Оптимизация способа получения протективного «с»-комплекса туляремийного микроба

«ядерные» мембраны и фильтры для грубой очистки (картон, фильтровальная бумага). В работе применяли фильтрационную ячейку «Ашюоп», ^рабочее давление воздуха составляло 0,8-1,0 кгс/см . В результате были подобраны мембраны для освобождения от балластных веществ в процессе поэтапного выделения С-комплекса. Кроме того, мы попытались применить ультрафильтрационный волоконный аппарат для концентрирования биомассы, полученной в ходе глубинного культивирования. Для этого 14 л культуральной жидкости, полученной при выращивании туляремийного микроба в ферментере, сконцентрировали на ультрафильтрационном волоконном аппарате марки УВА-ПС-17-1040 (предел исключения 17 кДа) с диаметром пор от 35-45 микрон. Скорость фильтрации составила 240 мл/мин при давлении 0,01 мПа, время фильтрации 1 ч 45 мин. Объем полученного концентрата - 1,5 л. Использование метода ультрафильтрации на полых волокнах позволяет за короткое время получать 10-кратный концентрат культуральной жидкости, что упрощает дальнейшее выделение антигенного препарата.

Из всех испытанных методов наиболее перспективным для внедрения в производство является метод получения антигенного комплекса в изоточке, так как он не требует больших временных затрат и дорогостоящего оборудования.

В результате проведенных исследований разработана новая технология получения антигенного комплекса туляремийного микроба с использованием сливно-доливного метода культивирования на среде БТ-агар, более совершенного и технологичного метода выделения антигенного комплекса -изоэлектрической преципитации и концентрации с использованием баромембранной технологии.

Таким образом, использование новых штаммов продуцентов, более совершенных способов культивирования и более технологических способов выделения антигенов позволило усовершенствовать и масштабировать технологию получения антигенов чумного и туляремийного микробов.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Бахрах Е.Э., Вейнблат В.И. // Пробл. особо опасных инф. - 1970. - Вып. 1 (11). - С. 109-115. - 2. Вейнблат В.И., Дальвадянц С.М., Веренков М.С. // Лаб. дело. -1983. - № 12. - С. 37-39. - 3. Дальвадянц С.М., Кутырев

B.В., Дятлов И.А., Еремин С.А. // Пробл. особо опасных инф. - Саратов, 2003 - Вып. 85. - С. 157-163. - 4. Дятлов И. А. Разработка технологий экспериментального и производственного аппаратного культивирования чумного микроба: Дис. ... док. мед. наук. - Саратов, 1992. - 407 с. - 5. Евстигнеев В.И., Кутырев В.В., Дальвадянц С.М. и др. // Диагн., лечение и профилакт. опасных инф. забол. Биотехнология. Ветеринария: Матер. Юбил. науч. конф. - Киров, 1998. -

C. 86-87. - 6. Жемчугов В.Е., Дятлов И.А., Кутырев В.В., Волох О.А. Способ получения препарата для активной иммунизации против туляремии. Патент на изобретение РФ № 2221591. Зарегистрирован в Гос. реестре изобретений РФ 20.01.2004 г. - 7. Никифоров А.К. Конструирование штаммов суперпродуцентов капсульного антигена Yersinia pestis: Дис. ... канд. мед. наук. - Саратов, 1995. - 143 с. - 8. Перт С. Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. - М.: Мир, 1978. - 131 с. - 9. Титенко М.М., Вейнблат В.И., Веренков М. С., Васенин А. С. // Диагн. и профилакт. особо опасных инф. - Саратов, 1983. - С. 34-39. - 10. Хлебников

В.С., Головлев И.Р., Кулевацкий Д.П. // Мол. генет., микробиол. и вирусол. - 1991. - № 7. - С. 15-20. - 11. Шепелев И. А., Дятлов И. А., Волох О. А. и др. // Пробл. особо опасных инф. - Саратов, 2003. - Вып. 85. - С. 157-163. -

12. Baker E.E., Sommer H., Foster L.E. et al. // J. Immunol. - 1952. - Vol. 68, N 2. - P. 131-145.

S.A.Yeremin, O.A.Volokh, I.A.Shepelev, S.M.Dalvadyants, I.A.Dyatlov

Designation of New Technological Patterns and Ranging the Processes of Deriving the Antigens from the Plague and Tularemia Microbial Agents

Russian Anti-Plague Research Institute “Microbe ", Saratov

Considered in the work are various processes of microbe culturing with their advantages and disadvantages. The main ways of scaling the processes to obtain the plague and tularemia microbial agents’ antigens are described including the search for promising producer strains, the choice of cultivation techniques, antigen concentration, isolation, and purification procedures.

