Изучение антимикробных пептидов из лейкоцитов Европейской болотной черепахи Emys orbicularis

УДК 612.398.1:547.964.4

Вестник СПбГУ. Сер. 3, 2007, вып. 3

А. А. Колобов, О. В. Шамова, В. Н. Кокряков

ИЗУЧЕНИЕ АНТИМИКРОБНЫХ ПЕПТИДОВ ИЗ ЛЕЙКОЦИТОВ ЕВРОПЕЙСКОЙ БОЛОТНОЙ ЧЕРЕПАХИ EMYS ORBICULARIS*

Введение. В связи с появлением в последнее время большого количества штаммов бактерий, устойчивых к классическим антибиотикам, все больший интерес вызывают антимикробные пептиды (АМП) животного происхождения как потенциальные лекарственные средства. АМП являются ведущими молекулярными факторами врожденного иммунитета у изученных видов животных и человека, обладающими широким спектром антимикробного действия и участвующими в защите организмов от инфекции. Поскольку механизм действия АМП отличается от такового классических антибиотиков (воздействие на бактериальную клеточную мембрану, а не на ключевые молекулы метаболизма) появление штаммов устойчивых к АМП практически исключено. В зависимости от первичной структуры АМП и структуры генов их разделяют на несколько групп (альфа-, бета-, тета-дефесины, кателицидины и др.). Наиболее распространенной в животном мире является группа дефенсинов. К настоящему времени в литературе отсутствуют сведения о наличии пептидов гомологичных дефенсинам у большинства видов основных таксономических групп беспозвоночных и позвоночных животных. Главная цель проведенной работы - поиск, очистка и структурный анализ дефенсинов и родственных им пептидов из фагоцитов, ранее неизученного, с этой точки зрения, класса позвоночных животных - рептилий.

Сравнительно-биохимическое исследование новых антибиотических пептидов, из неизучавшихся ранее видов животных, позволяет получить представление о первичном происхождении и распространенности молекулярной матрицы классических дефенсинов в живой природе как универсальных антимикробных агентов фагоцитов животных, стоящих на разных ступенях эволюционного развития.

Проведенная работа была направлена на решение фундаментальной проблемы: расшифровать молекулярные основы врожденного иммунитета животных. Кроме того, данная работа имеет перспективы прикладного значения, а именно: создание лекарственных препаратов для лечения и профилактики бактериальных, грибковых и вирусных инфекций.

Задачей исследования в рамках указанной проблемы являлось изучение структурных и функциональных свойств антибиотических пептидов и белков фагоцитов животных, чтобы установить молекулярные механизмы защиты от инфекции, мобилизуемых организмом животного в первые минуты и часы взаимодействия с инфекционным агентом. Особое внимание было уделено сравнению структур впервые выделенных пептидов и уже известных антибиотических пептидов животных (дефенсинов, бактенецинов и др.). Подобный анализ позволяет ответить на вопрос, в какой степени молекулярные матрицы этих соединений, впервые выявленные в нейтрофилах млекопитающих, характерны для пептидов из фагоцитов и тканей рептилий.

Методы. Обработка крови и получение лейкоцитарной массы. Кровь животных отбирали в пластиковые пробирки, в которые заранее добавляли гепарин из расчета 25 мкл гепарина на 1 мл крови. Сразу после забора пробирки ставили в термостат (37 °С) на 2-3 ч. Слой лейкоцитов, осевших на эритроциты (buffy coat), отбирали микропипеткой и переносили в отдельные пробирки.

* Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ

© А. А. Колобов, О. В. Шамова, В. Н. Кокряков, 2007

Экстрагирование катионных пептидов. Экстракцию белков и пептидов проводили из го-могената клеток 10%-ной уксусной кислотой (УК) при температуре 4 "С в течение 18 ч. Суперна-танты подвергали ультрафильтрации через фильтр «Amicon» YM-10 (фильтр в виде полых волокон с номинально отсекаемой молекулярной массой (НОММ) - 10 кДа). Далее ультрафильтрат концентрировали на фильтре «Amicon» YM-1 (НОММ-1 кДа), а также обессоливали на этом же фильтре путем пропускания через камеру для фильтрации избыточного объема 10%-ной УК.

