Психофизиологическое развитие первого и второго поколений самцов крыс, облучённых в дозе 1,5 Гр

Психофизиологическое развитие первого и второго поколений самцов крыс, облучённых в дозе 1,5 Гр

Панфилова В.В., Колганова О.И., Жаворонков Л.П., Павлова Л.Н.,

Палыга Г.Ф., Чибисова О.Ф.

ФГБУ МРНЦ Минздрава России, Обнинск

Изучено влияние облучения половых клеток самцов-крыс (60Со, доза 1,5 Гр, мощность дозы

0,003 Гр/с) на психофизиологическое развитие их потомства. Проведена оценка когнитивных функций мозга потомства первого и второго поколений по тесту выработки условного рефлекса избегания в челночной камере. Показано, что облучение на всех стадиях сперматогенеза негативно влияет на потомство первого поколения, менее выражено влияние на потомство второго поколения.

Ключевые слова: крысы, когнитивные функции мозга, ионизирующее излучение, челночная камера, сперматогенез.

Развитие и расширяющиеся масштабы применения ядерной энергии в народном хозяйстве увеличивает вероятность вредоносного воздействия ионизирующей радиации на человека. В связи с этим возрастает необходимость более глубокого и детального экспериментального изучения влияния относительно невысоких, нелетальных доз радиации на организм млекопитающих и их потомство. Возможность трансгенерационной передачи негативного влияния воздействия радиации на животных к их потомкам была продемонстрирована рядом исследователей экспериментально [10]. Однако в научной литературе в настоящий момент нет единого мнения о механизмах действия радиации на гаметы человека и животных, зависимости от дозы и мощности дозы облучения, а также о последствиях для потомства [10]. Исследования в этом направлении позволяют оценить условия, при которых возможно сохранение генофонда человека и животных, подвергшихся воздействию ионизирующей радиации в нестерилизующих дозах.

Особенно актуальным в последние годы стало выяснение генетической полноценности и жизнеспособности внешне здоровых детей - потомков облучённых родителей. Одним из важных показателей, характеризующих полноценность потомства, являются изменения в когнитивных функциях мозга. Однако до настоящего времени наблюдается недостаток научной информации в этой области знаний. В основном исследовали поведение пренатально облучённых людей или животных. Единичные работы посвящены изучению поведения потомков родителей, облучённых до зачатия. В этих исследованиях у потомков облучённых животных-отцов было обнаружено ухудшение показателей физиологической полноценности и выявлены отклонения в поведении. Например, было показано понижение общей приспособленности потомства облучённых животных к различным негативным факторам [1], статистически значимое снижение исследовательской двигательной активности по тесту открытого поля [6, 9] и изменение поведения в «беличьем колесе» [9].

В данной работе в экспериментах на крысах проведена оценка влияния облучения ионизирующим излучением самцов крыс в нестерилизующей дозе на когнитивные функции мозга их

Панфилова В.В.* - аспирант; Колганова О.И. - ст. научн. сотр.; к.б.н.; Жаворонков Л.П. - зав. лаб., д. мн.; Павлова Л.Н. - вед. научн. сотр., к.м.н.; Палыга Г.Ф. - гл. научн. сотр., д.мн.; Чибисова О.Ф. - научн. сотр. ФГБУ МРНЦ Минздрава России.

*Контакты: 249036, Калужская обл., Обнинск, ул. Королёва 4. Тел.: (48439) 9-71-38; e-mail: whiskas04@yandex.ru.

потомства первого и второго поколений, с использованием методики выработки условного рефлекса избегания в челночной камере. При этом анализировали значение стадии сперматогенеза в момент облучения отцов.

Материалы и методы

Объектом исследования были самцы крыс линии Вистар и их потомство первого и второго поколений. Психофизиологическое развитие потомства оценивалось по способности к обучению с помощью теста выработки условного оборонительного рефлекса избегания в челночной камере.

Для решения поставленных задач 25 половозрелых самцов крыс линии Вистар (Р0) подвергали однократному общему облучению на установке «Луч» (Россия, 60Со) в дозе 1,5 Гр (мощность дозы 0,003 Гр/с), а затем спаривали с интактными самками через разные интервалы времени после облучения. Для того, чтобы в оплодотворении участвовали облучённые на той или иной стадии половые клетки животных, в соответствии с циклом сперматогенеза у крыс [7, 8], самцов подсаживали к самкам (1 самец на 2 самки) после облучения на 5-6 сутки (облучение на стадии «сперматозоиды»), на 17-19 сутки (облучение на стадии «сперматиды»), на 3335 сутки (облучение на стадии «сперматоциты») и через три месяца (время, необходимое для созревания облучённых сперматогоний).

