СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТИКУМА ЭРИТРОЦИТАРНОГО САПНОГО ИММУНОГЛОБУЛИНОВОГО МОНОКЛОНАЛЬНОГО
METHOD FOR OBTAINING THE ERYTHROCYTAL EQUINIA IMMUNOGLOBULIN MONOCLONAL DIAGNOSTICUM

Изобретение относится к медицинской и ветеринарной микробиологии, в частности, к проблеме получения эритроцитарных диагностикумов на основе моноклональных антител (МКА), которые могут быть использованы для выявления антигенов возбудителя сапа в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА).
Сап - особо опасная инфекция, возбудителя которой Burkholderia mallei относят ко II группе патогенности. Возбудитель сапа общепризнан как потенциальное биологическое оружие [Мелиоидоз и сап /Топорков А.В., Викторов Д.В., Липницкий А.В., Меринова Л.К. и др. - Волгоград, изд-во «Волга-Пресс», 2016. - С. 31].
В естественных условиях сап поражает, прежде всего, непарнокопытных животных (лошадей, мулов, верблюдов, ослов, лошаков), а также медведей и представителей семейства кошачьих. Возможны заболевания у овец, коз, молодых собак, волков, а также - при заражении большими дозами возбудителя - крупного рогатого скота [там же, с. 35]. Животные с острыми формами болезни, проявляющимися в виде открытых с обильным гноетечением язв, являются основным резервуаром и источником высококонтагиозной для человека инфекции. Существует профессиональный риск для специалистов, имеющих контакт с однокопытными животными (ветеринаров, работников цирков, зоопарков, конных заводов, мясокомбинатов и т.д.). Не исключены случаи внутрилабораторного заражения сотрудников при нарушении ими требований биологической безопасности [там же, с. 30]. Восприимчивость человека к сапу считается очень высокой, особенно при аэрогенном заражении.
Заболевание является эндемичным, прежде всего, для некоторых районов Африки, Центральной и Южной Америки, а также на близлежащих к РФ территориях Турции, Ирана, Объединенных Арабских Эмиратов, Афганистана, Китая, Монголии, Туркменистана и др. Развитие транспортных и туристических связей, а также расширение потоков трудовых мигрантов потенцируют опасность завоза сапа в Россию.
Для повышения качества лабораторного анализа в Российской Федерации на базе Волгоградского научно-исследовательского противочумного института создан Референс-Центр по мониторингу за возбудителями мелиоидоза и сапа, и обеспечение Центра диагностическими препаратами с видоспецифическим действием для экспресс-анализа является актуальной задачей практического здравоохранения.
В схеме лабораторной диагностики сапа реакция непрямой гемагглютинации может быть использована как на этапах первичного исследования проб, так и при идентификации выделенной культуры возбудителя [Лабораторная диагностика опасных инфекционных заболеваний. Практ. рук-во. /Под рек. акад РАМН Г.Г. Онищенко и акад. РАМН В.В. Кутырева. - М., «Шико, 2013. - с. 219]. При этом проведение анализа осуществляют с помощью разработанного в ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора и зарегистрированного в РФ «Набора реагентов. Диагностикум эритроцитарный сапной и мелиоидозный иммуноглобулиновый сухой» (№ ФСР 2011/11613). Согласно нормативной документации, препарат предназначен для индикации и идентификации в биологическом материале, объектах внешней среды и чистых культурах как возбудителей сапа, так и возбудителей мелиоидоза. Близкое генетическое родство Burkholderia mallei и Burkholderia pseudomallei, обуславливающее наличие большого количества перекрестнореагирующих антигенных структур, существенно затрудняет проведение их видовой дифференциации. Сконструированный в ВолгоградНИПЧИ на основе сапных моноклональных антител Диагностикум эритроцитарный сапной и мелиоидозный моноклональный [Саяпина Л.В., Касина И.В., Малахаева и др. Оценка эффективности нового эритроцитарного сапного моноклонального диагностикума //Сб. научных трудов, посв. 75-летию НИИ микробиологии МО РФ. - Киров, 2003. - с. 53-54], обладая такими же аналитическими характеристиками, однако существенно отличаясь по трудоемкости и экономической целесообразности, не демонстрировал преимуществ перед препаратом на основе поликлональных антител козьих сывороток, в связи с чем не нашел практического применения.
