СИНТЕЗ ДНК С ПОВЫШЕННЫМ ВЫХОДОМ

1. Бесклеточный способ ферментного синтеза ДНК, включающий применение солей нуклеотидов в концентрации более 10 мМ, в соответствии с которым указанные соли содержат одновалентный катион с ионным радиусом, превышающим таковой иона натрия.
2. Бесклеточный способ ферментного синтеза ДНК, включающий применение солей нуклеотидов, в соответствии с которым указанные соли присутствуют в концентрации по меньшей мере 10 мМ и находятся:
(a) в форме соли нуклеотида, содержащей одновалентный катион, ионный радиус которого превышает таковой иона натрия, или
(b) в форме двух или более солей нуклеотидов, содержащих различные одновалентные катионы, причем по меньшей мере один из этих катионов имеет ионный радиус, превышающий таковой иона натрия.
3. Бесклеточный способ по любому из предшествующих пунктов, в соответствии с которым указанные соли нуклеотидов присутствуют в концентрации по меньшей мере 15 мМ, по меньшей мере 20 мМ, по меньшей мере 25 мМ, по меньшей мере 30 мМ, по меньшей мере 35 мМ или по меньшей мере 40 мМ.
4. Бесклеточный способ по любому из предшествующих пунктов, в соответствии с которым указанный одновалентный катион или катионы независимо выбраны из щелочноземельного металла, переходного металла или многоатомного иона.
5. Бесклеточный способ по п. 4, в соответствии с которым указанный одновалентный катион или катионы независимо выбраны из перечня, включающего калий, аммоний, производные аммония, рубидий, цезий, или франций.
6. Бесклеточный способ по любому из предшествующих пунктов, в соответствии с которым указанный бесклеточный способ дополнительно включает применение одного или более праймеров или праймазы.
7. Бесклеточный способ по любому из предшествующих пунктов, в соответствии с которым указанный бесклеточный способ дополнительно включает применение матрицы.
8. Бесклеточный способ для синтезирования ДНК по любому из предшествующих пунктов, в соответствии с которым бесклеточный способ дополнительно включает применение одного или более двухвалентных катионов металлов, предпочтительно выбранных из перечня, включающего магний, марганец, кальций, бериллий, цинк и стронций.
9. Бесклеточный способ по п. 8, в соответствии с которым соотношение между указанными двухвалентными катионами металлов и нуклеотидами в реакционной смеси равно или менее 1:1, предпочтительно менее 1:1.
10. Бесклеточный способ по любому из предшествующих пунктов, в соответствии с которым в способе применена максимальная концентрация 10 mM натриевых и/или литиевых солей нуклеотидов.
11. Бесклеточный способ по любому из предшествующих пунктов, в соответствии с которым способ дополнительно включает применение химического денатурирующего средства, предпочтительно гидроокиси натрия, гидроокиси калия или гидроокиси аммония и пирофосфатазы.
12. Бесклеточный способ по п. 11, в соответствии с которым в способе не добавляют буферных средств, поддерживающих pH, и предпочтительно не добавляют дополнительных солей или детергентов.
13. Бесклеточный способ по п. 12, в соответствии с которым соли нуклеотидов содержат ионы цезия.
14. Бесклеточный способ по п. 11, в соответствии с которым добавляют буферные средства, поддерживающие pH, но не добавляют дополнительные соли или детергенты.
15. Бесклеточный способ по п. 14, в соответствии с которым соли нуклеотидов содержат ионы аммония.
16. Бесклеточный способ по любому из предшествующих пунктов, в соответствии с которым способ предназначен для синтеза ДНК в большом масштабе, предпочтительно по меньшей мере 3 г/л.
17. Применение солей нуклеотидов, содержащих катионы цезия, в ферментном бесклеточном синтезе ДНК.
18. Применение по п. 17, в соответствии с которым ферментный бесклеточный синтез ДНК происходит в присутствии низких уровней двухвалентных катионов, при необходимости в соотношении двухвалентного катиона к нуклеотиду от 0,2:1 до 0,8:1, предпочтительно от 0,2:1 до 0,5:1.
19. Применение по п. 17, в соответствии с которым ферментный бесклеточный синтез ДНК происходит в минимальном буфере, при необходимости включающем только буфер, поддерживающий pH, без детергента или дополнительных солей.
20. Метод амплификации ДНК-матрицы с применением ДНК полимеразы, в соответствии с которым требуется поддержание соотношения двухвалентных катионов к нуклеотидам в реакционной смеси на уровне 0,5:1 или ниже, включающий применение солей нуклеотидов, содержащих ионы цезия.
21. Применение солей нуклеотидов, содержащих катионы рубидия, в ферментном бесклеточном синтезе ДНК.
22. Бесклеточный метод амплификации ДНК матрицы, отличающийся тем, что указанный метод включает контактирование указанной матрицы и ДНК полимеразы с нуклеотидами в форме соли в количестве равном или более 40 мМ, предпочтительно более 60 мМ или при необходимости более 80 мМ, в соответствии с которым указанная соль содержит ионы аммония.
23. Ферментный синтез ДНК, который проводят в условиях уменьшенной концентрации двухвалентных катионов, предпочтительно магния, включающий применение нуклеотидов в форме солей, содержащих одновалентный катион с ионным радиусом, превышающим таковой иона натрия.
24. Бесклеточный способ, применение, метод, бесклеточный метод или ферментный синтез по любому из предшествующих пунктов, в соответствии с которым ферментом является ДНК полимераза, при необходимости полимераза с активностью замещения цепи.