Влияние внутрисуставной озонотерапии в коррекции цитокинового дисбаланса при экспериментальном посттравматическом артрите

А.Н. Захватов, А.Н. Беляев, Н.А. Аткина

ВЛИЯНИЕ ВНУТРИСУСТАВНОЙ ОЗОНОТЕРАПИИ В КОРРЕКЦИИ ЦИТОКИНОВОГО ДИСБАЛАНСА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ПОСТТРАВМАТИЧЕСКОМ АРТРИТЕ

ФГБОУ ВПО «Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарёва», Саранск, Россия

Целью данного исследования явилось изучение влияния внутрисуставной озонотерапии на некоторые показатели цитокинового профиля при экспериментальном посттравматическом артрите. Эксперименты проведены на 132 белых нелинейных крысах обоего пола массой 180200 г. Установлено, что пероральное зондовое введение нимесулида в комбинации с внутрисуставным введением озона оказывает значительное влияние на показатели цитокинового профиля, способствуя снижению активности воспалительной реакции, определяемое по уменьшению провоспалительных и противовоспалительных пулов цитокинов, приближая их к данным интактных животных.

Ключевые слова: посттравматический артрит, цитокины, нимесулид, внутрисуставная озонотерапия

The aim of this study was to evaluate the effect of intra-articular ozone therapy on some parameters of the cytokin profile and changes the cellular composition of the synovial fluid in the experimental post-traumatic arthritis. Experiments were carried out on 132 white non-linear rats of both sexes weighing 180-200 g. It was found that oral enteral administration of nimesulid in combination with intra-articular injection of ozone had a significant effect on the cytokin profile, helping to reduce the activity of the inflammatory response, defined by a decrease in proinflammatory and anti-pools of cytokines, bringing their data intact animals.

Key words: post-traumatic arthritis, cytokines, nimesulid, intraarticular ozone therapy

Повреждение суставного хряща является пусковым фактором, активирующим цепь последовательных воспалительных изменений в травмированном суставе [7]. Формирование хронического воспалительного процесса в суставе способствует вторичной альтерации гиалинового хряща, с распадом которого фрагменты коллагена и протеогликанов усиливают катаболические процессы и приводят к развитию посттравматического артроза [4]. В настоящее время доказана важная роль цитокинов в деструкции суставных тканей при посттравматическом артрите [5]. Антигенная стимуляция приводит к секреции цитокинов, в действиях которых наблюдается синергизм, индуцирующий биосинтез медиаторов, вовлекая в иммунологическую реакцию все возрастающее число клеток. Значительная роль при этом отводится нарушению физиологического равновесия между провоспалительными (IL-1, TNF-а, IL-6) и противовоспалительными (IL-4, IL-10, INF-y, лактоферрин) цитокинами [2]. Преобладание провоспалительных цитокинов стимулирует синтез хондроцитами протеолитических ферментов (матриксные протеиназы), вызывающих деградацию коллагена и протеогликана хряща [6]. В настоящее время в дополнение к ранее изученным иммунным механизмам повреждения хряща и роли цитокинов важное место в патогенезе посттравматического остеоартроза отводится активации процессов перекисного окисления липидов, продукты которого участвуют в формировании дегенеративно-дистрофических изменений всех компонентов сустава [8]. Результатом таких макромолекулярных изменений в суставе при травме в условиях развивающегося вторичного воспаления является неэффективность репаративных процессов поврежденных тканей, приводящее как следствие к дальнейшей деградации хряща [1].

Учитывая патогенетические механизмы развития острого асептического посттравматического артрита, наиболее целесообразным в комплексном лечении данной патологии, с нашей точки зрения, является применение локальной внутрисуставной озонотерапии, так как озон обладает широким спектром воздействия, оказывая выраженное анальгетическое, противовоспалительное, иммуномодулирующее действие, улучшает микроциркуляцию, оптимизирует про - и антиоксидантные системы, потенцируя действие других лекарственных препаратов, в комбинации с нимесулидом, оказывающим противовоспалительный эффект. Более того, в доступной литературе недостаточно исследований о применении озонотерапии при посттравматических артрозо-артритах.

Цель исследования: изучение влияния внутрисуставной озонотерапии на некоторые показатели цитокинового профиля при экспериментальном посттравматическом артрите.

