Иммунокорригирующая и противовирусная активность полисахарида из морских бактерий в отношении вируса клещевого энцефалита

DOI: 10.37489/0235-2990-2019-64-11-12-16-24

Иммунокорригирующая и противовирусная активность полисахарида из морских бактерий в отношении вируса клещевого энцефалита

*Н. В. КРЫЛОВА, Т. П. СМОЛИНА, М. В. БЕРЛИЗОВА, Г. Н. ЛЕОНОВА

ФГБНУ Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г. П. Сомова, Владивосток

Immunocorrective and Antiviral Activity of Polysaccharide from Marine Bacteria Against Tick-Borne Encephalitis Virus

*N. V. KRYLOVA, T. P. SMOLINA, M. V. BERLIZOVA, G. N. LEONOVA

Somov Institute of Epidemiology and Microbiology, Vladivostok

Цель работы — изучение иммунокорригирующей и противовирусной активности экстрацеллюлярного полисахарида (ЭПС) из морских бактерий Pseudoalteromonas nigrifaciens в отношении вируса клещевого энцефалита (КЭ). Материал и методы. Цитотоксичность ЭПС определяли в культуре клеток почек эмбриона свиньи (СПЭВ) с помощью МТТ-теста. Противовирусную активность ЭПС в отношении вируса КЭ оценивали в культурах клеток СПЭВ и мононуклеарных клеток периферической крови человека с помощью методов ингибирования цитопатогенного действия вируса, непрямой им-мунофлуоресценции и ПЦР в реальном времени. Иммунокорригирующую активность ЭПС исследовали в образцах цельной крови (от 10 здоровых доноров), инфицированных вирусом КЭ, методами проточной цитофлуориметрии и иммунофер-ментного анализа. Результаты. Установлено, что ЭПС нетоксичен, ингибирует репликацию вируса КЭ в клетках СПЭВ и мононуклеарных клетках, значительно снижает количество вирус-инфицированных клеток и уровни вирусной РНК, проявляет выраженные вирулицидные свойства (SI — селективный индекс полисахарида более 40). Внесение ЭПС в образцы цельной крови, инфицированные вирусом КЭ, восстанавливает индуцированное вирусом снижение экспрессии CD69, HLA-DR и CD107a на поверхности моноцитов, NK- и СБ8+Т-клеток и продукцию провоспалительных цитокинов (IL-1/8, IFN-a, TNF-a, IFN-y, IL-6) иммунокомпетентными клетками. Заключение. Полученные результаты позволяют рассматривать экстрацеллюлярный полисахарид из морских бактерий Pseudoalteromonas nigrifaciens в качестве перспективного противовирусного и иммунокорригирующего средства в терапии КЭ.

Ключевые слова: экстрацеллюлярньш полисахарид, вирус клещевого энцефалита, противовирусная, иммунокорригирующая активность.

The aim of this study was to examine the immunocorrective and antiviral activity of extracellular polysaccharide (EPS) from the marine bacteria Pseudoalteromonas nigrifaciens against tick-borne encephalitis virus (TBEV). Materials and Methods. The cytotoxicity of EPS was determined in pig embryo kidney (PK) cells using the MTT test. Antiviral activity of EPS against virus TBE was evaluated in cell cultures of PK cells and human peripheral blood mononuclear cells using the methods of inhibiting the cytopathogenic effect of the virus, indirect immunofluorescence, and real-time PCR. The immunocorrective activity of EPS was investigated in whole-blood samples (from 10 healthy donors) infected with TBEV, using flow cytometry assay and enzyme immunoassay. Results. It was found that EPS is non-toxic, inhibits the TBEV replication in PK cells and mononuclear cells, significantly reduces the number of virus-infected cells and levels of viral RNA, exhibits pronounced virucidal effects (selectivity index of polysaccharide is more than 40). EPS treatment of TBEV-infected whole blood samples restored the virus-induced decline of CD69, HLA-DR and CD107a expression levels on the surface of monocytes, NK and CD8+T-cells and the pro-inflammatory cytokine production (IL-10, IFN-a, TNF- a, IFN-y, IL-6) by immunocompetent cells. Conclusion. The results obtained allow considering extracellular polysaccharide from marine bacteria Pseudoalteromonas nigrifaciens as a promising antiviral and immunocorrective agent against TBE infection.

Keywords: extracellular polysaccharide, tick-borne encephalitis virus, antiviral, immunocorrective activity.

Введение

Клещевой энцефалит (КЭ) является одной из самых опасных нейровирусных инфекций во многих странах Евразийского континента. Ежегодно регистрируется около 10 000—15 000 клини-

© Коллектив авторов, 2019

*Адрес для корреспонденции: 690087, Владивосток, Сельская, 1. НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г. П. Сомова. E-mail: krylovanatalya@gmail.com

ческих случаев КЭ, но эти цифры, как полагают, значительно ниже фактических [1]. Вирус клещевого энцефалита (ВКЭ) принадлежит к роду Flavivirus семейства Flaviviridae и имеет три субтипа: дальневосточный, сибирский и европейский [2]. Наиболее эффективным способом предотвращения заболевания КЭ является вакцинация. Лечение пациентов с КЭ, как правило, является симптоматическим и поддерживающим, лицензированных антивирусных препаратов против

ВКЭ до сих пор не существует [1]. Наряду с этим, было установлено, что решающее воздействие на течение и исход заболевания может оказывать способность всех флавивирусов, включая вирус КЭ, модулировать иммунный ответ хозяина [3, 4]. В этой связи, актуальным является поиск противовирусных препаратов, которые способны инги-бировать репликацию вируса и элиминировать его из организма, а также корригировать индуцированную вирусом иммуносупрессию.

