ОЧИЩЕННЫЕ КОМПОЗИЦИИ ОЛИГОСАХАРИДОВ ГРУДНОГО МОЛОКА
PURIFIED COMPOSITIONS OF BREAST MILK OLIGOSACCHARIDES

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет по предварительной заявке на патент США № 62/396,799, поданной 19 сентября 2016 г., содержание которой включено в настоящий документ путем ссылки.
ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0002] Изобретение относится к способу получения по существу очищенных композиций олигосахаридов грудного молока (ОГМ), по существу очищенным композициям, полученным таким способом, а также к способам применения таких композиций.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0003] Олигосахариды грудного молока (ОГМ) представляют собой семейство структурно разнородных неконъюгированных гликанов, которые содержатся в большом количестве в человеческом грудном молоке и уникальны для человеческого грудного молока. Первоначально считали, что ОГМ являются пребиотическими «бифидными факторами» или полагали, что гликаны грудного молока способствуют росту бифидобактерий кишечника и содержатся исключительно в кале младенцев на грудном вскармливании, но не младенцев, вскармливаемых детскими смесями. Дополнительные исследования позволили предположить, что разнообразные молочные гликаны в некоторой степени отвечают за полезные для здоровья эффекты, связанные с грудным вскармливанием. В настоящее время известно, что ОГМ являются не просто «пищей для бактерий». Накапливается все больше данных, свидетельствующих о том, что ОГМ представляют собой антиадгезивные противомикробные средства, которые служат в качестве растворимых рецепторов-ловушек, препятствующих прикреплению патогенов к поверхностям слизистой оболочки младенца и, таким образом, снижающих риск инфицирования вирусными, бактериальными и простейшими паразитами. Кроме того, полагают, что ОГМ модулируют ответы эпителиальных и иммунных клеток, таким образом уменьшая чрезмерную инфильтрацию лейкоцитов в слизистую оболочку и воспаление, таким образом снижая риск некротизирующего энтероколита, а также обеспечивая младенца сиаловой кислотой, которая является потенциально важным питательным веществом для развития мозга и когнитивной функции.
[0004] ОГМ состоят из пяти моносахаридов: глюкозы (GLC), галактозы (Gal), N-ацетилглюкозамина (GlcNAc), фукозы (Fuc) и сиаловой кислоты (Sia), при этом преобладающей, если не единственной формой Sia является N-ацетилнейраминовая кислота (Neu5Ac). До настоящего времени было выявлено более двухсот различных ОГМ, но не каждая женщина синтезирует один и тот же набор олигосахаридов и в одних и тех же количествах (см. обзор в публикации Kobata 2010). Таким образом, разнообразие ОГМ в популяции в целом часто гораздо выше, чем у любой отдельно взятой женщины.
[0005] Более того, состав и концентрация олигосахаридов также варьируется в течение периода лактации (см. обзор в публикации Kunz et al. 2000). Молозиво содержит до 20-25 г/л ОГМ, однако в период выработки молока со временем общее содержание ОГМ снижается до 5-20 г/л, что часто все еще превышает концентрацию общего молочного белка, и это делает фракцию ОГМ грудного молока третьей по величине фракцией после лактозы и жира. Широкий диапазон концентраций и разнообразие, отмеченные для ОГМ, отражают не только известные генетические вариации в путях гликозилирования среди женщин, но также и технические различия в аналитических методах, используемых для обнаружения и количественного определения ОГМ различными научно-исследовательскими и контрактными исследовательскими лабораториями.
[0006] Однако ясно, что в молоке других млекопитающих, таких как коровы, овцы и козы, олигосахариды присутствуют в гораздо меньшем количестве и структурно отличаются от олигосахаридов человеческого грудного молока. Например, даже наиболее обогащенная олигосахаридами часть коровьего молока, молозиво, содержит только приблизительно 50 видов молекул олигосахаридов. Козье молоко, олигосахаридная структура которого, как считается, наиболее точно соответствует ОГМ, содержит только около 40 видов молекул, что составляет менее 25% от характерного разнообразия ОГМ (Thum, et al. 2015).
[0007] Помимо ограниченной доступности сырьевого материала, еще одним серьезным препятствием для производства композиции олигосахаридов молока является уменьшение содержания лактозы и других минеральных веществ, которые обычно концентрируются вместе с олигосахаридными компонентами молока в процессе их выделения и концентрирования, в частности, когда для удаления белка используют ультрафильтрацию, а не осаждение белка, и делают это без снижения выхода. Хотя эта проблема лимитирует процесс независимо от вида обрабатываемого молока, она нигде не ощущается так остро, как при получении композиции человеческих олигосахаридов, поскольку исходный материал настолько дефицитен, что снижение выхода становится неприемлемым.
[0008] В других случаях эту проблему пытались решить, используя для удаления белка и других макронутриентов системы на основе растворителей. Этот способ предотвращает накопление лактозы и минеральных веществ, связанное с процессом ультрафильтрации. Действительно, отмечено, что этот способ фактически может способствовать удалению лактозы (см., например, Sarney, 2000). Однако этот процесс требует применения растворителей и по существу разрушает остальную часть грудного молока, делая его неподходящим для использования в получении других жизненно важных продуктов. Для такого дефицитного материала, как человеческое грудное молоко, это просто неприемлемо.
[0009] Процесс ультрафильтрации, применяемый для получения пермеата грудного молока, хотя и позволяет при использовании в настоящем изобретении избежать применения потенциально вредных органических растворителей и сохранить белковую фракцию для применения в других жизненно важных продуктах, только усугубляет проблему содержания лактозы и минеральных веществ в молоке. Содержание лактозы в концентрированном пермеате грудного молока, например, в некоторых случаях может доходить до 10-15%, тогда как концентрация лактозы в молоке составляет ≤ 6%. Такие уровни лактозы трудно перевариваются даже у людей, которые способны ферментативно расщеплять лактозу, не говоря уже о людях, которые этой возможности лишены. Для удаления лактозы используют несколько подходов, включая ферментативное расщепление с последующей последовательной диафильтрацией для удаления фермента, используемого для расщепления. Даже в тех образцах, в которых белок был удален путем осаждения органическим растворителем, а не ультрафильтрацией, которая концентрирует лактозу и минеральные вещества, после диафильтрации сохраняется значительный уровень лактозы, не говоря о содержании минеральных веществ в этой композиции. (См., например, Sarney, 2000 и Grandison, et al. 2002.) Более того, диафильтрация композиций ОГМ также приводит к недопустимой потере низкомолекулярных видов ОГМ, например 2FL.
[0010] Поскольку нет природных ресурсов, способных обеспечить доступ к большим количествам очищенных ОГМ, большинство детских смесей, имеющихся на рынке, вообще не обеспечивают новорожденных олигосахаридами, а прочие обеспечивают олигосахариды неприродного происхождения, предназначенные для имитации ОГМ, включая галактоолигосахариды (GOS) и фруктоолигосахариды (FOS) или недавно полученные химически синтезированные версии природных ОГМ: LNnT и 2’-FL (Bode, 2015). Хотя эти композиции могут иметь преимущества в сравнении с композициями, совершенно не содержащими ОГМ, они по существу менее разнообразны в отношении типов молекул ОГМ, чем среднее человеческое молоко, и, определенно, гораздо менее разнообразны, чем грудное молоко, если рассматривать всю популяцию.
