Скрытые биомаркеры процессов минералообразования в генезисе уролитов

DOI: 10.25702/KSC.2307-5228.2018.10.4.31-38 УДК 616.6:577.1:519.47: 549.02

СКРЫТЫЕ БИОМАРКЕРЫ ПРОЦЕССОВ МИНЕРАЛООБРАЗОВАНИЯ В ГЕНЕЗИСЕ УРОЛИТОВ

В. И. Каткова, О. Е. Амосова, С. Н. Шанина

ФГБУН Институт геологии Коми НЦ УрО РАН, г. Сыктывкар

Аннотация

Приведены показатели заболеваемости уролитиазом у лиц, проживающих в Республике Коми, значения которых оказались гораздо выше общероссийских. В связи с наблюдаемым увеличением частоты встречаемости уролитиаза и сложностью биоминералогенезиса, требующего специфического подхода, в данной работе представлены исследования аминокислотного состава биоминералов с новых позиций. Выполнена проверка статистической значимости различий белковой составляющей разных типов уролитов. Проведенный статистический анализ аминокислотного состава трех типов уролитов (оксалатных, фосфатных, уратных) позволил выявить отличия в их белковой составляющей и ее связь с основными минеральными компонентами. Показаны специфические особенности состава и содержания аминокислот 28 уролитов в зависимости от минерального состава. На основе анализа литературы показано, что модуляторами процессов минерализации являются продукты защитных реакций в тканях с участием различных типов клеток крови, эндотелия, соединительной ткани и эпителиев. Ключевые слова:

аминокислоты, уролиты, биоминералы, состав, биомаркеры, белки, критерий Краскела — Уоллиса, критерий Манна — Уитни, деревья классификации, дискриминантный анализ.

LATENT BIOMARKERS OF MINERAL-FORMING PROCESSES IN THE UROLITH GENESIS

Valentina I. Katkova, Olga E. Amosova, Svetlana N. Shanina

Institute of Geology of the Komi Science Centre of UB RAS, Syktyvkar

Abstract

The urolithiasis morbidity rate of people living in the Komi Republic is given, which is significantly higher than all-Russian. In connection with the observed increasing of urolithiasis occurrence and the complexity of biomineralogenesis, which requires a specific approach, the paper presents studies of the amino acid composition of biominerals, based on a new approach. The statistical importance of differences in the protein component of different urolithic types, was checked out. The statistical analysis of amino acid composition of three urolithic types (oxalates, phosphates, urates) allowed revealing differences in their protein component and its connection with the basic mineral components. The peculiarities of the amino acid composition and content of 28 urolithsare are shown depending on the mineral composition. On the basis of literature data, it is shown that modulators of mineralization are products of protective reactions in tissues involving different types of blood, endothelium, connective tissue, and epithelium cells.

Keywords:

amino acids, uroliths, biominerals, composition, biomarkers, proteins, Kruskel — Wallis criterion, Mann — Whitney criterion, classification trees, discriminant analysis.

Введение

Уролитиаз (мочекаменная болезнь) распространен на земном шаре неравномерно, частота его встречаемости может значительно различаться в стране в зависимости от района проживания.

Последние данные Госкомстата и Минздрава России свидетельствуют о том, что уровень заболеваемости уролитиазом

в Республике Коми возрастал, составив 2016 г. 8,52 случая на 1000 чел., а в целом по России — 5,98 [1]. По статистике, наибольшее число случаев мочекаменной болезни на 1000 чел. В Республике Коми приходится на Усинский (16 случаев), Усть-Цилемский, Койгородский, Прилузский районы (рис. 1). В динамике с 2007 по 2017 гг., по нашим наблюдениям, в этих районах неуклонно отмечался рост заболеваемости мочекаменной болезнью.

2010  2017

Рис. 1. Динамика роста заболеваемости уролитиазом в Республике Коми Fig. 1. The incidence of urolithiasis (urinary stone disease) in the Komi Republic

Эти показатели заболеваемости, отражающие проблемы взаимоотношений в системе «человек — среда», оказались значительно выше общероссийских. При исследовании 90 мочевых камней, полученных от лиц, проживающих в Республике Коми, было установлено, что на долю оксалатных уролитов приходится 67 %, фосфатных — 22 % (струвит-, апатит-, и ньюбериитсодержащие включительно) и уратных — 11 %. Струвит является наиболее распространенной минеральной фазой в фосфатных уролитах.

