Реактивные изменения нейронов и астроцитов прилежащего ядра головного мозга после ограничения кровотока у крыс

УДК 612.826: 616-092.9

РЕАКТИВНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ НЕЙРОНОВ И АСТРОЦИТОВ ПРИЛЕЖАЩЕГО ЯДРА ГОЛОВНОГО МОЗГА ПОСЛЕ ОГРАНИЧЕНИЯ КРОВОТОКА У КРЫС

Н.Г.Наумов, А.В.Дробленков

REACTIVE CHANGES OF NEURONS AND ASTROCYTES IN THE NUCLEUS ACCUMBENS AFTER BLOOD FLOW RESTRICTION IN RATS

N.G.Naumov, A.V.Droblenkov

Институт экспериментальной медицины, Санкт-Петербург, Droblenkov_a@mail.ru

Работа посвящена выявлению реактивных изменений нейронов и астроцитов прилежащего ядра переднего мозга (ПЯ) через 7 сут экспериментального ограничения кровотока в бассейне обеих общих сонных артерий. ПЯ в данных условиях располагается в центре ассиметричной глобальной ишемии. Визуальную и морфометрическую оценку реактивных изменений клеток осуществляли на площади семи последовательных квадратов у взрослых самцов крыс. Контролем служили ложно оперированные животные. После окрашивания гистологических срезов методом Ниссля и глиального фибриллярного кислого белка астроцитов определяли морфометрические параметры нейронов и астроцитов. Выявлено, что через 7 суток ишемии большинство нейронов подвергаются гибели и гиперхромии-сморщиванию (состояние клеток, близкое к тому, которое устанавливается во внутренней части zona penumbra при формировании ишемического инфаркта мозга). Астроциты более устойчивы к процессу ишемического повреждения, чем нейроны. Формирование нейроно-глио-васкулярных комплексов представляет собой защитный механизм и условие выживания клеток в фокусе частичной ишемии. Ключевые слова: нейроны, астроциты, ишемия, прилежащее ядро, реактивные изменения

This paper is devoted to the experimental research revealing reactive changes of neurons and astrocytes in the nucleus accumbens (NAc) after 7 days of ishemia. It was reproduced by ligation of both common carotid arteries when NAc is located in the core of global ischemia. There was made a visual and morphometry analysis of reactive changes of cells in the area of seven consecutive squares in adult male rats. The control group consisted of falsely operated animals. We determined some morphometry parameters of neurons and astrocytes after the Nissl staining which marks glial fibrillary acidic protein. It was found out that after 7 days of ischemia most neurons undergo death and hyperchromia-wrinkle (a cell state close to the one of interior penumbra in pale infarction of brain). Astrocytes are more resistant to ischemic process than neurons. The formation of neuro-glio-vascular complexes is a protective mechanism and condition for the cell survival in the focus of partial ischemia. Keywords: neurons, astrocytes, ischemia, nucleus accumbens, reactive changes

Распространенной моделью ишемических повреждений головного мозга является модель с перевязкой обеих общих сонных артерий. В этом случае развивается асимметричная неполная глобальная ишемия мозга. Центр ишемии захватывает передний мозг, кровоснабжение которого значительно ограничено, поскольку он получает кровь через коллатеральные сосуды большого артериального круга из позвоночных артерий. Кровоснабжение же среднего

мозга нарушено в меньшей степени, поскольку он получает кровь из конечных ветвей действующих позвоночных артерий [1], расположен в краевой области ишемии и, следовательно, страдает в наименьшей степени. Животные выживают в течение 2-4 недель, если их не подвергать стрессовым воздействиям [2]. В течение этого времени по результатам неврологических и биохимических тестов устанавливают эффективность антигипоксантов и нейропротекторов.

Однако при данных условиях реактивные изменения клеток прилежащего ядра переднего мозга (ПЯ), расположенного в центре частичной ишемии, ранее не изучались.

Цель исследования — установить структурные, пространственные и количественные изменения астро-цитов и тел нейронов ПЯ, расположенного в области выраженного ограничения кровотока.

Материал и методы

Опыты выполнены на крысах самцах Вистар массой 200-220 грамм в возрасте 4 мес. Была исследована наиболее широкая вентромедиальная часть ПЯ между передней спайкой, расположенной вблизи основания стриапаллидарного комплекса, и обонятельными ядрами, расположенными вблизи поверхности левого полушария. У крыс экспериментальной группы (4 особи) воспроизводили неполную ишемию переднего мозга. Под кратковременным эфирным наркозом выполняли билатеральную окклюзию обеих общих сонных артерий. Животных фиксировали на станке, препарировали и лигировали обе общие сонные артерии. Рану обрабатывали антисептиком и послойно зашивали. У ложно оперированных крыс (4 особи, контроль) воспроизводили все этапы операции без перевязки сонных артерий.

