СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВОДОРАСТВОРИМОГО ПОЛИПЕПТИДНОГО КОМПЛЕКСА ИЗ ПЕЧЕНИ РЫБ ЛОСОСЕВЫХ ПОРОД
METHOD FOR PRODUCTION OF WATER-SOLUBLE POLYPEPTIDE COMPLEX OF SALMON FISHES LIVER

Изобретение относится к пищевой промышленности, а именно к способам получения биологически активных добавок (БАД) из субпродуктов животного происхождения, в частности к получению БАД на основе водорастворимых белков печени лососевых рыб, обладающих сбалансированным аминокислотным составом, повышенным содержанием таурина и высокой антиоксидантной активностью.
В мировой практике имеется множество примеров обнаружения и выделения из печени водных организмов различных биологически активных веществ. Так, в печени и других органах японской камбалы Paralichtys olivaceus был обнаружен богатый цистеином пептид, проявляющий высокую антимикробиальную активность и получивший название гепсидин (Hirono I. et al., 2005). В печени атлантического лосося Salmo salar найдены и локализованы клетки, вырабатывающие эстроген и ксеноэстроген (Arukwe A. et al., 1999), из этого же объекта был выделен белок, обладающий антимикробным действием (Richards R.C., 2001). Таким образом, печень различных рыб может служить источником большого количества как низкомолекулярных веществ, так и целого набора ферментов, которые можно применять как для изготовления биологически активных пищевых добавок комплексного действия, так и высокоочищенных препаратов, применимых в качестве реагентов для научных исследований и имеющих весьма высокую стоимость.
Одним из массовых объектов морского промысла на Дальнем Востоке являются лососи. Печень лососей составляет от 1,2 до 3% массы отходов (Бассейновые нормы отходов, потерь, выхода готовой продукции и расходы сырья при производстве продукции из рыб Дальнего Востока. - М., 2007).
В качестве пищевого сырья печень лососей прошла государственную стандартизацию, однако, использование ее в пищевой промышленности для приготовления продукции, аналогичной продукции, получаемой из печени трески и минтая, препятствует трудность отделения желчного пузыря, придающего печени лососей горький привкус.
Известен способ получения ингибитора протеиназ «Ингипрол» (Россия, 2197252 С1, кл. 7 А61К 35/12, 2003), включающий измельчение и гомогенизацию органов крупного рогатого скота, экстракцию в кислой среде, отделение жмыха и последующую очистку целевого продукта высаливанием из экстракта с помощью хлорида натрия, осаждением примесных белков трихлоруксусной кислотой, катионообменной хроматографией, осаждением ацетоном и стерилизующей фильтрацией раствора, при этом после отделения жмыха к супернатанту добавляют хитозан для сорбции на нем отрицательно заряженных белков и углеводов, осветленный экстракт концентрируют ультрафильтрацией на полых волокнах с лимитом пропускания 5 кДа, элюат, полученный после хроматографической очистки на карбоксиметилцеллюлозе, обрабатывают 1%-ным раствором фенола, осадок удаляют. А из супернатанта дважды осаждают целевой продукт ацетоном с последующим растворением осадка в 0,9 М растворе хлорида натрия до концентрации 0,9-1,1 мг/мл.
Недостатком этого способа является большое количество рабочих стадий, применение хроматографии и ультрафильтрации, что не позволяет использовать данный способ для получения конечного продукта в промышленных масштабах, а также применение на конечной стадии пожароопасного органического растворителя.
Известен способ получения водорастворимого комплекса полипептидов из печени рыб, а именно из печени акулы, применяемого в качестве иммуностимулятора (США, 5840342 А, кл. А61К 35/407, 1998), включающий охлаждение печени акулы до 0°С; распыление охлажденной печени акулы для получения тщательно измельченного материала; смешивание тщательно измельченного материала с равным количеством воды при условии поддерживания в смеси температуры 0°С в течение 20 мин; центрифугирование смеси при 0-4°С в течение 4-6 ч для разделения смеси на три различных слоя, представляющих собой клеточный слой, водный слой и масляный слой; отделение водного слоя от других слоев; фильтрование водного слоя с целью получения профильтрованного раствора; и распыление профильтрованного раствора в вакуумной камере при 0-4°С с целью получения сухого порошкообразного вещества.
