Количественный анализ функциональной активности семенника крыс при окислительном стрессе, индуцированном адаптацией к низким температурам

этапе развития плода не удалось выявить половые различия в количественных параметрах тимуса человека. Полученные данные могут сравниваться с результатами, полученными в других регионах России.

Литература

1. Воеводин С.М. Возможности эхографического исследования тимуса у новорожденного // Вопр. Охр. Мат. Дет.-1989.- № 4.- С. 38.

2. Пыков М.И., Ефимов М.С., Будаева Е.К., Дементьев А.А., Любаева Е.В. Эхографическая характеристика вилочковой железы у здоровых новорожденных в раннем неонатальном периоде // Ультразвук. функцион. диагн.- 2005.- № 5.- С.- 78-83.

3.Медведев М.В. Пренатальная эхография.

Дифференциальный диагноз и прогноз // 2-е изд. перер. М.: Реал Тайм.- 2009.- С.- 132-135.

4.Гребеняк О.А. Антенатальные аспекты развития иммунной системы плода при физиологической и осложненной беременности. Автореф. Дисс. ... канд. мед. наук.- Волгоград.-2008.

5. Железнов Л.М. Галеева Э.Н., Лященко Д.Н., Михайлов С.Н., Яхина И.М. Топографическая анатомия органов грудной полости человека в раннем плодном периоде //Морфология.-2008.-T.134,N 5.-С.39-42.

6.Пуйда С.А., Ворнин Д.В., Чубкин И.В., Некрасова Е.С. Пренатальная диагностика редкх врожденных пороков и синдромов. XLII. Киста тимуса // Прена. Диагн.- 2010.- Т. 9.- №

1.- С.- 35-40.

7. Zalel Y.; Gamzu R.; Mashiach S.; Achiron R., The development of the fetal thymus: An in utero sonographic evaluation// Prenat. Diagn.- 2002.- V. 22.- № 9.- P.- 114-117.

8.Cho J. Y., Min J. Y., Lee Y.H. et al. Diameter of the normal fetal thymus on ultrasound. // Ultrasound Obstet. Gynecol.- 2007.- V. 29.- P. 634- 638.

9.Gamez F., Santolaya—Forgas J., De Leon J.A. et al., Normative data of the transverse diameter of the developing fetal thymus// Ultrasound Obstet. Gynecol.- 2008.- V. 32.- P. 293.

THE REGULARITIES OF THE INTRAVITAL TOPOGRAPHIC ANATOMY OF THE THYMUS HUMAN”S FETUSES ON THE STAGE OF SECOND ULTRASONIC SCREENING INSPECTIONS.

A.A. SARENKO, A.N. GALEEVA, L.M. ZHELEZNOV Orenburg State Medical Academy, Chair of Anthroponomy

The article presents the established regularities of intravital topographic anatomy of the human foetus thymus on the basis of studying 80 intravital ultrasonic scan of human foetuses' chest cavities at the age of 20-23 weeks and saw cuts of 20 foetuses' chest cavities of the same age by N.I. Pirogov's method. Not only size characteristics of this organ have been established, but its syntopy and skeletopy as well. The received dates are anatomic substantiation of thymus ultrasonography assessment.

Key words: thymus, ontogenesis, anatomy.

УДК 591.463.05: 678.048:616-003.96

КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ СЕМЕННИКА КРЫС ПРИ ОКИСЛИТЕЛЬНОМ СТРЕССЕ, ИНДУЦИРОВАННОМ АДАПТАЦИЕЙ К НИЗКИМ ТЕМПЕРАТУРАМ

И.Ю. САЯПИНА*

В рамках данного исследования проведён количественный анализ генеративной и инкреторной функций семенников при окислительном стрессе, индуцированном адаптацией к низким сезонным температурам. Установлено, что окислительный стресс вызывает уменьшение численности клеток Лейдига. Оставшиеся клетки Лей-дига проявляют признаки функционального напряжения, и обеспечивают синтез тестостерона на уровне интактных животных, вследствие чего выраженные нарушения генеративной функции семенников при адаптации к низким температурам отсутствуют. Через 8 недель после завершения адаптации численность клеток Лейдига восстанавливается, однако длительный окислительный стресс угнетает функциональную активность клеток Лейдига, что приводит к снижению выработки тестостерона. Генеративная функция семенников в условиях дефицита тестостерона нарушается.

