МИШЕНЬ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИОННОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ЛАЗЕРНЫХ ВРЕМЯПРОЛЕТНЫХ МАСС-СПЕКТРОМЕТРОВ С МАТРИЧНЫМ ТИПОМ ИОНИЗАЦИИ БИООБРАЗЦОВ

Область техники, к которой относится полезная модель
Настоящая полезная модель относится к области масс-спектрометрии.
Уровень техники
В предшествующем уровне техники настоящей полезной модели существовала потребность в повышении эффективности методики выполнения масс-спектрометрических измерений белков в составе тканевого материала. Такого рода измерения могут быть использованы, например, для определения токсического воздействия веществ на организм по изменению белкового профиля.
Обычно калибровка детекторов производится с использованием стандартных образцов веществ (аналитических стандартов), индивидуальных соединений и калибровочных смесей [Malyarenko D.I. et al. Clin Chem - 2005 - №51(1)-65-74; Brock A. et al. Anal Chem - 2003 - №75(14)-3419-28], поставляемых компаниями-производителями масс-спектрометрического оборудования. Аналитические стандарты, используемые в биологии и медицине, делятся на две категории. К первой категории относятся аналитические стандарты, представляющие собой чистый раствор белков [Zaia J. et al. Rapid Commun Mass Spectrom - 1992 - №6(1)-32-6]. Вторая категория аналитических стандартов - это плазма крови [Zhao Y. et al. Rapid Commun Mass Spectrom - 2008 - №22(20)-3217-24; Mata-Bilbao Mde L. et al. J Agric Food Chem - 2007 - №55(22)-8857-63].
Существующие методики выполнения масс-спектрометрических измерений ориентированы на проведение сложных и трудоемких процедур по подготовке пробы и предусматривают разделение белков по их молекулярным массам в геле. Необходимость использования методик разделения белков обусловлена тем, что штатные режимы эксплуатации масс-спектрометров допускают в большинстве случаев проводить регистрацию масс-спектров в диапазоне масс до 5 кДа. Белки приходится разделять и после разделения проводить гидролиз на пептидные фрагменты относительно низкой молекулярной массы.
Разработка масс-спектрометрической мишени и режимов ее эксплуатации, позволяющих с чувствительностью и высоким разрешением работать в существенно более широком диапазоне масс, обеспечило бы высокую экономическую эффективность за счет устранения необходимости проведения трудоемкой и затратной по расходным материалам процедуры разделения белков в геле. Кроме того, это существенно снизило бы вклад связанной с действиями лаборанта погрешности в общую ошибку измерений.
Раскрытие полезной модели
Для более ясного понимания сущности настоящей полезной модели ниже приведены определения основных использованных в настоящем описании терминов.
Мишень - токопроводящая пластина, на которую наносятся образцы молекул биополимеров в смеси с ионизирующей матрицей.
Разметка мишени - координаты позиций для нанесения образцов на мишень, обозначаемые по одной оси буквами латинского алфавита А, В, С и т.д., а по перпендикулярной оси - числами от 1 до 24-х.
Позиция на мишени - точка на мишени, имеющая координату в соответствии с разметкой мишени, например А2.
Стандартный образец - искусственным образом полученный биополимер с известной и охарактеризованной аминокислотной последовательностью, чистота которого превышает 90%.
Смесь - раствор, в котором содержится определенное количество одного или нескольких стандартных образцов в определенных концентрациях.
Эталонная мишень - мишень, на позиции которой нанесены стандартные растворы аналита в соответствии с эталонной схемой.
Предел чувствительности - минимальная концентрация стандартного образца, при которой соответствующий данному аналиту сигнал масс-спектрометра превышает заданный порог уровня шума (ед. изм. - моль на литр, М).
Разрешение пика - отношение интенсивности измеренной массе иона биополимера к ширине пика на половине его высоты.
Погрешность детекции массы (ПДМ) - отношение разности между измеренной величиной массы иона биополимера и фактической (известной) массой к фактической массе биополимера (ед. изм. - миллионная доля, м.д.)
Калибровка - процедура обработки масс-спектра, направленная на достижением минимально возможного значения ПДМ.
тм
Для эталона, предлагаемого в качестве полезной модели, используют смеси стандартных образцов органических соединений, растворенные в плазме крови и нанесенные на эталонную масс-спектрометрическую мишень в заданных концентрациях. Таким образом, эта эталонная мишень, в отличие от аналогичных мишеней, использующих аналитические стандарты компаний-производителей [Sigma-Aldrich (www.sigma-aldrich.com). Product Information. ProteoMass Peptide & Protein MALDI-MS Calibration Kit (catalog number MSCAL1)], позволяет определить метрологические характеристики, такие как чувствительность, разрешение и воспроизводимость масс-спектрометрических измерений, в условиях, максимально приближенных к решению биологических задач.
