Анализ плюрипотентных стволовых клеток
ANALYSIS OF PLURIPOTENT STEM CELLS

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Данное изобретение относится к способу выявления остаточных, недифференцированных плюрипотентных стволовых клеток (PSC) в культуре клеток, дифференцировавшихся из PSC.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Плюрипотентные стволовые клетки (PSC), в частности человеческие PSC, которые включают эмбриональные стволовые клетки (ESC) и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC), дают возможность разработки новых терапевтических продуктов на основе клеток.
Дифференцированные производные iPSC имеют терапевтическую эффективность в целом ряде приложений, связанных с заболеваниями (например, цирроз, болезнь Паркинсона, возрастная макулодегенерация, ишемическая болезнь сердца, диабет, болезнь «трансплантат против хозяина»).
Однако применение в клинических испытаниях терапевтических композиций, содержащих клетки, происходящие от PSC, создает несколько вызовов, в частности, присутствие остаточных недифференцированных PSC в конечном продукте, которые имеют известный потенциал в отношении образования опухолей. Такой вызов является особенно уместным в отношении терапий, для которых требуются высокие дозы дифференцированных клеток, происходящих из PSC.
Соответственно, существует потребность в способе или в улучшенном способе выявления остаточных, недифференцированных PSC в культуре клеток, происходящих от PSC, подлежащем применению в контроле качества при производстве терапевтических композиций, содержащих клетки, происходящие от PSC.
Любые публикации, упомянутые в данном описании изобретения, являются включенными сюда посредством ссылки. Однако, если здесь дается ссылка на любую публикацию, такая ссылка не составляет допущения того, что данная публикация образует часть обычного общего знания в данной области в Австралии или в любой другой стране.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Авторы данного изобретения удовлетворили эту потребность контроля качества в изготовлении терапевтических композиций, содержащих клетки, происходящие от PSC, посредством разработки способа выявления остаточных, недифференцированных PSC в культуре клеток, происходящих от PSC. Данный способ основывается на протоколе культивирования клеток для размножения сделанных одиночными, недифференцированных PSC для увеличения чувствительности (истинно позитивные) и специфичности (истинно негативные) в отношении остаточных, недифференцированных PSC.
Соответственно, в первом аспекте предложен способ выявления остаточных, недифференцированных плюрипотентных стволовых клеток (PSC) в культуре клеток, дифференцировавшихся из PSC, включающий:
культивирование указанных клеток на субстрате, покрытом ламинином-521 и Е- кадгерином, в среде, содержащей ингибитор Rho-ассоциированной протеинкиназы, содержащей суперспираль (ROCK);
количественное измерение в культивируемых клетках экспрессии маркера остаточных, недифференцированных PSC; и
сравнение экспрессии маркера в культивируемых клетках с экспрессией маркера в контрольной культуре клеток, содержащей известную долю PSC,
где более низкая экспрессия маркера в культуре клеток, чем экспрессия маркера в контрольной культуре клеток, указывает на отсутствие остаточных, недифференцированных PSC в культивируемых клетках или на присутствие остаточных, недифференцированных PSC в культивируемых клетках в меньшей доле, чем известная доля PSC в контрольной культуре клеток.
Авторы данного изобретения предлагают то, что согласно данному способу предложено улучшенное средство контроля качества, и он представляет собой важный вклад в безопасность и, следовательно, прогресс терапий, основанных на клетках, происходящих от PSC.
Соответственно, в одном воплощении данный способ дополнительно включает приготовление культуры клеток, в которой остаточные, недифференцированные PSC отсутствуют или присутствуют в меньшей доле, чем известная доля, в виде терапевтической композиции. Данный способ может дополнительно включать лечение или предупреждение состояния у субъекта посредством введения данному субъекту терапевтической композиции.
Согласно второму аспекту предложен способ изготовления терапевтической композиции, включающий приготовление в виде композиции для терапевтического введения субъекту культуры клеток, в которой остаточные, недифференцированные PSC отсутствуют или присутствуют в меньшей доле, чем известная доля, при выявлении способом по первому аспекту.
Согласно третьему аспекту предложен способ лечения или предупреждения состояния у субъекта, включающий введение субъекту:
культуры клеток, в которой остаточные, недифференцированные PSC отсутствуют или присутствуют в меньшей доле, чем известная доля, при выявлении способом по первому аспекту; или
терапевтической композиции, изготовленной способом по второму аспекту. Согласно альтернативной форме третьего аспекта предложено применение культуры клеток, в которой остаточные, недифференцированные PSC отсутствуют или присутствуют в меньшей доле, чем известная доля при изготовлении лекарственного средства, такого как терапевтическая композиция, для лечения или предупреждения состояния у субъекта, где остаточные, недифференцированные PSC в культуре клеток, дифференцированных из PSC, выявляют способом по первому аспекту.
Согласно другой альтернативной форме третьего аспекта предложена:
культура клеток, в которой остаточные, недифференцированные PSC отсутствуют или присутствуют в меньшей доле, чем известная доля, при выявлении способом по первому аспекту; или
терапевтическая композиция, изготовленная способом по второму аспекту, для применения в лечении или предупреждении состояния у субъекта.
Состояние, подлежащее предупреждению или лечению, может представлять собой следующие: кисты кости, новообразования кости, переломы, дефекты хряща, остеоартрит, повреждение связки, незавершенный остеогенез, остеонекроз, остеопороз, апластическая анемия, реакция «трансплантат против хозяина» (GvHD), миелодиспластический синдром, диабет типа 1, диабет типа 2, аутоиммунный гепатит, цирроз печени, печеночная недостаточность, дилатационная кардиомиопатия, сердечная недостаточность, инфаркт миокарда, ишемия миокарда, болезнь Крона, язвенный колит, ожоги, буллезный эпидермолиз, красная волчанка, ревматоидный артрит, болезнь Шегрена, системный склероз, бронхолегочная дисплазия, хроническое обструктивное заболевание дыхательных путей, эмфизема, легочный фиброз, боковой амиотрофический склероз (ALS), болезнь Альцгеймера, травма мозга, атаксия, остеохондроз, множественная системная атрофия, рассеянный склероз, болезнь Паркинсона, пигментная дистрофия сетчатки, болезнь Ромберга, травма спинного мозга, инсульт, мышечная дистрофия, ишемия конечности, повреждение почки, волчаночный нефрит, эндометриоз и осложнения трансплантации костного мозга или солидных органов.
Согласно четвертому аспекту предложен набор для выявления остаточных, недифференцированных PSC в культуре клеток, дифференцировавшихся из PSC, содержащий:
ламинин-521; и Е-кадгерин; и ингибитор ROCK.
В одном воплощении данный набор используют согласно способу по первому аспекту.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
Фиг. 1 представляет собой пример аминокислотной последовательности α цепи человеческого ламинина-521 (SEQ ID NO: 1).
Фиг. 2 представляет собой пример аминокислотной последовательности β цепи человеческого ламинина-521 (SEQ ID NO: 2).
Фиг. 3 представляет собой пример аминокислотной последовательности γ цепи человеческого ламинина-521 (SEQ ID NO: 3).
Фиг. 4 представляет собой пример аминокислотной последовательности человеческого Е-кадгерина (SEQ ID NO: 4).
Фиг. 5 представляет собой пример кодирующей нуклеотидной последовательности человеческого LIN28 (LIN28A) (SEQ ID NO: 5).
Фиг. 6 представляет собой пример кодирующей нуклеотидной последовательности человеческого ОСТ4 (POU5F1) (SEQ ID NO: 6).
Фиг. 7 представляет собой пример кодирующей нуклеотидной последовательности человеческого SOX2 (SEQ ID NO: 7).
Фиг. 8 представляет собой пример кодирующей нуклеотидной последовательности человеческого FOXD3 (SEQ ID NO: 8).
Фиг. 9 представляет собой пример кодирующей нуклеотидной последовательности человеческого NANOG (SEQ ID NO: 9).
Фиг. 10 представляет собой пример кодирующей нуклеотидной последовательности человеческого PODXL (SEQ ID NO: 10).
Фиг. 11 представляет собой пример кодирующей нуклеотидной последовательности человеческого REX1 (ZFP42) (SEQ ID NO: 11).
Фиг. 12 представляет собой пример кодирующей нуклеотидной последовательности человеческого SSEA1 (FUT4) (SEQ ID NO: 12).
Фиг. 13 представляет собой пример кодирующей нуклеотидной последовательости человеческого DPPA2 (SEQ ID NO: 13).
Фиг. 14 представляет собой пример кодирующей нуклеотидной последовательости человеческого DPPA3 (SEQ ID NO: 14).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В данном документе раскрыт способ выявления остаточных, недифференцированных PSC в культуре клеток, происходящих от PSC, где клетки, происходящие от PCS, предназначены для терапевтического введения субъекту. Соответственно, согласно изобретению предложен улучшенный способ контроля качества и минимизации риска, например, риска образования опухоли из таких остаточных, недифференцированных PSC.
Данный способ основывается на конкретных условиях культуры для размножения недифференцированных PSC при условиях, которые поддерживают клональный рост PSC, затем на количественном измерении экспрессии гена, который высоко экспрессируется в PSC, но не экспрессируется или только минимально экспрессируется в клетках, происходящих от PSC, которые подверглись дифференциации. Культуральные условия могут селективно поддерживать размножение PSC на уровне одной клетки. В одном воплощении PSC могут культивироваться при условиях, которые поддерживают рост PSC из суспензии одиночных клеток. Такие культуральные условия известны в данной области и включают ламинин-521 и Е-кадгерин, как здесь описано, а также имеющиеся в продаже системы, которые включают набор культуральой среды Cellartis DEF-CS для клонирования единичных клеток iPSC, среду Gibco™ StemFlex™ и среду для клонирования PluriQ™ G9™ в сочетании с ростом одиночных клеток на витронектине.
Экспрессия маркера в опытной культуре на уровне или ниже уровня экспрессии маркера в контрольной культуре с известной долей недифференцированных PSC указывает на то, что опытная культура содержит меньшую долю недифференцированных PSC, чем контрольная культура.
Важно то, что данный способ может выявлять остаточные недифференцированные PSC в культуре клеток, происходящих от PSC, при меньших долях общего числа клеток, например, 0,001% или 10 млн-1.
Если в данном описании изобретения не определено иначе, используемые здесь технические и научные термины, имеют такое же значение, которое обычно понятно специалисту в области, к которой принадлежит данное изобретение, и посредством ссылки на опубликованные тексты.
Следует отметить то, что термин в единственном числе относится к одному или более чем одному, например, понятно то, что «молекула» представляет собой одну или более чем одну молекулу. Термины в единственном числе, «один или более чем один» и «по меньшей мере один», как таковые, могут использоваться в данном документе взаимозаменяемо.
В формуле изобретения, которая следует далее, и в описании изобретения, за исключением случаев, когда контекст требует иного из-за прямо оговоренной формулировки или необходимого подразумеваемого, слово «содержать» или вариации, такие как «содержит» или «содержащий», используются во включительном смысле, т.е. для определения присутствия заявленной характеристики, но не для исключения присутствия или добавления дополнительных характеристик в разных воплощениях данного изобретения.
Термин «примерно» в том виде, в котором он здесь используется, рассматривает целый ряд значений для данного числа плюс/минус 25% от значения данного числа. В других воплощениях термин «примерно» рассматривает целый ряд значений для данного числа плюс/минус 20%, плюс/минус 15%, плюс/минус 10% или плюс/минус 5% от значения данного числа. Например, в одном воплощении фраза «примерно 3 грамма» указывает значение от 2,7 до 3,3 грамма (т.е. 3 грамма плюс/минус 10%) и тому подобное.
Аналогичным образом, в других воплощениях периоды времени могут варьировать на плюс/минус 25%, плюс/минус 20%, плюс/минус 15%, плюс/минус 10% или плюс/минус 5% от данного периода времени. Например, «одни сутки» могут включать период от примерно 18 до примерно 30 часов. Указанные периоды времени, которые представляют собой периоды в много суток, могут представлять собой кратные единицы «одних суток», как, например, двое суток могут охватывать период от примерно 36 до примерно 60 суток и тому подобное. В других воплощениях вариация времени может быть уменьшена, например, где: сутки 1 представляют собой 24 плюс/минус 3 часа от суток 0; сутки 2 представляют собой 48 плюс/минус 3 часа от суток 0; сутки 3 представляют собой 72 плюс/минус 3 часа от суток 0; сутки 4 представляют собой 96 плюс/минус 3 часа от суток 0; сутки 5 представляют собой 120 плюс/минус 3 часа от суток 0 и так далее. В некоторых воплощениях примерно 3 суток представляют собой 3 суток плюс/минус 1 сутки, и примерно 5 суток представляют собой 5 суток плюс/минус 1 сутки.
Термин «плюрипотентная стволовая клетка» или «PSC» в том виде, в котором он здесь используется, относится к клетке, которая имеет способность бесконечно воспроизводиться и дифференцироваться в любой другой тип клетки. Имеются два главных типа плюрипотентных стволовых клеток: эмбриональные стволовые клетки (ESC) и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC).
in vitro
Термин «эмбриональная стволовая клетка» или «ЕSC» в том виде, в котором он здесь используется, относится к клетке, выделенной из пяти-семисуточного эмбриона, подаренного по согласию пациентов, которые завершили терапию на основе оплодотворения и имеют излишек эмбрионов. Применению ESC в некоторой степени препятствовали этические опасения о выделении клеток из человеческих эмбрионов.
Человеческие PSC, подходящие для изготовления терапевтической композиции, включают человеческие ESC H1 и Н9.
Термин «индуцированная плюрипотентная стволовая клетка» или «iPSC» в том виде, в котором он здесь используется, относится к ESC-подобной клетке, полученной из взрослых клеток. iPSC имеют очень сходные характеристики с ESC, но с ними избегаются этические опасения, связанные с ESC, так как iPSC не происходят из эмбрионов. Вместо этого iPSC типично происходят из полностью дифференцированных клеток взрослых, которые были «перепрограммированы» обратно в плюрипотентное состояние.
Человеческие iPSC, подходящие для изготовления терапевтической композиции, включают iPSC 19-9-7T, MIRJT6i-mND1-4 и MIRJT7i-mND2-0, происходящие от фибробластов, и iPSC BM119-9, происходящие от одноядерных клеток костного мозга. Другие подходящие iPSCs могут быть приобретены у Cellular Dynamics International (CDI; Nasdaq: ICEL) из Madison, WI, США.
Термин «осуществление дифференциации» в том виде, в котором он здесь используется, относится к процессу изменения клетки от одного типа клетки до другого, в частности, когда менее специализированный тип клетки становится более специализированным типом клетки.
Термин «происходящий из» в том виде, в котором он здесь используется, может охватывать «осуществление дифференциации» PSC до другого типа клетки.
Соответственно, «недифференцированная PSC» представляет собой PSC, которая не дифференцировалась до другого типа клетки. В том, что касается настоящего раскрытия, недифференцированные PSC присутствуют в популяции дифференцированных в иных отношениях PSC.
in vitro
Термин «среда» или его множественное число - «среды» - в том виде, в котором он здесь используется, относится к жидкости или гелю, разработанным для поддержки роста, включающего размножение и дифференциацию клеток. Такой рост, включающий размножение и дифференциацию клеток , называется «культивированием» клеток или «культурой» клеток.
Однако клетки не могут бесконечно сохраняться в культуре, благодаря возрастающей концентрации токсичных метаболитов, снижающейся концентрации питательных веществ и, для делящихся клеток, возрастающему числу клеток. Термин «пассирование» в том виде, в котором он здесь используется, относится к способу получения новой клеточной культуры с освеженными концентрациями питательных веществ, отсутствием токсичных метаболитов и, возможно, меньшей плотностью клеток, чем в исходной культуре.
Число пассажей для культуры клеток, например, культуры клеток, происходящих от PSC, подлежащих тестированию настоящим способом, может составлять 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25. Предпочтительно число пассажей составляет 10 или меньше. Более предпочтительно число пассажей составляет 5 или 6. В одном воплощении клетки, происходящие от PSC, претерпели 5 пассажей перед тем, как быть подвергнутыми настоящему способу.
В одном воплощении клетка, происходящая из PSC, представляет собой мезенхимную стволовую (или стромальную) клетку (MSC).
В одном воплощении клетка, происходящая от ЕSC, представляет собой MSC.
В предпочтительном воплощении клетка, происходящая от iPSC, представляет собой MSC, которая также может называться iPSC-MSC.
Термин «мезенхимная стволовая клетка» или «MSC» в том виде, в котором он здесь используется, относится к конкретному типу стволовой клетки, которая может быть выделена из широкого спектра тканей, включающих костный мозг, жировую ткань (жир), плаценту и кровь пуповины. MSC могут дифференцироваться в клетки кости (остеоциты), клетки хряща (хондроциты), жировые клетки (адипоциты) и другие виды клеток соединительной ткани, такие как клетки в сухожилиях.
EMH
EMH
EMH
Согласно настоящему раскрытию MSC могут быть образованы из PSC посредством примитивных мезодермальных клеток lin-KDR+APLNR+PDGFRальфа+ с потенциалом мезенхимоангиобластов (МСА). Термин «примитивные мезодермальные клетки lin-KDR+APLNR+PDGFRальфа+ с потенциалом мезенхимоангиобластов (МСА)» относится к клетке, экспрессирующей типичные гены первичной полоски и боковой пластинки/внеэмбриональной мезодермы. Данные клетки имеют потенциал к образованию колоний мезенхимоангиобластов (МСА) и гемангиобластов в бессывороточной среде в ответ на FGF2. Термин lin- обозначает отсутствие экспрессии CD31, VE-кадгериновых эндотелиальных маркеров, мезенхимных/эндотелиальных маркеров CD73 и Cd105 и маркеров гематопоэтической линии CD43 и CD45.
Термин «мезенхима» или «мезенхимный» в том виде, в котором он здесь используется, относится к эмбриональной соединительной ткани, которая происходит из мезодермы, и которая дифференцируется в гематопоэтическую ткань (лимфатическую и кровеносную системы) и соединительную ткань, такую как кость и хрящ. Однако MSC не дифференцируются в гематопоэтические клетки.
MSC секретируют биоактивные молекулы, такие как цитокины, хемокины и факторы роста, и имеют способность модулировать иммунную систему. Было показано то, что MSC облегчают регенерацию и осуществляют воздействия на иммунную систему, не полагаясь на пересадку. Другими словами, сами MSC не обязательно могут становиться включенными в хозяина - скорее они могут оказывать их эффекты и затем устраняться в пределах короткого периода времени. Однако MSC могут быть пересажены в поврежденные ткани после введения и миграции.
MSC в настоящее время находятся в клинических испытаниях для лечения многочисленных состояний, заболеваний и расстройств, включая болезнь «трансплантат против хозяина».
Считается, что способность MSC оказывать иммуномодулирующие/иммунодепрессивные эффекты, в частности, посредством подавления Т-клеток, является центральной для терапевтических эффектов MSC при широком спектре состояний, заболеваний и расстройств, включающих болезнь «трансплантат против хозяина», иммунные расстройства, включающие аутоиммунные расстройства, сердечно-сосудистые расстройства, ортопедические расстройства и отторжение трансплантированных солидных органов. Некоторые конкретные примеры включают следующие: кисты кости, новообразования кости, переломы, дефекты хряща, остеоартрит, повреждение связки, незавершенный остеогенез, остеонекроз, остеопороз, апластическая анемия, миелодиспластический синдром, диабет типа 1, диабет типа 2, аутоиммунный гепатит, цирроз печени, печеночная недостаточность, дилатационная кардиомиопатия, сердечная недостаточность, инфаркт миокарда, ишемия миокарда, болезнь Крона, язвенный колит, ожоги, буллезный эпидермолиз, красная волчанка, ревматоидный артрит, болезнь Шегрена, системный склероз, бронхолегочная дисплазия, хроническое обструктивное заболевание дыхательных путей, эмфизема, легочный фиброз, боковой амиотрофический склероз (ALS), болезнь Альцгеймера, травма мозга, атаксия, остеохондроз, множественная системная атрофия, рассеянный склероз, болезнь Паркинсона, пигментная дистрофия сетчатки, болезнь Ромберга, травма спинного мозга, инсульт, мышечная дистрофия, ишемия конечности, повреждение почки, волчаночный нефрит, эндометриоз и осложнения трансплантации костного мозга или солидного органа.
Полагают, что MSC выполняют критически важную роль в заживлении ран, и было показано то, что они являются эффективными в лечении повреждения ткани и дегенеративных заболеваний, включающих заболевания в пищеварительной системе, например, цирроз печени и печеночная недостаточность, в скелетно-мышечной системе, в периодонтальной ткани, при диабетической критической ишемии конечностей, при остеонекрозе, при заболеваниях, связанных с ожогами, при инфаркте миокарда, при повреждении роговицы, в мозге, в спинном мозге, в легких и при лечении последствий воздействия радиации.
MSC показали терапевтические результаты при иммунных расстройствах, включающих болезнь «трансплантат против хозяина», системную красную волчанку (SLE), болезнь Крона, множественную системную атрофию, рассеянный склероз, боковой амиотрофический склероз и инсульт.
Было показано то, что MSC оказывают иммунодепрессивные активности против Т-клеток, В-клеток, дендритных клеток, макрофагов и клеток-природных киллеров. Не желая быть связанными теорией, лежащие в основе механизмы могут включать иммунодепрессивные медиаторы, например, оксид азота, индоламин 2,3, диоксигеназу, простагландин Е2, белок гена 6, индуцируемого фактором некроза опухолей, CCL-2 и лиганд 1 программируемой смерти. Данные медиаторы экспрессируются на низком уровне, пока не происходит стимуляции, например, воспалительными цитокинами, такими как IFNγ (интерферон-гамма), TNFα (фактор некроза опухолей-альфа) и IL-17 (интерлейкин-17).
in vitro
MSC, происходящие из iPSC (iPSC-MSC) имеют уникальное преимущество над MSC, полученными прямым способом, т.е. происходящими из таких тканей, как костный мозг, кровь пуповины, жировая ткань, так как размножение iPSC может обеспечивать фактически неограниченную поставку MSC.
iPSC-MSC могут быть получены согласно Примеру 1.
PSC способны дифференцироваться в любой тип клеток любой из эндодермы, эктодермы и мезодермы. PSC подвергаются дифференциации в мультипотентные клетки-предшественики, которые дифференцируются далее в функциональные клетки. Следовательно, приведенное выше описание MSC является примерным, и его не следует истолковывать как ограничивающее, и другие примеры клеток, происходящих от PSC, могут включать: гематопоэтические стволовые клетки, которые дают все типы клеток крови, включая эритроциты, В-лимфоциты, Т-лимфоциты, природные клетки- киллеры, нейтрофилы, базофилы, эозинофилы, моноциты, макрофаги и тромбоциты; природные стволовые клетки в мозгу, которые дают три его главных типа клеток, представляющих собой нервные клетки (нейроны) и две категории ненейронных клеток - астроциты и олигодендроциты; эпителиальные стволовые клетки в выстилке пищеварительного тракта, которые дают всасывающие клетки, бокаловидные клетки, клетки Панета и энтероэндокринные клетки; и стволовые клетки кожи, которые встречаются в базальном слое эпидермиса, давая кератиноциты, и которые встречаются у основания волосяных фолликулов и дают как волосяной фолликул, так и эпидермис.
Термин «субстрат» в том виде, в котором он здесь используется, представляет собой любое вещество, подходящее для культивирования PSC и/или клеток, происходящих от PSC. Примеры включают пластмассовую культуральную посуду, такую как чашки, многолуночные планшеты и флаконы.
Все белки, описанные в данном документе, известны специалисту в данной области и имеются в продаже.
Ламинин-521 представляет собой гетеротримерный белок, секретируемый человеческими PSC. Ламинин-521 содержит пять α цепей, две β цепи и одну γ цепь (т.е. α5β2γ1). В одном воплощении α цепь, β цепь и γ цепь имеют аминокислотные последовательности, представленные SEQ ID NO: 1, 2 и 3 (Фиг. 1, 2 и 3) соответственно.
Е-кадгерин представляет собой кальций-зависимый белок клеточной адгезии, ассоциированный с функцией эпителиальных клеток. В одном воплощении человеческий Е-кадгерин имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 4 (Фиг. 4).
При осуществлении настоящего способа субстрат может быть покрыт ламинином-521 с использованием примерно 0,1 мкг/мл, 0,2 мкг/мл, 0,3 мкг/мл, 0,4 мкг/мл, 0,5 мкг/мл, 0,6 мкг/мл, 0,7 мкг/мл, 0,8 мкг/мл, 0,9 мкг/мл, 1 мкг/мл, 2 мкг/мл, 3 мкг/мл, 4 мкг/мл, 5 мкг/мл, 6 мкг/мл, 7 мкг/мл, 8 мкг/мл, 9 мкг/мл или 10 мкг/мл, и/или примерно 0,1 мкг/см2, 0,2 мкг/см2, 0,3 мкг/см2, 0,4 мкг/см2, 0,5 мкг/см2, 0,6 мкг/см2, 0,7 мкг/см2, 0,8 мкг/см2, 0,9 мкг/см2, 1 мкг/см2, 2 мкг/см2, 3 мкг/см2, 4 мкг/см2, 5 мкг/см2, 6 мкг/см2, 7 мкг/см2, 8 мкг/см2, 9 мкг/см2 или 10 мкг/см2.
Субстрат может быть покрыт Е-кадгерином с использованием примерно 0,1 мкг/мл, 0,2 мкг/мл, 0,3 мкг/мл, 0,4 мкг/мл, 0,5 мкг/мл, 0,6 мкг/мл, 0,7 мкг/мл, 0,8 мкг/мл, 0,9 мкг/мл, 1 мкг/мл, 2 мкг/мл, 3 мкг/мл, 4 мкг/мл, 5 мкг/мл, 6 мкг/мл, 7 мкг/мл, 8 мкг/мл, 9 мкг/мл или 10 мкг/мл, и/или примерно 0,01 мкг/см2, 0,05 мкг/см2, 0,1 мкг/см2, 0,2 мкг/см2, 0,25 мкг/см2, 0,3 мкг/см2, 0,4 мкг/см2, 0,5 мкг/см2, 0,6 мкг/см2, 0,7 мкг/см2, 0,8 мкг/см2, 0,9 мкг/см2, 1 мкг/см2, 2 мкг/см2, 3 мкг/см2, 4 мкг/см2, 5 мкг/см2, 6 мкг/см2, 7 мкг/см2, 8 мкг/см2, 9 мкг/см2 или 10 мкг/см2.
В предпочтительном воплощении субстрат покрыт ламинином-521 с использованием 10 мкг/мл и 2 мкг/см2 и Е-кадгерином с использованием 1,1 мкг/мл и 0,22 мкг/см2.
Rho-ассоциированная протеинкиназа, содержащая суперспираль (ROCK), участвует, главным образом, в регуляции формы и движения клеток, посредством действия на цитоскелет. Таким образом, «ингибитор ROCK» ингибирует данную функцию, и для настоящих целей «ингибитор ROCK» увеличивает выживание iPSC.
В одном воплощении ингибитор ROCK представляет собой Y27632 (CAS No: 129830-38-2). Другими примерами ингибиторов ROCK, которые можно использовать в настоящем способе, являются AS 1892802 (CAS No: 928320-12-1), фасудила гидрохлорид (CAS No: 105628-07-7), GSK 269962 (CAS No: 850664-21-0), GSK 429286 (CAS No: 864082-47-3), H 1152 дигидрохлорид (CAS No: 871543-07-6), глицил-H 1152 дигидрохлорид (CAS No: 913844-45-8), HA 1100 гидрохлорид (CAS No: 155558-32-0), OXA 06 дигидрохлорид, RKI 1447 дигидрохлорид, SB 772077B дигидрохлорид (CAS No: 607373-46-6), SR 3677 дигидрохлорид (CAS No: 1072959-67-1) и TC-S 7001 (CAS No: 867017-68-3).
Концентрация ингибитора ROCK, в которой культивируются клетки, может составлять, например, примерно 0,1 мкМ, 0,5 мкМ, 1 мкМ, 2 мкМ, 3 мкМ, 4 мкМ, 5 мкМ, 6 мкМ, 7 мкМ, 8 мкМ, 9 мкМ, 10 мкМ, 11 мкМ, 12 мкМ, 13 мкМ, 14 мкМ, 15 мкМ, 16 мкМ, 17 мкМ, 18 мкМ, 19 мкМ, 20 мкМ, 25 мкМ, 30 мкМ, 40 мкМ, 50 мкМ, 60 мкМ, 70 мкМ, 80 мкМ, 90 мкМ или 100 мкМ.