6
6
Таким образом, прототипом изобретения является препарат, описанный в "Диагностикум эритроцитарный сапной и мелиоидозный иммуноглобулиновый" (Производственный Регламент №01898084 - 03-11), выпускаемый ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора [Куделина A.M. с соавт.], где в качестве сенситина эритроцитов использованы иммуноглобулины поликлонального происхождения. Этот препарат имеет высокую чувствительность (3,12⋅10м.к./мл, в макроварианте - 1,56⋅10м.к./мл), но не обладает видоспецифичными характеристиками.
Создание видоспецифичного препарата определяет задачу изобретения, заключающуюся в получении моноклональных антител, направленных к специфичной антигенной детерминанте возбудителя сапа, и производстве на их основе эритроцитарного диагностикума для РИГА.
Цель изобретения - конструирование диагностикума эритроцитарного сапного иммуноглобулинового моноклонального, обладающего видоспецифичностью и предназначенного для выявления антигенов возбудителя сапа в РНГА.
6
Поставленная цель достигается благодаря тому, что для нагрузки эритроцитов барана используют сапные моноклональные антитела, полученные в результате слияния клеток мышиной миеломы P3X63Ag8.653 и спленоцитов мыши BALB/c, иммунизированной подкожно инактивированными клетками В. mallei в суммарной дозе 3⋅10 м.к./мышь (микробных клеток на мышь) и получившую бустерную внутриселезеночную инъекцию водорастворимого антигенного комплекса, выделенного из клеток В. mallei методом формамидной экстракции (по D. Fuller в модификации Н.Н. Пивня), после чего полученный диагностикум в целях длительного (срок наблюдения - 2 года) сохранения его характеристик подвергается лиофилизации.
6
Для обеспечения максимального выхода высокоспецифических сапных моноклональных антител проводят иммунизацию мышей BALB/c инактивированной клеточной взвесью В. mallei 10230 трижды в дозе по 1⋅10м.к./мышь с интервалами между инъекциями 21 день - двукратно подкожно в смеси (1:1) с полным адьювантом Фрейнда (CFA, Sigma) и однократно внутрибрюшинно без адъюванта. Бустерную инъекцию осуществляют внутриселезеночно путем введения формамидного антигенного комплекса в дозе 50 мкг/мышь за 3 дня до опыта по гибридизации. Слияние клеток осуществляют с помощью высокоочищенного полиэтиленгликоля (ПЭГ). Селекцию гибридных клеток миелома/спленоцит проводят в НАТ-среде, после чего гибридомы клонируют методом лимитирующих разведений. Антителопродуцирующую активность в супернатантах лунок определяют в иммуноферментном анализе (ИФА) по мере роста клонов, накопление сапных иммуноглобулинов проводят в культуре и асцитической жидкости сингенных мышей. Сапные моноклональные антитела выделяют методом двукратного переосаждения сульфатом аммония, затем на их основе получают диагностикум эритроцитарный сапной иммуноглобулиновый моноклональный.
6
Для получения эритроцитарного диагностикума берут навески мышиных моноклональных сапных иммуноглобулинов в концентрациях 10, 20, 40 и 80 мкг/мл, определяют оптимальную сенсибилизирующую дозу (ОСД), проводят сенсибилизацию формалинизированных танизированных эритроцитов барана в двойной ОСД и последующую лиофилизацию полученного диагностикума при постепенном снижении вакуума, обеспечивающем плавный подъем температуры, после чего осуществляют постановку РНГА с полученным диагностикумом с бактериями сапа, мелиоидоза и гетерологичных микроорганизмов и в титрах (2,5-5,0)⋅10м.к./мл подтверждают аналитические характеристики препарата, который выявляет только возбудитель сапа и не взаимодействуют с близкородственными и гетерологичными микроорганизмами.
