СПОСОБ ВИДОВОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ РЫБ СЕМЕЙСТВА ТРЕСКОВЫХ МЕТОДОМ ПЦР В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ
METHOD FOR SPECIES IDENTIFICATION OF FISH OF THE CODD FAMILY BY PCR IN REAL TIME

Gadidae
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к молекулярной диагностике, и может быть использовано в пищевой промышленности для видовой идентификации рыб семейства тресковых () в пищевых продуктах и продовольственном сырье.
Cуществуют стандарты, регламентирующие видовую идентификацию рыб, в том числе семейства тресковых способами электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях [ГОСТ Р 54414-2011 Видовая идентификация рыбы методом электрофореза с додецилсульфатом натрия в полиакриламидном геле. Москва, Стандартинформ, 2013.], изоэлектрофокусировки [ГОСТ Р 52840-2007 Видовая идентификация рыбы методом изоэлектрофокусирования в полиакриламидном геле. Москва, Стандартинформ, 2008.] и секвенирования [ГОСТ 34106-2017 Метод секвенирования фрагментов митохондриального генома животных и рыб для определения видовой принадлежности в однокомпонентной продукции. Москва, Стандартинформ, 2017.].
Однако, эти способы по сравнению с ПЦР в режиме реального времени более трудоемки и времязатратны, требуют наличия у персонала специальных навыков, более сложного оборудования и наличия стандартных образцов для каждого вида рыб.
Известен подход к видовой идентификации тресковых рыб [Namikoshi, A., Takashima, Y., Iguchi, J., Yanagimoto, T., &Yamashita, M. (2011). Species identification of Alaska pollock, Gadus spp., and Micromesistius spp. in cod roe products using a PCR-based method.FisheriesScience, 77(4), 671-678.], основанный на детекции видоспецифической ДНК методом ПЦР. Тест-системы, описанные в этой научной работе, в качестве метода регистрации результата используют гель-электрофорез, что существенно усложняет анализ и увеличивает время, необходимое для его проведения.
Технической задачей настоящего изобретения является идентификация рыб семейства тресковых с помощью обнаружения специфических ДНК методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов ПЦР в режиме «реального времени».
Способ основан на выявлении специфических участков генапантофизина, NADH-дегидрогеназы, АТФазы 6 и родопсина с помощью синтетических олигонуклеотидных праймеров и зондов. Разработанные олигонуклеотиды имеют следующие последовательности:
Последовательность (5'-3')
Размер ампликона, п.н.
Ген-мишень
№№ в базе данныхGenBank
Треска тихоокеанская (Gadus macrocephalus)F: ATGTGTCAGATTATACCAGTTAATTCR: GTTGGTTAAATTGTATAACAAGGAPr: FAM-TCTGGGCGTGACCTCAACACTA-BHQ1
169
NADH-дегидрогеназа
EU729423.1
Треска атлантическая (Gadus morhua)F: CAATGTTAATGTTTCTCCTACTTTR: TGACGAAGTGTAGTTGCCAAPr: ROX-CAGCATCCTTACCAAGTCCCTACC-BHQ2
108
пантофизин
AF288943.1
Минтай (Gadus chalcogrammus)F: GCAATGTTAATGTTTCTCCTACTR: AGTTAGTTGCCAATAAGGAAAGPr: FAM-CAGCATTCTTACACAGTCCCTACCT-BHQ1
101
пантофизин
AY292495.1
Пикша (Melanogrammus aeglefinus)F: AATTTAGGCTTAGCTGTTCCR: GAATTAGAGCTGTAGGGGTGPr: ROX-TAGCAACTGTTCTTATTGGAATACGAA-BHQ2
115
АТФаза 6
DQ010963.1
Путассу (Micromesisteus poutassou)F: ACTCTCCTGGTTGATTGATATTR: CTATACAGGTGTTGGAAGCCPr: FAM-CTTGTTTCTTAGATTGATGCAGCATT-BHQ1
240
пантофизин
AY292496.1
Сайда (Pollachius virens)F: GTTTGTGCTATCATACCCATCR: GGACTTTGTAAGAATGCTGCPr: ROX-CTCCTAAATCGTGGCTGGTTGA-BHQ2
138
пантофизин
AY292491.1
Мерланг (Merlangius merlangus)F: TACACCCGCGCTGAGGR: GTAGATGGACGAGGACTTGGPr: FAM-AGATGGGACCGAAGACGCTG-BHQ1
330
родопсин
EU492056.1
Для проведения ПЦР используют геномную ДНК рыб. Для выделения ДНК используют готовые наборы реактивов, предназначенные для работы с пищевыми продуктами и продовольственным сырьем. Выделение ДНК осуществляют из кусочков филе рыб или образца продукта питания, не имевших контакта с внешней средой (с целью избежать возможной исходной контаминации чужеродной ДНК) в соответствии с протоколом (инструкцией по применению), рекомендованным производителем.