[0011] Необходим способ, который обеспечивает эффективное извлечение, концентрирование и очистку композиции ОГМ, которая является структурно и функционально разнородной, но по существу имеет пониженное содержание лактозы и/или минеральных веществ.
ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0012] В настоящем документе предложены способы производства композиций олигосахаридов грудного молока, которые сохраняют структурное и функциональное разнообразие олигосахаридов, встречающихся в грудном молоке человеческой популяции, и имеют существенно сниженные концентрации лактозы и/или минеральных веществ. Способы, предложенные в настоящем документе, имеют преимущество масштабируемости, а их дополнительное преимущество состоит в том, что они не разрушают оставшиеся фракции молока, например, в результате применения растворителей для удаления белка.
[0013] В одном варианте осуществления предлагается способ получения очищенной композиции олигосахаридов грудного молока (ОГМ). В одном варианте осуществления способ включает смешивание пермеата грудного молока с ферментом, способным расщеплять лактозу, в условиях, подходящих для расщепления лактозы в пермеате, и в течение периода времени, достаточного для такого расщепления. В некоторых вариантах осуществления фермент представляет собой фермент лактазу. В некоторых вариантах осуществления фермент лактазу удаляют из смеси расщепленного лактазой пермеата после расщепления. В некоторых вариантах осуществления перед удалением лактазы смесь пермеат/лактаза очищают, например, посредством пористых фильтров. В некоторых вариантах осуществления лактазу удаляют из смеси путем фильтрации. В некоторых вариантах осуществления фильтрация включает фильтрацию через мембрану с размером пор около 50 000 дальтон. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает фильтрацию смеси через один или более дополнительных фильтров. В одном варианте осуществления один или более дополнительных фильтров включают в себя мембрану с размером пор от около 2000 до около 3000 дальтон. В одном варианте осуществления один или более дополнительных фильтров включают в себя мембрану с размером пор около 600 дальтон.
[0014] В некоторых вариантах осуществления перед или одновременно с добавлением фермента лактазы в пермеат регулируют pH и/или температуру пермеата. В одном варианте осуществления pH доводят до величины от около 4,3 до около 4,7. В одном варианте осуществления pH доводят до около 4,5. В одном варианте осуществления температуру смеси пермеата регулируют перед или одновременно с добавлением лактаз. В одном варианте осуществления температуру доводят до значения от около 45°C до около 55°C. В одном варианте осуществления температуру доводят до значения около 50°C. В одном варианте осуществления pH пермеата доводят до величины от около 4,3 до около 4,7 и доводят температуру до значения от около 45°C до около 55°C.
[0015] В одном варианте осуществления лактазы добавляют в концентрации от около 0,1% до около 0,5% масс./масс. В некоторых вариантах осуществления лактазу добавляют в концентрации около 0,1% масс./масс. В некоторых вариантах осуществления лактазу инкубируют с пермеатом в течение от около 5 до около 225 минут. В некоторых вариантах осуществления лактазу инкубируют с пермеатом в течение от около 15 до около 120 минут. В некоторых вариантах осуществления лактазы инкубируют с пермеатом в течение периода от около 30 до около 90 минут. В некоторых вариантах осуществления лактазу инкубируют с пермеатом в течение периода около 60 минут.
[0016] В одном варианте осуществления после инкубации смесь пермеат/лактаза охлаждают до температуры от около 20°C до около 30°C. В одном варианте осуществления смесь пермеат/лактаза охлаждают до температуры около 25°C. В одном варианте осуществления смесь пермеат/лактаза очищают. В одном варианте осуществления смесь пермеат/лактаза очищают с помощью пористого фильтра. В одном варианте осуществления пористый фильтр включает в себя фильтр от около 1 микрона до около 5 микрон.
[0017] В одном варианте осуществления лактазу удаляют посредством фильтрации. В одном варианте осуществления лактазу удаляют посредством фильтрации через фильтр с размером пор около 50 000 дальтон. В одном варианте осуществления композицию дополнительно фильтруют через один или более дополнительных фильтров. В некоторых вариантах осуществления один или более дополнительных фильтров содержат мембрану с размером пор от около 2000 до около 3000 дальтон. В некоторых вариантах осуществления один или более дополнительных фильтров содержат мембрану с размером пор ≤ 600 дальтон. В некоторых вариантах осуществления композицию фильтруют через фильтр, содержащий мембрану с размером пор от около 2000 до около 3000 дальтон, с последующей фильтрацией через мембрану с размером пор ≤ 600 дальтон.
[0018] В некоторых вариантах осуществления предложены очищенные композиции ОГМ, полученные в соответствии со способами настоящего изобретения. В некоторых вариантах осуществления очищенная композиция ОГМ имеет пониженный уровень лактозы и минеральных веществ по сравнению с пермеатом. В некоторых вариантах осуществления очищенная композиция ОГМ содержит менее чем около 5,0% масс./масс. лактозы. В некоторых вариантах осуществления композиция ОГМ содержит профиль минеральных веществ, показанный в таблице 1. В одном варианте осуществления очищенная композиция ОГМ содержит ОГМ в концентрации от около 0,5% до около 7,5% ОГМ. В некоторых вариантах осуществления очищенная композиция ОГМ содержит ОГМ в концентрации от около 1,0% до около 2,0% ОГМ. В некоторых вариантах осуществления очищенная композиция ОГМ содержит ОГМ в концентрации от около 2,0% до около 4,0% ОГМ. В некоторых вариантах осуществления очищенная композиция ОГМ содержит ОГМ в концентрации от около 4,0% до около 5,0% ОГМ. В некоторых вариантах осуществления очищенная композиция ОГМ содержит ОГМ в концентрации от около 5,0% до около 7,5% ОГМ. В некоторых вариантах осуществления очищенная композиция ОГМ содержит ОГМ в концентрации около 5,0% масс./масс. в расчете на ОГМ. В одном варианте осуществления профиль ОГМ, полученный в соответствии со способами, описанными в настоящем документе, включает профиль ОГМ, показанный на Фиг. 5 (E и F).
[0019] В некоторых вариантах осуществления, представленных в настоящем документе, предложены способы введения очищенной композиции ОГМ нуждающемуся в этом субъекту. В некоторых вариантах осуществления, представленных в настоящем документе, предложен способ лечения или профилактики некротизирующего энтероколита (NEC) у нуждающегося в этом субъекта. В некоторых вариантах осуществления предлагается способ уменьшения системного воспаления путем введения очищенной композиции ОГМ, полученной способами, описанными в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления предлагается способ лечения или профилактики инфекции у нуждающегося в этом субъекта. В некоторых вариантах осуществления предлагается способ лечения или профилактики вирусной или бактериальной инфекции путем введения очищенной композиции ОГМ, полученной способами, описанными в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления бактериальная инфекция представляет собой инфекцию микроорганизмами Clostridium difficile. В некоторых вариантах осуществления вирусная инфекция представляет собой норовирус или ротавирус.
