НОВОЕ АНТИТЕЛО ПРОТИВ CCR8
NEW ANTIBODY AGAINST CCR8

[ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ]
[0001]
Настоящее изобретение относится к новому антителу против CCR8 и фармацевтической композиции, содержащей антитело.
[ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ]
[0002]
reg
Мощные механизмы отрицательной регуляции, включая иммуносупрессию, опосредованную регуляторными T-клетками (T-клетками) в микроокружении опухоли, представляют собой значительное препятствие для лечения опухолей (непатентный документ 1).
reg
Например, CD4-положительные T-клетки, инфильтрирующие опухоль, могут сильно ингибировать противоопухолевый иммунный ответ и становиться значительным препятствием для эффективного лечения злокачественных опухолей.
reg
reg
reg
Иммуносупрессия опухоли, опосредованная CD4-положительными FoxP3-положительными T-клетками в достаточной степени показана на моделях опухолей на животных. Показано, что системное (включая внутриопухолевое) удаление T-клеток приводит к противоопухолевому эффекту, где удаление приблизительно 50% инфильтрирующих опухоль T-клеток не является эффективным (непатентный документ 2).
[0003]
reg
reg
Показано, что повышенное соотношение CD4-положительных CD25-положительных T-клеток (популяции клеток, включающей T-клетки) и всей популяции CD4-положительных T-клеток у людей определяют в опухолях у пациентов с различными злокачественными новообразованиями, включая опухоли легких, молочной железы и яичника, и избыточное соотношение отрицательно коррелирует с вероятностью выживания пациентов (непатентные документы 3-8).
[0004]
reg
reg
reg
Подтверждено, что удаление CD4-положительных CD25-положительных T-клеток из опухолей с использованием антитела против CD25 приводит к противоопухолевому эффекту. Однако это удаление не является специфическим в отношении T-клеток, т.к. CD25 экспрессируется на поверхности CD4-положительных CD25-положительных T-клеток, а также недавно активированных эффекторных T-клеток. Кроме того, введение антитела против CD25 мышам приводит к ограниченному противоопухолевому эффекту. На различных моделях опухолей показано, что только введение антител перед инокуляцией опухолевого материала приводит к терапевтическому эффекту, в то время как введение антитела после приживления опухоли у мышей редко приводит к терапевтическому эффекту. Противоопухолевый эффект снижался в случае начала введения антитела против CD25 через 1 день после инокуляции опухолевого материала, и его редко наблюдали в случае начала введения антитела против CD25 через 2 дня после инокуляции опухолевого материала или позднее (непатентный документ 9).
[0005]
reg
reg
Анализы эффективности лекарственных средств осуществляли посредством введения антител мышам для удаления T-клеток. Несмотря на это, есть несколько статей, в которых показан противоопухолевый эффект. Таким образом, очень трудно подтвердить противоопухолевый терапевтический эффект, вызываемый удалением T-клеток посредством введения антител перед инокуляцией (непатентный документ 10).
[0006]
CCR8, также ранее обозначаемый как CY6, CKR-L1 или TER1, является сопряженным с G-белком 7-трансмембранным белком-рецептором CC-хемокинов, экспрессирующимся в тимусе, селезенке и т.д. Ген, кодирующий этот белок, находится на хромосоме 3p21 человека. CCR8 человека состоит из 355 аминокислот (непатентный документ 11). CCL1 известен как эндогенный лиганд CCR8 (непатентный документ 12). кДНК CCR8 человека состоит из нуклеотидной последовательности, представленной в GenBank ACC № NM_005201.3, и кДНК CCR8 мыши состоит из нуклеотидной последовательности, представленной в GenBank ACC № NM_007720.2.
[0007]
reg
CCR8 также специфически экспрессируется в инфильтрирующих опухоль T-клетках, и показано, что, когда клетки рака молочной железы инокулировали мышам с дефицитом CCR8 и мышам дикого типа, пролиферация и метастазирование рака молочной железы в большей степени подвергались супрессии у мыши с дефицитом CCR8 по сравнению с мышами дикого типа (патентный документ 1 и непатентный документ 13). Кроме того, описано, что введение антител против CCR8 животному в модели злокачественного новообразования вызывало противоопухолевый эффект (патентные документы 2 и 3).
[0008]
В патентном документе 4 описаны антитела против CCR8, которые можно использовать для лечения аллергических заболеваний и ВИЧ-инфекции. В этом документе описаны антитела против CCR8, представленные 414B, 414C, 414E, 433H, 459M, 464A, 464B, 433B и 455AL. Из них антитело против CCR8 433H доступно в BD Biosciences. Однако последовательность CDR антитела не описана. Кроме того, также показано, что антитела против CCR8 имеют противоопухолевую активность, и их можно использовать для лечения злокачественных новообразований.
В непатентном документе 14 описаны антитела против CCR8, представленные 3B10, 2D10 и 5B11. Антитело против CCR8 в виде продукта № L263G8 доступно в BioLegend. Антитело против CCR8 в виде продукта №191704 доступно в R&D Systems, Inc. Однако последовательности CDR этих антител не описаны. Также показано, что антитела против CCR8 имеют противоопухолевую активность, и их можно использовать для лечения злокачественных новообразований.
В патентном документе 5 и непатентных документах 15-19 описано, что CCR8 участвует в патогенезе злокачественного новообразования.
[ССЫЛКИ]
[Патентные документы]
[0009]
[Патентный документ 1] Патент США №10087259
[Патентный документ 2] WO 2018/181425
[Патентный документ 3] WO 2018/112032
[Патентный документ 4] WO 2007/044756
[Патентный документ 5] WO 2017/198631
[Непатентные документы]
[0010]
[Непатентный документ 1] Nat. Rev. Immunol., 2006, Vol. 6, No. 4, p. 295-307
[Непатентный документ 2] Eur. J. Immunol., 2010, Vol. 40, p. 3325-3335
[Непатентный документ 3] J. Clin. Oncol., 2006, Vol. 24, p. 5373-5380
[Непатентный документ 4] Nat. Med., 2004, Vol. 10, p. 942-949
[Непатентный документ 5] J. Clin. Oncol., 2007, Vol. 25, p. 2586-2593
[Непатентный документ 6] Cancer, 2006, Vol. 107, p. 2866-2872
[Непатентный документ 7] Eur. J. Cancer, 2008, Vol. 44, p. 1875-1882
[Непатентный документ 8] Cell. Mol. Immunol. 2011, Vol. 8, p. 59-66
[Непатентный документ 9] Cancer Res., 1999, Vol. 59, No. 13, p. 3128-33
[Непатентный документ 10] Cancer Res., 2010, Vol. 70, No. 7, p. 2665-74
[Непатентный документ 11] J. Immunol., 1996, Vol. 157, No. 7, p. 2759-63
[Непатентный документ 12] J. Biol. Chem., 1997, Vol. 272, No. 28, p. 17251-4
[Непатентный документ 13] Cancer Res., 2016, Vol. 76, No. 4, Supp.1, P4-04-11
[Непатентный документ 14] J. Exp. Med., 2004, Vol. 200, No. 10, p1231-1241
[Непатентный документ 15] Immunity, 2016, Vol. 45, p1122-1134
[Непатентный документ 16] Immunity, 2016, Vol. 45, p1135-1147
[Непатентный документ 17] Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2018, Vol. 115, No. 45, p10672-10681
[Непатентный документ 18] Targeting of CCR8 induces antitumor activity as a monotherapy that is further enhanced in combination with a Listeria-based immunotherapy, ASCO 2018, Daniel O Villarreal, et al. https://www.advaxis.com/wp-content/uploads/2018/04/KeystonePosterCCR8-combo-posterFINAL.pdf
[Непатентный документ 19] Cancer Res., 2018, Vol. 78, No. 18, p 5340-5348
[СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ]
[ЗАДАЧИ, ПОДЛЕЖАЩИЕ РЕШЕНИЮ ПОСРЕДСТВОМ ИЗОБРЕТЕНИЯ]
[0011]
Целью настоящего изобретения является предоставление нового антитела против CCR8 или его фрагмента. Дополнительной целью настоящего изобретения является предоставление нового антитела против CCR8 или его фрагмента, которое можно использовать в качестве терапевтического средства против злокачественного новообразования.
[СРЕДСТВА РЕШЕНИЯ ЗАДАЧ]
[0012]
В результате интенсивных исследований авторы настоящего изобретения обнаружили моноклональное антитело, специфически связывающееся с CCR8 человека, для ингибирования связывания CCR8 с лигандом CCR8. Авторы настоящего изобретения также обнаружили, что моноклональное антитело или его фрагмент, распознающее тирозин в положении 17 аминокислотной последовательности CCR8 человека, можно использовать для ингибирования связывания CCR8 с лигандом CCR8. Авторы настоящего изобретения также обнаружили, что моноклональное антитело по настоящему изобретению имеет противоопухолевую активность, и его можно использовать для лечения злокачественного новообразования. Авторы настоящего изобретения также обнаружили, что моноклональное антитело или его фрагмент, распознающее тирозин в положении 17 аминокислотной последовательности CCR8 человека, имеет противоопухолевую активность, и его можно использовать для лечения злокачественного новообразования. Другими словами, моноклональное антитело или его фрагмент по настоящему изобретению можно использовать для ингибирования связывания CCR8 с лигандом CCR8. Кроме того, моноклональное антитело или его фрагмент по настоящему изобретению можно использовать в качестве нейтрализующего антитела.
[0013]
В частности, настоящее изобретение относится к следующему.
(1) Моноклональное антитело или его фрагмент, связывающееся с CCR8, распознающее тирозин в положении 17 аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1.
(2) Антитело или его фрагмент по п. (1), являющееся нейтрализующим антителом.
(3) Антитело или его фрагмент по п. (1) или (2), дополнительно распознающее одну или более аминокислот в положениях 94-107 аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1.
(4) Антитело или его фрагмент по любому из пп. (1)-(3), дополнительно распознающее одну или более аминокислот в положениях 172-202 аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1.
(5) Антитело или его фрагмент по любому из пп. (1)-(4), распознающее одну или более аминокислот из изолейцина в положении 20, серина в положении 22, лизина в положении 35, лейцина в положении 181, цистеина в положении 183 и аспарагина в положении 188 в аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1.
(6) Антитело или его фрагмент по любому из пп. (1)-(5), являющееся гуманизированным моноклональным антителом или его фрагментом.
(7) Моноклональное антитело или его фрагмент, связывающееся с CCR8, содержащее:
1) вариабельную область легкой цепи, включающую
CDR1 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2, необязательно, имеющую делецию, замену, инсерцию и/или добавление одной или двух аминокислот,
CDR2 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3, необязательно, имеющую делецию, замену, инсерцию и/или добавление одной или двух аминокислот, и
CDR3 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 4, необязательно, имеющую делецию, замену, инсерцию и/или добавление одной или двух аминокислот, и
вариабельную область тяжелой цепи, включающую
CDR1 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 5, необязательно, имеющую делецию, замену, инсерцию и/или добавление одной или двух аминокислот,
CDR2 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 6, необязательно, имеющую делецию, замену, инсерцию и/или добавление одной или двух аминокислот, и
CDR3 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 7, необязательно, имеющую делецию, замену, инсерцию и/или добавление одной или двух аминокислот;
2) вариабельную область легкой цепи, включающую
CDR1 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2, необязательно, имеющую делецию, замену, инсерцию и/или добавление одной или двух аминокислот,
CDR2 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3, необязательно, имеющую делецию, замену, инсерцию и/или добавление одной или двух аминокислот, и
CDR3 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 4, необязательно, имеющую делецию, замену, инсерцию и/или добавление одной или двух аминокислот, и
вариабельную область тяжелой цепи, включающую
CDR1 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 8, необязательно, имеющую делецию, замену, инсерцию и/или добавление одной или двух аминокислот,
CDR2 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 6, необязательно, имеющую делецию, замену, инсерцию и/или добавление одной или двух аминокислот, и
CDR3 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 7, необязательно, имеющую делецию, замену, инсерцию и/или добавление одной или двух аминокислот;
3) вариабельную область легкой цепи, включающую
CDR1 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2, необязательно, имеющую делецию, замену, инсерцию и/или добавление одной или двух аминокислот,
CDR2 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 9, необязательно, имеющую делецию, замену, инсерцию и/или добавление одной или двух аминокислот, и
CDR3 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 10, необязательно, имеющую делецию, замену, инсерцию и/или добавление одной или двух аминокислот, и
вариабельную область тяжелой цепи, включающую
CDR1 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 8, необязательно, имеющую делецию, замену, инсерцию и/или добавление одной или двух аминокислот,
CDR2 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 6, необязательно, имеющую делецию, замену, инсерцию и/или добавление одной или двух аминокислот, и
CDR3 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 11, необязательно, имеющую делецию, замену, инсерцию и/или добавление одной или двух аминокислот;
где, необязательно, присутствует одна или более из следующих замен:
A) замена серина треонином в положении 2 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2,
B) замена серина треонином в положении 3 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2,
C) замена серина треонином в положении 5 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2,
D) замена глутамина аспарагином в положении 2 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10,
E) замена треонина серином в положении 1 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8,
F) замена аланина валином в положении 14 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6,
G) замена лизина аргинином в положении 18 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6,
H) замена аспарагиновой кислоты глутаминовой кислотой в положении 19 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6,
I) замена аспарагина глутамином в положении 5 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11, и
J) замена тирозина фенилаланином в положении 12 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11;
4) вариабельную область легкой цепи, включающую
CDR1 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2, необязательно, имеющую делецию, замену, инсерцию и/или добавление одной или двух аминокислот,
CDR2 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3, необязательно, имеющую делецию, замену, инсерцию и/или добавление одной или двух аминокислот, и
CDR3 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 10, необязательно, имеющую делецию, замену, инсерцию и/или добавление одной или двух аминокислот, и
вариабельную область тяжелой цепи, включающую
CDR1 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 12, необязательно, имеющую делецию, замену, инсерцию и/или добавление одной или двух аминокислот,
CDR2 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 6, необязательно, имеющую делецию, замену, инсерцию и/или добавление одной или двух аминокислот, и
CDR3 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 13, необязательно, имеющую делецию, замену, инсерцию и/или добавление одной или двух аминокислот;
5) вариабельную область легкой цепи, включающую
CDR1 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 14, необязательно, имеющую делецию, замену, инсерцию и/или добавление одной или двух аминокислот,
CDR2 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 15, необязательно, имеющую делецию, замену, инсерцию и/или добавление одной или двух аминокислот, и
CDR3 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 16, необязательно, имеющую делецию, замену, инсерцию и/или добавление одной или двух аминокислот, и
вариабельную область тяжелой цепи, включающую
CDR1 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 17, необязательно, имеющую делецию, замену, инсерцию и/или добавление одной или двух аминокислот,
CDR2 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 18, необязательно, имеющую делецию, замену, инсерцию и/или добавление одной или двух аминокислот, и
CDR3 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 19, необязательно, имеющую делецию, замену, инсерцию и/или добавление одной или двух аминокислот; или
6) вариабельную область легкой цепи, включающую
CDR1 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 20, необязательно, имеющую делецию, замену, инсерцию и/или добавление одной или двух аминокислот,
CDR2 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 21, необязательно, имеющую делецию, замену, инсерцию и/или добавление одной или двух аминокислот, и
CDR3 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 22, необязательно, имеющую делецию, замену, инсерцию и/или добавление одной или двух аминокислот, и
вариабельную область тяжелой цепи, включающую
CDR1 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 23, необязательно, имеющую делецию, замену, инсерцию и/или добавление одной или двух аминокислот,
CDR2 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 24, необязательно, имеющую делецию, замену, инсерцию и/или добавление одной или двух аминокислот, и
CDR3 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 25, необязательно, имеющую делецию, замену, инсерцию и/или добавление одной или двух аминокислот.
(8) Антитело или его фрагмент по п. (7), содержащее:
1) вариабельную область легкой цепи, включающую
CDR1 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2,
CDR2 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3, и
CDR3 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 4, и
вариабельную область тяжелой цепи, включающую
CDR1 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 5,
CDR2 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 6, и
CDR3 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 7,
где, необязательно, присутствует одна или более из следующих замен:
A) замена аспарагина лизином в положении 10 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2,
B) замена глицина глутамином, треонином, аланином, лизином, лейцином или аргинином в положении 11 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2,
C) замена аспарагина глутамином в положении 4 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3,
D) замена лейцина изолейцином в положении 5 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3,
E) замена лейцина изолейцином в положении 4 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4,
F) замена тирозина фенилаланином в положении 6 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4,
G) замена серина треонином в положении 16 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6, и
H) замена аспарагиновой кислоты глутаминовой кислотой в положении 19 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6;
2) вариабельную область легкой цепи, включающую
CDR1 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2,
CDR2 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3, и
CDR3 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 4, и
вариабельную область тяжелой цепи, включающую
CDR1 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 8,
CDR2 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 6, и
CDR3 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 7;
3) вариабельную область легкой цепи, включающую
CDR1 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2,
CDR2 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 9, и
CDR3 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 10, и
вариабельную область тяжелой цепи, включающую
CDR1 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 8,
CDR2 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 6, и
CDR3 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 11;
4) вариабельную область легкой цепи, включающую
CDR1 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2,
CDR2 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3, и
CDR3 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 10, и
вариабельную область тяжелой цепи, включающую
CDR1 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 12,
CDR2 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 6, и
CDR3 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 13;
5) вариабельную область легкой цепи, включающую
CDR1 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 14,
CDR2 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 15, и
CDR3 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 16, и
вариабельную область тяжелой цепи, включающую
CDR1 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 17,
CDR2 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 18, и
CDR3 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 19; или
6) вариабельную область легкой цепи, включающую
CDR1 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 20,
CDR2 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 21, и
CDR3 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 22, и
вариабельную область тяжелой цепи, включающую
CDR1 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 23,
CDR2 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 24, и
CDR3 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 25.
(9) Антитело или его фрагмент по п. (8), содержащее:
вариабельную область легкой цепи, включающую
CDR1 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2,
CDR2 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3, и
CDR3 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 4, и
вариабельную область тяжелой цепи, включающую
CDR1 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 5,
CDR2 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 6, и
CDR3 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 7,
где присутствует одна или более из следующих замен:
A) замена аспарагина лизином в положении 10 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2;
B) замена глицина глутамином, треонином, аланином, лизином, лейцином или аргинином в положении 11 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2;
C) замена аспарагина глутамином в положении 4 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3;
D) замена лейцина изолейцином в положении 5 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3;
E) замена лейцина изолейцином в положении 4 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4;
F) замена тирозина фенилаланином в положении 6 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4;
G) замена серина треонином в положении 16 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6; и
H) замена аспарагиновой кислоты глутаминовой кислотой в положении 19 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6.
(10) Антитело или его фрагмент по п. (9), где присутствует одна или более из следующих замен:
A) замена аспарагина лизином в положении 10 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2;
B) замена глицина аргинином в положении 11 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2; и
C) замена аспарагина глутамином в положении 4 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3.
(11) Антитело или его фрагмент по п. (9) или (10), где
аспарагин в положении 4 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3 заменяют глутамином; и
кроме того, необязательно, присутствует любая из следующих замен:
A) замена аспарагина лизином в положении 10 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2; и
B) замена глицина аргинином в положении 11 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2.
(12) Антитело или его фрагмент по п. (11), где аспарагин в положении 4 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3 заменяют глутамином; и глицин в положении 11 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 заменяют аргинином.
