СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ТРЕОНИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ГЕН rcsA
METHOD FOR OBTAINING L-THREONINE USING BACTERIUM RELATING TO Escherichia, IN WHICH rcsA GENE IS INACTIVATED

Область техники
Настоящее изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к способу получения L-аминокислоты с использованием бактерии семейства Enterobacteriaceae, модифицированной таким образом, что экспрессия гена rcsA в указанной бактерии ослаблена.
Описание предшествующего уровня техники
Традиционно L-аминокислоты в промышленном масштабе могут быть получены методом ферментации с использованием штаммов микроорганизмов, полученных из природных источников, или их мутантов, специально модифицированных для того, чтобы увеличить продукцию L-аминокислот.
Описано множество методов увеличения продукции L-аминокислот, например, путем трансформации микроорганизма рекомбинантной ДНК (см., например, патент США 4278765). Другие методы основаны на повышении активности ферментов, вовлеченных в биосинтез аминокислот, и/или уменьшении чувствительности целевого фермента к обратному ингибированию продуцируемой L-аминокислотой (см., например, патенты США 4346170; 5661012 и 6040160).
Другим методом увеличения продукции L-аминокислот является ослабление экспрессии одного или нескольких генов, вовлеченных в деградацию целевой L-аминокислоты; генов, экспрессия которых ведет к отвлечению предшественников целевой аминокислоты от пути биосинтеза L-аминокислоты; генов, вовлеченных в перераспределение потоков углерода, азота и фосфора; генов, кодирующих токсины и т.д.
Ген rcsA кодирует белок RcsA, нестабильный позитивный регулятор, требуемый для синтеза колановой кислоты полисахарида капсулы в Escherichia coli. Деградация белка RcsA in vivo зависит от АТФ-зависимой Lon протеазы. Последовательности ДНК и белка в высокой степени гомологичны гену rcsA и белку Klebsiella pneumoniae и других организмов. Область С-конца RcsA содержит вероятный элемент связывания с ДНК в области «спираль-поворот-спираль», который напоминает последовательность, найденную в области С-конца RcsB, другого позитивного регулятора синтеза капсулы, и в нескольких других транскрипционных регуляторах, включая члены семейства LuxR. Стабильность RcsA дикого типа in vivo увеличивается при наличии множества копий RcsB, в то время как деградирует RcsA быстрее в мутантном по rcsB хозяине, чем в хозяине дикого типа. Эти результаты позволяют предположить, что RcsA и RcsB взаимодействуют in vivo, и согласуются с генетическими экспериментами, которые указывают на взаимодействие между RcsA и RcsB (Stout, V. et.al., J Bacteriol. 1991 March; 173(5): 1738-1747)).
Показано, что RcsA функционирует как активатор собственной экспрессии, поскольку выявлено 100-кратное увеличение экспрессии rcsA::lacZ транскрипционного гибрида в штаммах с высоким уровнем белка RcsA, либо благодаря мутации в Ion, либо благодаря сверхэкспрессии RcsA с мультикопийной плазмиды. Экспрессия rcsA::lacZ гибрида увеличивается в отсутствие RcsB. Кроме того, воздействие H-NS, гистоноподобного белка, и RcsB на экспрессию rcsA не зависят друг от друга. Последовательность, консервативная для cps промотора Е.coli cps и ams промотора Erwinia amylovora и, как показано ранее, являющаяся сайтом связывания RcsA-RcsB, была идентифицирована в области промотора rcsA и, как показано, требуется для высокого уровня экспрессии rcsA. (Ebel, W. and Trempy, J.E., J Bacteriol., 181(2): 577-84 (1999)).
-
-
-
Была исследована роль DnaJ, белка теплового шока, в деградации RcsA. В то время как функциональный цикл RcsA в мутантном по dnaJ хозяине увеличен, накапливающийся белок RcsA в значительной степени агрегирован. Одновременная стабилизация и агрегация RcsA согласуются с моделью, в которой DnaJ (а также, возможно, DnaK и GrpE) действует как косвенный стимулятор протеолиза, способствуя поддержанию RcsA в растворимом виде. Влияние DnaJ на растворимость RcsA не ограничивается белком, сверхпродуцируемым при экспрессии гена, находящегося в составе плазмиды. Было обнаружено, что кодируемый геном на хромосоме белок RcsA в клетках lon в основном находится в растворимом виде, но в клетках lon dnaJ - в нерастворимом; более того, нерастворимость связана с неспособностью RcsA функционировать в мутантах по dnaJ (Jubete, Y., et.al., J. Biol. Chem., 271(48), 30798-803 (1996)).
Но в настоящее время нет сообщений, описывающих использование инактивации гена rcsA с целью получения L-аминокислот.
Описание изобретения
Целями настоящего изобретения являются повышение продуктивности штаммов-продуцентов L-аминокислоты и предоставление способа получения L-аминокислоты с использованием этих штаммов.
Вышеупомянутые цели были достигнуты путем установления того факта, что ослабление экспрессии гена rcsA может привести к повышению продукции L-аминокислот, таких как L-треонин, L-лизин, L-цистеин, L-метионин, L-лейцин, L-изолейцин, L-валин, L-гистидин, L-глицин, L-серин, L-аланин, L-аспарагин, L-аспарагиновая кислота, L-глутамин, L-глутаминовая кислота, L-пролин, L-аргинин, L-фенилаланин, L-тирозин и L-триптофан.
Настоящее изобретение предоставляет бактерию семейства Enterobacteriaceae, обладающую способностью к повышенной продукции аминокислот, таких как L-треонин, L-лизин, L-цистеин, L-метионин, L-лейцин, L-изолейцин, L-валин, L-гистидин, L-глицин, L-серин, L-аланин, L-аспарагин, L-аспарагиновая кислота, L-глутамин, L-глутаминовая кислота, L-пролин, L-аргинин, L-фенилаланин, L-тирозин и L-триптофан.
Целью настоящего изобретения является предоставление бактерии-продуцента L-аминокислоты семейства Enterobacteriaceae, модифицированной таким образом, что экспрессия гена rcsA в указанной бактерии ослаблена.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, в которой ослабление экспрессии указанного гена rcsA осуществлено путем инактивации указанного гена rcsA.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом указанная бактерия принадлежит к роду Escherichia.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом указанная бактерия принадлежит к роду Pantoea.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом указанная L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из ароматической L-аминокислоты и неароматической L-аминокислоты.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом ароматическая L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из L-фенилаланина, L-тирозина и L-триптофана.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, при этом неароматическая L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из L-треонина, L-лизина, L-цистеина, L-метионина, L-лейцина, L-изолейцина, L-валина, L-гистидина, L-глицина, L-серина, L-аланина, L-аспарагина, L-аспартата, L-глутамина, L-глутаминовой кислоты, L-пролина и L-аргинина.
Также целью настоящего изобретения является предоставление способа получения L-аминокислоты, который включает в себя:
- выращивание описанной выше бактерии в питательной среде с целью продукции и накопления L-аминокислоты в питательной среде, и
- выделение указанной L-аминокислоты из культуральной жидкости.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, при этом указанная L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из ароматической L-аминокислоты и неароматической L-аминокислоты.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, при этом указанная ароматическая L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из L-фенилаланина, L-тирозина и L-триптофана.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, при этом указанная неароматическая L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из L-треонина, L-лизина, L-цистеина, L-метионина, L-лейцина, L-изолейцина, L-валина, L-гистидина, L-глицина, L-серина, L-аланина, L-аспарагина, L-аспартата, L-глутамина, L- глутаминовой кислоты, L-пролина и L-аргинина.
Более детально настоящее изобретение описано ниже.
Подробное описание наилучшего способа осуществления изобретения
1. Бактерия согласно настоящему изобретению
Бактерия согласно настоящему изобретению - это бактерия-продуцент L-аминокислоты семейства Enterobacteriaceae, модифицированная таким образом, что экспрессия гена rcsA в указанной бактерии ослаблена.
Согласно настоящему изобретению «бактерия-продуцент L-аминокислоты» означает бактерию, обладающую способностью к продукции и выделению L-аминокислоты в питательную среду, когда бактерия согласно настоящему изобретению выращивается в указанной питательной среде.
Используемый здесь термин «бактерия-продуцент L-аминокислоты» также означает бактерию, которая способна к продукции L-аминокислоты и вызывает накопление L-аминокислоты в ферментационной среде в больших количествах по сравнению с природным или родительским штаммом Е.coli, таким как штамм Е.coli К-12, и предпочтительно означает, что указанный микроорганизм способен накапливать в среде целевую L-аминокислоту в количестве не менее чем 0.5 г/л, более предпочтительно не менее чем 1.0 г/л. Термин «L-аминокислота» включает в себя L-аланин, L-аргинин, L-аспарагин, L-аспарагиновую кислоту, L-цистеин, L-глутаминовую кислоту, L-глутамин, L-глицин, L-гистидин, L-изолейцин, L-лейцин, L-лизин, L-метионин, L-фенилаланин, L-пролин, L-серин, L-треонин, L-триптофан, L-тирозин и L-валин.
Термин «ароматическая L-аминокислота» включает в себя L-фенилаланин, L-тирозин и L-триптофан. Термин «неароматическая L-аминокислота» включает в себя L-треонин, L-лизин, L-цистеин, L-метионин, L-лейцин, L-изолейцин, L-валин, L-гистидин, L-глицин, L-серин, L-аланин, L-аспарагин, L-аспартат, L-глутамин, L-глутаминовую кислоту, L-пролин и L-аргинин. Наиболее предпочтительны L-треонин, L-лизин, L-цистеин, L-лейцин, L-гистидин, L-глутаминовая кислота, L-фенилаланин, L-триптофан, L-пролин и L-аргинин.
