ПУТЬ СТАНОВЛЕНИЯ СИСТЕМЫ CRISPR/CAS9 КАК ИНСТРУМЕНТА СОВЕРШЕНСТВОВАНИЯ ПРОДУКТИВНОСТИ ЖИВОТНЫХ

НИЖНЕВОЛЖСКОГО АГРОУНИВЕРСИТЕТСКОГО КОМПЛЕКСА НАУКА И ВЫСШЕЕ ПРОФЕССИОНАЛЬНОЕ ОБРАЗОВАНИЕ

5. Игошин О. Ю., Толманов А. А. Особенности содержания и разведения медоносных пчел в условиях Поволжья // Современные тенденции в биологических науках XXI века: сборник научных трудов IV Всероссийской научно-практической конференции. Уфа, 2019. С. 198-203.

6. Кашковский В. Г., Волков С. А. Выбор улья для пасек Западной Сибири // Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. 2014. № 4. С. 51-53.

7. Крутоголов В. Д. Технология содержания пчел // Пчеловодство. 2014. № 3. С. 30-32.

8. Мельникова Е. Н., Мельников М. М., Земскова Н. Е. Содержание пчел в условиях лесостепной зоны Самарской области // Пчеловодство. 2019. № 2. С. 12-13.

9. Налецкий М. М. Содержание пчел в многокорпусных ульях // Пчеловодство. 2014. № 8. С. 37-40.

10. Панков Д. М. Комплексный подход к содержанию пчел // Пчеловодство. 2013. № 6. С. 12-13.

11. Селицкий А. В. Содержание пчел в двухкорпусном улье // Пчеловодство. 2014. № 5. С. 45-47.

12. Филиппов В. С. Содержание пчел в теплых ульях // Пчеловодство. 2020. № 4. С. 36-39.

13. Чинакаев Г. Ш. Ульи из пенополистирола // Пчеловодство. 2018. № 1. С. 41-42.

14. Экономическая эффективность лечения медоносных пчел от варроатоза при ведении органического животноводства / В. А. Чучунов, Е. Б. Радзиевский, В. А. Злепкин, Т. В. Коно-блей, Ю. В. Радзиевская // Известия Нижневолжского агроуниверситетского комплекса: наука и высшее профессиональное образование. 2021. № 3 (63). С. 300-311.

15. Ярошевич Г. С., Мазина Г. С., Владимирова С. В. Приемы и способы содержания пчел в условиях Псковской области // Инновационные технологии для АПК юга России: материалы Всероссийской научно-практической конференции. Майкоп, 2016. С. 293-297.

Информация об авторах Чучунов Василий Александрович, доцент кафедры «Частная зоотехния» Волгоградского государственного аграрного университета (РФ, 400002, г. Волгоград, пр. Университетский, д. 26), кандидат биологических наук,доцент, ORCID:https://orcid.org/0000-0002-3569-5725; e-

mail: chuchunov.78@mail.ru

Радзиевский Евгений Борисович, доцент кафедры «Частная зоотехния» Волгоградского государственного аграрного университета (РФ, 400002, г.Волгоград, пр.Университетский, д.26.), кандидат сельскохозяйственных наук, доцент, ORCID:https://orcid.org/0001-5938-1045; e-mail: yenia79@mail.ru Коноблей Татьяна Викторовна, доцент кафедры «Частная зоотехния» Волгоградского государственного аграрного университета (РФ, 400002, г.Волгоград, пр. Университетский, д. 26) кандидат сельскохозяйственных наук ORCID:https://orcid.org/0000-0002-8274-3961, e-mail:oziola@mail.ru Самойлова Татьяна Сергеевна, доцент кафедры «Частная зоотехния» Волгоградского государственного аграрного университета ( РФ, 400002, г.Волгоград, пр.Университетский, д.26.) кандидат сельскохозяйственных наук e-mail: kolobova2802@mail.ru

DOI: 10.32786/2071-9485-2023-01-44 THE WAY OF FORMATION OF THE CRISPR/CAS9 SYSTEM AS A TOOL FOR IMPROVING THE PRODUCTIVITY OF ANIMALS

E. A. Polteva, T. A. Larkina, G. K. Peglivanyan, O. Yu. Barkova

Russian Research Institute of Farm Animal Genetics and Breeding — Branch of the L.K. Ernst Federal Research Center for Animal Husbandry

Received 12.12.2022 Submitted 28.02.2023

The study was supported by a grant from the Russian Science Foundation

Abstract

This review article presents the development of genome editing methods in living organisms. The history of the development of applied genetics from the first attempts in the field of cell engineering to the creation of the first cloned animal is briefly outlined. The fundamental discoveries that gave rise to genetic

399

НИЖНЕВОЛЖСКОГО АГРОУНИВЕРСИТЕТСКОГО КОМПЛЕКСА НАУКА И ВЫСШЕЕ ПРОФЕССИОНАЛЬНОЕ ОБРАЗОВАНИЕ

engineering, such as the production of a restriction enzyme, the creation of the first recombinant DNA, the development of a method for determining nucleotide sequences and a method for DNA cloning using cosmids, are highlighted. Particular attention is paid to a method known as the Clustered Short Regularly Spaced Palindromic Repeat (CRISPR) system, which has made a major breakthrough in the development of gene editing technologies. The mechanism of operation of the CRISPR/Cas system is described. Examples of the successful use of the CRISPR/Cas9 technique for editing the myostatin gene (MSNT) in a number of farm animals are given. So, in 2018, goats edited for the MSTN gene were successfully obtained. In 2016, a line of myostatin knockout rabbits was created and transmitting this modification to their descendants; in 2017, a line of genetically edited pigs with a knockout myostatin gene was obtained. A number of studies on editing myostatin in chicken cells using the CRISPR/Cas system are presented, as well as achievements in the field of editing such genes as SOCS2, FGF5, ASIP, AANAT and ASMT, which affect the expression of economically important traits.

Key words: genome editing, myostatin, CRISPR/Cas9.

Citation. Polteva E. A., Larkina T. A., Peglivanyan G. K., Barkova O. Yu. The way of formation of the CRISPR/Cas9 system as a tool for improving the productivity of animals. Proc. of the Lower Volga Agro-University Comp. 2023. 1(69). 399-414 (in Russian). DOI: 10.32786/2071-9485-2023-01-44.

Author's contribution. All authors of the review article were directly involved in planning and writing. All authors of this article reviewed the submitted final version and approved it.

Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.

УДК 577.218

ПУТЬ СТАНОВЛЕНИЯ СИСТЕМЫ CRISPR/CAS9 КАК ИНСТРУМЕНТА СОВЕРШЕНСТВОВАНИЯ ПРОДУКТИВНОСТИ ЖИВОТНЫХ

Е. А. Полтева, младший научный сотрудник

Т. А. Ларкина, кандидат биологических наук, младший научный сотрудник

Г. К. Пегливанян, аспирант, младший научный сотрудник О. Ю. Баркова, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник

Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных, филиал Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Федеральный научный центр животноводства — ВИЖ имени академика Л. К.

Эрнста», Санкт-Петербург

Дата поступления в редакцию 12.12.2022 Дата принятия к печати 28.02.2023

Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда (проект № 20-76-10006).

Аннотация. В данной обзорной статье представлен путь становления методов редактирования генома у живых организмов. Кратко изложена история развития прикладной генетики от первых попыток в области клеточной инженерии до создания первого клонированного животного. Освещены фундаментальные открытия, давшие начало генной инженерии, такие как получение рестрикционного фермента, создание первой рекомбинантной ДНК, разработка метода определения нуклеотидных последовательностей и метода клонирования ДНК с использованием космид. Особое внимание уделено методу, известному как система кластерных коротких палиндромных повторов с регулярными интервалами (CRISPR), совершившему большой прорыв в развитии технологий редактирования генов. Описан механизм работы системы CRISPR/Cas. Приведены примеры успешного использования методики CRISPR/Cas9 по редактированию гена миостатина (MSNT) у ряда сельскохозяйственных животных. Так, в 2018 году успешно получили отредактированных по гену MSTN коз. В 2016 году была создана линия кроликов, нокаутных по гену миостатина и передающих эту модификацию потомкам, в 2017 году была получена линия генетически редактированных свиней с нокаутным геном миостатина.

