СПОСОБ БЫСТРОГО ВЫРАЩИВАНИЯ, ДЕТЕКЦИИ И ИДЕНТИФИКАЦИИ ИЛИ ПОДСЧЕТА МИКРОКОЛОНИЙ МИКРООРГАНИЗМОВ РАННЕЙ СТАДИИ
METHOD FOR QUICK GROWTH, DETECTION AND IDENTIFICATION OR COUNTING OF MICROCOLONIES OF MICROORGANISMS AT EARLY STAGE

ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[0001] Настоящая заявка утверждает приоритет к заявке США Ser. No.60/896,321 с названием “Detection and Identification of Microorganisms on Transparent Permeable Membranes” которая приводится здесь полностью.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Область применения изобретения
[0002] Настоящее изобретение относится в основном к области биологии, в частности к области быстрого определения, идентификации и подсчета микроколоний микроорганизмов.
2. Описание предшествующих достижений
[0003] Современный микробиологический анализ основывается на двух основных направлениях: 1) анализ без предварительного подроста и 2) анализ после предварительного подроста. Первое направление включает группу иммунологических методов [в том числе иммунофлуоресценцию, радиоиммуноанализ, иммуно-ферментный анализ (ИФА) для одной клетки]; группу методов базирующихся на ДНК/РНК анализе c помощью Цепной Полимеразной Реакции (ЦПР) и группу методов Проточной Цитометрии [определение одной клетки после метки флуоресцентными антителами или флуорогенными субстратами]. Искусственные субстраты также используются для анализа клеток в микроскопии. Тем не менее, некоторые из этих методов (ЦПР и иммунологические методы) не способны определять живые клетки. Проточная Цитометрия в комбинации с искусственными (в основном флуорогенными) субстратами способна определять живые клетки, но очень дорога и требует труда высококвалифицированных специалистов и концентрированных образцов. Несмотря на это, дешевый и эффективный метод определения живых клеток в различных медицинских, биотехнологических, пищевых, сельскохозяйственных, фармацевтических, природных и военных образцах все еще необходим для человеческих потребностей. Вместе с тем, часто используемые тесты с применением клеток в микробиологии [хроматография жирных кислот, иммуно-ферментный анализ (ИФА), масс-спектрометрия, Фурье преобразующая инфракрасная спектроскопия и иммуно-тестирование], все нуждаются в предварительном подросте колоний микроорганизмов, что представляет собой по меньшей мере однократное длительное культивирование начальное клетки прежде чем определение и идентификация могут быть применимы.
[0004] Несмотря на эти высоко-технические возможности обычный рост на чашках Петри все еще наиболее распространенный метод определения микроорганизмов, присутствующих в образце. Типичный анализ требует нескольких 10-кратных разведений образца с последующим нанесением одного миллилитра разведенного образца равномерно по поверхности питательного агара. Количество 10-кратных разведений обычно бывает в последовательности от одного до двенадцати с тем чтобы нанести разведения на чашку Петри и найти наиболее подходящее для подсчета колоний. Для этого может потребоваться от нескольких до двенадцати чашек Петри. На практике, подходящим разведением считается такое, когда количество подсчитываемых колоний не превышает 250, что рекомендовано FDA. Чашки инкубируют 24-48 часов для бактерий и 72-120 часов для грибков с тем, чтобы достичь указанного количества. Это относительно длительное время необходимо для сформирования колоний хорошо видимых невооруженым глазом. Вместе с тем, если образец относится к важному по времени биозагрязнению или пациент находится в критическом состоянии когда время важно - длительная инкубация и серийные разведения могут быть существенным недостатком с потенциально опасными для жизни последствиями.
[0005] Колонии, появляющиеся на плотной питательной среде, подсчитываются для определения и посчета общего микробного роста или переносятся и анализируются в соответствии с обычными микробными методами, масс-спектрометрией, Фурье-преобразующей инфракрасной спектроскопией, хроматографией, иммуноанализом или ЦПР.
[0006] Снятие подозрительной колонии и последующий анализ этой колонии длительными и громоздкими традиционными методами или сложными и дорогими высокотехнологичными методами и инструментами привело к изобретению CHROMagar™ питательных сред, содержащих специальные вещества, субстраты, и антибиотики, которые позволяют рост с одновременной специфической окраской колоний. The CHROMagar™ Candida, CHROMagar™ O157, CHROMagar™ Salmonella, CHROMagar™ Staph. aureus и некоторые другие в настоящее время используется для идентификации колоний по розовому, зеленому, или синему цвету. Вещества, инициирующие окраску, накапливаются в телах клеток, что вызывает проблемы их роста. Поэтому колонии являются нетипично мелкими и очень часто нуждаются в продолжительной инкубации. Только колонии обычного размера могут быть обнаружены по цвету т.к. цвет достаточно бледный, и небольшое поглощение света бесполезно при микроскопии. Это означает, что микроколонии (ранняя стадия формирования колонии) не могут быть обнаружены с использованием CHROMagar™. Только определенные важные виды и некоторое количество других видов могут расти на CHROMagar™. Поэтому CHROMagar™ бесполезен для полного (Общее Число Живых Организмов) обнаружения и подсчета, которое наиболее часто используется в микробиологии.
[0007] В целом, рост на чашках Петри это обычная микробиологическая операция, используемая в медицинских, промышленных, биотехнологических, исследовательских и фармацевтических лабораториях. Во всем мире сотни миллионов анализов выполняются этим методом каждый год. Таким образом, существует огромная потребность в более эффективном, дешевом, точном и быстром анализе для обнаружения, идентификации и подсчете микробов.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0008] В настоящем описании приводится одно или более воплощений устройства, метода и материала, которые превосходят недостатки предшествующей технологии. В частности, настоящее описание делает это с помощью устройства для обнаружения, идентификации, или подсчета микроорганизмов, который включает контейнер с питательной средой для того, чтобы обеспечить питательными веществами рост микроорганизмов и пористый элемент, или пористую мембрану находящуюся в контакте с питательной средой. Сам пористый элемент позволяет питательным веществам проходить сквозь него, чтобы поддержать рост и для колоний обычного размера и для микроколоний (вместе называемые "колонии"). И пористый элемент может быть перенесен из контейнера в другие места для последующей обработки индикаторами и для дальнейшего визуального анализа.
