Генетические факторы риска развития антракосиликоза у работников угледобывающих предприятий Кузбасса

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

Захаренков В.В., Гафаров Н.И., Панев Н.И., Кучер А.Н., Фрейдин М.Б., Рудко А.А., Ядыкина Т.К., Казицкая А.С.

НИИ Комплексных проблем гигиены и профессиональных заболеваний СО РАМН,

г. Новокузнецк

НИИ медицинской генетики Томского научного центра СО РАМН,

г. Томск

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ РИСКА РАЗВИТИЯ АНТРАКОСИЛИКОЗА У РАБОТНИКОВ УГЛЕДОБЫВАЮЩИХ ПРЕДПРИЯТИЙ КУЗБАССА

Изучено распределение биохимических маркёров генов HP, GC, EsD, AcP, полиморфизм нуль-аллелей ферментов биотрансформации - трансфераз GSTT1 (GST-01), GSTM1 (GST-^1), а также полиморфизм VNTR4 гена NOS3 у больных ант-ракосиликозом и у лиц, не имеющих этой профессиональной патологии. Показано, что заболеванию наиболее подвержены обладатели генотипов HP 1-1, GC 1-2, GC 2-2, EsD 1-2, AcP bb, а резистентны обладатели HP 2-2, GC 1-1. Es D 1-1, AcP aa, AcP bc. В старшей возрастной группе больных лиц (50-59 лет) в большинстве случаев частота генотипов риска ниже, а частота генотипов резистентности выше, чем в более младшей возрастной группе (40-49 лет), что может указывать на профессиональный отбор у работников угледобывающих предприятий.

Ключевые слова: генетические маркёры; генотип; генетическая предрасположенность; резистентность.

Zakharenkov V.V., Gafarov N.I., Panev N.I., Kucher A.N., Freidin M.B., Rudko A.A., Yadykina T.K., Kazitskaya A.S.

Research Institute for Complex Problems of Hygiene and Occupational Diseases SB RAMS, Novokuznetsk,

Research Institute for medical genetics SB RAMS, Tomsk

GENETIC RISK FACTORS OF ANTRAKOSILIKOSIS DEVELOPMENT IN WORKERS

OF COAL-MINING ENTERPRISES IN KUZBASS

Distribution of biochemical markers of genes HP, GC, EsD, AcP, polymorphism zero-alleles of biotransformation enzymes -transferases GSTT1 (GST-01), GSTM1 (GST-^.1), and also polymorphism vNtR4 of gene NOS3 at the persons who wthout this professional pathology were investigated. It was shown, that owners of genotypes HP 1-1, GC 1-2, GC 2-2, EsD 1-2, AcP bb, are most subjected to disease, and owners of genotypes HP 2-2, GC 1-1. Es D 1-1, AcP aa, AcP bc are resistant. In senior age group of patients (50-59 years old) in most cases risk genotypes frequency is lower, and resistance genotypes frequency is higher, than in younger age group that can specify professional selection at workers of the coal-mining enterprises.

Key words: genetic markers; genotype; genetic predisposition; resistance.

Угольная отрасль до настоящего времени остается одной из важнейших в промышленности России, а Кузбасс является ведущим угольным регионом страны. В структуре профессиональной заболеваемости работников угледобывающей промышленности болезни органов дыхания занимают одно из первых мест. Наряду с таким способом снижения профессиональной заболеваемости, как исключение неблагоприятного производственного фактора, важное место занимает разработка методов ранней диагностики профессиональных заболеваний, основанная на изучении наследственной предрасположенности к профессиональным болезням. Анализ ассоциаций генетических маркеров с заболеваниями позволяет выявить среди населения группы лиц повышенного риска к отдельным заболеваниям, а это дает возможность разработки мер своевременной профилактики [1]. Это направление является приоритетным в современной медицине труда [2].

