СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ СВЕТЛОКЛЕТОЧНОЙ ПОЧЕЧНОКЛЕТОЧНОЙ КАРЦИНОМЫ И НАБОР ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
METHOD OF DIAGNOSING CLEAR CELL RENAL CELL CARCINOMA AND SET FOR ITS REALISATION

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к области медицины, в частности онкологии и молекулярной биологии, и может быть использовано для ранней диагностики, светлоклеточной почечно-клеточной карциномы (СПК).
Уровень техники
Почечно-клеточная карцинома (ПК) - тип рака почки, который обычно развивается из коркового слоя и составляет большую часть всех опухолей почки. Эта агрессивная опухоль, которая склонна к метастазированию и распространению на другие органы. В мире ежегодно выявляется в среднем 190 тыс. новых случаев почечно-клеточной карциномы (ПК), причем почти у 1/3 больных опухоль служит причиной смерти. Заболевание до 4% случаев имеет наследственный характер (синдром Хиппеля-Линдау) и связано с герминальными мутациями в соответствующих генах, тогда как подавляющее большинство представляют собой спорадические случаи. В настоящее время выделяют несколько типов ПК в зависимости от происхождения раковых клеток: наиболее распространенный - светлоклеточная почечноклеточная карцинома - СПК (70-75% всех опухолей почек). Папиллярная почечно-клеточная карцинома находится на втором месте по встречаемости (7-14%). Остальные гистологические типы встречаются крайне редко - это хромофобная почечноклеточная карцинома (4-10%), онкоцитарный рак почки (2-5%) и др. Для диагностики рака почки используют неинвазивные методы: ультразвуковая и рентгеновская компьютерная томография, магнитно-резонансная томография. Реже используют пункционную биопсию опухоли почки с последующим гистологическим исследованием. Часто рак почки выявляют на ранних стадиях только благодаря случайным обнаружениям при ультразвуковом обследовании. Около четверти пациентов на момент установления диагноза уже имеют метастазы.
Молекулярные маркеры, специфичные для ПК, в российской клинической практике практически не применяют. Только один опухолевый маркер М2-РК (изомерная форма пируваткиназы) используется для диагностики рака почки. Определение его содержания в крови применяют в качестве дополнительного исследования для диагностики, выявления метастазов и рецидивов некоторых опухолей, включая рак почки.
В литературе предлагают новые маркеры, например, увеличение экспрессии гена CD70 на уровне мРНК и/или белка в опухолевых клетках. Методом иммуногистохимии показана сильная экспрессия этого гена в опухолях ПК и ее отсутствие в прилежащих к опухоли нормальных тканях [Diegmann J, Junker К, Gerstmayer В, Bosio A, Hindermann W, Rosenhahn J, von Eggeling F. 2005. Identification of CD70 as a diagnostic biomarker for clear cell renal cell carcinoma by gene expression profiling, real-time RT-PCR and immunohistochemistry. Eur J Cancer. 41(12), 1794-1801].
Развитие ПК - сложный процесс, при котором найдены изменения в нескольких десятках генов, расположенных на разных хромосомах [Velickovic M., Delahunt В., Grebe S.К. 1999. Loss of heterozygosity at 3p14.2 in clear cell renal cell carcinoma is an early event and is highly localized to the FHIT gene locus. Cancer Res. 59, 1323-1326; Lam JS, Leppert JT, Figlin RA, Belldegrun AS. 2005. Role of molecular markers in the diagnosis and therapy of renal cell carcinoma. Urology. 66 (5 Suppl), 1-9]. В настоящее время накоплен достаточно большой объем данных, касающихся молекулярно-генетических изменений различных типов ПК. И хотя спектр этих изменений в случае каждой конкретной опухоли носит индивидуальный характер, тем не менее, наблюдаются определенные закономерности, которые дают основания связывать их с развитием и/или прогрессией той или иной патологии.
Диагностическими признаками злокачественной трансформации клеток могут служить геномные изменения в опухолевых клетках: точечные мутации, микросателлитная нестабильность, аллельные потери, эпигеномные изменения (метилирование промоторных участков генов), а также изменения функциональной активности многих генов на уровне мРНК и белка. Особенно перспективными можно считать гены, экспрессия которых увеличивается в опухоли по сравнению с нормальной тканью, так как это может повысить чувствительность методики.
На коротком плече хромосомы 16 идентифицирован ген NETO2 (другие обозначения Neuropilin (NRP) and tolloid (TLL) like 2, FLJ10430, FLJ14724, FLJ90456).
У человека ген NETO2 локализируется на длинном плече 16 хромосомы и кодирует предполагаемый трансмембранный белок с N-терминальной сигнальной последовательностью и двумя консервативными внеклеточными CUB доменами антипараллельной β-листовой структуры. За этими доменами следует одна копия цистеин богатых липопротеинов низкой плотности класса A (LDLa), модуль β-шпилечной структуры. Белок NETO2 на 57% идентичен по аминокислотной последовательности белку NETO1 (представителю того же семейства) и имеет две изоформы (изоформа 1 и 2). Изоформа 2 характеризуется наличием 7-ми дополнительных аминокислотных остатков в N-терминальной области [Stohr Н., Berger С., Frohlich S., Weber В.Н.F. A novel gene encoding a putative transmembrane protein with two extracellular CUB domains and a low-density lipoprotein class A module: isolation of alternatively spliced isoforms in retina and brain. Gene. 286, 2002. 223-231].
Оба белка, NETO1 и NETO2, обладают одинаковой уникальной структурой домена, что позволило отнести их к новому подсемейству CUB и LDLa содержащих белков. Модуль LDLa может принимать участие в белок-белковом взаимодействии и связываться с различными классами молекул. LDLa повторы инициируют процесс активного эндоцитоза путем иммобилизации лигандов на поверхности клетки. Такой комплекс необходим впоследствии для формирования клатриновых ямок. Цитоплазматические домены NETO1 и NETO2 не гомологичны другим известным белковым последовательностям, но содержат консервативные FXNPXY-подобные мотивы, необходимые для интернализации клатриновых пузырьков. Эти белки играют важную роль в молекулярных путях, в которых происходит взаимодействие рецептора и лиганда на клеточной поверхности, что вызывает каскад внутриклеточных сигналов.
