Изучение процессов кристаллизации в системе Ca(no 3) 2 (NH 4)2hpo 4 na 2SiO 3 / Si(OEt) 4 / желатин h 2O

ХИМИЯ

Вестн. Ом. ун-та. 2011. № 4. С. 131-138.

УДК 546.05, 546.02

О.А. Голованова, М.В. Фильченко, А.П. Солоненко

ИЗУЧЕНИЕ ПРОЦЕССОВ КРИСТАЛЛИЗАЦИИ В СИСТЕМЕ CA(NO3)2 - (NH4)2HPO4 - NA2SIO3 / SI(OET)4 / ЖЕЛАТИН - H2O*

В условиях in vitro была получена серия образцов ортофосфатов кальция путем осаждения малорастворимого соединения из системы Ca(NO3)2 - (NH4)2HPO4 -КН4ОН - Н2О с добавками (силикат-ионы, желатин) при варьировании рН среды: 6.00; 9.00; 12.00. Показано, что добавление силикат-ионов повышает соотношение Са/Р в синтезируемом гидроксилапатите, а концентрация желатины имеет определяющее значение для размера кристаллитов образующейся фазы.

Ключевые слова: биоминерал, гидроксилапатит, брушит, структура, кристалличность, модифицирование.

Введение

Увеличение средней продолжительности жизни, которое должно стать характерной чертой нового тысячелетия, требует решения ряда медико-материаловедческих проблем, в частности, создания материалов для искусственных органов и тканей.

В настоящее время рынок биоматериалов оценивается суммой 84 млрд руб., прогнозируемый годовой прирост составляет 10 % а объемы требуемых материалов оцениваются на уровне десятков тонн.

При утрате значительных по размеру участков кости (вследствие ее повреждения или после удаления опухоли) возникает необходимость в возмещении возникшего дефекта. Число больных, нуждающихся в операциях по восстановлению целостности костей, очень велико: только в США - более 1 млн человек ежегодно [1], в России это число достигает 1,82 млн человек (по данным НИИ ревматологии РАМН).

Создание биоматериалов для замены поврежденной костной ткани - перспективная, бурно развивающаяся область исследований [15,7,10,13 и др.]. Известно, что костная ткань представляет собой композиционный материал на основе ультрадисперсного карбонатсодержащего гидроксилапатита (ГА) и белка коллагена с многоуровневой структурной организацией компонентов. В силу сходства химического состава материалы на основе фосфатов кальция находят широкое применение в медицинской и биохимической практике в качестве сорбентов биополимеров, биосовместимых имплантантов в костной хирургии и в качестве носителей различных лекарственных средств. Считается, что не только химический состав, но и морфология синтетических кристаллов гидроксилапатита является важной характери* Работа выполнена в рамках реализации ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы (ГК № 16.740.11.0602) и при частичной финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 10-05-00881-а, грант № 11-05-90425-Укр_ф_а), в рамках государственного контракта № 14.741.11.0333 от 25.10.2011 с Министерством образования и науки РФ по Федеральной целевой программе ««Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг. по теме «Организационно-методическое обеспечение проведения Всероссийской научной школы “Превентивная медицина: вызовы XXI века”».

© О.А. Голованова, М.В. Фильченко, А.П. Солоненко, 2011

стикой, определяющей отклик организма на чужеродный материал. С этой точки зрения, идеальным является материал, химический состав и гранулометрия которого подобны костному биоминералу: нестехиометрический гидроксилапатит с кристаллами в форме пластин длиной 40-60 нм, шириной около 20 нм и толщиной до 5 нм, которые располагаются длинной стороной (ось с) вдоль коллагеновых волокон [2].

В этой связи возникает целый ряд химико-материаловедческих задач: синтез фосфатов кальция с заданным составом и микроморфологией, оценка их будущей биоактивности in vitro и разработка приемов корректировки биоактивности путем химического модифицирования полученного порошка.