[0009] Поскольку колонии могут быть перенесены с при помощи пористого элемента, рост и окраска с помощью индикатора для клеток и микроколоний могут быть разделены для оптимального результата: стадия роста для быстрого роста клеток без вредных индикаторов тормозящих рост, и стадия индикатора для окраски и идентификации, которая позволяет микроколониям быть обнаруженными быстро. Кроме того, если клетки анализируются в ранней стадии микроколоний, в соответствии с настоящим изобретением, тогда последовательные разведения намного менее необходимы. Таким образом, настоящее изобретение превосходит ограничения общепринятого метода, для которого необходимы колонии обычного размера и длительная инкубация например, как при использовании CHROMagar, после серийных разведений предотвращающих прорастание колоний друг на друге. С малым количеством разведений или без разведений, в соответствии с настоящим изобретением, результаты получаются быстрее, и ресурсы лаборатории экономятся. В частности, пористый элемент может быть перемещен вместе с колониями или на пористый элемент или на питательную среду выше другого пористого элемента для последующих шагов и широкого спектра обработки включая биохимические индикаторы или ручное или автоматическое визуальное определение, подсчет или анализ образа (анализ по форме), которое хорошо видно в обычном световом микроскопе. Чтобы инокулировать образец на питательную среду или на пористый элемент, пористый элемент имеет свойство, которое позволяет жидкой части образца быть пропущенным вниз контейнера. Далее, чтобы обеспечить рост клеток осажденных из образца, пористый элемент имеет особенность позволяющую питательным веществам питательной среды сообщаться через эту особенность с клетками. Затем, чтобы позволить клеткам быть обработанными индикатором, пористый элемент имеет особенность, которая позволяет биохимическим индикаторам, типа различных красок или антительным конъюгатам сообщаться через это свойство с клетками, одновременно поддерживая клетки и микроколонии в целостности на пористой мембране, не распадаясь и не размывая микроколонии. Наконец, чтобы позволить клеткам и микроколониям быть осмотренными, пористый элемент является прозрачным.
[0010] Существуют два возможных положения пористого элемента на питательной среде. В первом варианте, пористый элемент расположен сверху питательной среды и не покрыт никакими последующими слоями среды. Чтобы совершать транспортировку клеток, пористая мембрана в этом воплощении не имеет пористости большей, чем наименьшая клетка, с тем чтобы удержать клетки на пористом элементе. Так, когда пористый элемент переносится с питательной среды для последующего анализа, клетки и колонии переносятся вместе с ним. Это первое воплощение полезно для флуоресцентного анализа, так как пористый элемент не имеет собственной фоновой флуоресценции. Во втором воплощении пористый элемент устанавливается сверху питательного слоя и затем покрывается дополнительной средой. В этом воплощении клетки и микроколонии остаются сверху дополнительной среды и таким образом пористый элемент может иметь поры большего размера чем самые мелкие клетки т.к. клетки и микроколонии удерживаются на верхней поверхности дополнительной среды, сверху от пористого элемента. Следовательно, когда пористый элемент удаляется из контейнера, он переносит дополнительную среду на своей поверхности вместе с микроколониями находящимися на этой дополнительной среде. Второе воплощение полезно для свотопоглощающей окраски микроколоний, но не флуоресцентного анализа т.к. питательная среда сама имеет высокий уровень фоновой флуоресценции.
[0011] Чтобы обеспечивать надежное определение, тест система комплекта включает контейнер со средой для того, чтобы обеспечить питательные вещества, для роста микроорганизмов; водопроницаемую мембрану и вторичные среду, выбранную из группы, состоящей из: агарозы, каррагиинана, желатина или других гелей, способных пропускать молекулы индикатора, типа хромогенных субстратов, флуорогенных субстратов или флуоресцентных или радиомеченых антител.
[0012] В целом, настоящее изобретение обеспечивают намного более быстрый, более эффективный, менее дорогой способ и более надежное устройство и средства для: обнаружение общего количества жизнеспособных микроколоний или микроорганизмов (Общее Колическто Живых Организмов) с помощью интенсивно окрашенных микроколоний; дифференцирование одного типа микроколоний от другого по отчетливо видимой форме микроколоний, которая являются полуспецифичной для видов или групп видов; обнаружение и идентификация микроколоний антибиотикоустойчивых микроорганизмов; идентификация при помощи иммунофлуоресцентных или радио-меченых антител; и обнаружение, дифференцирование, и\или идентификация по светопоглощению или флуоресцентными методами. Эти и другие объекты и преимущества существующего изобретения станут очевидны для специалиста после прочтения описания основных воплощений, которые также иллюстрированы различными рисунками.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ К РИСУНКАМ
[0013] Рисунки, показанные здесь, являются частью данного описания. Рисунки иллюстрируют воплощения изобретения и, вместе с описанием, служат объяснению принципа изобретения. Должно пониматься, что рисунки, упомянутые в этом описании, показаны вне зависимости от масштаба, если это не отмечено особо.
[0014] Фиг.1 - функционально-блоковая диаграмма, иллюстрирующая пространственные и функциональные взаимоотношения воплощений пористости и структурного элемента и ростовой среды для анализа образца с клетками в растворе в соответствии с одним из воплощений настоящего изобретения.
[0015] Фиг.2А - контейнер с агаровой средой с несколькими фильтрующими элементами на ней в соответствии с одним из воплощений настоящего изобретения.
[0016] Фиг.2В - вид в разрезе нескольких воплощений среды и фильтрующего элемента, показывающих пространственные взаимоотношения в соответствии с одним воплощением настоящего изобретеия.
[0017] Фиг.3 - иллюстрирует элементы и этапы определения клеток и микроколоний с использованием среды и переносного пористого элемента в соответствии с одним из воплощений настоящего изобретения.
[0018] Фиг.4 - аннотированное изображение культуры в контейнере с агаровой средой, имеющем несколько пористых элементов вместе со вторичной средой для окрашивания в соответствии с одним из воплощений настоящего изобретения.
[0019] Фиг.5A-5H являются фотомикрографиями нескольких различных видов рода Bacillus, определенных с помощью пористого элемента и отдельной вторичной среды в соответствии с одним из воплощений настоящего изобретения.
[0020] Фиг.6 - фотомикрография видов рода Listeria, определенных с помощью пористого элемента и отдельной вторичной среды в соответствии с одним из воплощений настоящего изобретения.
[0021] Фиг.7 - фотомикрография видов рода Staphylococcus, определенных с помощью пористого элемента и отдельной вторичной среды в соответствии с одним из воплощений настоящего изобретения.
[0022] Фиг.8 - фотомикрография видов рода Escherichia, определенных с помощью пористого элемента и отдельной вторичной среды в соответствии с одним из воплощений настоящего изобретения.
[0023] Фиг.9 - фотомикрография видов рода Pseudomonas, определенных с помощью пористого элемента и отдельной вторичной среды в соответствии с одним из воплощений настоящего изобретения.
