СПОСОБ СТИМУЛЯЦИИ РЕПАРАТИВНОЙ РЕГЕНЕРАЦИИ ПРИ ТЕНДОПАТИЯХ
METHOD FOR STIMULATING REPARATIVE REGENERATION IN TENDOPATHIES

Заявленный способ относится к таким областям, как, ветеринарная травматология и ортопедия, а именно к стимуляции восстановительных потенций тканей опорно-двигательного аппарата и путей направленного воздействия на ускорение репаративных процессов.
Развитие науки в области регенеративной медицины и клеточной биологии, фундаментальные исследования и поиск перспективных терапевтических подходов в данном направлении обещают новые открытия в ближайшем будущем. Высокий интерес к технологиям применения различных типов стволовых клеток во многом определен их потенциалом в восстановлении поврежденных тканей и органов. Суть применения таких технологий заключается в стимуляции восстановления поврежденных сухожилий с помощью клеток, взятых из организма самого объекта. Аутологичные клетки не отторгаются организмом животного после введения, поскольку распознаются его защитными системами как собственные.
Среди клеточных препаратов наибольшей биологической безопасностью отличаются аутологичные. Из них в клинической практике положительно зарекомендовали себя клетки стромально-васкулярной фракции (СВФ) и мультипотентные мезенхимальные стволовые клетки (ММСК), обладающие способностью к самоподдержанию, дифференцировке в различные клеточные типы и мобилизующие репаративный процесс в тканях. Однако, метод регенерации соединительной ткани с использованием аутологичных мезенхимных стволовых клеток, имеет существенные недостатки, которые накладывают ограничения в применении, т.к. выращивание клеток МСК довольно длительная процедура по времени и занимает порядка 2-3 недели, что является ограничительным фактором данного метода. Кроме указанногоне все организации и практикующие врачи смогут себе это позволить, что также делает процедуру неприменимой в условиях только медицинской клиники и ведет к существенному удорожанию процедуры лечения. [Волкова И.М., Викторова Е.В., Савченкова И.П., Гулюкин М.И. Характеристика мезенхимных стволовых клеток, выделенных из костного мозга и жировой ткани крупного рогатого скота // И.М. Волкова, Е.В. Викторова, И.П. Савченкова, М.И. Гулюкин // Сельскохозяйственная биология. - 2012 г. - №2. - С. 32-38.].
Целью нашего предполагаемого способа является разработка наиболее эффективного способа стимуляции репаративной регенерации при тендопатиях, который значительно повлияет на совершенствование технологии коррекции патологий органов опорно-двигательной системы животных. Использование данного способа сопровождается доступностью выполнения и минимальными временными затратами.
Для решения этой задачи, предложен способ введения аутологичного клеточного продукта (стромально-васкулярная фракция) в область повреждения сухожильно-связочного аппарата, включающий анализ микроморфологической картины ахиллова сухожилия, микроморфометрические исследования коллагеновых конструкций и кровеносного русла при индуцированном дефекте.
Технический результат заключается в достижении наименьших сроков регенерации с активизацией процессов ангио- и коллагеногенеза, на основании анализа микроморфометрических показателей ахиллова сухожилия.
Определение данных показателей позволит достоверно выявить влияние стромально-васкулярной фракции на репаративную регенерацию сухожилия.
Способ осуществляют следующим образом. Производят липосакцию в области холки для получения фрагмента жировой ткани. Далее, проводят обработку липоаспирата 0,075% раствором коллагеназы в течение 30 мин при температуре, равной 37°С. В дальнейшем осуществляют фильтрацию клеток и центрифугирование, с последующим подсчетом ядросодержащих клеток. Полученный аутологичный продукт вводят животному в область травмы. По мере выведения из эксперимента на 7-е, 14-е, 30-е и 60-е сутки, на полученных гистологических срезах сухожилия проводят микроморфометрию области дефекта с помощью специализированных программ типа ImageScop 5.0.
Эксперимент был поставлен на трех группах декоративных крыс разновидности «Стандарт» (контрольная, подопытная и интактная), подобранных по принципу аналогов. Экспериментальные группы были сформированы из клинически здоровых животных с учетом происхождения, пола (самцы), возраста (3 месяца), живой массы (200 г. ). Животных карантинировали в течение 14 суток. Результаты исследований представлены в таблицах 1,2 и 3.