Оценку чистоты полученных препаратов ДНК производят спектрофотометрическим методом с помощью спектрофотометра, позволяющего измерять оптическую плотность при длинах волн 260 и 280 нм. Для анализа используют препараты ДНК с соотношением оптической плотности при длинах волн 260 нм и 280 нм (A260/A280) в пределах 1,8-2,0. Полученные препараты ДНК хранят в морозильной камере при −20°С до использования.
Для проведения ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов ПЦР в режиме «реального времени» используют амплификатор нуклеиновых кислот, позволяющий осуществлять термоциклирование и одновременную регистрацию флуоресцентного сигнала в режиме «реального времени» в формате микропробирок, микрочипов или микропланшетов.
Разработанный состав смеси для ПЦР и концентрации отдельных компонентов представлены в таблице.
Компонент
Концентрация
Объем, мкл
Конечная концентрация в реакции (25 мкл)
Смесь дНТФ (дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ)
2,5 ммоль/ дм<sup>3</sup> каждого дНТФ
2,5
250 мкмоль/дм<sup>3</sup>
Прямой праймер
5 пмоль/см<sup>3</sup>
2
0,4 пмоль/ см<sup>3</sup>
Обратный праймер
5 пмоль/ см<sup>3</sup>
2
0,4 пмоль/ см<sup>3</sup>
ДНК-зонд
2,5 пмоль/ см<sup>3</sup>
2
0,2 пмоль/ см<sup>3</sup>
ПЦР-буфер c MgCl<sub>2</sub>
10x
2,5
1x
Термостабильная ДНК-полимераза (Taq) с горячим стартом
5 Е/мкл
0,5
2,5 Е/реакция
Вода деионизованная
-
4,5
-
ДНК исследуемого образца
-
9
- (36% конечного объема реакции)
Объем реакции может быть масштабирован в соответствии с типом используемого оборудования (амплификатора нуклеиновых кислот).
Для корректной работы тест-систем используется следующая программа термоциклирования:
Первичная денатурация - 120с при 94°С с последующим циклированием: денатурация - 5с при 94°С, отжиг праймеров и элонгация - 30с при 60°С (45 циклов). Регистрация сигнала осуществляется после прохождения этапа отжига праймеров и элонгации.
Результаты интерпретируют на основании наличия/отсутствия пересечения кривойфлуоресценции с установленной пороговой линией (Threshold) и значения порогового цикла, рассчитываемого программным обеспечением амплификатора, следующим образом:
Melanogrammus aeglefinus
1. ДНК тресковых рыб (кроме пикши, ) считают обнаруженной, если для соответствующей пробирки/реактора значение порогового цикла не превышает 30.
Melanogrammus aeglefinus
2. ДНК пикши () считают обнаруженной, если одновременно выполняются следующие условия:
Melanogrammus aeglefinus
- для пробирки/реактора с тест-системой для определения пикши () значение порогового цикла не превышают 30;
Micromesisteus poutassou
Pollachius virens
- в пробирках/реакторах с тест-системами для определения путассу () и сайды () флуоресцентный сигнал не регистрируется или значения порогового цикла превышают 30.
Melanogrammus aeglefinus
3. ДНК тресковых рыб (кроме пикши, ) считают не обнаруженной, если для соответствующей пробирки/реактора флуоресцентный сигнал не регистрируется или значение порогового цикла превышает 30.
