КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ДЛЯ МОДУЛЯЦИИ ПЕРЕДАЧИ СИГНАЛА LAIR
COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODULATING THE TRANSMISSION OF A LAIR SIGNAL

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
По настоящей заявке испрашивается приоритет по предварительной патентной заявке США № 62/370334, зарегистрированной 3 августа 2016 года, и предварительной патентной заявке США № 62/450300, зарегистрированной 25 января 2017 года, содержание которых включено в настоящее описание посредством ссылки в полном объеме.
ССЫЛКА НА СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
Список последовательностей, поданный 3 августа 2017 года, в виде текстового файла под названием "LAIR1ST25.txt", созданного 3 августа 2017 года и имеющего размер 136 килобайт, включен, таким образом, в настоящее описание посредством ссылки в соответствии с 37 C.F.R. 1,52(e)(5).
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение, в целом, относится к области иммуномодуляции и, более конкретно, к композициям и способам для модуляции передачи сигнала LAIR-1 для повышения или снижения иммунного ответа и для лечения лейкозов посредством прямой регуляции выживания и самоподдержания лейкозных клеток.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
J. Leukoc. Biol.
Matrix Biol.
J. Leukoc. Biol.
Gene
Лейкоцит-ассоциированный иммуноглобулин-подобный рецептор-1 (LAIR-1) является ингибиторным рецептором поверхности клетки, экспрессирующимся на многих иммунных клетках и вызывающим ингибиторную передачу сигнала через два цитоплазматических домена с иммунорецепторными тирозиновыми ингибиторными мотивами (ITIM) (Verbrugge et al., 2006, 79:828-836). LAIR-1 перекрестно сшивается многочисленными коллагенами, компонентом комплемента C1q и белком сурфактанта D (SP-D), индуцируя отрицательную передачу сигнала, ингибирующую созревание, пролиферацию и дегрануляцию иммунных клеток (Lebbink et al., 2009, 28:202-210; Meyaard., 2008, 83:799-803). Геном человека, но не мыши, кодирует растворимый белок LAIR-2 (Sun et al., 2014, 552:140-145). Белок LAIR-2 связывается с теми же лигандами, что и LAIR-1 и, таким образом, может функционировать в качестве ловушки для снижения передачи ингибиторных сигналов через LAIR-1.
Gene
Leukemia
Haematolagica
Immunity
Biochem. Biophys. Res. Commun.
Ингибиторная передача сигнала LAIR-1 может предотвращать аутоиммунные заболевания, такие как красная волчанка, ревматоидный артрит, аутоиммунные заболевания щитовидной железы и атеросклероз, а также контактную гиперчувствительность (Sun et al., 2014, 552:140-145). Сниженная экспрессия LAIR-1 на клетках при хроническом лимфоцитарном лейкозе ассоциирована с усилением заболевания (Poggi et al., 2008, 22:980-988; Perbellini et al., 2014, 99:881-887). Также показано, что LAIR-1 экспрессируется на клетках эпителиального рака яичников и других опухолей человека, хотя функция LAIR-1, экспрессирующегося на солидных опухолях, остается неясной (Meyaard et al., 1997, 7:283-290; Cao et al., 2015, 458:399-404).
Nat. Cell Biol.
Показано, что экспрессия LAIR-1 на клетках острого миелолейкоза (AML) и, потенциально, клетках острого лимфобластного лейкоза (ALL) необходима для их роста с помощью фосфатаза-независимого пути передачи сигнала LAIR-1-SHP-1-CAMK1-CREB, ингибирующего апоптоз и дифференцировку лейкозных стволовых клеток для сохранения способности к самоподдержанию или "стволовости" этих клеток (Kang et al., 2015, 17:665-677).
В целом, накопленные данные о LAIR-1 свидетельствуют о его важной роли в иммунном гомеостазе, однако, сохраняется потребность в композициях и способах модуляции LAIR-1 для лечения заболеваний и нарушений.
Таким образом, целью изобретения является предоставление композиций, повышающих отрицательную передачу сигнала LAIR-1, и способов их применения для лечения воспалительных заболеваний и нарушений и аутоиммунных заболеваний.
Кроме того, целью изобретения является предоставление композиций, снижающих отрицательную передачу сигнала LAIR-1, и способов их применения для лечения злокачественных новообразований и инфекционных заболеваний.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к композициям и способам их применения для модуляции LAIR-1. Например, изобретение относится к иммуномодулирующим средствам, снижающим экспрессию LAIR-1, связывание лиганда, перекрестное сшивание, передачу сигнала или их комбинацию. LAIR-1 может экспрессироваться, например, миелоидной клеткой, T-клеткой, естественным киллером (NK) или их комбинацией. Миелоидная клетка может являться антигенпрезентирующей клеткой, например, моноцитом, макрофагом или дендритной клеткой. В некоторых вариантах осуществления композиции специфически воздействуют на один или несколько из указанных выше типов клеток.
Описанные средства можно использовать для повышения иммунного ответа у нуждающегося в этом субъекта. Иммунный ответ может являться, например, первичным иммунным ответом на антиген или повышением функции эффекторных клеток, таким как повышение антиген-специфической пролиферации T-клеток, повышение продукции цитокинов T-клетками, стимуляция дифференцировки или их комбинация. Примеры средств включают (i) растворимый полипептид или слитый белок LAIR-2, (ii) растворимый полипептид или слитый белок LAIR-1, (iii) блокирующее функцию антитело против LAIR-1, (iv) антитело, которое можно использовать для истощения LAIR-1-положительных клеток, и (v) их комбинации. В некоторых вариантах осуществления иммуномодулирующее средство является антагонистом LAIR-1.
В конкретных вариантах осуществления средство является слитым белком LAIR-2, например, слитым белком, включающим внеклеточный домен LAIR-2 или его функциональный вариант, соединенный с иммуноглобулиновым доменом. Пример слитого белка включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16.
В других вариантах осуществления средство является белком LAIR-2 или его функциональным фрагментом или вариантом. Например, белок LAIR-2 или его функциональный фрагмент или вариант может иметь по меньшей мере 80%, 90%, 95% или 100% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO: 6.
Средство может являться слитым белком LAIR-1, например, слитым белком, включающим внеклеточный домен LAIR-1 или его функциональный вариант, соединенный с иммуноглобулиновым доменом. Пример слитого белка LAIR-1 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9.
В других вариантах осуществления средство является растворимым белком LAIR-1 или его функциональным фрагментом или вариантом. Например, растворимый белок LAIR-1 может состоять из внеклеточного домена LAIR-1 или его функционального фрагмента или варианта. Пример растворимого белка имеет по меньшей мере 80%, 90%, 95% или 100% идентичности последовательности по отношению к SEQ ID NO: 2.
Способы повышения иммунного ответа у субъекта, как правило, включают введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества иммуномодулирующего средства, снижающего экспрессию LAIR-1, связывание лиганда, перекрестное сшивание, передачу сигнала или их комбинацию. Субъект может иметь, например, злокачественное новообразование или инфекционное заболевание.
В некоторых вариантах осуществления субъект, злокачественное новообразование или заболевание отличаются повышенной экспрессией LAIR-1, повышенной экспрессией лиганда LAIR-1, сниженной экспрессией LAIR-2 или их комбинацией. В конкретных вариантах осуществления злокачественное новообразование является раком яичника, раком легких, злокачественным новообразованием желудочно-кишечного тракта, острым миелолейкозом (AML) или острым лимфоидным лейкозом (ALL). Средство можно вводить одновременно или в комбинации в виде единой композиции с вакциной или ее компонентом.
Изобретение также относится к иммуномодулирующим средствам, повышающим экспрессию LAIR-1, связывание лиганда, перекрестное сшивание, отрицательную передачу сигнала или их комбинацию. Такие средства можно использовать для снижения иммунного ответа у нуждающегося в этом субъекта. Примеры средств включают: (i) активирующее функцию антитело против LAIR-1, (ii) блокирующее функцию антитело против LAIR-2 и (iii) их комбинацию.
Один из вариантов осуществления относится к антителу против LAIR, получаемому с помощью гибридомы, выбранной из группы, состоящей из 1E11, 1G7, 4B3, 5A6, 5E1, 6B2, 6F4, 6G6, 7G3, 9H6, 11B3, 12E10a и 12E10b.
Другой вариант осуществления относится к антителу против LAIR, содержащему по меньшей мере одну легкую цепь или по меньшей мере одну тяжелую цепь антитела, получаемого с помощью одной или нескольких гибридом, выбранных из группы, состоящей из 1E11, 1G7, 4B3, 5A6, 5E1, 6B2, 6F4, 6G6, 7G3, 9H6, 11B3, 12E10a и 12E10b.
Другой вариант осуществления относится к антителу против LAIR, содержащему вариабельную область легкой цепи, имеющую по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичности последовательности по отношению к вариабельной области легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 19, 27, 35, 43, 51, 59, 67, 75, 83, 91, 99, 107 или 115.
Другой вариант осуществления относится к антителу против LAIR, содержащему вариабельную область тяжелой цепи, имеющую по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, или 100% идентичности последовательности по отношению к вариабельной области тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 23, 31, 39, 47, 55, 63, 71, 79, 87, 95, 103 или 111.
Другой вариант осуществления относится к антителу против LAIR, содержащему вариабельную область легкой цепи, имеющую по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичности последовательности по отношению к вариабельной области легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 19, 27, 35, 43, 51, 59, 67, 75, 83, 91, 99, 107 или 115, и вариабельную область тяжелой цепи, имеющую по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичности последовательности по отношению к аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 23, 31, 39, 47, 55, 63, 71, 79, 87, 95, 103 или 111.
Другой вариант осуществления относится к антителу против LAIR, содержащему определяющую комплементарность область (CDR), выбранную из группы CDR, имеющих аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 20-22, 24-26, 28-30, 32-34, 36-38, 40-42, 44-46, 48-50, 52-54, 56-58, 60-62, 64-66, 68-70, 72-74, 76-78, 80-82, 84-86, 88-90, 92-94, 96-98, 100-102, 104-106, 108-110, 112-114 и 116-118.
Другой вариант осуществления относится к антителу против LAIR, содержащему множество CDR, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 20-22, 24-26, 28-30, 32-34, 36-38, 40-42, 44-46, 48-50, 52-54, 56-58, 60-62, 64-66, 68-70, 72-74, 76-78, 80-82, 84-86, 88-90, 92-94, 96-98, 100-102, 104-106, 108-110, 112-114 и 116-117. Множество CDR может составлять 2-12.
Другой вариант осуществления относится к химерному антителу, содержащему тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью, имеющей по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичности последовательности по отношению к аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 120 или SEQ ID NO: 122, и/или легкую цепь с аминокислотной последовательностью, имеющей по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичности последовательности по отношению к аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 124.
Другой вариант осуществления относится к химерному антителу, содержащему тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью, имеющей по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичности последовательности по отношению к аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 126 или SEQ ID NO: 128, и/или легкую цепь с аминокислотной последовательностью, имеющей по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичности последовательности по отношению к аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 130.
Другой вариант осуществления относится к химерному антителу, содержащему тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью, имеющей по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичности последовательности по отношению к аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 132 или SEQ ID NO: 134, и/или легкую цепь с аминокислотной последовательностью, имеющей по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичности последовательности по отношению к аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 136.
Другой вариант осуществления относится к химерному антителу, содержащему тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью, имеющей по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичности последовательности по отношению к аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 138 или SEQ ID NO: 140, и/или легкую цепь с аминокислотной последовательностью, имеющей по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичности последовательности по отношению к аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 142.
Другой вариант осуществления относится к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело, содержащее аминокислотную последовательность легкой цепи, соответствующую SEQ ID NO: 124, 130, 136 или 142, и/или аминокислотную последовательность тяжелой цепи, соответствующую SEQ ID NO: 120, 122, 126, 128, 132, 134, 138 или 140.
Другой вариант осуществления относится к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельную область легкой цепи, соответствующую SEQ ID NO: 19, 27, 35, 43, 51, 59, 67, 75, 83, 91, 99, 107 или 115, и/или вариабельную область тяжелой цепи, соответствующую SEQ ID NO: 23, 31, 39, 47, 55, 63, 71, 79, 87, 95, 103 или 111. Нуклеиновые кислоты, кодирующие легкую цепь и/или тяжелую цепь, могут являться частью экспрессирующего вектора. Нуклеиновые кислоты могут экспрессироваться клеткой. Экспрессия может являться индуцибельной или конститутивной.
Другой вариант осуществления относится к клетке, конститутивно или индуцибельно экспрессирующей антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфически связывающиеся с LAIR-1, где клетка содержит нуклеиновую кислоту или нуклеиновые кислоты, кодирующие аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 19, 27, 35, 43, 51, 59, 67, 75, 83, 91, 99, 107, 115, 23, 31, 39, 47, 55, 63, 71, 79, 87, 95, 103, 111 или их комбинацию.
Другой вариант осуществления относится к клетке, конститутивно или индуцибельно экспрессирующей антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфически связывающиеся с LAIR-1, где клетка содержит нуклеиновую кислоту или нуклеиновые кислоты, кодирующие аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142 или их комбинацию.
Способы снижения иммунного ответа у субъекта, как правило, включает введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества иммуномодулирующего средства, повышающего экспрессию LAIR-1, связывание лиганда, перекрестное сшивание, отрицательную передачу сигнала или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления субъект имеет воспаление, аутоиммунное нарушение. В конкретном варианте осуществления субъект имеет ревматоидный артрит.
В некоторых вариантах осуществления субъект, или заболевание, или состояние отличается сниженной экспрессией LAIR-1, сниженной экспрессией лиганда LAIR-1, повышенной экспрессией LAIR-2 или их комбинацией.
Любой из описанных способов может включать введение субъекту иммуномодулирующего средства в отдельности или в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтическими средствами.
Один из вариантов осуществления относится к способу лечения лейкоза у нуждающегося в этом субъекта посредством введения субъекту эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей моноклональное антитело против LAIR-1, растворимый полипептид LAIR-1, растворимый полипептид LAIR-2, слитый белок LAIR-1, слитый белок LAIR-2 или их комбинации, для ингибирования или снижения передачи сигнала LAIR-1 в лейкозных клетках и, таким образом, ингибирования выживания лейкозных клеток или стимуляции противоопухолевого иммунного ответа на лейкозные клетки. Лейкоз может являться острым миелолейкозом.
Один из вариантов осуществления относится к способу оценки или прогнозирования эффективности лечения с использованием связывающей молекулы против LAIR посредством анализа клеток субъекта, нуждающегося в лечении, для определения того, экспрессируют ли клетки LAIR, партнеров LAIR по связыванию или и то, и другое. Неограничивающие примеры клеток, подлежащих анализу, включают злокачественные клетки, полученные из субъекта. Неограничивающие примеры злокачественных клеток включают клетки острого миелолейкоза (AML). Считают, что злокачественные клетки, экспрессирующие многочисленные взаимодействующие ингибиторные рецепторы лучше отвечают на лечение с использованием связывающих молекул против LAIR. Неограничивающие примеры партнеров LAIR по связыванию включают трансмембранные коллагены (XIII, XVII и XXIII) и LILRB4. На фигуре 3 показан прогнозируемый исход лечения с учетом наличия LAIR-1 или партнеров LAIR-1 по связыванию на злокачественных клетках.
Один из вариантов осуществления относится к слитому белку, соответствующему SEQ ID NO: 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 или 18.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фигура 1A представляет собой таблицу, в которой представлена аминокислотная последовательность вариабельных областей легких цепей антител против LAIR-1 из клонов 1E11, 1G7, 4B3, 5A6, 5E1, 6B2, 6F4, 6G6, 7G3, 9H6, 11B3, 12E10a и 12E10b. Фигура 1B представляет собой таблицу, в которой представлена аминокислотная последовательность вариабельных областей тяжелых цепей антител против LAIR-1 из клонов 1E11, 1G7, 4B3, 5A6, 5E1, 6B2, 6F4, 6G6, 7G3, 9H6, 11B3 и 12E10 (a и b).
Фигура 2A представляет собой график множественного выравнивания вариабельных областей легких цепей из указанных гибридом. Фигура 2B представляет собой график множественного выравнивания вариабельных областей тяжелых цепей из указанных гибридом.
Фигура 3 представляет собой таблицу, в которой показаны предполагаемые исходы лечения с учетом экспрессии LAIR-1, партнеров LAIR-1 по связыванию или их комбинаций.
Фигура 4 представляет собой принципиальную схему, на которой проиллюстрирована регуляция LAIR иммунной функции и гомеостаза.
Фигура 5 представляет собой принципиальную схему LAIR-2 Fc и моноклональных антител против LAIR-1 (mAb) с качестве терапевтических средств.
На фигуре 6A показан гель ПААГ с LAIR-2 Fc после электрофореза в присутствие SDS. На фигуре 6B показана эксклюзионная хроматограмма LAIR-2 Fc.
Фигура 7A представляет собой график активируемой флуоресценцией сортировки клеток (FACS) клеток K562-Col17, окрашенных с использованием LAIR-2 Fc, а затем PE-меченым антителом против hIg. Фигура 7B представляет собой график FACS контрольных клеток, окрашенных с использованием LAIR-2 Fc, а затем PE-меченым антителом против hIg. Фигура 7C представляет собой график FACS контрольных клеток, окрашенных с использованием LAIR-1 Fc, а затем PE-меченым антителом против hIg. Фигура 7D представляет собой график FACS контрольных клеток, окрашенных с использованием LAIR-1 Fc, а затем PE-меченым антителом против hIg. На фигуре 7E показан гель ПААГ с LAIR-1 Fc и LAIR-2 Fc после электрофореза в присутствие SDS в невосстанавливающих условиях. На фигуре 7F показан гель ПААГ с LAIR-1 Fc и LAIR-2 Fc после электрофореза в присутствие SDS в восстанавливающих условиях.
Фигура 8A представляет собой график FACS T-клеток Jurkat, окрашенных с использованием α-LAIR-1. Фигура 8B представляет собой график FACS T-клеток Jurkat, окрашенных с использованием LAIR-1 Fc. Фигура 8C представляет собой график FACS T-клеток Jurkat, окрашенных с использованием LAIR-2 Fc. Фигура 8D представляет собой график FACS клеток K562 Col 17, окрашенных с использованием α-LAIR-1. Фигура 8E представляет собой график FACS клеток K562 Col 17, окрашенных с использованием LAIR-1 Fc. Фигура 8F представляет собой график FACS клеток K562 Col 17, окрашенных с использованием LAIR-2 Fc. Фигура 8G представляет собой график FACS клеток THP-1 AML, окрашенных с использованием α-LAIR-1. Фигура 8H представляет собой график FACS клеток K562 Col 17, окрашенных с использованием LAIR-1 Fc. Фигура 8I представляет собой график FACS клеток K562 Col 17, окрашенных с использованием LAIR-2 Fc.
Фигура 9A представляет собой линейный график % NF-kB-GFP+ относительно антитела против CD3 (мкг/мл). LAIR-2 Fc (•), контрольный Fc () и среды (). Фигура 9B представляет собой линейный график NFAT-Lucia (RLU) относительно белка (мкг/мл). LAIR-2 Fc (•) и контрольный Fc (). Фигура 9C представляет собой гистограмму ИЛ-2 (пг/мл) относительно белка в количестве 10 мкг/мл; результаты для LAIR-2 Fc показаны слева, для контрольного Fc - справа. Фигура 9D представляет собой гистограмму ФНО (пг/мл) относительно белка в количестве 10 мкг/мл; результаты для LAIR-2 Fc показаны слева, для контрольного Fc - справа.
Фигура 10A представляет собой линейный график MFI относительно белка (мкг/мл), на котором показано, что LAIR-2 Fc (•) связывается с клетками THP-1 дозозависимым образом по сравнению с контрольным Fc (). Фигура 10B представляет собой гистограмму. Фигура 10B представляет собой гистограмму индукции IRF (интерферон-регуляторного фактора) (RLU) в случае клеток THP-1, обработанных 1 мкг/мл LPS и LAIR-2 Fc (правая колонка в каждой паре) или контрольным Fc (левая колонка в каждой паре). Фигура 10C представляет собой гистограмму индукции IRF (RLU) в случае клеток THP-1, обработанных средами RPMI и LAIR-2 Fc (правая колонка в каждой паре) или контрольным Fc (левая колонка в каждой паре).
Фигура 11A представляет собой линейный график % пролиферации T-клеток, измеряемой с помощью разбавленной CFSE популяции клеток относительно OKT3 (мкг/мл) в случае CD4+ T-клеток, обработанных LAIR-2 Fc (•) или контрольным Fc (). Фигура 11B представляет собой линейный график % пролиферации T-клеток, измеряемой с помощью CFSE относительно OKT3 (мкг/мл), в случае CD8+ клеток, обработанных LAIR-Fc (•) или контрольным Fc ().
Фигура 12A представляет собой гистограмму CD3+CD4+ T-клеток донора 1710, выделенных из мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC), обработанных LAIR-2 Fc. Фигура 12B представляет собой гистограмму CD3+CD8+ T-клеток донора 1710, выделенных из мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC), обработанных LAIR-2 Fc. Фигура 12C представляет собой гистограмму CD3-CD16+CD56+ NKC-клеток донора 1710, выделенных из мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC), обработанных LAIR-2 Fc. Фигура 12D представляет собой гистограмму CD14+ моноцитов донора 1710, выделенных из мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC), обработанных LAIR-2 Fc. Фигура 12E представляет собой гистограмму CD3+CD4+ T-клеток донора 1711, выделенных из мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC), обработанных LAIR-2 Fc. Фигура 12F представляет собой гистограмму CD3+CD8+ T-клеток донора 1711, выделенных из мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC), обработанных LAIR-2 Fc. Фигура 12G представляет собой гистограмму CD3-CD16+CD56+ NKC-клеток донора 1711, выделенных из мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC), обработанных LAIR-2 Fc. Фигура 12H представляет собой гистограмму CD14+ моноцитов донора 1711, выделенных из мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC), обработанных LAIR-2 Fc. Фигура 12I представляет собой гистограмму CD3+CD4+ T-клеток донора 1712, выделенных из мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC), обработанных LAIR-2 Fc. Фигура 12J представляет собой гистограмму CD3+CD8+ T-клеток донора 1712, выделенных из мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC), обработанных LAIR-2 Fc. Фигура 12CK представляет собой гистограмму CD3-CD16+CD56+ NKC-клеток донора 1712, выделенных из мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC), обработанных LAIR-2 Fc. Фигура 12L представляет собой гистограмму CD14+ моноцитов донора 1712, выделенных из мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC), обработанных LAIR-2 Fc.
in vivo
Фигура 13 представляет собой диаграмму обработки для экспансии T-клеток OT-1 . Фигура 13B представляет собой линейный график % OT-1 (донорных) от всех CD8+ T-клеток относительно дней после трансплантации OT-1 в случае клеток, обработанных LAIR-2 Fc () или контрольным Fc (○).
Фигура 14A представляет собой гистограмму проточной цитометрии, на которой показана прединъекционная оценка уровней и соотношения CFSE у мышей, которым вводили спленоциты CD45.1 без пептида овальбумина (OVA). Фигура 14B представляет собой гистограмму проточной цитометрии, на которой показана прединъекционная оценка уровней и соотношения CFSE у мышей, которым вводили спленоциты CD45.1, нагруженные пептидом OVA (CFSE hi). Фигура 14C представляет собой гистограмму проточной цитометрии, на которой показана прединъекционная оценка уровней и соотношения CFSE у мышей, которым вводили спленоциты CD45.1, ненагруженных пептидов OVA (CFSE lo) и нагруженных пептидом OVA (CFSE hi). Фигура 14D представляет собой гистограмму проточной цитометрии через 48 часов после переноса спленоцитов: оценка меченых клеток в селезенке (гейтированных по CD45.1+ клеткам) (клетками-хозяевами являлись CD45.2) с наивными контролями (без OT-1). Фигура 14E представляет собой гистограмму проточной цитометрии через 48 часа после переноса спленоцитов: оценка меченых клеток в селезенке (гейтированных по CD45.1+ клеткам) (клетками-хозяевами являлись CD45.2), обработанных контрольным Fc OT-1. Фигура 14F представляет собой гистограмму проточной цитометрии через 48 часов после переноса спленоцитов: оценка меченых клеток в селезенке (гейтированных по CD45.1+ клеткам) (клетками-хозяевами являлись CD45.2), обработанных OT-1 LAIR-2 Fc. Фигура 14G представляет собой гистограмму % специфического лизиса, вычисленного как % специфического лизиса=[1-(соотношение в контроле без OT-I)/экспериментальное соотношение)]×100 для мышей, которым вводили Fc (левая колонка) и LAIR-2 Fc (правая колонка).
Фигура 15A представляет собой диаграмму модели лечения с использованием интраперитонеальной инъекции (i.p.) 5e6 опухолевых клеток ID8-OVA, инъецируемых в день 0. T-клетки OT-I инъецировали i.p. через 3 недели после опухоли. Введение 200 мкг LAIR-2 Fc или контрольного Fc начинали через день после переноса T-клеток и каждые 4 дня всего в количестве 5 доз. Фигура 15B представляет собой линейный график процента увеличения массы (опухолевой массы) относительно дней после инокуляции ID8.OVA. Контроль (); LAIR-2 Fc (•). Фигура 15C представляет собой линейный график процента выживания относительно дней после инокуляции ID8.OVA. Контроль (пунктирная линия), LAIR-2 Fc (сплошная линия).
Фигура 16 представляет собой линейный график выживания относительно дней после инокуляции ID8.OVA у мышей, которым инъецировали опухолевые клетки ID8-OVA и вводили 200 мкг LAIR-2 Fc или контрольного Fc, начиная через день после переноса T-клеток и каждые 4 дня всего в количестве 5 дней или проводили указанную обработку. Данные свидетельствуют о том, что LAIR-2 Fc с антителом против PD-1 представляет собой эффективное комбинированное иммунотерапевтическое средство при раке яичников. () цисплатин, (ρ) цисплатин+LAIR-2 Fc, (○) антитело против PD-1+LAIR-2 Fc, (σ) антитело против PD-1, (◊) LAIR-2 Fc, (шестиугольник) контрольный IgG.
Фигура 17A представляет собой диаграмму примера схемы лечения лимфомы с использованием LAIR-2 Fc. Фигура 17B представляет собой линейный график объема опухоли относительно дней после инокуляции опухоли у мышей, которым вводили контрольный Fc () или LAIR-2 Fc (). Фигура 17C представляет собой линейный график процента выживания относительно дней после инокуляции опухоли у мышей, которым вводили контрольный Fc (пунктирная линия) или LAIR-2 Fc (сплошная линия).
Фигура 18 представляет собой гистограмму процента положительных результатов связывания указанного mAb (моноклонального антитела) со следующими линиями клеток (слева направо для каждой группы): HL-60 (LAIR-1 +), MV-4-11 (LAIR-1 +) K562-LAIR-1 (трансфицированные) и U266B1 (отрицательный контроль).
Фигура 19 представляет собой гистограмму поглощения (450 нм) для указанного mAb, на которой показано блокирование или усиление связывания LAIR-1 Fc с коллагеном I и III. Коллаген I указан в левой колонке и коллаген III указан в правой колонке для каждого mAb.
Фигура 20 представляет собой гистограмму поглощения (450 нм) указанных mAb при связывании с C1q и SP-D. Левая колонка для каждого набора соответствует C1q, а правая колонка соответствует SP-D.
Фигура 21 представляет собой таблицу, в которой показаны результаты анализа эпитопного биннинга химерного mAb против LAIR-1. Подчеркнутые одной линией антитела не демонстрировали блокирование. Подчеркнутыми двумя линиями антитела демонстрировали блокирование. Связывание mAb, связывающихся с одним и тем же эпитопом, с LAIR-1 Fc будет блокироваться по причине насыщения связывания, что можно наблюдать, когда одно и то же mAb используют в качестве первого и второго mAb (без подчеркивания, заштрихованный фон).
Фигура 22 представляет собой диаграмму карты биннинга химерного mAb против LAIR-1. На этой карте показано, что существует значительное перекрывание mAb, хотя многие из них занимают разные участки на молекуле LAIR-1.
Фигура 23 представляет собой таблицу, в которой показана оценка оптимизированной аффинности указанных mAb против LAIR-1, осуществленная с использованием устройства Octet RED96 (ForteBio).
Фигура 24A представляет собой гистограмму индукции IRF (RLU) для указанных mAb против LAIR-1, на которой показана дифференциальная индукция репортерной активности интерферона в клетках THP-1, когда планшет покрывали mAb. Фигура 24B представляет собой гистограмму индукции IRF (RLU) для указанных mAb против LAIR-1, на которой показана дифференциальная индукция репортерной активности интерферона в клетках THP-1, когда mAb добавляли в виде растворимых белков.
Фигура 25A представляет собой гистограмму индукции NFAT (RLU) для указанных mAb против LAIR-1, на которой показана индукция репортерной активности T-клеток Jurkat, когда планшеты покрывали антителом против CD3 (OKT3 в количестве 0,5 мкг/мл). После аспирации OKT3 покрывали mAb против LAIR-1 или LAIR-2 Fc и контрольным Fc в течение 24 часов в количестве 10 мкг/мл. Перед добавлением репортерных для пути NFAT-Lucia T-клеток Jurkat (Invivogen) аспирировали несвязавшиеся белки. T-клетки Jurkat высевали в количестве 50000 клеток/на лунку в общем объеме 200 мкл. Через 48 часов удаляли 10 мкл супернатанта и переносили в отдельный планшет. Quanti-Luc (Inivivogen) добавляли по протоколу. Люминесценцию анализировали с использованием спектрофотометра для чтения планшетов Perkin Elmer Envision. Фигура 25B представляет собой гистограмму индукции NFAT (RLU) для указанных mAb, на которой показана индукция репортерной активности T-клеток Jurkat, как на фигуре 25a, когда mAb против LAIR-1, LAIR-2 Fc и контрольный Fc добавляли в растворимой форме.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
I. Определения
В рамках изобретения указывают, что молекула способна "иммуноспецифически связываться" со второй молекулой, если для такого связывания характерна специфичность и аффинность антитела для его когнатного антигена. Указывают, что антитела способны иммуноспецифически связываться с целевой областью или конформацией ("эпитопом") антигена, если такое связывание включает участок распознавания антигена на молекуле иммуноглобулина. Антитело, иммуноспецифически связывающееся с конкретным антигеном, может связываться с другими антигенами с более низкой аффинностью, если другой антиген имеет некоторое сходство последовательности или конформационное сходство, распознаваемое участком распознавания антигена, что определяют с помощью, например, иммунологических анализов, анализов BIACORE или других анализов, известных в этой области, но не будет связываться с полностью неродственным антигеном. Однако в некоторых вариантах осуществления антитела (и их антигенсвязывающие фрагменты) не будут перекрестно реагировать с другими антигенами. Антитела также могут неиммуноспецифически связываться с другими молекулами, такими как рецепторы FcR, с помощью связывающих доменов в других областях/доменах молекулы, не включающих участок распознавания антигена, таких как Fc-область.
В рамках изобретения указывают, что молекула "физиоспецифически связывается" со второй молекулой, если для такого связывания характерна специфичность и аффинность рецептора для его когнатного связывающегося лиганда. Молекула может быть способна физиоспецифически связываться с несколькими другими молекулами.
et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5
Ed. Public Health Service, National Institutes of Health
J. Mol. Biol.
et al.
Trends Biochem. Sci.
et al.
, Cur. Pharm. Biotech
J. Immunol. Meth
см.
The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore
th
1
2
3
4
1
2
В рамках изобретения термин "антитело" предназначен для обозначения молекулы иммуноглобулина, обладающей "вариабельной областью" участка распознавания антигена. Термин "вариабельная область" предназначен для различения такого домена иммуноглобулина и доменов, более или менее общих для антител (таких как Fc-домен антитела). Вариабельная область включает "гипервариабельную область", остатки в которой отвечают за связывание антигена. Гипервариабельная область включает аминокислотные остатки из "определяющей комплементарность области" или "CDR" (т.е., как правило, приблизительно остатки 24-34 (L1), 50-56 (L2) и 89-97 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и приблизительно остатки 27-35 (H1), 50-65 (H2) и 95-102 (H3) в вариабельном домене тяжелой цепи; Kabat , Bethesda, MD. (1991)) и/или остатки из "гипервариабельной петли" (т.е. остатки 26-32 (L1), 50-52 (L2) и 91-96 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 26-32 (H1), 53-55 (H2) и 96-101 (H3) в вариабельном домене тяжелой цепи; Chothia and Lesk, 1987, 196:901-917). Остатки "каркасной области" или "FR" являются остатками вариабельного домена, иными, чем остатки гипервариабельной области, как определено в настоящем описании. Термин "антитело" включает моноклональные антитела, мультиспецифические антитела, антитела человека, гуманизированные антитела, синтетические антитела, химерные антитела, камелизированные антитела (см. например, Muyldermans ,2001, 26:230; Nuttall ,2000. 1:253; Reichmann and Muyldermans, 1999, . 231:25; международные патентные публикации №№ WO 94/04678 и WO 94/25591; патент США № 6005079), одноцепочечные Fv (scFv) (см., например, Pluckthun в eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)), одноцепочечные антитела, соединенные дисульфидной связью Fv (sdFv), интратела и антиидиотипические (анти-Id) антитела (включая, например, анти-Id и анти-анти-Id антитела против антител). В частности, такие антитела включают молекулы иммуноглобулинов любого типа (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY), класса (например, IgG, IgG, IgG, IgG, IgA и IgA) или подкласса.
2
В рамках изобретения термин "антигенсвязывающий фрагмент" антитела относится к одной или нескольким частям антитела, содержащим определяющие комплементарность области антитела ("CDR") и, необязательно, каркасные остатки, включающие "вариабельную область" участка распознавания антигена антитела, и проявляющим способность иммуноспецифически связываться с антигеном. Такие фрагменты включают Fab', F(ab'), Fv, одноцепочечный фрагмент (ScFv) и их мутанты, природные варианты и слитые белки, включающие "вариабельную область" антигенраспознающего участка антитела и гетерологичный белок (например, токсин, антигенраспознающий участок для другого антигена, фермент, рецептор или лиганд рецептора и т.д.).
В рамках изобретения термин "фрагмент" относится к пептиду или полипептиду, включающему аминокислотную последовательность из по меньшей мере 5 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 10 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 15 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 20 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 25 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 40 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 50 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 60 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 70 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 80 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 90 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 100 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 125 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 150 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 175 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 200 смежных аминокислотных остатков или по меньшей мере 250 смежных аминокислотных остатков.
В рамках изобретения термин "модулировать" относится к способности изменять эффект, результат или активность (например, передачу сигнала). Такая модуляция может являться агонистической или антагонистической. Антагонистическая модуляция может являться частичной (т.е. уменьшающей, но не прекращающей) или может полностью прекращать такую активность (например, нейтрализовать). Модуляция может включать интернализацию рецептора после связывания антитела или снижение экспрессии рецептора на клетке-мишени. Агонистическая модуляция может усиливать или иным образом повышать активность (например, передачу сигнала). В еще одном дополнительном варианте осуществления такая модуляция может изменять природу взаимодействия между лигандом и его когнатным рецептором, изменяя природу вызываемой передачи сигнала. Например, молекулы посредством связывания с лигандом или рецептором могут изменять способность таких молекул связываться с другими лигандами или рецепторами и, таким образом, изменять их общую активность. В некоторых вариантах осуществления такая модуляция будет обеспечивать по меньшей мере 10% изменение измеряемой активности иммунной системы, по меньшей мере 50% изменение такой активности или по меньшей мере 2-кратное, 5-кратное, 10-кратное или по меньшей мере 100-кратное изменение такой активности.
Термин "по существу", как используют в отношении связывания или проявляемого эффекта, предназначен для обозначения того, что наблюдаемый эффект является физиологически или терапевтически значимым. Таким образом, например, молекула способна, по существу, блокировать активность лиганда или рецептора, если степень блокирования является физиологически или терапевтически значимой (например, если такая степень является более чем на 60% завершенной, более чем на 70% завершенной, более чем на 75% завершенной, более чем на 80% завершенной, более чем на 85% завершенной, более чем на 90% завершенной, более чем на 95% завершенной или более чем на 97% завершенной). Аналогично, указывают, что молекула имеет, по существу, ту же иммуноспецифичность и/или характеристику, что и другая молекула, если такая иммуноспецифичность и характеристика является более чем на 60% идентичной, более чем на 70% идентичной, более чем на 75% идентичной, более чем на 80% идентичной, более чем на 85% идентичной, более чем на 90% идентичной, более чем на 95% идентичной или более чем на 97% идентичной).
В рамках изобретения "костимуляторные" сигналы включают положительные костимуляторные сигналы (например, сигналы, приводящие к повышению активности) и отрицательные костимуляторные сигналы (например, сигналы, приводящие к ингибированию активности).
Термин "производное" относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, иммуноспецифически связывающемуся с той же мишенью, что и родительское или референсное антитело, но отличающемуся по аминокислотной последовательности от родительского или референсного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента включением одной, двух, трех, четырех, пяти или более замен, добавлений, делеций или модификаций аминокислот относительно родительского или референсного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. В некоторых вариантах осуществления такие производные будут иметь, по существу, ту же иммуноспецифичность и/или характеристики или ту же иммуноспецифичность и характеристики, что и родительское или референсное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. Замены или добавления аминокислот в таких производных могут включать природные (т.е. ДНК-кодируемые) или неприродные аминокислотные остатки. Термин "производное" включает, например, химерные или гуманизированные варианты, а также варианты, имеющие измененные области CH1, шарнирные области, области CH2, CH3 или CH4, таким образом, что они образуют, например, антитела, и т.д., имеющие варианты Fc-областей, демонстрирующие повышенные или нарушенные эффекторные характеристики или характеристики связывания.
В рамках изобретения "химерное антитело" представляет собой молекулу, в которой различные части антитела получают из разных молекул иммуноглобулинов, таких как антитела, имеющие вариабельную область, полученную из не принадлежащего человеку антитела, и константную область иммуноглобулина человека.
В рамках изобретения, термин "гуманизированное антитело" относится к иммуноглобулину, включающему каркасную область человека и одну или несколько CDR из не принадлежащего человеку иммуноглобулина (как правило, мыши или крысы). Не принадлежащий человеку иммуноглобулин, из которого получают CDR, называют "донором", а иммуноглобулин человека, из которого получают каркас, называют "акцептором". Константные области могут отсутствовать, но если они есть, то должны быть, по существу, идентичными константным областям иммуноглобулинов человека, т.е. по меньшей мере на приблизительно 85-99% или приблизительно 95% или более идентичными. Таким образом, все части гуманизированного иммуноглобулина, за исключением, возможно, CDR, являются, по существу, идентичными соответствующим частям природных последовательностей иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело является антителом, включающим гуманизированную легкую цепь и гуманизированную тяжелую цепь иммуноглобулина. Например, гуманизированное антитело не будет включать типичное химерное антитело, т.к., например, вся вариабельная область химерного антитела не принадлежит человеку.
Термин "эндогенная концентрация" относится к уровню, на котором молекула нативно экспрессируется (т.е. в отсутствие экспрессирующих векторов или рекомбинантных промоторов) клеткой (при этом клетка может являться нормальной клеткой, злокачественной клеткой или инфицированной клеткой).
В рамках изобретения термины "лечить", "лечение" и "терапевтическое применение" относятся к устранению, снижению или улучшению одного или нескольких симптомов заболевания или нарушения. В рамках изобретения термин "терапевтически эффективное количество" относится к количеству терапевтического средства, достаточному для опосредования клинически значимого устранения, снижения или улучшения таких симптомов. Эффект является клинически значимым, если его величина является достаточной для влияния на здоровье или прогноз для субъекта-реципиента. Термин "терапевтически эффективное количество" может относиться к количеству терапевтического средства, достаточному для задержки или минимизации дебюта заболевания, например, задержки или минимизации распространения злокачественного новообразования. Термин "терапевтически эффективное количество" также может относиться к количеству терапевтического средства, обеспечивающему терапевтическую пользу при лечении заболевания.
В рамках изобретения термин "профилактическое средство" относится к средству, которое можно использовать в профилактике нарушения или заболевания до определения каких-либо симптомов такого нарушения или заболевания. "Профилактически эффективное" количество является количеством профилактического средства, достаточным для опосредования такой защиты. Термин "профилактически эффективное количество" также может относиться к количеству профилактического средства, обеспечивающему профилактическую пользу в профилактике заболевания.
В рамках изобретения термин "злокачественное новообразование" относится к неоплазии или опухоли, являющейся результатом неконтролируемого роста клеток. В рамках изобретения злокачественное новообразование конкретно включает лейкозы и лимфомы. Термин "злокачественное новообразование" относится к заболеванию, включающему клетки, обладающим потенциалом к метастазированию в отдаленные участки и проявляющим фенотипические признаки, отличающиеся от признаков незлокачественных клеток, например, образование колоний в трехмерном субстрате, таком как мягкий агар, или образование тубулярных сетей или подобных паутине матриц в трехмерном препарате базальной мембраны или внеклеточного матрикса. Незлокачественные клетки не образуют колонии в мягком агаре и образуют отдельные сфероподобные структуры в трехмерных препаратах базальной мембраны или внеклеточного матрикса.
В рамках изобретения термин "иммунная клетка" относится к любой клетке гемопоэтического происхождения, включая, в качестве неограничивающих примеров, T-клетки, B-клетки, моноциты, дендритные клетки и макрофаги.
В рамках изобретения термин "воспалительные молекулы" относится к молекулам, приводящим к воспалительным ответам, включая, в качестве неограничивающих примеров, цитокины и металлопротеазы, такие как, в качестве неограничивающих примеров, ИЛ-1β, ФНО, TGF-бета, ИФНγ, ИЛ-18, ИЛ-17, ИЛ-6, ИЛ-23, ИЛ-22, ИЛ-21 и MMP.
В рамках изобретения термин "валентность" относится к количеству доступных участков связывания на молекулу.
+
+
+
В рамках изобретения термины "иммунологический" или "иммунный" ответ означает развитие благоприятного гуморального (опосредованного антителами) и/или клеточного (опосредованного антиген-специфическими T-клетками или их продуктами секреции) ответа, направленного против пептида у пациента-реципиента. Такой ответ может являться активным ответом, индуцированным введением иммуногена, или пассивным ответом, индуцированным введением антитела или примированных T-клеток. Клеточный иммунный ответ вызван презентацией полипептидных эпитопов, связанных с молекулами MHC класса I или класса II, для активации антиген-специфических CD4 хелперных T-клеток и/или CD8 цитотоксических T-клеток. Ответ также может включать активацию моноцитов, макрофагов, NK-клеток, базофилов, дендритных клеток, астроцитов, клеток микроглии, эозинофилов, активацию или рекрутирование нейтрофилов или других компонентов врожденного иммунитета. Наличие опосредованного клетками иммунного ответа можно определять с помощью анализов пролиферации (CD4 T-клеток) или анализов CTL (цитотоксических T-лимфоцитов). Относительный вклад гуморального и клеточного ответов в протективный или терапевтический эффект иммуногена можно различать, раздельно выделяя антитела и T-клетки из иммунизированного сингенного животного и измеряя протективный или терапевтический эффект во втором субъекте.
"Иммуногенное средство" или "иммуноген" способен вызывать иммунный ответ против самого себя при введении млекопитающему, необязательно, в комбинации с адъювантом.
В рамках изобретения термины "субъект", "хозяин" и "пациент" в настоящем описании используют взаимозаменяемо, и они относятся к млекопитающему, включая, в качестве неограничивающих примеров, людей, грызунов, таких как мыши и крысы, и других лабораторных животных.
В рамках изобретения термин "полипептид" относится к цепи аминокислот любой длины, независимо от модификации (например, фосфорилирование или гликозилирование). Термин "полипептид" включает белки и их фрагменты. Полипептиды могут являться "экзогенными", что означает, что они являются "гетерологичными", т.е. чужеродными используемой клетке-хозяину, например, полипептид человека, продуцируемый бактериальной клеткой. Полипептиды представлены в настоящем описании в виде аминокислотных последовательностей. Эти последовательности написаны слева направо в направлении от амино- к карбокси-концу. В соответствии со стандартной номенклатурой, аминокислотные последовательности обозначают с помощью трехбуквенного или однобуквенного кода следующим образом: аланин (Ala, A), аргинин (Arg, R), аспарагин (Asn, N), аспарагиновая кислота (Asp, D), цистеин (Cys, C), глутамин (Gln, Q), глутаминовая кислота (Glu, E), глицин (Gly, G), гистидин (His, H), изолейцин (Ile, I), лейцин (Leu, L), лизин (Lys, K), метионин (Met, M), фенилаланин (Phe, F), пролин (Pro, P), серин (Ser, S), треонин (Thr, T), триптофан (Trp, W), тирозин (Tyr, Y) и валин (Val, V).
В рамках изобретения термин "вариант" относится к полипептиду или полинуклеотиду, отличающемуся от референсного полипептида или полинуклеотида, но сохраняющему необходимые свойства. Типичный вариант полипептида отличаются по аминокислотной последовательности от другого, референсного полипептида. В основном, отличия ограничены таким образом, что последовательности референсного полипептида и варианта очень схожи в целом и во многих областях идентичны. Вариант и референсный полипептид могут отличаться по аминокислотной последовательности одной или несколькими модификациями (например, заменами, добавлениями и/или делециями). Замененный или встроенный аминокислотный остаток может являться или не являться остатком, кодируемым генетическим кодом. Вариант полипептида может являться природным, таким как аллельный вариант, или может являться вариантом, о котором неизвестно, встречается ли он в природе.
Можно осуществлять модификации и изменения структуры полипептидов по изобретению и все равно получать молекулу, имеющую схожие с полипептидом характеристики (например, консервативную аминокислотную замену). Например, конкретные аминокислоты можно заменять другими аминокислотами в последовательности без заметной потери активности. Т.к. это представляет собой способность, основанную на взаимодействии, и соответствует природе полипептида, определяющей биологическую функциональную активность полипептида, можно осуществлять конкретные замены в аминокислотной последовательности полипептида и, несмотря на это, получать полипептид с подобными свойствами.
При осуществлении таких изменений можно учитывать индекс гидрофобности аминокислот. В целом, в этой области известна важность индекса гидрофобности аминокислот в придании интерактивной биологической функции полипептиду. Известно, что конкретные аминокислоты можно заменять другими аминокислотами, имеющими схожий индекс гидрофобности и все равно получать полипептид со схожей биологической активностью. Каждой аминокислоте приписан индекс гидрофобности на основе ее гидрофобности и характеристик заряда. Эти индексы являются следующими: изолейцин (+4,5); валин (+4,2); лейцин (+3,8); фенилаланин (+2,8); цистеин/цистин (+2,5); метионин (+1,9); аланин (+1,8); глицин (-0,4); треонин (-0,7); серин (-0,8); триптофан (-0,9); тирозин (-1,3); пролин (-1,6); гистидин (-3,2); глутамат (-3,5); глутамин (-3,5); аспартат (-3,5); аспарагин (-3,5); лизин (-3,9) и аргинин (-4,5).
Полагают, что относительный гидрофобный характер аминокислоты определяет вторичную структуру получаемого полипептида, что, в свою очередь, определяет взаимодействие полипептида с другими молекулами, такими как ферменты, субстраты, рецепторы, антитела, антигены и кофакторы. В этой области известно, что аминокислоту можно заменять другой аминокислотой, имеющей схожий индекс гидрофобности, и все равно получать функционально эквивалентный полипептид. При таких изменениях предпочтительной является замена аминокислот, индексы гидрофобности которых составляют в пределах ± 2, замены аминокислот с индексами в пределах ± 1 являются особенно предпочтительными, и замены аминокислот с индексами в пределах ± 0,5 являются даже более предпочтительными.
Замену подобных аминокислот также можно осуществлять с учетом гидрофильности, в частности, когда биологически функциональный эквивалентный полипептид или пептид, полученный таким образом, предназначен для использования в иммунологических вариантах осуществления. Аминокислотным остаткам приписывают следующие значения гидрофильности: аргинин (+3,0); лизин (+3,0); аспартат (+3,0 ± 1); глутамат (+3,0 ± 1); серин (+0,3); аспарагин (+0,2); глутамин (+0,2); глицин (0); пролин (-0,5 ± 1); треонин (-0,4); аланин (-0,5); гистидин (-0,5); цистеин (-1,0); метионин (-1,3); валин (-1,5); лейцин (-1,8); изолейцин (-1,8); тирозин (-2,3); фенилаланин (-2,5); триптофан (-3,4). Следует понимать, что аминокислоту можно заменять другой аминокислотой, имеющей схожее значение гидрофильности, и все равно получать биологически эквивалентный и, в частности, иммунологически эквивалентный полипептид. При таких изменениях предпочтительной является замена аминокислот, значение гидрофильности которых составляет в пределах ± 2, замены аминокислот со значением гидрофильности в пределах ± 1 являются особенно предпочтительными, и замены аминокислот со значением гидрофильности в пределах ± 0,5 являются даже более предпочтительными.
Как описано выше, замены аминокислот, как правило, основаны на относительном сходстве заместителей боковых цепей аминокислот, например, их гидрофобности, гидрофильности, заряда, размера и т.п. Примеры замен, при которых учитывают различные указанные выше характеристики, хорошо известны специалистам в этой области и включают (исходный остаток: пример замены): (Ala: Gly, Ser), (Arg: Lys), (Asn: Gln, His), (Asp: Glu, Cys, Ser), (Gln: Asn), (Glu: Asp), (Gly: Ala), (His: Asn, Gln), (Ile: Leu, Val), (Leu: Ile, Val), (Lys: Arg), (Met: Leu, Tyr), (Ser: Thr), (Thr: Ser), (Trp: Tyr), (Tyr: Trp, Phe) и (Val: Ile, Leu). Таким образом, в вариантах осуществления настоящего изобретения предусмотрены функциональные или биологические эквиваленты полипептида, как указано выше. В частности, варианты осуществления полипептидов могут включать варианты, имеющие приблизительно 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичности последовательности по отношению к интересующему полипептиду.