(13) Антитело или его фрагмент по п. (8), содержащее
вариабельную область легкой цепи, включающую
CDR1 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2,
CDR2 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 9, и
CDR3 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 10, и
вариабельную область тяжелой цепи, включающую
CDR1 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 8,
CDR2 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 6, и
CDR3 c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 11,
где присутствует одна или более из следующих замен:
A) замена серина треонином в положении 2 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2;
B) замена серина треонином в положении 3 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2;
C) замена серина треонином в положении 5 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2;
D) замена глутамина аспарагином в положении 2 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10;
E) замена треонина серином в положении 1 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8;
F) замена аланина валином в положении 14 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6;
G) замена лизина аргинином в положении 18 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6;
H) замена аспарагиновой кислоты глутаминовой кислотой в положении 19 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6;
I) замена аспарагина глутамином в положении 5 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11; и
J) замена тирозина фенилаланином в положении 12 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11.
(14) Антитело или его фрагмент по любому из пп. (7)-(13), являющееся гуманизированным моноклональным антителом или его фрагментом.
(15) Гуманизированное моноклональное антитело или его фрагмент по п. (14), содержащее
вариабельную область легкой цепи, имеющую
аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40, 42, 43, 44, 45 или 47, или
аминокислотную последовательность, имеющую 95% или более идентичности в отношении аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 40, 42, 43, 44, 45 или 47, и
вариабельную область тяжелой цепи, имеющую
аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 41 или 46, или
аминокислотную последовательность, имеющую 95% или более идентичности в отношении аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 41 или 46.
(16) Гуманизированное моноклональное антитело или его фрагмент по п. (14) или (15), содержащее:
1) вариабельную область легкой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 40, и
вариабельную область тяжелой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 41;
2) вариабельную область легкой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 42, и
вариабельную область тяжелой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 41;
3) вариабельную область легкой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 43, и
вариабельную область тяжелой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 41;
4) вариабельную область легкой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 44, и
вариабельную область тяжелой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 41;
5) вариабельную область легкой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 45, и
вариабельную область тяжелой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 41;
6) вариабельную область легкой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 47, и
вариабельную область тяжелой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 41;
7) вариабельную область легкой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 40, и
вариабельную область тяжелой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 46;
8) вариабельную область легкой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 42, и
вариабельную область тяжелой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 46;
9) вариабельную область легкой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 43, и
вариабельную область тяжелой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 46;
10) вариабельную область легкой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 44, и
вариабельную область тяжелой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 46;
11) вариабельную область легкой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 45, и
вариабельную область тяжелой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 46; или
12) вариабельную область легкой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 47, и
вариабельную область тяжелой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 46,
где, необязательно, присутствует одна или более из следующих замен:
A) замена аспарагина лизином в положении 33 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 40, 42, 43, 44, 45 или 47;
B) замена глицина глутамином, треонином, аланином, лизином, лейцином или аргинином в положении 34 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 40, 42, 43, 44, 45 или 47;
C) замена аспарагина глутамином в положении 58 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 40, 42, 43, 44, 45 или 47;
D) замена лейцина изолейцином в положении 59 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 40, 42, 43, 44, 45 или 47;
E) замена лейцина изолейцином в положении 97 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 40, 42, 43, 44, 45 или 47;
F) замена тирозина фенилаланином в положении 99 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 40, 42, 43, 44, 45 или 47;
G) замена серина треонином в положении 65 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 41 или 46; и
H) замена аспарагиновой кислоты глутаминовой кислотой в положении 68 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 41 или 46.
(17) Гуманизированное моноклональное антитело или его фрагмент по п. (16), где присутствует одна или более из следующих замен:
A) замена аспарагина лизином в положении 33 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 40, 42, 43, 44, 45 или 47;
B) замена глицина глутамином, треонином, аланином, лизином, лейцином или аргинином в положении 34 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 40, 42, 43, 44, 45 или 47;
C) замена аспарагина глутамином в положении 58 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 40, 42, 43, 44, 45 или 47;
D) замена лейцина изолейцином в положении 59 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 40, 42, 43, 44, 45 или 47;
E) замена лейцина изолейцином в положении 97 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 40, 42, 43, 44, 45 или 47;
F) замена тирозина фенилаланином в положении 99 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 40, 42, 43, 44, 45 или 47;
G) замена серина треонином в положении 65 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 41 или 46; и
H) замена аспарагиновой кислоты глутаминовой кислотой в положении 68 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 41 или 46.
(18) Гуманизированное моноклональное антитело или его фрагмент по п. (17), содержащее
вариабельную область легкой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 40 или 42, и
вариабельную область тяжелой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 41,
где присутствует одна или более из следующих замен:
A) замена аспарагина лизином в положении 33 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 40 или 42;
B) замена глицина глутамином, треонином, аланином, лизином, лейцином или аргинином в положении 34 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 40 или 42;
C) замена аспарагина глутамином в положении 58 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 40 или 42;
D) замена лейцина изолейцином в положении 59 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 40 или 42;
E) замена лейцина изолейцином в положении 97 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 40 или 42;
F) замена тирозина фенилаланином в положении 99 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 40 или 42;
G) замена серина треонином в положении 65 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 41; и
H) замена аспарагиновой кислоты глутаминовой кислотой в положении 68 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 41.
(19) Гуманизированное моноклональное антитело или его фрагмент по п. (17) или (18), содержащее:
вариабельную область легкой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 40 или 42, и
вариабельную область тяжелой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 41,
где присутствует одна или более из следующих замен:
A) замена аспарагина лизином в положении 33 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 40 или 42;
B) замена глицина аргинином в положении 34 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 40 или 42; и
C) замена аспарагина глутамином в положении 58 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 40 или 42.
(20) Гуманизированное моноклональное антитело или его фрагмент по любому из пп. (17)-(19), содержащее
вариабельную область легкой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 40 или 42, и
вариабельную область тяжелой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 41,
где
аспарагин в положении 58 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 40 или 42 заменяют глутамином, и
кроме того, необязательно, присутствует любая из следующих замен:
A) замена аспарагина лизином в положении 33 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 40 или 42; и
B) замена глицина аргинином в положении 34 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 40 или 42.
(21) Гуманизированное моноклональное антитело или его фрагмент по п. (20), содержащее
вариабельную область легкой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 42, и
вариабельную область тяжелой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 41,
где аспарагин в положении 58 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 42 заменяют глутамином, и глицин в положении 34 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 42 заменяют аргинином.
(22) Гуманизированное моноклональное антитело или его фрагмент по п. (20), содержащее
вариабельную область легкой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 59, и вариабельную область тяжелой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 41.
(23) Гуманизированное моноклональное антитело или его фрагмент по п. (14), содержащее:
вариабельную область легкой цепи, имеющую
аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 54, 55 или 56, или
аминокислотную последовательность, имеющую 95% или более идентичности в отношении аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 54, 55 или 56; и
вариабельную область тяжелой цепи, имеющую
аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57 или 58, или
аминокислотную последовательность, имеющую 95% или более идентичности в отношении аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 57 или 58.
(24) Гуманизированное моноклональное антитело или его фрагмент по п. (14) или (23), содержащее:
1) вариабельную область легкой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 54, и
вариабельную область тяжелой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 57;
2) вариабельную область легкой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 55, и
вариабельную область тяжелой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 57;
3) вариабельную область легкой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 56, и
вариабельную область тяжелой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 57;
4) вариабельную область легкой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 54, и
вариабельную область тяжелой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 58;
5) вариабельную область легкой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 55, и
вариабельную область тяжелой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 58;
6) вариабельную область легкой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 56, и
вариабельную область тяжелой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 58,
где, необязательно, присутствует одна или более из следующих замен:
A) замена серина треонином в положении 25 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 54, 55 или 56;
B) замена серина треонином в положении 26 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 54, 55 или 56;
C) замена серина треонином в положении 28 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 54, 55 или 56;
D) замена глутамина аспарагином в положении 95 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 54, 55 или 56;
E) замена треонина серином в положении 31 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 57 или 58;
F) замена аланина валином в положении 63 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 57 или 58;
G) замена лизина аргинином в положении 67 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 57 или 58;
H) замена аспарагиновой кислоты глутаминовой кислотой в положении 68 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 57 или 58;
I) замена аспарагина глутамином в положении 99 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 57 или 58; и
J) замена тирозина фенилаланином в положении 105 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 57 или 58.
(25) Гуманизированное моноклональное антитело или его фрагмент по п. (24), имеющее вариабельную область легкой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 56, и вариабельную область тяжелой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 57, где, необязательно, присутствует одна или более из следующих замен:
A) замена серина треонином в положении 25 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 56;
B) замена серина треонином в положении 26 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 56;
C) замена серина треонином в положении 28 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 56;
D) замена глутамина аспарагином в положении 95 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 56;
E) замена треонина серином в положении 31 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 57;
F) замена аланина валином в положении 63 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 57;
G) замена лизина аргинином в положении 67 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 57;
H) замена аспарагиновой кислоты глутаминовой кислотой в положении 68 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 57;
I) замена аспарагина глутамином в положении 99 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 57; и
J) замена тирозина фенилаланином в положении 105 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 57.
(26) Гуманизированное моноклональное антитело или его фрагмент по любому из пп. (14)-(25), дополнительно содержащее:
константную область легкой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 52, и
константную область тяжелой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 53,
где лизин, необязательно, добавлен на C-конец SEQ ID NO: 53.
(27) Фармацевтическая композиция, содержащая антитело или его фрагмент по любому из пп. (1)-(26).
(28) Фармацевтическая композиция, содержащая антитело или его фрагмент по любому из пп. (1)-(26), для применения в ингибировании связывания CCR8 с лигандом CCR8.
(29) Фармацевтическая композиция, содержащая антитело или его фрагмент по любому из пп. (1)-(26), для применения в качестве нейтрализующего антитела.
(30) Фармацевтическая композиция, содержащая моноклональное антитело или его фрагмент по любому из пп. (1)-(26) связывающееся с CCR8, для применения в распознавании тирозина в положении 17 аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1.
(31) Фармацевтическая композиция по п. (30) для применения в ингибировании связывания CCR8 с лигандом CCR8.
(32) Фармацевтическая композиция по любому из пп. (27)-(31), где антитело имеет активность ADCC.
(33) Фармацевтическая композиция по любому из пп. (27)-(31), где антитело является антителом IgG.
(34) Фармацевтическая композиция по любому из пп. (27)-(33) для применения в лечении злокачественного новообразования.
(35) Полинуклеотид, кодирующий вариабельную область легкой цепи или вариабельную область тяжелой цепи антитела по любому из пп. (7)-(18).
(36) Экспрессирующий вектор, содержащий полинуклеотид по п. (35).
[0014]
(51) Моноклональное антитело или его фрагмент, связывающееся с CCR8, распознающее участок на антигене, распознаваемым антителом по любому из пп. (7)-(19).
(52) Антитело или его фрагмент по п. (51), являющееся нейтрализующим антителом.
(53) Антитело или фрагмент антитела по п. (51) или (52), являющееся гуманизированным моноклональным антителом или его фрагментом.
[0015] (54) Моноклональное антитело или его фрагмент, имеющее нейтрализующую активность против CCR8 человека и конкурирующее с антителом по любому из пп. (7)-(26) за связывание с CCR8 человека.
(55) Моноклональное антитело или его фрагмент, имеющее нейтрализующую активность против CCR8 человека и конкурирующее за связывание с CCR8 человека с антителом, имеющим вариабельную область легкой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 42, и вариабельную область тяжелой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 41.
(56) Моноклональное антитело или его фрагмент, распознающее эпитоп, полностью или частично идентичный эпитопу антитела, имеющего вариабельную область легкой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 42, и вариабельную область тяжелой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 41.
(57) Моноклональное антитело или его фрагмент, имеющее нейтрализующую активность против CCR8 человека и конкурирующее за связывание с CCR8 человека с антителом, имеющим вариабельную область легкой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 42, и вариабельную область тяжелой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 41, где аспарагин в положении 58 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 42 заменяют глутамином и глицин в положении 34 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 42 заменяют аргинином.
(58) Моноклональное антитело или его фрагмент, распознающее эпитоп, полностью или частично идентичный эпитопу антитела, имеющего вариабельную область легкой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 42, и вариабельную область тяжелой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 41, где аспарагин в положении 58 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 42 заменяют глутамином и глицин в положении 34 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 42 заменяют аргинином.
(59) Моноклональное антитело или его фрагмент по любому из пп. (54)-(58), являющееся антителом или его фрагментом, распознающим тирозин в положении 17 аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1.
(60) Антитело или его фрагмент по п. (59), дополнительно распознающее одну или более аминокислот в положениях 94-107 аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1.
(61) Антитело или его фрагмент по п. (59) или (60), дополнительно распознающее одну или более аминокислот в положениях 172-202 аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1.
(62) Антитело или его фрагмент по любому из пп. (59)-(61), где антитело или его фрагмент распознает одну или более аминокислоты из изолейцина в положении 20, серина в положении 22, лизина в положении 35, лейцина в положении 181, цистеина в положении 183 и аспарагина в положении 188 в аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1.
(63) Моноклональное антитело или его фрагмент по любому из пп. (54)-(62), являющееся гуманизированным моноклональным антителом или его фрагментом.
(64) Фармацевтическая композиция, содержащая моноклональное антитело или его фрагмент по любому из пп. (54)-(63).
[0016]
(71) Антитело или его фрагмент по любому из пп. (1)-(5) или (7)-(13), получаемое с помощью антитело-продуцирующей гибридомы, получаемой с использованием гена CCR8 человека в качестве антигена.
[0017]
(81) Моноклональное антитело или его фрагмент, связывающееся с CCR8 человека, распознающее тирозин в положении 17 аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1, где моноклональное антитело или его фрагмент исключает следующие антитела:
a) антитело против CCR8, представленное 414B, 414C, 414E, 433H, 459M, 464A, 464B, 433B и 455AL, как описано в WO 2007/044756;
b) антитело против CCR8, представленное 3B10, 2D10 и 5B11, как описано в статье Qu et al. (J. Exp. Med., (2004), 200(10), 1231-1241);
c) антитело против CCR8 в виде продукта № L263G8 BioLegend;
d) антитело против CCR8 в виде продукта №191704 R&D Systems, Inc.
[0018]
(91) Способ ингибирования связывания CCR8 с лигандом CCR8, включающий использование антитела или его фрагмента по любому из пп. (1)-(26).
(92) Способ лечения злокачественного новообразования, включающий введение антитела или его фрагмента по любому из пп. (1)-(26).
(93) Способ распознавания тирозина в положении 17 аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1, с использованием моноклонального антитела или его фрагмента, связывающегося с CCR8, по любому из пп. (7)-(26).
(94) Применение моноклонального антитела или его фрагмента по любому из пп. (1)-(26) для получения лекарственного средства, ингибирующего связывание CCR8 с лигандом CCR8.
(95) Применение антитела или его фрагмента по любому из пп. (1)-(26) для получения терапевтического средства против злокачественного новообразования.
(96) Применение моноклонального антитела или его фрагмента по любому из пп. (1)-(26), связывающегося с CCR8, для получения средства, распознающего тирозин в положении 17 аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1.
(97) Антитело или его фрагмент по любому из пп. (1)-(26) для применения в ингибировании связывания CCR8 с лигандом CCR8.
(98) Антитело или его фрагмент по любому из пп. (1)-(26) для применения в лечении злокачественного новообразования.
(99) Моноклональное антитело или его фрагмент по любому из пп. (1)-(26), связывающееся с CCR8, для применения в распознавании тирозина в положении 17 аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1.
[ЭФФЕКТЫ ИЗОБРЕТЕНИЯ]
[0019]
Моноклональное антитело или его фрагмент по настоящему изобретению специфически связывается с CCR8 человека, и, таким образом, его можно использовать для детекции CCR8 человека в биологическом образце. Кроме того, моноклональное антитело или его фрагмент по настоящему изобретению имеет активность, селективно ингибирующую CCR8 человека. Таким образом, фармацевтическую композицию, содержащую моноклональное антитело или его фрагмент по настоящему изобретению, можно использовать в качестве лекарственного средства, в частности, лекарственного средства для лечения или профилактики заболеваний, связанных с CCR8 человека.
[КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ]
[0020]
На фигуре 1 показано сравнение аминокислотных последовательностей CCR8 человека, CCR4 человека и каждой химеры, в которой N-концевую область, область петли 1, область петли 2 или область петли 3, являющиеся внеклеточными доменами CCR8 человека, заменяют соответствующей N-концевой областью, областью петли 1, областью петли 2 или областью петли 3 CCR4 человека, соответственно.
На фигуре 2 показана нумерация по Kabat и результаты выравнивания для вариабельных областей легкой цепи 10A11, 27G1, 1H4, 19D7, 8F7 и 2C7.
На фигуре 3 показана нумерация по Kabat и результаты выравнивания для вариабельных областей тяжелой цепи 10A11, 27G1, 1H4, 19D7, 8F7 и 2C7.
Фигура 4 представляет собой нумерацию по Kabat и результаты выравнивания для вариабельной области легкой цепи 10A11, IGKV4-1, IGKV3-20, IGKV1-39, IGKV2-40, IGKV2-28 и IGKV1-16.
Фигура 5 представляет собой нумерацию по Kabat и результаты выравнивания для вариабельной области тяжелой цепи 10A11, IGHV3-15 T94R и IGHV3-73.
Фигура 6 представляет собой нумерацию по Kabat и результаты выравнивания для вариабельной области легкой цепи 19D7, IGKV3-15, IGKV2-18 и IGKV3-20.
Фигура 7 представляет собой нумерацию по Kabat и результаты выравнивания для вариабельной области тяжелой цепи 19D7, IGHV3-15 T94R и IGHV3-73.
На фигуре 8 показана противоопухолевая активность антител против CCR8 человека, которую оценивали на мышах с нокином CCR8 человека, которым инокулировали клетки рака толстого кишечника CT26, посредством измерения объема опухоли после инокуляции. Что касается уровней значимости, символом "**" указано p<0,01 и символом "***" указано p<0,001 по результатам анализа t-критерия Уэлча.
[СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ]
[0021]
Термины, используемые в настоящем описании, используют в значении, как правило, используемом в этой области, если конкретно не указано иначе.
[0022]
В настоящем изобретении можно использовать способы получения антител, известные в этой области. Примеры способов включают способ, описанный в Immunochemistry in Practice (Blackwell Scientific Publiations).
Также можно использовать способы генетической инженерии, известные в этой области. Примеры способов включают способы, описанные в Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Fourth Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2012), и Current Protocols Essential Laboratory Techniques, Current Protocols (2012).
[0023]
Аминокислотная последовательность CCR8 человека приведена в UniProtKB/Swiss-Prot: P51685 (SEQ ID NO: 1). Внеклеточные домены CCR8 человека соответствуют N-концевой области, состоящей из положений аминокислот 1-35, области петли 1, состоящей из положений аминокислот 94-107, области петли 2, состоящей из положений аминокислот 172-202, и области петли 3, состоящей из положений аминокислот 264-280. Аминокислота в положении 17 аминокислотной последовательности CCR8 человека является тирозином. В аминокислотной последовательности CCR8 мыши аминокислота в положении 17 отсутствует. Моноклональное антитело или его фрагмент по настоящему изобретению не обладает связывающей активностью в отношении CCR8 мыши, как показано в таблице 2 в примере 3.
