СПОСОБ ДЕЦЕЛЛЮЛЯРИЗАЦИИ ДЕРМЫ СВИНЬИ ДЛЯ РЕКОНСТРУКТИВНОЙ ПЛАСТИЧЕСКОЙ ХИРУРГИИ
METHOD OF DECELLULARIZATION OF PIG DERMIS FOR RECONSTRUCTIVE PLASTIC SURGERY

Предполагаемое изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к регенеративной медицине, и может быть использовано при создании ацеллюлярных дермальных матриксов для последующего применения в реконструктивной хирургии.
Реконструктивная и пластическая хирургия направлены на восстановление форм и функций отдельных органов, что играет важную роль при таких патологических состояниях как грыжи передней брюшной стенки, паховые грыжи, рак молочной железы (после маммопластики), рак прямой кишки (экстирпация и цилиндрическая резекция прямой кишки) и др. В качестве поддерживающих имплантов в настоящее время используются собственные ткани пациента, синтетические или природные материалы отличающиеся высокой биосовместимостью, обладающие оптимальными физико-механическими свойствами (прочностью, жесткостью, деформационными характеристиками), хорошими манипуляционными качествами, устойчивостью к инфицированию, атравматичностью.
Собственные ткани, взятые с отдаленных участков тела, не всегда имеют достаточные механические свойства и способны быстро резорбироваться после операции. При этом для взятия аутотрансплантатов (апоневротический, фасциальный или кожный лоскут) требуются дополнительные разрезы и манипуляции. Это увеличивает время как самой операции, так и послеоперационной реабилитации, а также ухудшает косметический эффект вмешательства [Борисов А.Е., Чистяков Д.Б., Ященко А.С. Эволюция технологии применения синтетических имплантатов в герниологии // Вестник хирургии имени ИИ Грекова. - 2011. - Т. 170. - №. 2.]. Использование аутогенного материала имеет только одно преимущество - полное иммунное и генетическое соответствие тканям реципиента.
Для использования синтетического материала в хирургической практике необходимо быть уверенным в его универсальности, экономической целесообразности и доступности техники применения. Также материалы должны соответствовать таким характеристикам как биологическая совместимость, стимулирование фиброза и ангиогенеза, наличие устойчивости к инфекциям (монофиламентные материалы) и возможности прорастать окружающими тканями (размер поры более 75 мкм), быть гистологически инертными, сохранять мягкость и эластичность и не сжиматься в процессе заживления [Ханзадян М.Л. и др. Профилактика и лечение осложнений хирургического лечения опущения и выпадения внутренних половых органов // Вестник Российского университета дружбы народов. Серия: Медицина. - 2010. - №. 6].
Недостатком применения синтетических материалов является их микропористость и связанная с этим опасность инфицирования. В них легко попадают микроорганизмы (диаметр стафилококка порядка 1 мкм) и не могут попасть макрофаги (диаметр 18-35 мкм) и лейкоциты (15-20 мкм). Поэтому фагоцитоз внутри таких эксплантатов затруднен, что создает опасность их нагноения и отторжения [Борисов А.Е., Чистяков Д.Б., Ященко А.С. Эволюция технологии применения синтетических имплантатов в герниологии // Вестник хирургии имени ИИ Грекова. - 2011. - Т. 170. - №. 2]. Также использование синтетических материалов может приводить к значительному увеличению интенсивности и продолжительности болевого синдрома, чувству дискомфорта и ограничению двигательной активности пациента в отдаленном послеоперационном периоде [Шестаков А.Л. и др. Сравнительная характеристика результатов герниопластики по Лихтенштейну с использованием стандартных и облегченных сетчатых протезов // Клиническая и экспериментальная хирургия. - 2018. - Т. 6. - №. 2].
