Валидация аналитической методики определения остаточных органических растворителей для стандартизации субстанции 5,7-бис-(мета-нитрофениламино)-4,6-динитробензофуроксана

Статья поступила в редакцию 09 .12 . 2013, доработана автором 20 . 02 . 2014

УДК 543.4:544.2

валидация аналитической методики определения остаточных органических растворителей для стандартизации субстанции 5,7-бис-(мета-нитрофениламино)-4,6-динитробензофуроксана

Целью исследования являлась разработка и валидация методики количественного определения остаточных органических растворителей в субстанции 5,7-бис-(мета-нитрофениламино)-4,6-динитробензофу-роксана с применением метода газовой хроматографии. Проведенная валидация разработанной нами методики количественного определения остаточных органических растворителей - этилового спирта и ацетонитрила в субстанции 5,7-бис-(мета-нитрофениламино)-4,6-динитробензофуроксана с использованием метода газовой хроматографии позволила оценить ее метрологические характеристики. Исходя из валидационных испытаний, валидационные характеристики соответствуют принятым критериям. Специфичность методики демонстрируется полным хроматографическим разделением пиков этанола и ацетонитрила, а также отсутствием пика этанола и ацетонитрила на хроматограмме растворителя. Линейность методики доказана в диапазоне от предела их количественного определения до 120 % от заявленных концентраций соответственно. Прецизионность методики соответствует допустимым нормам - относительное стандартное отклонение промежуточной прецизионности при определении этанола и ацетонитрила менее 4 %. Результаты валидационных испытаний методики доказывают пригодность аналитической методики количественного определения остаточных органических растворителей в субстанции 5,7-бис-(мета-нитрофениламино)-4,6-динитробензофуроксана методом газовой хроматографии.

Ключевые слова: 5,7-бис-(мета-нитрофениламино)-4,6-динитробензофу-роксан, валидация, стандартизация .

Среди производных бензофуроксанов синтезирована малотоксичная субстанция 5,7-бис-(мета-нитрофениламино)-4,6-динитробензофуро-ксана, обладающая выраженными антигельминтными свойствами [1] . Для стандартизации субстанции 5,7-бис-(мета-нитрофениламино)-4,6-динитро-бензофуроксана первоначально необходимо исследовать ее физические и физико-химические свойства, разработать точные и надежные методики анализа. Согласно ОСТ 42-506-96 в случае использования токсичных растворителей при изготовлении лекарственных средств обязателен контроль остаточных количеств растворителей [2] Для очистки субстанции

Мархабуллина Р . Ш .

Аспирант кафедры химии и технологии органических соединений азота

Юсупова Л . М .

Д-р хим . наук, проф . кафедры ХТОСА КНИТУ Россия, 420015, г. Казань, ул . К. Маркса, 68 E-mail: remarkh@bk.ru

от посторонних примесей используются органические растворители второго и третьего класса токсичности (ацетонитрил и этиловый спирт 96 %). Для количественного определения этанола 96 % и ацетонитрила в субстанции 5,7-бис-(мета-нитрофениламино)-4,6-динитробензофуроксана использован метод газовой хроматографии, характеризующийся универсальностью и высокой чувствительностью [3] . Для подтверждения достоверности и воспроизводимости разработанной методики необходимо провести ее валидацию . Вали-дация аналитических методик доказывает обоснованность выбора метода и условий проведения анализа, увеличивает степень гарантии качества лекарственных средств [4]

Исходя из актуальности темы целью исследования является проведение валидации аналитической методики количественного определения остаточных органических растворителей в субстанции 5,7-бис-(мета-нитрофениламино)-4,6-динитробензофуроксана по показателям: специфичность, правильность, линейность, предел количественного определения, сходимость, промежуточная прецизионность, стабильность, а также определить возможность использования метода газовой хроматографии для количественного определения остаточных органических растворителей в субстанции 5,7-бис-(мета-нитрофениламино)-4,6-динитробензофуроксана .

