Метод ультрафильтрации в технологии получения тинростима

2006

Известия ТИНРО

Том 146

УДК 664.959

Г.А. Боровская, Е.В. Михеев, Л.М. Эпштейн, Н.Н. Ковалев, А.К. Гажа, Т.С. Запорожец

МЕТОД УЛЬТРАФИЛЬТРАЦИИ В ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ТИНРОСТИМА

Приведена технология получения фракций тинростима с помощью ступенчатой ультрафильтрации. Показано преимущество ультрафильтрации по сравнению с методом осаждения ацетоном, заключающееся в значительном уменьшении количества используемого в технологическом процессе ацетона. С помощью ультрафильтрации значительно повышается уровень безопасности производства, поскольку нет необходимости хранения на предприятии больших запасов ацетона. Приведены сравнительные данные фагоцитарной активности четырех фракций тинрости-ма, полученных методом ультрафильтрации, и тинростима, полученного методом осаждения ацетоном. Все фракции имеют высокую иммунологическую активность, сравнимую с цельным тинростимом.

Borovskaya G.A., Mikheev E.V., Epshtein L.M., Kovalev N.N., Gaja A.K., Zaporozhets T.S. Method of ultrafiltration in the Tinrostim technology // Izv. TIN-RO. — 2006. — Vol. 146. — P. 294-299.

Technology for extraction the fractions of the Tinrostim preparation by graduated ultrafiltration is investigated. Three fractions (in four) were received as dry powder. Their total output from raw material was 0.85 %. The fraction with molecular weight 1-10 kDa was 43.0 % of them, the fraction with weight 10-100 kDa — 25.6 %, and the fraction with weight > 100 kDa — 31.4 %. In compare with the method of precipitation by acetone, the method of ultrafiltration has higher technological safety, because the acetone storage is not necessary. Fagocytic activity of the Tinrostim fractions extracted by ultrafiltration is comparable with the activity of the fractions extracted by precipitation.

В процессе экстрагирования биологически активных веществ (БАВ) из различных объектов искомые вещества нередко выделяются в виде сильно разбавленных растворов, которые необходимо сконцентрировать. Среди наиболее известных методов концентрирования БАВ можно выделить высаливание, осаждение органическими растворителями, диализ, упаривание и ультрафильтрацию. Последний метод является наиболее оптимальным, поскольку позволяет проводить концентрирование БАВ при очень мягких условиях: низкой температуре, широких значениях рН, любой ионной силе раствора. Существенно, что увеличение концентрации БАВ происходит без концентрирования растворителя и, следовательно, денатурирующие воздействия самой процедуры сведены к минимуму (Современные методы ..., 1977).

Метод ультрафильтрации основан на разности давления (рабочего и атмосферного) на мембрану. Обычно ультрафильтрацию проводят при сравнительно невысоких давлениях 0,3-1,0 МПа (3-10 кгс/см2). С помощью ультрафильтрации можно проводить отделение как макро-, так и микрочастиц (размером 10 А);

размеры отделяемых веществ могут варьировать от размеров неповрежденных клеток до буферных солей (Брок, 1987).

В настоящее время ультрафильтрация (мембранная фильтрация) применяется практически во всех отраслях производства (Дытнерский, 1975): пищевой, нефтеперерабатывающей промышленности, в медицине и др.

Фирма "Миллипор" является ведущим разработчиком и производителем мембран и установок на их основе ("Пелликон"). Мембраны производятся в нескольких форматах: плоские пластины (кассеты); спиральные навивки; полые волокна. Фирма "Миллипор" производит мембраны для ультрафильтрации из различных материалов, в зависимости от встречающихся характеристик производства и химической совместимости материалов и сред. Каждый из материалов мембран представлен широким рядом предела номинальной молекулярной массы (ПНММ). Двумя наиболее часто используемыми материалами для изготовления ультрафильтрационных мембран являются регенерированная целлюлоза и поли-эфирсульфон. Миллипоровская мембрана "Ультрасел" произведена из регенерированной целлюлозы и имеет широкий диапазон мембран по ПНММ (Ультрасел PL — от 1 до 300 кДа, Ультрасел PLC — от 5 до 1000 кДа).

Характерной особенностью системы "Пелликон" является то, что процесс фильтрации проходит в тангенциальном потоке. Выделяют два режима фильтрации: фильтрация в нормальном потоке и фильтрация в тангенциальном потоке. Различие между этими режимами заключается в токе жидкости.

При фильтрации в нормальном потоке жидкость конвектирует напрямую через мембрану под действием давления. Вещества крупнее пор мембраны накапливаются на ее поверхности, вызывая снижение скорости процесса фильтрации, забивание мембраны, что ведет к снижению селективности и уменьшению срока служения мембраны.

