ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО НА ОСНОВЕ ДИИНДОЛИЛМЕТАНА (DIM) С ПОВЫШЕННОЙ БИОДОСТУПНОСТЬЮ И ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В ЛЕЧЕНИИ ГИПЕРПЛАСТИЧЕСКИХ И ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ЧЕЛОВЕКА
DIINDOLYLMETHANE (DIM)-BASED MEDICATION WITH INCREASED BIOACCESSEBILITY AND ITS APPLICATION IN TREATMENT OF HUMAN HYPERPLASTIC AND INFLAMMATORY DISEASES

Изобретение относится к области медицины и химико-фармацевтической промышленности.
В настоящее время в медицинской практике широкое распространение получили средства на основе индольных соединений, выделенных из семейства крестоцветных (Cruciferous), к которому относятся все виды кочанной капусты, брюссельская, цветная капуста и брокколи, а также их синтетические аналоги. Интерес к соединениям данной группы вызван, в частности, их антиканцерогенными и антиэстрогенными свойствами, в связи с чем они могут быть использованы при лечении заболеваний органов женской репродуктивной системы и некоторых гормональных патологий, сопровождающихся гиперпластическими процессами. К числу наиболее распространенных заболеваний данной категории относятся мастопатии, миомы матки, эндометриоз, аденомиоз, дисплазии шейки матки различной этиологии, а также гиперплазии щитовидной железы.
В структуре онкологической заболеваемости у женщин опухоли репродуктивных органов занимают первое место, и в среднем заболеваемость увеличивается на 1% в год. В структуре смертности они стоят на втором месте, при этом "темп прироста" по показателям смертности остается самым высоким (28%). По данным экспертов ВОЗ в настоящее время каждый год во всем мире регистрируется около миллиона новых случаев рака молочной железы (РМЖ), одна треть из которых заканчивается смертельным исходом. По оценкам ряда исследователей, в следующем десятилетии 5 млн женщин во всем мире будут страдать от данной злокачественной опухоли.
Известно, что ткани репродуктивных органов подвергаются непрерывному воздействию множества различных факторов, стимулирующих их к активному делению (пролиферации) и индуцирующих запуск специфических сигнальных каскадов. Среди них можно выделить три основных внутриклеточных механизма, приводящих к активации клеточной пролиферации: 1) гормональный (или эстроген-зависимый); 2) индуцируемый ростовыми факторами и 3) активируемый провоспалительными цитокинами.
Участие эстрогенов в развитии неопластических процессов в гормон-зависимых тканях (эпителий молочных желез, эндометрий и шейка матки) в настоящее время считается общепризнанным и рассматривается как один из ведущих этиологических факторов их возникновения.
Как известно, в тканях женской репродуктивной системы ежемесячно происходят колебания митотической клеточной активности, регулируемые ритмическими изменениями уровня половых гормонов. В первой (т.н. пролиферативной) фазе менструального цикла секретируемый яичниками эстроген индуцирует пролиферацию клеток эндометрия, гибнущих во время менструации. Аналогично, каждый менструальный цикл эстроген стимулирует пролиферацию внутреннего слоя эпителиальных клеток протоков молочных желез, которые впоследствии также подвергаются апоптозу. Всего в течение приблизительно 40-летнего репродуктивного периода в организме женщины осуществляется несколько сотен подобных циклов.
Попадая в клетку, эстроген (Е) активирует эстрогеновый рецептор (ER), находящийся в цитоплазме в неактивном состоянии. Взаимодействие гормона с рецептором активирует последний и способствует его проникновению в ядро. Попав в ядро, гормон-рецепторный комплекс стимулирует экспрессию т.н. эстроген-зависимых генов, среди которых большая часть прямо или опосредованно контролирует клеточную пролиферацию, а также повышает чувствительность клеток к факторам, активирующим гиперпластические процессы. Это гены, кодирующие рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), фактор роста кератиноцитов (KGF), регуляторы клеточного цикла - белки-циклины и циклин-зависимые киназы (CDK), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), инсулиноподобный фактор роста (IGF) и множество других белков.
Регулярно повторяющиеся циклы эстроген-индуцированного клеточного деления могут двояко влиять на развитие опухолевого процесса в гормон-зависимых тканях. Во-первых, пролиферировать под действием эстрогенов могут уже малигнизированные (подвергнувшиеся действию внешнего канцерогена или имеющие набор герминальных мутаций) клетки, пролиферация которых приводит к формированию "опухолевого клона". Однако чаще всего имеет место другая ситуация. Периодически повторяющиеся циклы клеточного деления неизбежно повышают частоту появления новых, спонтанных мутаций (особенно с увеличением возраста женщины, а также при наличии других факторов риска). При условии накопления от 3 до 7 подобных генетических ошибок, не ликвидированных иммунной и/или репаративными клеточными системами, эстроген-зависимая пролиферация трансформированных клеток также приведет к образованию опухоли. При этом инициатор опухолевого процесса, в его традиционном понимании, во втором случае отсутствует.
В случае если в организме женщины имеется повышенное содержание одного из производных эстрогенов, а именно 16α-гидроксиэстрона, патологические пролиферативные процессы в гормон-зависимых тканях многократно усиливаются (Clemons M, Goss P. (2001) Estrogen and risk of breast cancer, N Engl J Med, 344 (4), 276-285). Именно поэтому повышенное содержание 16α-гидроксиэстрона рассматривается в настоящее время как фактор риска развития рака молочной железы.
Однако патологическая клеточная пролиферация может протекать и по эстроген-независимому механизму. В этом случае включаются сигнальные каскады, стимулируемые полипептидными ростовыми факторами и цитокинами.
Основным полипептидным фактором, стимулирующим рост клеток молочной железы, является эпидермальный фактор роста (EGF). Фактор EGF через последовательность сигнальных белков активирует ядерный фактор транскрипции NF-κВ - стимулятор экспрессии большого числа генов, ответственных за клеточную выживаемость и пролиферацию. Среди них - гены, кодирующие рецептор EGF (EGFR), фактор роста кератиноцитов (KGF), регуляторы клеточного цикла - циклин-зависимые киназы, фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), инсулиноподобный фактор роста (IGF) и многие другие белки.
Цитокиновый путь регуляции клеточного роста связан с фактором некроза опухоли TNF-α. В больших концентрациях этот цитокин активирует проапоптотические рецептор-опосредованные сигнальные каскады, т.е. останавливает процессы клеточного деления и вызывает физиологическую гибель клеток. Однако в малых дозах он же действует как фактор выживания и пролиферации клеток. При этом повышается активность циклооксигеназы-2 (СОХ-2) - основного фермента, участвующего в биосинтезе простагландинов и стимулирующего экспрессию фактора NF-κВ, который, как мы уже говорили, включает экспрессию генов, стимулирующих клеточное деление.
Таким образом, в настоящее время достаточно хорошо изучены патогенетические механизмы развития гиперпластических процессов в молочной железе. Очевидно, что, блокируя основные каналы проведения сигналов, стимулирующих пролиферацию клеток молочной железы, мы можем рассчитывать на успех в профилактике и лечении возникающих на этой основе патологических состояний. Другими словами, фармакологическая коррекция гиперпролиферативных заболеваний органов репродуктивной системы должна осуществляться на всех этапах и по отношению ко всем сигнальным каскадам, опосредующим ключевые патофизиологические функции.