* Амурская государственная медицинская академия, 675000, г. Благовещенск ул. Горького, 95. Тел. 4162-525356, e-mail: agma@nm.ru

Ключевые слова: семенники, количественный анализ, функциональная активность, окислительный стресс, адаптация, низкие температуры.

В последние годы активно изучается феномен окислительного стресса (ОС) в биологических системах. Большое количество исследований посвящено изучению влияния ОС на мужскую репродуктивную систему человека и животных. Как показывает анализ печатных работ, при изучении ОС в органах мужской репродуктивной системы преимущество имеют экспериментальные методы исследования, позволяющие моделировать ОС различного генеза, и изучать его повреждающее действие на систему репродукции на различных уровнях организации. Экспериментальные исследования показали, что именно через ОС реализуются токсические эффекты на семенники большинства природных и промышленных токсикантов [4,5,8,15], лекарственных препаратов [10]. Было установлено, что ОС в семенниках способствует развитию глубоких изменений сперматогенеза в виде нарушения созревания и массовой гибели гамет [8,10], доказана связь между ОС и апопто-зом герминативных клеток. Кроме нарушения генеративной функции, ОС угнетает инкреторную активность семенников, приводя к уменьшению количества клеток Лейдига, или интерстициальных гландулоцитов, и снижению концентрации тестостерона в плазме крови [5,10,15]. Многие авторы отмечают, что кроме прямого повреждающего действия на герминативные клетки и эндокринный аппарат яичек, ОС может изменять функциональную активность семенников опосредованно, через нарушения в регуляторной системе гипоталамус - гипофиз - гонады [5,10].

Ряд экспериментальных исследований доказывает, что ОС способен трансформировать действие экстремальных факторов среды в нарушения структуры и функции системы репродукции. Например, ОС в семенниках и придатках крыс, вызванный гипоба-рической гипоксией в условиях высокогорья [11], приводил к нарушениям сперматогенеза, ухудшению количественных и качественных показателей спермограммы; описывается ОС в семенниках при ультрафиолетовом облучении [13]. Хорошо известно, что при адаптации организма человека и животных к низким сезонным температурам ОС является стереотипной реакцией. Тем не менее, вопросы функционирования семенников при ОС, индуцированном низкими температурами, остаются малоизученными: в исследовании [4] содержатся сведения об активации реакций перекисного окисления липидов (ПОЛ) в семенниках крыс в зимний период, а в работе [3] сообщается о снижении концентрации тестостерона в плазме крови при хроническом холодовом стрессе у крыс. Морфологические работы по изучению функциональной активности семенников в условиях ОС, вызванного адаптацией организма к холоду, с использованием количественных гистологических методов, в доступной литературе отсутствуют.

Цель исследования - провести количественный анализ генеративной и инкреторной активности семенников крыс при ОС, индуцированном адаптацией организма к низким сезонным температурам.

Материалы и методы исследования. Исследование было проведено на 90 нелинейных половозрелых белых крысах-самцах с массой тела 200-250 г., которые были разделены на III группы. I группа (группа контроля) состояла из интактных крыс, содержавшихся в стандартных температурных условиях вивария. У крыс II и II экспериментальных групп моделировали ОС путём общего охлаждения животных в течение 28 дней при температуре -15°С по 3 часа ежедневно. Крысы II группы выводились из эксперимента на следующий день после его окончания, крысы III группы выводились из эксперимента через 56 дней, что соответствует длительности сперматогенеза у крыс. Забой животных проводили под тиопенталовым наркозом путём дислокации шейных позвонков. Все манипуляции проводились в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных».

Для количественного гистологического исследования фрагменты семенников из экваториальной зоны толщиной около 10 мм фиксировали в 10% нейтральном формалине, обезвоживали и заливали в парафин согласно стандартной гистологической схеме, парафиновые срезы окрашивали гематоксилином и эозином.

