Изучение роли вируса краснухи в формировании врожденных пороков развития методом рт-пцр

Оригинальные статьи

Изучение роли вируса краснухи в формировании врожденных пороков развития методом РТ-ПЦР

Е. М. Малкова, И. П. Терешенко, О. Н. Гришаева, Г. И. Тюнников, И. Я. Извекова, И. А. Петрова, В. С. Петров, М. П. Гришаев, Е. И. Краснова

НИИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ ГОСУДАРСТВЕННОГО НАУЧНОГО ЦЕНТРА ВИРУСОЛОГИИ И БИОТЕХНОЛОГИИ «ВЕКТОР»

Новосибирская государственная медицинская академия

Проведено обследование 38 новорожденных детей с врожденными пороками развития для выявления роли вируса краснухи в этиопатогенезе заболевания с использованием метода РТ-ПЦР. РНК вируса краснухи выделена у 65,8% новорожденных с пороками развития. Клиническая картина у детей с ВПР, инфицированных вирусом краснухи, соответствовала степени деформации жизненно важных органов и систем, а также генерализованной форме внутриутробной инфекции и не имела специфических признаков. При инфицировании плода во время беременности и формировании ВПР не происходит элиминации вируса, а возникает течение хронического инфекционного процесса. Отсутствие специфических признаков врожденной краснушной инфекции требует исследования для обнаружения РНК вируса краснухи всех новорожденных с пороками развития и клиникой генерализованной внутриутробной инфекции.

Ключевые слова: краснуха, новорожденные дети, внутриутробные инфекции, врожденные пороки развития, ПЦР-диаг-ностика

В последние годы наблюдается рост частоты внутриутробных инфекций (ВУИ) у новорожденных детей, связанный с появлением новых, более информативных методов диагностики, расширением спектра изучаемых возбудителей и возрастанием выявляемости заболевания, а также возможным истинным увеличением частоты данной патологии, обусловленным повышенной заболеваемостью женщин детородного возраста [1]. Суммарный показатель распространенности врожденных вирусных инфекций в России равен 518 на 1000 новорожденных [1, 2]. Среди ВУИ краснуха занимает особое место, связанное с высоким уровнем заболеваемости и тяжелыми уродствами при инфицировании беременных женщин [3].

В последние годы в России (в условиях отсутствия производства отечественной противокраснушной вакцины) заболеваемость увеличилась почти в два раза [4]. Существующая тенденция роста числа случаев рождения в России детей с дефектами развития, по всей видимости, не в последнюю очередь связана с заболеваемостью краснухой. Частота выявления вируса краснухи колеблется от 43,3—63,7%, причем отмечается подавляющая роль генерализованной краснушной инфекции в причинах смерти детей первых 7 суток жизни [5].

Относительно легкое течение заболевания, наличие стертых форм, бессимптомного течения, а также высокая контагиозность способствует вовлечению в инфекционный процесс большого количества населения. В России заболеваемость почти повсеместно имеет волнообразный характер и характеризуется периодичностью подъема и спада. Характерно периодическое увеличение заболеваемости в крупных городах: умеренное — каждые 3—5 лет (450—800 на 100 000 населения) и более значительное — каждые 10—12 лет (до 1500— 2000 на 100 000 населения) [4]. Во время крупных эпидемий интенсивно вовлекаются в процесс старшие возрастные группы детей и взрослые [6]. формирование иммунитета к краснухе зависит от плотности населения, степени его миграции, социально-экономиче-

ских условий, а также биологических особенностей штаммов вируса, циркулирующего в стране [7]. При краснухе иммунная прослойка создается менее активно и охватывает значительно меньшую часть чувствительных контингентов, чем при большинстве других вирусных инфекций. Таким образом, среди женщин детородного возраста остается значительное количество неиммунных к данному заболеванию.

Вирус краснухи способен проникать через плаценту и реплицироваться в развивающемся плоде, вызывая врожденные пороки развития (ВПР). Возникающие аномалии развития встречаются в различных сочетаниях и тем самым обуславливают индивидуальные особенности течения врожденной краснухи у каждого конкретного больного [3]. Наиболее часто встречаются пороки сердца, поражение глаз, отсутствие дифференциации кортиевого органа и полукружных каналов и поражение центральной нервной системы [3, 8, 9].