Начиная с 1940-х годов, морская биотехнология является одним из ключевых направлений поиска и создания новых лекарств. Было показано, что многие биологически активные соединения из морских микроорганизмов, включая бактериальные экстрацеллюлярные полисахариды (ЭПС), являются структурно уникальными и часто превосходят аналоги наземного происхождения по биологической или фармакологической активности [5, 6]. Морские аэробные бактерии рода Pseudoalteromonas (более 30 видов) продуцируют широкий спектр биоактивных соединений и обнаруживаются в Мировом Океане на поверхности биотических и абиотических объектов, в морской воде; их также можно культивировать в искусственных условиях [7]. Было показано, что некоторые ЭПС из бактерий Pseudoalteromonas ингибируют образование биоплёнок патогенными для человека микроорганизмами Vibrio sp. и Paracoccus sp. [8]. Другие ЭПС обладают антибактериальным действием [9, 10], а также проявляют иммуномодулирующую [11, 12] и противоопухолевую активность [13]. Продемонстрирована противовирусная активность ЭПС, продуцируемых морскими бактериями, в отношении вирусов герпеса 1 и 2 типа [14, 11], гепатита А [15], гриппа H1N1 [16]. В отношении вируса КЭ активность ЭПС из морских бактерий не известна.

В этой связи целью настоящего исследования явилось изучение противовирусной активности ЭПС из морских бактерий Pseudoalteromonas nigri-faciens в отношении вируса КЭ. Кроме того была исследована способность ЭПС восстанавливать активацию, цитотоксический потенциал и продукцию цитокинов ВКЭ-инфицированных им-мунокомпетентных клеток крови человека.

Материал и методы

Экстрацеллюлярный полисахарид (ЭПС) из Pseudoalteromonas nigrifaciens. Экстрацеллюлярный полисахарид был любезно предоставлен сотрудниками лаборатории химии углеводов Тихоокеанского института биоорганической химии им. Г. Б. Еля-кова ДВО РАН. ЭПС был получен из штамма КММ 156 бактерий Pseudoalteromonas (ранее Alteromonas) nigrifaciens, выделенного из ткани желудка мидии Crenomytilus grayanus [17]. Этот легкорастворимый полисахарид, по данным ЯМР-спек-троскопии, имеет одинаковую структуру с входящим в состав липополисахарида О-специфическим полисахаридом и состоит из тетрасахаридных повторяющихся звеньев, содержащих два остатка L-рамнозы, один остаток 2-ацетамидо-2-дез-

окси-В-глюкозы и один остаток 3-0-[(К)-1-карбоксиэтил]-D-глюкозы (глюколактиловой кислоты). На основании данный метилирования, 1Н- и 13С-ЯМР-спектроскопии установлена следующая структура повторяющегося звена кислыгх полисахаридов [17]:

^4)-e-D-GlcpNAc-(1^2)-a-L-Rhap-(1^3)-e-L-Rhap-(^.

3

t

1

a—D—Glcp3

Культура клеток и вирус. В работе быши использованы клетки почек эмбриона свиньи (СПЭВ), выращенные в среде 199 с добавлением 10% фетальной быгаьей сыворотки (FBS) и 100 ЕД/мл гентамицина при 37°С в С02-инкубаторе, в поддерживающей среде концентрация FBS быта снижена до 1%.

Был использован штамм Дальнегорск вируса КЭ дальневосточного субтипа (Gene Bank Whole Genome Sequence Number: FJ402886), выделенный в 1973 г. из мозга пациента с очаговой формой КЭ [18]. В исследование была взята 10% вируссодержащая суспензия мозга мышей-сосунков, инфицированных этим штаммом (10 пассаж). Титр вируса определяли по цитопатогенному действию (ЦПД) на культуру клеток СПЭВ и выражали как 50% тканевую цитопатогенную Дозу (ТЦД50/мл).

Определение цитотоксичности экстрацеллюлярного полисахарида. Цитотоксичность ЭПС оценивали по жизнеспособности клеток с помощью МТТ-теста [19]. Клетки СПЭВ, выращенные в 96-луночныгх планшетах (2х104 клеток/лунку), обрабатывали различными концентрациями ЭПС (от 0 до 12000 мкг/мл); необработанные клетки служили контролем. Клетки культивировали в течение 6 сут. при 37°С в С02-инку-баторе. По окончанию опыта к монослою клеток добавляли 5 мг/мл МТТ ([3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-diphenyl tetrazoli-um bromide], Sigma, USA) по 20 мкл/лунку на 2 ч при 37°C, затем добавляли изопропиловый спирт (150 мкл/лунку). Оптическую плотность (OD) измеряли при 540 нм с использованием 96-луночного ридера (Labsystems Multiskan RC, Finland). Жизнеспособность клеток рассчитывали как (0Dt)/(0Dc)x100%, где ODt и ODc — оптическая плотность обработанный: и контрольный: клеток, соответственно. Цитотоксичность выражали как 50% цитотоксическую концентрацию (СС50) полисахарида, которая снижала жизнеспособность обработанный: клеток на 50% по сравнению с контрольными клетками. Эксперименты проводились трижды.

Определение противовирусной активности ЭПС. Противовирусную активность тестируемого полисахарида в отношении ВКЭ определяли по ингибированию цитопатогенного действия вируса на клетках СПЭВ, выфащенныгх в 96-луноч-ныгх планшетах (2х104 клеток/лунку). Исследовали несколько схем применения ЭПС, каждая из которых выполнена в 3 независимым повторах с использованием триплетов различных концентраций полисахарида (15—1000 мкг/мл):

— Предварительная обработка клеток ЭПС. Монослой клеток обрабатывали разными концентрациями ЭПС в течение 2 ч при 37°С, контролем являлись необработанные клетки. Затем клетки промывали и инфицировали 10-кратными разведениями вируса в течение 1 ч при 37°С. Клетки промывали от неадсорбированного вируса и инкубировали с поддерживающей средой в течение 6 сут. при 37°С в С02-инкубаторе.

— Предварительная обработка вируса ЭПС. Каждое из 10-кратных разведений вируса соединяли с различными концентрациями ЭПС в соотношении 1:1 и инкубировали в течение 2 ч при 4 °C. На монослой клеток наносили вируссодержащую суспензию, обработанную ЭПС и необработанную (контроль) на 1 ч при 37°С. Затем клетки промывали и инкубировали с поддерживающей средой в течение 6 сут. при 37°С в С02-инкубаторе.

— Обработка инфицированных клеток ЭПС. Монослой клеток инфицировали десятикратными разведениями вируса в течение 1 ч при 37°C. После этого клетки промывали, обрабатывали различными концентрациями ЭПС (необработан-

ные клетки являлись контролем) и инкубировали в течение 6 сут. при 37°С в С02-инкубаторе.

