СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МИКОПЛАЗМОЗНЫХ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ СЫВОРОТОК ДЛЯ РЕАКЦИИ НЕПРЯМОЙ ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНЦИИ ПУТЕМ ГИПЕРИММУНИЗАЦИИ КРОЛИКОВ
METHOD OF OBTAINING MYCOPLASMOSIS DIAGNOSTIC SERUMS FOR INDIRECT IMMUNOFLUORESCENCE REACTION BY RABBIT HYPERIMMUNISATION

Способ получения микоплазмозных сывороток для реакции непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ) относится к методам лабораторной диагностики микоплазмозов и может быть использован в ветеринарной медицине.
Известны способы получения гипериммунных сывороток при бруцеллезе, лептоспирозе животных, описанные в рефератах российских патентных документов за 1994-2007 гг. (№№2173169, 1999.07.27; 2138292, 1998.10.13).
Однако данные способы обладают следующими недостатками: длительные сроки гипериммунизации; невысокие титры образующихся в крови кроликов антител и низкая активность полученных сывороток.
Наиболее близким к заявляемому способу является способ получения диагностических сывороток путем гипериммунизации кроликов, используемых в РНИФ для диагностики микоплазмозов плотоядных (Новикова Н.Н. Экспресс-методы диагностики ассоциативного урогенитального микоплазмоза плотоядных: дис… канд. вет. наук.: 16.00.03. / Н.Н.Новикова; - Новосибирск - 2002. - С.55-60).
Суть этого способа состоит в следующем.
Для гипериммунизации используются трехсуточные культуры микоплазм, выделенные от плотоядных (M.fermentans, M.canis, M.laidlawii, U.urealyticum). Культуральную жидкость центрифугируют при 6 тыс. оборотах /мин в течение часа. Осадок после трехкратного ресуспендирования в физиологическом растворе и последующего центрифугирования доводят до концентрации 1,7 млрд микробных тел в 1 мл по бактериальному стандарту мутности.
Гипериммунизацию микоплазмами проводят на 8 кроликах (по 2 головы на каждый штамм) весом 2,5-3 кг. Суть гипериммунизации состоит в дробном внутривенном введении антигена кроликам каждые три дня с двукратным применением иммуностимулятора левомизола подкожно.
Таблица 1.
Схема гипериммунизации кроликов культурамимикоплазм.
Время введения, сут
1
4
7
10
13
16
20
24
Доза антигена, млрд м.т.
0,85
1,7
1,7
1,7
3,4
3,4
3,4
3,4
Левамизол, мл
1
1
-
-
-
-
-
-
Динамику синтеза антител изучают на 7, 14, 21 и 30 сутки после первого введения антигена в реакции непрямой иммунофлюоресценции, которую ставят на предметных стеклах по стандартной методике, учет реакции проводят в крестах, свечение менее чем на два креста считают отрицательным. В качестве антигенов в РНИФ применяют 1 млрд взвеси микоплазм, инактивированных на водяной бане при 70°С - 30 мин. На 30-е сутки всех кроликов тотально обескровливают и получают микоплазмозные диагностические сыворотки.
Таблица 2.
Динамика синтеза антител у кроликов, гипериммуникультурами микоплазм.
Сроки взятия крови(дни)
Титр антител
7-й день
1:40
14-й день
1:160
21-й день
1:320
30-й день
1:640
Наиболее высокий уровень антител регистрируется на 21-30 дни после гипериммунизации, который колеблется в пределах 1:320-1:640.
Целью изобретения является получение микоплазмозных диагностических сывороток путем гипериммунизации кроликов для диагностики микоплазмозов свиней в реакции непрямой иммунофлуоресценции.
Поставленная цель достигается при соблюдении ряда приемов: получением антигенов из трех культур микоплазм (М.hyosynoviae, M.hyorhinis и Ureaplasma sp.); гипериммунизацией кроликов в течение 21 дня путем дробного внутривенного введения антигенов каждые три дня с трехкратным применением иммуностимулятора левомизола.
Описание метода
Для гипериммунизации кроликов используются трехсуточные инактивированные нагреванием до 70°С в течение 30 минут культуры микоплазм (штаммы М.hyosinoviae, М.hyorhinis и Ureaplasma sp.), которые отмывали от питательной среды путем центрифугирования при 6000 об. 30 мин, осадок после трехкратного ресуспендирования и последующего центрифугирования разводили до концентрации 1,7 млрд микробных клеток в 1 мл по бактериальному стандарту мутности (ГИСК им. Л.А.Тарасовича).