Семейство Enterobacteriaceae включает в себя бактерии, принадлежащие к родам Escherichia, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Pantoea, Photorhabdus, Providencia, Salmonella, Serratia, Shigella, Morganella, Yersinia и т.д. Более конкретно, могут быть использованы бактерии, классифицируемые как принадлежащие к семейству Enterobacteriaceae в соответствии с таксономией, используемой в базе данных NCBI (National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbinpost/Taxonomy/wgetorg?mode=Tree&id=1236&lvl=3&keep=1&srchmode=1&unlock). Бактерия, принадлежащая к родам Escherichia или Pantoea, предпочтительна.
Термин “бактерия, принадлежащая к роду Escherichia” означает, что бактерия относится к роду Escherichia в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. В качестве примера микроорганизма, принадлежащего к роду Escherichia, использованного в настоящем изобретении, может быть упомянута бактерия Escherichia coli (E. coli).
Круг бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, не ограничен каким-либо образом, однако, например, бактерии, описанные в книге Neidhardt, F.C. et al. (Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Таблица 1), могут быть включены в число бактерий согласно настоящему изобретению.
Термин «бактерия, принадлежащая к роду Pantoea» означает, что бактерия относится к роду Pantoea в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. Недавно несколько видов Enterobacter agglomerans были классифицированы как Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis, Pantoea stewartii или подобные им, на основе анализа нуклеотидной последовательности 16S рРНК и т.д. (Int. J. Syst. Bacteriol, 43, 162-173 (1993)).
Термин «бактерия модифицирована таким образом, что экспрессия гена rcsA ослаблена» означает, что указанная бактерия была модифицирована таким образом, что в результате модификации такая бактерия содержит пониженное количество белка RcsA по сравнению с немодифицированной бактерией, или модифицированная бактерия не способна синтезировать белок RcsA.
Термин «инактивация гена rcsA» означает, что указанный ген модифицирован таким образом, что такой модифицированный ген кодирует полностью неактивный белок. Также возможно, что естественная экспрессия модифицированного участка ДНК невозможна из-за делеции целевого гена или его части, сдвига рамки считывания данного гена, введения missense/nonsense мутации (мутаций) или модификации прилегающих к гену областей, которые включают последовательности, контролирующие экспрессию гена, такие как промотор(ы), энхансер(ы), аттенуатор(ы), сайт(ы) связывания рибосомы и т.д.
Уровень экспрессии гена можно оценить путем измерения количества мРНК, транскрибируемой с целевого гена, с использованием различных известных методик, включая гибридизацию по Нозерну (Northern blotting), количественный метод ОТ-ПЦР (RT-PCR) и подобные им. Количество белка, кодируемого данным геном, может быть измерено с помощью известных методов, включающих метод SDS-PAGE с последующим иммуноблотингом (Western blotting) и подобные им.
Ген rcsA (синонимы - ЕСК1949, cpsR, b1951) кодирует белок RcsA (синонимы - CpsR, В 1951). Ген rcsA (номера нуклеотидов с 2,021,992 по 2,022,615 в нуклеотидной последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank; gi: 49175990; SEQ ID NO:1) расположен на хромосоме штамма Е. coli K-12 между геном fliR и геном dsrB. Нуклеотидная последовательность гена rcsA и соответствующая ей аминокислотная последовательность белка RcsA, кодируемого геном rcsA, приведены в Перечне последовательностей под номерами 1 (SEQ ID NO:1) и 2 (SEQ ID NO:2) соответственно.
Поскольку у представителей различных родов и штаммов семейства Enterobacteriaceae возможны некоторые вариации в нуклеотидных последовательностях, понятие инактивируемого гена rcsA не ограничивается геном, последовательность которого приведена в Перечне последовательностей под номером 1 (SEQ ID No:1), но также может включать и гомологичные ему гены, кодирующие варианты белка RcsA. Термин «вариант белка», как он используется в настоящем изобретении, означает белок с изменениями в последовательности, будь то делеции, вставки, добавления или замены аминокислот, при этом сохраняющий активность белка RcsA. Количество изменений в варианте белка зависит от положения или типа аминокислотного остатка в третичной структуре белка. Возможно от 1 до 30, предпочтительно от 1 до 15, более предпочтительно от 1 до 5, изменений в последовательности, приведеннной в Перечне последовательностей под номером 2 (SEQ ID No:2). Эти изменения в вариантах белка могут иметь место в областях белка, которые некритичны для функционирования белка. Такие изменения допускаются благодаря тому, что некоторые аминокислоты имеют высокую гомологию друг к другу, поэтому такие изменения не влияют на третичную структуру или активность. Таким образом, вариант белка, кодируемого геном rcsA, может быть представлен белком с гомологией не менее 80%, предпочтительно не менее 90% и наиболее предпочтительно не менее 95%, по отношению к полной аминокислотной последовательности, приведенной в Перечне последовательностей под номером 2 (SEQ ID NO.2).
Гомология между двумя аминокислотными последовательностями может быть определена с использованием известных методов, например, компьютерной программы BLAST 2.0, которая считает три параметра: число аминокислот, идентичность и сходство.
Кроме того, ген rcsA может быть представлен вариантом, который гибридизуется в жестких условиях с нуклеотидной последовательностью, приведенной в Перечне последовательностей под номером 1 (SEQ ID NO:1), или с зондом, который может быть синтезирован на основе указанной нуклеотидной последовательности, при условии, что указанный вариант кодирует функциональный белок RcsA. «Жесткие условия» включают такие условия, при которых специфические гибриды, например гибриды со степенью гомологии не менее 60%, предпочтительно не менее 70%, более предпочтительно не менее 80%, еще более предпочтительно не менее 90%, наиболее предпочтительно не менее 95%, образуются, а неспецифические гибриды, например гибриды со степенью гомологии ниже вышеуказанной, не образуются. Практическим примером жестких условий является однократная отмывка, предпочтительно двух- или трехкратная, при концентрации солей, соответствующей стандартным условиям отмывки при гибридизации по Саузерну, например, 1×SSC, 0.1% SDS, предпочтительно 0.1×SSC, 0.1% SDS, при 60°С. Продолжительность отмывки зависит от типа используемой для блоттинга мембраны и, как правило, такова, как рекомендовано производителем. Например, рекомендуемая продолжительность отмывки для нейлоновой мембраны Hybond™ N+ (Amersham) при строгих условиях 15 минут. Предпочтительна двух-трехкратная отмывка. Длина зонда может быть выбрана в зависимости от условий гибридизации, обычно она составляет от 100 п.н. до 1 т.п.н.
Экспрессия гена rcsA может быть ослаблена введением такой мутации в ген на хромосоме, что активность кодируемого геном белка снижена по сравнению с немодифицированным штаммом. Такой мутацией может быть перестановка одного или более основания с целью получения аминокислотной замены в кодируемом геном белке («миссенс»-мутация), введение стоп-кодона («нонсенс»-мутация), делеция одного или нескольких оснований для сдвига рамки считывания, вставка гена устойчивости к антибиотику или делеция части гена или делеция гена полностью (Qiu, Z. and Goodman, M.F., J. Biol. Chem., 272, 8611-8617 (1997); Kwon, D.H. et al., J. Antimicrob. Chemother., 46, 793-796 (2000)). Экспрессия гена rcsA также может быть ослаблена модификацией регулирующей экспрессию последовательности, такой как промотор, последовательность Шайн-Дальгарно (SD) и т.д. (заявка РСТ WO 95/34672, Carrier, T.A. and Keasling, J.D., Biotechnol Prog 15, 58-64 (1999)).
Например, для введения мутации генной рекомбинацией могут применяться следующие методы. Конструируется мутантный ген, кодирующий мутантный белок со сниженной активностью, бактерия для модификации трансформируется фрагментом ДНК, содержащим мутантный ген. Затем нативный ген на хромосоме заменяется с использованием гомологичной рекомбинации мутантным геном, отбирается полученный штамм. Такое замещение гена с использованием гомологичной рекомбинации может быть проведено методом с использованием линейной ДНК, известным как "Red-зависимая интеграция" (Datsenko, K.A. and Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 12. p 6640-6645 (2000), заявка РСТ WO 2005/010175), или методами с использованием плазмиды, репликация которой чувствительна к температуре (Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 97, 12, р.6640-6645 (2000), патенты США 6303383 и 5616480). Далее, введение сайт-специфической мутации генной заменой с использованием гомологичной рекомбинации, такой, как описано выше, также может быть проведено с использованием плазмиды, неспособной реплицироваться в клетке хозяина.
Экспрессия гена также может быть ослаблена вставкой в кодирующую область гена транспозона или IS-фактора (патент США 5175107) или такими традициоными методами, как мутагенез с использованием УФ-излучения или обработка нитрозогуанидином (N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин).
Инактивация гена также может быть осуществлена традиционными методами, такими как мутагенез с использованием УФ-излучения или обработка нитрозогуанидином (N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин), сайт-направленный мутагенез, разрушение гена с использованием гомологичной рекомбинации и/или мутагенеза вставкой-делецией (Yu, D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12: 5978-83 и Datsenko, K.A. and Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12: 6640-45), также называемого "Red-зависимая интеграция".
Присутствие белка RcsA может быть определено с использованием поликлональных антител методом, описанным в (Ebel, W. and Trempy, J.E., J Bacteriol., 181(2): 577-84 (1999)).