[0024]
В качестве моноклонального антитела против CCR8 мыши, антитело SA214G2 доступно в BioLegend. Антитело обладает нейтрализующей активностью против CCR8 мыши. Авторы настоящего изобретения подтверждали, что это антитело не проявляет связывающей активности в отношении CCR8 человека и не распознает тирозин в положении 17 аминокислотной последовательности CCR8 человека. Авторы настоящего изобретения также подтверждали, что антитело распознает фенилаланин в положении 27 аминокислотной последовательности CCR8 мыши, и аминокислота является важной аминокислотой для нейтрализующей активности в отношении CCR8 мыши. Аминокислота в положении 27 аминокислотной последовательности CCR8 мыши соответствует аминокислоте в положении 29 аминокислотной последовательности CCR8 человека, когда эти последовательности выравнивают. Аминокислота в положении 29 аминокислотной последовательности CCR8 человека является лейцином. Считают, что из-за этого отличия моноклональное антитело, имеющее нейтрализующую активность в отношении CCR8 мыши, не имеет связывающей активности в отношении CCR8 человека.
[0025]
Гибридому, продуцирующую антитело против CCR8 по настоящему изобретению, можно получать с использованием в качестве иммуногена белка CCR8 человека, гена, кодирующего полноразмерный CCR8 человека, клетки, экспрессирующей CCR8 человека, или тому подобное. Если ген, кодирующий полноразмерный CCR8 человека, используют в качестве иммуногена, гибридому, продуцирующую антитело против CCR8, можно получать, например, посредством слияния клетки селезенки мыши, которую ДНК-иммунизировали с использованием гена в качестве антигена, с миеломной клеткой мыши.
[0026]
Один из аспектов моноклонального антитела или его фрагмента по настоящему изобретению относится к моноклональному антителу или его фрагменту, имеющему CDR или вариабельную область тяжелой/легкой цепи, представленные в настоящем описании. Антитело или фрагмент антитела может принадлежать любому классу или подклассу молекул иммуноглобулина (например, IgG, IgE, IgM, IgD или IgA, предпочтительно, IgG). Антитело или фрагмент антитела также можно получать из любого биологического вида, такого как мышь, крыса, акула, кролик, свинья, хомяк, верблюд, лама, коза или человек. Антитело или его фрагмент, предпочтительно, является гуманизированным моноклональным антителом или фрагментом гуманизированного моноклонального антитела.
[0027]
В настоящем описании термин "эпитоп" относится к области антигена, связанной антителом, нацеленным на антиген. Если антиген является белком, эпитоп содержит конкретную аминокислоту, напрямую контактирующую с антителом. Настоящее изобретение относится не только к моноклональным антителам или их фрагментам, распознающим точно тот же эпитоп, что и моноклональное антитело или его фрагмент по настоящему изобретению, но также и к моноклональным антителам или их фрагментам, распознающим частично тот же эпитоп.
[0028]
Моноклональное антитело или его фрагмент по настоящему изобретению является моноклональным антителом или его фрагментом, связывающимся с CCR8 человека, распознающим тирозин в положении 17 аминокислотной последовательности CCR8 человека.
Из указанных моноклональных антител или их фрагментов, следующие моноклональные антитела или их фрагменты являются предпочтительными:
моноклональное антитело или его фрагмент, связывающееся с CCR8 человека, распознающее одну или более аминокислот в положениях 94-107 аминокислотной последовательности, соответствующей петле 1 CCR8 человека;
моноклональное антитело или его фрагмент связывающееся с CCR8 человека, распознающее одну или более аминокислот в положениях 172-202 аминокислотной последовательности, соответствующей петле 2 CCR8 человека; и
моноклональное антитело или его фрагмент связывающееся с CCR8 человека, распознающее одну или более аминокислот из изолейцина в положении 20, серина в положении 22, лизина в положении 35, лейцина в положении 181, цистеина в положении 183 и аспарагина в положении 188 в аминокислотной последовательности CCR8 человека.
В указанных выше предпочтительных случаях может распознаваться множество необязательно выбранных эпитопов из описанных выше эпитопов. Кроме того, моноклональное антитело или его фрагмент по настоящему изобретению может дополнительно распознавать иную аминокислоту, чем указанные выше аминокислоты в аминокислотной последовательности CCR8 человека.
[0029]
Моноклональное антитело по настоящему изобретению конкретно не ограничено при условии, что оно распознает тирозин в положении 17 аминокислотной последовательности CCR8 человека, но в одном из аспектов последовательность CDR моноклональных антител по настоящему изобретению, предпочтительно, имеет следующую последовательность:
(1) CDR1 легкой цепи: SEQ ID NO: 2, 14 или 20;
(2) CDR2 легкой цепи: SEQ ID NO: 3, 9, 15 или 21;
(3) CDR3 легкой цепи: SEQ ID NO: 4, 10, 16 или 22;
(4) CDR1 тяжелой цепи: SEQ ID NO: 5, 8, 12, 17 или 23;
(5) CDR2 тяжелой цепи: SEQ ID NO: 6, 18 или 24;
(6) CDR3 тяжелой цепи: SEQ ID NO: 7, 11, 13, 19 или 25.
Более предпочтительно, последовательность CDR имеет следующую последовательность:
(1) CDR1 легкой цепи: SEQ ID NO: 2;
(2) CDR2 легкой цепи: SEQ ID NO: 3 или 9;
(3) CDR3 легкой цепи: SEQ ID NO: 4 или 10;
(4) CDR1 тяжелой цепи: SEQ ID NO: 5, 8 или 12;
(5) CDR2 тяжелой цепи: SEQ ID NO: 6;
(6) CDR3 тяжелой цепи: SEQ ID NO: 7, 11 или 13.
Наиболее предпочтительно, последовательность CDR имеет следующую последовательность:
(1) CDR1 легкой цепи: SEQ ID NO: 2;
(2) CDR2 легкой цепи: SEQ ID NO: 3;
(3) CDR3 легкой цепи: SEQ ID NO: 4;
(4) CDR1 тяжелой цепи: SEQ ID NO: 5;
(5) CDR2 тяжелой цепи: SEQ ID NO: 6;
(6) CDR3 тяжелой цепи: SEQ ID NO: 7.
Каждая из аминокислотных последовательностей (SEQ ID NO: 2-25), необязательно, содержит делецию, замену, инсерцию и/или добавление одной или двух аминокислот.
В настоящем описании в последовательности CDR моноклонального антитела по настоящему изобретению аспарагин можно заменять глутамином или лизином, аспарагиновую кислоту можно заменять глутаминовой кислотой, лейцин можно заменять изолейцином, тирозин можно заменять фенилаланином, серин можно заменять треонином и глицин можно заменять глутамином, треонином, аланином, лизином, лейцином или аргинином.
Предпочтительно, необязательно, присутствует одна или более из следующих замен:
A) замена аспарагина лизином в положении 10 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2;
B) замена глицина глутамином, треонином, аланином, лизином, лейцином или аргинином в положении 11 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2;
C) замена аспарагина глутамином в положении 4 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3;
D) замена лейцина изолейцином в положении 5 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3;
E) замена лейцина изолейцином в положении 4 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4;
F) замена тирозина фенилаланином в положении 6 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4;
G) замена серина треонином в положении 16 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6; и
H) замена аспарагиновой кислоты глутаминовой кислотой в положении 19 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6.
Более предпочтительно, необязательно, присутствует одна или более из следующих замен:
A) замена аспарагина лизином в положении 10 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2;
B) замена глицина аргинином в положении 11 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2; и
C) замена аспарагина глутамином в положении 4 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3.
Кроме того, предпочтительно, аспарагин в положении 4 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3 заменяют глутамином; и,
кроме того, необязательно, присутствует любая из следующих замен:
A) замена аспарагина лизином в положении 10 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2; и
B) замена глицина аргинином в положении 11 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2.
Если моноклональное антитело по настоящему изобретению имеет следующую последовательность:
(1) CDR1 легкой цепи: SEQ ID NO: 2;
(2) CDR2 легкой цепи: SEQ ID NO: 9;
(3) CDR3 легкой цепи: SEQ ID NO: 10;
(4) CDR1 тяжелой цепи: SEQ ID NO: 8;
(5) CDR2 тяжелой цепи: SEQ ID NO: 6;
(6) CDR3 тяжелой цепи: SEQ ID NO: 11,
необязательно, присутствует одна или более из следующих замен:
A) замена серина треонином в положении 2 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2;
B) замена серина треонином в положении 3 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2;
C) замена серина треонином в положении 5 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2;
D) замена глутамина аспарагином в положении 2 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10;
E) замена треонина серином в положении 1 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8;
F) замена аланина валином в положении 14 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6;
G) замена лизина аргинином в положении 18 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6;
H) замена аспарагиновой кислоты глутаминовой кислотой в положении 19 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6;
I) замена аспарагина глутамином в положении 5 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11; и
J) замена тирозина фенилаланином в положении 12 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11.
[0030]
В настоящем описании выражение "фрагмент моноклонального антитела" означает часть моноклонального антитела по настоящему изобретению и фрагмент, специфически связывающийся с CCR8 человека и селективно ингибирующий CCR8 человека тем же образом, что и моноклональное антитело. Фрагмент моноклонального антитела по настоящему изобретению распознает тирозин в положении 17 аминокислотной последовательности CCR8 человека.
[0031]
2
В частности, примеры фрагмента антитела включают Fab (антигенсвязывающий фрагмент), Fab', F(ab'), одноцепочечное антитело (одноцепочечный Fv; далее в настоящем описании обозначаемый как scFv), стабилизированное дисульфидной связью антитело (стабилизированный дисульфидной связью Fv; далее в настоящем описании обозначаемый как dsFv), димеризованный фрагмент V-области (далее в настоящем описании обозначаемый как диатело), пептид, содержащий CDR, и тому подобное, специфически связывающиеся с CCR8 человека (Expert Opinion on Therapeutic Patents, vol. 6, No. 5, pp. 441-456, 1996).
[0032]
Fab является фрагментом антитела, имеющим антигенсвязывающую активность и молекулярную массу приблизительно 50000, состоящим из приблизительно половины N-концевой стороны H-цепи и целую L-цепь, полученным посредством деградации пептидной части верхней части двух дисульфидных связей (связей S-S), перекрестно связывающих две H-цепи в шарнирной области IgG, с использованием фермента папаина. Fab, используемый в настоящем изобретении, можно получать посредством обработки моноклонального антитела по настоящему изобретению папаином. Fab также можно получать посредством инсерции ДНК, кодирующей Fab моноклонального антитела по настоящему изобретению, в экспрессирующийся в клетке вектор, и встраивания полученного вектора в клетку для экспрессии Fab.
[0033]
2
2
Fab' является фрагментом антитела, имеющим антигенсвязывающую активность и молекулярную массу приблизительно 50000, получаемым посредством расщепления связей S-S в шарнирной области F(ab'). Fab', используемый в настоящем изобретении, можно получать посредством обработки F(ab') моноклонального антитела по настоящему изобретению восстановителем дитиотреитолом. Fab' также можно получать посредством инсерции ДНК, кодирующей Fab' моноклонального антитело по настоящему изобретению, в экспрессирующийся в клетке вектор и встраивания полученного вектора в E. coli, дрожжи или клетки животных для экспрессии Fab'.
[0034]
2
2
2
2
F(ab') является фрагментом антитела, имеющим антигенсвязывающую активность и молекулярную массу приблизительно 100000, состоящим из двух областей Fab', связанных в шарнирной части, полученных посредством деградации нижней части двух связей S-S в шарнирной области IgG ферментом пепсином. F(ab'), используемый в настоящем изобретении, можно получать посредством обработки моноклонального антитела по настоящему изобретению пепсином. F(ab') также можно получать посредством инсерции ДНК, кодирующей F(ab') моноклонального антитела по настоящему изобретению, в экспрессирующийся в клетке вектор и встраивания полученного вектора в E. coli, дрожжи или клетки животных для экспрессии F(ab')2.
[0035]
scFv представляет собой полипептид VH-P-VL или VL-P-VH, в котором одна VH и одна VL связаны с помощью подходящего пептидного линкера (далее в настоящем описании обозначаемого как P), и является фрагментом антитела, имеющим антигенсвязывающую активность. VH и VL, содержащиеся в scFv, используемым в настоящем изобретении, могут являться VH и VL моноклонального антитела по настоящему изобретению. scFv, используемый в настоящем изобретении, также можно получать посредством конструирования экспрессирующего вектора scFv с использованием кДНК, кодирующей VH и VL моноклонального антитела по настоящему изобретению, и встраивания полученного вектора в E. coli, дрожжи или клетки животных для экспрессии scFv.
[0036]
Термин "sFv" относится к фрагменту антитела, полученному посредством связывания полипептидов, в которых 1 аминокислотный остаток в VH и VL заменяют остатком цистеина, соответственно, посредством связи S-S. Аминокислотные остатки, подлежащие замене остатками цистеина, можно выбирать с учетом стереоструктурного прогнозирования антитела способом, описанным Reiter et al. (Protein Engineering, 7, 697 (1994)). VH или VL, содержащиеся в dsFv, используемом в настоящем изобретении, могут являться VH или VL моноклонального антитела по настоящему изобретению. dsFv, используемый в настоящем изобретении, также можно получать посредством конструирования экспрессирующего вектора dsFv посредством инсерции кДНК, кодирующей VH и VL моноклонального антитела по настоящему изобретению в подходящий экспрессирующий вектор и встраивания полученного вектора в E. coli, дрожжи или клетки животных для экспрессии dsFv.
[0037]
Диатело является фрагментом антитела, в котором scFv, имеющие одну и ту же или разные специфичности связывания антигена, образуют димер, и фрагментом антитела, имеющим бивалентную антигенсвязывающую активность в отношении одного антигена или две разные специфические антигенсвязывающие активности в отношении разных антигенов. Например, бивалентное диатело, специфически реагирующее с моноклональным антителом по настоящему изобретению, можно получать с использованием кДНК, кодирующей VH и VL моноклонального антитела по настоящему изобретению, для конструирования ДНК, кодирующей scFv, содержащий пептидный линкер из 3-10 остатков, инсерции ДНК в экспрессирующийся в клетке вектор, встраивания полученного вектора в E. coli, дрожжи или клетки животных для экспрессии диатела.
[0038]
Пептид, содержащий CDR, состоит из по меньшей мере одной или более областей CDR VH или VL. Множество CDR можно связывать напрямую или с помощью подходящего пептидного линкера. Пептид, содержащий CDR, используемую в настоящем изобретении, можно получать посредством конструирования CDR-кодирующей ДНК с использованием кДНК, кодирующей VH и VL моноклонального антитела по настоящему изобретению, инсерции ДНК в экспрессирующий вектор для клеток животных, и встраивания полученного вектора в E. coli, дрожжи или клетки животных для экспрессии пептида. Пептид, содержащий CDR, также можно получать способами химического синтеза, такими как способ Fmoc (способ с использованием флуоренилметилоксикарбонила), способ tBoc (способ с использованием трет-бутилоксикарбонила) и тому подобное.
[0039]
Моноклональное антитело и его фрагмент по настоящему изобретению отличаются тем, что связываются с CCR8 человека. В частности, предпочтительными являются те, которые специфически связываются с CCR8 человека.
[0040]
-6
-7
-8
-9
Специфическое связывание можно охарактеризовывать посредством равновесной константы диссоциации по меньшей мере приблизительно 1×10 M или менее (например, меньшая Kd соответствует более сильному связыванию). Значение Kd составляет предпочтительно 1×10 M или менее, более предпочтительно - 1×10 M или менее, еще более предпочтительно - 1×10 M или менее. Способы определения того, связываются ли две молекулы специфически, хорошо известны в этой области, и их примеры включают конкурентные способы ELISA, поверхностный плазмонный резонанс и другие подобные способы.
[0041]
Настоящее изобретение включает моноклональное антитело или его фрагмент, конкурирующее с моноклональным антителом или его фрагментом, представленным в настоящем описании, за связывание с CCR8 человека.
-7
-8
-9
Термин "моноклональное антитело или его фрагмент, конкурирующее с" означает антитело или его фрагмент, ингибирующее специфическое связывание с CCR8 человека моноклонального антитела или его фрагмента по настоящему изобретению (предпочтительно, антитела, описанного в примерах в настоящем описании, в частности, предпочтительно, 10A11). Например, антитело, содержащее вариабельную область легкой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 42, и вариабельную область тяжелой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 41. Антитело, содержащее вариабельную область легкой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 42, и вариабельную область тяжелой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 41, где аспарагин в положении 58 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 42 заменяют глутамином и глицин в положении 34 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 42 заменяют аргинином. Определяют, конкурирует ли моноклональное антитело или его фрагмент с моноклональным антителом или его фрагментом по настоящему изобретению. Среди антител, для которых связывание с антигеном (CCR8 человека) можно подтверждать в присутствии антитела изотипического контроля, антитело, для которого сигнал связывания значительно снижается в присутствии моноклонального антитела или его фрагмента по настоящему изобретению, можно идентифицировать как антитело, конкурирующее с моноклональным антителом или его фрагментом по настоящему изобретению. Снижение сигнала связывания составляет предпочтительно 50%, более предпочтительно - 70%. Значение Ki антитела, конкурирующего с моноклональным антителом или его фрагментом по настоящему изобретению за связывание с антигеном, составляет предпочтительно 1×10 M или менее, более предпочтительно - 1×10 M или менее, еще более предпочтительно - 1×10 M или менее.
50
Нейтрализующая активность в отношении CCR8 человека антитела, конкурирующего с полученным моноклональным антителом или его фрагментом по настоящему изобретению, предпочтительно, соответствует значению IC 10 нМ или менее.
[0042]
Моноклональное антитело или его фрагмент по настоящему изобретению отличаются тем, что ингибируют связывание CCR8 с лигандом CCR8. Термин "лиганд CCR8" конкретно не ограничен при условии, что он означает вещество, связывающееся с CCR8, такое как CCL1, CCL8 или CCL18, но он, предпочтительно, является CCL1, CCL18, и особенно предпочтительно - CCL1.
2+
50
Способность к ингибированию связывания CCR8 с лигандом CCR8 можно определять, если лиганд CCR8 является CCL1 человека, например, с использованием экспрессирующих CCR8 человека клеток 293, определяя поток Ca при добавлении CCL1 человека и вычисляя значение IC при условии, что сигнал, когда не добавляют CCL1 человека, принимают за степень ингибирования 100%, а сигнал, когда добавляют CCL1 человека и не добавляют антитело, принимают за степень ингибирования 0%. Способность к ингибированию связывания с другими лигандами CCR8 также можно определять сходно с CCL1 человека, как описано выше.
[0043]
CCL1 человека имеет аминокислотную последовательность, приведенную в UniProtKB/Swiss-Prot № P22362 или тому подобное. CCL8 человека имеет аминокислотную последовательность, приведенную в GenBank № AAI 26243.1 или тому подобное. CCL18 человека имеет аминокислотную последовательность, приведенную в GenBank № EAW80102.1 или тому подобное.
[0044]
Моноклональное антитело по настоящему изобретению можно получать способом, общепринятым в этой области, с использованием CDR или вариабельной области тяжелой цепи/вариабельной области легкой цепи, представленной в настоящем описании.
[0045]
Термин "моноклональное антитело по настоящему изобретению" также относится к химерному антителу, гуманизированному антителу, полностью человеческому антителу, конъюгату антитело-лекарственное средство (ADC) и биспецифическому антителу.
