ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ НАРУШЕНИЙ ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНОГО ТРАКТА И СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ НАРУШЕНИЙ ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНОГО ТРАКТА
THERAPEUTIC AGENT FOR TREATING FUNCTIONAL GASTROINTESTINAL DISTURBANCE AND METHOD OF TREATING FUNCTIONAL GASTROINTESTINAL DISTURBANCE

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для лечения функциональных нарушений желудочно-кишечного тракта.
Из уровня техники известно лекарственное средство для лечения эрозивных и воспалительных заболеваний желудочно-кишечного тракта на основе активированных форм сверхмалых доз антител к морфину и активированных форм сверхмалых доз антител к гистамину (RU 2197266 C1, A61K 39/395, 27.01.2003). Однако данное лекарственное средство не во всех случаях может обеспечить достаточную терапевтическую эффективность.
Изобретение направлено на повышения эффективности лечения функциональных нарушений желудочно-кишечного тракта.
Решение поставленной задачи обеспечивается тем, что лекарственное средство для лечения и профилактики функциональных нарушений желудочно-кишечного тракта, содержащее активированную - потенцированную форму антител к гистамину, согласно изобретению, выполнено в виде фармацевтической композиции и содержит в качестве дополнительных (усиливающих) компонентов активированную -потенцированную форму антител к фактору некроза опухоли - альфа (ФНО-α) и активированную - потенцированную форму антител к мозгоспецифическому белку S-100.
Указанными функциональными нарушениями желудочно -кишечного тракта могут быть, например, синдром раздраженного кишечника, функциональное нарушение кишечника (функциональное вздутие живота, функциональная диарея), абдоминальный болевой синдром, неспецифический язвенный колит, болезнь Крона, язвенная болезнь желудка (ЯБЖ) и двенадцатиперстной кишки (12ПК), рецидивы ЯБЖ и 12ПК, эзофагит и рефлюкс-эзофагит.
Активированную - потенцированную форму антител к гистамину, активированную - потенцированную форму антител к ФНО-α и активированную - потенцированную форму антител к мозгоспецифическому белку S-100 используют в виде активированного - потенцированного водного или водно-спиртового раствора, полученного в процессе последовательного многократного разведения в водном или водно-спиртовом растворителе и промежуточного внешнего механического воздействия -вертикального встряхивания.
Фармацевтическая композиция заявленного лекарственного средства может быть выполнена в твердой лекарственной форме, которая содержит эффективное количество гранул нейтрального носителя, насыщенного смесью водных или водно-спиртовых растворов активированной - потенцированной формы антител к гистамину, активированной - потенцированной формы антител к ФНО-α и активированной - потенцированной формы антител к мозгоспецифическому белку S-100, и фармацевтически приемлемые добавки. При этом фармацевтически приемлемые добавки включают, например, лактозу, целлюлозу микрокристаллическую и магния стеарат.
Водные или водно-спиртовые растворы активированных - потенцированных форм антител к гистамину, к ФНО-α и к мозгоспецифическому белку S-100 могут быть получены путем многократного последовательного разведения и промежуточного внешнего воздействия из матричных растворов аффинно очищенных антител к гистамину, к ФНО-α и к мозгоспецифическому белку S-100 с концентрацией 0,5÷5,0 мг/мл.
При этом каждый из компонентов сверхмалых доз аффинно очищенных антител используют в виде смеси различных, преимущественно сотенных, гомеопатических разведений.
12
30
200
Предпочтительно активированную - потенцированную форму антител к гистамину, активированную - потенцированную форму антител к ФНО-α и активированную - потенцированную форму антител к мозгоспецифическому белку S-100 в сверхмалой дозе каждого компонента, приготовленной из матричного раствора, разведенного в 100, в 100, в 100, что эквивалентно смеси сотенных гомеопатических разведений С12, СЗО, С200.
Решение поставленной задачи может обеспечиваться также, что в способе лечения функциональных нарушений желудочно-кишечного тракта путем введения в организм лекарственного средства, содержащего активированную - потенцированную форму антител к гистамину, согласно изобретению, дополнительно одновременно и сочетано вводят активированную - потенцированную форму сверхмалых доз аффинно очищенных антител к ФНО-α и активированную - потенцированную форму антител к мозгоспецифическому белку S-100.
При этом используют приготовленные в виде единого лекарственного препарата - одной лекарственной формы смесь различных гомеопатических разведений антител к гистамину в
сочетании со смесью различных гомеопатических разведений антител к ФНО-α и смесью различных гомеопатических разведений антител к мозгоспецифическому белку S-100.
Заявленное лекарственное средство может быть использовано для лечения и профилактики больных с функциональными нарушениями желудочно-кишечного тракта, в том числе синдрома раздраженного кишечника, функционального нарушения кишечника (функциональное вздутие живота, функциональная диарея), абдоминального болевого синдрома, неспецифического язвенного колита, болезни Крона, язвенной болезни желудка (ЯБЖ) и двенадцатиперстной кишки (12ПК), рецидивов ЯБЖ и 12ПК, эзофагитов и рефлюкс-эзофагитов и т.п.
12
30
200
Кроме того, заявленное лекарственное средство, как комплексное, содержит действующие компоненты в соотношении 1:1:1, при этом каждый компонент используют в виде смеси трех соответствующих матричных растворов, разведенных в 100, 100, и 100 раз, что эквивалентно сотенным гомеопатическим разведениям С12, С30, С200.
