СПОСОБ ПОДАВЛЕНИЯ ОПУХОЛЕВОГО РОСТА
METHOD FOR TUMOUR GROWTH INHIBITION

Изобретение относится к медицине, более конкретно к онкологии, а именно к подавлению роста злокачественных опухолей.
В настоящее время по данным ВОЗ рак является одной из основных причин смерти в большинстве районов мира, включая и развитые страны, где он стоит на втором месте после сердечно-сосудистых заболеваний и составляет 15-20% от общего ежегодного числа смертельных случаев. Химиотерапия является одним из важнейших методов лечения, в арсенал которой входит более 40 фармакологических препаратов, обладающих цитотоксическими свойствами и направленных на подавление роста опухолевых клеток.
Широко известны способы с применением цитостатиков разного механизма действия, например цис-дихлордиаминоплатины и других платиновых комплексов. Обладая широким спектром действия, эти лекарственные средства используется для лечения солидных опухолей различной локализации [Cancer Treat Rep. 1982 Jan; 66(1): 135-46; Вопросы онкологии, 1989, 35,3, с.325-330]. Основным недостатком цитостатиков является недостаточная избирательность противоопухолевого действия, что проявляется как побочное действие на клетки желудочно-кишечного тракта, кроветворение, нефротоксичность [Вопросы онкологии, 1975, 21, 8, с.95-105].
3
2-3
В настоящее время получила распространение фотодинамическая терапия опухолей, в которой используются фотосенсибилизаторы - свободные тетрапиррольные макроциклические лиганды или их комплексы с металлами, например алюминиевый комплекс сульфированного фталоцианина Al[Рс(SOH)]. Применение этого способа возможно только в случае опухолей поверхностной локализации, точнее - доступных для лазерного световода [Итоги науки и техники. М.; ВИНИТИ, 1990, 3, с.5-6].
Наиболее близок к предлагаемому изобретению способ с применением бинарной каталитической системы (БКС), содержащей октакарбоксифталоцианин кобальта (терафтал, ТФ) и биогенный восстановитель (аскорбиновую кислоту, АК), в соотношении концентраций компонентов 1:10. Применение этого способа позволяет подавить пролиферацию опухолевых клеток in vitro и тормозить рост широкого круга перевиваемых опухолей у мышей: солидных опухолей (меланомы В 16, аденокарциномы молочной железы Са-755) и асцитных опухолей (карциномы Эрлиха, асцитной гепатомы 22), [Рос. хим. журнал. - 1998. - Т.XLII, №5. - с.140-146..].
В ходе клинических испытаний установлена способность каталитической системы «терафтал+аскорбиновая кислота» вызывать стабилизацию процесса у больных с исчерпанными возможностями специфической терапии при таких резистентных к воздействию цитостатиков злокачественных опухолях как рак почки, рак коры надпочечников, злокачественный карциноид и ряде других. Положительный лечебный эффект (стабилизация процесса, минимальная регрессия опухоли) отмечены у 25 больных из 95 (26,3%). [РБЖ. - 2005. - №1, т.4. - с.105-107].
Эти данные свидетельствуют о недостаточном лечебном эффекте БКС, что заставляет искать дополнительные способы повышения ее эффективности.
Задачей изобретения является изыскание более эффективного способа с применением указанной БКС для подавления опухолевого роста.
Для решения поставленной задачи предлагается использовать способ подавления роста опухоли с использованием бинарной каталитической системы терафтал и аскорбиновая кислота, причем до введения БКС внутривенно вводят 3-амино-1,2,4 триазол (3-АТ) в нетоксической дозе.
Испытания заявляемого способа подавления опухолевого роста на цитотоксическую и противоопухолевую активность были проведены на культурах опухолевых клеток (in vitro) и на мышах с перевиваемыми опухолями (in vivo).
Определение активности препаратов на культурах опухолевых клеток (in vitro).
Методика 1. Определение цитостатической активности комбинации БКС (ТФ+АК) в условиях преинкубации с 3-АТ проводили с использованием биотеста, основанного на ингибировании пролиферации лейкозных клеток человека 2-х линий (линия U937 и К562), обусловленного воздействием цитотоксических агентов.
