Проблемы и достижения в структурном анализе сульфатированных полисахаридов красных водорослей

Химия растительного сырья. 2001. №2. С. 7-20.

УДК 547.458+582.273

ПРОБЛЕМЫ И ДОСТИЖЕНИЯ В СТРУКТУРНОМ АНАЛИЗЕ СУЛЬФАТИРОВАННЫХ ПОЛИСАХАРИДОВ КРАСНЫХ ВОДОРОСЛЕЙ

© А.И. Усов

Институт органической химии им. Н.Д.Зелинского РАН Москва (Россия) e-mail: usov@ioc.ac.ru

Обзорная статья посвящена истории развития и современному состоянию методов определения первичной структуры сульфатированных галактанов красных морских водорослей. Рассмотрены специфические химические методы исследования, используемые в этом классе полисахаридов, такие как сольволитическое десульфатирование, а также полный и частичный восстановительный гидролиз, позволяющий определять количество и абсолютную конфигурацию производных 3,6-ангидрогалактозы. Изложены возможности применения спектроскопии ЯМР для установления строения сложных галактанов, а также данные, получаемые при прямом анализе биомассы водорослей без выделения полисахаридов. Обсуждается применимость накопленных сведений о структурном разнообразии галактанов для обнаружения новых источников практически ценных полисахаридов и для химической таксономии красных водорослей.

Работа поддержана грантом Научного совета РАН "Химия и технология переработки возобновляемого растительного сырья " ХТРС №8.1.14.

Введение. Общие представления о строении галактанов красных водорослей

Сульфатированные галактаны красных морских водорослей представляют собой уникальный класс полисахаридов [1-3]. В основе молекул большинства галактанов лежит углеводная цепь, построенная из чередующихся остатков 3-связанной P-D-галактопиранозы и 4-связанной а-галактопиранозы. Эти 4-связанные остатки могут частично или полностью находиться в форме 3,6-ангидропроизводного и принадлежать либо к L-ряду (в полисахаридах группы агара), либо к D-ряду (в полисахаридах группы каррагинана). Таким образом, в основе молекул галактанов лежат четыре типа дисахаридных повторяющихся звеньев (схема 1) [4].

Гидроксильные группы линейных цепей галактанов могут нести разнообразные заместители. Для полисахаридов группы агара наиболее характерно наличие О-метильных и сульфатных групп, единичных остатков моносахаридов, таких как 4-О-метил-а^-галактопираноза или P-D-ксилопираноза, и ацеталей пировиноградной кислоты в положении 4,6 остатков P-D-галактозы (схема 2). При этом только в сравнительно редких случаях молекула галактана представляет собой строго регулярный полимер, построенный из одинаковых повторяющихся звеньев (примером является агароза). Гораздо чаще в составе галактана можно обнаружить несколько повторяющихся звеньев, различающихся наличием или отсутствием 3,6-ангидрогалактозы и природой заместителей, как в случае порфирана

(схема 2). В полисахаридах группы каррагинана главными заместителями являются сульфатные группы, и отдельные представители этих полисахаридов, обладающие регулярной структурой и различающиеся числом и расположением сульфатных групп в повторяющихся звеньях, принято обозначать буквами греческого алфавита (схема 3).

Некоторые галактаны находят широкое практическое применение как гелеобразователи или стабилизаторы суспензий и эмульсий, в первую очередь в пищевой технологии, биотехнологии и медицине [5, 6]. В настоящее время известно, что необходимым условием для проявления гелеобразующих свойств является высокое содержание остатков 3,6-ангидрогалактозы и высокая степень регулярности строения полисахаридов [7]. При этом в полисахаридах группы агара наиболее прочные гели дает несульфатированная агароза, а увеличение степени сульфатирования обычно снижает гелеобразующие свойства вплоть до их полного исчезновения. Напротив, для образования гелей в каррагинанах требуется вполне определенное расположение сульфатных групп, но в этом случае гели формируются только в присутствии специфических катионов. Галактаны многих красных водорослей благодаря своим структурным особенностям не способны к гелеобразованию, однако им можно придать гелеобразующие свойства путем химической модификации или использовать в нативном виде как биологически активные вещества. В соответствии с этим знание первичной структуры конкретного галактана позволяет предложить наиболее рациональные пути его практического использования. Систематизация имеющихся сведений о связи химического строения галактанов с таксономическим положением соответствующих водорослей имеет большое значение при поиске новых видов водорослей - потенциальных источников практически ценных полисахаридов.