Термин "процент (%) идентичности последовательности" определяют как процентную долю нуклеотидов или аминокислот в последовательности-кандидате, идентичных нуклеотидам или аминокислотам в референсной последовательности нуклеиновой кислоты, после выравнивания последовательностей и встраивания пропусков, при необходимости, для достижения максимального процента идентичности последовательности. Выравнивания в целях определения процента идентичности последовательности можно достигать различными способами, известными специалистам в этой области, например, с использованием общедоступного компьютерного программного обеспечения, такого как программное обеспечение BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 или Megalign (DNASTAR). Подходящие параметры для выравнивания, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей, можно определять известными способами.
В целях по настоящему изобретению % идентичности последовательности указанных нуклеотидов или аминокислот в последовательности C по отношению к указанной последовательности нуклеиновой кислоты D (которую альтернативно можно формулировать как указанную последовательность C, имеющую конкретный % идентичности последовательности в отношении указанной последовательности D) вычисляют следующим образом:
100×W/Z фракции,
где W является количеством нуклеотидов или аминокислот, оцененных как идентичные совпадения с помощью программы для выравнивания последовательностей при выравнивании C и D, и где Z является общим количеством нуклеотидов или аминокислот в D. Следует понимать, что, если длина последовательности C не равна длине последовательности D, % идентичности последовательности C по отношению к D не будет равен % идентичности последовательности D по отношению к C.
В рамках изобретения термин "фармацевтически приемлемый носитель" включает любой из стандартных фармацевтических носителей, таких как фосфатно-солевой буфер, вода и эмульсии, такие как эмульсия масло/вода или вода/масло, и различные типы увлажнителей.
II. Композиции
Настоящее изобретение относится к LAIR-связывающим молекулам, применимым для модуляции передачи сигнала через белки LAIR. На фигуре 4 показана регуляция LAIR иммунной функции и гомеостаза. На фигуре 5 показано, как можно использовать mAb против LAIR-1 и LAIR-2 Fc в качестве терапевтических средств.
A. Полипептиды LAIR
Описаны полипептиды LAIR-1 и LAIR-2. Полипептиды могут включать аминокислотную последовательность полноразмерных белков LAIR-1 или LAIR-2 или ее фрагмент, или вариант, или слитый белок.
LAIR-1 является ингибиторным рецептором поверхности клетки, экспрессирующимся на многих иммунных клетках и вызывающим ингибиторную передачу сигнала через два цитоплазматических иммунорецепторных тирозиновых ингибиторных мотива (ITIM) (Verbrugge et al., 2006) (фигура 4). Геномы человека и не являющегося человеком примата, но не мыши, кодируют ген LAIR-2, являющегося растворимым гомологом LAIR-1 (Sun et al., 2014). В LAIR-2 отсутствуют трансмембранные и цитоплазматические домены, но он связывается с теми же лигандами, что и LAIR-1, и, таким образом, может функционировать в качестве ловушки для снижения ингибиторных сигналов через LAIR-1 (Meyaard, 2008). LAIR-1 и LAIR-2 взаимодействуют с множеством коллагенов, включая фибриллярные коллагены I и III и трансмембранные коллагены 13, 17 и 23, но также могут связываться с другими коллагенами с разной степенью благодаря распознаванию канонического гидроксипролинового повтора Gly-Pro-Hyp (Meyaard, 2008). LAIR-1 и LAIR-2 также связываются с компонентом комплемента C1q, белком сурфактанта D (SP-D) и маннозо-связывающим лектином (MBL). Перекрестное сшивание этих молекул с LAIR-1 на плазматической мембране лейкоцитов индуцирует отрицательную передачу сигнала, ингибирующую созревание, пролиферацию и дегрануляцию иммунных клеток (Lebbink et al., 2009, Meyaard, 2008).
Ингибиторная передача сигнала LAIR-1 может предотвращать аутоиммунные заболевания, такие как красная волчанка, ревматоидный артрит, аутоиммунное заболевание щитовидной железы и атеросклероз, а также контактную гиперчувствительность (Sun et al., 2014). При этом гиперэкспрессия LAIR-2 может способствовать аутоиммунности в результате связывания лигандов LAIR-1 с ловушкой. Связывание LAIR-2 с лигандами LAIR-1 может, по существу, снижать перекрестное сшивание LAIR-1 на поверхности клеток, ограничивая ингибиторные пути передачи сигнала, приводящие к иммунной гиперреакции. С другой стороны, предполагают, что повышенные уровни LAIR-2 могут способствовать противоопухолевому иммунитету посредством того же механизма.
Сниженная экспрессия LAIR-1 на клетках хронического лимфоцитарного лейкоза (CLL) ассоциирована с усилением заболевания (Poggi et al., 2008; Perbellini et al., 2014). С другой стороны, исследования позволяют предполагать, что повышенная экспрессия LAIR-1 при остром миелолейкозе (AML) способствует выживанию AML посредством поддержания состояния, подобного состоянию стволовых клеток, и предотвращения дифференцировки и апоптоза (Kang et al., 2015). В поддержку этого предположения, в других исследованиях также показано, что LAIR-1 повышен при AML и остром лимфобластном лейкозе (ALL) (Mirkowska et al., Blood, 2013; Chen et al., Nature, 2015; Zhang et al., обзор на life.sciechina.com, 2015). Также показано, что LAIR-1 экспрессируется на клетках эпителиального рака яичников и других опухолях человека, хотя функция LAIR-1, экспрессирующегося на солидных опухолях, остается неясной (Meyaard et al., 1997; Cao et al., 2015).
Микроокружение опухоли зачастую богато белками внеклеточного матрикса (ECM), включая коллагены (Rygiel et al., 2011). Таким образом, LAIR-1-экспрессирующие клетки, локализованные в микроокружении опухоли, могут, в частности, супрессироваться посредством перекрестного сшивания коллагена с LAIR-1 и последующей ингибиторной передачи сигнала. Примечательно, что показано, что коллаген и C1q ограничивают или изменяют дифференцировку и активацию антигенпрезентирующих клеток (моноцитов/макрофагов/DC) через LAIR-1. Исследования показали, что перекрестное сшивание LAIR-1 на NK-клетках может ингибировать пролиферацию и функционирование T-клеток. Однако, необходимо дальнейшее исследование роли LAIR-1 в регуляции противоопухолевого иммунитета.
В совокупности, накопленные данные о LAIR-1 свидетельствуют о его важной роли в модуляции иммунитета. Однако дифференциальная экспрессия LAIR-1 на клетках мыши и человека, а также наличие LAIR-2 у людей, но не у мышей, позволяет предполагать, что исследования на мышах могут не быть показательными в отношении функции LAIR-1/LAIR-2 у людей. Поскольку предполагают, что систему человека легче можно использовать терапевтически из-за наличия LAIR-2. Другими словами, LAIR-2 можно использовать терапевтически для модуляции функции LAIR-1 у людей, что невозможно в системе мыши. Таким образом, белки-ловушки LAIR-2 Fc или блокирующие (антагонистические) mAb против LAIR-1 могут быть эффективными для иммунотерапии злокачественных новообразований для повышения иммунной функции посредством предотвращения передачи сигнала через LAIR-1 на поверхности клеток (фигура 5). С другой стороны, агонистические mAb против LAIR-1 или блокирование LAIR-2 с помощью mAb можно использовать для лечения аутоиммунного заболевания, т.к. они, по существу, будут повышать передачу сигнала через LAIR-1, таким образом, отрицательно регулируя иммунные ответы.
1. LAIR-1
Представлены последовательности LAIR-1. В некоторых вариантах осуществления лидирующая аминокислота метионин отщепляется в посттрансляционной форме белка.
a. LAIR-1 человека
Последовательности LAIR-1 человека известны в этой области. Например, консенсусная последовательность LAIR-1a (изоформа 1) представляет собой
MSPHPTALLGLVLCLAQTIHTQEEDLPRPSISAEPGTVIPLGSHVTFVCRGPVGVQTFRL
ERESRSTYNDTEDVSQASPSESEARFRIDSVSEGNAGPYRCIYYKPPKWSEQSDYLELLV
KETSGGPDSPDTEPGSSAGPTQRPSDNSHNEHAPASQGLKAEHLYILIGVSVVFLFCLLL
LVLFCLHRQNQIKQGPPRSKDEEQKPQQRPDLAVDVLERTADKATVNGLPEKDRETDTSA
LAAGSSQEVTYAQLDHWALTQRTARAVSPQSTKPMAESITYAAVARH
(SEQ ID NO: 1, UniProtKB - Q6GTX8 (LAIR1_HUMAN)), где аминокислоты 1-21 представляют собой сигнальную последовательность, аминокислоты 22-165 (подчеркнуты) представляют собой внеклеточный домен, аминокислоты 166-186 представляют собой трансмембранный домен, и аминокислоты 187-287 представляют собой цитоплазматический домен. Аминокислоты 29-117 образуют Ig-подобный C2-домен. Аминокислоты 249-254 и 279-284 образуют мотив ITIM 1 и 2, соответственно. В LAIR-1b (также известном как изоформа 2) отсутствуют аминокислоты 122-138 относительно SEQ ID NO: 1. В LAIR-1c (также известном как изоформа 3) отсутствуют аминокислоты 23-23 и 122-138 относительно SEQ ID NO: 1. В LAIR-1d (также известном как изоформа 4) отсутствуют аминокислоты 210-287 относительно SEQ ID NO: 1.
Как представлено выше, внеклеточный домен LAIR-1 человека может представлять собой
QEEDLPRPSISAEPGTVIPLGSHVTFVCRGPVGVQTFRLERESRSTYNDTEDVSQASPSESEARFRIDSVSEGNAGPYRCIYYKPPKWSEQSDYLELLVKETSGGPDSPDTEPGSSAGPTQRPSDNSHNEHAPASQGLKAEHLY
(SEQ ID NO: 2) или его фрагмент, например, Ig-подобный C2-домен (подчеркнутые аминокислоты 8-96 SEQ ID NO: 2), или область, фланкированную цистеинами, образующими дисульфидную связь между аминокислотами 49-101 SEQ ID NO: 1 (аминокислоты 28-80 SEQ ID NO: 2, указаны курсивом).
J. Biol. Chem.
Int. Immunol.,
Eur. J. Immunol.
Известные варианты и мутанты LAIR-1 включают E63D, Y251F и Y251F относительно SEQ ID NO: 1. Показано, что Y215F снижал фосфорилирование тирозина и демонстрировал утрату связывания с PTPN6 и CSK, а также полную утрату ингибиторной активности, а также утрату фосфорилирования и ингибирования мобилизации кальция при связывании с F-281 (Xu, et al., 275:17440-17446 (2000), Verbrugge, et al., 15:1349-1358 (2003), Verbrugge, et al., , 36:190-198 (2006)). Y281F демонстрировал сниженное фосфорилирование тирозина, утрату связывания с PTPN6 и частичное ингибирование цитотоксической активности.
J. Leukoc. Biol
Immunity
Eur. J. Immunol
Eur. J. Immunol.
Eur. J. Immunol.
Eur. J. Immunol.
Haematologica
Nat. Cell Biol.
Immunity
Biochem. Biophys, Res. Commun.
Nat. Cell Biol.
В Meyaard, 2008, . 83:799-803 показано, что LAIR-1 широко экспрессируется на иммунных клетках человека. Изучение фактических данных об экспрессии, полученных посредством проточной цитометрии, в исследовательских статьях показывает, что LAIR-1 гораздо больше экспрессируется на клетках миелоидной линии, таких как моноциты, макрофаги и дендритные клетки, чем на T-клетках и NK-клетках (Meyaard et al., 1997, 7:283-290). Однако B-клетки дифференциально экспрессируют высокие уровни LAIR-1 в течение дифференцировки (van der Vuurst de Vries et al., 1999, .29:3160-3167). Также обнаружено, что LAIR-1 экспрессируется на клетках острого миелолейкоза, клетках острого лимфобластного лейкоза и клетках хронического лимфоцитарного лейкоза (van der Vuurst de Vries et al., 1999, 29:3160-3167; Poggi et al., 2000, 30:2751-2758; Zocchi et al., 2001, 31:3667-3675; Perbellini et al., 2014, , 99:881-887; Kang et al., 2015, 17:665-677). И наконец, показано, что LAIR-1 экспрессируется на нескольких линиях опухолевых клеток человека (Meyaard et al., 1997, 7:283-290; Cao et al., 2015, 458:399-404; Kang et al., 2015, 17:665-677).
J. Leukoc. Biol.
Immunol. Lett.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
J. Leukoc. Biol.
У людей и мышей LAIR-1 связывается с несколькими типами коллагена с высокой аффинностью (Meyaard, 2008, 83:799-803 и Meyaard, 2010, 128:26-28). У людей также показано, что LAIR-1 связывается с компонентном комплемента C1q (Son et al., 2012, 109:E3160-3167) и коллагеновым лектином C-типа, белком сурфактанта D (SP-D), коллагеновым углевод-связывающим гликопротеином (коллектином), играющим важную роль во врожденном иммунном ответе легких на стимуляцию микроорганизмом и антигеном (Olde Nordkamp et al., 2014, 96:105-111). Способность LAIR-1 мыши связываться с C1q и SP-D не исследовали.
Mol. Med.,
PNAS
Системная красная волчанка (SLE) является прототипом аутоиммунного заболевания, отличающегося утратой иммунологической толерантности. Иммуносупрессорная роль C1q подтверждается высокой долей субъектов с недостаточностью C1q, у которых развивается SLE. Dr. Son и ее соавторы из Feinstein Institute Dr. Betty Diamond, Dr. Frances Santiago-Schwarz и Dr. Yousef Al-Abed показали, что C1q является функциональным лигандом LAIR-1, известного как универсальный рецептор коллагенов. Они также показали, что C1q способствует толерантности посредством ингибирования дифференцировки моноцитов в DC и активации pDC посредством вовлечения LAIR-1 (Son and Diamond, 2015, 20:559-568; Son et al., , 109(46):E3160-3167). Это открытие имеет большое влияние в отношении системной красной волчанки, т.к. эти данные проливают свет на механизм, посредством которого система комплемента регулирует толерантность и предотвращает аутоиммунные заболевания, такие как системная красная волчанка.
Blood
Все коллагены состоят из 3 полипептидных цепей, отличающихся повторением последовательности Gly-X-X', где X зачастую является пролином, и X' часто является 4-R-гидроксипролином (Hyp, O) (Brondijk, , 115(7):1364-1373 (2010). Триплеты GPO являются почти исключительно признаком коллагенов и делают возможным образование характерной трехспиральной структуры коллагена.
Blood
Blood
Matrix Biol.,
10
Эктодомены известных рецепторов коллагена суперсемейства иммуноглобулинов, LAIR-1, GPVI и OSCAR, состоят из 1 или 2 иммуноглобулин-подобных доменов. Хотя GPVI и LAIR-1 функционально отличаются, они схожи по своим свойствам связывания коллагена. Однако, как описано в Zhou, et al., , 127(5):529-537 (2016), несмотря на их структурную гомогенность, три белка обладают очень разными участками распознавания коллагена. GPVI сильнее всего связывается с модельным пептидом, родственным коллагену, с тяжами коллагена III (GPO), богатыми последовательностью глицин-пролин-гидроксипролин (GPO), и некоторым пептидам Toolkit (III-1, III-30 и III-40), содержащим 1 или 2 триплета GPO (Jarvis, et al., , 111(10):4986-4996 (2008)). LAIR-1 также демонстрирует высокую аффинность к III-30 и подгруппе богатых аминокислотами пептидов, но связывается с III-1 и пептидом, родственным коллагену, менее сильно (Lebbink, et al., 28(4):202-210 (2009)).
Blood
Посредством мутагенеза и титрования с помощью ядерного магнитного резонанса определяли участок остатков в мембрано-дистальной области LAIR-1, контактирующий с модельным трехспиральным пептидом (THP), находящимся в бороздке, состоящей из цепей C, C9, F и петли FG (Brondijk, , 115(7):1364-1373 (2010), конкретно включенная в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме). Например, адгезия к иммобилизованным коллагенам I, III и IV была значительно снижена в случае мутантов R59A, E61A, R65A и E111A, хотя величина эффекта зависела от типа тестируемого коллагена. Кроме того, адгезия была отчасти снижена в случае мутантов R62A и N69A, демонстрирующих связывание коллагена, близкое к дикому типу, при анализе проточной цитометрии. Brondijk, et al. описали, что остатки E61, S66, Y68, I102, W109 и Y115 LAIR-1 обеспечивают вандерваальсовы взаимодействия, в то время как водородные связи с лигандом зачастую включают остатки R59, E63, R100, E111 и Q112 LAIR-1, и делали вывод о том, что R59, E61, а также W109 составляют кор коллаген-связывающего участка, в то время как более периферические остатки, такие как E111, меньше участвуют в связывании (остатки со ссылкой, например, на SEQ ID NO: 1).
b. LAIR-1 мыши
В этой области известны последовательности LAIR-1 мыши (mLAIR-1). Например, консенсусная последовательность mLAIR-1a (изоформа 1) представляет собой
MSLHPVILLVLVLCLGWKINTQEGSLPDITIFPNSSLMISQGTFVTVVCSYSDKHDLYNM
VRLEKDGSTFMEKSTEPYKTEDEFEIGPVNETITGHYSCIYSKGITWSERSKTLELKVIK
ENVIQTPAPGPTSDTSWLKTYSIY
IFTVVSVIFLLCLSALLFCFLRHRQKKQGLPNNKRQ
QQRPEERLNLATNGLEMTPDIVADDRLPEDRWTETWTPVAGDLQEVTYIQLDHHSLTQRA VGAVTSQSTDMAESSTYAAIIRH
(SEQ ID NO: 3, UniProtKB - Q8BG84 (LAIR1_MOUSE)), где аминокислоты 1-21 представляют собой сигнальную последовательность, аминокислоты 22-144 (подчеркнуты) представляют собой внеклеточный домен, аминокислоты 145-165 представляют собой трансмембранный домен, и аминокислоты 166-263 представляют собой цитоплазматический домен. Аминокислоты 27-115 образуют Ig-подобный C2-домен. Аминокислоты 226-231 и 255-260 образуют мотив ITIM 1 и 2, соответственно. В mLAIR-1b (также известном как изоформа 2) отсутствуют аминокислоты 124-133 относительно SEQ ID NO: 3. Изоформа 3 содержит аминокислоты 25-56 [SLPDITIFPNSSLMISQGTFVTVVCSYSDKHD (SEQ ID NO: 7) из SEQ ID NO: 3)], замененные ELCLWFLLYPWATLELIMCTWDAWKETLEYFL (SEQ ID NO: 8), и в ней отсутствуют аминокислоты 57-263 относительно SEQ ID NO: 3. В mLAIR-1d (также известном как изоформа 5) отсутствуют аминокислоты 24-172 относительно SEQ ID NO: 3. В mLAIR-1e (также известном как изоформа 6) отсутствуют аминокислоты 134-172.
Как описано выше, внеклеточный домен LAIR-1 мыши может представлять собой
QEGSLPDITIFPNSSLMISQGTFVTVVCSYSDKHDLYNMVRLEKDGSTFMEKSTEPYKTEDEFEIGPVNETITGHYSCIYSKGITWSERSKTLELKVIKENVIQTPAPGPTSDTSWLKTYSIY
(SEQ ID NO: 4) или его фрагмент, например, Ig-подобный C2-домен (подчеркнутые аминокислоты 6-94 SEQ ID NO: 4), или область, фланкированную цистеинами, образующими дисульфидную связь между аминокислотами 49-99 SEQ ID NO: 3 (аминокислоты 28-78 SEQ ID NO: 4, указаны курсивом). Пример выравнивания внеклеточных доменов человека и мыши представлен ниже:
Поисковая последовательность 1 представляет собой SEQ ID NO: 2, и анализируемая последовательность представляет собой SEQ ID NO: 4.
Известные варианты и мутанты LAIR-1 включают IYI → MYM в положениях аминокислот 143-145, V149G, L154P и H263R относительно SEQ ID NO: 3.
J. Leukoc. Biol
Int. Immunol.
J. Immunol.
В Meyaard (2008, .83:799-803) описана обширная экспрессия LAIR-1 на иммунных клетках мыши, с одним большим отличием, состоящим в том, что LAIR-1, по-видимому, отсутствует на B-клетках в противоположность тому, что он сильно экспрессируется на субпопуляциях B-клеток человека. Как и в случае профиля экспрессии у человека, при исследовании фактических данных проточной цитометрии, касающихся экспрессии LAIR-1, обнаруживали, что LAIR-1 сильно экспрессируется на моноцитах, макрофагах и DC, в то время как T-клетки, NK-клетки и Gr-1+ клетки экспрессируют LAIR-1 на относительно более низких уровнях (Lebbink et al., 2007 19:1011-1019; Tang et al., 2012, 188:548-558).
J. Immunol
in vitro
Gene
Tang et al. (2012, .188:548-558) исследовали фенотип мышей с недостаточностью LAIR-1. KO-мыши были здоровыми и фертильными и демонстрировали признаки измененной иммунной функции, но без значительной аутоиммунности или воспаления, наблюдаемых у мышей CTLA-4 KO. Мыши LAIR-1 KO имели повышенные количества дендритных клеток, B-клеток селезенки и регуляторных T-клеток, а также более высокую долю активированных T-клеток и T-клеток памяти, что позволяет предполагать повышенную реактивность T-клеток. Однако не наблюдали различий в моделях EAE и колита у мышей LAIR-1 wt и KO. Эти модели заболеваний могут не являться оптимальными для исследования фенотипа LAIR-1 KO, и функциональные исследования подгрупп иммунных клеток с недостаточностью LAIR-1 не осуществляли. Также предполагают, что мыши LAIR-1 KO могут не быть показательными в отношении роли LAIR-1 у людей по причине дифференциальной экспрессии и наличия растворимого LAIR-2 у людей. Различия между генетическими путями LAIR-1 во внутренних органах мыши и человека описаны в Sun, et al., , 552:14-145 (2014), и это можно учитывать в экспериментах по дизайну и оценке с использованием модели мыши.
2. LAIR-2
Изобретение относится к последовательностям LAIR-2 и его слитых белков. В некоторых вариантах осуществления лидирующая аминокислота метионин отщепляется в посттрансляционной форме белка.
В этой области известны последовательности LAIR-2 человека. Например, консенсусная последовательность LAIR-2a (изоформа 1) представляет собой
MSPHLTALLGLVLCLAQTIHTQEGALPRPSISAEPGTVISPGSHVTFMCRGPVGVQTFRL
EREDRAKYKDSYNVFRLGPSESEARFHIDSVSEGNAGLYRCLYYKPPGWSEHSDFLELLV KESSGGPDSPDTEPGSSAGTVPGTEASGFDAP
(SEQ ID NO: 5, UniProtKB - Q6ISS4 (LAIR2_HUMAN)), где аминокислоты 1-21 представляют собой сигнальную последовательность, аминокислоты 22-152 (подчеркнуты) представляют собой домен лейкоцит-ассоциированного иммуноглобулин-подобного рецептора 2. Аминокислоты 29-117 образуют Ig-подобный C2-домен. В LAIR-2b (также известном как изоформа 2) отсутствуют аминокислоты 122-138 относительно SEQ ID NO: 5.
Как описано выше, домен лейкоцит-ассоциированного иммуноглобулин-подобного рецептора 2 LAIR-2 человека может представлять собой
QEGALPRPSISAEPGTVISPGSHVTFMCRGPVGVQTFRLEREDRAKYKDSYNVFRLGPSE
SEARFHIDSVSEGNAGLYRCLYYKPPGWSEHSDFLELLVKESSGGPDSPDTEPGSSAGTV
PGTEASGFDAP
(SEQ ID NO: 6) или его фрагмент, например, Ig-подобный C2-домен (подчеркнутые аминокислоты 8-96 SEQ ID NO: 6), или область, фланкированную цистеинами, образующими дисульфидную связь между аминокислотами 49-101 SEQ ID NO: 1 (аминокислоты 28-80 SEQ ID NO: 6, указаны курсивом).
Известные варианты и мутанты LAIR-2 включают G78S, H87R и F115Y относительно SEQ ID NO: 5.
J. Leukoc. Biol.
J. Innate Immun.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
Mol. Immunol.
Показано, что LAIR-2 у людей связывается с коллагеном и SP-D с более высокой аффинностью, чем LAIR-1 (Meyaard, 2008, 83:799-803). Dr. Linde Meyaard показала, что LAIR-2 также связывается с C1q и маннозо-связывающим лектином (MBL), оба из которых содержат коллаген-подобные домены (Olde Nordkamp et al., 2014, 6(3):284-92). Эти данные подтверждают результаты, полученные Son et al., о том, что LAIR-2 связывается с C1q (Son et al., 2012, 109:E3160-3167). Хотя коллагены и C1q экспрессируются повсеместно, SP-D, главным образом, ограничен слизистыми оболочками (поверхность альвеол легких и ЖКТ), где он функционирует как врожденная защита первой линии против патогенов (Herias et al., 2007, 44:3324-3332).
Пример выравнивания внеклеточных доменов LAIR-1 человека и LAIR-2 человека представлен ниже:
Поисковая последовательность представляет собой SEQ ID NO: 2, и анализируемая последовательность представляет собой SEQ ID NO: 6.
B. Иммуномодулирующие средства
Изобретение относится к иммуномодулирующим средствам, включая агонистов и антагонистов LAIR-1 и антагонистов LAIR-2. Агонист LAIR-1, как правило, индуцирует, потенцирует или активирует отрицательную передачу сигнала LAIR-1. Антагонист LAIR-1, как правило, предотвращает, снижает или блокирует отрицательную передачу сигнала LAIR-1. Антагонист LAIR-2, как правило, снижает или предотвращает способность LAIR-2 связываться со своим лигандом, включая лиганды, общие для LAIR-1 и LAIR-2. Можно использовать композиции и способы для модуляции отрицательной передачи сигнала LAIR-1, например, на миелоидных клетках, включая антигенпрезентирующие клетки (например, моноциты, макрофаги или дендритные клетки), T-клетки, естественные киллеры (NK) или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления композиции специфически воздействуют на один или несколько типов клеток. Примеры молекул, которые могут являться агонистом или антагонистом LAIR-1 и антагонистом LAIR-2, более подробно описаны ниже.
В некоторых вариантах осуществления антагонисты LAIR-1, включая блокирующие функцию антитела против LAIR-1, связываются или иным образом противодействуют коллаген-связывающему домену, C1q-связывающему домену, SP-D-связывающему домену или их комбинации в LAIR-1. Например, в некоторых вариантах осуществления антагонист LAIR-1 связывается, блокирует, создает конформационное изменение или иным образом противодействует остатку LAIR-1 R59, E61, R62, E63, R65, S66, Y68, N69, I102, R100, W109, E111, Q112 и Y115 или любой комбинации любых из указанных выше. В некоторых вариантах осуществления блокирующее функцию антитело против LAIR-1 или его функциональный фрагмент специфически связываются с эпитопом, включающим один или несколько из R59, E61, R62, E63, R65, S66, Y68, N69, I102, R100, W109, E111, Q112 и Y115 (например, относительно SEQ ID NO: 1). В некоторых вариантах осуществления иммуномодулирующее средство не противодействует связыванию или активности OSCAR, связыванию или активности GPVI или их комбинации.
1. Антитела
Иммуномодулирующее средство может являться антителом. Подходящие антитела известны в этой области, или их может получать специалист в этой области. Последовательности нуклеиновой кислоты и полипептида LAIR-1 и LAIR-2 известны в этой области, и примеры последовательностей белков представлены выше. Специалист в этой области можно использовать последовательности, как описано ниже, для получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, специфического для LAIR-1 или LAIR-2. Таким образом, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может являться агонистом или антагонистом LAIR-1 или антагонистом LAIR-2.
Активность (т.е. агонистическая или антагонистическая) антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, специфического для LAIR-1 или LAIR-2, можно определять с использованием известных в этой области функциональных анализов, и они включают анализы, описанные ниже. Как правило, анализы включают определение того, повышает (т.е. агонист) или снижает (т.е. антагонист) ли антитело или его антигенсвязывающий фрагмент передачу сигнала через LAIR-1. В некоторых вариантах осуществления анализ включает определение того, снижает (т.е. агонист) или повышает (т.е. антагонист) ли антитело или его антигенсвязывающий фрагмент иммунный ответ, отрицательно регулируемый LAIR-1.
В некоторых вариантах осуществления описанные антитела и их антигенсвязывающие фрагменты иммуноспецифически связываются с LAIR-1 или LAIR-2 (например, любым из SEQ ID NO: 1-6). В некоторых вариантах осуществления антитело связывается с внеклеточным доменом LAIR-1 или LAIR-2.
Например, представлены молекулы, которые могут иммуноспецифически связываться с LAIR-1:
(I) расположенная на поверхности клетки (в особенности, живой клетки);
(II) расположенная на поверхности клетки (в особенности, живой клетки) в эндогенной концентрации;
(III) расположенная на поверхности живой клетки и модулирующая связывание между LAIR-1 и его лигандом;
(IV) расположенная на поверхности живой клетки и снижающая или ингибирующая иммуносупрессию под действием LAIR-1;
(V) расположенная на поверхности живой клетки и индуцирующая или повышающая иммуносупрессию под действием LAIR-1;
(VI) расположенная на поверхности живой клетки, где клетка является миелоидной клеткой, включая антигенпрезентирующие клетки (например, моноцит, макрофаг или дендритную клетку), T-клетку, естественный киллер (NK) или их комбинацию;
(VII) комбинации I-IV и VI;
(VIII) комбинации I-III и V-IV; и
(IX) расположенная на поверхности живых миелоидных или лимфоидных злокачественных клеток (AML или ALL) и повышающая апоптоз и дифференцировку, что приводит к снижению самоподдержания злокачественных стволовых клеток.
Изобретение также относится к молекулам, которые могут иммуноспецифически связываться с растворимым эндогенным LAIR-2. В некоторых вариантах осуществления молекулы снижают или предотвращают связывание или иное взаимодействие LAIR-2 с его лигандом.
В некоторых вариантах осуществления молекулы могут индуцировать антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC), обусловленную комплементом цитотоксичность (CDC) или апоптоз клеток с помощью других механизмов в LAIR-1-экспрессирующей клетке.
Для получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, специфически связывающегося с LAIR-1 или LAIR-2, можно использовать очищенные белки, полипептиды, фрагменты, слитые белки или эпитопы LAIR-1 или LAIR-2 или полипептиды, экспрессируемые с их последовательностей нуклеиновой кислоты. Антитела или его антигенсвязывающие фрагменты можно получать с использованием любых подходящих известных в этой области способов, таких как описываемые ниже.
a. Человеческие и гуманизированные антитела
Многие не принадлежащие человеку антитела (например, полученные из мышей, крыс или кроликов) являются естественным образом антигенными у людей и, таким образом, могут приводить к нежелательным иммунным ответам при введении людей. Таким образом, использование человеческих или гуманизированных антител в способах предназначено для уменьшения вероятности того, что антитело, вводимое человеку, будет вызывать нежелательный иммунный ответ.
Можно использовать трансгенных животных (например, мышей), после иммунизации способных продуцировать полный репертуар антител человека в отсутствие продукции эндогенных иммуноглобулинов. Например, описано, что гомозиготная делеция гена соединительной области тяжелой цепи антитела (J(H)) у химерных мышей и мышей мутантной зародышевой линии приводит к полному ингибированию продукции эндогенных антител. Перенос набора генов иммуноглобулинов зародышевой линии человека у таких мышей мутантной зародышевой линии будет приводить к продукции антитела человека после стимуляции антигеном.
2
Необязательно, антитела получают в других видах и "гуманизируют" для введения людям. Гуманизированными формами не принадлежащих человеку (например, мышиных) антител являются химерные иммуноглобулины, иммуноглобулиновые цепи или их фрагменты (такие как Fv, Fab, Fab', F(ab') или другие антигенсвязывающие подпоследовательности антител), содержащие минимальную последовательность, полученную из не принадлежащего человеку иммуноглобулина. Гуманизированные антитела включают иммуноглобулины человека (реципиентное антитело), в которых остатки из определяющей комплементарность области (CDR) реципиентного антитела заменяют остатками из CDR не являющихся человеком видов (донорное антитело), таких как мышь, крыса или кролик, имеющих желаемую специфичность, аффинность и активность. В некоторых случаях каркасные остатки Fv иммуноглобулина человека заменяют соответствующими не принадлежащими человеку остатками. Гуманизированные антитела также могут содержать остатки, не обнаруживаемые ни в реципиентном антителе, ни в пересаженных CDR или каркасных последовательностях. В основном, гуманизированное антитело будет содержать, по существу, все из по меньшей мере одного и, как правило, двух вариабельных доменов, в которых все или, по существу, все из областей CDR соответствуют CDR не принадлежащего человеку иммуноглобулина, и все или, по существу, все из областей FR являются областями FR консенсусной последовательности иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело в оптимальном варианте также будет содержать, по меньшей мере, часть константной области иммуноглобулина (Fc), как правило, иммуноглобулина человека.
Nature
Способы гуманизации не принадлежащих человеку антител хорошо известны в этой области. См. например, Jones, P.T., et al. (1986). Replacing the complementarity-determining regions in a human antibody with those from a mouse. 321, 522-525. Как правило, гуманизированное антитело содержит один или несколько аминокислотных остатков, встроенных в него из источника, не принадлежащего человеку. Эти не принадлежащие человеку аминокислотные остатки зачастую обозначают как "импортированные" остатки, как правило, полученные из "импортированного" вариабельного домена. Способы гуманизации антител, как правило, включают использование технологии рекомбинантных ДНК для манипуляций с последовательностью ДНК, кодирующей одну или несколько полипептидных цепей молекулы антитела. Гуманизацию можно, по существу, осуществлять, заменяя CDR грызуна или последовательности CDR соответствующими последовательностями из антитела человека. Таким образом, гуманизированная форма не принадлежащего человеку антитела (или его фрагмента) является химерным антителом или фрагментом, где, по существу, меньшую область, чем интактный вариабельный домен человека, заменяют соответствующей последовательностью из не являющихся человеком видов. На практике, гуманизированные антитела, как правило, являются антителами человека, в которых некоторые остатки CDR и, возможно, некоторые остатки FR заменяют остатками из аналогичных участков в антителах грызунов.
Выбор вариабельных доменов легких и тяжелых цепей человека для использования в получении гуманизированных антител очень важен для снижения антигенности. В соответствии со способом "наилучшего совпадения" последовательность вариабельного домена антитела грызуна подвергают скринингу относительно полной библиотеки известных последовательностей вариабельных доменов человека. Затем последовательность человека, ближайшую к последовательности грызуна, принимают за каркас человека (FR) для гуманизированного антитела. В другом способе используют конкретный каркас, полученный из консенсусной последовательности всех антител человека из конкретной подгруппы легких или тяжелых цепей. Тот же каркас можно использовать для нескольких разных гуманизированных антител.
Также важно гуманизировать антитела так, чтобы они сохраняли высокую аффинность к антигену и другие благоприятные биологические свойства. Для достижения этой цели гуманизированные антитела можно получать с помощью анализа родительских последовательностей и различных концептуальных гуманизированных продуктов с использованием трехмерных моделей родительских и гуманизированных последовательностей. Трехмерные модели иммуноглобулинов доступны и хорошо известны специалистам в этой области. Доступны компьютерные программы, с помощью которых иллюстрируют и отображают возможные трехмерные конформационные структуры выбранных последовательностей иммуноглобулинов-кандидатов. Изучение этого отображения данных делает возможным анализ вероятной роли остатков в функционировании последовательности иммуноглобулина-кандидата, т.е. анализ остатков, влияющих на способность иммуноглобулинов-кандидатов связываться со своим антигеном. Таким образом, остатки FR можно выбирать и комбинировать, используя консенсусную и импортированную последовательность так, чтобы достигать желаемой характеристики антитела, такой как повышенная аффинность к антигенам-мишеням. В основном, остатки CDR прямо и наиболее существенно влияют на связывание антигена.
Антитело может быть связанным с субстратом, или меченым детектируемым веществом, или и связанным, и меченым. Детектируемые вещества, предлагаемые для композиций по изобретению, включают флуоресцентные, ферментативные и радиоактивные маркеры.
b. Одноцепочечные антитела
Способы получения одноцепочечных антител хорошо известны специалистам в этой области. Одноцепочечное антитело получают посредством слияния вариабельных доменов тяжелых и легких цепей с использованием короткого пептидного линкера, таким образом, восстанавливая антигенсвязывающий участок на одной молекуле. Разработаны вариабельные фрагменты одноцепочечного антитела (scFv), в которых C-конец одного вариабельного домена соединяют с N-концом другого вариабельного домена с помощью пептида или линкера из 15-25 аминокислот, без значительного нарушения связывания антигена или специфичности связывания. Линкер выбирают так, чтобы позволить тяжелой цепи и легкой цепи связываться друг с другом в правильной конформационной ориентации. В этих Fv отсутствуют константные области (Fc), присутствующие в тяжелых и легких цепях нативного антитела.
c. Моновалентные антитела
in vitro
2
Способы также подходят для получения моновалентных антител. Расщепление антител для получения их фрагментов, в частности, Fab-фрагментов, можно осуществлять общепринятыми способами, известными в этой области. Например, расщепление можно осуществлять с использованием папаина. Расщепление антител папаином, как правило, приводит к получению двух идентичных антигенсвязывающих фрагментов, названных Fab-фрагментами, каждый из которых имеет один антигенсвязывающий участок, и остаточного Fc-фрагмента. Обработка пепсином приводит к получению фрагмента, названного F(ab')-фрагментом, имеющего два антигенсвязывающих участка и все равно способного к перекрестному сшиванию антигена.
2
Fab-фрагменты, полученные при расщеплении антитела, также содержат константные домены легкой цепи и первый константный домен тяжелой цепи. Fab'-фрагменты отличаются от Fab-фрагментов добавлением нескольких остатков на карбокси-конце домена тяжелой цепи, включая один или несколько цистеинов из шарнирной области антитела. F(ab')-фрагмент является бивалентным фрагментом, содержащим два Fab'-фрагмента, соединенных дисульфидным мостиком в шарнирной области. Fab'-SH в настоящем описании является обозначением Fab', в котором остатки цистеина константных доменов несут свободную тиоловую группу. Фрагменты антител исходно получали как пары Fab'-фрагментов, имеющих цистеины шарнирной области между ними. Также известны другие химические соединения фрагментов антител.
d. Гибридные антитела
Антитело может являться гибридным антителом. В гибридных антителах одна пара тяжелой и легкой цепи является гомологичной паре, обнаруживаемой в антителе, индуцированном против одного эпитопа, в то время как другая пара тяжелой и легкой цепи является гомологичной паре, обнаруживаемой в антителе, индуцированном против другого эпитопа. Это приводит к тому, что антитело обладает свойством мультифункциональной валентности, т.е. способностью связываться по меньшей мере с двумя разными эпитопами одновременно. Такие гибриды можно получать посредством слияния гибридом, продуцирующих соответствующие компоненты антител, или рекомбинантными способами. Такие гибриды, разумеется, также можно получать с использованием химерных цепей.
e. Конъюгаты или слитые белки фрагментов антител
Функцию направленного воздействия антитела можно использовать терапевтически, соединяя антитело или его фрагмент с терапевтическим средством. Такого соединения антитела или фрагмента (например, по меньшей мере, части константной области иммуноглобулина (Fc)) с терапевтическим средством можно достигать, получая иммуноконъюгат или слитый белок, содержащий антитело или фрагмент антитела и терапевтическое средство.
Такого соединения антитела или фрагмента с терапевтическим средством можно достигать, получая иммуноконъюгат или слитый белок или соединяя антитело или фрагмент с нуклеиновой кислотой, такой как миРНК, и продукт будет содержать антитело или фрагмент антитела и терапевтическое средство.
В некоторых вариантах осуществления антитело модифицируют для изменения его времени полужизни. В некоторых вариантах осуществления желательно повышать время полужизни антитела таким образом, что оно присутствует в кровотоке или месте лечения в течение более длительного периода времени. Например, желательным может быть поддержание титров антитела в кровотоке или месте, подлежащем лечению, в течение длительного периода времени. Антитела можно конструировать с использованием вариантов Fc, увеличивающих время полужизни, например, с использованием технологии пролонгирования времени полужизни антитела Xtend™ (Xencor, Monrovia, CA). В других вариантах осуществления время полужизни антитела против ДНК снижают для снижения потенциальных побочных эффектов. Описанные конъюгаты можно использовать для модификации указанного биологического ответа. Лекарственное средство не следует истолковывать как ограниченное классическими химическими терапевтическими средствами. Например, лекарственное средство может являться белком или полипептидом, обладающим желаемой биологической активностью. Такие белки могут включать, например, токсин, такой как абрин, рицин A, псевдомонадный экзотоксин или дифтерийный токсин.
f. Примеры антител
Один из вариантов осуществления относится к антителу против LAIR, полученному с помощью гибридомы, выбранной из группы, состоящей из 1E11, 1G7, 4B3, 5A6, 5E1, 6B2, 6F4, 6G6, 7G3, 9H6, 11B3, 12E10a и 12E10b.
Другой вариант осуществления относится к антителу против LAIR, содержащему по меньшей мере одну легкую цепь или по меньшей мере одну тяжелую цепь антитела, полученного с помощью одной или нескольких гибридом, выбранных из группы, состоящей из 1E11, 1G7, 4B3, 5A6, 5E1, 6B2, 6F4, 6G6, 7G3, 9H6, 11B3, 12E10a и 12E10b.
Другой вариант осуществления относится к антителу против LAIR, содержащему вариабельную область легкой цепи, имеющую по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичности последовательности по отношению к вариабельной области легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 19, 27, 35, 43, 51, 59, 67, 75, 83, 91, 99, 107 или 115.
Другой вариант осуществления относится к антителу против LAIR, содержащему вариабельную область тяжелой цепи, имеющую по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичности последовательности по отношению к вариабельной области тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 23, 31, 39, 47, 55, 63, 71, 79, 87, 95, 103 или 111.
Другой вариант осуществления относится к антителу против LAIR, содержащему вариабельную область легкой цепи, имеющую по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичности последовательности по отношению к вариабельной области легкой цепи, имеющей аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 19, 27, 35, 43, 51, 59, 67, 75, 83, 91, 99, 107 или 115, и вариабельную область тяжелой цепи, имеющую по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичности последовательности по отношению к аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 23, 31, 39, 47, 55, 63, 71, 79, 87, 95, 103 или 111.
Другой вариант осуществления относится к антителу против LAIR, содержащему определяющую комплементарность область (CDR), выбранную из группы CDR, имеющих аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 20-22, 24-26, 28-30, 32-34, 36-38, 40-42, 44-46, 48-50, 52-54, 56-58, 60-62, 64-66, 68-70, 72-74, 76-78, 80-82, 84-86, 88-90, 92-94, 96-98, 100-102, 104-106, 108-110, 112-114 и 116-118.
Другой вариант осуществления относится к антителу против LAIR, содержащему множество CDR, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 20-22, 24-26, 28-30, 32-34, 36-38, 40-42, 44-46, 48-50, 52-54, 56-58, 60-62, 64-66, 68-70, 72-74, 76-78, 80-82, 84-86, 88-90, 92-94, 96-98, 100-102, 104-106, 108-110, 112-114 и 116-117. Множество CDR может составлять 2-12.
Другой вариант осуществления относится к химерному антителу, содержащему тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью, имеющей по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичности последовательности по отношению к аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 120 или SEQ ID NO: 122, и/или легкую цепь с аминокислотной последовательностью, имеющей по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичности последовательности по отношению к аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 124.
Другой вариант осуществления относится к химерному антителу, содержащему тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью, имеющей по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичности последовательности по отношению к аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 126 или SEQ ID NO: 128, и/или легкую цепь с аминокислотной последовательностью, имеющей по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичности последовательности по отношению к аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 130.
Другой вариант осуществления относится к химерному антителу, содержащему тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью, имеющей по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичности последовательности по отношению к аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 132 или SEQ ID NO: 134, и/или легкую цепь с аминокислотной последовательностью, имеющей по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичности последовательности по отношению к аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 136.
Другой вариант осуществления относится к химерному антителу, содержащему тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью, имеющей по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичности последовательности по отношению к аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 138 или SEQ ID NO: 140, и/или легкую цепь с аминокислотной последовательностью, имеющей по меньшей мере 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичности последовательности по отношению к аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 142.
Другой вариант осуществления относится к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело, содержащее аминокислотную последовательность легкой цепи, соответствующую SEQ ID NO: 124, 130, 136 или 142, и/или аминокислотную последовательность тяжелой цепи, соответствующую SEQ ID NO: 120, 122, 126, 128, 132, 134, 138 или 140.
Другой вариант осуществления относится к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельную область легкой цепи, соответствующую SEQ ID NO: 19, 27, 35, 43, 51, 59, 67, 75, 83, 91, 99, 107 или 115, и/или вариабельную область тяжелой цепи, соответствующую SEQ ID NO: 23, 31, 39, 47, 55, 63, 71, 79, 87, 95, 103 или 111. Нуклеиновые кислоты, кодирующие легкую цепь и/или тяжелую цепь, могут являться частью экспрессирующего вектора. Нуклеиновые кислоты можно экспрессировать с помощью клетки. Экспрессия может быть индуцибельной или конститутивной.
2. Белки и полипептиды
a. Композиции белков и полипептидов
Иммуномодулирующее средство может являться белком, полипептидом или слитым белком. Например, иммуномодулирующее средство может являться выделенным или рекомбинантным белком или полипептидом или функциональным фрагментом, вариантом или слитым белком LAIR-1 или LAIR-2.
Белок или полипептид или его функциональный фрагмент, вариант или слитый белок может являться агонистом или антагонистом. Например, в некоторых вариантах осуществления антагонист LAIR-1 является полипептидом LAIR-1 или LAIR-2 или его фрагментом или слитым белком, связывающимся с лигандом LAIR-1. Полипептид может являться растворимым фрагментом, например, внеклеточным доменом LAIR-1 или LAIR-2 или его функциональным фрагментом или слитым белком. В некоторых вариантах осуществления растворимый лиганд LAIR-1 может служить в качестве агониста, повышающего передачу сигнала через LAIR-1.
Активность (т.е. агонистическая или антагонистическая) белка или полипептида LAIR-1 или LAIR-2 или его любого фрагмента, варианта или слитого белка можно определять с использованием функциональных анализов, известных в этой области, и они включают анализы, описанные ниже. Как правило, анализы включают определение того, повышает (т.е. агонист) или снижает (т.е. антагонист) ли белок, полипептид или его фрагмент, вариант или слитый белок передачу сигнала через рецептор LAIR-1. В некоторых вариантах осуществления анализ включает определение того, повышает (т.е. агонист) или снижает (т.е. антагонист) ли белок, полипептид или его фрагмент, вариант или слитый белок иммунный ответ (т.е. костимуляторный или коингибиторный), ассоциированный с LAIR-1. Как правило, анализы включают определение того, повышает (т.е. агонист) или снижает (т.е. антагонист) ли белок, полипептид или его фрагмент, вариант или слитый белок передачу сигнала через LAIR-1. В некоторых вариантах осуществления анализ включает определение того, снижает (т.е. агонист) или повышает (т.е. антагонист) ли белок, полипептид или его фрагмент, вариант или слитый белок иммунный ответ, отрицательно регулируемый LAIR-1. В некоторых вариантах осуществления анализ включает определение того, повышает (т.е. антагонист) ли белок, полипептид или его фрагмент, вариант или слитый белок апоптоз и дифференцировку клеток острого миелолейкоза и клеток острого лимфобластного лейкоза, что приводит к снижению способности к самоподдержанию стволовых клеток AML и ALL.
Последовательности нуклеиновой кислоты и полипептида LAIR-1 и LAIR-2 известны в этой области, и примеры белковых и пептидных последовательностей представлены выше. Специалист в этой области может использовать последовательности, как более подробно описано ниже, для получения любого белка или полипептида LAIR-1 или LAIR-2 или его любого фрагмента, варианта или слитого белка. Как правило, белки, полипептиды, фрагменты, варианты и слитые белки LAIR-1 и LAIR-2 экспрессируют с нуклеиновых кислот, включающих последовательности, кодирующие сигнальную последовательность. Сигнальная последовательность, как правило, отщепляется от незрелого полипептида с образованием зрелого полипептида, в котором отсутствует сигнальная последовательность. Сигнальную последовательность можно заменять сигнальной последовательностью другого полипептида с использованием стандартных способов молекулярной биологии для влияния на уровни экспрессии, секрецию, растворимость или другие свойства полипептида. Описаны LAIR-1 и LAIR-2 с сигнальной последовательностью и без нее. Следует понимать, что в некоторых случаях, зрелый белок, как он известен или описан в этой области, т.е. последовательность белка без сигнальной последовательности, является предполагаемым зрелым белком. При нормальной экспрессии в клетке сигнальная последовательность может удаляться под действием клеточной пептидазы с образованием зрелого белка. Последовательность зрелого белка можно определять или подтверждать способами, известными в этой области.
i. Фрагменты
В рамках изобретения термин "фрагмент" LAIR-1 или LAIR-2 относится к любой подгруппе полипептидов, по меньшей мере на одну аминокислоту короче полноразмерного белка. Применимые фрагменты включают фрагменты, сохраняющие способность связываться со своим природным лигандом или лигандами. Полипептид, являющийся фрагментом любого полноразмерного LAIR-1 или LAIR-2, как правило, имеет по меньшей мере 20 процентов, 30 процентов, 40 процентов, 50 процентов, 60 процентов, 70 процентов, 80 процентов, 90 процентов, 95 процентов, 98 процентов, 99 процентов, 100 процентов или даже более 100 процентов способности связываться со своим природным лигандом, соответственно, по сравнению с полноразмерным белком.