Разработанные к настоящему времени растворные методы синтеза ГА позволяют получать высокодисперсные порошки, форма частиц которых, в зависимости от условий синтеза, непредсказуемо варьируется в широких пределах. Информация о влиянии параметров синтеза ГА на морфологию конечного продукта, выраженная в явном и количественном виде, отсутствует.

Многочисленные исследования направлены на регулирование биологических характеристик синтетического ГА [1-7; 10; 13 и др.]. Одним из перспективных направлений является химическое модифицирование ГА посредством изоморфных замещений. Минеральные фазы природной костной ткани, дентина и эмали содержат значительное количество физиологически важных элементов: натрий, магний, калий, хлор, фтор, а также карбонатные и силикатные группы. Известно, что анионные и катионные замещения в синтетическом ГА оказывают значительное влияние на его взаимодействие с протеинами, клетками и внеклеточными жидкостями организма. В частности, силикатные группы в ГА существенно повышают скорость остеогенеза in vivo при имплантировании керамики [3].

В последнее время большое внимание уделяется изучению соединений гидрокси-лапатита с белками, в частности с коллагеном и аминокислотами, входящими в состав коллагена. По аминокислотному и элементному составу наиболее близка к коллагену желатина. Желатина - смесь тропоколлагеновых цепей и их фрагментов; содержит глицин

[4]. Желатинсодержащие гидроксилапати-ты кальция являются биологически важными материалами и могут быть использованы в хирургии и стоматологии.

Цель данной работы - экспериментальное исследование возможности и закономерностей кристаллизации минеральной фазы в системе Са(Ы0зр - (ИН4)2НР04 -На2БЮз / Б1(0Е1)4 / желатин - Н2О.

Объекты и методы исследования Осаждение основного фосфата кальция проводили при комнатной температуре путем кристаллизации в результате спонтанного осаждения малорастворимого соединения из водного раствора. В качестве исходных реагентов использовали Са(Ы0з)2'4Н20 и (ЫН4^НР04, содержащие ионы Ы0з- и ЫН4+, которые обладают низкой способностью изоморфно замещать ионы в структуре гидроксилапатита.

Получение гидроксилапатита в системе Са2+ - НРО42- - БЮ44- - Н2О

Синтез проводили при постоянной концентрации Са2+ (0.068 моль/л). Концентрации ионов НРО42- и БЮ44- варьируют так, что П1 = БЮ44-/(НРО42- + БЮ44-) изменяется в пределах от 0.5 до 30 % а П2 = Са2+/(НРО42-+БЮ44-) = 1.70. Добавку ионов БЮ44- в виде На28Юз-5Н20 или Б1(0Е1:)4 (0.1 моль/л, спиртовой раствор) вводят в раствор (ЫН4^НР04. В остальном проведение синтеза проводили аналогично вышеописанному способу осаждения основного фосфата кальция.

Получение гидроксилапатита в системе Са2+ - НРО42- - желатин - Н2О

Синтез гидроксилапатита проводили в растворе желатины (марки П-11) при комнатной температуре (22-25°С). Синтез системы проводится при постоянной концентрации РО4з- (0,040 моль/л) и гидроксида аммония (в каждую колбу с раствором Са(Ы0з)2 добавляют 5 мл конц. раствора аммиака). Концентрацию нитрата кальция рассчитывают таким образом, чтобы соотношение Писх = Са(Ы0з)2 / (ЫН4)2НР04 составляло 1,70.

После отстаивания в течение 48 часов растворы фильтровали под вакуумом. По окончании фильтрования осадок на фильтре промывали дистиллированной водой (V = 50 мл), высушивали в сушильном шкафу при температуре ~ 100°С до полного удаления химически не связанной воды.

Полученный осадок анализировали методами ИК-спектроскопии. ИК-спектры были получены на спектрофотометре «ФТ-801». Образцы готовились методом прессования таблеток с КВг. Запись спектра

исследуемых образцов проводили в области от 4000 до 470 см-1. Для расшифровки использовалась программа «ZaIR 3.5», в базах данных которой содержится более 130 тысяч спектров.