Противовирусную активность ЭПС определяли по разнице титров вируса между обработанными и необработанными инфицированными клетками и выражали в процентах ингибиро-вания (PI). PI рассчитывали по формуле (PI)=(1—T/C)x100%, где T — антилогарифм титра вируса в ЭПС-обработанных клетках, а C — антилогарифм титра вируса в контрольных клетках [20]. Ингибирующую концентрацию (IC50) определяли как концентрацию ЭПС, которая снижала индуцированный вирусом ЦПД на 50%. Индекс селективности (SI) рассчитывали как отношение CC50 к IC50.

Моделирование ВКЭ-инфекции ex vivo. Образцы цельной крови (12 мл) были собраны с гепарином от здоровых доноров (n=10), не болевших КЭ и не вакцинированных против КЭ. Средний возраст доноров составил 32 года (от 28 до 37 лет). Все доноры дали письменное информированное согласие на участие в исследовании, и протокол исследования был одобрен Комитетом по этике НИИ ЭМ им. Сомова (протокол №2 от 12 февраля 2017 г.). Каждый образец цельной крови (~4x106 клеток/мл) был разделён на три равные порции для анализа: 1) ВКЭ-инфекции в мононуклеарных клетках периферической крови человека (МНК); 2) экспрессии поверхностных антигенов на клетках крови (FACS анализ); 3) продукции цито-кинов этими клетками.

Мононуклеарные клетки были выделены из образцов цельной крови после центрифугирования (400 g, 30 мин) с использованием градиента плотности фиколл-верографина (Pan-Eco, Россия). Клетки дважды промывали и ресуспенди-ровали в среде 199, содержащей гентамицин, с последующим разбавлением клеточной суспензии до конечной концентрации 4x106 клеток/мл. Жизнеспособность выделенных МНК, которую оценивали по окрашиванию трипановым синим, составила > 97%.

Для оценки продукции цитокинов иммунокомпетентны-ми клетками образцы цельной крови разводили 1:2 в среде RPMI-1640 (Пан-Эко, Россия), содержащей L-глутамин и гентамицин.

Каждая порция как цельной крови, так и МНК, была разделена на четыре аликвоты по 1 мл. Первую группу аликвот инфицировали вирусом КЭ в дозе 100 ТЦД50/мл и обозначали как ВКЭ-образцы (вирус-инфицированные и необработанные). Вторую группу аликвот одновременно инфицировали 100 ТЦД50/мл ВКЭ и обрабатывали 100 мкг/мл ЭПС и обозначали как ВКЭ+ЭПС образцы (вирус-инфицированные и ЭПС-обработанные). Третью группу аликвот обрабатывали 100 мкг/мл ЭПС и обозначали как ЭПС-образцы (обработанные ЭПС). Четвёртая группа необработанных и неинфициро-ванных аликвот использовалась в качестве контроля. Все аликвоты инкубировали в течение 24 ч при 37°С. После инкубации жизнеспособность МНК при окрашивании трипано-вым синим составила > 95%.

Исследование ВКЭ-инфекции в мононуклеарных клетках периферической крови человека. Аликвоты с МНК, инфицированные (обработанные ЭПС и необработанные) вирусом КЭ, через 24 ч после инфицирования (п. и.) центрифугировали (500 g, 10 мин), промывали и ресуспендировали и в каждом образце определяли процент вирус-инфицированных клеток, титр вируса и присутствие вирусной РНК.

Процент МНК, инфицированных ВКЭ, определяли методом непрямой иммунофлуоресценции. Мононуклеарные клетки помещали на покровные стёкла, фиксировали охлаждённым ацетоном. На клетки наносили человеческую сыворотку, содержащую антитела к ВКЭ (разведение 1:40), и антивидовые иммуноглобулины против иммуноглобулинов человека, меченые FITC (разведение 1:64; Медгамал, Россия), и визуализировали в люминесцентном микроскопе (Micros 200A, Австрия). В каждом образце, по меньшей мере, в пяти полях (100—120 клеток на поле) были подсчитаны соотношения (%) инфицированных вирусом клеток (окрашенных) к об-

щему количеству клеток. Флуоресцентные изображения МНК (ВКЭ+ЭПС-образцы, ВКЭ-образцы и контроли) получали на лазерном сканирующем микроскопе LSM 710 (Carl Zeiss, Германия) с использованием иммерсионного объектива 40X.

Количество вируса, связанного с МНК, определяли с помощью титрования образцов на клетках СПЭВ. Каждую алик-воту дважды замораживали/оттаивали и центрифугировали (500 g, 10 мин). Супернатанты серийно разводили (от 10-1 до 10-8), и каждое разведение наносили на монослой клеток СПЭВ, выращенных в 96-луночных планшетах. После 1 ч адсорбции при 37°С клетки промывали и инкубировали с поддерживающей средой в течение 6 сут. при 37°С в С02-инкуба-торе. Титры вируса выражали в виде ТЦД^/мл.

Анализ полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ) проводился для выявления РНК ВКЭ в образцах инфицированных мононуклеарных клеток. Выделение суммарной РНК вируса из клеток проводили с использованием набора реагентов для экстракции нуклеиновых кислот «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Россия), в соответствии с инструкциями производителя. ПЦР-РВ с гибридизаци-онно-флуоресцентной детекцией осуществляли с использованием набора «AmpliSens TBE-FL» (ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Россия), содержащего олигонуклеотидные праймеры, фланкирующие фрагмент гена структурного белка Е вируса КЭ. Амплификацию проводили в объёме 25 мкл реакционной смеси в следующих условиях: 1 цикл при 50°С — 30 мин; 1 цикл при 95°С — 15 мин; 5 циклов при 95°С — 10 с, 65°С — 45 с и 72°С — 15 с; затем 45 циклов при 95°С — 10 с и 60°С — 45 с. РНК вируса КЭ детектировали по каналу флуоресценции FAM/Green (470 нм/510 нм) с использованием «Rotor-Gene Q» (QIAGEN Hilden, Германия). Данные ПЦР-РВ анализировали с помощью метода определения порогового цикла реакции (Ct), где значение Ct менее 37 циклов считается положительным.