ОН

О

агаран

агароза

НО

ОН

каррагинан

каррагиноза

Схема 1. Повторяющиеся дисахаридные звенья четырех базовых структур галактанов красных водорослей

Я30

Я = Н или Ме Я1 = Н, Ме или Р-Б-Ху]р Я2 = Н или 803-Я3 = Н или 803Я* = Н, Ме, 803-, Р-Б-Ху]р или 4-0-Ме-а-Ь-ва]р Я3,Я* = Н00С ч ,

\/

Ме

порфиран

Схема 2. Структурные особенности полисахаридов группы агара

Химические методы структурного анализа сульфатированных галактанов

Классическая последовательность операций при установлении строения сульфатированных галактанов состоит в выделении полисахарида из водоросли, расщеплении его на моно- и олигомеры, идентификации и количественном определении продуктов расщепления и использовании полученных данных для воссоздания структуры исходного полимера (схема 4 а, Ь, с). Мы не будем обсуждать здесь проблему выделения индивидуальных полисахаридов, скажем только, что это довольно трудоемкая и весьма нестандартная во многих случаях процедура, поскольку свойства выделяемого вещества определяются его строением, которое в момент выделения неизвестно и его еще только предстоит установить. Химические методы структурного анализа также требуют больших затрат труда и времени. Тем не менее именно таким путем было установлено строение первых представителей рассматриваемого класса полисахаридов. По сравнению с другими природными полисахаридами использование химических методов в галактанах красных водорослей имеет ряд особенностей, связанных с наличием

3,6-ангидрогалактозы и сульфатных групп.

омега-каррагинан

каппа-каррагинан

иота-каррагинан

Схема 3. Повторяющиеся звенья некоторых распространенных каррагинанов

Важный компонент галактанов, 3,6-ангидрогалактоза, - это единственная 3,6-ангидрогексоза, найденная в природе, и она не встречается нигде, кроме красных водорослей. Этот моносахарид отличается большой склонностью к деградации в кислой среде, так что в условиях кислотного гидролиза гликозидных связей, применяемого для определения моносахаридного состава полисахаридов, 3,6-ангидрогалактоза разрушается полностью. Такая легкая деструкция позволяет избирательно определять 3,6-ангидрогалактозу в присутствии других сахаров по цветной реакции с резорцином [8]. Необходимо иметь в виду, что одновременно в эту реакцию вступает и 2-О-метил-3,6-ангидрогалактоза, остатки которой часто присутствуют в агароподобных полисахаридах. Естественно, колориметрическая методика не дает информации об абсолютной конфигурации ангидросахара.

Необходимость определять абсолютную конфигурацию 3,6-ангидрогалактозы заставила разработать несколько приемов химического расщепления галактанов, при которых удавалось избежать разрушения этого моносахарида и выделять соответствующие защищенные производные 3,6-ангидрогалактозы в препаративных количествах. К таким приемам относятся кислотный меркаптолиз, кислотный метанолиз и окислительный гидролиз (схема 5). Они в свое время сыграли важную роль при изучении как агаров, так и каррагинанов, но сейчас заменены более удобным в практическом отношении восстановительным гидролизом [9].

Сырье

(биомасса

водоросли)

Выделение ----------->

Полисахарид

Химические

методы

структурного

анализа

-----------

Продукты

химических

модификаций

Восстановительный (Ф і Спектроскопия

гидролиз т ЯМР

Количественное содержание галактана, отнесение к группе агара или каррагинана, прогноз способности к гелеобразованию

Идентификация или установление строения по спектральным данным

Строение

полисахарида

Схема 4. Последовательность операций при установлении строения галактана

Этот последний вариант расщепления галактанов удалось разработать после того, как был найден достаточно эффективный и относительно устойчивый в кислой среде восстановитель - 4-метил-морфолин-боран [10]. Хотя этот реагент разрушается при нагревании с кислотой, гидролиз гликозидных связей остатков 3,6-ангидрогалактозы происходит быстрее, и освобождающиеся альдегидные группы успевают восстановиться, давая вполне устойчивый к кислотам 3,6-ангидродульцит. Остатки 2-О-метил-

3,6-ангидрогалактозы превращаются в этих условиях в остатки 2-О-метил-3,6-ангидродульцита. Гидролиз прочих гликозидных связей происходит много медленнее и приводит к образованию альдоз, которые можно либо дополнительно восстановить (для анализа методом ГЖХ в виде ацетатов полиолов), действуя на гидролизат новой порцией 4-метилморфолин-борана или более привычным боргидридом натрия, а можно превратить в ацетаты альдононитрилов и также проанализировать методом ГЖХ. В обоих случаях 3,6-ангидродульцит и 2-О-метил-3,6-ангидродульцит превращаются в ацетаты, которые в условиях ГЖХ легко отделяются друг от друга и от производных других сахаров. Таким образом, восстановительный гидролиз позволяет в одной пробе и одним методом количественно определить полный моносахаридный состав образца полисахарида (схема 6) [11, 12].