Альтернативой используемых имплантов может выступать обесклеченный (децеллюляризированный) ксеногенный материал. Во многих тканях животных основным компонентом с точки зрения объема являются не клетки, а секретируемая клетками трехмерная структура, известная как внеклеточный матрикс (ВКМ). Необходимость децеллюляризации связана с возможностью иммунологической реакции отторжения при использовании алло- и ксеногенных трансплантатов, которую могут вызывать клеточные компоненты [Mendibil U. et al. Tissue-specific decellularization methods: Rationale and strategies to achieve regenerative compounds // International Journal of Molecular Sciences. - 2020. - T. 21. - №. 15. - C. 5447]. Децеллюляризация удаляет большую часть клеточных компонентов, сохраняя ВКМ в состоянии, максимально приближенном к нативной ткани. Структурные белки, гликопротеины и протеогликаны являются макромолекулярными компонентами ВКМ, и они поддерживают структурную целостность тканей и обеспечивают гистоархитектуру органов. Параллельно с этим в ВКМ происходит обмен питательных веществ, воды и метаболитов.
Известно несколько методов децеллюляризации, которые подразделяются на химические, физические и ферментативные. Однако единого алгоритма децеллюляризации не существует, так как в зависимости от типа ткани может увеличиваться время и концентрация детергентов для удаления ДНК и иммуногенных белков, что, в свою очередь, может привести к нарушению структурной организации ткани [Gilbert Т.W., Sellaro Т.L., Badylak S.F. Decellularization of tissues and organs // Biomaterials. - 2006. - T. 27. - №. 19. - C. 3675-3683]. Физические методы обычно используются в дополнение к химическим и ферментативным методам и, следовательно, усиливают эффекты децеллюляризации, однако в ходе их использования возможно повреждение структуры ВКМ. По этой причине оптимизация алгоритма децеллюляризации имеет первостепенное значение в каждом конкретном случае [Keane T.J., Swinehart I., Badylak S.F. Methods of tissue decellularization used for preparation of biologic scaffolds and in vivo relevance. Methods. 2015; 16(84): 25-34. DOI: 10.1016/j.ymeth.2015.03.00].
Преимуществом децеллюляризации, с помощью которой возможно сохранение структуры ВКМ, является получение материалов с наиболее оптимальными механическими и биохимическими свойствами, в наибольшей степени приближенных к характеристикам нативной ткани, что является важным критерием хирургических материалов [Keane Т.J., Swinehart I.Т., Badylak S.F. Methods of tissue decellularization used for preparation of biologic scaffolds and in vivo relevance // Methods. - 2015. - T. 84. - C. 25-34].
В зависимости от характеристик ткани процесс децеллюляризации может быть модифицирован за счет варьирования агентов и времени обработки [Terzini М. et al. Ex vivo dermis mechanical behavior in relation to decellularization treatment length // The open biomedical engineering journal. - 2016. - T. 10. - C. 34]. Чем больше размер ткани, тем больше длительность его обработки. Однако, увеличение времени действия детергентов повышает вероятность повреждения компонентов ВКМ. Поэтому для оценки целостности структурной организации ВКМ используют гистологический анализ. Тем не менее, даже при отсутствии видимых ядер на гистологических срезах, важно количественно оценивать содержание ДНК, которое не должно превышать 50 нг ДНК на миллиграмм ткани [Cramer М.С., Badylak S.F. Extracellular matrix-based biomaterials and their influence upon cell behavior // Annals of biomedical engineering. - 2020. - T. 48. - №. 7. - C. 2132-2153].
При сравнении алгоритмов децеллюляризации ксеногенных биологических материалов нами был выбран метод обесклечивания с использованием ферментов и химических детергентов.
