ИНСЕКТИЦИДНЫЕ ПОЛИПЕПТИДЫ, ОБЛАДАЮЩИЕ УЛУЧШЕННЫМ СПЕКТРОМ АКТИВНОСТИ, И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
INSECTICIDAL POLYPEPTIDES WITH AN IMPROVED ACTIVITY SPECTRUM AND USE THEREOF

ССЫЛКА НА ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ, ПРЕДСТАВЛЕННЫЙ В ЭЛЕКТРОННОМ ВИДЕ
Перечень последовательностей с названием файла ʺ5409WOPCT_SequenceListing.txtʺ, созданный 24 сентября 2015 года, и размером 267 килобайт подается в машиночитаемой форме одновременно с настоящим описанием. Перечень последовательностей является частью настоящего описания и включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее раскрытие относится к рекомбинантным нуклеиновым кислотам, которые кодируют пестицидные полипептиды, обладающие инсектицидной активностью против кукурузной совки и/или травяной совки, и/или улучшенным спектром пестицидной активности в отношении насекомых-вредителей. В композициях и способах согласно настоящему раскрытию используются раскрытые нуклеиновые кислоты и кодируемые ими пестицидные полипептиды для контроля вредителей растений.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Насекомые-вредители являются основным фактором, причиняющим ущерб сельскохозяйственным культурам в мире. Например, питание совок, повреждение совкой-ипсилон или повреждение кукурузным мотыльком могут быть опустошительными в экономическом плане для сельскохозяйственных производителей. Связанный с насекомым-вредителем ущерб от нападений кукурузного мотылька только на полевую и сладкую кукурузу достиг приблизительно одного миллиарда долларов в год по издержкам от повреждения и затратам на контроль.
Традиционно, главным способом воздействия на популяции насекомых-вредителей является применение химических инсектицидов широкого спектра действия. Тем не менее, потребители, также как и осуществляющие регулирование правительственные органы становятся все более обеспокоенными риском неблагоприятного воздействия на окружающую среду, связанного с получением и применением синтетических химических пестицидов. Вследствие таких опасений регулирующие органы запретили или ограничили применение некоторых из более опасных пестицидов. Таким образом, разработка альтернативных пестицидов представляет значительный интерес.
Биологический контроль насекомых-вредителей, имеющих сельскохозяйственное значение, с применением микробного агента, такого как грибы, бактерии или другие виды насекомых, представляет собой не оказывающую негативного влияния на окружающую среду и коммерчески привлекательную альтернативу синтетическим химическим пестицидам. В целом можно сказать, что применение биопестицидов приводит к меньшему риску загрязнения и неблагоприятных воздействий на окружающую среду, и биопестициды обеспечивают большую специфичность по отношению к мишени, чем та, которая характерна для традиционных химических инсектицидов широкого спектра действия. Кроме того, зачастую производство биопестицидов стоит дешевле и, вследствие этого, улучшается экономически эффективный выход продукции для широкого спектра сельскохозяйственных культур.
B. larvae, B. lentimorbus, B. sphaericus
ed
Bacillus
B. cereus
Определенные виды микроорганизмов из рода Bacillus, как известно, обладают пестицидной активностью против широкого спектра насекомых-вредителей, в том числе Lepidoptera, Diptera, Coleoptera, Hemiptera и других. Bacillus thuringiensis (Bt) и Bacillus papilliae входят в число наиболее успешных средств биологического контроля, обнаруженных к настоящему времени. Патогенность в отношении насекомых также приписывалась штаммам(Harwook, ., ((1989)  (Plenum Press), 306), и  (WO 96/10083). Пестицидная активность, как оказывается, сконцентрирована в параспоральных кристаллических белковых включениях, хотя пестицидные белки также были выделены из Bacillus на вегетативной стадии роста. Несколько генов, кодирующих эти пестицидные белки, были выделены и охарактеризованы (см., например, патенты США №№ 5,366,892 и 5,840,868).
Bt
Cell Mol. Life Sci
et al.
Microbiol Mol Biol Rev
Микробные инсектициды, в частности полученные от штаммов Bacillus, сыграли важную роль в сельском хозяйстве как альтернатива химическому контролю вредителей. Недавно ученые в области сельского хозяйства разработали культурные растения с улучшенной устойчивостью к насекомым при помощи генной инженерии культурных растений с тем, чтобы они продуцировали пестицидные белки, происходящие из Bacillus. Например, с помощью методик генной инженерии были созданы растения кукурузы и хлопчатника для продуцирования пестицидных белков, выделенных из штаммов  (см., например, Aronson (2002) . 59(3):417-425; Schnepf  (1998) . 62(3):775-806). Эти сельскохозяйственные культуры, разработанные при помощи генной инженерии, в настоящее время широко применяются в американском сельском хозяйстве и предоставляют фермеру не оказывающую негативного влияния на окружающую среду альтернативу традиционным способам контроля насекомых. Кроме того, разновидности картофеля, измененные при помощи генной инженерии таким образом, чтобы они содержали пестицидные Cry токсины, реализовывались американским фермерам. В то время как они были признаны очень коммерчески успешными, эти разработанные при помощи генной инженерии устойчивые к насекомым культурные растения обеспечивают устойчивость только к узкому диапазону экономически важных насекомых-вредителей.
Bt
Lepidoptera
Coleoptera
Соответственно, остается потребность в новых токсинах  с улучшенным спектром инсектицидной активности против насекомых-вредителей, например,в токсинах с улучшенной активностью против насекомых из отряда  и/или . Кроме того, остается потребность в биопестицидах, обладающих активностью против насекомых-вредителей, и в биопестицидах, которые обладают улучшенной инсектицидной активностью.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Предусматриваются композиции и способы для оказания воздействия на насекомых-вредителей. Более конкретно, варианты осуществления настоящего раскрытия относятся к способам оказания воздействия на насекомых с использованием нуклеотидных последовательностей, кодирующих инсектицидные пептиды, способам получения трансформированных микроорганизмов и растений, которые экспрессируют инсектицидный полипептид согласно вариантам осуществления. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидные последовательности кодируют полипептиды, которые являются пестицидными по меньшей мере для одного насекомого, принадлежащего к отряду Lepidoptera.
например
например
Bt,
В некоторых аспектах предусматривают молекулы нуклеиновой кислоты и их фрагменты и варианты, которые кодируют полипептиды, обладающие пестицидной активностью против насекомых-вредителей (, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, и SEQ ID NO: 46, и которые кодируют полипептид с SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43 или SEQ ID NO: 45, соответственно). Нуклеотидная последовательность дикого типа (, встречающаяся в естественных условиях) согласно вариантам осуществления, которая была получена из кодирует инсектицидный пептид. Варианты осуществления дополнительно предусматривают фрагменты и варианты раскрытой нуклеотидной последовательности, которые кодируют биологически активные (например, инсектицидные) полипептиды.
В другом аспекте предусматривают вариантные полипептиды Cry1B, кодируемые модифицированной (например,подвергнутой мутагенезу или манипуляции) молекулой нуклеиновой кислоты согласно вариантам осуществления. В конкретных примерах пестицидные белки согласно вариантам осуществления включают фрагменты белков и полипептидов полной длины, которые получены из подвергнутых мутагенезу нуклеиновых кислот, сконструированных для введения конкретных аминокислотных последовательностей в полипептиды согласно вариантам осуществления. В конкретных вариантах осуществления полипептиды обладают усиленной пестицидной активностью по сравнению с активностью встречающегося в естественных условиях полипептида, из которого они получены.
например,
В другом аспекте нуклеиновые кислоты согласно вариантам осуществления также можно применять для получения трансгенных ( трансформированных) однодольных или двудольных растений, которые характеризуются геномами, содержащими по меньшей мере одну стабильно встроенную нуклеотидную конструкцию, содержащую кодирующую последовательность согласно вариантам осуществления, функционально связанную с промотором, который управляет экспрессией кодируемого пестицидного полипептида. Соответственно, также предусматриваются трансформированные растительные клетки, ткани растений, растения и их семена.
В другом аспекте трансформированное растение можно получить с применением нуклеиновой кислоты, которая была оптимизирована для повышенной экспрессии в растении-хозяине. Например, один из пестицидных полипептидов согласно вариантам осуществления может быть восстановлен по полипептидной последовательности с получением нуклеиновой кислоты, содержащей кодоны, оптимизированные для экспрессии в конкретном хозяине, например, в культурном растении, таком как растение кукурузы (Zea mays). Экспрессия кодирующей последовательности таким трансформированным растением (например, двудольным или однодольным) будет приводить в результате к выработке пестицидного полипептида и придавать растению повышенную устойчивость к насекомым. Некоторые варианты осуществления предусматривают трансгенные растения, экспрессирующие пестицидные полипептиды, которые находят применение в способах оказания воздействия на различных насекомых-вредителей.
В другом аспекте предусматривают пестицидные или инсектицидные композиции, содержащие вариантные полипептиды Cry1B согласно вариантам осуществления, при этом композиция может необязательно содержать дополнительные инсектицидные пептиды. Варианты осуществления охватывают применение таких композиций по отношению к среде обитания насекомых-вредителей с целью воздействия на насекомых-вредителей.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
На фигуре 1a - 1g показано выравнивание аминокислотных последовательностей Cry1Bd (SEQ ID NO: 1), IP1B-B1 (SEQ ID NO: 3), IP1B-B21 (SEQ ID NO: 5), IP1B-B22 (SEQ ID NO: 7), IP1B-B23 (SEQ ID NO: 9), IP1B-B24 (SEQ ID NO: 11), IP1B-B25 (SEQ ID NO: 13), IP1B-B26 (SEQ ID NO: 15), IP1B-B27 (SEQ ID NO: 17), IP1B-B28 (SEQ ID NO: 19), IP1B-B29 (SEQ ID NO: 21), IP1B-B31 (SEQ ID NO: 23), IP1B-B32 (SEQ ID NO: 25), IP1B-B33 (SEQ ID NO: 27), IP1B-B34 (SEQ ID NO: 29), IP1B-B40 (SEQ ID NO: 31), IP1B-B41 (SEQ ID NO: 33), IP1B-B42 (SEQ ID NO: 35), IP1B-B43 (SEQ ID NO: 37), IP1B-B44 (SEQ ID NO: 39), IP1B-B45 (SEQ ID NO: 41), IP1B-B46 (SEQ ID NO: 43), IP1B-B47 (SEQ ID NO: 45), MP258 (SEQ ID NO: 47), и GS060 (SEQ ID NO: 49) с использованием модуля ALIGNX программного пакета Vector NTI. Выделено отличие аминокислотных последовательностей между полипептидами Cry1B.
На фигуре 2a - 2e показана аминокислотная последовательность MP258 с лидерным участком (*), доменом I (#), доменом II (&) и доменом III (!), обозначенными ниже последовательности.
На фигуре 3 показано выравнивание аминокислотных последовательностей с использованием модуля ALIGNX программного пакета Vector NTI домена I Cry1Be-типа Cry1Be (аминокислоты 35-276 в SEQ ID NO: 58) и домена I Cry1Be-типа MP258 (аминокислоты 36-276 в SEQ ID NO: 47). Выделено отличие аминокислот в доменах I полипептидов Cry1B.
На фигуре 4 показано выравнивание аминокислотных последовательностей домена III Cry1Ah (SEQ ID NO: 61), Cry1Bd, Cry1Bh (SEQ ID NO: 52), Cry1Bi (SEQ ID NO: 54), и MP258 (SEQ ID NO: 47) с использованием модуля ALIGNX программного пакета Vector NTI. Выделено отличие аминокислот в домене III полипептидов Cry1B.
На фигуре 5a - 5c показано выравнивание аминокислотных последовательностей домена I и домена II MP258 (SEQ ID NO: 47), Cry1Be (SEQ ID NO: 58), Cry1Bi (SEQ ID NO: 54), Cry1Bg (SEQ ID NO: 60), Cry1Bf (SEQ ID NO: 59), Cry1Ba (SEQ ID NO: 55), Cry1Bh (SEQ ID NO: 52), Cry1Bd (SEQ ID NO: 1), Cry1Bb (SEQ ID NO: 56), и Cry1Bc (SEQ ID NO: 57) с использованием модуля ALIGNX пакета Vector NTI. Выделено отличие аминокислот в домене I и домене II полипептидов Cry1B.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
например,
Варианты осуществления настоящего раскрытия направлены на композиции и способы для оказания воздействия на насекомых-вредителей, в частности, на вредителей растений. Более конкретно, выделенная нуклеиновая кислота согласно вариантам осуществления, а также ее фрагменты и варианты содержат нуклеотидные последовательности, которые кодируют пестицидные полипептиды (например, белки). Раскрытые пестицидные белки являются биологически активными ( пестицидными) против насекомых-вредителей, таких как без ограничения насекомые-вредители отряда Lepidoptera и/или Coleoptera.
Композиции согласно вариантам осуществления предусматривают выделенные нуклеиновые кислоты, а также их фрагменты и варианты, которые кодируют пестицидные полипептиды, кассеты экспрессии, содержащие нуклеотидные последовательности согласно вариантам осуществления, выделенные пестицидные белки и пестицидные композиции. Некоторые варианты осуществления предусматривают модифицированные пестицидные полипептиды, обладающие улучшенной инсектицидной активностью против чешуекрылых по сравнению с пестицидной активностью соответствующего белка дикого типа. Варианты осуществления дополнительно предусматривают растения и микроорганизмы, трансформированные этими новыми нуклеиновыми кислотами, и способы, предполагающие применение таких нуклеиновых кислот, пестицидных композиций, трансформированных организмов и продуктов из них при оказании воздействия на насекомых-вредителей.
et al.
Biotechnology
et al.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
Нуклеиновые кислоты и нуклеотидные последовательности согласно вариантам осуществления можно применять для трансформации любого организма для выработки кодируемых пестицидных белков. Предусматриваются способы, которые предполагают применение таких трансформированных организмов для воздействия на вредителей растений или для их контроля. Нуклеиновые кислоты и нуклеотидные последовательности согласно вариантам осуществления можно также использовать для трансформации органелл, таких как хлоропласты (McBride  (1995)  13: 362-365; и Kota (1999)  96: 1840-1845).
Помимо этого, варианты осуществления относятся к идентификации фрагментов и вариантов встречающейся в естественных условиях кодирующей последовательности, которые кодируют биологически активные пестицидные белки. Нуклеотидные последовательности согласно вариантам осуществления находят непосредственное применение в способах оказания воздействия на вредителей, в особенности на насекомых-вредителей, таких как вредители из отряда Lepidoptera. Соответственно, варианты осуществления предусматривают новые подходы к оказанию воздействия на насекомых-вредителей, которые не зависят от применения традиционных синтетических химических инсектицидов. Варианты осуществления предполагают выявление встречающихся в естественных условиях биоразлагаемых пестицидов и генов, которые их кодируют.
Варианты осуществления дополнительно предусматривают фрагменты и варианты встречающейся в естественных условиях кодирующей последовательности, которые также кодируют биологически активные (например, пестицидные) полипептиды. Нуклеиновые кислоты согласно вариантам осуществления охватывают последовательности нуклеиновой кислоты или нуклеотидные последовательности, которые были оптимизированы для экспрессии клетками конкретного организма, например, последовательности нуклеиновой кислоты, которые были восстановлены по полипептидной последовательности (т.е. подвергнуты "обратной трансляции") с использованием предпочтительных для растений кодонов на основе аминокислотной последовательности полипептида с усиленной пестицидной активностью. Варианты осуществления дополнительно предусматривают мутации, которые придают улучшенные или измененные свойства полипептидам согласно вариантам осуществления, см., например, патент США № 7,462,760.
В последующем описании широко применяется ряд выражений. Следующие определения представлены для облегчения понимания вариантов осуществления.
Единицы измерения, приставки и обозначения можно обозначить в форме, принятой в системе СИ. Если не указано иное, нуклеиновые кислоты записаны слева направо в ориентации от 5' к 3'; аминокислотные последовательности записаны, соответственно, слева направо в направлении от аминогруппы к карбоксигруппе. Область числовых значений включает числа, определяющие диапазон. Аминокислоты в данном документе могут быть названы либо по их общеизвестным трехбуквенным обозначениям, либо по однобуквенным обозначениям, рекомендованным комиссией по биохимической номенклатуре IUPAC-IUB. Нуклеотиды, аналогичным образом, могут быть названы по их общепринятым однобуквенным кодам. Вышеупомянутые термины более полно определены со ссылкой на настоящее описание в целом.
Как используется в данном документе, "нуклеиновая кислота" включает ссылки на дезоксирибонуклеотидный или рибонуклеотидный полимер или в одно-, или в двухнитевой форме и, если не ограничен иным образом, охватывает известные аналоги (например, пептидо-нуклеиновые кислоты), обладающие основными свойствами природных нуклеотидов, заключающимися в том, что они гибридизуются с однонитевыми нуклеиновыми кислотами подобно встречающимся в естественных условиях нуклеотидам.
например
например
Используемые в данном документе термины "кодирующий" или "кодируемый", когда они используются в контексте определенной нуклеиновой кислоты, означают, что нуклеиновая кислота содержит необходимую информацию для управления трансляцией нуклеотидной последовательности в определенный белок. Информация, которой кодируется белок, определяется применением кодонов. Нуклеиновая кислота, кодирующая белок, может содержать нетранслируемые последовательности (, интроны) в границах транслируемых участков нуклеиновой кислоты или может не содержать такие промежуточные нетранслируемые последовательности (, как в кДНК).
Используемая в данном документе фраза "последовательность полной длины" в отношении определенного полинуклеотида или кодируемого им белка означает наличие полной последовательности нуклеиновой кислоты или полной аминокислотной последовательности нативной (несинтетической) эндогенной последовательности. Полинуклеотид полной длины кодирует полноразмерную каталитически активную форму определенного белка.
Используемый в данном документе термин "антисмысловая" при использовании в контексте ориентации нуклеотидной последовательности, относится к дуплексной последовательности полинуклеотида, которая функционально связана с промотором в ориентации, при которой транскрибируется антисмысловая нить. Антисмысловая нить в значительной степени комплементарна эндогенному продукту транскрипции, так что трансляция эндогенного продукта транскрипции часто подавляется. Таким образом, в случаях, когда термин ʺантисмысловаяʺ используется в контексте конкретной нуклеотидной последовательности, термин относится к комплементарной нити для эталонного продукта транскрипции.
Термины "полипептид", "пептид" и "белок" используются в данном документе взаимозаменяемо для обозначения полимера из аминокислотных остатков. Термины используют в отношении аминокислотных полимеров, в которых один или несколько аминокислотных остатков представляют собой искусственный химический аналог соответствующей встречающейся в естественных условиях аминокислоты, а также в отношении встречающихся в естественных условиях аминокислотных полимеров.
Термины "остаток", или "аминокислотный остаток", или "аминокислота" используются в данном документе взаимозаменяемо и относятся к аминокислоте, которая встроена в белок, полипептид или пептид (в собирательном значении "белок"). Аминокислота может представлять собой встречающуюся в естественных условиях аминокислоту, и, если не ограничивается иным образом, она может охватывать известные аналоги природных аминокислот, которые могут функционировать подобно встречающимся в естественных условиях аминокислотам.
Полипептиды согласно вариантам осуществления можно получить либо из нуклеиновой кислоты, раскрытой в данном документе, либо посредством применения стандартных методик молекулярной биологии. Например, белок согласно вариантам осуществления можно получить путем экспрессии рекомбинантной нуклеиновой кислоты согласно вариантам осуществления в соответствующей клетке-хозяине или, в качестве альтернативы, при помощи комбинации ex vivo процедур.
Используемые в данном документе термины "выделенный" и "очищенный" используются взаимозаменяемо и относятся к нуклеиновым кислотам или полипептидам или их биологически активным частям, которые практически или, по сути, не содержат компонентов, которые в норме сопутствуют или взаимодействуют с нуклеиновой кислотой или полипептидом, когда те находятся в естественном окружении. Таким образом, выделенные или очищенные нуклеиновая кислота или полипептид практически не содержат другой клеточный материал или культуральную среду при получении с помощью рекомбинантных методик, или практически не содержат химических предшественников или других химических продуктов, если они синтезированы химическим способом.
"Выделенная" нуклеиновая кислота обычно не содержит последовательности (такие как, например, последовательности, кодирующие белок), которые в естественных условиях фланкируют нуклеиновую кислоту (т.е. последовательностей, расположенных на 5' и 3' концах нуклеиновой кислоты) в геномной ДНК организма, из которого получена нуклеиновая кислота. Например, в различных вариантах осуществления выделенные нуклеиновые кислоты могут содержать менее приблизительно 5 т.о., 4 т.о., 3 т.о., 2 т.о., 1 т.о., 0,5 т.о. или 0,1 т.о. нуклеотидных последовательностей, которые в естественных условиях фланкируют нуклеиновые кислоты в геномной ДНК клетки, из которой получена нуклеиновая кислота.
Используемые в данном документе термины "выделенный" или "очищенный" в случае, когда они используются в отношении полипептида согласно вариантам осуществления, означают, что выделенный белок практически не содержит клеточный материал и включает препараты белка, содержащие менее приблизительно 30%, 20%, 10% или 5% (по сухому весу) загрязняющего белка. Если белок согласно вариантам осуществления или его биологически активная часть являются полученными с помощью методик рекомбинантных ДНК, то культуральная среда представляет менее приблизительно 30%, 20%, 10% или 5% (по сухому весу) химических предшественников или химических продуктов, не являющихся белком, представляющим интерес.
ʺРекомбинантнаяʺ молекула нуклеиновой кислоты (или ДНК) применяется в данном документе для обозначения последовательности нуклеиновой кислоты (или ДНК), которая находится в рекомбинантной бактериальной или растительной клетке-хозяине. В некоторых вариантах осуществления ʺвыделеннаяʺ или ʺрекомбинантнаяʺ нуклеиновая кислота не содержит последовательности (предпочтительно, последовательности, кодирующие белок), которые в естественных условиях фланкируют нуклеиновую кислоту (т.е., последовательности, расположенные на 5′- и 3′-концах нуклеиновой кислоты) в геномной ДНК организма, из которого получена нуклеиновая кислота. В контексте настоящего раскрытия термины ʺвыделенныеʺ или ʺрекомбинантныеʺ при применении для обозначения молекул нуклеиновой кислоты исключают выделенные хромосомы.
Применяемые в данном документе ʺпоследовательность нуклеиновой кислоты, отличающаяся от геномнойʺ или ʺмолекула нуклеиновой кислоты, отличающаяся от геномнойʺ относятся к молекуле нуклеиновой кислоты, которая имеет одно или несколько изменений в последовательности нуклеиновой кислоты по сравнению с нативной или геномной последовательностью нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления изменение по отношению к нативной или геномной молекуле нуклеиновой кислоты включает без ограничения: изменения в последовательности нуклеиновой кислоты, обусловленные вырожденностью генетического кода; оптимизацию кодонов последовательности нуклеиновой кислоты для экспрессии в растениях; изменения в последовательности нуклеиновой кислоты для введения по меньшей мере одной аминокислотной замены, вставки, делеции и/или добавления по сравнению с нативной или геномной последовательностью; удаление одного или нескольких интронов, ассоциированных с геномной последовательностью нуклеиновой кислоты; вставку одного или нескольких гетерологичных интронов; делецию одного или нескольких регуляторных участков, расположенных выше или ниже, ассоциированных с геномной последовательностью нуклеиновой кислоты; вставку одного или нескольких гетерологичных регуляторных участков, расположенных выше или ниже; делецию 5'- и/или 3'-нетранслируемого участка, ассоциированного с геномной последовательностью нуклеиновой кислоты; вставку гетерологичного 5'- и/или 3'-нетранслируемого участка и модификацию сайта полиаденилирования. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты, отличающаяся от геномной, представляет собой кДНК. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты, отличающаяся от геномной, представляет собой синтетическую последовательность нуклеиновой кислоты.
Будет понятно, что по всей заявке слово "содержащий" или варианты, такие как "содержит" или "содержащий", подразумевает включение приведенного элемента, целого числа или стадии, или группы элементов, целых чисел или стадий, а не исключение любого другого элемента, целого числа или стадии, или группы элементов, целых чисел или стадий.
Используемый в данном документе термин "воздействие на насекомых-вредителей" относится к осуществлению изменений питания, роста и/или поведения насекомого на любой стадии развития, в том числе без ограничения к уничтожению насекомого; задержке роста; предотвращению возникновения способности к репродукции; антифидантной активности и т.п.
Используемые в данном документе термины "пестицидная активность" и "инсектицидная активность" используются как синонимы и относятся к активности организма или вещества (такого как, например, белок), которую можно измерить, но без ограничения, по смертности вредителя, потере веса вредителем, отпугиванию вредителя и другим изменениям поведения и физических характеристик вредителя после питания и воздействия в течение соответствующего периода времени. Таким образом, организм или вещество с пестицидной активностью оказывает отрицательное воздействие по меньшей мере на один измеряемый параметр приспособляемости вредителя. Например, "пестицидные белки" представляют собой белки, которые проявляют пестицидную активность сами по себе или в комбинации с другими белками.
Используемый в данном документе термин "пестицидно эффективное количество" означает количество вещества или организма, который обладает пестицидной активностью, когда присутствует в среде обитания вредителя. Для каждого вещества или организма пестицидно эффективное количество определяют эмпирически в отношении каждого вредителя, подверженного влиянию в специфической среде. Аналогично, "инсектицидно эффективное количество" может быть использовано для обозначения "пестицидно эффективного количества", когда вредитель представляет собой вредителя-насекомого.
Используемые в данном документе термины "рекомбинантно сконструированный" или ʺсконструированныйʺ означают использование технологии рекомбинантной ДНК для внесения (например, при конструировании) изменения в структуру белка, исходя из понимания механизма действия белка и анализа аминокислот, которые вводят, удаляют или заменяют.
Используемые в данном документе термины ʺмутантная нуклеотидная последовательностьʺ, или ʺмутацияʺ, или "подвергнутая мутагенезу нуклеотидная последовательность" означают нуклеотидную последовательность, которая была подвергнута мутагенезу или изменена таким образом, чтобы она содержала один или несколько нуклеотидных остатков (например, пару оснований), которые не присутствуют в соответствующей последовательности дикого типа. Такой мутагенез или изменение заключаются в одном или нескольких добавлениях, делециях, или заменах, или замещениях остатков нуклеиновой кислоты. Если мутации созданы путем добавления, удаления или замены аминокислоты в сайте протеолитического расщепления, такие добавление, удаление или замена могут присутствовать в пределах мотива протеолитического сайта или прилегать к нему при условии, что цель мутации достигается (т.е. при условии, что протеолиз по данному сайту изменен).
Мутантная нуклеотидная последовательность может кодировать мутантный инсектицидный токсин, проявляющий улучшенную или пониженную инсектицидную активность, или аминокислотную последовательность, которая придает улучшенную или пониженную инсектицидную активность полипептиду, содержащему ее. Используемые в данном документе термины ʺмутантʺ или ʺмутацияʺ в контексте белка, полипептидной или аминокислотной последовательности относятся к последовательности, которая была подвергнута мутагенезу или изменена таким образом, чтобы она содержала один или несколько аминокислотных остатков, которые не присутствуют в соответствующей последовательности дикого типа. Такой мутагенез или изменение заключается в одном или нескольких добавлениях, делециях, или заменах, или замещениях аминокислотных остатков. Мутантный полипептид проявляет улучшенную или пониженную инсектицидную активность или представляет собой аминокислотную последовательность, которая придает улучшенную инсектицидную активность полипептиду, содержащему ее. Таким образом, термины ʺмутантʺ или ʺмутацияʺ относятся к любому из мутантной нуклеотидной последовательности и кодируемых аминокислот или к ним обоим. Мутантов можно использовать отдельно или в любой совместимой комбинации с другими мутантами согласно вариантам осуществления или с другими мутантами. ʺМутантный полипептидʺ может, напротив, проявлять снижение инсектицидной активности. В случае, когда более чем одну мутацию добавляют к конкретной нуклеиновой кислоте или белку, мутации могут быть добавлены одновременно или последовательно; если последовательно, мутации могут быть добавлены в любом подходящем порядке.
Используемые в данном документе термины "улучшенная инсектицидная активность" или ʺулучшенная пестицидная активностьʺ относятся к инсектицидному полипептиду согласно вариантам осуществления, который обладает усиленной инсектицидной активностью по сравнению с активностью соответствующего ему белка дикого типа, и/или к инсектицидному полипептиду, который является эффективным против более широкого спектра насекомых, и/или к инсектицидному полипептиду, характеризующемуся специфичностью по отношению к насекомому, которое не чувствительно к токсичности белка дикого типа. Заключение об улучшенной или усиленной пестицидной активности требует демонстрации повышения пестицидной активности по меньшей мере на 10% против насекомого-мишени или повышения пестицидной активности по меньшей мере на 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 100%, 150%, 200% или 300% или более по сравнению с пестицидной активностью инсектицидного полипептида дикого типа, определенной в отношении такого же насекомого.
Например, улучшенная пестицидная или инсектицидная активность обеспечивается в тех случаях, когда полипептид оказывает воздействие на более широкий или более узкий спектр насекомых по сравнению со спектром насекомых, на которые воздействует Bt токсин дикого типа. Более широкий спектр воздействия может быть желательным в тех случаях, когда необходима универсальность, тогда как более узкий спектр воздействия может быть желателен в тех случаях, когда, например, в иных обстоятельствах полезные насекомые могут подвергнуться воздействию при применении или присутствии токсина. Хотя варианты осуществления не привязаны к какому-либо конкретному механизму действия, улучшенную пестицидную активность также можно обеспечить посредством изменений одной или нескольких характеристик полипептида; например, стабильность или продолжительность существования полипептида в кишечнике насекомого могут быть увеличены по сравнению со стабильностью или продолжительностью существования соответствующего белка дикого типа.
Используемый в данном документе термин ʺтоксинʺ относится к полипептиду, проявляющему пестицидную активность, или инсектицидную активность, или улучшенную пестицидную активность, или улучшенную инсектицидную активность. Токсин ʺBtʺ или ʺBacillus thuringiensisʺ, как предполагается, включает более широкий класс Cry токсинов, обнаруживающихся в различных штаммах Bt, который включает такие токсины, как, например, Cry1s, Cry2s или Cry3s.
Термины ʺсайт протеолитического расщепленияʺ или ʺсайт расщепленияʺ относятся к аминокислотной последовательности, которая придает чувствительность к классу протеаз или конкретной протеазе таким образом, что полипептид, содержащий эту аминокислотную последовательность, расщепляется классом протеаз или конкретной протеазой. Сайт протеолитического расщепления считается ʺчувствительнымʺ к протеазе (протеазам), которая распознает этот сайт. Из уровня техники известно, что эффективность расщепления будет варьировать, и что снижение эффективности расщепления может привести к увеличению стабильности или продолжительности существования полипептида в кишечнике насекомого. Таким образом, протеолитический сайт может придавать чувствительность к более чем одной протеазе или классу протеаз, но эффективность расщепления по этому сайту может варьировать для различных протеаз. Сайты протеолитического расщепления включают, например, сайты для трипсина, сайты для химотрипсина и сайты для эластазы.
et al
Arch. Insect Biochem. Physiol
et al
Arch. Insect Biochem. Physiol
Helicoverpa armigera
et al
Insect Biochem. Mol. Biol
et al
Insect Biochem. Mol. Biol
Исследование показало, что протеазы кишечника насекомого, относящегося к чешуекрылым, включают трипсины, химотрипсины и эластазы, см., например, Lenz . (1991) . 16: 201-212; и Hedegus . (2003) . 53: 30-47. Например, приблизительно 18 различных трипсинов было обнаружено в средней кишке личинки  (см.,Gatehouse . (1997) . 27: 929-944). Были выявлены предпочтительные сайты-субстраты для протеолитического расщепления этими протеазами, см., например, Peterson . (1995) . 25: 765-774.
Arch. Insect Biochem. Phys
et al
J. Invertebrate Pathology
Предпринимались попытки понять механизм действия Bt токсинов и сконструировать токсины с улучшенными свойствами. Было показано, что протеазы кишечника насекомого могут оказывать влияние на воздействие Cry белков Bt на насекомое. Некоторые протеазы активируют Cry белки посредством их процессинга из формы ʺпротоксинаʺ в токсичную форму, или ʺтоксинʺ, см., Oppert (1999) . 42: 1-12; и Carroll . (1997)  70: 41-49. Эта активация токсина может включать удаление N- и C-концевых пептидов из белка, а также может включать внутреннее расщепление белка. Другие протеазы могут разлагать Cry белки. См., Oppert, там же.
et al
Nature,
et al.
Structure
Сравнение аминокислотных последовательностей Cry токсинов с различной специфичностью выявило пять высококонсервативных блоков последовательностей. В плане структуры токсины содержат три отдельных домена, которые представляют собой, от N- к C-концу: кластер из семи альфа-спиралей, вовлеченных в образовании поры (называемый ʺдоменом Iʺ), три антипараллельных бета-листа, вовлеченных в связывание с клеткой (называемые ʺдоменом 2ʺ), и бета-сэндвич (называемый ʺдоменом 3ʺ). Расположение и свойства этих доменов известны специалисту в данной области техники. см., например, Li . (1991) 305:815-821 и Morse  (2001) , 9:409-417. Если упоминается конкретный домен, например, домен I, следует понимать, что точные конечные характеристики домена применительно к конкретной последовательности не являются решающими при условии, что последовательность или ее часть включает в себя последовательность, которая обеспечивает по меньшей мере какую-либо функцию, приписываемую конкретному домену. Таким образом, например, при упоминании ʺдомена Iʺ предполагается, что конкретная последовательность включает в себя кластер из семи альфа-спиралей, но точные конечные показатели последовательности, используемой или упоминаемой применительно к данному кластеру, не являются решающими. Специалисту в данной области техники знакомы определение таких конечных показателей и оценка таких функций.
В попытке улучшить токсины Cry2B была предпринята попытка идентифицировать нуклеотидные последовательности, кодирующие белки кристаллов из выбранных штаммов, которые обладают улучшенной активностью по сравнению с нативным токсином. В зависимости от характеристик данного препарата считается, что демонстрация пестицидной активности иногда требует предварительной обработки трипсином для активации пестицидных белков. Таким образом, понятно, что некоторые пестицидные белки требуют расщепления протеазой (например, трипсином, химотрипсином и т.п.) для активации, тогда как другие белки являются биологически активными (например, пестицидными) в отсутствие активации.
Такие молекулы можно изменять с помощью средств, описанных, например, в патенте США № 7462760. Кроме того, последовательности нуклеиновой кислоты можно сконструировать таким образом, чтобы они кодировали полипептиды, которые содержат дополнительные мутации, придающие улучшенную или измененную пестицидную активность по сравнению с пестицидной активностью встречающегося в естественных условиях полипептида. Нуклеотидные последовательности таких сконструированных нуклеиновых кислот содержат мутации, не обнаруживающиеся в последовательностях дикого типа.
Cry
Мутантные полипептиды согласно вариантам осуществленияобычно получают с помощью способа, который включает стадии получения последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид семейства ; анализа структуры полипептида для идентификации конкретных сайтов-"мишеней" для мутагенеза лежащей в основе генной последовательности исходя из представлений о предполагаемой функции домена-мишени и механизма действия токсина; введения одной или нескольких мутаций в последовательность нуклеиновой кислоты с получением необходимого изменения в одном или нескольких аминокислотных остатках кодируемой полипептидной последовательности и анализа полученного полипептида в отношении пестицидной активности.
et al
Bt
et al
Nature
Многие из инсектицидных Bt токсинов являются родственными с различными степенями сходства их аминокислотных последовательностей и третичной структуры, и при этом средства для получения кристаллических структур Bt токсинов являются хорошо известными. Иллюстративные результаты расчета кристаллической структуры с высоким разрешением для полипептидов как Cry3A, так и Cry3B доступны в литературе. Рассчитанная структура Cry3A (Li . (1991) Nature 353:815-821) обеспечивает понимание взаимосвязи между структурой и функцией токсина. Совместное рассмотрение опубликованных структурных анализов Bt токсинов и описанной функции, связанной с конкретными структурами, мотивами и т.п., указывает на то, что специфические участки токсина соотносятся с конкретными функциями и отдельными стадиями механизма действия белка. Например, многие токсины, выделенные из , обычно описывают как содержащие три домена: пучок из семи спиралей, который вовлечен в образование поры, домен из трех листов, который вовлечен в связывание с рецептором, и бета-сэндвич мотив (Li . (1991) 305: 815-821).
Cry3A
et al
Proc. Natl. Acad. Sci.
USA
in vitro
Как описано в патентах США № 7105332 и № 7462760, токсичность белков Cryможно улучшить путем целенаправленного воздействия на участок, расположенный между альфа-спиралями 3 и 4 в домене I токсина. Эта теория основывается на совокупности знаний, имеющих отношение к инсектицидным токсинам, в том числе: 1) о том, что альфа-спирали 4 и 5 в домене I токсинов , как сообщалось, встраиваются в липидный бислой клеток, выстилающих среднюю кишку чувствительных насекомых (Gazit . (1998)  95: 12289-12294); 2) на знаниях авторов настоящего изобретения о расположении сайтов расщепления трипсином и химотрипсином в аминокислотной последовательности белка дикого типа; 3) на наблюдении, что белок дикого типа был более активным против определенных насекомых после активации  при обработке трипсином или химотрипсином; и 4) на сообщениях о том, что расщепление токсинов с 3' конца приводило в результате к пониженной токсичности в отношении насекомых.
например
например
Для создания новых полипептидов с усиленной или измененной пестицидной активностью можно создать ряд мутаций и поместить в различные фоновые последовательности. См., , патент США № 7462760. Эти мутанты предусматривают без ограничения добавление по меньшей мере одного дополнительного чувствительного к протеазе сайта (например,сайт расщепления для трипсина) в участок, расположенный между спиралями 3 и 4 в домене I; замещение исходного чувствительного к протеазе сайта в последовательности дикого типа отличающимся чувствительным к протеазе сайтом; добавление нескольких чувствительных к протеазе сайтов в конкретном положении; добавление аминокислотных остатков рядом с чувствительным к протеазе сайтом(сайтами) для изменения фолдинга полипептида и, таким образом, усиления расщепления полипептида в чувствительном к протеазе сайте(сайтах); и добавление мутаций для защиты полипептида от разрушающего расщепления, которое снижает токсичность (, создание ряда мутаций, при которых аминокислота дикого типа заменяется валином для защиты полипептида от расщепления). Мутации можно использовать по отдельности или в любой комбинации для обеспечения полипептидов согласно вариантам осуществления.
Гомологичные последовательности идентифицировали с помощью поиска сходства в неизбыточной (nr) базе данных Национального центра биотехнологической информации (NCBI) с использованием BLAST и PSI-BLAST. Гомологичные белки состояли из Cry токсинов преимущественно из Bacillus thuringiensis.
Heliothis zea
et al.
Arch. Insect Biochem. Physiol
.
Мутация, которая представляет собой дополнительный или альтернативный чувствительный к протеазе сайт, может быть чувствительной к нескольким классам протеаз, таких как сериновые протеазы, которые включают трипсин и химотрипсин, или ферментов, таких как эластаза. Таким образом, мутацию, которая представляет собой дополнительный или альтернативный чувствительный к протеазе сайт, можно сконструировать для того, чтобы сайт легко распознавался и/или расщеплялся категорией протеаз, таких как протеазы млекопитающих или протеазы насекомых. Чувствительный к протеазе сайт также можно сконструировать таким образом, чтобы он расщеплялся конкретным классом ферментов или конкретным ферментом, о котором известно, что он продуцируется в организме, таким как, например, химотрипсин, продуцируемый кукурузной совкой  (Lenz  (1991) . 16: 201-212)Мутации также могут придавать устойчивость к протеолитическому расщеплению, например, к расщеплению химотрипсином по C-концу пептида.
et al.
Arch. Insect Biochem. Physiol
et al
Arch. Insect Biochem. Physiol.
Cry
Наличие дополнительного и/или альтернативного чувствительного к протеазе сайта в аминокислотной последовательности кодируемого полипептида может улучшить пестицидную активность и/или специфичность полипептида, кодируемого нуклеиновыми кислотами согласно вариантам осуществления. Соответственно, нуклеотидные последовательности согласно вариантам осуществления могут быть рекомбинантно сконструированными или с ними могут быть произведены манипуляции для получения полипептидов с улучшенной или измененной инсектицидной активностью и/или специфичностью по сравнению с таковыми у немодифицированного токсина дикого типа. Кроме того, мутации, раскрытые в данном документе, можно поместить в другие нуклеотидные последовательности или применять в сочетании с ними для обеспечения улучшенных свойств. Например, чувствительный к протеазе сайт, который легко расщепляется химотрипсином насекомого,например, химотрипсином, обнаруженный у совки Берта или кукурузной совки (Hegedus  (2003) . 53: 30-47; и Lenz . (1991) 16: 201-212), можно поместить в фоновую последовательность  для обеспечения улучшенной токсичности у этой последовательности. Таким образом, варианты осуществления предусматривают токсичные полипептиды с улучшенными свойствами.
Например, подвергнутая мутагенезу нуклеотидная последовательность Cry может предусматривать дополнительные мутанты, содержащие дополнительные кодоны, которые вводят вторую чувствительную к трипсину аминокислотную последовательность (дополнительно к встречающемуся в естественных условиях сайту для трипсина) в кодируемый полипептид. Альтернативный дополнительный мутант согласно вариантам осуществления предусматривает дополнительные кодоны, сконструированные для введения по меньшей мере одного дополнительного отличающегося чувствительного к протеазе сайта в полипептид, например, чувствительного к химотрипсину сайта, расположенного непосредственно в направлении 5' или 3' от встречающегося в естественных условиях сайта для трипсина. В качестве альтернативы, можно создать мутантов с заменой, у которых по меньшей мере один кодон нуклеиновой кислоты, который кодирует встречающийся в естественных условиях чувствительный к протеазе сайт, разрушен, а альтернативные кодоны введены в последовательность нуклеиновой кислоты с целью обеспечения отличающегося (например, замененного) чувствительного к протеазе сайта. Мутант с замещением также может быть добавлен к последовательности Cry, в которой встречающийся в естественных условиях сайт расщепления для трипсина, присутствующий в кодируемом полипептиде, разрушен, а сайт расщепления для химотрипсина или эластазы введен на его место.
Считается, что можно применять любую нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотные последовательности, которые представляют собой сайты протеолитического расщепления или предполагаемые сайты протеолитического расщепления (например, последовательности, такие как RR или LKM), и что точная идентичность кодонов, используемых для введения любого из этих сайтов расщепления в вариантный полипептид, может варьировать в зависимости от применения, т.е. экспрессии в конкретном виде растений. Также считается, что любую из раскрытых мутаций можно ввести в любую последовательность полинуклеотида согласно вариантам осуществления, которая содержит кодоны для аминокислотных остатков, обеспечивающих нативный сайт расщепления для трипсина, на который целенаправленно воздействует модификация. Соответственно, варианты либо токсинов полной длины, либо их фрагментов можно модифицировать таким образом, чтобы они содержали дополнительные или альтернативные сайты расщепления, и предполагается, что эти варианты осуществления охватываются объемом вариантов осуществления, раскрытых в данном документе.
Специалист в данной области техники поймет, что любую полезную мутацию можно добавить к последовательностям согласно вариантам осуществления при условии, что кодируемые полипептиды сохраняют пестицидную активность. Таким образом, последовательности также можно подвергнуть мутагенезу с тем, чтобы кодируемые полипептиды были устойчивы к протеолитическому расщеплению химотрипсином. Более одного сайта распознавания можно добавить в конкретном положении в любой комбинации, и при этом несколько сайтов распознавания можно добавить к токсину или удалить из него. Таким образом, дополнительные мутации могут содержать три, четыре или более сайтов распознавания. Следует понимать, что несколько мутаций можно сконструировать в любой подходящей последовательности полинуклеотида; соответственно, либо последовательности полной длины, либо их фрагменты можно модифицировать таким образом, чтобы они содержали дополнительные или альтернативные сайты расщепления, а также были устойчивы к протеолитическому расщеплению. Таким образом, варианты осуществления предусматривают Cry токсины, содержащие мутации, которые улучшают пестицидную активность, а также улучшенные композиции и способы оказания воздействия на вредителей с использованием других Bt токсинов.
Мутации могут защищать полипептид от разрушения протеазой, например, путем удаления предполагаемых сайтов протеолитического расщепления, таких как предполагаемые сайты для сериновой протеазы и сайты распознавания для эластазы, из различных областей. Некоторые или все такие предполагаемые сайты можно удалить или изменить с тем, чтобы снизить протеолиз в месте расположения исходного сайта. Изменения протеолиза можно оценить путем сравнения мутантного полипептида с токсинами дикого типа или путем сравнения мутантных токсинов, которые отличаются их аминокислотной последовательностью. Предполагаемые сайты протеолитического расщепления и сайты протеолитического расщепления включают без ограничения следующие последовательности: RR, сайт расщепления для трипсина; LKM, сайт для химотрипсина; и сайт для трипсина. Эти сайты можно изменить путем добавления или удаления любого числа и вида аминокислотных остатков при условии, что пестицидная активность полипептида повышается. Таким образом, полипептиды, кодируемые нуклеотидными последовательностями, содержащими мутации, будут содержать по меньшей мере одно изменение или добавление аминокислоты по сравнению с нативной или фоновой последовательностью или 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 35, 38, 40, 45, 47, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, или 280 или более изменений или добавлений аминокислоты. Пестицидную активность полипептида также можно улучшить путем усечения нативной последовательности или последовательности полной длины, как известно из уровня техники.