Key words: scaling, cultivation, chemical vaccines.

Поступила 09.12.05.

УДК 616.981.455

И.А.Шепелёв, О.А.Волох, С.А.Ерёмин, И.А.Дятлов

ОПТИМИЗАЦИЯ СПОСОБА ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТЕКТИВНОГО «С»-КОМПЛЕКСА

ТУЛЯРЕМИЙНОГО МИКРОБА

Российский научно-исследовательский институт «Микроб», Саратов

В работе представлены данные по усовершенствованию способа выделения протективного «С»-комплекса как с поверхности клеток штамма-продуцента туляремийного микроба, так и из культуральной жидкости. Установлено, что препарат «С»-комплекса, выделенный из культуральной жидкости, не уступает по своему составу и основным иммунохимическим свойствам антигенному комплексу, полученному с поверхности клеток туляремийного микроба независимо от способа выращивания. Показана возможность усовершенствованя процесса выделения «С»-комплекса с помощью ультрафильтрации. Применение ультрафильтрационного волоконного аппарата позволяет за короткое время получать концентрат культуральной жидкости и является перспективным в плане масштабирования технологии получения «С»-комплекса.

Ключевые слова: Егапсіі'еііа їиіагетіі', антиген, иммуногенность, ультрафильтрация.

Вакцины, используемые до настоящего времени в большинстве стран мира, содержат практически полный набор антигенов, свойственных данному возбудителю при культивировании на пита-

тельных средах. Причем, наряду с веществами, определяющими протективный эффект, вакцины содержат также компоненты, обуславливающие реак-тогенность препарата или являющиеся балластом, и

их вклад в развитие иммунной реакции может тормозить ответ макроорганизма на введение протек-тивных антигенов [10]. Развитие живых вакцин нового поколения (генно-инженерных) затруднено, поскольку существуют в настоящее время очень жесткие стандарты для таких препаратов. Кроме того, нет доступных лицензированных живых вакцин во многих странах. Таким образом, более перспективным является создание и развитие субъеди-ничных вакцин [6], хотя эта работа в отношении туляремийной инфекции более сложная, чем разработка таких препаратов против чумы и сибирской язвы, поскольку для последних установлены и охарактеризованы протективные антигены. У Fran-cisella tularensis к настоящему времени не определены основные иммунодоминантные антигены и специфические вирулентные детерминанты [15]. Всех этих недостатков в какой-то степени лишены химические вакцины, при получении которых возможно создавать в готовых препаратах рациональные композиции протективных антигенов [2]. В качестве химической вакцины могут быть использованы поверхностные структуры F. tularensis, в частности белки внешней мембраны. Установлено, что препараты внешней мембраны обладают протек-тивной активностью для белых мышей и морских свинок [12]. Было показано, что антигенные компоненты внешней мембраны оказывают выраженный иммуномодулирующий эффект на разные формы функциональной активности макрофагов [9]. Одним из таких антигенных компонентов внешней мембраны является протективный «С»-(от «слизи-стый»)-комплекс [5], который представляет собой липополисахарид-белковый комплекс (ЛПБК) с поверхности клеток туляремийного микроба.

В нашей работе представлены данные по оптимизации способа получения «С»-комплекса туляре-мийного микроба с целью увеличения выхода продукта и повышения его иммуногенности.

