СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОВАЛЕНТНО-СВЯЗАННОГО ХИТОЗАН-МЕЛАНИНОВОГО КОМПЛЕКСА ИЗ МУХИ ЧЕРНАЯ ЛЬВИНКА HERMETIA ILLUCENS
METHOD OF PRODUCING COVALENT-LINKED CHITOSAN-MELANIN COMPLEX FROM BLACK SOLDIER FLY HERMETIA ILLUCENS

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения хитозан-меланиновых комплексов, соединенных ковалентной связью.
Муха черная львинка Hermetia illucens - уникальное насекомое, личинки которого способны перерабатывать широкий спектр органических отходов. Данная технология уже применяется в промышленных масштабах по всему миру. Важно отметить, что помимо утилизации органических отходов и производства удобрения, белка и жира, насекомое служит источником и других важных биологически активных веществ, таких как хитин, хитозан и меланин.
Меланин образуется на более поздних стадиях развития насекомого и связан с хитином прочными ковалентными связями. Меланин считается природным фото- и радиопротектором. В зависимости от источника и метода выделения меланин обладает различными физико-химическими свойствами, которые могут дополнять и усиливать биологическую активность хитозана, дезацетилированного производного хитина, и использоваться для решения важных научных и практических задач.
Известен способ получения хитозан-меланинового комплекса из подмора пчел [М.И. Селионова и Н.В. Погарская «Способ получения хитозан-меланинового комплекса из подмора пчел», Патент РФ №2382051, 21.07.2008]. Способ включает предварительную сушку хитин-меланинового сырья до влажности 4-6%, обеспечивающую его крошимость, затем высушенную массу перетирают до порошкообразного состояния, депротеинируют 10% раствором щелочи NaOH при температуре 78-82°С в течение 1,5-2,0 часов. 50% раствор NaOH добавляют в реакционную смесь, таким образом доводя его концентрацию до 30% от исходной. Полученный хитин-меланиновый комплекс дезацетилируют при температуре 90-95°С в течение 1,5-2,0 часов, фильтруют, при этом отфильтрованную массу получают путем промывания массы дистиллированной водой до достижения рН 7. Из оставшегося после фильтрования раствора осаждают меланин воздействием концентрированной соляной кислоты до изменения рН среды обрабатываемого раствора в кислую область и выпадения хлопьевидного осадка, представляющего собой меланин. Меланин отделяют от жидкой фазы центрифугированием, промывают, отдельно сушат хитозан и меланин при температуре 50-60°С до влажности 8-10% и смешивают их для получения конечного продукта хитозан-меланинового комплекса.
Важно отметить, что в данном способе хитозан и меланин получают раздельно, а комплексы - путем механического смешивания двух биополимеров.
Также этот способ с некоторыми модификациями опубликован в двух статьях [Получение хитозан-меланинового комплекса из подмора пчел и его использование для профилактики дисбактериоза молодняка животных (Н.В. Погарская, М.И. Селионова) С. 188-190, 2008] и [Н.В. Погарская, М.И. Селионова, В.В. Бинатова, Получение хитозан-меланинового комплекса из подмора пчел и определение его физико-химических и биологических характеристик, Веткорм. - 2008. - №6. - С. 28-29]. Предварительно высушенный до влажности 3-4% пчелиный подмор растирают в ступке или в барабанной мельнице до размера частиц 3-4 мм. В полученный порошок добавляют 10% раствор NaOH в соотношении 1:10 по массе и проводят дезацетилирование при постоянном перемешивании при 78-82°С в закрытом сосуде без доступа воздуха в течение 1,5 ч. Затем после охлаждения в том же количестве добавляют 50% раствор NaOH, доводя концентрацию NaOH до 30% от исходной, и проводят процесс дезацетилирования в закрытом сосуде при 90-97°С в течение 1,5-2,0 ч при периодическом перемешивании. Для выделения хитозан-меланинового комплекса полученный гидролизат отфильтровывают и промывают до нейтральной реакции промывных вод (рН 7). Извлечение меланина из щелочного экстракта проводится осаждением концентрированной соляной кислотой до изменения рН среды в кислую область с последующим центрифугированием раствора при 5000 об/мин в течение 15 мин. Полученный меланин промывают до нейтральной реакции промывных вод с последующим центрифугированием и сушкой. Полученный меланин сушат одновременно с хитозан-меланиновым комплексом в сушильном шкафу при 50°С. Выход хитозан-меланинового комплекса составил около 24% по массе от исходного сырья. По данным авторов следует, из подмора пчел невозможно получать хитозан-меланиновые комплексы, в которых компоненты соединены ковалентной связью, так как при реакции дезацетилирования происходит разрушение такого комплекса.
