Влияние различных режимов введения мексидола и 3-гидроксипиридина никотината в терапии острой ишемии головного мозга

УДК 591.2:616.831-005.4:615.27

Н. А. Костычев, И. Н. Чаиркин, Н. В. Чаиркина, В. И. Инчина, И. С. Рагинов

ВЛИЯНИЕ РАЗЛИЧНЫХ РЕЖИМОВ ВВЕДЕНИЯ МЕКСИДОЛА И 3-ГИДРОКСИПИРИДИНА НИКОТИНАТА В ТЕРАПИИ ОСТРОЙ ИШЕМИИ ГОЛОВНОГО МОЗГА

Аннотация. Целью исследования явился анализ терапевтического действия мексидола и 3-гидроксипиридина никотината на неврологический статус и популяцию нейронов при моделировании острой ишемии головного мозга. На основании полученных экспериментальных данных наиболее приемлемыми для выравнивания гомеостаза оказались производные 3-гидроксипиридина в группах с введением препаратов за три дня до моделирования острой ишемии головного мозга.

Ключевые слова: мексидол, 3-гидроксипиридина никотинат (3-ГПН).

Abstract. The article investigates therapeutic influence of mexidol and 3-gidro-xipiridin nicotinatis on the neurologic status and on the population of neurons when modeling acute brain ischemia. On the basis of received experimental data,the authors decided the 3-gidroxipiridin derivatives to be the most acceptable for homeostasis balancing when introducing the preparations in groups 3 days prior to modelling of acute brain ischemia.

Key words: mexidol, 3-gidroxipiridin nicotinat.

Введение

Из-за значительной распространенности, высокой смертности, длительной инвалидизации и утраты трудоспособности больных острые нарушения мозгового кровообращения являются важнейшей медицинской и социальной проблемой. Цереброваскулярные заболевания занимают второе место в структуре смертности от болезней системы кровообращения и в общей смертности населения и первое место среди причин первичной инвалидности. По данным Национальной ассоциации борьбы с инсультом, в России ежегодно регистрируется до 500 тысяч человек с нарушением мозгового кровообращения [1]. Ранняя (30-дневная) летальность после инсульта составляет до 35 %, а в течение года после дебюта заболевания умирают до 48 % больных [2].

1. Материалы и методы исследования

Эксперименты проводились на нелинейных белых крысах обоего пола массой 180-200 г, самцы и самки содержались раздельно в стандартных условиях вивария с соблюдением всех гигиенических нормативов. У животных моделировали сахарный диабет и гиперхолестеринемию. Под эфирным наркозом посредством хирургического доступа перевязывали внутренние сонные артерии [3]. Исследования на крысах проводили в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 №755) и рекомендациями Международного комитета по науке о лабораторных животных, поддержанных Всемирной организацией здравоохранения.

Мексидол и 3-гидроксипиридина никотинат (3-ГПН) вводили внутри-брюшинно, через 20 мин после перевязки сонных артерий и далее ежедневно, а в группах с профилактическим направлением препараты начинали вводить за три дня до моделирования острой ишемии. В I контрольной группе (59 крыс) вводили физиологический раствор в дозе 50 мг/кг. Во II группе (32 крысы) изучалось влияние 3-ГПН в дозе 50 мг/кг. В III группе (26 крыс) и в IV группе (36 крыс) с профилактическим направлением животным вводили 3-ГПН в дозе 50 мг/кг и 100 мг/кг за 3 дня до моделирования острой ишемии. В V группе (28 крыс) вводили мексидол в дозе 50 мг/кг. В VI группе (36 крыс) с профилактическим направлением вводили мексидол в дозе 50 мг/кг за три дня до моделирования острой ишемии.

Для оценки неврологического статуса использовали метод оценки неврологического дефицита по шкале оценки инсульта (stroke-index) McGrow в модификации И. В. Ганнушкиной, тяжесть состояния оценивалась по сумме соответствующих баллов. Для регистрации мышечного тонуса использовали тест подтягивания на горизонтальной перекладине. В этом тесте крысы подвешиваются передними лапами на проволоку, натянутую на высоте 20-30 см от поверхности стола. Интактные крысы с ненарушенным мышечным тонусом быстро подтягиваются и удерживаются на перекладине четырьмя лапами. Невыполнение этого рефлекса животными опытной группы свидетельствует о нарушении мышечного тонуса и неврологическом дефиците. Для регистрации неврологического дефицита, выражающегося в нарушении координации движений, крыс помещали на горизонтальный стержень диаметром 4 см, вращающийся со скоростью 3 оборота в минуту. Неспособность животных под влиянием препарата удерживать равновесие на стержне в течение 2 мин рассматривалась как проявление нарушения координации движений. Тестирование повторяли в одно и то же время на протяжении всего эксперимента.

