ВАРИАНТЫ АЛЬФА-АМИЛАЗЫ С ИЗМЕНЕННЫМИ СВОЙСТВАМИ
VERSIONS OF ALPHA-AMYLASE WITH CHANGED PROPERTIES

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ПУБЛИКАЦИИ
Эта заявка заявляет приоритет Предварительных заявок на патент США 60/985619, поданной 5 ноября 2007 года, 61/026579, поданной 6 февраля 2008 года, 61/041075, поданной 31 марта 2008 года, и 61/059411, поданной 6 июня 2008 года, описания каждой из которых включены здесь в качестве ссылки в их полном объеме, для всех целей.
К описанию прилагается список последовательностей, содержащий SEQ ID NO:1-30, каждая из которых включена здесь в качестве ссылки в полном объеме.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Это описание относится к новым альфа-амилазам. В частности, оно относится к способам применения некоторых вариантных альфа-амилазных активностей и их смесей для удаления пятен и в качестве компонента детергентных композиций для стирки.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Альфа-амилазы (альфа-1,4-глюкан-4-глюканогидролазы, E.C. 3.2.1.1) составляют группу ферментов, которые катализируют гидролиз крахмала и родственных линейных или разветвленных 1,4-глюкозидных олиго- и полисахаридов.
Амилазы могут быть использованы для различных целей. Например, амилазы используют коммерчески в начальных стадиях обработки крахмала (например, разжижения); в процессах мокрого способа помола и в получении спирта из углеводных источников. Они используются также в качестве очищающих средств или вспомогательных агентов в детергентных матриксах; в текстильной промышленности для расшлихтовки крахмала; в хлебопекарных применениях; в производстве напитков; в нефтяных промыслах для процессов бурения; в процессах рециркуляции, например, для очищения от краски бумаги, и в корме для животных.
Предпринимались попытки конструирования вариантов альфа-амилазы с улучшенными свойствами для конкретных применений, таких как разжижение крахмала и расшлихтовка текстиля.
Существует потребность в создании и улучшении амилаз, которые обеспечивают, например, преимущества изготовления и/или эффективности в сравнении со стандартными промышленными ферментами (например, из Bacillus licheniformis), для различных применений, включающих в себя коммерческую расшлихтовку, а также процессы чистки/мойки и удаления краски или крахмала. Имеется также потребность в детергентах и чистящих добавках или препаратах, содержащих улучшенные амилазы и дополнительные компоненты, такие как поверхностно-активное вещество, комплексообразователи и т.п.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В одном аспекте данное изобретение относится, inter alia, к новым вариантам α-амилолитических ферментов исходной α-амилазы, такой как AmyS-подобная α-амилаза, в частности, вариантов, проявляющих измененные свойства, которые являются выгодными в связи с процессами очищения или мойки, или удалением крахмала, например, в расшлихтовке тканого материала.
2+
2+
Например, этот вариант изменен, в сравнении с исходной AmyS-подобной альфа-амилазой или референсной амилазой, в одном или нескольких свойствах, таких как общий заряд, субстратная специфичность, расщепление субстрата, связывание субстрата, термостабильность, активность при одном или нескольких pH, стабильность при одном или нескольких pH, стабильность в условиях окисления, потребности в Ca, удельная активность, каталитическая скорость, каталитическая эффективность, активность в присутствии комплексообразователя (хелатообразователя), термо- или pH-стабильность в присутствии комплексообразователя, применимость для расшлихтовки или применимость для процесса очистки или величина экспрессии в системе экспрессии белков, и других представляющих интерес свойствах. Например, одно или несколько изменений могут приводить к варианту, который имеет уменьшенную Ca-зависимость и/или измененный профиль pH/активности и/или измененную термостабильность, в сравнении с исходной α-амилазой, такой как AmyS-подобная амилаза.
В одном аспекте здесь обеспечен вариант исходной α-амилазы Geobacillus stearothermophilus, причем этот вариант имеет аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере приблизительно 95% гомологию относительно исходной α-амилазы Geobacillus stearothermophilus и содержит замену аминокислоты 242, где положения аминокислот в этой пептидной последовательности пронумерованы относительно референсной амилазы (например, SEQ ID NO:1 или 2) и где этот вариант имеет α-амилазную активность.
В другом аспекте обеспечены композиции, содержащие: a) по меньшей мере один вариант альфа-амилазы, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на приблизительно 95% идентичную аминокислотной последовательности исходной AmyS-подобной альфа-амилазе и имеющую замену в положении аминокислоты, соответствующем положению 242 референсной альфа-амилазы, причем указанный вариант имеет детектируемую альфа-амилазную активность, и b) по меньшей мере один дополнительный фермент, детергент, по меньшей мере одно поверхностно-активное вещество, по меньшей мере один комплексообразователь, окислитель, подкислитель, подщелачивающий агент, источник пероксида, источник жесткости, соль, детергентный комплексообразующий агент, полимер, стабилизирующий агент или кондиционер. В предпочтительных вариантах осуществления референсной амилазой является SEQ ID NO:1 или 2, и эта композиция является компонентом продукта для применения в стирке, очистке посуды и твердой поверхности, расшлихтовке или обработке тканей или пятен.
В одном варианте осуществления эта композиция содержит дополнительный фермент, который является протеазой, липазой, амилазой, целлюлазой, пероксидазой, оксидазой, пектиназой, лиазой, кутиназой, лакказой или их комбинацией.
В различных вариантах осуществления поверхностно-активное вещество является неионогенным, анионогенным, катионогенным или цвиттерионным. Этой вариантной альфа-амилазой является предпочтительно вариант S242A, S242D, S242E, S242F, S242G, S242H, S242L, S242M, S242N, S242Q или S242T. В некоторых вариантах осуществления этот вариант имеет измененную устойчивость к окислению и эта вариантная альфа-амилаза дополнительно включает в себя делецию или замену одного или нескольких остатков метионина, в том числе остатков, расположенных в положениях аминокислот 8, 9, 96, 200, 206, 284, 307, 311, 316 и 438 исходной AmyS-подобной альфа-амилазы, где эта референсная альфа-амилаза имеет SEQ ID NO:2.
В других вариантах осуществления эта вариантная альфа-амилаза дополнительно содержит модификацию последовательности в одном или нескольких положениях аминокислот, соответствующих положениям аминокислот 97, 179, 180, 193, 319, 349, 358, 416, 428 или 443 референсной альфа-амилазы. В дополнительных других вариантах осуществления этот вариант содержит одну или несколько замен в следующих положениях: цистеин в положении 349, цистеин в положении 428, глутаминовую кислоту в положении 97, аргинин в положении 97, глутаминовую кислоту в положении 319, аргинин в положении 319, глутаминовую кислоту в положении 358, аргинин в положении 358, глутаминовую кислоту в положении 443 или аргинин в положении 443.
Здесь применимы также вариантные альфа-амилазы, содержащие замену N193 или V416 или обе эти замены, например, замену N193F или V416G или обе. В некоторых вариантах осуществления эти варианты обнаруживают делецию одной или нескольких аминокислот, например, в положениях F178, R179, G180, I181, G182 и K183.
Предпочтительно, эта вариантная альфа-амилаза имеет измененную зависимость от ионов металлов или измененную стабильность или активность в отсутствие добавленного кальция или в присутствии комплексообразователя в некоторых вариантах.
Эта вариантная альфа-амилаза предпочтительно имеет по меньшей мере 95%, 98% или даже 99% или большую гомологию относительно SEQ ID NO:2 и содержит замену аминокислоты 242 относительно нумерации в референсной альфа-амилазе, содержащей SEQ ID NO:1, причем эта вариантная альфа-амилаза имеет альфа-амилазную активность.
Исходная AmyS-подобная альфа-амилаза является SEQ ID NO:1, 2, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15 или 16, а референсная альфа-амилаза является SEQ ID NO:1 или 2 в одном варианте.
Предпочтительно, эта вариантная альфа-амилаза имеет улучшенную эффективность (эксплуатационные качества) в процессе мойки при pH ≥ приблизительно 8, относительно исходной AmyS-подобной альфа-амилазы.
Эта вариантная альфа-амилаза может обнаруживать, в различных вариантах, ряд замен a) Q97E, Q319E, Q358E, Q443E; b) Q97E, Q319R, Q358E, Q443R; c) Q97E, Q319R, Q358E; d) Q97E, Q319R, Q443E; e) Q97E, Q319R, Q443R; f) Q97E, Q358R; g) Q97E, Q443E; h) Q319R, Q358E, Q443E или i) Q319R, Q358R, Q443E.
В другом из его нескольких аспектов это изобретение обеспечивает композиции, которые являются детергентными или чистящими препаратами, содержащими по меньшей мере одну вариантную амилазу, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на приблизительно 95% идентичную аминокислотной последовательности исходной AmyS-подобной альфа-амилазы и имеющую замену в положении аминокислоты, соответствующем положению 242 референсной альфа-амилазы, причем этот вариант имеет детектируемую альфа-амилазную активность; где этой референсной амилазой является SEQ ID NO:1 или 2. В некоторых вариантах осуществления этот вариант является вариантом S242, содержащим по меньшей мере замену S242A, S242D, S242E, S242F, S242G, S242H, S242L, S242M, S242N, S242Q или S242T.
В другом из его нескольких аспектов это изобретение обеспечивает способы расшлихтовки тканого материала после процесса ткачества, предусматривающие контактирование тканого материала с вариантной альфа-амилаза, содержащей аминокислотную последовательность, по меньшей мере на приблизительно 95% идентичную аминокислотной последовательности исходной AmyS-подобной альфа-амилазы, и имеющую замену в положении аминокислоты, соответствующем положению 242 референсной альфа-амилазы. Предпочтительно, этот вариант имеет детектируемую альфа-амилазную активность. Это контактирование выполняют при условиях и в течение времени, которые являются эффективными по меньшей мере для частичного удаления шлихты из тканого материала.
2+
В различных вариантах осуществления эта альфа-амилаза является измененной, в сравнении с исходной AmyS-подобной альфа-амилазой или референсной альфа-амилазой, в одном или нескольких из таких свойств, как (a) общий заряд, (b) субстратная специфичность, (c) расщепление субстрата, (d) связывание субстрата, (e) термостабильность, (f) активность при одном или нескольких pH, (g) стабильность при одном или нескольких pH, (h) стабильность в условиях окисления, (i) потребности Ca, (j) удельная активность, (k) каталитическая скорость, (l) каталитическая эффективность, (m) активность в присутствии комплексообразователя, (n) термо- или pH-стабильность в присутствии комплексообразователя, (o) эффективность в отношении расшлихтовки или (p) величина экспрессии в системе экспрессии белков.
Исходная AmyS-подобная альфа-амилаза является SEQ ID NO:1, 2, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15 или 16, а референсная альфа-амилаза является SEQ ID NO:1 или 2 в различных вариантах осуществления. Предпочтительно, эта вариантная альфа-амилаза является вариантом S242A, S242D, S242E, S242F, S242G, S242H, S242L, S242M, S242N, S242Q или S242T.
В некоторых вариантах осуществления эта вариантная альфа-амилаза дополнительно содержит одну или несколько замен в следующих положениях: цистеин в положении 349, цистеин в положении 428, глутаминовую кислоту в положении 97, аргинин в положении 97, глутаминовую кислоту в положении 319, аргинин в положении 319, глутаминовую кислоту в положении 358, аргинин в положении 358, глутаминовую кислоту в положении 443 или аргинин в положении 443, где референсной альфа-амилазой является SEQ ID NO:1 или 2.
Обеспечены также способы мойки или очистки. Эти способы предусматривают контактирование одного или нескольких изделий, подлежащих мойке или очистке, с композицией, содержащей вариантную альфа-амилазу, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на приблизительно 95% идентичную аминокислотной последовательности исходной AmyS-подобной альфа-амилазы и имеющую замену в положении аминокислоты, соответствующем положению 242 референсной альфа-амилазы. Это контактирование выполняют при условиях и в течение времени, которые являются эффективными по меньшей мере для частичной мойки или очистки этих одного или нескольких изделий. Этот вариант имеет детектируемую альфа-амилазную активность. В примерах способов по меньшей мере одно изделие загрязнено по меньшей мере одним крахмалсодержащим веществом, удаление которого улучшается этой вариантной альфа-амилазой. В различных вариантах осуществления этих способов, эта композиция дополнительно содержит один или несколько из дополнительных компонентов, таких как фермент, детергент, поверхностно-активное вещество, окислитель, подкислитель, подщелачивающий агент, источник пероксида, источник жесткости, соль, детергентный комплексообразующий агент, полимер, стабилизирующий агент или кондиционер.
В одном варианте этих способов исходная AmyS-подобная альфа-амилаза является SEQ ID NO:1, 2, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15 или 16, а референсная альфа-амилаза является SEQ ID NO:1 или 2. Предпочтительно, эта вариантная альфа-амилаза является вариантом S242A, S242D, S242E, S242F, S242G, S242H, S242L, S242M, S242N, S242Q или S242T.
В различных вариантах осуществления эта вариантная альфа-амилаза имеет улучшенную эффективность (эксплуатационные качества) в процессе мойки при pH ≥ приблизительно 8, относительно исходной AmyS-подобной альфа-амилазы.
В одном варианте осуществления эта вариантная альфа-амилаза содержит одну или несколько замен в следующих положениях: цистеин в положении 349, цистеин в положении 428, глутаминовую кислоту в положении 97, аргинин в положении 97, глутаминовую кислоту в положении 319, аргинин в положении 319, глутаминовую кислоту в положении 358, аргинин в положении 358, глутаминовую кислоту в положении 443 или аргинин в положении 443. В других вариантах осуществления эта вариантная альфа-амилаза содержит набор замен a) Q97E, Q319E, Q358E, Q443E; b) Q97E, Q319R, Q358E, Q443R; c) Q97E, Q319R, Q358E; d) Q97E, Q319R, Q443E; e) Q97E, Q319R, Q443R; f) Q97E, Q358R; g) Q97E, Q443E; h) Q319R, Q358E, Q443E или i) Q319R, Q358R, Q443E.
Этот способ может также предусматривать применение вариантных альфа-амилаз, содержащих делецию одной или нескольких аминокислот в положениях F178, R179, G180, I181, G182 или K183.
В некоторых вариантах осуществления вариантная альфа-амилаза имеет измененную зависимость от ионов металлов или измененную стабильность или активность в отсутствие добавленного кальция или в присутствии комплексообразователя.
Здесь обеспечены также наборы, содержащие а) одну или несколько вариантных альфа-амилаз, содержащих аминокислотную последовательность, по меньшей мере на приблизительно 95% идентичную аминокислотной последовательности исходной AmyS-подобной альфа-амилазы и имеющую замену в положении аминокислоты, соответствующем положению 242 референсной альфа-амилазы, и b) по меньшей мере один дополнительный фермент, детергент, поверхностно-активное вещество, комплексообразователь, окислитель, подкислитель, подщелачивающий агент, источник пероксида, источник жесткости, соль, детергентный комплексообразующий агент, полимер, стабилизирующий агент или кондиционер.
В одном варианте осуществления этот набор дополнительно содержит инструкции для применения, например, для применения компонентов этого набора в процессе расшлихтовки тканого материала или для мойки или очистки одного или нескольких изделий, загрязненных крахмалсодержащим веществом.
Эти и другие признаки этого изобретения будут описаны более подробно ниже.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
Фигура 1 показывает выравнивание аминокислотных последовательностей среди нескольких кандидатных исходных альфа-амилаз (AmyS-подобных амилаз) для применения здесь. Положения, соответствующие положению любой аминокислоты (например, 1-520) амилазы из Geobacillus stearothermophilus (SEQ ID NO:1) могут быть легко определены. SEQ ID NO:1, альфа-амилаза из G. stearothermophilus "BSG"; SEQ ID NO:2, укороченная амилаза из G. stearothermophilus (AmyS, SPEZYME XTRA); SEQ ID NO:3, G. stearothermophilus (S242A, вариантная амилаза); SEQ ID NO:4, G. stearothermophilus (S242Q, вариантная амилаза); SEQ ID NO:5, G. stearothermophilus (S242E, вариантная амилаза); SEQ ID NO:6, амилаза Yamane 707; SEQ ID NO:7, зрелая амилаза LAT; SEQ ID NO:8, амилаза Bacillus licheniformis дикого типа [TERMAMYL (NOVOZYMES)=SEQ ID NO:8 в WO 02/10355A2]; SEQ ID NO:9, амилаза B. amyloliquefaciens, BAN; SEQ ID NO:10, STAINZYME=AA560, которая является SEQ ID NO:2 в WO 0060060 или SEQ ID NO:24 в US 6528298; SEQ ID NO:11, амилаза B. halmapalus (NATALASE); SEQ ID NO:12, KSM-1378 (KAO CORP., SEQ ID NO:3 в EP1199356); SEQ ID NO:13, Bacillus spp. KSM-K38 (KAO CORP., SEQ ID NO:4 в US 6403355 B1); SEQ ID NO:14, Bacillus spp. KSM-K36 (KAO CORP., SEQ ID NO:2 в US 6403355 B1); SEQ ID NO:15, LIQUOZYME SC (NOVOZYMES); и SEQ ID NO:16, Консенсусная последовательность №1 исходной альфа-амилазы.
Фигура 2 показывает плазмиду pHPLT-AmyS.
Фигура 3 показывает процентную остаточную активность вариантов S242 после теплового стресса при 95°C в течение 30 минут. Вариантные положения P, S, W и Y отсутствовали и заменялись AmyS дикого типа (Spezyme Xtra (помеченная "Z")). Показан также положительный контроль, G. stearothermophilus с Δ179-180 с С-концом, укороченным на 29 аминокислот (т.е. SEQ ID NO:2). Линии показывают в 2 и 3 раза более высокое стандартное отклонение процентной остаточной активности фермента дикого типа. S242A и S242Q ясно показывают более высокие остаточные активности, чем эти активности дикого типа.
Фигура 4: Панели A, B, C, D, E, F, G, H и I показывают парные сопоставления и консенсусные последовательности для нескольких последовательностей из фигуры 1 и изображают, соответственно, консенсусные последовательности 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 и 10 или SEQ ID NO:22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 и 30, соответственно.
Фигура 5 показывает кривые теплового плавления и точек плавления для амилазы дикого типа и вариантов амилазы без добавленного кальция.
Фигура 6 показывает кривые теплового плавления и точек плавления в присутствии 2 мМ добавленного кальция как для амилазы дикого типа, так и для вариантов амилазы.
Фигура 7 показывает профиль активности при 4, 10 и 20 минутах для Spezyme Xtra и двух вариантов, относительно Liquozyme SC.
Фигура 8 показывает профиль активности четырех вариантов относительно варианта S242Q для трех временных точек.
Фигура 9 является диаграммой, изображающей эффективность S242Q (черные кружки) и его вариантов (белые кружки), как функцию заряда, в анализе маленьких образцов тканей (микролоскутков) с рисовым крахмалом при условиях североамериканской стирки с использованием комбинаторной библиотеки зарядов, причем чистку микролоскутков с рисовым крахмалом выполняли в Tide 2x, при 20°C. Делается ссылка на пример 10.
Фигура 10 является диаграммой, изображающей эффективность укороченной амилазы TS-23 Bacillus sp. (черные кружки) со следующими мутациями: Q98R, M201L, S243Q R309A, Q320R, Q359E и K444E и ее вариантами зарядов (белые кружки) (см. находящуюся в процессе одновременного рассмотрения заявку на патент США № PCT/US2008/007103, поданную 6 июня 2008 года) в анализе маленьких образцов тканей (микролоскутков) с рисовым крахмалом как функцию заряда при условиях западноамериканской стирки с использованием комбинаторной библиотеки зарядов TS23t, причем чистку микролоскутков с рисовым крахмалом выполняли в Persil при 40°C. Делается ссылка на пример 10.
Фигура 11 является диаграммой, изображающей эффективность S242Q (черные кружки) и ее вариантов (белые кружки) в анализе с BODIPY-крахмалом как функцию заряда. Комбинаторная библиотека зарядов S242Q (CCL), удельная активность на BODIPY-крахмале, стандартные условия анализа. Делается ссылка на пример 10.
Фигура 12: Панель А является диаграммой, изображающей относительный гидролиз BODIPY-крахмала как функцию относительной экспрессии во встряхиваемой пробирке (т.е. относительный гидролиз BODIPY-крахмала в зависимости от относительной экспрессии во встряхиваемой пробирке); Панель В является диаграммой, изображающей относительный гидролиз крахмала на микролоскутках как функцию относительной экспрессии во встряхиваемой пробирке (т.е. относительный гидролиз крахмала на микролоскутках в зависимости от относительной экспрессии во встряхиваемой пробирке). Делается ссылка на пример 13.
Фигура 13: Панель А является диаграммой, изображающей относительную экспрессию во встряхиваемой пробирке как функцию заряда; Панель В является диаграммой, изображающей относительный гидролиз BODIPY-крахмала как функцию заряда. Делается ссылка на пример 13.
Фигура 14: Панель А является диаграммой, изображающей относительную экспрессию во встряхиваемой пробирке как функцию заряда; Панель В является диаграммой, изображающей относительную активность очистки микролоскутков как функцию заряда. Делается ссылка на пример 13.
2+
2
Фигура 15 показывает действия добавленного Ca на эффективность расшлихтовки варианта S242Q в сравнении с эффективностью расшлихтовки Ethyl и Xtra в лаундерометре при условиях 85°C, в течение 30 минут при 0,01 м.д. активного белка. Расшлихтовку выполняли в присутствии 0 или 5 м.д. CaCl. См. пример 14.
2+
2
Фигура 16 показывает действия добавленного Ca на эффективность расшлихтовки варианта S242Q в сравнении с эффективностью расшлихтовки Ethyl и Xtra в лаундерометре при условиях 97°C, в течение 30 минут при 0,01 м.д. активного белка. Расшлихтовку выполняли в присутствии 0 или 5 м.д. CaCl. См. пример 14.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
1. Определения и аббревиатуры
В соответствии с этим описанием, используются следующие аббревиатуры и определения. Следует отметить, что в данном контексте единственные формы существительных включают в себя множественные формы, если контекст не диктует ясно противоположное. Так, например, ссылка на "полипептид" включает в себя множество таких полипептидов, а ссылка на "готовую форму" включает в себя ссылку на одну или несколько готовых форм и их эквивалентов, известных квалифицированным в данной области специалистам, и т.д.
Если нет другого указания, все технические и научные термины, используемые здесь, имеют такое же значение, какое понимается квалифицированным в данной области специалистом. Ниже обеспечены следующие термины.
