ПРИМЕНЕНИЕ КЛЕТОЧНОЙ ЛИНИИ МЕЛАНОМЫ КОЖИ ЧЕЛОВЕКА 369 ADMEL
APPLICATION OF CELL LINE OF 369 ADMEL HUMAN SKIN MELANOMA

Изобретение относится к области медицинской биотехнологии, в частности, к получению клеточных линий, используемых для клеточных технологий в медицине, среди которых создание биомедицинских клеточных продуктов - противоопухолевых вакцин, тестирование активности различных фармацевтических препаратов, создание диагностических наборов, а также тест-систем для разработки новых лекарственных средств и новых терапевтических подходов.
Культивирование клеток и тканей животных к настоящему времени получило широкое распространение в различных областях исследований, от клеточной и молекулярной биологии до быстро прогрессирующих прикладных областей биотехнологии. Особенный интерес в последние десятилетия возник по отношению к проблеме культивирования опухолевых клеток, так как исследования опухолей животных и человека, адаптированных к росту in vitro, обладают рядом преимуществ: это возможность получать неограниченное количество клеток для любых исследований, в том числе неосуществимых in vivo; изучать специализированные свойства клеток в строго контролируемых условиях окружающей среды вне коррелятивных влияний целостного организма. Существование банков постоянных линий опухолевых клеток дает возможность проводить исследования на идентичном материале, что важно для выработки стандартных подходов к решению ряда проблем в биологии и медицине. В настоящее время работы по приготовлению клеточных линий приобрели систематический характер, однако каждая полученная клеточная линия имеет индивидуальные неповторяющиеся свойства и характеристики, так как является продуктом, полученным из биологического материала конкретного индивидуума.
Несмотря на колоссальные успехи, достигнутые в последние десятилетия в области хирургического лечения и лекарственной терапии злокачественных новообразований, по-прежнему остается проблема высокой смертности среди больных метастатическими формами paкa [Monjazeb A.M., Hsiao H.H., Sckisel G.D., Murphy W.J. Theroleofantigen-specificandnon-specificimmunotherapyinthetreatmentofcancer // JImmunotoxicol. - 2012. - Jul-Sep; 9(3). - P. 248-58. - doi: 10.3109/1547691Х.2012.685527].
Применение принципиально новых методов лечения, основанных на клеточных технологиях, расширяет арсенал приемов воздействия на опухолевый процесс. Показатель распространенности меланомы кожи в общей структуре заболеваемости злокачественными новообразованиями в 2015 году в Российской Федерации составил 57,0 на 100000 населения по сравнению с 38,0 для 2005 года [Под ред. А.Д. Каприна, В.В. Старинского, Г.В. Петровой Состояние онкологической помощи населению России в 2015 году // М: МНИОИ им. П.А. Герцена - филиал ФГБУ «НМИРЦ» Минздрава России, 2016. - Ил. - 236 с. ISBN 978-5-85502-226-1].
Меланома кожи - это злокачественное новообразование, характеризующееся агрессивным течением и высоким метастатическим потенциалом, резистентное к стандартным методам химио- и радиотерапии. Однако в настоящее время уже известно, что иммунная система играет важную роль на некоторых этапах патогенеза этой опухоли. Это положение является отправной точкой для различных новейших молекулярно-биологических приемов воздействия на клеточный и гуморальный иммунитет этой категории больных, поэтому особенно активно разрабатываются методы биотерапии, направленные на активацию естественного противоопухолевого иммунитета, то есть методы активной специфической иммунотерапии.
Активная иммунотерапия включает в себя неспецифическую иммунотерапию (индуцирование активного воспалительного процесса, неспецифическая вакцинация, местное и системное использование БЦЖ, применение, интерферонов-α и -γ, фактора некроза опухолей, интерлейкинов, колониестимулирующих факторов, высоких доз антиэстрогенов и др.); специфическую иммунотерапию с иммунизацией опухолевыми антигенами (вакцинотерапию); генную терапию [Galluzzi L., Vacchelli Е., Bravo-San Pedro J.M. et al. Classification of current anticancer immunotherapies // Oncotarget. - 2014. - Dec 30; 5(24). - P. 12472-508.-DOI: 10.18632/oncotarget. 2998].
