Способ прогнозирования исходов экстракорпорального оплодотворения
METHOD FOR PREDICTING OUTCOMES OF IN VITRO FERTILIZATION

Изобретение относится к области медицины, в частности к урологии, репродуктологии, андрологии, а именно к лабораторной диагностике мужского фактора бесплодия, и может быть использовано для пронозирования исходов экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) в процессе диагностики и лечения мужского бесплодия с применением вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ).
В настоящее время широко проводится лечение бесплодных пар с применением вспомогательных репродуктивных технологий (Приказ Министерства здравоохранения РФ от 30 августа 2012 г. №107н "О порядке использования вспомогательных репродуктивных технологий, противопоказаниях и ограничениях к их применению"). Выбор метода репродуктивной технологии у конкретной пары, прогноз наступления беременности, наличие или отсутствие патологии при развитии плода напрямую зависит от показателей здоровья женщины и качества спермы партнера. Эякулят оценивают в соответствии с рекомендациями ВОЗ, исследуют концентрацию и количество сперматозоидов, их подвижность и особенности морфологии (Руководство ВОЗ по исследованию и обработке эякулята человека. Пер. с англ. Н.П. Макарова. Науч. ред. Л.Ф. Курило. 5-е изд. М.: Капитал Принт, 2012. [WHO Laboratory manual for the xamination and processing of human semen. Trans, from English by N.P. Makarov. Scientific ed. by L.F. Kurilo. 5th ed. Moscow: Kapital Print, 2012. (In Russ.)]. Объем эякулята (мл) определяют гравиметрически, рассчитывая разницу массы пустого контейнера и контейнера с материалом обследуемых. Вязкость образца оценивают по длине нити (мм), образующейся при извлечении стеклянной палочки из эякулята. Для подсчета концентрации и общего количества сперматозоидов, а также оценки их подвижности используют анализатор спермы (SQA-V, «MES», Израиль). При низкой концентрации сперматозоидов (менее 1 мл/мл) их подсчет проводят в камере Горяева.
Известен способ диагностики ранних репродуктивных нарушений у мужчин (Способ диагностики ранних репродуктивных нарушений у мужчин Тарасова М.Н., 2009 https://yandex.ru/patents/doc/RU2413949C1_20110310), основанный на определении в сыворотке крови концентрации цитокинов IL-8, IL-10 и IL-1RA, а затем вычисляют диагностический индекс DI по формуле DI=0,037⋅IL-8+(-0,033)IL-10+0,022⋅IL-1RA-3,99, и при DI более 0 диагностируют ранние нарушения репродуктивной функции у мужчин, а при DI менее 0 делают заключение об отсутствии лабораторных признаков нарушений мужской репродуктивной функции. Недостатками указанного способа является невозможность его проведения в большинстве клинико-диагностических лабораторий из-за отсутствия необходимого оборудования, дороговизна, так как необходимо проводить исследование сразу с тремя наборами, один из которых (IL-1RA) производится в РФ в малых количествах и имеются трудности с поставкой его клинико-диагностическим лабораториям.
Способов, позволяющих точно и объективно прогнозировать инфертильность эякулята, в изученных нами патентных источниках и научной медицинской литературе не обнаружено.
Задачей заявляемого решения является разработка критерия косвенной оценки качества сперматозоидов по уровню белка связывающего жирные кислоты (БСЖК) для прогнозирования исходов экстракорпорального оплодотворения.
Технический результат: повышение точности прогнозирования исходов ЭКО, который обеспечивается за счет количественного критерия, основанного на результатах лабораторного исследования спермы мужчины, определяющего наличие репродуктивных нарушений у мужчин (инфертильности эякулята), что позволяет повысить эффективность программы ВРТ за счет точного отбора мужчин на этапе планирования беременности в супружеской паре; экономическая эффективность метода за счет возможности применения до начала процедуры ЭКО.
Указанный результат достигается путем определения концентрации белка связывающего жирные кислоты в эякуляте мужчины.