Ген экспрессируется в норме, главным образом, в тканях головного мозга и сетчатки, что позволяет предполагать роль кодируемого им трансмембранного пептида в транспорте лигандов в этих органах. Недавние исследования in vitro показали, что NETO2 взаимодействует, по крайней мере, с GluK2 и GluK5 субъединицами каинатных рецепторов, а также, что белки NETO1 и NETO2 могут значительно усиливать сигналы, опосредованные каинатными рецепторами [Perrais D., Veran J., Mulle Ch. Gating and permeation of kainite receptors: differences unveiled. Trends in Pharmacological Sciences. 31, 2011. 516-522, Diaz, E. Regulation of AMPA receptors by transmembrane accessory proteins. Eur. J. Neurosci. 32, 2010. 261-268].
Далее в работах Horak Ch.E. изучалась экзогенная гиперэкспрессия гена супрессора метастазирования Nm23-H1. При нормальном функционировании экспрессия этого гена снижает метастатический потенциал различных типов раковых клеток. Было показано, девять генов, включая NETO2, экспрессируются на низком уровне в линии дикого типа, но не в линии, мутантной по nm23-H1. Уменьшение экспрессии этих генов совпадало с гиперэкспрессией nm23-H1, наблюдаемой в опухоли молочной железы у человека, клеточной линии рака груди и гепатоцеллюлярной карциноме [Horak Ch.E., Lee J.H., Elkahloun A.G., et al. Nm23-H1 Suppresses Tumor Cell Motility by Down-regulating the Lysophosphatidic Acid Receptor EDG2. Cancer Research. 67, 2007. 7238-7246].
Недавно показано, что экспрессия NETO2 повышена в детских пролиферирующих гемангиомах [Calicchio M.L., Collins Т., Kozakewich H.P. Identification of Signaling Systems in Proliferating and Involuting Phase Infantile Hemangiomas by Genome-Wide Transcriptional Profiling. The American Journal of Pathology. 5, 2009. 1638-1649]. Таким образом, приведенные данные свидетельствуют о вероятной вовлеченности NETO2 в процесс канцерогенеза. Данных по экспрессии гена NETO2 в тканях опухолей почки к настоящему моменту в литературе нет.
Изобретение, предлагающее способ диагностики различных карцином человека, в том числе РЛ, а также лимфом и лейкемий, основано на выявлении цитогенетических изменений и аллельных потерь для 10-ти генов-супрессоров опухолевого роста, расположенных в критичной области LUCA хромосомы 3 [Ji L., Minna J., Roth J., Lerman M. Chromosome 3p21.3 genes are tumor suppressors. 2002. Международные патенты № WO 0204511, № US 2004016006].
Изобретение, относящееся к способу диагностики рака молочной железы, толстой кишки, мочевого пузыря, основано на обнаружении методом ПЦР с радиоактивно меченными праймерами повышения уровня мРНК множественных сплайсированных форм гена поверхностного гликопротеина CD44 в опухолевых тканях, соответствующих метастазах и биоптатах по сравнению с нормальными тканями [Tarin D., Matsumura Y. Diagnostic method. 1994. Международный патент № WO 94/02633].
Изобретение, предлагающее способ диагностики лимфом, основано на сравнении относительного уровня мРНК генов легких λ- и κ-иммуноглобулинов, вовлеченных в развитие лимфом, методом ПЦР-РВ [Stalberg A., Kubista M. Method to measure gene expression ratio of key genes. 2002. Международный патент № WO 02/09913].
Изобретение, предлагающее способ диагностики светлоклеточной почечноклеточной карциномы, основанный на определении содержания мРНК гена CHL1 (CALL) [Кудрявцева А.В., Анедченко Е.А., Кондратьева Т.Т., ЛЕРМАН М.И., Сенченко В.Н.. "Способ диагностики светлоклеточной почечноклеточной карциномы и набор для его осуществления". Дата приоритета 20.02.09, Регистрационный номер 2393472, Роспатент].
Данный аналог наиболее близок по технической сущности заявленному изобретению и принят за прототип.
Проведен поиск охранных документов и/или патентных заявок для гена NETO2 по базам данных с учетом следующих различных обозначений и вариантов написания названия гена: Neuropilin (NRP) and tolloid (TLL) like 2, FLJ10430, FLJ14724, FLJ90456. Ни для одного из перечисленных вариантов не обнаружено охранных документов и/или патентных заявок, ограничивающих возможность использования повышения содержания мРНК гена NETO2, в том числе с использованием метода ПЦР-РВ, для диагностики СПК.
Для оценки содержания мРНК генов используют различные методы. Современный высокочувствительный метод ПЦР-РВ отличается от традиционных качественных и полуколичественных методов тем, что позволяет быстро и точно определить количество копий ДНК или кДНК в широком диапазоне концентраций [Livak K.J., Flood S.J., Marmaro J., Giusti W., Deets K. 1995. Oligonucleotides with fluorescent dyes at opposite ends provide a quenched probe system useful for detecting PCR product and nucleic acid hybridization. PCR Methods Appl. 4, 357-362]. Метод широко используют в мире как для научных, так и клинических целей, благодаря высокой производительности, обычно проводят 96 или 384 реакций. В отличие от обычной ПЦР, когда количество продуктов определяют на конечной стадии реакции, ПЦР-РВ позволяет следить за накоплением продуктов в экспоненциальной фазе реакции. В этой системе наряду с праймерами используют зонд (пробу), меченный флуоресцентным красителем. Зонд является олигонуклеотидом, который гибридизуется с последовательностью ДНК/кДНК между двумя фланкирующими праймерами. ПЦР-РВ состоит из двух основных этапов: 1) гибридизации исследуемой матрицы с зондом и 2) ПЦР, катализируемой ТаqДНК-полимеразой, обладающей 5′-экзонуклеазной активностью, расщепляющей зонд, что приводит к появлению и нарастанию флуоресцентного сигнала. На мировом рынке представлены различные модели приборов для ПЦР-РВ, разработанные известными фирмами-изготовителями - Applied Biosystems, Bio-Rad, Invitrogene, Eppendorf и др., а также отечественные приборы ДТ-322 (ДНК-Технология), АНК-32 (Институт Аналитического Приборостроения РАН, http://www.syntol.ru/productank.htm).