Заявленную фармацевтическую композицию рекомендуется принимать, предпочтительно, по 1-2 таблетке 2-4 раза в день.
При лечении функциональных нарушений желудочно-кишечного тракта возможно раздельное применение в виде трех отдельно приготовленных препаратов как в виде растворов, так и в твердых лекарственных формах (таблеток), каждая из которых содержит активированную - потенцированную форму сверхмалых доз аффинно очищенных антител к гистамину, активированную -потенцированную форму сверхмалых доз аффинно очищенных антител к ФНО-α и, соответственно, активированную - потенцированную форму сверхмалых доз аффинно очищенных антител к мозгоспецифическому белку S-100.
Предложенное сочетание активированных - потенцированных форм антител к гистамину, к ФНО-α и к мозгоспецифическому белку S-100 в фармацевтической композиции (т.е. формы антител к гистамину, к ФНО-α и к мозгоспецифическому белку S-100, приготовленные по гомеопатической технологии потенцирования путем многократного последовательного разведения и промежуточного внешнего воздействия - вертикального встряхивания, которые обладают активностью в фармакологических моделях и/или клинических методах лечения функциональных нарушений желудочно-кишечного тракта) обеспечивает получение неожиданного синергетического терапевтического эффекта, который заключается в более выраженном терапевтическом эффекте по сравнению с действием, оказываемым отдельными компонентами, что подтвержденного на адекватных экспериментальных моделях и клинических исследованиях, который заключается в нормализации нервной и гуморальной регуляции функции кишечника, снижении висцеральной гиперчувствительности рецепторов толстой кишки к растяжению, что обеспечивает восстановление нарушения моторики желудочно-кишечного тракта, купировании ощущения вздутия живота и переполнения желудка, уменьшении выраженности болевого синдрома. При этом происходит расслабление гладкой мускулатуры, уменьшение тонуса стенки желудочно-кишечного тракта, снижение внутрипросветного давления, нормализация консистенции стула, его частоты и сопутствующих симптомов (купирование императивных позывов, тенезмов, чувства неполного опорожнения кишечника, дополнительных усилий при акте дефекации и др.).
Таким образом, лекарственное средство содержит три компонента, каждый из которых оказывает многофакторное позитивное (лечебное) воздействие на различные проявления нарушенной деятельности желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) и их заявленное совместное использование в виде фармацевтической композиции сопровождается нормализацией нейрогуморальной регуляции ЖКТ с благоприятным взаимодействием компонентов, направленным на нормализацию деятельности желудочно-кишечного тракта и усиливающим их суммарный терапевтический эффект.
Кроме того, заявленное лекарственное средство расширяет арсенал препаратов, предназначенных для лечения и профилактики желудочно-кишечного тракта.
Лекарственный препарат приготовляют, преимущественно, следующим образом.
Для приготовления гомеопатически активированной потенцированной формы действующих компонентов используют моноклональные или, преимущественно, поликлональные антитела, которые могут быть получены по известным технологиям - методикам, описанным, например, в книге: Иммунологические методы, под ред. Г. Фримеля, М., «Медицина», 1987, с.9-33; или, например, в статье Laffly E., Sodoyer R. Hum. Antibodies. Monoclonal and recombinant antibodies, 30 years after. - 2005 - Vol.14. - N 1-2. P.33-55. Для проведения экспериментальных исследований могут быть использованы антитела, приготовленные по заказу специализированной фармацевтической фирмой.
Моноклональные антитела получают, например, с помощью гибридомной технологии. Причем начальная стадия процесса включает иммунизацию, основанную на принципах, уже разработанных при приготовлении поликлональных антисывороток. Дальнейшие этапы работы предусматривают получение гибридных клеток, продуцирующих клоны одинаковых по специфичности антител. Их выделение в индивидуальном виде проводится теми же методами, что и в случае поликлональных антисывороток.
Поликлональные антитела могут быть получены активной иммунизацией животных. Для этого по специально разработанной схеме животным делают серию инъекций требуемым в соответствии с изобретением веществом - антигеном: гистамином, ФНО-α и мозгоспецифическим белком S-100. В результате проведения такой процедуры получают моноспецифическую антисыворотку с высоким содержанием антител, которую и используют для получения активированной - потенцированной формы. При необходимости проводят очистку антител, присутствующих в антисыворотке, например, методом аффинной хроматографии, путем применения фракционирования солевым осаждением или ионообменной хроматографии.
5
9
3
Поликлональные антитела к гистамину, который является биогенным амином (4-(2-Аминоэтил)-имидазол или бета имидазолил-этиламин с химической формулой CHN), получают, используя в качестве иммуногена (антигена) для иммунизации кроликов адъювант и промышленно выпускаемый дигидрохлорид гистамина.
