Способ оценки работоспособности передних конечностей у экспериментальных животных
METHOD FOR ASSESSMENT OF OPERABILITY OF ANTERIOR EXTREMITIES IN EXPERIMENTAL ANIMALS

Изобретение относится к области экспериментальной биологии и медицины и может быть использовано для выявления расстройств двигательной активности (мышечный статус, неестественные движения, асимметрия работоспособности ипсилатеральной и контралатеральной стороне повреждения конечностей), тактильной сферы, рефлексов и координации движений экспериментальных животных.
Ловкость передних конечностей играет ключевую роль в повседневной деятельности грызунов, а нарушения нервной системы часто приводят к моторной дисфункции передних лап, носящей необратимый характер. Грызуны довольно ловко манипулируют передними лапами, когда охотятся или добывают корм, что в некоторой степени сходно с движениями рук человека. Их можно обучить доставать и зажимать предметы различной формы и размеров. Это используется, например, при выработке инструментальных условных рефлексов (Nichols CM, Myckatyn ТМ, Rickman SR, Fox IK, Hadlock T, Mackinnon SE. Choosing the correct functional assay: a comprehensive assessment of functional tests in the rat. Behav Brain Res. 2005 Sep 8; 163(2): 143-58. Review. PubMed PMID: 15979168).
В настоящее время для оценки мышечной силы передних конечностей применяют тест «сила хватки». Для этого используют проволочный экран с размером ячейки не более 0,6×0,6 см. Экран располагается на высоте 70 см от матерчатой подложки, предназначенной для снижения риска травматизации животного при падении с экрана. Животное располагают на горизонтальном экране, позволяя вцепиться всеми лапами в металлическую решетку. Затем решетку переворачивают таким образом, чтобы животное оказалось висящим под решеткой, и производят расчет времени до падения животного. Перед тестированием животных обучают проведению теста в течение двух недель (Weydt P. Assessing disease onset and progression in the SOD1 mouse model of ALS / P. Weydt, S.Y. Hong, M. Kliot, T. Moller // Neuroreport. - 2003. - V. 14, No 7. - P. 1051-4). Недостатками данного теста являются необходимость в дополнительном обучении или привыкании к установке и длительность проведения данного теста.
Для изучения моторики передних конечностей у крыс известен тест «лестница» («Staircase test»). Установка для проведения теста «лестница» представляет собой удлиненную камеру из органического стекла (285×90×60 мм) с закрывающимся входом с одной стороны. Внутри находится центральная приподнятая плоская платформа длиной 2/3 камеры и шириной 27 мм, образующая небольшое свободное пространство в самом начале камеры и узкое пространство над платформой. В дальнем конце по обеим сторонам от платформы находится съемная парная лестница, имеющая 7 уходящих вниз ступеней. Животное занимает положение на платформе и получает возможность дотянуться и собрать зерна подсолнечника, помещенные в выемках ступеней парной лестницы по обеим сторонам от платформы. При этом если до двух верхних ступеней крыса может достать зубами и языком, то далее ей придется тянуться и собирать зерна одной лапой с каждой стороны, поскольку узость пространства не позволяет ей развернуться и использовать две передние конечности совместно. Животному приходится цепко схватывать зерно кистью одной лапы, чтобы подтянуть его к себе. Задачей для крысы является собрать максимальное количество зерен корма, разложенных по два на каждой из семи ступеней лестницы. Верхняя ступень лестницы на 13 мм, а нижняя на 64 мм ниже центральной платформы. Таким образом, ступени представляют собой 7 уровней сложности этой задачи. Регистрируемым количественным показателем является общее число зерен, собранных крысой, а также число зерен, собранных каждой конечностью по отдельности (Montoya С.Р., Campbell-Hope L.J., Pemberton K.D., Dunnett S.B. The "staircase test" a measure of independent forelimb reaching and grasping abilities in rats. Journal of Neuroscience Methods, 36 (1991) 219-228). Недостатками теста является его сложность в исполнении и необходимость в дополнительном обучении экспериментального животного.