В настоящее время разработаны различные алгоритмы децеллюляризации дермы детергентно-энзиматическим способом с различным временем обработки [Сотниченко А.С. и др. Разработка методики получения дермального внеклеточного матрикса // Вестник трансплантологии и искусственных органов. - 2020. - Т. 21. - №. 4. - С. 81-87.; Reing J.Е. et al. The effects of processing methods upon mechanical and biologic properties of porcine dermal extracellular matrix scaffolds // Biomaterials. - 2010. - T. 31. - №. 33. - C. 8626-8633]
В частности, известен способ децеллюляризации дермы [Сарбаева Н.Н. и соавт. Патент РФ на изобретение №№219.017.В5СС от 16.07.2019 г. «Способ получения дермального матрикса»], где исходным сырьем является кожа свиней, из которой выкраивают необходимые по размеру лоскуты, отмывают их, подвергают трехкратному циклу замораживания и оттаивания, после чего на первом этапе с целью деэпителизации лоскуты погружают в емкость с гипертоническим раствором. Через 4 часа матрикс из гипертонического раствора переносят в разбавленный 1:9 фосфатный буфер Серенсена, индуцируя осмотический шок, затем повторяют первый этап еще раз. На втором этапе для децеллюляризации применяют раздельную трехкомпонентную децеллюляризующую систему: сначала лоскуты погружают в емкость с 2% раствором дезоксихолата натрия, длительностью обработки дезоксихолатом натрия 48 часов со сменой раствора каждые 12 часов, затем их погружают в емкость с 2% раствором дезоксихолата натрия и добавляют 0,07 г панкреатической липазы на 9 часов. Смену децеллюляризующего раствора проводят трижды через каждые 3 часа. В контрольных образцах лоскутов определяют содержание липидов, если выявляют любое отличное от нуля содержание липидов, то при комнатной температуре основные образцы размораживают и домывают, используя 1% раствор дезоксихолата натрия и 0,03 г панкреатической липазы, после этого лоскуты погружают в раствор ДНКазы 0,1 мг/мл и инкубируют их в емкости без перемешивания при температуре 37°С в течение 9 часов с трехкратной сменой раствора. Лоскуты ополаскивают путем погружения в емкость с трис-HCl буфером рН 6,8, заменяют промывочный раствор на деионизированную воду на 12 часов. В контрольных образцах лоскутов определяют содержание ДНК, если в контрольных образцах количество ДНК превышает 200 нг/мг, то образцы при комнатной температуре размораживают и повторно инкубируют в идентичном растворе ДНКазы до достижения содержания ДНК в образцах не превышающего 200 нг/мг. Далее их дважды в течение 12 часов промывают деионизированной водой и трехкратно в течение 12 часов фосфатно-солевым раствором рН 7,2-7,4.
Недостатком данного способа является многостадийный процесс с использованием большого количества компонентов, длительное время обработки дермального матрикса (не менее 94 часов), что неизбежно приведет к значительному нарушению структуры коллагеновых волокон, дороговизна получения образца в следствие большого расхода реагентов, а также есть большая вероятность возникновения бактериальной контаминации в результате многостадийного процесса обработки материал.
2
В качестве ближайшего аналога был взят способ получения ацеллюлярного дермального матрикса с ферментной (раствор Трипсин-Версена и свиная панкреатическая ДНКаза I) и циклической обработкой химическими детергентами [Гилевич И.В. и соавт. Патент РФ на изобретение №2717088 С1 от 18.10.2019. г. «Способ получения ацеллюлярного дермального матрикса»]. На первом этапе предварительно деэпителизированный с помощью электродерматома образец дермы замораживали при -80°С, после разморозки образцы заливали раствором Трипсин-Версена помещали в шейкер-инкубатор в режиме 100 об/мин при +37°С на 18 часов. На втором этапе образцы помещали на вращающуюся платформу в режиме 170 об/мин и подвергали последовательному циклическому воздействию растворов детергентов: 1% раствора Тритона X-100 в течение 2 часов и 4% раствора дезоксихолата натрия в комбинации с 0,002 М Na-ЭДТА в течение 2 часов, общее число циклов обработки равнялось 5, после воздействия каждого детергента образцы промывали в деионизированной воде в течение 10 минут; на третьем этапе для удаления нуклеиновых кислот образцы обрабатывали раствором свиной панкреатической ДНКазы I (2000 ЕД растворяли в 200 мл фосфатного буфера с кальцием и магнием) в шейкер-инкубаторе в режиме 100 об/мин при +37°С в течение 4 часов. Завершали процесс децеллюляризации воздействием 10% раствора хлоргексидина биглюконата в фосфатном буфере в течение 24 часов со сменой раствора каждые 6 часов.
