Некоторые аспекты действия озонированного физиологического раствора на состояние Pseudomonas aeruginosa

НЕКОТОРЫЕ АСПЕКТЫ ДЕЙСТВИЯ ОЗОНИРОВАННОГО ФИЗИОЛОГИЧЕСКОГО РАСТВОРА НА СОСТОЯНИЕ PSEUDOMONAS AERUGINOSA

Н.А. Кувакина

Ассоциация российских озонотерапевтов, Нижний Новгород

Целью работы служило определение действия озонированного физиологического раствора на патогенные свойства Pseudomonas aeruginosa. В экспериментах использованы 9 гемокультур P. aeruginosa, выделенных от пациентов с ожоговым сепсисом и стандартный штамм P. aeruginosa "Тесаков" из Государственной коллекции ГИСК им. Л.А. Тарасевича. У микроорганизмов до и после воздействия физиологического раствора с тремя концентрациями озона 200, 600 и 1000 мкг/л изучали культуральные свойства, ферментативную активность, чувствительность к антибиотикам, ростовые свойства и адгезивную способность. Установлено, что озонированный физиологический раствор угнетает ростовые свойства госпитальных синегнойных бактерий in vitro, причем наибольшие изменения определяются в ЛАГ-фазе и выражаются в удлинении ее времени на 1,5 ч-2,3 ч. Степень выраженности обнаруженных изменений пропорциональна концентрации озона, а максимальное влияние на факторы патогенности синегнойных бактерий оказывает озонированный физиологический раствор с концентрацией озона 1000 мкг/л.

Ключевые слова: озон, антибактериальное действие, Pseudomonas aeruginosa

SOME ASPECTS OF THE ACTION OF OZONIZED SALINE ON PSEUDOMONAS AERUGINOSA N.A. Kuvakina

Association of Russian Ozone Therapeutists, Nizhny Novgorod

Abstract

The aim of this work was the determination of the action of ozonized physiological solution on the pathogenic properties of Pseudomonas aeruginosa. The experiments were executed on 9 cultures of P. aeruginosa isolated from patients with burn sepsis and a standard strain of P. aeruginosa "Tesakov" from state collection of the GISK named after L.A. Tarasevich. Before and after exposure to physiological solution with three ozone concentrations of 200, 600 and 1000 mcg/l we studied cultural properties, enzymatic activity, antibiotic sensitivity, growth properties and the ability of the adhesive of P. aeruginosa. It is established that the ozonized physiological solution depresses the growth properties of hospital Pseudomonas bacteria in vitro, with the greatest changes are defined in the LAG-phase and elongation are expressed in

its time of 1.5 h and 2.3 h. The degree of severity of the detected changes is proportional to the concentration of ozone, and the maximum impact on the virulence factors of Pseudomonas bacteria having the ozonized physiological solution with ozone concentration of 1000 mcg/L.

Key words: ozone, antibacterial effect, Pseudomonas aeruginosa

Ожоговая рана в значительно большей степени подвержена инфекции, чем раны при других видах травм, и зачастую она становится источником инвазивной генерализованной инфекции. Серьезную опасность представляет сепсис ранних периодов ожоговой болезни, наиболее часто вызываемый синегнойной палочкой, характеризующийся молниеносным развитием, тяжелым течением и крайне высокой летальностью [1, 2, 12]. Подтверждением тому служат данные Нижегородского научно-исследовательского института травматологии и ортопедии [2], свидетельствующие о том, что основной причиной гибели обожженных в периодах шока и токсемии остается генерализованная инфекция, 60% случаев которой составляет ранний сепсис.

Устойчивость синегнойной палочки во внешней среде, непритязательность к условиям питания, наличие мощных факторов вирулентности, природная резистентность к антибактериальным препаратам определяют широту ее распространения и формирования госпитальных штаммов, что превращает ожоговый стационар в "эпидемиологический очаг" синегнойной инфекции [9, 10, 13]. Нерешенность проблемы борьбы с госпитальной синегнойной инфекцией с помощью химиотерапевтических препаратов побуждает проводить поиск других методов и средств.

В последние годы разрабатываются и внедряются новые технологии лечения обожженных, способные подавлять агрессивность и уменьшать вирулентность госпитальной микрофлоры. В этом плане возрастает интерес к озонотерапии. Обладая высоким окислительным потенциалом, озон проявляет бактерицидные, вирицидные, фунгицидные свойства [4, 8, 11]. Технология системного использования озона, растворенного в физиологическом растворе, существенно расширяет спектр его лечебных возможностей за счет оптимизации нарушенного кислородного гомеостаза организма больного [3-7]. Это позволяет использовать метод не только для местного лечения ожоговых ран, но и для комплексной терапии ожоговой болезни и ее осложнений, в том числе инфекционных [4, 8].