Известен тест с постановкой лапы (Placing test). Данный тест чувствителен к выявлению расстройств двигательной активности передних лап. Крысу нужно держать таким образом, чтобы ее конечности свисали без опоры. Затем крысу поднимают к краю стола так, чтобы ее усы касались поверхности края стола параллельного ее телу. Считается число раз, когда крыса успешно поднимала свою переднюю лапу на поверхность стола в 10 попытках для каждой лапы (Hua Y, Schallert Т, Keep RF, Wu J, Hoff JT, Xi G. Behavioral tests after intracerebral hemorrhage in the rat. // Stroke 2002, 33:2478-2484). Недостатками теста является трудоемкость и недостаточная значимость для всесторонней оценки работоспособности передних конечностей экспериментальных животных - грызунов.
Известен также тест установки позы (Bracing test). Данный тест чувствителен к выявлению расстройств двигательной активности передних лап и координации движений. Экспериментатор располагает руку с одной стороны от крысы и начинает мягко тащить ее в бок на 90 см со скоростью 20 см/с по гладкой поверхности. Здоровые крысы регулируют свою позу, производя множество движений передними лапами. Считается количество шагов, выполненных передней лапой на той стороне, в которую толкают крысу. Крыса тестируется два раза в каждом направлении (Schallert Т, Woodlee МТ: Orienting and placing. In In the Behavior of the Laboratory Rat: A Handbook with Tests. Edited by Whishaw I, Kolb B. Oxford: Oxford University Press; 2005: 129-140). Данный тест рассмотрен в качестве ближайшего аналога. Недостатками данного теста является трудоемкость и недостаточно объективная оценка работоспособности передних конечностей экспериментальных животных - грызунов.
Задачей, решаемой заявленным изобретением, является разработка способа выявления опорно-двигательных нарушений конечностей у крыс, позволяющего снизить трудоемкость и временные затраты на проведение эксперимента. Данный метод наиболее четко выявляет нарушения работоспособности именно передних конечностей грызунов, а также позволяет оценить координацию движений животного. На выполнение данной методики и получение данных по каждому животному уходит в среднем не более 1 минуты, не требуется дополнительное обучение или привыкание к установке.
Технический результат заключается в снижении трудоемкости и временных затрат на проведение эксперимента для оценки работоспособности передних конечностей у экспериментальных животных с высокой достоверностью и точностью.
Технический результат достигается тем, что оценку работоспособности передних конечностей у крыс проводят путем определения двигательной активности передних лап и координации движений, при этом двигательную активность и координацию движений определяют посредством проведения пяти тестов и балльной оценки, причем на первом тестировании используют лестницу, выполненную из железа или пластика и имеющую следующие размеры: длина лестницы составляет 66 см, диаметр каждой перекладины 1,5-2 мм, расстояние между перекладинами 1 см, при этом крысу держат на весу за корень хвоста и дают ей возможность прикоснуться передними лапами к одной из перекладин вертикально закрепленной лестницы, после чего осуществляют попытку оттянуть ее от перекладины, каждую лапу оценивают отдельно по следующей шкале: захват и удержание лапы на перекладине - крыса пытается вырваться из рук экспериментатора и не отпускает перекладину более 10 секунд - оценивают как 2 балла, захватывает, но через 5-10 секунд отпускает перекладину - 1,5 балла, захватывает и удерживает перекладину в течение 2-4 секунд - 1 балл, захватывает, но не удерживает перекладину - 0,5 баллов, нет захвата и удержания перекладины - 0 баллов, затем на втором тестировании крысу держат за туловище, обе передние лапы подносят к самой нижней перекладине вертикальной лестницы и одновременно с этим крысу отпускают так, чтобы оно оказалось висящей на нижней перекладине, уцепившись за нее только передними лапами, а задние лапы остаются без опоры, причем, в случае если крыса подтягивается за счет передних конечностей вверх и оказывается всеми четырьмя конечностями на лестнице, это оценивают как 2 балла, висит не менее 30 сек, но не может подтянуться вверх - 1 балл, висит менее 30 сек и падает вниз - 0 баллов, далее в процессе третьего тестирования лестницу делят на три одинаковых отрезка, каждый из которых равен 22 см и, проползая каждую треть, крыса получает по 1 баллу, максимум 3 балла, при этом осуществляют четвертое тестирование, применяя стимуляцию в виде прикосновения к каждой стороне туловища или к спинке, если крыса останавливается на каком-либо отрезке лестницы, в этом случае она получает 0 баллов, если же крыса забирается по лестнице вверх без дополнительной стимуляции, то это оценивают как 1 балл; при пятом тестировании в случае, если крыса забирается вверх по лестнице прямолинейно, не совершая каких-либо дополнительных боковых движений ни правой, ни левой передней конечностью, это оценивают как 1 балл, в случае, если крыса при подъеме начинает совершать боковые круговые движения любой из передних лап - 0 баллов, затем суммируют полученные данные пяти тестов, и при значении 10-11 баллов оценивают работоспособность как нормальную, а при менее 10 баллов оценивают ее как сниженную.
