Иммунобиологическое средство на основе бутирата и способ его использования для терапии воспалительных заболеваний кишечника
IMMUNOBIOLOGICAL AGENT BASED ON BUTYRATE AND THE METHOD FOR ITS USE FOR THE TREATMENT OF INFLAMMATORY BOWEL DISEASES

Область техники
Изобретение относится к фармакологии и гастроэнтерологии и касается способа получения иммунобиологического средства на основе бутирата натрия и его применения для терапии воспалительных заболеваний кишечника.
Предшествующий уровень техники
Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК) являются одной из актуальнейших проблем современного здравоохранения. В структуре заболеваний органов пищеварения ВЗК занимают ведущее место по частоте осложнений, тяжести течения, инвалидизации и летальности. При этом результаты эпидемиологических исследований свидетельствуют о постоянном росте заболеваемости данной патологией как в России, так и во всем мире.
Среди воспалительных заболеваний кишечника выделяют две основные клинические формы - язвенный колит и болезнь Крона. Язвенный колит характеризуется поражением толстого кишечника, тогда как болезнь Крона может поражать любой отдел желудочно-кишечного тракта. Сходство этих заболеваний заключается в том, что в их основе лежит хроническое разрушение слизистой оболочки; течение заболеваний носит фазный характер с периодами обострения и стадиями ремиссии. Этиология ВЗК до конца не ясна и, согласно современным представлениям, зависит от нескольких факторов, таких как, генетическая предрасположенность, факторы окружающей среды, иммунологический статус пациента и нарушение гомеостаза микробиоты.
Терапия ВЗК в настоящее время включает использование противовоспалительных препаратов на основе салицилатов (сульфасалазин, олсалазин и мезаламин) [Г.Адлер. Болезнь Крона и язвенный колит. Москва. «ГЭОТАР-МЕД». 2001. стр.285, 322]. Однако данные препараты имеют ряд побочных эффектов (наиболее часто встречаются - снижение аппетита, головная боль, тошнота, рвота, расстройства желудка, обратная олигоспермия и более редко - зуд, крапивница, сыпь, повышение температуры тела, анемия с тельцами Гейнца, гемолитическая анемия и цианоз). Если ремиссии у пациента в этой фазе лечения достичь не удается, то происходит «эскалация» терапии, заключающаяся в назначении глюкокортикостероидов и иммунодепрессантов. Данные препараты переносятся гораздо хуже за счет серьезных побочных эффектов, включающих повышение восприимчивости к инфекциям, потерю костной массы, диабет, мышечную атрофию и психиатрические нарушения.
По различным оценкам, у 10-20% пациентов с тяжелым течением заболевания, лекарственная терапия не дает эффекта и требуется хирургическое вмешательство.
Очевидно, что в настоящее время существует большая потребность в разработке новых средств, позволяющих расширить арсенал терапевтических препаратов против воспалительных заболеваний кишечника.
Известно изобретение по патенту № PCT / US2012 / 058574, которое предполагает использование для лечения и выявления воспалительных заболеваний кишечника молекулы, специфически связывающей изоформу ED-A фибронектина. При этом данная молекула может быть конъюгирована с иммунодепрессивной или противовоспалительной молекулой, такой как интерлейкин-10.
Известно несколько решений, в которых для профилактики и лечения воспалительных заболеваний кишечника используют пробиотики - штаммы Lactobacillus salivarius AH102, AH103, AH105, AH109 или AH110 (патент №2302458), штамм Lactobacillus brevis 47f (RU2675110C1), штамм Escherichia coli M-17 совместно с антибиотиком метронидазолом, к которому устойчив данный штамм (EP2040724B1).
Известна схема лечения согласно патенту № 2463055, которая предполагает на первом этапе пероральное введение пробиотика бифиформ (Enterococcus faecium и Bifidobacterium longum), а затем 4-5 кратное введение в слизистую оболочку измененных участков кишки препарата ремикейд (ингибитор ФНОα) и далее прием пробиотика бифиформ в течение 3х недель. Способ позволяет повысить эффективность лечения за счет усиления пролиферации эпителиальных клеток и усиления образования мелких фолликулов и увеличения количества бокаловидных клеток слизистой оболочки кишечника, нормализации структуры кишечных крипт.
Известно решение согласно патенту №2297835, где для лечения неинфекционных воспалительных болезней кишечника используется препарат, содержащий 5-аминосалициловую кислоту (5-АСК) или вещество, распадающееся в организме с образованием 5-АСК и лиофильно высушенную микробную массу живых бифидобактерий или лактобактерий или их смесь, где бактерии могут быть иммобилизованы на сорбенте. Компоненты препарата сгруппированы в две капсулы, при этом одна капсула содержит микробную массу живых бактерий, а другая - месалазин или сульфасалазин.
Известно решение согласно патенту EP 2114391 A1, в котором для терапии воспалительных заболеваний кишечника используется бутират натрия, защищенный триглициридной матрицей. Данное техническое решение как наиболее близкое к заявляемому по составу действующего вещества и способу его использования выбрано авторами заявляемого изобретения за прототип. Главными недостатками прототипа являются небольшая продолжительность действия и большое количество побочных эффектов.
Таким образом, в настоящее время существует потребность в разработке эффективного средства для терапии воспалительных заболеваний кишечника, лишенного указанных недостатков.
Осуществление изобретения
Технической задачей данного изобретения является создание безопасного средства для эффективного лечения воспалительных заболеваний кишечника.
Технический результат заключается в создании безопасного иммунобиологического средства для терапии воспалительных заболеваний кишечника на основе бутирата натрия, обеспечивающего доставку действующего вещества в кишечник, а также обеспечивающего пролонгированное действие.
Указанный технический результат достигается тем, что создано иммунобиологическое средство для терапии воспалительных заболеваний кишечника, содержащее компонент 1, представляющее собой средство в виде бутирата натрия, упакованного внутрь частиц из сополимера молочной и гликолевой кислот в буферном растворе, и компонент 2, представляющий собой средство в виде бутират-синтезирующих бактерий в буферном растворе.