[0020] В некоторых вариантах осуществления очищенную композицию ОГМ вводят до, во время или после введения дополнительного фармацевтического или терапевтического агента. В некоторых вариантах осуществления очищенную композицию ОГМ вводят до, во время или после трансплантации фекальной микробиоты, органа или костного мозга. В некоторых вариантах осуществления очищенную композицию ОГМ вводят до, во время или после применения схем лечения антибиотиком, противовирусным или противогрибковым средством. В некоторых вариантах осуществления очищенную композицию ОГМ вводят до, во время или после применения пробиотической композиции. В некоторых вариантах осуществления очищенную композицию ОГМ вводят до, во время или после химиотерапии и/или лучевой терапии.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
[0021] На Фиг. 1 представлена схема примерного способа получения ОГМ.
[0022] На Фиг. 2 представлена схема альтернативного способа получения ОГМ.
[0023] На Фиг. 3 представлена схема способа, применяемого для получения пермеата в 20-кратной концентрации из пермеата в ≥ 8-кратной концентрации.
[0024] На Фиг. 4 представлена (А) схема процесса, применяемого для приготовления очищенной композиции ОГМ и (B) способа, применяемого для пастеризации и розлива очищенной композиции ОГМ.
[0025] На Фиг. 5 показаны результаты высокоэффективной анионообменной хроматографии с импульсным амперометрическим детектированием (HPAEC-PAD) нейтральных (A, C и E) и сиалилированных (B, D и F) ОГМ из объединенного донорского молока (A и B), пермеата грудного молока (C и D) и очищенных композиций ОГМ (E и F).
[0026] На Фиг. 6 показана полученная с использованием ЖХ/МС/МС и ЖХ с полярной колонкой нецелевая метаболомика сыворотки, фекалий и мочи у взрослых, которым вводили ОГМ. Результаты включают парентеральные ОГМ и продукты разложения ОГМ, обнаруженные в (А) сыворотке, (B) моче, (C) фекалиях и (D) молоке.
[0027] На Фиг. 7 представлен (А) метаболический путь эйкозаноидов, полученный с использованием ЖХ/МС/МС и ЖХ с полярной колонкой, и (B и C) уровни метаболитов эйкозаноидов с течением времени у субъектов, принимающих внутрь очищенные композиции ОГМ, полученные способами настоящего изобретения.
[0028] На Фиг. 8 показаны концентрации метаболитов сфинголипидов в сыворотке, полученные с применением ЖХ/МС/МС и ЖХ с полярной колонкой, в зависимости от времени у субъектов, принимающих внутрь очищенные композиции ОГМ, полученные в соответствии со способами изобретения.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
[0029] В настоящем изобретении предложены способы получения очищенных композиций олигосахаридов грудного молока, которые имеют по существу сниженное содержание лактозы и минеральных веществ, а также новые композиции, полученные этими способами, и способы применения таких новых композиций. Первая стадия способа представляет собой получение фильтрованных фракций объединенного грудного молока, следовательно, очищенные композиции ОГМ настоящего изобретения могут содержать более разнообразный профиль отдельных видов молекул ОГМ по сравнению с любой типичной отдельно взятой женщиной. Следовательно, композиции, описанные в настоящем документе, часто являются репрезентативными для популяции ОГМ в целом, а не для профиля ОГМ отдельно взятой женщины.
[0030] Термин «олигосахарид (-ы) грудного молока» (также применяемый в настоящем документе в виде «ОГМ») означает семейство структурно разнородных неконъюгированных гликанов, которые встречаются в человеческом грудном молоке.
[0031] Олигосахариды грудного молока представляют собой углеводы, которые содержат лактозу на восстанавливающем конце и, как правило, фукозу или сиаловую кислоту на невосстанавливающем конце (Morrow et al. 2005). Эти концевые сахара представляют собой остатки, которые наиболее сильно влияют на селективный рост бактерий и взаимодействие олигосахаридов с другими молекулами или клетками, включая бактериальные патогены в просвете кишечника. Кроме этого, сиаловые кислоты являются структурными и функциональными компонентами ганглиозидов головного мозга и принимают участие в развитии нервной системы младенцев.
[0032] Олигосахариды могут быть свободными или конъюгированными в виде гликопротеинов, гликолипидов и т. п., и они относятся к гликанам. Они представляют собой третий по количеству сухой компонент грудного молока после лактозы и липидов (Morrow, 2005). Однако большинство олигосахаридов молока не перевариваются младенцами и могут обнаруживаться в фекалиях младенцев по большей части в интактном виде.
[0033] Под «пермеатом» понимают ту часть молока (например, объединенного грудного молока), которая является продуктом ультрафильтрации. В частности, это жидкость, которая остается после ультрафильтрации (например, через фильтр около 1-1000 кДа). Жидкость, которая прошла через этот процесс ультрафильтрации, называют пермеатом. В ретентате данного способа концентрируется человеческий молочный белок, который затем можно использовать для создания других жизненно важных составов, например для получения композиций обогатителя грудного молока, таких как описанные в патенте США № 8,377,455. Таким образом, в отличие от способов, основанных на осаждении белка растворителями, которые могут загрязнить продукт ОГМ, применение ультрафильтрации для получения по существу не содержащего белка исходного материала, используемого в настоящем изобретении, сохраняет оставшуюся часть ценных макронутриентов грудного молока, позволяя при этом избегать использования органических растворителей.
[0034] Под «молоком» понимают жидкость, которая вырабатывается молочной железой млекопитающих и выделяется из молочной железы. К молоку относятся все продукты лактации, включая, без ограничений, молозиво, цельное молоко и обезжиренное молоко, полученные в любой момент после родов. Если не указано иное, в настоящем документе термин «молоко» относится, как правило, к цельному человеческому грудному молоку.
[0035] Под «цельным молоком» понимают молоко (например, объединенное грудное молоко), из которого не удален жир.
[0036] Под «обезжиренным молоком» понимается молоко (например, объединенное грудное молоко), из которого удалили по меньшей мере 75% жира, или, в альтернативном варианте осуществления, молоко, которое подвергали центрифугированию для удаления жира.
[0037] Термин «по существу», как в «по существу сниженное содержание лактозы и/или минеральных веществ», означает, что снижение уровня минеральных веществ и/или лактозы имеет статистическое различие по сравнению с концентрированным пермеатом, не подвергавшимся воздействию текущих способов. В качестве примера в некоторых вариантах осуществления очищенные композиции ОГМ с по существу сниженным содержанием лактозы имеют концентрации лактозы ≤ 5%.
[0038] В настоящем документе термин «состоящий по существу из» относится к композициям, содержащим определенные приведенные здесь компоненты, но исключающим другие основные биологически активные факторы. Например, композиция, состоящая по существу из ОГМ, не будет содержать таких компонентов, как белок, жир, добавленный экзогенно материал, но может содержать, например, другой инертный или следовой материал, такой как вода, приемлемые уровни некоторых солей, микроРНК или экзосомы.
[0039] Используемый в настоящем документе термин «очищенная композиция ОГМ» означает композицию ОГМ (например, концентрированный человеческий пермеат) с по существу сниженными уровнями лактозы и/или минеральных веществ, полученную способами, предложенными в настоящем документе. Пример очищенной композиции ОГМ представлен на Фиг. 5 (E) и (F).
СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ ОЧИЩЕННЫХ КОМПОЗИЦИЙ ОГМ
[0040] Пермеат грудного молока служит исходным материалом, из которого получают очищенные композиции ОГМ настоящего изобретения способами, описанными в настоящем документе. Способы получения пермеата грудного молока можно найти, например, в патенте США № 8,927,027, который полностью включен в настоящий документ путем ссылки.