При фильтрации в тангенциальном потоке жидкость прокачивается тангенциально вдоль поверхности мембраны, т.е. по касательной. При фильтрации в нормальном потоке вещества крупнее пор мембраны задерживаются на ее поверхности, а в тангенциальном не оседают на поверхности, а сметаются тангенциальным потоком и не засоряют мембрану. Эта особенность фильтрации в тангенциальном потоке делает ее идеальным процессом для утонченного разделения, основанного на различии размеров веществ.

Диафильтрация в тангенциальном потоке применяется в целях увеличения степени извлечения продукта и увеличения его чистоты. Для диафильтрации в рециркулирующую емкость вводится буфер до тех пор, пока фильтрат не удаляется из процесса.

Целью настоящей работы являлась разработка технологии безопасного получения тинростима, используемого в качестве основы для производства БАД, а также для изучения возможности последующего его применения в качестве лекарственного инъекционного средства в медицине и ветеринарии.

Сырьем для изготовления тинростима служили мороженые ганглии кальмаров, хранившиеся при температуре минус 18 0С в течение 10 мес.

Экстракцию пептидов проводили методом кислотного гидролиза при температуре 17 ± 2 0С в течение 36-48 ч.

Ультрафильтрацию экстракта проводили на установке "Пелликон" фирмы "Миллипор" на плоских кассетных мембранах, изготовленных из материала "Ультрасел". Процесс ультрафильтрации проводили в несколько этапов, с последовательной сменой кассет с мембранами пор ПНММ 100, 10 и 1 кДа.

Иммунологическую активность фракций тинростима определяли по восстановлению фагоцитарной активности нейтрофилов крови человека in vitro. Имму-нодефицитное состояние нейтрофилов индуцировали путем инкубации клеток с циклофосфаном (20 мг/см3) в течение 60 мин при 37 0С, затем вносили исследуемые образцы тинростима в дозах 0,05, 0,005 и 0,0005 мкг/ см3 и взвесь мик-

295

роорганизмов — S. aureus — в количестве 109 клеток/см3. Инкубацию проводили в течение 30 мин при 37 0С. Клеточную взвесь центрифугировали при 1000 об/мин, из осадка готовили мазки, которые фиксировали метанолом, окрашивали азур-п-эозином. Фагоцитарную активность нейтрофилов (ФП — фагоцитарный показатель — процент фагоцитирующих клеток и ФЧ — фагоцитарное число — среднее количество микробов, поглощенных одним нейтрофилом) определяли, подсчитывая клетки под микроскопом.

Контролем служили нейтрофилы, инкубированные с микроорганизмами без тинростима.

Для статистической обработки результатов использовали t-критерий Стьюдента.

Используемая в настоящее время технология получения тинростима включает стадию осаждения ацетоном. Для получения 100 г вещества расход ацетона составляет 250 л. Это обстоятельство приводит к необходимости хранения на производстве больших запасов этого растворителя, что делает производство токсичным, взрыво- и огнеопасным.

В течение нескольких лет в экспериментальном цехе ФГУП "ТИНРО-центр" получают биологически активную субстанцию "тинростим", служащую основой для получения биологически активных добавок к пище — тинростим СТ+, тинро-стим-С. Кроме того, тинростим используют для получения продуктов лечебно-профилактического назначения. Препарат представляет собой пептидно-белковый комплекс, обладающий высокой иммуномодулирующей активностью (Боровская и др., 1996; Эпштейн и др., 1997). За весьма короткое время эта уникальная БАД завоевала заслуженное внимание со стороны как пищевой промышленности (Беседнова и др., 1997), так и ветеринарии (Беседнова и др., 1995) и медицины (Беседнова и др., 1991; Боровская, Эпштейн, 1999).

Ранее проведенное разделение тинростима методом ионообменной хроматографии на колонке с сульфокатионом с помощью анализатора "Biotvomk-2000" позволило обнаружить 45 пептидных фракций (А.с. 1259185).