Кроме того, технический результат достигается тем, что предложен способ использования разработанного иммунобиологического средства для лечения воспалительных заболеваний кишечника путем перорального введения его компонентов в эффективном количестве. При этом вводят компонент 1 с последующим введением компонента 2, или компоненты вводят одновременно.
Краткое описание фигур.
На фиг. 1
представлен график зависимости активности люциферазы, экспрессируемой клетками линии HT29-AHR-lucia, от концентрации бутирата натрия, содержащегося в культуральной среде данных клеток.
Ось абсцисс - активность люциферазы (отн. ед).
Ось ординат - концентрация бутирата, мМоль/л.
На фиг. 2
представлена кинетика распределения рентгеноконтрастного вещества Тразограф в отделах желудочно-кишечного тракта после перорального введения в различных объемах. Черной стрелкой отмечен желудок. Серой стрелкой отмечена слепая кишка (cecum). В столбцах: 1 - контрольное (интактное) животное; 2 - животные, которым вводили Тразограф в объеме 300 мкл, 3 - животные, которым вводили Тразограф в объеме 500 мкл. В строках: А - сразу после введения вещества, В - через 20 минут после введения вещества, С - через 1 час после введения вещества.
На фиг. 3
представлена схема эксперимента по проверке эффективности разработанного иммунобиологического средства на модели колита, индуцированного декстран сульфатом натрия.
На фиг. 4
представлен график изменения веса мышей с колитом, индуцированным введением декстран сульфата натрия. На графике представлены следующие экспериментальные группы животных:
DSS, ПЛГА с бутиратом натрия;
DSS, ПЛГА с бутиратом натрия, бутират-синтезирующие бактерии (Faecaliabacterium prausnitzii);
DSS, бутират-синтезирующие бактерии (Faecaliabacterium prausnitzii);
DSS, ФСБ 500 мкл;
Интактные животные.
Ось абсцисс - изменение веса животных, в % от начального веса.
Ось ординат - время с начала эксперимента (дни).
На фиг. 5
представлены результаты эксперимента по оценке выживаемости мышей с колитом, индуцированным введением декстран сульфата натрия. На графике представлены следующие экспериментальные группы животных:
DSS, ПЛГА с бутиратом натрия;
DSS, ПЛГА с бутиратом натрия, бутират-синтезирующие бактерии (Faecaliabacterium prausnitzii);
DSS, бутират-синтезирующие бактерии (Faecaliabacterium prausnitzii);
DSS, ФСБ 500 мкл;
Интактные животные.
Ось абсцисс - выживаемость животных, %.
Ось ординат - время с начала эксперимента (дни).
На фиг. 6
представлена схема эксперимента по оценке эффективности разработанного иммунобиологического средства на модели хронического воспаления кишечника мышей, колонизированных Campylobacter jejuni, под воздействием декстран сульфата натрия
На фиг. 7
представлены результаты сравнительного анализа длины кишечника мышей, имеющих хроническое воспаление кишечника, которым вводили разработанное иммунобиологическое средство и контрольных групп.
Ось абсцисс - длина кишечника животных, см
Ось ординат - экспериментальные группы.
Группа 1: Интактные животные.
Группа 2: С. Jejuni;
Группа 3: С. Jejuni, DSS;
Группа 4: С. Jejuni, DSS, ПЛГА-бутират;
Группа 5: С. Jejuni, DSS, ПЛГА-бутират, бутират-синтезирующие бактерии (Roseburia intestinalis);
На фиг. 8
представлены результаты сравнительного анализа экспрессии ИЛ-6 в кишечнике мышей, колонизированых Campylobacter jejuni, которым вводили разработанное иммунобиологическое средство и контрольных групп.
Группа 1: С. Jejuni;
Группа 2: С. Jejuni, ПЛГА-бутират;
Группа 3: С. Jejuni, ПЛГА-бутират, бутират-синтезирующие бактерии (Roseburia intestinalis);
Реализация изобретения.
Воспалительные заболевания кишечника тесно связаны с изменением состава и функции кишечной микробиоты. Было показано, что у пациентов с воспалительными заболеваниями кишечника видовой состав микрофлоры кишечника значительно отличается от такового у здоровых людей, в том числе отмечено значительное снижение количества бактерий, продуцирующих короткоцепочечные жирные кислоты, в частности бутират.
Бутират является основным энергетическим субстратом для колоноцитов, и, кроме того, является важным регулятором гомеостаза кишечника. Было показано влияние бутирата на проницаемость кишечного барьера, которое заключается в увеличении секреции основного компонента слизи - муцина (muc2) и стимуляции экспрессии белков плотных контактов (TJ) клеток эпителия (Finnie IA. Colonic mucin synthesis is increased by sodium butyrate. Gut. 1995;36(1):93-9.; Wang HB, Butyrate enhances intestinal epithelial barrier function via up-regulation of tight junction protein Claudin-1 transcription. Dig Dis Sci. 2012 57(12):3126-35). Также бутират влияет на регенерацию эпителия, стимулируя дифференцировку энтероцитов.
Кроме того, показано влияние бутирата на формирование иммунного ответа в кишечнике. Он способствует повышению экспрессии антимикробных пептидов в просвет кишечника, а также оказывает противовоспалительное действие на слизистую оболочку за счет увеличения ацетилирования гистонов и уменьшения активации провоспалительного транскрипционного фактора NF-κB.
Было показано, что недостаток бутирата и других короткоцепочечных жирных кислот приводит к атрофии слизистой оболочки, а затем к питательному колиту. Следовательно, введение бутирата может оказывать благоприятное действие при различных воспалительных заболеваниях кишечника.
Известно использование бутирата в виде клизм для лечения экспериментального диверсионного колита крыс (R. Pacheco, Use of butyrate or glutamine in enema solution reduces inflammation and fibrosis in experimental diversion colitis World J Gastroenterol. 2012 18(32): 4278-4287). Обработка бутиратом приводила к значительному снижению колоноскопических и гистологических показателей, восстановлению плотности коллагеновых волокон в ткани и количества бокаловидных клеток, а также уменьшению скорости апоптоза в эпителии до нормальных значений. Высокие уровни цитокинов в толстой кишке крыс с диверсионным колитом после лечения бутиратом также снижались до нормальных значений.