1.1. Аббревиатуры
Следующие аббревиатуры применяются, если не указаны другие значения:
AATCC Американская Ассоциация химиков и колористов текстильной промышленности;
ADWавтоматическая мойка посуды;
AEэтоксилат спирта;
AEOэтоксилат спирта;
AEOSэтоксисульфат спирта;
AESэтоксисульфат спирта;
AFAUкислотные единицы грибной α-амилазы;
AGUединицы глюкоамилазной активности;
AOSα-олефинсульфонат;
ASсульфат спирта;
BAAбактериальная α-амилаза;
°Cградусы Цельсия;
CCLкомбинаторная библиотека зарядов;
кДНКкомплементарная ДНК;
CMCкарбоксиметилцеллюлоза;
dEобщее различие окраски, определенное по цветовому пространству CIE-LAB;
2
dHOдеионизованная вода;
2
dIHOдеионизованная вода, Milli-Q фильтрация;
DEдекстрозный эквивалент;
DNAдезоксирибонуклеиновая кислота;
dNTPдезоксирибонуклеотидтрифосфаты;
DOрастворенный кислород;
DP3степень полимеризации с тремя субъединицами;
DPnстепень полимеризации с n субъединицами;
DS (или ds)содержание сухих веществ;
DSCдифференциальная сканирующая калориметрия;
DTMPAдиэтилтриаминпентауксусная кислота;
ECкомиссия по ферментам для классификации ферментов;
EDTAэтилендиаминтетрауксусная кислота;
EDTMPAэтилендиаминтетраметиленфосфоновая кислота;
EOэтиленоксид;
Eqэквиваленты;
ETOHэтанол;
F&HCуход за тканями и бытовой техникой;
ФТЕ"фитазные единицы", фитат-гидролизующая единица;
г (или гм) граммы;
ГАЕглюкоамилазные единицы;
gpgграны на галлон;
г/лграммы на литр;
GenencorDanisco US Inc, Genencor Division, Palo Alto, CA;
2
HOвода;
HDGгранулированный детергент интенсивного режима;
HDLжидкий детергент интенсивного режима;
HFCSфруктозный кукурузный сироп;
HFSSфруктозный сироп на основе крахмала;
HPAEC-PADанионообменная хроматография высокого разрешения с импульсным амперометрическим детектированием;
ч (часы) ч (часы);
IKAIKA Works Inc. 2635 North Chase Parkway SE, Wilmington, NC;
IPTGизопропил-β-D-тиогалактозид;
JPNЯпония;
кгкилограммы;
LAагар Луриа;
LASлинейный алкилбензолсульфонат;
LBбульон Луриа;
LUлипазные единицы;
Mмолярный;
MBD-средасреда на основе MOPS определенного состава;
MES2-(N-морфолино)этансульфоновая кислота;
мгмиллиграммы;
минминута/минуты;
млмиллилитр (или миллилитры);
мммиллиметры;
мМмиллимолярный;
MOPS3-(N-морфолино)пропансульфоновая кислота;
MWмолекулярная масса;
NAСеверная Америка;
нсмньютон-сантиметр;
NEOнеомицин;
нгнанограмм;
нмнанометр;
NOBSнонаноилоксибензолсульфонат;
ннормальный;
NTAнитрилотрехуксусная кислота;
PAHBAHгидразид п-гидроксибензойной кислоты;
ПЦРполимеразная цепная реакция;
ПЭГполиэтиленгликоль;
pIизоэлектрическая точка;
м.д. миллионная доля;
PVAполи(виниловый спирт);
PVPполи(винилпирролидон);
RAUединицы референсной амилазы;
RMSсреднеквадратичное значение;
РНКрибонуклеиновая кислота;
об/минобороты в минуту;
SAPUспектрофотометрическая единица кислой протеазы;
SASвторичные алкансульфонаты;
1X SSC0,15 M NaCl, 0,015 M цитрат натрия, pH 7,0;
сексекунды;
%SRIпроцентный показатель удаления краски;
SSFодновременные осахаривание и ферментация;
TAEDтетраацетилэтилендиамин;
m
Tтемпературная средняя точка для DSC-кривой, или температура плавления белка;
TNBSтринитробензолсульфоновая кислота;
мкгмикрограммы;
мклмикролитры;
мкНммикроньютон-метры;
мкммикрометр;
мкМмикромолярный;
Еединицы;
О/Ообъем/объем;
WEЗападная Европа;
масс.% массовый процент;
м/о (или М/О)масса/объем;
м/м (или М/М)масса/масса;
wtдикий тип.
1.2. Определения
В некоторых аспектах данное описание основывается на рутинных способах и методах, используемых в области генной инженерии и молекулярной биологии. Следующие источники включают в себя описания общей методологии, применимой в соответствии с тем, что описано здесь: Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (2nd Ed., 1989); Kreigler, GENE TRANSFER AND EXPRESSION; A LABORATORY MANUAL (1990) и Ausubel et al., Eds. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (1994).
Эти общие ссылки обеспечивают определения и способы, известные квалифицированным в данной области специалистам. Если нет других указаний, все технические и научные термины, используемые здесь, имеют такие же значения, какие обычно понимаются специалистом с обычной квалификацией в области, к которой относится это описание. Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2D ED., John Wiley and Sons, New York (1994) и Hale & Markham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991) обеспечивают одно из руководств с общими словарями многих терминов, используемых в этом описании.
"Выделенные" означает, что выделенное вещество, например, соединение или последовательность, модифицировано рукой человека относительно этого соединения или этой последовательности, обнаруживаемых в природе. Например, выделенная последовательность является по меньшей мере частично свободной, или по существу свободной, по меньшей мере от одного другого компонента, с которым эта последовательность природно ассоциирована при обнаружении в природе.
"Очищенные", при описании материала или вещества, означает, что этот материал или это вещество находится в относительно чистом состоянии, например, является по меньшей мере приблизительно на 90% чистым, по меньшей мере приблизительно на 95% чистым, по меньшей мере приблизительно на 98% чистым или по меньшей мере приблизительно на 99% чистым.
6
10
5
х
В данном контексте "крахмал" обозначает любую углеводную композицию, содержащую комплексные полисахариды, содержащие амилозу и/или амилопектин формулы (CHO), где "X" может быть любым числом. Предпочтительно, крахмалом называют любой такой углевод, который природно присутствует в растениях, в том числе, но не только, в зернах, травах, клубнях и корнях и, более конкретно, происходит из пшеницы, ячменя, кукурузы, ржи, риса, сорго, кассавы, проса, картофеля, сладкого картофеля и тапиоки. Крахмалом называют также синтетические крахмалы или модифицированные крахмалы, такие как химически модифицированный крахмал, для применения в качестве детектируемого субстрата для ферментных анализов, или крахмалы, химически или ферментативно модифицированные для улучшения одного или нескольких свойств, для применения.
В данном контексте "фитиновая кислота" (или инозитгексафосфат (IP6)), является важной запасной формой фосфора во многих тканях растений, таких как отруби, семена и т.п. Фитиновую кислоту называют здесь также "фитатом", в частности, когда она имеет форму соли. Различные другие инозитфосфаты, такие как инозитпента- (IP5), тетра- (IP4) и трифосфат (IP3), также называют здесь фитатами. Фитаты являются обычно трудноперевариваемыми человеком и большинством животных с моногастрическим (однокамерным) желудком.
Ферменты, которые деградируют фитаты, называют здесь "фитазами", и "фитазы" обычно являются миоинозитгексафосфатфосфогидролазами. Фитазную активность определяют в виде фитазных единиц (ФТЕ или Е), где одна ФТЕ определяется как количество фермента, которое высвобождает 1 микромоль неорганического фосфора (Р) в минуту из 0,0015 моль/л фитата натрия при pH 5,5 и 37°C. Это определение обеспечивает применимую меру количества фитазной активности и представляет простое эталонное измерение. Деградирующие фитат ферменты дрожжей (например, Schwanniomyces occidentalis, Pichia anomala, Arxula adeninivorans), грамотрицательных бактерий (например, Escherichia coli, Pseudomonas spp., Klebsiella spp.) и грамположительных бактерий (например, Bacillus spp.) были идентифицированы и охарактеризованы. Известны также фитазы из многих растений и из мицелиальных грибов, таких как Penicillium spp., Aspergillus spp., Trichoderma spp., Mucor piriformis и Cladosporium spp. 3-фитазы (EC 3.1.3.8) и 6-фитазы (EC 3.1.3.26) были охарактеризованы в зависимости от сайта инициации гидролиза. Фитазы были также охарактеризованы на основе их pH-"оптимума" либо как кислые (pH-оптимум около 5), либо как щелочные (pH-оптимум около 9). Доступны различные коммерческие фитазы, в том числе ROVABIO (Genencor International).
"Амилазой" называют фермент, который способен катализировать расщепление крахмального субстрата, приводящее к деградации или частичной деградации крахмала. Амилазы являются обычно гидролазами, которые расщепляют гликозидные связи в крахмале. В данном контексте амилаза включает в себя любую глюкоамилазу, альфа-амилазу, β-амилазу, например, альфа-амилазы дикого типа Bacillus spp., в частности, B. licheniformis. Обычно альфа-амилазы (EC 3.2.1.1; α-D-(1→4)-глюканогидролаза) являются эндо-действующими ферментами, определяемыми как ферменты, расщепляющие α-D-(l→4)-O-гликозидные связи в молекуле крахмала случайным образом. В противоположность этому, экзо-действующие амилолитические ферменты, такие как β-амилазы (EC 3.2.1.2; α-D-(l→4)-глюканмальтогидролаза) и некоторые продукт-специфические амилазы, такие как мальтогенная альфа-амилаза (EC 3.2.1.133), расщепляют субстратную молекулу крахмала от нередуцирующего конца. β-амилазы, α-глюкозидазы (EC 3.2.1.20; α-D-глюкозидглюкогидролаза), глюкоамилаза (EC 3.2.1.3; α-D-(1→4)-глюканглюкогидролаза) и продукт-специфические амилазы могут продуцировать мальтоолигосахариды конкретной длины из крахмала. Альфа-амилазу дикого типа из Bacillus stearothermophilus, или "AmyS"-амилазу, называют здесь иногда XTRA или SPEZYME XTRA, которые являются коммерческими продуктами AmyS из Genencor International.
В данном контексте "AmyS-подобные альфа-амилазы" применимы здесь в качестве исходных альфа-амилаз. AmyS-подобные альфа-амилазы составляют здесь класс альфа-амилаз на основе существенной гомологии, обнаруженной между ними. Предполагается, что термин "AmyS-подобная альфа-амилаза" указывает класс альфа-амилаз, в частности, альфа-амилаз Bacillus, особенно альфа-амилаз Geobacillus stearothermophilus, которые, на уровне аминокислот, обнаруживают существенную идентичность с альфа-амилазой, имеющей аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:2, здесь. Spezyme Xtra является коммерчески доступным из Danisco US Inc, Genencor Division. Geobacillus stearothermophilus назывался Bacillus stearothermophilus в литературе, и эти два названия могут использоваться здесь взаимозаменяемо. Считается, что все альфа-амилазы, имеющие аминокислотные последовательности, обеспеченные здесь, в виде SEQ ID NO:1, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15 и 16, соответственно, являются AmyS-подобными альфа-амилазами и, следовательно, пригодны в качестве исходных альфа-амилаз. AmyS-подобные альфа-амилазы включают в себя также альфа-амилазы, i) имеющие аминокислотные последовательности с по меньшей мере приблизительно 60% гомологией (идентичностью), например, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 75% или по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98% или по меньшей мере приблизительно 99% идентичностью, с по меньшей мере одной из аминокислотных последовательностей, показанных в SEQ ID NO:1, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15 и 16, и/или ii) которые кодируются ДНК-последовательностью, которая гибридизуется с ДНК-последовательностью, кодирующей любую из вышеуказанных альфа-амилаз, или которые очевидны из SEQ ID NO:9 (BAN), 5 (BSG), 3 (SP722), 1 (SP690), 7 (LAT), 11 (AA560) WO 06/002643 или данного описания, которые кодируют любую из аминокислотных последовательностей, показанных в SEQ ID NO: 1, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15 и 16 здесь, соответственно. Другие дополнительные гомологичные альфа-амилазы, применимые в качестве AmyS-подобных альфа-амилаз и, следовательно, в качестве исходных ферментов для получения описанных здесь вариантов, включают в себя альфа-амилазу, продуцируемую штаммом B. lichenformis, описанным в EP 0252666; (ATCC 27811), и альфа-амилазы, идентифицированные в WO 91/00353 и WO 94/18314; коммерческие AmyS-подобные альфа-амилазы содержатся в продуктах, продаваемых под следующими товарными названиями: Spezyme AA и ULTRAPHLOW (доступные из Danisco US Inc, Genencor Division), Keistase™ (доступный из Daiwa) и LIQUEZYME SC (доступный из Novozymes, Denmark). Раздел 1.5 здесь ниже обеспечивает дополнительную информацию, касающуюся AmyS-подобных альфа-амилаз. Таблица А в нем обеспечивает список нескольких применимых AmyS-подобных альфа-амилаз, а также удобный способ сравнения идентичностей аминокислотных последовательностей между ними. Квалифицированному специалисту будет понятно, что подобные таблицы могут быть созданы для других альфа-амилаз для определения их пригодности для применения здесь в качестве среднего (условного) фермента.
В данном контексте "спектрометрическая единица кислой протеазы" ("SAPU") является единицей активности протеазного фермента, где 1 SAPU является количеством активности протеазного фермента, которое высвобождает один микромоль тирозина в минуту из казеинового субстрата в условиях этого анализа.
"Глюкоамилазная единица" ("ГАЕ") является мерой амилолитической активности, которая будет продуцировать 1 г редуцирующего сахара, в расчете на глюкозу, в час из растворимого крахмального субстрата при pH 4,2 и 60°C.
В данном контексте термин "вариант" может быть использован взаимозаменяемо с термином "мутант". "Вариантами" могут называться либо полипептиды, либо нуклеиновые кислоты. Варианты включают в себя замены, инсерции, делеции, укорочения, трансверсии и/или инверсии, в одном или нескольких местоположениях относительной референсной последовательности. Вариантные нуклеиновые кислоты включают в себя последовательности, которые комплементарны последовательностям, которые способны гибридизоваться с представленными здесь нуклеотидными последовательностями. Например, описанная здесь вариантная нуклеиновая кислота может быть по меньшей мере частично комплементарной последовательности, способной гибридизоваться при строгих условиях (например, 50°C и 0,2X SSC {1X SSC=0,15 M NaCl, 0,015 M цитрат натрия, pH 7,0}) с представленными здесь нуклеотидными последовательностями. Более предпочтительно, термин вариант включает в себя последовательности, которые комплементарны последовательностям, которые способны гибридизоваться в условиях высокой строгости (например, 65°C и 0,1X SSC) с представленными здесь нуклеотидными последовательностями.
"Термостабильный (термостойкий)", при применении для описания фермента означает, что этот фермент является более термостабильным, чем референсный фермент. В данной заявке вариант альфа-амилазы является более термостабильным, чем альфа-амилаза B. licheniformis дикого типа, если этот вариант имеет относительно более высокую ферментативную активность после конкретного интервала времени при одних и тех же экспериментальных условиях, например, при одной и той же температуре, концентрации субстрата, и т.д. Альтернативно, более термостабильный фермент имеет более высокую теплоемкость, определяемую дифференциальной сканирующей калориметрией, в сравнении с референсным ферментом.
m
m
"Температура плавления" (T) полипептида является температурой, при которой конформация этого полипептида подвергается измеримому зависимому от температуры изменению. Конформация белка и T могут быть анализированы, например, по круговому дихроизму, одному из наиболее общих и основных инструментов для исследования фолдинга (укладки) белка. Спектроскопия кругового дихроизма измеряет абсорбцию (поглощение) циркулярно (круговым образом) поляризованного света. В белках такие структуры как альфа-спирали и бета-складки являются обычно хиральными и, следовательно, абсорбируют циркулярно поляризованный свет. Эта абсорбция света обеспечивает меру степени сворачиваемости (укладки) этого белка. Изменения в этой абсорбции в зависимости от температуры или концентрации денатурирующего агента могут быть использованы для исследования развертывания белка. Этот тип спектроскопии может быть также объединен с устройствами, такими как миксеры с останавливаемым потоком, для измерения кинетики укладки/развертывания белка.
"Кальций-зависимый" означает, что конкретный фермент требует кальция для существенного проявления каталитической активности. Обычно в данном контексте термин "кальций-зависимый" включает в себя свойство любого фермента, который имеет строгую потребность в ионе двухвалентного металла для проявления каталитической активности, а также включает в себя ферменты, каталитическая активность которых существенно (например, более чем на 20%) увеличивается в присутствии кальция или другого двухвалентного катиона.
В данном контексте "pH-стабильный" в отношении фермента может относиться к активности фермента или конформации белка этого фермента. В первом смысле "pH-стабильный" означает, что этот фермент остается каталитически активным при указанном pH или в указанном диапазоне pH. Во втором смысле фермент может считаться "стабильным" при pH, когда этот белок не денатурирован необратимо. В таком случае этот фермент мог бы стать каталитически активным при возвращении к pH, способному поддерживать каталитическую активность. pH-стабильность может быть также использована относительным или сравнительным образом, например, со референсным ферментом. В данной заявке вариант альфа-амилазы мог бы быть более pH-стабильным, чем альфа-амилаза B. licheniformis дикого типа, например, при поддержании при конкретном pH или при анализе в одних и тех же условиях, в том числе pH. Представляющие наибольший интерес pH являются обычно либо условиями фактического применения, либо pH, которые находятся на границах или вблизи границ или в экстремальных областях природной способности этого фермента оставаться каталитически активным.
"Диапазон pH" означает диапазон pH-величин, например, от кислых до более щелочных или наоборот. Что касается активности фермента, pH-диапазон указывает верхнюю и нижнюю величины pH, при которых этот фермент проявляет указанный уровень активности, например, минимальную активность, указанный процент максимальной активности или указанный уровень превращения субстрата или образования продукта.
"Рекомбинантные" при использовании в ссылке на клетку, нуклеиновую кислоту, белок или вектор, указывает, что эта клетка, нуклеиновая кислота, белок или вектор является результатом введения или был модифицирован введением гетерологичной последовательности или изменением нативной последовательности, или что эта клетка произведена из клетки, модифицированной или измененной таким образом. Так, например, рекомбинантные клетки могут экспрессировать гены, которые не обнаруживаются в природной (не рекомбинантной) форме этой клетки, или могут экспрессировать природные гены, которые в противном случае по-другому экспрессируются (например, экспрессируются уменьшенным образом или сверхэкспрессируются), экспрессируются атипично или вообще не экспрессируются.
В данном контексте термины "нуклеотидная последовательность" или "последовательность нуклеиновой кислоты" относятся к любой последовательности двух или нескольких нуклеотидов, рибонуклеотидов или т.п. или их производных. Нуклеотидные последовательности включают в себя олигонуклеотидные и полинуклеотидные последовательности, а также их варианты, гомологи, фрагменты и производные. Нуклеотидная последовательность может быть одноцепочечной, двухцепочечной или мультицепочечной. Эта нуклеотидная последовательность может быть получена из любого источника или иметь любое происхождение, например, быть геномной, синтетической или рекомбинантной, и включает в себя геномную ДНК, кДНК, синтетическую ДНК и РНК и т.п., а также их гибриды. Нуклеотидные последовательности могут содержать один или несколько кодонов и могут кодировать один или несколько полипептидов. Нуклеотидные последовательности могут преимущественно предполагать одну или несколько энергетически предпочтительных трехмерных структур.
"Вектором" называют нуклеотидную последовательность, часто используемую для экспериментального применения in vitro или для введения нуклеиновых кислот в один или несколько типов клеток. Векторы включают в себя клонирующие векторы, экспрессирующие in vivo и in vitro векторы, челночные векторы, плазмиды, фагмиды, космиды, фаговые частицы, кассеты и т.п.
"Экспрессирующий вектор" обозначает в данном контексте ДНК-конструкцию, содержащую ДНК-последовательность, которая функционально связана с подходящей регуляторной последовательностью, способной осуществлять экспрессию этой ДНК в подходящем хозяине. Такие регуляторные последовательности могут включать в себя промотор для выполнения транскрипции, необязательную операторную последовательность для регуляции транскрипции, последовательность, кодирующую подходящие сайты связывания рибосом на мРНК, энхансеры и последовательности, которые регулируют терминацию транскрипции и трансляции.
Полинуклеотид или полипептид, имеющие определенный процент (например, по меньшей мере приблизительно 80%, 85%, 90%, 95% или 99%) идентичности последовательности с другой последовательностью, означает, что, при сопоставлении, процент оснований или аминокислотных остатков является одним и тем же в сравнении этих двух последовательностей. Это сопоставление и процентная гомология или идентичность могут быть измерены с использованием подходящей программы программного обеспечения, известной в данной области, например, программ, описанных в CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel et al. (eds) 1987, Supplement 30, section 7.7.18). Такие программы могут включать в себя программу GCG Pileup, FASTA (Pearson et al. (1988) Proc. Natl, Acad. Sci USA 85:2444-2448) и BLAST (BLAST Manual, Altschul et al., Natl Cent. Biotechnol. Inf., Natl Lib. Med. (NCIB NLM NIH), Bethesda, Md., и Altschul et al., (1997) NAR 25:3389-3402). Другой программой сопоставления является ALIGN Plus (Scientific and Educational Software, PA), использующая параметры по умолчанию. Другой программой программного обеспечения для последовательностей, которая находит применение, является TFASTA Data Searching Program, доступная в Sequence Software Package Version 6.0 (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI).
m
Квалифицированному в данной области специалисту будет понятно, что последовательности, включенные в данное изобретение, определяются также способностью гибридизоваться при строгих условиях гибридизации с приведенной в качестве примера amyS-последовательностью (например, SEQ ID NO:5 WO 06/002643). Нуклеиновая кислота может гибридизоваться с другой последовательностью нуклеиновой кислоты, когда одноцепочечная форма этой нуклеиновой кислоты может отжигаться с другой нуклеиновой кислотой при подходящих условиях температуры и ионной силы раствора. Условия гибридизации и промывки хорошо известны в данной области (см., например, Sambrook (1989) supra, в частности, части 9 и 11). В некоторых вариантах осуществления строгие условия соответствуют T 65°C и 0,1х SSC, 0,1% ДСН.
"Геном" называют ДНК-сегмент, который участвует в продуцировании полипептида и включает в себя районы, предшествующие кодирующим районам и следующие за кодирующими районами, а также промежуточные последовательности (интроны) между отдельными кодирующими сегментами (экзонами).
"Гетерологичный" со ссылкой на полинуклеотид или белок обозначает полинуклеотид или белок, который природно не встречается в клетке-хозяине. В некоторых вариантах осуществления этот белок является коммерчески важным промышленным белком. Предполагается, что этот термин включает в себя белки, которые кодируются природно встречающимися генами, мутированными генами и/или синтетическими генами.
"Эндогенный" со ссылкой на полинуклеотид или белок относится к полинуклеотиду или белку, который встречается природно в клетке-хозяине.
В данном контексте термины "трансформированные", "стабильно трансформированные" и "трансгенные", используемые в ссылке на клетку, означают, что эта клетка содержит по меньшей мере одну неприродную (например, гетерологичную) последовательность нуклеиновой кислоты. Стабильно трансформированная клетка содержит по меньшей мере одну такую последовательность нуклеиновой кислоты, интегрированную в ее геном или в эписомной плазмиде, которая сохраняется на протяжении многих генераций.
В данном контексте "экспрессия" обозначает процесс, при помощи которого полипептид продуцируется на основе последовательности нуклеиновой кислоты гена. Этот процесс включает в себя как транскрипцию, так и трансляцию.
"Сигнальной последовательностью" называют последовательность аминокислот, ковалентно связанную с N-концевой частью белка, которая облегчает транспорт этого белка, например, секрецию зрелой формы этого белка наружу из клетки. Это определение сигнальной последовательности является функциональным. Зрелая форма внеклеточного белка лишена сигнальной последовательности, которая отщепляется, например, во время процесса секреции.
В данном контексте термин "произведенный" включает в себя термины "происходящий из", "полученный из" или "получаемый из" и "выделенный из".
Термины "белок" и "полипептид" используются здесь взаимозаменяемо. Здесь используется общепринятый однобуквенный или трехбуквенный код для аминокислотных остатков.
"Промотор" является регуляторной последовательностью, которая участвует в связывании РНК-полимеразы для инициации транскрипции гена. Промотор может быть индуцируемым промотором или конститутивным промотором. Например, здесь может быть использован индуцируемый промотор cbh1 из Trichoderma reesei.
"Функционально связанные" относится к размещению, в котором элементы находятся в расположении, позволяющем им быть функционально связанными, даже в том случае, когда они не находятся в тесной физической близости. Например, промотор является функционально связанным с кодирующей последовательностью, если он способен регулировать кодирующую последовательность и действительно регулирует транскрипцию этой последовательности при пермиссивных условиях или способствует ей.
"Селективным маркером" называют ген, способный к экспрессии в хозяине, который позволяет отбор хозяев, экспрессирующих этот маркерный ген. Примеры селектируемых маркеров включают в себя, но не ограничиваются ими, ген, который обеспечивает измененную устойчивость к антимикробному агенту (например, гигромицину, блеомицину или хлорамфениколу), и/или гены, которые придают метаболическую селективность, например, пищевое преимущество клетке-хозяину, например, рост на конкретном субстрате в качестве единственного источника углевода.
"Введенные", в контексте введения последовательности нуклеиновой кислоты в клетку, означает "трансфекцию" или "трансформацию" или "трансдукцию" и включает в себя ссылку на включение последовательности нуклеиновой кислоты в эукариотическую или прокариотическую клетку, в которой эта последовательность нуклеиновой кислоты может быть включена в геном этой клетки (например, хромосомную, плазмидную, пластидную или митохондриальную ДНК), превращена в автономный репликон или транзиторно экспрессирована (например, трансфицированная мРНК).
"Хозяин", "штамм-хозяин" или "клетка-хозяин" обозначает подходящую клетку, в которой помещены экспрессирующий вектор или ДНК-конструкция, содержащие полинуклеотид, например, кодирующий вариантную альфа-амилазу. Штаммы-хозяева являются бактериальными клетками. В предпочтительном варианте осуществления "клетка-хозяин" означает клетки и/или протопласты, полученные из клеток микробного штамма, например, Bacillus spp.
Термин "культивирование" относится к росту популяции микробных клеток при подходящих условиях а среде, способной поддерживать такой рост. В одном варианте осуществления культивирование относится к ферментативному биопревращению крахмального субстрата, содержащего гранулированный крахмал, в конечный продукт (обычно в сосуде или реакторе).
