Взаимодействие протеаз с синтетическими химическими субстратами у термофильной бактерии Se-1-10

В донных отложениях озер численность бактерий варьировала от 103 до 108 кл./мл, в воде колебалась от 103 до 106 кл./мл. Максимальные численности аэробных и анаэробных целлюлолитиков отмечены в илах озера Хилганта (09) до 106 и 108 кл./мл соответственно. Минимальные численности бактерий отмечены в илах озера Бормашовое до 103-104 кл./мл. Наличие высокой численности микроорганизмов указывает на наличие в илах озер легкоусвояемого органического вещества и предопределяет его деструкцию в этих водных экосистемах.

Полученные результаты показывают, что микроорганизмы - деструкторы играют важную роль в круговороте углерода и других биогенных элементов в воде и донных осадках исследуемых озер Бурятии и Монголии.

Работа выполнена при финансовой поддержке грантов МО РФ РНП.2.1.1/2165, МО РФ РНП №2.1.1. НОЦ «Байкал», интеграционных проектов СО РАН №38 и СО РАН №95.

ЛИТЕРАТУРА

1. Couglan M.P., Mayer F. The cellulose-decomposing bacteria and their enzyme systems. The procariotes. - NY: Springer. - 1992. - P. 469-516

2. Lynd L.R., Weimer P.J., van Zyl W.H., Pretorius I.S. Microbial cellulose utilization: fundamentals and biotechnology // Microbiol. Mol. Biol. Rev. - 2002. - V.66, №3. - P. 506-577.

3. Думова В. А., Круглов Ю.В. Ассоциация бактерий, утилизирующая целлюлозы // Микробиология. - 2009. - Т.78, №2. - С. 268-274.

4. Практикум по микробиологии / под ред. Н.С. Егорова. - М.: Изд-во МГУ, 1976. - С.61-65.

УДК 577.151.01

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ПРОТЕАЗ С СИНТЕТИЧЕСКИМИ ХИМИЧЕСКИМИ СУБСТРАТАМИ

У ТЕРМОФИЛЬНОЙ БАКТЕРИИ SE-1-10

А.А. Раднагуруева, Е.В. Лаврентьева*, Б.Б. Намсараев*, Я.Е. Дунаевский**

Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, Улан-Удэ Бурятский государственный университет, Улан-Удэ НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва

Изучена внеклеточная протеазная активность культуры Se-1-10, выделенной из поверхностного микробного мата термального источника Сея. Показано, что протеиназы относятся к классу сериновых и металлопротеаз.

Ключевые слова: протеиназы, ингибиторы, активный центр.

INTERACTION OF PROTEASES WITH SYNTHETIC CHEMICAL SUBSTRATE AT THERMOPHILIC BACTERIA SE-1-10 A.A. Radnagurueva, E.V. Lavrentieva, B.B. Namsaraev, Ya.E. Dunaevskiy Institute of General and Experimental Biology, SB RAS, Ulan-Ude Buryat State University, Ulan-Ude Belozerskiy Institute of Physiochemical Biology, Moscow State University, Moscow

Extracellular protease activity of culture Se-1-10 isolated from microbial mat of thermal source Seya is studied. It is shown, that proteinases belong to the class of serine and metalloproteases.

Key words: proteinases, inhibitors, active centre.

Протеазы относятся к классу гидролаз, в составе которого образуют подкласс пептидгидролазы. Ранее было показано [1], что протеиназы в основном действуют по четырем каталитическим механизмам, что и было положено в основу их классификации: сериновые (КФ 3.4.21), цистеиновые (КФ 3.4.22), аспартатные (КФ 3.4.23) и металлопротеиназы (КФ 3.4.24). На сегодняшний день показано, что микроорганизмы, выделенные из горячих источников Байкальского региона, относятся к сериновым и металлопротеазам. Активность сериновых протеиназ зависит от каталитической триады аминокислот - аспарагиновая кислота/гистидин/серин (Asp/His/Ser), расположенных в активном центре. Гидроксильная группа серина (Ser) выступает как нуклеофил, атакующий пептидную связь, остаток гистидина (His), расположенный в активном центре, играет роль донора протона, а остаток аспарагина (Asp) участвует в ориентации имидазольного кольца гистидина.

Металлопротеиназы содержат в молекуле ионы различных металлов, например, цинка, кобальта или марганца, принимающие непосредственное участие в процессах протеолиза. В роли лигандов, связывающих ионы металлов, выступают три аминокислотных остатка: гистидин (His), глутаминовая кислота (Glu), аспарагиновая кислота (Asp) или остаток лизина (Lys). Кроме связывания ионов металлов один из трех аминокислотных остатков принимает участие в катализе. У одних металлопротеиназ это может быть остаток глутаминовой кислоты, у других эту роль могут играть лизин или аргинин [2].

Целью данного исследования явилось изучение взаимодействия протеаз с синтетическими химическими субстратами у культуры Se-1-10, выделенной из термального источника Сея.

