Использование мини-свиней светлогорской популяции в качестве биомодели для изучения иммунного ответа на введение иммуноглобулина g лошади

Биомедицина • № 4, 2016, С. 47-53

Использование мини-свиней светлогорской популяции в качестве биомодели для изучения иммунного ответа на введение иммуноглобулина й лошади

А.Г. Берзина1, Н.В. Станкова2, Л.И. Ульянова1, Н.Б. Гамалея1, Г.Д. Капанадзе2

1 - НИИ наркологии - филиал ФГБУ «Федеральный медицинский исследовательский центр психиатрии и наркологии им. В.П. Сербского» Минздрава России, Москва

2 - ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий ФМБА России», Московская область

Контактная информация: к.б.н. СтанковаНаталияВладимировна, sinayva@yandex.ru

Оптимизирована методика определения свиных антител против иммуноглобулина (Щ класса О лошади методом иммуноферментного анализа (ИФА). На мини-свиньях светлогорской популяции исследовано формирование иммунного ответа на введение ^ G лошади. Свиноматку иммунизировали ^ G лошади в дозе 0,2 мг/кг, через 14 дней антиген вводили повторно. Через 6 мес. цикл инъекций повторяли с использованием меньшей дозы антигена (0,1 мг/кг). Потомство, рождённое после реим-мунизации свиноматки, подвергалось проверке на содержание антител к Ig G лошади в возрасте 5 и 10 мес. В качестве контроля в реакции ИФА использовали сыворотку крови неиммунной свиньи. Определение титра антител проводили на 21-й и 142-й день от произведенных инъекций. Полученные результаты свидетельствуют о высокой иммуногенности антигена - Ig G лошади. После одного цикла иммунизации титр антител к Ig G лошади составил 1:100000. Реиммунизация животного через 6 мес. позволяет увеличить титр антител до 1:1000000. Содержание антител в сыворотке крови иммунной свиньи сохраняется высоким на протяжении 1,5 лет (титр 1:100000). Антитела к Ig G лошади, полученные поросятами внутриутробно из кровяного русла матери и присутствовавшие в титрах от 1:1000 до 1:10000 в возрасте 5 мес., постепенно исчезали. К 10 мес. титр антител уменьшался до 1:100.

Ключевые слова: иммуноглобулин G лошади, иммунный ответ, светлогорские мини-свиньи, потомство, биомодель.

Введение

Экспериментальные исследования на животных, позволяющие моделировать необходимые состояния и изучать динамику процесса, играют важную роль в решении многих проблем медицины. Одной из таких проблем является разработка антиидиотипических вакцин к психоактивным веществам (ПАВ). Анти-идиотипические (вторичные) антитела, как известно, в их поливалентной форме могут быть использованы в качестве антигена при создании вакцинных препара-

тов [1,2]. Ранее были получены данные, согласно которым антиидиотипические антитела способны выполнять сигнальную функцию антигена в том случае, когда они являются гетерологичными для реципиента [5]. В списке иммунобиологических препаратов, разрешённых к применению в лечебных целях у людей, основное место занимают иммуноглобулины человека, а также гетерологичные иммуноглобулины лошади.

Иммуноглобулин лошади класса в в) обладает высокой иммуногенностью,

широко применяется в медицинскои практике для лечения столбняка, дифтерии и бешенства. Однако при его применении у человека возможны аллергические реакции. При разработке антиидиотипических вакцин с использованием ^ G лошади нужно иметь представление о реакции иммунноИ системы на данный антиген. Для выыснения особенностей иммунного ответа необходимо проводить эксперименты на лабораторных животных-биомоделях. В последние годы в качестве биомодели человека при проведении биомедицинских исследовании успешно используются мини-свиньи светлогорскоИ популяции [3, 4, 7]. В связи с этим, при изучении вопроса о создании антиидио-типическоИ вакцины от ПАВ нами бышо принято решение исследовать формирование иммунного ответа на ^ G лошади у светлогорских мини-свинеИ.

Цель данноИ работы - оптимизировать методику определения свиных антител против ^ О лошади методом ИФА и проследить динамику накопления в крови мини-свиньи светлогорскоИ популяции антител к Ig G лошади с исполь-

зованием малых доз антигена в процессе иммунизации на протяжении 1,5 лет, а также выявить наличие антител к Ig G лошади у потомства иммунной мини-свиньи в разные возрастные периоды.