Гуманизированное моноклональное антитело можно использовать при введении людям для терапевтических целей или тому подобное, т.к. оно является менее антигенным для людей. Гуманизированное моноклональное антитело является антителом, в котором определяющую комплементарность область (CDR) антитела не являющегося человеком млекопитающего, такого как антитело мыши, пересаживают на каркасную область (FR) антитела человека. Таким образом, FR гуманизированного моноклонального антитела получают из человека. Подходящую FR можно выбирать с помощью работ Kabat E.A. et al. В этом случае в качестве FR выбирают FR, с которой CDR может образовывать подходящий антигенсвязывающий участок. При необходимости, аминокислоты FR вариабельной области антитела можно заменять так, чтобы CDR восстановленного гуманизированного моноклонального антитела образовывала соответствующий антигенсвязывающий участок (Sato, K. et al., Cancer Res. 1993, vol. 53, p. 851). Процент аминокислот FR, подлежащих замене, составляет от 0 до 15%, предпочтительно - от 0 до 5% всей области FR.
[0046]
Гуманизированное моноклональное антитело по настоящему изобретению, предпочтительно, содержит:
вариабельную область легкой цепи, состоящую из
аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 40, 42, 43, 44, 45 или 47, или
аминокислотной последовательности, имеющей 95% или более идентичности в отношении аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 40, 42, 43, 44, 45 или 47; и
вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из
аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 41 или 46, или
аминокислотной последовательности, имеющей 95% или более идентичности в отношении аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 41 или 46.
Более предпочтительно, гуманизированное моноклональное антитело по настоящему изобретению содержит:
1) вариабельную область легкой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 40, и
вариабельную область тяжелой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 41;
2) вариабельную область легкой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 42, и
вариабельную область тяжелой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 41;
3) вариабельную область легкой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 43, и
вариабельную область тяжелой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 41;
4) вариабельную область легкой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 44, и
вариабельную область тяжелой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 41;
5) вариабельную область легкой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 45, и
вариабельную область тяжелой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 41;
6) вариабельную область легкой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 47, и
вариабельную область тяжелой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 41;
7) вариабельную область легкой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 40, и
вариабельную область тяжелой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 46;
8) вариабельную область легкой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 42, и
вариабельную область тяжелой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 46;
9) вариабельную область легкой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 43, и
вариабельную область тяжелой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 46;
10) вариабельную область легкой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 44, и
вариабельную область тяжелой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 46;
11) вариабельную область легкой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 45, и
вариабельную область тяжелой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 46; или
12) вариабельную область легкой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 47, и
вариабельную область тяжелой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 46,
где, необязательно, присутствует одна или более из следующих замен:
A) замена аспарагина лизином в положении 33 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 40, 42, 43, 44, 45 или 47;
B) замена глицина глутамином, треонином, аланином, лизином, лейцином или аргинином в положении 34 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 40, 42, 43, 44, 45 или 47;
C) замена аспарагина глутамином в положении 58 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 40, 42, 43, 44, 45 или 47;
D) замена лейцина изолейцином в положении 59 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 40, 42, 43, 44, 45 или 47;
E) замена лейцина изолейцином в положении 97 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 40, 42, 43, 44, 45 или 47;
F) замена тирозина фенилаланином в положении 99 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 40, 42, 43, 44, 45 или 47;
G) замена серина треонином в положении 65 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 41 или 46; и
H) замена аспарагиновой кислоты глутаминовой кислотой в положении 68 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 41 или 46.
Кроме того, предпочтительно, гуманизированное моноклональное антитело по настоящему изобретению содержит:
1) вариабельную область легкой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 40, и
вариабельную область тяжелой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 41; или
2) вариабельную область легкой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 42, и
вариабельную область тяжелой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 41,
где, необязательно, присутствует одна или более из следующих замен:
A) замена аспарагина лизином в положении 33 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 40 или 42;
B) замена глицина глутамином, треонином, аланином, лизином, лейцином или аргинином в положении 34 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 40 или 42;
C) замена аспарагина глутамином в положении 58 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 40 или 42;
D) замена лейцина изолейцином в положении 59 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 40 или 42;
E) замена лейцина изолейцином в положении 97 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 40 или 42;
F) замена тирозина фенилаланином в положении 99 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 40 или 42;
G) замена серина треонином в положении 65 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 41; и
H) замена аспарагиновой кислоты глутаминовой кислотой в положении 68 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 41.
Особенно предпочтительно, гуманизированное моноклональное антитело по настоящему изобретению содержит:
1) вариабельную область легкой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 40, и
вариабельную область тяжелой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 41; или
2) вариабельную область легкой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 42, и
вариабельную область тяжелой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 41,
где, необязательно, присутствует одна или более из следующих замен:
A) замена аспарагина лизином в положении 33 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 40 или 42;
B) замена глицина аргинином в положении 34 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 40 или 42; и
C) замена аспарагина глутамином в положении 58 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 40 или 42.
Наиболее предпочтительно, гуманизированное моноклональное антитело по настоящему изобретению содержит:
1) вариабельную область легкой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 40, и
вариабельную область тяжелой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 41; или
2) вариабельную область легкой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 42, и
вариабельную область тяжелой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 41,
где
аспарагин в положении 58 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 40 или 42 заменяют глутамином, и
кроме того, необязательно, присутствует любая из следующих замен:
A) замена аспарагина лизином в положении 33 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 40 или 42; и
B) замена глицина аргинином в положении 34 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 40 или 42.
Наиболее предпочтительным является гуманизированное моноклональное антитело, имеющее вариабельную область легкой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 42, и вариабельную область тяжелой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 41, где аспарагин в положении 58 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 42 заменяют глутамином и глицин в положении 34 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 42 заменяют аргинином.
[0047]
Примеры последовательностей вариабельных областей легкой и тяжелой цепи в гуманизированных моноклональных антителах по настоящему изобретению включают комбинации в таблице 1.
[Таблица 1]
Комбинация
Вариабельная область легкой цепиSEQ ID NO:
Тип замены
Вариабельная область тяжелой цепиSEQ ID NO:
Тип замены
1
42
C
41
Нет
2
42
C+A
41
Нет
3
42
C+A
41
H
4
42
C+B5
41
Нет
5
42
C+B5
41
H
6
42
C+B6
41
Нет
7
42
C+B6
41
H
8
40
C
41
Нет
9
40
C+A
41
Нет
10
40
C+A
41
H
11
40
C+B5
41
Нет
12
40
C+B5
41
H
13
40
C+B6
41
Нет
14
40
C+B6
41
H
15
42
D
41
Нет
16
42
E
41
Нет
17
42
F
41
Нет
18
42
B1
41
Нет
19
42
B6
41
Нет
20
42
B2+C
41
Нет
21
42
B3+C+D
41
Нет
22
42
Нет
41
H
23
42
C
41
H
24
42
Нет
41
G+H
25
42
A
41
G+H
26
40
D
41
Нет
27
40
E
41
Нет
28
40
F
41
Нет
29
40
B4
41
Нет
30
40
B5
41
Нет
31
40
Нет
41
H
32
40
A
41
H
В настоящем описании каждый символ в колонке "Тип замены" в таблице 1, соответственно, означает следующие замены.
(1) Вариабельная область легкой цепи, имеющая аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40 или 42
A) Замена аспарагина лизином в положении 33 аминокислотной последовательности.
B1) Замена глицина глутамином в положении 34 аминокислотной последовательности.
B2) Замена глицина треонином в положении 34 аминокислотной последовательности.
B3) Замена глицина аланином в положении 34 аминокислотной последовательности.
B4) Замена глицина лизином в положении 34 аминокислотной последовательности.
B5) Замена глицина лейцином в положении 34 аминокислотной последовательности.
B6) Замена глицина аргинином в положении 34 аминокислотной последовательности.
C) Замена аспарагина глутамином в положении 58 аминокислотной последовательности.
D) Замена лейцина изолейцином в положении 59 аминокислотной последовательности.
E) Замена лейцина изолейцином в положении 97 аминокислотной последовательности.
F) Замена тирозина фенилаланином в положении 99 аминокислотной последовательности.
(2) Вариабельная область тяжелой цепи, имеющая аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 41
G) Замена серина треонином в положении 65 аминокислотной последовательности.
H) Замена аспарагиновой кислоты глутаминовой кислотой в положении 68 аминокислотной последовательности.
[0048]
Другой аспект гуманизированного моноклонального антитела по настоящему изобретению содержит:
вариабельную область легкой цепи, имеющую
аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40, 42, 43, 44, 45 или 47, или
аминокислотную последовательность, имеющую 95% или более идентичности в отношении аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 40, 42, 43, 44, 45 или 47, где аминокислоты в положениях 26, 27, 30 и 98 аминокислотной последовательности представляют собой серин, лизин, лейцин и глутаминовую кислоту, соответственно; и
вариабельную область тяжелой цепи, имеющую
аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 41 или 46, или
аминокислотную последовательность, имеющую 95% или более идентичности в отношении аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 41 или 46, где аминокислоты в положениях 33, 35, 52, 56, 62, 102, 103, 104, 109 и 113 аминокислотной последовательности представляют собой аланин, тирозин, аргинин, аспарагин, тирозин, аргинин, фенилаланин, тирозин, глицин и аспарагиновую кислоту, соответственно.
Более предпочтительно, гуманизированное моноклональное антитело по настоящему изобретению содержит:
вариабельную область легкой цепи, имеющую
аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40 или 42, или
аминокислотную последовательность, имеющую 95% или более идентичности в отношении аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 40 или 42, где аминокислоты в положениях 26, 27, 30 и 98 аминокислотной последовательности представляют собой серин, лизин, лейцин и глутаминовую кислоту, соответственно; и
вариабельную область тяжелой цепи, имеющую
аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 41 или 46, или
аминокислотную последовательность, имеющую 95% или более идентичности в отношении аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 41 или 46, где аминокислоты в положениях 33, 35, 52, 56, 62, 102, 103, 104, 109 и 113 аминокислотной последовательности представляют собой аланин, тирозин, аргинин, аспарагин, тирозин, аргинин, фенилаланин, тирозин, глицин и аспарагиновую кислоту, соответственно.
Кроме того, предпочтительно, гуманизированное моноклональное антитело по настоящему изобретению содержит:
вариабельную область легкой цепи, имеющую
аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 42, или
аминокислотную последовательность, имеющую 95% или более идентичности в отношении аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 42, где аминокислоты в положениях 26, 27, 30 и 98 аминокислотной последовательности представляю собой серин, лизин, лейцин и глутаминовую кислоту, соответственно; и
вариабельную область тяжелой цепи, имеющую
аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 41 или 46, или
аминокислотную последовательность, имеющую 95% или более идентичности в отношении аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 41 или 46, где аминокислоты в положениях 33, 35, 52, 56, 62, 102, 103, 104, 109 и 113 аминокислотной последовательности представляют собой аланин, тирозин, аргинин, аспарагин, тирозин, аргинин, фенилаланин, тирозин, глицин и аспарагиновую кислоту, соответственно.
[0049]
Гуманизированное моноклональное антитело по настоящему изобретению также предпочтительно содержит:
вариабельную область легкой цепи, имеющую
аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 54, 55 или 56, или
аминокислотную последовательность, имеющую 95% или более идентичности в отношении аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 54, 55 или 56; и
вариабельную область тяжелой цепи, имеющую
аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57 или 58, или
аминокислотную последовательность, имеющую 95% или более идентичности в отношении аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 57 или 58.
Более предпочтительно, гуманизированное моноклональное антитело по настоящему изобретению содержит:
1) вариабельную область легкой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 54, и
вариабельную область тяжелой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 57;
2) вариабельную область легкой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 55, и
вариабельную область тяжелой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 57;
3) вариабельную область легкой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 56, и
вариабельную область тяжелой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 57;
4) вариабельную область легкой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 54, и
вариабельную область тяжелой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 58;
5) вариабельную область легкой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 55, и
вариабельную область тяжелой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 58;
6) вариабельную область легкой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 56, и
вариабельную область тяжелой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 58,
где, необязательно, присутствует одна или более из следующих замен:
A) замена серина треонином в положении 25 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 54, 55 или 56;
B) замена серина треонином в положении 26 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 54, 55 или 56;
C) замена серина треонином в положении 28 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 54, 55 или 56;
D) замена глутамина аспарагином в положении 95 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 54, 55 или 56;
E) замена треонина серином в положении 31 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 57 или 58;
F) замена аланина валином в положении 63 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 57 или 58;
G) замена лизина аргинином в положении 67 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 57 или 58;
H) замена аспарагиновой кислоты глутаминовой кислотой в положении 68 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 57 или 58;
I) замена аспарагина глутамином в положении 99 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 57 или 58; и
J) замена тирозина фенилаланином в положении 105 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 57 или 58.
Кроме того, предпочтительно, гуманизированное моноклональное антитело по настоящему изобретению содержит:
вариабельную область легкой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 56, и вариабельную область тяжелой цепи c аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 57,
где, необязательно, присутствует одна или более из следующих замен:
A) замена серина треонином в положении 25 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 56;
B) замена серина треонином в положении 26 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 56;
C) замена серина треонином в положении 28 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 56;
D) замена глутамина аспарагином в положении 95 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 56;
E) замена треонина серином в положении 31 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 57;
F) замена аланина валином в положении 63 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 57;
G) замена лизина аргинином в положении 67 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 57;
H) замена аспарагиновой кислоты глутаминовой кислотой в положении 68 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 57;
I) замена аспарагина глутамином в положении 99 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 57; и
J) замена тирозина фенилаланином в положении 105 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 57.
[0050]
Следует отметить, что в гуманизированном моноклональном антителе по настоящему изобретению используют константную область антитела человека. Предпочтительные примеры константной области антитела человека включают Cγ, такую как Cγ1, Cγ2, Cγ3 или Cγ4, в отношении тяжелой цепи и Cκ и Cλ в отношении легкой цепи. C-область антитела человека можно модифицировать для улучшения стабильности антитела или его получения. Антитело человека, используемое в получении гуманизированного антитела, может иметь любой изотип антитела человека, такой как IgG, IgM, IgA, IgE или IgD, и в настоящем изобретении, предпочтительно, используют IgG и, более предпочтительно - IgG1 или IgG4.
[0051]
В гуманизированных моноклональных антителах по настоящему изобретению лизин можно добавлять или не добавлять на C-конец константной области тяжелой цепи. Предпочтительно, гуманизированные моноклональные антитела по настоящему изобретению имеют константную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 52 и константную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 53, где лизин можно добавлять или не добавлять на C-конец SEQ ID NO: 53.
[0052]
Гуманизированное моноклональное антитело можно получать общими способами получения (см., например, WO 95/14041, WO 96/02576). В частности, во-первых, последовательность ДНК, кодирующую вариабельную область, сконструированную для связывания CDR антитела мыши с FR антитела человека, синтезируют способом ПЦР из нескольких олигонуклеотидов, полученных так, что они содержат остатки, перекрывающиеся на концах (см. WO 98/13388). Полученную ДНК связывают с ДНК, кодирующую константную область антитела человека, а затем встраивают в экспрессирующий вектор. Альтернативно, ДНК, кодирующую вариабельную область антитела, можно встраивать в экспрессирующий вектор, содержащий ДНК константной области антитела. Для получения антитела, используемого в настоящем изобретении, ген антитела встраивают в экспрессирующий вектор так, что он экспрессируется под контролем области контроля экспрессии, например, энхансера/промотора. Затем экспрессирующий вектор можно использовать для трансформации клетки-хозяина и экспрессии антитела.
[0053]
Примеры клетки-хозяина, являющейся трансформантом, включают клетку позвоночного, такую как клетка COS или клетка CHO, прокариотическую клетку и дрожжи. Трансформанта можно культивировать способом, хорошо известным специалистам в этой области, и моноклональное антитело по настоящему изобретению получают из трансформанта внутриклеточно или внеклеточно. Среду, используемую для культивирования, можно выбирать из различных типов общеупотребительных сред, при необходимости, в зависимости от используемой клетки-хозяина. Если клетка-хозяин является клеткой COS, примеры среды включают такую среду, как среда RPMI-1640 или модифицированная по способу Дульбекко среда Игла (DMEM), при необходимости, дополненная компонентами сыворотки, такими как фетальная бычья сыворотка (FBS). Температура во время культивирования трансформанта может являться любой температурой, не снижающей значительно способность к синтезу белка в клетке, и, предпочтительно, составляет от 32°C до 42°C, наиболее предпочтительно - 37°C. При необходимости, трансформанта можно культивировать в атмосфере, содержащей от 1 до 10% (об./об.) диоксида углерода.
[0054]
Фракции, содержащие моноклональное антитело по настоящему изобретению, полученное из трансформанта внутриклеточно или внеклеточно, как описано выше, можно разделять и очищать различными известными способами разделения с использованием физических и химических свойств белков или тому подобное. Конкретные примеры таких способов включают общепринятую обработку осадителем белков, ультрафильтрацию, различные способы хроматографии, такие как хроматография на молекулярных ситах (гель-фильтрация), адсорбционная хроматография, ионообменная хроматография, аффинная хроматография или высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), способ диализа и их комбинации. Используя способы, моноклональное антитело по настоящему изобретению легко можно получать с высоким выходом и высокой чистотой.
[0055]
Моноклональное антитело или его фрагмент по настоящему изобретению можно дополнительно модифицировать с помощью различных молекул, таких как полиэтиленгликоль (PEG), радиоактивные материалы, токсины и тому подобное. В качестве способа модификации антитела можно использовать способы, известные в этой области.
[0056]
Кроме того, другие белки можно подвергать слиянию с N- или C-концом моноклонального антитела по настоящему изобретению (Clinical Cancer Research, 2004, 10, 1274-1281). Специалисты в этой области можно соответствующим образом выбирать белок, подлежащий слиянию.
[0057]
Моноклональное антитело по настоящему изобретению относится к антителу, содержащему N-гликозид-связанную гликоцепь, присоединенную к Fc-области антитела. Необходимо отметить, что фукозу можно не присоединять к N-ацетилглюкозамину на восстановительный конец N-гликозид-связанной гликоцепи. Примеры антитела, в которых N-гликозид-связанную гликоцепь присоединяют к Fc-области антитела, а фукозу не присоединяют к N-ацетилглюкозамину на восстановительный конец N-гликозид-связанной гликоцепи, включают антитело, полученное с использованием клетки CHO, в которой отсутствует ген α1,6-фукозилтрансферазы (WO 2005/035586, WO 02/31140). Антитело по настоящему изобретению, в котором N-гликозид-связанную гликоцепь присоединяют к Fc-области антитела, а фукозу не присоединяют к N-ацетилглюкозамину на восстановительный конец N-гликозид-связанной гликоцепи, имеет высокую активность ADCC.
[0058]
reg
reg
reg
В терминах удаления T-клеток или макрофагов предпочтительно, чтобы моноклональное антитело или его фрагмент по настоящему изобретению имело антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в отношении клеток, экспрессирующих CCR8. Термин "активность ADCC" означает активность in vivo, в рамках которой антитело, связанное с антигеном поверхности клетки, такой как клетка-мишень, активирует эффекторную клетку посредством связывания Fc-области антитела с Fc-рецептором, присутствующим на поверхности эффекторной клетки, и повреждает клетку-мишень или тому подобное. Примеры эффекторной клетки включают естественный киллер и активированный макрофаг. В настоящем изобретении термин "активность ADCC" означает активность in vivo, в рамках которой антитело, связанное с антигеном (CCR8) поверхности клетки, такой как T-клетка или макрофаг, активирует эффекторную клетку посредством связывания Fc-области антитела с Fc-рецептором, присутствующим на поверхности эффекторной клетки, повреждает T-клетку или макрофаг или тому подобное, и, таким образом, повреждает опухолевую клетку или тому подобное.
