БИОЧИП И СПОСОБ ТИПИРОВАНИЯ ПАТОГЕНОВ I ГРУППЫ, ОТНОСЯЩИХСЯ К СЕМЕЙСТВАМ АРЕНА- И ФИЛОВИРУСОВ
BIOCHIP AND METHOD OF TYPING PATHOGENS OF GROUP I WHICH BELONGS TO FAMILY OF ARENA- AND FILOVIRUSES

Изобретение относится к молекулярной биологии, генетической инженерии. медицине и предназначено для типирования вирусов Lassa, Junin, Machupo, Guanarito (семейство Arenaviridae) и вирусов Ebola и Marburg (семейство Filoviridae). Предлагаемый способ типирования вирусов основан на проведении полимеразной цепной реакции (ПЦР) кДНК вирусов с последующей гибридизацией меченых флуоресцентной меткой ампликонов с ДНК-микрочипом, содержащим дискриминирующие гибридизационныс зонды. Использование этого способа позволяет определять все известные субтипы отмеченных выше вирусов.
Согласно классификации Всемирной организации здравоохранения к патогенам I группы относят инфекционные агенты, ассоциированные с тяжелыми и часто летальными заболеваниями человека, для которых в большинстве случаев не существует эффективных лечебных и профилактических мер (Практическое руководство по биологической безопасности в лабораторных условиях. Женева: Всемирная организация здравоохранения, 2004.)
В данную группу, в частности, включены вызывающие геморрагические лихорадки вирусы Lassa (LASV), Junin (JUNV), Machupo (MACV), Guanarito (GTOV) и вирусы Ebola (EBOV) и Marburg (MARV). Быстрая лабораторная диагностика в тех случаях, когда может возникнуть предположение об инфекциях, ассоциированных с указанными патогенами, очень важна в развертывании системы противоэпидемических мероприятий. Вследствие этого актуальной задачей представляется разработка диагностических тест-систем, посредством которых возможно быстрое и точное выявление соответствующих инфекционных агентов.
Патогены I группы часто диагностируются серологически. При использовании для диагностики быстро появляющихся в крови больных IgM тестирование осложняется кроссгибридизацией между различными видами аренавирусов. Значительно более селективны нейтрализующие антитела, однако такие антитела появляются слишком поздно для ранней диагностики. Например, в крови больных, зараженные вирусом Ласса. нейтрализующие антитела не образуются на протяжении нескольких недель. В то же время смерть при заражении патогенами I группы часто наступает на 7-10 день после инфицирования.
Тесты основанные, на использовании цепной полимеразной реакции (ГИДР), можно использовать значительно раньше появления нейтрализующих антител в организме больного.
Такие тесты были разработаны в ряде работ (Gibb T.R., Norwood D.A.-Jr, Woollen N., Henchal E.A. Development and evaluation of a fluorogenic 5′ nuclease assay to detect and differentiate between Ebola virus subtypes Zaire and Sudan. 2001. J. Clin. Microbiol. V.39; P.4125-4130.
Weidmann M., Muhlberger E., Hufert F.T. Rapid detection protocol for filoviruses. 2004. J. Clin. Virol. V.30. P.94-99.
Sanchez A., Lukwiya M., Bausch D., Mahanty S., Sanchez A.J., Wagoner K.D., Rollin P.1L. Analysis of human peripheral blood samples from fatal and nonfatal cases of Ebola (Sudan) hemorrhagic fever: cellular responses, virus load, and nitric oxide levels. 2004. J. Virol. V.78: P.10370-10377.
Towner J.S., Sealy Т.K., Khristova M.L., Albarino C.G., Conlan S., Reeder S.A., Quan P.L., Lipkin W.I., Downing R., Tappero J.W., Okware S., Lutwama J., Bakamutumaho В., Kayiwa.1.. Comer J.A., Rollin P.E., Ksiazek T.G., Nichol S.T. Newly discovered Ebola virus associated with hemorrhagic fever outbreak in Uganda. 2008. PLoS Pathog. V.4. e1000212.
