СПОСОБ ПОЛИАЛКОКСИЛИРОВАНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ, КОТОРЫЙ ПОЗВОЛЯЕТ ИЗВЛЕКАТЬ И ПОВТОРНО ИСПОЛЬЗОВАТЬ ИЗБЫТОК ПОЛИАЛКОКСИЛИРУЮЩЕГО РЕАГЕНТА

1. Способ получения модифицированной молекулы нуклеиновой кислоты, включающей нуклеиновокислотную часть и не-нуклеиновокислотную часть, путем взаимодействия первого взаимодействующего вещества и второго взаимодействующего вещества, где первое взаимодействующее вещество включает не-нуклеиновокислотную часть и карбоксильную группу, и где второе взаимодействующее вещество представляет собой амино-модифицированную молекулу нуклеиновой кислоты, включающую нуклеиновокислотную часть и амино-модификацию, включающую аминогруппу, которая присоединена к нуклеиновокислотной части, где способ включает следующие стадии:
a) активирование первого взаимодействующего вещества, предпочтительно карбоксильной группы первого взаимодействующего вещества, реагентом конденсации в смешиваемом с водой органическом растворителе, и
b) взаимодействие активированного первого взаимодействующего вещества, предпочтительно активированной карбоксильной группы первого взаимодействующего вещества, со стадии a) и второго взаимодействующего вещества, предпочтительно аминогруппы амино-модификации амино-модифицированной молекулы нуклеиновой кислоты, которая была растворена в воде или смеси смешиваемого с водой органического растворителя и воды, в результате чего образуется модифицированная молекула нуклеиновой кислоты.
2. Способ по п. 1, где амино-модифицированную молекулу нуклеиновой кислоты растворяют в смеси воды и смешиваемого с водой органического растворителя в присутствии четвертичной аммониевой соли.
3. Способ по любому из пп. 1, 2, где активированное первое взаимодействующее вещество со стадии a) добавляют к амино-модифицированной молекуле нуклеиновой кислоты, растворенной в воде или в смеси смешиваемого с водой органического растворителя и воды.
4. Способ по любому из пп. 1-3, где первое взаимодействующее вещество и/или не-нуклеиновокислотная часть выбраны из группы, включающей полиалкокси соединение, пептид, белок, гликопротеин, нуклеиновую кислоту, углеводный фрагмент и химическую группу, отличную от пептида, белка, гликопротеина, нуклеиновой кислоты и/или фрагмента на основе углевода, предпочтительно первое взаимодействующее вещество и/или не-нуклеиновокислотная часть представляет собой полиалкокси соединение.
5. Способ по любому из пп. 1-4, где амино-модифицированная молекула нуклеиновой кислоты является подходящей для использования в аналитическом методе, в диагностике и/или терапии.
6. Способ по любому из пп. 1-5, где амино-модифицированная молекула нуклеиновой кислоты выбрана из группы, включающей амино-модифицированные аптамеры, амино-модифицированные шпигельмеры, амино-модифицированные иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты, амино-модифицированные миРНК, амино-модифицированные молекулы микроРНК и антисмысловые амино-модифицированные молекулы нуклеиновых кислот, предпочтительно аптамеры представляют собой аптамеры, состоящие из L- и/или D-нуклеотидов;
и/или где нуклеиновокислотная часть выбрана из группы, включающей аптамеры, шпигельмеры, иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты, миРНК, молекулы микроРНК и антисмысловые молекулы нуклеиновых кислот, предпочтительно аптамеры представляют собой аптамеры, состоящие из L- и/или D-нуклеотидов.
7. Способ по любому из пп. 1-6, где на стадии b) используют избыток молекул активированного первого взаимодействующего вещества относительно амино-модифицированных молекул нуклеиновых кислот.
8. Способ по п. 7, где избыток выражают как молярное отношение молекул активированного первого взаимодействующего вещества и амино-модифицированных молекул нуклеиновых кислот, где молярное отношение составляет от около 1,1 до около 10, предпочтительно от около 1,5 до около 3,5.
9. Способ по любому из пп. 1-8, где для активирования первого взаимодействующего вещества в соответствии со стадией a) первое взаимодействующее вещество растворяют в смешиваемом с водой органическом растворителе и добавляют конденсирующий агент и основание, предпочтительно сначала конденсирующий агент и затем основание, где предпочтительно конденсирующий агент растворяют в смешиваемом с водой органическом растворителе.
10. Способ по п. 9, где основание представляет собой ненуклеофильное основание.
11. Способ по любому из пп. 9, 10, где через 0,25 мин - 60 мин, предпочтительно через 0,5 мин - 20 мин, и более предпочтительно через 1,0 мин - 5,0 мин после добавления основания полученный таким образом раствор добавляют к раствору, содержащему амино-модифицированную молекулу нуклеиновой кислоты, предпочтительно через 1,0 мин - 5,0 мин после добавления основания раствор, содержащий конденсирующий агент и основание, добавляют к раствору, содержащему амино-модифицированную молекулу нуклеиновой кислоты.