Однако оборудование для высокоскоростного центрифугирования в течение нескольких часов является настолько дорогостоящим, что применить его для производства продукции в промышленных масштабах вряд ли представляется возможным.
Известен способ получения лекарственного препарата «Скваакан» - комплекса полипептидов из печени рыб, а именно из печени акулы (Россия, 2211700 С2, кл. 7 А61К 35/60, 2003), заключающийся в том, что печень акулы катран гомогенизируют, обезжиривают путем холодного отстоя при 1-+5°С в течение 20-24 часов, затем обезжиренный гомогенат направляют на термическую и химическую коагуляцию белков при рН 1,0-6,0, оттаивают при комнатной температуре в течение 5-6 ч с получением стабилизированного экстракта, который после центрифугирования и мембранной фильтрации ампулируют и автоклавируют.
Недостатком данного метода является большая продолжительность процесса и использование для осветления конечного экстракта центрифуг и мембранного оборудования, не позволяющего обрабатывать большие объемы экстракта.
Известен способ получения комплекса полипептидов из рыб, применяемого в качестве иммуностимулятора (Россия, 2137390 С1, кл. 7 А23J 1/04, А23L 1/326), при этом в качестве сырья используют промывные воды рыбоперерабатывающих предприятий, которые бедны по аминокислотному составу и поэтому для получения иммуномодулирующего эффекта в конечный продукт добавляют хитозан.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту является способ получения белкового концентрата из морских объектов животного происхождения (СССР, №772518, Кл. А23J 1/04, 1980), где в качестве сырья используются любые отходы рыбной промышленности, включая внутренности целиком, а процесс включает водную экстракцию в сильнощелочной среде, нейтрализацию минеральной кислотой с высаждением липид-белкового комплекса и дальнейшую обработку этого комплекса смесью этилового спирта и галоидорганического растворителя.
В результате этого процесса в качестве конечного продукта получаются деградированные фрагменты нативных белков в широком диапазоне молекулярных масс, кроме того, применение органических растворителей плохо соответствует современным требованиям охраны труда и создает повышенную пожароопасность на производстве.
Задачей изобретения является промышленная переработка печени рыб лососевых пород с получением водорастворимого полипептидного комплекса, обладающих сбалансированным аминокислотным составом с повышенным содержанием таурина и высокой антиоксидантной активностью.
Задача изобретения решается тем, что в предлагаемом способе получения водорастворимого полипептидного комплекса из печени рыб лососевых пород, включающем измельчение исходного сырья, экстракцию, отделение твердой фракции, очистку целевого продукта и его сушку, согласно изобретению в качестве исходного сырья используют печень рыб лососевых пород, экстракцию проводят дистиллированной водой при соотношении сырье:экстрагент 1:5-1:30 с последующим подщелачиванием суспензии до рН 8-9 и настаиванием ее при комнатной температуре в течение 2-4 часов с перемешиванием, очистку целевого продукта осуществляют путем обработки жидкой фракции 0.3% раствором хитозана в 3% растворе пищевой органической кислоты при рН 2,5-3,0 в соотношении 1:20 с перемешиванием в течение 1 часа и последующим инкубированием смеси в течение 2-3 часов и двойным разделением путем сепарирования на твердую и жидкую фракции с последующим соединением жидких фракций.
Причем печень рыб лососевых пород используют в качестве сырья в свежем, мороженном или сухом виде.
Получают продукт, на 40 и более процентов состоящий из белково-пептидного материала. При проведении электрофореза в полиакриламидном геле выяснилось, что из большого спектра белков и полипептидов, присутствующих в водном экстракте печени лососей, в конечном продукте после обработки хитозаном остаются две полипептидные фракции с молекулярной массой 30 и 60 кДа и низкомолекулярная фракция, куда входят мелкие пептиды и свободные аминокислоты. Среди последних особенно много весьма ценной для человека и других теплокровных позвоночных сульфоаминокислоты таурина (около 30 мг/г продукта). В полученных образцах проводили определение антиоксидантной активности по методу Глевинда с использованием стабильного свободного радикала α-дифенил-α-пикрилгидразина в качестве субстрата. В качестве антиоксиданта сравнения использовался дипептид карнозин (антиоксидант средней силы). Было показано, что антиокислительная активность образцов, полученных из цельной мороженой и сублимированной печени горбуши, соответственно в 6,5 и 4,9 раз выше активности карнозина. При этом активность водного экстракта, полученного из мороженой печени горбуши без обработки хитозаном, составляет всего 90% от активности карнозина.