Соответственно, потомство первого поколения было поделено на 4 подопытные группы («сперматозоиды», «сперматиды», «сперматоциты», «сперматогонии»). В группы для дальнейшего тестирования условно-рефлекторной деятельности в месячном возрасте отбирали по два внешне здоровых детёныша разного пола от каждой самки-матери и доращивали их до трёхмесячного возраста. Контрольную группу составляли интактные самцы и самки, которые находились в идентичных с подопытными крысами условиях содержания. Животных содержали в стандартных условиях вивария и на стандартном рационе, состоящем преимущественно из брикетированного корма, согласно нормативам лабораторного животноводства.

Для получения второго поколения (Р2) по материнской линии спаривали самок р! из первого поколения (дочерей облучённых самцов р0) с интактными самцами.

Изучение психофизиологического развития крыс первого и второго поколений (р! и р2) проводили после достижения ими возраста 3 месяца, в подопытные группы из числа выживших потомков отбирали клинически здоровых животных без выраженных пороков развития. Тестирование проводилось отдельно для групп самок и самцов.

Когнитивные (памятные) функции мозга оценивали по способности к выработке и воспроизведению условного рефлекса избегания (УРИ). В экспериментах использовали стандартную методику обучения крыс в челночной камере Шаттл-бокс [3]. Данный метод позволяет судить о таких элементах высшей нервной деятельности, как ассоциативное мышление, память, закрепление условных связей и воспроизведение выработанного навыка. В трёхканальной камере тестировали крыс, предъявляя им следующую последовательность сигналов: свет + звук (условный сигнал) - 4 с, болевое электрическое раздражение (безусловный сигнал) - с 4 по 12 с; пауза - 20 с. За один сеанс крысам предъявляли по 50 сочетаний условного и безусловного раздражителей.

При анализе выработки и воспроизведения УРИ использовали ряд показателей, отражающих конечную результативность (интегративные критерии) либо характеризующих скорость обучения (динамические критерии).

К интегративным критериям относили: 1) число нанесённых током ударов до регистрации первого УРИ - лаг-фаза обучения; 2) общее число УРИ за сессию; 3) количество перебежек в другой отсек после удара током; 4) число отказов (отсутствие перебежек даже на электрокож-ное подкрепление); 5) наличие крыс, имеющих серии из пяти и более УРИ подряд (критерий оценки состояния консолидации памятного следа); 6) среднее по группе значение латентного периода реакции избегания либо перебежки.

Показатели скорости обучения основаны на оценке параметров кривых линейной регрессии, отражающих нарастание частоты избеганий в процессе обучения. Регрессионный анализ позволяет количественно оценить различия в исходном уровне обученности и скорости обучения.

С помощью уравнений линейной регрессии оценивали: 1) динамику количества УРИ в процентах к максимально возможному за интервал в десять попыток с шагом в две попытки индивидуально по каждой особи и в целом по группе; 2) при использовании в качестве функции отношения числа УРИ к числу совершённых попыток (%) вычисляли также критерий 50 % обученности (ОБ-50) с доверительным интервалом (число попыток до появления 50 % УРИ в среднем у каждой крысы в группе).

Животных тестировали два раза с интервалом в двое суток.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием ряда методов параметрической (t-критерий Стьюдента) и непараметрической статистики (медианный критерий х2, X-критерий Ван дер Вардена, U-критерий Вилкоксона-Манна-Уитни). Значимость различий считалась достаточной, если p<0,05. Все приведённые статистические подходы реализованы в разработанных Л.П. Жаворонковым и Л.Н. Павловой комплексной компьютерной программе, которая использовалась при обработке данных.

Результаты и обсуждение

Уже при первом тестировании было отмечено, что у потомков F1 облучённых в дозе 1,5 Гр самцов была нарушена способность к обучению (табл. 1). Так, у самцов из двух подопытных групп («сперматоциты» и «сперматогонии») было значительно больше отказов от перебежек, чем у животных из контрольной группы, что свидетельствует о нарушении у них устойчивости высшей нервной деятельности - в процессе обучения развивается эмоциональный стресс. У самок из подопытных групп отставание в обучении, по сравнению с контрольной группой, было выражено сильнее, чем у самцов. В группах «сперматиды» и «сперматоциты» позднее начинают вырабатываться УРИ (длиннее лаг-фазы обучения), количество УРИ к концу первой сессии обучения значимо меньше, чем в контрольной группе, чаще наблюдаются отказы от побежек, больше показатель ОБ-50.

