Исследование изменения агрегации эритроцитов при инкубации с вновь синтезированными химическими соединениями

УДК 612.1

Е. В. Узикова, М. Ю. Милорадов, С. В. Булаева, А. В. Муравьёв, Ж. В. Чиркова, Л. Г. Зайцев

Исследование изменения агрегации эритроцитов при инкубации с вновь синтезированными

химическими соединениями

Работа выполнена в рамках реализации Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы.

В статье приводятся результаты исследования вновь синтезированных в Ярославском государственном педагогическом университете соединений 1, 2, 3, 4-тетрагидропиримидинтионового (онового) ряда на процесс объединения в агрегаты эритроцитов крови человека. Установлено, что соединения проявляют биологическую активность, угнетают агрегацию эритроцитов по сравнению с контрольным образцом. Выявлено, что наибольшее снижение агрегации эритроцитов (на 55 %) произошло при инкубации эритроцитов с 3-(4-метилбензоил)-2-(2-оксо-4-фенил-1, 2, 3, 4-тетрагидро-пиримидин-5-ил)-бензофуран-5, 6-дикарбонитрилом.

Ключевые слова: агрегация эритроцитов, биологическая активность, текучесть крови.

E. V. Uzikova, M. Ju. Miloradov, S. V. Bulaeva, A. V. Muravyov, Zh. V.Chirkova, L. G. Zaitsev

Research of Red Blood Cell Aggregation Change at the Incubation with Newly Synthesized Chemical

Compounds

The present study examined the influence of unknown before some chemical compounds on the RBCs aggregation. It was investigated the biological activity of 1,2,3,4-tetrahydropirimidinbenzofuran-5,6-dicarbonitriles. The addition of those compounds led to statistically significant decrease of the RBCs aggregation by 14-55 %.

Keywords: RBCs aggregation, biological activity, blood flow.

Введение

Развитие и совершенствование химии и химической технологии, наряду с последними достижениями микробиологии, способствует бурному развитию фармацевтической индустрии. В последнее время синтезу производных бензофу-рана уделяется большое внимание, что связано с определением их биологической роли и проявляемой физиологической активностью. Эта гетероциклическая система входит в состав многих природных и синтетических лекарственных пре-паратов[6, 10-12, 15]. Также известно, что соединения пиримидинового ряда находят применение в фармакологии как противовирусные, бактерицидные, противоопухолевые, антигипертонические и противовоспалительные препараты [15].

Вышеизложенное позволяет предположить, что сочетание бензофуранового и пиримидино-вого фрагментов в одной молекуле открывает широкие возможности в области исследования реологии крови. Такие соединения могут быть использованы как сигнальные молекулы, кото-

рые, попав в кровоток, оказывают влияние на микрореологические свойства клеток крови, и в том числе на агрегацию и текучесть эритроцитов. Поскольку на уровне обменных капилляров эффективность кровотока в основном определяется реологическими свойствами эритроцитов и, в первую очередь, их деформируемостью и агрегацией, то изменение их текучести будет влиять не только на степень оксигенации тканевого микрорайона, но и на доставку самого лекарственного препарата клеткам-мишеням.

Целью данного исследования было изучение микрореологических свойств эритроцитов при инкубации с синтезированными соединениями 1,2,3,4-тетрагидропиримидинтионового(онового) ряда.

Материалы и методы исследования

Цельную кровь (в объеме 20 мл) получали ве-нопункцией у здоровых лиц 20-25 лет (п = 40), в донорском пункте. В качестве антикоагулянта использовали гепарин (5 МЕ/мл). Все измерения

© Узикова Е. В., Милорадов М. Ю., Булаева С. В., Муравьёв А. В., Замышляев А. В., Зайцев Л. Г., 2012

и манипуляции с кровью проводились в течение 4 часов после ее забора.

Для регистрации агрегации эритроцитов кровь отделяли от плазмы центрифугированием цельной крови в течение 15 минут при 3000 об/мин. Концентрированную суспензию эритроцитов (НЛ = 95 %) отмывали три раза в изотоническом растворе №С1 (Не* = 40 %). Затем разделяли их на несколько аликвот и суспендировали при 37 оС в различных инкубационных средах при гематокрите равном, 40 %, в течение 15 минут. После этого исследуемые эритроциты ре-суспендировали в аутологичной плазме (доводя до гематокрита 0,5 %) при комнатной температуре (21±1 оС).

Эритроциты инкубировали с веществами, представленными в табл. 1 в концентрации 0,1 цМ. В качестве растворителя использовали ди-мексид.

Сведения о химических соединен

Степень агрегации эритроцитов определяли с помощью метода оптической микроскопии с последующей видеорегистрацией и компьютерным анализом изображения [3]. При регистрации рассчитывали показатель агрегации (ПА) как отношение числа агрегатов к количеству эритроцитов; среднее число клеток, приходящееся на один агрегат (ЧА), и интегральный индекс агрегации (ИИА), равный произведению ПА на размер агрегата (число клеток в агрегате - ЧА), который характеризует две стороны агрегации - ее интенсивность и величину.