Для изучения популяций нейронов и нейроглии гиппокампа мозг животных, прошедший фиксацию, промывали и проводили по спиртам возрастающей концентрации и заливали в парафин по общепринятой методике. При морфометрическом исследовании изучали популяцию нейронов поля СА1 гиппокампа, а при гистохимическом исследовании изучали количество TUNEL+ (апоптозных) клеток. Готовили серийные фронтальные срезы толщиной 7 мкм, причем одни исследовали на наличие TUNEL+ (апоптозных) клеток, используя гистохимический метод, а вторые окрашивали тионином по методу Ниссля [4]. Подсчет клеток проводили при увеличении *1000, все количественные показатели пересчитывали на 1 мм2. Верификацию проводили с помощью стереотаксического атласа мозга взрослой крысы G. Paxinos, Ch. Watson [5]. Для светооптического исследования использовались фронтальные срезы мозга на уровнях, соответствующих 20-22 рисункам атласа.

Статистическую обработку данных проводили в программе Microsoft Office Excel с вычислением средних арифметических значений (М), ее ошибки (± m). Степень и оценку достоверности различий определяли с помощью критерия Колмогорова и критерия соответствия хи-квадрат (%2). Достоверно значимыми считали результаты прир < 0,05.

2. Результаты исследования

При моделировании ишемии по предложенной методике у крыс отмечался односторонний или двухсторонний полуптоз или птоз, тремор, замед-

ленность движений, слабость конечностей, парезы и параличи конечностей, в тяжелых случаях кома и летальный исход. На 1-е сутки после операции при оценке неврологических отклонений у крыс I группы средний неврологический балл составил 4,4 ± 0,4, в других группах с применением исследуемых препаратов он был достоверно ниже (при р < 0,05), так, во II группе -

3,5 ± 0,4; в III группе - 3,7 ± 0,3; в IV группе - 3,9 ± 0,5; в V и VI группах неврологический балл составил 4 ± 0,5 и 4,2 ± 0,4 соответственно (рис. 1).

Неврологический балл

1 сутки щЭ сутки п7 сутки

1 группа 2 группа 3 группа

4 группа 5 группа 6 группа

Рис. 1. Динамика тяжести неврологических нарушений в исследуемых группах

На 3-е и 7-е сутки после моделирования ишемии происходило снижение тяжести неврологических нарушений в исследуемых группах, особенно значительное снижение неврологических нарушений произошло в группах с применением мексидола и 3-ГПН с введением препаратов за 3 дня до моделирования ишемии. На 7-е сутки средний неврологический балл составил: в группе контроля - 3,3 ± 0,3, во II группе - 2,1 ± 0,3, в III группе - 1,8 ± 0,3, в IV группе - 1,4 ± 0,3, в V группе - 1,6 ± 0,4, в VI группе - 1,2 ± 0,3 соответственно.

На 1-е сутки после операции ослабление мышечного тонуса у животных в I группе не позволяет им выполнить подтягивание на горизонтальной перекладине, на 3-е сутки подтянулось на перекладине 17 %, а на 7-е сутки -25 % животных. Во II группе на горизонтальной перекладине подтянулось 17 % на 1-е сутки, на 3-е сутки - 50 %, а на 7-е сутки - 60 % животных. В III группе на 1-е сутки подтянулось 40 %, на 3-е сутки - 60 % и на 7-е сутки -75 % крыс. В IV группе на 1-е сутки подтянулось 38 %, на 3-е и 7-е сутки -43 % и 83 % животных соответственно. В V группе тест на 1-е сутки выполнили 29 %, на 3-е сутки - 50 %, на 7-е сутки - 75 % крыс, а в VI на 1-е сутки подтянулось 64 %, на 3-е и 7-е сутки - 73 % и 80 % животных соответственно (рис. 2).