[0041] Если коротко, объединенное молоко от предварительно отобранных доноров, прошедших скрининг на наркотики, загрязняющие вещества, патогены и посторонние вещества, отфильтрованное для удаления термостойких бактериальных спор, разделяют (например, путем центрифугирования) на жиросодержащую и обезжиренную фракции. Обезжиренную фракцию подвергают дополнительной фильтрации, например ультрафильтрации, например, на мембране с размером пор 1-1000 кДа, для получения обогащенного белками ретентата и содержащего ОГМ пермеата. Подробную информацию об этом процессе можно найти, например, в патентах США № 8,545,920; 7,914,822; 7,943,315; 8,278,046; 8,628,921 и 9,149,052, каждый из которых полностью включен в настоящий документ путем ссылки.
[0042] В одном варианте осуществления предлагается способ получения очищенной композиции ОГМ с по существу пониженным содержанием лактозы. В данном процессе требуется биохимическое и/или ферментативное удаление лактозы из обогащенной лактозой пермеатной фракции грудного молока без потери выхода или без изменения молекулярного профиля содержания ОГМ в пермеате грудного молока, а в некоторых вариантах осуществления — без оставления остаточного инактивированного инородного белка, если для уменьшения содержания лактозы применяют ферментативное расщепление.
[0043] В одном варианте осуществления способ уменьшения содержания лактозы в пермеате грудного молока и, следовательно, в очищенной композиции ОГМ, включает следующие стадии: а) изменение pH смеси пермеата; b) нагревание смеси с измененным pH; c) добавление фермента лактазы к нагретой смеси пермеата для создания смеси пермеат/лактаза и инкубация в течение некоторого периода времени; d) удаление лактазы из смеси и фильтрация смеси для удаления лактазы и e) концентрирование олигосахаридов грудного молока. Хотя описанные в настоящем документе стадии перечислены в хронологическом порядке, специалисту в данной области будет понятно, что порядок, в котором выполняются стадии (a)-(c), может быть различным. Иными словами и исключительно в качестве примера, фермент-лактазу можно добавлять до нагревания смеси или, в альтернативном варианте осуществления, в любой момент в ходе процесса нагревания. Аналогичным образом и также только в качестве примера смесь можно нагревать перед изменением pH. Более того, несколько стадий могут быть сгруппированы в одну стадию, например, «ферментативное расщепление лактозы» или «расщепление лактозы лактазами» включает стадии (a)-(c), описанные выше. Эти стадии могут выполняться одновременно или последовательно в любом порядке. Таким образом, в настоящем документе термин «расщепление лактозы» относится к выполнению по меньшей мере этих трех стадий в любом порядке, последовательно или одновременно.
[0044] В одном варианте осуществления pH пермеата доводят до величины от около 3 до около 7,5. В одном варианте осуществления pH доводят до величины от около 3,5 до около 7,0. В другом варианте осуществления pH доводят до величины от около 3,0 до около 6,0. В еще одном варианте осуществления pH доводят до величины от около 4 до около 6,5. В еще одном варианте осуществления pH доводят до величины от около 4,5 до около 6,0. В еще одном варианте осуществления pH доводят до величины от около 5,0 до около 5,5. В еще одном варианте осуществления pH доводят до величины от около 4,3 до около 4,7, предпочтительно 4,5. pH можно изменять путем добавления кислоты или щелочи. В некоторых аспектах pH изменяют путем добавления кислоты, например HCl. В других аспектах pH изменяют путем добавления 1Н раствора HCl и смешивания в течение некоторого периода времени, например около 15 минут.
[0045] В одном варианте осуществления пермеат с измененным pH нагревают до температуры от около 25°C до около 60°C. В другом варианте осуществления пермеат нагревают до температуры от около 30°C до около 55°C. В другом варианте осуществления пермеат нагревают до температуры от около 40°C до около 50°C. В другом варианте осуществления пермеат нагревают до температуры от около 48°C до около 50°C. В еще одном варианте осуществления изобретения пермеат нагревают до температуры около 50°C. В еще одном варианте осуществления пермеат нагревают до температуры, меньшей или равной около 40°C.
[0046] В одном аспекте фермент лактазу добавляют к нагретому пермеату с измененным рН для получения смеси пермеат/лактаза и для расщепления лактозы на моносахариды. В одном варианте осуществления фермент лактазу добавляют в концентрации от около 0,1% масс./масс. до около 0,5% масс./масс. В еще одном аспекте фермент лактазу добавляют в концентрации около 0,1% масс./масс., или 0,2%, или 0,3%, или 0,4%, или 0,5% масс./масс. В продаже есть множество пригодных для использования ферментов-лактаз. Таким образом, фермент лактаза может иметь любое происхождение (например, грибковое или бактериальное).
[0047] В некоторых вариантах осуществления нагретый пермеат с измененным pH инкубируют с ферментом лактазой в течение от около 5 до около 225 минут. В некоторых вариантах осуществления время инкубации составляет от около 15 минут до около 90 минут. В некоторых вариантах осуществления время инкубации составляет от около 30 минут до около 90 минут. В некоторых вариантах осуществления время инкубации составляет около 60 минут. Специалисту в данной области будет понятно, что время инкубации зависит от множества факторов, включая, без ограничений, источник используемого фермента, температуру и pH смеси, а также концентрацию используемого фермента. Для любого из этих переменных факторов может потребоваться более длительное или более короткое время инкубации с ферментом лактазой. Хотя описанные в настоящем документе значения рН, температуры и условия инкубации с ферментом оптимально подходят для способа, описанного в настоящем документе, специалисту в данной области будет понятно, что для достижения аналогичных результатов можно вносить изменения в одну или более из этих переменных. Например, если используется меньшее количество фермента, чем описанный в настоящем документе уровень от около 0,1% масс./масс. до около 0,5% масс./масс., может потребоваться увеличить время инкубации для достижения такого же уровня расщепления лактозы. Аналогичные корректировки также могут быть внесены и в такие переменные факторы, как температура и pH.
[0048] В одном варианте осуществления после инкубации смесь пермеат/лактаза охлаждают до температуры от около 20°C до около 30°C. В одном конкретном варианте осуществления смесь пермеат/лактаза охлаждают до температуры около 25°C.
[0049] В одном варианте осуществления смесь пермеат/лактаза очищают для удаления нерастворимых компонентов. В некоторых случаях при изменении pH и температуры может образовываться нерастворимый материал. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления может быть необходимо или полезно очистить смесь для удаления этих нерастворимых компонентов, например, с помощью пористого фильтра. Фильтры могут представлять собой фильтры с размерами пор от 0,1 до 10 микрон. В некоторых вариантах осуществления фильтры представляют собой фильтры с размерами пор от около 1 до около 5 микрон. В альтернативном варианте осуществления удаление нерастворимых компонентов может быть достигнуто путем центрифугирования или комбинации центрифугирования и фильтрации на мембране. Стадия очистки не является необходимой для получения композиции разнородных ОГМ, как описано в настоящем документе, но эта необязательная стадия помогает получить более высоко очищенную композицию ОГМ. Кроме того, стадия очистки важна для возможности повторного использования фильтрующих мембран и, следовательно, для масштабируемости процесса. Без адекватной очистки потребуется по существу большее количество фильтрующего материала, что затруднит и сделает более затратным получение композиций ОГМ в масштабе клинического учреждения. Однако следует понимать, что на данной стадии можно осуществить более или менее полную очистку для получения более или менее очищенных композиций ОГМ в зависимости от состава и области применения. Например, осажденные минеральные вещества могут представлять собой меньшую проблему для состава, предназначенного для лиофилизации, или составов, предназначенных для применения у здоровых взрослых людей, чем жидкий состав или составы, предназначенные для применения у уязвимых популяций (например, новорожденных).