НИЖНЕВОЛЖСКОГО АГРОУНИВЕРСИТЕТСКОГО КОМПЛЕКСА НАУКА И ВЫСШЕЕ ПРОФЕССИОНАЛЬНОЕ ОБРАЗОВАНИЕ

Приведен ряд исследований по редактированию миостатина в куриных клетках с помощью системы CRISPR/Cas, а также достижения в области редактирования таких генов, как SOCS2, FGF5, ASIP, AANAT и ASMT, влияющих на проявление хозяйственно важных признаков.

Ключевые слова: редактирование генома, миостатин, CRISPR/Cas9.

Цитирование. Полтева Е. А., Ларкина Т. А., Пегливанян Г. К., Баркова О. Ю. Путь становления системы CRISPR/Cas9 как инструмента совершенствования продуктивности животных. Известия НВЛУК. 2023. 1(69). 399-414. DOI: 10.32786/2071-9485-2023-01-44.

Авторский вклад. Все авторы обзорной статьи принимали непосредственное участие в планировании и написании. Все авторы настоящей статьи ознакомились с представленным окончательным вариантом и одобрили его.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Введение. В настоящее время во всем мире активно используется система редактирования генома CRISPR/Cas9. С ее помощью стало более доступно и просто внести изменения в наследственный аппарат, поскольку все ранее использующиеся методы более трудоемкие. CRISPR/Cas9 - это адаптивная иммунная система у бактерий и архей; человек использует ее как РНК-управляемые эндонуклеазы (RGEN) для редактирования генома различных биологических объектов, в том числе животных. Принцип действия основан на малых РНК и белках-эндонуклеазах Cas, которые могут индуцировать сайт-специфические двухцепочечные разрывы ДНК [34]. Простота этого нового молекулярного инструмента произвела революцию в генетической инженерии множества клеток и организмов. В данной статье мы рассматриваем этапы становления генной инженерии и описываем основные достижения в области редактирования генома системой CRISPR/Cas9.

Краткая история клеточной и генной инженерии. Первые опыты в области клеточной инженерии были начаты еще в начале XX века. Одним из пионеров генной инженерии был немецкий эмбриолог Ганс Шпеманн. Его первые эксперименты по сжатию бластомеров оплодотворенной яйцеклетки саламандры волоском ребенка позволили получить эмбрион с двумя головами и одним хвостом. В 1938 Шпеманн предположил, что удаление ядра из неоплодотворенной яйцеклетки и замена его дифференцированным ядром эмбриона может дать жизнь всему организму [63, 64]. Позднее в 1952 году Робертом Бриггсом и Томасом Кингом был разработан метод нуклеотрансфера. Перенос ядра соматической клетки лягушки Rana pipiens в оплодотворенную икринку, ядро которой предварительно разрушали, показал, что из таких клеток развивался жизнеспособный головастик. Однако подобные опыты с переносом ядер дифференциальных клеток не закончились успехом. Тем не менее фундамент для дальнейших исследований был заложен [6, 7, 28]. Несколькими годами позднее Джон Гардон в опытах на лягушке Xenopus laevis доказал, что пересадка ядра от дифференцированных клеток возможна, и данные опыты опровергли «парадигму необратимости развития» [31]. Работы Дж. Гардона легли в основу клонирования путём переноса ядра соматической клетки (somatic cell nuclear transfer), и по истечении нескольких десятков лет в 1997 году именно с применением данных подходов была получена знаменитая овечка Долли [70].

Параллельно с клеточной инженерией развивались технологии работы с ДНК.

В 70-е годы XX века Гамильтон Смит получил эндонуклеазу рестрикции типа II (Hind II) из бактерии Haemophilus influenzae (H. influenzae) и обнаружил, что этот фермент разрезает ДНК в центре определенной последовательности из шести пар оснований. Смит показал, что Hind II режет лишь чужеродные специфические фрагменты ДНК, но не разрезает эту же последовательность в клетке хозяина H. Influenzae [62]. В наше время различные рестриктазы широко используются как для исследований генома, так и для генетической инженерии.

НИЖНЕВОЛЖСКОГО АГРОУНИВЕРСИТЕТСКОГО КОМПЛЕКСА НАУКА И ВЫСШЕЕ ПРОФЕССИОНАЛЬНОЕ ОБРАЗОВАНИЕ

Генетическая инженерия как таковая заключается в изменении наследственной информации клеток и организмов, то есть в создании гибридной или рекомбинантной молекулы ДНК. В 1972 году была опубликована статья, впоследствии принесшая одному из ее авторов, Полу Бергу, Нобелевскую премию. В этой статье описано получение первой рекомбинантной ДНК на основе вируса SV40. Эксперимент проходил в несколько этапов. Сначала молекула ДНК была переведена из кольцевой формы в линейную, затем с помощью дезоксинуклеотидилтрансферазы к 5' и 3' концам цепей были добавлены новые фрагменты, и финальным этапом стал обратный перевод рекомбинантной молекулы в кольцевую форму [38].

Позднее значимым этапом в развитии генной инженерии стал описанный Фредериком Сенгером в 1975 году метод определения нуклеотидных последовательностей в одноцепочечной ДНК. Впервые данный метод был использован для определения двух последовательностей в ДНК бактериофага \X174 с использованием синтетического де-кануклеотида AGAAATAAAA и продукта расщепления рестриктазами в качестве прай-меров. Метод Сенгера находится в основе современных методов определения нуклео-тидной последовательности ДНК [60]. Секвенирование генома в конечном итоге позволило человечеству расшифровать значение множества генов, которые в дальнейшем стали использоваться для нужд генетической инженерии.

В 1978 году Коллинз и Холман разработали метод клонирования ДНК с использованием космид. Космида - это разновидность плазмиды, содержащая cos-сайт фага лямбда и имеющая возможность упаковки в субъединицы лямбда-бактериофага. Они могут быть использованы в качестве векторов для клонирования генов в сочетании с системой in vitro. Описаны свойства серии космид на основе репликона ColE1, включая небольшие термочувствительные плазмиды [9]. Использование космид в определенных диапазонах размеров позволяет обеспечивать высокоэффективную систему клонирования, с помощью которой можно получать гибридные клоны, не прибегая ко второму этапу отбора или скрининга и без предварительной обработки ДНК (например, фосфатазой). Эти векторы можно амплифицировать в бактериях с использованием хлорамфеникола, благодаря которому они составляют около 50 % всей клеточной ДНК. Коллинз и Холман создали две плазмиды pJC75-58 и pJC75-37, содержащие сайты рестрикции для эндонуклеаз Bglll, EcoRI и BamH1, или только для BgH1 и EcoRI. В данных плазмидах удалена функция, необходимая для F-промотируемого конъюгационного переноса, и присутствует мутация в гене, контролирующем репликацию, что делает их температурно-чувствительными [10].

В конечном итоге два направления воздействия на клетки и организмы (клеточная инженерия и работа с нуклеиновыми кислотами) объединились и так возникла генетическая инженерия, а позднее — её современная разновидность, редактирование генома.

Один из ранних методов редактирования генома базируется на цинк-пальцевых нуклеазах (zinc-finger nucleases, ZFNs). Это химерные конструкции, состоящие из двух частей — белка типа Cys2-His2, способного связываться с ДНК, и нуклеазного домена FokI. Сконструировав цинк-пальцевую нуклеазу конкретной конфигурации, можно нацелить её на заранее определённый участок генома с целью управления транскрипцией отдельных генов — повышения или понижения транскрипционной активности [15].

Также редактирование генома возможно с помощью химерных эффекторных нуклеаз, подобных активаторам транскрипции (transcription activator-like effector nucleases, TALENs). Как и белки «цинковых пальцев», белки TALE обладают способностью связываться с ДНК, взаимодействуя с конкретной последовательностью нуклеоти-дов, зашифрованной в их структуре. Объединение TALE с доменом FokI позволяет создать нуклеазу, вносящую двухцепочечные разрывы в ДНК-мишень, что открывает большие возможности для дальнейшей рекомбинации [72].