Способ осуществляется следующим образом: у обследуемого мужчины производят сбор эякулята после 2-4 дней полового воздержания. Семенную плазму отделяют путем центрифугирования образцов эякулята при 3000 об/минуту в течение 10 минут. Концентрацию БСЖК определяют методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием тест-системы «Белок, связывающий жирные кислоты - ИФА - БЕСТ» («Вектор-Бест», Россия; артикул А-9104). Оптическую плотность проб регистрируют на вертикальном фотометре StatFax 3200 (Awareness, США).
Необходимые реактивы: Набор реагентов «Белок, связывающий жирные кислоты - ИФА - БЕСТ» предназначен для количественного определения концентрации белка, связывающего жирные кислоты, в сыворотке крови человека методом твердофазного иммуноферментного анализа, «Вектор-Бест», Россия.
Ход определения: процедура основана на принципах конкурентного твердофазного иммуноферментного анализа (конкурентной ELISA). Биотинилированный и небиотинилированный антиген конкурируют за ограниченное число связывающих мест специфических антител, иммобилизированных на твердой фазе. Количество биотинилированного антигена обратно пропорционально концентрации анализируемого вещества в образце. После установления равновесия и отмывания несвязанного антигена, оставшийся связанный антиген метят антителами к биотину, конъюгированными с белком, связывающим жирные кислоты. Затем его количество регистрируют фотометрически на длине волны 405 после проведения ферментативной реакции с Субстратом. Концентрацию антигена рассчитывают путем экстраполяции полученных данных на калибровочный график, построенный по результатам анализа с серией Стандартов, выражают в нг/мл (Инструкция к набору для ИФА «Белок, связывающий жирные кислоты - ИФА - БЕСТ» («Вектор-Бест», Россия, артикул А-9104), и при значении от 0 до 0,95 нг/мл прогнозируют инфертильность эякулята, то есть неблагоприятный исход экстракорпорального оплодотворения, при значении более 0,95 нг/мл эякулят рассматривают как фертильный, прогнозируя благоприятный исход ЭКО.
Таким образом, способ обеспечивает точность прогнозирования исходов ЭКО за счет оценки фертильности эякулята, а также повышает достоверность выявления мужского фактора бесплодия на доклинических стадиях, что позволяет как можно раньше ставить на учет пациента, проводить ему своевременную адекватную терапию, прогнозировать исход применения вспомогательных репродуктивных технологий, в частности экстракорпорального оплодотворения.
Примеры конкретного выполнения
Пример 1. Пациент Д., 31 год. Жалоб не предъявляет. Брак 1-й, в браке 6 лет. Частота половых сношений в паре два раза в неделю, половая жизнь регулярная, без применения контрацептивных средств. Случаев беременности в паре не зарегистрировано. Копулятивной дисфункции не выявлено. В течение всей жизни к урологу не обращался, соматическими заболеваниями не болел. Жена обследована гинекологом - диагностирован эндометриоз, нарушена проходимость маточных труб. Из анамнеза жизни пациента: родился вторым ребенком в семье, рос и развивался нормально. Перенесенные заболевания - эпидемический паротит, болезнь Боткина, туберкулез, заболевания, передающиеся половым путем, отрицает. Травм, операций не было. Профессиональных вредностей нет. Проведено 2 анализа эякулята с интервалом 6 месяцев. Результат спермограммы перед назначением семейной паре лечения: объем 3,4 мл; вязкость 2 мм; цвет серо-белый; количество сперматозоидов в 1 мл 62 млн; общее количество сперматозоидов в эякуляте - 210,8 млн. Живых - 67%. Подвижность: быстро прогрессивное движение - 33%, 24% - непрогрессивное движение, 5% - малоподвижные, 38% - неподвижные. Морфология: 82% - нормальные формы, 8% - патология головки, 5% - патология шейки, 5% - патология хвоста. Лейкоциты - нет, рН 7,7. Заключение по анализу спермы: астенозооспермия.
