СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДНК-ГИДРОЛИЗУЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ МОЛЕКУЛ И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
METHOD OF DETERMINING DNA-HYDROLYSING ACTIVITY OF MOLECULES AND DEVICE FOR ITS REALISATION

Предлагаемое изобретение относится к области физики и может быть использовано для анализа материалов с помощью биохимических электродов.
ДНК-гидролизующие молекулы - молекулы, способные расщеплять высокомолекулярную дезоксирибонуклеиновую кислоту (далее по тексту - ДНК) на фрагменты. Расщепление ДНК нарушает ее первичную структуру и приводит к развитию заболеваний у живых организмов. Важными ДНК-гидролизующими молекулами являются ферменты: ДНКазы, ДНК-гидролизующие антитела (абзимы), фосфодиэстеразы, которые содержатся в крови и других физиологических жидкостях. Активность этих ферментов изменяется при патологии, поэтому активность этих ферментов служит важным показателем состояния здоровья человека. Отклонение ДНК-гидролизующей активности ферментов от нормы свидетельствует о наличии, степени и течении заболевания [1].
Известен способ оценки активности ДНК-гидролизующих ферментов [2], основанный на спектрофотометрическом определении продуктов гидролиза ДНК - по увеличению оптического поглощения ее (ДНК) раствора. Недостатками способа [2] являются низкая чувствительность, из-за чего невозможно определение слабой степени гидролиза ДНК, а также низкая специфичность вследствие мешающего влияния белков на спектрофотометрическое определение ДНК. Из-за -этих недостатков способ [2] обладает низкой разрешающей способностью.
По содержанию к предлагаемому изобретению наиболее близок известный способ оценки ДНК-гидролизующей активности антител к ДНК [3], используемый, в том числе, для диагностики аутоиммунных заболеваний. Способ прототип-[3] основан на электрофоретическом анализе в теле продуктов гидролиза ДНК, различающихся по молекулярной массе. Недостатками известного способа [3] являются трудоемкость и значительная продолжительность электрофоретического анализа, низкая чувствительность, сложность количественного определения ДНК-гидролнзующей активности, а также необходимость использования большого перечня реактивов и материалов, например буферных растворов сложного состава, гелей, токсичных красителей.
Целью предлагаемого изобретения является упрощение и сокращение продолжительности определения ДНК-гидролизующей активности молекул, повышение избирательности, чувствительности, повышение производительности труда при анализе, повышение достоверности и точности результатов, уменьшение стоимости анализа.
Цель достигают тем, что ДНК-гидролизующую активность молекул определяют электрохимически, адсорбируя реакционную смесь, состоящую из ДНК и ДНК-гидролизующих молекул, на рабочем электроде, модифицированном углеродными наноматериалами, регистрируя и сравнивая величины сигналов окисления ДНК в составе реакционной смеси до выдерживания реакционной смеси на рабочем электроде (контроль) и после выдерживания реакционной смеси (опыт). Увеличение сигнала окисления ДНК свидетельствует о наличии ДНК-гидролизующей активности у молекул. ДНК-гидролизующую активность молекул определяют в составе биологических материалов. ДНК-гидролизующую активность определяют у молекул, выделенных из биологических материалов. ДНК-гидролизующую активность определяют у небиологических молекул. Для электрохимического определения активности ДНК-гидролизующих молекул используют электрохимический анализатор, содержащий электрохимическую ячейку с рабочим электродом, модифицированным углеродными наноматериалами, противоэлектродом и электродом сравнения, погруженными в электролит и соединенными с регистрирующим устройством. Используют электрод, модифицированный нанотрубками. Используют электрод, модифицированный нановолокнами. Используют электрод, модифицированный наноконусами.
Предлагаемое изобретение реализуют, например, следующим образом. Используют электрохимический анализатор, блок-схема которого показана на фиг.1, где 1 - регистрирующее устройство, например потенциостат; 2 электрохимическая ячейка, содержащая электролит 3, например фосфатно-солевой буферный раствор; 4 - электрод сравнения, например хлоридсеребряный; 5 - противоэлектрод, например никелевый; 6 - рабочий электрод, например стеклоуглеродный, модифицированный, например, углеродными нанотрубками. Электроды 4, 5, 6 электрохимической ячейки 2 погружены в электролит 3 и соединены, например электропроводами с регистрирующим устройством 1.
