УСТРОЙСТВО ДЛЯ СУБРЕТИНАЛЬНОГО ДОЗИРОВАННОГО ВВЕДЕНИЯ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК
SYSTEM FOR SUBRETINAL DOSING OF STEM CELLS

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в офтальмологии для субретинального введения стволовых клеток.
Одним из перспективных методов лечения различной офтальмопатологии, сопровождающейся дистрофическими, атрофическими и т.п. процессами, например возрастной макулярной дистрофии, атрофии зрительного нерва, прогрессирующей миопии и т.д., может явиться применение стволовых клеток, однако такие методы еще недостаточно разработаны.
Стволовые клетки обладают рядом существенных достоинств: могут обеспечивать регенерацию поврежденных участков через продукцию различных факторов роста и ключевых метаболитов; способны разворачивать программы пролиферации и дифференцировки, восполняя тем самым недостаток активно работающих клеток; могут интегрироваться в патологически измененные участки сетчатки и образовывать клетки с ретинальным фенотипом.
Предложены различные способы введения стволовых клеток при патологии сетчатки и зрительного нерва: внутривенное, субконъюнктивальное, субтеноновое, парабульбарное, интравитреальное, супрахориоидальное, введение в канал, образованный после радиальной оптической нейротомии. Преимущественным является метод субретинального введения в связи с возможностью максимального приближения к месту повреждения. Но, к сожалению, субретинальный способ введения клеток является неконтролируемым, трудно дозируемым, достаточно травматичным и не исключает миграции клеток.
Решением проблемы дозируемого контролируемого субретинального введения стволовых клеток может явиться разработка специальных устройств.
В доступной литературе авторами не обнаружено данных об устройстве для субретинального дозированного введения стволовых клеток.
Задачей изобретения является создание устройства для субретинального дозированного введения стволовых клеток.
Техническим результатом является локальное контролируемое введение через pars plana точного дозированного объема суспензии стволовых клеток в субретинальное пространство с наименьшей травматизацией сетчатки.
Технический результат достигается тем, что согласно изобретению устройство для субретинального дозированного введения стволовых клеток включает иглу 25g, внутри которой расположена канюля 41g, на выходе из иглы канюля изогнута под углом 90°, а ее конец заточен кнаружи под углом 60°, переходник для соединения иглы с изогнутой канюлей с инсулиновым одноразовым шприцем и дозатор, который содержит корпус, в который ввинчивается резьбовая втулка, имеющая ходовую резьбу с шагом 0,7 мм для перемещения дозирующего винта, снабженного маховичком, с противоположной стороны относительно маховичка в корпус ввинчивается стопорный винт для фиксации инсулинового одноразового шприца, внутри корпуса расположена пружина для набора жидкости в шприц и устранения люфта между штоком шприца и ходовым винтом, на резьбовой втулке и маховичке нанесены метки для отсчета количества оборотов маховичка.
Технический результат достигается за счет того, что:
1) канюля 41g изогнута под углом 90° на выходе из иглы 25g, а ее конец заточен кнаружи под углом 60°, что позволяет ввести канюлю субретинально через микропрокол в сетчатке с наименьшей ее травматизацией;
2) переходник и инсулиновый одноразовый шприц предназначены для набора жидкости - суспензии стволовых клеток;
3) переходник служит для соединения иглы с изогнутой канюлей с инсулиновым одноразовым шприцем;
4) конструкция дозатора, в корпус которого ввинчивается резьбовая втулка, имеющая ходовую резьбу с шагом 0,7 мм для перемещения дозирующего винта, снабженного маховичком, позволяет точно дозировать объем суспензии стволовых клеток, выходящий через канюлю 41g в субретинальное пространство за счет вращения маховичка на необходимое количество оборотов, для отсчета которых предназначены метки на резьбовой втулке и маховичке, при этом известно, что за один оборот маховичка доза выходящей через канюлю 41g жидкости составляет 0,012 мл;
5) внутри корпуса расположена пружина для набора жидкости в шприц и устранения люфта между штоком инсулинового одноразового шприца и ходовым винтом;
6) с противоположной стороны относительно маховичка в корпус ввинчивается стопорный винт для фиксации инсулинового одноразового шприца.