Проведены дополнительные обследования: общие анализы крови и мочи, ультразвуковое исследование почек, мочевого пузыря, предстательной железы, органов мошонки - патологии не выявлено. Концентрация БСЖК в эякуляте 1,8 нг/мл.
Диагноз: Бесплодие в браке.
По рекомендации гинеколога семейной паре было назначено лечение с применением вспомогательных репродуктивных технологий -экстракорпоральное оплодотворение спермой мужа. Через 2 месяца у партнерши наступила беременность.
Данный пример иллюстрирует связь достаточной концентрации БСЖК в сперме с благоприятным исходом экстракорпорального оплодотворения.
Пример 2. Пациент С., 29 лет. Жалоб не предъявляет. Брак 1-й, в браке четыре года. Частота половых сношений в паре три раза в неделю. Половая жизнь регулярная, частота половых сношений в паре три раза в неделю, контрацептивные средства не использовались. Случаев беременности в паре не зарегистрировано. Копулятивной дисфункции не выявлено. Жена обследована гинекологом - патологии нет. Из анамнеза жизни пациента: родился первым ребенком в семье, рос и развивался нормально. Из перенесенных заболеваний - в детстве часто ОРВИ, в течение последних 5 лет проходит лечение по поводу герпетической инфекции; эпидемический паротит, другие заболевания, передающиеся половым путем, болезнь Боткина, туберкулез отрицает. Травм, операций не было. Профессиональных вредностей нет. В анализах эякулята (всего сделано четыре в разное время) определялось снижение концентрации, количества и подвижности сперматозоидов. Анализ спермы перед лечением пары: объем 3,0 мл, цвет серо-белый, консистенция - вязкая. Количество сперматозоидов в 1 мл 8 млн; общее количество сперматозоидов в эякуляте - 24 млн. Живых - 57%. Подвижность: быстро прогрессивное движение - не выявлено, 5% -непрогрессивное движение, 15% - малоподвижные, 80% - неподвижные. Морфология: 26% - нормальные формы, 40% - патология головки, 25% - патология шейки, 5% - патология хвоста, 4% - юные формы. Лейкоциты - единичные, рН 7,8. Заключение по анализу спермы: олигозооспермия, тератоспермия.
Проведены дополнительные обследования: общие анализы крови и мочи, ультразвуковое исследование почек, мочевого пузыря, предстательной железы, органов мошонки. Определена концентрация фолликулостимулирующего гормона лютеинизирующего гормона, пролактина, тестостерона, эстрадиола в сыворотке крови. Результаты в норме. Консультация уролога - патологии не выявлено. Консультация эндокринолога - эндокринологических заболеваний не выявлено. Концентрация БСЖК в эякуляте 0,7 нг/мл.
Диагноз: Бесплодие в браке.
Больной проходил терапию в течение 1 года, у партнерши беременность не наступила. После проведения экстракорпорального оплодотворения через год от начала обследования пары беременность у партнерши также не наступила. При применении метода экстракорпорального оплодотворения спермой донора 2 раза в течение 2-х лет у партнерши наступила беременность, закончившаяся рождением здорового ребенка.
Вышеописанный случай демонстрирует связь низкой концентрации БСЖК в сперме с неблагоприятным исходом экстракорпорального оплодотворения.