Таблица 1

Влияние облучения в дозе 1,5 Гр на условно-рефлекторную деятельность крыс первого поколения по результатам первого тестирования

Г руппа Лаг-фаза Количество УРИ Количество отказов Латентный период УРИ (с) Латентный период перебежек (с) ОБ-50 Число крыс с сериями УРИ

Самцы

Контроль

Самки

Контроль

Примечание: п - количество животных; * - значимое различие с контролем при р<0,05.

При повторном тестировании, которое является более информативным, чем первое, практически по всем интегративным и динамическим показателям условно-рефлекторной деятельности, потомки Р1 облучённых самцов обоего пола, значительно отличались от контрольных животных в худшую сторону (табл. 2, рис. 1). У потомков облучённых животных условные рефлексы начинают вырабатываться позже, чем у контрольных. У них снижено количество условных рефлексов в целом за сессию обучения, во всех подопытных группах значительно больше количество отказов и выше показатель ОБ-50. Среди потомков первого поколения от облучённых самцов значительно меньше животных, чем в контроле, имели серии из нескольких УРИ подряд, то есть у них было нарушено запоминание выработанного навыка.

Таблица 2

Влияние облучения в дозе 1,5 Гр на условно-рефлекторную деятельность крыс первого поколения по результатам второго тестирования

Г руппа Лаг-фаза Количество УРИ Количество отказов Латентный период УРИ (с) Латентный период перебежек (с) ОБ-50 Число крыс с сериями УРИ

Самцы

Контроль

Самки

Контроль

Примечание: п - количество животных; * - значимое различие с контролем при р<0,05.

80 70 Н 60 50 й! 40>

^ 30 20 10 4 0

1.5 Г р., 2 тест, самцы П

1

/• • • V ^ 2

/ Л/#** 3

у/

.ж

*-*Л7-у-У?/7

“Г

т

Т

5 10 15 20

порядковый номер шага

25

70

60

50

40

30

20

10

0

1.5 Г р., 2 тест, самки П

У ^

2

•У г#*

А

л/

—I— 10

15

—I— 20

порядковый номер шага

25

А

Б

Рис. 1. Динамика нарастания % УРИ по попыткам за 10 попыток с шагом в 2 попытки в процессе обучения самцов (А) и самок (Б) первого поколения в процессе второго тестирования.

К - контрольная группа, 1 - группа «сперматозоиды», 2 - группа «сперматиды»,

3 - группа «сперматоциты», 4 - группа «сперматогонии».

К

К

По результатам анализа способности к обучению можно заключить, что у потомства первого поколения от облучённых отцов, как у самцов, так и у самок, значительно нарушены выработка и закрепление УРИ во всех изученных группах. Наиболее выраженное угнетение когнитивных функций было отмечено в группах «сперматиды» и «сперматоциты», практически в равной степени у самцов и самок. Меньше пострадала условно-рефлекторная деятельность потомков первого поколения в группах «сперматозоиды» и «сперматогонии».

Таблица 3

Влияние облучения в дозе 1,5 Гр на условно-рефлекторную деятельность крыс второго поколения по результатам первого тестирования

Г руппа Лаг-фаза Количество УРИ Количество отказов Латентный период УРИ (с) Латентный период перебежек (с) ОБ-50 Число крыс с сериями УРИ

Самцы

Контроль

Самки

Контроль

Примечание: п - количество животных; * - значимое различие с контролем при р<0,05.

Таблица 4

Влияние облучения в дозе 1,5 Гр на условно-рефлекторную деятельность крыс второго поколения по результатам второго тестирования

Г руппа Лаг-фаза Количество УРИ Количество отказов Латентный период УРИ (с) Латентный период перебежек (с) ОБ-50 Число крыс с сериями УРИ

Самцы

Контроль

Самки

Контроль

Примечание: п - количество животных; * - значимое различие с контролем при р<0,05.

80 70 Н 60 50 й! 40>

^ 30 20 10-| 0

1.5 Г р., 2 тест, самцы Р2

-Яш*

Ш-Я-Ш /

У*-*

• * 3

7 / /•!> * ,• и*

АҐ

“Г

"Г

5 10 15

порядковый номер шага

і— 20

25

80

70

60

50

40

30

20

10

1.5 Г р., 2 тест, самки Р2

/

аЛ»

г* / /

• Г*

.Л'7 У V

-і/Л.А-'

,*/ А*/* _ /

~I— 10

—I—

15

20

порядковый номер шага

25

1

3

А Б

Рис. 2. Динамика нарастания % УРИ по попыткам за 10 попыток с шагом в 2 попытки в процессе обучения самцов (А) и самок (Б) второго поколения в процессе второго тестирования.