Проточная цитометрия (FACS-анализ). Экспрессию мембранных молекул (CD69, HLA-DR и CD107a) на иммуноком-петентных клетках человека оценивали в образцах цельной крови через 24 ч п.и. с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания моноклональными антителами (МКА). В настоящем исследовании использовались следующие МКА с соответствующими изотипическими контролями: анти-CD3-FITC, анти-CD3-PC5, анти-CD14-FITC, анти-CD69-PE, ан-™-CD8-FITC, анти-HLA-DR- PE, анти-CD56-APC, анти-CD107а-PE (Beckman Coulter, США).

0бразцы цельной крови инкубировали с МКА в течение 30 мин при комнатной температуре. Эритроциты лизировали FACS Lysing Solution (Becton Dickinson, США) в течение 15 мин при комнатной температуре, клетки промывали и ресус-пендировали в PBS (Cell Wash, Becton Dickinson). Окрашенные клетки (минимум 10000 клеток/образец) анализировали с использованием проточного цитофлуориметра FACSCalibur (США) и программного обеспечения CellQuest Pro (Becton Dickinson, США). Результаты анализа экспрессии CD69, HLA-DR, CD107a представлены как средний процент имму-нокомпетентных клеток, экспрессирующих соответствующие молекулы клеточной поверхности.

Анализ продукции цитокинов методом ИФА. Уровни цитокинов (IL-1/3, IFN-a, TNF-a, IFN-y, IL-6) в супернатантах образцов цельной крови оценивали через 24 ч п.и. с помощью коммерческих ИФА-наборов («Цитокин», Санкт-Петербург, Россия) в соответствии с инструкциями производителя. Все тесты проводились в двух повторах, а оптическая плотность (OD) измерялась при 450 нм. Концентрации цитокинов рассчитывали по значениям OD с использованием стандартной кривой для каждого анализируемого цитокина. Минимальные определяемые концентрации составляли 6,3 пкг/мл для IL-1/3; 5,0 пкг/мл для IFN-a; 1,0 пкг/мл для TNF-a; 20 пкг/мл для IFN-y и 5,0 пкг/мл для IL-6.

Статистический анализ. Значения CC50 и IC50 были рассчитаны с помощью регрессионного анализа кривой доза-ответ. Результаты выражены как среднее значение ± стандарт-

ное отклонение. Данные были проанализированы с помощью одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим специальным тестом Бонферрони. Расчёты проводились с использованием Statistica 10. Значения p<0,05 считались статистически значимыми.

Результаты

Цитотоксичность и противовирусная активность ЭПС. Анализ цитотоксичности проводили для определения нетоксичного для клеток СПЭВ диапазона концентраций тестируемого полисахарида и последующего изучения его активности в отношении вируса КЭ. На основании результатов MTT-анализа была получена кривая доза—ответ для ЭПС (рис. 1, а), рассчитана 50% цитотоксическая концентрация (CC50) и определена максимальная не-цитотоксическая концентрация (MNTC), при которой более 90% клеток СПЭВ были жизнеспособны. Значение СС50 составило 10 900+350 мкг/мл, MNTC — 1000+30 мкг/мл ЭПС. Дальнейший анализ противовирусной активности проводили при концентрациях ниже 1000 мкг/мл.

Для изучения механизма вирусингибирующе-го действия ЭПС было исследовано влияние различных концентраций тестируемого полисахарида (от 15 до 1000 мкг/мл) на некоторые стадии жизненного цикла ВКЭ. Клетки были предварительно обработаны ЭПС перед вирусной инфекцией (предварительная обработка клеток), вирус инкубировали с ЭПС перед инфицированием клеток (предварительная обработка вируса) и инфицированные клетки инкубировали с ЭПС (обработка инфицированных клеток) (рис. 1, б, в).

Установлено, что наиболее высокая активность ЭПС в отношении ВКЭ наблюдалась при прямом воздействии полисахарида на вирусные частицы. Так, предварительная обработка вируса максимальной нецитотоксической концентрацией ЭПС (1000 мкг/мл) вызывала снижение титра вируса на 5,3+0,5 log10 ТЦД50/мл по сравнению с необработанными контролями, процент ингиби-рования вирус-индуцированного ЦПД составил 67,9+5% (рис. 1, б, в). При этом значение IC50 составило 244,4+10,2 мкг/мл при SI 44,6+0,8. В то же время предварительная обработка клеток полисахаридом показала умеренную противовирусную активность (IC50 — 1071,2+20,5; SI — 10,2+1,1), а использование 1000 мкг/мл ЭПС привело к снижению титров вируса КЭ на 3,7+0,4 log10 ТЦД50/мл (рис. 1, б). Между тем, добавление тестируемого полисахарида после проникновения вируса в клетки (обработка инфицированных клеток) слабо защищало клетки от ВКЭ-индуцированного ЦПД.

Оценка способности ЭПС влиять на ранние стадии ВКЭ инфекции (первые 24 ч) была выполнена в экспериментах ex vivo с использованием образцов цельной крови и мононуклеарных клеток периферической крови от здоровых доноров. Эти эксперименты были проведены с использованием

Рис. 1. Цитотоксичность и противовирусная активность ЭПС в отношении вируса КЭ в культуре клеток СПЭВ.

а — цитотоксичность ЭПС; б, в — противовирусная активность ЭПС при разных схемах его применения через 6 сут. п.и.; б— противовирусная активность ЭПС оценивалась по снижению титров вируса в ЭПС-обработанных и необработанных инфицированных клетках; в — противовирусная активность ЭПС представлена в процентах ингибирования цитопатогенного действия вируса в ЭПС-обработанных и необработанных инфицированных клетках.

100 мкг/мл ЭПС и 100 ТЦД50/мл вируса КЭ. Выбор концентрации полисахарида и инфицирующей дозы вируса быш ранее определён в исследованиях, оценивающих влияние как ЭПС [21], так и вируса КЭ [22] на иммунокомпетентные клетки в образцах цельной крови здоровых доноров.

Рис. 2. Влияние ЭПС на вирус-инфицированные мононуклеарные клетки человека через 24 ч п.и.