Вероятность возникновения ВПР зависит от сроков беременности при заболевании или контакте с краснухой. Риск внутриутробного заражения вирусом составляет 90% при инфицировании в первые 11 недель беременности, 50% — в течение 11—20 недель и 37% — во второй половине беременности [3]. Частота инфицирования эмбриона снижается во втором и снова возрастает в третьем триместре беременности, что связано с неспецифическими изменениями в плаценте, возникающими на поздних сроках гестации [10]. Цитопатическое воздействие вируса первично направлено на стенки кровеносных сосудов или выстилку сердца и в последующем инфицирование органа и/или ишеми-ческое его повреждение могут инициировать те патологические процессы, которые составят клинику заболевания у данного ребенка. Снижение чувствительности тканей к повреждению во втором триместре беременности связано с развивающимся иммунным ответом плода и наличием материнских 1дС. При этом инфицирование эндотелия и повреждение органов прогрессирует, несмотря на наличие антител [10].

Таблица 1. Результаты обследования детей с пороками развития методом РТ-ПЦР

В настоящее время для постановки диагноза врожденной краснухи используются методы молекулярной диагностики, в частности, полимеразная цепная реакция (ПЦР). Использование ПЦР-диагностики у новорожденных детей не только позволяет уточнять этиологию инфекционных процессов в перинатальном периоде, но и ставит новые проблемы в патологии неонатального периода в целом [11, 12].

Целью настоящего исследования явилось изучение роли вируса краснухи в формировании врожденных пороков развития при использовании молекулярно-биоло-гического метода.

Материалы и методы исследования

Обследовано 38 новорожденных детей с ВПР различных органов и систем, находившихся на лечении в инфекционном отделении патологии новорожденных и недоношенных детей Муниципальной детской больницы № 4 г. Новосибирска. РНК вируса краснухи выделялась из сыворотки крови и мочи новорожденных детей методом обратной транскрипции — полимераз-ной цепной реакции (РТ-ПЦР) с использованием тест-систем «Векто-Рубелла-РНК-ампли-100». Тест-системы разработаны в ГНЦ вирусологии и биотехнологии «Вектор», произведены ЗАО «Вектор-Бест» (Кольцо-во, Новосибирская область).

Опытно-экспериментальные серии тест-системы показали высокую чувствительность и специфичность не менее 98% при исследовании клинических образцов [13].

Среди обследованных детей были выделены следующие группы: I — новорожденные с пороками сердца (дефекты межжелудочковой и межпредсердных перегородок, стеноз легочной артерии, персистирующие фетальные коммуникации) — 18 случаев (47,37%); II — новорожденные с пороками развития опорно-двигательной системы — 5 (13,16%); III — новорожденные с пороками развития нервной системы — 8 (7 детей со спинномозговыми грыжами и 1 ребенок с микроцефалией) (21,05%); IV — 7 новорожденных детей с множественными пороками развития (МПР) (18,42%). Во всех группах наблюдения проведен анализ анамнестических данных и клинического течения заболевания.

Результаты и их обсуждение

Настоящее исследование проводилось в период с 1999 по 2003 гг. и охватывало последствия локальных вспышек краснушной инфекции в 1998— 2000 гг., а также эпидемии краснухи в 2001 году в г. Новосибирске. В структуре ВУИ инфекционного отделения патологии новорожденных и недоношенных детей в 1999 году краснуха составила 20,8%. Этот

показатель, в сравнении с другими внутриутробными инфекциями показывает достаточно высокий уровень инфицированности вирусом краснухи. Удельный вес краснухи в структуре внутриутробной патологии в начале 90-х годов составил 26,9% [5].

Положительные результаты ПЦР были получены у 25 новорожденных (65,8%). В результате проведения РТ-ПЦР РНК вируса краснухи была выделена у детей с ВПС в 31,6% случаев, у детей с пороками ЦНС — в 15,8%, при аномалиях строения опорно-двигательного аппарата — в 7,9% и при МПР — в 10,5% случаев (относительно всех обследованных детей). При анализе отдельных групп больных установлено инфицирование вирусом краснухи в 66,7% у новорожденных детей с ВПС, 75% детей с пороками ЦНС, 60% детей с аномалиями скелета и 57,1% — с МПР (таблица 1).

Возраст матерей, родивших детей с ВПР, выделивших РНК вируса краснухи, не превышал 35 лет. Средний возраст составил 25,3 + 2,77 лет. Первобере-менные в группе матерей детей с ВНР составили 44% (11 случаев), имеющих 3 и более беременностей в анамнезе составили 28% (7 случаев). Первые роды отмечались в 18 наблюдениях (72%), вторые в 2 (8%) и имеющие 3 и более родов в анамнезе — 3 (12%).