Присутствие или отсутствие гена rcsA на хромосоме бактерии может быть определено известными методами, включая ПЦР, блоттинг по Саузерну, и т.п. Кроме того, уровень экспрессии гена можно оценить измерением количества транскрибируемой с гена РНК с использованием известных методов, включая блоттинг по Нозерну, количественнуй ОТ-ПЦР и т.п. Количество или молекулярная масса белка, кодируемого геном, может быть измерено известными методами, включая SDS-ПААГ-электрофорез с последующим иммуноблоттингом (Western blotting analysis) и т.п.
Методами получения плазмидной ДНК, разрезания и дотирования ДНК, трансформации, выбора олигонуклеотидов в качестве праймеров и подобными им могут являться обычные методы, хорошо известные специалисту в данной области. Эти методы описаны, например, в книге Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, Т., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).
Бактерия-продуцент L-аминокислоты
В качестве бактерии согласно настоящему изобретению, модифицированной таким образом, что экспрессия гена rcsA ослаблена, может быть использована бактерия, способная к продукции ароматической или неароматической L-аминокислоты.
Бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем ослабления экспрессии гена rcsA в бактерии, уже обладающей способностью к продукции L-аминокислот. С другой стороны, бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем придания бактерии, в которой экспрессия гена rcsA уже ослаблена, способности к продукции L-аминокислот.
Бактерия-продуцент L-треонина
Примеры родительского штамма для получения бактерии-продуцента L-треонина согласно настоящему изобретению включают, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е. coli TDH-6/pVIC40 (ВКПМ В-3996) (патенты США 5175107 и 5705371), штамм Е. coli NRRL-21593 (патент США 5939307), штамм Е. coli FERM ВР-3756 (патент США 5474918), штаммы Е. coli FERM ВР-3519 и FERM BP-3520 (патент США 5376538), штамм Е. coli MG442 (Гусятинер и др., Генетика, 14, 947-956 (1978)), штаммы Е.coli VL643 и VL2055 (Европейская патентная заявка ЕР 1149911 А) и подобные им.
Штамм TDH-6 является дефектным по гену thrC, способен ассимилировать сахарозу и содержит ген ilvA с мутацией типа "leaky". Указанный штамм содержит мутацию в гене rhtA, которая обуславливает устойчивость к высоким концентрациям треонина и гомосерина. Штамм В-3996 содержит плазмиду pVIC40, которая была получена путем введения в вектор, производный от вектора RSF1010, оперона thrA*BC, включающего мутантный ген thrA, кодирующий аспартокиназа-гомосериндегидрогеназу I, у которой существенно снижена чувствительность к ингибированию треонином по типу обратной связи. Штамм В-3996 был депонирован 19 ноября 1987 года во Всесоюзном научном центре антибиотиков (РФ, 117105 Москва, Нагатинская ул., 3-А) с инвентарным номером РИА 1867. Указанный штамм также был депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (РФ, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) с инвентарным номером В-3996.
В качестве родительского штамма для получения бактерии-продуцента L-треонина согласно настоящему изобретению также может быть использован штамм E. coli ВКПМ В-5318 (Европейская заявка 0593792 В). Штамм В-5318 является прототрофным относительно изолейцина, регуляторная область треонинового оперона на плазмиде pVIC40 заменена чувствительным к температуре С1 репрессором фага λ и промотором PR. Штамм ВКПМ В-5318 депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) 3 мая 1990 г. с инвентарным номером ВКПМ В-5318.
Предпочтительно, чтобы бактерия согласно настоящему изобретению была далее модифицирована таким образом, чтобы иметь повышенную экспрессию одного или нескольких следующих генов:
- мутантного гена thrA, кодирующего аспартокиназа-гомосериндегидрогеназу I, устойчивую к ингибированию треонином по типу обратной связи;
- гена thrB, кодирующего гомосеринкиназу;
- гена thrC, кодирующего треонинсинтазу;
- гена rhtA, предположительно кодирующего трансмембранный белок;
- гена asd, кодирующего аспартат-β-семиальдегиддегидрогеназу, и
- гена aspC, кодирующего аспартатаминотрансферазу (аспартаттрансаминазу).
Нуклеотидная последовательность гена thrA, кодирующего аспартокиназа-гомосериндегидрогеназу I из Escherichia coli, известна (номера нуклеотидов с 337 по 2799 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank, gi: 49175990). Ген thrA расположен на хромосоме штамма Е.coli К-12 между генами thrL и thrB. Нуклеотидная последовательность гена thrB, кодирующего гомосеринкиназу из Escherichia coli, известна (номера нуклеотидов с 2801 по 3733 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank, gi: 49175990). Ген thrB расположен на хромосоме штамма Е.coli К-12 между генами thrA и thrC. Нуклеотидная последовательность гена thrC, кодирующего треонинсинтазу из Escherichia coli, известна (номера нуклеотидов с 3734 по 5020 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank, gi: 49175990). Ген thrC расположен на хромосоме штамма Е. coli К-12 между геном thrB и открытой рамкой считывания уааХ. Все три указанных гена функционируют как один треониновый оперон. Для усиления эксперссии треонинового оперона область аттенюатора, влияющего на транскрипцию, удаляется из оперона (заявки РСТ WO 2005/049808, WO 2003/097839).
Мутантный ген thrA, кодирующий аспартокиназу-гомосериндегидрогеназу I, устойчивую к ингибированию треонином по типу обратной связи, так же как и гены thrB и thrC, могут быть получены в виде единого оперона из хорошо известной плазмиды pVIC40, которая представлена в штамме-продуценте Е.coli ВКПМ В-3996. Плазмида pVIC40 подробно описана в патенте США 5705371.
th
Ген rhtA расположен на 18 минуте хромосомы Е.coli около оперона glnHPQ, который кодирует компоненты транспортной системы глутамина, ген rhtA идентичен ORF1 (ген ybiF, номера нуклеотидов с 764 по 1651 в последовательности с инвентарным номером ААА218541 в базе данных GenBank, gi:440181), расположен между генами рехВ и ompX. Участок ДНК, экспрессирующийся с образованием белка, кодируемого рамкой считывания ORF1, был назван геном rhtA (rht: resistance to homoserine and threonine). Также было показано, что мутация rhtA23 представляет собой замену А-на-G в положении -1 по отношению к старт кодону ATG (ABSTRACTS of 17International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with 1997 Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No.457, EP 1013765 A).
Нуклеотидная последовательность гена asd из E.coli известна (номера нуклеотидов с 3572511 по 3571408 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.1 в базе данных GenBank, gi:16131307) и может быть получена с помощью ПЦР (полимеразная цепная реакция; ссылка на White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)) с использованием праймеров, синтезированных на основе нуклеотидной последовательности указанного гена. Гены asd из других микроорганизмов могут быть получены сходным образом.
Также нуклеотидная последовательность гена aspC из E. coli известна (номера нуклеотидов с 983742 по 984932 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.1 в базе данных GenBank, gi:16128895) и может быть получена с помощью ПЦР. Гены aspC из других микроорганизмов могут быть получены сходным образом.
Бактерия-продуцент L-лизина
Примеры бактерий-продуцентов L-лизина, принадлежащих к роду Escherichia, включают мутанты, обладающие устойчивостью к аналогу L-лизина. Аналог L-лизина ингибирует рост бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, но это ингибирование полностью или частично снимается, когда в среде также присутствует L-лизин. Примеры аналога L-лизина включают, но не ограничиваются оксализином, лизингидроксаматом, S-(2-аминоэтил)-L-цистеином (AEC), γ-метиллизном, α-хлорокапролактамом и так далее. Мутанты, обладающие устойчивостью к указанным аналогам лизина, могут быть получены путем обработки бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, традиционными мутагенами. Конкретные примеры бактериальных штаммов, используемых для получения L-лизина, включают штамм Escherichia coli AJ11442 (FERM BP-1543, NRRL В-12185; смотри патент США 4346170) и штамм Escherichia coli VL611. В этих микроорганизмах аспартокиназа устойчива к ингибированию L-лизином по принципу обратной связи.
Штамм WC196 может быть использован в качестве бактерии-продуцента L-лизина Escherichia coli. Данный бактериальный штамм был получен путем селекции фенотипа устойчивости к АЕС у штамма W3110, производного от штамма Escherichia coli К-12. Полученный штамм был назван Escherichia coli AJ13069 и был депонирован в Национальном Институте Биологических Наук и Человеческих Технологий, Агенство Промышленной Науки и Технологии (National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology), в настоящее время называющийся Национальный Институт Прогрессивной Промышленной Науки и Технологии, Международный Депозитарий Организмов для Целей Патентования, Централ 6, 1-1, Хигаши 1-Чоме, Тсукуба-ши, Ибараки-кен, 305-8566, Япония (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan), 6 декабря 1994 года и получил инвентарный номер FERM P-14690. Затем было произведено международное депонирование этого штамма согласно условиям Будапештского Договора 29 сентября 1995 года, и штамм получил инвентарный номер FERM BP-5252 (смотри патент США 5827698).
Примеры родительских штаммов для получения бактерий, продуцирующих L-лизин согласно настоящему изобретению, также включают штаммы, в которых усилена экспрессия одного или нескольких генов, кодирующих ферменты биосинтеза L-лизина. Примеры ферментов, вовлеченных в биосинтез L-лизина, включают, но не ограничиваются ими, дигидродипиколинатсинтазу (dapA), аспартокиназу (lysC), дигидродипиколинатредуктазу (dapB), диаминопимелатдекарбоксилазу (lysA), диаминопимелатдегидрогеназу (ddh) (патент США. 6040160), фосфоенолпируваткарбоксилазу (ррс), аспартатсемиальдегиддегидрогеназу (asd, никотинамидадениндинуклеотидтрансгидрогеназу (pntAB) и аспартазу (aspA) (европейская заявка ЕР 1253195 А). Кроме того, родительские штаммы могут иметь повышенный уровень экспрессии гена, вовлеченного в процесс дыхания (суо) (европейская заявка ЕР 1170376 А), гена, кодирующего никотинамиднуклеотидтрансгидрогеназу (pntAB) (патент США 5830716), гена ybjE (заявка РСТ WO 2005/073390) или комбинации этих генов.