Термин "ферментативное превращение" обычно относится к модификации субстрата под действием фермента. Этот термин, в данном контексте относится также к модификации крахмального субстрата под действием фермента.
В данном контексте термин "осахаривание" относится к ферментативному превращению крахмала в глюкозу.
Термин "степень полимеризации (DP)" относится к количеству (n) ангидроглюкопиранозных единиц в конкретном сахариде. Примерами DP1 являются моносахариды, такие как глюкоза и фруктоза. Примерами DP2 являются дисахариды, такие как мальтоза и сахароза. DP>3 обозначает полимеры со степенью полимеризации, большей, чем 3. Квалифицированному в данной области специалисту будет понятно, что соединения с более высокими DE являются более полимерными.
"Конечный продукт" или "желаемый конечный продукт" обозначает любой предполагаемый продукт ферментативной реакции, например, произведенную из крахмала молекулу, которая ферментативно образуется из крахмального субстрата.
Термин "остаточный крахмал" относится к любому остаточному крахмалу (растворимому или нерастворимому), оставшемуся в композиции после ферментации крахмалсодержащего субстрата.
В данном контексте "удельная активность" означает единицу фермента, определяемую как количество молей субстрата, превращаемого в продукт препаратом фермента за единицу времени при конкретных условиях. Удельную активность выражают в виде единицы (U)/единицу массы белка, обычно, Е/мг белка.
"Выходом" называют количество конечного продукта или желаемых конечных продуктов, получаемых с использованием способов данного изобретения. В некоторых вариантах осуществления этот выход является большим, чем выход, получаемый с использованием способов, известных в данной области. В некоторых вариантах осуществления этот термин относится к объему конечного продукта, а в других вариантах осуществления этот термин относится к концентрации конечного продукта.
В данном контексте "биологически активными” являются соединение или последовательность, которые оказывают измеримое действие на биологическую систему, например, на клетку, орган или организм.
"ATCC" обозначает Американскую Коллекцию Типовых Культур, находящуюся в Manassas, VA 20108 (ATCC).
"NRRL" обозначает Коллекцию культур службы сельскохозяйственных исследований, Национальный Центр сельскохозяйственных исследований (ранее известный как USDA (Северная региональная исследовательская лаборатория) Peoria, Ill.
В данном контексте "пищевой продукт" означает любые ингредиент, компонент или композицию, которые обеспечивают питательную ценность для животного, в том числе человека.
В данном контексте обычно, при описании белков и генов, которые их кодируют, термин для гена обычно пишут курсивом (например, ген, который кодирует amyL (альфа-амилазу B. licheniformis), может обозначаться как amyL). Термин для белка обычно не пишут курсивом и первая буква обычно является заглавной буквой, например, AmyL или amyL). Если нет других указаний, нуклеиновые кислоты пишут обычно слева направо в ориентации 5'→3' и аминокислотные последовательности пишут слева → направо в ориентации амино → карбокси, соответственно.
В этом контексте термин "содержащий" и родственные термины используют в смысле включения в себя; т.е. в виде эквивалента термина "включающий в себя" и его родственных терминов. Численные диапазоны включают в себя и числа, определяющие этот диапазон.
Обеспеченные здесь заголовки не являются ограничениями различных аспектов или вариантов того, что описывается.
Хотя любые способы и материалы, сходные с описанными здесь или эквивалентные описываемым здесь, могут быть использованы в практике или тестировании того, что здесь раскрывается, некоторые предпочтительные в настоящее время способы и материалы описаны без намерения ограничения практика какими-либо описанными способами, протоколами и реагентами, так как они могут варьироваться. Все патенты и публикации, в том числе все последовательности, раскрываемые такими патентами и публикациями, приведенными здесь, специально включены здесь в качестве ссылки.
2. Номенклатура
В данном описании и формуле изобретения используются однобуквенный и трехбуквенный коды для аминокислотных остатков. Для легкости приведения ссылок варианты альфа-амилазы обычно описываются с использованием следующей номенклатуры:
Исходная аминокислота (аминокислоты): положение (положения); замененная аминокислота (аминокислоты).
Согласно этой номенклатуре, замена, например, серина аланином в положении 242 показана как:
Ser242Ala или S242A
Делеция аланина в положении 30 показана как:
Ala30* или A30* или ΔA30
и инсерция дополнительного аминокислотного остатка, такого как лизин, показана как:
Ala30AlaLys или A30AK
Делеция последовательного участка аминокислотных остатков, таких как аминокислотные остатки 30-33, показана как (30-33)* или Δ(A30-N33).
Когда конкретная альфа-амилаза содержит "делецию" в сравнении с другими альфа-амилазами и в этом положении произведена инсерция, это указывается как:
*36Asp или *36D
для инсерции аспарагиновой кислоты в положении 36.
Множественные мутации разделяются знаком плюс, т.е.:
Ala30Asp+Glu34Ser или A30N+E34S,
представляющие мутации в положениях 30 и 34, замены аланина и глутаминовой кислоты аспарагином и серином, соответственно.
При инсерции одного или нескольких аминокислотных остатков в конкретном положении, это указывается как
A30N,E или альтернативно A30N или A30E
Кроме того, когда положение, подходящее для модификации, идентифицируется здесь без какой-либо конкретной предполагаемой модификации, должно быть понятно, что аминокислотный остаток в этом положении может быть заменен любым аминокислотным остатком. Так, например, когда упоминается, но не указывается конкретно, модификация аланина в положении 30, должно быть понятно, что этот аланин может быть делетирован или заменен любой другой аминокислотой, т.е. любой из:
R, N, D, A, C, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V.
Кроме того, "A30X" обозначает любую из следующих замен: A30R, A30N, A30D, A30C, A30Q, A30E, A30G, A30H, A30I, A30L, A30K, A30M, A30F, A30P, A30S, A30T, A30W, A30Y или A30V; или вкратце:
A30R,N,D,C,Q,E,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V.
Если исходный фермент - используемый для нумерации - уже имеет рассматриваемый аминокислотный остаток, предназначенный для замены в этом положении, используется следующая номенклатура:
"X30N" или "X30N,V", в случае, когда один из N или V присутствует в диком типе. Это указывает на то, что другие соответствующие исходные ферменты имеют замены "Asn" или "Val" в положении 30.
Характеристики аминокислотных остатков
Заряженные аминокислоты:
Asp, Glu, Arg, Lys, His
Отрицательно заряженные аминокислоты (с наиболее отрицательным первым остатком):
Asp, Glu
Положительно заряженные аминокислоты (с наиболее положительным первым остатком):
Arg, Lys, His
Нейтральные аминокислоты:
Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Met, Cys, Asn, Gln, Ser, Thr, Pro
Гидрофобные аминокислотны остатки (с наиболее гидрофобным последним остатком):
Gly, Ala, Val, Pro, Met, Leu, Ile, Tyr, Phe, Trp
Гидрофильные аминокислоты (с наиболее гидрофильным последним остатком):
Thr, Ser, Cys, His, Glu, Gln, Asn, Asp, Lys, Arg
4. Альфа-амилазы и AmyS-подобные амилазы
4.1 Идентичности аминокислот различных альфа-амилаз
Ряд альфа-амилаз, продуцируемых Bacillus spp., являются высоко гомологичными (идентичными) на уровне аминокислот и могут быть применимы в качестве исходных ферментов здесь. Процентная идентичность (на основе аминокислотной последовательности) ряда известных альфа-амилаз Bacillus, относительно друг друга, может быть найдена в таблице А ниже:
Квалифицированному в данной области специалисту будет понятно, что процентные идентичности могут быть определены из литературы или определены любым способом, описанным здесь или известным в данной области. Например, было обнаружено, что альфа-амилаза B. licheniformis (LAT) (SEQ ID NO:7) является приблизительно на 81% гомологичной с альфа-амилазой B. amyloliquefaciens (SEQ ID NO:9) и приблизительно на 65% гомологична с альфа-амилазой G. stearothermophilus (BSG) (SEQ ID NO:1). Дополнительные гомологичные альфа-амилазы включают в себя SP690 и SP722, описанные в WO 95/26397, и альфа-амилазу #707, полученную из Bacillus spp. (SEQ ID NO:6), описанную Tsukamoto et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 151 (1988), pp. 25-31. Альфа-амилаза KSM AP1378 описана WO 97/00324 (из KAO Corporation).
4.2. Исходные альфа-амилазы
AmyS-подобные альфа-амилазы, определенные выше, могут быть использованы в качестве исходной альфа-амилазы. В предпочтительном варианте осуществления исходная альфа-амилаза получена из G. stearothermophilus, например, одна из альфа-амилаз, описанных выше, такая как альфа-амилаза G. stearothermophilus, имеющая аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:1 или 2.
4.3 Исходные гибридные альфа-амилазы
Исходная альфа-амилаза (т.е. каркасная альфа-амилаза) может быть также гибридной альфа-амилазой, т.е. альфа-амилазой, которая содержит комбинацию частичных аминокислотных последовательностей, произведенных по меньшей мере из двух альфа-амилаз.
Эта исходная гибридная альфа-амилаза может быть альфа-амилазой, которая на основе аминокислотной гомологии (идентичности) и/или ДНК-гибридизации (определенной выше), может быть определена как принадлежащая к семейству AmyS-подобных альфа-амилаз, описанному выше. В таком случае, эта гибридная альфа-амилаза обычно состоит по меньшей мере из одной части AmyS-подобной альфа-амилазы и части (частей) одной или нескольких других альфа-амилаз, выбранных из AmyS-подобных альфа-амилаз или не AmyS-подобных альфа-амилаз, происходящих из микробов (бактерий или грибов) и/или млекопитающих.
Таким образом, исходная гибридная альфа-амилаза может содержать комбинацию частичных аминокислотных последовательностей, происходящих по меньшей мере из двух AmyS-подобных альфа-амилаз, или по меньшей мере из одной AmyS-подобной и по меньшей мере из одной не AmyS-подобной бактериальной альфа-амилазы, AmyS-подобной и по меньшей мере одной грибной альфа-амилазы. AmyS-подобная альфа-амилаза, из которой происходит частичная аминокислотная последовательность, может быть любой из конкретных AmyS-подобных альфа-амилаз, на которые здесь делаются ссылки.
Например, исходная альфа-амилаза может содержать С-концевую часть альфа-амилазы, происходящей из штамма B. licheniformis, и N-концевую часть альфа-амилазы, происходящей из штамма G. stearothermophilus или из штамма G. stearothermophilus (BSG).
5. Гомология (идентичность)
Гомология может быть определена как степень идентичности между двумя последовательностями, показывающая родство между ними, например, образование первой последовательности из второй или наоборот. Гомология может быть определена визуальным исследованием или вычислениями вручную, но более предпочтительно с использованием компьютерных программ, известных в данной области, таких как GAP, программы, обеспеченной в пакете программ GCG (описанных выше). Так, может быть использована Gap GCG v8, например, с матрицей оценок по умолчанию для идентичности и следующих параметров по умолчанию: штраф создания GAP 5,0 и штраф удлинения GAP 0,3, соответственно, для сравнения последовательностей нуклеиновых кислот, и штраф создания GAP 3,0 и штраф удлинения GAP 0,1, соответственно, для сравнения последовательностей белков. GAP использует способ Needleman and Wunsch, (1970), J. Mol. Biol. 48: 443-453, для получения сопоставлений и расчета идентичности.
Структурное сопоставление между Spezyme Xtra (SEQ ID NO:2) и, например, другой альфа-амилазой может быть использовано для идентификации эквивалентных/соответствующих положений в других AmyS-подобных альфа-амилазах. Одним способом получения указанного структурного сопоставления является применение программы Pile Up из пакета GCG с использованием величин по умолчанию штрафов создания гэпа, т.е. штрафа создания гэпа 3,0 и штрафа удлинения гэпа 0,1. Другие способы структурного сопоставления включают в себя гидрофобный кластерный анализ (Gaboriaud et al., FEBS Lett. 224: 149-155, 1987) и способ замены боковых цепей одного белка боковыми цепями другого белка с сохранением постоянной конформации основной цепи (Huber, T; Torda, AE, Protein Sci. 7(1) 142-149, 1998).
6. Гибридизация
Олигонуклеотидный зонд, используемый в характеристике AmyS-подобной альфа-амилазы, описанной выше, может быть получен удобным способом на основе полной или частичной нуклеотидной и аминокислотной последовательности рассматриваемой альфа-амилазы.
nd
Подходящие условия для оценивания гибридизации включают в себя предварительное пропитывание в 5X SSC и предварительную гибридизацию в течение 1 часа при 40ºC в растворе 20% формамида, 5X раствора Денхардта, 50 мМ фосфата натрия, pH 6,8, и 50 мг денатурированной обработанной ультразвуком ДНК тимуса теленка с последующей гибридизацией в том же самом растворе, дополненном 100 мМ АТФ, в течение 18 часов при 40ºC, с последующими тремя промывками фильтра в 2X SSC, 0,2% ДСН при 40°C в течение 30 минут (низкая строгость), предпочтительно при 50ºC (средняя строгость), более предпочтительно при 65ºC (высокая строгость) и даже более предпочтительно при 75ºC (очень высокая строгость). Более подробно описание способа гибридизации может быть найдено в Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2 Ed., Cold Spring Harbor, 1989.
В данном контексте "происходящая из" обозначает не только указание на альфа-амилазу, продуцированную или продуцируемую рассматриваемым штаммом организма, но также на альфа-амилазу, кодируемую ДНК-последовательностью, выделенной из такого штамма, и продуцируемую в организме-хозяине, трансформированном указанной ДНК-последовательностью. Наконец, этот термин предназначен для указания на альфа-амилазу, которая кодируется ДНК-последовательностью синтетического происхождения или ДНК-последовательностью, происходящей из кДНК, и которая имеет идентифицирующие характеристики рассматриваемой альфа-амилазы. Этот термин предназначен также для указания, что исходная альфа-амилаза может быть вариантом природно встречающейся альфа-амилазы, т.е. вариантом, который является результатом модификации (инсерции, замены, делеции) одного или нескольких аминокислотных остатков природно встречающейся альфа-амилазы.
7. Основные мутации в вариантных альфа-амилазах
Описанный здесь вариант, в одном из вариантов осуществления, может содержать одну или несколько модификаций, наряду с вышеописанными модификациями. Так, может быть выгодно, чтобы один или несколько остатков пролина (Pro), присутствующих в части альфа-амилазного варианта, были модифицированы и/или заменены остатком, не являющимся пролином, который может быть любым из возможных, природно встречающихся остатков, не являющихся пролином, и который может быть предпочтительно аланином, глицином, серином, треонином, валином или лейцином.
Аналогично, в одном варианте осуществления один или несколько остатков цистеина, присутствующих в исходной альфа-амилазе, могут быть заменены остатком, не являющимся цистеином, таким как серин, аланин, треонин, глицин, валин или лейцин.
Должно быть понятно, что это описание включает в себя варианты, включающие в себя две или более вышеуказанных модификаций.
Кроме того, может быть выгодным введение мутаций в одном или нескольких из следующих положений (с использованием для нумерации SEQ ID NO:7):
M15, V128, A111, H133, W138, T149, M197, N188, A209, A210, H405, T412, в частности, следующих единственных, двойных или тройных или множественных мутаций:
M15X, в частности, M15T,L;
V128X, в частности, V128E;
H133X, в частности, H133Y;
N188X, в частности, N188S,T,P;
M197X, в частности, M197T,L;
A209X, в частности, A209V;
M197T/W138F; M197T/138Y; M15T/H133Y/N188S;
M15N128E/H133Y/N188S; E119C/S130C; D124C/R127C;
H133Y/T149I; и/или
G475R, H133Y/S187D; H133Y/A209V.
В случае, когда исходная альфа-амилаза имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:7, релевантные аминокислотные остатки, которые могут быть делетированы или заменены с целью улучшения стабильности к окислению, включают в себя единственный остаток цистеина (C363) и остатки метионина, расположенные в положениях M8, M9, M96, M200, M206, M284, M307, M311, M316 и M438 в SEQ ID NO:2.
Что касается увеличения термостабильности варианта альфа-амилазы относительно его исходной альфа-амилазы, по-видимому, особенно желательно делетировать по меньшей мере один и предпочтительно два или даже три из следующих аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO:2: F178, R179, G180, I181, G182 и K183.
Особенно интересными парными делециями этого типа являются R179*+G180*; и I181*+G182* (SEQ ID NO:16 или 15, соответственно) (или эквиваленты этих парных делеций в другой альфа-амилазе, удовлетворяющие требованиям исходной альфа-амилазы в контексте данного изобретения).
Другие представляющие интерес остатки включают в себя N193F и V416G в аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO:2.
8. Измененные свойства вариантов
8.1 Общая часть
Следующий раздел описывает взаимосвязь между мутациями, которые присутствуют в описанном здесь варианте, и желаемыми изменениями свойств (относительно свойств исходной AmyS-подобной альфа-амилазы), которые могут происходить из этого.
Здесь описаны AmyS-подобные альфа-амилазы с измененными свойствами. Исходными альфа-амилазами, конкретно рассматриваемыми здесь, являются AmyS-подобные альфа-амилазы и исходные гибридные AmyS-подобные альфа-амилазы.
В одном варианте осуществления в качестве исходной точки используют альфа-амилазу Geobacillus stearothermophilus (SEQ ID NO:2), т.е. исходную амилазу, но в других вариантах осуществления могут использоваться SP722, BLA, BAN, AA560, SP690, KSM AP1378, #707 и другие альфа-амилазы Bacillus. Положения аминокислот, соответствующие положениям в SEQ ID NO:2, могут быть легко определены в соответствии с этим.
Квалифицированному в данной области специалисту будет понятно, что, хотя любая исходная альфа-амилаза могла бы использоваться в качестве референсной амилазы или быть модифицирована в конкретном варианте, SEQ ID NO:1 является в настоящее время предпочтительной последовательностью для такой цели, так как она является самой длинной последовательностью B. stearothermophilus, доступной здесь.
В одном аспекте это изобретение относится к варианту с измененными свойствами, например, как описано выше.
В одном из нескольких его аспектов это изобретение обеспечивает вариант исходной альфа-амилазы G. stearothermophilus, содержащий изменение в одном или нескольких положениях (с использованием, например, SEQ ID NO:1 для нумерации аминокислот), выбранный из группы, состоящей из
P17, D19, T21, N28, S51, G72, V74, A82, Q86, Q89, A93, G95, Q97, W115, D117, P123, S124, D125, N127, I130, G132, Q135, P145, G146, G148, S153, Y159, W166, S169, K171, W187, P209, N224, S242, G256, D269, N271, T278, N281, G302, A304, R308, T321, Q358, P378, S382, K383, T398, H405, T417, E418, P420, G421, P432, W437, G446, G454, S457, T459, T461, S464, G474, R483,
где
(a) это изменение (эти изменения) являются независимо (i) инсерцией аминокислоты справа от аминокислоты, которая занимает это положение; (ii) делецией аминокислоты, которая занимает это положение; или (iii) заменой аминокислоты, которая занимает это положение, другой аминокислотой,
(b) этот вариант имеет альфа-амилазную активность и
(c) каждое положение соответствует положению аминокислотной последовательности исходной альфа-амилазы, например, альфа-амилазы G. stearothermophilus, например, имеющей аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:2, например, укороченной альфа-амилазы, которая доступна коммерчески в виде SPEZYME XTRA из Genencor.
Конкретно, здесь рассматриваются S242A, S242Q, S242N и S242E.
Кроме того, остатки R179, G180, I181, G182, K183 были выбраны для выяснения действия мутаций в кальций-натрий-связывающем районе, и P245 был выбран, поскольку пролин в середине альфа-спирали является необычным.
Соответствующие положения в других исходных AmyS-подобных альфа-амилазах могут быть найдены посредством сопоставления, описанного выше, например, как это сделано с последовательностями, показанными на фигуре 4. Таким образом, здесь обсуждаются варианты исходной AmyS-подобной альфа-амилазы, содержащие изменение в одном или нескольких из перечисленных выше положениях (с использованием, например, SEQ ID NO:1 для сравнительной нумерации аминокислот).
8.2 Измененные свойства: стабильность
В контексте описанных здесь вариантов мутации (в том числе аминокислотные замены и делеции), важные в отношении достижения измененной стабильности, в частности, улучшенной стабильности (т.е. более высокой или более низкой), при особенно высоких температурах (т.е. приблизительно 70-120°C) и/или крайних pH (т.е. низком или высоком pH, т.е. pH 4-6 или pH 8-11, соответственно), в частности, при концентрациях свободного (т.е. несвязанного, следовательно, находящегося в растворе) кальция ниже 60 м.д., включают в себя любую из мутаций, перечисленных в разделе "Измененные свойства". Стабильность может быть определена, как описано в разделе "Способы" ниже.
2+
8.3 Измененные свойства: устойчивость к Ca
2+
+
2+
Измененная устойчивость к Ca означает, что устойчивость этого фермента при истощении Ca была улучшена, т.е. была более высокой или более низкой устойчивостью, относительно исходного фермента. В контексте описанных теперь вариантов мутации (в том числе аминокислотные замены и делеции), важные в отношении достижения измененной устойчивости к Ca, в частности, улучшенной устойчивости, т.е. более высокой или более низкой устойчивости, при особенно высоком pH (т.е. pH 8-10,5), включают в себя любую из мутаций, перечисленных в разделе "Измененные свойства".
8.4 Измененные свойства: удельная активность
В следующем аспекте важные мутации (в том числе аминокислотные замены и делеции) в отношении получения вариантов, проявляющих измененную удельную активность, в частности, увеличенную или уменьшенную удельную активность, особенно при температурах приблизительно 10-60ºC, предпочтительно приблизительно 20-50ºC, в частности, приблизительно 0-40ºC, включают в себя любую из мутаций, перечисленных в разделе "Измененные свойства". Удельная активность может быть определена, как описано в разделе "Способы" ниже.
8.5 Измененные свойства: устойчивость к окислению
Описанные варианты могут иметь измененную устойчивость к окислению, в частности, более высокую устойчивость к окислению, в сравнении с исходной альфа-амилазой. Увеличенная устойчивость к окислению является выгодной в композициях, предназначенных для разжижения крахмала. Устойчивость к окислению может быть определена, как описано в разделе "Способы" ниже.
8.6 Измененные свойства: измененный профиль pH
Важные положения и мутации в отношении получения вариантов с измененным профилем pH, в частности, улучшенной активностью при особенно высоком pH (т.е. pH 8-10,5) или низком pH (т.е. pH 4-6), включают в себя мутации аминокислотных остатков, расположенных вблизи остатков активного центра.
Предпочтительные конкретные мутации/замены включают в себя мутации/замены, перечисленные выше в разделе "Измененные свойства" для рассматриваемых положений. Подходящие анализы описаны в разделе "Способы" ниже.
8.7 Измененные свойства: моющая способность
Важные положения и мутации в отношении получения вариантов с улучшенной моющей способностью при особенно высоком pH (т.е. pH 8,5-11) включают в себя конкретные мутации/замены, перечисленные выше в разделе "Измененные свойства" для рассматриваемых положений. Моющая способность может быть тестирована, как описано ниже в разделе "Способы".
9. Способы получения вариантов альфа-амилазы
Способы введения мутаций в гены известны в данной области, как и способы клонирования для кодирующих α-амилазу ДНК-последовательностей. Такие способы, в том числе способы генерирования мутаций в специфических сайтах в кодирующей α-амилазу последовательности, будут обсуждаться ниже.
9.1 Клонирование ДНК-последовательности, кодирующей α-амилазу
ДНК-последовательность, кодирующая исходную α-амилазу, может быть выделена из любой клетки или любого микроорганизма, продуцирующих рассматриваемую α-амилазу, с использованием способов, хорошо известных в данной области. Сначала должна быть сконструирована библиотека геномной ДНК и/или кДНК с использованием хромосомной ДНК или мессенджер-РНК из организма, который продуцирует исследуемую α-амилазу. Если аминокислотная последовательность этой α-амилазы известна, могут быть синтезированы гомологичные, меченые олигонуклеотидные зонды и использованы для идентификации кодирующих α-амилазу клонов из геномной библиотеки, приготовленной из рассматриваемого организма. Альтернативно, содержащие меченый зонд последовательности, гомологичные известному гену α-амилазы, могут быть использованы для идентификации кодирующих α-амилазу клонов, например, с использованием гибридизации и промывочных условий более низкой строгости.
Другой способ идентификации кодирующих α-амилазу клонов основан на инсертировании фрагментов геномной ДНК в экспрессирующий вектор, такой как плазмида, трансформации α-амилаза-негативных бактерий с полученной библиотекой геномной ДНК и посеве трансформированных бактерий на агар, содержащий субстрат для α-амилазы, с позволением посредством этого легкой идентификации клонов, экспрессирующих α-амилазу.