12. Способ по любому из пп. 9-11, где конденсирующий агент выбран из группы, включающей
a) соли фосфония, такие как BOP, PyBOP, PyBrop, AOP, PyAOP, BrOP и PyClOP,
b) соли урония, такие как HCTU, TCTU, TBTU, HBTU, HATU, TOTU и COMU, и
c) карбодиимиды,
где предпочтительно конденсирующий растворитель представляет собой PyBOP, TBTU, COMU, HBTU, более предпочтительно HBTU.
13. Способ по п. 12, где карбодиимид выбран из группы, включающей DCC (N,N'-дициклогексилкарбодиимид), EDC (1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид) и DIC (N,N'-диизопропилкарбодиимид).
14. Способ по любому из пп. 1-13, где смешиваемый с водой органический растворитель выбран из группы, включающей метанол, этанол, н-пропанол, изопропанол, н-бутанол, втор-бутанол, трет-бутанол, диметилсульфоксид, диэтилсульфоксид, метилэтилсульфоксид, формамид, метилформамид, диметилформамид, этилформамид, этилметилформамид, диэтилформамид, 2-пирролидон, N-метилпирролидон, N-этилпирролидон, ацетонитрил, ацетон, этилметилкетон, метилпропилкетон, диэтилкетон, метилизопропилкетон, метилформиат, этилформиат, пропилформиат, изопропилформиат, метилацетат, этилацетат, метилпропаноат, тетрагидрофуран и диоксан, предпочтительно диметилформамид, ацетонитрил и диметилсульфоксид.
15. Способ по любому из пп. 9-14, где основание выбрано из группы, включающей диизопропилэтиламин (DIPEA), триметиламин и DBU, предпочтительно диизопропилэтиламин (DIPEA).
16. Способ по любому из пп. 9-15, где молярное отношение основания к первому взаимодействующему веществу равно или больше чем 1.
17. Способ по любому из пп. 9-16, где раствор амино-модифицированной молекулы нуклеиновой кислоты содержит основание, предпочтительно ненуклеофильное основание, при этом предпочтительно молярное отношение ненуклеофильного основания к числу фосфодиэфиров в амино-модифицированной молекуле нуклеиновой кислотыбольше чем 3.
18. Способ по любому из пп. 1-17, где стадию а) осуществляют при температуре 5°C-60°C, предпочтительно при температуре 10°C-40°C, более предпочтительно при температуре 15°C-30°C, наиболее предпочтительно при температуре окружающей среды.
19. Способ по любому из пп. 1-18, где стадию b) осуществляют при температуре 5°C-60°C, предпочтительно при температуре 10°C-40°C, более предпочтительно при температуре 15°C-30°C, наиболее предпочтительно при температуре окружающей среды.
20. Способ по любому из пп. 1-19, где реакция активированной карбоксильной группы первого взаимодействующего вещества с аминогруппой амино-модифицированной молекулы нуклеиновой кислоты завершается через 5 минут - шесть часов, предпочтительно через 15 минут - 45 минут, более предпочтительно через 15-30 минут.
21. Способ по любому из пп. 1-20, где стадию b) осуществляют в диапазоне pH 7,5-10, предпочтительно в диапазоне pH 7,5-9 и более предпочтительно в диапазоне pH 7,5-8,5.
22. Способ по любому из пп. 1-21, где на стадии b) активированное первое взаимодействующее вещество добавляют к раствору амино-модифицированных молекул нуклеиновых кислот до тех пор, пока от 80% до 100% амино-модифицированных молекул не прореагируют с первым взаимодействующим веществом, предпочтительно пока от 90% до 100% амино-модифицированных молекул нуклеиновых кислот не прореагируют с первым взаимодействующим веществом.
23. Способ по любому из пп. 1-22, где после завершения стадии b) любое непрореагировавшее первое взаимодействующее вещество выделяют из реакции при помощи ультрафильтрации и/или хроматографии, предпочтительно при помощи ионообменной хроматографии.
24. Способ по п. 23, где выделенное первое взаимодействующее вещество направляют в повторный цикл и используют на стадии a).
25. Способ по любому из пп. 4-24, где полиалкокси соединение представляет собой полиалкокси соединение с прямой или разветвленной цепью.
26. Способ по любому из пп. 4-25, где полиалкокси соединение выбрано из группы, включающей полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль, полибутиленгликоль, полиглицерин.
27. Способ по любому из пп. 4-26, где полиалкокси соединение представляет собой полиэтиленгликоль.
28. Способ по любому из пп. 4-27, где полиалкокси соединение имеет молекулярную массу от 5000 до 100000 Да, предпочтительно от 20000 до 80000 Да, более предпочтительно 40000 Да.
29. Модифицированная молекула нуклеиновой кислоты, полученная способом по любому из пп. 1-28.
30. Модифицированная молекула нуклеиновой кислоты, полученная способом по любому из пп. 1-28, для применения в терапии.
31. Модифицированная молекула нуклеиновой кислоты, полученная способом по любому из пп. 1-28, для применения в диагностике.
32. Применение модифицированной молекулы нуклеиновой кислоты, полученной способом по любому из пп. 1-28, в методе анализа образца in vitro.