Материалы и методы

Выращивание вакцинного штамма F. tularensis 15 линии НИИЭГ проводили на средах FT (производства ГНЦПМ, Оболенск), T и LB, как описано в работе [7], с компонентами фирмы «Difco». Глубинное культивирование проводили в ферментере «New Brunswik M19» (США) с рабочим объемом 10 л. Параметры выращивания, требования к питательной среде, особенности культивирования штам-ма-продуцента представлены в ранее опубликованных работах [13, 14]. В опытах по подбору режимов фильтрации применяли фильтрационную ячейку «Amicon» (США) с поверхностью фильтрации 44,18 см2, рабочее давление воздуха составляло 0,81,0 кгс/см , объем пробы - 100 мл. Использовали мембраны с размером пор от 2 до 0,22 мкм, а также «ядерные» мембраны и фильтры для грубой очистки (картон, фильтровальная бумага).

Анализ идентичности препаратов разных серий проводили биохимическими (SDS-PAGE, определение концентрации белка, углеводов и липидов) и серологическими (РДП, иммуноблот, ИЭФ, ДОТ-иммуноанализ) методами. Концентрацию белка, углеводов, количество липида и нуклеиновых кислот

определяли общепринятыми методами [3].

Для оценки иммуногенной активности «С»-комплекса против заражения штаммом F. tularensis 15 НИИЭГ (LD50 = 5-104 м.к.) использовали препараты, полученные разными способами. Беспородных белых мышей (18-20 г) иммунизировали однократно подкожно в объеме 0,2 мл в дозе от 1 до 125 мкг (по 6 животных на дозу). По истечении 21 дня животных заражали подкожным введением 106 м.к F. tularensis 15 НИИЭГ. Наблюдение велось в течение 18 дней. Среднюю иммунизирующую дозу (ED50) вычисляли по методике Кербера [1].

Результаты и обсуждение

В литературе описана методика выделения препарата липополисахарид-белкового комплекса

(ЛПБК) из внешних мембран клеток F. tularensis путем многократного переосаждения на ультрацентрифуге с последующей гель-фильтрацией диализом и концентрированием [11]. В.Е.Жемчугов с со-авт. [5] при получении «С»-комплекса биомассу ту-ляремийного микроба, обработанную фенолом, подвергали действию ультразвука для удаления «С»-комплекса с клеточной поверхности, а затем многократно переосаждали в деионизированной воде на ультрацентрифуге (100000 g) [13, 14]. Однако при реализации масштабного культивирования применение ультразвуковой установки и ультрацентрифуги требует дополнительных затрат. Кроме того, описанные выше способы разработаны для выделения антигенного комплекса с поверхности клеток, тогда как из культуральной жидкости штаммов-продуцентов «С»-комплекс не выделяли. Ранее нами показано наличие этого антигена в культуральной жидкости [13]. В связи с этим была проведена работа по оптимизации способа получения данного антигенного комплекса.

Биомассу агаровой культуры вакцинного штамма туляремийного микроба смывали охлажденным забуференным 0,86 % раствором NaCl (рН 7,2), добавляли фенол до конечной концентрации 1 % и оставляли при 4 °С при периодическом помешивании на 4 сут для инактивации. Более высокое содержание фенола приводило к лизису части клеток, что усложняло выделение поверхностных структур. Затем клеточную суспензию подвергали интенсивному гидродинамическому стрессу с помощью гомогенизатора «Virtis 45» (США) с последующим центрифугированием при 9000 g для освобождения от клеточного осадка (рисунок). Клеточную таблетку ресуспенди-ровали в холодной дистиллированной воде в течение 30-40 мин при перемешивании. Далее повторяли однократно весь цикл. Супернатанты после обоих осаждений объединяли и использовали для выделения «С»-комплекса. Последующий анализ показал, что в случае предварительной отмывки клеточной массы от остатков среды 0,86 % раствором NaCl препарат не содержит компонентов среды и требует меньше времени для освобождения от фенола (диализ в течение 12-14 ч вместо 24-28 ч). Выделение комплекса проводили следующими методами: ультрацентрифугирование при 100000 g; осаждение на фильтрационных мембранах с разным размером пор; осаждение в изоэлектрической точке; дифференциальное концен-

Биомасса + 1 % фенол Центрифуга или сепаратор, 9000 об ./мин

Клетки

Водно-фенольный смыв

Культуральная жидкость

I

Концентрирование на УВА-ПС-20-1040

і

Концентрат + 1 М HCl до рН 4,3 і

Осадок + Н2О дист + 1 М NaOH до рН 7,2

Центрифуга

20 тыс. об./мин, 20 мин ^ 3 тыс. об./мин., 10 мин

Супернатант до рН 6,0

I

Супернатант до рН 5,2

I

+ 1М HCl до рН 4,3 «С»-комплекс

I

2-3 раза Центрифуга 20 тыс. об./мин, 20 мин

Осадок + Н2О дист + 1 М NaOH до рН 7,2

Схема выделения «С»-комплекса туляремийного микроба

трирование на центрифужных ячейках типа «Сепіхісоп».