Материалы и методы

В работе в качестве антигена для иммунизации был использован коммерческий препарат Ig G лошади фирмы «Sigma» (США). В качестве биомоделей были использованы светлогорские мини-свиньи, которые содержались в оборудованном виварии с оптимальными условиями [6]. Свиноматке (в возрасте 8 мес. и массой 15 кг) вводили Ig G лошади в дозе 0,2 мг/кг в две точки задних конечностей внутримышечно в смеси 1:1 с полным адъювантом Фрейнда (ПАФ). Через 14 дней эти же дозы антигена вводили подкожно в область шейных лимфоузлов в смеси 1:1с неполным адъювантом Фрейнда (НАФ). Третью инъекцию проводили аналогичным образом через 14 дней. Заборы крови осуществляли из краниальной полой вены на 21-й день от последней инъекции (рис. 1).

Рис. 1. Забор крови у мини-свиньи из краниальной полой вены.

Биомедицина • № 4, 2016 48

Через 6 мес. цикл инъекций повторяли с использованием меньшей дозы препарата (0,1 мг/кг). Титр специфических антител определяли с помощью непрямого варианта ИФА с использованием антивидового иммунопероксидазного конъюгата фирмы «Sigma» (США). Для блокировки неспецифической реакции в буфер (PBST) добавляли 0,3% бычьего сывороточного альбумина (БСА). За величину титра принимали максимальное разведение сыворотки, при котором оптическая плотность (ОП) при длине волны 490 нм превышала значения в контроле в два раза. В качестве контроля в реакции ИФА использовали сыворотку крови неиммунной свиньи. Потомство, рождённое после реиммунизации свиноматки в период первой беременности, подвергалось проверке на содержание антител к Ig G лошади в возрасте 5 мес. (первая проверка), вторую проверку поросятам проводили в возрасте 10 мес. Одному из поросят того же потомства в возрасте 5 мес. вводили внутримышечно антиген в дозе 0,1 мг/кг в смеси 1:1с ПАФ. Определение титра антител проводили на 21-й и 142-й день от произведенной инъекции.

Физиологическое состояние животных оценивали визуально, проводили

взвешивание в начале эксперимента и через полгода, а также измеряли ректальную температуру.

Результаты и их обсуждение

В ходе выполнения работы были подобраны оптимальные условия для определения свиных антител к Ig G лошади методом ИФА. Поскольку, по литературным данным, у свиньи и лошади имеется частичное серологическое родство между иммуноглобулинами класса G, то в реакции с контрольной сывороткой неиммунной свиньи возможны высокие фоновые значения. Для снижения фоновых значений были подобраны оптимальные условия постановки ИФА (концентрация антигена, сорбированного на твердой фазе - 2 мкг/мл, разведение антивидового коньюгата 1:10000, концентрация субстрата орто-фенилендиамина (ОФД) -2мг/мл). Несмотря на оптимизацию условий, значения ОП в контроле оставались довольно высокими (0,2 ед. ОП). Определение титра специфических антител к ^ G лошади в сыворотке мини-свиньи № 454 после первого цикла иммунизации, проведенного в апреле 2015 г., показало наличие антител в разведении сыворотки 1:100000 (май 2015 г., рис. 2).

г, s

о

100 1000 10 000 100000 1000 000 Разве де ни е с ы воротки

Рис. 2. Титры антител в сыворотках крови свиноматки № 454 против ^ G лошади после первого цикла иммунизации в 2015 г.: 1 - контроль, сыворотка неиммунной свиньи; 2 - сыворотка иммунной свиньи (май 2015 г.); 3 - сыворотка иммунной свиньи (сентябрь 2015 г.).

49

Biomedicine • № 4, 2016

На протяжении 4 мес. (с мая по сентябрь 2015 г.) титр антител оставался практически неизменным. Второй цикл иммунизации проводили в октябре 2015 г. (через 6 мес. от начала иммунизации) с использованием меньших доз антигена - 0,1 мг/мл. В результате, к концу декабря 2015 г. титр антител у свиноматки составил 1:1000000 (рис. 3).

На протяжении длительного времени титр антител оставался высоким (1:100000). Результаты тестирования антисывороток в июле и октябре 2016 г. представлены на рис. 4.

В потомстве свиноматки, рожденном вскоре после реиммунизации (январь 2016 г.), нами также был определён титр антител к Ig G лошади. Обнаруже-

о

100 1000 10000 100000 1000 000 10000000 Рлзве де ни е с ыво ротки

Рис. 3. Титры антител в сыворотках крови свиноматки № 454 против ^ G лошади после второго цикла иммунизации в 2015 г.: 1 - контроль, сыворотка неиммунной свиньи; 2 - сыворотка иммунной свиньи (декабрь 2015 г.).