Пример 3. Пациент Л., 34 года обратился к андрологу с жалобой на отсутствие детей в браке. Других жалоб не предъявлял. Брак 2-й, в браке три года. Половая жизнь в паре два раза в неделю, регулярная, без применения контрацептивов. Копулятивной дисфункции не выявлено. При обследовании супруги гинекологом патологии не выявлено. Из анамнеза жизни пациента: родился вторым ребенком в семье, рос и развивался нормально. Перенесенные заболевания - в детстве ветряная оспа в 8 лет; эпидемический паротит, болезнь Боткина, туберкулез, заболевания, передающиеся половым путем, отрицает. Травм, операций не было. Профессиональных вредностей нет. В анализах эякулята (три исследования с интервалом в 5 месяцев) определялось снижение концентрации, количества и подвижности сперматозоидов. Анализ спермы перед назначением лечения: объем 2,6 мл, цвет серо-белый, вязкость по тесту отрыва нити 10 мм. Количество сперматозоидов в 1 мл 18 млн; общее количество сперматозоидов в эякуляте - 46,8 млн. Живых - 76%. Подвижность: 5% - быстро прогрессивное движение, 5% - непрогрессивное движение, 20% - малоподвижные, 70% - неподвижные. Морфология: 20% - нормальные формы, 40% - патология головки, 35% - патология шейки, 5% - патология хвоста. Лейкоциты - единичные, рН 7,6. Заключение по анализу спермы: олигоастенозооспермия. Проведены дополнительные обследования: общие анализы крови и мочи, ультразвуковое исследование почек, мочевого пузыря, предстательной железы, органов мошонки - патологии не выявлено. В сыворотке крови определяли содержание фолликулостимулирующего гормона лютеинизирующего гормона, пролактина, тестостерона, эстрадиола. Показатели в пределах нормы. Консультация уролога - патологии не выявлено. Консультация эндокринолога - эндокринная система без патологии. Концентрация БСЖК в эякуляте 0,9 нг/мл.
Диагноз: Бесплодие в браке.
Больной проходил терапию в течение 1 года, у партнерши беременность не наступила. После проведения экстракорпорального оплодотворения через год от начала обследования пары беременность у партнерши также не наступила.
Данный случай подтверждает неблагоприятный исход экстракорпорального оплодотворения при использовании эякулята с уровнем БСЖК ниже 0,95 нг/мл.
Пример 4. Пациент О., 35 лет. Жалоб не предъявляет. Брак 1-й, в браке 5 лет. Частота половых сношений в паре более чем три раза в неделю, половая жизнь регулярная, контрацептивны не применялись. Беременность у партнерши не наступала. Копулятивной дисфункции нет. Жена обследована гинекологом - патологии не выявлено. Из анамнеза жизни пациента: родился первым ребенком в семье, рос и развивался нормально. Из перенесенных заболеваний - в детстве часто ОРВИ; эпидемический паротит, туберкулез, заболевания, передающиеся половым путем, болезнь Боткина отрицает. Травм, операций не было. Профессиональных вредностей нет. В анализах эякулята (всего сделано четыре в разное время) определялось снижение концентрации, количества и подвижности сперматозоидов. Анализ спермы перед лечением пары: объем 4,0 мл, цвет серо-белый, консистенция - вязкая. Количество сперматозоидов в 1 мл 32 млн; общее количество сперматозоидов в эякуляте - 128 млн. Живых - 46%. Подвижность: 28% - быстро прогрессивное движение, 5% - непрогрессивное движение, 65% - малоподвижные, 2% - неподвижные. Морфология: 85% - нормальные формы, 7% - патология головки, 5% - патология шейки, 3% - патология хвоста. Лейкоциты - нет, рН 7,4. Заключение по анализу спермы: Астенозооспермия. Концентрация БСЖК в эякуляте 0,6 нг/мл.
Диагноз: Бесплодие в браке.
По поводу лечения бесплодия семейной паре было рекомендовано применение вспомогательной репродуктивной технологии - экстракорпорального оплодотворения. Беременность у партнерши не наступила. Больной проходил терапию в течение более 1 года. Концентрация БСЖК в эякуляте после лечения 1,1 нг/мл. Через 15 месяцев от начала обследования пары у партнерши наступила беременность на фоне увеличения концентрации БСЖК в сперме.
Таким образом, использование предложенного способа позволяет обеспечить косвенную оценку качества сперматозоидов, улучшить результат лечения бесплодия в супружеской паре с применением вспомогательных репродуктивных технологий, прогнозировать мужское бесплодие на доклинических стадиях, что позволяет выделять таких пациентов (со сниженной концентрацией в эякуляте белка, связывающего жирные кислоты) в отдельную группу, проводить им адекватный диагностический поиск и своевременную терапию.