Лекарственное средство пролонгированного действия на основе фактора свертываемости крови VIII для лечения гемофилии А

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК рАР227, кодирующая полипептид с последовательностью фактора VIII свертываемости крови человека, имеющая размер 13973 п.о. и состоящая из следующих элементов:
- оптимизированной последовательности, кодирующей полипептид фактора VIII свертываемости крови человека с делецией В-домена, представленной в виде SEQ ID NO: 2,
- MAR - области прикрепления к ядерному матриксу гена лизоцима птиц,
- усилителя транскрипции вируса CMV,
- внутреннего сайта инициации трансляции IRES вируса энцефаломиокардита,
- гена DHFR мыши,
- сигнала полиаденилирования вируса SV40,
- аминогликозид-3'-фосфотрансферазы, обеспечивающего устойчивость штамма клеток-продуцента к генетицину (Neo),
- кассеты для экспрессии в клетках бактерий гена β-лактамазы, обеспечивающей устойчивость к ампицилину,
- уникальных участков узнавания следующих эндонуклеаз рестрикции: AhdI (10094 п.о.), AsiSI (660 п.о.), BglII (2674 п.о.), BmtI (1085 п.о.), BssHII (8520 п.о.), BstBI (8804 п.о.), Eco47III (13117 п.о.), EcoRI (12777 п.о.), EcoRV (13711 п.о.), MluI (5474 п.о.), NheI (1085 п.о.), NotI (6660 п.о.), PpuMI (5458 п.о.), RsrII (8638 п.о.), SbfI (5105 п.о.), SpeI (152 п.о.), Tth111I (8238 п.о.), XcmI (2096 п.о.).
2. Линия клеток Cricetulus griseus CHO 2H5 - продуцент рекомбинантного фактора VIII свертываемости крови человека, полученная путем трансформации линии клеток Cricetulus griseus CHO DHFR - рекомбинантной плазмидной ДНК рАР227 по п. 1.
3. Способ получения полипептида, обладающего активностью фактора VIII, включающий культивирование линии клеток по п. 2, и выделение полипептида из культуральной жидкости, характеризующийся тем, что культивирование, обеспечивающее экспрессию указанного полипептида, проводят в среде DME/F12, содержащей 2-4% фетальной сыворотки, 1% диметилсульфоксида и 50 МЕ/л инсулина.
4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что выделение полипептида осуществляют при помощи следующей последовательности операций:
осветление культуральной жидкости, катион-обменная хроматография на SP-Сефарозе, антивирусная обработка, аффинная хроматография на CNBr-IgG Сефарозе, анион-обменная хроматография на Q-Сефарозе.