При получении субстанции "тинростим" были проведены следующие операции, применяемые и при получении препарата методом осаждения ацетоном: размораживание сырья, измельчение, мягкий гидролиз и экстрагирование 3 %-ным раствором уксусной кислоты, центрифугирование. Для получения отдельных фракций тинростима с точно заданной молекулярной массой (м.м.) центри-фугат подвергали ступенчатой ультрафильтрации. Первое разделение проводили на мембране с ПНММ 100 кДа. При этом вещества с м.м. от 100 кДа и выше не проходили через поры мембраны и концентрировались в емкости (концентрат). Вещества с м.м. менее 100 кДа проходили через поры мембраны и накапливались в другой емкости (фильтрат). Для более полного перехода из концентрата веществ с м.м. менее 100 кДа проводили диафильтрацию. Для этого концентрат разбавляли в 3 раза водой и повторно пропускали через эту же кассету. Фильтрат (раствор с веществами менее 100 кДа) подавали на кассету с ПНММ 10 кДа. Таким же образом, как и на первой ступени, происходило отделение веществ с м.м. более 10 кДа (концентрат — раствор с веществами от 10 до 100 кДа) от раствора с веществами менее 10 кДа (фильтрат). Фильтрат, полученный на второй ступени, подавали на кассету с ПНММ 1 кДа для отделения веществ с м.м. от 1 до 10 кДа от фильтрата — раствора с веществами м.м. менее 1 кДа, — и концентрирования. Для более полной очистки этой фракции (1-10 кДа) проводили диафильтрацию. По окончании процесса ультрафильтрации концентрированные растворы с фракциями тинростима м.м. 1-10 и 10-100 кДа, а также фильтрат (раствор с м.м. менее 1 кДа) сублимировали при конечной температуре высушивания 30 ± 3 0С.

Концентрат — раствор фракции тинростима с веществами м.м. более 100 кДа, содержащий большое количество примесей, — концентрировали с по-

296

мощью ацетона. Ацетон декантировали, осадок в ацетоне фильтровали, промывали чистым ацетоном, сушили на воздухе, измельчали, растворяли в воде, центрифугировали (удаление водонерастворимого балласта), супернатант сублимировали при тех же условиях, что и остальные фракции.

51,5 дм3 центрифугата, полученного после экстрагирования 10 кг сырья в уксуснокислом растворе, удалось сконцентрировать до 2,75 дм3 с помощью ультрафильтрации через мембрану с ПНММ 100 кДа. К полученному концентрату (м.м. более 100 кДа) добавляли ацетон в соотношении 1 : 5. Таким образом, вместо 272,5 дм3 ацетона, необходимого для получения тинростима методом осаждения, было израсходовано 13,75 дм3 этого растворителя. Расход ацетона уменьшается в 20 раз, вследствие чего отпадает необходимость хранения больших запасов этого растворителя, что повышает безопасность производства.

В процессе выделения получено четыре фракции тинростима с различной м.м.: 1-я — более 100 кДа; 2-я — от 10 до 100; 3-я — от 1 до 10; 4-я — менее 1 кДа (табл. 1). Три первые фракции после сублимирования представляли собой аморфный порошок от белого до светло-желтого цвета. Четвертая фракция, являющаяся фильтратом с веществами низкой м.м., при сублимировании не высыхала, оставаясь в виде густой, вязкой полужидкой фазы. При добавлении ацетона эта фракция не осаждалась, образовывая в растворе белесую взвесь.

Таблица 1

Выход фракций тинростима из 10 кг сырья при ультрафильтрации

Table 1

Output of tinrostim fractions by ultrafiltration Образец, № фракции Объем, дм3 Молекулярная масса, кДа Выход фракций, г Центрифугат 51,5 ± 1,0 - -

Концентрат, 1 2,75 ± 0,3 Более 100 26,6 ± 0,2

Концентрат, 2 1,70 ± 0,1 10-100 21,8 ± 0,1

Концентрат, 3 3,5 ± 0,1 1-10 36,6 ± 0,2

Фильтрат, 4 52,0 ± 0,1 Менее 1 -

Тинростим, полученный

стандартным методом 50,0 ± 1,0 Менее 1 и более 100 85,0 ± 0,5

Примечание. Объемы образцов приведены с учетом диафильтрации.

Суммарный выход трех фракций тинростима составляет 0,85 % от количества сырья, что соответствует выходу препарата, полученного стандартным методом. Наиболее высокий выход оказался у 3-й фракции (м.м. от 1 до 10 кДа), которая составила около половины всего тинростима (43 %).

Таким образом, новая принципиальная схема (см. рисунок) получения тин-ростима с помощью ультрафильтрации обеспечивает применение минимального количества ацетона.

Сравнительное изучение биологической активности тинростима, полученного стандартным методом осаждения, и фракций препарата, полученных с помощью ступенчатой ультрафильтрации, проводили на модели определения фагоцитарной активности нейтрофилов человека (табл. 2).

Из данных табл. 2 следует, что инкубирование клеток с циклофосфаном значительно подавляет фагоцитарную активность нейтрофилов, сопровождаясь снижением как фагоцитарного показателя (более чем в 2 раза), так и фагоцитарного числа (более чем в 3 раза) по сравнению с контролем. Внесение в среду инкубирования растворов тинростима и его фракций в дозах, указанных в табл. 2, восстанавливает активность нейтрофилов и возвращает фагоцитарные показатели к контрольным значениям. Все фракции тинростима оказывают выраженное влияние на фагоцитарную активность нейтрофилов крови человека и незначительно отличаются друг от друга и от цельного тинростима по этим показателям. Наибольшее влияние на нейтрофилы оказывает фракция 4 при минимальной дозе.