К - контрольная группа, 1 - группа «сперматозоиды», 2 - группа «сперматиды»,

3 - группа «сперматоциты», 4 - группа «сперматогонии».

При первом тестировании потомство второго поколения мало отличалось от контрольных животных по способности к обучению, за исключением группы «сперматиды» (табл. 3), однако при втором тестировании оказалось, что в подопытных группах снижена скорость обучения и нарушено запоминание выученного «урока» (табл. 4, рис. 2). У самцов в подопытных группах «сперматиды» и «сперматогонии» во второй сессии обучения была длиннее лаг-фаза, меньше общее количество УРИ, больше отказов и выше ОБ-50. У самок, судя по показателю ОБ-50, нарушения в способности к обучению наблюдались во всех подопытных группах; но особенно плохо, практически по всем критериям, обучались крысы из группы «сперматозоиды». Следует

отметить, что у потомков второго поколения, по сравнению с потомками первого поколения, зафиксированные нарушения условно-рефлекторной деятельности были менее выражены (в меньшей степени снижено количество выработанных условных рефлексов), однако по ряду динамических показателей эти нарушения были весьма значительны.

Заключение

В результате проведённых экспериментов были получены данные, свидетельствующие о наличии негативных эффектов облучения в дозе 1,5 Гр на высшую нервную деятельность потомства первого и второго поколений облучённых родителей-крыс по критериям, характеризующим выработку, закрепление и последующее воспроизведение условного рефлекса избегания в челночной камере. Установлено, что степень выраженности этих нарушений существенно зависит от стадии сперматогенеза. Наиболее глубокое угнетение когнитивных функций, в равной степени у самцов и самок первого и второго поколений, было зафиксировано у животных, развившихся из гамет, облучённых на стадии «сперматиды». У них наблюдалось снижение способности к обучению, нарушение кратковременной и долговременной памяти, нарушение устойчивости высшей нервной деятельности. Менее пострадали потомки, зачатые от облучённых самцов на стадии гаметогенеза «сперматозоиды» и «сперматогонии». Наши результаты согласуются с данными литературы [4] по радиочувствительности и способности к репарации половых клеток самцов на разных стадиях сперматогенеза. Известно, что облучение самцов крыс в дозе 0,25 Гр и выше [5] вызывает гибель части сперматогониев. Однако уцелевшие сперматогонии, представляющие собой диплоидные клетки с относительно большим количеством цитоплазмы, ещё не утраченной в процессе дальнейшего преобразования гамет, обладают высокой способностью к репарации полученных в результате облучения повреждений и, следовательно, передают дальнейшим поколениям половых клеток меньше повреждений, чем получили сами. Сперматозоиды - это зрелые, закончившие дифференцировку клетки, более устойчивы к действию радиации, чем незрелые клетки. Напротив, сперматиды - незрелые гаплоидные клетки с очень ограниченными возможностями к репарации, и «удар» радиации сказывается на них наиболее тяжело, соответственно, и потомство, развившееся из таких клеток, имеет наибольшее количество повреждений.

Исследование условно-рефлекторной деятельности животных часто позволяет выявить такие нарушения в их развитии, которые не выявляются другими методиками. Так, нами ранее было изучено влияние облучения самцов крыс в дозе 1,5 Гр на разных стадиях сперматогенеза на эмбриогенез и ранний постнатальный онтгогенез потомства двух поколений этих самцов [2]. В первом поколении было обнаружено снижение числа новорожденных в помете за счет повышенной внутриутробной гибели зародышей у самок, оплодотворенных самцами, половые клетки которых были облучены на стадиях сперматозоидов, сперматид и сперматоцитов. Тестирование способности к обучению выживших потомков F1 из этих групп показало их психофизиологическую неполноценность. Облучение на стадии сперматогоний не вызвало отклонений в ходе беременности и физических показателях потомства. Однако при тестировании условно-

рефлекторной деятельности потомков первого поколения группы «сперматогонии», особенно самцов, были отмечены нарушения в высшей нервной деятельности.