Электрофорез в полиакриламидном геле в кислой среде. Спектр катионных пептидов в нативных условиях оценивали методом электрофореза (ЭФ) в кислой буферной системе в присутствии мочевины в полиакриламидном геле (ПААГ) на приборе фирмы Hoefer (США). В качестве электродного буфера использовали 5%-ную УК (pH 2.2). Длительность как преэлектро-фореза, так и электрофореза составляла 1 ч. Разделение проводили в пластинах 12%-ного полиак-риламидного геля длиной 75 мм и толщиной 1 мм при напряжении 20 В/10 мм2.

Препаративный электрофорез в полиакриламидном геле в кислой среде. Препаративный ЭФ проводили в 12.5%-ном ПААГ в кислой буферной системе в присутствии мочевины [5] в аппарате для препаративного ЭФ (Bio-Rad, модель - AG501-X8, США).

Преэлектрофорез проводили в течение 8-12 ч при напряжении 20 В/см с площадью поперечного сечения трубки 10 см2 и длиной 12 см. Разделение проводили в течение 18-20 ч при напряжении 35 В/см. В качестве буфера использовали 5%-ную УК. Пробы по 5 мл собирали на коллекторе Beckman SC при скорости элюции 20 мл/час (элюирующий буфер - 5%-ная УК).

Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Чистоту полученных препаратов и приблизительную молекулярную массу пептидов оценивали при помощи ЭФ в присутствии ДС-Na ЭФ проводили в ПААГ на приборе фирмы Hoefer (США).

Напряженность электрического поля при ЭФ составляла 10 В/см при концентрации геля 12%.

Окраска полиакриламидных гелей Кумасси бриллиантовым голубым. После проведения ЭФ белки и пептиды в ПААГ окрашивали Кумасси бриллиантовым голубым G-250.

Окраска полиакриламидных гелей серебром. Окраска ПААГ серебром проводилась для выявления минорных белковых примесей в пробах [8]. После ЭФ в ПААГ гель отмывали в 50%-ном метаноле, затем к гелю добавляли красящий раствор. После окраски гель отмывали дистиллированной водой. Затем гель опускали в проявляющий раствор до появления требуемой окраски, после чего отмывали в воде в течение 20-30 с и помещали в закрепляющий раствор на 10-15 мин.

Обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография (ОФ ВЭЖХ). ОФ ВЭЖХ проводили на хроматографе System Gold (Beckman, США, детектор - Beckman 166А) с использованием колонок Vydac С18, 5мкм, 250 х 4.1 мм или Alltech С18, 5 мкм, 150 х 4.1 мм. Пробы по 1 мл собирали на коллекторе Beckman SC при скорости элюции 1 мл/мин, затем высушивали с помощью центрифугирования под вакуумом на установке Speed Vac и перерастворяли в 200 мкл 0.01%-ной УК.

В ходе работы применялись следующие системы растворителей: ацетонитрил - 0.01%-ная трифторуксусная кислота (ТФУ), ацетонитрил - 0.13%-ная гептафтормасляная кислота (ГФМК) и ацетонитрил - 10 мМ тетрабутил аммония.

Метод наложения гелей. Метод использовали для выявления пептидов, обладающих антимикробной активностью (AMA), в ПААГ после ЭФ в кислой среде. После ЭФ гели отмывали 0.01 М натрий-фосфатным буфером, pH 7,4. Далее гель накладывали на чашку с агарозным гелем (1%-ная агароза, 0.01 М натрий-фосфатный буфер, pH 7.4), содержащим 4106 КФЕ/мл микроорганизмов, и помещали в термостат для инкубации в течение 3 ч при 37 °С. После инкубации чашки заливали 1%-ной агарозой с 6%-ной питательной средой (триптический гидролизат сои) и оставляли на 16 ч при температуре 37 °С. Фиксацию роста микроорганизмов производили с помощью 5%-ной УК.

Для данного метода использовали по четыре параллельные пробы каждого образца, нанося их на отдельные ПААГ. Три из них использовали для выявления AMA. Последний окрашивали Кумасси бриллиантовым голубом G-250 для выявления полос, соответствующих зонам лизиса.