Towner J.S., Rollin P.E., Bausch D.G., Sanchez A., Crary S.M., Vincent M., Lee W.F., Spiropoulou C.F., Ksiazek T.G., Lukwiya M., Kaducu F., Downing R., Nichol S.T. Rapid diagnosis of Ebola hemorrhagic fever by reverse transcription-PCR in an outbreak setting and assessment of patient viral load as a predictor of outcome. 2004. J. Virol. V.78 P.4330-4341.
Drosten C., Gottig S., Schilling S-, Asper M., Panning M., Schmitz H., Gunther S. Rapid detection and quantification ofRNA of Ebola and Marburg viruses, Lassa virus, Crimean-Congo hemorrhagic fever virus. Rift valley fever virus, dengue virus, and yellow fever virus by real-time reverse transcription-PCR. 2002. J. Clin. Microbiol. V.40. P.2323-2330.
Gibb T.R., Norwood D.A. Jr, Woollen N., Henchal E.A. Development and evaluation of a fluorogenic 5′-nuclease assay to identify Marburg virus. 2001. Mol. Cell Probes, V.15. P.259-266.
Trappier S.G., Conaty A.L., Farrar B.B., Auperin D.D., McCormick J.B., Fisher-Hoch S.P. Evaluation of the polymerase chain reaction for diagnosis of Lassa virus infection. 1993. Am. J. Trop. Med. Hyg. V.49. P.214-221.
Demby A.H., Chamberlain J., Brown D.W., Clegg C.S. Early diagnosis of Lassa fever by reverse transcription-PCR. 1994. J. Clin. Microbiol. V.32: P.2898-2903.
Lunkenheimer К., Hufert F.T., Schmitz H. Detection of Lassa virus RNA in specimens from patients with Lassa fever by using the polymerase chain reaction. 1990. J. Clin. Microbiol. V.28. P.2689-2692.
Lozano M.E., Enria D., Maiztegui J.I., Grau 0., Romanowski V. Rapid diagnosis of Argentine hemorrhagic fever by reverse transcriptase PCR-based assay. 1995. J. Clin. Microbiol. V.33. P.1327-1332.
Trombley A.R., Wachter L., Garrison J., Buckley-Beason V.A., Jahrling J., Hensley L.E., Schoepp R.J., Norwood D.A., Goba A., Fair J.N., Kulesh D.A. Short Report: Comprehensive Panel of Real-Time TaqMan™ Polymerase Chain Reaction Assays for Detection and Absolute Quantification of Filoviruses, Arenaviruses, and New World Hantaviruses. 2010. Am. J. Trop. Med. Hyg. V. 82. P.954-960.
Этот метод имеет существенные недостатки. Из-за высокой вариабельности вирусов практически каждый штамм определяемого вируса требует использовать свой собственный диагностический тест, содержащий праймеры для проведения амплификации и флуоресцентый зонд для выявления ампликона. Например, для выявления вирусов Lassa, Junin, Machupo, Guanarito, Ebola и Marburg (Trombley A.R.. Wachter L., Garrison J., Buckley-Beason V.A., Jahrling J., Hensley L.E., Schoepp R.J.. Norwood D.A., Goba A., Fair J.N., Kulesh D.A. Short Report: Comprehensive Panel of Real-Time TaqMan™ Polymerase Chain Reaction Assays for Detection and Absolute Quantification of Filoviruses, Arenaviruses, and New World Hantaviruses. 2010. Am. J. Trop. Med. Hyg. V.82. P.954-960.) используется 41 вид диагностических наборов. Т.е. для определения конкретного вида вируса при лабораторном тестировании необходимо провести 41 анализ, что является очень затратным и требующим значительного времени исследованием.