Гликозидные связи остатков 3,6-ангидрогалактозы расщепляются в кислой среде на 2-3 порядка быстрее галактозидных связей, и это явление удобно использовать для частичного расщепления молекул галактанов. В частности, кислотный метанолиз, приводящий к диметилацеталям диастереомерных дисахаридов (агаробиозы - из агаров или каррабиозы - из каррагинанов, схема 5), применялся как для определения абсолютной конфигурации остатков 3,6-ангидрогалактозы, так и для оценки распределения остатков 3,6-ангидрогалактозы вдоль цепи галактана (по выходу дисахарида) в тех случаях, когда 4-связанные моносахаридные остатки лишь частично представлены 3,6-ангидрогалактозой [13]. После введения в практику 4-метилморфолин-борана было показано, что для частичного расщепления галактанов, содержащих остатки 3,6-ангидрогалактозы, удобнее всего использовать восстановительное расщепление. При этом могут образоваться диастереомерные восстановленные дисахариды - агаробиит

или каррабиит (схема 7). Ацетаты этих дисахаридов хорошо разделяются методом ГЖХ, что позволяет определять абсолютную конфигурацию 3,6-ангидрогалактозы, а следовательно, относить неизвестный полисахарид к группе агара или каррагинана, на хроматографическом уровне с минимальными затратами времени и вещества [11].

0.5% НС1/МеОН, кипячение 2 ч

Схема 5. Различные варианты расщепления каппа-каррагинана, предохраняющие остатки

3,6-ангидрогалактозы от кислотной деградации

Схема 6. Полный восстановительный гидролиз агароподобного полисахарида

При невысоком содержании 3,6-ангидрогалактозы в полисахариде результатом частичного восстановительного гидролиза будут высшие олигосахариды, содержащие остаток 3,6-ангидродульцита на восстановленном конце. В мягких условиях частичного гидролиза в таких олигосахаридах удается сохранить сульфатные группы и ответвления от главной цепи. Этим способом удалось, например, выделить сульфатированный пентасахаридный фрагмент агарановой цепи с боковым остатком ксилозы и впервые непосредственно определить положение этого ответвления [14]. Частичный восстановительный гидролиз полезен и при изучении галактанов методом метилирования, поскольку позволяет получать восстановленные и частично метилированные дисахаридные фрагменты. В этом случае также удается разделять методом ГЖХ диастереомеры, различающиеся только абсолютной конфигурацией остатка

3.6-ангидродульцита [15].

Помимо 3,6-ангидрогалактозы, не менее важным структурным элементом галактанов, определяющим их свойства и химическое поведение, являются сульфатные группы. Эти группы отщепляются в кислой среде со скоростями, сравнимыми со скоростью гидролиза галактозидных связей, так что при полном кислотном гидролизе полисахарида происходит и полное десульфатирование. В щелочной среде, включая условия метилирования полисахаридов, сульфатные группы обычно устойчивы, за одним исключением: сульфат в положении 6 остатка галактозы, связанного в положении 4, легко претерпевает внутримолекулярное замещение свободным гидроксилом при С-3 с образованием 3,6-ангидрогалактозы [16]. Именно такая последовательность реакций (ферментативное сульфатирование по С-6 с последующим ферментативным элиминированием серной кислоты, приводящим к образованию

3.6-ангидроцикла) лежит в основе биосинтеза остатков 3,6-ангидрогалактозы в составе галактанов красных водорослей [17], а в промышленности щелочная обработка водорослей часто применяется для увеличения содержания 3,6-ангидрогалактозы и, следовательно, для улучшения гелеобразующих свойств выделяемых полисахаридов. В структурном анализе обычным приемом для локализации устойчивых к щелочи сульфатных групп служит сравнение результатов метилирования нативного полисахарида и его десульфатированного производного, однако для этого нужны эффективные методы десульфатирования.