Многолетние поиски природных соединений, блокирующих развитие гиперпластических процессов в гормон-зависимых тканях наконец увенчались успехом. Одно из таких соединений - содержащийся в овощах семейства крестоцветных (различных видах капусты) фитонутриент индол-3-карбинол (I3C). Противоопухолевая защита, оказываемая I3C, обусловлена широким спектром его биологических активностей. Один из механизмов противоопухолевого действия I3C заключается во взаимодействии данного вещества с арилкарбоновыми рецепторами (AhR), блокирующем связывание AhR с канцерогенами. Таким образом, I3C - это природный лиганд AhR. При активации AhR в результате его взаимодействия с I3C образованный лиганд-рецепторный комплекс проникает в ядро и способствует усилению экспрессии CYP1A1 - изоформы цитохрома Р-450, гидроксилирующей эстрон (метаболит эстрогена) во 2-м положении с образованием 2-гидроксиэстрона (2-ОНЕ1). Установлено, что данный метаболит обладает выраженной антипролиферативной (антиэстрогенной) активностью (Hong СВ, Kirn НА, Firestone GL, Bjeldanes LF (2002) 3,3'-Diindolyl-methane (DIM) induces a G(1) cell cycle arrest in human breast cancer cells that is accompanied by Sp1-mediated activation of p21(WAF1/CIP1) expression, Carcinogenesis, 23, 1297-1305). Изофермент CYP1A1 является индуцибельной формой и активируется в ответ на пищевые ингредиенты и сигаретный дым. В отсутствие I3C рецептор AhR активируется канцерогенными ариловыми углеводородами, поступающими в организм из окружающей среды или с продуктами питания (особенно с консервированной пищей), что способствует экспрессии CYPB1 - изоформы цитохрома Р-450, гидроксилирующей эстрон по 16α- и 4-положениям с образованием, соответственно, 16α-гидроксиэстрона (16α-ОНЕ1) и 4-гидроксиэстрона (4-ОНЕ1) (Smigel K (1998). Breast cancer prevention trial shows major benefit, some risk. J Nati Cancer Inst (Bethesda), 90, 647-648). Показано, что основной образующийся при этом метаболит 16α-ОНЕ1 способен ковалентно связываться с эстрогеновыми рецепторами, ядерными белками-гистонами и с ДНК, в результате чего происходит пролонгирование эстрогенной активности (эстроген-зависимого пролиферативного сигнала), а также инициация генотоксических повреждений ДНК. Таким образом, данные гидроксипроизводные эстрона являются сильнейшими канцерогенами для клеток-мишеней.
Таким образом, эстрадиол может превращаться в две метаболические формы - гидроксипроизводные эстрона - 2-ОНЕ1 и 16α-ОНЕ1, образующиеся посредством катализа разными изоферментами цитохрома Р-450 и обладающие абсолютно противоположными биологическими свойствами. 2-ОНЕ1 не влияет на пролиферацию клеток, в то время как 16α-ОНЕ1, наоборот, стимулирует клеточный рост и является агонистом эстрогена. Изучение функций этих двух метаболитов позволило выявить однозначную связь между уровнем 16α-ОНЕ1 и риском развития опухолей в эстроген-зависимых тканях. В то же время при повышении уровня 2-ОНЕ1 наблюдалась тенденция к гибели опухолевых клеток и профилактике их дальнейшего образования.
Многочисленные клинические исследования показали, что для поддержания нормального гормонального баланса как у пре-, так и у постменопаузальных женщин необходимо, чтобы концентрация 2-ОНЕ1 превышала концентрацию 16α-ОНЕ1 как минимум в два раза. При понижении данного соотношения статистически значимо возрастает риск возникновения РМЖ (Leong H, Firestone GL, Bjeldanes LF (2002). Cytostatic effects of 3,3'-diindolylmethane in human endometrial cancer cells result from an estrogen receptor-mediated increase in transforming growth factor-alpha expression, Carcinogenesis (bond), 22, 1809-1817; Patent WO 9203973 (1992). Onset of antiestrogen resistence in breast cancer).
В рандомизированных клинических исследованиях, проведенных в конце 90-х гг., было установлено, что у постменопаузальных женщин с диагнозом РМЖ отмечалось пониженное соотношение 2-ОНЕ1/16α-ОНЕ1 по сравнению с соответствующим контролем. Более того, было показано, что пациенты с III и IV стадиями РМЖ имели более низкие соотношения 2-ОНЕ1/16α-ОНЕ1, чем пациенты с I и II стадиями заболевания (Huang CS, Chem HD, Chang KJ et al. (1999) Breast cancer risk associated with genotype polymorphism of the estrogen-metabolizing genes CYP17, CYP1A1, and COMT: a multigenic study on cancer susceptibility, Cancer Res, 59(19), 4870-4875).
Поскольку индол-3-карбинол непосредственно влияет на уровень 2-гидроксизстрона и 16α-гидроксиэстрона, измерение соотношения данных метаболитов может служить надежным маркером эффективности его действия. Стабильное превышение 2-гидроксиэстрона более чем в 2 раза на протяжении 1-3 месяцев на фоне приема I3С - показатель адекватной коррекции гормонального фона и терапевтической эффективности данного соединения.
Препараты на основе индол-3-карбинола в виде биологически активных добавок широко используются в США для коррекции дисгормональных нарушений. Первое клиническое исследование на эту тему ставило своей целью проверку гипотезы о возможности использования I3С для стимуляции образования производного эстрогена - 2-гидроксиэстрона (2-ОНЕ1) (Bradlow et al. (1994) Long-responses of women to indol-3-carbinol. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 7, 591-595). Авторы пришли к заключению о том, что I3С является эффективным средством для коррекции метаболизма эстрогенов.
В 1997 г. 60 женщин-волонтеров, проживающих в США, приняли участие в рандомизированных клинических исследованиях. Все участники были разделены на три группы: 1) контрольная группа, получавшая плацебо; 2) группа, получавшая низкие дозы I3С (50, 100 и 200 мг в день), и 3) группа, получавшая высокие дозы I3C (300 и 400 мг в день) в течение 4 недель. У всех женщин определяли соотношение 2-ОНЕ1/16α-ОНЕ1 как биомаркер эффективности проводимой терапии. Результаты проведенных исследований позволили авторам сделать два важных вывода:
1. Ни в одном случае не отмечалось никаких побочных эффектов.
2. Минимальная суточная доза I3C, при которой наблюдалось изменение соотношения метаболитов эстрогена, составила 300 мг, на основании чего авторы рекомендуют для профилактики рака груди дозы I3C - 300-400 мг/сутки.
Годом позже Фондом профилактической онкологии были проведены клинические исследования, посвященные этому же вопросу. Женщины-волонтеры в возрасте от 35 до 47 лет в течение 2-х месяцев принимали I3С в дозе 400 мг в день. Измерение уровня 2-гидроксиэстрона (2-ОНЕ1) показало значительное увеличение данного метаболита в результате приема I3C, что свидетельствует о высокой терапевтической эффективности данного препарата в отношении коррекции гормонального фона.
В ходе многочисленных экспериментальных исследований была доказана универсальность противоопухолевой активности I3C, обусловленная способностью данного соединения блокировать все основные пути трансдукции внутриклеточных сигналов, стимулирующих клеточный рост, в том числе эстроген-независимые пролиферативные пути, активируемые ростовыми факторами и цитокинами.
Ростовые факторы, к каковым относятся эпидермальный фактор роста (EGF), фибробластический фактор роста (FGF), фактор роста кератиноцитов (KGF или FGF-7), инсулиноподобный фактор роста (IGF-I) и др., в отсутствие какого-либо препятствия активируют специфические рецепторы, обладающие тирозинкиназной активностью. Лиганд-индуцируемая димеризация рецепторов активирует каскад цитоплазматических сигнальных киназ (MAPK, Akt), протоонкогенов (fos, ras), активаторов транскрипции (NF-κВ), что приводит к экспрессии лиганд-индуцируемых генов, среди которых - упоминавшиеся выше ростовые факторы и их рецепторы; киназы; факторы, стимулирующие образование новых сосудов; белки теплового шока; а также другие необходимые для опухолевого метаболизма белки.
Индол-3-карбинол, проникая в клетку, препятствует фосфорилированию тирозиновых остатков киназ, что мешает каскадной передаче пролиферативных сигналов с поверхности к ядру клетки (Chinni SR, Sarkar FH. (2002) Akt inactivation is a key event in indole-3-carbmol-induced apoptosis in PC-3 cells, Clin Cancer Research, 8, 1228-1236). Кроме того, он ингибирует ядерный фактор транскрипции NF-κВ, который является основным активатором транскрипции большого числа генов, вовлеченных в пролиферацию и воспаление (Brignall MS (2001) Prevention and treatment of cancer with indole-3-carbinol, AltemMedRev, 6(6), 580-589).