Через 7 сут животных декапитировали, головной мозг фиксировали в 9% растворе нейтрального формалина, обезвоживали в этаноле возрастающей концентрации и заливали в парафин, готовили фронтальные срезы ПЯ толщиной 3 мкм. Срезы окрашивали крезиловым фиолетовым по Нисслю, выявляли глиальный фибриллярный кислый белок астроцитов, GFAP (с использованием мышиных моноклональных антител, клон GA-5, Biocare medical, США, разведение 1:250). Вторичные биотинилированные антитела применяли из набора VECTASTAIN ABC, США. После проявления связанных антигенов диаминобензи-дином срезы докрашивали гематоксилином Карацци.

Визуальную и морфометрическую оценку нейронов и астроцитов осуществляли в семи последовательных квадратах площадью 0,01 мм2 у каждого животного в группе (n = 28). Нейроны подсчитывали после их идентификации согласно классификации Ю.М.Жаботинского [3], широко используемой в современных нейроморфологических исследованиях [46], как неизмененные (малоизмененные), гипохром-ные, сморщенные гиперхромные (пикноморфные) и теневидные. Определяли абсолютное количество и долю данных форм, площадь тел жизнеспособных нейроцитов (малоизмененных и гипохромных), расстояние тел нейронов этих разновидностей, а также тел астроцитов до стенки кровеносного капилляра в пределах окружности радиусом 20 мкм. Устанавливали количество астроцитов, расстояние между их телами и стенкой капилляра в пределах окружности радиусом 20 мкм, площадь тел клеток, длину их главных отростков. Определяли глиоцито-нейрональный индекс как отношение числа клеток-сателлитов (оли-годендроцитов и астроцитов) к числу жизнеспособных нейронов (малоизмененных, гипохромных набухших и сморщенных гиперхромных).

Морфометрию проводили с помощью программы Imagescope (Электронный анализ, Россия). Среднее арифметическое, среднее квадратическое отклонение и стандартная ошибка среднего арифметического определяли с помощью компьютерной программы Ехе11. О значимости различий судили по величине /-критерия Стьюдента и считали их значимыми при р < 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

Тела большинства нейронов ПЯ у ложно оперированных крыс были неизмененными, т.е. содержали хроматофильную субстанцию, имели отчетливые ровные контуры клеточной и ядерной поверхности. Единичные нейроны были изменены и обладали признаками нарушения водно-солевого баланса с окружающим нейропилем [3]. Гипохромные нейроны не содержали хроматофильных глыбок, были просветлены, контуры оболочки их ядра и цитоплазмы в некоторых участках были гофрированы; небольшое ядрышко часто располагалось вблизи оболочки ядра. Тела других нейронов были сморщенными и гипер-хромными; структуры ядра и цитоплазмы в них были слабо различимы. Нейроны-«тени» обладали стертыми и сморщенными контурами поверхности, были слабо окрашены, иногда были представлены фрагментами ядерной оболочки.

50мкм

Рис.1. Особенности строения и расположения астроцитов прилежащего ядра у интактных крыс (а) и через 7 суток частичной ишемии (б). Окраска GFAP астроцитов и ядер гематоксилином. Ок. х10, об. х63. Астроциты — стрелки. Центр окружности (пунктир) радиусом 20 мкм совмещен со стенкой кровеносного капилляра, ближайшей к телу астроцита

Все нейроциты находились на разном расстоянии от стенки кровеносных капилляров, клетки са-теллитной формы глии были единичными (рис.1а, табл.1 и 2). GFAP в телах астроцитов имел строение рыхлой тонкопетлистой сети, во многих клетках окружавшей ядро и часто образовывал сгущение в виде одной-двух глыбок вытянутой формы. С материалом глыбок была связана рыхлая сеть GFAP, формирующая главные и вторичные отростки астроцитов. Главные отростки некоторых астроцитов были ориентированы в направлении стенки капилляров и тел нейронов. Тонкие главные отростки астроцитов в количестве от 1 до 5 равномерно экспрессировали GFAP. Концевые части некоторых отростков образовывали периваскулярные глиальные мембраны, экспрессия GFAP в них была непрерывной. Средняя длина главных отростков астроцитов на плоскости в 3-4 раза превышала длинный диаметр тел клеток, которые по отношению к капиллярам были расположены на разном расстоянии (табл.3).