Предпочтительно ингибитор ROCK представляет собой Y27632, и концентрация Y27632, в которой культивируются клетки, составляет примерно 10 мкМ.
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
2
3
2
3
2
3
2
3
2
3
2
3
2
3
2
3
2
4
2
4
2
4
2
4
2
4
2
4
2
4
2
4
2
4
2
5
5
2
5
2
5
2
5
2
5
2
5
2
5
2
5
2
6
2
6
2
6
2
6
2
6
2
6
2
6
2
6
2
6
2
4
2
4
2
4
2
4
2
4
2
4
2
4
2
4
2
4
2
4
2
Согласно настоящему способу для культивирования клеток на субстрате, покрытом ламинином-521 и Е-кадгерином, в среде, содержащей ингибитор Rho- ассоциированной протеинкиназы, содержащей суперспираль (ROCK), клетки должны быть посеяны на субстрат. Плотность посева клеток на субстрате может составлять примерно 1×10 клеток/см, 2×10 клеток/см, 3×10 клеток/см, 4×10 клеток/см, 5×10 клеток/см, 6×10 клеток/см, 7×10 клеток/см, 8×10 клеток/см, 9×10 клеток/см, 1×10 клеток/см, 2×10 клеток/см, 3×10 клеток/см, 4×10 клеток/см, 5×10 клеток/см, 6×10 клеток/см, 7×10 клеток/см, 8×10 клеток/см, 9×10 клеток/см, 1×10 клеток/см, 2×10 клеток/см, 3×10 клеток/см, 4×10 клеток/см, 5×10 клеток/см, 6×10 клеток/см, 7×10 клеток/см, 8×10 клеток/см, 9×10 клеток/см, 1×10 клеток/см2, 2×10 клеток/см, 3×10 клеток/см, 4×10 клеток/см, 5×10 клеток/см, 6×10 клеток/см, 7×10 клеток/см, 8×10 клеток/см, 9×10 клеток/см, 1×10 клеток/см, 2×10 клеток/см, 3×10 клеток/см, 4×10 клеток/см, 5×10 клеток/см, 6×10 клеток/см, 7×10 клеток/см, 8×10 клеток/см, 9×10 клеток/см. В некоторых воплощениях плотность посева может составлять примерно 1,1×10 клеток/см, 1,2×10 клеток/см, 1,3×10 клеток/см, 1,4×10 клеток/см, 1,5×10 клеток/см, 1,6×10 клеток/см, 1,7×10 клеток/см, 1,8×10 клеток/см или 1,9×10 клеток/см. В предпочтительном воплощении плотность посева составляет примерно 1,3×10 клеток/см.
Как часть настоящего способа клетки могут культивироваться в течение примерно 1 суток, 2 суток, 3 суток, 4 суток, 5 суток, 6 суток, 7 суток, 8 суток, 9 суток, 10 суток или более перед количественным измерением экспрессии маркера в культивируемых клетках. Предпочтительно клетки культивируются в течение примерно 5 суток перед количественным измерением экспрессии маркера в культивируемых клетках.
Как часть настоящего способа клетки могут культивироваться в присутствии ингибитора ROCK в течение примерно 1 суток, 2 суток, 3 суток, 4 суток, 5 суток, 6 суток, 7 суток, 8 суток, 9 суток, 10 суток или более перед количественным измерением экспрессии маркера в культивируемых клетках.
После культивирования клеток в присутствии ингибитора ROCK клетки можно далее культивировать в отсутствие ингибитора ROCK перед количественным измерением экспрессии маркера в культивируемых клетках. В одном воплощении клетки далее культивируются в отсутствие ингибитора ROCK в течение примерно 1 суток, 2 суток, 3 суток, 4 суток, 5 суток, 6 суток, 7 суток, 8 суток, 9 суток, 10 суток или более перед количественным измерением экспрессии маркера в культивируемых клетках.
В предпочтительном воплощении клетки культивруются в присутствии ингибитора ROCK в течение примерно 3 суток, затем культивируются далее в отсутствие ингибитора ROCK в течение примерно 2 суток перед количественным измерением экспрессии маркера в культивируемых клетках.
В заключение, было продемонстрировано то, что размножение клеток, происходящих из PSC, таких как MSC, на субстрате, таком как пластмассовая культуральная посуда, покрытом ламинином-521 и Е-кадгерином, поддерживает размножение ставших единичными, недифференцированных PSC, которые находятся в популяции клеток, происходящих из PSC, тогда как ингибитор ROCK одновременно увеличивает выживание PSC.
Термин «экспрессия маркера» в том виде, в котором он здесь используется, относится к гену, который экспрессируется в остаточных, недифференцированных PSC, но не экспрессируется или экспрессируется только с более низкими уровнями в клетках, происходящих от PSC. Такой ген может быть кодирующим или некодирующим, например, мРНК, микроРНК или некодирующую РНК.
Маркеры, экспрессия которых может быть количественно измерена согласно настоящему способу, включают LIN28 (LIN28A), OCT4 (POU5F1), SOX2, FOXD3, NANOG, PODXL (изоформы белка которого, выявляют антителами TRA-1-60 и TRA-1-81), REX1 (ZFP42), SSEA1 (FUT4), SSEA4, DPPA2 и DPPA3. Предпочтительно экспрессией маркера является экспрессия LIN28. Ген LIN28 кодирует белок LIN28, который представляет собой РНК-связывающий белок, который стимулирует плюрипотентность и высоко экспрессируется в PSC, но демонстрирует понижающую регуляцию в ответ на дифференциацию.
«Экспрессию маркера» можно количественно измерять как экспрессию белка или мРНК. Предпочтительно экспрессия маркера количественно измеряется как экспрессия мРНК.
Белок-маркер может быть количественно измерен способами, включающими гель-электрофорез (например, вестерн-блоттинг или двухмерный гель-электрофорез), денситометрию, флюоресценцию, люминесценцию, радиоактивность, чипы и/или масс- спектрометрию.
Маркерную мРНК можно количественно измерять способами, включающими гель-электрофорез (например, нозерн-блоттинг), денситометрию, флуоресценцию, люминесценцию, радиоактивность, чипы и/или полимеразную цепную реакцию (ПЦР). ПЦР обычно основывается на обратной транскрипции с получением маркерной кДНК из маркерной мРНК.
Предпочтительно экспрессия маркера количественно измеряется с использованием ПЦР. Предпочтительно экспрессия маркера количественно измеряется с использованием количественной ПЦР, сопряженной с обратной транскрипцией (кПЦР-РВ). Предпочтительно кПЦР-РВ представляет собой кПЦР-РВ в реальном времени, в которой мРНК подвергается обратной транскрипции до матрицы - кДНК, и матрица - кДНК - экспоненциально амплифицируется и количественно измеряется посредством флуоресценции в реальном времени.
Количественное измерение экспрессии маркера может быть относительным или абсолютным.
В одном воплощении количественное измерение экспрессии маркера является относительным и основывается на измерении цикла количественного измерения (Cq), который представляет собой цикл, где флуоресцентный сигнал пересекает порог для анализов кПЦР-РВ. Cq обратно пропорционален экспрессии мРНК.
Относительное количественное измерение экспрессии маркера основывается на сравнении экспрессии маркера в опытной культуре клеток с экспрессией маркера в одной или более чем одной контрольной культуре (т.е. контроли).
«Контрольная культура» может представлять собой позитивный контроль или негативный контроль. Когда контрольная культура представляет собой позитивный контроль, данная контрольная культура клеток содержит PSC. Предпочтительно такая контрольная культура содержит известную долю PSC. То есть, в контрольную культуру «добавлен внутренний стандарт» с известной долей недифференцированных PSC, обеспечивая, посредством этого, сравнение между опытной культурой и контрольной культурой. В данном воплощении количественное измерение может быть и относительным (например, применение Cq в качестве единицы количественного измерения), и абсолютным (например, применение Cq к известному количеству). Это также может называться полуколичественным. Таким образом, меньшая экспрессия маркера в культуре тестируемых клеток, чем экспрессия маркера в контрольной культуре клеток показывает отсутствие остаточных, недифференцированных PSC в культивируемых клетках. В качестве альтернативы, меньшая экспрессия маркера в культуре тестируемых клеток, чем экспрессия маркера в контрольной культуре клеток показывает присутствие остаточных, недифференцированных PSC в культивируемых клетках, но присутствие в меньшей доле, чем известная доля PSC в контрольной культуре клеток.
Известная доля PSC в контрольной культуре клеток может составлять 0,000001%, 0,000005%, 0,00001%, 0,00005%, 0,0001%, 0,0005%, 0,0006%, 0,0007%, 0,0008%, 0,0009%, 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008%, 0,009% или 0,01% от общего числа клеток. В предпочтительном воплощении известная доля PSC в контрольной культуре составляет 0,001% от общего числа клеток.
В некоторых воплощениях экспрессия маркера «нормируется», что компенсирует внутри- и межкинетическии вариации (вариации от образца к образцу и от измерения к измерению). Нормированные данные являются особенно полезными при количественном измерении экспрессии гена с использованием кПЦР-РВ. Специалисту в данной области будут известны разные способы нормирования, включающие нормирование к одному или более чем одному подвергающемуся повышающей регуляции или конститутивному гену «домашнего хозяйства», например, GAPDH (глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа), ACTB (актин В), LDHA (лактатдегидрогеназа А), NONO (октамерсвязывающий белок, не содержащий домен POU), PGK1 (фосфоглицераткиназа) или PPIH (пептидилпролилизомераза Н), и нормирование к общей РНК. В одном воплощении экспрессия маркера нормируется к экспрессии GAPDH.
Для ПЦР требуются нуклеотидные праймеры. Специалисту в данной области будет понятно, как конструировать праймеры для ПЦР и кПЦР-РВ, и комбинации праймер/зонд для кПЦР-РВ. Праймеры для некоторых генов имеются в продаже. Комбинации праймер/зонд для некоторых генов также имеются в продаже. Например, имеются в продаже следующие анализы для экспрессии генов TaqMan, все с каталожным № 4331182: анализ человеческого LIN28 (LIN28A) Hs00702808_s1; анализ человеческого OCT4 (POU5F1) Hs04260367_gH; анализ человеческого SOX2 Hs01053049_s1; анализ человеческого FOXD3 Hs00255287_s1; анализ человеческого NANOG Hs04399610_g1; анализ человеческого PODXL (изоформы белка которого выявляются антителами TRA-1-60 и TRA-1-81) Hs01574644; анализ человеческого REX1 (ZFP42) Hs01938187_s1; анализ человеческого SSEA1 (FUT4) Hs01106466_s1; анализ человеческого DPPA2 Hs00414515_m1 и анализ человеческого DPPA3 Hs01931905_g1.

Комбинации праймеров или праймеров/зондов могут быть легко сконструированы специалистом в данной области с использованием инструмента, доступного онлайн, например, комбинации праймеров/зондов могут быть сконструированы на заказ с использованием такого инструмента, как Custom TaqMan Assay Design Tool или инструмент GenScript Real-time PCR (TaqMan) Primer Design. Праймеры могут быть сконструированы с использованием таких инструментов как Primer3Plus или PrimerQuest Tool. Данные инструменты являются лишь примерами, и значительно больше легко доступно специалисту в данной области.
Альтернативно или дополнительно, комбинации праймеров или праймеров/зондов могут быть легко сконструированы на основе основных принципов, которые включают следующие соображения.
ПЦР включает цикл: денатурирования двухцепочечной ДНК-мишени; отжига праймеров с комплементарными областями одноцепочечной ДНК; элонгации ДНК посредством действия ДНК-полимеразы; и повторение часто около 50 циклов. Данные стадии являются температурочувствительными и обычно проводятся при 94°С, 60°С и 70°С соответственно. Хорошая конструкция праймеров является важной для успешных реакций. Важные соображения при конструировании включают:
1. длину праймера, часто 18-22 п.о.;
2. температуру плавления праймера (Tm), часто в интервале 52-58°С;
3. температуру отжига праймера (Tа);
4. содержание GC, часто 40-60%;
5. GC-кламп, т.е. основания G или С, расположенные в пределах последних пяти оснований от 3'-конца праймеров;
6. вторичные структуры праймера и матрицы, т.е. межмолекулярные или внутримолекулярные взаимодействия, например, шпильки, димеры с самим собой или перекрестные димеры;
7. двухнуклеотидные повторы;
8. длинные тяжи одного вида основания;
9. стабильность 3'-конца;
10. перекрестная гомология/специфичность;
11. длина ампликона, часто около 100 п.о. для кПЦР-РВ и около 500 п.о. для стандартной ПЦР;
12. Tm продукта;
13. Tm пары праймеров, часто меньше 5°С.
Tm праймера может быть рассчитана следующим образом:
Tm(K)={ΔH/ ΔS + R ln(C)}, или Tm(°C) = {ΔH/ ΔS + R ln(C)} - 273,15, где
ΔH (ккал/моль): H представляет собой энтальпию, и ΔH представляет собой изменение энтальпии
ΔS (ккал/моль): S представляет собой энтропию, и ΔS представляет собой изменение энтропии.
ΔS (солевая поправка) = ΔS (1M NaCl) + 0,368 × N × ln([Na+]), где
N представляет собой число пар нуклеотидов в праймере (длина праймера -1)
[Na+] представляет собой солевой эквивалент в мM
Расчет [Na+]:
[Na+] = концентрация одновалентного иона +4 × свободный Mg2+.
Та праймера может быть рассчитана следующим образом:
Та = 0,3 × Tm (праймер) + 0,7 Tm (продукт) - 14,9
Типичные кодирующие нуклеотидные последовательности для человеческого LIN28 (LIN28A), человеческого OCT4 (POU5F1), человеческого SOX2, человеческого FOXD3, человеческого NANOG, человеческого PODXL, человеческого REX1 (ZFP42), человеческого SSEA1 (FUT4), человеческого DPPA2 и человеческого DPPA3 предоставлены на Фиг. 5-14 и в SEQ ID NO: 5-14 соответственно. Данные последовательности могут быть использованы специалистом в данной области для конструирования праймеров и комбинаций праймер/зонд.
кПЦР-РВ основана на флуоресценции для количественного измерения экспрессии генов, например, экспрессии маркера. Такая флуоресценция может включать (1) неспецифичный флуоресцентный краситель, который внедряется в любую двухцепочечную ДНК, т.е. амплифицированный ПЦР-продукт, или (2) специфичный в отношении последовательности олигонуклеотидный зонд, меченный флуоресцентным репортером, который флуоресцирует только после гибридизации зонда с комплементарной ему последовательностью. Одним примером первого типа флуоресценции является SYBR Green (CAS No. 163795-75-3). Обычно второй тип содержит гаситель, ковалентно присоединенный к 3'-концу зонда, который гасит флуоресцентный репортер, пока гаситель не высвобождается от зонда во время амплификации.
В одном воплощении способ выявления остаточных, недифференцированных PSC в культуре клеток, дифференцированных из PSC, раскрытый в данном документе, может дополнительно включать получение сообщения, описывающего долю остаточных, недифференцированных PSC, выявленных в культуре клеток, происходящих из PSC.
В одном воплощении способ выявления остаточных, недифференцированных PSC в культуре клеток, дифференцированных из PSC, раскрытый в данном документе, может дополнительно включать приготовление культуры клеток, происходящих от PSC, в которой остаточные, недифференцированные PSC отсутствуют или присутствуют в меньшей доле, чем известная доля в терапевтической композиции для введения субъекту. Данный способ может дополнительно включать лечение или предупреждение состояния у субъекта посредством введения данному субъекту культуры клеток, происходящих от PSC, в которой остаточные, недифференцированные PSC отсутствуют или присутствуют в меньшей доле, или терапевтической композиции, содержащей такие клетки, происходящих от PSC. Данное состояние может представлять собой следующие: кисты кости, новообразования кости, переломы, дефекты хряща, остеоартрит, повреждение связки, незавершенный остеогенез, остеонекроз, остеопороз, апластическая анемия, болезнь «трансплантат против хозяина», миелодиспластический синдром, диабет типа 1, диабет типа 2, аутоиммунный гепатит, цирроз печени, печеночная недостаточность, дилатационная кардиомиопатия, сердечная недостаточность, инфаркт миокарда, ишемия миокарда, болезнь Крона, язвенный колит, ожоги, буллезный эпидермолиз, красная волчанка, ревматоидный артрит, болезнь Шегрена, системный склероз, бронхолегочная дисплазия, хроническое обструктивное заболевание дыхательных путей, эмфизема, легочный фиброз, боковой амиотрофический склероз (ALS), болезнь Альцгеймера, травма мозга, атаксия, остеохондроз, множественная системная атрофия, рассеянный склероз, болезнь Паркинсона, пигментная дистрофия сетчатки, болезнь Ромберга, травма спинного мозга, инсульт, мышечная дистрофия, ишемия конечности, повреждение почки, волчаночный нефрит, эндометриоз и осложнения трансплантации костного мозга или солидного органа.
Термин «состояние» в том виде, в котором он здесь используется, включает состояние, заболевание или расстройство, и их симптом.
Термин «терапевтическая композиция» в том виде, в котором он здесь используется, относится к клеткам, происходящим от PSC, как здесь описано, которые были приготовлены для введения субъекту. Предпочтительно терапевтическая композиция является стерильной. Это легко осуществляется фильтрованием через мембраны для стерилизующего фильтрования. Предпочтительно терапевтическая композиция является апирогенной.
Термин «приготовление» в том виде, в котором он здесь используется, относится к смешиванию культуры клеток, в которой остаточные, недифференцированные PSC отсутствуют или присутствуют в меньшей доле, чем известная доля, с возможными фармацевтически приемлемыми носителями, эксципиентами или стабилизаторами и поддержанию жизнеспособности клеток. Приемлемые носители, эксципиенты или стабилизаторы являются нетоксичными для субъектов-реципиентов при используемых дозировках и концентрациях, и могут включать: буферы, такие как фосфатный, цитратный и на основе других органических кислот; антиоксиданты, включающие аскорбиновую кислоту и метионин; низкомолекулярные (меньше, чем примерно 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включающие глюкозу, маннозу или декстрины; хелаторы, такие как EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота); сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы металлов (например, комплексы Zn-белок); и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN™, PLURONICS™ или полиэтиленгликоль (PEG).
Приготовленная в виде препарата фармацевтическая композиция также может содержать другие активные соединения, как необходимо для конкретного показания, которое лечат, предпочтительно соединения с дополняющими активностями, которые не оказывают вредного влияния друг на друга. Данная композиция может содержать цитотоксический агент, цитокин и/или агент, ингибирующий рост. Такие молекулы подходящим образом присутствуют в комбинации в количествах, которые являются эффективными для намеченной цели.
Клетки, происходящие от PSC, в которых остаточные, недифференцированные PSC отсутствуют или присутствуют в меньшей доле, чем известная доля, или терапевтическая композиция, содержащая такие клетки, происходящие от PSC, могут вводиться до, во время или после наличия состояния. В одном воплощении клетки, происходящие от PSC, или терапевтическая композиция вводятся во время воспаления. Клетки, происходящие из PSC, могут вводиться (а) в качестве предупредительной меры, (б) как только было диагностировано состояние, (в) когда другие лечения не имели успеха и/или (г) когда состояние развилось до заранее определенной степени тяжести.
В одном воплощении клетки, происходящие из PSC, в которых остаточные, недифференцированные PSC отсутствуют или присутствуют в меньшей доле, чем известная доля, или терапевтическая композиция, содержащая такие клетки, происходящие от PSC, предварительно обрабатывают до введения. Предварительная обработка может осуществляться фактором роста или посредством редактирования генов, например, где фактор роста может примировать клетки, происходящие от PSC, и редактирование генов может придавать новое терапевтическое свойство клеткам, происходящим из PSC.
Специалисту в данной области будет понятно то, что точный способ введения субъекту терапевтически эффективного количества клеток, происходящих из PSC, в которых остаточные, недифференцированные PSC отсутствуют или присутствуют в меньшей доле, чем известная доля, или терапевтической композиции, содержащей такие клетки, происходящие из PSC, будет осуществляться по решению лечащего врача со ссылкой на состояние, подлежащее лечению или предупреждению. На способ введения, включающий дозировку, комбинацию с другими агентами, расписание и частоту введения, и тому подобное может влиять диагноз вероятной восприимчивости субъекта на лечение клетками, происходящими из PSC, или терапевтической композицией, а также состояние и история заболевания субъекта.
Клетки, происходящие из PSC, в которых остаточные, недифференцированные PSC отсутствуют или присутствуют в меньшей доле, чем известная доля, будут приготовлены, дозированы и введены способом, согласующимся с надлежащей медицинской практикой. Факторы для рассмотрения в данном контексте включают конкретное состояние, которое лечат или предупреждают, конкретного субъекта, которого лечат, клинический статус субъекта, место введения, способ введения, схему введения, возможные побочные эффекты и другие факторы, известные практикующим врачам. Терапевтически эффективное количество клеток, происходящих из PSC, в которых остаточные, недифференцированные PSC отсутствуют или присутствуют в меньшей доле, чем известная доля, или терапевтической композиции, содержащей такие клетки, происходящие из PSC, подлежащее введению, будет определяться такими соображениями.
Клетки, происходящие из PSC, в которых остаточные, недифференцированные PSC отсутствуют или присутствуют в меньшей доле, чем известная доля, или терапевтическая композиция, содержащая такие клетки, происходящие из PSC, могут вводиться системно или периферически, например, путями, включающими внутривенный (в.в.), внутриартериальный, внутримышечный, внутрибрюшинный, интрацереброспинальный, подкожный (п.к.), внутрисуставной, интрасиновиальный, подоболочечный, внутрикоронарный, трансэндокардиальный, хирургическую имплантацию, местный и ингаляцию (например, внутрилегочную). Наиболее предпочтительно клетки, происходящие из PSC, или терапевтическая композиция вводится в.в. Клетки, происходящие из PSC, или терапевтическая композиция может вводиться в комбинации с каркасом биосовместимого вещества.
Термин «терапевтически эффективное количество» относится к количеству клеток, происходящих из PSC, в которых остаточные, недифференцированные PSC отсутствуют или присутствуют в меньшей доле, чем известная доля, или терапевтической композиции, содержащей такие клетки, происходящие от PSC, которое является эффективным для лечения состояния у субъекта.
Термины «лечить», «осуществление лечения» или «лечение» относятся как к терапевтическому лечению, так и к профилактическим или предупредительным мерам, где целью является предупреждение или уменьшение интенсивности состояния, заболевания или расстройства у субъекта, или замедление (ослабление) прогрессирования состояния, заболевания или расстройства у субъекта. Субъекты, нуждающиеся в лечении, включают субъектов уже с состоянием, заболеванием или расстройством, а также субъектов, у которых состояние, заболевание или расстройство подлежит предупреждению.
Термины «осуществление предупреждения», «предупреждение», «предупредительный» или «профилактический» относятся к предотвращению появления или к препятствованию, защите от появления состояния, заболевания или расстройства, включая ненормальность или симптом. Субъект, нуждающийся в предупреждении, может быть склонным к развитию состояния, заболевания или расстройства.
Термин «уменьшать интенсивность» или «уменьшение интенсивности» относится к уменьшению, ослаблению или устранению состояния, заболевания или расстройства, включая ненормальность или симптом. Субъект, нуждающийся в лечении, уже может иметь состояние, заболевание или расстройство, или может быть склонен к тому, чтобы иметь состояние, заболевание или расстройство, или может представлять собой того, у кого состояние, заболевание или расстройство подлежит предупреждению.
Термин «субъект» в том виде, в котором он здесь используется, относится к млекопитающему. Млекопитающее может представлять собой примата, в частности, человека, или может быть домашним, содержащимся в зоопарке животным или животным-спутником. Хотя, в частности, и рассматривается то, что способ и образующиеся в результате его MSC или популяция MSC, раскрытые в данном документе, подходят для медицинского лечения человека, они также применимы для ветеринарного лечения, включающего лечение домашних животных, таких как лошади, крупный рогатый скот и овцы, животных-спутников, таких как собаки и кошки, или животных, содержащихся в зоопарке, таких как кошачьи, псовые, полорогие жвачные и копытные.
Также здесь раскрыта культура клеток, в которой остаточные, недифференцированные PSC отсутствуют или присутствуют в меньшей доле, чем известная доля, при выявлении способом по первому аспекту.
Также здесь раскрыта терапевтическая композиция, изготовленная способом по второму аспекту.
Также здесь раскрыт набор для выявления остаточных, недифференцированных плюрипотентных стволовых клеток (PSC) в культуре клеток, дифференцированных из PSC, содержащий:
ламинин-521; и
Е-кадгерин; и
ингибитор ROCK.
В одном воплощении ингибитор ROCK представляет собой раскрытый здесь ингибитор ROCK.
В одном воплощении данный набор дополнительно содержит праймеры ПЦР и, возможно, зонд ПЦР для количественного измерения в культивируемых клетках экспрессии маркера остаточных, недифференцированных PSC. Праймеры и зонд ПЦР являются специфичными в отношении маркера остаточных, недифференцированных PSC. В одном воплощении праймеры и/или зонд ПЦР представляют собой раскрытые здесь праймеры и/или зонд ПЦР.
В одном воплощении данный набор содержит готовую к применению композицию для ПЦР, возможно кПЦР-РВ, именуемую «мастер-микс», содержащую компоненты для ПЦР, за исключением матрицы ДНК и праймеров, и, возможно, зонд. Данные компоненты могут включать буфер, дезоксинуклеотидтрифосфаты (дНТФ), Mg2+ и полимеразу. Мастер-миксы имеются в продаже, например, мастер-микс 2X TaqMan GE.
В другом воплощении данный набор дополнительно содержит среду. В одном воплощении данная среда представляет собой раскрытую здесь среду. В одном воплощении данная среда содержит ингибитор ROCK.
В другом воплощении данный набор дополнительно содержит субстрат. Такой субстрат подходит для культивирования клеток, дифференцированных из PSC, в которых подлежат выявлению остаточные, недифференцированные PSC. Предпочтительно данным субстратом является пластмассовая культуральная посуда, такая как чашка, многолуночный планшет или колба. В одном воплощении субстрат покрыт ламинином-521 и Е-кадгерином.
В одном воплощении набор содержит инструкцию по применению данного набора в способе, включающем:
культивирование клеток на субстрате, покрытом ламинином-521 и Е-кадгерином, в среде, содержащей ингибитор ROCK;
количественное измерение экспрессии маркера в культивируемых клетках; и
сравнение экспрессии маркера в культивируемых клетках с экспрессией маркера в контрольной культуре клеток, содержащей известную долю PSC,
где меньшая экспрессия маркера в культуре клеток, чем экспрессия маркера в контрольной культуре клеток показывает отсутствие остаточных, недифференцированных PSC в культивируемых клетках или присутствие остаточных, недифференцированных PSC в культивируемых клетках в меньшей доле, чем известная доля PSC в контрольной культуре клеток.
В одном воплощении набор содержит инструкцию по применению данного набора согласно способу по первому аспекту.
В другом воплощении набор используют согласно способу по первому аспекту. Это может указываться термином «при использовании».
В предпочтительном воплощении iPSC-MSC культивируются в течение 3 суток в среде Е8, содержащей 10 мкМ Y27632, ингибитор ROCK, затем культивируются в течение 2 суток в отсутствие ингибитора ROCK, и экспрессия LIN28 количественно измеряется кПЦР-РВ и нормируется к экспрессии GAPDH, обеспечивая выявление 0,001% остаточных, недифференцированных iPSC.
Другие определения, которые могут помогать в понимании настоящего раскрытия, в частности, примеров, включают следующие.
а) Анализ экспрессии генов (GE) TaqMan (20×): тип анализа кПЦР-РВ в реальном времени, доступный от Life Technologies, который разработан с использованием патентованных программного обеспечения и реактивов Applied Biosystems. Данные анализы используют для количественного измерения специфических мРНК в образце и доступны в виде предварительно разработанных или сделанных на заказ анализов. Анализы GE TaqMan предоставляют в виде 20× смеси геноспецифичных праймеров и зонда.
1) Зонд FAM™/MGB-NFQ: флуоресцентная репортерная молекула (FAM: 6- карбоксифлуоресцеин), ковалентно присоединенная к 5'-концу зонда TaqMan. MGB- NFQ представляет собой связыватель малой бороздки-нефлуоресцентную молекулу- гаситель, ковалентно присоединенную к 3'-концу зонда TaqMan. Во время амплификации зонд отщепляется, высвобождая репортер от гасителя. Образующийся флуоресцентный сигнал является пропорциональным концентрации мРНК в образце. Вместо FAM™ доступны другие флуоресцентные красители. VIC обычно используется для эндогенных контрольных генов, используемых для нормирования, таких как GAPDH.