[0024] Фиг.10 - диаграмма процесса определения и идентификации клеток и микроколоний в соответствии с одним из воплощений настоящего изобретения.
ДЕТАЛЬНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0025] Описание сделано в подробностях к предпочтительным воплощениям изобретения. Примеры предпочтительного воплощения иллюстрированы сопровождающими рисунками. В то время как изобретение будет описано в привязке к предпочтительным воплощениям, понятно, что они не предназначены, чтобы ограничить изобретение только этими воплощениями. Скорее изобретение предназначено, чтобы раскрыть альтернативы, модификации и эквиваленты, которые могут быть включены в духе и возможностях изобретения, как определено в соответствии с приложенными заявлениями. Дополнительно, в настоящем детальном описании изобретения, многочисленные определенные детали сформулированы, чтобы обеспечить полное понимание настоящего изобретения. Однако очевидно для профессионала, что настоящее изобретение может быть осуществлено без этих специфических деталей. В других случаях, известные методы, процедуры, компоненты, и микробиологические детали не описываются подробно, чтобы не затенять аспекты настоящего изобретения.
Термины и разъяснения
[0026] Среда для роста. Среда для роста - это питательная среда используемая для роста микроколоний в контексте данного изобретения. Это может быть обычная среда для бактериального роста, такая как Триптиказный Соевый Агар, среда для плесени и дрожжей - Сабуро Декстрозный Агар, или среда для роста отдельных груп микроорганизмов, такая как Цетримидный Агар, используемый для роста видов рода Pseudomonas, или МакКонки Агар для выявления Грам-негативных кишечных патогенов. Ростовая среда служит основанием для пористого элемента, устанавливаемого на ее поверхности.
[0027] Микроколонии. Микроколония - это небольшая колония, появляющаяся после 3-6 часов инкубирования. Типичный размер микроколоний 10-100 µм. Они бесцветны и невидимы в обычный световой микроскоп. Даже такие как окрашенные в желтый цвет микроколонии Staphylococcus aureus, обычно не видны в световом микроскопе. Поэтому, обычно, микроколонии должны быть окрашены, чтобы стать видимыми. Большинство микробных видов производят микроколонии специфической формы в течении ранней стадии роста (3-6 часов). Достаточно часто различия в их форме столь очевидны, что дают хорошую возможность различать виды просто по форме данной колонии (см Фиг.5A-5H и 6-9). Микроколонии состоят из цепочек клеток, не связанных механически друг с другом. Поэтому и ростовая среда и вторичная среда не должны содержать свободную жидкость, иначе клетки микроколонии размоются. Все питательные жидкости и растворенные вещества связаны агарозой или иным полимерным гелем.
[0028] Мембрана. Мембрана или пористый элемент - важный материал, позволяющий рост и окраску микроколоний с тем, чтобы сделать их видимыми и исследовать их специфическую форму. Требования к мембране следующие: она должна быть прозрачна, чтобы пропускать свет, когда используется с микроскопом; должна быть проницаема для воды и питательных веществ и индикаторных веществ, находящихся во вторичной среде с тем, чтобы питать микроорганизмы в период образования микроколонии и соответственно окрашивать эти микроколонии; должна позволять молекулям индикаторов проходить насквозь и вступать в реакцию с клетками микроколоний; должна быть непроницаема для клеток (за исключением пористой мембраны со слоем среды добавленной сверху) с тем, чтобы клетки могли расти только с одной стороны мембраны; должна быть устойчива к внешним клеточным ферментам с тем, чтобы держать мембрану неповрежденной и поддерживать полупроницаемость; должна выдерживать автоклавирование, т.к. мембрана должна быть стерильна перед использованием; должна быть гидрофильна с тем, чтобы свободно пропускать воду и большинство веществ через себя - гидрофобные мембраны сильно резистентны к такого рода проникновениям; должна быть нефлуоресцирующей и бесцветной т.к. фоновая флуоресценция нетерпима при флуоресцентных методах анализа, а окраска может маскировать цвет микроколоний; не должна содержать вещества предотвращающие или подавляющие микробный рост. В дополнении, мембрана не должна содержать видимых частиц или волокон, как это имеет мембрана для фильтрования т.к. частицы и волокна затрудняют свободный рост микроколоний и способны изменить время роста и форму микроколоний (за исключением когда слоя среды находится сверху пористой мембраны). Эксперименты показали, что наилучшим полимером для этих целей является регенерированная целлюлоза и такие ее производные как целлофан, купрофан и диализная мембрана. Другие полимеры имеющие те же свойства могут быть использованы также. Многие другие типы материалов для мембраны могут быть использованы тоже: это органические и неорганические материалы с натуральными или искуственно создаными порами. Мембраны могут быть прозрачными для пропускания света для наилучшего визуального наблюдения или полупрозрачными или белыми или цветными, хотя последние обеспечивают менее желательное качество наблюдения.
[0029] Вторичная среда. Вторичная среда - это гель, полимер или BioNanoChannel™ пластина, служащие носителем для индикаторного вещества или для меченых антител. Ее основная функция быть носителем индикаторного вещества, растворенного в жидкости (воде или буферном растворе), или антител и переносить их через мембрану к микроколониям путем простой диффузии. Такие гели, как очищеный Агар (Агароза), Желатина, Каррагиинан и другие подходящие полисахариды с длинными полимерными молекулами, могут быть использованы для связывания жидкости и веществ в полутвердой форме. Простое использование жидких растворов, как индикаторов, обычно следует избегать (с понятным исключением для BioNanoChannel пластины), поскольку реальный жидкий раствор проникает через мембрану быстро и формирует большие площади, где микроколонии распадаются, теряют форму и соединяются опять вместе, образуя большой комок клеток. Меченые антитела, тем не менее, относительно большие молекулы (IgG имеют примерный размер 150,000 дальтон) и не могут освободиться из полимерной структуры геля свободно. В этом случае BioNanoChannel пластины могут быть использованы вместо упомянутых гелей. Каждая пластина состоит из миллионов мелких нано-каналов диаметром 10 µм или меньше. Так, меченые антитела в тысячи раз меньше чем нано-каналы и могут свободно передвигаться в жидкости в нано-каналах с одной стороны пластины. Когда жидкость в нано-канале, она связана сильными капилярными силами и не может свободно двигаться через мембрану и разрушать микроколонии, как это может делать свободная жидкость.