До начала измерения из стандартного электрода (на фиг.1 не показан), например стеклоуглеродного, изготавливают рабочий электрод 6. Для этого стандартный электрод модифицируют, например, многослойными углеродными нанотрубками (далее по тексту - УНТ), подвергнутыми химическому окислению, например, в смеси азотной и серной кислот. Для модификации рабочую поверхность стандартного электрода покрывают, например, с помощью автоматической пипетки суспензией УНТ и удаляют растворитель, например, высушиванием суспензии на воздухе. Таким образом завершают изготовление рабочего электрода 6.
Для определения активности ДНК-гидролизующих ферментов используют субстрат - высокомолекулярную ДНК. ДНК растворяют в фосфатно-солевом буферном растворе до концентрации (ДНК) 1 мг/мл. Далее туда (в раствор ДНК в буфере) добавляют раствор ДНК-гидролизующего фермента, активность которого необходимо определить, и получают реакционную смесь. Реакционную смесь выдерживают, например, 1 ч при 37°С. Таким путем осуществляют гидролиз ДНК.
Далее рабочий электрод 6 погружают в реакционную смесь и выдерживают в контакте с реакционной смесью, например, в течение 1 мин. Это приводит к адсорбции ДНК и продуктов ее гидролиза на рабочем электроде 6. Далее рабочий электрод 6 с адсорбированной ДНК переносят в электрохимическую ячейку 2, например трехэлектродную, с электролитом 3, не содержащим электроактивных веществ, то есть веществ, не окисляющихся и не восстанавливающихся на электроде под действием потенциала. Ячейку 2 подсоединяют к регистрирующему устройству 1, например потенциостату, и при потенциале +1 В регистрируют величину тока окисления (далее по тексту - сигнала) ДНК, адсорбированной на рабочем электроде 6.
Наличие и степень ДНК-гидролизующей активности фермента в реакционной смеси определяют путем сравнения величин регистрируемых сигналов до выдерживания реакционной смеси (контроль) и после выдерживания (опыт). Разность между сигналом ДНК в опыте и сигналом ДНК в контроле является количественной мерой ДНК-гидролизующей активности реакционной смеси и, следовательно, активности исследуемого ДНК-гидролизующего фермента.
С использованием стандартных растворов ДНК-гидролизующего фермента с известной активностью (концентрацией) строят калибровочный график зависимости регистрируемого сигнала от ДНК-гидролизующей активности фермента, по которому определяют ДНК-гидролиэующую активность исследуемого фермента. Указанным образом определяют ДНК-гидролизующую активность ферментов как в составе биологических материалов, так и выделенных из них (биологических материалов),
Осуществление предлагаемого способа приведенным примером не ограничивается. Например, в зависимости от потребности и цели исследования используют стандартные электроды, изготовленные из различных материалов, например металлов, полупроводников, полимеров, композитов. Модификацию стандартного электрода выполняют с использованием различных материалов, например однослойных и/или многослойных углеродных нанотрубок, нановолокон, наноконусов, нанопластин, фуллеренов. Для модификации электрода используют нанотрубки, подготовленные способами, отличными от приведенного примера, например, окислением в атмосфере кислорода, озона, суспендированием в присутствии поверхностно-активных веществ. Измерения проводят с помощью различных, в том числе известных, средств измерения тока, например полярографов.
Предлагаемый способ позволяет определять ДНК-гидролизующую активность очищенных ферментов, например ДНКаз, абзимов, фосфодиэстераз, а также цельных физиологических жидкостей, например слюны, слезной жидкости, сыворотки и плазмы крови, лимфы, пота, спермы. С помощью предлагаемого способа определяют ДНК-гидролизующую активность молекул небиологического происхождения, например загрязнителей окружающей среды, генотоксических ксенобиотиков и антибиотиков.
В основе предлагаемого изобретения лежит использование явления зависимости производимого ДНК электрохимического сигнала окисления от молекулярной массы (линейного размера) ДНК.