Исследование структуры кристаллитов проводили с помощью оптической микроскопии (микроскопа МБР-1 при 120-ти-кратном общем увеличении (увеличение окуляра *15, увеличение объектива х8)).

Содержание основных компонентов в фильтрате определяли с помощью химических методов: Ca и Mg при их совместном присутствии - методом комплексоно-метрического титрования с отделением фосфатов; концентрацию фосфатов - фотометрически по реакции образования молибденовой сини (Лэфф = 690 нм, кюветы с толщиной слоя 2 см); содержание силикат-ионов в фильтрате устанавливают по методике фотометрического определения концентрации кремния в виде желтой формы молибдокремниевой кислоты [РД 52.24.433-2005]. Величину рН системы определяли потенциометрическим методом [5].

Статистическую обработку полученных данных проводили методом Стьюдента для доверительной вероятности Р = 0,95 исходя из предположения о их распределении по нормальному закону (программный пакет Statistic Soft 2006).

Результаты и их обсуждение

Кристаллизация минеральной фазы в системе Са(Ы0э)2 - (ЫИ4)2НР04 - ЩОЩ* -Н2О

Известно, что замещение РО4-тетраэд-ров в составе ГА силикат-ионами рассматривается как одна из возможностей модифицирования и направленного изменения биоактивных и механических свойств основного фосфата кальция. Но, несмотря на то, что многими исследователями [3; 6-9] отмечается сильное влияние наличия кремния в структуре апатита на его биоактивность, вопрос о количественных данных предельной степени замещения фосфатных групп силикатными в структуре апатита остается открытым.

Анализ синтетических фосфатов кальция, полученных при рН = 6.00, методом ИК-Фурье-спетроскопии показал изменение фазового состава при повышении содержания SiO44- в исследуемой системе. В частности, в интервале концентраций кремния от 0,5 до 5,0 % масс. в системе установлено присутствие 2 фосфатов кальция: брушита (на ИК-спектре присутствуют полосы, характерные для валентных (653, 578 и 527 см-1) и деформационных (1135, 1060 и 986 см-1) колебаний связей О-Р-О в тетраэдрах РО43-, а также полосы с минимумами при 3531, 3484 и 1646 см-1, характерные для колебаний кристаллизационной воды) и гидроксила-патита (рис. 1).

- Волновое число

При увеличении количества силикат-ионов, вводимого в систему, интенсивность полос, соответствующих брушиту, уменьшается. Таким образом, начиная с концентрации БЮ^- 10,0 % выявлено образование только гидроксилапатита.

Можно сделать вывод, что силикат-ионы стабилизируют образование ГА.

При изучении зависимости содержания фосфат- и силикат-ионов в осадке установлено, что степень замещения фосфатных групп силикатными до 5,0 % масс. кремния резко возрастает. При повышении концентрации кремния в системе до

10,0 - 30,0 %, увеличение количества фосфат- и силикат-ионов в осадке не так ярко выражено. Данное явление может быть связано с тем, что при малых концентрациях кремния замещение фосфат-ионов более крупными силикат-ионами (расстояния Б1-0 = 1,66 А и Р-О = 1,55 А) стериче-ски менее затруднено по сравнению со случаем, когда в растворе концентрация кремния высокая (10,0 - 30,0 %).

В ИК-спектрах образцов, полученных при рН = 9,00 (аналогично и для рН = 12) (рис. 2), присутствуют полосы, соответствующие V!, Уз, V4 модам колебаний фосфатных групп, в интервалах волновых чисел соответственно 955-962, 1020-1080 и 520-660 см-1. Колебаниям У2 и Уз карбо-

натных групп соответствуют полосы в интервалах 870-875 и 1300-1650 см-1. Карбонатные группы из-за большого сродства к группе БЮ42- компенсируют заряд, что свидетельствует об изоморфном замещении в структуре ГА. Отсутствие в спектрах пика при 1540 см-1 указывает на то, что синтезированные кремнийсодержащие апатиты - преимущественно Б-типа замещения. Пик деформационных колебаний ОН- - групп при 3570 см-1 расположен на фоне полосы высокой интенсивности в области 3200-3700 см-1. Наличие этой полосы может быть обусловлено адсорбированной водой [10]. Интенсивность полос, относящихся к колебаниям групп БЮ44-, при 888 и 504 см-1 низкая, поэтому проследить изменение интенсивности при увеличении содержания кремния от 0,5 до 30,0 масс. % не представляется возможным.