а - количество вирус-инфицированных МНК (%, столбцы); количество вируса, связанного с МНК (титр вируса в 1од10 ТЦД50/мл, линия); б - флуоресцентные изображения МНК, полученные с помощью лазерного сканирующего микроскопа, иммерсионный объектив 40х.

Влияние ЭПС на ВКЭ инфекцию мононуклеар-ных клеток периферической крови. Способность ЭПС влиять на ранние стадии ВКЭ инфекции в МНК оценивали по количеству вирус-инфициро-ванных клеток, инфекционным титрам вируса и выявлению вирусной РНК. Через 24 ч п. и. процент вирус-инфицированных клеток в инфицированных необработанных МНК (ВКЭ-образцы) составлял 55±5%, титры вируса были 1,25±0,2 log10 ТЦД50/мл (рис. 2, а, б). В то же время в инфицированных и одновременно обработанных ЭПС моно-нуклеарных клетках (ВКЭ+ЭПС-образцы) среднее значение вирус-инфицированных клеток достигало только 8±2%, и инфекционный вирус (в титрах) не был обнаружен (рис. 2, а, б). ПЦР-РВ через 24 ч п. и. подтвердила присутствие вирусной РНК в ВКЭ-образцах МНК (значение Ct = 33,7±0,9), в то время как в ВКЭ+ЭПС-образцах вирусная РНК не была обнаружена (значение Ct > 37).

Экспрессия CD69, HLA-DR и CD107a на поверхности иммунокомпетентных клеток в образцах цельной крови. Активацию и цитотоксический потенциал иммунокомпетентных клеток (моноцитов, NK- и СБ8+Т-клеток) оценивали в образцах цельной крови доноров. Следует отметить, что использование цельной крови позволяет сохранить существующий in vivo баланс различных типов

клеток крови и наиболее близко отражает процессы, которые происходят in vivo.

Экспрессия CD69 и HLA-DR на моноцитах (рис. 3). CD69 является одним из ранних активацион-ных антигенов, который экспрессируется на поверхности моноцитов, NK-клеток и лимфоцитов, хотя динамика экспрессии CD69 зависит от типа клеток и методов стимуляции [23]. Мы обнаружили, что через 24 ч п. и. уровни экспрессии CD69 на моноцитах в инфицированных образцах (ВКЭ-образцах) были ниже по сравнению с контролем (р<0,05) (рис. 3, б). Обработка образцов крови исследуемым полисахаридом (ЭПС-образцы и ВКЭ+ЭПС-образ-цы) значимо повышала уровень экспрессии этого активационного антигена по сравнению с контролем (p<0,05). Но процент моноцитов, экс-прессирующих CD69, был выше в ЭПС-образцах (45,5±6,6%), чем таковой в ВКЭ+ЭПС-образцах (29,5+4,5%) (p<0,05).

HLA-DR относится к молекулам главного комплекса гистосовместимости класса II, которые необходимы для процессинга антигена и презентации Т-клеткам, и конститутивно экспресси-руются на поверхности моноцитов у здорового человека [24].

При исследовании экспрессии HLA-DR на моноцитах в образцах цельной крови доноров через 24 ч п. и. были обнаружены высокие уровни экспрессии этого антигена в контрольных образцах, ЭПС- и ВПЭ+ЭПС-образцах (рис. 3, в). В ВКЭ-образцах процент моноцитов, экспрессиру-ющих HLA-DR, был значительно ниже по сравнению с контролем (p<0,05).

Экспрессия CD69 и CD107a на NK- и CD8+T-клетках (рис. 4). Изменения экспрессии CD69 на поверхности NK-клеток в образцах цельной крови через 24 ч п. и. были сходны с таковыми на моноцитах: процент NK-клеток, экспрессирующих CD69, был значительно ниже в V-образцах, в то время как в ЭПС- и ВКЭ+ЭПС-образцах этот

Рис. 3. Влияние ЭПС и вируса КЭ на экспрессию CD69 и HLA-DR моноцитами донорской крови через 24 ч п. и.

а — стратегия гейтирования моноцитов. Верхняя панель показывает экспрессию CD69 на моноцитах: б — одного образца крови из 10 исследованных; в — всех 10 образцов крови. Нижняя панель показывает экспрессию HLA-DR на моноцитах: г— одного образца крови из 10 исследованных; д — всех 10 образцов крови. * — различия значимы по отношению к показателям контрольных образцов (р70,05); ** — значимы при сравнении показателей ЭПС-образцов и ВКЭ+ЭПС-образцов (р<0,05); *** — различия значимы при сравнении показателей ВКЭ-образцов и ВКЭ+ЭПС-об-разцов (р<0,05).

процент был значительно выше по сравнению с контролями (р<0,05). В тоже время отмечались более высокие уровни экспрессии СБ69 на МК-клетках в ЭПС-образцах (70,7+4,8%), чем в ВКЭ+ЭПС-образцах (43,1+3,8%) (р<0,05).

СБ 107а, связанный с лизосомами мембранный белок-1 (ЬЛМР-1), является маркёром дегра-нуляции МК-клеток, активированных СБ8+Т-клеток и других типов клеток, и уровни экспрессии СБ107а положительно коррелируют с цито-токсической активностью этих клеток [25, 26]. Мы наблюдали низкие уровни экспрессии СБ107а (1,1—2,5%) на МК-клетках в контрольных и ВКЭ-образцах цельной крови через 24 ч п. и. (см. рис. 4). Между тем процент МК-клеток, экс-прессирующих СБ107а, был выше в ЭПС-образ-

цах (10,2+1,7%) и ВКЭ+СР8-образцах (7,0+1,5%) по сравнению с контролями (p<0,05).

Процент СБ8+Т-клеток, экспрессирующих CD69 и СБ107а в образцах цельной крови через 24 ч п. и., был невысок. Уровни экспрессии этих молекул в контрольных и ВКЭ-образцах отличались незначительно, но в ЭПС- и ВКЭ+ЭПС-образцах экспрессия CD69 и СБ107а была выше по сравнению с контролем (p<0,05). При этом количество СБ8+Т-клеток, экспрессирующих CD69 в ВКЭ+ЭПС-образцах, было ниже (11,4+1,5%), чем в ЭПС-образцах (19,1+2,6%) (p<0,05) (см. рис. 4).