Авторами установлено, что низкомолекулярные фрагменты ДНК на рабочем электроде производят больший сигнал, чем высокомолекулярная ДНК, а относительное увеличение сигнала прямо пропорционально изменению молекулярной массы (размера) ДНК. Это объясняет схема, представленная на фиг.2; где 1 - поверхность электрода, модифицированного наноматериалами, например УНТ; 2 - ДНК до (А) и после (Б) гидролиза. Поскольку ДНК окисляется на электроде в адсорбированном состоянии, то уменьшение размера ДНК в результате гидролиза приводит к увеличению количества точек адсорбции ДНК на электроде, что сопровождается увеличением сигнала ДНК. Таким образом, предлагаемый способ позволяет зафиксировать даже небольшие значения ДНК-гидролизующей активности, не определяемые прототипом. Этим подтверждается факт существенного увеличения чувствительности предлагаемого способа по сравнению с прототипом. Кроме того, при применении предлагаемого способа для определения ДНК-гидролизующей активности на сигнал не влияет (то есть не вносит помехи и не искажает сигнал) присутствие белков в реакционной смеси. Этим обеспечиваются высокие избирательность, разрешающая способность и чувствительность предлагаемого способа по сравнению с прототипом и другими известными способами.
Примеры применения способа
1. Определение ДНК-гидролизующей активности молекул небиологической природы с помощью заявленного изобретения.
С помощью заявленного изобретения оценена ДНК-гидролизующая активность молекул небиологической природы - активных форм кислорода (АФК), полученных химически в реакции Фентона [4]:
2+
+
3+
-
2
2
Fe+НO+H→Fе+ОН+•OН
АФК генерировали в 0.01 М натрийфосфатном буферном растворе (рН 6,5), содержащем сульфат железа (II), ЭДТА и пероксид водорода до конечных концентраций 20 мкМ, 40 мкМ и 100 мкМ соответственно. Реактив предварительно выдерживали 15 мин при комнатной температуре.
Образовавшиеся АФК (•ОН) инкубировали с нативной ДНК эритроцитов цыплят в течение 15 мин. Электрохимический сигнал окисления ДНК регистрировали до (контроль, пунктирная линия, фиг.3) и после (сплошная линия, фиг.3) выдерживания ДНК с АФК (опыт). После обработки сигнал окисления ДНК увеличивается (фиг.3), так как АФК вызывают расщепление (гидролиз) ДНК [1].
Подобным образом оценивают ДНК-гидролизующую активность любых небиологических молекул, поскольку действие ДНК-гидролизующих молекул приводит к расщеплению ДНК, а с помощью заявленного изобретения можно детектировать даже небольшие изменения в размере молекул ДНК.
2. С помощью заявленного способа определена ДНК-гидролизующая активность молекул в составе сыворотки крови. Известно, что ДНК-гидролизующая активность крови обусловлена работой ферментов - ДНКаз, антител к ДНК и фосфодиэстераз [1]. Исследованы электрохимические свойства компонентов крови, способных оказать мешающее влияние на определение ДНК. Установлено, что сыворотка крови производит пик окисления при потенциале около +0.8 В. Пик обусловлен адсорбцией и окислением сывороточных белков и, вероятно, небелковых компонентов крови. При потенциале окисления ДНК (+1,0 В) сыворотка не окисляется, что позволяет определять ДНК и продукты ее гидролиза в присутствии сыворотки крови.
Отсутствие пиков компонентов крови при потенциале +1,0 В также свидетельствует об отсутствии помех для анализа расщепления ДНК со стороны внеклеточной ДНК крови. Это связано с тем, что концентрация внеклеточной ДНК в крови и других биологических жидкостях обычно менее 60 нг/мл [5]. В такой концентрации внеклеточная ДНК не может оказывать мешающего влияния на анализ используемой в качестве ДНК (концентрация около 0,5 мг/мл).