Альтернативно, ДНК-последовательность, кодирующая этот фермент, может быть получена синтетически установленными, стандартными способами, например, фосфоамидитным способом, описанным S. L. Beaucage and M. H. Caruthers, Tetrahedron Letters 22: 1859-1869 (1981), или способом, описанным Matthes et al., EMBO J. 3:801-895 (1984). В фосфоамидитном способе олигонуклеотиды синтезируют, например, в автоматизированном ДНК-синтезаторе, очищают, отжигают, лигируют и клонируют в подходящих векторах.
Наконец, эта ДНК-последовательность может быть последовательностью смешанного происхождения, например, геномными и синтетическими последовательностями, синтетическими и кДНК-последовательностями или геномными и кДНК-последовательностями, полученными лигированием фрагментов, происходящих из синтетической, геномной ДНК или кДНК (соответственно, фрагментов, соответствующих различным частям полной ДНК-последовательности), в соответствии со стандартными способами. Эта ДНК-последовательность может быть также получена полимеразной цепной реакцией (ПЦР) с использованием специфических праймеров, например, как описано в патенте США № 4683202 или R. K. Saiki et al. EMBO J. 3:801-895 (1988).
9.2 Сайт-направленный мутагенез
После выделения кодирующей α-амилазу ДНК-последовательности и идентификации желаемых сайтов для мутаций, мутации могут быть введены с использованием синтетических олигонуклеотидов. Эти олигонуклеотиды содержат нуклеотидные последовательности, фланкирующие желаемые сайты мутации; мутантные нуклеотиды инсертируют во время синтеза олигонуклеотидов. В конкретном способе одноцепочечный гэп ДНК, присоединяющий мостиковой связью кодирующую α-амилазу последовательность, создают в векторе, несущем ген α-амилазы. Затем этот синтетический нуклеотид, несущий желаемую мутацию, отжигают с гомологичной частью этой одноцепочечной ДНК. Затем оставшийся гэп достраивают ДНК-полимеразой I (фрагментом Кленова) и эту конструкцию лигируют с использованием лигазы Т4. Конкретный пример этого способа описан в Morinaga et al. Biotechnology 2:636-639 (1984). Патент США № 4760025 описывает введение олигонуклеотидов, кодирующих множественные мутации, выполнением минорных изменений этой кассеты. Однако даже большее разнообразие мутаций может быть введено за один раз по способу Morinaga, так как могут вводиться множество олигонуклеотидов разной длины.
Другой способ введения мутаций в кодирующие α-амилазу ДНК-последовательности описан в Nelson and Long, Analytical Biochem., 180: 147-151, 1989. Он включает в себя 3-ступенчатое генерирование ПЦР-фрагмента, содержащего желаемую мутацию, вводимого с использованием химически синтезированной ДНК-цепи в качестве одного из праймеров в ПЦР-реакциях. Из ПЦР-генерированного фрагмента может быть выделен несущий мутацию фрагмент расщеплением рестрикционными эндонуклеазами и повторно инсертирован в экспрессионную плазмиду.
Квалифицированному в данной области специалисту будет понятно, что для обеспечения или получения описанных вариантов доступны многие альтернативные способы, например, перетасовка генов, например, как описано в WO 95/22625 (из Affymax Technologies N.V.) или в WO 96/00343 (from Novo Nordisk A/S), или другие соответствующие способы, приводящие к обсуждаемым гибридным ферментам, содержащим мутацию (мутации), например, замену (замены) и/или делецию (делеции).
9.3 Экспрессия вариантов альфа-амилазы
ДНК-последовательность, кодирующая вариант, продуцированная вышеописанными способами или любыми альтернативными способами, известными в данной области, может быть экспрессирована, в форме фермента, с использованием экспрессирующего вектора, который обычно включает в себя регуляторные последовательности, кодирующие промотор, оператор, сайт связывания рибосом, сигнал инициации трансляции и, необязательно, репрессорный ген или различные активаторные гены.
Рекомбинантный экспрессирующий вектор, несущий ДНК-последовательность, кодирующую вариант альфа-амилазы, для применения здесь, может быть любым вектором, который может быть удобным образом подвергнут процедурам рекомбинантых ДНК, и выбор вектора будет часто зависеть от клетки-хозяина, в которую он должен вводиться. Таким образом, этот вектор может быть автономно реплицирующимся вектором, т.е. вектором, который существует в виде внехромосомной частицы, репликация которого не зависит от хромосомной репликации, например, плазмидой, бактериофагом, внехромосомным элементом, минихромосомой или искусственной хромосомой. Альтернативно, этот вектор может быть интегрирован в геном клетки-хозяина и реплицирован вместе с хромосомой (хромосомами), в которые он был интегрирован.
В этом векторе ДНК-последовательность должна быть функционально присоединена к подходящей промоторной последовательности. Этот промотор может быть любой ДНК-последовательностью, которая обнаруживает транскрипционную активность в выбранной клетке-хозяине, и может быть получен из генов, кодирующих белки, гомологичные или гетерологичные относительно этой клетки-хозяина. Примерами подходящих промоторов для управления транскрипцией ДНК-последовательности, кодирующей вариант альфа-амилазы для применения здесь, в частности, в бактериальном хозяине, являются промотор оперона lac E. coli, промоторы гена dag A агарозы Streptomyces coelicolor, промоторы гена альфа-амилазы Bacillus licheniformis (amyL), промоторы гена мальтогенной амилазы Geobacillus stearothermophilus (amyM), промоторы гена альфа-амилазы Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), промоторы генов Bacillus subtilis xylA и xylB и т.д. Для транскрипции в грибном хозяине примерами применимых промоторов являются промоторы, произведенные из гена, кодирующего амилазу TAKA A. oryzae, аспартатпротеиназу Rhizomucor miehei, нейтральную альфа-амилазу A. niger, кислотоустойчивую альфа-амилазу A. niger, глюкоамилазу A. niger, липазу Rhizomucor miehei, щелочную протеазу A. oryzae, триозофосфатизомеразу A. oryzae или ацетамидазу A. nidulans.
Экспрессирующие векторы для применения здесь могут также содержать подходящий терминатор транскрипции и, в эукариотах, последовательности полиаденилирования, функционально связанные с ДНК-последовательностью, кодирующей вариант альфа-амилазы. Последовательности терминации и полиаденилирования могут быть удобным образом получены из тех же самых источников, что и промотор.
Этот вектор может дополнительно содержать ДНК-последовательность, позволяющую этому вектору реплицироваться в рассматриваемой клетке-хозяине. Примерами таких последовательностей являются сайты инициации репликации плазмид pUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1 и pIJ702.
Этот вектор может также содержать селектируемый маркер, например, ген, продукт которого восполняет дефект в клетке-хозяине, такой как гены dal из B. subtilis или B. licheniformis, или ген, который придает устойчивость к антибиотику, например, устойчивость к ампициллину, канамицину, хлорамфениколу или тетрациклину. Кроме того, этот вектор может содержать селектируемые маркеры Aspergillus, такие как amdS, argB, niaD и sC, маркер, придающий устойчивость к гигромицину, или отбор может выполняться ко-трансформацией, например, как описано в WO 91/17243.
Хотя внутриклеточная экспрессия может быть полезной в некоторых отношениях, например, при использовании некоторых бактерий в качестве клеток-хозяев, обычно предпочтительно, чтобы экспрессия была внеклеточной. Обычно альфа-амилазы Bacillus, упоминаемые здесь, содержат пре-район, разрешающий секрецию экспрессированной протеазы в культуральную среду. Если желательно, этот пре-район может быть заменен отличающимся пре-районом или отличающейся сигнальной последовательностью, что предпочтительно выполняется заменой ДНК-последовательностей, кодирующих соответствующие пре-районы.
nd
Процедуры, используемые для лигирования ДНК-конструкции, кодирующей вариант альфа-амилазы, промотор, терминатор и другие элементы, соответственно, и для инсертирования их в подходящие векторы, содержащие информацию, необходимую для репликации, хорошо известны лицам, с квалификацией в данной области (сравните, например, Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2 Ed., Cold Spring Harbor, 1989).
Клетки для применения здесь, например, содержащие ДНК-конструкцию или экспрессирующий вектор, определенные выше, могут быть использованы в качестве клеток-хозяев в рекомбинантном получении варианта альфа-амилазы. Эта клетка может быть трансформирована ДНК-конструкцией, кодирующей этот вариант, предпочтительно интеграцией этой ДНК-конструкции (в виде одной или нескольких копий) в хромосому хозяина. Обычно считается, что эта интеграция является предпочтительной, так как эта ДНК-последовательность с большей вероятностью будет стабильно сохраняться в клетке. Интеграция ДНК-конструкций в хромосому хозяина может выполняться в соответствии с общепринятыми способами, например, гомологичной или гетерологичной рекомбинацией. Альтернативно, клетка может быть трансформирована экспрессирующим вектором, описанным выше в связи с различными типами клеток-хозяев.
Клетки для применения здесь, могут быть клетками высших организмов, таких как млекопитающее или насекомое, но предпочтительно являются микробными клетками, например, бактериальными или грибными (в том числе дрожжевыми) клетками.
Примерами подходящих бактерий являются грамположительные бактерии, такие как Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Geobacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis или Streptomyces lividans или Streptomyces murinus, или грамотрицательные бактерии, такие как E. coli. Трансформация этих бактерий может, например, выполняться трансформацией протопластов или с использованием компетентных клеток известным per se способом.
При использовании для экспрессии дрожжи могут быть предпочтительно выбраны из видов Saccharomyces или Schizosaccharomyces, например, Saccharomyces cerevisiae. Мицелиальный гриб может быть преимущественно выбран из видов Aspergillus, например, Aspergillus oryzae или Aspergillus niger. Грибные клетки могут быть трансформированы способом, включающим в себя образование протопластов и трансформацию этих протопластов с последующей регенерацией клеточной стенки известным per se способом. Подходящая процедура для трансформации клеток-хозяев Aspergillus описана в EP 238 023.
Еще в одном аспекте это изобретение относится к способу получения варианта альфа-амилазы, предусматривающему культивирование клетки-хозяина, как описано выше, при условиях, способствующих продуцированию этого варианта, и извлечение этого варианта из клеток и/или культуральной среды.
Среда, используемая для культивирования этих клеток, может быть любой общепринятой средой, подходящей для выращивания рассматриваемой клетки-хозяина и получения экспрессии варианта альфа-амилазы. Подходящие среды доступны от коммерческих поставщиков или могут быть приготовлены в соответствии с опубликованными рецептами (например, описанными в каталогах ATCC).
Вариант альфа-амилазы, секретируемый из клеток-хозяев, может быть извлечен из культуральной среды известными процедурами, включающими в себя отделение клеток от среды центрифугированием или фильтрованием и осаждением белковых компонентов этой среды с использованием соли, такой как сульфат аммония, с последующим применением хроматографических процедур, таких как ионообменная хроматография, аффинная хроматография или т.п.
9.4 Способы характеристики и скрининга вариантов
9.4.1 Скрининг-анализы с использованием фильтров
2+
Приведенные ниже анализы могут быть использованы для скрининга вариантов AmyS-подобных альфа-амилаз, имеющих измененную стабильность при высоком или низком pH и/или при условиях истощенного Ca, в сравнении с исходным ферментом и AmyS-подобной альфа-амилазой.
9.4.2 Анализ с фильтрами с высоким pH
о
Библиотеки Bacillus высевают на сэндвич ацетата целлюлозы (OE 67, Schleicher & Schuell, Dassel, Germany) и нитроцеллюлозных фильтров (Protran-Ba 85, Schleicher & Schuell, Dassel, Germany) на чашках с TY-агаром с 10 мкг/мл канамицина и выдерживают при 37С в течение по меньшей мере 21 часа. Слой ацетата целлюлозы помещают на эту чашку с TY-агаром.
Каждый сэндвич-фильтр специально маркируют иглой после посева, но перед инкубацией, чтобы можно было определить местоположение положительных вариантов на фильтре, и этот нитроцеллюлозный фильтр со связанными вариантами переносят в контейнер с буфером глицин-NaOH, pH 8,6-10,6 и инкубируют при комнатной температуре (может быть изменено от приблизительно 10-60°C) в течение 15 минут. Фильтры из ацетата целлюлозы с колониями хранят на TY-чашках при комнатной температуре до использования. После инкубации оставшуюся активность детектируют на чашках, содержащих 1% агарозу, 0,2% крахмал в буфере глицин-NaOH, pH 8,6-10,6. Чашки для анализа с нитроцеллюлозными фильтрами маркируют таким же образом, что и сэндвич-фильтры, и инкубируют в течение 2 часов при комнатной температуре. После удаления этих фильтров чашки для анализа окрашивают 10% раствором Люголя. Деградирующие крахмал варианты детектируют в виде белых пятен на темном синем фоне и затем идентифицируют на хранящихся чашках. Положительные варианты подвергают повторному скринингу при тех же условиях, что и условия в первом скрининге.
9.4.3 Анализ с фильтрами с низким содержанием кальция
Библиотеки Bacillus высевают на сэндвич ацетата целлюлозы (OE 67, Schleicher & Schuell, Dassel, Germany) и нитроцеллюлозных фильтров (Protran-Ba 85, Schleicher & Schuell, Dassel, Germany) на чашках с TY-агаром с 10 мкг/мл канамицина или хлорамфеникола и выдерживают при 37ºС в течение по меньшей мере 21 часа. Слой ацетата целлюлозы помещают на эту чашку с TY-агаром.
Каждый сэндвич-фильтр специально маркируют иглой после посева, но перед инкубацией, чтобы можно было определить местоположение положительных вариантов на фильтре, и этот нитроцеллюлозный фильтр со связанными вариантами переносят в контейнер с карбонат/бикарбонатным буфером приблизительно pH 8,5-10 и с различными концентрациями ЭДТА (приблизительно 0,001 мМ - приблизительно 100 мМ). Эти фильтры инкубируют при комнатной температуре в течение 1 часа. Фильтры из ацетата целлюлозы с колониями хранят на TY-чашках при комнатной температуре до использования. После инкубации оставшуюся активность детектируют на чашках, содержащих 1% агарозу, 0,2% крахмал в карбонат/бикарбонатном буфере, pH 8,5-10. Чашки для анализа с нитроцеллюлозными фильтрами маркируют таким же образом, что и сэндвич-фильтры, и инкубируют в течение приблизительно 2 часов при комнатной температуре. После удаления этих фильтров чашки для анализа окрашивают 10% раствором Люголя. Деградирующие крахмал варианты детектируют в виде белых пятен на темном синем фоне и затем идентифицируют на хранящихся чашках. Положительные варианты подвергают повторному скринингу при тех же условиях, что и условия в первом скрининге.
9.4.4 Анализ с фильтрами с низким pH
Библиотеки Bacillus высевают на сэндвич ацетата целлюлозы (OE 67, Schleicher & Schuell, Dassel, Germany) и нитроцеллюлозных фильтров (Protran-Ba 85, Schleicher & Schuell, Dassel, Germany) на чашках с TY-агаром с 10 мкг/мл хлорамфеникола и выдерживают при 37ºС в течение по меньшей мере 21 часа. Слой ацетата целлюлозы помещают на эту чашку с TY-агаром.
Каждый сэндвич-фильтр специально маркируют иглой после посева, но перед инкубацией, чтобы можно было определить местоположение положительных вариантов на фильтре, и этот нитроцеллюлозный фильтр со связанными вариантами переносят в контейнер с цитратным буфером, pH 4,5 и инкубируют при 80°C в течение 20 минут (при скрининге на варианты в каркасе дикого типа) или 85ºC в течение 60 минут (при скрининге на варианты исходной альфа-амилазы). Фильтры из ацетата целлюлозы с колониями хранят на TY-чашках при комнатной температуре до использования. После инкубации оставшуюся активность детектируют на чашках, содержащих 1% агарозу, 0,2% крахмал в цитратном буфере, pH 6,0. Чашки для анализа с нитроцеллюлозными фильтрами маркируют таким же образом, что и сэндвич-фильтры, и инкубируют в течение приблизительно 2 часов при комнатной температуре. После удаления этих фильтров чашки для анализа окрашивают 10% раствором Люголя. Деградирующие крахмал варианты детектируют в виде белых пятен на темном синем фоне и затем идентифицируют на хранящихся чашках. Положительные варианты подвергают повторному скринингу при тех же условиях, что и условия в первом скрининге.
9.4.5 Вторичный скрининг
Положительные трансформанты после повторного скрининга извлекают извлечением (выскребанием) из хранящейся чашки и тестируют во вторичном анализе на чашках. Положительные трансформанты выращивают в течение 22 часов при 37ºС в 5 мл LB+хлорамфеникол. Эту культуру Bacillus каждого положительного трансформанта и в качестве контроля клона, экспрессирующего соответствующий каркас, инкубируют в цитратном буфере, pH 4,5 при 90ºC и берут пробы при 0, 10, 20, 30, 40, 60 и 80 минутах. Пробу 3 мкл наносят в виде пятна на чашке для анализа. Эту чашку для анализа окрашивают 10% раствором Люголя. Улучшенные варианты видны в виде вариантов с более высокой остаточной активностью (детектируемой в виде ореолов (зон ингибирования) на чашке для анализа, чем в случае каркаса. Эти улучшенные варианты определяют секвенированием нуклеотидов.
9.4.6 Анализ стабильности на неочищенных вариантах
7
Стабильность этих вариантов может анализироваться следующим образом. Культуры Bacillus, экспрессирующие подлежащие анализу варианты, выращивают в течение 21 часа при 37ºС в 10 мл LB+хлорамфеникол. 800 мкл культуры смешивают с 200 микролитрами цитратного буфера, pH 4,5. Количество аликвот по 70 мкл, соответствующее количеству временных точек взятия проб, помещают в ПЦР-пробирки и инкубируют при 70ºC или 90ºC для различных временных точек (обычно 5, 10, 15, 20, 25 и 30 минут) в ПЦР-приборе. Пробу 0 минут не инкубируют при высокой температуре. Активность в пробе измеряют перенесением 20 мкл в 200 мкл субстрата альфа-амилазы PNP-G MPR3 (Boehringer Mannheim Cat. No. 1660730), описанного ниже под заголовком "Анализы на альфа-амилазную активность". Результаты строят в виде графика процентной активности после инкубирования в течение определенного периода времени.
9.4.7 Ферментация и очистка вариантов альфа-амилазы
Штамм B. subtilis, несущий релевантную экспрессирующую плазмиду, может ферментироваться и очищаться следующим образом: этот штамм высевают штриховой разводкой на чашке с LB-агаром с 10 мкг/мл канамицина из исходного раствора, хранящегося при -80ºC, и выращивают в течение ночи при 37°C. Эти колонии переносят в 100 мл среды PS-1, дополненной 10 мкг/мл хлорамфеникола, во встряхиваемой колбе на 500 мл.
Состав среды PS-1
Сахарное драже
100 г/л
Соевая мука
40 г/л
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>, 12 H<sub>2</sub>O
10 г/л
Плюроник™ PE 6100
0,1 г/л
CaCO<sub>3</sub>
5 г/л
Эту культуру встряхивают при 37ºС при 270 об/мин в течение 5 дней.
Клетки и остатки клеток удаляют из ферментационного бульона центрифугированием при 4500 об/мин в течение 20-25 минут. После этого супернатант фильтруют с получением полностью прозрачного раствора. Этот фильтрат концентрируют и промывают на UF-фильтре (мембране с пределом отсечения 10000) и этот буфер заменяют 20 мМ ацетатом при pH 5,5. UF-фильтрат наносят на S-SEPHAROSE F.F. (Pharmacia) и элюцию проводят ступенчатой элюцией 0,2 M NaCl в том же самом буфере. Элюат диализуют против 10 мМ Триса, pH 9,0 и наносят на Q-SEPHAROSE F.F. и элюируют линейным градиентом 0-0,3 M NaCl с использованием более 6 колоночных объемов. Фракции, которые содержат активность (измеряемую при помощи PHADEBAS-анализа), объединяют, pH доводят до pH 7,5 и оставшуюся окраску удаляют обработкой 0,5% (мас./об.) активированным углем в течение 5 минут.
9.4.8 Определение удельной активности
Удельная активность может быть определена при помощи PHADEBAS-анализа (Magle Life Sciences) как активность/мг фермента. Инструкции изготовителя прилагаются (см. также ниже под заголовком "Анализ на альфа-амилазную активность").
9.4.9 Определение изоэлектрической точки
pI может быть определена изоэлектрическим фокусированием (например, с использованием Pharmacia, Ampholine, pH 3,5-9,3).
9.4.10 Определение стабильности
Стабильность амилазы может быть измерена с использованием следующего способа:
Фермент инкубируют при соответствующих условиях. Пробы берут в различных временных точках, например, после 0, 5, 10, 15 и 30 минут и разбавляют в 25 раз (одно и то же разбавление для всех взятых проб) в буфере для анализа (50 мМ буфер Бриттона, pH 7,3) и активность измеряют с использованием PHADEBAS-анализа (Magle Life Sciences) при стандартных условиях pH 7,3, 37ºC.
Активность, измеренную перед инкубацией (0 минут) используют в качестве ссылки (100%). Уменьшение в процентах рассчитывают как функцию времени инкубации. Таблица показывает остаточную активность, например, после 30 минут инкубации.
9.4.11 Анализы на альфа-амилазную активность
1. PHADEBAS-анализ
Альфа-амилазную активность определяют способом, использующим таблетки PHADEBAS в качестве субстрата. Таблетки PHADEBAS (тест на амилазу PHADEBAS, поставляемый Magle Life Sciences) содержат сшитый нерастворимый полимер крахмала синего цвета, который был смешан с бычьим сывороточным альбумином и буферным веществом и таблетирован.
2
Для каждого отдельного измерения одну таблетку суспендируют в пробирке, содержащей 5 мл 50 мМ буфера Бриттона-Робинсона (50 мМ уксусная кислота, 50 мМ фосфорная кислота, 50 мМ борная кислота, 0,1 мМ CaCl, pH, доведенный до требуемой величины при помощи NaOH). Этот тест выполняют на водяной бане при требуемой температуре. Подлежащую тестированию альфа-амилазу разбавляют в 50 мМ буфере Бриттона-Робинсона. Один мл этого раствора альфа-амилазы добавляют к 5 мл 50 мМ буфера Бриттона-Робинсона. Крахмал гидролизуется альфа-амилазой, образуя растворимые синие фрагменты. Оптическая плотность полученного синего раствора, измеренная спектрофотометрически при 620 нм, является функцией активности альфа-амилазы.
Важным условием является то, что измеренная оптическая плотность при 620 нм после 10 или 15 минут инкубации (времени тестирования) должна находиться в диапазоне 0,2-2,0 единиц оптической плотности при 620 нм. В этом диапазоне оптической плотности имеется линейность между активностью и оптической плотностью (закон Ламберта-Беера). Таким образом, разбавление фермента должно корректироваться для соответствия этому критерию. При указанном наборе условий (температуре, pH, времени реакции, буферных условиях) 1 мг конкретной альфа-амилазы будет гидролизовать определенное количество субстрата и будет образовываться синяя окраска. Интенсивность окрашивания измеряют при 620 нм. Измеренная оптическая плотность прямо пропорциональна удельной активности (активности/мг чистого белка альфа-амилазы) рассматриваемой альфа-амилазы при данном наборе условий.
2. Альтернативный способ
7
7
7
Альфа-амилазную активность определяют способом, использующим субстрат PNP-G. PNP-G (аббревиатура для п-нитрофенил-альфа-D-мальтогептаозида) является блокированным олигосахаридом, который может расщепляться эндоамилазой. После расщепления альфа-глюкозидаза, включенная в этом наборе, расщепляет этот субстрат с высвобождением свободной молекулы PNP, которая имеет желтую окраску и, следовательно, может быть измерена спектрофотометрией в видимом спектре при λ=405 нм (400-420 нм). Наборы, содержащие субстрат PNP-G и альфа-глюкозидазу, изготовляются Boehringer-Mannheim (Cat. No. 1054635).
Для приготовления раствора этого реагента 10 мл субстрата/буферного раствора добавляют к 50 мл раствора фермента/буферного раствора, в соответствии с рекомендациями изготовителя. Анализ выполняют перенесением 20 мкл пробы в 96-луночный микротитрационный планшет и инкубированием при 25ºC. Добавляют 200 мкг раствора реагента, предварительно уравновешенного до 25°C. Этот раствор перемешивают и предварительно инкубируют 1 минуту и измеряют поглощение каждые 30 секунд на протяжении 4 минут при OD 405 нм в ELISA-ридере.