В России этот метод все больше применяется для количественной оценки содержания мРНК генов как в фундаментальных исследованиях, так и в клинике. Появление на отечественном рынке недорогих приборов, разработанных российскими фирмами, а также недорогих отечественных наборов реактивов («Синтол», «ДНК-Технологии», «Изоген» и др.), сравнимых по эффективности с зарубежными наборами, обеспечит более широкое распространения этого технологичного метода [Манзенюк О.Ю., Малахо С.Г., Пехов В.М., Косорукова И.С., Полтараус А.Б. 2006. Характеристика универсальных отечественных наборов реагентов для ПЦР в реальном времени. Опыт использования в молекулярной онкодиагностике. Молекулярная биология. 40, 349-356]. Методики и протоколы, описанные в данной заявке, предполагают, в основном, использование отечественных наборов и хотя выполнены на приборе ABI Prism 7500 (Applied Biosystems, США), могут быть адаптированы для отечественных приборов. Сочетание недорогих приборов и отечественных наборов реактивов позволит сделать доступным этот технологичный метод для отечественных научных и клинических лабораторий.
Из изложенного ясно, что изменение содержания мРНК онкозначимых генов в опухолях по сравнению с нормальными тканями в качестве молекулярного маркера для диагностики большинства карцином, в том числе рака почки, пока не нашло широкого практического применения в клиниках. В данной области существует потребность в поиске новых диагностических маркеров, позволяющих достоверно и уже на ранних стадиях диагностировать заболевания, а также в разработке на их основе, чувствительного, надежного, применимого в условиях клинических или поликлинических медицинских учреждений способа диагностики рака почки, а именно СПК - наиболее распространенного типа.
Раскрытие изобретения
Данное изобретение стало возможным в результате проведенного авторами сравнительного анализа содержания мРНК гена NETO2 в образцах СПК, на разных клинических стадиях и открытия того факта, что уже на ранних стадиях при СПК, происходит значительное и частое повышение содержания мРНК гена NETO2.
Настоящее изобретение в своем первом аспекте относится к новому маркеру для диагностики СПК, который представляет собой изменение содержания мРНК гена NETO2. Повышенное содержание мРНК гена в предположительно пораженной раком ткани почки человека по сравнению с его содержанием в нормальных/здоровых тканях служит диагностическим маркером СПК.
В одном из воплощений рак почки, в отношении которого повышение мРНК гена NETO2 служит в качестве диагностического маркера, является ПК.
В одном из воплощений рак почки, маркером которого является повышение содержания мРНК гена NETO2, является СПК.
В своем следующем аспекте настоящее изобретение относится к применению повышения содержания мРНК гена NETO2 в качестве маркера для диагностики СПК.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу диагностики СПК.
Данный способ включает следующие стадии:
а) получение исходной пары образцов тканей от пациента, где один из образцов получен из предположительно пораженных раком тканей, а второй получен из прилегающих гистологически нормальных тканей;
б) выделение и очистка препаратов РНК из исходной пары образцов;
в) синтез одноцепочечной кДНК на матрице РНК с использованием олигонуклеотидных праймеров;
г) проведение количественной реакции амплификации фрагмента гена NETO2 с использованием кДНК, полученной на стадии в), в качестве матрицы и пары геноспецифичных олигонуклеотидных праймеров и зонда;
д) сравнение количества амплифицированного фрагмента ДНК NETO2 в образце, полученном из предположительно пораженных раком тканей почки, с количеством амплифицированного фрагмента ДНК в образце, полученном из нормальных тканей, где указанные количества амплифицированного фрагмента ДНК отражают содержание мРНК гена NETO2, причем его повышение служит диагностическим маркером рака почки.
В следующем воплощении способа настоящего изобретения для амплификации кДНК на стадии д) используют олигонуклеотидные праймеры и зонд, подобранные таким образом, что они специфически гибридизуются с кДНК даже в присутствии в препарате примеси геномной ДНК.
В отдельном предпочтительном воплощении данного изобретения последовательность праймеров представлена SEQ ID NO: 1, 2.
В отдельном предпочтительном воплощении данного изобретения последовательность зонда представлена SEQ ID NO: 3.
Еще одним аспектом настоящего изобретения является набор праймеров и зонда для осуществления полимеразной цепной реакции с целью определения содержания мРНК гена NETO2, имеющий последовательности SEQ ID NO: 1, 2 и 3.
В еще одном воплощении способа настоящего изобретения на стадии д) количественная реакция амплификации фрагмента гена NETO2 представляет собой ПЦР в реальном времени.
В следующем воплощении заявленного способа для рака почки на стадии д) в качестве контрольных генов используют гены GUSB или RPN1, кодирующие бета-глюкуронидазу и рибофорин 1 соответственно.
Перечень фигур
Далее изобретение будет более подробно раскрыто со ссылкой на отдельные иллюстративные примеры и фигуры, где
Фиг.1. Относительное содержание мРНК (R) гена NETO2 в образцах светлоклеточной почечно-клеточной карциномы СПК. Фигура показывает, что повышение содержания мРНК гена NETO2 обнаружено в большинстве исследованных образцов СПК по сравнению с «условной нормой». Данные нормированы относительно контрольных генов RPN1 и GUSB.
Таблица 1. Клиническая характеристика исследованных образцов СПК.
cp
Таблица 2. Частота (FI) и средний уровень повышения мРНК (LI) гена NETO2 при СПК.