Композиции согласно вариантам осуществления включают нуклеиновые кислоты, а также их фрагменты и варианты, которые кодируют пестицидные полипептиды. В частности, варианты осуществления предусматривают выделенные молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43 и SEQ ID NO: 45, или нуклеотидные последовательности, кодирующие указанную аминокислотную последовательность, например, нуклеотидную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44 или SEQ ID NO: 46, а также их фрагменты и варианты.
В частности, варианты осуществления предусматривают выделенные молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 8, или нуклеотидные последовательности, кодирующие указанную аминокислотную последовательность, например, нуклеотидную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, и SEQ ID NO: 46, а также их фрагменты и варианты.
et al.
Nucleic Acids Res.
Интерес также представляют оптимизированные нуклеотидные последовательности, кодирующие пестицидные белки согласно вариантам осуществления. Используемая в данном документе фраза "оптимизированные нуклеотидные последовательности" относится к нуклеиновым кислотам, которые являются оптимизированными для экспрессии в конкретном организме, например, в растении. Оптимизированные нуклеотидные последовательности можно получить для любого организма, представляющего интерес, с помощью способов, известных из уровня техники. См., например, патент США № 7462760, в котором описывается оптимизированная нуклеотидная последовательность, кодирующая раскрытый пестицидный белок. В данном примере нуклеотидную последовательность получали посредством "обратной трансляции" аминокислотной последовательности белка и изменения нуклеотидной последовательности с тем, чтобы она содержала предпочтительные для маиса кодоны, при этом все еще кодировала ту же аминокислотную последовательность. Эта процедура более подробно описана в Murray  (1989)  17:477-498. Оптимизированные нуклеотидные последовательности находят применение при повышении экспрессии пестицидного белка в растении, например, в однодольных растениях семейства Gramineae (Poaceae), таких как, например, растение маиса или кукурузы.
В некоторых вариантах осуществления предусматриваются полипептиды, содержащие аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43 или SEQ ID NO: 45, а также их фрагменты и варианты.
В некоторых вариантах осуществления предусматриваются полипептиды, содержащие аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43 или SEQ ID NO: 45, а также их фрагменты и варианты.
В некоторых вариантах осуществления предусматриваются полипептиды, содержащие аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27 или SEQ ID NO: 29, а также их фрагменты и варианты.
В некоторых вариантах осуществления предусматриваются вариантные полипептиды Cry1B с аминокислотной заменой по сравнению с соответствующим эталонным полипептидом Cry1B, обладающие повышенной инсектицидной активностью против кукурузной совки и/или травяной совки по сравнению с ʺсоответствующим эталонным полипептидом Cry1Bʺ. Под ʺсоответствующим эталонным полипептидом Cry1Bʺ подразумевают полипептид Cry1B дикого типа или нативный или вариантный полипептид Cry1B согласно настоящим вариантам осуществления, который может служить в качестве аминокислотной последовательности, которую подвергают мутагенезу для создания вариантного полипептида Cry1B. В некоторых вариантах осуществления соответствующий эталонный полипептид Cry1B содержит домен I Cry1Be-типа и домен III Cry1Ah-типа. Под ʺдоменом I Cry1Be-типаʺ подразумевают аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или большее идентична последовательности из аминокислот 36-276 с SEQ ID NO: 58 (Cry1Be) или аминокислотами 35-276 с SEQ ID NO: 47. Выравнивание аминокислотной последовательности домена I Cry1Be (SEQ ID NO: 58) и MP258 (SEQ ID NO: 47) показано на фигуре 3. Аналогично, другие нативные полипептиды Cry1B можно выравнивать с Cry1Be (SEQ ID NO: 58) и MP258 (SEQ ID NO: 47) для идентификации других участков домена I Cry1Be-типа. Под ʺдоменом III Cry1Ah-типаʺ подразумевают аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 81%, по меньшей мере на 82%, по меньшей мере на 83%, по меньшей мере на 84%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 86%, по меньшей мере на 87%, по меньшей мере на 88%, по меньшей мере на 89%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92% по меньшей мере на 93% по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95% по меньшей мере 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере на 99% или больше идентична последовательности из аминокислот 483-643 с SEQ ID NO: 61 (Cry1Ah) или 494-655 с SEQ ID NO: 47. Выравнивание аминокислотной последовательности домена III Cry1Ah (SEQ ID NO: 61), Cry1Bd (SEQ ID NO: 1), Cry1Bh (SEQ ID NO: 52), Cry1Bi (SEQ ID NO: 54) и MP258 (SEQ ID NO: 47) показано на фигуре 4. Аналогично, другие нативные полипептиды Cry1B можно выровнять с Cry1Ah (SEQ ID NO: 61), Cry1Bd, Cry1Bh (SEQ ID NO: 52), Cry1Bi (SEQ ID NO: 54) и/или MP258 (SEQ ID NO: 47) для идентификации других участков домена III Cry1Ah-типа. В некоторых вариантах осуществления соответствующий эталонный полипептид Cry1B содержит домен I и домен II Cry1Ba-типа. Под ʺдоменом I и доменом II Cry1Ba-типаʺ подразумевают аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 71%, по меньшей мере на 72%, по меньшей мере на 73%, по меньшей мере на 74%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 76%, по меньшей мере на 77%, по меньшей мере на 78%, по меньшей мере на 79%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 81%, по меньшей мере на 82%, по меньшей мере на 83%, по меньшей мере на 84%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 86%, по меньшей мере на 87%, по меньшей мере на 88%, по меньшей мере на 89%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92% по меньшей мере на 93% по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95% по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или больше идентична последовательности из аминокислот 30-489 с SEQ ID NO: 55 (Cry1Ba). Выравнивание аминокислотной последовательности домена I и домена II MP258 (SEQ ID NO: 47), Cry1Be (SEQ ID NO: 58), Cry1Bi (SEQ ID NO: 54), Cry1Bg (SEQ ID NO: 60), Cry1Bf (SEQ ID NO: 59), Cry1Ba (SEQ ID NO: 55), Cry1Bh (SEQ ID NO: 52), Cry1Bd (SEQ ID NO: 1), Cry1Bb (SEQ ID NO: 56), и Cry1Bc (SEQ ID NO: 57) показано на фигуре 5. Аналогично, другие нативные полипептиды Cry1B можно выравнивать с Cry1Ba (SEQ ID NO: 55) и MP258 (SEQ ID NO: 47) для идентификации других участков домена I и домена II Cry1Ba-типа.
В некоторых вариантах осуществления соответствующий эталонный полипептид Cry1B содержит домен I и домен II Cry1Be-типа. Под ʺдоменом I и доменом II Cry1Bе-типаʺ подразумевают аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 71%, по меньшей мере на 72%, по меньшей мере на 73%, по меньшей мере на 74%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 76%, по меньшей мере на 77%, по меньшей мере на 78%, по меньшей мере на 79%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 81%, по меньшей мере на 82%, по меньшей мере на 83%, по меньшей мере на 84%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 86%, по меньшей мере на 87%, по меньшей мере на 88%, по меньшей мере на 89%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92% по меньшей мере на 93% по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95% по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или больше идентична последовательности из аминокислот 35-494 с SEQ ID NO: 58 (Cry1Be) или аминокислотами 35-493 с SEQ ID NO: 47. Выравнивание аминокислотной последовательности домена I и домена II MP258 (SEQ ID NO: 47), Cry1Be (SEQ ID NO: 58), Cry1Bi (SEQ ID NO: 54), Cry1Bg (SEQ ID NO: 60), Cry1Bf (SEQ ID NO: 59), Cry1Ba (SEQ ID NO: 55), Cry1Bh (SEQ ID NO: 52), Cry1Bd (SEQ ID NO: 1), Cry1Bb (SEQ ID NO: 56), и Cry1Bc (SEQ ID NO: 57) показано на фигуре 5. Аналогично, другие нативные полипептиды Cry1B можно выравнивать с Cry1Be (SEQ ID NO: 58) и MP258 (SEQ ID NO: 47) для идентификации других участков домена I и домена II Cry1Be-типа.
Под "улучшенной активность" или ʺповышенной активностьюʺ подразумевают повышение по меньшей мере на приблизительно 10%, по меньшей мере на приблизительно 15%, по меньшей мере на приблизительно 20%, по меньшей мере на приблизительно 25%, по меньшей мере на приблизительно 30%, по меньшей мере на приблизительно 35%, по меньшей мере на приблизительно 40%, по меньшей мере на приблизительно 50%, по меньшей мере на приблизительно 60%, по меньшей мере на приблизительно 70%, по меньшей мере на приблизительно 80%, по меньшей мере на приблизительно 90%, по меньшей мере на приблизительно 100%, по меньшей мере на приблизительно 110%, по меньшей мере на приблизительно 120%, по меньшей мере на приблизительно 130%, по меньшей мере на приблизительно 140%, по меньшей мере на приблизительно 150%, по меньшей мере на приблизительно 160%, по меньшей мере на приблизительно 170%, по меньшей мере на приблизительно 180%, по меньшей мере на приблизительно 190%, по меньшей мере на приблизительно 200%, по меньшей мере на приблизительно 210% по меньшей мере на приблизительно 220%, по меньшей мере на приблизительно 230%, по меньшей мере на приблизительно 240%, по меньшей мере на приблизительно 250%, по меньшей мере на приблизительно 260%, по меньшей мере на приблизительно 270%, по меньшей мере на приблизительно 280%, по меньшей мере на приблизительно 290%, по меньшей мере на приблизительно 300%, по меньшей мере на приблизительно 310%, по меньшей мере на приблизительно 320%, по меньшей мере на приблизительно 330%, по меньшей мере на приблизительно 340%, по меньшей мере на приблизительно 350%, по меньшей мере на приблизительно 360%, по меньшей мере на приблизительно 370%, по меньшей мере на приблизительно 380%, по меньшей мере на приблизительно 390%, по меньшей мере на приблизительно 400%, по меньшей мере на приблизительно 410%, по меньшей мере на приблизительно 420%, по меньшей мере на приблизительно 430%, по меньшей мере на приблизительно 440%, по меньшей мере на приблизительно 450%, по меньшей мере на приблизительно 460%, по меньшей мере на приблизительно 470%, по меньшей мере на приблизительно 480%, по меньшей мере на приблизительно 490%, по меньшей мере на приблизительно 500%, по меньшей мере на приблизительно 510%, по меньшей мере на приблизительно 520%, по меньшей мере на приблизительно 530%, по меньшей мере на приблизительно 540%, по меньшей мере на приблизительно 550%, по меньшей мере на приблизительно 560%, по меньшей мере на приблизительно 570%, по меньшей мере на приблизительно 580%, по меньшей мере на приблизительно 590%, по меньшей мере на приблизительно 600%, по меньшей мере на приблизительно 650%, по меньшей мере на приблизительно 700%, по меньшей мере на приблизительно 750%, по меньшей мере на приблизительно 800%, по меньшей мере на приблизительно 850%, по меньшей мере на приблизительно 900%, по меньшей мере на приблизительно 950%, по меньшей мере на приблизительно 1000% или больше, или повышение по меньшей мере в приблизительно 1,1 раза, по меньшей мере в приблизительно 1,2 раза, по меньшей мере в приблизительно 1,3 раза, по меньшей мере в приблизительно 1,4 раза или по меньшей мере в приблизительно 1,5 раза, по меньшей мере в приблизительно 1,6 раза, по меньшей мере в приблизительно 1,7 раза, по меньшей мере в приблизительно 1,8 раза, по меньшей мере в приблизительно 1,9 раза, по меньшей мере в приблизительно 2 раза, по меньшей мере в приблизительно 2,1 раза, по меньшей мере в приблизительно 2,2 раза, по меньшей мере в приблизительно 2,3 раза, по меньшей мере в приблизительно 2,4 раза, по меньшей мере в приблизительно 2,5 раза, по меньшей мере в приблизительно 2,6 раза, по меньшей мере в приблизительно 2,7 раза, по меньшей мере в приблизительно 2,8 раза, по меньшей мере в приблизительно 2,9 раза, по меньшей мере в приблизительно 3 раза, по меньшей мере в приблизительно 3,1 раза, по меньшей мере в приблизительно 3,2 раза, по меньшей мере в приблизительно 3,3 раза, по меньшей мере в приблизительно 3,4 раза, по меньшей мере в приблизительно 3,5 раза, по меньшей мере в приблизительно 3,6 раза, по меньшей мере в приблизительно 3,7 раза, по меньшей мере в приблизительно 3,8 раза, по меньшей мере в приблизительно 3,9 раза, по меньшей мере в приблизительно 4 раза, по меньшей мере в приблизительно 4,1 раза, по меньшей мере в приблизительно 4,2 раза, по меньшей мере в приблизительно 4,3 раза, по меньшей мере в приблизительно 4,4 раза, по меньшей мере в приблизительно 4,5 раза, по меньшей мере в приблизительно 4,6 раза, по меньшей мере в приблизительно 4,7 раза, по меньшей мере в приблизительно 4,8 раза, по меньшей мере в приблизительно 4,9 раза, по меньшей мере в приблизительно 5 раз, по меньшей мере в приблизительно 5,1 раза, по меньшей мере в приблизительно 5,2 раза, по меньшей мере в приблизительно 5,3 раза, по меньшей мере в приблизительно 5,4 раза, по меньшей мере в приблизительно 5,5 раза, по меньшей мере в приблизительно 5,6 раза, по меньшей мере в приблизительно 5,7 раза, по меньшей мере в приблизительно 5,8 раза, по меньшей мере в приблизительно 5,9 раза, по меньшей мере в приблизительно 6 раз, по меньшей мере в приблизительно 6,1 раза, по меньшей мере в приблизительно 6,2 раза, по меньшей мере в приблизительно 6,3 раза, по меньшей мере в приблизительно 6,4 раза, по меньшей мере в приблизительно 6,5 раза, по меньшей мере в приблизительно 6,6 раза, по меньшей мере в приблизительно 6,7 раза, по меньшей мере в приблизительно 6,8 раза, по меньшей мере в приблизительно 6,9 раза, по меньшей мере в приблизительно 7 раз, по меньшей мере в приблизительно 7,1 раза, по меньшей мере в приблизительно 7,2 раза, по меньшей мере в приблизительно 7,3 раза, по меньшей мере в приблизительно 7,4 раза, по меньшей мере в приблизительно 7,5 раза, по меньшей мере в приблизительно 7,6 раза, по меньшей мере в приблизительно 7,7 раза, по меньшей мере в приблизительно 7,8 раза, по меньшей мере в приблизительно 7,9 раза, по меньшей мере в приблизительно 8 раз, по меньшей мере в приблизительно 8,1 раза, по меньшей мере в приблизительно 8,2 раза, по меньшей мере в приблизительно 8,3 раза, по меньшей мере в приблизительно 8,4 раза, по меньшей мере в приблизительно 8,5 раза, по меньшей мере в приблизительно 8,6 раза, по меньшей мере в приблизительно 8,7 раза, по меньшей мере в приблизительно 8,8 раза, по меньшей мере в приблизительно 8,9 раза, по меньшей мере в приблизительно 9 раз, по меньшей мере в приблизительно 9,1 раза, по меньшей мере в приблизительно 9,2 раза, по меньшей мере в приблизительно 9,3 раза, по меньшей мере в приблизительно 9,4 раза, по меньшей мере в приблизительно 9,5 раза, по меньшей мере в приблизительно 9,6 раза, по меньшей мере в приблизительно 9,7 раза, по меньшей мере в приблизительно 9,8 раза, по меньшей мере в приблизительно 9,9 раза, по меньшей мере в приблизительно 10 раз или больше по сравнению с активностью соответствующего эталонного полипептида Cry1B.
В некоторых вариантах осуществления улучшение заключается в снижении EC50 по меньшей мере на приблизительно 10%, по меньшей мере на приблизительно 15%, по меньшей мере на приблизительно 20%, по меньшей мере на приблизительно 25%, по меньшей мере на приблизительно 30%, по меньшей мере на приблизительно 35%, по меньшей мере на приблизительно 40%, по меньшей мере на приблизительно 50%, по меньшей мере на приблизительно 60%, по меньшей мере на приблизительно 70%, по меньшей мере на приблизительно 80%, по меньшей мере на приблизительно 90%, по меньшей мере на приблизительно 100%, по меньшей мере на приблизительно 110%, по меньшей мере на приблизительно 120%, по меньшей мере на приблизительно 130%, по меньшей мере на приблизительно 140%, по меньшей мере на приблизительно 150%, по меньшей мере на приблизительно 160%, по меньшей мере на приблизительно 170%, по меньшей мере на приблизительно 180%, по меньшей мере на приблизительно 190%, по меньшей мере на приблизительно 200%, по меньшей мере на приблизительно 210%, по меньшей мере на приблизительно 220%, по меньшей мере на приблизительно 230%, по меньшей мере на приблизительно 240%, по меньшей мере на приблизительно 250%, по меньшей мере на приблизительно 260%, по меньшей мере на приблизительно 270%, по меньшей мере на приблизительно 280%, по меньшей мере на приблизительно 290%, по меньшей мере на приблизительно 300%, по меньшей мере на приблизительно 310%, по меньшей мере на приблизительно 320%, по меньшей мере на приблизительно 330%, по меньшей мере на приблизительно 340%, по меньшей мере на приблизительно 350%, по меньшей мере на приблизительно 360%, по меньшей мере на приблизительно 370%, по меньшей мере на приблизительно 380%, по меньшей мере на приблизительно 390%, по меньшей мере на приблизительно 400%, по меньшей мере на приблизительно 410%, по меньшей мере на приблизительно 420%, по меньшей мере на приблизительно 430%, по меньшей мере на приблизительно 440%, по меньшей мере на приблизительно 450%, по меньшей мере на приблизительно 460%, по меньшей мере на приблизительно 470%, по меньшей мере на приблизительно 480%, по меньшей мере на приблизительно 490%, по меньшей мере на приблизительно 500%, по меньшей мере на приблизительно 510%, по меньшей мере на приблизительно 520%, по меньшей мере на приблизительно 530%, по меньшей мере на приблизительно 540%, по меньшей мере на приблизительно 550%, по меньшей мере на приблизительно 560%, по меньшей мере на приблизительно 570%, по меньшей мере на приблизительно 580%, по меньшей мере на приблизительно 590%, по меньшей мере на приблизительно 600%, по меньшей мере на приблизительно 650%, по меньшей мере на приблизительно 700%, по меньшей мере на приблизительно 750%, по меньшей мере на приблизительно 800%, по меньшей мере на приблизительно 850%, по меньшей мере на приблизительно 900%, по меньшей мере на приблизительно 950%, по меньшей мере на приблизительно 1000% или больше, или по меньшей мере в приблизительно 1,1 раза, по меньшей мере в приблизительно 1,2 раза, по меньшей мере в приблизительно 1,3 раза, по меньшей мере в приблизительно 1,4 раза или по меньшей мере в приблизительно 1,5 раза, по меньшей мере в приблизительно 1,6 раза, по меньшей мере в приблизительно 1,7 раза, по меньшей мере в приблизительно 1,8 раза, по меньшей мере в приблизительно 1,9 раза, по меньшей мере в приблизительно 2 раза, по меньшей мере в приблизительно 2,1 раза, по меньшей мере в приблизительно 2,2 раза, по меньшей мере в приблизительно 2,3 раза, по меньшей мере в приблизительно 2,4 раза, по меньшей мере в приблизительно 2,5 раза, по меньшей мере в приблизительно 2,6 раза, по меньшей мере в приблизительно 2,7 раза, по меньшей мере в приблизительно 2,8 раза, по меньшей мере в приблизительно 2,9 раза, по меньшей мере в приблизительно 3 раза, по меньшей мере в приблизительно 3,1 раза, по меньшей мере в приблизительно 3,2 раза, по меньшей мере в приблизительно 3,3 раза, по меньшей мере в приблизительно 3,4 раза, по меньшей мере в приблизительно 3,5 раза, по меньшей мере в приблизительно 3,6 раза, по меньшей мере в приблизительно 3,7 раза, по меньшей мере в приблизительно 3,8 раза, по меньшей мере в приблизительно 3,9 раза, по меньшей мере в приблизительно 4 раза, по меньшей мере в приблизительно 4,1 раза, по меньшей мере в приблизительно 4,2 раза, по меньшей мере в приблизительно 4,3 раза, по меньшей мере в приблизительно 4,4 раза, по меньшей мере в приблизительно 4,5 раза, по меньшей мере в приблизительно 4,6 раза, по меньшей мере в приблизительно 4,7 раза, по меньшей мере в приблизительно 4,8 раза, по меньшей мере в приблизительно 4,9 раза, по меньшей мере в приблизительно 5 раз, по меньшей мере в приблизительно 5,1 раза, по меньшей мере в приблизительно 5,2 раза, по меньшей мере в приблизительно 5,3 раза, по меньшей мере в приблизительно 5,4 раза, по меньшей мере в приблизительно 5,5 раза, по меньшей мере в приблизительно 5,6 раза, по меньшей мере в приблизительно 5,7 раза, по меньшей мере в приблизительно 5,8 раза, по меньшей мере в приблизительно 5,9 раза, по меньшей мере в приблизительно 6 раз, по меньшей мере в приблизительно 6,1 раза, по меньшей мере в приблизительно 6,2 раза, по меньшей мере в приблизительно 6,3 раза, по меньшей мере в приблизительно 6,4 раза, по меньшей мере в приблизительно 6,5 раза, по меньшей мере в приблизительно 6,6 раза, по меньшей мере в приблизительно 6,7 раза, по меньшей мере в приблизительно 6,8 раза, по меньшей мере в приблизительно 6,9 раза, по меньшей мере в приблизительно 7 раз, по меньшей мере в приблизительно 7,1 раза, по меньшей мере в приблизительно 7,2 раза, по меньшей мере в приблизительно 7,3 раза, по меньшей мере в приблизительно 7,4 раза, по меньшей мере в приблизительно 7,5 раза, по меньшей мере в приблизительно 7,6 раза, по меньшей мере в приблизительно 7,7 раза, по меньшей мере в приблизительно 7,8 раза, по меньшей мере в приблизительно 7,9 раза, по меньшей мере в приблизительно 8 раз, по меньшей мере в приблизительно 8,1 раза, по меньшей мере в приблизительно 8,2 раза, по меньшей мере в приблизительно 8,3 раза, по меньшей мере в приблизительно 8,4 раза, по меньшей мере в приблизительно 8,5 раза, по меньшей мере в приблизительно 8,6 раза, по меньшей мере в приблизительно 8,7 раза, по меньшей мере в приблизительно 8,8 раза, по меньшей мере в приблизительно 8,9 раза, по меньшей мере в приблизительно 9 раз, по меньшей мере в приблизительно 9,1 раза, по меньшей мере в приблизительно 9,2 раза, по меньшей мере в приблизительно 9,3 раза, по меньшей мере в приблизительно 9,4 раза, по меньшей мере в приблизительно 9,5 раза, по меньшей мере в приблизительно 9,6 раза, по меньшей мере в приблизительно 9,7 раза, по меньшей мере в приблизительно 9,8 раза, по меньшей мере в приблизительно 9,9 раза, по меньшей мере в приблизительно 10 раз или больше снижение EC50 для вариантного полипептида Cry1B по сравнению с пестицидной активностью соответствующего эталонного полипептида Cry1B.
В некоторых вариантах осуществления EC50 вариантного полипептида Cry1B составляет <100 ppm, <90 ppm, <80 ppm, <70 ppm, <60 ppm, <50 ppm, <45 ppm, <40 ppm, <35 ppm, <30 ppm, <25 ppm, <20 ppm, <19 ppm, <18 ppm, <17 ppm, <16 ppm, <15 ppm, <14 ppm, <13 ppm, <12 ppm, <11 ppm, <10 ppm, <9 ppm, <8 ppm, <7 ppm, <6 ppm, <5 ppm, <4 ppm, <3 ppm, <2 ppm, <1 ppm, <0,9 ppm, <0,8 ppm, <0,7 ppm, <0,6 ppm, <0,5 ppm, <0,4 ppm, <0,3 ppm, <0,2 ppm или <0,1 ppm.
В некоторых вариантах осуществления улучшение заключается в повышении среднего значения индекса FAE по меньшей мере на приблизительно 10%, по меньшей мере на приблизительно 15%, по меньшей мере на приблизительно 20%, по меньшей мере на приблизительно 25%, по меньшей мере на приблизительно 30%, по меньшей мере на приблизительно 35%, по меньшей мере на приблизительно 40%, по меньшей мере на приблизительно 50%, по меньшей мере на приблизительно 60%, по меньшей мере на приблизительно 70%, по меньшей мере на приблизительно 80%, по меньшей мере на приблизительно 90%, по меньшей мере на приблизительно 100%, по меньшей мере на приблизительно 110%, по меньшей мере на приблизительно 120%, по меньшей мере на приблизительно 130%, по меньшей мере на приблизительно 140%, по меньшей мере на приблизительно 150%, по меньшей мере на приблизительно 160%, по меньшей мере на приблизительно 170%, по меньшей мере на приблизительно 180%, по меньшей мере на приблизительно 190%, по меньшей мере на приблизительно 200%, по меньшей мере на приблизительно 210%, по меньшей мере на приблизительно 220%, по меньшей мере на приблизительно 230%, по меньшей мере на приблизительно 240%, по меньшей мере на приблизительно 250%, по меньшей мере на приблизительно 260%, по меньшей мере на приблизительно 270%, по меньшей мере на приблизительно 280%, по меньшей мере на приблизительно 290%, по меньшей мере на приблизительно 300%, по меньшей мере на приблизительно 310%, по меньшей мере на приблизительно 320%, по меньшей мере на приблизительно 330%, по меньшей мере на приблизительно 340%, по меньшей мере на приблизительно 350%, по меньшей мере на приблизительно 360%, по меньшей мере на приблизительно 370%, по меньшей мере на приблизительно 380%, по меньшей мере на приблизительно 390%, по меньшей мере на приблизительно 400%, по меньшей мере на приблизительно 410%, по меньшей мере на приблизительно 420%, по меньшей мере на приблизительно 430%, по меньшей мере на приблизительно 440%, по меньшей мере на приблизительно 450%, по меньшей мере на приблизительно 460%, по меньшей мере на приблизительно 470%, по меньшей мере на приблизительно 480%, по меньшей мере на приблизительно 490%, по меньшей мере на приблизительно 500%, по меньшей мере на приблизительно 510%, по меньшей мере на приблизительно 520%, по меньшей мере на приблизительно 530%, по меньшей мере на приблизительно 540%, по меньшей мере на приблизительно 550%, по меньшей мере на приблизительно 560%, по меньшей мере на приблизительно 570%, по меньшей мере на приблизительно 580%, по меньшей мере на приблизительно 590%, по меньшей мере на приблизительно 600%, по меньшей мере на приблизительно 650%, по меньшей мере на приблизительно 700%, по меньшей мере на приблизительно 750%, по меньшей мере на приблизительно 800%, по меньшей мере на приблизительно 850%, по меньшей мере на приблизительно 900%, по меньшей мере на приблизительно 950%, по меньшей мере на приблизительно 1000% или больше, или по меньшей мере в приблизительно 1,1 раза, по меньшей мере в приблизительно 1,2 раза, по меньшей мере в приблизительно 1,3 раза, по меньшей мере в приблизительно 1,4 раза или по меньшей мере в приблизительно 1,5 раза, по меньшей мере в приблизительно 1,6 раза, по меньшей мере в приблизительно 1,7 раза, по меньшей мере в приблизительно 1,8 раза, по меньшей мере в приблизительно 1,9 раза, по меньшей мере в приблизительно 2 раза, по меньшей мере в приблизительно 2,1 раза, по меньшей мере в приблизительно 2,2 раза, по меньшей мере в приблизительно 2,3 раза, по меньшей мере в приблизительно 2,4 раза, по меньшей мере в приблизительно 2,5 раза, по меньшей мере в приблизительно 2,6 раза, по меньшей мере в приблизительно 2,7 раза, по меньшей мере в приблизительно 2,8 раза, по меньшей мере в приблизительно 2,9 раза, по меньшей мере в приблизительно 3 раза, по меньшей мере в приблизительно 3,1 раза, по меньшей мере в приблизительно 3,2 раза, по меньшей мере в приблизительно 3,3 раза, по меньшей мере в приблизительно 3,4 раза, по меньшей мере в приблизительно 3,5 раза, по меньшей мере в приблизительно 3,6 раза, по меньшей мере в приблизительно 3,7 раза, по меньшей мере в приблизительно 3,8 раза, по меньшей мере в приблизительно 3,9 раза, по меньшей мере в приблизительно 4 раза, по меньшей мере в приблизительно 4,1 раза, по меньшей мере в приблизительно 4,2 раза, по меньшей мере в приблизительно 4,3 раза, по меньшей мере в приблизительно 4,4 раза, по меньшей мере в приблизительно 4,5 раза, по меньшей мере в приблизительно 4,6 раза, по меньшей мере в приблизительно 4,7 раза, по меньшей мере в приблизительно 4,8 раза, по меньшей мере в приблизительно 4,9 раза, по меньшей мере в приблизительно 5 раз, по меньшей мере в приблизительно 5,1 раза, по меньшей мере в приблизительно 5,2 раза, по меньшей мере в приблизительно 5,3 раза, по меньшей мере в приблизительно 5,4 раза, по меньшей мере в приблизительно 5,5 раза, по меньшей мере в приблизительно 5,6 раза, по меньшей мере в приблизительно 5,7 раза, по меньшей мере в приблизительно 5,8 раза, по меньшей мере в приблизительно 5,9 раза, по меньшей мере в приблизительно 6 раз, по меньшей мере в приблизительно 6,1 раза, по меньшей мере в приблизительно 6,2 раза, по меньшей мере в приблизительно 6,3 раза, по меньшей мере в приблизительно 6,4 раза, по меньшей мере в приблизительно 6,5 раза, по меньшей мере в приблизительно 6,6 раза, по меньшей мере в приблизительно 6,7 раза, по меньшей мере в приблизительно 6,8 раза, по меньшей мере в приблизительно 6,9 раза, по меньшей мере в приблизительно 7 раз, по меньшей мере в приблизительно 7,1 раза, по меньшей мере в приблизительно 7,2 раза, по меньшей мере в приблизительно 7,3 раза, по меньшей мере в приблизительно 7,4 раза, по меньшей мере в приблизительно 7,5 раза, по меньшей мере в приблизительно 7,6 раза, по меньшей мере в приблизительно 7,7 раза, по меньшей мере в приблизительно 7,8 раза, по меньшей мере в приблизительно 7,9 раза, по меньшей мере в приблизительно 8 раз, по меньшей мере в приблизительно 8,1 раза, по меньшей мере в приблизительно 8,2 раза, по меньшей мере в приблизительно 8,3 раза, по меньшей мере в приблизительно 8,4 раза, по меньшей мере в приблизительно 8,5 раза, по меньшей мере в приблизительно 8,6 раза, по меньшей мере в приблизительно 8,7 раза, по меньшей мере в приблизительно 8,8 раза, по меньшей мере в приблизительно 8,9 раза, по меньшей мере в приблизительно 9 раз, по меньшей мере в приблизительно 9,1 раза, по меньшей мере в приблизительно 9,2 раза, по меньшей мере в приблизительно 9,3 раза, по меньшей мере в приблизительно 9,4 раза, по меньшей мере в приблизительно 9,5 раза, по меньшей мере в приблизительно 9,6 раза, по меньшей мере в приблизительно 9,7 раза, по меньшей мере в приблизительно 9,8 раза, по меньшей мере в приблизительно 9,9 раза, по меньшей мере в приблизительно 10 раз или большее повышение среднего значения индекса FAE для вариантного полипептида Cry1B по сравнению с пестицидной активностью соответствующего эталонного полипептида Cry1B.
"Среднее значение индекса FAE" (MFI) относится к среднему значению для множества FAEGN, среднему арифметическому значению FAEGN. Как используется в данном документе, "среднее значение показателя отклонения" относится к среднему арифметическому значению для множества показателей отклонения.
В некоторых вариантах осуществления улучшение заключается в повышении среднего значения показателя отклонения по меньшей мере на приблизительно 10%, по меньшей мере на приблизительно 15%, по меньшей мере на приблизительно 20%, по меньшей мере на приблизительно 25%, по меньшей мере на приблизительно 30%, по меньшей мере на приблизительно 35%, по меньшей мере на приблизительно 40%, по меньшей мере на приблизительно 50%, по меньшей мере на приблизительно 60%, по меньшей мере на приблизительно 70%, по меньшей мере на приблизительно 80%, по меньшей мере на приблизительно 90%, по меньшей мере на приблизительно 100%, по меньшей мере на приблизительно 110%, по меньшей мере на приблизительно 120%, по меньшей мере на приблизительно 130%, по меньшей мере на приблизительно 140%, по меньшей мере на приблизительно 150%, по меньшей мере на приблизительно 160%, по меньшей мере на приблизительно 170%, по меньшей мере на приблизительно 180%, по меньшей мере на приблизительно 190%, по меньшей мере на приблизительно 200%, по меньшей мере на приблизительно 210%, по меньшей мере на приблизительно 220%, по меньшей мере на приблизительно 230%, по меньшей мере на приблизительно 240%, по меньшей мере на приблизительно 250%, по меньшей мере на приблизительно 260%, по меньшей мере на приблизительно 270%, по меньшей мере на приблизительно 280%, по меньшей мере на приблизительно 290%, по меньшей мере на приблизительно 300%, по меньшей мере на приблизительно 310%, по меньшей мере на приблизительно 320%, по меньшей мере на приблизительно 330%, по меньшей мере на приблизительно 340%, по меньшей мере на приблизительно 350%, по меньшей мере на приблизительно 360%, по меньшей мере на приблизительно 370%, по меньшей мере на приблизительно 380%, по меньшей мере на приблизительно 390%, по меньшей мере на приблизительно 400%, по меньшей мере на приблизительно 410%, по меньшей мере на приблизительно 420%, по меньшей мере на приблизительно 430%, по меньшей мере на приблизительно 440%, по меньшей мере на приблизительно 450%, по меньшей мере на приблизительно 460%, по меньшей мере на приблизительно 470%, по меньшей мере на приблизительно 480%, по меньшей мере на приблизительно 490%, по меньшей мере на приблизительно 500%, по меньшей мере на приблизительно 510%, по меньшей мере на приблизительно 520%, по меньшей мере на приблизительно 530%, по меньшей мере на приблизительно 540%, по меньшей мере на приблизительно 550%, по меньшей мере на приблизительно 560%, по меньшей мере на приблизительно 570%, по меньшей мере на приблизительно 580%, по меньшей мере на приблизительно 590%, по меньшей мере на приблизительно 600%, по меньшей мере на приблизительно 650%, по меньшей мере на приблизительно 700%, по меньшей мере на приблизительно 750%, по меньшей мере на приблизительно 800%, по меньшей мере на приблизительно 850%, по меньшей мере на приблизительно 900%, по меньшей мере на приблизительно 950%, по меньшей мере на приблизительно 1000% или больше, или по меньшей мере в приблизительно 1,1 раза, по меньшей мере в приблизительно 1,2 раза, по меньшей мере в приблизительно 1,3 раза, по меньшей мере в приблизительно 1,4 раза или по меньшей мере в приблизительно 1,5 раза, по меньшей мере в приблизительно 1,6 раза, по меньшей мере в приблизительно 1,7 раза, по меньшей мере в приблизительно 1,8 раза, по меньшей мере в приблизительно 1,9 раза, по меньшей мере в приблизительно 2 раза, по меньшей мере в приблизительно 2,1 раза, по меньшей мере в приблизительно 2,2 раза, по меньшей мере в приблизительно 2,3 раза, по меньшей мере в приблизительно 2,4 раза, по меньшей мере в приблизительно 2,5 раза, по меньшей мере в приблизительно 2,6 раза, по меньшей мере в приблизительно 2,7 раза, по меньшей мере в приблизительно 2,8 раза, по меньшей мере в приблизительно 2,9 раза, по меньшей мере в приблизительно 3 раза, по меньшей мере в приблизительно 3,1 раза, по меньшей мере в приблизительно 3,2 раза, по меньшей мере в приблизительно 3,3 раза, по меньшей мере в приблизительно 3,4 раза, по меньшей мере в приблизительно 3,5 раза, по меньшей мере в приблизительно 3,6 раза, по меньшей мере в приблизительно 3,7 раза, по меньшей мере в приблизительно 3,8 раза, по меньшей мере в приблизительно 3,9 раза, по меньшей мере в приблизительно 4 раза, по меньшей мере в приблизительно 4,1 раза, по меньшей мере в приблизительно 4,2 раза, по меньшей мере в приблизительно 4,3 раза, по меньшей мере в приблизительно 4,4 раза, по меньшей мере в приблизительно 4,5 раза, по меньшей мере в приблизительно 4,6 раза, по меньшей мере в приблизительно 4,7 раза, по меньшей мере в приблизительно 4,8 раза, по меньшей мере в приблизительно 4,9 раза, по меньшей мере в приблизительно 5 раз, по меньшей мере в приблизительно 5,1 раза, по меньшей мере в приблизительно 5,2 раза, по меньшей мере в приблизительно 5,3 раза, по меньшей мере в приблизительно 5,4 раза, по меньшей мере в приблизительно 5,5 раза, по меньшей мере в приблизительно 5,6 раза, по меньшей мере в приблизительно 5,7 раза, по меньшей мере в приблизительно 5,8 раза, по меньшей мере в приблизительно 5,9 раза, по меньшей мере в приблизительно 6 раз, по меньшей мере в приблизительно 6,1 раза, по меньшей мере в приблизительно 6,2 раза, по меньшей мере в приблизительно 6,3 раза, по меньшей мере в приблизительно 6,4 раза, по меньшей мере в приблизительно 6,5 раза, по меньшей мере в приблизительно 6,6 раза, по меньшей мере в приблизительно 6,7 раза, по меньшей мере в приблизительно 6,8 раза, по меньшей мере в приблизительно 6,9 раза, по меньшей мере в приблизительно 7 раз, по меньшей мере в приблизительно 7,1 раза, по меньшей мере в приблизительно 7,2 раза, по меньшей мере в приблизительно 7,3 раза, по меньшей мере в приблизительно 7,4 раза, по меньшей мере в приблизительно 7,5 раза, по меньшей мере в приблизительно 7,6 раза, по меньшей мере в приблизительно 7,7 раза, по меньшей мере в приблизительно 7,8 раза, по меньшей мере в приблизительно 7,9 раза, по меньшей мере в приблизительно 8 раз, по меньшей мере в приблизительно 8,1 раза, по меньшей мере в приблизительно 8,2 раза, по меньшей мере в приблизительно 8,3 раза, по меньшей мере в приблизительно 8,4 раза, по меньшей мере в приблизительно 8,5 раза, по меньшей мере в приблизительно 8,6 раза, по меньшей мере в приблизительно 8,7 раза, по меньшей мере в приблизительно 8,8 раза, по меньшей мере в приблизительно 8,9 раза, по меньшей мере в приблизительно 9 раз, по меньшей мере в приблизительно 9,1 раза, по меньшей мере в приблизительно 9,2 раза, по меньшей мере в приблизительно 9,3 раза, по меньшей мере в приблизительно 9,4 раза, по меньшей мере в приблизительно 9,5 раза, по меньшей мере в приблизительно 9,6 раза, по меньшей мере в приблизительно 9,7 раза, по меньшей мере в приблизительно 9,8 раза, по меньшей мере в приблизительно 9,9 раза, по меньшей мере в приблизительно 10 раз или большем повышении среднего значения показателя отклонения для вариантного полипептида Cry1B по сравнению с пестицидной активностью соответствующего эталонного полипептида Cry1B.
В некоторых вариантах осуществления активность вариантного полипептида Cry1B является улучшенной по сравнению с пестицидной активностью SEQ ID NO: 1 (Cry1Bd), SEQ ID NO: 47 (MP258), SEQ ID NO: 52 (Cry1Bh), SEQ ID NO: 54 (Cry1Bi), SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43 или SEQ ID NO: 45.
В конкретных вариантах осуществления пестицидные белки согласно вариантам осуществления предполагают инсектицидные полипептиды полной длины, фрагменты инсектицидных полипептидов полной длины и вариантные полипептиды, которые получены из подвергнутых мутагенезу нуклеиновых кислот, сконструированных для введения конкретных аминокислотных последовательностей в полипептиды согласно вариантам осуществления. В конкретных вариантах осуществления аминокислотные последовательности, которые вводят в полипептиды, содержат последовательность, которая обеспечивает сайт расщепления для фермента, такого как протеаза.
Из уровня техники известно, что пестицидная активность Bt токсинов, как правило, активируется при расщеплении пептида в кишечнике насекомого различными протеазами. Поскольку пептиды не всегда могут расщепляться в кишечнике насекомого с полной эффективностью, фрагменты токсина полной длины могут обладать усиленной пестицидной активностью по сравнению с самим токсином полной длины. Таким образом, некоторые из полипептидов согласно вариантам осуществления включают фрагменты инсектицидного полипептида полной длины, и некоторые из фрагментов, вариантов и мутаций полипептида будут характеризоваться усиленной пестицидной активностью по сравнению с активностью встречающегося в естественных условиях инсектицидного полипептида, из которого они получены, в особенности, если встречающийся в естественных условиях инсектицидный полипептид не активируется in vitro протеазой перед скринингом в отношении активности. Таким образом, настоящим изобретением охватываются усеченные варианты или фрагменты последовательностей.
Мутации можно поместить в любую фоновую последовательность, в том числе в такие усеченные полипептиды при условии, что полипептид сохраняет пестицидную активность. Специалист в данной области техники может легко сравнить два или более белков в отношении пестицидной активности с помощью анализов, известных из уровня техники или описанных в других местах в данном документе. Следует понимать, что полипептиды согласно вариантам осуществления можно получить либо путем экспрессии нуклеиновой кислоты, раскрытой в данном документе, либо путем применения стандартных методик молекулярной биологии.
Считается, что пестицидные белки могут быть олигомерными и будут отличаться по молекулярному весу, числу остатков, составляющим пептидам, активности против конкретных вредителей и другим характеристикам. Тем не менее, с помощью способов, изложенных в данном документе, можно выделить и охарактеризовать белки, активные против ряда вредителей. Пестицидные белки согласно вариантам осуществления можно применять в комбинации с другими Bt токсинами или другими инсектицидными белками для расширения спектра насекомых-мишеней. Более того, применение пестицидных белков согласно вариантам осуществления в комбинации с другими Bt токсинами или другими инсектицидными активными компонентами отличной природы является особенно полезным для предотвращения и/или сдерживания развития устойчивости у насекомых. Другие инсектицидные средства включают ингибиторы протеаз (как серинового, так и цистеинового типов), α-амилазы и пероксидазы.
Фрагменты и варианты нуклеотидных и аминокислотных последовательностей и полипептидов, кодируемых ими, также охватываются вариантами осуществления. Используемый в данном документе термин "фрагмент" относится к части нуклеотидной последовательности полинуклеотида или к части аминокислотной последовательности полипептида согласно вариантам осуществления. Фрагменты нуклеотидной последовательности могут кодировать фрагментыбелка, которые сохраняют биологическую активность нативного белка или соответствующего белка полной длины и, следовательно, обладают пестицидной активностью. Таким образом, считается, что некоторые из последовательностей полинуклеотидов и аминокислотных последовательностей согласно вариантам осуществления можно справедливо называть и фрагментами, и мутантами.
Следует понимать, что термин "фрагмент" в том значении, в котором он используется по отношению к последовательностям нуклеиновой кислоты согласно вариантам осуществления, также охватывает последовательности, которые являются полезными в качестве гибридизационных зондов. Нуклеотидные последовательности из этого класса обычно не кодируют фрагменты белков, сохраняющие биологическую активность. Таким образом, фрагменты нуклеотидной последовательности могут варьировать в диапазоне от по меньшей мере приблизительно 20 нуклеотидов, приблизительно 50 нуклеотидов, приблизительно 100 нуклеотидов и до нуклеотидной последовательности полной длины, кодирующей белки согласно вариантам осуществления.
например
in vitro
Фрагмент нуклеотидной последовательности согласно вариантам осуществления, который кодирует биологически активную часть пестицидного белка согласно вариантам осуществления, будет кодировать по меньшей мере 15, 25, 30, 50, 100, 200, 250 или 300 смежных аминокислот или до общего числа аминокислот, присутствующих в пестицидном полипептиде согласно вариантам осуществления (например, 651 аминокислота для SEQ ID NO: 3). Таким образом, следует понимать, что вариантами осуществления также охватываются полипептиды, которые представляют собой фрагменты иллюстративных пестицидных белков согласно вариантам осуществления и имеют длину по меньшей мере 15, 25, 30, 50, 100, 200, 250 или 300смежных аминокислот или до общего числа аминокислот, присутствующих в пестицидном полипептиде согласно вариантам осуществления (например, 651 аминокислота для SEQ ID NO: 3). От фрагментов нуклеотидной последовательности согласно вариантам осуществления, которые являются полезными в качестве гибридизационных зондов или ПЦР-праймеров обычно не требуется, чтобы они кодировали биологически активную часть пестицидногобелка. Таким образом, фрагмент нуклеиновой кислоты согласно вариантам осуществления может кодировать биологически активную часть пестицидного белка, или он может представлять собой фрагмент, который можно применять в качестве гибридизационного зонда или ПЦР-праймера с использованием способов, раскрытых в данном документе. Биологически активную часть пестицидного белка можно получить путем выделения части одной из нуклеотидных последовательностей согласно вариантам осуществления, экспрессии кодируемой части пестицидногобелка (, путем рекомбинантной экспрессии ) и оценки активности кодируемой части пестицидного белка.