б) 2× мастер-микс TaqMan GE: содержит ДНК-полимеразу AmpliTaq Gold, UP (ультрачистая) для активации горячего старта, смесь дНТФ с дТТФ/дУТФ и урацил- ДНК-гликозилазой (UDG) для минимизации переходящего загрязнения ПЦР, и пассивный внутренний контроль на основе патентованного красителя ROX™.
в) кДНК: комплементарная ДНК, которая подвергается обратной транскрипции от мРНК с использованием обратной транскриптазы (ОТ).
г) мРНК: матричная РНК.
д) гДНК: геномная ДНК.
е) матрица: нуклеиновая кислота-мишень (например, кДНК), намеченная для амплификации посредством ПЦР.
ж) Общая РНК: сложная смесь видов РНК, включающая мРНК (~1-5%), рибосомальную РНК (рРНК) (~80%), транспортную РНК (тРНК) и микро РНК (миРНК). Точная композиция варьирует, в зависимости от типа клеток.
з) РНКаза: рибонуклеаза - класс ферментов, которые разрушают РНК, и которые очень трудно инактивировать.
и) Эндогенный контрольный ген: ген позитивного контроля, который экспрессируется во всех типах образцов. GAPDH: глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа представляет собой обычный эндогенный контрольный ген, используемый для нормирования.
й) Ген-мишень: интересующий ген, который дифференциально экспрессируется в стволовых клетках по сравнению с дифференцированными клетками (например, в iPSC по сравнению с iPSC-MSC), такой как LIN28.
к) плюс ОТ и минус ОТ мастер-миксы: содержат необходимые реактивы для обратной транскрипции образцов общей РНК. Минус ОТ представляет собой негативный контроль, содержащий общую РНК, но не содержащий обратную транскриптазу. Образцы минус ОT анализируют на загрязнение образцов общей РНК посредством гДНК.
л) Реакционные смеси плюс/минус ОT: комбинация плюс/минус ОT мастер-микса с каждым образцом общей РНК или контролем для обратной транскрипции.
м) Смесь для амплификации кДНК: комбинация 2× мастер-микса TaqMan GE с каждой реакционной смесью плюс/минус ОT.
н) Смесь для анализа GE (например, смесь для анализа LIN28 или GAPDH): комбинация 20× анализа TaqMan GE с каждой смесью для амплификации кДНК для кПЦР-РВ в реальном времени.
о) Нематричный контроль (NTC): тип негативного контроля (NEG), в котором общая РНК заменяется водой в реакции кДНК плюс/минус ОT. Используется для выявления загрязнения реактивов матрицами нуклеиновых кислот.
п) SNP: однонуклеотидный полиморфизм.
р) Cq: цикл количественного измерения (например, Cq(X) представляет собой цикл, где флуоресцентный сигнал пересекает пороговое значение для анализов кПЦР в реальном времени и кПЦР-РВ. Cq обратно связан с концентрацией мРНК. По мере увеличения Cq концентрация мРНК снижается и наоборот. «Cq(50)» показывает то, что было проведено 50 циклов. «Нет Cq(50)» показывает то, что за 50 циклов не было получено значение Cq.
ПРИМЕРЫ Пример 1 - получение iPSC-MSC Материалы

Реактивы, перечисленные в Таблице 1, известны специалисту в данной области и имеют принятые составы, например, IMDM и F12 Хэма. GLUTAMAX содержит дипептид L-аланил-L-глутамин, обычно поставляемый в концентрации 200 мМ в 0,85% NaCl. GLUTAMAX высвобождает L-глутамин при расщеплении культивируемыми клетками связи данного дипептида. Химически определенный липидный концентрат содержит 2 мг/л арахидоновой кислоты, 220 мг/л холестерина, 70 мг/л DL-альфа- токоферола ацетата, 10 мг/л линолевой кислоты, 10 мг/л линоленовой кислоты, 10 мг/л миристиновой кислоты, 10 мг/л олеиновой кислоты, 10 мг/л пальмитиновой кислоты, 10 мг/мл пальмитоолеиновой кислоты, 90 г/л плюроника F-68, 10 мг/л стеариновой кислоты, 2,2 г/л TWEEN 80 и этиловый спирт. Н-1152 и Y27632 являются высокоэффективными проницаемыми в клетку селективными ингибиторами ROCK (Rho-ассоциированная серин/треониновая протеинкиназа, образующая суперспираль).
Способ
2
1. Размораживали iPSC в полной среде Е8 (базальная среда DMEM/F12 плюс добавка Е8) плюс 1 мкМ Н1152 на пластмассовой посуде, покрытой витронектином (0,5 мкг/см). Инкубировали пересаженные на чашки iPSC при 37°С, 5% СО2, 20% О2 (нормоксические).
2
2. Проводили три пассажа размноженных iPSC в полной среде Е8 (без ингибитора ROCK) на пластмассовой посуде, покрытой витронектином (0,5 мкг/см), и инкубировали при 37°С, 5% СО2, 20% О2 (нормоксические) до инициации процесса дифференциации.
3
2
2
3. Отбирали и высевали iPSC в виде одиночных клеток/маленьких колоний в плотности 5×10 клеток/см на пластмассовую посуду, покрытую коллагеном IV (0,5 мкг/см), в полной среде Е8 плюс 10 мкМ Y27632 и инкубировали при 37°С, 5% СО2, 20% О2 (нормоксические) в течение 24 ч.
4. Заменяли полную среду Е8 плюс 10 мкМ Y27632 средой для дифференциации и инкубировали при 37°С, 5% СО2, 5% О2 (гипоксические) в течение 48 ч.
5. Отбирали колониеобразующие клетки из прикрепленной культуры в среде для дифференциации в виде суспензии одиночных клеток, переносили в суспензионную культуру с M-CFM и инкубировали при 37°С, 5% СО2, 20% О2 (нормоксические) в течение 12 суток.
2
2
6. Отбирали и высевали колонии (пассаж 0) на пластмассовую посуду, покрытую фибронектином/коллагеном I (0,67 мкг/см фибронектина, 1,2 мкг/см коллагена I) в M-SFEM и инкубировали при 37°С, 5% СО2, 20% О2 (нормоксические) в течение 3 суток.
4
2
7. Отбирали колонии и высевали в виде одиночных клеток (пассаж 1) в плотности 1,3×10 клеток/см на пластмассовую посуду, покрытую фибронектином/коллагеном I, в M-SFEM и инкубировали при 37°С, 5% СО2, 20% О2 (нормоксические) в течение 3 суток.
4
2
8. Отбирали и высевали в виде одиночных клеток (пассаж 2) в плотности 1,3×10 клеток/см на пластмассовую посуду, покрытую фибронектином/коллагеном I, в M-SFEM и инкубировали при 37°С, 5% СО2, 20% О2 (нормоксические) в течение 3 суток.
4
2
9. Отбирали и высевали в виде одиночных клеток (пассаж 3) в плотности 1,3×10 клеток/см на пластмассовую посуду, покрытую фибронектином/коллагеном I, в M- SFEM и инкубировали при 37°С, 5% СО2, 20% О2 (нормоксические) в течение 3 суток.
4
2
10. Отбирали и высевали в виде одиночных клеток (пассаж 4) в плотности 1,3×10 клеток/см на пластмассовую посуду, покрытую фибронектином/коллагеном I, в M-SFEM и инкубировали при 37°С, 5% СО2, 20% О2 (нормоксические) в течение 3 суток.
4
2
11. Отбирали и высевали в виде одиночных клеток (пассаж 5) в плотности 1,3×10 клеток/см на пластмассовую посуду, покрытую фибронектином/коллагеном I, в M-SFEM и инкубировали при 37°С, 5% СО2, 20% О2 (нормоксические) в течение 3 суток.
12. Отбирали пассаж 5 (Р5) iPSC-MSC в виде одиночных клеток и замораживали конечный продукт.
Пример 2 - количественное измерение остаточных недифференцированных стволовых клеток посредством кПЦР-РВ
1) ЦЕЛЬ
Данный типичный протокол описывает количественное измерение остаточных, недифференцированных iPSC посредством анализов экспрессии генов TagMan (кПЦР-РВ). Несмотря на то, что в качестве примера приводится выявление недифференцированных iPSC среди iPSC-MSC с использованием экспрессии LIN28, данный протокол, в общем, применим к культуре клеток, происходящих от PSC, с использованием любого маркера PSC, дифференциально экспрессируемого в PSC, но не экспресируемого в клетках, происходящих от PSC. Данный протокол предназначен для контроля качества клеток, происходящих от PSC, предназначенных для приготовления в виде терапевтической композиции.
2) МАТЕРИАЛЫ
а) Материалы для протокола для культуры размножения iPSC-MSC c ламинином-521/Е-кадгерином:
i) Человеческий рекомбинантный ламинин-521 - LN521™, Biolamina, каталожный № LN521-03.
ii) Е-кадгерин, человеческий, рекомбинантный, Advanced BioMatrix, каталожный № 5085-0.1MG.
2+
2+
iii) Фосфатно-солевой буфер Дульбекко (1×) с Mg и Са (DPBS++) (6 × 500 мл), Corning/Mediatech, каталожный № 21-030-СV или эквивалентный.
2+
2+
iv) Фосфатно-солевой буфер Дульбекко HyClone™ без Mg и Са, раствор, (DPBS--), GE Healthcare Life Sciences, каталожный № SH30028 или эквивалентный.
v) Ингибитор ROCK Y27632, Sigma-Aldrich, каталожный № Y0503-1MG или Y0503-5MG
vi) Питательная среда 8™ (набор), Thermo Fisher Scientific, каталожный № A1517001.
(1) Базовая питательная среда 8™ (500 мл)
(2) Питательная добавка 8™ (Витронектин) (10 мл)
vii) Фермент TrypLE™ (1×), без фенолового красного (100 мл), Thermo Fisher Scientific, каталожный № 12563011.
viii) Диметилсульфоксид (DMSO), Sigma-Aldrich, каталожный № D2650.
2
ix) 75 см прямоугольный флакон для культуры клеток со скошенным горлышком и вентилируемой крышкой Falcon, Corning Life Sciences, каталожный №353136 или эквивалентный.
x) Скребок для клеток Falcon с 25 см ручкой и 1,8 см лезвием, стерильный, Corning Life Sciences, каталожный № 353086 или эквивалентный.
xi) 0,4%-ный трипановый синий HyClone™, Thermo Fisher Scientific, каталожный № SV30084 или эквивалентный.
xii) Гемоцитометр с покровным стеклом, Reichert Right Line или эквивалентный.
б) Мининабор RNeasy Protect Cell (50): QIAGEN, каталожный № 74624. Состоит из двух продуктов QIAGEN:
i) Реактив RNАрrotect Cell (коробка 1 из 2): разработан для культивируемых или сортированных клеток. Может быть добавлен непосредственно к клеткам в культуральную среду. Останавливает картины экспрессии генов, давая немедленную стабилизацию общей РНК. Образцы можно хранить при 4°С, -20°С или архивировать при -80°С.
Plus
Plus
ii) Мининабор RNeasy (коробка 2 из 2): разработан для выделения общей РНК из целого ряда типов образцов. «» указывает на то, что данный набор содержит колонки для устранения геномной ДНК (гДНК) и связанных с ней реактивов.
в) QIAshredder (50): каталожный № 79654 QIAGEN. Требуется для гомогенизации клеточных лизатов для выделения РНК.
г) Набор ДНКазы, не содержащей РНКазы (50 препаратов), QIAGEN, каталожный № 79254. Для обработки на мембране ДНКазой с использованием наборов для очистки РНК QIAGEN.
Plus
д) Этанол (96-100%): Fisher BioReagents, уровень качества для молекулярной биологии, абсолютнный (мера крепости 200), 100 мл, каталожный № ВР2818100 Fisher Scientific или эквивалентный. Требуется для мининабора RNeasy от QIAGEN.
е) ДНКаза UltraPure™/дистиллированная вода, не содержащая РНКазу, Life Technologies, каталожный № 10977-015 или эквивалентный.
Plus
ж) β-Меркаптоэтанол (β-МЕ) 14,3 М, Thermo Fisher Scientific, каталожный № ВР176-100 или эквивалентный. Требуется для мининабора RNeasy от QIAGEN для инактивации РНКаз.
з) Порошок для контроля биологически опасных жидкостей Safetec Green-Z™, Thermo Fisher Scientific, каталожный № 19-023-901. Для удаления реактива RNAprotect Cell, который является опасным для окружающей среды.
и) Реактив для удаления загрязнений RNase AWAY™ (250 мл), Life Technologies, каталожный № 10328-011 или эквивалентный. Нанести готовый для применения раствор на поверхности, такие как лабораторные столы, пипетки, стеклянная или пластмассовая посуда. Промыть водой Milli-Q для устранения загрязнения РНКазой и ДНК.
й) Высокоэффективный набор RNA-to-cDNA™ (50): Thermo Fisher Scientific, каталожный № 4387406.
к) Ингибитор РНКазы SUPERase⋅In™: Thermo Fisher Scientific, каталожный № AM2694.
л) Мастер-микс для экспрессии генов TaqMan (2×): Thermo Fisher Scientific, каталожный № 4369016 (1 упаковка, 5 мл: 200 × 50 мкл реакции).
м) Вода уровня качества для ПЦР-РВ Ambion: Thermo Fisher Scientific, каталожный № AM9935 (10 × 1,5 мл) (предпочтительная) или эквивалентная. Примечание: AM9935 является автоклавированной, фильтрованной на мембране и не обработанной DEPC. AM9935 тестируется на загрязнение прокариотической (16S рРНК) и эукариотической (18S рРНК) геномной ДНК посредством ПЦР в реальном времени. Она является сертифицированной, не содержащей РНКазы, не содержащей ДНКазы и не содержащей геномную ДНК.
н) Анализ(ы) экспрессии генов TaqMan, который(рые) содержит(жат) 20×, готовую к применению смесь праймеров и зонда FAM/MGB-NFG в ТЕ. FAM представляет собой самый обычный флуоресцентный репортер. (1× - 250 нМ зонд TaqMan плюс 900 нМ каждый ПЦР-праймер (прямой и обратный)). Каталожные номера, приведенные ниже, относятся к размеру анализа, изготовленного на заказ. Светочувствительные. Предпочтительно хранить в виде аликвот для одноразового применения при -20°С в 1,5 мл антипригарных пробирках Ambion.
i) Сделанные на заказ анализы экспрессии генов TaqMan (20×, одна пробирка), Thermo Fisher Scientific, сделанные по заказу. (Заметьте то, что сделанные на заказ анализы могут быть заказаны только с зондами FAM-MGB).
(1) Каталожный № 4331348 (маленький - 360 реакций по 20 мкл для кПЦР-РВ).
(2) Каталожный № 4332078 (средний - 750 реакций по 20 мкл для кПЦР-РВ).
Highly Sensitive In Vitro Methods for Detection of Residual Undifferentiated Cells in Retinal Pigment Epithelial Cells Derived from Human iPS Cells
ii) Сделанные на заказ анализы экспрессии гена LIN28 TaqMan, Thermo Fisher Scientific; каталожный №: 4331348; ID анализа: AIVI48S; название анализа: LIN28. кПЦР-РВ; масштаб: малый: 360 реакций; сделанные на заказ. Это сконструированный по заказу анализ с известными последовательностями праймеров и зондов, как раскрыто в Kuroda, et al. (PLoS ONE 7, 1-9 (2012) ). Последовательность зонда LIN28 (5'→3') CGCATGGGGTTCGGCTTCCTGTCC (SEQ ID NO: 14); последовательность прямого праймера LIN28 (5'→3') CACGGTGCGGGCATCTG (SEQ ID NO: 15); последовательность обратного праймера LIN28 (5'→3') CCTTCCATGTGCAGCTTACTC (SEQ ID NO: 16).
iii) Анализы эндогенного контроля TaqMan: данные анализы были предварительно разработаны и могут быть инвентаризированы. Эндогенные контроли доступны с зондами FAM-MGB или VIC-MGB. Предпочтительно выбирают зонд VIC- MGB для отличения контрольного анализа от различающего анализа.
(1) Анализ экспрессии генов GAPDH (глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназа) (символ гена: GAPDH, hCG2005673), Life Technologies; каталожный №: 4448489; ID анализа: Hs02758991_g1 (зонд VIC-MGB); сделан на заказ. Анализ «наилучшего покрытия» был выбран из многих предварительно разработанных анализов GAPDH. Данный анализ охватывает интрон и, следовательно, не должен выявлять геномную ДНК.
о) Антипригарные, не содержащие РНКаз микроцентрифужные пробирки Ambion (1,5 мл): Life Technologies; каталожный № АМ12450. Примечание: 1,5 мл пробирки АМ12450 имеют поверхность со слабым связыванием и являются сертифицированными, не содержащими РНКаз и не содержащими ДНКаз. Предпочтительно используются для хранения аликвот сделанного на заказ анализа GE TaqMan (20×) и получения кДНК.
п) 1,5 мл микроцентрифужные пробирки с закручивающейся крышкой (Sarstedt 72.692.005): Fisher Scientific, каталожный № 50809238 или эквивалентный; коническое дно, стерильные с собранной крышкой с О-кольцом. Предпочтительно используются для получения амплификационных смесей кДНК. Винтовая крышка с наружной резьбой предотвращает образование аэрозолей, которые, в противном случае, могли бы вызвать загрязнение ПЦР.
р) Белые, 96-луночные окантованные ПЦР-планшеты с твердыми стенками и низким профилем: Bio-Rad, каталожный № HSP-9655. Белый планшет будет уменьшать фоновый шум и увеличивать флуоресцентный сигнал по сравнению с прозрачными 96- луночными планшетами и пробирками. Для данной процедуры не следует использовать полосатые пробирки.
с) Адгезивные запечатывающие средства Microseal 'B' (100): Bio-Rad, каталожный № MSB-1001. Это рекомендованное оптически прозрачное запечатывающее средство для твердостенных 96-луночных планшетов.
т) Запечатывающий ролик: Bio-Rad, каталожный № MSR-1001. Используется для запечатывания твердостенного 96-луночного планшета адгезивным запечатывающим средством Microseal 'B'.
у) Выявляющая система ПЦР в реальном времени Bio-Rad CFX96 с программой Bio-Rad CFX (ID 0394) или эквивалентной.
ф) Микроцентрифуга Eppendorf MiniSpin Plus (ID 0569) или эквивалентная.
ц) Спектрофотометр, работающий в УФ (ультрафиолетовая) - видимой области Nanodrop 2000 (ID 0504), или эквивалентный.
3) МЕТОДИКА
а) Получение конечного продукта iPSC-MSC P5 (1 флакон) для анализа кПЦР-РВ с использованием селективного размножения остаточных недифференцированных iPSC
i) Данная методика селективно размножает недифференцированные iPSC на фоне iPSC-MSC для того, чтобы увеличивать чувствительность кПЦР-РВ в отношении остаточных недифференцированных iPSC.
ii) Получение сред для культуры клеток:
(1) Получение полной среды Е8 (Е8СМ):
(а) Разморозить добавку Е8 в течение ночи при 2-8°С.
(б) Удалить 10 мл базальной среды Е8 из 500 мл бутыли.
(в) Добавить 10 мл добавки Е8 к 490 мл базальной среды Е8. Хорошо смешать и хранить при 2-8°С. Срок хранения составляет 2 недели после приготовления.
(2) Получение Е8СМ плюс 10 мкМ среды Y27632:
2+
2+
(a) Приготовить 10 мМ Y27632 посредством добавления 312 мкл DPBS - (без Ca и Mg) к 1 мг Y27632. Аликвотировать и заморозить при -20°С.
(б) Добавить 1 мкл 10 мМ Y27632 в каждый мл Е8СМ для достижения конечной концентрации 10 мкМ Y27632 (например, 75 мкл 10 мМ Y27632 в 75 мл Е8СМ). Хранить при 4°С. Срок хранения составляет 2 недели после приготовления.
iii) Приготовление замораживающей среды
(Е8СМ плюс 20% DMSO):
(1) Приготовить 10 мл замораживающей среды следующим образом: объединить 8 мл Е8СМ с 2 мл DMSO. Перенести в 4°С для охлаждения перед применением.
(2) Добавить 1 мкл 10 мМ Y27632 в каждый мл Е8СМ для достижения конечной концентрации 10 мкМ Y27632 (например, 75 мкл 10 мМ Y27632 в 75 мл Е8СМ). Хранить при 4°С. Срок хранения составляет 2 недели после приготовления.
iv) Приготовление покрытия ламинин-521/Е-кадгерин (в DPBS++):
(1) Разморозить ламинин-521 и Е-кадгерин в течение ночи при 2-8°С.
(2) Приготовить вещество покрытия (30 мл, требующихся для 2 × флакона Т75):
(3) Покрыть культуральную посуду (2 × флакона Т75) и хранить при 2-8°С в течение по меньшей мере ночи до применения (срок хранения 1 месяц). Убедиться в том, что раствор покрытия покрывает всю культуральную область.
v) Приготовление культуры для размножения
(1) Минимум за 1 час до посева удалить вещество покрытия из флаконов и добавить 15 мл E8CM плюс 10 мкМ Y27632/T75. Дать уравновеситься при 37°С.
(2) Разморозить iPSC-MSC P5 на водяной бане при 37°С.
(3) Перенести содержимое флакона в 15 мл пробирку, содержащую 9 мл E8CM плюс 10 мкМ Y27632.
(4) Центрифугировать при 200 g в течение 5 минут.
(5) Отсосать супернатант и ресуспендировать осадок в 5 мл E8CM плюс 10 мкМ Y27632.
6
6
(6) Подсчитать клетки с использованием гемоцитометра. Оценочная концентрация 5×10 клеток/5 мл - 1×10 клеток/мл. Предложенное разведение в трипановом синем составляет 1:2. Рассчитать процент жизнеспособности.
4
2
5
(7) Рассчитать число клеток, требующееся для посева в каждый флакон Т75 в плотности 1,3×10 клеток/см или 1×10 клеток/Т75).
(8) Засеять флаконы, покрытые ламинином-521/Е-кадгерином, рассчитанным числом клеток.
(9) Подпитывать клетки по следующей схеме: (а) Сутки 1 - нет подпитки.
(б) Сутки 2 - подпитать каждый флакон Т75 15 мл E8CM плюс 10 мкМ Y27632. (в) Сутки 3 - нет подпитки.
(г) Сутки 4 и 5 - подпитать каждый флакон Т75 15 мл E8CM (без Y27632).
(10) Ежесуточно проверять культуры на признаки микробного загрязнения (например, мутность). Отбрасывать любые загрязненные культуры и начинать заново со стадии 3) а).
vi) Сбор (сутки 6 после посева)
4
2
6
6
(1) Примечания: клетки трудно отделять от культуральной посуды, покрытой ламинином-521/Е-кадгерином. Применение клеточных скребков рекомендуется для отделения всех клеток. Средняя плотность сбора составляет 4×10 клеток/см или 3×10 клеток/флакон Т75. При сборе недостаточного числа клеток из одного флакона Т75 (меньше 2×10 клеток) может потребоваться сбор со второго Т75.
(2) Отсосать ростовую среду и промыть флакон 10 мл DPBS--.
(3) Добавить во флакон Т75 8 мл TrypLE. Инкубировать при 37°С в течение 15 минут.
(4) Решительно постучать по флакону для того, чтобы выбить клетки и перенести в 50 мл коническую пробирку (приблизительно 8 мл).
(5) Добавить во флакон 8 мл Е8СМ плюс 10 мкМ Y27632, всасывать в пипетку и выпускать из нее, и объединить с клеточной суспензией в 50 мл пробирке (всего 16 мл).
(6) Добавить во флакон 8 мл Е8СМ плюс 10 мкМ Y27632 и использовать стерильный одноразовый скребок для клеток для аккуратного соскабливания клеток. Собрать клетки посредством промывки средой соскобленной поверхности и объединить с клеточной суспензией (всего 24 мл).
(7) Повторить соскабливание после добавления во флакон дополнительных 8 мл Е8СМ плюс 10 мкМ Y27632. Собрать суспензию клеток, как описано выше (всего 32 мл).
(8) Центрифугировать клетки при 200 g в течение 10 минут. Отсосать супернатант.
6
6
(9) Ресуспендировать клеточный осадок в Е8СМ плюс 10 мкМ Y27632 и подсчитать клетки. Предложенный ресуспензионный объем составляет 2 мл с оценочной концентрацией 3×10 клеток/2 мл - 1,5×10 клеток/мл. Предложенное разведение в трипановом синем составляет 1:2. Для точного подсчета может потребоваться диссоциация на одиночные клетки с использованием наконечника 1 мл пипетки.
(а) Подсчитать клетки с использованием гемоцитометра.
6
(б) Требующаяся процентная доля жизнеспособности составляет 70% или более. Требующийся выход составляет 2×10 клеток или более.
(10) Центрифугировать клетки при 200 g в течение 10 минут. Отсосать супернатант.
6
(11) Ресуспендировать клеточный осадок в Е8СМ при 2×10 клеток/мл.
vii) Заморозить клетки до анализа
6
(1) Добавить равный объем замораживающей среды COLD (Е8СМ с 20% DMSO) для получения конечной концентрации 1×10 клеток/мл.
(2) Добавить 1 мл клеточной суспензии в каждый криофлакон.
(3) Немедленно перенести криофлаконы в холодильник на -80°С. (4) Перенести на следующие сутки в емкость с жидким азотом.
б) Получение реактивов для набора RNeasy
Plus
Mini:
i) Получение промывочного раствора буфера RPE oт QIAGEN:
(1) Добавить 100% этанол, как указано на бутыли, в концентрат буфера RPE (т.е. 44 мл для набора RNeasy Protect Cell Mini на 50 препаратов).
ii) Приготовление 70%-ного этанола:
(1) Объединить 7 мл 100%-ного этанола с 3 мл воды, не содержащей нуклеаз. Срок хранения - один месяц после приготовления.
iii) Получение лизирующего буфера для выделения общей РНК:
(1) Добавить 10 мкл β-меркаптоэтанола (β-МЕ) на 1 мл буфера RLT Plus до применения, используя химический вытяжной шкаф.
iv) Получение ДНКазы, не содержащей РНКаз, для набора ДНКазы, не содержащей РНКаз, от QIAGEN:
(1) Добавить указанное количество воды, не содержащей РНКаз (т.е. 550 мкл) к лиофилизированной ДНКазе с использованием стерильной иглы и шприца. Осторожно ресуспендировать ДНКазу посредством переворачивания. Не встряхивать. Хранить разведенную ДНКазу при -20°С в 20 мкл аликвотах, предпочтительно в антипригарных микроцентрифужных пробирках, не содержащих РНКаз, от Ambion. Срок хранения разведенной ДНКазы составляет девять месяцев после приготовления. Хранить остальные компоненты набора при 2-8°С.
в) Получение культивируемых клеток для выделения общей РНК с использованием реактива для клеток RNAprotect
i) Реактив для клеток RNAprotect немедленно стабилизирует общую РНК в обработанных клетках, сохраняя профиль экспрессии генов. Данный реактив добавляют непосредственно к клеткам, в присутствии среды или без нее. Также могут быть приготовлены замороженные клетки в DMSO с использованием модифицированного протокола.
6
6
(1) Рекомендованное число клеток составляет 1-2×10 клеток на общий минипрепарат РНК. Оно может увеличиваться до максимум 5×10 клеток на минипрепарат без изменения объема реактивов. Для большего числа клеток обработайте многие минипрепараты или используйте методику для препаратов РНК среднего размера, следуя протоколу изготовителя.
(2) Используйте отношение 1 мл образца к 5 мл реактива для клеток RNAprotect.
ii) Приготовьте подходящее число 15 мл пробирок, содержащих 5 мл реактива для клеток RNAprotect.
iii) Замороженные клетки: поместить флаконы с замороженными клетками на сухой лед для предотвращения оттаивания. Не размораживать клетки до добавления реактивов. Обрабатывать один флакон за раз для максимизации защиты РНК.
(1) Перенести ~750 мкл реактива для клеток RNAprotect из одной 15 мл пробирки в криофлакон с замороженными клетками, содержащий ~1 мл замораживающей среды. Довести объемы, как необходимо для других сценариев. Не переполнять.
(а) Использовать высококачественные наконечники пипеток с малым удерживанием для предотвращения потерь при пипетировании.
(2) Немедленно встряхнуть смесь в течение ~10 секунд. Быстро перенести частично оттаявшую смесь обратно в ту же самую 15 мл пробирку, содержащую реактив для клеток RNAprotect.