Варианты кислотной обработки (чаще всего кислотный метанолиз) иногда удается использовать для полисахаридов, не содержащих 3,6-ангидрогалактозы, но в общем случае такая обработка приводит к слишком сильной деградации полимера. Более мягким способом является так называемое сольволитическое десульфатирование [18], при котором прямое действие кислоты на полисахарид исключено: сульфатированный галактан, обычно в виде пиридиниевой соли, нагревают в растворителе, способном образовать комплекс с серным ангидридом, чаще всего в диметилсульфоксиде. Недавно предложена важная модификация этого метода, согласно которой в реакционную смесь дополнительно вводят реагент (например, А$203), образующий особенно прочные комплексы с серным ангидридом [19].

.

0 /1ЧМе ВНз , 0.5 М СР3СООИ, 65 °С, 8 ч

Схема 7. Частичный восстановительный гидролиз агаров и каррагинанов

В остальном для структурного анализа галактанов используют весь арсенал химических методов установления строения, применяемый при изучении других классов полисахаридов.

Физико-химические методы структурного анализа галактанов

Процедура установления строения галактанов красных водорослей существенно изменилась после введения в практику спектроскопии 13С-ЯМР [20]. В 1977 г. было показано, что углеродные спектры регулярных полисахаридов типа агарозы или каппа-каррагинана выглядят как спектры дисахаридов и представляют собой 12 хорошо разрешенных сигналов. При этом положение аномерного сигнала 4-связанной галактозы зависит от ее абсолютной конфигурации, что позволяет по спектру 13С-ЯМР относить неизвестный полисахарид к группе агара или каррагинана [21]. Заместители типа О-метильных или сульфатных групп вызывают закономерные смещения сигналов ближайших атомов углерода (как правило, на 6-10 м.д. в слабое поле для атома, несущего заместитель, и на 2-4 м.д. в сильное поле для двух соседних атомов), что дает возможность локализовать такие заместители по данным спектра 13С-ЯМР. Вскоре были описаны и сведены в таблицу спектры 13С-ЯМР дисахаридных повторяющихся звеньев большинства наиболее известных галактанов красных водорослей [22]. В результате этой работы впервые появилась возможность прямой идентификации галактанов: если из водоросли выделяли полисахарид уже известного типа, то вместо длительной процедуры его химического исследования было достаточно сравнить его спектр 13С-ЯМР с литературными данными [23]. В случае же обнаружения новых повторяющихся звеньев их строение можно было вывести из спектра 13С-ЯМР, зная закономерности изменения положения сигналов под действием заместителей [23] (схема 4, ф. Спектроскопию 13С-ЯМР стали весьма эффективно использовать и в сочетании с химическими методами структурного анализа, например, для оценки результатов химической модификации полимеров [24], ферментативного гидролиза [25] и т.д. Со временем усовершенствование разрешающей способности спектрометров привело к тому, что стало возможным получение удовлетворительных спектров :Н-ЯМР полисахаридов. Это позволило применять для интерпретации сигналов технику двумерной спектроскопии [26]. Современная работа по установлению строения галактанов просто немыслима без применения спектроскопии ЯМР.

В то же время не следует думать, что этот метод решил все проблемы структурного анализа. Его главная ценность состоит в том, что по спектрам 13С-ЯМР можно легко отделить сравнительно простые полисахариды от более сложных, для которых одних спектральных данных недостаточно, и сосредоточить усилия по применению химических методов исследования на установлении строения последних. Хорошим примером таких сложных галактанов являются полисахариды известковых красных водорослей, так называемые «кораллинаны» [27]. Они представляют собой агараны, настолько перегруженные заместителями (О-метильными, сульфатными группами и остатками Р-Б-ксилопиранозы), что сигналы углеродных атомов главной цепи в спектре 13С-ЯМР выглядят как уширенные и плохо разрешенные пики, которые невозможно интерпретировать. Однако несколько химических модификаций (десульфатирование до и после расщепления по Смиту) и анализ спектров ЯМР модифицированных полимеров позволили разобраться в структуре этих полисахаридов [28].