Однако исследования на людях, в процессе которых проводилось ректальное орошение слизистой кишечника бутиратом, не продемонстрировали столь впечатляющих результатов (Breuer RI и др. Short chain fatty acid rectal irrigation for left-sided ulcerative colitis: a randomised, placebo controlled trial. Gut. 1997 Apr;40(4):485-91; Scheppach W. Treatment of distal ulcerative colitis with short-chain fatty acid enemas. A placebo-controlled trial. German-Austrian SCFA Study Group. Dig Dis Sci. 1996 Nov;41(11):2254-9). Оба исследования показали, что у пациентов, которым ректально вводили бутират, наблюдались тенденции к улучшению гистологических и колоноскопических показателей, однако статистически значимых улучшений клинических показателей достичь не удалось. Скорее всего, негативные результаты исследований связаны с тем, что ректальное орошение неспособно обеспечить длительного контакта бутирата со слизистой кишечника, достаточного для проявления терапевтического эффекта. Кроме того, при ректальном введении препарата человеку, воздействие в основном происходит на прямую кишку, тогда как в патогенез воспалительных заболеваний кишечника могут быть вовлечены вышестоящие отделы. При этом оральное применение бутирата ограничено тем, что он разрушается в процессе прохождения через желудочно-кишечный тракт и в толстом кишечнике не достигается терапевтическая концентрация.
В изобретении, взятом авторами патента за прототип, предлагается использование бутирата, защищенного триглицеридной матрицей. Однако, клинические исследования триглицерида бутирата показали, что данный препарат обладает значительным количеством побочных эффектов, включающих диарею, головную боль, спазмы в животе, тошноту, анемию, запор, азотемию, усталость, сыпь, алопецию, запах, дисфорию и потерю ориентации. Кроме того, было показано, что бутират не обнаруживается в плазме крови уже через 5 часов после введения.
Таким образом, задачей данного изобретения была разработка эффективного и безопасного средства на основе бутирата для лечения воспалительных заболеваний кишечника пролонгированного действия. Данная задача была решена путем создания двухкомпонентного иммунобиологического средства.
Компонент 1 представляет собой средство в виде бутирата натрия, инкапсулированного в частицы, состоящие из сополимера молочной и гликолевой кислот (ПЛГА-бутират) в буферном растворе.
Проведенные исследования показали, что частицы ПЛГА-бутират способны эффективно доставлять действующее вещество в толстый кишечник и обеспечивают достижение концентраций, необходимых для реализации терапевтического эффекта.
Компонент 2 представляет средство в виде бутират-синтезирующих бактерий в буферном растворе. Компонент 1 разработанного средства оказывает опосредованное бактериостатическое действие на многие патогенные бактерии, при этом он не действует на представителей нормофлоры. Таким образом, введение компонента 1 позволяет освободить экологические ниши для заселения бутират-синтезирующими комменсальными бактериями. Далее, терапевтический эффект будет поддерживаться за счет синтеза бутирата бутират-синтезирующими бактериями. Таким образом, введение компонента 2 позволит пролонгировать полученный терапевтический эффект.
Пример 1. Получение компонента 1 разработанного иммунобиологического средства.
Целью данной работы является получение частиц сополимера молочной и гликолевой кислот, внутри которых находится бутират натрия, (ПЛГА-бутират) которые являются компонентом 1 иммунобиологического средства.
Для этого водный раствор бутирата натрия (1,6 мг/мл) смешивали с раствором сополимера молочной и гликолевой кислот 50:50 (2мг/мл) в этилацетате в соотношении 1:10 с образованием эмульсии типа «вода/масло». Эмульгирование проводили с помощью источника ультразвука (30 секунд при амплитуде 45-50% и времени озвучивания/покоя 2/2 секунд). Первичную эмульсию затем приливали к внешней водной фазе, которая содержала стабилизатор поливиниловый спирт (ПВС) (4мг/мл), и гомогенизировали с помощью источника ультразвука (1 минуту 45-50% и времени озвучивания/покоя 2/2 секунд). Реакционную смесь выдерживали на льду в течение 12 ч при непрерывном перемешивании для дальнейшего удаления растворителя и затвердевания частиц. Далее суспензию центрифугировали 1000xg в течение 10 мин. Супернатант отбирали в новую пробирку, разбавляли деионизированной водой до 40 мл и центрифугировали 16000xg 1,5 часа. Затем супернатант удаляли, а образовавшийся осадок растворяли в 5 мл деионизированной воде с помощью ультразвуковой бани. Далее суспензию 5 раз отмывали от избыточного ПВС, путем разбавления водой и ультрацентрифугирования и далее сушили методом лиофилизации.
Таким образом, в результате проведенной работы были получены частицы сополимера молочной и гликолевой кислот, внутри которых находится бутират натрия (ПЛГА-бутират), которые являются компонентом 1 в разработанном иммунобиологическом средстве.
Пример 2. Получение компонента 2 иммунобиологического средства.
Компонент 2 иммунобиологического средства представляет собой бутират-синтезирующие бактерии в буферном растворе, обеспечивающем их выживаемость.
В качестве бутират-синтезирующих бактерий использовали Faecaliabacterium prausnitzii (DSM 17677), Roseburia intestinalis (DSM 14610) или смесь данных бактерий в фосфатно-солевом буфере. Бутират-синтезирующие бактерии заселяют кишечник и синтезируют бутират, оказывающий терапевтический эффект на ЖКТ, тем самым пролонгируя действие компонента 1 (ПЛГА-бутират). Поэтому вместо вышеперечисленных видов бактерий можно использовать любые бутират-синтезирующие бактерии. В качестве буферного раствора может быть использован любой раствор, обеспечивающий жизнеспособность бактерий и не токсичный для млекопитающих.