Для разработки и валидации методики количественного определения остаточных органических растворителей в субстанции 5,7-бис-(мета-нитрофениламино)-4,6-динит-робензофуроксана использовали мерную посуду класса А, аналитические весы марки AUW 120 D фирмы Shimadzu и газовый хроматограф "Clarus 500" марки PerkinElmer с кварцевой капиллярной колонкой длиной 3000 см, диаметром 0,32 мм, типа Elit-5, позволяющей получить степень разделения не менее 1,5 для пиков определяемых веществ В работе использовались очищенная субстанция 5,7-бис-(мета-нитрофениламино)-4,6-динит-робензофуроксана, этиловый спирт 96 %, ацетонитрил и диметилсульфоксид (для хроматографии) .

Очистка субстанции 5,7-бис-(мета-нитрофениламино)-4,6-динитробензофуроксана от примесей (мета-нит-роанилин и 5,7-дихлоро-4,6-динитробензофуроксан) проводилась методом перекристаллизации в бинарной системе растворителей: этиловый спирт 96 % - ацетонитрил . Для максимального удаления ацетонитрила и этилового спирта 96 % перекристаллизованную субстанцию промывали сначала этиловым спиртом 96 % (для удаления ацетонитрила), а затем большим количеством очищенной воды . Высушенную до постоянной массы субстанцию далее анализировали на содержание актив-

ного вещества и остаточных органических растворителей . После перекристаллизации содержание активного вещества было определено потенциометрически и составило 99,99 % . Определение органических растворителей проводили методом газовой хроматографии с использованием хроматографа с пламенно-ионизационным детектором .

Количество органических растворителей в субстанции 5,7-бис-(мета-нитрофениламино)-4,6-динитробензофу-роксана рассчитывали методом внешнего стандарта . Для приготовления раствора стандартного образца около 0,5 г (точная навеска) этилового спирта 96 % (для хроматографии) и около 0,041 г ацетонитрила (с точностью до 0,0001 г) (для хроматографии), помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяли в 80 мл диме-тилсульфоксида (для хроматографии), доводили диме-тилсульфоксидом до метки и перемешивали Полученный раствор фильтровали через фильтр с диаметром пор не более 0,45 мкм . Для приготовления испытуемого раствора около 0,1 г (с точностью до 0,0001 г) субстанции помещали в мерную колбу вместимостью 10 мл, растворяли в 5 мл диметилсульфоксида (для хроматографии), доводили тем же растворителем до метки и перемешивали Полученный раствор фильтровали через фильтр с диаметром пор не более 0,45 мкм . Испытуемый раствор и раствор стандартного образца хроматографировали не менее трех раз . В результате исследований выбраны следующие условия: газовый хроматограф с пламенно-ионизационным детектором; кварцевая капиллярная колонка длиной 3 000 см, диаметром 0,32 мм, типа Е№-5, или аналогичная, позволяющая получить степень разделения не менее 1,5 для пиков определяемых веществ; температурный режим: температура термостата колонки 50 °С в течение 2 мин, далее подъем температуры до 150 °С со скоростью 10 °С/мин и выдерживание при этой температуре в течение 15 мин; температура испарителя - 230 °С; температура детектора - 250 °С; скорость газа-носителя (гелий) - 1 мл/мин; расход водорода -45 мл/мин; расход воздуха - 450 мл/мин; деление потока - 50/1; время анализа - 27 мин .