Нуклеиновые кислоты, которые представляют собой фрагменты нуклеотидной последовательности согласно вариантам осуществления, содержат по меньшей мере 16, 20, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 850, 900 или 950 нуклеотидов или до числа нуклеотидов, присутствующих в нуклеотидной последовательности, раскрытой в данном документе (например, 1953 нуклеотидов для SEQ ID NO: 4). Конкретные варианты осуществления предусматривают фрагменты, происходящие из (например, полученные из) первой нуклеиновой кислоты согласно вариантам осуществления, где фрагмент кодирует усеченный токсин, обладающий пестицидной активностью. Усеченные полипептиды, кодируемые полинуклеотидными фрагментами согласно вариантам осуществления, обладают пестицидной активностью, которая является либо эквивалентной, либо улучшенной по сравнению с активностью соответствующего полипептида полной длины, кодируемого первой нуклеиновой кислотой, из которой происходит фрагмент. Предусматривается, что такие фрагменты нуклеиновой кислоты согласно вариантам осуществления могут быть усеченными по 3' концу нативной кодирующей последовательности или соответствующей кодирующей последовательности полной длины. Фрагменты нуклеиновой кислоты также могут быть усеченными как по 5′-, так и по 3′ концу нативной кодирующей последовательности или соответствующей кодирующей последовательности полной длины.
Термин "варианты" используется в данном документе для обозначения практически сходных последовательностей. Для нуклеотидных последовательностей консервативные варианты включают те последовательности, которые из-за вырожденности генетического кода кодируют аминокислотную последовательность одного из пестицидных полипептидов согласно вариантам осуществления. Специалисты в данной области техники легко поймут, что вследствие вырожденности генетического кода существует множество нуклеотидных последовательностей, кодирующих, белки согласно настоящему раскрытию.
В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид, представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, отличающуюся от геномной. Используемые в данном документе "последовательность нуклеиновой кислоты, отличающаяся от геномной", или "молекула нуклеиновой кислоты, отличающаяся от геномной", или "полинуклеотид, отличающийся от геномного" относятся к молекуле нуклеиновой кислоты, которая имеет одно или несколько изменений в последовательности нуклеиновой кислоты по сравнению с нативной или геномной последовательностью нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления изменение по отношению к нативной или геномной молекуле нуклеиновой кислоты включает без ограничения: изменения в последовательности нуклеиновой кислоты, обусловленные вырожденностью генетического кода; оптимизацию кодонов последовательности нуклеиновой кислоты для экспрессии в растениях; изменения в последовательности нуклеиновой кислоты для введения по меньшей мере одной аминокислотной замены, вставки, делеции и/или добавления по сравнению с нативной или геномной последовательностью; удаление одного или нескольких интронов, ассоциированных с геномной последовательностью нуклеиновой кислоты; вставку одного или нескольких гетерологичных интронов; делецию одного или нескольких регуляторных участков, расположенных выше или ниже, ассоциированных с геномной последовательностью нуклеиновой кислоты; вставку одного или нескольких гетерологичных регуляторных участков, расположенных выше или ниже; делецию 5'- и/или 3'-нетранслируемого участка, ассоциированного с геномной последовательностью нуклеиновой кислоты; вставку гетерологичного 5'- и/или 3'-нетранслируемого участка и модификацию сайта полиаденилирования. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты, отличающаяся от геномной, представляет собой кДНК. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты, отличающаяся от геномной, представляет собой синтетическую последовательность нуклеиновой кислоты.
Plant Physiol.
et al
Nucleic Acids Res
et al.
Nucleic Acids Res.
Mol Bio Rep
При необходимости нуклеиновую кислоту можно оптимизировать для повышения экспрессии в организме-хозяине. Таким образом, если организм-хозяин является растением, для улучшенной экспрессии можно синтезировать синтетические нуклеиновые кислоты с использованием кодонов, предпочтительных для растений. См., например,Campbell и Gowri, (1990)  92:1-11 в отношении обсуждения использования кодонов, предпочтительных для хозяина. Например, хотя последовательности нуклеиновых кислот согласно вариантам осуществления могут экспрессироваться у видов как однодольных, так и двудольных растений, последовательности можно модифицировать с учетом специфических предпочтений в отношении кодонов и предпочтений по содержанию GC у однодольных или двудольных, если было показано, что предпочтения отличаются (Murray . (1989) . 17:477-498). Таким образом, кодон, предпочтительный для маиса, для конкретной аминокислоты можно установить из известных генных последовательностей маиса. Использование кодонов маисом для 28 генов из растений маиса приведено в таблице 4 из Murray, et al., выше. Из уровня техники доступны способы синтеза генов, предпочтительных для растений. См., например, патенты США №№ 5,380,831, и 5,436,391 и Murray, , (1989)  17:477-498, и Liu H et al.  37:677-684, 2010, включенные в данный документ посредством ссылки. Таблицу использования кодонов Zea maize также можно найти на сайте kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi?species=4577, доступ к которому можно получить с применением префикса www.
Таблица использования кодонов Glycine max показана в виде таблицы 3, и ее также можно найти на сайте kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi?species=3847&aa=1&style=N, доступ к которому можно получить с применением префикса www.
К тому же, специалист в данной области техники поймет, что изменения можно вводить путем мутирования последовательностей нуклеиновой кислоты, что ведет к изменениям в аминокислотной последовательности кодируемого полипептида без изменения биологической активности белков. Таким образом, вариантные молекулы нуклеиновой кислоты можно создавать путем введения одной или нескольких нуклеотидных замен, добавлений и/или делеций в соответствующую последовательность нуклеиновой кислоты, раскрытую в данном документе, так что одна или несколько аминокислотных замен, добавлений или делеций вводятся в кодируемый белок. Мутации можно вводить при помощи стандартных методик, таких как сайт-направленный мутагенез и ПЦР-опосредованный мутагенез. Такие вариантные последовательности нуклеиновой кислоты также охватываются настоящим раскрытием.
Встречающиеся в природе аллельные варианты, такие как эти, можно идентифицировать с применением хорошо известных методик молекулярной биологии, таких как, например, полимеразная цепная реакция (ПЦР) и методики гибридизации, как изложено в данном документе.
В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид, кодирующий полипептид SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43 или SEQ ID NO: 45, представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, отличающуюся от геномной.
Вариантные нуклеотидные последовательности также включают синтетически полученные нуклеотидные последовательности, такие как полученные, например, с помощью сайт-направленного мутагенеза, но которые все еще кодируют пестицидный белок согласно вариантам осуществления, такой как мутантный токсин. В целом, варианты конкретной нуклеотидной последовательности согласно вариантам осуществления будут иметь последовательность, по меньшей мере на приблизительно 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичную конкретной нуклеотидной последовательности при определении с помощью программ для выравнивания последовательностей, описанных в других местах в данном документе, с использованием параметров по умолчанию. Вариант нуклеотидной последовательности согласно вариантам осуществления может отличаться от данной последовательности лишь 1-15 нуклеотидами, лишь 1-10, как например, 6-10, лишь 5, лишь 4, 3, 2 или даже 1 нуклеотидом.
Варианты конкретной нуклеотидной последовательности согласно вариантам осуществления (т.е. иллюстративной нуклеотидной последовательности) также можно оценивать путем сравнения процентной идентичности последовательности для полипептида, кодируемого вариантной нуклеотидной последовательностью, и полипептида, кодируемого эталонной нуклеотидной последовательностью. Таким образом, например, раскрыты выделенные нуклеиновые кислоты, которые кодируют полипептид с указанной процентной идентичностью последовательности по отношению к полипептидам с SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43 или SEQ ID NO: 45. Процентную идентичность последовательности для любых двух полипептидов можно рассчитать с помощью программ для выравнивания последовательностей, описанных в других местах в данном документе, с использованием параметров по умолчанию. При оценке любой заданной пары полинуклеотидов согласно вариантам осуществления путем сравнения процентной идентичности последовательности, общей для двух полипептидов, которые они кодируют, последовательности двух кодируемых полипептидов идентичны по меньшей мере на приблизительно 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, обычно по меньшей мере на приблизительно 75%, 80%, 85%, по меньшей мере на приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% или по меньшей мере на приблизительно 98%, 99% или более.
Используемый в данном документе термин "вариантный белок" охватывает полипептиды, которые получены из нативного белка: путем делеции (так называемого усечения) или добавления одной или нескольких аминокислот на N-конце и/или C-конце нативного белка; делеции или добавления одной или нескольких аминокислот в одном или нескольких сайтах в нативном белке или замены одной или нескольких аминокислот в одном или нескольких сайтах в нативном белке. Соответственно, термин ʺвариантный белокʺ охватывает биологически активные фрагменты нативного белка, которые содержат достаточное число смежных аминокислотных остатков для сохранения биологической активности нативного белка, т.е. для того, чтобы он обладал пестицидной активностью. Такая пестицидная активность может быть отличающейся или улучшенной по сравнению с нативным белком, или она может быть неизменной при условии, что пестицидная активность сохраняется.
Вариантные белки, охватываемые вариантами осуществления, являются биологически активными, то есть они продолжают обладать необходимой биологической активностью нативного белка, то есть пестицидной активностью, как описано в данном документе. Такие варианты могут быть результатом, например, генетического полиморфизма или манипуляции, осуществляемой человеком. Биологически активные варианты нативного пестицидного белка согласно вариантам осуществления будут иметь последовательность, по меньшей мере на приблизительно 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичную аминокислотной последовательности для нативного белка при определении с помощью программ для выравнивания последовательностей, описанных в других местах в данном документе, с использованием параметров по умолчанию. Биологически активный вариант белка согласно вариантам осуществления может отличаться от данного белка лишь 1-15 аминокислотными остатками, лишь 1-10, как например, 6-10, лишь 5, лишь 4, 3, 2 или даже 1 аминокислотным остатком.
В некотором варианте осуществления инсектицидный полипептид характеризуется последовательностью, которая по меньшей мере на 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентична аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43 или SEQ ID NO: 45.
Food Technology
Nature Biotechnology
J. Agric Food Chem
В некоторых вариантах осуществления полипептид характеризуется модифицированным физическим свойством. Применяемый в данном документе термин ʺфизическое свойствоʺ относится к какому-либо параметру, который подходит для описания физико-химических характеристик белка. Применяемые в данном документе термины ʺфизическое свойство, представляющее интересʺ и ʺсвойство, представляющее интересʺ применяются взаимозаменяемо для обозначения физических свойств белков, которые исследуются и/или модифицируются. Примеры физических свойств включают без ограничения суммарный поверхностный заряд и распределение зарядов на поверхности белка, суммарную гидрофобность и распределение гидрофобных остатков на поверхности белка, плотность поверхностного заряда, плотность гидрофобности поверхности, общее число поверхностных ионизируемых групп, поверхностное натяжение, размер белка и его распределение в растворе, температуру плавления, теплоемкость и второй вириальный коэффициент. Примеры физических свойств также включают без ограничения растворимость, фолдинг, стабильность и усвояемость. В некоторых вариантах осуществления полипептид характеризуется повышенной перевариваемостью фрагментов, полученных в результате протеолитического расщепления, в кишечнике насекомого. В некоторых вариантах осуществления полипептид обладает повышенной стабильностью в кишечнике насекомого. Модели для переваривания при помощи искусственного желудочного сока известны специалисту в данной области техники (Fuchs, R.L. и J.D. Astwood.  50: 83-88, 1996; Astwood, J.D., et al  14: 1269-1273, 1996; Fu TJ et al . 50: 7154-7160, 2002).
Кроме того, вариантами осуществления охватывается микроорганизм, который трансформирован по меньшей мере одной нуклеиновой кислотой согласно вариантам осуществления, кассетой экспрессии, содержащей нуклеиновую кислоту, или вектором, содержащим кассету экспрессии. В некоторых вариантах осуществления микроорганизм представляет собой микроорганизм, размножающийся на растениях. Вариант осуществления настоящего раскрытия относится к инкапсулированному пестицидному белку, который содержится в трансформированном микроорганизме, способном к экспрессии по меньшей мере одного пестицидного белка согласно вариантам осуществления.
Варианты осуществления предусматривают пестицидные композиции, содержащие трансформированный микроорганизм согласно вариантам осуществления. В таких вариантах осуществления трансформированный микроорганизм обычно присутствует в пестицидной композиции в пестицидно эффективном количестве вместе с подходящим носителем. Вариантами осуществления также охватываются пестицидные композиции, содержащие выделенный белок согласно вариантам осуществления, отдельно или в комбинации с трансформированным организмом согласно вариантам осуществления, и/или инкапсулированный пестицидный белок согласно вариантам осуществления в инсектицидно эффективном количестве вместе с подходящим носителем.
Варианты осуществления дополнительно предусматривают способ расширения спектра насекомых-мишеней путем применения пестицидного белка согласно вариантам осуществления в комбинации по меньшей мере с одним другим или ʺвторымʺ пестицидным белком. В способах согласно вариантам осуществления можно использовать любой пестицидный белок, известный из уровня техники. Такие пестицидные белки включают без ограничения Bt токсины, ингибиторы протеаз, α-амилазы и пероксидазы.
Вариантами осуществления также охватываются трансформированные или трансгенные растения, содержащие по меньшей мере одну нуклеотидную последовательность согласно вариантам осуществления. В некоторых вариантах осуществления растение является стабильно трансформированным нуклеотидной конструкцией, содержащей по меньшей мере одну нуклеотидную последовательность согласно вариантам осуществления, функционально связанную с промотором, который управляет экспрессией в растительной клетке. Используемые в данном документе термины "трансформированное растение" и "трансгенное растение" относятся к растению. которое содержит в своем геноме гетерологичный полинуклеотид. В целом, гетерологичный полинуклеотид стабильно интегрирован в геном трансгенного или трансформированного растения таким образом, что полинуклеотид передается последующим поколениям. Гетеролигичный полинуклеотид может быть интегрирован в геном сам или как часть рекомбинантной кассеты экспрессии.
Следует понимать, что используемый в данном документе термин "трансгенный" включает любую клетку, клеточную линию, каллюс, ткань, часть растения или растение, генотип которого был изменен в результате присутствия гетерологичной нуклеиновой кислоты, в том числе такие трансгенные объекты, которые исходно изменены таким образом, а также такие трансгенные объекты, которые созданы путем половых скрещиваний или бесполого размножения из исходного трансгенного объекта. Используемый в данном документе термин ʺтрансгенныйʺ не охватывает изменение генома (хромосомного или внехромосомного) с помощью традиционных способов селекции растений или встречающихся в природе трансгенных объектов, например, случайное перекрестное опыление, инфекция, вызванная нерекомбинантным вирусом, трансформация нерекомбинантными бактериями, нерекомбинационная транспозиция или спонтанная мутация.
Используемый в данном документе термин "растение" включает целые растения, органы растений (например, листья, стебли, корни и т.д.), семена, растительные клетки и потомство таковых. Части трансгенных растений находятся в пределах объема вариантов осуществления и предусматривают, например, растительные клетки, растительные протопласты, тканевые культуры растительных клеток, из которых можно регенерировать растения, растительные каллюсы, скопления растительных клеток и растительные клетки, которые являются интактными в растениях или частях растений, таких как зародыши, пыльца, семяпочки, семена, листья, цветки, ветви, плоды, зерна, колоски, стержни початков, шелуха, стебли, корни, верхушки корней, пыльники и т.п., происходящих из трансгенных растений или их потомства, ранее трансформированных молекулой ДНК согласно вариантам осуществления и, таким образом, по меньшей мере частично состоящих из трансгенных клеток. Класс растений, которые можно применять в способах согласно вариантам осуществления обычно настолько же широк, как и класс высших растений, поддающихся методикам трансформации, включающий как однодольные, так и двудольные растения.
Хотя варианты осуществления не зависят от конкретного биологического механизма повышения устойчивости растения к вредителю растений, экспрессия нуклеотидных последовательностей согласно вариантам осуществления в растении может приводить в результате к выработке пестицидных белков согласно вариантам осуществления и к повышению устойчивости растения к вредителю растений. Растения согласно вариантам осуществления находят применение в сельском хозяйстве в способах оказания воздействия на насекомых-вредителей. Определенные варианты осуществления предусматривают трансформированные культурные растения, такие как, например, растения маиса, которые находят применение в способах оказания воздействия на насекомых-вредителей растения, таких как, например, чешуекрылые вредители.
ʺИсследуемое растение или растительная клеткаʺ представляют собой растение или растительную клетку, в которых генетическое изменение, такое как трансформация, затронуло ген, представляющий интерес, или представляют собой растение или растительную клетку, которые происходят от растения или клетки, измененных таким образом, и которые содержат изменение. ʺКонтрольʺ, или ʺконтрольное растениеʺ, или ʺконтрольная растительная клеткаʺ обеспечивают точку отсчета для измерения изменений фенотипа исследуемого растения или растительной клетки.
Контрольное растение или растительная клетка могут представлять собой, например, (a) растение или клетку дикого типа, т.е. с таким же генотипом, что и у исходного материала для генетического изменения, который дал в результате исследуемое растение или клетку; (b) растение или растительную клетку с таким же генотипом, что и у исходного материала, но которые были трансформированы нуль-конструкцией (т.е. конструкцией, которая не оказывает известного влияния на признак, представляющий интерес, такой как конструкция, содержащая маркерный ген); (c) растение или растительную клетку, которые являются нетрансформированным сегрегантом среди потомства исследуемых растения или растительной клетки; (d) растение или растительную клетку, генетически идентичные исследуемым растению или растительной клетке, но которые не были подвергнуты воздействию условий или стимулов, которые будут индуцировать экспрессию гена, представляющего интерес, или (e) исследуемое растение или растительную клетку, как таковые, в условиях, при которых ген, представляющий интерес, не экспрессируется.
Специалист в данной области техники легко поймет, что достижения в области молекулярной биологии, такие как сайт-специфический и неспецифический мутагенез, методики полимеразной цепной реакции и методики белковой инженерии, обеспечивают богатый набор инструментов и протоколов, подходящих для применения с целью изменения или конструирования как аминокислотной последовательности, так и лежащих в основе генных последовательностей белков, представляющих интерес с точки зрения сельского хозяйства.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
et al.
Methods in Enzymol.
Techniques in Molecular Biology
Таким образом, белки согласно вариантам осуществления можно изменять различными способами, включая аминокислотные замены, делеции, усечения и вставки. Способы осуществления таких манипуляций, как правило, известны из уровня техники. Например, варианты аминокислотных последовательностей пестицидных белков можно получить путем введения мутаций в синтетическую нуклеиновую кислоту (например, молекулу ДНК). Способы мутагенеза и внесения изменений в нуклеиновую кислоту хорошо известны из уровня техники. Например, сконструированные изменения можно вводить с использованием методики опосредованного олигонуклеотидами сайт-направленного мутагенеза. См., например, Kunkel (1985)  82:488-492; Kunkel  (1987) 154:367-382; патент США № 4,873,192; Walker и Gaastra, eds. (1983)  (MacMillan Publishing Company, New York) и источники, цитируемые в этом документе.
Подвергнутые мутагенезу нуклеотидные последовательности согласно вариантам осуществления можно модифицировать с тем, чтобы изменить приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12 или более из аминокислот, присутствующих в первичной последовательности кодируемого полипептида. В качестве альтернативы, можно вводить даже еще большее количество изменений по отношению к нативной последовательности таким образом, чтобы у кодируемого белка по меньшей мере приблизительно 1% или 2%, или приблизительно 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, или даже приблизительно 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, или 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, или 25%, 30%, 35%, или 40%, или более кодонов могли быть измененными или иным образом модифицированными по сравнению с соответствующим белком дикого типа. Таким же образом, у кодируемого белка может быть по меньшей мере приблизительно 1% или 2%, или приблизительно 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, или даже приблизительно 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, или 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, или 25%, 30%, 35%, или 40% или больше дополнительных кодонов по сравнению с соответствующим белком дикого типа. Следует понимать, что подвергнутые мутагенезу нуклеотидные последовательности согласно вариантам осуществления, как предполагается, охватывают биологически функциональные эквивалентные пептиды, которые обладают пестицидной активностью, такой как улучшенная пестицидная активность, которую определяют по антифидантным свойствам в отношении личинок кукурузного мотылька. Такие последовательности могут возникнуть как следствие избыточности кодонов и функциональной эквивалентности, которые, как известно, встречаются в естественных условиях в последовательностях нуклеиновой кислоты и кодируемых таким образом белках.
Специалист в данной области техники поймет, что добавления аминокислот и/или аминокислотные замены обычно основываются на относительном сходстве заместителей в боковой цепи аминокислот, например, их гидрофобности, заряда, размера и т.п. Иллюстративные группы аминокислотных замен, в которых принимаются во внимание несколько из вышеизложенных характеристик, хорошо известны специалисту в данной области техники и включают: аргинин и лизин; глутамат и аспартат; серин и треонин; глутамин и аспарагин; и валин, лейцин и изолейцин.
et al
Atlas of Protein Sequence and Structure
Руководство по соответствующим аминокислотным заменам, которые не влияют на биологическую активность белка, представляющего интерес, можно найти в модели Dayhoff . (1978)  (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.), включенной в данный документ посредством ссылки. Могут быть произведены консервативные замены, такие как замещение одной аминокислоты другой с аналогичными свойствами.
Таким образом, гены и нуклеотидные последовательности согласно вариантам осуществления включают как встречающиеся в естественных условиях последовательности, так и мутантные формы. Аналогично, белки согласно вариантам осуществления охватывают как встречающиеся в естественных условиях белки и варианты (например, усеченные полипептиды), так и их модифицированные (например, мутантные) формы. Такие варианты будут продолжать обладать необходимой пестициднойактивностью. Очевидно, что мутации, которые будут произведены в нуклеотидной последовательности, кодирующей вариант, не должны выводить последовательность из рамки считывания и, в целом, не будут создавать комплементарные участки, которые могут образовать вторичную структуру мРНК. См. публикацию заявки на европейский патент №75444.
et al
J. Econ. Entomol.
J. Econ. Entomol.
Ожидается, что делеции, вставки и замены в белковых последовательностях, охватываемые данным документом, не произведут радикальных изменений в характеристиках белка. Тем не менее, если трудно предсказать точный эффект замены, делеции и вставки перед ее осуществлением, специалист в данной области техники поймет, что данный эффект будет оценен посредством обычных скрининговых анализов, таких как анализы с кормлением насекомых. См., например, Marrone . (1985) 78: 290-293 и Czapla и Lang (1990) 83: 2480-2485, включенный в данный документ посредством ссылки.
in vitro
in
vivo
Вариантные нуклеотидные последовательности и белки также охватывают последовательности и белки, полученные в результате мутагенной и рекомбиногенной процедуры, такой как ДНК-шаффлинг. При такой процедуре можно производить манипуляции с одной или несколькими различными кодирующими последовательностями для создания нового пестицидного белка, обладающего необходимыми свойствами. Таким образом, библиотеки рекомбинантных полинуклеотидов создают из популяции родственных по последовательностям полинуклеотидов, содержащих участки последовательностей, которые характеризуются значительной идентичностью последовательности и могут подвергаться гомологичной рекомбинации  или . Например, с применением этого подхода кодирующие последовательности полной длины, мотивы в последовательностях, кодирующих домен, представляющий интерес, или любой фрагмент нуклеотидной последовательности согласно вариантам осуществления можно перетасовать между нуклеотидными последовательностями согласно вариантам осуществления и соответствующими частями других известных нуклеотидных последовательностей Cry с получением нового гена, кодирующего белок с улучшенным свойством, представляющим интерес.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
Nature
et al.
Nature Biotech.
et al.
J. Mol. Biol.
et al.
(1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
et al.
Nature
Свойства, представляющие интерес, включают без ограничения пестицидную активность на единицу пестицидного белка, стабильность белка и токсичность в отношении видов, не являющихся мишенью, в особенности людей, домашнего скота, а также растений и микробов, которые экспрессируют пестицидные полипептиды согласно вариантам осуществления. Варианты осуществления не связываются конкретной стратегией шаффлинга, нужно только, чтобы по меньшей мере одна нуклеотидная последовательность согласно вариантам осуществления или ее часть была задействована в такой стратегии шаффлинга. В шаффлинге могут быль задействованы только нуклеотидные последовательности, раскрытые в данном документе, или он может дополнительно предусматривать шаффлинг других нуклеотидных последовательностей, известных из уровня техники. Стратегии ДНК-шаффлинга известны из уровня техники. См., например, Stemmer (1994)  91:10747-10751; Stemmer (1994)  370:389-391; Crameri  (1997)  15:436-438; Moore  (1997)  272:336-347; Zhang 94:4504-4509; Crameri  (1998)  391:288-291; и патенты США №№ 5,605,793 и 5,837,458.
Нуклеотидные последовательности согласно вариантам осуществления также можно применять для выделения соответствующих последовательностей из других организмов, в частности, из других бактерий и более конкретно из других штаммов Bacillus. Таким образом, такие способы как ПЦР, гибридизация и т.п., можно применять для идентификации таких последовательностей на основе гомологии их последовательности с последовательностями, изложенными в данном документе. Вариантами осуществления охватываются последовательности, выбранные на основе идентичности последовательности с полными последовательностями, изложенными в данном документе, или их фрагментами. Такие последовательности включают последовательности, которые являются ортологами раскрытых последовательностей. Термин "ортологи" относится к генам, происходящим от общего предкового гена и выявляемым у различных видов вследствие видообразования. Гены, обнаруживаемые у различных видов, считаются ортологами, если их нуклеотидные последовательности и/или кодируемые ими белковые последовательности имеют существенную степень идентичности, как определено в других разделах в данном документе. Функции ортологов часто являются высококонсервативными среди видов.
et al
Molecular Cloning: A Laboratory Manual
et al
PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications
PCR Strategies
PCR Methods Manual
a
В случае подхода, основанного на ПЦР, олигонуклеотидные праймеры можно сконструировать для применения в ПЦР-реакциях для амплификации соответствующих последовательностей ДНК исходя из кДНК или геномной ДНК, извлеченных из какого-либо организма, представляющего интерес. Способы конструирования ПЦР-праймеров и ПЦР-клонирования, в целом, известны из уровня техники и раскрыты в Sambrook . (1989)  (2 ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York), именуемом далее в данном документе как "Sambrook". См. Также Innis ., eds. (1990)  (Academic Press, New York); Innis и Gelfand, eds. (1995)  (Academic Press, New York); и Innis и Gelfand, eds. (1999)  (Academic Press, New York). Известные способы ПЦР включают без ограничений способы с использованием парных праймеров, гнездовых праймеров, одиночных специфичных праймеров, вырожденных праймеров, ген-специфических праймеров, вектор-специфических праймеров, частично несовпадающих праймеров и им подобных.
т.е.,
32
При гибридизационных методиках всю известную нуклеотидную последовательность или ее часть применяют в качестве зонда, который избирательно гибридизируется с другими соответствующими нуклеотидными последовательностями, присутствующими в популяции клонированных фрагментов геномной ДНК или фрагментов кДНК ( геномные библиотеки или библиотеки кДНК) из выбранного организма. Гибридизационные зонды могут представлять собой фрагменты геномной ДНК, фрагменты кДНК, фрагменты РНК или другие олигонуклеотиды, и их можно пометить выявляемой группой, такой как P, или любым другим выявляемым маркером. Таким образом, например, зонды для гибридизации можно получить с помощью мечения синтетических олигонуклеотидов на основе последовательностей согласно вариантам осуществления. Способы получения зондов для гибридизации и для построения библиотек кДНК и геномных библиотек, как правило, известны из уровня техники и раскрыты в Sambrook.
Например, полную последовательность, раскрытую в данном документе, или одну или несколько ее частей можно применять в качестве зонда, способного специфично гибридизироваться с соответствующими последовательностями и матричными РНК. Для обеспечения специфической гибридизации в различных условиях такие зонды включают последовательности, которые являются уникальными по отношению к последовательностям согласно вариантам осуществления и обычно имеют длину по меньшей мере приблизительно 10 или 20 нуклеотидов. Такие зонды можно применять для амплификации соответствующих последовательностей Cry из выбранного организма с помощью ПЦР. Эту методику можно применять для выделения дополнительных кодирующих последовательностей из требуемого организма или в качестве диагностического анализа для определения присутствия кодирующих последовательностей в организме. Методики гибридизации включают гибридизационный скрининг высеянных на чашку Петри библиотек ДНК (бляшек или колоний; см., например, Sambrook).
Гибридизацию таких последовательностей можно проводить в жестких условиях. Используемые в данном документе термины "жесткие условия" или "жесткие условия гибридизации" относятся к условиям, при которых зонд будет гибридизоваться со своей целевой последовательностью в явно большей степени, чем с другими последовательностями (например, по меньшей мере в 2 раза, в 5 раз или в 10 раз больше по сравнению с фоном). Жесткие условия являются зависимыми от последовательности и будут отличаться при различных обстоятельствах. Путем контроля жесткости условий гибридизации и/или отмывки можно идентифицировать целевые последовательности, которые на 100% комплементарны зонду (гомологичное зондирование). В качестве альтернативы, условия жесткости можно отрегулировать так, чтобы они допускали некоторое несовпадение в последовательностях с тем, чтобы выявлять более низкие степени сходства (гетерологичное зондирование). Обычно зонд имеет длину менее приблизительно 1000 или 500 нуклеотидов.
например
например
Как правило, жесткие условия будут такими, при которых концентрация соли составляет менее приблизительно 1,5M ионов Na, как правило, концентрация ионов Na (или других солей) составляет приблизительно 0,01-1,0M при pH 7,0-8,3, а температура составляет по меньшей мере приблизительно 30°C для коротких зондов (, 10-50 нуклеотидов) и по меньшей мере приблизительно 60°C для длинных зондов (, более 50 нуклеотидов). Жесткие условия также могут быть достигнуты с помощью добавления дестабилизирующих средств, таких как формамид. Иллюстративные условия низкой жесткости включают гибридизацию с буферным раствором 30-35% формамида, 1 M NaCl, 1% SDS (додецилсульфат натрия) при 37°С и отмывкой 1Х - 2Х SSC (20X SSC=3,0 М NaCl/0,3 М тринатрия цитрат) при 50-55°С. Иллюстративные условия умеренной жесткости включают гибридизацию в 40-45% формамиде, 1,0 М NaCl, 1% SDS при 37°С и отмывку в 0,5X-1X SSC при 55-60°C. Иллюстративные условия высокой жесткости включают гибридизацию в 50% формамиде, 1 M NaCl, 1% SDS при 37°C и окончательную отмывку в 0,1X SSC при 60-65°C в течение по меньшей мере приблизительно 20 минут. Необязательно, отмывочные буферы могут содержать от приблизительно 0,1% до приблизительно 1% SDS. Длительность гибридизации, в целом, составляет менее приблизительно 24 часов, обычно от приблизительно 4 до приблизительно 12 часов.
Следующие термины применяют для описания родства последовательностей между двумя или более нуклеиновыми кислотами или полинуклеотидами: (a) "эталонная последовательность", (b) "окно сравнения", (c) "идентичность последовательностей", (d) "процентная идентичность последовательностей" и (e) "существенная идентичность".
(a) Как применяется в данном документе, "эталонная последовательность" является заданной последовательностью, применяемой в качестве основы для сравнения последовательностей. Эталонная последовательность может представлять собой сокращенную версию или полную форму определенной последовательности; например, в виде сегмента кДНК полной длины или последовательности гена, или полной кДНК или последовательности гена.
(b) Используемое в данном документе "окно сравнения" относится к непрерывному и точно определенному сегменту в последовательности полинуклеотида, причем последовательность полинуклеотида в окне сравнения может содержать добавления или делеции (т.е. гэпы) по сравнению с эталонной последовательностью (которая не содержит добавлений или делеций) для оптимального выравнивания двух последовательностей. Как правило, длина окна сравнения составляет по меньшей мере 20 смежных нуклеотидов и необязательно может составлять 30, 40, 50, 100 или больше. Специалисты в данной области техники понимают, что во избежание высокого сходства с эталонной последовательностью, вследствие включения гэпов в последовательность полинуклеотида, как правило, вводится штраф за гэп, и его вычитают из количества совпадений.
CABIOS
et al
Adv. Appl. Math.
J. Mol. Biol.
Proc. Natl. Acad. Sci.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
Способы выравнивания последовательностей для сравнения хорошо известны из уровня техники. Таким образом, определение процентной идентичности последовательностей между любыми двумя последовательностями можно выполнить с использованием математического алгоритма. Неограничивающими примерами таких математических алгоритмов являются алгоритм по Myers и Miller (1988)  4:11-17; алгоритм локального выравнивания по Smith . (1981)  2:482; алгоритм глобального выравнивания по Needleman и Wunsch (1970)  48:443-453; способ поиска локального выравнивания по Pearson и Lipman (1988)  85:2444-2448; алгоритм из Karlin и Altschul (1990)  872264, который модифицирован в Karlin и Altschul (1993)  90:5873-5877.
Для сравнения последовательностей можно использовать компьютерные реализации данных математических алгоритмов для того, чтобы определить идентичность последовательностей. Такие реализации включают без ограничений CLUSTAL в программе PC/Gene (доступна от Intelligenetics, Маунтин-Вью, Калифорния); программу ALIGN (версия 2.0) и GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA и TFASTA в GCG Wisconsin Genetics Software Package, версия 10 (доступны от Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, Сан-Диего, Калифорния, США). Выравнивания при помощи этих программ могут быть выполнены с использованием параметров по умолчанию. Программа CLUSTAL хорошо описана в Higgins et al. (1988) Gene 73:237-244 (1988); Higgins et al. (1989) CABIOS 5:151-153; Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang et al. (1992) CABIOS 8:155-65; и Pearson et al. (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307-331. Программа ALIGN основана на алгоритме из Myers and Miller (1988), упоминаемом выше. При сравнении аминокислотных последовательностей в программе ALIGN можно применять таблицу весов замен остатков PAM120, штраф за продолжение гэпа 12 и штраф за открытие гэпа 4. Программы BLAST из Altschul et al (1990) J. Mol. Biol. 215:403 основаны на алгоритме Karlin и Altschul (1990), упоминаемом выше. Поиски нуклеотидных последовательностей в BLAST можно выполнять с помощью программы BLASTN при параметрах вес выравнивания=100, длина слова=12 с получением нуклеотидных последовательностей, гомологичных нуклеотидной последовательности, кодирующей белок согласно вариантам осуществления. Поиски белковых последовательностей в BLAST можно выполнять с помощью программы BLASTX при параметрах вес выравнивания=50, длина слова=3 с получением аминокислотных последовательностей, гомологичных белку или полипептиду согласно вариантам осуществления. Для получения выравнивания с введением гэпов с целью сравнения можно использовать Gapped BLAST (в BLAST 2.0), как описано в Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. В качестве альтернативы, можно использовать PSI-BLAST (в BLAST 2.0) для выполнения итерированного поиска, который обнаруживает отдаленные взаимосвязи между молекулами. См., Altschul et al. (1997) выше. При использовании BLAST, Gapped BLAST, PSI-BLAST можно применять параметры по умолчанию соответствующих программ (например, BLASTN для нуклеотидных последовательностей, BLASTX для белков). См. веб-сайт Национальной центра биотехнологической информации в сети Интернет по адресу ncbi.hlm.nih.gov. Выравнивание также можно проводить вручную путем просмотра.
(c) Как используется в данном документе, "идентичность последовательностей" или "идентичность" в контексте двух последовательностей нуклеиновой кислоты или полипептидных последовательностей относится к остаткам в двух последовательностях, которые являются одинаковыми при выравнивании на максимальное соответствие в пределах определенного окна сравнения. Если процентную идентичность последовательностей используют применительно к белкам, подразумевается, что положения остатков, которые не являются идентичными, часто отличаются консервативными аминокислотными заменами, при этом аминокислотные остатки заменены другими аминокислотными остатками с аналогичными химическими свойствами (например, зарядом или гидрофобностью) и, следовательно, не изменяют функциональные свойства молекулы. Если последовательности отличаются консервативными заменами, то процентную идентичность последовательностей можно повысить с тем, чтобы внести поправку на консервативную природу замены. Говорят, что последовательности, которые отличаются такими консервативными заменами, характеризуются "сходством последовательностей" или "сходством". Средства для осуществления такой корректировки хорошо известны специалистам в данной области техники. Как правило, она предусматривает оценку в баллах консервативной замены как частичного, а не полного несовпадения, что, таким образом, увеличивает процентную идентичность последовательностей. Таким образом, например, если идентичной аминокислоте присваивается балл 1, а неконсервативной замене присваивается балл ноль, то консервативной замене присваивается балл от нуля до 1. Оценку консервативных замен в баллах рассчитывают, например, как реализовано в программе PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, California).
(d) Как используется в данном документе, "процентная идентичность последовательностей" означает значение, определяемое с помощью сравнения двух последовательностей с оптимальным выравниванием в пределах окна сравнения, где часть последовательности полинуклеотида в окне сравнения может содержать добавления или делеции (т.е. гэпы) по сравнению с эталонной последовательностью (которая не содержит добавлений или делеций) для оптимального выравнивания двух последовательностей. Процент рассчитывают путем определения количества положений, в которых идентичное основание нуклеиновой кислоты или аминокислотный остаток встречаются в обеих последовательностях, с получением числа совпадающих положений, деления числа совпадающих положений на общее число положений в окне сравнения и умножения результата на 100 с получением процентной идентичности последовательности.
(e)(i) Термин "существенная идентичность" последовательностей полинуклеотидов означает, что полинуклеотид содержит последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 80%, 90% или 95% или более идентична при сравнении с эталонной последовательностью с помощью одной из описанных программ для выравнивания с использованием стандартных параметров. Специалист в данной области техники поймет, что данные значения можно соответствующим образом скорректировать для определения соответствующей идентичности белков, кодируемых двумя нуклеотидными последовательностями с учетом вырожденности кодона, аминокислотного сходства, расположения рамки считывания и т.п. Существенная идентичность аминокислотных последовательностей для данных целей обычно означает, что последовательности идентичны по меньшей мере на 60%, 70%, 80%, 90% или 95% или более.
m
m
Другим показателем того, что нуклеотидные последовательности являются существенно идентичными, является то, что две молекулы гибридизируются друг с другом в жестких условиях. Обычно, жесткие условия выбирают так, чтобы температура была приблизительно на 5°C ниже T для конкретной последовательности при определенной ионной силе и pH. Тем не менее, жесткие условия охватывают температуры в диапазоне от приблизительно 1°C до приблизительно 20°C ниже T в зависимости от необходимой степени жесткости, что в ином случае оговорено в данном документе. Нуклеиновые кислоты, которые не гибридизируются друг с другом в жестких условиях, все еще являются существенно идентичными, если полипептиды, которые они кодируют, являются существенно идентичными. Это может иметь место, например, если копия нуклеиновой кислоты создана с использованием максимальной вырожденности кодона, допускаемой генетическим кодом. Одним показателем того, что две последовательности нуклеиновой кислоты существенно идентичны, является то, что полипептид, кодируемый первой нуклеиновой кислотой, является иммунологически перекрестно-реагирующим с полипептидом, кодируемым второй нуклеиновой кислотой.
(e)(ii) Термин "существенная идентичность" в контексте пептида указывает на то, что пептид содержит последовательность, по меньшей мере на 70%, 80%, 85%, 90%, 95% или более идентичную эталонной последовательности в пределах определенного окна сравнения. Оптимальное выравнивание для этих целей можно провести с использованием алгоритма глобального выравнивания по Needleman and Wunsch (1970), выше. Признаком того, что две пептидные последовательности являются существенно идентичными, является то, что один пептид иммунологически реагирует с антителами ко второму пептиду. Таким образом, пептид является существенно идентичным второму пептиду, например, где два пептида отличаются только по консервативному замещению. Пептиды, которые являются "существенно сходными", имеют общие последовательности, как отмечалось выше, за исключением того, что положения остатков, которые не идентичны, могут отличаться по консервативным аминокислотным изменениям.
Применение термина "нуклеотидные конструкции" в данном документе не предназначено ограничивать варианты осуществления нуклеотидными конструкциями, содержащими ДНК. Специалисты в данной области техники поймут, что нуклеотидные конструкции, в частности полинуклеотиды и олигонуклеотиды, состоящие из рибонуклеотидов и комбинаций рибонуклеотидов и дезоксирибонуклеотидов, также можно применять в способах, раскрытых в данном документе. Нуклеотидные конструкции, нуклеиновые кислоты и нуклеотидные последовательности согласно вариантам осуществления дополнительно охватывают все комплементарные формы таких конструкций, молекул и последовательностей. Кроме того, нуклеотидные конструкции, нуклеотидные молекулы и нуклеотидные последовательности согласно вариантам осуществления охватывают все нуклеотидные конструкции, молекулы и последовательности, которые можно использовать в способах согласно вариантам осуществления для трансформации растений, в том числе, без ограничения, состоящие из дезоксирибонуклеотидов, рибонуклеотидов и их комбинаций. Такие дезоксирибонуклеотиды и рибонуклеотиды имеют в составе как встречающиеся в природе молекулы, так и синтетические аналоги. Нуклеотидные конструкции, нуклеиновые кислоты и нуклеотидные последовательности согласно вариантам осуществления также охватывают все формы нуклеотидных конструкций, в том числе без ограничения однонитевые формы, двунитевые формы, шпильки, структуры "стебель-и-петля" и т.п.
Дополнительный вариант осуществления относится к трансформированному организму, такому как организм, выбранный из группы, состоящей из растительных клеток или клеток насекомых, бактерий, дрожжей, бакуловируса, простейших, нематод и водорослей. Трансформированный организм содержит молекулу ДНК согласно вариантам осуществления, кассету экспрессии, содержащую указанную молекулу ДНК, или вектор, содержащий указанную кассету экспрессии, которые могут быть стабильно встроенными в геном трансформированного организма.
Последовательности согласно вариантам осуществления предусмотрены в составе конструкций ДНК для экспрессии в организме, представляющем интерес. Конструкции будут включать 5' и 3' регуляторные последовательности, функционально связанные с последовательностью согласно вариантам осуществления. Применяемый в данном документе термин "функционально связанные" относится к функциональной связи между промотором и второй последовательностью, где последовательность промотора инициирует и опосредует транскрипцию последовательности ДНК, соответствующей второй последовательности. Как правило, функционально связанный означает, что связанные последовательности нуклеиновых кислот являются смежными и, где необходимо для соединения двух кодирующих белок областей, смежными и в той же рамке считывания. Конструкция может дополнительно содержать по меньшей мере один дополнительный ген, подлежащий введению в организм путем котрансформации. В качестве альтернативы, дополнительный ген (гены) могут предусматриваться в нескольких конструкциях ДНК.
Такая ДНК-конструкция снабжена несколькими сайтами рестрикции для вставки последовательности Cry токсина, транскрипция которой будет регулироваться регуляторными участками. ДНК-конструкция может дополнительно содержать гены селектируемых маркеров.
В направлении транскрипции 5' - 3' ДНК-конструкция будет включать участок инициации транскрипции и трансляции (т.е. промотор), последовательность ДНК согласно вариантам осуществления и участок терминации транскрипции и трансляции (т.е. участок терминации), функционирующие в организме, служащем хозяином. Участок инициации транскрипции (т.е. промотор) может быть нативным, аналогичным, чужеродным или гетерологичным относительно организма-хозяина и/или последовательности согласно вариантам осуществления. Кроме того, промотор может быть природной последовательностью или, в качестве альтернативы, синтетической последовательностью. Применяемый в данном документе термин "чужеродный" указывает на то, что промотор не найден в нативном организме, в который введен промотор. Если промотор является "чужеродным" или "гетерологичным" относительно последовательности согласно вариантам осуществления, предполагается, что промотор не является нативным или встречающимся в природе промотором для функционально связанной последовательности согласно вариантам осуществления. Используемый в данном документе химерный ген содержит кодирующую последовательность, функционально связанную с участком инициации транскрипции, который является гетерологичным для кодирующей последовательности. Если промотор является нативной или природной последовательностью, экспрессия функционально связанной последовательности изменена по сравнению с экспрессией дикого типа, что приводит к изменению фенотипа.
Участок терминации может быть нативным относительно участка инициации транскрипции, может быть нативным относительно функционально связанной последовательности ДНК, представляющей интерес, может быть нативным относительно растения-хозяина или может быть получен из другого источника (т.e. чужеродный или гетерологичный для промотора, последовательности, представляющей интерес, растения-хозяина или какой-либо их комбинации).
A. tumefaciens
et al.
Mol. Gen. Genet.
Cell
et al.
Genes Dev.
et al.
Plant Cell
et al.
Gene
et al.
Nucleic Acids Res.
et al.
Nucleic Acid Res.