Таким образом, технологию получения диагностикума осуществляют в соответствии со следующими этапами:
1. Получение клеточной взвеси и формамидного экстракта инактивированных клеток возбудителя сапа;
2. Проведение иммунизации мышей линии BALB/c; проверка иммунного ответа экспериментальных животных;
3. Осуществление слияния клеток;
4. Культивирование гибридом в селективных средах;
5. Клонирование гибридом методом лимитирующих разведений;
6. Накопление гибридом in vitro и in vivo;
7. Выделение иммуноглобулинов из асцитической жидкости мышей BALB/c;
8. Приготовление формалинизированных танизированных эритроцитов барана;
9. Осуществление сенсибилизации обработанных формалином и танином эритроцитов сапными моноклональными иммуноглобулинами;
10. Лиофилизация диагностикума;
11. Проверка активности (чувствительности и специфичности) полученного препарата в РНГА.
Примеры конкретного выполнения Пример №1. Получение гибридомы, продуцирующей сапные моноклональные антитела.
Штамм клеток возбудителя сапа В. mallei 10230 получали из Коллекции живых культур ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора и высевали на гидролизат-казеиновый агар (АГК), содержащий 5% глицерина. Через 48 час культуру смывали стерильным 0,15 М раствором NaCl. С целью инактивации возбудителя к взвеси добавляли трехкратный объем ацетона, после чего спустя 2-3 сут осуществляли контроль стерильности в соответствии с СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)» и использовали в работе.
Для получения формамидного экстракта 4,0 г ацетонвысушенных клеток В. mallei 10230 суспендировали в 15-кратном по объему количестве формамида (Serva, Германия), встряхивали на шейкере в течение 48 час при комнатной температуре, после чего к смеси добавляли 2,5 объема ацетона, содержащего 5% 2N HCl. Образующийся осадок отделяли центрифугированием (10000 g - 15 мин при 10°С), растворяли в 10 мл дистиллированной воды и повторно центрифугировали при тех же условиях. К супернатанту добавляли 50 мл подкисленного ацетона и вновь осаждали (10000 g - 15 мин при 10°С). Осадок растворяли в дистиллированной воде и подвергали диализу (24 час при +4°С).
Концентрация белка в полученном растворе при спектрофотометрическом измерении по 1% раствору бычьего сывороточного альбумина (БСА) при длине волны 280 нм составляла 8,4 мг/мл.
6
Мышей линии BALB/c 6-8 недельного возраста иммунизировали инактивированной клеточной взвесью В. mallei 10230 в дозе 3⋅10 м.к./мл с интервалами между инъекциями 21 день двукратно подкожно в смеси (1:1) с полным адьювантом Фрейнда (CFA, Sigma) и однократно внутрибрюшинно без адъюванта. Спустя 7 дней путем прижизненного взятия крови из ретроорбитального пространства и проведения ее исследования в ИФА была отобрана мышь с наиболее выраженным иммунным ответом (титр реакции по отношению к возбудителю сапа составлял 1:1280, к возбудителю мелиоидоза - 1:20). Бустерную инъекцию осуществляли внутриселезеночно с помощью формамидного антигенного комплекса в дозе 50 мкг/мышь за 3 дня до опыта по гибридизации.
Клетки мышиной миеломы P3X63Ag8.653, находящиеся в хранилище с жидким азотом, размораживали по стандартной методике и путем культивирования при 37°С и ежедневных пересевов в среде RPMI-1640, содержащей 10% фетальной сыворотки теленка (FCS, Sigma), а также антибиотики-антимикотики, HEPES-буфер, раствор витаминов, пируват натрия, глутамин, выводили в логарифмическую фазу роста.
Для слияния ядерного материала клеток применяли химический метод гибридизации с помощью ПЭГ с М.м. 4000. Для этого клетки миеломы и селезенки отмывали путем их центрифугирования в бессывороточной среде RPMI-1640 (800 g - 10 мин), после чего к осадку в центрифужной пробирке по каплям в течение 1 мин добавляли 1 мл 50% ПЭГ 4000 (Merck, Германия), который затем ежеминутно постепенно разводили двукратными объемами бессывороточной среды, добавляя ее последовательно в объеме 1, 2, 4, 8 и 16 мл. Смесь клеток центрифугировали (800 g - 10 мин), супернатант декантировали, а осадок осторожно суспендировали в 20 мл НАТ-среды, после чего раскапывали в лунки 96 - луночного планшета (Tissue Culture, Costar) на предварительно подготовленный слой интактных «подкормочных» перитонеальных макрофагов (так называемый Feeder).