Соотношение Са/Р в образцах, полученных при рН 9,00 при варьировании концентрации кремния, колеблется в интервале значений 1,52-1,56, соответствующих фазе кальций-дефицитного ГА. Для фосфатов кальция, полученных при рН = 12,00, наблюдается увеличение соотношения Са/ Р при повышении концентрации кремния в системе (Са/Р = 1,71 - 2,05). Тот факт, что соотношение Са/Р для кремнийзамещен-

*---- Волновое число

2500

Рис. 2. ИК-спектры образцов, полученных при рН = 9,00 при варьировании С Э1,%

ных апатитов больше, чем для незамещенных, можно объяснить образованием в системе дополнительной фазы - силиката кальция, что приводит к увеличению содержания ионов кальция в осадке.

Таким образом, в данных условиях не обнаружено образование стехиометрического гидроксилапатита, но синтезирован кремнийсодержащий гидроксилапа-тит с соотношением Са/Р = 2,05 (при рН = 12,00 и С(силикат-ионов) = 30,0 %). Данное соотношение Са/Р соответствует значению, характерному для эмали зубов [7].

При изучении морфологии осадка, полученного при рН = 6,00 и небольших концентрациях кремния, установлено, что частицы фосфата кальция имеют вид тонких прозрачных пластинок, характерных

для брушита с примесью ГА (рис. 3а, б). При повышении содержания кремния частицы гидроксилапатита агрегатируют-ся (рис. 4 в, г).

Для фазы, полученной при рН = 9,00, замечено образование кристаллов бруши-та, на которых присутствуют центры кристаллизации гидроксилапатита (рис. 4а). По мере увеличения исходного содержания ионов кремния образуется только ГА (рис. 4 б, в).

Для образца, полученного при рН = = 12,00, на стадии созревания осадка частицы принимают вид закристаллизовавшегося гидроксилапатита, а при увеличении содержания SiO44- в осадке (рис. 5) наблюдается агрегация частиц.

Рис. 3. Вид осадка: а - С Б1 = 0,5 %; б - С Б1 = 1,0 %; в - С Б1 = 2,5 %; г -

С Б1 = 10,0 %

-Я ИЛ ' К Д- Л

яйЙЕ

п. ВаГ ‘ 1 иММгЛйГ^Т - Д Т %*- * Э 0 £ Жи 1- ,1с- • . А ДНгВДД и

Рис. 4. Вид частиц после доведения рН: а - С Б1 = 0,5 %; б - С Б1 = 2,5 %; в - С Б1 = 30,0 %

Рис. 5. Вид частиц после созревания осадка: а - С Б1 = 0,5 %; б - С Б1 = 15,0 %

Кристаллизация минеральной фазы в системе Са(Ы0з)2 - (ЫН4)2НР04 - желатин - Н2О

Как уже упоминалось, гидроксилапа-тит находит широкое применение в медицине. В частности, ГА вводят в качестве армирующей фазы в композиционные материалы на основе полимеров, обеспечивая биологическую совместимость и механические свойства [10-13]. Известны различные способы синтеза ГА, среди которых осаждение в водных растворах биополимеров представляется одним из наиболее перспективных. Нами проведен синтез ГА в водных растворах желатины при варьируемой ее концентрации и рН среды.

С помощью ИК-спектроскопии установлено, что при рН = 6.00 ортофосфаты кальция, полученные осаждением при изменении концентрации желатины от 0,5 до

2,0 г/л, представляют двухфазную смесь брушита и гидроксилапатита (рис. 6).