НИЖНЕВОЛЖСКОГО АГРОУНИВЕРСИТЕТСКОГО КОМПЛЕКСА НАУКА И ВЫСШЕЕ ПРОФЕССИОНАЛЬНОЕ ОБРАЗОВАНИЕ

В 2012 году американский биохимик Дженнифер Дудна совместно с французским микробиологом Эммануэль Шарпантье разработали молекулярный инструмент, использующий кластерные короткие палиндромные повторы с регулярными интервалами (CRISPR). Это открытие заложило основу для создания принципиально нового способа редактирования генома, что позволило исследователям вносить конкретные изменения в последовательности ДНК технически более простым и часто более эффективным образом, чем предыдущие методы. Используя систему CRISPR/Cas9, ученые смогли исправить генетические дефекты у животных и изменить последовательности ДНК в эмбриональных стволовых клетках, что открыло путь к модификации генома зародышевой линии (сперматозоидов и яйцеклеток) у людей [20]. Дудна и Шарпантье разделили Нобелевскую премию по химии 2020 года за открытие и развитие технологий редактирования генов.

Метод редактирования генома CRISPR/Cas. CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats или же кластерные короткие палиндромные повторы с регулярными интервалами) представляют собой повторяющиеся последовательности, обнаруженные в бактериальных и архейных геномах, прерванные спейсерами, захваченными из ранее встречавшихся вирусных геномов и другой инвазивной ДНК. Их функция заключается в обеспечении формы адаптивного иммунитета через CRISPR-ассоциированные (Cas) белки, которые действуют как РНК-направленные эндонукле-азы, разрушая тот же тип инвазивной ДНК, если она встречается снова [16].

Система CRISPR/Cas заняла свое место в ряду других инструментов редактирования генома, таких как ZFN, гибридные ферменты и TALEN [39]. В настоящее время системы CRISPR/Cas можно разделить на несколько больших групп и два больших класса в зависимости от строения эффектора. Среди них выделяют системы I-VI типа со множеством подтипов, в зависимости от используемого белка Cas. Классификация проводилась на основе родства между отдельными белками [4, 25]. Например, к I типу относят семейства CRISPR, ассоциированные с белками Cas3, Cas5, Cas6 и Cas7. Системы II типа включают в себя только Cas9, именно они наиболее активно используются в качестве молекулярного инструмента. Системы III типа отличаются наличием RAMP (receptor activity-modifying proteins; белки, модифицирующие активность рецепторов), что делает их использование достаточно неудобным. Также в редактировании генома можно применять CRISPR типа V и VI, которые имеют строение эффектора, схожее с системами типа II.

Общий принцип действия систем CRISPR/Cas заключается в том, что бактерии захватывают фрагменты чужеродной ДНК длиной примерно 20 п.н, так называемые протоспейсеры, и включают их в геномную кассету CRISPR, таким образом протоспей-сер становится спейсером [1]. Захват происходит благодаря соседству протоспейсера с короткими последовательностями, называемыми смежным мотивом протоспейсера (PAM). Транскрипция кассеты дает длинный транскрипт, который преобразуется в более короткие РНК CRISPR (crRNA), каждая из которых представляет собой один спей-сер и CRISPR повтор. В дальнейшем, при проникновении в бактерию инфекционных агентов, белковые комплексы на основе Cas связываются с ДНК, содержащей PAM и протоспейсер, соответствующий crRNA, после чего происходит рестрикция и обезвреживание инфекционного агента.

В системах типа II CrRNA образует комплекс с эндонуклеазой Cas9 и трансакти-вирующей crRNA (tracrRNA), которая опосредует взаимодействие [1]. После связывания рибонуклеопротеина Cas9 (RNP) с чужерожной ДНК на обеих цепях происходит опосредованное эндонуклеазными доменами Cas9 RuvC и HNH расщепление происходит на три нуклеотида выше PAM [51].

НИЖНЕВОЛЖСКОГО АГРОУНИВЕРСИТЕТСКОГО КОМПЛЕКСА: НАУКА И ВЫСШЕЕ ПРОФЕССИОНАЛЬНОЕ ОБРАЗОВАНИЕ

Способность системы CRISPR/Cas9 распознавать специфические ДНК-мишени была использована для разработки платформы редактирования генома, управляемой РНК. Данная платформа является более универсальной, чем эквивалентные платформы, включающие белковые ДНК-связывающие модули [34]. Естественная система была преобразована в универсальную платформу для редактирования генома и сокращена до двух удобных компонентов (рисунок 1) [52]. Первый — это эндонуклеаза Cas9, обычно из Streptococcus pyogenes (Sp Cas9), которая для эукариотических мишеней снабжена сигналом ядерной локализации [21, 53]. Второй — это синтетическая направляющая РНК (sgRNA), в дальнейшем по тексту нРНК, объединяющая функции tracrRNA и crRNA естественной системы в единой молекуле [21, 59]. нРНК нацелена на уникальную последовательность из 20 пар оснований в геноме организма-хозяина, и может быть выбрана любая последовательность, если она примыкает к PAM. Оптимизированные по кодонам версии гена Cas9 обладают максимальной активностью у разных видов хозяев [5], хотя белок дикого типа также активен в гетерологичных системах, таких как протопласты риса и листья табака [14].

Рисунок 1 - Пример системы CRISPR / Cas9 для редактирования генома [52] Figure 1 - An example of a CRISPR/Cas9 system for genome editing [52]

При взаимодействии Cas9 и геномного сайта-мишени образуется двухцепочеч-ный разрыв ДНК (DSB, double strand breaks,), как это происходит в естественных условиях внутри бактерии. У высших эукариот DSB обычно восстанавливается с помощью негомологичного соединения концов (NHEJ), при котором часто возникают небольшие точечные мутации — инсерции и делеции, известные под общим названием indels или индели [53, 57]. Если донорская ДНК отсутствует, индели являются единственными следами редактирования и они часто используются для индукции мутаций со сдвигом рамки считывания путем нацеливания на экзон около 5'-конца гена, но если донорская ДНК присутствует, то она может быть встроена в месте разрыва. Эти процессы показа-

НИЖНЕВОЛЖСКОГО АГРОУНИВЕРСИТЕТСКОГО КОМПЛЕКСА: НАУКА И ВЫСШЕЕ ПРОФЕССИОНАЛЬНОЕ ОБРАЗОВАНИЕ

ны в верхней левой панели рисунка 2. Если имеются мутации в генах эндонуклеаз (например, RuvC с мутацией D10A или HNH с мутацией Н840А), тогда Cas9 становится никазой и две нРНК, соответствующие соседним геномным мишеням, могут генерировать ступенчатый двухцепочечный разрыв [1]. Это увеличивает точность нацеливания, поскольку специфичность зависит от двух сайтов-мишеней с общей уникальной длиной последовательности ~ 40 п.н., и любые повреждения вне мишени исправляются эндогенными системами репарации без введения ошибок, присущих негомологичной репарации DSB [26]. Другое преимущество ступенчатых разрывов состоит в том, что можно ввести донорскую ДНК с «липкими» концами, комплементарными концам ступенчатого разрыва, что облегчит встраивание [49]. Это показано на верхней правой панели рисунка 2. В качестве альтернативы двойным никазам можно также ввести ступенчатые разрывы с помощью эндонуклеазы Francisella novicida ^пСрП), которая в своем естественном состоянии относится к двухкомпонентным системам V типа. Она также производит DSB (и результирующий отступ) на дальнем конце целевого сайта, тем самым сохраняя исходную цель для последующих раундов редактирования, если это необходимо [12]. Если оба эндонуклеазных домена Cas9 мутированы, фермент становится каталитически неактивным, но все еще может связываться со своим целевым сайтом. Эти неактивные белки Cas9 (dCas9), называемые «мёртвыми», могут использоваться для решения различных задач, включая эпигенетическую модификацию и регуляцию транскрипции [19], или могут быть слиты с неспецифической эндонуклеазой, такой как Fok1, в качестве альтернативного способа получения ступенчатых DSB [17, 30].