Метод радиальной диффузии пептидов в агарозных гелях. Метод радиальной диффузии пептидов в агарозном геле, содержащем микроорганизмы, использовали для определения антимикробной активности проб [3]. Пробы в объеме 2.5 мкл наносили в лунки размером 2.0 х 1.5 мм

в агарозном геле (1%-ная агароза, 0.01 М натрий-фосфатный буфер, рН 7.4), содержащем 4 • 106 КФЕ/мл микроорганизмов в логарифмической стадии роста (для бактерий), и инкубировали чашки Петри агарозными гелями в течение 3 ч при температуре 37 "С. После инкубации чашки заливали 1 %-ной агарозой с 6%-ной питательной средой (триптический гидролизат сои) и оставляли на 16 ч при температуре 37 "С. Фиксацию роста микроорганизмов производили с помощью 5%-ной УК.

Микроорганизмы, использованные в работе:

Escherichia coli, штамм ML-35p (грамотрицательная бактерия),

Listeria monocytogenes, штамм EGD (грамположительная бактерия),

Staphilococcus aureus, штамм MRSA (грамположительная бактерия),

Candida albicans (низший грибок).

АМА рассчитывалась по формуле:

(d (мм) - d , (мм)) 10 = АМА (у. е.).

4 лунки4 ' зоны ингибирования роста микроорганизмов V '' 4 J '

Зона ингибирования роста микроорганизмов - область геля, рост бактерий в которой подавлен анализируемым образцом, диффундировавшим в агарозный гель из лунки.

Минимальные ингибирующие концентрации (МИК) очищенных пептидов определяли путем построения регрессий зависимости АМА от концентраций образцов. Точка пересечения графика регрессии с осью ординат принималась равной МИК.

Гемолиз (од (Поглощение540о6рВДа-Поглощение540негатавногоконтра1Я)100%

П°ГЛО1ЧеНИе540 позитивного контроля _ПоГЛОЩеНИе540негативногоконтроля '

Метод определения дисульфидных связей в молекулах пептидов. Наличие дисульфидных связей в катионных белках определяли, окисляя их надмуравьиной кислотой [4]. При взаимодействии с ней остатки цистеина и цистина превращаются в цистеиновую кислоту с выходом >90%. О возможном наличии дисульфидных связей свидетельствовало изменение электрофоре-тической подвижности пептидов, обработанных надмуравьиной кислотой, по сравнению с контрольными пробами при проведении аналитического электрофореза в кислой буферной системе.

Методы определения концентраций пептидов. Концентрации пептидов в растворах определялись по методам:

1) Витакера [6] по формуле:

Концентрация (мг/мл) = (Поглощение235 - Поглощение2а0)/2.51;

2) Кэлба [2] по формуле:

Концентрация (мг/мл) = 184 • Поглощение230 - 81.7  Поглощение260;

3) Вулфа [7] по формуле:

Концентрация (мкг/мл) = (Пощение215 - Поглощение225) 144.

Определение молекулярной массы методами масс-спектрометрии. Масс-спектромег-рический анализ производили на базе ББЦ Университета Лейпцига в лаборатории профессора Ральфа Хофмана на приборе М ALDI-TOF-MS (4700 proteomic analyzer, Applied Biosystems GmbH, Дармштад, Германия). В качестве матрицы была использована альфа-циано-гидрокси-циннамо-вая кислота. Ошибка определения молекулярной массы составляет 0.05% в обоих случаях.

Результаты исследования. Выделение и очистка пептидов. Лейкоциты выделили из крови трех самцов и трех самок европейской болотной черепахи. Из полученных клеток были получены уксуснокислые экстракты. Далее изучили спектр кислоторастворимых белков с помощью электрофореза и метода наложения гелей, выявили фракции, обладающие антимикробным действием в отношении Е. coli ML35p, L.monocytogenes EGD и С. albicans. На рис. 1 приведен ЭФ в ПААГ в кислой среде и результаты теста по выявлению антимикробной активности по методу наложения гелей. В качестве стандарта был использован а-дефенсин кролика NP-1. У пептидов, обладающих электрофоретической подвижностью, сходной с таковой у стандарта, была выявлена активность против всех используемых микроорганизмов. Для отделения высокомолекулярных компонентов (более 10 кДа) провели ультрафильтрацию. Электрофоретическая подвижность активных фракций была достаточна велика и наблюдалось удовлетворительное разделение по заряду

при ЭФ в ПААГ в кислой среде, поэтому препаративный ЭФ в ПААГ в кислой среде был выбран как первая стадия разделения активных низкомолекулярных фракций.