3
Перед отбором крови за 7-9 дней проводят 1-3 внутривенных инъекций для повышения уровня антител. В процессе иммунизации у кроликов отбирают небольшие пробы крови для оценки количества антител. Максимальный уровень иммунного ответа на введение большинства растворимых антигенов достигается через 40-60 дней после первой инъекции. После окончания первого цикла иммунизации кроликов в течение 30 дней дают восстановить здоровье и проводят реиммунизацию, включающую 1-3 внутривенные инъекции. Для получения антисыворотки из иммунизированных кроликов собирают кровь в центрифужную пробирку объемом 50 мл. С помощью деревянного шпателя удаляют со стенок пробирки образовавшиеся сгустки и помещают палочку в сгусток, образовавшийся в центре пробирки. Кровь помещают в холодильник (температура 4°С) на ночь. На следующий день удаляют сгусток, прикрепившийся к шпателю, и центрифугируют оставшуюся жидкость при 13000g в течение 10 мин. Супернатант (надосадочная жидкость) является антисывороткой. Полученная антисыворотка должна быть желтого цвета. Добавляют к антисыворотке 20% (весовая концентрация) NaN до конечной концентрации 0,02% и хранят до использования в замороженном состоянии при температуре -20°С. Для выделения из антисыворотки антител к гистамину производят абсорбцию на твердой фазе в следующей последовательности:
2
4
1. 10 мл антисыворотки кролика разбавляют в 2 раза 0,15 М NaCl добавляют 6,26 г NaSO, перемешивают и инкубируют 12-16 ч при 4°C;
2. выпавший осадок удаляют центрифугированием, растворяют в 10 мл фосфатного буфера и затем диализуют против того же буфера в течение ночи при комнатной температуре;
3. после удаления осадка центрифугированием раствор наносят на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенную фосфатным буфером;
4. фракцию антител определяют, измеряя оптическую плотность элюата при 280 нм.
Затем производят очистку антител методом аффинной хроматографии путем прикрепления полученных антител к гистамину, который находится на нерастворимом матриксе с последующим элюированием концентрированными растворами соли.
Полученный, таким образом, буферный раствор поликлональных кроличьих антитела к гистамину, очищенных на антигене, с концентрацией 0,5÷5,0 мг/мл, предпочтительно 2,0÷3,0 мг/мл, используют в качестве матричного (первичного) раствора для последующего приготовления активированной - потенцированной формы.
Получение поликлональных антител к фактору некроза опухоли - альфа (ФНО-α) может быть произведено по вышеуказанному методу получения поликлональных антител к гистамину с использованием цельной молекулы фактора некроза опухоли - альфа следующей последовательности:
1 MSTESMIRDV ELAEEALPKK TGGPQGSRRC LFLSLFSFLI VAGATTLFCL LHFGVIGPQR
61 EEFPRDLSLI SPLAQAVRSS SRTPSDKPVA HVVANPQAEG QLQWLNRRAN ALLANGVELR
121 DNQLVVPSEG LYLIYSQVLF KGQGCPSTHV LLTHTISRIA VSYQTKVNLL SAIKSPCQRE
181 TPEGAEAKPW YEPIYLGGVF QLEKGDRLSA EINRPDYLDF AESGQVYFGIIAL
Возможно для получения поликлональных антител к фактору некроза опухоли - альфа (ФНО-α) использование полипептидного фрагмента фактора некроза опухоли, выбранного, например, из следующих последовательностей:
84-88: PSDKP
93-97: VANPQ
65-199:
RDLSLI SPLAQAVRSS SRTPSDKPVA HVVANPQAEG QLQWLNRRAN ALLANGVELR DNQLVVPSEG LYLIYSQVLF KGQGCPSTHV LLTHTISRIA VSYQTKVNLL SAIKSPCQRE TPEGAEAKPW YEPIYLGGV
77-93:
RSS SRTPSDKPVA HVV
32-54:
GGPQGSRRC LFLSLFSFLI VAGA
56-73:
IGPQR EEFPRDLSLI SPL
123-160:
QLVVPSEG LYLIYSQVLF KGQGCPSTHV LLTHTISRIA
176-190:
PCQRE TPEGAEAKPW
5-45:
SMIRDV ELAEEALPKK TGGPQGSRRC LFLSL
150-184:
V LLTHTISRIA VSYQTKVNLL SAIKSPCQRE TPEG
77-233:
VRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELR
DNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKV
NLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINR
PDYLDFAESGQVYFGIIAL.
Получение антител к мозгоспецифическому белку S-100. Для приготовления потенцированной формы антител - антисыворотки к мозгоспецифическому белку S-100 используют мозгоспецифический белок S-100, выделенный из ткани головного мозга быка по следующей методике:
- замороженную в жидком азоте ткань растирают в порошок на специальной мельнице;
- экстракцию белков проводят в соотношении 1:3 (вес/объем) в экстрагирующем буфере при гомогенизации;
- гомогенат прогревают в течение 10 мин при 60°С и охлаждают до 4°С на ледяной бане;
- термолабильные белки удаляют центрифугированием;
- проводят ступенчатое фракционирование сульфатом аммония с последующим удалением выпадающих в осадок примесных белков;
- содержащую белок S-100 фракцию осаждают 100% насыщенным сульфатом аммония при снижении рН до 4,0 и собирают центрифугированием;
- осадок растворяют в минимальном объеме буфера, содержащего ЭДТА и меркаптоэтанол, диализируют против деионизованной воды и лиофильно высушивают;
- фракционирование кислых белков продолжают хроматографией на ионообменных носителях - ДЭАЭ целлюлозе ДЕ-52 и затем ДЭАЭ- сефадексе А-50;
- собранные и отдиализованные фракции, содержащие белок S-100, разделяют по молекулярному весу гель-фильтрацией на сефадексе G-100;
- очищенный белок S-100 диализируют и лиофильно высушивают.