(3) Повторять стадии 3) в) iii) (1) и 3) в) iii) (2), пока смесь полностью не оттает. На это уйдет 3-4 повтора.
(4) Хорошо перемешать посредством встряхивания, пока образец не станет гомогенным.
iv) Немедленно перейти к выделению общей РНК или хранить полученные образцы в реактиве для клеток RNAprotect. Хранить образцы при 2-8°С в течение вплоть до 4 недель или архивировать при -20°С или -80°С.
г) Приготовление клеточных лизатов для выделения общей РНК.
i) При нахождении в замороженном состоянии разморозить клеточную смесь RNAprotect при комнатной температуре без смешивания.
ii) Центрифугировать клеточную смесь RNAprotect в течение 5 минут при 4000 об./мин (Sorvall ID 0018 или эквивалентная) для сбора клеток и любого осадка, который возможно образовался. Должен образоваться видимый белый осадок.
iii) Удалить столько супернатанта, сколько возможно, в контейнер для отходов. Постучать по пробирке или встряхнуть для разрыхления осадка. Это очень важно для полной солюбилизации на следующей стадии.
(1) Добавить 350 мкл свежеприготовленного буфера RLT Plus плюс β- меркаптоэтанол к осадку. Энергично встряхивать в течение 1-2 минут, пока осадок полностью не растворится. При необходимости данный лизат можно хранить при -80°С. Разморозить при комнатной температуре и встряхнуть перед применением.
д) Выделение общей РНК с использованием набора QIAGEN RNeasy
Plus
Mini.
Все стадии проводятся при комнатной температуре. Выделить общую РНК из следующих криоконсервированных образцов. Разводить в 30 мкл воды, не содержащей нуклеаз.
№1: iPSC-MSC (неразмноженные) (контрольная культура)
№2: iPSC-MSC (размноженные) (контрольная культура)
№3: iPSC-MSC плюс 0,001% внутреннего стандарта iPSC (неразмноженные) (контрольная культура)
№4: iPSC-MSC плюс 0,001% внутреннего стандарта iPSC (размноженные) (контрольная культура)
№5: iPSC-MSC Р5 конечный продукт (неразмноженные)
№6: iPSC-MSC Р5 конечный продукт (размноженные)
i) Перенести лизат в QIAshredder. Центрифугировать на полной скорости в течение 2 минут для приложения усилия сдвига и гомогенизации лизата. На дне пробирки для сбора может образоваться тонкий круглый осадок.
ii) Перенести гомогенизированный лизат в собранную центрифугируемую колонку gDNA Eliminator, избегая любого осажденного вещества. Центрифугировать на полной скорости в течение 30 секунд. При необходимости, повторять, пока весь лизат не пройдет через центрифугируемую колонку.
iii) Добавить 350 мкл 70%-ного этанола в элюат и хорошо перемешать пипетированием. Не центрифугировать. Немедленно перенести данную смесь в собранную центрифугируемую колонку RNeasy с любым осадком, который возможно образовался.
iv) Осторожно закрыть крышку и центрифугировать на полной скорости в течение 15 секунд. Отбросить элюат из пробирки для сбора. РНК теперь связана с центрифугируемой колонкой RNeasy.
v) Обработка ДНКазой на мембране:
(1) Для максимального удаления геномной ДНК связавшуюся РНК обрабатывают ДНКазой, не содержащей РНКаз.
(а) Добавить 350 мкл буфера RW1 в центрифугируемую колонку. Осторожно закрыть крышку и центрифугировать на полной скорости в течение 15 секунд. Отбросить элюат из пробирки для сбора.
(б) Для каждого образца объединить 20 мкл разведенной ДНКазы, 140 мкл буфера RDD и 2 мкл SUPERase. In™. Осторожно смешать пипетированием и объединить все в одной пробирке. Не встряхивать.
(в) Отобрать пипеткой 80 мкл смеси ДНКазы непосредственно в центр мембраны RNeasy. Инкубировать при комнатной температуре в течение 20 минут.
(г) Добавить 350 мкл буфера RW1 в центрифугируемую колонку. Осторожно закрыть крышку и центрифугировать на полной скорости в течение 15 секунд. Отбросить элюат из пробирки для сбора.
vi) Добавить 500 мкл буфера RPE в центрифугируемую колонку. Осторожно закрыть крышку и центрифугировать на полной скорости в течение 15 секунд. Отбросить элюат из пробирки для сбора.
vii) Повторить промывку добавлением 500 мкл буфера RPE в центрифугируемую колонку. Осторожно закрыть крышку и центрифугировать на полной скорости в течение 2 минут.
viii) Перенести центрифугируемую колонку в свежую 2 мл пробирку для сбора. Центрифугировать на полной скорости в течение 1 минуты для удаления любого остаточного промывочного раствора.
ix) Перенести центрифугируемую колонку в 1,5 мл пробирку для сбора. Добавить 30 мкл воды, не содержащей РНКаз, непосредственно на мембрану. Осторожно закрыть крышку и центрифугировать на полной скорости в течение 1 минуты для элюции РНК.
x) Отбросить центрифугируемую колонку и закрыть крышкой пробирку. Пометить пробирку датой и ID (идентификационный номер) образца.
xi) Нормировать объем каждого образца общей РНК до 30 мкл.
(1) Установить пипетку 10-100 мкл на 30 мкл и измерить объем элюата.
(2) Если объем меньше, чем 30 мкл, добавить воду, не содержащую нуклеаз, из набора RNeasy до конечного объема 30 мкл.
(3) Образец теперь нормирован по отношению к исходному числу клеток.
xii) Определить общую концентрацию РНК для каждого образца с использованием Nanodrop 2000.
(1) Очистить основание образца водой Milli-Q до запуска программы для удаления любого потенциального загрязнения от предыдущего использования.
(2) Как только запускается программа, снять отметку с поля поправка на фон 340 нм.
(3) Очистить прибор водой Milli-Q.
(4) Проанализировать образец воды Milli-Q для убеждения в том, что фон равен нулю. Если необходимо, повторно очистить основание образца водой Milli-Q.
(5) Определить общую концентрацию РНК каждого образца с использованием одного определения.
(6) Рассчитать общий выход РНК и выход на клетку.
(7) Рассчитать объем 1,0-2,0 мкг общей РНК для каждого образца. (Максимум 2,0 мкг общей РНК может быть подвергнуто обратной транскрипции на реакцию кДНК).
(8) Концентрация общей РНК должна составлять 100 нг/мкл или более для удовлетворения требования 1 мкг общей РНК на 10 мкл (максимальный объем) для обратной транскрипции. Повторно выделить общую РНК из свежего флакона с клетками, если необходимо.
6
Ожидаемый выход общей РНК на 1×10 криоконсервированных iPSC-MSC составляет ~5-10 мкг. Это эквивалентно ~5-10 пг общей РНК на клетку.
xiii) Перейти к синтезу кДНК или хранить общую РНК при -20°С в течение вплоть до 1 года.
е) Получение кДНК с использованием высокоэффективного набора RNA-to-cDNA
™
i) Для каждого образца общей РНК приготовить кДНК плюс/минус ОТ с использованием 1 мкг общей РНК / 22 мкл ОТ. Включить контроли Н2О (NTC) плюс/минус ОТ (N равно 14).
ii) Разморозить компоненты набора на льду.
iii) Приготовить один плюс ОТ и один минус ОТ мастер-микс на льду, в зависимости от числа образцов общей РНК, подлежащих анализу. Образцы минус ОТ служат в качестве негативных контролей, не имеющих обратной транскриптазы. Включить контроли Н2О (NTC) плюс/минус ОТ посредством замены общей РНК водой уровня качества для ПЦР-ОТ.
iv) Получить индивидуальные реакционные смеси плюс/минус ОТ на льду для каждого образца общей РНК.
(1) Максимальный объем общей ДНК составляет 10 мкл на 22 мкл плюс/минус ОТ. Объем общей РНК будет варьировать, в зависимости от концентрации общей РНК.
(2) Рассчитать объем воды уровня качества для ПЦР-ОТ для каждой пробирки путем вычитания объема общей РНК из 10 мкл.
2
(3) Перенести пипеткой подходящий объем воды уровня качества для ПЦР-ОТ в каждую пробирку. Использовать 10 мкл для контролей с НО плюс/минус ОТ.
(4) Добавить подходящий объем общей РНК в каждую пробирку.
(5) Добавить 12 мкл плюс ОТ или минус ОТ мастер-микса в каждую пробирку и осторожно смешивать пипетированием.
v) Инкубировать при 37°С в течение 60 минут.
vi) Инактивировать нагреванием при 95°С в течение 5 минут.
vii) Кратковременно центрифугировать пробирки для сбора кДНК.
viii) Измерить объем кДНК с использованием калиброванной пипетки на 10-100 мкл.
(1) Установить объем пипетки на реакционный объем кДНК (20-22 мкл) и измерить объем кДНК.
(2) Довести объем кДНК до 100 мкл водой, не содержащей нуклеаз. Это разбавит ингибиторы и даст достаточное количество кДНК для многих анализов кПЦР-РВ.
ix) Смешать посредством встряхивания и кратковременно осадить образцы центрифугированием.
x) Перейти к кПЦР-РВ или хранить при -20°С.
ж) кПЦР-РВ (анализы экспрессии генов TaqMan)
i) Для каждой кДНК (N равно 14) амплифицировать 50 нг кДНК (эквивалентов общей РНК) на 20 мкл кПЦР-РВ для LIN28 и GAPDH (N равно 3 для каждого). Провести кПЦР-РВ с использованием 50 циклов. (Файл протокола: TaqMan qRT-PCR Assays Cq(50).prcl).
ii) Приготовить смесь для амплификации кДНК для каждой кДНК плюс ОТ и минус ОТ, в зависимости от числа повторов и числа анализов GE TaqMan, подлежащих проведению.
(1) Рекомендованное максимальное количество кДНК на реакцию составляет 100 нг (эквивалентов общей РНК).
iii) Приготовить смесь для анализа GE для каждой кДНК, в зависимости от числа анализов GE TaqMan и повторов. Одна смесь для анализа GE будет получена для каждой кДНК и каждого анализа GE TaqMan, подлежащего проведению.
iv) Перенести 20 мкл каждой смеси для анализа GE в белый планшет CFX96 и запечатать оптическим приспособлением для запечатывания планшетов.
v) Центрифугировать планшет при 400 об./мин в течение 1 минуты в центрифуге с адаптером для планшетов (ID #0018) для сбора содержимого на дне лунок.
vi) Осторожно поместить плашет в термоциклер, будучи осторожным, чтобы не встряхивать содержимое лунок.
vii) Запрограммировать систему выявления ПЦР в реальном времени Bio-Rad CFX96 с использованием программы Bio-Rad CFX Manager™ на присоединенном компьютере со следующими параметрами термоциклирования:
(1) 2 минуты при 50,0°С (инкубация UNG; требуется для оптимальной активности урацил-N-гликозилазы; деградирует ранее амплифицированные ПЦР- продукты с включением дУТФ с уменьшением загрязнения ПЦР).
(2) 10 минут при 95°С (горячий старт: AmpliTaq Gold, активация поимеразы UP).
(3) [15 секунд при 95°С (денатурация) плюс 1 минута при 60°С (отжиг/элонгация) плюс считывание планшета] - повторить 49 раз за 50 циклов (амплификация и выявление в реальном времени).
viii) Установить объем образца 20 мкл.
ix) Оценочное время прогона должно составлять 01:59:00 ч.
х) Считать все лунки и все каналы во время прогона для убеждения в том, что во время прогона отбираются все данные.
(1) Установки предварительного просмотра, расположенные выше схемы планшета, должны быть следующими:
(а) Флуорофоры: FAM, HEX, техасский красный, Cy5, Quasar 705 (VIC может быть добавлен позднее)
(б) Тип планшета: BR белый
(в) Способ сканирования: все каналы
xi) Все лунки должны быть помечены «Unk», указывая то, что программа рассматривает все лунки как неизвестные во время прогона. Реальная схема планшета будет установлена после завершения прогона.
xii) Нажмите Next для перехода к вкладке Start Run. Введите идентификационную информацию о прогоне в разделе Notes.
xiii) Нажмите на кнопку Start Run для начала кПЦР-РВ.
з) Анализ данных
i) Окно анализа данных будет открыто в конце прогона.
(1) Данные кПЦР-РВ приводятся в виде значений Cq (т.е. Cq(50)).
ii) Нажмите на кнопку Plate Setup сверху, на правой стороне окна.
(1) Выберите View/Edit Plate. Следуйте руководству по загрузке планшета для установки для планшета информации об образце.
(а) Очистите любые пустые лунки.
(б) Не ставьте метку «Exclude Wells in Analysis». Должны быть проанализированы все данные.
(2) Нажмите на OK и сохраните файл.
iii) Нажмите на вкладку Quantification около верхней части окна.
iv) Отметьте следующие установки:
(1) Способ определения Cq: один порог
(2) Установка фонового уровня: аппроксимация кривой с вычитанием фона
(3) Способ анализа: флуорофор
v) Генерировать отчет из меню Tools со следующими разделами и ассоциированными подразделами: Header, Run Setup, Quantification и QC Parameters.
(1) Снимите выделение с опций Gene Expression, Allelic Discrimination и End Point, так как данные разделы не являются релевантными.
vi) Экспортировать данные для анализа посредством выбора Export > “Export All Data Sheets to Excel”. Это будет давать данные в формате крупноформатной таблицы.
vii) Анализировать данные с использованием крупноформатной таблицы.
(1) Сообщить «N/A» (не доступно) в виде «Нет Cq(50)».
(2) Рассчитать средн. Cq(50) и % относительного стандартного отклонения (RSD или коэффициент вариации (CV)) для каждого набора данных LIN28 и GAPDH плюс/минус ОТ.
(3) Нормировать средн. значения Cq(50) посредством вычитания средн. Cq(50) GAPDH (N равно 3) из средн. Cq(50) LIN28 (N равно 3).
(4) Рассчитать средн. Cq(50) GAPDH и %RSD для всех образцов.
(5) Сравнить нормированные средн. значения Cq(50) образцов №2 (iPSC-MSC (размноженные) и №4 (iPSC-MSC плюс 0,001% внутреннего стандарта iPSC (размноженные)). Сравнить нормированные средн. значения Cq(50) образцов №4 (iPSC-MSC плюс 0,001% внутреннего стандарта iPSC (размноженные)) и №6 (конечный продукт - iPSC-MSC Р5 (размноженные)).
4) КРИТЕРИИ ПРИНЯТИЯ
а) Нормированное средн. значение Cq(50) образца №2 (iPSC-MSC (размноженные)) должно быть больше, чем нормированное средн. значение Cq(50) образца №4 (iPSC-MSC плюс 0,001% внутреннего стандарта iPSC (размноженные)). Это демонстрирует то, что 0,001% внутреннего стандарта iPSC (размноженные) может быть выявлено выше фона.
* Норм. Cq(50) LIN28 = (Cq(50) LIN28 - Cq(50) GAPDH) +/- станд. отклон. (N равно 3×3)
б) %RSD Cq(50) GAPDH для всех образцов должен составлять 5% или меньше. %RSD для всех средних значений Cq(50) и нормированных значений Cq(50) должен составлять 5% или меньше.
в) Контроли Н2О (NTC) (плюс/минус ОТ) не должны давать выявляемый амплификационный сигнал в пределах 50 циклов амплификации для всех повторностей.
i) Если любому из контролей Н2О (NTC) (плюс/минус ОТ) приписывается значение Cq(50), повторите анализы кПЦР-РВ TaqMan со стадии 2) ж). Это указывает на загрязнение реактивов матричной ДНК.
Пример 3 - результаты протокола, проведенного согласно Примеру 2
Пример 4 - количественное измерение остаточных, недифференцированных стволовых клеток посредством кПЦР-РВ
Данный пример описывает количественное измерение остаточных, недифференцированных iPSC по существу посредством протокола Примера 2, но LIN28 заменяют на ОСТ4 (POU5F1). Предполагаемые результаты согласуются с Примером 2, Таблицей 7 и Примером 3, Таблицей 8.
Пример 5 - количественное измерение остаточных, недифференцированных стволовых клеток посредством кПЦР-РВ
Данный пример описывает количественное измерение остаточных, недифференцированных iPSC по существу посредством протокола Примера 2, но LIN28 заменяют на SOX2. Предполагаемые результаты согласуются с Примером 2, Таблицей 7 и Примером 3, Таблицей 8.
Пример 6 - количественное измерение остаточных, недифференцированных стволовых клеток посредством кПЦР-РВ
Данный пример описывает количественное измерение остаточных, недифференцированных iPSC по существу посредством протокола Примера 2, но LIN28 заменяют на FOXD3. Предполагаемые результаты согласуются с Примером 2, Таблицей 7 и Примером 3, Таблицей 8.
Пример 7 - количественное измерение остаточных, недифференцированных стволовых клеток посредством кПЦР-РВ
Данный пример описывает количественное измерение остаточных, недифференцированных iPSC по существу посредством протокола Примера 2, но LIN28 заменяют NANOG. Предполагаемые результаты согласуются с Примером 2, Таблицей 7 и Примером 3, Таблицей 8.
Пример 8 - количественное измерение остаточных, недифференцированных стволовых клеток посредством кПЦР-РВ
Данный пример описывает количественное измерение остаточных, недифференцированных iPSC по существу посредством протокола Примера 2, но LIN28 заменяют PODXL. Предполагаемые результаты согласуются с Примером 2, Таблицей 7 и Примером 3, Таблицей 8.
Пример 9 - количественное измерение остаточных, недифференцированных стволовых клеток посредством кПЦР-РВ
Данный пример описывает количественное измерение остаточных, недифференцированных iPSC по существу посредством протокола Примера 2, но LIN28 заменяют на REX1 (ZFP42). Предполагаемые результаты согласуются с Примером 2, Таблицей 7 и Примером 3, Таблицей 8.
Пример 10 - количественное измерение остаточных, недифференцированных стволовых клеток посредством кПЦР-РВ
Данный пример описывает количественное измерение остаточных, недифференцированных iPSC по существу посредством протокола Примера 2, но LIN28 заменяют на SSEA1 (FUT4). Предполагаемые результаты согласуются с Примером 2, Таблицей 7 и Примером 3, Таблицей 8.
Пример 11 - количественное измерение остаточных, недифференцированных стволовых клеток посредством кПЦР-РВ
Данный пример описывает количественное измерение остаточных, недифференцированных iPSC по существу посредством протокола Примера 2, но LIN28 заменяют на SSEA4. Предполагаемые результаты согласуются с Примером 2, Таблицей 7 и Примером 3, Таблицей 8.
Пример 12 - количественное измерение остаточных, недифференцированных стволовых клеток посредством кПЦР-РВ
Данный пример описывает количественное измерение остаточных, недифференцированных iPSC по существу посредством протокола Примера 2, но LIN28 заменяют на DPPA2. Предполагаемые результаты согласуются с Примером 2, Таблицей 7 и Примером 3, Таблицей 8.
Пример 13 - количественное измерение остаточных, недифференцированных стволовых клеток посредством кПЦР-РВ
Данный пример описывает количественное измерение остаточных, недифференцированных iPSC по существу посредством протокола Примера 2, но LIN28 заменяют на DPPA3. Предполагаемые результаты согласуются с Примером 2, Таблицей 7 и Примером 3, Таблицей 8.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
SEQUENCE LISTING
<110>  Cynata Therapeutics Limited
<120>  PLURIPOTENT STEM CELL ASSAY
<130>  P104383.PCT
<150>  AU 2016904679
<151>  2016-11-16
<160>  14
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  3695
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  laminin-521 alpha chain
Met Ala Lys Arg Leu Cys Ala Gly Ser Ala Leu Cys Val Arg Gly Pro
1               5                   10                  15
Arg Gly Pro Ala Pro Leu Leu Leu Val Gly Leu Ala Leu Leu Gly Ala
20                  25                  30
Ala Arg Ala Arg Glu Glu Ala Gly Gly Gly Phe Ser Leu His Pro Pro
35                  40                  45
Tyr Phe Asn Leu Ala Glu Gly Ala Arg Ile Ala Ala Ser Ala Thr Cys
50                  55                  60
Gly Glu Glu Ala Pro Ala Arg Gly Ser Pro Arg Pro Thr Glu Asp Leu
65                  70                  75                  80
Tyr Cys Lys Leu Val Gly Gly Pro Val Ala Gly Gly Asp Pro Asn Gln
85                  90                  95
Thr Ile Arg Gly Gln Tyr Cys Asp Ile Cys Thr Ala Ala Asn Ser Asn
100                 105                 110
Lys Ala His Pro Ala Ser Asn Ala Ile Asp Gly Thr Glu Arg Trp Trp
115                 120                 125
Gln Ser Pro Pro Leu Ser Arg Gly Leu Glu Tyr Asn Glu Val Asn Val
130                 135                 140
Thr Leu Asp Leu Gly Gln Val Phe His Val Ala Tyr Val Leu Ile Lys
145                 150                 155                 160
Phe Ala Asn Ser Pro Arg Pro Asp Leu Trp Val Leu Glu Arg Ser Met
165                 170                 175
Asp Phe Gly Arg Thr Tyr Gln Pro Trp Gln Phe Phe Ala Ser Ser Lys
180                 185                 190
Arg Asp Cys Leu Glu Arg Phe Gly Pro Gln Thr Leu Glu Arg Ile Thr
195                 200                 205
Arg Asp Asp Ala Ala Ile Cys Thr Thr Glu Tyr Ser Arg Ile Val Pro
210                 215                 220
Leu Glu Asn Gly Glu Ile Val Val Ser Leu Val Asn Gly Arg Pro Gly
225                 230                 235                 240
Ala Met Asn Phe Ser Tyr Ser Pro Leu Leu Arg Glu Phe Thr Lys Ala
245                 250                 255
Thr Asn Val Arg Leu Arg Phe Leu Arg Thr Asn Thr Leu Leu Gly His
260                 265                 270
Leu Met Gly Lys Ala Leu Arg Asp Pro Thr Val Thr Arg Arg Tyr Tyr
275                 280                 285
Tyr Ser Ile Lys Asp Ile Ser Ile Gly Gly Arg Cys Val Cys His Gly
290                 295                 300
His Ala Asp Ala Cys Asp Ala Lys Asp Pro Thr Asp Pro Phe Arg Leu
305                 310                 315                 320
Gln Cys Thr Cys Gln His Asn Thr Cys Gly Gly Thr Cys Asp Arg Cys
325                 330                 335
Cys Pro Gly Phe Asn Gln Gln Pro Trp Lys Pro Ala Thr Ala Asn Ser
340                 345                 350
Ala Asn Glu Cys Gln Ser Cys Asn Cys Tyr Gly His Ala Thr Asp Cys
355                 360                 365
Tyr Tyr Asp Pro Glu Val Asp Arg Arg Arg Ala Ser Gln Ser Leu Asp
370                 375                 380
Gly Thr Tyr Gln Gly Gly Gly Val Cys Ile Asp Cys Gln His His Thr
385                 390                 395                 400
Thr Gly Val Asn Cys Glu Arg Cys Leu Pro Gly Phe Tyr Arg Ser Pro
405                 410                 415
Asn His Pro Leu Asp Ser Pro His Val Cys Arg Arg Cys Asn Cys Glu
420                 425                 430
Ser Asp Phe Thr Asp Gly Thr Cys Glu Asp Leu Thr Gly Arg Cys Tyr
435                 440                 445
Cys Arg Pro Asn Phe Ser Gly Glu Arg Cys Asp Val Cys Ala Glu Gly
450                 455                 460
Phe Thr Gly Phe Pro Ser Cys Tyr Pro Thr Pro Ser Ser Ser Asn Asp
465                 470                 475                 480
Thr Arg Glu Gln Val Leu Pro Ala Gly Gln Ile Val Asn Cys Asp Cys
485                 490                 495
Ser Ala Ala Gly Thr Gln Gly Asn Ala Cys Arg Lys Asp Pro Arg Val
500                 505                 510
Gly Arg Cys Leu Cys Lys Pro Asn Phe Gln Gly Thr His Cys Glu Leu
515                 520                 525
Cys Ala Pro Gly Phe Tyr Gly Pro Gly Cys Gln Pro Cys Gln Cys Ser
530                 535                 540
Ser Pro Gly Val Ala Asp Asp Arg Cys Asp Pro Asp Thr Gly Gln Cys
545                 550                 555                 560
Arg Cys Arg Val Gly Phe Glu Gly Ala Thr Cys Asp Arg Cys Ala Pro
565                 570                 575
Gly Tyr Phe His Phe Pro Leu Cys Gln Leu Cys Gly Cys Ser Pro Ala
580                 585                 590
Gly Thr Leu Pro Glu Gly Cys Asp Glu Ala Gly Arg Cys Leu Cys Gln
595                 600                 605
Pro Glu Phe Ala Gly Pro His Cys Asp Arg Cys Arg Pro Gly Tyr His
610                 615                 620
Gly Phe Pro Asn Cys Gln Ala Cys Thr Cys Asp Pro Arg Gly Ala Leu
625                 630                 635                 640
Asp Gln Leu Cys Gly Ala Gly Gly Leu Cys Arg Cys Arg Pro Gly Tyr