[0050] Кроме того, в некоторых случаях может быть желательно удалить отработанный и избыточный фермент-лактазу из очищенной смеси пермеат/лактаза. Однако возможны случаи, когда инактивированный чужеродный белок не будет представлять биологического риска, и, следовательно, дополнительные стадии удаления или даже инактивации лактазы могут не потребоваться. В некоторых вариантах осуществления использованную и избыточную лактазу инактивируют, например, посредством воздействия высокой температуры, давления или обоих факторов. В некоторых вариантах осуществления инактивированную лактазу не удаляют из композиции.
[0051] Однако в других вариантах осуществления может потребоваться дополнительная очистка для удаления чужеродных белков. В таких вариантах осуществления удаление фермента-лактазы можно провести путем ультрафильтрации. В некоторых вариантах осуществления ультрафильтрацию выполняют с использованием мембраны для ультрафильтрации, например с использованием мембраны с отсечением по молекулярной массе ≤ 50 000 дальтон, например BIOMAX-50K. (См. также Фиг. 1.)
[0052] В некоторых вариантах осуществления дополнительную ультрафильтрацию выполняют через мембрану с порами меньшего размера, чем у первой мембраны с отсечением по молекулярной массе ≤ 50 000 дальтон. В некоторых вариантах осуществления дополнительную ультрафильтрацию выполняют с помощью мембраны с отсечением по молекулярной массе около 2000-3000 дальтон. Эта дополнительная необязательная стадия фильтрации дополнительно способствует общей чистоте продукта ОГМ, помогая удалять меньшие по размеру потенциально биологически активные и/или иммуногенные факторы, такие как микроРНК и экзосомы. На Фиг. 3 представлен вариант осуществления с этой дополнительной стадией фильтрации.
[0053] В одном варианте осуществления очищенная смесь, которая прошла по меньшей мере один, а в некоторых случаях два или более цикла ультрафильтрации (или альтернативного способа удаления лактазы), дополнительно фильтруется для очистки и концентрирования олигосахаридов грудного молока и для уменьшения содержания минеральных веществ и моносахаридов.
[0054] В некоторых вариантах осуществления фильтрация может выполняться с использованием нанофильтрационной мембраны. В некоторых вариантах осуществления мембрана имеет отсечение по молекулярной массе ≤ 1000 дальтон. В некоторых вариантах осуществления мембрана имеет отсечение по молекулярной массе ≤ 600 дальтон. В других вариантах осуществления отсечение по молекулярной массе у мембраны составляет от около 400 до около 500 дальтон. Эта дополнительная нанофильтрация представляет собой важную стадию для удаления моносахаридов, минеральных веществ, в частности кальция, и меньших по размеру молекул с получением готовой очищенной композиции ОГМ.
[0055] В некоторых вариантах осуществления для удаления минеральных веществ могут применяться дополнительные или альтернативные стадии. Такая дополнительная стадия может включать в себя, например, центрифугирование, мембранную очистку (≤ 0,6 микрона) или комбинацию центрифугирования и мембранной фильтрации нагретого (≥ 40°C) или охлажденного/замороженного и размороженного концентрата ОГМ. Собранный супернатант или фильтрат этих дополнительных или альтернативных стадий в некоторых вариантах осуществления дополнительно концентрируют с использованием нанофильтрационной мембраны. В некоторых вариантах осуществления нанофильтрация включает фильтрацию через мембрану с отсечением по молекулярной массе ≤ 600 дальтон. В некоторых вариантах осуществления эти дополнительные стадии можно выполнить на любой стадии способа, включая, без ограничений, их выполнение до или после пастеризации.
[0056] В некоторых вариантах осуществления физические свойства нанофильтрационных мембран можно модифицировать, например, химической модификацией, для избирательного концентрирования сиалилированных ОГМ, например, обеспечивая более высокую эффективность удаления нейтральных ОГМ из концентрата ОГМ в тех случаях, когда предпочтительными являются концентрированные сиалилированные ОГМ.
[0057] В одном варианте осуществления очищенную композицию ОГМ стерилизуют. Стерилизацию можно осуществлять любым способом, известным в данной области. В некоторых вариантах осуществления очищенную композицию ОГМ пастеризуют. В некоторых аспектах пастеризацию выполняют при температуре ≥ 63°C в течение не менее 30 минут. После пастеризации композицию охлаждают до температуры от около 25°C до около 30°C и очищают через фильтр с размером пор 0,2 микрона для полного удаления остатков осажденного материала.
ОЧИЩЕННЫЕ КОМПОЗИЦИИ ОГМ
[0058] Очищенные композиции ОГМ настоящего изобретения имеют по существу сниженные уровни лактозы и/или минеральных веществ. В настоящем документе термин «по существу сниженный» применительно к содержанию лактозы означает уровень лактозы ≤ 5% масс./масс. В некоторых вариантах осуществления очищенные композиции ОГМ, полученные способом, описанным в настоящем документе, содержат от около 4,5 до около 8,5 грамм ОГМ, ≤ 5% масс./масс. лактозы и минеральный состав, показанный в таблице 1.
Таблица 1. Пример минерального состава композиции ОГМ с пониженным содержанием минеральных веществ
[0059] Специалисту в данной области будет понятно, что в некоторых случаях, например когда очищенный продукт ОГМ нужно приготовить в виде порошка, уменьшение количества минеральных веществ может быть менее критичным. По существу представленные выше значения приведены исключительно как пример состава, и в частности в качестве примера жидкого состава, хотя нет причин, по которым данный состав не может быть порошкообразным.
[0060] В некоторых вариантах осуществления ОГМ в очищенной композиции присутствуют в концентрации от около 0,5% до около 7,5% масс./масс. ОГМ. В некоторых вариантах осуществления ОГМ в композиции присутствуют в концентрации от около 1,0% до около 2,0% масс./масс. ОГМ. В некоторых вариантах осуществления ОГМ в очищенной композиции присутствуют в концентрации от около 2,0% до около 4,0% масс./масс. ОГМ. В некоторых вариантах осуществления ОГМ в очищенной композиции присутствуют в концентрации от около 4,0% до около 5,0% масс./масс. ОГМ. В некоторых вариантах осуществления ОГМ в очищенной композиции присутствуют в концентрации от около 5,0% до около 7,5% масс./масс. ОГМ.
[0061] В некоторых вариантах осуществления очищенная композиция ОГМ имеет осмоляльность менее чем около 2000 мОсм/кг. В некоторых вариантах осуществления очищенная композиция ОГМ содержит около 10% масс./масс. или менее глюкозы. В некоторых вариантах осуществления очищенная композиция ОГМ, полученная способами, описанными в настоящем документе, содержит 10% масс./масс. или менее галактозы. Присутствие моносахаридов, глюкозы и галактозы является результатом расщепления лактозы, и по мере снижения содержания лактозы повышается содержание моносахаридов. Хотя бóльшую часть содержащихся моносахаридов можно удалить с помощью того же процесса фильтрации, который удаляет минеральные вещества и остаточную лактозу, в очищенном продукте ОГМ остается низкое содержание моносахаридов. Однако в отличие от дисахарида-лактозы наличие этих моносахаридов не представляет клинической проблемы для подавляющего числа индивидуумов, в особенности при таких низких концентрациях.