В ходе исследования анализировали соматический и акушерско-гинекологический анамнез, характер течения беременности и родов, состояние детей при рождении и в неонатальный период. У 14 матерей, дети которых выделили РНК вируса краснухи, был отягощен соматический анамнез (56%). Отягощенный акушер-ско-гинекологический анамнез имелся у 10 (40%) женщин: у 1 женщины — в анамнезе медицинские аборты (4%) и у 9 — гинекологические заболевания (36%).

ВУИ, в том числе и вирусной этиологии являются одной из ведущих причин самопроизвольного прерывания беременности, преждевременных родов, перинатальной и младенческой смертности [5]. Случаи угрозы прерывания беременности в первую и вторую половины имели место в 11 случаях (44%). Этот факт играет большую роль, так как свидетельствует о неблагополучии, при котором нормальное внутриутробное развитие становится невозможным. На перенесенное во время беременности острое респираторное заболевание указывали 10 женщин (40%), при этом контакт с краснушной инфекцией не обозначила ни одна из матерей, родивших детей с пороками развития, которые выделили РНК этого вируса. Эти данные подтверждают преобладание субклинического и латентного течения современной краснушной инфекции.

Осложненное течение беременности, приводящее к изменениям фетоплацентарного барьера, особенно на ранних сроках, и инфицирование плодных оболочек, определяло более массивное проникновение вируса в кровеносную систему плода, что имело немаловажное значение в чувствительные периоды органогенеза. Кроме того, возникающее состояние гипоксии усугубляло цитопатическое действие вируса, персис-тирующего в органах и тканях плода. В течение настоящей беременности у 16 женщин (64%) развивался гестоз различной степени тяжести. Хроническая вну-триматочная инфекция наблюдалась в 17 наблюдениях (68%), причем одна беременность (4%) протекала на фоне хламидиоза, одна — на фоне кандиломатоза

Группы больных Количество больных Положительный результат РТ-ПЦР

ВПС 18

Аномалии скелета 5

Пороки ЦНС 8

МПР 7

6

Детские инфекции 3 • 2004

половых органов, и одна — на фоне сочетания хлами-диоза и уреаплазмоза. фетоплацентарную недостаточность и хроническую внутриутробную гипоксию плода диагностировали у 9 беременных (36%). Синдром задержки развития плода, характерный для внутриутробной вирусной инфекции наблюдался только в 3 случаях (12%). Следует обратить внимание на тот факт, что часть женщин длительное время не посещала врача, не состояла на учете в женской консультации и не наблюдалась специалистами во время беременности.

Неблагоприятное течение беременности осложняло течение родов, что в свою очередь вызывало негативное воздействие на ребенка, находящегося в состоянии гипоксии. В нашем наблюдении в 68% случаев роды происходили в срок более 37 недель (17 наблюдений), недоношенными, на сроках 35—37 недель родились 4 ребенка (16%). В 84 % случаев роды были самопроизвольными и в 12% — оперативными по показаниям как со стороны матери (гестоз тяжелой степени), так и со стороны плода. Нарушения родовой деятельности осложнили течение родов в 32% случаев, преждевременное излитие околоплодных вод — в 28%.

Известно, что при внутриутробном инфицировании ребенок чаще рождается в тяжелом состоянии. В нашем наблюдении при рождении в состоянии асфиксии родилось 2 ребенка (8%). Оценка по шкале Апгар составила 24 балла. Оба новорожденных относились к группе детей с ВПС. Оценка по шкале Апгар 77 балов отмечалась в 2 наблюдениях (8%), 78 балов — в 5-и (20%), 79 — в 1-ом (4%), 88 — в 2-х (8%), 89 балов — в 7 случаях (28%). Состояние при рождении в 44% случаев оценивалось как средней степени тяжести, тяжелое — в 28 %, в удовлетворительном состоянии родилось 4 ребенка, что составило лишь 16%. Внутриутробное заражение вирусом краснухи приводит к нарушению развития плода, примерно половина детей рождаются с недостаточной массой тела [3, 5]. В нашем наблюдении вес от 2000 до 3000 грамм имели 44% новорожденных, в то же время вес более 3000 грамм имело большинство детей (56%) с пороками развития и положительными результатами ПЦР. Таким образом, несмотря на гипоксическое состояние, обусловленное осложненным течением беременности на фоне внутриутробной вирусной инфекции, у детей с пороками развития в первые минуты рождения не наблюдалось нарушения адаптации к внеутробной жизни.