Наклон кривой зависимого от времени поглощения прямо пропорционален активности рассматриваемой альфа-амилазы при данном наборе условий.
9.4.12 Определение чувствительности к LAS
Вариант инкубируют с различными концентрациями LAS (линейный алкилбензолсульфонат; Nansa 1169/P) в течение 10 минут при 40°C.
7
Остаточную активность определяют с использованием способа анализа PHADEBAS или альтернативного способа, использующего субстрат PNP-G.
LAS разводят в 0,1 M фосфатном буфере, pH 7,5.
Используют следующие концентрации: 500 м.д., 250 м.д., 100 м.д., 50 м.д., 25 м.д. и 10 м.д. при точке “отсутствие” LAS.
Вариант разводят в различных буферах LAS до концентрации 0,01-5 мг/л в общем объеме 10 мл и инкубируют в течение 10 минут на водяной бане с регулируемой температурой. Инкубирование останавливают перенесением малой аликвоты в холодный буфер для анализа. Важно, чтобы во время измерения активности концентрация LAS была ниже 1 м.д., чтобы не было действия на измерение активности. Остаточную активность определяют в двух повторностях с использованием вышеуказанного анализа PHADEBAS или альтернативного способа. Активность измеряют после вычитания слепого опыта. Активность в отсутствие LAS равна 100%.
10. Способы применения вариантов амилазы: промышленные применения
Варианты альфа-амилазы, представленные здесь, имеют ценные свойства, делающие возможными различные промышленные применения в процессах очистки и удаления пятен. Один или несколько из вариантных ферментов, описанных здесь, могут быть также использованы в детергентах, в частности, в детергентных композициях для стирки и детергентных композициях для мойки посуды, композициях очистки поверхностей. Эти варианты могут быть также использованы в композициях для расшлихтовки текстильных изделий, тканей или одежды, для получения целлюлозы и бумаги, пивоварения, производства этанола и процессов превращения крахмала, описанных выше.
Приведенные здесь варианты могут быть также применимы в расшлихтовке текстильных изделий, тканей или одежды (см., например, WO 95/21247, патент США № 4643736 и EP 119920, включенные здесь в качестве ссылки), приготовлении пива или пивоварении и в производстве целлюлозы и бумаги или родственных процессах.
10.1 Производство целлюлозы и бумаги
Вариант щелочной альфа-амилазы может быть также использован в производстве лигноцеллюлозных материалов, таких как целлюлоза, бумага и картон, из укрепленных крахмалом макулатуры и картона, особенно, когда превращение макулатуры в волокнистую массу происходит при pH выше приблизительно 7 и когда амилазы способствуют разрушению макулатуры посредством деградации укрепляющего крахмала. Варианты альфа-амилазы особенно применимы в процессе получения волокнистого сырья для производства бумаги из покрытой крахмалом запечатанной бумаги. Этот процесс может выполняться, как описано в WO 95/14807 и содержит следующие стадии:
a) измельчение этой бумаги для получения волокнистой массы (целлюлозы),
b) обработку деградирующим крахмал ферментом до, во время или после стадии а), и
c) отделение частиц типографской краски из волокнистой массы после стадий а) и b).
Эти альфа-амилазы могут быть также очень применимы в модификации крахмала, когда ферментативно модифицированный крахмал используется в бумажном производстве, вместе со щелочными наполнителями, такими как карбонат кальция, каолин и глины. С использованием вариантов альфа-амилазы можно модифицировать этот крахмал в присутствии этого наполнителя, что позволяет получить более простой интегрированный процесс.
10.2 Расшлихтовка текстильных изделий, тканей и одежды
Вариант альфа-амилазы может быть также очень полезным в расшлихтовке текстиля, ткани или одежды. В текстильной промышленности альфа-амилазы традиционно используют в качестве вспомогательных средств в процессе расшлихтовки для облегчения удаления крахмалсодержащей шлихты, которая служила в качестве защитного покрытия на уточной пряже во время процесса ткачества. Полное удаление покрытия из шлихты после ткачества является важным для гарантии оптимальных результатов в последующих процессах, в которых ткань очищается от клеящего вещества, отбеливается и окрашивается. Ферментативное разрушение крахмала является предпочтительным, так как оно не включает в себя какого-либо вредного действия на волокнистый материал. Для уменьшения стоимости обработки и увеличения выхода фабрики обработку посредством расшлихтовки иногда комбинируют со стадиями очищения от клеящего вещества и отбеливания. В таких случаях неферментативные вспомогательные вещества, такие как щелочи и окислители, используют обычно для разрушения крахмала, так как традиционные альфа-амилазы являются не очень совместимыми с высокими уровнями pH и отбеливающими агентами. Это неферментативное разрушение крахмальной шлихты действительно приводит к некоторому повреждению волокон вследствие довольно агрессивных используемых химикалиев. Таким образом, было бы желательным применение вариантов альфа-амилазы, так как они имеют улучшенные свойства в щелочных растворах. Эти альфа-амилазы могут быть использованы отдельно или в комбинации с целлюлазой при расшлихтовке содержащих целлюлозу ткани или текстиля.
Процессы расшлихтовки и отбеливания хорошо известны в данной области. Например, такие процессы описаны в WO 95/21247, патенте США № 4643736 и EP 119920, которые включены здесь в качестве ссылки.
Коммерчески доступные продукты для расшлихтовки включают в себя OPTISIZE FLEX из Genencor.
10.3 Процессы чистки и детергентные композиции
Описанные здесь вариантные альфа-амилазы могут быть добавлены к детергентным композициям и, следовательно, могут стать компонентом детергентной композиции для различных чистящих и моечных процессов, в том числе стирки белья и мойки посуды.
Детергентная композиция, обеспеченная здесь, может быть, например, приготовлена в виде детергентной композиции для ручной или машинной стирки, включающей в себя вспомогательную композицию, пригодную для предварительной обработки окрашенных тканей, и добавляемого при полоскании композиции мягчителя ткани, или может быть приготовлена в виде детергентной композиции для применения в обычных операциях чистки твердых поверхностей в домашнем хозяйстве, или может быть приготовлена для операций ручной или машинной мойки посуды.
В одном конкретном аспекте здесь обеспечена детергентная добавка, содержащая описанный здесь вариантный фермент. Эта детергентная добавка, а также детергентная композиция может содержать один или несколько других ферментов, таких как протеаза, липаза, пероксидаза, другой амилолитический фермент, например, другая альфа-амилаза, глюкоамилаза, мальтогенная амилаза, CGTаза и/или целлюлаза-маннаназа (такая как MANNASTAR™ из Danisco US Inc., Genencor Division)), пектиназа, пектинлиаза, кутиназа и/или лакказа.
Обычно свойства выбранного фермента (выбранных ферментов) должны быть совместимы с выбранным детергентом (т.е. в отношении pH-оптимума, совместимости с другими ферментными и неферментными ингредиентами, и т.д.), и этот фермент должен присутствовать в эффективных количествах.
Протеазы: Подходящие протеазы включают в себя протеазы животного, растительного или микробного происхождения. Предпочтительными являются протеазы микробного происхождения. Могут быть включены также химически модифицированные или полученные белковой инженерией мутанты. Эта протеаза может быть сериновой протеазой или металлопротеазой, предпочтительно щелочной микробной протеазой или трипсин-подобной протеазой. Примерами щелочных протеаз являются субтилизины, особенно субтилизины, происходящие из Bacillus, например, субтилизин Novo, субтилизин Carlsberg, субтилизин 309, субтилизин 147 и субтилизин 168 (описанные в WO 89/06279). Примерами трипсин-подобных протеаз являются трипсин (например, свиного или бычьего происхождения) и протеаза Fusarium, описанная в WO 89/06270 и WO 94/25583. Другие примеры применимых протеаз могут быть найдены в WO98/23732, WO99/20770, WO 92/19729, WO 98/20115, WO 98/20116 и WO 98/34946.
Предпочтительные коммерчески доступные протеазные ферменты включают в себя ALCALASE, SAVINASE, PRIMASE, DURALASE, ESPERASE и KANNASE (из Novozymes A/S), MAXATASE, MAXACAL, MAXAPEM, PROPERASE, PURAFECT, PURAFECT OXP, FN2, FN3, FN4 (Genencor International Inc.).
Липазы: Подходящие липазы включают в себя липазы бактериального или грибного происхождения. Могут быть включены также химически модифицированные или полученные белковой инженерией мутанты. Примеры применимых липаз включают в себя липазы из Humicola (синоним Thermomyces), например, из H. lanuginosa (T. lanuginosus), описанные в EP 258 068 и EP 305 216, или из H. insolens, описанная в WO 96/13580, липаза Pseudomonas, например, из P. alcaligenes или P. pseudoalcaligenes (EP 218 272), P. cepacia (EP 331 376), P. stutzeri (GB 1372034), P. fuorescens, штамма Pseudomonas spp. SD 705 (WO 95/06720 и WO 96/27002), P. wisconsinensis (WO 96/12012), липаза Bacillus, например, из B. subtilis (Dartois et al. (1993), Biochemica et Biophysica Acta, 1131, 253-360), B. stearothermophilus (JP 64/744992) или B. pumilus (WO 91/16422). Другими примерами являются варианты липаз, такие как липазы, описанные в WO 92/05249, WO 94/01541, EP 407 225, EP 260 105, WO 95/35381, WO 96/00292, WO 95/30744, WO 94/25578, WO 95/14783, WO 95/22615, WO 97/04079 и WO 97/07202.
Предпочтительные коммерчески доступные липазные ферменты включают в себя LIPOLASE™ и LIPOLASE ULTRA™ (Novozymes A/S).
Амилазы: Могут быть включены также дополнительные амилазы. Подходящие амилазы (альфа и/или бета) включают в себя амилазы бактериального или грибного происхождения. Включены также химически модифицированные или полученные белковой инженерией мутанты. Амилазы включают в себя, например, альфа-амилазы, полученные из Bacillus, например, специального штамма B. licheniformis, описанного более подробно в GB 1296839. Примерами применимых альфа-амилаз являются варианты, описанные в WO 94/18314, WO 96/39528, WO 94/02597, WO 94/18314, WO 96/23873 и WO 97/43424.
Коммерчески доступными альфа-амилазами являются DURAMYL™, LIQUEZYME™, TERMAMY™, NATALASE™, FUNGAMYL™ и BAN™ (Novozymes A/S), RAPIDASE™ и PURASTAR™ (от Genencor).
Целлюлазы: Подходящие целлюлазы включают в себя целлюлазы бактериального или грибного происхождения. Могут быть включены также химически модифицированные или полученные белковой инженерией мутанты. Подходящие целлюлазы включают в себя целлюлазы из родов Bacillus, Pseudomonas, Trichoderma, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium, например, грибные целлюлазы, полученные из Humicola insolens, Myceliophthora thermophila и Fusarium oxysporum, описанные в патенте США № 4435307, патенте США № 5648263, патенте США № 5691178, патенте США № 5776757 и WO 89/09259. Целлюлазы Trichoderma reesei описаны в патенте США № 4689297, патенте США № 5814501, патенте США № 5324649, WO 92/06221 и WO 92/06165. Целлюлазы Bacillus описаны в патенте США № 6562612.
Коммерчески доступные целлюлазы включают в себя CELLUZYME, и CAREZYME (Novozymes A/S), CLAZINASE и PURADAX HA (Genencor International Inc.) и KAC-500(B) (Kao Corporation).
Пероксидазы/оксидазы: Подходящие пероксидазы/оксидазы включают в себя пероксидазы/оксидазы бактериального или грибного происхождения. Могут быть включены также химически модифицированные или полученные белковой инженерией мутанты. Примеры применимых пероксидаз включают в себя все пероксидазы из Coprinus, например, из C. cinereus, и их варианты, такие, как описанные в WO 93/24618, WO 95/10602 и WO 98/15257.
Коммерчески доступные пероксидазы включают в себя GUARDZYME (Novozymes A/S).
Детергентный фермент (детергентные ферменты) могут быть включены в детергентную композицию добавлением отдельных вспомогательных веществ, содержащих один или несколько ферментов, или добавлением объединенной добавки, содержащей все эти ферменты. Детергентная добавка, например, отдельная добавка или комбинированная добавка, может быть приготовлена, например, в виде гранулята, жидкости, суспензии и т.д. Предпочтительными детергентными вспомогательными добавками являются грануляты, в частности непылящие грануляты, жидкости, в частности, стабилизированные жидкости, или суспензии.
Непылящие грануляты могут быть приготовлены, например, как описано в патентах США №№ 4106991 и 4661452, и, необязательно, могут быть обеспечены покрытием способами, известными в данной области. Примерами воскообразных материалов покрытий являются продукты поли(этиленоксида); (полиэтиленгликоль, ПЭГ) со средними молекулярными массами 1000-20000; этоксилированные нонилфенолы, имеющие 16-50 этиленоксидных единиц; этоксилированные жирные спирты, в которых спирт содержит 12-20 атомов углерода и в которых имеются 15-80 этиленоксидных единиц; жирные спирты; жирные кислоты и моно- и ди- и триглицериды жирных кислот. Примеры пленкообразующих материалов покрытий, подходящих для нанесения способом с использованием псевдоожиженного слоя, приведены, например, в патенте Великобритании № 1483591. Жидкие препараты фермента могут быть, например, стабилизированы добавлением полиола, такого как пропиленгликоль, сахара или сахароспирта, молочной кислоты или борной кислоты, в соответствии с установленными способами. Защищенные ферменты могут быть приготовлены в соответствии со способом, описанным в EP 238216.
Эта детергентная композиция может находиться в любой удобной форме, например, в форме бруска, таблетки, порошка, гранул, пасты или жидкости. Жидкий детергент может быть водным, обычно содержащим до приблизительно 70% воды и 0% - приблизительно 30% органического растворителя, или неводным.
Эта детергентная композиция содержит одно или несколько поверхностно-активных веществ, которые могут быть неионогенными, полуполярными, анионогенными, катионогенными или цвиттерионными. Эти поверхностно-активные вещества присутствуют обычно при уровне от приблизительно 0,1 масс.% до приблизительно 60 масс.%.
При включении в нее, этот детергент будет обычно содержать от приблизительно 1% до приблизительно 40% анионогенного поверхностно-активного вещества, такого как линейный алкилбензолсульфонат; α-олефинсульфонат; алкилсульфат (сульфат жирного спирта); этоксисульфат спирта; вторичные алкансульфонаты; метиловые эфиры α-сульфожирной кислоты; алкил- или алкенилянтарная кислота, или мыло.
При включении в нее, этот детергент будет обычно содержать приблизительно 0,2% - приблизительно 40% неионогенного поверхностно-активного вещества, такого как этоксилат спирта, нонилфенолэтоксилат, алкилполигликозид, алкилдиметиламиноксид, этоксилированный моноэтаноламид жирной кислоты, моноэтаноламид жирной кислоты, амид полигидроксиалкилжирной кислоты или N-ацил-N-алкилпроизводные глюкозамина (“глюкамиды”).
Этот детергент может содержать приблизительно 1% - приблизительно 65% модифицирующей добавки детергента или комплексообразующего агента, такого как цеолит, дифосфат, трифосфат, фосфонат, карбонат, цитрат, нитрилотриуксусная кислота, этилендиаминтетрауксусная кислота, диэтилентриаминпентауксусная кислота, алкил- или алкенилянтарная кислота, растворимые силикаты или слоистые силикаты (например, SKS-6 из Hoechst).
Этот детергент может содержать один или несколько полимеров. Примеры включают в себя карбоксиметилцеллюлозу, поли(винилпирролидон), полиэтиленгликоль, поли(виниловый спирт), поли(винилпиридин-N-оксид), поли(винилимидазол), поликарбоксилаты, такие как полиакрилаты, сополимеры малеиновой и акриловой кислот и сополимеры лаурилметакрилата и акриловой кислоты.
2
2
Этот детергент может содержать систему отбеливания, которая может содержать источник HO, такой как перборат или перкарбонат, которые могут быть объединены с образующим перкислоту активатором отбеливания, таким как тетраацетилэтилендиамин или нананоилоксибензолсульфонат. Альтернативно, эта система отбеливания может содержать, например, пероксикислоты амидного, имидного или сульфонового типа.
Фермент (ферменты) этой детергентной композиции могут быть стабилизированы с использованием общепринятых стабилизирующих агентов, например, полиола, такого как пропиленгликоль или глицерин; сахара или сахароспирта; молочной кислоты; борной кислоты или производного борной кислоты, такого как ароматический эфир борной кислоты; или производного фенилбороновой кислоты, такого как 4-формилфенилбороновая кислота, и эта композиция может быть приготовлена, как описано, например, в WO 92/19709 и WO 92/19708.
Этот детергент может также содержать другие общепринятые детергентные ингредиенты, такие как кондиционеры, включающие в себя, например, глины, усилители пенообразования, подавители мыльной пены, противокоррозийные агенты, суспендирующие грязь агенты, препятствующие повторному осаждению грязи агенты, красители, бактерициды, оптические отбеливатели, гидротропы, ингибиторы тусклости или ароматизаторы.
В настоящее время обсуждается, что в детергентных композициях любой фермент, в частности, один или несколько вариантных ферментов, описанных здесь, может добавляться, например, при приблизительно 0,01 мг - приблизительно 100 мг белка фермента на литр моющего раствора. В одном варианте осуществления используют приблизительно 0,055 мг белка фермента на литр моющего раствора. В других вариантах осуществления используют приблизительно 0,1 мг - приблизительно 1,0 мг белка фермента на литр моющего раствора.
Один или несколько вариантных ферментов, описанных здесь, могут быть дополнительно включены в детергентные препараты, описанные в WO 97/07202, который включен здесь в качестве ссылки.
10.4 Детергентные композиции для мойки посуды
Эти ферменты могут быть также использованы в детергентных композициях для мойки посуды, включающих в себя следующие композиции:
1) ПОРОШКООБРАЗНАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ АВТОМАТИЧЕСКОЙ МОЙКИ ПОСУДЫ
Неионогенное поверхностно-активное вещество
0,4-2,5%
Метасиликат натрия
0-20%
Дисиликат натрия
3-20%
Трифосфат натрия
20-40%
Карбонат натрия
0-20%
Перборат натрия
2-9%
Тетраацетилэтилендиамин (TAED)
1-4%
Сульфат натрия
5-33%
Ферменты
0,0001-0,1%
2) ПОРОШКООБРАЗНАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ АВТОМАТИЧЕСКОЙ МОЙКИ ПОСУДЫ
Неионогенное поверхностно-активное вещество(например, этоксилат спирта)
1-2%
Дисиликат натрия
2-30%
Карбонат натрия
10-50%
Фосфонат натрия
0-5%
Дигидрат тринатрийцитрата
9-30%
Нитрилотринатрийацетат (NTA)
0-20%
Моногидрат пербората натрия
5-10%
Тетраацетилэтилендиамин (TAED)
1-2%
Полиакрилатный полимер (например, сополимер малеиновой кислоты/акриловой кислоты)
6-25%
Ферменты
0,0001-0,1%
Ароматизатор
0,1-0,5%
Вода
5-10%
3) ПОРОШКООБРАЗНАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ АВТОМАТИЧЕСКОЙ МОЙКИ ПОСУДЫ
Неионогенное поверхностно-активное вещество
0,5-2,0%
Дисиликат натрия
25-40%
Цитрат натрия
30-55%
Карбонат натрия
0-29%
Бикарбонат натрия
0-20%
Моногидрат пербората натрия
0-15%
Тетраацетилэтилендиамин (TAED)
0-6%
Сополимер малеиновой кислоты/акриловой кислоты
0-5%
Глина
1-3%
Полиаминокислоты
0-20%
Полиакрилат натрия
0-8%
Ферменты
0,0001-0,1%
4) ПОРОШКООБРАЗНАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ АВТОМАТИЧЕСКОЙ МОЙКИ ПОСУДЫ
Неионогенное поверхностно-активное вещество
1-2%
Цеолит MAP
15-42%
Дисиликат натрия
30-34%
Цитрат натрия
0-12%
Карбонат натрия
0-20%
Моногидрат пербората натрия
7-15%
Тетраацетилэтилендиамин (TAED) полимер
0-4%
Сополимер малеиновой кислоты/акриловой кислоты
0-5%
Органический фосфат
0-4%
Глина
1-2%
Ферменты
0,0001-0,1%
Сульфат натрия
Баланс (до 100%)
5) ПОРОШКООБРАЗНАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ АВТОМАТИЧЕСКОЙ МОЙКИ ПОСУДЫ
Неионогенное поверхностно-активное вещество
1-7%
Дисиликат натрия
18-30%
Тринатрийцитрат
10-24%
Карбонат натрия
12-20%
Моноперсульфат(2 KHSO<sub>5</sub>.KHSO<sub>4</sub>.K<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>)
15-21%
Стабилизатор отбеливания
0,1-2%
Сополимер малеиновой кислоты/акриловойкислоты
0-6%
Пентанатриевая соль, пентаацетил диэтилентриамина
0-2,5%
Ферменты
0,0001-0,1%
Сульфат натрия, вода
Баланс (до 100%)
6) ПОРОШКООБРАЗНАЯ И ЖИДКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ МОЙКИ ПОСУДЫ С ЧИСТЯЩЕЙ СИСТЕМОЙ ПОВЕРХНОСТНО-АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ
Неионогенное поверхностно-активное вещество
0-1,5%
Дигидрат N-оксида октадецилдиметиламина
0-5%
Смесь 80:20 wt. C18/C16 дигидрата N-оксидаоктадецилдиметиламина и дигидрата N-оксидагексадецилдиметиламина
0-4%
Смесь 70:30 wt. C18/C16 N-оксидаоктадецилбис(гидроксиэтил)амина безводного иN-оксида гексадецилбис(гидроксиэтил)амина безводного
0-5%
C<sub>13</sub>-C<sub>15</sub> алкилэтоксисульфат со среднейстепенью этоксилирования 3
0-10%
C<sub>12</sub>-C<sub>15</sub> алкилэтоксисульфат со средней степенью этоксилирования 3
0-5%
C<sub>13</sub>-C<sub>15</sub> этоксилированный спирт со среднейстепенью этоксилирования 12
0-5%
Смесь C<sub>12</sub>-C<sub>15</sub> этоксилированных спиртов со средней степенью этоксилирования 9
0-6,5%
Смесь C<sub>13</sub>-C<sub>15</sub> этоксилированных спиртовсо средней степенью этоксилирования 30
0-4%
Дисиликат натрия
0-33%
Триполифосфат натрия
0-46%
Цитрат натрия
0-28%
Лимонная кислота
0-29%
Карбонат натрия
0-20%
Моногидрат пербората натрия
0-11,5%
Тетраацетилэтилендиамин (TAED)
0-4%
Сополимер малеиновой кислоты/акриловойкислоты
0-7,5%
Сульфат натрия
0-12,5%
Ферменты
0,0001-0,1%
7) НЕВОДНАЯ ЖИДКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ АВТОМАТИЧЕСКОЙ МОЙКИ ПОСУДЫ
Жидкое неионогенное поверхностно-активное вещество (например, этоксилаты спирта)
2,0-10,0%
Силикат щелочного металла
3,0-15,0%
Фосфат щелочного металла
20,0-40,0%
Жидкий носитель, выбранный из высших гликолей, полигликолей, полиоксидов, простых эфиров гликоля
25,0-45,0%
Стабилизатор (например, неполный эфирфосфорной кислоты и С<sub>16</sub>-С<sub>18</sub>-спирта)
0,5-7,0%
Подавитель пены (например, силикон)
0-1,5%
Ферменты
0,0001-0,1%
8) НЕВОДНАЯ ЖИДКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ МОЙКИ ПОСУДЫ
Жидкое неионогенное поверхностно-активноевещество (например, этоксилаты спирта)
2,0-10,0%
Силикат натрия
3,0-15,0%
Карбонат щелочного металла
7,0-20,0%
Цитрат натрия
0,0-1,5%
Стабилизирующая система (например, смеситонкоизмельченного силикона и низкомолекулярных диалкиловых эфиров полигликоля)
0,5-7,0%
Полиакрилатный полимер с низкой молекулярной массой
5,0-15,0%
Глиноземный гелевый загуститель (например, бентонит)
0,0-10,0%
Полимер гидроксипропилцеллюлозы
0,0-0,6%
Ферменты
0,0001-0,1%
Жидкий носитель, выбранный из высшихгликолей, полигликолей, полиоксидов, простых эфиров гликоля
Баланс(до 100%)
9) ТИКСОТРОПНАЯ ЖИДКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ АВТОМАТИЧЕСКОЙ МОЙКИ ПОСУДЫ
С<sub>12</sub>-С<sub>14</sub> жирная кислота
0-0,5%
Блок-сополимерное поверхностно-активноевещество
1,5-15,0%
Цитрат натрия
0-12%
Триполифосфат натрия
0-15%
Карбонат натрия
0-8%
Тристеарат алюминия
0-0,1%
Кумолсульфонат натрия
0-1,7%
Полиакрилатный загуститель
1,32-2,5%
Полиакрилат натрия
2,4-6,0%
Борная кислота
0-4,0%
Формиат натрия
0-0,45%
Формиат кальция
0-0,2%
Дисульфонат н-децилдифенилоксида натрия
0-4,0%
Моноэтаноламин (MEA)
0-1,86%
Гидроксид натрия (50%)
1,9-9,3%
1,2-пропандиол
0-9,4%
Ферменты
0,0001-0,1%
Подавитель мыльной пены, краситель,ароматизаторы, вода
Баланс(до 100%)
10) ЖИДКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ АВТОМАТИЧЕСКОЙ МОЙКИ ПОСУДЫ
Этоксилат спирта
0-20%
Сульфонат эфира жирной кислоты
0-30%
Додецилсульфат натрия
0-20%
Алкилполигликозид
0-21%
Олеиновая кислота
0-10%
Моногидрат дисиликата натрия
18-33%
Дигидрат цитрата натрия
18-33%
Стеарат натрия
0-2,5%
Моногидрат пербората натрия
0-13%
Тетраацетилэтилендиамин (TAED)
0-8%
Сополимер малеиновой кислоты/акриловой кислоты
4-8%
Ферменты
0,0001-0,1%
11) ЖИДКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ АВТОМАТИЧЕСКОЙ МОЙКИ ПОСУДЫ, СОДЕРЖАЩАЯ ЗАЩИЩЕННЫЕ ЧАСТИЦЫ ОТБЕЛИВАТЕЛЯ
Силикат натрия
5-10%
Тетракалийпирофосфат
15-25%
Трифосфат натрия
0-2%
Карбонат калия
4-8%
Защищенные частицы отбеливателя, например, хлора
5-10%
Полимерный загуститель
0,7-1,5%
Гидроксид калия
0-2%
Ферменты
0,0001-0,1%
Вода
Баланс (до 100%)
12) Композиции для автоматической мойки посуды, такие как композиции, описанные в 1), 2), 3), 4), 6) и 10), в которых перборат заменен перкарбонатом.