Основными недостатками данного способа является относительно продолжительное время (44 ч) проведения процесса децеллюляризации и промывки образцов, что не исключает возможность серьезных структурных повреждений ацеллюлярного дермального матрикса, а также отсутствие данных о размерах или массе используемых образцов, что может привести к неполному удалению клеточных элементов и структур, содержащих ДНК или перерасходу реагентов.
Задачи:
- сократить продолжительность этапов процессов обесклечивания образца дермы;
- сэкономить реагенты, за счет предварительного расчета соотношения массы образца дермы и необходимого объема растворов;
- расширить возможности обработки дермы с различной массой с максимальным сохранением его гистологической структуры и отсутствием клеточных компонентов;
- получить образцы децеллюляризированной дермы с минимальным содержанием остаточной ДНК при количественной оценке ДНК;
- оценить показатели, значимо влияющие на биосовместимость децеллюляризированного образца дермы.
Сущностью предложенного изобретения является оптимизация процесса децеллюляризации дермы свиньи, включающая забор дермы свиньи электродерматомом; замораживание образцов дермы при температуре -80°С с последующей разморозкой; обработку образцов в шейкере-инкубаторе 100 оборотов в минуту в растворе Трипсин-Версена при +37°С в течение 6 часов с условием замены раствора через каждые два часа; последовательное двухкратное воздействие на шейкере 100 оборотов в минуту растворами 1% Тритона Х-100 в течение 3 часов и 4% дезоксихолата натрия в течение 3 часов; обработку в шейкере-инкубаторе 100 оборотов в минуту раствором ДНКазы I при +37°С в течение 4 часов, причем после каждого воздействия раствора на образец его промывают однократно в деионизированной воде в течение 10 минут в том же режиме, отличающаяся тем, что образцы дермы обрабатывают в указанных растворах в соотношении массы образца к объему растворов - 1:10 в течение 22 часов, затем осуществляют контроль качества обесклечивания, образцы соответствуют требованиям при условии содержания ДНК не более 50 нг/мг ткани.
Техническим результатом является сокращение времени обработки образцов дермы химическими детергентами и ферментами до 22 часов и предварительный расчет соотношения массы образца дермы и необходимого объема растворов как 1:10 с последующим осуществлением жесткого контроля качества содержания ДНК не более 50 нг/мг ткани, что позволяет уменьшить объем трудозатрат, экономить реагенты и расширить возможности обработки дермы с различной массой с максимальным сохранением его гистологической структуры и отсутствием клеточных компонентов, а также получить биосовместимые образцы децеллюляризированной дермы с минимальным содержанием остаточной ДНК.
Способ апробирован в течение года на 16 образцах биологического материала (дерма) экспериментальных животных (свиньи). Получены образцы децеллюляризированной дермы с максимально сохранной гистологической структурой, отсутствием клеточных элементов и не являющиеся цитотоксичными в условиях in vitro.