Исследование динамики нарушений координации движений у крыс с ишемическим повреждением головного мозга показало, что на 1-е сутки после инсульта нарушение координации движений отмечалось у 14-50 % животных, в зависимости от исследуемой группы. Так, в I группе на 1-е и

3-е сутки после моделирования острой ишемии нарушение координации движений отмечалось у половины крыс. В I группе на 7-е сутки тест выполнило 75 % крыс, а в других группах на 7-е сутки тест выполнили все животные. Во II группе на 1-е сутки удержалось на стержне 67 % животных, а на 3-е сутки - 83 % животных. В III группе на 1-е и 3-е сутки тест выполнило 80 % крыс. В IV группе на 1-е сутки смогла удержаться на вращающемся тесте половина крыс, а на 3-е сутки - 57 % животных. В V группе на 1-е сутки на вращающемся стержне удержались 57 %, а к 3-м суткам тест выполнили все крысы. В VI группе на 1-е сутки тест выполнили 86 % животных, а на 3-е сутки - 91 % животных (рис. 3).

I  1 сутки  3 сутки  7 сутки

1 группа

2 группа

3 группа

4 группа

5 группа

6 группа

%

Рис. 2. Количество животных, подтянувшихся на горизонтальной перекладине

Рис. 3. Количество животных, удержавшихся на вращающемся стержне

На фоне сахарного диабета в сыворотке крови отмечено достоверное снижение содержания общего белка (рис. 4). Так, концентрация общего белка

в группе интактных животных составила 79,6 ± 0,7 г/л, а в контрольной группе на 7-е сутки - 58,3 ± 0,4 г/л, что на 26,8 % меньше (р < 0,05). Наиболее эффективно корригирует воздействие патологических факторов введение 3-ГПН в дозе 50 мг/кг и 100 мг/кг за 3 дня до моделирования ишемии в III и IV группах. Содержание общего белка в данных группах достоверно возрастало до 69,7 ± 0,8 и 75,7 ± 0,8 г/л, что на 19,7 % (р < 0,05) и 30 % больше группы контроля (р < 0,05).

Общий белок

£

Й

о С 80

Интактная 1 группа 2 группа 3 группа 4 группа 5 группа 6 группа группа

Рис. 4. Уровень общего белка в плазме крови по сравнению с контрольной группой

Наиболее значимый гипогликемический эффект был выявлен в IV исследуемой группе (рис. 5), где зафиксировано достоверное снижение уровня глюкозы на 7-е сутки с 12,9 ± 0,5 в контрольной группе, до 6,3 ± 0,4 ммоль/л, что на 6,8 % выше показателя интактной группы (5,9 ± 0,2 ммоль/л). Во II группе уровень гликемии составил 8,1 ± 0,2 ммоль/л, что достоверно меньше группы контроля на 37,4 % (р < 0,05).

100 90 80 * 70 | 60 В 50

40

30

20

10

0

глюкоза

і

Интактная 1 группа 2 группа 3 группа 4 группа 5 группа 6 группа

группа

Рис. 5. Уровень глюкозы в плазме крови по сравнению с контрольной группой

Использование 3-ГПН в дозе 50 мг/кг за три дня до ишемии в III группе снижало уровень глюкозы до 7,2 ± 0,1 ммоль/л, что достоверно больше группы интактных животных на 22 % (р < 0,05), а группы контроля достоверно меньше на 44,3 % (р < 0,05). Введение экспериментальным животным мекси-дола в дозе 50 мг/кг с различным режимом введения в V и VI группах способствовало развитию сопоставимого гипогликемического эффекта: наблюдалось снижение содержания глюкозы в V группе до 8,3 ± 0,4 ммоль/л и в VI группе до 7,1 ± 0,2 ммоль/л, что на 35,8 и 45,2 % соответственно достоверно ниже показателей контрольной группы (р < 0,05).