Эффективность противоопухолевой вакцины зависит от точности определения возможных мишеней для иммунного ответа на молекулярном уровне. Опухолеассоциированные антигены (ОАА), выявляемые на клетках злокачественных опухолей человека и определяемые только у небольшого числа нормальных клеток, потенциально могут быть использованы в качестве материала для приготовления вакцин [Papaioannou N.E., Beniata O.V., Vitsos P. et al. Harnessing the immune system to improve cancer therapy // Ann Transl Med. - 2016. - Jul; 4 (14). - P. 261. - doi: 10.21037/atm. 2016.04.01].
В качестве носителей ОАА используют аутологичные и аллогенные цельные или лизированные опухолевые клетки, причем каждая опухолевая клеточная линия обладает специфическим уникальным набором ОАА, и расширение спектра клеточных линий позволяет создать более широкий пул данных антигенов, которые могут стать доступны для антигенпрезентирующих клеток (АПК), таких как дендритные клетки (ДК) в процессе манипуляций in vitro при создании противоопухолевых вакцин, что позволяет с наибольшей эффективностью индуцировать противоопухолевый иммунитет [Franks H.A., Wang Q., Patel P.M. Newanticancerimmunotherapies // AnticancerRes. - 2012. - Jul; 32 (7). - Р. 2439-53].
В настоящее время уже созданы поливалентные вакцины на основе нескольких клеточных линий меланомы кожи для лечения диссеминированных форм этого вида злокачественного новообразования, однако в результате проведения рандомизированных клинических испытаний их эффективность не признана достаточной [Srivatsan S., Patel J.M, Bozeman E.N. et al. Allogeneic tumor cell vaccines: the promise and limitations in clinical trials // Hum Vaccin Immunother. - 2014. - 10(1). - P. 52-63. doi: 10.4161/hv. 26568].
Проблема заключается в несостоятельности иммунологических синапсов, связанных с анергией АПК, которую можно преодолеть с помощью создания противоопухолевых вакцин на основе ДК, активированных опухолевыми клеточными лизатами, богатыми ОАА. Для этого необходимо иметь разнообразный спектр характеризованных линий малигнизированных клеток опухолей разных локализаций.
Кроме того, исследования последних лет убедительно показали, что такие ОАА как раково-тестикулярные антигены (РТА) присутствуют в клетках многих опухолей и потенцируют противоопухолевый иммунный ответ, что дает основание к разработке универсальных подходов в клеточной иммунотерапии злокачественных новообразований [Bodey B. Cancer-testisantigens: promisingtargetsforantigendirectedantineoplasticimmunotherapy // ExpertOpinBiolTher. - 2002. - Aug; 2 (6). - P. 577-84].
Техническим результатом изобретения является расширение арсенала клеточных линий, используемых для создания цельноклеточных и генноинженерных противоопухолевых вакцин, что дает возможность повысить эффективность лечения и увеличить продолжительность жизни при лечении злокачественных новообразований. Кроме того, полученная новая клеточная линия может использоваться для тестирования активности различных фармацевтических препаратов, создания диагностических наборов и тест-систем для разработки новых лекарственных средств и новых терапевтических подходов.
Указанный технический результат достигается применением клеточной линии меланомы кожи человека 369 ADmel, экспрессирующей раково-тестикулярные антигены, хранящейся в специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур под регистрационным номером РККК (П) 727Д, для приготовления биомедицинских клеточных продуктов и тестирования противоопухолевых препаратов.
Полученная клеточная линия 369 ADmel обладает стабильными культуральными и морфологическими характеристиками. Родословная клеточной линии 369 ADmel представлена следующим образом.
Клеточная линия получена из метастаза эпителиоидно-клеточной меланобластомы с небольшим количеством пигмента в лимфатический узел больной Н., 36 л., проходившей лечение в специализированном онкологическом медицинском учреждении. Материал получен при хирургическом удалении метастатического образования.
Получение клеточной линии 369 ADmel осуществлено следующим образом.
2
Опухолевая ткань получена хирургическим путем. Измельченные стерильным скальпелем образцы опухоли (1-3 мм) подвергали механической дезагрегации в автоматическом режиме, помещая их на стерильные ножи, в течение 30-60 сек. Полученную суспензию клеток пропускали последовательно через стерильные нейлоновые фильтры 100 мкм, 70 мкм, 50 мкм, суспендировали в полной питательной среде и переносили в культуральную посуду, в которой осуществляли культивирование в течение длительного времени. Стабильно растущая клеточная линия была получена на 25 пассаже.