[0059]
2+
Предпочтительно, чтобы моноклональное антитело или его фрагмент по настоящему изобретению являлось нейтрализующим антителом или нейтрализующим фрагментом антитела против CCR8. Термин "нейтрализующее антитело или нейтрализующий фрагмент антитела против CCR8" означает антитело или фрагмент антитела, имеющее нейтрализующую активность в отношении CCR8. Имеет ли антитело нейтрализующую активность в отношении CCR8, можно определять, например, посредством измерения того, ингибирует ли антитело физиологическое действие лиганда CCR8 (например, CCL1) в отношении CCR8. Их неограничивающие примеры включают измерение связывания CCL1 с CCR8, миграцию или повышение внутриклеточного Ca в CCR8-экспрессирующих клетках под действием CCL1 или варианты экспрессии генов, восприимчивых к стимуляции CCL1. Их также можно измерять способом, описанным в примерах ниже.
2+
Нейтрализующую активность моноклонального антитела или его фрагмент по настоящему изобретению в отношении связывания CCR8 с CCL1 можно измерять посредством добавления разведения антитела, полученного с помощью среды, к клеткам 293, экспрессирующим CCR8 человека, в которые индикаторный Ca включен заранее. Аффинность CCR8 к лиганду CCR8 является наиболее высокой, если лиганд CCR8 является CCL1, таким образом, можно использовать антитела, имеющие высокую ингибиторную активность в отношении CCL1.
50
50
Предпочтительно, чтобы нейтрализующая активность моноклонального антитела или его фрагмента по настоящему изобретению соответствовала значению IC 10 нМ или менее. Более предпочтительно, нейтрализующая активность соответствует значению IC 5 нМ или менее, даже более предпочтительно - 2 нМ или менее, особенно предпочтительно - 1 нМ или менее, наиболее предпочтительно - 0,5 нМ или менее.
[0060]
Среди антител против CCR8 или их фрагментов, распознающих CCR8 человека, предпочтительным является антитело или его фрагмент, распознающее CCR8 человека. При выборе антитела или его фрагмента, распознающего CCR8 человека, антитело или его фрагмент, сильнее распознающее CCR8 человека, можно выбирать посредством выбора антитела или его фрагмента с использованием силы нейтрализующей активности в качестве показателя.
[0061]
Антитело против CCR8 или его фрагмент, распознающее тирозин в положении 17 аминокислотной последовательности CCR8 человека, ингибирует связывание CCR8 с CCL1, и его можно использовать в качестве антитела против CCR8 или его фрагмента, имеющего нейтрализующую активность. Антитело или его фрагмент, имеющее более высокую нейтрализующую активность, является предпочтительным в терминах выбора антитела или его фрагмента, сильнее распознающего CCR8 человека. Например, предпочтительными являются следующие антитела или их фрагменты. Более предпочтительным является антитело или его фрагмент, в дополнение к тирозину в положении 17 аминокислотной последовательности CCR8 человека, распознающее одну или более аминокислот в положениях 94-107 аминокислотной последовательности, соответствующих петле 1 CCR8 человека, и/или одну или более аминокислот в положениях 172-202 аминокислотной последовательности, соответствующих петле 2 CCR8 человека.
Более предпочтительным является антитело против CCR8 или его фрагмент, в дополнение к тирозину в положении 17 аминокислотной последовательности CCR8 человека, распознающее одну или более аминокислот из изолейцина в положении 20, серина в положении 22, лизин в положении 35, лейцина в положении 181, цистеина в положении 183 и аспарагина в положении 188 аминокислотной последовательности CCR8 человека.
[0062]
В качестве антител, распознающих CCR8 человека, известны следующие антитела.
a) антитело против CCR8, представленное 414B, 414C, 414E, 433H, 459M, 464A, 464B, 433B и 455AL, как описано в WO 2007/044756.
b) антитело против CCR8, представленное 3B10, 2D10 и 5B11, как описано в статье Qu et al. (J. Exp. Med., (2004), 200(10), 1231-1241).
c) антитело против CCR8 в виде продукта № L263G8 BioLegend.
d) антитело против CCR8 в виде продукта № 191704 R&D Systems, Inc.
Что касается антител против CCR8 в a), в WO 2007/044756 описано, что антитело связывается с положениями 1-39 аминокислотной последовательности CCR8 человека при анализе эпитопов. Однако детализированные участки эпитопов еще не проанализированы или совсем не описаны.
Что касается антител против CCR8 в b)-d), участки эпитопов совсем не описаны. Другими словами, нигде не описано или не предложено, что моноклональное антитело или его фрагмент, распознающее тирозин в положении 17 аминокислотной последовательности CCR8 человека, можно использовать для ингибирования связывания CCR8 с лигандом CCR8 (например, CCL1).
[0063]
reg
reg
Моноклональное антитело или его фрагмент по настоящему изобретению предпочтительно оказывает действие по удалению инфильтрирующих опухоль T-клеток. Оказывает ли моноклональное антитело по настоящему изобретению действие по удалению инфильтрирующих опухоль T-клеток, можно измерять, например, способом, описанным в примерах в патентном документе 2.
[0064]
Моноклональное антитело или его фрагмент по настоящему изобретению предпочтительно оказывает действие по удалению внутриопухолевых инфильтрирующих макрофагов. Оказывает ли антитело или его фрагмент по настоящему изобретению действие по удалению внутриопухолевых инфильтрирующих макрофагов, можно измерять, например, способом, описанным в примерах в патентном документе 2.
[0065]
Моноклональное антитело или его фрагмент по настоящему изобретению можно использовать для фармацевтической композиции. В частности, моноклональное антитело или его фрагмент, распознающее тирозин в положении 17 аминокислотной последовательности CCR8 человека, можно использовать для фармацевтической композиции. Таким образом, фармацевтическую композицию, содержащую моноклональное антитело или его фрагмент по настоящему изобретению, можно вводить системно или топически, перорально или парентерально. Примеры парентерального введения включают внутривенную инъекцию, такую как инфузия, внутримышечная инъекция, интраперитонеальная инъекция, подкожная инъекция, интраназальное введение и ингаляцию.
[0066]
reg
Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно использовать в качестве лекарственного средства для лечения и/или профилактики заболевания, связанного с CCR8. В частности, ее можно использовать в качестве лекарственного средства для лечения и/или профилактики злокачественного новообразования, при котором происходит внутриопухолевая инфильтрация CCR8-экспрессирующими T-клетками. Например, фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно использовать в качестве лекарственного средства для лечения и/или профилактики злокачественного новообразования, такого как рак молочной железы, рак тела матки, рак шейки матки, рак яичника, рак предстательной железы, рак легких, рак желудка (аденокарциному желудка), немелкоклеточный рак легких, рак поджелудочной железы, плоскоклеточный рак головы и шеи, рак пищевода, рак мочевого пузыря, меланома, колоректальный рак, рак почки, неходжкинскую лимфому, уротелиальный рак, саркому, гемобластоз (лейкоз, лимфому и т.д.), карциному желчных протоков, карциному желчного пузыря, карциному щитовидной железы, рак яичка, карциному тимуса, гепатокарциному и тому подобное, предпочтительно - рак молочной железы, рак тела матки, рак яичника, рак легких, колоректальный рак, рак почки и саркому, более предпочтительно - рак молочной железы, колоректальный рак, рак почки и саркому.
[0067] Термин "злокачественное новообразование" в выражении "фармацевтическая композиция для лечения злокачественного новообразования" по настоящему изобретению относится ко всем солидным злокачественным новообразованиям и гемобластозам. Конкретные примеры злокачественного новообразования включают рак молочной железы, рак тела матки, рак шейки матки, рак яичника, рак предстательной железы, рак легких, рак желудка (аденокарциному желудка), немелкоклеточный рак легких, рак поджелудочной железы, плоскоклеточный рак головы и шеи, рак пищевода, рак мочевого пузыря, меланому, колоректальный рак, рак почки, неходжкинскую лимфому, уротелиальный рак, саркому, гемобластоз (лейкоз, лимфому и т.д.), карциному желчных протоков, карциному желчного пузыря, карциному щитовидной железы, рак яичка, карциному тимуса, гепатокарциному. Их предпочтительные примеры включают рак молочной железы, рак тела матки, рак яичника, рак легких, колоректальный рак, рак почки и саркому, и их более предпочтительные примеры включают рак молочной железы, рак легких, колоректальный рак, рак почки и саркому.
Кроме того, термин "злокачественное новообразование" в выражении "фармацевтическая композиция для лечения злокачественного новообразования" по настоящему изобретению, предпочтительно, означает злокачественное новообразование, экспрессирующие опухолеспецифический антиген.
[0068]
Необходимо отметить, что термин "злокачественное новообразование", как представлено в настоящем описании, должен означать не только эпителиальные злокачественные новообразования, такие как рак яичников, рак желудка и тому подобное, но и неэпителиальные злокачественные новообразования, включая гемобластозы, такие как хронический лимфоцитарный лейкоз и лимфома Ходжкина. Кроме того, в настоящем описании такие термины как "злокачественное новообразование", "карцинома", "опухоль" и "неоплазия" не отличаются друг от друга, и их используют взаимозаменяемо.
[0069]
Моноклональное антитело или его фрагмент по настоящему изобретению можно использовать в комбинации с другими средствами и вводить в качестве сопутствующего средства для
(1) дополнения и/или повышения терапевтического эффекта фармацевтической композиции по настоящему изобретению,
(2) улучшения кинетики или абсорбции или снижения дозы фармацевтической композиции по настоящему изобретению, и/или
(3) снижения побочных эффектов фармацевтической композиции по настоящему изобретению.
[0070]
Сопутствующее средство для моноклонального антитела или его фрагмент по настоящему изобретению в комбинации с другими средствами можно вводить в форме комбинированного лекарственного средства, содержащего оба компонента в одном составе, или в отдельных составах. При введении в отдельных составах, их можно вводить совместно или вводить с временным интервалом. Введение с временным интервалом можно осуществлять посредством введения моноклонального антитела или его фрагмента по настоящему изобретению, а затем другого средства, или посредством введения другого средства, а затем моноклонального антитела или его фрагмента по настоящему изобретению, где каждый способ введения может быть тем же или отличаться.
[0071]
Примеры других средств, которые можно использовать в комбинации с моноклональным антителом или его фрагментом по настоящему изобретению, включают антитело против PD-1, антитело против PD-L1 и антитело против CTLA-4. Антитело против PD-1 и антитело против PD-L1 являются предпочтительными, и антитело против PD-1 является более предпочтительным.
[0072]
В настоящем изобретении примеры антитела против PD-1 включают ниволумаб и пембролизумаб.
[0073]
В настоящем изобретении примеры антитела против PD-L1 включают атезолизумаб, авелумаб и дурвалумаб.
[0074]
В настоящем изобретении примеры антитела против CTLA-4 включают ипилимумаб.
[0075]
Предполагают, что пациент, подлежащий воздействию фармацевтической композиции по настоящему изобретению, является пациентом со злокачественным новообразованием, или предполагают, что он им является. Эффективная доза фармацевтической композиции по настоящему изобретению выбрана из диапазона от 0,01 мг до 100 мг на кг массы тела на дозу. Альтернативно, ее можно выбирать из дозы от 5 до 5000 мг, предпочтительно - от 10 до 500 мг на пациента. Однако, доза фармацевтической композиции, содержащей моноклональное антитело или его фрагмент по настоящему изобретению, не ограничена этими дозами. Период введения также можно соответствующим образом выбирать в зависимости от возраста или симптомов пациента. Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый носитель или добавку в зависимости от пути введения. Примеры носителя и добавки включают воду, фармацевтически приемлемый органический растворитель, коллаген, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, альгинат натрия, водорастворимый декстран, пектин, метилцеллюлозу, этилцеллюлозу, казеин, диглицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, петролатум, сывороточный альбумин человека (HSA), маннит, сорбит, лактозу и поверхностно-активное вещество, приемлемое в качестве фармацевтической добавки. Используемые добавки, в качестве неограничивающих примеров, выбирают по мере необходимости или из комбинации указанных выше веществ в зависимости от лекарственной формы.
[0076]
Настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, кодирующему вариабельную область легкой цепи или вариабельную область тяжелой цепи моноклонального антитела по настоящему изобретению. Настоящее изобретение дополнительно включает экспрессирующий вектор, содержащий полинуклеотид.
[0077]
Полинуклеотид конкретно не ограничен при условии, что он кодирует вариабельную область легкой цепи или вариабельную область тяжелой цепи моноклонального антитела по настоящему изобретению, и он является полимером, состоящим из нуклеотидов, таких как множество дезоксирибонуклеиновых кислот (ДНК) или рибонуклеиновых кислот (РНК). Он может включать неприродный нуклеотид. Полинуклеотид по настоящему изобретению можно использовать для получения антител способами генетической инженерии. Полинуклеотид по настоящему изобретению также можно использовать в качестве зонда для скрининга антитела, имеющего ту же функцию, что и моноклональное антитело по настоящему изобретению. Т.е. полинуклеотид, кодирующий моноклональное антитело по настоящему изобретению или его часть, можно использовать в качестве зонда в способах, таких как способы гибридизации, амплификации гена (например, ПЦР) или тому подобное, для получения ДНК, гибридизующейся с полинуклеотидом в строгих условиях и кодирующей антитело, имеющее активность, эквивалентную моноклональному антителу по настоящему изобретению. Такая ДНК также включена в полинуклеотид по настоящему изобретению.
[0078]
Способы гибридизации (Sambrook, J et al., Molecular Cloning 2nd ed., 9,47-9,58, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) являются способами, хорошо известными специалистам в этой области. Примеры условий гибридизации включают условия низкой строгости. Условия низкой строгости являются, например, условиями, представляющими собой 42°C, 0,1-кратный SSC, 0,1% SDS, предпочтительно - условиями, представляющими собой 50°C, 0,1-кратный SSC, 0,1% SDS, при промывке после гибридизации. Примеры более предпочтительных условий гибридизации включают условия высокой строгости. Условия высокой строгости являются, например, условиями, представляющими собой 65°C, 5-кратный SSC и 0,1% SDS. При этих условиях можно ожидать, что полинуклеотиды, имеющие высокую гомологию, эффективно получают с повышением температуры. Однако, считают, что на строгость гибридизации влияют многие факторы, такие как температура и концентрация соли. Специалисты в этой области могут достигать той же строгости, выбирая эти факторы, при необходимости.
[0079]
Антитела, являющиеся функционально эквивалентными моноклональному антителу по настоящему изобретению, кодируемые полинуклеотидами, получаемыми этими способами гибридизации и амплификации гена, как правило, имеют высокую гомологию с аминокислотной последовательностью антитела. Термин "моноклональное антитело по настоящему изобретению" также относится к антителу, функционально эквивалентному моноклональному антителу по настоящему изобретению и имеющему высокую гомологию с аминокислотной последовательностью антитела. Термин "высокая гомология", как правило, относится по меньшей мере к 75% идентичности или более, предпочтительно - 85% идентичности или более, более предпочтительно - 95% идентичности или более на уровне аминокислот. Гомологию полипептида можно определять с помощью алгоритма, описанного в Wilbur, W. J. and Lipman, D. J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80, 726-730.
[0080]
Моноклональное антитело или его фрагмент по настоящему изобретению специфически связывается с CCR8, и, таким образом, его можно использовать для детекции CCR8 в биологическом образце. Примеры биологического образца включают кровь, плазму, сыворотку, мочу, орган, ткань, костный мозг и лимфоузел. Таким образом, набор, содержащий моноклональное антитело по настоящему изобретению, доступен в виде набора для детекции CCR8. Набор содержит моноклональное антитело или его фрагмент по настоящему изобретению и может дополнительно содержать вторичное антитело для мечения, субстрат, необходимый для детекции метки, носитель, промывочный буфер, буфер для разведения образцов, субстрат фермента, раствор для остановки реакции, белок CCR8 в качестве очищенного стандарта вещества, инструкции по использованию и тому подобное.
[0081]
Настоящее изобретение также относится к моноклональному антителу или его фрагменту, связывающемуся с CCR8, распознающему участок на антигене, распознаваемом моноклональным антителом или его фрагментом по настоящему изобретению. Т.е. в настоящее изобретение также включены моноклональные антитела или их фрагменты, конкурирующие с моноклональным антителом или его фрагментом по настоящему изобретению за связывание с CCR8. Такие антитела можно выбирать, например, осуществляя конкурентные эксперименты с использованием антител, таких как клон №10A11 в примере 3, или антител, имеющих последовательности CDR, представленные в настоящем описании, в вариабельных областях легкой и тяжелой цепи.
[ПРИМЕРЫ]
[0082]
Далее в настоящем описании настоящее изобретение будет более подробно описано с помощью примеров по настоящему изобретению, но настоящее изобретение ими не ограничено.
[0083]
Пример 1. Получение гибридомы мыши, продуцирующей антитело против CCR8 человека
Ген, кодирующий полноразмерный CCR8 человека (UniProtKB/Swiss-Prot: P51685), использовали в качестве антигена и осуществляли ДНК-иммунизацию самок мышей A/J Jms Slc. ДНК-иммунизацию повторяли два или три раза с двухнедельными интервалами и проводили бустерную иммунизацию посредством интраперитонеального введения экспрессирующих CCR8 человека клеток Expi293 через одну неделю после конечной иммунизации. Через три дня селезенку удаляли, спленоциты и миеломные клетки мыши (p3×6363-Ag8., Tokyo Oncology Institute) подвергали слиянию способом с использованием PEG и осуществляли селекцию в среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин. Используя полученный супернатант культуры, антитела против CCR8 человека и нейтрализующие антитела против CCR8 человека подвергали селекции следующим способом.
В случае антител против CCR8 человека супернатант культуры подвергали реакции с экспрессирующими CCR8 человека клетками Expi293 и экспрессирующими CCR4 человека клетками Expi293, соответственно, и клоны, специфически связывающиеся только с CCR8 человека, подвергали селекции посредством детекции с использованием меченых Alexa488 антител против IgG мыши (производимых Thermo Fisher Scientific).
2+
2+
2+
В случае нейтрализующих антител против CCR8 человека супернатант культуры в достаточной степени подвергали реакции с экспрессирующими CCR8 человека клетками 293, в которые заранее включали индикаторный Ca, затем измеряли поток Ca посредством добавления 200 нМ hCCL1 (производимого BioLegend) с помощью FLIPR и выбирали клоны, ингибирующие поток Ca при стимуляции с помощью hCCL1.
Клоны, демонстрирующие особенно сильную нейтрализующую активность (% ингибирования >80%), и клоны, не имеющие нейтрализующей активности, соответствующим образом клонировали для получения гибридом.
[0084]
Пример 2. Получение гибридомы крысы, продуцирующей антитело против CCR8 человека
Иммуноген, экспрессирующую CCR8 человека клетку Rat-1, получали посредством трансфекции клеток Rat-1 с использованием экспрессирующего вектора, где ген CCR8 человека клонировали в pQCXIP (Clontech Laboratories, Inc.), а затем клетки подвергали селекции с помощью лекарственного средства пуромицина (1 мкг/мл) в течение одного месяца.
Экспрессирующие CCR8 человека клетки Rat-1 использовали для однократной иммунизации крыс. Через приблизительно две недели собирали лимфоузлы и рутинным способом получали гибридомы.