Осуществление изобретения
Данное изобретение предлагает способ диагностики СПК на разных стадиях развития злокачественной трансформации, включая начальные, основанный на определении повышения содержания мРНК гена NETO2. Достоверно обнаруживаемое различие содержания мРНК гена NETO2 в нормальных и опухолевых тканях может быть использовано для обнаружения СПК.
Образцы тканей для анализа
В качестве образцов почки для проведения анализа могут быть использованы биоптаты или операционные образцы ткани.
Выделение РНК из образцов тканей
Способы выделения суммарной РНК из образцов тканей млекопитающих хорошо известны специалистам и, как правило, включают следующие стадии: измельчение в жидком азоте образцов опухолевых и нормальных тканей, лизис клеток, выделение РНК и ее очистку, проверку качества РНК электрофорезом в 1%-ном агарозном геле в присутствии красителя бромида этидия или в денатурирующем полиакриламидном геле, а также спектрофотометрическое определение количества РНК. Гомогенизацию кусочков тканей можно проводить вручную, растирая пестиком в керамической ступке, или с помощью механических гомогенизаторов, например, Omni Mixer или Micro-Dismembrator фирмы Sartorius (Германия). Для выделения РНК могут быть использованы различные протоколы, широко известные специалистам в данной области. В классических методах выделения РНК используют сильные хаотропные агенты, такие как гуанидинхлорид и гуанидинизотиоцианат, растворяющие белки, и последовательные экстракции фенолом и хлороформом для денатурации и удаления белков [Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. 1989. Molecular Cloning. A laboratory Manual. 2nd Edition ed. Cold Spring Harbour: CSHL Press]. Широко используют также метод с использованием реагента Trizol [GIBCO/Life Technologies]. Для предотвращения разрушения РНК РНКазами могут быть использованы ингибиторы, такие как ингибитор RNAsin плацентарного или рекомбинантного происхождения или, например, ванадил-рибозидный комплекс - неспецифический ингибитор РНКаз широкого спектра действия.
Быстрое и качественное выделение РНК можно проводить с использованием ряда коммерчески доступных наборов (Клоноген, Санкт-Петербург; RNeasy kits (Qiagen); SV Total RNA Isolation System, Promega (США) и т.д.). Использование различных приборов, например, QuickGene-810 (Life Science, Япония), позволяет исключить работу с агрессивными агентами, ускорить и упростить выделение РНК. Для экстракции РНК в этом приборе используют 80 мкм пористую мембрану, которая в 12,5 раз тоньше обычно используемого в таких приборах стеклянного фильтра (1000 мкм), что позволяет уменьшить деградацию РНК и увеличить ее выход.
Реакция обратной транскрипции: синтез кДНК на матрице РНК, выделенной из образцов тканей
Реакция обратной транскрипции, в результате которой на РНК-матрице синтезируют одноцепочечную цепь ДНК, при необходимости, с достройкой второй цепи, позволяет перейти от нестабильных молекул РНК к более стабильным молекулам ДНК. Дальнейшая ПЦР-амплификация позволяет использовать очень малые количества исходной РНК (на уровне нескольких нанограмм), а следовательно, и количества исследуемых легочных тканей, из которых выделяют РНК.
2+
Реакцию обратной транскрипции можно проводить с использованием коммерчески доступных препаратов обратных транскриптаз, таких как обратная транскриптаза вируса лейкоза мышей Молони (M-MLV), вируса миелобластоза птиц (AMV), PowerScript (точечная мутация M-MLV-RT), С. Therm Polymerase и др., с помощью которых можно получать продукты амплификации длиною до нескольких тысяч и даже несколько десятков тысяч пар нуклеотидов (т.п.н.). Может быть использована термостабильная ДНК-полимераза Thermus thermophilus (Tth), обладающая обратной транскриптазной активностью в присутствии ионов Mn.
Для обратной транскрипции могут быть использованы различные праймеры, например:
n
1) Олиго(dT)-содержащие праймеры связываются с эндогенным полиА-хвостом на 3′-конце мРНК (число n обычно равно 12-18, но может достигать и большей величины). Эти праймеры наиболее часто используют для получения полноразмерных кДНК. К олиго(dT)-последовательности часто добавляют на 3′-конце нуклеотиды А, С или G, чтобы «заякорить» праймер на границу транскрипта и поли-А тракта;
2) Случайные гексануклеотидные праймеры (статистические затравки) гибридизуются с РНК в многочисленных участках. При обратной транскрипции с этими праймерами получают короткие кДНК. Случайные гексамеры используют для преодоления трудностей, связанных с вторичной структурой РНК, они более эффективны при обратной транскрипции 5′-областей мРНК;
3) Гексамеры или другие короткие олигонуклеотиды (10-12 нуклеотидов) случайного состава могут быть также использованы в комбинации с олигоdТ-содержащими праймерами;
4) Специфические олигонуклеотидные праймеры используют для транскрипции участка мРНК, представляющего интерес для исследования. Эти праймеры успешно применяют для диагностических целей.