Известен способ выявления вируса Lassa, использующий ПЦР с последующей гиридизацией полученных ампликонов на микрочипе (Stephan Olschlager S.. Gunther S. Rapid and Specific Detection of Lassa Virus by Reverse Transcription-PCR Coupled with Oligonucleotide Array Hybridization. 2012. J. Clin. Microbiol. V.50. P.2496-2499).
Микрочип содержит 47 зондов, типирующих все известные штаммы вируса Lassa. Такой способ позволяет одновременно определять все штаммы вируса Lassa, что значительно экономит время анализа. Недостатком разработанного метода является то, что метод позволяет определить только вирус Lassa и не определяет другие вирусы, относящиеся к патогенам I группы.
Раскрытие изобретения. Задачей настоящего изобретения является создание нового более экономичного способа одновременного тонирования вирусов Lassa, Guanarito (семейство Arenaviridae) и вирусов Ebola и Marburg (семейство Filoviridae). для устранения недостатков известных методов.
Эта задача решается созданием диагностического теста, основанного на проведении мультиплексной ПЦР с универсальными праймерами для амплификации Lassa, Junin. Machupo, Guanarito, Ebola, Marburg и типированием полученных ампликонов с помощью гибридизации на микрочипе, содержащем специфические зонды к кДНК исследуемых вирусов. Метод включает также способы регистрации и интерпретации результатов анализа.
Сущность изобретения.
Сущность изобретения заключается в нахождении набора универсальных праймеров. способных амплифицировать все известные штаммы Lassa, Junin, Machupo, Guanarito. Ebola, Marburg и создании микрочипа, позволяющего с помощью метода молекулярной гибридизации типировать целевые вирусы.
Биологические микрочипы были успешно использованы для диагностики: вируса папилломы, корона- и риновирусов, ротавирусов, ортопоксвирусов, вируса гриппа А. Однако возможность параллельного анализа одного образца на множестве дискриминирующих зондов микрочипа представляется особенно важной для диагностики инфекций, ассоциированных с патогенами I группы, поскольку данный подход позволяет снизить время анализа от нескольких дней или даже недель до нескольких часов.
Эффективность микрочиповой диагностики, основанной на гибридизации анализируемой ДНК с дискриминирующими олигонуклеотидными зондами, зависит от правильного выбора последних. Задача поиска зондов решается достаточно просто для сильно различающихся по первичной структуре геномных последовательностей, например, при нахождении родоспецифичных зондов, и в большинстве случаев не представляет каких-либо проблем. Однако задача поиска дискриминирующих зондов существенно осложняется при анализе близких по структуре нуклеотидных последовательностей, что, в частности, имеет место в случае одинаковых генов внутри семейства (Arena- или Filoviridae). Помимо этого, в отношении подбора зондов для дискриминации указанных патогенов имеют место дополнительные сложности, связанные с высокой вариабельностью геномов в пределах одного вида.
Ранее был разработан новый подход для расчета гибридизационных олигонуклеотидных зондов в случае высоковариабельных вирусных геномов, основанный на анализе последовательностей вирусных белков (Патент РФ №2470076. Костина E.R., Синяков А.Н., Максакова Г.А., Рябинин В.А. "Способ выбора ДНК-зондов для микрочиповой диагностики, биочип и способ типирования генов нейраминидазы и гемагглютинина вируса гриппа А"). Данный метод был успешно использован при типирования вируса гриппа А. Этот же подход был использован при расчете гибридизационных зондов для создания олигонуклеотидного микрочипа для выявления целевых инфекционных агентов, принадлежащих к первой группе.
Работа по расчету зондов включает в себя следующие этапы:
- Сбор данных по аминокислотным и нуклеотидным последовательностям для JUNV, GTOV, MACV, LASV, EBOV и MARV.
- Отбор пептидных фрагментов выбранного для анализа вирусного белка, являющихся общими для всех штаммов и изолятов данного патогена.