Подбор фильтрационных мембран позволил осадить «С» на мембранах «Атісоп ХМ50» (США) с пределом исключения 50 кДа и выше, Р=1,2 кгс/м2. По этому же принципу проводили осаждение на «Сеп1хісоп100» (предел исключения 100 кДа и выше). Определение изоэлектрической точки проводили ступенчатым осаждением при постепенном понижении рН. Показано, что выпадение осадка происходит при рН 5,2; 4,3 и 4,0, при постепенном повышении содержания водородных ионов осаждение «С»-ком-плекса происходит только в кислой среде.

Для установления препарата, идентичного антигенному комплексу, полученному описанным в литературе методом (ультрацентрифугированием), проводили серологический и биохимический анализы. В последнем случае использовали метод 8Б8-РАОЕ с окраской гелей серебром (на ЛПС) и параллельно Кумасси (на белки). Показана схожесть профиля как липидного, так и белкового для препаратов комплекса, полученного ультрацентрифугированием (при рН 4,3 и 5,2) на «Сеп1хісоп100». Препарат, полученный на «Атісоп ХМ50», отличался наличием мажорного белка 45-50 кДа. РДП позволил установить наличие двух линий, идентичных у препаратов, полученных разными методами. Титры составляли 1/32. Две линии, на наш взгляд, принадлежат ЛПС и белковой части, последняя - ближе к

антигену. Иммуноблоттинг с коммерческой туляре-мийной сывороткой показал полную идентичность препаратов, полученных при рН 4,3 и на «СепШ-соп100», с препаратом, полученным ультрацентрифугированием. В связи с тем, что получение «С»-комплекса на «Сеп1;псоп100» являлось менее технологичным, чем осаждение в изоточке, т.к было более длительно по времени и требовало использования дополнительного оборудования, то для определения иммуногенности препарат, полученный этим способом, не использовали.

Анализ иммуногенности препаратов, полученных разными методами, выявил достоверное увеличение продолжительности жизни иммунных животных в 2,5-3 раза по сравнению с отрицательным контролем (интактные животные). Было показано, что препарат «С»-комплекса, осажденный при рН 4,3, обладает большей протективной активностью для белых мышей, чем «С»-комплекс, выделенный тремя другими способами (таблица).

Поскольку получение антигенного комплекса в изоточке значительно дешевле и менее трудоемко, чем методом ультрацентрифугирования, а также полученный препарат обладает большей иммуноген-ностью по сравнению с оригинальным, то разработанная нами методика поэтапного осаждения при понижающемся рН является, на наш взгляд, перспективным методическим подходом, который был использован при создании способа получения «С»-комплекса при масштабных процессах.

Далее нами была проведена работа по применению метода поэтапного осаждения для выделения «С»-комплекса из биомассы полученной в условиях глубинного культивирования в ферментере.

Освобождение от клеточной массы и выделение поверхностного антигенного «С»-комплекса из инактивированной фенолом культуральной жидкости осуществляли по методике, описанной выше. Полученный из культуральной жидкости и из клеток препарат объединяли, доводили рН до 7,0 и диализовали против дистиллированной воды. Концентрирование осуществляли переосаждением в изоточке. Полученный осадок растворяли в деионизованной воде и лиофильно высушивали. Для стерилизации использовали у-излучение на установке МРХ-у-100 с источниками излучения 60Со, подобрана стерилизующая доза, которая составила 25 кГрэй.