Подходящие участки терминации доступны из Ti-плазмиды , такие как участки терминации генов октопинсинтазы и нопалинсинтазы. См. Также Guerineau  (1991)  262:141-144; Proudfoot (1991)  64:671-674; Sanfacon  (1991)  5:141-149; Mogen  (1990) 2:1261-1272; Munroe  (1990)  91:151-158; Ballas  (1989)  17:7891-7903; и Joshi  (1987)  15:9627-9639.
Plant Physiol.
et al
Nucleic Acids Res
et al.
Nucleic Acids Res.
При необходимости нуклеиновую кислоту можно оптимизировать для повышения экспрессии в организме-хозяине. Таким образом, если организм-хозяин является растением, для улучшенной экспрессии можно синтезировать синтетические нуклеиновые кислоты с использованием кодонов, предпочтительных для растений. См., например, Campbell и Gowri (1990)  92:1-11 в отношении обзора использования кодонов, предпочтительных для хозяина. Например, хотя последовательности нуклеиновых кислот согласно вариантам осуществления могут экспрессироваться у видов как однодольных, так и двудольных растений, последовательности можно модифицировать с учетом специфических предпочтений в отношении кодонов и предпочтений по содержанию GC у однодольных или двудольных, если было показано, что предпочтения отличаются (Murray . (1989) . 17:477-498). Таким образом, кодон, предпочтительный для маиса, для конкретной аминокислоты можно установить из известных генных последовательностей маиса. Данные о частоте использования кодонов у маиса для 28 генов из растений маиса приведены в таблице 4 в Murray et al., выше. Из уровня техники доступны способы синтеза генов, предпочтительных для растений. См., например, патенты США №№ 5,380,831, и 5,436,391, и Murray  (1989)  17:477-498, включенные в данный документ посредством ссылки.
Известны дополнительные модификации последовательности для усиления экспрессии гена у клеточного хозяина. Они включают устранение последовательностей, кодирующих ложные сигналы полиаденилирования, сигналы сайта сплайсинга экзонов и интронов, транспозон-подобные повторы и другие хорошо изученные последовательности, которые могут быть вредны для экспрессии гена. Содержание GC в последовательности можно скорректировать до уровней, средних для данного клеточного хозяина, рассчитываемых с учетом известных генов, экспрессируемых в клетке-хозяине. Применяемый в данном документе термин "клетка-хозяин" относится к клетке, которая содержит вектор и которая поддерживает репликацию и/или экспрессию предполагаемых векторов экспрессии. Клетки-хозяева могут быть прокариотическими клетками, такими как E. coli, или эукариотическими клетками, такими как клетки дрожжей, насекомых, амфибий или млекопитающих, или клетками однодольных или двудольных растений. Примером клетки-хозяина, относящейся к однодольному растению, является клетка-хозяин маиса. Если возможно, последовательность модифицируют для того, чтобы избежать образования прогнозируемых шпилечных вторичных структур мРНК.
et al
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
et al
Gene
et al
Nature
et al
Nature
et al.
Molecular Biology of RNA
-
et al
Virology
et al.
Plant Physiol.
Кассеты экспрессии могут дополнительно содержать 5'-лидерные последовательности. Такие лидерные последовательности могут способствовать усилению трансляции. Лидерные последовательности трансляции известны из уровня техники и включают лидерные последовательности пикорнавирусов, например, лидерную последовательность (5'-некодирующий участок вируса энцефаломиокардита) (Elroy-Stein . (1989)  86: 6126-6130);лидерные последовательности потивирусов, например, лидерную последовательность TEV (вирус гравировки табака) (Gallie . (1995)  165(2): 233-238), лидерную последовательность MDMV (вирус карликовой мозаики кукурузы), белок, связывающий тяжелую цепь иммуноглобулина человека (BiP) (Macejak . (1991)  353: 90-94); нетранслируемую лидерную последовательность из мРНК белка оболочки вируса мозаики люцерны (AMV RNA 4) (Jobling . (1987) 325: 622-625); лидерную последовательность вируса табачной мозаики (TMV) (Gallie  (1989) в , ed. Cech (Liss, New York), pp. 237256); и лидерную последовательность вируса хлорозной мозаичности маиса (MCMV) (Lommel . (1991)  81: 382-385). См. Также, Della-Cioppa  (1987) 84: 965-968.
in vitro
например
При получении кассеты экспрессии с различными фрагментами ДНК можно проводить манипуляции так, чтобы получить последовательности ДНК в надлежащей ориентации и, при необходимости, в надлежащей рамке считывания. С этой целью для соединения фрагментов ДНК можно использовать адаптеры или линкеры, или можно задействовать другие манипуляции для обеспечения подходящих сайтов рестрикции, удаления избыточной ДНК, удаления сайтов рестрикции и т.п. С этой целью можно задействовать мутагенез , репарацию с помощью праймеров, рестрикцию, гибридизацию, повторные замены, , транзиции и трансверсии.
et al.
Nature
et al.
Plant Cell
et al.
Plant Mol. Biol.
et al.
Plant Mol. Biol.
et al.
Theor. Appl. Genet.
et al.
EMBO J.
При практическом осуществлении вариантов осуществления можно применять ряд промоторов. Промоторы можно выбирать исходя из необходимого результата. Нуклеиновые кислоты можно объединять с конститутивными, тканепредпочтительными, индуцируемыми или другими промоторами для экспрессии в организме-хозяине. Подходящие конститутивные промоторы для использования в растительной клетке-хозяине включают, например, коровый промотор промотора Rsyn7 и другие конститутивные промоторы, раскрытые в документе WO 99/43838 и патенте США № 6072050; коровый промотор 35S CaMVр (Odell  (1985) 313: 810-812); актиновый промотор риса (McElroy  (1990) 2: 163-171); убиквинтиновый промотор (Christensen  (1989) 12: 619-632 и Christensen  (1992) 18: 675-689); pEMU (Last  (1991) 81: 581-588); MAS (Velten  (1984) 3:2723-2730); промотор ALS (патент США № 5,659,026) и т. п. Другие конститутивные промоторы включают, например, раскрытые в патентах США №№ 5,608,149; 5,608,144; 5,604,121; 5,569,597; 5,466,785; 5,399,680; 5,268,463; 5,608,142; и 6,177,611.
Ann. Rev. Phytopath.
et al.
Nature Biotechnology
et al
Mol. Gen. Genet.
et al.
Science
et al
Plant Mol. Biol.
et al
FEBS Letters
et al
Plant J.
В зависимости от требуемого результата, может быть полезно экспрессировать ген при помощи индуцируемого промотора. Особый интерес для регуляции экспрессии нуклеотидных последовательностей согласно вариантам осуществления у растений представляют собой индуцируемые ранением промоторы. Такие индуцируемые ранением промоторы могут реагировать на повреждение, вызванное питанием насекомого, и они включают промотор гена ингибитора протеиназы картофеля (pin II) (Ryan (1990) 28: 425-449; Duan  (1996) 14: 494-498); промоторы генов wun1 и wun2, патент США № 5428148; промоторы генов win1 и win2 (Stanford . (1989) 215: 200-208); промотор гена системина(McGurl  (1992)225: 1570-1573); промотор гена WIP1 (Rohmeier . (1993) 22: 783-792; Eckelkamp . (1993) 323: 73-76); промотор гена MPI (Corderok . (1994) 6(2): 141-150); и т. п., включенные в данный документ посредством ссылки.
et al.
Neth. J. Plant Pathol.
et al.
Plant Cell
Plant Mol. Virol.
Кроме того, в способах и нуклеотидных конструкциях согласно вариантам осуществления можно использовать индуцируемые патогеном промоторы. Такие индуцируемые патогеном промоторы включают промоторы из генов, связанных с патогенезом белков (PR белков), которые индуцируются после инфицирования патогеном;например, PR-белков, SAR-белков, бета-1,3-глюканазы, хитиназы и т. д.См., например, Redolfi  (1983)  89: 245-254; Uknes  (1992)  4: 645-656; и Van Loon (1985)  4: 111-116. См. Также WO 99/43819, включенные в данный документ посредством ссылки.
et al.
Plant Mol. Biol.
et al.
Molecular Plant-Microbe Interactions
et al.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
et al.
Mol. Gen. Genet.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
et al.
Plant J.
et al
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
et al.
Plant J.
et al.
Plant Cell
Fusarium moniliforme
et al.
Physiol. Mol. Plant Path.
Представляют интерес промоторы, которые экспрессируются локально в месте заражения патогеном или рядом с ним. См., например, Marineau  (1987)  9:335-342; Matton  (1989)  2:325-331; Somsisch  (1986)  83:2427-2430; Somsisch  (1988)  2:93-98; и Yang (1996) 93:14972-14977. См. Также, Chen  (1996)  10:955-966; Zhang . (1994)  91:2507-2511; Warner  (1993)  3:191-201; Siebertz  (1989)  1:961-968; патент США № 5,750,386 (индуцируемый нематодой) и источники, цитируемые в этих документах. Особый интерес представляет индуцируемый промотор для гена маиса PRms, экспрессия которого индуцируется патогеном  (см., например, Cordero  (1992) 41:189-200).
et al
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
et al
Plant J
et al
Mol. Gen. Genet
Регулируемые химическими веществами промоторы можно применять для модуляции экспрессии гена в растении посредством внесения экзогенного химического регулятора. В зависимости от цели, промотор может быть индуцируемым химическим веществом промотором, в этом случае применение химического вещества индуцирует экспрессию гена, или репрессируемым химическим веществом промотором, в этом случае применение химического вещества подавляет экспрессию гена. Индуцируемые химическими веществами промоторы известны из уровня техники, и они включают без ограничения промотор In2-2 маиса, который активируется антидотами к бензолсульфонамидным гербицидам, промотор GST маиса, который активируется гидрофобными электрофильными соединениями, которые применяются в качестве предвсходовых гербицидов, и промотор PR-1a табака, который активируется салициловой кислотой. Другие регулируемые химическими веществами промоторы, представляющие интерес, включают чувствительные к стероидам промоторы (см., например, индуцируемый глюкокортикоидами промотор в Schena . (1991)  88:10421-10425 и McNellis . (1998). 14(2):247-257) и индуцируемые тетрациклином и репрессируемые тетрациклином промоторы (см., например, Gatz . (1991) . 227:229-237, и патенты США №№ 5,814,618 и 5,789,156), включенные в данный документ посредством ссылки.
et al
Plant J.
et al.
Plant Cell Physiol.
et al.
Mol. Gen Genet.
et al.
Transgenic Res.
et al
Plant Physiol.
et al.
Plant Physiol.
et al
Plant Physiol.
et al
Plant Cell Physiol.
Results Probl. Cell Differ.
et al
Plant Mol Biol.
et al
Proc Natl. Acad. Sci. USA
et al
Plant J.
Тканепредпочтительные промоторы можно использовать для целенаправленного усиления экспрессии пестицидного белка в пределах конкретной ткани растения. Тканепредпочтительные промоторы включают промоторы, обсуждаемые в Yamamoto .(1997) 12(2)255-265; Kawamata (1997) 38(7):792-803; Hansen  (1997) 254(3):337-343; Russell  (1997) 6(2):157-168; Rinehart . (1996) 112(3):1331-1341; Van Camp (1996) 112(2):525-535; Canevascini . (1996) 112(2):513-524; Yamamoto . (1994) 35(5):773-778; Lam (1994)  20:181-196; Orozco . (1993) 23(6):1129-1138; Matsuoka . (1993) 90(20):9586-9590; и Guevara-Garcia . (1993) 4(3):495-505. В случае необходимости, такие промоторы можно модифицировать с получением слабой экспрессии.
et al.
Plant J.
et al
Plant Physiol
et al.
Plant Cell Physiol.
et al
Plant J.
et al.
Plant Mol. Biol.
et al.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
Промоторы, активные преимущественно в листьях, известны из уровня техники. См., например, Yamamoto  (1997)  12(2):255-265; Kwon . (1994) . 105:357-67; Yamamoto  (1994)  35(5):773-778; Gotor . (1993)  3:509-18; Orozco  (1993)  23(6):1129-1138; и Matsuoka  (1993) 90(20):9586-9590.
et al.
Plant Mol. Biol.
Plant Cell
et al
Plant Mol. Biol.
Agrobacterium tumefaciens
et al
Plant Cell
et al
Plant Cell
Parasponia andersonii
Trema tomentosa
Agrobacterium rhizogenes
Plant Science
Agrobacterium
EMBO J.
et al.
Plant Mol. Biol.
et al.
Plant Mol. Biol.
Известны промоторы, активные преимущественно в корнях, или промоторы, специфичные по отношению к корню, и их можно выбирать из многих доступных из литературы или выделенных de novo из различных совместимых видов. См., например, Hire  (1992)  20(2):207-218 (специфичные по отношению к корню сои ген глутаминсинтетазы);Keller и Baumgartner (1991)  3(10):1051-1061 (специфичный по отношению к корню регуляторный элемент в гене GRP 1.8 фасоли);Sanger . (1990)  14(3):433-443 (специфичный по отношению к корню промотор гена маннопин-синтазы (MAS) из );и Miao . (1991)  3(1):11-22 (кДНК-клон полной длины, кодирующий цитозольную глутаминсинтетазу (GS), которая экспрессируется в корнях и корневых клубеньках сои). См. Также Bogusz . (1990) 2(7):633-641, где описаны два специфичных по отношению к корню промотора, выделенные из генов гемоглобина азотфиксирующего, не относящегося к бобовым растения , и родственного, не относящегося к азотфиксирующим и не относящегося к бобовым растения . Промоторы этих генов были связаны с репортерным геном β-глюкуронидазы и введены как в Nicotiana tabacum, не относящийся к бобовым, так и в бобовое Lotus corniculatus, и при этом в обоих случаях активность промотора, специфичная по отношению к корню, сохранялась. Leach и Aoyagi (1991) описывают свой анализ промоторов, обеспечивающих высокий уровень экспрессии генов rolC и rolD , индуцирующих разрастание корней (см.  (Limerick) 79(1):69-76). Они пришли к выводу, что в этих промоторах энхансер и тканепредпочтительные ДНК-детерминанты разделены. Teeri et al. (1989) использовали слияние гена с lacZ для того, чтобы показать, что ген из T-ДНК , кодирующий октопинсинтазу, является особенно активным в эпидермисе кончика корня, и что ген TR2' является специфичным по отношению к корню в интактном растении и стимулируется при ранении ткани листа, что является особенно желательной комбинацией характеристик для использования с инсектицидным или ларвицидным геном (см.  8(2):343-350). Ген TR1', слитый с nptII (неомицинфосфотрансфераза II), продемонстрировал аналогичные характеристики. Дополнительные промоторы, активные преимущественно в корнях, включают промотор гена VfENOD-GRP3 (Kuster  (1995)  29(4):759-772); и промотор rolB (Capana  (1994)  25(4):681-691. См. Также патенты США №№ 5,837,876; 5,750,386; 5,633,363; 5,459,252; 5,401,836; 5,110,732; и 5,023,179.
et al
BioEssays
Промоторы, ʺактивные преимущественно в семениʺ, включают как промоторы, ʺспецифичные по отношению к семениʺ (промоторы, которые активны во время развития семени, такие как промоторы запасных белков семени), так и промоторы ʺпрорастания семениʺ (промоторы, которые активны во время прорастания семени). См. Thompson . (1989)  10:108, включенный в данный документ посредством ссылки. Такие промоторы, активные преимущественно в семени, включают без ограничения промоторы генов Cim1 (индуцируемый цитокинином транскрипт); cZ19B1 (19 кДа зеин маиса) и milps (мио-инозитол-1-фосфатсинтаза); (см. патент США № 6225529, включенный в данный документ посредством ссылки). Промоторы генов гамма-зеина и Glob-1 представляют собой промоторы, специфичные по отношению к эндосперму. У двудольных растений промоторы, специфичные по отношению к семени, включают без ограничения промоторы генов β-фазеолина фасоли, напина, β-конглицинина, лектина сои, круциферина и т.п. У однодольных растений промоторы, специфичные по отношению к семени, включают без ограничения промоторы генов 15 кДа зеина, 22 кДа зеина, 27 кДа зеина, g-зеина, waxy, shrunken 1, shrunken 2, глобулина 1 маиса и т.д. См. также включенный в данный документ посредством ссылки документ WO 00/12733, где раскрыты промоторы, активные преимущественно в семени, из генов end1 и end2. Промотор, который имеет ʺпреимущественнуюʺ экспрессию в конкретной ткани, экспрессируется в такой ткани в большей степени, чем по меньшей мере в одной другой растительной ткани. Для некоторых промоторов, активных преимущественно в определенной ткани, показана экспрессия почти исключительно в конкретной ткани.
Если требуется низкий уровень экспрессии, будут применяться слабые промоторы. Как правило, применяемый в данном документе термин "слабый промотор" относится к промотору, который управляет экспрессией кодирующей последовательности на низком уровне. Под низким уровнем экспрессии подразумевают уровни от приблизительно 1/1000 транскриптов до приблизительно 1/100000 транскриптов, до приблизительно 1/500000 транскриптов. В качестве альтернативы, понятно, что термин ʺслабые промоторыʺ также охватывает промоторы, которые управляют экспрессией только в небольшом количестве клеток и не управляют в других, при этом обеспечивается общий низкий уровень экспрессии. Если промотор управляет экспрессией с неприемлемо высокими уровнями, части промоторной последовательности можно удалить или модифицировать для снижения уровней экспрессии.
Такие слабые конститутивные промоторы включают, например, коровый промотор промотора Rsyn7 (WO 99/43838 и патент США № 6,072,050), коровый промотор 35S CaMV и им подобные. Другие конститутивные промоторы включают, например, раскрытые в патентах США №№ 5,608,149; 5,608,144; 5,604,121; 5,569,597; 5,466,785; 5,399,680; 5,268,463; 5,608,142; и 6,177,611; включенных в данный документ посредством ссылки.
et al
EMBO J.
2
et al
Nature
303
et al
Plant Mol. Biol.
16
et al
Mol. Gen. Genet.
210
et al
Transgenic Res.
5
et al
Plant Mol. Biol.
7
et al
Plant Mol. Biol.
15
et al
Science
242
et al
Science
233
et al
EMBO J.
6
Curr. Opin. Biotech.
et al.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
et al.
Cell
Mol. Microbiol.
et al.
The Operon
et al.
Cell
et al.
Cell
et al.
Cell
et al.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
et al.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
et al.
Science
et al.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
et al.
Mol. Cell. Biol.
et al.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
et al.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
et al.
Nucleic Acids Res.
Topics Mol. Struc. Biol.
et al.
Antimicrob. Agents Chemother.
et al.
Biochemistry
et al.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
et al.
Antimicrob. Agents Chemother.
et al.
Handbook of Experimental Pharmacology
et al.
Nature
Как правило, кассета экспрессии будет содержать ген селектируемого маркера для отбора трансформированных клеток. Гены селектируемых маркеров используют для отбора трансформированных клеток или тканей. Гены маркеров включают в себя гены, отвечающие за устойчивость к антибиотикам, такие как гены, кодирующие неомицин-фосфотрансферазу II (NEO) и гигромицин-фосфотрансферазу (HPT), а также гены, обеспечивающие устойчивость к гербицидным соединениям, таким как глуфосинат аммония, бромоксинил, имидазолиноны и 2,4-дихлорфеноксиацетат (2,4-D). Дополнительные примеры генов подходящих селектируемых маркеров включают без ограничения гены, кодирующие устойчивость к хлорамфениколу (Herrera Estrella . (1983) :987-992); метотрексату (Herrera Estrella . (1983) :209-213; и Meijer . (1991) :807-820); стрептомицину (Jones . (1987) :86-91); спектиномицину (Bretagne-Sagnard . (1996) :131-137); блеомицину (Hille . (1990) :171-176); сульфонамиду (Guerineau . (1990) :127-136); бромоксинилу (Stalker . (1988) :419-423); глифосату (Shaw . (1986) :478-481; и патенты США №№ 7,709,702; и 7,462,481); фосфинотрицину (DeBlock . (1987) :2513-2518). см. в общем, Yarranton (1992)  3: 506-511; Christopherson  (1992)  89: 6314-6318; Yao  (1992)  71: 63-72; Reznikoff (1992)  6: 2419-2422; Barkley  (1980) in , pp. 177-220; Hu  (1987)  48: 555-566; Brown  (1987)  49: 603-612; Figge  (1988)  52: 713-722; Deuschle  (1989)  86: 5400-5404; Fuerst  (1989)  86: 2549-2553; Deuschle  (1990)  248: 480-483; Gossen (1993) докторская диссертация, University of Heidelberg; Reines  (1993)  90: 1917-1921; Labow  (1990)  10: 3343-3356; Zambretti  (1992)  89: 3952-3956; Baim  (1991)  88: 5072-5076; Wyborski  (1991)  19: 4647-4653; Hillenand-Wissman (1989)  10: 143-162; Degenkolb  (1991)  35: 1591-1595; Kleinschnidt  (1988)  27: 1094-1104; Bonin (1993) докторская диссертация, University of Heidelberg; Gossen  (1992)  89: 5547-5551; Oliva  (1992)  36: 913-919; Hlavka  (1985) , Vol. 78 (Springer-Verlag, Berlin); и Gill  (1988) 334: 721-724. Такие раскрытия включены в данный документ посредством ссылки.
Приведенный выше перечень генов селектируемых маркеров не предназначен для ограничения. Любой ген селектируемого маркера можно применять в вариантах осуществления.
Способы согласно вариантам осуществления включают введение полипептида или полинуклеотида в растение. Как подразумевается, "введение" означает представление растению полинуклеотида или полипептида таким образом, что последовательность попадает внутрь клетки растения. Способы согласно вариантам осуществления не зависят от конкретного способа введения полинуклеотида или полипептида в растение, нужно только, чтобы полинуклеотид или полипептиды проникали внутрь по меньшей мере одной клетки растения. Из уровня техники известны способы введения полинуклеотида или полипептидов в растения, в том числе без ограничений способы стабильной трансформации, способы временной трансформации и способы трансформации, опосредованной вирусами.
Подразумевается, что "стабильная трансформация" означает, что нуклеотидный конструкция, вводимая в растение, интегрируется в геном растения и может быть унаследована его потомками. Подразумевается, что "временная трансформация" означает, что полинуклеотид вводится в растение и не интегрируется в геном растения, или в растение вводится полипептид.
et al
Biotechniques
et al
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
Agrobacterium
et al
EMBO J.
et al
Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods
et al
Biotechnology
et al.
Plant Molecular Biology
et al.
Transgenic Research
et al
Ann. Rev. Genet.
et al
Particulate Science and Technology
et al
Plant Physiol.
et al
Bio/Technology
In Vitro Cell Dev. Biol.
et al
Theor. Appl. Genet.
et al
Biotechnology
et al
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
et al
Biotechnology
et al
Plant Physiol.
et al
Biotechnology
et al
Nature (London)
et al
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
et al
The Experimental Manipulation of Ovule Tissues,
et al
et al
Plant Cell Reports
et al
Theor. Appl. Genet.
et al
Plant Cell
et al
Plant Cell Reports
Annals of Botany
et al
Nature Biotechnology
Agrobacterium tumefaciens
Протоколы трансформации, а также протоколы для введения нуклеотидных последовательностей в растения могут изменяться в зависимости от типа растения или растительной клетки, т.е. однодольных или двудольных, на которые нацелена трансформация. Подходящие способы введения нуклеотидных последовательностей в клетки растений и последующей вставки в геном растения включают микроинъекцию (Crossway . (1986) 4: 320-334), электропорацию (Riggs . (1986) 83: 5602-5606), трансформацию, опосредованную  (патенты США №№ 5,563,055 и 5,981,840), прямой перенос гена (Paszkowski . (1984) 3: 2717-2722) и баллистическое ускорение частиц (см., например, патенты США №№ 4,945,050; 5,879,918; 5,886,244; и 5,932,782; Tomes . (1995) в , ed. Gamborg и Phillips (Springer-Verlag, Berlin); и McCabe . (1988) 6: 923-926); и трансформацию гена Lecl (WO 00/28058). Что касается трансформации картофеля, см.Tu (1998)  37: 829-838 и Chong  (2000) 9: 71-78. Дополнительные методики трансформации можно найти в Weissinger . (1988) 22: 421-477; Sanford . (1987)5: 27-37 (лук); Christou . (1988)  87: 671-674 (соя); McCabe . (1988)  6: 923-926 (соя); Finer и McMullen (1991)  27P: 175-182 (соя); Singh . (1998)  96: 319-324 (соя); Datta . (1990) 8: 736-740 (рис); Klein . (1988)  85: 4305-4309 (маис); Klein . (1988)  6:559-563 (маис); патентах США №№ 5,240,855; 5,322,783 и 5,324,646; Klein . (1988)  91: 440-444 (маис); Fromm . (1990) 8: 833-839 (маис); Hooykaas-Van Slogteren . (1984) 311: 763-764; патенте США № 5,736,369 (зерновые злаки); Bytebier . (1987) 84: 5345-5349 (Liliaceae); De Wet . (1985) in  ed. Chapman . (Longman, New York), pp. 197-209 (пыльца); Kaeppler . (1990)  9: 415-418 и Kaeppler . (1992) 84: 560-566 (опосредованная нитевидными кристаллами трансформация); D'Halluin . (1992)  4: 1495-1505 (электропорация); Li . (1993)  12: 250-255 и Christou и Ford (1995)  75: 407-413 (рис); Osjoda . (1996)  14: 745-750 (маис при участии ); все из которых включены в данный документ посредством ссылки.
et al.
Mol Gen. Genet.
et al.
Plant Sci.
et al.
Proc. Natl. Acad. Sci.
et al.
The Journal of Cell Science
В конкретных вариантах осуществления последовательности согласно вариантам осуществления можно предоставлять растению с применением ряда способов временной трансформации. Такие способы временной трансформации включают без ограничения введение белка Cry токсина или его вариантов и фрагментов непосредственно в растение или введение транскрипта Cry токсина в растение. Такие способы включают, например, микроинъекцию или бомбардировку частицами. См., например, Crossway  (1986) 202: 179-185; Nomura  (1986) 44: 53-58; Hepler  (1994) 91: 2176-2180 и Hush  (1994) 107: 775-784, все из которых включены в данный документ посредством ссылки. В качестве альтернативы, растение можно временно трансформировать полинуклеотидом Cry токсина с использованием методик, известных из уровня техники. Такие методики включают применение вирусной векторной системы и осаждение полинуклеотида таким способом, который исключает последующее высвобождение ДНК. Таким образом, может происходить транскрипция ДНК, связанной с частицами, но частота, с которой она высвобождается для интеграции в геном, в значительной степени снижена. Такие способы включают применение частиц, покрытых полиэтиленимином (PEI; № по кат. Sigma P3143).
Из уровня техники известны способы нацеленной вставки полинуклеотида в специфическое местоположение в геноме растения. В одном варианте осуществления вставку полинуклеотида в требуемое местоположение в геноме выполняют с использованием системы сайт-специфичной рекомбинации. См., например, WO99/25821, WO99/25854, WO99/25840, WO99/25855, и WO99/25853, все из которых включены в данный документ посредством ссылки. Вкратце, полинуклеотид согласно вариантам осуществления может содержаться в кассете для переноса, фланкированной двумя неидентичными сайтами рекомбинации. Кассету для переноса вводят в растение, имеющее в своем геноме стабильно встроенный целевой сайт, фланкированный двумя неидентичными сайтами рекомбинации, которые соответствуют сайтам кассеты для переноса. Обеспечивают подходящую рекомбиназу, и кассета для переноса интегрируется в целевой сайт. Полинуклеотид, представляющий интерес, таким образом, интегрируется в конкретное хромосомное положение в геноме растения.
et al.
Plant Cell Reports
Из клеток, которые были трансформированы, можно вырастить растения в соответствии с традиционными способами. См., например, McCormick  (1986) 5: 81-84. Эти растения затем можно выращивать и опылять либо с использованием такого же трансформированного штамма, либо других штаммов и идентифицировать полученный гибрид с конститутивной или индуцируемой экспрессией требуемой фенотипической характеристики. Можно вырастить два или более поколений для того, чтобы убедиться в том, что экспрессия требуемой фенотипической характеристики стабильно поддерживается и наследуется, а затем собрать семена, чтобы убедиться в том, что экспрессия требуемой фенотипической характеристики была достигнута.
Нуклеотидные последовательности согласно вариантам осуществления можно обеспечить в растении путем приведения растения в контакт с вирусом или вирусными нуклеиновыми кислотами. Как правило, такие способы включают встраивание нуклеотидной конструкции, представляющей интерес, в вирусную молекулу ДНК или РНК. Понятно, что рекомбинантные белки согласно вариантам осуществления могут первоначально синтезироваться как часть вирусного полипротеина, который позже может процессироваться путем протеолиза in vivo или in vitro с образованием необходимого пестицидного белка. Также понятно, что такой вирусный полипротеин, содержащий по меньшей мере часть аминокислотной последовательности пестицидного белка согласно вариантам осуществления, может обладать необходимой пестицидной активностью. Такие вирусные полипротеины и нуклеотидные последовательности, которые их кодируют, охвачены вариантами осуществления. Способы получения растений с нуклеотидными конструкциями и продукции кодируемых белков в растениях, которые включают вирусные молекулы ДНК или РНК, известны из уровня техники. См., например, патенты США №№ 5,889,191;5,889,190; 5,866,785; 5,589,367; и 5,316,931, включенные в данный документ посредством ссылки.
Варианты осуществления дополнительно относятся к материалу для размножения трансформированного растения согласно вариантам осуществления,в том числе без ограничения семенам, клубням, клубнелуковицам, луковицам, листьям и черенкам корней и побегов.
Zea mays
Brassica
например
B. napus, B. rapa, B. juncea
Brassica
Medicago sativa
Oryza sativa
Secale cereale
Sorghum bicolor, Sorghum vulgare
Pennisetum glaucum
Panicum miliaceum
Setaria italica
Eleusine coracana
Helianthus annuus
Carthamus tinctorius
Triticum aestivum
Glycine max
Nicotiana tabacum
Solanum tuberosum
Arachis hypogaea
Gossypium barbadense
Gossypium hirsutum
Ipomoea batatus
Manihot esculenta
Coffea
Cocos nucifera
Ananas comosus
Citrus
Theobroma cacao
Camellia sinensis
Musa
Persea americana
Ficus casica
Psidium guajava
Mangifera indica
Olea europaea
Carica papaya
Anacardium occidentale
Macadamia integrifolia
Prunus amygdalus
Beta vulgaris
Saccharum
Варианты осуществления можно применять для трансформации любых видов растений, в том числе без ограничения однодольных и двудольных. Примеры растений, представляющих интерес, включают без ограничений кукурузу (),  sp. (, ), в частности виды , пригодные в качестве источников масла из семян растений, люцерну (), рис (), рожь (), сорго (), просо (например,пеннисетум рогозовидный (), просо культурное (), щетинник итальянский (), просо пальчатое ()), подсолнечник (), сафлор (), пшеницу (), сою (), табак (), картофель (), арахис (), хлопчатник (,), батат (), маниок (), кофейное дерево( spp.), кокосовую пальму (), ананас (), цитрусовые деревья ( spp.), шоколадное дерево (), чайный куст (), банан ( spp.), авокадо (), инжир (), гуаву (), манго (), маслину (), папайю (), кешью (), макадамию (), миндаль (), сахарную свеклу (), сахарный тростник ( spp.), разновидности овса, ячмень, овощи, декоративные растения и хвойные растения.
Lycopersicon esculentum
например
Lactuca sativa
Phaseolus vulgaris
Phaseolus limensis
Lathyrus
Cucumis
C. sativus
C. cantalupensis
C. melo
Rhododendron
Macrophylla hydrangea
Hibiscus rosasanensis
Rosa
Tulipa
Narcissus
Petunia hybrida
Dianthus caryophyllus
Euphorbia pulcherrima
Pinus taeda
Pinus elliotii
Pinus ponderosa
Pinus contorta
Pinus radiata
Pseudotsuga menziesii
Tsuga canadensis
Picea glauca
Sequoia sempervirens
Abies amabilis
Abies balsamea
Thuja plicata
Chamaecyparis nootkatensis
Brassica spp.
Овощи включают томаты (), латук (, ), зеленую фасоль (), лимскую фасоль (), разновидности гороха ( spp.) и представителей рода , таких как огурец (), канталупа () и дыня мускусная (). Декоративные растения включают азалию ( spp.), гортензию (), гибискус (), розы ( spp.), тюльпаны ( spp.), нарциссы ( spp.), петунии (), гвоздику (), пуансеттию () и хризантему. Хвойные деревья, которые могут быть использованы в реализации настоящего изобретения на практике, включают, например, виды сосны, такие как сосна ладанная (), сосна Эллиота (), сосна желтая (), скрученная широкохвойная сосна() и сосна лучистая (); лжетсугу тиссолистую (); тсугу западную (); ель ситхинскую (); калифорнийское мамонтово дерево (); истинные ели, такие как пихта белая() и пихта бальзамическая (); и кедры, такие как туя() и аляскинский желтый кедр (). Растения согласно вариантам осуществления включают культурные растения, в том числе без ограничения кукурузу, люцерну, подсолнечник, , сою, хлопчатник, сафлор, арахис, сою, пшеницу, просо, табак, сахарный тростник и т. д.
Poa annua
Lolium multiflorum
Poa compressa
Festuca rubra
Agrostis tenuis
Agrostis
palustris
Agropyron desertorum
Agropyron
cristatum
Festuca longifolia
Poa pratensis
Dactylis glomerata
Lolium perenne
Festuca
rubra
Agrostis alba
Poa trivialis
Festuca ovina
Bromus inermis
Festuca arundinacea
Phleum pratense
Agrostis canina
Puccinellia
distans
Agropyron smithii
Cynodon
Stenotaphrum secundatum
Zoysia
Paspalum notatum
Axonopus affinis
Eremochloa
ophiuroides
Pennisetum clandesinum
Paspalum
vaginatum
Bouteloua gracilis
Buchloe dactyloids
Bouteloua curtipendula
Разновидности газонной травы включают без ограничения мятлик однолетний (); райграс однолетний (); мятлик сплюснутый (); овсяницу красную Чуинга (); полевицу тонкую (); полевицу болотную(); житняк пустынный (); житняк гребенчатый(); овсяницу длиннолистную (); мятлик луговой (); ежу сборную (); плевел многолетний (); овсяницу красную(); полевицу белую (); мятлик обыкновенный (); овсяницу овечью (); костер безостый (); овсяницу тростниковую (); тимофеевку луговую (); полевицу собачью (); бескильницу расставленную(); пырей Смита (); свинорой пальчатый (spp.); узкобороздник однобокий (); зойсию ( spp.); гречку заметную (); аксонопус афинский (); эремохлою змеехвостую(); кикуйю (); паспалум влагалищный(); москитную траву (); бизонову траву (); боковой овес ().
и т. д.
Brassica
и т. д.
и т. д.
Растения, представляющие интерес, включают зерновые растения, которые дают семена, представляющие интерес, масличные растения и бобовые растения. Семена, представляющие интерес, включают семена зерновых культур, таких как кукуруза, пшеница, ячмень, рис, сорго, рожь, просо  Масличные растения включают хлопчатник, сою, сафлор, подсолнечник, , маис, люцерну, пальму, кокосовую пальму, лен, клещевину, маслину  Бобовые растения включают разновидности бобов и разновидности гороха. Бобы включают гуар, рожковое дерево, пажитник, сою, разновидности обыкновенной фасоли, вигну китайскую, золотистую фасоль, лимскую фасоль, стручковую фасоль, разновидности чечевицы, турецкий горох
Bt
et al.
Gene
et al
Eur. J. Biochem
et al
J. Biol. Chem
et al
Gene
et al
Plant Mol. Biol
В определенных вариантах осуществления последовательности нуклеиновой кислоты согласно вариантам осуществления можно пакетировать с любой комбинацией представляющих интерес последовательностей полинуклеотидов для создания растений с необходимым фенотипом. Например, полинуклеотиды согласно вариантам осуществления можно пакетировать с любыми другими полинуклеотидами, кодирующими полипептиды с пестицидной и/или инсектицидной активностью, такими как другие токсичные белки  (описанные в патентах США №№ 5,366,892; 5,747,450; 5,736,514; 5,723,756; 5,593,881; и Geiser  (1986)  48:109), пентин (описан в патенте США № 5981722) и им подобные. Полученные комбинации также могут включать несколько копий любого представляющего интерес полинуклеотида. Полинуклеотиды согласно вариантам осуществления можно также пакетировать с любым другим геном или комбинацией генов для получения растений с разнообразными комбинациями необходимых признаков, в том числе без ограничений с признаками, желательными для использования для питания животных, такими как гены, обуславливающие высокое содержание масла (например, патент США № 6,232,529); сбалансированное содержание аминокислот (например,хордотионины (патенты США №№ 5,990,389; 5,885,801; 5,885,802; и 5,703,049); ячмень с высоким содержанием лизина (Williamson . (1987) . 165: 99-106; и WO 98/20122) и белки с высоким содержанием метионина (Pedersen . (1986) . 261: 6279; Kirihara . (1988)  71: 359; и Musumura . (1989) . 12: 123)); повышенную усвояемость (например,модифицированные запасные белки (патент США № 6,858,778); и гены тиоредоксинов (патент США № 7,009,087), раскрытия которых включены в данный документ посредством ссылки.
например
et al
Science
et al
Science
et al
Cell
например
например
например
et al.
J. Bacteriol
.
Полинуклеотиды согласно вариантам осуществления также можно пакетировать с признаками, желательными для устойчивости к заболеваниям или гербицидам (, гены детоксикации фумонизина (патент США № 5,792,931); гены авирулентности или устойчивости к заболеваниям (Jones . (1994)  266:789; Martin . (1993)  262: 1432; и Mindrinos . (1994)  78:1089); мутанты по ацетолактат-синтазе (ALS), которые обуславливают устойчивость к гербицидам, как например, мутации S4 и/или Hra; устойчивости к ингибиторам глутамин-синтазы, таким как фосфинотрицин или basta (, ген bar); и обуславливающие устойчивость к глифосату (ген EPSPS и ген GAT, которые раскрыты в патентах США №№ 7709702 и 7462481; и с признаками, желательными для обработки или переработки продуктов, такими как высокое содержание масла (, патент США № 6,232,529); модифицированные масла (например,гены десатуразы жирных кислот (патент США № 5,952,544; WO 94/11516)); модифицированные крахмалы (например,ADPG-пирофосфорилазы (AGPаза), крахмал-синтазы (SS), крахмал-ветвящие ферменты (SBE) и крахмал-деветвящие ферменты (SDBE)); и с полимерами или биопластмассами (, патент США № 5602321; бета-кетотиолаза, полигидроксибутиратсинтаза и ацетоацетил-CoA-редуктаза (Schubert  (1988) . 170: 5837-5847), с признаками, облегчающими экспрессию полигидроксиалканоатов (PHA)), раскрытия которых включены в данный документ посредством ссылки. Также можно комбинировать полинуклеотиды согласно вариантам осуществления с полинуклеотидами, обеспечивающими агрономические признаки, такие как мужская стерильность(см. в общем патент США № 5,583,210), прочность стебля, время цветения, или признаки, связанные с технологией трансформации, такие как регуляция клеточного цикла или целенаправленное воздействие на гены (например WO 99/61619; WO 00/17364; WO 99/25821), раскрытия которых включены в данный документ посредством ссылки.
В некотором варианте осуществления пакетированный признак может представлять собой признак или трансгенный объект, который получил разрешение контролирующих органов, которые хорошо известны специалисту в данной области техники и их можно найти на сайте Центра оценки риска для окружающей среды (cera-gmc.org/?action=gm_crop_database, доступ к которому можно получить с использованием префикса www) и на сайте Международной службы по приобретению агробиотехнологических приложений (isaaa.org/gmapprovaldatabase/default.asp, доступ к которому можно получить с применением префикса www).
Эти пакетированные комбинации можно создавать любым способом, в том числе без ограничений перекрестным скрещиванием растений с помощью любой традиционной методики, или методики TOPCROSS, или генетической трансформации. Если признаки пакетированы с помощью генетической трансформации растений, то представляющие интерес последовательности полинуклеотидов можно комбинировать в любое время и в любом порядке. Например, трансгенное растение, содержащее один или несколько требуемых признаков, можно применять в качестве мишени для введения дополнительных признаков с помощью последовательной трансформации. Признаки можно вводить одновременно в протоколе котрансформации с представляющими интерес полинуклеотидами, представленными любой комбинацией кассет трансформации. Например, если будут вводиться две последовательности, то эти две последовательности могут содержаться в отдельных кассетах для трансформации (транс) или содержаться в одной кассете для трансформации (цис). Экспрессия этих последовательностей может управляться одним и тем же промотором или различными промоторами. В определенных случаях может потребоваться введение кассеты для трансформации, которая будет подавлять экспрессию представляющего интерес полинуклеотида. Ее можно комбинировать с любой комбинацией других кассет супрессии или кассет сверхэкспрессии для получения требуемой комбинации признаков в растении. Кроме того, считается, что полинуклеотидные последовательности можно пакетировать в требуемом местоположении в геноме с применением системы для сайт-специфичной рекомбинации. См., например, WO99/25821, WO99/25854, WO99/25840, WO99/25855 и WO99/25853, все из которых включены в данный документ посредством ссылки.
Композиции согласно вариантам осуществления находят разнообразные применения в защите растений, семян и растительных продуктов. Например, композиции можно использовать в способе, который предполагает помещение эффективного количества пестицидной композиции в среду обитания вредителя с помощью процедуры, выбранной из группы, состоящей из опрыскивания, опыливания, разбрасывания или нанесения покрытия на семена.
Перед продажей материала для размножения растений (плода, клубня, луковицы, клубнелуковиц, зерен, семени), в особенности семени, в качестве коммерческого продукта, его в обычном порядке обрабатывают с использованием защитного покрытия, содержащего гербициды, инсектициды, фунгициды, бактерициды, нематоциды, моллюскоциды или смеси некоторых из этих препаратов, при необходимости, вместе с дополнительными носителями, поверхностно-активными веществами или способствующими нанесению вспомогательными веществами, обычно применяемыми в области получения составов для обеспечения защиты от повреждения, вызванного бактериальными, грибковыми вредителями или животными-вредителями. Для того чтобы обработать семя, защитное покрытие можно применять по отношению к семенам либо путем пропитки клубней или зерен жидким составом, либо путем нанесения на них покрытия из комбинированного влажного или сухого состава. Кроме того, в особых случаях возможны другие способы применения по отношению к растениям, например, обработка, направленная на почки или плоды.
Семя растения согласно вариантам осуществления, содержащее нуклеотидную последовательность, кодирующую пестицидный белок согласно вариантам осуществления, можно обрабатывать защитным покрытием для семян, содержащим соединение для обработки семян, такое как, например, каптан, карбоксин, тирам, металаксил, пиримифос-метил и другие, которые обычно применяются в обработке семян. В одном варианте осуществления защитное покрытие для семян, содержащих пестицидную композицию согласно вариантам осуществления, используют отдельно или в комбинации с одним из защитных покрытий для семян, обычно применяемых в обработке семян.
Считается, что гены, кодирующие пестицидные белки, можно использовать для трансформации организмов, патогенных для насекомых. Такие организмы включают бакуловирус, грибы, простейших, бактерий и нематод.
Ген, кодирующий пестицидный белок согласно вариантам осуществления, можно вводить с помощью подходящего вектора в микроорганизм-хозяин, а указанного хозяина применять по отношению к окружающей среде, или растениям, или животным. Термин ʺвведенныйʺ в контексте вставки нуклеиновой кислоты в клетку означает ʺтрансфекциюʺ, или ʺтрансформациюʺ, или ʺтрансдукциюʺ и включает ссылку на встраивание нуклеиновой кислоты в эукариотическую или прокариотическую клетку, где нуклеиновая кислота может встраиваться в геном клетки (например, хромосому, плазмиду, пластидную или митохондриальную ДНК), превращаться в автономный репликон или временно экспрессироваться (например, трансфицированная мРНК).
Могут быть выбраны микроорганизмы-хозяева, которые, как известно, заселяют "фитосферу" (филлоплан, филлосферу, ризосферу и/или ризоплан) одной или нескольких сельскохозяйственных культур, представляющих интерес. Эти микроорганизмы выбирают таким образом, чтобы они могли успешно конкурировать в конкретной среде с микроорганизмами дикого типа, обеспечивать стабильное поддержание и экспрессию гена, экспрессирующего пестицидный белок, и, желательно, обеспечивать улучшенную защиту пестицида от разрушения и инактивации в окружающей среде.
Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc,
Alcaligenes
Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula,
Aureobasidium.
Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobacteria, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus, Clavibacter xyli
Azotobacter vinelandii
Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces roseus, S. odorus, Kluyveromyces veronae,
Aureobasidium pollulans
Такие микроорганизмы включают бактерии, водоросли и грибы. Особый интерес представляют микроорганизмы, такие как бактерии, например,и, грибы, в частности, дрожжи,например, иОсобый интерес представляют такие виды бактерий фитосферы как и, а также виды дрожжей фитосферы, такие как и. Особый интерес представляют пигментированные микроорганизмы.