13) Композиции для автоматической мойки посуды, такие как композиции, описанные в 1)-6), которые дополнительно содержат марганецсодержащий катализатор. Этим марганецсодержащим катализатором может быть, например, одно из соединений, описанных в "Efficient manganese catalysts for low-temperature bleaching", Nature 369: 637-639 (1994).
14) ЖИДКИЕ ДЕТЕРГЕНТНЫЕ КОМПОЗИЦИИ PREMIUM HDL
Bio-Soft S-101
(линейный алкил)бензолсульфоновая кислота
Steol CS-330
Лауретсульфат натрия
Bio-soft N25-7
(линейный алкил)этоксилат с 7 молями EO
Stepanate SXS
Ксилолсульфонат натрия
15) УЛЬТРАЖИДКАЯ ДЕТЕРГЕНТНАЯ КОМПОЗИЦИЯ
Tionopal CBS-X
Флуоресцентный отбеливающий агент
Alpha-step MC-48
альфа-сульфометиловый эфир натрия
Makon TD-6
Этоксилат тридецилового спирта
11. Композиции, содержащие вариантные альфа-амилазы
В одном из его нескольких аспектов, это раскрытие изобретения обеспечивает композиции, содержащие:
a) по меньшей мере одну вариантную альфа-амилазу, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную аминокислотной последовательности исходной AmyS-подобной альфа-амилазы, и имеющую замены в положении аминокислоты, соответствующем положению 242 референсной альфа-амилазы, причем указанный вариант имеет детектируемую альфа-амилазную активность, и
b) по меньшей мере один дополнительный фермент, детергент, поверхностно-активное вещество, комплексообразователь, окислитель, подкислитель, подщелачивающий агент, источник пероксида, источник жесткости, соль, детергентный комплексообразующий агент, полимер, стабилизирующий агент или кондиционер.
2+
В предпочтительных вариантах осуществления этот вариант является измененным, в сравнении с исходной AmyS-подобной альфа-амилазой или референсной амилазой, в одном или нескольких различных свойствах, которые могут изменять ее применение или эффективность для определенных применений, например, описанных здесь коммерческих процессов. Эти измененные свойства могут включать в себя любое свойство, например, такое как общий заряд, субстратная специфичность, расщепление субстрата, связывание субстрата, термостабильность, активность при одном или нескольких pH, стабильность при одном или нескольких pH, стабильность в окисляющих условиях, потребности в Ca, удельная активность, каталитическая скорость, каталитическая эффективность, активность в присутствии комплексообразователя (хелатообразователя), термо- или pH-стабильность в присутствии комплексообразователя, применимость для расшлихтовки или применимость для процесса очистки или величина экспрессии в системе экспрессии белков. Как будет понятно квалифицированному в данной области специалисту, эти измененные свойства предпочтительно имеют применение для конечного пользователя или для производителя этой амилазы, или для тех и других.
Ряд амилаз с известной или легко определяемой последовательностью могут быть использованы в качестве референсной амилазы. В различных вариантах осуществления референсной амилазой является SEQ ID NO:1 или 2. Исходная амилаза и референсная амилаза могут быть одной и той же амилазой в некоторых вариантах.
Эта композиция является, в некоторых вариантах осуществления компонентом продукта для применения в стирке, очистке посуды или твердой поверхности, расшлихтовке или обработке ткани или пятен. Например, эта композиция может быть частью детергента для мойки посуды для применения в виде жидкой, полутвердой, твердой и т.д. композиции или может быть гранулированной или жидкой детергентной композицией для стирки белья. Эта композиция содержит дополнительные компоненты, требующиеся для предполагаемого применения. Примеры многих таких композиций обеспечены здесь, а другие примеры будут известны квалифицированным в данной области специалистам.
В одном варианте осуществления эта композиция содержит дополнительный фермент, который является протеазой, липазой, амилазой, целлюлазой, пероксидазой, оксидазой, пектиназой, лиазой, кутиназой, лакказой или другим применимым ферментом. Квалифицированному в данной области специалисту будут известны эти и другие ферменты, которые могут быть применимы в связи с обеспеченными здесь вариантными амилазами. Количества фермента, которые являются применимыми, могут быть определены эмпирически для конкретного применения, однако здесь обеспечены руководящие указания, например, в примерах.
В различных вариантах осуществления эта композиция содержит одно или несколько поверхностно-активных веществ. Это поверхностно-активное вещество является обычно неионогенным, анионогенным, катионогенным или цвиттерионным или их комбинацией.
В одном варианте осуществления этим вариантом амилазы является предпочтительно вариант S242A, S242D, S242E, S242F, S242G, S242H, S242L, S242M, S242N, S242Q, или S242T. Для некоторых применений, например, в вариантах мойки и чистки, полезной является устойчивость к окислению и устойчивость к комплексообразователям или измененным концентрациям ионов металлов. Таким образом, в различных вариантах осуществления эта вариантная амилаза имеет измененную устойчивость к окислению и эта вариантная альфа-амилаза дополнительно включает в себя делецию или замену одного или нескольких остатков метионина, в том числе остатков, расположенных в положениях аминокислот 8, 9, 96, 200, 206, 284, 307, 311, 316 и 438 исходной альфа-амилазы, где эта референсная альфа-амилаза показана в SEQ ID NO:1 или 2. Вариантные амилазы могут дополнительно содержать модификацию аминокислотной последовательности в одном или нескольких положениях аминокислот, соответствующих положениям 97, 179, 180, 193, 319, 349, 358, 416, 428 или 443 референсной амилазы (которая является предпочтительно SEQ ID NO:1 или 2).
В различных вариантах осуществления этот вариант содержит или дополнительно содержит одну или несколько замен в следующих положениях: цистеин в положении 349, цистеин в положении 428, глутаминовую кислоту в положении 97, аргинин в положении 97, глутаминовую кислоту в положении 319, аргинин в положении 319, глутаминовую кислоту в положении 358, аргинин в положении 358, глутаминовую кислоту в положении 443 или аргинин в положении 443.
Кроме того, этот вариант в одном варианте осуществления содержит замену N193 или V416 или обе эти замены, например, замену, которая является N193F или V416G или обе. Другие варианты осуществления включают в себя дополнительную модификацию, такую как делеция одной или нескольких аминокислот в положениях F178, R179, G180, I181, G182 и K183. Как описано в другом месте здесь, такие делеции могут быть даже более полезными при обеспечении их парами или в большем количестве. Предпочтительно в таких вариантах осуществления этот вариант имеет измененную зависимость от ионов металлов или измененную стабильность или активность в отсутствие добавленного кальция или в присутствии комплексообразователя, или их комбинации. Такие варианты могут также иметь хорошие свойства для способов мойки и очистки.
В одном варианте осуществления эта вариантная альфа-амилаза предпочтительно имеет по меньшей мере 95% гомологию относительно SEQ ID NO:2 и содержит замену аминокислоты 242 относительно нумерации в референсной альфа-амилазе, содержащей SEQ ID NO:1. Как в случае других описанных здесь вариантов, этот вариант предпочтительно имеет детектируемую альфа-амилазную активность, в частности, в условиях ее применения.
В некоторых предпочтительных в настоящее время вариантах осуществления исходная альфа-амилаза является SEQ ID NO: 1, 2, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15 или 16, а референсная альфа-амилаза является SEQ ID NO:1 или 2.
В различных вариантах осуществления эта вариантная альфа-амилаза имеет улучшенную эффективность (эксплуатационные качества) в процессе мойки при очень низких и очень высоких pH. В одном варианте осуществления моющая способность улучшается при pH ≥ приблизительно 8, относительно исходной амилазы. Более предпочтительными являются варианты с улучшенной моющей способностью при pH, большем, чем приблизительно 8,5 - приблизительно 11.
Этот вариант альфа-амилазы в одном варианте осуществления содержит ряд замен a) Q97E, Q319E, Q358E, Q443E; b) Q97E, Q319R, Q358E, Q443R; c) Q97E, Q319R, Q358E; d) Q97E, Q319R, Q443E; e) Q97E, Q319R, Q443R; f) Q97E, Q358R; g) Q97E, Q443E; h) Q319R, Q358E, Q443E или i) Q319R, Q358R, Q443E относительно референсной амилазы, например, последовательности амилазы SEQ ID NO:1 или 2.
В другом аспекте данного изобретения обеспечены детергентные или чистящие композиции (препараты), содержащие по меньшей мере одну вариантную амилазу, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную аминокислотной последовательности AmyS-подобной альфа-амилазы. Эти варианты амилазы имеют замену в положении аминокислоты, соответствующем положению 242 референсной альфа-амилазы, и имеют детектируемую альфа-амилазную активность. Предпочтительно, эта референсная амилаза является SEQ ID NOS:1 или 2.
Эта детергентная или чистящая композиция предпочтительно содержит вариант амилазы, который является вариантом S242, содержащим по меньшей мере одну замену S242A, S242D, S242E, S242F, S242G, S242H, S242L, S242M, S242N, S242Q или S242T. Как и в случае композиций, приведенных выше, этот вариант может содержать любой вариантный признак или любое изменение или комбинацию вариантных признаков и изменений, описанных здесь.
В другом из его аспектов это изобретение обеспечивает наборы. Один вариант этого набора содержит
a) одну или несколько вариантных альфа-амилаз, содержащих аминокислотную последовательность, по меньшей мере на приблизительно 95% идентичную аминокислотной последовательности исходной AmyS-подобной альфа-амилазе, и имеющую замену в положении аминокислоты, соответствующем положению 242 референсной альфа-амилазы, причем указанный вариант имеет детектируемую альфа-амилазную активность, и
b) по меньшей мере один дополнительный фермент, детергент, одно поверхностно-активное вещество, один комплексообразователь, окислитель, подкислитель, подщелачивающий агент, источник пероксида, источник жесткости, соль, детергентный комплексообразующий агент, полимер, стабилизирующий агент или кондиционер.
В одном варианте осуществления эти наборы дополнительно содержат инструкции для использования этого набора в процессе расшлихтовки тканого материала или мойки или чистки одного или нескольких изделий, загрязненных крахмалсодержащим веществом.
Квалифицированному в данной области специалисту будет также понятно, что обеспечены также наборы для получения описанных альфа-амилаз. Эти наборы обеспечивают репрезентативные последовательности, например, аминокислотные последовательности, и/или нуклеиновые кислоты, из которых они получены, для применения в качестве исходных альфа-амилаз и референсных амилаз.
12. Применение вариантов амилазы в расшлихтовке и процессах мойки/чистки
В другом аспекте это изобретение обеспечивает способы применения вариантных альфа-амилаз в расшлихтовке тканей или другого тканого материала и в процессах мойки и чистки.
В одном аспекте это изобретение обеспечивает способы расшлихтовки тканого материала после процесса ткачества. Эти способы обычно предусматривают контактирование тканого материала с вариантной альфа-амилазой при условиях и в течение времени, эффективных по меньшей мере для частичного удаления шлихты из тканого материала. Этот вариант содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на приблизительно 95% идентичную аминокислотной последовательности исходной AmyS-подобной альфа-амилазы, и имеет замену в положении аминокислоты, соответствующем положению 242 референсной альфа-амилазы. Этот вариант имеет детектируемую альфа-амилазную активность.
2+
Этот вариант предпочтительно изменен в его одном или нескольких физических или ферментативных свойствах в сравнении с исходной AmyS-подобной альфа-амилазой или референсной амилазой. В различных вариантах осуществления эта амилаза изменена в одной или нескольких характеристиках, таких как общий заряд, субстратная специфичность, расщепление субстрата, связывание субстрата, термостабильность, активность при одном или нескольких pH, стабильность при одном или нескольких pH, стабильность в окисляющих условиях, потребности в Ca, удельная активность, каталитическая скорость, каталитическая эффективность, активность в присутствии комплексообразователя, термо- или pH-стабильность в присутствии комплексообразователя, эффективность для расшлихтовки или величина экспрессии в системе экспрессии белков.
Референсные амилазы обсуждаются выше, и в одном варианте осуществления этого способа референсной амилазой является SEQ ID NO:1 или 2.
В одном варианте осуществления исходной альфа-амилазой является SEQ ID NO: 1, 2, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15 или 16, а референсной амилазой является SEQ ID NO:1 или 2. В некоторых вариантах осуществления этим вариантом является вариант S242A, S242D, S242E, S242F, S242G, S242H, S242L, S242M, S242N, S242Q или S242T.
Этот вариант может дополнительно содержать одну или несколько замен в следующих положениях: цистеин в положении 349, цистеин в положении 428, глутаминовую кислоту в положении 97, аргинин в положении 97, глутаминовую кислоту в положении 319, аргинин в положении 319, глутаминовую кислоту в положении 358, аргинин в положении 358, глутаминовую кислоту в положении 443 или аргинин в положении 443, где референсной альфа-амилазой является SEQ ID NO:1 или 2.
В другом аспекте здесь обеспечены способы мойки или очистки. Хотя операции мойки и очистки могут часто выигрывать вследствие включения одной или нескольких ферментативных активностей, эти процессы мойки или очистки могут подвергать эти ферменты, в том числе амилазы, крайним условиям и изменять границы активности этого фермента. Таким образом, обеспеченные способы предусматривают контактирование одного или нескольких изделий, подлежащих мойке или очистке, с композицией, содержащей вариантную альфа-амилазу, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную аминокислотной последовательности исходной AmyS-подобной альфа-амилазы, и имеющую замену в положении аминокислоты, соответствующем положению 242 референсной альфа-амилазы. Этот вариант предпочтительно имеет детектируемую альфа-амилазную активность, и стадию контактирования выполняют при условиях и в течение времени, эффективных по меньшей мере для частичной мойки или очистки этих одного или нескольких изделий. Предпочтительно, по меньшей мере одно из этих одного или нескольких изделий загрязнено по меньшей мере одним крахмалсодержащим материалом, удалению которого способствует эта вариантная амилаза.
В одном варианте осуществления эта композиция дополнительно содержит по меньшей мере один компонент детергентной композиции или чистящей композиции. Например, эта композиция содержит один или несколько из дополнительного фермента, детергента, поверхностно-активного вещества, комплексообразователя, окислителя, подкислителя, подщелачивающего агента, источника пероксида, источника жесткости, соли, детергентного комплексообразующего агента, полимера, стабилизирующего агента или кондиционера.
В одном варианте осуществления исходная альфа-амилаза может быть любой из SEQ ID NO: 1, 2, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15 или 16, а референсной амилазой является SEQ ID NO:1 или 2. В некоторых вариантах осуществления исходной альфа-амилазой является предпочтительно SEQ ID NO:1, 2, 15 или 16, тогда как в других исходной альфа-амилазой является SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12.
В предпочтительных в настоящее время вариантах осуществления этим вариантом является вариант S242A, S242D, S242E, S242F, S242G, S242H, S242L, S242M, S242N, S242Q или S242T. В некоторых вариантах осуществления референсной амилазой является SEQ ID NO:1 или 2, а вариантом альфа-амилазы является S242A, S242D, S242E, S242F, S242G, S242H, S242L, S242M, S242N, S242Q или S242T.
В различных вариантах осуществления, например, когда этим вариантом является вариант S242A, S242D, S242E, S242F, S242G, S242H, S242L, S242M, S242N, S242Q или S242T, этот вариант дополнительно содержит модификацию последовательности в одном или нескольких положениях аминокислот, соответствующих положениям аминокислот 97, 179, 180, 193, 319, 349, 358, 416, 428 или 443 референсной амилазы. Более конкретно, этот вариант содержит одну или несколько замен в следующих положениях: цистеин в положении 349, цистеин в положении 428, глутаминовую кислоту в положении 97, аргинин в положении 97, глутаминовую кислоту в положении 319, аргинин в положении 319, глутаминовую кислоту в положении 358, аргинин в положении 358, глутаминовую кислоту в положении 443 или аргинин в положении 443 в различных вариантах осуществления. Замена N193 или V416 или обе эти замены, например, замена N193F или V416G или обе также применимы в некоторых вариантах.
В других вариантах осуществления этот вариант обнаруживает делецию одной или нескольких аминокислот в любом из конкретных положений F178, R179, G180, I181, G182 и K183. В таких вариантах осуществления этот вариант предпочтительно имеет измененную зависимость от ионов металлов или измененную стабильность или активность в отсутствие добавленного кальция или в присутствии комплексообразователя. Как в случае других модификаций, вышеуказанные делеции аминокислот могут быть также использованы - отдельно или в комбинации - с любым из вышеуказанных изменений.
Этот вариант обычно имеет улучшенную эффективность в моечном процессе в сравнении с исходной амилазой, например, при таких условиях, как pH ≥ приблизительно 8.
В одном предпочтительном в настоящее время варианте осуществления этот способ включает в себя применение варианта, который содержит набор замен: a) Q97E, Q319E, Q358E, Q443E; b) Q97E, Q319R, Q358E, Q443R; c) Q97E, Q319R, Q358E; d) Q97E, Q319R, Q443E; e) Q97E, Q319R, Q443R; f) Q97E, Q358R; g) Q97E, Q443E; h) Q319R, Q358E, Q443E или i) Q319R, Q358R, Q443E.
Это изобретение включает в себя дополнительные подробности в следующих примерах, которые не предназначены для какого-либо ограничения заявляемого объема изобретения. Присоединенные фигуры являются интегральными частями представленного описания изобретения. Все цитируемые ссылки специально включены в качестве ссылки для всего, описанного здесь. Таким образом, следующие примеры представлены для иллюстрации, но не для ограничения заявленного материала.
ПРИМЕРЫ
Пример 1 - Конструирование вариантов
Варианты в положении S242 зрелой последовательности AmyS конструировали с использованием сайт-направленного мутагенеза. Матрицей для мутагенеза была метилированная плазмида pHPLT-AmyS (см. фигуру 2) с использованием dam-метилазы из New England Biolabs (Massachusetts). Вырожденные праймеры (S242F(прямой) и S242R(обратный), приведенные ниже) синтезировали и разбавляли до 10 мкМ в Operon (Huntsville, AL) с комплементарными прямой и обратной последовательностями, обе из которых содержат 5'-фосфатную группу для лигирования в этой реакции. Последовательность исходной альфа-амилазы (SEQ ID NO:2) присоединяют к ней. Библиотеки создавали с использованием набора Stratagene Quik-Change™ Multi-site kit (Stratagene, La Jolla CA) с применением олигонуклеотидных праймеров, рандомизированных NN(G/C) в положении-мишени. Выбранную аминокислоту (т.е. S242) случайным образом заменяли всеми 19 возможными альтернативами.
Праймеры S242 для мутагенеза:
S242 F:
5'[Phos]GTCAAGCATATTAAGTTCNNSTTTTTTCCTGATTGGTTG 3' SEQ ID NO:17
S242 R:
5'[Phos]CAACCAATCAGGAAAAAASNNGAACTTAATATGCTTGAC 3' SEQ ID NO:18
Эту реакцию выполняли следующим образом:
Реакция QUIK-CHANGE:
2
Эта реакционная смесь состояла из 18 мкл стерильной дистиллированной HO, 2,5 мкл 10x буфера из этого набора, 1 мкл dNTP из этого набора, 1,25 мкл прямых праймеров (из исходного 10 мкМ раствора), 1,25 мкл обратных праймеров (из исходного 10 мкМ раствора), 1 мкл ДНК плазмиды pHPLT-AmyS в качестве матрицы (~70 нг) и 1 мкл ферментной смеси из этого набора, всего 26,5 мкл.
Условия проведения циклического процесса:
Условиями проведения циклов были 95°C в течение 1 минуты один раз, затем 95°C в течение 1 минуты, 55°C в течение 1 минуты, 65°C в течение 10 минут на протяжении 25 циклов.
Один микролитр DpnI (10 Е/мкл) добавляли к реакционной смеси Multi-site Quik-Change™ и инкубировали при 37°C в течение 18 часов и затем добавляли еще 0,5 мкл и инкубировали еще в течение 3 часов.
Один микролитр расщепленной DpnI реакционной смеси использовали в качестве матрицы для круговой амплификации с набором для амплификации TEMPLIPHI (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) и эту реакцию выполняли согласно протоколу Amersham. Один микролитр ДНК, полученной согласно модели репликации катящегося кольца, трансформировали в 100 мкл компетентных клеток Bacillus subtilis (штамма Bacillus subtilis с 2 полученными с использованием протеазы делециями (ΔaprE, ΔnprE, amyE::xylRPxylAcomK-phleo)) и встряхивали при 37ºС в течение 1 часа. Затем всю эту смесь для трансформации высевали на чашки с LA + 10 м.д. Neo + 1% нерастворимый крахмал (25 мкл на одной чашке, 75 мкл на другой чашке) и инкубировали в течение ночи при 37ºС. Девяносто шесть трансформантов извлекали в 150 мкл LB + 10 м.д. Neo в микротитрационном планшете и выращивали в течение ночи при 37°C. Этот ночной планшет культуры переносили в виде отпечатка на большую чашку с LA + 10 м.д. Neo + 1% нерастворимый крахмал при помощи инструмента для получения реплик с 96 штифтами и передавали в Quintara Biosciences (Berkeley, CA) для ПЦР и секвенирования колоний.
2
После определения вариантных последовательностей эти варианты извлекали в 96-луночные микротитрационные планшеты, содержащие 125 мкл LB+10 м.д. Neo, располагая эти варианты в формат четверок с контролями. Этот выстроенный микротитрационный планшет выращивали в течение 6 часов при 37ºС и 250 об/мин. При помощи инструмента для получения реплик (Enzyscreen, Leiden, The Netherlands) этот микротитрационный планшет использовали для инокуляции нового микротитрационного планшета (микротитрационный планшет и крышки планшета из Enzyscreen, Leiden, The Netherlands), содержащего 150 мкл MBD-среды для экспрессии белков (G. Vogtentanz et al., "A Bacillus subtilis fusion protein system to produce soybean Bowman-Birk protease inhibitor," Prot. Expr. & Purif, 55: 40-52, 2007) и дополняли 5 мМ CaCl для экспрессии белков. Экспрессионные планшеты выращивали в течение 64 часов при 37°C, 250 об/мин и 70% влажности. Затем экспрессионные культуры фильтровали через микрофильтрующий планшет (0,22 мкм, Millipore, Billerica, MA) и подвергали скринингу на термостабильность (см. пример 3).