Обнаружено (фиг.4), что белки крови блокируют поверхность сенсора, что затрудняет диффузию нативной (высокомолекулярной) ДНК к электроду и ее последующее определение (пунктирная линия, фиг.4). После расщепления ДНК сывороткой крови фрагменты ДНК проникают через слой адсорбированных на электроде белков, генерируя сигнал окисления (сплошная линия, фиг.4). При этом сигнал прямо пропорционален степени расщепления ДНК. В качестве примера показана электрофореграмма проб нативной ДНК и ДНК после гидролиза сывороткой крови (фиг.5), а также величина тока окисления этих же проб ДНК на электроде, модифицированном углеродными нанотрубками.
Результаты (фиг.3, 4, 5) демонстрируют высокую селективность заявленного способа. Благодаря высокой селективности способ позволяет определять ДНК-гидролизующую активность крови даже на фоне высоких концентраций мешающих компонентов. Установлено, что другие более простые по составу биологические жидкости, например слюна и моча, также не производят сигнал при потенциале окисления ДНК на электроде, модифицированном углеродными нанотрубками. Это однозначно свидетельствует о применимости способа для анализа ДНК-гидролиэующей активности любых известных биологических материалов, например крови, мочи, слюны.
3. Предлагаемое изобретение применено для определения активности фермента ДНКазы I. С помощью предлагаемого способа авторами установлено, что расщепление ДНК под действием ДНКазы I сопровождается увеличением сигнала окисления ДНК (I, µА) во времени (t, мин) (фиг.6). При этом сигнал линейно зависит от времени ДНКазной реакции (степени гидролиза ДНК) и, следовательно, от активности ДНКазы I в растворе. Это позволяет по величине сигнала проводить количественное определение активности ДНКазы I и других ДНК-гидролизующих молекул с существенно более высокой достоверностью, чем при использовании прототипа,
Преимуществами предложенного способа по сравнению с прототипом являются также существенно меньшие трудоемкость и скорость измерения (продолжительность анализа по предлагаемому способу - 10 мин, по прототипу - около 120 мин), большая избирательность и чувствительность, отсутствие необходимости использования дорогостоящих материалов и токсичных красителей.
Полученные с использованием предлагаемого изобретения данные применимы в различных областях деятельности, например в медицине, фармакологии, ветеринарии, а также в фундаментальных научных исследованиях.
Предложенный способ адаптируют и применяют для получения различных технических решений, например для создания одноразовых тестов на основе тест-полосок, используемых, например, в медицине, фармакологии, ветеринарии для диагностики и прогнозирования течения заболеваний человека и животных.
Техническим результатом изобретения является простота и доступность осуществления способа, его высокая чувствительность, избирательность, быстрота определения ДНК-гидролизующей активности молекул то есть увеличение достоверности и точности результатов, сопровождающееся повышением производительности и качества труда.
Предлагаемое изобретение удовлетворяет критериям новизны, так как при определении уровня техники не обнаружено средство, которому присущи признаки, идентичные (совпадающие по исполняемой ими функции и форме выполнения этих признаков) всем признакам, перечисленным в формуле изобретения, включая характеристику назначения.
Способ оценки ДНК-гидролизующей активности молекул имеет изобретательский уровень, поскольку не выявлены технические решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками данного изобретения, и не установлена известность влияния отличительных признаков на указанный технический результат.
Заявленное техническое решение можно реализовать в промышленном производстве диагностического оборудования, в деятельности организаций здравоохранения и животноводства, экологических организаций и посредством использования стандартных технических устройств и оборудования. Это соответствует критерию «промышленная применимость», предъявляемому к изобретениям.
Использованные источники
1. А.Г.Барановский, В.Н.Буиева, Г.А.Невинский. Биохимия. 2004. Т. 69. вып.6. С.723-741.
2. L.Ripoll', P.Reinert et al. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 1996, V.37. P.987-991
3. Реферат к описанию изобретения по заявке №2006130509 на получение Патента РФ.
4. Cadet, J, Hydroxyl radicals and DNA base damage / J. Cadet, T.Delatour, T.Douki [et al.] // Mutat. Res. - 1999. - V.424. - P.9-21.
5. Tamkovich, S.N. Circulating DNA in the blood and its application in medical diagnosis / S.N.Tamkovich, V.V.Vlassov, P.P.Laktionov // Molecular Biology. - 2008. - V.42. - №1. - P.9-19.