В среде HAT (Гипоксантин-Аминоптерин-Тимидин) блокируется основной путь синтеза ДНК, за счет чего выживание возможно только гибридом, получивших от миеломного партнера способность к неограниченному росту, а от селезеночных соматических клеток, деление которых лимитировано барьером Хейфлика, фермент гуанидингипоксантинфосфорибозилтрансферазу (HHPRT), обеспечивающую клеткам возможность метаболизировать гипоксантин и осуществлять репликацию ДНК за счет обходного пути метаболизма. В целом, гибридные клетки приобретают способность выживать в НАТ-среде и неограниченно долго размножаться в культуре.
6
3
4
6
3
4
Лунки с ростом гибридом тестировали в ИФА и по показателям наиболее выраженной антителопродуцирующей активности отбирали для клонирования с целью гарантированного получения клеток одного клона. Для этого на предварительно (за 1-2 сут) подготовленный слой фидерных клеток вносили клетки из отобранной лунки 96 луночной планшеты из расчета: 3 ряда - 10 кл/лунку, 3 ряда - 5 кл/лунку, 2 ряда - 1 кл/лунку. В дальнейшем отбирали лунку с ростом единственного клона, активного в качестве антителопродуцента. Таким образом этап клонирования повторяли дважды. В целом был отобран стабильный клон G/C/F, синтезирующий сапные иммуноглобулины, специфическая активность и специфичность которого были подтверждены результатами ИФА. На рис. 1 представлены результаты ИФА с супернатантами лунок растущих клонов гибридомы G/C/F в 96-луночной (1-6 ряды) и 24-луночной планшетах (ряды 7-8). За положительный результат реакции принимали показатели оптической плотности (ОП) раствора в лунках с пробами, не менее чем двукратно превышающие ОП контролей. На верхней планшете, сенсибилизированной антигенным комплексом В. mallei 10230, ОП контролей составляет (0,04-0,08), ОП лунок с супернатантами - (0,177-0,432). Нижняя пластина сенсибилизирована антигенами В. pseudomallei 56830, в ней ОП контролей и ОП лунок с супернатантами находятся на одном уровне - (0,048-0,075) и (0,038-0,08) соответственно. Таким образом, полученные результаты подтверждают специфичность антителопродукции полученного клона в отношении возбудителя сапа.
Для сохранения клон был тиражирован и заморожен в жидком азоте при температуре - 196°С. По мере производственной необходимости культуру гибридных клеток извлекают извлекали из сосуда Дьюара с жидким азотом, размораживали при температуре +37°С и использовали для накопления в культуре и асцитической жидкости сингенных мышей.
3
3
5
6
Клон гибридом, продуцирующий сапные моноклональные антитела, накапливали путем рассева в культуральных матрацах объемом 25 см и 100 см (Tissue Culture, Costar). По мере роста клетки отбирали, осаждали центрифугированием, отмывали в бессывороточной среде и вводили внутрибрюшинно (10-10 кл/мышь - 0,5 мл) предварительно праймированным пристаном (Prystane, synthetic, Sigma) мышам BALB/c с целью получения у них асцитической жидкости. В среднем на 7-10 сут у мышей, уснувших под парами хлороформа, осуществляли отбор асцитической жидкости, которую центрифугировали (1000 g - 10 мин), после чего тестировали в иммуноферментном анализе (ИФА) и непрямом методе флуоресцирующих антител (НМФА) и хранили в условиях низкотемпературного холодильника при - 40°С.
9
На рис. 2 представлены результаты НМФА, при выполнении которого на стекла с мазками из клеток В. mallei 10230 и В. pseudomallei 56830 в концентрациях по 1⋅10 м.к./мл наслаивали пробу асцитической жидкости в разведениях от 1:8 до 1:4096. Положительный результат реакции (флуоресценция на 3+) был отмечен у клеток В. mallei 10230 титрах до 1:1024.