Антимикробная активность каждой фракции после препаративного ЭФ тестировалась против Е. coli ML35p, L. monocytogenes EGD и С, albicans. Оптическая плотность каждой фракции измерялась при длине волны 280 нм. Все полученные данные были сведены в единый график, представленный на рис. 2. Фракции, обладающие антимикробной активностью против всех тестовых микроорганизмов и имеющие высокую электрофорети-ческую подвижность, подверглись дальнейшей очистке при помощи ОФ ВЭЖХ.

А Б

12 3 4

Полиакриламид-ньш гель (60% АА, 1.5% БАА в присутствии мочевины.

С. albicans

Е. coli

штшт жяшж

ОТ

L. monocitogenes

Микроорганизм в 1%-ном агарозе на 0.01 М фосфатном буфере (рН 7.4); 4хЮ6 колонии формирующих единиц на чашку.

Рис. 1. Спектр антимикробных пептидов в уксуснокислом экстракте из лейкоцитов Европейской болотной черепахи

А - ПААГ после ЭФ в кислой среде, окраска Кумасси бриллиантовым голубым G-250. 1 - уксуснокислый экстракт из лейкоцитов самца, 2 - из лейкоцитов самки Европейской болотной черепахи; 3 - вторичный уксуснокислый экстракт из лейкоцитов самца Европейской болотной черепахи; 4 - а-дефенсин кролика NP-4; Б - результаты антимикробного теста по методу наложения гелей. Стрелкой отмечены пептиды с электрофоретической подвижностью, подобной таковой у NP-4 и зоны ингибирования роста микроорганизмов, соответствующие им.

Исходно в качестве ионной пары использовали 10 мМ раствор тетрабутила аммония, однако по данным ЭФ в ПААГ, в присутствии ДС-Na удовлетворительного разделения добиться не удалось. Как и в случае препаративного ЭФ в ПААГ АМА каждой фракции тестировалась против Е. coli ML35p, L. monocytogenes EGD и С. Albicans (рис. 3,A) Фракции, обладающие антимикробной активностью против всех тестовых микроорганизмов, подверглись рехроматографии. При рехроматографии в качестве ионной пары использовали 0.13%-ную ГФМК (рис. 3, Б). Была опробована и схема очистки, при которой на первой стадии в качестве ионной пары использовали 0.1%-ную ТФУ. Обе комбинации ионных пар позволили получить высокоочищенные фракции пептидов, обладающих антимикробной активностью.

Таким образом, в высокоочищенном виде были получены 4 пептида, обладающие антимикробной активностью с молекулярной массой в диапазоне 4.5-4.8 кДа.

Гомогенность препаратов и их молекулярную массу оценивали при помощи ЭФ в ПААГ в присутствии ДС-Na (рис. 4) и с помощью масс-спектрометрического анализа. Молекулярная масса выделенных пептидов составила 4543,4585,4749 и 4762 Да.

Рис. 2. Результаты анализа антимикробной активности и оптической плотности (OD) фракций после препаративного электрофореза в полиакриламидном геле уксуснокислых экстрактов.

Представлен профиль элюции белков и пептидов с электрофоретической колонки (Hoefer, США) при проведении электрофореза в 12%-ном полиакриламидном геле в кислой среде в присутствии мочевины (скорость элюции - 20 мл/час, при напряжении 35 В/см, площадь поперечного сечения трубки 10 см2, длина 12 см) и результаты последующего анализа AMA и OD полученных фракций.

