Штамм бактерий Bacillus atrophaeus B-13893 для получения биопрепарата против возбудителей грибных болезней сои
BACTERIAL STRAIN BACILLUS ATROPHAEUS B-13893 FOR THE PREPARATION OF A BIOLOGICAL DRUG AGAINST PATHOGENS OF FUNGAL DISEASES OF SOY

Изобретение относится к биотехнологии и сельскохозяйственной микробиологии, в частности к штамму Bacillus atrophaeus В-13893, обладающему выраженными фунгицидными и ростостимулирующими свойствами, который может быть использован для получения средств защиты сои от заболеваний, вызываемых фитопатогенными грибами и грибоподобными протистами, стимуляции роста и повышения урожайности сои.
Известен штамм Bacillus atrophaeus SKD-1 (см. ст. Коряжкина М.Ф. Использование культуры Bacillus atrophaeus SKD-1 для разработки биопрепарата с фунгицидными свойствами. // Первые Международные Беккеровские чтения. Сборник научных трудов по материалам конференции 27-29 мая, Волгоград, 2009 г., в 2-х частях, Ч. 2. С. 121-123; Коряжкина М.Ф. Bacillus atrophaeus SKD-1 как перспективный штамм для разработки биопрепарата // Юг России: экология, развитие. №4. 2010. С. 80-82), выделенный из аллювиально-луговой почвы Астраханской области. Недостатком этого штамма является отсутствие доказанной эффективности в полевых условиях. Вегетационные испытания штамма Bacillus atrophaeus SKD-1 проводились в вегетационных сосудах с грунтом в течение ограниченного времени (37 суток), а не в открытом грунте, что не позволяет сделать вывод о влиянии штамма на заболеваемость и урожайность сельскохозяйственных культур в полевых условиях.
Наиболее близким к предлагаемому штамму, взятым за прототип, является штамм Bacillus atrophaeus ВКПМ-11474 (см. патент RU 2570624 C2, 2015). Штамм Bacillus atrophaeus ВКПМ В-11474 выделен из городских почв (культуроземов) Астраханской области путем многоступенчатого отбора по следующим признакам: широкий спектр высокой фунгицидной активности к фитопатогенным грибам; высокая ростстимулирующая активность; отсутствие токсического действия на биологические объекты. Штамм Bacillus atrophaeus ВКПМ-11474, а также его препаративная форма в виде 48-часовой жидкой культуры на бобовом отваре (см. патент RU 2655848 C1, 2018) обладает фунгицидной активностью в отношении фитопатогенных грибов, относящихся к родам Alternaria, Fusarium, Cladosporium, Bipolaris, Cochliobolus, Phytium, Phoma. Недостатками штамма Bacillus atrophaeus ВКПМ-11474 являются:
1. Отсутствие доказанной эффективности в отношении возбудителей грибных болезней сои, а также доказанной эффективности в повышении урожайности сои в полевых условиях. Полевые опыты по применению штамма Bacillus atrophaeus ВКПМ-11474 проводились на томатах (см. патент RU 2570624 C2, 2015) и на картофеле (см. патент RU 2655848 C1, 2018).
2. Необходимость неоднократной обработки растений суспензией клеток штамма в течение вегетации.
Технической задачей заявляемого изобретения является выделение штамма, при однократной обработке семенного материала обеспечивающего прибавку урожая сои за счет снижения интенсивности развития грибных болезней, и не оказывающего негативного влияния на нодуляцию.
7
Технический результат - прибавка урожая сои за счет снижения интенсивности развития грибных болезней с помощью заявляемого штамма при однократной обработке семенного материала суспензией спор штамма с титром 10 на 1 мл из расчета 10 л суспензии на 1 т семян.
