Биокатализаторы и молекулярная диагностика

< "nT

Биокатализаторы и молекулярная диагностика

Резюме. Представлен обзор исследований в области использования в диагностике и терапии ферментов, в частности фосфолипазы А2, для выявления острого панкреатита и как индикатора с целью обнаружения потенциальных антигемолитических и антипанкреатитных средств, а также оценки антиоксидантного потенциала организма и безопасности антибиотиков. Разработано новое направление в энзимодиагностике и энзимотерапии: создание и применение инновационных нанореакторов - одно- и двухкомпонентных по белку на основелиполитических ферментов «фосфолипаза А2 -лиганд», «фосфолипаза А2 - гемоглобин» и «фосфолипаза А2 - цитохром Р450».

Ключевые слова: фосфолипаза А2, энзимодиагностика, острый панкреатит, энзимотерапия, антигемолитические и антипанкреатитные средства.

Задачу решает

не тот, кто наслаждается частичным успехом, а исследователь, добивающийся полноценного результата.

Абрам Иоффе

Наталья Литвинко,

заместитель главного ученого секретаря НАН Беларуси, завлабораторией Института биоорганической химии НАН Беларуси, доктор химических наук, доцент

Химические реакции в живых организмах протекают с высокой скоростью благодаря биокатализаторам (ферментам, или энзимам) - наноструктурам белковой природы. Более четкая картина о функционировании этих представителей нано-мира сформировалась с развитием теории химического катализа, выдвинутой шведским химиком Й.Я. Берцелиусом, который первым отметил высокую производительность биологических катализаторов на примере диастазы (альфа-амилазы) - фермента, вырабатываемого в поджелудочной железе и слюнных железах и помогающего переваривать поступающие с пищей углеводы. Однако целенаправленное изучение энзимов началось только в 1920-1930-х гг.

Если множество химических реакций, протекающих с участием ферментов внутри клеток и во внеклеточной среде, идет в таких условиях и с такой скоростью, что обеспечивается максимальная жизнеспособность и поддерживается

физиологически нормальное состояние, с биохимической точки зрения организм можно считать здоровым. Любое нарушение этого «статус-кво» приводит к недугу. Следовательно, методы ранней диагностики, в том числе с применением энзимов, играют определяющую роль в профилактике и лечении болезней человека.

В клиническую практику прочно вошел ряд энзимных препаратов животного происхождения (трипсин, химотрипсин, липаза, амилаза, пепсин, лидаза и др.), а также получаемых из растений (папаин, бромелаин и др.). Отмечено, что при комбинации ферментов растительной и животной природы, имеющих различную субстратную специфичность, значительно усиливается суммарная активность смесей. Официнальные средства, содержащие подобные смеси, известны как препараты системной энзи-мотерапии. Например, «Вобэнзим» выпускается в Германии с 1959 г., его успех привел к созданию серии подобных энзимных композитов.

В нашей стране интенсивное развитие функциональной биохимии началось с 50-х гг. XX в. Наибольший вклад белорусские ученые внесли в функциональную биохимию центральной нервной системы (ЦНС) и синапсов, в том числе нейромедиаторов и мембран; в разработку нейрохимических основ поведения, в совершенствование патологической химии ЦНС, гистохимии, витаминологии, радиационной и клинической биохимии, лабораторной медицины; в изучение

влияния фармакологических средств и экстремальных факторов на нервную систему [1].

Новые молекулярно-биохимические технологии лабораторного исследования, созданные в Республике Беларусь в ходе выполнения финансируемых целевым назначением тем НИР, все шире внедряются в деятельность клинико-диагностических подразделений лечебно-профилактических организаций. В целом в отечественных медучреждениях осуществляется 170-200 млн исследований в год, в том числе общеклинических - около 80-90 млн, гематологических - 70-80 млн, биохимических -35-40 млн, иммунологических - 11-14 млн, цитологических и бактериологических -по 5-6 млн [2].

В медицине энзимы находят применение по нескольким направлениям: энзимодиагно-стика, медицинские технологии и промышленность, энзимотерапия, применение ингибиторов ферментов.