Рисунок 2 - Возможные результаты редактирования генома с помощью CRISPR / Cas9 в зависимости от природы двухцепочечного разрыва (DSB), преобладающего пути репарации и присутствия донорской ДНК [52]

Figure 2 - Possible outcomes of genome editing with CRISPR/Cas9 depending on the nature of the double-strand break (DSB), the predominant repair pathway, and the presence of donor DNA [52]

НИЖНЕВОЛЖСКОГО АГРОУНИВЕРСИТЕТСКОГО КОМПЛЕКСА НАУКА И ВЫСШЕЕ ПРОФЕССИОНАЛЬНОЕ ОБРАЗОВАНИЕ

Сравнение с донорской ДНК также можно использовать для отбора в зависимости от наличия гомологически направленной репарации (HDR), которая обычна для микробов, но у эукариот встречается куда реже — 1 HDR на 105-106 NHEJ. Этот подход может использоваться либо для вставки донорской ДНК, либо для замены одного алле-ля другим, можно также вырезать целые гены или заменять отдельные нуклеотиды [21]. Иногда при гомологически направленной рекомбинации на границе вставленной ДНК могут возникать индели из-за того, что действует также механизм репарации, основанной на микрогомологии (MMEJ). Это особенно часто случается при использовании двойной никазы Cas9, поскольку она оставляет отступы на 5' и 3' концах. Эти процессы показаны на нижней панели рисунка 2. В диплоидных организмах целевые мутации могут быть гомозиготными, гетерозиготными или двуаллельными, причем последнее является результатом создания двух разных мутантных аллелей-мишеней [61].

Нецелевые мутации представляют некоторую степень риска при редактировании генома. Системы CRISPR изначально предназначены для обезвреживания бактериальных вирусов, ДНК которых имеет относительно малую длину. Однако при работе с более генетически ёмкими объектами, такими как растения и животные, следует учитывать большое число повторов отдельных нуклеотидных последовательностей. CRISPR/Cas9 действует на определенную последовательность нуклеотидов, которая может присутствовать не только в гене-мишени, но и других участках ДНК, что может привести ко множественным двухцепочечным разрывам. Для уменьшения этого риска следует выбирать как можно более уникальные последовательности.

Таким образом, система CRISPR/Cas9 является удобным инструментом для различных манипуляций с целевым геномом, имеющим относительно мало недостатков, и может быть использована для многих целей, таких как вставка, удаление и изменение нуклеотидных последовательностей.

Система CRISPR/Cas9 как инструмент для успешного редактирования гена миостатин (MSTN). Получив в руки новый надежный молекулярный инструмент для вмешательства в наследственный код, человечество обрело возможность использовать его в различных направлениях. Животных, геном которых отредактирован, можно использовать, среди прочего, в науке, медицине и сельском хозяйстве. На последнем остановимся подробнее.

Одним из наиболее известных генов, который используется в редактировании генома системой CRISPR/Cas9, является ген миостатина (MSTN). Миостатин (фактор роста и дифференцировки-8, GDF-8, кодируемый MSTN) - член суперсемейства белков трансформирующего фактора роста-Р (TGF-Р), является критическим аутокрин-ным/паракринным негативным регулятором массы скелетных мышц во время эмбриогенеза и раннего постнатального развития [48, 65]. Он преимущественно синтезируется и экспрессируется в скелетных мышцах и имеет высокую степень гомологии в структуре генов и сходную биологическую активность у широкого спектра животных [43, 44].

Модификация гена миостатина представляет определенный интерес для мясного животноводства, поскольку особи с мутациями в данном локусе демонстрируют увеличенную мышечную массу по сравнению с животными дикого типа. Хорошим примером может служить порода крупного рогатого скота Бельгийская голубая, полученная путем селекции на основе спонтанно возникшей мутации в гене MSTN. Сегодня с помощью редактирования генома получают модифицированные линии мелкого рогатого скота (овец и коз), кроликов, кур и т.д. [22, 45].

Так, в 2018 году группа ученых под руководством Zhengyi He сообщила об успешном получении отредактированных по гену MSTN KO (KO - knockout, означает удаление или повреждение гена до полного прекращения экспрессии) коз. С помощью системы

НИЖНЕВОЛЖСКОГО АГРОУНИВЕРСИТЕТСКОГО КОМПЛЕКСА НАУКА И ВЫСШЕЕ ПРОФЕССИОНАЛЬНОЕ ОБРАЗОВАНИЕ

CRISPR/Cas9 были внесены изменения в третий экзон гена, что привело к получению животных со среднесуточным приростом массы, значительно превышающим таковой у контрольной группы. При этом был показан аномальный метаболизм белков, жиров и углеводов по сравнению с козами дикого типа. Полученное от отредактированных животных потомство сохранило привнесенный генотип и демонстрировало соответственный генотипу фенотип, а также показало высокую генетическую стабильность и фертильность [69]. Таким образом, система CRISPR/Cas9 является подходящим инструментом для создания новых линий и пород животных, обладающих хозяйственно-полезными признаками.

Одним из преимуществ редактирования генома является возможность одновременно вносить несколько целенаправленных изменений в различные участки генома. Классическая генетическая инженерия решает этот вопрос ступенчато, либо созданием двух раздельных линий с последующей гибридизацией, либо чередой последовательных трансге-незов, что заметно увеличивает сроки получения животного с необходимыми признаками. Примером такого полиредактирования является опыт получения модифицированных по двум генам коз. В оплодотворенные яйцеклетки до первого деления были инъецированы мРНК Cas9 и четыре нРНК, нацеленных на два функциональных гена (вышеупомянутый MSTN и FGF5, ответственный за формирование шерстного покрова) [29]. Родившиеся животные обладали повышенной мышечной массой [13], увеличенным количеством волосяных фолликулов и более длинной шерстью [46]. При этом и сами экспериментальные козы, и их потомки были физиологически здоровы, а частота мутаций de novo у потомства в значительной степени оказалась эквивалентна частоте мутаций в других популяциях. Эти данные, а также результаты, полученные тем же коллективом при редактировании овец [71], показывают низкую частоту нецелевых мутаций, что подтверждает надежность и предсказуемость системы CRISPR/Cas9 как инструмента точечного воздействия на геном как для исследовательских, так и для утилитарных целей.

Подобные исследования проводились на кроликах. В 2016 году Lv Q. с коллегами сообщили о создании линии кроликов, нокаутных по гену миостатина и передающих эту модификацию потомкам [23]. Предварительно созданные целевые РНК протестировали на 12 зиготах, которые вырастили до бластоцисты и исследовали. В 10 (83,3 %) из исследованных эмбрионов обнаружили мутацию в гене MSTN, при этом в трех из них (25 %) изменения присутствовали в обоих аллелях гена. После подтверждения эффективности системы во втором этапе эксперимента 158 инъецированных зигот были помещены в яйцеводы четырех крольчих. Из 20 родившихся живых крольчат, обозначенных в исследовании как поколение F0, мутация была обнаружена у 16, при этом indels варьировались от 3 до 76 пар нуклеотидов. MSTN KO кролики демонстрировали характерный для этой мутации фенотип, и уже в 4 месяца были значительно крупнее кроликов нормального типа в аналогичном возрасте. Для проверки наследования скрестили самку и самца из поколения F0. Из 9 потомков 5 имели одну копию мутантного гена и 2 — две копии, что соответствует закону расщепления признака.

В исследовании Lv также была проведена проверка на наличие или отсутствие нецелевых мутаций. Предварительно отобранные POTS (потенциальные нецелевые сайты) были амплифицированы и отсеквенированы по методу Сэнгера. Результаты показали отсутствие нецелевых мутаций в данных участках. Исследователи связывают это с тем, что система CRISPR/Cas9 быстро деградировала после внесения изменений в ген миостатина и не взаимодействовала с другими участками [23].

Система CRISPR/Cas9 хорошо работает и в сочетании с другими молекулярными методами. Так, в 2017 году была получена линия генетически редактированных свиней с нокаутным геном миостатина, свободная от селективного маркерного гена (selectable

НИЖНЕВОЛЖСКОГО АГРОУНИВЕРСИТЕТСКОГО КОМПЛЕКСА НАУКА И ВЫСШЕЕ ПРОФЕССИОНАЛЬНОЕ ОБРАЗОВАНИЕ

marker gene, SMG). На первом этапе ген MSTN нокаутировали при помощи CRISPR/Cas9, а затем рекомбиназой Cre вырезали SMG (эффективность вырезания составила 82,7 %). Клетки, не содержащие маркерного гена, использовали для получения свиней методом переноса ядра. Всего 685 эмбрионов были имплантированы трем реци-пиентным свиноматкам, у одной из них наступила беременность, завершившаяся рождением двух живых самцов. Исследование ДНК полученных поросят показало у обоих отсутствие селективного маркерного гена и моноаллельное разрушение локуса MSTN. По достижении 6 месяцев были изучены такие фенотипические признаки, как размер мышечной массы и толщина подкожного жира, и оба животных демонстрировали характерный для MSTN KO животных фенотип — усиленный рост скелетных мышц и снижение накопления жира [37].