Молекулярный вес очищенного мозгоспецифического белка S-100 составляет - 21000 Д.
Для получения мозгоспецифической антисыворотки к выделенному мозгоспецифическому белку S-100 готовят смесь очищенного белка S-100 (антигена) в комплексе с метилированным бычьим сывороточным альбумином в качестве носителя с полным адъювантом Фрейнда, которую вводят подкожно лабораторному животному - кролику в область спины в количестве 1-2 мл.
Полученная антисыворотка имеет титр 1:500-1:1000. Предпочтительным для приготовления заявленного лекарственного препарата является использование поликлональных антител к гистамину, к ФНО-α и к мозгоспецифическому белку S-100, которые в качестве матричного (первичного) раствора с концентрацией 0,5÷5,0 мг/мл (преимущественно, 2,0÷3,0 мг/мл) используют для последующего приготовления активированной -потенцированной формы.
Активированную - потенцированную форму каждого компонента готовят путем равномерного уменьшения концентрации в результате последовательного разведения 1 части упомянутого матричного раствора в 9 частях (для десятичного разведения) или в 99 частях (для сотенного разведения) или в 999 частях (для тысячного разведения) нейтрального растворителя с многократным вертикальным встряхиванием ("динамизацией") каждого полученного разведения и использованием отдельных емкостей для каждого последующего разведения до получения требуемой потенции - кратности разведения по гомеопатическому методу (см., например, В. Швабе "Гомеопатические лекарственные средства", М., 1967 г., с.14-29).
Внешнюю обработку в процессе уменьшения концентрации также можно осуществлять ультразвуком, электромагнитным или иным физическим воздействием.
12
Например, для приготовления 12-го сотенного разведения С12 одну часть упомянутого матричного раствора антител к гистамину с концентрацией 2,5 мг/мл разводят в 99 частях нейтрального водного или водно-спиртового растворителя (преимущественно 15% этилового спирта) и многократно (10 и более раз) вертикально встряхивают - потенцируют полученное 1-е сотенное С1 разведение. Из 1-го сотенного С1 разведения приготовляют 2-ое сотенное разведение С2. Данную операцию повторяют 11 раз, получая 12-е сотенное разведение С12. Таким образом, 12-е сотенное разведение С12 представляет собой раствор, полученный разбавлением последовательно в разных емкостях 12 раз 1-ой части исходного матричного раствора антител к гистамину с концентрацией 2,5 мг/мл в 99-ти частях нейтрального растворителя, т.е. раствор, приготовленный из матричного раствора, разведенного в 100 раз. Аналогичные операции с соответствующей кратностью разведения проводят для получения разведений С30 и С200.
12
30
200
При использовании в качестве биологически активного жидкого компонента смеси различных гомеопатических, преимущественно сотенных, разведений, действующего вещества каждый компонент состава (например, С12, С30, С200) приготовляют раздельно по описанной выше технологии до их предпоследнего разведения (соответственно, до получения С11, С29, С199) и затем вносят в соответствии с составом смеси в одну емкость по одной части каждого компонента и смешивают с требуемым количеством растворителя (соответственно, с 97 частями для сотенного разведения). При этом получают активированную - потенцированную форму антител к гистамину в сверхмалой дозе, приготовленной из матричного раствора, разведенного в 100, в 100, в 100, что эквивалентно смеси сотенных гомеопатических разведений С12, С30, С200.
Возможно использование действующего вещества в виде смеси других различных гомеопатических, разведений, например, десятичных и или сотенных, (D20, С30, С100 или С12, С30, С50 и т.д.), эффективность которых определяют экспериментально.
При потенцировании вместо встряхивания в процессе уменьшения концентрации также можно осуществлять внешнее воздействие ультразвуком, электромагнитным или иным физическим воздействием.
Для получения заявленной фармацевтической композиции водные или водно-спиртовые растворы действующих компонентов смешивают, преимущественно, в соотношении 1:1:1 и используют в жидкой лекарственной форме.
Заявленная фармацевтическая композиция может быть использована и в твердой лекарственной форме, которая содержит эффективное количество гранул нейтрального носителя - лактозы, насыщенного путем пропитывания до насыщения смесью водных или водно-спиртовых растворов активированной - потенцированной формой антител к гистамину, активированной - потенцированной формой антител к ФНО-α и активированную-потенцированную форму антител к мозгоспецифическому белку S-100, и фармацевтически приемлемые добавки, включающие, преимущественно, лактозу, целлюлозу микрокристаллическую и магния стеарат.