В случае антител против CCR8 человека супернатант культур гибридом подвергали реакции с экспрессирующими CCR8 человека клетками 293 и клетками 293, соответственно, и клоны, способные к специфическому связыванию с CCR8 человека, подвергали селекции посредством детекции с использованием меченых Alexa647 антител против IgG крысы (производимых Thermo Fisher Scientific).
[0085]
Пример 3. Анализ эпитопов нейтрализующих и ненейтрализующих антител против CCR8 человека
2+
2+
50
Супернатанты культур гибридом, продуцирующих антитела против CCR8 человека, полученных в примере 1, культивируемых в бессывороточной среде, подвергали очистке с протеином G и очистке посредством гель-фильтрации для получения очищенных антител из 40 клонов. Из полученных 40 клонов очищенные антитела из 27 нейтрализующих антител и 13 ненейтрализующих антител использовали для тестирования связывания антигена описанным ниже способом для идентификации эпитопов, важных для нейтрализующей активности. Что касается нейтрализующей активности каждого клона, ингибиторную активность против потока Ca измеряли посредством добавления 100 нМ hCCL1 (производимого BioLegend) с помощью FLIPR способом, описанным в примере 1. Каждое нейтрализующее антитело имело значение IC 2 нМ или менее в отношении активности ингибирования потока Ca при стимуляции с помощью 100 нМ hCCL1.
Ген, кодирующий полноразмерный CCR8 человека (UniProtKB/Swiss-Prot: P51685, SEQ ID NO: 1), ген, кодирующий полноразмерный CCR4 человека (UniProtKB/Swiss-Prot: P51679, SEQ ID NO: 48), и ген, кодирующий полноразмерный CCR8 мыши (UniProtKB/Swiss-Prot: P56484, SEQ ID NO: 39), клонировали в векторы pcDNA 3.4, соответственно. Эти векторы использовали для трансфекции для получения клеток Expi293, транзиторно экспрессирующих CCR8 человека, CCR4 человека или CCR8 мыши. Эти клетки подвергали реакции с серийными разведениями очищенных антител каждого клона и оценивали их связывающие свойства посредством детекции с помощью меченого Alexa488 антитела против мышь IgG (производимого Thermo Fisher Scientific). В результате, каждое антитело связывалось с CCR8 человека, но совсем не связывалось с CCR4 человека и CCR8 мыши.
Затем получали химеры (фигура 1), в которых внеклеточные домены CCR8 человека, N-концевую область (аминокислоты 1-35 SEQ ID NO: 1), область петли 1 (аминокислоты 94-107 SEQ ID NO: 1), область петли 2 (аминокислоты 172-202 SEQ ID NO: 1) и область петли 3 (аминокислоты 264-280 SEQ ID NO: 1) заменяли соответствующими областями CCR4 человека, N-концевой областью (аминокислоты 1-39 SEQ ID NO: 48), областью петли 1 (аминокислоты 98-111 SEQ ID NO: 48), областью петли 2 (аминокислоты 176-206 SEQ ID NO: 48) и областью петли 3 (аминокислоты 268-284 SEQ ID NO: 48), соответственно, и оценивали связывание каждого антитела способом, схожим с описанным выше.
Оценивали связывание при 5 мкг/мл, 0,5 мкг/мл и 0,05 мкг/мл, и, сравнивая с CCR8 человека дикого типа (hCCR8), антитело, имеющее значимо сниженную связывающую активность, обозначали с помощью Δ, а антитело, имеющее связывающую активность на пределе чувствительности или менее, обозначали с помощью ×. Пустой столбец означает, что наблюдают ту же связывающую активность, что и в случае CCR8 человека дикого типа (hCCR8).
В результате, как показано в таблице 2, все антитела, имеющие нейтрализующую активность, имели связывающую активность на пределе чувствительности или менее в результате замены N-концевой области на CCR4 человека (N-конец hCCR4-hCCR8), таким образом, показано, что N-концевая область является важным эпитопом для индуцирования нейтрализующей активности. Кроме того, также снижались активности связывания CCR8 человека с заменой на петлю 1 CCR4 человека и CCR8 человека с заменой на петлю 2 CCR4 человека. Учитывая изложенное выше, считают, что антитела против CCR8, имеющие сильную нейтрализующую активность, обладают сильным стереоструктурным распознаванием N-концевой области и связываются с петлей 1 и петлей 2.
Необходимо отметить, что, хотя в качестве контроля использовали антитело, не распознающее любой из CCR8 человека, CCR4 человека и CCR8 мыши, контрольное антитело не связывалось с каждым антигеном. Отсутствие снижения экспрессии hCCR8 в результате мутации также подтверждали посредством присоединения метки к N-концу каждого антигена и детекции с помощью антитела против метки.
Кроме того, для более подробного анализа N-концевой области, являющейся эпитопной областью, общей для всех клонов, имеющих сильную нейтрализацию, получали точечных мутантов CCR8 человека, приведенные в таблице 2. В результате оценки связывающей активности каждого клона в отношении мутантов способом, схожим с описанным выше способом, все 27 нейтрализующих антител, описанных выше, имели значимое снижение своей связывающей активности в отношении мутанта, в котором Y в положении 17 CCR8 человека заменяют A (hCCR8 (Y17A)), до предела чувствительности или ниже. Таким образом, считают, что нейтрализующие антитела распознают Y в положении 17. Кроме того, хотя в таблице 2 приведен только клон №8F7, многие другие нейтрализующие антитела имели сниженную связывающую активность в отношении мутанта, в котором I в положении 20 CCR8 человека заменяют A (hCCR8 (I20A)). Таким образом, считают, что некоторые нейтрализующие антитела обладают стереоструктурным распознаванием, связываясь с изолейцином в положении 20.
При этом у 13 описанных выше ненейтрализующих антител не снижалась связывающая активность в отношении hCCR8 (Y17A), и, таким образом, считают, что они распознают ту же N-концевую область, но не Y в положении 17. Учитывая изложенное выше, считают, что Y в положении 17 является аминокислотой, крайне важной для индуцирования нейтрализующей активности. Результаты для типичных нейтрализующих антитела (клоны №№10A11, 27G1, 1H4, 8F7, 2C7) и ненейтрализующие антитела (клон №5B5) приведены в таблице 2.
[0086]
[Таблица 2]
№ клона
10A11
27G1
1H4
8F7
2C7
5B5*
Нейтрализующая активность IC50 (нМ)
0,08
0,09
0,32
1,56
0,40
>1000
hCCR8
hCCR4
×
×
×
×
×
×
mCCR8
×
×
×
×
×
×
N-конец hCCR4-hCCR8
×
×
×
×
×
Δ
Петля 1 hCCR4-hCCR8
Δ
Δ
Δ
×
×
Петля 2 hCCR4-hCCR8
Δ
Δ
Δ
Δ
Δ
Петля 3 hCCR4-hCCR8
hCCR8 (L5A)
Δ
Δ
hCCR8 (D6A)
hCCR8 (L7A)
hCCR8 (S8A)
hCCR8 (T10A)
Δ
hCCR8 (T11A)
Δ
hCCR8 (V12A)
hCCR8 (T13A)
hCCR8 (Y15A)
hCCR8 (Y16A)
hCCR8 (Y17A)
×
×
×
×
×
hCCR8 (I20A)
Δ
hCCR8 (S22A)
Δ
hCCR8 (S23A)
hCCR8 (L29A)
hCCR8 (I30A)
Δ
hCCR8 (Q31A)
hCCR8 (T32A)
hCCR8 (N33A)
hCCR8 (G34A)
hCCR8 (K35A)
×
Δ
*ненейтрализующие антитела
[0087]
Пример 4. Определение последовательностей антител
Среди полученных клонов в случае антитела мыши, приведенного в таблице 3, и антитела крысы, приведенного в таблице 4, аминокислотные последовательности вариабельных областей легких и тяжелых цепей определяли в гибридомных клетках рутинным способом.
[0088]
[Таблица 3]
mAb
SEQ ID NO:
SEQ ID NO:
SEQ ID NO:
SEQ ID NO:
10A11
Легкая цепь
26
CDR1
2
Тяжелая цепь
27
CDR1
5
CDR2
3
CDR2
6
CDR3
4
CDR3
7
27G1
Легкая цепь
26
CDR1
2
Тяжелая цепь
28
CDR1
8
CDR2
3
CDR2
6
CDR3
4
CDR3
7
1H4
Легкая цепь
29
CDR1
2
Тяжелая цепь
30
CDR1
8
CDR2
3
CDR2
6
CDR3
4
CDR3
7
19D7
Легкая цепь
31
CDR1
2
Тяжелая цепь
32
CDR1
8
CDR2
9
CDR2
6
CDR3
10
CDR3
11
8F7
Легкая цепь
33
CDR1
2
Тяжелая цепь
34
CDR1
12
CDR2
3
CDR2
6
CDR3
10
CDR3
13
2C7
Легкая цепь
35
CDR1
14
Тяжелая цепь
36
CDR1
17
CDR2
15
CDR2
18
CDR3
16
CDR3
19
[0089]
[Таблица 4]
mAb
SEQ ID NO:
SEQ ID NO:
SEQ ID NO:
SEQ ID NO:
2-7B
Легкая цепь
37
CDR1
20
Тяжелая цепь
38
CDR1
23
CDR2
21
CDR2
24
CDR3
22
CDR3
25
[0090]
Пример 5. Выравнивание последовательностей антител
Аминокислотные последовательности легкой и тяжелой цепи нейтрализующих антител против CCR8 человека из гибридомных клеток мыши, описанных в примере 4, выравнивали с нумерацией по Kabat с использованием программного обеспечения для анализа последовательностей антител abYsis (фигуры 2 и 3). В результате, аминокислотные последовательности 10A11, 27G1, 1H4, 19D7 и 8F7 содержали последовательности, схожие с CDR, как описано ниже.
CDR1 легкой цепи состояла из 16 аминокислот SEQ ID NO: 2.
CDR2 легкой цепи состояла из 7 аминокислот R-Xaa1-S-N-L-A-S (где Xaa1 является M или V: SEQ ID NO: 49) (SEQ ID NO: 3 или 9).
CDR3 легкой цепи состояла из 9 аминокислот M-Q-H-L-E-Y-P-Xaa1-T (где Xaa1 является L или F: SEQ ID NO: 50) (SEQ ID NO: 4 или 10).
CDR1 тяжелой цепи состояла из 5 аминокислот Xaa1-Y-A-Xaa2-Y (где Xaa1 является T или P, и Xaa2 является L или M: SEQ ID NO: 51) (SEQ ID NO: 5, 8 или 12).
CDR2 тяжелой цепи состояла из 19 аминокислот SEQ ID NO: 6.
CDR3 тяжелой цепи, общая для 10A11, 27G1, 1H4, состояла из 14 аминокислот SEQ ID NO: 7.
[0091]
Пример 6. Оценка нейтрализующей активности
Полученные гибридомы культивировали в бессывороточной среде и супернатант культуры подвергали аффинной очистке с протеином G и очистке для гель-фильтрации для получения очищенного антитела. Нейтрализующую активность очищенного антитела измеряли способом, описанным ниже.
2+
2+
50
50
Разведенное средой антитело добавляли к экспрессирующим CCR8 человека клеткам 293, в которые заранее добавляли индикаторный Ca, и измеряли поток Ca посредством добавления 200 нМ hCCL1 (производимого BioLegend) с помощью FLIPR. Степень ингибирования вычисляли, принимая сигнал без добавления hCCL1 в качестве степени ингибирования 100%, а сигнал при добавлении hCCL1 и без добавления антитела - в качестве степени ингибирования 0%, и концентрацию антитела, при которой наблюдали степень ингибирования 50%, принимали за IC. Оценку осуществляли по меньшей мере трижды и выражали IC как среднее значение±SD (таблица 5).
[0092]
[Таблица 5]
Клон
IC<sub>50</sub> (нМ)
10A11
0,23±0,10
27G1
0,27±0,06
1H4
0,36±0,10
19D7
0,18±0,06
8F7
3,03±0,91
2C7
1,19±0,64
2-7B
0,23±0,10
[0093]
Пример 7. Гуманизация антител (10A11, 2C7)
Гуманизацию осуществляли для 10A11, 2C7 описанными ниже способами.
Определение нумерации по Kabat и CDR осуществляли с использованием программного обеспечения для анализа последовательностей антител abYsis. Акцепторные последовательности репродуктивной системы человека, аналогичные последовательностям области V-гена тяжелых и легких цепей аминокислотных последовательностей антител мыши, подвергали поиску и выбору с использованием программного обеспечения для анализа последовательностей Absis. В случае области J-цепи последовательности, в высокой степени гомологичные последовательностям ДНК антител мыши, подвергали поиску с использованием IMGT (http://www.imgt.org/) и использовали их в качестве каркасных последовательностей человека. На эти каркасные последовательности человека, CDR1, CDR2, CDR3 тяжелой цепи антитела мыши и CDR1, CDR2, CDR3 легкой цепи антитела мыши, определяемые с помощью нумерации по Kabat (Wu, T. T. and Kabat, E.A., J Exp. Med. Aug 1; 132 (2): 211-50. (1970)), имплантировали для конструирования последовательности гуманизированного моноклонального антитела (легкая цепь; фигура 4, тяжелая цепь; фигура 5). Нейтрализующую активность измеряли способом, описанным в примере 6, что приводило к тому, что гуманизированное моноклональное антитело, приведенное в таблице 6, демонстрировало аффинность, равную или большую, чем у антитела мыши.
[0094]
[Таблица 6]
mAb
Легкая цепьSEQ ID NO:
Тяжелая цепьSEQ ID NO:
IC<sub>50</sub> (нМ)
h10A11 (IGKV3-20/IGHV3-15 T94R)
40
41
0,16±0,08
h10A11 (IGKV4-1/IGHV3-15 T94R)
42
41
0,15±0,10
h10A11 (IGKV1-39/IGHV3-15 T94R)
43
41
0,20±0,08
h10A11 (IGKV2-40/IGHV3-15 T94R)
44
41
0,30±0,12
h10A11 (IGKV1-16/IGHV3-15 T94R)
45
41
0,70±0,36
h10A11 (IGKV3-20/IGHV3-73)
40
46
0,22±0,07
h10A11 (IGKV4-1/IGHV3-73)
42
46
0,17±0,09
h10A11 (IGKV1-39/IGHV3-73)
43
46
0,16±0,08
h10A11 (IGKV2-40/IGHV3-73)
44
46
0,21±0,06
h10A11 (IGKV2-28/IGHV3-73)
47
46
0,20±0,05
h10A11 (IGKV1-16/IGHV3-73)
45
46
0,31±0,08
m10A11
26
27
0,23±0,10
[0095]
Пример 7-2. Гуманизация антитела (19D7)
В случае 19D7 гуманизацию осуществляли аналогично примеру 7 (легкая цепь; фигура 6, тяжелая цепь; фигура 7). Нейтрализующую активность измеряли способом, описанным в примере 6, что приводило к тому, что гуманизированное моноклональное антитело, приведенное в таблице 7, демонстрировало аффинность, равную или большую, чем у антитела мыши.
[0096]
[Таблица 7]
mAb
Легкая цепьSEQ ID NO:
Тяжелая цепьSEQ ID NO:
IC<sub>50</sub> (нМ)
h19D7 (IGKV3-15/IGHV3-15 T94R)
54
57
0,18±0,04
h19D7 (IGKV2-18/IGHV3-15 T94R)
55
57
0,27±0,05
h19D7 (IGKV3-20/IGHV3-15 T94R)
56
57
0,24±0,04
h19D7 (IGKV3-15/IGHV3-73)
54
58
0,27±0,06
h19D7 (IGKV2-18/IGHV3-73)
55
58
0,46±0,12
h19D7 (IGKV3-20/IGHV3-73)
56
58
0,31±0,04
m19D7
31
32
0,18±0,06
[0097]
Пример 8. Идентификация аминокислот, важных для активности гуманизированного 10A11
50
50
50
50
50
В случае гуманизированного 10A11, приведенного на фигурах 4 и 5, получали мутантов, в которые встраивали точечные мутации в аминокислоты, соответствующие CDR, и нейтрализующую активность каждого мутанта вычисляли способом, описанным в примере 6. Оценку нейтрализующей активности осуществляли многократно для каждого мутанта, и значение IC выражали с помощью соотношения IC (IC WT/IC мутанта), являющегося соотношением со значением IC WT.
50
Результаты приведены в таблицах 8 и 9. "N.d." (= недетектируемо) означает, что значение IC мутанта составляет 10 нМ или более, значение предела системы измерения, и активность снижается до предела чувствительности или ниже. В результате оценки нейтрализующей активности в случае легких цепей активности каждого мутанта S26T, K27R, L27cI и E93D, имеющего мутации в положениях аминокислот L26, L27, L27c и L93 при нумерации по Kabat, соответственно, снижались в 10 раз или более (таблица 8). В случае тяжелых цепей активности каждого мутанта A33V, Y35F, R52K, N53Q, Y59F, R96K, F97L, Y98F, G100cA, D101E, имеющего мутации в положениях аминокислот H33, H35, H52, H53, H59, H96, H97, H98, H100c, H101 при нумерации по Kabat, соответственно, снижались в 10 раз или более (таблица 9). Эти аминокислоты крайне важны для активности.
[0098]
[Таблица 8]
Каркас легкой цепи
Каркас тяжелой цепи
Мутация CDR легкой цепи
Соотношение IC<sub>50</sub>
IGKV4-1Мутант
IGHV3-15T94R
R24K
0,16
S26T
0,05
K27R
n.d.
L27cI
0,05
H27dR
0,18
N28Q
0,79
G29A
0,18
N30Q
0,19
T31S
0,50
L33I
0,70
Y34F
0,25
M51L
0,24
N53Q
2,10
L54I
1,18
M89L
0,49
H91R
0,15
L92I
1,27
E93D
n.d.
Y94F
0,87
P95G
0,20
L96I
0,56
wt
1,00
*положение аминокислоты является положением при нумерации по Kabat.
[0099]
[Таблица 9]
Каркас легкой цепи
Каркас тяжелой цепи
Мутация CDR тяжелой цепи
Соотношение IC<sub>50</sub>
IGKV4-1
IGHV3-73Мутант
T31A
0,17
Y32F
0,44
A33V
n.d.
L34I
0,43
Y35F
n.d.
R50K
0,12
I51L
0,22
R52K
n.d.
S52aT
0,22
K52bR
0,47
S52cT
0,53
N53Q
0,03
Y55F
0,47
A56V
0,55
T57S
0,49
Y58F
0,50
Y59F
0,03
A60V
0,67
D61E
0,25
S62T
1,60
V63L
0,56
K64R
0,54
D65E
1,30
R96K
n.d.
F97L
n.d.
Y98F
0,07
Y99F
0,80
S100T
0,64
D100aE
0,30
Y100bF
0,75
G100cA
0,07
Y100dF
0,55
A100eV
0,49
M100fL
0,72
D101E
n.d.
Y102F
0,99
wt
1,00
*положение аминокислоты является положением при нумерации по Kabat.
[0100]
Пример 8-2. Идентификация аминокислот, важных для активности гуманизированного 19D7
50
50
50
50
50
В случае гуманизированного 19D7, приведенного на фигурах 6 и 7, получали мутантов, в которые встраивали точечные мутации в аминокислоты, соответствующие CDR, и нейтрализующую активность каждого мутанта вычисляли способом, описанным в примере 6. Оценку нейтрализующей активности осуществляли многократно для каждого мутанта, и значение IC выражали с помощью соотношения IC (IC WT/IC мутанта), являющегося соотношением со значением IC WT.