Объекты и методы исследования

В качестве источника секретируемых протеолитических ферментов использовали культуральную жидкость культуры Se-1-10, выделенную из поверхностного микробного мата горячего источника Сея (Бурятия).

Определение внеклеточной протеазной активности в культуральной жидкости проводили по методу Эрлангера с соавт. [3], используя 5 мМ пара-нитроанилидные субстраты протеаз -трипсиноподобных: ВАРА (К-бензоил^-аргинил-п-нитроанилид), субтилизиноподобных:

GlpAALpNA (пироглутамил-аланил-аланил-лейцил-п-нитроанилид), и аминопептидаз: TpNA (L-тирозил-п-нитроанилид), ApNA (L-аланил-п-нитроанилид-гидрохлорид), LpNA (L-лейцил-п-нитроанилид), ZAAGlupNa (N-карбобензокси-аланил-аланил-глютамин-п-нитроанилид) и на белковом субстрате азоказеине, используемом для определения общей активности. Для изучения зависимости секреции ферментов от суток культивирования культуральную жидкость отбирали через 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96 и 108 ч. В работе использовались ингибиторы металлопротеаз-этилендиаминтетраацетат Na (ЭДТА) и о-фенантролин, цистеиновых протеаз - иодацетамид (HAA) и сериновых протеаз - фенилметилсульфонилфторид (ФМСФ).

Результаты исследования

Определение субстратной специфичности показало, что изученный штамм не гидролизует субстрат, специфичный для трипсинподобных протеиназ, независимо от времени культивирования (до 108 ч). Культура наиболее активна в отношении субстрата для субтилизинподобных протеиназ -GlpAALpNA и аминопептидаз - ZAAGlupNa. Максимальные значения определены на 96-108 ч культивирования и составили 1,325 и 1,099 ед. соответственно (рис.).

Рис. Внеклеточная протеазная активность на различных субстратах

Оптимум активности протеаз лежит в широком пределе значений рН от 7,4 до 11,3, что характерно для сериновых протеаз. Протеазы стабильны в диапазоне от 6,26 до 11,3.

Результаты исследования зависимости активности протеиназ от температуры культивирования показали, что протеиназа стабильна в диапазоне температур от 23 до 60оС, максимум активности наблюдался при температуре 40-50оС. Исследование влияния ингибиторов на активность протеаз показало низкие значения. Все металлопротеазы инактивируются хелатными реагентами, такими как ЭДТА или о-фенантролин. В свою очередь, все сериновые протеиназы чувствительны к специфическим ингибиторам, взаимодействующим с каталитическим остатком серина: эфирам фосфорной кислоты (диизопропилфторфосфат) и фенилметансульфогалогенидам (ФМСФО) [2]. Важно отметить, что могут существовать значительные различия в сродстве тех или иных ингибиторов к разным ферментам этой группы.

Проведенный анализ функциональных групп активного центра показал, что активность внеклеточных протеиназ по субстрату ОірЛЛЬрКЛ у культуры 8е-1-10 подавляется специфическим ингибитором сериновых протеиназ - ФМСФ на 86,4%, причем интересно, что в отношении другого субстрата 2ЛЛОІирКа, он не был столь эффективным, подавляя лишь 15% активности при концентрации 0,01 М (табл.). Таким образом, субстрат ОірЛЛЬрКЛ, использованный нами для определения активности субтилизинподобных протеиназ у культуры 8е-1-10, эффективно гидролизуется сериновой протеиназой. Ингибирование на 92,5% ЭДТА, по-видимому, является ошибочным, т.к. активность о-фенантролином не ингибировалась. По субстрату 2ЛЛОІирКа протеиназы культуры 8е-1-10 ингибируется ЭДТА на 77%. Ингибирование о-фенантролином было слабым и составило 4,5%. Ингибирование ИАА не дал никаких результатов.

Таблица.

Влияние ингибиторов на активность протеиназ культуры Se-1-10

Эффектор Концентрация эффектора

Субстрат

GlpAALpNA ZAAGlupNa

ФМСФ 0,01 86,4 15

ЭДТА 0,01 67,9 н.о.

0,1 92,5 77

о-фенантролин 0,01 2,78 4,5

ИАА 0,01 1,1 0

Примечание: н.о. - не определено

С помощью гель-хроматографии на колонке Superdex-75 была определена молекулярная масса протеиназы культуры Se-1-10, которая составила 85000 Да.

Таким образом, можно заключить, что культура Se-1 секретирует, по крайней мере, два

фермента принадлежащих к двум классам протеиназ - сериновым и металлопротеазам.

Работа выполнена при поддержке грантов МО РФ РНП 2.1.1/2165, НОЦ «Байкал».

ЛИТЕРАТУРА

1. Hartley B.S. Proteolytic enzymes // Ann. Rev. Biochem. - 1960. - V.29. - P. 45-72.

2. Антонов В.К. Химия протеолиза. - М.: Наука, 1991. - 504 с.

3. Erlanger B.F., Kokowsky N., Cohen W. The preparation and properties of two new chromogenic

substrates of trypsin // Arch. Biochem. Biophis. - 1961. - V.95. - P. 271-278.