Способ осуществляется следующим образом.
Метод оценки работоспособности передних конечностей у экспериментальных крыс включает в себя пять различных последовательных тестирований и балльную оценку.
Установка для тестирования представляет собой вертикально закрепленную на неподвижной поверхности лестницу, с расстоянием между перекладинами 1 см, толщина перекладин соответствует размеру, при котором экспериментальному животному было бы удобно удерживать хват максимально продолжительное время.
Первое тестирование оценивает силу передних конечностей и рефлекс хватания, отражающий состояние срединного нерва, который у грызуна, отвечает за хватку передних конечностей. Для этого используют лестницу, выполненную из любого материала, например из пластика или же железа, покрытое краской, чтобы легко могла осуществляться уборка. Краской может и не быть покрыто - принципиального значения для выполнения данного теста это не имеет, лишь эстетическая сторона дела или чтобы избежать свойства железа ржаветь со временем. Длина лестницы составляет 66 см, каждая ее треть равна 22 см. Перекладины, разграничивающие трети между собой могут быть окрашены в любой другой яркий цвет, чтобы выделить границы между ключевыми третями (или же иметь белые отметки сбоку). Ширина лестничного полотна может быть разной, но не менее 10 см, чтобы можно было протестировать крысу любого возраста. Расстояние между перекладинами составляет 1 см, диаметр каждой перекладины 1,5-2 мм. Лестница может быть прикреплена к любой поверхности (стене, двери и т.д.), и отстоять от нее не менее чем на 3-5 мм (см. фиг. 1). Также расстояние от пола до самой нижней первой перекладины вертикально закрепленной лестницы должно быть не менее 1 метра (см. фиг. 2 на которой видно, что крыса висит над пропастью, и ей не хочется падать). Для исключения скольжения лап крысы лестница и ее перекладины должны быть сухими и чистыми. Захват перекладины крысой происходит только в том случае, если конечность хорошо работает и не имеет существенных нарушений.
Крысу держат на весу за корень хвоста и дают ей возможность прикоснуться передними лапами к одной из перекладин вертикально закрепленной лестницы. В норме пальцы крысы охватывают перекладину и сжимаются вокруг нее. Реакция усиливается при попытке экспериментатора оттянуть животное от перекладины. Каждую лапу оценивают отдельно по следующей шкале: 2 балла - захват и сильное удержание лапы на перекладине более 10 секунд (крыса пытается вырваться из рук экспериментатора, не отпускает перекладину), 1,5 балла - захватывает, но через 5-10 секунд отпускает перекладину, 1 балл - имеется захват с последующим удержанием перекладины в течение 2-4 секунд. 0,5 баллов - захватывает, но не удерживает перекладину и 0 баллов - захват и удержание перекладины отсутствуют.
С помощью данного теста также возможно оценить асимметрию работы ипси- и контралатеральной очагу повреждения передних конечностей. Для этого рассчитывают разницу баллов удержания передней ипсилатеральной очагу повреждения лапы на перекладине относительно передней контралатеральной лапы. При этом если разница составляет 2 балла, то это свидетельствует о максимальной асимметрии работы передних конечностей, а 0 баллов - об ее отсутствии.
Затем на втором тестировании крысу держат за туловище, обе передние лапы подносят к самой нижней перекладине вертикальной лестницы и одновременно с этим отпускают ее так, чтобы она оказалось висящей на нижней перекладине, уцепившись за нее только передними лапами, а задние лапы остаются без опоры (см. фиг. 2). В норме крыса быстро подтягивается за счет передних конечностей вверх и оказывается всеми четырьмя конечностями на лестнице, что оценивается в 2 балла, висит не менее 30 сек, но не может подтянуться вверх, оценивают в 1 балл, висит менее 30 сек и падает вниз, оценивают в 0 баллов.