Известен способ получения хитина из личинок черной львинки Hermetia illucens [С.А. Лопатин, А.Ш. Хайрова, В.П. Варламов, И.В. Соколов «Способ получения хитина из личинок черной львинки Hermetia illucens», Патент РФ №2680691, 25.02.2019]. Способ получения хитина из личинок черной львинки Hermetia illucens предусматривает обработку обездвиженных личинок на маслопрессе. К 30-50 г полученного твердого остатка добавляют 150-200 мл 85% фосфорной кислоты, тщательно перемешивают и оставляют на 16-20 ч при комнатной температуре. Полученную суспензию фильтруют под вакуумом через стеклянный пористый фильтр №1 и промывают 70-100 мл 40% фосфорной кислоты. Объединенный фильтрат разбавляют 2,5-3,0 л воды при интенсивном перемешивании. Выпавший осадок хитина в фильтрате отмывают водой методом декантации до рН 5,5-6,0 и лиофильно высушивают. Изобретение позволяет упростить процесс получения хитина из личинок черной львинки Hermetia illucens, а также получить хитин в аморфной форме.
Также в [A. Khayrova, S. Lopatin, V. Varlamov, Black soldier fly Hermetia illucens as a novel source of chitin and chitosan // International Journal of Sciences, Vol.8, pp. 81-86, 2019] показано, что обработка хитина из черной львинки 50% щелочью позволяет получать хитозан со степенью дезацетилирования 90%, в то время как обработка более слабой 30% щелочью не приводит к дезацетилированию хитина, а увеличение концентрации NaOH приводит к повышению содержания белка в комплексе. Это можно объяснить тем, что более концентрированная щелочь более вязкая, что не позволяет ей эффективно смачивать материю и проникать в нее.
Известен способ получения меланина из личинок черной львинки [Патент РФ №2692260]. Способ получения меланина из личинок мух черной львинки Hermetia illucens в возрасте от 25 до 35 дней заключается в том, что сначала личинки тщательно промывают и высушивают, затем помещают в экструдер и экструдирование осуществляют при температуре 37-38°С методом холодного отжима в течение одной минуты, по завершении экструдирования дают полученному экструдату отстояться до разделения на фракции при температуре от 0 до -15°С и полученный на поверхности слой меланина отделяют механическим способом, для повторного получения слоя меланина оставшуюся смесь выдерживают при комнатной температуре и полученный на поверхности слой меланина отделяют механическим способом, после чего на завершающем этапе оставшуюся смесь замораживают, затем нагревают ее до комнатной температуры и вновь полученный на поверхности слой меланина отделяют механическим способом, при определенных условиях. Способ позволяет получить меланин путем естественной переработки личинок, не прибегая к агрессивным воздействиям химических реагентов.
В данной работе не описывается метод определения примесей в конечном продукте. По данным автора, содержание меланина составляло 88-90%, что свидетельствует о наличии примесей. Жир, более легкий по сравнению с меланином, образуется на поверхности, и входит в состав конечного продукта.