Асцитические жидкости подвергали для получения фракции сапных моноклональных иммуноглобулинов двукратному осаждению насыщенным раствором сульфата аммония при его 50%-ном насыщении. Для этого к смеси асцитов при постоянном перемешивании в течение 15-20 мин дробно добавляли равный объем насыщенного раствора сульфата аммония и оставляли на сутки при температуре от +2 до +4°С. Через 24 часа пробы центрифугировали (6000 g - 15 мин), супернатант декантировали, осадок иммуноглобулинов ресуспендировали до первоначального объема в 0,15 М растворе NaCl (pH 7,2), затем процедуру высаливания повторяли. После второго переосаждения осадок иммуноглобулинов ресуспендировали в половинном от исходного объема 0,15 М растворе NaCl (рН 7,2) и диализировали против дистиллированной воды. Диализ проводили при температуре от +2 до +4°С в течение 24-48 часов с интервалами замены дистиллированной воды от 4 до 8 часов. После проведения контроля специфической активности выделенной фракции сапных моноклональных иммуноглобулинов проводили определение концентрации белка в растворе (спектрофотометр Nanophotometer Р-300, длина волны 280 нм) при использовании в качестве стандарта 1% раствора БСА.
Пример №2. Получение эритроцитарного диагностикума на основе сапных моноклональных антител.
Для приготовления формалинизированных танизированных эритроцитов кровь барана, взятую из яремной вены, отбирали в стеклянные колбы с 5%-ным раствором цитрата натрия (из расчета 250 мл цитрата натрия на 1000 мл крови) и тщательно перемешивали. Дефибринированную кровь фильтровали через 4 слоя марлевой ткани и трижды отмывали 0,15 М раствором NaCl (рН 7,2) центрифугированием (1100 g - 20 мин) с целью освобождения эритроцитарной массы от лейкоцитов. Осадок отмытых эритроцитов разводили в 0,15 М раствором NaCl (рН 7,2) до конечной концентрации 8%. После определения процентного содержания формальдегида в исходном растворе формалина по МУК 4.1/4/2.588-96 последний с помощью 0,15 М раствора NaCl (рН 7,2) доводили до концентрации 3% по формальдегиду.
Формалинизацию эритроцитов проводили путем капельного добавления полученного 3% раствора формалина (по формальдегиду) к эритроцитарной массе в соотношении по объему 1:1 при непрерывном перемешивании на водяной бане (Wasserbad Water Bath, GFL, Germany) при температуре 37°C в течение 24 часов. Обработанные формалином эритроциты трижды отмывали 0,15 М раствором NaCl (pH 7,2) и суспендировали (1:1) в 0,15 М растворе NaCl (рН 7,2), содержащим 1% формалина.
К отмытым эритроцитам ex tempore добавляли равный объем раствора танина в концентрации последнего 1:40 000. Танизацию осуществляли на водяной бане при 37°С в течение 15 мин, после чего танизированные формалинизированные эритроциты трижды отмывали 0,15 М раствором NaCl (рН 7,2) путем центрифугирования при 2500 g - 20 мин. Конечную концентрацию формалинизированных танизированных эритроцитов доводили до 10%.
Для контроля спонтанной агглютинации формалинизированные танизированные эритроциты разводили до концентрации 2,5% и по капле вносили в лунки заранее подготовленного макропланшета для РНГА, содержащего 0,5 мл 0,15 М раствора NaCl (рН 7,2). Наличие осадка в виде «пуговки» эритроцитов свидетельствовало об отсутствии у биологического носителя склонности к спонтанной агглютинации и его пригодности для сенсибилизации.
Непосредственно перед нагрузкой эритроцитов моноклональными иммуноглобулинами определяли их ОСД. Для этого в 4 центрифужные пробирки вносили по 0,5 мл 10%-ных формалинизированных танизированных эритроцитов барана, к которым после осаждения центрифугированием (3000 g - 5 мин) добавляли по 2,5 мл разведенных на 0,01 М ФБР (рН 5,9) сапных моноклональных иммуноглобулинов в концентрациях по белку 10, 20, 40 и 80 мкг/мл. Взвесь тщательно перемешивали и инкубировали, периодически встряхивая, на водяной бане при 45°С 90 мин. Затем с целью фиксации иммуноглобулинов на эритроцитах в каждую пробирку добавляли раствор формалина до конечной концентрации 1%, после чего сенсибилизированные эритроциты отмывали трехкратно центрифугированием (3000 g - 5 мин) с помощью 0,15 М раствора NaCl (рН 7,2), содержащим 1% формалина, и в этом же растворе суспендировали до концентрации 1% (для микрометода) и 2,5% (для макрометода), после чего проверяли в РНГА с взвесью инактивированной культуры В. mallei 10230.