- Удаление из полученного набора пептидов тех, что присутствуют в аминокислотных последовательностях других целевых вирусов.
- Расчет олигонуклеотидных зондов исходя из структуры отобранных пептидов.
- Отбор оптимальной по размеру выборки олигонуклеотидных зондов, позволяющей с наибольшей вероятностью определять данный вирус.
- Удаление из полученного набора олигонуклеотидных зондов тех, введение в которые одной или двух точечных замен приводит к зондам на другие целевые вирусы.
- Отбор олигонуклеотидных зондов с оптимальной (входящей в определенный интервал) темпе ратурой плавления дуплекса, образуемого зондом и анализируемой ДНК.
При расчете были использованы данные GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) и Protein Sequence Database For Pathogenic Arenaviruses (http://epitope.liai. org:8080/projects/arena) по нуклеокапсидному белку и РНК-зависимой РНК-полимеразе (для JUNV, MACV, GTOV и LASV соответственно) и данные GenBank по РНК-зависимой РНК-полимеразе для EBOV и MARV. Выбор анализируемого белка во всех случаях определялся фактором наибольшей представительности соответствующих аминокислотных последовательностей в используемых базах данных.
В полученных из баз данных выборках аминокислотных последовательностей для всех штаммов и изолятов каждого из целевых вирусов выявляли идентичные участки длиной в 7 а.о. ((согласно данным (патент РФ №2470076. Костина Е.В., Синяков А.Н., Максакова Г.А., Рябинин В.А. "Способ выбора ДНК-зондов для микрочиповой диагностики, биочип и способ типирования генов нейраминидазы и гемагглютинииа вируса гриппа А") выбор более длинных пептидов снижает количество зондов, общих для определяемого вируса, а выбор более коротких приводит к менее специфичным зондам). Поскольку нахождение общих пептидов для абсолютно всех штаммов и изолятов каждого из целевых вирусов оказалось невозможным (как в силу вариабельности аминокислотных последовательностей, так и из-за наличия в базах данных частично секвенированных последовательностей), то отбирались пептиды, присутствующие в не менее чем 90% анализируемых аминокислотных последовательностей для каждого из патогенов.
На следующем этапе производили селекцию пептидных наборов, полученных для JUNV, GTOV, MACV, LASV, EBOV и MARV. При этом из соответствующего набора для каждого вируса удаляли пептиды, присутствующие в анализируемых аминокислотных последовательностях других целевых патогенов. Полученные шесть наборов 7-членных пептидов, специфических для JUNV, GTOV, MACV, LASV, EBOV и MARV, переводили в набор 21-членных олигонуклеотидов, кодирующих эти пептиды. Из полученных наборов нуклеотидных последовательностей с использованием описанной в патенте РФ №2470076 схемы селекции зондов получали наборы олигонуклеотидов, обеспечивающих дискриминацию целевых вирусов.
Для уменьшения числа возможных ложноположительных результатов полученный набор олигонуклеотидных зондов для каждого из патогенов тестировали на наличие в нем олигонуклеотидов, введение в которые одной или двух точечных замен приводят к зондам, характерным для других целевых вирусов (такие олигонуклеотиды исключались из набора).
Частичное выравнивание температур плавления дуплексов, образуемых анализируемой кДНК и отобранными олигонуклеотидными зондами, достигалось изменением протяженности (укорачивании или удлинении) последних. Указанный температурный интервал, использованный в настоящей работе, был выбран равным 2 градусам (от 60 до 62°С). Модифицированные подобным образом зонды для каждою из патогенов также подвергали проверке на их наличие в последовательностях кДНК других целевых вирусов.
В соответствии с изложенными выше принципами были отобраны шесть наборов олигонуклеотидных зондов для определения JUNV, GTOV, MACV, LASV, EBOV и MARV. Количество зондов для определения конкретного целевого вируса варьировалось от 7 до 25. В общей сложности было отобрано 94 зонда (таблица 1).