Энзимодиагностика заключается в постановке диагноза на основе определения активности ферментов в биологических жидкостях человека. Она развивается по двум путям:

использование ферментов в качестве избирательных реагентов для открытия и количественного определения нормальных или аномальных химических веществ

в сыворотке крови, моче, желудочном соке и др. (например, выявление глюкозы, белка или других компонентов в моче, в норме не обнаруживаемых). Так, установление активности лактатдегидрогеназы в плазме крови необходимо при заболеваниях сердца, печени, скелетной мускулатуры. Увеличение активности альфа-амилазы (диастазы) в плазме крови и моче наблюдается при воспалительных процессах в поджелудочной и слюнных железах. В последнее время стали применять ферменты рестрикции - специфические эндонуклеазы, катализирующие разрывы межнуклеотидных связей ДНК, для диагностики фенилкетонурии, а- и р-талассе-мии и других наследственных болезней. Метод основан на полиморфизме рестрикционных фрагментов ДНК;

открытие и количественное определение самих ферментов в биологических жидкостях при патологии. Заболевания тех или иных органов всегда сопровождаются специфичным «ферментативным профилем». Инфаркт миокарда - увеличением активности лактатдегидрогеназы, креатинкиназы, аспартатаминотранс-феразы. Оказалось, что ряд молекул появляется в сыворотке крови при распаде клеток (отсюда их название «некротические ферменты»).

Ферменты в медицинских технологиях. Специфичность энзимов к определенным субстратам нашла широкое применение

в лабораторной диагностике. Многие ее методы основаны на взаимодействии добавляемого извне фермента с распознаваемым соединением. В результате возникает специфичный продукт реакции, по содержанию которого судят о концентрации искомого вещества (глю-козооксидазный, холестеролоксидазный способы). Иммуноферментные методы базируются на образовании тройного комплекса «фермент -антиген - антитело». Определяемый компонент не является субстратом фермента, но является антигеном. Фермент может присоединять этот антиген вблизи от активного центра. Если в среде есть антиген, то при добавлении антител и формировании тройного комплекса активность фермента изменяется, ее измеряют любым способом.

Энзимотерапия. Ферменты служат лекарством. Самые распространенные ферментативные препараты - комплексы ферментов желудочно-кишечного тракта (Фестал, Панзинорм форте, Мезим форте, Энзистал и т.п.), содержащие пепсин, трипсин, амилазу и другие и используемые для заместительной терапии при нарушениях переваривания пищи. Тканевой фермент гиалуронидаза нужна организму для обратимого изменения проницаемости межклеточного вещества, в основе которого - гиа-луроновая кислота. Лекарственную форму гиа-луронидазы - лидазу - вводят для размягчения рубцов, восстановления подвижности в суставах, рассасывания гематом. Цитохром с - белок, участвующий в процессах тканевого дыхания,-применяют при асфиксии новорожденных, астматических состояниях, сердечной недостаточности, различных видах гепатита. Рибонуклеаза и дезоксирибонуклеаза входят в состав глазных капель для лечения вирусных конъюнктивитов. Трипсин ингалируют при бронхолегочных заболеваниях для разжижения густой и вязкой мокроты. Фицин фармпромышленность добавляет к зубным пастам для удаления зубного налета. Коллагеназа важна для ускорения отторжения некротизированных тканей, очистки трофических язв.

Использование ингибиторов ферментов. Весьма широко применяются ингибиторы про-теаз (контрикал, гордокс) при панкреатитах - состояниях, когда в протоках и клетках поджелудочной железы активируются пищеварительные ферменты. Ингибиторы холин-эстеразы (физостигмин, прозерин) приводят к накоплению нейромедиатора ацетилхо-лина в синапсах и показаны при миастении,

Основные разделы Ферменты Примеры использования

Лактатдегидрогеназа (изофермент ЛДГ-1) Инфаркт миокарда

Аспартатаминотрансфераза (ACT) Инфаркт миокарда

Аланинаминотрансфераза (АЛТ) Заболевания печени (например, инфекционный гепатит), инфаркт миокарда

КК (изофермент ММ - мышечный типизофермент, МВ - сердечный тип) Прогрессирующая дистрофия, инфаркт миокарда

Кислая фосфатаза (КФ) Рак предстательной железы

Альфа-амилаза (диастаза) Заболевания поджелудочной железы

Пепсин Нарушение переваривания белков в желудке, нарушение синтеза или секреции пепсина