Влияние ЭПС и ВКЭ на продукцию цитокинов клетками цельной крови. Воздействие тестируемого полисахарида и вируса КЭ на продукцию различных провоспалительных цитокинов (IFN-a, IL-1ß,

дуцированную вирусом иммуносупрес-сию. Это побудило нас исследовать противовирусную активность экстрацеллю-лярного полисахарида, выделенного из морской бактерии Pseudoalteromonas nigrifaciens, который, как было показано ранее [21], активировал NK-клетки, CD8+T-лимфоциты и моноциты. Эти иммуно-компетентные клетки играют важную роль в иммунной защите от многих вирусных инфекций, включая ВКЭ, благодаря своей цитотоксической активности и продукции провоспалительных цито-кинов [28].

В настоящей работе мы исследовали активность ЭПС в отношении вируса КЭ и цитоток-сичность этого полисахарида для клеток СПЭВ, высокочувствительных к ВКЭ инфекции. Установлено, что ЭПС практически нетоксичен для этих клеток (CC50=10900 мкг/мл, рис. 1, а). При различных способах воздействия ЭПС на вирус КЭ и клетки СПЭВ полисахарид снижал титры вируса в зависимости от концентрации препарата (см. рис. 1, б, в). Предварительная обработка вируса ЭПС показала наиболее эффективную противовирусную активность, приводящую к значительному ингибированию вирус-индуцированно-го ЦПД через 6 сут п. и. (SI — 44,6). Умеренное снижение репликации вируса TBE наблюдалось при предварительной обработке клеток СПЭВ полисахаридом (SI — 10,2). Таким образом, результаты, полученные при воздействии ЭПС на разные стадии репликации вируса, позволяют предположить, что ингибирующий эффект ЭПС может быть обусловлен его способностью непосредственно инактивировать вирусные частицы, а также предотвращать адсорбцию вируса на

Уровни цитокинов в супернатантах образцов цельной крови через 24 ч после обработки

Цитокины (пкг/мл) Обработка образцов

Контроль ВКЭ ЭПС ВКЭ+ЭПС

IFN-a 10,3+2,7 <5,0 52,7+5,4* 21,8+3,9**

IL-1/3 11,7+2,4 <6,3 501,9+24,1* 343,3+18,7**

TNF-a 3,2+0,7 <1,1 216,1+12,1* 112,2+11,3**

IFN-y 28,1+3,2 <20,0 87,5+7,9* 42,3+6,7**

IL-6 8,4+1,5 <5,0 402,9+12,8* 292,5+13,4**

Примечание. * - различия значимы по отношению к показателям контрольных образцов (р<0,05); ** - различия значимы при сравнении показателей ЭПС-образцов и ВКЭ+ЭПС-образцов (р<0,05).

Рис. 4. Влияние ЭПС на вирус-инфицированные мононуклеарные клетки человека через 24 ч п.и.

а - количество вирус-инфицированных МНК (%, столбцы); количество вируса, связанного с МНК (титр вируса в 1од10 ТЦД50/мл, линия); б - флуоресцентные изображения МНК, полученные с помощью лазерного сканирующего микроскопа, иммерсионный объектив 40х.

№N-7 и 1Ь-6) исследовали в образцах цельной крови через 24 ч п. и. (таблица). Высокие уровни всех анализируемых цитокинов быши обнаружены в супернатантах ЭПС-образцов (неин-фицированных ВКЭ). Напротив, инфицирование образцов цельной крови вирусом КЭ (ВКЭ-образ-цы) не индуцировало значимую продукцию цитокинов 1Ь-1в, ТОТ-а, №N-7 и 1Ь-6. В то же время обработка ЭПС и одновременное инфицирование вирусом образцов цельной крови (ВКЭ+ЭПС) приводило к значительному увеличению продукции цитокинов по сравнению с таковым в ВКЭ-образцах (р<0,05). Однако концентрации цитокинов 1Ь-1^, TNF-a, №N-7 и 1Ь-6 в супернатантах ВКЭ+ЭПС-образцов были ниже, чем таковые в ЭПС-образцах (р<0,05).

Обсуждение

Известно, что все флавивирусы, включая ВКЭ, выработали различные стратегии модуляции иммунного ответа хозяина для эффективной инфекции и репликации [4, 27]. В этой связи, остаётся актуальным поиск препаратов, способных ингибировать репликацию вируса и элиминировать его из организма, а также корригировать ин-

клетки. Сообщалось, что некоторые ЭПС, продуцируемые морскими бактериями, имеют аналогичные механизмы действия против таких вирусов, как ШУ-1, ШУ-2, ИСУ [29, 30].

Кроме того, мы исследовали, способен ли тестируемый полисахарид индуцировать вирусин-гибирующее действие на ранней стадии ВКЭ инфекции в мононуклеарных клетках периферической крови (МНК), выделенных из крови здоровых доноров. Полученные нами результаты подтвердили предыдущие данные [22] о том, что штамм Дальнегорск вируса КЭ быстро проникает и эффективно размножается в МНК (ВКЭ-об-разцы) в течение 24 ч п. и. (см. рис. 2). Между тем, обработка ЭПС инфицированных МНК (ВКЭ+ЭПС-образцы) значительно снижала количество вирус-инфицированных клеток, приводила к низким титрам вируса и необнаружи-ваемым уровням вирусной РНК. Эти данные согласуются с результатами ЭПС-обработки инфицированных вирусом КЭ клеток СПЭВ и указывают на способность тестируемого полисахарида защищать МНК от вирус-индуцированного ЦПД на ранней стадии инфекции. Мы предполагаем, что одним из возможных механизмов противовирусного действия, когда МНК одновременно инфицированы вирусом КЭ и обработаны ЭПС, является способность ЭПС связывать и/или инактивировать вирусные частицы, тем самым предотвращая прикрепление, проникновение и репликацию вируса.