645                 650                 655
Thr Gly Thr Ala Cys Gln Glu Cys Ser Pro Gly Phe His Gly Phe Pro
660                 665                 670
Ser Cys Val Pro Cys His Cys Ser Ala Glu Gly Ser Leu His Ala Ala
675                 680                 685
Cys Asp Pro Arg Ser Gly Gln Cys Ser Cys Arg Pro Arg Val Thr Gly
690                 695                 700
Leu Arg Cys Asp Thr Cys Val Pro Gly Ala Tyr Asn Phe Pro Tyr Cys
705                 710                 715                 720
Glu Ala Gly Ser Cys His Pro Ala Gly Leu Ala Pro Val Asp Pro Ala
725                 730                 735
Leu Pro Glu Ala Gln Val Pro Cys Met Cys Arg Ala His Val Glu Gly
740                 745                 750
Pro Ser Cys Asp Arg Cys Lys Pro Gly Phe Trp Gly Leu Ser Pro Ser
755                 760                 765
Asn Pro Glu Gly Cys Thr Arg Cys Ser Cys Asp Leu Arg Gly Thr Leu
770                 775                 780
Gly Gly Val Ala Glu Cys Gln Pro Gly Thr Gly Gln Cys Phe Cys Lys
785                 790                 795                 800
Pro His Val Cys Gly Gln Ala Cys Ala Ser Cys Lys Asp Gly Phe Phe
805                 810                 815
Gly Leu Asp Gln Ala Asp Tyr Phe Gly Cys Arg Ser Cys Arg Cys Asp
820                 825                 830
Ile Gly Gly Ala Leu Gly Gln Ser Cys Glu Pro Arg Thr Gly Val Cys
835                 840                 845
Arg Cys Arg Pro Asn Thr Gln Gly Pro Thr Cys Ser Glu Pro Ala Arg
850                 855                 860
Asp His Tyr Leu Pro Asp Leu His His Leu Arg Leu Glu Leu Glu Glu
865                 870                 875                 880
Ala Ala Thr Pro Glu Gly His Ala Val Arg Phe Gly Phe Asn Pro Leu
885                 890                 895
Glu Phe Glu Asn Phe Ser Trp Arg Gly Tyr Ala Gln Met Ala Pro Val
900                 905                 910
Gln Pro Arg Ile Val Ala Arg Leu Asn Leu Thr Ser Pro Asp Leu Phe
915                 920                 925
Trp Leu Val Phe Arg Tyr Val Asn Arg Gly Ala Met Ser Val Ser Gly
930                 935                 940
Arg Val Ser Val Arg Glu Glu Gly Arg Ser Ala Thr Cys Ala Asn Cys
945                 950                 955                 960
Thr Ala Gln Ser Gln Pro Val Ala Phe Pro Pro Ser Thr Glu Pro Ala
965                 970                 975
Phe Ile Thr Val Pro Gln Arg Gly Phe Gly Glu Pro Phe Val Leu Asn
980                 985                 990
Pro Gly Thr Trp Ala Leu Arg Val  Glu Ala Glu Gly Val  Leu Leu Asp
995                 1000                 1005
Tyr Val  Val Leu Leu Pro Ser  Ala Tyr Tyr Glu Ala  Ala Leu Leu
1010                 1015                 1020
Gln Leu  Arg Val Thr Glu Ala  Cys Thr Tyr Arg Pro  Ser Ala Gln
1025                 1030                 1035
Gln Ser  Gly Asp Asn Cys Leu  Leu Tyr Thr His Leu  Pro Leu Asp
1040                 1045                 1050
Gly Phe  Pro Ser Ala Ala Gly  Leu Glu Ala Leu Cys  Arg Gln Asp
1055                 1060                 1065
Asn Ser  Leu Pro Arg Pro Cys  Pro Thr Glu Gln Leu  Ser Pro Ser
1070                 1075                 1080
His Pro  Pro Leu Ile Thr Cys  Thr Gly Ser Asp Val  Asp Val Gln
1085                 1090                 1095
Leu Gln  Val Ala Val Pro Gln  Pro Gly Arg Tyr Ala  Leu Val Val
1100                 1105                 1110
Glu Tyr  Ala Asn Glu Asp Ala  Arg Gln Glu Val Gly  Val Ala Val
1115                 1120                 1125
His Thr  Pro Gln Arg Ala Pro  Gln Gln Gly Leu Leu  Ser Leu His
1130                 1135                 1140
Pro Cys  Leu Tyr Ser Thr Leu  Cys Arg Gly Thr Ala  Arg Asp Thr
1145                 1150                 1155
Gln Asp  His Leu Ala Val Phe  His Leu Asp Ser Glu  Ala Ser Val
1160                 1165                 1170
Arg Leu  Thr Ala Glu Gln Ala  Arg Phe Phe Leu His  Gly Val Thr
1175                 1180                 1185
Leu Val  Pro Ile Glu Glu Phe  Ser Pro Glu Phe Val  Glu Pro Arg
1190                 1195                 1200
Val Ser  Cys Ile Ser Ser His  Gly Ala Phe Gly Pro  Asn Ser Ala
1205                 1210                 1215
Ala Cys  Leu Pro Ser Arg Phe  Pro Lys Pro Pro Gln  Pro Ile Ile
1220                 1225                 1230
Leu Arg  Asp Cys Gln Val Ile  Pro Leu Pro Pro Gly  Leu Pro Leu
1235                 1240                 1245
Thr His  Ala Gln Asp Leu Thr  Pro Ala Met Ser Pro  Ala Gly Pro
1250                 1255                 1260
Arg Pro  Arg Pro Pro Thr Ala  Val Asp Pro Asp Ala  Glu Pro Thr
1265                 1270                 1275
Leu Leu  Arg Glu Pro Gln Ala  Thr Val Val Phe Thr  Thr His Val
1280                 1285                 1290
Pro Thr  Leu Gly Arg Tyr Ala  Phe Leu Leu His Gly  Tyr Gln Pro
1295                 1300                 1305
Ala His  Pro Thr Phe Pro Val  Glu Val Leu Ile Asn  Ala Gly Arg
1310                 1315                 1320
Val Trp  Gln Gly His Ala Asn  Ala Ser Phe Cys Pro  His Gly Tyr
1325                 1330                 1335
Gly Cys  Arg Thr Leu Val Val  Cys Glu Gly Gln Ala  Leu Leu Asp
1340                 1345                 1350
Val Thr  His Ser Glu Leu Thr  Val Thr Val Arg Val  Pro Lys Gly
1355                 1360                 1365
Arg Trp  Leu Trp Leu Asp Tyr  Val Leu Val Val Pro  Glu Asn Val
1370                 1375                 1380
Tyr Ser  Phe Gly Tyr Leu Arg  Glu Glu Pro Leu Asp  Lys Ser Tyr
1385                 1390                 1395
Asp Phe  Ile Ser His Cys Ala  Ala Gln Gly Tyr His  Ile Ser Pro
1400                 1405                 1410
Ser Ser  Ser Ser Leu Phe Cys  Arg Asn Ala Ala Ala  Ser Leu Ser
1415                 1420                 1425
Leu Phe  Tyr Asn Asn Gly Ala  Arg Pro Cys Gly Cys  His Glu Val
1430                 1435                 1440
Gly Ala  Thr Gly Pro Thr Cys  Glu Pro Phe Gly Gly  Gln Cys Pro
1445                 1450                 1455
Cys His  Ala His Val Ile Gly  Arg Asp Cys Ser Arg  Cys Ala Thr
1460                 1465                 1470
Gly Tyr  Trp Gly Phe Pro Asn  Cys Arg Pro Cys Asp  Cys Gly Ala
1475                 1480                 1485
Arg Leu  Cys Asp Glu Leu Thr  Gly Gln Cys Ile Cys  Pro Pro Arg
1490                 1495                 1500
Thr Ile  Pro Pro Asp Cys Leu  Leu Cys Gln Pro Gln  Thr Phe Gly
1505                 1510                 1515
Cys His  Pro Leu Val Gly Cys  Glu Glu Cys Asn Cys  Ser Gly Pro
1520                 1525                 1530
Gly Ile  Gln Glu Leu Thr Asp  Pro Thr Cys Asp Thr  Asp Ser Gly
1535                 1540                 1545
Gln Cys  Lys Cys Arg Pro Asn  Val Thr Gly Arg Arg  Cys Asp Thr
1550                 1555                 1560
Cys Ser  Pro Gly Phe His Gly  Tyr Pro Arg Cys Arg  Pro Cys Asp
1565                 1570                 1575
Cys His  Glu Ala Gly Thr Ala  Pro Gly Val Cys Asp  Pro Leu Thr
1580                 1585                 1590
Gly Gln  Cys Tyr Cys Lys Glu  Asn Val Gln Gly Pro  Lys Cys Asp
1595                 1600                 1605
Gln Cys  Ser Leu Gly Thr Phe  Ser Leu Asp Ala Ala  Asn Pro Lys
1610                 1615                 1620
Gly Cys  Thr Arg Cys Phe Cys  Phe Gly Ala Thr Glu  Arg Cys Arg
1625                 1630                 1635
Ser Ser  Ser Tyr Thr Arg Gln  Glu Phe Val Asp Met  Glu Gly Trp
1640                 1645                 1650
Val Leu  Leu Ser Thr Asp Arg  Gln Val Val Pro His  Glu Arg Gln
1655                 1660                 1665
Pro Gly  Thr Glu Met Leu Arg  Ala Asp Leu Arg His  Val Pro Glu
1670                 1675                 1680
Ala Val  Pro Glu Ala Phe Pro  Glu Leu Tyr Trp Gln  Ala Pro Pro
1685                 1690                 1695
Ser Tyr  Leu Gly Asp Arg Val  Ser Ser Tyr Gly Gly  Thr Leu Arg
1700                 1705                 1710
Tyr Glu  Leu His Ser Glu Thr  Gln Arg Gly Asp Val  Phe Val Pro
1715                 1720                 1725
Met Glu  Ser Arg Pro Asp Val  Val Leu Gln Gly Asn  Gln Met Ser
1730                 1735                 1740
Ile Thr  Phe Leu Glu Pro Ala  Tyr Pro Thr Pro Gly  His Val His
1745                 1750                 1755
Arg Gly  Gln Leu Gln Leu Val  Glu Gly Asn Phe Arg  His Thr Glu
1760                 1765                 1770
Thr Arg  Asn Thr Val Ser Arg  Glu Glu Leu Met Met  Val Leu Ala
1775                 1780                 1785
Ser Leu  Glu Gln Leu Gln Ile  Arg Ala Leu Phe Ser  Gln Ile Ser
1790                 1795                 1800
Ser Ala  Val Phe Leu Arg Arg  Val Ala Leu Glu Val  Ala Ser Pro
1805                 1810                 1815
Ala Gly  Gln Gly Ala Leu Ala  Ser Asn Val Glu Leu  Cys Leu Cys
1820                 1825                 1830
Pro Ala  Ser Tyr Arg Gly Asp  Ser Cys Gln Glu Cys  Ala Pro Gly
1835                 1840                 1845
Phe Tyr  Arg Asp Val Lys Gly  Leu Phe Leu Gly Arg  Cys Val Pro
1850                 1855                 1860
Cys Gln  Cys His Gly His Ser  Asp Arg Cys Leu Pro  Gly Ser Gly
1865                 1870                 1875
Val Cys  Val Asp Cys Gln His  Asn Thr Glu Gly Ala  His Cys Glu
1880                 1885                 1890
Arg Cys  Gln Ala Gly Phe Val  Ser Ser Arg Asp Asp  Pro Ser Ala
1895                 1900                 1905
Pro Cys  Val Ser Cys Pro Cys  Pro Leu Ser Val Pro  Ser Asn Asn
1910                 1915                 1920
Phe Ala  Glu Gly Cys Val Leu  Arg Gly Gly Arg Thr  Gln Cys Leu
1925                 1930                 1935
Cys Lys  Pro Gly Tyr Ala Gly  Ala Ser Cys Glu Arg  Cys Ala Pro
1940                 1945                 1950
Gly Phe  Phe Gly Asn Pro Leu  Val Leu Gly Ser Ser  Cys Gln Pro
1955                 1960                 1965
Cys Asp  Cys Ser Gly Asn Gly  Asp Pro Asn Leu Leu  Phe Ser Asp
1970                 1975                 1980
Cys Asp  Pro Leu Thr Gly Ala  Cys Arg Gly Cys Leu  Arg His Thr
1985                 1990                 1995
Thr Gly  Pro Arg Cys Glu Ile  Cys Ala Pro Gly Phe  Tyr Gly Asn
2000                 2005                 2010
Ala Leu  Leu Pro Gly Asn Cys  Thr Arg Cys Asp Cys  Thr Pro Cys
2015                 2020                 2025
Gly Thr  Glu Ala Cys Asp Pro  His Ser Gly His Cys  Leu Cys Lys
2030                 2035                 2040
Ala Gly  Val Thr Gly Arg Arg  Cys Asp Arg Cys Gln  Glu Gly His
2045                 2050                 2055
Phe Gly  Phe Asp Gly Cys Gly  Gly Cys Arg Pro Cys  Ala Cys Gly
2060                 2065                 2070
Pro Ala  Ala Glu Gly Ser Glu  Cys His Pro Gln Ser  Gly Gln Cys
2075                 2080                 2085
His Cys  Arg Pro Gly Thr Met  Gly Pro Gln Cys Arg  Glu Cys Ala
2090                 2095                 2100
Pro Gly  Tyr Trp Gly Leu Pro  Glu Gln Gly Cys Arg  Arg Cys Gln
2105                 2110                 2115
Cys Pro  Gly Gly Arg Cys Asp  Pro His Thr Gly Arg  Cys Asn Cys
2120                 2125                 2130
Pro Pro  Gly Leu Ser Gly Glu  Arg Cys Asp Thr Cys  Ser Gln Gln
2135                 2140                 2145
His Gln  Val Pro Val Pro Gly  Gly Pro Val Gly His  Ser Ile His
2150                 2155                 2160
Cys Glu  Val Cys Asp His Cys  Val Val Leu Leu Leu  Asp Asp Leu
2165                 2170                 2175
Glu Arg  Ala Gly Ala Leu Leu  Pro Ala Ile His Glu  Gln Leu Arg
2180                 2185                 2190
Gly Ile  Asn Ala Ser Ser Met  Ala Trp Ala Arg Leu  His Arg Leu
2195                 2200                 2205
Asn Ala  Ser Ile Ala Asp Leu  Gln Ser Gln Leu Arg  Ser Pro Leu
2210                 2215                 2220
Gly Pro  Arg His Glu Thr Ala  Gln Gln Leu Glu Val  Leu Glu Gln
2225                 2230                 2235
Gln Ser  Thr Ser Leu Gly Gln  Asp Ala Arg Arg Leu  Gly Gly Gln
2240                 2245                 2250
Ala Val  Gly Thr Arg Asp Gln  Ala Ser Gln Leu Leu  Ala Gly Thr
2255                 2260                 2265
Glu Ala  Thr Leu Gly His Ala  Lys Thr Leu Leu Ala  Ala Ile Arg
2270                 2275                 2280
Ala Val  Asp Arg Thr Leu Ser  Glu Leu Met Ser Gln  Thr Gly His
2285                 2290                 2295
Leu Gly  Leu Ala Asn Ala Ser  Ala Pro Ser Gly Glu  Gln Leu Leu
2300                 2305                 2310
Arg Thr  Leu Ala Glu Val Glu  Arg Leu Leu Trp Glu  Met Arg Ala
2315                 2320                 2325
Arg Asp  Leu Gly Ala Pro Gln  Ala Ala Ala Glu Ala  Glu Leu Ala
2330                 2335                 2340
Ala Ala  Gln Arg Leu Leu Ala  Arg Val Gln Glu Gln  Leu Ser Ser
2345                 2350                 2355
Leu Trp  Glu Glu Asn Gln Ala  Leu Ala Thr Gln Thr  Arg Asp Arg
2360                 2365                 2370
Leu Ala  Gln His Glu Ala Gly  Leu Met Asp Leu Arg  Glu Ala Leu
2375                 2380                 2385
Asn Arg  Ala Val Asp Ala Thr  Arg Glu Ala Gln Glu  Leu Asn Ser
2390                 2395                 2400
Arg Asn  Gln Glu Arg Leu Glu  Glu Ala Leu Gln Arg  Lys Gln Glu
2405                 2410                 2415
Leu Ser  Arg Asp Asn Ala Thr  Leu Gln Ala Thr Leu  His Ala Ala
2420                 2425                 2430
Arg Asp  Thr Leu Ala Ser Val  Phe Arg Leu Leu His  Ser Leu Asp
2435                 2440                 2445
Gln Ala  Lys Glu Glu Leu Glu  Arg Leu Ala Ala Ser  Leu Asp Gly
2450                 2455                 2460
Ala Arg  Thr Pro Leu Leu Gln  Arg Met Gln Thr Phe  Ser Pro Ala
2465                 2470                 2475
Gly Ser  Lys Leu Arg Leu Val  Glu Ala Ala Glu Ala  His Ala Gln
2480                 2485                 2490
Gln Leu  Gly Gln Leu Ala Leu  Asn Leu Ser Ser Ile  Ile Leu Asp
2495                 2500                 2505
Val Asn  Gln Asp Arg Leu Thr  Gln Arg Ala Ile Glu  Ala Ser Asn
2510                 2515                 2520
Ala Tyr  Ser Arg Ile Leu Gln  Ala Val Gln Ala Ala  Glu Asp Ala
2525                 2530                 2535
Ala Gly  Gln Ala Leu Gln Gln  Ala Asp His Thr Trp  Ala Thr Val
2540                 2545                 2550
Val Arg  Gln Gly Leu Val Asp  Arg Ala Gln Gln Leu  Leu Ala Asn
2555                 2560                 2565
Ser Thr  Ala Leu Glu Glu Ala  Met Leu Gln Glu Gln  Gln Arg Leu
2570                 2575                 2580
Gly Leu  Val Trp Ala Ala Leu  Gln Gly Ala Arg Thr  Gln Leu Arg
2585                 2590                 2595
Asp Val  Arg Ala Lys Lys Asp  Gln Leu Glu Ala His  Ile Gln Ala
2600                 2605                 2610
Ala Gln  Ala Met Leu Ala Met  Asp Thr Asp Glu Thr  Ser Lys Lys
2615                 2620                 2625
Ile Ala  His Ala Lys Ala Val  Ala Ala Glu Ala Gln  Asp Thr Ala
2630                 2635                 2640
Thr Arg  Val Gln Ser Gln Leu  Gln Ala Met Gln Glu  Asn Val Glu
2645                 2650                 2655
Arg Trp  Gln Gly Gln Tyr Glu  Gly Leu Arg Gly Gln  Asp Leu Gly
2660                 2665                 2670
Gln Ala  Val Leu Asp Ala Gly  His Ser Val Ser Thr  Leu Glu Lys
2675                 2680                 2685
Thr Leu  Pro Gln Leu Leu Ala  Lys Leu Ser Ile Leu  Glu Asn Arg
2690                 2695                 2700
Gly Val  His Asn Ala Ser Leu  Ala Leu Ser Ala Ser  Ile Gly Arg
2705                 2710                 2715
Val Arg  Glu Leu Ile Ala Gln  Ala Arg Gly Ala Ala  Ser Lys Val
2720                 2725                 2730
Lys Val  Pro Met Lys Phe Asn  Gly Arg Ser Gly Val  Gln Leu Arg
2735                 2740                 2745
Thr Pro  Arg Asp Leu Ala Asp  Leu Ala Ala Tyr Thr  Ala Leu Lys
2750                 2755                 2760
Phe Tyr  Leu Gln Gly Pro Glu  Pro Glu Pro Gly Gln  Gly Thr Glu
2765                 2770                 2775
Asp Arg  Phe Val Met Tyr Met  Gly Ser Arg Gln Ala  Thr Gly Asp
2780                 2785                 2790
Tyr Met  Gly Val Ser Leu Arg  Asp Lys Lys Val His  Trp Val Tyr
2795                 2800                 2805
Gln Leu  Gly Glu Ala Gly Pro  Ala Val Leu Ser Ile  Asp Glu Asp
2810                 2815                 2820
Ile Gly  Glu Gln Phe Ala Ala  Val Ser Leu Asp Arg  Thr Leu Gln
2825                 2830                 2835
Phe Gly  His Met Ser Val Thr  Val Glu Arg Gln Met  Ile Gln Glu
2840                 2845                 2850
Thr Lys  Gly Asp Thr Val Ala  Pro Gly Ala Glu Gly  Leu Leu Asn
2855                 2860                 2865
Leu Arg  Pro Asp Asp Phe Val  Phe Tyr Val Gly Gly  Tyr Pro Ser
2870                 2875                 2880
Thr Phe  Thr Pro Pro Pro Leu  Leu Arg Phe Pro Gly  Tyr Arg Gly
2885                 2890                 2895
Cys Ile  Glu Met Asp Thr Leu  Asn Glu Glu Val Val  Ser Leu Tyr
2900                 2905                 2910
Asn Phe  Glu Arg Thr Phe Gln  Leu Asp Thr Ala Val  Asp Arg Pro
2915                 2920                 2925
Cys Ala  Arg Ser Lys Ser Thr  Gly Asp Pro Trp Leu  Thr Asp Gly
2930                 2935                 2940
Ser Tyr  Leu Asp Gly Thr Gly  Phe Ala Arg Ile Ser  Phe Asp Ser
2945                 2950                 2955
Gln Ile  Ser Thr Thr Lys Arg  Phe Glu Gln Glu Leu  Arg Leu Val
2960                 2965                 2970
Ser Tyr  Ser Gly Val Leu Phe  Phe Leu Lys Gln Gln  Ser Gln Phe
2975                 2980                 2985
Leu Cys  Leu Ala Val Gln Glu  Gly Ser Leu Val Leu  Leu Tyr Asp
2990                 2995                 3000
Phe Gly  Ala Gly Leu Lys Lys  Ala Val Pro Leu Gln  Pro Pro Pro
3005                 3010                 3015
Pro Leu  Thr Ser Ala Ser Lys  Ala Ile Gln Val Phe  Leu Leu Gly
3020                 3025                 3030
Gly Ser  Arg Lys Arg Val Leu  Val Arg Val Glu Arg  Ala Thr Val
3035                 3040                 3045
Tyr Ser  Val Glu Gln Asp Asn  Asp Leu Glu Leu Ala  Asp Ala Tyr
3050                 3055                 3060
Tyr Leu  Gly Gly Val Pro Pro  Asp Gln Leu Pro Pro  Ser Leu Arg
3065                 3070                 3075
Arg Leu  Phe Pro Thr Gly Gly  Ser Val Arg Gly Cys  Val Lys Gly
3080                 3085                 3090
Ile Lys  Ala Leu Gly Lys Tyr  Val Asp Leu Lys Arg  Leu Asn Thr
3095                 3100                 3105
Thr Gly  Val Ser Ala Gly Cys  Thr Ala Asp Leu Leu  Val Gly Arg
3110                 3115                 3120
Ala Met  Thr Phe His Gly His  Gly Phe Leu Arg Leu  Ala Leu Ser
3125                 3130                 3135
Asn Val  Ala Pro Leu Thr Gly  Asn Val Tyr Ser Gly  Phe Gly Phe
3140                 3145                 3150
His Ser  Ala Gln Asp Ser Ala  Leu Leu Tyr Tyr Arg  Ala Ser Pro
3155                 3160                 3165
Asp Gly  Leu Cys Gln Val Ser  Leu Gln Gln Gly Arg  Val Ser Leu
3170                 3175                 3180
Gln Leu  Leu Arg Thr Glu Val  Lys Thr Gln Ala Gly  Phe Ala Asp
3185                 3190                 3195
Gly Ala  Pro His Tyr Val Ala  Phe Tyr Ser Asn Ala  Thr Gly Val
3200                 3205                 3210
Trp Leu  Tyr Val Asp Asp Gln  Leu Gln Gln Met Lys  Pro His Arg
3215                 3220                 3225
Gly Pro  Pro Pro Glu Leu Gln  Pro Gln Pro Glu Gly  Pro Pro Arg
3230                 3235                 3240
Leu Leu  Leu Gly Gly Leu Pro  Glu Ser Gly Thr Ile  Tyr Asn Phe
3245                 3250                 3255
Ser Gly  Cys Ile Ser Asn Val  Phe Val Gln Arg Leu  Leu Gly Pro
3260                 3265                 3270
Gln Arg  Val Phe Asp Leu Gln  Gln Asn Leu Gly Ser  Val Asn Val
3275                 3280                 3285
Ser Thr  Gly Cys Ala Pro Ala  Leu Gln Ala Gln Thr  Pro Gly Leu
3290                 3295                 3300
Gly Pro  Arg Gly Leu Gln Ala  Thr Ala Arg Lys Ala  Ser Arg Arg
3305                 3310                 3315
Ser Arg  Gln Pro Ala Arg His  Pro Ala Cys Met Leu  Pro Pro His
3320                 3325                 3330
Leu Arg  Thr Thr Arg Asp Ser  Tyr Gln Phe Gly Gly  Ser Leu Ser
3335                 3340                 3345
Ser His  Leu Glu Phe Val Gly  Ile Leu Ala Arg His  Arg Asn Trp
3350                 3355                 3360
Pro Ser  Leu Ser Met His Val  Leu Pro Arg Ser Ser  Arg Gly Leu
3365                 3370                 3375
Leu Leu  Phe Thr Ala Arg Leu  Arg Pro Gly Ser Pro  Ser Leu Ala
3380                 3385                 3390
Leu Phe  Leu Ser Asn Gly His  Phe Val Ala Gln Met  Glu Gly Leu
3395                 3400                 3405
Gly Thr  Arg Leu Arg Ala Gln  Ser Arg Gln Arg Ser  Arg Pro Gly
3410                 3415                 3420
Arg Trp  His Lys Val Ser Val  Arg Trp Glu Lys Asn  Arg Ile Leu
3425                 3430                 3435
Leu Val  Thr Asp Gly Ala Arg  Ala Trp Ser Gln Glu  Gly Pro His
3440                 3445                 3450
Arg Gln  His Gln Gly Ala Glu  His Pro Gln Pro His  Thr Leu Phe
3455                 3460                 3465
Val Gly  Gly Leu Pro Ala Ser  Ser His Ser Ser Lys  Leu Pro Val
3470                 3475                 3480
Thr Val  Gly Phe Ser Gly Cys  Val Lys Arg Leu Arg  Leu His Gly
3485                 3490                 3495
Arg Pro  Leu Gly Ala Pro Thr  Arg Met Ala Gly Val  Thr Pro Cys
3500                 3505                 3510
Ile Leu  Gly Pro Leu Glu Ala  Gly Leu Phe Phe Pro  Gly Ser Gly
3515                 3520                 3525
Gly Val  Ile Thr Leu Asp Leu  Pro Gly Ala Thr Leu  Pro Asp Val
3530                 3535                 3540
Gly Leu  Glu Leu Glu Val Arg  Pro Leu Ala Val Thr  Gly Leu Ile
3545                 3550                 3555
Phe His  Leu Gly Gln Ala Arg  Thr Pro Pro Tyr Leu  Gln Leu Gln
3560                 3565                 3570
Val Thr  Glu Lys Gln Val Leu  Leu Arg Ala Asp Asp  Gly Ala Gly
3575                 3580                 3585
Glu Phe  Ser Thr Ser Val Thr  Arg Pro Ser Val Leu  Cys Asp Gly
3590                 3595                 3600
Gln Trp  His Arg Leu Ala Val  Met Lys Ser Gly Asn  Val Leu Arg
3605                 3610                 3615
Leu Glu  Val Asp Ala Gln Ser  Asn His Thr Val Gly  Pro Leu Leu
3620                 3625                 3630
Ala Ala  Ala Ala Gly Ala Pro  Ala Pro Leu Tyr Leu  Gly Gly Leu
3635                 3640                 3645
Pro Glu  Pro Met Ala Val Gln  Pro Trp Pro Pro Ala  Tyr Cys Gly
3650                 3655                 3660
Cys Met  Arg Arg Leu Ala Val  Asn Arg Ser Pro Val  Ala Met Thr
3665                 3670                 3675
Arg Ser  Val Glu Val His Gly  Ala Val Gly Ala Ser  Gly Cys Pro
3680                 3685                 3690