Трипсин, химотрипсин Лечение гнойных ран

Таблица. Применение ферментов в медицине

Лечение

Стрептокиназа, урокиназа Предотвращение тромбообразования при пересадке органов и других операциях

Гиалуронидаза Рассасывание рубцов

Аспарагиназа Лечение некоторых злокачественных образований

Нуклеазы (ДНКаза) Вирусный конъюнктивит, ринит, гнойный бронхит

Уреаза Удаление мочевины из организма в аппаратах «искусственная почка»

Глюкозооксидаза Определение концентрации глюкозы в крови

Холестеролоксидаза Определение холестерина в крови

Липаза Определение триацилглицеринов в крови

Использование ферментов в качестве аналитических реактивов

Уреаза

Определение мочевины в крови

двигательных и чувствительных нарушениях при невритах, радикулитах, психогенной импотенции. Препараты, содержащие ингибиторы моноаминоксидазы («Наком», «Мадопар»), повышают выработку нейромедиаторов катехолами-нов при лечении паркинсонизма, сохраняя нормальную передачу сигналов в нервной системе. Ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента (каптоприл, эналаприл и т.п.) используются как антигипертензивное средство, вызывающее расширение периферических сосудов, уменьшение нагрузки на миокард, снижение артериального давления. Ингибиторы гидрок-симетилглутарил-КоА-редуктазы (ловастатин, флувастатин, аторвастатин) «работают» на снижение синтеза холестерола при атеросклерозе, заболеваниях сердечно-сосудистой системы, дислипопротеинемиях. Ингибитор карбоанги-дразы (ацетазоламид) - как мочегонное средство при лечении глаукомы, отеков, эпилепсии, алкалозах и горной болезни.

Для диагностики органических и функциональных поражений органов и тканей широко применяются отдельные ферментные тесты, выгодно отличающиеся от других клинических химических анализов высокой чувствительностью и специфичностью. Известно около 20 тестов, основанных на количественном определении активности ферментов (и изофермен-тов), главным образом в крови (реже в моче), а также в биоптатах (кусочки тканей, полученные при биопсии). Следует отметить, что из огромного числа ферментов (более 3500),

открытых в природе (частично и в организме человека), в диагностической энзимологии используется лишь ограниченный их набор и для весьма небольшого числа болезней (гепатиты, инфаркт миокарда, органические поражения почек, поджелудочной железы, печени и др.).

Доказано, что органы и ткани человека характеризуются специфическим ферментным и изоферментным спектром, подверженным не только индивидуальным, но и суточным колебаниям. Существует большой градиент концентрации энзимов между внутриклеточными и внеклеточными частями тела. Поэтому любые, даже незначительные, повреждения клеток (иногда функциональные расстройства) приводят к выделению ферментов во внеклеточное пространство, откуда они поступают в кровь.

Благодаря усилиям ученых Института микробиологии НАН Беларуси полностью удовлетворяется спрос наших потребителей по ферменту глюкозооксидаза для отечественных датчиков «Глюкосен» для экспресс-анализа глюкозы в крови. В 2016 г. в институте разработана и экспериментально обоснована схема ферментативного получения флударабин-5'-монофосфата из 2-фтораденина и циклоцитидина как донора арабинозного фрагмента. Итоговый препарат может использоваться в качестве пролекарства в терапии рака.

В ходе реализации Госпрограммы «Наукоемкие технологии и техника» на 2016-2020 гг. (подпрограмма 8 «Импортозамещающие диагностикумы

1Лнгм,

\ л>

Антигемолитическое действие

ФЛА2 Naja naja oxiana

3,5-дизамещенные производные тиотетроновой кислоты

н

ч

%

Антипанкреатитное действие

ФЛА2 поджелудочной железы

Рис. 1. Подавление активности ФЛА2 яда кобры Naja naja oxiana в присутствии тестируемых соединений (например, 3,5-дизамещенных производных тиотетроновой кислоты) свидетельствует об их антигемолитическом действии - потенциальных свойствах противоядия, а снижение активности ФЛА2 панкреаса - об их анти-панкреатитном действии, то есть способности противодействовать развитию воспаления поджелудочной железы