2
2
2
Faecaliabacterium prausnitzii культивировали при 37°C в среде LYHBHI [сердечно-мозговой бульон (Himedia M210) с добавлением 0,5% дрожжевого экстракта и 5 мг / л гемина] с добавлением целлобиозы (1 мг / мл), мальтозы (1 мг / л) и цистеина (0,5 мг / мл) в анаэробной камере. Ночная культура бактерий была лиофильно высушена. Roseburia intestinalis культивировали в среде Rumen bacteria medium (DSMZ Medium 330) при 37°C без перемешивания в анаэробном шкафу в атмосфере 85% N /10% H /5% CO. Ночная культура бактерий была лиофильно высушена.
Таким образом, был получен компонент 2 разработанного иммунобиологического средства, представляющий собой бутират-синтезирующие бактерии Faecaliabacterium prausnitzii и Roseburia intestinalis.
Пример 3. Изучение стабильности компонента 1 (ПЛГА-бутират) в средах кислым рН.
Для обеспечения эффективной доставки действующего вещества (бутирата натрия) в толстый кишечник, частицы ПЛГА-бутират (компонент 1) должны быть устойчивы к кислой среде пищеварительного тракта и не разрушаться длительное время.
Целью данного исследования являлось изучение стабильности частиц ПЛГА-бутират (компонент 1) в средах кислым рН.
Для этого готовили буферные растворы с различным рН (Государственная Фармакопея РФ):
1) Фосфатный буферный раствор рН3,5: 68,0 г калия дигидрофосфата растворяют в воде, доводят рН до 3,5 потенциометрически с помощью фосфорной кислоты концентрированной. Доводят объём раствора водой до 1000,0 мл.
2) 0,05М Фосфатный буферный раствор рН4,5: 6,80 г калия дигидрофосфата растворяют в 1000,0 мл воды.
3) Фосфатный буферный раствор рН5,5: готовят раствор I. Для этого 13,61 г калия дигидрофосфата растворяют в воде и доводят объём раствора водой до 1000,0 мл; также готовят раствор II.Для этого 35,81 г динатрия гидрофосфата растворяют в воде и доводят объём раствора водой до 1000,0 мл. Смешивают 96,4 мл раствора I и 3,6 мл раствора II.
Далее в пробирку помещали 1 мл одного из перечисленных буферных растворов и добавляли 1 мг ПЛГА-бутират (компонент 1). Далее оценивали размер частиц на Malvern ZetaSizer Nano S сразу (0 часов) или через 3, 6 часов. Полученные данные представлены в таблице 1.
Таблица 1. Размер частиц ПЛГА-бутират (компонент 1) после выдержки в буферных растворах с различным рН.
Время, часы
0
3
6
рН 3,5
256,6
271,6
276,6
pH4,5
189,6
191,3
196,8
pH 5,5
241,6
186,8
249,6
Результаты эксперимента показали, что кислая среда не ускоряет разложение частиц ПЛГА. Время прохождения пищи через желудок у человека в среднем занимает до 6 часов. Как видно из представленных данных, за это время размер частиц ПЛГА-бутират (компонент 1) в кислой среде практически не меняется. Это позволяет предположить, что частицы могут успешно преодолеть желудок.
Таким образом, полученные результаты показывают, что частицы ПЛГА бутират не разрушаются в кислой среде в течение 6 часов и. следовательно, позволяют доставлять действующее вещество в кишечник.
Пример 4. Определение количества бутирата натрия, инкапсулированного внутрь частиц ПЛГА-бутират (компонент 1).
Различные партии частиц ПЛГА-бутират могут незначительно отличаться по содержанию бутирата натрия, инкапсулированного внутрь частиц.
Целью данного эксперимента является определение количества бутирата натрия, инкапсулированного внутрь частиц ПЛГА-бутирата из 3-х партий.
Для достижения данной цели использовали культуру клеток HT29-AHR-Lucia (Invivogen). Это клеточная линия на основе клеток аденокарциномы толстой кишки человека НТ29, содержащая секретируемый репортерный ген люциферазы Lucia, экспрессия которой зависит от активности транскрипционного фактора, называемого арилуглеводородный рецептор (AhR). Известно, что бутират способен активировать AhR и экспрессию AhR-зависимых генов (Ludovica Marinelli, Camille Martin-Gallausiaux, Jean-Marie Bourhis, Fabienne Béguet-Crespel, Hervé M. Blottière, Nicolas Lapaque. Identification of the novel role of butyrate as AhR ligand in human intestinal epithelial cells. Sci Rep. 2019; 9: 643.Published online 2019 Jan 24. doi: 10.1038/s41598-018-37019-2). Таким образом, добавление бутирата натрия в культуральную среду клеток в итоге приводит к экспрессии клетками люциферазы, которая накапливается в культуральной среде.
2
Для проведения данного эксперимента клетки помещали на 96 луночный планшет для культур клеток и культивировали в среде DMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, 2мМ глутамина и смеси антибиотиков, в СО инкубаторе при температуре 37°С и влажности 5% в течение суток. Далее к клеткам добавляли бутират натрия до конечной концентрации 0,2 mM, 2mM, 20mM. ПЛГА-бутират из трех различных партий предварительно лизировали в 0,1н NaOH 30 мин при температуре 37С на ультразвуковой бане, далее суспензию нейтрализовали добавлением HCl и добавляли к клеткам до конечной концентрации 20mM.
Через 8 часов оценивали активность люциферазы в культуральной среде клеток согласно рекомендации производителя. Используя полученные результаты строили калибровочную кривую (фиг. 1). Полученная кривая может быть описана формулой y=832,65ln(х)+2292,8, где у - это активность люциферазы, а х - концентрация бутирата натрия в культуральной среде клеток HT29-AHR-lucia.
((y-2292,8)/832,65)
Таким образом, концентрация бутирата натрия в культуральной среде клеток HT29-AHR-lucia после добавления частиц ПЛГА-бутират определяли по формуле: x=e,где у - это активность люциферазы, а х - концентрация бутирата натрия в культуральной среде клеток HT29-AHR-lucia. Соотношение между количеством частиц ПЛГА-бутират и количеством бутирата натрия, инкапсулированного внутрь частиц ПЛГА-бутират определялось путем деления концентрации частиц ПЛГА-бутират в клеточной среде (20mM) на концентрацию бутирата натрия (х), полученную в результате расчетов. Результаты расчетов представлены в таблице 2
Таблица 2. Количество бутирата натрия инкапсулированного внутрь частиц ПЛГА-бутират.