[0030] Индикаторы. В пределах настоящего изобретения, индикаторы - это вещества, способные специфично или неспецифично метить микроколонии. Это могут быть хромогенные и\или флуорогенные субстраты или их смеси и меченые антитела. Хромогенные и флуорогенные субстраты производят светопоглощающие или флуоресцирующие вещества в результате реакции со специфическими или неспецифическими ферментами или группами ферментов. Небольшие молекулы этих субстратов могут свободно покидать гель, проходить через мембрану и реагировать с ферментами живых клеток. Антитела, меченые флуорохромами или радиоизотопами и встроенные в BioNanoChannel пластину, могут свободно покидать нано-каналы и проходить через мембрану, если размеры мембраны 10^6 дальтон или больше. Не вступившие в реакцию меченые антитела удаляются путем переноса мембраны на другую BioNanoChannel пластину один или более раз.
[0031] Определение, дифференциация и идентификация. Термин «определение» в целом понимается как возможность выявить и подсчитать любые микроколонии независимо от их таксономической принадлежности. «Дифференциация» означает возможность используемого метода дифференцировать два или более видов между собой на мембране по их форме, цвету или длине волны\цвету флуоресценции. «Идентификация» означает выявление рода и вида данной микроколонии. Определение нуждается только в хромогенных или флуорогенных субстратах. Дифференциация основывается на различиях в форме или цвете микроколоний. Идентификация нуждается в использовании антител, предпочтительно моноклональных.
Детальное описание рисунков
[0032] Относительно Фиг.1, функциональная блоковая диаграмма 10 иллюстрирует пространственные и функциональные отношения двух воплощений пористости и структурного элемента и элемента ростовой среды для оценки образца с клетками в растворе в соответствии с одним из воплощением настоящей заявки. Первое воплощение использует пористость и структурный элемент 14A, который устанавливается сверху поверхности 17 ростовой среды 16 с жидкой порцией 18 В раствора образца 12, проходя фильтрующий элемент 14A вниз ростовой среды 16 в направлении дна контейнера, содержащего ростовую среду 16, в то время как порция клеток 20 В раствора образца 12 удерживается или блокируется от прохождения пористым элементом 14А посредством размера пор мембраны, которые меньше размера ожидаемых клеток. Питательные вещества 22 из питательной среды 16 проходят через мембрану 14 к клеткам 20 В, расположенным сверху пористого элемента 14A.
[0033] В противоположность первому воплощению, второе воплощение Фиг.1 использует дополнительный слой ростовой среды 13 сверху к, или расположенный на, пористости или структурного элемента 14A. В этом случае жидкая порция 18A раствора образца 12 проходит через оба - дополнительный слой ростовой среды 13 и пористый элемент 14A через ростовую среду 16, но порция клеток 20A из жидкого раствора 12 захватывается или блокируется от прохождения через дополнительный слой ростовой среды 13 посредством того, что жидкость может проникать в среду, а клетки не могут. Вследствие этого для мембраны во втором воплощении 14A не требуется пористость меньше, чем размер клеток, которые должны быть удержаны. Предпочтительный пористый элемент 14A во втором воплощении имеет основную функцию предоставлять структурную поддержку дополнительному слою ростовой среды 13 и клеткам с микроколониям для переноса 24. Вторая функция пористого элемента 14A во втором воплощении - в проникновении питательных веществ 22 из ростовой среды 16 к клеткам и микроколониям, расположенным на дополнительном слое питательной среды 13, который сам может иметь питательные вещества для той же цели. Вследствии этого, для фильтрующего элемента выбор материала и размера пор может быть шире с тем, чтобы отвечать структурным требованиям и проникновению питательных веществ.
[0034] Важной функцией мембраны 14А для всех воплощений является перенос или извлечение, функция 24 фильтрованые, удержанные или окрашенные клетки, расположенные или на пористом элементе 14A, или на дополнительном слое ростовой среды 13 расположенные за тем для последующего процессинга удержанных или блокированных клеток микроколоний на стадии индикатора 31 на измененной пористости\структурном элементе 14 В путем взаимодествия с индикатором 23.
Возможность переноса живых клеток и микроколоний с поддержанием их целостности позволяет ростовой и индикаторной стадиям для клеток и микроколоний быть оптимально разделенными: ростовая стадия 21 для быстрого клеточного роста без отравляющих индикаторов и индикаторная стадия 31 для специальной окраски и идентификации, которые микроколониям малого размера быть определенными быстро. Более того, клетки определяются на ранней стадии при начальных размерах микроколоний, потому что они могут эффективно определяться настоящим изобретением, и серийные разведения намного менее необходимы. Таким образом, настоящее изобретение преодолевает ограничение предыдущих методов, которые существенно нуждаются в традиционном размере колоний и длительной инкубации как например с CHROMagar, после серийных разведений предотвращающих перехлест колоний.
[0035] Относительно Фиг.2A, контейнер 202 агаровой среды 203 с несколькими мембранами 204 показаны в соответствии с одним из вооплощений настоящего изобретения для параллельного тестирования образца в одном контейнере. Контейнер 202 может быть обычной чашкой Петри с питательной средой 203, которая содержит только вещества, не предотвращающие и/или ингибирующие микробный рост с тем, чтобы способствовать неингибированному росту для более быстрого тестирования. Различные виды питетельных сред 203, включая плотные среды общего назначения или селективные, дифференциальные, жидкие и полужидкие или среды с веществами, имеющими влияние на микробный рост могут быть применены.
[0036] Пористый элемент 204 может быть пористым элементом, позволяющим жидкому образцу и питательным веществам проходить через них. Пористый элемент может быть мембраной, проницаемой мембраной, диализной мембраной или любым типом существующих фильтровальых элементов, включая целлюлозу, пластические материалы с отверстиями и т.д. Специфический тип пористого элемента 204 выбран в зависимости от того, как слой дополнительной среды располагается на нем. Пористый элемент может быть прозрачным, водопроницаемым и проницаемым для питательных и индикаторных веществ, но не процицаемым для микроорганизмов. В другом воплощении пористый элемент - это проницаемая мембрана имеющая, одну или более следующих характеристик: возможность быть автоклавированной, гидрофильность, отсутствие флуоресценции, бесцветность, сопротивляемость секретируемым клеточным ферментам, наличие регулярных или нерегулярных пор в пределах: 1000-10^7 Дальтон (Да). Материал для пористого элемента может быть выбран из группы, состоящей из: регенерированной целлюлозы, целлофана, купрофана, диализной мембраны, или другого материала, имеющего подходящий размер пор и отвечающего другим упомянутым требованиям. Известно, что диализная мембрана высоко проницаема для веществ\молекул определенного размера, таких как питательные вещества для роста микроорганизмов. Поры диализных мембран могут быть в пределах от 1000 до нескольких сотен тысяч Да (Дальтон). Большой размер пор позволяет многим веществам проходить через мембрану. Тем не менее полимеры с длинными молекулами, такими как полимер галактозы в галактозном агаре, используемом в микробиологических плотных средах, не могут проникнуть через диализную мембрану. Эксперименты показывают, что микроорганизмы могут расти на поверхности диализной мембраны, положенной на поверхность плотной питательной среды ввиду свободного прохождения питательных веществ сквозь мембрану к растущим клеткам. Диализная мембрана на поверхности плотной питательной среды или встроенная в слой агара позволяет переносить колонии и микроколонии, появляющиеся на их поверхности на другую поверхность, заполненную индикаторными веществами.