и биопрепараты - 2020») в 2016 г. разработаны технологии производства и выпущены опытные партии 8 диагностикумов: гемосор-бент «Антилипопротеид», набор реагентов для определения на молекулярном уровне нарушений метаболизма лекарственных средств, комплект изотонических, лизирующих, депротеи-нирующих растворов и детергентов для автоматических гематологических анализаторов типа MEK Nihon Kohden (Япония) на 18 параметров крови (3 раствора и 1 детергент), изделие медицинского назначения «Универсальный РНК-стандарт», никель-активированная поли-стирольная 96-луночная панель для иммуно-ферментных тест-систем «Никель-Сорб»; изготовлены экспериментальные образцы тест-системы для выявления специфических антител к вирусу гепатита С методом иммунного блоттинга, препараты мышиных антивидовых поликлональных иммуноглобулинов, специфичных к IgG и IgM человека [3].

Также в прошлом году при поддержке ГКНТ успешно завершен совместный белорусско-индийский проект «Вклад в биоинформатику и наномедицину: компьютерная, биохимическая и биофизическая оценка новых производных пептидов и жирных кислот, а также наноструктурированных материалов на их

основе в качестве «молекулярного оружия» против инфекционных заболеваний», в котором от нашей стороны принимали участие ученые НИИ ФХП БГУ.

Определяющими для разработки новых методов диагностики являются результаты исследования взаимосвязи «структура - функция» в ряду биополимеров (белков, гликопро-теинов, ДНК, РНК) и низкомолекулярных биорегуляторов (компонетов нуклеиновых кислот, гормонов, производных липидов), полученные на системной основе в Институте биоорганической химии НАН Беларуси (ИБОХ) [4]. Это достижения в области иммуноферментного микроанализа на базе ферментов-маркеров антигенов и антител (пероксидаза хрена, ката-лаза, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, лактат-дегидрогеназа, конъюгаты ферментов с антигенами и антителами против них, с низкомолекулярными стероидными гаптенами, тироперок-сидаза и др.) для обнаружения широкого спектра заболеваний, в том числе патологий щитовидной железы, инфекционных и злокачественных опухолей предстательной железы.

Созданные в институте средства молекулярной диагностики с использованием полимераз-ной цепной реакции (ПЦР-диагностика) позволяют определить новые наследственные аномалии или склонность к их развитию и обеспечивают точность постановки диагноза (например, ускоренное выявление туберкулеза по идентификации комплекса Mycobacterium tuberculosis, опухолей в тканях молочной железы - по уровню экспрессии онкогена Her-2 и др.) и выбор схемы лечения.

Впервые в мире в 2016 г. у микобактерий, вызывающих туберкулез, обнаружен фермент (цитохром Р450 124 Micobacterium tuberculosis), способный превращать витамин D и 7-дегидро-холестерин в неактивные формы, предположительно выступающий в качестве фактора пато-генности этих микроорганизмов и их способности подавлять иммунитет организма-хозяина. Полученные результаты реально перспективны для направленного поиска новых эффективных противотуберкулезных препаратов.

Важную роль для медицинской диагностики заболеваний, связанных с нарушением процессов стероидогенеза, в том числе в определении риска возникновения химически индуцируемых раковых опухолей, играет исследование полиморфизма монооксигеназ - стероид-пре-вращающих ферментов семейства цитохромов Р450 (CYP). В 2016 г. в ИБОХ созданы наборы

реагентов для ПЦР-диагностики полиморфизмов генов СУР2С 19, СУР2С 9, а также выпущены ферментные препараты рекомбинантных цитохромов - СУР 19, СУР 11В2, СУР 17, СУР 51, СУР2С9.1, СУР2С9.2, СУР2С9.3, СУР2С19.1А, СУР2С19.1В, СУР2С 19.9 и СУР2С19.13.

В лаборатории прикладной энзимологии ИБОХ накоплен значительный потенциал в изучении важнейших практически значимых аспектов структурной химии 10 фосфолипаз разных классов (ФЛА2 ядов трех змей и пчелы, панкреаса свиньи, человека; трех изоформ микробных ФЛС и Б 1 - из капусты), а также в области их взаимодействия с ферментами стероидогенеза (СУР2В 4 и СУР3А4), на основе углубленных исследований взаимосвязи «структура - функция» в условиях воздействия внутренних и внешних факторов на гидролиз фосфолипидов (фосфолипо-лиз) [4]. Полученные новые фундаментальные знания привели к развитию прикладных исследований в обоих упомянутых направлениях энзимодиагностики: использование ферментов для обнаружения потенциальных терапевтически важных соединений (одноферментные нано-реакторы: ФЛА2 - лиганд) и определение активности энзимов как маркеров патологических процессов (сопряженные биферментные нано-реакторы: ФЛА2 - гемоглобин; ФЛА2 - СУР2В 4 и ФЛА2 - СУР3А4).