2,5

о

IDO 1DDD 10 000 100 000 1000 000

Разведение сыворогки

Рис. 4. Титры антител в сыворотках крови свиноматки № 454 против ^ G лошади после однократной внутримышечной инъекции в июне 2016 г.: 1 - контроль, сыворотка неиммунной свиньи; 2 - сыворотка иммунной свиньи (июль 2016 г.); 3 - сыворотка иммунной свиньи (октябрь 2016 г.).

но, что все поросята в возрасте 5 мес. обладали материнским иммунитетом к данному антигену, однако антитела в их сыворотках присутствовали в меньших количествах (титры от 1:1000 до 1:10000), чем у матери. Через 5 мес. в сыворотках десятимесячных поросят антител практически не осталось (титр 1:100, рис. 5).

Однако у поросенка из данного потомства, получившего всего одну инъекцию антигена в дозе 0,1 мг/кг в возрасте 5 мес., титр антител сохранялся высоким (1:10000) до10 мес. (рис. 6).

Ректальная температура у животных не изменялась в процессе иммунизации и оставалась на уровне 38,6°С, что свидетельствует об отсутствии неблагопри-

Рис. 5. Титры антител против G лошади в сыворотках крови потомства свиноматки № 454 (в возрасте 5и10 мес.).

Рис. 6. Титры антител против G лошади в сыворотке крови поросёнка №№ 555, получивше-гов5 мес. одну внутримышечную инъекцию антигена.

51

Вюше&сте • № 4, 2016

ятного влияния ^ G лошади на организм свиней. Животные нормально росли и развивались согласно своему возрасту, имели хороший аппетит и адекватное поведение. Масса свиноматки № 454 через 6 мес. от начала иммунизации составила 30 кг, что также является нормой для данного вида, позже от нее было получено еще одно здоровое потомство (рис. 7).

Заключение

Таким образом, полученные нами результаты по иммунизации мини-свиньи светлогорской популяции антигеном ^ G лошади свидетельствуют о высокой иммуногенности данного антигена. Оптимизирована методика определения свиных антител против ^ О лошади методом ИФА. После одного цикла иммунизации титр антител к Ig G лошади составил 1:100000. Реиммуниза-ция животного через 6 мес. позволяет увеличить титр антител до 1:1000000. Содержание антител в сыворотке крови иммунной свиньи сохраняется высоким на протяжении 1,5 лет (титр 1:100000). Антитела к иммуноглобулину лошади,

полученные поросятами внутриутробно из кровяного русла матери и присутствующие в титрах от 1:1000 до 1:10000 в возрасте 5 мес., постепенно исчезают. К 10 мес. титр антител уменьшается до 1:100. Однократная инъекция антигена в дозе 0,1 мг/кг свиноматке и ее пятимесячному поросенку позволила продлить высокое содержание антител в крови матери (титр 1:1000000) и поросенка (титр 1:10000) до полугода. Побочных эффектов у животных при иммунизации с использованием предложенной нами схемы не наблюдалось.

Список литературы

1. Бялоеский Ю.Ю., Булатецкий C.B. Изменения иммунологических показателей в условиях увеличенного сопротивления дыханию у спортсменов // Спортивная медицина: наука и практика. 2016. № 2. С. 29-34.

2. Гамалея Н.Б., Берзина А.Г. Вакцины от наркотиков - новое перспективное направление профилактики злоупотребления ПАВ // Наркология. 2011. № 10. С. 70-83.

3. Гамалея Н.Б., Берзина А.Г., Шестакое К.А., Капанадзе Г.Д., Станкоеа Н.В. Получение диагностических антисывороток к морфину на мини-свиньях светлогорской популяции // Биомедицина. 2014.№3. 96 с.

4. Капанадзе Г.Д. Использование миниатюрных свиней в биомедицинских экспериментах И Биомедицина. 2006. № 2. С.40-51.

5. Кульберг А.Я. Антииммуноглобулины. - М.: Медицина. 1978. 183 с.

6. Руководство по лабораторным животным и альтернативным моделям в биомедицин-

ских исследованиях / под ред. H.H. Кар-кищенко, C.B. Грачева. - М.: Профиль-2С. 2010. 358 с.