[0037] В другом воплощении пористый элемент может быть широким разнообразием фильтров, необходимых для структурных и жидкостных функций, а не для осаждения клетки или функции блокирования, которая вместо этого выполнена с дополнительным слоем среды сверху элемента фильтра, как обеспечивается исключительно первым воплощением Фиг.1.
[0038] Относительно Фиг.2B, разрез 200 для различных воплощений среды и пористого элемента показывает пространственные взаимоотношения в соответствии с одним из воплощений настоящего изобретения. Разрез A-A показывает пористый элемент 204A, просто установленный сверху плотной питательной среды 206A, позволяющий простой перенос на плотную питательную среду 206А, но возможно уменьшающий от данного приложения клеток из образца на верхнюю поверхность пористого элемента. В противоположность этому, альтернативное воплощение в разрезе A-A показывает вдавление 210 на верхнем слое плотной питательной среды с глубиной, достаточной для пористого элемента 204B от нуля до номинального значения 208, например 0.1-5 мм ниже поверхности плотной питательной среды, посредством этого делая неглубокий колодец, в который образец может быть пипетирован и надежно распределен по контролируемой площади поверхности. Вдавление 210 может быть сформировано горячим элементом с формой вдавления путем расплавления питательной среды вокруг временной прокладки в форме вдавления, которая удаляется после затвердевания среды. Разрез В-В показывает воплощение, где первая порция плотной питательной среды осаждается, затем затвердевает с последующей установкой пористого элемента 204C и с последующим формированием вторичного слоя питательной среды 206c, который покрывает пористый элемент на глубину слоя 212, делая спайку 214 между первым 206 В и вторым слоем среды С невидимой. Настоящее изобретение хорошо подходит к широкому спектру методов и процедур с установкой пористого элемента на или в питательную среду.
[0039] Фиг.3 иллюстрирует компоненты и шаги для набора с целью определения клеток 300 путем определения микроколоний с использованием среды и переносного пористого элемента в соответствии с одним из воплощений настоящего изобретения. Пористый элемент 204D-1, после переноса из контейнера 202, содержит ростовую среду 321, переносится на вторичную среду 302 с индикаторным веществом 331, которое изменяет клетки и микроколонии на пористом элементе 204D-2. В одном из воплощений две или более индикаторных стадии используются, чтобы удовлетворить процедуру по определению искомых клеток и микроколоний, например, второй индикатор использует среду 303, которая переносит индикаторное вещество с тем, чтобы потенциально изменить клетки и микроколонии на пористом элементе 204D-3. Вторичная среда выбирается из группы, состоящей из агарозы, каррагиинана, желатина или геля, способного быть носителем с возможностью освобождения молекул индикатора. В другом воплощении, тестовая система имеет концентрацию геля в пределах 0.1%-10% в растворах воды, буфера, хлорида натрия или жидкой питательной среды.
Индикатором для микроколоний может быть хромогенный субстрат, флуорогенный субстрат или флуоресцентно или радио-меченые антитела. Например, вторичной средой может быть чистый агар, наполненный метилтиазолилтетразолием бромистым (МТТ), который окрашивает микроколонии в темно-фиолетовый цвет. Неокрашенные микроколонии практически невидимы в микроскоп. Многие другие вещества могут быть использованы для определения и дифференциации микроорганизмов, включая те из них, которые токсичны для клеток или ограничивают рост. Много быстрых и простых методов определения и идентификации может быть приспособлено для использования с этим методом.
[0040] После того как индикаторный материал использован, пористый элемент 204D-5 с соответственно окрашенными микроколониями 322А и 322 В может быть исследован и просчитан, например при помощи светового микроскопа или автоматической системы идентификации, узнавания и подсчета образов с увеличением. Выборочная сетка 324 сделаная печатью или геометрически сформированная нагреванием или гравировкой, способствующая надежному подсчету отношения площади к числу подсчитаных микроколоний.
[0041] В альтернативном анализе, колонии и микроколонии могут быть идентифицированы с помощью антител маркированных флуоресцентными красителями. Этот вид анализа может совершаться в одном из воплощений с использованием BioNanoChannel ("BNC") устройство для определения 330 в качестве носителя антител. В этом случае антитела помещаются в раствор жидкости внутри нано-каналов, на который помещается пористый элемент с колониями. Верхняя поверхность BNC является поддержкой для пористого элемента 204D-4 чтобы, поддержать целостность и сцепление имеющихся колоний, одновременно позволяя большим молекулам антител двигаться в микроканалах и связываться с любыми колониями на пористом элементе 204D-4 через верхнюю часть открытого канала. Пористая мембрана с существенно большими порами, например 10^6 Да или больше или подходящая для определенного типа антител, чтобы быть перенесенной к колонии. Только соответствующая колония (антиген) будет реагировать с антителами, находящимися в контакте с ней. Избыток меченых антител может быть удален путем переноса пористого элемента один или более раз на другую BNC, имеющую растворитель или буфер без флуоресцентных молекул. В противоположность этому большие молекулы антител не могут двигаться в агаре или геле т.к. их большие размеры будут препятствовать этому. Более того, установка пористого элемента непосредственно на открытый контейнер с жидкой средой с антителами не будет поддерживать целостность колоний если мембрана станет пропитанной, затопленной или размытой жидкостью, растворяя и размывая этим колонии. Таким образом, использование переносных пористых мембран в соответствии с данным изобретением в комбинации с ВНС пластиной, обеспечивающей поддержку пористой мембране, и механизм доставки меченых антител обеспечивает эффективное решение, преодолевающее ограничения известных методов.
[0042] ВНС - это пластина, содержащая множество цилиндрических и параллельных микроканалов, открытых с одного или обеих концов, и имеющая микроканалы диаметром примерно 1-30 µм с длиной примерно 100-1000 µм и количеством микроканалов на квадратном сантиметре 100000-1000000, длинных (диаметр\длина=1\10-1\100). Более подробное описание BioNanoChannel устройств и методов приводится в Заявке США 11\109,857, Sergey Gazenko, озаглавленная: "Device For Rapid Detection And Identification Of Single Microorganisms Without Preliminary Growth", где заявка дана полностью.