Доступен ряд способов для введения гена, экспрессирующего пестицидный белок, в микроорганизм-хозяин в условиях, которые создают возможность для стабильного сохранения и экспрессии данного гена. Например, можно конструировать кассеты экспрессии, которые содержат нуклеотидные конструкции, представляющие интерес, функционально связанные с сигналами регуляции транскрипции и трансляции для экспрессии нуклеотидных конструкций, и нуклеотидную последовательность, гомологичную последовательности в организме-хозяине, при помощи которой будет происходить внедрение, и/или систему репликации, функционирующую в хозяине, при помощи которой будет происходить внедрение или стабильное поддержание.
et al
et al
Advanced Bacterial Genetics
Сигналы регуляции транскрипции и трансляции включают в себя без исключения промоторы, старт-сайты инициации транскрипции, операторы, активаторы, энхансеры, другие регуляторные элементы, сайты связывания рибосом, кодон инициации, сигналы терминации и т.п. См., например, патенты США №№ 5,039,523 и 4,853,331; EPO 0480762A2; Sambrook; Maniatis . (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York); Davis ., eds. (1980)  (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) и источники, цитируемые в этом документе.
Enterobacteriaceae
Escherichia
Erwinia
Shigella
Salmonella
и Proteus
Bacillaceae
Rhizobiaceae
Rhizobium
Spirillaceae
Zymomonas
Serratia
Aeromonas
Vibrio
Desulfovibrio
Spirillum; Lactobacillaceae
Pseudomonadaceae
Pseudomonas
Acetobacter
Azotobacteraceae
Nitrobacteraceae.
Подходящие клетки-хозяева, где клетки, содержащие пестицидный белок, будут обрабатывать для продления активности пестицидных белков в клетке в случае, когда обработанную клетку вносят в среду обитания вредителя-мишени(вредителей-мишеней), могут включать либо прокариотов, либо эукариотов, при этом они обычно ограничены теми клетками, которые не вырабатывают веществ, токсичных для высших организмов, таких как млекопитающие. Тем не менее, организмы, которые вырабатывают вещества, токсичные для высших организмов, можно применять в том случае, когда токсин является нестабильным или уровень применения является весьма низким, чтобы избежать любой возможности токсичности в отношении млекопитающего-хозяина. В качестве хозяев особый интерес будут представлять прокариоты и низшие эукариоты, такие как грибы. Иллюстративные прокариоты, как грамотрицательные, так и грамположительные включают ,такие как ,,,,;;,такие как ;,такие как Рhotobacterium,,,,,,;, такие как и ;и Среди эукариот представлены грибы, такие как Phycomycetes и Ascomycetes, которые включают дрожжи, такие как Saccharomyces и Schizosaccharomyces; и дрожжи из отдела Basidiomycetes, такие как Rhodotorula, Aureobasidium, Sporobolomyces и т.п.
Характеристики, представляющие особый интерес при выборе клетки-хозяина с целью выработки пестицидного белка, включают простоту введения гена пестицидного белка в хозяина, доступность систем экспрессии, эффективность экспрессии, стабильность белка в хозяине и наличие сопутствующих генетических возможностей. Характеристики, представляющие интерес для применения в виде пестицидной микрокапсулы, включают защитные свойства для пестицида, такие как толстые клеточные стенки, пигментация и внутриклеточная упаковка или образование телец включений; сродство к листьям; отсутствие токсичности для млекопитающих; привлекательность для поглощения вредителями; простота уничтожения и усвоение без повреждения токсина и т.п. Другие соображения включают легкость составления и обращения, экономичность, стабильность при хранении и т.п.
Организмы-хозяева, представляющие особый интерес, включают дрожжи, такие как Rhodotorula spp., Aureobasidium spp., Saccharomyces spp. (такие как S. cerevisiae), Sporobolomyces spp., организмы филлоплана, такие как Pseudomonas spp. (такие как P. aeruginosa, P. fluorescens), Erwinia spp. и Flavobacterium spp., а также другие такие организмы, в том числе Bt, E. coli, Bacillus subtilis и т.п.
Гены, кодирующие пестицидные белки согласно вариантам осуществления, можно вводить в микроорганизмы, которые размножаются на растениях (эпифиты) для доставки пестицидных белков к потенциальным вредителям-мишеням. Эпифиты, например, могут представлять собой грамположительные или грамотрицательные бактерии.
Bacillus cereus
et al
Appl. Environ. Microbiol.
Бактерии, колонизирующие корни, например, можно выделять из растений, представляющих интерес, при помощи способов, известных из уровня техники. А именно, штамм , который колонизирует корни, можно выделять из корней растения (см., например, Handelsman . (1991)56:713-718). Гены, кодирующие пестицидные белки согласно вариантам осуществления, можно вводить в Bacillus cereus, колонизирующую корни, при помощи стандартных способов, известных из уровня техники.
Bacillus
Bacillus
et al
FEMS Microbiol. Letts.
Гены, кодирующие пестицидные белки, можно вводить, например, в , колонизирующую корни, посредством электротрансформации. В частности, гены, кодирующие пестицидные белки, можно клонировать в челночный вектор, например, pHT3101 (Lerecius et al. (1989) FEMS Microbiol.Letts. 60: 211-218. При помощи челночного вектора pHT3101, содержащего кодирующую последовательность конкретного гена пестицидного белка, можно, например, трансформировать , колонизирующую корни, посредством электропорации (Lerecius . (1989) 60: 211-218).
Системы экспрессии можно разрабатывать таким образом, чтобы пестицидный белки секретировались за пределы цитоплазмы грам-отрицательных бактерий, таких как, например, E. coli. Преимущества секреции пестицидных белков являются следующими: (1) возможность избежать потенциальных цитотоксических эффектов экспрессируемого белка и (2) улучшение эффективности очистки пестицидного белка, в том числе без ограничения повышение эффективности выделения и очистки белка в расчете на объем клеточного бульона и снижение времени и/или затрат на извлечение и очистку в пересчете на единицу белка.
E. coli
E. coli
et al.
EMBO J,
et al.
Meth. Enzymol.
Пестицидные белки можно создать таким образом, чтобы они секретировались в E. coli, например, путем слияния подходящего сигнального пептида E. coli с амино-концом пестицидного белка. Сигнальные пептиды, распознаваемые , можно найти в белках, которые, как уже известно, секретируются у , например, белок OmpA (Ghrayeb  (1984) 3:2437-2442). OmpA представляет собой главный белок внешней мембраны E. coli, и, таким образом, полагают, что его сигнальный пептид является эффективным в процессе транслокации. Также сигнальный пептид OmpA не нужно модифицировать перед процессингом, что может иметь место в случае других сигнальных пептидов, например, сигнального пептида липопротеинов (Duffaud  (1987) 153: 492).
Пестицидные белки согласно вариантам осуществления можно ферментировать в бактерии-хозяине, а полученные бактерии обрабатывать и использовать в виде микробных распыляемых растворов тем же способом, что и штаммы Bt, которые применялись в виде инсектицидных распыляемых растворов. В случае пестицидного белка (белков), которые секретируются из Bacillus, сигнал секреции удаляют или подвергают мутации с применением методик, известных из уровня техники. Такие мутации и/или делеции предотвращают секрецию пестицидного белка (белков) в ростовую среду во время процесса ферментации. Пестицидные белки остаются в пределах клетки, и клетки затем обрабатывают для получения инкапсулированных пестицидных белков. Для этой цели можно применять любой подходящий микроорганизм. Pseudomonas применяли для экспрессии Bt токсинов в виде инкапсулированных белков, а полученные клетки подвергали обработке и распылению в качестве инсектицида (Gaertner et al. (1993), в: Advanced Engineered Pesticides, ed. Kim).
В качестве альтернативы, пестицидные белки вырабатываются при введении гетерологичного гена в клеточного хозяина. Экспрессия гетерологичного гена приводит, прямо или опосредованно, к выработке и сохранению пестицида внутри клетки. Эти клетки затем обрабатывают при условиях, которые продлевают активность токсина, вырабатываемого в клетке, когда осуществляют применение клетки по отношению к среде целевого вредителя(вредителей). Полученный продукт сохраняет токсичность токсина. Эти инкапсулированные естественным образом пестицидные белки можно затем составлять в соответствии с традиционными методиками для применения по отношению к среде пребывания вредителя-мишени, например, почва, вода и листва растений. См., например, документ EP0192319 и источники, цитируемые в этом документе.
В вариантах осуществления трансформированный микроорганизм (который включает целые организмы, клетки, спору(споры), пестицидный белок (белки), пестицидный компонент(компоненты), оказывающий воздействие на вредителя компонент(компоненты), мутант(мутанты), живые или мертвые клетки и клеточные компоненты, в том числе смеси живых и мертвых клеток и клеточных компонентов, и в том числе разрушенные клетки и клеточные компоненты) или выделенный пестицидный белок можно составить с приемлемым носителем в пестицидную композицию (композиции), которая представляет собой, например, суспензию, раствор, эмульсию, распыляемый порошок, диспергируемые гранулы или пеллеты, смачиваемый порошок и эмульгируемый концентрат, аэрозоль или распыляемый раствор, пропитанные гранулы, вспомогательное вещество, наносимую в качестве покрытия пасту, коллоид, а также инкапсулированные формы, например, в полимерных веществах. Такие составленные композиции можно получать с помощью таких общепринятых способов, как высушивание, лиофилизация, гомогенизация, экстракция, фильтрование, центрифугирование, седиментация или концентрирование культуры клеток, содержащих полипептид.
,
Такие композиции, раскрытые выше, можно получать с помощью добавления поверхностно-активного средства, инертного носителя, консерванта, увлажнителя, стимулятора поедания, аттрактанта, средства для инкапсуляции, связующего, эмульгатора, красителя, защитного средства от УФ, буфера, средства, повышающего текучесть, или удобрения, донора питательных микроэлементов или других препаратов, которые влияют на рост растения. Один или несколько агрохимикатов, в том числе без ограничения гербициды, инсектициды, фунгициды, бактерициды, нематоциды моллюскоциды, акарициды, регуляторы роста растений, вспомогательные средства для сбора урожая и удобрения, можно комбинировать с носителями, поверхностно-активными веществами или вспомогательными средствами, традиционно используемыми в области составления, или другими компонентами для облегчения обращения с продуктом и его применения по отношению к конкретным целевым вредителям. Подходящие носители и вспомогательные средства могут быть твердыми или жидкими и соответствуют веществам, обычно используемым в технологии составления, например, природным или регенерированным минеральным веществам, растворителям, диспергирующим веществам, смачивающим средствам, веществам, придающим клейкость, связующим или удобрениям. Активные ингредиенты согласно вариантам осуществления обычно применяют в виде композиций и их можно применять по отношению к возделываемой площади, растению или семени, подлежащим обработке. Например, композиции согласно вариантам осуществления можно применять по отношению к зерну при подготовке к хранению или во время хранения в зерновом бункере или элеваторе и т.д. Композиции можно применять одновременно или последовательно с другими соединениями. Способы применения активного ингредиента согласно вариантам осуществления или агрохимической композиции согласно вариантам осуществления, которая содержит по меньшей мере один из пестицидных белков, вырабатываемых штаммами бактерий согласно вариантам осуществления, включают без ограничения внекорневое применение, нанесение покрытия на семена и применение по отношению к почве. Количество применений и норма применения зависят от интенсивности поражения соответствующим вредителем.
например
например
например
например
например
Подходящие поверхностно-активные средства включают без ограничений анионные соединения, такие как карбоксилат, например, металла; карбоксилат длинноцепочечной жирной кислоты; N-ацилсаркозинат; сложные моно- или диэфиры фосфорной кислоты с этоксилатами жирных спиртов или соли таких сложных эфиров; сульфаты жирных спиртов, такие как додецилсульфат натрия, октадецилсульфат натрия или цетилсульфат натрия; сульфаты этоксилированных жирных спиртов; этоксилированные алкилфенолсульфаты; лигнинсульфонаты; нефтяные сульфонаты; алкиларилсульфонаты, такие как алкил-бензолсульфонаты или низшие алкилнафталинсульфонаты, , бутилнафталинсульфонат; соли сульфированных нафталин-формальдегидных конденсатов; соли сульфированных фенол-формальдегидных конденсатов; более сложные сульфонаты, такие как сульфонаты амидов, , сульфированный продукт конденсации олеиновой кислоты и N-метилтаурина; или диалкилсульфосукцинаты, , сульфонат натрия или диоктилсукцинат. Неионогенные средства включают продукты конденсации сложных эфиров жирных кислот, жирных спиртов, амидов жирных кислот или жирных алкил- или алкенилзамещенных фенолов с этиленоксидом, сложные эфиры жирной кислоты и эфиров многоатомных спиртов, , сложные эфиры сорбита и жирных кислот, продукты конденсации таких сложных эфиров с этиленоксидом, , сложные эфиры полиоксиэтиленсорбитанаи жирных кислот, блок-сополимеры этиленоксида и пропиленоксида, ацетиленовые гликоли, такие как 2,4,7,9-тетраэтил-5-децин-4,7-диол, или этоксилированные ацетиленовые гликоли. Примеры катионного поверхностно-активного средства включают, к примеру, алифатический моно-, ди- или полиамин, такой как ацетат, нафтенат или олеат; или кислородсодержащий амин, такой как аминоксид полиоксиэтиленалкиламина; амины с амидными связями, полученные путем конденсации карбоновой кислоты с ди- или полиамином; или соль четвертичного аммония.
Примеры инертных материалов включают без ограничений неорганические минеральные вещества, такие как каолин, филлосиликаты, карбонаты, сульфаты, фосфаты, или растительные материалы, такие как пробка, измельченные в порошок стержни кукурузных початков, шелуха арахиса, шелуха риса и скорлупа грецких орехов.
Композиции согласно вариантам осуществления могут находиться в форме, подходящей для непосредственного применения, или в виде концентрата первичной композиции, для которого требуется разведение подходящим количеством воды или другого разбавителя перед применением. Концентрация пестицида будет варьировать в зависимости от природы конкретного состава, в частности от того, является ли он концентратом или должен применяться непосредственно. Композиция содержит 1-98% твердого или жидкого инертного носителя и 0-50% или 0,1-50% поверхностно-активного вещества. Эти композиции будут вводить в обозначенной норме для коммерческого продукта, например, от приблизительно 0,01 фунта до 5,0 фунтов на акр при применении в сухой форме и при от приблизительно 0,01 пинты до 10 пинт на акр при применении в жидкой форме.
Animal Tissue Techniques
В дополнительном варианте осуществления композиции, а также трансформированные микроорганизмы и пестицидные белки согласно вариантам осуществления можно обрабатывать перед составлением для продления пестицидной активности при применении по отношению к среде обитания вредителя-мишени при условии, что предварительная обработка не оказывает вредное воздействие на пестицидную активность. Такие обработки можно осуществлять с помощью химических и/или физических средств при условии, что обработка не влияет отрицательно на свойства композиции(композиций). Примеры химических реактивов включают без ограничения галогенирующие средства; альдегиды, такие как формальдегид и глутаровый альдегид; антибактериальные средства, такие как зефиран хлорид; спирты, такие как изопропанол и этанол; и фиксирующие смеси для гистологических препаратов, такие как фиксирующая смесь Буэна и фиксирующая смесь Хелли (см., например, Humason (1967)  (W.H. Freeman and Co.).
Biochem. J.
Biochem. J.
3
В других вариантах осуществления преимущество будет иметь обработка полипептидов Cry токсинов протеазой, например трипсином, для активации белка перед применением композиции с пестицидным белком согласно вариантам осуществления по отношению к среде обитания вредителя-мишени. Способы активации протоксина сериновой протеазой хорошо известны из уровня техники. См., например, Cooksey (1968)  6:445-454 и Carroll и Ellar (1989)  261:99-105, содержание которых включено в данный документ посредством ссылки. Например, подходящий протокол активации включает без ограничения объединение полипептида, который нужно активировать, например, очищенного нового Cry полипептида (например, с аминокислотной последовательностью, изложенной в SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 8, и трипсина в весовом соотношении белок/трипсин 1/100 в 20 нМ NaHCO, pH 8, и расщепление образца при 36°C в течение 3 часов.
Композиции (в том числе трансформированные микроорганизмы и пестицидные белки согласно вариантам осуществления) можно применять по отношению к среде обитания насекомого-вредителя, например, при помощи опрыскивания, мелкодисперсного распыления, опыливания, разбрасывания, нанесения покрытия или поливания, введения в почву или на нее, введения в поливную воду, при помощи обработки семян или общего применения или опыливания во время, когда вредитель начал появляться, или перед появлением вредителей в качестве меры защиты. Например, пестицидный белок и/или трансформированные микроорганизмы согласно вариантам осуществления можно смешивать с зерном для защиты зерна во время хранения. В целом, важно обеспечивать хороший контроль вредителей на ранних стадиях роста растений, поскольку как раз в это время растение может повреждаться наиболее сильно. В целях удобства композиции согласно вариантам осуществления могут содержать другой инсектицид, если это считается необходимым. В одном варианте осуществления композицию применяют непосредственно по отношению к почве, во время высаживания, в гранулярной форме композиции носителя и мертвых клеток штамма Bacillus или трансформированного микроорганизма согласно вариантам осуществления. Другим вариантом осуществления является гранулярная форма композиции, содержащей агрохимикат, такой как, например, гербицид, инсектицид, удобрение, инертный носитель и мертвые клетки штамма Bacillus или трансформированного микроорганизма согласно вариантам осуществления.
Специалистам в данной области техники будет понятно, что не все соединения в равной степени эффективны против всех вредителей. Соединения согласно вариантам осуществления проявляют активность против насекомых-вредителей, которые могут включать экономически важных агрономических, лесных, тепличных вредителей, вредителей питомников, декоративных растений, пищи и тканей, здоровья людей и животных, домашней и коммерческой инфраструктуры, домашнего хозяйства и подвергающихся хранению продуктов. Насекомые-вредители включают насекомых, выбранных из отрядов Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthoptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera и т.д., в частности, Coleoptera и Lepidoptera.
Agrotis ipsilon
A. orthogonia
A. segetum
A. subterranea
Alabama argillacea
Anticarsia gemmatalis
Athetis mindara
Earias insulana
E. vittella
Egira (Xylomyges) curialis
Euxoa messoria
Helicoverpa armigera
H. zea
Heliothis virescens
Hypena scabra
Mamestra configurata
M. brassicae
Melanchra picta
Pseudaletia unipuncta
Pseudoplusia includens
Richia albicosta
Spodoptera frugiperda
S. exigua
S. litura
Trichoplusia ni
Achroia grisella
Amyelois transitella
Anagasta kuehniella
Cadra cautella
Chilo partellus
C. suppressalis
C. terrenellus
Corcyra cephalonica
Crambus caliginosellus
C. teterrellus
Cnaphalocrocis medinalis
Desmia funeralis
Diaphania hyalinata
D. nitidalis
Diatraea grandiosella
D. saccharalis
Elasmopalpus lignosellus
Eoreuma loftini
Ephestia elutella
Galleria mellonella
Hedylepta accepta
Herpetogramma licarsisalis
Homoeosoma electellum
Loxostege sticticalis
Maruca testulalis
Orthaga thyrisalis
Ostrinia nubilalis
Plodia interpunctella
Scirpophaga incertulas
Udea rubigalis
Acleris gloverana
A. variana
Adoxophyes orana
Archips spp.,
A. argyrospila
A. rosana
Argyrotaenia spp
Bonagota salubricola
Choristoneura spp.
Cochylis hospes
Cydia latiferreana
C. pomonella
Endopiza viteana
Eupoecilia ambiguella
Grapholita molesta
Lobesia botrana
Platynota flavedana
P. stultana
Spilonota ocellana
Suleima helianthana
Насекомые из отряда Lepidoptera включают без ограничения совок, подгрызающих совок, пядениц и гелиотин семейства Noctuidae:  Hufnagel (совка-ипсилон); Morrison (совка прямоугольная); Denis & Schiffermüller (совка озимая); Fabricius (совка зернистая);  Hübner (совка хлопковая американская); Hübner (гусеница бархатных бобов);Barnes and McDunnough (шершавая совка); Boisduval (совка хлопковая египетская); Fabricius (совка пятнистая); Grote (цитрусовая совка); Harris (чернобокая гусеница совки); Hübner (совка щетинконогая резедовая); Boddie (совка кукурузная или хлопковая совка);  Fabricius (табачная листовертка);  Fabricius (совка клеверная);  Walker (совка Берта);  Linnaeus (совка капустная); Harris (совка);  Haworth (совка луговая);  Walker (соевая совка); Smith (личинка западной бобовой совки);JE Smith (совка травяная);  Hübner (совка малая); Fabricius (табачная совка, гусеница, пожирающая соцветия); Hübner (совка ни); огневки, чехлоноски, бабочки, строящие паутинные гнезда, конусные бабочки и вредители, скелетирующие листья, из семейств Pyralidae и Crambidae, такие как  Fabricius (малая восковая моль);  Walker (гусеница, повреждающая рубчики цитрусовых); Zeller (огневка мельничная);  Walker (огневка сухофруктовая);Swinhoe (огневка кукурузная стеблевая); Walker (желтая рисовая огневка); Pagenstecher (огневка тростниковая стеблевая); Stainton (огневка рисовая);  Clemens (огневка кукурузная); Zincken (огневка мятликовая);  Guenée (листовертка рисовая); Hübner (виноградная листовертка);  Linnaeus (дынная огневка);  Stoll (огневка огурцов-пикули); Dyar (огневка кукурузная юго-западная),  Fabricius (тростниковая огневка); Zeller (малый кукурузный мотылек);  Dyar (мексиканская рисовая огневка);  Hübner (огневка табачная (шоколадная));  Linnaeus (большая восковая моль); Butler (тростниковая листовертка);  Walker (луговой мотылек); Hulst (огневка-травянка); Linnaeus (луговой мотылек); Geyer (огневка акациевая); Walker (чайная моль);  Hübner (кукурузный мотылек); Hübner (моль индийская мучная);  Walker (огневка рисовая стеблевая);  Guenée (огневка ржаво-коричневая); и листовертки, листовертки-почкоеды, плодожорки и гусеницы-вредители плодов семейства Tortricidae  Walsingham (западная черноголовая листовертка); Fernald (восточная черноголовая листовертка); Fischer von Rösslerstamm (листовертка сетчатая);  в том числеWalker (листовертка плодовых деревьев) and  Linnaeus (европейская листовертка); .; Meyrick (листовертка бразильская яблочная);; Walsingham (полосатая подсолнечниковая моль); Walsingham (лещинная плодожорка); Linnaeus (яблонная плодожорка); Clemens (листовертка виноградная);Hübner (листовертка гроздевая); Busck (плодожорка восточная персиковая);  Denis & Schiffermüller (листовертка европейская виноградная); Clemens (листовертка изменчивая);  Walsingham (листовертка всеядная); Denis & Schiffermüller (листовертка почковая); and  Riley (листовертка подсолнечниковая).
Alsophila pometaria
Anarsia lineatella
Anisota senatoria
Antheraea pernyi
Bombyx mori
Bucculatrix thurberiella
Colias eurytheme
Datana integerrima
Dendrolimus sibiricus
Ennomos subsignaria
Erannis tiliaria
Erechthias flavistriata
Euproctis chrysorrhoea
Harrisina americana
Heliothis subflexa
Hemileuca oliviae
Hyphantria cunea
Keiferia lycopersicella
Lambdina fiscellaria fiscellaria
L. fiscellaria
lugubrosa
Leucoma salicis
Lymantria dispar
Malacosoma spp.
Manduca quinquemaculata
M. sexta
Operophtera brumata
Orgyia spp
Paleacrita vernata
Papilio cresphontes
Phryganidia californica
Phyllocnistis citrella
Phyllonorycter blancardella
Pieris brassicae
P. rapae
P. napi
Platyptilia carduidactyla
Plutella xylostella
Pectinophora gossypiella
Pontia protodice
Sabulodes aegrotata
Schizura concinna
Sitotroga cerealella
Thaumetopoea pityocampa
Tineola bisselliella
Tuta absoluta
Yponomeuta padella
Другие выбранные сельскохозяйственные вредители из отряда Lepidoptera включают без ограничения Harris (осенний плодовый червь); Zeller (моль фруктовая полосатая); J.E. Smith (сатурния оранжевая дубовая);  Guérin-Méneville (китайский дубовый шелкопряд);  Linnaeus (тутовый шелкопряд);  Busck (кривоусая хлопковая моль);  Boisduval (люцерновая желтушка); Grote & Robinson (хохлатка ореховая); Tschetwerikov(сибирский шелкопряд), Hübner (пяденица вязовая);  Harris (пяденица липовая);  Walsingham (листовертка почковая тростниковая);  Linnaeus (шелкопряд золотистый);  Guérin-Méneville (пироморфида американская);  Guenée; Cockrell (гусеница бабочки-сатурнии);  Drury (американская белая бабочка);  Walsingham (томатная моль); Hulst (пяденица гемлоковая восточная); Hulst (пяденица гемлоковая западная);  Linnaeus (волнянка ивовая);  Linnaeus (непарный шелкопряд);; Haworth (бражник пятиточечный, томатный бражник); Haworth (томатный бражник, табачный бражник); Linnaeus(пяденица зимняя); .; Peck (пяденица весенняя);  Cramer (парусник кресфонтес, «апельсиновая собака»); Packard (коконопряд кольчатый калифорнийский);  Stainton (цитрусовая мушка-минер);Fabricius (моль-пестрянка плодовая нижнесторонняя);  Linnaeus (белянка капустная большая);  Linnaeus (белянка капустная малая);  Linnaeus (белянка брюквенная); Riley (пальцекрылка артишоковая);  Linnaeus (моль капустная); Saunders (розовый коробочный червь);Boisduval & Leconte (клетчатая белянка);  Guenée (всеядная пяденица);  J.E. Smith (хохлатка);  Olivier (моль ячменная ангумуазская);  Schiffermuller(походный шелкопряд сосновый); Hummel (моль комнатная);  Meyrick (томатная моль) и Linnaeus (горностаевая моль плодовая).
Anthonomus grandis
Cylindrocopturus adspersus
Diaprepes abbreviatus
Hypera punctata
Lissorhoptrus oryzophilus
Metamasius hemipterus hemipterus
M. hemipterus sericeus
Sitophilus granarius
S. oryzae
Smicronyx fulvus
S. sordidus
Sphenophorus maidis
Rhabdoscelus obscurus
Chaetocnema ectypa
C. pulicaria
Colaspis brunnea
Diabrotica barberi
)
D. undecimpunctata howardi
D. virgifera
virgifera
Leptinotarsa decemlineata
Oulema melanopus
Phyllotreta cruciferae
Zygogramma exclamationis
Epilachna varivestis
Antitrogus parvulus
Cyclocephala borealis
);
C. immaculata
); Dermolepida albohirtum
Euetheola humilis rugiceps
Lepidiota frenchi
Tomarus gibbosu
T. subtropicus
Phyllophaga crinita
P. latifrons
Popillia japonica
Rhizotrogus majalis
Eleodes
Melanotus
M. communis
Conoderus
Limonius
Agriotes
Ctenicera
Aeolus
Migdolus fryanus
Aphanisticus cochinchinae seminulum
Представляют интерес личинки и имаго из отряда Coleoptera, в том числе долгоносики из семейств Anthribidae, Bruchidae и Curculionidae, в том числе без ограничения:  Boheman (долгоносик хлопковый); LeConte (долгоносик подсолнечниковый стеблевой); Linnaeus (скосарь люцерновый);  Fabricius (долгоносик точечный);  Kuschel (долгоносик рисовый водяной);  Linnaeus (долгоносик западно-индийский тростниковый); Olivier (долгоносик тростниковый);  Linnaeus (долгоносик амбарный);  Linnaeus (долгоносик рисовый); LeConte (красный долгоносик подсолнечниковый); LeConte (серый долгоносик подсолнечниковый);Chittenden (долгоносик маисовый); Boisduval (долгоносик новогвинейский тростниковый); земляные блошки, блошки, корневые черви, листоеды, картофельные жуки и листовые минеры из семейства Chrysomelidae, в том числе без ограничения:  Horn (блошка стеблевая хлебная);  Melsheimer (земляная кукурузная блошка); Fabricius (листоед виноградный); Smith & Lawrence (северный кукурузный жук; Barber (блошка 11-точечная Говарда);  LeConte (западный кукурузный жук);  Say (колорадский жук);  Linnaeus (пьявица красногрудая); Goeze (блошка крестоцветная); Fabricius (подсолнечниковый листоед); жуки из семейства Coccinellidae, в том числе без ограничения: Mulsant (мексиканская фасолевая коровка); хрущи и другие жуки из семейства Scarabaeidae, в том числе без ограничения: Britton (личинка жука, поедающая сахарный тростник); Arrow (дупляк северный, хрущ Olivier (дупляк южный, хрущWaterhouse (сероспинный жук, поедающий сахарный тростник); LeConte (тростниковый жук); Blackburn (личинка Lepidiota, поедающая сахарный тростник); s De Geer (жук морковный);  Blatchley (личинка жука, поедающая сахарный тростник); Burmeister (хрущ);  LeConte (июньский хрущ);  Newman (хрущик японский);  Razoumowsky (нехрущ майский); кожееды из семейства Dermestidae; проволочники из семейства Elateridae,  spp.,  spp., в том числе Gyllenhal (проволочник);  spp.;  spp.;  spp.;  spp.;  spp.; короеды из семейства Scolytidae и жуки из семейства Tenebrionidae; жуки из семейства Cerambycidae, такие как, но без ограничения,  Westwood (усач); и жуки из семейства Buprestidae, в том числе, но без ограничения, Obenberger (минирующая листья узкозлатка).
Agromyza parvicornis
Contarinia sorghicola
Mayetiola destructor
Neolasioptera murtfeldtiana
Sitodiplosis mosellana
Oscinella frit
Delia
Delia platura
D. coarctata
Fannia canicularis
F. femoralis
Meromyza americana
Musca domestica
Stomoxys calcitrans
Chrysomya
Phormia
Tabanus
Gastrophilus
Oestrus
Hypoderma
Chrysops
Melophagus
ovinus
Brachycera
Aedes
Anopheles
Culex
Prosimulium
Simulium
Nematocera
Представляют интерес имаго и незрелые особи отряда Diptera, в том числе минирующие мушки  Loew (кукурузная минирующая мушка); галлицы в том числе без ограничения:  Coquillett (галлица сорговая); Say (гессенская муха);  Felt, (подсолнечниковая галлица);  Géhin (оранжевая зерновая галлица); плодовые мушки (Tephritidae),  Linnaeus (плодовые мушки); личинки, в том числе без ограничения:  spp., в том числе  Meigen (муха ростковая);  Fallen (муха озимая);Linnaeus,  Stein (малые комнатные мухи);  Fitch (американская меромиза); Linnaeus (комнатные мухи);  Linnaeus (жигалка осенняя)); мухи полевые, жигалки, мухи мясные, spp.;  spp.; и другие мухи-вредители надсемейства Muscoidea, слепни  spp.; носоглоточные оводы  spp.;  spp.; бычьи оводы  spp.; пестряки  spp.;  Linnaeus (рунец овечий); и другие , комары  spp.;  spp.;  spp.; мошки  spp.;  spp.; мокрецы, москиты, сциариды и другие .
В качестве насекомых, представляющих интерес включены насекомые из отряда Hemiptera, такие как без ограничения следующие семейства: Adelgidae, Aleyrodidae, Aphididae, Asterolecaniidae, Cercopidae, Cicadellidae, Cicadidae, Cixiidae, Coccidae, Coreidae, Dactylopiidae, Delphacidae, Diaspididae, Eriococcidae, Flatidae, Fulgoridae, Issidae, Lygaeidae, Margarodidae, Membracidae, Miridae, Ortheziidae, Pentatomidae, Phoenicococcidae, Phylloxeridae, Pseudococcidae, Psyllidae, Pyrrhocoridae и Tingidae.
Acrosternum hilare
Acyrthisiphon pisum
Adelges
Adelphocoris rapidus
Anasa tristis
Aphis craccivora
A. fabae
A. gossypii
A. maidiradicis
A. pomi
A. spiraecola
Aulacaspis tegalensis
Aulacorthum solani
Bemisia tabaci
B. argentifolii
Blissus leucopterus leucopterus
Blostomatidae spp.; Brevicoryne brassicae
Cacopsylla pyricola
Calocoris norvegicus
Chaetosiphon fragaefolii
Cimicidae spp
Coreidae spp.; Corythuca gossypii
Cyrtopeltis modesta
C. notatus
Deois flavopicta
Dialeurodes citri
Diaphnocoris chlorionis
Diuraphis noxia
Duplachionaspis divergens
Dysaphis plantaginea
Dysdercus suturellus
Dysmicoccus boninsis
Empoasca fabae
Eriosoma lanigerum
Erythroneoura
Eumetopina flavipes
Eurygaster spp.; Euschistus servus
E. variolarius
Hyalopterus pruni
Icerya purchasi
Labopidicola allii
Laodelphax striatellus
Leptoglossus corculus
Leptodictya tabida
Lipaphis erysimi
Lygocoris pabulinus
Lygus lineolaris
L. Hesperus
L. pratensis
L. rugulipennis
Macrosiphum euphorbiae
Macrosteles quadrilineatus
Magicicada septendecim
Mahanarva fimbriolata
Melanaphis sacchari
Melanaspis glomerata
Metopolophium dirhodum
Myzus persicae
Nasonovia ribisnigri
Nephotettix cinticeps
N. nigropictus
Nezara viridula
Nilaparvata lugens
Nysius ericae
Nysius raphanus
Oebalus pugnax
Oncopeltus fasciatus
Orthops campestris
Pemphigus
Peregrinus maidis
Perkinsiella saccharicida
Phylloxera devastatrix
Planococcus citri
Plesiocoris rugicollis
Poecilocapsus lineatus
Pseudatomoscelis seriatus
Pseudococcus
Pulvinaria elongata
Pyrilla perpusilla
Pyrrhocoridae spp.; Quadraspidiotus perniciosus
Reduviidae spp.; Rhopalosiphum maidis
R. padi
Saccharicoccus sacchari
Schizaphis graminum
Sipha flava
Sitobion avenae
Sogatella furcifera
Sogatodes oryzicola
Spanagonicus albofasciatus
Therioaphis maculata
Tinidae spp.; Toxoptera aurantii
T. citricida
Trialeurodes abutiloneus
T. vaporariorum
Trioza diospyri
Typhlocyba pomaria
Важные с точки зрения сельского хозяйства представители отряда Hemiptera включают без ограничения:  Say (клоп-щитник зеленый);  Harris (тля гороховая); spp. (хермесы); Say (клоп люцерновый); De Geer (клоп-ромбовик печальный);  Koch (тля люцерновая);  Scopoli (тля свекловичная);  Glover (тля хлопковая, тля бахчевая); Forbes (тля кукурузная корневая); De Geer (тля яблонная);  Patch (тля зеленая цитрусовая); Zehntner (щитовка тростниковая); Kaltenbach (тля картофельная обыкновенная);  Gennadius (белокрылка табачная, белокрылка хлопковая);  Bellows & Perring (белокрылка магнолиевая); Say (клоп-черепашка пшеничный североамериканский);  Linnaeus (тля капустная); Foerster (медяница грушевая); Gmelin (клопик картофельный);  Cockerell (тля земляничная американская); .; Fabricius (клоп хлопковый); Distant (клоп томатный); Distant (слепняк);Stål (слюнявица); Ashmead (белокрылка цитрусовая); Say (клоп-вредитель гледичии); Kurdjumov/Mordvilko (тля ячменная);  Green (щитовка); Paaserini (тля яблонно-подорожниковая);  Herrich-Schäffer (красноклоп хлопковый);  Kuwana (серый тростниковый мучнистый червец); Harris (цикадка картофельная); Hausmann (тля кровяная);  spp. (цикадки виноградные);  Muir(цикадка островная тростниковая);  Say (щитник коричневый);  Palisot de Beauvois (клоп однопятнистый); Graptostethus spp.(комплекс клопов-наземников); and Geoffroy (тля мучнистая сливовая);  Maskell (червец желобчатый австралийский); Knight (жук-вредитель растений лука);  Fallen (темная цикадка);  Say (сосновый семенной клоп); Herrich-Schaeffer (клоп тростниковый); Kaltenbach (тля горчичная листовая); Linnaeus (зеленый слепняк); Palisot de Beauvois (клоп луговой); Knight (клоп луговой западный);Linnaeus (клоп травяной);Poppius(клоп полевой); Thomas (тля картофельная большая);  Forbes (цикадка астровая); Linnaeus (цикада семнадцатилетняя); Stål (слюнявица тростниковая); Zehntner (тля тростниковая); Green (червец черный); Walker (тля розанно-злаковая);  Sulzer (тля оранжерейная, тля персиковая зеленая);  Mosley (тля цикориево-смородиновая);  Uhler (цикадка зеленая);  Stål (цикадка рисовая);  Linnaeus (зеленый овощной клоп);  Stål (бурая цикадка); Schilling(низиус вересковый);Howard (низиус); Fabricius (клоп-щитник рисовый); Dallas (ластовневый клоп); Linnaeus;spp. (тли корневые и тли галловые);  Ashmead (цикадка кукурузная);  Kirkaldy (дельфацида тростниковая); Pergande (филлоксера гикори);  Risso (мучнистый червец цитрусовый); Fallen (клоп яблонный);Fabricius (клоп четырехполосный травяной);  Reuter (хлопковый слепняк); spp. (другие мучнистые червецы); Newstead (червец пушицевый); Walker (цикадка тростниковая); Comstock (щитовка калифорнийская);  Fitch (тля сорговая);  Linnaeus (тля черемуховая обыкновенная);  Cockerell (тростниковый мучнистый червец); Rondani (тля злаковая обыкновенная); Forbes (тля сахарного тростника желтая);  Fabricius (тля злаковая);  Horvath (цикадка белоспинная);  Muir (дельфацида рисовая); Reuter (слепняк белокрапчатый);  Buckton (пятнистая люцерновая тля);  Boyer de Fonscolombe (тля померанцевая); и  Kirkaldy (тля цитрусовая); (белокрылка полосатокрылая) и  Westwood (белокрылка тепличная); Ashmead (листоблошка хурмовая); иMcAtee (цикадка яблонная).
Aceria tosichella
Panonychus ulmi
Petrobia latens
Steneotarsonemus bancrofti
Oligonychus grypus
O. indicus
O. pratensis
O. stickneyi
Tetranychus urticae
T.
mcdanieli
T. cinnabarinus
T. turkestani
Brevipalpus lewisi
Ixodes scapularis
I. holocyclus
Dermacentor variabilis
Amblyomma americanum
Также включены имаго и личинки из отряда Acari (клещи), такие как  Keifer (галловый клещ пшеничный);  Koch (красный плодовый клещ);  Müller (петробия многоядная); Michael (клещ, повреждающий стебель сахарного тростника); клещики паутинные и клещики красные семейства Tetranychidae,  Baker & Pritchard, Hirst (клещ листовой тростниковый),  Banks (травяной клещ Бэнкса),  McGregor (клещ паутинный тростниковый);  Koch (клещ паутинный двупятнистый);  McGregor (клещик МакДэниела); Boisduval (красный паутинный клещик);  Ugarov & Nikolski (туркестанский паутинный клещик); плоские клещи семейства Tenuipalpidae,  McGregor (оранжевый клещ); ржавчинные и почковые клещи семейства Eriophyidae и другие клещи, питающиеся листьями, и клещи, важные для здоровья человека и животных, т. е., пылевые клещи семейства Epidermoptidae, железницы семейства Demodicidae, зерновые клещи семейства Glycyphagidae, иксодовые клещи отряда Ixodidae.  Say (черноногий клещ);  Neumann (австралийский паралитический клещ);  Say (клещ иксодовый собачий); Linnaeus (иксодовый клещ Amblyomma) и конские и чесоточные клещи семейств Psoroptidae, Pyemotidae и Sarcoptidae.
Lepisma saccharina
Thermobia domestica
Представляющими интерес насекомыми-вредителями из отряда Thysanura являются, например,  Linnaeus (чешуйница);  Packard (термобия).
Дополнительные охваченные вредители-артроподы включают: пауков из отряда Araneae, таких как Loxosceles reclusa Gertsch & Mulaik (бурый паук-отшельник) и Latrodectus mactans Fabricius (черная вдова), и многоножек из отряда Scutigeromorpha, таких как Scutigera coleoptrata Linnaeus (обыкновенная мухоловка). Кроме того, интерес представляют насекомые-вредители из отряда Isoptera, в том числе из семейства Termitidae, такие как, но без ограничения, Cylindrotermes nordenskioeldi Holmgren и Pseudacanthotermes militaris Hagen (тростниковый термит). Интерес также представляют насекомые из отряда Thysanoptera, в том числе без ограничения трипсы, такие как Stenchaetothrips minutus van Deventer (тростниковый трипс).
J. Econ. Entomol.
Пестицидную активность композиций согласно вариантам осуществления можно тестировать на насекомых-вредителях на ранних стадиях развития, например, в виде личинок или других незрелых форм. Насекомых можно разводить в полной темноте при температуре от приблизительно 20°C до приблизительно 30°C и при относительной влажности от приблизительно 30% до приблизительно 70%. Биологические анализы можно осуществлять, как описано в Czapla и Lang (1990)  83(6): 2480-2485. Способы разведения личинок насекомых и проведения биологических анализов хорошо известны специалисту в данной области техники.
Специалисту в данной области техники известен широкий спектр методик биологических анализов. Общие процедуры включают добавление экспериментального соединения или организма к источнику пищи в закрытом контейнере. Пестицидную активность можно измерить, но без ограничения, по изменениям смертности, потери веса, привлечения, отпугивания, а также другим изменениям поведения и физическим изменениям после поедания и воздействия в течение соответствующего периода времени. Биологические анализы, описанные в данном документе можно использовать с любым питающимся насекомым-вредителем на стадии личинки или имаго.
Следующие примеры представлены в качестве иллюстрации, а не для ограничения.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Пример 1 - получение вариантов Cry1B с улучшенным спектром инсектицидной активности
Ostrinia nubilalis
Helicoverpa zea
Spodoptera frugiperda
Ostrinia nubilalis
Helicoverpa zea
Spodoptera frugiperda
Инсектицидный белок Cry1Bd, содержащий аминокислоту с SEQ ID NO: 1 (US 8692065), обладает высокой инсектицидной активностью (ILC50=1 ppm) против личинки кукурузного мотылька (), но низкой инсектицидной активностью (ILC50 > 1000 ppm и ~ 400 ppm, соответственно) против кукурузной совки () и травяной совки (). Инсектицидный белок Cry1B, называемый MP258 (порядковый номер PCT/US14/49923), содержащий аминокислоту с SEQ ID NO: 47, обладает высокой инсектицидной активностью (ILC50=4 ppm) против личинки кукурузного мотылька (), но низкой инсектицидной активностью (ILC50 24 ppm и 62 ppm, соответственно) против кукурузной совки () и травяной совки (). Серии вариантных полипептидов Cry1B, полученных из Cry1Bd (SEQ ID NO: 1) и MP258, конструировали для улучшения инсектицидной активности против кукурузной совки (CEW) и/или травяной совки (FAW) в сравнении с Cry1Bd (SEQ ID NO: 1) и/или MP258 (SEQ ID NO: 47), сохраняя при этом инсектицидную активность в отношении ECB. Вариантные полипептиды Cry1B, обладающие улучшенной инсектицидной активностью, которые были получены, включают указанные в таблице 1. Инсектицидную активностью вариантов Cry1B определяли как описано в примере 4, и результаты по инсектицидной активности показаны в таблице 3. Выравнивание аминокислотной последовательности вариантных полипептидов Cry1B показано на фигуре 1.
Таблица 1
ID клона
Полипептид
Полинуклеотид
Cry1Bd
SEQ ID NO: 1
SEQ ID NO: 2
IP1B-B1
SEQ ID NO: 3
SEQ ID NO: 4
IP1B-B21
SEQ ID NO: 5
SEQ ID NO: 6
IP1B-B22
SEQ ID NO: 7
SEQ ID NO: 8
IP1B-B23
SEQ ID NO: 9
SEQ ID NO: 10
IP1B-B24
SEQ ID NO: 11
SEQ ID NO: 12
IP1B-B25
SEQ ID NO: 13
SEQ ID NO: 14
IP1B-B26
SEQ ID NO: 15
SEQ ID NO: 16
IP1B-B27
SEQ ID NO: 17
SEQ ID NO: 18
IP1B-B28
SEQ ID NO: 19
SEQ ID NO: 20
IP1B-B29
SEQ ID NO: 21
SEQ ID NO: 22
IP1B-B31
SEQ ID NO: 23
SEQ ID NO: 24
IP1B-B32
SEQ ID NO: 25
SEQ ID NO: 26
IP1B-B33
SEQ ID NO: 27
SEQ ID NO: 28
IP1B-B34
SEQ ID NO: 29
SEQ ID NO: 30
IP1B-B40
SEQ ID NO: 31
SEQ ID NO: 32
IP1B-B41
SEQ ID NO: 33
SEQ ID NO: 34
IP1B-B42
SEQ ID NO: 35
SEQ ID NO: 36
IP1B-B43
SEQ ID NO: 37
SEQ ID NO: 38
IP1B-B44
SEQ ID NO: 39
SEQ ID NO: 40
IP1B-B45
SEQ ID NO: 41
SEQ ID NO: 42
IP1B-B46
SEQ ID NO: 43
SEQ ID NO: 44
IP1B-B47
SEQ ID NO: 45
SEQ ID NO: 46
MP258
SEQ ID NO: 47
SEQ ID NO: 48
GS060
SEQ ID NO: 49
SEQ ID NO: 50
Значения в процентах идентичности аминокислотных последовательностей вариантных полипептидов Cry1B, рассчитанные с использованием алгоритма Нидлмана-Вунша, реализованного в программе Needle (набор инструментов EMBOSS), показаны в виде матричной таблице в таблицах 2a - 2b. Пустая часть матричной таблицы не показана.
