СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ОЦЕНКИ АКТИВНОСТИ СИСТЕМЫ АПОПТОЗА
METHOD OF THE APOPTOSIS SYSTEM ACTIVITY QUANTITATIVE ESTIMATION

Предлагаемое изобретение относится к области медицины и описывает способы неинвазивной количественной оценки параметров системы апоптоза, эффективности действия апоптоз-модулирующих препаратов, состояния иммунной системы и системы внутриклеточной репарации, используя метод динамической эритемодиагностики. Особенностью разрабатываемого автором метода динамической эритемодиагностики является возможность наблюдать процесс развития стерильного, строго дозированного воспаления в ткани, вызванного ультрафиолетовым (УФ) облучением (УФО) небольшого (доли квадратного сантиметра) участка поверхности исследуемого органа, причем основным критерием воспалительной реакции является гиперемия (покраснение, эритема) УФ облученного участка ткани (фотоэритема).
Фотоэритема используется в медицине для оценки чувствительности ткани к действию ультрафиолета, и известны способы количественной характеристики выраженности фотоэритемы. Обычно исследуемым органом является кожа. Традиционно в качестве количественной характеристики выраженности фотоэритемы используют Эритемный Индекс (Ei) или Степень Покраснения (СП) УФ-облученного участка. Показания большинства приборов, используемых в медицине (например, Mexameter), принцип действия которых основан на исследованиях оптичеких свойств кожи (Diffey В.L., Oliver R.J., Farr P.M., A portable instrument for quantifying erythema induced by ultraviolet radiation. British Journal of Dermatology l984; 111, 663-672.), (Патент РФ №2251963 A61B 5/00, 2005 г.), позволяют измерить степень покраснения в условных единицах, соответствующих степени покраснения, оцениваемой визуально. Основным диагностическим параметром является Минимальная Эритемогенная Доза (МЭД), то есть доза УФ излучения (доза УФИ), вызывающая через 24 часа на УФ облученном участке «едва заметное» или, по другим источникам, «минимальное, достоверно различимое покраснение». Указанный параметр в своем определении содержит элемент субъективности. Для повышения точности измерения чувствительности кожи к УФИ предлагается заменить МЭД на объективно регистрируемый параметр - максимальную неэритемогенную дозу (НЭД). Данный параметр определяется как точка пересечения дозовой зависимости Ei или СП с осью доз УФИ, то есть как максимальная доза УФИ, при которой эритема еще отсутствует. Если по оси доз равномерно откладывать логарифм дозы УФИ, то зависимость Ei или СП от Lg D (логарифма дозы УФИ) становится практически линейной, что позволяет ввести количественный параметр k=tgϕ, то есть тангенс угла наклона дозовой зависимости Ei или СП.
Известно, что измерение МЭД используется в фототерапии для определения чувствительности кожи к действию ультрафиолета с целью индивидуального дозирования лечебных процедур УФО, а также для оценки эффективности действия противовопалительных средств (Jocher A, Kessler S, Hornstein S, Schulte Mönting J, Schempp CM. The UV erythema test as a model to investigate the anti-inflammatory potency of topical preparations-reevaluation and optimization of the method. Skin Pharmacol Physiol. 2005 Sep-Oct; 18(5):234-40. Epub 2005 Jul 5.), (Reuter J, Jocher A, Stump J, Grossjohann B, Franke G, Schempp СМ., Investigation of the anti-inflammatory potential of Aloe vera gel (97.5%) in the ultraviolet erythema test., Skin Pharmacol Physiol. 2008; 21(2):106-10. doi: 10.1159/000114871. Epub 2008 Feb 5.), (Casetti F, Jung W, Wölfle U, Reuter J, Neumann K, Gilb B, Wähling A, Wagner S, Merfort I, Schempp СМ., Topical application of solubilized Reseda luteola extract reduces ultraviolet B-induced inflammation in vivo., J Photochem Photobiol B. 2009 Sep 4; 96(3):260-5. doi: 10.1016 / j.jphotobiol. 2009.07.003. Epub 2009 Jul 17.). Существуют многочисленные способы постановки диагностических кожных проб с аллергенами, в которых очаг воспаления создается внутрикожным введением микродоз аллергена. (Заявка: 2007113363/14, А61В 10/00, 2008 г.). В методе кожных проб при исследовании воспалительной реакции в качестве критерия реактивности в большинстве случаев используют инфильтрат (размер папулы), а не эритему, что, вероятно, обусловлено плохим знанием механизма эритемогенеза.