Номер партии частиц ПЛГА-бутират
Активность люциферазы в культуральной среде клеток HT29-AHR-lucia после добавления частиц ПЛГА-бутират до концентрации 20 mM, отн. ед.
Концентрация бутирата натрия в культуральной среде клеток HT29-AHR-lucia после добавления ПЛГА-бутират до концентрации 20 mM (mM)
Соотношение между количеством частиц ПЛГА-бутират и количеством бутирата натрия, инкапсулированного внутрь частиц ПЛГА-бутират
0123
2900
2,07
9,66
0124
3018
2,39
8,37
0127
2813
1,87
10,70
Как видно из полученных результатов, количество бутирата натрия в частицах ПЛГА-бутират (компонент 1), полученных в различных партиях, может незначительно отличаться. Поэтому в дальнейших экспериментах все растворы, содержащие частицы ПЛГА-бутират (компонент 1), были нормализованы по содержанию инкапсулированного бутирата натрия.
Пример 5. Определение оптимального объема средства для перорального введения.
Целью данного исследования является определение оптимального объема компонентов средства для перорального введения животным.
Для проведения эксперимента самкам мышей линии C57BLV5 (18-20 г.) перорально, используя гаважную иглу, проводилось введение рентгеноконтрастного вещества Тразограф 76% ("Unique Pharmaceutical Laboratories", Индия) в различных объемах: 300 мкл и 500мкл. Оценка распределения рентгеноконтрастного вещества проводилась непосредственно сразу после перорального введения рентгеноконтрастного вещества, а также через 20 и 60 минут. В качестве контроля использовались интактные животные, которым не проводилось введение рентгеноконтрастного вещества. Для оценки распределения рентгеноконтрастного вещества по отделам желудочно-кишечного тракта животные обездвиживались инъекционным ксилазин-золетиловым наркозом ("Interchemie werken "De Adelaar" B.V", Нидерланды и Virbac, Франция, соответственно), после чего животные помещались в систему для визуализации с источником рентгеновых волн Kodak in vivo FX Pro, США. Время экспозиции составляло 3 минуты. Результаты эксперимента представлены на Фиг. 2.
Согласно полученным изображениям непосредственно сразу после перорального введения 300 и 500 мкл Тразографа вещество присутствует в желудке всех животных (обозначено красной стрелкой). При этом только у животных получивших 500 мкл Тразографа непосредственно после введения отмечается контрастирование верхних отделов кишечника. Через 20 минут после перорального введения рентгеноконтрастного вещества у животных получивших 300 мкл препарата контрастирование наблюдается только верхних отделов кишечника. При этом количество препарата в желудке резко падает. В группе животных получивших 500 мкл Тразографа через 20 минут рентгеноконтрастное вещество наблюдается не только в желудке, но и на протяжении всего тонкого и толстого кишечника. Отчетливо видно заполнение слепого отростка (cecum) препаратом (обозначено синей стрелкой). Через 60 минут после перорального введения вещество во всех группах находится в кишечнике, отличия между группами стираются из-за процессов всасывания препарата через стенку кишечника. На основании полученных результатов, для введения частиц ПЛГА была выбран объем 300 мкл, а для введения бутират-синтезирующих бактерий был выбран объем 500 мкл.
Пример 6. Проверка эффективности разработанного иммунобиологического средства на модели колита, индуцированного декстран сульфатом натрия.
Целью данного эксперимента является проверка способности разработанного средства оказывать благоприятный терапевтический эффект на колит, индуцированный декстран сульфатом натрия у мышей.
Схема эксперимента представлена на фиг. 3. Для данного эксперимента использовали SPF мышей линии С57/Bl6 18-20г. Все животные были разделены на 5 групп по 10 мышей:
1) DSS; ПЛГА с бутиратом натрия;
2) DSS; ПЛГА с бутиратом натрия, бутират-синтезирующие бактерии (Faecaliabacterium prausnitzii);
3) DSS; бутират-синтезирующие бактерии (Faecaliabacterium prausnitzii);
4) DSS;ФСБ 500 мкл;
5) Интактные животные.
Животным в группах 1-4 питьевую воду заменяли на 2% раствор декстран сульфата натрия (DSS) (Affymetrix, США, молекулярный вес 40-50 кДа) в стерильной воде. Контрольным животным (группа 5) оставляли стерильную питьевую воду. Поилки заполняли из расчета 200 мл жидкости/группу. Поилки заменяли каждые два дня. Животным обеспечивали неограниченный доступ к воде и корму.
Терапию начинали со 2 дня после начала эксперимента. В группе 1 каждый день в течение 7 дней вводили ПЛГА-бутират (компонент 1) в дозе 3,86 мг/мышь (что соответствует дозе 0,4 мкг действующего вещества - бутирата натрия, на мышь). Для этого лиофилизированные частицы ПЛГА-бутират (компонент 1) растворяли в фосфатно-солевом буферном растворе и вводили в объеме 300 мкл. В группе 2 начиная со 2 дня после начала эксперимента каждый день, в течение 7 дней, вводили ПЛГА-бутират (компонент 1) в дозе 3,86 мг/мышь (что соответствует 400 мкг действующего вещества - бутирата натрия, на мышь). Для этого лиофилизированные частицы ПЛГА-бутират (компонент 1) растворяли в фосфатно-солевом буферном растворе и вводили в объеме 300 мкл. Также животным этой группы со 2 дня после начала эксперимента каждый день, в течение 7 дней, перорально вводили бутират-синтезирующие бактерии вида Faecaliabacterium prausnitzii (компонент 2). Лиофилизированные бактерии растворяли в стерильном фосфатно-солевом буфере (ФСБ) и вводили в объеме 500 мкл. В группе 3 начиная со 2 дня после начала эксперимента каждый день в течение 7 дней вводили бутират-синтезирующие бактерии вида Faecaliabacterium prausnitzii (компонент 2). Лиофилизированные бактерии растворяли в стерильном фосфатно-солевом буфере (ФСБ) и вводили в объеме 500 мкл. Группа 4 и 5 использовались в качестве контроля. В группе 4 были животные, которые получали DSS и не получали терапии. В группе 5 были интактные животные, которые не получали DSS.