Морфологические признаки клеточной линии 369 ADmel характеризуются следующим образом.
Культура представлена фибробластоподобными веретеновидными и полигональными клетками с крупными ядрами и одним-двумя ядрышками.
Цитоплазма клеток содержит значительное количество гранул меланина. Ядра 53% клеток окрашиваются антителами против Ki-67.
Маркерные признаки клеточной линии 369 ADmel следующие.
Методом проточной цитометрии определена поверхностная экспрессия антигенов HLAA/B/C - 94,4%. Произведено типирование антигенов HLAIкласса - А*02,24, В*55, С*17,07.
На основании иммуноцитохимического исследования определена экспрессия дифференцировочных опухолеассоциированных антигенов-MelanA, MITF, gp100, S100, тирозиназа, TRP-1.
Методом проточной цитометрии определена экспрессия раково-тестикулярных антигенов: NY-ESO-1 и семейств MAGE,BAGE,GAGE. Методом ПЦР выявлена экспрессия MAGEA4, А12; GAGE 1, 3; LAGE 1a, 1b
Культуральные свойства клеточной линии 369 ADmel представлены следующим образом.
2
2
6
Клеточная линия культивируется в питательной среде DMEM/F12 с добавлением 20% эмбриональной телячьей сыворотки, глутамина (365 мг/л), инсулина (5 мкг/мл), трансферрина (5 мкг/мл), селена (5 нг/мл), антибиотиков (пенициллин со стрептомицином в концентрации: 100 ед/мл и 100 мкг/мл соответственно).Культивирование осуществляется при 37°С, 5% СО, 100% влажности. Культура имеет адгезионный монослойный тип роста. Во флаконы объемом 25 см в 5 мл среды засевают 1×10 клеток. При субкультивировании клетки снимаются 2 раза в неделю в соотношении 1:1 с использованием стандартных растворов 0,25% трипсина и 0,02% раствора версена (1:1).
Условия криоконсервации следующие.
6
2
Для длительного хранения клетки консервируют путем замораживания в жидком азоте. Криосреда: DMEM/F12 50%, эмбриональная телячья сыворотка 40%, DMSO 10%; 3×10 клеток/мл на ампулу. Клетки клеточной линии ресуспендируют в среде для замораживания. Режим замораживания: жидкий азот, снижение температуры на 1°С в минуту до -25°С, затем быстрое замораживание до минус 70°С. Хранение в жидком азоте при температуре -196°С. Размораживание быстрое, при 37°С. Клетки разводят в 10 мл бессывороточной среды и осаждают центрифугированием, ресуспендируют в 5 мл той же среды, содержащей 20% эмбриональной телячьей сыворотки, и переносят в культуральный флакон объемом 25 см. Жизнеспособность клеток оценивают по включению трепанового синего. Жизнеспособность клеток после криоконсервации составляет 87%. Контаминация исследована следующим образом.
При длительном наблюдении бактерии и грибы в культуре не обнаружены. Методом ПЦР были проведены исследования на наличие Mycoplasmapneumonia, genitalium, hominis-тест на микоплазму отрицателен.
Кариологическая характеристика клеточной линии 369 ADmel следующая:
44, XX, t(1;9), -4, +6q, -10, t(11;14), +13q, t(20;15).
Использование клеточной линии 369 ADmel представлено следующими примерами.
Пример 1. Использование клеточной линии 369 ADmel для приготовления противоопухолевых вакцин на основе активированных дендритных клеток.
2
2
1. Клеточную линию 369 ADmel культивировали в пластиковых флаконах в полной питательной среде DMEM/F12 с добавлением 20% эмбриональной телячьей сыворотки, глутамина (365 мг/л), инсулина (5 мкг/мл), трансферрина (5 мкг/мл), селена (5 нг/мл), пенициллина (100 ед/мл), стрептомицина (100 мкг/мл). Культивирование осуществляли при 37°С, 5% СO, 100% влажности в СO-инкубаторе «Heracel» (TermoElectronLTDGmbH, Германия).
