Фенотип и функциональные свойства ммск из жировой ткани после взаимодействия с мононуклеарами пуповинной крови

Оригинальные исследования

39

ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Фенотип и функциональные свойства ММСК из жировой ткани после взаимодействия с мононуклеарами пуповинной крови

П.И. Бобылева, И.В. Андрианова, Е.В. Маслова, Е.Р. Андреева, Б.Ш. Гогия, Л.Б. Буравкова Институт медико-биологических проблем РАН, Москва

Phenotype and functional properties of adipose derived MMSC after interaction with cord blood mononuclear cells

P.I. Bobyleva, I.V. Andrianova, E.V. Maslova, E.R. Andreeva, BSh. Gogiya, L.B. Buravkova Institute of Biomedical Problems of the RAS, Moscow

Хорошо известно, что ex vivo экспансия гемопоэтических стволовых клеток более эффективно проходит в тех случаях, когда создаются условия, приближенные к их микроокружению in vivo. Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК], благодаря их способности поддерживать кроветворение, широко используются в таких системах. На конечный результат взаимодействия ММСК и гемопоэтических клеток может оказывать влияние такой фактор, как низкая концентрация О2, которая характерна для костномозговой ниши и, как показано, отражается на ряде свойств ММСК. Обратные эффекты, которые клетки гемопоэтического происхождения оказывают на ММСК, изучены в гораздо меньшей степени.

В данной работе проводилось изучение влияния моно-нуклеаров пуповинной крови (МПК] на отдельные морфофункциональные характеристики ММСК из жировой ткани при ко-культивировании их в течение 72 ч в условиях атмосферной (20%] и пониженной (5%] концентрации О2. Динамику прикрепления МПК характеризовали при микроскопии, влияние МПК на экспрессию CD54, CD44, CD90 и жизнеспособность ММСК определяли при помощи проточной цитофлюориметрии.

Взаимодействие гемопоэтических и стромальных клеток при обеих концентрациях О2 увеличивало экспрессию ММСК CD54, в некоторых случаях повышалась продукция CD44, на высоком уровне сохранялись экспрессия CD90 и жизнеспособность ММСК. Прикрепление МПК происходило несколько быстрее при 20% О2.

Таким образом, при ко-культивировании аллогенных ММСК и МПК человека вне зависимости от концентрации О2 происходило повышение экспрессии ММСК молекул адгезии, участвующих в формировании специализированных межклеточных контактов, что обеспечивало эффективное прикрепление МПК. При этом не наблюдалось каких-либо цитотоксических эффектов, что особо важно в случае возможного применения аллогенных ММСК в рамках регенеративной медицины.

Ключевые слова: мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки, мононуклеары пуповинной крови, концентрация О2, межклеточное взаимодействие.

Формирование стромы различных тканей, в частности гемопоэтической ниши, является одной из важнейших цитофизиологических функций ММСК, причем они не столько обеспечивают механическую «структуру» ткани, сколько вовлечены

e-mail: blastoblast@gmail.com

It is well known, that ex vivo expansion of hematopoietic stem cells is more effective when the culture conditions mimic their in vivo microenvironment. Multipotent mesenchymal stromal cells (MMSC) are widely used in such systems due to their ability to support hematopoiesis. In addition, the result of MMSC-hematopoietic cells' interaction can be affected by O2 concentration, which is shown to modify the number of MMSC characteristics. The feedback effects of hematopoietic cells on MMSC during their interactions are less investigated.

We studied the effects of cord blood mononuclear cells (MNC] and MMSC interaction on the later cells morphofunctional characteristics during 72 h coculture at 20% or 5% O2. The dynamics of adhesion was estimated with CCD-camera equipped microscopy, the effects of the interaction with MNC on MMSC viability and CD54, CD44, CD90 expression were detected by flow cytometry.

After interaction with MNC, MMSC displayed increased CD54 and in some cases — CD44 expression. The share of CD90+-MMSCs and their viability remained high during coculture with MNC at both O2 levels. The adhesion of MNC was somewhat faster in 20% O2.

Thus, regardless of O2 concentration coculture of allogenic MMSCs and MNC increased the expression of MMSC adhesion molecules involved in formation of specialized cell-to-cell contacts that provided effective adhesion of MNC. MMSC did not provoke allogenic MNC cytotoxic activity that is of particular importance in the case of potential therapeutic application of MMSC.

