СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФРАКЦИИ ЛИПОФИЛЬНЫХ ВЕЩЕСТВ ИЗ ЧАГИ
METHOD OF PRODUCING FRACTION OF LIPOPHILIC SUBSTANCES FROM SHELF FUNGUS

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, а именно к получению фракции биологически активных липофильных веществ из чаги.
Известны способы выделения липофильных веществ из гриба чаги, включающие экстракцию измельченного гриба органическими растворителями: гексаном (Kahlos К. // Planta Medica. - 1984. - №50. - P.197-198), этиловым спиртом (Shin Y. // Int. J. of Medicinal Mushrooms. - 2001. - V.3. - P.250), хлороформом (Handa N. // Phytochemistry. - 2010. - V.71. - P.1774-1779) и разделение полученных экстрактов на фракции с помощью колоночной хроматографии. Это позволило идентифицировать в грибе к настоящему времени более 20 стериновых соединений, представленных эргостеролом и ланостеролом, а также их различными производными. Для ланостерола и отдельных его производных показана высокая противоопухолевая, иммуномодулирующая и противовоспалительная активность, для эргостерола и его производных - провитаминные и противоопухолевые свойства.
Недостатком данных способов является извлечение малого количества и узкого спектра липофильных веществ из гриба чага.
Известен способ выделения фракции липофильных веществ из гриба чаги (W. Mazurkiewicz [and others] // Acta Poloniae Pharmaceutica. - 2010. - V.67, I.4. - P.397-406). Получают водный экстракт гриба, концентрируют и высушивают. Далее проводят гидролиз сухого остатка хлористоводородной кислотой, отделяют осадок 1, оставшийся фильтрат упаривают досуха и получают осадок 2. Осадки 1 и 2 обрабатывают этилацетатом и метанолом, полученные экстракты объединяют и удаляют растворители под вакуумом с получением сухого остатка черного цвета. Разделение веществ сухого остатка проводят с помощью колоночной хроматографии.
Известен способ получения липофильных веществ из гриба, включающий получение водных экстрактов чаги, которые далее экстрагируют различными органическими растворителями: петролейным эфиром, этилацетатом, хлороформом, хлороформ - этанольной смесью (Сысоева М.А. [и другие] Исследование золя водных извлечений чаги. XI. Липиды водного извлечения чаги // Химия растительного сырья. - 2008 - 3. - С.119-122). Во всех полученных органических экстрактах обнаружены моно-, ди- и триацилглицериды, алифатические спирты и альдегиды, стерины и их эфиры, углеводороды, воски, витамины E и K, кофермент Q, высшие жирные кислоты.
Недостатком данных способов является нерациональное использование сырья, поскольку в водный экстракт чаги переходит около 20±2% веществ гриба. При этом значительная часть биологически активных соединений гриба, обладающих гидрофобными свойствами, остаются в шроте (жоме, остатке сырья). В частности известно, что после водной экстракции гриба стериновые соединения частично эмульгируются и извлекаются водой, но до 80% этих соединений остается в шроте чаги, который является отходом производства и в дальнейшем не используется (Шиврина А.Н. // Продукты биосинтеза высших грибов и их использование. - М.-Л., 1966. - С.49-56.). Это обуславливает актуальность дальнейшей переработки шрота чаги.
Наиболее близким техническим решением, взятым за прототип, является способ получения спиртового экстракта из чаги (патент РФ №2341277, А61К 36/06, B01D 11/02, 2007). Измельченную чагу экстрагируют водой, водный экстракт отделяют от шрота. Шрот заливают 70%-ным этиловым спиртом и кипятят в течение 1-3 часа. Полученный спиртовой экстракт отделяют.
Недостатком данного способа является извлечение из шрота чаги сложного комплекса соединений, включающего фенольные вещества, углеводы и меланин. Это усложняет методику стандартизации полученных экстрактов, выделения из них индивидуальных биологически активных веществ.
Технической задачей настоящего изобретения является разработка способа получения фракции липофильных веществ, включающих стериновые соединения, из чаги.