Для культивирования лейкозных клеток использовали среду RPMI 1640, содержащую 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 100 мкг/мл гентамицина и 20 мкМ глютамина. Культивирование клеток проводили в стандартных условиях: при 37°С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% двуокиси углерода.
4
При постановке цитостатического биотеста в лунки плоскодонного 96-ти луночного микропланшета ("Costar", США) вносили по 200 мкл суспензии клеток (концентрация) 2·10 клеток/лунку/200 мкл с добавлением к началу фазы логарифмического роста тестируемых препаратов в объеме 20 мкл/лунку.
Цитостатическую активность тестируемых препаратов оценивали колориметрическим методом, основанным на способности митохондриальных дегидрогеназ живых тест-клеток восстанавливать экзогенно вносимый растворимый бромид 3-(4,5-диметил-2-тиазолил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолия (МТТ, "Sigma Chemical Co", США) в нерастворимый кристаллический формазан. При этом в каждую лунку 96-ти луночного микропланшета вносили по 20 мкл раствора МТТ в концентрации 5 мг/мл, после чего центрифугировали клеточные культуры, удаляли из лунок весь объем культуральной среды. Для солюбилизации окрашенных продуктов реакции (кристаллов формазана) в каждую лунку микропланшета вносили по 60 мкл диметилсульфоксида ("Sigma") и инкубировали микропланшеты при комнатной температуре и непрерывном встряхивании. Результаты учитывали по поглощению при длине волны 530 нм на миниридере «Uniplan» (Россия)
Уровни ингибирования пролиферации клеточных культур препаратами, тестируемыми на цитостатическую активность, вычисляли по формуле
<mrow><mi>И</mi><msub><mi>П</mi><mrow><mrow><mo>(</mo><mi>%</mi><mo>)</mo></mrow></mrow></msub><mo>=</mo><mn>100</mn><mi>%</mi><mo>−</mo><mfrac><mrow><msub><mi>П</mi><mi>о</mi></msub></mrow><mrow><msub><mi>П</mi><mi>к</mi></msub></mrow></mfrac><mo>×</mo><mn>100</mn><mi>%</mi></mrow>
где ИП - уровень ингибирования пролиферации,
о
П - уровень пролиферации в опыте (с препаратами); поглощение красителя в опытных образцах;
к
П - уровень пролиферации в контроле (без препаратов); поглощение красителя в опытных образцах.
Количественным критерием эффективности препаратов in vitro служит показатель IC50, соответствующий концентрации препаратов, при которой достигается 50% выживаемость клеток.
Статистическую обработку результатов проводили методом проб анализа.
В табл.1 представлены данные, полученные при исследовании ингибирования пролиферации in vitro опухолевых клеток в присутствии комбинации ТФ+АК с 3-АТ.
Таблица 1
Ингибирование пролиферации опухолевых клеток in vitro в присутствии комбинации ТФ+АК после преинкубации с 3-АТ в течение 1 часа
Линии клеток
IC50 БКС, мкМ
БКС
БКС+(3-АТ)
U937
33±0.7
15±1.3
К562
25±0.5
12±08
Методика №2.
Определение влияния 3-АТ на противоопухолевый эффект БКС (ТФ+АК) выполнялось на мышах с перевиваемыми опухолями (in vivo).
Испытания были проведены на подкожно трансплантированной меланоме В16 (пример). Лекарственную форму терафтал-ЛИО растворяли в стерильном физиологическом растворе до получения 0,2% концентрации. 5% аптечный раствор аскорбата натрия растворяли в стерильной дистиллированной воде или изотоническом растворе натрия хлорида до концентрации 2,2%. Субстанцию 3-АТ сухой рассыпки во флаконах (Sigma) растворяли в стерильном физиологическом растворе до получения 5% концентрации. Путь введения - внутривенный.