5
Анализ содержания мРНК гена можно проводить, используя одноцепочечную или двуцепочечную амплифицированную кДНК. Для синтеза второй цепи и ее амплификации наиболее часто используют специфичные праймеры. В продаже имеются наборы для синтеза кДНК, основанные на применении различных обратных транскриптаз и различных праймеров для затравки. Для получения кДНК разработан также SMART-метод (switching mechanism at the 5′ end of RNA templates of reverse transcriptase), в основе которого лежит свойство обратных транскриптаз добавлять на 3′-конец синтезированной первой цепи кДНК несколько нуклеотидных остатков, преимущественно dC. Эта олиго(dC)-последовательность служит местом отжига олигонуклеотидного адаптера, имеющего комплементарную олиго(dG)-последовательность на 3′-конце. Обратная транскриптаза воспринимает праймер как продолжение РНК-матрицы и продолжает синтез первой цепи [Schmidt W.M., Mueller M.W. 1999. CapSelect: a highly sensitive method for 5′ CAP-dependent enrichment of full-length cDNA in PCR-mediated analysis of mRNAs. Nucleic Acids Res. 27, e31]. Таким образом, первая цепь кДНК оказывается фланкирована с одной стороны последовательностью 3′-праймера с олиго(dT) на 3′-конце, а с другой - последовательностью, комплементарной адаптору. Эти праймеры имеют одинаковые внешние последовательности, отличаясь только на 3′-конце. Затем первую цепь амплифицируют в ПЦР с праймером, соответствующим внешней части 3′-праймера и адаптора. Нуклеотидную последовательность общей части этих праймеров подбирают в зависимости от дальнейших целей, например получения клонотек, применения вычитающей гибридизации и т.д. В результате получают двухцепочечную ДНК, обогащенную полноразмерными последовательностями. За счет использования адаптера с заблокированным 3′-концом достигается существенное снижение фоновой амплификации. При использовании модифицированного SMART-метода за короткое время происходит амплификация исходного материала более чем в 10 раз, что позволяет работать с очень небольшими количествами РНК (меньше 1 нанограмма), а следовательно, и с небольшим количеством исследуемых тканей [Zhu Y.Y., Machleder E.M., Chenchik A., Li R., Siebert P.D. 2001. Reverse transcriptase template switching: a SMART approach for full-length cDNA library construction. Biotechniques. 30, 892-897]. Наборы для получения кДНК этим способом выпускают различные фирмы, например, Евроген, Россия (набор MINT), Clontech, США и т.п.
Выбор специфических праймеров и зондов
Выбор специфических праймеров и зондов осуществляют способом, хорошо известным специалистам в данной области, для чего используют имеющиеся программы, многие из которых находятся в свободном доступе в Интернете. Среди таких программ можно упомянуть Oligo (версия 6.42), PrimerSelect из пакета Lasergene (www.dnastar.com), Primer Express (Applied Biosystems, (USA), Primer Designer (ИМБ РАН), FastPCR (http://www.biocenter.helsinki.fi/bi/Programs/fastpcr.htm), PrimerQuest (http://scitools.idtdna.com/Primerquest/) и др. С учетом сложности анализируемого генома, длина праймеров может быть выбрана в диапазоне от 18 до 25 п.н. Оптимальный размер ампликона около 150 п.н. Подбор зондов для проведения ПЦР-РВ осуществляется в соответствии со стандартными рекомендациями и требованиями метода.
В предпочтительном воплощении используют праймеры и зонд:
NETO2_F (SEQ ID NO: 1) 5′-GCTCTGCTCGGTCCTCAAAGTGTTG-3′;
NETO2_R (SEQ ID NO: 2) 5′-AAATGCCACACTGGGTTGCAGG-3′;
NETO2_Z (SEQ ID NO: 3) 5′-[FAM]ACTGGTAGTGGAAGGGATTGCCGTGGCCCA-[RTQ1]-3′, размер ампликона - 128 п.н.
Оценка содержания мРНК гена NETO2 методом ПЦР-РВ
Количественная оценка содержания мРНК достигается с помощью параллельного проведения ПЦР-РВ с тестируемым и контрольным образцами. Выбору подходящего контрольного гена для нормализации количественных данных посвящено много обзоров [Radonic A., Thulke S., Mackay I.M., Landt O., Siegert W., Nitsche A. 2004. Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR. Biochem Biophys Res Commun. 313, 856-862; Huggett J., Dheda K., Bustin S., Zumla A. 2005. Real-time RT-PCR normalisation; strategies and considerations. Genes and Immunity. 6, 279-284; Wong M.L, Medrano J.F. 2005. Real-time PCR for mRNA quantification. BioTechniques. 39, 1-11]. Чаще всего в качестве контрольных выбирают гены «домашнего хозяйства», хотя для этой цели может быть использован любой ген с относительно постоянным уровнем транскрипции в исследуемых образцах. Однако вариабельность содержания мРНК необходимо проверять для каждой исследуемой выборки образцов данного типа тканей. Решение о выборе того или иного гена в качестве контрольного зависит также от степени выбранной/требуемой точности. Согласно предпочтительной форме осуществления количественной оценки содержания мРНК генов необходимо выбрать контрольный ген, имеющий незначительную вариабельность содержания мРНК в опухолевых и нормальных тканях легкого по сравнению с исследуемым геном.
В настоящем изобретении для образцов рака почки и нормальных тканей почки выбраны два контрольных гена - GUSB (глюкуронидаза) и RPN1 (рибофорин 1) ввиду отсутствия в литературе оптимального контрольного гена для этого типа ткани. Вариабельность наиболее часто используемого в качестве контроля гена GAPDH также нами оценена, однако оказалась более значительной, чем для генов GUSB и RPN1. Можно использовать как оба эти гена совместно, а затем усреднять результат для целевого гена относительно них. Использование двух контрольных генов особенно актуально в тех случаях, когда содержание целевого гена изменяется незначительно. Поскольку содержание мРНК гена NETO2 в опухолях почки изменяется существенно, также допустимо использование одного контрольного гена (RPN1 или GUSB).
Оценка содержания мРНК генов может быть основана на абсолютном и относительном измерении количества копий исследуемых транскриптов - абсолютный метод (метод абсолютной стандартной прямой) и относительный количественный анализ (ΔΔCt-метод). Согласно предпочтительной форме осуществления количественной оценки содержания мРНК генов в качестве основного метода измерений выбран второй из них, позволяющий проводить двойное сравнение данных для исследуемого и контрольного генов в опухоли и норме и не требующий выравнивания концентраций опухолевых и нормальных образцов РНК/кДНК, которое необходимо при использовании других методов, например, ОТ-ПЦР.
Выбор образцов сравнения
Согласно предпочтительной форме осуществления количественной оценки содержания мРНК генов важно проверить пригодность образцов сравнения, в данном случае «условных норм» [Кудрявцева А.В., Е.А. Анедченко, Н.Ю. Опарина, Г.С. Краснов и др. 2009. Экспрессия генов FTL и FTH, кодирующих субъединицы ферритина, при раке легкого и почки. Мол. биол. 43(6), 1-11].