В исследованных образцах поляризационным, рентгеноструктурным и ИК-спектроскопическими методами идентифицированы 7 минералов: уэвеллит (СаС2О4Н2О), уэдделлит (СаС2О42Н2О), карбонатсодержащий апатит-(СаОН), струвит (MgNH4PO4-6H2O), ньюбериит (MgHPO43H2O), мочевая кислота (С5Н4К4О3) и дигидрат мочевой кислоты (С5Н4К4О32Н2О). Все уролиты, состоящие из мочевой кислоты, были обнаружены у мужчин, за исключением одного образца. Следует также заметить, что у них уролитиаз встречается чаще, чем у женщин. По данным анализа 60 анамнезов, фактор наследственности имел место у 11 человек при отсутствии сведений в 8 случаях.

В настоящее время отсутствует единая точка зрения на природу уролитиаза, поэтому лучшее понимание этого сложного механизма приведет к разработке новой стратегии не только профилактики и метафилактики, но и лечения этого заболевания. В последние десятилетия пристальное внимание уделялось изучению активности различных протеолитических ферментов у больных уролитиазом, а также их активаторов и ингибиторов в моче. Биохимические исследования показали, что основой матрицы уролитов, как правило, являются ингибиторы минерализации (уропонтин, уромодулин, бикунин, альбумин и др.), вырабатываемые почечным уротелием [2, 3]. Несмотря на многолетние исследования и большой объем новой информации о белках в составе органической матрицы, в литературе остаются неосвещенными вопросы, касающиеся биомаркеров минерализации [з].

Целью работы является выявление взаимосвязи минеральной фазы и аминокислотного состава в уролитах.

Материал и методы исследований

Материалом исследования послужила коллекция уролитов жителей Республики Коми. По химическому составу изученные мочевые камни были предварительно разделены на оксалатные (12 образцов), фосфатные и уратные (по 8 образцов).

Определение аминокислотного состава 14 белковых аминокислот (аланина (Ala), валина (Val), глицина (Gly), изолейцина (Ile), лейцина (Leu), аспарагиновой (Asp) и глутаминовой (Glu) кислоты, треонина (Thr), серина (Ser), фенилаланина (Phe), тирозина (Tyr), пролина (Pro), лизина (Lys), метионина (Met)) проводили по ранее разработанной методике [4]. Для извлечения аминокислот из образцов применяли кислотный гидролиз в 6М HCl при 105 oC в течение 12 час. Выделенные из гидролизата аминокислоты очищали от примесей и переводили в N-пентафторпропионовые изопропиловые эфиры соответствующих аминокислот. Идентификация аминокислот и определение их содержания в образцах выполнены на газовом хроматографе GC-l7A (Shimadzu, капиллярная колонка Chirasil-L-Val).

Результаты и обсуждение исследований

Как следует из обзора литературы [Э], содержание матрицы составляет 2-5 % от сухого веса уролита. Основная масса органической составляющей уролитов приходится на долю белка (64 %). Кроме того, в составе матрицы идентифицированы гликозаминогликаны, липиды и вода.

^смотря на значительные успехи в изучении органической матрицы уролитов, до сих пор не обнаружено ни одного компонента, которому бы отводилась основополагающая роль в генезисе патогенных биоминералов [S]. В настоящее время для определения биомаркеров процессов минералообразования при уролитиазе используются протеомные методы исследований, позволяющие определять белки, участвующие в сигнальных путях на молекулярном уровне [5-7]. Основным инструментом протеомики является метод двумерного гель-электрофореза в сочетании с масс-спектрометрией, который позволяет проанализировать несколько тысяч белков в одном образце. Предполагается, что расшифровка протеома поможет найти многие новые молекулярные маркеры и причины патологий человека различной природы. бедует отметить, что выявленное многообразие макромолекул гликопротеидов, по-видимому, обусловлено не только особенностью минерального состава конкремента, но и методами исследований [S].

Исследования 25 образцов (13 оксалатсодержащих, 12 апатитсодержащих) [5] показали, что уэвеллитсодержащие уролиты содержат внутриклеточные элементы и структуры клеточных мембран (16 %), белки свертывающей системы (4 %). Взаимодействие почечных эпителиальных клеток с кристаллами оксалата кальция приводит к увеличению синтеза остеопонтина, бикунина, гепарансульфата и моноцитарного хемотаксического фактора-1 (МСТ-l). (МСТ-l) совместно с простагландином (PG) E2 при воспалительных процессах участвует в производстве внеклеточного матрикса. Кальциофосфаты имеют большой спектр воспалительных белков (40 %). Кальпротектин выявляется в каждом втором исследованном образце. Авторы установили более 100 белков и заключили, что органическая составляющая кальцийсодержащих камней не различается по составу, что поддерживает гипотезу о том, что образование камней индуцирует клеточный воспалительный ответ.