В настоящее время одним из распространенных методов изучения фермент-лигандных взаимодействий является их оценка путем компьютерного моделирования (докинга), которое, однако, обязательно требует экспериментального подтверждения.

В наших исследованиях в качестве избирательных реагентов для выявления среди химических соединений потенциальных антипан-креатитных или антигемолитических средств сразу применялась фосфолипаза. Сначала полуколичественным методом с использованием

гель-диффузии ферментов в агарозный гель, содержащий эмульсию яичного желтка [5] или эритроциты [6], проводили скрининг десятков тестируемых веществ на их способность подавлять фосфолиполиз. Затем среди выявленных образцов с наиболее выраженным ингибиру-ющим ферменты эффектом проводили углубленное изучение их действия количественно с помощью кинетики ферментативной реакции [7, 8] (рис. 1).

На основе установления спектральных изменений гемоглобина под влиянием жирных кислот [9] нами разработана уникальная методология определения активности ФЛА2 в биологических жидкостях [10], а также в рамках выполнения задания ГП «Импортозамещающая фармпродукция» создана не имеющая аналогов в мире соответствующая тест-система и организовано совместное с ХОП ИБОХ производство наборов реагентов ФЛА2-ФОА для диагностики острого некротического панкреатита [11].

Впервые по развитию дифференциального спектра гемоглобина (НЬ) в диапазоне волн полосы Соре, возникающего при образования его супрамолекулярного комплекса с жирными кислотами, отщепляемыми под действием ФЛА2 от субстрата, определена особенность динамики активности ФЛА2, кардинально отличающая таковую от показателей других, общепринятых лабораторных тестов диагностики острого панкреатита: ФЛА2 отражает поражение мембран клеток, вызванное некробиотическим процессом, тогда как все остальные ферментативные (и многие не ферментативные) тесты - преимущественно общий отклик организма на воспалительный процесс в поджелудочной железе [12].

На первом этапе (рис. 2А) при взаимодействии фермента ФЛА2 с фосфолипидами (субстрат) отщепляется жирная кислота (ЖК). На втором этапе (рис. 2Б) во время образования супрамолекулярного комплекса гемоглобина

^ разностный спектр НЬ

гемоглобин

Взаимодействие ФЛА2 панкреаса с субстратом

Модель супрамолекулярного комплекса НЬ с ЖК

л р

0,04

0,02

-0,02

-0,04

2

3

Л, нм

400 1 440

_

Рис. 2.

Определение активности ФЛА2 в сыворотке крови гемоглобиновым методом

0

Рис. 3. Результаты доклинических(А) и клинических(Б) испытаний набора реактивов ФЛА2-ФОА

62

Рис. 4. Предложенная схема сопряженности биохимических процессов антибиотик-»цито-хром Р450«- фос-фолипаза А2: эконазолдействует на активность ФЛА2 предположительно через конформационные изменения цитохрома Р450, которые влияют на взаимодействие цитохрома и фосфолипазы А2

Активность ФЛА2 (мкмоль/л) в сыворотке крови

10

12 3 4

у крыс (слева направо):

1 - интактные животные

2 - в день лапаротомии

3 - экспериментальный панкреатит 4-6 - после лечения

16 гНБЪ

14 12 10

1 2 3 4 5

Группы больных

у человека (слева направо):

1 - стандарт ЮООХ без ФЛА2

2 - здоровые доноры

3 - больные парапроктитом 4-5 - больные панкреатитом

с ЖК, полученной в процессе фосфолиполиза, гемопротеин превращается в окисленную низкоспиновую форму - гемихром, что выражается в развитии на третьем этапе (рис. 2В) разностного спектра. При этом интенсивность возникающего спектра является количественным показателем активности панкреатической ФЛА2 в сыворотке крови подопытных животных:

ФЛА2

50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0

увеличение

Эконазол *

Р450

Каталитическая активность

к + Р450 - а -Р450 - econazol

10

20

30

40

50

интактного (1), с экспериментальным панкреатитом (2), после введения лекарства (3) (рис. 2В). Все этапы проходят в кювете спектрофотометра в одну стадию.