Однако состояние новорожденных к моменту поступления в отделение патологии новорожденных из родильного дома расценивалось как тяжелое, и было обусловлено пороками развития и преобладанием признаков инфекционного токсикоза. В клинике у всех детей был выставлен диагноз гипоксически-ишемического поражения центральной нервной системы, с преобладанием гипертензионно-гидроцефального синдрома у 36% новорожденных. Развитие внутриутробной или постна-тальной пневмонии отмечено в 92% случаев. В группе новорожденных со спинномозговой грыжей наблюдался синдром Арнольда-Киари, составивший 8% всех наблюдений. При спинномозговых грыжах наблюдались нарушения функции тазовых органов в 3 наблюдениях, и одно- и двухсторонней косолапость — в 3 наблюдениях. Конъюгационная желтуха наблюдалась только в 4 случаях (12%), фетальный гепатит — в 1 случае (4%).

В целом, клиническое течение заболевания соответствовало генерализованной форме внутриутробной инфекции, но не имело каких-либо специфических признаков, позволяющих диагностировать врожденную краснуху без использования современных методов исследования. Структура патологии среди групп детей, выделивших РНК вируса краснухи, представлена на рисунке 1.

Изменения гемограммы считаются одним из постоянных проявлений краснухи. Особенно характерным являются тромбоцитопения, нейтропения и анемия [14]. В анализах крови в 36% случаев не выявлено значительных отклонений от нормы. В 16% наблюдений отмечался лимфоцитоз, в 16% лимфоцитоз сочетался с моноцито-зом, в 3 наблюдениях (12%) преобладал нейтрофилез. Полученные изменения гемограммы отражали течение генерализованной внутриутробной инфекции. Поскольку для вируса краснухи характерна длительная персистен-ция, то с возрастом частота выявления гематологических расстройств может возрастать. Тромбоцитопении в настоящем исследовании не отмечено ни в одном случае.

Биохимическое исследование крови не имело изменений основных параметров в 44% наблюдений. В 24% отмечалась непрямая гипербилирубинемия в сочетании с повышением уровня трансаминаз, изолированное повышение трансаминаз наблюдалось только у 1 ребенка (4%). В данном случае выявили затянувшуюся желтуху новорожденного и гепатомегалию.

Изменения в составе мочи не имели особенностей в 60% случаев, в 12% наблюдалась протеинурия, в 8% — бактериурия и в 1 случае (4%) преобладала лейкоци-турия. Специфических изменений, свидетельствующих о заинтересованности ткани почек при генерализованной краснушной инфекции, не выявлено. Не исключено, что протеинурия может быть связана с использованием нефротоксических лекарственных препаратов.

30

25

Ь 20 -

ф

15

^ ю

О

И__ иын 1| т

±§У ¿Я? * 81 5 £ о

ф щ 3 т Ф

и

о § 8 с з X

Т ~ и

о. о ф о. с Ч

5 5

К о

0 X

1 X I ь

ё*

е-

о

Всего  ВПС Аномалии скелета

Пороки ЦНС ] МПР

Рисунок 1. Структура патологии среди детей, выделивших РНК вируса краснухи.

Сравнивая данные, представленные в литературе, и данные собственного исследования, можно высказать предположение об особенности и своеобразии течения краснуш-ной инфекции на современном этапе [3, 15] (рисунок 2).

Обращая внимание на 13 детей с ВПР, у которых результаты ПЦР-диагностики были отрицательными, следует отметить вероятность нескольких причин. Во-первых, нельзя исключить тератогенное воздействие других вирусов, их сочетание или какие-либо другие тератогенные факторы, вызвавшие формирование ВПР. Во-вторых, исследование могло начинаться после того, как ребенок находился в отделении более 1—2 недель и получал интенсивную терапию, особенно, если в лечении использовались препараты интерферона. В-третьих, не исключены технические ошибки, связанные с забором, хранением и транспортировкой материала в ПЦР-лабораторию.

Рассматривая течение краснушной инфекции у новорожденных детей как хроническое, можно предполагать длительное персистирование вируса краснухи и продолжающееся его патогенное воздействие на организм. Вирус краснухи обнаруживался в нашем исследовании у пациентов в возрасте от 1 недели до 3 месяцев, вполне вероятна его детекция у детей с врожденной краснухой и в более позднем возрасте, но уже из пораженных органов и тканей [3]. Наличие клиники генерализованной ВУИ в сочетании с выявлением РНК краснухи является показанием для проведения противовирусной терапии. В связи с этим патогенетически обоснованным становится введение в комплексную терапию больного новорожденного ребенка препаратов интерферона, в частности, виферона.