До настоящего времени не проводилось исследований по влиянию не бактерицидных концентраций озона в озонированном физиологическом растворе, применяемых для парентеральной озонотерапии инфекционных осложнений при ожоговой болезни, на патогенные свойства гемокультур высоковирулентной госпитальной микрофлоры, а также на развитие и течение инфекционного процесса.

Поэтому целью работы служило определение действия озонированного физиологического раствора на патогенные свойства Pseudomonas aeruginosa.

Материал и методы

Для решения поставленных задач выполнены эксперименты in vitro с применением озонированного физиологического раствора (ОФР) с тремя концентрациями озона 200, 600 и 1000 мкг/л. В экспериментах использованы 9 гемокультур P. aeruginosa, выделенных от пациентов с ожоговым сепсисом и стандартный штамм P. aeruginosa "Тесаков" из Государственной коллекции ГИСК им. Л.А. Тарасевича. У микроорганизмов до и после воздействия ОФР изучали: культуральные свойства, ферментативную активность с помощью тест-систем «Неферм-24» (Lachema, Чехия); чувствительность к антибиотикам диско-диффузионным методом МУК 4.2.1890-04 (2004); ростовые свойства фотометрическим методом с помошью автоматического микро-биологического анализатора iEMS Reader "Labsystems" и программы «Микроб»; адгезивную способность - по методике В.И. Бриллис с соавт. (1986).

Озонированный физиологический раствор получали из стандартного раствора хлорида натрия изотонического 0,9% для инъекций с помощью аппарата озонотерапии с деструктором озона АОТ-Н-01-Арз-01.

Концентрацию растворенного в физиологическом растворе озона определяли с помощью оптического анализатора концентрации озона в жидкой среде ИКОЖ-5 (№29708-05 в Государственном реестре средств измерений).

Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью пакета программ "Statistica". При статистическом анализе выполняли парные групповые сравнения с использованием критериев Стьюдента и Фишера.

Результаты

Изучение ростовых свойств синегнойных бактерий после воздействия ОФР с концентрациями озона 200, 600 и 1000 мкг/л показало дозозависимый эффект действия озона. Чем выше концентрация озона в физиологическом растворе, тем ниже была скорость размножения микроорганизмов и тем медленнее нарастала оптическая плотность взвесей бактерий (рис.1).

£

Ь

О

О

X

5

с;

с

о ш У х

с

о §

X 5

0.5 1 2 3 4 5 6 7 $ 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

Время,час

Рис. 1. Кривые роста синегнойных бактерий после воздействия ОФР с концентрациями озона 200мкг/л, 600 мкг/л и 1000 мкг/л (усредненные данные по

10 штаммам).

Максимальное угнетающее действие на рост оказывал ОФР с концентрацией озона 1000 мкг/л. Анализ ростовых кривых показан значительные изменения отдельных фаз роста, наибольшие из которых определялись в адаптацноную фазу (ЛАГ-фазу). У микроорганизмов, взятых в эксперимент до озонирования, ЛАГ-фаза составляла в среднем 5 часов. После контакта бактерий с ОФР с концентрацией озона 200 мкг/л ЛАГ-фаза удлинилась до 6 часов 50 мин., при действии ОФР с концентрацией озона 600 мкг/л - до 7 ч. 20 мин., при действии ОФР с концентрацией озона 1000 мкг/л - до 7 ч. 30 мин.

Биологические свойства P. aeruginosa до и после воздействия на них in vitro ОФР с концентрациями озона 200, 600 и 1000 мкг/л оставались без изменения. В то же время, анализ антибиотике грамм выявил, что у 7 штаммов из 10 под действием ОФР с концентрацией озона 1000 мкг/л происходило изменение чувствительности к наиболее часто применяемым при синегнойной инфекции антибиотикам групп цефалоспоринов и фторхинолонов. ОФР с концентрациями озона 200 и 600 мкг/л не изменял антибиотикограммы культур P. aeruginosa.