А Б

Рис. 3. Обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография фракций после препаративного электрофореза в полиакриламидном геле,

А - профиль элюции полипептидов с колонки Vydac С18 (5мкм, 250x4.1 мм). Использован линейный градиент 10 мМ тетрабутил аммония - ацетонитрил от 0 до 60% за 60 мин. Стрелкой отмечена фракция 21, содержащая пептид с молекулярной массой около 4.5 кДа, подвергнутая дальнейшей очистке. Б - профиль элюции полипептидов с колонки Alltech С18 (5 мкм, 150x4.1 мм). С использованием линейного градиента 0.1%-ная ТФУ - ацетонитрил от 0 до 60% за 60 мин. Стрелкой отмечена фракция 28, содержащая очищенный пептид с молекулярной массой около 4.5 кДа.

43 кДа 29 кДа

18.4 кДа

14.3 кДа

6.2 кДа

2.8 кДа

Рис. 4. Результаты электрофоретического анализа выделенных пептидов (12%-ный ПААГ в присутствии ДС-Иа).

1 - низкомолекулярные маркеры; 2 - пептид с молекулярной массой 4543 Да; 3 - 4585 Да; 4 - 4749 Да; 5 - 4762 Да; 6 - фракция пептидов с молекулярным весом от 1 до 10 кДа, полученная путем ультрафильтрации из уксуснокислого экстракта; 7 - уксуснокислый экстракт.

Структурный анализ выделенных пептидов. Заряд молекул выделенных пептидов анализировали с помощью ЭФ в ПААГ в кислой среде, оценивая их электрофоретическую подвижность в сравнении с таковой у а-дефенсинов кролика (КР-1,4). Молекулы всех выделенных пептидов обладают положительным зарядом в кислой среде (рН 2) и их элек-трофоретическая подвижность близка к таковой у ЫР-4. Для получения более подробных данных о структуре выделенных пептидов провели тест на содержание в их молекулах дисульфидных мостиков. Для этого пептиды инкубировали с охлажденной надмуравьи-ной кислотой и затем провели ЭФ в ПААГ в кислой среде. Результатом реакции стало окисление цистина в два остатка цистеиновой кислоты и, как следствие, изменение элек-трофоретической подвижности пептидов. В молекулах всех выделенных пептидов были выявлены дисульфидные связи.

Антимиробная активность выделенных пептидов

Минимальные ингибирующие концентрации

Пептиды Е. coli ML35p Listeria monocytogenes EGD Staphylococcus aureus MRSA Candida albicans

LS HS LS HS LS HS LS HS

4543 Да 0.65 >20 0.65 >20 5.6 >20 5.2 >20

4585 Да 0.35 >20 1.5 >20 >20 >20 4.5 >20

4749 Да 0.65 1.5 1.5 >20 2.8 >20 5.3 >20

4762 Да 0.75 2.9 1.5 5.3 2.8 >20 5.3 >20

HNP-1 0.90 >20 1.1 1.2 2.9 >20 3.6 >20

PG-1 0.95 1.1 0.95 0.45 0.85 0.75 2.2 2.0

Примечание. За МИК (мкМ) принималась точка пересечения графика линейной регрессии данных AMA выделенных пептидов с осью абсцисс. LS (low salt) - среда: 0.01 М натрий-фосфатный буфер без добавления NaCl. HS (high salt) - среда: 0.01 М натрий-фосфатный буфер с добавлением 0.1 М NaCl. HNP-1- дефенсин человека; PG-1 - протегрин свиньи.

Оценка антимикробной активности выделенных пептидов. Антимикробная активность для всех выделенных пептидов определялась при помощи метода радиальной диффузии в агарозных гелях. Значения минимальных ингибирующих концентраций сведены в таблицу. В отношении грамотрицательной бактерии выделенные пептиды проявили большую активность, чем в отношении грамположительных бактерий и низшего гриба. При переходе к высокой концентрации соли МИК цистин-содержащих пептидов заметно увеличились вплоть до полной потери антимикробных свойств у пептида с молекулярной массой около 4585 Да.

Уровень гемолиза, %

20

Концентрация, мкМ

Рис. 5. Гемолитическая активность выделенных пептидов по отношению к эритроцитам человека.

Пептиды инкубировали с 2.5%-ной суспензией эритроцитов при 37 °С в течение 30 мин. В качестве контроля использовали протегрин-1 свиньи и альфа-дефенсин-1 кролика.