Поиск по патентным и научно-техническим источникам не выявил известного способа, совпадающего с совокупностью существенных признаков заявляемого способа, в связи с чем можно сделать вывод, что предлагаемое техническое решение соответствует критериям изобретения «новизна» и «изобретательский уровень».
Существенными отличительными признаками заявляемого способа по сравнению с прототипом являются:
1. в качестве исходного сырья используют: свежую, мороженую или сухую печень рыб лососевых пород, как правило, для пищевых целей.
2. экстракцию сырья проводят дистиллированной водой при соотношении сырье:экстрагент 1:5 -1:30 с последующим подщелачиванием суспензии до рН 8-9 и настаиванием ее при комнатной температуре в течение 2-4 часов с перемешиванием. Экспериментальным путем было установлено, при таком рН соотношении сырье :экстрагент и времени воздействия на сырье белково-пептидный материал экстрагируется наиболее полно.
3. очистку целевого продукта осуществляют путем обработки жидкой фракции 0.3% раствором хитозана в 3% растворе пищевой органической кислоты при рН 2,5-3,0 в соотношении 1:20 с последующим перемешиванием смеси в течение 1 часа и инкубированием в течение 2-3 часов. Эта операция позволяет полностью избавить экстракт от липидного материала и высокомолекулярных белков, при этом минеральные реактивы не применяются. Кроме того, обработка хитозаном полностью избавляет экстракт от характерного (неприятного) запаха, присущего внутренностям рыб.
Предлагаемое техническое решение соответствует критерию «промышленное применение», так как использование свежего и мороженого или сухого сырья позволяет организовать производство водорастворимого полипептидного комплекса на любом рыбоперерабатывающем производстве, в том числе, находящемся в удалении от места промысла.
Сущность способа заключается в следующем. Свежую или замороженную печень рыб лососевой породы (горбуша, кета, чавыча и т.п.) измельчают на куттере или электромясорубке. Как показали предварительные опыты, более тщательное измельчение с разрушением клеток не требуется. Высушенную печень измельчать нет необходимости, поскольку она измельчается перед сушкой. Фарш свежей или замороженной печени или раздробленные кусочки сушеной печени заливаются водой в соотношении 1:5 для свежей или замороженной печени и 1:30 в случае сублимированной печени. Затем полученную суспензию подщелачивают гидроокисью натрия до слабощелочного рН (8-9).
Экспериментальным путем было установлено, что при таком рН (8-9) белково-пептидный материал из свежей или замороженной печени экстрагируется наиболее полно (фиг.1-3).
При использовании сушеной печени было установлено, что при подщелачивании экстрагента увеличения выхода белково-пептидного материала не достигается. В этом случае добавление раствора гидроокиси натрия для достижения щелочного рН целесообразно проводить непосредственно перед обработкой жидкой фракции раствором хитозана, поскольку формирование хитозанового осадка происходит только в щелочной среде.
Суспензию инкубируют с перемешиванием около 4 часов, затем отделяют осадок, что целесообразно проводить на промышленном сепараторе или проточной центрифуге непрерывного действия - это позволяет обработать весьма большие объемы суспензии. Применение центрифуг с роторной загрузкой такой возможности не дает, фильтрование под вакуумом также требует большого времени, поскольку любой фильтровальный материал быстро забивается мелкими и жирными частичками суспензии. Получившаяся твердая фракция может быть использована для изготовления тука, а к жидкой фракции добавляют 1/20 объема 0,3% раствора хитозана в 3% уксусной кислоте, рН 2,5. В течение одного часа смесь перемешивали и оставляли на 2-3 часа для формирования осадка. Надосадочную жидкость декантировали, а выпавшую суспензию снова разделяли на сепараторе или проточной центрифуге. Хитозановый осадок может быть направлен на дальнейшую переработку для извлечения белков и липидов, имеющих самостоятельную ценность. Полученный фильтрат объединяли с отобранной ранее надосадочной жидкостью и высушивали тем или иным способом, за исключением высокотемпературного выпаривания. Проведенные опыты показали, что лучше всего для этого подходит распылительная сушка циклонного типа. Сублимационная сушка позволяет получить препарат в еще более мягких условиях, но в настоящее время все известные образцы такого оборудования имеют ограничения по загрузке.