Цель работы — изучить связь биохимического и молекулярно-генетического полиморфизма с предрасположенностью к антракосиликозу — профессиональному заболеванию органов дыхания у работников угледобывающих шахт Кузбасса.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В ходе работы были обследованы 307 работников угледобывающих предприятий Кузбасса, больных антракосиликозом (АС), и 69 человек — контрольная группа горнорабочих, работающих в тех же санитарно-гигиенических условиях, но не имеющих профессиональной патологии. Все обследованные лица по национальной принадлежности — русские, возраст — 40-59 лет. Проведенные исследования соответствовали этическим стандартам биоэтического комитета, с информированного согласия на участие в исследовании, о чём имеется заключение экспертного совета по биоэтике при НИИ КПГПЗ СО РАМН.

Материалом для исследования служили образцы венозной крови и результаты клинических исследований. Сывороточные маркёры — гаптоглобин НР (аллели Нр1 и Нр2) и группоспецифический компонент GC (аллели Gc1 и Gc2) определяли методом электрофореза в полиакриламидном геле, эритроци-тарные изоферменты — флуоресцентная эстераза EsD (аллели EsD1 и EsD2), кислая фосфатаза АсР (аллели АсРа, АсРЬ, АсРс) — определялись электрофорезом в крахмальном геле [3].

Изучался полиморфизм ДНК. Ген GSTT1 кодирует глутатион^-трансферазу класса 0, которая локализована в эритроцитах и связана со II фазой биотрансформации ксенобиотиков. Ген GSTM1 кодирует глутатион^-трансферазу класса ц, которая локализована в цитоплазме и также метаболизирует ксено-

Корреспонденцию адресовать:

ГАФАРОВ Николай Исмаилович, 654041, Новокузнецк, ул. Кутузова, 23. Тел.: 8 (3843) 79-66-69.

E-mail: genlab_nk@mail.ru

50 T. її № 4 2012 MedicLn^ OMSurnia

inKuzbass вК^бага

биотики [4]. Из сопутствующих мультифакторных заболеваний в ряде случаев встречалась артериальная гипертония, поэтому мы изучили полиморфизм 4-го интрона (аллели А/В) гена NOS3, который кодирует эндотелийную синтазу оксида азота.

Выделение ДНК проводилось фенол-хлорофор-мным методом [5]. Генотипирование для генов GSTT1, GSTM1 и NOS3 проводили с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции [6, 7]. Для ко-доминантных генетических систем оценивали соответствие наблюдаемого распределения генотипов ожидаемому при равновесии Харди-Вайнберга [8]. Статистическую значимость различий в распределении полиморфных вариантов между группами здоровых и больных лиц оценивали по критерию х2 с поправкой Йетса на непрерывность. Об ассоциации разных генотипов с заболеванием судили по величине OR [9] при уровне значимости р < 0,05. Вычисления проводили с помощью пакета программ <^ТАТКТ1-СА 6.0», а также по оригинальным программам. В данной работе мы оценивали частоты генотипов и фенотипов в двух возрастных группах больных лиц: 40-49 лет и 50-59 лет. Использовался доверительный интервал (^) — 95% (р < 0,05).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Биохимические полиморфные системы

Анализ литературных данных указывает на неодинаковую функциональную активность продуктов разных аллелей ряда генов. Для гаптоглобина это неодинаковое сродство разных генотипов к НЬ, функции антител продуктов НР 2-2 и НР 2-1 против некоторых патогенных микроорганизмов, их большая физиологическая устойчивость по сравнению с НР 1-1 [3]. Показана роль НР как белка «острой фазы» при воспалительных заболеваниях. Для флуоресцентной эстеразы EsD обнаружено, что функциональная активность гена EsD1 на 60 % выше, чем EsD2 [10]. Изучение группоспецифического компонента — основного переносчика витамина Dз — показало, что полиморфизм GC может быть одним из факторов риска хронических обструктивных заболеваний лёгких [11].