Фрагменты LAIR-1 и LAIR-2 включают бесклеточные фрагменты. Бесклеточный полипептид может являться фрагментами полноразмерных, трансмембранных полипептидов, которые могут отщепляться, секретироваться или иным образом отделяться от продуцирующих клеток. Бесклеточные фрагменты полипептидов могут включать некоторые или все внеклеточные домены полипептиды, и в них могут отсутствовать некоторые или все из внутриклеточных и/или трансмембранных доменов полноразмерного белка. В одном из вариантов осуществления полипептидные фрагменты включают целый внеклеточный домен полноразмерного белка. В других вариантах осуществления бесклеточные фрагменты полипептидов включают фрагменты внеклеточного домена, сохраняющие биологическую активность полноразмерного белка. Внеклеточный домен может включать 1, 2, 3, 4 или 5 смежных аминокислот из трансмембранного домена и/или 1, 2, 3, 4 или 5 смежных аминокислот из сигнальной последовательности. Альтернативно, из внеклеточного домена можно удалять 1, 2, 3, 4, 5 или более аминокислот с C-конца, N-конца или обоих концов. В некоторых вариантах осуществления внеклеточный домен является единственным функциональным доменом фрагментов (например, лиганд-связывающим доменом).
ii. Варианты
Изобретение также относится к вариантам LAIR-1 и LAIR-2 и их фрагментам. В некоторых вариантах осуществления вариант является по меньшей мере на 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99 процентом идентичным любой из SEQ ID NO: 1-6. Применимые варианты включают варианты, повышающие биологическую активность, как определяют с помощью любого из анализов, представленных в настоящем описании, или повышающие время полужизни или стабильность белка. Белок и полипептиды LAIR-1 или LAIR-2 и их фрагменты, варианты и слитые белки можно конструировать для повышения биологической активности. Например, в некоторых вариантах осуществления полипептид LAIR-2, белок или его фрагмент, вариант или слитый белок модифицируют с помощью по меньшей мере одной замены, делеции или инсерции аминокислоты, повышающей ее функцию.
Другие варианты являются вариантами, сконструированными для селективного связывания с одним или несколькими типами лигандов LAIR-1 и/или LAIR-2 относительно других лигандов LAIR-1 и/или LAIR-2. Например, варианты можно конструировать для предпочтительного связывания с одним или несколькими коллагенами, SP-D, C1q или MBL или их конкретной комбинацией. Термин "предпочтительное связывание" относится к связыванию, составляющему по меньшей мере 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или более для одного типа лиганда по сравнению с другим типом лиганда.
Другие варианты можно конструироваться так, чтобы они имели сниженное связывание с одним лигандом по сравнению с другим. Эти варианты можно использовать в комбинации с вариантами, имеющими более сильные связывающие свойства, для модуляции иммунного ответа с умеренным воздействием.
Blood
В других вариантах осуществления варианты можно конструировать так, чтобы они имели сниженное связывание с одним или несколькими участками связывания коллагенов относительно других. Как описано в Brondijk, et al., , 18(115):1364-73 (2010), мутация остатков в LAIR-1 может иметь дифференциальный эффект в отношении связывания с разными коллагеновыми лигандами. Например, в случае мутантов R59A, E61A, R65A и E111A адгезия к иммобилизованным коллагенам I, III, и IV значительно снижалась, хотя величина эффекта зависела от типа тестируемого коллагена. Кроме того, адгезия в некоторой степени снижалась в случае мутантов R62A и N69A. В некоторых вариантах осуществления вариант являлся мутантным в одном или нескольких положениях из R59, E61, R62, E63, R65, S66, Y68, N69, I102, R100, W109, E111, Q112 и Y115 относительно SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления вариант являлся мутантным в одном или нескольких положениях из R59, E61, R65, E111, R62A и N69A. В конкретных вариантах осуществления мутации являются заменами аланином.
И наконец, варианты полипептидов можно конструировать так, чтобы они имели повышенное время полужизни относительно дикого типа. Эти варианты, как правило, модифицируют для устойчивости к ферментативной деградации. Примеры модификаций включают модифицированные аминокислотные остатки и модифицированные пептидные связи, устойчивые к ферментативной деградации. В этой области известны различные модификации для достижения этой цели. Варианты можно модифицировать для коррекции эффектов аффинности к рецептору в отношении времени полужизни белков, полипептидов, их фрагментов или слитых белков в сыворотке и при эндосомном pH.
iii. Слитые белки
Слитые полипептиды содержат первого партнера по слиянию, содержащего весь полипептид LAIR-1 или LIAR-2 или его часть, слитую со вторым полипептидом напрямую или через последовательность линкерного пептида, слитую со вторым полипептидом. Слитые белки, необязательно, содержат домен, функционирующий, димеризуя или мультимеризуя два или более слитых белка. Пептидный/полипептидный линкерный домен может являться отдельным доменом или, альтернативно, может содержаться в одном из других доменов (первом полипептиде или втором полипептиде) слитого белка. Аналогично, домен, функционирующий, димеризуя или мультимеризуя слитые белки, может являться отдельным доменом или, альтернативно, может содержаться в одном из других доменов (первом полипептиде, втором полипептиде или пептидном/полипептидном линкерном домене) слитого белка. В одном из вариантов осуществления домен димеризации/мультимеризации и пептидный/полипептидный линкерный домен являются одним и тем же доменом.
Слитые белки, представленные в настоящем описании, имеют формулу I:
1
2
3
N-R-R-R-C,
1
2
3
3
1
где "N" представляет собой N-конец слитого белка, "C" представляет собой C-конец слитого белка. В некоторых вариантах осуществления "R" является полипептидом или белка LAIR-1 или LIAR-2 или его фрагментом или вариантом, "R" является необязательным пептидным/полипептидным линкерным доменом, и "R" является вторым полипептидом. Альтернативно, R может являться полипептидом или белком LAIR-1 или LIAR-2 или его фрагментом или вариантом, и R может являться вторым полипептидом. В некоторых вариантах осуществления полипептид LAIR-1 или LIAR-2 представляет собой внеклеточный домен или его фрагмент, такой как Ig-подобный C2-домен, или область, фланкированную цистеинами, образующими дисульфидную связь, как указано выше.
Димеризация или мультимеризация может происходить между двумя или более слитыми белками с помощью доменов димеризации или мультимеризации. Альтернативно, димеризация или мультимеризация слитых белков может происходить посредством химической перекрестной сшивки. Образующиеся димеры или мультимеры могут являться гомодимерными/гомомультимерными или гетеродимерными/гетеромультимерными.
В некоторых вариантах осуществления слитый белок включает внеклеточный домен LAIR-1 или LAIR-2 или его фрагмент или вариант, слитый с Fc-областью Ig. Рекомбинантные слитые белки Ig можно получать посредством слияния кодирующей области внеклеточного домена или его фрагмента или варианта с Fc-областью IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека или IgG2a мыши или другим подходящим доменом Ig, как описано ранее (Chapoval, et al., Methods Mol. Med., 45:247-255 (2000)).
iv. Примеры слитых белков
Примеры слитых белков представлены ниже. Сигнальная последовательность указана двойным подчеркиванием, внеклеточный домен LAIR-1 или LAIR-2 указан одинарным подчеркиванием, и домен Ig указан курсивом.Сигнальная последовательность, как правило, удалена из зрелого белка. Кроме того, можно использовать (например, заменять) сигнальные пептиды из других полипептидов или организмов для повышения секреции слитого белка из хозяина при производстве.
hLAIR1.hG1
В некоторых вариантах осуществления слитый белок LAIR1 человека-hIg (hIgG1) (hLAIR1.hG1) имеет по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентичности последовательности по отношению к аминокислотной последовательности:
MEWSWVFLFFLSVTTGVHSQEEDLPRPSISAEPGTVIPLGSHVTFVCRGPVGVQTFRLERESRSTYNDTEDVSQASPSESEARFRIDSVSEGNAGPYRCIYYKPPKWSEQSDYLELLVKETSGGPDSPDTEPGSSAGPTQRPSDNSHNEHAPASQGLKAEH
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
(SEQ ID NO: 9) с сигнальной последовательностью или без нее.
SEQ ID NO: 9 без сигнальной последовательности представляет собой
QEEDLPRPSISAEPGTVIPLGSHVTFVCRGPVGVQTFRLERESRSTYNDTEDVSQASPSESEARFRIDSVSEGNAGPYRCIYYKPPKWSEQSDYLELLVKETSGGPDSPDTEPGSSAGPTQRPSDNSHNEHAPASQGLKAEH
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
(SEQ ID NO: 10).
LAIR1 человека-hIg (hIgG1) (hLAIR1.hG1) может являться антагонистом передачи сигнала LAIR-1, служа в качестве ловушки для лигандов LAIR-1, и его можно использовать для лечения злокачественного новообразования или инфекционного заболевания. hLAIR1.hG1 также может являться контролем для тестирования активности hLAIR2.hG1.
hLAIR1.mG2a
В некоторых вариантах осуществления слитый белок LAIR1 человека-mIg (mIgG2a) (hLAIR1.mG2a) имеет по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентичности последовательности по отношению к аминокислотной последовательности:
MEWSWVFLFFLSVTTGVHSQEEDLPRPSISAEPGTVIPLGSHVTFVCRGPVGVQTFRLERESRSTYNDTEDVSQASPSESEARFRIDSVSEGNAGPYRCIYYKPPKWSEQSDYLELLVKETSGGPDSPDTEPGSSAGPTQRPSDNSHNEHAPASQGLKAEH
EPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPG
(SEQ ID NO: 11) с сигнальной последовательностью или без нее.
SEQ ID NO: 11 без сигнальной последовательности представляет собой
QEEDLPRPSISAEPGTVIPLGSHVTFVCRGPVGVQTFRLERESRSTYNDTEDVSQASPSESEARFRIDSVSEGNAGPYRCIYYKPPKWSEQSDYLELLVKETSGGPDSPDTEPGSSAGPTQRPSDNSHNEHAPASQGLKAEH
EPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPG
(SEQ ID NO: 12).
В некоторых вариантах осуществления слитый белок LAIR1 человека-mIg (mIgG2a) (hLAIR1.mG2a) используют для получения антител против hLAIR1. Антитела могут являться, например, антагонистическими антителами против LAIR-1 (например, mAb или их фрагментами), которые можно использовать для лечения злокачественных новообразований, или агонистическими антителами против LAIR-1 (например, mAb или их фрагментами), которые можно использовать для лечения аутоиммунных заболеваний.
mLAIR1.mG2a
В некоторых вариантах осуществления LAIR1 слитый белок мыши-mIg (mLAIR1.mG2a) имеет по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентичности последовательности по отношению к аминокислотной последовательности:
MEWSWVFLFFLSVTTGVHSQEGSLPDITIFPNSSLMISQGTFVTVVCSYSDKHDLYNMVRLEKDGSTFMEKSTEPYKTEDEFEIGPVNETITGHYSCIYSKGITWSERSKTLELKVIKENVIQTPAPGPTSDTSWLKTYSIY
EPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPG
(SEQ ID NO: 13), с сигнальной последовательностью или без нее.
SEQ ID NO: 13 без сигнальной последовательности представляет собой
QEGSLPDITIFPNSSLMISQGTFVTVVCSYSDKHDLYNMVRLEKDGSTFMEKSTEPYKTEDEFEIGPVNETITGHYSCIYSKGITWSERSKTLELKVIKENVIQTPAPGPTSDTSWLKTYSIY
EPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPG
(SEQ ID NO: 14).
in vivo
В некоторых вариантах осуществления слитый белок LAIR1 мыши-mIg является аналогом мыши, используемым для исследований  на модели мыши.
hLAIR2.hG1
В некоторых вариантах осуществления слитый белок LAIR2 человека-hIg (hIgG1) (hLAIR2.hG1) имеет по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентичности последовательности по отношению к аминокислотной последовательности:
MEWSWVFLFFLSVTTGVHSQEGALPRPSISAEPGTVISPGSHVTFMCRGPVGVQTFRLEREDRAKYKDSYNVFRLGPSESEARFHIDSVSEGNAGLYRCLYYKPPGWSEHSDFLELLVKESSGGPDSPDTEPGSSAGTVPGTEASGFDAP
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
(SEQ ID NO: 15) с сигнальной последовательностью или без нее.
SEQ ID NO: 15 без сигнальной последовательности представляет собой
QEGALPRPSISAEPGTVISPGSHVTFMCRGPVGVQTFRLEREDRAKYKDSYNVFRLGPSESEARFHIDSVSEGNAGLYRCLYYKPPGWSEHSDFLELLVKESSGGPDSPDTEPGSSAGTVPGTEASGFDAP
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
(SEQ ID NO: 16).
Слитый белок LAIR2 человека-hIg (hIgG1) (hLAIR2.hG1) может являться антагонистом передачи сигнала LIAR-1, служа в качестве ловушки для лигандов LAIR-1, и его можно использовать для лечения злокачественных новообразований или инфекционного заболевания.
LAIR2.mIg
В некоторых вариантах осуществления слитый белок человеческого LAIR2.mIg (mIgG2a) имеет по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентичности последовательности по отношению к аминокислотной последовательности:
MEWSWVFLFFLSVTTGVHSQEGALPRPSISAEPGTVISPGSHVTFMCRGPVGVQTFRLEREDRAKYKDSYNVFRLGPSESEARFHIDSVSEGNAGLYRCLYYKPPGWSEHSDFLELLVKESSGGPDSPDTEPGSSAGTVPGTEASGFDAP
EPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPG
(SEQ ID NO: 17) с сигнальной последовательностью или без нее.
SEQ ID NO: 17 без сигнальной последовательности представляет собой
QEGALPRPSISAEPGTVISPGSHVTFMCRGPVGVQTFRLEREDRAKYKDSYNVFRLGPSESEARFHIDSVSEGNAGLYRCLYYKPPGWSEHSDFLELLVKESSGGPDSPDTEPGSSAGTVPGTEASGFDAP
EPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPG
(SEQ ID NO: 18).
Слитый белок человеческого LAIR2.mIg (mIgG2a) можно использовать для получения антагонистического антитела против LAIR2 (например, mAb или его фрагментов), которое можно использовать для лечения аутоиммунных заболеваний.
v. Модификации полипептидов
Полипептиды и слитые белки можно модифицировать с помощью химических веществ, которые могут присутствовать в полипептидах в нормальной среде клетки, например, посредством фосфорилирования, метилирования, амидирования, сульфатирования, ацилирования, гликозилирования, сумоилирования и убиквитинирования. Слитые белки также можно модифицировать с помощью метки, способной обеспечивать детектируемый сигнал прямо или косвенно, включая, в качестве неограничивающих примеров, радиоактивные изотопы и флуоресцентные соединения.
Полипептиды и слитые белки также можно модифицировать с помощью химических веществ, как правило, не добавляемых в полипептиды в клеточной среде. Например, описанные слитые белки также можно модифицировать посредством ковалентного присоединения полимерных цепей, включая, в качестве неограничивающих примеров, полиэтиленгликолевые полимерные (PEG) цепи (т.е. пегилирование). Конъюгирование макромолекул с PEG появилось недавно в качестве эффективной стратегии для изменения фармакокинетических (PK) профилей различных лекарственных средств и, таким образом, для улучшения их терапевтического потенциала. Конъюгирование с PEG повышает удержание лекарственных средств в кровотоке, защищая от ферментативного расщепления, замедляя фильтрацию почками и снижая образование нейтрализующих антител. Кроме того, конъюгаты с PEG можно использовать, чтобы сделать возможной мультимеризацию слитых белков.
Модификации можно включать в молекулу, проводя реакцию целевых аминокислотных остатков полипептида с органическим дериватизирующим средством, способным реагировать с выбранными боковыми цепями или концевыми остатками. Другой модификацией является циклизация белка.
Примеры химических производных полипептидов включают лизинил и амино-концевые остатки, дериватизированные с помощью ангидридов янтарной или другой карбоновой кислоты. Дериватизация с использованием циклического карбоксильного ангидрида имеет эффект реверсирования заряда лизиниловых остатков. Другие подходящие реагенты для дериватизации амино-содержащих остатков включают имидоэфиры, такие как метилпиколинимидат; пиридоксальфосфат; пиридоксаль; хлорборогидрид; тринитробензолсульфоноую кислоту; O-метилизомочевину; 2,4-пентандион, а также можно осуществлять катализируемую трансаминазой реакцию с глиоксилатом. Карбоксильные боковые группы, аспартил или глутамил, можно селективно модифицировать посредством реакции с карбодиимидами (R-N=C=N--R'), такими как 1-циклогексил-3-(2-морфолинил-(4-этил)карбодиимид или 1-этил-3-(4-азониа-4,4-диметилпентил)карбодиимид. Кроме того, аспартиловые и глутамиловые остатки можно преобразовывать в аспарагиниловые и глутаминиловые остатки посредством реакции с аммиаком. Слитые белки также могут включать одну или несколько D-аминокислот, замещающих одну или несколько L-аминокислот.
vi. Модифицированные связывающие свойства
Связывающие свойства белков, полипептидов, их фрагментов, вариантов и слитых белков важны для дозы и схемы дозирования. В одном из вариантов осуществления описанные белки, полипептиды, их фрагменты, варианты и слитые белки имеют свойства связывания с лигандом LAIR-1, характеризующиеся большим временем, или более высокой процентной долей, занятости участков связывания (например, на лиганде) относительно других молекул рецепторов, связывающихся с ним. В других вариантах осуществления описанные белки, полипептиды, их фрагменты, варианты и слитые белки имеют сниженную аффинность связывания с лигандом LAIR-1 относительно белка дикого типа.
В некоторых вариантах осуществления белки, полипептиды, их фрагменты, варианты и слитые белки имеют относительно высокую аффинность к лиганду LAIR-1 и, таким образом, могут иметь относительно небольшую скорость обратной реакции. В других вариантах осуществления белки, полипептиды, их фрагменты, варианты и слитые белки периодически вводят в течение дней, недель или месяцев для снижения иммунных ответов, которым позволяют восстанавливаться перед следующим введением, что может служить для изменения иммунного ответа без полного включения или выключения иммунного ответа и во избежание длительных побочных эффектов.
3. Выделенные молекулы нуклеиновой кислоты
В настоящем описании представлены выделенные последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие белки, полипептиды, их фрагменты, варианты и слитые белки. В рамках изобретения термин "выделенная нуклеиновая кислота" относится к нуклеиновой кислоте, отделенной от других молекул нуклеиновой кислоты, присутствующих в геноме млекопитающего, включая нуклеиновые кислоты, как правило, фланкирующие одну или обе стороны нуклеиновой кислоты в геноме млекопитающего. В рамках изобретения термин "выделенный" в отношении нуклеиновых кислот также включает комбинацию с любой неприродной последовательностью нуклеиновой кислоты, т.к. такие неприродные последовательности не обнаруживают в природе, и они не содержат непосредственно смежные последовательности в природном геноме.
Выделенная нуклеиновая кислота может являться, например, молекулой ДНК при условии, что одна из последовательностей нуклеиновой кислоты, как правило, непосредственно фланкирующих эту молекулу ДНК в природном геноме, удалена или отсутствует. Таким образом, выделенная нуклеиновая кислота включает, в качестве неограничивающих примеров, молекулу ДНК, существующую в виде отдельной молекулы независимо от других последовательностей (например, химически синтезированной нуклеиновой кислоты, или кДНК, или фрагмента геномной ДНК, получаемых с помощью ПЦР или обработки эндонуклеазами рестрикции), а также рекомбинантную ДНК, встроенную в вектор, автономно реплицирующуюся плазмиду, вирус (например, ретровирус, лентивирус, аденовирус или вирус герпеса) или в геномную ДНК прокариоты или эукариоты. Кроме того, выделенная нуклеиновая кислота может включать сконструированную нуклеиновую кислоту, такую как молекула рекомбинантной ДНК, являющуюся частью гибридной или слитой нуклеиновой кислоты. Нуклеиновую кислоту, существующую среди тысяч или миллионов других нуклеиновых кислот, например, в библиотеке кДНК или геномной библиотеке, или в куске геля, содержащего продукт рестрикции геномной ДНК, не следует считать выделенной нуклеиновой кислотой.
Нуклеиновые кислоты, кодирующие белки, полипептиды, их фрагменты, варианты и слитые белки можно оптимизировать для экспрессии в экспрессирующем хозяине по выбору. Кодоны можно заменять альтернативными кодонами, кодирующими ту же аминокислоту, для учета различий в использовании кодонов между млекопитающим, из которого получают последовательность нуклеиновой кислоты, и экспрессирующим хозяином. Таким образом, нуклеиновые кислоты можно синтезировать с использованием кодонов, предпочтительных для экспрессирующего хозяина.
Нуклеиновые кислоты могут находиться в смысловой или антисмысловой ориентации или могут быть комплементарными референсной последовательности, кодирующей полипептид или белок LAIR-1 или LAIR-2. Нуклеиновые кислоты могут являться ДНК, РНК или аналогами нуклеиновых кислот. Аналоги нуклеиновых кислот можно модифицировать на уровне основания, сахара или фосфатного остова. С помощью такой модификации можно улучшать, например, стабильность, гибридизацию или растворимость нуклеиновой кислоты. Модификации на уровне основания могут включать замену дезокситимидина дезоксиуридином и замену дезоксицитидина 5-метил-2'-дезоксицитидином или 5-бром-2'-дезоксицитидином. Модификации на уровне сахара могут включать модификацию 2'-гидроксила рибозы для получения 2'-O-метильных или 2'-O-аллильных сахаров. Дезоксирибозный фосфатный остов можно модифицировать для получения морфолинонуклеиновых кислот, в которых каждое основание соединено с шестичленным морфолиновым кольцом, или пептид-нуклеиновых кислот, в которых дезоксифосфатный остов заменяют псевдопептидным остовом, а четыре основания сохраняют. См., например, Summerton and Weller (1997) Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 7:187-195; и Hyrup et al. (1996) Bioorgan. Med. Chem. 4:5-23. Кроме того, дезоксифосфатный остов можно заменять, например, фосфотиоатным или фосфодитиоатным остовом, фосфоамидатом или алкил-фосфотриэфирным остовом.
Нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды, можно вводить нуждающимся в этом субъектам. Доставка нуклеиновых кислот включает введение "чужеродных" нуклеиновых кислот в клетку и, в конечном итоге, живому животному. В этой области известны композиции и способы для доставки нуклеиновых кислот субъекту (см. Understanding Gene Therapy, Lemoine, N.R., ed., BIOS Scientific Publishers, Oxford, 2008).
4. Векторы и клетки-хозяева
Изобретение также относится к векторам, кодирующим белки, полипептиды, их фрагменты, варианты и слитые белки. Нуклеиновые кислоты, такие как описанные выше, можно встраивать в векторы для экспрессии в клетках. В рамках изобретения "вектор" представляет собой репликон, такой как плазмида, фаг, вирус или космида, в который можно встраивать другой сегмент ДНК таким образом, чтобы достигать репликации встроенного сегмента. Векторы могут являться экспрессирующими векторами. "Экспрессирующий вектор" является вектором, включающим одну или несколько последовательностей контроля экспрессии, и "последовательность контроля экспрессии" является последовательностью ДНК, контролирующей и регулирующей транскрипцию и/или трансляцию другой последовательности ДНК.
Нуклеиновые кислоты в векторах могут быть функционально связаны с одной или несколькими последовательностями контроля экспрессии. В рамках изобретения термин "функционально связанный" означает встроенный в генетическую конструкцию таким образом, что последовательности контроля экспрессии эффективно контролируют экспрессию интересующей кодирующей последовательности. Примеры последовательностей контроля экспрессия включают промоторы, энхансеры и области терминации транскрипции. Промотор является последовательностью контроля экспрессии, состоящей из области молекулы ДНК, как правило, в пределах 100 нуклеотидов выше точки начала транскрипции (как правило, вблизи участка инициации для РНК-полимеразы II). Для установления контроля промотора над кодирующей последовательностью необходимо располагать участок инициации трансляции трансляционной рамки считывания полипептида от одного до приблизительно пятидесяти нуклеотидов ниже промотора. Энхансеры обеспечивают специфичность экспрессии в терминах времени, локализации и уровня. В отличие от промоторов, энхансеры могут функционировать при расположении на разных расстояниях от участка инициации транскрипции. Энхансер также может располагаться ниже участка инициации транскрипции. Кодирующая последовательность "функционально связана" и "находится под контролем" последовательностей контроля экспрессии в клетке, если РНК-полимераза способна транскрибировать кодирующую последовательность в мРНК, которая затем может транслироваться в белок, кодируемый кодирующей последовательности.
Подходящие экспрессирующие векторы включают, в качестве неограничивающих примеров, плазмиды и вирусные векторы, полученные, например, из бактериофага, бакуловирусов, вируса табачной мозаики, вирусов герпеса, цитомегаловируса, ретровирусов, вирусов осповакцины, аденовирусов и аденоассоциированных вирусов. Многочисленные векторы и системы экспрессии являются коммерчески доступными в таких фирмах, как Novagen (Madison, WI), Clontech (Palo Alto, CA), Stratagene (La Jolla, CA) и Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA).
H
H
Экспрессирующий вектор может включать последовательность метки. Последовательности меток, как правило, экспрессируются в виде продукта слияния с кодируемым полипептидом. Такие метки можно встраивать куда-либо в полипептид, включая карбоксильный конец или амино-конец. Неограничивающие примеры применимых меток включают зеленый флуоресцентный белок (GFP), глутатион-S-трансферазу (GST), полигистидин, c-myc, гемагглютинин, метку Flag™ (Kodak, New Haven, CT), мальтоза E-связывающий белок и протеин A. В одном из вариантов осуществления молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая один из описываемых полипептидов, находится в векторе, содержащем нуклеиновые кислоты, кодирующие один или несколько доменов константной области тяжелой цепи Ig, например, имеющих аминокислотную последовательность, соответствующую шарнирной области, областям C2 и C3 цепи Cγ1 иммуноглобулина человека.
Векторы, содержащие нуклеиновые кислоты, подлежащие экспрессии, можно переносить в клетки-хозяева. Термин "клетка-хозяин" предназначен для включения прокариотических и эукариотических клеток, в которые можно встраивать рекомбинантный экспрессирующий вектор. В рамках изобретения, термины "трансформированный" и "трансфицированный" включают встраивание молекулы нуклеиновой кислоты (например, вектора) в клетку одним из множества способов. Хотя он и не ограничен конкретным способом, ряд этих способов хорошо известен в этой области. Прокариотические клетки можно трансформировать с использованием нуклеиновых кислот посредством, например, электропорации или опосредованной хлоридом кальция трансформации. Нуклеиновые кислоты можно трансфицировать в клетки млекопитающих с помощью способов, включающих, например, осаждение фосфатом кальция, опосредованную DEAE-декстраном трансфекцию, липофекцию, электропорацию или микроинъекцию. Клетки-хозяева (например, прокариотическую клетку или эукариотическую клетку, такую как клетку CHO) можно использовать, например, для получения белков, полипептидов, их фрагментов, вариантов и слитых белков, представленных в настоящем описании.
ex vivo
ex vivo
ex vivo
Описанные векторы можно использовать для экспрессии белков, полипептидов, их фрагментов, вариантов и слитых белков в клетках. Неограничивающие примеры векторов включают аденовирусный вектор. Один из подходов включает перенос нуклеиновых кислот в первичные клетки в культуре с последующей аутологичной трансплантацией трансформированных  клеток хозяину системно или в конкретный орган или ткань. Способы  могут включать, например, стадии сбора клеток из субъекта, культивирования клеток, их трансдукции с использованием экспрессирующего вектора и поддержания клеток в условиях, подходящих для экспрессии кодируемых полипептидов. Эти способы известны в области молекулярной биологии. Стадию трансдукции можно осуществлять стандартными способами, используемыми для генной терапии , включая, например, осаждение фосфатом кальция, липофекцию, электропорацию, вирусную инфекцию и биолистический перенос генов. Альтернативно, можно использовать липосомы или полимерные микрочастицы. Затем успешно трансдуцированные клетки можно подвергать селекции, например, по экспрессии кодирующей последовательности или гена резистентности к лекарственному средству. Затем клетки можно летально облучать (при желании) и инъецировать или имплантировать субъекту. В одном из вариантов осуществления экспрессирующие векторы, содержащие нуклеиновые кислоты, кодирующие слитые белки, трансфицируют в клетки, вводимые нуждающемуся в этом субъекту.
in vivo
in vivo
Терапию нуклеиновыми кислотами  можно осуществлять посредством прямого переноса функционально активной ДНК в соматическую ткань или орган млекопитающего . Например, нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды, представленные в настоящем описании можно вводить напрямую в лимфоидные ткани. Альтернативно, специфического для лимфоидных тканей направленного воздействия можно достигать с использованием специфических для лимфоидных тканей транскрипционных регуляторных элементов (TRE), таких как B-лимфоцит-, T-лимфоцит- или дендритная клетка-специфический TRE. Специфические для лимфоидных тканей TRE известны в этой области.
in vivo
Нуклеиновые кислоты также можно вводить  с помощью вирусных средств. Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие слитые белки, можно упаковывать в ретровирусные векторы с использованием упаковывающих линий клеток, продуцирующих дефектные по репликации ретровирусы, как известно в этой области. Также можно использовать другие вирусные векторы, включая рекомбинантные аденовирусы и вирус осповакцины, которые можно делать нереплицирующимися. В дополнение к депротеинизированной ДНК или РНК или вирусным векторам, в качестве векторов можно использовать сконструированные бактерии.
Нуклеиновые кислоты также можно доставлять с помощью других носителей, включая липосомы, полимерные микро- и наночастицы и поликатионы, такие как асиалогликопротеин/полилизин.
in vivo
В дополнение к опосредованному вирусом и носителем переносу генов , для прямого переноса ДНК можно использовать физические средства, хорошо известные в этой области, включая введение плазмидной ДНК и опосредованный бомбардировкой частицами перенос генов.
Один из вариантов осуществления относится к клетке, конститутивно или индуцибельно экспрессирующей антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфически связывающийся с LAIR-1, где клетка содержит нуклеиновую кислоту или нуклеиновые кислоты, кодирующие аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NOs: 19, 27, 35, 43, 51, 59, 67, 75, 83, 91, 99, 107, 115, 23, 31, 39, 47, 55, 63, 71, 79, 87, 95, 103, 111 или их комбинации.
5. Низкомолекулярные соединения
Иммуномодулирующее средство может являться низкомолекулярным соединением. Низкомолекулярные соединения, агонисты и антагонисты LAIR-1 и антагонисты LAIR-2 известны в этой области, или их можно идентифицировать общепринятыми способами скрининга.
В некоторых вариантах осуществления способы скрининга могут включать случайный скрининг больших библиотек тестируемых соединений. Альтернативно, можно использовать анализы, направленные на конкретные классы соединений, как предполагают, модулирующих уровень LAIR-1 или LAIR-2. Анализы могут включать определение активности передачи сигнала LAIR-1 или ингибиторного ответа, опосредованного LAIR-1. Другие анализы могут включать определение транскрипции или трансляции нуклеиновых кислот, уровней мРНК, стабильности мРНК, деградации мРНК, скорости транскрипции и скорости трансляции.
C. Фармацевтические композиции
Изобретение относится к фармацевтическим композициям, включающим описанные иммуномодулирующие средства. Фармацевтические композиции, содержащие иммуномодулирующее средство, могут быть предназначены для введения парентеральным (посредством внутримышечной, интраперитонеальной, внутривенной (IV) или подкожной инъекции), трансдермальным (пассивно или с использованием ионтофореза или электропорации) или чрезслизистым (назальным, вагинальным, ректальным или сублингвальным) путем введения или с использованием биоразлагаемых имплантатов, и их можно составлять в лекарственных формах, подходящих для каждого пути введения.
in vivo
В некоторых подходах композиции, представленные в настоящем описании, вводят субъекту в терапевтически эффективном количестве. В рамках изобретения термин "эффективное количество" или "терапевтически эффективное количество" означает дозу, достаточную для лечения, ингибирования или облегчения одного или нескольких симптомов нарушения, подвергаемого лечению, или иного обеспечения желаемого фармакологического и/или физиологического эффекта. Точная доза будет варьироваться в зависимости от множества факторов, таких как зависящие от субъекта переменные (например, возраст, состояние иммунной системы и т.д.), заболевание и осуществляемое лечение.
Что касается описываемых иммуномодулирующих средств, по мере проведения дальнейших исследований будет поступать информация, касающаяся подходящих уровней доз для лечения различных состояний у различных пациентов, и специалист в этой области, учитывая терапевтический контекст, возраст и общее состояние здоровья реципиента, будет способен установить правильную дозировку. Выбранная доза зависит от желаемого терапевтического эффекта, пути введения и желаемой длительности лечения. Что касается описываемых иммуномодулирующих средств, как правило, млекопитающим вводят дозы от 0,001 до 20 мг/кг массы тела в сутки. Как правило, в случае внутривенной инъекции или инфузии доза может быть более низкой.
В определенных вариантах осуществления иммуномодулирующее средство вводят местно, например, посредством инъекции непосредственно в место, подвергаемое лечению. Как правило, инъекция вызывает повышение локальной концентрации композиции иммуномодулирующего средства, превышающей концентрацию, которую можно достигнуть посредством системного введения. Композиции иммуномодулирующего средства можно комбинировать с матрицей, как описано выше, для создания повышенной локальной концентрации композиций полипептида посредством снижения пассивной диффузии полипептидов из места, подвергаемого лечению.
1. Составы для парентерального введения
В некоторых вариантах осуществления композиции, представленные в настоящем описании, включая композиции, содержащие пептиды и полипептиды, вводят в водном растворе посредством парентеральной инъекции. Состав также может находиться в форме суспензии или эмульсии. В основном, изобретение относится к фармацевтическим композициям, включающим эффективные количества пептида или полипептида и, необязательно, включающим фармацевтически приемлемые дилюенты, консерванты, солюбилизаторы, эмульгаторы, адъюванты и/или носители. Такие композиции, необязательно, включают один или несколько из следующего: дилюенты, стерильную воду, забуференный физиологический раствор с различным содержанием буфера (например, Трис-HCl, ацетат, фосфат), pH и ионной силой; и добавки, такие как детергенты и солюбилизаторы (например, TWEEN 20 (полисорбат-20), TWEEN 80 (полисорбат-80)), антиоксиданты (например, аскорбиновую кислоту, метабисульфит натрия) и консерванты (например, тиомерсал, бензиловый спирт) и наполнители (например, лактозу, маннит). Примерами неводных растворителей или носителей являются пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло и кукурузное масло, желатин и инъецируемые органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Составы можно лиофилизировать и перерастворять/ресуспендировать непосредственно перед использованием. Состав можно стерилизовать, например, посредством фильтрации через удерживающий бактерии фильтр, включения в композиции стерилизующих средств, облучения композиций или нагревания композиций.
2. Составы для перорального введения
th
th
in vivo
in vivo
В вариантах осуществления композиции составляют для перорального введения. Пероральные твердые лекарственные формы, в целом, описывают в Remington's Pharmaceutical Sciences, 18 Ed. 1990 (Mack Publishing Co. Easton Pa. 18042) в главе 89. Твердые лекарственные формы включают таблетки, капсулы, пилюли, троше или пастилки, облатки, пеллеты, порошки или гранулы или включение материалов в дисперсные препараты полимерных соединений, таких как полимолочная кислота, полигликолевая кислота и т.д., или липосомы. Такие композиции могут влиять на физическое состояние, стабильность, скорость высвобождения и скорость клиренса описываемых средств. См., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18 Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, Pa. 18042) стр. 1435-1712, включенную в настоящее описание в качестве ссылки. Композиции можно получать в жидкой форме или в форме высушенного порошка (например, лиофилизированного). Для составления композиций можно использовать липосомную или протеиноидную инкапсуляцию. Можно использовать липосомную инкапсуляцию и липосомы можно дериватизировать с использованием различных полимеров (например, патент США № 5013556). Также см. Marshall, K. In: Modern Pharmaceutics Edited by G. S. Banker и C. T. Rhodes Chapter 10, 1979. В основном, состав будет включать пептид (или его химически модифицированные формы) и инертные ингредиенты, защищающие пептид в желудочной среде и высвобождающие биологически активный материал в кишечнике.
Средства можно химически модифицировать таким образом, чтобы пероральная доставка производного была эффективной. Как правило, предполагаемая химическая модификация является присоединением по меньшей мере одного вещества к самой молекуле-компоненту, где вещество делает возможным захват в кровоток из желудка или кишечника или захват непосредственно в слизистой оболочке кишечника. Также желательным является повышение общей стабильности компонента или компонентов и повышение времени циркуляции в организме. Пегилирование является примером химической модификации для фармацевтического использования. Другие вещества, которые можно использовать, включают: пропиленгликоль, сополимеры этиленгликоля и пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлозу, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, полипролин, поли-1,3-диоксолан и поли-1,3,6-тиоксокан [см., например, Abuchowski and Davis (1981) "Soluble Polymer-Enzyme Adducts," в Enzymes as Drugs. Hocenberg and Roberts, eds. (Wiley-Interscience: New York, N.Y.) pp. 367-383; и Newmark, et al. (1982) J. Appl. Biochem. 4:185-189].
Другой вариант осуществления относится к жидким лекарственным формам для перорального введения, включая фармацевтически приемлемые эмульсии, растворы, суспензии и сиропы, которые могут содержать другие компоненты, включая инертные дилюенты; вспомогательные вещества, такие как увлажнители, эмульгаторы и суспендирующие средства; и подсластители, вкусовые добавки и ароматизаторы.
Желательными могут являться пероральные составы для контролируемого высвобождения. Средство можно включать в инертную матрицу, делающую возможным высвобождение посредством механизмов диффузии или вымывания, например, камеди. В состав также можно включать медленно разлагаемые матрицы. Другая форма контролируемого высвобождения основана натерапевтической системе Oros (Alza Corp.), т.е. лекарственное средство заключают в полупроницаемую мембрану, позволяющую воде проникать и выталкивать лекарственное средство через единственное небольшое отверстие благодаря осмотическим эффектам.
В случае пероральных составов местом высвобождения может являться желудок, тонкий кишечник (двенадцатиперстная кишка, тощая кишка или подвздошная кишка) или толстый кишечник. В некоторых вариантах осуществления при высвобождении будут избегать вредных воздействий желудочной среды посредством защиты средства (или производного) или высвобождения средства (или производного) вне желудочной среды, например, в кишечнике. Для обеспечения полной устойчивости к желудочной среде важно покрытие, непроницаемое по меньшей мере при pH 5,0. Примеры более распространенных инертных ингредиентов, используемых в качестве растворяющихся в кишечнике покрытия, ацетат-тримеллитат целлюлозы (CAT), фталат гидроксипропилметилцеллюлозы (HPMCP), HPMCP 50, HPMCP 55, поливинилацетат фталат (PVAP), Eudragit L30D™, Aquateric™, ацетат-фталат целлюлозы (CAP), Eudragit L™, Eudragit S™ и Shellac™. Эти покрытия можно использовать в качестве смешанных пленок.
3. Составы для местного введения
Описанные иммуномодулирующие средства можно использовать местно. Местное введение не очень эффективно для большинства пептидных составов, хотя оно может быть эффективным, в частности, при нанесении на слизистую оболочку легких, носа, ротовой полости (сублингвально, буккально), влагалища или прямой кишки.
Композиции можно вводить в легкие с использованием ингаляции и перемещения через эпителиальную выстилку легких в кровоток при доставке в форме аэрозоля или полученных сушкой распылением частиц, имеющих аэродинамический диаметр менее приблизительно 5 мкм.
Можно использовать широкий диапазон механических устройств, сконструированных для легочной доставки терапевтических продуктов, включая, в качестве неограничивающих примеров, небулайзеры, дозирующие ингаляторы и порошковые ингаляторы, все из которых хорошо известны специалистам в этой области. Некоторыми конкретными примерами коммерчески доступных устройств являются небулайзер Ultravent (Mallinckrodt Inc., St. Louis, Mo.); небулайзер Acorn II (Marquest Medical Products, Englewood, Colo.); дозирующий ингалятор Ventolin (Glaxo Inc., Research Triangle Park, N.C.) и порошковый ингалятор Spinhaler (Fisons Corp., Bedford, Mass.). Все из Nektar, Alkermes и Mannkind имеют ингалируемые порошковые препараты инсулина, одобренные или находящиеся на стадии клинических исследований, при этом эту технологию можно применять к составам, представленным в настоящем описании.
Составы для введения в слизистую оболочку, как правило, будут частицами лекарственного средства, полученными сушкой распылением, которые можно включать в таблетку, гель, капсулу, суспензию или эмульсию. Доступны стандартные фармацевтические эксципиенты от любого разработчика рецептур.
Также можно получать трансдермальные составы. Они, как правило, будут являться мазями, лосьонами, спреями или пластырями, все из которых можно получать с использованием стандартной технологии. В случае трансдермальных составов может потребоваться включение средств, улучшающих проникновение.
4. Полимерные матрицы с контролируемой доставкой
Иммуномодулирующие средства, представленные в настоящем описании, также можно вводить в составах с контролируемым высвобождением. Можно получать полимерные устройства с контролируемым высвобождением для длительного системного высвобождения после имплантации полимерного устройства (стержня, цилиндра, пленки, диска) или инъекции (микрочастиц). Матрица может иметь форму микрочастиц, таких как микросферы, где средство диспергировано в твердой полимерной матрице, или микрокапсулы, где кор состоит из иного материала, чем полимерная оболочка, и пептид диспергирован или суспендирован в коре, который может быть жидким или твердым по своей природе. Если в настоящем описании не указано иначе, термины "микрочастицы", "микросферы" и "микрокапсулы" используют взаимозаменяемо. Альтернативно, полимер можно получать в форме пластины или пленки размером в диапазоне от нанометров до четырех сантиметров, порошка, полученного с помощью перемалывания или других стандартных способов, или даже геля, такого как гидрогель.
Для доставки слитых полипептидов или нуклеиновых кислот, кодирующих слитые полипептиды, можно использовать небиодеградирующие или биодеградирующие матрицы, хотя в некоторых вариантах осуществления биодеградирующие матрицы являются предпочтительными. Они могут являться природными или синтетическими полимерами, хотя в некоторых вариантах осуществления синтетические полимеры являются предпочтительными по причине лучшей характеризации деградации и профилей высвобождения. Полимер выбирают с учетом периода, в течение которого желательно высвобождение. В некоторых случаях наиболее полезным может являться линейное высвобождение, хотя в других случаях прерывистое высвобождение или "масштабное высвобождение" может приводить к более эффективным результатам. Полимер может находиться в форме гидрогеля (как правило, абсорбирующего до приблизительно 90% по массе воды), и, необязательно, его можно перекрестно сшивать с мультивалентными ионами или полимерами.
Матрицы можно получать посредством испарения растворителя, сушки распылением, экстракции растворителем и другими способами, известными специалистам в этой области. Биоразлагаемые микросферы можно получать любыми способами, разработанными для получения микросфер для доставки лекарственного средства, например, как описано в Mathiowitz and Langer, J. Controlled Release, 5:13-22 (1987); Mathiowitz, et al., Reactive Polymers, 6:275-283 (1987); и Mathiowitz, et al., J. Appl. Polymer Sci., 35:755-774 (1988).
Устройства можно составлять для локального высвобождения для воздействия на область имплантации или инъекции, посредством чего, как правило, будут доставлять дозу гораздо меньше дозы для воздействия на целый организм, или системной доставки. Их можно имплантировать или инъецировать подкожно, в мышцу, жир или проглатывать.
III. Способы производства
A.
Способы получения антител
Antibody Production: Essential Techniques
Monoclonal Antibodies
Monoclonal Antibodies: Principles And Practice
Current Protocols In Immunology
Антитела можно получать с помощью культуры клеток, фага или различных животных, включая, в качестве неограничивающих примеров, коров, кроликов, коз, мышей, крыс, хомяков, морских свинок, овец, собак, кошек, обезьян. Таким образом, в одном из вариантов осуществления антитело представляет собой антитело млекопитающего. Фаговые способы можно использовать для выделения исходного антитела или для получения вариантов с измененной специфичностью или авидностью. Такие способы являются общепринятыми и хорошо известными в этой области. В одном из вариантов осуществления антитело получают рекомбинантными способами, известными в этой области. Например, рекомбинантное антитело можно получать посредством трансфекции клетки-хозяина с использованием вектора, содержащего последовательность ДНК, кодирующую антитело. Можно использовать один или несколько векторов для трансфекции последовательностей ДНК, экспрессирующих по меньшей мере одну область VL и одну область VH в клетке-хозяине. Примеры описания рекомбинантных способов получения антитела включают Delves,  (Wiley, 1997); Shephard, et al.,  (Oxford University Press, 2000); Goding,  (Academic Press, 1993);  (John Wiley & Sons, последнее издание).
Mol. Immunol
Antibody Engineering: A Practical Approach
Описанные антитела можно модифицировать рекомбинантными способами для повышения эффективности антитела в опосредовании желаемой функции. Таким образом, в объем изобретения входит то, что антитела можно модифицировать посредством замен с использованием рекомбинантных средств. Как правило, замены будут являться консервативными заменами. Например, по меньшей мере одну аминокислоту в константной области антитела можно заменять другим остатком. См., например, патент США № 5624821, патент США № 6194551, заявка № WO 9958572; и Angal, et al., .30:105-08 (1993). Модификация аминокислот включает делеции, добавления и замены аминокислот. В некоторых случаях такие изменения осуществляют для снижения нежелательной активности, например, комплементзависимой цитотоксичности. Зачастую антитела метят посредством ковалентного или нековалентного присоединения вещества, обеспечивающего детектируемый сигнал. Известен широкий спектр меток и способов конъюгации, широко описанных и в научной, и в патентной литературе. Эти антитела можно подвергать скринингу на связывание с белками, полипептидами или слитыми белками LAIR-1 или LAIR-2. См., например,  (Oxford University Press, 1996).
in vitro,
in vivo,
Например, подходящие антитела с желаемой биологической активностью можно идентифицировать с использованием анализов включая, в качестве неограничивающих примеров: пролиферацию, миграцию, адгезию, рост в мягком агаре, ангиогенез, межклеточное взаимодействие, апоптоз, транспорт, передачу сигнала, и анализов таких как ингибирование роста опухоли. Антитела, представленные в настоящем описании, также могут быть полезными в диагностике. В качестве захватывающих или ненейтрализующих антител, их можно подвергать скринингу на способность связываться со специфическим антигеном без ингибирования рецептор-связывающей или биологической активности антигена. В качестве нейтрализующих антител, антитела могут быть полезными в анализах конкурентного связывания.
Антитела, которые можно использовать в описываемых композициях и способах, включают целый иммуноглобулин (т.е. интактное антитело) любого класса, его фрагменты и синтетические белки, содержащие, по меньшей мере, антигенсвязывающий вариабельный домен антитела. Вариабельные домены отличаются последовательностью среди антител, и они вносят вклад в связывание и специфичность каждого конкретного антитела к конкретному антигену. Однако вариабельность, как правило, неравномерно распределяется среди вариабельных доменов антител. Как правило, она концентрируется в трех сегментах, названных определяющими комплементарность областями (CDR) или гипервариабельными областями, в вариабельных доменах легкой цепи и тяжелой цепи. Более консервативные части вариабельных доменов называют каркасом (FR). Вариабельные домены каждой из нативных тяжелых и легких цепей содержат четыре области FR, в значительной степени принимающих конфигурацию бета-листа, соединенные тремя CDR, образующими петли, соединяющие, а в некоторых случаях образующие части, структуры бета-листа. CDR в каждой цепи удерживаются в непосредственной близости с помощью областей FR и вместе с CDR из другой цепи они участвуют в образовании антигенсвязывающего участка антитела.
Также описаны фрагменты антител, имеющие биологическую активность. Фрагменты, присоединенные или неприсоединенные к другим последовательностям, включают инсерции, делеции, замены или другие выбранные модификации конкретных областей или конкретных аминокислотных остатков, при условии, что активность фрагмента не изменена или нарушена значительно по сравнению с немодифицированным антителом или фрагментом антитела.
Способы также можно адаптировать для получения одноцепочечных антител, специфических для антигенного пептида. Способы получения одноцепочечных антител хорошо известны специалистам в этой области. Одноцепочечное антитело можно получать посредством слияния с вариабельными доменами тяжелых и легких цепей с использованием короткого пептидного линкера, таким образом, восстанавливая антигенсвязывающий участок на одной молекуле. Разработаны вариабельные фрагменты одноцепочечного антитела (scFv), в которых C-конец одного вариабельного домена соединяют с N-концом другого вариабельного домена через пептид или линкер из 15-25 аминокислот, без значительного нарушения связывания антигена или специфичности связывания. Линкер выбирают так, чтобы позволить тяжелой цепи и легкой цепи соединяться в правильной конформационной ориентации.
Можно конструировать бивалентные одноцепочечные вариабельные фрагменты (di-scFv), соединяя два scFv. Это можно осуществлять посредством получения одной пептидной цепи с двумя областями VH и двумя областями VL, получая тандемные scFv. ScFv также можно конструировать с использованием линкерных пептидов, слишком коротких для того, чтобы две вариабельные области сворачивались вместе (приблизительно пять аминокислот), заставляя scFv димеризоваться. Этот тип известен как диатела. Показано, что диатела имеют константы диссоциации до 40 раз ниже соответствующих scFv, что означает, что они имеют гораздо более высокую аффинность к своей мишени. Еще более короткие линкеры (одна или две аминокислоты) приводят к образованию тримеров (триател или трител). Также получают тетратела. Они демонстрируют даже более высокую аффинность к своим мишеням, чем диатела.
Моноклональное антитело получают из, по существу, гомогенной популяции антител, т.е. отдельные антитела в популяции являются идентичными, за исключением возможных природных мутаций, которые могут присутствовать в небольшой подгруппе молекул антител. Моноклональные антитела включают "химерные" антитела, в которых часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, полученных из конкретных видов или принадлежащих к конкретному классу или подклассу антител, в то время как остальная часть цепей идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, полученных из другого вида или принадлежащих другому классу или подклассу антител, а также фрагменты таких антител, при условии, что они проявляют желательную антагонистическую активность.
in vitro
Моноклональные антитела можно получать с использованием любого способа, с помощью которого получают моноклональные антитела. В гибридомном способе мышь или другое подходящее животное-хозяина, как правило, иммунизируют с использованием иммунизирующего средства для получения лимфоцитов, продуцирующих или способных продуцировать антитела, которые будут специфически связываться с иммунизирующим средством. Альтернативно, лимфоциты можно иммунизировать .