кДНК
кДНК
«Условной нормой» принято считать образец ткани с отсутствующими макро- и микроскопическими признаками опухолевого роста. При «непригодности» образца условно-нормальной ткани (т.е. в случаях, когда при микроскопии обнаруживали опухолевые клетки, или материал был трудно интерпретируемый) использовали усредненные нормы нескольких имеющихся «условных норм», а также ткани почки, полученные от людей, скончавшихся от не связанных с онкологией заболеваний. Поскольку не для всех опухолевых образцов имелись пригодные парные «условные нормы», расчеты относительного количества копий транскрипта гена NETO2 (R) проводили, используя разные образцы сравнения - парные «условные нормы» и/или усредненные «условные нормы» от нескольких больных. В качестве дополнительных образцов сравнения использовали также 6 образцов тканей почки от здоровых доноров, для этих образцов усредняли значение ΔCt=Ct(NETO2)-Ct(GUSB) или ΔCt=Ct(NETO2)-Ct(RPN1) и далее проводили расчеты R. Те «условные нормы», для которых значения Ct(NETO2)-Ct(GUSB) или Ct(NETO2)-Ct(RPN1) отличались от среднего более, чем в 2 раза, исключались из исследования.
Учет эффективностей реакций
Согласно предпочтительной форме осуществления количественной оценки изменения содержания мРНК генов необходимо учитывать значения эффективности проводимых реакций, которые могут оказать заметное влияние на конечный результат. Для этого нами разработана программа математической обработки экспериментальных данных ПЦР-РВ с расчетом эффективностей реакций [Программа для ЭВМ «Анализ транскрипции генов». Свидетельство о государственной регистрации №2008612585, 2008, Роспатент]. Программа совместима с файлами экспериментальных данных (Ct, ΔRn и др.) из программного обеспечения RQ, Relative Quantification (Applied Biosystems, ABI Prism SDS Software) и также позволяет проводить статистическую оценку достоверности измеряемых изменений и оценку пригодности выбранного контрольного гена.
Далее настоящее изобретение будет подробно проиллюстрировано со ссылкой на конкретные примеры, представляющие собой наиболее предпочтительные воплощения изобретения. Изобретение не ограничивается описанными воплощениями, напротив, предполагается, что оно включает любые альтернативы, модификации или эквиваленты, допустимые с учетом сущности и объема изобретения.
Пример 1. Образцы тканей
Образцы опухолевых тканей (Т), прилегающие к опухолям морфологически нормальные ткани (N) (т.н. «условные нормы»), собраны и охарактеризованы в НИИ КО ГУ РОНЦ им Н.Н. Блохина РАМН. Образцы опухолевых тканей (опухоль, «условная норма») получены непосредственно после удаления опухоли. Каждый образец делили примерно на 3 равные части и хранили в жидком азоте.
Коллекция образцов тканей СПК, подлежащих исследованию, составила 30 образцов, а также 30 образцов «условной нормы». Средний возраст больных с диагнозом СПК, среди которых 12 женщин и 18 мужчин, составляет 53 года (32-76 лет). Среди больных 3 человека имели метастазы в регионарные лимфоузлы.
Пример 2. Выделение РНК из образцов тканей
РНК из нормальных и опухолевых тканей человека выделяли с использованием набора реагентов RNeasy Mini Kit («Qiagen», Германия) согласно протоколу. Основные этапы включали: 1) разрушение ткани, замороженной в жидком азоте, с использованием микро-десмембратора («Sartorius» Германия) и гомогенизацию разрушенного образца в лизирующем буфере RLT в расчете 600 мкл на 30 мкг ткани. 2) центрифугирование 3 минуты при 14000 об/мин (4°C); 2) добавление равного объема водного 70% этилового спирта к супернатанту; 3) нанесение на колонку; 4) промывание колонки после сорбции РНК один раз буфером RW1 объемом 700 мкл и дважды буфером RPE объемом 500 мкл; 5) элюцию РНК водой, свободной от РНКаз. Концентрацию РНК определяли на спектрофотометре «NanoDrop ND1000», («NanoDrop Technologies Inc.», США) при длине волны 260 нм. Качество выделенной РНК проверяли с помощью электрофореза в 1% агарозе, а т в присутствии бромистого этидия, а также на приборе Bioanalyser Agilent 2100 («Agilent Technologies», США).
Нуклеотидный состав ампликонов подтверждали секвенированием на автоматическом секвенаторе 3730 DNA Analyzer ("Applied Biosystems"). Секвенирование проводили отдельно с 5′ и 3′-концевого праймеров с использованием реактивов DYEnamic ЕТ Terminator Cycler Sequencing Kit ("Amersham", США). Все праймеры и зонды были специфичны в условиях ПЦР-РВ, ампликоны имели ожидаемые нуклеотидные последовательности и размер.
Пример 3. Реакция обратной транскрипции
Для проведения реакции обратной транскрипции брали по 1 мкг РНК, полученной одним из двух вышеописанных методов с использованием наборов реагентов Trizol RNA Prep («Лаборатория Изоген») или реагентов RNeasy Mini Kit («Qiagen», Германия), предварительно обработанной не содержащей РНКаз ДНКазой I (Invitrogene), 100 нг гексануклеотидных праймеров, 1 мМ dNTP, 1x реакционный буфер («Fermentas», Литва), содержащий 250 мМ Tris-HCl (рН 8.3, 25°C), 250 мМ KCl, 20 мМ MgCl2, 50 мМ DTT, и 200 единиц обратной транскриптазы M-MuLV ((«Fermentas», Литва). Реакцию проводили в объеме 20 мкл при следующем температурном режиме: 25°C - 10 мин, 42°C - 60 мин, 50°C - 10 мин, 70°C - 10 мин.
Пример 4. Подбор условий для количественной оценки содержания мРНК гена NETO2 в опухолях почки.
Использовали специфичные праймеры и зонды для гена NETO2 (SEQ ID NO: 1, 2, 3).