Ala Ala
3695
<210>  2
<211>  1811
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  laminin-521 beta chain
Met Glu Leu Thr Ser Arg Glu Arg Gly Arg Gly Gln Pro Leu Pro Trp
1               5                   10                  15
Glu Leu Arg Leu Gly Leu Leu Leu Ser Val Leu Ala Ala Thr Leu Ala
20                  25                  30
Gln Ala Pro Ala Pro Asp Val Pro Gly Cys Ser Arg Gly Ser Cys Tyr
35                  40                  45
Pro Ala Thr Gly Asp Leu Leu Val Gly Arg Ala Asp Arg Leu Thr Ala
50                  55                  60
Ser Ser Thr Cys Gly Leu Asn Gly Pro Gln Pro Tyr Cys Ile Val Ser
65                  70                  75                  80
His Leu Gln Asp Glu Lys Lys Cys Phe Leu Cys Asp Ser Arg Arg Pro
85                  90                  95
Phe Ser Ala Arg Asp Asn Pro His Ser His Arg Ile Gln Asn Val Val
100                 105                 110
Thr Ser Phe Ala Pro Gln Arg Arg Ala Ala Trp Trp Gln Ser Glu Asn
115                 120                 125
Gly Ile Pro Ala Val Thr Ile Gln Leu Asp Leu Glu Ala Glu Phe His
130                 135                 140
Phe Thr His Leu Ile Met Thr Phe Lys Thr Phe Arg Pro Ala Ala Met
145                 150                 155                 160
Leu Val Glu Arg Ser Ala Asp Phe Gly Arg Thr Trp His Val Tyr Arg
165                 170                 175
Tyr Phe Ser Tyr Asp Cys Gly Ala Asp Phe Pro Gly Val Pro Leu Ala
180                 185                 190
Pro Pro Arg His Trp Asp Asp Val Val Cys Glu Ser Arg Tyr Ser Glu
195                 200                 205
Ile Glu Pro Ser Thr Glu Gly Glu Val Ile Tyr Arg Val Leu Asp Pro
210                 215                 220
Ala Ile Pro Ile Pro Asp Pro Tyr Ser Ser Arg Ile Gln Asn Leu Leu
225                 230                 235                 240
Lys Ile Thr Asn Leu Arg Val Asn Leu Thr Arg Leu His Thr Leu Gly
245                 250                 255
Asp Asn Leu Leu Asp Pro Arg Arg Glu Ile Arg Glu Lys Tyr Tyr Tyr
260                 265                 270
Ala Leu Tyr Glu Leu Val Val Arg Gly Asn Cys Phe Cys Tyr Gly His
275                 280                 285
Ala Ser Glu Cys Ala Pro Ala Pro Gly Ala Pro Ala His Ala Glu Gly
290                 295                 300
Met Val His Gly Ala Cys Ile Cys Lys His Asn Thr Arg Gly Leu Asn
305                 310                 315                 320
Cys Glu Gln Cys Gln Asp Phe Tyr Arg Asp Leu Pro Trp Arg Pro Ala
325                 330                 335
Glu Asp Gly His Ser His Ala Cys Arg Lys Cys Glu Cys His Gly His
340                 345                 350
Thr His Ser Cys His Phe Asp Met Ala Val Tyr Leu Ala Ser Gly Asn
355                 360                 365
Val Ser Gly Gly Val Cys Asp Gly Cys Gln His Asn Thr Ala Gly Arg
370                 375                 380
His Cys Glu Leu Cys Arg Pro Phe Phe Tyr Arg Asp Pro Thr Lys Asp
385                 390                 395                 400
Leu Arg Asp Pro Ala Val Cys Arg Ser Cys Asp Cys Asp Pro Met Gly
405                 410                 415
Ser Gln Asp Gly Gly Arg Cys Asp Ser His Asp Asp Pro Ala Leu Gly
420                 425                 430
Leu Val Ser Gly Gln Cys Arg Cys Lys Glu His Val Val Gly Thr Arg
435                 440                 445
Cys Gln Gln Cys Arg Asp Gly Phe Phe Gly Leu Ser Ile Ser Asp Arg
450                 455                 460
Leu Gly Cys Arg Arg Cys Gln Cys Asn Ala Arg Gly Thr Val Pro Gly
465                 470                 475                 480
Ser Thr Pro Cys Asp Pro Asn Ser Gly Ser Cys Tyr Cys Lys Arg Leu
485                 490                 495
Val Thr Gly Arg Gly Cys Asp Arg Cys Leu Pro Gly His Trp Gly Leu
500                 505                 510
Ser His Asp Leu Leu Gly Cys Arg Pro Cys Asp Cys Asp Val Gly Gly
515                 520                 525
Ala Leu Asp Pro Gln Cys Asp Glu Gly Thr Gly Gln Cys His Cys Arg
530                 535                 540
Gln His Met Val Gly Arg Arg Cys Glu Gln Val Gln Pro Gly Tyr Phe
545                 550                 555                 560
Arg Pro Phe Leu Asp His Leu Ile Trp Glu Ala Glu Asp Thr Arg Gly
565                 570                 575
Gln Val Leu Asp Val Val Glu Arg Leu Val Thr Pro Gly Glu Thr Pro
580                 585                 590
Ser Trp Thr Gly Ser Gly Phe Val Arg Leu Gln Glu Gly Gln Thr Leu
595                 600                 605
Glu Phe Leu Val Ala Ser Val Pro Lys Ala Met Asp Tyr Asp Leu Leu
610                 615                 620
Leu Arg Leu Glu Pro Gln Val Pro Glu Gln Trp Ala Glu Leu Glu Leu
625                 630                 635                 640
Ile Val Gln Arg Pro Gly Pro Val Pro Ala His Ser Leu Cys Gly His
645                 650                 655
Leu Val Pro Lys Asp Asp Arg Ile Gln Gly Thr Leu Gln Pro His Ala
660                 665                 670
Arg Tyr Leu Ile Phe Pro Asn Pro Val Cys Leu Glu Pro Gly Ile Ser
675                 680                 685
Tyr Lys Leu His Leu Lys Leu Val Arg Thr Gly Gly Ser Ala Gln Pro
690                 695                 700
Glu Thr Pro Tyr Ser Gly Pro Gly Leu Leu Ile Asp Ser Leu Val Leu
705                 710                 715                 720
Leu Pro Arg Val Leu Val Leu Glu Met Phe Ser Gly Gly Asp Ala Ala
725                 730                 735
Ala Leu Glu Arg Gln Ala Thr Phe Glu Arg Tyr Gln Cys His Glu Glu
740                 745                 750
Gly Leu Val Pro Ser Lys Thr Ser Pro Ser Glu Ala Cys Ala Pro Leu
755                 760                 765
Leu Ile Ser Leu Ser Thr Leu Ile Tyr Asn Gly Ala Leu Pro Cys Gln
770                 775                 780
Cys Asn Pro Gln Gly Ser Leu Ser Ser Glu Cys Asn Pro His Gly Gly
785                 790                 795                 800
Gln Cys Leu Cys Lys Pro Gly Val Val Gly Arg Arg Cys Asp Leu Cys
805                 810                 815
Ala Pro Gly Tyr Tyr Gly Phe Gly Pro Thr Gly Cys Gln Ala Cys Gln
820                 825                 830
Cys Ser His Glu Gly Ala Leu Ser Ser Leu Cys Glu Lys Thr Ser Gly
835                 840                 845
Gln Cys Leu Cys Arg Thr Gly Ala Phe Gly Leu Arg Cys Asp Arg Cys
850                 855                 860
Gln Arg Gly Gln Trp Gly Phe Pro Ser Cys Arg Pro Cys Val Cys Asn
865                 870                 875                 880
Gly His Ala Asp Glu Cys Asn Thr His Thr Gly Ala Cys Leu Gly Cys
885                 890                 895
Arg Asp His Thr Gly Gly Glu His Cys Glu Arg Cys Ile Ala Gly Phe
900                 905                 910
His Gly Asp Pro Arg Leu Pro Tyr Gly Gly Gln Cys Arg Pro Cys Pro
915                 920                 925
Cys Pro Glu Gly Pro Gly Ser Gln Arg His Phe Ala Thr Ser Cys His
930                 935                 940
Gln Asp Glu Tyr Ser Gln Gln Ile Val Cys His Cys Arg Ala Gly Tyr
945                 950                 955                 960
Thr Gly Leu Arg Cys Glu Ala Cys Ala Pro Gly His Phe Gly Asp Pro
965                 970                 975
Ser Arg Pro Gly Gly Arg Cys Gln Leu Cys Glu Cys Ser Gly Asn Ile
980                 985                 990
Asp Pro Met Asp Pro Asp Ala Cys  Asp Pro His Thr Gly  Gln Cys Leu
995                 1000                 1005
Arg Cys  Leu His His Thr Glu  Gly Pro His Cys Ala  His Cys Lys
1010                 1015                 1020
Pro Gly  Phe His Gly Gln Ala  Ala Arg Gln Ser Cys  His Arg Cys
1025                 1030                 1035
Thr Cys  Asn Leu Leu Gly Thr  Asn Pro Gln Gln Cys  Pro Ser Pro
1040                 1045                 1050
Asp Gln  Cys His Cys Asp Pro  Ser Ser Gly Gln Cys  Pro Cys Leu
1055                 1060                 1065
Pro Asn  Val Gln Gly Pro Ser  Cys Asp Arg Cys Ala  Pro Asn Phe
1070                 1075                 1080
Trp Asn  Leu Thr Ser Gly His  Gly Cys Gln Pro Cys  Ala Cys His
1085                 1090                 1095
Pro Ser  Arg Ala Arg Gly Pro  Thr Cys Asn Glu Phe  Thr Gly Gln
1100                 1105                 1110
Cys His  Cys Arg Ala Gly Phe  Gly Gly Arg Thr Cys  Ser Glu Cys
1115                 1120                 1125
Gln Glu  Leu His Trp Gly Asp  Pro Gly Leu Gln Cys  His Ala Cys
1130                 1135                 1140
Asp Cys  Asp Ser Arg Gly Ile  Asp Thr Pro Gln Cys  His Arg Phe
1145                 1150                 1155
Thr Gly  His Cys Ser Cys Arg  Pro Gly Val Ser Gly  Val Arg Cys
1160                 1165                 1170
Asp Gln  Cys Ala Arg Gly Phe  Ser Gly Ile Phe Pro  Ala Cys His
1175                 1180                 1185
Pro Cys  His Ala Cys Phe Gly  Asp Trp Asp Arg Val  Val Gln Asp
1190                 1195                 1200
Leu Ala  Ala Arg Thr Gln Arg  Leu Glu Gln Arg Ala  Gln Glu Leu
1205                 1210                 1215
Gln Gln  Thr Gly Val Leu Gly  Ala Phe Glu Ser Ser  Phe Trp His
1220                 1225                 1230
Met Gln  Glu Lys Leu Gly Ile  Val Gln Gly Ile Val  Gly Ala Arg
1235                 1240                 1245
Asn Thr  Ser Ala Ala Ser Thr  Ala Gln Leu Val Glu  Ala Thr Glu
1250                 1255                 1260
Glu Leu  Arg Arg Glu Ile Gly  Glu Ala Thr Glu His  Leu Thr Gln
1265                 1270                 1275
Leu Glu  Ala Asp Leu Thr Asp  Val Gln Asp Glu Asn  Phe Asn Ala
1280                 1285                 1290
Asn His  Ala Leu Ser Gly Leu  Glu Arg Asp Arg Leu  Ala Leu Asn
1295                 1300                 1305
Leu Thr  Leu Arg Gln Leu Asp  Gln His Leu Asp Leu  Leu Lys His
1310                 1315                 1320
Ser Asn  Phe Leu Gly Ala Tyr  Asp Ser Ile Arg His  Ala His Ser
1325                 1330                 1335
Gln Ser  Ala Glu Ala Glu Arg  Arg Ala Asn Thr Ser  Ala Leu Ala
1340                 1345                 1350
Val Pro  Ser Pro Val Ser Asn  Ser Ala Ser Ala Arg  His Arg Thr
1355                 1360                 1365
Glu Ala  Leu Met Asp Ala Gln  Lys Glu Asp Phe Asn  Ser Lys His
1370                 1375                 1380
Met Ala  Asn Gln Arg Ala Leu  Gly Lys Leu Ser Ala  His Thr His
1385                 1390                 1395
Thr Leu  Ser Leu Thr Asp Ile  Asn Glu Leu Val Cys  Gly Ala Pro
1400                 1405                 1410
Gly Asp  Ala Pro Cys Ala Thr  Ser Pro Cys Gly Gly  Ala Gly Cys
1415                 1420                 1425
Arg Asp  Glu Asp Gly Gln Pro  Arg Cys Gly Gly Leu  Ser Cys Asn
1430                 1435                 1440
Gly Ala  Ala Ala Thr Ala Asp  Leu Ala Leu Gly Arg  Ala Arg His
1445                 1450                 1455
Thr Gln  Ala Glu Leu Gln Arg  Ala Leu Ala Glu Gly  Gly Ser Ile
1460                 1465                 1470
Leu Ser  Arg Val Ala Glu Thr  Arg Arg Gln Ala Ser  Glu Ala Gln
1475                 1480                 1485
Gln Arg  Ala Gln Ala Ala Leu  Asp Lys Ala Asn Ala  Ser Arg Gly
1490                 1495                 1500
Gln Val  Glu Gln Ala Asn Gln  Glu Leu Gln Glu Leu  Ile Gln Ser
1505                 1510                 1515
Val Lys  Asp Phe Leu Asn Gln  Glu Gly Ala Asp Pro  Asp Ser Ile
1520                 1525                 1530
Glu Met  Val Ala Thr Arg Val  Leu Glu Leu Ser Ile  Pro Ala Ser
1535                 1540                 1545
Ala Glu  Gln Ile Gln His Leu  Ala Gly Ala Ile Ala  Glu Arg Val
1550                 1555                 1560
Arg Ser  Leu Ala Asp Val Asp  Ala Ile Leu Ala Arg  Thr Val Gly
1565                 1570                 1575
Asp Val  Arg Arg Ala Glu Gln  Leu Leu Gln Asp Ala  Arg Arg Ala
1580                 1585                 1590
Arg Ser  Trp Ala Glu Asp Glu  Lys Gln Lys Ala Glu  Thr Val Gln
1595                 1600                 1605
Ala Ala  Leu Glu Glu Ala Gln  Arg Ala Gln Gly Ile  Ala Gln Gly
1610                 1615                 1620
Ala Ile  Arg Gly Ala Val Ala  Asp Thr Arg Asp Thr  Glu Gln Thr
1625                 1630                 1635
Leu Tyr  Gln Val Gln Glu Arg  Met Ala Gly Ala Glu  Arg Ala Leu
1640                 1645                 1650
Ser Ser  Ala Gly Glu Arg Ala  Arg Gln Leu Asp Ala  Leu Leu Glu
1655                 1660                 1665
Ala Leu  Lys Leu Lys Arg Ala  Gly Asn Ser Leu Ala  Ala Ser Thr
1670                 1675                 1680
Ala Glu  Glu Thr Ala Gly Ser  Ala Gln Gly Arg Ala  Gln Glu Ala
1685                 1690                 1695
Glu Gln  Leu Leu Arg Gly Pro  Leu Gly Asp Gln Tyr  Gln Thr Val
1700                 1705                 1710
Lys Ala  Leu Ala Glu Arg Lys  Ala Gln Gly Val Leu  Ala Ala Gln
1715                 1720                 1725
Ala Arg  Ala Glu Gln Leu Arg  Asp Glu Ala Arg Asp  Leu Leu Gln
1730                 1735                 1740
Ala Ala  Gln Asp Lys Leu Gln  Arg Leu Gln Glu Leu  Glu Gly Thr
1745                 1750                 1755
Tyr Glu  Glu Asn Glu Arg Ala  Leu Glu Ser Lys Ala  Ala Gln Leu
1760                 1765                 1770
Asp Gly  Leu Glu Ala Arg Met  Arg Ser Val Leu Gln  Ala Ile Asn
1775                 1780                 1785
Leu Gln  Val Gln Ile Tyr Asn  Thr Cys Gln Lys Ser  Ser Trp Pro
1790                 1795                 1800
Gly Arg  Ala Pro Asn Lys Pro  Val
1805                 1810
<210>  3
<211>  1609
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  laminin-521 gamma chain
Met Arg Gly Ser His Arg Ala Ala Pro Ala Leu Arg Pro Arg Gly Arg
1               5                   10                  15
Leu Trp Pro Val Leu Ala Val Leu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Cys
20                  25                  30
Ala Gln Ala Ala Met Asp Glu Cys Thr Asp Glu Gly Gly Arg Pro Gln
35                  40                  45
Arg Cys Met Pro Glu Phe Val Asn Ala Ala Phe Asn Val Thr Val Val
50                  55                  60
Ala Thr Asn Thr Cys Gly Thr Pro Pro Glu Glu Tyr Cys Val Gln Thr
65                  70                  75                  80
Gly Val Thr Gly Val Thr Lys Ser Cys His Leu Cys Asp Ala Gly Gln
85                  90                  95
Pro His Leu Gln His Gly Ala Ala Phe Leu Thr Asp Tyr Asn Asn Gln
100                 105                 110
Ala Asp Thr Thr Trp Trp Gln Ser Gln Thr Met Leu Ala Gly Val Gln
115                 120                 125
Tyr Pro Ser Ser Ile Asn Leu Thr Leu His Leu Gly Lys Ala Phe Asp
130                 135                 140
Ile Thr Tyr Val Arg Leu Lys Phe His Thr Ser Arg Pro Glu Ser Phe
145                 150                 155                 160
Ala Ile Tyr Lys Arg Thr Arg Glu Asp Gly Pro Trp Ile Pro Tyr Gln
165                 170                 175
Tyr Tyr Ser Gly Ser Cys Glu Asn Thr Tyr Ser Lys Ala Asn Arg Gly
180                 185                 190
Phe Ile Arg Thr Gly Gly Asp Glu Gln Gln Ala Leu Cys Thr Asp Glu
195                 200                 205
Phe Ser Asp Ile Ser Pro Leu Thr Gly Gly Asn Val Ala Phe Ser Thr
210                 215                 220
Leu Glu Gly Arg Pro Ser Ala Tyr Asn Phe Asp Asn Ser Pro Val Leu
225                 230                 235                 240
Gln Glu Trp Val Thr Ala Thr Asp Ile Arg Val Thr Leu Asn Arg Leu
245                 250                 255
Asn Thr Phe Gly Asp Glu Val Phe Asn Asp Pro Lys Val Leu Lys Ser
260                 265                 270
Tyr Tyr Tyr Ala Ile Ser Asp Phe Ala Val Gly Gly Arg Cys Lys Cys
275                 280                 285
Asn Gly His Ala Ser Glu Cys Met Lys Asn Glu Phe Asp Lys Leu Val
290                 295                 300
Cys Asn Cys Lys His Asn Thr Tyr Gly Val Asp Cys Glu Lys Cys Leu
305                 310                 315                 320
Pro Phe Phe Asn Asp Arg Pro Trp Arg Arg Ala Thr Ala Glu Ser Ala
325                 330                 335
Ser Glu Cys Leu Pro Cys Asp Cys Asn Gly Arg Ser Gln Glu Cys Tyr
340                 345                 350
Phe Asp Pro Glu Leu Tyr Arg Ser Thr Gly His Gly Gly His Cys Thr
355                 360                 365
Asn Cys Gln Asp Asn Thr Asp Gly Ala His Cys Glu Arg Cys Arg Glu
370                 375                 380
Asn Phe Phe Arg Leu Gly Asn Asn Glu Ala Cys Ser Ser Cys His Cys
385                 390                 395                 400
Ser Pro Val Gly Ser Leu Ser Thr Gln Cys Asp Ser Tyr Gly Arg Cys
405                 410                 415
Ser Cys Lys Pro Gly Val Met Gly Asp Lys Cys Asp Arg Cys Gln Pro
420                 425                 430
Gly Phe His Ser Leu Thr Glu Ala Gly Cys Arg Pro Cys Ser Cys Asp
435                 440                 445
Pro Ser Gly Ser Ile Asp Glu Cys Asn Ile Glu Thr Gly Arg Cys Val
450                 455                 460
Cys Lys Asp Asn Val Glu Gly Phe Asn Cys Glu Arg Cys Lys Pro Gly
465                 470                 475                 480
Phe Phe Asn Leu Glu Ser Ser Asn Pro Arg Gly Cys Thr Pro Cys Phe
485                 490                 495
Cys Phe Gly His Ser Ser Val Cys Thr Asn Ala Val Gly Tyr Ser Val
500                 505                 510
Tyr Ser Ile Ser Ser Thr Phe Gln Ile Asp Glu Asp Gly Trp Arg Ala
515                 520                 525
Glu Gln Arg Asp Gly Ser Glu Ala Ser Leu Glu Trp Ser Ser Glu Arg
530                 535                 540
Gln Asp Ile Ala Val Ile Ser Asp Ser Tyr Phe Pro Arg Tyr Phe Ile
545                 550                 555                 560
Ala Pro Ala Lys Phe Leu Gly Lys Gln Val Leu Ser Tyr Gly Gln Asn
565                 570                 575
Leu Ser Phe Ser Phe Arg Val Asp Arg Arg Asp Thr Arg Leu Ser Ala
580                 585                 590
Glu Asp Leu Val Leu Glu Gly Ala Gly Leu Arg Val Ser Val Pro Leu
595                 600                 605
Ile Ala Gln Gly Asn Ser Tyr Pro Ser Glu Thr Thr Val Lys Tyr Val
610                 615                 620
Phe Arg Leu His Glu Ala Thr Asp Tyr Pro Trp Arg Pro Ala Leu Thr
625                 630                 635                 640
Pro Phe Glu Phe Gln Lys Leu Leu Asn Asn Leu Thr Ser Ile Lys Ile
645                 650                 655
Arg Gly Thr Tyr Ser Glu Arg Ser Ala Gly Tyr Leu Asp Asp Val Thr
660                 665                 670
Leu Ala Ser Ala Arg Pro Gly Pro Gly Val Pro Ala Thr Trp Val Glu
675                 680                 685
Ser Cys Thr Cys Pro Val Gly Tyr Gly Gly Gln Phe Cys Glu Met Cys
690                 695                 700
Leu Ser Gly Tyr Arg Arg Glu Thr Pro Asn Leu Gly Pro Tyr Ser Pro
705                 710                 715                 720
Cys Val Leu Cys Ala Cys Asn Gly His Ser Glu Thr Cys Asp Pro Glu
725                 730                 735
Thr Gly Val Cys Asn Cys Arg Asp Asn Thr Ala Gly Pro His Cys Glu
740                 745                 750
Lys Cys Ser Asp Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Thr Ala Gly Thr Ser Ser
755                 760                 765
Asp Cys Gln Pro Cys Pro Cys Pro Gly Gly Ser Ser Cys Ala Val Val
770                 775                 780
Pro Lys Thr Lys Glu Val Val Cys Thr Asn Cys Pro Thr Gly Thr Thr
785                 790                 795                 800
Gly Lys Arg Cys Glu Leu Cys Asp Asp Gly Tyr Phe Gly Asp Pro Leu
805                 810                 815
Gly Arg Asn Gly Pro Val Arg Leu Cys Arg Leu Cys Gln Cys Ser Asp
820                 825                 830
Asn Ile Asp Pro Asn Ala Val Gly Asn Cys Asn Arg Leu Thr Gly Glu
835                 840                 845
Cys Leu Lys Cys Ile Tyr Asn Thr Ala Gly Phe Tyr Cys Asp Arg Cys
850                 855                 860
Lys Asp Gly Phe Phe Gly Asn Pro Leu Ala Pro Asn Pro Ala Asp Lys
865                 870                 875                 880
Cys Lys Ala Cys Asn Cys Asn Leu Tyr Gly Thr Met Lys Gln Gln Ser
885                 890                 895
Ser Cys Asn Pro Val Thr Gly Gln Cys Glu Cys Leu Pro His Val Thr
900                 905                 910
Gly Gln Asp Cys Gly Ala Cys Asp Pro Gly Phe Tyr Asn Leu Gln Ser
915                 920                 925
Gly Gln Gly Cys Glu Arg Cys Asp Cys His Ala Leu Gly Ser Thr Asn
930                 935                 940
Gly Gln Cys Asp Ile Arg Thr Gly Gln Cys Glu Cys Gln Pro Gly Ile
945                 950                 955                 960
Thr Gly Gln His Cys Glu Arg Cys Glu Val Asn His Phe Gly Phe Gly
965                 970                 975
Pro Glu Gly Cys Lys Pro Cys Asp Cys His Pro Glu Gly Ser Leu Ser
980                 985                 990
Leu Gln Cys Lys Asp Asp Gly Arg  Cys Glu Cys Arg Glu  Gly Phe Val
995                 1000                 1005
Gly Asn  Arg Cys Asp Gln Cys  Glu Glu Asn Tyr Phe  Tyr Asn Arg
1010                 1015                 1020
Ser Trp  Pro Gly Cys Gln Glu  Cys Pro Ala Cys Tyr  Arg Leu Val
1025                 1030                 1035
Lys Asp  Lys Val Ala Asp His  Arg Val Lys Leu Gln  Glu Leu Glu
1040                 1045                 1050
Ser Leu  Ile Ala Asn Leu Gly  Thr Gly Asp Glu Met  Val Thr Asp
1055                 1060                 1065
Gln Ala  Phe Glu Asp Arg Leu  Lys Glu Ala Glu Arg  Glu Val Met
1070                 1075                 1080
Asp Leu  Leu Arg Glu Ala Gln  Asp Val Lys Asp Val  Asp Gln Asn
1085                 1090                 1095
Leu Met  Asp Arg Leu Gln Arg  Val Asn Asn Thr Leu  Ser Ser Gln
1100                 1105                 1110
Ile Ser  Arg Leu Gln Asn Ile  Arg Asn Thr Ile Glu  Glu Thr Gly
1115                 1120                 1125
Asn Leu  Ala Glu Gln Ala Arg  Ala His Val Glu Asn  Thr Glu Arg
1130                 1135                 1140
Leu Ile  Glu Ile Ala Ser Arg  Glu Leu Glu Lys Ala  Lys Val Ala
1145                 1150                 1155
Ala Ala  Asn Val Ser Val Thr  Gln Pro Glu Ser Thr  Gly Asp Pro
1160                 1165                 1170
Asn Asn  Met Thr Leu Leu Ala  Glu Glu Ala Arg Lys  Leu Ala Glu
1175                 1180                 1185
Arg His  Lys Gln Glu Ala Asp  Asp Ile Val Arg Val  Ala Lys Thr
1190                 1195                 1200
Ala Asn  Asp Thr Ser Thr Glu  Ala Tyr Asn Leu Leu  Leu Arg Thr
1205                 1210                 1215
Leu Ala  Gly Glu Asn Gln Thr  Ala Phe Glu Ile Glu  Glu Leu Asn
1220                 1225                 1230
Arg Lys  Tyr Glu Gln Ala Lys  Asn Ile Ser Gln Asp  Leu Glu Lys
1235                 1240                 1245
Gln Ala  Ala Arg Val His Glu  Glu Ala Lys Arg Ala  Gly Asp Lys
1250                 1255                 1260
Ala Val  Glu Ile Tyr Ala Ser  Val Ala Gln Leu Ser  Pro Leu Asp