Способ получения ацеллюлярного дермального матрикса осуществляют следующим образом: осуществляют забор дермального лоскута электродерматомом; перед забором образца дермы снимают эпидермис электродерматомом, затем выполняют заморозку образца при температуре -80°С, далее образец размораживают. Рассчитывают объемы всех растворов соотношением массы образца к объему раствора - 1:10. Затем образцы обрабатывают раствором Трипсин-Версена в шейкере-инкубаторе в режиме 100 оборотов в минуту при +37°С в течение 6 часов, меняя раствор через каждые 2 часа. Затем образцы помещают на шейкер в режиме 100 оборотов в минуту и подвергают последовательному циклическому воздействию растворов детергентов: 1% раствора Тритона Х-100 и 4% раствора дезоксихолата натрия в течение 3 часов в каждом растворе, общее число таких циклов обработки равняется 2, далее следует обработка образцов раствором свиной панкреатической ДНКазы I в шейкере-инкубаторе в режиме 100 оборотов в минуту при +37°С в течение 4 часов, после воздействия каждого раствора следует промывка образцов в деионизированной воде. Общее количество времени обработки дермы составляет 22 часа. Качество децеллюляризации подтверждают путем контроля остаточного содержания ДНК, которое не должно составлять более 50 нг на 1 мг сухой массы ткани. Контроль остаточного содержания ДНК проводят с использованием набора реагентов (Dneasy Blood and Tissue Kit, Qiagen, Швеция) по протоколу фирмы-изготовителя. Отсутствие цитотоксического действия образцов исследуемого матрикса оценивают по методике Live/Dead. При этом производят оценку цитотоксичности образцов дермы in vitro методом Live/Dead (ThermoFisher Scientific Inc., США) по протоколу фирмы-производителя. Для проведения анализа используют линию человеческих дермальных фибробластов DF-1, полученную из Российской коллекции клеточных культур позвоночных ФГБУН Института цитологии РАН. При этом живые клетки приобретают зеленое, а мертвые - красное свечение за счет взаимодействия с кальцеином-АМ и гомодимером этидия соответственно.
Пример 1. В условиях операционной производили забор лоскута кожи свиньи массой 23,12 г, предварительно удалив электродерматомом слой эпидермиса. Полученный материал замораживали при температуре -80°С, затем образец размораживали. Объемы всех растворов рассчитывали соотношением массы образца к объему раствора - 1:10. Далее образцы заливали раствором Трипсин-Версена (231,2 мл) и помещали в шейкер-инкубатор в режиме 100 оборотов в минуту при +37°С на 6 часов, меняя раствор через каждые 2 часа. Затем образцы помещали на шейкер в режиме 100 оборотов в минуту и подвергали последовательному циклическому воздействию растворов детергентов: 1% раствора Тритона Х-100 (231,2 мл) в течение 3 часов и 4% раствора дезоксихолата натрия (231,2 мл) в течение 3 часов, общее число циклов обработки равнялось 2, после воздействия каждого детергента образец промывали в деионизированной воде, далее обрабатывали образец раствором свиной панкреатической ДНКазы I (231,2 мл) в шейкере-инкубаторе в режиме 100 оборотов в минуту при +37°С в течение 4 часов. При этом время обработки было сокращено в 2 раза, а экономия реагентов составила 32,6%. Качество децеллюляризации подтверждали путем контроля остаточного содержания ДНК в трех повторностях. Исследование показало, что среднее значение количества ДНК в полученном образце составляло 48,35±1,65 нг/мг сухого вещества, что соответствовало критерию качества децеллюляризации. Анализ данных, полученных по методике Live/Dead продемонстрировал, что 80±10% клеток DF-1 оставались жизнеспособными на полученном образце дермы. Данный результат свидетельствовал об отсутствии цитотоксического действия образцов исследуемых матриксов.
Пример 2. В условиях операционной производили забор лоскута кожи свиньи массой 18,56 г, предварительно удалив электродерматомом слой эпидермиса. Полученный материал замораживали при температуре -80°С, затем образец размораживали. Объемы всех растворов рассчитывали соотношением массы образца к объему раствора - 1:10. Далее образцы заливали раствором Трипсин-Версена (185,6 мл) и помещали в шейкер-инкубатор в режиме 100 оборотов в минуту при +37°С на 6 часов, меняя раствор через каждые 2 часа. Затем образцы помещали на шейкер в режиме 100 оборотов в минуту и подвергали последовательному циклическому воздействию растворов детергентов: 1% раствора Тритона Х-100 (185,6 мл) в течение 3 часов и 4% раствора дезоксихолата натрия (185,6 мл) в течение 3 часов, общее число циклов обработки равнялось 2, после воздействия каждого детергента образец промывали в деионизированной воде, далее обрабатывали образец раствором свиной панкреатической ДНКазы I (185,6 мл) в шейкере-инкубаторе в режиме 100 оборотов в минуту при +37°С в течение 4 часов. При этом время обработки было сокращено в 2 раза, а экономия реагентов составила 33,3%. Качество децеллюляризации подтверждали путем контроля остаточного содержания ДНК в трех повторностях. Исследование показало, что среднее количество ДНК в полученном образце составляло 32,91±0,5 нг/мг сухого вещества, что соответствует критерию качества децеллюляризации. Анализ данных, полученных по методике Live/Dead продемонстрировал, что 80±10% клеток DF-1 оставались жизнеспособными на полученном образце дермы. Данный результат свидетельствовал об отсутствии цитотоксического действия образцов исследуемых матриксов.