Затем мы исследовали влияние ЭПС на имму-нокомпетентные клетки в образцах цельной крови, инфицированных ВКЭ. Так, через 24 ч п. и. в образцах крови, инфицированных, но необработанных ЭПС (ВКЭ-образцы), отмечалось снижение уровней экспрессии маркёров ранней и поздней активации (СБ69 и ИЬЛ-БЯ) на поверхности моноцитов (см. рис. 3) и значительное уменьшение количества МК-клеток, экспресси-рующих СБ69 (см. рис. 4). В этих образцах цито-токсические лимфоциты (МК и СБ8+Т-клетки) экспрессировали незначительные уровни маркёра дегрануляции СБ107а (см. рис. 4), экспозиция которого на поверхности коррелирует с опосредованной гранзимом и перфорином цитотокси-ческой активностью этих клеток [25, 26]. Кроме того, супернатанты ВКЭ-образцов содержали незначительные количества 1КК-а, 1Ь-1в, ТМБ-а, 1КК-у, 1Ь-6 (см. таблицу), которые являются важными компонентами раннего иммунного ответа на вирусные инфекции. Таким образом, способность вируса ВКЭ на ранней стадии инфицирования клеток крови индуцировать снижение активации и цитотоксического потенциала иммуно-компетентных клеток и подавление продукции провоспалительных цитокинов может быть одной из стратегий, выработанных ВКЭ для избега-

ния иммунных реакций хозяина. Это способствует эффективной репликации вируса в клетках, как показано на рис. 2. Рядом авторов установлено, что некоторые флавивирусы (БЕМУ, и ТВЕУ) способны задерживать индукцию ШМ-а на ранней стадии инфекции (первые 24 ч). Эта задержка необходима вирусам для создания из ци-топлазматических мембран клетки «компартмен-тов репликации», в которых вирусная РНК защищена от иммунного распознавания до тех пор, пока не будет достаточного количества вирусного потомства [3, 31, 32].

Мы показали, что обработка ЭПС образцов крови, инфицированных ВКЭ (ВКЭ+ЭПС), приводит к значительному увеличению экспрессии мембранных молекул на моноцитах, МК и СБ8-клетках, и повышению продукции цитокинов (ШК-а, 1Ь-1/3, ТОТ-а, ШК-у, 1Ь-6) по сравнению с ВКЭ-образцами. Известно, что эффективная элиминация вируса зависит от способности хозяина развивать иммунный ответ ТЫ-типа, характеризующийся активацией моноцитов/макрофагов, МК-клеток, цитоток-сических Т-лимфоцитов и продукцией провос-палительных цитокинов [11, 33]. Вероятно противовирусный эффект ЭПС (см. рис. 1, 2) может быть опосредованно связан с его способностью индуцировать ТЫ-тип клеточный иммунитет на ранней стадии ВКЭ-инфекции посредством активации иммунокомпетентных клеток, увеличения их цитотоксичности и повышения продукции ТЫ -цитокинов. Поскольку исследование проводилось на образцах донорской цельной крови, существует вероятность того, что другие факторы могут способствовать процессу инги-бирования ВКЭ-инфекции тестируемым полисахаридом. Необходимы дальнейшие исследования для более точного определения механизма противовирусного действия ЭПС.

Таким образом, полученные результаты продемонстрировали противовирусную активность и иммунокорригирующее действие экстрацеллю-лярного полисахарида из морских бактерий РзгийоаИгготопаз nigrifaciens. ЭПС ингибирует репликацию вируса КЭ в клетках СПЭВ и моно-нуклеарных клетках периферической крови человека, инактивирует вирусные частицы и предотвращает адсорбцию вируса на эти клетки. Обработка ЭПС ВКЭ-инфицированных клеток крови может восстанавливать вызванные вирусом нарушения функциональной активности иммунокомпетентных клеток на ранней стадии инфекции. Взятые вместе наши результаты различных аспектов активности ЭПС позволяют нам рассматривать этот полисахарид как потенциальное противовирусное и иммунокорригирующее средство в отношении ВКЭ и, возможно, других флавиви-русных инфекций.

ЛИТЕРАТУРА

1. Bogovic P., Strle F. Tick-borne encephalitis: A review of epidemiology, clinical characteristics, and management. World J Clin Cases 2015; 3: 430-441.

2. King A.M.Q., Adams M.J., Carstens E.B., Lefkowitz E.J.Virus Taxonomy: Classification and Nomenclature of Viruses: Ninth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Elsevier Academic Press, San Diego; 2012.

3. Robertson S.J., LubickK.J., Freedman B.A., Carmody A.B., Best S.M. TickBorne Flaviviruses Antagonize Both IRF-1 and Type I IFN Signaling To Inhibit Dendritic Cell Function. J Immunology 2014; 192: 2744-2755.

4. Ye J., Zhu B, Fu Z.F., Chen H, Cao S. Immune evasion strategies of flaviviruses. Vaccine 2013; 31: 461-471.

5. CasilloA., Lanzetta R, Parrilli M, Corsaro M.M. Exopolysaccharides from Marine and Marine Extremophilic Bacteria: Structures, Properties, Ecological Roles and Applications. Mar Drugs 2018; 16: 69-103.

6. Parkar D, Jadhav R, Pimpliskar M. Marine bacterial extracellular polysaccharides: A review. JCLM 2017; 5: 29-35.

7. Holmstrom C, Kjelleberg S. Marine Pseudoalteromonas species are associated with higher organisms and produce biologically active extracellular agents. FEMS Microbiology Ecology 1999; 30: 285-293.

8. Dheilly A., Soum-Soutera E, Klein G.L., Bazire A., Compere C, Haras D. et al. Antibiofilm activity of the marine bacterium Pseudoalteromonas sp. strain 3J6. Applied Environ Microbiol 2010; 76: 3452-3461.

9. Sivasubramanian K, Ravichandran S, Vijayapriya M. Antagonistic activity of marine bacteria Pseudoalteromonas tunicata against microbial pathogens. Afr J Microbiol Res 2011; 5: 562-567.

10. Yu M, Wang J., Tang K, Shi X., Wang S, Zhu W.M. et al. Purification and characterization of antibacterial compounds of Pseudoalteromonas flavip-ulchra JG1. Microbiology 2012; 158: 835-842.

11. Gugliandolo C., Spano A., Maugeri T, Poli A., Arena A., Nicolaus B. Role of Bacterial Exopolysaccharides as Agents in Counteracting Immune Disorders Induced by Herpes Virus. Microorganisms 2015; 3: 464-483.