C использованием жидкостной хроматографии и масс-спектроскопии идентифицированы остеопонтин, уромодулин, альбумин, белок Z, белок S, протромбин, гемоглобин и гистон H4 в оксалатсодержащих уролитах как наиболее распространенные белки [б]. Для мочекислых уролитов особенностью является присутствие IgG из преимущественно гуанидиновой фракции — наиболее распространенного иммуноглобулина, обеспечивающего защиту от микроорганизмов и токсинов. Эпителиальные клетки почки, подвергающиеся воздействию кристаллов мочевой кислоты, синтезируют МСТ-l. Моноциты и нейтрофилы, подвергнутые воздействию кристаллов урата, производят фактор некроза опухоли а-интерлейкин-l (IL-l), IL-6 и IL-8. Исследования показали, что уромодулин и альбумин часто обнаруживаются в камнях независимо

от минеральной фазы [8]. Идентифицировано 1059 белков при изучении двух оксалатсодержащих уролитов, состав которых отражает молекулярную и клеточную реакцию организма при воспалении, повреждении и восстановлении клеток [9]. Кроме того, выявлен набор, уникальный для каждого из этих двух образцов.

Таким образом, показано, что протеом уролитов представляет многообразный спектр белков, включая макромолекулы почечного и сывороточного происхождения — цитокины, формирующие комплекс защитных реакций в ответ на повреждение тканей токсинами различного происхождения, элементы клеточной мембраны и внутриклеточные белки эпителия мочевых путей.

Ранее проведенные исследования аминокислотного состава разных генетических типов биоминералов в организме человека показали, что различные минералы формируются в условиях повышенного содержания одного и того же набора аминокислот, выполняющих роль структурообразующих компонентов в генезисе патогенных твердых образований [10]. В дальнейшем исследования биоминеральных образований, в частности уролитов, были продолжены. На основании анализа 28 образцов нами выявлено, что общая сумма аминокислот может значительно колебаться в уролитах одного и того же минерального состава, например, в оксалатсодержащих образцах, сформированных в одной почке, разница в их содержании по общей сумме различается двукратно (рис. 2). Анализы аминокислотного состава проб, отобранных из разных частей уролитов, подтвердили неравномерную локализацию белковых веществ, о чем ранее упоминалось в работе [9].

Рис. 2. Содержание аминокислот в оксалатсодержащих уролитах (уэвеллит + уэдделлит),

сформированных в одной почке, мг/г

Fig. 2. Amino acids composition in oxalate uroliths (whewellite, weddellite), formed in one kidney, mg/g

При изучении 12 образцов фосфатсодержащих уролитов (ФСУ) были выделены три группы по содержанию аминокислот (АК): с высоким (29-46 мг/г, 3 образца), средним (18-22 мг/г, 4 образца) и низким (10-14 мг/г, 5 образцов). Анализы показали, что образцы характеризуются доминированием глутаминовой (12-22 %) и аспарагиновой (10-22 %) кислот, в 6 образцах отмечается высокое содержание лизина (9-13 %).

Оксалатсодержащие уролиты (ОСУ) по общей сумме АК разделились на две группы (8 образцов): с высоким содержанием (30-34 мг/г) и низким (13-27 мг/г) при отсутствии корреляции с минеральным составом. Образцы с высоким содержанием АК характеризуются значительными концентрациями аланина (14-29 %), во второй группе его содержания находятся на уровне 5-6 %. Во всех изученных образцах повышены содержания глутаминовой (12-20 %) и аспарагиновой кислоты (8-21 %). В трех случаях установлено высокое содержание пролина (12-15 %). Оксалаты

6

5

обр.2

обр.1

характеризуются самыми низкими концентрациями глицина (4-7 %). В фосфатных и оксалатных уролитах в единичных случаях установлено присутствие гидроксипролина, что указывает на возможное присутствие в их составе фибриллярных белков.

Уратные мочевые камни (УМК). Изучено 8 образцов, которые по содержанию АК разбиваются на две группы — с высоким (29-33 мг/г образца) и низким (12-20 мг/г) содержанием. Установлено, что среди индивидуальных аминокислот доминирует глицин (9-S6 %). По сравнению с другими типами камней здесь меньше глутаминовой (9-12 %) и аспарагиновой кислоты (5-14 %). В S образцах установлены высокие содержания тирозина (9-11 %).