2. При достижении конфлюэнтного монослоя производили пересев клеток и дальнейшее пассирование культуры с рассевом 1:1.
2
3. Из флакона удаляли культуральную среду, омывали поверхность флакона небольшим количеством ферментативного раствора (0,25% трипсина и 0,02% раствора версена в равных пропорциях) и затем к клеткам добавляли 1-3 мл этого раствора. Помещали флаконы в СО-инкубатор и проводили визуальный контроль состояния клеток.
4. Клетки собирали серологической пипеткой, отмывали двукратным центрифугированием в 10 мл 0,9% физиологического раствора при 1000 об/мин в течение 10 мин.
5. Производили подсчет клеток и оценку их жизнеспособности.
6. Для приготовления опухолевого лизата клетки линии 369 ADmel смешивали в равных пропорциях с клетками других опухолевых клеточных линий и проводили 6 последовательных циклов моментального замораживания до -196°С и оттаивания до комнатной температуры в фосфатно-солевом буфере без криопротектора, качество лизиса контролировали с помощью 0,1% трипанового синего и светового микроскопа.
7. Осуществляли осаждение клеточного детрита центрифугированием (10 мин, 3000 об/мин), фильтрацию надосадочной фракции через фильтр 0,2 мкм и расфасовку опухолевого лизата в криопробирки для хранения при -20°С до использования.
2
2
8. Вносили лизат с клеточной линией 369 ADmel в культуры незрелых дендритных клеток пациентов на 5-й день культивирования в соотношении 3 лизированные опухолевые клетки: 1 ДК, добавляли ростовые факторы: гранулоцитарно-макрофагальный фактор роста (72 нг/мл), интерлейкин 4 (20 нг/мл) и фактор некроза опухолей альфа (20 нг/мл). Инкубировали в условиях 37°С, 5% СО, 100% влажности в СO-инкубаторе «Heracel» (TermoElectronLTDGmbH, Германия) в течение 48 часов.
-
-
+
+
+
+
9. В результате получали активированные ДК с иммунофенотипом CD14/CD1a/CD83/CD80/CD86/HLADR.
Пример 2. Использование клеточной линии 369 ADmel для создания модельной системы, позволяющей определить оптимальные дозы фотосенсибилизатора для фотодинамической терапии.
1. Клеточную линию 369 ADmel культивировали, как описывается выше. После пересева клетки собирали, осуществляли подсчет их количества и оценку жизнеспособности и высевали в чашки Петри 35 мм (BDFalcon, США) в количестве 500 тыс. клеток.
2
2. После адаптации клеток к субстрату добавляли фотосенсибилизатор фотодитазин в концентрациях 0, 0,5 мкг/мл, 1 мкг/мл, 2,5 мкг/мл, 3 мкг/мл. Облучали клетки линии 369 ADmel светом лазера с длиной волны 662 нм через 30 мин инкубации (время облучения 6 мин и 10 мин). Суммарная доза облучения составила от 40 до 60 Дж/см.
3. Клетки снимали с субстрата, отмывали от диссоциирующего ферментативного раствора, подсчитывали и проводили анализ эффекта через 1 час и через 4 часа после фотодинамического воздействия.
6
4. К полученной суспензии клеток (1×10/мл) добавляли моноклональные антитела против аннексина V, меченные FITC (Annexin V-FITC), пропидиум йодид (BD, США), затем инкубировали 15 мин в темноте при комнатной температуре. Подсчет клеток проводили с использованием флуоресцентного микроскопа Carl Zeiss, Германия. Уровень апоптоза оценивали по апоптотическому индексу.
5. Обнаружили, что все изученные концентрации фотосенсибилизатора обладают сопоставимой способностью индуцировать ранний апоптоз. При увеличении времени лазерного облучения происходит более быстрый переход фотосенсибилизированных опухолевых клеток линии ADmel в позднюю фазу апоптоза.
Заявляемый способ расширяет арсенал клеточных линий, используемых для создания цельноклеточных и генноинженерных противоопухолевых вакцин, способствует повышению эффективности лечения и увеличению продолжительность жизни пациентов при лечении злокачественных новообразований. Полученная новая клеточная линия 369 Admel может использоваться для тестирования активности различных фармацевтических препаратов, создания диагностических наборов и тест-систем для разработки новых лекарственных средств и новых терапевтических подходов.