12. Yu L., Sun G., Wei J., Wang Y., Du C., Li J. Activation of macrophages by an exopolysaccharide isolated from Antarctic Psychrobacter sp. B-3. Chin J Ocean Limnol 2016; 34: 1064-1071.

13. Chen G., Qiana W., Lia J., Xua Y., Chena K. Exopolysaccharide of Antarctic bacterium Pseudoalteromonas sp. S-5 induces apoptosis in K562 cells. Carbohydr Polym 2015; 121: 107-114.

14. Al-Nahas M.O., Darwish M.M., Ali A.E., Amin M.A. Characterization of an exopolysaccharide-producing marine bacterium, isolate Pseudoalteromonas sp. AM Afr J Microbiol Res 2011; 5: 3823-3831.

15. Ghada S.I., Manal G.M., Mohsen M.S.A., Eman A.G. Production and Biological Evaluation of Exopolysaccharide from Isolated Rhodotorula glutinins. Aust J Basic & Appl Sci 2012; 6: 401-408.

16. Osama H.E.S., Abd El Kader M.E.S., Hassan M.S., Manal G.M., Mohsen S.A., Saher S.M. Isolation, characterization and biological activities of exopolysaccharide produced by Bacillus marinus. Der Pharma Chemica 2015; 7: 200-208.

17. Горшкова P.П., Назаренко Е.Л., Зубков B.A., Иванова Е.П., Оводов Ю.С., Шашков A.C. и соавт. Структура повторяющегося звена кислого полисахарида Alteromonas haloplanktis KMM 156. Биоорган химия. — 1993. — № 19. — С. 327-336. / Gorshkova R.P., Nazarenko E.L., Zubkov V.A., Ivanova E.P., Ovodov Jyu.S., Shashkov A.S. i soavt.

СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ:

Крылова Наталья Владимировна — д. б. н., ведущий научный сотрудник лаборатории экспериментальной вирусологии НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г. П. Сомова, Владивосток

Смолина Татьяна Павловна — к. б. н., ведущий научный сотрудник лаборатории иммунологии НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г. П. Сомова, Владивосток

Struktura povtoryajyushchegosya zvena kislogo polisakharida Alteromonas haloplanktis KMM 156. Bioorgan khimiya 1993; 19: 327—336. [in Russian]

18. Leonova G.N., Maystrovskaya O.S., Kondratov I.G., Takashima I., Belikov S.I. The nature of replication of tick-borne encephalitis virus strains isolated from residents of the Russian Far East with inapparent and clinical forms of infection. Virus Res 2014; 189: 34-42.

19. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods 1983; 65: 55-63.

20. Koseki I., Simoni I.C., Nakamura I.T., Noronha A.B., Costa S.S. Antiviral activity of plant extracts against aphthovirus, pseudorabies virus and pes-tivirus in cell cultures. Microbios Letters 1990; 44: 19-30.

21. Смолина Т.П., Запорожец Т.С., Беседнова Н.Н. Изменение уровня экспрессии молекул адгезии клеток врождённого иммунитета человека гликополимерами морских бактерий. Антибиотики и химиотер. - 2015. - Т. 60. - № 5-6. С. 3-7. / Smolina T.P., Zaporozhets T.S., Besednova N.N. Izmenenie urovnya ekspressii molekul adgezii kletok vrozhdennogo immuniteta cheloveka glikopolimerami morskikh bakterij. Antibiotiki i khimioter 2015; 60 (5—6): 3-7. [in Russian]

22. Krylova N.V., Smolina T.P., Leonova G.N. Molecular Mechanisms of Interaction between Human Immune Cells and Far Eastern Tick-Borne Encephalitis Virus Strains. Viral Immunology 2015; 28: 272-281.

23. Craston R., Koh M, McDermott A., Ray N., Prentice E.G., Lowdell M.W. Temporal dynamics of CD69 expression on lymphoid cells. J Immunol Methods 1997; 10: 37-45.

24. Cheadle W.G. The human leukocyte antigens and their relationship to infection. Am J Surg 1993; 165 (2A Suppl): 75-81.

25. Alter G., Malenfant J.M., AltfeldM.CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity. J Immunol Meth 2004; 294: 15-22.

26. Betts M.R., Koup R.A. Detection of T-cell degranulation: CD107a and b. Methods Cell Biol 2004; 75: 497-512.

27. Chen S., Wu Z., Wang M., Cheng A. Innate Immune Evasion Mediated by Flaviviridae Non-Structural Proteins. Viruses 2017; 9: 291-310.

28. Pastorino B., Nougairede A., Wurtz N., Gould E., de Lamballerie X. Role of host cell factors in flavivirus infection: Implications for pathogenesis and development of antiviral drugs. Antiviral Research 2010; 87: 281-294.

29. Bastos J.C.S., de Menezes C.B.A., Fantinatti-Garboggini F., Padilla M.A., Arns C.W., Kohn L.K. Antiviral Activity of Marine Actinobacteria against Bovine Viral Diarrhea Virus, a Surrogate Model of the Hepatitis C Virus. RRJMB 2015; 4: 55-62.

30. Wang W., Wang S.X., Guan H.S. The Antiviral Activities and Mechanisms of Marine Polysaccharides: An Overview. Mar Drugs 2012; 10: 2795-2816.

31. Miorin L., Maestre A.M., Fernandez-Sesma A., García-Sastre A. Antagonism of type I interferon by flaviviruses. Biochem Biophys Res Commun 2017; 492: 587-596.

32. Overby A.K., Popov V.L., Niedrig M., Veber F. Tick-borne encephalitis virus delays interferon induction and hides its double-stranded RNA in intracellular membrane vesicles. J Virology 2010; 84: 8470-8483.

33. Shevtsova A.S., Motuzova O.V., Kuragina V.M., Karganova G.G. Lethal Experimental Tick-Borne Encephalitis Infection: Influence of Two Strains with Similar Virulence on the Immune Response. Frontiers in Microbiology 2017; 7: Article 2172.

Берлизова Мария Владимировна — м. н. с. лаборатории флавирусных инфекций НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г. П. Сомова, Владивосток Леонова Галина Николаевна — д. м. н., профессор, зав. лабораторией флавирусных инфекций НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г. П. Сомова, Владивосток