СПОСОБЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ TGF-β В КОМПОЗИЦИИ

1. Способ определения биологической активности фактора TGF-β в образце порошкообразной пищевой композиции или порошкообразного источника необработанного белка, включающий:
a. Восстановление образца до концентрации от приблизительно 140 мг/мл до приблизительно 150 мг/мл;
b. Центрифугирование восстановленного образца при приблизительно 10000 об/мин в течение приблизительно 10 мин и сохранение супернатантного слоя;
c. Подкисление супернатантного слоя до pH от приблизительно 2 до приблизительно 3;
d. Инкубирование супернатантного слоя в течение приблизительно 15 мин при комнатной температуре;
e. Центрифугирование супернатантного слоя при приблизительно 10000 об/мин в течение приблизительно 10 мин и сохранения супернатантного слоя;
f. Нейтрализация супернатантного слоя со стадии (e) до pH от приблизительно 7 до приблизительно 7,5;
g. Центрифугирование супернатантного слоя со стадии (f) при приблизительно 10000 об/мин в течение приблизительно 10 мин и сохранение супернатантного слоя;
h. Контактирование супернатантного слоя с клетками HT-2 и
i. Определение концентрации, при которой ингибирование биологической активности в клетках HT-2 составляет 50%.
2. Способ по п.1, где пищевая композиция выбрана из группы, состоящей из пищевой добавки, детского пищевого продукта, смеси для питания младенцев и обогатителя женского молока.
3. Способ по п.1, где стадия подкисления включает добавление концентрированной HCl.
4. Способ по п.1, где стадия нейтрализации включает добавление 50%-го NaOH.
5. Способ определения биологической активности фактора TGF-β в образце жидкого молока, включающий:
a. Центрифугирование образца при приблизительно 13000 об/мин в течение приблизительно 15 мин;
b. Отбор супернатантного слоя образца и повторение стадии (a) с использованием супернатанта;
c. Отбор супернатантного слоя образца со стадии (b) и повторение стадии (a) с использованием супернатанта со стадии (b);
d. Подкисление супернатантного слоя до pH приблизительно от 2 до приблизительно 3;
e. Инкубирование супернатантного слоя в течение приблизительно 3 ч при комнатной температуре;
f. Нейтрализация супернатантного слоя до pH от приблизительно 7 до приблизительно 7,5;
g. Центрифугирование супернатантного слоя со стадии (f) при приблизительно 10000 об/мин в течение приблизительно 10 мин и сохранение супернатантного слоя;
h. Контактирование супернатантного слоя с клетками HT-2 и
i. Определение концентрации, при которой ингибирование биологической активности в клетках HT-2 составляет 50%.
6. Способ по п.5, где стадия подкисления включает добавление приблизительно 25 мкл 1 N HCl к приблизительно 125 мкл образца.
7. Способ по п.5, где стадия нейтрализации включает добавление приблизительно 25 мкл 1 N NaOH к приблизительно 125 мкл образца.
8. Способ определения биологической активности фактора TGF-β в образце жидкого молока, включающий:
a. Подкисление образца до pH от приблизительно 2 до приблизительно 3;
b. Инкубирование образца в течение приблизительно 3 ч при комнатной температуре;
c. Нейтрализация образца до pH от приблизительно 7 до приблизительно 7,5;
d. Центрифугирование образца при приблизительно 10000 об/мин в течение приблизительно 5 мин и сохранение супернатантного слоя;
e. Центрифугирование супернатантного слоя приблизительно при 10000 об/мин в течение приблизительно 5 мин и сохранение супернатантного слоя;
f. Контактирование супернатантного слоя со стадии (e) с клетками HT-2 и
g. Определение концентрации, при которой ингибирование биологической активности в клетках HT-2 составляет 50%.
9. Способ определения биологической активности фактора TGF-β в образце порошкообразной пищевой композиции или порошкообразного источника необработанного белка, включающий:
a. Восстановление образца до концентрации от приблизительно 140 мг/мл до приблизительно 150 мг/мл;
b. Подкисление восстановленного образца до pH от приблизительно 2 до приблизительно 3;
c. Инкубирование супернатантного слоя в течение приблизительно 15 мин при комнатной температуре;
d. Центрифугирование супернатантного слоя при приблизительно 10000 об/мин в течение приблизительно 10 мин и сохранение супернатантного слоя;
e. Нейтрализация супернатантного слоя со стадии (d) до pH от приблизительно 7 до приблизительно 7,5;
f. Выдерживание образца с клетками MDA-M-B-468 в присутствии 1%-й сыворотки и
g. Анализирование ответа фактора TGF-β на основе перемещения Smad2 с GFP-тагом от цитоплазмы до ядра.
10. Способ по п.9, где стадия подкисления включает добавление приблизительно от 13 мкл до приблизительно 16 мкл HCl к приблизительно 1 мл образца.
11. Способ по п.9, где стадия нейтрализации включает добавление от приблизительно 4 мкл до приблизительно 8 мкл NaOH к приблизительно 1 мл образца.
12. Способ определения биологической активности фактора TGF-β в образце жидкого молока, включающий:
a. Подкисление образца до pH приблизительно от 2 до приблизительно 3;
b. Инкубирование образца в течение приблизительно 15 мин при комнатной температуре;
c. Центрифугирование образца приблизительно при 10000 об/мин в течение приблизительно 10 мин и сохранение супернатантного слоя;
d. Нейтрализация супернатантного слоя со стадии (c) до pH от приблизительно 7 до приблизительно 7,5;
e. Выдерживание образца с клетками MDA-M-B-468 в присутствии 1%-й сыворотки и
f. Анализирование ответа фактора TGF-β на основе перемещения Smad2 с GFP-тагом от цитоплазмы до ядра.
13. Способ по п.12, где стадия подкисления включает добавление приблизительно от 4 мкл до приблизительно 5 мкл HCl к приблизительно 1 мл образца.
14. Способ по п.12, где стадия нейтрализации включает добавление приблизительно от 1 мкл до приблизительно 2 мкл NaOH к приблизительно 1 мл образца.