Статистическую обработку полученных цифровых материалов и все виды анализа результатов проводили на РС IBM, используя табличный редактор Microsoft Excel и программу "Statistica" (версия 6.0).

Таблица 1

:, применяемых в эксперименте

Номер соединения Формула Название

а H O 3-(4-метилбензоил)-2-(2-оксо-4-фенил-1,2,3,4-тетрагадропиримидин-5-ил)-бензофуран-5,6-дикарбонитрил

b 2-[4-(4-метоксифенил)-2-оксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил]-3-(4-метил-бензоил)-1-бензофуран-5,6-дикарбонитрил

c N^ ^-N 3-(4-метилбензоил)-2-(4-фенил-2-тиоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил )-1-бензофуран-5,6-дикарбонитрил

d jCX^vks N& ^-N 3-(4-метилбензоил)-2-(4-(4-метоксифенил)-2-тиоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5 -ил )-1-бензофуран-5,6-дикарбонитрил

e —O 3-(4-метоксибензоил)-2-[4-(4-метоксифенил)-2-тиоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил]-бензо фуран-5,6-дикарбонитрил

f ^—С ^ /—(N этиловый эфир 5,6-дициано-2-(4-фенил-2-тиоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5 -ил )-1-бензофуран-3-карбоновой кислоты

Результаты исследования и их обсуждение влияние препарата в среднем на процесс агрега-По полученным данным с помощью статисти- ции. Результаты проведенных исследований ческих методов обработки было установлено представлены в таблице 2.

Таблица 2

Показатели агрегации эритроцитов при инкубации эритроцитов с соответствующими 1,2,3,4-тетрагидропиримидин-2-онами

"""~\..Показатели Препараты ПА, отн. ед. ЧА, отн. ед. ИИА, отн. ед.

Контроль для а 0,040±0,008 4,722±0,261 0,209±0,042

а 0,018±0,003** 4,096±0,219 0,074±0,018**

Контроль для Ь 0,066±0,011 4,762±0,209 0,329±0,080

Ь 0,044±0,005* 4,534±0,189 0,199±0,047*

Контроль для с 0,060±0,010 4,881±0,243 0,293±0,066

с 0,044±0,007 4,893±0,202 0,215±0,049

Контроль для и 0,056±0,009 4,826±0,208 0,270±0,059

а 0,047±0,006 4,625±0,207 0,217±0,036

Контроль для е 0,052±0,011 4,761±0,185 0,248±0,056

е 0,044±0,008 4,719±0,226 0,214±0,048

Контроль для f 0,057±0,013 4,774±0,211 0,269±0,056

f 0,048±0,008 4,756±0,206 0,228±0,043

* - различия достоверны при р<0,05. ** - различия достоверны при р<0,01.

В ходе исследований было установлено, что присутствие в исследуемых образцах замещенных 2-[2-оксо(тиоксо)-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил]бензофуран-5,6-ди-карбонитрилов приводит к заметному снижению агрегации по сравнению с

контролем (суспензией эритроцитов в физиологическом растворе) (рис. 1). Так, в случае введения раствора препарата а наблюдалось достоверное снижение агрегации на 55 %, Ь - на 33 %.

Рис. 1. Изменение агрегации (в % к контрольному раствору без препарата) эритроцитов под влияние инкубации

с соединениями а - f

Снижение агрегации было статистически достоверным (табл. 2) по двум основным критериям: по показателю агрегации (ПА) и интегральному индексу агрегации (ИИА). Эти изменения следует расценивать как позитивные изменения реологической картины крови: ее текучести и транспортного потенциала. Остальные препараты также проявили тенденцию к снижению агрегации.

Исходя из химической структуры данных соединений, можно предположить, что снижение агрегации обусловлено связыванием Са2+ в клетке. Роль ионов кальция в процессах метаболизма клеток и регуляции их функций хорошо известна [9, 16, 18]. Ионизированный кальций участвует практически во всех физиологических процессах, и, в том числе, является основным элементом регуляторных каскадов при межклеточных взаимодействиях [8]. Около половины общего кальция плазмы находится в ионизированном состоянии, а следовательно, физиологически активно. Доля свободного кальция может изменяться при сдвигах кислотно-щелочного равно-

весия [2, 7]. Повышение содержания ионизированного кальция в плазме крови вызывает увеличение его мембранного пула, где он способен связываться с анионами (главным образом с карбоксильными группами белков и кислыми фос-фолипидами). Подтверждением важной роли Са2+ в клеточном взаимодействии служат данные, полученные при его связывании в среде инкубации эритроцитов. Был обнаружено снижение агрегации эритроцитов под влиянием хелатора кальция (ЭДТА) [1]. Блокатор кальциевых каналов верапамил тоже выраженно снижал агрегацию эритроцитов [1, 4, 5, 12]. Известно, что обработка хелаторами кальция почти полностью (до 90 %) удаляет мембраносвязанный кальций, локализованный на внешней стороне клеточной мембраны [6]. Ингибирование прироста агрегации после обработки соединениями 1,2,3,4-тетрагидропиримидинтионового(онового) ряда позволяет предположить участие мембраносвязанного кальция в отмеченной интенсификации процесса агрегатообразования эритроцитов.