Для структурного анализа сложных галактанов, в молекулах которых встречается несколько различных повторяющихся звеньев, недавно предложен новый подход, заключающийся в сопоставлении

спектров 13С-ЯМР нативного полисахарида, продукта его метилирования и продуктов десульфатирования этих двух полимеров. Принципы этого подхода изложены в двух обстоятельных статьях, опубликованных в 2000 г. [29, 30], а несколько других работ иллюстрируют использование этой методики при изучении конкретных галактанов [31, 32]. Следует отметить, что интерпретация спектров 13С-ЯМР обычно делается в предположении, что полисахариды содержат блоки, построенные из одинаковых дисахаридных звеньев. Блочное построение было действительно доказано в ряде случаев для галактанов, содержащих 2-3 типа повторяющихся звеньев (см., например, [25]), но с дальнейшим усложнением димерного состава удельный вес «переходных областей» в структуре должен неизбежно возрастать. Как выглядят спектры 13С-ЯМР таких переходных областей, где непосредственно соседствуют дисахаридные звенья разного строения, еще предстоит установить.

Из других физико-химических методов исследования в галактанах красных водорослей традиционно широко используется ИК-спектроскопия. В ИК-спектрах можно видеть полосу поглощения при 1240 см-1 , общую для всех сульфатных групп, и специфические полосы поглощения первичного (820 см-1), вторичного экваториального (830 см-1) и вторичного аксиального (850 см-1) сульфата. Сульфатная группа в положении 2 остатка 3,6-ангидрогалактозы обладает собственной полосой поглощения при 810 см-1 [33]. Исходя из этого можно использовать ИК-спектры как простой метод локализации сульфатных групп, дающий ориентировочные сведения о количественном содержании сульфата в разных положениях молекулы полисахарида [34].

Анализ биомассы водорослей

Применение спектроскопии ЯМР позволило модернизировать процедуру установления строения, но никак не сказалось на процессе выделения полисахаридов. В то же время было очень заманчиво научиться получать данные о полисахаридном составе водорослей заранее, до выделения из нее сульфатированных галактанов (схема 4, е). Такая возможность появилась вместе с введением в практику исследований полного и частичного восстановительного гидролиза [35].

При полном восстановительном гидролизе небольших навесок биомассы водоросли можно получить данные о соотношении 3,6-ангидрогалактозы и галактозы, а также о содержании глюкозы и ксилозы, компонентов сопутствующих галактанам полисахаридов - флоридного крахмала и ксилана. Высокое содержание 3,6-ангидрогалактозы означает, что водоросль может оказаться перспективным источником гелеобразующего галактана. При низком содержании 3,6-ангидрогалактозы имеет смысл обработать биомассу щелочью и повторить полный восстановительный гидролиз: если содержание

3,6-ангидрогалактозы при этом существенно возрастает, то гелеобразующие свойства галактану можно, вероятно, придать путем несложной щелочной обработки. Параллельно с другой навеской биомассы проводят частичный восстановительный гидролиз. Обнаружение в продуктах этого гидролиза агаробиита или каррабиита позволяет отнести галактан к группе агара или каррагинана. Следует иметь в виду, что низкий выход восстановленных дисахаридов, определяемых в виде ацетатов методом ГЖХ, может быть следствием высокой степени сульфатирования исходного полисахарида, поэтому целесообразно ацетилировать продукты частичного восстановительного гидролиза в условиях, способствующих десульфатированию [15]. Интересно отметить, что для агаров с высокой степенью метилирования частичный восстановительный гидролиз приводит к получению набора метилированных

агаробиитов, в которых можно локализовать метильные группы с помощью хромато-масс-спектрометрии [36].

Описанный анализ биомассы водорослей позволяет быстро получить предварительные сведения о полисахаридном составе больших серий образцов и особенно полезен при выборе объектов для более подробных исследований, поиске новых источников практически ценных полисахаридов или установлении корреляций между полисахаридным составом и таксономическим положением водоросли.

Из физико-химических методов исследования для анализа биомассы предложен специальный вариант ИК-спектроскопии (спектроскопия диффузного отражения), позволяющий идентифицировать

каррагинаны в высушенных и измельченных образцах водорослей [37].

Заключение. Сульфатированные галактаны как таксономические маркеры красных водорослей