В течение всего срока эксперимента оценивали вес и выживаемость животных. Полученные данные представлены на фиг. 4-5. Как видно из представленных данных, животные, которые получали DSS, теряли в весе из-за воспаления в ЖКТ и затем погибали. Терапия компонентом 1 разработанного средства (ПЛГА с бутиратом натрия) привела к улучшению состояния животных, вследствие чего их вес стал расти. Однако после отмены терапии, животные снова начали терять вес и погибли. Вследствие чего можно сделать вывод, что ПЛГА с бутиратом натрия эффективно защищают животных от DSS-индуцированного колита, однако эффект не сохраняется после отмены препарата. В группах животных, которым вводили ПЛГА с бутиратом натрия и бутират-синтезирующие бактерии также наблюдался положительный терапевтический эффект, который сохранялся и после отмены препарата, что говорит о пролонгированном действии. Введение мышам с индуцированным колитом только бутират-синтезирующих бактерий не приводило к значимому улучшению состояния животных.
Таким образом, по результатам проведенного исследования можно сделать вывод, что разработанное иммунобиологическое средство обладает благоприятным терапевтическим эффектом для лечения колита, индуцированного декстран сульфатом натрия.
Пример 7. Проверка эффективности разработанного иммунобиологического средства на модели хронического воспаления кишечника мышей, колонизированных Campylobacter jejuni, под воздействием декстран сульфата натрия.
Воспалительные заболевания кишечника часто связаны с дисрегуляцией иммунного ответа на бактериальную микрофлору у восприимчивых людей. Campylobacter jejuni признана одной из ведущих причин инфекционных бактериальных кишечных инфекций во всем мире (S.Mousavi, S. Bereswill, M.Heimesaat. Novel Clinical Campylobacter jejuni Infection Models Based on Sensitization of Mice to Lipooligosaccharide, a Major Bacterial Factor Triggering Innate Immune Responses in Human Campylobacteriosis. Microorganisms. 2020 Apr; 8(4): 482. Published online 2020 Mar 28. doi: 10.3390/microorganisms8040482). У большинства пациентов с диареей Campylobacter есть какой-либо компонент сегментарного колита, который обычно начинается в тонкой кишке и прогрессирует дистально к слепой и толстой кишке (Siegal D, Syed F, Hamid N, Cunha BA. Campylobacter jejuni pancolitis mimicking idiopathic ulcerative colitis. Heart Lung. 2005 Jul-Aug;34(4):288-90. doi: 10.1016/j.hrtlng.2004.10.003. PMID: 16027651). Авторами патента была разработана модель хронического (не летального) воспаления кишечника мышей, индуцированного Campylobacter jejuni.
Целью данного эксперимента являлась оценка эффективности разработанного иммунобиологического средства на модели хронического воспаления кишечника мышей, колонизированных Campylobacter jejuni, под воздействием декстран сульфата натрия.
Для данного эксперимента были использованы мыши гнотобионты (свободные от микрофлоры) линии C57/B6NTac. Моноколонизация кишечника мышей гнотобионтов Campylobacter jejuni в предварительном эксперименте не приводила к развитию воспалительной патологии кишечника. Поэтому животным дополнительно добавляли в воду декстран сульфат натрия (DSS). Выбор DSS основан на его способности удалять слой слизи кишечника, тем самым обеспечивая прямой контакт микроорганизмов с эпителиальными клетками кишечника. Обработка DSS способна имитировать дефицит слизистого слоя, который наблюдается у пациентов с генетическими дефектами в генах муцинов. В свою очередь мутации в генах муцинов ассоциированы с развитием хронических заболеваний кишечника, таких как болезнь Крона (Boltin D., Perets T.T., Vilkin A., Niv Y. Mucin function in inflammatory bowel disease: an update. // J Clin Gastroenterol. - 2013. V. 47. № - 2. P. - 106-11 5), язвенный колит (Senapati S., Ho S.B., Sharma P., Das S., Chakraborty S., Kaur S., Niehans G., Batra S.K. Expression of intestinal MUC17 membrane-bound mucin in inflammatory and neoplastic diseases of the colon. // J Clin Pathol. - 2010. V. - 63. № - 8. P. - 702-707).
Схема эксперимента представлена на фиг. 6
Были образованы следующие группы животных:
1) Интактные животные;
2) С. Jejuni;
3) С. Jejuni, DSS;
4) С. Jejuni, DSS, ПЛГА-бутират (компонент 1);
5) С. Jejuni, DSS, ПЛГА-бутират (компонент 1), бутират-синтезирующие бактерии Roseburia intestinalis (компонент 2).
2
2
8
8
Колонизацию кишечника животных С. jejuni осуществляли путем перорального введения суспензии микроорганизмов в объеме 500 мкл. Для культивирования клеток С. jejuni использовали колумбийский кровяной агар (BD, США). Бактерии культивировали при температуре 37°С, в газовой среде N2:C0:0 (17:2:1), время роста составляло 24-48 часов. Далее бактериальную суспензию центрифугировали при скорости 6000 об/мин. Осадок растворяли в фосфатно-солевом буферном растворе. Концентрацию бактерий в суспензии рассчитывали по стандарту мутности. Фактическая концентрация бактерий определялась путем высева дозы суспензии на специфические среды. Расчетная концентрация бактерий составила 2*10 КОЕ/мл. Фактическая концентрация, вводимая животным, составила 8*10 КОЕ/мл.