Таким образом, при наличии емкостей соответствующего объема за одну рабочую смену может быть переработано от 100 до 200 кг свежей или замороженной печени рыб лососевых пород, либо соответственно до 20 кг сушеной печени. При этом выход готового продукта составляет примерно 0,5% от исходной массы свежей или мороженой печени либо 5% от исходной массы сушеной печени.
Конечный продукт представляет собой порошок коричневого цвета, не гигроскопичный, с солоноватым привкусом и не обладающий неприятным запахом. Он не содержит тяжелых или токсичных элементов в количествах, превышающих ПДК и патогенной микрофлоры, т.е. соответствует показателям безопасности. Продукт на 40 или более процентов состоит из белково-пептидного материала. При проведении электрофореза в полиакриламидном геле выяснилось, что из большого спектра белков и полипептидов, присутствующих в водном экстракте печени лососей, в конечном продукте после обработки хитозаном остаются две полипептидные фракции с молекулярной массой 30 и 60 кДа и низкомолекулярная фракция, куда входят мелкие пептиды и свободные аминокислоты. Среди последних особенно много весьма ценного для человека и других теплокровных позвоночных сульфоаминокислоты таурина (табл.).
В полученных образцах проводили определение антиоксидантной активности по методу Глевинда с использованием стабильного свободного радикала α-дифенил-α-пикрилгидразина в качестве субстрата. В качестве антиоксиданта сравнения использовался дипептид карнозин (антиоксидант средней силы). Было показано, что антиокислительная активность образцов, полученных из цельной мороженой и сублимированной печени горбуши, соответственно в 6,5 и 4,9 раз выше активности карнозина. При этом активность водного экстракта, полученного из мороженой печени горбуши без обработки хитозаном, составляет всего 90% от активности карнозина.
ПРИМЕР 1
Отбирали 10 кг свежей печени горбуши, измельчали ее с помощью электромясорубки, после чего фарш помещали в емкость и заливали 50 л дистиллированной воды, перемешивали и доводили рН полученной суспензии 1 М раствором гидроокиси натрия до рН 8-9, затем оставляли при комнатной температуре на 4 часа при перемешивании. Полученную суспензию разделяли на сепараторе (56 тарелок). Твердую фракцию направляли на изготовление кормовой муки, жидкую фракцию - на дальнейшую очистку, для чего ее снова помещали в сосуд с мешалкой и добавляли 3 л 0,3% раствора хитозана в 3% уксусной кислоте, рН 2,5. В течение одного часа смесь перемешивали, затем перемешивание прекращали и оставляли в сосуде на 3 часа для формирования осадка. Надосадочную жидкость декантировали. Полученный влажный осадок снова разделяли на сепараторе на твердую и жидкую фракции. Последнюю объединяли с отобранной ранее надосадочной жидкостью и высушивали на распылительной сушке циклонного типа. В результате получено 45 г сухого продукта.
Конечный продукт представляет собой порошок коричневого цвета, не гигроскопичный, с солоноватым привкусом и не обладающий неприятным запахом. Он не содержит тяжелых или токсичных элементов в количествах, превышающих ПДК и патогенной микрофлоры, т.е. соответствует показателям безопасности.