В испаритель хроматографа вводили по 0,1 мкл испытуемого раствора и раствора стандартного образца Получали не менее трех хроматограмм для каждого раствора

Время удерживания пика этанола 96 % - около 3,91 мин, пика ацетонитрила - около 4,21 мин

Содержание этилового спирта 96 % и ацетонитрила в препарате в процентах (Х) вычисляли по формуле:

х= Бга0-10-100 = 5га0 йо-а,-100-100 Зо-а!-^

где S0 - среднее значение площади пика соответствующего растворителя, вычисленное по трем хромато-граммам раствора стандартного образца;

Si - среднее значение площади пика соответствующего растворителя, вычисленное по трем хромато-граммам испытуемого раствора;

a1 - навеска субстанции, г;

а0 - навеска этилового спирта 96 % (ацетонитрила), взятая для приготовления стандартного раствора, г

Содержание этилового спирта 96 % и ацетонитрила в субстанции должно быть не более 0,5 % и не более 0,041 % соответственно .

Результаты анализов показали, что в субстанции 5,7-бис-(мета-нитрофениламино)-4,6-динитробензофуро-ксана присутствуют растворители второго (ацетонитрил) и третьего (этиловый спирт 96 %) класса токсичности в количествах, не превышающих регламентируемые нормы [5] .

Для гарантии воспроизводимости разработанной методики была проведена ее валидация по следующим параметрам:

- специфичность;

- правильность;

- линейность;

- предел количественного определения;

- сходимость;

- промежуточная прецизионность;

- стабильность

Специфичность методики проводилась для определения влияния подвижной фазы на пики примесей (этилового спирта 96 % и ацетонитрила) [6, 7, 8] .

Согласно рис . 1 время удерживания пика диметил-сульфоксида составило около 10,4 мин .

На рис . 2 представлена хроматограмма раствора стандартного образца . Время удерживания пика этилового спирта 96 % составило 3,92 мин, а ацетонит-рила - 4,22 мин

При тестировании методики определения остаточных органических растворителей в субстанции 5,7-бис-(мета-нитрофениламино)-4,6-динитробензофуроксана по параметру «Специфичность» на хроматограмме подвижной фазы наблюдается отсутствие пиков, принадлежащих этиловому спирту 96 % и ацетонитрилу

Для определения правильности были приготовлены три модельных раствора с содержанием этилового спирта 96 % и ацетонитрила в диапазоне концентраций 80, 100, 120 % от заданного предельного содержания соответствующего органического растворителя . Каждый раствор хроматографировали не менее трех раз . Относительное стандартное отклонение для количественного

дмсо

"'S.....1......J......I......i......Ч......1......S.....

''ïfc.....íe.....^.....

Рис. 1 . Xроматограмма подвижной фазы

0 5 ' 1.0 ' 15 ' ¿Л ' 2 5 3.0 ' З!Б " 4 0 ' ¿Б' ' ВО ' Б!Б ' 6 0 ' в!б ' 7 0 ' 7.5 ' 8 0 6.5 ' в!о " 9.5 ' 10 0 10.6 ' 110

Рис. 2. Хроматограмма раствора стандартного образца

j Этанол 96%

Ацетонитрил

Рис. 3. Хроматограмма раствора стандартного образца

определения этилового спирта 96 % и ацетонитрила должно быть не более 4 % [9]

Согласно табл . 1 значение относительного стандартного отклонения для количественного определения этилового спирта 96 % составило 1,56 % .

Согласно табл 2 значение относительного стандартного отклонения для ацетонитрила составило 1,90 % .

Для определения линейности методики приготовлены пять проб с концентрациями ацетонитрила и этанола 96 % от предела их количественного определения до 120 % от заявленных концентраций (5 мг/мл для этанола 96 % и 0,41 мг/мл для ацетонитрила) .