Вышеуказанные способы позволяют получать каждый из биополимеров- хитин, хитозан и меланин - раздельно. Соответственно, чтобы получить хитин- или хитозан-меланиновый комплекс дополнительно требуется соединить биополимеры механическим способом.
Наиболее близким к заявленному является способ получения хитозан-меланинового комплекса из мухи черной львинки Н. illucens [А.И. Бастраков и др., Муха черная львинка Hermetia illucens в условиях искусственного разведения - возобновляемый источник меланин-хитозанового комплекса, Известия Уфимского Научного Центра РАН, 2016, №4, С. 77-79]. Тем не менее, авторы работы не описывают сам способ, а ссылаются на работу Н.В. Погарской [Pogarskaya N.V., Selionova M.I., Binatova V.V. Production of chitosan-melanin complex from dead bees and identification of its physicochemical and biological characteristics, Vetkorm, 2008, no. 6, pp .28-29.], что свидетельствует о том, что комплексы являются механической смесью биополимеров. Идентификацию пигментов проводили на основании оценки их растворимости, спектральных и парамагнитных свойств, что также свидетельствует о том, что меланин получали отдельно, а затем добавляли к хитозану. Следует заметить, что по нашим данным, 30% щелочи недостаточно для удаления примесей (белка, жира) из подмора, поэтому конечный продукт не является чистым.
Из вышесказанного следует, что ранее в литературе не было описано способов получения ковалентно-связанных хитозан-меланиновых комплексов из мухи черной львинки Hermetia illucens и не было определено содержание примесей в этих комплексах. Нами был разработан способ получения ковалентных хитозан-меланиновых комплексов из подмора Hermetia illucens.
Подмор Hermetia illucens служил исходным сырьем для получения хитозан-меланиновых комплексов. В исходном сырье содержалось более 30% белка, около 5% золы и 27% жира. Содержание золы определяли гравиметрически, массовую долю жира в образце определяли экстракцией органическим растворителем в аппарате Сокслета, а содержание белка путем анализа аминокислот (свободных и связанных) - методом ионообменной хроматографии с постколоночной дериватизацией проб нингидрином.
С целью преодоления перечисленных выше недостатков предлагается для получения ковалентно-связанных хитозан-меланиновых комплексов из мухи черной львинки Hermetia illucens (далее по тексту - Н. Illucens) использование подмора Н. Illucens (с содержанием более 30% белка, около 5% золы и 27% жира).
Сущность способа получения ковалентно-связанного хитозан-меланинового комплекса из мухи черная львинка Н. illucens заключается в следующем: 500 г подмора мухи черная львинка обезжиривают диэтиловым эфиром в аппарате Сокслета, высушивают при комнатной температуре в вытяжном шкафу и получают 325 г обезжиренного подмора. Затем полученный обезжиренный подмор измельчают в ступке и фракционируют через сито. Размер частиц составляет 0,2-0,5 мм (выход = 275 г). Далее 275 г измельченной и обезжиренной массы деминерализуют 2,5 л 1% НСl при комнатной температуре в течение 2 часов при перемешивании. Твердый остаток фильтруют на стеклянном пористом фильтре №2, промывают дистиллированной водой до нейтральных значений рН и лиофильно высушивают. Получают 200 г деминерализованной материи, содержащей менее 0,3% золы. Из полученных 200 г деминерализованной материи берут только 60 г, обрабатывают 400-600 мл 30-50% раствором NaOH при 100°С в течение 2 часов при перемешивании, твердый остаток фильтруют на стеклянном пористом фильтре. Полученный хитозан-меланиновый комплекс отмывают дистиллированной водой до рН 5,5-6,0 и лиофильно высушивают. Получают 11-23 г ковалентно-связанного хитозан-меланинового комплекса, содержащего 2,2-4,3% белка.
Технический результат данного способа заключается в получении нового продукта - хитозан-меланинового комплекса, который сочетает в себе свойства этих биополимеров.