Количественный анализ функциональной активности семенников проводили при помощи аппаратно-программного комплекса, состоящего из программного обеспечения для количественного анализа ВидеоТесТ - Морфология 5.0., цифровой камеры

ЭСМ 500, адаптированной к световому микроскопу «Микромед-1», и персонального компьютера. Для оценки генеративной активности семенника измеряли диаметр извитых семенных канальцев, рассчитывали индекс сперматогенеза [7]. Для анализа инкреторной активности измеряли диаметры ядра и цитоплазмы клеток Лейдига, производили подсчёт относительного количества интерстициальных эндокриноцитов [7], определяли % количества малых, средних и больших клеток Лейдига, по отношению активных клеток Лейдига к неактивным клеткам рассчитывали индекс активности [2]. Для установления взаимосвязи между количественными характеристиками клеток Лейдига и их функциональной активностью определяли концентрацию тестостерона в плазме крови крыс методом иммуноферментного анализа. ОС верифицировали путём определения в сыворотке крови и ткани семенников продуктов ПОЛ - диеновых конъюгатов, гидроперекисей липидов, малонового диальдегида, и главного компонента антиокислительной системы витамина Е.

Для статистической обработки количественных данных использовали программное обеспечение Зіаіівііса 6.0, выборки сравнивались при помощи 1-критерия Стьюдента, различия считались значимыми при р<0,05.

Результаты и их обсуждение. Индекс сперматогенеза, отражающий количество слоёв сперматогенных клеток в стенке извитых семенных канальцев, является важнейшим количественным показателем, характеризующим генеративную активность семенника [7]. Количественный анализ показал, что индекс сперматогенеза у крыс II группы не имеет различий с группой контроля (табл. 1). Диаметр извитых семенных канальцев у крыс II группы достоверно меньше, чем у крыс I группы (табл. 1). Согласно литературным данным, диаметр извитых семенных канальцев находится в тесной взаимосвязи с количеством клеток в составе эпителиосперматогенного пласта. Таким образом, уменьшение диаметра извитых семенных канальцев косвенно указывает на уменьшение количества сперматогенных клеток в семенниках крыс II группы.

Количественный анализ инкреторной активности семенника показал (табл.1), что после четырёх недель адаптации к низким температурам на 19% уменьшается относительное количество клеток Лейдига (р<0,05). Диаметры ядра и цитоплазмы клеток Лейдига у крыс II группы по сравнению с группой контроля, напротив, достоверно увеличиваются (табл. 1). В интерстициальной соединительной ткани семенников у крыс II группы присутствуют клетки Лейдига различных морфофункциональных типов, а именно малые, средние и большие (рис.). Однако в популяции интерстициальных эндокриноцитов доля малых клеток Лейдига уменьшается на 24%, доля средних и больших клеток Лейдига увеличивается на 20% и на 4% соответственно (рис.). Согласно литературным данным, клетки Лейдига малых размеров являются малоактивными в отношении стероидогенеза, и представляют собой инволюциони-рующие формы [2,5,14], интерстициальные эндокриноциты среднего и большого размера являются клетками, активно продуцирующими стероидные гормоны [2,5,14]. Таким образом, изменение числа активных и неактивных клеток эндокриноцитов в семенниках животных II группы приводит к повышению в 3,2 раза индекса активности клеток Лейдига (табл. 1). Концентрация тестостерона в сыворотке крови крыс II группы 32,17±0,83 нмоль/л, что практически не отличается от показателя крыс I группы, у которых концентрация данного гормона 33,72±1,71 нмоль/л.

Биохимическое исследование показало (табл. 2), после четырёх недель адаптации к низким температурам в плазме крови и тканях семенника крыс повышено содержание основных продуктов ПОЛ, содержание витамина Е ниже, чем в группе контроля (р<0,05), что свидетельствует о развитии у животных II экспериментальной группы ОС.