Не выявлено значимых различий при использовании различных доз исследуемых образцов, за исключением фракций 1 и 4, где максимальный эффект восстановления фагоцитарной активности нейтрофилов наблюдался при использовании дозы 0,005 мкг/см3.

Таким образом:

— применение ультрафильтрации позволяет в 20 раз сократить количество ацетона, используемого для получения тинростима, и таким образом обеспечить безопасность производства;

— все полученные фракции тинростима имеют высокую иммунологическую активность, сравнимую с активностью препарата, полученного методом осаждения;

— с помощью ультрафильтрации возможно получение препаратов со строго ограниченной заданной молекулярной массой, что особенно важно при получении инъекционных лекарственных форм препаратов, поскольку известно, что для инъекций, во избежание побочных эффектов, применяют только низкомолекулярные белковые вещества (верхняя граница м.м. 10-15 кДа);

Таблица 2

Влияние тинростима и его фракций на фагоцитарную активность нейтрофилов человека

Table 2

Influence tinrostim, and its fractions on fagocytic activity of man neutrophiles

Образец Доза, мкг/см3 Фагоцитарный показатель, % Фагоцитарное число

Контроль - 75 ± 6,3 2,8 ± 0,3

Циклофосфан 20 мг/см3 32 ± 2,1* 0,8 ± 0,1*

Тинростим 0,05 58 ± 3,5* 1,6 ± 0,2**

" 0,005 66 ± 5,1* 1,3 ± 0,2**

0,0005 60 ± 4,8* 1,9 ± 0,3**

Фракция 1 (более 100 кДа) 0,05 50 ± 4,1** 1,2 ± 0,1**

" 0,005 48 ± 4,4** 1,0 ± 0,1**

0,0005 70 ± 3,7* 1,8 ± 0,3**

Фракция 2 (10-100 кДа) 0,05 50 ± 1,8* 1,2 ± 0,2**

" 0,005 54 ± 2,0* 1,3 ± 0,1**

" 0,0005 48 ± 3,3** 1,1 ± 0,2**

Фракция 3 (1-10 кДа) 0,05 58 ± 4,0* 1,3 ± 0,1**

" 0,005 56 ± 2,8* 1,5 ± 0,2**

" 0,0005 55 ± 4,2* 1,7 ± 0,2**

Фракция 4 (менее 1 кДа) 0,05 52 ± 1,9* 1,2 ± 0,1**

" 0,005 65 ± 2,1* 2,1 ± 0,3**

" 0,0005 70 ± 5,6* 2,0 ± 0,2*

* P < 0,01. ** P < 0,05.

— тинростим, полученный с помощью ультрафильтрации, может применяться в качестве биологически активного сырья для получения БАД, а также лечебно-профилактических продуктов с иммуномодулирующими свойствами. Фракция тинростима с м.м. от 1 до 10 кДа может быть рекомендована для изготовления инъекционной формы иммуномодулятора.

Литература

A.c. 1259185 SU. Способ хроматографического разделения пептидов / Демушкин В.П., Малыгина Т.А., Зотов В.М. и др. — Опубл. 23.09.86, Бюл. № 35.

Беседнова H.H., Запорожец Т.С., Сергиенко A.K. и др. Иммуноактивный пептид, полученный из оптических ганглиев кальмара // Антибиотики и химиотерапия. — 1991. — Т. 36, № 7. — С. 35-37.

Беседнова H.H., Эпштейн Л.М., Гажа A.K. Лечебно-профилактические молочные продукты с новым иммунокорректором природного происхождения // Вопр. питания. — 1997. — № 3. — С. 31-34.

Беседнова H.H., Эпштейн Л.М., Гусева Н.И. и др. Использование ганглиина в пушном звероводстве // Ветеринария. — 1995. — № 8. — С. 43-46.

Боровская Г.А., Бояркина Л.Г., Эпштейн Л.М. и др. Новый лечебно-профилактический продукт с иммуномодулирующей добавкой // Вопр. питания. — 1996. — № 4. — С. 28-30.

Боровская Г.А., Эпштейн Л.М. Физико-химические свойства тинростима и его применение в медицине // Изв. ТИНРО. — 1999. — Т. 125. — С. 176-184.

Брок Т. Мембранная фильтрация. — М.: Мир, 1987. — 361 с.

Дытнерский Ю.И. Мембранные процессы разделения жидких смесей. — М.: Химия, 1975. — 328 с.

Современные методы в биохимии. — М.: Медицина, 1977. — 390 с.

Эпштейн Л.М., Боровская Г.А., Левачев М.М. и др. Эффективность перораль-ного применения нового иммунокорректора природного происхождения // Вопр. питания. — 1997. — № 1. — С. 10-13.