Поставленная задача достигается способом, в котором измельченную чагу экстрагируют водой, полученный водный экстракт отделяют от шрота чаги, шрот высушивают, добавляют к нему петролейный эфир с температурой кипения 40-70°C, кипятят в течение 1 ч, полученный органический экстракт отделяют, удаляют растворитель с получением сухого остатка фракции липофильных веществ.
Технический результат заключается в получении фракции липофильных веществ, включающих стериновые соединения.
Сущность способа заключается в следующем.
Сначала измельченную чагу экстрагируют водой. Водный экстракт отделяют от шрота и используют, например, для получения меланина. Так же на основе водного экстракта чаги в фармацевтической промышленности получают препарат «Бефунгин». При водной экстракции из сырья в экстракт переходят гидрофильные компоненты, что позволяет органическому растворителю легче проникать внутрь сырья (шрота) и увеличить доступность оставшихся в шроте чаги липофильных (гидрофобных) веществ к их дальнейшему извлечению. Оставшийся после отделения водного экстракта шрот предварительно высушивают при комнатной температуре для удаления остаточной влаги. К высушенному шроту чаги добавляют петролейный эфир с температурой кипения 40-70°C. Выбор растворителя обоснован его селективностью по отношению к липофильным веществам, в том числе к стериновым соединениям. При этом в петролейном эфире не растворяются вещества фенольной природы, содержащиеся в сырье в значительном количестве. Проводят кипячение шрота с органическим растворителем в течение оптимального времени проведения процесса - 1 ч. Увеличение времени кипячения шрота не влияет на выход экстрактивных веществ. Полученный органический экстракт отделяют, удаляют растворитель под вакуумом и получают сухой остаток фракции липофильных веществ.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.
Пример 1
Использовали сырье ООО «КФХ «Кентавр», партия 011209.
Проводили экстракцию чаги водой. Полученный водный экстракт отделяли от шрота, шрот высушивали при комнатной температуре. 5 г высушенного шрота чаги заливали 250 мл петролейного эфира с температурой кипения 40-70°C (массовое соотношение шрот: растворитель 1:50), кипятили 1 ч. Экстракт отделяли, удаляли растворитель на вакуумном испарителе при 25-30°C и получали 0,0179±0,0010 г липофильных веществ. В полученной фракции липофильных веществ показано наличие стериновых соединений, количественное содержание которых составило 15,33±0,20 мас.% от экстрактивных веществ.
Пример 2
Аналогичен примеру 1, но для экстракции взяли 10 г шрота (массовое соотношение шрот: растворитель 1:25).
Получили 0,0369±0,0015 г липофильных веществ. В полученной фракции липофильных веществ показано наличие стериновых соединений, количественное содержание которых составляет 12,42±0,50 мас.% от экстрактивных веществ.
Пример 3
Аналогичен примеру 1, но для экстракции взяли 15 г шрота (массовое соотношение шрот: растворитель 1:16).
Получили 0,0507±0,0010 г липофильных веществ. В полученной фракции липофильных веществ показано наличие стериновых соединений, количественное содержание которых составляет 15,20±0,46 мас.% от экстрактивных веществ.
Пример 4
Аналогичен примеру 1, но использовали сырье ИП Гордеев, партия 041010.
Получили 0,0173±0,0010 г липофильных веществ. В полученной фракции липофильных веществ показано наличие стериновых соединений, количественное содержание которых составляет 13,40±0,50 мас.% от экстрактивных веществ.