7. Станкова Н.В., Капанадзе Г.Д. Селекционно-генетическая и экспериментальная работа с мини-свиньями светлогорской популяции // Биомедицина. 2012. №1.С 49-53.

Svetlogorsk mini-pigs as a biomodel for studying the immune response of the horse immunoglobulin G

A.G. Berzina, N.V. Stankova, L.I. Ul'yanova, N.B. Gamaleya,

G.D. Kapanadze

The technique of detecting pig antibodies against the horse immunoglobulin (Ig) of the G class was optimized by the method of the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Formation of the immune response against the horse Ig G was investigated on Svetlogorsk mini-pigs. The sow was immunized with the horse Ig G at a dose of 0.2 mg/kg, 14 days after the antigen was administered again. After 6 months, the injection cycle was repeated using a smaller dose of the antigen (0.1 mg/kg). The offspring born after reimmunization of the sow was tested for the content of antibodies against the horse Ig G at the age of 5 and 10 months. Blood serum of non-immune pigs was used as a control in ELISA. Determination of the antibody titers was conducted on the 21st and 142nd day after injections. The results indicated the high immunogenicity of the antigen, horse Ig G. After one cycle of immunization, the titer of antibodies against horse IgG was 1:100000. Reimmunization of the animal after 6 months allows increasing the antibody titer up to 1:1000000. The content of antibodies in the blood serum of immune pigs remains high for 1.5 years (the titer was 1:100000). Antibodies against the horse IgG received by piglets in utero from the blood stream of their mother presented in titers from 1:1000to 1:10000 at the age of 5 months and disappeared gradually. By the 10 months the antibody titer reduced to 1:100.

Key words: horse immunoglobulin G, immune response, Svetlogorsk mini-pigs, offspring, biomodel.

53

Biomedicine • № 4, 2016

Биомедицина . № 4, 2016, С. 54-64

Метаболиты цианобактерий: компьютерный прогноз биологической активности неосакситоксина, гониатоксина II и аэругинозида 126A

Я.В. Русских1, E.H. Чернова1, Е.И. Афонина1, З.А. Жаковская1, Е.В. Федорова2, В.А. Островский1,3

1 - ФГБУН «Санкт-Петербургский научно-исследовательский центр экологической безопасности РАН», Санкт-Петербург

2 - ООО «ВВС Лаб», Санкт-Петербург

3 — Санкт-Петербургский государственный технологический институт (технический университет), Санкт-Петербург

Контактная информация: РусскихЯнаВладимировна, yanarussk@gmail.com; Федорова Елена Викторовна, elena.vic.fedorova@gmail.com

С помощью методов компьютерного моделирования выявлены новые и подтверждены ранее известные виды биологической активности для ряда наиболее распространенных цианобактериальных метаболитов (микроцистинов, анабаенопептинов, сакситоксинов). В рамках дизайна, основанного на структуре мишени (structure-based drug design), изучены докинг-взаимодействия (3D-QSAR) c участием молекул цианометаболитов. На основе результатов проведенного исследования были отобраны наиболее перспективные кандидаты для дальнейшего изучения - неосакситоксин (neosaxitoxin), гониатоксин II (gonyautoxin GTX2) и аэругинозид 126А (aeruginoside 126А), для которых отмечено проявление свойств цитостатиков, противоопухолевых антибиотиков и антикоагулянтов.

Ключевые слова: цианометаболиты, сакситоксины, аэругинозид 126А, методы компьютерного моделирования, PASS, QSAR, биологическая активность.

Введение

В последние десятилетия доминирующее положение в составе фитопланктона во многих пресноводных и морских экосистемах занимают цианобактерии (фотосинтезирующие прокариоты) [18]. Большинство метаболитов цианобактерий проявляют различные виды биологической активности. В настоящее время широко проводятся исследования метаболитов цианобактерий как потенциальных лекарственных средств, обладающих эффективностью и селективностью действия и проявляющих противоопухолевую, противовирусную, противомикробную, противомалярий-

ную, антигрибковую активность; предложено их использование в качестве антифидантов, гербицидов и иммуноде-прессантов [4, 18]. Так, сакситоксины -соединения, принадлежащие группе нейротоксичных цианобактериальных метаболитов, рассматриваются как эффективные анастезирующие и обезболивающие средства [8, 17]. В ходе клинических испытаний было показано, что неосакситоксин обеспечивает более выраженный анестизирующий эффект по сравнению с применяемыми в настоящий момент аналогами новокаина (Ви-р1уасате) [17], а гониатоксин II может использоваться для лечения патологий,