Он достигается тем, что заявляемый штамм Bacillus atrophaeus В-13893 предлагается в качестве средства для защиты сои от фитопатогенных грибов и грибоподобных протистов. Новый штамм выделен из почвы учебно-научного комплекса (УНПК) «Борский» ФГБОУ ВО Красноярский ГАУ (Сухобузимский район Красноярского края, тип почвы - комплекс черноземов выщелоченных мало-, среднемощных тяжелосуглинистого гранулометрического состава) и депонирован в Национальном биоресурсном центре - Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов, г. Москва, под регистрационным номером В-13893. Идентифицирование штамма проводилось с использованием молекулярно-генетических методов по последовательности нуклеотидов в 16S рРНК.
Штамм характеризуется следующими морфолого-культуральными и физиолого-биохимическими признаками. Спорообразующие
грамположительные аэробные палочки; при выращивании на жидкой среде -подвижные; молодые клетки - до 24 мкм длиной, клетки в зрелой культуре - 4,2-9,6×1,1-1,3 мкм; спора - овальная, 1,5-2,4×0,7-1,3 мкм, расположение в клетке - центральное или субтерминальное; прорастание споры - латеральное. На среде №2 ГРМ (Сабуро) производства ФБУН ГНЦ ПМБ в разведении 1:1 формируются плоские колонии бежевого цвета диаметром до 40 мм со слабоморщинистой поверхностью и ризоидным краем. На среде с пептоном (20 г/л) производства ФБУН ГНЦ ПМБ формируются выпуклые колонии черного цвета диаметром 10-11 мм со складчатой поверхностью и фестончатым краем. На среде Чапека-Докса колонии выпуклые, бесцветные с розовым центром, диаметром 11-12 мм, со складчатой поверхностью и ровным краем. При выращивании на среде Чапека-Докса спорообразование нарушено. Оптимальная температура культивирования +26…+29°С.
Чистая культура штамма Bacillus atrophaeus В-13893 хранится в пробирках на агаризованной среде №2 ГРМ (Сабуро) производства ФБУН ГНЦ ПМБ в разведении 1:1 либо на агаризованной среде с 20 г/л пептона при температуре +4…+10°С с пересевами 1 раз в 12 месяцев. Содержание агара - 15-20 г/л.
Пример 1. Изучение антифунгальной активности заявляемого штамма Bacillus atrophaeus В-13893.
Проверку антифунгальной активности in vitro штамма Bacillus atrophaeus В-13893 проводили методом совместного культивирования по наличию и размеру зоны подавления роста тест-культуры (см. ст. Qi D, Zou L, Zhou D, Chen Y, Gao Z, Feng R, Zhang M, Li K, Xie J and Wang W (2019) Taxonomy and Broad-Spectrum Antifungal Activity of Streptomyces sp. SCA3-4 Isolated From Rhizosphere Soil of Opuntia stricta. Front. Microbiol. 10:1390. doi: 10.3389/fmicb.2019.01390). Установлено, что штамм Bacillus atrophaeus В-13893 обладает антифунгальной активностью в отношении фитопатогенных грибов, а также грибов, вызывающих плесневение семян, из родов Rhizopus, Aspergillus, Penicillium, Cladosporium, Fusarium, Alternaria, Bipolaris, Acremonium, Rhizoctonia, Pythium (таблица 1).
Вышеприведенные данные свидетельствуют о широком спектре антифунгальной активности заявляемого штамма Bacillus atrophaeus В-13893.
Пример 2. Изучение лабораторной эффективности заявляемого штамма Bacillus atrophaeus В-13893 в защите сои от фузариоза в сравнении с химическим протравителем.