Антитела также можно получать способами рекомбинантной ДНК. ДНК, кодирующую описываемые антитела, легко можно выделять и секвенировать общепринятыми способами (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, способных специфически связываться с генами, кодирующим тяжелые и легкие цепи антител мыши). Библиотеки антител или активных фрагментов антител также можно получать и подвергать скринингу способами фагового дисплея.
in vivo
В этой области также известны способы получения антител с использованием химии белков. Одним из способов получения белков, содержащих антитела, является соединение двух или более пептидов или полипептидов способами химии белков. Например, пептиды или полипептиды можно химически синтезировать с использованием доступного в настоящее время лабораторного оборудования с использованием химии Fmoc (9-фторенилметилоксикарбонила) или Boc (трет-бутилoоксикарбонила) (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). Специалисту в этой области будет понятно, что пептид или полипептид, соответствующий антителу, например, можно синтезировать с помощью стандартных химических реакций. Например, пептид или полипептид можно синтезировать и не отщеплять от смолы для синтеза, в то время как другой фрагмент антитела можно синтезировать, а затем отщеплять от смолы, таким образом, экспонируя терминальную группу, функционально заблокированную на другом фрагменте. С помощью реакции конденсации пептидов эти два фрагмента можно ковалентно соединять с помощью пептидной связи на карбокси- и амино-конце, соответственно, для получения антитела или его фрагмента. Альтернативно, пептид или полипептид независимо синтезируют , как описано выше. После выделения эти независимые пептиды или полипептиды можно соединять для получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента с помощью схожих реакций конденсаций пептидов.
Например, ферментативное лигирование клонированных или синтетических пептидных сегментов позволяет соединять относительно короткие пептидные фрагменты для получения более крупных пептидных фрагментов, полипептидов или целых белковых доменов. Альтернативно, можно использовать нативное химическое лигирование синтетических пептидов для синтетического конструирования больших пептидов или полипептидов из более коротких пептидных фрагментов. Этот способ состоит из двухстадийной химической реакции. Первой стадией является хемоселективная реакция незащищенного синтетического пептид-альфа-тиоэфира с другим незащищенным пептидным сегментом, содержащим амино-концевой остаток Cys, для получения соединенного тиоэфиром промежуточного продукта в качестве исходного ковалентного продукта. Без изменений условий реакции этот промежуточный продукт подвергается спонтанной, быстрой внутримолекулярной реакции с образованием нативной пептидной связи в участке лигирования.
B.
Способы получения белков
Описанные белки, полипептиды, их фрагменты, варианты и слитые белки можно производить общепринятыми способами, известными в этой области. Выделенные слитые белки можно получать посредством, например, химического синтеза или рекомбинантного получения в клетке-хозяине. Для рекомбинантного получения белка, полипептида, их фрагмента, варианта или слитого белка нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, полипептид, его фрагмент, вариант или слитый белок, можно использовать для трансформации, трансдукции или трансфекции бактериальной или эукариотической клетки-хозяина (например, клетки насекомого, дрожжевой клетки или клетки млекопитающего). В основном, конструкции нуклеиновой кислоты включают регуляторную последовательность, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей белок, полипептид, его фрагмент, вариант или слитый белок. Регуляторные последовательности (также обозначенные в настоящем описании как последовательности контроля экспрессии), как правило, не кодируют продукт гена, но вместо этого влияют на экспрессию последовательностей нуклеиновой кислоты, с которыми они функционально связаны.
Escherichia coli
Применимые прокариотические и эукариотические системы для экспрессии и получения полипептидов хорошо известны в этой области и включают, например, штаммы , такие как BL-21, и культивируемые клетки млекопитающих, такие как клетки CHO.
В эукариотических клетках-хозяевах можно использовать ряд систем экспрессии на основе вирусов для экспрессии слитых белков. Системы экспрессии на основе вирусов хорошо известны в этой области и включают, в качестве неограничивающих примеров, вирусные векторы на основе бакуловирусов, SV40, ретровирусов или вируса осповакцины.
Линии клеток млекопитающих, стабильно экспрессирующие белки, полипептиды, их фрагменты, варианты или слитые белки, можно получать с использованием экспрессирующих векторов с подходящими элементами контроля и селективным маркером. Например, эукариотические экспрессирующие векторы pCR3.1 (Invitrogen Life Technologies) и p91023(B) (см. Wong et al. (1985) Science 228:810-815) подходят для экспрессии белков, полипептидов, их фрагментов, вариантов или слитых белков, например, в клетках яичника китайского хомяка (CHO), клетках COS-1, эмбриональных клетках почки человека 293, клетках NIH3T3, клетках BHK21, клетках MDCK и клетках эндотелия сосудов человека (HUVEC). Дополнительные подходящие системы экспрессии включают систему GS Gene Expression System™, доступную в Lonza Group Ltd.
in vitro
После введения экспрессирующего вектора посредством электропорации, липофекции, осаждения фосфатом кальция или осаждения хлоридом кальция, DEAE-декстраном или с помощью другого подходящего способа трансфекции можно выбирать стабильные линии клеток (например, посредством метаболической селекции или селекции по резистентности к антибиотику G418, канамицину или гигромицину). Трансфицированные клетки можно культивировать таким образом, что экспрессируется интересующий полипептид, и полипептид можно выделять, например, из супернатанта культуры клеток или лизированных клеток. Альтернативно, белок, полипептид, его фрагмент, вариант или слитый белок можно получать посредством (a) лигирования амплифицированных последовательностей в экспрессирующий вектор млекопитающего, такой как pcDNA3 (Invitrogen Life Technologies), и (b) транскрипции и трансляции  с использованием экстракта из пшеничных зародышей или лизата ретикулоцитов кролика.
Белки, полипептиды, их фрагменты, варианты или слитые белки можно выделять с использованием, например, способов хроматографии, таких как аффинная хроматография, ионообменная хроматография, хроматография с гидрофобными взаимодействиями, ионообменная хроматография с DEAE, гель-фильтрация и хроматография на гидроксиапатите. В некоторых вариантах осуществления белки, полипептиды, их фрагменты, варианты или слитые белки можно конструировать так, чтобы они содержали дополнительный домен, содержащий аминокислотную последовательность, позволяющую фиксировать полипептиды на аффинной матрице. Например, Fc-слитый полипептид в супернатанте культуры клеток или цитоплазматическом экстракте можно выделять с использованием колонки с протеином A. Кроме того, для облегчения очистки полипептида можно использовать метку, такую как c-myc, гемагглютинин, полигистидин или Flag™ (Kodak). Такие метки можно встраивать куда-либо в полипептид, включая карбокси- или амино-конец. Другие партнеры по слиянию, которые могут быть полезными, включают ферменты, облегчающие детекцию полипептида, такие как щелочная фосфатаза. Для очистки полипептидов также можно использовать иммуноаффинную хроматографию. Слитые белки дополнительно можно конструировать так, чтобы они содержали секреторный сигнал (если секреторный сигнал еще не присутствует), вызывающий секрецию белков, полипептидов, их фрагментов, вариантов или слитых белков клетками, в которых они продуцируются. Затем секретируемые белки, полипептиды, их фрагменты, варианты или слитые белки легко можно выделять из сред для культивирования клеток.
C.
Способы получения выделенных молекул нуклеиновой кислоты
PCR Primer: A Laboratory Manual
Выделенные молекулы нуклеиновой кислоты можно получать стандартными способами, включая, в качестве неограничивающих примеров, распространенное молекулярное клонирование и химический синтез нуклеиновых кислот. Например, способы полимеразной цепной реакции (ПЦР) можно использовать для получения выделенной нуклеиновой кислоты, кодирующей вариант полипептида. ПЦР является способом, посредством которого ферментативно амплифицируют целевые нуклеиновые кислоты. Как правило, информацию о последовательности от концов интересующей области или вне ее можно использовать в дизайне олигонуклеотидных праймеров, идентичных последовательности на противоположной цепи матрицы, подлежащей амплификации. ПЦР можно использовать для амплификации конкретных последовательностей из ДНК, а также РНК, включая последовательности из тотальной геномной ДНК или тотальной клеточной РНК. Праймеры, как правило, составляют от 14 до 40 нуклеотидов в длину, но могут находиться в диапазоне от 10 нуклеотидов до сотен нуклеотидов в длину. Общие способы ПЦР описаны, например, в , ed., Dieffenbach and Dveksler, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995. При использовании РНК в качестве источника матрицы можно использовать обратную транскриптазу для синтеза комплементарной цепи ДНК (кДНК). Для получения выделенных нуклеиновых кислот также можно использовать лигазную цепную реакцию, амплификацию с замещением цепей, самоподдерживающуюся репликацию последовательности или амплификацию, основанную на последовательности нуклеиновой кислоты. См., например, Lewis (1992) Genetic Engineering News 12:1; Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878; и Weiss (1991) Science 254:1292-1293.
Short Protocols in Molecular Biology
Выделенные нуклеиновые кислоты можно химически синтезировать в виде одной молекулы нуклеиновой кислоты или в виде серии олигонуклеотидов (например, с использованием фосфоамидатной технологии для автоматизированного синтеза ДНК в 3'-5'-направлении). Например, можно синтезировать одну или несколько пар длинных олигонуклеотидов (например, >100 нуклеотидов), содержащих желаемую последовательность, при этом каждая пара содержит короткий комплементарный сегмент (например, приблизительно 15 нуклеотидов) таким образом, что образует дуплекс при отжиге пары олигонуклеотидов. Можно использовать ДНК-полимеразу для элонгации олигонуклеотидов, что приводит к получению одной двухцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты на пару олигонуклеотидов, которую затем можно лигировать в вектор. Выделенные нуклеиновые кислоты также можно получать посредством мутагенеза. Кодирующие белок нуклеиновые кислоты можно подвергать мутагенезу стандартными способами, включая сайт-специфический мутагенез и/или сайт-специфический мутагенез посредством ПЦР. См., . Chapter 8, Green Publishing Associates and John Wiley & Sons, edited by Ausubel et al., 1992.
IV. Анализы и скрининг антител
Получение слитого белка LAIR-2 Fc ("LAIR-2-Fc") для терапии злокачественных новообразований позволяет обходить потребность в разработке и скрининге mAb против LAIR-1. Т.к. LAIR-2 имеет более высокую аффинность, чем LAIR-1, в некоторых вариантах осуществления LAIR-2-Fc выбирают в качестве терапевтического средства вместо слитого белка LAIR-1 Fc ("LAIR-1-Fc"). В некоторых вариантах осуществления LAIR-1-Fc можно использовать в доклинических моделях мыши, т.к. у мыши нет LAIR-2.
A. Анализы LAIR-2-Fc
1. Подтверждение способности связываться с множеством форм коллагена, SP-D, C1q и MBL посредством ELISA.
2. Подтверждение способности LAIR-2-Fc ингибировать связывание LAIR-1 с множеством коллагенов, SP-D и C1q. Это можно тестировать посредством: 1) конкурентных анализов ELISA, и 2) проточной цитометрии с использованием LAIR-1-трансфицированных клеток, инкубированных в присутствие титруемых количеств LAIR-2-Fc и флуоресцентно меченых лигандов LAIR.
3. Анализ аффинности связывания LAIR-2-Fc с лигандами по сравнению с LAIR-1.
4. Функциональные анализы для подтверждения того, что LAIR-2-Fc предотвращает передачу сигнала LAIR-1-экспрессирующими клетками. Для этих анализов можно использовать репортерные клетки, или другим вариантом являются первичные LAIR-1+ клетки.
B. Анализы и скрининг антител на LAIR-2-блокирующие mAb
Т.к. LAIR-2 отсутствует у мышей, мышей дикого типа можно использовать для получения высокоаффинных mAb против LAIR-2. Т.к. LAIR-2 является растворимым и связывается с растворимыми лигандами, скрининг трансфицированных клеток для этой молекулы не применим.
1. Скрининг фазы I: Связывание mAb с LAIR-2, но не LAIR-1 по результатам ELISA. Эти mAb должны быть высокоспецифическими для LAIR-2.
2. Скрининг фазы II: LAIR-2-специфические mAb должны блокировать связывание LAIR-2 с множеством коллагенов, SP-D, C1q и MBL. Возможно, что ни одно из mAb не будет блокировать связывание всех трех лигандов, и, таким образом, множество mAb против LAIR-2 можно использовать одновременно в качестве состава для блокирования всех взаимодействий для максимального терапевтического эффекта.
3. Скрининг фазы III: Функциональные анализы для подтверждения того, что mAb против LAIR-2 или комбинация mAb повышают передачу сигнала LAIR-1 в присутствие титруемых количеств растворимого LAIR-2 в присутствие титруемых количеств множества коллагенов, SP-D, C1q и MBL. (т.е. mAb против LAIR-2 должны блокировать доступ лиганда к растворимому LAIR-2, что, таким образом, приводит к связыванию лигандов с LAIR-1 на поверхности клетки и индуцирует отрицательные пути передачи сигнала).
in vivo
Анализы фазы II и III можно использовать для прогнозирования концентраций mAb против LAIR-2, необходимых для блокирования физиологических уровней лигандов .
C. Анализы и скрининг антител на LAIR-1-блокирующие mAb или LAIR-1-истощающие mAb
Мышей с недостаточностью LAIR-1 ("нокаутных") или мышей дикого типа можно использовать для получения высокоаффинных mAb против LAIR-1 с использованием запатентованных способов иммунизации.
1. Скрининг фазы I:
Связывание mAb с LAIR-1, но не LAIR-2 по результатам ELISA. Связывание mAb с линиями клеток, трансфицированными для экспрессии LAIR-1 на поверхности клеток. Кроме того, mAb должны обладать способностью связываться с эндогенно экспрессирующимся LAIR-1 на поверхности субпопуляций первичных клеток человека. Эти mAb должны быть высокоспецифическими для LAIR-1.
2. Скрининг фазы II:
LAIR-1-специфические mAb должны блокировать связывание LAIR-1 с одним или несколькими из множества коллагенов, SP-D и C1q. Возможно, что ни одно из mAb не будет блокировать все три лиганда, и, таким образом, множество mAb против LAIR-1 можно использовать одновременно в виде состава для блокирования всех взаимодействий для максимального терапевтического эффекта.
3. Скрининг фазы III:
Функциональные анализы для подтверждения того, что mAb против LAIR-1 или комбинация mAb снижают передачу сигнала LAIR-1 в присутствие титруемых количеств множества коллагенов, SP-D и C1q (антагонистические или блокирующие mAb). В этих анализах будут использовать линии клеток, экспрессирующие эндогенный LAIR-1, такие как клетки THP-1, или первичные клетки, такие как субпопуляции моноцитов, макрофагов и дендритных клеток человека, для оценки функции в присутствие mAb против LAIR-1. Кроме того, репортерные линии клеток можно использовать для определения того, изменяются ли пути передачи сигнала, такие как NFkB (репортер NFkB) или NFAT (репортер NFAT) после культивирования с mAb против LAIR-1.
4. Скрининг фазы IV:
Функциональные анализы для определения того, способны ли mAb против LAIR-1 индуцировать антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC), обусловленную комплементом цитотоксичность (CDC) или апоптоз клеток посредством других механизмов в случае LAIR-1-экспрессирующих линий клеток. В частности, mAb против LAIR-1 будут тестировать на способность истощать одним из этих способов линии лейкозных клеток, таких как THP-1, как известно, экспрессирующих LAIR-1 на поверхности клеток. mAb против LAIR-1 также можно конструировать для истощения LAIR-1-экспрессирующих клеток и тестировать, как описано ниже, известными способами.
5. Скрининг фазы V:
Функциональные анализы для определения того, способны ли mAb против LAIR-1 доставлять или индуцировать отрицательный сигнал (агонист) через LAIR-1 в LAIR-1-экспрессирующих клетках для ингибирования функции клеток. Линии клеток, такие как THP-1 или U937, эндогенно экспрессирующих LAIR-1, или трансфектантов линий клеток, таких как K562, будут оценивать на ингибирование после культивирования с mAb против LAIR-1. В других анализах репортерные линии клеток будут использовать для определения того, ослабляют ли mAb против LAIR-1 положительные пути передачи сигнала, такие как NF-kB (репортер NF-kB) или другие известные репортеры передачи сигнала в клетке. Также будут оценивать индукцию апоптоза в линиях клеток, таких как THP-1 и U937.
in vivo
Анализы фазы II и III можно использовать для прогнозирования концентраций mAb против LAIR-1, необходимых для блокирования физиологических уровней лигандов .
V. Способ применения
Mol. Immunol
Существующие доказательства свидетельствуют об ингибиторной роли рецептора LAIR-1 на поверхности клетки и о том, что LAIR-2 косвенно противодействует функции LAIR-1 посредством связывания тех же лигандов, что и LAIR-1, таким образом, служа, по существу, в качестве рецептора-ловушки. Микроокружение опухоли зачастую богато белками внеклеточного матрикса (ECM), включая лиганд LAIR-1 коллаген (Rygiel et al., 2011, .49:402-406). Таким образом, LAIR-1-экспрессирующие клетки, локализующиеся в микроокружении опухоли, можно супрессировать посредством перекрестного сшивания коллагена и LAIR-1 и последующей ингибиторной передачи сигнала. Показано, что повышенная экспрессия и передача сигнала LAIR-1 ингибирует пролиферацию, дифференцировку и функцию нескольких субпопуляций иммунных клеток, и, таким образом, считают, что она супрессирует противоопухолевый иммунитет, в частности, в микроокружении опухоли с высокими уровнями лигандов LAIR-1 коллагена, C1q и SP-D.
Показано, что коллаген и C1q ограничивают или изменяют дифференцировку и активацию антигенпрезентирующих клеток (моноцитов/макрофагов/дендритных клеток (DC)) посредством LAIR-1. Также обнаружено, что LAIR-1 экспрессируется на NK- и T-клетках, но на гораздо более низких уровнях, чем на APC. Несмотря на это, исследования показали, что перекрестное сшивание LAIR-1 на NK-клетках и T-клетках может ингибировать пролиферацию и функционирование. Таким образом, полагают, что снижение перекрестного сшивания LAIR-1 может повышать иммунный ответ против злокачественного новообразования и инфекционных заболеваний. Считают, что повышенные уровни LAIR-2 способствуют противоопухолевому иммунитету посредством того же механизма. Таким образом, растворимый LAIR-1 и растворимый LAIR-2, включая полипептиды LAIR-1 и LAIR-2 и слитые белки LAIR-1 и LAIR-2, можно использовать для терапии заболеваний человека. Например, белки LAIR-2Fc можно использовать для иммунотерапии злокачественных новообразований для усиления функции иммунитета посредством предотвращения связывания лиганда с LAIR-1. Эта стратегия является особенно многообещающей, т.к. LAIR-2 связывается с лигандами с более высокой аффинностью, чем LAIR-1.
Nat. Cell Biol
Альтернативно, передача сигнала через LAIR-1 на злокачественных клетках AML, экспрессирующих высокие уровни LAIR-1, поддерживает способность к самоподдержанию или "стволовость" клеток AML посредством ингибирования апоптоза и дифференцировки через уникальный путь LAIR-1-SHP-1-CAMK1-CREB (Kang et al., 2015, .17:665-677). При этих злокачественных новообразованиях сниженная передача сигнала LAIR-1 приводит к гибели клеток AML. Таким образом, считают, что блокирование (т.е. антагонизм) передачи сигнала LAIR-1 при лейкозах может представлять собой лечение для эрадикации лейкозов. В связи с этим, блокирование передачи сигнала LAIR-1 с использованием моноклональных антител против LAIR-1 или растворимого LAIR-1 и растворимого LAIR-2, включая полипептиды LAIR-1 и LAIR-2 и слитые белки LAIR-1 и LAIR-2, можно использовать для лечения лейкозов посредством прямого ингибирования выживания злокачественных клеток, а также посредством стимуляции противоопухолевого иммунного ответа.
J. Immunol
С другой стороны, сниженная экспрессия или функция LAIR-1 ассоциирована с несколькими аутоиммунными проявлениями, в то время как гиперэкспрессия LAIR-2 может способствовать аутоиммунности посредством связывания лигандов LAIR-1 с ловушкой. Связывание LAIR-2 лигандов LAIR-1 может, по существу, снижать перекрестное сшивание LAIR-1 на поверхности клетки, ограничивая ингибиторные пути передачи сигнала, что приводит к гиперреактивной иммунной функции. Таким образом, полагают, что повышение перекрестного сшивания LAIR-1 может снижать гиперреактивный или неправильный иммунный ответ, например, в случае аутоиммунного заболевания или воспаления. Например, блокирование LAIR-2 с помощью mAb можно использовать для лечения аутоиммунного заболевания, т.к. оно будет повышать связывание лиганда с LAIR-1, таким образом, отрицательно регулируя иммунный ответ. Направленное воздействие на LAIR-2 будет особенно эффективным при заболеваниях, при которых существует дисбаланс между экспрессией LAIR-1 на поверхности клетки и растворимым LAIR-2, как показано для ревматоидного артрита (Lebbink et al., 2008, 180:1662-1669).
Примеры способов более подробно описаны ниже.
A. Стимуляция иммунного ответа
1. Терапевтические стратегии
ex vivo
Изобретение относится к способам индуцирования или усиления иммунного ответа у субъекта. Как правило, способы включают введение субъекту эффективного количества иммуномодулирующего средства или клеток, примированных с использованием иммуномодулирующего средства. Иммунный ответ может являться, например, первичным иммунным ответом на антиген или повышением функции эффекторных клеток, таким как повышение антиген-специфической пролиферации T-клеток, повышение продукции цитокинов T-клетками, стимуляция дифференцировки или их комбинация. В некоторых вариантах осуществления средство может повышать развитие наивных T-клеток в Th1, Th17, Th22 или другие клетки, секретирующие или заставляющие другие клетки секретировать воспалительные молекулы, включая, в качестве неограничивающих примеров, ИЛ-1β, ФНО, TGF-бета, ИФНγ, ИЛ-17, ИЛ-6, ИЛ-23, ИЛ-22, ИЛ-21 и MMP. В некоторых вариантах осуществления средство может снижать или ингибировать активность Treg, снижать продукцию Treg цитокинов, таких как ИЛ-10, снижать дифференцировку Treg, снижать количество Treg, снижать соотношение Treg в популяции иммунных клеток или снижать выживаемость Treg. Иммуномодулирующее средство можно вводить нуждающемуся в этом субъекту в эффективном количестве для преодоления истощения T-клеток и/или анергии T-клеток. Преодоление истощения T-клеток или анергии T-клеток можно определять посредством измерения функции T-клеток известными способами.
in vivo
ex vivo
ex vivo
Способы можно использовать  или  в качестве терапевтических способов стимуляции иммунного ответа. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления средство или нуклеиновую кислоту, кодирующую средство, вводят непосредственно субъекту. В некоторых вариантах осуществления средство или нуклеиновую кислоту, кодирующую средство, приводят в контакт с клетками (например, иммунными клетками) , и лечебные клетки вводят субъекту (например, посредством адоптивного переноса). В основном, описанные иммуномодулирующие средства можно использовать для лечения субъекта, имеющего или предрасположенного к любому заболеванию или нарушению, на которое иммунная система субъекта вырабатывает иммунный ответ. Средства могут сделать возможным более устойчивые иммунный ответ. Описанные композиции применимы для стимуляции или усиления иммунного ответа, включающего T-клетки.
Blood
Blood
Иммуномодулирующие средства, используемые для повышения иммунного ответа, как правило, являются средствами, снижающими экспрессию LAIR-1, связывание лиганда, перекрестное сшивание, отрицательную передачу сигнала или их комбинацию. Например, средство может являться антагонистом LAIR-1, таким как антагонистическое (блокирующее) антитело против LAIR-1 или его антигенсвязывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления антагонист связывается с коллаген-связывающим доменом LAIR-1 (см., например, Brondijk, et al., , 18(115):1364-73 (2010), и Zhou, et al., , 127(5):529-537 (2016) и дополнительную информацию, конкретно включенные в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме). В некоторых вариантах осуществления антагонист LAIR-1, такой как блокирующее функцию антитело или его функциональный фрагмент, специфически связывается с эпитопом LAIR-1, включающим один или несколько из R59, E61, R62, E63, R65, S66, Y68, N69, I102, R100, W109, E111, Q112 и Y115 (например, относительно SEQ ID NO: 1). Средство также может являться полипептидом LAIR-1, например, растворимым полипептидом, или его слитым белком, который может служить в качестве рецептора-ловушки для одного или нескольких лигандов LAIR-1. Средство также может являться LAIR-2 или его функциональным фрагментом или слитым белком, который может служить в качестве рецептора-ловушки для одного или нескольких лигандов LAIR-1.
Например, в некоторых вариантах осуществления эффективное количество слитого белка LAIR-2, например LAIR-2-Fc, вводят субъекту со злокачественным новообразованием или инфекцией. Лечение пациентов с использованием LAIR-2-Fc будет приводить к снижению перекрестного сшивания рецептора LAIR-1, а затем снижению ингибиторной передачи сигнала в LAIR-1+ клетках и улучшению иммунной функции. Отклонение соотношения в сторону повышенных уровней растворимого LAIR-2 по сравнению с LAIR-1 на поверхности клетки, в частности, в опухолевом микроокружении, где экспрессия лигандов LAIR-1/2 является высокой, будет благоприятствовать повышенному противоопухолевому иммунитету.
Опухолевое микроокружение с высокими уровнями коллагенов, SP-D и/или C1q и с иммунными инфильтратами, экспрессирующими высокие уровни LAIR-1, будет идеальным для описываемой иммунотерапии (например, иммунотерапии с использованием LAIR-2-Fc). Хотя рак яичников характеризуется высокими уровнями коллагена, неясно, являются ли уровни SP-D и C1q высокими. В то же время злокачественные новообразования легких и ЖКТ могут характеризоваться высокими уровнями коллагенов и SP-D и, таким образом, могут являться злокачественными новообразованиями, подвергаемыми направленному воздействию с использованием LAIR-2-Fc. В других вариантах осуществления используют растворимый LAIR-2, растворимый LAIR-1 или слитый белок LAIR-1 (например, LAIR-1-Fc). В некоторых вариантах осуществления можно выбирать молекулы на основе LAIR-2, т.к. LAIR-2 связывается с лигандами с более высокой аффинностью, чем LAIR-1.
Блокирование LAIR-1, например, с использованием блокирующих функцию антител против LAIR-1, может представлять собой альтернативное средство или дополнительное средство для растворимых полипептидов и слитых белков LAIR-1 и LAIR-2. Например, в некоторых вариантах осуществления блокирование LAIR-1 комбинируют с рецептором-ловушкой, таким как растворимый LAIR-1 или LAIR-2 или их слитый белок. Комбинированное лечение (например, блокирование LAIR-2-Fc и LAIR-1) может быть дополняющим.
В некоторых вариантах осуществления терапия для стимуляции иммунного ответа (например, при лечении злокачественного новообразования или инфекций) включает истощение LAIR-1+ клеток. LAIR-1 сильно экспрессируется в асцитической жидкости при раке яичников у мыши и человека. Положительная регуляция LAIR-1 ограничена иммунорегуляторными макрофагами и F4/80+ DC, коэкспрессирующими высокие уровни PD-L1. Таким образом, направленное истощение LAIR-1-экспрессирующих клеток будет улучшать общее состояние опухолевого микроокружения посредством удаления иммунорегуляторных популяций. Хотя не наблюдали экспрессию LAIR-1 на других субпопуляциях клеток при раке яичников, т.к. LAIR-1 является универсальным ингибитором, истощение других LAIR-1+ клеток также будет иметь эффект снижения ингибирования иммунной системы и улучшения противоопухолевого иммунитета. Также показано, что LAIR-1 экспрессируется на поверхности клеток острого миелолейкоза и является ключевым для его развития (Kang et al, Nature Cell Biology, Vol17, No 5, 2015; pp 665-679). Таким образом, истощение гемопоэтических злокачественных новообразований ("злокачественных новообразований крови") с использованием LAIR-1-истощающих mAb будет иметь прямой эффект снижения или эрадикации LAIR-1-положительных злокачественных новообразований.
Blood.
Front Immunol
+
+
Разработку и идентификацию LAIR-1-истощающих mAb можно осуществлять известными способами конструирования и скрининга, включая способы, представленные в настоящем описании. См., например, Reff, et al., Vol83, No 2, 1994: pp 435-445, где описывают получение химерного антитела против CD20, связывающегося с C1q человека и опосредующего комплемент-зависимый лизис клеток (CDCC) в присутствие комплемента человека и антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) с использованием эффекторных клеток человека. Ритуксимаб разрушает B-клетки, и, таким образом, его используют для лечения заболеваний, отличающихся гиперреактивными, дисфункциональными или избыточными B-клетками. Другие антитела, истощающие B-клетки, включают окрелизумаб и офатумумаб. В другом примере Ab против CD3 могут предпочтительно направленно воздействовать и истощать активированные эффекторные T-клетки с сохранением CD4Foxp3 Treg. Антитела транзиторно истощают T-клетки, хотя они демонстрируют небольшую комплемент-зависимую и антителозависимую клеточную цитотоксичность или ее отсутствие. Показан переориентированный лизис клеток, связанный со способностью перекрестно сшивать молекулы CD3, экспрессируемые двумя разными клетками (цитотоксическими CD8+ T-клетками с одной стороны и другими T-клетками-мишенями с другой стороны), однако, истощение T-клеток, главным образом, является результатом AICD (обзор в You, . 2015; 6: 242).
В некоторых вариантах осуществления истощающие клетки антитела снижают количество LAIR-1-положительных макрофагов, F4/80+ DC, злокачественных клеток или их комбинации.
2. Субъекты, подлежащие лечению
a. Лечение злокачественного новообразования
Описанные композиции и способы можно использовать для лечения злокачественных новообразований. Как правило, средства используют для стимуляции или усиления иммунного ответа на злокачественное новообразование у субъекта посредством введения субъекту количества иммуномодулирующего средства, снижающего экспрессию LAIR-1, связывание лиганда, перекрестное сшивание, отрицательную передачу сигнала или их комбинацию. С помощью способа можно снижать один или несколько симптомов злокачественного новообразования.
Иммунная система является признанной защитой против возникновения и роста злокачественного новообразования. Регуляция иммунного ответа управляется взаимодействиями поверхностей клеток, направляющими функцию иммунных клеток специфическими путями, включая активацию или ингибирование, направленные против злокачественных клеток. LAIR-1 является ингибиторным рецептором на поверхности некоторых субпопуляций иммунных клеток (лейкоцитов), предотвращающим оптимальный иммунный ответ. В то же время LAIR-2 является растворимым гомологом, действующим как ловушка для блокирования LAIR-1-опосредованного ингибирования.
in vitro
in vivo
in vitro
В одном из вариантов осуществления слитый белок LAIR-2 Fc стимулирует иммунный ответ  и . В другом варианте осуществления LAIR-2 Fc снижает рост опухоли и способствует выживанию. В другом варианте осуществления LAIR-2 Fc способствует иммунотерапии, направленной против PD-1. Данные, представленные в настоящем описании, свидетельствуют о том, что mAb против LAIR-1 обладают активностью  в T-клетках человека и линиях миелоидных клеток, что свидетельствует о специфической агонистической и антагонистеской активности в случае конкретных клонов mAb. Эти данные свидетельствую о потенциальной модуляции пути LAIR-1 с помощью LAIR-2 Fc или mAb против LAIR-1 для иммунотерапевтического вмешательства при злокачественном новообразовании и других заболеваниях.
in vivo
В другом варианте осуществления LAIR-Fc повышает отвечаемость первичных T-клеток человека на стимуляцию TCR. В другом варианте осуществления LAIR-2 Fc повышает антигенспецифические ответы T-клеток .
В ходе своего развития злокачественные клетки приобретают набор характерных функциональных способностей, хотя и с помощью разных механизмов. Такие способности включают избегание апоптоза, автономность ростовых сигналов, нечувствительность к противоростовым сигналам, инвазию в ткань/метастазирование, неограниченный репликативный потенциал и устойчивый ангиогенез. Термин "злокачественная клетка" предназначен для включения предзлокачественных и злокачественных клеток. В некоторых вариантах осуществления термин "злокачественное новообразование" относится к доброкачественной опухоли, остающейся локализованной. В других вариантах осуществления термин "злокачественное новообразование" относится к злокачественной опухоли, инвазирующей и разрушающей соседние структуры организма и распространяющейся в отдаленные участки. В других вариантах осуществления злокачественное новообразование ассоциировано с конкретным антигеном злокачественной опухоли (например, панкарциномный антиген (KS 1/4), антиген карциномы яичников (CA125), простатспецифический антиген (PSA), раково-эмбриональный антиген (CEA), CD19, CD20, HER2/neu и т.д.).
Способы и композиции, представленные в настоящем описании, применимы в лечении или профилактике различных злокачественных новообразований или других аномальных пролиферативных заболеваний, включая (в качестве неограничивающих примеров) следующие: карциному, включая карциному мочевого пузыря, молочной железы, толстого кишечника, почки, печени, легких, яичников, поджелудочной железы, желудка, шейки матки, щитовидной железы и кожи; включая плоскоклеточную карциному; гемопоэтические опухоли лимфоидной линии, включая лейкоз, острый лимфоцитарный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз, B-клеточную лимфому, T-клеточную лимфому, лимфому Беркитта; гемопоэтические опухоли миелоидной линии, включая острые и хронические миелогенные лейкозы и промиелоцитарный лейкоз; опухоли мезенхимального происхождения, включая фибросаркому и рабдомиосаркому; другие опухоли, включая меланому, семиному, тератокарциному, нейробластому и глиому; опухоли центральной и периферической нервной системы, включая астроцитому, нейробластому, глиому и шванному; опухоли мезенхимального происхождения, включая фибросаркому, рабдомиосаркому и остеосаркому; и другие опухоли, включая меланому, пигментную ксеродерму, кератоакантому, семиному, фолликулярный рак щитовидной железы и тератокарциному.
Злокачественные новообразования, вызываемые аномалиями апоптоза, также можно лечить с помощью описываемых способов и композиций. Такие злокачественные новообразования могут включать, в качестве неограничивающих примеров, фолликулярные лимфомы, карциномы с мутациями p53, гормонозависимые опухоли молочной железы, предстательной железы и яичников, и предопухолевые повреждения, такие как семейный аденоматозный полипоз, и миелодиспластические синдромы. В конкретных вариантах осуществления с помощью способов и композиций лечению или профилактике подвергают озлокачествление, или диспролиферативные изменения (такие как метаплазии и дисплазии), или гиперпролиферативные нарушения в яичнике, мочевом пузыре, молочной железе, толстом кишечнике, легких, коже, поджелудочной железе или матке. В других конкретных вариантах осуществления саркому, меланому или лейкоз подвергают лечению или профилактике с помощью способов и композиций.
Описанные композиции и способы особенно полезны для лечения злокачественных новообразований, ассоциированных с клетками, экспрессирующими аномально высокие уровни LAIR-1, высокие уровни лиганда LAIR-1, низкие уровни LAIR-2 или их комбинацию.
nd
Конкретные злокачественные новообразования и родственные нарушения, которые можно подвергать лечению или профилактике с помощью способов и композиций, представленных в настоящем описании, включают, в качестве неограничивающих примеров, лейкозы, включая, в качестве неограничивающих примеров, острый лейкоз, острый лимфоцитарный лейкоз, острый миелоцитарный лейкоз, такой как миелобластный, промиелоцитарный, миеломоноцитарный, моноцитарный лейкоз, эритролейкоз и миелодиспластический синдром, хронический лейкозы, такие как, в качестве неограничивающих примеров, хронический миелоцитарный (гранулоцитарный) лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз, волосатоклеточный лейкоз; истинную полицитемию; лимфомы, в качестве неограничивающих примеров, такие как лимфома Ходжкина или неходжкинская лимфома (например, диффузная отрицательная по киназе анапластической лимфомы (ALK) крупноклеточная B-клеточная лимфома (DLBCL); диффузная положительная по киназе анапластической лимфомы (ALK) крупноклеточная B-клеточная лимфома (DLBCL); положительная по киназе анапластической лимфомы (ALK) ALK+ анапластическая крупноклеточная лимфома (ALCL), острая миелоидная лимфома (AML)); множественные миеломы, в качестве неограничивающих примеров, такие как тлеющая множественная миелома, несекреторная миелома, остеосклеротическая миелома, плазмоцитарный лейкоз, солитарная плазмоцитома и экстрамедуллярная плазмоцитома; макроглобулинемия Вальденстрема; моноклональную гаммапатию неясного генеза; доброкачественную моноклональную гаммапатию; болезнь тяжелых цепей; саркомы костной и соединительной ткани, в качестве неограничивающих примеров, такие как саркома костной ткани, остеосаркома, хондросаркома, саркома Юинга, злокачественная гигантоклеточная опухоль, фибросаркома костной ткани, хордома, паростальная саркома, саркомы мягких тканей, ангиосаркома (гемангиосаркома), фибросаркома, саркома Капоши, лейомиосаркома, липосаркома, лимфангиосаркома, неврилеммома, рабдомиосаркома, синовиальная саркома; опухоли головного мозга, включая, в качестве неограничивающих примеров, глиому, астроцитому, глиому ствола мозга, эпендимому, олигодендроглиому, неглиальную опухоль, невриному слухового нерва, краниофарингиому, медуллобластому, менингиому, пинеоцитому, пинеобластому, первичную лимфому головного мозга; рак молочной железы, включая, в качестве неограничивающих примеров, аденокарциному, лобулярную (мелкоклеточную) карциному, внутрипротоковую карциному, медуллярный рак молочной железы, слизистый рак молочной железы, тубулярный рак молочной железы, папиллярный рак молочной железы, болезнь Педжета и воспалительный рак молочной железы; злокачественное новообразование надпочечников, включая, в качестве неограничивающих примеров, феохромоцитому и адренокортикальную карциному; рак щитовидной железы, такой как, в качестве неограничивающих примеров, папиллярный или фолликулярный рак щитовидной железы, медуллярный рак щитовидной железы и анапластический рак щитовидной железы; рак поджелудочной железы, включая, в качестве неограничивающих примеров, инсулиному, гастриному, глюкагоному, випому, соматостатин-секретирующую опухоль и карциноид или опухоль островковых клеток; злокачественные новообразования гипофиза, включая, в качестве неограничивающих примеров, болезнь Кушинга, пролактин-секретирующую опухоль, акромегалию и несахарный диабет; злокачественные новообразования глаза, включая, в качестве неограничивающих примеров, меланому глаза, такую как меланома радужки, хороидальная меланома и меланома ресничного тела, и ретинобластому; злокачественные новообразования влагалища, включая, в качестве неограничивающих примеров, плоскоклеточную карциному, аденокарциному и меланому; злокачественное новообразование наружных женских половых органов, включая, в качестве неограничивающих примеров, плоскоклеточную карциному, меланому, аденокарциному, базально-клеточную карциному, саркому и болезнь Педжета; рак шейки матки, включая, в качестве неограничивающих примеров, плоскоклеточную карциному и аденокарциному; рак матки, включая, в качестве неограничивающих примеров, карциному эндометрия и саркому матки; рак яичников, включая, в качестве неограничивающих примеров, эпителиальный рак яичников, пограничную опухоль, опухоль половых клеток и стромальную опухоль; рак пищевода, включая, в качестве неограничивающих примеров, плоскоклеточный рак, аденокарциному, аденокистозную карциному, мукоэпидермоидную карциному, железисто-плоскоклеточную карциному, саркому, меланому, плазмоцитому, бородавчатую карциному и овсяноклеточную (мелкоклеточную) карциному; рак желудка, включая, в качестве неограничивающих примеров, аденокарциному, грибовидное поражение (полипоид), изъязвление, поверхностное распространение, диффузное распространение, злокачественную лимфому, липосаркому, фибросаркому и карциносаркому; рак толстого кишечника; рак прямой кишки; рак печени, включая, в качестве неограничивающих примеров, печеночноклеточную карциному и гепатобластому, рак желчного пузыря, включая, в качестве неограничивающих примеров, аденокарциному; холангиокарциномы, включая, в качестве неограничивающих примеров, папиллярную, нодулярную и диффузную; рак легких, включая, в качестве неограничивающих примеров, немелкоклеточный рак легких, плоскоклеточную карциному (эпидермоидную карциному), аденокарциному, крупноклеточную карциному и мелкоклеточный рак легких; рак яичек, включая, в качестве неограничивающих примеров, герминому, семиному, анаплатический, классический (типичный), сперматоцитарный рак, несеминомные опухоли, эмбриональную карциному, тератому, хориокарциному (опухоль желточного мешка), рак предстательной железы, включая, в качестве неограничивающих примеров, аденокарциному, лейомиосаркому и рабдомиосаркому; злокачественные новообразования полового члена; злокачественные новообразования ротовой полости, включая, в качестве неограничивающих примеров, плоскоклеточную карциному; базальноклеточные злокачественные новообразования; злокачественные новообразования слюнных желез, включая, в качестве неограничивающих примеров, аденокарциному, мукоэпидермоидную карциному и аденокистозную карциному; злокачественные новообразования глотки, включая, в качестве неограничивающих примеров, плоскоклеточный рак и бородавчатый рак; рак кожи, включая, в качестве неограничивающих примеров, базально-клеточную карциному, плоскоклеточную карциному и меланому, поверхностную распространяющуюся меланому, нодулярную меланому, меланому типа злокачественного лентиго, акральную лентигинозную меланому; рак почки, включая, в качестве неограничивающих примеров, почечноклеточный рак, аденокарциному, гипернефрому, фибросаркому, переходноклеточный рак (почечной лоханки и/или мочеточника); опухоль Вильмса; рак мочевого пузыря, включая в качестве неограничивающих примеров, переходноклеточную карциному, плоскоклеточный рак, аденокарциному, карциносаркому. Кроме того, злокачественные новообразования включают миксосаркому, остеогенную саркому, эндотелиосаркому, лимфангиоэндотелиосаркому, мезотелиому, синовиому, гемангиобластому, эпителиальную карциному, цистаденокарциному, бронхогенную карциному, карциному потовых желез, карциному сальных желез, папиллярную карциному и папиллярные аденокарциномы (обзор таких нарушений, см. Fishman et al., 1985, Medicine, 2 Ed., J.B. Lippincott Co., Philadelphia и Murphy et al., 1997, Informed Decisions: The Complete Book of Cancer Diagnosis, Treatment, and Recovery, Viking Penguin, Penguin Books U.S.A., Inc., United States of America).
b. Лечение инфекций
Описанные композиции и способы можно использовать для лечения инфекций и инфекционных заболеваний. Как правило, средства используют для стимуляции или усиления иммунного ответа на возбудителя инфекции у субъекта посредством введения субъекту количества иммуномодулирующего средства, снижающего экспрессию LAIR-1, связывание лиганда, перекрестное сшивание, отрицательную передачу сигнала или их комбинацию. С помощью способа можно снижать один или несколько симптомов инфекции. Кроме того, т.к. растворимый LAIR-1 и/или LAIR-2 может связываться с компонентом комплемента C1q, субъекты, экспрессирующие аномально высокие уровни растворимого LAIR-1 или LAIR-2, в некоторых случаях могут иметь сниженный комплемент-опосредованный иммунный клиренс инфекций. Таким образом, субъектам с аномально высокими уровнями LAIR-1 или LAIR-2, имеющим сниженную функцию комплемента, можно вводить средства, такие как mAb против LAIR-1 и LAIR-2, блокирующие связывание LAIR-1 и LAIR-2 с компонентом комплемента C1q, соответственно, для улучшения каскада комплемента и, таким образом, улучшения врожденного иммунного ответа на инфекцию.
Инфекцию или заболевание могут вызывать бактерия, вирус, простейшее, гельминт или другой патогенный микроорганизм, проникающий внутрь клетки и атакуемый, например, цитотоксическими T-лимфоцитами.
Инфекция или заболевание может быть острой или хронической. Острая инфекция, как правило, является инфекцией с небольшой продолжительностью. При острой микробной инфекции иммунные клетки начинают экспрессировать иммуномодулирующие рецепторы. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления способ включает усиление стимуляторного иммунного ответа против острой инфекции.
Candida albicans
Listeria monocytogenes
Streptococcus pyogenes
Streptococcus pneumoniae
Neisseria meningitidis
Staphylococcus aureus
Escherichia coli
Acinetobacter baumannii
Pseudomonas aeruginosa
Mycobacterium
Инфекцию могут вызывать, в качестве неограничивающих примеров, , , , , , , , ,  или .
В некоторых вариантах осуществления описанные композиции используют для лечения хронических инфекций, например, инфекций, при которых происходит истощение T-клеток или анергия T-клеток, позволяющие инфекции оставаться в организме-хозяине в течение длительного периода времени.
Примерами инфекций, подлежащих лечению, являются хронические инфекции, вызванные вирусом гепатита, вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), T-лимфотропным вирусом человека (HTLV), вирусом герпеса, вирусом Эпштейна-Барр или вирусом папилломы человека.
Т.к. против вирусных инфекций действуют, главным образом, T-клетки, повышение активности T-клеток будет терапевтически полезным в ситуациях, в которых более быстрый или тщательный клиренс вируса-возбудителя будет благоприятным для животного или человека. Таким образом, описанные композиции можно вводить для лечения локальных или системных вирусных инфекций, включая, в качестве неограничивающих примеров, иммунодефицит (например, ВИЧ), папиллому (например, HPV), герпес (например, HSV), энцефалит, грипп (например, вирус гриппа человека A), простуду (например, риновирус человека) и другие вирусные инфекции, вызванные, например, HTLV, вирусом гепатита, респираторно-синцитиальным вирусом, вирусом осповакцины и вирусом бешенства. Молекулы можно вводить местно для лечения вирусных заболеваний кожи, таких как герпетические повреждения или опоясывающий лишай, или остроконечной кондиломы. Молекулы также можно вводить системно для лечения системных вирусных заболеваний, включая, в качестве неограничивающих примеров, СПИД, грипп, простуду или энцефалит.
Actinomyces
Anabaena
Bacillus
Bacteroides
Bdellovibrio
Bordetella
Borrelia
Campylobacter
Caulobacter
Chlamydia
Chlorobium
Chromatium
Clostridium
Corynebacterium
Cytophaga
Deinococcus
Escherichia
Francisella
Halobacterium
Heliobacter
Haemophilus
Hemophilus influenza
Hyphomicrobium
Legionella
Leptspirosis
Listeria
Meningococcus
Methanobacterium
Micrococcus
Myobacterium
Mycoplasma
Myxococcus
Neisseria
Nitrobacter
Oscillatoria
Prochloron
Proteus
Pseudomonas
Phodospirillum
Rickettsia
Salmonella
Shigella
Spirillum
Spirochaeta
Staphylococcus
Streptococcus
Streptomyces
Sulfolobus
Thermoplasma
Thiobacillus
Treponema
Vibrio
Yersinia
Cryptococcus neoformans
Histoplasma capsulatum
Candida
albicans
Candida tropicalis
Nocardia asteroides
Rickettsia ricketsii
Rickettsia typhi
Mycoplasma pneumoniae
Chlamydial psittaci
Chlamydial trachomatis
Plasmodium falciparum
Trypanosoma brucei
Entamoeba histolytica
Toxoplasma gondii
Trichomonas vaginalis
Schistosoma mansoni
Типичные инфекции, которые можно лечить, включают, в качестве неограничивающих примеров, инфекции, вызываемые микроорганизмами, включая, в качестве неограничивающих примеров, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,  типа B (HIB), , , , ,  A, B и C, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,  и , , , , , , , , , , , , , , , , ,  и .
Klebsiella, Serratia, Pasteurella;
Candida (albicans, krusei, glabrata, tropicalis и т.д.), Cryptococcus, Aspergillus (fumigatus, niger и т.д.), Genus Mucorales (mucor, absidia, rhizophus), Sporothrix (schenkii), Blastomyces (dermatitidis), Paracoccidioides (brasiliensis), Coccidioides (immitis)
Histoplasma (capsulatuma), Entamoeba histolytica, Balantidium coli, Naegleria fowleri, Acanthamoeba sp., Giardia lambia, Cryptosporidium sp., Pneumocystis carinii, Plasmodium vivax, Babesia microti, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, Toxoplasma gondi и т.д., Sporothrix, Blastomyces, Paracoccidioides, Coccidioides, Histoplasma, Entamoeba, Histolytica, Balantidium, Naegleria, Acanthamoeba, Giardia, Cryptosporidium, Pneumocystis, Plasmodium, Babesia или Trypanosoma
Другие микроорганизмы, вызывающие инфекции, которые можно лечить с использованием описанных композиций и способов включают, бактерии, такие как патогены, ассоциированные с холерой, столбняком, ботулизмом, сибирской язвой, чумой и болезнью Лайма; или грибковые или паразитарные патогены, такие как и и т.д.