Key words: multipotent mesenchymal stromal cells, cord blood mononuclear cells, O2 concentration, intercellular interaction.

в регуляцию пролиферативного и дифференциро-вочного статуса кроветворных клеток-предшествен-ниц посредством продукции растворимых медиаторов (IL-6, IL-8, MCP1, GCSF, GRO, T IMP-1, TIMP-2, IGFBP-1, IGFBP-2) и прямых межклеточных контактов

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 4, 2013

40

Оригинальные исследования

(cadherin-11, N-cadherin, NCAM1, VCAM1) [1, 2]. Значимую роль в установлении контактных взаимодействий играют молекулы адгезии ICAM1 [3] и HCAM [4, 5], последняя также регулирует дифферен-цировку гемопоэтических предшественников [6, 7].

Исследования in vitro предоставляют широкие возможности для изучения отдельных аспектов функционирования и взаимодействия клеток кроветворной ниши костного мозга [1, 8—10]. Следует отметить, что основное внимание в подобных исследованиях, как правило, фокусировалось на влиянии компонентов ниши на гемопоэтические клетки, тогда как обратный эффект — воздействие гемопоэтиков на ММСК — изучен в меньшей степени.

Физиологическая ниша ММСК характеризуется низким содержанием кислорода (3—7%). Влияние этого параметра на свойства ММСК было показано в ряде исследований, в том числе и выполненных в нашей лаборатории [11—13]. Отмечено, что при пониженной концентрации кислорода увеличивается пролиферативная активность ММСК и их способность к колониеобразованию, замедляется диффе-ренцировка в осте- и адипогенном направлениях, усиливается — в хондрогенном [14]. Тем не менее, на настоящий момент из всех работ, посвящённых изучению взаимодействия гемопоэтических клеток и ММСК, лишь в некоторых при культивировании учитывался этот важный физиологический фактор [10, 15, 16].

Недавно в нашей лаборатории был предложен способ обогащения популяции мононуклеаров пуповинной крови (МПК) ранними гемопоэтическими предшественниками в ко-культуре с ММСК жировой ткани [17]. В описанной модели МПК ко-культивировались с ММСК в течение 72 ч, после чего все неприкрепившиеся МПК удалялись и далее выполнялась экспансия только прикрепившихся малодифференцированных гемопоэтических клеток.

Целью настоящего исследования являлось определение влияния МПК на морфофункциональные особенности ММСК жировой ткани при ко-культивировании в стандартных условиях (20%) и при пониженном содержании О2, близком к физиологической концентрации в гемопоэтической нише.

Материал и методы

Источники ММСК и гемопоэтических клеток-пред-шественниц. ММСК веделяли из стромально-васкулярной фракции жировой ткани человека, используя метод P.A. Zuk с соавт. (2001) [18] в модификации Л.Б. Буравковой и др. (2009) [11]. Образцы жировой ткани от 5 практически здоровых доноров (женщины в возрасте от 38 до 45 лет) были предоставлены многопрофильной клиникой «Союз» в соответствии с договором о научном сотрудничестве.

Все доноры подписывали информированное согласие на выполнение липоаспирации и последующее использование жировой ткани в рамках научного исследования.

Для проверки соответствия полученных клеток критериям ММСК они были охарактеризованы по экспрессии маркёров CD45, CD73, CD90 и CD105, а также способности к дифференцировке в остеогенном и адипогенном направлениях.

Источником гемопоэтических клеток-предше-ственниц являлась фракция мононуклеаров пуповин-

ной крови (МПК), предоставленой Банком стволовых клеток ООО «Криоцентр» (Москва).

Дизайн исследования. После размораживания МПК в концентрации 2х10в кл/мл добавляли к ММСК и ко-культивировали в течение 72 ч. Ко-культуры клеток были разделены на две группы в соответствии с условиями инкубирования. Группа 1 находилась в СО2-инкубаторе (Sanyo, Япония) в стандартных условиях: 5%СО2, 20% О2, 37°С, 100% влажность; группа 2 — в мультигазовом инкубаторе (Sanyo, Япония) в условиях пониженного содержания кислорода: 5%СО2, 5%O2, 37°С, 100% влажности. В качестве контроля использовали также монокультуры ММСК. Через 24 и 72 ч ко-культивирования проводили микроскопию (Nikon Eclipse TiU, Nikon, Япония) и фотосъёмку фиксированных участков чашки Петри с культурами клеток. На полученных изображениях подсчитывали количество МПК, используя программу анализа изображений SigmaScan Pro 5.0 Image Analysis Software (SPSS Inc, США). Затем выполняли цитологические исследования, включавшие цитохимический, иммуноцитохимический и морфометрический анализы.