[0043] Относительно Фиг.4, показано аннотированное изображение 400 культуры в контейнере с агаровой средой, имеющей несколько пористых элементов вместе с отдельно стоящей вторичной средой для окрашивания, в соответствии с одним из воплощений данного изобретения. Чашка Петри, контейнер 202A с питательной средой с несколькими пористыми элементами 204E и культура - на них демонстрируют успешный рост микроколоний в стадии роста 421 вместе с прозрачностью пористого элемента и простотой переноса пористого элемента в контейнер 302 в стадии индикатора 431 с вторичной индикаторной средой в нем, где индикатор инициирует потемнение микроколоний, с трудом определяемых без использования индикатора в контейнере с одной лишь питательной средой 202A.
[0044] Относительно Фиг.5A-5H; показаны фотомикрографии нескольких различных видов рода Bacillus, идентифицируемые с использованием пористого элемента, и отдельной вторичной среды в соответствии с одним из воплощений данного изобретения.
[0045] Относительно Фиг.6; показаны фотомикрографии нескольких различных видов рода Listeria, идентифицируемые с использованием пористого элемента, и отдельной вторичной среды в соответствии с одним из воплощений данного изобретения.
[0046] Относительно Фиг.7; показаны фотомикрографии видов рода Staphyllococcus, идентифицируемые с использованием пористого элемента, и отдельной вторичной среды в соответствии с одним из воплощений данного изобретения.
[0047] Относительно Фиг.8; показаны фотомикрографии нескольких видов рода Escherichia, идентифицируемые с использованием пористого элемента и отдельной вторичной среды в соответствии с одним из воплощений данного изобретения.
[0048] Относительно Фиг.9; показаны фотомикрографии видов рода Pseudomonas, идентифицируемые с использованием пористого элемента и отдельной вторичной среды в соответствии с одним из воплощений данного изобретения.
[0049] Относительно Фиг.10 график 1000 процесса определения и идентификации колоний, включая микроколонии и обычные колонии, показан в соответствии c одним из воплощений настоящего изобретения. Для начальной стадии 1002 требуется контейнер с питательной средой и пористый элемент, установленный на или под поверхностью питательной среды, как показано на Фиг.2В. В последующей стадии 1004 заливается или пипетируется жидкий образец в контейнер сверху пористого элемента. Образец может быть распределен по всей поверхности чашки Петри или сконцентрирован только на пористом элементе, например, как показано на разрезе A-A', где пористый элемент 204B установлен в вдавление 210, ограничавая площадь распределения образца пористым элементом 204 В. Далее в соответствии с шагом 1006, микроорганизмы захвачены или блокированы на пористом элементе или на дополнительном слое среды, расположенной сверху пористого элемента, последнее показано на разрезе B-B Фиг.2B. Шаг 1008 проводится в целях инкубации для развития микроколоний, хотя и намного меньше времени, чем типичные известные методы инкубирования для развития колоний обычного размера, хотя последнее является другим воплощением настоящего изобретения. В последующем шаге 1010, пористый элемент и любая среда сверху него переносится из контейнера с питательной средой на другую среду с индикатором с целью определения - детектирования или / идентификации микроорганизмов. В шаге 1012 определяется потребность в использовании дополнительных шагов с индикатором. Если потребность существует, как часто случается, шаг 1010 повторяется, но в большинстве случаев с новым подходящим индикатором. В дополнении, шаг 1014 предусматривает заключительный шаг исследования формы или цвета колоний для обнаружения, идентификации, или подсчета соответствующих микроколоний.
ПРИМЕРЫ
[0050] Обнаружение общего количества жизнеспособных микроорганизмов (ОКЖО) - одна из наиболее необходимых лабораторных процедур в мире. Оно показывает присутствие и уровень микробного загрязнения в пище, биотехнологической, экологической, и других отраслях промышленности. Обычное ОКЖО проводится, делая несколько (3-12) 10-кратных разведений образца в буфере, жидких питательных средах, или раствора 0.9% NaCl и затем распределением одного миллилитра каждого растворения на поверхности обычных чашек Петри, заполненных соответствующим питательным агаром. Чашки инкубируются 24-48 часов при 32-37°C. После этого чашки удаляются из инкубатора и колонии подсчитываются. Эта процедура требует 3-12 пробирок с разведениями, 3-12 чашек Петри и длительного инкубирования. Результат появляется только после 24-48 часов. Эта простая процедура повторяется сотни миллионов раз ежегодно во всем мире. Метод в соответствии с настоящим изобретением описываемый здесь намного более быстрее (3-6 часа), не требует 10-кратных разведений и требует только 1-2 чашки с преинсталированными мембранами. Несколько стерилизованных (121°C, 15 мин) диализных мембран (размер пор 12,000-18,000 Да) круглой формы устанавливаются на поверхности затвердевшего питательного агара в чашку Петри. Другие мембраны с другими размерами пор или целлофановые мембраны могут быть использованы также. Поверхность чешки с мембранами покрывается затем горячей (80-90°C) питательной средой на 1-2 секунды, избыток среды незатвердевший за 1-2 секунды выливается. Это означает, что все мембраны будут покрыты тонким (0.1-0.2 мм) слоем питательной среды. Верхний слой имеет свободный обмен с нижним слоем в том смысле, что вода и питательные вещества, кроме полимера Агарозы, могут проходить и обмениваться между слоями.
[0051] Процедура в соответствии с настоящим изобретением следующая: один миллилитер образца переноситься и распределяется на проверхности чашки Петри с установленными мембранами (Фиг.2). Жидкость образца впитывается в среду, чашка инкубируется и живые клетки, которые присутствуют, начинают рост и формирование микроколоний. Экспериметы показывают, что все исследованные бактерии образовывают микроколонии в течении 5 часов при 35-37°С. Эти микроколонии состоят из от нескольких десятков до нескольких сотен неокрашенных и практически невидимых клеток. Для того чтобы окрасить их, мембраны отрывают от чашки, используя стерильный пинцет, и переносят на вторичную среду. В соответствии со стандартным методом вторичная среда - это 1% Агароза в 0.15М фосфатном буфере с pH 7.5 и с хромогенным субстратом 3-(4,5-Диметилтиазолил-2)-3,5-дифенилтетразолием бромистым в концентрации 0.7 мг/мл. Этот, слегка желтый, субстрат может превращаться в темно-фиолетовый после реакции с дегидрогеназами живых клеток. Это вещество способно менять цвет всех известных аэробных и анаэробных бактерий и дрожжей, потому что реагирует на последней ступени электрон-проводящей цепи микроорганизмов.