Melanogrammus aeglefinus
4. ДНК пикши () считают не обнаруженной, если выполняется хотя бы одно из следующих условий:
Melanogrammus aeglefinus
- для пробирки/реактора с тест-системой для определения пикши () флуоресцентный сигнал не регистрируется или значение порогового цикла превышают 30;
Melanogrammus aeglefinus
Pollachius virens
- одновременно регистрируется флуоресцентный сигнал со значением порогового цикла, не превышающим 30, в пробирках/реакторах с тест-системами для определения пикши () и сайды ();
Melanogrammus aeglefinus
Micromesisteus poutassou
- одновременно регистрируется флуоресцентный сигнал со значением порогового цикла, не превышающим 30, в пробирках/реакторах с тест-системами для определения пикши () и путассу ().
Разработанный способ видовой идентификации тресковых рыб по сравнению с существующими методами обладает следующими преимуществами:
- возможность идентификации основных промысловых видов тресковых рыб;
- идентификация всех заявленных видов тресковых рыб в рамках одного анализа за счет оптимизированных последовательностей специфических олигонуклеотидов и унифицированной программы термоциклирования;
- ускоренное по сравнению с существующими способами получение результата анализа.
--->
Перечень последовательностей
<110> Общество с ограниченной ответственностью "ГенБит"
<120> СПОСОБ ВИДОВОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ РЫБ СЕМЕЙСТВА ТРЕСКОВЫХ МЕТОДОМ ПЦР
В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ
<140> 2020133599
<141> 13.10.2020
<160> 21
<210> 1
<211> 26
<212>ДНК
Gadus macrocephalus
<213>
<400> 1
atgtgtcagattataccagttaattc
<210>2
<211> 24
<212>ДНК
Gadus macrocephalus
<213>
<400> 2
gttggttaaattgtataacaagga
<210>3
<211> 22
<212>ДНК
Gadus macrocephalus
<213>
<400>3
tctgggcgtgacctcaacacta
<210> 4
<211> 24
<212>ДНК
Gadus morhua
<213>
<400> 4
caatgttaatgtttctcctacttt
<210>5
<211> 20
<212>ДНК
Gadus morhua
<213>
<400> 5
tgacgaagtgtagttgccaa
<210>6
<211> 24
<212>ДНК
Gadus morhua
<213>
<400> 6
cagcatccttaccaagtccctacc
<210> 7
<211> 23
<212>ДНК
Gadus chalcogrammus
<213>
<400> 7
gcaatgttaatgtttctcctact
<210>8
<211> 22
<212>ДНК
Gadus chalcogrammus
<213>
<400> 8
agttagttgccaataaggaaag
<210> 9
<211> 25
<212>ДНК
Gadus chalcogrammus
<213>
<400> 9
cagcattcttacacagtccctacct
<210> 10
<211> 20
<212>ДНК
Melanogrammus aeglefinus
<213>
<400>10
aatttaggcttagctgttcc
<210>11
<211> 20
<212>ДНК
Melanogrammus aeglefinus
<213>
<400>11
gaattagagctgtaggggtg
<210>12
<211> 27
<212>ДНК
Melanogrammus aeglefinus
<213>
<400>12
tagcaactgttcttattggaatacgaa
<210>13
<211> 22
<212>ДНК
Micromesisteus poutassou
<213>
<400>13
actctcctggttgattgatatt
<210>14
<211> 20
<212>ДНК
Micromesisteus poutassou
<213>
<400>14
ctatacaggtgttggaagcc
<210>15
<211> 26
<212>ДНК
Micromesisteus poutassou
<213>
<400> 15
cttgtttcttagattgatgcagcatt
<210>16
<211> 21
<212>ДНК
Pollachius virens
<213>
<400> 16
gtttgtgctatcatacccatc
<210>17
<211> 20
<212>ДНК
Pollachius virens
<213>
<400> 17
ggactttgtaagaatgctgc
<210>18
<211> 22
<212>ДНК
Pollachius virens
<213>
<400> 18
ctcctaaatcgtggctggttga
<210>19
<211> 16
<212>ДНК
Merlangius merlangus
<213>
<400>19
tacacccgcgctgagg
<210>20
<211> 20
<212>ДНК
Merlangius merlangus
<213>
<400>20
gtagatggacgaggacttgg
<210>21
<211> 20
<212>ДНК
Merlangius merlangus
<213>
<400>21
agatgggaccgaagacgctg
<---