Далее в процессе третьего тестирования лестницу делят на три одинаковых отрезка, каждый из которых составляет 22 см. При достижении крысой пограничной перекладины передними лапами - засчитывается прохождение трети. При этом животное, проползая каждую треть, получает по 1 баллу. Максимум 3 балла, если крыса освоила все три отрезка.
Затем осуществляют четвертое тестирование с помощью стимуляции в виде прикосновения к каждой стороне туловища или к спинке, если крыса останавливается на каком-либо отрезке лестницы, то она получает 0 баллов, если же крыса забирается по лестнице вверх без дополнительной стимуляции, это оценивают как 1 балл. Таким образом, также может оцениваться и проприорецепция тела животного.
Для оценки координации крысы проводят пятое тестирование. В норме крыса забирается вверх по лестнице прямолинейно, не совершая каких-либо дополнительных боковых движений ни правой, ни левой передней конечностью, что оценивают в 1 балл. В случае если крыса при подъеме начинает совершать боковые круговые движения любой из передних лап, это оценивают в 0 баллов. Полученные данные пяти тестов суммируют, и при значении 10-11 баллов оценивают работоспособность как нормальную, а при менее 10 баллов оценивают ее как сниженную.
Проведена оценка работоспособности передних конечностей у ложнооперированных крыс: n=19 и группы экспериментальных животных, получивших травму, n=101.
Была использована модифицированная модель фокальной открытой черепно-мозговой травмы (ЧМТ) у крыс (Genrikhs Е.Е., Stelmashook E.V., Popova O.V. Kapay N.A., Korshunova G.A., Sumbatyan N.V., Skrebitsky V.G., Skulachev V.P., Isaev N.K.. Mitochondria-targeted antioxidant SKQT1 decreases trauma-induced neurological deficit in rat and prevents amyloid-β-induced impairment of long-term potentiation in rat hippocampal slices. // Journal of Drug Targeting. - 2015. - V. 23. - №4. - P. 347-352). Исследование выполнено на крысах-самцах линии Вистар весом от 160 до 220 г. Для моделирования травматического повреждения левого полушария головного мозга в трепанационное отверстие, высверленное в черепе над зоной сенсомоторной коры, помещали подвижный тефлоновый поршень диаметром 4 мм и ходом 2,5 мм, по которому с высоты 10 см ударял с ускорением свободного падения груз весом 50 г. Локализацию зоны сенсомоторной коры определяли по данным, представленным в атласе (Paxinos G., Watson С. Atlas of anatomy of rat brain. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates: San Diego. 1997) и работе Hicks, D'Amato (Hicks S.P., D'Amato C.J. Locating corticospinal neurons by retrograde axonal transport of horseradish peroxidase. // Exp. Neurol. - 1977. - V. 56. - P. 410-420). С ложнооперированными животными проводили все те же манипуляции, исключая удар груза. Тестирование осуществляли с помощью предложенной лестницы имеющей длину 66 см, с каждой ее третью равной 22 см, с шириной лестничного полотна не менее 10 см, с расстоянием между перекладинами в 1 см, и диаметром каждой перекладины 1,5 мм и 2 мм и шкалы до моделирования черепно-мозговой травмы и через сутки после ЧМТ, данные представлены ниже в таблицах 1-4. Контрольное исследование наличия в нужной области головного мозга очага повреждения выполняли на 7 сутки после ЧМТ. Для этого мозг животных извлекали и фиксировали с помощью смеси формалин-этиловый спирт-уксусная кислота в пропорции 2:7:1. Экспериментальная травма зоны сенсомоторной коры левого полушария головного мозга крысы вызывает образование очага повреждения, что сопровождается выраженным неврологическим дефицитом.
Таким образом, до операции средний балл, набранный посредством заявленного теста, для контрольной ложнооперированной группы экспериментальных животных и группы, впоследствии получившей ЧМТ, был сходным и составил 10,76±0,12 и 10,6±0,09, соответственно. У группы животных после моделирования черепно-мозговой травмы спустя 24 часа балл, полученный посредством заявленного теста, снизился и составил 4,8±0,19, при этом у группы ложнооперированных животных через сутки после операции он остался на том же уровне, что и до манипуляций - 10,76±0,14 (см. также Фиг. 3). Заявленный тест показал высокую чувствительность и достоверность при выявлении снижения работоспособности передних конечностей у животных, получивших травматическое повреждение зоны сенсомоторной коры головного мозга (p<0,001).