Рост и развитие скелетных мышц тесно связаны с мясной продуктивностью не только млекопитающих (свиньи, кролики, крупный рогатый скот), но и птицы. Механизм регуляции роста мышц у кур в настоящее время активно изучается, о чем свидетельствуют исследования по анализу транскриптома быстрорастущих и медленнорастущих групп куриц Jinghai Yellow [24], сравнение мышц куриных ног на трех различных стадиях развития [66] и изучение мышцы куриной грудки на 6-й и 21-й день после вылупления [50]. В результате этих исследований были обнаружены некоторые ключевые гены (например, MSTN и IGF1), участвующие в регуляции роста и развития мышц. Биоинформатический анализ показал, что ген MSTN расположен на 7-й хромосоме и содержит 5493 п.н. и три экзона [40, 55].

У кур предыдущие исследования были сосредоточены на связи между мутациями гена MSTN и признаками роста [67, 68], но лишь немногие исследования изучали молекулярные механизмы роста и развития мышц с использованием редактирования генов. По этой причине использование технологий геномного редактирования на основе системы CRISPR/Cas теперь имеет исключительные перспективы для продвижения исследований MSTN на цыплятах.

В настоящее время технология редактирования генома не получила широкого применения для создания новых линий сельскохозяйственных птиц. Одним из ограничений является то, что для птиц характерно внешнее эмбриональное развитие, а сформированное яйцо содержит более 60 000 эмбриональных клеток, что затрудняет получение трансгенных цыплят по зародышевой линии. Следовательно, предыдущие применения CRISPR/Cas9 у кур в основном были исследованиями in vitro [41].

Способность системы AdV-CRISPR вносить изменения в ген миостатина доказали, трансдуцировав ее в клетки DF-1 и выполнив ПЦР с использованием ДНК, выделенной из клеток DF-1. Электрофорез в агарозном геле выявил полосу 550 п.н. для продукта MSTN в клетках, трансдуцированных системой AdV-CRISPR после предсказанной делеции 5093 п.н., тогда как в контрольных клетках полосы не было [42, 54]. Продукты ПЦР были клонированы в вектор для клонирования ТА, и данные секвенирова-ния отдельных клонов подтвердили делецию большого фрагмента. Эти результаты подтвердили функцию редактирования генов системы AdV-CRISPR для MSTN в куриных клетках. В дальнейшем систему AdV-CRISPR доставили в переднюю большеберцовую мышцу цыплят, а затем собрали мышечные ткани у цыплят в возрасте 3 и 14 дней. С использованием РНК, выделенной из мышц, была проведена ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Продукты ОТ-ПЦР также были клонированы в вектор клонирования ТА, и данные секвенирования отдельных клонов подтвердили, что все мышцы, подвергшиеся действию системы AdV-CRISPR, были идентифицированы как имеющие делеционный мутант с числом удаленных нуклеотидов в мРНК в диапазоне от 736 до

НИЖНЕВОЛЖСКОГО АГРОУНИВЕРСИТЕТСКОГО КОМПЛЕКСА НАУКА И ВЫСШЕЕ ПРОФЕССИОНАЛЬНОЕ ОБРАЗОВАНИЕ

783 нуклеотидов. Определение уровня экспрессии MSTN с помощью ПЦР в реальном времени выявило значительное подавление экспрессии MSTN (p<0.001) в мышцах 14-дневных цыплят MSTN KO по сравнению с мышцами 14-дневных цыплят дикого типа. Делеция от 736 до 783 нуклеотидов в мРНК может вызвать делецию до 261 аминокислоты в белке MSTN [35, 36].

Подавление миостатина и двух его рецепторов, а именно ACVR2A и ACVR2B, значительно (P <0,05) влияет на массу тела курицы в разном возрасте. В суточном возрасте подавление гена MSTN показало самую высокую массу тела у цыплят. На 28-й день подавление только ACVR2B и MSTN и комбинация MSTN, ACVR2A и ACVR2B показало более высокую массу тела, чем у контрольной группы птиц. Однако трансгенные птицы, у которых был подавлен гена ACVR2B, имели наибольшую массу тела в возрасте 28 (454,2 ± 18,7 г), 35 (703,4 ± 20,6 г) и 42 (779,1 ± 21,4 г) дней. В случае сбоя MSTN и тройного сбоя MSTN, ACVR2A и ACVR2B генов соответственно, масса тела на 35 сутки (668,3 ± 12,2 и 657,2 ± 32,4 г) и 42 сутки (735,9 ± 14,0 и 732,1 ± 32,8 г) была достоверно выше, чем в контрольной группе (581,5 ± 8,8 и 639,1 ± 10,3 г) [11].

Подобные исследования проводились и ранее, в 2017 году. Тогда сайты направляющей РНК-мишени (gRNA) были созданы в соответствии с последовательностями смежных мотивов протоспейсера (PAM). Сайты-мишени никазы Cas9-D10A были сконструированы в экзоне 1 гена MSTN курицы. Две мРНК, нацеленые на последовательности левой и правой гРНК длиной 20 и 19 пар оснований соответственно, были сконструированы со смещением +7 пар оснований, таким образом, целевые сайты имели 5'-выступ на 43 п.н. после опосредованных Cas9-D10A разрывов ДНК никазой. После ко-трансфекции векторов экспрессии никазы-GFP и гРНК MSTN в куриные DF1 клетки, GFP-положительные клетки были отсортированы с помощью FACS. Впоследствии стабильные клетки DF1 с нокаутом MSTN были отобраны после сортировки и культивирования in vitro. Не было значительных фенотипических различий между обычными клетками DF1 и клетками с нокаутом MSTN. В клетках DF1 с нокаутом MSTN, индуцированным никазой Cas9-D10A, были идентифицированы различные мутантные генотипы смешанной популяции. Неожиданно все генотипы были идентифицированы как деле-ционные мутанты, а количество удаленных нуклеотидов составляло от 2 до 39 нуклеотидов. Эти мутантные генотипы могут вызывать сдвиг рамки считывания открытой рамки считывания или делецию 13 аминокислот в белке миостатина. Для подтверждения экспрессии белка миостатина был проведен вестерн-блоттинг со специфическими антителами против куриного миостатина. По сравнению с обычными клетками DF1, в клетках DF1 с нокаутом MSTN не было обнаружено положительного сигнала, что указывает на то, что система нокаута, опосредованная Cas9-D10A никазой, эффективно и полностью нарушает экспрессию белка миостатина в куриных клетках [42].

Достижения в области редактирования системой CRISPR/CAS9 хозяйственно-важных признаков. Несмотря на то, что миостатин оказывает заметное влияние на мышечный каркас, есть и иные гены, способные повлиять на мясную продуктивность. Например, ген супрессорной передачи цитокинов 2 (SOCS2) оказывает заметное влияние на массу, размер тела и производство молока у овец. Редактирование генома позволило усилить признаки роста после проведения точечной мутации в данном гене [56].