B. Ингибирование иммунного ответа
1. Терапевтические стратегии
ex vivo
Изобретение относится к способам снижения или ингибирования иммунного ответа у субъекта. Как правило, способы включают введение субъекту эффективного количества иммуномодулирующего средства или клеток, примированных с использованием иммуномодулирующего средства. Иммунный ответ может являться, например, первичным иммунным ответом на антиген или повышением функции эффекторных клеток, таким как повышение антиген-специфической пролиферации T-клеток, повышение продукции цитокинов T-клетками, стимуляция дифференцировки или их комбинация. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления средство снижает пролиферацию T-клеток, продукцию цитокинов T-клетками, дифференцировку T-клеток или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления средство может снижать развитие наивных T-клеток в Th1, Th17, Th22 или другие клетки, секретирующие или заставляющие другие клетки секретировать воспалительные молекулы, включая, в качестве неограничивающих примеров, ИЛ-1β, ФНО, TGF-бета, ИФНγ, ИЛ-17, ИЛ-6, ИЛ-23, ИЛ-22, ИЛ-21 и MMP. В некоторых вариантах осуществления средство может повышать или стимулировать активность Treg, повышать продукцию Treg цитокинов, таких как ИЛ-10, повышать дифференцировку Treg, повышать количество Treg, повышать соотношение Treg в популяции иммунных клеток или повышать выживаемость Treg.
in vivo
ex vivo
ex vivo
Способы можно использовать  или  в качестве терапевтических средств для ингибирования иммунного ответа. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления средство или нуклеиновую кислоту, кодирующую средство, вводят непосредственно субъекту. В некоторых вариантах осуществления средство или нуклеиновую кислоту, кодирующую средство, приводят в контакт с клетками (например, иммунными клетками)  и обработанные клетки вводят субъекту (например, посредством адоптивного переноса). В основном, описанные иммуномодулирующие средства можно использовать для лечения субъекта, имеющего или предрасположенного к любому заболеванию или нарушению, на которое иммунная система субъекта вырабатывает гиперреактивный или неприемлемый иммунный ответ. Средства могут делать возможным менее устойчивый иммунный ответ. Описанные композиции применимы для снижения или ингибирования иммунного ответа, включающего T-клетки.
Иммуномодулирующие средства, используемые для снижения иммунного ответа, как правило, являются средствами, повышающими экспрессию LAIR-1, связывание лиганда, перекрестное сшивание, отрицательную передачу сигнала или их комбинацию. Например, средство может являться агонистом LAIR-1, таким как агонистическое (стимулирующее) антитело против LAIR-1 или его антигенсвязывающий фрагмент. Средство также может являться антагонистом LAIR-2, таким как антагонистическое (блокирующее) антитело против LAIR-2, снижающее способность LAIR-2 служить в качестве рецептора-ловушки для одного или нескольких лигандов LAIR-1.
Arthritis Rheum.
Например, в некоторых вариантах осуществления эффективное количество средства, индуцирующего блокирование LAIR-2, вводят субъекту с аутоиммунным заболеванием или воспалительным заболеванием или нарушением. Передача сигнала LAIR-1 действует, ограничивая иммунный ответ, что особенно важно для профилактики аутоиммунных и иммунных аутореактивных проявлений. Таким образом, сниженная экспрессия LAIR-1 может приводить к повышению аутоиммунности. Альтернативно, повышенные уровни LAIR-2 могут способствовать аутоиммунности, предотвращая перекрестное сшивание лиганда и ингибиторную передачу сигнала LAIR-1. Фактически, повышенные уровни LAIR-2 наблюдают у пациентов с ревматоидным артритом (Olde Nordkamp et al. 2011, 63:3749-3757). В связи с этим, несмотря на повышенные уровни LAIR-1 у пациентов с RA, т.к. LAIR-2 имеет более высокую аффинность к лиганду, повышение экспрессии LAIR-1 будет иметь небольшой эффект. Таким образом, блокирование связывания LAIR-2 с коллагенами, SP-D и C1q будет приводить к повышению перекрестного сшивания LAIR-1 с последующим снижением в отношении иммунных воспалительных путей. mAb, истощающие LAIR-2 или блокирующие связывание LAIR-2 с лигандом, могут быть особенно эффективными при лечении аутоиммунных заболеваний, при которых системные или локальные уровни LAIR-2 повышены. Фактически, в случае аутоиммунных заболеваний с повышенной экспрессией и LAIR-2, и LAIR-1 вероятность успеха иммунотерапии с использованием mAb против LAIR-2 будет наиболее высокой, т.к. после нейтрализации LAIR-2 высокие уровни LAIR-1 будут иметь более высокий ингибиторный эффект, чем при заболеваниях с низкими уровнями экспрессии LAIR-1. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления иммунотерапию с использованием mAb против LAIR-2 используют для лечения субъекта с ревматоидным артритом.
a. Воспалительные ответы
Описанные композиции и способы можно использовать для лечения воспаления. Как правило, средства используют для снижения или ингибирования иммунного ответа у субъекта посредством введения субъекту количества иммуномодулирующего средства, повышающего экспрессию LAIR-1, связывание лиганда, перекрестное сшивание, отрицательную передачу сигнала или их комбинацию. С помощью способа можно снижать один или несколько симптомов воспаления. Воспаление может являться острым, хроническим или персистирующим воспалением.
В некоторых вариантах осуществления иммуномодулирующие средства замедляют иммунную систему. Например, средство можно использовать для контроля гипервоспалительного ответа, вызывающего повреждение здоровых тканей. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления средства вводят субъекту, имеющим гипервоспалительный ответ. В таких случаях контроль избыточного иммунного ответа может быть полезным для субъекта.
b. Воспалительные и аутоиммунные заболевания/нарушения
Средства, повышающие экспрессию LAIR-1, связывание лиганда, перекрестное сшивание, отрицательную передачу сигнала или их комбинацию, также можно использовать для лечения воспалительных или аутоиммунных заболеваний и нарушений. Типичные воспалительные или аутоиммунные заболевания/нарушения включают, в качестве неограничивающих примеров, ревматоидный артрит, системную красную волчанку, гнездную алопецию, анкилозирующий спондилит, антифосфолипидный синдром, аутоиммунную болезнь Аддисона, аутоиммунную гемолитическую анемию, аутоиммунный гепатит, аутоиммунное заболевание внутреннего уха, аутоиммунный лимфопролиферативный синдром (ALPS), аутоиммунную тромбоцитопеническую пурпуру (АТФ), болезнь Бехчета, буллезный пемфигоид, кардиомиопатию, целиакию, синдром хронической усталости и иммунной дисфункции (CFIDS), хроническую воспалительную демиелинизирующую полинейропатию, рубцующийся пемфигоид, болезнь холодовых агглютининов, CREST-синдром, болезнь Крона, болезнь Дего, дерматомиозит, ювенильный дерматомиозит, дискоидную волчанку, первичную криоглобулинемию смешанного типа, фибромиалгию - фибромиозит, болезнь Грейвса, синдром Гийена-Барре, тиреоидит Хашимото, идиопатический легочный фиброз, идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру (ITP), Iga-нефропатию, инсулинозависимый диабет (типа I), ювенильный артрит, болезнь Миньера, смешанное заболевание соединительной ткани, рассеянный склероз, миастению, обыкновенную пузырчатку, пернициозную анемию, нодозный полиартериит, полихондрит, полигландулярные синдромы, ревматическую полимиалгию, полимиозит и дерматомиозит, первичную агаммаглобулинемию, первичный биллиарный цирроз, псориаз, феномен Рейно, синдром Рейтера, ревматическую лихорадку, саркоидоз, склеродермию, синдром Шегрена, синдром мышечной скованности, артериит Такаясу, височный артериит/гигантоклеточный артериит, язвенный колит, увеит, васкулит, витилиго и гранулематоз Вегенера.
В некоторых вариантах осуществления воспаление или аутоиммунное заболевание вызваны патогеном или являются результатом инфекции.
V. Способы комбинированного лечения
Описанные иммуномодулирующие средства можно вводить нуждающемуся в этом субъекту в отдельности или в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтическими средствами. В некоторых вариантах осуществления иммуномодулирующее средство и дополнительное терапевтическое средство вводят раздельно, но одновременно. Иммуномодулирующее средство и дополнительное терапевтическое средство также можно вводить как часть одной композиции. В других вариантах осуществления иммуномодулирующее средство и второе терапевтическое средство вводят раздельно и в разное время, но как часть одной схемы лечения.
Субъекту можно вводить первое терапевтическое средство за 1, 2, 3, 4, 5, 6 или более часов или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или более дней перед введением второго терапевтического средства. В некоторых вариантах осуществления субъекту можно вводить одну или несколько доз первого средства каждые 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 14, 21, 28, 35 или 48 дней до первого введения второго средства. Иммуномодулирующее средство может являться первым или вторым терапевтическим средством.
Иммуномодулирующее средство и дополнительное терапевтическое средство можно вводить как часть схемы лечения. Например, если первое терапевтическое средство можно вводить субъекту каждый четвертый день, второе терапевтическое средство можно вводить в первый, второй, третий или четвертый день или в их комбинациях. Первое терапевтическое средство или второе терапевтическое средство можно повторно вводить на всем протяжении всей схемы лечения.
Неограничивающие примеры молекул включают цитокины, химиотерапевтические средства, радионуклиды, другие иммунотерапевтические средства, ферменты, антибиотики, противовирусные средства (в особенности, ингибиторы протеаз в отдельности или в комбинации с нуклеозидами для лечения ВИЧ или гепатита B или C), антипаразитарные средства (против гельминтов, простейших), факторы роста, ингибиторы роста, гормоны, антагонисты гормонов, антитела и их биоактивные фрагменты (включая гуманизированные, одноцепочечные и химерные антитела), антигенные и вакцинные составы (включая адъюванты), пептидные лекарственные средства, противовоспалительные средства, лиганды, связывающиеся с толл-подобными рецепторами (включая, в качестве неограничивающих примеров, CpG-олигонуклеотиды) для активации врожденной иммунной системы, молекулы, мобилизующие и оптимизирующие адаптивную иммунную систему, другие молекулы, активирующие или положительно регулирующие действие цитотоксических T-лимфоцитов, естественных киллеров и хелперных T-клеток, и другие молекулы, инактивирующие или отрицательно регулирующие супрессорные или регуляторные T-клетки.
Дополнительные терапевтические средства выбирают с учетом состояния, нарушения или заболевания, подлежащего лечению. Например, иммуномодулирующее средство можно вводить совместно с одним или несколькими дополнительными средствами, повышающими или стимулирующими иммунный ответ или снижающими или ингибирующими иммунный ответ.
A. Усиление иммунного ответа
1. Противомикробные средства
Например, иммуномодулирующее средство на основе LAIR-1 или LAIR-2 можно использовать профилактически в лечении и профилактике заболевания, как указано выше, а также в случае тяжелой травмы, подобной обширному ожогу, открытому перелому кости, случайной ампутации или другим повреждениям. Таким образом, иммуномодулирующие средства на основе LAIR-1 или LAIR-2 можно вводить субъекту в комбинации с противомикробным средством, таким как антибиотик, противогрибковое средство, противовирусное средство, противопаразитарное средство или эфирное масло.
В некоторых вариантах осуществления субъекту вводят иммуномодулирующее средство на основе LAIR-1 или LAIR-2 и/или противомикробное средство во время поступления в больницу для профилактики дальнейших бактериальных, грибковых или вирусных осложнений. Антибиотик может воздействовать на патогены, и иммуномодулирующее средство на основе LAIR-1 или LAIR-2 может стимулировать иммунную систему, обеспечивая усиленный ответ для лечения или профилактики дальнейшей инфекции или заболевания.
2
. Химиотерапевтические средства
Иммуномодулирующие средства на основе LAIR-1 или LAIR-2 можно комбинировать с одним или несколькими химиотерапевтическими средствами и проапоптотическими средствами. Типичные химиотерапевтические средства включают, в качестве неограничивающих примеров, амсакрин, блеомицин, бусульфан, капецитабин, карбоплатин, кармустин, хлорамбуцил, цисплатин, кладрибин, клофарабин, кризантаспазу, циклофосфамид, цитарабин, дакарбазин, дактиномицин, даунорубицин, доцетаксел, доксорубицин, эпирубицин, этопозид, флударабин, фторурацил, гемцитабин, гидроксикарбамид, идарубицин, ифосфамид, иринотекан, лейковорин, липосомальный доксорубицин, липосомальный даунорубицин, ломустин, мелфалан, меркаптопурин, месна, метотрексат, митомицин, митоксантрон, оксалиплатин, паклитаксел, пеметрексед, пентостатин, прокарбазин, ралтитрексед, сатраплатин, стрептозоцин, тегафур-урацил, темозоломид, тенипозид, тиотепа, тиогуанин, топотекан, треосульфан, винбластин, винкристин, виндезин, винорелбин или их комбинацию. Типичные проапоптотические средства включают, в качестве неограничивающих примеров флударабин, стауроспорин, циклогексимид, актиномицин D, лактозилцерамид, 15d-PGJ(2) и их комбинации.
3. Другие иммуномодуляторы
a. Антагонисты PD-1
В некоторых вариантах осуществления иммуномодулирующие средства на основе LAIR-1 или LAIR-2 вводят совместно с антагонистом PD-1. Белок программируемой гибели-1 (PD-1) является членом семейства рецепторов CD28, участвующих в отрицательном иммунном ответе при индукции на T-клетках. Контакт между PD-1 и одним из его лигандов (B7-H1 или B7-DC) индуцирует ингибиторный ответ, снижающий деление T-клеток и/или силу и/или длительность T-клеточного ответа. Подходящие антагонисты PD-1 описаны в патентах США №№ 8114845, 8609089 и 8709416, конкретно включенных в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме, и они включают соединения или средства, связывающиеся и блокирующие лиганд PD-1, противодействуя или ингибируя связывание лиганда с рецептором PD-1, или непосредственно связывающиеся и блокирующие рецептор PD-1 без индукции ингибиторной передачи сигнала через рецептор PD-1.
В некоторых вариантах осуществления антагонист рецептора PD-1 связывается непосредственно с рецептором PD-1 без запуска ингибиторной передачи сигнала, а также связывается с лигандом рецептора PD-1, снижая или ингибируя запуск лигандом передачи сигнала через рецептор PD-1. При снижении количества лигандов, связывающихся с рецептором PD-1 и запускающих трансдукцию ингибиторного сигнала, меньшее количество клеток аттенуируется под действием отрицательного сигнала, передаваемого при передаче сигнала PD-1 и можно достигать более устойчивого иммунного ответа.
Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A
Полагают, что передача сигнала PD-1 регулируется связыванием с лигандом PD-1 (таким как B7-H1 или B7-DC) в непосредственной близости с пептидным антигеном, презентируемым главным комплексом гистосовместимости (MHC) (см., например, Freeman, , 105:10275-10276 (2008)). Таким образом, белки, антитела или низкомолекулярные соединения, предотвращающие совместное лигирование PD-1 и TCR на T-клеточной мембране, также являются применимыми антагонистами PD-1.
В некоторых вариантах осуществления антагонисты рецептора PD-1 являются низкомолекулярными антагонистами или антителами, снижающими передачу сигнала через рецептор PD-1 или противодействующими ей посредством связывания с лигандами PD-1 или самим PD-1, особенно когда после такого связывания не следует совместное лигирование PD-1 и TCR, что, таким образом, приводит к отсутствию запуска ингибиторной передачи сигнала через рецептор PD-1.
Другие антагонисты PD-1, предусмотренные в случае способов по настоящему изобретению, включают антитела, связывающиеся с PD-1 или лигандами PD-1, и другие антитела.
Подходящие антитела против PD-1 включают, в качестве неограничивающих примеров, антитела, описываемые в следующих публикациях:
PCT/IL03/00425 (Hardy et al., WO/2003/099196)
PCT/JP2006/309606 (Korman et al., WO/2006/121168)
PCT/US2008/008925 (Li et al., WO/2009/014708)
PCT/JP03/08420 (Honjo et al., WO/2004/004771)
PCT/JP04/00549 (Honjo et al., WO/2004/072286)
PCT/IB2003/006304 (Collins et al., WO/2004/056875)
PCT/US2007/088851 (Ahmed et al., WO/2008/083174)
PCT/US2006/026046 (Korman et al., WO/2007/005874)
PCT/US2008/084923 (Terrett et al., WO/2009/073533)
Clin. Cancer Res.
Berger et al., , 14:30443051 (2008).
Конкретным примером антитела против PD-1 является антитело, описанное в патентной заявке США № US 20070166281 Kosak (опубликованной 19 июля 2007 года) в параграфе 42), антитело человека против PD-1, в некоторых вариантах осуществления вводимое в дозе 3 мг/кг.
Примеры антител против B7-H1 включают, в качестве неограничивающих примеров, антитела, описываемые в следующих публикациях:
PCT/US06/022423 (WO/2006/133396, опубликованную 14 декабря 2006 года)
PCT/US07/088851 (WO/2008/083174, опубликованную 10 июля 2008 года)
US 2006/0110383 (опубликованную 25 мая 2006 года)
Конкретным примером антитела против B7-H1 является антитело, описанное в WO/2007/005874 (опубликованной 11 января 2007 года), антитело человека против B7-H1.
Дополнительные антитела против PD-1 и против B7-H1, описанные в 2014/0044738, включенной в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
Антитела против B7-DC описаны в патентах №№ 7411051, 7052694, 7390888 и патентной заявке США № 2006/0099203.
Другие неограничивающие примеры антагонистов рецептора PD-1 включают полипептиды B7-DC, включая их гомологи и варианты, а также активные фрагменты любых из указанных выше, и слитые белки, включающие любые из них. В некоторых вариантах осуществления слитый белок включает растворимую часть B7-DC, соединенную с Fc-частью антитела, такого как IgG человека, и не включает всю или часть трансмембранной части B7-DC человека.
Антагонист PD-1 также может являться фрагментом B7-H1 млекопитающего, например, мыши или примата, такого как человек, где фрагмент связывается и блокирует PD-1, но не приводит к ингибиторной передаче сигнала через PD-1. Фрагменты также могут являться частью слитого белка, например, слитого белка Ig.
Immunity
PNAS
Другие применимые антагонисты полипептидов PD-1 включают антагонистов, связывающихся с лигандами рецептора PD-1. Они включают белок-рецептор PD-1 или его растворимые фрагменты, которые могут связываться с лигандами PD-1, такими как B7-H1 или B7-DC, и предотвращать связывание с эндогенным рецептором PD-1, таким образом, предотвращая ингибиторную передачу сигнала. Также показано, что B7-H1 связывается с белком B7.1 (Butte et al., , Vol. 27, pp. 111-122, (2007)). Такие фрагменты также включают растворимую часть ECD белка PD-1, включающую мутации, такие как мутация A99L, повышающая связывание с природными лигандами (Molnar et al., , 105:10483-10488 (2008)). Также применимы B7-1 или его растворимые фрагменты, которые могут связываться с лигандом B7-H1 и предотвращать связывание с эндогенным рецептором PD-1, таким образом, предотвращая ингибиторную передачу сигнала.
Антисмысловые нуклеиновые кислоты PD-1 и B7-H1, и ДНК, и РНК, а также молекулы миРНК также могут являться антагонистами PD-1. Такие антисмысловые молекулы предотвращают экспрессию PD-1 на T-клетках, а также продукцию T-клеточных лигандов, таких как B7-H1, PD-L1 и/или PD-L2. Например, миРНК (например, приблизительно 21 нуклеотидов в длину, специфических для гена, кодирующего PD-1 или кодирующего лиганд PD-1, и при этом олигонуклеотиды легко можно приобретать в коммерческих источниках), комплексированные с носителями, такими как полиэтиленимин (см. Cubillos-Ruiz et al., J. Clin. Invest. 119(8): 2231-2244 (2009)), легко захватываются клетками, экспрессирующими PD-1, а также лиганды PD-1, и снижают экспрессию этих рецепторов и лигандов для достижения снижения ингибиторной передачи сигнала в T-клетках и, таким образом, активации T-клеток.
b. Антагонисты CTLA4
Другие молекулы, применимые в опосредовании эффектов T-клеток при иммунном ответе, также предусмотрены в качестве дополнительных терапевтических средств. В некоторых вариантах осуществления молекула является антагонистом CTLA4, например, антагонистическим антителом против CTLA4. Пример антитела против CTLA4, предусмотренного для использования в способах по изобретению, включает антитело, описанное в PCT/US2006/043690 (Fischkoff et al., WO/2007/056539).
Дозы антитела против PD-1, против B7-H1 и против CTLA4 известны в этой области и могут находиться в диапазоне, например, от 0,1 до 100 мг/кг, или в меньшем диапазоне от 1 до 50 мг/кг или от 10 до 20 мг/кг. Подходящая доза для человека может составлять от 5 до 15 мг/кг, при этом 10 мг/кг антитела (например, антитела человека против PD-1) представляет собой конкретный вариант осуществления.
Clinical Kidney Journal
Конкретными примерами антитела против CTLA4, применимого в способах по изобретению, являются ипилимумаб, антитело человека против CTLA4, вводимый в дозе, например, приблизительно 10 мг/кг, и тремелимумаб, антитело человека против CTLA4, вводимое в дозе, например, приблизительно 15 мг/кг. Также см. Sammartino, et al., , 3(2):135-137 (2010), опубликованную он-лайн в декабре 2009 года.
J. Biol. Chem.
В других вариантах осуществления антагонист является низкомолекулярным соединением. Показано, что серия низкомолекулярных органических соединений связывается с лигандом B7-1, предотвращая связывание с CTLA4 (см. Erbe et al., , 277:7363-7368 (2002)). Такие низкомолекулярные органические соединения можно вводить в отдельности или совместно с антителом против CTLA4 для снижения ингибиторной передачи сигнала в T-клетках.
4. Потенцирующие средства
В некоторых вариантах осуществления дополнительные терапевтические средства включают потенцирующее средство. Потенцирующее средство действует, повышая эффективность положительного регулятора иммунного ответа, вероятно, с помощью нескольких механизмов, хотя точный механизм действия не важен для практического осуществления настоящего изобретения.

В некоторых вариантах осуществления потенцирующее средство является циклофосфамидом. Циклофосфамид (CTX, Cytoxan или Neosar) является оксазафосфориновым лекарственным средством, и его аналоги включают ифосфамид (IFO, Ifex), перфосфамид, трофосфамид (трофосфамид; Ixoten) и их фармацевтически приемлемые соли, сольваты, пролекарства и метаболиты (патентная заявка США № 20070202077, включенная в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме). Ифосфамид (MITOXANA) является структурным аналогом циклофосфамида, и его механизм действия считают идентичным или, по существу, схожим с механизмом действия циклофосфамида. Перфосфамид (4-гидропероксициклофосфамид) и трофосфамид также являются алкилирующими средствами, структурно родственными циклофосфамиду. Например, перфосфамид алкилирует ДНК, таким образом, ингибируя репликацию ДНК и синтез РНК и белка. Созданы и проанализированы новые производные оксазафосфорина для улучшения селективности и ответа со сниженной токсичностью для хозяина (Liang J, Huang M, Duan W, Yu XQ, Zhou S. Design of new oxazaphosphorine anticancer drugs. Curr Pharm Des. 2007;13(9):963-78. Review). Они включают мафосфамид (NSC 345842), глуфосфамид (D19575, бета-D-глюкозилизофосфорамидный иприт), S-(-)-бромофосфамид (CBM-11), NSC 612567 (альдофосфамид пергидротиазин) и NSC 613060 (альдофосфамид тиазолидин). Мафосфамид является аналогом оксазафосфорина, представляющим собой химически стабильную соль 4-тиоэтансульфоновой кислоты и 4-гидрокси-CPA. Глуфосфамид является производным IFO, в котором изофосфорамидный иприт, алкилированный метаболит IFO, соединен гликозидной связью с молекулой бета-D-глюкозы. Дополнительные аналоги циклофосфамида описаны в патенте США № 5190929 под названием "Cyclophosphamide analogs useful as anti-tumor agents", включенном в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
Хотя сам CTX нетоксичен, некоторые из его метаболитов являются цитотоксическими алкилирующими средствами, индуцирующими перекрестное сшивание ДНК и, в более высоких дозах, разрывы цепей. Многие клетки резистентны к CTX, т.к. они экспрессируют высокие уровни детоксифицирующего фермента альдегиддегидрогеназы (ALDH). CTX воздействует на пролиферирующие лимфоциты, т.к. лимфоциты (но не гемопоэтические стволовые клетки) экспрессирует лишь низкие уровни ALDH, и циклирующие клетки являются наиболее чувствительными к ДНК-алкилирующим средствам.
Crit Rev. Immunol.
Низкие дозы CTX (<200 мг/кг) могут иметь иммуностимуляторные эффекты, включая стимуляцию противоопухолевых иммунных ответов у людей и в мышиных моделях злокачественных новообразований (Brode & Cooke  28:109-126 (2008)). Эти низкие дозы являются субтерапевтическими и не имеют прямой противоопухолевой активности. В отличие от этого, высокие дозы CTX ингибируют противоопухолевый ответ. Роль CTX в потенцировании противоопухолевого иммунного ответа можно объяснить несколькими механизмами: (a) истощением CD4+CD25+FoxP3+ Treg (и особенно пролиферирующих Treg, которые могут являться особенно супрессорными), (b) истощением B-лимфоцитов; (c) индукцией оксида азота (NO), что приводит к супрессии роста опухолевых клеток; (d) мобилизацией и экспансией CD11b+Gr-1+ MDSC. Эти первичные эффекты приводят к многочисленным вторичным эффектам; например, после истощения Treg макрофаги продуцируют больше ИФНγ и меньше ИЛ-10. Также показано, что CTX индуцирует экспрессию ИФН типа I и способствует гомеостатической пролиферации лимфоцитов.
Cancer Immunol. Immunother.
J. Immunol.
Истощение Treg наиболее часто упоминают в качестве механизма, посредством которого CTX потенцирует противоопухолевый иммунный ответ. Этот вывод частично основан на результатах экспериментов по адоптивному переносу. В модели опухоли AB1-HA введение CTX в день 9 приводит к уровню излечения 75%. Перенос очищенных Treg в день 12 почти полностью ингибирует ответ на CTX (van der Most et al.  58:1219-1228 (2009)). Аналогичный результат наблюдали в модели опухоли HHD2: адоптивный перенос CD4+CD25+ Treg после предварительного введения CTX устранял терапевтический ответ на вакцину (Taieb, J.  176:2722-2729 (2006)).
Cancer Immunol. Immunother.
47
Многочисленные клинические исследования на людях показали, что низкая доза CTX является безопасным, хорошо переносимым и эффективным средством для стимуляции противоопухолевых иммунных ответов (Bas, & Mastrangelo :1-12 (1998)).
Оптимальная доза CTX для потенцирования противоопухолевого иммунного ответа является дозой, снижающей общее количество T-клеток посредством снижения уровней Treg ниже нормального диапазона, но являющейся субтерапевтической (см. Machiels et al. Cancer Res. 61:3689-3697 (2001)).
2
2
2
Cancer Res.
Cancer Res.
Cancer Res.
В клинических исследованиях на людях, в которых CTX использовали в качестве иммунопотенцирующего средства, как правило, использовали дозу 300 мг/м. Для среднего мужчины (ростом 6 футов (1,83 м), массой 170 фунтов (78 кг) с площадью поверхности тела 1,98 м) доза 300 мг/мпредставляет собой 8 мг/кг или 624 мг общего белка. В мышиных моделях злокачественных новообразований эффективность наблюдали при дозах в диапазоне 15-150 мг/кг, что соответствует 0,45-4,5 мг общего белка в случае мыши массой 30 г (Machiels et al.  61:3689-3697 (2001), Hengst et al  41:2163-2167 (1981), Hengst  40:2135-2141 (1980)).
2
В случае более крупных млекопитающих, таких как примат, такой как человек, можно использовать такие дозы мг/м, но также можно использовать однократные дозы, вводимые в течение конечного временного интервала. Такие однократные дозы можно вводить ежедневно в течение конечного периода времени, например, до 3 дней, или до 5 дней, или до 7 дней, или до 10 дней, или до 15 дней, или до 20 дней, или до 25 дней, и все их них предусмотрены изобретением. Ту же схему лечения можно использовать для других потенцирующих средств, упомянутых в настоящем описании.

В других вариантах осуществления потенцирующее средство является средством, снижающим активность и/или количество регуляторных T-лимфоцитов (T-regs), таким как сунитиниб (SUTENT), антитело против TGFβ или иматиниб (GLEEVAC). Упомянутая схема лечения также может включать введение адъюванта.
Применимые потенцирующие средства также включают ингибиторы митоза, такие как паклитаксел, ингибиторы ароматазы (например летрозол) и ингибиторы ангиогенеза (ингибиторы VEGF, например, Авастин, VEGF-ловушка) (см., например, Li et al., Vascular endothelial growth factor blockade reduces intratumoral regulatory T cells and enhances the efficacy of a GM-CSF-secreting cancer immunotherapy. Clin Cancer Res. 2006 Nov 15; 12(22):6808-16.), антрациклины, оксалиплатин, доксорубицин, антагонисты TLR4 и антагонисты ИЛ-18.
B. Снижение иммунного ответа
1. Иммуносупрессорные средства
В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ или воспалительное/аутоиммунное заболевание/нарушение лечат посредством введения субъекту иммуномодулирующего средства на основе LAIR-1 или LAIR-2 и второго средства, являющегося иммуносупрессорным средством. Иммуносупрессорные средства включают, в качестве неограничивающих примеров, антитела против других поверхностных маркеров лимфоцитов (например, CD40, альфа-4 интегрина) или против цитокинов, слитые белки (например, CTLA-4-Ig (Orencia), TNFR-Ig (Enbrel)), блокаторы ФНО, такие как энбрел, ремикейд, симзия и хумира, циклофосфамид (CTX) (т.е. Endoxan, Cytoxan, Neosar, Procytox, Revimmune™), метотрексат (MTX) (т.е. Rheumatrex, Trexall), белимумаб (т.е. Benlysta) или другие иммуносупрессорные лекарственные средства (например, циклоспорин A, FK506-подобные соединения, рапамициновые соединения или стероиды), антипролиферативные средства, цитотоксические средства или другие соединения, которые могут способствовать иммуносупрессии.
in vivo
Терапевтическое средство может являться слитым белком CTLA-4, таким как CTLA-4-Ig (абатацепт). Слитые белки CTLA-4-Ig конкурируют с костимуляторным рецептором CD28 на T-клетках за связывание с CD80/CD86 (B7-1/B7-2) на антигенпрезентирующих клетках и, таким образом, ингибируют активацию T-клеток. В другом варианте осуществления терапевтическое средство является слитым белком CTLA-4-Ig, известным как белатацепт. Белатацепт содержит две замены аминокислот (L104E и A29Y), значительно повышающие его авидность к CD86 . В другом варианте осуществления терапевтическое средство является Maxy-4.
В другом варианте осуществления терапевтическое средство является циклофосфамидом (CTX). Циклофосфамид (родовое наименование для Endoxan, Cytoxan, Neosar, Procytox, Revimmune™), также известный как цитофосфан, является азотистым ипритом, алкилирующим средством из группы оксазафосфоринов. Его используют для лечения различных типов злокачественных новообразований и некоторых аутоиммунных нарушений. Циклофосфамид (CTX) является основным лекарственным средством, используемым в случае диффузного пролиферативного гломерулонефрита у пациентов с поражением почек при системной красной волчанке.
Терапевтическое средство можно вводить в эффективном количестве для снижения уровней аутоантител против двухцепочечной ДНК (против ds-ДНК) в крови или сыворотке и/или снижения протеинурии у нуждающегося в этом пациента.
В другом варианте осуществления терапевтическое средство повышает количество аденозина в сыворотке, см., например, WO 08/147482. Например, второе терапевтическое средство может являться CD73-Ig, рекомбинантным CD73 или другим средством (например, цитокином, или моноклональным антителом, или низкомолекулярным соединением), повышающим экспрессию CD73, см., например, WO 04/084933. В другом варианте осуществления терапевтическое средство является интерфероном-бета.
Терапевтическое средство может являться низкомолекулярным соединением, ингибирующим или снижающим дифференцировку, пролиферацию, активность и/или продукцию и/или секрецию цитокинов Th1, Th17, Th22 и/или другими клетками, секретирующими или заставляющими другие клетки секретировать воспалительные молекулы, включая, в качестве неограничивающих примеров, ИЛ-1β, ФНО, TGF-бета, ИФНγ, ИЛ-18 ИЛ-17, ИЛ-6, ИЛ-23, ИЛ-22, ИЛ-21 и MMP. В другом варианте осуществления терапевтическое средство является низкомолекулярным соединением, взаимодействующим с Treg, повышающим активность Treg, стимулирующим или повышающим секрецию ИЛ-10 Treg, повышающим количество Treg, повышающим супрессорную активность Treg или их комбинациями.
В некоторых вариантах осуществления композиция повышает активность или продукцию Treg. Неограничивающие примеры Treg-усиливающих средств включают глюкокортикоид флутиказон, салметерол, антитела против ИЛ-12, ИФНγ и ИЛ-4; витамин D3, дексаметазон и их комбинации.
В некоторых вариантах осуществления терапевтическое средство является антителом, например, блокирующим функцию антителом против провоспалительной молекулы, такой как ИЛ-6, ИЛ-23, ИЛ-22 или ИЛ-21.
В рамках изобретения термин "рапамициновое соединение" включает нейтральное трициклическое соединение рапамицин, производные рапамицина, аналоги рапамицина и другие макролидные соединения, которые, как считают, имеют тот же механизм действия, что и рапамицин (например, ингибирование функции цитокинов). Термин "рапамициновые соединения" включает соединения со структурным сходством с рапамицином, например, соединения со схожей макроциклической структурой, модифицированные для повышения их терапевтической эффективности. Примеры рапамициновых соединений известны в этой области (См., например, WO95122972, WO 95116691, WO 95104738, патент США № 6015809; 5989591; патент США № 5567709; 5559112; 5530006; 5484790; 5385908; 5202332; 5162333; 5780462; 5120727).
Термин "FK506-подобные соединения" включает FK506 и производные и аналоги FK506, например, соединения со структурным сходством с FK506, например, соединения со схожей макроциклической структурой, модифицированной для повышения их терапевтической эффективности. Примеры FK506-подобных соединений включают, например, соединения, описанные в WO 00101385. В некоторых вариантах осуществления в рамках изобретения термин "рапамициновое соединение" не включает FK506-подобные соединения.
2. Противовоспалительные средства
Другие подходящие терапевтические средства включают, в качестве неограничивающих примеров, противовоспалительные средства. Противовоспалительное средство может являться нестероидным, стероидным средством или их комбинацией. Один из вариантов осуществления относится к пероральным композициям, содержащим от приблизительно 1% (масс./масс.) до приблизительно 5% (масс./масс.), как правило, приблизительно 2,5% (масс./масс.) противовоспалительного средства. Типичные неограничивающие примеры нестероидных противовоспалительных средств включают оксикамы, такие как пироксикам, изоксикам, теноксикам, судоксикам; салицилаты, такие как аспирин, салсалат, бенорилат, трилисат, сафаприн, солприн, дифлунисал и фендосал; производные уксусной кислоты, такие как диклофенак, фенклофенак, индометацин, сулиндак, толметин, изоксепак, фурофенак, тиопинак, зидометацин, ацетамацин, фентиазак, зомепирак, клинданак, оксепинак, фелбинак и кеторолак; фенаматы, такие как мефенаминовая, меклофенаминовая, флуфенаминовая, нифлуминовая и толфенаминовая кислоты; производные пропионовой кислоты, такие как ибупрофен, напроксен, беноксапрофен, флурбипрофен, кетопрофен, фенопрофен, фенбуфен, индопрофен, пирпрофен, карпрофен, оксапрозин, пранопрофен, миропрофен, тиоксапрофен, супрофен, алминопрофен и тиапрофеновую кислоту; пиразолы, такие как фенилбутазон, оксифенбутазон, фепразон, азапропазон и триметазон. Также можно использовать смеси этих нестероидных противовоспалительных средств.
Типичные неограничивающие примеры стероидных противовоспалительных лекарственных средств включают кортикостероиды, такие как гидрокортизон, гидроксил-триамцинолон, альфа-метилдексаметазон, дексаметазон-фосфат, бекламетазона дипропионаты, клобетазола валераты, дезонид, дезоксиметазон, дезоксикортикостерона ацетат, дексаметазон, дихлоризон, дифлоразона диацетат, дифлукортолона валерат, флуадренолон, флуклоролона ацетонид, флудрокортизон, флуметазона пивалат, флуозинолона ацетонид, флуоцинонид, сложные бутиловые эфиры флукортина, флуокортолон, флупреднидена ацетат (флупреднилидена), флурандренолон, гальцинонид, гидрокортизона ацетат, гидрокортизона бутират, метилпреднизолон, триамцинолона ацетонид, кортизон, кортодоксон, флуцетонид, флудрокоризон, дифлурозона диацетат, фурадренолон, флудрокортизон, дифлурозона диацетат, флурадренолона ацетонид, медризон, амцинафел, амцинафид, бетаметазон и смесь его сложных эфиров, хлорпреднизон, хлорпреднизона ацетат, клокортелон, клесцинолон, дихлоризон, дифлурпреднат, флуклоронид, флунизолид, фторметалон, флуперолон, флупреднизолон, гидрокортизона валерат, гидрокортизона циклопентилпропионат, гидрокортамат, мепреднизон, параметазон, преднизолон, преднизон, беклометазона дипропионат, триамцинолон и их смеси.
VI. Биомаркеры AML
Один из вариантов осуществления относится к способу оценки или прогнозирования эффективности лечения с использованием связывающей молекулы против LAIR посредством анализа клеток субъекта, нуждающегося в лечении, для определения того, экспрессируют ли клетки LAIR, партнеров LAIR по связыванию или и то, и другое. Неограничивающие примеры клеток, подлежащих анализу, включают злокачественные клетки, полученные из субъекта. Неограничивающие примеры злокачественных клеток включают клетки острого миелолейкоза (AML). Считают, что злокачественные клетки, экспрессирующие множество взаимодействующих ингибиторных рецепторов, лучше отвечают на лечение с использованием связывающих молекул против LAIR. Неограничивающие примеры партнеров LAIR по связыванию включают трансмембранные коллагены (XIII, XVII и XXIII) и LILRB4. На фигуре 3 показан прогнозируемый исход лечения с учетом наличия LAIR-1 или партнеров LAIR-1 по связыванию на злокачественных клетках.
VII. Наборы
Описанные иммуномодулирующие средства на основе LAIR-1 и LAIR-2 можно упаковывать в герметично закрытый контейнер, такой как ампула или саше, с указанием количества. Средство можно поставлять в виде сухого стерилизованного лиофилизированного порошка или безводного концентрата в герметично закрытом контейнере и восстанавливать, например, с использованием воды или физиологического раствора до подходящей концентрации для введения субъекту. Например, средство можно поставлять в виде сухого стерильного лиофилизированного порошка в герметично закрытом контейнере при единице дозирования по меньшей мере 5 мг или по меньшей мере 10 мг, по меньшей мере 15 мг, по меньшей мере 25 мг, по меньшей мере 35 мг, по меньшей мере 45 мг, по меньшей мере 50 мг или по меньшей мере, 75 мг. Лиофилизированное средство можно хранить при температуре от 2 до 8°C в исходном контейнере, и его, как правило, вводят в пределах 12 часов, или в пределах 6 часов, или в пределах 5 часов, или в пределах 3 часов, или в пределах 1 часа после восстановления.
В альтернативном варианте осуществления средство поставляют в жидкой форме в герметично закрытом контейнере с указанием количества и концентрации. В некоторых вариантах осуществления жидкую форму средства поставляют в герметично закрытом контейнере, включающем по меньшей мере 1 мг/мл или по меньшей мере 2,5 мг/мл, по меньшей мере 5 мг/мл, по меньшей мере 8 мг/мл, по меньшей мере 10 мг/мл, по меньшей мере 15 мг/мл, по меньшей мере 25 мг/мл, по меньшей мере 50 мг/мл, по меньшей мере 100 мг/мл, по меньшей мер, 150 мг/мл, по меньшей мере 200 мг/мл средства.
Изобретение также относится к фармацевтическим упаковкам и наборам, включающим один или несколько контейнеров, наполненных средством. Кроме того, в фармацевтическую упаковку или набор также можно включать одно или несколько других профилактических или терапевтических средств, применимых в лечении заболевания. Фармацевтическая упаковка или набор также может включать один или несколько контейнеров, наполненных одним или несколькими ингредиентами описанных фармацевтических композиций. Необязательно, к таким контейнерам можно прилагать информационное сообщение в форме, предписанной государственным органом, регулирующим производство, использование или продажу фармацевтических средств или биологических продуктов, при этом в информационном сообщении отражено одобрение государственным органом производства, использования или продажи для введения людям.
Изобретение также относится к наборам, созданным для указанных выше способов. Варианты осуществления, как правило, включают, одно или несколько иммуномодулирующих средств на основе LAIR-1 и/или LAIR-2. В конкретных вариантах осуществления набор также включает одно или несколько других профилактических или терапевтических средств, применимых для лечения злокачественных новообразований, в одном или нескольких контейнерах. В других вариантах осуществления набор также включает одно или несколько противовоспалительных средств, применимых для лечения воспалительных и аутоиммунных заболеваний, в одном или нескольких контейнерах.
Примеры
Пример 1: Антитела против LAIR и последовательности их тяжелых и легких цепей
Материалы и способы
Моноклональные антитела мыши против LAIR-1 человека
Мышей иммунизировали растворимым LAIR-1 человека (термин "растворимый LAIR-1" относится к внеклеточному домену LAIR-1), слитым с G2a Fc мыши (SEQ ID NO: 10). Мышам вводили тот же иммуноген через 2 недели. Мышам вводили 3-ю дозу антигена через две недели. Через три дня после последнего введения спленоциты мыши собирали и ресуспендировали в RPMI, дополненной 10% FBS и глутамином, и позднее подвергали слиянию для получения гибридом.
RACE
Идентификацию тяжелых и легких цепей посредством RACE (быстрой амплификации концов кДНК) осуществляли следующим образом: (1) денатурация мРНК, (2) синтез кДНК, (3) реакция 5'RACE, (4) анализ результатов ПЦР (на агарозном геле для визуализации амплифицированного фрагмента ДНК: правильные фрагменты ДНК вариабельной области антитела должны иметь размер 500-700 пар оснований, (5) TOPO-клонирование положительных полос продуктов ПЦР; (6) получение ПЦР-амплифицированных TOPO-клонов с последующим электрофорезом в геле и выделением из агарозного геля, (7) секвенирование всего 218 клонов, (8) осуществление анализа CDR с использованием данных секвенирования (области CDR определяют с использованием базы данных VBASE2, доступной на vbase2.org).
Результаты
Антитела клонировали способами RACE. С помощью анализа последовательностей антител идентифицировали одну вариабельную область тяжелой цепи и одну вариабельную область легкой цепи для 13 гибридом антител, обозначенных в настоящем описании как 1E11, 1G7, 4B3, 5A6, 5E1, 6B2, 6F4, 6G6, 7G3, 9H6, 11B3, 12E10a и 12E10b. Последовательности представлены выше и ниже. Последовательности тяжелой и легкой цепи и CDR представлены выше, ниже и проиллюстрированы на фигурах 1A и 1B.
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 1E11
Аминокислотная последовательность VL 1E11
DIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQVLIYQMSSLASGVPDRFSSSGSGTEFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELPLTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 19)
CDR1 VL 1E11
Аминокислотная последовательность CDR1 VL 1E11 включает
RSSKSLLHSNGITYLY (SEQ ID NO: 20)
CDR2 VL 1E11
Аминокислотная последовательность CDR2 VL 1E11 включает
QMSSLAS (SEQ ID NO: 21).
CDR3 VL 1E11
Аминокислотная последовательность CDR3 VL 1E11 включает
AQNLELPLT (SEQ ID NO: 22).
Аминокислотная последовательность VH 1E11
QVQLQQSGPELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYDINWVKQRPGQGLEWIGWIYPRDGSTKYNEKLKGKATLTVDTSSRTAYMELHSLTSEDSAVYFCARGGYYDYDGYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 23)
CDR1 VH 1E11
Аминокислотная последовательность CDR1 VH 1E11 включает
SYDIN (SEQ ID NO: 24).
CDR2 VH 1E11
Аминокислотная последовательность CDR2 VH 1E11 включает
WIYPRDGSTKYNEKLKG (SEQ ID NO: 25).
CDR3 1E11 VH
Аминокислотная последовательность CDR3 VH 1E11 включает
GGYYDYDGY (SEQ NO:26).
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ 1G7
Аминокислотная последовательность VL 1G7
DIQMTQSPASQSASLGESVTITCLASQTIGTWLAWYQQKPGKSPQLLIYAATSLADGVPSRFSGSGSGTKFSFKISSLQAEDFVSYYCQQLYSTPLTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 27).
CDR1 VL IG7
Аминокислотная последовательность CDR1 VL 1G7 включает
LASQTIGTWLA (SEQ ID NO: 28).
CDR2 VL IG7
Аминокислотная последовательность CDR2 VL 1G7 включает
AATSLAD (SEQ ID NO: 29).
CDR3 VL IG7
Аминокислотная последовательность CDR3 VL 1G7 включает
SEQ ID NO: 30
QQLYSTPLT ().
Аминокислотная последовательность VH 1G7
EVQLVESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNTNAMYWVRQAPGKGLEWVARIRSKSSNYATYYADSVKDRFTISRDDSQSMLYLQMNNLKTEDTARYYCVRGGSGFFAYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 31).
CDR1 VH 1G7
Аминокислотная последовательность CDR1 VH 1G7 включает
TNAMY (SEQ ID NO: 32).
CDR2 VH 1G7
Аминокислотная последовательность CDR2 VH 1G7 включает
SEQ ID NO: 33
RIRSKSSNYATYYADSVKD ().
CDR3 VH 1G7
Аминокислотная последовательность CDR3 VH 1G7 включает
SEQ ID NO: 34
GGSGFFAY ().
Последовательности 4B3
Аминокислотная последовательность VL 4B3
DIVMKQSPSSLRVSAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRESGVPDRFTGSGSGTDFALTISSVQAEDLAVYYCQNDHSYPFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 35)
CDR1 VL 4B3
Аминокислотная последовательность CDR1 VL 4B3 включает
SEQ ID NO: 36
KSSQSLLNSGNQKNYLA ().
CDR2 VL 4B3
Аминокислотная последовательность CDR2 VL 4B3 включает
GASTRES (SEQ ID NO: 37).
CDR3 of 4B3 VL
Аминокислотная последовательность CDR3 VL 4B3 включает
SEQ ID NO: 38
QNDHSYPFT ().
4B3 VH Аминокислотная последовательность
QIQLQQSGAELARPGASVKLPCKASDYIFISYGLNWVRQTTGQGLEWIGEIYPRSGHTYYNEKFKGKATLTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYFCARRSVFYDYDKNGFDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 39).
CDR1 VH 4B3
Аминокислотная последовательность CDR1 VH 4B3 включает
SYGLN (SEQ ID NO: 40).
CDR2 VH 4B3
Аминокислотная последовательность CDR2 VH 4B3 включает
SEQ ID NO: 41
EIYPRSGHTYYNEKFKG ().
CDR3 VH 4B3
Аминокислотная последовательность CDR3 VH 4B3 включает
SEQ ID NO: 42
RSVFYDYDKNGFDY ().
Последовательности 5A6
Аминокислотная последовательность VL 5A6
DIQMTQSPSSLSASLGERVSFSCRASQDIGSSLNWLQQEPDGTIKRLIYATSSLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFVEYYCLQYDSFPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 43).
CDR1 VL 5A6
Аминокислотная последовательность CDR1 VL 5A6 включает
SEQ ID NO: 44
RASQDIGSSLN ().
CDR2 VL 5A6
Аминокислотная последовательность CDR2 VL 5A6 включает
ATSSLDS (SEQ ID NO: 45).
CDR3 VL 5A6
Аминокислотная последовательность CDR3 VL 5A6 включает
SEQ ID NO: 46
LQYDSFPYT ().
Аминокислотная последовательность VH5A6
QVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFTSYGISWVKQRTGQGLEWIGEIYPRRGNTYYNEKFKGKATLTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYFCARQLFAYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 47).
CDR1 VH 5A6
Аминокислотная последовательность CDR1 VH 5A6 включает
SYGIS (SEQ ID NO: 48).
CDR2 VH 5A6
Аминокислотная последовательность CDR2 VH 5A6 включает
SEQ ID NO: 49
EIYPRRGNTYYNEKFKG ().
CDR3 VH 5A6
Аминокислотная последовательность CDR3 VH 5A6 включает
QLFAY (SEQ ID NO: 50).
Последовательности 5E1
Аминокислотная последовательность VL 5E1
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPRTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 51).
CDR1 VL 5E1
Аминокислотная последовательность CDR1 VL 5E1 включает
RASQDISNYLN (SEQ ID NO: 52).
CDR2 VL 5E1
Аминокислотная последовательность CDR2 VL 5E1 включает
YTSRLHS (SEQ ID NO: 53).
CDR3 VL 5E1
Аминокислотная последовательность CDR3 VL 5E1 включает
QQGNTLPRT (SEQ ID NO: 54).
5E1 VH Аминокислотная последовательность
EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTGYFMNWVKQSPEKSLEWIGEIHPSTGSIIYNQKFKAKATLTIDKSSSTAYMQLKSLTSEDSAVYYCARFDYSNSFAYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 55).
CDR1 VH 5E1
Аминокислотная последовательность CDR1 VH 5E1 включает
GYFMN (SEQ ID NO: 56).
CDR2 VH 5E1
Аминокислотная последовательность CDR2 VH 5E1 включает
EIHPSTGSIIYNQKFKA (SEQ ID NO: 57).
CDR3 VH 5E1
Аминокислотная последовательность CDR3 VH 5E1 включает
FDYSNSFAY (SEQ ID NO: 58).
Последовательности 6B2
Аминокислотные последовательности VL 6B2
DIQMTQSPASQSASLGESVTITCLASQTIGTWLAWYQQKPGKSPQLLIYAATSLADGVPSRFSGSGSGTKFSFKISSLQAEDFVSYYCQQLYSTPLTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 59).
CDR1 VL 6B2
Аминокислотная последовательность CDR1 VL 6B2 включает
LASQTIGTWLA (SEQ ID NO: 60).
CDR2 VL 6B2
Аминокислотная последовательность CDR2 VL 6B2 включает
AATSLAD (SEQ ID NO: 61).
CDR3 VL 6B2
Аминокислотная последовательность CDR3 VL 6B2 включает
QQLYSTPLT (SEQ ID NO: 62).
Аминокислотные последовательности VH 6B2
EVQLVESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFSFNINAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKSNNYETYYADSVKDRFTISRDDSESMVYLQMNNLKTEDTAMYYCVRSLWFVYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 63).