8
Через 7 дней после перорального введения культур бактерий проводили оценку эффективности колонизации кишечника животных. С этой целью проводили высев фекалий всех животных на твердые питательные среды и затем производили учет титров бактерий. Через 7 дней после перорального введения бактерий у всех животных в фекалиях определялись бактерии С.jejuni в титре не менее 5x10КОЕ на 1 грамм фекалий. Ни одно животное до добавления 2% декастрана сульфата в воду не теряло в весе и не характеризовалось каким-либо отклонением в поведении или внешнем виде от контрольных интактных животных. После получения информации, подтверждающей успешную колонизацию кишечника животных, на 14-й день эксперимента, у животных в группах 1-4 питьевую воду заменяли на 2% раствор декстран сульфата натрия (DSS) (Affymetrix, США, молекулярный вес 40-50 кДа) в стерильной воде. DSS продолжали давать до конца эксперимента независимо от проводимой терапии. Контрольные группы животных продолжали получать стерильную воду.
8
Через сутки после введения DSS, начинали терапию заболевания. Все вещества вводились перорально в стерильном фосфатно-солевом буфере (ФСБ). В группе 4 животным вводили ПЛГА-бутират (компонент 1) в дозе 3,35 мг/мышь (что соответствует 400 мкг действующего вещества - бутирата натрия, на мышь), в объеме 300 мкл, средство вводили каждый день в течение 7 дней. В группе 5 животным вводили ПЛГА-бутират (компонент 1) в дозе 3,35 мг/мышь (что соответствует 400 мкг действующего вещества - бутирата натрия, на мышь), в объеме 300 мкл, средство вводили каждый день в течение 7 дней. Далее через сутки после прекращения введения бутирата начинали терапию бутират-синтезирующими бактериями (компонент 2), которые вводили в дозе 2*10 КОЕ/мышь в объеме 500 мкл каждый день в течение 7 дней. Остальные группы животных были контрольными. В этих группах животным не проводили терапию воспалительных заболеваний кишечника.
На 30 день была проведена эвтаназия животных для определения тяжести воспалительной патологии кишечника. По сравнению с животными не получавшими терапию (группа 2) структура кишечников мышей подвергшихся терапии одним (группа 3) или двумя компонентами разработанного средства (группа 4) характеризовалась меньшей интенсивностью геморагий. При этом наибольший терапевтический эффект наблюдался в группе животных, которым вводили оба компонента разработанного иммунобиологического средства. Количественная оценка эффективности проведенной терапии была проведена измерением длины толстого кишечника животных и веса самих животных до и после проведенной терапии. Результаты эксперимента представлены на фиг. 7. Согласно полученным данным длина кишечника в группе животных, подвергшихся терапии одним или двумя компонентами разработанного средства, была статистически больше длины кишечника животных без терапии. На основании полученных данных, можно сделать вывод о том, что терапия разработанным иммунобиологическим средством способна обеспечивать терапевтический эффект в отношении воспалительной патологии кишечника мышей колонизированных С.jejuni с сочетанным воздействием декстрана сульфата.
Пример 8. Определение концентрации IL6 в тканях кишечника животных после введения разработанного иммунобиологического средства.
Интерлейкин 6 (ИЛ-6) является одним из важнейших медиаторов воспаления в кишечнике. Было показано, что повышение экспрессии ИЛ-6 в кишечнике приводит к индукции антиапоптотических факторов bcl-2 и bcl-xl и формированию пула Т-клеток, устойчивых к апоптозу, что приводит к хроническому воспалению. При этом блокировании передачи сигналов ИЛ-6 с помощью моноклональных антител (mAb) к рецептору ИЛ-6 устраняет устойчивость к апоптозу Т-клеток собственной пластинки кишечника. Клинические исследования гуманизированных моноклональных антител к рецептору ИЛ-6 показали, что введение данных антител пациентам с болезнью Крона приводит к хорошему терапевтическому эффекту, что также подтверждает важную роль ИЛ-6 в патогенезе воспалительных заболеваний кишечника.
Целью данного исследования являлась оценка способности разработанного средства влиять на повышенную экспрессию ИЛ-6 в кишечнике мышей, индуцированную инфекцией Campylobacter jejuni.
8
8
8
8
Для данного эксперимента были использованы мыши гнотобионты (свободные от микрофлоры) линии C57/B6NTac. Колонизацию кишечника животных Campylobacter jejuni осуществляли путем перорального введения суспензии микроорганизмов в объеме 500 мкл. Концентрацию бактерий в суспензии рассчитывали по стандарту мутности. Фактическая концентрация бактерий определялась путем высева дозы суспензии на специфические среды. Расчетная концентрация бактерий составила 2*10 КОЕ/мл. Фактическая концентрация, вводимая животным, составила 2,8*10 КОЕ/мл. На 14-й день эксперимента, у животных питьевую воду заменяли на 2% раствор декстран сульфата натрия (DSS) (Affymetrix, США, молекулярный вес 40-50 кДа) в стерильной воде. DSS продолжали давать до конца эксперимента независимо от проводимой терапии. Контрольная группа животных продолжала получать стерильную воду. Терапию начинали на 15-й день эксперимента и продолжали каждый день в течение 1 недели. ПЛГА-бутират (компонент 1) вводили в дозе 4,28 мг/мышь (что соответствует 400 мкг действующего вещества - бутирата натрия, на мышь), в объеме 300 мкл. Бутират-синтезирующие бактерии (компонент 2): смесь Faecaliabacterium prausnitzii 10КОЕ/мышь и Roseburia intestinalis 10КОЕ/мышь) в объеме 500 мкл вводили в группе 3 одновременно с компонентом 1.