Через 7 суток ишемии среди нейроцитов ПЯ преобладали теневидные, гиперхромные сморщенные и набухшие гипохромные формы клеток (рис.2; табл.1). Наименее измененные нейроны, определявшиеся в единичном количестве вблизи стенки кровеносных капилляров, были окружены сателлитной формой олигодендроцитов и астроцитов. Тела этих нейроцитов были набухшими, но сохранившими скопления глыбок хроматофильного вещества. ПЯ было лишено жизнеспособных нейронов (малоизмененных, гипохромных и пикноморфных) почти наполовину, которые, как и наибольшая часть теневидных клеток, группировались вблизи стенки капилляров. Между перикапиллярными скоплениями нейронов были видны участки разреженности клеток, среди которых располагались единичные измененные нейроциты. Расстояние между телами жизнеспособных нейронов и стенкой капилляров после гипоксии, по сравнению с таковым в контроле, значительно сократилось, а глиоцито-нейрональный индекс — возрос (табл.2).

Таблица 1

Изменения долевого соотношения субпопуляций нейронов прилежащего ядра

через 7 сут ишемии на площади 0,01 мм2

Группа Абсолютное количество (в 12 квадратах, верхняя строка) и доля (нижняя строка, %) нейронов в популяции

животных малоизмененнных гипохромных пикноморфных теневидных

После ложной операции 19,0±0,7 74,1±2,2 1,4±0,2 5,4±0,7 1,0±0,2 3,6±0,7 4,4±0,4 16,9±1,5

После ишемии 0,3±0,2 1,9±0,9* 3,1±0,5 18,1±2,4* 5,6±0,9 31,3±4,1* 8,3±0,7 48,7±3,7*

Примечание: * различие в сравнении с параметрами в группе контроля значимо (р < 0,05). Количество подсчетов п производилось в 7 квадратах (п = 28).

Таблица 2

Изменения морфометрических параметров нейронов прилежащего ядра через 7 сут ишемии

на площади 0,01 мм2

Группа животных Площадь тел нейронов, мкм2 Расстояние между телом нейрона и стенкой капилляра, мкм

малоизмененных гипохромных малоизмененных гипохромных

После ложной 58,8±2,4 51,8±4,7 8,8±1,2 9,8±2,0

операции

После ишемии 79,5±7,4*

Примечание: * различие в сравнении с параметрами в группе контроля значимо (р < 0,05); п — количество подсчетов.

Таблица 3

Изменения количества и морфометрическихпараметров астроцитов прилежащего ядра

через 7 сут ишемии на площади 0,01 мм2

Группа животных Количество Расстояние между телом астроцита и стенкой капилляра, мкм Площадь тел, мкм2 Длина главных отростков, мкм Глиоцито-нейрональный индекс

После ложной операции 3,3±0,3 11,0±1,2 38,0±1,8 13,8±1,1 (п = 51) 0,14±0,02

После ишемии 3,6±0,3* 4,1±1,1* 49,3±2,4* 8±1,0* (п = 44) 0,27±0,05*

Примечание: * различие в сравнении с параметрами в группах контроля значимо (р < 0,05); п — количество подсчетов

Рис.2. Изменения клеток прилежащего ядра переднего мозга через 7 сут ишемии на площади 0,01 мм2 (пунктир). Нейроны: Н — малоизмененные, Г — набухшие гипохромные, С — сморщенные гиперхромные, Т — клетки-«тени»; олигоденд-роциты — звездочки; астроциты — стрелки; Э — эндотелио-циты; са — передняя спайка мозга

В телах астроцитов развивались признаки клеточного отека-набухания (рис.1б, 2). Вокруг ядра, в отличие от астроцитов в контроле, определялся светлый однородный ободок цитоплазмы. Площадь тел клеток, по сравнению с таковой у контрольных крыс, возросла в 1,4 раза (Р < 0,05). Ядро астроцитов также выглядело просветленным, эухроматин во многих клетках был неразличим, ядрышко располагалось вблизи ядерной оболочки. GFAP-материал в телах большинства астроцитов концентрировался в одном из участков цитоплазмы вблизи поверхности ядра. Основания главных отростков многих клеток были утолщены и также представляли собой область концентрации GFAP. В остальной части главных и других отростков астроцитов GFAP+ материал выглядел более истонченным, чем в группах контроля; участки его разрыхленного расположения отсутствовали. Длина главных отростков клеток, в сравнении с таковой в обеих группах контроля, значительно сократилась (Р < 0,05). В пери-васкулярных глиальных мембранах GFAP-структуры выглядели более тонкими, чем в контроле, и в ряде участков отсутствовали.