12
30
200
Для получения твердой оральной формы заявленного лекарственного средства производят в установке кипящего слоя (например, типа «Hüttlin Pilotlab» производства компании Hüttlin GmbH) орошение до насыщения вводимых в псевдоожиженный - кипящий слой гранул нейтрального вещества - лактозы (молочного сахара) с размером частиц 150÷300 мкм, предварительно полученным водным или водно-спиртовым раствором активированных - потенцированных форм антител к гистамину, активированных - потенцированных форм антител к ФНО-α и активированных - потенцированных форму антител к мозгоспецифическому белку S-100, преимущественно, в соотношении 1 кг раствора антител на 5 или 10 кг лактозы (1:5-1:10) с одновременной сушкой в потоке подаваемого под решетку нагретого воздуха при температуре не выше 40°C. Расчетное количество 0,17÷0,45 от массы твердой оральной формы) высушенных гранул, насыщенных активированной - потенцированной формой антител, загружают в смеситель и смешивают с микрокристаллической целлюлозой, вводимой в количестве 2÷5 масс. частей от общей массы загрузки - от массы твердой оральной формы. Затем в эту смесь добавляют 10÷25 масс. частей от общей массы загрузки «ненасыщенной» чистой лактозы (для снижения стоимости и некоторого упрощения и ускорения технологического процесса без снижения эффективности лечебного воздействия), стеарат магния в количестве 0,1÷0,3 масс. частей от общей массы загрузки и микрокристаллическую целлюлозу в количестве 2÷5 масс. частей от общей массы загрузки. Полученную таблеточную массу равномерно перемешивают и таблетируют прямым сухим прессованием (например, в таблет - прессе Korsch - XL 400) с формированием круглых таблеток массой 150÷500 мг. После таблетирования получают таблетки массой 300 мг, пропитанные водно-спиртовым раствором (3,0-6,0 мг/табл.) активированной - потенцированной формой антител к гистамину, к ФНО-α и к мозгоспецифическому белку S-100 в сверхмалой дозе каждого компонента, приготовленной из матричного раствора, разведенного в 100, в 100, в 100, что эквивалентно смеси сотенных гомеопатических разведений С12, С30, С200.
Предпочтительно заявленную фармацевтическую композицию рекомендуется принимать по 1-2 таблетке 2-4 раза в день.
Пример 1.
В исследовании влияния заявленного лекарственного средства на моторно-эвакуаторную функцию кишечника мышей были использованы 31 аутбредных самцов мыши (масса 17,5-26,3 г, возраст 1,5-2 месяца), которым внутрижелудочно в течение 5 дней вводили дистиллированную воду (контроль, 15 мл/кг, 10 мышей), AT Гис (15 мл/кг, 11 мышей) или AT S100 + AT ФНО-α + AT Гис (15 мл/кг, 10 мышей). Состояние моторно-эвакуаторной функции кишечника изучали методом «меток» (Coopman G.P., Kennis H.M. Two methods to assess the gastrointestinal transit - time in mice // Z. Versuchstierk. 1977. Vol.19, No.5. P.298-303). Для этого через 1 час после последнего введения препаратов мышам в качестве «метки» в пищеварительный тракт вводили 10% взвесь активированного угля, приготовленную на 2% слизи картофельного крахмала, в количестве 0,5 мл/одну мышь. Через 10 мин после введения «метки» у мышей извлекали кишечник, растягивали на стеклянной пластине, измеряли общую длину кишечника и заполненную углем (отношение длины заполненной активированным углем части кишечника к общей длине выражали в процентах).
Установлено, что предварительное курсовое введение здоровым мышам-самцам препарата AT SI00+AT ФНО-α + AT Гис в дозе 15 мл/кг приводило к статистически значимому увеличению длины пробега активированного угля по кишечнику в 1,3 и 1,2 раза относительно соответствующих значений групп AT Гис и дистиллированной воды (контроля) (Таблица 1). При этом в данной группе отношение длины заполненной углем части к общей длине кишечника также превышало аналогичные показатели в группе AT Гис (Р<0,05) и контрольной группы (Р<0,05).
Таблица 1.
Влияние тестируемых препаратов на моторно-эвакуаторную активность кишечника аутбредных мышей-самцов при проведении исследования с помощью «угольных меток»
Экспериментальная группа (количество животных)
Длина заполненной углем части кишечника на 1 мышь (M±m), см
Длина заполненной углем части к общей длине кишечника (M±m), %
Дист. вода (n=10)
25,4±1,49
44,1±2,77
AT Гис (n=11)
24,1±1,92
44,9±3,65
AT S100 + AT ФНО-α + АТ Гис (n=10)
31,1±2,09*#
54,4±3,24*#
* - отличия достоверны относительно группы контроля (р<0,05)
# - отличия достоверны относительно группы AT Гис (р<0,05)
Таким образом, показано, что комплексный препарат AT S100 + AT ФНО-α + AT Гис усиливает моторно-эвакуаторную активность кишечника мышей, то есть обладает умеренным тоногенным действием, превосходящим по эффективности AT Гис.
Пример 2.
В исследовании влияния заявленного комплексного лекарственного средства на выделительную функцию кишечника мышей было использовано 33 аутбредных мышей-самцов (масса 17,5-26,3 г, возраст 1,5-2 мес), которым внутрижелудочно однократно вводили дистиллированную воду (контроль, 15 мл/кг), AT Гис (15 мл/кг) или AT S100 + AT ФНО-α + AT Гис (15 мл/кг). Состояние выделительной функции кишечника изучали по методу Г.В. Оболенцевой (Оболенцева Г.В., Хаджай Я.И. Фармакологическое исследование плантаглюцида // Фармакология и токсикология. - 1996. - №4. - С.469-472). Для этого препараты вводили вместе с активированным углем в дозе 10 мг/кг. Положительным результатом считали появление фекалий, окрашенных углем в черный цвет. Замеры результатов проводились через 3, 6, 24 ч от начала эксперимента. Степень проявления эффекта для каждого животного определяли в баллах: «+» - появление оформленного окрашенного кала; «++» - появление мягкого окрашенного кала; «+++» - появление жидкого окрашенного кала. Слабительную активность препаратов оценивали суммой баллов в группе и по проценту животных с положительной реакцией. Влияние тестируемых препаратов на выделительную функцию кишечника у аутбредных мышей-самцов приведено в Таблице 2.
