СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НАНОЧАСТИЦ ЭЛЕМЕНТНОГО АМОРФНОГО СЕЛЕНА
METHOD FOR ELEMENTAL AMORPHOUS SELENIUM NANOPARTICLES PRODUCTION

Область техники
Изобретение относится к способам получения наночастиц металлов и металлоидов из растворов и может применяться в различных отраслях промышленности (электронной), биотехнологии (биоремедиации), а также для целей фундаментальных научных исследований.
Уровень техники
Способность восстанавливать восстановленные соединения селена (селенит, селенат) с образованием элементного селена встречается среди микроорганизмов различных таксономических групп (Stolz et al., 2006). Это может быть как специфическим физиологическим процессом (например, дыханием с использованием оксианионов селена в качестве терминального акцептора электронов (Herbel et al., 2003)), так и неспецифическим процессом (обусловленным, например, сбросом избыточных электронов в процессе аноксигенного фотосинтеза (Moore & Kaplan, 1992)). В любом случае происходит переход токсичных форм селена (селенита и селената) в нетоксичную - элементный селен. Данное явление можно использовать для биоремедиации загрязненных промышленных сточных вод, а также для получения биогенного красного аморфного селена для целей научных исследований (биогенный красный аморфный селен более биодоступен, чем химически полученный (Herbel et al., 2003)).
Из уровня техники известны ряд способов получения наночастиц аморфного элементного селена при помощи гетеротрофных микроорганизмов - бацилл (Bacillus sp., патент CN 102703513), лактобактерий (Pediococcus pentosaceus SP80, патент US 20070077238; Bifidobacterium sp., Lactobacillus sp., Streptococcus sp., патент US 8003071). В общем методы сводятся к культивированию указанных микроорганизмов на жидкой среде, содержащей селенит натрия, и последующей очистке частиц селена от клеток последовательными отмываниями в буферах различной кислотности; замораживанием; высушиванием; осмотическим воздействием; воздействием ультразвуком. Основными недостатками этих методов являются: высокая стоимость (среда для культивирования содержит большое количество дорогих органических субстратов - пептона, дрожжевого экстракта, глюкозы, ацетата); грубое воздействие на частицы селена при очистке, приводящие к потере красным селеном аморфной структуры и переходу в кристаллическую серую форму; неоднородность получаемых частиц по размеру (50-500 нм).
Также известны способы получения наночастиц аморфного элементного селена при помощи фототрофных микроорганизмов - Rhodobacter sphaeroides 2.4.1, 2.4.7, 2.4.9, RS2, RS630, Si4, SWL, WS8, Rhodobacter capsulatus B10 (CA 2127976), Rhodopseudomonas palustris (патент CN 103361380). К недостаткам методов относятся: 1. высокая себестоимость среды культивирования (используются богатые среды Лурия-Бертани, пептонно-дрожжевая, SSM), 2. долгое время культивирования (3-10 суток), 3. неэффективная очистка полученного элементного селена от клеток и клеточных фрагментов.
Наиболее близким к заявляемому является способ получения наночастиц элементного аморфного селена с помощью фототрофных бактерий, описанный в патенте CN 103361380 и выбранный нами в качестве прототипа. Он состоит из следующих стадий.
4
2
2
2
2
4
4
2
4
4
2
2
4
3
3
4
2
2
4
2
4
4
2
1. Подготовка инокулята фототрофных бактерий Rhodopseudomonas palustris. Стерильная среда (состав: MgSO⋅7HO 100-300 мг, CaCl⋅2HO 50-100 мг, EDTA 10-30 мг, дрожжевой экстракт 500-1500 мг, KHPO 500-1500 мг, (NH)SO 1000-2000 мг, FeSO⋅7HO 5-15 мг, KHPO 400-1000 мг, раствор микроэлементов 1-5 мл, деионизованная вода 1000-2000 мл, pH 5-9; раствор микроэлементов: HBO 200-300 мг, MnSO⋅4HO 150-250 мг, NaMoO⋅2HO 50-100 мг, CuSO 2-10 мг, ZnSO⋅7HO 20-30 мг, деионизованная вода 100-200 мл) инокулируется фототрофными бактериями Rhodopseudomonas palustris. Культура инкубируется в течение 3-10 дней в анаэробных условиях на свету (500-3000 люкс) при температуре 15-40°С.
2. Внесение селенита натрия в культуру анаэробно фототрофно растущих бактерий Rhodopseudomonas palustris из расчета 0.5 мМ/л. Культура инкубируется с селенитом в течение 3-10 дней в анаэробных условиях на свету (500-3000 люкс) при температуре 15-40°С. При этом происходит восстановление селенита до элементного красного аморфного селена, представленного наночастицами размером 60-200 нм.
3. Отделение селена от культуральной среды и бактерий. Культуральная среда, содержащая бактерии и элементный селен, подвергается центрифугированию 10 мин при 3000 g и 4°С. Далее осадок центрифугируется 60 мин. при 18000 g 4°С. Полученный осадок разбавляется 50 мМ TRIS-HCL буфером (pH 7.5), центрифугируется 60 мин при 18000 g три раза.