Лабораторную эффективность Bacillus atrophaeus В-13893 в подавлении развития фузариоза в сравнении с химическим протравителем изучали методом рулонных культур на сое сорта Заряница (скороспелый сорт, оригинаторы - ФГБНУ Омский аграрный научный центр, ФГБОУ ВО Красноярский ГАУ; регион допуска - Восточно-Сибирский). В эксперименте использовали семена, полученные в УНПК «Борский» и характеризующиеся высоким (свыше 60%) уровнем естественной зараженности фузариозом. Схема эксперимента включала следующие варианты: 1) семена без обработки; 2) обработка штаммом Bacillus atrophaeus В-13893; 3) обработка химическим протравителем; 4) искусственное заражение возбудителями фузариоза; 5) искусственное заражение возбудителями фузариоза + обработка штаммом Bacillus atrophaeus В-13893; 6) искусственное заражение возбудителями фузариоза + обработка химическим протравителем. В каждом варианте было 4 повторности, по 50 семян в повторности. В качестве химического протравителя использовали препарат "Оплот" (действующие вещества: дифеноконазол - 90 г/л, тебуконазол - 45 г/л) производства АО Фирма "Август", рекомендованный для защиты сои от комплекса грибных болезней (см. "Государственный каталог пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории Российской Федерации", 2018 год, Министерство сельского хозяйства Российской Федерации (Минсельхоз России), с. 205), обработку семян проводили в соответствии с инструкцией производителя.
8
6
Бактеризацию проводили водной суспензией спор Bacillus atrophaeus В-13893 с титром 10 спор на мл, полученной смывом с колоний, выращенных на агаризованной среде, из расчета 1 мл суспензии на 100 г семян, что соответствует стандартному расходу 10 л на тонну при обработке семян в полевых условиях. Искусственное заражение проводили суспензией конидий, полученной смывом с 10-суточных колоний четырех морфологически различающихся изолятов Fusarium sp., выделенных из пораженных фузариозом растений сои, титр 10 конидий на мл.
Учет распространенности фузариоза проводили в соответствии с Межгосударственным стандартом ГОСТ 12044-93 "Семена сельскохозяйственных культур. Методы определения зараженности болезнями". Распространенность фузариоза вычисляли как выраженное в процентах отношение растений с признаками заболевания к общему числу растений. Кроме распространенности фузариоза, учитывали длину надземной части проростков сои. Значимость различий по распространенности фузариоза между вариантами с обработкой и вариантами без обработки проверяли точным тестом Фишера для таблиц 2×2.
Результаты влияния обработки штаммом Bacillus atrophaeus В-13893 в сравнении с химическим препаратом "Оплот" на распространенность фузариоза в эксперименте на проростках сои представлены в таблице 2.
Вышеприведенные данные свидетельствуют о высокой (сопоставимой с эффективностью химического протравителя) эффективности заявляемого штамма Bacillus atrophaeus В-13893 в защите сои от фузариоза в лабораторных условиях, при этом снижение распространенности фузариоза за счет обработки заявляемым штаммом Bacillus atrophaeus В-13893 в высшей степени статистически значимо (р<0,001), как при естественном, так и при искусственном заражении семян возбудителями фузариоза.
Пример 3. Изучение влияния заявляемого штамма Bacillus atrophaeus В-13893 на рост проростков сои.
Изучение влияния заявляемого штамма Bacillus atrophaeus В-13893 на рост проростков сои проводили методом рулонных культур в эксперименте, описанном в Примере 2. Анализ результатов показал, что обработка заявляемым штаммом Bacillus atrophaeus В-13893 на фоне естественной зараженности семян сои фузариозом привела к незначительному (на 2,0%) увеличению средней длины проростков, а на фоне искусственного заражения семян сои фузариозом - к существенному (на 39,8%) и статистически значимому (р<0,001) увеличению длины проростков (таблица 3).
Вышеприведенные данные свидетельствуют об отсутствии у заявляемого штамма Bacillus atrophaeus В-13893 лабораторной фитотоксичности при отсутствии искусственного заражения семян сои возбудителем фузариоза, и о ярко выраженных ростстимулирующих свойствах заявляемого штамма при искусственном заражении семян сои возбудителем фузариоза.
Пример 4. Изучение влияния заявляемого штамма Bacillus atrophaeus В-13893 на интенсивность развития грибных болезней, нодуляцию, накопление биомассы и урожайность сои в полевых условиях.