Таблица 1

Количественное определение этанола 96 % в модельных растворах

№ Заложено, г Измерено Метрологические характеристики

г %

1 0,4 0,406 101,50 Число определений п = 9, f = п - 1 = 8 Среднее значение X = 100,30 % Дисперсия S2 = 2,42 Среднее квадратичное отклонение S = 1,56 % Коэффициент Стьюдента t (95 %, Т) = 2,31 Относительное стандартное отклонение Бу = 1,56 % Доверительный интервал ДТ = 1,20 % Относительная погрешность е = 1,20 %

2 0,4 0,412 103,00

3 0,4 0,398 99,50

4 0,5 0,509 101,80

5 0,5 0,497 99,40

6 0,5 0,491 98,20

7 0,6 0,604 100,67

8 0,6 0,599 99,83

9 0,6 0,593 98,83

Таблица 2

Количественное определение ацетонитрила в модельных растворах

№ Заложено, г Измерено Метрологические характеристики

г %

1 0,0328 0,0334 101,83 Число определений п = 9, Т = п - 1 = 8 Среднее значение X = 101,30 % Дисперсия S2 = 3,68 Среднее квадратичное отклонение S = 1,92 % Коэффициент Стьюдента t (95 %, Т) = 2,31 Относительное стандартное отклонение Бу = 1,90 % Доверительный интервал ДХ = 1,48 % Относительная погрешность е = 1,46 %

2 0,0328 0,0325 99,09

3 0,0328 0,0339 103,35

4 0,0410 0,0418 101,95

5 0,0410 0,0424 103,41

6 0,0410 0,0405 98,78

7 0,0492 0,0500 101,63

8 0,0492 0,0486 98,78

9 0,0492 0,0506 102,85

Таблица 3

Зависимость площадей пиков растворителей от их концентраций в растворе стандартного образца

Концентрация этанола 96 %, мг/мл Площадь пика этанола 96 %, мВ*с Высота сигнала этанола 96 % Концентрация ацетонитрила, мг/мл Площадь пика ацетонитрила, мВ^с Высота сигнала ацето-нитрила

2,500 9 350 2,70 0,2050 1 179 0,44

1,250 4 676 1,30 0,1025 591 0,22

0,625 2 339 0,60 0,0513 296 0,11

0,313 1 167 0,30 0,0256 148 0,06

0,156 583 0,14 0,0128 75 0,03

0,078 291 0,07 0,0064 достоверно определить невозможно -

0,040 141 0,035 - - -

0,020 достоверно определить невозможно - - - -

Концентрация этанола 96 %, мг/мл

Рис. 4. График зависимости площади пика от концентрации этанола 96 %

По полученным данным были построены графики зависимости площади пика от концентрации этилового спирта 96 % и ацетонитрила . Значение квадрата коэффициента корреляции должно быть не менее 0,99 [7] .

Согласно рис . 4 квадрат коэффициента корреляции для этилового спирта 96 % составил 1. Следовательно, зависимость площади пика от концентрации этилового спирта линейна .

Согласно рис . 5 квадрат коэффициента корреляции для ацетонитрила составил 0,999 Следовательно, зависимость площади пика от концентрации ацетонитрила линейна

Предел количественного определения устанавливали путем измерения аналитических сигналов этилового спирта 96 % и ацетонитрила в процессе последовательного уменьшения их концентраций от максимальной концентрации (50 % от предельного значения) до концентрации, при которой соотношение сигнал/ шум будет >10 . Коэффициент вариации результатов, полученных при шестикратном введении проб, должен быть меньше 15 % [8, 9].

На рис . 6 представлен фрагмент «шума» базовой линии на хроматограмме раствора диметилсульфок-сида . Значение высоты сигнала «шума» базовой линии составило 0,003 . Следовательно, минимальное значение высоты сигнала этилового спирта 96 % и ацетонитрила, при которой они могут быть достоверно определены, равно 0,03

При тестировании методики определения остаточных органических растворителей в субстанции 5,7-бис-(мета-нитрофениламино)-4,6-динитробензофуроксана по параметру «предел количественного определения» выявлено, что предел количественного определения

Концентрация ацетонитрила, мг/мл

Рис. 5. График зависимости площади пика от концентрации ацетонитрила

Рис. 6. Фрагмент «шума» базовой линии на хроматограмме раствора диметилсульфоксида

этанола 96 % составляет 0,04 мг/мл, а ацетонитрила 0,0128 мг/мл . Коэффициент вариации результатов, полученных при шестикратном введении этанола 96 % с концентрацией 0,04 мг/мл, составил 2,76 %, а при шестикратном введении ацетонитрила с концентрацией 0,0128 мг/мл - 7,71 %, что соответствует заявленному критерию .