Культивирование клеток. Культивирование ММСК проводили в среде a-MEM (Gibco, США), содержащей антибиотик-антимикотик (пеницил-лин-стрептомицин-фунгизон) (Gibco, США) и 10% фетальной сыворотки коров (FCS) (Hyclone, Бельгия). Для эксперимента использовали ММСК 2—4 пассажей, достигшие 70—80% конфлюентности монослоя. Эксперименты проводили в среде RPMI-1640 (Gibco, США), содержащей антибиотик-антимикотик (пенициллин-стрептомицин-фунгизон) и 5% FCS.

Цитологические исследования. Цитохимический анализ МПК, прикрепившихся к ММСК через 24 и 72 ч ко-культивирования, проводили после фиксации метанолом и окрашивания гематологическим красителем по Гимза (BDH, США).

После 24 и 72 ч ко-культивирования ММСК с ад-гезированными на них МПК обрабатывали раствором 0,05% трипсин-0,02% ЭДТА (1х) (Gibco, США) и суспендировали до получения одиночных клеток. Выполняли цитохимические реакции с моноклональными антителами к CD90 (FITC)/CD45 (PE), СD44 (FITC), CD54 (PE) (Beckman Coulter IO Test, США). Анализ флюоресценции клеток проводили на проточном цитофлюориметре Epics XL (Beckman Coulter, США), используя программное обеспечение System II для захвата и анализа изображения (Beckman Coulter). Кроме этого, цитофлюориметрически определяли количество некротических и апоптотических клеток при помощи набора Annexin-PI (Immunotech, Франция).

Для того, чтобы среди клеток в суспензии, полученной при обработке раствором трипсина, выделить ММСК, проводили одновременное выявление CD90 — молекулы, конститутивно экспрессирующейся ММСК, и CD45 — общего лейкоцитарного антигена, который отсутствует на ММСК. После окрашивания на данные антигены в суспензии ММСК и МПК при проточной цитофлюориметрии выделяли 2 популяции клеток. В первую входили сравнительно мелкие клетки, большая часть которых экспрессировала маркёр CD45, — лейкоциты пуповинной крови; ко второй популяции относили сравнительно крупные гетерогенные по размеру клетки, большинство

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 4, 2013

Оригинальные исследования

41

из которых экспрессировало CD90. В соответствии с этим для дальнейшего цитофлюориметрического анализа ММСК был создан протокол, учитывающий только вторую популяцию клеток.

Статистический анализ. Статистический анализ полученных данных выполняли с помощью программы «Statistica 7.0» (StatSoft, США), используя U-критерий Манна — Уитни. Различия считались статистически значимыми при p<0,05.

Результаты

Практически все клетки, полученные из стромально-васкулярной фракции жировой ткани, экспрессировали характерные для ММСК маркёры CD73 (95,5±1,3%), CD90 (табл. 1), CD105 (99,6±0,1%) и дифференцировались в остеогенном и адипоген-

ном направлениях. Доля клеток, экспрессировавщих CD45, была незначительна (1,5±0,5%).

В первые сутки ко-культивирования при 20% и 5% О2 наблюдалось активное прикрепление МПК к ММСК (рис. 1). Большая часть популяции прикрепленных МПК была представлена клетками грануло-цитарного ростка, были выявлены предшественники, которые можно отнести к нейтрофильным и эозинофильным миелоцитам и метамиелоцитам. Эритро-идный ряд клеток был представлен базофильными, полихроматофильными и оксифильными нормо-цитами (рис. 2). Также были обнаружены клетки, в которых в различной степени выражена базофилия цитоплазмы, и имеющие хроматин облаковидного вида — признаки, позволяющие отнести эти клетки к зрелым лимфоцитам периферической крови.