Иммуностимулятор левамизол вводили трехкратно для повышения иммуногенности вводимых штаммов микоплазм и сроки гипериммунизации сократили до 21-х суток в связи с максимальным титром антител в крови кроликов на 21-е сутки. В дальнейшем титр антител в крови кроликов начинает снижаться.
Таблица 3.
Схема гипериммунизации кроликов культурами микоплазм.
Время введения, сут
1
4
7
10
13
16
19
Доза антигена, млрд м.т.
0,85
1,7
1,7
1,7
3,4
3,4
3,4
Левамизол, мл
1
1
1
-
-
-
-
Динамику синтеза антител изучали на 7,14 и 21 сутки после первого введения антигена в реакции непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ). На 21-е сутки всех кроликов тотально обескровливали и получали микоплазмозные диагностические сыворотки.
При постановке РНИФ была использована следующая методика. На тщательно обезжиренные без царапин предметные стекла наносили пастеровской пипеткой параллельно друг другу несколько капель антигенов. Антигены высушивали и фиксировали над пламенем спиртовки. Затем на каждую каплю антигена наносили такую же каплю сыворотки, начиная с последнего разведения. Стекла выдерживали во влажной камере при 37°-38°С в течение 50-60 мин для образования комплекса антиген - антитело. После чего их промывали от несвязавшихся антител дистиллированной водой, подсушивали и наносили в красящем титре (подобранным опытным путем) ослиный антикроличий глобулин меченный ФИТЦ (флуоресцеин изотиоционатом натрия), изготовленный НИИ ЭМ им. Н.Ф.Гамалеи. Затем стекла помещали на 15-20 минут во влажную камеру при температуре 37°-38°С. По истечении этого времени мазки промывали дистиллированной водой, просушивали и просматривали в люминесцентном микроскопе с обязательными контролями.
1. Антиген + сыворотка положительная + сыворотка люминесцентная;
2. Антиген + сыворотка отрицательная + сыворотка люминесцентная;
3. Антиген + физиологический раствор + сыворотка люминесцентная.
Микроскопию проводили в падающем свете микроскопа МБИ-15.
Для оценки интенсивности свечения использовали четырехкрестовую систему:
++++ - очень яркая люминесценция по периферии микробной клетки, четко контрастирующая с телом клетки; +++ - яркая люминесцирующая периферия клетки; ++ или + - слабое свечение периферии клетки; - (минус) люминесценция клеток отсутствует. За положительный результат принимали яркое специфическое свечение контуров микробов в виде ободков с оценкой в 3 и 4 креста; сомнительные результаты оценивали в 2 креста при наличии слабого свечения контуров клеток.
Таблица 4.
Динамика синтеза антител у кроликов, гипериммунизированных культурами микоплазм.
Сроки взятия крови (дни)
Титр антител
М.hyosynoviae
M.hyorhinis
Ureaplasma sp.
7-й день
1:20
1:10
1:20
14-й день
1:640
1:640
1:320
21-й день
1:640
1:1280
1:640
Установлено, что на 7-й день после первого введения антигена антитела в РНИФ выявлялись в низких титрах 1:10-1:20. На 14-й день положительная реакция в РНИФ была при более высоких разведениях в пределах 1:320-1:640, а на 21-е сутки синтез антител достиг максимального уровня 1:640-1:1280.
Преимущество данного способа получения противомикоплазмозных сывороток в более высоких диагностических титрах антител, в сокращении сроков гипериммунизации и в возможности использования полученных сывороток для диагностики микоплазмозов свиней в РНИФ. Контроль на видовую специфичность и активность полученных микоплазмозных сывороток в РНИФ.
Для изучения видовой специфичности и активности использовали кроличьи антимикоплазмозные сыворотки в разведениях с 1:10 до 1:640 и микоплазмозные антигены, полученные вышеописанным способом.
Определяя видовую специфичность и активность полученных микоплазмозных кроличьих сывороток в РНИФ, установили, что полученные сыворотки реагируют только с аналогичными антигенами и активны во всех используемых разведениях.