HLA-DR, dq-генотипы и предрасположенность к миастении

ную взаимосвязь между некоторыми клиническими признаками, оцениваемыми в баллах по шкале Unified Parkinson's Disease Rating Scale, и стабилометрическими параметрами. Так, определялась тесная связь между степенью ригидности и среднем радиусом отклонения ЦЦ (г=0.41, р< 0.05), тремором и площадью (г=0.81, р< 0.001), а стабильность позы оказалась тестно связана со скоростью (г=0.71, р<0.001). Выявлена взаимосвязь показателя нарушения ходьбы с площадью статокинезиграммы (г= 0.82, р< 0.001).

Наиболее значительные нарушения функции равновесия отмечались у больных с мозжечковой атаксией, у которых значения средней скорости движения центра давления (также как и другие показатели) чрезвычайно превышали норму, что свидетельствовало о значительной неустойчивости этих больных.

Таким образом, проведенные исследования позволили выявить ряд характерных особенностей поддержания равновесия у больных с различными нарушениями вертикальной позы центрального генеза.

Работа выполнена при поддержке Российского научного гуманитарного фонда (грант №00-06-00242а).

HLA-DR, DQ-ГЕНОТИПЫ И ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТЬ К

МИАСТЕНИИ

В.Я. Неретин, В.Н. Шабалин, J1.Д. Серова, Ю.А. Серов,

Н.А.Малыгина, М.В. Покровская, И.В. Костомарова, Б.В. Агафонов, В.Г.

Гехт,

О.П. Сидорова, А.Е. Наливкин

Московский областной научно-исследовательский клинический институт РНИИ геронтологии МЗ РФ, Москва Медицинский Университет, Индианаполис, США

Миастения является аутоиммунным заболеванием, в этиологии которого, по-видимому, играет роль генетическое предрасположение. Выявлены положительные ассоциации между миастенией и определенными аллелями главного комплекса гистосовместимости (HLA). В различных популяциях определены различные антигены, являющиеся факторами предрасположенности к миастении.

В сообщениях за 1970-е-1980-е г.г. HLA-типирование у больных проводилось с помощью лимфоцито-токсического теста. В Финляндии, Швеции, Англии, Индии, Италии была выявлена ассоциация миастении с HLA-A1, В8, в Англии, Польше, Италии, Франции - с DR3. В Англии определена положительная ассоциация заболевания с HLA-B7, DR2; в Индии - с В21, В35; в Китае - с А2, А11, В46, DR9; в Японии - DR9; в Швеции -с DQ2; в Италии - с DR1(1, 2, 4-14, 16, 18-20, 22). С появлением новых молекулярно-биологических методов исследования HLA стало возможным определение полиморфизма этого комплекса не только на уровне белковых продуктов HLA-антигенов, но также и кодирующих аллелей HLA. Показано, что у больных миастенией выявляется не только повышенная частота определенных аллелей HLA, но и мутации в этих генах.

После появления молекулярно-биологических методов исследования выявлены положительные ассоциации миастении со следующими аллелями HLA класса II: во Франции с HLA DRB1*03, DRB3*0101; DQB 1*0201, DQB1*0301; DQB3*0101(15, 21); в Китае - с DQA1*0601, DQB1*0302, 0503, DQB1*1202, DRB3*0301; в Японии - с DRB1*0201 (12, 13), в Швеции - DQB1*0201, что соответствует HLA-DR3, DR12 (5), DR52, DQ2, DQ7 (3), DQ8 (3) и DPw2, определяемых при серологическом типировании.

HLA-система выполняет в организме человека ценный ряд важнейших функций. Именно антигены тканевой гистосовместимости ответственны за отторжение чужеродного трансплантата. Система HLA обеспечивает генетический контроль иммунного ответа, осуществляет взаимодействие клеток, участвующих в иммунном ответе, распознавание «своего», а также представлении чужеродных агентов для их распознавания и т.д. Возможно с функцией генетического контроля иммунного ответа связан факт наличия высокого иммунного ответа у лиц, в HLA фенотипе которых содержатся антиген HLA-B8, для которого выявлены ассоциации с дисбалансом иммунного ответа в сторону гиперактивности Т-хелперов естественных киллеров и Т-киллеров.