Создание микрочиповой диагностической тест-системы для дискриминация целевых вирусов имеет смысл только при возможности проведения на предварительном этапе анализа мультиплексной ПЦР. Критическим моментом в данной ситуации, является число используемых праймеров. В случае большого количества праймеров резко увеличивается вероятность нежелательных взаимодействий между ними, что, в свою очередь, снижает эффективность мультиплексной ПЦР. Универсальные праймеры для ампли4)икации целевых фрагментов генома арена и филовирусов содержат значительное количество точек вырождения, что приводит к большой гетерогенности этих праймеров. Число индивидуальных олигонуклеотидов, входящих в состав универсальных праймеров, может превышать 1500 единиц. Общее число олигонуклеотидов, вводимых в реакцию амплификации заданного участка ДНК, можно значительно снизить, уменьшая их длину и, соответственно, число точек вырождения в них. Однако использование данного подхода приводит к уменьшению температуры плавления гетеродуплексов, образованных праймерами и матрицей, что, в свою очередь, также негативно сказывается на эффективности ПЦР.
Для преодоления данной проблемы при проведении ПЦР в настоящей работе в качестве праймеров были использованы конъюгаты олигодезоксирибонуклео гидов с малобороздочным карбоксамидопиррольным лигандом H-γ-Py-Py-Py-γ-Py-Py-Py-P-Dp, стабилизирующим А-Т-тракт. Указанный подход позволил существенно сократить (за счет значительного увеличения термостабильности гибридных ДНК-дуплексов) длину используемых в качестве праймеров олигонуклеотидов и, как следствие, общее их число.
Для синтеза конъюгатов были использованы укороченные олигодезоксирибонуклеотиды (длиной от 15 до 22 нт.), содержащие на 5′-конце квартет из трех (А или Т) и одного (G или С) оснований. Полученные конъюгаты были разделены на две группы: соответствующие прямым (33 олигонуклеотида) и обратным (32 олигонуклеотида) праймерам. Производные олигодезоксирибонуклеотидов, входящие в одну группу, объединяли в эквимолярных количествах и использовали в 11 ЦР. Амплификацию (с одновременным введением флуоресцентной метки Су5) проводили в асимметричном режиме для получения преимущественно одноцепочечных продуктов для последующей гибридизации на микрочипе.
Разработанный микрочип был тестирован на образцах, представляющих собой ампликоны фрагмента гена нуклеокапсидного белка вирусов JUNV (штамм XJ #44). GTOV (штамм VHF-1750), MACV (штамм Carvallo) и ампликоны фрагмента гена РНК-зависимой РНК-полимеразы вирусов LASV (штамм CSF), MARV (штамм Рорр) и ZEBOV (Zaire ebolavirus, штамм Mayinga).
Для оценки результатов микрочипового определения была использована величина средней флуоресценции спотов (Y), равная отношению суммы интенсивностей флуоресценции спотов, отвечающих зондам для данного вируса, к числу этих спотов:
i
где I - интенсивность флуоресценции i-го слота для данного вируса, N - число спотов, отвечающих зондам для данного вируса.
Ошибку расчетов определяли исходя из вариации интенсивностей флуоресценции маркерных спотов, расположенных в крайних левом и правом столбцах микрочипа (помечены на фиг.4 черным цветом). Данная ошибка является интегральной и включает в себя все ошибки, связанные с приготовлением растворов олигонуклеотидов для печати и с самой процедурой печати микрочипа.
На фиг.5 представлены примеры полученных картин гибридизации, а также соответствующие гистограммы распределения средней флуоресценции слотов. Из приведенных примеров видно, что с использованием разработанного микрочипа возможна однозначная дискриминация целевых вирусов. Наблюдаемая в некоторых случаях кросс-гибридизация с неспецифическими зондами не снижает достоверность интерпретации данных по причине значительной (на порядок) разницы между значениями величин средней флуоресценции спотов.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют применимости разработанного микрочипа для экспресс-диагностики фило- и ареновирусов, позволяющей провести дифференциально-диагностический анализ клинического образца до получения данных вирусологических исследований.