Ближайшим аналогом является способ исследования процесса развития стерильного воспаления участка ткани, вызванного УФИ (Бондырев Ю.А. Анализ возможности использования УФ излучения как тестирующего диагностического воздействия. /Ю.А. Бондырев/ Современные проблемы науки и образования" №2 с. 30, 2006 г.). Была проанализирована возможность разработки способа количественной оценки функционального состояния систем организма, при котором исследуют процесс развития стерильного воспаления участка ткани, вызванного УФИ различного спектрального состава, интенсивности и дозы, оцениваемый по степени выраженности гиперемии (эритемы) УФ облученного участка ткани. В этих работах содержатся основы метода эритемодиагностики, основанного на анализе двухкомпонентной (быстрая и задержанная эритема) кинетики УФ эритемы, который, по сравнению с существующими методами диагностики, основанными на анализе процесса развития намеренно созданного очага воспаления (методы кожных проб), является несравненно более точным, информативным, использует неинвазивные методики, имеет широкий спектр применения в диагностике.
Недостатком существующих методик диагностики, основанных на исследовании воспалительной реакции ткани в ответ на повреждение, является их инвазивность, узкая диагностическая направленность, низкие точность и информативность.
Задачей исследования является создание точного неинвазивного способа диагностики, позволяющего по анализу фотоэритемы, являющейся обязательным проявлением УФ индуцированного, строго дозированного стерильного воспаления, количественно оценивать функциональное состояние систем организма, участвующих в процессе устранения повреждений, вызванных УФ воздействием.
Поставленная задача достигается тем, что в способе количественной оценки функционального состояния систем организма, при котором исследуют процесс развития стерильного воспаления участка ткани, вызванного УФИ различного спектрального состава, интенсивности и дозы, оцениваемый по степени выраженности гиперемии (эритемы) УФ облученного участка, для измерения активности системы апоптоза, индуцированного УФИ, измеряют тангенс угла наклона (k) и точку пересечения с осью абсцисс дозовой зависимости степени покраснения УФ облученного участка ткани исследуемого органа (максимальная НеЭритемогенная Доза - НЭД) в различные (до 48 часов после УФ облучения) моменты времени.
- Сравнивают значения k и НЭД при системных и/или местных модулирующих активность апоптоза фармакологических воздействиях и без них для быстрой и для задержанной УФ-В эритемы.
- Сравнивают кинетику развития покраснения, вызванного УФ-С (250-280 нм) и УФ-В (280-320 нм) облучением при системных и/или местных фармакологических воздействиях и без них.
- Сравнивают степень покраснения от одинаковых доз УФ излучения, полученных при УФ облучении различной интенсивности.
- Сравнивают кинетику развития покраснения от больших (больше 3 НЭД) и малых (вблизи НЭД) доз УФ-В излучения при системных и/или местных фармакологических воздействиях и без них.