Таблица 2a
.
GS060
IP1B-B1
IP1B-B21
IP1B-B22
IP1B-B23
IP1B-B24
IP1B-B25
IP1B-B26
IP1B-B27
IP1B-B28
IP1B-B29
Cry1Bd
65,6
95,4
84,3
82,6
82,5
84,3
84,3
84,2
83,7
83,7
83,7
GS060
-
67,0
60,1
60,2
60,1
60,1
60,2
60,1
60,0
59,9
60,1
IP1B-B1
-
-
83,4
82,6
84,5
83,4
83,4
83,2
82,9
82,9
82,9
IP1B-B21
-
-
-
95,4
96,9
99,7
99,7
99,5
99,1
99,1
99,1
IP1B-B22
-
-
-
-
95,4
95,1
95,1
95,0
94,5
94,8
94,8
IP1B-B23
-
-
-
-
-
96,6
96,6
96,5
96,0
96,0
96,0
IP1B-B24
-
-
-
-
-
-
99,4
99,2
98,8
98,8
98,8
IP1B-B25
-
-
-
-
-
-
-
99,8
99,4
99,4
99,4
IP1B-B26
-
-
-
-
-
-
-
-
99,5
99,2
99,2
IP1B-B27
-
-
-
-
-
-
-
-
-
99,4
99,4
IP1B-B28
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
99,8
Таблица 2b
.
IP1B-B31
IP1B-B32
IP1B-B33
IP1B-B34
IP1B-B40
IP1B-B41
IP1B-B42
IP1B-B43
IP1B-B44
IP1B-B45
IP1B-B46
IP1B-B47
MP258
Cry1Bd
80,4
80,4
81,0
82,0
83,7
83,9
83,9
83,9
83,9
83,9
83,9
83,9
82,3
GS060
66,6
66,9
66,3
65,5
59,8
59,9
60,1
60,1
60,1
60,1
59,9
59,9
59,9
IP1B-B1
83,6
83,0
82,7
81,6
82,8
82,9
83,1
83,1
83,1
83,1
83,1
83,1
80,9
IP1B-B21
71,6
71,5
71,8
71,8
99,1
99,1
99,2
99,2
99,2
99,2
99,2
99,2
96,9
IP1B-B22
70,7
70,4
70,7
71,0
94,7
94,7
94,7
94,7
94,7
94,7
94,8
94,8
97,6
IP1B-B23
72,5
72,3
72,6
72,3
96,0
96,0
96,2
96,2
96,2
96,2
96,2
96,2
96,0
IP1B-B24
71,6
71,5
71,8
71,8
98,8
98,9
98,9
98,9
98,9
98,9
98,9
98,9
96,6
IP1B-B25
71,8
71,6
71,9
71,9
99,4
99,4
99,5
99,5
99,5
99,5
99,5
99,5
96,6
IP1B-B26
71,6
71,5
71,8
71,8
99,5
99,2
99,4
99,4
99,4
99,4
99,4
99,4
96,5
IP1B-B27
71,3
71,2
71,5
71,3
99,2
98,9
99,7
99,5
99,5
99,5
99,2
99,2
96,0
IP1B-B28
71,3
71,2
71,5
71,3
99,1
99,1
99,4
99,2
99,2
99,2
99,5
99,5
96,3
IP1B-B29
71,3
71,2
71,5
71,3
99,1
99,1
99,4
99,2
99,2
99,2
99,4
99,4
96,3
IP1B-B31
-
99,4
99,1
98,0
71,3
71,6
71,5
71,5
71,5
71,5
71,5
71,5
69,2
IP1B-B32
-
-
99,2
98,0
71,2
71,5
71,3
71,3
71,3
71,3
71,3
71,3
69,1
IP1B-B33
-
-
-
98,0
71,5
71,8
71,6
71,6
71,6
71,6
71,6
71,6
69,4
IP1B-B34
-
-
-
-
71,5
71,8
71,5
71,5
71,5
71,5
71,5
71,5
69,7
IP1B-B40
-
-
-
-
-
99,7
99,1
99,1
99,1
99,2
99,2
99,4
96,2
IP1B-B41
-
-
-
-
-
-
99,1
99,1
99,1
99,2
99,2
99,4
96,2
IP1B-B42
-
-
-
-
-
-
-
99,8
99,8
99,7
99,5
99,4
96,2
IP1B-B43
-
-
-
-
-
-
-
-
99,8
99,8
99,5
99,5
96,2
IP1B-B44
-
-
-
-
-
-
-
-
-
99,7
99,7
99,4
96,2
IP1B-B45
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
99,4
99,7
96,2
IP1B-B46
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
99,7
96,3
IP1B-B47
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
96,3
Пример 2 - насыщающий мутагенез в выбранных положениях MP258 и IP-1B вариантных полипептидов Cry1B
Полинуклеотиды с SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 42, кодирующие MP258, IP1B-B21, IP1B-B25 и IP1B-B45 (SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 41, соответственно), использовали в качестве матриц для насыщающего мутагенеза в выбранных положениях аминокислот. Сконструировали обратный праймер для мутагенеза и комплементарный прямой праймер для мутагенеза для получения необходимой(необходимых) аминокислотной(аминокислотных) замены(замен) в сайте(сайтах), представляющих интерес. Как правило, праймер для мутагенеза имел длину от 30 до 45 оснований, причем с двумя или большим количеством оснований, обычно 10-15, по обеим сторонам от сайта, представляющего интерес. Для осуществления насыщающего мутагенеза использовали вырожденные праймеры, которые охватывают все возможные аминокислотные остатки. Реакции мутагенеза осуществляли с использованием набора Agilent's QuikChange™ Lightening Site-Directed Mutagenesis. Материалы, предоставленные в наборе, представляют собой QuikChange™ Lightening Enzyme, 10X QuikChange™ Lightning Buffer, смесь dNTP, реактив QuikSolution™ и фермент рестрикции Dpnl, согласно инструкциям производителя.
ПЦР-амплификацию, как правило, осуществляли с использованием Expand™ High Fidelity PCR system (Roche, Швейцария) в 50 мкл, содержащих 50-100 нг матриц, 0,4-2 мкМ пары праймеров, 200 мкМ дНТФ и 2 единицы ДНК-полимеразы. Реакцию мутагенеза инициировали путем предварительного нагревания реакционной смеси до 94°C в течение 3 мин., с последующими 16 циклами следующей программы амплификации: 94°C в течение 1 мин., 52°C в течение 1 мин. и 68°C в течение 8, 12, 16 или 24 мин. в зависимости от длины матрицы. Реакцию мутагенеза завершали посредством инкубации при 68°C в течение 1 ч. Продукты ПЦР-амплификации оценивали при помощи электрофореза в агарозном геле. Продукты ПЦР очищали с использованием набора QIAquick™ PCR purification (Qiagen, Германия) и дополнительно обрабатывали ферментом рестрикции Dpnl. Аликвотой 1 мкл продукта ПЦР, как правило, трансформировали клетки BL21 (DE3) и инокулировали чашки Петри со средой Луриа-Бертани (LB), содержащей 100 мкг/мл ампициллина. Отбирали приблизительно 48 или более колоний для насыщающего мутагенеза и выделяли плазмидную ДНК для секвенирования. Использовали двухстадийное секвенирование, вначале для определенного (определенных) сайта (сайтов) мутации с использованием одного праймера для секвенирования, с последующим подтверждением последовательности полной длины с использованием нескольких праймеров для секвенирования. После того, как все 19 аминокислотных мутаций подтверждали путем секвенирования, эти мутантные гены были усовершенствованы для экспрессии и очистки белка.
В случае мутаций, проведенных для охвата всего домена III IP1B-B25, охватывающего с T495 по E655, из каждого сайта брали 48 мутантных клонов и подвергали скринингу в отношении активности CEW, как описано в примере 4. Для секвенирования этих мутантных клонов с целью определения мутированных аминокислот среди 151 аминокислотных остатков, подвергнутых мутагенезу, секвенировали 103 сайта на основе числа мутаций, повышающих активность, и мутаций, понижающих активность. Сайты, содержащие мутанты, не проявляющие значительного изменения активности, не секвенировали.
Пример 3 - очищение вариантных инсектицидных белков cry1B
E. coli
Гены вариантного инсектицидного белка cry1B экспрессировали в модифицированном векторе pMAL (№ кат. E8000S от New England Biolabs) в виде слияния с MBP (белок, связывающий мальтозу). Вектор pMAL модифицировали для присоединения 6X His-метки к N-N-концу MBP после метионина в положении 1. Плазмиду, содержащую ген инсектицидного белка клонировали в  BL21 (DE3). Клетки BL21 выращивали на MagicMedia™ (Life Technologies), либо в планшетах в формате 96 глубоких лунок, либо в колбах на шейкере, работающем при 250 об./мин. при 37°C в течение 8 ч., затем при 16°C в течение 64 ч. В ходе инкубации при 16°C белок слияния MBP-токсин накапливался в клетках BL21 в виде растворимого белка.
E. coli
E. coli
Для очистки белка слияния клетки  собирали посредством центрифугирования и обрабатывали раствором лизоцима, состоящим из 2 мг/мл лизоцима в 50 мл натрий-фосфатного буфера при pH 8, содержащего 300 мМ NaCl, 2 ед./мл эндонуклеазы (Epicentre) и 5 мМ MaCl2, в течение 3 ч. при 37°C при осторожном встряхивании. Затем обработанные лизоцимом клетки  разрушали с использованием 1% Triton X100, и прозрачный лизат, содержащий белки IP-1B, получали путем центрифугирования при 4000 об./мин., 30 мин. (96-луночные планшеты) или 9000 об./мин. (образцы, полученные из колбы). His-меченые белки MBP-токсин выделяли из прозрачного лизата при помощи аффинной хроматографии с использованием агарозы NiNTA от Qiagen™ в соответствии со стандартной методикой от производителя. Для этих образцов из прозрачного лизата, полученных в 96-луночных планшетах, планшеты от Pall Corporation™ (25 Harbor Park Drive Port Вашингтон, Нью-Йорк 11050) с 96 глубокими лунками использовали в качестве колонок для аффинной хроматографии. Очищенные белки-токсины, элюированные из агарозы NiNTA, пропускали через Sephadex G25 с заменой фосфатного буфера на 25 мМ HEPES-NaOH, pH 8, и использовали в биологическом анализе с использованием насекомых для определения инсектицидной активности. MBP расщепляли при помощи 1/100 (вес/вес) Factor Xa (New England Biolabs) при 25°C в течение ночи и удаляли из белков IP-1B при помощи колоночной хроматографии на Superdex 200 с использованием различия по размеру и слабой аффинности MBP к Superdex.
Концентрации белка определяли при помощи капиллярного электрофореза с использованием устройства LabChip™ GXII (Caliper LifeSciences). Анализ белка повторяли по меньшей мере 3 раза до тех пор, пока конечные концентрации не считались надежными в пределах предварительно определенного отклонения, составляющего менее 10%.
Пример 4 - определение инсектицидной активности вариантных белков IP-1B
Ostrinia nubilalis
Helicoverpa zea
Spodoptera frugiperda
Bacillus thuringiensis
Активность вариантов полипептида Cry1B против основных вредителей кукурузы, кукурузного мотылька (ECB, ), кукурузной совки (ECW, ) и травяной совки (FAW, ) определяли посредством анализа с кормлением, описанного в Cong, R., et al. Proceedings of the 4th Pacific Rim Conferences on Biotechnology of  and its environmental impact, pp.118-123, под редакцией R. J. Akhurst, C. E. Beard и P. Hughes, опубликованного в 2002, Canberra, Australia. Вкратце, анализы проводили на искусственном рационе, содержащем инсектицидные белки. Инсектицидные белки получали, как описано в примере 1, и 10 мкл образцов белка смешивали с 40 мкл расплавленного искусственного рациона для насекомых (40-50°C), полученного на основе Southland Premix, составленного для насекомых из отряда чешуекрылых (Southland Products, Лейк-Виллидж, Арканзас) с использованием агарозы с низкой температурой плавления. Смесь рацион-инсектицидный белок помещали в каждую лунку 96-луночного титрационного микропланшета. Одну или несколько новорожденных личинок насекомых помещали в каждую лунку для кормления в течение 4 дней для CEW и FAW и 5 дней для ECB при 28°C.
В качестве альтернативы, яйца или личинки насекомых сортировали посредством проточной цитометрии больших частиц с использованием COPAS™ (Complex Object Parametric Analyzer and Sorter), полученного от Union Biometrica (Holliston, Массачусетс), с помещением одного яйца или личинки в лунку 96-луночного титрационного микропланшета, который содержал затвердевший искусственный рацион для насекомых. Если яйца использовали для размещения в планшетах для анализа, то через 16 часов для сбора данных анализа использовали только те лунки, которые содержали вылупившихся личинок. Как правило, в результате эффективной сортировки COPAS получали уровни вылупливания 90-95%. После определенных периодов скармливания ответ насекомых на белки оценивали с использованием системы с оценкой в баллах 0-3 с учетом размера и смертности личинок в каждой лунке. Если не наблюдали ответа (или рост был нормальным), то присваивали балл 0. Если рост был несколько замедлен, то присваивали балл 1. Балл 2 означал, что у личинки значительно замедлился рост (был близким к размеру новорожденной). Балл 3 означал гибель всех личинок в лунке. Ответ в процентах (ответ) для каждой обработки рассчитывали путем деления общего балла, суммы баллов по параллельным лункам для каждой обработки на максимально возможные баллы. Например, если одна обработка (один образец, одна доза) имела 6 параллельных лунок, то общий максимальный возможный балл составлял 3×6=18.
p
Для идентификации вариантных полипептидов Cry1B, обладающих повышенными уровнями активности против данных вредителей кукурузы, значительно более высокими, чем активность эталонного белка, такого как немутированный эталонный белок дикого типа (например, MP258 с SEQ ID NO: 47). Вариантные полипептиды в определенных концентрациях анализировали вместе с 4 дозами эталонного белка в пределах одного 96-луночного планшета для анализа. Концентрации инсектицидных белков находились в пределах значений концентрации эталонного белка для 4 доз, предпочтительно вблизи средней точки значений концентрации для 4 доз. Каждый планшет с образцом содержал эталонный белок в значительном числе лунок, например, в 16 лунках в 4 отдельных дозах. Также каждый планшет включал до 80 мутантных белков для сравнения активности с эталонным белком. Из планшета с образцами, при помощи многоканальной пипетки, из каждой лунки отбирали 10 мкл образцов и переносили в один планшет для анализа, содержащий в каждой лунке 40 мкл расплавленного рациона, и перемешивали на шейкере. Данный процесс подготовки планшета для анализа повторяли 6 раз или более для получения требуемого числа планшета для анализа. После затвердения рациона и охлаждения до 4°C новорожденные личинки насекомых помещали в каждую лунку, закрытую перфорированной пленкой Mylar, и инкубировали в термостате при постоянной температуре 28°C. После определенного времени скармливания ответы насекомых оценивали под увеличительным стеклом. Значения сигмоидальной функции доза-ответ (значения ответа) преобразовывали в значения линейной функции доза-ответ, построенной методом пробит, при помощи SAS-JMP, обобщенная линейная модель, биномиальное распределение ответа, пробит). Значение ответа для каждого белка в параллелях суммировали и сравнивали с кривой доза-ответ, построенной методом пробит, для активности эталонного белка, получая новое число, называемое расчетным показателем FAE (быстрая оценка активности). Например, если мутантные белок показывал определенное пробит-значение при 40 ppm и фактическая доза с таким же пробит-значением для эталонного белка составляла 100 ppm; тогда значение FAE составляло 2,5 (100/40). Это означает, что мутантный белок в 2,5 раза более эффективен, чем эталонный белок. Данный анализ проводили с 2 разными дозами мутантных белков за раз и повторяли 3 раза, получая 6 точек измерения расчетного показателя FAE для каждого мутанта. Средний расчетный показатель FAE называли индексом FAE. Для каждого белка рассчитывали значение двустороннего t-критерия при сравнении 6 расчетных показателей FAE. Поправку Бонферрони использовали для оценки -значений (число новых белков/альфа) для определения статистической значимости индекса FAE.
Еще одним способом скрининга, используемым в данной заявке на патент, был анализ с высокими дозами (HDA, High Dose Assay). В этом способе исследуемые белки в высоких концентрациях (выше EC50) помещали в планшеты для анализа насекомых, как описано выше, вместе с одним или более эталонным белком с известным уровнем активности при аналогичной концентрации. Данный HDA часто использовали в многоуровневых скринингах для быстрого исключения белков с низкой или отсутствующей активностью.
Еще одним используемым способом скрининга являлся высокопроизводительный функциональный анализ (HFA, High throughput Functional Assay). Данный анализ был аналогичен FAE, но в нем использовали только одну дозу вместо 2 доз. В остальном HFA, особенно способ расчета индекса, был идентичен FAE. Следовательно, индекс HFA имел такое же значение, что и индекс FAE.
Прогнозируемая точка с 50% ответом в схеме подсчета баллов называется ILC50, поскольку она представляет собой комбинацию подавления роста или питания и летальные ответы. Для определения значений ILC50 каждую обработку (одна доза) повторяли 6 раз или более, обычно 24 раза. Инсектицидная активность вариантов Cry1B показана в таблице 3.
В таблице 4 показана инсектицидная активностью против кукурузной совки для аминокислотных замен, обладающих повышенной активностью (значение FAE ≥ 1,2) по сравнению с эталонным полипептидом MP258 (SEQ ID NO: 47), IP1B-B21 (SEQ ID NO: 5), IP1B-B25 (SEQ ID NO: 13), или IP1B-B45 (SEQ ID NO: 41). В таблице 4 показаны номер положения и аминокислота, соответствующая положениям 50-651 MP258 (SEQ ID NO: 47); предсказанная вторичная структура и присвоение; оценка в баллах воздействия растворителя; выравнивание аминокислотной последовательности MP258 (SEQ ID NO: 47); IP1B-B21 (SEQ ID NO: 5), IP1B-B25 (SEQ ID NO: 13), IP1B-B45 (SEQ ID NO: 41), IP1B-B21 (SEQ ID NO: 5), Cry1Bd (SEQ ID NO: 1), Cry1Bh (SEQ ID NO: 52), и Cry1Bi (SEQ ID NO: 54); остов полипептида, из которого был получен вариант; вариант аминокислотной замены (например, L50R); и значение инсектицидной FAE в отношении хлопковой совки по сравнению с остовом соответствующего полипептида (MP258 - SEQ ID NO: 47, IP1B-B21 - SEQ ID NO: 5, IP1B-B25 - SEQ ID NO: 13, или IP1B-B45 - SEQ ID NO: 41).
Таблица 3
ID клона
Полипептид с SEQ ID NO
ECB
CEW
FAW
Cry1Bd
SEQ ID NO: 1
ILC50=1 ppm
ILC50=>1000 ppm
ILC50=~400 ppm
IP1B-B1
SEQ ID NO: 3
ILC50=1,3 ppm
ILC50=21 ppm
ILC50=34,3 ppm
IP1B-B21
SEQ ID NO: 5
ILC50=22,4 ppm
IP1B-B22
SEQ ID NO: 7
ILC50=27,1 ppm
IP1B-B23
SEQ ID NO: 9
ILC50=29,2 ppm
IP1B-B24
SEQ ID NO: 11
ILC50=12,6 ppm
IP1B-B25
SEQ ID NO: 13
ILC50=11,91 ppm
IP1B-B26
SEQ ID NO: 15
ILC50=8,36 ppm
IP1B-B27
SEQ ID NO: 17
ILC50=7,99 ppm
IP1B-B28
SEQ ID NO: 19
ILC50=7,74 ppm
IP1B-B29
SEQ ID NO: 21
ILC50=8,45 ppm
IP1B-B31
SEQ ID NO: 23
ILC50=2,8 ppm
IP1B-B32
SEQ ID NO: 25
ILC50=2,9 ppm
IP1B-B33
SEQ ID NO: 27
ILC50=3,0 ppm
IP1B-B34
SEQ ID NO: 29
ILC50=2,9 ppm
IP1B-B40
SEQ ID NO: 31
ILC50=5,78 ppm
IP1B-B41
SEQ ID NO: 33
ILC50=4,54 ppm
IP1B-B42
SEQ ID NO: 35
ILC50=6,2 ppm
IP1B-B43
SEQ ID NO: 37
ILC50=6,7 ppm
IP1B-B44
SEQ ID NO: 39
ILC50=6,9 ppm
IP1B-B45
SEQ ID NO: 41
ILC50=5,7 ppm
IP1B-B46
SEQ ID NO: 43
ILC50=8 ppm
IP1B-B47
SEQ ID NO: 45
ILC50=6,1 ppm
MP258
SEQ ID NO: 47
ILC50=4 ppm
ILC50=24 ppm
ILC50=62 ppm
В таблице 5 показана инсектицидная активностью против кукурузной совки для аминокислотных замен со значением FAE ≤ 1,2 по сравнению с остовом полипептида MP258 (SEQ ID NO: 47), IP1B-B21 (SEQ ID NO: 5), IP1B-B25 (SEQ ID NO: 13) или IP1B-B45 (SEQ ID NO: 41). В таблице 5 показаны номер положения и аминокислота, соответствующая положениям 50-651 MP258 (SEQ ID NO: 47); остов полипептида, из которого был получен вариант; вариант аминокислотной замены (например, L50R) и значение инсектицидной FAE в отношении кукурузной совки по сравнению с остовом соответствующего полипептида (MP258 - SEQ ID NO: 47, IP1B-B21 - SEQ ID NO: 5, IP1B-B25 - SEQ ID NO: 13 или IP1B-B45 - SEQ ID NO: 41.
Таблица 4
ПоложениеMP258
a.к.
2D-структ.
2D --присв.
Ож. раст.
MP258
B21
B25
B45
Bd
Bh
Bi
Остов
Вариант
FAE
Вариант
FAE
Вариант
FAE
Вариант
FAE
Вариант
FAE
50
L
Клубок
90
L
L
L
L
L
F
F
B45
L50R
1,72
L50I
1,52
L50D
1,5
L50A
1,43
L50H
1,42
L50Y
1,42
L50S
1,38
L50F
1,38
L50V
1,37
L50K
1,34
L50N
1,26
51
V
Спираль
a1
37
V
V
V
V
V
V
V
52
S
Спираль
20
S
S
S
S
S
S
S
53
A
Спираль
67
A
A
A
A
A
A
A
B45
A53R
1,79
A53Y
1,72
A53K
1,7
A53H
1,45
A53P
1,42
A53V
1,35
A53Q
1,31
A53D
1,25
A53E
1,23
A53G
1,22
A53T
1,21
54
S
Спираль
47
S
S
S
S
S
S
S
B45
S54P
1,6
S54K
1,4
S54G
1,39
S54A
1,36
S54I
1,25
S54R
1,21
55
T
Спираль
0
T
T
T
T
T
T
T
56
V
Спираль
5
V
V
V
V
V
V
V
57
Q
Спираль
75
Q
Q
Q
Q
Q
Q
Q
B45
Q57V
1,76
Q57R
1,71
Q57L
1,54
Q57N
1,53
Q57G
1,38
Q57D
1,3
58
T
Спираль
33
T
T
T
T
T
T
T
59
G
Спираль
4
G
G
G
G
G
G
G
60
I
Спираль
3
I
I
I
I
I
I
I
61
N
Спираль
27
N
N
N
N
N
N
S
62
I
Спираль
3
I
I
I
I
I
I
I
63
A
Спираль
19
A
A
A
A
A
A
A
64
G
Спираль
4
G
G
G
G
G
G
G
65
R
Спираль
42
R
R
R
R
R
R
R
B45
R65Q
1,54
R65A
1,53
R65S
1,48
R65G
1,36
66
I
Спираль
4
I
I
I
I
I
I
I
67
L
Спираль
27
L
L
L
L
L
L
L
B45
L67M
2,03
L67F
1,41
L67I
1,27
68
G
Спираль
113
G
G
G
G
G
G
G
B45
G68A
1,83
G68R
1,3
G68F
1,27
69
V
Спираль
6
V
V
V
V
V
V
V
70
L
Виток
1
L
L
L
L
L
L
L
B45
L70E
1,51
L70W
1,3
L70H
1,23
71
G
Виток
8
G
G
G
G
G
G
G
B45
G71S
1,33
72
V
Клубок
22
V
V
V
V
V
V
V
B45
V72G
1,87
73
P
Клубок
46
P
P
P
P
P
P
P
B45
P73S
1,27
P73G
1,35
74
F
Клубок
94
F
F
F
F
F
F
F
B45
F74I
1,92
F74E
1,91
F74S
1,64
F74R
1,33
F74V
1,25
F74D
1,24
75
A
Спираль
a2
33
A
A
A
A
A
A
A
B45
A75S
2,23
A75P
1,67
A75E
1,28
76
G
Спираль
115
G
G
G
G
G
G
G
B45
G76T
2,01
G76S
1,76
G76Y
1,6
G76V
1,6
G76D
1,41
G76R
1,4
77
Q
Спираль
53
Q
Q
Q
Q
Q
Q
Q
B45
Q77N
1,86
Q77D
1,82
Q77G
1,78
Q77L
1,76
Q77I
1,69
Q77H
1,64
Q77P
1,63
Q77A
1,59
Q77T
1,58
Q77M
1,39
Q77C
1,38
Q77S
1,22
78
L
Спираль
8
L
L
L
L
L
L
L
79
A
Спираль
36
A
A
A
A
A
A
A
B45
A79S
1,83
A79V
1,78
A79T
1,71
A79L
1,69
A79R
1,65
A79I
1,55
A79P
1,5
A79N
1,32
A79Q
1,31
A79K
1,23
80
S
Спираль
61
S
S
S
S
S
S
S
B45
S80Q
2,06
S80K
1,97
S80G
1,93
S80E
1,86
S80R
1,84
S80M
1,77
S80N
1,66
S80C
1,56
S80W
1,45
S80Y
1,44
S80D
1,29
81
F
Спираль
4
F
F
F
F
F
F
F
82
Y
Спираль
4
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
B45
Y82F
1,41
83
S
Спираль
85
S
S
S
S
S
S
S
B45
S83E
1,97
S83D
1,91
S83G
1,89
S83A
1,87
S83K
1,8
S83H
1,7
S83R
1,51
S83Y
1,39
S83L
1,32
84
F
Спираль
54
F
F
F
F
F
F
F
85
I
Спираль
5
I
I
I
I
L
L
I
86
V
Спираль
22
V
V
V
V
V
V
V
87
G
Спираль
101
G
G
G
G
G
G
G
B45
G87D
1,95
G87K
1,65
G87N
1,44
G87C
1,42
G87W
1,28
G87H
1,24
88
E
Спираль
19
E
E
E
E
E
E
E
89
L
Спираль
2
L
L
L
L
L
L
L
90
W
Клубок
11
W
W
W
W
W
W
W
91
P
Клубок
44
P
P
P
P
P
P
P
B45
P91S
1,64
P91Y
1,49
P91T
1,46
P91D
1,28
92
S
Клубок
93
S
S
S
S
S
S
K
B45
S92E
2,54
S92G
1,88
S92F
1,72
S92V
1,72
S92L
1,71
S92T
1,47
93
G
Клубок
140
G
G
G
G
G
G
G
B45
G93H
1,68
G93D
1,53
G93I
1,28
94
R
Клубок
97
R
R
R
R
R
R
R
B45
R94L
2,27
R94H
2,19
R94T
1,7
R94S
1,35
95
D
Клубок
35
D
D
D
D
D
D
D
B45
D95G
1,86
D95Q
1,67
D95V
1,55
D95F
1,2
96
P
Спираль
a2
18
P
P
P
P
P
P
Q
97
W
Спираль
2
W
W
W
W
W
W
W
98
E
Спираль
35
E
E
E
E
E
E
E
99
I
Спираль
29
I
I
I
I
I
I
I
100
F
Спираль
1
F
F
F
F
F
F
F
101
L
Спираль
4
L
M
M
M
L
L
M
102
E
Спираль
40
E
E
E
E
E
E
E
103
H
Спираль
0
H
H
H
H
H
H
H
104
V
Спираль
0
V
V
V
V
V
V
V
105
E
Спираль
16
E
E
E
E
E
E
E
106
Q
Спираль
75
Q
Q
Q
Q
Q
Q
Q
B45
Q106I
2,16
Q106A
1,77
Q106F
1,74
Q106G
1,71
Q106H
1,67
Q106C
1,52
Q106K
1,43
Q106V
1,32
Q106R
1,29
Q106S
1,25
107
L
Спираль
0
L
L
L
L
L
L
L
108
V
Спираль
5
V
V
V
V
I
I
V
B45
V108L
1,92
V108M
1,55
V108T
1,29
109
R
Виток
94
R
R
R
R
R
R
R
258
R109S
1,35
R109V
1,28
R109N
1,23
110
Q
Клубок
54
Q
Q
Q
Q
Q
Q
Q
258
Q110T
1,93
Q110R
1,51
Q110V
1,32
Q110F
1,26
Q110H
1,24
111
Q
Клубок
87
Q
Q
Q
H
Q
Q
Q
258
Q111H
4,5
Q111L
2,97
Q111S
2,37
Q111M
2,16
Q111R
2,14
Q111A
1,99
Q111K
1,8
Q111E
1,54
112
I
Клубок
0
I
I
I
I
V
V
I
B45
I112L
2,03
113
T
Клубок
80
T
T
T
T
T
T
T
B45
T113L
1,44
T113V
1,4
T113S
1,34
T113N
1,29
T113K
1,25
114
E
Спираль
a3
73
E
E
E
M
E
E
A
258
E114L
2,67
E114T
2,29
E114M
2,11
E114H
2,03
E114Y
1,94
E114A
1,73
E114S
1,67
E114V
1,54
E114F
1,39
115
N
Спираль
116
N
N
N
N
N
N
N
B45
N115P
1,39
116
A
Спираль
11
A
A
A
A
T
T
A
117
R
Спираль
18
R
R
R
R
R
R
R
118
N
Спираль
79
N
N
N
N
N
N
N
B45
N118V
2,16
N118T
1,84
N118E
1,72
N118D
1,4
N118F
1,37
N118G
1,22
119
T
Спираль
55
T
T
T
T
T
T
T
B45
T119A
2,3
T119M
2,08
T119S
1,89
T119K
1,76
T119H
1,69
T119E
1,66
T119R
1,65
T119V
1,44
120
A
Спираль
5
A
A
A
A
A
A
A
121
L
Спираль
20
L
L
L
L
I
I
L
122
A
Спираль
87
A
A
A
A
A
A
A
B45
A122R
1,38
A122I
1,32
A122F
1,27
A122N
1,26
A122G
1,23
A122T
1,23
123
R
Спираль
55
R
R
R
R
R
R
R
B45
R123K
1,81
124
L
Спираль
6
L
L
L
L
L
L
L
125
Q
Спираль
58
Q
Q
Q
Q
E
E
Q
B45
Q125N
1,83
Q125R
1,58
Q125E
1,48
126
G
Спираль
103
G
G
G
G
G
G
G
127
L
Спираль
9
L
L
L
L
L
L
L
128
G
Спираль
0
G
G
G
G
G
G
G
129
A
Спираль
96
A
A
A
A
R
R
D
B45
A129K
1,69
A129W
1,56
A129L
1,38
A129P
1,32
A129V
1,23
130
S
Спираль
37
S
S
S
S
G
G
S
131
F
Спираль
2
F
F
F
F
Y
Y
F
132
R
Спираль
95
R
R
R
R
R
R
R
133
A
Спираль
49
A
A
A
A
S
S
A
134
Y
Спираль
1
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
135
Q
Спираль
24
Q
Q
Q
Q
Q
Q
Q
136
Q
Спираль
77
Q
Q
Q
Q
Q
Q
Q
B45
Q136I
1,52
Q136F
1,34
Q136I
1,31
137
S
Спираль
5
S
S
S
S
A
A
S
138
L
Спираль
10
L
L
L
L
L
L
L
139
E
Спираль
55
E
E
E
E
E
E
E
140
D
Спираль
77
D
D
D
D
T
T
D
B45
D140E
1,65
141
W
Спираль
6
W
W
W
W
W
W
W
142
L
Спираль
67
L
L
L
L
L
L
L
143
E
Спираль
76
E
E
E
E
D
D
E
B45
E143S
2,18
E143R
1,78
E143G
1,64
E143Y
1,62
E143M
1,62
E143Q
1,58
E143L
1,55
E143W
1,55
E143T
1,5
E143A
1,48
E143N
1,37
E143P
1,34
144
N
Клубок
62
N
N
N
N
N
N
N
B45
N144M
1,81
N144A
1,56
N144T
1,21
145
R
Клубок
67
R
R
R
R
R
R
R
B45
R145N
1,81
R145P
1,55
R145A
1,45
R145L
1,44
R145S
1,23
146
D
Клубок
85
D
D
D
D
N
N
N
B45
D146W
1,53
D146T
1,3
D146H
1,22
D146V
1,21
147
D
Клубок
31
D
N
N
N
D
D
D
B45
N147V
1,77
N147R
1,65
N147D
1,42
N147S
1,37
148
A
Спираль
a4
64
A
A
A
A
A
A
A
B45
A148F
2,22
A148W
1,83
A148P
1,75
A148N
1,74
A148L
1,73
149
R
Спираль
80
R
R
R
R
R
R
R
B45
R149V
2,2
R149A
1,89
R149S
1,88
R149L
1,49
150
T
Спираль
22
T
T
T
T
S
S
T
151
R
Спираль
57
R
R
R
R
R
R
R
152
S
Спираль
93
S
S
S
S
S
S
S
153
V
Спираль
65
V
V
V
V
I
I
V
154
L
Спираль
0
L
L
L
L
I
I
L
155
Y
Спираль
42
Y
Y
Y
Y
L
L
Y
156
T
Спираль
77
T
T
T
T
E
E
T
157
Q
Спираль
31
Q
Q
Q
Q
R
R
Q
158
Y
Спираль
3
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
B45
Y158F
1,7
159
I
Спираль
31
I
I
I
I
V
V
I
B45
I159V
1,37
160
A
Спираль
72
A
A
A
A
A
A
A
B45
A160V
1,65
161
L
Спираль
0
L
L
L
L
L
L
L
162
E
Спираль
13
E
E
E
E
E
E
E
163
L
Спираль
87
L
L
L
L
L
L
L
164
D
Спираль
29
D
D
D
D
D
D
D
165
F
Спираль
2
F
F
F
F
I
I
F
166
L
Спираль
89
L
L
L
L
T
T
L
B45
L166V
1,67
L166E
1,62
L166C
1,34
L166I
1,28
L166T
1,25
167
N
Спираль
56
N
N
N
N
T
T
N
B45
N167T
1,43
N167M
1,37
N167Q
1,3
N167L
1,29
N167A
1,22
168
A
Спираль
16
A
A
A
A
A
A
A
169
M
Спираль
10
M
M
M
M
I
I
M
170
P
Спираль
70
P
P
P
P
P
P
P
171
L
Спираль
30
L
L
L
L
L
L
L
172
F
Виток
4
F
F
F
F
F
F
F
173
A
Клубок
48
A
A
A
A
R
R
A
B45
A173F
1,56
A173T
1,56
174
I
Клубок
45
I
I
I
I
I
I
I
175
N
Виток
118
N
N
N
N
R
R
R
176
N
Виток
112
N
N
N
N
N
N
E
177
Q
Клубок
12
Q
Q
Q
Q
E
Q
Q
B45
Q177C
1,78
Q177S
1,48
Q177T
1,3
Q177P
1,21
178
Q
Виток
16
Q
Q
Q
Q
E
E
E
B45
Q178K
1,69
179
V
Виток
21
V
V
V
V
V
V
V
B45
V179I
2,06
V179L
1,67
180
P
Виток
2
P
P
P
P
P
P
P
B45
P180A
1,7
P180S
1,51
P180L
1,51
P180M
1,38
181
L
Виток
3
L
L
L
L
L
L
L
182
L
Спираль
a5
0
L
L
L
L
L
L
L
183
M
Спираль
1
M
M
M
M
M
M
M
184
V
Спираль
1
V
V
V
V
V
V
V
185
Y
Спираль
6
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
186
A
Спираль
0
A
A
A
A
A
A
A
187
Q
Спираль
2
Q
Q
Q
Q
Q
Q
Q
188
A
Спираль
1
A
A
A
A
A
A
A
189
A
Спираль
0
A
A
A
A
A
A
A
190
N
Спираль
1
N
N
N
N
N
N
N
191
L
Спираль
5
L
L
L
L
L
L
L
192
H
Спираль
0
H
H
H
H
H
H
H
193
L
Спираль
1
L
L
L
L
L
L
L
194
L
Спираль
5
L
L
L
L
L
L
L
195
L
Спираль
0
L
L
L
L
L
L
L
196
L
Спираль
0
L
L
L
L
L
L
L
197
R
Спираль
7
R
R
R
R
R
R
R
198
D
Спираль
0
D
D
D
D
D
D
D
199
A
Спираль
2
A
A
A
A
A
A
A
200
S
Спираль
10
S
S
S
S
S
S
S
201
L
Спираль
16
L
L
L
L
L
L
L
B45
L201V
1,27
202
F
Спираль
9
F
F
F
F
F
F
Y
203
G
Виток
0
G
G
G
G
G
G
G
204
S
Виток
101
S
S
S
S
S
S
R
205
E
Виток
66
E
E
E
E
E
E
E
206
F
Виток
3
F
F
F
F
W
W
F
B45
F206L
2,37
F206I
1,47
F206T
1,46
F206W
1,45
207
G
Виток
88
G
G
G
G
G
G
G
208
L
Клубок
12
L
L
L
L
M
T
L
209
T
Клубок
87
T
T
T
T
A
A
T
B45
T209E
1,86
T209R
1,7
T209D
1,66
T209L
1,59
T209V
1,3
T209C
1,22
210
S
Спираль
a6
126
S
S
S
S
S
S
S
B45
S210P
2,15
S210T
1,78
S210I
1,46
S210R
1,25
211
Q
Спираль
95
Q
Q
Q
Q
S
S
Q
B45
Q211I
1,9
Q211R
1,74
Q211G
1,55
Q211T
1,44
Q211P
1,33
Q211L
1,22
212
E
Спираль
40
E
E
E
E
D
D
E
213
I
Спираль
35
I
I
I
I
V
V
I
B45
I213V
1,71
I213T
1,66
I213L
1,64
I213M
1,53
I213Q
1,5
I213N
1,28
I213G
1,21
214
Q
Спираль
58
Q
Q
Q
Q
N
N
Q
B21
Q214W
3,46
215
R
Спираль
82
R
R
R
R
Q
Q
R
216
Y
Спираль
1
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
217
Y
Спираль
17
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
218
E
Спираль
86
E
E
E
E
Q
Q
E
B45
E218T
1,76
E218A
1,65
E218H
1,62
E218S
1,55
E218I
1,51
E218V
1,33
E218Y
1,29
E218W
1,21
E218D
1,21
219
R
Спираль
28
R
R
R
R
E
E
R
B21
R219N
1,63
220
Q
Спираль
6
Q
Q
Q
Q
Q
Q
Q
221
A
Спираль
66
A
A
A
A
I
I
V
B45
A221L
2,21
A221Y
1,86
A221V
1,84
A221K
1,81
A221I
1,62
A221D
1,48
A221G
1,43
A221H
1,42
A221W
1,3
A221R
1,28
A221T
1,25
222
E
Спираль
70
E
E
E
E
R
R
E
B45
E222G
1,89
E222M
1,75
E222K
1,72
E222T
1,67
E222D
1,39
E222I
1,36
223
K
Спираль
16
K
K
K
K
Y
Y
R
224
T
Спираль
33
T
T
T
T
T
T
T
225
R
Спираль
67
R
R
R
R
E
E
R
B45
R225V
4,65
R225Q
2,37
R225M
2,32
R225F
2,07
R225L
2,04
R225G
1,58
R225I
1,58
R225Y
1,55
R225C
1,54
R225N
1,46
226
E
Спираль
66
E
E
E
E
E
E
D
B45
E226D
2,17
E226S
2,13
E226V
1,68
E226C
1,52
E226Y
1,46
E226R
1,33
E226A
1,24
227
Y
Спираль
3
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
228
S
Спираль
11
S
S
S
S
S
S
S
229
D
Спираль
31
D
D
D
D
N
N
D
230
Y
Спираль
17
Y
Y
Y
Y
H
H
H
B45
Y230A
2,65
Y230L
1,83
Y230S
1,22
231
C
Спираль
1
C
C
C
C
C
C
C
232
A
Спираль
27
A
A
A
A
V
V
V
233
R
Спираль
87
R
R
R
R
Q
Q
Q
B45
R233K
2,13
R233D
1,96
R233Q
1,91
R233G
1,56
R233I
1,41
R233A
1,26
R233Y
1,2
234
W
Спираль
31
W
W
W
W
W
W
W
B45
W234V
2,15
W234M
2,15
W234L
2,06
W234I
1,87