Большинство тел астроцитов при моделировании ишемии располагались периваскулярно и являлись клетками-сателлитами. Расстояние между телами астроцитов и стенкой капилляра сократилось в 2,7 раза (по сравнению с контролем, Р < 0,05), тогда как глиоцито-нейрональный индекс возрос в 2,1 раза (Р < 0,05). Количество астроцитов через 7 суток после ишемии значительно не изменилось.

Выявленные патологические изменения нейронов и астроцитов не могут не быть отсроченным проявлением цитотоксических реакций глютамат-кальциевого каскада, которые запускаются в фокусе ишемии [7]. Вследствие этих реакций происходит активация кальмодулин-зависимых клеточных ферментов, оксидантный стресс, избыточная выработка токсичного оксида азота и накопление низкомолекулярных цитотоксичных соединений. Отек-набухание тел нейронов и астроцитов, гиперхромию и сморщивание нейронов, установленные в нашей модели ишемии, во

многом объясняют ультраструктурные изменения нервных и макроглиальных клеток, выявленные через несколько часов ишемии, индуцированной инъекцией хлорида кобальта [8]. Авторы имеют в виду процесс набухания и расширения просвета канальцев эндо-плазматической сети, пластинчатого комплекса, мат-рикса митохондрий и, в целом, отек цитоплазмы, который может завершиться утратой внутриклеточной жидкости и сморщиванием ядра и тела клетки. По-видимому, гиперхромия-сморщивание нейронов развивается в исходе ишемического отека и предшествует образованию клетки-«тени». Среди астроцитов, несмотря на их промежуточное положение в системе «капилляр-нейрон», клетки-«тени» и сморщенные формы отсутствуют, что указывает на высокую устойчивость астроцитов к альтерации.

Защитно-приспособительный процесс транслокации тел нейронов и макроглиоцитов, считающихся оседлыми клетками, малоизучен, однако наши данные подтверждают способность астроцитов к перемещению их тел после частичного разрушения GFAP. Косвенно подтвердить способность к перемещению тел астроцитов в головном мозге взрослых организмов при определенных условиях может результат эксперимента Okoye G.S. et al. [9]. После введения суспензии астроцитов в стриатум взрослого мозга авторы наблюдали миграцию этих клеток в направлении сосудистой стенки со скоростью 31 мкм в день.

Объединение тел поврежденных нейронов между собой и стенкой капилляров в условиях ишемии отмечали также при электронной микроскопии [6]. Авторы наблюдали формирование простых и плотных контактов между телами нейронов, повреждение периваскулярных мембран и прямые нейровазальные контакты.

Увеличение числа периваскулярных форм нейронов, астроцитов и олигодендроцитов, происходящее в сочетании с увеличением числа клеток-сателлитов, может иметь определенное компенсаторно-приспособительное значение для всех клеток этого комплекса и нейронов в особенности, поскольку принято считать, что увеличение числа клеток-сателлитов способствует передаче телам нейронов РНК, аминокислот [10] и факторов роста [11].

Выводы

При моделировании глобальной ишемии мозга через 7 суток в области выраженного ограничения кровотока (прилежащее ядро) большинство нейронов подвергаются гибели и гиперхромии-сморщиванию (состояние клеток, близкое к тому, которое устанавливается во внутренней части zona penumbra при формировании ишемического инфаркта мозга). Аст-роциты более устойчивы к процессу ишемического повреждения, чем нейроны. Они испытывают отек-набухание, деструкцию промежуточных филаментов в части площади их тел, периферических отделах отростков и периваскулярных глиальных мембранах. Происходит объединение клеток макроглии с телами нейронов вблизи стенки кровеносных капилляров. Формирование нейроно-глио-васкулярных комплексов представляет собой защитный механизм и условие выживания клеток в фокусе частичной ишемии.

1. Paxinos G. The Rat Nervous System. 3-d ed. Amsterdam-Boston-Heidelberg-London-NewYork-Oxford-Paris-SanDiego-SanFrancisco-Singapore-Sydney-Tokyo: Elsevier Acad. Press. 2004. Р. 1176-1780.

2. Шабанов П.Д., Зарубина И.В., Султанов В.С. К механизму действия полипренолов при ишемии головного мозга // Мед. акад. журн. 2011. Т.11. №2. С.24-31.

3. Жаботинский Ю.М. Нормальная и патологическая морфология нейрона. М.: Наука. 1965. 323 с.