В целом, проведенное исследование показало, что клиническая картина у детей с ВПР, инфицированных вирусом краснухи, соответствовала течению патологического процесса, связанного с аномалиями жизненно важных органов и систем. Однако тяжесть состояния усугублялась развитием признаков инфекционного ток-

омбо

кая пр

Ми

раже

По

пле ГГепа

ора

эоки ЦНС

кроцефалия

цитопения

асса тела рождении

>к

зантема номегалия томегалия Недоношенность Желтуха енрие ЦНС ВПС

120 %

Рйсунок 2. Сравнение данных о течении краснушной инфекции у новорожденных детей (1 — по данным Казанцева А. П., Поповой Н. И., 1980 [3]; 2 — по данным Нисевич Л. Л. и со-авт., 1992 [15]; 3 — собственные данные).

сикоза. Таким образом, можно предположить, что при инфицировании плода в I триместре беременности и формировании за счет этого ВПР, не происходит элиминации вируса, а возникает течение хронического инфекционного процесса. Все это в значительной степени осложняет течение неонатального периода, способствует прогрессивному поражению органов новорожденного ребенка и влияет на его дальнейшее развитие.

Выводы

1. Выделение РНК вируса краснухи у 65,8% новорожденных с ВПР, свидетельствует о сохраняющейся актуальности синдрома врожденной краснухи в структуре внутриутробных инфекций.

2. Часть женщин фертильного возраста остаются се-ронегативны к краснушной инфекции: средний возраст матерей, родивших детей с пороками развития составил 25,3 i 2,77 лет, 44% которых были первобеременными.

3. Развитию генерализованной краснушной инфекции способствует наличие у матери соматической патологии, отягощенный акушерско-гинекологический анамнез, неблагоприятное течение беременности на фоне угрозы прерывания, гестоза, фетоплацентарной недостаточности.

4. Отсутствие указаний на контакт с краснушной инфекцией у женщин, дети которых выделили РНК вируса краснухи, затрудняет диагностику синдрома врожденной краснухи у новорожденных.

5. Клинически течение заболевания соответствует генерализованной форме внутриутробной инфекции и не имеет специфических признаков.

6. Отсутствие специфических признаков врожденной краснушной инфекции требует исследования для обнаружения РНК вируса краснухи всех новорожденных с пороками развития и клиникой генерализованной внутриутробной инфекции.

Литература:

1. Самсыгина Г. А. // Педиатрия. — 1997. — № 5. — С. 34—36.

2. Лозовская Л. С. и др. // Педиатрия. — 1998. — № 4. — С. 11—15.

3. Казанцев А. П., Попова Н. И. Внутриутробные инфекционные заболевания детей и их профилактика. — Л.: Медицина, 1980. — 232 с.

4. Семериков В. В. и др. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. — 1994. — № 1. — С. 36—39.

5. Нисевич Л. Л. и др. // Педиатрия. — 1999. — № 1. — С. 4—10.

6. Корягин В. П. // Клин. мед. — 1982. — Т. 60, № 8 — С. 76—80.

7. Висницкий Н. Н. Актуальные вопросы медицинской вирусологии / Н. Н. Висницкий, А. А. Смородинцев, И. П. Смо-родинцева.— Свердловск, 1989. — С. 216—219.

8. Тератология человека. Руководство для врачей. Под ред. Г. И. Лазюка. — М.: Медицина, 1991. — 480 с.

9. Frey Т. К. Molecular biology of rubella virus. — Academic Press, 1994, — P. 71—73.

10. Webster W. S. // Teratology. — 1998. — Vol. 58. — N 1. — P. 13—23.

11. Учайкин В. ф. // Педиатрия. — 2003. — № 3. — С. 8—10.

12. Малкова Е. М. и др. // Педиатрия. — 2002. — № 1. — С. 36—40.

13. Петрова И. Д. и др. // Аллергия, астма и клиническая иммунология. — 2000. — № 10. — С. 20—23.

14. Самсыгина Г. А., Буслаева Г. Н., Непокульчитская Н. В. // Педиатрия. — 1997. — № 4. — С. 59—62.

15. Нисевич Л. Л. и др. // Педиатрия. — 1992. — № 10—12. — С. 6—10.

8

Äetckhe инфекции 3 • 2004