Примеры родительских штаммов для получения бактерий, продуцирующих L-лизин согласно настоящему изобретению, также включают штаммы, в которых снижена или отсутствует активность ферментов, которые катализируют реакции образования отличных от L-лизина соединений, ответвляющихся от основного пути биосинтеза L-лизина. Примеры ферментов, которые катализируют реакции образования отличных от L-лизина соединений, ответвляющихся от основного пути биосинтеза L-лизина, включают гомосериндегидрогеназу, лизиндекарбоксилазу (патент США 5827698) и малатдегидрогеназу (заявка РСТ WO 2005/010175).
Бактерия-продуцент L-цистеина
Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-цистеина согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е. coli JM15, трансформированный различными аллелями гена cysE, кодирующими устойчивые к ингибированию по типу обратной связи серинацетилтрансферазы (патент США 6218168, патентная заявка РФ 2003121601); штамм Е. coli W3110, содержащий гены с повышенной экспрессией, кодирующие белок, способный к секреции соединений, токсичных для клетки (патент США 5972663); штаммы Е. coli, содержащие цистеиндесульфогидразу со сниженной активностью (патент Японии JP 11155571 A2); штамм Е. coli W3110 с повышенной активностью позитивного транскрипционного регулятора цистеинового регулона, кодируемого геном cysB (международная заявка РСТ WO 0127307 A1) и подобные им.
Бактерия-продуцент L-лейцина
Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-лейцина согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штаммы Е. coli, устойчивые к аналогам лейцина, включающие, например, β-2-тиенилаланин, 3-гидроксилейцин, 4-азалейцин и 5,5,5-трифлуоролейцин (выложенные патентные заявки Японии 62-34397 и 8-70879), штаммы Е. coli, полученные с помощью генно-инженерных методов, описанных в заявке РСТ 96/06926; Е. coli штамм Н-9068 (JP 08-70879А), и подобные им.
Бактерия согласно настоящему изобретению может быть улучшена путем усиления экспрессии одного или нескольких генов, вовлеченных в биосинтез L-лейцина. Примеры таких генов включают в себя гены оперона leuABCD и предпочтительно представлены мутантным геном leuA, кодирующим изопропилмалатсинтазу со снятым ингибированием L-лейцином по типу обратной связи (патент США 6403342). Кроме того, бактерия согласно настоящему изобретению может быть улучшена путем усиления экспрессии одного или нескольких генов, кодирующих белки, которые экспортируют L-аминокислоту из бактериальной клетки. Примеры таких генов включают в себя гены b2682 и b2683 (гены ygaZH) (Европейская заявка 1239041 А2).
Бактерия-продуцент L-гистидина
Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-гистидина согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются бактериями-продуцентами L-гистидина, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е. coli 24 (ВКПМ В-5945, патент РФ 2003677); штамм Е. coli 80 (ВКПМ В-7270, патент РФ 2119536); штаммы Е. coli NRRL B-12116-B12121 (патент США 4388405); штаммы Е. coli H-9342 (FERM ВР-6675) и Н-9343 (FERM ВР-6676) (патент США 6344347); штамм Е. coli H-9341 (FERM BP-6674) (Европейский патент 1085087); штамм Е. coli AI80/pFM201 (патент США 6258554) и подобные им. Примеры родительских штаммов для получения бактерий, продуцирующих L-гистидин согласно настоящему изобретению, также включают штаммы, в которых усилена экспрессия одного или нескольких генов, кодирующих ферменты биосинтеза L-гистидина. Примеры таких генов включают гены, кодирующие АТФ-фосфорибозилтрансферазу (hisG), фосфорибозил-АМФ-циклогидролазу (hisI), фосфорибозил-АТФ-фосфогидролазу (hisIE), фосфорибозилформимино-5-аминоимидазолкарбоксамидриботидизомеразу (hisA), амидотрансферазу (hisH), гистидинолфосфатаминотрансферазу (hisC), гистидинолфосфатазу (hisB), гистидинолдегидрогеназу (hisD) и т.д.
Известно, что гены, кодирующие ферменты биосинтеза L-гистидина (hisG, hisBHAFI), ингибируются L-гистидином, поэтому способность к продукции L-гистидина также может быть значительно усилена введением мутации, придающей устойчивость к ингибированию по типу обратной связи, в ген АТФ-фосфорибозидтрансферазы (hisG) (патенты РФ. 2003677 и 2119536).
Специфические примеры штаммов, обладающих способностью к продукции L-гистидина, включают Е. coli FERM-P 5038 и 5048, в которые был введен вектор, содержащий ДНК, кодирующую фермент биосинтеза L-гистидина (заявка Японии 56-005099 А), штаммы E. coli, в которые введен ген rht, для экспорта аминокислоты (европейская заявка ЕР 1016710А), штамм Е. coli 80, которому придана устойчивость к сульфагуанидину, DL-1,2,4-триазол-3-аланину и стрептомицину (ВКПМ В-7270, патент РФ. 2119536), и т.д.
Бактерия-продуцент L-глутаминовой кислоты
+
+
Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-глутаминовой кислоты согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е. coli VL334thrC(Европейский патент ЕР 1172433). Штамм Е. coli VL334 (ВКПМ В-1641) является ауксотрофом по L-изолейцину и L-треонину с мутациями в генах thrC и ilvA (патент США 4278765). В этот штамм была перенесена природная аллель гена thrC методом общей трансдукции с использованием бактериофага Р1, выращенного на клетках природного штамма Е. coli К12 (ВКПМ В-7). В результате был получен штамм, ауксотроф по L-изолейцину, VL334thrC(ВКПМ В-8961). Этот штамм обладает способностью к продукции L-глутаминовой кислоты.
Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-глутаминовой кислоты согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются ими, штаммы, в которых усилена экспрессия одного или нескольких генов, кодирующих ферменты биосинтеза L-глутаминовой кислоты. Примеры таких ферментов включают глутаматдегидрогеназу (gdh), глутаминсинтетазу (glnA), глутаматсинтетазу (gltAB), изоцитратдегидрогеназу (icdA), аконитатгидратазу (acnA, acnB), цитратсинтазу (gltA), фосфоенолпируваткарбоксилазу (ррс), пируватдегидрогеназу (aceEF, lpdA), пируваткиназу (pykA, pykF), фосфоенолпируватсинтазу (ppsA), енолазу (eno), фосфоглицеромутазу (pgmA, pgmI), фосфоглицераткиназу (pgk), глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу (gapA), триозофосфатизомеразу (tpiA), фруктозобифосфатальдолазу (fbp), фосфофруктокиназу (pfkA, pfkB) и глюкозофосфатизомеразу (pgi).
Примеры штаммов, модифицированных таким образом, что усилена экспрессия гена цитратсинтетазы, гена фосфоенолпируваткарбоксилазы и/или гена глутаматдегидрогеназы, включают описанные в Европейских заявках ЕР 1078989 А, ЕР 955368 А и ЕР 952221 А.
Примеры штаммов, модифицированных таким образом, что экспрессия гена цитратсинтетазы и/или гена фосфоенолпируваткарбоксилазы снижена, и/или лишенные по активности α-котоглутаратдегидрогеназы, включают описанные в Европейских заявках ЕР 1078989 А, ЕР 955368 А и ЕР 952221 А.
Примеры родительских штаммов для получения продуцирующих L-глутаминовую кислоту бактерий согласно настоящему исследованию, также включают штаммы, в которых снижена или отсутствует активность ферментов, которые катализируют синтез отличных от L-глутаминовой кислоты соединений, ответвляющихся от основного пути биосинтеза L-глутаминовой кислоты. Примеры таких ферментов включают изоцитратлиазу (асеА), α-кетоглутаратдегидрогеназу (sucA), фосфотрансацетилазу (pta), ацетаткиназу (ack), синтазу ацетогидроксикислот (ilvG), ацетолактатсинтазу (ilvI), форматацетилтрансферазу (pfl), лактатдегидрогеназу (ldh) и глутаматдекарбоксилазу (gadAB). Бактерии, принадлежащие к роду Escherichia, лишенные активности α-кетоглутаратдегидрогеназы или обладающие сниженной активностью α-кетоглутаратдегидрогеназы, и способы их получения описаны в патентах США 5378616 и 5573945. Конкретно, примеры таких штаммов включают в себя следующие штаммы:
R
E. coli W3110 sucA::Km
Е. coli AJ12624 (FERM ВР-3853)
Е. coli AJ12628 (FERM BP-3854)
Е. coli AJ12949 (FERM BP-4881)
R
Штамм Е. coli W3110 sucA::Km был получен в результате разрушения гена α-кетоглутаратдегидрогеназы (далее называемого "ген sucA") в штамме Е. coli W3110. У этого штамма активность α-кетоглутаратдегидрогеназы отсутствует полностью.