Генетической причиной физиологической неполноценности внешне здорового потомства, по мнению Воробцовой И.Е. [1], является, по-видимому, совокупность рецессивных мутаций полигенов жизнеспособности, а также нарушения ДНК регуляторного характера, возникающие в половых клетках родителей. Фенотипически эти повреждения могут никак себя и не проявлять, пока на организм не подействует какая-либо дополнительная нагрузка, заболевание или провоцирующий фактор. В нашем случае таким фактором, позволившим выявить нарушения у внешне нормальных потомков облучённых самцов, явилось тестирование животных на способность к выработке условных рефлексов. Эти нарушения проявляются у потомков первого поколения и, что важнее, от них передаются второму поколению.

Таким образом, по результатам нашей работы (по тесту выработки условного рефлекса избегания у потомства облучённых самцов-родителей) можно сделать вывод о значительном нарушении когнитивных функций у потомков первого (Р1) и второго (Р2) поколений крыс-самцов, облучённых в дозе 1,5 Гр. Вероятно, во время облучения при данной дозе нарушения в мужских половых клетках возникают при всех изученных стадиях сперматогенеза и передаются потомкам.

Литература

1. Воробцова И.Е. Генетические и соматические эффекты ионизирующей радиации у человека и животных (сравнительный аспект) //Радиационная биология. Радиоэкология. 2002. Т. 42, № 6. С. 639643.

2. Дергилев А.А., Палыга Г.Ф., Чибисова О.Ф., Иванов В.Л., Панфилова В.В., Жаворонков Л.П.

Радиация и сперматогенез: экспериментальная оценка онтогенетических эффектов при остром облучении в нестерилизующих дозах //Радиация и риск. 2012. Т. 21, № 4. С. 51-60.

3. Навакатикян М.А. Методика изучения оборонительных условных рефлексов активного избегания //Журнал высшей нервной деятельности. 1992. Т. 42, № 4. С. 812-818.

4. Нефёдов И.Ю., Нефёдова И.Ю., Палыга Г.Ф. Актуальные аспекты проблемы генетических последствий облучения млекопитающих //Радиационная биология. Радиоэкология. 2000. Т. 40, № 4. С. 358372.

5. Орлова Н.Н. Ранние и поздние изменения в семенниках крыс в условиях длительного хронического воздействия малых доз радиации //Действие малых доз ионизирующих излучений на гонады и плод: тезисы докладов. Обнинск, 1988. С. 52-54.

6. Панфилова В.В., Колганова О.И., Чибисова О.Ф., Харитонова Е.С. Исследовательская активность потомства самцов крыс, подвергшихся острому гамма-облучению //VII съезд по радиационным исследованиям: тезисы докладов. М., 2010. Т. 1. С. 74.

7. Райцина С.С. Цикл сперматогенного эпителия и кинетика сперматогенеза у млекопитающих //Успехи современной биологии. 1967. Т. 63, Вып. 1. С. 135-153.

8. Рузен-Ранге Э. Сперматогенез у животных /Пер. с англ. яз. Л.В. Даниловой. М.: Мир, 1980. 255 с.

9. Сахаров Д.Г., Дыгало Н.Н. Поведение потомков пренатально облучённых крыс //Журнал высшей нервной деятельности. 1996. Т. 46, Вып. 6. С. 1109-1114.

10. Barber R.C., Dubrova Y.E. The offspring of irradiated parents, are they stable? //Mutation Research. 2006. V. 598, N 1-2. P. 50-60.

Psychophysiological development of the first and second generations of male rats exposed to radiation of 1.5 Gy

Panfilova V.V., Kolganova O.I., Zhavoronkov L. P., Pavlova L.N.,

Palyga G.F., Chibisova O.F.

Medical Radiological Research Center of the Russian Ministry of Health, Obninsk

Effect of exposure of rat males to gamma-radiation at dose of 1.5 Gy, dose rate 3x10-3 Gy/s on psychophysiological development of their first and second generations was studied. The rats were exposed to radiation at different stages of spermatogenesis. Cognitive function of brain in both generations was tested using shuttle-box avoidance method. Irradiation of male rats at all stages of spermatogenesis produced negative effect on the first generation, the adverse radiation-induced effect on the second generation was less pronounced.

Key words: rats, brain cognitive functions, gamma-irradiation, Shuttle-box, spermatogenesis.

Panfilova V.V.* - Postgraduate Student; Kolganova O.I. - Senior Researcher, C. Sc., Biol.; Zhavoronkov L.P. - Head of Dep., MD; Pavlova L.N. - Lead. Researcher, C. Sc., Med.; Palyga G.F. - Main Researcher, MD; Chibisova O.F. - Research Assistant. MRRC.

‘Contacts: 4 Korolyov str., Obninsk, Kaluga region, Russia, 249036. Tel.: (48439) 9-71-38; e-mail: whiskas04@yandex.ru.