CDR1 VH 6B2
Аминокислотная последовательность CDR1 VH 6B2 включает
INAMN (SEQ ID NO: 64).
CDR2 VH 6B2
Аминокислотная последовательность CDR2 VH 6B2 включает
RIRSKSNNYETYYADSVKD (SEQ ID NO: 65).
CDR3 VH 6B2
Аминокислотная последовательность CDR3 VH 6B2 включает
SLWFVY (SEQ ID NO: 66).
Последовательности 6F4
Аминокислотные последовательности VL 6F4
DIKMTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDINSYLSWVQQKPGKSPKTLIDRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLEYEDMGIYYCLQYDEFPPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 67).
CDR1 VL 6F4
Аминокислотная последовательность CDR1 6F4 включает
KASQDINSYLS (SEQ ID NO: 68).
CDR2 VL 6F4
Аминокислотная последовательность CDR2 6F4 включает
RANRLVD (SEQ ID NO: 69).
CDR3 VL 6F4
Аминокислотная последовательность CDR3 6F4 включает
LQYDEFPPYT (SEQ ID NO: 70).
Аминокислотные последовательности VH 6F4
QVQLQQSGAELAKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGYINPFSGHTKYNQKFKDKATLTADKSSSTAYMQLSSLTYEDSAVYYCARNFDQWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 71).
CDR1 VH 6F4
Аминокислотная последовательность CDR1 VH 6F4 включает
SYWMH (SEQ ID NO: 72).
CDR2 VH 6F4
Аминокислотная последовательность CDR2 VH 6F4 включает
YINPFSGHTKYNQKFKD (SEQ ID NO: 73).
CDR3 VH 6F4
Аминокислотная последовательность CDR3 VH 6F4 включает
NFDQ (SEQ ID NO: 74).
Последовательности 6G6
Аминокислотные последовательности VL 6G6
DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQNVGTAVAWYQQKPGQSPKLLIYWASIRHTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLADYFCQQYSSHPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 75).
CDR1 VL 6G6
Аминокислотная последовательность CDR1 VL 6G6 включает
KASQNVGTAVA (SEQ ID NO: 76).
CDR2 VL 6G6
Аминокислотная последовательность CDR2 VL 6G6 включает
WASIRHT (SEQ ID NO: 77).
CDR3 VL 6G6
Аминокислотная последовательность CDR3 VL 6G6 включает
QQYSSHPYT (SEQ ID NO: 78).
Аминокислотные последовательности VH G6G
EVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFTTYYMNWVKQSHGKSLEWIGNINPDNGITSYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCARGKSLAYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 79).
CDR1 VH 6G6
Аминокислотная последовательность CDR1 VH 6G6 включает
TYYMN (SEQ ID NO: 80).
CDR2 VH 6G6
Аминокислотная последовательность CDR2 VH 6G6 включает
NINPDNGITSYNQKFKG (SEQ ID NO: 81).
CDR3 VH 6G6
Аминокислотная последовательность CDR3 VH 6G6 включает
GKSLAY (SEQ ID NO: 82).
Последовательности 7G3
Аминокислотные последовательности VL 7G3
DIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQVLIYQMSNLASGVPDRFSSSGSGTEFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLEFPLTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 83).
CDR1 VL 7G3
Аминокислотная последовательность CDR1 VL 7G3 включает
RSSKSLLHSNGITYLY (SEQ ID NO: 84).
CDR2 VL 7G3
Аминокислотная последовательность CDR2 VL 7G3 включает
QMSNLAS (SEQ ID NO: 85).
CDR3 VL 7G3
Аминокислотная последовательность CDR3 VL 7G3 включает
AQNLEFPLT (SEQ ID NO: 86).
Аминокислотные последовательности VH 7G3
QVQLQQSGPELVKPGASVKLSCKASGYTFTTYDINWVKQRPGQGLEWIGWIYPRDGTTKYNEKFKGKATLTVDTSSTTAYMELHSLTSEDSAVYFCARGGYYDYDGYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 87).
CDR1 VH 7G3
Аминокислотная последовательность CDR1 VH 7G3 включает
TYDIN (SEQ ID NO: 88).
CDR2 VH 7G3
Аминокислотная последовательность CDR2 VH 7G3 включает
WIYPRDGTTKYNEKFKG (SEQ ID NO: 89).
CDR3 VH 7G3
Аминокислотная последовательность CDR3 VH 7G3 включает
GGYYDYDGY (SEQ ID NO: 90).
Последовательности 9H6
Аминокислотные последовательности VL 9H6
DIQMTQSPASQSASLGESVTITCLASQTIGTWLAWYQQKPGRSPQLLIYAATSLADGVPSRFSGSGSGTKFSFKINSLQAEDFVSYYCQQLYSTPFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 91).
CDR1 VL 9H6
Аминокислотная последовательность CDR1 VL 9H6 включает
LASQTIGTWLA (SEQ ID NO: 92).
CDR2 VL 9H6
Аминокислотная последовательность CDR2 VL 9H6 включает
AATSLAD (SEQ ID NO: 93).
CDR3 VL 9H6
Аминокислотная последовательность CDR3 VL 9H6 включает
QQLYSTPFT (SEQ ID NO: 94).
Аминокислотные последовательности VH 9H6
EVQLVESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFSFNTHAMNWVRQAPGKGLEWVARIRTKSNNYATYYADSVKDRFIISRDDSENMVYLQMNNLKTEDTAIYYCVRLRGGFLDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 95).
CDR1 VH 9H6
Аминокислотная последовательность CDR1 VH 9H6 включает
THAMN (SEQ ID NO: 96).
CDR2 VH 9H6
Аминокислотная последовательность CDR2 VH 9H6 включает
RIRTKSNNYATYYADSVKD (SEQ ID NO: 97).
CDR3 VH 9H6
Аминокислотная последовательность CDR3 VH 9H6 включает
LRGGFLDY (SEQ ID NO: 98).
Последовательности 11B3
Аминокислотные последовательности VL 11B3
DIQMAQSSSSFSVSLGDRVTITCKASEDIYIRLAWYQQKPGNAPRLLISTATSLETGVPSRFSGSGSGKDYTLSITSLQTEDVATYYCQQYWSTPYTFGGGTRLEIK (SEQ ID NO: 99).
CDR1 VL 11B3
Аминокислотная последовательность CDR1 VL 11B3 включает
KASEDIYIRLA (SEQ ID NO: 100).
CDR2 VL 11B3
Аминокислотная последовательность CDR2 VL 11B3 включает
TATSLET (SEQ ID NO: 101).
CDR3 VL 11B3
Аминокислотная последовательность CDR3 VL 11B3 включает
QQYWSTPYT (SEQ ID NO: 102).
Аминокислотные последовательности VH 11B3
EVQLVESGGGLVQPKGSLKLSCAASDFTFNTYAMHWVRQAPGKGLEWVARIRTKSNNYATYYADSVKDRFTISRDDSQSMLYLQMNNLTTEDTAMYYCVRDRYGGAMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 103)
CDR1 VH 11B3
Аминокислотная последовательность CDR1 VH 11B3 включает
TYAMH (SEQ ID NO: 104).
CDR2 VH 11B3
Аминокислотная последовательность CDR2 VH 11B3 включает
RIRTKSNNYATYYADSVKD (SEQ ID NO: 105).
CDR3 VH 11B3
Аминокислотная последовательность CDR3 VH 11B3 включает
DRYGGAMDY (SEQ ID NO: 106).
Последовательности 12E10a
Обнаруживали, что клон 12E10 имеет две легкие цепи (12E10a и 12E10b).
Аминокислотные последовательности VL 12E10a
DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSITCKASQNVRSAVAWYQQKPGQSPKTLIYLASNRHTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLADYFCLQHWNYPLTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 107).
CDR1 VL 12E10a
Аминокислотная последовательность CDR1 VL 12E10a включает
KASQNVRSAVA (SEQ ID NO: 108).
CDR2 VL 12E10a
Аминокислотная последовательность CDR2 VL 12E10a включает
LASNRHT (SEQ ID NO: 109).
CDR3 VL 12E10a
Аминокислотная последовательность CDR3 VL 12E10a включает
LQHWNYPLT (SEQ ID NO: 110).
Аминокислотные последовательности VH 12E10(a и b)
QVQLQQSGAELARPGTSVKLSCKASGYTFTSCGLSWVKQRTGQGLEWIGEIYPSNGNSYYSDKVKDKATLTADKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYFCARAYYTNGYYAMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 111).
CDR1 VH 12E10
Аминокислотная последовательность CDR1 VH 12E10 включает
SCGLS (SEQ ID NO: 112).
CDR2 VH 12E10
Аминокислотная последовательность CDR2 VH 12E10 включает
EIYPSNGNSYYSDKVKD (SEQ ID NO: 113).
CDR3 VH 12E10
Аминокислотная последовательность CDR3 VH 12E10 включает
AYYTNGYYAMDY (SEQ ID NO: 114).
Аминокислотные последовательности VL 12E10b
DIVLTQSPATLSVTPGDSVSLSCRASQSISNNLHWYQQKSHESPRLLIKYASQSISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVETEDFGMYFCQQSNSWPLTFGAGTKLELK (SEQ ID NO: 115).
CDR1 VL 12E10b
Аминокислотная последовательность CDR1 VL 12E10b включает
RASQSISNNLH (SEQ ID NO: 116).
CDR2 VL 12E10b
Аминокислотная последовательность CDR2 VL 12E10b включает
YASQSIS (SEQ ID NO: 117).
CDR3 VL 12E10b
Аминокислотная последовательность CDR3 VL 12E10b включает
QQSNSWPLT (SEQ ID NO: 118).
Пример 2: Очистка LAIR-2 Fc
Способы и материалы
LAIR-2 hIgG1 (далее обозначаемый как LAIR-2 Fc) получали с использованием родительских линий CHOK1SV KO, трансфицированных с использованием вектора Lonza GS. Эту линию клеток использовали для экспрессии основного кандидата LAIR-2 hIgG1 (нативный IgG1) и мутантных версий Fc LAIR2-hIgG1 Fc (L145A/L146A). LAIR-2 Fc очищали посредством хроматографии с протеином A и анализировали с помощью электрофореза в ПААГ в присутствие SDS (фигура 6A) и эксклюзионной хроматографии (фигура 6B). LAIR-1 Fc получали аналогично контрольному LAIR-2 Fc, очищали посредством эксклюзионной хроматографии и визуализировали с использованием электрофореза в ПААГ в присутствие SDS.
Результаты
Фигура 6A представляет собой гель после электрофореза в ПААГ в присутствие SDS, на котором показан LAIR-2 Fc в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях. Фигура 6B представляет собой хроматограмму, на которой показан один основной пик на 38,550 минуты. Данные подтверждают ожидаемый размер LAIR-2 Fc и высокий уровень чистоты белка LAIR-2 Fc, используемого в описываемых исследованиях.
Пример 3: LAIR-2Fc связывается с коллагеном
Материалы и Способы
Линию клеток AML K562 со стабильной экспрессией коллагена 17 или контроли без коллагена 17 окрашивали с использованием 1 мкг LAIR-2 Fc и LAIR-1 Fc, инкубировали в течение 30 минут на льду, затем промывали клетки буфером FACS (PBS+1% FBS), затем окрашивали с использованием 0,05 мкг PE-меченого антитела против hIgG в течение 30 минут на льду. Клетки промывали, ресуспендировали в фиксирующем буфере FACS (3% параформальдегид в PBS) и анализировали посредством проточной цитометрии.
Результаты
Функциональность LAIR-2 Fc (фигуры 7A и 7B) и LAIR-1 Fc (фигуры 7C и 7D) оценивали по способности связываться с эндогенным трансмембранным лигандом коллагеном 17, экспрессирующимся на поверхности клеток K562. Анализ LAIR-2 Fc и LAIR-1 Fc посредством электрофореза в ПААГ в присутствие SDS использовали для оценки чистоты белков, используемых в этом и последующих исследованиях (фигуры 7E и 7F). Чистота LAIR-2 Fc и LAIR-1 Fc более 95% была стандартной для всех данных, представленных в описании.
Пример 4: Экспрессия LAIR-1 на линиях клеток AML и связывание LAIR-1 Fc и LAIR-2 Fc
Способы и материалы
T-клетки Jurkat, клетки K562 Col 17 и клетки THP-1 окрашивали с использованием 10 мг/мл PE-меченого антитела против LAIR-1 (eBioscience, NKTA255) или 10 мг/мл биотинилированного LAIR-1 Fc или LAIR-2 Fc после блокирования Fc-рецепторов с использованием TruStain FcX (Biolegend) и hIgG (Innovative Research). После инкубации в течение 30 минут клетки промывали буфером FACS и окрашивали 0,4 мкг/мл стрептавидина-PE. Экспрессию анализировали посредством проточной цитометрии.
Результаты
Подтверждали, что LAIR-1 сильно экспрессировался на конкретных линиях клеток AML. LAIR-2 Fc связывается с неизвестными молекулами на поверхности конкретных линий клеток AML, в то время как не наблюдали связывания LAIR-1 Fc.
in vitro
Для анализа линий клеток, применимых для анализа , гемопоэтические линии клеток AML анализировали на экспрессию LAIR-1, а также потенциальное связывание LAIR-2 Fc и связывание LAIR-1 Fc (фигуры 8A-8I).
Фигуры 8A-8I являются гистограммами проточной цитометрии указанной линии клеток, обработанной антителом против LAIR-1, LAIR-1 Fc или LAIR-2 Fc. На фигурах 8A-8C показаны клетки Jurkat, обработанные антителом против LAIR-1, LAIR-1 Fc и LAIR-2 Fc, соответственно.
На фигурах 8D-8F показаны клетки K562 Col 17, обработанные антителом против LAIR-1, LAIR-1 Fc и LAIR-2 Fc, соответственно.
На фигурах 8G-8I показаны клетки THP-1, обработанные антителом против LAIR-1, LAIR-1 Fc и LAIR-2 Fc, соответственно.
in vitro
Как указано, T-клетки Jurkat, лейкозные T-клетки и клетки THP-1 моноцитарного лейкоза экспрессировали высокие уровни LAIR-1, в то время как K562 клетки не экспрессировали. Кроме того, LAIR-2 Fc связывался с клетками THP-1, а также экспрессирующими коллаген 17 клетками K562 положительного контроля, но не с T-клетками Jurkat. С учетом этих результатов T-клетки Jurkat и клетки THP-1, трансдуцированные с использованием репортеров пути передачи сигнала, выбирали для исследований .
Пример 5: LAIR-2 Fc индуцирует передачу сигнала NF-kB и NFAT в T-клетках Jurkat.
Материалы и способы
96-луночные плоскодонные планшеты покрывали титрованными количествами антитела против CD3 (OKT3) в течение ночи с последующей аспирацией перед добавлением клеток. T-клетки Jurkat с репортером пути NF-kB-GFP высевали в количестве 50000 клеток/лунку/200 мкл RPMI-C в присутствие 10 мкг/мл LAIR-2 Fc, контрольного Fc или без белков. Клетки культивировали в течение 1 дня. Клетки собирали с планшетов и оценивали на экспрессию GFP посредством проточной цитометрии.
T-клетки Jurkat с репортером пути NFAT культивировали в присутствие 0,5 мкг/мл нанесенного в виде покрытия антитела против CD3 и титрованных количеств растворимого LAIR-2 Fc или контрольного Fc. Через приблизительно 24 часа супернатанты оценивали на уровни секретируемого Lucia по инструкциям производителя (Invivogen). Результаты регистрировали с помощью спектрофотометра для чтения планшетов Perkin-Elmer Envision.
Супернатанты T-клеток Jurkat-NFAT-Lucia, обработанных 10 мкг/мл LAIR-2 Fc или контрольного Fc, оценивали на уровни ИЛ-2 и ФНО посредством анализа цитокина MSD.
Результаты
in vitro
Анализы показали, что LAIR-2 Fc может индуцировать активность в линиях гемопоэтических лейкозных клеток. T-клетки Jurkat с репортером пути NF-kB-GFP культивировали с титрованными концентрациями нанесенного в виде покрытия антитела против CD3 в присутствие 10 мкг/мл LAIR-2 Fc, контрольного Fc или контрольных сред и оценивали на индукцию NF-kB посредством анализа процента GFP+ клеток с помощью проточной цитометрии (фигура 9A). Этот анализ показал, что LAIR-2 Fc способствуют индукции передачи сигнала NF-kB в T-клетках Jurkat. Этот эффект возникает без наблюдаемого связывания LAIR-2 Fc с T-клетками Jurkat, что, таким образом, свидетельствует о том, что LAIR-2 Fc действует в качестве ловушки для связывания лиганда с LAIR-1, экспрессируемым на плазматической мембране T-клеток Jurkat.
С использованием второй линии T-клеток Jurkat с репортером пути NFAT-Lucia было показано, что NFAT индуцировался в зависимости от дозы LAIR-2 Fc в присутствие установленной концентрации антитела против CD3 (фигура 9B).
Супернатанты T-клеток Jurkat в анализе репортера NFAT в присутствие 10 мкг/мл LAIR-2 Fc или контрольного Fc тестировали на уровни цитокинов ИЛ-2 и ФНО (фигуры 9C и 9D). Культивируемые с LAIR-2 Fc T-клетки Jurkat демонстрировали более высокие уровни обоих цитокинов цитокины, что соответствует индукции репортера пути. Т.к. не показано, что LAIR-2 Fc напрямую связывается с T-клетками Jurkat, предполагают, что LAIR-2 Fc нарушает взаимодействие LAIR-1 с растворимым фактором или нарушает ингибиторную передачу сигнала LAIR-1 с помощью других механизмов для повышения репортерной активности Jurkat.
Пример 6: LAIR-2 Fc связывается с клетками THP-1 и индуцирует репортерную активность.
Материалы и способы
0,1 мкг/мл биотинилированного LAIR-2 Fc добавляли к клеткам THP-1 на льду после блокирования Fc-рецептора с использованием Trustain FcX (Biolegend) и hIgG (Innovative Research). Затем клетки промывали буфером FACS и окрашивали 0,4 мкг/мл PE-меченым вторичным антителом со стрептавидином (Biolegend) в течение 30 минут на льду. Клетки промывали, фиксировали и анализировали посредством проточной цитометрии.
Клетки THP-1 добавляли в 96-луночные плоскодонные планшеты в количестве 50000 клеток/лунку. Добавляли LPS в конечной концентрации 1 мкг/мл или полных сред RPMI, а затем LAIR-2 Fc или контрольный Fc в конечной концентрации 10 мкг/мл. Все лунки содержали конечный объем 200 мкл. Клетки инкубировали в течение указанного количества дней с последующим анализом супернатанта на секретируемый Lucia по протоколу (Invivogen). Считывание осуществляли с использованием спектрофотометра для чтения планшетов Perkin-Elmer Envision.
Результаты
Клетки THP-1 с репортером пути также оценивали на ответ в присутствие LAIR-2 Fc или контрольного Fc. Примечательно, что, в дополнение к экспрессии LAIR-1, LAIR-2 Fc связывается с клетками THP-1 дозозависимым образом (фигура 10A). Вероятно, причиной этого является то, что клетки THP-1 экспрессируют трансмембранные коллагены (данные не представлены), являющиеся известными лигандами LAIR-2. Клетки THP-1 культивировали с лигандом толл-подобных рецепторов LPS, который, как известно, индуцирует путь интерферона в клетках THP-1, или без него. В присутствие LPS и LAIR-2 Fc индукция интерферон-регуляторного фактора (IRF) значительно повышалась по сравнению с LPS с контрольным Fc (фигура 10B). Кроме того, LAIR-2 Fc мог индуцировать передачу сигнала через интерфероновый путь даже в отсутствие LPS, что свидетельствует о прямом эффекте в отношении клеток THP-1 без необходимости совместной передачи сигнала (фигура 10C). Вероятно, механизмом действия является блокирование связывания LAIR-1 с трансмембранными коллагенами, т.к. остается маловероятным, что LAIR-2 Fc может индуцировать передачу сигнала через трансмембранные коллагены.
Пример 7: LAIR-2 Fc повышает пролиферацию первичных T-клеток.
Материалы и способы
Из PBMC здорового донора выделяли все T-клетки, включая CD4+ и CD8+ T-клетки. CD4+ T-клетки и CD8+ T-клетки выделяли из всех PBMC посредством обогащения магнитными частицами MACS (Miltenyi), метили 1 мкМ CFSE (LifeTechnologies) и добавляли в 96-луночные планшеты, предварительно покрытые титрованными количествами антитела против CD3 (OKT3) в течение ночи при 4°C. LAIR-2 Fc или контрольное Fc добавляли в количестве 10 мкг/мл и культивировали клетки в течение 72 часов с последующим анализом посредством проточной цитометрии. Для проточного цитометрического анализа конкретных субпопуляций T-клеток клетки окрашивали с использованием mAb против CD4 и против CD8. Таким образом, гейтировали субпопуляции CD4 и CD8 T-клеток и оценивали на разведение CFSE как меры пролиферации.
Результаты
Затем LAIR-2 Fc анализировали на эффекты в отношении первичных T-клеток человека. Результаты свидетельствуют о повышенной пролиферации CD4+ T-клеток и CD8+ T-клеток в присутствие LAIR-2 Fc (фигуры 11A и 11B).
Пример 8: LAIR-2 Fc не связывается напрямую с субпопуляциями клеток PBMC человека.
Материал и способы
Свежие PBMC человека от трех нормальных здоровых доноров окрашивали на CD3+CD4+ T-клетки, CD3+CD8+ T-клетки, CD3-CD16+CD56+ NK-клетки и CD14+ моноциты и анализировали посредством проточной цитометрии.
Результаты
Для определения того, является ли этот эффект результатом прямого связывания LAIR-2 Fc с T-клетками, PBMC здоровых доноров окрашивали с использованием LAIR-2 Fc. На фигурах 12A-12D показаны CD4+ клетки, CD8+ клетки, NK-клетки и моноциты, соответственно, от донора 1710, обработанные LAIR-2 Fc. На фигурах 12E-12H показаны CD4+ клетки, CD8+ клетки, NK-клетки и моноциты, соответственно, от донора 1711, обработанные LAIR-2 Fc. На фигурах 12I-12L показаны CD4+ клетки, CD8+ клетки, NK-клетки и моноциты, соответственно, от донора 1712, обработанные LAIR-2 Fc.
in vivo
Данные свидетельствуют о том, что LAIR-2 Fc не связывался напрямую с T-клетками человека. Кроме того, LAIR-2 Fc, по-видимому, не связывается с какими-либо субпопуляциями клеток PBMC на значительном уровне. В связи с этим, вероятно, LAIR-2 Fc нарушает взаимодействие LAIR-1 с лигандами LAIR, присутствующими или экспрессирующимися в этой культуральной системе. Эти данные также позволяют предполагать, что LAIR-2 Fc не имеет какого-либо эффекта в отношении истощения гематопоэтических клеток , в то время как клетки, экспрессирующие трансмембранные лиганды LAIR, потенциально можно истощать или напрямую влиять на них другими способами, которые предстоит изучить.
Пример 9: LAIR-2 Fc способствует антиген-специфической экспансии CD8+ T-клеток
in vivo
.
Материалы и способы
Использовали CD8+ T-клетки, специфические для модельного антигена овальбумина (OVA) куриного яйца в контексте C57BL/6 MHC класса I мыши (H-2Kb). CD8+ OT-I T-клетки распознают пептид OVA SIINFEKL (SEQ ID NO: 119) при связывании с H-2Kb. В присутствие адъюванта OT-I T-клетки подвергаются экспансии, а затем сокращению. Для определения того, повышена ли экспансия OT-I и/или замедленно ли сокращение, использовали OVA и адъювант поли-I:C.
Дизайн эксперимента представлен на фигуре 13A. Десяти мышам/группу в день -2 и 5 вводили 500 мкг контрольного Fc или LAIR-2 Fc. В день 0 CD8+ T-клетки выделяли из мышей OT-I x Ly5.1 F1 посредством разделения MACS (Miltenyi) и 2e5 клеток инъецировали i.p. В день 1 100 мкг пептида SIINFEKL (SEQ ID NO: 119) (Peptides International) и 150 мкг адъюванта поли-I:C (Invivogen) инъецировали i.p. в общем объеме 300 мкл/мышь. У мышей забирали кровь в день 0 перед иммунизацией и в дни 1, 3, 5, 7, 10 и 14 и OT-I T-клетки в крови анализировали с помощью проточной цитометрии посредством гейтирования по TCR Vbeta2+CD8+ T-клеткам и Ly5.1 (CD45.1).
Результаты
in vivo
Затем LAIR-2 Fc тестировали  для определения того, будет ли LAIR-2 Fc повышать антиген-специфические T-клеточные ответы. На фигуре 13B показано, что процентная доля OT-I от всех CD8+ T-клеток значительно повышалась ко дню 5 относительно контрольного Fc. Результаты свидетельствуют о том, что T-клетки OT-I подвергаются значительно повышенной экспансии в присутствие LAIR-2 Fc по сравнению с мышами, которым вводили контрольный Fc (фигура 13B). Эти данные напрямую относятся к моделям OVA-экспрессирующих опухолей для оценки опухолевых антиген-специфических T-клеточных ответов.
Пример 10: У мышей, которым вводили LAIR-2 Fc, наблюдали значительно улучшенный антиген-специфический вторичный ответ.
Материалы и способы
Через ~10 недель после исходной экспансии мышам вводили равные количества (по 1e6 каждых) спленоцитов CD45.1, нагруженных пептидом OVA (CFSE hi) или ненагруженных пептидом (CFSE lo). Через 48 часов мышей умерщвляли и с помощью проточной цитометрии анализировали спленоциты на соотношение ненагруженных и нагруженных OVA спленоцитов как меру опосредованной OT-I антиген-специфической цитотоксической активности CTL памяти.
Результаты
Мышей из эксперимента по экспансии OT-I (пример 9) оставляли на ~10 недель, а затем анализировали антиген-специфические вторичные ответы CTL памяти для определения того, преобразуется ли усиленная LAIR-2 Fc экспансия в усиленный функциональный вторичный ответ, о котором свидетельствует уничтожение CTL нагруженных антигеном спленоцитов.
Контролей, которым не делали инъекции, анализировали на пиковое гейтирование CFSE и начальное соотношение (фигуры 14A-14C). Типичные примеры соотношений CFSE hi иCFSE lo в каждой группе показаны на фигурах 14D-14F. Результаты свидетельствуют о том, что мыши, которым вводили LAIR-2 Fc в течение начальной экспансии T-клеток OT-I (необходимо отметить, что ничего не вводили в течение вторичного ответа), имели значимо лучший вторичный ответ, вычисленный как специфический лизис нагруженных OVA спленоцитов (фигура 14C).
Пример 11: LAIR-2 Fc контролирует рост рака яичников 1D8-OVA и пролонгирует выживание.
Материалы и способы
Мышам C57BL/6 инъецировали i.p. 5e6 клеток ID8-OVA, а через 3 недели инъецировали i.p. 1e6 CD8+ T-клеток OT-I. Затем мышам вводили LAIR-2 Fc или контрольный Fc, начиная через один день после переноса OT-I и каждые четыре дня всего в количестве 5 введений. Увеличение массы подвергали мониторингу каждые 2-3 дней. Для анализа выживаемости мышей умерщвляли, когда наблюдали продукцию асцитической жидкости и повышение массы мышей на 50% относительно начальной массы. Фигура 15A представляет собой диаграмму примера схемы лечения, в которой 5e6 опухолевых клеток ID8-OVA инъецировали i.p. в день 0.
Результаты
Исследовали то, преобразуется ли улучшенный антиген-специфический T-клеточный ответ, опосредованный введением LAIR-2 Fc, в улучшенный противоопухолевый иммунитет при использовании OVA-экспрессирующей модели опухоли и T-клеток OT-I. Ранее определяли, что T-клетки OT-I, перенесенные через 3 недели после инокуляции опухолевого материала, не являются протективными, и что у T-клеток OT-I развивается дисфункциональный или истощенный фенотип. Таким образом, она является полезной моделью для определения того, могут ли иммунотерапевтические средства способствовать антиген-специфическим T-клеточным ответам и/или реверсировать/предотвращать истощение.
Результаты свидетельствовали о значительно замедленном увеличении массы и значительном повышении длительной выживаемости (фигуры 15B и 15C). 60% мышей выживало в течение длительного периода времени по сравнению с 20% контролей, что позволяет предполагать значительное общее излечение при использовании LAIR-2 Fc (фигура 15C).
Пример 12: LAIR-2 Fc и антитело против PD-1 представляют собой эффективное комбинированное иммунотерапевтическое средство при раке яичников.
Материалы и способы
Схема введения средств мышам являлась той же, что и на фигуре 15A, за исключением того, что больше (6e6) опухолевых клеток ID8-OVA инъецировали i.p. в день 0 и меньше T-клеток OT-I (5e5) подвергали адоптивному переносу через 3 недели. Введение 200 мкг LAIR-2 Fc или контрольного Fc начинали через один день после переноса T-клеток и осуществляли каждые 4 дня всего в количестве 5 доз. Массу мышей подвергали мониторингу каждые 2-3 дня и мышей умерщвляли, когда наблюдали продукцию асцитической жидкости и повышение массы мышей на 50% относительно начальной массы.
Результаты
Исследовали LAIR-2 Fc в отдельности по сравнению с иммунотерапевтическим средством против PD-1 и химиотерапией цисплатином, а также в комбинации с PD-1 и цисплатином для изучения их синергического действия (фигура 16). Результаты свидетельствуют об умеренном эффекте при использовании LAIR-2 Fc в отдельности в этой модели. Однако лучший ответ наблюдали в случае комбинации LAIR-2 Fc и антитела против PD-1, при этом 50% мышей выживали после 13 недель. Ни одна из мышей в других группах отдельного введения или комбинированного введения не доживала до 13 недель.
Пример 13: LAIR-2 Fc замедляет рост опухоли и повышает выживание в подкожной модели лимфомы.
Материалы и способы
3
4e5 опухолевых клеток A20 подкожно (s.c.) имплантировали в день 0. 200 мкг LAIR-2 Fc или контрольного Fc вводили i.p., начиная со дня 4 и каждые 4 дня в количестве 5 введений. Рост опухоли подвергали мониторингу и измеряли 2-3 раз/неделю и умерщвляли мышей, когда средний диаметр опухоли достигал 15 мм или опухоль достигала 2000 мм. На фигуре 17A представлен пример схемы лечения с использованием модели опухоли A20.
Результаты
Результаты свидетельствуют о том, что рост опухоли значительно замедлялся (фигура 17B). Кроме того, наблюдали значительное пролонгирование выживания, при этом у одного животного наблюдали отсутствие опухоли в течение длительного периода времени (фигура 17C).
Пример 14. Получение, селекция и характеризация mAb против LAIR-1.
Материалы и способы
Иммунизацию, слияние и клонирование для получения mAb против LAIR-1 человека осуществляли с помощью Precision Antibody CRO. В NextCure получали слитый белок LAIR-1 человека и Fc mG2a для иммунизации и бустер-иммунизации пяти мышей линии SJL в Precision Antibody. Электрослияние осуществляли с использованием спленоцитов и лимфоузлов из двух мышей с высоким титром. Приблизительно 1200 клонов гибридом подвергали скринингу посредством ELISA на связывание со слитым белком LAIR-1 человека и Fc hG1 и посредством проточной цитометрии на связывание с линиями опухолевых клеток AML, экспрессирующих эндогенный LAIR-1 (Jurkat, HL-60).
Супернатанты клонов гибридом против LAIR-1 человека инкубировали с линиями клеток, о которых известно, что они экспрессируют LAIR-1 (HL-60, MV-4-11), линией клеток A, отрицательной по LAIR-1, трансфицированной с использованием LAIR-1 (K562-LAIR-1) для тестирования на специфичность, и линией клеток, о которой известно, что она является отрицательной по экспрессии LAIR-1 (U266B1). В кратком изложении, 50 мкл супернатанта инкубировали с 1e5 клетками в 96-луночных круглодонных планшетах в течение 30 минут. Клетки промывали буфером для FACS (PBS+1% FBS) и окрашивали с использованием 0,05 мкг PE-меченого вторичного антитела (Ab) против IgG мыши в течение 30 минут. Клетки промывали и фиксировали в 100 мкл 3% параформальдегида в PBS для проточного цитометрического анализа. Представленные данные представляют собой процентную долю клеток, окрашиваемых сильнее фона, с вторичным контролем окрашивания (последняя колонка).
Результаты
Результаты представлены для 15 конечных выбранных клонов (фигура 18). Супернатанты гибридом имели дифференциальные уровни связывания с конкретными типами клеток. Это может являться результатом различных уровней mAb в супернатанте клеток или разной силой (авидности) связывания с LAIR-1 на плазматической мембране. Однако, т.е. некоторые супернатанты связываются с LAIR-1 на конкретных типах клеток на более высоких уровнях, остается возможность того, что клоны mAb против LAIR-1 связываются с конкретными гликоформами или иными модифицированными формами LAIR-1 на линиях опухолевых клеток.
В следующих последовательностях полужирным шрифтом и подчеркиванием указана лидерная последовательность. В некоторых вариантах осуществления лидерная последовательность удалена.
Последовательности химерного 1E11:
HC hG1
Аминокислотная последовательность тяжелой цепи hG1 представляет собой
MEWSWVFLFFLSVTTGVHS
QVQLQQSGPELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYDINWVKQRP
GQGLEWIGWIYPRDGSTKYNEKLKGKATLTVDTSSRTAYMELHSLTSEDSAVYFCARGGY
YDYDGYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS
GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD
GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK
GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS
DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG* (SEQ ID NO: 120)
Последовательность нуклеиновой кислоты тяжелой цепи hG1 представляет собой
atggaatggtcctgggtgttcctgttcttcctgtctgtgaccaccggcgtgcactctcag
gtt
cagttgcagcagtctggccctgagcttgtgaaacctggcgcctctgtgaagctgtct
tgcaaggcctctggctacaccttcaccagctacgacatcaactgggtcaagcagaggcct
ggacagggactcgagtggatcggctggatctaccctagagatggctccaccaagtacaac
gagaagctgaagggcaaagctaccctgaccgtggacacctcctctcggaccgcttacatg
gaactgcactccctgacctctgaggactccgccgtgtacttttgtgccagaggcggctac
tacgactacgatggctattggggacagggcaccctggtcacagtgtctgctgcttctacc
aaggggccctccgtgttccctctggccccttccagcaagtctacctctggcggcacagcc
gctctgggctgcctcgtgaaggactacttccccgagcctgtgaccgtgtcctggaactct
ggcgctctgacatccggcgtgcacaccttccctgctgtgctgcagtcctccggcctgtac
tccctgtcctccgtcgtgaccgtgccttccagctctctgggcacccagacctacatctgc
aacgtgaaccacaagccctccaacaccaaggtggacaagaaggtggaacccaagtcctgc
gacaagacccacacctgtcccccttgtcctgcccctgaactgctgggcggacccagcgtg
ttcctgttccccccaaagcccaaggacaccctgatgatctcccggacccccgaagtgacc
tgcgtggtggtggatgtgtcccacgaggaccctgaagtgaagttcaattggtacgtggac
ggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcctagagaggaacagtacaactccacctac
cgggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggattggctgaacggcaaagagtacaag
tgcaaggtgtccaacaaggccctgcctgcccccatcgaaaagaccatctccaaggccaag
ggccagccccgggaaccccaggtgtacacactgccccctagcagggacgagctgaccaag
aaccaggtgtccctgacctgtctcgtgaaaggcttctacccctccgatatcgccgtggaa
tgggagtccaacggccagcctgagaacaactacaagaccaccccccctgtgctggactcc
gacggctcattcttcctgtacagcaagctgacagtggacaagtcccggtggcagcagggc
aacgtgttctcctgctccgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtcc
ctgtccctgagccccggctga
(SEQ ID NO: 121)
HC hG4P
Аминокислотная последовательность тяжелой цепи hG4P представляет собой:
MEWSWVFLFFLSVTTGVHS
QVQLQQSGPELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYDINWVKQRP
GQGLEWIGWIYPRDGSTKYNEKLKGKATLTVDTSSRTAYMELHSLTSEDSAVYFCARGGY
YDYDGYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS
GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYG
PPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVE
VHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQP
REPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS
FFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG*
(SEQ ID NO: 122)
Последовательность нуклеиновой кислоты hG4P представляет собой:
atggaatggtcctgggtgttcctgttcttcctgtctgtgaccaccggcgtgcactctcag
gtt
cagttgcagcagtctggccctgagcttgtgaaacctggcgcctctgtgaagctgtct
tgcaaggcctctggctacaccttcaccagctacgacatcaactgggtcaagcagaggcct
ggacagggactcgagtggatcggctggatctaccctagagatggctccaccaagtacaac
gagaagctgaagggcaaagctaccctgaccgtggacacctcctctcggaccgcttacatg
gaactgcactccctgacctctgaggactccgccgtgtacttttgtgccagaggcggctac
tacgactacgatggctattggggacagggcaccctggtcacagtgtctgctgcttctacc
aaggggccctccgtgttccctctggccccttgctccagatccacctccgagtctaccgcc
gctctgggctgcctcgtgaaggactacttccccgagcctgtgaccgtgtcctggaactct
ggcgctctgacctctggcgtgcacaccttccctgctgtgctgcagtcctccggcctgtac
tccctgtcctccgtcgtgaccgtgccttccagctctctgggcaccaagacctacacctgt
aacgtggaccacaagccctccaacaccaaggtggacaagcgggtggaatctaagtacggc
cctccctgccctccttgcccagcccctgaatttctgggcggacccagcgtgttcctgttc
cccccaaagcccaaggacaccctgatgatctcccggacccccgaagtgacctgcgtggtg
gtggatgtgtcccaggaagatcccgaggtgcagttcaattggtacgtggacggcgtggaa
gtgcacaacgccaagaccaagcctagagaggaacagttcaactccacctaccgggtggtg
tccgtgctgaccgtgctgcaccaggattggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtg
tccaacaagggcctgcccagctccatcgaaaagaccatctccaaggccaagggccagccc
cgggaaccccaggtgtacacactgcctccaagccaggaagagatgaccaagaaccaggtg
tccctgacctgtctcgtgaaaggcttctacccctccgatatcgccgtggaatgggagtcc
aacggccagcctgagaacaactacaagaccaccccccctgtgctggactccgacggctcc
ttcttcctgtactctcgcctgaccgtggacaagtcccggtggcaggaaggcaacgtgttc
tcctgctccgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgtccctg
tctctgggatga
(SEQ ID NO: 123)
Легкая цепь
Аминокислотная последовательность легкой цепи химерного 1E11 представляет собой:
MSVPTQVLGLLLLWLTDARC
DIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYLYW
YLQKPGQSPQVLIYQMSSLASGVPDRFSSSGSGTEFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELP
LTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQ
SGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC*
(SEQ ID NO: 124)
Последовательность нуклеиновой кислоты легкой цепи химерного 1E11 представляет собой:
atgtccgtgcctacacaggttctgggactgctgctgctgtggctgaccgacgctagatgc
gatatcgtgatgacccaggccgccttcagcaatcctgtgacactgggaacctccgcctcc
atctcctgcagatcctctaagtccctgctgcactccaacggcatcacctacctgtactgg
tatctgcagaagcccggccagtctcctcaggtgctgatctaccagatgtcctctctggcc
tctggcgtgcccgacagattctcttcttctggctctggcaccgagttcaccctgcggatc
tctagagtggaagctgaggacgtgggcgtgtactactgcgcccagaatctggaactgcct
ctgacctttggcgctggcaccaagctggaactgaagcgtacggtggccgctccctccgtg
ttcatcttcccaccttccgacgagcagctgaagtccggcaccgcttctgtcgtgtgcctg
ctgaacaacttctacccccgcgaggccaaggtgcagtggaaggtggacaacgccctgcag
tccggcaactcccaggaatccgtgaccgagcaggactccaaggacagcacctactccctg
tcctccaccctgaccctgtccaaggccgactacgagaagcacaaggtgtacgcctgcgaa
gtgacccaccagggcctgtctagccccgtgaccaagtctttcaaccggggcgagtgctga
(SEQ ID NO: 125)
5E1
Последовательности химерного
HC hG1
Аминокислотная последовательность тяжелой цепи hG1 представляет собой:
MEWSWVFLFFLSVTTGVHSEV
QLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTGYFMNWVKQSP
EKSLEWIGEIHPSTGSIIYNQKFKAKATLTIDKSSSTAYMQLKSLTSEDSAVYYCARFDY
SNSFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS
GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVD
GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK
GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS
DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG* (SEQ ID NO: 126)
Последовательность нуклеиновой кислоты тяжелой цепи hG1 представляет собой:
atggaatggtcctgggtgttcctgttcttcctgtctgtgaccaccggcgtgcactctgaa
gtt
cagttgcagcagtctggccccgagcttgtgaaacctggcgcctctgtgaagatctcc
tgcaaggcctctggctactccttcaccggctacttcatgaactgggtcaagcagtcccct
gagaagtccctggaatggatcggcgagatccatccttccaccggcagcatcatctacaac
cagaagttcaaggccaaggctaccctgaccatcgacaagtcctcttccaccgcctacatg
cagctgaagtctctgacctctgaggactccgccgtgtactactgcgccagattcgactac
tccaactccttcgcttattggggccagggcaccctggttaccgtgtctgctgcttctacc
aaggggccctccgtgttccctctggccccttccagcaagtctacctctggcggcacagcc
gctctgggctgcctcgtgaaggactacttccccgagcctgtgaccgtgtcctggaactct
ggcgctctgacatccggcgtgcacaccttccctgctgtgctgcagtcctccggcctgtac
tccctgtcctccgtcgtgaccgtgccttccagctctctgggcacccagacctacatctgc
aacgtgaaccacaagccctccaacaccaaggtggacaagaaggtggaacccaagtcctgc
gacaagacccacacctgtcccccttgtcctgcccctgaactgctgggcggacccagcgtg
ttcctgttccccccaaagcccaaggacaccctgatgatctcccggacccccgaagtgacc
tgcgtggtggtggatgtgtcccacgaggaccctgaagtgaagttcaattggtacgtggac
ggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcctagagaggaacagtacaactccacctac
cgggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggattggctgaacggcaaagagtacaag
tgcaaggtgtccaacaaggccctgcctgcccccatcgaaaagaccatctccaaggccaag
ggccagccccgggaaccccaggtgtacacactgccccctagcagggacgagctgaccaag
aaccaggtgtccctgacctgtctcgtgaaaggcttctacccctccgatatcgccgtggaa
tgggagtccaacggccagcctgagaacaactacaagaccaccccccctgtgctggactcc
gacggctcattcttcctgtacagcaagctgacagtggacaagtcccggtggcagcagggc
aacgtgttctcctgctccgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtcc
ctgtccctgagccccggctga
(SEQ ID NO: 127)
HC hG4P
Аминокислотная последовательность тяжелой цепи hG4P представляет собой:
MEWSWVFLFFLSVTTGVHSEV
QLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTGYFMNWVKQSP
EKSLEWIGEIHPSTGSIIYNQKFKAKATLTIDKSSSTAYMQLKSLTSEDSAVYYCARFDY
SNSFAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS
GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYG
PPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVE
VHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQP
REPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS
FFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG*
(SEQ ID NO: 128)
Последовательность нуклеиновой кислоты тяжелой цепи hG4P представляет собой:
atggaatggtcctgggtgttcctgttcttcctgtctgtgaccaccggcgtgcactctgaa
gtt
cagttgcagcagtctggccccgagcttgtgaaacctggcgcctctgtgaagatctcc
tgcaaggcctctggctactccttcaccggctacttcatgaactgggtcaagcagtcccct
gagaagtccctggaatggatcggcgagatccatccttccaccggcagcatcatctacaac
cagaagttcaaggccaaggctaccctgaccatcgacaagtcctcttccaccgcctacatg
cagctgaagtctctgacctctgaggactccgccgtgtactactgcgccagattcgactac
tccaactccttcgcttattggggccagggcaccctggttaccgtgtctgctgcttctacc
aaggggccctccgtgttccctctggccccttgctccagatccacctccgagtctaccgcc
gctctgggctgcctcgtgaaggactacttccccgagcctgtgaccgtgtcctggaactct
ggcgctctgacctctggcgtgcacaccttccctgctgtgctgcagtcctccggcctgtac
tccctgtcctccgtcgtgaccgtgccttccagctctctgggcaccaagacctacacctgt
aacgtggaccacaagccctccaacaccaaggtggacaagcgggtggaatctaagtacggc
cctccctgccctccttgcccagcccctgaatttctgggcggacccagcgtgttcctgttc
cccccaaagcccaaggacaccctgatgatctcccggacccccgaagtgacctgcgtggtg
gtggatgtgtcccaggaagatcccgaggtgcagttcaattggtacgtggacggcgtggaa
gtgcacaacgccaagaccaagcctagagaggaacagttcaactccacctaccgggtggtg
tccgtgctgaccgtgctgcaccaggattggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtg
tccaacaagggcctgcccagctccatcgaaaagaccatctccaaggccaagggccagccc
cgggaaccccaggtgtacacactgcctccaagccaggaagagatgaccaagaaccaggtg
tccctgacctgtctcgtgaaaggcttctacccctccgatatcgccgtggaatgggagtcc
aacggccagcctgagaacaactacaagaccaccccccctgtgctggactccgacggctcc
ttcttcctgtactctcgcctgaccgtggacaagtcccggtggcaggaaggcaacgtgttc
tcctgctccgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgtccctg
tctctgggatga
(SEQ ID NO: 129)
Легкая цепь
Аминокислотная последовательность легкой цепи химерного 5E1 представляет собой:
MSVPTQVLGLLLLWLTDARC
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKP
DGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPRTFGG
GTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQ
ESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC*
(SEQ ID NO: 130)
Последовательность нуклеиновой кислоты легкой цепи химерного 1E5 представляет собой:
atgtccgtgcctacacaggttctgggactgctgctgctgtggctgaccgacgctagatgc
gatatccagatgacccagaccacctccagcctgtctgcttctctgggcgacagagtgacc
atctcctgcagagcctctcaggacatctccaactacctgaactggtatcagcagaaaccc
gacggcaccgtgaagctgctgatctactacacctccagactgcactccggcgtgccctct
agattttctggctctggatctggcaccgactactccctgaccatcagcaacctggaacaa
gaggatatcgctacctacttctgccagcaaggcaacaccctgcctagaacctttggcgga
ggcaccaagctggaaatcaagcgtacggtggccgctccctccgtgttcatcttcccacct
tccgacgagcagctgaagtccggcaccgcttctgtcgtgtgcctgctgaacaacttctac
ccccgcgaggccaaggtgcagtggaaggtggacaacgccctgcagtccggcaactcccag
gaatccgtgaccgagcaggactccaaggacagcacctactccctgtcctccaccctgacc
ctgtccaaggccgactacgagaagcacaaggtgtacgcctgcgaagtgacccaccagggc
ctgtctagccccgtgaccaagtctttcaaccggggcgagtgctga
(SEQ ID NO: 131)
6G6
Последовательности химерного
Тяжелая цепь hG1
Аминокислотная последовательность тяжелой цепи hG1 представляет собой:
MEWSWVFLFFLSVTTGVHSEV
QLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFTTYYMNWVKQSH
GKSLEWIGNINPDNGITSYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCARGKS
LAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGAL
TSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKT
HTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE
VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQP
REPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS
FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG*
(SEQ ID NO: 132)
Последовательность нуклеиновой кислоты тяжелой цепи hG1 представляет собой:
atggaatggtcctgggtgttcctgttcttcctgtctgtgaccaccggcgtgcactctgaa
gtt
cagttgcagcagtctggccccgagcttgtgaaacctggcgcctctgtgaagatctcc
tgcaaggcctctggctacaccttcaccacctactacatgaactgggtcaagcagtcccac
ggcaagtccctggaatggatcggcaacatcaaccccgacaacggcatcacctcctacaac
cagaagttcaagggcaaagctaccctgaccgtggacaagtcctcctccaccgcctacatg
gaactgagatccctgacctctgaggactccgccgtgtactactgtgccagaggcaagtct
ctggcttattggggccagggcacactggtcacagtgtctgctgcttccaccaaggggccc
tccgtgttccctctggccccttccagcaagtctacctctggcggcacagccgctctgggc
tgcctcgtgaaggactacttccccgagcctgtgaccgtgtcctggaactctggcgctctg
acatccggcgtgcacaccttccctgctgtgctgcagtcctccggcctgtactccctgtcc
tccgtcgtgaccgtgccttccagctctctgggcacccagacctacatctgcaacgtgaac
cacaagccctccaacaccaaggtggacaagaaggtggaacccaagtcctgcgacaagacc
cacacctgtcccccttgtcctgcccctgaactgctgggcggacccagcgtgttcctgttc
cccccaaagcccaaggacaccctgatgatctcccggacccccgaagtgacctgcgtggtg
gtggatgtgtcccacgaggaccctgaagtgaagttcaattggtacgtggacggcgtggaa
gtgcacaacgccaagaccaagcctagagaggaacagtacaactccacctaccgggtggtg
tccgtgctgaccgtgctgcaccaggattggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtg
tccaacaaggccctgcctgcccccatcgaaaagaccatctccaaggccaagggccagccc
cgggaaccccaggtgtacacactgccccctagcagggacgagctgaccaagaaccaggtg
tccctgacctgtctcgtgaaaggcttctacccctccgatatcgccgtggaatgggagtcc
aacggccagcctgagaacaactacaagaccaccccccctgtgctggactccgacggctca
ttcttcctgtacagcaagctgacagtggacaagtcccggtggcagcagggcaacgtgttc
tcctgctccgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgtccctg
agccccggctga
(SEQ ID NO: 133)
Аминокислотная последовательность тяжелой цепи hG4P представляет собой:
MEWSWVFLFFLSVTTGVHSEV
QLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFTTYYMNWVKQSH
GKSLEWIGNINPDNGITSYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCARGKS
LAYWGQGTLVTVSAASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGAL
TSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPC
PPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHN
AKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREP
QVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL
YSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG*
(SEQ ID NO: 134)
Последовательность нуклеиновой кислоты тяжелой цепи hG4P представляет собой:
atggaatggtcctgggtgttcctgttcttcctgtctgtgaccaccggcgtgcactctgaa
gtt
cagttgcagcagtctggccccgagcttgtgaaacctggcgcctctgtgaagatctcc
tgcaaggcctctggctacaccttcaccacctactacatgaactgggtcaagcagtcccac
ggcaagtccctggaatggatcggcaacatcaaccccgacaacggcatcacctcctacaac
cagaagttcaagggcaaagctaccctgaccgtggacaagtcctcctccaccgcctacatg
gaactgagatccctgacctctgaggactccgccgtgtactactgtgccagaggcaagtct
ctggcttattggggccagggcacactggtcacagtgtctgctgcttccaccaaggggccc
tccgtgttccctctggccccttgctccagatccacctccgagtctaccgccgctctgggc
tgcctcgtgaaggactacttccccgagcctgtgaccgtgtcctggaactctggcgctctg
acctctggcgtgcacaccttccctgctgtgctgcagtcctccggcctgtactccctgtcc
tccgtcgtgaccgtgccttccagctctctgggcaccaagacctacacctgtaacgtggac
cacaagccctccaacaccaaggtggacaagcgggtggaatctaagtacggccctccctgc
cctccttgcccagcccctgaatttctgggcggacccagcgtgttcctgttccccccaaag
cccaaggacaccctgatgatctcccggacccccgaagtgacctgcgtggtggtggatgtg
tcccaggaagatcccgaggtgcagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaac
gccaagaccaagcctagagaggaacagttcaactccacctaccgggtggtgtccgtgctg
accgtgctgcaccaggattggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtgtccaacaag
ggcctgcccagctccatcgaaaagaccatctccaaggccaagggccagccccgggaaccc
caggtgtacacactgcctccaagccaggaagagatgaccaagaaccaggtgtccctgacc
tgtctcgtgaaaggcttctacccctccgatatcgccgtggaatgggagtccaacggccag
cctgagaacaactacaagaccaccccccctgtgctggactccgacggctccttcttcctg
tactctcgcctgaccgtggacaagtcccggtggcaggaaggcaacgtgttctcctgctcc
gtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgtccctgtctctggga
tga (SEQ ID NO: 135)
Аминокислотная последовательность легкой цепи представляет собой:
MSVPTQVLGLLLLWLTDAR
CDIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQNVGTAVAWYQQKP
GQSPKLLIYWASIRHTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLADYFCQQYSSHPYTFGG
GTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQ
ESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC*
(SEQ ID NO: 136)
Последовательность нуклеиновой кислоты легкой цепи представляет собой:
atgtccgtgcctacacaggttctgggactgctgctgctgtggctgaccgacgctagatgc
gacatcgtgatgacccagagccacaagttcatgtccacctccgtgggcgacagagtgtcc
atcacatgcaaggcctctcagaatgtgggcaccgccgttgcctggtatcagcagaaacct
ggccagtctcctaagctgctgatctactgggcctccatcagacacaccggcgtgccagat
agattcaccggctctggctctggcaccgacttcaccctgaccatctctaacgtgcagtct
gaggacctggccgactacttctgccagcagtacagctctcacccctacacctttggcgga
ggcaccaagctggaaatcaagcgtacggtggccgctccctccgtgttcatcttcccacct
tccgacgagcagctgaagtccggcaccgcttctgtcgtgtgcctgctgaacaacttctac
ccccgcgaggccaaggtgcagtggaaggtggacaacgccctgcagtccggcaactcccag
gaatccgtgaccgagcaggactccaaggacagcacctactccctgtcctccaccctgacc
ctgtccaaggccgactacgagaagcacaaggtgtacgcctgcgaagtgacccaccagggc
ctgtctagccccgtgaccaagtctttcaaccggggcgagtgctga
(SEQ ID NO: 137)
11B3
Последовательности химерного
HC hG1
Аминокислотная последовательность тяжелой цепи hG1 представляет собой:
MEWSWVFLFFLSVTTGVHSEV
QLVESGGGLVQPKGSLKLSCAASDFTFNTYAMHWVRQAP
GKGLEWVARIRTKSNNYATYYADSVKDRFTISRDDSQSMLYLQMNNLTTEDTAMYYCVRD
RYGGAMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSW
NSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPK
SCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY
VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK
AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL
DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG* (SEQ ID NO: 138)
Последовательность нуклеиновой кислоты тяжелой цепи hG1 представляет собой:
atggaatggtcctgggtgttcctgttcttcctgtctgtgaccaccggcgtgcactctgaa
gtg
cagttggttgaatctggcggcggactggtgcagcctaagggatctctgaagctgtct
tgcgccgcctccgacttcaccttcaatacctacgccatgcactgggtccgacaggcccct
ggaaaaggactggaatgggtcgccagaatccggaccaagtccaacaactacgccacctac
tacgccgactccgtgaaggacagattcaccatctctcgggacgactcccagtccatgctg
tacctgcagatgaacaacctgaccaccgaggacaccgccatgtactactgcgtgcgggat
agatatggcggcgctatggattattggggccagggcacatctgtgaccgtgtcctctgct
tccaccaaggggccctccgtgttccctctggccccttccagcaagtctacctctggcggc
acagccgctctgggctgcctcgtgaaggactacttccccgagcctgtgaccgtgtcctgg
aactctggcgctctgacatccggcgtgcacaccttccctgctgtgctgcagtcctccggc
ctgtactccctgtcctccgtcgtgaccgtgccttccagctctctgggcacccagacctac
atctgcaacgtgaaccacaagccctccaacaccaaggtggacaagaaggtggaacccaag
tcctgcgacaagacccacacctgtcccccttgtcctgcccctgaactgctgggcggaccc
agcgtgttcctgttccccccaaagcccaaggacaccctgatgatctcccggacccccgaa
gtgacctgcgtggtggtggatgtgtcccacgaggaccctgaagtgaagttcaattggtac
gtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcctagagaggaacagtacaactcc
acctaccgggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggattggctgaacggcaaagag
tacaagtgcaaggtgtccaacaaggccctgcctgcccccatcgaaaagaccatctccaag
gccaagggccagccccgggaaccccaggtgtacacactgccccctagcagggacgagctg
accaagaaccaggtgtccctgacctgtctcgtgaaaggcttctacccctccgatatcgcc
gtggaatgggagtccaacggccagcctgagaacaactacaagaccaccccccctgtgctg
gactccgacggctcattcttcctgtacagcaagctgacagtggacaagtcccggtggcag
cagggcaacgtgttctcctgctccgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccag
aagtccctgtccctgagccccggctga
(SEQ ID NO: 139)
HC hG4P
Аминокислотная последовательность тяжелой цепи hG4P представляет собой:
MEWSWVFLFFLSVTTGVHSEV
QLVESGGGLVQPKGSLKLSCAASDFTFNTYAMHWVRQAP
GKGLEWVARIRTKSNNYATYYADSVKDRFTISRDDSQSMLYLQMNNLTTEDTAMYYCVRD
RYGGAMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSW
NSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESK
YGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDG
VEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKG
QPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD
GSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG* (SEQ ID NO: 140)
Последовательность нуклеиновой кислоты тяжелой цепи hG4P представляет собой:
atggaatggtcctgggtgttcctgttcttcctgtctgtgaccaccggcgtgcactctgaa
gtg
cagttggttgaatctggcggcggactggtgcagcctaagggatctctgaagctgtct
tgcgccgcctccgacttcaccttcaatacctacgccatgcactgggtccgacaggcccct
ggaaaaggactggaatgggtcgccagaatccggaccaagtccaacaactacgccacctac
tacgccgactccgtgaaggacagattcaccatctctcgggacgactcccagtccatgctg
tacctgcagatgaacaacctgaccaccgaggacaccgccatgtactactgcgtgcgggat
agatatggcggcgctatggattattggggccagggcacatctgtgaccgtgtcctctgct
tccaccaaggggccctccgtgttccctctggccccttgctccagatccacctccgagtct
accgccgctctgggctgcctcgtgaaggactacttccccgagcctgtgaccgtgtcctgg
aactctggcgctctgacctctggcgtgcacaccttccctgctgtgctgcagtcctccggc
ctgtactccctgtcctccgtcgtgaccgtgccttccagctctctgggcaccaagacctac
acctgtaacgtggaccacaagccctccaacaccaaggtggacaagcgggtggaatctaag
tacggccctccctgccctccttgcccagcccctgaatttctgggcggacccagcgtgttc
ctgttccccccaaagcccaaggacaccctgatgatctcccggacccccgaagtgacctgc
gtggtggtggatgtgtcccaggaagatcccgaggtgcagttcaattggtacgtggacggc
gtggaagtgcacaacgccaagaccaagcctagagaggaacagttcaactccacctaccgg
gtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggattggctgaacggcaaagagtacaagtgc
aaggtgtccaacaagggcctgcccagctccatcgaaaagaccatctccaaggccaagggc
cagccccgggaaccccaggtgtacacactgcctccaagccaggaagagatgaccaagaac
caggtgtccctgacctgtctcgtgaaaggcttctacccctccgatatcgccgtggaatgg
gagtccaacggccagcctgagaacaactacaagaccaccccccctgtgctggactccgac
ggctccttcttcctgtactctcgcctgaccgtggacaagtcccggtggcaggaaggcaac
gtgttctcctgctccgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctg
tccctgtctctgggatga
(SEQ ID NO: 141)
Легкая цепь
Аминокислотная последовательность легкой цепи представляет собой:
MSVPTQVLGLLLLWLTDAR
CDIQMAQSSSSFSVSLGDRVTITCKASEDIYIRLAWYQQKP
GNAPRLLISTATSLETGVPSRFSGSGSGKDYTLSITSLQTEDVATYYCQQYWSTPYTFGG
GTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQ
ESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC*
(SEQ ID NO: 142)
Последовательность нуклеиновой кислоты легкой цепи представляет собой:
atgtccgtgcctacacaggttctgggactgctgctgctgtggctgaccgacgctagatgt
gatatccagatggcccagtcctcctccagcttctctgtgtctctgggcgacagagtgacc
atcacatgcaaggcctccgaggacatctacatccggctggcctggtatcagcagaagcct
ggaaacgcccctcggctgctgatctctaccgctacatctctggaaaccggcgtgccctct
agattctctggctctggatctggcaaggactacaccctgtctatcaccagcctgcagacc
gaggatgtggccacctactactgccagcagtactggtctaccccttacacctttggcggc
ggaacccggctggaaatcaaacgtacggtggccgctccctccgtgttcatcttcccacct
tccgacgagcagctgaagtccggcaccgcttctgtcgtgtgcctgctgaacaacttctac
ccccgcgaggccaaggtgcagtggaaggtggacaacgccctgcagtccggcaactcccag
gaatccgtgaccgagcaggactccaaggacagcacctactccctgtcctccaccctgacc
ctgtccaaggccgactacgagaagcacaaggtgtacgcctgcgaagtgacccaccagggc
ctgtctagccccgtgaccaagtctttcaaccggggcgagtgctga
(SEQ ID NO: 143)
Химерные антитела получают посредством комбинирования легкой цепи с одной из представленных тяжелых цепей.