Другими словами, оно не блокирует начало или среднюю часть дыхательной цепи, что может приводить к ранней смерти клеток. Так, окрашенный продукт собирается в большой концентрации на поверхности клеточных мезосомз (место нахождения дегидрогеназ в клетке), придавая темно-фиолетовый или черный цвет телам клеток. Время необходимое для окрашивания микроколоний обычно в пределах 10-20 мин. при 30-40°C. Этого времени достаточно для освобождения молекул из субстрата и чтобы позволить им проникнуть через мембрану и тонкий слой плотной питательной среды путем диффузии и прореагировать с дегидрогеназами. После завершения реакции, чашка со вторичной средой и окрашенными микроколониями переносится под световой микроскоп и микроколонии подсчитываются. Размер и форма микроколоний могут быть дополнительными характеристиками для дифференциации видов (Фиг.5.1-5.8).
[0052] Этот метод требует только 5-6 часов и намного меньше материалов и манипуляций чем традиционный метод. Важно отметить, что в данном примере не требуются многочисленные 10-кратные разведения, а только 1-2 разведения на случай экстремально большой концентрации. Это удобство возможно благодаря относительно малым размерам микроколоний: концентрация клеток в образце может быть миллионы в миллилитре, но все микроколонии будут расти раздельно без перехлеста, потому что площадь занимаемая одной колонии в тысячи раз меньше, чем площадь занимаемая обычной колонией.
Флуоресцентное воплощение
[0053] Мембраны, используемые в данном методе, сделаны из регенерированной целлюлозы, которая является не флуоресцентным и прозрачным материалом. Тем не менее сама питательная среда содержит высокофлуоресцентные вещества. Это ограничивает использование тонкого слоя питательной среды сверху пористого элемента или мембраны, как это было описано в одном из воплощений. Рекомендуемая мембрана в этом случае это 100,000 Да диализная мембрана.
Относительно большой размер пор в этой мембране способствует удовлетворительному росту микроколоний даже без тонкого слоя среды сверху. Дополнительная влажность также полезна для данного воплощения, т.к. создает более благоприятные условия (микроклимат) для формирования колоний.
После 5-6 часового роста мембрана переносится на вторичную среду, наполненную одним или более флуорогенных субстратов. Для определения ОКЖО используется свежеприготовленная смесь 4-метилумбеллиферил фосфата и 4-метилумбеллиферил ацетата в концентрации 0.1 мг\мл в ацетоне. Эта смесь заливается на поверхность вторичной среды (1% Агарозы в дистиллированной воде) за несколько минут до того, как мембрана с микроколониями водружается сверху. Инкубирование занимает 10-15 минут при 35-40°C. Все микроколонии получают голубую флуоресценцию, хорошо видимую во флуоресцентном микроскопе, поскольку смесь используемых субстратов реагирует с большим количеством фосфатаз и эстераз, присутствующих во всех живых клетках.
Прозрачная и нефлуоресцентная мембрана позволяет использовать недорогой флуоресцентный микроскоп с возбуждением УФ (например, длина волны 350-380 нм) света, направленным снизу вверх, вместе с тем дорогие эпифлуоресцентные микроскопы могут быть использованы также.
Иммунофлуоресцентное воплощение; идентификация
[0054] Идентификация микроорганизмов с помощью антител, меченных флуорохромами (FITC, флуоресцеин, родамин и др.), может быть проведена с использованием пористого элемента или мембраны без слоя плотной питательной среды сверху. Иммуноглобулины, используемые как антитела, являются очень большими белковыми молекулярными комплексами. Например, часто используемый имуноглобулин G (IgG) имеет размет примерно 150,000 Да. Такой большой комплекс должен пройти через мембрану и прореагировать (антиген-антитело взаимодействие) со специальными поверхностными антигенами клетки. Поэтому размер пор должен быть больше, например 10^6 Да или больше.
[0055] Для исполнения метода, образец содержащий живые клетки различных видов, включая целевые виды, распределяется на поверхности мембраны. Жидкость впитывается в агаровую ростовую среду и чашка инкубируется 5-6 часов при 35-37°C в высоко влажных условиях с тем чтобы сформировать микроколонии. После этого мембрана с микроколониями на поверхности переносится на BioNanoChannel пластину заполненную раствором содержащим антитело комплиментарное к целевому микроорганизму (например IgG-FITC). Молекулы меченого антитела свободно плавают внутри наноканалов, имеющих каждый диаметр 10 µм и длину 500 µM. Примерно 2.5 миллионов наноканалов покрывают BioNanoChannel пластину имеющую диаметр 25 мм. Таким образом, раствор с антителами «захвачен» в массивном наборе мельчайших стеклянных каналов. Это важно для предотвращения образования мокрых участков с избытком жидкости, которая может размыть микроколонии и смешать целевые клетки с клетками других видов. Использование BioNanoChannel пластины также важно поскольку позволяет большим IgG молекулам двигаться свободно, в то время как Агароза, используемая в других воплощениях (для молекул малого размера), не способна освободить IgG из своей полимерной структуры.
[0056] Молекулы меченой IgG достигают всех микроколоний путем диффузии и реагтруют с целевым антигеном. Процесс занимает 0.5-1.0 часа при комнатной температуре. Непрореагировавшие молекулы могут быть удалены путем переноса мембраны на другую BioNanoChannel™ пластину, заполненную моющим раствором (PBS, pH 7.5) на 10-20 минут. После этого мембрана с мечеными и немечеными (флуоресцентные, нефлуоресцентные или слабофлуоресцентные) микроколонии переносятся под флуоресцентный микроскоп и флуоресцентные (целевые) микроколонии определяются и подсчитываются.
[0057] Определение, идентификация и/или узнавание формы микроколонии может быть проведено оператором с использованием визуального метода или определителя образов. Различные виды определителей образа используются в настоящее время на базе CCD камер и компьютерных программ распознавания и соединены с микроскопом и компьютером с целью зафиксировать образ и проанализировать его.
[0058] Идентификация микроколоний может быть улучшена с использованием микроманипуляторов, которые снимают колонию выбранной формы или флуоресценции с последующей идентификацией с помощью ПЦР или другим подходящим методом. Сбор колоний может быть проведен разными способами. Тем не менее, идентификация микроколонии с помощью ПЦР необязательно означает специфический сбор обязательно данной колонии т.к. ПЦР методы позволяют распознование целевой ДНК целевого организма на фоне ДНК других видов.