Таблица 1. Доля CD90+-MMCK в монокультуре и при ко-культивирования с МПК

Время 20% О2 5% О2

культивирования ММСК, % ММСК+МПК, % ММСК, % ММСК+МПК, %

24 ч 89,3±4,6 94,0±2,9 92,9±1,9 95,6±2,4

72 ч 96,3±2,7 86,8±2,8 99,20±0,6 85,2±4,1

20% О2

5% О2

А

Б

Рис.1. ММСК и МПК, 24 ч (А) и 72 ч (Б) ко-культивирования при различном содержании кислорода. Окр.: по Гимза. Световая микроскопия. Масштабный отрезок - 25 мкм

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 4, 2013

42

Оригинальные исследования

20% О2 5% О2

Рис. 2. МПК, прикрепившиеся к ММСК в течение 72 ч ко-культивирования при различном содержании кислорода. Масштабный отрезок - 25 мкм

Количество прикреплённых к ММСК мононукле-аров после 24 ч ко-культивирования при 20% О2 было приблизительно в 2,5 раза больше, чем при 5% О2, и в течение дальнейшего ко-культивирования практически не изменялось. Через 72 ч при 5% О2 количество прикреплённых МПК возросло и уже не отличалось от такового при 20% О2 (рис. 3).

Цитофлюориметрический анализ показал, что взаимодействие с МПК привело к значительному увеличению доли ММСК, экспрессирующих CD54 антиген (рис. 4). Было выявлено не только увеличение доли CD54+-клеток, но и средней интенсивности флюоресценции клеток, что свидетельствовало о возрастании количества экспрессированных молекул ICAM1 на поверхности ММСК. Это повышение наблюдалось в течение всего эксперимента в равной степени при 20% и 5% О2 и составляло от 2 до 3 раз по сравнению с монокультурой ММСК (рис. 5).

Практически все ММСК в монокультуре и при ко-культивировании с МПК экспрессировали CD44 антиген. Интенсивность экспрессии данного антигена после 24 ч ко-культивирования была в среднем выше на 50—75%, чем в монокультуре, однако высокая вариабельность, связанная, по-видимому, с индивидуальными особенностями ММСК, полученными от разных доноров, не позволяет говорить о

достоверном повышении. Через 72 ч интенсивность флюоресценции при выявлении CD44 антигена была одинаковой у ММСК в ко- и монокультурах.

Кл./мм2

6000

5000

4000

3000

2000

1000

0

24 ч 72 ч

20%О2  5%О2

Рис. 3. Количество МПК, прикрепившихся к монослою ММСК в ходе ко-культивирования при различном содержании кислорода О2.

*различия между 20% и 5% О2 статистически значимы, p < 0,05

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 4, 2013

Оригинальные исследования

43

ММСК

ММСК

20% О,

А

5% О,

ММСК+МПК

ММСК

Б

ММСК+МПК

ММСК+МПК

ММСК

ММСК+МПК

Рис. 4. Уровень экспрессии CD54 ММСК в монокультуре (I] и при ко-культивирования с МПК (II] в течение 24 ч (А] и 72 ч (Б] при различном содержании кислорода. Проточная цитофлуориметрия

ММСК И ММСК+МПК

Рис. 5. Доля CD54+-MMCK в моно- и в ко-культуре с МПК (ММСК+МПК].

*различия между группами статистически значимы, p < 0,05

Таблица 2. Жизнеспособность ММСК в монокультуре и после ко-культивирования с МПК (ММСК+МПК). Данные представлены как M±m трёх независимых экспериментов

Некроз (PI+), % Ранний апоптоз (Ann+), % Поздний апоптоз (Ann+/PI+), % Живые клетки (Ann-/PI-), %

20% О2 ММСК 2±1 2±0 2±0 94±1

24 ч ММСК+МПК 1±1 7±2 8±7 84±8

5% О2 ММСК 2±1 6±3 2±1 90±3

ММСК+МПК 1±1 3±1 4±2 92±2

20% О2 ММСК 3±1 4±1 4±2 90±2

72 ч ММСК+МПК 4±2 4±3 3±1 90±4

5% О2 ММСК 1±0 4±1 5±0 88±0

ММСК+МПК 3±2 6±3 5±2 86±5

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 4, 2013

44

Оригинальные исследования

Экспрессия CD90 статистически значимо не отличалась в ко- и монокультурах, не изменялась в зависимости от условий и сроков культивирования (см. табл. 1).