4. Дробленков А.В., Шабанов П.Д. Дофаминергические механизмы алкогольной зависимости. СПб.: Art-Xpress. 2014. 256 с.

5. Литвинцев Б.С., Одинак М.М., Гайкова О.Н. и др. Кли-нико-морфологическая характеристика неврологических проявлений наркомании // Профилактич. и клин. медицина. 2011. Т.39. №2. С.99-104.

6. Гелеранская О.А., Гончаров Н.В., Маслова Н.М. и др. Влияние физической нагрузки на ультраструктурные изменения в коре головного мозга крыс // Морфология. 2016. Т. 149. Вып.3. С.62.

7. Гусев Е.И., Скворцова В.И. Ишемия головного мозга. М.: Медицина, 2001. 328 с.

8. Caltana L., Merelli A., Lazarowski A., Brusco A. Neuronal and glial alterations due to focal cortical hypoxia induced by direct cobalt chloride (CoCl2) brain injection // Neurotox. Res. 2009. V.15. №4. P.348-358.

9. Okoye G.S., Powel E.M., Geller H.M. Migration of A7 immortalized astrocyte cells grafted into the adult rat striatum // J. Comp. Phys. 1995. V.262. P.524-534.

10. Певзнер Л.З. Функциональная биохимия нейроглии. Л.: Наука, 1972. 198 с.

11. Dai X., Larcher L.D., Clinton P.V. et al. The trophic role of oligodendrocytes in the basal forebrain // J. Neurosci. 2003. V.23. №13. P.5846-5853.

References

1. Paxinos G. The rat nervous system. 3d ed. Amsterdam-Boston-Heidelberg-London-NewYork-Oxford-Paris-

SanDiego-SanFrancisco-Singapore-Sydney-Tokyo, Elsevier Academic Press, 2004, pp. 1176-1780.

2. Shabanov P.D., Zarubina I.V., Soultanov Vagif S. K mekha-nizmu deistviia poliprenolov pri ishemii golovnogo mozga [About mechanism of antiischemic action for polyprenols]. Meditsinskii akademicheskii zhurnal - Medical Academic Journal, 2011, vol. 11, no. 2, pp. 25-32.

3. Zhabotinskii Iu.M. Normal'naia i patologicheskaia mor-fologiia neirona [Normal and pathological morphology of a neuron]. Moscow, "Nauka" Publ., 1965. 323 p.

4. Droblenkov A.V., Shabanov P.D. Dofaminergicheskie mek-hanizmy alkogol'noi zavisimosti [Dopaminergic mechanisms of alcohol abuse]. Saint-Petersburg, Art-Xpress Publ., 2014. 256 p.

5. Litvintsev B.S., Odinak M.M., Gaikova O.N., Onishchenko L.S., Trofimova A.V. Kliniko-morfologicheskaia kharakter-istika nevrologicheskikh proiavlenii narkomanii [Clinical and morphological characteristics of neurological manifestations of drug abuse]. Profilakticheskaia i klinicheskaia meditsina -Preventive and Clinical Medicine, 2011, vol. 39, no.2, pp. 99104.

6. Geleranskaia O.A., Goncharov N.V., Maslova N.M., Para-monova N.M., Tavrovskaia T.V. Vliianie fizicheskoi na-gruzki na ul'trastrukturnye izmeneniia v kore golovnogo mozga krys [Effect of exercise on the ultrastructural changes in the rat cerebral cortex]. Morfologiia - Morphology, 2016, vol. 149, no. 3, p. 62.

7. Gusev E.I., Skvortsova V.I. Ishemiia golovnogo mozga [Cerebral ischemia]. Moscow, "Meditsina" Publ., 2001. 328 p.

8. Caltana L., Merelli A., Lazarowski A., Brusco A. Neuronal and glial alterations due to focal cortical hypoxia induced by direct cobalt chloride (CoCl2) brain injection. Neurotoxicity Research, 2009, vol. 15, no. 4, pp. 348-358.

9. Okoye G.S., Powel E.M., Geller H.M. Migration of A7 immortalized astrocyte cells grafted into the adult rat striatum. Journal of Computational Physics, 1995, vol. 262, pp. 524-534.

10. Pevzner L.Z. Funktsional'naia biokhimiia neiroglii [Functional biochemistry of neuroglia]. Leningrad, "Nauka" Publ., 1972. 198 p.

11. Dai X., Larcher L.D., Clinton P.V. et al. The trophic role of oligodendrocytes in the basal forebrain. Journal of Neuroscience, 2003, vol. 23, no. 13, pp. 5846-5853.