[0059] Мембраны с различными размерами пор и другими качествами полезны для вирусологии, особенно в случаях когда клеточные культуры используются для роста и определения вирусов по отверстиям в клеточном слое.
Качество деконтаминации
[0060] Деконтаминация внутреннего состояния строений после эпидемий, присутствия заболевшего смертельными болезнями или террористической атаки или военной биологической атаки - это все важные проблемы микробиологии.
Присутствие и количество выживших клеток после деконтаминации определяет будущее деконтаминированных площадей. Этот анализ должен быть завершен в очень короткий промежуток времени, особенно если площади относятся к важным общественным площадям (аэропорты, государственные военные помещения или другие места, где имеет место высокая посещаемость или социальная значимость). Только живые/выжившие клетки должны быть определены в этих обстоятельствах.
К тому же только реальный рост клеток известен как наиболее надежный метод определения живых микроорганизмов. Обычный рост требует 24-48 часов или более для образования колоний. Настоящее изобретение допускает тот же результат за 5-6 часов, много дешевле и требует много меньше труда, то есть большее количество образцов может быть анализировано. Например, если площади были заражены спорами Bacillus anthracis и деконтаминация убила только вегетативные клетки и споры, тогда только споры Bacillus могут выжить. Споры Clostridium, Actinomycetes и грибков не растут на среде используемой для роста B. anthracis по ряду причин. Таким образом, только один вид рода Bacillus, будет расти на этой среде это B. anthracis. Триптиказный Соевый Агар (TSA) может быть полезен в этом случае. Жидкие образцы из разных частей здания помещаются на TSA с мембраной и тонким слоем TSA сверху. После 5 часов инкубации при 37°C мембраны с возможными микроколониями переносятся на чашку с 3-(4,5-Диметилтиазолил-2)-3,5-дифенилтетразолиум бромид (1% чистой Агарозы в PBS pH 7.5). Через 10-20 минут интенсивно окрашенные микроколонии специфической формы могут быть отличены от микроколоний других видов Bacillus (например, Фиг.5.4 показывает как выглядят микроколонии вида Bacillus subtilis globigii, известного как модель для исследований Bac. anthracis). Эти микроколонии могут быть сняты и проанализированы быстрой ПЦР (1-1.5 часа) для подтверждения B. anthracis выживания после деконтаминации. Таким образом, разрешение на дальнейшее использование площадей может быть получено через 6-8 часов вместо 24-48 часов.
Определение антибиотикоустойчивых микроорганизмов
[0061] Определение антибиотикоустойчивых микроорганизмов в человеческих образцах или госпитальные инфекции (Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella oxitoca и др.) быстро растущая медицинская проблема. Жизнь инфецированного больного сильно зависит от скорости диагностики антибиотикоустойчивого штамма. Рост и образование колонии в присутствии антибиотика - единственный надежный метод широко, применяемый в диагностике антибиотикоустойчивых штаммов. В настоящее время требуется 24 часа, чтобы обнаружит рост/колонии на чашке с питательной средой с антибиотиком (CHROMagar, MRSA и др.). Ускорение этого анализа до 6-8 часов способно спасти тысячи жизней ежегодно. В качестве примера, основной метод для быстрого определения Staphylococcus aureus следующий: образец (крови или внешней среды), вероятно содержащий антибиотикоустойчивый S. aureus распределяется на чашке с метицилином (MRSA среда) с вставленными мембранами. После 5-6 часов мембраны переносятся на чашку с Агарозой и хромогенным субстратом. После 10-15 минут все микроколонии приобретают темно-фиолетовую окраску и становятся видимыми. Микроколонии специфической формы (Фиг.7) определяются как антибиотикоустойчивые S. aureus.
Быстрое определение E.coli
[0062] Присутствие E.coli в пище или образцах окружающей среды известно как надежная характеристика фекального загрязнения. Только живые клетки важны для подсчета; ПЦР и иммунологические методы неэффективны в данном случае. Способность образовывать колонию - наиболее надежная характеристика живых E.coli. Для роста и определения E.coli используется агар МакКонки для Грам-отрицательных и лактозо-положительных микроорганизмов. Кроме того для быстрого роста E.coli может быть использована CIRCLEGROW среда. Также может быть использован LB агар. Все эти среды подходят для роста E.coli и некоторых других микробов присутствующих в образцах. Пористый элемент или мембрана встроенная в поверхность среды не должна иметь тонкого слоя среды на поверхности и должна иметь соответствующий размер пор, например 50,000-100,000 Да. E.coli формирует хорошо видимые микроколонии после 4-6 часов инкубирования при 37°C (Фиг.8). После инкубирования, мембрана несущая E.coli и микроколонии других видов переносится на BioNanoChannel пластину, заполненную 4-метилумбеллиферил-β-D-галактопиранозидом (0.1 мг/мл в 35% этаноле). После 5-10 минут инкубирования микроколонии E.coli приобретают яркую голубую флуоресценцию под флуоресцентным микроскопом и возбуждением УФ 350-380 нм. Остальные микроколонии остаются бесцветными.
Альтернативные Воплощения
[0063] Настоящее описание применимо к широкому кругу разнообразных приложений и не ограничено специальным типом анализа, средой, фильтром, мембраной или микроорганизмом описанным в данном изобретении. В обзоре описанных приложений настоящее изобретение приводит метод и устройство преодолевающие недостатки существующего подхода, такие как многочисленные серийные разведения, длительность и материалоемкость и слабые результаты.
[0064] Например, настоящее изобретение может быть приспособлено для определения вирусов растущих на тонком слое прокариотических или эукариотических клеток и производящих прозрачные зоны на поверхности в местах размножения вирусов. В этом случае окрашиваться будут интактные клетки, но не инфецированные вирусом маленькие зоны прозрачности или бляшки, где клетки инфецированы и дезинтегрированы вирусом и не имеют живых клеток для окраски.
[0065] Предыдущие описания специфических воплощений настоящего изобретения были представлены в целях иллюстрации и описания. Они не предназначены, чтобы быть исчерпывающими или ограничить изобретение определенными формами. Естественно, много модификаций и изменений возможны в свете вышеупомянутого изобретения. Воплощения были выбраны и описаны, чтобы лучше всего объяснить принципы изобретения и его практическую значимость, и позволять другим, квалифицированным специалистам лучше использовать изобретение и его различные воплощения в различных модификациях для практического применения. Предполагается, что суть изобретения определена пуктами заявления, присоединенными здесь и их эквивалентами.