Таблица 2.
Влияние тестируемых препаратов на выделительную функцию кишечника у аутбредных мышей-самцов
Группа наблюдения (количество животных)
Величина эффекта (балл/% животных с реакцией)
3 ч
6 ч
24 ч
Четырехкратное введение препаратов
Контроль (n=11)
22/100
18/100
7/55
AT Гис (n=11)
18/100
18/100
6/55
AT S100 + AT ФНО-α + AT Гис (n=11)
25/100
24/100
6/55
Некоторое усиление перистальтики наступало уже в первые 3 ч после введения AT S100 + AT ФНО-α + AT Гис: 25 баллов vs 18 баллов в группе AT Гис и 22 баллов в группе контроля (Табл. 3). Эффект сохранялся в группе AT S100 + AT ФНО-α + AT Гис через 6 ч наблюдения: 24 vs 18 баллов в группах AT Гис и контроля. Через 24 ч отмечалось снижение выделительной активности во всех трех опытных группах вплоть до прекращения дефекации у 45% животных.
Таким образом, показано, что комплексный препарат AT S100 + AT ФНО-α + AT Гис обладает умеренным слабительным действием, превосходящим по эффективности AT Гис.
Пример 3.
В исследовании спазмолитической активности заявленного комплексного лекарственного средства было использовано 30 аутбредных мышей-самцов (масса 17,5-26,3 г, возраст 1,5-2 мес), которым внутрижелудочно в течение 5 дней вводили дистиллированную воду (контроль, 15 мл/кг), AT Гис (15 мл/кг) или AT S100 + AT ФНО-α + AT Гис (15 мл/кг). Спазмолитическую активность препаратов оценивали по методу J. Setnicar (Setnicar J., Da Re P. 3-methyl-6(N-diethyl-amino-methyl)-Flavone - a new smooth-muscle relaxant // Arzneimittel - Forsch. 1959. No.9. P.653-697).
2
Через 1 час после последнего введения препаратов мышам вводили внутрибрюшинно 0,2 мл 0,1% раствора BaCl и внутрижелудочно 0,5 мл 10% взвеси активированного угля, приготовленного на 2% слизи картофельного крахмала. Через 10 минут животных умерщвляли и определяли соотношение между общей длиной кишечника и заполненной углем. Соотношение выражали в процентах и учитывали как первичный результат опыта.
2
В группе мышей, получавшей препарат AT S100 + AT ФНО + AT Гис, отмечалась максимальная дистанция продвижения угля по кишечнику мышей: длина заполненной улем части оказалась в 1,3 раза больше относительно аналогичных показателей группы AT Гис и контроля (Таблица 3). То есть спазм ЖКТ, вызванный введением BaCl и приводящий к снижению скорости продвижения активированного угля по кишечнику, менее всего был выражен в группе AT S100 + AT ФНО-α + AT Гис.
Таблица 3.
Оценка спазмолитического действия тестируемых препаратов методом «угольных меток» (с BaCl<sub>2</sub>)
Группа наблюдения (количество животных)
Длина заполненной углем части кишечника на 1 мышь (М±m), см
Длина заполненной углем части к общей длине кишечника (М±m), %
Контроль (n=10)
23,3±2,20
42,4±3,49
АТ Гис (n=10)
22,3±2,09
40,1±3,81
AT S100 + AT ФНО-α + АТ Гис (n=10)
30,0±2,42*#
56,4±4,50*#
* - отличия достоверны относительно группы контроля (р<0,05)
# - отличия достоверны относительно группы AT Гис (р<0,05)
Таким образом, показано, что комплексный препарат AT S100 + AT ФНО-α + AT Гис обладает умеренным спазмолитическим действием, превосходящим по эффективности AT Гис.
Пример 4.
12
30
200
12
30
200
При исследовании свойств заявленного лекарственного средства для лечения пациентов группы активного препарата были использованы таблетки массой 300 мг, пропитанные фармацевтической композицией, содержащей водно-спиртовые растворы (6 мг/табл.) активированных - потенцированных форм поликлональных аффинно очищенных кроличьих антител к человеческому фактору некроза опухоли-альфа (AT ФНО-α), мозгоспецифическому белку S-100 (AT S100) и гистамину (AT Гис) в сверхмалых дозах (СМД), полученных сверхразведением исходного матричного раствора концентрации 2,5 мг/мл в 100, 100, 100 раз, эквивалентных смеси сотенных гомеопатических разведений С12, С30, С200. Для лечения пациентов группы сравнения были использованы таблетки массой 300 мг, пропитанные водно-спиртовым раствором (3 мг/табл.) активированной - потенцированной формы поликлональных кроличьих антител к гистамину, очищенных на антигене, в сверхмалой дозе (СМД AT Гис), полученной сверхразведением исходного матричного раствора концентрации 2,5 мг/мл в 100, 100, 100 раз, эквивалентной смеси сотенных гомеопатических разведений С12, С30, С200 (препарат сравнения).