Каждый разностный спектр характеризуется в единицах оптической плотности как разность поглощения (AD) в диапазоне длин волн 405-423 в опытной кювете против контрольной через 60 и 100 минут от начала реакции (AD = (D 405-423 = Di(405) + D2(423)). Активность ФЛА2 выражается в международных единицах (МЕ/л), то есть количестве продукта - миристиновой кислоты (мкмоль), полученного при гидролизе димиристоилфосфатидилхолина сывороточной ФЛА2 за 1 минуту.

Набор ФЛА2-ФОА хорошо зарекомендовал себя как в эксперименте на животных (рис. 3А), так и в клинических испытаниях (100%-ное выявление больных панкреатитом, n=90) (рис. 3Б). В 2016 г. удовлетворены потребности БелМАПО в 30 таких диагностикумах. Импортозамещение составило около 15 тыс. долл.

Проведено исследование на кинетическом уровне активности ФЛА2 в условиях повышающейся концентрации цитохрома Р450 (моль/ моль) в присутствии и при отсутствии экона-зола - антибиотика нового поколения (рис. 4). Обнаружено, что преинкубация с эконазолом цитохрома Р450 3А4 человека повышает активирующее действие последнего на фосфолипаз-ную реакцию. Полученные данные при масштабировании могут стать основой для методики тест-системы определения in vitro безопасных доз антибиотиков [13].

На кинетическом уровне проведен ингиби-торный анализ функционирования фосфолипаз под действием ряда ксенобиотиков. Обнаружены

1000 0

-1000 -2000 -3000 -4000 -5000 -6000 -7000 -8000 -9000

ФЛА2 + P450 P450 ---ФЛА2

Л, нм

45

40

25

20

15

5

0

5

6

8

0

t, мин

'N Absorbance, A423-405 1 I Di, положение / ^ максимума S \ при Л = 423 нм 14 V V j Wavelenght, nm Рис. 5. Действие перекисно-окисленного фосфатидилхолина, индуцированного УФ, на спектральные свойства метгемоглобина, вызванные

380 400 1 1 1 У 420 440 460 переходом его

в гемихром,

в присутствии

-Т сыворотки крови

ч. ,,-У с использованием

Ч [ разностной

спектрофотометрии

D2, положение

vA- минимума

при Л = 405 нм

неизвестные ранее ингибиторы фосфолиполиза среди амидов жирных кислот, 9-Ме, 10-Ме, 11-Ме аналогов простагландинов, производных тиоте-троновой кислоты, оксазола, 1-, 3-циклогексан-дионов, фосфодиэфирных производных ацикло-вира и аденозина и др. [7, 8, 14].

В настоящее время в нашей лаборатории разрабатывается методика тест-системы для оценки общей антиоксидантной способности сыворотки крови и совместно с сотрудниками БелМАПО осуществляется ее апробация при конкретных патологиях (остром некротическом панкреатите, перитоните, кардиомиопатиях, ревматических заболеваниях и др.) для выяснения необходимости хирургического вмешательства или консервативного лечения с использованием универсального агента УФ-окисленного фосфатидилхолина (рис. 5). Установлено, что в присутствии сыворотки крови амплитуда разностного спектра гемоглобина существенно меньше, чем в ее отсутствие. Это показывает, что сыворотка за счет своего антиоксидантного потенциала значительно снижает степень окисления фосфолипидов. Следовательно, наблюдаемая разница между интенсивностью дифференциального спектра гемоглобина в присутствии сыворотки и без нее может служить мерой общей антиоксидантной способности этой биологической жидкости [15].

Таким образом, достижения энзимологии находят все большее применение в медицине,

http://innosfera.by/2017/11/diagnostics

ЛИТЕРАТУРА

1. Становление лабораторной медицины и клинико-лабораторной службы в Республике Беларусь / В.С. Камышников, В.Г. Колб, Г.М. Костин // Лабораторная диагностика. Восточная Европа. 2012, №3. С. 10-21.

2. Камышников В.С. Лабораторная медицина за рубежом: подготовка и клинико-лабораторная деятельность специалистов с медицинским и немедицинским образованием // Медицинские новости. 2011, №2. С. 55-61.