Пример 2 - Экспрессия, очистка и характеристика вариантов
Колонии высевали штриховой разводкой из микротитрационных планшетов из примера 1 на чашки с крахмалом с 10 м.д. неомицина. Эти чашки инкубировали в течение ночи при 37ºС и отдельные колонии извлекали и использовали для инокуляции встряхиваемых колб (колб на 250 мл с 25 мл среды), содержащих среды (см. ниже) и 20 м.д. неомицина. Эти культуры выращивали при 37ºС, 275 об/мин, в течение приблизительно 8 часов (до достижения OD (600 нм) 2,0). Эти культуральные бульоны смешивали с 50% глицерином при отношении 2:1, помещали в отдельно помеченные культуральные флаконы и замораживали при -80ºC. Последующее получение выбранных альфа-амилаз производили из этих исходных глицериновых растворов.
2
2
Ферментации для альфа-амилаз проводили во встряхиваемых колбах на 50 мл, выращиваемых при 37°C в течение 60 часов в минимальной культуральной среде MOPS (Neidhardt et al., J. Bacteriol. 119(3):736-747, 1974) с 1% (мос./об.) Soytone. Ферменты очищали из ферментационного бульона с использованием гидрофобной хроматографии следующим образом: этот бульон концентрировали в 10 раз, затем разбавляли обратно до его исходного объема 50 мМ MES, 2 мМ CaCl, pH 6,8 с 1 М сульфатом аммония, затем стерильно фильтровали с использованием стекловолоконного фильтра. Затем пробы наносили на колонку высокой плотности PHENYL SEPHAROSE FF (20×95 мм; Amersham, GE Healthcare Bio-Sciences, Sweden), предварительно уравновешенную тем же самым буфером. Неамилазные белки удаляли 10 колоночными объемами того же самого буфера без сульфата аммония с последующими 5 колоночными объемами воды. Представляющие интерес ферменты элюировали 50 мМ MES, 2 мМ CaCl, pH 6,8, содержащим 40% пропиленгликоль.
Концентрации белка определяли либо стандартным количественным денситометрическим способом на ДСН-ПААГ, либо с использованием анализа активности при помощи набора для анализа из Megazyme (Wicklow, Ireland). Калибровочную кривую, полученную с использованием очищенной амилазы (амилазы Bacillus 707; SEQ ID NO:6), использовали для сравнения результатов анализа.
Пример 3 - Определение измененных свойств: тепловой стресс
Этот пример показывает, что описанные здесь варианты могут иметь измененное свойство относительно исходной альфа-амилазы. Проводили высокопроизводительный скрининг термостабильности вариантов альфа-амилазы (AmyS) G. stearothermophilus.
После начального исследования были выбраны такие условия теплового стресса, что фермент дикого типа обнаруживал приблизительно 40% его начальной (предстрессовой) активности после теплового стресса (т.е. (активность после теплового стресса)/(активность перед тепловым стрессом) была равна приблизительно 0,4). Библиотеки мутантов подвергали скринингу в четырех повторностях и потенциальные ферменты-победители идентифицировали как ферменты, которые обнаруживали остаточную активность после теплового стресса, которая была равна по меньшей мере на два стандартных отклонения более высокой, чем средняя остаточная активность фермента дикого типа.
2
2
Экспрессия амилазы была равна приблизительно 100 м.д. в культуральных супернатантах чашек для экспрессии. После 60-65 часов роста при 37°C в увлажненном шейкере (250 об/мин и 70% относительная влажность), эти культуральные супернатанты осветляли для удаления клеточного материала с использованием фильтрующих планшетов. Эти осветленные супернатанты разбавляли 10-кратно в буфере, содержащем 50 мМ NaOAc/2,6 мМ CaCl/0,002% Твин-20, при pH 5,8, до конечной концентрации приблизительно 10 м.д. Одну аликвоту каждого супернатанта дополнительно разбавляли до 0,02 м.д., для определения активности вариантов ферментов, как описано ниже, с использованием флуоресцентно меченого кукурузного крахмала в качестве субстрата. Вторую аликвоту каждого супернатанта подвергали 30-минутному теплового стрессу при 95°C в термоциклере, затем разбавляли до 0,02 м.д. в 50 мМ NaOAc/2,6 мМ CaCl/0,002% Твин-20, при pH 5,8 и анализировали на остаточную активность с использованием флуоресцентного субстрата и анализа, описанных ниже.
2
Амилазную активность определяли с использованием набора для анализа амилазы ENZCHECK ULTRA AMYLASE, по существу, как описано изготовителем (Invitrogen, San Diego CA). Конечная концентрация этой амилазы в анализе была равна приблизительно 0,02 м.д. Буфер для анализа был 50 мМ NaOAc/2,6 мМ CaCl/0,002% Твин-20, pH 5,8. Субстратом был конъюгированный с флуоресцентным красителем BODIPY 100 мкг/мл DQ™-крахмал из кукурузы (Invitrogen - Eugene, OR). Увеличенную флуоресценцию, указывающую амилазную активность, измеряли при помощи прибора SpectraMAX M2 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Реакцию подвергали мониторингу при комнатной температуре в течение 5 минут с использованием прибора, регистрирующего в кинетическом режиме. Длина волны возбуждения была 485 нм; испускание подвергали мониторингу при 520 нм с фильтром с порогом отсечения 515 нм.
AmyS дикого типа (Xtra) проявила 33-43%-ную остаточную активность после подвергания тепловому стрессу в течение 30 минут при 95°C. Варианты AmyS, S242A и S242Q, сохраняли остаточные активности 55-65% и 70-80%, соответственно, после тех же самых условий теплового стресса. См. фигуру 3 и таблицу 3-1. Эти измерения остаточной активности указывают на то, что эти два варианта являются более теплостойкими, чем альфа-амилаза дикого типа.
Таблица 3-1Процентные остаточные активности каждого варианта. Дикий тип (SPEZYME XTRA). Каждая чашка включает в себя SPEZYME ETHYL и SPEZYME XTRA в качестве контролей, как указано
<img file="00000004.tif" he="95" wi="132" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000005.tif" he="25" wi="130" img-content="undefined" img-format="tif" />
Пример 4 - Определение измененных свойств: DSC
2
Spezyme Xtra, S242A, S242E и S242Q очищали из ферментационного бульона встряхиваемых колб (см. пример 2) с использованием гидрофобной хроматографии. Белок элюировали из колонки в очищенном виде с использованием 50 мМ MES, pH 6,8, содержащего 40% пропиленгликоль и 2 мМ CaCl.
m
Кривые дополнительной теплоемкости измеряли с использованием сверхчувствительного сканирующего высокопроизводительного микрокалориметра, VP-CAP DSC (Micr°Cal, Inc., Northampton, MA). Стандартная процедура для измерений DSC и теория этого способа были опубликованы (E. Freire, "Differential Scanning Calorimetry," Methods. Mol. Biol. 41: 191-218, 1995). Приблизительно 500 мкл 0,5 мг/мл α-амилазы дикого типа Bacillus stearothermophilus или варианта S242A, S242E и S242Q (в обоих случаях в отсутствие и в присутствии 2 мМ хлорида кальция) сканировали на протяжении диапазона температуры 30-120ºC. Затем ту же самую пробу повторно сканировали для проверки обратимости этого процесса. Для α-амилазы процесс теплового развертывания был необратимым. Используемым буфером был 10 мМ ацетат натрия, pH 5,5. Использовали скорость сканирования 200°C/ч для минимизации любых артефактов, которые могли происходить из агрегации. Среднюю тепловую точку (T) кривых DSC использовали в качестве индикатора термостойкости тестируемого белка. Таблица 4-1 показывает точки теплового плавления для тестируемых амилаз. Кривые теплового плавления и точки плавления для амилазы дикого типа и вариантных амилаз показаны на фигуре 5.
m
m
m
m
Тепловое развертывание для вариантов амилазы S242A, S242E и S242Q в отсутствие и в присутствии 2 мМ хлорида кальция показывает существенное увеличение точек плавления для этих вариантов в сравнении с точками плавления для дикого типа. В отсутствие добавленного хлорида кальция амилаза дикого типа имеет точку теплового плавления 100,8ºC, тогда как T для S242A, S242E и S242Q равны 106,5ºC, 107,8ºC и 110,1ºC, соответственно. Таким образом, замена S242 на A приводит к увеличению T на 5,7ºC; замена S242 на E приводит к увеличению T на 7,0ºC и замена S242 на Q приводит к увеличению T на 9,3ºC.
m
m
m
m
m
m
В присутствии 2 мМ хлорида кальция амилаза дикого типа обнаруживала точку теплового плавления 106,8ºC, тогда как T для S242A, S242E и S242Q были равны 111,8ºC, 112,2ºC и 113,8ºC, соответственно. Таким образом, относительно измерений в отсутствие хлорида кальция, в присутствии 2 мМ хлорида кальция все четыре белка имели увеличенные величины T. Увеличение T для дикого типа и вариантов S242A в присутствии кальция было равно 6ºC и 5,3ºC, соответственно. Увеличение T для варианта S242E было равно 4,4°C. Увеличение T для варианта S242Q было равно 3,7ºC. Это предполагает, что варианты S242Q меньше стабилизируются кальцием или этот вариант меньше зависит от кальция в отношении стабильности. Увеличение T S242A, S242E и S242Q относительно дикого типа в присутствии хлорида кальция было 5ºC, 5,4ºC и 3ºC, соответственно. Это предполагает, что термодинамические свойства этих вариантов отличаются от термодинамических свойств дикого типа, или Spezyme Xtra. Это наблюдение согласуется с их увеличенным действием в исследованиях их применения (см. пример 5).
Таблица 4-1T<sub>m</sub> (°C) для различных амилаз согласно DSC
<img file="00000006.tif" he="40" wi="142" img-content="undefined" img-format="tif" />
Пример 5 - Профили активности
Этот пример показывает, что тестируемые варианты имеют измененные профили активности не только относительно исходной альфа-амилазы, но также относительно промышленного стандартного фермента. Определение белка выполняли на очищенных пробах или пробах из чашек. В каждом случае варианты и стандартные альфа-амилазы анализировали на основе равной концентрации белка.
Любые варианты из чашек или очищенные варианты разбавляли до приблизительно 20 м.д. с использованием содержащего яблочную кислоту буфера pH 5,6. Субстрат состоял из 15% кукурузного крахмала в том же самом 50 мМ содержащем яблочную кислоту буфере, pH 5,6. Четыреста микролитров суспензии крахмала уравновешивали до 70°C в течение 2,5 минут. Семь (7) мкл этого разбавленного фермента быстро добавляли к уравновешенному крахмалу при конечной концентрации приблизительно 0,36 м.д. Затем эту реакционную смесь помещали в предварительно нагретый до 85°C встряхивающийся нагревающийся узел и перемешивали при 300 об/мин. Реакции останавливали 50 мкл 125 мМ NaOH при заданных временных интервалах. Реакционные пробирки откручивали и супернатант разбавляли в 10 раз в 1 мМ NaOH для анализа DP-профиля при помощи HPAEC-PAD.
Реакции устанавливали на 4, 10 и 20 минут. 4-минутная реакция обеспечивает показатель начального превращения ферментом продукта в субстрат; 10-миинутная реакция обеспечивает показатель тепловой активности фермента, а 20-минутная реакция обеспечивает показатель термостабильности фермента.
Общую площадь от DP2 до конца HPLC-эксперимента интегрировали и делили на общий белок и время реакции. Эти результаты показаны на фигурах 6 и 7.
Пример 6 - Дополнительные способы
Следующие анализы использовали в этих примерах. Отклонения от протоколов, представленных ниже, обычно указываются в примерах. В этих экспериментах использовали спектрофотометр для измерения оптической плотности продуктов, образованных во время реакций.
А. Определение содержания белка
2
BCA(бицинхониновая кислота)-анализ. BCA-анализ (Pierce) использовали для определения концентрации белка в пробах в масштабе микротитрационного планшета (MTP). Используемыми растворами химикалиев и реагентов были: BCA-реагент для анализа белка и буфер для разбавления Pierce (50 мМ MES, pH 6,5, 2 мМ CaCl, 0,005% TWEEN-80). Оборудование включало в себя МТР-ридер SpectraMAX (type 340; Molecular Devices). MTP получали из Costar (типа 9017).
562
Двести (200) мкл BCA-реагента пипетировали в каждую лунку с последующим добавлением 20 мкл разбавленного белка. После основательного перемешивания эти MTP инкубировали в течение 30 минут при 37°C. Воздушные пузырьки удаляли перед считыванием оптической плотности (OD) раствора в лунках при 562 нм. Для определения концентрации белка показания фона вычитали из показаний проб. OD строили в виде графика для стандартов белка (очищенного фермента) для получения калибровочной кривой. Концентрацию белка этих проб интерполировали из этой калибровочной кривой.
2
Анализ по Бредфорду. Анализ с реагентом-красителем Бредфорда (Quick Start) использовали для определения концентрации белка в пробах в масштабе микротитрационных планшетов (МТР). Используемыми растворами химикалиев и реагентов были: реагент-краситель Бредфорда Quick Start (BIO-RAD Catalog No. 500-0205), буфер для разбавления (10 мМ NaCl, 0,1 мМ CaCl, 0,005% TWEEN-80). Используемым оборудованием был Biomek FX Robot (Beckman) и МТР-ридер SpectraMAX (типа 340). MTP получали из Costar (типа 9017).
595
Двести (200) мкл BCA-реагента пипетировали в каждую лунку с последующим добавлением 15 мкл буфера для разбавления. Десять (10) мкл отфильтрованного культурального бульона добавляли в эти лунки. После основательного перемешивания эти MTP инкубировали по меньшей мере в течение 10 минут при комнатной температуре. Воздушные пузырьки выдували и OD каждой лунки считывали при 595 нм. Для определения концентрации белка показания фона (т.е. из неинокулированных лунок) вычитали из показаний проб. Полученные величины OD обеспечивают относительное измерение содержания белка в этих пробах.
В. Анализ микролоскутков (маленьких образцов тканей) для тестирования эффективности фермента
Детергенты, используемые в этом анализе, не содержали ферментов, или ферменты, присутствующие в коммерческих детергентах, разрушали посредством тепловой активации, как описано в другом месте в этом документе. Используемое оборудование включало в себя Термомиксер Эппендорфа и МТР-ридер SpectraMAX (типа 340). MTP получали из Costar (типа 9017).
Приготовление детергента (AATCC HDL; условия США). Воду Milli-Q доводили до жесткости воды 6 гранов на галлон (gpg) (Ca/Mg=3/1), и добавляли 1,5 г/л стандартного ссылочного жидкого детергента AATCC 2003 без оптического отбеливателя (брайтнера). Этот детергентный раствор интенсивно перемешивали в течение по меньшей мере 15 минут. Затем добавляли 5 мМ HEPES (свободную кислоту) и pH доводили до 8,0.
Анализ микролоскутков с рисовым крахмалом для тестирования на эффективность (эксплуатационные свойства) амилазы. Тестируемые детергенты готовили, как описано в другом месте в этом документе. Используемое оборудование включало в себя шейкер/инкубатор New Brunswick Innova 4230 и МТР-ридер SpectraMAX (типа 340). MTP получали из Corning (типа 3641). Выдержанный рисовый крахмал с лоскутками с оранжевым пигментом (CS-28) получали из Center for Test Materials (Vlaardingen, Netherlands). Перед нарезанием круглых микролоскутков 0,25 дюйма, эту ткань промывали водой. Два микролоскутка помещали в каждую лунку 96-луночного микротитрационного планшета. Тестируемый детергент уравновешивали при 20ºC (Северная Америка) или 40ºC (Западная Европа). 190 мкл раствора детергента добавляли в каждую лунку MTP, содержащую микролоскутки. К этой смеси добавляли 10 мкл разбавленного раствора детергента. MTP герметизировали адгезивной пленкой и помещали в термостат на 1 час с перемешиванием при 750 об/мин при желаемой тест-температуре (обычно 20ºC или 40ºС). После инкубирования 150 мкл раствора из каждой лунки переносили в свежий МТР и считывали при 488 нм с использованием МТР-ридера SpectraMAX MTP для количественного определения очистки. Включали также слепые контроли, а также контроли, содержащие микролоскутки и детергент, но без фермента.
Расчет эффективности фермента. Полученную величину оптической плотности корректировали на величину слепого опыта (т.е. полученную после инкубирования микролоскутков в отсутствие фермента). Полученная оптическая плотность была мерой гидролитической активности.
С. Определение концентрации амилазы титрованием с антителами
Концентрацию альфа-амилазы и удельную активность определяли, в некоторых случаях, титрованием с ингибиторным поликлональным антителом. Было обнаружено, что поликлональные антитела, индуцированные против альфа-амилазы Bacillus stearothermophilus (AmyS) являются в сильной степени ингибирующими AmyS и альфа-амилазу из Bacillus sp. TS-23 (например, это связывание является достаточно прочным для получения линейного титрования потери активности). Таким образом, это антитело может быть использовано для измерения концентрации фермента, которую, в свою очередь, используют для расчета удельной активности.
Вкратце, измеряют величину ингибирования фермента несколькими известными концентрациями антитела. Из этой информации, экстраполируют концентрацию антитела, требуемую для полного ингибирования. Альфа-амилазную активность и ингибирование измеряли с использованием анализа флуорогенного BODIPY-крахмала. Буфером был 50 мМ MOPS, pH 7,0, содержащий 0,005% Твин-80.
Поликлональное антитело, направленное против очищенного AmyS, индуцировали в кролике и очищали стандартными способами. Эмпирическую величину "средней (кажущейся) концентрации" исходного раствора антитела определяли измерением ингибирования пробы AmyS известной удельной активности. Эту пробу антитела использовали для определения концентрации и удельной активности AmyS и вариантов TS23t. Эти величины использовали для создания нормализованных 96-луночных исходных планшетов фермента, в которых все эти варианты разбавляли до обычной концентрации.
D. Нативный гель-электрофорез белка
Электрофоретическую подвижность проб вариантных белков измеряли с использованием системы PHASTGEL (GE Healthcare) на предварительно залитых нативных полиакриламидных гелях (PHASTGEL Homogeneous) при концентрации либо 7,5%, либо 12,5%. Использовали буферные полоски (PHASTGEL Native), которые имели pH 8,8 в 0,88 M L-аланине, 0,25 M Трис-буфере. Условиями типичного эксперимента были 400 В в течение 12,75 минут с расстоянием от анода до катода 3,7 см.
Альтернативно, электрофоретическую подвижность проб вариантного белка измеряли на имеющих толщину 1 мм 0,5-1,5% агарозных гелях при различных величинах pH (т.е. 5,8, 8,0 и 10,0), получаемых выбором подходящей буферной системы. Электрофорез проводили при денатурирующих условиях. Длина катод-анод была равна 13,9 см. Пробу 1-2 мкг белка смешивали с 5% глицерином и 0,05% бромфеноловым синим и наносили на каждую дорожку. Гель-электрофорез обычно проводили в течение 1 часа при 100 В.
Гели окрашивали красителем Louiseville синим, растворенным в 10% уксусной кислоте, и обесцвечивали 10% метанолом и 10% уксусной кислотой в воде. Одновременно наносили 12-20 вариантов белков в зависимости от нативной системы геля. В результате, электрофоретическая подвижность варианта белка могла быть немедленно оценена относительно стандартов лэддеров зарядов, нанесенных на тот же самый гель.
Е. Инактивация нагревом детергентов
Инактивация нагревом коммерческих детергентных смесей служит для разрушения ферментативной активности любых белковых компонентов при сохранении свойств неферментативных компонентов. Таким образом, этот способ пригоден для получения коммерчески продаваемых детергентов для использования в тестировании вариантов ферментов. Для североамериканских (NA) и западноевропейских (WE) жидких детергентов для стирки в интенсивном режиме инактивацию нагревом выполняли помещением предварительно взвешенного жидкого детергента (в стеклянной бутыли) в водяную баню при 95ºC на 2 часа. Время инкубирования для инактивации нагревом североамериканского (NA) и японского (JPN) гранулированного детергента (HDG) для стирки в интенсивном режиме составляло 8 часов, а это время для западноевропейского (WE) HDG-детергента составляло 5 часов. Время инкубирования для инактивации нагревом NA и WE детергентов для автоматической мойки посуды (ADW) составляло 8 часов. Эти детергенты покупали в магазинах местных супермаркетов. Как ненагреваемые, так и нагреваемые детергенты анализировали в пределах 5 минут растворения детергента для точного определения дезактивированного процента. Активность ферментов тестировали с использованием suc-AAPF-pNA-анализа.
Для тестирования активности фермента в инактивированных нагревом детергентах рабочие растворы детергентов готовили из инактивированных нагревом исходных растворов. Подходящие величины жесткости воды (6 гранов на галлон (gpg) или 12 гранов на галлон (gpg)) и в растворы детергентов добавляли буфер для соответствия желаемым условиям (таблица 6-1). Эти растворы смешивали при помощи вортекса или перевертыванием бутылей.
Таблица 6-1Условия стирки и мойки посуды
<img file="00000007.tif" he="77" wi="157" img-content="undefined" img-format="tif" />
F. Анализ на очищающую способность с использованием прибора TERG-O-TOMETER
Определение
Для оценивания очистки от белковой и углеводной грязи использовали стандартный протокол, посредством которого уровень грязи на лоскутке ткани измеряли до и после очистки при стандартных условиях. Лоскутки ткани состояли из тканой хлопчатобумажной ткани, загрязненной либо кукурузным крахмалом, рисовым крахмалом, либо смесью крови, молока и угля. Лоскутки получали из Testfabrics, Inc. (West Pittiston, PA). Maize Starch (EMPA 161) и технические загрязнения из крови, молока, угля (EMPA 116) были произведены EMPA Test materials AG (St. Gallen, Switzerland). Загрязнения рисовым крахмалом были произведены в Center for Testmaterials BV (Vlaardingen, Netherlands). Каждое пятно измеряли до и после обработки по оптическому коэффициенту отражения с использованием рефлектометра Minolta Reflectometer CR-410, установленного на стандартный источник света D65 (6500ºK). Различие в величинах L, a, b преобразовывали в общее цветовое различие (dE), определяемое цветовым пространством CIE-LAB. Очищение от пятен выражали в виде процентного индекса удаления пятен (%SRI) получением отношения между цветовым различием до и после стирки и сравнением его с цветовым различием не подвергнутых стирке загрязнений (до стирки) относительно незагрязненной ткани.
Эксперименты по очистке проводили в TERG-O-TOMETER (United States Testing Co., Hoboken, NJ), оборудованном 6 чанами на 2 л из нержавеющей стали с расположенными сверху мешалками. Каждую обработку проводили в общем объеме 1 л, имеющем жесткость воды либо 6 гранов на галлон 3:1 (кальций:магний), либо 12 гранов на галлон. Детергентами, используемыми в этих экспериментах по стирке, были жидкий детергент 1,5 г/л AATCC HDL WOB 2003 с 5 мМ HEPES-буфером при pH 8, гранулированный детергент 0,7 г/л AATCC HDD WOB 1993, гранулированный детергент 8 г/л IEC A* 60456 с периодатом и отбеливателем TAED или 5 г/л жидкий детергент Persil Power Gel. Фермент добавляли непосредственно в моечный раствор и затем реакции инициировали добавлением либо 40 г/л, либо 200 г/л загрязненной или балластной ткани. Моющие реакционные смеси перемешивали при 100 об/мин в течение 10, 15 или 40 минут при 20ºC, 25ºC, 30ºC, 40ºC или 50ºC. После очистки лоскутки промывали в течение 3 минут в водопроводной воде, полоскали в загружаемой спереди стиральной машине при 1000 об/мин для удаления избытка воды и сушили в сушилке при низком нагреве в постоянном цикле отжима в течение приблизительно 45 минут. Сравнение степени удаления грязи оценивали рефлектометрией и выражали в виде % индекса удаления грязи (%SRI). Контрольные условия не содержали фермента и положительные контроли состояли из различных доз эталонных коммерческих ферментов.