Пример 15: Скрининг супернатантов гибридом LAIR-1 на блокирование или повышение связывания LAIR-1 Fc с коллагеном I и III.
Материалы и способы
1 мкг/мл коллагена I или коллагена III (Millipore) наносили в качестве покрытия (отдельные планшеты для отдельных скринингов) в течение ночи в PBS. Планшеты промывали, блокировали блокирующим буфером для ELISA (5% BSA в PBS). После промывки на планшеты добавляли 50 мкл супернатанта гибридомы LAIR-1, затем добавляли 50 мкл 2 мкг/мл LAIR-1 человека-Fc-биотина. Планшеты промывали и добавляли SA-HRP (eBio) в разведении 1:10000. После инкубации в течение 30 минут добавляли TMB, а затем стоп-раствор. Поглощение определяли с помощью анализатора PerkinElmer.
Результаты
На фигуре 19 показаны результаты скрининга гибридом LAIR-1. Клоны P1-A4, P1-D6 и P6-F4 идентифицировали как усилители связывания LAIR-1 Fc с коллагеном I и III. Обнаруживали, что клоны P1-E11, P2-A10, P4-B3, P5-A6, P5-E1, P6-B2, P6-G6, P7-G3, P9-H6, P10-G7, P11-B3 и P12-E10 являлись блокаторами связывания LAIR-1 Fc с коллагеном I и III.
Пример 16: Скрининг супернатантов гибридом LAIR-1 на блокирование или повышение связывания LAIR-1 Fc с C1q и SP-D.
Материалы и способы
1 мкг/мл C1q (Sigma) или SP-D (R&D Systems) наносили в качестве покрытия (отдельные планшеты для отдельных скринингов) в течение ночи в PBS. Планшеты промывали, блокировали блокирующим буфером для ELISA (5% BSA в PBS). После промывки на планшеты добавляли 50 мкл супернатанта гибридом LAIR-1, затем добавляли 50 мкл 2 мкг/мл LAIR-1 человека-Fc-биотина. Планшеты промывали и добавляли SA-HRP (eBio) в разведении 1:10000. После инкубации в течение 30 минут добавляли TMB, а затем стоп-раствор. Поглощение определяли с помощью анализатора PerkinElmer Envision.
Результаты
На фигуре 20 показаны результаты скрининга. Обнаруживали, что клоны P1-A4, P1-D6 и P6-F4 повышали связывание LAIR-1 Fc с C1q и SP-D. Обнаруживали, что клоны P1-E11, P2-A10, P4-B3, P5-A6, P5-E1, P6-B2, P6-G6, P7-G3, P9-H6, P10-G7, P11-B3 и P12-E10 являлись блокаторами связывания LAIR-1 Fc с C1q и SP-D.
Пример 17: Биннинг химерных mAb против LAIR-1.
Способы и материалы
Для биннинга использовали устройство Octet RED96 (ForteBio). LAIR-1 Fc (hIgG1) связывался с сенсорным антителом против IgG человека. После подтверждения стабильности LAIR-1 Fc на сенсоре, сенсор погружали в лунку с первым mAb, указанным в левой колонке. Связывание первого mAb насыщалось при связывании избытка mAb с LAIR-1 Fc. Затем сенсор помещали в лунку, содержащую 2-е mAb, как показано в верхнем ряду. Связывание mAb, связывающихся с одним и тем же эпитопом, с LAIR-1 Fc будет блокироваться из-за насыщения связывания, что можно наблюдать, когда одно и то же mAb используют в качестве первого и второго mAb (фигура 21, без подчеркивания, заштрихованные ячейки). Отсутствие блокирования свидетельствовало об отдаленности эпитопов, а также отсутствии стерического препятствия. Частичное блокирование, вероятно, является результатом небольшого перекрывания эпитопов или стерического препятствия для связывания из-за близости участков связывания mAb. Учитывая очень слабое связывание (низкую авидность), три клона исключали из дальнейшего исследования, оставляя 12 клонов. В целях сравнения в исследование включали два коммерческих клона антитела против LAIR-1 человека DX26 и NKTA.
Результаты
На фигуре 21 показаны результаты биннинга химерных Ab против LAIR-1. Отсутствие блокирования указано одинарным подчеркиванием. Блокирование указано двойным подчеркиванием. Данные позволяют идентифицировать mAb, связывающиеся со схожими, перекрывающимися или отдаленными участками (эпитопами) на внеклеточном домене (ECD) LAIR-1, и конструировать карту эпитопов mAb, связывающихся с LAIR-1.
Учитывая результаты биннинга, определяли, что в этом наборе из 12 клонов было четыре основных бина mAb (фигура 22). Ими являлись: бин 1: 11B3, 6B2, 6F4; бин 2: 5E1 и 4B3; бин 3: 5A6 и 6G6; бин 4: 1E11, 7G3, 1A4 и 10G7.
Пример 18: Карта биннинга химерных mAb против LAIR-1.
Материалы и способы
Используя данные биннинга, представленные на фигуре 21, конструировали карту участков связывания в 2D-формате для визуализации соответствующих участков связывания.
Результаты
Используя данные биннинга, полученные в примере 17, конструировали карту участков связывания в 2D-формате для визуализации соответствующих участков связывания (фигура 22). Эта карта свидетельствует о том, что существует значительное перекрывание mAb. Одновременно, многие mAb занимают разные участки на молекуле LAIR-1. mAb с наибольшим перекрыванием и блокированием связывания с LAIR-1 рассматривали в качестве бина. В совокупности, эти данные позволяют предполагать, что панель mAb охватывает основную часть белка LAIR-1.
Пример 19: Осуществляли оптимизированную оценку аффинности с использованием устройства Octet RED96 (ForteBio).
Материалы и способы
Сенсоры для захвата с антителом против IgG человека использовали для связывания с химерными mAb против LAIR-1 при плотности, обеспечивающей связывание 1:1 с мономерным LAIR-1-His (R&D Systems) в растворе в различных концентрациях. Аналитический буфер представлял собой PBS с 0,05% Tween-20, и регенерационный буфер представлял собой 10 мМ глицин, pH 1,5. Сначала химерные mAb против LAIR-1 наносили на сенсор. За этим следовала стадия ассоциации с LAIR-1-His и стадия диссоциации в отдельной лунке без LAIR-1-His. Данные обрабатывали с использованием программного обеспечения для анализа данных ForteBio 9.0. Использовали глобальную аппроксимацию после вычитания референсных лунок. Зарегистрированные средние значения KD получали из по меньшей мере трех независимых запусков Octet с высокой достоверностью и точностью с учетом значений X2 и R2. Необходимо отметить, что тестировали две химерные версии 12E10. Обе имели относительно низкую аффинность, при этом mAb 12E10V2 исключали из исследования по причине очень низкой аффинности.
Результаты
На фигуре 23 показаны результаты оценки аффинности. Константа диссоциации (Kd) представлена в виде значений нМ в третьей колонке с учетом скоростей диссоциации (Kdis) и ассоциации (Kon). Большинство mAb имело очень высокие скорости ассоциации, но также и относительно высокие скорости диссоциации. Все из 1E11, 7G3 и 11B3, 5E1 и 6G6 имели значения Kd <5 нМ, что свидетельствует об очень высокой аффинности к LAIR-1.
Пример 20: mAb против LAIR-1 проявляют дифференциальную индукцию репортерной активности интерферона в клетках THP-1.
Материалы и способы
Клетки THP-1-Dual (Invivogen) с репортером интерферон-регуляторным фактором (IRF) высевали в количестве 25000 клеток/лунку 96-луночного планшета в планшеты, предварительно покрытые mAb против LAIR-1 (10 мкг/мл) (фигура 24A) или оставленные непокрытыми (фигура 24B). Как показано на фигуре 24B, mAb против LAIR-1 добавляли в виде растворимых белков в количестве 10 мкг/мл. LAIR-2 Fc или контрольный Fc также наносили в виде покрытия (фигура 24A) или добавляли в качестве растворимых белков (фигура 24B) в качестве положительных и отрицательных контролей.
LPS добавляли в количестве 1 мкг/мл для индукции IRF низкого уровня для тестирования того, усиливают ли или ингибируют mAb против LAIR-1 путь индукции IRF. Через 72 часа 10 мкл супернатанта удаляли из планшетов для анализа и переносили в отдельный планшет для анализа. Quanti-luc (Invivogen) добавляли по инструкциям производителя и измеряли люминесценцию с помощью устройства PerkinElmer Envision.
Результаты
В случае связанных с планшетом mAb против LAIR-1 наблюдали, что три mAb 11B3, 6G6 и 5E1 могут усиливать передачу сигнала IRF, в то время как два mAb 1E11 и 7G3 имели небольшой эффект или могут фактически ингибировать индукцию IRF (фигура 24A). mAb имели схожий эффект в растворимой форме (фигура 24B). Примечательно, что 1E11 и 7G3, попадающие в один бин, по-видимому, имеют схожую функцию. И наоборот, 11B3, 6G6 и 5E1 попадают в разные бины, но, по-видимому, имеют схожую функцию, что контрастирует с клонами 1E11 и 7G3.
Пример 21: Скрининг mAb против LAIR-1 на индукцию репортерной активности T-клеток Jurkat.
Материалы и способы
96-луночные планшеты покрывали антителом против CD3 (OKT3) в количестве 0,5 мкг/мл в течение ночи при 4°C. Несвязавшееся антитело против CD3 удаляли посредством аспирации. После аспирации OKT3 mAb против LAIR-1 или LAIR-2 Fc и контрольный Fc наносили в виде покрытия в течение 24 часов в количестве 10 мкг/мл (фигура 25A). Перед добавлением репортерных для пути NFAT-Lucia T-клеток Jurkat (Invivogen) осуществляли аспирацию несвязавшихся белков. T-клетки Jurkat высевали в количестве 50000 клеток/лунку в общем объеме 200 мкл. Через 48 часов 10 мкл супернатанта удаляли и переносили в отдельный планшет. Quanti-Luc (Inivivogen) добавляли по инструкциям производителя. Люминесценцию анализировали с использованием спектрофотометра для чтения планшетов Perkin Elmer Envision. В случае фигуры 25B эксперимент осуществляли так же, как в случае фигуры 25A, но белки добавляли в растворимой форме, а не покрывали ими планшет.
Результаты
Результаты свидетельствовали о том, что 1E11 имел небольшой эффект или не имел эффекта в отношении индукции репортера NFAT, в то время как 11B3, 6G6 и 5E1 индуцировали NFAT (фигура 25A). В схожем анализе mAb против LAIR-1 или LAIR-2 Fc и контрольный Fc добавляли в виде растворимых белков (фигура 25B). В этом анализе наблюдали небольшой эффект при любой обработке. Необходимо отметить, что 7G3 тестировали только в анализе THP-1, не в анализе Jurkat.
В целом, данные, представленные в Примерах, свидетельствуют о специфической функциональности mAb против LAIR-1 в анализах репортеров путей в линиях клеток.
Если не указано иначе, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют значения, общепринято понятные специалисту в области, к которой принадлежит изобретение. Публикации, процитированные в настоящем описании, и материалы, в отношении которых они процитированы, конкретно включены в настоящее описание в качестве ссылок.
Специалистам в этой области будут понятны многие эквиваленты конкретных вариантов осуществления изобретения, представленных в настоящем описании, или они смогут установить их с использованием не более чем рутинного экспериментирования. Такие эквиваленты предназначены для включения в следующую формулу изобретения.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  NextCure, Inc
FLIES, DALLAS
LIU, LINDA
LANGERMANN, SOLOMON
<120>  КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ДЛЯ МОДУЛЯЦИИ ПЕРЕДАЧИ СИГНАЛА LAIR
<130>  064467.002PCT
<150>  62/370,334
<151>  2016-08-03
<150>  62/450,300
<151>  2017-01-25
<160>  143
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  287
<212>  БЕЛОК
<213>  homo sapiens
<400>  1
Met Ser Pro His Pro Thr Ala Leu Leu Gly Leu Val Leu Cys Leu Ala
1               5                   10                  15
Gln Thr Ile His Thr Gln Glu Glu Asp Leu Pro Arg Pro Ser Ile Ser
20                  25                  30
Ala Glu Pro Gly Thr Val Ile Pro Leu Gly Ser His Val Thr Phe Val
35                  40                  45
Cys Arg Gly Pro Val Gly Val Gln Thr Phe Arg Leu Glu Arg Glu Ser
50                  55                  60
Arg Ser Thr Tyr Asn Asp Thr Glu Asp Val Ser Gln Ala Ser Pro Ser
65                  70                  75                  80
Glu Ser Glu Ala Arg Phe Arg Ile Asp Ser Val Ser Glu Gly Asn Ala
85                  90                  95
Gly Pro Tyr Arg Cys Ile Tyr Tyr Lys Pro Pro Lys Trp Ser Glu Gln
100                 105                 110
Ser Asp Tyr Leu Glu Leu Leu Val Lys Glu Thr Ser Gly Gly Pro Asp
115                 120                 125
Ser Pro Asp Thr Glu Pro Gly Ser Ser Ala Gly Pro Thr Gln Arg Pro
130                 135                 140
Ser Asp Asn Ser His Asn Glu His Ala Pro Ala Ser Gln Gly Leu Lys
145                 150                 155                 160
Ala Glu His Leu Tyr Ile Leu Ile Gly Val Ser Val Val Phe Leu Phe
165                 170                 175
Cys Leu Leu Leu Leu Val Leu Phe Cys Leu His Arg Gln Asn Gln Ile
180                 185                 190
Lys Gln Gly Pro Pro Arg Ser Lys Asp Glu Glu Gln Lys Pro Gln Gln
195                 200                 205
Arg Pro Asp Leu Ala Val Asp Val Leu Glu Arg Thr Ala Asp Lys Ala
210                 215                 220
Thr Val Asn Gly Leu Pro Glu Lys Asp Arg Glu Thr Asp Thr Ser Ala
225                 230                 235                 240
Leu Ala Ala Gly Ser Ser Gln Glu Val Thr Tyr Ala Gln Leu Asp His
245                 250                 255
Trp Ala Leu Thr Gln Arg Thr Ala Arg Ala Val Ser Pro Gln Ser Thr
260                 265                 270
Lys Pro Met Ala Glu Ser Ile Thr Tyr Ala Ala Val Ala Arg His
275                 280                 285
<210>  2
<211>  144
<212>  БЕЛОК
<213>  homo sapiens
<400>  2
Gln Glu Glu Asp Leu Pro Arg Pro Ser Ile Ser Ala Glu Pro Gly Thr
1               5                   10                  15
Val Ile Pro Leu Gly Ser His Val Thr Phe Val Cys Arg Gly Pro Val
20                  25                  30
Gly Val Gln Thr Phe Arg Leu Glu Arg Glu Ser Arg Ser Thr Tyr Asn
35                  40                  45
Asp Thr Glu Asp Val Ser Gln Ala Ser Pro Ser Glu Ser Glu Ala Arg
50                  55                  60
Phe Arg Ile Asp Ser Val Ser Glu Gly Asn Ala Gly Pro Tyr Arg Cys
65                  70                  75                  80
Ile Tyr Tyr Lys Pro Pro Lys Trp Ser Glu Gln Ser Asp Tyr Leu Glu
85                  90                  95
Leu Leu Val Lys Glu Thr Ser Gly Gly Pro Asp Ser Pro Asp Thr Glu
100                 105                 110
Pro Gly Ser Ser Ala Gly Pro Thr Gln Arg Pro Ser Asp Asn Ser His
115                 120                 125
Asn Glu His Ala Pro Ala Ser Gln Gly Leu Lys Ala Glu His Leu Tyr
130                 135                 140
<210>  3
<211>  263
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  3
Met Ser Leu His Pro Val Ile Leu Leu Val Leu Val Leu Cys Leu Gly
1               5                   10                  15
Trp Lys Ile Asn Thr Gln Glu Gly Ser Leu Pro Asp Ile Thr Ile Phe
20                  25                  30
Pro Asn Ser Ser Leu Met Ile Ser Gln Gly Thr Phe Val Thr Val Val
35                  40                  45
Cys Ser Tyr Ser Asp Lys His Asp Leu Tyr Asn Met Val Arg Leu Glu
50                  55                  60
Lys Asp Gly Ser Thr Phe Met Glu Lys Ser Thr Glu Pro Tyr Lys Thr
65                  70                  75                  80
Glu Asp Glu Phe Glu Ile Gly Pro Val Asn Glu Thr Ile Thr Gly His
85                  90                  95
Tyr Ser Cys Ile Tyr Ser Lys Gly Ile Thr Trp Ser Glu Arg Ser Lys
100                 105                 110
Thr Leu Glu Leu Lys Val Ile Lys Glu Asn Val Ile Gln Thr Pro Ala
115                 120                 125
Pro Gly Pro Thr Ser Asp Thr Ser Trp Leu Lys Thr Tyr Ser Ile Tyr
130                 135                 140
Ile Phe Thr Val Val Ser Val Ile Phe Leu Leu Cys Leu Ser Ala Leu
145                 150                 155                 160
Leu Phe Cys Phe Leu Arg His Arg Gln Lys Lys Gln Gly Leu Pro Asn
165                 170                 175
Asn Lys Arg Gln Gln Gln Arg Pro Glu Glu Arg Leu Asn Leu Ala Thr
180                 185                 190
Asn Gly Leu Glu Met Thr Pro Asp Ile Val Ala Asp Asp Arg Leu Pro
195                 200                 205
Glu Asp Arg Trp Thr Glu Thr Trp Thr Pro Val Ala Gly Asp Leu Gln
210                 215                 220
Glu Val Thr Tyr Ile Gln Leu Asp His His Ser Leu Thr Gln Arg Ala
225                 230                 235                 240
Val Gly Ala Val Thr Ser Gln Ser Thr Asp Met Ala Glu Ser Ser Thr
245                 250                 255
Tyr Ala Ala Ile Ile Arg His
260
<210>  4
<211>  123
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  4
Gln Glu Gly Ser Leu Pro Asp Ile Thr Ile Phe Pro Asn Ser Ser Leu
1               5                   10                  15
Met Ile Ser Gln Gly Thr Phe Val Thr Val Val Cys Ser Tyr Ser Asp
20                  25                  30
Lys His Asp Leu Tyr Asn Met Val Arg Leu Glu Lys Asp Gly Ser Thr
35                  40                  45
Phe Met Glu Lys Ser Thr Glu Pro Tyr Lys Thr Glu Asp Glu Phe Glu
50                  55                  60
Ile Gly Pro Val Asn Glu Thr Ile Thr Gly His Tyr Ser Cys Ile Tyr
65                  70                  75                  80
Ser Lys Gly Ile Thr Trp Ser Glu Arg Ser Lys Thr Leu Glu Leu Lys
85                  90                  95
Val Ile Lys Glu Asn Val Ile Gln Thr Pro Ala Pro Gly Pro Thr Ser
100                 105                 110
Asp Thr Ser Trp Leu Lys Thr Tyr Ser Ile Tyr
115                 120
<210>  5
<211>  152
<212>  БЕЛОК
<213>  homo sapiens
<400>  5
Met Ser Pro His Leu Thr Ala Leu Leu Gly Leu Val Leu Cys Leu Ala
1               5                   10                  15
Gln Thr Ile His Thr Gln Glu Gly Ala Leu Pro Arg Pro Ser Ile Ser
20                  25                  30
Ala Glu Pro Gly Thr Val Ile Ser Pro Gly Ser His Val Thr Phe Met
35                  40                  45
Cys Arg Gly Pro Val Gly Val Gln Thr Phe Arg Leu Glu Arg Glu Asp
50                  55                  60
Arg Ala Lys Tyr Lys Asp Ser Tyr Asn Val Phe Arg Leu Gly Pro Ser
65                  70                  75                  80
Glu Ser Glu Ala Arg Phe His Ile Asp Ser Val Ser Glu Gly Asn Ala
85                  90                  95
Gly Leu Tyr Arg Cys Leu Tyr Tyr Lys Pro Pro Gly Trp Ser Glu His
100                 105                 110
Ser Asp Phe Leu Glu Leu Leu Val Lys Glu Ser Ser Gly Gly Pro Asp
115                 120                 125
Ser Pro Asp Thr Glu Pro Gly Ser Ser Ala Gly Thr Val Pro Gly Thr
130                 135                 140
Glu Ala Ser Gly Phe Asp Ala Pro
145                 150
<210>  6
<211>  131
<212>  БЕЛОК
<213>  homo sapiens
<400>  6
Gln Glu Gly Ala Leu Pro Arg Pro Ser Ile Ser Ala Glu Pro Gly Thr
1               5                   10                  15
Val Ile Ser Pro Gly Ser His Val Thr Phe Met Cys Arg Gly Pro Val
20                  25                  30
Gly Val Gln Thr Phe Arg Leu Glu Arg Glu Asp Arg Ala Lys Tyr Lys
35                  40                  45
Asp Ser Tyr Asn Val Phe Arg Leu Gly Pro Ser Glu Ser Glu Ala Arg
50                  55                  60
Phe His Ile Asp Ser Val Ser Glu Gly Asn Ala Gly Leu Tyr Arg Cys
65                  70                  75                  80
Leu Tyr Tyr Lys Pro Pro Gly Trp Ser Glu His Ser Asp Phe Leu Glu
85                  90                  95
Leu Leu Val Lys Glu Ser Ser Gly Gly Pro Asp Ser Pro Asp Thr Glu
100                 105                 110
Pro Gly Ser Ser Ala Gly Thr Val Pro Gly Thr Glu Ala Ser Gly Phe
115                 120                 125
Asp Ala Pro
130
<210>  7
<211>  32
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  7
Ser Leu Pro Asp Ile Thr Ile Phe Pro Asn Ser Ser Leu Met Ile Ser
1               5                   10                  15
Gln Gly Thr Phe Val Thr Val Val Cys Ser Tyr Ser Asp Lys His Asp
20                  25                  30
<210>  8
<211>  32
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  8
Glu Leu Cys Leu Trp Phe Leu Leu Tyr Pro Trp Ala Thr Leu Glu Leu
1               5                   10                  15
Ile Met Cys Thr Trp Asp Ala Trp Lys Glu Thr Leu Glu Tyr Phe Leu
20                  25                  30
<210>  9
<211>  387
<212>  БЕЛОК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  синтетическая конструкция
<400>  9
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1               5                   10                  15
Val His Ser Gln Glu Glu Asp Leu Pro Arg Pro Ser Ile Ser Ala Glu
20                  25                  30
Pro Gly Thr Val Ile Pro Leu Gly Ser His Val Thr Phe Val Cys Arg
35                  40                  45
Gly Pro Val Gly Val Gln Thr Phe Arg Leu Glu Arg Glu Ser Arg Ser
50                  55                  60
Thr Tyr Asn Asp Thr Glu Asp Val Ser Gln Ala Ser Pro Ser Glu Ser
65                  70                  75                  80
Glu Ala Arg Phe Arg Ile Asp Ser Val Ser Glu Gly Asn Ala Gly Pro
85                  90                  95
Tyr Arg Cys Ile Tyr Tyr Lys Pro Pro Lys Trp Ser Glu Gln Ser Asp
100                 105                 110
Tyr Leu Glu Leu Leu Val Lys Glu Thr Ser Gly Gly Pro Asp Ser Pro
115                 120                 125
Asp Thr Glu Pro Gly Ser Ser Ala Gly Pro Thr Gln Arg Pro Ser Asp
130                 135                 140
Asn Ser His Asn Glu His Ala Pro Ala Ser Gln Gly Leu Lys Ala Glu
145                 150                 155                 160
His Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
165                 170                 175
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
180                 185                 190
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
195                 200                 205
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
210                 215                 220
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
225                 230                 235                 240
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
245                 250                 255
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
260                 265                 270
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
275                 280                 285
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
290                 295                 300
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
305                 310                 315                 320
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
325                 330                 335
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
340                 345                 350
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
355                 360                 365
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
370                 375                 380
Ser Pro Gly
385
<210>  10
<211>  368
<212>  БЕЛОК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  синтетическая конструкция
<400>  10
Gln Glu Glu Asp Leu Pro Arg Pro Ser Ile Ser Ala Glu Pro Gly Thr
1               5                   10                  15
Val Ile Pro Leu Gly Ser His Val Thr Phe Val Cys Arg Gly Pro Val
20                  25                  30
Gly Val Gln Thr Phe Arg Leu Glu Arg Glu Ser Arg Ser Thr Tyr Asn
35                  40                  45
Asp Thr Glu Asp Val Ser Gln Ala Ser Pro Ser Glu Ser Glu Ala Arg
50                  55                  60
Phe Arg Ile Asp Ser Val Ser Glu Gly Asn Ala Gly Pro Tyr Arg Cys
65                  70                  75                  80
Ile Tyr Tyr Lys Pro Pro Lys Trp Ser Glu Gln Ser Asp Tyr Leu Glu
85                  90                  95
Leu Leu Val Lys Glu Thr Ser Gly Gly Pro Asp Ser Pro Asp Thr Glu
100                 105                 110
Pro Gly Ser Ser Ala Gly Pro Thr Gln Arg Pro Ser Asp Asn Ser His
115                 120                 125
Asn Glu His Ala Pro Ala Ser Gln Gly Leu Lys Ala Glu His Asp Lys
130                 135                 140
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
145                 150                 155                 160
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
165                 170                 175
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
180                 185                 190
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
195                 200                 205
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
210                 215                 220
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
225                 230                 235                 240
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
245                 250                 255
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
260                 265                 270
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
275                 280                 285
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
290                 295                 300
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
305                 310                 315                 320
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
325                 330                 335
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
340                 345                 350
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
355                 360                 365
<210>  11
<211>  393
<212>  БЕЛОК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  синтетическая конструкция
<400>  11
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1               5                   10                  15
Val His Ser Gln Glu Glu Asp Leu Pro Arg Pro Ser Ile Ser Ala Glu
20                  25                  30
Pro Gly Thr Val Ile Pro Leu Gly Ser His Val Thr Phe Val Cys Arg
35                  40                  45
Gly Pro Val Gly Val Gln Thr Phe Arg Leu Glu Arg Glu Ser Arg Ser
50                  55                  60
Thr Tyr Asn Asp Thr Glu Asp Val Ser Gln Ala Ser Pro Ser Glu Ser
65                  70                  75                  80
Glu Ala Arg Phe Arg Ile Asp Ser Val Ser Glu Gly Asn Ala Gly Pro
85                  90                  95
Tyr Arg Cys Ile Tyr Tyr Lys Pro Pro Lys Trp Ser Glu Gln Ser Asp
100                 105                 110
Tyr Leu Glu Leu Leu Val Lys Glu Thr Ser Gly Gly Pro Asp Ser Pro
115                 120                 125
Asp Thr Glu Pro Gly Ser Ser Ala Gly Pro Thr Gln Arg Pro Ser Asp
130                 135                 140
Asn Ser His Asn Glu His Ala Pro Ala Ser Gln Gly Leu Lys Ala Glu
145                 150                 155                 160
His Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys
165                 170                 175
Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
180                 185                 190
Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys
195                 200                 205
Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp
210                 215                 220
Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg
225                 230                 235                 240
Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln
245                 250                 255
His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn
260                 265                 270
Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly
275                 280                 285
Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu
290                 295                 300
Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met
305                 310                 315                 320
Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu
325                 330                 335
Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe
340                 345                 350
Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn
355                 360                 365
Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr
370                 375                 380
Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly
385                 390
<210>  12
<211>  374
<212>  БЕЛОК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  синтетическая конструкция
<400>  12
Gln Glu Glu Asp Leu Pro Arg Pro Ser Ile Ser Ala Glu Pro Gly Thr
1               5                   10                  15
Val Ile Pro Leu Gly Ser His Val Thr Phe Val Cys Arg Gly Pro Val
20                  25                  30
Gly Val Gln Thr Phe Arg Leu Glu Arg Glu Ser Arg Ser Thr Tyr Asn
35                  40                  45
Asp Thr Glu Asp Val Ser Gln Ala Ser Pro Ser Glu Ser Glu Ala Arg
50                  55                  60
Phe Arg Ile Asp Ser Val Ser Glu Gly Asn Ala Gly Pro Tyr Arg Cys
65                  70                  75                  80
Ile Tyr Tyr Lys Pro Pro Lys Trp Ser Glu Gln Ser Asp Tyr Leu Glu
85                  90                  95
Leu Leu Val Lys Glu Thr Ser Gly Gly Pro Asp Ser Pro Asp Thr Glu
100                 105                 110
Pro Gly Ser Ser Ala Gly Pro Thr Gln Arg Pro Ser Asp Asn Ser His
115                 120                 125
Asn Glu His Ala Pro Ala Ser Gln Gly Leu Lys Ala Glu His Glu Pro
130                 135                 140
Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro
145                 150                 155                 160
Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys
165                 170                 175
Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val
180                 185                 190
Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn
195                 200                 205
Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr
210                 215                 220
Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp
225                 230                 235                 240
Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu
245                 250                 255
Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg
260                 265                 270
Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys
275                 280                 285
Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp
290                 295                 300
Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys
305                 310                 315                 320
Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser
325                 330                 335
Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser
340                 345                 350
Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser
355                 360                 365
Phe Ser Arg Thr Pro Gly
370
<210>  13
<211>  374
<212>  БЕЛОК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  синтетическая конструкция
<400>  13
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1               5                   10                  15
Val His Ser Gln Glu Gly Ser Leu Pro Asp Ile Thr Ile Phe Pro Asn
20                  25                  30
Ser Ser Leu Met Ile Ser Gln Gly Thr Phe Val Thr Val Val Cys Ser
35                  40                  45
Tyr Ser Asp Lys His Asp Leu Tyr Asn Met Val Arg Leu Glu Lys Asp
50                  55                  60
Gly Ser Thr Phe Met Glu Lys Ser Thr Glu Pro Tyr Lys Thr Glu Asp
65                  70                  75                  80
Glu Phe Glu Ile Gly Pro Val Asn Glu Thr Ile Thr Gly His Tyr Ser
85                  90                  95
Cys Ile Tyr Ser Lys Gly Ile Thr Trp Ser Glu Arg Ser Lys Thr Leu
100                 105                 110
Glu Leu Lys Val Ile Lys Glu Asn Val Ile Gln Thr Pro Ala Pro Gly
115                 120                 125
Pro Thr Ser Asp Thr Ser Trp Leu Lys Thr Tyr Ser Ile Tyr Glu Pro
130                 135                 140
Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro
145                 150                 155                 160
Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys
165                 170                 175
Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val
180                 185                 190
Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn
195                 200                 205
Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr
210                 215                 220
Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp
225                 230                 235                 240
Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu
245                 250                 255
Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg
260                 265                 270
Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys
275                 280                 285
Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp
290                 295                 300
Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys
305                 310                 315                 320
Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser
325                 330                 335
Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser
340                 345                 350
Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser
355                 360                 365
Phe Ser Arg Thr Pro Gly
370
<210>  14
<211>  355
<212>  БЕЛОК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  синтетическая конструкция
<400>  14
Gln Glu Gly Ser Leu Pro Asp Ile Thr Ile Phe Pro Asn Ser Ser Leu
1               5                   10                  15
Met Ile Ser Gln Gly Thr Phe Val Thr Val Val Cys Ser Tyr Ser Asp
20                  25                  30
Lys His Asp Leu Tyr Asn Met Val Arg Leu Glu Lys Asp Gly Ser Thr
35                  40                  45
Phe Met Glu Lys Ser Thr Glu Pro Tyr Lys Thr Glu Asp Glu Phe Glu
50                  55                  60
Ile Gly Pro Val Asn Glu Thr Ile Thr Gly His Tyr Ser Cys Ile Tyr
65                  70                  75                  80
Ser Lys Gly Ile Thr Trp Ser Glu Arg Ser Lys Thr Leu Glu Leu Lys
85                  90                  95
Val Ile Lys Glu Asn Val Ile Gln Thr Pro Ala Pro Gly Pro Thr Ser
100                 105                 110
Asp Thr Ser Trp Leu Lys Thr Tyr Ser Ile Tyr Glu Pro Arg Gly Pro
115                 120                 125
Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu
130                 135                 140
Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu
145                 150                 155                 160
Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
165                 170                 175
Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu
180                 185                 190
Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr
195                 200                 205
Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser
210                 215                 220
Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro
225                 230                 235                 240
Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln
245                 250                 255
Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val
260                 265                 270
Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val
275                 280                 285
Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu
290                 295                 300
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg
305                 310                 315                 320
Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val
325                 330                 335
Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg
340                 345                 350
Thr Pro Gly
355
<210>  15
<211>  376
<212>  БЕЛОК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  синтетическая конструкция
<400>  15
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1               5                   10                  15
Val His Ser Gln Glu Gly Ala Leu Pro Arg Pro Ser Ile Ser Ala Glu
20                  25                  30
Pro Gly Thr Val Ile Ser Pro Gly Ser His Val Thr Phe Met Cys Arg
35                  40                  45
Gly Pro Val Gly Val Gln Thr Phe Arg Leu Glu Arg Glu Asp Arg Ala
50                  55                  60
Lys Tyr Lys Asp Ser Tyr Asn Val Phe Arg Leu Gly Pro Ser Glu Ser
65                  70                  75                  80
Glu Ala Arg Phe His Ile Asp Ser Val Ser Glu Gly Asn Ala Gly Leu
85                  90                  95
Tyr Arg Cys Leu Tyr Tyr Lys Pro Pro Gly Trp Ser Glu His Ser Asp
100                 105                 110
Phe Leu Glu Leu Leu Val Lys Glu Ser Ser Gly Gly Pro Asp Ser Pro
115                 120                 125
Asp Thr Glu Pro Gly Ser Ser Ala Gly Thr Val Pro Gly Thr Glu Ala
130                 135                 140
Ser Gly Phe Asp Ala Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
145                 150                 155                 160
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
165                 170                 175
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
180                 185                 190
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
195                 200                 205
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
210                 215                 220
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
225                 230                 235                 240
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
245                 250                 255
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
260                 265                 270
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
275                 280                 285
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
290                 295                 300
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
305                 310                 315                 320
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
325                 330                 335
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
340                 345                 350
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
355                 360                 365
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
370                 375
<210>  16
<211>  357
<212>  БЕЛОК
<213>  artificial seqyuence
<220>
<223>  синтетическая конструкция
<400>  16
Gln Glu Gly Ala Leu Pro Arg Pro Ser Ile Ser Ala Glu Pro Gly Thr
1               5                   10                  15
Val Ile Ser Pro Gly Ser His Val Thr Phe Met Cys Arg Gly Pro Val
20                  25                  30
Gly Val Gln Thr Phe Arg Leu Glu Arg Glu Asp Arg Ala Lys Tyr Lys
35                  40                  45
Asp Ser Tyr Asn Val Phe Arg Leu Gly Pro Ser Glu Ser Glu Ala Arg
50                  55                  60
Phe His Ile Asp Ser Val Ser Glu Gly Asn Ala Gly Leu Tyr Arg Cys
65                  70                  75                  80
Leu Tyr Tyr Lys Pro Pro Gly Trp Ser Glu His Ser Asp Phe Leu Glu
85                  90                  95
Leu Leu Val Lys Glu Ser Ser Gly Gly Pro Asp Ser Pro Asp Thr Glu
100                 105                 110
Pro Gly Ser Ser Ala Gly Thr Val Pro Gly Thr Glu Ala Ser Gly Phe
115                 120                 125
Asp Ala Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
130                 135                 140
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
145                 150                 155                 160
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
165                 170                 175
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
180                 185                 190
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
195                 200                 205
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
210                 215                 220
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
225                 230                 235                 240
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
245                 250                 255
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
260                 265                 270
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
275                 280                 285
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
290                 295                 300
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
305                 310                 315                 320
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
325                 330                 335
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
340                 345                 350
Ser Leu Ser Pro Gly
355
<210>  17
<211>  382
<212>  БЕЛОК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  синтетическая конструкция
<400>  17
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1               5                   10                  15
Val His Ser Gln Glu Gly Ala Leu Pro Arg Pro Ser Ile Ser Ala Glu
20                  25                  30
Pro Gly Thr Val Ile Ser Pro Gly Ser His Val Thr Phe Met Cys Arg
35                  40                  45
Gly Pro Val Gly Val Gln Thr Phe Arg Leu Glu Arg Glu Asp Arg Ala
50                  55                  60
Lys Tyr Lys Asp Ser Tyr Asn Val Phe Arg Leu Gly Pro Ser Glu Ser
65                  70                  75                  80
Glu Ala Arg Phe His Ile Asp Ser Val Ser Glu Gly Asn Ala Gly Leu
85                  90                  95
Tyr Arg Cys Leu Tyr Tyr Lys Pro Pro Gly Trp Ser Glu His Ser Asp
100                 105                 110
Phe Leu Glu Leu Leu Val Lys Glu Ser Ser Gly Gly Pro Asp Ser Pro
115                 120                 125
Asp Thr Glu Pro Gly Ser Ser Ala Gly Thr Val Pro Gly Thr Glu Ala
130                 135                 140
Ser Gly Phe Asp Ala Pro Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys
145                 150                 155                 160
Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
165                 170                 175
Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser
180                 185                 190
Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp
195                 200                 205
Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln
210                 215                 220
Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser
225                 230                 235                 240
Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys
245                 250                 255
Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile
260                 265                 270
Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro
275                 280                 285
Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met
290                 295                 300
Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn
305                 310                 315                 320
Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser
325                 330                 335
Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn
340                 345                 350
Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu
355                 360                 365
His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly
370                 375                 380
<210>  18
<211>  363
<212>  БЕЛОК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  синтетическая конструкция
<400>  18
Gln Glu Gly Ala Leu Pro Arg Pro Ser Ile Ser Ala Glu Pro Gly Thr
1               5                   10                  15
Val Ile Ser Pro Gly Ser His Val Thr Phe Met Cys Arg Gly Pro Val
20                  25                  30
Gly Val Gln Thr Phe Arg Leu Glu Arg Glu Asp Arg Ala Lys Tyr Lys
35                  40                  45
Asp Ser Tyr Asn Val Phe Arg Leu Gly Pro Ser Glu Ser Glu Ala Arg
50                  55                  60
Phe His Ile Asp Ser Val Ser Glu Gly Asn Ala Gly Leu Tyr Arg Cys
65                  70                  75                  80
Leu Tyr Tyr Lys Pro Pro Gly Trp Ser Glu His Ser Asp Phe Leu Glu
85                  90                  95
Leu Leu Val Lys Glu Ser Ser Gly Gly Pro Asp Ser Pro Asp Thr Glu
100                 105                 110
Pro Gly Ser Ser Ala Gly Thr Val Pro Gly Thr Glu Ala Ser Gly Phe
115                 120                 125
Asp Ala Pro Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys
130                 135                 140
Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe
145                 150                 155                 160
Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val
165                 170                 175
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile
180                 185                 190
Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr
195                 200                 205
His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro
210                 215                 220
Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val
225                 230                 235                 240
Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro
245                 250                 255
Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu
260                 265                 270
Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp
275                 280                 285
Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr
290                 295                 300
Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
305                 310                 315                 320
Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu
325                 330                 335
Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His
340                 345                 350
His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly
355                 360
<210>  19
<211>  112
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  19
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Phe Ser Asn Pro Val Thr Leu Gly
1               5                   10                  15
Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20                  25                  30
Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Gln Val Leu Ile Tyr Gln Met Ser Ser Leu Ala Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Arg Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn
85                  90                  95
Leu Glu Leu Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100                 105                 110
<210>  20
<211>  16
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  20
Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr
1               5                   10                  15
<210>  21
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  21
Gln Met Ser Ser Leu Ala Ser
1               5
<210>  22
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  22
Ala Gln Asn Leu Glu Leu Pro Leu Thr
1               5
<210>  23
<211>  118
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  23
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Asp Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Trp Ile Tyr Pro Arg Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Leu
50                  55                  60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Arg Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu His Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Ala Arg Gly Gly Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210>  24
<211>  5
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  24
Ser Tyr Asp Ile Asn
1               5
<210>  25
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  25
Trp Ile Tyr Pro Arg Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Leu Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>  26
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  26
Gly Gly Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Tyr
1               5
<210>  27
<211>  107
<212>  БЕЛОК
<213>  mus msuculus
<400>  27
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Gln Ser Ala Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Glu Ser Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly Thr Trp
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Ala Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Lys Phe Ser Phe Lys Ile Ser Ser Leu Gln Ala
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Val Ser Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Tyr Ser Thr Pro Leu
85                  90                  95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100                 105
<210>  28
<211>  11
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  28
Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly Thr Trp Leu Ala
1               5                   10
<210>  29
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  29
Ala Ala Thr Ser Leu Ala Asp
1               5
<210>  30
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  30
Gln Gln Leu Tyr Ser Thr Pro Leu Thr
1               5
<210>  31
<211>  119
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  31
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Asn
20                  25                  30
Ala Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Ser Ser Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50                  55                  60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Met
65                  70                  75                  80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Arg Tyr
85                  90                  95
Tyr Cys Val Arg Gly Gly Ser Gly Phe Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210>  32
<211>  5
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  32
Thr Asn Ala Met Tyr
1               5
<210>  33
<211>  19
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  33
Arg Ile Arg Ser Lys Ser Ser Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
1               5                   10                  15
Val Lys Asp
<210>  34
<211>  8
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  34
Gly Gly Ser Gly Phe Phe Ala Tyr
1               5
<210>  35
<211>  113
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  35
Asp Ile Val Met Lys Gln Ser Pro Ser Ser Leu Arg Val Ser Ala Gly
1               5                   10                  15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20                  25                  30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35                  40                  45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50                  55                  60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ala Leu Thr
65                  70                  75                  80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85                  90                  95
Asp His Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100                 105                 110
Lys
<210>  36
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  36
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu
1               5                   10                  15
Ala
<210>  37
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  37
Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1               5
<210>  38
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  38
Gln Asn Asp His Ser Tyr Pro Phe Thr
1               5
<210>  39
<211>  123
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  39
Gln Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Leu Pro Cys Lys Ala Ser Asp Tyr Ile Phe Ile Ser Tyr
20                  25                  30
Gly Leu Asn Trp Val Arg Gln Thr Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Glu Ile Tyr Pro Arg Ser Gly His Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe
50                  55                  60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Ala Arg Arg Ser Val Phe Tyr Asp Tyr Asp Lys Asn Gly Phe Asp Tyr
100                 105                 110
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  40
<211>  5
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  40
Ser Tyr Gly Leu Asn
1               5
<210>  41
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  41
Glu Ile Tyr Pro Arg Ser Gly His Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>  42
<211>  14
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  42
Arg Ser Val Phe Tyr Asp Tyr Asp Lys Asn Gly Phe Asp Tyr
1               5                   10
<210>  43
<211>  107
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  43
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Ser Ser
20                  25                  30
Leu Asn Trp Leu Gln Gln Glu Pro Asp Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Asp Ser Gly Val Pro Lys Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Val Glu Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Ser Phe Pro Tyr
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105
<210>  44
<211>  11
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  44
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Ser Ser Leu Asn
1               5                   10
<210>  45
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  mu musculus
<400>  45
Ala Thr Ser Ser Leu Asp Ser
1               5
<210>  46
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  46
Leu Gln Tyr Asp Ser Phe Pro Tyr Thr
1               5
<210>  47
<211>  114
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  47
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Gly Ile Ser Trp Val Lys Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Glu Ile Tyr Pro Arg Arg Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe
50                  55                  60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Ala Arg Gln Leu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
100                 105                 110
Ser Ala
<210>  48
<211>  5
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  48
Ser Tyr Gly Ile Ser
1               5
<210>  49
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  49
Glu Ile Tyr Pro Arg Arg Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>  50
<211>  5
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  50
Gln Leu Phe Ala Tyr
1               5
<210>  51
<211>  107
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  51
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Arg
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105
<210>  52
<211>  11
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  52
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn
1               5                   10
<210>  53
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  53
Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser
1               5
<210>  54
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  54
Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Arg Thr
1               5
<210>  55
<211>  118
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  55
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20                  25                  30
Phe Met Asn Trp Val Lys Gln Ser Pro Glu Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Glu Ile His Pro Ser Thr Gly Ser Ile Ile Tyr Asn Gln Lys Phe
50                  55                  60
Lys Ala Lys Ala Thr Leu Thr Ile Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Gln Leu Lys Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Phe Asp Tyr Ser Asn Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210>  56
<211>  5
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  56
Gly Tyr Phe Met Asn
1               5
<210>  57
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  57
Glu Ile His Pro Ser Thr Gly Ser Ile Ile Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1               5                   10                  15
Ala
<210>  58
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  58
Phe Asp Tyr Ser Asn Ser Phe Ala Tyr
1               5
<210>  59
<211>  107
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  59
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Gln Ser Ala Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Glu Ser Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly Thr Trp
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Ala Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Lys Phe Ser Phe Lys Ile Ser Ser Leu Gln Ala
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Val Ser Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Tyr Ser Thr Pro Leu
85                  90                  95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100                 105
<210>  60
<211>  11
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  60
Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly Thr Trp Leu Ala
1               5                   10
<210>  61
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  61
Ala Ala Thr Ser Leu Ala Asp
1               5
<210>  62
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  62
Gln Gln Leu Tyr Ser Thr Pro Leu Thr
1               5
<210>  63
<211>  117
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  63
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Asn Ile Asn
20                  25                  30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Glu Thr Tyr Tyr Ala Asp
50                  55                  60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Glu Ser Met
65                  70                  75                  80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr
85                  90                  95
Tyr Cys Val Arg Ser Leu Trp Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ala
115
<210>  64
<211>  5
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  64
Ile Asn Ala Met Asn
1               5
<210>  65
<211>  19
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  65
Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Glu Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
1               5                   10                  15
Val Lys Asp
<210>  66
<211>  6
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  66
Ser Leu Trp Phe Val Tyr
1               5
<210>  67
<211>  108
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  67
Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr
20                  25                  30
Leu Ser Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile
35                  40                  45
Asp Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr
65                  70                  75                  80
Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Pro
85                  90                  95
Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105
<210>  68
<211>  11
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  68
Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr Leu Ser
1               5                   10
<210>  69
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  69
Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp
1               5
<210>  70
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  70
Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Pro Tyr Thr
1               5                   10
<210>  71
<211>  113
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  71
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Tyr Ile Asn Pro Phe Ser Gly His Thr Lys Tyr Asn Gln Lys Phe
50                  55                  60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Tyr Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Asn Phe Asp Gln Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser
100                 105                 110
Ser
<210>  72
<211>  5
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  72
Ser Tyr Trp Met His
1               5
<210>  73
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  73
Tyr Ile Asn Pro Phe Ser Gly His Thr Lys Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1               5                   10                  15
Asp
<210>  74
<211>  4
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  74
Asn Phe Asp Gln
1
<210>  75
<211>  107
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  75
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Ala
20                  25                  30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Trp Ala Ser Ile Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65                  70                  75                  80
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser His Pro Tyr
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105
<210>  76
<211>  11
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  76
Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Ala Val Ala