[0062] Композиции олигосахаридов грудного молока настоящего изобретения по существу сходны как в структурном, так и в функциональном отношении с профилем ОГМ, наблюдаемым по цельному грудному молоку в популяции. Иными словами, поскольку композиции получают от пула доноров, а не от индивидуального донора, набор ОГМ будет более разнообразным, чем в композиции, полученной от любой отдельно взятой женщины. На Фиг. 5 представлены типичные хроматограммы объединенного грудного молока (A и B), пермеата грудного молока (C и D) и очищенных композиций ОГМ, полученных в соответствии со способами настоящего изобретения (E и F).
[0063] Одним из самых главных переменных факторов в разнообразии ОГМ является материнская группа крови Льюиса и, в частности, имеет ли она активный ген фукозилтрансферазы 2 (FUT2) и/или фукозилтрансферазы 3 (FUT3). При наличии активного гена FUT2 образуется фукоза с α1-2-связью, тогда как при активном гене FUT3 остатки фукозы имеют α1-4-связь. Результатом этого «секреторного статуса» по существу является то, что «секреторные типы» (т. е. люди с активным FUT2-геном) имеют значительно более разнообразный профиль ОГМ, среди которых доминируют α1-2-связанные олигосахариды, тогда как «несекреторные типы» (т. е. люди, не имеющие активного FUT2 гена) могут иметь более разнообразный набор, например α1-4-связанных олигосахаридов (по сравнению с секреторными типами), но характеризуются в целом сниженным разнообразием, поскольку не могут синтезировать основной компонент репертуара ОГМ, характерный для секреторного типа.
[0064] В некоторых вариантах осуществления пулы молока можно формировать на основе, например, секреторного статуса. То есть в некоторых вариантах осуществления может быть полезно собирать пулы молока у матерей, которые относятся к секреторному типу, отдельно от пулов молока матерей, не относящихся к секреторному типу. Пулы молока от матерей, которые относятся к секреторному типу, будут содержать большую долю α1-2-связанных ОГМ, и они могут применяться, например, для улучшения состояния кишечника или уменьшения воспаления. Пулы молока от матерей, относящихся к несекреторному типу, будут содержать гораздо более разнообразный набор α1-4-связанных олигосахаридов и они могут подходить для лечения или профилактики некоторых вирусных инфекций желудочно-кишечного тракта, включая, например, норовирусные или ротавирусные инфекции. В некоторых вариантах осуществления может быть полезно обеспечить наличие в любом пуле грудного молока, используемом для приготовления описанных в настоящем документе очищенных композиций ОГМ, определенной пропорции молока от секреторного и несекреторного типов для обеспечения максимально разнообразного и репрезентативного профиля ОГМ. Полиморфизмы FUT2 и FUT3 являются лишь типичными примерами полиморфизмов, которые можно использовать для отбора доноров для конкретных пулов. Специалисту в данной области будет понятно, что сортировку пулов молока для создания пула с определенным профилем ОГМ можно выполнить для любого полиморфизма.
[0065] Определить, относится ли мать к секреторному или несекреторному типу, можно до взятия молока, а в альтернативном или дополнительном варианте осуществления секреторный статус матери можно определить во время предварительного отбора матери для донорства и/или после получения донорского молока. Скрининг секреторного статуса является обычной процедурой и может быть выполнен любым обычным способом.
ПРИМЕНЕНИЕ ОЧИЩЕННЫХ КОМПОЗИЦИЙ ОГМ
[0066] Очищенные композиции ОГМ настоящего изобретения можно добавлять к композициям обогатителей грудного молока, к грудному молоку, к детской смеси, к не человеческому молоку и т. п. для увеличения питательной и/или иммунологической ценности. В альтернативном варианте осуществления очищенные композиции олигосахаридов грудного молока настоящего изобретения могут быть приготовлены в виде перорального раствора для употребления младенцами, детьми старшего возраста и взрослыми. В некоторых вариантах осуществления очищенные композиции ОГМ, полученные способами, описанными в настоящем документе, могут быть лиофилизированы или сублимированы или иным образом переведены в порошковую форму.
[0067] Благодаря противоинфекционным, иммуномодулирующим и пребиотическим эффектам очищенных композиций ОГМ, полученных с применением способов, описанных в настоящем документе, эти композиции находят применение в широком спектре биологических и клинических сфер. К таким способам применения относятся, без ограничений, антиадгезивное, противомикробное действие, действие в качестве модулятора ответа эпителиальных клеток кишечника, действие в качестве иммунного модулятора и/или средства защиты от некротизирующего энтероколита (NEC).
[0068] Очищенные композиции олигосахаридов грудного молока настоящего изобретения можно использовать для позитивного изменения микробиоты слизистой оболочки человека (например, желудочно-кишечного тракта или урогенитального тракта), для влияния на образование противовоспалительных медиаторов и/или для предотвращения адгезии патогенных бактерий к поверхности эпителия кишечника.
[0069] В настоящем изобретении предложен способ введения субъекту очищенной композиции ОГМ, полученной в соответствии со способом, описанным в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления субъект является недоношенным или доношенным младенцем. В некоторых вариантах осуществления субъект является ребенком. В некоторых вариантах осуществления субъект является взрослым. В некоторых вариантах осуществления композицию вводят местно, перорально или ректально. В некоторых вариантах осуществления композицию вводят перорально посредством зонда для искусственного кормления.
[0070] В некоторых вариантах осуществления очищенную композицию ОГМ настоящего изобретения можно вводить до, в течение или после обработки другим активным агентом. Например, очищенную композицию ОГМ можно вводить в качестве части курса терапии антибиотиками, противовирусными, противогрибковыми и/или пробиотическими агентами и в комбинации с антибиотиками и пробиотическими агентами. В одном варианте осуществления очищенную композицию ОГМ можно вводить в связи с химиотерапией или радиационной терапией.
[0071] В некоторых вариантах осуществления очищенные композиции ОГМ, полученные с применением способов, описанных в настоящем документе, оказывают синергетический эффект при введении в комбинации с антибиотиками. В некоторых вариантах осуществления очищенные композиции ОГМ можно вводить в сочетании с фекальным трансплантатом или их можно вводить субъекту, которому вводится, планируется вводить или недавно введен фекальный трансплантат.
[0072] В настоящем изобретении предложены способы лечения субъекта, имеющего инфекцию или подвергающегося риску развития инфекции, каковые способы включают введение субъекту очищенной композиции олигосахаридов грудного молока. В некоторых вариантах осуществления симптомы инфекции вызваны бактериями, бактериальными токсинами, грибками или вирусами. В некоторых вариантах осуществления субъект является человеком. В некоторых вариантах осуществления инфекция вызвана бактериями. В некоторых вариантах осуществления бактерии представляют собой Clostridium difficile. В некоторых вариантах осуществления инфекция вызвана вирусом. В некоторых вариантах осуществления вирус представляет собой норовирус или ротавирус. В другом варианте осуществления вирус представляет собой геморрагический вирус, вызывающий симптомы в результате воспалительной вспышки. В некоторых вариантах осуществления вирус представляет собой вирус Эбола или вирус другой геморрагической лихорадки. В некоторых вариантах осуществления субъект является человеком: новорожденным, младенцем, ребенком или взрослым. В некоторых вариантах осуществления лечение включает облегчение по меньшей мере одного симптома инфекции. В некоторых вариантах осуществления лечение включает стимулирование развития полезных кишечных бактерий. В некоторых вариантах осуществления полезные кишечные бактерии представляют собой одну или более из бифидобактерий, молочнокислых бактерий, стрептококков или энтерококков.