Сходимость результатов анализа была оценена по результатам анализа шести отдельно приготовленных проб из одного образца субстанции 5,7-бис-(мета-нитрофениламино)-4,6-динитробензофуроксана . Значение коэффициента вариации для шести определений должно быть не более 4 % [9]

Промежуточная прецизионность методики была исследована в течение двух рабочих дней

Значение коэффициента вариации для шести отдельно приготовленных проб из одного образца субстанции 5,7-бис-(мета-нитрофениламино)-4,6-динитробензофу-роксана должно быть не более 4 % [9].

Согласно табл 4 и 5 результаты количественного определения этилового спирта 96 % и ацетонитрила доказали удовлетворительную прецизионность методики .

Стабильность раствора субстанции 5,7-бис-(мета-нитрофениламино)-4,6-динитробензо-фуроксана была определена путем сравнения площадей пиков на хроматограммах свежеприготовленного раствора субстанции 5,7-бис-(мета-нитрофениламино)-4,6-динитробензофуроксана и «несвежего» раствора после хранения при комнатной температуре 20 ± 2 °С и при температуре +8 °С до возникновения нестабильности (до 7 дней). Максимальное отклонение от первоначального результата для раствора, который хранился при комнатной температуре, для этилового спирта 96 % составило 0,94 %, для ацетонитрила - 0,99 %, а для раствора, который хранился при температуре +8 °С, для этилового спирта 96 % составило 0,51 %, для ацетонит-рила - 0,55 % Процентное содержание этанола 96 % и ацетонитрила, полученное при анализе растворов субстанции 5,7-бис-(мета-нитрофениламино)-4,6-динит-робензофуроксана, не отклоняется от первоначального результата более чем на 2 %

В процессе исследований установлено, что метод газовой хроматографии позволяет получить достоверные и надежные результаты, а также может быть использован для количественного определения остаточных органических растворителей в субстанции 5,7-бис-(мета-нитрофениламино)-4,6-динитробензофуроксана

Таблица 4

Содержание остаточных органических растворителей при анализе субстанции 5,7-бис-(мета-нитрофениламино)-4,6-динитробензофуроксана

Обозначение анализа Содержание этанола 96 %, % Содержание ацетонитрила, %

Проба 1 0,298 0,0102

Проба 2 0,291 0,0100

Проба 3 0,301 0,0099

Проба 4 0,296 0,0100

Проба 5 0,293 0,0101

Проба 6 0,294 0,0098

Среднее значение, % 0,296 0,0100

Стандартное отклонение, % 0,0036 0,00014

Коэффициент вариации, % 1,22 1,40

Доверительный интервал (Р = 95 %), % 0,296 ± 0,0038 0,0100 ± 0,00015

Проведенная валидация методики определения остаточных органических растворителей в субстанции 5,7-бис-(мета-нитрофениламино)-4,6-динитробензофуроксана по показателям: специфичность, правильность, линейность, предел количественного определения, сходимость, промежуточная прецизионность, стабильность - позволила получить значения, соответствующие заявленным критериям Методика может быть использована при аттестации стандартного образца субстанции 5,7-бис-(мета-нитрофениламино)-4,6-динитробензофуроксана

Таблица 5

Содержание остаточных органических растворителей при анализе субстанции 5,7-бис-(мета-нитрофениламино)-4,6-динитробензофуроксана