Таблица 1
Качественный состав фракции липофильных веществ, выделенных из чаги
коэффициент распределения (R<sub>f</sub>)
Отнесение*
0,81-0,90
углеводороды, эфиры стеринов, воски, сквален
0,55
высшие алифатические альдегиды, витамин K
0,32-0,35
Триацилглицериды
0,16-0,17
высшие жирные кислоты
0,14
высшие алифатические спирты
0,09-0,11
Стерины
0,05-0,06
O-диалкиловые эфиры глицерина
0,02-0,04
1,3- и 1,2-диацилглицериды
0,00
моноацилглицериды, 1-O-моноалкиловые эфиры глицерина
* - Кейтс М. Техника липидологии / М. Кейтс. - М., 1975. - 324 с;
f
Качественный состав липофильных веществ во всех полученных экстрактах определяли методом тонкослойной хроматографии на пластинах «Sorbfil». Для разделения нейтральных липофильных соединений использовали систему растворителей №1: петролейный эфир - диэтиловый эфир - уксусная кислота в соотношении 90:10:1, хроматограммы обрабатывали специфичным реагентом на стериновые соединения - раствором хлорного железа (Кейтс М. Техника липидологии. - М., 1975. - 324 с.). В качестве веществ-метчиков использовали миристиновую кислоту, ланостерол (№ S 446793-1ЕА Sigma-Aldrich) и сквален (№83626-10ML Sigma-Aldrich). Идентификацию веществ проводили сравнением коэффициентов распределения (R) с метчиками и данными литературы (таблица 1).
Согласно данным, приведенным в таблице 1, фракция липофильных соединений, выделенная из чаги, кроме стериновых соединений содержит широкий спектр биологически активных веществ, включающих жирные кислоты, алифатические спирты, витамин K, ацилглицериды.
Таблица 2
Состав стериновых соединений фракции липофильных веществ, выделенных из чаги
коэффициент распределения (R<sub>f</sub>)
Отнесение*
0,85
сквален
0,77
ланостерол
0,76
не идентифицировано
0,69
эргостерол
0,60
0,49
0,41
0,35
0,20
не идентифицированы
0,13
0,05
0,02
0,00
* - К вопросу о стандартизации препаратов «чаги настойка» и «Бефунгин» / Е.Н. Жукович // Химико-фармацевтический журнал. - 2010. - Т.44, №.3. - С.35-37.
Для разделения стериновых соединений была подобрана другая система растворителей №2: хлороформ - этанол в соотношении 25:1 (К вопросу о стандартизации препаратов «чаги настойка» и «Бефунгин» / Е.Н. Жукович // Химико-фармацевтический журнал. - 2010. - Т.44, №.3. - С.35-37). Результаты хроматографии представлены в таблице 2. Присутствие в экстрактах сквалена и ланостерола подтверждено использованием стандартов-метчиков: Lanosterol (№ S 446793-1ЕА Sigma-Aldrich) и Squalene (№53626-10ML Sigma-Aldrich).
f
При хроматографировании в системе №2 были идентифицированы сквален, ланостерол, эргостерол (таблица 2), обладающие выраженной биологической активностью (Y. Shin [and others] // Journal of Wood Science. - 2001. - V.47, I.4. - P.313-316.). Не идентифицированные соединения также можно отнести к стериновым веществам по специфической окраске пятен на хроматограмме. Использование дополнительной системы растворителей толуол - муравьиная кислота - этилацетат в соотношении 5:1:4 при сравнении коэффициентов распределения (R) с данными литературы позволило дополнительно идентифицировать инотодиол.
Спектрофотометрическим методом было определено количество стериновых соединений во фракциях липофильных веществ, выделенных из чаги (Антипов Л.В. Физические методы контроля сырья и продуктов в мясной промышленности. - СПб.: ГИОРД, 2006. - 200 с.). Показано, что содержание стериновых соединений во фракциях, полученных по предлагаемому способу, составляет 12,42-15,33 мас.% от экстрактивных веществ фракций. При этом в самом грибе их содержание не превышает 0,60%, а в гидролизатах меланина чаги и спиртовых экстрактах шрота присутствие стериновых соединений обнаружено не было.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет извлечь из чаги фракцию липофильных веществ, включающую стериновые соединения, которые обладают противоопухолевой, иммуномодулирующей и противовоспалительной активностями. Фракция липофильных веществ может быть использована для разработки на ее основе лекарственных препаратов и биологически активных добавок, обеспечивающих терапевтическое действие, которое обусловлено содержанием в них стериновых соединений. Предлагаемое изобретение может быть использовано в промышленных условиях для комплексной переработки сырья чаги.