Устройство для субретинального дозированного введения стволовых клеток включает иглу 25g, внутри которой расположена канюля 41g, на выходе из иглы канюля изогнута под углом 90°, а ее конец заточен кнаружи под углом 60°, переходник для соединения иглы с изогнутой канюлей с инсулиновым одноразовым шприцем и дозатор.
Дозатор состоит из корпуса, в который ввинчивается резьбовая втулка, имеющая ходовую резьбу для перемещения дозирующего винта, снабженного маховичком. Маховичок служит для ручного вращения дозирующего винта. Стопорный винт предназначен для фиксации инсулинового одноразового шприца 1 мл. Пружина предназначена для набора жидкости в шприц, устранения люфта между штоком шприца и ходовым винтом. При шаге резьбы ходового винта 0,7 мм за один оборот маховичка доза жидкости составляет 0,012 мл. Отсчет количества оборотов и соответственно дозы жидкости - суспензии стволовых клеток - ведется по меткам, расположенным на резьбовой втулке и маховичке.
Дозатор стерилизуется автоклавированием при температуре 134°С в разобранном состоянии. Стерильная пружина одевается на шток инсулинового одноразового шприца при сборке дозатора.
Переходник в виде силиконовой трубочки имеет насадки: с одной стороны - для соединения с дозатором, с другой - для насаживания иглы 25g, внутри которой расположена канюля 41g.
Для субретинального дозированного введения суспензии стволовых клеток предлагаемое устройство используют, например, следующим образом.
С целью субретинального введения суспензии стволовых клеток на шприц дозатора надевают переходник, через переходник в шприц набирают физиологический раствор, затем суспензию, содержащую стволовые клетки, меченные магнитными частицами, после чего на переходник надевают иглу 25g, внутри которой расположена канюля 41g, на выходе из иглы канюля изогнута под углом 90°, а ее конец заточен кнаружи под углом 60°.
Затем устанавливают блефаростат, в 3 мм от лимба проводят разрез конъюнктивы и теноновой оболочки с помощью конъюнктивальных ножниц, берут нижнюю прямую мышцу на шов-держалку. Затем в 7 мм от лимба к склере узловым швом 5-0 Dacron (Alcon) фиксируют комплекс полимерного эластичного магнитного имплантата (ПЭМИ) толщиной 0,35 мм, диаметром 4 мм, напряженностью магнитного поля 5,0 мТл с лазерным зондом в виде тонкого оптоволокна с короткофокусной рассеивающей линзой на конце. Устанавливают три порта 25g в 3 мм от лимба в верхнем, верхне-наружном и нижне-наружном сегментах, фиксируют инфузионную систему, световод, витреотом и проводят срединную витрэктомию.
ПЭМИ с лазерным зондом обеспечивает интраоперационную диафаноскопию и позволяет локализовать место предполагаемого введения стволовых клеток. Изогнутую канюлю вводят интравитреально и подводят к месту фиксации ПЭМИ, аккуратно вводят заточенный конец канюли под сетчатку и, поворачивая маховичок дозатора на нужное количество оборотов, ориентируясь по меткам, расположенным на резьбовой втулке и маховичке, субретинально вводят необходимый объем суспензии стволовых клеток, меченных магнитными частицами, из расчета, что за один полный оборот маховичка доза выделяемой жидкости составляет 0,012 мл.
Для предотвращения выхождения клеток через ретинотомическое отверстие сразу после их введения в витреальную полость вводят 0,3-0,4 мл газо-воздушной смеси. Операцию заканчивают наложением швов Coated Vicryl 8-0 (Ethicon) на склеротомические отверстия и конъюнктиву.
Изобретение поясняется фигурами 1-7.