Есть данные, что I3C-опосредованное подавление пролиферативной активности опухолевых клеток сопровождается ингибированием активности белков-регуляторов клеточного цикла - циклинов D1 и Е и циклин-зависимых киназ (CDK2, CDK4 и CDK6), а также стимуляцией образования супрессоров опухолевого роста - белков р15, р21 и р27. При этом происходит остановка клеточного цикла в фазе G1 (Aggarwal BB, Ichikawa H. (2005) Molecular targets and anticancer potential of indole-3-carbinol and its derivatives. Cell Cycle, 4(9), 1201-1215; Cover CM, Hsieh SJ, Tran SH et al. (1998) Indole-3-carbinol inhibits the expression of cyclin-dependent kinase-6 and induces a G1 cell cycle arrest of human breast cancer cells independent of estrogen receptor signaling. Biol Chem, 273(7), 3838-3847; Garcia HH, Brar GA, Nguyen DH et al. (2005) Indole-3-carbinol (I3C) inhibits cyclin-dependent kinase-2 function in human breast cancer cells by regulating the size distribution, associated cyclin E forms, and subcellular localization of the CDK2 protein complex. JBiolChem, 280(10), 8756-8764; Kim YS, Milner JA. (2005) Targets for indole-3-carbinol in cancer prevention, J Nutr Biochem, 16(2), 65-73; Matsuzaki Y, Koyama M, Hitomi Т et al. (2004) Indole-3-carbinol activates the cyclin-dependent kinase inhibitor p15(INK4b) gene, FEBS Lett, 576(1-2), 137-140).
Еще одной уникальной особенностью I3C является его способность избирательно индуцировать в опухолевых клетках процессы программируемой клеточной гибели - апоптоза (Powles TJ. (1997) Efficacy of tamoxifen as treatment of breast cancer. Semin Oncol, 24(1), S1-48-54. При этом одновременно с проявлением апоптотической активности I3C наблюдается ингибирование активности антиапоптотических белков - Bcl-2, Bcl-xL, сурвивина, IAP (inhibitor-of-apoptosis protein), XIAP (X chromosome-linked IAP) и FLIP (Fas-associated death domain protein-like interleukin-1-beta-converting enzyme inhibitory protein).
Кроме того, есть данные, указывающие на антиоксидантные свойства I3C, а также на его способность подавлять ангиогенные, инвазивные и миграционные процессы при канцерогенезе в молочных железах (McCarty MF, Block KI. (2005) Multifocal angiostatic therapy: an update. Integral Cancer Ther, 4, 301-314; Meng Q, Goldberg ID, Rosen EM, Fan S. (2000) Inhibitory effects of Indole-3-carbinol on invasion and migration in human breast cancer cells. Breast Cancer Res Treat, 63(2), 147-152; Wu HT, Lin SH, Chen YH. (2005) Inhibition of cell proliferation and in vitro markers of angiogenesis by indole-3-carbinol, a major indole metabolite present in cruciferous vegetables. JAgric Food Chem, 53(13), 5164-5169).
Таким образом, I3C является универсальным корректором патологических пролиферативных процессов в органах женской репродуктивной системы. Универсальность противоопухолевого действия I3C обусловлена способностью данного соединения блокировать все основные (гормон-зависимые и гормон-независимые) пути трансдукции внутриклеточных сигналов, стимулирующих клеточный рост, а также индуцировать избирательный апоптоз (программированную клеточную гибель) опухолевых клеток. I3C является поистине уникальным соединением, поскольку способен подавлять развитие опухолевого процесса практически на всех его уровнях: субмолекулярном (активация опухоль-супрессорных генов и супрессия генов, стимулирующих онкогенез), молекулярном (блокировка пролиферативных сигналов на всем их протяжении - от рецепторов до ядерных белков и ДНК) и надмолекулярном (торможение процессов клеточной миграции и инвазии).
Перечисленные фармакологические свойства индол-3-карбинола позволяют считать данное вещество весьма перспективным кандидатом для создания на его основе лекарственных средств. Однако I3C является очень нестабильным соединением и при попадании в кислую среду желудка очень быстро превращается в несколько олигомерных производных, основным из которых является его димерная форма - 3,3'-дииндолилметан (ДИМ, DIM) (Arneson DW, Hurwitz A, McMahon LM et al. (1999) Presence of 3,3'-diindolylmethane in human plasma after oral administration of indole-3-carbinol [abstract 2833], Proc Am Assoc Cancer Res 40, 429; Grose KR et al. (1992) Oligomerization of indole-3-carbinol in aqueous acid. Chem Res Toxicol, 5, 188-193). Именно поэтому, несмотря на многочисленные эффекты I3C in vivo, до настоящего времени нет полной ясности в отношении их истинного источника, т.е. по-прежнему открытым остается вопрос, связаны ли биологические свойства I3C непосредственно с его собственным действием на клеточные мишени или это результат активности продуктов конденсации и окисления индол-3-карбинола, в частности дииндолилметана (ДИМ, DIM).
В то же время известно, что клинический эффект, оказываемый I3C при тех или иных патологиях, существенно зависит от индивидуальных особенностей метаболизма принимающих данный препарат пациентов, в частности от способности конвертировать I3C в различные его производные, между которыми в свою очередь возможны синергетические и/или антагонистические взаимодействия (Dalessandri KM, Firestone GL et al. (2004) Pilot study: effect of 3-Diindolylmethane supplements on urinary hormone metabolites in postmenopausal women with a history of early-stage breast cancer. Nutrition and cancer, 50(2), 161-167). Одновременно с этим есть экспериментальные данные, указывающие на самостоятельную биологическую активность I3C, независимую от биологической активности образующихся в результате его олигомеризации метаболитов (Anderton MJ, Manson MM, Verschoyle RD et al. (2004) Pharmacokinetics and tissue disposition of indole-3-carbinol and its acid condensation products after oral administration to mice. Clin Cancer Research, 10, 5233-5241; Hsu JC, Zhang J, Dev A et al. (2005) Indole-3-carbinol inhibition of androgen receptor expression and downregulation of androgen responsiveness in human prostate cancer cells. Carcinogenesis, 26(11), 1896-1904).
Как уже упоминалось, индол-3-карбинол претерпевает многочисленные превращения, в частности, кислая среда желудка способствует образованию различных производных, окончательная биологическая активность которых до настоящего времени не определена (Anderton M., Manson M. et al. (2004) Pharmacokinetics and tissue disposition of indole-3-carbinol and its acid condensation products after oral administration to mice, Clin Cancer Research, 10, 5233-5241). Этот процесс плохо предсказуем и протекает очень индивидуально у каждого пациента. Возможно, именно этим объясняется выраженный разброс в клинической эффективности препаратов на основе индол-3-карбинола при лечении заболеваний гормон-чувствительных органов.
Вероятно, столь существенные различия в результатах лечения индол-3-карбинолом могут объясняться индивидуальными особенностями метаболизма этого вещества у пациентов.
Одним из производных индол-3-карбинола, образующимся при его олигомеризации, является дииндолилметан (DIM). Это соединение обладает практическими всеми биологическими эффектами, присущими индол-3-карбинолу, в том числе и способностью позитивно влиять на изменения в соотношении метаболитов эстрогенов (Michnovicz JJ and Bradlow HL. (1991) Altered estrogen metabolism and excretion in humans following consumption of indole-3-carbinol. Nutr Cancer, 16, 59-66; Aggarwal BB, Ichikava H. (2005) Molecular targets and anticancer potential of indole-3-carbinol and its derivatives. Cell Cycle, 4(9), 1201-1215). При этом DIM не подвергается метаболическим превращениям в организме человека и является стабильным химическим соединением (Anderton М, Manson M et al. (2004) Physiological modeling of formulated and crystalline diindolylmetane pharmacokinetics following oral administration in mice. Drug metabolism and Disposition, 32, 6, 632-638). Эти отличия индол-3-карбинола от дииндолилметана делают использование DIMa более предпочтительным в фармацевтических композициях с другими фармакологически активными субстанциями при лечении гиперпластических и пролиферативных заболеваний.