Другие примеры бактерии-продуцента L-глутаминовой кислоты включают в себя бактерии, принадлежащие к роду Escherichia и обладающие устойчивостью к антиметаболитам аспарагиновой кислоты и дефицитные по активности α-кетоглутаратдегидрогеназы, например, штамм AJ13199 (FERM BP-5807) (патент США 5908768), или штамм FERM P-12379, дополнительно обладающий низкой активностью по расщеплению L-глутаминовой кислоты (патент США 5393671); штамм Е. coli AJ13138 (FERM BP-5565) (патент США 6110714) и подобные им.
Примеры бактерии-продуцента L-глутаминовой кислоты включают в себя мутантные штаммы, принадлежащие к роду Pantoea, которые лишены активности α-кетоглутаратдегидрогеназы или имеют сниженную активность α-кетоглутаратдегидрогеназы и могут быть получены описанным выше способом. Примерами таких штаммов являются штамм Pantoea ananatis AJ13356 (патент США 6,331,419), штамм Pantoea ananatis AJ13356, депонированный в Национальном Институте Биологических Наук и Человеческих Технологий, Агенство Промышленной Науки и Технологии, Министерство Международной Торговли и Промышленности (National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry) (в настоящее время называющийся Национальный Институт Прогрессивной Промышленной Науки и Технологии, Международный Депозитарий Организмов для Целей Патентования, Централ 6, 1-1, Хигаши 1-Чоме, Тсукуба-ши, Ибараки-кен, 305-8566, Япония - National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Central 6,1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan) 19 февраля, 1998 и получивший инвентарный номер FERM Р-16645. Затем было произведено международное депонирование этого штамма согласно условиям Будапештского Договора от 11 января 1999 г., и штамм получил инвентарный номер FERM BP-6615. Штамм Pantoea ananatis AJ13356 не имеет α-KGDH активности в результате разрушения гена αKGDH-E1 субъединицы (sucA). Вышеупомянутый штамм при выделении был идентифицирован как Enterobacter agglomerans и депонирован как штамм Enterobacter agglomerans AJ13356. Тем не менее позднее он был классифицирован как Pantoea ananatis на основе нуклеотидной последовательности 16S рРНК и других доказательств. Несмотря на то что штамм AJ13356 был депонирован в указанный выше депозитарий как Enterobacter agglomerans, для целей данного описания он будет упоминаться как Pantoea ananatis.
Бактерия-продуцент L-фенилаланина
Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-фенилаланина согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм E. coli AJ12739 (tyrA::Tn10, tyrR) (ВКМП В-8197); штамм E.coli HW1089 (АТСС-55371), содержащий ген pheA34 (патент США 5354672); мутантный штамм E. coli MWEC101-b (KR8903681); штаммы E. coli NRRL В-12141, NRRL В-12145, NRRL В-12146 и NRRL B-12147 (патент США 4407952) и подобные им. Также в качестве родительских штаммов могут быть использованы бактерии, принадлежащие к роду Escherichia, - продуценты L-фенилаланина, такие как штамм E. coli K-12 [W3110(tyrA)/pPHAB] (FERM ВР-3566), штамм E. coli K-12 [W3110(tyrA)/pPHAD] (FERM BP-12659), штамм E. coli K-12 [W3110(tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662) и штамм E. coli K-12 [W3110(tyrA)/pBR-aroG4, рАСМАВ], названный как AJ12604 (FERM ВР-3579) (Европейский патент ЕР 488424 В1). Кроме того, также могут быть использованы бактерии-продуценты L-фенилаланина, принадлежащие к роду Escherichia с повышенной активностью белков, кодируемых геном yedA или геном yddG (патентные заявки США 2003/0148473 А1 и 2003/0157667 A1).
Бактерия-продуцент L-триптофана
Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-триптофана согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются бактериями-продуцентами L-триптофана, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штаммы Е. coli JP4735/pMU3028 (DSM10122) и JP6015/pMU91 (DSM10123), лишенные активности триптофанил-тРНК синтетазы, кодируемой мутантным геном trpS (патент США 5756345); штамм Е. coli SV164 (pGH5), содержащий аллель serA, кодирующий фосфоглицератдегидрогеназу, не ингибируемую серином по типу обратной связи, и аллель trpE, кодирующий антранилатсинтазу, не ингибируемую триптофаном по типу обратной связи (патент США 6180373); штаммы Е. coli AGX17 (pGX44) (NRRL В-12263) и AGX6(pGX50)aroP (NRRL В-12264), в которых отсутствует активность триптофаназы (патент США 4371614); штамм Е. coli AGX17/pGX50, pACKG4-pps, в котором усилена способность к синтезу фосфоенолпирувата (заявка РСТ WO 9708333, патент США 6319696), и подобные им. Также могут быть использованы бактерии-продуценты L-триптофана, принадлежащие к роду Escherichia, в которых увеличена активность белка, кодируемого геном yedA или геном yddG (заявки на патент США 2003/0148473 A1 и 2003/0157667 A1).
Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-триптофана согласно настоящему изобретению, также включают в себя штаммы, в которых увеличена активность одного или нескольких ферментов, выбранных из группы, состоящей из антранилатсинтазы, фосфоглицератдегидрогеназы и триптофансинтазы. И антранилатсинтаза, и фосфоглицератдегидрогеназа подвержены ингибированию L-триптофаном и L-серином по типу обратной связи, так что в эти ферменты могут быть введены мутации, снижающие чувствительность к ингибированию по типу обратной связи. Специфические примеры штаммов с такой мутацией включают Е. coli SV164, антранилатсинтаза которой не чувствительна к ингибированию по типу обратной связи, и штамм-трансформант, полученный введением в Е. coli SV164 плазмиды pGH5 (заявка РСТ WO 94/08031), которая содержит мутантный ген serA, кодирующий фосфоглицератдегидрогеназу, которая не чувствительна к ингибированию по типу обратной связи.
Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-триптофана согласно настоящему изобретению, также включают в себя штаммы, в которые введен триптофановый оперон, содержащий ген, кодирующий антранилатсинтазу, которая не чувствительна к ингибированию по типу обратной связи (заявка Японии 57-71397 А, заявка Японии 62-244382 А, патент США 4371614). Кроме того, способность к продукции L-триптофана может быть придана путем усиления экспрессии гена (из триптофанового оперона), кодирующего триптофансинтазу. Триптофансинтаза состоит из двух субъединиц α и β, которые кодируются trpA и trpB соответственно. Кроме того, способность к продукции L-триптофана может быть увеличена усилением экспрессии оперона изоцитратлиазы-малатсинтазы (заявка РСТ WO 2005/103275).
Бактерия-продуцент L-пролина
Примеры бактерий-продуцентов L-пролина, используемых в качестве родительского штамма согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е. coli 702ilvA (ВКПМ В-8012), дефицитного по гену ilvA и способного к продукции L-пролина (Европейский патент ЕР 1172433). Бактерия согласно настоящему изобретению может быть улучшена путем усиления экспрессии одного или нескольких генов, вовлеченных в биосинтез L-пролина. Предпочтительно примеры таких генов для бактерий-продуцентов L-пролина включают ген proB, кодирующий глутаматкиназу с десенсибилизированной регуляцией L-пролином по типу обратной связи (патент Германии 3127361). Кроме того, бактерия согласно настоящему изобретению может быть улучшена путем усиления экспрессии одного или нескольких генов, кодирующих белки, экскретирующие L-аминокислоту из бактериальной клетки. Примерами таких генов являются гены b2682 и b2683 (ygaZH гены) (Европейская патентная заявка ЕР 1239041 А2).
th
Примеры бактерий, принадлежащих к роду Escherichia и обладающих способностью к продукции L-пролина, включают следующие штаммы Е. coli: NRRL В-12403 и NRRL В-12404 (патент Великобритании GB 2075056), ВКПМ В-8012 (патентная заявка РФ 2000124295), плазмидные мутанты, описанные в патенте Германии DE 3127361, плазмидные мутанты, описанные у Bloom F.R. et al. (The 15Miami winter symposium, 1983, p.34), и подобные им.
Бактерия-продуцент L-аргинина
Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-аргинина согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е. coli 237 (ВКПМ В-7925) и его производные, содержащие мутантную N-ацетилглутаматсинтазу (патентная заявка РФ 2001112869), штамм Е. coli 382 (ВКПМ В-7926) (Европейская патентная заявка ЕР 1170358 А1), штамм-продуцент аргинина, в который введен ген argA, кодирующий N-ацетилглутаматсинтетазу (Европейская патентная заявка ЕР 1170361 А1), и подобные им.
Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-аргинина согласно настоящему изобретению, также включают в себя штаммы, в которых усилена экспрессия одного или нескольких генов, кодирующих ферменты биосинтеза L-аргинина. Примеры ферментов биосинтеза L-аргинина включают N-ацетилглутамилфосфатредуктазу (argC), орнитинацетилтрансферазу (argJ), N-ацетилглутаматкиназу (argB), ацетилорнитинтрансаминазу (argD), орнитинкарбамоилтрансферазу (argF), синтетазу аргининсукциниловой кислоты (argG), лиазу аргининсукциниловой кислоты (argH) и карбамоилфосфатсинтетазу (carAB).
Бактерия-продуцент L-валина
Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-валина согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются ими, штаммы, модифицированные с целью сверхэкспрессии оперона ilvGMEDA (патент США 5998178). Желательно удалить область оперона ilvGMEDA, которая необходима для ослабления экспрессии, с тем чтобы экспрессия оперона не ослаблялась образующимся L-валином. Далее, желательно разрушить в опероне ген ilvA, с тем чтобы снизить активность треониндеаминазы.
Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-валина согласно настоящему изобретению, также включают в себя мутантные штаммы, имеющие мутацию аминоацил-тРНК-синтетазы (патент США 5658766). Например, может использоваться штамм E. coli VL1970, который имеет мутацию в гене ileS, кодирующем изолейцин-тРНК-синтетазу. Штамм E. coli VL1970 депонирован в Российской Национальной Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) (Россия, 113545 Москва, 1-й Дорожный проезд) 24 июня 1988 г. с инвентарным номером ВКПМ В-4411.
+
Далее, в качестве родительских штаммов также могут использоваться мутантные штаммы, для роста которых требуется липоевая кислота, и/или с недостаточным количеством Н-АТФазы (заявка РСТ WO 96/06926).
Бактерия-продуцент L-изолейцина
Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-изолейцина согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются ими, мутантные штаммы с устойчивостью к 6-диметиламинопурину (заявка Японии 5-304969 А), мутантные штаммы с устойчивость к аналогу изолейцина, такому как тиаизолейцин и гидроксамат изолейцина, и мутантные штаммы, дополнительно имеющие устойчивость к DL-этионину и/или гидроксамату аргинина (заявка Японии 5-130882 А). Кроме того, в качестве родительских штаммов также могут использоваться рекомбинантные штаммы, трансформированные генами, кодирующими белки, вовлеченные в биосинтез L-изолейцина, такие как треониндеаминаза и ацетогидроксатсинтаза (заявка Японии 2-458 А, патент Франции 0356739 и патент США 5998178).
2. Способ согласно настоящему изобретению.
Способом согласно настоящему изобретению является способ получения L-аминокислоты, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде с целью продукции и накопления L-аминокислоты в питательной среде, и выделения L-аминокислоты из культуральной жидкости.
Согласно настоящему изобретению выращивание, выделение и очистка L-аминокислоты из культуральной или подобной ей жидкости может быть осуществлена способом, подобным традиционным способам ферментации, в которых аминокислота продуцируется с использованием бактерии.
Питательная среда, используемая для выращивания, может быть как синтетической, так и натуральной, при условии, что указанная среда содержит источники углерода, азота, минеральные добавки и, если необходимо, соответствующее количество питательных добавок, необходимых для роста микроорганизмов. К источникам углерода относятся различные углеводы, такие как глюкоза и сахароза, а также различные органические кислоты. В зависимости от характера ассимиляции используемого микроорганизма могут использоваться спирты, такие как этанол и глицерин. В качестве источника азота могут использоваться различные неорганические соли аммония, такие как аммиак и сульфат аммония, другие соединения азота, такие как амины, природные источники азота, такие как пептон, гидролизат соевых бобов, ферментолизат микроорганизмов. В качестве минеральных добавок могут использоваться фосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат железа, сульфат марганца, хлорид кальция и подобные им соединения. В качестве витаминов могут использоваться тиамин и дрожжевой экстракт.
Выращивание осуществляется предпочтительно в аэробных условиях, таких как перемешивание культуральной жидкости на качалке, взбалтывание с аэрацией, при температуре в пределах от 20 до 40°С, предпочтительно в пределах от 30 до 38°С. рН среды поддерживают в пределах от 5 до 9, предпочтительно от 6.5 до 7.2. рН среды может регулироваться аммиаком, карбонатом кальция, различными кислотами, основаниями и буферными растворами. Обычно, выращивание в течение от 1 до 5 дней приводит к накоплению целевой L-аминокислоты в культуральной жидкости.
После выращивания твердые остатки, такие как клетки, могут быть удалены из культуральной жидкости методом центрифугирования или фильтрацией через мембрану, а затем L-аминокислота может быть выделена и очищена методами ионообменной хроматографии, концентрирования и/или кристаллизации.
Краткое описание чертежей
На фиг.1 изображены относительные положения праймеров Р1 и Р2 на плазмиде pACYC184, используемой для амплификации гена cat.
На фиг.2 изображено конструирование фрагмента хромосомной ДНК, содержащего инактивированный ген rcsA.
Примеры
Настоящее изобретение будет более подробно описано ниже со ссылкой на следующие не ограничивающие настоящее изобретение Примеры.
Пример 1. Конструирование штамма с инактивированным геном rcsA
1. Деления гена rcsA
Штамм, содержащий делецию гена rcsA, был сконструирован с использованием методики, разработанной Datsenko, K.A. и Wanner, B.L. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12), 6640-6645), известной как "Red-зависимая интеграция". В соответствии с этой методикой были синтезированы ПЦР-праймеры P1 (SEQ ID NO:3) и Р2 (SEQ ID NO:4), гомологичные участку, прилегающему к гену rcsA, и гену, сообщающему устойчивость к антибиотику, на плазмиде, используемой в качестве матрицы для ПЦР. В качестве матрицы для ПЦР была использована плазмида pACYC184 (NBL Gene Sciences Ltd., UK) (инвентарный номер Х06403 в базе данных GenBank/EMBL). Использовался следующий температурный профиль для ПЦР: денатурация при 95°С в течение 3 мин; два первых цикла: 1 мин при 95°С, 30 сек при 50°С, 40 сек при 72°С; и последующие 25 циклов: 30 сек при 95°С, 30 сек при 54°С, 40 сек при 72°С; и заключительная полимеризация: 5 мин при 72°С.
araB
Полученный продукт ПЦР длиной 1152 п.н. (фиг.1), очищенный в агарозном геле, может быть использован для электропорации в Е.coli MG1655 (АТСС 700926), содержащий плазмиду pKD46 с термочувствительным репликоном. Плазмида pKD46 (Datsenko, K.A. and Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12:6640-45) содержит фрагмент ДНК фага λ длиной 2154 нуклеотида (позиции с 31088 по 33241 нуклеотидной последовательности с инвентарным номером J02459 в базе данных GenBank), а также содержит гены λ Red-гомологичной системы рекомбинации (гены γ, β, ехо) под контролем промотора Р, индуцируемого арабинозой. Плазмида pKD46 необходима для интеграции продукта ПЦР в хромосому штамма MG1655.
600
2
R
Электрокомпетентные клетки были получены следующим образом: ночную культуру Е. coli MG1655 выращивали при 30°С в среде LB с добавкой ампициллина (100 мг/л), разводили в 100 раз, добавив 5 мл среды SOB (Sambrook et al., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)), содержащей ампициллин и L-арабинозу (1 мМ). Полученную культуру растили с перемешиванием при 30°С до достижения OD≈0.6, после чего делали клетки электрокомпетентными путем концентрирования в 100 раз и трехкратного отмывания ледяной деионизированной НO. Электропорацию проводили с использованием 70 мкл клеток и ≈100 нг продукта ПЦР. После электропорации клетки инкубировали в 1 мл среды SOC (Sambrook et al., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) при 37°С в течение 2.5 часов, после чего высевали на чашки с L-агаром, содержащим хлорамфеникол (30 мкг/мл) и выращивали при 37°С для отбора Cm-рекомбинантов. Затем для удаления плазмиды pKD46 проводили 2 пассажа на L-агаре с Cm при 42°С и полученные колонии проверяли на чувствительность к ампициллину.
2. Подтверждение делении гена rcsA с помощью ПЦР.
+
Мутанты с делегированным геном rcsA, содержащие ген устойчивости к Cm, были проверены с помощью ПЦР. Локус-специфичные праймеры Р3 (SEQ ID NO:5) и Р4 (SEQ ID NO:6) были использованы для проверки делеции с помощью ПЦР. Использовался следующий температурный профиль для ПЦР-проверки: денатурация при 94°С в течение 3 мин; профиль для 30 циклов: 30 сек при 94°С, 30 сек при 54°С, 1 мин при 72°С; заключительный шаг: 7 мин при 72°С. Длина продукта ПЦР, полученного в результате реакции с использованием в качестве матрицы клеток родительского штамма rcsA MG1655, составляет 722 п.н. Длина продукта ПЦР, полученного в результате реакции с использованием в качестве матрицы клеток мутантного штамма MG1655 ΔrcsA::cat, составляет 1214 п.н. (фиг.2). Мутантный штамм назвали MG1655 ΔrcsA::cat.
Пример 2. Продукция L-треонина штаммом Е.coli B-3996-ΔrcsA.
Для оценки влияния инактивации гена rcsA на продукцию треонина ДНК-фрагменты хромосомы описанного выше штамма Е. coli MG1655 ΔrcsA::cat перенесли в штамм-продуцент L-треонина Е. coli В-3996 (ВКПМ В-3996) с помощью Р1-трансдукции (Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY) для получения штамма В-3996-ΔrcsA. Штамм В-3996 был депонирован 19 ноября 1987 года во Всесоюзном научном центре антибиотиков (РФ, 117105 Москва, Нагатинская ул., 3-А) с инвентарным номером РИА 1867. Указанный штамм также был депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (РФ, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) 7 апреля 1987 г. с инвентарным номером В-3996.
Оба штамма Е. coli, B-3996 и B-3996-ΔrcsA, выращивали в течение 18-24 часов при температуре 37°С на чашках с L-агаром. Для получения посевной культуры указанные штаммы выращивали при 32°С в течение 18 часов на роторной качалке (250 об/мин) в пробирках размером 20×200 мм, содержащих 2 мл L-бульона с 4% глюкозой. Затем в ферментационную среду вносили по 0.21 мл (10%) посевной культуры. Ферментацию проводили в 2 мл минимальной ферментационной среды в пробирках размером 20×200 мм. Клетки выращивали в течение 72 часов при 32°C с перемешиванием (250 об/мин).