Кроме мясной продуктивности, существуют и другие хозяйственно-важные признаки. Так, фактор роста фибробластов 5 (FGF5) играет важную роль в определении длины шерсти у собак [8, 33], кошек [47] и мышей [27]. В исследовании Wang с соавторами [ 18] было показано, что увеличение длины волокон у кашемировых коз вызывается нокаутными аллелями в FGF5. Были получены генетически отредактированные козы

НИЖНЕВОЛЖСКОГО АГРОУНИВЕРСИТЕТСКОГО КОМПЛЕКСА НАУКА И ВЫСШЕЕ ПРОФЕССИОНАЛЬНОЕ ОБРАЗОВАНИЕ

с нокаутом гена FGF5 [29]. Животные развивались нормально и сохраняли относительно хорошее здоровье. Начиная с 30-го дня (D30) после рождения и каждые 30 дней авторы измеряли длину как остевого волоса, так и подшерстка. Результаты показали, что, за исключением длины остевого волоса на 30-й день, длина шерсти у коз с нокаутом FGF5 (n = 6) была значительно больше, чем в контрольной группе (n = 20) от D30 до D120 (p<0,05). Помимо более длинной шерсти, продуктивность кашемира у редактированных животных оказалась выше, чем у WT на D120 (p = 0.018), со средним увеличением на 92.75 г кашемира для каждого животного. Оценка выхода кашемира, а также диаметра и длины волокон, которые являются тремя наиболее экономически важными характеристиками у кашемировых коз, показала, что отредактированные с помощью системы CRISPR/Cas9 козы с нокаутированным геном FGF5 демонстрируют увеличенную длину волокна и общую продуктивность при неизменной толщине [18].

Для производства шерсти важным признаком является не только длина и тонина волоса, но и цвет. Наибольшей ценностью обладает белая шерсть. В 2017 году, выбрав в качестве мишени ген сигнального белка агути (ASIP), коллектив авторов из института биотехнологии животных [2] получил несколько ягнят с отредактированными генами. Была разработана сигнальная РНК, направленная на второй экзон гена, после чего в 105 зигот китайского мериноса была инъецирована CRISPR/Cas9. Всего родилось шесть ягнят, из них один обладал белым окрасом, остальные пять отличались разнообразным цветным рисунком на шерсти. Анализ их ДНК показал, что, помимо целевого изменения гена, произошли дополнительные спонтанные мутации. Данный пример показывает, что технология редактирования генома все еще не дает стопроцентного результата и нуждается в совершенствовании, дабы избежать нецелевого изменения генетического кода.

Еще одним примером удачного редактирования генома сельскохозяйственных животных можно назвать использование овец в качестве биореакторов — природных систем для получения биологически активных веществ. Трансгенные животные, в частности, коровы, овцы и козы, уже давно используются для производства некоторых биологически активных веществ в молоке, например, лизоцима, лактоферрина, эритропоэ-тина [32, 58]. Теперь таких животных получили с помощью CRISPR/Cas9 [3]. В качестве целевого продукта был выбран мощный антиоксидант мелатонин. Гены AANAT и ASMT, связанные с синтезом мелатонина, были активированы в эпителии молочных желез овец. Результатом стали овцы, в чьем молоке находилось значительно больше мела-тонина, чем у животных дикого типа.

Таким образом, редактирование генома позволяет улучшать различные параметры сельскохозяйственных животных, такие как их мясная продуктивность, качество шерсти и молока.

Выводы. CRISPR/Cas системы существуют в природе долгие тысячи лет как часть иммунной системы прокариот. Однако универсальность и точность этих «молекулярных ножниц» в сочетании с системами репарации ДНК позволяют использовать кластерные короткие палиндромные повторы и ассоциированные с ними белки в качестве удобного инструмента редактирования генома, наряду с такими методами, как ZFN и TALEN. Наибольший интерес в ряду CRISPR/Cas систем представляют системы 2 класса и особенно II типа, ассоциированные с белком Cas9. Именно они отличаются наибольшей вариативностью и удобством применения. Благодаря CRISPR/Cas9 было получено множество генетически отредактированных животных, при этом исследования показывают высокую эффективность данного способа вмешательства в наследственный аппарат.

Метод редактирования генома с помощью системы CRISPR/Cas9 не только достаточно удобен для проведения лабораторных исследований, но и перспективен для последующего создания линий и пород высокопродуктивных сельскохозяйственных животных.

НИЖНЕВОЛЖСКОГО АГРОУНИВЕРСИТЕТСКОГО КОМПЛЕКСА НАУКА И ВЫСШЕЕ ПРОФЕССИОНАЛЬНОЕ ОБРАЗОВАНИЕ

Библиографический список

1. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity / M. Jinek, K. Chylinski, I. Fonfara, M. Hauer, J. A. Doudna, E. Charpentie // Science. 2012. V. 337. P. 816-821.

2. Alteration of sheep coat color pattern by disruption of ASIP gene via CRISPR Cas9 / X. Zhang, W. Li, C. Liu, X. Peng, J. Lin, S. He, X. Li, B. Han, N. Zhang, Y. Wu, L. Chen, L. Wang, J. Huang, M. Liu // Sci. Rep. 2017. V. 7(1). P. 8149.

3. An AANAT/ASMT transgenic animal model constructed with CRISPR/Cas9 system serving as the mammary gland bioreactor to produce melatonin-enriched milk in sheep / T. Ma, J. Tao, M. Yang, C. He, X. Tian, X. Zhang, J. Zhang, S. Deng, J. Feng, Z. Zhang, J. Wang, P. Ji, Y. Song, P. He, H. Han, J. Fu, Z. Lian, G. Liu // J. Pineal Res. 2017. V. 63.

4. An updated evolutionary classification of CRISPR-Cas systems / K. S. Makarova, Y. I. Wolf, O. S. Alkhnbashi, F. Costa, S. A. Shah, S. J. Saunders, R. Barrangou // Nat. Rev. Microbiol. 2015. V. 13. P. 722- 736.

5. Bortesi L., Fischer R. The CRISPR/Cas9 system for plant genome editing and beyond // Bi-otechnol. Adv. 2015. V. 33. P. 41-52.

6. Briggs R., Green U., King T. An investigation of the capacity for cleavage and differentiation in Rana pipiens eggs lacking ''functional" chromosomes // J. Exp. Zool. 1951. V. 116. № 3. P. 455-499.

7. Briggs R., King T. Factors affecting the transplantability of nuclei of frog embryonic cells // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1953. V. 38. № 5. P. 455-463.

8. Coat Variation in the Domestic Dog Is Governed by Variants in Three Genes / E. Cadieu, M. W. Neff, P. Quignon, K. Walsh, K. Chase, H. G. Parker // Science. 2009. V. 326. P. 150-153.

9. Collins J., Hohn B. Cosmids: a type of plasmid gene-cloning vector that is packageable in vitro in bacteriophage lambda heads // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1978. V. 75 № 9. P. 4242-4246.

10. Collins J., Brüning H. J. Plasmids useable as gene-cloning vectors in an in vitro packaging by coliphage lambda: "cosmids" // Gene. V. 4 № 2. P. 85-107.

11. Comparative analysis of silencing expression of myostatin (MSTN) and its two receptors (ACVR2A and ACVR2B) genes affecting growth traits in knock down chicken / T. K. Bhattacharya, R. Shukla, R. N. Chatterjee, S. K. Bhanja // Sci Rep. 2019. V. 9(1). P. 7789.

12. Cpf1 Is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system / B. Zetsche, J. S. Gootenberg, O. O. Abudayyeh, I. M. Slaymaker, K. S. Makarova, P. Essletzbichler, S. E. Volz [et al.] // Cell. 2015. V. 163. P. 759-771.

13. CRISPR/Cas9-mediated MSTN disruption and heritable mutagenesis in goats causes increased body mass / X. Wang, Y. Niu, J. Zhou, H. Zhu, B. Ma, H. Yu // Anim. Genet. 2018. V. 49. P. 43-51.

14. Demonstration of CRISPR/Cas9/sgRNA-mediated targeted gene modification in Ara-bidopsis, tobacco, sorghum and rice / W. Jiang, H. Zhou, H. Bi, M. Fromm, B. Yang, D. P. Weeks // Nucleic Acids Res. 2013. V. 41. № 20. P. e188.

15. Design of polydactyl zinc-finger proteins for unique addressing within complex genomes / Q. Liu, D. J. Segal, J. B. Ghiara, C. F. Barbas // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1997. V. 94. № 11. P. 5525-5530.

16. Designed nucleases for targeted genome editing / J. Lee, J. H. Chung, H. M. Kim, D. W. Kim, H. Kim // Plant Biotechnol. J. 2015. V. 14, P. 448-462.

17. Dimeric CRISPR RNA-guided FokI nucleases for highly specific genome editing / S. Q. Tsai, N. Wyvekens, C. Khayter, J. A. Foden, V. Thapar, D. Reyon, M. J. Goodwin [et al.] // Nat. Biotechnol. 2014. V. 32. P. 569- 576.