Для того, чтобы определить, как взаимодействие с МПК влияет на жизнеспособность ММСК, после 24 и 72 ч ко-культивирования при различном содержании О2 в среде была проведена оценка доли живых, апоптотических и некротических ММСК (табл. 2). Оказалось, что в течение всего времени эксперимента жизнеспособность ММСК была высокой и не отличалась от значений, характерных для монокультуры ММСК, независимо от концентрации кислорода.

Обсуждение

Анализ ранних этапов взаимодействия МПК и ММСК жировой ткани, проведенный в настоящей работе, показал, что в течение 72 ч происходит адгезия большей части МПК к ММСК, причём среди прикрепившихся клеток были выявлены как дифференцированные, так и значительное количество малодифференцированных клеток-предшественниц. Прикрепление МПК к стромальной подложке при атмосферной концентрации кислорода происходило быстрее, чем при 5% О2 в среде культивирования. Взаимодействие с МПК привело к увеличению доли ММСК, эспрессирующих CD54 (ICAM1), что указывает на роль ICAM1 в установлении специализированных клеточных контактов при взаимодействии ММСК с МПК. Хорошо известно, что ICAM1 — это рецептор, опосредующий адгезию лейкоцитов к эндотелиальным клеткам [19—21]. Кроме того, была также показана существенная роль, которую эти молекулы играют в прикреплении к ММСК гемопоэтических предшественников, в частности, значительный вклад взаимодействия ICAM-1/LFA-1 в этот процесс [22]. Ещё одним важным белком контактных взаимодействий в кроветворной нише является CD44 (HCAM). Помимо участия в реализации таких значимых функций, как адгезия клеток к субстрату, а также агрегация клеток [4], HCAM задействована во взаимодействии гемопоэтических предшественников и ММСК [23], и её блокирование ведёт к нарушению процесса гемопоэза [6]. По нашим данным практически все ММСК независимо от условий культивирования экспрессировали данную молекулу адгезии, что подтверждает полученные ранее данные о том, что высокий уровень экспрессии данного антигена характерен для ММСК жирового происхождения, по сравнению с ММСК из других источников [24].

К настоящему моменту существует значительный массив данных об иммуномодулирующих свойствах ММСК. В частности, показано, что они способны оказывать супрессивное воздействие на лимфоциты и подавлять их активацию [25—28]. Характерную для ММСК низкую иммуногеннность связывают с пониженной экспрессией MHC-I и отсутствием

ЛИТЕРАТУРА:

1. Wagner W., Saffrich R., Ho A.D. The Stromal Activity of Mesenchymal Stromal Cells. Transfus. Med. Hemother. 2008; 35(3): 185-93.

2. Hofmeister C.C., Zhang J., Knight K.L. et al. Ex vivo expansion of umbilical cord blood stem cells for transplantation: growing knowledge from the hematopoietic niche. Bone Marrow Transplant. 2007; 39(1): 11-23.

экспрессии MHC-II [29]. МПК представляет собой гетерогенную по степени зрелости смесь клеток гемопоэтической линии, значительную долю которых составляют дифференцированные лейкоциты. Есть данные о том, что ММСК из жировой ткани, по сравнению с клетками из других тканей, подвержены лизису CD8+Т-лимфоцитами и естественными киллерами [30]. Однако лимфоциты пуповинной крови обладают сниженной цитотоксической активностью [31, 32]. Можно предположить, что в нашем исследовании сочетание иммуносупрессивных свойств ММСК и их иммунотолерантности с низкой цитотоксической активностью МПК привело к тому, что присутствие аллогенных ММСК не вызывало активации иммунных клеток, что подтверждается высокой жизнеспособностью ММСК в ходе ко-культивирования.