В сравнительном исследовании оценки эффективности композиции СМД AT ФНО-α + AT S100 + AT Гис и монокомпонентного препарата AT Гис в лечении больных с синдромом раздраженного кишечника (СРК) приняли участие 52 пациента с верифицированным в соответствии с Римскими критериями III (2006) диагнозом, которые проходили амбулаторный курс наблюдения и терапии в течение 12 недель. 24 участника исследования были включены в группу активного препарата (СМД AT ФНО-α + AT S100 + AT Гис по 2 таблетки 2 раза в день), 28 - в группу препарата сравнения (СМД AT Гис по 2 таблетки 2 раза в день). Обе группы пациентов были сопоставимы по исходным демографическим, антропометрическим и клинико-лабораторным показателям. 18 больных имели СРК с запорами (твердый или комковатый стул составлял более 25%, а жидкий стул - менее 25% всех опорожнений кишечника), 14 - СРК с диареей (кашицеобразный или жидкий стул составлял более 25%, а твердый стул - менее 25% всех опорожнений кишечника) и 20 - смешанный вариант СРК (соответственно и твердый, комковатый стул, и жидкий стул составляли более 25% всех опорожнений кишечника). В качестве критериев эффективности терапии учитывали снижение интенсивности боли/дискомфорта (среднее значение за неделю, колебания от 0 до 10 баллов) по сравнению с исходным состоянием, а также динамику других диспепсических симптомов по шкале VAS-IBS (Visual Analogue Scale Irritable Bowel Syndrome (VAS-IBS): Guidance for Industry Irritable Bowel Syndrome - Clinical Evaluation of Products for Treatment. U.S. Department of Health and Human Services; Food and Drug Administration; Center for Drug Evaluation and Research (CDER). - March 2010; Muller-Lissner, S, G Koch, NJ Talley et al., 2004, Subject′s Global Assessment of Relief: An Appropriate Method to Assess the Impact of Treatment on IBS-Related Symptoms in Clinical Trials, J Clin Epidemiol, 56:310-316; CPMP/EWP/785/97, 2003, Points to Consider on the Evaluation of Medicinal Products for 483 the Treatment of Irritable Bowel Syndrome, London, Available at: 484 http://www.emea.europa.eu/pdfs/human/ewp/078597en.pdf.); изменение индекса висцеральной чувствительности (наихудший - 15, наилучший - 90) по шкале VSI (Visceral Sensitivity Index (VSI): Labus S. Jennifer et al. The Central Role of Gastrointestinal-Specific Anxiety in Irritable Bowel Syndrome: Further Validation of the Visceral Sensitivity Index Psychosomatic Medicine, 2007; 69:89-98) и результатов оценки по шкале HADS (Hospital Anxiety And Depression Scale (HADS): Snaith R. Philip. The Hospital Anxiety And Depression Scale. Health and Quality of Life Outcomes 2003, 1:1-4. http://www.hqlo.eom/content/l/l/29); у пациентов с СРК с преобладанием диареи подсчитывали долю пациентов с изменением типа стула по Бристольской шкале формы стула (Guidance for Industry Irritable Bowel Syndrome - Clinical Evaluation of Products for Treatment. U.S. Department of Health and Human Services; Food and Drug Administration; Center for Drug Evaluation and Research (CDER). - March 2010.) до 5 и менее (но не ниже <2 в среднем за неделю); у пациентов в подгруппе СРК с преобладанием запоров - процент пациентов с увеличением числа актов дефекации в среднем на 1 раз в неделю по сравнению с исходным.
В клинической картине заболевания в обеих группах превалировал болевой абдоминальный синдром (средний балл 7,56±0,26 - в группе активного препарата и 7,21±0,24 - в группе сравнения по VAS-IBS) (Таблица 4), встречавшийся у 100% больных при первоначальном обследовании. Среди диспепсических проявлений одинаково часто регистрировались диарея (у 54% пациентов группы активного препарата и у 57% больных группы сравнения) и запоры (62% и 57% соответственно), вздутие живота и метеоризм (у 46% и 36% соответственно), выраженность которых была примерно одинаковой в двух группах (Таблица 4). Реже встречались тошнота и рвота (30% и 32% соответственно). Средние значения индекса висцеральной чувствительности (VSI) и показателя шкалы HADS не имели различий в обеих группах (Таблица 4), указывая на значимое влияние нарушений со стороны центральной нервной системы в развитии СРК. Помимо исследуемой терапии пациентам обеих групп разрешался прием слабительного средства Гутталакс и противодиарейного средства Смекта для купирования запоров или диареи соответственно, а также препарата Но-шпа для уменьшения выраженности спастических болей в животе. Данные препараты принимались пациентами по необходимости. Все пациенты исследуемых групп завершили лечение в сроки, установленные протоколом исследования, досрочно выбывших пациентов не было.
Таблица 4.