Основное отличие данного способа заключается в том, что в отличие от предыдущих способов получения хитозан-меланиновых комплексов, получаемый продукт является не механической смесью двух соединений - хитозана и меланина, а химическим соединением, где оба биополимера соединены друг с другом ковалентными связями. Кроме того, в указанном способе контролируется полнота удаления примесей, что ранее не встречалось в литературе. Важным отличием предложенного способа является введение первоначальной стадии обезжиривания органическим растворителем. Было обнаружено, что после обработки 10% NaOH (90-100°С, 2 часа) в подморе содержалось 26% жира. При обработке 30% NaOH (90 -100°С, 2 часа) оставалось 8% жира и даже при обработке 50% NaOH щелочью в тех же условиях жир полностью не удаляется (остается 5,4%). Возможно, что в подморе черной львинки помимо триглицеридов может содержаться и воск, который не гидролизуется щелочью. Наличие жира в биомассе приводит к ухудшению ее смачиваемости и неполному удалению золы и белка. В результате обработки диэтиловым эфиром, жир из исходного сырья был удален.
Содержание меланина было показано из данных ЭПР-анализа. Содержание меланина в пересчете на ДОФА-меланин в исходном подморе составляло 10%, а в комплексах превышало 14%.
Определение свободных аминогрупп в полученных комплексах проводили с помощью реакции с нингидрином по методу [Taylor I., Hovard A.G. Measurement of primary amine groups on surface-modified silica and their role in metal binding // Analytica Chimica Acta. 1993. V. 271. №1. Р.77-82]. Результаты титрования аминогрупп показывают, что после обработки 50% NaOH значительно возрастает концентрация аминогрупп по сравнению с материей, обработанной 30% NaOH, что подтверждает протекание реакции дезацетилирования хитина.
Пример 1.
500 г подмора мухи черная львинка обезжиривают диэтиловым эфиром в аппарате Сокслета, высушивают при комнатной температуре в вытяжном шкафу и получают 325 г обезжиренного подмора. Затем препарат измельчают в ступке и фракционируют через сито. Размер частиц составляет 0,2-0,5 мм (выход = 275 г).
275 г измельченной и обезжиренной массы деминерализуют 2,5 л 1% НСl при комнатной температуре в течение 2 часов при перемешивании. Твердый остаток фильтруют на стеклянном пористом фильтре №2, промывают дистиллированной водой до нейтральных значений рН и лиофильно высушивают. Получают 200 г деминерализованной материи, содержащей менее 0,3% золы.
60 г деминерализованной материи депротеинируют обработкой 600 мл 50% раствором NaOH при 100°С в течение 2 часов при перемешивании, твердый остаток фильтруют на стеклянном пористом фильтре №2. Полученный хитозан-меланиновый комплекс отмывают дистиллированной водой до рН 5,5-6,0 и лиофильно высушивают. Получают 11 г ковалентно-связанного хитозан-меланинового комплекса, содержащего 3,5% белка.
Пример 2.
Аналогично примеру 1, но после стадии деминерализации 60 г деминерализованной материи депротеинируют обработкой 600 мл 30% раствора NaOH при 100°С в течение 2 часов при перемешивании. Твердый остаток фильтруют на стеклянном пористом фильтре №2. Полученный хитозан-меланиновый комплекс отмывают дистиллированной водой до рН 5,5-6,0 и лиофильно высушивают. Получают 13,5 г ковалентно-связанного хитозан-меланинового комплекса с содержанием белка 2,2%.
Пример 3.
Аналогично примеру 1, но после стадии деминерализации 60 г деминерализованной материи обрабатывают 400 мл 50% раствора NaOH при 90°С в течение 2 часов при перемешивании. Твердый остаток фильтруют на стеклянном пористом фильтре №2, отмывают дистиллированной водой до рН 5,5-6,0 и лиофильно высушивают. Получают 23 г ковалентного хитозан-меланинового комплекса, содержащего 4,3% белка.