-9
Эталон масс-спектрометрической мишени согласно настоящей полезной модели предназначен, в том числе, для проведения испытаний времяпролетных детекторов с матричным типом ионизации молекул биополимеров в диапазонах масс от 0,5 до 150 кДа с погрешностью детекции масс не превышающей 250 м.д. и с чувствительностью не ниже 10 М в биоматериале, для выполнения первичных и периодических поверок и калибровки указанного типа детектора, для осуществления приемочных испытаний оборудования и аттестации методик выполнения измерений, основанных на масс-спектрометрическом анализе образцов. Эталон масс-спектрометрической мишени согласно настоящей полезной модели может быть представлен для регистрации в системе единства измерений и использован для проведения процедуры приемки закупаемых и разрабатываемых масс-спектров, для периодических поверок и метрологического контроля масс-спектрометрического оборудования и аттестации методик выполнения масс-спектрометрических измерений.
Итак, настоящая полезная модель представляет собой эталон масс-спектрометрической мишени, характеризующийся особой разметкой позиций. Масс-спектрометрическая мишень представляет собой токопроводящую пластину с 386 равновеликими позициями для нанесения образцов, имеющую фиксированные размеры, совместимые с размерами загрузочного лотка лазерных масс-спектрометров серии Flex производства фирмы Bruker Daltoniks (Бремен, Германия) - см. информацию о продукте www.care-bdal.de/…/231968/PI_227463_231968_231924_PAC_V4.pdf.
Для изготовления эталона масс-спектрометрической мишени согласно настоящей полезной модели использовали следующие стандартные образцы органических соединений:
- калибровочные смеси - К5П, К2Б;
- пептидные смеси - ПС.5-3
- белковые смеси: БС.3-18, БС.2-97, БС.3-150, БС.2-97п.;
- ионизирующие матрицы: цианокоричная кислота (М1), дигидроксиацетофенон (М2), синапиновая кислота (М3).
Состав смесей приведен в таблице 2 ниже.
Таблица 1.
Состав аттестованных смесей
№п/п
Наименование смеси
Обозначение
Состав смеси
1
Калибровочная пептидная смесь
К5П
Ангиотензин I, ангиотензин II, АКТГ (фрагмент 18-39)
2
Пептидная смесь
ПС5-3
Брадикинин, бомбезин, соматостатин 28
3
Белковая смесь
БС3-18
Рибонуклеаза А, цитохром С, миоглобин
4
Калибровочная белковая смесь
К2Б
Протеин А, сывороточный альбумин
5
Белковая смесь
БС2-97
Апотрансферрин, фосфорилаза В
6
Белковая смесь
БС3-150
Сывороточный альбумин, IgG, IgM
7
Смесь в составе биоматериала
БС.2-97п
Препарат плазмы крови, после истощения в смеси с белковой смесью БС-2
Краткое описание чертежа
На фиг.1 представлена схема нанесения аттестованных смесей на позиции масс-спектрометрической мишени. Обозначения, использованные в схеме, раскрыты ниже в таблице 2.
Таблица 2.
Обозначения, использованные в схеме эталонной мишени

К5П

К2Б
○
ПС5-3
●
БС3-18
◇
БС2-97
◆
БС3-150
△
БС-2п
1
Разведение образца в 5 раз
2
Разведение образца в 10 раз
3
Разведение образца в 50 раз
*
Аттестационная позиция
s
Позиция для снятия после выгрузки и повторной загрузки мишени
a
Позиция для снятия в автоматическом режиме
w
Позиция для выполнения периодических поверок
Осуществление полезной модели
Инструкция по подготовке эталонной масс-спектрометрической мишени
1. Нанесение калибровочных смесей
1.1. Отобрать 56 мкл аттестованной смеси К5П, смешать с 56 мкл М1 и нанести в объеме 2 мкл на следующие 28 позиций масс-спектрометрической мишени: А1, А2, А23, А24, В1, В2, В23, В24, С3, С22, Е1, F1, G1, Н1, J9, К9, L9, М9, N3, N22, O1, O2, O23, O24, Р1, Р2, Р23, Р24.
1.2. Отобрать 52 мкл аттестованной смеси К2Б, смешать с 52 мкл М2 и нанести в объеме 2 мкл на следующие 26 позиций масс-спектрометрической мишени: A3, А22, ВЗ, В13, В22, С1, С2, С23, С24, Е23, F23, G23, Н23, J16, К16, L16, М16, N1, N2, N23, N24, O3, O10, O22, Р3, Р22.
2. Нанесение неразведенных аттестационных смесей ПС5-3, БС3-18, БС2-97, БС3-150, БС-2П
2.1. Отобрать 12 мкл аттестационной смеси ПС5-3, смешать с 12 мкл М1 и нанести в объеме 2 мкл на следующие 6 позиций масс-спектрометрической мишени: В14, F2, F7, F12, F17, O11.
2.2. Отобрать 38 мкл аттестационной смеси БС3-18, смешать с 38 мкл М1 и нанести в объеме 2 мкл на следующие 19 позиций масс-спектрометрической мишени: В15, Е3, Е4, Е5, Е6, Е8, Е9, Е10, Е11, Е13, Е14, Е15, Е16, Е18, Е19, Е20, Е21, J11, O12.
