СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АКТИВНЙ ФОРМЫ ПРОИЗВОДНОГО АНАЛОГА ИНСУЛИНА ДЛИТЕЛЬНОГО ДЕЙСТВИЯ КЛОСТРИПАИНА

1. Способ получения активной формы производного аналога инсулина длительного действия, включающий стадию взаимодействия производного аналога инсулина с клострипаином, где аналог инсулина, содержащий вариант В-цепи инсулина, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 2, аргинин (Arg) в положении аминокислоты 22 В-цепи инсулина заменен лизином (Lys) в нативном инсулине, слит с альбумин-связывающим доменом.
2. Способ по п. 1, в котором аналог инсулина дополнительно содержит одну или более аминокислотных замен, выбранных из группы, состоящей из:
замены валина (Val) на лейцин (Leu) в положении аминокислоты 3 А-цепи инсулина, представленной аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 4;
замены треонина (Thr) на аспарагиновую кислоту (Asp) в положении аминокислоты 8 А-цепи инсулина, представленной аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 4;
замены изолейцина (Ile) на лизин (Lys) в положении аминокислоты 10 А-цепи инсулина, представленной аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 4;
замены тирозина (Tyr) на глутаминовую кислоту (Glu) в положении аминокислоты 14 А-цепи инсулина, представленной аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 4;
замены тирозина (Tyr) на фенилаланин (Phe) в положении аминокислоты 19 А-цепи инсулина, представленной аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 4;
замены гистидина (His) на треонин (Thr) в положении аминокислоты 5 варианта В-цепи инсулина, представленного аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 2;
замены серина (Ser) на аспарагиновую кислоту (Asp) в положении аминокислоты 9 варианта В-цепи инсулина, представленного аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 2;
замены глутаминовой кислоты (Glu) на аланин (Ala) в положении аминокислоты 13 варианта В-цепи инсулина, представленного аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 2;
замены лейцина (Leu) на глутамин (Gln) в положении аминокислоты 17 варианта В-цепи инсулина, представленного аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 2; и
замены фенилаланина (Phe) на серин (Ser) в положении аминокислоты 24 варианта В-цепи инсулина, представленного аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 2.
3. Способ по п. 1, в котором альбумин-связывающий домен содержит альбумин-связывающий мотив, представленный следующей аминокислотной последовательностью:
a
b
c
GVSDFYKKLIXKAKTVEGVEALKXXI,
где:
а
Х независимо выбран из D и Е,
b
X независимо выбран из D и Е, и
c
X независимо выбран из А и Е.
4. Способ по п. 3, в котором альбумин-связывающий домен содержит следующую аминокислотную последовательность:
3
6
7
10
14
43
44
LAXAKXXANXELDXY-[BM]-LXXLP,
где:
[ВМ] представляет собой альбумин-связывающий мотив, как определено в п. 3,
3
Х независимо выбран из С, Е, Q и S;
6
Х независимо выбран из С, Е и S;
7
X независимо выбран из А и S;
10
Х независимо выбран из A, R и S;
14
Х независимо выбран из А, С, K и S;
43
Х независимо выбран из А и K; и
44
Х независимо выбран из А, Е и S.
5. Способ по п. 4, в котором альбумин-связывающий домен представлен аминокислотными последовательностями, выбранными из группы, состоящей из SEQ ID NO 6-13.
6. Способ п. 5, в котором альбумин-связывающий домен представлен аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 6.
7. Способ по п. 1, в котором аналог инсулина и альбумин-связывающий домен слиты друг с другом посредством пептидной связи; полипептидного линкера;
или непептидильного линкера, выбранного из группы, состоящей из полиэтиленгликоля, полипропиленгликоля, сополимера этиленгликоля и пропиленгликоля, полиоксиэтилированного полиола, поливинилового спирта, полисахаридов, декстрана, простого поливинилэтилового эфира, биоразлагаемых полимеров, жирных кислот, нуклеотидов, липидных полимеров, хитина, гиалуроновой кислоты и их комбинаций.
n
8. Способ по п. 7, в котором полипептидный линкер содержит (GGGGS) (где n представляет собой целое число, находящееся в интервале от 1 до 6).
9. Способ по п. 8, в котором полипептидный линкер представлен аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 5.
10. Способ по п. 1, в котором восстанавливающий агент добавляют во время реакции с клострипаином.
11. Способ по п. 10, в котором восстанавливающий агент выбран из группы, состоящей из цистеина, β-меркаптоэтанола, трис-(2-карбоксиэтил)-фосфин гидрохлорида (ТСЕР), глутатиона (GSH) и дитиотреитола (ДТТ).
12. Способ по п. 10, в котором добавляют от 0,1 до 0,5 мМ ДТТ в качестве восстанавливающего агента.
13. Способ по п. 12, в котором ДТТ добавляют на начальной стадии, на которой производное аналога инсулина взаимодействует с клострипаином, и дополнительно добавляют через 3-6 часов после реакции.
14. Способ по п. 1, в котором производное аналога инсулина дополнительно приводят во взаимодействие с карбоксипептидазой В (СрВ), которую добавляют во время или после реакции с клострипаином.
15. Способ по п. 14, в котором клострипаин и/или карбоксипептидазу В (СрВ) приводят во взаимодействие в условиях рН 6,0-9,0.
16. Способ по п. 15, в котором клострипаин и/или карбоксипептидазу В (СрВ) приводят во взаимодействие в условиях рН 6,5-7,5.
17. Способ по п. 14, в котором клострипаин и/или карбоксипептидазу В (СрВ) приводят во взаимодействие в условиях 4-40°С.
18. Активная форма производного аналога инсулина длительного действия, полученная способом по любому из пп. 1-17.