В настоящее время ОС рассматривается учёными в качестве основной причины, вызывающей программируемую гибель клеток [9,12]. В связи с этим уменьшение диаметра извитых семенных канальцев у животных II группы можно объяснить ускоренной элиминацией герминативных клеток путём апоптоза. Однако отсутствие различий между индексом сперматогенеза контрольной и экспериментальной групп не позволяет сделать однозначный вывод об угнетении сперматогенеза у крыс II группы.

Таблица 1

Количественные характеристики функциональной активности семенника

Количественные характеристики I группа II группа III группа

Диаметр канальцев (мкм) 277,9±1,3 255,7±1,1* 249,3±1,4*

Индекс сперматогенеза 3,30±0,45 3,28±0,44 3,19±0,39*

Диаметр ядра КЛ (мкм) 6,23±0,02 6,57±0,03* 6,39±0,03*

Диаметр (мкм) цитоплазмы КЛ 8,31±0,03 9,04±0,04* 7,89±0,04*

Относительное количество КЛ 10,9±0,4 8,8±0,3* 11,0±0,4

Индекс активности КЛ 1,38 4,55 0,63

Примечание: КЛ - клетки Лейдига,

* - различия достоверны с I группой при р<0,05.

Не исключено, что в нашем исследовании ОС также выступает в роли индуктора апоптоза клеток Лейдига, приводя к снижению их численности. В пользу данной гипотезы свидетельствует уменьшение относительного количества интерстициальных эндок-риноцитов за счёт малых форм, представляющих собой инволю-ционирующие клетки Лейдига [2,5]. Стойкое уменьшение количества клеток Лейдига у крыс после иммобилизационного стресса, приводящее к снижению уровня тестостерона описывают [6]. В нашем исследовании ОС тоже приводит к уменьшению относительного количества интерстициальных эндокриноцитов, но, как показывают данные иммуноферментного анализа, уменьшение численности клеток Лейдига не отражается на выработке тестостерона. По-видимому, гипертрофия клеток Лейдига, подтверждённая методами количественного анализа и увеличение в популяции интерстициальных эндокриноцитов активных форм, вырабатывают стероидные гормоны в количестве, достаточном для обеспечения репродуктивной функции в экстремальных условиях.

Таблица 2

Содержание основных продуктов ПОЛ и витамина Е в плазме крови и ткани семенников

Биохимические показатели I группа II группа III группа

Плазма крови

ДК (нмоль/г) 27,2±3,0 48,9±2,8* 51,4±2,3*

ГЛ (нмоль/г) 26,06± 32,7±1,8* 32,9±2,1*

МДА (нмоль/л) 4,84±0,27 6,06±0,34* 5,57±0,34*

Витамин Е (мкг/г) 51,1±4,1 32,48±2,2* 41,3±3,5*

Семенник

ДК (нмоль/г) 69,9±5,4 78,9±5,0* 62,3±7,5

ГЛ (нмоль/г) 25,8±0,9 43,3±2,8* 37,5±2,1 *

Витамин Е (мкг/г) 52,6±3,8 38,8±1,6* 35,8±0,8*

Примечание: ДК - диеновые конъюгаты, ГЛ - гидроперекиси липидов, МДА - малоновый диальдегид. * - различия достоверны с I группой при р<0,05

Малые  Средние  Большие

Рис. Распределение клеток Лейдига на три морфофункциональных типа

В семенниках крыс III группы относительное количество клеток Лейдига возвращается к показателям интактных животных (табл. 1). Согласно литературным данным, клетки Лейдига взрослого типа представляют собой высокоспециализированную популяцию с очень низким митотическим индексом. Тем не менее, экспериментально доказано, что популяция клеток Лейдига

способна к восстановлению [1,14]. После гибели клеток Лейдига путём апоптоза, уже через 2-3 недели из мезенхимоподобных стволовых клеток могут образовываться новые интерстициальные эндокриноциты незрелого типа, способные к пролиферации и дифференцировке [1,14]. Пролиферация интерстициальных эндокриноцитов и их дифференцировка в клетки Лейдига взрослого типа заканчиваются на 5-7 неделе [1,14], что сопоставимо с нашими результатами.