Дииндолилметан может использоваться при различных воспалительных заболеваниях (WO 2006105196, опубл. 2006-10-05).
Установлено, что дииндолилметан способен индуцировать проапоптотическую гибель клеток с нарушенным метаболизмом. В частности, DIM активирует один из ключевых ферментов апоптоза, каспазу-8, вызывая гибель трансформированных клеток рака кишечника (Kim EJ, Park SY et al. (2007) Activation of caspase-8 contributes to Diindolylmethane-induced apoptosis in colon cancer cells, J of Nutrition, 137, 31-36). Мы предположили, что способность DIM активировать механизмы апоптоза может распространяться и на клетки, инфицированные внутриклеточными микроорганизмами. В частности, Clamydia Trachomatis. Хламидийная инфекция имеет весьма широкое распространение и, по мнению многих авторов, является одной из основных причин женского бесплодия. Традиционным методом лечения хламидийных цервицитов является терапия антибиотиками. Однако почти в 30-40% после завершения курса лечения не удается добиться полной иррадикации возбудителя, что приводит к рецидивированиию заболевания. Дело в том, что жизненный цикл Clamydia Trachomatis состоит из различных стадий, одна из которых «тельца включения» обладает устойчивостью к антибиотикам. Этот факт объясняет недостаточную эффективность терапии антибиотиками.
Первая убедительная попытка описать клинические эффекты при использовании дииндолилметана была предпринята на примере модифицированного DIM с повышенной биодоступностью на основе пегилированного витамина Е (TPGS) (Anderton MJ, Manson MM et al. (2004) Phsiological modeling of formulated and crystalline Diindolylmethane pharmacokinetics following oral administration in mice. Drug metabolism and Disposition, 32, 6, 632-638), известного своей способностью увеличивать водную растворимость различных соединений (Соnstantinides РР, Tustian A, Kessler DR. (2004) Tocol emulsions for drug solubilization and parenteral delivery, Adv Drug Deliv Rev, 56, 1243-1255) и усиливать их биологическую доступность при пероральном введении (Wu SH, Hopkins WK. (1999) Characteristics of d-α-tocopheryl PEG 1000 succinate for applications as an absorption enhancer in drug delivery systems, Pharm Technol, 23. 52-68).
На основе этой технологии американская компания Bioresponse производит препарат, известный под названием BR-DIM. Изучение фармакокинетики этого препарата на здоровых волонтерах показало, что при разовой дозировке 50 мг в крови пациентов не удается обнаружить DIM. При дозировании 100 и 200 мг максимальная концентрация DIM в плазме составляла соответственно 32 нг/мл и 104 нг/мл. Дальнейшее увеличение дозы препарата не приводило к увеличению концентрации DIM в плазме волонтеров (Reed GA, Sunega JM, Sullivan DK et al. (2008) Single-dose pharmacokinetics and tolerability of absoption-enhanced 3,3-diindolylmethane in healthy subjects. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 17(10), 2619-2624). Концентрация 104 нг/мл примерно соответствует 0,5 мкм DIM. Эта концентрация находится на нижней границе концентраций DIM, при которой in vitro регистрируются биологические эффекты (Rahman KM, Li Y et al. (2006) Gene expression profiling revealed as target of diindolylmethane-induced cell growth inhibition and apoptosis in breast cancer cells. Cancer Res 66(9), 4952-4959; Fan S, Meng Q et al. (2009) Low concentration of diindolylmethane, a metabolite of indole-3-carbinol, protect against oxidative stress in a BRCA1-dependent manner. Cancer Res 69(15), 6083-6091).
Исследователями предпринимались попытки создания форм с повышенной абсорбцией дииндолилметана.
В частности, известен патент США 6689387, опубликованный 10.02.2004, описывающий микрочастицы I3C или 3,3'-дииндолилметана в крахмальной матрице, в том числе в виде твердых лекарственных форм для орального введения. Данные формы содержат 30-70% крахмала, что, повышая растворимость активного вещества, не обеспечивает достаточной стабильности в процессе хранения.
Известны формуляции DIM на основе пегилированного витамина Е, описанные в патенте Zeligs et al, US patent 6.416.793. Однако использование композиций на основе TPGS позволило добиться только очень небольшого (не более чем в 1,5-2 раза) увеличения биологической доступности DIM, его аналогов и производных, что не позволяет в полной мере использовать терапевтический потенциал этих соединений. Кроме того, технология изготовления препарата предполагает использование распылительной сушки, что является весьма энергоемким процессом и удорожает его производство.
Наиболее близким аналогом (прототипом) данного изобретения является решение, описанное в международной заявке WО 2009032699, касающееся фармацевтических композиций на основе антипролиферативной комбинации дииндолилметана (DIM), полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) и фолиевой кислоты. Недостатком данных композиций является недостаточная стабильность, так как при хранении наблюдается выпадение основного вещества в виде мелких кристаллов. Кроме того, в условиях дефицита омега-3 жирных кислот у большинства населения, эффекты от использования выделенных ПНЖК могут проявиться как чрезмерные. Включение фолиевой кислоты по последним данным нежелательно для детей с воспалительными заболеваниями аутоиммунного типа.
Следует отметить, что индольные производные доказали свою эффективность в педиатрической практике (Wiatrak BJ. (2003) Overview of recurrent respiratory papillomatosis, Curr Opm Otolaryngol Head Neck Surg, 11, (6), 433-441; Auborn KJ. (2002) Therapy for recurrent respiratory papillomatosis. Antiviral therapy, 7(1), 1-9). В частности, индол-3-карбинол и дииндолилметан широко используются при лечении детского респираторного папилломатоза гортани. При использовании твердых лекарственных форм возникают трудности с дозированием препарата. Клиническая практика нуждается в жидких лекарственных формах, которые позволят точно дозировать препарат из расчета 1 мг на 1 кг веса.
Задачей изобретения является следующее:
1) разработать лекарственные формы на основе дииндолилметана, эффективные при лечении хронических воспалительных и гиперпластических процессов, обладающие максимальной биодоступностью и обеспечивающие достижение концентрации активного вещества в крови пациентов, существенно превышающей 200 нг в мл крови;
2) разработать жидкую лекарственную форму дииндолилметана, удобную для дозирования препарата в педиатрической практике.
Задача решается новой лекарственной формой 3,3'-дииндолилметана.
Новая форма представляет собой раствор, содержащий активное начало - 3,3'-дииндолилметан, и носитель из рыбьего жира и, по меньшей мере, один полисорбат при следующем содержании компонентов в мас.%:
3,3'-дииндолилметан
1-20
рыбий жир
10-20
полисорбат
остальное
Максимальная биодоступность и стабильность при хранении достигается за счет подобранного носителя из рыбьего жира и полисорбатов, взятых в определенных количествах.
Полисорбаты - это поверхносто-активные вещества (ПАВ), которые являются эмульгаторами и солюбилизаторами (растворителями) жиров, как правило, для средств на водной основе. Номера полисорбатов (20, 40, 60, 80) связаны с типом жирных кислот, соединенных с частью молекул (кислот из кокосового масла - полисорбат 20, пальмового - полисорбаты 40 и 60, оливкового - полисорбат 80). Согласно изобретению могут использоваться любые полисорбаты или их смеси. Предпочтительно использование полисорбата 80 или полисорбата 20.
В рыбьем жире полиненасыщенные жирные кислоты, имеющие способность к конкурентному с арахидоновой кислотой биосинтезу преимущественно вазодилатирующих простагландинов и лейкотриенов, обладающих меньшей тромбогенной активностью /ЭПК и ДГК/, находятся в недостаточной концентрации для проявления собственно терапевтического эффекта, поэтому использование их в качестве носителя приводит к повышению биодоступности ДИМ, но не приводит к нежелательным эффектам.