Выявлено заметное уменьшение антимикробной активности, вплоть до полной потери антимикробных свойств при исследованных концентрациях, при переходе к высокой концентрации соли.

Оценка гемолитической активности выделенных пептидов. Оценку гемолитической активности против эритроцитов человека провели для пептидов с молекулярной массой около 4543 и 4762 Да. В качестве стандартов были использованы а-дефенсин кролика КР-1 и протегрин-1.

Данные анализа представлены на рис. 5. Показано отсутствие гемолитической активности при концентрациях пептида, в 10-50 раз больших минимальных ингибирующих концентраций.

Обсуждение результатов исследования. К настоящему времени описано более тысячи антибиотических пептидов, выделенных из различных органов и тканей животных. Выделение и изучение структуры, а также физико-химических и антибиотических свойств этих пептидов представляет интерес как в фундаментальном, так и в прикладном аспектах. Фундаментальный аспект исследования антимикробных пептидов связан с изучением механизмов, лежащих в основе бактерицидного, фунгицидного и цитотоксического действий

этих антибиотиков животного происхождения. Кроме того, сопоставление структуры пептидов животных, принадлежащих разным таксономическим группам, вносит вклад в понимание закономерностей развития факторов системы врожденного иммунитета.

В данной работе был исследован спектр АМП Европейской болотной черепахи. Ввиду того, что в настоящее время в литературе отсутствуют данные о АМП в лейкоцитах представителей класса рептилий, проделанная работа представляет интерес в первую очередь для понимания эволюционных аспектов развития АМП.

В ходе работы была предложена схема очистки, позволяющая получать 41.12 мкг пептида с молекулярной массой 4543 Да, 13.52 мкг пептида с молекулярной массой 4585 Да, массой 4762 Да мкг из 394.95 мг белка первичного уксуснокислого экстракта лейкоцитов Европейской болотной черепахи.

Проведенные эксперименты по изучению некоторых физико-химических свойств (молекулярная масса, электрофоретическая подвижность и наличие дисульфидных связей в молекуле) позволяют предположить, к какому семейству АМП относятся выделенные пептиды.

Анализируя полученные данные можно сделать предположение о родстве выделенных пептидов с дефенсинами, так как выделенные пептиды обладают электрофоретической подвижностью, сходной с таковой у дефенсина кролика NP-4. Молекулярная масса этих пептидов тоже близка к массе дефенсинов, хотя и несколько выше, чем у а-дефенсинов. Кроме того, в молекулах всех исследованных пептидов содержатся дисульфидные связи, что является одним из основных признаков пептидов семейства дефенсинов. Время выхода с обращенно-фазовой колонки при хроматографии пептидов черепахи аналогично таковому у дефенсинов, которые имеют в составе молекулы относительно большое количество гидрофобных аминокислот.

Результаты проведенных экспериментов по выявлению биологических свойств, таких, как антимикробная и гемолитическая активность, тоже позволяют отнести выделенные пептиды к тому или иному семейству АМП, Анализ АМА при разных концентрациях соли дает основания определить, к какому из семейств АМП принадлежат данные пептиды, так как высокие концентрации соли по-разному влияют на пептиды ввиду их различий в химической структуре и механизмах антимикробного действия.

Для выделенных пептидов показано снижение антимикробной активности при повышении концентрации соли (см. таблицу). В отношении Е. coli активность выделенных пептидов была сходна с таковой у взятых стандартов. При переходе к высокой концентрации соли МИК в отношении Е. coli у всех пептидов заметно увеличились, что характерно для большинства дефенсинов, за исключением NP-1. В отношении L. monocytogenes активность выделенных пептидов была сходна со стандартами; при переходе к высокой концентрации соли она значительно снижалась. Что касается S. aureus и С. albicans, то характер активности выделенных пептидов был аналогичным. Из этого можно сделать предположение, что выделенные пептиды принадлежат к семейству дефенсинов, ввиду того, что большинство из них обладает подобными свойствами.

Одним из важных свойств АМП является характер взаимодействия таковых с клетками эукариотических организмов, В отношении выделенных пептидов было показано полное отсутствие гемолитической активности в концентрациях, в 10-50 раз больших минимальных ингибирующих концентраций (см. рис. 5), что характерно для пептидов дефенсинового семейства, в отличие от протегринов.