[0073] В некоторых вариантах осуществления очищенную композицию ОГМ настоящего изобретения можно вводить нуждающемуся в этом субъекту в качестве противовоспалительного агента. В некоторых вариантах осуществления требующий лечения субъект находится в состоянии воспаления. В некоторых вариантах осуществления субъект болен аутоиммунным заболеванием. В некоторых вариантах осуществления субъект болен колитом. В некоторых вариантах осуществления субъект болен язвенным колитом. В некоторых вариантах осуществления субъект болен паучитом. В некоторых вариантах осуществления у субъекта имеется болезнь Крона. В некоторых вариантах осуществления у субъекта имеется аутоиммунное заболевание.
[0074] В некоторых вариантах осуществления очищенные композиции ОГМ, полученные в соответствии со способами настоящего изобретения, можно применять в связи с трансплантацией. В некоторых вариантах осуществления очищенная композиция ОГМ снижает риск отторжения или возникновения реакции трансплантата против хозяина в организме пациента, которому проводят трансплантацию. В некоторых вариантах осуществления трансплантат представляет собой трансплантат солидного органа, а в некоторых вариантах осуществления трансплантат представляет собой трансплантат костного мозга.
ПРИМЕРЫ
[0075] Пример 1. производство олигосахаридов грудного молока
[0076] Способ получения очищенной композиции ОГМ начинается с пермеата, описанного выше, который размораживали и объединяли. Начальная температура пермеата составляла от 23°C до 28°C. Значение pH пермеата доводили до 4,3-4,7 (при целевом уровне 4,5) добавлением 1Н раствора HCl и перемешивали в течение около 15 минут. После этого пермеат нагревали до температуры от около 48°C до около 55°C, предпочтительно 50°C. Для расщепления лактозы на моносахариды добавляли фермент лактазу (0,1% масс./масс.), после чего раствор перемешивали в течение около 60 минут. Затем смесь пермеат/лактаза охлаждали до температуры от около 20°C до около 30°C, предпочтительно 25°C и очищали пропусканием через пористый фильтр (CUNO60SP). Для удаления лактазы из очищенного фильтром CUNO технологического потока использовали ультрафильтрационную мембрану (Biomax-50K). Пермеат, собранный на выходе Biomax-50K, концентрировали с помощью нанофильтрационной мембраны с номинальным отсеканием по молекулярной массе 400-500 (GE G-5 UF). Процесс концентрирования при помощи G-5 UF завершался, когда концентрат пермеата (PC) достигал целевой концентрации 5% (масс./масс.) олигосахаридов грудного молока. Перед розливом полученный PC пастеризовали и очищали с помощью стерильных фильтров с размером пор 0,2 мкм. PC хранили в контейнерах при ≤ -20°C, маркировали и упаковывали перед транспортировкой продукта. Данные способы представлены на Фиг. 1. Альтернативный способ показан на Фиг. 2.
[0077] Пример 2. переработка концентрата пермеата (PC) в концентрат-концентрат пермеата (PC-C)
[0078] Замороженный концентрат пермеата (≥ 8X, обозначается как «PC»), полученный в соответствии с примером 1, разморозили и объединили в пул с поддержанием температуры в диапазоне от около 20°C до около 30°C, предпочтительно 25°C и перемешивали в течение около 10 минут. PC дополнительно концентрировали посредством ультрафильтрации, например с использованием GE G-5 UF, для достижения целевой концентрации ≥ 20X. Концентрат-концентрат пермеата (PC-C) переносили в контейнеры для хранения молока и хранили в морозильнике при температуре ≤ -20°C для продолжения обработки в более позднее время. Данный способ графически представлен на Фиг. 3.
[0079] Пример 3. Состав ОГМ
[0080] PC-C размораживали и объединяли в пул при температуре в диапазоне от около 20°C до около 30°C, предпочтительно 25°C. К PC-C добавляли расчетное количество P2-OneA или очищенной воды для достижения конечной целевой концентрации 5% масс./масс. ОГМ. Эта стадия не требуется, если не требуется коррекция концентрации ОГМ в образце PC-C. Данный способ представлен на Фиг. 4 (А).
[0081] Пример 4. окончательная пастеризация контейнера и фильтрация
[0082] Если концентрированные ОГМ были заморожены, их размораживали до температуры от около 20°C до около 30°C, предпочтительно 25°C. Далее пастеризовали около 30 минут при температуре ≥ 63°C. После пастеризации концентрированные ОГМ охлаждали до температуры от около 20°C до около 30°C, предпочтительно 25°C, для очистки пропусканием через стерильные фильтры с размером пор 0,2 микрона, затем хранили при температуре от около 2°C до около 8°C. Отбирали репрезентативный образец для визуального осмотра, определения общего содержания ОГМ, pH, осмоляльности, минеральных веществ и сахара.
[0083] После получения результатов по общему содержанию ОГМ на основе этих результатов вычисляли объем для розлива с целью достижения целевого диапазона ОГМ для каждой дозы.
[0084] После получения результатов по ОГМ и формирования этикеток продукт извлекали из холодильника и перемещали в чистую комнату стандарта ISO 8. К каждой бутылке прикрепляли этикетку и каждую маркированную бутылку помещали в воздухонепроницаемый пакет или в воздухонепроницаемый флакон, защищенный от несанкционированного вскрытия, и помещали в ящик. После заполнения ящика ящик упаковывали в двойной мешок и возвращали в морозильник, где продукт выдерживали при температуре ≤ -20°C до готовности к транспортировке. Данный способ графически представлен на Фиг. 4 (В).
[0085] Пример 5. спецификация готового изделия: очищенного олигосахарида грудного молока (ОГМ)
[0086] Срок годности и условия хранения: срок годности составлял один год от даты пастеризации минус один день; условия хранения: в морозильнике при температуре -20°C или ниже.
[0087] Один репрезентативный образец отбирали из одного из контейнеров после стерильной фильтрации на стадии очистки через фильтры с размером пор 0,2 микрона. Образец подвергали визуальной проверке, определяли рН, осмоляльность, профиль сахаров, содержание минеральных веществ и общее содержание ОГМ. Результаты этого исследования сведены в таблицу 2.
Таблица 2. Результаты испытания контроля качества очищенной композиции ОГМ
[0088] Аттестационное испытание бионагрузки готового контейнера
Репрезентативные образцы отбирали в процессе розлива. Для каждой конечной разливаемой партии требовался лишь один образец для анализа бионагрузки. Например: если одна (1) конечная разливаемая партия использовалась для получения целевых доз 0,1Х и 0,2X, то отбирали только один (1) образец, представляющий разлитые целевые дозы 0,1X и 0,2X. Результаты этого испытания представлены в таблице 3.