В связи с тем, что изученные типы уролитов невозможно отличить по содержанию и выделению доминирующих аминокислот, был проведен статистический анализ по относительным процентным содержаниям аминокислот одномерными (критерии Краскела — Уоллиса и Манна — Уитни) и многомерными методами («деревья классификации» и дискриминантный анализ) с использованием программного продукта Statistica 6.0. Критерием Краскела — Уоллиса установлено, что мочевые камни статистически значимо различаются по Gly, Ile, Asp, Glu, Lys (p < 0,05). Для того чтобы установить, какие именно группы объектов различаются, был применен критерий Манна — Уитни. При попарном сравнении трех независимых групп образцов — мочекислых (уратных), фосфат- и оксалатсодержащих — использовался скорректированный критический уровень значимости, равный 0,017 [11]. Установлено, что по относительным содержаниям Gly и Glu фосфатные и оксалатные уролиты статистически значимо отличаются от мочекислых, но не различаются между собой. Удержание Asp статистически значимо различается только в УМК и ФСУ, но не различается для других пар мочевых камней.

Поскольку УМК очень хорошо отличаются от ФСУ и ОСУ по Gly и Glu, то сравнение только этих двух типов уролитов (фосфат- и оксалатсодержащих) проводилось с заданным уровнем значимости 0,05. Установлено, что они различаются статистически значимо по Ile, Pro, Phe, Lys.

Метод «деревья классификации» [l2], проведенный по аминокислотному составу, показал 100 %-но правильную классификацию всех 28 образцов мочевых камней для всех типов ветвления, реализованных в программе Statistica 6.0 (дискриминантное одномерное ветвление для категориальных и порядковых предикторов, полный перебор для одномерных ветвлений по методу C&RT, дискриминантное ветвление по линейным комбинациям порядковых предикторов), с условием прекращения ветвлений — прямая остановка (FACT) и априорными вероятностями (0,67 — оксалатные, 0,22 — фосфатные, 0,11 — уратные), заданными с учетом исходных частот встречаемости разных типов уролитов у жителей Республики Коми.

Cамое простое и короткое дерево классификации, имеющее наименьшее число ошибок классификации в результате проведенной глобальной кросс-проверки, получено дискриминантным ветвлением по линейным комбинациям порядковых предикторов остановкой — прямая остановка (FACT). Граф дерева показан на рис. 3.

Также для выявления статистически значимых различий аминокислотного состава образцов разных типов уролитов использовался традиционный метод — дискриминантный анализ [lS]. В результате его применения установлено, что все три типа мочевых камней различаются по аминокислотному составу статистически значимо (статистика лямбда Уилкса 0,005 при уровне значимости p = 1,37Е-09). Для выявления информативных аминокислот, вносящих значимый вклад в различение образцов мочевых камней разных типов, был проведен дискриминантный анализ двумя методами — пошаговый с включением и пошаговый с исключением.

^ибольшая доля правильной классификации образцов (100 %) была получена методом пошаговый с включением. C его помощью выявлено10 наиболее информативных аминокислот — Gly, Tyr, Lys, Leu, Ile, Ser, Thr, Phe, Glu, Pro. По этим аминокислотам были вычислены две канонические дискриминантные функции: первая дискриминантная функция очень хорошо различает оксалатные от других типов, но плохо — мочекислые и фосфатные уролиты.

Наибольший вклад в значение первой дискриминантной функции вносят Gly, Leu, Ile, Ser, Thr. Вторая дискриминантная функция очень хорошо различает фосфатные и уратные образцы. Наибольший вклад в значение второй дискриминантной функции вносят Tyr и Phe. Все уролиты с помощью двух вычисленных канонических дискриминантных функций по аминокислотному составу белковой составляющей четко разделяются на три типа (рис. 4), определяемых основными минеральными компонентами. Таким образом, на основании статистического анализа показана существующая взаимосвязь аминокислотного состава с минеральной составляющей уролитов.

Рис. 3. Граф дерева классификации уролитов по составу 14 аминокислот Fig. 3. The graph of classification tree of uroliths on composition of 14 amino acids

Рис. 4. Расположение образцов уролитов на плоскости, заданной первой и второй дискриминантными функциями

Fig. 4. Location of uroliths on the plane defined by the first and second discriminant functions

Выводы

Установлен значительный рост заболеваемости уролитиазом у жителей, проживающих в Республике Коми.

Анализ белковой составляющей 28 уролитов, разделенных по химическому составу, позволил выделить единичные аминокислоты, доминирование которых специфично для конкретного типа уролитов: в оксалатных наблюдаются относительно высокие концентрации аланина и пролина, в фосфатных — лизина, а в уратных — глицина и тирозина.

Статистическим анализом выявлены статистически значимые различия содержаний аминокислот разных типов уролитов, что свидетельствует о взаимосвязи аминокислотного состава с минеральной составляющей мочевых камней.