2
После выращивания количество накопленного в среде L-треонина определяли с помощью бумажной хроматографии, с использованием подвижной фазы следующего состава: бутанол: уксусная кислота: вода = 4:1:1 (v/v). Для визуализации использовали раствор (2%) нингидрина в ацетоне. Пятно, содержащее L-треонин, вырезали; L-треонин элюировали 0.5% водным раствором CdCl, после чего количество L-треонина оценивали спектрофотометрическим методом при длине волны 540 нм. Результаты восьми независимых пробирочных ферментаций приведены в табл. 1. Как видно из табл. 1, штамм B-3996-ΔrcsA накапливал большее количество L-треонина по сравнению со штаммом B-3996. Использовали ферментационную среду следующего состава (г/л):
Глюкоза
80.0
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
22.0
NaCl
0.8
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>
2.0
MgSO<sub>4</sub> 7H<sub>2</sub>O
0.8
FeSO<sub>4</sub> 7H<sub>2</sub>O
0.02
MnSO<sub>4</sub> 5H<sub>2</sub>O
0.02
Тиамин гидрохлорид
0.0002
Дрожжевой экстракт
1.0
СаСО<sub>3</sub>
30.0
3
Глюкозу и сульфат магния стерилизовали отдельно. СаСО стерилизовали сухим жаром при 180°С в течение 2 часов. рН доводили до 7.0. Антибиотик добавляли в среду после стерилизации.
Пример 3. Продукция L-лизина штаммом Е. coli WC196-ΔrcsA.
Для оценки влияния инактивации гена rscA на продукцию лизина ДНК-фрагменты хромосомы описанного выше штамма Е. coli MG1655 ΔrscA::cat могут быть перенесены в штамм-продуцент L-лизина Е. coli AJ11442) с помощью P1-трансдукции (Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY) с целью получения штамма AJ11442-ΔrscA. Плазмида pCABD2 содержит ген dapA, кодирующий дигидродипиколинатсинтазу с мутацией, вызывающей устойчивость к ингибированию по типу обратной связи L-лизином, ген lysC, кодирующий аспартокиназу III с мутацией, вызывающей устойчивость к ингибированию по типу обратной связи L-лизином, ген dapB, кодирующий дигидродипиколинатредуктазу, и ген ddh, кодирующий диаминопимелатдегидрогеназу (патент США 6040160).
Оба штамма Е. coli, AJ11442 и AJH442-ΔrscA, могут быть выращены в L-среде, содержащей 20 мг/л стрептомицина, при 37°С; и 0.3 мл полученных культур может быть внесено в 20 мл ферментационной среды, содержащей необходимые антибиотики, в колбы объемом 500 мл. Культивирование может проводиться при 37°С в течение 16 часов с использованием возвратно-поступательной качалки со скоростью перемешивания 115 об/мин. После выращивания количество L-лизина и остаточной глюкозы в среде может быть измерено известным способом (Biotech-analyzer AS210, производитель - Sakura Seiki Co.). Затем для каждого из штаммов может быть рассчитан выход L-лизина в пересчете на потребленную глюкозу. Может быть использована ферментационная среда следующего состава (г/л):
Глюкоза
40
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
24
К<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>
1.0
MgSO<sub>4</sub> 7H<sub>2</sub>O
1.0
FeSO<sub>4</sub> 7Н<sub>2</sub>О
0.01
MnSO<sub>4</sub> 5H<sub>2</sub>O
0.01
Дрожжевой экстракт
2.0
4
2
3
рН доводят до 7.0 с помощью КОН и среду автоклавируют при 115°С в течение 10 мин. Глюкозу и MgSO×7HO стерилизуют отдельно. Также добавляют СаСО до концентрации 30 г/л, предварительно простерилизованный сухим жаром при 180°С в течение 2 часов.
Пример 4. Продукция L-цистеина штаммом Е. coli JM15(vdeD)-ΔrcsA.
Для оценки влияния инактивации гена rcsA на продукцию L-цистеина ДНК-фрагменты хромосомы описанного выше штамма Е. coli MG1655 ΔrcsA::cat могут быть перенесены в штамм-продуцент L-цистеина Е.coli JM15(ydeD) с помощью Р1-трансдукции (Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY), в результате чего может быть получен штамм JM15(ydeD)-ΔrcsA.
Штамм Е. coli JM15(ydeD) является производным штамма Е. coli JM15 (патент США 6218168), который может быть трансформирован ДНК, содержащей ген ydeD, кодирующий мембранный белок, не вовлеченный в пути биосинтеза ни одной из L-аминокислот (патент США 5972663). Штамм JM15 (CGSC# 5042) может быть получен в Генетической коллекции Coli при E.coli Genetic Resource Center, MCD Biology Department, Yale University (http://cgsc.biology.yale.edu/).
Условия ферментации для оценки продукции L-цистеина детально описаны в Примере 6 патента США 6218168.
Пример 5. Продукция L-лейцина штаммом Е. coli 57-ΔrcsA.
Для оценки влияния инактивации гена rcsA на продукцию L-лейцина ДНК-фрагменты хромосомы описанного выше штамма Е. coli MG1655 ΔrcsA::cat могут быть перенесены в штамм-продуцент L-лейцина Е. coli 57 (ВКПМ В-7386, патент США 6124121) с помощью P1-трансдукции (Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY), в результате чего может быть получен штамм 57-pMW-ΔrcsA. Штамм 57 депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (Россия, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) 19 мая 1997 г. с инвентарным номером ВКПМ В-7386.
Оба штамма Е. coli, 57 и 57-ΔrcsA, могут быть выращены в течение 18-24 часов при температуре 37°С на чашках с L-агаром. Для получения посевной культуры указанные штаммы могут быть выращены на роторной качалке (250 об/мин) при 32°С в течение 18 часов в пробирках размером 20×200 мм, содержащих 2 мл L-бульона с 4% глюкозы. Затем в ферментационную среду может быть внесено по 0.21 мл (10%) посевной культуры. Ферментацию можно проводить в 2 мл минимальной ферментационной среды в пробирках размером 20×200 мм. Клетки могут быть выращены в течение 48-72 часов при 32°C с перемешиванием (250 об/мин). Количество L-лейцина может быть измерено с помощью бумажной хроматографии (состав подвижной фазы: бутанол - уксусная кислота - вода = 4:1:1).
Может быть использована ферментационная среда следующего состава (г/л) (рН 7.2):
Глюкоза
60.0
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
25.0
К<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>
2.0
MgSO<sub>4</sub> 7H<sub>2</sub>O
1.0
Тиамин
0.01
СаСО<sub>3</sub>
25.0
3
Глюкозу и СаСО следует стерилизовать отдельно.
Пример 6. Продукция L-гистидина штаммом Е. coli 80-ΔrcsA.
Для оценки влияния инактивации гена rcsA на продукцию L-гистидина ДНК-фрагменты хромосомы описанного выше штамма Е. coli MG1655 ΔrcsA::cat могут быть перенесены в штамм-продуцент L-гистидина Е. coli 80 с помощью P1-трансдукции (Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY) для получения штамма 80-ΔrcsA. Штамм 80 описан в патенте РФ 2119536 и депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (Россия, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) 15 октября 1999 г. с инвентарным номером ВКПМ В-7270, затем 12 июля 2004 г. было произведено международное депонирование этого штамма согласно условиям Будапештского Договора. Оба штамма Е. coli, 80 и 80-ΔrcsA, могут быть выращены в L-бульоне при 29°С в течение 6 часов. Затем 0.1 мл каждой из полученных культур может быть внесено в 2 мл ферментационной среды в пробирки размером 20×200 мм, и культуры могут быть выращены при 29°С в течение 65 часов на роторной качалке (350 об/мин). После выращивания количество накопленного в среде гистидина может быть определено с помощью бумажной хроматографии. Может быть использована подвижная фаза следующего состава: n-бутанол - уксусная кислота - вода = 4:1:1 (v/v). Раствор нингидрина (0.5%) в ацетоне может быть использован для визуализации.
Состав ферментационной среды (рН 6.0) (г/л):
Глюкоза
100.0
Мамено(гидролизат сои)
0.2 общего азота
L-пролин
1.0
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
25.0
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>
2.0
MgSO<sub>4</sub> 7H<sub>2</sub>O
1.0
FeSO<sub>4</sub> 7H<sub>2</sub>O
0.01
MnSO<sub>4</sub>
0.01
Тиамин
0.001
Бетаин
2.0
СаСО<sub>3</sub>
60.0
3
Глюкозу, пролин, бетаин и СаСО стерилизуют отдельно. рН доводят до 6.0 перед стерилизацией.
+
Пример 7. Продукция L-глутаминовой кислоты штаммом Е.coli VL334thrC-ΔrcsA.
+
+
+
Для оценки влияния инактивации гена rcsA на продукцию L-глутаминовой кислоты ДНК-фрагменты хромосомы описанного выше штамма Е. coli MG1655 ΔrcsA::cat могут быть перенесены в штамм-продуцент L-глутаминовой кислоты Е. VL334thrC(ЕР 1172433) с помощью P1-трансдукции (Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY), в результате чего может быть получен штамм VL334thrC-ΔrcsA. Штамм VL334thrCдепонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (Россия, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) 6 декабря 2004 г. с инвентарным номером В-8961, затем 8 декабря 2004 г. было произведено международное депонирование этого штамма согласно условиям Будапештского Договора.