Распределение генотипов НР, GC, EsD, АсР (табл. 1) у больных и у здоровых лиц в большинстве случаев соответствовало правилу Харди-Вайнбер-га и было сходно с распределением генотипов и генов, изученных у русскоязычного населения Сибири

Сведения об авторах:

ЗАХАРЕНКОВ Василий Васильевич, доктор мед. наук, профессор, директор, УРАМН НИИ КПГПЗ СО РАМН, г. Новокузнецк, Россия. E-mail: zacharenkov@nvkz.kuzbass.net

ГАФАРОВ Николай Исмаилович, канд. биол. наук, руководитель лаборатории популяционной генетики, УРАМН НИИ КПГПЗ СО РАМН, г. Новокузнецк, Россия. E-mail: genlab_nk@mail.ru

ПАНЕВ Николай Иванович, канд. мед. наук, руководитель отдела медицины труда, УРАМН НИИ КПГПЗ СО РАМН, г. Новокузнецк, Россия. E-mail: ecologia_nie@mail.ru

КУЧЕР Аксана Николаевна, доктор биол. наук, профессор, руководитель лаборатории молекулярной генетики, УРАМН НИИ медицинской генетики ТНЦ СО РАМН, г. Томск, Россия. E-mail: aksana.kucher@medgenetics.ru

ФРЕЙДИН Максим Борисович, канд. биол. наук, ст. науч. сотрудник, лаборатория популяционной генетики, УРАМН НИИ медицинской генетики ТНЦ СО РАМН, г. Томск, Россия. E-mail: maxim.freidin@medgenetics.ru

РУДКО Алексей Анатольевич, канд. мед. наук, гл. врач генетической клиники, УРАМН НИИ медицинской генетики ТНЦ СО РАМН, г. Томск, Россия. E-mail: aleksey.rudko@medgenetics.ru

ЯДЫКИНА Татьяна Константиновна, науч. сотрудник, лаборатория популяционной генетики, УРАМН НИИ КПГПЗ СО РАМН, г. Новокузнецк, Россия. E-mail: genlab_nk@mail.ru

КАЗИЦКАЯ Анастасия Сергеевна, биолог, лаборатория популяционной генетики, УРАМН НИИ КПГПЗ СО РАМН, г. Новокузнецк, Россия. E-mail: genlab_nk@mail.ru

Information about authors:

ZAKHARENKOV Vasily Vasilievich, doctor of medical sciences, professor, director, Research Institute for Complex Problems of Hygiene and Occupational Diseases, Novokuznetsk, Russia. E-mail: zacharenkov@nvkz.kuzbass.net

GAFAROV Nikolay Ismailovich, candidate of biological sciences, head of laboratory of population genetics, Research Institute for Complex Problems of Hygiene and Occupational Diseases, Novokuznetsk, Russia. E-mail: genlab_nk@mail.ru

PANEV Nikolai Ivanovich, candidate of medical sciences, head of occupational medicine department, Research Institute for Complex Problems of Hygiene and Occupational Diseases, Novokuznetsk, Russia. E-mail: ecologia_nie@mail.ru

KUCHER Aksana Nikolaevna, doctor of biological sciences, professor, head of molecular genetics laboratory, Research Institute for medical genetics, Tomsk, Russia. E-mail: aksana.kucher@medgenetics.ru

FREIDIN Maxim Borisovich, candidate of biological sciences, senior research worker of population genetics laboratory, Research Institute for medical genetics, Tomsk, Russia. E-mail: maxim.freidin@medgenetics.ru

RUDKO Aleksey Anatolievich, candidate of medical sciences, head of genetic clinic, Research Institute for medical genetics, Tomsk, Russia. E-mail: aleksey.rudko@medgenetics.ru

YADYKINA Tatyana Konstantinovna, reserch worker, population genetics laboratory, Research Institute for Complex Problems of Hygiene and Occupational Diseases, Novokuznetsk, Russia. E-mail: genlab_nk@mail.ru