1               5                   10
<210>  77
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  77
Trp Ala Ser Ile Arg His Thr
1               5
<210>  78
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  78
Gln Gln Tyr Ser Ser His Pro Tyr Thr
1               5
<210>  79
<211>  115
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  79
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr
20                  25                  30
Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Asn Ile Asn Pro Asp Asn Gly Ile Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50                  55                  60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Gly Lys Ser Leu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100                 105                 110
Val Ser Ala
115
<210>  80
<211>  5
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  80
Thr Tyr Tyr Met Asn
1               5
<210>  81
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  81
Asn Ile Asn Pro Asp Asn Gly Ile Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>  82
<211>  6
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  82
Gly Lys Ser Leu Ala Tyr
1               5
<210>  83
<211>  112
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  83
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Phe Ser Asn Pro Val Thr Leu Gly
1               5                   10                  15
Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20                  25                  30
Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Gln Val Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Arg Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn
85                  90                  95
Leu Glu Phe Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100                 105                 110
<210>  84
<211>  16
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  84
Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr
1               5                   10                  15
<210>  85
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  85
Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser
1               5
<210>  86
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  86
Ala Gln Asn Leu Glu Phe Pro Leu Thr
1               5
<210>  87
<211>  118
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  87
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr
20                  25                  30
Asp Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Trp Ile Tyr Pro Arg Asp Gly Thr Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50                  55                  60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Thr Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu His Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Ala Arg Gly Gly Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210>  88
<211>  5
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  88
Thr Tyr Asp Ile Asn
1               5
<210>  89
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  89
Trp Ile Tyr Pro Arg Asp Gly Thr Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>  90
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  90
Gly Gly Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Tyr
1               5
<210>  91
<211>  107
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  91
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Gln Ser Ala Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Glu Ser Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly Thr Trp
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Arg Ser Pro Gln Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Ala Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Lys Phe Ser Phe Lys Ile Asn Ser Leu Gln Ala
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Val Ser Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Tyr Ser Thr Pro Phe
85                  90                  95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105
<210>  92
<211>  11
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  92
Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly Thr Trp Leu Ala
1               5                   10
<210>  93
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  93
Ala Ala Thr Ser Leu Ala Asp
1               5
<210>  94
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  94
Gln Gln Leu Tyr Ser Thr Pro Phe Thr
1               5
<210>  95
<211>  119
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  95
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Asn Thr His
20                  25                  30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Arg Ile Arg Thr Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50                  55                  60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asp Ser Glu Asn Met
65                  70                  75                  80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Ile Tyr
85                  90                  95
Tyr Cys Val Arg Leu Arg Gly Gly Phe Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100                 105                 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210>  96
<211>  5
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  96
Thr His Ala Met Asn
1               5
<210>  97
<211>  19
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  97
Arg Ile Arg Thr Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
1               5                   10                  15
Val Lys Asp
<210>  98
<211>  8
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  98
Leu Arg Gly Gly Phe Leu Asp Tyr
1               5
<210>  99
<211>  107
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  99
Asp Ile Gln Met Ala Gln Ser Ser Ser Ser Phe Ser Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ile Arg
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35                  40                  45
Ser Thr Ala Thr Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Lys Asp Tyr Thr Leu Ser Ile Thr Ser Leu Gln Thr
65                  70                  75                  80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Trp Ser Thr Pro Tyr
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100                 105
<210>  100
<211>  11
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  100
Lys Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Ile Arg Leu Ala
1               5                   10
<210>  101
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  101
Thr Ala Thr Ser Leu Glu Thr
1               5
<210>  102
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  102
Gln Gln Tyr Trp Ser Thr Pro Tyr Thr
1               5
<210>  103
<211>  120
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  103
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Asp Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20                  25                  30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Arg Ile Arg Thr Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50                  55                  60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Met
65                  70                  75                  80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr
85                  90                  95
Tyr Cys Val Arg Asp Arg Tyr Gly Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  104
<211>  5
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  104
Thr Tyr Ala Met His
1               5
<210>  105
<211>  19
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  105
Arg Ile Arg Thr Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
1               5                   10                  15
Val Lys Asp
<210>  106
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  106
Asp Arg Tyr Gly Gly Ala Met Asp Tyr
1               5
<210>  107
<211>  107
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  107
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Arg Ser Ala
20                  25                  30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Thr Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Leu Ala Ser Asn Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65                  70                  75                  80
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Leu Gln His Trp Asn Tyr Pro Leu
85                  90                  95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100                 105
<210>  108
<211>  11
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  108
Lys Ala Ser Gln Asn Val Arg Ser Ala Val Ala
1               5                   10
<210>  109
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  109
Leu Ala Ser Asn Arg His Thr
1               5
<210>  110
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  110
Leu Gln His Trp Asn Tyr Pro Leu Thr
1               5
<210>  111
<211>  121
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  111
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Thr
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Cys
20                  25                  30
Gly Leu Ser Trp Val Lys Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Glu Ile Tyr Pro Ser Asn Gly Asn Ser Tyr Tyr Ser Asp Lys Val
50                  55                  60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ala Tyr Tyr Thr Asn Gly Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100                 105                 110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  112
<211>  5
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  112
Ser Cys Gly Leu Ser
1               5
<210>  113
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  113
Glu Ile Tyr Pro Ser Asn Gly Asn Ser Tyr Tyr Ser Asp Lys Val Lys
1               5                   10                  15
Asp
<210>  114
<211>  12
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  114
Ala Tyr Tyr Thr Asn Gly Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr
1               5                   10
<210>  115
<211>  107
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  115
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Asp Ser Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn
20                  25                  30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35                  40                  45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Thr
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Leu
85                  90                  95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100                 105
<210>  116
<211>  11
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  116
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn Leu His
1               5                   10
<210>  117
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  117
Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser
1               5
<210>  118
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  mus musculus
<400>  118
Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Leu Thr
1               5
<210>  119
<211>  8
<212>  БЕЛОК
<213>  gallus gallus
<400>  119
Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu
1               5
<210>  120
<211>  466
<212>  БЕЛОК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  синтетическая конструкция
<400>  120
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1               5                   10                  15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys
20                  25                  30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35                  40                  45
Thr Ser Tyr Asp Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu
50                  55                  60
Glu Trp Ile Gly Trp Ile Tyr Pro Arg Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn
65                  70                  75                  80
Glu Lys Leu Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Arg
85                  90                  95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu His Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
100                 105                 110
Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Tyr Trp Gly
115                 120                 125
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
130                 135                 140
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
145                 150                 155                 160
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
165                 170                 175
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
180                 185                 190
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
195                 200                 205
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
210                 215                 220
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
225                 230                 235                 240
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
245                 250                 255
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
260                 265                 270
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
275                 280                 285
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
290                 295                 300
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
305                 310                 315                 320
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
325                 330                 335
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
340                 345                 350
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
355                 360                 365
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
370                 375                 380
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
385                 390                 395                 400
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
405                 410                 415
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
420                 425                 430
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
435                 440                 445
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
450                 455                 460
Pro Gly
465
<210>  121
<211>  1401
<212>  ДНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  синтетическая конструкция
<400>  121
atggaatggt cctgggtgtt cctgttcttc ctgtctgtga ccaccggcgt gcactctcag       60
gttcagttgc agcagtctgg ccctgagctt gtgaaacctg gcgcctctgt gaagctgtct      120
tgcaaggcct ctggctacac cttcaccagc tacgacatca actgggtcaa gcagaggcct      180
ggacagggac tcgagtggat cggctggatc taccctagag atggctccac caagtacaac      240
gagaagctga agggcaaagc taccctgacc gtggacacct cctctcggac cgcttacatg      300
gaactgcact ccctgacctc tgaggactcc gccgtgtact tttgtgccag aggcggctac      360
tacgactacg atggctattg gggacagggc accctggtca cagtgtctgc tgcttctacc      420
aaggggccct ccgtgttccc tctggcccct tccagcaagt ctacctctgg cggcacagcc      480
gctctgggct gcctcgtgaa ggactacttc cccgagcctg tgaccgtgtc ctggaactct      540
ggcgctctga catccggcgt gcacaccttc cctgctgtgc tgcagtcctc cggcctgtac      600
tccctgtcct ccgtcgtgac cgtgccttcc agctctctgg gcacccagac ctacatctgc      660
aacgtgaacc acaagccctc caacaccaag gtggacaaga aggtggaacc caagtcctgc      720
gacaagaccc acacctgtcc cccttgtcct gcccctgaac tgctgggcgg acccagcgtg      780
ttcctgttcc ccccaaagcc caaggacacc ctgatgatct cccggacccc cgaagtgacc      840
tgcgtggtgg tggatgtgtc ccacgaggac cctgaagtga agttcaattg gtacgtggac      900
ggcgtggaag tgcacaacgc caagaccaag cctagagagg aacagtacaa ctccacctac      960
cgggtggtgt ccgtgctgac cgtgctgcac caggattggc tgaacggcaa agagtacaag     1020
tgcaaggtgt ccaacaaggc cctgcctgcc cccatcgaaa agaccatctc caaggccaag     1080
ggccagcccc gggaacccca ggtgtacaca ctgcccccta gcagggacga gctgaccaag     1140
aaccaggtgt ccctgacctg tctcgtgaaa ggcttctacc cctccgatat cgccgtggaa     1200
tgggagtcca acggccagcc tgagaacaac tacaagacca ccccccctgt gctggactcc     1260
gacggctcat tcttcctgta cagcaagctg acagtggaca agtcccggtg gcagcagggc     1320
aacgtgttct cctgctccgt gatgcacgag gccctgcaca accactacac ccagaagtcc     1380
ctgtccctga gccccggctg a                                               1401
<210>  122
<211>  463
<212>  БЕЛОК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  синтетическая конструкция
<400>  122
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1               5                   10                  15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys
20                  25                  30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35                  40                  45
Thr Ser Tyr Asp Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu
50                  55                  60
Glu Trp Ile Gly Trp Ile Tyr Pro Arg Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn
65                  70                  75                  80
Glu Lys Leu Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Arg
85                  90                  95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu His Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
100                 105                 110
Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Tyr Trp Gly
115                 120                 125
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
130                 135                 140
Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala
145                 150                 155                 160
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
165                 170                 175
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
180                 185                 190
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
195                 200                 205
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His
210                 215                 220
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly
225                 230                 235                 240
Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser
245                 250                 255
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
260                 265                 270
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro
275                 280                 285
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
290                 295                 300
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
305                 310                 315                 320
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
325                 330                 335
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr
340                 345                 350
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
355                 360                 365
Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
370                 375                 380
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
385                 390                 395                 400
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
405                 410                 415
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser
420                 425                 430
Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
435                 440                 445
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
450                 455                 460
<210>  123
<211>  1392
<212>  ДНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  синтетическая конструкция
<400>  123
atggaatggt cctgggtgtt cctgttcttc ctgtctgtga ccaccggcgt gcactctcag       60
gttcagttgc agcagtctgg ccctgagctt gtgaaacctg gcgcctctgt gaagctgtct      120
tgcaaggcct ctggctacac cttcaccagc tacgacatca actgggtcaa gcagaggcct      180
ggacagggac tcgagtggat cggctggatc taccctagag atggctccac caagtacaac      240
gagaagctga agggcaaagc taccctgacc gtggacacct cctctcggac cgcttacatg      300
gaactgcact ccctgacctc tgaggactcc gccgtgtact tttgtgccag aggcggctac      360
tacgactacg atggctattg gggacagggc accctggtca cagtgtctgc tgcttctacc      420
aaggggccct ccgtgttccc tctggcccct tgctccagat ccacctccga gtctaccgcc      480
gctctgggct gcctcgtgaa ggactacttc cccgagcctg tgaccgtgtc ctggaactct      540
ggcgctctga cctctggcgt gcacaccttc cctgctgtgc tgcagtcctc cggcctgtac      600
tccctgtcct ccgtcgtgac cgtgccttcc agctctctgg gcaccaagac ctacacctgt      660
aacgtggacc acaagccctc caacaccaag gtggacaagc gggtggaatc taagtacggc      720
cctccctgcc ctccttgccc agcccctgaa tttctgggcg gacccagcgt gttcctgttc      780
cccccaaagc ccaaggacac cctgatgatc tcccggaccc ccgaagtgac ctgcgtggtg      840
gtggatgtgt cccaggaaga tcccgaggtg cagttcaatt ggtacgtgga cggcgtggaa      900
gtgcacaacg ccaagaccaa gcctagagag gaacagttca actccaccta ccgggtggtg      960
tccgtgctga ccgtgctgca ccaggattgg ctgaacggca aagagtacaa gtgcaaggtg     1020
tccaacaagg gcctgcccag ctccatcgaa aagaccatct ccaaggccaa gggccagccc     1080
cgggaacccc aggtgtacac actgcctcca agccaggaag agatgaccaa gaaccaggtg     1140
tccctgacct gtctcgtgaa aggcttctac ccctccgata tcgccgtgga atgggagtcc     1200
aacggccagc ctgagaacaa ctacaagacc accccccctg tgctggactc cgacggctcc     1260
ttcttcctgt actctcgcct gaccgtggac aagtcccggt ggcaggaagg caacgtgttc     1320
tcctgctccg tgatgcacga ggccctgcac aaccactaca cccagaagtc cctgtccctg     1380
tctctgggat ga                                                         1392
<210>  124
<211>  239
<212>  БЕЛОК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  синтетическая конструкция
<400>  124
Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr
1               5                   10                  15
Asp Ala Arg Cys Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Phe Ser Asn Pro
20                  25                  30
Val Thr Leu Gly Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser
35                  40                  45
Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys
50                  55                  60
Pro Gly Gln Ser Pro Gln Val Leu Ile Tyr Gln Met Ser Ser Leu Ala
65                  70                  75                  80
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe
85                  90                  95
Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr
100                 105                 110
Cys Ala Gln Asn Leu Glu Leu Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys
115                 120                 125
Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro
130                 135                 140
Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu
145                 150                 155                 160
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp
165                 170                 175
Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp
180                 185                 190
Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys
195                 200                 205
Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln
210                 215                 220
Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225                 230                 235
<210>  125
<211>  720
<212>  ДНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  синтетическая конструкция
<400>  125
atgtccgtgc ctacacaggt tctgggactg ctgctgctgt ggctgaccga cgctagatgc       60
gatatcgtga tgacccaggc cgccttcagc aatcctgtga cactgggaac ctccgcctcc      120
atctcctgca gatcctctaa gtccctgctg cactccaacg gcatcaccta cctgtactgg      180
tatctgcaga agcccggcca gtctcctcag gtgctgatct accagatgtc ctctctggcc      240
tctggcgtgc ccgacagatt ctcttcttct ggctctggca ccgagttcac cctgcggatc      300
tctagagtgg aagctgagga cgtgggcgtg tactactgcg cccagaatct ggaactgcct      360
ctgacctttg gcgctggcac caagctggaa ctgaagcgta cggtggccgc tccctccgtg      420
ttcatcttcc caccttccga cgagcagctg aagtccggca ccgcttctgt cgtgtgcctg      480
ctgaacaact tctacccccg cgaggccaag gtgcagtgga aggtggacaa cgccctgcag      540
tccggcaact cccaggaatc cgtgaccgag caggactcca aggacagcac ctactccctg      600
tcctccaccc tgaccctgtc caaggccgac tacgagaagc acaaggtgta cgcctgcgaa      660
gtgacccacc agggcctgtc tagccccgtg accaagtctt tcaaccgggg cgagtgctga      720
<210>  126
<211>  0
<212>  БЕЛОК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  синтетическая конструкция
<400>  126
000
<210>  127
<211>  1401
<212>  ДНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  синтетическая конструкция
<400>  127
atggaatggt cctgggtgtt cctgttcttc ctgtctgtga ccaccggcgt gcactctgaa       60
gttcagttgc agcagtctgg ccccgagctt gtgaaacctg gcgcctctgt gaagatctcc      120
tgcaaggcct ctggctactc cttcaccggc tacttcatga actgggtcaa gcagtcccct      180
gagaagtccc tggaatggat cggcgagatc catccttcca ccggcagcat catctacaac      240
cagaagttca aggccaaggc taccctgacc atcgacaagt cctcttccac cgcctacatg      300
cagctgaagt ctctgacctc tgaggactcc gccgtgtact actgcgccag attcgactac      360
tccaactcct tcgcttattg gggccagggc accctggtta ccgtgtctgc tgcttctacc      420
aaggggccct ccgtgttccc tctggcccct tccagcaagt ctacctctgg cggcacagcc      480
gctctgggct gcctcgtgaa ggactacttc cccgagcctg tgaccgtgtc ctggaactct      540
ggcgctctga catccggcgt gcacaccttc cctgctgtgc tgcagtcctc cggcctgtac      600
tccctgtcct ccgtcgtgac cgtgccttcc agctctctgg gcacccagac ctacatctgc      660
aacgtgaacc acaagccctc caacaccaag gtggacaaga aggtggaacc caagtcctgc      720
gacaagaccc acacctgtcc cccttgtcct gcccctgaac tgctgggcgg acccagcgtg      780
ttcctgttcc ccccaaagcc caaggacacc ctgatgatct cccggacccc cgaagtgacc      840
tgcgtggtgg tggatgtgtc ccacgaggac cctgaagtga agttcaattg gtacgtggac      900
ggcgtggaag tgcacaacgc caagaccaag cctagagagg aacagtacaa ctccacctac      960
cgggtggtgt ccgtgctgac cgtgctgcac caggattggc tgaacggcaa agagtacaag     1020
tgcaaggtgt ccaacaaggc cctgcctgcc cccatcgaaa agaccatctc caaggccaag     1080
ggccagcccc gggaacccca ggtgtacaca ctgcccccta gcagggacga gctgaccaag     1140
aaccaggtgt ccctgacctg tctcgtgaaa ggcttctacc cctccgatat cgccgtggaa     1200
tgggagtcca acggccagcc tgagaacaac tacaagacca ccccccctgt gctggactcc     1260
gacggctcat tcttcctgta cagcaagctg acagtggaca agtcccggtg gcagcagggc     1320
aacgtgttct cctgctccgt gatgcacgag gccctgcaca accactacac ccagaagtcc     1380
ctgtccctga gccccggctg a                                               1401
<210>  128
<211>  463
<212>  БЕЛОК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  синтетическая конструкция
<400>  128
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1               5                   10                  15
Val His Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys
20                  25                  30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe
35                  40                  45
Thr Gly Tyr Phe Met Asn Trp Val Lys Gln Ser Pro Glu Lys Ser Leu
50                  55                  60
Glu Trp Ile Gly Glu Ile His Pro Ser Thr Gly Ser Ile Ile Tyr Asn
65                  70                  75                  80
Gln Lys Phe Lys Ala Lys Ala Thr Leu Thr Ile Asp Lys Ser Ser Ser
85                  90                  95
Thr Ala Tyr Met Gln Leu Lys Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
100                 105                 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Phe Asp Tyr Ser Asn Ser Phe Ala Tyr Trp Gly
115                 120                 125
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
130                 135                 140
Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala
145                 150                 155                 160
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
165                 170                 175
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
180                 185                 190
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
195                 200                 205
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His
210                 215                 220
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly
225                 230                 235                 240
Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser
245                 250                 255
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
260                 265                 270
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro
275                 280                 285
Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
290                 295                 300
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
305                 310                 315                 320
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
325                 330                 335
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr
340                 345                 350
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
355                 360                 365
Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
370                 375                 380
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
385                 390                 395                 400
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
405                 410                 415
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser
420                 425                 430
Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
435                 440                 445
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
450                 455                 460
<210>  129
<211>  1392
<212>  ДНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  синтетическая конструкция
<400>  129
atggaatggt cctgggtgtt cctgttcttc ctgtctgtga ccaccggcgt gcactctgaa       60
gttcagttgc agcagtctgg ccccgagctt gtgaaacctg gcgcctctgt gaagatctcc      120
tgcaaggcct ctggctactc cttcaccggc tacttcatga actgggtcaa gcagtcccct      180
gagaagtccc tggaatggat cggcgagatc catccttcca ccggcagcat catctacaac      240
cagaagttca aggccaaggc taccctgacc atcgacaagt cctcttccac cgcctacatg      300
cagctgaagt ctctgacctc tgaggactcc gccgtgtact actgcgccag attcgactac      360
tccaactcct tcgcttattg gggccagggc accctggtta ccgtgtctgc tgcttctacc      420
aaggggccct ccgtgttccc tctggcccct tgctccagat ccacctccga gtctaccgcc      480
gctctgggct gcctcgtgaa ggactacttc cccgagcctg tgaccgtgtc ctggaactct      540
ggcgctctga cctctggcgt gcacaccttc cctgctgtgc tgcagtcctc cggcctgtac      600
tccctgtcct ccgtcgtgac cgtgccttcc agctctctgg gcaccaagac ctacacctgt      660
aacgtggacc acaagccctc caacaccaag gtggacaagc gggtggaatc taagtacggc      720
cctccctgcc ctccttgccc agcccctgaa tttctgggcg gacccagcgt gttcctgttc      780
cccccaaagc ccaaggacac cctgatgatc tcccggaccc ccgaagtgac ctgcgtggtg      840
gtggatgtgt cccaggaaga tcccgaggtg cagttcaatt ggtacgtgga cggcgtggaa      900
gtgcacaacg ccaagaccaa gcctagagag gaacagttca actccaccta ccgggtggtg      960
tccgtgctga ccgtgctgca ccaggattgg ctgaacggca aagagtacaa gtgcaaggtg     1020
tccaacaagg gcctgcccag ctccatcgaa aagaccatct ccaaggccaa gggccagccc     1080
cgggaacccc aggtgtacac actgcctcca agccaggaag agatgaccaa gaaccaggtg     1140
tccctgacct gtctcgtgaa aggcttctac ccctccgata tcgccgtgga atgggagtcc     1200
aacggccagc ctgagaacaa ctacaagacc accccccctg tgctggactc cgacggctcc     1260
ttcttcctgt actctcgcct gaccgtggac aagtcccggt ggcaggaagg caacgtgttc     1320
tcctgctccg tgatgcacga ggccctgcac aaccactaca cccagaagtc cctgtccctg     1380
tctctgggat ga                                                         1392
<210>  130
<211>  234
<212>  БЕЛОК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  синтетическая конструкция
<400>  130
Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr
1               5                   10                  15
Asp Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser
20                  25                  30
Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp
35                  40                  45
Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val
50                  55                  60
Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser
65                  70                  75                  80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser
85                  90                  95
Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn
100                 105                 110
Thr Leu Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
115                 120                 125
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
130                 135                 140
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
145                 150                 155                 160
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
165                 170                 175
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
180                 185                 190
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
195                 200                 205
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
210                 215                 220
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225                 230
<210>  131
<211>  705
<212>  ДНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  синтетическая конструкция
<400>  131
atgtccgtgc ctacacaggt tctgggactg ctgctgctgt ggctgaccga cgctagatgc       60
gatatccaga tgacccagac cacctccagc ctgtctgctt ctctgggcga cagagtgacc      120
atctcctgca gagcctctca ggacatctcc aactacctga actggtatca gcagaaaccc      180
gacggcaccg tgaagctgct gatctactac acctccagac tgcactccgg cgtgccctct      240
agattttctg gctctggatc tggcaccgac tactccctga ccatcagcaa cctggaacaa      300
gaggatatcg ctacctactt ctgccagcaa ggcaacaccc tgcctagaac ctttggcgga      360
ggcaccaagc tggaaatcaa gcgtacggtg gccgctccct ccgtgttcat cttcccacct      420
tccgacgagc agctgaagtc cggcaccgct tctgtcgtgt gcctgctgaa caacttctac      480
ccccgcgagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtccgg caactcccag      540
gaatccgtga ccgagcagga ctccaaggac agcacctact ccctgtcctc caccctgacc      600
ctgtccaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaagtgac ccaccagggc      660
ctgtctagcc ccgtgaccaa gtctttcaac cggggcgagt gctga                      705
<210>  132
<211>  463
<212>  БЕЛОК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  синтетическая конструкция
<400>  132
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1               5                   10                  15
Val His Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys
20                  25                  30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35                  40                  45
Thr Thr Tyr Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu
50                  55                  60
Glu Trp Ile Gly Asn Ile Asn Pro Asp Asn Gly Ile Thr Ser Tyr Asn
65                  70                  75                  80
Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser
85                  90                  95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
100                 105                 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Lys Ser Leu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
115                 120                 125
Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
130                 135                 140
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
145                 150                 155                 160
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
165                 170                 175
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
180                 185                 190
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
195                 200                 205
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
210                 215                 220
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
225                 230                 235                 240
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
245                 250                 255
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
260                 265                 270
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
275                 280                 285
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
290                 295                 300
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
305                 310                 315                 320
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
325                 330                 335
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
340                 345                 350
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
355                 360                 365
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
370                 375                 380
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
385                 390                 395                 400
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
405                 410                 415
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
420                 425                 430
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
435                 440                 445
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
450                 455                 460
<210>  133
<211>  1392
<212>  ДНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  синтетическая конструкция
<400>  133
atggaatggt cctgggtgtt cctgttcttc ctgtctgtga ccaccggcgt gcactctgaa       60
gttcagttgc agcagtctgg ccccgagctt gtgaaacctg gcgcctctgt gaagatctcc      120
tgcaaggcct ctggctacac cttcaccacc tactacatga actgggtcaa gcagtcccac      180
ggcaagtccc tggaatggat cggcaacatc aaccccgaca acggcatcac ctcctacaac      240
cagaagttca agggcaaagc taccctgacc gtggacaagt cctcctccac cgcctacatg      300
gaactgagat ccctgacctc tgaggactcc gccgtgtact actgtgccag aggcaagtct      360
ctggcttatt ggggccaggg cacactggtc acagtgtctg ctgcttccac caaggggccc      420
tccgtgttcc ctctggcccc ttccagcaag tctacctctg gcggcacagc cgctctgggc      480
tgcctcgtga aggactactt ccccgagcct gtgaccgtgt cctggaactc tggcgctctg      540
acatccggcg tgcacacctt ccctgctgtg ctgcagtcct ccggcctgta ctccctgtcc      600
tccgtcgtga ccgtgccttc cagctctctg ggcacccaga cctacatctg caacgtgaac      660
cacaagccct ccaacaccaa ggtggacaag aaggtggaac ccaagtcctg cgacaagacc      720
cacacctgtc ccccttgtcc tgcccctgaa ctgctgggcg gacccagcgt gttcctgttc      780
cccccaaagc ccaaggacac cctgatgatc tcccggaccc ccgaagtgac ctgcgtggtg      840
gtggatgtgt cccacgagga ccctgaagtg aagttcaatt ggtacgtgga cggcgtggaa      900
gtgcacaacg ccaagaccaa gcctagagag gaacagtaca actccaccta ccgggtggtg      960
tccgtgctga ccgtgctgca ccaggattgg ctgaacggca aagagtacaa gtgcaaggtg     1020
tccaacaagg ccctgcctgc ccccatcgaa aagaccatct ccaaggccaa gggccagccc     1080
cgggaacccc aggtgtacac actgccccct agcagggacg agctgaccaa gaaccaggtg     1140
tccctgacct gtctcgtgaa aggcttctac ccctccgata tcgccgtgga atgggagtcc     1200
aacggccagc ctgagaacaa ctacaagacc accccccctg tgctggactc cgacggctca     1260
ttcttcctgt acagcaagct gacagtggac aagtcccggt ggcagcaggg caacgtgttc     1320
tcctgctccg tgatgcacga ggccctgcac aaccactaca cccagaagtc cctgtccctg     1380
agccccggct ga                                                         1392
<210>  134
<211>  460
<212>  БЕЛОК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  синтетическая конструкция
<400>  134
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1               5                   10                  15
Val His Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys
20                  25                  30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35                  40                  45
Thr Thr Tyr Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu
50                  55                  60
Glu Trp Ile Gly Asn Ile Asn Pro Asp Asn Gly Ile Thr Ser Tyr Asn
65                  70                  75                  80
Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser
85                  90                  95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
100                 105                 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Lys Ser Leu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
115                 120                 125
Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
130                 135                 140
Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly
145                 150                 155                 160
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
165                 170                 175
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
180                 185                 190
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
195                 200                 205
Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser
210                 215                 220
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys
225                 230                 235                 240
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
245                 250                 255
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
260                 265                 270
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
275                 280                 285
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
290                 295                 300
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
305                 310                 315                 320
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
325                 330                 335
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
340                 345                 350
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
355                 360                 365
Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
370                 375                 380
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
385                 390                 395                 400
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
405                 410                 415
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
420                 425                 430
Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
435                 440                 445
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
450                 455                 460
<210>  135
<211>  1383
<212>  ДНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  синтетическая конструкция
<400>  135
atggaatggt cctgggtgtt cctgttcttc ctgtctgtga ccaccggcgt gcactctgaa       60
gttcagttgc agcagtctgg ccccgagctt gtgaaacctg gcgcctctgt gaagatctcc      120
tgcaaggcct ctggctacac cttcaccacc tactacatga actgggtcaa gcagtcccac      180
ggcaagtccc tggaatggat cggcaacatc aaccccgaca acggcatcac ctcctacaac      240
cagaagttca agggcaaagc taccctgacc gtggacaagt cctcctccac cgcctacatg      300
gaactgagat ccctgacctc tgaggactcc gccgtgtact actgtgccag aggcaagtct      360
ctggcttatt ggggccaggg cacactggtc acagtgtctg ctgcttccac caaggggccc      420
tccgtgttcc ctctggcccc ttgctccaga tccacctccg agtctaccgc cgctctgggc      480
tgcctcgtga aggactactt ccccgagcct gtgaccgtgt cctggaactc tggcgctctg      540
acctctggcg tgcacacctt ccctgctgtg ctgcagtcct ccggcctgta ctccctgtcc      600
tccgtcgtga ccgtgccttc cagctctctg ggcaccaaga cctacacctg taacgtggac      660
cacaagccct ccaacaccaa ggtggacaag cgggtggaat ctaagtacgg ccctccctgc      720
cctccttgcc cagcccctga atttctgggc ggacccagcg tgttcctgtt ccccccaaag      780
cccaaggaca ccctgatgat ctcccggacc cccgaagtga cctgcgtggt ggtggatgtg      840
tcccaggaag atcccgaggt gcagttcaat tggtacgtgg acggcgtgga agtgcacaac      900
gccaagacca agcctagaga ggaacagttc aactccacct accgggtggt gtccgtgctg      960
accgtgctgc accaggattg gctgaacggc aaagagtaca agtgcaaggt gtccaacaag     1020
ggcctgccca gctccatcga aaagaccatc tccaaggcca agggccagcc ccgggaaccc     1080
caggtgtaca cactgcctcc aagccaggaa gagatgacca agaaccaggt gtccctgacc     1140
tgtctcgtga aaggcttcta cccctccgat atcgccgtgg aatgggagtc caacggccag     1200
cctgagaaca actacaagac caccccccct gtgctggact ccgacggctc cttcttcctg     1260
tactctcgcc tgaccgtgga caagtcccgg tggcaggaag gcaacgtgtt ctcctgctcc     1320
gtgatgcacg aggccctgca caaccactac acccagaagt ccctgtccct gtctctggga     1380
tga                                                                   1383
<210>  136
<211>  234
<212>  БЕЛОК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  синтетическая конструкция
<400>  136
Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr
1               5                   10                  15
Asp Ala Arg Cys Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser
20                  25                  30
Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn
35                  40                  45
Val Gly Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro
50                  55                  60
Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Ile Arg His Thr Gly Val Pro Asp
65                  70                  75                  80
Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
85                  90                  95
Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser
100                 105                 110
Ser His Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
115                 120                 125
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
130                 135                 140
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
145                 150                 155                 160
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
165                 170                 175
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
180                 185                 190
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
195                 200                 205
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
210                 215                 220
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225                 230
<210>  137
<211>  705
<212>  ДНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  синтетическая конструкция
<400>  137
atgtccgtgc ctacacaggt tctgggactg ctgctgctgt ggctgaccga cgctagatgc       60
gacatcgtga tgacccagag ccacaagttc atgtccacct ccgtgggcga cagagtgtcc      120
atcacatgca aggcctctca gaatgtgggc accgccgttg cctggtatca gcagaaacct      180
ggccagtctc ctaagctgct gatctactgg gcctccatca gacacaccgg cgtgccagat      240
agattcaccg gctctggctc tggcaccgac ttcaccctga ccatctctaa cgtgcagtct      300
gaggacctgg ccgactactt ctgccagcag tacagctctc acccctacac ctttggcgga      360
ggcaccaagc tggaaatcaa gcgtacggtg gccgctccct ccgtgttcat cttcccacct      420
tccgacgagc agctgaagtc cggcaccgct tctgtcgtgt gcctgctgaa caacttctac      480
ccccgcgagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtccgg caactcccag      540
gaatccgtga ccgagcagga ctccaaggac agcacctact ccctgtcctc caccctgacc      600
ctgtccaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaagtgac ccaccagggc      660
ctgtctagcc ccgtgaccaa gtctttcaac cggggcgagt gctga                      705
<210>  138
<211>  468
<212>  БЕЛОК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  синтетическая конструкция
<400>  138
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1               5                   10                  15
Val His Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20                  25                  30
Pro Lys Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Asp Phe Thr Phe
35                  40                  45
Asn Thr Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50                  55                  60
Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Thr Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr
65                  70                  75                  80
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser
85                  90                  95
Gln Ser Met Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Thr Thr Glu Asp Thr
100                 105                 110
Ala Met Tyr Tyr Cys Val Arg Asp Arg Tyr Gly Gly Ala Met Asp Tyr
115                 120                 125
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
130                 135                 140
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
145                 150                 155                 160
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
165                 170                 175
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
180                 185                 190
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
195                 200                 205
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
210                 215                 220
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
225                 230                 235                 240
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
245                 250                 255
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
260                 265                 270
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
275                 280                 285
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
290                 295                 300
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
305                 310                 315                 320
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
325                 330                 335
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
340                 345                 350
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
355                 360                 365
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
370                 375                 380
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
385                 390                 395                 400
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
405                 410                 415
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
420                 425                 430
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
435                 440                 445
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
450                 455                 460
Leu Ser Pro Gly
465
<210>  139
<211>  1407
<212>  ДНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  синтетическая конструкция
<400>  139
atggaatggt cctgggtgtt cctgttcttc ctgtctgtga ccaccggcgt gcactctgaa       60
gtgcagttgg ttgaatctgg cggcggactg gtgcagccta agggatctct gaagctgtct      120
tgcgccgcct ccgacttcac cttcaatacc tacgccatgc actgggtccg acaggcccct      180
ggaaaaggac tggaatgggt cgccagaatc cggaccaagt ccaacaacta cgccacctac      240
tacgccgact ccgtgaagga cagattcacc atctctcggg acgactccca gtccatgctg      300
tacctgcaga tgaacaacct gaccaccgag gacaccgcca tgtactactg cgtgcgggat      360
agatatggcg gcgctatgga ttattggggc cagggcacat ctgtgaccgt gtcctctgct      420
tccaccaagg ggccctccgt gttccctctg gccccttcca gcaagtctac ctctggcggc      480
acagccgctc tgggctgcct cgtgaaggac tacttccccg agcctgtgac cgtgtcctgg      540
aactctggcg ctctgacatc cggcgtgcac accttccctg ctgtgctgca gtcctccggc      600
ctgtactccc tgtcctccgt cgtgaccgtg ccttccagct ctctgggcac ccagacctac      660
atctgcaacg tgaaccacaa gccctccaac accaaggtgg acaagaaggt ggaacccaag      720
tcctgcgaca agacccacac ctgtccccct tgtcctgccc ctgaactgct gggcggaccc      780
agcgtgttcc tgttcccccc aaagcccaag gacaccctga tgatctcccg gacccccgaa      840
gtgacctgcg tggtggtgga tgtgtcccac gaggaccctg aagtgaagtt caattggtac      900
gtggacggcg tggaagtgca caacgccaag accaagccta gagaggaaca gtacaactcc      960
acctaccggg tggtgtccgt gctgaccgtg ctgcaccagg attggctgaa cggcaaagag     1020
tacaagtgca aggtgtccaa caaggccctg cctgccccca tcgaaaagac catctccaag     1080
gccaagggcc agccccggga accccaggtg tacacactgc cccctagcag ggacgagctg     1140
accaagaacc aggtgtccct gacctgtctc gtgaaaggct tctacccctc cgatatcgcc     1200
gtggaatggg agtccaacgg ccagcctgag aacaactaca agaccacccc ccctgtgctg     1260
gactccgacg gctcattctt cctgtacagc aagctgacag tggacaagtc ccggtggcag     1320
cagggcaacg tgttctcctg ctccgtgatg cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag     1380
aagtccctgt ccctgagccc cggctga                                         1407
<210>  140
<211>  465
<212>  БЕЛОК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  синтетическая конструкция
<400>  140
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1               5                   10                  15
Val His Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20                  25                  30
Pro Lys Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Asp Phe Thr Phe
35                  40                  45
Asn Thr Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50                  55                  60
Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Thr Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr
65                  70                  75                  80
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser
85                  90                  95
Gln Ser Met Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Thr Thr Glu Asp Thr
100                 105                 110
Ala Met Tyr Tyr Cys Val Arg Asp Arg Tyr Gly Gly Ala Met Asp Tyr
115                 120                 125
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
130                 135                 140
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser
145                 150                 155                 160
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
165                 170                 175
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
180                 185                 190
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
195                 200                 205
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val
210                 215                 220
Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys
225                 230                 235                 240
Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly
245                 250                 255
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
260                 265                 270
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu
275                 280                 285
Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
290                 295                 300
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg
305                 310                 315                 320
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
325                 330                 335
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu
340                 345                 350
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
355                 360                 365
Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
370                 375                 380
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
385                 390                 395                 400
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
405                 410                 415
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp
420                 425                 430
Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
435                 440                 445
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu
450                 455                 460
Gly
465
<210>  141
<211>  1398
<212>  ДНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  синтетическая конструкция
<400>  141
atggaatggt cctgggtgtt cctgttcttc ctgtctgtga ccaccggcgt gcactctgaa       60
gtgcagttgg ttgaatctgg cggcggactg gtgcagccta agggatctct gaagctgtct      120
tgcgccgcct ccgacttcac cttcaatacc tacgccatgc actgggtccg acaggcccct      180
ggaaaaggac tggaatgggt cgccagaatc cggaccaagt ccaacaacta cgccacctac      240
tacgccgact ccgtgaagga cagattcacc atctctcggg acgactccca gtccatgctg      300
tacctgcaga tgaacaacct gaccaccgag gacaccgcca tgtactactg cgtgcgggat      360
agatatggcg gcgctatgga ttattggggc cagggcacat ctgtgaccgt gtcctctgct      420
tccaccaagg ggccctccgt gttccctctg gccccttgct ccagatccac ctccgagtct      480
accgccgctc tgggctgcct cgtgaaggac tacttccccg agcctgtgac cgtgtcctgg      540
aactctggcg ctctgacctc tggcgtgcac accttccctg ctgtgctgca gtcctccggc      600
ctgtactccc tgtcctccgt cgtgaccgtg ccttccagct ctctgggcac caagacctac      660
acctgtaacg tggaccacaa gccctccaac accaaggtgg acaagcgggt ggaatctaag      720
tacggccctc cctgccctcc ttgcccagcc cctgaatttc tgggcggacc cagcgtgttc      780
ctgttccccc caaagcccaa ggacaccctg atgatctccc ggacccccga agtgacctgc      840
gtggtggtgg atgtgtccca ggaagatccc gaggtgcagt tcaattggta cgtggacggc      900
gtggaagtgc acaacgccaa gaccaagcct agagaggaac agttcaactc cacctaccgg      960
gtggtgtccg tgctgaccgt gctgcaccag gattggctga acggcaaaga gtacaagtgc     1020
aaggtgtcca acaagggcct gcccagctcc atcgaaaaga ccatctccaa ggccaagggc     1080
cagccccggg aaccccaggt gtacacactg cctccaagcc aggaagagat gaccaagaac     1140
caggtgtccc tgacctgtct cgtgaaaggc ttctacccct ccgatatcgc cgtggaatgg     1200
gagtccaacg gccagcctga gaacaactac aagaccaccc cccctgtgct ggactccgac     1260
ggctccttct tcctgtactc tcgcctgacc gtggacaagt cccggtggca ggaaggcaac     1320
gtgttctcct gctccgtgat gcacgaggcc ctgcacaacc actacaccca gaagtccctg     1380
tccctgtctc tgggatga                                                   1398
<210>  142
<211>  234
<212>  БЕЛОК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  синтетическая конструкция
<400>  142
Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr
1               5                   10                  15
Asp Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Ala Gln Ser Ser Ser Ser Phe Ser
20                  25                  30
Val Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asp
35                  40                  45
Ile Tyr Ile Arg Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro
50                  55                  60
Arg Leu Leu Ile Ser Thr Ala Thr Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser
65                  70                  75                  80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Lys Asp Tyr Thr Leu Ser Ile Thr
85                  90                  95
Ser Leu Gln Thr Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Trp
100                 105                 110
Ser Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg
115                 120                 125
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
130                 135                 140
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
145                 150                 155                 160
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
165                 170                 175
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
180                 185                 190
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
195                 200                 205
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
210                 215                 220
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225                 230
<210>  143
<211>  705
<212>  ДНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  синтетическая конструкция
<400>  143
atgtccgtgc ctacacaggt tctgggactg ctgctgctgt ggctgaccga cgctagatgt       60
gatatccaga tggcccagtc ctcctccagc ttctctgtgt ctctgggcga cagagtgacc      120
atcacatgca aggcctccga ggacatctac atccggctgg cctggtatca gcagaagcct      180
ggaaacgccc ctcggctgct gatctctacc gctacatctc tggaaaccgg cgtgccctct      240
agattctctg gctctggatc tggcaaggac tacaccctgt ctatcaccag cctgcagacc      300
gaggatgtgg ccacctacta ctgccagcag tactggtcta ccccttacac ctttggcggc      360
ggaacccggc tggaaatcaa acgtacggtg gccgctccct ccgtgttcat cttcccacct      420
tccgacgagc agctgaagtc cggcaccgct tctgtcgtgt gcctgctgaa caacttctac      480
ccccgcgagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtccgg caactcccag      540
gaatccgtga ccgagcagga ctccaaggac agcacctact ccctgtcctc caccctgacc      600
ctgtccaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaagtgac ccaccagggc      660
ctgtctagcc ccgtgaccaa gtctttcaac cggggcgagt gctga                      705
<---