Методика количественной оценки активности апоптоза клеток (кератиноцитов кожи), индуцированного УФ излучением, основана на том, что активная элиминация УФ поврежденных клеток механизмом апоптоза происходит только при достаточно малых (близких к НЭД) дозах УФИ, а с ростом дозы растет вероятность нарушения и поломки (инактивации) энергозависимого механизма апоптоза. Нарушение работы механизма апоптоза достаточно большой дозой УФИ может придать процессу УФ индуцированного апоптоза провоспалительный характер, что приводит к появлению «быстрой» эритемы, которая появляется и достигает максимума через 1,5-6 часов после облучения и до 12 часов исчезает, а поломка или инактивация большими дозами УФИ механизма апоптоза приводит к увеличению доли клеток, разрушающихся посредством некроза, следствием чего является возрастание эритемогенеза, регистрируемого на поздних (более 12 часов после облучения) стадиях развития эритемы (задержанная эритема). Активность системы апоптоза снижает число УФ поврежденных клеток, которые разрушаются посредством некроза и проявляют эритемогенность на поздних стадиях развития УФ индуцированного воспаления. Следствием элиминации (механизмом апоптоза) УФ поврежденных клеток является возрастание НЭД для задержанной эритемы (достигающей максимума после 12 часов с момента облучения), а особенности (немонотонной) дозовой зависимости УФ индуцированного апоптоза приводят к увеличению крутизны дозовой зависимости (k) для задержанной УФ эритемы (регистрируемой через сутки после УФО). Возрастание k для дозовой зависимости задержанной фотоэритемы вследствие активности апоптоза обусловлено тем, что уменьшение эритемогенности (увеличение НЭД на 24 часа) кожи за счет элиминации УФ поврежденных клеток механизмом апоптоза наиболее активно происходит при малых (сравнимых с НЭД) дозах УФИ и эффект снижается с ростом дозы УФИ (вследствие поломки/инактивации УФ воздействием механизма апоптоза). Если значение НЭД зависит от нескольких причин, то параметр k (при стандартных условиях УФ воздействия) однозначно определяет именно активность системы апоптоза.
Способ осуществляется следующим образом.
При измерении Ei или СП или при визуальной оценке степени покраснения по дозовой оси (абсцисс) следует откладывать логарифм дозы для привидения зависимости к линейному виду и расчета тангенса угла наклона дозовой зависимости k=tgϕ. Для возможности сравнения результатов измерения k, полученных разными исследователями, следует принять, что максимально возможное покраснение кожи (ткани) оценивается в 5 условных единиц, а отсутствие покраснения - 0. При таком условии параметр k может быть измерен точно и объективно независимо от методики измерения Ei или СП. Параметр НЭД имеет преимущество перед МЭД еще и потому, что его значение не зависит от единиц измерения Ei или СП, так как значения Ei и СП для кожи без эритемы считаются равными нулю. Для расчета НЭД, k и определения точности их измерения создана и приведена в приложении программа в MS EXCEL (Фиг. 1). В прилагаемой таблице проводится расчет НЭД, k и погрешности измерения по дозовой зависимости Степени Покраснения, измеренной прибором или определенной визуально (СП кожи без эритемы равна нулю, максимально возможная СП равняется пяти). В ячейки таблиц, выделенные желтым цветом, можно вводить значения степени покраснения для двух дозовых зависимостей (значения СП 1 и СП 2) и изменять доверительную вероятность (погрешность в определении k и НЭД рассчитывается по методу Стьюдента).
Наиболее удобным, простым и достаточно точным является метод обработки в графическом редакторе фотографий фотоэритемы в цифровой форме. Желательно, чтобы фотографирование проводилось при стандартном освещении и на фоне эталона. Но и для произвольной фотографии нескольких фотоэритем от различных (известных) доз УФИ можно достаточно точно решить задачу нахождения не только НЭД, но и k. В качестве примера с помощью графического редактора Adobe Photoshop CS3 определены данные Red Green Blue фотоснимка дозовой зависимости УФ эритемы, взятого с сайта http://uvinfo.bsmu.by/med.html. В табличном процессоре MS EXCEL по авторской программе для этих данных проведен расчет параметров НЭД и k (Фиг. 2). Использование фото-индекса Fi - (аналога СП или Ei), - полученного по результатам обработки фотографии, предполагает, что доза УФ (при построении дозовой зависимости для расчета параметров фотоэритемы) откладывается по оси абсцисс линейно. Значения НЭД не зависят от метода регистрации эритемы и предусмотрена возможность сравнения значений k, полученных как при измерении Fi, так и при измерении СП или Ei.