Обозначение анализа Содержание этанола 96 %, % Содержание ацетонитрила, %

1-й день 2-й день 1-й день 2-й день

Проба 1 0,293 0,299 0,0100 0,0102

Проба 2 0,296 0,289 0,0101 0,0100

Проба 3 0,298 0,300 0,0100 0,0098

Проба 4 0,299 0,296 0,0099 0,0101

Проба 5 0,291 0,291 0,0101 0,0100

Проба 6 0,294 0,295 0,0103 0,0102

Среднее значение, % 0,295 0,295 0,0101 0,0101

Стандартное отклонение, % 0,0031 0,0043 0,00014 0,00015

Коэффициент вариации, % 1,05 1,46 1,39 1,49

Доверительный интервал (Р = 95 %), % 0,295 ± 0,0031 0,295 ± 0,0045 0,0101 ± 0,00015 0,0101 ± 0,00016

ЛИТЕРАТУРА

1. Юсупова Л . М . , Гармонов С . Ю . , Захаров И . М . , Быков А. Р . , Гарипов Т. В . , Фаляхов И . Ф . Средства биологической защиты многоцелевого назначения на основе хлорпроизводных нитробензофуроксана // Вестн . Казан . технол . ун-та . 2004 . № 1. С . 103-111.

2 . ОСТ 42-506-96 . Порядок согласования и утверждения нормативной документации на лекарственные средства и лекар-

ственное растительное сырье

3 . ГОСТ 31811-2012 . Спирт этиловый и спиртсодержащая продукция . М . , 2013 . 16 с .

4 ГОСТ Р 52249-2009 Правила производства и контроля качества лекарственных средств М , 2009 245 с

5 . ОФС 42-0004-00 «Остаточные органические растворители» .

6 . Гризодуб А. И . , Губаревич И . Г , Карпова Т. А . , Никишина Л . Е . , Леонтьев Д . А. Стандартизованная процедура валидации

методики контроля остаточных растворителей в лекарственных средствах методом газовой хроматографии // Фармаком . 2005 . № 4 . С . 5-21.

7 . Эрмер Й . , Миллер Дж . Валидация методики в фармацевтическом анализе . М . , 2013 . 495 с .

8 . Руководство по валидации методики анализа лекарственных средств / под ред . Н . В . Юргеля, А. Л . Младенцева, А. В . Бур-

дейна, М . А . Гетьмана . М . , 2007 . 190 с .

9 . Валидация аналитических методики для производителей лекарств / под ред . В . В . Береговых . М . , 2008 . 132 с .

VALIDATION OF ANALYTICAL PROCEDURE FOR DETERMINATION OF RECIDUAL ORGANIC SOLVENTS FOR STANDARDIZATION THE SUBSTANCE OF 5,7-BIS-META-NITROPHENYLAMINO-4,6-DINITROBENZOFUROXAN

R . Sh . Markhabullina, L . M . Yusupova

The aim of this study was to develop and validate a gas chromatography methods of quantitative determination of residual organic solvents in substance of 5,7-bis-(meta-nitrophenylamino)-4,6-dinitrobenzofuroxan. Validation of elaborating methods of quantitative determination of residual organic solvents - ethyl alcohol and acetonitrile in substance of 5,7-bis-(meta-nitrophenylamino)-4,6-dinitrobenzofuroxan using gas chromatography method allowed to evaluate their metrology parameters. All parameters of validation characteristics met their acceptance criteria's. Specificity was demonstrated by a complete chromatographic separation of peaks of ethyl alcohol and acetonitrile, and lack of peaks of ethyl alcohol and acetonitrile in the chromatogram of solvent. The linearity was proven in the range of quantitation limit to 120 % of the test concentrations. Precision of the methods comply with the requirement defined - the relative standard deviation for of ethyl alcohol and acetonitrile below 3 %. The results of this validation study prove the suitability of the gas chromatography method for quantitative determination of residual organic solvents in substance of 5,7-bis-(meta-nitrophenylamino)-4,6-dinitrobenzofuroxan.

Key words: 5,7-bis-(meta-nitrophenylamino)-4,6-dinitrobenzofuroxan, validation, standardization .