KAZITSKAYA Anastasia Sergeevna, biologist, population genetics laboratory, Research Institute for Complex Problems of Hygiene and Occupational Diseases, Novokuznetsk, Russia. E-mail: genlab_nk@mail.ru

OКОицина Medicine

в Кузбассе

T. її № 4 20ї2 51

Таблица 1

Распределение генотипов и частот аллелей биохимических маркеров генов в группе больных антракосиликозом и в контроле

Частота генотипа у больных лиц разного возраста Все больные OR Р2

Локус и генотип 40-49 лет 50-59 лет Р1 Контроль

НР 1-2 0,4000 0,2470 0,0267 0,2769 0,1594 2,02 0,0616

НР 1-2 0,4000 0,4696 0,4082 0,4560 0,4493 1,03 0,9744

НР 2-2 0,2000 0,2834 0,2513 0,2671 0,3913 0,57 0,0564

N 60 247 307 69

Частота аллеля Gc2 0,4 0,5182 0,4951 0,6159

X2 (Сі. = 1) 1,67 0,87 2,37 0,18

СС 1-1 0,2333 0,4856 0,0007 0,4356 0,6812 0,36 3*10-4

СС 1-2 0,3333 0,4280 0,2345 0,4093 0,2754 1,89 0,0541

СС 2-2 0,4333 0,0864 0,0000 0,1551 0,0434 4,04 0,0239

N 60 243 303 69

Частота аллеля Сс1 0,4000 0,6996 0,6403 0,8188

X2 (Сі. = 1) 5,6* 0,08 3,77 0,36

ЕбЭ 1-1 0,3167 0,6290 0,0000 0,5682 0,7536 0,43 0,0067

ЕбЭ 1-2 0,5167 0,3024 0,0028 0,3442 0,2029 2,06 0,0328

ЕбЭ 2-2 0.1666 0,0686 0,0309 0,0876 0,0435 2,11 0,3272

N 60 248 308 69

Частота аллеля EsD1 0,5750 0,7802 0,7403 0,8551

X2 (Сі. = 1) 0,19 3,46 3,39 2,26

АсР аа 0,0500 0,0447 0,8605 0,0457 0,1449 0,28 0,0056

АсР аЬ 0,2333 0,3131 0,2931 0,2974 0,3044 0,97 0,9749

АсР ЬЬ 0,2333 0,4431 0,0047 0,4020 0,1739 3,19 0,0006

АсР ас 0,1500 0.0528 0,0196 0,0719 0,0435 1,70 0,5567

АсР Ьс 0,2667 0,1300 0,0159 0,1569 0,2754 0,49 0,0317

АсР сс 0,0667 0,0163 0,0813 0,0261 0,0579 0,44 0,32379

N 60 246 306 69

Частота аллеля АсР а 0,2417 0,2276 0,2304 0,3188

Частота аллеля АсР Ь 0,4833 0,6646 0,6291 0,4638

Частота аллеля АсР с 0,2750 0,1078 0,1405 0,2174

Х2(Сі. = 3) 0,29 1,15 1,96 8,36**

Примечание: N - объём выборки; х2 - тест использован для оценки соответствия наблюдаемого распределения генотипов ожидаемому исходя из равновесия Харди-Вайнберга; Сі. - число степеней свободы; р-| - уровень значимости значения при сравнении различий в распределении генотипов между больными лицами младшей (40-49 лет) и старшей (50-59 лет) возрастных групп; р2 - уровень значимости значения х2 при сравнении различий в распределении генотипов между больными лицами и контролем; OR - отношение шансов.

[12]. Статистически значимые различия по значениям х2 и OR обнаружены между группами лиц, больных АС, и здоровых лиц по локусам GC, EsD и АсР. Генотипами риска являются GC 1-2, GC 2-2, EsD 1-2, АсР ЬЬ, и, возможно, генотип НР 1-1 (OR = 2,02; р = 0,061). Протективным действием обладают генотипы GC 1-1, EsD 1-1, АсР аа, АсР Ьс и, возможно, НР 2-2 ^ = 0,57; р = 0,056).