Отделенные пептиды антигенов гистосовместимости класса II индуцируют ответ CD4+ клонов. Эти клоны продуцируют интерферон-у и относятся к Thl клонам. Антигены класса II при любом типе распознавания обеспечивают инициальный запуск иммунного ответа. Пептиды класса II (HLA-DR) представляются для распознавания предшественниками-Т-хелперами/ индукторами на аутологичных для них моноцитах/макрофагах и распознаются только совместно с собственными аутологичными пептидами класса И, которые обеспечивают и взаимодействие между аутологичными Т-хелперами/индукторами и предшественниками Т-киллеров. Результатом распознавания пептидов класса II Т-хелперами/индукторами является последующий синтез ими ИЛ-2 сигнала для предшественников Т-киллеров, без которого нет созревания их в зрелые эффек-торные клетки. Сами предшественники Т-киллеров распознают антигены класса I. Их специфический киллер-эффект определяется присутствием на клетках мишенях этих HLA-специфичностей. Установлено, что Т-клетки киллеры реагируют против антигенов класса I, в то время как Т-клетки хелперы выполняют вспомогательную

3. Брами, Цуман, Б.М.

по отношению к Т-киллерам функцию и сами осуществляют цитотоксический эффект, реагируя против антигенов классов I и II, но преимущественно против последних.

Целью данного исследования является установление на основе генотипирования аллелей локусов БЯ и БО возможной ассоциации определенных генотипов НЬА с миастенией.

Методика исследования.

Использована методика типирования НЬЛ-БЯ и ЭО-генов с применением полимеразной цепной реакции и дот блот гибридизации со специфическими олигонуклеотидными зондами. ДНК выделяли из периферической крови. Аллель специфическое типирование генов ЭМН проводили в два этапа. На первом этапе типирования специфичностей (DR.1-DR.13) , а на втором этапе более точное определение аллелей. Фрагмент гена 011В1 в 276 н.п. амплифицировали и переносили на нейлоновую мембрану для гибридизации с 23 специфическими олигонуклеотидными зондами мечеными биотином. Оценку полученных результатов проводили по 9-ти балльной системе в соответствии с рекомендациями 12-й Международной конференции по гистосовместимости (Париж, 1995). На втором этапе амплифицировали ОШ и ОЯ2-фрагменты в 258 н.п. и фрагмент в 261 н.п., которые затем гибридизовали с 4, 7 и 15 специфическими олигонуклеотидными зондами соответственно для более полного аллельного типирования. Для объединенной специфичности ОЯ52 амплифицировали фрагмент в 270 н.п., а затем гибридизовали с 26 мечеными олигонуклеодидными зондами. Для ОЬШЗ амплифицировали фрагменты в 279 н.п. с последующей гибридизацией с 7 и 4 олигонуклеотидными зондами соответственно. Гены Б0А1 и ОС)В1 типировали подобным образом: амплифицировали фрагменты в 231 н.п. и 165 н.п. и гибридизовали с 8 и 11 зондами соответственно.

Статистический анализ.

больных, имеющих данный генотип; Ь - число здоровых людей с данным генотипом; с - число больных, не имеющих данного генотипа; (1 - число здоровых людей, не имеющих данного генотипа.

Статистический анализ ассоциации определенных генотипов с миастенией проводили по методу %2, при необходимости по критерию Фишера(З).

Также вычисляли показатель неравновесного сцепления гаплотипов НЬА по трем локусам НЬА-01Ш1-В0А1-О0В1 с использованием специально разработанной компьютерной программой по методу, описанному Ы.УаБиёа (23).

Результаты и обсуждение.

Исследованы больные и здоровые люди русской национальности. Проведено генотипирование 14 неродственных больных глазной и генерализованной миастенией с дебютом болезни до и после 15 лет и 48 неродственных здоровых людей.

Исследовано распределение НЬА-ОЯВ1, ОЯВЗ, Б1Ш4, Б0А1, Б0В1 у больных глазной и генерализованной формой миастении с дебютом до и после 15 лет, у мужчин и женщин. У больных отмечается статистически достоверное повышение частоты НЬА-ОЯВ 1*0301 (0=33,3% у больных, 0=5,3% в контроле; Ю1=9,0; этиологическая фракция =0,29; р=0,02), 0701 ((2=30,8% у больных, 0=4,3% в контроле; Ю1=9,77; этиологическая фракция=0,27; р=0,01). Гены НЬА-ОЯВ1*1401 и 1601 в контрольной группе не отмечались, а у больных наблюдались в 15,4% . Распределение частоты НЬА-ОЯВЗ, 011В4 и О0А1, О0В1 у больных не отличается от контрольных данных. Отмечено повышение частоты НЬА-ЭОВ 1*0601 (0=20% у больных; 0=4,3% в контроле; 1111=5,5; этиологическая фракция=0,16), но статистически не значимое (р=0,1) (табл.1-4).