Таким образом, работа интересна в практическом плане, так как выделенные пептиды обладают широким спектром антимикробного действия и отсутствием гемолитического, также, как а-дефенсин кролика NP-1, один из самых активных представителей семейства дефенсинов.

Немаловажны данные о выделении из лейкоцитов кур АМП, названных галинацина-ми и относящихся к семейству р-дефенсинов, с молекулярной массой 4581 Да у галина-цина Gal-1а, 4504 Да у галинацина Gal-1 и 3916 Да у галинацина Gal-2 [1]. Сходство молекулярной массы у выделенных пептидов и галинацинов показывает, что из всех де-фенсинов выделенные пептиды ближе всего к галииацинам. На основании этого можно сделать вывод о возможном сходстве АМП у птиц и рептилий, таксономически близких групп, поэтому работа интересна и в эволюционном отношении.

Однако окончательное заключение о принадлежности выделенных пептидов к тому или иному семейству можно будет сделать только после определения их первичных структур.

Выделение АМП из лейкоцитов рептилии дает возможность в дальнейшем глубже изучить процессы быстрой защиты организма от патогенных грибов и бактерий и механизмы их развития. Отсутствие гемолитической активности у выделенных пептидов и их относительно высокая активность против грамотрицательных бактерий позволяет предложить их на роль лекарственных препаратов локального применения, так как благодаря отличному от классических антибиотиков механизму действия (воздействие на бактериальную клеточную мембрану, а не на ключевые молекулы метаболизма), практически исключено появление штаммов, устойчивых к АМП.

Summary

Kolobov A. A., Shamova О. V., Kokryakov V. N. Investigation of antimicrobial peptides derived from leucocytes of European pond turtle Emys orbicularis.

Four antimicrobial peptides were purified from European pond turtle's leucocytes. Their molecular masses (4543, 4585, 4749, 4762 Da) were estimated using MALDI-TOF-MS. In all peptides disulfide bridges were developed. All of them possess broad spectrum of antimicrobial activities with the lack of hemolitical activity. According to all their characteristics the hypothesis of their pertaining defensin superfamily can be made.

E-mail: alexander-kolobov@yandex.ru Литература

1. HarwigS. S., Swiderek К. M., Kokryakov V. N. Gallinacins: Cystein-rich antimicrobial, peptides of chicken leukocytes // FEBS Lett. 1994. Vol. 42. P. 281-285. 2. Kalb V. F.Jr., Bemlohr R.W., A new spectrophotometry assay for protein in cell extracts // Anal. Biochem.1977. Vol. 82 (2). P .362-371. 3. LehrerR. I., Rosenman M., HarwigS. S.Jackson R., EisenhauerP. Ultrasensitive assays for endogenous antimicrobial polypeptides//J. Immunol. Methods. 1991. Vol. 137. P. 167-173.4. MarchiniD., Giordano P. C., Amons R, Purification and primary structure of ceratotoxin-a and ceratotoxin-b, 2 antibacterial peptides from the female reproductive accessory glands of the medfly Ceratitis capitata (Insecta, Diptera) // Insect. Biochem. Molec. Dial. 1993. Vol. 23. P. 591-598.5. WeberK., OsbomH. The rebiliaty of molecular weight determination by dodecylsulfate-polyacrilamide gel electrophoresis // J. Biol. Chem. 1969. Vol. 244(16). P. 4406-4412.6. WhitakerJ. R„ Granum P. E„ An absolute method for protein determination based on difference in absorbance at 235 and 280 nm // Anal. Biochem. 1980. Vol. 109(1). P. 155-159.7. Wolf P. A critical reappraisal of Waddell's technique for ultraviolet spectrophotometric protein estimation // Anal. Biochem. 1983. Vol. 129(1). P. 145-155.8. Wray W., Boulikas Т., Wray V. P., Hancock R. Silver staining of proteins in polyacrylamide gels // Anal. Biochem. 1981. Vol. 118. P. 197.

Статья принята к печати 19 февраля 2007 г.