Отдел красных водорослей насчитывает около 4000 видов растений, разделенных на несколько порядков, несколько десятков семейств и несколько сотен родов. Поскольку высококачественный агар или гелеобразующие каррагинаны традиционно получают всего из нескольких видов водорослей, постоянно существует проблема поиска новых перспективных источников сырья. Установление корреляций между таксономическим положением водоросли и ее полисахаридным составом могло бы оказать большую пользу в этом поиске. Первая попытка связать полисахаридный состав и ботаническую классификацию красных водорослей была сделана еще в 1957 г., когда сведения о химическом строении галактанов практически отсутствовали, и авторы принимали во внимание главным образом физикохимические свойства экстрактов [38]. Более позднее рассмотрение этого вопроса с учетом структур полисахаридов можно найти в обзоре Крэйги, опубликованном в 1990 г. [39], однако за последние годы получено много новых данных, позволяющих существенно дополнить картину десятилетней давности [40]. Главное открытие этого периода заключается в том, что между водорослями, производящими каррагинан, и агарофитами нет такого глубокого различия, какое предполагалось ранее в течение многих лет. В последние годы все чаще обнаруживаются галактаны, в которых соотношение производных Б- и Ь-галактозы отличается от единицы и которые можно рассматривать как молекулярные гибриды агара и каррагинана. Фракции галактанов, содержащие Ь-галактозу, найдены в составе нескольких «классических» каррагинанофитов [41, 42], а фракции, содержащие 4-связанную Б-галактозу, - в составе агарофитов [43-45].

По-видимому, не вызывает сомнений тот факт, что водоросли, принадлежащие к разным порядкам, различаются и по структуре полисахаридов (табл.). Особенно четко это видно на примере таких порядков, как Gigartinales, к которому относятся все практически важные источники каррагинанов, ОгасПапакБ (водоросли содержат агары), Ра1тапа1е8 (единственный порядок, где ксиланы преобладают над галактанами), СогаШпа1е8 (единственный порядок, где обнаружены альгиновые кислоты). В то же время пестрый полисахаридный состав таких порядков, как №таИа1е8, Cryptonemia1es и Сегата1е8, возможно, свидетельствует о необходимости пересмотра ботанической классификации соответствующих водорослей. Имеются интересные данные о различиях в полисахаридном составе водорослей, входящих в состав более мелких групп - семейств, родов и даже отдельных видов [39, 40], но подробное рассмотрение этих различий выходит за рамки настоящей статьи. Несомненно, приведенные в таблице данные будут уточняться по мере появления новых результатов структурного анализа полисахаридов, но

даже такая таблица может оказать большую помощь при выборе новых видов водорослей, пригодных либо для непосредственного использования в качестве сырья при получении полисахаридов, либо для введения с этой же целью в марикультуру.

Таблица. Зависимость полисахаридного состава от таксономического положения водоросли на примере подкласса F1orideophyceae

Порядок Семейство Тип полисахарида

NEMALIALES Nemalionaceae, Сульфатированные ксиломаннаны и

Helminthocladiaceae нейтральные ксиланы

Chaetangiaceae

Gelidiaceae, Наиболее типичные агары

Gelidiellaceae

CORALLINALES Corallinaceae Сульфатированные ксилогалактаны группы агара и альгиновые кислоты

CRYPTONEMIALES Halymeniaceae, Kallymeniaceae, Dumontiaceae Сложные сульфатированные галактаны

Endocladiaceae Модифицированные агары

Tichocarpaceae Каррагинаны

GRACILARIALES Gracilariaceae Агары

GIGARTINALES Большинство семейств Наиболее типичные каррагинаны

RHODYMENIALES Все семейства Сложные сульфатированные галактаны

PALMARIALES Palmariaceae Нейтральные ксиланы и сульфатированные галактаны группы агара

CERAMIALES Delesseriaceae Сложные сульфатированные галактаны

Ceramiaceae, Rhodomelaceae Модифицированные агары

Список литературы

1. Усов А.И. Полисахариды красных морских водорослей // Прогресс химии углеводов. М., 1985. С. 77-96.

2. Usov A.I. Sulfated polysaccharides of the red seaweeds // Food Hydrocolloids. 1992. V. 6. №1. P. 9-23.

3. Usov A.I. Structural analysis of red seaweed galactans of agar and carrageenan groups // Food Hydrocolloids. 1998. V. 12. №3. P. 301-308.

4. Knutsen S.H., Myslabodski D.E., Larsen B., Usov A.I. A modified system of nomenclature for red algal galactans // Bot. Mar. V. 37. №2. P. 163-169.

5. Selby H.H., Whistler R.L. Agar // Industrial gums: Polysaccharides and their derivatives. San Diego, CA, 1993. P. 87103.

6. Therkelsen G.H. Carrageenan // Industrial gums: Polysaccharides and their derivatives. San Diego, CA, 1993. P. 145180.

7. Rees D.A. Structure, conformation, and mechanism in the formation of polysaccharide gels and networks // Adv. Carbohydr.Chem. Biochem. 1969. V. 24. P. 267-332.