При исследовании цитоархитектоники гиппокампа в группе интактных животных на фронтальных срезах, окрашенных тионином по методу Ниссля, гиппокамп был представлен в виде четких клеточных формаций, симметричных в правом и левом полушариях мозга. Интересующее нас поле СА1 представлено плотно расположенными клетками треугольной или ближе к округлой формы. В этой области численная плотность нейронов у интактных животных составляет: 3246,3 ± 341,9/мм2. В популяции пирамидного слоя в группе интактных животных в поле СА1 преобладают нормохромные нейроны со средней интенсивностью окраски цитоплазмы, более светлым ядром и темным ядрышком; в функциональном отношении они характеризуют состояние относительного покоя или нормальной активности. При гистохимическом исследовании в интактной группе встречались единичные ТЦКЕЬ+ (апоптозные) клетки.

При моделировании ишемии отмечалось снижение численной плотности в нейрональной популяции зоны СА1 гиппокампа (рис. 6). Так, при введении 3-ГПН во II группе на 3-е сутки численная плотность нейронов составила 1508 ± 241,7 в мм2, что на 36,7 % достоверно выше группы контроля (р < 0,05). В III и VI группах количество нейронов составляет 1722,2 ± 194,5 и 2381 ± 182,1 в мм2 соответственно, что на 56,1 и 115,8 % достоверно выше группы контроля (р < 0,05). При применении мексидола в V группе на 3-е сутки после операции численная плотность нейронов составила 1785,7 ± 204,1 в мм2, что на 61,9 % достоверно выше показателей контрольной группы животных.

Интактная 1 группа 2 группа 3 группа 4 группа 5 группа 6 группа

группа

Рис. 6. Численная плотность нейронов в исследуемых группах

Рис. 7. Количество ТиМЕЬ+ (апоптозных) клеток в исследуемых группах

Наиболее выраженный эффект наблюдается при введении мексидола в VI группе, где численная плотность нейронов составляет 2706,3 ± 356,4 в мм2, что на 145,3 % достоверно выше показателя контрольной группы и на 16,6 % достоверно ниже показателей интактных животных (р < 0,05). Количество ТиКЕЬ+ клеток в I группе животных на 3-е сутки после моделирования ишемии составляет 757,7 ± 83,5 клеток в мм2, а во II, III и IV группах количество ТиКЕЬ+ клеток достоверно ниже на 38,2; 49,6 и 67,9 % соответственно по сравнению с контрольной группой (р < 0,05). В V и VI группах на 3-е сутки число ТиКЕЬ+ клеток составляет 358,6 ± 43,5 и 190,9 ± 21,3 в мм2, что достоверно ниже показателей контрольной группы на 52,7 и 74,8 % соответственно по сравнению с контрольной группой (р < 0,05).

К 7-м суткам после моделирования острой ишемии численная плотность в I группе составила 698,4 ± 115,4 клеток в мм2, что на 78,5 % ниже показателя интактной группы - 3246,3 ± 341,9 клеток в мм2 (р < 0,05). Во II группе на 7-е сутки число клеток составило 1134,9 ± 138,1 в мм2. В III и IV группах к 7-м суткам количество выживших нейронов составило 1468,3 ± 190,1 и 2119,1 ± 294,8 клеток в мм2 соответственно. В V и VI группах на 7-е сутки численная плотность нейронов составила 1476,2 ± 163,4 и 1674,6 ± 210,5 клеток в мм2 соответственно (при р < 0,05). Количество ТЦКЕЬ+ клеток в I группе животных на 7-е сутки ниже, чем на 3-е сутки и составляет

306,5 ± 37,9 клеток в мм2. Во II группе число ТЦКЕЬ+ клеток составляет 161,9 ± 19,4 в мм2, что ниже на 47,2 % по сравнению с контрольной группой (р < 0,05). В III и VI группах количество ТЦКЕЬ+ клеток в данных группах ниже на 58,5 и 73,6 % соответственно по сравнению с контрольной группой (р < 0,05). Количество ТЦКЕЬ+ клеток в V и VI группах животных на 7-е сутки эксперимента составляет 144,6 ± 19,8 и 306,5 ± 37,9 в мм2, что достоверно ниже показателей контрольной группы на 52,8 и 45,3 % (р < 0,05).