1265                 1270                 1275
Ser Glu  Thr Leu Glu Asn Glu  Ala Asn Asn Ile Lys  Met Glu Ala
1280                 1285                 1290
Glu Asn  Leu Glu Gln Leu Ile  Asp Gln Lys Leu Lys  Asp Tyr Glu
1295                 1300                 1305
Asp Leu  Arg Glu Asp Met Arg  Gly Lys Glu Leu Glu  Val Lys Asn
1310                 1315                 1320
Leu Leu  Glu Lys Gly Lys Thr  Glu Gln Gln Thr Ala  Asp Gln Leu
1325                 1330                 1335
Leu Ala  Arg Ala Asp Ala Ala  Lys Ala Leu Ala Glu  Glu Ala Ala
1340                 1345                 1350
Lys Lys  Gly Arg Asp Thr Leu  Gln Glu Ala Asn Asp  Ile Leu Asn
1355                 1360                 1365
Asn Leu  Lys Asp Phe Asp Arg  Arg Val Asn Asp Asn  Lys Thr Ala
1370                 1375                 1380
Ala Glu  Glu Ala Leu Arg Lys  Ile Pro Ala Ile Asn  Gln Thr Ile
1385                 1390                 1395
Thr Glu  Ala Asn Glu Lys Thr  Arg Glu Ala Gln Gln  Ala Leu Gly
1400                 1405                 1410
Ser Ala  Ala Ala Asp Ala Thr  Glu Ala Lys Asn Lys  Ala His Glu
1415                 1420                 1425
Ala Glu  Arg Ile Ala Ser Ala  Val Gln Lys Asn Ala  Thr Ser Thr
1430                 1435                 1440
Lys Ala  Glu Ala Glu Arg Thr  Phe Ala Glu Val Thr  Asp Leu Asp
1445                 1450                 1455
Asn Glu  Val Asn Asn Met Leu  Lys Gln Leu Gln Glu  Ala Glu Lys
1460                 1465                 1470
Glu Leu  Lys Arg Lys Gln Asp  Asp Ala Asp Gln Asp  Met Met Met
1475                 1480                 1485
Ala Gly  Met Ala Ser Gln Ala  Ala Gln Glu Ala Glu  Ile Asn Ala
1490                 1495                 1500
Arg Lys  Ala Lys Asn Ser Val  Thr Ser Leu Leu Ser  Ile Ile Asn
1505                 1510                 1515
Asp Leu  Leu Glu Gln Leu Gly  Gln Leu Asp Thr Val  Asp Leu Asn
1520                 1525                 1530
Lys Leu  Asn Glu Ile Glu Gly  Thr Leu Asn Lys Ala  Lys Asp Glu
1535                 1540                 1545
Met Lys  Val Ser Asp Leu Asp  Arg Lys Val Ser Asp  Leu Glu Asn
1550                 1555                 1560
Glu Ala  Lys Lys Gln Glu Ala  Ala Ile Met Asp Tyr  Asn Arg Asp
1565                 1570                 1575
Ile Glu  Glu Ile Met Lys Asp  Ile Arg Asn Leu Glu  Asp Ile Arg
1580                 1585                 1590
Lys Thr  Leu Pro Ser Gly Cys  Phe Asn Thr Pro Ser  Ile Glu Lys
1595                 1600                 1605
Pro
<210>  4
<211>  555
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  E-cadherin
Met Asp Trp Val Ile Pro Pro Ile Ser Cys Pro Glu Asn Glu Lys Gly
1               5                   10                  15
Pro Phe Pro Lys Asn Leu Val Gln Ile Lys Ser Asn Lys Asp Lys Glu
20                  25                  30
Gly Lys Val Phe Tyr Ser Ile Thr Gly Gln Gly Ala Asp Thr Pro Pro
35                  40                  45
Val Gly Val Phe Ile Ile Glu Arg Glu Thr Gly Trp Leu Lys Val Thr
50                  55                  60
Glu Pro Leu Asp Arg Glu Arg Ile Ala Thr Tyr Thr Leu Phe Ser His
65                  70                  75                  80
Ala Val Ser Ser Asn Gly Asn Ala Val Glu Asp Pro Met Glu Ile Leu
85                  90                  95
Ile Thr Val Thr Asp Gln Asn Asp Asn Lys Pro Glu Phe Thr Gln Glu
100                 105                 110
Val Phe Lys Gly Ser Val Met Glu Gly Ala Leu Pro Gly Thr Ser Val
115                 120                 125
Met Glu Val Thr Ala Thr Asp Ala Asp Asp Asp Val Asn Thr Tyr Asn
130                 135                 140
Ala Ala Ile Ala Tyr Thr Ile Leu Ser Gln Asp Pro Glu Leu Pro Asp
145                 150                 155                 160
Lys Asn Met Phe Thr Ile Asn Arg Asn Thr Gly Val Ile Ser Val Val
165                 170                 175
Thr Thr Gly Leu Asp Arg Glu Ser Phe Pro Thr Tyr Thr Leu Val Val
180                 185                 190
Gln Ala Ala Asp Leu Gln Gly Glu Gly Leu Ser Thr Thr Ala Thr Ala
195                 200                 205
Val Ile Thr Val Thr Asp Thr Asn Asp Asn Pro Pro Ile Phe Asn Pro
210                 215                 220
Thr Thr Tyr Lys Gly Gln Val Pro Glu Asn Glu Ala Asn Val Val Ile
225                 230                 235                 240
Thr Thr Leu Lys Val Thr Asp Ala Asp Ala Pro Asn Thr Pro Ala Trp
245                 250                 255
Glu Ala Val Tyr Thr Ile Leu Asn Asp Asp Gly Gly Gln Phe Val Val
260                 265                 270
Thr Thr Asn Pro Val Asn Asn Asp Gly Ile Leu Lys Thr Ala Lys Gly
275                 280                 285
Leu Asp Phe Glu Ala Lys Gln Gln Tyr Ile Leu His Val Ala Val Thr
290                 295                 300
Asn Val Val Pro Phe Glu Val Ser Leu Thr Thr Ser Thr Ala Thr Val
305                 310                 315                 320
Thr Val Asp Val Leu Asp Val Asn Glu Ala Pro Ile Phe Val Pro Pro
325                 330                 335
Glu Lys Arg Val Glu Val Ser Glu Asp Phe Gly Val Gly Gln Glu Ile
340                 345                 350
Thr Ser Tyr Thr Ala Gln Glu Pro Asp Thr Phe Met Glu Gln Lys Ile
355                 360                 365
Thr Tyr Arg Ile Trp Arg Asp Thr Ala Asn Trp Leu Glu Ile Asn Pro
370                 375                 380
Asp Thr Gly Ala Ile Ser Thr Arg Ala Glu Leu Asp Arg Glu Asp Phe
385                 390                 395                 400
Glu His Val Lys Asn Ser Thr Tyr Thr Ala Leu Ile Ile Ala Thr Asp
405                 410                 415
Asn Gly Ser Pro Val Ala Thr Gly Thr Gly Thr Leu Leu Leu Ile Leu
420                 425                 430
Ser Asp Val Asn Asp Asn Ala Pro Ile Pro Glu Pro Arg Thr Ile Phe
435                 440                 445
Phe Cys Glu Arg Asn Pro Lys Pro Gln Val Ile Asn Ile Ile Asp Ala
450                 455                 460
Asp Leu Pro Pro Asn Thr Ser Pro Phe Thr Ala Glu Leu Thr His Gly
465                 470                 475                 480
Ala Ser Ala Asn Trp Thr Ile Gln Tyr Asn Asp Pro Thr Gln Glu Ser
485                 490                 495
Ile Ile Leu Lys Pro Lys Met Ala Leu Glu Val Gly Asp Tyr Lys Ile
500                 505                 510
Asn Leu Lys Leu Met Asp Asn Gln Asn Lys Asp Gln Val Thr Thr Leu
515                 520                 525
Glu Val Ser Val Cys Asp Cys Glu Gly Ala Ala Gly Val Cys Arg Lys
530                 535                 540
Ala Gln Pro Val Glu Ala Gly Leu Gln Ile Pro
545                 550                 555
<210>  5
<211>  4024
<212>  DNA
<213>  Homo sapiens
<400>  LIN28 (LIN28A) coding
caccgctatt gtgcggggga agatgtagca gcttcttctc cgaaccaacc ctttgccttc       60
ggacttctcc ggggccagca gccgcccgac caggggcccg gggccacggg ctcagccgac      120
gaccatgggc tccgtgtcca accagcagtt tgcaggtggc tgcgccaagg cggcagaaga      180
ggcgcccgag gaggcgccgg aggacgcggc ccgggcggcg gacgagcctc agctgctgca      240
cggtgcgggc atctgtaagt ggttcaacgt gcgcatgggg ttcggcttcc tgtccatgac      300
cgcccgcgcc ggggtcgcgc tcgacccccc agtggatgtc tttgtgcacc agagtaagct      360
gcacatggaa gggttccgga gcttgaagga gggtgaggca gtggagttca cctttaagaa      420
gtcagccaag ggtctggaat ccatccgtgt caccggacct ggtggagtat tctgtattgg      480
gagtgagagg cggccaaaag gaaagagcat gcagaagcgc agatcaaaag gagacaggtg      540
ctacaactgt ggaggtctag atcatcatgc caaggaatgc aagctgccac cccagcccaa      600
gaagtgccac ttctgccaga gcatcagcca tatggtagcc tcatgtccgc tgaaggccca      660
gcagggccct agtgcacagg gaaagccaac ctactttcga gaggaagaag aagaaatcca      720
cagccctacc ctgctcccgg aggcacagaa ttgagccaca atgggtgggg gctattcttt      780
tgctatcagg aagttttgag gagcaggcag agtggagaaa gtgggaatag ggtgcattgg      840
ggctagttgg cactgccatg tatctcaggc ttgggttcac accatcaccc tttcttccct      900
ctaggtgggg ggaaagggtg agtcaaagga actccaacca tgctctgtcc aaatgcaagt      960
gagggttctg ggggcaacca ggagggggga atcaccctac aacctgcata ctttgagtct     1020
ccatccccag aatttccagc ttttgaaagt ggcctggata gggaagttgt tttcctttta     1080
aagaaggata tataataatt cccatgccag agtgaaatga ttaagtataa gaccagattc     1140
atggagccaa gccactacat tctgtggaag gagatctctc aggagtaagc attgtttttt     1200
tttcacatct tgtatcctca tacccacttt tgggataggg tgctggcagc tgtcccaagc     1260
aatgggtaat gatgatggca aaaagggtgt ttgggggaac agctgcagac ctgctgctct     1320
atgctcaccc ccgccccatt ctgggccaat gtgattttat ttatttgctc ccttggatac     1380
tgcaccttgg gtcccacttt ctccaggatg ccaactgcac tagctgtgtg cgaatgacgt     1440
atcttgtgca ttttaacttt ttttccttaa tataaatatt ctggttttgt atttttgtat     1500
attttaatct aaggccctca tttcctgcac tgtgttctca ggtacatgag caatctcagg     1560
gatagccagc agcagctcca ggtctgcgca gcaggaatta ctttttgttg tttttgccac     1620
cgtggagagc aactatttgg agtgcacagc ctattgaact acctcatttt tgccaataag     1680
agctggcttt tctgccatag tgtcctcttg aaaccccctc tgccttgaaa atgttttatg     1740
ggagactagg ttttaactgg gtggccccat gacttgattg ccttctactg gaagattggg     1800
aattagtcta aacaggaaat ggtggtacac agaggctagg agaggctggg cccggtgaaa     1860
aggccagaga gcaagccaag attaggtgag ggttgtctaa tcctatggca caggacgtgc     1920
tttacatctc cagatctgtt cttcaccaga ttaggttagg cctaccatgt gccacagggt     1980
gtgtgtgtgt ttgtaaaact agagttgcta aggataagtt taaagaccaa tacccctgta     2040
cttaatcctg tgctgtcgag ggatggatat atgaagtaag gtgagatcct taacctttca     2100
aaattttcgg gttccaggga gacacacaag cgagggtttt gtggtgcctg gagcctgtgt     2160
cctgccctgc tacagtagtg attaatagtg tcatggtagc taaaggagaa aaagggggtt     2220
tcgtttacac gctgtgagat caccgcaaac ctaccttact gtgttgaaac gggacaaatg     2280
caatagaacg cattgggtgg tgtgtgtctg atcctgggtt cttgtctccc ctaaatgctg     2340
ccccccaagt tactgtattt gtctgggctt tgtaggactt cactacgttg attgctaggt     2400
ggcctagttt gtgtaaatat aatgtattgg tctttctccg tgttctttgg gggttttgtt     2460
tacaaacttc tttttgtatt gagagaaaaa tagccaaagc atctttgaca gaaggttctg     2520
caccaggcaa aaagatctga aacattagtt tggggggccc tcttcttaaa gtggggatct     2580
tgaaccatcc tttcttttgt attccccttc ccctattacc tattagacca gatcttctgt     2640
cctaaaaact tgtcttctac cctgccctct tttctgttca cccccaaaag aaaacttaca     2700
cacccacaca catacacatt tcatgcttgg agtgtctcca caactcttaa atgatgtatg     2760
caaaaatact gaagctagga aaaccctcca tcccttgttc ccaacctcct aagtcaagac     2820
cattaccatt tctttctttc tttttttttt ttttttaaaa tggagtctca ctgtgtcacc     2880
caggctggag tgcagtggca tgatcggctc actgcagcct ctgcctcttg ggttcaagtg     2940
attctcctgc ctcagcctcc tgagtagctg ggatttcagg cacccgccac actcagctaa     3000
tttttgtatt tttagtagag acggggtttc accatgttgt ccaggctggt ctggaactcc     3060
tgacctcagg tgatctgccc accttggctt cccaaagtgc tgggattaca ggcatgagcc     3120
accatgctgg gccaaccatt tcttggtgta ttcatgccaa acacttaaga cactgctgta     3180
gcccaggcgc ggtggctcac acctgtaatc ccagcacttt ggaaggctga ggcgggcgga     3240
tcacaaggtc acgagttcaa aactatcctg gccaacacag tgaaaccccg tctctactaa     3300
aatacaaaaa aattagccgg gtgtggtggt gcatgccttt agtcctagct attcaggagg     3360
ctgaggcagg ggaatcgctt gaacccgaga ggcagaggtt gcagtgagct gagatcgcac     3420
cactgcactc cagcctggtt acagagcaag actctgtctc aaacaaaaca aaacaaaaca     3480
aaaacacact actgtatttt ggatggatca aacctcctta attttaattt ctaatcctaa     3540
agtaaagaga tgcaattggg ggccttccat gtagaaagtg gggtcaggag gccaagaaag     3600
ggaatatgaa tgtatatcca agtcactcag gaacttttat gcaggtgcta gaaactttat     3660
gtcaaagtgg ccacaagatt gtttaatagg agacgaacga atgtaactcc atgtttactg     3720
ctaaaaacca aagctttgtg taaaatcttg aatttatggg gcgggagggt aggaaagcct     3780
gtacctgtct gtttttttcc tgatcctttt ccctcattcc tgaactgcag gagactgagc     3840
ccctttgggc tttggtgacc ccatcactgg ggtgtgttta tttgatggtt gattttgctg     3900
tactgggtac ttcctttccc attttctaat cattttttaa cacaagctga ctcttccctt     3960
cccttctcct ttccctggga aaatacaatg aataaataaa gacttattgg tacgcaaact     4020
gtca                                                                  4024
<210>  6
<211>  1430
<212>  DNA
<213>  Homo sapiens
<400>  OCT4 (POU5F1) coding
agagaggggt tgagtagtcc cttcgcaagc cctcatttca ccaggccccc ggcttggggc       60
gccttccttc cccatggcgg gacacctggc ttcggatttc gccttctcgc cccctccagg      120
tggtggaggt gatgggccag gggggccgga gccgggctgg gttgatcctc ggacctggct      180
aagcttccaa ggccctcctg gagggccagg aatcgggccg ggggttgggc caggctctga      240
ggtgtggggg attcccccat gccccccgcc gtatgagttc tgtgggggga tggcgtactg      300
tgggccccag gttggagtgg ggctagtgcc ccaaggcggc ttggagacct ctcagcctga      360
gggcgaagca ggagtcgggg tggagagcaa ctccgatggg gcctccccgg agccctgcac      420
cgtcacccct ggtgccgtga agctggagaa ggagaagctg gagcaaaacc cggaggagtc      480
ccaggacatc aaagctctgc agaaagaact cgagcaattt gccaagctcc tgaagcagaa      540
gaggatcacc ctgggatata cacaggccga tgtggggctc accctggggg ttctatttgg      600
gaaggtattc agccaaacga ccatctgccg ctttgaggct ctgcagctta gcttcaagaa      660
catgtgtaag ctgcggccct tgctgcagaa gtgggtggag gaagctgaca acaatgaaaa      720
tcttcaggag atatgcaaag cagaaaccct cgtgcaggcc cgaaagagaa agcgaaccag      780
tatcgagaac cgagtgagag gcaacctgga gaatttgttc ctgcagtgcc cgaaacccac      840
actgcagcag atcagccaca tcgcccagca gcttgggctc gagaaggatg tggtccgagt      900
gtggttctgt aaccggcgcc agaagggcaa gcgatcaagc agcgactatg cacaacgaga      960
ggattttgag gctgctgggt ctcctttctc agggggacca gtgtcctttc ctctggcccc     1020
agggccccat tttggtaccc caggctatgg gagccctcac ttcactgcac tgtactcctc     1080
ggtccctttc cctgaggggg aagcctttcc ccctgtctcc gtcaccactc tgggctctcc     1140
catgcattca aactgaggtg cctgcccttc taggaatggg ggacaggggg aggggaggag     1200
ctagggaaag aaaacctgga gtttgtgcca gggtttttgg gattaagttc ttcattcact     1260
aaggaaggaa ttgggaacac aaagggtggg ggcaggggag tttggggcaa ctggttggag     1320
ggaaggtgaa gttcaatgat gctcttgatt ttaatcccac atcatgtatc acttttttct     1380
taaataaaga agcctgggac acagtagata gacacactta aaaaaaaaaa                1430
<210>  7
<211>  2520
<212>  DNA
<213>  Homo sapiens
<400>  SOX2 coding
ggatggttgt ctattaactt gttcaaaaaa gtatcaggag ttgtcaaggc agagaagaga       60
gtgtttgcaa aagggggaaa gtagtttgct gcctctttaa gactaggact gagagaaaga      120
agaggagaga gaaagaaagg gagagaagtt tgagccccag gcttaagcct ttccaaaaaa      180
taataataac aatcatcggc ggcggcagga tcggccagag gaggagggaa gcgctttttt      240
tgatcctgat tccagtttgc ctctctcttt ttttccccca aattattctt cgcctgattt      300
tcctcgcgga gccctgcgct cccgacaccc ccgcccgcct cccctcctcc tctccccccg      360
cccgcgggcc ccccaaagtc ccggccgggc cgagggtcgg cggccgccgg cgggccgggc      420
ccgcgcacag cgcccgcatg tacaacatga tggagacgga gctgaagccg ccgggcccgc      480
agcaaacttc ggggggcggc ggcggcaact ccaccgcggc ggcggccggc ggcaaccaga      540
aaaacagccc ggaccgcgtc aagcggccca tgaatgcctt catggtgtgg tcccgcgggc      600
agcggcgcaa gatggcccag gagaacccca agatgcacaa ctcggagatc agcaagcgcc      660
tgggcgccga gtggaaactt ttgtcggaga cggagaagcg gccgttcatc gacgaggcta      720
agcggctgcg agcgctgcac atgaaggagc acccggatta taaataccgg ccccggcgga      780
aaaccaagac gctcatgaag aaggataagt acacgctgcc cggcgggctg ctggcccccg      840
gcggcaatag catggcgagc ggggtcgggg tgggcgccgg cctgggcgcg ggcgtgaacc      900
agcgcatgga cagttacgcg cacatgaacg gctggagcaa cggcagctac agcatgatgc      960
aggaccagct gggctacccg cagcacccgg gcctcaatgc gcacggcgca gcgcagatgc     1020
agcccatgca ccgctacgac gtgagcgccc tgcagtacaa ctccatgacc agctcgcaga     1080
cctacatgaa cggctcgccc acctacagca tgtcctactc gcagcagggc acccctggca     1140
tggctcttgg ctccatgggt tcggtggtca agtccgaggc cagctccagc ccccctgtgg     1200
ttacctcttc ctcccactcc agggcgccct gccaggccgg ggacctccgg gacatgatca     1260
gcatgtatct ccccggcgcc gaggtgccgg aacccgccgc ccccagcaga cttcacatgt     1320
cccagcacta ccagagcggc ccggtgcccg gcacggccat taacggcaca ctgcccctct     1380
cacacatgtg agggccggac agcgaactgg aggggggaga aattttcaaa gaaaaacgag     1440
ggaaatggga ggggtgcaaa agaggagagt aagaaacagc atggagaaaa cccggtacgc     1500
tcaaaaagaa aaaggaaaaa aaaaaatccc atcacccaca gcaaatgaca gctgcaaaag     1560
agaacaccaa tcccatccac actcacgcaa aaaccgcgat gccgacaaga aaacttttat     1620
gagagagatc ctggacttct ttttggggga ctatttttgt acagagaaaa cctggggagg     1680
gtggggaggg cgggggaatg gaccttgtat agatctggag gaaagaaagc tacgaaaaac     1740
tttttaaaag ttctagtggt acggtaggag ctttgcagga agtttgcaaa agtctttacc     1800
aataatattt agagctagtc tccaagcgac gaaaaaaatg ttttaatatt tgcaagcaac     1860
ttttgtacag tatttatcga gataaacatg gcaatcaaaa tgtccattgt ttataagctg     1920
agaatttgcc aatatttttc aaggagaggc ttcttgctga attttgattc tgcagctgaa     1980
atttaggaca gttgcaaacg tgaaaagaag aaaattattc aaatttggac attttaattg     2040
tttaaaaatt gtacaaaagg aaaaaattag aataagtact ggcgaaccat ctctgtggtc     2100
ttgtttaaaa agggcaaaag ttttagactg tactaaattt tataacttac tgttaaaagc     2160
aaaaatggcc atgcaggttg acaccgttgg taatttataa tagcttttgt tcgatcccaa     2220
ctttccattt tgttcagata aaaaaaacca tgaaattact gtgtttgaaa tattttctta     2280
tggtttgtaa tatttctgta aatttattgt gatattttaa ggttttcccc cctttatttt     2340
ccgtagttgt attttaaaag attcggctct gtattatttg aatcagtctg ccgagaatcc     2400
atgtatatat ttgaactaat atcatcctta taacaggtac attttcaact taagttttta     2460
ctccattatg cacagtttga gataaataaa tttttgaaat atggacactg aaaaaaaaaa     2520
<210>  8
<211>  2078
<212>  DNA
<213>  Homo sapiens
<400>  FOXD3 coding
atgaccctct ccggcggcgg cagcgccagc gacatgtccg gccagacggt gctgacggcc       60
gaggacgtgg acatcgatgt ggtgggcgag ggcgacgacg ggctggaaga gaaggacagc      120
gacgcaggtt gcgatagccc cgcggggccg ccggagctgc gcctggacga ggcggacgag      180
gtgcccccgg cggcacccca tcacggacag cctcagccgc cccaccagca gcccctgaca      240
ttgcccaagg aggcggccgg agccggggcc ggaccggggg gcgacgtggg cgcgccggag      300
gcggacggct gcaagggcgg tgttggcggc gaggagggcg gcgcgagcgg cggcgggcct      360
ggcgcgggca gcggttcggc gggaggcctg gccccgagca agcccaagaa cagcctagtg      420
aagccgcctt actcgtacat cgcgctcatc accatggcca tcctgcagag cccgcagaag      480
aagctgaccc tgagcggcat ctgcgagttc atcagcaacc gcttccccta ctacagggag      540
aagttccccg cctggcagaa cagcatccgc cacaacctct cactcaacga ctgcttcgtc      600
aagatccccc gcgagccggg caacccgggc aagggcaact actggaccct ggacccgcag      660
tccgaggaca tgttcgacaa cggcagcttc ctgcggcgcc ggaaacgctt caagcgccac      720
cagcaggagc acctgcgcga gcagacggcg ctcatgatgc agagcttcgg cgcttacagc      780
ctggcggcgg cggccggcgc cgcgggaccc tacggccgcc cctacggcct gcaccctgcg      840
gcggcggccg gtgcctattc gcacccggca gcggcggcgg ccgcggctgc tgcggcggcg      900
ctccagtacc cgtacgcgct gccgccggtg gcaccggtgc tgcctcccgc tgtgccgctg      960
ctgccctcgg gcgagctggg ccgcaaagcg gccgccttcg gctcacagct cggcccgggc     1020
ctgcagctgc agctcaatag cctgggcgcc gccgcggccg ctgcgggcac agcgggcgcc     1080
gcgggcacca ccgcgtcgct catcaagtcc gagccaagcg cgcggccgtc gttcagcatc     1140
gagaacatca taggtggggg ccccgcggct cctgggggct cggcggtggg cgctggggtc     1200
gccggcggca ctgggggttc agggggcggc agcacggcgc agtcgtttct gcggccaccc     1260
gggaccgtgc agtcggcagc gctcatggcc acccaccaac cgctgtcgct gagccggacg     1320
actgccacca tcgcgcccat tcttagcgtg ccactctccg gacagtttct gcagcccgca     1380
gcctcggccg ccgccgctgc tgcggccgcc gctcaagcca aatggccggc gcaataggga     1440
cgcgccaatg gccgggaccc agggtccggc ggcggcctcg agcaacaaat gcacctccag     1500
gctgcgcgcc ctgtcccaag cccggtcccg gtcccgctgc ccaatcctgg actctgcctc     1560
tccccaattt cctttcccct gagcccccaa cgcctacctt ccgcggcctc catcccctcg     1620
cgcacaccta agctggtcga gcaaactcac cgcgcgcccg ccggggatag ctttccatac     1680
aggtaaaacc gaaaaccgaa ttttccaaaa atgcaccccg acggcgcctg ctcttagtac     1740
cgtggggatg ggagggaaat tctttgtata tatttgtaaa aaaattattg actttccttt     1800
tggggttttt atttttttaa gaaaaaacaa attccgtaga tttagagctc tgaactttca     1860
ttttttttga aggttcactc tccgaagttt tatctgagaa aagaatgtat agagacgttg     1920
ggagatttta aatataaaaa attttcaaaa aggcaaaaag tgtcattcta ttataaaagt     1980
ctgtttatat atgaatgaat atatatggta ttctaaatgt tattccatcg tgttgtacac     2040
aactttgtaa ataaattttt aaaatgccaa aaaaaaaa                             2078
<210>  9
<211>  2103
<212>  DNA
<213>  Homo sapiens
<400>  NANOG coding
ttcattataa atctagagac tccaggattt taacgttctg ctggactgag ctggttgcct       60
catgttatta tgcaggcaac tcactttatc ccaatttctt gatacttttc cttctggagg      120
tcctatttct ctaacatctt ccagaaaagt cttaaagctg ccttaacctt ttttccagtc      180
cacctcttaa attttttcct cctcttcctc tatactaaca tgagtgtgga tccagcttgt      240
ccccaaagct tgccttgctt tgaagcatcc gactgtaaag aatcttcacc tatgcctgtg      300
atttgtgggc ctgaagaaaa ctatccatcc ttgcaaatgt cttctgctga gatgcctcac      360
acggagactg tctctcctct tccttcctcc atggatctgc ttattcagga cagccctgat      420
tcttccacca gtcccaaagg caaacaaccc acttctgcag agaagagtgt cgcaaaaaag      480
gaagacaagg tcccggtcaa gaaacagaag accagaactg tgttctcttc cacccagctg      540
tgtgtactca atgatagatt tcagagacag aaatacctca gcctccagca gatgcaagaa      600
ctctccaaca tcctgaacct cagctacaaa caggtgaaga cctggttcca gaaccagaga      660
atgaaatcta agaggtggca gaaaaacaac tggccgaaga atagcaatgg tgtgacgcag      720
aaggcctcag cacctaccta ccccagcctt tactcttcct accaccaggg atgcctggtg      780
aacccgactg ggaaccttcc aatgtggagc aaccagacct ggaacaattc aacctggagc      840
aaccagaccc agaacatcca gtcctggagc aaccactcct ggaacactca gacctggtgc      900
acccaatcct ggaacaatca ggcctggaac agtcccttct ataactgtgg agaggaatct      960
ctgcagtcct gcatgcagtt ccagccaaat tctcctgcca gtgacttgga ggctgccttg     1020
gaagctgctg gggaaggcct taatgtaata cagcagacca ctaggtattt tagtactcca     1080
caaaccatgg atttattcct aaactactcc atgaacatgc aacctgaaga cgtgtgaaga     1140
tgagtgaaac tgatattact caatttcagt ctggacactg gctgaatcct tcctctcccc     1200
tcctcccatc cctcatagga tttttcttgt ttggaaacca cgtgttctgg tttccatgat     1260
gcccatccag tcaatctcat ggagggtgga gtatggttgg agcctaatca gcgaggtttc     1320
tttttttttt tttttcctat tggatcttcc tggagaaaat actttttttt tttttttttt     1380
tgaaacggag tcttgctctg tcgcccaggc tggagtgcag tggcgcggtc ttggctcact     1440
gcaagctccg tctcccgggt tcacgccatt ctcctgcctc agcctcccga gcagctggga     1500
ctacaggcgc ccgccacctc gcccggctaa tattttgtat ttttagtaga gacggggttt     1560
cactgtgtta gccaggatgg tctcgatctc ctgaccttgt gatccacccg cctcggcctc     1620
cctaacagct gggatttaca ggcgtgagcc accgcgccct gcctagaaaa gacattttaa     1680
taaccttggc tgccgtctct ggctatagat aagtagatct aatactagtt tggatatctt     1740
tagggtttag aatctaacct caagaataag aaatacaagt acaaattggt gatgaagatg     1800
tattcgtatt gtttgggatt gggaggcttt gcttattttt taaaaactat tgaggtaaag     1860
ggttaagctg taacatactt aattgatttc ttaccgtttt tggctctgtt ttgctatatc     1920
ccctaatttg ttggttgtgc taatctttgt agaaagaggt ctcgtatttg ctgcatcgta     1980
atgacatgag tactgcttta gttggtttaa gttcaaatga atgaaacaac tatttttcct     2040
ttagttgatt ttaccctgat ttcaccgagt gtttcaatga gtaaatatac agcttaaaca     2100