За ОСД принимали такое разведение сенситина, при котором диагностикум демонстрировал наиболее высокую чувствительность при четких отрицательных контролях (оседание эритроцитов в разводящей жидкости - 1% нормальной кроличьей сыворотке (НКС).
Для приготовления основной серии диагностикума эритроцитарного сапного иммуноглобулинового моноклонального использовали 2 мл 10%-ной взвеси формалинизированных танизированных эритроцитов, которые осаждали центрифугированием (3000 g - 5 мин). К осадку при постоянном перемешивании добавляли 10 мл сапных МКА в двукратной ОСД, после чего инкубировали на водяной бане при постоянном встряхивании при 45°С в течение 2 час. Сенситин на эритроцитах фиксировали добавлением формалина до конечной концентрации 1% и инкубированием смеси в течение 30 мин.
Полученный диагностикум осаждали (3000 g - 5 мин), после чего отмывали 0,15 М раствором NaCl (рН 7,2), содержащим 1% формалина, путем трехкратного центрифугирования при тех же условиях, и затем суспендировали до 5%-ой концентрации.
Для лиофилизации, существенно расширяющей возможности сохранения нативных свойств диагностикума в течение 2 и более лет (срок наблюдения), готовили среду высушивания: реополиглюкин 15%, сахароза 7,5%, азид натрия 0,001%, твин-80 0,001% в дистиллированной воде. Диагностикум суспендировали в протективной среде до концентрации 5% и разливали в ампулы по 1 мл.
Диагностикум, разлитый в ампулы, замораживали в низкотемпературном холодильнике (SANYO Electric Co., Ltd.) при -70°C и закаливали в течение 18-24 час.
Лиофилизацию диагностикума проводили на установке «COOLSAFE-100-9» (изготовитель «SCANLAF», Дания), в комплектацию которого входил вакуумный насос RZ-1 фирмы «VACUUBRAND», блок автоматического регулирования вакуума («SCANLAF», Дания), а также компьютер для программирования и контроля параметров высушивания.
Режим лиофилизации, представленный в графике на рис. 3, был основан на плавном снижении вакуума 0,3 hPa до 0,1 hPa и постепенном без скачков подъеме температуры от -35°С до +22°С (Пушкарь В.Г., Новицкая И.В., Кулаков М.Я., Павлова К.А., Степурина A.M. Способ лиофильной сушки эритроцитарного диагностикума: пат. RU 2476791. 2013 г.).
По окончании процесса ампулы запаивали в устройстве полуавтоматного типа АП-6М (Россия). Качество сухого диагностикума оценивали по следующим параметрам:
1.1 Растворимость - при добавлении 5 мл 0,15 М раствора NaCl (рН 7,2) диагностикум должен растворяться в течение 1 мин;
1.2 рН - должен находится в пределах 7,0±0,2;
1.3 Потеря в массе при высушивании - не более 5%;
1.4 Гомогенность ресуспендированного диагностикума - при микроскопии должно быть не более 3-х скоплений эритроцитов в 10 полях зрения;
1.5 Отсутствие спонтанной агглютинации - при добавлении к 0,5 мл 0,15 М раствору NaCl (рН 7,2) 2,5%-ой взвеси диагностикума через 4 часа должен формироваться осадок в виде "пуговки";
3
5
1.6 Количество эритроцитов - при подсчете в камере Горяева в 1 мм2,5%-ного диагностикума должно содержаться (5,5±0,5)⋅10эритроцитов;
6
6
1.7 Чувствительность - должен выявлять В. mallei в концентрации 5⋅10 м.к./мл в микроварианте РНГА и 2,5⋅10 м.к./мл в макроварианте РНГА;
7
1.8 Специфичность - не должен выявлять в РНГА инактивированные культуры гетерологичных микроорганизмов в концентрации 2⋅10м.к./мл;
1.9 Для проверки качества герметизации ампул их на кассетах помещают капиллярами вниз в камеру, в которой при откачивании воздуха создают разрежение. Из плохо запаянных ампул раствор выливается полностью или частично.
Пример №3. Проверка аналитических характеристик (чувствительности и специфичности) диагностикума эритроцитарного сапного иммуноглобулинового моноклонального в РНГА.