Последовательности выбранных праймеров и зондов для контрольных генов:
Прямой GUSB-F 5′-GATGGAAGAAGTGGTGCGTAGG-3′
Обратный GUSB-R 5′-TTAGAGTTGCTCACAAAGGTTCACAG-3′
Зонд GUSB-Z - 5′-[FAM]-CGTCCCACCTAGAATCTGCTGGCTACTACTT-[RTQ1]-3′. Размер ампликона - 171 п.н.
Прямой RPN1-F 5′-CACCCTCAACAGTGGCAAGAAGG-3′
Обратный RPN1-R 5′-TGCATTTCGCTCACTCTGTCG-3′
Зонд RPN1-Z - 5′-[FAM]-CCCTCTGTCTTCAGCCTGGACTGCA-[RTQ1]-3′.
Размер ампликона - 125 п.н.
Для проведения ПЦР-РВ подобраны оптимальные концентрации праймеров и зондов исследуемого и контрольного генов. Концентрации праймеров варьировали в диапазоне 100-500 nM при постоянной концентрации зондов равной 100 nM, затем концентрацию зондов варьировали от 100 до 500 nM при оптимальной концентрации праймеров. Для гена NETO2 оптимальные концентрации праймеров составили 300 нМ и зонда 400 нМ, для гена GUSB - концентрация праймеров - 300 нМ, зонда - 250 нМ, для гена RPN1 - концентрация праймеров - 350 нМ, зонда - 200 нМ.
Пример 5. Количественная оценка содержания мРНК гена NETO2
Для количественных измерений использовали прибор ABI PRISM  7000 Sequence Detection System, Applied Biosystems, США.
Протокол определения содержания мРНК гена NETO2 методом ПЦР-РВ
1. Готовили реакционные смеси для генов NETO2, RPN1 и GUSB, осторожно смешав все компоненты реакции, кроме матрицы (кДНК), из расчета 1 реакция объемом 25 мкл для каждого образца + 1 дополнительная реакция по 25 мкл.
Состав реакционной смеси для гена NETO2:
Реагент
Концентрация исходных растворов
Объем в расчете на одну реакцию (мкл)
Конечные концентрации в реакции
ПЦР буфер (ГенЛаб)
5Х
5
1X
НТФ
2,5 мМ
2.5
0,25 мМ
Прямой праймер
1.0·10<sup>-5</sup> мМ
0.75
3·10<sup>-4</sup> мМ
Обратный праймер
1.0·10<sup>-5</sup> мМ
0.75
3·10<sup>-4</sup> мМ
Зонд
1.0·10<sup>-5</sup> мМ
1.0
4·10<sup>-4</sup> мМ
ROX
10.0·10<sup>-5</sup>
0,13
5,2·10<sup>-4</sup> мМ
мМ
Tag-Полимераза
1 о.е/мкл
2.0
кДНК
-
5
-
H<sub>2</sub>O
-
7.87
-
Состав реакционной смеси для гена GUSB:
Реагент
Концентрация исходных растворов
Объем в расчете на одну реакцию (мкл)
Конечные концентрации в реакции
ПЦР буфер (ГенЛаб)
5Х
5
1X
НТФ
2,5 мМ
2.5
0,25 мМ
Прямой праймер
1.0·10<sup>-5</sup> мМ
0.75
3·10<sup>-4</sup> мМ
Обратный праймер
1.0·10<sup>-5</sup> мМ
0.75
3·10<sup>-4</sup> мМ
Зонд
1.0·10<sup>-5</sup> мМ
0.625
2,5·10<sup>-4</sup> мМ
ROX
10.0·10<sup>-5</sup> мМ
0,13
5,2·10<sup>-4</sup> мМ
Tag-Полимераза
1 о.е/мкл
2.0
кДНК
-
5
-
H<sub>2</sub>O
-
8.245
-
Состав реакционной смеси для гена RPN1:
Реагент
Концентрация исходных растворов
Объем в расчете на одну реакцию (мкл)
Конечные концентрации в реакции
ПЦР буфер (ГенЛаб)
5Х
5
1X
НТФ
2,5 мМ
2.5
0,25 мМ
Прямой праймер
1.0·10<sup>-5</sup> мМ
0.875
3,5·10<sup>-4</sup> мМ
Обратный праймер
1.0·10<sup>-5</sup> мМ
0.875
3,5·10<sup>-4</sup> мМ
Зонд
1.0·10<sup>-5</sup> мМ
0.5
2·10<sup>-4</sup> мМ
ROX
10.0·10<sup>-5</sup> мМ
0,13
5,2·10<sup>-4</sup> мМ
Tag-Полимераза
1 о.е/мкл
2.0
кДНК
-
5
-
H<sub>2</sub>O
-
8.12
-
2. В 96-луночную планшету добавляли по 20 мкл приготовленных реакционных смесей без матрицы.
3. Вносили по 5 мкл кДНК образца, плотно закрывали планшету пленкой.
4. Помещали планшету в приборное отделение, задавали названия ячеек, температурный режим для 40 циклов: 95°C - 10 мин - денатурация и активация фермента, 95°C - 15 с - денатурация, 60°C - 1 мин - отжиг зонда и полимеризация, затем запускали прибор.
5. Реакции проводили в режиме относительных количественных измерений (программное обеспечение RQ, Relative Quantification, Applied Biosystems).
6. Нуклеотидный состав ампликонов подтверждали секвенированием на автоматическом секвенаторе 3730 DNA Analyzer (Applied Biosystems, США). Секвенирование проводили отдельно с 5′ и 3′-концевого праймеров с использованием реактивов DYEnamic ET Terminator Cycler Sequencing Kit ("Amersham", США).
7. Проводили математическую обработку данных ПЦР-РВ и представляли результаты в графическом и/или табличном виде.