Принципиальная схема микрочипового анализа патогенов I группы включает следующие стадии:
1. Из анализируемого образца выделяют суммарную РНК;
2. с помощью статистического праймера получают кДНК;
3. с помощью праймеров, перечисленных в таблице 2 в асимметричном режим получают ампликоны целевых вирусов, содержащие флуоресцентную метку;
4. на следующей стадии проводят гибридизацию полученных ампликонов с дискриминирующими зондами, входящими в состав разработанного микрочипа;
5. анализ результатов гибридизации проводят с помощью сканера микрочипов и программы Scanarray Express. Результаты анализа представляются в графической форме с помощью программы Microsoft Office Excel,
Сопоставительный анализ с прототипом позволяет сделать вывод, что заявленный способ отличается от прототипа по нескольким параметрам.
К преимуществам разработанного микрочипа и способа типирования патогенов I группы, принадлежащих к семействам арена- и филовирусам, относится:
1. Разработанный нами биочип позволяет одновременно типировать шесть различных патогенов, принадлежащих к I группе, вместо одного вируса Lassa как в прототипе;
2. использование малобороздочного лиганда при конструировании праймеров для амплификации кДНК целевых патогенов позволяет проводить амплификацию любого из известных штаммов, принадлежащих к типируемым вирусам, полученным набором праймеров (таблица 2);
3. проведение мультиплексной ПЦР с помощью разработанного набора праймеров значительно упрощает работу по подготовке анализируемого образца, поскольку не требует использования специфических для каждого штамма патогена пар праймеров;
4. на одном биочипе можно печатать до трех микромассивов и таким образом один биочип может быть использован для анализа трех разных образцов.
Таким образом, предложенный биочип по своим возможностям значительно превосходит прототип.
Изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами:
Фиг.1. Таблица 1. Последовательности олигонуклеотидных зондов для выявления вирусов JUNV, GTOV, MACV, LASV, EBOV и MARV.
Фиг.2. Таблица 2. Последовательности праймеров для амплификации кДНК вирусов JUNV, GTOV, MACV, LASV. EBOV и MARV.
Фиг.3. Структура карбоксамидопиррольного лиганда H-γ-Py-Py-Py-γ-Py-Py-Py-β-Dp.
Фиг.4. Дизайн микрочипа размером 12×11 спота. (A1, A12; B1, B12; C1, C12, Dl, D12; E1, E12, F1, F12, G1, G12, H1, H12, I1, I12, K1, K12) - маркер; (A11, B11, D9-D11, Е10, E11, F9-F11, G11, Н10, H11, I10, I11, K9-K11) - буфер; (A2-A10, B2 B10) - JUNV; (C2-C11, D2-D8) - GTOV; (E2-E9, F2-F8) - MACV; (G2-G10, H2-H9, I2-I9,) - LASV; (J1-J12) - EBOV; (K2-K8) - MARV.
JUNV, GTOV; MACV; LASV; EBOV; MARV-слоты, содержащие олитонуклеотидные зонды, типирующие соответствующие вирусы.
Фиг.5. Гибридизационные картины и гистограммы, полученные при определении JUNV (1), GTOV (2), MACV (3), LASV (4), EBOV (5) и MARV (6).
Для лучшего понимания сущности изобретения ниже приведены примеры его конкретного выполнения.
Пример 1. Изготовление микрочипов для типирования патогенов I группы
Печать микрочипов осуществляли на стеклянных, содержащих изотиоцианатную группу слайдах методом контактной печати на споттере BioOdyssey Calligraphcr miniarrayer («Bio-Rad») одним пином. Каждый слайд содержал 3 эквивалентных микромассивов зондов (микроэрреея), пригодных для одновременной гибридизации 3 образцов. Средний диаметр слотов (ячеек микрочипа с иммобилизованными зондами) был ~360 µm, расстояние между слотами - 380 µm.