На фиг. 1 представлена игла 25g, внутри которой расположена канюля 41g, на выходе из иглы канюля изогнута под углом 90°, а ее конец заточен кнаружи под углом 60°. На фиг. 2 представлен переходник для соединения иглы с изогнутой канюлей с инсулиновым одноразовым шприцем. На фиг. 3 представлен дозатор, в котором в корпус 2 ввинчивается резьбовая втулка 5, имеющая ходовую резьбу для перемещения дозирующего винта 4, снабженного маховичком 6, стопорный винт 7 предназначен для фиксации инсулинового одноразового шприца 1, пружина 3 предназначена для набора жидкости в шприц и устранения люфта между штоком шприца и ходовым винтом, для отсчета количества оборотов маховичка на резьбовой втулке и маховичке нанесены метки 8.
На фиг. 4 представлена микроскопия в режиме флуоресценции, оптимальном для зеленого флуоресцентного белка: увеличение ×10; срок наблюдения 1 сутки: клетки НЕК-293 GFP под сетчаткой. На фиг. 5 представлена микроскопия в режиме флуоресценции, оптимальном для зеленого флуоресцентного белка: увеличение ×4; срок наблюдения 3 суток: окраска среза бисбензимидом для визуализации ядер живых клеток, группы клеток НЕК-293 GFP, расположенных субретинально. На фиг. 6 представлена микроскопия в режиме флуоресценции, оптимальном для зеленого флуоресцентного белка: увеличение ×20; срок наблюдения 7 суток: группы клеток НЕК-293 GFP, расположенных субретинально. На фиг. 7 представлена микроскопия в режиме флуоресценции, оптимальном для зеленого флуоресцентного белка, в проходящем свете: увеличение ×10; срок наблюдения 14 сутки: группы клеток НЕК-293 GFP, расположенных субретинально.
Изобретение поясняется следующими экспериментальными данными.
Субретинальное введение стволовых клеток НЕК-293 GFP, меченных магнитными частицами, с использованием предлагаемого устройства выполнено на 12 глазах 12 кроликов породы Шиншилла.
Во всех случаях клетки введены субретинально в запланированном месте, в парацентральной области в нижнем сегменте. Объем суспензии введенных клеток контролировали по количеству оборотов маховичка устройства, отсчет которых производили при помощи меток на резьбовой втулке и маховичке. Во всех глазах субретинально было введено по 0,024 мл клеточно суспензии, что составляло около 7000-7200 стволовых клеток НЕК-293 GFP, меченных магнитными частицами, за два оборота маховичка.
В сроки наблюдения 1, 3, 7, 14 суток во всех прооперированных глазах отслойки сетчатки по данным ультразвукового В-сканирования диагностировано не было.
Энуклеация была проведена через 1, 3, 7, 14 суток после операции.
После проведения криозамораживания глазных яблок и изготовления срезов результаты были оценены при помощи микроскопа Olympus 1X81 в режиме флуоресценции, оптимальном для зеленого флуоресцентного белка (GFP), при увеличении 4х, 10х, 20х. Микроскоп был снабжен цифровой камерой Olympus DP72, соединенной с компьютером.
В первые сутки после проведения хирургического вмешательства во всех глазах клетки НЕК-293 GFP располагались в месте их введения под сетчаткой. В стекловидном теле и других структурах глаза обнаружены не были.
На 3 сутки во всех глазах клетки НЕК-293 GFP располагались в месте введения под сетчаткой. В стекловидном теле и других структурах глаза обнаружены не были. При добавлении на срезы красителя бисбензимида, окрашивающего ядра живых клеток, доказано, что группа клеток, находящихся под сетчаткой, является живой.
На 7 сутки во всех глазах клетки НЕК-293 GFP располагались также локально в месте их введения под сетчаткой. Миграции клеток в стекловидное тело и другие структуры глаза обнаружено не было.
На 14 сутки во всех глазах клетки НЕК-293 GFP визуализировались в месте их имплантации под сетчаткой, в зоне подшивания магнитного имплантата. В стекловидном теле и других структурах глаза клетки обнаружены не были.
Таким образом, предлагаемое изобретение обеспечивает локальное контролируемое введение через pars plana точного дозированного объема суспензии стволовых клеток в субретинальное пространство с наименьшей травматизацией сетчатки.