Динамика основных показателей в зависимости от вида терапии
Период
AT ФНО-а+AT S100+AT Гис (n=24; M±SE)
AT Гис (n=28; M±SE)
VAS-IBS: боль/дискомфорт, баллы
Исходно
7,56±0,26
7,21±0,24
12 нед
3,32±0,13* **
5,64±0,24 **
VAS-IBS: диарея, баллы
Исходно
5,52±0,18
5,73±0,34
12 нед
3,34±0,22*
4,86±0,22
VAS-IBS: запор, баллы
Исходно
5,79±0,26
4,98±0,34
12 нед
4,41±0,33**
4,25±0,26
VAS-IBS: вздутие живота и метеоризм, баллы
Исходно
4,98±0,34
4,57±0,31
12 нед
3,84±0,24**
4,04±0,31
VAS-IBS: рвота и тошнота, баллы
Исходно
3,94±0,31
3,56±0,24
12 нед
2,87±0,12*
3,03±0,27
Индекс висцеральной чувствительности (VSI-IBS), баллы
Исходно
22,3±1,6
25,4±1,8
12 нед
68,7±2,4***
33,9±1,7
Госпитальная шкала тревоги и депрессии HADS, баллы
Исходно
19,3±1,4
18,9±1,5
12 нед
12,8±0,6***
14,4±1,3
Примечание. * достоверность различий групп AT ФНО-α + АТ S100 + AT Гис и AT Гис, р<0,05; ** достоверность различий с исходным показателем, р<0,05.
При анализе эффективности выявлено, что в течение 12-недельной терапии выраженность основного клинического проявления СРК - болевого абдоминального синдрома - у пациентов группы приема композиции СМД AT ФНО-α + AT S100 + AT Гис снизилась в среднем более чем на 50% по сравнению с исходным состоянием (до 3,32±0,13 баллов). Данное снижение имело значимые отличия и при сравнении с результатами лечения препаратом сравнения (СМД AT Гис), который также способствовал уменьшению выраженности боли/дискомфорта, однако это уменьшение было менее существенным (менее чем на 30%).
Прием композиции СМД AT ФНО-α + AT S100 + AT Гис положительно влиял на другие диспепсические расстройства у больных, включая диарею (снижение исходных 5,52±0,18 баллов до 3,34±0,22 баллов к окончанию терапии), запор (5,79±0,26 и 4,41±0,33 баллов соответственно), вздутие живота и метеоризм (4,98±0,34 и 3,84±0,24 баллов соответственно), причем эффективность в отношении двух последних симптомов имела значимые отличия при сравнении как с исходным состоянием, так и с эффективностью терапией монокомпонентным препаратом СМД AT Гис.
В подгруппе пациентов с СРК с преобладанием диареи (n=14) доля пациентов с изменением типа стула по Бристольской шкале формы стула до 5 и менее в результате 12-недельного курса терапии композицией СМД AT ФНО-α + AT S100+AT Гис составила 57%; в подгруппе СРК с преобладанием запоров (n=18) процент пациентов с увеличением числа актов дефекации в среднем на 1 раз в неделю достиг 94%; среди пациентов со смешанным вариантом СРК (n=20) аналогичные показатели составили 45% и 75% соответственно. Среди пациентов группы сравнения изучаемые показатели не имели значимой динамики.
Эффективность лечения композицией СМД AT ФНО-α + AT S100 + AT Гис проявлялась в положительном влиянии на висцеральную гиперчувствительность, которая значимо снизилась через 12-недель приема комбинированного препарата, в результате чего индекс VSI возрос с 22,3±1,6 до 68,7±2,4 (против 25,4±1,8 и 33,9±1,7 соответственно в группе препарата сравнения). Позитивные сдвиги под воздействием композиции СМД AT ФНО-α + AT S100 + AT Гис проявлялись также в уменьшении суммарного балла по шкале HADS (с 19,3±1,4 до 12,8±0,6), что свидетельствовало о купировании исходно имевшей место субклинически выраженной тревоги и депрессии.
Оценка безопасности терапии, которую проводили на основании регистрации нежелательных явлений в период лечения и повторного исследования лабораторных показателей, свидетельствовала о хорошей переносимости препаратов. В анализ безопасности были включены данные всех пациентов, участвовавших в исследовании (n=52). В течение 12-недельного курса лечения ни у одного пациента из обеих групп не было выявлено ни одного нежелательного явления, имеющего «возможную» либо «очевидную» связь с приемом лекарственного средства. Лабораторные исследования, включая общий и биохимический анализы крови, клинический анализ мочи, также не зафиксировали каких-либо патологических отклонений в ходе терапии.
Таким образом, исследование продемонстрировало эффективность и безопасность композиции СМД AT ФНО-α + AT S100 + AT Гис в лечении пациентов с СРК. Показано, что 12-недельный прием композиции СМД AT ФНО-α + AT S100 + AT Гис способствовал купированию болевого абдоминального синдрома, а также значимому уменьшению выраженности диспепсических проявлений у больных с СРК. Эффект лечения подтверждался высоким процентом пациентов, улучшивших показатели опорожнения кишечника. Помимо положительной динамики основных симптомов со стороны желудочно-кишечного тракта, отмечалась закономерная нормализация соматического и психического состояния больного, что выражалось в позитивных изменениях висцеральной чувствительности и нивелировании симптомов тревоги и депрессии. Все отмеченные эффекты терапии композицией СМД AT ФНО-α + AT S100 + AT Гис имели значимые различия по сравнению с исходным состоянием и результатами лечения СМД AT Гис. Профиль безопасности был одинаково высоким у обоих препаратов. И композиция СМД AT ФНО-α + AT S100 + AT Гис, и монокомпонентный препарат СМД AT Гис не приводили к появлению нежелательных явлений либо патологических отклонений лабораторных показателей, связанных с приемом исследуемых лекарственных средств.