Таблица 3. Испытание бионагрузки для очищенного продукта ОГМ
1
Если результат составляет ≥ 100 КОЭ/мл, это указывает на исключительную ситуацию и испытаниям подвергаются два (2) дополнительных образца. Итоговый указанный результат представляет собой усредненное значение для трех образцов.
2
Если результат составляет ≥ 100 КОЭ/мл, это указывает на исключительную ситуацию и испытаниям подвергаются два (2) дополнительных образца. Итоговый указанный результат представляет собой усредненное значение для трех образцов.
[0089] Пример 6. Оценка биодоступности и биологической активности очищенных ОГМ
[0090] Для оценки биодоступности и потенциального влияния на иммунную систему очищенной композиции ОГМ, полученной способом настоящего изобретения и описанной в предыдущих примерах, было проведено исследование начальной фазы с контролируемой повышающейся дозой у 32 здоровых взрослых людей в возрасте от 18 до 50 лет.
[0091] Испытуемым субъектам перорально вводили очищенный концентрат ОГМ, полученный способами, описанными в предыдущих примерах, три раза в день в течение семи дней подряд (дни 1-7). Четыре отдельные группы испытуемых мужского и женского пола получали очищенную композицию ОГМ в следующих концентрациях: 0,1x, 0,2x, 0,5x и 1x, где x представляет собой суммарную массу ОГМ, рассчитанную на взрослого человека массой 70 кг, исходя из концентрации в грудном молоке и дозы, которую получает преждевременно родившийся младенец в расчете на его массу тела. В настоящее время это количество составляет 0,75 г/кг, исходя из объема потребления для младенцев, составляющего 150 мл/кг/сут. В результате взрослый человек массой 70 кг, получающий дозу 1х, получит 52,5 г очищенной композиции ОГМ, приготовленной как описано в настоящем документе.
[0092] У всех субъектов выполнялись заборы образцов крови, мочи, кала и слюны, а у субъектов женского пола также вагинальных мазков — в дни -1 (где день 1 — это первый день приема очищенной композиции ОГМ), 7, 14 и 28. Мочу, кровь и кал анализировали на наличие исходного ОГМ, 3-сиалиллактозы, а также основных компонентов ОГМ: глюкозы, фукозы, N-ацетилглюкозамина и сиаловой кислоты. Исходная интактная ОГМ, 3-сиалиллактоза, была обнаружена только в моче, что указывает на рециркуляцию ОГМ, однако продукты расщепления ОГМ обнаруживались и в моче, и в крови, и в кале (Фиг. 6), что подтверждает биодоступность очищенной композиции ОГМ при пероральном приеме.
[0093] Чтобы определить, является ли перорально введенная в данном исследовании очищенная композиция ОГМ биологически активной и, в частности, оказывала ли очищенная композиция ОГМ физиологический эффект на системные маркеры воспаления, был проведен анализ сыворотки на эйкозаноиды. Эйкозаноиды представляют собой разнородное семейство иммунных активаторов, продуцируемых при воздействии фосфолипазы A на фосфолипиды клеточной мембраны (см. Фиг. 7 (А)), и повышение их содержания в сыворотке представляет собой показатель иммунного ответа.
[0094] Как показано на Фиг. 7 (В) и (С), в сыворотке испытуемых субъектов присутствовал пониженный уровень эйкозаноидов и их метаболитов, и это снижение со временем становилось все более значимым, что указывает на то, что очищенные композиции ОГМ не только биологически доступны, но и биологически активны и способны к снижению общих воспалительных признаков у субъектов, получающих композицию.
[0095] Для дальнейшей проверки этой биологической активности было также проанализировано содержание в сыворотке метаболитов сфинголипидного метаболизма, которые являются еще одним маркером воспаления. Как показано на Фиг. 8, как и в случае с эйкозаноидами, у субъектов, получающих очищенные композиции ОГМ, полученные с помощью способов, описанных в настоящем документе, также снижаются уровни нескольких метаболитов сфинголипидов.
[0096] Таким образом, в настоящем документе впервые предложен способ эффективного получения очищенных композиций ОГМ, которые обеспечивают полный комплемент ОГМ при существенном снижении содержания лактозы и/или минеральных веществ. Более того, данная новая очищенная композиция ОГМ, как показано в настоящем документе, является как биологически доступной, так и биологически активной, оказывая заметные эффекты на иммунную систему.
1. Bao Y, Zhu L, Newburg DS. Simultaneous quantification of sialyloligosaccharides from human milk by capillary electrophoresis. Anal Biochem. 2007;370:206-214.
2. Bode, L. Human milk oligosaccharides: Every baby needs a sugar mama. Glycobiology. 2012 Sep; 22(9): 1147-1162. Published online 2012 Apr 18.
3. 14. Bode, et al. (2016) Nutritional Reviews, 74(10):635-644
4. Chaturvedi P, Warren CD, Altaye M, Morrow AL, Ruiz-Palacios G, Pickering LK, Newburg DS. Fucosylated human milk oligosaccharides vary between individuals and over the course of lactation.Glycobiology. 2001;11:365-372.
5. Coppa GV, Pierani P, Zampini L, Carloni I, Carlucci A, Gabrielli O. Oligosaccharides in human milk during different phases of lactation. Acta Paediatr. 1999;88:89-94.
6. Davidson B, Meinzen-Derr JK, Wagner CL, Newburg DS, Morrow AL. Fucosylated oligosaccharides in human milk in relation to gestational age and stage of lactation. Adv Exp Med Biol. 2004;554:427-430.
7. Gabrielli O, Zampini L, Galeazzi T, Padella L, Santoro L, Peila C, Giuliani F, Bertino E, Fabris C, Coppa GV. Preterm milk oligosaccharides during the first month of lactation. Pediatrics.2011;128:e1520-1531.
8. German, JB et al. Nestle Nutr Workshop Ser Pediatr Program. 2008. 62:205-18.
9. Grandison, et al (2002) Songklanakarin J. Sci. Technol. 24(Suppl):91-928.
10. Kunz C, Rudloff S, Baier W, Klein N, Strobel S. Oligosaccharides in human milk: Structural, functional, and metabolic aspects. Annu Rev Nutr. 2000;20:699-722.
11. Kunz C, Rudloff S, Schad W, Braun D. Lactose-derived oligosaccharides in the milk of elephants: Comparison with human milk. Br. J. Nutr. 1999;82:391-399.
12. Kunz et al. “Bioactivity of Human Milk Oligosaccharides” page 5 in Food Oligosaccharides: Production, Analysis and Bioactivity, First Edition. Edited by Dr. F. Javier Moreno and Dr. Mar´ıa Luz Sanz
13. Morrow Ruiz-Palacios GM, Jiang X, Newburg DS., Human-milk glycans that inhibit pathogen binding protect breast-feeding infants against infectious diarrhea. J. Nutr. 135:1304-07, 2005.
14. Newburg DS, Shen Z, Warren CD. Quantitative analysis of human milk oligosaccharides by capillary electrophoresis. Adv Exp Med Biol. 2000;478:381-382.
15. Sarney, et al (2000) Biotechnol. Bioeng. 69:461-467
16. Morgan et al. (2015) J Food Comp and Anal., 42:30-37.
17. Ward (2009) Open Glycoscience 2: 9-15
18. Zivkovic, et al (2011) Proc. Natl. Acad. Sci., 108(s1):4653-4658.