Заключение

Полученные данные свидетельствуют, что моделирование острой ишемии головного мозга приводит к существенным изменениям в неврологическом статусе и изменению биохимических показателей крови у животных. Структурные проявления реактивных, деструктивных и компенсаторновосстановительных изменений после моделирования острой ишемии голов-

ного мозга выявляются во всех группах экспериментальных животных в виде изменений в нейрональной популяции поля СА1 гиппокампа и в наличии TUNEL+ клеток. Таким образом, наиболее эффективным оказалось введение 3-ГПН в дозе 100 мг/кг и мексидола в дозе 50 мг/кг за три дня до моделирования острой ишемии, что приводит к достоверному снижению тяжести неврологических нарушений, восстановлению координации движений и мышечного тонуса. Данные препараты оказывают положительное влияние на углеводный и белковый обмен в исследуемых группах при моделировании острой ишемии головного мозга на фоне метаболических нарушений. При моделировании острой ишемии головного мозга исследуемые препараты оказывают нейропротективный эффект и сохраняют большее число нейронов в зоне СА1 гиппокампа, причем на 3-и сутки наиболее эффективен мексидол, а на 7-е сутки - 3-ГПН. Количество TUNEL+ клеток при введении препаратов за 3 дня до моделирования острой ишемии ниже, чем в других группах.

Список литературы

1. Виленский, Б. С. Инсульт - современное состояние проблемы / Б. С. Виленский // Неврологический журнал. - 2008. - Т. 13, № 2. - С. 4-10.

2. Кадыков, А. С. Профилактика повторного ишемического инсульта / А. С. Кадыков, Н.В. Шахпаронова // Consilium Medicum. - 2006. - № 2. - С. 96-99.

3. Лобанова, Н. Н. Моделирование глобальной ишемии головного мозга путем билатеральной окклюзии сонных артерий у бодрствующих гипертензивных крыс (SHR-SP) / Н. Н. Лобанова // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2008. - Т. 146, № 12. - С. 627-630.

4. Саркисов, Д. С. Микроскопическая техника : руководство / Д. С. Саркисов, Ю. Л. Перов. - М. : Медицина, 1996. - 544 с.

5. Paxinos, G. The rat brain in stereotaxic coordinates / G. Paxinos, Ch. A. Watson. -Toronto : Acad. Press, 1982. - 90 p.

Костычев Николай Александрович ассистент, кафедра нормальной физиологии, Мордовский государственный университет им. Н. П. Огарева

E-mail: kostnikal@yandex.ru

Чаиркин Иван Николаевич

доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой нормальной анатомии, Мордовский государственный университет им. Н. П. Огарева

E-mail: chairkin@rambler.ru

Чаиркина Наталья Викторовна

кандидат медицинских наук, доцент, кафедры патологии, Мордовский государственный университет им. Н. П. Огарева

E-mail: chairkina@rambler.ru

Kostychev Nikolay Alexandrovich Assistant, sub-department of normal physiology, Mordovia State University named after N. P. Ogaryov

Chairkin Ivan Nikolaevich

Doctor of medical sciences, professor,

head of sub-department of normal anatomy,

Mordovia State University

named after N. P. Ogaryov

Chairkina Natalya Victorovna Candidate of medical sciences, associate professor, sub-department of pathology, Mordovia State University named after N. P. Ogaryov

Инчина Вера Ивановна

доктор медицинских наук, профессор, заведующая кафедрой фармакологии с курсом клинической фармакологии, Мордовский государственный университет им. Н. П. Огарева

E-mail: vinchina@mail.ru

Рагинов Иван Сергеевич доктор медицинских наук, ассистент, кафедра гистологии, цитологии и эмбриологии, Казанский государственный медицинский университет

E-mail: raginovi@mail.ru

Inchina Vera Ivanovna

Doctor of medical sciences, professor, head of sub-department of pharmacology with a course of clinical pharmacology, Mordovia State University named after N. P. Ogaryov

Raginov Ivan Sergeevich Doctor of medical sciences, sub-department of histology, cytology and embryology, Kazan State Medical University

УДК 591.2:616.831-005.4:615.27 Костычев, Н. А.

Влияние различных режимов введения мексидола и 3-гидроксипи-ридина никотината в терапии острой ишемии головного мозга / Н. А. Костычев, И. Н. Чаиркин, Н. В. Чаиркина, В. И. Инчина, И. С. Рагинов // Известия высших учебных заведений. Поволжский регион. Медицинские науки. -2011. - № 1 (17). - С. 11-19.