2.3. Отобрать 38 мкл аттестационной смеси БС2-97, смешать с 38 мкл М2 и нанести в объеме 2 мкл на следующие 19 позиций масс-спектрометрической мишени: В16, F3, F4, F5, F6, F8, F9, F10, F11, F13, F14, F15, F16, F18, F19, F20, F21, K11, O13.
2.4. Отобрать 38 мкл аттестационной смеси БС3-150, смешать с 38 мкл М3 и нанести в объеме 2 мкл на следующие 19 позиций масс-спектрометрической мишени: В17, G3, G4, G5, G6, G8, G9, G10, G11, G13, G14, G15, G16, G18, G19, G20, G21, L11, O14.
2.5. Отобрать 38 мкл аттестационной смеси БС-2П, смешать с 38 мкл М2 и нанести в объеме 2 мкл на следующие 19 позиций масс-спектрометрической мишени: В18, Н3, Н4, Н5, Н6, Н8, Н9, Н10, Н11, Н13, Н14, Н15, Н16, Н18, Н19, Н20, Н21, М11, O15.
3. Подготовка разведении аттестационных смесей БС3-18, БС2-97, БС3-150, БС-2П
3.1. Отобрать 2 мкл аттестационной смеси БС3-18, добавить 8 мкл деионизованной воды (разведение в 5 раз). Из полученного раствора (БС3-18_5) отобрать 2 мкл, смешать с 2 мкл М1 и нанести в объеме 2 мкл на позицию J12 масс-спектрометрической мишени. Отобрать 2 мкл раствора БС3-18_5, добавить 2 мкл деионизованной воды (разведение исходной смеси в 10 раз). Из полученного раствора (БС3-18_10) отобрать 2 мкл, смешать с 2 мкл М1 и нанести в объеме 2 мкл на позицию J13 масс-спектрометрической мишени. Отобрать 2 мкл раствора БС3-18_10, добавить 8 мкл деионизованной воды (разведение исходного раствора в 50 раз). Из полученного раствора (БС3-18_50) отобрать 2 мкл, смешать с 2 мкл М1 и нанести в объеме 2 мкл на позицию J14 масс-спектрометрической мишени.
3.2. Отобрать 2 мкл аттестационной смеси БС2-97, добавить 8 мкл деионизованной воды (разведение в 5 раз). Из полученного раствора (БС2-97_5) отобрать 2 мкл, смешать с 2 мкл М2 и нанести в объеме 2 мкл на позицию К12 масс-спектрометрической мишени. Отобрать 2 мкл раствора БС2-97_5, добавить 2 мкл деионизованной воды (разведение исходной смеси в 10 раз). Из полученного раствора (БС2-97_10) отобрать 2 мкл, смешать с 2 мкл М2 и нанести в объеме 2 мкл на позицию К13 масс-спектрометрической мишени. Отобрать 2 мкл раствора БС2-97_10, добавить 8 мкл деионизованной воды (разведение исходного раствора в 50 раз). Из полученного раствора (БС2-97_50) отобрать 2 мкл, смешать с 2 мкп М2 и нанести в объеме 2 мкл на позицию К14 масс-спектрометрической мишени.
3.3. Отобрать 2 мкл аттестационной смеси БС3-150, добавить 8 мкл деионизованной воды (разведение в 5 раз). Из полученного раствора (БС3-150_5) отобрать 2 мкл, смешать с 2 мкл М3 и нанести в объеме 2 мкл на позицию L12 масс-спектрометрической мишени. Отобрать 2 мкл раствора БС3-150_5, добавить 2 мкп деионизованной воды (разведение исходной смеси в 10 раз). Из полученного раствора (БС3-150_10) отобрать 2 мкл, смешать с 2 мкл М3 и нанести в объеме 2 мкл на позицию L13 масс-спектрометрической мишени. Отобрать 2 мкл раствора БС3-150_10, добавить 8 мкл деионизованной воды (разведение исходного раствора в 50 раз). Из полученного раствора (БС3-150_50) отобрать 2 мкл, смешать с 2 мкл МЗ и нанести в объеме 2 мкл на позицию L14 масс-спектрометрической мишени.
3.4. Отобрать 2 мкл аттестационной смеси БС-2П, добавить 8 мкл деионизованной воды (разведение в 5 раз). Из полученного раствора (БС-2П_5) отобрать 2 мкл, смешать с 2 мкл М2 и нанести в объеме 2 мкл на позицию М12 масс-спектрометрической мишени. Отобрать 2 мкл раствора БС-2П_5, добавить 2 мкл деионизованной воды (разведение исходной смеси в 10 раз). Из полученного раствора (БС-2П_10) отобрать 2 мкл, смешать с 2 мкл М2 и нанести в объеме 2 мкл на позицию М13 масс-спектрометрической мишени. Отобрать 2 мкл раствора БС-2П_10, добавить 8 мкл деионизованной воды (разведение исходного раствора в 50 раз). Из полученного раствора (БС-2П_50) отобрать 2 мкл, смешать с 2 мкл М2 и нанести в объеме 2 мкл на позицию М14 масс-спектрометрической мишени.