с использованием калибровочной кривой, отражающей зависимость оптической плотности образца от концентрации цитокина.
Статистический анализ и графическое представление результатов проведено с помощью непараметрической статистики с использованием программ OiginPro 7,5 и Microsoft Office Excel 2010 (плагин AtteStat). Результаты представлены в виде медианных значений с квартилями (IQR). Достоверность различий между медианными значениями оценивали с помощью U-критерия Манна-Уитни. Различия медианных значений считались достоверными при уровне значимости р<0,05.
В ответ на активацию ЛТК S. pyogenes нарабатывались высокие уровни исследуемых цитокинов и хемокинов (TNF-α, IL-6, IL-1β, IL-8 и IFN-γ) (Фигуры 2-6). Нетоксичный ЛПС R. capsulatus PG в концентрации равной концентрации ЛТК S. pyogenes не стимулировал клетки к наработке TNF-α, IL-6, IL-1β и IFN-γ (Фигуры 2-4, 6). В случае хемокина IL-8 в ответ на ЛПС R. capsulatus PG нарабатывалось его незначительное количество по сравнению с контролем, но значительно меньше, чем при активации клеток крови ЛТК (Фиг. 5).
В случае активации клеток посредством ЛТК S. pyogenes, предварительная инкубация с ЛПС R. capsulatus PG приводила к значительному достоверному снижению синтеза исследуемых цитокинов и хемокинов (TNF-α, IL-6, IL-1β, IL-8 и IFN-γ) (Фиг. 2-6).
Промышленная применимость
Новизной изобретения является то, что, основываясь на исследованиях на цельной крови условно здоровых добровольцев обоих полов в возрасте 25-30 лет, не имеющих клинико-лабораторных признаков тяжелых хронических заболеваний и не использовавших медикаментозную терапию в течение последних 3-х месяцев, установлена неизвестная раннее способность антагонистического эффекта ЛПС R. capsulatus PG в отношении ЛТК S. pyogenes. При этом эффективность новых свойств подтверждена тем, что в случае активации клеток посредством ЛТК S. pyogenes, предварительная инкубация с ЛПС R. capsulatus PG приводила к значительному достоверному снижению синтеза исследуемых провоспалительных цитокинов и хемокинов (TNF-α, IL-6, IL-1β, IL-8 и IFN-γ).
На основании полученных результатов нетоксичный липополисахарид фототрофной бактерии ЛПС Rhodobacter capsulatus PG защищает от липотейхоевой кислоты Streptococcus pyogenes - агониста TLR2, блокируя активацию клеток крови к синтезу провоспалительных цитокинов. ЛПС Rhodobacter capsulatus PG может быть прототипом для создания препарата, защищающего от ЛТК грамположительных бактерий.