4. Полученный осадок дважды промывается деионизованной водой и высушивается.
Прототип обладает следующими существенными недостатками: 1. длительное время роста культуры (3-10 суток) и накопления в культуральной среде красного аморфного селена (3-10 суток); 2. получаемые наночастицы селена являются неоднородными по размеру (60-200 нм); 3. метод отделения частиц элементного селена от культуральной среды и бактерий не является эффективным, так как последовательное центрифугирование и разбавление в буфере не позволяет избавиться от значительного количества клеток и клеточных фрагментов, и как следствие, полученные частицы селена не очищены полностью.
Раскрытие изобретения
Техническим результатом, на который направлено изобретение, является ускорение способа получения однородных по размеру наночастиц (280±45 нм) аморфного красного селена, более полная мягкая очистка полученных наночастиц от клеток бактерий и клеточных фрагментов без нарушения аллотропной модификации селена.
Технический результат достигается тем, что способ получения наночастиц элементного аморфного селена включает подготовку инокулята фототрофных бактерий, внесение селенита натрия в культуру фототрофных бактерий, отделение селена от культуральной среды и бактерий первичным центрифугированием, разбавлением осадка и последующим многостадийным центрифугированием, промывку наночастиц селена деионизированной водой, при этом используют фототрофные бактерии Rhodobacter capsulatus В10, осадок разбавляют лизирующим составом и инкубируют с последующим центрифугированием, после чего проводят центрифугирование осадка в градиенте водного раствора сахарозы.
При этом:
- градиент водного раствора сахарозы формируют из последовательных слоев 80%, 60% и 40% водных растворов сахарозы,
- проводят центрифугирование после промывки наночастиц селена деионизированной водой,
- осадок с лизирующим составом инкубируют в темноте 12-48 часов.
Краткое описание чертежей
На фигуре показаны однородные по размеру наночастицы элементного аморфного селена, полученного с помощью бактерий Rhodobacter capsulatus В10 предложенным способом.
Пример реализации
Способ осуществляется следующим образом.
2
4
2
2
4
4
2
2
3
2
2
1. Подготовка инокулята фототрофных бактерий. Стерильная среда (состав: NaSO 330 мг, MgCl⋅6HO 330 мг, KCl 330 мг, KHPO 330 мг, NHCl 330 мг, NaSO 500 мг, CaCl⋅2HO 50 мг, дрожжевой экстракт 500 мг, Na ацетат 500 мг, раствор микроэлементов (Pfennig & Lippert, 1966) 1 мл, деионизованная вода 1000 мл, pH 7-7.5) инокулируется фототрофными бактериями Rhodobacter capsulatus В10. Культура инкубируется в течение 24 часов в анаэробных условиях на свету (2000 люкс) при температуре 20-25°С.
2. Вносят селенит натрия в культуру анаэробно фототрофно растущих бактерий Rhodobacter capsulatus В10 из расчета 5 мМ/л. Культуру инкубируют с селенитом в течение 24 часов в анаэробных условиях на свету (2000 люкс) при температуре 20-25°С. При этом происходит восстановление селенита до элементного красного аморфного селена, представленного наночастицами размером 280±45 нм.
2
3. Отделение селена от культуральной среды и бактерий. Культуральную среду центрифугируют при 8000 g 10 мин. Полученный осадок, состоящий из бактерий и наночастиц селена, разбавляют лизирующим составом для разрушения клеток бактерий (последовательно растворить 0.4 г TRIS и 0.37 г NaEDTA в 50 мл воды; довести pH раствора до 6.4; растворить 28.7 г гуанидин гидрохлорида; перемешать) в соотношении 1:4, тщательно перемешивают и инкубируют при комнатной температуре 12-48 часов в темноте. Раствор центрифугируют при 5000 g 20 мин. Полученный осадок центрифугируют при 6000 g 30 мин в градиенте сахарозы (в центрифужную пробирку последовательно аккуратно, чтобы не допускать перемешивания, вносились друг на друга 80%, 60%, 40% растворы сахарозы в воде, сверху вносился осадок, содержащий разрушенные клетки и наночастицы селена) для избавления от остаточных клеток и клеточных фрагментов. После центрифугирования наночастицы селена оседают вниз, в слоях сахарозы остаются клетки, клеточные фрагменты и остаточное количество наночастиц селена. Верхние слои сахарозы сливаются.
4. Осажденные наночастицы селена промывают 3 раза деионизированной водой, центрифугируют при 5000 g 15 мин и высушивают для последующего использования.
Предлагаемый способ позволяет получить наночастицы красного аморфного селена в короткие сроки (24 часа вместо нескольких суток, как в аналогичных работах), при этом достигается большая размерная однородность частиц (в среднем размер составляет 280 нм, при этом разброс значений не превышает 45 нм) (см. фигуру), а метод очистки наночастиц позволяет практически полностью избавиться от клеток бактерий и клеточных фрагментов без нарушения аллотропной модификации полученного селена (таблица).