Раствор может быть расфасован во флаконы темного стекла. Также раствор может быть помещен в капсулы. Традиционно лекарственные формы на основе масел фасуют в мягкие желатиновые капсулы. Однако такие капсулы пропускают воздух, ДИМ постепенно окисляется, что может сопровождаться снижением концентрации основного вещества. Именно поэтому предпочтительно использование твердых желатиновых капсул, покрытых гидроксипропилметилцеллюлозой или ее фталатом. Например, могут быть использованы капсулы Licaps, разработанные компанией Capsulgel. В эти капсулы можно фасовать растворы под аргоном с последующей запайкой капсул с помощью лазера.
Предлагается также применение лекарственного средства для лечения гиперпастиче-ских и воспалительных заболеваний человека. Примерами заболеваний, при которых полезно назначение данного средства, являются: миома, аденомиоз, гиперплазия щитовидной железы, атопический дерматит, болезнь Крона и другие воспалительные заболевания кишечника, папилломатоз гортани, хламидийные цервициты. Предпочтительно средство вводят из расчета 0,5-2 мг 3,3'-дииндолилметана на кг веса пациента. Однако в зависимости от тяжести заболевания, возраста, пола, сопутствующих патологий дозы могут быть увеличены или уменьшены.
Изобретение может быть проиллюстрировано следующими примерами конкретного выполнения.
Пример 1
Способ получения растворимой лекарственной формы дииндолилметана, обладающего повышенной биодоступностью (DIM-High Bioavailability (DIM-HB)).
К полисорбату (или смеси полисорбатов) добавляют рыбий жир в количестве 10-20% от общей массы композиции и полученную смесь тщательно перемешивают до получения однородной жидкости. В полученный раствор вносят субстанцию дииндолилметана 1-20% (10-200 мг вещества на 1 г композиции) и перемешивают до ее полного растворения. Полученный раствор фасуют по специальным капсулам или флаконам из темного стекла.
Пример 2
Лекарственные формы на основе дииндолилметана
А. Капсулы, содержащие 100 мг дииндолилметана. Рыбий жир 100 мг, полисорбат 80 - 400 мг.
Б. Капсулы, содержащие 50 мг дииндолилметана. Рыбий жир 50 мг, полисорбат 80 - 400 мг.
С. Капсулы, содержащие 20 мг дииндолилметана. Рыбий жир 80 мг, полисорбат 80 - 450 мг.
Д. Флаконы из темного стекла объемом 10 мл, содержащие раствор, с концентрацией ДИМ 10 мг на 1 г раствора, 10% рыбьего жира и полисорбат 20 в смеси с полисорбатом 40 - остальное.
Е. Флаконы из темного стекла, объемом 50 мл, содержащие раствор с концентрацией ДИМ 100 мг на 1 г раствора, 15% рыбьего жира и полисорбат 80 - остальное.
Пример 3
Экспериментальное изучение специфической фармакологической активности предлагаемого средства в условиях in vivo
За 1 неделю до прививки опухолевых клеток самкам бестимусных (nu/nu) линейных мышей C57Black/6 имплантировали в подлопаточную область пилюлю, содержащую 0,72 мг эстрадиола, из которой гормон высвобождается в течение 60 дней.
Для индукции солидных опухолей опухолевые клетки аденокарциномы молочной железы человека линии MCF-7 собирали с помощью 0,05% раствора Трипсин-ЭДТА ("Sigma", США), трижды промывали стерильным фосфатно-солевым буфером (PBS) и затем в количестве 3 млн клеток в 0,1 мл физиологического раствора вводили подкожно каждому экспериментальному животному в боковую область (число живых клеток подсчитывали с помощью красителя трипанового синего (0,1%) и светового микроскопа).
Через 24 час после инокуляции ксеногенных опухолевых клеток молочной железы животным из опытной группы (10 животных в группе) начинали вводить внутрижелудочно (с помощью зонда) предлагаемое средство по примеру 2, пункт Д, в количестве, эквивалентном 1 мг на одну мышь ежедневно. Контрольным животным вводили физиологический раствор.
Размер солидных опухолей измеряли 1 раз в 2-3 дня после ее появления.
Количественное определение уровня DIM в плазме крови у мышей линии С57Вlаck/6 осуществляли методом HPLC (ВЭЖХ) на жидкостном хроматографе "System Gold" (Beckman, США) с УФ-детектором с переменной длиной волны.
Для получения образцов крови животным из опытной группы вводили внутрижелудочно (с помощью зонда) предлагаемое средство в количестве, эквивалентном 250 мг DIM/кг (всего 36 животных в группе) и индивидуальное вещество I3C в количестве 250 мг DIM/кг (30 животных в группе). Контрольным животным вводили физиологический раствор. Через 0,25; 0,5; 0,75; 1,0; 1,5; 2,0; 4,0; 6,0; 12,0; 18,0; 24,0 и 36,0 ч после введения предлагаемого средства и через 0,25; 0,5; 0,75; 1,0; 1,5; 2,0; 4,0; 6,0; 12,0 и 24,0 ч после введения индивидуального вещества DIM у экспериментальных животных (по 3 животных для каждой временной точки) из хвостовой вены гепаринизированным шприцем осуществляли забор периферической крови. Каждый образец крови помещали в пробирку, содержащую гепарин. Пробы крови центрифугировали (10000×g, 5 мин), после чего отбирали по 1,5-2,0 мл плазмы, замораживали и хранили при -20°С.
Непосредственно перед проведением HPLC-анализа в опытные образцы плазмы крови объемом 250 мкл добавляли внутренний стандарт - 4-метокси-индол (IS) (2,5 мкл раствора концентрации 0,4 мг/мл), перемешивали с помощью Vortex и оставляли при комнатной температуре на 30 мин, после чего образцы дважды экстрагировали с помощью третбутилметилового эфира (750 мкл).
В каждом образце органическую фазу отделяли от водной центрифугированием (2800×g, 10 мин) и переносили ее в новую 4 мл пробирку. Органические слои образцов для каждой экспериментальной точки объединяли, эфир упаривали в токе азота, к осадку добавляли 150 мкл элюента (ацетонитрил/50 mМ Hepes-буфер (объемное соотношение 40:60; рН 7,4)) и 50 мкл полученного образца вводили в хроматограф.
Аналогичные процедуры проводили с контрольными образцами плазмы крови, в которые затем были внесены заданные количества дииндолилметана в диапазоне концентраций:
для: 0,05-10,0 мкг/мл.
Количественное определение дииндолилметана в плазме крови проводили на жидкостном хроматографе "System Gold" (Beckman, США) с УФ-детектором при длине волны 280 нм.
Жидкостная хроматография производилась при комнатной температуре (22°-24°С) на колонке Nucleosil, С18,5 мкм (4,6×50 мм). Элюент (подвижная фаза) состоял из воды и ацетонитрила (АЦ). Перед хроматографированием подвижную фазу дегазировали и фильтровали. Элюция осуществлялась градиентом концентрации АЦ по следующей схеме: 1) от 15% до 60% АЦ в течение первых 20 мин; 2) линейный градиент АЦ от 60% до 65% с 20 по 40 мин; 3) линейный градиент АЦ от 65% до 85% с 40 по 65 мин; 4) повторное уравновешивание колонки 15% АЦ в течение 5 мин. Суммарная продолжительность элюции составляла 70 мин, скорость элюирования - 1 мл/мин.
Концентрацию DIM в экспериментальных образцах определяли по калибровочным графикам, отражающим зависимость между концентрациями данных веществ в пробе и площадями хроматографических пиков.
Минимальная чувствительность метода HPLC-анализа составила 0,05 мкг/мл.
Противоопухолевую эффективность данных соединений оценивали, определяя объем солидной опухоли в опытной и контрольной группах животных.