3. Отчет о деятельности Национальной академии наук Беларуси в 2016 году.- Минск, 2017.

4. Литвинко Н.М. Прикладная энзимология фосфатидацилгидролаз в изучении взаимосвязи «структура - функция» в ряду биополимеров и низкомолекулярных биорегуляторов (обзор) // Вес-ф Нацыянальнай акадэми навук Беларуси Сер. хм. навук. 2017, №3. С. 115-128.

5. Способ определения эффекторных свойств физиологически активных соединений / Н.М. Литвинко, С.В. Кучуро, Т.А. Желдакова, Е.Р. Филич. Патент BY №5752, зарег. 07.08.2003.

6. Способ определения антигемолитической активности химического соединения / Н.М. Литвинко, С.В. Кучуро, Г.Н. Рахуба, Д.Б. Рубинов, Т.А. Желдакова. Патент BY №10604, опубл. 30.06.2008.

7. 3,5-дизамещенные производные тиотетроновой кислоты, проявляющие антифосфолипазную активность антипанкреатического профиля действия, и способ их получения / Рубинов Д.Б., Желдакова Т.А., Литвинко Н.М., Кучуро С.В., Рахуба Г.Н. Патент BY №10191, опубл. 28.02.2008.

8. Производные ß-трикетоновтиофенового ряда, проявляющие антифосфолипазную активность антигемолитического профиля действия / Рубинов Д.Б., Желдакова Т.А., Литвинко Н.М., Кучуро С.В., Рахуба Г.Н. Патент BY №10192, опубл. 28.02.2008.

9. Андреюк Г.М. Превращение гемоглобина в гемихром при взаимодействии со свободными жирными кислотами: автореф. дис. ... канд. хим. наук: 02.00.10 / АН БССР, Ин-тбиорган. химии.-Минск, 1988.

10. Способ определения активности фосфолипазы А2 в сыворотке крови / Н.М. Литвинко, Л.А. Скоростецкая, С.В. Кучуро, Г.Н. Рахуба. Патент BY №12552: МПК (2006) C 12Q 1/34, опубл. 30.10.2009.

11. Способ диагностики панкреатита по уровню А2 фосфолипазной активности сыворотки крови / Н.М. Литвинко, Л.А. Скоростецкая. Патент BY №13143: МПК (2009), A 61B 5/145, C 12Q 1/34, опубл. 30.04.2010.

12. Супрамолекулярный комплекс жирной кислоты с гемоглобином как индикатор фосфолиполиза для выявления экспериментального панкреатита / Литвинко Н.М., Скоростецкая Л.А., Гудко Т.Г. и др. // Доклады НАН Беларуси. 2016. Т. 60, №4. С. 82-88.

13. Литвинко Н.М., Антончик Г.Н., Глушакова Т.Г., Герловский Д.О. Особенности взаимодействия цитохрома Р450 и фосфолипаз А2 разной специфичности, обнаруживаемые КД-спектроско-пией // Доклады НАН Беларуси. 2016. Т. 60, №6. С. 64-71.

14. Фосфодиэфирные производные ацикловира - новые ингибиторы панкреатической фосфолипазы А2 / Герловский Д.О., Литвинко Н.М., Скоростецкая Л.А., Кучуро С.В., Калиниченко Е.Н., Фа-рина А.В. // Доклады НАН Беларуси. 2010. Т. 54, №1. С. 75-82.

15. Способ определения общей антиоксидантной способности биологической жидкости с использованием липидной фазы / Литвинко Н.М., Скоростецкая Л.А., Герловский Д.О. Патент BY №19670: МПК (2006.01) G 01N 33/48, опубл. 30.12.2015.

Амплитуда разностного спектра гемоглобина:

1 - УФ-облученного фосфолипида;

2 - необлученного фосфолипида;

3 - УФ-облученного фосфолипида в присутствии сыворотки крови

в частности в профилактике, диагностике и лечении болезней. Успешно развивается новое направление, имеющее свои цели и задачи, специфические методологические подходы и методы исследования, - медицинская энзимология. Она движется по трем главным направлениям, хотя возможности применения научных достижений энзимологии в медицине теоретически безграничны, в частности в области энзимопатологии, энзимодиагностики и энзимотерапии. СИ