18. Disruption of FGF5 in Cashmere Goats Using CRISPR/Cas9 Results in More Secondary Hair Follicles and Longer Fibers / X. Wang, B. Cai, J. Zhou, H. Zhu, Y. Niu, B. Ma, H. Yu, A. Lei, H. Yan, Q. Shen, L. Shi, X. Zhao, J. Hua, X. Huang, L. Qu, Y. Chen // PLoS One. 2016. V. 11(10). P. e0164640.

19. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases / P. D. Hsu, D. A. Scott, J. A. Weinstein, F. A. Ran, S. Konermann, V. Agarwala, Y. Li // Nat. Biotechnol. 2013. V. 31. P. 827- 832.

НИЖНЕВОЛЖСКОГО АГРОУНИВЕРСИТЕТСКОГО КОМПЛЕКСА НАУКА И ВЫСШЕЕ ПРОФЕССИОНАЛЬНОЕ ОБРАЗОВАНИЕ

20. Doudna J. A., Sontheimer E. J. Methods in Enzymology. Preface. // Methods Enzymol. 2014.V. 546. P. 19-20.

21. Editing plant genomes with CRISPR/Cas9 / K. Belhaj, A. Chaparro-Garcia, S. Kamoun, N. J. Patron, V. Nekrasov // Curr. Opin. Biotechnol. 2015. V. 32. P. 76-84.

22. Efficient Generation of Myostatin Knock-Out Sheep Using CRISPR/Cas9 Technology and Microinjection into Zygotes / M. Crispo, A. P. Mulet, L. Tesson, N. Barrera, F. Cuadro, P. C. dos Santos-Neto, T. N. Nguyen, A. Crénéguy, L. Brusselle, I. Anegón, A. Menchaca // PLoS One. 2015. V. 10. № 8. P. e0136690.

23. Efficient Generation of Myostatin Gene Mutated Rabbit by CRISPR/Cas9 / Q. Lv, L. Yuan, J. Deng, M. Chen, Y. Wang, J. Zeng, Z. Li, L. Lai // Sci. Rep. 2016. V. 6. P. 25029.

24. Effective MSTN Gene Knockout by AdV-Delivered CRISPR/Cas9 in Postnatal Chick Leg Muscle / K. Xu, C. X. Han, H. Zhou, J. M. Ding, Z. Xu, L. Y. Yang, C. He, F. Akinyemi, Y. M. Zheng, C. Qin, H. X. Luo, H. Men // Int. J. Mol. Sci. 2020. V. 21. № 7. P. 2584.

25. Evolution and classification of the CRISPR-Cas systems / K. S. Makarova, D. H. Haft, R. Barrangou, S. J. Brouns, E. Charpentier, P. Horvath, S. Moineau // Nat. Rev. Microbiol. 2011. V. 9 P. 467-477.

26. Fauser F., Schiml S., Puchta H. Both CRISPR/Cas-based nucleases and nickases can be used efficiently for genome engineering in Arabidopsis thaliana // Plant J. 2014. V. 79. P. 348-359.

27. FGF5 as a regulator of the hair growth cycle: evidence from targeted and spontaneous mutations / J. M. Hébert, T. Rosenquist, J. Götz, G. R. Martin // Cell. 1994. V. 78. P. 1017-1025.

28. Flickinger R. A study of the metabolism of amphibian neural crest cells during their migration and pigmentation in vitro // J. Exp. Zool. 1949. V. 112. № 3. P. 465-84.

29. Generation of gene-modified goats targeting MSTN and FGF5 via zygote injection of CRISPR/Cas9 system / X. Wang, H. Yu, A. Lei, J. Zhou, W. Zeng, H. Zhu, Z. Dong, Y. Niu, B. Shi, B. Cai, J. Liu, S. Huang, H. Yan, X. Zhao, G. Zhou, X. He, X. Chen, Y. Yang, Y. Jiang, L. Shi, X. Tian, Y. Wang, B. Ma, X. Huang, L. Qu, Y. Chen // Sci. Rep. 2015. V. 5. P. 13878.

30. Guilinger J. P., Thompson D. B., Liu D. R. Fusion of catalytically inactive Cas9 to FokI nuclease improves the specificity of genome modification // Nat. Biotechnol. 2014. V. 32. P. 577- 582.

31. Gurdon J. B. The developmental capacity of nuclei taken from intestinal epithelium cells of feeding tadpoles // J. Embryol. Exp. Morphol. 1962. V. 10 P. 622-640.

32. Houdebine L. M. Transgenic animal bioreactors // Transgenic Res. 2000. V. 9 (4). P. 305320.

33. Housley D. J., Venta P. J. The long and the short of it: evidence that FGF5 is a major determinant of canine 'hair'-itability // Anim Genet. 2006. 37(4). P. 309-15.

34. Hsu P. D., Lander E. S., Zhang F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering // Cell. 2014. V. 157. P. 1262-1278.

35. In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy / C. E. Nelson, C. H. Hakim, D. G. Ousterout, P. I. Thakore, E. A. Moreb, R. M. Castellanos Rivera, S. Madhavan, X. Pan, F. A. Ran, W. X. Yan // Science. 2016. V. 351. P. 403-407.

36. In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells / M. Tabebordbar, K. Zhu, J. K. Cheng, W. L. Chew, J. J. Widrick, W. X. Yan, C. Maesner, E. Y. Wu, R. Xiao, F. A. Ran // Science. 2016. V. 351. P. 407-411.

37. Isozygous and selectable marker-free MSTN knockout cloned pigs generated by the combined use of CRISPR/Cas9 and Cre/LoxP / Y. Bi, Z. Hua, X. Liu, W. Hua, H. Ren, H. Xiao, L. Zhang, L. Li, Z. Wang, G. Laible, Y. Wang, F. Dong, X. Zheng // Sci. Rep. 2016. V. 6. P. 31729.

38. Jackson D. A., Symons R. H., Berg P. Biochemical method for inserting new genetic information into DNA of Simian Virus 40: circular SV40 DNA molecules containing lambda phage genes and the galactose operon of Escherichia coli // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1972. V. 69. № 10. P. 2904-2909.

39. Kumar V., Jain M. The CRISPR-Cas system for plant genome editing: advances and opportunities // J. Exp. Bot. 2015. V. 66, P. 47-57.

НИЖНЕВОЛЖСКОГО АГРОУНИВЕРСИТЕТСКОГО КОМПЛЕКСА НАУКА И ВЫСШЕЕ ПРОФЕССИОНАЛЬНОЕ ОБРАЗОВАНИЕ

40. Lee S. J. Quadrupling muscle mass in mice by targeting TGF-beta signaling pathways // PLoS ONE. 2007. V. 2. P. e789.

41. Lee S. J. Regulation of muscle mass by myostatin // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2004. V. 20. P. 61-86.

42. Lee J. H., Kim S. W., Park T. S. Myostatin gene knockout mediated by Cas9-D10A nickase in chicken DF1 cells without off-target effect // Asian-Australas. J. Anim. Sci. 2017. V. 30. P. 743-748.

43. McPherron A. C., Lawler A. M., Lee S. J. Regulation of skeletal muscle mass in mice by a new TGF-beta superfamily member // Nature. 1997. V. 387. P. 83-90.

44. McPherron A. C., Lee S. J. Double muscling in cattle due to mutations in the myostatin gene // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1997. V. 94. P. 12457-61.

45. Menchaca A., Dos Santos-Neto P. C., Mulet A. P., Crispo M. CRISPR in livestock: From editing to printing // Theriogenology. 2020. V. 150. P. 247-254.

46. Multiplex gene editing via CRISPR/Cas9 exhibits desirable muscle hypertrophy without detectable off-target effects in sheep / X. Wang, Y. Niu, J. Zhou, H. Yu, Q. Kou, A. Lei, X. Zhao, H. Yan, B. Cai, Q. Shen, S. Zhou, H. Zhu, G. Zhou, W. Niu, J. Hua, Y. Jiang, X. Huang, B. Ma, Y. Chen // Sci Rep. 2016. V. 6. P. 32271.