Как видно из Фиг.1, начиная приблизительно с 12 дня от начала эксперимента у животных контрольной группы, не получавших предлагаемого средства, отмечался интенсивный рост солидных опухолей. В течение последующих 20 дней (с 14 по 34 день эксперимента) средний размер опухоли, индуцированной клетками аденокарциномы человека линии MCF-7, увеличился ~ в 10 раз. В то же время средний объем опухоли у животных, получавших предлагаемое средство, за тот же промежуток времени увеличился всего в 5 раз.
Таким образом, ведение бестимусным (nu/nu) мышам C57Black/6 предлагаемого средства в дозе 1 мг существенно тормозило рост солидных опухолей, индуцированных инокуляцией животным опухолевых клеток молочной железы человека линии MCF-7. При этом предлагаемое средство в применявшихся дозах не вызывало каких-либо изменений клеточной морфологии печени, почек и др. функционально важных органов, а также не влияло на вес экспериментальных животных.
Отсюда можно заключить, что предлагаемое средство обладает выраженным противоопухолевым действием в отношении рака молочной железы in vivo на животной ксенотрансплантационной модели.
Гистологическое исследование тканей животных, получавших предлагаемое средство (умерщвленных под эфирным наркозом в конце эксперимента), показало, что данный препарат в применявшихся дозах не вызывает каких-либо изменений клеточной морфологии печени, почек и др. функционально важных органов, а также не влияет на вес экспериментальных животных.
Пример 4
Концентрации дииндолилметана в плазме крови экспериментальных животных (мкг/мл) при внутрижелудочном введении субстанции дииндолилметана, 200,0 мг/кг
Результаты измерения концентрации субстанции Дииндолилметана в плазме крови крыс при внутрижелудочном введении представлены в Таблице 1. Усредненные фармакокинетические кривые отображены на Фиг.2-3.
Таблица 1
№№
Время взятия пробы крови, ч
0,25
0,5
1,0
2,0
4,0
6,0
8,0
12,0
1
0.05
0.13
0.17
0.12
0.07
0.04
0.03
<0.03
2
0.05
0.12
0.15
0.12
0.06
0.03
0.03
<0.03
3
0.04
0.11
0.16
0.10
0.07
0.04
0.03
<0.03
4
0.03
0.12
0.13
0.11
0.06
0.05
0.04
<0.03
5
0.04
0.13
0.15
0.13
0.06
0.04
0.03
<0.03
6
0.03
0.15
0.14
0.12
0.08
0.03
0.03
<0.03
Арифметическое среднее
0.04
0.13
0.15
0.12
0.07
0.04
0.03
<0.03
Ош. среднего
0.00
0.01
0.01
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
Стандартные отклонения
0.01
0.01
0.01
0.01
0.01
0.01
0.00
0.0
Коэффициент вариации
22.36%
10.79%
9.43%
8.85%
12.25%
19.97%
12.27%
Медиана
0.04
0.13
0.15
0.12
0.07
0.04
0.03
Геометрическое среднее
0.04
0.13
0.15
0.12
0.07
0.04
0.03
После введения дииндолилметан начинал определяться в системном кровотоке через 15 минут, максимум концентрации наблюдался около 1 часа (0,13-0,17 мкг/мл). Далее концентрация дииндолилметана начинала плавно снижаться, и через 12 часов после введения дииндолилметан определялся в крови в минимальных количествах (менее 0,03 мкг/мл). Разброс индивидуальных значений умеренный: коэффициент вариации CV составил 8-22%.
Пример 5
Концентрации дииндолилметана в плазме крови экспериментальных животных (мкг/мл) при внутрижелудочном введении дииндолилметана с повышенной биодоступностью 0,10 мг/кг
Результаты измерения концентрации субстанции дииндолилметана в плазме крови крыс при внутрижелудочном введении представлены в Таблице 2. Усредненные фармакокинетические кривые отображены на Фиг.4-5.
Таблица 2
№№
Время взятия пробы крови, ч
0,25
0,5
1,0
2,0
4,0
6,0
8,0
12,0
1
1,38
1,70
0,20
0,98
0,15
0,12
0,11
0,04
2
1,52
1,61
0,19
1,10
0,16
0,11
0,07
0,03
3
1,29
1,65
0,25
1,06
0,12
0,10
0,09
0,03
4
1,40
1,88
0,18
0,93
0,14
0.11
0,10
0,04
5
1,12
1,59
0,16
0,88
0,14
0,11
0,11
0,05
6
1,64
1,80
0,23
1,08
0,14
0.11
0,07
0,03
Арифметическое среднее
1,39
1,71
0,20
1,01
0,14
0,11
0,09
0,04
Ош. среднего
0,07
0,05
0,01
0,04
0,01
0,00
0,01
0,00
Стандартные отклонения
0,18
0,11
0,03
0,09
0,01
0,01
0,02
0,01
Коэффициент вариации
12,95%
6,68%
16,42%
8,85%
9,38%
5,75%
20,02%
22,27%
Медиана
1,39
1,68
0,20
1,02
0,14
0,11
0,10
0,04
Геометрическое среднее
1,38
1,70
0,20
1,00
0,14
0,11
0,09
0,04
После введения дииндолилметан начинал определяться в системном кровотоке через 15 минут, максимум концентрации наблюдался около 30 минут (1,6-1,8 мкг/мл), далее концентрация снижалась в 8 раз, и через 2 часа после введения наблюдался повторный максимум концентрации (0,9-1,1 мкг/мл). Далее концентрация дииндолилметана начинала плавно снижаться, и через 12 часов после введения дииндолилметан определялся в крови в минимальных количествах (около 0,03 мкг/мл). Разброс индивидуальных значений умеренный: коэффициент вариации CV составил 5-20%.
Обращает на себя внимание тот факт, что дозировка разработанной формуляции DIM на 1 животное в 2000 раз меньше, чем в случае кристаллического DIMa.
Несмотря на такие различия в дозировках концентрация DIM в плазме экспериментальных животных имеет сопоставимые значения для двух препаратов.
Пример 6
Эффективность предлагаемого средства при лечении атопического дерматита
Под нашим наблюдением находилось 43 больных атопическим дерматитом в возрасте от 18 до 25 лет, из них 35 мужчин (81,4%) и 8 женщин (18,6%). Кожные проявления заболевания соответствовали клинике атопического дерматита с типичной для данного дерматоза морфологией и локализацией высыпаний. У больных выявлены следующие клинические формы АД: эритематозно-сквамозная со слабой или умеренной лихенификацией - у 34 пациентов (78,3%), лихеноидная - у 1 (2,3%), пруригоподобная - у 2 (4,6%), экзематозная - у 6 больных (13,8%). Тяжесть заболевания оценивалась по индексу SCORAD, колебалась в пределах от 12,4 до 61,2. Из них с легкой степенью было 27 больных (62,8%), средней - 15 больных (34,9%), тяжелой - 1 больной (2,3%). Белый разлитой стойкий дермографизм определялся у 44%. Всех больных беспокоил зуд различной степени интенсивности: от незначительного до биопсирующего. Среди больных 35 человек (81,4%) характеризовали зуд как умеренный, терпимый, 8 больных - как нетерпимый. Большинство - 37 больных (86%) - отмечали раздражительность, плохое настроение, быструю утомляемость, нарушение сна. У большинства больных (90,7%) отмечали колебания в течение заболевания. Наиболее часто обострения АД наблюдались в холодное время года. Среди факторов, провоцирующих очередное обострение, 27 (62,8%) пациентов отмечают нарушение гипоаллергенной диеты, 8 (18,6%) - стрессовые ситуации, 5 (11,6%) - инфекционные заболевания, 4 больных АД (9,3%) - прием лекарственных средств.
Для лечения больных был применен новый препарат. Активной субстанцией препарата является дииндолилметан в жидкой лекарственной форме, обладающей повышенной биодоступностью.
Препарат использовали в виде капсул, содержащих 10, 20, 50 и 100 мг активного вещества. Все пациенты получали препарат в дозировке 1 мг на 1 кг веса в сутки.