Пример 6. Математическая обработка данных ПЦР-РВ
кДНК
Данные ПЦР-РВ переносили в виде текстового файла в Microsoft Excel и проводили математическую обработку данных. Относительное содержание мРНК R (далее R), представляющее отношение количества копий исследуемой последовательности кДНК к количеству копий контрольной последовательности в опухоли (Т) по сравнению с нормой (N), связана с основными параметрами ПЦР-РВ пороговым циклом Ct и эффективностью реакции Е общим выражением [Бюллетень 2, http://docs.appliedbiosystems.com/pebiodocs/04303859.pdf]
Интервал крайних значений R вычисляли с учетом рассчитанных отклонений Е для значений Ct
<mrow><mover accent="true"><mi>x</mi><mo>¯</mo></mover><mo>=</mo><mfrac><mrow><mstyle displaystyle="true"><munderover><mo>∑</mo><mrow><mi>i</mi><mo>=</mo><mn>1</mn></mrow><mi>n</mi></munderover><mrow><msub><mi>x</mi><mi>i</mi></msub></mrow></mstyle></mrow><mi>n</mi></mfrac></mrow>
, где
, i=1, 2, …, n, где n - число повторов реакции (в нашем случае n=3). При суммировании величин отклонения вычисляют по формуле
<mrow><mi>e</mi><mo>=</mo><msqrt><mrow><mstyle displaystyle="true"><munderover><mo>∑</mo><mrow><mi>j</mi><mo>=</mo><mn>1</mn></mrow><mi>k</mi></munderover><mrow><msubsup><mi>e</mi><mi>j</mi><mn>2</mn></msubsup></mrow></mstyle></mrow></msqrt></mrow>
j=1, 2, …, k, где k - число суммируемых величин.
опухоль
норма
опухоль
норма
опухоль
норма
Сравнивали уровень повышения мРНК генов, равный 1/R и показывающий во сколько раз содержание мРНК каждого гена повышено в опухоли по сравнению с нормой. Эффективность ПЦР-РВ (Е) для генов GUSB, RPN1 и NETO2 рассчитывалась с помощью программы «Анализ Транскрипции Генов». В данной программе эффективность реакции рассчитывается по тангенсу угла наклона прямой, которая аппроксимирует кинетическую кривую на ее линейном участке с помощью метода наименьших квадратов. При дальнейшей обработке данных учитывали полученные значения эффективностей, которые составили в NETO2 в образцах почки для гена NETO2 Е=Е=(92±8)%, для гена GUSB - Е=Е=(80±9)%, для гена RPN1 - Е=Е=(86±9)%. Достоверность наблюдаемых изменений оценивали при помощи непараметрических тестов Уилкоксона и Манна-Уитни. Данные считали достоверными при Р<0,05, где Р - показатель статистической значимости данных.
Оценка содержания мРНК гена NETO2 при СПК
cp
cp
Во всех случаях СПК (97%, 29/30, Р<0.01) обнаружено повышение содержания мРНК гена NETO2 от 3-х до 100-х раз по сравнению с «условными» нормальными тканями (фиг.1). Значение LI (Level Increase - средний уровень повышения) для всей выборки составило 15 раз. Значения LI и FI (Frequency Increase - частота повышения) в образцах, соответствующих различным клиническим стадиям и для всей выборки близки.
Статистически значимых корреляций между степенью, частотой повышения содержания мРНК гена NETO2 и такими характеристиками, как клиническая стадия, размер первичной опухоли, возраст и пол пациента, не выявлено. В исследованной выборке всего 3 образца СПК с метастазами, поэтому разделения образцов на группы с метастазами и без метастазов не проводили.
Представленное выше подробное описание изобретения и его конкретных воплощений, приведенных в примерах со ссылкой на фигуры, предназначено исключительно для более полного уяснения сущности заявленного изобретения, но не для его ограничения. Специалисту будет ясно, что могут быть сделаны различные изменения, которые, тем не менее, будут соответствовать сущности и объему настоящего изобретения, которые определяются прилагаемой формулой изобретения.
Таблица 1
Характеристики
Пациенты
мужчины/18,
пол/количество
женщины/12
средний возраст
53 года (32-76 лет)
T<sub>1</sub>N<sub>0</sub>M<sub>0</sub>/стадия I
7
T<sub>2a</sub>N<sub>0</sub>M<sub>0</sub>, T<sub>2</sub>N<sub>0</sub>M<sub>0</sub>/стадия II
14
T<sub>3</sub>N<sub>0</sub>M<sub>0</sub>, T<sub>3a</sub>N<sub>0</sub>M<sub>0</sub>, T<sub>3b</sub>N<sub>0</sub>M<sub>0</sub>, T<sub>3</sub>N<sub>1</sub>M<sub>0</sub>/стадия III
9
пациенты без метастазов
27
пациенты с метастазами в лимфатические узлы
3
Таблица 2
Частота (FI) и средний уровень повышение мРНК (LD<sub>cp</sub>) гена NETO2 при СПК
Параметр
Значение
FI
97% (29/30)
LI<sub>cp</sub>
15 (3-10<sup>2</sup>)
Р
<0.01
Примечание: При оценке результатов пять образцов с метастазами не выделяли в отдельную группу. В строке LI<sub>cp</sub> в скобках показан диапазон значений уровня мРНК гена NETO2
SEQUENCE LISTING
<110> ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ ИМ. В. А. ЭНГЕЛЬГАРДТА РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК
INSTITUT MOLEKULYARNOI BIOLOGII ROSSIISKOI AKADEMII NAUK
<120>  СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ  СВЕТЛОКЛЕТОЧНОЙ  ПОЧЕЧНО-КЛЕТОЧНОЙ КАРЦИНОМЫ И НАБОР ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
<130>  R06100200/44
<160>  2
<170>  PatentIn version 3.1
<210>  1
<211>  25
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
<220>
<223>  Forward primer NETO2_F
<400>  1
gctctgctcg gtcctcaaag tgttg 25
<210>  2
<211>  21
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
<220>
<223>  Reverse primer NETO2_R
<400>  2
aaatgccaca ctgggttgca gg       22
<210>  3
<211>  31
<212>  DNA
<213>  Artificial sequence
<220>
<223>  Probe NETO2_Z
<400>  3
5'- FAM -actggtagtg gaagggattg ccgtggccca -RTQ1- 3'    30