G. Анализ с комплексом BODIPY-крахмал для определения амилазной активности
2
Анализ с BODIPY-крахмал выполняли с использованием набора для анализа амилазы EnzChek Ultra Kit (E33651, Invitrogen). Исходный раствор 1 мг/мл DQ-крахмала в качестве субстрата готовили растворением содержимого флакона, содержащего этот лиофилизированный субстрат, в 100 мкл 50 мМ натрий-ацетатного буфера при pH 4,0. Этот флакон перемешивали на вортексе в течение приблизительно 20 секунд и оставляли при комнатной температуре, в темноте, со случайным смешиванием до растворения. Добавляли 900 мкл буфера для анализа (50 мМ ацетат натрия с 2,6 мМ CaCl при pH 5,8) и этот флакон перемешивали при помощи вортекса в течение приблизительно 20 секунд. Раствор субстрата хранили при комнатной температуре, в темноте, пока он не становился готовым для применения, или при 4ºС. Для этого анализа готовили 100 мкг/мл рабочего раствора субстрата DQ из раствора субстрата 1 мг/мл в буфере для анализа. 190 мкл раствора субстрата 100 мкг/мл добавляли в каждую лунку плоскодонного 96-луночного микротитрационного планшета. 10 мкл пробы каждого фермента добавляли в лунку, перемешивали в течение 30 секунд при помощи термомиксера при 800 об/мин. В этот анализ включали слепую пробу, содержащую только буфер и субстрат (слепой опыт без фермента). Скорость изменения интенсивности флуоресценции измеряли (возбуждение: 485 нм, испускание: 520 нм) в планшет-ридере для считывания флуоресценции микротитрационного планшета при 25ºС в течение 5 минут.
Н. Измерение связывания фермента с макромолекулярными субстратами
Выполняли анализы связывания для определения связывания субстрата вариантами (AmyS) с лэддером зарядов (изменение заряда = -12 - +12 относительно AmyS дикого типа) с кукурузным кормом и багассой (жомом). Используемые субстраты включали в себя багассу (тростниково-сахарную багассу из Бразилии, предварительно обработанную разведенной кислотой в National Renewable Energy Laboratory, промытую и забуференную при pH 5), AFEX (кукурузный корм с расширенными аммиаком волокнами) и PCS (предварительно обработанный разведенной серной кислотой кукурузный корм, промытый и доведенный до pH 5). Все субстраты перед применением доводили до желаемого процента твердых веществ.
Связывание амилазы: Варианты лэддеров зарядов амилазы очищали и разбавляли до 200 м.д. для тестирования. 1% раствор целлюлозной багассы готовили в боратном буфере (40 мМ, pH 8,5, 0,016% Tween-80). 150 мкл этого раствора багассы добавляли в каждую лунку в микротитрационном фильтрующем планшете. 150 мкл боратного буфера добавляли в серию отдельных лунок, которые служили в качестве контролей. 10 мкл вариантов лэддеров зарядов амилазы добавляли в этот фильтрующий планшет, в двух повторностях для каждого условия. Этот планшет инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов. Фильтрат собирали и амилазную активность в супернатанте измеряли при помощи анализа с использованием BODIPY-крахмала.
Измерение связывания фермента с микролоскутками: Варианты альфа-амилазы инкубировали в присутствии или в отсутствие микролоскутков с рисовым крахмалом CS-28 при стандартных условиях стирки в течение 30 минут. Количество свободного фермента измеряли с использованием BODIPY-крахмал-анализа. Фракцию фермента, связанного с микролоскутками, рассчитывали следующим образом: Связанная фракция = (активность фермента в отсутствие лоскутка - Активность фермента в присутствии лоскутка)/(Активность фермента в отсутствие лоскутка).
Пример 7 - Получение амилазы в B. subtilis
В этом примере описано получение мутантной укороченной формы амилазы Bacillus stearothermophilus, альфа-амилазы (имеющей мутацию S242Q и делецию 29 аминокислот из С-конца; также называемую здесь S242Q) и ее вариантов в B. subtilis. Трансформацию выполняли, как известно в данной области (см., например, WO 02/14490). Вкратце, ген, кодирующий исходные амилазы, клонировали в экспрессирующий вектор pHPLT, который содержит промотор LAT (PLAT), последовательность, кодирующую сигнальный пептид LAT (preLAT), за которыми следуют сайты рестрикции PstI и HpaI для клонирования.
Кодирующий район для сигнального пептида LAT показан ниже: atgaaacaac aaaaacggct ttacgcccga ttgctgacgc tgttatttgc gctcatcttc ttgctgcctc attctgcagc ttcagca (SEQ ID NO:19).
Аминокислотная последовательность сигнального пептида LAT показана ниже:
MKQQKRLYAR LLTLLFALIF LLPHSAASA (SEQ ID NO:20)
Аминокислотную последовательность зрелой укороченной амилазы S242Q с замененной аминокислотой, показанной курсивом, использовали в качестве основы для получения описанных здесь библиотек вариантов:
AAPFNGTMMQ YFEWYLPDDG TLWTKVANEA NNLSSLGITA LWLPPAYKGT SRSDVGYGVY DLYDLGEFNQ KGTVRTKYGT KAQYLQAIQA AHAAGMQVYA DWFDHKGGA DGTEWVDAVE VNPSDRNQEI SGTYQIQAWT KFDFPGRGNT YSSFKWRWYH FDGVDWDESR KLSRIYKFRG IGKAWDWEVD TENGNYDYLM YADLDMDHPE WTELKNWGK WYVNTTNIDG FRLDAVKHIK FQFFPDWLSY VRSQTGKPLF TVGEYWSYDI NKLHNYITKT NGTMSLFDAP LHNKFYTASK SGGAFDMRTL MTNTLMKDQP TLAVTFVDNH DTEPGQALQS WVDPWFKPLA YAFILTRQEG YPCVFYGDYY GIPQYNIPSL KSKIDPLLIA RRDYAYGTQH DYLDHSDIIG WTREGVTEKP GSGLAALITD GPGGSKWMYV GKQHAGKVFY DLTGNRSDTV TINSDGWGEF KVNGGSVSVW VPRKTT (SEQ ID NO:21).
ПЦР-продукты очищали с использованием колонок QIAQUIK из Qiagen и ресуспендировали в 50 мкл деионизованной воды. 50 мкл очищенной ДНК расщепляли HpaI (Roche) и PstI (Roche) и полученную ДНК ресуспендировали в 30 мкл деионизованной воды. 10-20 нг/мкл этой ДНК клонировали в плазмиду pHPLT с использованием сайтов клонирования PstI и HpaI. Смеси для лигирования непосредственно трансформировали в компетентные клетки B. subtilis (генотип: Δvpr, AwprA, Δmpr-ybfJ, ΔnprB). Эти клетки B. subtilis имеют ген компетентности (comK), который помещен под контроль индуцируемого ксилозой промотора, так что ксилозу использовали для индукции компетентности в отношении связывания и поглощения ДНК (см. Hahn et al., Mol. Microbiol., 21: 763-775, 1996).
Элементы плазмиды pHPLT-AmyS включают в себя: pUB110=ДНК-фрагмент из плазмиды pUB110 (McKenzie et al., Plasmid 15: 93-103, 1986). Признаки плазмиды включают в себя: ori-pUB110 = сайт инициации репликации из pUB110; neo = ген устойчивости к неомицину из pUB110; Plat = транскрипционный промотор из амилазы B. licheniformis; Pre LAT = сигнальный пептид из амилазы B. licheniformis; SAMY 425ss = кодирующий район для укороченной последовательности гена AmyE (замененный кодирующими районами для каждого укороченного варианта AmyE, экспрессируемого в этом исследовании); и Терминатор = терминатор транскрипции из амилазы B. licheniformis.
Пример 8 - Экспрессия вариантов фермента
Этот пример описывает способы, используемые для экспрессии различных рекомбинантных ферментов трансформированной B. subtilis предыдущих примеров.
Экспрессия альфа-амилазы - в масштабе 2 мл. Клоны B. subtilis, содержащие экспрессирующие векторы S242Q (или ее вариант), переносили в виде реплик с использованием стального 96-луночного репликатора из глицериновых исходных растворов в 96-луночные культуральные планшеты (BD, 353075), содержащие 150 мкл LB-среда + 10 мкг/мл неомицин, выращивали в течение ночи при 37ºC, 220 об/мин в увлажненной пространстве. Аликвоту 100 мкл из этой ночной культуры использовали для инокуляции 2000 мкл среды определенного состава + 10 мкг/мл неомицин в пластиковые культуральные пробирки на 5 мл. Среды для культивирования были обогащенными средами наполовину определенного состава на основе буфера MOPS, с мочевиной в качестве основного источника азота, глюкозой в качестве основного источника углерода, дополненными 1% SOYTONE и 5 мМ кальцием для интенсивного роста клеток. Культуральные пробирки инкубировали при 37°C, 250 об/мин, в течение 72 часов. После этого инкубирования культуральные бульоны центрифугировали в течение 10 минут при 3000×g. Раствор супернатанта декантировали в полипропиленовые конические пробирки на 15 мл; 80 мкл каждой пробы помещали в качестве аликвоты в 96-луночные планшеты для определения количества белка.
Пример 9 - Получение вариантов фермента
Этот пример описывает получение лэддеров зарядов фермента и комбинаторных библиотек зарядов.
Лэддеры зарядов фермента. Множественные варианты белка, простирающиеся в некотором диапазоне представляющих интерес физических свойств, отбирали из существующих библиотек или генерировали способами сайт-направленного мутагенеза, как известно в данной области (см., например, заявки на патент США с порядковыми номерами 10/576331, 11/581102 и 11/583334, переуступленные Genencor International). Затем этот определенный набор белков-зондов анализировали в представляющем интерес тесте.
Примеры вариантов лэддеров зарядов амилазы показаны в следующих таблицах и анализированы, как описано здесь. В этих таблицах изменение заряда показано относительно исходного фермента.
Таблица 9-1Лэддер зарядов AmyS-S242Q
<img file="00000008.tif" he="87" wi="157" img-content="undefined" img-format="tif" />
Комбинаторные библиотеки зарядов фермента (CCL)
Генерирование CCL AmyS-S242Q B. stearothermophilus. ДНК плазмиды AmyS-S242Q выделяли из трансформированного штамма В. subtilis (генотипа: ΔaprE, ΔnprE, amyE::xylRPxylAcomK-phleo) и отсылали в DNA2.0 Inc. в качестве шаблона для конструирования CCL. Был сделан запрос в DNA2.0 Inc. (Mountain View, CA) на генерирование позиционных библиотек в каждом из четырех сайтов в амилазе AmyS-S242Q (S242Q), которые показаны в таблице 9-2. Варианты обеспечивали в виде исходных глицериновых растворов в 96-луночных планшетах.
Комбинаторные библиотеки зарядов AmyS S242Q конструировали идентификацией следующих четырех остатков: Gln97, Gln319, Gln358 и Gln443. Четырехсайтовую, 81-членную CCL создавали генерированием всех комбинаций трех возможностей в каждом сайте: дикого типа, аргинина или аспарагиновой кислоты.
Пример 10 - Моющая эффективность фермента
Этот пример описывает тестирование варианта S242Q в анализе с использованием микролоскутков в 1,0 мкг/мл детергенте AATCC HDL или 5 мМ HEPES-буфере при варьирующейся ионной силе. Использовали способы, представленные в примере 6 (см. "Анализ микролоскутков (маленьких образцов тканей) для тестирования эффективности фермента" и "Гидролиз кукурузной муки ").
Существует оптимальный общий заряд для очищающей эффективности для фермента в детергенте AATCC HDL. Очищающую эффективность измеряют в виде относительной очищающей эффективности, наблюдаемой в анализе активности с использованием микролоскутков с рисовым крахмалом. Величина около 1,0 указывает наивысшую очищающую эффективность в этом анализе. Этот способ является примером оптимизации физического свойства белка (например, общего заряда) для улучшения конкретного результата или преимущества (например, очищающей эффективности в жидком детергенте для стирки белья). Этот оптимальный заряд, идентифицированный с этим ограниченным набором белков-зондов, совпадает с оптимальным зарядом, наблюдаемым при измерении всего заряда комбинаторной библиотеки. Таким образом, применение белков-зондов является предсказывающим поведение всей библиотеки.
nd
Согласно теории Debye-Hückel (Israelachivili, INTERMOLECULAR AND SURFACE FORCES, SECOND EDITION: WITH APPLICATIONS TO COLLOIDAL AND BIOLOGICAL SYSTEMS, Academic Press 2 Ed. [1992]), электростатические взаимодействия управляются прежде всего прочностью двухслойных сил между взаимодействующими частицами при постоянном потенциале или постоянном заряде (ферментов, субстратов, ткани и детергента), их размере и диэлектрической константе окружающей среды. Чтобы охарактеризовать электростатическое поведение частиц в комплексной среде, такой как детергентная композиция, их взаимодействие в уменьшенном окружении, обладающем той же самой длиной скрининга Debye, является достаточным. Это выполняли выбором буфера с соответствующими pH и проводимостью относительно pH и проводимости детергента при условиях стирки. Одним подходящим буфером для такого тестирования является 5 мМ HEPES-буфер при pH 8,0 с варьирующимися количествами инертного электролита, такого как NaCl. Добавление 2,5 мМ NaCl к этому буферу соответствует pH и проводимости типичных североамериканских условий стирки. Добавление более высокой концентрации NaCl является характерным для японских и европейских условий стирки, которые обычно имеют более высокую ионную силу как вследствие увеличенной жесткости воды, так и вследствие увеличенных концентраций детергента.
Фигура 10 показывает, что варианты заряда S242Q с положительным зарядом являются превосходными для очистки микролоскутка с рисовым крахмалом при североамериканских условиях стирки. Подобным образом, варианты TS23t с отрицательным зарядом являются превосходными для очистки микролоскутка с рисовым крахмалом при западноевропейских условиях стирки (фигура 11).
Фигура 12 демонстрирует, что положительные варианты S242Q проявляют более высокую удельную активность в отношении гидролиза гранулированных субстратов кукурузного крахмала.
Пример 11 - Термостабильность
Этот пример описывает определение взаимосвязи между зарядом белка и термостабильностью. Анализы альфа-амилазы основывались на гидролизе BODIPY-крахмала до и после нагревания культурального супернатанта. Использовали те же самые растворы химикалиев и реагентов, что и растворы, описанные в примере 6.
2
Анализ термостабильности для альфа-амилаз. Отфильтрованные культуральные супернатанты серийно разводили в 50 мМ ацетате натрия + 2 мМ CaCl, при pH 5,8 с 0,002% Твином. 10 мкл каждого разведенного культурального супернатанта анализировали для определения начальной амилазной активности при помощи анализа с использованием BODIPY-крахмала. 50 мкл каждого разведенного культурального супернатанта помещали в 96-луночный планшет для ПЦР с низким профилем VWR. В каждую лунку добавляли 30 мкл минерального масла в качестве герметика. Этот планшет инкубировали в термоциклере BioRad DNA engine Peltier при 95°C в течение 30 или 60 минут в зависимости от стабильности исходного фермента. После инкубирования планшет охлаждали до 4ºС в течение 5 минут и затем хранили при комнатной температуре. 10 мкл каждой пробы добавляли в свежий планшет и анализировали для определения конечной амилазной активности при помощи анализа с BODIPY-крахмалом, как описано в примере 1.
Расчет термостабильности. Остаточную активность пробы выражали в виде отношения конечной оптической плотности и начальной оптической плотности, обе из которых корректировали относительно слепых опытов. Более высокий показатель указывает более термостабильный вариант. Это является примером оптимизации физического свойства белка, в этом случае общего заряда, для улучшения термостабильности фермента для применения в виде жидкости в стирке.
Анализ термостабильности. Термостабильность этих вариантов оценивали, как описано выше. Варианты наиболее высокой термостабильности (“победители”) определены как варианты, имеющие отношение остаточной активности мутанта к остаточной активности исходного фермента (т.е. S242Q), большее, чем 1.
Пример 12 - Эффективность фермента
Этот пример демонстрирует, что на эффективность фермента может влиять заряд.
Эффективность фермента оценивали с использованием инактивированных нагревом детергентов, как описано выше в примере 6. Победителей определяли как варианты, имеющие индекс производительности (эффективности) (PI), больший, чем 1. PI является отношением остаточной активности мутанта к остаточной активности исходного фермента (т.е. S242Q). Результаты показаны в таблицах 12-1 и 12-2.
Таблица 12-1S242Q CCL - победители в анализе с микролоскутками CS-28 с рисовым крахмалом, Tide 2x (североамериканские условия стирки, описанные в примере 6)
<img file="00000014.tif" he="55" wi="124" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000015.tif" he="221" wi="125" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000016.tif" he="41" wi="126" img-content="undefined" img-format="tif" />
Таблица 12-2S242Q CCL - победители в анализе с микролоскутками CS-28 с рисовым крахмалом, Persil (западноевропейские условия)
<img file="00000017.tif" he="164" wi="124" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000018.tif" he="128" wi="126" img-content="undefined" img-format="tif" />
Активность измеряли также с использованием анализа гидролиза BODIPY-крахмала, описанного здесь. Эти результаты показаны в таблице 12-3. Относительная удельная активность на этом крахмальном субстрате (кукурузном крахмале), превышающая 1, указывает на то, что этот вариант имеет более высокую удельную активность, чем исходный фермент S242Q. Относительные м.д., показывающие титры экспрессии, большие, чем 1, указывают более высокие титры (во встряхиваемых пробирках), чем титры исходного фермента S242Q.
Таблица 12-3S242Q CCL - победители в отношении титра и/или в анализе с BODIPY-крахмалом
<img file="00000019.tif" he="47" wi="142" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000020.tif" he="225" wi="143" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000021.tif" he="109" wi="142" img-content="undefined" img-format="tif" />
Пример 13 - Уравновешивание мутационных действий на амилазной активности и экспрессии
Этот пример иллюстрирует, что два отдельных свойства фермента могут быть одновременно оптимизированы введением множественных аминокислотных замен, даже когда эти свойства имеют отрицательную корреляцию, например, вследствие того, что они противоположно связаны с характеристиками заряда этого белка.
Во время экспериментирования было определено, что медиана экспрессии AmyS-242Q уменьшалась с увеличением положительного заряда. Однако специфический гидролиз BODIPY-крахмала увеличивался с увеличением положительного заряда. Увеличенные экспрессия амилазы и гидролиз крахмала являются желательными в сконструированном варианте AmyS-242Q, подходящем для разжижения крахмала, например, в производстве топливного этанола или очистке в применениях в качестве детергента. Однако эти свойства является явно конфликтующими свойствами. С использованием обеспеченных здесь способов можно получать более высоко экспрессируемый вариант амилазы без значительного ухудшения гидролиза крахмала посредством селективного комбинирования отдельных мутаций. Описанную здесь стратегию успешно использовали для получения и отбора множественно замещенных вариантов AmyS-242Q, имеющих улучшения в первом свойстве (например, экспрессии в качестве первичного свойства), при улучшении или отсутствии ухудшения второго свойства (например, гидролиза крахмала в качестве вторичного свойства).
Кроме того, в противоположность медианной экспрессии вариантов AmyS-242Q, очистка микролоскутков с кукурузным крахмалом увеличивалась с увеличением положительного заряда. Увеличенные экспрессия рекомбинантной амилазы и эффективность очистки являются желательными в сконструированном варианте AmyS-242Q. Однако эти свойства также являются явно конфликтующими свойствами. С использованием описанных здесь способов можно получать более высоко экспрессируемый вариант амилазы без значительного ухудшения очищающей эффективности посредством селективного отбора отдельных мутаций. Описанную здесь стратегию успешно использовали для получения и отбора множественно замещенных вариантов AmyS-242Q, имеющих улучшения в первом свойстве (например, экспрессии в качестве первичного свойства), при улучшении или отсутствии ухудшения второго свойства (например, очищения микролоскутков с рисовым крахмалом в качестве вторичного свойства).
В частности, содержащую восемьдесят членов комбинаторную библиотеку зарядов AmyS-S242Q (CCL), включающую в себя комбинации из одной-четырех замен заряженных остатков, тестировали на экспрессию во встряхиваемых пробирках, на гидролиз BODIPY-крахмала и очищающую рисовый крахмал активность. Наилучшие AmyS-S242Q (“победители”) показаны в таблицах 13-1 и 13-2. Важно, что множественно замещенные варианты таблицы 13-1 имели равную или улучшенную экспрессию и равный или улучшенный гидролиз BODIPY-крахмала в сравнении с исходным ферментом. Подобным образом, множественно замещенные варианты таблицы 13-2 имели равную или улучшенную экспрессию и равную или улучшенную очищающую рисовый крахмал активность в сравнении с исходным ферментом.
Таблица 13-1“Победители” экспрессии AmyS-S242Q и гидролизаBODIPY-крахмала
<img file="00000022.tif" he="21" wi="154" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000023.tif" he="89" wi="154" img-content="undefined" img-format="tif" />
Таблица 13-2“Победители” экспрессии AmyS-S242Q и гидролиза рисового крахмала
<img file="00000024.tif" he="77" wi="156" img-content="undefined" img-format="tif" />
В целом, поскольку активность фермента и продуцирование фермента имеют разные зависимости от заряда (см. фиг. 13A, 13B, 14A и 14B), они отрицательно коррелируют друг с другом (см. фиг. 12A и 12B). Однако, имеются ряд вариантов, которые являются улучшенными как в отношении экспрессии, так и в отношении активности, и анализ библиотеки, таким образом, позволяет их идентифицировать.
Хотя этот способ демонстрируется с использованием амилаз, он применим также к другим классам ферментов, таким как протеазы, липазы, целлюлазы, трансферазы и пектиназы. Кроме того, любая комбинация двух или более свойств может анализироваться одновременно, например, экспрессия, активность, связывание, термостабильность, стабильность в присутствии одного или нескольких детергентов и стабильность к комплексообразователю.
Пример 14 - Эффективность амилаз в расшлихтовке
В этом примере способность к расшлихтовке варианта S242Q сравнивали со способностью к расшлихтовке Ethyl и Xtra при 85°C и 97°C при нескольких концентрациях кальция.
2
2
Концентрация CaCl варьировалась от 0 до 20 м.д. на тест добавлением различных количеств исходного раствора CaCl к воде Milli Q, pH ~6,5. Ethyl, Xtra и вариант S242Q использовали при 0,01 м.д. активного белка на тест. Этот анализ выполняли в лаундерометре (LAUNDER-O-METER) с использованием отношения раствора 50:1. Тесты на эффективность проводили на лоскутках ткани с пятнами рисового крахмала с индикаторным красителем, связанным с крахмалом (TestFabrics Cat. No. CS-28; TestFabrics Inc.). Три лоскутка CS-28 (6×8 см) и 4 лоскутка неотделанной набивной ткани (Testfabrics, Style 400R; 3×4 дюйма) использовали в качестве субстратов на один эксперимент. Температуру лаундерометра (LAUNDER-O-METER) с Milli Q-водой/Ca предварительно доводили до 85°C или 97°C, после чего добавляли ферменты и лоскутки. Реакцию проводили в течение 30 минут, после чего лоскутки полоскали в воде и сушили снятием показаний.
Измерения выполняли при помощи рефлектометрии с использованием цветового пространства CIE L*a*b*. Любой воспринимаемый цвет может быть представлен координатой L*a*b* в этом цветовом пространстве. "L*" представляет светлоту (яркость) или величину серой шкалы (нейтрального клина) 0-100, от чистого черного до чистого белого цвета, "a*” представляет смещение от пурпурного до зеленого, где большие положительные величины представляют очень красный оттенок, а большие отрицательные величины представляют очень зеленый оттенок. "b*" представляет смещение от желтого к синему, где большие положительные величины представляют очень желтый оттенок, а большие отрицательные величины представляют очень синий оттенок. Когда обе величины a* и b* равны 0, наблюдается отсутствие цвета, оставляющее чистые серые цвета со светлотой (яркостью), определяемой величиной L*.
Колориметр Minolta Chromameter CR 200 в цветовом пространстве CIE Lab с источником света D 65 использовали для измерения эффективности в расшлихтовке. Для количественного определения эффективности в расшлихтовке четыре показания CIE L* (т.е. 2 показания из передней и задней сторон лоскутка в каждом случае) считывали из каждого лоскутка CS-28 после обработки амилазой. Более высокие величины CIE L* указывают лучшую эффективность в расшлихтовке.
Как показано на фигурах 15 и 16, вариант S242Q показывал значимо более низкую зависимость от кальция для эффективности в расшлихтовке в сравнении как с Ethyl, так и с Xtra при условиях тестирования.
Все публикации и патенты, упоминаемые в приведенном выше описании, включены здесь в качестве ссылки. Хотя описанные способы и ферменты были в некоторых случаях описаны в связи с конкретными или предпочтительными вариантами осуществления, должно быть понятно, что все, включенное в прилагаемую формулу изобретение, не ограничивается такими конкретными или предпочтительными вариантами осуществления. Действительно, различные модификации и вариации описанных способов и ферментов будут очевидны квалифицированным в данной области специалистам, и различные модификации описанных способов для применения на практике того, что было описано, включены в объем прилагаемой формулы изобретения.