Аналитические характеристики диагностикума эритроцитарного сапного иммуноглобулинового моноклонального изучали в РНГА на наборе штаммов возбудителей сапа, мелиоидоза, а также ряда гетерологичных микроорганизмов, представленных в Музее Коллекционных штаммов ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора.
7
7
4
Для постановки микроварианта реакции во все лунки 96-луночной пластины вносили по 50 мкл 1% раствора НКС и 50 мкл клеточной взвеси в концентрации 8⋅10 м.к./мл в первую лунку длинного ряда (при этом концентрация исследуемых микроорганизмов в первой лунке составляла 4⋅10 м.к/мл) и титровали двукратным шагом до 11 лунки пластины (до концентрации 3,9⋅10 м.к./мл), из которой 50 мкл взвеси удаляли (12 лунка - отрицательный контроль). Затем во все лунки, включая контрольные, добавляли по 25 мкл полученного 1%-ного эритроцитарного диагностикума, аккуратно встряхивали пластину и оставляли при температуре 22±4°С. Учет результатов проводили предварительно через 2-4 часа, окончательно на следующие сутки.
7
Для макроварианта РНГА во все лунки планшета вносили по 0,5 мл 1% раствора НКС. Затем в первую лунку добавляли 0,5 мл клеточной взвеси в концентрации 8⋅10 м.к./мл и проводили последовательные двукратные разведения до 11 лунки. 12 лунка - отрицательный контроль диагностикума. Из 11-ой лунки лишние 0,5 мл удаляли. Затем вносили по 0,05 мл 2,5% диагностикума, пластины аккуратно встряхивали и оставляли при температуре 22±4°С. Через 2-4 часа проводили предварительный учет результатов, окончательно - на следующие сутки.
6
6
7
Чувствительность по отношению к возбудителю сапа в микроварианте РНГА составила 5⋅10 м.к./мл (табл. 1, рис. 4), в макроварианте РНГА - 2,5⋅10 м.к./мл (табл. 2), при этом как с близкородственным возбудителем мелиоидоза, так и гетерологичными микроорганизмами, включая условно-патогенные виды В. cepacia и В. thailandensis, в дозах до 2⋅10 м.к./мл гемагглютинации отмечено не было (рис. 4).
Диагностикум эритроцитарный сапной иммуноглобулиновый моноклональный успешно прошел контрольные межлабораторные испытания на базе ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора (протокол №1 от 15.02.2017 г., утвержденный директором института д.м.н. А.В. Топорковым) и рекомендован к внедрению в производство.
Следует отметить, что по сравнению с используемым в настоящее время в лабораторной практике прототипом (Набор реагентов. Диагностикум эритроцитарный сапной и мелиоидозный иммуноглобулиновый сухой) в технологическом процессе наиболее дорогостоящим является процесс получения клона-продуцента, однако при наличии такого клона воспроизводство иммуноглобулинов значительно упрощается: не требуется накопление ПБА, что связано с особыми режимными условиями работы, не используются крупные животные, при этом все полученные иммуноглобулины стандартны, воспроизводимы в неограниченном количестве и видоспецифичны.
Полученные впервые в РФ видоспецифичные сапные антитела позволяют с высокой точностью проводить дифференциацию особо опасных буркхольдерий, что в диагностическом отношении является их несомненным преимуществом. Используемый режим лиофилизации позволяет сохранять аналитические характеристики препарата в течение не менее 2 лет (срок наблюдения), что делает его для медицинской практики более доступным.
Примечание: *За титр реакции принимали концентрацию м.к./мл, которая была выявлена в РНГА с Диагностикумом эритроцитарным сапным иммуноглобулиновый моноклональным в лунках на 3+ и 4+ по общепринятым принципам учета реакции:
«+» - положительный результат реакции (формирование «зонтика» агглютината);
«-» - отрицательный результат реакции (нагруженные эритроциты на дне лунки в виде «пуговки»)
Примечание: *За титр реакции принимали концентрацию м.к/мл, которая была выявлена в РНГА с Диагностикумом эритроцитарным сапных иммуноглобулиновым моноклональным в лунках на 3+ и 4+ по общепринятым принципам учета реакции:
«+» - положительный результат реакции (формирование «зонтика» агглютината);
«-» - отрицательный результат реакции (нагруженные эритроциты на дне лунки в виде «пуговки»)