В результате установлено, что препараты «С»-комплекса, полученные из клеток и культуральной жидкости вакцинного штамма, выращенного как на жидкой питательной среде в колбах, так и в условиях глубинного культивирования в ферментере, сходны по содержанию углеводов - 7-15 %, белков - 5277 % и липидов - 16-32 % с препаратом, получен-

Анализ иммуногенности препаратов «С»-комплекса F.tularensis 15 НИИЭГ, полученных разными способами

Доза, мкг

Способ получения ED50, мкг 1 5 25 125

n/N | А t, сут n/N | А t, сут n/N | А t, сут n/N | А t, сут

100TbK:.g 2,95 3/6 14,8±1,8 5/6 16,1±1,8 4/6 16,3±1,8 5/6 16,1±1,8

рН 4,3 1,26 3/5 11,6±2,6 6/6 18,0±0 5/6 16,5±1,5 5/6 16,1±1,8

рН 5,2 9,13 4/6 15,0±1,9 3/6 13,1±2,2 4/6 15,6±1,8 2/6 10,0±2,5

«Amicon» 5,37 4/6 15,0±1,9 4/6 14,3±2,3 4/5 16,2±1,8 2/6 10,3±2,5

Примечания: n/N - отношение количества выживших к общему количеству животных, взятых в опыт, А t - средняя продолжительность

жизни белых мышей, сут; для контрольной группы п/К составило 0/6, А 1 - 5,7 сут.

ным по ранее разработанной методике. Присутствие нуклеиновых кислот во всех образцах обнаружить не удалось. Полученные нами данные о составе «С»-комплекса совпадают с данными из литературных источников [5]. Анализ иммуногенной активности показал, что препараты «С»-комплекса выделенного из культуральной жидкости не уступают аналогичному препарату, полученному из клеточной биомассы.

Для оптимизации процесса получения антигенного комплекса из больших объемов биомассы были проведены эксперименты по замене метода центрифугирования для освобождения от осажденного балластного осадка на мембранную фильтрацию на всех этапах выделения продукта. В этом случае культуральную жидкость при рН 6,0 после 60 мин инкубации пропускали через фильтрационную установку «Amicon» (США), в последующем рН фильтрата доводили до 5,2, операцию повторяли до конечного рН - 4,3. Эффективность фильтрации контролировали центрифугированием при 6000 g (для образцов с рН 6,0) и 12500 g (для препаратов с рН 5,2 и 4,3). Отсутствие осадка свидетельствовало о высоком качестве фильтрации. Присутствие «С»-комплекса в фильтратах и осадках определяли в ДОТ-ИФА с моноклональными антителами гибри-домы FB-11X.

В результате установлено, что для освобождения от балластных веществ на этапе осаждения при рН 6,0 и 5,2 подходят мембраны Schleiher & Schuell (0,45 мкм), пропускная способность которых составила 5,09 и 0,9 мл/см2 соответственно. Кроме того, при рН 5,2 хорошие характеристики показал картон для фильтрации шампанских вин, который обладал той же скоростью и эффективностью фильтрации при более низком давлении воздуха (пропускная способность 0,9 мл/см2). В ходе анализа результатов ДОТ-ИФА выяснилось, что если при рН 6,0 на мембранах остается незначительное количество антигена (обратный титр 40-20), то при рН 5,2 мембранами задерживается большая часть «С»-комплекса. На конечном этапе фильтрации при рН 4,3 лучшими характеристиками обладали мембраны Millipore и УАМ-100 (обратный титр 1), тогда как в фильтратах антиген не обнаруживался.

Следующим этапом работы была оценка возможности применения ультрафильтрационных методов. Имеются данные о применении для концентрирования, диализа и диафильтрации ультрафильтра-ционного волоконного аппарата (УВА-ПС-20-1040, Россия) с пределом исключения 20 кДа при получении О-антигена холерного вибриона [8]. Мы применяли ультрафильтрационный волоконный аппарат для концентрирования культуральной жидкости F. tularensis 15 НИИЭГ. Для этого 14 л культуральной жидкости, полученной при выращивании туля-ремийного микроба в ферментере отъемно-доливным способом, сконцентрировали на ультрафильтрацион-ном волоконном аппарате марки УВА-ПС-17-1040 (предел исключения 17 кДа) с диаметром пор от 3545 микрон. Скорость фильтрации составила 240 мл/мин при давлении 0,01 мПа, время фильтрации - 1 ч 45 мин. Объем полученного концентрата 1,5 л. Использование метода ультрафильтрации на полых волокнах позволяет за короткое время получать 10-кратный концентрат культуральной жидко-

сти, что упрощает дальнейшее выделение антигенного препарата. Дальнейшую работу по выделению «С»-комплекса проводили как описано выше. В результате получен препарат с повышенной иммунной активностью.