На спектрах присутствуют полосы, характерные для брушита: валентные (653, 578 и 527 см-1) и деформационные (1135, 1060 и 986 см-1) колебания связей О-Р-О в тетраэдрах РО43-, а также полосы с минимумами при 3531, 3484 и 1646 см-1, характерные для колебаний кристаллизационной воды. Структуру ГА определяют следующие полосы: характерная полоса валентных

колебаний ионов ОН- при 3570 см-1 малой интенсивности, полосы валентных РО43--групп при 962 и 602 см-1.

ИК-спектры поглощения соединений, синтезированных при рН = 9.00; 12.00 имеют одинаковый вид независимо от исходного количества желатины и характеризуются набором полос, характерных как для ГА, так и для желатина (рис. 7).

В области 3600-3100 см-1 в ИК-спект-рах имеется широкая полоса с минимумом 3431 и 3425 см-1 (желатин), соответствующая валентным колебаниям Ы-И. Эта полоса перекрывается полосой валентных колебаний воды, входящей в состав соединений. Полоса при 1453 см-1 характеризует колебания С-Н - групп, входящих в состав желатины, а полосу при 1645 см-1 (1641 - желатин) следует рассматривать как суммарную, отражающую колебания С = О амидной группы желатины и 6(Н2О) гидроксилапатита.

Присутствие в композитах небольшого количества карбоната подтверждается наличием в ИК-спектрах поглощения полос, относящихся к колебаниям карбонатных групп при частотах 1454 и 1423 см-1 и полосы при 875 см-1.

Полоса на всех ИК-спектрах в области 1384 см-1 соответствует колебаниям ЫИ4+ -и Ы03--групп, так как небольшая доля нитрата аммония захватывается и удерживается порошком за счет адсорбции. Значительная часть этой соли удерживается плотными агрегатами кристаллов желатинсодержащего ГА (межкристалли-ческий захват). Кроме того, выпадающий первоначально из раствора аморфный фосфат кальция имеет мезопористую стуктуру с порами, заполненными маточным раствором. ГА, кристаллизующийся из аморфного фосфата кальция при старении, наследует его пористую структуру. Это означает, что в первичных кристал-

литах ГА часть N^N03 может присутствовать в виде порового флюида [14].

При повышении содержания желатина в системе значительного изменения концентрации кальция не установлено. При этом увеличение концентрации желатина в исследуемом растворе сказывается на возрастании массы полученных осадков, что свидетельствует об увеличении содержания желатина в получаемых композитах.

Таким образом, можно сделать вывод, что в системе Са(Ы03)2 - (ЫИ4)2ИР04 - желатин - И20 в твердую фазу выделяются осадки - желатинсодержащие гидрокси-лапатиты кальция общей формулы Саю(Р04)б(0И)2  х И2О  у желатина, что согласуется с данными ИК-спектроскопии.

В процессе осаждения ГА в растворе желатины концентрация последней является определяющим фактором в зарождении кристаллов ГА. По-видимому, плотность центров кристаллизации, зависящая от концентрации желатины, имеет определяющее значение для размера частиц выделяющейся фазы. При высокой плотности центров кристаллизации происходит взаимодействие растущих частиц, их объединение и укрупнение (рис. 8) [11].

Таким образом, в работе разработан синтез модифицированных фосфатов кальция при варьировании рН среды: 6,00; 9,00; 12,00.

Рис. 8. Вид осадка: рН = 6,00 Сж = 0,5 г/л; рН = 9,00 Сж = 1,0 г/л; рН = 12,00 Сж = 1,5 г/л

В присутствии силиката натрия и тет-раэтоксисилана установлено: при рН синтеза = 6,00 и увеличении концентрации силикат-ионов в системе происходит фазовый переход брушита в кальций-дефицитный ГА; при рН синтеза = 9,00 и

12,00 образуются кремнийзамещенные гидроксилапатиты, причем степень замещения для силиката натрия выше, чем для тетраэтоксисилана; добавление силикат-ионов повышает соотношение Са/Р в гидроксилапатите.