В большинстве случаев у больных старшей возрастной группы (50-59 лет) частота генотипов риска снижена по сравнению с лицами возраста 40-49 лет, в ряде случаев различия статистически значимы. Это может указывать на элиминацию обладателей этих генотипов вследствие выбывания их с производства по состоянию здоровья. Вероятно, наличие этих генотипов способствует более тяжёлому течению болезни. Частота протективных генотипов в старшей возрастной группе выше, чем у работников 40-49 лет.

Возможно, это связано с более успешной адаптацией их обладателей к неблагоприятным факторам подземной добычи угля.

По системе АсР также наблюдалось соответствие наблюдаемого и ожидаемого распределения генотипов и в основной, и в контрольной группах. К генотипам риска относятся генотип АсР ЬЬ, его частота (0,402) статистически значимо выше, чем в контроле (0,1739). С другой стороны, в старшей возрастной группе больных лиц частота АсР ЬЬ увеличена с 0,233 до 0,4431 (х2 = 7,98; р = 3 х 10-6). Вероятно, наличие этого генотипа обуславливает лишь повышенный риск заболевания АС.

Молекулярно-генетический полиморфизм

Частота нуль-аллелей глутатионтрансфераз GSTT1 и GSTM1, генотипов VNTR гена NOs3 (табл. 2) в

52 Т. 11 № 4 2012 Мес|іс1п^ ОМ(0шта

іпКщЬаи вК^бага

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

Таблица 2

Распределение генотипов и частот аллелей молекулярно-генетических маркерам

в группе больных антракосиликозом и в контроле

Частота генотипа у больных лиц разного возраста Все больные OR P2

Локус и генотип 4O-49 лет 5O-59 лет Рї Контроль

GSTT ( + ) O,8BBB O,84 O,5849 O,8B9B O,8929 O,6B O,74O8

GSTT (-) OJ667 OJ6 O,5849 OJ6O7 O^ 1,60 O,74O8

N 6 5O 56 28

Частота аллеля (-) O,4O82 O,4 O,4OO8 O,B27B

GSTM1 (+) O,5 O,54 O,8O45 O,5B57 O,4286 ї,54 O,4874

GSTM1 (-) O,5 O,46 O,8O45 O,464B 0,5714 O,65 O,4874

N 6 5O 56 28

Частота аллеля (-) 0,7071 O,6782 O,68M O,7559

VNTR aa O,OOOO O,O7B2 O,8B42 O,O6B8 0,1071 O,57 0,8190

VNTR ab O,6667 O^m O,2264 O^U O,2858 ї,42 O,67BO

VNTR bb O,BBBB O,6O97 O,4O25 O,5745 0,6071 O,87 O,97^

N 6 4ї 47 28

Частота аллеля b O,6667 O,768B O,755B O,75

X2 (d.f. = ї) ї,5 O,49 O,OB ї,59

основном соответствовали уже опубликованным данным по России [13, 14]. «Нуль-аллель» гена GSTT1 в гомозиготном состоянии обуславливает отсутствие активности его продукта. Частота «нуль-аллеля» гена GSTT1 у европеоидов достигает 38 % [4]. Отсутствие активности GSTM1 может быть фактором риска рака лёгких [15], атопической бронхиальной астмы

[13].

Ни по одному из указанных полиморфизмов не было обнаружено статистически значимых различий по частотам гено- и фенотипов между группой больных антракосиликозом и контролем. Возможно, это связано с большим количеством генов, участвующих в процессах детоксикации, с перекрывающейся субстратной специфичностью. Определённое значение играет и тяжесть заболевания: обследованные нами лица относятся к работающему населению.