Оценку результатов терапии проводили на основании изменения клинической картины на 7 и 14 день лечения и через 1 месяц от начала лечения. Объективными критериями служили динамика кожной симптоматики заболевания, оцениваемая с помощью шкалы SCORAD.
Среди 43 пациентов, получавших препарат, клиническое выздоровление, характеризующееся исчезновением зуда и воспалительных изменений кожи, было достигнуто у 10 больных (23,3%) с легкой степенью и у 9 больных (20,9%) со средней степенью тяжести заболевания в среднем через 2 недели от момента начала терапии. Значительное улучшение отмечалось у 8 пациентов (18,6%) с легкой и у 5 (11,6%) со средней степенью тяжести заболевания. Положительная динамика на фоне проводимой терапии в виде улучшения была отмечена у 7 больных (16,3%) с легкой степенью, у 1 (2,3%) - с тяжелой степенью тяжести заболевания. Отсутствие эффекта от проводимой терапии в данной группе наблюдали у 2 больных (4,6%) с легкой степенью и у 1 больного (2,3%) со среднетяжелой степенью тяжести заболевания. Клиническая эффективность препарата составила 74,4%.
Продукция цитокинов
Методом проточной цитометрии на бусах, покрытых антителами к цитокинам, определяли уровень продукции фактора некроза опухолей альфа (ФНО-α) и интерферона g (ИФН-g) у больных атопическим дерматитом до и после лечения.
После лечения наблюдали достоверное (t-test, p<0,05) снижение продукции ФНО-α, ИФН-g (Фиг.6)
Продукция IgE
Лечение препаратом приводило к достоверному снижению уровня IgE, что наблюдается достаточно редко при этом заболевании. Повторный забор крови у больных после лечения осуществляли через 1,5-2 месяца. Время жизни иммуноглобулинов в сыворотке крови составляет около 1 месяца. Соответственно, снижение уровня IgE в сыворотке крови больных АД после лечения означает прямое действие препарата на продукцию IgE. Снижение IgE наблюдали в 100% случаев, даже если исходный уровень был низким (Фиг.7).
Пример 7
Клиническая эффективность новой формуляции DIM для профилактики рецидивов при болезни Крона
Цель
Определить эффективность новой формуляции DIM для поддержания ремиссии при болезни Крона.
Структура исследования
Рандомизированное двойное слепое плацебо-контролируемое исследование;
длительность - 1 год.
Больные
58 больных (от 18 до 67 лет, 50% мужчины) с болезнью Крона в стадии клинической ремиссии, но с высоким риском рецидивирования. Лабораторные показатели отражали наличие хронического воспалительного процесса. Критерии исключения: возраст <18 или >75 лет; прием мезаламина, сульфасалазина или кортикостероидов в течение предшествующих 3 месяцев, а иммуносупрессивных препаратов - в течение предшествующих 6 месяцев.
Лечение
Больные получали 2-3 раза/сут DIM в капсулах по 50 мг (пример 2, пункт Б) или плацебо.
Критерии оценки
Частота рецидивов и длительность ремиссии. Рецидив определялся по повышению индекса активности болезни Крона по сравнению с базисным уровнем на 100 пунктов и его удержанию на уровне >150 баллов в течение 2 недель.
Основные результаты
Лечение DIM в капсулах по 50 мг снизило частоту рецидивов по сравнению с плацебо (28 и 69% соотв.; р<0,001).
Вывод
Лечение DIM в капсулах по 50 мг снижает частоту рецидивов и поддерживает ремиссию при болезни Крона в тех случаях, когда клинические проявления заболевания отсутствуют, но содержание в крови маркеров воспаления повышено.
Пример 8
Исследование концентрации DIM в плазме крови пациентов
Во всех клинических исследованиях проводилось сравнение эффективности DIM-HB и кристаллического DIM в равных дозировках. Во всех исследуемых группах пациентов установлена выраженная положительная динамика при приеме DIM-HB и отсутствие таковой при приеме кристаллического DIM.
Вероятно, эти отличия обусловлены достижением эффективных терапевтических концентраций DIM в периферической крови и тканях-мишенях при лечении DIM-HB. Результаты измерений этих параметров представлены в таблице 3.
Таблица 3
Препарат
Дозировка
Клиническая эффективность
Концентрация DIM в плазме
DIM кристаллический
10 мг
-
Не определяется
DIM-HB
10 мг
+
Более 100 нг/мл
DIM кристаллический
100 мг
-
20-30 нг/мл
DIM-HB
100 мг
+
Более 300 нг/мл
Как следует из наших наблюдений, устойчивые клинические эффекты достигнуты при лечении DIM-HB в дозировке 100 мг в день. При этом концентрация DIM в плазме при приеме 100 мг DIM-HB составила более 300 нг/мл.
Пример 9
Применение DIM-HB у женщин с гиперпластическими процессами в эндометрии
В исследовании принимали участие 32 пациентки, средний возраст которых 47,3±1,53 лет, отказавшиеся от гормональной терапии и у которых отсутствовали показания к хирургическому лечению.
Больные получали DIM-HB по 50 мг 2 раза в сутки в течение 6 месяцев.
Оценка эффективности проводилась через 3 месяца и 6 месяцев по клиническим данным, определению уровня гормонов, УЗИ, РДВ и пайпель-биопсии эндометрия. Результаты представлены в Таблице 4.
Таблица 4
Показатели
До лечения, %
После 3 месяцев лечения, %
После 6 месяцев лечения, %
Меноррагия (обильные менструации)
65,6
56,3
34,4
Метроррагия
46,9
28,1
15,6
Боли внизу живота, связанные с менструальным циклом
28,1
18,8
15,6
Пред- и постменструальные кровяные выделения
21,9
21,9
12,5 (скудные)
Пример 10
Результаты клинических исследований эффективности DIM-HB при лечении больных с сочетанной патологией аденомиоз + миома матки.
В исследовании участвовало 72 пациентки с длительностью заболевания 10 лет, средний возраст которых составил 38,5±2,7 лет.
Отбор пациенток осуществлялся по следующим критериям:
1. Больные с начальными проявлениями заболеваний, отказавшиеся от приема гормональных препаратов.
2. Больные с неэффективной ранее проведенной терапией.
3. Больные с отсутствием показаний для оперативного лечения.
Лечение проводилось DIM-HB по 50 мг 2 раза в день в течение 6 месяцев.
Динамика клинических симптомов у пациенток с сочетанной патологией аденомиоз и миома матки после шести месяцев лечения представлены в Таблице 5.
Таблица 5
Показатели
До лечения, %
После лечения, %
Общая слабость, повышенная утомляемость, снижение работоспособности
21,7
4,3
Гиперполименорея
65,2
10,9
Дисменорея
45,7
8,7
Предменструальные кровяные выделения
39,1
10,9
Ациклические кровотечения
10,9
2,2
Боли внизу живота, не связанные с менструальным циклом
48
17
Диспареуния
10,9
2,2
Нарушение функций соседних органов
19,6
6,5
Масталгия
76,1
8,7
Объем матки
522,7±60,2 см<sup>3</sup>
480±55,8 см<sup>3</sup>
Толщина задней стенки матки с аденомиозом
29,4 мм
25,2 мм
Пример 11
Изменение уровня молекулярных маркеров в узлах миомы матки после применения DIM-HB по сравнению с контролем
В исследовании принимали участие 24 пациентки с показаниями к оперативному лечению, но операция по различным причинам отсрочена.
Длительность приема DIM-HB по 50 мг 2 раза в день составила 3,5 месяца. Результаты иммуногистохимических исследований (оценка в баллах полуколичественным методом по проценту окрашенных клеток (Colvin R et al., 1995) (р<0,05)) представлены в Таблице 6.
Таблица 6
Процесс
Маркер
Кратность увеличения ↑/уменьшения ↓
Пролиферация
Ki-67*
↓4,3
PCNA
↓3,8
C-myc
↓4,5
FGFβ
↓1,9
IGF-I
↓9,2 (!!!)