W234A
1,55
W234R
1,55
W234F
1,52
W234Y
1,48
W234S
1,22
235
Y
Спираль
12
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
236
N
Спираль
71
N
N
N
N
N
N
N
B45
N236E
2,2
N236K
1,87
N236S
1,43
N236T
1,41
N236L
1,41
237
T
Спираль
50
T
T
T
T
T
T
T
238
G
Спираль
8
G
G
G
G
G
G
G
239
L
Спираль
19
L
L
L
L
L
L
L
240
N
Спираль
100
N
N
N
N
N
N
N
B45
N240Y
1,77
N240A
1,56
N240M
1,53
N240S
1,5
N240T
1,49
N240G
1,46
N240K
1,46
N240F
1,36
N240L
1,28
N240R
1,26
N240W
1,22
N240C
1,22
241
N
Спираль
92
N
N
N
N
N
N
N
B45
N241S
1,7
N241I
1,68
N241W
1,62
N241M
1,57
N241K
1,48
N241Y
1,47
N241V
1,33
N241L
1,27
N241C
1,21
242
L
Спираль
13
L
L
L
L
L
L
L
B45
L242P
2,07
L242V
1,44
243
R
Клубок
76
R
R
R
R
R
R
R
B45
R243M
2,3
R243V
2
R243T
1,84
R243C
1,75
R243K
1,72
R243I
1,68
R243S
1,59
R243Q
1,54
244
G
Клубок
46
G
G
G
G
G
G
G
245
T
Клубок
107
T
T
T
T
T
T
T
B45
T245Q
2,71
T245Y
2,46
T245K
2,4
T245G
2,13
T245A
2,03
T245I
1,96
T245W
1,95
T245H
1,91
T245S
1,89
T245M
1,82
T245D
1,82
T245N
1,77
T245V
1,66
T245R
1,64
T245F
1,34
246
N
Клубок
57
N
N
N
N
N
N
N
B45
N246T
1,73
N246S
1,69
N246G
1,66
N246Q
1,63
247
A
Спираль
a7
0
A
A
A
A
A
A
A
B45
A247E
1,73
A247S
1,73
A247G
1,57
A247P
1,53
248
E
Спираль
60
E
E
E
E
E
E
E
B45
E248S
2,17
E248N
1,55
E248T
1,53
E248L
1,49
E248Y
1,49
E248V
1,42
E248R
1,42
E248F
1,24
249
S
Спираль
58
S
S
S
S
S
S
S
250
W
Спираль
1
W
W
W
W
W
W
W
251
L
Спираль
31
L
L
L
L
L
V
V
252
R
Спираль
67
R
R
R
R
R
R
R
B45
R252N
1,47
R252A
1,4
R252F
1,24
253
Y
Спираль
20
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
254
N
Спираль
0
N
N
N
N
N
N
N
255
Q
Спираль
37
Q
Q
Q
Q
Q
Q
Q
256
F
Спираль
0
F
F
F
F
F
F
F
257
R
Спираль
23
R
R
R
R
R
R
R
258
R
Спираль
2
R
R
R
R
R
R
R
259
D
Спираль
7
D
D
D
D
D
D
D
260
L
Спираль
0
L
L
L
L
L
L
L
261
T
Спираль
20
T
T
T
T
T
T
T
262
L
Спираль
2
L
L
L
L
L
L
L
263
G
Спираль
13
G
G
G
G
G
G
G
264
V
Виток
0
V
V
V
V
V
V
V
265
L
Спираль
15
L
L
L
L
L
L
L
266
D
Спираль
6
D
D
D
D
D
D
D
267
L
Спираль
6
L
L
L
L
L
L
L
268
V
Спираль
3
V
V
V
V
V
V
V
269
A
Спираль
7
A
A
A
A
A
A
A
270
L
Виток
9
L
L
L
L
L
L
L
271
F
Виток
0
F
F
F
F
F
F
F
272
P
Спираль
29
P
P
P
P
P
P
P
273
S
Спираль
2
S
S
S
S
S
S
S
274
Y
Спираль
0
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
275
D
Клубок
22
D
D
D
D
D
D
D
276
T
Виток
30
T
T
T
T
T
T
T
277
R
Виток
58
R
R
R
R
R
R
R
B45
R277Q
1,35
R277G
1,27
R277V
1,23
278
I
Виток
44
I
I
I
I
T
T
T
279
Y
Клубок
4
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
280
P
Клубок
30
P
P
P
P
P
P
P
B45
P280H
1,54
P280C
1,32
P280T
1,29
281
I
Клубок
39
I
I
I
I
I
I
I
B45
I281Q
2,16
I281M
1,93
I281R
1,46
I281K
1,35
I281S
1,31
I281H
1,29
I281A
1,23
282
N
Клубок
42
N
N
N
N
N
N
N
283
T
Лист
0
T
T
T
T
T
T
T
284
S
Лист
72
S
S
S
S
S
S
S
285
A
Клубок
8
A
A
A
A
A
A
A
286
Q
Клубок
6
Q
Q
Q
Q
Q
Q
Q
287
L
Клубок
9
L
L
L
L
L
L
L
288
T
Клубок
2
T
T
T
T
T
T
T
289
R
Клубок
8
R
R
R
R
R
R
R
290
E
Лист
b1
11
E
E
E
E
E
E
E
291
I
Лист
1
I
I
I
I
I
V
V
292
Y
Лист
7
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
293
T
Клубок
8
T
T
T
T
T
T
T
294
D
Клубок
24
D
D
D
D
D
D
D
295
P
Клубок
4
P
P
P
P
P
A
A
296
I
Клубок
3
I
I
I
I
I
I
I
297
G
Клубок
15
G
G
G
G
G
G
G
298
R
Клубок
16
R
R
R
R
R
T
A
299
T
Клубок
48
T
T
T
T
T
V
T
300
N
Клубок
59
N
N
N
N
N
H
G
301
A
Клубок
109
A
A
A
A
A
P
V
302
P
Клубок
63
P
P
P
P
P
S
N
303
S
Клубок
0
S
S
S
S
S
Q
-
258
S303N
1,28
S303P
1,24
304
G
Клубок
67
G
G
G
G
G
A
-
305
F
Клубок
78
F
F
F
F
F
F
M
306
A
Клубок
31
A
A
A
A
A
A
A
258
A306G
1,47
307
S
Клубок
11
S
S
S
S
S
S
S
308
T
Клубок
29
T
T
T
T
T
T
M
309
N
Клубок
20
N
N
N
N
N
T
N
310
W
Спираль
5
W
W
W
W
W
W
W
311
F
Спираль
8
F
F
F
F
F
F
Y
312
N
Спираль
48
N
N
N
N
N
N
N
313
N
Клубок
60
N
N
N
N
N
N
N
314
N
Клубок
96
N
N
N
N
N
N
N
315
A
Клубок
0
A
A
A
A
A
A
A
316
P
Клубок
33
P
P
P
P
P
P
P
317
S
Клубок
65
S
S
S
S
S
S
S
318
F
Спираль
a8
6
F
F
F
F
F
F
F
319
S
Спираль
96
S
S
S
S
S
S
S
320
A
Спираль
58
A
A
A
A
A
A
A
321
I
Спираль
4
I
I
I
I
I
I
I
322
E
Спираль
39
E
E
E
E
E
E
E
323
A
Спираль
98
A
A
A
A
A
A
T
324
A
Спираль
52
A
A
A
A
A
A
A
325
V
Спираль
18
V
I
I
I
I
V
V
326
I
Клубок
24
I
F
F
F
F
I
I
327
R
Клубок
11
R
R
R
R
R
R
R
328
P
Клубок
77
P
P
P
P
P
P
S
329
P
Клубок
53
P
P
P
P
P
P
P
330
H
Клубок
21
H
H
H
H
H
H
H
331
L
Клубок
17
L
L
L
L
L
L
L
332
L
Клубок
3
L
L
L
L
L
L
L
333
D
Лист
21
D
D
D
D
D
D
D
334
F
Лист
6
F
F
F
F
F
F
F
335
P
Лист
13
P
P
P
P
P
P
L
336
E
Клубок
19
E
E
E
E
E
E
E
337
Q
Лист
b2
48
Q
Q
Q
Q
Q
Q
Q
338
L
Лист
11
L
L
L
L
L
L
L
339
T
Лист
13
T
T
T
T
T
T
K
340
I
Лист
0
I
I
I
I
I
I
I
341
F
Лист
30
F
Y
Y
Y
Y
Y
F
342
S
Лист
5
S
S
S
S
S
S
S
343
V
Лист
29
V
A
A
A
A
T
A
344
L
Лист
88
L
S
S
S
S
L
S
345
S
Лист
39
S
S
S
S
S
S
S
346
R
Лист
67
R
R
R
R
R
R
R
347
W
Лист
41
W
W
W
W
W
W
W
348
S
Виток
L1
51
S
S
S
S
S
S
S
349
N
Виток
113
N
S
S
S
S
N
N
350
T
Виток
78
T
T
T
T
T
T
T
351
Q
Лист
b3
36
Q
Q
Q
Q
Q
Q
R
352
Y
Лист
45
Y
H
H
H
H
F
H
353
M
Лист
0
M
M
M
M
M
M
M
354
N
Лист
19
N
N
N
N
N
N
T
355
Y
Лист
4
Y
Y
Y
Y
Y
I
Y
356
W
Лист
1
W
W
W
W
W
W
W
357
V
Клубок
9
V
V
V
V
V
A
R
358
G
Лист
0
G
G
G
G
G
G
G
359
H
Лист
0
H
H
H
H
H
H
H
360
R
Лист
61
R
R
R
R
R
R
T
B21
R360S
1,68
R360N
1,57
R360T
1,38
R360Y
1,29
R360M
1,23
361
L
Лист
13
L
L
L
L
L
L
I
362
E
Лист
20
E
N
N
N
N
E
Q
B21
N362Y
2,25
N362H
1,79
N362W
1,64
N362K
1,57
N362I
1,57
N362D
1,45
N362V
1,45
N362A
1,32
N362L
1,3
N362G
1,26
N362E
1,26
363
S
Лист
8
S
F
F
F
F
S
S
364
R
Лист
40
R
R
R
R
R
R
R
365
T
Лист
10
T
P
P
P
P
P
P
366
I
Виток
1
I
I
I
I
I
I
I
367
R
Виток
70
R
G
G
G
G
A
R
B21
G367H
3,17
G367Q
2,72
G367N
1,97
G367W
1,84
G367T
1,62
G367L
1,58
G367Y
1,45
G367I
1,37
G367A
1,36
368
G
Клубок
21
G
G
G
G
G
G
G
369
S
Клубок
116
S
T
T
T
T
S
A
370
L
Лист
b4
37
L
L
L
L
L
L
L
371
S
Лист
117
S
N
N
N
N
N
I
372
T
Лист
29
T
T
T
T
T
T
T
373
S
Лист
45
S
S
S
S
S
S
S
374
T
Лист
63
T
T
T
T
T
T
T
375
H
Лист
29
H
H
H
H
Q
Q
H
376
G
Лист
23
G
G
G
G
G
G
G
377
N
Клубок
80
N
A
A
A
L
S
N
378
T
Клубок
24
T
T
T
T
T
T
T
379
N
Клубок
106
N
N
N
N
N
N
N
-
-
-
-
-
-
N
-
-
380
T
Клубок
74
T
T
T
T
T
T
T
381
S
Клубок
124
S
S
S
S
S
S
S
382
I
Клубок
20
I
I
I
I
I
I
I
383
N
Лист
b5
76
N
N
N
N
N
N
N
384
P
Лист
66
P
P
P
P
P
P
P
385
V
Лист
42
V
V
V
V
V
V
V
386
T
Лист
99
T
T
T
T
T
T
T
387
L
Лист
5
L
L
L
L
L
L
F
388
Q
Лист
109
Q
Q
Q
Q
Q
Q
Q
389
F
Клубок
3
F
F
F
F
F
F
F
390
T
Виток
66
T
T
T
T
T
T
P
391
S
Виток
56
S
S
S
S
S
S
S
392
R
Клубок
28
R
R
R
R
R
R
R
393
D
Лист
3
D
D
D
D
D
D
D
394
V
Лист
1
V
V
V
V
V
I
V
395
Y
Клубок
8
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
396
R
Лист
b6
31
R
R
R
R
R
R
R
397
T
Лист
6
T
T
T
T
T
T
T
398
E
Лист
35
E
E
E
E
E
E
E
399
S
Лист
3
S
S
S
S
S
S
S
400
Y
Лист
35
Y
Y
Y
Y
N
L
Y
401
A
Лист
1
A
A
A
A
A
A
A
402
G
Лист
0
G
G
G
G
G
G
G
403
I
Лист
0
I
I
I
I
T
L
V
404
N
Лист
0
N
N
N
N
N
N
L
405
I
Лист
53
I
I
I
I
I
I
L
406
L
Клубок
L2
38
L
L
L
L
L
F
W
258
L406M
1,65
-
-
-
-
-
-
-
-
G
-
-
-
-
-
-
-
-
I
407
L
Клубок
114
L
L
L
L
F
I
Y
258
L407W
1,99
408
T
Клубок
107
T
T
T
T
T
T
L
409
T
Клубок
50
T
T
T
T
T
Q
E
410
P
Лист
1
P
P
P
P
P
P
P
411
V
Лист
12
V
V
V
V
V
V
I
412
N
Лист
3
N
N
N
N
N
N
H
413
G
Лист
0
G
G
G
G
G
G
G
414
V
Клубок
0
V
V
V
V
V
V
V
415
P
Клубок
6
P
P
P
P
P
P
P
416
W
Лист
b7
21
W
W
W
W
W
W
T
417
A
Лист
1
A
A
A
A
A
V
V
418
R
Лист
42
R
R
R
R
R
R
R
B21
R418K
1,26
R418T
1,24
419
F
Лист
2
F
F
F
F
F
F
F
420
N
Лист
17
N
N
N
N
N
N
N
421
W
Лист
4
W
W
W
W
F
W
F
422
R
Лист
17
R
R
R
R
I
R
R
423
N
Лист
18
N
N
N
N
N
N
N
424
P
Виток
23
P
P
P
P
P
P
P
425
L
Виток
96
L
L
L
L
Q
L
Q
B21
L425P
1,94
L425G
1,31
426
N
Виток
50
N
N
N
N
N
N
N
427
S
Виток
71
S
S
S
S
I
S
T
B21
S427Y
1,44
428
L
Лист
b8
104
L
L
L
L
Y
L
F
429
R
Лист
57
R
R
R
R
E
R
E
B21
R429I
1,36
-
-
-
-
-
-
R
-
R
430
G
Лист
71
G
G
G
G
G
G
G
431
S
Лист
56
S
S
S
S
A
S
T
B21
S431L
1,63
S431H
1,63
S431G
1,42
S431A
1,3
432
L
Лист
42
L
L
L
L
T
L
A
433
L
Лист
39
L
L
L
L
T
L
N
434
Y
Лист
4
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
435
T
Лист
54
T
T
T
T
S
T
S
B21
T435Y
2,14
T435H
1,43
T435L
1,21
436
I
Клубок
21
I
I
I
I
Q
I
Q
437
G
Клубок
75
G
G
G
G
P
G
P
B21
G437S
1,57
G437N
1,57
G437A
1,43
G437K
1,34
G437R
1,34
438
Y
Клубок
5
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
G437Q
1,33
439
T
Клубок
60
T
T
T
T
Q
T
E
B21
T439M
1,22
T439Q
1,21
440
G
Клубок
77
G
G
G
G
G
G
S
441
V
Клубок
13
V
V
V
V
V
V
P
442
G
Лист
b9
67
G
G
G
G
G
G
G
443
T
Лист
37
T
T
T
T
I
T
L
444
Q
Лист
39
Q
Q
Q
Q
Q
Q
Q
445
L
Лист
87
L
L
L
L
L
L
L
446
F
Лист
31
F
F
F
F
F
Q
K
447
D
Лист
41
D
D
D
D
D
D
D
B21
D447N
1,55
D447V
1,52
D447I
1,47
D447S
1,34
D447L
1,33
D447A
1,31
D447E
1,3
D447M
1,21
448
S
Спираль
2
S
S
S
S
S
S
S
449
E
Спираль
31
E
E
E
E
E
E
E
450
T
Спираль
76
T
T
T
T
T
T
T
451
E
Спираль
15
E
E
E
E
E
E
E
452
L
Клубок
2
L
L
L
L
L
L
L
453
P
Клубок
14
P
P
P
P
P
P
P
454
P
Клубок
21
P
P
P
P
P
P
P
455
E
Клубок
38
E
E
E
E
E
E
E
456
T
Клубок
45
T
T
T
T
T
T
T
457
T
Клубок
119
T
T
T
T
T
T
T
458
E
Клубок
95
E
E
E
E
E
E
E
459
R
Клубок
75
R
R
R
R
R
R
R
460
P
Клубок
32
P
P
P
P
P
P
P
461
N
Спираль
34
N
N
N
N
N
N
N
462
Y
Спираль
41
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
463
E
Спираль
57
E
E
E
E
E
E
E
464
S
Спираль
2
S
S
S
S
S
S
S
465
Y
Клубок
3
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
466
S
Клубок
0
S
S
S
S
S
S
S
467
H
Лист
b10
1
H
H
H
H
H
H
H
468
R
Лист
3
R
R
R
R
R
R
R
469
L
Лист
13
L
L
L
L
L
L
L
470
S
Клубок
1
S
S
S
S
S
S
S
471
N
Лист
2
N
N
N
N
H
H
H
472
I
Лист
7
I
I
I
I
I
I
I
473
R
Лист
15
R
R
R
R
G
G
G
B21
R473T
12,6
R473G
5,48
R473A
4,94
R473S
3,04
R473M
1,94
R473N
1,43
R473K
1,42
R473D
1,39
R473Y
1,22
R473N
1,43
474
L
Лист
1
L
L
L
L
L
L
I
475
I
Лист
20
I
I
I
I
I
I
I
476
S
Клубок
L3
2
S
I
I
I
I
S
L
B21
I476Y
1,71
I476H
1,55
I476G
1,48
I476L
1,32
I476S
1,28
I476F
1,25
I476M
1,23
477
G
Виток
126
G
G
G
G
G
S
Q
B21
G477S
2,35
G477A
1,29
478
N
Виток
105
N
N
N
G
N
S
T
B21
N478G
2,96
N478K
1,23
479
T
Клубок
31
T
T
T
T
T
H
R
B21
T479V
2,16
480
L
Клубок
16
L
L
L
L
L
V
L
481
R
Клубок
22
R
R
R
R
R
R
N
482
A
Лист
b11
4
A
A
A
A
A
A
V
483
P
Лист
0
P
P
P
P
P
L
P
484
V
Лист
3
V
V
V
V
V
V
V
485
Y
Лист
1
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
486
S
Лист
0
S
S
S
S
S
S
S
487
W
Лист
1
W
W
W
W
W
W
W
488
T
Лист
1
T
T
T
T
T
T
T
489
H
Лист
8
H
H
H
H
H
H
H
490
R
Виток
39
R
R
R
R
R
R
R
258
R490Q
3,53
491
S
Виток
2
S
S
S
S
S
S
S
492
A
Клубок
0
A
A
A
A
A
A
A
493
D
Клубок
30
D
D
D
D
D
D
D
494
R
Клубок
20
R
R
R
R
R
R
R
495
T
Клубок
49
T
T
T
T
T
T
T
B25
T495N
1,54
496
N
Клубок
5
N
N
N
N
N
N
N
497
T
Лист
60
T
T
T
T
T
T
T
498
I
Лист
9
I
I
I
I
I
I
I
499
A
Клубок
68
A
A
A
A
G
G
G
B25
A499R
1,69
A499S
1,56
A499G
1,52
A499M
1,5
A499C
1,49
A499V
1,42
A499P
1,28
A499W
1,26
500
T
Клубок
41
T
T
T
T
P
P
P
501
N
Клубок
103
N
N
N
N
N
N
N
502
I
Клубок
16
I
I
I
I
R
R
R
B25
I502K
2,45
I502V
2,26
I502A
1,97
I502T
1,96
I502N
1,83
I502E
1,83
I502L
1,71
I502Q
1,61
I502P
1,58
I502H
1,57
I502R
1,54
I502F
1,48
I502S
1,42
I502Y
1,37
503
I
Лист
b13
0
I
I
I
I
I
I
I
504
T
Лист
5
T
T
T
T
T
T
T
505
Q
Лист
8
Q
Q
Q
Q
Q
Q
Q
506
I
Лист
12
I
I
I
I
I
I
I
507
P
Лист
3
P
P
P
P
P
P
P
508
A
Спираль
0
A
A
A
A
A
A
A
509
V
Спираль
8
V
V
V
V
V
V
V
B25
V509T
1,26
510
K
Спираль
0
K
K
K
K
K
K
K
511
G
Клубок
0
G
G
G
G
G
G
G
512
N
Клубок
13
N
N
N
N
R
R
N
258
N512Y
1,75
N512P
1,71
N512M
1,42
N512R
1,41
N512K
1,34
N512G
1,31
N512Q
1,26
N512I
1,21
N512W
1,21
513
F
Лист
b14
47
F
F
F
F
F
F
L
B25
F513G
1,84
F513V
1,71
F513P
1,67
F513L
1,56
F513H
1,44
514
L
Лист
23
L
L
L
L
L
L
L
515
F
Клубок
29
F
F
F
F
F
F
F
B25
F515H
2,24
516
N
Клубок
125
N
N
N
N
N
N
N
517
G
Клубок
13
G
G
G
G
G
G
G
B25
G517A
2,22
G517H
1,58
G517S
1,44
518
S
Клубок
37
S
S
S
S
S
S
S
B25
S518D
3,21
S518A
2,55
S518Y
2,53
S518K
2,39
S518V
2,37
S518L
2,36
S518G
2,26
S518H
2,25
S518E
2,24
S518R
2,18
S518T
2,08
S518C
1,76
519
V
Лист
7
V
V
V
V
V
V
V
520
I
Лист
34
I
I
I
I
I
I
I
B25
I520V
3,39
I520R
2,18
I520Y
2,08
I520C
2,05
I520K
1,93
I520M
1,74
I520E
1,67
I520L
1,49
I520F
1,34
I520S
1,31
I520A
1,25
521
S
Клубок
110
S
S
S
S
S
S
S
B25
S521G
2,71
S521L
2,52
S521V
2,47
S521A
2,34
S521D
2,09
S521I
1,73
S521Q
1,56
S521F
1,54
S521P
1,52
S521N
1,44
S521M
1,4
522
G
Клубок
2
G
G
G
G
G
G
G
523
P
Клубок
4
P
P
P
P
P
P
P
524
G
Клубок
46
G
G
G
G
G
G
G
525
F
Клубок
11
F
F
F
F
F
F
F
526
T
Клубок
0
T
T
T
T
T
T
T
B25
T526L
1,23
527
G
Клубок
13
G
G
G
G
G
G
G
528
G
Клубок
2
G
G
G
G
G
G
G
529
D
Клубок
47
D
D
D
D
D
D
D
530
L
Лист
b15
8
L
L
L
L
V
V
L
531
V
Лист
2
V
V
V
V
V
V
V
532
R
Лист
50
R
R
R
R
R
R
R
B25
R532K
2,58
R532C
1,98
R532W
1,63
R532S
1,59
R532L
1,53
R532V
1,49
R532H
1,37
R532G
1,24
533
L
Лист
6
L
L
L
L
L
L
L
534
N
Клубок
52
N
N
N
N
N
N
N
B25
N534S
2,2
N534Y
1,95
N534Q
1,9
N534W
1,78
N534E
1,58
N534H
1,51
N534D
1,49
N534L
1,48
535
N
Клубок
62
N
N
N
N
R
R
N
B25
N535M
2,96
N535Q
2,26
N535E
1,88
N535F
1,68
N535K
1,68
N535L
1,48
N535R
1,48
N535A
1,43
N535S
1,29
N535I
1,23
N535D
1,21
536
S
Клубок
50
S
S
S
S
N
N
S
537
G
Лист
92
G
G
G
G
N
N
G
258
G537W
2,23
G537E
2,02
G537F
1,9
G537A
1,77
G537K
1,69
G537S
1,48
G537Q
1,48
G537Y
1,43
G537R
1,4
G537D
1,33
G537V
1,33
G537N
1,3
G537H
1,3
G537T
1,25
538
N
Лист
72
N
N
N
N
G
G
N
258
N538G
2,22
N538T
2
N538S
1,95
N538V
1,57
N538W
1,5
N538L
1,47
N538H
1,43
N538Q
1,42
N538I
1,41
N538D
1,32
N538V
1,57
N538W
1,5
N538L
1,47
N538Q
1,42
N538I
1,4
N538E
1,3
N538P
1,25
N538A
1,23
N538M
1,2
539
N
Клубок
4
N
N
N
N
N
N
N
540
I
Лист
b16
2
I
I
I
I
I
I
I
541
Q
Лист
50
Q
Q
Q
Q
Q
Q
Q
258
Q541Y
2,48
Q541W
1,35
Q541F
1,27
542
N
Лист
23
N
N
N
N
N
N
N
543
R
Лист
35
R
R
R
R
R
R
R
544
G
Лист
38
G
G
G
G
G
G
G
545
Y
Лист
37
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
258
Y545F
1,3
546
L
Лист
8
L
I
I
I
I
I
L
547
E
Клубок
101
E
E
E
E
E
E
E
258
E547A
1,88
E547S
1,82
E547G
1,72
E547I
1,25
E547M
1,24
E547Q
1,21
548
V
Клубок
4
V
V
V
V
V
V
V
549
P
Клубок
50
P
P
P
P
P
P
P
550
I
Клубок
7
I
I
I
I
I
I
I
551
Q
Клубок
90
Q
Q
Q
Q
Q
Q
Q
B25
Q551C
2,51
Q551R
2,17
Q551A
1,98
Q551S
1,76
Q551D
1,54
Q551Y
1,34
552
F
Клубок
103
F
F
F
F
F
F
F
B25
F552T
1,72
F552V
1,69
F552W
1,57
553
I
Клубок
75
I
I
I
I
T
T
T
B25
I553Q
2,41
I553D
2,15
I553R
1,96
I553E
1,83
I553A
1,78
I553F
1,71
I553L
1,69
I553P
1,65
I553G
1,5
I553W
1,49
I553S
1,49
I553T
1,47
554
S
Клубок
120
S
S
S
S
S
S
S
B25
S554K
1,87
S554R
1,56
S554D
1,45
S554H
1,43
S554N
1,25
S554G
1,22
555
T
Клубок
79
T
T
T
T
T
T
T
B25
T555V
2,13
T555M
1,64
T555I
1,32
T555W
1,3
556
S
Клубок
24
S
S
S
S
S
S
S
B25
S556A
2,65
S556W
2,25
S556G
2,05
S556D
1,6
S556C
1,41
S556P
1,27
557
T
Клубок
21
T
T
T
T
T
T
T
B25
T557I
1,75
T557R
1,61
T557G
1,55
T557S
1,39
T557Q
1,38
T557M
1,31
T557V
1,28
T557A
1,27
T557C
1,26
558
R
Лист
b17
65
R
R
R
R
R
R
R
B25
R558Y
2,16
R558K
2,01
R558T
1,95
R558L
1,83
R558N
1,79
R558G
1,75
R558S
1,59
R558E
1,53
R558I
1,43
R558D
1,4
R558F
1,37
R558P
1,27
R558V
1,26
R558M
1,23
R558H
1,22
559
Y
Лист
1
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
B25
Y559W
1,26
560
R
Лист
38
R
R
R
R
R
R
R
561
V
Лист
7
V
V
V
V
V
V
V
562
R
Лист
21
R
R
R
R
R
R
R
563
V
Лист
5
V
V
V
V
V
V
V
B25
V563N
4,65
V563L
2,56
V563I
2,1
V563A
1,39
564
R
Лист
7
R
R
R
R
R
R
R
B25
R564H
4,11
R564V
3,28
R564W
3,03
R564I
3,02
R564K
2,71
R564C
1,79
R564S
1,42
R564A
1,36
565
Y
Лист
5
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
B25
Y565F
3,4
566
A
Лист
55
A
A
A
A
A
A
A
567
S
Лист
2
S
S
S
S
S
S
S
568
V
Клубок
29
V
V
V
V
V
V
V
B25
V568C
2,44
V568A
2,31
V568E
1,81
V568F
1,8
V568R
1,65
V568G
1,54
V568L
1,52
V568S
1,5
V568W
1,39
V568N
1,31
569
T
Клубок
33
T
T
T
T
T
T
T
B25
T569I
1,75
T569M
1,67
T569G
1,29
T569S
1,2
570
P
Клубок
69
P
P
P
P
S
S
P
258
P570M
2,08
P570F
1,6
P570W
1,45
P570T
1,38
571
I
Лист
b18
4
I
I
I
I
I
I
I
B25
I571G
4,18
I571V
3,13
I571T
3,07
I571C
2,72
I571L
2,2
572
Q
Лист
32
Q
Q
R
R
E
E
H
258
Q572H
2,51
Q572P
2,29
Q572R
2,03
Q572I
1,96
Q572K
1,69
Q572F
1,65
Q572S
1,54
Q572A
1,38
Q572V
1,35
Q572W
1,3
Q572M
1,28
573
L
Лист
7
L
L
L
L
L
L
L
B25
L573A
3,14
L573T
3,09
L573G
2,12
574
S
Лист
21
S
S
S
S
N
N
S
258
S574R
1,22
575
V
Лист
11
V
V
V
V
V
V
V
576
N
Лист
26
N
N
N
N
N
N
N
577
W
Лист
6
W
W
W
W
L
W
W
258
W577R
3,24
W577F
2,01
W577K
1,74
W577M
1,72
W577V
1,63
W577A
1,56
W577T
1,47
W577H
1,33
W577G
1,28
W577I
1,24
578
G
Виток
109
G
G
G
G
G
G
G
579
N
Виток
120
N
N
N
N
N
N
N
580
S
Клубок
66
S
S
S
S
S
S
S
581
N
Клубок
85
N
N
N
N
S
S
N
258
N581S
1,83
N581K
1,57
582
I
Клубок
14
I
I
I
I
I
I
I
B25
I582V
1,69
583
F
Лист
b19
3
F
F
F
F
F
F
F
B25
F583S
2,8
584
S
Лист
71
S
S
S
S
T
T
S
B21
S584R
1,21
585
S
Лист
33
S
S
S
S
N
N
S
258
S585R
3,33
S585T
2,53
S585K
2,17
S585H
2,14
S585Q
2,04
S585L
1,86
S585W
1,69
S585N
1,59
S585M
1,3
S585F
1,3
S585I
1,27
586
I
Лист
73
I
I
I
I
T
T
T
258
I586M
4,11
I586Y
2,77
I586P
2,19
I586A
1,97
I586S
1,84
I586K
1,83
I586R
1,77
I586F
1,73
I586G
1,65
I586V
1,6
I586Q
1,48
I586N
1,41
I586L
1,35
I586W
1,32
I586T
1,26
587
V
Лист
17
V
V
V
V
L
L
V
258
V587H
2,82
V587C
2,28
V587N
1,97
V587S
1,85
V587D
1,76
V587R
1,7
V587A
1,7
V587T
1,65
V587K
1,57
V587E
1,43
V587W
1,4
V587L
1,4
V587Y
1,4
V587F
1,37
588
P
Клубок
77
P
P
P
P
P
P
P
589
A
Клубок
38
A
A
A
A
A
A
A
590
T
Клубок
6
T
T
T
T
T
T
T
B25
T590A
1,8
T590D
1,56
T590F
1,54
T590S
1,3
T590G
1,26
591
A
Клубок
42
A
A
A
A
A
A
A
258
A591H
2,82
A591V
2,28
A591N
1,97
A591T
1,85
A591D
1,76
A591R
1,7
A591S
1,7
A591K
1,65
A591C
1,65
A591E
1,43
A591W
1,4
A591L
1,4
A591Y
1,4
A591F
1,37
A591P
1,26
A591Q
1,2
592
T
Клубок
87
T
T
T
T
A
A
A
258
T592Q
2,9
T592M
2,39
T592A
2,02
T592Y
1,82
T592N
1,8
T592K
1,78
T592P
1,7
T592S
1,63
T592D
1,57
T592I
1,41
T592G
1,33
T592F
1,23
T592V
1,21
T592W
1,21
593
S
Виток
102
S
S
S
S
S
S
S
B21
S593Y
1,66
S593G
1,44
S593R
1,24
S593V
1,24
594
L
Виток
130
L
L
L
L
L
L
L
595
D
Клубок
63
D
D
D
D
D
D
D
B21
D595R
1,83
D595S
1,77
D595G
1,74
D595H
1,72
D595N
1,57
D595V
1,55
D595F
1,54
D595K
1,52
D595T
1,5
D595Y
1,4
D595I
1,36
D595M
1,3
D595A
1,25
D595P
1,21
596
N
Клубок
100
N
N
N
N
N
N
N
B21
N596V
2,7
N596T
2,45
N596I
2,15
N596S
2,14
N596G
1,97
N596L
1,7
N596W
1,54
N596Y
1,33
N596H
1,3
N596P
1,3
N596D
1,29
597
L
Клубок
64
L
L
L
L
L
L
L
598
Q
Клубок
57
Q
Q
Q
Q
Q
Q
Q
B21
Q598V
1,5
Q598G
1,27
Q598D
1,22
Q598I
1,21
599
S
Клубок
35
S
S
S
S
S
S
S
B25
S599C
1,72
S599Q
1,72
S599L
1,6
S599Y
1,48
S599T
1,47
S599V
1,44
S599A
1,27
S599P
1,24
600
R
Клубок
58
R
R
R
R
G
G
R
601
D
Лист
b20
20
D
N
N
N
D
D
D
B21
N601Y
1,47
N601F
1,33
N601V
1,33
N601G
1,25
N601M
1,24
N601E
1,22
602
F
Лист
55
F
F
F
F
F
F
F
B25
F602M
2,53
603
G
Лист
27
G
G
G
G
G
G
G
B25
G603M
2,12
G603A
2,04
G603Y
2,04
G603R
1,88
G603S
1,75
G603L
1,57
G603W
1,46
G603D
1,3
G603T
1,23
604
Y
Клубок
4
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
605
F
Клубок
108
F
F
F
F
V
V
F
258
F605S
2,2
F605W
1,91
F605R
1,89
F605M
1,85
F605A
1,63
F605I
1,56
F605C
1,52
F605V
1,49
F605K
1,45
F605I
1,56
F605D
1,39
F605Y
1,38
F605N
1,38
F605Q
1,35
F605G
1,34
F605E
1,27
F605P
1,25
606
E
Клубок
86
E
E
E
E
E
E
E
B21
E606R
3,03
E606H
2,38
E606K
2,27
E606F
2,19
E606Q
2,12
E606W
1,83
E606G
1,78
E606Y
1,76
E606M
1,74
E606T
1,64
E606A
1,51
E606I
1,37
E606L
1,34
E606N
1,28
607
S
Клубок
9
S
S
S
S
I
I
S
258
S607R
2,59
S607C
1,58
S607T
1,58
S607I
1,55
S607Q
1,48
S607G
1,34
S607D
1,31
S607E
1,27
S607V
1,26
608
T
Лист
14
T
T
R
R
N
N
T
258
T608R
2,35
T608S
2,24
T608V
2,2
T608L
1,88
T608F
1,7
T608G
1,5
T608Y
1,47
T608A
1,33
T608K
1,32
T608W
1,23
T608Q
1,22
609
N
Лист
40
N
N
N
N
N
N
N
B25
N609G
2,52
N609P
2,4
N609L
2,23
N609R
2,2
N609S
1,93
N609V
1,91
N609F
1,46
N609I
1,31
610
A
Клубок
0
A
A
A
A
A
A
A
B25
A610G
2,13
A610F
1,45
A610P
1,29
A610L
1,28
611
F
Клубок
90
F
F
F
F
F
F
F
B25
F611L
2,19
F611K
1,58
F611G
1,48
F611W
1,44
F611V
1,38
612
T
Клубок
73
T
T
T
T
T
T
T
B25
T612F
2,32
T612H
2,07
T612G
1,36
T612E
1,35
T612N
1,31
T612D
1,23
T612P
1,21
613
S
Клубок
89
S
S
S
S
S
S
S
B25
S613M
2,85
S613T
1,98
S613W
1,58
S613V
1,54
S613N
1,5
S613R
1,47
S613Y
1,33
S613G
1,25
614
A
Лист
b22
51
A
A
A
A
A
A
V
B25
A614M
2,07
A614S
2,01
A614L
1,73
A614H
1,66
A614V
1,66
A614R
1,64
A614G
1,55
A614Y
1,35
A614D
1,2
A614R
1,64
615
T
Лист
14
T
T
T
T
T
T
T
616
G
Лист
50
G
G
G
G
G
G
G
617
N
Лист
31
N
N
N
N
N
N
N
B25
N617V
2,25
N617Q
1,96
N617G
1,96
N617K
1,76
N617M
1,57
N617R
1,56
N617C
1,25
N617L
1,23
618
V
Лист
17
V
V
V
V
I
I
V
258
V618N
1,82
V618H
1,51
V618W
1,44
V618R
1,4
V618G
1,31
V618L
1,3
V618D
1,29
V618T
1,24
619
V
Лист
10
V
V
V
V
V
V
V
620
G
Лист
2
G
G
G
G
G
G
G
621
V
Лист
4
V
V
V
V
A
V
V
622
R
Лист
61
R
R
R
R
R
R
R
623
N
Клубок
89
N
N
N
N
N
N
N
624
F
Клубок
0
F
F
F
F
F
F
F
B25
F624A
1,27
F624M
625
S
Клубок
123
S
S
S
S
S
S
S
626
E
Клубок
83
E
E
E
E
A
A
E
258
E626K
3,16
E626G
2,62
E626R
2,01
E626T
1,84
E626H
1,81
E626A
1,71
E626N
1,45
E626I
1,44
E626Y
1,43
E626Q
1,37
E626P
1,31
E626S
1,29
627
N
Клубок
98
N
N
N
N
N
N
N
628
A
Клубок
19
A
A
A
A
A
A
A
B25
A628V
2,38
A628F
2,05
A628K
1,86
A628Q
1,81
A628W
1,62
A628S
1,59
A628R
1,49
A628G
1,49
A628L
1,42
A628I
1,21
A628D
1,21
629
G
Клубок
42
G
G
G
G
E
E
R
258
G629M
1,57
G629Q
1,42
G629R
1,4
G629P
1,36
G629A
1,32
G629S
1,28
G629T
1,28
G629E
1,23
630
V
Лист
b23
2
V
V
V
V
V
V
V
B25
V630A
1,9
V630C
1,62
631
I
Лист
12
I
I
I
I
I
I
I
632
I
Лист
8
I
I
I
I
I
I
I
633
D
Клубок
4
D
D
D
D
D
D
D
634
R
Лист
7
R
R
R
R
R
R
R
635
F
Лист
23
F
F
F
F
F
F
F
636
E
Лист
0
E
E
E
E
E
E
E
637
F
Лист
15
F
F
F
F
F
F
F
638
I
Лист
12
I
I
I
I
I
I
I
639
P
Лист
6
P
P
P
P
P
P
P
640
V
Виток
33
V
V
V
V
V
V
V
641
T
Виток
113
T
T
T
T
T
T
T
B25
T641P
3,01
T641H
2,65
T641A
2,45
T641L
2,43
T641Q
2,31
T641Y
2,21
T641E
2,1
T641I
1,96
T641S
1,91
T641V
1,82
T641D
1,57
T641G
1,21
642
A
Клубок
3
A
A
A
A
A
A
A
643
T
Клубок
117
T
T
T
T
T
T
T
B25
T643L
2,72
T643A
2,09
T643Q
2,04
T643H
1,94
T643S
1,58
T643D
1,53
T643M
1,51
T643C
1,38
T643R
1,26
644
F
F
F
F
F
F
F
F
645
E
E
E
E
E
E
E
E
B25
E645T
2,28
E645M
2,26
E645L
1,8
E645Y
1,77
E645A
1,73
E645N
1,71
E645V
1,67
E645P
1,65
E645I
1,61
E645W
1,48
E645C
1,28
E645S
1,21
646
A
A
A
A
A
A
A
A
B25
A646S
1,96
A646Y
1,95
A646D
1,78
A646E
1,65
A646M
1,57
A646F
1,51
A646H
1,46
A646V
1,41
A646W
1,37
A646I
1,37
A646C
1,27
A646C
1,27
647
E
E
E
E
E
E
K
E
648
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
649
D
D
D
D
D
D
D
D
650
L
L
L
L
L
L
L
L
651
E
E
E
E
E
E
E
E
Таблица 5
Положение MP258
А.к. MP258
Остов
Вариант
FAE
Вариант
FAE
Вариант
FAE
Вариант
FAE
Вариант
FAE
Вариант
FAE
Вариант
FAE
Вариант
FAE
50
L
B45
L50W
1,06
L50M
1,05
L50E
0,98
L50T
0,89
L50G
0,73
53
A
B45
A53N
1,19
A53I
1,15
A53W
1,13
A53L
1,08
A53M
1,06
A53S
0,55
54
S
B45
S54M
1,16
S54Y
1,13
S54H
1,11
S54L
1,08
S54V
1,03
S54N
0,99
S54E
0,95
S54T
0,89
S54D
0,87
S54W
0,57
57
Q
B45
Q57C
1,19
Q57E
1,14
Q57S
1,13
Q57W
1,13
Q57F
0,91
65
R
B45
R65M
1,19
R65T
1,15
R65K
1,04
R65L
0,99
R65V
0,94
R65F
0,87
R65E
0,74
R65P
0,53
R65W
0,50
67
L
B45
L67P
1,12
L67Q
1,11
L67W
0,54
L67A
0,52
L67E
0,52
L67Y
0,51
L67T
0,51
L67R
0,50
L67S
0,49
L67C
0,48
L67D
0,48
L67V
0,46
L67G
0,44
68
G
B45
G68D
1,16
G68K
1,08
G68M
0,75
G68L
0,62
G68V
0,60
G68S
0,54
G68I
0,50
G68N
0,50
G68P
0,48
G68W
0,37
70
L
B45
L70S
1,16
L70T
1,11
L70Q
1,10
L70A
0,98
L70F
0,97
L70C
0,97
L70N
0,96
L70G
0,92
L70Y
0,92
L70V
0,92
L70P
0,90
L70R
0,87
L70D
0,85
71
G
B45
G71D
1,12
G71E
1,11
G71F
1,10
G71N
1,00
G71R
1,00
G71K
0,96
G71A
0,88
G71I
0,87
G71Q
0,79
G71C
0,75
G71V
0,72
G71L
0,61
G71Y
0,26
G71W
0,25
G71T
0,22
72
V
B45
V72S
0,85
V72R
0,84
V72L
0,81
V72F
0,79
V72Y
0,75
V72I
0,74
V72N
0,72
V72H
0,66
V72A
0,66
V72W
0,64
V72C
0,64
V72K
0,55
V72E
0,35
V72P
0,28
73
P
B45
P73F
1,14
P73R
1,11
P73V
0,80
P73A
0,33
74
F
B45
F74N
1,19
F74T
1,15
F74W
1,04
F74L
1,00
F74H
0,91
F74K
0,88
F74A
0,82
F74Y
0,80
F74C
0,78
F74M
0,37
75
A
B45
A75D
1,03
A75F
0,94
A75R
0,90
A75V
0,83
A75L
0,59
A75T
0,59
A75G
0,57
A75I
0,29
76
G
B45
G76K
1,15
G76W
0,94
G76Q
0,91
G76H
0,54
G76C
0,52
G76N
0,51
G76L
0,50
G76F
0,48
77
Q
B45
Q77V
1,15
Q77F
1,13
Q77Y
1,08
Q77R
0,96
79
A
B45
A79E
0,98
A79G
0,71
A79F
0,57
80
S
B45
S80I
1,20
S80T
0,54
83
S
B45
S83T
1,19
S83V
0,60
S83I
0,60
S83P
0,58
S83W
0,53
87
G
B45
G87Y
1,10
G87S
1,05
G87F
1,01
G87L
0,97
G87V
0,92
G87T
0,69
G87Q
0,50
G87I
0,46
91
P
B45
P91I
1,17
P91Q
1,14
P91W
1,13
P91G
1,05
P91F
1,01
P91M
0,67
P91L
0,55
P91V
0,55
P91K
0,54
P91C
0,53
P91H
0,53
P91A
0,50
92
S
B45
S92K
1,03
S92W
0,85
S92R
0,76
S92M
0,70
S92A
0,39
S92P
0,32
93
G
B45
G93E
0,93
G93N
0,90
G93V
0,86
G93L
0,86
G93A
0,83
G93T
0,82
G93S
0,80
G93K
0,75
G93W
0,74
G93C
0,72
G93R
0,69
G93Y
0,53
94
R
B45
R94E
0,99
R94K
0,95
R94V
0,95
R94G
0,92
R94A
0,88
R94W
0,88
R94N
0,77
R94I
0,71
R94M
0,70
95
D
B45
D95W
1,10
D95T
0,94
D95L
0,87
D95R
0,83
D95K
0,80
D95S
0,64
D95E
0,50
D95A
0,28
106
Q
B45
Q106P
1,08
Q106L
1,08
Q106N
0,98
Q106Y
0,96
Q106T
0,52
108
V
B45
V108G
1,14
V108K
1,14
V108S
1,06
V108C
1,04
V108E
0,95
V108W
0,83
109
R
258
R109K
1,07
R109A
1,05
R109Q
1,02
R109W
0,97
R109H
0,92
R109L
0,91
R109E
0,91
R109G
0,86
R109T
0,85
R109I
0,84
R109D
0,83
R109F
0,79
R109M
0,74
R109C
0,73
R109Y
0,49
R109P
0,07
110
Q
258
Q110K
1,19
Q110D
1,18
Q110I
1,18
Q110M
1,14
Q110N
1,13
Q110E
1,09
Q110S
1,09
Q110L
0,89
Q110C
0,84
Q110A
0,77
Q110W
0,73
Q110G
0,70
Q110P
0,15
111
Q
258
Q111V
1,14
Q111W
1,08
Q111N
1,01
Q111F
1,01
Q111P
0,85
Q111T
0,79
Q111C
0,77
Q111Y
0,50
Q111D
0,25
112
I
B45
I112K
0,93
I112G
0,84
I112M
0,64
I112C
0,57
I112T
0,57
I112E
0,39
I112Y
0,28
I112N
0,28
I112S
0,27
I112F
0,27
I112D
0,26
I112R
0,24
I112W
0,24
113
T
B45
T113W
0,98
T113F
0,82
T113C
0,75
T113P
0,73
T113I
0,61
114
E
258
E114Q
1,15
E114W
1,13
E114C
0,79
E114R
0,41
E114P
0,09
115
N
B45
N115I
0,96
N115Y
0,93
N115M
0,91
N115S
0,88
N115V
0,87
N115D
0,82
N115L
0,69
N115C
0,61
N115W
0,57
N115K
0,51
N115R
0,35
N115H
0,24
118
N
B45
N118W
1,05
N118K
0,99
N118Y
0,92
N118R
0,84
N118M
0,60
119
T
B45
T119Y
1,00
T119F
0,95
T119P
0,94
T119W
0,84
T119L
0,78
T119C
0,62
T119G
0,50
T119N
0,42
122
A
B45
A122E
1,11
A122L
1,06
A122S
1,06
A122W
1,04
A122D
1,01
A122V
1,00
A122K
0,96
A122C
0,96
123
R
B45
R123H
0,73
R123A
0,73
R123Y
0,72
R123P
0,63
R123T
0,61
R123V
0,61
R123L
0,61
R123F
0,57
R123G
0,55
R123N
0,49
R123S
0,49
R123M
0,46
R123C
0,43
R123W
0,42
R123D
0,32
R123E
0,28
R123I
0,24
125
Q
B45
Q125V
1,14
Q125I
0,96
Q125K
0,63
129
A
B45
A129E
1,08
A129Y
1,08
A129R
1,07
A129Q
1,06
A129C
1,05
A129M
0,91
A129G
0,90
A129N
0,87
A129F
0,83
A129I
0,83
132
R
B45
R132Y
0,98
R132A
0,96
R132V
0,96
R132M
0,89
R132L
0,86
R132Q
0,80
R132S
0,72
R132E
0,70
R132F
0,68
R132D
0,66
R132G
0,65
R132N
0,59
R132C
0,59
R132P
0,36
133
A
B45
A133D
0,87
A133V
0,85
A133S
0,63
A133T
0,54
A133G
0,47
A133P
0,36
A133H
0,33
A133M
0,32
A133Q
0,32
A133F
0,32
A133E
0,29
A133L
0,26
A133R
0,23
A133Q
136
Q
B45
Q136G
1,06
Q136W
1,03
Q136D
0,96
Q136S
0,92
Q136V
0,59
140
D
B45
D140G
0,92
D140Y
0,73
D140S
0,46
D140T
0,40
D140Q
0,40
D140M
0,36
D140C
0,36
D140K
0,30
D140R
0,24
D140A
0,22
D140L
0,22
142
L
B45
L142H
1,03
L142Q
0,86
L142S
0,78
L142R
0,73
L142A
0,67
L142G
0,67
L142Y
0,66
L142M
0,62
L142W
0,58
L142D
0,52
L142C
0,47
L142E
0,43
143
E
B45
E143K
0,98
E143D
0,98
E143V
0,95
144
N
B45
N144F
1,13
N144P
1,09
N144S
1,07
N144Y
0,94
N144E
0,86
N144G
0,84
N144D
0,52
145
R
B45
R145F
1,16
R145Q
1,02
R145V
0,99
R145T
0,94
R145C
0,69
146
D
B45
D146E
1,16
D146A
1,15
D146P
1,14
D146S
1,11
D146R
1,05
D146N
1,05
D146L
1,01
D146Q
0,95
D146F
0,95
D146G
0,83
D146M
0,80
147
D
B45
N147T
1,02
N147L
1,01
N147Y
0,63
N147K
0,62
N147F
0,61
N147I
0,59
N147P
0,57
N147M
0,55
N147Q
0,49
N147G
0,45
148
A
B45
A148G
1,18
A148Q
1,00
A148M
0,95
A148R
0,90
A148Y
0,87
A148T
0,85
A148S
0,84
A148D
0,83
A148E
0,76
149
R
B45
R149F
1,00
R149Q
0,99
R149H
0,94
R149W
0,94
R149Y
0,87
R149P
0,84
R149G
0,82
R149C
0,24
151
R
B45
R151S
1,06
R151V
0,90
R151K
0,72
R151M
0,69
R151L
0,68
R151G
0,63
R151T
0,56
R151Q
0,52
R151A
0,50
R151I
0,42
R151N
0,42
R151Y
0,39
R151W
0,39
R151E
0,38
R151P
0,32
R151D
0,32
R151F
0,27
152
S
B45
S152K
1,07
S152M
0,98
S152C
0,95
S152Q
0,89
S152L
0,83
S152I
0,76
S152R
0,61
S152G
0,60
S152P
0,47
S152Y
0,44
S152F
0,41
S152W
0,37
S152D
0,32
S152V
0,25
159
I
B45
I159G
0,92
I159D
0,78
I159S
0,59
I159T
0,32
I159R
0,32
I159Y
0,29
I159N
0,28
I159M
0,28
I159P
0,27
I159F
0,26
I159W
0,26
I159E
0,26
I159Q
0,25
I159L
0,25
160
A
B45
A160F
1,12
A160E
0,92
A160P
0,89
A160G
0,85
A160K
0,82
A160T
0,81
A160I
0,75
163
L
B45
L163F
0,80
L163Q
0,72
L163V
0,60
L163M
0,56
L163C
0,28
L163A
0,28
L163K
0,27
L163P
0,26
L163E
0,24
L163G
0,24
L163S
0,24
L163R
0,24
L163D
0,23
L163N
0,23
164
D
B45
D164A
0,90
D164S
0,88
D164G
0,81
D164M
0,81
D164R
0,72
D164N
0,71
D164L
0,63
D164Y
0,56
D164V
0,54
D164F
0,51
D164T
0,49
D164C
0,49
D164I
0,42
D164E
0,30
D164P
0,25
166
L
B45
L166Q
1,07
L166D
1,01
L166M
0,98
L166P
0,98