8
Микромассив состоял из 11 строк и 12 столбцов, и помимо типирующих зондов. содержал также маркерные олигонуклеотиды (dT) -TAMRA (Фиг.4).
При подготовке растворов смеси олигонуклеотидных зондов для печати они смешивались в эквимолярных количествах, так чтобы суммарная концентрация составляла 70 нмоль/мл. Микрочип представляет собой набор слотов, в который, кроме типирующих зондов на различные вирусы I группы включаются маркерные еноты, содержащие октатимидилат с красителем Tamra (20 повторов), и споты с печатью гибридизационного буфера для оценки фоновой флуоресценции (отрицательный контроль, 18 повторов). Общее число спотов составило 132.
3
В каждую ячейку планшета при печати типирующих зондов добавлял 60 мкл раствора А (135 мМ NaHCO) и 20 мкл раствора зондов (С=280 нмоль/мл). При печати маркеров использовали 80 мкл 6 нМ раствор Tamra (dT8)~NH2 в 100 мкл раствора А. При печати буфера использовали 60 мкл раствора А и 10 мкл воды.
Пример 2. Синтез праймеров для амплификации целевых вирусов, содержащих малобороздочный лиганд H-γ-Py-Py-Py-γ-Py-Py-Py-β-Dp
4
Синтез конъюгатов осуществляли по следующей методике: к обезвоженному осадку цетавлоновой соли олигодезоксирибонуклеотида (0.2 мкмоль), несущего на 5′-концс фосфатную группу, добавляли 15 мг трифенилфосфина, 15 мг 2,2′-дипиридилдисульфида и 7-8 мг 4-N,N-диметиламинопиридина. Смесь растворяли в 100 мкл ДМСО, перемешивали в течение 20 мин, после чего добавляли 2 мг карбоксамидопиррольного лиганда Н-γ-Py-Py-Py-γ-Py-Py-PY-β-Dp и 3 мкл диизопропилэтиламина. Далее реакционную смесь перемешивали в течение 20 мин и оставляли на 20 ч при комнатной температуре. Конъюгат осаждали добавлением 1.2 мл 2% раствора LiClO в ацетоне, центрифугировали течение 5 мин при 14000 об/мин. Супернатант удаляли, осадок 3 раза промывали 0.5 мл ацетона, высушивали досуха на воздухе и растворяли в 1 мл бидистиллированной воды. Выделение производного олигодезоксирибонуклеотида после синтеза проводили методом офВЭЖХ на хроматографе "Aglient 1100 Series" ("Aglient Technologies", США). Использовали линейный градиент концентрации ацетонитрила (от 0 до 70%) в водном растворе 20 мМ ацетата триэтиламмония в течение 40 мин (скорость элюции 2 мл/мин. колонка RP-C18, 4×250 мм, размер частиц 10 мкм).
Пример 3. Синтез ампликонов целевых вирусов для микрочипового анализа
2
х
Для получения преимущественно одноцепочечных форм ампликонов ПЦР проводили в асимметричном режиме. Длина нарабатываемых ампликонов составляла ~370-480 п.о. ПЦР проводили в 50 мкл реакционной смеси, имеющей следующий состав (указаны конечные концентрации): 1× SE-буфер ("СибЭнзим", РФ) для Taq-полимеразы (60 мМ Tris-HCl, 25 мМ КС1, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 0.1% "Тритон Х-100", рН 8.5), 200 нМ dATP, dGTP, dGTP, 70 нМ dTTP, 50 нМ dUTP-Cy5, 130 нМ прямых праймеров. 1300 нМ обратных праймеров, 5 мМ MgCl, 4 мкл раствора кДНК и 1 ед. акт.Taq-полимеразы ("СибЭнзим", РФ). ПЦР проводили в термоциклере "iCycler" ("BioRad", США), используя следующий протокол: 95°С - 3 мин, затем 35 циклов 95°С - 45 с, 65°С - 30 с, 72°С - 1 мин. Контроль прохождения реакции осуществляли методом горизонтального гель-электрофореза в 1.5% агарозном геле в 1 буфере ТАЕ с окрашиванием бромитым этидием. Флуоресцентно-меченные ампликоны очищали от избытка dUTP-Cy5 с использованием гель-фильтрующих колонок ("Qiagen", Германия), высушивали досуха при 60°С в вакуумном концентраторе "DNA 120 SpeedVac" ("ThermoSavant", США) и использовали для гибридизации.