m
0
0
0
m
m
m
m
m
0
m
m
0
0
m
В таблицу заносятся доза УФ и цветовые характеристики эритемы (R G В), полученные при обработке фотографии эритемы с помощью фоторедактора (исходные данные иллюстрирует первый (верхний) график таблицы Фиг. 2). Индекс Fi рассчитывают по формуле Fi=(R-(G+B)/N)/M, где R, G, В - данные фоторедактора, N и Μ - калибровочные коэффициенты для приведения зависимости Fi от дозы УФИ к стандартному виду. Расчет N и Μ проводится по двум точкам - кожа с известным значением Fi и кожа без эритемы: N=(G+B)/R и M=(R-(G+B)/N)/Fi=(R-R×(G+B)/(G+B))/Fi
0
0
0
0
m
m
m
m
0
0
0
m
∧
Здесь R G и В - цветовые характеристики кожи без эритемы (Fi), a R, G и B цветовые характеристики эритемы с известным значением Fi (Fi). При измерении R G и В участок кожи выбирают вблизи исследуемого участка. Эта точка (с координатами 0.0) отмечена на втором графике красным цветом. Но при построении дозовой зависимости точка с координатами 0.0 не используется, так как дозовая зависимость имеет плечо и параметр Fi остается равным нулю при увеличении дозы УФИ до значения D=НЭД (линейная интерполяция, третий (нижний) график). Значение НЭД находится как точка пересечения зависимости Fi с осью дозы УФ и рассчитывается по формуле НЭД=b/k, где b и k - коэффициенты линейной зависимости (линии тренда), построенной по экспериментальным точкам и отраженной на графике в таблице MS EXCEL (Фиг. 2). Для нахождения k требуется определить коэффициент М, используя для этого эритему с известным значением степени покраснения (Fi). На приведенной фотографии степень покраснения эритемы от самой большой дозы УФИ принята равной 3.5 (визуальная оценка). Неточность в определении Μ на значение НЭД не влияет, а погрешность в оценке степени покраснения для F больше, чем 3, значительно меньше, чем при определении МЭД, в том числе и при использовании эталонов. Напомним, что максимально возможное покраснение принято считать равным 5. Погрешность расчета параметров фотоэритемы позволяет оценить величина достоверности линейной аппроксимации (R2), отображенная на графике в таблице MS EXCEL. Для возможности сравнения значений k, полученных разными авторами, по дозовой оси рекомендуется откладывать дозу УФИ в килоджоулях.
Удобство метода расчета параметров НЭД и k по фотографиям участков покраснения кожи, вызванного облучением различными дозами УФИ, состоит также в том, что обследуемый пациент может самостоятельно проводить регистрацию фотоэритемы с помощью (цифрового) фотоаппарата в нужные моменты времени, а сами фотографии являются способом регистрации первичных данных. Для измерения параметров эритемной реакции пациента 2-7 участков кожи площадью в доли квадратного сантиметра облучают УФ-С или УФ-В излучением в различных дозах, минимальная из которых соответствует (среднему) значению НЭД, а последующие возрастают с шагом 10-100%. Оптимальным является одновременное УФ облучение нескольких участков ткани (например, при исследовании дозовой зависимости эритемы). Такая методика ускоряет и упрощает процесс облучения, а наиболее удобным является применение для УФ облучения набора светодиодов, излучающих в ультрафиолетовом диапазоне.
Для нахождения k и НЭД в принципе достаточно измерить СП двух участков кожи с эритемой, полученной от разных доз УФИ, но увеличение количества УФ облученных и покрасневших участков кожи повышает точность определения параметров. Достаточную точность измерения НЭД и k можно получить, облучая 5 участков кожи в дозе, изменяющейся (от участка к участку) на 25%. Минимальная и максимальная дозы облучения в этом случае отличаются почти в 3 раза, что в большинстве случаев достаточно для получения 2-5 покрасневших участков кожи, и в то же время максимальная доза, как правило, не превышает 7 НЭД. При слишком больших дозах УФ-В излучения возможно появление сильного покраснения с эдемой и последующей заметной пигментацией, что нежелательно при методах обследования, считающихся неинвазивными. УФ-С излучение не приводит к эдеме даже при больших дозах УФИ и может вызвать только шелушение кожи.
При диагностическом УФ воздействии (как и при проведении физиотерапевтических процедур) следует избегать облучения участков кожи с пигментными пятнами или повреждениями. В течение четырех недель перед проведением эритемодиагностики пациент не должен подвергаться УФ облучению, так как это может изменить результат тестирования.