Торможение роста опухоли (солидной) рассчитывали по формуле:
<mrow><mi>T</mi><mi>P</mi><mi>O</mi><mo>=</mo><mfrac><mrow><msub><mi>V</mi><mrow><mi>с</mi><mi>р</mi><mo>.</mo><mi>к</mi><mi>о</mi><mi>н</mi><mi>т</mi><mi>р</mi><mi>о</mi><mi>л</mi><mi>я</mi></mrow></msub><mo>−</mo><msub><mi>V</mi><mrow><mi>с</mi><mi>р</mi><mo>.</mo><mi>о</mi><mi>п</mi><mi>ы</mi><mi>т</mi><mi>а</mi></mrow></msub></mrow><mrow><msub><mi>V</mi><mrow><mi>с</mi><mi>р</mi><mo>.</mo><mi>к</mi><mi>о</mi><mi>н</mi><mi>т</mi><mi>р</mi><mi>о</mi><mi>л</mi><mi>я</mi></mrow></msub></mrow></mfrac><mo>×</mo><mn>100</mn><mi>%</mi></mrow>
cp
3
где V - средний объем опухоли (контроль и опыт), рассчитанный как произведение трех измерений и выраженный в мм.
Результаты, полученные на мышах с опухолями, оценивают с помощью общепринятых показателей противоопухолевой активности при наличии в качестве контроля мышей, не получавших противоопухолевой терапии [Трещалина Е.М., и др. В кн.: Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / под общей ред. Член-корр. РАМН проф. Р.У. Хабриева. - 2 изд., перераб. и доп. - М.: ОАО изд. «Медицина», 2005 г. стр.637-651]..
Пример. Опухоль, меланому В 16, прививали мышам подкожно (п/к). Прививочная доза 50 мг взвеси опухолевой ткани в 0,5 мл питательной среды 199 на мышь. Использованы мыши-самки. Вес мыши - не менее 18 г. Начало лечения - через 72 ч после прививки опухоли.
3
3
3
У мышей контрольной группы без лечения на 8, 11 и 14 сутки после трансплантации средний объем опухоли составлял 470±146 мм, 2735±640 мм и 5308±1332 мм.
3
3
3
В группе мышей, получивших лечение ТФ в разовой дозе 40 мг/кг и через 1 час АК в разовой дозе 88 мг/кг на 5, 8 и 11 сутки после лечения средний объем опухоли составлял 223±141 мм, 2097±813 мм и 4992±2003 мм, соответственно.
По отношению к группе контроля в группе ТФ+АК торможение роста опухоли не достигло достоверных отличий и составило, соответственно 53%, 23% и 6%. Гибели от токсичности не наблюдали.
3
3
3
В группе мышей, получивших предварительно за 2 часа до начала применения БКС 3-АТ в дозе 1000 мг/кг, на 5, 8 и 11 сутки после лечения средний объем опухоли составлял, соответственно 147±78 мм, 1323±661 мм и 3347±1207 мм.
По отношению к группе контроля в группе 3-АТ+ТФ+АК торможение роста опухоли достигло достоверного отличия на 5 сутки после лечения и составило 69%, оставаясь в течение 11 суток на значимом уровне 52 и 37%.
По отношению к группе ТФ+АК торможение роста опухоли было увеличено в 1,3-2,4-6,0 раз соответственно срокам регистрации эффекта.
Гибели от токсичности не наблюдали.
Таблица 2
Динамика роста п/к меланомы В16 и эффективность воздействия при сочетании 3-АТ и ТФ+АК
Группа
Доза
Средний объем опухоли (мм<sup>3</sup>) с доверительным интервалом
ТРО% на сутки после лечения
8
11
14
5
8
11
Контроль роста опухоли (физ.р-р)
0,2 мл/мышь
470 [324÷616]
2735 [2095÷3375]
5308 [3976÷6640]
-
-
-
ТФ+АК
40+88 мг/кг
223 [82÷364]
2097 [1284÷2910]
4992 [2989÷6995]
53
23
6
3-АТ+2ч+[ТФ+АК]
1000+[40+88] мг/кг
147 [69÷225]
1323 [662÷1984]
3347 [2140÷4554]
69*
52
37
Примечание: *отличие от контроля достоверно, р<0,05.
Таким образом, использование предлагаемого способа позволяет усилить эффективность подавления роста относительно малочувствительного к действию каталитической системы ТФ+АК злокачественного новообразования, а именно: добиться подавления пролиферации раковых клеток (in vitro) и увеличения торможения роста опухолей у мышей в 1,3-6,0 раз по сравнению с прототипом в зависимости от сроков регистрации эффекта.