Пример 4. Гибридизация анализируемых флуоресцентных ампликонов
Высушенный образец ампликона растворяли в 10 мкл бидистиллированной воды, добавляли 10 мкл 2× гибридизационного буфера (1× гибридизационный буфер: 6× SSC. 5× раствор Денхардта, 0.1% Твин-20), прогревали перед нанесением на слайд в течение 5 мин при температуре 97°С и охлаждали во льду. Гибридизацию проводили в гибридизационной камере ("Arraylt", США) при температуре 67°С в течение 1.5 ч. Далее слайд последовательно отмывали в растворах 6× SSC, 2× SSC+0.1% SDS, 2× SSC и 1× SSC и высушивали центрифугированием. Сканирование слайда проводили на сканере "ScanArray Express 2.0" ("PerkinElmer", США) при длине волны возбуждающего лазера равной 633 нм. Компьютерный анализ результатов сканирования осуществляли с использованием программы "ScanArray Express v.4" ("PerkinElmer").
Пример 5. Анализ результатов гибридизации
1
2
2
1
Сканирование слайда проводили на сканере ScanArray Express 2.0 (Perkin Elmer) последовательно с использованием двух возбуждающих лазеров с длинами волн λ=543 нм для Cy3 и λ=633 нм для Cy5. Изображение, полученное по каналу возбуждения флуоресценции с длиной волны λ служила показателем качества печати чипа. а интегральная величина флуоресценции каждого спота рассматривалась в качестве нормировочной для флуоресценции того же спота, измеренной по каналу возбуждения с λ. Анализ изображения осуществляли с использованием программы Scanarray Express, входящих в математическое обеспечение сканера. Для i-го спота нормированную флуоресценцию рассчитывали по формуле:
i
i
i
I=I(Cy3)/I(Cy5),
i
i
i
i
i
i
где I(Cy3)=F(Cy3)-B(Cy3), F(Cy3) - интегральная интенсивность флуоресценции в пределах спота, B(Cy3) - средняя фоновая интенсивность флуоресценции в окружении спота. Аналогичным образом рассчитывали величину I(Cy5).
Для анализа результатов гибридизации рассчитывали среднюю флуоресценцию енотов по формуле:
µ - вид вируса,
i - номер спота,
N - число слотов на чипе для, используемых для определения вида вируса
Вид вируса определяли по столбцу гистограммы с максимальным значением средней флуоресценции спотов. Указанием на однозначность отнесения является отсутствие перекрывания интервалов ошибок субтипов. Интервал ошибок для каждого из субтипов рассчитывался по формуле
x
µ
Sµ=SY, где
x
S - относительная ошибка флуоресценции
i
Относительная ошибка измерения значения флуоресценции определялась исходя из вариации в интенсивности флуоресценции маркерных спотов субэррея (x, расположены в левой и правой колонках микрочипа).
x
ср
S=σ/Х, где
i
x - флуоресценция i-го маркерного спота
n - число маркерных слотов
Результаты анализа представляются в графической форме с помощью программы Microsoft Office Excel
Во всех проанализированных случаях типирование анализируемых патогеновов с помощью заявляемого микрочипа осуществлялось корректно.