Несмотря на восстановление количества клеток Лейдига до уровня контроля, концентрация тестостерона в сыворотке крови крыс III группы снижается до 28,06±1,8 нмоль/л (р<0,05). Из табл. 1 видно, что недостаток тестостерона, в свою очередь, приводит к уменьшению диаметра извитых семенных канальцев и снижению индекса сперматогенеза у крыс III группы (р<0,05). Достоверное уменьшение диаметра извитых семенных канальцев в совокупности со снижением индекса сперматогенеза свидетельствует об угнетении сперматогенеза в семенниках крыс III группы.

Через 8 недель после окончания адаптации диаметры ядра и цитоплазмы клеток Лейдига достоверно ниже показателей крыс I группы (табл. 1). В популяции интерстициальных эндокриноци-тов на 19% увеличивается количество малых клеток Лейдига, количество клеток Лейдига среднего размера уменьшается на 17% и больших клеток на 2% (рис.), в 2,2 раза уменьшается индекс активности интерстициальных эндокриноцитов (табл. 1). Уменьшение процента количества средних и больших клеток Лейдига, приводящее к падению индекса активности, а также снижение уровня тестостерона свидетельствуют об истощении компенсаторно-приспособительного резерва клеток Лейдига в отдалённые сроки после адаптации к низким температурам.

Биохимическое исследование показало, что даже через 8 недель после окончания адаптации к низким температурам у крыс III группы сохраняются проявления ОС (табл. 2). Содержание основных продуктов ПОЛ в плазме крови и тканях семенника крыс III группы повышено, содержание витамина Е ниже, чем в группе контроля (р<0,05). Экспериментальные исследования показали, что усиление процессов ПОЛ в плазме крови и семенниках крыс угнетает активность 3р-гидроксистероид-дегидрогеназы и 17р-гидроксистероид-дегидрогеназы, играющих ключевую роль в синтезе тестостерона в микросомальных фракциях клеток Лейдига [8,15]. Следовательно, снижение функциональной активности клеток Лейдига, обнаруженное в данном исследовании, может быть связано с подавлением ферментных систем в цитоплазме интерстициальных эндокриноцитов.

Выводы. ОС, индуцированный адаптацией организма к низким температурам, вызывает уменьшение относительной численности клеток Лейдига. В популяции интерстициальных эндокри-ноцитов увеличивается количество средних и больших клеток, количество малых клеток уменьшается, что приводит к повышению индекса активности клеток Лейдига, появляются признаки гипертрофии клеток Лейдига в виде увеличения линейных размеров ядра и цитоплазмы. Клетки Лейдига в состоянии функционального напряжения обеспечивают синтез тестостерона на уровне интактных животных, вследствие чего выраженные нарушения генеративной функции семенников при адаптации к низким температурам отсутствуют. Через 8 недель после завершения адаптации относительная численность клеток Лейдига восстанавливается, однако функциональная активность клеток Лейдига угнетается, что приводит к снижению выработки тестостерона. В условиях дефицита тестостерона уменьшается диаметр извитых семенных канальцев, снижается индекс сперматогенеза, что свидетельствует об угнетении сперматогенеза. Таким образом, продолжительный ОС, индуцированный адаптацией организма к низким сезонным температурам, вызывает депрессивные изменения генеративной и инкреторной активности семенника.

Литература

1. Пролиферация и дифференциация регенерирующих клеток Лейдига крыс после воздействия этандиметансульфонатом / Бакал-ска М.В. [и др.] // Морфология, 2001.- Т. 119.- № 1.- С. 69-72.

2. Брюхин, Г.В. Характеристика инкреторной функции семенников потомства самок крыс с экспериментальным хроническим поражением печени различного генеза / Брюхин Г.В., Сизо-ненко М.Л., Романов А.С. // Вопросы морфологии XXI века. Выпуск 2: сборник научных трудов. СПб.: Изд-во «Деан», 2010.-С.70-75.

3. Дмитриева, О.А. Влияние стресс-индуцированного снижения уровня тестостерона на гистохимические изменения половых органов крыс / Дмитриева О. А., Шерстюк Б.В. // Тихоокеанский мед. Журнал, 2007.- № 3.- С. 55-57.

