РЕФОЛДИНГ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ

1. Способ выделения повторно свернутого рекомбинантного белка из культуры прокариотических клеток, причем способ включает стадии
(a) выделения рекомбинантного белка из культуры прокариотических клеток;
(b) растворения указанного белка в первом буферном растворе, pH более 9, содержащем первое хаотропное средство;
(c) рефолдинга указанного растворенного белка во втором буферном растворе, pH>9, но ≤11, содержащем второе хаотропное средство, два или более восстанавливающих средств, и добавления воздуха или кислорода в течение такого времени и при таких условиях, при которых происходит рефолдинг рекомбинантного белка; и
(d) выделения указанного повторно свернутого рекомбинантного белка.
2. Способ по п.1, где рекомбинантный белок представляет собой фактор роста.
3. Способ по п.2, где фактор роста представляет собой фактор роста эндотелия сосудов (VEGF).
165
4. Способ по п.3, где VEGF представляет собой VEGF.
5. Способ по п.1, где первое и второе хаотропные средства представляют собой мочевину.
6. Способ по п.1, где первый буферный раствор дополнительно содержит аргинин.
7. Способ по п.1, где второй буферный раствор дополнительно содержит аргинин.
8. Способ по п.1, где первый буферный раствор содержит в конечной концентрации 1 M мочевину, 300 мМ аргинин, 10 мМ CHES, 5 мМ EDTA, pH 11.
9. Способ по п.1, где первый буферный раствор содержит в конечной концентрации 1 M мочевину, 300 мМ аргинин, 10 мМ ТРИС, 5 мМ EDTA, pH 11.
10. Способ по п.1, где второй буферный раствор содержит в конечной концентрации 1 M мочевину, 15 мМ цистеин, 2 мМ DTT, 100 мМ аргинин, 10 мМ CHES, 5 мМ EDTA, pH 10.
11. Способ по п.1, где второй буферный раствор содержит в конечной концентрации 1 M мочевину, 15 мМ цистеин, 0,5-2 мМ DTT, 100 мМ аргинин, 10 мМ ТРИС, 5 мМ EDTA, pH 10.
12. Способ по п.1, где рекомбинантный белок инкубируют в первом буферном растворе в течение, по меньшей мере, 1 ч.
13. Способ по п.12, где инкубацию выполняют при 2-40°C.
14. Способ по п.1, где растворенный белок инкубируют во втором буферном растворе в течение приблизительно 3-24 ч.
15. Способ по п.14, где инкубацию выполняют при 2-40°C.
16. Способ по п.1, где два или более восстанавливающих средства содержат цистеин и DTT.
La
-1
17. Способ по п.1, где добавление воздуха или кислорода обеспечивают при k = от 0,001 до 0,1 мин.
18. Способ по п.1, дополнительно включающий стабилизацию повторно свернутого рекомбинантного белка добавлением азота.
19. Способ по п.1, где указанная стадия выделения (d) включает осветление второго буферного раствора с рекомбинантным белком и последовательное приведение указанного повторно свернутого рекомбинантного белка в контакт с хроматографическим носителем комбинированного типа, катионным хроматографическим носителем и первым гидрофобным хроматографическим носителем, и селективное элюирование повторно свернутого рекомбинантного белка с каждого носителя.
20. Способ по п.19, где стадия осветления включает: добавление детергента до конечной концентрации 1%, доведение pH до приблизительно 8,5-9,5, инкубирование раствора в течение 1-10 ч при 25-30°C, центрифугирование раствора; и фильтрование жидкости, полученной со стадии центрифугирования.
21. Способ по п.19, дополнительно включающий приведение указанного повторно свернутого рекомбинантного белка в контакт со вторым гидрофобным хроматографическим носителем или ионообменным носителем и селективное элюирование повторно свернутого рекомбинантного белка с носителя.
22. Способ по п.19 или 21, где указанный первый и второй хроматографические носители для гидрофобного взаимодействия выбраны из группы, состоящей из бутил-, пропил-, октил-, фенил- и арилагарозных смол.
23. Способ выделения повторно свернутого рекомбинантного белка из культуры прокариотических клеток, причем способ включает стадии:
(a) выделения рекомбинантного белка из культуры прокариотических клеток;
(b) растворения и рефолдинга указанного белка в комбинированном буферном растворе, pH>9, но ≤11, с добавлением воздуха или кислорода; и
(c) выделения указанного повторно свернутого рекомбинантного белка.
24. Способ по п.23, где стадия выделения включает осветление комбинированного раствора с рекомбинантным белком и последовательное приведение указанного повторно свернутого рекомбинантного белка в контакт с хроматографическим носителем комбинированного типа, катионным хроматографическим носителем и первым гидрофобным хроматографическим носителем, и селективное элюирование повторно свернутого рекомбинантного белка с каждого носителя.
25. Способ по п.24, где стадия осветления включает: добавление детергента до конечной концентрации 1%, доведение pH до приблизительно 8,5-9,5, инкубирование раствора в течение 1-10 ч при 25-30°C, центрифугирование раствора; и фильтрование жидкости, полученной со стадии центрифугирования.
26. Способ по п.23, где комбинированный буферный раствор содержит в конечной концентрации 1 M мочевину, 15 мМ цистеин, 2 мМ DTT, 100 мМ аргинин, 10 мМ CHES, 5 мМ EDTA, pH 10.
27. Способ по п.23, где комбинированный буферный раствор содержит в конечной концентрации 1 M мочевину, 15 мМ цистеин, 0,5-2 мМ DTT, 100 мМ аргинин, 10 мМ ТРИС, 5 мМ EDTA, pH 10.
28. Способ по п.23, где рекомбинантный белок инкубируют в комбинированном буферном растворе в течение приблизительно 3-24 ч.
29. Способ по п.28, где инкубацию выполняют при 2-40°C.
30. Способ по п.24, дополнительно включающий приведение указанного повторно свернутого рекомбинантного белка в контакт со вторым гидрофобным хроматографическим носителем или ионообменным носителем и селективное элюирование повторно свернутого рекомбинантного белка с носителя.
31. Способ очистки рекомбинантного белка, где способ включает стадии последовательного приведения рекомбинантного белка в контакт с носителем комбинированного типа, катионным хроматографическим носителем, первым хроматографическим носителем для гидрофобного взаимодействия и селективного элюирования рекомбинантного белка с каждого носителя.
32. Способ по п.31, дополнительно включающий приведение рекомбинантного белка в контакт со вторым гидрофобным хроматографическим носителем или ионообменным носителем и селективное элюирование рекомбинантного белка с носителя.