50
Результаты приведены в таблицах 10 и 11. "N.d." (= недетектируемо) означает, что значение IC мутанта составляет 10 нМ или более, значение предела системы измерения, и активность снижается до предела чувствительности или ниже.
[0101]
[Таблица 10]
Каркас легкой цепи
Каркас тяжелой цепи
Мутация CDR легкой цепи
Соотношение IC<sub>50</sub>
IGKV3-20Мутант
IGHV3-15T94R
R24K
0,94
S25T
0,63
S26T
0,79
K27R
0,77
S27aT
1,01
L27bI
0,26
L27cI
0,68
H27dR
n.d.
S27eT
0,58
N28Q
0,02
G29A
0,75
N30Q
0,64
T31S
0,61
Y32F
0,33
L33I
0,20
Y34F
0,78
R50K
0,52
V51L
0,67
S52T
0,60
N53Q
0,49
L54I
0,85
A55V
0,66
S56T
0,69
M89L
0,85
Q90N
1,01
H91R
0,05
L92I
0,43
E93D
0,58
Y94F
0,69
P95G
0,34
F96L
0,10
T97S
0,53
N28A
0,05
N28E
n.d.
N28F
n.d.
N28G
n.d.
N28I
n.d.
N28K
n.d.
N28L
n.d.
N28P
n.d.
N28R
n.d.
N28S
n.d.
N28T
n.d.
N28Y
n.d.
N28V
0,14
*положение аминокислоты является положением при нумерации по Kabat.
[0102]
[Таблица 11]
Каркас легкой цепи
Каркас тяжелой цепи
Мутация CDR тяжелой цепи
Соотношение IC<sub>50</sub>
IGKV3-20
IGHV3-15T94RМутант
T31S
1,22
Y32F
0,77
A33V
0,32
M34L
0,64
Y35F
n.d.
R50K
n.d.
I51L
0,79
R52K
n.d.
S52aT
0,58
K52bR
0,69
S52cT
0,25
N53Q
n.d.
N54Q
0,48
Y55F
0,98
A56V
0,60
T57S
0,61
Y58F
0,67
Y59F
0,50
A60V
0,74
D61E
0,65
S62T
0,74
V63L
0,73
K64R
1,45
D65E
0,88
G95A
0,53
G96A
0,02
Y97F
0,80
G98A
0,73
N99Q
0,85
Y100F
0,60
R100aK
0,11
Y100bF
n.d.
A100cV
n.d.
M100dL
0,60
D101E
0,19
Y102F
0,62
*положение аминокислоты является положением при нумерации по Kabat.
[0103] Пример 9. Повышение активности гуманизированного 10A11
Оптимизацию гуманизированного 10A11 осуществляли посредством комбинирования повышающих активность мутаций, приведенных в примере 8, и мутаций N в L28 и G в L29 в положении аминокислоты при нумерации по Kabat, соответствующей последовательности, имеющей риск дезамидирования, при этом гуманизированный каркас приведен в примере 7. В результате получали мутантное гуманизированное 10A11, приведенное в таблице 12.
[0104]
[Таблица 12]
Вариабельная область легкой цепи
Вариабельная область тяжелой цепи
IC<sub>50</sub> (нМ)
Каркас
Мутация
Каркас
IGKV4-1
N53Q
IGHV3-15 T94R
0,12±0,02
IGKV4-1
N53Q, N28K
IGHV3-15 T94R
0,29±0,04
IGKV4-1
N53Q, G29L
IGHV3-15 T94R
0,18±0,02
IGKV4-1
N53Q, G29R
IGHV3-15 T94R
0,12±0,04
IGKV4-1
G29R
IGHV3-15 T94R
0,20±0,05
IGKV3-20
N53Q
IGHV3-15 T94R
0,18±0,05
IGKV3-20
N53Q, N28K
IGHV3-15 T94R
0,29±0,06
IGKV3-20
N53Q, G29L
IGHV3-15 T94R
0,21±0,03
IGKV3-20
N53Q, G29R
IGHV3-15 T94R
0,19±0,02
*положение аминокислоты является положением при нумерации по Kabat.
[0105] Пример 9-2. Повышение активности гуманизированного 19D7
Оптимизацию гуманизированного 19D7 осуществляли посредством встраивания точечных мутаций в гуманизированный каркас, приведенный в примерах 7-2. В результате получали мутантное гуманизированное 19D7, приведенное в таблице 13.
[0106]
[Таблица 13]
Вариабельная область легкой цепи
Вариабельная область тяжелой цепи
IC<sub>50</sub> (нМ)
Каркас
Мутация CDR
Каркас
Мутация CDR
IGKV3-20
S25T
IGHV3-15 T94R
Нет
0,31±0,04
S26T
Нет
0,20±0,01
S27aT
Нет
0,22±0,04
Q90N
Нет
0,30±0,17
Нет
T31S
0,26±0,04
Нет
A60V
0,27±0,04
Нет
K64R
0,24±0,05
Нет
D65E
0,27±0,04
Нет
N99Q
0,22±0,04
Нет
Y102F
0,31±0,06
[0107]
Пример 10. Противоопухолевая активность антитела против CCR8 человека у мышей с инокулированными опухолями и нокином CCR8 человека (далее в настоящем описании обозначаемых как мыши hCCR8-KI (KI/KI))
(1) Получение мышей hCCR8-KI (KI/KI)
Ген CCR8 мыши (Gene ID: 12776) и ген CCR8 человека (Gene ID: 1237) состояли из двух экзонов и включали полноразмерную ORF (открытую рамку считывания) во втором экзоне. Удаляли полноразмерную ORF (CCDS ID: 23621.1) гена CCR8 мыши и встраивали полноразмерную ORF (CCDS ID: 2684.1) гена CCR8 человека, таким образом, получая мышей hCCR8-KI (KI/KI), у которых экспрессируемый белок CCR8 являлся полностью гуманизированным.
Фрагменты ДНК, подлежащие использованию в качестве гомологичных рекомбинируемых плеч, получали посредством ПЦР-амплификации геномных последовательностей мыши на приблизительно 2 т.п.н. (тысяч пар нуклеотидов) выше и ниже ORF гена CCR8 мыши, соответственно. Гомологичные рекомбинируемые плечи конструировали так, что удаляли только ORF. Гомологичные рекомбинируемые плечи как единое целое соединяли с обеими сторонами полноразмерной последовательности ORF гена CCR8 человека, соответственно, для получения направленного вектора. Направленный вектор подвергали гомологичной рекомбинации для получения мыши hCCR8-KI (KI/+) Balb/c. То, что в полученной мыши hCCR8-KI (KI/+) Balb/c полноразмерную ORF гена CCR8 мыши корректно заменяли полноразмерной ORF гена CCR8 человека, и не было инсерций в ORF и рекомбинируемых плечах, подтверждали посредством ПЦР и анализа нуклеотидной последовательности ДНК. Мышей hCCR8-KI (KI/+) Balb/c скрещивали для получения мыши hCCR8-KI (KI/KI).
[0108]
(2) Подтверждение экспрессии CCR8 человека во внутриопухолевых инфильтрирующих клетках в колоректальном раке CT26, инокулированном мышам hCCR8-KI(KI/KI)
5
3,5×10 (50 мкл) клеток CT26 инокулировали в кожу спины мышей hCCR8-KI (KI/KI) (возраст 6 недель, самки) и выделяли опухоль из 5 индивидуумов через 17 дней после инокуляции (N=5). Опухолевые массы из клеток CT26 мелко нарезали ножницами и получали инфильтрирующие опухоль клетки с использованием коммерчески доступных наборов (набор Tumor Dissociation Kit, мышь, Miltenyi Biotec, и The gentleMACS (TM) Dissociator, Miltenyi Biotec) по инструкциям производителя.
Полученные клетки пропускали через клеточное сито 70 мкм, а затем дважды промывали 10 мМ HEPES/HBSS/2% FBS. Затем клетки обрабатывали раствором для лизиса эритроцитов (BD Biosciences) в течение 5 минут для удаления эритроцитов, и дополнительно дважды промывали буфером 2% FBS/10 мМ HEPES/HBSS. Инфильтрирующие опухоль клетки окрашивали следующим способом с использованием описанных ниже антител.
Инфильтрирующие клетки окрашивали на льду с использованием реагента из набора Zombie NIR Fixable Viability Kit (BioLegend) в течение 30 минут. После одной промывки 2% FBS/10 мМ HEPES/HBSS клетки окрашивали Bv510-меченым антителом против CD45 мыши (30-F11, BioLegend), FITC-меченым антителом против CD4 мыши (RM4-4, BioLegend), PE/Cy7-меченым антителом против CD8 мыши (53-6,7, BioLegend), PerCP/Cy5.5-меченым антителом против TCRβ мыши (H57-597, BioLegend), PE-меченым антителом против CD25 мыши (PC61, BioLegend), BV421-меченым антителом против CCR8 человека антитело (433H, BD Biosciences) (или BV421-меченым антителом изотипического контроля). Окрашивание осуществляли на льду в течение 30 минут. После двукратной промывки 2% FBS/HEPES/HBSS клетки анализировали с использованием проточного цитометра.
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Анализировали экспрессию CCR8 человека в CD45TCRβCD4CD25 T-клетках. Области отрицательных клеток определяли посредством окрашивания антителами изотипического контроля, и вычисляли долю положительных клеток среди внутриопухолевых инфильтрирующих клеток в злокачественном новообразовании через 17 дней после инокуляции с учетом клеток, становящихся положительными при использовании антител против CCR8 человека в виде CCR8 человека клеток. В результате, CCR8 человека определяли в приблизительно 47% CD45TCRβCD4CD25 клетках в опухолях мышей.
[0109]
(3) Оценка противоопухолевого эффекта введения антитела против CCR8 человека в модели рака толстого кишечника CT26
5
3
Мышам hCCR8-KI (KI/KI) (возрастом 8 недель, самки) инокулировали 4×10 (50 мкл) клеток рака толстого кишечника CT26. В дни 4 и 11 после инокуляции опухолевого материала внутривенно вводили (N=10) 100 мкг (100 мкл) или 200 мкг (100 мкл) гуманизированного антитела 10A11 (вариабельная область легкой цепи: IGKV4-1 N53Q+G29R (SEQ ID NO: 59)/вариабельная область тяжелой цепи: IGHV3-15 T94R (SEQ ID NO: 41)). В качестве контроля вводили 100 мкл носителя (фосфатно-солевого буфера) (N=10). Размеры опухоли измеряли через 4, 7, 10, 11, 14, 16, 18, 21, 24 дня после инокуляции опухолевого материала. Размер опухоли (мм) измеряли как длинный диаметр (мм) × короткий диаметр (мм) × короткий диаметр (мм)/2.
В результате, размеры опухоли были значимо меньше в группе введения антитела против CCR8 человека в любой дозе через 11, 14, 16, 18, 21 и 24 дня после инокуляции (фигура 8, уровни значимости по результатам анализа t-критерия Уэлча составляли **; p<0,01 в день 10, и ***; p<0,001 в день 11 и позднее, при любой дозе). Кроме того, в группе введения антитела против CCR8 человека были индивидуумы, у которых наблюдали полное регрессирование. В день 24 опухоли исчезали почти полностью у 5 из 10 мышей в группе введения 100 мкг антитела против CCR8 человека и 6 из 10 мышей в группе введения 200 мкг антитела против CCR8 человека.
[0110]
Пример 11. Скрининг антител против CCR8 человека, конкурирующих с 10A11
Гуманизированное антитело 10A11 (вариабельная область легкой цепи: IGKV4-1/вариабельная область тяжелой цепи: IGHV3-15 T94R) использовали для осуществления скрининга на антитела, конкурирующие с антителом за связывание с hCCR8.
Аналогично способу, описанному в примере 1, ген, кодирующий полноразмерный CCR8 человека (UniProtKB/Swiss-Prot: P51685), использовали в качестве антигена и самок мышей A/J Jms Slc подвергали ДНК-иммунизации для получения гибридомы. Полученную гибридому высевали в 96-луночные планшеты и супернатант культуры в 176 лунках, полученный после 9 дней культивирования, использовали для осуществления конкурентного анализа связывание с гуманизированными антителами 10A11. Конкурентный анализ связывания осуществляли на экспрессирующих CCR8 человека клетках Expi293, полученных способом из примера 1, посредством смешивания супернатанта культуры с 10 нМ гуманизированного антитела 10A11 или изотипического контроля, проведения реакции в течение 3 часов при комнатной температуре, 3-кратной промывки PBS, а затем детекции с использованием меченого Alexa488 антитела против мышь IgG (производимого Thermo Fisher Scientific). Антитела, для которых связывание полученного посредством гибридомы антитела подтверждали в присутствии изотипического контроля, определяли как нормальные связывающие CCR8 человека антитела. Среди связывающих CCR8 человека антител, антитело, сигнал связывания которого был значимо снижен в присутствии гуманизированного антитела 10A11, идентифицировали как антитело, конкурирующее с гуманизированным антителом 10A11. В результате, антитела из 56 лунок среди 170 лунок являлись связывающими CCR8 человека антителами. В 56 лунках антитела из 7 лунок являлись антителами, конкурирующими с гуманизированным антителом 10A11.
Кроме того, из антител, идентифицированных как конкурирующие антитела, три типичных клона клонировали и после клонирования получали очищенные антитела из супернатантов гибридомных культур. В случае очищенных антител, нейтрализующую активность в отношении CCL1 человека-CCR8 человека измеряли способом из примера 1. В результате было показано, что все антитела имели нейтрализующую активность (таблица 14), и антитела, конкурирующие с гуманизированным антителом 10A11, являлись сильными нейтрализующими антителами.
[0111]
[Таблица 14]
Клон
IC<sub>50</sub> (нМ)
19B10
4,5
6D11
3,3
7F4
6,4
[0112]
Пример 12. Эпитопный анализ гуманизированных моноклональных антител
Аналогично примеру 3, осуществляли валидацию эпитопов гуманизированного антитела 10A11 и гуманизированного антитела 19D7. В дополнение к химерам CCR4 человека и точечным мутантам в N-концевой области CCR8 человека, полученным в примере 3, оценку связывания также осуществляли для точечных мутантов в области петли 1 и области петли 2 CCR8 человека. Оценку связывания осуществляли посредством транзиторной экспрессии каждого мутанта в клетках Expi293 и реакции мутанта с раствором гуманизированного антитела 10A11 (вариабельная область легкой цепи: IGKV4-1/вариабельная область тяжелой цепи: IGHV3-15 T94R) или гуманизированного антитела 19D7 (вариабельная область легкой цепи: IGKV3-20/вариабельная область тяжелой цепи: IGHV3-15 T94R), полученным с помощью 8 серийных 3-кратных разведений от 20 мкг/мл. После реакции при комнатной температуре в течение 3 часов проводили реакцию с меченым Alexa488 антителом против человек IgG (Thermo Fisher Scientific) и осуществляли анализ проточной цитометрии. Степень экспрессии каждого мутанта корректировали аналогичным образом посредством мечения N-конца каждого мутанта и детекции с использованием антитела против метки.
Результаты приведены в таблицах 15 и 16. Сравнивая с CCR8 человека, мутанта, имеющего связывающую активность 70% или менее, обозначали с помощью Δ, а мутанта, имеющего связывающую активность 20% или менее, обозначали с помощью ×.
[0113]
[Таблица 15]
Мутант
h10A11
h19D7
hCCR8
hCCR4
×
×
mCCR8
×
×
N-конец hCCR4-hCCR8
×
×
Петля 1 hCCR4-hCCR8
Δ
Δ
Петля 2 hCCR4-hCCR8
Δ
Δ
Петля 3 hCCR4-hCCR8
Δ
hCCR8 (L5A)
Δ
Δ
hCCR8 (D6A)
hCCR8 (L7A)
hCCR8 (S8A)
hCCR8 (T10A)
Δ
hCCR8 (T11A)
Δ
hCCR8 (V12A)
hCCR8 (T13A)
Δ
hCCR8 (Y15A)
Δ
hCCR8 (Y17A)
×
×
hCCR8 (I20A)
Δ
Δ
hCCR8 (S22A)
Δ
Δ
hCCR8 (S23A)
Δ
hCCR8 (L29A)
Δ
hCCR8 (I30A)
hCCR8 (Q31A)
hCCR8 (T32A)
Δ
hCCR8 (N33A)
hCCR8 (G34A)
hCCR8 (K35A)
Δ
Δ
hCCR8 (Y94A)
hCCR8 (L95A)
hCCR8 (L96A)
hCCR8 (D97A)
Δ
hCCR8 (Q98A)
hCCR8 (V100A)
hCCR8 (T103A)
[Таблица 16]
hCCR8 (V104A)
hCCR8 (M105A)
hCCR8 (K107A)
hCCR8 (Y172A)
hCCR8 (Q173A)
hCCR8 (V174A)
hCCR8 (A175G)
hCCR8 (S176A)
hCCR8 (E177A)
hCCR8 (D178A)
hCCR8 (G179A)
hCCR8 (V180A)
Δ
hCCR8 (L181A)
Δ
Δ
hCCR8 (Q182A)
hCCR8 (C183A)
×
×
hCCR8 (Y184A)
hCCR8 (S185A)
hCCR8 (F186A)
hCCR8 (Y187A)
hCCR8 (N188A)
Δ
Δ
hCCR8 (Q189A)
hCCR8 (Q190A)
hCCR8 (T191A)
hCCR8 (L192A)
hCCR8 (K193A)
Δ
hCCR8 (W194A)
hCCR8 (K195A)
hCCR8 (I196A)
hCCR8 (F197A)
hCCR8 (T198A)
hCCR8 (N199A)
hCCR8 (F200A)
[ПРОМЫШЛЕННАЯ ПРИМЕНИМОСТЬ]
[0114]
Моноклональное антитело или его фрагмент по настоящему изобретению можно использовать для детекции CCR8 в биологическом образце. Кроме того, фармацевтическую композицию, содержащую моноклональное антитело или его фрагмент по настоящему изобретению, можно использовать в качестве лекарственного средства для лечения или профилактики заболеваний, связанных с CCR8.
[СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ]
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  СИОНОГИ ЭНД КО., ЛТД.