4. Котельникова, С.В. Состояние перекисного окисления липидов в разных органах и тканях белых крыс в зимний и летний периоды в условиях кадмиевой интоксикации / Котельникова С.В. Соколова Н.Г., Котельников А.В. // Бюл. экспер. биол. и мед., 2008.- Т. 146.- № 9.- С. 264-265.

5. Логинов, П.В. Влияние витамина Е (а-токоферола) на ги-поталамо-гипофизарно-гонадную систему самцов белых крыс при окислительном стрессе, индуцированном природными токсикантами: Автореф. дис. ... канд. биол. Наук / П.В. Логинов.-Астрахань, 2004.- 24 с.

6. Потёмина, Т.Е. Нарушение сперматогенеза в условиях стресса у самцов крыс / Т.Е. Потёмина // Бюл. экспер. биол. и мед., 2008.- Т. 145.- № 6.- С. 645-647.

7. Ухов, Ю.И. Морфометрические методы в оценке функционального состояния семенников / Ухов Ю.И., Астраханцев А.Ф.// Арх. анат., гист. и эмбр., 1983.- Т. 84.- №3.- С.66-72.

8. Ушакова, М.В. Функционирование репродуктивной системы самцов крыс при хроническом воздействии природных токсикантов: Автореф. дис. . канд. биол. наук. / М.В. Ушакова.-Астрахань, 2002.- 22 с.

9. Almeida M., Han L., Ambrogini E. et al. Oxidative stress stimulates apoptosis and activates NF-kB in osteoblastic cells via a PKCp/p66shc signaling cascade: counter regulation by estrogens or androgens // Molecular Endocrinology. 2010. Vol. 24, №10. P. 20302037.

10. Armagan A., Uzar E., Uz E., Yilmaz H.R. et al. Caffeic acid phenethyl ester modulates methotrexate-induced oxidative stress in testes of rat // Human & Experimental Toxicology. 2006. Vol. 25. P. 119-125.

11. Farias J.G., Puebla M., Acevedo A. et al. Oxidative stress in rat testis and epididymis under intermittent hypobaric hypoxia: protective role of ascorbate supplementation // J. Androl. 2010. Vol.

31, № 3. P. 314-321.

12. Husain P.S., Amstad P., He P., Robles A. et al. p-53-mediated oxidative stress and apoptosis // Toxicol. Pathol. 2004. Vol.

32, № 1. P. 163-164.

13. NechiforM.T., Constantin C., Manda G. et al. Biochemical changes in rat testis induced in vitro by reactive oxygen species // Romanian Archives of Microbiology & Immunology. 2006. Vol. 65, № 3-4. P. 135-140.

14. O’Shaughnessy P.J., Morris I.D., Baker P.J. Leydig cell regeneration and expression of cell signaling molecules in the germ cell-free testis // Reproduction. 2008. Vol. 135, №6. P. 851-858.

15. Rajeswary S., Kumaran B., Ilangovan R. et al. Modulation of antioxidant defense system by the environmental fungicide carben-dazim in Leydig cells of rats // Reprod. Toxicol. 2007. Vol. 24, № 3-

4. P. 371-380.

THE QUANTITATIVE ANALYSIS OF FUNCTIONAL ACTIVITY OF RATS' TESTICLES AT AN OXIDATIVE STRESS INDUCED BY THE ADAPTATION TO LOW TEMPERATURES

I.Y. SAYAPINA Amur State Medical Academy, Blagoveshchensk

The generative and endocrine function of testicles at an oxidative stress induced by adaptation to low seasonal temperatures has been studied by methods of quantitative analysis. It was established that oxidative stress causes the decrease of Leydig cells number. The remaining Leydig cells show signs of functional activity and provide the synthesis of testosterone on the level of intact animals. Therefore pronounced generative testicle function disorders at adaptation to low temperatures are absent. 8 weeks after the end of the adaptation the number of Leydig cells is restored. However, prolonged oxidative stress inhibits the functional activity of Leydig cells. This leads to testosterone production decrease. The generative function of the testicles at testosterone deficiency is affected.

Key words: testicles, quantitative analysis, functional activity, oxidative stress, adaptation, low temperatures.