Пример 3. В условиях операционной производили забор лоскута кожи свиньи массой 6,07 г, предварительно удалив электродерматомом слой эпидермиса. Полученный материал замораживали при температуре -80°С, затем образец размораживали. Объемы всех растворов рассчитывали соотношением массы образца к объему раствора - 1:10. Далее образцы заливали раствором Трипсин-Версена (60,7 мл) и помещали в шейкер-инкубатор в режиме 100 оборотов в минуту при +37°С на 6 часов, меняя раствор через каждые 2 часа. Затем образцы помещали на шейкер в режиме 100 оборотов в минуту и подвергали последовательному циклическому воздействию растворов детергентов: 1% раствора Тритона Х-100 (60,7 мл) в течение 3 часов и 4% раствора дезоксихолата натрия (60,7 мл) в течение 3 часов, общее число циклов обработки равнялось 2, после воздействия каждого детергента образец промывали в деионизированной воде, далее обрабатывали образец раствором свиной панкреатической ДНКазы I (60,7 мл) в шейкере-инкубаторе в режиме 100 оборотов в минуту при +37°С в течение 4 часов. При этом время обработки было сокращено в 2 раза, а экономия реагентов составила 44,2%. Качество децеллюляризации подтверждали путем контроля остаточного содержания ДНК в трех повторностях. Исследование показало, что среднее количество ДНК в полученном образце составляло 18,09±0,6 нг/мг сухого вещества, что соответствует критерию качества децеллюляризации. Анализ данных, полученных по методике Live/Dead продемонстрировал, что 70±10% клеток DF-1 оставались жизнеспособными на полученном образце дермы. Данный результат свидетельствовал об отсутствии цитотоксического действия образцов исследуемых матриксов.
Пример 4. В условиях операционной производили забор лоскута кожи свиньи массой 15,32 г, предварительно удалив электродерматомом слой эпидермиса. Полученный материал замораживали при температуре -80°С, затем образец размораживали. Объемы всех растворов рассчитывали соотношением массы образца к объему раствора - 1:10. Далее образцы заливали раствором Трипсин-Версена (153,2 мл) и помещали в шейкер-инкубатор в режиме 100 оборотов в минуту при +37°С на 6 часов, меняя раствор через каждые 2 часа. Затем образцы помещали на шейкер в режиме 100 оборотов в минуту и подвергали последовательному циклическому воздействию растворов детергентов: 1% раствора Тритона Х-100 (153,2 мл) в течение 3 часов и 4% раствора дезоксихолата натрия (153,2 мл) в течение 3 часов, общее число циклов обработки равнялся 2, после воздействия каждого детергента образец промывали в деионизированной воде, далее обрабатывали образец раствором свиной панкреатической ДНКазы I (153,2 мл) в шейкере-инкубаторе в режиме 100 оборотов в минуту при +37°С в течение 4 часов. При этом время обработки было сокращено в 2 раза, а экономия реагентов составила 35,1%. Качество децеллюляризации подтверждали путем контроля остаточного содержания ДНК в трех повторностях. Исследование показало, что среднее количество ДНК в полученном образце составляло 31,99±0,6 нг/мг сухого вещества, что соответствует критерию качества децеллюляризации. Анализ данных, полученных по методике Live/Dead продемонстрировал, что 80±10% клеток DF-1 оставались жизнеспособными на полученном образце дермы. Данный результат свидетельствовал об отсутствии цитотоксического действия образцов исследуемых матриксов.