L166H
0,98
L166G
0,97
L166R
0,96
L166K
0,96
L166S
0,95
L166N
0,92
L166Y
0,73
L166F
0,62
L166S
0,95
167
N
B45
N167R
1,15
N167G
1,13
N167S
1,04
N167C
0,98
N167F
0,92
N167E
0,90
N167D
0,87
N167P
0,83
N167I
0,67
173
A
B45
A173N
1,12
A173P
0,97
A173G
0,92
A173V
0,88
A173S
0,77
A173E
0,56
174
I
B45
I174V
0,91
I174Q
0,89
I174H
0,77
I174K
0,73
I174G
0,72
I174M
0,72
I174E
0,63
I174N
0,59
I174S
0,56
I174R
0,33
I174D
0,32
177
Q
B45
Q177F
1,10
Q177N
1,06
Q177H
1,05
Q177Y
1,01
Q177I
1,00
Q177R
0,96
Q177M
0,95
Q177V
0,93
Q177L
0,89
Q177D
0,78
Q177G
0,74
Q177K
0,40
178
Q
B45
Q178E
0,98
Q178H
0,92
Q178W
0,83
Q178G
0,78
Q178S
0,75
Q178V
0,74
Q178P
0,67
Q178I
0,54
Q178F
0,53
Q178Y
0,50
Q178L
0,37
Q178D
0,31
179
V
B45
V179C
1,01
V179A
0,86
V179N
0,80
V179M
0,80
V179E
0,77
V179S
0,75
V179P
0,67
V179G
0,61
V179R
0,61
V179F
0,44
V179W
0,41
V179D
0,37
180
P
B45
P180C
1,05
P180K
1,00
P180T
0,94
P180V
0,88
P180G
0,83
P180F
0,62
P180R
0,60
P180N
0,56
P180Y
0,53
P180W
0,38
P180D
0,28
201
L
B45
L201C
0,79
L201N
0,67
L201A
0,64
L201P
0,64
L201Q
0,62
L201G
0,61
L201W
0,60
L201Y
0,60
L201H
0,55
L201R
0,54
L201D
0,52
206
F
B45
F206V
1,00
F206C
0,86
F206E
0,76
F206A
0,75
F206Y
0,74
F206Q
0,69
F206G
0,58
F206R
0,53
F206S
0,53
F206D
0,51
F206K
0,49
F206N
0,47
F206P
0,37
208
L
B45
L208F
0,91
L208I
0,79
L208Y
0,71
L208S
0,71
L208E
0,67
L208V
0,66
L208M
0,56
L208H
0,50
L208Q
0,44
L208W
0,44
L208C
0,39
L208G
0,37
L208T
0,35
L208A
0,35
L208P
0,34
L208R
0,30
L208D
0,29
209
T
B45
T209S
0,94
T209Q
0,88
T209I
0,75
T209G
0,68
T209W
0,67
T209F
0,64
T209Y
0,62
T209P
0,28
210
S
B45
S210G
1,13
211
Q
B45
Q211V
1,17
Q211K
1,15
Q211H
1,10
Q211E
1,08
Q211W
1,03
Q211F
1,01
Q211Y
1,01
Q211C
1,00
Q211S
0,94
Q211D
0,54
212
E
B45
E212F
1,05
E212A
0,86
E212V
0,79
E212N
0,78
E212P
0,77
E212C
0,72
E212T
0,68
E212G
0,64
E212L
0,64
E212Q
0,63
E212K
0,61
E212S
0,59
E212R
0,56
213
I
B45
I213C
1,11
I213S
0,98
I213R
0,94
I213E
0,91
I213W
0,74
I213D
0,67
I213Y
0,63
I213F
0,62
I213P
0,59
I213H
0,58
I213A
0,49
214
Q
B21
Q214S
1,12
Q214F
1,05
Q214Y
1,01
Q214D
0,76
Q214V
0,68
Q214C
0,67
Q214E
0,58
Q214I
0,53
Q214T
0,53
Q214H
0,52
Q214L
0,43
Q214G
0,40
Q214K
0,28
Q214R
0,27
215
R
B45
R215V
0,95
R215A
0,94
R215I
0,85
R215N
0,83
R215Y
0,77
R215F
0,75
R215Q
0,73
R215K
0,72
R215S
0,67
R215G
0,66
R215T
0,66
R215P
0,59
R215D
0,56
R215E
0,54
218
E
B45
E218G
1,18
E218L
1,10
E218C
1,10
E218K
1,08
E218R
0,93
E218F
0,92
E218P
0,55
219
R
B21
R219Y
1,15
R219E
1,13
R219W
1,08
R219Q
0,71
R219K
0,63
R219D
0,53
R219P
0,23
R219H
0,07
R219T
0,05
R219M
0,03
R219L
0,01
R219A
0,01
R219V
0,01
R219I
0,01
R219C
0,00
221
A
B45
A221S
1,16
A221C
1,03
A221E
0,91
A221M
0,83
A221P
0,62
A221Q
0,50
222
E
B45
E222C
1,13
E222S
1,11
E222L
1,10
E222F
1,10
E222A
0,98
E222N
0,98
E222V
0,94
E222W
0,90
E222R
0,84
E222P
0,59
225
R
B45
R225W
1,19
R225S
1,17
R225E
1,14
R225A
1,02
R225P
0,87
R225K
0,85
R225T
0,77
226
E
B45
E226T
1,18
E226F
1,17
E226G
1,15
E226W
1,13
E226N
1,11
E226M
1,05
E226I
1,00
E226L
0,98
E226H
0,96
E226Q
0,96
230
Y
B45
Y230F
1,19
Y230M
1,15
Y230R
1,01
Y230C
0,93
Y230T
0,93
Y230D
0,88
Y230N
0,85
Y230G
0,81
Y230I
0,63
Y230V
0,57
Y230P
0,53
233
R
B45
R233E
1,19
R233V
1,10
R233F
1,09
R233N
1,05
R233L
1,03
R233M
1,01
R233S
0,87
R233C
0,78
R233H
0,50
234
W
B45
W234G
1,06
W234K
0,93
W234T
0,63
W234E
0,60
W234D
0,59
W234P
0,46
W234Q
0,45
236
N
B45
N236Q
1,18
N236D
1,16
N236R
1,08
N236A
1,04
N236I
0,93
N236Y
0,89
N236V
0,89
N236G
0,58
N236M
0,54
N236C
0,53
N236W
0,42
240
N
B45
N240I
1,18
N240D
1,17
N240V
1,16
N240E
0,57
N240P
0,44
241
N
B45
N241G
1,17
N241F
1,16
N241Q
1,15
N241E
1,13
N241T
1,12
N241D
1,07
N241H
0,90
N241P
0,50
N241R
0,49
242
L
B45
L242M
0,95
L242I
0,93
L242C
0,83
L242R
0,75
L242S
0,70
L242Q
0,68
L242A
0,66
L242N
0,58
L242F
0,49
L242H
0,46
L242W
0,40
L242G
0,39
L242Y
0,33
L242K
0,32
243
R
B45
R243L
0,98
R243A
0,86
R243Y
0,82
R243F
0,76
R243H
0,73
R243W
0,71
R243G
0,67
R243D
0,57
R243P
0,46
244
G
B45
G244C
0,94
G244L
0,72
G244A
0,71
G244Q
0,60
G244S
0,58
G244D
0,56
G244K
0,54
G244R
0,54
G244Y
0,53
G244E
0,53
G244H
0,47
G244M
0,47
G244N
0,46
G244T
0,37
G244V
0,28
G244P
0,28
G244I
0,26
245
T
B45
T245P
0,96
T245L
0,82
T245C
0,71
246
N
B45
N246A
0,85
N246K
0,84
N246P
0,79
N246E
0,78
N246M
0,77
N246R
0,76
N246F
0,66
N246L
0,61
N246Y
0,60
N246V
0,60
N246I
0,58
247
A
B45
A247C
0,52
A247N
0,52
A247L
0,41
A247D
0,41
A247V
0,39
A247W
0,39
A247R
0,31
A247F
0,30
A247Y
0,30
A247M
0,28
A247K
0,28
A247H
0,25
248
E
B45
E248I
1,11
E248W
1,06
E248H
1,01
E248C
0,82
E248G
0,76
E248M
0,74
E248K
0,50
252
R
B45
R252L
1,09
R252Y
1,06
R252K
1,06
R252G
1,05
R252M
1,05
R252S
0,99
R252Q
0,98
R252H
0,96
R252V
0,92
R252D
0,90
R252E
0,79
R252L
0,76
R252P
0,66
R252T
0,48
277
R
B45
R277H
1,13
R277N
1,07
R277C
0,95
R277E
0,88
R277W
0,87
R277S
0,87
R277F
0,86
R277T
0,85
R277Y
0,82
R277D
0,70
R277A
0,69
R277I
0,55
R277P
0,47
280
P
B45
P280Q
1,18
P280Y
1,08
P280V
0,98
P280R
0,90
P280F
0,90
P280W
0,87
P280E
0,86
P280K
0,64
P280G
0,62
P280A
0,58
P280S
0,54
P280D
0,50
P280I
0,47
P280L
0,46
281
I
B45
I281T
1,15
I281N
1,14
I281Y
1,14
I281C
1,07
I281G
1,00
I281F
0,94
I281W
0,82
I281D
0,72
303
S
258
S303A
1,09
S303M
0,95
S303L
0,70
S303Y
0,66
S303G
0,64
S303I
0,61
S303T
0,57
S303H
0,57
S303F
0,56
S303C
0,43
S303Q
0,39
S303V
0,37
S303W
0,29
S303D
0,15
S303K
0,13
S303E
0,07
S303R
0,03
304
G
258
G304N
0,22
G304C
0,02
G304S
0,01
G304A
0,01
G304I
0,01
G304L
0,01
G304T
0,01
G304F
0,01
G304E
0,01
G304Q
0,01
G304K
0,01
G304P
0,01
G304R
0,01
G304H
0,01
G304W
0,01
G304V
0,01
G304D
0,01
G304M
0,00
G304Y
0,00
305
F
258
F305A
0,07
F305Q
0,03
F305N
0,03
F305M
0,02
F305I
0,01
F305L
0,01
F305R
0,01
F305G
0,01
F305V
0,01
F305K
0,01
F305E
0,00
F305D
0,00
F305C
0,00
F305W
0,00
F305T
0,00
F305S
0,00
F305H
0,00
F305P
0,00
F305Y
0,00
306
A
258
A306Q
1,14
A306K
0,96
A306N
0,93
A306S
0,87
A306M
0,78
A306T
0,52
A306H
0,50
A306R
0,48
A306W
0,44
A306L
0,33
A306F
0,30
A306I
0,30
A306V
0,26
A306P
0,22
A306D
0,09
A306C
0,07
A306E
0,02
A306Y
0,00
308
T
258
T308S
0,63
T308A
0,03
T308G
0,02
T308K
0,02
T308F
0,02
T308Q
0,01
T308V
0,01
T308C
0,01
T308N
0,01
T308E
0,01
T308R
0,01
T308D
0,01
T308L
0,01
T308I
0,01
T308P
0,01
T308M
0,01
T308Y
0,01
T308W
0,01
T308H
0,00
360
R
B21
R360K
0,97
R360A
0,94
R360G
0,66
R360H
0,63
R360Q
0,44
R360E
0,41
R360L
0,28
362
E
B21
N362Q
1,20
N362M
1,16
N362C
0,95
N362T
0,88
364
R
B21
R364G
1,02
R364S
0,89
R364A
0,39
R364K
0,38
R364M
0,25
367
R
B21
G367S
1,09
G367M
0,97
G367C
0,53
G367F
0,38
406
L
258
L406I
0,76
L406W
0,53
L406A
0,39
L406F
0,31
L406C
0,29
L406V
0,27
L406Q
0,27
L406H
0,24
L406N
0,23
L406K
0,13
L406T
0,05
L406S
0,03
L406Y
0,03
L406G
0,02
L406D
0,01
L406P
0,01
L406E
0,01
407
L
258
L407E
1,13
L407D
1,00
L407V
0,66
L407C
0,56
L407F
0,46
L407A
0,41
L407R
0,34
L407T
0,34
L407N
0,20
L407M
0,17
L407H
0,11
L407S
0,10
L407G
0,06
L407K
0,04
L407Q
0,02
L407P
0,01
408
T
258
T408A
0,96
T408Y
0,54
T408S
0,48
T408V
0,47
T408L
0,36
T408M
0,32
T408Q
0,30
T408N
0,27
T408R
0,26
T408H
0,25
T408K
0,25
T408F
0,24
T408P
0,22
T408W
0,20
T408I
0,17
T408C
0,11
T408G
0,08
T408E
0,02
409
T
258
T409Q
0,53
T409M
0,30
T409A
0,26
T409I
0,21
T409V
0,20
T409L
0,17
T409S
0,16
T409K
0,13
T409H
0,11
T409W
0,11
T409E
0,10
T409R
0,10
T409Y
0,08
T409N
0,08
T409F
0,05
T409C
0,02
T409D
0,01
T409P
0,01
T409G
0,01
411
V
258
V411I
0,82
V411M
0,52
V411L
0,51
V411C
0,32
V411R
0,27
V411N
0,21
V411Q
0,19
V411T
0,14
V411H
0,12
V411W
0,11
V411A
0,10
V411F
0,09
V411S
0,08
V411G
0,06
V411K
0,03
V411E
0,02
V411Y
0,02
V411D
0,01
V411P
0,01
418
R
B21
R418S
1,13
R418A
1,11
R418L
1,09
R418H
0,91
R418D
0,89
R418I
0,83
R418V
0,78
R418N
0,76
R418Y
0,76
R418M
0,69
R418E
0,63
R418G
0,58
R418Q
0,58
R418W
0,54
R418F
0,43
R418C
0,36
R418P
0,14
420
N
B21
N420D
1,11
N420Y
1,10
N420E
1,04
N420P
1,00
N420G
0,98
N420L
0,91
N420F
0,90
N420W
0,89
N420V
0,81
N420M
0,74
N420K
0,71
N420T
0,68
N420H
0,68
N420R
0,68
N420Q
0,65
N420S
0,63
N420I
0,60
N420C
0,50
N420A
0,47
422
R
B21
R422Q
1,13
R422S
1,13
R422Y
1,06
R422A
1,01
R422T
0,92
R422K
0,91
R422L
0,87
R422V
0,84
R422N
0,79
R422D
0,77
R422W
0,74
R422M
0,72
R422G
0,67
R422H
0,66
R422C
0,63
R422E
0,60
R422F
0,59
R422I
0,51
R422P
0,03
425
L
B21
L425V
1,19
L425A
1,16
L425Y
1,15
L425M
1,15
L425F
1,08
L425R
1,04
L425S
1,00
L425K
0,96
L425Q
0,93
L425I
0,93
L425W
0,93
L425N
0,92
L425H
0,89
L425T
0,84
L425E
0,83
L425C
0,67
L425D
0,54
426
N
B21
N426M
1,17
N426S
1,09
N426D
1,05
N426Y
1,01
N426A
0,99
N426V
0,91
N426E
0,83
N426L
0,83
N426Q
0,83
N426R
0,80
N426T
0,77
N426G
0,68
N426F
0,59
N426K
0,59
N426I
0,53
N426H
0,51
N426C
0,34
N426W
0,31
N426P
0,29
427
S
B21
S427H
1,20
S427P
1,14
S427Q
1,13
S427N
1,12
S427W
1,10
S427T
1,10
S427G
1,03
S427L
0,97
S427F
0,87
S427I
0,84
S427E
0,83
S427M
0,78
S427K
0,74
S427A
0,73
S427C
0,68
S427D
0,55
S427V
0,53
S427R
0,48
428
L
B21
L428N
1,15
L428Q
1,08
L428G
1,07
L428P
0,96
L428T
0,92
L428M
0,85
L428H
0,83
L428R
0,82
L428S
0,82
L428W
0,76
L428A
0,74
L428V
0,73
L428E
0,72
L428D
0,65
L428Y
0,63
L428I
0,60
L428K
0,52
L428F
0,42
L428C
0,28
429
R
B21
R429L
1,13
R429H
1,09
R429W
1,09
R429N
1,08
R429K
1,00
R429M
0,99
R429F
0,91
R429A
0,89
R429Y
0,88
R429Q
0,86
R429T
0,83
R429G
0,79
R429V
0,73
R429P
0,72
R429E
0,65
R429D
0,63
R429S
0,54
R429C
0,36
431
S
B21
S431K
1,15
S431M
1,00
S431V
0,90
S431T
0,87
S431E
0,87
S431Y
0,86
S431Q
0,86
S431F
0,82
S431R
0,81
S431N
0,81
S431I
0,73
S431W
0,71
S431P
0,61
S431D
0,60
S431C
0,32
435
T
B21
T435M
1,13
T435W
1,01
T435F
1,00
T435I
0,90
T435K
0,88
T435Q
0,82
T435V
0,79
T435S
0,58
T435N
0,57
T435D
0,55
T435E
0,52
T435A
0,52
T435R
0,47
T435C
0,24
T435G
0,20
T435P
0,04
437
G
B21
G437M
1,15
G437T
1,13
G437Y
1,00
G437F
0,95
G437H
0,94
G437V
0,88
G437W
0,88
G437L
0,84
G437I
0,75
G437E
0,67
G437D
0,62
G437P
0,36
G437C
0,26
439
T
B21
T439S
1,20
T439F
1,16
T439V
1,16
T439A
1,15
T439H
1,08
T439N
0,99
T439Y
0,92
T439I
0,89
T439K
0,83
T439R
0,80
T439L
0,79
T439G
0,67
T439D
0,64
T439E
0,58
T439W
0,54
T439C
0,17
T439P
0,02
444
Q
B21
Q444E
0,91
Q444M
0,89
Q444A
0,62
Q444H
0,58
Q444T
0,53
Q444L
0,48
Q444S
0,48
Q444V
0,47
Q444F
0,34
Q444D
0,31
Q444N
0,28
Q444K
0,28
Q444Y
0,26
Q444W
0,24
Q444I
0,18
Q444G
0,12
Q444C
0,10
Q444R
0,05
Q444P
0,01
447
D
B21
D447Q
1,17
D447Y
1,16
D447K
1,01
D447G
0,94
D447F
0,94
D447H
0,94
D447T
0,88
D447W
0,78
D447R
0,63
D447P
0,52
D447C
0,52
473
R
B21
R473H
1,07
R473C
1,07
R473L
1,02
R473Q
1,02
476
S
B21
I476K
1,13
I476T
1,12
I476N
1,07
I476C
0,84
I476R
0,59
I476D
0,40
I476A
0,29
477
G
B21
G477R
1,04
G477T
1,01
G477Q
0,90
G477K
0,53
G477H
0,42
G477M
0,41
G477E
0,33
G477F
0,25
G477Y
0,24
G477C
0,13
G477W
0,04
478
N
B21
N478Q
1,14
N478R
1,12
N478H
1,06
N478T
1,04
N478L
0,88
N478V
0,82
N478M
0,68
N478I
0,59
N478D
0,31
N478F
0,26
N478C
0,13
479
T
B21
T479G
1,00
T479I
0,93
T479L
0,81
T479S
0,75
T479A
0,66
T479N
0,50
T479Q
0,44
T479Y
0,40
T479P
0,40
T479R
0,30
T479M
0,23
T479F
0,19
T479W
0,18
481
R
B21
R481K
0,65
R481L
0,48
R481W
0,30
R481Y
0,23
R481N
0,18
R481T
0,18
R481D
0,15
R481F
0,14
R481A
0,13
R481S
0,13
R481G
0,07
R481E
0,04
492
A
B25
A492S
0,93
A492C
0,70
A492V
0,69
A492G
0,38
498
I
B25
I498V
1,02
I498E
0,93
I498L
0,90
I498C
0,65
I498W
0,47
I498M
0,43
I498Y
0,37
I498A
0,28
I498R
0,27
499
A
B25
A499D
1,09
503
I
B25
I503C
0,63
I503L
0,59
I503V
0,44
504
T
B25
T504S
0,78
T504G
0,66
T504A
0,63
T504C
0,60
T504Q
0,52
505
Q
B25
Q505C
0,34
Q505L
0,28
Q505E
0,26
Q505S
0,20
506
I
B25
I506L
0,96
I506V
0,94
I506W
0,19
I506A
0,11
507
P
B25
P507A
0,44
P507G
0,34
P507S
0,29
508
A
B25
A508V
0,91
A508M
0,64
A508S
0,48
A508I
0,23
509
V
B25
V509I
0,95
V509C
0,86
V509N
0,86
V509G
0,83
V509S
0,72
V509A
0,67
V509W
0,57
V509M
0,55
V509D
0,31
V509E
0,24
511
G
B25
G511A
0,88
G511S
0,62
512
N
258
N512S
1,13
N512C
1,10
N512H
1,08
N512L
1,05
N512T
1,04
N512F
0,96
N512A
0,82
513
F
B25
F513R
1,18
F513A
1,02
F513Y
0,91
F513M
0,75
514
L
515
F
B25
F515W
1,04
F515G
0,60
F515R
0,56
F515V
0,53
F515Q
0,51
F515K
0,50
F515T
0,45
F515A
0,44
F515S
0,43
F515E
0,22
F515D
0,19
517
G
B25
G517V
0,39
520
I
B25
I520G
1,02
I520N
0,93
525
F
B25
F525T
0,82
F525S
0,79
F525V
0,77
F525W
0,72
F525C
0,60
F525A
0,40
F525G
0,39
526
T
B25
T526A
0,79
T526S
0,70
T526V
0,69
T526G
0,24
527
G
B25
G527T
0,45
G527S
0,23
530
L
B25
L530I
0,86
L530V
0,80
L530C
0,56
L530Y
0,52
S536N
0,41
L530G
0,31
L530S
0,27
L530E
0,22
L530K
0,22
531
V
B25
V531I
0,96
V531C
0,75
V531A
0,21
533
L
B25
L533I
0,86
L533N
0,62
L533V
0,54
V531A
0,21
534
N
B25
N534R
1,17
N534V
1,12
N534M
1,04
N534A
0,86
N534T
0,81
535
N
B25
N535G
1,10
N535C
0,92
N535V
0,91
536
S
258
S536Y
1,03
S536T
1,02
S536A
0,85
S536N
0,83
S536Q
0,66
S536C
0,62
S536M
0,60
S536H
0,56
S536F
0,55
S536G
0,49
S536W
0,47
S536D
0,35
S536E
0,30
S536P
0,27
S536K
0,21
S536V
0,20
S536R
0,18
S536L
0,11
S536I
0,09
537
G
258
G537L
1,18
G537M
1,17
G537I
1,06
G537C
0,95
G537P
0,57
538
N
258
N538K
1,17
N538Y
0,98
N538R
0,80
539
N
B25
N539D
0,95
N539A
0,92
N539S
0,88
N539H
0,79
N539E
0,77
N539L
0,72
N539A
0,60
N539F
0,57
N539T
0,57
N539V
0,56
N539G
0,51
N539C
0,49
N539W
0,43
N539Y
0,39
N539R
0,18
N539K
0,17
540
I
B25
I540V
0,90
I540H
0,86
I540S
0,84
I540P
0,84
I540L
0,82
I540G
0,51
I540C
0,50
I540R
0,17
541
Q
258
Q541H
0,92
Q541G
0,71
Q541A
0,62
Q541S
0,54
Q541E
0,39
Q541C
0,37
Q541T
0,30
Q541L
0,30
Q541K
0,20
Q541R
0,12
542
N
B25
N542R
0,87
N542M
0,86
N542A
0,65
N542L
0,64
N542Y
0,63
N542H
0,61
N542T
0,53
N542C
0,52
N542S
0,50
N542G
0,41
N542V
0,31
N542I
0,24
N542P
0,05
543
R
258
R543Y
0,1104
R543H
0,0972
R543G
0,068
R543W
0,06
R543M
0,0587
R543L
0,0419
R543K
0,0394
R543S
0,033
R543A
0,0329
R543V
0,0262
R543C
0,0171
R543Q
0,0079
R543P
0,0079
R543D
0,002
R543T
0,0011
R543E
0,0002
545
Y
258
Y545A
0,39
Y545L
0,34
Y545C
0,28
Y545V
0,26
Y545H
0,26
Y545N
0,25
Y545W
0,24
Y545T
0,21
Y545K
0,19
Y545R
0,11
Y545D
0,10
Y545G
0,08
Y545I
0,07
Y545Q
0,07
Y545E
0,06
Y545P
0,04
546
L
B25
I546V
1,04
I546L
1,02
I546M
1,01
I546F
0,80
I546S
0,32
I546G
0,23
547
E
258
E547K
1,11
E547V
1,04
E547R
1,01
E547Y
0,94
E547T
0,85
E547H
0,78
E547P
0,75
E547L
0,58
E547C
0,53
E547W
0,28
E547D
0,28
E547F
0,27
548
V
B25
V548L
1,02
V548S
0,58
V548A
0,57
V548G
0,45
V548W
0,26
549
P
B25
P549Y
0,52
P549V
0,38
P549T
0,50
P549S
0,75
P549R
1,03
P549M
0,55
P549L
0,86
P549G
1,73
P549D
0,78
P549C
0,89
550
I
B25
I550V
0,96
I550L
0,95
I550A
0,61
I550F
0,45
551
Q
B25
Q551V
1,12
Q551F
1,09
Q551M
1,05
Q551G
1,01
Q551E
0,93
Q551N
0,87
Q551L
0,85
552
F
B25
F552C
1,10
F552D
1,06
F552G
1,00
F552A
0,98
F552Q
0,80
F552R
0,51
553
I
B25
I553N
1,12
554
S
B25
S554M
0,93
555
T
B25
T555R
1,13
T555C
1,13
T555S
0,85
T555G
0,78
T555L
0,27
557
T
B25
T557L
1,16
T557W
1,05
558
R
B25
R558A
1,11
559
Y
B25
Y559L
0,67
Y559M
0,63
Y559V
0,61
Y559A
0,47
Y559E
0,43
Y559T
0,27
Y559S
0,17
Y559D
0,10
Y559R
0,10
Y559P
0,07
Y559G
0,05
563
V
B25
V563G
1,05
V563S
0,69
V563C
0,68
V563T
0,54
V563E
0,05
564
R
B25
R564M
1,04
R564G
0,78
R564L
0,24
R564P
0,20
568
V
B25
V568P
1,17
569
T
B25
T569V
1,19
T569E
1,15
T569L
1,12
T569R
1,10
T569W
1,02
T569K
0,82
T569A
0,58
T569Y
0,35
570
P
258
P570A
1,15
P570K
1,07
P570G
1,07
P570Y
1,07
P570V
1,06
P570H
1,05
P570R
1,03
P570I
1,03
P570S
0,89
P570Q
0,79
P570N
0,79
P570C
0,70
P570D
0,52
P570L
0,47
571
I
B25
I571E
1,09
I571A
0,90
572
Q
258
Q572G
1,16
Q572T
1,07
Q572Y
1,07
Q572N
0,87
Q572E
0,75
Q572D
0,75
Q572C
0,57
574
S
258
S574V
0,82
S574I
0,76
S574M
0,69
S574W
0,64
S574Q
0,64
S574F
0,56
S574Y
0,56
S574A
0,53
S574N
0,48
S574L
0,38
S574E
0,32
S574P
0,29
S574C
0,29
S574D
0,26
577
W
258
W577L
1,18
W577N
1,16
W577C
1,08
W577S
1,04
W577P
0,97
W577D
0,92
W577E
0,81
581
N
258
N581I
1,02
N581G
1,02
N581F
1,00
N581T
0,90
N581V
0,86
N581H
0,70
N581Y
0,64
N581M
0,63
N581P
0,63
N581W
0,58
N581E
0,57
N581Q
0,46
N581A
0,42
N581L
0,32
N581D
0,29
N581C
0,13
N581R
0,00
584
S
B21
S584K
1,14
S584G
1,11
S584A
1,00
S584Q
0,90
S584V
0,81
S584C
0,78
S584N
0,67
S584Y
0,66
S584L
0,66
S584H
0,65
S584T
0,64
S584F
0,59
S584I
0,54
S584M
0,41
S584W
0,38
S584D
0,31
S584E
0,21
S584P
0,12
585
S
258
S585E
1,11
S585Y
1,09
S585G
0,93
S585P
0,79
S585A
0,74
S585D
0,67
S585C
0,60
S585V
0,47
590
T
B25
T590K
1,00
T590V
0,98
T590M
0,73
T590W
0,72
T590L
0,54
T590R
0,53
T590E
0,52
T590P
0,15
591
A
258
A591I
1,17
A591G
1,17
A591M
0,94
592
T
258
T592E
1,04
T592C
0,66
593
S
B21
S593A
1,10
S593F
1,07
S593L
1,06
S593Q
1,06
S593T
1,00
S593M
0,96
S593H
0,92
S593D
0,89
S593I
0,87
S593W
0,84
S593E
0,80
S593K
0,79
S593N
0,75
S593P
0,75
S593C
0,59
595
D
B21
D595L
1,19
D595W
1,18
D595Q
1,13
D595C
0,91
D595E
0,09
596
N
B21
N596F
1,14
N596C
1,10
N596Q
1,06
N596M
0,98
N596E
0,93
N596R
0,92
N596K
0,92
598
Q
B21
Q598H
1,03
Q598F
1,03
Q598Y
1,02
Q598R
0,95
Q598L
0,92
Q598E
0,89
Q598W
0,88
Q598N
0,83
Q598P
0,82
Q598M
0,80
Q598A
0,76
Q598T
0,60
Q598K
0,58
Q598S
0,58
Q598C
0,55
599
S
B25
S599G
1,09
S599D
1,07
S599I
0,85
S599W
0,81
S599E
0,61
600
R
B21
R600G
0,88
R600S
0,85
R600M
0,77
R600A
0,74
R600E
0,70
R600T
0,69
R600K
0,69
R600F
0,66
R600V
0,65
R600Q
0,60
R600I
0,57
R600H
0,56
R600C
0,54
R600L
0,54
R600P
0,47
R600N
0,45
R600Y
0,36
R600D
0,34
R600W
0,31
601
D
B21
N601Q
1,14
N601W
1,07
N601T
1,00
N601A
0,96
N601S
0,81
N601H
0,79
N601L
0,78
N601K
0,76
N601R
0,73
N601C
0,73
N601I
0,64
N601D
0,58
602
F
B25
F602L
1,15
F602V
0,75
F602Y
0,70
F602K
0,59
605
F
258
F605H
1,12
F605T
0,96
F605L
0,83
606
E
B21
E606C
1,15
E606V
1,03
E606S
0,97
E606D
0,85
E606P
0,39
607
S
258
S607N
1,14
S607H
1,08
S607K
1,01
S607M
1,01
S607W
1,01
S607Y
0,90
S607P
0,86
S607F
0,83
S607L
0,75
608
T
258
T608M
1,19
T608H
1,16
T608E
1,05
T608D
0,98
T608P
0,68
T608I
0,53
T608C
0,53
T608N
0,50
609
N
B25
N609D
0,74
612
T
B25
T612A
1,17
T612L
1,09
T612K
0,97
T612Y
0,86
T612W
0,84
T612I
0,53
613
S
B25
S613E
1,01
S613L
0,98
S613A
0,97
614
A
B25
A614W
1,15
A614P
1,14
A614Q
0,98
617
N
B25
N617E
1,19
N617S
1,14
N617F
0,96
618
V
258
V618F
1,17
V618Y
1,11
V618M
1,10
V618A
1,10
V618P
1,07
V618E
1,05
V618K
1,03
V618I
0,94
V618S
0,70
V618C
0,69
V618Q
0,67
620
G
B25
G620S
0,38
G620A
0,35
G620E
0,27
G620L
0,25
G620F
0,23
G620K
0,23
G620V
0,23
G620Q
0,22
G620W
0,21
G620R
0,20
G620M
0,15
622
R
B25
R622H
0,28
R622W
0,20
R622C
0,19
R622E
0,09
623
N
B25
N623S
1,19
N623A
1,14
N623D
0,88
N623H
0,85
N623C
0,70
N623V
0,68
N623T
0,65
N623Q
0,61
N623I
0,57
624
F
B25
F624M
1,14
F624E
0,86
F624V
0,76
F624S
0,73
F624D
0,68
F624C
0,59
F624H
0,56
F624R
0,44
F624T
0,33
626
E
258
E626D
1,18
E626L
1,10
E626F
1,09
E626C
0,66
E626M
0,08
628
A
B25
A628E
1,15
A628T
1,14
629
G
258
G629C
1,18
G629L
1,15
G629H
1,08
G629I
1,07
G629V
1,05
G629K
1,03
G629D
0,87
G629W
0,86
G629F
0,85
G629Y
0,81
630
V
B25
V630I
1,12
V630T
1,08
V630L
0,82
V630G
0,76
V630R
0,66
V630D
0,64
V630S
0,55
641
T
<b>B25</b>
T641M
1,18
T641C
0,98
T641K
0,97
643
T
B25
T643V
1,14
T643P
0,98
T643E
0,93
T643F
0,70
645
E
B25
E645R
1,16
E645F
1,13
E645D
0,75
646
A
B25
A646N
1,08
A646Q
1,06
Пример 5 - временная экспрессия в листьях маиса и биологический анализ с насекомыми
Полинуклеотиды, кодирующие вариантные полипептиды Cry1B, клонировали в векторы для временной экспрессии под управлением убиквитинового промотора маиса (Christensen и Quail, (1996) Transgenic Research 5:213-218) и дуплицированного варианта промотора из вируса мозаики мирабилис (DMMV PRO; Dey и Maiti, (1999) Plant Mol. Biol., 40:771-82). Из уровня техники хорошо известен способ инфильтрации агробактериями путем введения клеточной суспензии Agrobacterium в растительные клетки интактных тканей с тем, чтобы можно было измерить или изучить воспроизводимые инфицирование и дальнейшую экспрессию трансгена, полученного из растения (Kapila, et. al., (1997) Plant Science 122:101-108). Вкратце, проводили инфильтрацию агробактериями молодых проростков маиса с использованием нормализованных культур бактериальных клеток тестовых и контрольных штаммов. Листовые диски получали из каждого проростка и заражали WCRW (Diabrotica virgifera) вместе с соответствующими контролями. Степень поедания зеленых тканей листа оценивали через 2 дня после заражения.
Пример 6 - временная экспрессия в листьях кустовой фасоли и биологический анализ с насекомыми
Agrobacterium
et. al.
Plant Science
Chrysodeixis includens),
Helicoverpa zea),
Anticarsia gemmatalis
(Spodoptera frugiperda)
Agrobacterium
Для экспрессии в сое можно сконструировать оптимизированные кодирующие последовательности. Из уровня техники хорошо известен способ инфильтрации агробактериями путем введения клеточной суспензии  в растительные клетки интактных тканей с тем, чтобы можно было измерить или изучить воспроизводимые инфицирование и дальнейшую экспрессию трансгена, полученного из растения (Kapila, , (1997)  122:101-108). Вкратце, проводили инфильтрацию агробактериями вырезанных листовых дисков кустовой фасолис использованием нормализованных культур бактериальных клеток тестовых и контрольных штаммов. Через 4 дня листовые диски заражали по отдельности 2 новорожденными особями соевой совки (SBL) (кукурузной совки, (CEW) (гусеницы бархатных бобов (VBC) () или травяной совки. Контрольные листовые диски получали с , содержащимитолько вектор экспрессии флуоресцентного маркера DsRed2 (Clontech™, 1290 Terra Bella Ave. Маунтин-Вью, Калифорния 94043). Листовые диски от не подвергнутых инфильтрации растений включали в качестве второго контроля. Поедание зеленых тканей листа оценивали через три дня после заражения и присваивали баллы от 0 до 9.
Пример 7 - опосредованная Agrobacterium трансформация маиса и регенерация трансгенных растений
Для трансформации маиса, опосредованной Agrobacterium, с использованием полинуклеотидной последовательности согласно настоящему раскрытию, использовали способ согласно Zhao (патент США № 5981840 и PCT публикация патентной заявки WO98/32326; содержание которых включено в данный документ посредством ссылки). Вкратце, незрелые зародыши выделяли из маиса и зародышей и эмбрионы приводили в контакт с суспензией Agrobacterium в условиях, при которых бактерии были способны переносить нуклеотидную последовательность токсина по меньшей мере в одну клетку по меньшей мере одного из незрелых зародышей (стадия 1: стадия инфицирования). На этой стадии незрелые зародыши можно погружать в суспензию Agrobacterium для инициации инокуляции. Зародыши в течение определенного времени культивировали совместно с Agrobacterium (стадия 2: стадия совместного культивирования). Незрелые зародыши можно культивировать на твердой среде после стадии инфицирования. После периода совместного культивирования предполагалась необязательная стадия "покоя". На этой стадии покоя зародыши инкубировали в присутствии по меньшей мере одного антибиотика, который, как известно, ингибирует рост Agrobacterium, без добавления средства для отбора к растительным трансформантам (стадия 3: стадия покоя). Незрелые зародыши можно культивировать на твердой среде с антибиотиком, но без средства для отбора, для исключения Agrobacterium и в течение фазы покоя для инфицированных клеток. Затем инокулированные зародыши культивировали на среде, содержащей средство для отбора, и выделяли растущий трансформированный каллюс (стадия 4: стадия отбора). Незрелые зародыши культивировали на твердой среде со средством для отбора, что приводило к выборочному росту трансформированных клеток. Затем каллюс регенерировали c получением растений (стадия 5: стадия регенерации), и каллюсы, выращенные на селективной среде, культивировали на твердой среде для регенерации растений.
Пример 8. Трансформация зародышей сои
Зародыши сои подвергали бомбардировке плазмидой, содержащей нуклеотидную последовательность токсина, функционально связанную с подходящим промотором, что указано ниже. Для индукции соматических зародышей семядоли длиной 3-5 мм, вырезанные из поверхностно-стерилизованных, незрелых семян соответствующего сорта сои, культивировали на свету или в темноте при 26°C на соответствующей агаровой среде в течение шести-десяти недель. Соматические зародыши, дающие вторичные зародыши, затем вырезали и помещали в подходящую жидкую среду. После повторного отбора в отношении кластеров соматических зародышей, деление клеток в которых уже привело к зародышам на стадии глобулы, суспензии поддерживали, как описано ниже.
Соевые зародышевые суспензионные культуры можно поддерживать в 35 мл жидкой среды на ротационном шейкере при 150 об./мин. при 26°C с флюоресцентными источниками света согласно схеме день/ночь 16:8 часов. Культуры пересевали каждые две недели путем инокуляции примерно 35 мг ткани в 35 мл жидкой среды.
Соевые зародышевые суспензионные культуры затем можно трансформировать при помощи способа бомбардировки генной пушкой (Klein, et al., (1987) Nature (London) 327:70-73, патент США № 4,945,050). Для этих трансформаций можно использовать устройство Biolistic PDS1000/HE от Du Pont (гелиевая модификация).
Селектируемый маркерный ген, который можно использовать для облегчения трансформации сои, без ограничения предусматривал следующее: промотор 35S из вируса мозаики цветной капусты (Odell, et al., (1985) Nature 313:810-812), ген гигромицин-фосфотрансферазы из плазмиды pJR225 (из E. coli; Gritz, et al., (1983) Gene 25:179-188) и 3'-участок из гена нопалин-синтазы из T-ДНК Ti-плазмиды Agrobacterium tumefaciens. Кассету экспрессии, содержащую нуклеотидную последовательность токсина (например, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 или оптимизированную последовательность маиса), функционально связанную с подходящим промотором, можно выделять в виде рестрикционного фрагмента. Этот фрагмент затем можно вставить в уникальный рестрикционный сайт вектора, несущего маркерный ген.
К 50 мкл суспензии 1 мкм золотых частиц при концентрации 60 мг/мл добавляли (по порядку): 5 мкл ДНК (1 мкг/мкл), 20 мкл спермидина (0,1 М) и 50 мкл CaCl2 (2,5 М). Препарат частиц затем перемешивали в течение трех минут, центрифугировали с использованием микроцентрифуги в течение 10 секунд и удаляли супернатант. Покрытые ДНК частицы затем однократно промывали в 400 мкл 70% этанола и ресуспендировали в 40 мкл безводного этанола. Суспензию ДНК/частицы можно обрабатывать ультразвуком три раза в течение одной секунды. Пять микролитров золотых частиц, покрытых ДНК, затем загружали на каждый диск-макроноситель.
Примерно 300-400 мг двухнедельной суспензионной культуры помещали в пустую 60×15 мм чашку Петри, и остаточную жидкость удаляли из ткани при помощи пипетки. Для каждого трансформационного эксперимента обычно подвергали бомбардировке приблизительно 5-10 плашек с тканью. Устанавливали давление разрыва мембраны 1100 фунтов на кв. дюйм, и в камере создавали вакуум с понижением давления до 28 дюймов ртутного столба. Ткань располагали на расстоянии приблизительно 3,5 дюйма от задерживающего экрана и бомбардировали три раза. После бомбардировки ткань можно разделить пополам, и поместить обратно в жидкость, и культивировать, как описано выше.
Через пять-семь дней после бомбардировки жидкую среду можно заменить свежей средой, а через одиннадцать-двенадцать дней после бомбардировки заменить свежей средой, содержащей 50 мг/мл гигромицина. Эту селективную среду можно обновлять еженедельно. Через семь-восемь недель после бомбардировки можно наблюдать зеленую трансформированную ткань, растущую из нетрансформированных, некрозных зародышевых кластеров. Выделенную зеленую ткань отбирали и инокулировали в отдельные колбы для получения новых, клонально размноженных, трансформированных зародышевых суспензионных культур. Каждую новую линию можно рассматривать как независимый объект трансформации. Эти суспензии затем можно пересевать и поддерживать в виде кластеров незрелых зародышей или регенерировать в целые растения путем созревания и проращивания отдельных соматических зародышей.
Все публикации, патенты и заявки на патент, упомянутые в данном описании, ориентированы на уровень специалиста в области техники, к которой относится настоящее раскрытие. Все публикации, патенты и заявки на патент включены в данный документ посредством ссылки в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация, патент или заявка на патент специально и отдельно была включена посредством ссылки.
Хотя в целях ясности понимания вышеприведенное раскрытие было довольно подробно описано посредством иллюстрации и примеров, очевидно, что на практике можно осуществлять определенные изменения и модификации в пределах объема вариантов осуществления.