Животным группы «контроль» и «подопытная»перед наркозом проводили премедикацию. Операцию по созданию модели травмы на ахилловом сухожилие выполняли под газовым наркозом. Доступ к сухожилию осуществляли с медиальной стороны тазовой конечности в области голени. Перед оперативным вмешательством в этой области удаляли волосяной покров и создавали стерильное оперативное поле. Для лучшей визуализации осуществляли продольные разрезы и выделяли сухожилие.Травму моделировали посредством поперечного разреза дистальной трети ахилла, ближе к месту прикрепления к пяточной кости заплюсны. В условиях полного расслабления мышц, область повреждения сухожилия сшивали специальным сухожильным швом.
Аналогичные оперативные вмешательства выполняли на всех сроках эксперимента (7-е сутки, 14-е сутки, 30-е сутки, и 60-е сутки).
На третье сутки после операции, каждому животному подопытной группы проводили введение аутологичного клеточного продукта (СВФ). Животным контрольной группы стромально-васкулярную фракцию не вводили, преследуя задачу - получить полную картину естественной регенерации ахиллова сухожилия.
Для получения тестируемой фракции осуществляли липосакцию в области холки. После разреза фрагмент жировой ткани помещали в транспортную среду и доставляли в лабораторию, где производили приготовление суспензии стромально-васкулярной фракции.
Животным подопытной группы стромально-васкулярную фракцию вводили однократно, в объеме 1 мл подкожно в область дефекта на расстоянии 5 мм от области травмы с двух сторон. У крыс контрольной группы область повреждения регенерировала самопроизвольно.
На основании данных сравнительного микромофометрического анализа регенерата в исследуемых группах, установлено, что на 7 сутки у особей контрольной группы пучки коллагеновых волокон первого порядка тонкие, не имеют строгой ориентационной упорядоченности и четких границ, в отличие от пучков первого порядка у крыс подопытной группы, которые по параметрам толщины коллагеновых конструкций опережали группу контроля. На 14 сутки наблюдений тенденция к увеличению толщины пучков сохранялась с преимуществом у подопытной группы. К 30 суткам эксперимента у крыс подопытной группы толщина пучков 1-го порядка существенно возрастала, по сравнению с предыдущим сроком наблюдений. Следует отметить, что сами волокна приобретают волнистую конфигурацию, свойственную морфологической организации сухожилия в норме. На заключительном сроке эксперимента выявлены достоверные различия в показателях толщины пучков 1-го порядка у животных сравниваемых групп. Более того, морфометрические показатели сухожильной ткани у животных подопытной группы на 60-е сутки практически соответствовали параметрам нормы (интактной группе). Таблица 1.
При изучении микроморфометрических показателей на 14-е сутки эксперимента, было выявлено, что на данном сроке регенеративного процесса в ткани сухожилия формируются хорошо различимые пучки 2-го порядка. Представители подопытной группы достоверно опережают по показателям их толщины своих контрольных аналогов. Этот процесс усиливается к 30-м суткам эксперимента. На заключительном сроке эксперимента (60-е сутки), показатель толщины волокон в подопытной группе становится равен 40.1±6.8 мкм, что соответствует цифровым значениям структур сухожильной ткани в норме (показатель толщины составляет 43±4.85 мкм). Таблица 2.
При микроморфометрических исследованиях кровеносного русла ткани регенерата, было установлено, что существенных различий между показателями представительства кровеносных капилляров в сравниваемых группах не обнаружено. Вместе с тем, на 30-е сутки наблюдений у животных в подопытной группе насыщенность ткани сухожилия капиллярами превосходит таковую в контроле. Из этого следует, что стромально-васкулярная фракция существенное влияние на развитие капиллярной сети в области дефекта оказывает на 30-ые сутки эксперимента. Таблица 3.
Таким образом, предложенный способ стимуляции репаративной регенерации при тендопатиях, отличается быстротой выполнения, стимуляцией процессов ангио- и коллагеногенеза в травмированной зоне, а такжесокращением общих сроков заживления и возможностью профилактирования возникновения рецидивов повреждения.