+
+
2
4
4
3
3
2
Оба штамма, VL334thrCи VL334thrC-ΔrcsA, могут быть выращены на чашках с L-агаром при 37°С в течение 18-24 часов. Далее, одна петля клеток может быть перенесена в пробирки, содержащие 2 мл ферментационной среды. Ферментационная среда должна содержать глюкозу 60 г/л, сульфат аммония 25 г/л, КНPO 2 г/л, MgSO 1 г/л, тиамин 0.1 мг/мл, L-изолейцин 70 мкг/мл и СаСО 25 г/л (рН 7.2). Глюкозу и СаСО следует стерилизовать отдельно. Выращивание может производиться при 30°С в течение 3 дней с перемешиванием. После выращивания количество полученной L-глутаминовой кислоты может быть определено с помощью бумажной хроматографии (состав подвижной фазы: бутанол - уксусная кислота - вода = 4:1:1) с последующим окрашиванием нингидрином (1% раствор в ацетоне) и дальнейшим элюированием полученных соединений в 50% этаноле с 0.5% CdCl.
Пример 8. Продукция L-фенилаланина штаммом Е. coli AJ12739-ΔrcsA.
Для оценки влияния инактивации гена rcsA на продукцию L-фенилаланина ДНК-фрагменты хромосомы описанного выше штамма Е. coli MG1655 ΔrcsA::cat могут быть перенесены в штамм-продуцент L-фенилаланина Е. coli AJ12739 с помощью Р1-трансдукции (Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY) для получения штамма AJ12739-ΔrcsA. Штамм AJ12739 депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (Россия, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) 6 ноября 2001 года с инвентарным номером ВКПМ В-8197, затем 23 августа 2002 г. было произведено международное депонирование этого штамма согласно условиям Будапештского Договора.
Оба штамма, AJ12739-ΔrcsA и AJ12739, могут быть выращены при 37°С в течение 18 часов в питательном бульоне; 0.3 мл каждой из полученных культур может быть внесено в 3 мл ферментационной среды в пробирки размером 20×200 мм, и культуры могут быть выращены при 37°С в течение 48 часов на роторной качалке. По окончании ферментации количество накопленного в среде фенилаланина может быть определено с помощью тонкослойной хроматографии (TLC). Для этой цели могут быть использованы TLC-пластинки размером 10×15 см, покрытые 0.11 мм-слоем силикагеля Сорбфил без флуоресцентного индикатора (Акционерное Общество Сорбполимер, Краснодар, Россия). Пластинки Сорбфил могут быть экспонированы в подвижной фазе следующего состава: пропан-2-ол: этилацетат: 25% водного аммиака: вода = 40:40:7:16 (v/v). Раствор (2%) нингидрина в ацетоне может быть использован для визуализации.
Состав ферментационной среды (г/л):
Глюкоза
40.0
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
16.0
К<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>
0.1
MgSO<sub>4</sub> 7H<sub>2</sub>O
1.0
FeSO<sub>4</sub> 7H<sub>2</sub>O
0.01
MnSO<sub>4</sub> 5H<sub>2</sub>O
0.01
Тиамин HCl
0.0002
Дрожжевой экстракт
2.0
Тирозин
0.125
СаСО<sub>3</sub>
20.0
3
Глюкозу и сульфат магния стерилизуют отдельно. СаСО стерилизуют сухим жаром при 180°С в течение 2 часов. рН доводят до 7.0.
Пример 9. Продукция L-триптофана штаммом Е. coli SV164 (pGH5)-ΔrcsA.
Для оценки влияния инактивации гена rcsA на продукцию L-триптофана ДНК-фрагменты хромосомы описанного выше штамма Е. coli MG1655 ΔrcsA::cat могут быть перенесены в штамм-продуцент L-триптофана Е. coli SV164 (pGH5) с помощью Р1-трансдукции (Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY) для получения штамма SV164(pGH5)-ΔrcsA. Штамм SV164 содержит аллель trpE, кодирующий антранилатсинтазу, которая не подвержена ингибированию триптофаном по типу обратной связи. Плазмида pGH5 содержит мутантный ген serA, кодирующий фосфоглицератдегидрогеназу, которая не подвержена ингибированию серином по типу обратной связи. Штамм SV164 (pGH5) детально описан в патенте США 6180373 и в Европейском патенте 0662143.
Оба штамма, SV164(pGH5)-ΔrcsA4 и SV164(pGH5), могут быть выращены с перемешиванием при 37°С в течение 18 часов в 3 мл питательного бульона с добавлением тетрациклина (маркера плазмиды pGH5, 20 мг/мл). По 0.3 мл полученных культур может быть внесено в 3 мл ферментационной среды, содержащей тетрациклин (20 мг/мл), в пробирках размером 20×200 мм; и культуры могут быть выращены при 37°С в течение 48 часов на роторной качалке при 250 об/мин. После выращивания количество накопленного в среде триптофана может быть определено с помощью TLC, как описано в Примере 8. Компоненты ферментационной среды представлены в табл. 1, но группы компонентов А, В, С, D, Е, F и Н следует стерилизовать отдельно, как и показано в табл. 1, чтобы избежать нежелательных взаимодействий во время стерилизации.
Пример 10. Продукция L-пролина штаммом Е. coli 702ilvA-ΔrcsA.
Для оценки влияния инактивации гена rcsA на продукцию L-пролина ДНК-фрагменты из хромосомы описанного выше штамма Е. coli MG1655 ΔrcsA::cat могут быть перенесены в штамм-продуцент L-пролина Е. coli 702ilvA с помощью Р1-трансдукции (Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY) для получения штамма 702ilvA-ΔrcsA. Штамм 702ilvA депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (Россия, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) 18 июля 2000 г. с инвентарным номером ВКПМ В-8012, затем 18 мая 2001 г. было произведено международное депонирование этого штамма согласно условиям Будапештского Договора.
Оба штамма Е. Coli, 702ilvA и 702ilvA-ΔrcsA, могут быть выращены в течение 18-24 часов при температуре 37°С на чашках с L-агаром. Затем ферментация с использованием этих штаммов может производиться в тех же условиях, как описано в Примере 7.
Пример 11. Продукция L-аргинина штаммом Е. coli 382-ΔrcsA.
2
Для оценки влияния инактивации гена rcsA на продукцию L-аргинина ДНК-фрагменты хромосомы описанного выше штамма Е.coli MG1655 ΔrcsA::cat могут быть перенесены в штамм-продуцент L-аргинина Е. coli 382 с помощью Р1-трансдукции (Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY) для получения штамма 382-ΔrcsA. Штамм 382 депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (Россия, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) 10 апреля 2000 года с инвентарным номером ВКПМ В-7926, затем 18 мая 2001 г. было произведено международное депонирование этого штамма согласно условиям Будапештского Договора. Оба штамма, 382-ΔrcsA и 382, могут быть выращены с перемешиванием при 37°С в течение 18 часов в 3 мл питательного бульона; по 0.3 мл полученных культур может быть внесено в 3 мл ферментационной среды в пробирки размером 20×200 мм, и культуры могут быть выращены при 32°С в течение 48 часов на роторной качалке. После выращивания количество накопленного в среде L-аргинина может быть определено с помощью бумажной хроматографии, при этом может быть использован следующий состав подвижной фазы: бутанол: уксусная кислота: вода = 4:1:1 (v/v). Раствор нингидрина (2%) в ацетоне может быть использован для визуализации. Пятно, содержащее L-аргинин, может быть вырезано; L-аргинин может быть элюирован 0.5% водным раствором CdCl, после чего количество L-аргинина может быть определено спектрофотометрическим методом при длине волны 540 нм. Состав ферментационной среды (г/л):
Глюкоза
48.0
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
35.0
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>
2.0
MgSO<sub>4</sub> 7H<sub>2</sub>O
1.0
Тиамин HCl
0.0002
Дрожжевой экстракт
1.0
L-изолейцин
0.1
СаСО<sub>3</sub>
5.0
3
Глюкозу и сульфат магния стерилизуют отдельно. СаСО стерилизуют сухим жаром при 180°С в течение 2 часов. рН доводят до 7.0.
Хотя указанное изобретение описано в деталях со ссылкой на наилучший способ осуществления изобретения, для специалиста в указанной области техники очевидно, что могут быть совершены различные изменения и произведены эквивалентные замены, и такие изменения и замены не выходят за рамки настоящего изобретения. Каждому из упомянутых выше документов соответствует ссылка, и все цитируемые документы являются частью описания настоящего изобретения.
Таблица 1
Штамм
OD<sub>540</sub>
L-треонин, г/л
В-3996
29.4±0.7
25.9±0.7
B-3996-ΔrcsA
29.8±0.5
27.7±0.8
Таблица 2
Растворы
Компонент
Конечная концентрация, г/л
А
КН<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>
1.5
NaCl
0.5
(NN<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
1.5
L-метионин
0.05
L-фенилаланин
0.1
L-тирозин
0.1
Mameno (общий N)
0.07
В
Глюкоза
40.0
MgSO<sub>4</sub> 7H<sub>2</sub>O
0.3
С
CaCl<sub>2</sub>
0.011
D
FeSO<sub>4</sub> 7H<sub>2</sub>O
0.075
Цитрат натрия
1.0
Е
Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub> 2H<sub>2</sub>O
0.00015
Н<sub>3</sub>ВО<sub>3</sub>
0.0025
CoCl<sub>2</sub> 6Н<sub>2</sub>O
0.00007
CuSO<sub>4</sub> 5H<sub>2</sub>O
0.00025
MnCl<sub>2</sub> 4H<sub>2</sub>O
0.0016
ZnSO<sub>4</sub> 7Н<sub>2</sub>O
0.0003
F
Тиамин HCl
0.005
G
СаСО<sub>3</sub>
30.0
H
Пиридоксин
0.03
4
pH раствора А доводили до значения 7.1 при помощи NHOH. Каждый раствор стерилизовали отдельно, перемешивали и затем растворы смешивали.