Пролиферация,
EGF (EGFR)
↓2,4
ангиогенез
PDGF
↓2,3
Апоптоз
Bcl-2
↓8,0 (!!!)
ApopDETEK**
↑5,5 (!!!)
Ангиогенез
CD-34
↓5,9 (!!!)
* подсчет процента окрашенных ядер на 3000 клеток** подсчет процента выявленных апоптозных телец на 3000 клеток
Пример 12
Изучение результативности лечения лиц с патологией щитовидной железы препаратом на основе DIM-HB
Для этого проведен клинико-биохимический анализ эффективности лечения 138 больных. В I группу вошли больные, получавшие терапию препаратом на основе DIM-HB в дозировках 10-100 мг в день. Во вторую группу вошли больные, получавшие лечение в соответствии с принятыми стандартами. Эффективность лечения больных в группе I препаратом на основе DIM-HB отображена в Таблице 7.
Таблица 7
Нозология
Количество обследованных больных
Эффективность через
Побочное действие препаратов
3 мес
12 мес
Диффузный зоб II-III ст.
68
52
68
Во всех случаях отсутствовало отрицательное побочное действие. Отмечали положительный эффект в отношении функций других органов
Узловатый зоб
47
21
47
Диффузный токсический зоб
9
9
9
Гипотиреоз идиопатический
14
3
14
Анализ эффективности лечения в I группе продемонстрировал улучшение всех показателей. В тех случаях гипотиреоза, где больные (до момента обращения к врачу) принимали стандартную терапию, лечение препаратом DIM-HB позволило постепенно отменить или значительно снизить дозу L-тироксина (его аналогов).
Эффективность лечения больных в группе II (стандартная терапия) отображена в Таблице8.
Выводы
Прием препаратов на основе DIM-HB как самостоятельный метод лечения патологии щитовидной железы позволяет достичь положительных клинических результатов; эффективность их подтверждается лабораторными и инструментальными методами исследования.
Преимущество лечения этими препаратами патологии щитовидной железы заключается в достижении стойкого клинического результата без ухудшения со стороны других органов (отсутствие побочного действия). С помощью этих препаратов можно достичь положительной динамики в лечении гипотиреоза (при постепенной отмене или снижении доз заместительной терапии); во многих случаях избежать оперативного вмешательства, нормализуя структуру и функцию щитовидной железы в случаях диффузного токсического зоба и узловатого зоба.
Пример 13
Противорецидивирующая терапия респираторного папилломатоза гортани препаратом на основе DIM-HB
Раствор по примеру 2, пункт Д, на основе DIM-HB назначали в дозировке 1 мг на 1 кг веса ребенка. Препарат вводили в 1-3 приема во время еды. Длительность лечения составляла не менее 12 недель. Терапию начинали после очередного удаления папиллом.
Анализировали длительность межрецидивного периода до и после назначения препарата.
Эффективность лечения оценивали по критериям:
- длительная ремиссия (прекращение роста папиллом в течение 2 лет и более);
- увеличение межрецидивного периода (увеличение временного интервала между операциями по удалению папиллом в 1,5 раза и более от исходного);
- отсутствие эффекта (временной интервал между операциями не изменялся или увеличивался менее чем в 1,5 раза от исходного).
Критериями исключения из исследования явились самостоятельное прекращение приема препарата на основе DIM-HB (2 больных) и недостаточный срок наблюдения (у 7 больных длительность наблюдения от начала приема препарата до проведения анализа результатов лечения была меньше длительности исходного межрецидивного периода).
Таким образом, анализу подвергнуты результаты противорецидивной терапии РРП при помощи препарата у 46 больных. Первые симптомы заболевания у этих 46 пациентов возникли в возрасте от 1 до 156 мес (в среднем 44,7±29,38 мес). Возраст первой операции по удалению папиллом составлял от 2 до 162 мес (в среднем 56,7±29,26 мес).
До начала терапии препаратом детям было проведено от 2 до 64 операций по удалению папиллом (в среднем 13,4±9,01). Длительность межрецидивного периода до лечения препаратом составляла от 2 нед до 12 мес (в среднем 5,6±2,26 мес). Возраст на момент начала терапии составлял от 2 до 14 лет (в среднем 8,9±3,49 лет).
Результаты
Выраженный положительный эффект противорецидивной терапии препаратом получен у 41 (89,1%) больных, в том числе у 21 (45,6%) достигнута длительная (от 2 лет до 3 лет 10 мес наблюдения) ремиссия, а у 20 (43,4%) - увеличение длительности межрецидивного периода в 1,5-6 раз.
Ни в одном случае не наблюдали каких-либо побочных эффектов от проводимой терапии.
Пример 14
Активность в отношении хламидийного цервицита
Для проверки были отобраны 30 женщин с диагнозом «хламидийный цервицит». Одной группе (15 человек) проводили стандартную терапию антибиотиками (Сумамед по 250 мг, 2 раза в день). Другой группе (15 человек) дополнительно назначали DIM по 50 мг (пример 2, пункт Б) 3 раза в день. После 30 дней лечения пробы из цервикального канала исследовали методом ПЦР на наличие Clamydia Trachomatis. В первой группе отрицательный результат лабораторного тестирования был получен у 9 женщин, тогда как во второй группе у 14 женщин не выявлялась Clamydia Trachomatis.
Вывод
Введение в схему лечения хламидийных цервицитов препаратов на основе DIM с повышенной биодоступностью позволит индуцировать апоптотическую гибель инфицированных клеток, что приведет к увеличению эффективности проводимой терапии.
Пример 15
Исследование стабильности лекарственных форм DIM полученных по технологии, описанной в примере 1
Для получения лекарственных форм использовали мягкие желатиновые капсулы и твердые желатиновые капсулы «Licaps». Капсулы хранили при комнатной температуре и через определенные интервалы времени определяли количество активного вещества DIM методом хроматографии высокого давления.
Результаты проведенного исследования представлены в Таблице 9.
Таблица 9
Тип капсул
Дозировка DIM
Содержание DIM после хранения при комнатной температуре
30 дней
60 дней
90 дней
120 дней
Мягкие
50 мг
40 мг
35 мг
30 мг
28 мг
Твердые (Licaps)
50 мг
50 мг
50 мг
50 мг
50 мг
Как следует из полученных данных, в твердых желатиновых кансулах «Licaps» содержание активного вещества DIM остается без изменений, тогда как в мягких желатиновых капсулах наблюдается снижение концентрации вещества DIM вследствие его окисления.
Изобретение поясняется следующими чертежами:
Фигура 1 - динамика роста привитой опухоли MCF-7 у бестимусных (nu/nu) мышей C57Black/6 в контроле (--) и после внутрижелудочного введения животным предлагаемого средства (--) и препаратов на основе кристаллического DIM (--).
Фигура 2 - усредненная динамика концентрации Дииндолилметана в плазме крови экспериментальных животных при внутрижелудочном введении субстанции Дииндолилметана 200,0 мг/кг (в линейных координатах).
Фигура 3 - усредненная динамика концентрации Дииндолилметана в плазме крови экспериментальных животных при внутрижелудочном введении субстанции Дииндолилметана 200,0 мг/кг (в логарифмических координатах).
Фигура 4 - усредненная динамика концентрации Дииндолилметана в плазме крови экспериментальных животных при внутрижелудочном введении капсул Дииндолилметана с повышенной биодоступностью 0,10 мг/кг (в линейных координатах).
Фигура 5 - усредненная динамика концентрации Дииндолилметана в плазме крови экспериментальных животных при внутрижелудочном введении капсул Дииндолилметана с повышенной биодоступностью 0,10 мг/кг (в логарифмических координатах).
Фигура 6 - продукция цитокинов лимфоцитами периферической крови больных атопическим дерматитом до и после лечения.
Фигура 7 - влияние лечения больных атопическим дерматитом на уровень общего IgE в сыворотке.