Были образованы следующие группы животных (по 3 мыши/группу):
1) С. Jejuni; DSS;
2) С. Jejuni; DSS; ПЛГА-бутират (компонент 1);
8
8
3) С. Jejuni; DSS; ПЛГА-бутират (компонент 1) и одновременно бутират-синтезирующие бактерии (компонент 2): смесь Faecaliabacterium prausnitzii 10КОЕ/мышь и Roseburia intestinalis 10КОЕ/мышь);
На 21-й день эксперимента производили отбор образов кишечника (примерно 1 см в длину) у всех животных в одних и тех же отделах. Образцы после извлечения сразу помещались в центрифужные пробирки, содержащие 1мл фосфатно-солевого буфера, частицы для гомогенизации тканей (Omni International, США), а также однократный раствор ингибиторов протеаз (Sigma, США). Пробирки с образцами помещали в гомогенизатор и проводили разрушение ткани в течение 60 сек (МР Biomedicals, США). Полученные гомогенаты кишечника были нормализованы по концентрации белка. Концентрацию белка измеряли методом Бредфорда (Sigma, США) согласно протоколу производителя. Определение цитокинов и хемокинов проводили с использованием набора магнитных шариков с иммобилизованными антителами (BioRad, США) согласно протоколу производителя. Флуорисцентномеченные магнитные шарики (Magnetic beads), с сорбироваными антителами, вносили в лунки 96-луночного планшета и дважды промывали 100 мкл промывочным буфером (Wash buffer). Все этапы промывки производились с использованием магнитной подложки. В лунки планшета к шарикам вносили разбавленную в два раза буфером (Sample buffer) гомогенаты кишечника (по 500мкг на пробу) по 50 мкл, отрицательный контроль (буфер для образца) и контрольные образцы для построения калибровочной кривой. Затем, планшет инкубировали в течение 30 минут в орбитальном шейкере при комнатной температуре и 300 об/мин. Планшет трижды промывали 100 мкл промывочного буфера, после чего добавляли по 25 мкл вторичных антител, конъюгированных с биотином. Затем, инкубировали в течение 30 минут в орбитальном шейкере при комнатной температуре и 300 об/мин. Планшет трижды промывали 100 мкл промывочного буфера. В лунки планшета вносили по 50 мкл стрептовидинна, конъюгированного со фикоэритрином (РЕ) и инкубировали в течение 15 минут, после чего промывали трижды промывочным буфером. Затем в лунки планшета вносили по 120 мкл буфера (Assay buffer). Учет результатов производили на приборе 32 MAGPIX (Luminex, США). Расчет концентрации цитокинов проводили, используя программное обеспечение прибора.
Результаты эксперимента представлены на Фиг. 8. Как видно из представленных результатов, у животных, колонизированных Campylobacter jejuni под воздействием, декстран сульфата натрия, возникает хроническое воспаление кишечника, которое характеризуется повышением уровня ИЛ-6. Введение мышам разработанного средства позволяет достоверно снизить уровень ИЛ-6, а, следовательно снизить воспаление в кишечнике животных.
Таким образом, приведенные примеры подтверждают достижение технического результата: создание безопасного иммунобиологического средства для терапии воспалительных заболеваний кишечника на основе бутирата натрия, обеспечивающего доставку действующего вещества в кишечник, а также обеспечивающего пролонгированное действие.
Пример 9. Исследование токсичности разработанного средства на мышах при пероральном введении.
Целью данного эксперимента являлось исследование токсичности разработанного средства при пероральном введении.
В исследовании были использованы аутбредные мыши, самцы, массой 18-20 грамм, возрастом 7-8 недель.
Были сформированы следующие экспериментальные группы животных:
1) Компонент 1: ПЛГА-бутират в дозе 3,86 мг/мышь (0,4 мг инкапсулированного бутирата натрия), 20 мышей;
2) мг/мышь (4 мг инкапсулированного бутирата натрия), 20 мышей;
3) Компонент 1: ПЛГА-бутират в дозе 19,3 мг/мышь (2 мг инкапсулированного бутирата натрия), 20 мышей;
4) Компонент 1: ПЛГА-бутират в дозе 38,64 мг/мышь (4 мг инкапсулированного бутирата натрия), 20 мышей;
8
5) Компонент 2: бутират-синтезирующие бактерии (Roseburia intestinalis) в дозе 10КОЕ/мышь, 20 мышей;
9
6) Компонент 2: бутират-синтезирующие бактерии (Roseburia intestinalis) в дозе 10КОЕ/мышь, 20 мышей;
10
7) Компонент 2: бутират-синтезирующие бактерии (Roseburia intestinalis) в дозе 10КОЕ/мышь, 20 мышей;
8) плацебо (буферный раствор), 20 мышей.
Клинический осмотр каждого животного проводили ежедневно в течение 14 дней, регистрируя признаки интоксикации и число павших животных.
Фиксировали следующие параметры функционального состояния лабораторных животных: активность, передвижение, внешний вид, состояние шерсти, глаз, ушей, зубов, конечностей. Физиологические функции: дыхание, слюноотделение, слюна, моча, экскрет. -На протяжении эксперимента все животные оставались живы. Во всех группах животные выглядели здоровыми, активно поедали корм, адекватно реагировали на раздражители, проявляли исследовательский интерес. Шерстный покров густой, ровный и блестящий, плотно прилегал к поверхности тела, выпадения или ломкости шерсти не выявлено. Мышечный тонус не отличался повышенной возбудимостью. Ушные раковины без корок, не воспалены, подергиваний не замечено. Зубы обычного цвета, без поломок. Мыши были средней упитанности, истощением не страдали. Область живота в объеме не увеличена. Дыхание ровное, незатрудненное. Слюноотделение в норме. Частота мочеиспускания, цвет мочи, желудочно-кишечные показатели, мышечный тонус, рефлексы соответствовали физиологической норме. Поведение опытных животных не отличалось от контрольных.
На 14 сутки от начала эксперимента, осуществляли запланированную эвтаназию мышей методом дислокации шейных позвонков. В ходе проведения исследования животные в тяжелом состоянии с признаками неминуемой смерти не наблюдались, гибели животных не было.
Проводили полную некропсию тел всех животных. При некропсии исследовали внешнее состояние тела, внутренние поверхности и проходы, полость черепа, грудную, брюшную и тазовую полости с находящимися в них органами и тканями, шею с органами и тканями и скелетно-мышечную систему.
При макроскопическом исследовании не обнаружено влияния средства на состояние внутренних органов мышей, различий между контрольными и опытными группами не найдено. Статистически достоверных различий в массе органов между опытными и контрольной группами не обнаружено. Набор массы животных в опытных и контрольных группах не отличался.
Все приведенные примеры подтверждают выполнение поставленной технической задачи, а именно создание безопасного средства для эффективного лечения воспалительных заболеваний кишечника.
Промышленная применимость
Все приведенные примеры подтверждают эффективность иммунобиологического средства для терапии воспалительных заболеваний кишечника и промышленную применимость.