ПРИМЕР 2
Отбирали 12 кг замороженной печени кеты, оттаивали ее и измельчали с помощью волчкового куттера, после чего фарш помещали в емкость с мешалкой и заливали 60 л дистиллированной воды, перемешивали и доводили рН полученной суспензии 1 М раствором гидроокиси натрия до рН 8-9, затем оставляли при комнатной температуре на 4 часа при перемешивании. Затем разделяли суспензию на центрифуге при 2500-3000 об/мин и длительностью центрифугирования для одной загрузки 25-30 мин при температуре 10°С, осадок направляли на изготовление кормовой муки, супернатант (жидкую фракцию) направляли на дальнейшую очистку, для чего его снова помещали в сосуд с мешалкой и добавляли 3,5 л 0,3% раствора хитозана в 3% уксусной кислоте, рН 2,5. В течение одного часа смесь перемешивали, затем перемешивание прекращали и оставляли на 2 часа для формирования осадка. Надосадочную жидкость декантировали; полученный влажный осадок снова разделяли на центрифуге на твердую и жидкую фракции при тех же условиях. Полученный супернатант объединяли с отобранной ранее надосадочной жидкостью и высушивали на сублимационной сушке. В результате получено 50 г сухого препарата.
Конечный продукт представляет собой порошок коричневого цвета, не гигроскопичный, с солоноватым привкусом и не обладающий неприятным запахом. Он не содержит тяжелых или токсичных элементов в количествах, превышающих ПДК и патогенной микрофлоры, т.е. соответствует показателям безопасности.
ПРИМЕР 3
1,5 кг сублимированной печени горбуши помещали ее в емкость с мешалкой, предварительно разбив крупные комки, заливали 45 л дистиллированной воды, запускали перемешивание и оставляли на 4 часа при температуре 15-18°С. Затем разделяли суспензию на сепараторе (56 тарелок), осадок отбрасывали либо направляли на производство кормовой муки. Жидкую фракцию снова помещали в емкость с мешалкой, подщелачивали 1 М гидроокисью натрия до рН 8-9 и добавляли к ней 2,5 л 0,3% раствора хитозана в 3% уксусной кислоте, рН 2,5. Затем запускали перемешивание, которое проводили в течение одного часа, останавливали перемешивание и оставляли на 3 часа для формирования осадка. Надосадочную жидкость декантировали, а отделенный от нее влажный осадок снова разделяли на сепараторе на твердую и жидкую фракции. Последнюю объединяли с отобранной ранее надосадочной жидкостью и высушивали на распылительной сушке циклонного типа. В результате получено 70 г сухого препарата.
Конечный продукт представляет собой порошок коричневого цвета, не гигроскопичный, с солоноватым привкусом и не обладающий неприятным запахом. Он не содержит тяжелых или токсичных элементов в количествах, превышающих ПДК и патогенной микрофлоры, т.е. соответствует показателям безопасности.
ПРИМЕР 4
2 кг сублимированной печени кеты помещали в емкость с мешалкой, предварительно разбив крупные комки, заливали 60 л дистиллированной воды и запускали перемешивание на 4 часа при комнатной температуре. Полученную суспензию разделяли на центрифуге при 2500-3000 об/мин и длительностью центрифугирования для одной загрузки 25-30 мин при температуре 10°С, твердую фракцию отбрасывали либо направляли на производство кормовой муки. Жидкую фракцию снова помещали в емкость с мешалкой, подщелачивали 1 М гидроокисью натрия до рН 8-9 и добавляли к ней 2,5 л 0,3% раствора хитозана в 3% уксусной кислоте, рН 2,5. Затем запускали перемешивание, которое проводили в течение одного часа, останавливали перемешивание и оставляли на 2 часа для формирования осадка. Надосадочную жидкость декантировали, а отделенный от нее влажный осадок снова разделяли на центрифуге на твердую и жидкую фракции. Последнюю объединяли с отобранной ранее надосадочной жидкостью и высушивали на сублимационной сушке. В результате получено 85 г сухого препарата.
Конечный продукт представляет собой порошок коричневого цвета, не гигроскопичный, с солоноватым привкусом и не обладающий неприятным запахом. Он не содержит тяжелых или токсичных элементов в количествах, превышающих ПДК и патогенной микрофлоры, т.е. соответствует показателям безопасности.
Использование предлагаемого способа позволит наладить промышленную переработку печени рыб лососевых пород с получением водорастворимого комплекса полипептидов, обладающих сбалансированным аминокислотным составом с повышенным содержанием таурина и высокой антиоксидантной активностью.