Синтезированы желатинсодержащие фосфаты кальция, при этом выявлено: при повышении исходного количества желатины увеличивается масса осадка, а также ее содержание в нем; концентрация желатины имеет определяющее значение для размера выделяющейся фазы.

Ввиду того, что в ходе проведенной работы получены кремнийсодержащие ортофосфаты кальция (при варьировании рН среды и концентрации силикат-ионов в растворе), развитием данного направления является получение плотной и пористой керамики на основе синтезированных соединений.

ЛИТЕРАТУРА

[1] Вересов А. Г., Путляев В. И., Третьяков Ю. Д. Химия неорганических биоматериалов на основе фосфатов кальция // Российский химический журнал. 2004. Т. 48. № 4. С. 52-64.

[2] Кузнецов А. В., Фомин А. С., Вересов А. Г., Путляев В. И., Фадеева И. В., Баринов С. М. Гидроксилапатит пластинчатой морфологии, синтезированный осаждением из растворов с применением ультразвука // Неорганическая химия. 2008. Т. 53. № 1. С. 5-10.

[3] Бакунова Н. В., Фомин А. С., Фадеева И. В. и др. Нанопорошки кремнийсодержащих гидро-ксилапатитов // Неорганическая химия. 2007. Т. 52. № 10. С. 1594-1599.

[4] Ежова Ж. А., Захаров Н. А., Коваль Е. М., Калинников В. Т. Синтез и физико-химическое исследование желатиносодержащих гидро-ксилапатитов кальция // Неорганическая химия. 2009. Т. 54. № 3. С. 526-530.

[5] РД 52.24.433-2005. Массовая концентрация кремния в поверхностных водах суши. Методика выполнения измерений фотометрическим методом в виде желтой формы молиб-докремниевой кислоты. М. : ГУ «Гидрохимический институт», 2005.

[6] Розанцев Г. М., Заславская Л. В., Белоусова Е. Е. Синтез гидроксилапатита, модифицированного ионами лантана и кремния // Неорганическая химия. 2005. Т. 50. № 3. С. 357-361.

[7] Sergey V. Dorozhkin, Calcium orthophosphates // Journal of Material Science. 2007. T. 42. P. 1061-1095.

[8] Кузнецов А. В., Вересов А. Г., Путляев В. И. Гидролитическая активность силикофосфатов в системе Ca2SiO4 - Ca3(PO4)2 // Альтернативная энергетика и экология. 2009. Т. 45. № 1. С. 82-85.

[9] Баринов С. М., Фадеева И. В., Ферро Д., Ком-лев В. С., Фомин А. С. О стабилизации карбонатсодержащего гидроксилапатита изоморфным замещением кальция натрием // Неорганическая химия. 2008. Т. 53. № 2. С. 204-208.

[10] Ежова Ж.А., Захаров Н.А., Коваль Е.М., Калинников В. Т. Синтез и физико-химическое исследование желатинсодержащих гидрокси-лапатитов кальция // Неорганическая химия. 2009. Т. 54. № 3. С. 526-530.

[11] Фомин А. С., Баринов С. М., Фадеева И. В. и др. Наноразмерный гидроксилапатит, синтезированный осаждением в растворе желатина // Доклады Академии наук. 2006. Т. 411. № 3. С. 348-351.

[12] Ежова Ж. А, Орловский В. П., Коваль Е. М. Изучение условий совместного осаждения гидроксилапатита кальция, гидроксида титана и коллагена аммиаком из водных растворов // Неорганическая химия. 2000. Т. 45. № 4.

С. 727-731.

[13] Родичева Г. В., Орловский В. П., Романова Н. М. Синтез и физико-химическое исследование глицинсодержащего гидроксилапати-та кальция // Неорганическая химия. 2000, Т. 45. № 4. С. 648-651.

[14] Сафронова Т. В., Шехирев М. А, Путляев В. И., Третьяков Ю. Д. Керамические материалы на основе гидроксилапатита, полученные из растворов различной концентрации // Неорганическая химия. 2007. Т. 43. № 8. С.1005-1014.