Материалы и методы. Эксперименты проведены на 132 белых нелинейных крысах обоего пола массой 180-200 г., содержавшихся в стандартных условиях вивария ФГБОУ ВПО «МГУ им. Н.П. Огарева». Исследования одобрены локальным этическим комитетом медицинского института ФГБОУ ВПО «МГУ им. Н.П. Огарева» и осуществлялись в соответствии с «Правилами гуманного обращения с животными» и методическими указаниями МЗ РФ «Деонтология медико-биологического эксперимента». Животные были разделены на 5 серий. Первую серию составили интактные животные в количестве 12 крыс. В контрольной (30 животных) и опытных сериях под ингаляционным наркозом моделировали повреждение коленного сустава механическим путём в модификации Г. М. Дубровина [2]. Во II контрольной серии лечение не проводилось. Животным III серии (30 крыс), начиная со дня моделирования травмы, проводился курс лечения нимесулидом через зонд в среднетерапевтической дозе 2 мг/кг ежедневно в течение 10 дней. В IV серии (30 животных) проводилось внутрисуставное введение озоно-кислородной смеси в концентрации озона на выходе из аппарата 15 мг/л через день в количестве 5 сеансов. На животных V серии (30 крыс) изучалось комбинированное влияние нимулида в дозе 2 мг/кг и внутрисуставного введения озоно-кислородной смеси в концентрации 15 мг/л. Для исследования от животных получали периферическую кровь.

Цитокиновый профиль исследовали по уровню провоспалительных (IL-1ß, TNF-a, IL-6, IL-17) и противовоспалительных (IL-4, IL-2, IL-10) цитокинов в сыворотке крови методом твердофазного иммуноферментного анализа в «sandwich» варианте с применением пероксидазы в качестве индикаторного фермента. Для регистрации результатов использовали иммуноферментный анализатор «Multiscan». Для обнаружения цитокинов использовали набор реагентов Bender Medsystems (Австрия). Количество цитокинов выражали в пикограммах на мл (пг/мл).

Исследования проводили на 28 сутки наблюдения. Животных выводили из эксперимента в соответствии с Конвенцией по защите животных, принятой Советом Европы в 1986 г., путем декапитации после предварительного внутрибрюшинного введения раствора тиопентала натрия в дозе 100 мг/кг. Статистическая обработка результатов исследований проведена с помощью t-критерия Стьюдента. Изменения считали достоверными при р<0,05 (0,01; 0,001).

Результаты и обсуждение. Моделирование травматического повреждения коленного сустава в эксперименте приводило к нарушению динамического равновесия про- и противовоспалительных цитокинов.

Отмечалось значительное повышение уровня провоспалительных цитокинов в плазме лабораторных животных: IL-1ß, TNF-a, IL-17 и IL-6 относительно значений интактной серии были повышенными в 2,46 (р<0,001), 3,05 (р<0,001), 2,26 (р<0,001) и 2,75 раза (р<0,001) соответственно. На этом фоне наблюдался также резкий рост регуляторного и противовоспалительных цитокинов в плазме лабораторных животных. Так, IL-2 увеличился в 3,56 раз (р<0,001), IL-4 в 2,92 раза (р<0,001), IL-10 в 3,43 раза (р<0,001) соответственно относительно показателей интактных животных. Данный факт указывает на необходимость медикаментозной коррекции цитокинового дисбаланса, приводящего к хронизации процесса и

дальнейшей деструкции хряща.При пероральном зондовом введении нестероидного противовоспалительного средства нимесулида отмечалось снижение содержания оцениваемых показателей цитокинового профиля по сравнению с данными контрольной серии. Так, отмечалось уменьшение провоспалительных цитокинов Т№-а, ГЬ-1р, ГЬ-17 и ГЬ-6 на 19,08 % (р1<0,001), 13,04 % (р1<0,001), 18,47 % (р1<0,001) и 21,65 % (р1<0,001) соответственно.

Таблица 1. Динамика некоторых показателей цитокинового профиля при посттравматическом _артрите на 28 сутки эксперимента (М±т)_

Показатель, пг/мл Интактные животные

48,69±0,72 148,49±2,01 120,15±1,96 115,32±1,67 93,46±1,78

ЮТ-а, пг/мл р<0,001 р<0,001 Р1<0,001 р<0,001 р1<0,001 р2>0,05 р<0,001 р1<0,001 р2<0,001 р3<0,001

35,61±0,41 87,76±2,13 76,32±1,82 72,14±1,61 65,54±1,75

ГЬ - 1Р, пг/мл р<0,001 р<0,001 р1<0,001 р<0,001 р1<0,001 р2>0,05 р<0,001 р1<0,001 р2<0,001 р3<0,05