47. Mutations within the FGF5 gene are associated with hair length in cats / C. Drogemüller, S. Rüfenacht, B. Wichert, T. Leeb // Animal Genetics. 2007. V. 38. P. 218-221.

48. Myostatin acts as an autocrine/paracrine negative regulator in myoblast differentiation from human induced pluripotent stem cells / F. Gao, T. Kishida, A. Ejima, S. Gojo, O. Mazda // Bio-chem. Biophys. Res. Commun. 2013. V. 431. P. 309-14.

49. Obligate ligation-gated recombination (ObLiGaRe): custom-designed nuclease-mediated targeted integration through nonhomologous end joining / M. Maresca, V. G. Lin, N. Guo, Y. Yang // Genome Res. 2013. V. 23. P. 539-546.

50. Oksbjerg N., Therkildsen M. Myogenesis and muscle growth and meat quality // New Aspects of Meat Quality. Amsterda: Elsevier. 2017. P. 33-62.

51. Osakabe Y., Osakabe K. Genome editing with engineered nucleases in plants // Plant Cell Physiol. 2015. V. 56. P. 389-400.

52. Patterns of CRISPR/Cas9 activity in plants, animals and microbes / L. Bortesi, C. Zhu, J. Zischewski, L. Perez, L. Bassié, R. Nadi, G. Forni, S. B. Lade, E. Soto, X. Jin, V. Medina, G. Villorbina, P. Muñoz, G. Farré, R. Fischer, R. M. Twyman, T. Capell, P. Christou, S. Schillberg // Plant Biotechnol. J. 2016. V. 14. № 12. P. 2203-2216.

53. Plant genome editing made easy: targeted mutagenesis in model and crop plants using the CRISPR/Cas system / K. Belhaj, A. Chaparro-Garcia, S. Kamoun, V. Nekrasov // Plant Methods. 2013. V. 9. P. 39.

54. Postnatal genome editing partially restores dystrophin expression in a mouse model of muscular dystrophy / C. Long, L. Amoasii, A. A. Mireault, J. R. McAnally, H. Li, E. Sanchez-Ortiz, S. Bhattacharyya, J. M. Shelton, R. Bassel-Duby, E. N. Olson // Science. 2016. V. 351. P. 400-403.

55. Production of a monoclonal anti-myostatin antibody and the effects of in ovo administration of the antibody on posthatch broiler growth and muscle mass / Y. S. Kim, N. K. Bobbili, K. S. Paek, H. J. Jin // Poult. Sci. 2006. V. 85. P. 1062-1071.

56. Programmable Base Editing of the Sheep Genome Revealed No Genome-Wide Off-Target Mutations / S. Zhou, B. Cai, C. He, Y. Wang, Q. Ding, J. Liu, Y. Liu, Y. Ding, X. Zhao, G. Li, C. Li, H. Yu, Q. Kou, W. Niu, B. Petersen, T. Sonstegard, B. Ma, Y. Chen, X. Wang // Front Genet. 2019. V. 10. P. 215.

57. Quétier F. The CRISPR-Cas9 technology: closer to the ultimate toolkit for targeted genome editing // Plant Sci. 2016. V. 242. P. 65-76.

58. Samiec M., Skrzyszowska M. Transgenic mammalian species, generated by somatic cell cloning, in biomedicine, biopharmaceutical industry and human nutrition/dietetics-recent achievements // Pol. J. Vet. Sci. 2011. V. 14(2). P. 317-328.

59. Sander J. D., Joung J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes // Nat. Biotechnol. 2014. V. 32. P. 347-355.

НИЖНЕВОЛЖСКОГО АГРОУНИВЕРСИТЕТСКОГО КОМПЛЕКСА НАУКА И ВЫСШЕЕ ПРОФЕССИОНАЛЬНОЕ ОБРАЗОВАНИЕ

60. Sanger F., Coulson A. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase // J. Mol. Biol. 1975. V. 94. № 3. P. 441-448.

61. Schiml S., Fauser F., Puchta H. Repair of adjacent single-strand breaks is often accompanied by the formation of tandem sequence duplications in plant genomes // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2016. V. 113. P. 7266-7271.

62. Smith H. O., Wilcox K. W. A restriction enzyme from Haemophilus influenzae: I. Purification and general properties // J. Mol. Biol. 1970. V. 51. № 2. P. 379-391.

63. Spemann H. Embryonic Development and Induction. N.Y.: Hafner Publishing Company, 1962.401 p.

64. Spemann H. Embryonic Induction // American Zoologist. 1987. V. 27. № 2. P. 575-579.

65. The regulation and action of myostatin as a negative regulator of muscle development during avian embryogenesis / H. Amthor, R. Huang, I. McKinnell, B. Christ, R. Kambadur, M. Sharma, K. Patel // Dev. Biol. 2002. V. 251. P. 241-57.

66. Transcriptome Analysis of Differentially Expressed Genes Related to the Growth and Development of the Jinghai Yellow Chicken / F. Chen, P. Wu, M. Shen, M. He, L. Chen, C. Qiu, H. Shi, T. Zhang, J. Wang, K. Xie // Genes. 2019. V. 10. P. 539.

67. Transcriptome Analysis of Post-Hatch Breast Muscle in Legacy and Modern Broiler Chickens Reveals Enrichment of Several Regulators of Myogenic Growth / R. V. N. Davis, S. J. La-mont, M. F. Rothschild, M. E. Persia, C. M. Ashwell, C. J. Schmidt // PLoS ONE. 2015. V. 10. P. e0122525.

68. Transcriptomic profile of leg muscle during early growth in chicken / Q. Xue, G. Zhang, T. Li, J. Ling, X. Zhang, J. Wang // PLoS ONE. 2017. V. 12. P. e0173824.

69. Use of CRISPR/Cas9 technology efficiently targetted goat myostatin through zygotes microinjection resulting in double-muscled phenotype in goats / Z. He, T. Zhang, L. Jiang, M. Zhou, D. Wu, J. Mei, Y. Cheng // Biosci. Rep. 2018. V. 38. № 6. P. BSR20180742.

70. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells / I. Wilmut, A. E. Schnieke, J. McWhir, A. J. Kind, K. H. Campbell // Nature. 1997. V. 385. P. 810-813.

71. Wang X., Liu J., Niu Y. Low incidence of SNVs and indels in trio genomes of Cas9-mediated multiplex edited sheep // BMC Genomics. 2018. V. 19. P. 397.

72. Yoshida K., Treen N. TALEN-Based Knockout System // Adv. Exp. Med. Biol. 2018. V. 1029. P.131-139.

Информация об авторах: Полтева Екатерина Андреевна, младший научный сотрудник Всероссийского научно-исследовательского института генетики и разведения сельскохозяйственных животных, филиала Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Федеральный научный центр животноводства — ВИЖ имени академика Л. К. Эрнста». (196625, г. Санкт-Петербург, пос. Тярлево, Московское шоссе, д. 55а). ORCID: 0000-0001-9082-3059; E-mail: ketlin.liselse@yandex.ru Ларкина Татьяна Александровна, кандидат биологических наук, младший научный сотрудник Всероссийского научно-исследовательского института генетики и разведения сельскохозяйственных животных, филиала Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Федеральный научный центр животноводства — ВИЖ имени академика Л. К. Эрнста». (196625, г. Санкт-Петербург, пос. Тярлево, Московское шоссе, д. 55а). ORCID: 0000-0002-7764-1338; E-mail: tanya.larkina2015@yandex.ru

Пегливанян Григорий Карапетович, аспирант, младший научный сотрудник Всероссийского научно-исследовательского института генетики и разведения сельскохозяйственных животных, филиала Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Федеральный научный центр животноводства — ВИЖ имени академика Л. К. Эрнста». (196625, г. Санкт-Петербург, пос. Тярлево, Московское шоссе, д. 55а). ORCID: 0000-0001-5194-4851; E-mail: peglivanian_grig@mail.ru Баркова Ольга Юрьевна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Всероссийского научно-исследовательского института генетики и разведения сельскохозяйственных животных, филиала Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Федеральный научный центр животноводства — ВИЖ имени академика Л. К. Эрнста». (196625, г. Санкт-Петербург, пос. Тярлево, Московское шоссе, д. 55а). ORCID: 0000-0002-0963-905X; E-mail: barkoffws@list.ru