Ранее в нашей лаборатории было показано, что изменение уровня О2 не влияет на экспрессию CD90 (Thy1) [11]. При взаимодействии с МПК мы также не обнаружили изменения иммунофенотипа ММСК по данному антигену, а его экспрессия поддерживалась на высоком уровне. Предполагается, что Thy1 через соответствующие интегрины может опосредовать адгезию лейкоцитов к эндотелию и фибробластам, клеток меланомы к эндотелию, тимоцитов к эпителию тимуса [33]. Ранее было показано, что снижение уровня экспрессии Thy1 связано с потерей иммуносупрессивной активности ММСК [34]. Участие в подавлении Т-клеточной активности было выявлено и для ICAM-1: чем больше экспрессия, тем выраженнее был иммуносупрессивный эффект [34]. Таким образом, наблюдавшаяся в данном исследовании стабильная экспрессия Thy1 и повышение уровня ICAM1 при взаимодействии с МПК также могла отразиться на функциональной активности ММСК, связанной с иммуносупрессией, что способствовало снижению цитотоксичности МПК и, таким образом, поддержанию жизнеспособности ММСК.

Проведенное исследование показало, что прикрепление аллогенных малодифференцированных гемопоэтических предшественников к ММСК жировой ткани может одинаково эффективно происходить как при 20%, так и 5% О2. ММСК активно экспрессировали молекулы адгезии, опосредующие формирование специализированных клеточных контактов, причём начальный этап прикрепления мононуклеаров проходил быстрей при 20% О2. Аллогенные ММСК не провоцировали цитотоксическое действие со стороны МПК и сохраняли высокую жизнеспособность при ко-культивировании.

Полученные данные могут быть использованы для разработки систем ко-культивирования, эффективных для обогащения фракции гемопоэтических стволовых клеток, показанных для последующего применения в гематологической практике.

Благодарности

Работа выполнена при поддержке Программы №7 Президиума РАН.

3. Majumdar M.K., Keane-Moore M., Buyaner D. et al. Characterization and functionality of cell surface molecules on human mesenchymal stem cells. J Biomed. Sci. 2003; 10(2): 228-41.

4. Goodison S., Urquidi V., Tarin D. CD44 cell adhesion molecules. Mol. Pathol. 1999; 52(4): 189-96.

5. Ponta H., Sherman L., Herrlich P.A. CD44: from adhesion molecules to signalling regulators. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2003; 4(1): 33-45.

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 4, 2013

Оригинальные исследования

45

6. Miyake K., Medina K.L., Hayashi S. et al. Monoclonal antibodies to Pgp-1/CD44 block lympho-hemopoiesis in long-term bone marrow cultures. J Exp. Med. 1990; 171(2): 477-88.

7. Walenda T., Bork S., Horn P. et al. Co-culture with mesenchymal stromal cells increases proliferation and maintenance of haematopoietic progenitor cells. J Cell Mol. Med. 2010; 14(1-2): 337-50.

8. Alakel N., Jing D., Muller K. et al. Direct contact with mesenchymal stromal cells affects migratory behavior and gene expression profile of CD133+ hematopoietic stem cells during ex vivo expansion. Exp. Hematol. 2009; 37(4): 504-13.

9. Jing D., Fonseca A.-V., Alakel N. et al. Hematopoietic stem cells in co-culture with mesenchymal stromal cells - modeling the niche compartments in vitro. Haematologica 2010; 95(4): 542-50.

10. Jing D., Wobus M., Poitz D.M. et al. Oxygen tension plays a critical role in the hematopoietic microenvironment in vitro. Haematologica 2012; 97(3): 331-9.

11. Буравкова Л.Б., Гринаковская О.С., Андреева Е.Р. и др. Характеристика мезенхимальных стромальных клеток из липоаспирата человека, культивируемых при пониженном содержании кислорода. Цитология 2009; 51(1): 5-11.

12. Рылова Ю.В., Андреева Е.Р., Буравкова Л.Б. Пролиферация и метаболический статус мезенхимальных стромальных клеток из жировой ткани при различном содержании кислорода в среде культивирования. Авиакосмическая и экологическая медицина 2010; 44(5): 38-41

13. Гринаковская О.С., Андреева Е.Р., Буравкова Л.Б. и др. Пониженное содержание О2 замедляет коммитирование культивируемых мезенхимальных стромальных клеток-предшественников из жировой ткани в ответ на остеогенные стимулы. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 2009; 147(6): 704-7.

14. Буравкова Л.Б., Андреева Е.Р., Григорьев А.И. Роль кислорода как физиологического фактора микроокружения в проявлении функциональных свойств мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток человека. Физиология человека 2012; 38(4): 1-10.

15. Koller M.R., Bender J.G., Papoutsakis E.T. et al. Effects of synergistic cytokine combinations, low oxygen, and irradiated stroma on the expansion of human cord blood progenitors. Blood 1992; 80(2): 403-11.