57,43±0,70 127,94±2,35 100,24±2,21 96,54±2,26 90,74±1,98

IL -6, пг/мл р<0,001 р<0,001 р1<0,001 р<0,001 р1<0,001 р2>0,05 р<0,001 р1<0,001 р2<0,01 р3>0,05

21,43±0,72 48,52±1,57 39,56±1,43 35,41±1,28 31,38±0,97

IL -17, пг/мл р<0,001 р<0,001 р1<0,001 р<0,001 р1<0,001 р2>0,05 р<0,001 р1<0,001 р2<0,01 р3<0,05

62,72±1,22 223,46±4,03 135,87±3,10 120,48±2,48 93,57±2,16

ГЬ -2, пг/мл р<0,001 р<0,001 р1<0,001 р<0,001 р1<0,001 р2<0,01 р<0,001 р1<0,001 р2<0,001 р3<0,001

6,59±0,34 19,25±0,64 9,84±0,45 9,41±0,49 8,14±0,32

ГЬ -4, пг/мл р<0,001 р<0,001 р1<0,001 р<0,001 р1<0,001 р2>0,05 р<0,01 р1<0,001 р2<0,01 р3<0,05

17,04±0,88 58,39±1,06 32,02±0,83 31,15±0,79 27,78±0,94

ГЬ -10, пг/мл р<0,001 р<0,001 р1<0,001 р<0,001 р1<0,001 р2>0,05 р<0,001 р1<0,001 р2<0,01 р3<0,05

Примечание. р - достоверность отличий к данным интактных животных; р1- к данным контрольной серии; р2 - к данным при введении нимесулида; р3 -к данным при в/с введении озона

Аналогичные положительные изменения зафиксированы в отношении регуляторного цитокина ГЬ-2, концентрация которого уменьшалась на 39,19 % (р1<0,001) по сравнению с

данными контрольной серии. На фоне применения нимесулида содержание противовоспалительных цитокинов IL-4 и IL-10 синхронно снижалось одновременно с регуляторным и деструктивными маркерами воспалительного процесса. Отмечались статистически значимые изменения сравнительно с данными контрольной серии: IL-4 и IL-10 снижались на 48, 88 % (р1<0,001) и 45,16 % (р1<0,001). Несмотря на данную положительную динамику, уровни маркеров воспаления значительно превышали значения животных интактной серии, что говорит о недостаточной эффективности нимесулида в виде монотерапии посттравматических артритов.

На фоне внутрисуставного введения озона вследствие активирующего действия препарата на клетки иммунной системы продолжилась дальнейшая регрессивная динамика купирования активности маркеров воспаления. Выявлено достоверное уменьшение уровней провоспалительных цитокинов: TNF-a, IL-1P, IL-17 и IL-6 на 22,34 % (p1<0,001), 17,80 % (p1<0,001), 27,02 % (p1<0,001) и 24,53 % (p1<0,001) соответственно. Так же происходило значительное снижение концентрации IL-2 на 46,08 % (p1<0,001) в сравнении с контрольной серией. Противовоспалительные цитокины IL-4 и IL-10 относительно серии контроля были ниже на 51,11 % (р1<0,001) и 46,65 % (р1<0,001). При сравнительном анализе показателей цитокинового профиля, полученных при внутрисуставной озонотерапии и применении нимесулида, значимых достоверных различий выявлено не было (р2>0,05). Несмотря на позитивную динамику, к концу эксперимента исследуемые маркеры воспаления значительно превышали должные величины, сопоставимо с пероральным зондовым введением нимесулида. Учитывая различные механизмы действия оцениваемых препаратов, рационально изучение влияния их комбинированного применения на показатели цитокинового профиля.