12
2т
При необходимости УФ-В облучения в большой дозе используется метод модификации дозного поля (микрофракционное облучение). Уменьшение повреждения кожи в процессе УФО при воздействии большими дозами УФИ достигается тем, что облучение проводится через непрозрачный экран с множеством отверстий диаметром в доли миллиметра, прикладываемый во время облучения вплотную к коже. Светопропускание такого экрана составляет несколько процентов, за счет чего средняя доза УФИ на облучаемом участке снижается в соответствии с коэффициентом светопропускания экрана, а облучению в высокой дозе подвергаются только микроучастки кожи в зоне отверстий экрана. Благодаря тому, что УФ облученные микроучастки расположены близко друг к другу и микроэритемы не имеют четкой границы, покраснение выглядит равномерным. Но кинетика развития слабого покраснения при микрофракционном УФ-В облучении соответствует кинетике эритемы, полученной при УФ-В облучении в большой дозе (отсутствует быстрая компонента эритемы). Микрофракционное облучение можно проводить, сканируя участок ткани сфокусированным лучом импульсного лазера в сравнении с облучением этим же лазером, но при расфокусированном луче. При интенсивностях лазерного излучения выше 10 Вт/м следует учитывать нелинейные эффекты (вероятность двухфотонного поглощения). При сравнении кинетики УФ-В эритемы от большой дозы облучения (по сравнению с облучением в малой дозе) следует использовать именно микрофракционное облучение, т.к. такое воздействие, травмирует облучаемую поверхность в значительно меньшей степени. Так как фотопродукты при микрофракционном облучении соответствуют облучению в большой дозе, в то время как средняя лучевая нагрузка мала, данную методику можно рекомендовать и при многих терапевтических воздействиях.
Пример
При излучении механизма УФ индуцированного эритемогена были  проведены исследования фотоэритемы кроликов с лейкопенией (девятикратное снижение количества лейкоцитов на третий день после инъекции ципролоксацина), изучено действие аппликации антиоксиданта на эритему кроликов, вызванную внутрикожной инъекцией фито-геммагглютинина, и выявлены особенности эритемогенеза для пациентов отделения осложненной травмы в сравнении с эритемогенезом практически здоровых людей, что позволяет установить связь параметров фотоэритемы с особенностями иммунной системы человека с целью эритемодиагностики нарушения функций иммунитета.
Также было проведено исследование для группы кроликов (20 животных) зависимости параметров НЭД и k от интенсивности облучения ртутно-кварцевой лампой ПРК-2, причем интенсивность облучения изменялась на 4 порядка - время облучения эритемогенными дозами УФ изменялось от десятых долей до тысяч секунд. Установлено, что при дозах УФ вблизи НЭД интенсивность облучения (в соответствии с известными данными) не влияла на его эритемогенность, в то время как при больших дозах УФИ эритемогенность возрастала пропорционально интенсивности УФ облучения, что количественно выражалось в возрастании k от 2,5±0,3 до 5,4±0,5 при увеличении интенсивности УФИ в 10000 раз. Данная особенность эритемогенеза может быть объяснена только эффективностью работы внутриклеточных репарационных систем и, таким образом, исследование эритемогенности кожи (и других органов) при различных интенсивностях УФО может позволить проводить количественную оценку эффективности систем внутриклеточной репарации УФ поврежденных клеток.
Установлена возможность усиления фотоэритемы аппликацией антиоксиданта на ранних (до 8 часов) этапах ее развития и найден механизм (немонотонная дозовая зависимость «быстрой» эритемы), объясняющий «парадоксальное» действие антиоксидантов. Перспективным является подробное исследование быстрой эритемы, являющейся проявлением провоспалительного апоптоза, индуцированного УФИ, которая хорошо воспроизводится при УФ-В облучении дозами вблизи НЭД. Наиболее удобный способ наблюдения быстрой эритемы - исследование УФ-В эритемы, полученной с применением обычного облучения, в сравнении с кинетикой эритемы, полученной с использованием микрофракционного облучения при одинаковой (средней по облученной площади) дозе вблизи НЭД. Диапазон доз УФ-В облучения, в пределах которых проявляется быстрая эритема, характеризует процессы запуска и инактивации апоптоза.
Предлагаемая методика также позволяет измерить эффективность апоптоз-модулирующих препаратов, в том числе системного действия, и оценить активность системы апоптоза как для других (не только для кожи) органов и тканей, так и для всего организма.