№ штама

боа воздействия  30 мин 060 мин

Рис.2. Уровень ИА синегнойных бактерий до и после воздействия ОФР с

концентрацией озона 200 мкг/л

№ цгаиа

воздействия  ЗО^ин ОйО мим

Рис. 3. Уровень ИА синегнойный бактерий до и после воздействия ОФР с

концентрацией озона 600 мкг/л

Исследования адгезивной способности P. aeruginosa - одного из важных факторов патогенности - показали, что культуры имели высокий и средний исходный индекс адгезивности (ИА). Концентрация озона в ФР в 200 мкг/л разнонаправленно влияла на микробные клетки: у одних штаммов снижала, а у других - стимулировала их адгезивную способность (рис. 2).

8.0 л

5,5-5,а -4,5 -

Теми 396 21 Ш 340 539 479 766 ЛЛ5 852

№ шГДмЭ

сез еоэдейстн ни  30 мин  60 нин

Рис. 4. Уровень ИА синегнойный бактерий до и после воздействия ОФР с

концентрацией озона 1000 мкг/л

После воздействия ОФР с концентрацией озона 600 и 1000 мкг/л у всех штаммов уровень ИА снижался и более половины из них переходили из разряда высоко- и средне-адгезивных - в разряд неадгезивных (рис. 3 и 4).

Выводы:

1. Озонированный физиологический раствор в условиях in vitro угнетает ростовые свойства госпитальных синегнойных бактерий. Наибольшие изменения определяются в ЛАГ-фазе и выражаются в удлинении ее времени на 1,5 ч-2,3 ч.

2. Озонированный физиологический раствор снижает адгезивность и повышает фагоцитабельность госпитальных синегнойных бактерий, но не оказывает влияния на спектры белков наружной мембраны и внеклеточных белков. Степень выраженности обнаруженных изменений пропорциональна концентрации озона в озонированном физиологическом растворе. Максимальное влияние на факторы патогенности синегнойных бактерий оказывает озонированный физиологический раствор с концентрацией озона 1000 мкг/л.

Список литературы:

1. Алексеев А.А., Лавров В.А. Ожоговая септикотоксемия: этиология, патогенез, клиника, лечение // Российский медицинский журнал. 1999. №1. С. 4144.

2. Вазина И.Р., Бугров С.Н. Летальность и причины смерти обожженных // Российский медицинский журнал. 2009. №3. С. 14-17.

3. Вегеле Л.С. Комплексное использование озона и повиаргола для лечения гнойных ран в травматологии и ортопедии: Автореф. дисс. ... канд. мед. наук. Н. Новгород, 2003. 22 с.

4. Вилков С.А., Пылаева С.И., Костина О.В. с соавт. Парентеральная озонотерапия в лечении пневмоний у тяжелообожженных // Нижегородский медицинский журнал. 2003. Прил. «Озонотерапия». С. 235-236.

5. Девятов В.А., Янгилев Ф.Ш. Выбор оптимального метода контроля за течением раневого процесса // Материалы конф. «Актуальные вопросы гнойных осложнений и заболеваний в хирургической практике». Новосибирск, 1999. С. 194-196.

6. Кувакина Н.А., Куракина Т.В. Влияние различных концентраций озонированного физиологического раствора на адгезивность госпитальных изолятов синегнойных бактерий // Нижегородский медицинский журнал. 2003. Прил. «Озонотерапия». С. 19-20.

7. Носенко В.М., Челзаков Е.В. Парентеральная озонотерапия в комбустиологии // Нижегородский медицинский журнал. 2004. Прил. «Комбустиология». С. 94-95.

8. Перетягин С.П. Патофизиологическое обоснование озонотерапии постгеморрагического периода: Автореф. дисс. ... докт. мед. наук. Казань, 1991. 30 с.

9. Руднов В. А. Современное клиническое значение синегнойной инфекции и возможности ее терапии у пациентов отделений реанимации // Инфекции и антимикробная терапия. 2002. Т. 6. С. 170-177.

10. Сидоренко С.В. Клиническое значение Pseudomonas aeruginosa // Клиническая фармакология и терапия. 2003. №2. С. 1-8.

11. Стручков А.А., Перетягин С.П., Кувакина Н.А. с соавт. Антисептические свойства озонированных растворов // Вестник физиотерапии и курортологии. 2006. №5. С. 21-22.

12. Gang R.K. Bang R L. Sanyal S.C. et al. Pseudomonas aeruginosa septicemia in burns // Burns. 1999. Vol. 25. №7. P. 611-616.

13. Li T.Z., Luo L., Xu Y. В. el al. Clinical significance of the predominant bacterial strains on burn wound during early postburm stage // Zhonghua Shao Shong Za Zlu. 2003. Vol. 19, №2. P. 71-74.