ОСАКА ЮНИВЕРСИТИ
<120>  НОВОЕ АНТИТЕЛО ПРОТИВ CCR8
<130>  19P00085WO
<150>  JP2018-245044
<151>  2018-12-27
<150>  JP2019-099923
<151>  2019-05-29
<160>  59
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  355
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  1
Met Asp Tyr Thr Leu Asp Leu Ser Val Thr Thr Val Thr Asp Tyr Tyr
1               5                   10                  15
Tyr Pro Asp Ile Phe Ser Ser Pro Cys Asp Ala Glu Leu Ile Gln Thr
20                  25                  30
Asn Gly Lys Leu Leu Leu Ala Val Phe Tyr Cys Leu Leu Phe Val Phe
35                  40                  45
Ser Leu Leu Gly Asn Ser Leu Val Ile Leu Val Leu Val Val Cys Lys
50                  55                  60
Lys Leu Arg Ser Ile Thr Asp Val Tyr Leu Leu Asn Leu Ala Leu Ser
65                  70                  75                  80
Asp Leu Leu Phe Val Phe Ser Phe Pro Phe Gln Thr Tyr Tyr Leu Leu
85                  90                  95
Asp Gln Trp Val Phe Gly Thr Val Met Cys Lys Val Val Ser Gly Phe
100                 105                 110
Tyr Tyr Ile Gly Phe Tyr Ser Ser Met Phe Phe Ile Thr Leu Met Ser
115                 120                 125
Val Asp Arg Tyr Leu Ala Val Val His Ala Val Tyr Ala Leu Lys Val
130                 135                 140
Arg Thr Ile Arg Met Gly Thr Thr Leu Cys Leu Ala Val Trp Leu Thr
145                 150                 155                 160
Ala Ile Met Ala Thr Ile Pro Leu Leu Val Phe Tyr Gln Val Ala Ser
165                 170                 175
Glu Asp Gly Val Leu Gln Cys Tyr Ser Phe Tyr Asn Gln Gln Thr Leu
180                 185                 190
Lys Trp Lys Ile Phe Thr Asn Phe Lys Met Asn Ile Leu Gly Leu Leu
195                 200                 205
Ile Pro Phe Thr Ile Phe Met Phe Cys Tyr Ile Lys Ile Leu His Gln
210                 215                 220
Leu Lys Arg Cys Gln Asn His Asn Lys Thr Lys Ala Ile Arg Leu Val
225                 230                 235                 240
Leu Ile Val Val Ile Ala Ser Leu Leu Phe Trp Val Pro Phe Asn Val
245                 250                 255
Val Leu Phe Leu Thr Ser Leu His Ser Met His Ile Leu Asp Gly Cys
260                 265                 270
Ser Ile Ser Gln Gln Leu Thr Tyr Ala Thr His Val Thr Glu Ile Ile
275                 280                 285
Ser Phe Thr His Cys Cys Val Asn Pro Val Ile Tyr Ala Phe Val Gly
290                 295                 300
Glu Lys Phe Lys Lys His Leu Ser Glu Ile Phe Gln Lys Ser Cys Ser
305                 310                 315                 320
Gln Ile Phe Asn Tyr Leu Gly Arg Gln Met Pro Arg Glu Ser Cys Glu
325                 330                 335
Lys Ser Ser Ser Cys Gln Gln His Ser Ser Arg Ser Ser Ser Val Asp
340                 345                 350
Tyr Ile Leu
355
<210>  2
<211>  16
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR1 VL 10A11
<400>  2
Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr
1               5                   10                  15
<210>  3
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR2 VL 10A11
<400>  3
Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser
1               5
<210>  4
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR3 VL 10A11
<400>  4
Met Gln His Leu Glu Tyr Pro Leu Thr
1               5
<210>  5
<211>  5
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR1 VH 10A11
<400>  5
Thr Tyr Ala Leu Tyr
1               5
<210>  6
<211>  19
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR2 VH 10A11
<400>  6
Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
1               5                   10                  15
Val Lys Asp
<210>  7
<211>  14
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR3 VH 10A11
<400>  7
Ala Arg Phe Tyr Tyr Ser Asp Tyr Gly Tyr Ala Met Asp Tyr
1               5                   10
<210>  8
<211>  5
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR2 VH 27G1
<400>  8
Thr Tyr Ala Met Tyr
1               5
<210>  9
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR2 VL 19D7
<400>  9
Arg Val Ser Asn Leu Ala Ser
1               5
<210>  10
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR3 VL 19D7
<400>  10
Met Gln His Leu Glu Tyr Pro Phe Thr
1               5
<210>  11
<211>  12
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR3 VH 19D7
<400>  11
Gly Gly Tyr Gly Asn Tyr Arg Tyr Ala Met Asp Tyr
1               5                   10
<210>  12
<211>  5
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR1 VH 8F7
<400>  12
Pro Tyr Ala Met Tyr
1               5
<210>  13
<211>  8
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR3 VH 8F7
<400>  13
Gly His Gln Gly Thr Met Asp Tyr
1               5
<210>  14
<211>  16
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR1 VL 2C7
<400>  14
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His
1               5                   10                  15
<210>  15
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR2 VL 2C7
<400>  15
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1               5
<210>  16
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR3 VL 2C7
<400>  16
Ser Gln Ser Thr Gln Val Pro Leu Thr
1               5
<210>  17
<211>  5
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR1 VH 2C7
<400>  17
Ala Tyr Gly Val His
1               5
<210>  18
<211>  16
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR2 VH 2C7
<400>  18
Val Ile Trp Arg Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Met Ser
1               5                   10                  15
<210>  19
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR3 VH 2C7
<400>  19
Lys Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
1               5
<210>  20
<211>  15
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR1 VL 2-7B
<400>  20
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ile Ser Arg Tyr Asn Ile Met His
1               5                   10                  15
<210>  21
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR2 VL 2-7B
<400>  21
Arg Ala Ser Asn Leu Ala Ser
1               5
<210>  22
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR3 VL 2-7B
<400>  22
Gln Gln Ser Arg Glu Ser Pro Pro Thr
1               5
<210>  23
<211>  5
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR1 VH 2-7B
<400>  23
Asp Tyr Tyr Met Ala
1               5
<210>  24
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR2 VH 2-7B
<400>  24
Thr Ile Thr Tyr Asp Val Tyr Ser Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>  25
<211>  14
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR3 VH 2-7B
<400>  25
His Gly Gly Asp Gly Tyr Asn Ser Gly Asn Trp Phe Ala Tyr
1               5                   10
<210>  26
<211>  113
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VL 10A11
<400>  26
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Pro Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His
85                  90                  95
Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100                 105                 110
Arg
<210>  27
<211>  125
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VH 10A11
<400>  27
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Gln Pro Lys Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Asn Thr Tyr
20                  25                  30
Ala Leu Tyr Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50                  55                  60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Met
65                  70                  75                  80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr
85                  90                  95
Tyr Cys Val Arg Ala Arg Phe Tyr Tyr Ser Asp Tyr Gly Tyr Ala Met
100                 105                 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115                 120                 125
<210>  28
<211>  125
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VH 27G1
<400>  28
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Gln Pro Lys Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Asn Thr Tyr
20                  25                  30
Ala Met Tyr Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50                  55                  60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Met
65                  70                  75                  80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr
85                  90                  95
Tyr Cys Val Arg Ala Arg Phe Tyr Tyr Ser Asp Tyr Gly Tyr Ala Met
100                 105                 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115                 120                 125
<210>  29
<211>  113
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VL 1H4
<400>  29
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Pro Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Ala Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His
85                  90                  95
Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100                 105                 110
Arg
<210>  30
<211>  125
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VH 1H4
<400>  30
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Gln Pro Lys Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20                  25                  30
Ala Met Tyr Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50                  55                  60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Met
65                  70                  75                  80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr
85                  90                  95
Tyr Cys Val Arg Ala Arg Phe Tyr Tyr Ser Asp Tyr Gly Tyr Ala Met
100                 105                 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115                 120                 125
<210>  31
<211>  113
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VL 19D7
<400>  31
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Pro Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ala Ala Phe Thr Leu Arg Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His
85                  90                  95
Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
Arg
<210>  32
<211>  123
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VH 19D7
<400>  32
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Gln Pro Lys Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20                  25                  30
Ala Met Tyr Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50                  55                  60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Met
65                  70                  75                  80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr
85                  90                  95
Tyr Cys Val Arg Gly Gly Tyr Gly Asn Tyr Arg Tyr Ala Met Asp Tyr
100                 105                 110
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  33
<211>  113
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VL 8F7
<400>  33
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Pro Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Thr Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His
85                  90                  95
Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
Arg
<210>  34
<211>  119
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VH 8F7
<400>  34
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Gln Pro Lys Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Pro Tyr
20                  25                  30
Ala Met Tyr Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50                  55                  60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Met
65                  70                  75                  80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr
85                  90                  95
Tyr Cys Val Arg Gly His Gln Gly Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100                 105                 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  35
<211>  113
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VL 2C7
<400>  35
Asp Val Val Leu Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Gly Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
85                  90                  95
Thr Gln Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100                 105                 110
Arg
<210>  36
<211>  117
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VH 2C7
<400>  36
Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Ser Leu Val Gln Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ala Tyr
20                  25                  30
Gly Val His Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Gln Glu Trp Leu
35                  40                  45
Gly Val Ile Trp Arg Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Met
50                  55                  60
Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe
65                  70                  75                  80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Ala Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85                  90                  95
Lys Lys Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  37
<211>  111
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VL 2-7B
<400>  37
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln
1               5                   10                  15
Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ile Ser Arg
20                  25                  30
Tyr Asn Ile Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro Lys
35                  40                  45
Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg
50                  55                  60
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Pro
65                  70                  75                  80
Val Gln Ala Asp Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg Glu
85                  90                  95
Ser Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg
100                 105                 110
<210>  38
<211>  123
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VH 2-7B
<400>  38
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Asp Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20                  25                  30
Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Thr Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Thr Ile Thr Tyr Asp Val Tyr Ser Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg His Gly Gly Asp Gly Tyr Asn Ser Gly Asn Trp Phe Ala Tyr
100                 105                 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  39
<211>  353
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  39
Met Asp Tyr Thr Met Glu Pro Asn Val Thr Met Thr Asp Tyr Tyr Pro
1               5                   10                  15
Asp Phe Phe Thr Ala Pro Cys Asp Ala Glu Phe Leu Leu Arg Gly Ser
20                  25                  30
Met Leu Tyr Leu Ala Ile Leu Tyr Cys Val Leu Phe Val Leu Gly Leu
35                  40                  45
Leu Gly Asn Ser Leu Val Ile Leu Val Leu Val Gly Cys Lys Lys Leu
50                  55                  60
Arg Ser Ile Thr Asp Ile Tyr Leu Leu Asn Leu Ala Ala Ser Asp Leu
65                  70                  75                  80
Leu Phe Val Leu Ser Ile Pro Phe Gln Thr His Asn Leu Leu Asp Gln
85                  90                  95
Trp Val Phe Gly Thr Ala Met Cys Lys Val Val Ser Gly Leu Tyr Tyr
100                 105                 110
Ile Gly Phe Phe Ser Ser Met Phe Phe Ile Thr Leu Met Ser Val Asp
115                 120                 125
Arg Tyr Leu Ala Ile Val His Ala Val Tyr Ala Ile Lys Val Arg Thr
130                 135                 140
Ala Ser Val Gly Thr Ala Leu Ser Leu Thr Val Trp Leu Ala Ala Val
145                 150                 155                 160
Thr Ala Thr Ile Pro Leu Met Val Phe Tyr Gln Val Ala Ser Glu Asp
165                 170                 175
Gly Met Leu Gln Cys Phe Gln Phe Tyr Glu Glu Gln Ser Leu Arg Trp
180                 185                 190
Lys Leu Phe Thr His Phe Glu Ile Asn Ala Leu Gly Leu Leu Leu Pro
195                 200                 205
Phe Ala Ile Leu Leu Phe Cys Tyr Val Arg Ile Leu Gln Gln Leu Arg
210                 215                 220
Gly Cys Leu Asn His Asn Arg Thr Arg Ala Ile Lys Leu Val Leu Thr
225                 230                 235                 240
Val Val Ile Val Ser Leu Leu Phe Trp Val Pro Phe Asn Val Ala Leu
245                 250                 255
Phe Leu Thr Ser Leu His Asp Leu His Ile Leu Asp Gly Cys Ala Thr
260                 265                 270
Arg Gln Arg Leu Ala Leu Ala Ile His Val Thr Glu Val Ile Ser Phe
275                 280                 285
Thr His Cys Cys Val Asn Pro Val Ile Tyr Ala Phe Ile Gly Glu Lys
290                 295                 300
Phe Lys Lys His Leu Met Asp Val Phe Gln Lys Ser Cys Ser His Ile
305                 310                 315                 320
Phe Leu Tyr Leu Gly Arg Gln Met Pro Val Gly Ala Leu Glu Arg Gln
325                 330                 335
Leu Ser Ser Asn Gln Arg Ser Ser His Ser Ser Thr Leu Asp Asp Ile
340                 345                 350
Leu
<210>  40
<211>  114
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  10A11-IGKV3-20
<400>  40
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala
35                  40                  45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Met Gln His
85                  90                  95
Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105                 110
Arg Thr
<210>  41
<211>  125
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  10A11-IGHV3-15 T94R
<400>  41
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Ala Leu Val Lys Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20                  25                  30
Ala Leu Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Gly Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50                  55                  60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65                  70                  75                  80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85                  90                  95
Tyr Cys Thr Arg Ala Arg Phe Tyr Tyr Ser Asp Tyr Gly Tyr Ala Met
100                 105                 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120                 125
<210>  42
<211>  114
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  10A11-IGKV4-1
<400>  42
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro
35                  40                  45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65                  70                  75                  80
Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Met Gln His
85                  90                  95
Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
Arg Thr
<210>  43
<211>  114
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  10A11-IGKV1-39
<400>  43
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
35                  40                  45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65                  70                  75                  80
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Met Gln His
85                  90                  95
Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
Arg Thr
<210>  44
<211>  114
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  10A11-IGKV2-40
<400>  44
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His
85                  90                  95
Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
Arg Thr
<210>  45
<211>  114
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  10A11-IGKV1-16
<400>  45
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
35                  40                  45
Pro Lys Ser Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65                  70                  75                  80
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Met Gln His
85                  90                  95
Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
Arg Thr
<210>  46
<211>  125
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  10A11-IGHV3-73
<400>  46
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Asn Thr Tyr
20                  25                  30
Ala Leu Tyr Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Gly Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50                  55                  60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65                  70                  75                  80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85                  90                  95
Tyr Cys Thr Arg Ala Arg Phe Tyr Tyr Ser Asp Tyr Gly Tyr Ala Met
100                 105                 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120                 125
<210>  47
<211>  114
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  10A11-IGKV2-28
<400>  47
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His
85                  90                  95
Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105                 110
Arg Thr
<210>  48
<211>  360
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  48
Met Asn Pro Thr Asp Ile Ala Asp Thr Thr Leu Asp Glu Ser Ile Tyr
1               5                   10                  15
Ser Asn Tyr Tyr Leu Tyr Glu Ser Ile Pro Lys Pro Cys Thr Lys Glu
20                  25                  30
Gly Ile Lys Ala Phe Gly Glu Leu Phe Leu Pro Pro Leu Tyr Ser Leu
35                  40                  45
Val Phe Val Phe Gly Leu Leu Gly Asn Ser Val Val Val Leu Val Leu
50                  55                  60
Phe Lys Tyr Lys Arg Leu Arg Ser Met Thr Asp Val Tyr Leu Leu Asn
65                  70                  75                  80
Leu Ala Ile Ser Asp Leu Leu Phe Val Phe Ser Leu Pro Phe Trp Gly
85                  90                  95
Tyr Tyr Ala Ala Asp Gln Trp Val Phe Gly Leu Gly Leu Cys Lys Met
100                 105                 110
Ile Ser Trp Met Tyr Leu Val Gly Phe Tyr Ser Gly Ile Phe Phe Val
115                 120                 125
Met Leu Met Ser Ile Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His Ala Val Phe
130                 135                 140
Ser Leu Arg Ala Arg Thr Leu Thr Tyr Gly Val Ile Thr Ser Leu Ala
145                 150                 155                 160
Thr Trp Ser Val Ala Val Phe Ala Ser Leu Pro Gly Phe Leu Phe Ser
165                 170                 175
Thr Cys Tyr Thr Glu Arg Asn His Thr Tyr Cys Lys Thr Lys Tyr Ser
180                 185                 190
Leu Asn Ser Thr Thr Trp Lys Val Leu Ser Ser Leu Glu Ile Asn Ile
195                 200                 205
Leu Gly Leu Val Ile Pro Leu Gly Ile Met Leu Phe Cys Tyr Ser Met
210                 215                 220
Ile Ile Arg Thr Leu Gln His Cys Lys Asn Glu Lys Lys Asn Lys Ala
225                 230                 235                 240
Val Lys Met Ile Phe Ala Val Val Val Leu Phe Leu Gly Phe Trp Thr
245                 250                 255
Pro Tyr Asn Ile Val Leu Phe Leu Glu Thr Leu Val Glu Leu Glu Val
260                 265                 270
Leu Gln Asp Cys Thr Phe Glu Arg Tyr Leu Asp Tyr Ala Ile Gln Ala
275                 280                 285
Thr Glu Thr Leu Ala Phe Val His Cys Cys Leu Asn Pro Ile Ile Tyr
290                 295                 300
Phe Phe Leu Gly Glu Lys Phe Arg Lys Tyr Ile Leu Gln Leu Phe Lys
305                 310                 315                 320
Thr Cys Arg Gly Leu Phe Val Leu Cys Gln Tyr Cys Gly Leu Leu Gln
325                 330                 335
Ile Tyr Ser Ala Asp Thr Pro Ser Ser Ser Tyr Thr Gln Ser Thr Met
340                 345                 350
Asp His Asp Leu His Asp Ala Leu
355                 360
<210>  49
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная последовательность CDR2 VL
<220>
<221>  прочий_признак
<222>  (2)..(2)
<223>  Xaa может являться любой природной аминокислотой
<400>  49
Arg Xaa Ser Asn Leu Ala Ser
1               5
<210>  50
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная последовательность CDR3 VL
<220>
<221>  прочий_признак
<222>  (8)..(8)
<223>  Xaa может являться любой природной аминокислотой
<400>  50
Met Gln His Leu Glu Tyr Pro Xaa Thr
1               5
<210>  51
<211>  5
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Консенсусная последовательность CDR1 VH
<220>
<221>  прочий_признак
<222>  (1)..(1)
<223>  Xaa может являться любой природной аминокислотой
<220>
<221>  прочий_признак
<222>  (4)..(4)
<223>  Xaa может являться любой природной аминокислотой
<400>  51
Xaa Tyr Ala Xaa Tyr
1               5
<210>  52
<211>  105
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CL h10A11
<400>  52
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
1               5                   10                  15
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
20                  25                  30
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
35                  40                  45
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
50                  55                  60
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
65                  70                  75                  80
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
85                  90                  95
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100                 105
<210>  53
<211>  329
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CH h10A11
<400>  53
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85                  90                  95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100                 105                 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115                 120                 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130                 135                 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145                 150                 155                 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165                 170                 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180                 185                 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195                 200                 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210                 215                 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225                 230                 235                 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245                 250                 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260                 265                 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275                 280                 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290                 295                 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305                 310                 315                 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210>  54
<211>  112
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  19D7-IGKV3-15
<400>  54
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala
35                  40                  45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro
50                  55                  60
Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile
65                  70                  75                  80
Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Met Gln His
85                  90                  95
Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210>  55
<211>  112
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  19D7-IGKV2-18
<400>  55
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Pro Ser Leu Pro Val Asn Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Trp Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His
85                  90                  95
Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210>  56
<211>  112
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  19D7-IGKV3-20
<400>  56
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala
35                  40                  45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Met Gln His
85                  90                  95
Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210>  57
<211>  123
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  19D7-IGHV3-15 T94R
<400>  57
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Ala Leu Val Lys Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20                  25                  30
Ala Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Gly Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50                  55                  60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65                  70                  75                  80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85                  90                  95
Tyr Cys Thr Arg Gly Gly Tyr Gly Asn Tyr Arg Tyr Ala Met Asp Tyr
100                 105                 110
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  58
<211>  123
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  19D7-IGHV3-73
<400>  58
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20                  25                  30
Ala Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Gly Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50                  55                  60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65                  70                  75                  80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85                  90                  95
Tyr Cys Thr Arg Gly Gly Tyr Gly Asn Tyr Arg Tyr Ala Met Asp Tyr
100                 105                 110
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  59
<211>  114
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  10A11-IGKV4-1 N53Q+G29R
<400>  59
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20                  25                  30
Asn Arg Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro
35                  40                  45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Gln Leu Ala Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65                  70                  75                  80
Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Met Gln His
85                  90                  95
Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
Arg Thr
<---