8. Yaphe W., Arsenault G.P. Improved resorcinol reagent for the determination of fructose, and of 3,6-anhydrogalactose in polysaccharides // Anal. Biochem. 1965. V. 13. №3. P. 143-148.

9. Usov A.I. A new chemical tool for characterization and partial depolymerization of red algal galactans // Hydrobiologia. 1993. V. 260/261. P. 641-645.

10. Garegg P.J., Lindberg B., Konradsson P., Kvarnstrom I. Hydrolysis of glycosides under reducing conditions // Carbohydr. Res. 1988. V. 176. №1. P. 145-148.

11. Усов А.И., Элашвили М.Я. Количественное определение производных 3,6-ангидрогалактозы и специфическое расщепление галактанов красных водорослей в условиях восстановительного гидролиза // Биоорган. химия. 1991. Т. 17. №6. С. 839-848.

12. Stevenson T.T., Furneaux R.H. Chemical methods for the analysis of sulphated galactans from red algae // Carbohydr. Res. 1991. V. 210. P. 277-280.

13. Anderson N.S., Rees D.A. The repeating structure of some polysaccharide sulphates from red seaweeds // Proc. Int. Seaweed Symp. 1966. V. 5. P. 243-249.

14. Usov A.I., Elashvili M.Ya. Polysaccharides of algae. 44. Investigation of sulfated galactan from Laurencia nipponica Yamada (Rhodophyta, Rhodomelaceae) using partial reductive hydrolysis // Bot. Mar. 1991. V. 34. №6. P. 553-560.

1 5. Falshaw R., Furneaux R.H. The structural analysis of disaccharides from red algal galactans by methylation and reductive partial-hydrolysis // Carbohydr. Res. 1995. V. 269. №1. P. 183-189.

1 6. Rees D.A. Estimation of the relative amounts of isomeric sulphate esters in some sulphated polysaccharides // J. Chem. Soc. 1961. №12. P. 5168-5171.

17. Rees D.A. Enzymic synthesis of 3,6-anhydro-L-galactose within porphyran from L-galactose 6-sulphate units // Biochem. J. 1961. V. 81. №3. P. 347-352.

18. Usov A.I., Adamyants K.S., Miroshnikova L.I., Shaposhnikova A.A., Kochetkov N.K. Solvolytic desulphation of sulphated carbohydrates // Carbohydr. Res. 1971. V. 18. №2. P. 336-338.

19. Miller I.J., Blunt J.W. Desulfation of algal galactans // Carbohydr. Res. 1998. V. 309. №1. P. 39-43.

20. Usov A.I. NMR spectroscopy of red seaweed polysaccharides: agars, carrageenans, and xylans // Bot. Mar. 1 984. V. 27. №5. P. 189-202.

21. Яроцкий С.В., Шашков А.С., Усов А.И. Анализ спектров 13С-ЯМР некоторых галактанов красных водорослей // Биоорган. химия. 1977. Т. 3. №8. С. 1135-1137.

22. Usov A.I., Yarotsky S.V., Shashkov A.S. 13C-NMR spectroscopy of red algal galactans // Biopolymers. 1980. V. 19. №5. P. 977-990.

23. Usov A.I., Shashkov A.S. Polysaccharides of algae. 34. Detection of iota-carrageenan in Phyllophora brodiaei (Turn.) J. Ag. (Rhodophyta) using 13C-NMR spectroscopy // Bot. Mar. 1985. V. 28. №9. P. 367-373.

24. Usov A.I., Ivanova E.G., Shashkov A.S. Polysaccharides of algae. 33. Isolation and 13C-NMR spectral study of some new gel-forming polysaccharides from Japan Sea red seaweeds // Bot. Mar. 1983. V. 26. №6. P. 285-294.

25. Usov A.I., Ivanova E.G. Polysaccharides of algae. 37. Characterization of hybrid structure of substituted agarose from Polysiphonia morrowii (Rhodophyta, Rhodomelaceae) using P-agarase and 13C-NMR spectroscopy // Bot. Mar. 1987. V. 30. №5. P. 365-370.

26. Falshaw R., Furneaux R.H., Wong H., Liao M.-L., Bacic A., Chandrakrachang S. Structural analysis of carrageenans from Burmese and Thai samples of Catenella nipae Zanardini // Carbohydr. Res. 1996. V. 285. P. 81-98.

27. Stortz C.A., Cases M.R., Cerezo A.S. Red seaweed galactans. Methodology for the structural determination of corallinan, a different agaroid // Techniques in glycobiology. New York, 1977. P. 567-593.