ЛИТЕРАТУРА:

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенное исследование показало, что в развитии профессионального антракосиликоза у шахтёров-угольщиков определённую роль играют эндогенные факторы, в частности, особенности генетического статуса. Это было показано, по крайней мере, для 3-х биохимических полиморфных систем из 4-х изученных. Эндогенными факторами риска развития ант-ракосиликоза у шахтёров-угольщиков юга Кузбасса является наличие маркёров НР 1-1, GC 2-2, EsD 1-2, АсР ЬЬ. Эндогенными факторами резистентности к развитию антракосиликоза является наличие маркёров НР 2-2, GC 1-1. Es D 1-1, АсР аа, АсР Ьс. Вероятно, есть смысл изучать сочетания генотипов риска профессиональных заболеваний. Этот анализ будет проведен в дальнейшем.

1. Геном человека и гены «предрасположенности» /В.С. Баранов, Е.В. Баранова, Т.Э. Иващенко и др. - СПб., 2000. - 272 с.

2. Измеров, Н.Ф. Медицина труда. Введение в специальность /Н.Ф. Измеров, А.А. Каспаров. - М., 2002. - 392 с.

3. Прокоп, О. Группы крови человека /О. Прокоп, В. Гелер; пер. с нем. - М., 1991. - 511 с.

4. Mannervik, B. The isozymes of glutathione transferase /B. Mannervik //Adv. Enzym. Relat. Areas Molec. Biol. - 1985. - V. 57. - P. 357-417.

5. Молекулярная клиническая диагностика. Методы: пер. с англ. /под ред. С. Херрингтона, Дж. Макги. - М., 1999. - 558 с.

6. Endothelial nitric synthase as a potential susceptibility gene in the pathogenesis of emphysema in alpha-1-antitrypsin deficiency /A. Novoradovsky [et al.] //Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. - 1999. - V. 20. - P. 441-447.

7. Polymorphisms at the glutathione-S-transferase GSTM1, GSTT1 and GSTP1 loci: risk of ovarian cancer by histological subtype /A.B. Spurdle [et al.] //Carcinogenesis. - 2001. - V. 22. - P. 67-72.

8. Вейр, Б. Анализ генетических данных /Б. Вейр. - М., 1995. - 400 с.

9. Pearce, N. What does the odds ratio estimate in case-control study? /N. Pearce //Int. J. Epidemiol. - 1993. - V. 26, N 6. - P. 1189-1192.

10. Horai, S. Differential enzyme activities in human esterase D phenotypes /S. Horai, E. Matsunaga //Hum. Genet. - 1984. - V. 66(2-3). - Р. 168-170.

11. Association of Gc-globulin variation with susceptibility to COPD and diffuse panbronchiolitis /T. Ishii, N. Keicho, S. Teramoto et al. //Eur. Respir. J. -2001. - V. 18(5). - Р. 753-757.

12. Генофонд и геногеография народонаселения. Т. 1. Генофонд населения России и сопредельных стран /под ред. Ю.Г. Рычкова. - СПб., 2000. - 611 с.

13. Роль ферментов биотрансформации ксенобиотиков в предрасположенности к бронхиальной астме и формировании особенностей её клинического фенотипа /В.В. Ляхович, В.А. Вавилин, С.И. Макарова и др. //Вестн. РАМН. - 2000. - № 12. - С. 36-41.

14. Мустафина, О.Е. Полиморфизм минисателлита гена эндотелиальной синтазы оксида азота: исследование в популяциях Волго-Уральского региона и анализ ассоциаций с инфарктом миокарда и эссенциальной гипертензией /О.Е. Мустафина //Генетика. - 2001. - Т. 37, № 5. - С. 668-674.

^Мбдшшпа Medicine

в Кузбассе

T. її № 4 2O^ 53

15. Izoensyme(s) of glutathione transferases (class mu) as a marker for susceptibility to lung cancer: a follow up study /J. Seidegard, R.W. Pero, M.M. Markowitz et al. //Carcinogenesis. - 1990. - V. 11. - P. 33-36.

If

54 T. 11 № 4 2012 MedicLn^ OMSuima

inKuzbass вК^бага