Таким образом, можно выделить основные этапы получения «С»-комплекса из вакцинного штамма туляремийного микроба: выращивание, концен -трирование, выделение и очистка. На основании полученных данных нами разработан оптимальный алгоритм проведения процесса выращивания вакцинного штамма туляремийного микроба для получения биомассы и протективного «С »-комплекса, составлена оптимальная биотехнологическая схема получения и очистки протективного «С»-комплекса туляремийного микроба из клеточной массы и культуральной жидкости.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Ашмарин И.П., Воробьев А. А. Статистичесике методы в микробиологических исследованиях. - Л., 1962. -180 с. - 2. Дальвадянц С.М., Белобородов Р.А., Серо-глазов В. В. и др. // Состояние и перспективы специфической профилактики чумы: Матер. науч.-практ. конф. - Саратов. -1997. - Т. 1. - С. 201. - 3. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. - М.: Мир. - 1991. -544 с. - 4. Жемчугов В.Е., Дятлов И.А., Кутырев

B.В., Волох О.А. Способ получения препарата для активной иммунизации против туляремии. Патент № 2221591 РФ, 27. 01. 03 г. - 5. Жемчугов В.Е. Как мы делали химические вакцины: Записки о современных охотниках за микробами. - М.: Наука, 2004. - 349 с. - 6. Магазов Р.Ш. // ЖМЭИ. - 2000. -№ 5. - С. 108-112. - 7. Мишанькин Б.Н., Павлович Н.В., Романова Л.В. и др. // Лаб. диагн. возбудит. особо опасных инф. - Саратов, 1998. - Т. 1. - С. 111-143. - 8. Нижегородцев Н.А. Разработка новой технологии получения О-антигена холерного вибриона для проиэводства профилактических препаратов: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. - Саратов, 2003. -22 с. - 9. Скатов Д.В., Хлебников В.С., Василенко Н.Р. // ЖМЭИ. - 1993. - № 4. - С. 87-91. - 10. Станиславский Е.С. Бактериальные структуры и их антигенность. - М., 1971. - 11. Хлебников В.С., Головлев И.Р., Кулевац-кий Д.П. и др. // Мол. генет., микробиол. и вирусол. - 1991. -№ 7. - С. 15-20. -12. Хлебников В.С., Головлев И.Р., Чугунов А.М. и др. // ЖМЭИ. - 1994. - № 1. - С. 84-88. -

13. Шепелев И.А., Дятлов И.А., Волох О.А. и др. // Пробл. особо опасных инф. - Саратов, 2003. - Вып. 85. -

C. 157-163. - 14. Шепелев И.А., Дятлов И.А., Волох О. А. и др. // Метод. докум. и отчеты по сан.-эпид. охране тер-рит. Российск. Федерации: Реф. сб. - Саратов, 2005. - С. 1314. - 15. Sjostedt A. // Curr. Opin. Microbiol. - 2003. - N 6. -P. 66-71.

I.A.Shepelyov, O.A.Volokh, S.A.Yereomin, I.A.Dyatlov

Optimization of the Techniques for Deriving the Protective “C” Complex of the Tularemia Pathogen

Russian Anti-Plague Research Institute “Microbe ", Saratov

Information presented in the work concerns the attempts to improve the procedure of isolation of the protective “C” complex both from the cell surface and the cultural fluids of Francisella tularensis, the agent of tularemia. The “C” complex isolated from the cultural fluids was shown to be on par with that of the antigenic complex preparation obtained from the cell surface, irrespectively of the cultivation method. A possibility was demonstrated for the “C” complex isolation process to be optimized using, in particular, the ultrafiltration step. The ultrafiltration fiber apparatus involved in the process permits concentrated cultural fluids to be obtained in a short time, thus providing a promising method for scaling the technology of the “C” complex production.

Key words: Francisella tularensis, antigen, immunogenicity, ultrafiltration.

Поступила 27.04.06.