28. Usov A.I., Bilan M.I., Shashkov A.S. Structure of a sulfated xylogalactan from the calcareous red alga Corallina pilulifera P. et R. (Rhodophyta, Corallinaceae) // Carbohydr. Res. 1997. V. 303. №1. P. 93-102.

29. Miller I.J., Blunt J.W. New 13C NMR methods for determining the structure of algal polysaccharides. Part 1. The effect of substitution on the chemical shifts of simple diad galactans // Bot. Mar. 2000. V. 43. №3. P. 239-250.

30. Miller I.J., Blunt J.W. New 13C NMR methods for determining the structure of algal polysaccharides. Part 2. Galactans consisting of mixed diads // Bot. Mar. 2000. V. 43. №3. P. 251-261.

31. Miller I.J., Blunt J.W. New 13C NMR methods for determining the structure of algal polysaccharides. Part 3. The structure of the polysaccharide from Cladhymenia oblongifolia // Bot. Mar. 2000. V. 43. №3. P. 251-261.

20

32.

33.

34.

35.

36.

37.

38.

39.

40.

41.

42.

43.

44.

45.

Miller I.J. Further evaluation of the structure of the polysaccharide from Plocamium costatum with the use of set theory // Hydrobiologia. 1999. V. 398/399. P. 385-389.

Anderson N.S., Dolan T.C.S., Penman A., Rees D.A., Mueller G.P., Stancioff D.J., Stanley N.F. Carrageenans. Part IV. Variations in the structure and gel properties of к-carrageenan, and the characterization of sulphate esters by infrared spectroscopy // J. Chem. Soc., C. 1968. №5. P. 602-606.

Rochas C., Lahaye M., Yaphe W. Sulfate content of carrageenan and agar determined by infrared spectroscopy // Bot. Mar. 1986. V. 29. №4. P. 335-340.

Usov A.I., Klochkova N.G. Polysaccharides of algae. 45. Polysaccharide composition of red seaweeds from Kamchatka coastal waters (Northwestern Pacific) studied by reductive hydrolysis of biomass // Bot. Mar. 1992. V. 35. №5. P. 371378.

Усов А.И., Иванова Е.Г. Полисахариды водорослей. 46. Изучение агара из красной водоросли Gelidiella acerosa // Биоорган. химия. 1992. Т. 18. №8. С. 1108-1116.

Chopin T., Whalen E. A new and rapid method for carrageenan identification by FT IR diffuse reflectance spectroscopy directly on dried, ground algal material // Carbohydr. Res. 1993. V. 246. P. 51-59.

Stoloff L., Silva P. An attempt to determine possible taxonomic significance of the properties of water extractable polysaccharides in red algae // Econ. Bot. 1957. V. 11. P. 327-330.

Craigie J.S. Cell walls // Biology of the red algae. Cambridge, 1990. P. 221-257.

Miller I.J. The chemotaxonomic significance of the water-soluble red algal polysaccharides // Recent Res. Dev. Phytochem. 1997. V. 1. P. 531-565.

Ciancia M., Matulewicz M.C., Cerezo A.S. A L-galactose-containing carrageenan from cystocarpic Gigartina scottsbergii // Phytochemistry. 1997. V. 45. № 5. P. 1009-1013.

Stortz C.A., Cases M.R., Cerezo A.S. The system of agaroids and carrageenans from the soluble fraction of the tetrasporic stage of the red seaweed Iridaea undulosa // Carbohydr. Polym. 1997. V. 34. №1/2. P. 61-65.

Takano R., Nose Y., Hayashi K., Hara S., Hirase S. Agarose-carrageenan hybrid polysaccharide from Lomentaria catenata // Phytochemistry. 1994. V. 37. №6. P. 1615-1619.

Takano R., Iwane-Sakata H., Hayashi K., Hara S., Hirase S. Concurrence of agaroid and carrageenan chains in funoran from the red seaweed Gloiopeltis furcata Post. et Ruprecht (Cryptonemiales, Rhodophyta) // Carbohydr. Polym. 1998. V. 35. №1/2. P. 81-87.

Takano R., Yokoi T., Kamei K., Hara S., Hirase S. Coexistence of agaroid and carrageenan structures in a polysaccharide from the red seaweed Rhodomela larix (Turner) J. Ag. // Bot. Mar. 1999. V. 42. №2. P. 183-188.

Поступило в редакцию 3 апреля 2001 г.