taa                                                                   2103
<210>  10
<211>  6007
<212>  DNA
<213>  Homo sapiens
<400>  PODXL coding
agccgcgcag acgccgccca ggacgcagcc gccgccgccg ccgctcctct gccactggct       60
ctgcgcccca gcccggctct gctgcagcgg cagggaggaa gagccgccgc agcgcgactc      120
gggagccccg ggccacagcc tggcctccgg agccacccac aggcctcccc gggcggcgcc      180
cacgctccta ccgcccggac gcgcggatcc tccgccggca ccgcagccac ctgctcccgg      240
cccagaggcg acgacacgat gcgctgcgcg ctggcgctct cggcgctgct gctactgttg      300
tcaacgccgc cgctgctgcc gtcgtcgccg tcgccgtcgc cgtcgccctc ccagaatgca      360
acccagacta ctacggactc atctaacaaa acagcaccga ctccagcatc cagtgtcacc      420
atcatggcta cagatacagc ccagcagagc acagtcccca cttccaaggc caacgaaatc      480
ttggcctcgg tcaaggcgac cacccttggt gtatccagtg actcaccggg gactacaacc      540
ctggctcagc aagtctcagg cccagtcaac actaccgtgg ctagaggagg cggctcaggc      600
aaccctacta ccaccatcga gagccccaag agcacaaaaa gtgcagacac cactacagtt      660
gcaacctcca cagccacagc taaacctaac accacaagca gccagaatgg agcagaagat      720
acaacaaact ctggggggaa aagcagccac agtgtgacca cagacctcac atccactaag      780
gcagaacatc tgacgacccc tcaccctaca agtccactta gcccccgaca acccacttcg      840
acgcatcctg tggccacccc aacaagctcg ggacatgacc atcttatgaa aatttcaagc      900
agttcaagca ctgtggctat ccctggctac accttcacaa gcccggggat gaccaccacc      960
ctactagaga cagtgtttca ccatgtcagc caggctggtc ttgaactcct gacctcgggt     1020
gatctgccca ccttggcctc ccaaagtgct gggattacag cgtcatcggt tatctcgcaa     1080
agaactcaac agacctccag tcagatgcca gccagctcta cggccccttc ctcccaggag     1140
acagtgcagc ccacgagccc ggcaacggca ttgagaacac ctaccctgcc agagaccatg     1200
agctccagcc ccacagcagc atcaactacc caccgatacc ccaaaacacc ttctcccact     1260
gtggctcatg agagtaactg ggcaaagtgt gaggatcttg agacacagac acagagtgag     1320
aagcagctcg tcctgaacct cacaggaaac accctctgtg cagggggcgc ttcggatgag     1380
aaattgatct cactgatatg ccgagcagtc aaagccacct tcaacccggc ccaagataag     1440
tgcggcatac ggctggcatc tgttccagga agtcagaccg tggtcgtcaa agaaatcact     1500
attcacacta agctccctgc caaggatgtg tacgagcggc tgaaggacaa atgggatgaa     1560
ctaaaggagg caggggtcag tgacatgaag ctaggggacc aggggccacc ggaggaggcc     1620
gaggaccgct tcagcatgcc cctcatcatc accatcgtct gcatggcatc attcctgctc     1680
ctcgtggcgg ccctctatgg ctgctgccac cagcgcctct cccagaggaa ggaccagcag     1740
cggctaacag aggagctgca gacagtggag aatggttacc atgacaaccc aacactggaa     1800
gtgatggaga cctcttctga gatgcaggag aagaaggtgg tcagcctcaa cggggagctg     1860
ggggacagct ggatcgtccc tctggacaac ctgaccaagg acgacctgga tgaggaggaa     1920
gacacacacc tctagtccgg tctgccggtg gcctccagca gcaccacaga gctccagacc     1980
aaccacccca agtgccgttt ggatggggaa gggaaagact ggggagggag agtgaactcc     2040
gaggggtgtc ccctcccaat ccccccaggg ccttaatttt tcccttttca acctgaacaa     2100
atcacattct gtccagattc ctcttgtaaa ataacccact agtgcctgag ctcagtgctg     2160
ctggatgatg agggagatca agaaaaagcc acgtaaggga ctttatagat gaactagtgg     2220
aatcccttca ttctgcagtg agattgccga gacctgaaga gggtaagtga cttgcccaag     2280
gtcagagcca cttggtgaca gagccaggat gagaacaaag attccatttg caccatgcca     2340
cactgctgtg ttcacatgtg ccttccgtcc agagcagtcc cgggcagggg tgaaactcca     2400
gcaggtggct gggctggaaa ggagggcagg gctacatcct ggctcggtgg gatctgacga     2460
cctgaaagtc cagctcccaa gttttccttc tcctacccca gcctcgtgta cccatcttcc     2520
caccctctat gttcttaccc ctccctacac tcagtgtttg ttcccactta ctctgtcctg     2580
gggcctctgg gattagcaca ggttattcat aaccttgaac cccttgttct ggattcggat     2640
tttctcacat ttgcttcgtg agatgggggc ttaacccaca caggtctccg tgcgtgaacc     2700
aggtctgctt aggggacctg cgtgcaggtg aggagagaag gggacactcg agtccaggct     2760
ggtatctcag ggcagctgat gaggggtcag caggaacact ggcccattgc ccctggcact     2820
ccttgcagag gccacccacg atcttctttg ggcttccatt tccaccaggg actaaaatct     2880
gctgtagcta gtgagagcag cgtgttcctt ttgttgttca ctgctcagct gatgggagtg     2940
attccctgag acccagtatg aaagagcagt ggctgcagga gaggccttcc cggggccccc     3000
catcagcgat gtgtcttcag agacaatcca ttaaagcagc caggaaggac aggctttccc     3060
ctgtatatca taggaaactc agggacattt caagttgctg agagttttgt tatagttgtt     3120
ttctaaccca gccctccact gccaaaggcc aaaagctcag acagttggca gacgtccagt     3180
tagctcatct cactcactct gattctcctg tgccacagga aaagagggcc tggaaagcgc     3240
agtgcatgct gggtgcatga agggcagcct gggggacaga ctgttgtggg aacgtcccac     3300
tgtcctggcc tggagctagg ccttgctgtt cctcttctct gtgagcctag tggggctgct     3360
gcggttctct tgcagtttct ggtggcatct caggggaaca caaagctatg tctattcccc     3420
aatataggac ttttatgggc tcggcagtta gctgccatgt agaaggctcc taagcagtgg     3480
gcatggtgag gtttcatctg attgagaagg gggaatcctg tgtggaatgt tgaactttcg     3540
ccatggtctc catcgttctg ggcgtaaatt ccctgggatc aagtaggaaa atgggcagaa     3600
ctgcttaggg gaatgaaatt gccatttttc gggtgaaacg ccacacctcc agggtcttaa     3660
gagtcaggct ccggctgtag tagctctgat gaaataggct atccactcgg gatggcttac     3720
tttttaaaag ggtaggggga ggggctgggg aagatctgtc ctgcaccatc tgcctaattc     3780
cttcctcaca gtctgtagcc atctgatatc ctaggggaaa aggaaggcca ggggttcaca     3840
tagggcccca gcgagtttcc caggagttag agggatgcga ggctaacaag ttccaaaaac     3900
atctgccccg atgctctagt gtttggaggt gggcaggatg gagaacagtg cctgtttggg     3960
ggaaaacagg aaatcttgtt aggcttgagt gaggtgtttg cttccttctt gcccagcgct     4020
gggttctctc cacccagtag gttttctgtt gtggtcccgt gggagaggcc agactggatt     4080
attcctcctt tgctgatcct gggtcacact tcaccagcca gggcttttga cggagacagc     4140
aaataggcct ctgcaaatca atcaaaggct gcaaccctat ggcctcttgg agacagatga     4200
tgactggcaa ggactagaga gcaggagtgc ctggccaggt cggtcctgac tctcctgact     4260
ctccatcgct ctgtccaagg agaacccgga gaggctctgg gctgattcag aggttactgc     4320
tttatattcg tccaaactgt gttagtctag gcttaggaca gcttcagaat ctgacacctt     4380
gccttgctct tgccaccagg acacctatgt caacaggcca aacagccatg catctataaa     4440
ggtcatcatc ttctgccacc tttactgggt tctaaatgct ctctgataat tcagagagca     4500
ttgggtctgg gaagaggtaa gaggaacact agaagctcag catgacttaa acaggttgta     4560
gcaaagacag tttatcatca gctctttcag tggtaaactg tggtttcccc aagctgcaca     4620
ggaggccaga aaccacaagt atgatgacta ggaagcctac tgtcatgaga gtggggagac     4680
aggcagcaaa gcttatgaag gaggtacaga atattctttg cgttgtaaga cagaatacgg     4740
gtttaatcta gtctaggcac cagatttttt tcccgcttga taaggaaagc tagcagaaag     4800
tttatttaaa ccacttcttg agctttatct tttttgacaa tatactggag aaactttgaa     4860
gaacaagttc aaactgatac atatacacat atttttttga taatgtaaat acagtgacca     4920
tgttaaccta ccctgcactg ctttaagtga acatactttg aaaaagcatt atgttagctg     4980
agtgatggcc aagttttttc tctggacagg aatgtaaatg tcttactgga aatgacaagt     5040
ttttgcttga tttttttttt taaacaaaaa atgaaatata acaagacaaa cttatgataa     5100
agtatttgtc ttgtagatca ggtgttttgt tttgtttttt taattttaaa atgcaaccct     5160
gccccctccc cagcaaagtc acagctccat ttcagtaaag gttggagtca atatgctctg     5220
gttggcaggc aaccctgtag tcatggagaa aggtatttca agatctagtc caatcttttt     5280
ctagagaaaa agataatctg aagctcacaa agatgaagtg acttcctcaa aatcacatgg     5340
ttcaggacag aaacaagatt aaaacctgga tccacagact gtgcgcctca gaaggaataa     5400
tcggtaaatt aagaattgct actcgaaggt gccagaatga cacaaaggac agaattcctt     5460
tcccagttgt taccctagca aggctaggga gggcatgaac acaaacataa gaactggtct     5520
tctacacttt ctctgaatca tttaggttta agatgtaagt gaacaattct ttctttctgc     5580
caagaaacaa agttttggat gagcttttat atatggaact tactccaaca ggactgaggg     5640
accaaggaaa catgatgggg gaggcagaga gggcaagagt aaaactgtag catagctttt     5700
gtcacggtca ctagctgatc cctcaggtct gctgcaaaca cagcatggag gacacagatg     5760
actctttggt gttggtcttt ttgtctgcag tgaatgttca acagtttgcc caggaactgg     5820
gggatcatat atgtcttagt ggacaggggt ctgaagtaca ctggaattta ctgagaaact     5880
tgtttgtaaa aactatagtt aataattatt gcattttctt acaaaaatat attttggaaa     5940
attgtatact gtcaattaaa gtgtttttgt gtaaactggt tcaaaaaaaa aaaaaaaaaa     6000
aaaaaaa                                                               6007
<210>  11
<211>  2660
<212>  DNA
<213>  Homo sapiens
<400>  REX1 (ZFP42)
agtttctcct ttgttttacg tttgggagga ggtggcattg gaaatagcag agtgcttcgc       60
ggtaacaggg gttggagtgc aatggtgtga tctcagctca ctgcaacccc tgcctcccag      120
gctccagcga tcctcccacc tcagcctcct gaatagctga ccaccagcac actaggcaaa      180
cccaccccac tcacggcctc ccttgggaat tcagacctaa ccatcgctga gctgaaacaa      240
atgtactgag gctggagcct gtgtgaacag aacagaagag gccttcactc tagtagtgct      300
cacagtccag caggtgtttg ctgaagacag cttactcaga tcactactgc ctggaggtgg      360
ttgatatatc ctggtgtaaa ccttcaagaa gggcacaggc aggaaaacat gagccagcaa      420
ctgaagaaac gggcaaagac aagacaccag aaaggcctgg gtggaagagc ccccagtggg      480
gctaagccca ggcaaggcaa gtcaagccaa gacctgcagg cggaaataga acctgtcagc      540
gcggtgtggg ccttatgtga tggctatgtg tgctatgagc ctggccctca ggctctcgga      600
ggggatgatt tctcagactg ttacatagaa tgcgtcataa ggggtgagtt ttctcaaccc      660
atcctggaag aggactcact ttttgagtcc ttggaatacc taaagaaagg atcagaacaa      720
cagctttctc aaaaggtttt cgaagcaagc tcccttgaat gttctttgga atacatgaaa      780
aaaggggtaa agaaagagct tccacaaaag atagttggag agaattcgct tgagtattct      840
gagtacatga caggcaagaa gcttccgcct ggaggaatac ctggcattga cctatcagat      900
cctaaacagc tcgcagaatt tgctagaaag aagcccccca taaataaaga atatgacagt      960
ctgagcgcaa tcgcttgtcc tcagagtgga tgcactagga agttgaggaa tagagctgcc     1020
ctgagaaagc atctcctcat tcatggtccc cgagaccacg tctgtgcgga atgtgggaaa     1080
gcgttcgttg agagctcaaa actaaagaga catttcctgg ttcatactgg agagaagccg     1140
tttcggtgca cttttgaagg gtgcggaaag cgcttctctc tggactttaa tttgcgtacg     1200
cacgtgcgca tccacacggg ggagaaacgt ttcgtgtgtc cctttcaagg ctgcaacagg     1260
aggtttattc agtcaaataa cctgaaagcc cacatcctaa cgcatgcaaa tacgaacaag     1320
aatgaacaag agggaaagta gtcctccaac aggatgaagc agattaacag aagagtgatc     1380
agtgacaaac atgcctcatt gattattgtt tctaggaagg aatttctaaa tcaatattgc     1440
aaccccaaaa gcggttataa tttggtgtta ctaagatgct cctacacttt gtgataccgt     1500
tttaaggaca tggtgcattt ttttttcttt tatttgtttt atttagaact ttttttattt     1560
gttttattta gaactttgtg tgttcttaaa gtgtgcttcc aacaggaagg tcagtgataa     1620
attttcaaaa gcataacctt caatatatta tctgttggat tattggatat aagacttatt     1680
ttcatgtact ataaatatga aaataacttt gatttttaat tgtgtagttt ccatttctta     1740
gcttttgcct tttaaattta tacttcagcc aggcatagtg actgatgcct gtaatcccaa     1800
cactttgttg ggaggccaaa gcaggaggat agcttgaggc caggagttcc agaccagcct     1860
gggcaacata gtgagatcct gtctctacaa aaaaatttgt ttttatttgt atttatatat     1920
ttttattttt gtttttgttg gtaggcgtct cgctctgtca cccaggctgg agtctagtgt     1980
cgtgatcttg gctcactgca acctccacct cccgggttca agtgattctc tggcctcagc     2040
ctcccaagta gctgggacta caggtgtgtg tcaccacgcc cggctaattt ttgtattttt     2100
agtagagatg gggtttcacc atgttggcca ggctagtctc aaactcctga cctccagtga     2160
tctgcccacc tcggcctccc aaagtgctgg gattacaggt gtgagccact gtgcctggcc     2220
ccccacaaca tgtttaaact tagctaggcc tggttgcata cgcctgtgtt cccagctact     2280
caggaggctg aagcaggagg atagcttgag cccaggagtt tgaggctaca gtgagctgtg     2340
attgcaccac tgtactccag actggataac agcaagagcc catcttttaa aaaaagtaaa     2400
aattaaaaat atacttcatg gttcatgtca tagccctaga gaatgaaaaa tttgcagtag     2460
atagtcaata aatgaatcag tagttaaata ttccttaaag tcaactgtat ttcattgtga     2520
tttttgtttt ctttttatca ttgtatcaaa ctatatggaa atcatatggt tagatgtgat     2580
tatttgataa tgttagtcca tttgaatcca ttttagatat ttcacaatta aagaatatga     2640
aacttcagaa aaaaaaaaaa                                                 2660
<210>  12
<211>  6063
<212>  DNA
<213>  Homo sapiens
<400>  SSEA1 (FUT4) coding
aatccctccc tccggcgggc gtcgctggcg ggtggctagg cccaacggca ggaagccgac       60
gctatcctcc gttccgcggc gccgggtccg ccttccgtct gttctagggc ctgctcctgc      120
gcggcagctg ctttagaagg tctcgagcct cctgtacctt cccagggatg aaccgggcct      180
tccctctgga aggcgagggt tcgggccaca gtgagcgagg gccagggcgg tgggcgcgcg      240
cagagggaaa ccggatcagt tgagagagaa tcaagagtag cggatgaggc gcttgtgggg      300
cgcggcccgg aagccctcgg gcgcgggctg ggagaaggag tgggcggagg cgccgcagga      360
ggctcccggg gcctggtcgg gccggctggg ccccgggcgc agtggaagaa agggacgggc      420
ggtgcccggt tgggcgtcct ggccagctca ccttgccctg gcggctcgcc ccgcccggca      480
cttgggagga gcagggcagg gcccgcggcc tttgcattct gggaccgccc ccttccattc      540
ccgggccagc ggcgagcggc agcgacggct ggagccgcag ctacagcatg agagccggtg      600
ccgctcctcc acgcctgcgg acgcgtggcg agcggaggca gcgctgcctg ttcgcgccat      660
gggggcaccg tggggctcgc cgacggcggc ggcgggcggg cggcgcgggt ggcgccgagg      720
ccgggggctg ccatggaccg tctgtgtgct ggcggccgcc ggcttgacgt gtacggcgct      780
gatcacctac gcttgctggg ggcagctgcc gccgctgccc tgggcgtcgc caaccccgtc      840
gcgaccggtg ggcgtgctgc tgtggtggga gcccttcggg gggcgcgata gcgccccgag      900
gccgccccct gactgccggc tgcgcttcaa catcagcggc tgccgcctgc tcaccgaccg      960
cgcgtcctac ggagaggctc aggccgtgct tttccaccac cgcgacctcg tgaaggggcc     1020
ccccgactgg cccccgccct ggggcatcca ggcgcacact gccgaggagg tggatctgcg     1080
cgtgttggac tacgaggagg cagcggcggc ggcagaagcc ctggcgacct ccagccccag     1140
gcccccgggc cagcgctggg tttggatgaa cttcgagtcg ccctcgcact ccccggggct     1200
gcgaagcctg gcaagtaacc tcttcaactg gacgctctcc taccgggcgg actcggacgt     1260
ctttgtgcct tatggctacc tctaccccag aagccacccc ggcgacccgc cctcaggcct     1320
ggccccgcca ctgtccagga aacaggggct ggtggcatgg gtggtgagcc actgggacga     1380
gcgccaggcc cgggtccgct actaccacca actgagccaa catgtgaccg tggacgtgtt     1440
cggccggggc gggccggggc agccggtgcc cgaaattggg ctcctgcaca cagtggcccg     1500
ctacaagttc tacctggctt tcgagaactc gcagcacctg gattatatca ccgagaagct     1560
ctggcgcaac gcgttgctcg ctggggcggt gccggtggtg ctgggcccag accgtgccaa     1620
ctacgagcgc tttgtgcccc gcggcgcctt catccacgtg gacgacttcc caagtgcctc     1680
ctccctggcc tcgtacctgc ttttcctcga ccgcaacccc gcggtctatc gccgctactt     1740
ccactggcgc cggagctacg ctgtccacat cacctccttc tgggacgagc cttggtgccg     1800
ggtgtgccag gctgtacaga gggctgggga ccggcccaag agcatacgga acttggccag     1860
ctggttcgag cggtgaagcc gcgctcccct ggaagcgacc caggggaggc caagttgtca     1920
gctttttgat cctctactgt gcatctcctt gactgccgca tcatgggagt aagttcttca     1980
aacacccatt tttgctctat gggaaaaaaa cgatttacca attaatatta ctcagcacag     2040
agatgggggc ccggtttcca tattttttgc acagctagca attgggctcc ctttgctgct     2100
gatgggcatc attgtttagg ggtgaaggag ggggttcttc ctcaccttgt aaccagtgca     2160
gaaatgaaat agcttagcgg caagaagccg ttgaggcggt ttcctgaatt tccccatctg     2220
ccacaggcca tatttgtggc ccgtgcagct tccaaatctc atacacaact gttcccgatt     2280
cacgtttttc tggaccaagg tgaagcaaat ttgtggttgt agaaggagcc ttgttggtgg     2340
agagtggaag gactgtggct gcaggtggga ctttgttgtt tggattcctc acagccttgg     2400
ctcctgagaa aggtgaggag ggcagtccaa gaggggccgc tgacttcttt cacaagtact     2460
atctgttccc ctgtcctgtg aatggaagca aagtgctgga ttgtccttgg aggaaactta     2520
agatgaatac atgcgtgtac ctcactttac ataagaaatg tattcctgaa aagctgcatt     2580
taaatcaagt cccaaattca ttgacttagg ggagttcagt atttaatgaa accctatgga     2640
gaatttatcc ctttacaatg tgaatagtca tctcctaatt tgtttcttct gtctttatgt     2700
ttttctataa cctggatttt ttaaatcata ttaaaattac agatgtgaaa ataaagcaga     2760
agcaaccttt ttccctcttc ccagaaaacc agtctgtgtt tacagacaga agagaaggaa     2820
gccatagtgt cacttccaca caattattta tttcatgtct ttactggacc tgaaatttaa     2880
actgcaatgc cagtcctgca ggagtgctgg cattaccctc tgcagaacag tgaaaggtat     2940
tgcactacat tatggaatca tgcaaaagga aaaaaagttt catgatatct gttgttggca     3000
gtttttgttt atctctgaca gtttttagtt aaatgtttag atcctcagaa ctacattagt     3060
gcctactatt aacttactct gtctcttgtt aaaggctaaa tctgcgcttc tccctggtgc     3120
cagcaggttc ccctcacagt caatgcagtg gtatagcata tcctcacatt tctagtgccc     3180
ttgagactgt gctatggaac caatcttgaa catacatgca ttgacttgac aagttactga     3240
gtaagcagca tattcagcag gtgccactac atgcctactc tgccagacac tgagcttggg     3300
gccctaggga agatagagaa ttatacaagg caaagtcctt ctctttaggg ctcttacaat     3360
ctatcacttc caaaaagtaa atggtgactg ataaaacaat tggcagaacc tgtttgatta     3420
ctgtgacagt cttaatgata ccataaatca atattagaaa gctagttgac ttaaagcctg     3480
aaataatggg agttttctcc tccacttatt agaataagga ccctcagtga ctaattattg     3540
tgggtagggt caagattaac tagttttata cagagttctg ctgtaaatag tcattttgca     3600
tttgattagt gcagttctct gaatcataaa gcaagtttta cctctctgta catgtttttg     3660
cagacatact tgaaaagctc acttaaatct aggtgcttca attcactttc ttgagaggac     3720
aaatgaaaag ctgtggagaa aatgtcctca ttaaagtatt aaagtgtggg cagaattaca     3780
attacaaagt gccagccacc gaataaagat aaaagttcag ttcttaaaat gagtttttat     3840
gagataacag tcagtgatct tggtgttacc gggattccac atggggcagt gggaaagagt     3900
tcaggttttg aaggtaacct agtttagatt tgaattccag ctatgtgaca ttgggtaaat     3960
tagtagtagt cctgagcctc agcgtcctca tctataaaat gactggcgaa aatacttcac     4020
aagctcattt tgagcacttt aggaagtaag tgaaagtacc taaaatagca ggcacccaat     4080
tgatgatttt atatcttcct tctttgcttg cagtgatttc aggatgtcct catatctatt     4140
tataggtcta aaattatatc ttaaggtatg ttgtagaata aattaaaagg ataatctaaa     4200
tcaccattta gattaagctt gacttgcaaa ctaggaagaa gcacctaggc tttctttgaa     4260
aatatttttt tggttcgttt tggtaaagct ctataaattg gtatctatta ttttaccaat     4320
ttttttttag tattaagtcc atttagaact aaccatatta tttatggaat aattagcatg     4380
aggaaggtat aattgcattt tttttttttt gagacggagt cttgcactgt agccccagct     4440
ggactgcagt ggcgtgatct tggctcactg caacctccgc ctcccaggtt caagcgattc     4500
tcctgcctca gcctcccgag cagctgagac tacaggcgcc tgccaccacg cctggccaat     4560
tttttgtatt tttagtagag actgcgtttc accatgttgg gcaggctggt cttgaactcc     4620
tgaccttgtg atccacctgc ctcggcctct cagagagctg ggattacagg tgtgagccgc     4680
cgtgcccagc cattgcattt ttattcacat acacattgtt aatgtggaac aatttaacac     4740
taatctcatc agagagcgag atgaatgtgg caattgctca ttttattttg catatattaa     4800
attgagtagg ttcagctcta acatacctta agaaaaatgc atatcggtgc actgtatgta     4860
tttcaaaatg cctttcctat gattgtcatg tcctccttta aggcttttcc ctcaaattta     4920
ttacaaattt agtattttta gtacttgatg actctaatta catgaatgca cctggaatga     4980
catttgtaac agaagacggt ctgacttgct ttcagtattc acaagttctt tccagtttcc     5040
aagtcttttc ctagcagtaa tttaggggag acagaggagt ttcatgtaaa gagcatgcag     5100
tttggagtca gaacctgggt atgactctgt ggccttgatg aagcaagtta cttaaactct     5160
tgagttttag ctttctcctt tacaatgcat gaatgcctat ccccctacaa aacaaagatt     5220
aaatgtgatg atgtatgcca aggtgctttg tatattgtaa agtgctatat aattataaga     5280
tgttctaaat tttcaaggat ctaaaccagg gattggcaaa cgtttttcca gggagtaaat     5340
attttacgct ttgcatatat aatttatgga ggtgttgaga ggatagatta gacacttgaa     5400
gtactcagga tagtgcctgg catgtaggaa gcacctggaa aatattcgct gtgattacca     5460
tcagtccatt ttaccgagga aggagccaag gtccaggccc actgaaggac ttgcataaca     5520
ttacaatagc agtggcagaa ccagccatgc ttctgcaaat cacaacctct ttgagcctct     5580
gtcacctgaa ctgcaaaatg agtgggttag acaaaatcat ctgttgggac ctcctagttc     5640
cacgtgctat cattctacta actggcaccc taaggttgaa agtgcttatc tgctttccaa     5700
tgtggcttcc ttacagtctg gaactgacaa tatgcaggag cagtaaactg gcagaaaacc     5760
aggaatcaga gaaagaaaat ataatttaac tttaaagatg taaattatat atatagtata     5820
ttatatatat ttttaaagct ttatatgcct caaatatcag ggaaaggagc caagtccttg     5880
gtatttagtt tggtgaatac ttgcattgaa tacatgtcaa gatgtcaagt catttttgaa     5940
tgtgtctcag ggatttctat gctacacatt cttttaacaa atcaagtatt tatgtacaca     6000
tgttcagatt ttttgacaaa atgattaaaa taatgagatg gaaaatgaaa aaaaaaaaaa     6060
aaa                                                                   6063
<210>  13
<211>  1393
<212>  DNA
<213>  Homo sapiens
<400>  DPPA2 coding
agccctttgt ttatggcctg atctagctaa ggcttctaga cttcaggagc ttaagaatcg       60
tccggagggc tgggcgtggc ggtgcaggcc tgtagtccca cccactccga aggctgcgga      120
gggaggatca acttgagtct gggaactcag ccaggaattc aagaccagcc tgggcaacac      180
agtgaggccc cctacccaca tcctctccgt ccccgcaatc tccttccatc ccagggtgtt      240
gctgaaaatg tcagatgcaa atttggatag cagcaagaag aatttcttgg agggggaagt      300
agatgatgag gaaagtgtga ttttgacact ggtgccagtt aaagatgacg caaatatgga      360
acaaatggaa ccaagcgttt cttcaacttc tgatgtcaaa ctggagaagc ctaagaaata      420
caatccaggt catctacttc aaacaaatga gcaatttaca gctccacaaa aagctagatg      480
caaaatacca gcccttccct tgccgaccat tttgcctccc attaataagg tgtgtcggga      540
cactttgcgg gactggtgtc aacaactcgg tttgagtact aatggcaaga aaatcgaagt      600
ttatctgagg cttcataggc atgcttaccc tgaacaacgg caagatatgc ctgaaatgtc      660
acaagagacc agattacagc gatgttcgag gaaacgcaag gcagtgacca agagagcaag      720
gcttcagaga agttatgaga tgaatgagag agcagaagag accaatacag ttgaagtgat      780
aacttcagca ccgggagcca tgttggcatc atgggcaaga attgctgcaa gagctgttca      840
gcctaaggct ttgaattcat gttccattcc tgtttctgtt gaggcctttt tgatgcaagc      900
ctctggcgtc aggtggtgtg tggtccatgg cagacttctc tcggcagaca caaagggttg      960
ggtacgcctg cagtttcatg caggtcaggc ctgggtgcct accactcaca ggaggatgat     1020
ttctctcttc ttgttacctg cctgcatttt cccatcccca ggcatagaag ataatatgtt     1080
atgccccgac tgtgctaaga ggaataagaa gatgatgaaa agattaatga cagtagagaa     1140
gtagcagcaa cctgtttgaa tacaatgtac taaaggaggg atgtactttc agatcatgta     1200
acctattacg aaggagtgga agaggagaca atttgaatga atcctcatga tctacaaaac     1260
aaaatcatag tgactaggac tccacagtga agatggttga ctagtgacac agccccatct     1320
aaagaatccc tttctgtatg tctgaaaacc cattaaaata aagtcactgc aattggcctt     1380
gtaaaaaaaa aaa                                                        1393
<210>  14
<211>  1079
<212>  DNA
<213>  Homo sapiens
<400>  DPPA3 coding
tggagctccg gttttcagcc tctttccggg ctacctggta gcaatttgag gctctgtcat       60
cagtttctgc tacgtttcaa agatcctgga gaagcctagt gttgtgtcaa gacgccgatg      120
gacccatcac agtttaatcc aacctacatc ccagggtctc cacaaatgct caccgaagaa      180
aattcccggg acgattcagg ggcctctcaa atctcctccg agacgttgat aaagaacctt      240
agtaacttga ctatcaacgc tagtagcgaa tctgtttccc ctctatcgga agctttactc      300
cgtcgagagt ctgtaggagc agcagtcctc agggaaatcg aagatgagtg gctttacagc      360
aggagaggag taagaacatt gctgtctgtg cagagagaaa agatggcaag attgagatac      420
atgttactcg gcggagttcg tacgcatgaa agaagaccaa caaacaagga gcctaaggga      480
gttaagaagg aatcaagacc attcaaatgt ccctgcagtt tctgcgtgtc taatggatgg      540
gatccttctg agaatgctag aatagggaat caagacacca agccacttca gccataaatc      600
ttattcttgc accttttttt cttggtagta attttatata gcaggttgag aaagctactc      660
tatgctagta tagactatac accaataatt ttgataatga gttctaggat gtatttttct      720
tgtatctttt tcttcctact atgatactag taattcataa gggatctgtg taatctgaat      780
gtatttgaat aactttagct ctactgtttg atttgaccca aagaagccaa gatgatataa      840
gtattcccat gtgtcttaga agcccaaagt cagtgagatg aaacccaaca tcaagaaatt      900
gaagcaaagt tacttatgga taaagaaagc attaggtagt tgggctatag cataattaga      960
ttttctggct ttcaaaaatt tggattgcaa tcacagcaaa ctttgttatt tttacagttt     1020
tcagtacaaa agtgtttata tagaaacaat aaagttgaca tttgagtacc ttttaaaaa      1079
<---