На основании проведенных исследований и анализа литературы можно сделать вывод о том, что аминокислоты в составе органической составляющей уролитов являются скрытыми биомаркерами в генезисе патогенных биоминералов.

Выявленные различия в аминокислотном составе органической составляющей уролитов служат подтверждением многообразного спектра белков протеома органоминеральных конкрементов. Дальнейшие исследования могли бы способствовать поиску специфических органических предикторов и биомаркеров уролитиаза.

ЛИТЕРАТУРА

1. Заболеваемость всего населения России в 2016 году: стат. сб. М., 2017. Ч. II. 142 с. 2. Оксалатно-кальциевый нефролитиаз в детском возрасте / Е. И Прахин [и др.]// Педиатрия. 2004. № 2. С. 67-70. 3. Nephrolithiasis: Molecular Mechanism of Renal Stone Formation and the Critical Role Played by Modulators / K. P.Aggarwa [et al.] // BioMed Res. Intern. 2013. Р. 1-22. 4. Шанина С.Н., Голубев Е. А. Аминокислоты в шунгитах Карелии // Геохимия.2010. № 9. С. 972-987.5. Proteome of Human Calcium Kidney Stones / B. K. Canales [et al.] // Urology 76 (4). 2010. P. 13-20. 6. Comparison of matrix proteins in different types of urinary stone by proteomic analysis using liquid chromatography — tandem mass spectrometry / K. Kaneko [et al.] // Intern. J. Urology. 2012. P. 1-8. 7. Stock A., Yadav K. K., Gapta M. Analysis of Methods for Extracting Matrix Proteins from Human Kidney Stones // Urology & Nephrology Open Access J. 2017. Vol. 4 (1). Р. 1-5. 8. Khan S. R. Crystal-induced inflammation of the kidneys: results from human studies, animal models, and tissue-culture studies // Clinical and Experimental Nephrology. 2004. Р. 75-88. 9. Label-free proteomic methodology for the analysis of human kidney stone matrix composition / F. A. Witzmann [et al.] // Proteome Sci. 2016. С. 1-10. 10. Каткова В. И., Шанина С. Н., Боровкова Е. В. Аминокислоты: структурообразующие компоненты биоминералов и маркеры процессов биосинтеза // ЗРМО. 2008. № 5. С.80-85. 11. Унгуряну Т. Н., Гожибовский А. М. Сравнение трех и более независимых групп с использованием непараметрического критерия Краскела — Уоллиса в программе STATA // Экология человека. 2014. № 6. С. 55-58.12. Деревья классификации: электрон. учебник. URL: http://www.statlab.kubsu.ru/sites/project_bank/trees.pdf. 13. Клекка У. Р. Дискриминантный анализ // Факторный, дискриминантный и кластерный анализ. М.: Финансы и статистика, 1989.

Сведения об авторах

Каткова Валентина Ивановна — кандидат геолого-минералогических наук, старший научный сотрудник Института геологии Коми НЦ УрО РАН E-mail: katkova@geo.komisc.ru

Амосова Ольга Евгеньевна — кандидат геолого-минералогических наук, научный сотрудник Института геологии Коми НЦ УрО РАН E-mail: kramosova@geo.komisc.ru

Шанина Светлана Николаевна — кандидат геолого-минералогических наук, старший научный сотрудник Института геологии Коми НЦ УрО РАН E-mail: shanina@geo.komisc.ru

Author Affiliation

Valentina I. Katkova — PhD (Geology & Mineralogy), Senior Researcher of the Institute of Geology of the Komi Science Centre of UB RAS, Syktyvkar E-mail: katkova@geo.komisc.ru

Olga E. Amosova — PhD (Geology & Mineralogy), Researcher of the Institute of Geology of the Komi Science Centre of UB RAS, Syktyvkar E-mail: kramosova@geo.komisc.ru

Svetlana N. Shanina — PhD (Geology & Mineralogy), Senior Researcher of the Institute of Geology of the Komi Science Centre of UB RAS, Syktyvkar E-mail: shanina@geo.komisc.ru

Библиографическое описание статьи

Каткова, В. И. Скрытые биомаркеры процессов минералообразования в генезисе уролитов / В. И. Каткова, О. Е. Амосова, С. Н. Шанина // Вестник Кольского научного центра РАН. — 2018. — № 4 (10). — С. 31-38.

Reference

Katkova Valentina I., Amosova Olga E., Shanina Svetlana N. Latent Biomarkers оf Mineral-Forming Processes in the Urolith Genesis. Herald of the Kola Science Centre of RAS, 2018, vol. 4 (10), pp. 31-38 (In Russ.).