16. Hammoud M., Vlaski M., Duchez P. et al. Combination of low O(2) concentration and mesenchymal stromal cells during culture of cord blood CD34( + ) cells improves the maintenance and proliferative capacity of hematopoietic stem cells. J Cell Physiol. 2012; 227(6): 2750-8.

17. Маслова Е.В., Андреева Е.Р., Андрианова И.В. и др. Обогащение мононуклеаров пуповинной крови гемопоэтическими клетка-ми-предшественниками в совместной культуре с мезенхимальными стромальными клетками жировой ткани человека. КТБМ 2013; 4: 238-43.

18. Zuk P.A., Zhu M., Mizuno H. et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 2001; 7: 211-28.

19. Rothlein R.D. A human intercellular adhesion molecule (ICAM-1) distinct from LFA-1. J Immunology 1986; 137 (4): 1270-4.

20. Patarroyo M., Prieto J., Rincon J. et al. Leukocyte-cell adhesion: a molecular process fundamental in leukocyte physiology. Immunol. Rev. 1990; 114: 67-108.

21. Yang L., Froio R.M., Sciuto T.E. et al. ICAM-1 regulates neutrophil adhesion and transcellular migration of TNF-a-activated vascular endothelium under flow. Blood 2005; 106(2): 584-92.

22. Teixido J., Hemler M.E., Greenberger J.S. et al. Role of p1, and p2 Integrins in the Adhesion of Human CD34hi Stem Cells to Bone Marrow Stroma. J Clin. Invest. 1992; 90(2): 358-67.

23. Wagner W., Wein F., Roderburg C. et al. Adhesion of human hematopoietic progenitor cells to mesenchymal stromal cells involves CD44. Cells Tissues Organs 2008; 188(1-2): 160-9.

24. Wagner W., Wein F., Seckinger A. et al. Comparative characteristics of mesenchymal stem cells from human bone marrow, adipose tissue, and umbilical cord blood. Exp. Hematol. 2005; 33(11): 1402-16.

25. Ghannam S., Bouffi C., Djouad F. et al. Immunosuppression by mesenchymal stem cells: mechanisms and clinical applications. Stem Cell Res. Ther. 2010; 1(1): 2.

26. Gebler A., Zabel O., Seliger B. The immunomodulatory capacity of mesenchymal stem cells. Trends Mol. Med. 2012; 18(2): 128-34.

27. Marigo I., Dazzi F. The immunomodulatory properties of

mesenchymal stem cells. Semin. Immunopathol. 2011; 33(6):

593-602.

28. Горностаева А.Н., Андреева Е.Р., Андрианова И.В. и др. Оценка иммуносупрессивных эффектов мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток при разном содержании О2 в среде культивирования. Клеточные технологии в биологии и медицине 2011; 2: 92-6.

29. Le Blanc K., Tammik C., Rosendahl K. et al. HLA expression and immunologic properties of differentiated and undifferentiated mesenchymal stem cells. Exp. Hematol. 2003; 31(10): 890-6.

30. Abumaree M., Al Jumah M., Pace R.A. et al. Immunosuppressive properties of mesenchymal stem cells. Stem Cell Rev. 2012; 8(2): 375-92.

31. Risdon G., Gaddy J., Stehman F.B. et al. Proliferative and cytotoxic responses of human cord blood T lymphocytes following allogeneic stimulation. Cell Immunol. 1994; 154(1): 14-24.

32. Gaddy J., Risdon G., Broxmeyer H.E. Cord blood natural killer cells are functionally and phenotypically immature but readily respond to interleukin-2 and interleukin-12. J Interferon Cytokine Res. 1995; 15(6): 527-36.

33. Rege T.A., Hagood J.S. Thy-1 as a regulator of cell-cell and cell-matrix interactions in axon regeneration, apoptosis, adhesion, migration, cancer, and fibrosis. FASEB J 2006; 20(8): 1045-54.

34. Ren G., Zhao X., Zhang L. et al. Inflammatory cytokine-induced intercellular adhesion molecule-1 and vascular cell adhesion molecule-1 in mesenchymal stem cells are critical for immunosuppression. J Immunol. 2010; 184(5): 2321-8.

Поступила 16.07.2013

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 4, 2013