Проведено изучение распределения НЬА-ОЯВ1, Б11ВЗ и ОИБ4 у больных генерализованной миастенией с дебютом до и после 15 лет, русской национальности. Как и в гетерогенной группе больных отмечено статистически достоверное повышение частоты НЬА-ОЯВ 1*0301 у больных по сравнению с контрольной группой (0=33,3% у больных; 0=5,3% у здоровых; Ш1=9,0; этиологическая фракция равна 0,29; р=0,02) и НЬА-ОЯВ 1*0701 (0=41,7% у больных; 0=4,3% в контрольной группе; Ю1=15,7; этиологическая фракция равна 0,39; р=0,01). Частота НЬА-О0А1 и О0В1у больных генерализованной миастенией статистически достоверно не отличалась от группы здоровых обследуемых (табл.4).

Изучены показатели неравновесного сцепления гаплотипов по трем локусам (01Ш1 -ООА1 -БОВ1) у больных миастенией (гетерогенная группа). Статистически достоверно у больных миастенией увеличен показатель неравновесного сцепления НЬА-ОЯВ 1*0701 -О0А1*0201-О0В 1*0201, который составил у больных 95,8*103; у здоровых лиц - 40,8*103,1=2,3. У больных миастенией показатель неравновесного сцепления НЬА-Э1Ш1 *0701-О0А1 *0201 -ООВ1 *0302; О11В1*0701-О0А1*0301-О0В1*0201 выше, чем у здоровых обследуемых, но статистически не значимо.

Таким образом, у больных миастенией факторами предрасположенности к миастении является НЬА -класса IIБ ИБ 1*0301, 0701, как в гетерогенной группе больных, так и в группе больных генерализованной миастенией с дебютом в детском возрасте и у взрослых, у лиц русской национальности. В гетерогенной группе больных миастенией факторами предрасположенности к болезни являются также НЬА-ОЯВ 1*1401 и 1601. Не выявлено НЬА - класса II, определяющихся фактором резистентности к миастении.

Относительный риск (RR) вычисляли по методу Woolf (2) по формуле

12-4197

В группе больных генерализованной миастенией также факторами предрасположенности к болезни являются DRB 1*0301 и 0701. HLA-DRB1*1401 и 1601 не являются факторами предрасположенности к генерализованной миастении, в отличие от гетерогенной группы больных.

Ген HLA-DRB1*0301 соответствует HLA-DR17(3), определяемому серологическим методом. HLA-DRB1*0701 соответствует HLA-DR7, определяемому серологическим методом. HLA-DRB1*1401 соответствует HLA-DR14(6), определяемым серологическим методом и HLA-DRB1*1601 соответствует HLA-DR16(2).

Определен показатель неравновесного сцепления HLA-DRB1 *0701-DQA1 *0201-DQB1 *0201 у больных миастенией. HLA-DQA*0201 серологическим методом не определяется. HLA-DQB 1*0201 соответствует HLA-DQ2. HLA-DQB 1*0201 у больных миастенией в гетерогенной группе и в группе генерализованной миастении превышает контрольные данные, но статистически не значимо.

Полученные результаты согласуются с литературными данными. Так, во Франции также как и в нашем исследовании у больных миастенией определена повышенная частота HLA-DRB1*03, DQB 1*0201. В Швеции фактором предрасположенности к болезни является HLA-DQB 1*0201. В Китае и Японии выявлены дру.ие гены HLA, определяющие предрасположенность к миастении.

Существуют работы по исследованию связи заболевания миастенией с конкретными аминокислотными заменами в генах HLA (17). В России такие исследования не проводились.

Таким образом, поиск маркеров миастении является незавершенным, хотя роль локуса HLA-DR в этом заболевании несомненна, так как установлена связь миастении с определенными генотипами HLA-DRB1. Дальнейшие иммуногенетические исследования, в том числе с определением аминокислотных замен у представителей различных этнических групп, поможет уточнить маркеры миастении и приблизиться к пониманию процессов, которые лежат в основе этого заболевания. Выводы:

1 .Генотипирование аллелей локусов HLA-DRB1, DRB3, DRB4, DQA1 и DQB1 на основе полимеразной цепной реакции с последующей гибридизацией с олигонуклеотидными зондами 14 неродственных больных глазной и генерализованной миастенией с дебютом до и после 15 лет и 48 неродственных здоровых людей показало, что факторами предрасположенности к заболеванию являются HLA-DRB1*0301 и 0701.