A

B

Рис. 2. Изменение агрегации эритроцитов под влиянием инкубации с а

Заключение

В результате исследования установлено, что соединения под шифрами «а - Г» обладают биологической активностью: определен эффект влияния 2-[2-оксо(тиоксо)-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил]бензофуран-5,6-дикарбонитрилов на агрегацион-ные свойства эритроцитов. Показано, что указанные соединения угнетают агрегацию эритроцитов по сравнению с контрольным образцом. Выявлены структуры, которые в максимальной степени проявляют этот эффект, что сопровождается значитель-

ным улучшением кислородтранспортной функции крови, повышением ее текучести.

Установлено, что наибольшую биологическую активность проявил 3-(4-метилбензоил)-2-(2-оксо-4-фенил-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-ил)-бензофуран-5,6-дикарбонитрил, показавший в концентрации 0,1 цМ снижение агрегации эритроцитов на 55 %.

Таким образом, сочетание бензофуранового и пиримидинового фрагментов в одной молекуле открывает широкие возможности в области исследования реологии крови.

Библиографический список

1. Маймистова, А. А. Роль внутриклеточных эф-фекторных путей эритроцитов в изменении их микрореологических свойств в норме и на фоне атеросклероза [Текст] автореф. дисс...канд. биол. наук / А. А. Маймистова. - Ярославль, 2009. - 24 с.

2. Матюшичев, В. Б., Шамратова, В. Г. Зависимость электрофоретической подвижности эритроцитов от состояния кислотно-щелочного равновесия крови [Текст] / В. Б. Матюшевич, В. Г. Шамратова // Вестник Санкт-Петербургского университета, серия 3, биология. - 2005. - Вып.1. - С. 98-103.

3. Муравьев, А. В. Компьютерная регистрация агрегации эритроцитов при их инкубации с адреналином [Текст] / А. В. Муравьев // Мат. научно-практической конференции «Методы исследования регионарного кровообращения и микроциркуляции в клинике». - СПб, 2003. - С. 78-80.

4. Орлов, С. Н. Транспорт кальция в эритроцитах, нагруженных высокоселективным хелатором Са2+. Характеристики, связанные с первичной гипертензией [Текст] / С. Н. Орлов, Н. И. Покудин, Ю. В. Постнов // Кардиология. - 1986. - Т. 26, № 11. - С. 90-96.

5. Орлов, С. Н., Новиков, К. Н. Регуляция объема клеток: механизмы, сопряженные клеточные реакции и патофизиологическое значение [Текст] / С. Н. Орлов

// Росс. физиол. журнал им. И. М. Сеченова. - 1996. -Т. 82, № 8-9. - С. 1-15.

6. Орлов, С. Н., Шевченко, А. С. О возможном механизме действия мембраносвязанного кальция на активность аденозинтрифосфатазы и проницаемость эритроцитов для одновалентных катионов [Текст] / С. Н. Орлов, А. С. Шевченко // Биохимия. - 1978. - Т. 43. - № 2.- С. 208-215.

7. Тихомирова, И. А. Роль экстрацеллюлярных мембранных и внутриклеточных факторов в процессе агрегации эритроцитов [Текст] : автореф. дисс...док. биол. наук / И. А. Тихомирова. - Ярославль, 2005. -40 с.

8. Ткачук, В. А. Введение в молекулярную эндокринологию [Текст] / В. А. Ткачук. - М. : Изд-во МГУ, 1983. - 256 с.

9. Черницкий, Е. А., Воробей, А. В. Структура и функции эритроцитарных мембран [Текст] / Е. А. Черницкий, А. В. Воробей. - Минск : Наука и техника, 1981. - 214 с.

10. Bakunova S. M., Bakunov S. A., Wenzler T., et al // J. Med. Chem., 50, 23, 5807.

11. Bang-Le Zhang, Fang-Dao Wang, Jian-Min Yue // Synlett, 2006, 4, 567.

12. Boykin D. W., Kumar A., Xiao G., et al // J. Med. Chem., 1998, 41, 124, 9.

13. Davtian T. K., Giul'khandanian A. V., Gambarov S. S. et al. The effect of adriamycin and ethidium bromide on the Ca2+-dependent K channel of human erythrocytes // Tsitologiia. - 1996. - Vol. 38. - № 2. - P. 135-144.

14. Jauk B., Pernat T., Kappe C. O. // Molecules, 2000, 5, 227.

15. Kappe C. O. 100 Years of the Biginelli Dihydro-pyrimidine Synthesis. Tetrahedron 1993, 49, 6937-6963.

16. Miller C. An overview of the potassium channel family // Genome Biology. -2000. - Vol. 1. - № 4. - P. 41-45.

17. Ohemeng K.A., Appollina M.A., Nguyen V.N., et al // J. Med. Chem., 1994, 37, 3663.

18. Wiley J.S., McCulloch K.E. Calcium ions, drug action and the red cell membrane. Pharmacol. Ther. -1982. - Vol. 18. - № 2. - P. 271-292.