На фоне комбинации зондового перорального введения нимесулида и внутрисуставной озонотерапии наблюдалось снижение показателей цитокинового профиля, но, несмотря на это, значения исследуемых цитокинов сохранялись повышенными по отношению с интактными животными в среднем на 50-70 % (р<0,001). Провоспалительные цитокины TNF-a, IL-1P уменьшились на 37,06 % (р1<0,001) и 25,32 % (р1<0,001) соответственно относительно величин контрольной серии, IL-17 на 35,33 % (р1<0,001), IL-6 на 29,19 % (р1<0,001). Противовоспалительные цитокины IL-4 и IL-10 снижались на 57,74 % (р1<0,001) и 52,42 % (р1<0,001) соответственно. Уровень регуляторного цитокина IL-2 понизился на 58,12 % (р1<0,001). По отношению к серии с применением нимесулида отмечалось достоверное снижение изучаемых медиаторов воспаления. Так, провоспалительные цитокины TNF-a, IL-1P, IL-17 и IL-6 были ниже на 22,21 % (p2<0,001), 14,12 % (p2<0,001), 20,68 % (p2<0,01) и 9,51 % (p2<0,01) соответственно. Противовоспалительные цитокины IL-4 и IL-10 уменьшились на 17,28 % (p2<0,01) и 13,24 % (p2<0,01). Регуляторный цитокин IL-2 понизился на 31,13 % (p2<0,001). При оценке влияния комбинированного применения нимесулида и озона в сравнении с изолированным внутрисуставным введением озона наблюдалось снижение провоспалительных цитокинов TNF-a на 18,96 % (рэ<0,001), IL-1P на 9,15 % (рэ<0,05), IL-17 на 11,38 % (рэ<0,05) соответственно. Противовоспалительные цитокины IL-4 и IL-10 были ниже на 13,49 % (р3<0,05) и 10,82 % (р3<0,05). Величина регуляторного цитокина IL-2 уменьшалась на 22,34 % (р3<0,001) (табл. 1).

Заключение. Таким образом, в ходе исследования установлено, что дисбаланс в цитокиновом профиле играет важную роль в патогенезе посттравматического артрита, способствуя усилению процессов деструкции и снижению репаративных возможностей хрящевой ткани и синовиальной оболочки. Полученные результаты доказывают обоснованность комбинированного применения нестероидной противовоспалительной и внутрисуставной озонотерапии, позволяющей в ранние сроки купировать воспалительный процесс в пораженном суставе, стимулировать заживление травматического дефекта, уменьшая развитие дегенеративно-дистрофических процессов в тканях сустава. Данный эффект, по-видимому, обусловлен потенцированием лечебного действия препаратов за счет воздействия на различные звенья патогенеза посттравматического артрита. Так, противовоспалительное действие нимесулида, приводящее к ингибированию ЦОГ,

обусловливает подавление синтеза простеноидов в очаге воспаления, активирует выработку противовоспалительных цитокинов. Внутрисуставное введение озона способствует улучшению микроциркуля-ции и уменьшению гипоксии в поврежденных тканях, которая является предраспо-лагающим фактором для активации процессов перекисного окисления липидов.

Список литературы:

1. Балабанова Р.М. Роль иммунного воспаления в патогенезе остеоартроза, возможности коррекции иммунных нарушений // Современная ревматология. - 2011. - №4. - С. 74-78.

2. Дубровин Г.М., Блинков Ю.А., Нетяга С.В., Нетяга А.А. Обоснование применения миелопида для профилактики посттравматического остеоартроза (экспериментальное исследование) // Вестник травматологии и ортопедии им. Н. Н. Приорова. - 2005. - № 2. - С. 60-62.

3. Момбеков А.О. с соавт. Роль интерлейкина-1Р и интерлейкина-4р в патогенезе деформирующего артроза голеностопного сустава в разные сроки катамнестического периода наблюдения // Фундаментальные исследования. - 2013. - №9. - С. 1073-1076.

4. Самойлов В.В., Мироманов А.М., Самойлова С.И. Значение цитокинов в патогенезе остеоартроза // Забайкальский медицинский вестник. - 2014. - №2. - С. 119-125.

5. Ударцев Е.Ю. Иммуноцитологические механизмы посттравматического синовиального воспаления и обоснование возможности использования радонотерапии для профилактики остеоартроза // Фундаментальные исследования. - 2011. - №7. - С. 147-151.

6. Elvis A.M., Ekta J.S. Ozone therapy: A clinical review // Journal of Natural Science, Biology and Medicine. - 2011. - Vol. 2. - N 1. - P. 66-70.

7. Vangsness C.T. et al. Human knee synovial fluid cytokines correlated with grade of knee osteoarthritis - a pilot study // Bulletin of the NYU Hospital for Joint Diseases. - 2011. - Vol. 69. - N 2. - P. 122-127.

8. Ziskoven C. et al. Oxidative stress in secondary osteoarthritis: from cartilage destruction to clinical presentation // Orthopedic Reviews. - 2010. - Vol. 2. - N 2. - P. 95-101.