2.Не обнаружено статистически достоверной ассоциации между миастенией и HLA-DRB3, DRB4, DQA1 hDQBI.

3.У больных миастенией статистически достоверно повышен показатель неравновесного сцепления по трем локусам HLA-DRB1*0701-DQA1*0201-DQB 1*0201.

ЛИТЕРАТУРА

1. Матей Г., Купичко Я., Каламардис М. И др. // Матер. VII междунар. Совещания по тканевому типированию. - Л., 1981.-С. 145.

2. Математические методы в изучении генетики мультифакториальных заболеваний / Учебно-методическое пособие для студентов медицинских вузов и врачей // Под ред. Член-корр. РАМН, проф.В.Н.Шабалина. - М., 1994. - 70 С.

3. Певницкий Л.А. // Вестник академии медицинских наук СССР. -1988. - Ne 7. - С. 48-51.

4. Chan S., Tan С.. Lin Y. Et al.// Int. Arch. Allergy. Immunol. - 1993,-Vol. 101. - N 2. - P.119-125.

5. Chan-Luí W., Leung N.. Lau T. / Dev. Med. Child. Neurol. - 1984.-Vol.26, N6.-P.717-724.

6. Compston D., Vincent A., Newsom-Davis J., Batcheler J. // Brain. - 1980.-Vol.103 - pt. Ill- P.579-601.

7. Gin W.. Hawkins В., Zhang W. Et al. II Ann. Ny Akad Sei. - 1988.-Vol.540 - P.513-515.

8. Hawkins В., Chan-Lui W„ Choi E. //J.Neurol. Neurosurg. Psychiatry. - 1984.-V.47.-N 555-557.

9. Hawkins В., Ma J., Lan К // Clin. Endocrinol. - 1985.-Vol.23 - N3 - P.245-252.

10. Hawkins В., Yu Y., Wong V. //Quarterly j. Of Medicine. - 1989.-N 263.-P. 235-241.

11. Hayashi M„ Kida K„ Yamada J. Et al. // J. Neuroimmunol. - 1988.-V.18 - N 2.-P. 171-179.

12. Hjemsstrom P., Giscombe R., Lefvert A.et al. И Human immunology. - 1996,-Vol. 47 - N 1.-P.33.

13. Horiki T., Moriuchi J., Inoko H. Et al. // Neurology. - 1993.-Vol. 43.-N 4.-P.771-774.

14. Kersin-Storrar L„ Matealfe R., Dyer P. Et al. // Neurology. - 1988. - Vol. 38.-N 1,- P.38-42.

15. Khalil Y., Benich-Aknin, Lepage V. et al. // Comples Rendus de L. Acad Des Sciences ser. Ill Sciences de la vie life Sciences. -1993.-V. 316-N 7.-P.652.

16. Mehra N.. Ahuja G., Aaheja V., Vaidga M. // J. Neurol. Neurosury. Psych. - 1983,-Vol. 46.-N 4.-P.361-364.

17. Pile K., Willcox N.. Bell J.. Wordsworth В.// A novel HLA-DR allele (DRB1*0414) in a patient with myasthenia gravis II Tissue Antigens. - 1992.-Vol. 40.-P.214-266.

18. Pirskanen K., Tiilikanen A., Hokkanen E. II Ann. Clin. Res. - 1972,-Vol. 4.-N 5 - P. 304-306.

19. Safwenberg J., Hammarstrom L„ Lindblom J. et al. II Tissue Antigens. - 1978,-Vol. 12 - N 2 - P. 136-142.

20. Tola M., Caniatti L„ Casetta Y. //Acta Neurol. Scand. - 1994,-Vol. 90 - N 5 - P. 318-323.

21. Vieira M.. Callatzucman S., Gajdos P. Et al. II J. Of Neuroimmunol. - 1993.-Vol. 47 - N 2.-P.115-122.

22. Yoshida T., Tsuchiya M., Ono A. Et al. // J. Neurol. Sei. - 1977,-Vol. 32.-P. 195-201.

23. Yasuda N. //Tissue Antigens. - 1978.-Vol. 12.-N 5.-P. 315-322.

ЭПИДЕМИОЛОГИЯ МИАСТЕНИИ В.Я.Неретин, Б.В.Агафонов, Б.М.Гехт, О.П.Сидорова

Московский областной научно-исследовательский клинический институт

Основными показателями в эпидемиологических исследованиях, проводимых на определенной территории в определенный период времени являются: распространенность - это число случаев заболевания в попу-