7
7
Полевые опыты по исследованию влияния штамма Bacillus atrophaeus В-13893 на развитие грибных болезней, нодуляцию и урожайность сои выполнены на базе УНПК «Борский» ФГБОУ ВО Красноярский ГАУ в зернопаропропашном севообороте чистый пар-картофель-соя-яровая пшеница. В качестве тест-культур использованы сорт Заряница (см. пример 2) и сорт Эос (скороспелый сорт сои Восточно-Сибирского экотипа, созданный в ФГБОУ ВО Красноярский ГАУ). Основная обработка - осеннее плоскорезное рыхление на глубину 15-17 см. Весной выполнено ранневесеннее боронование и предпосевная культивация на глубину 5-6 см КПС-4. Посев сои выполнен 22 мая селекционной сеялкой ССФК-7, рядовым способом с учетом всхожести, чистоты и массы тысячи семян. Коэффициент высева оптимальный для зоны исследования (см. 32. Чураков А.А. Влияние сорта и элементов агротехники на формирование урожайности сои в Красноярской лесостепи: автореф. дис. … канд. с.-х. наук / А.А. Чураков. - Новосибирск, 2009. - 17 с.) и составил 0,8 млн. всхожих семян на 1 га. После посева выполнено прикатывание кольчато-шпоровыми катками. Для стимулирования нодуляции семена сои обрабатывали аборигенным штаммом ризобактерий, зарекомендовавшим себя в качестве эффективного микросимбионта сортов Эос и Заряница в полевых опытах, проводившихся в 2019 г. Титр инокулята составлял 1×10 клеток/мл. В опытных вариантах семена дополнительно обрабатывали споровой суспензией заявляемого штамма Bacillus atrophaeus В-13893 с титром 1×10 клеток/мл из расчета 10 мл суспензии на 1 кг семян, контролем служили семена без обработки.
2
Повторность опытов 4-кратная, площадь делянки 6,7 м, размещение делянок - рандомизированное. Полевые опыты, наблюдения за развитием растений выполнены в соответствии с общепринятыми рекомендациями для полевых экспериментов с культурой (см. Коллекция генетических ресурсов зерновых бобовых ВИР: пополнение, сохранение и изучение. Методические указания. [Под ред. д-ра биол. наук М.А. Вишняковой] - СПб, 2010. - 141 с.; Синеговская В.Т. Методы исследований в полевых опытах с соей (Учебно-методическое пособие) / В.Т. Синеговская, Е.Т. Наумченко, Т.П. Кобозева // ФГБНУ ВНИИ сои. - Благовещенск, ООО "ИПК "ОДЕОН", 2016. - 115 с.). Уборку делянок проводили напрямую комбайном «Terrion» в период полной спелости культуры. Семена очищались на ситах с диаметром ячейки 4×20 мм, взвешивались с точностью до 1 г, урожайность приводилась к стандартной влажности 14%.
Влияние заявляемого штамма Bacillus atrophaeus В-13893 на интенсивность развития грибных болезней сои в полевых условиях представлено в таблице 4.
Влияние заявляемого штамма Bacillus atrophaeus В-13893 на высоту, биомассу и нодуляцию растений сои в полевых условиях представлено в таблице 5.
Вышеприведенные данные свидетельствуют о том, что заявляемый штамм Bacillus atrophaeus В-13893 в полевых условиях статистически значимо снижает интенсивность развития комплекса грибных болезней сои, стимулирует рост растений сои, и не оказывает негативного влияния (в случае сорта Эос), либо оказывает позитивное влияние (в случае сорта Заряница) на нодуляцию сои.
Влияние заявляемого штамма Bacillus atrophaeus В-13893 на урожайность сои в полевых условиях представлено в таблице 6.
Приведенные данные свидетельствуют о том, что заявляемый штамм Bacillus atrophaeus В-13893 в полевых условиях статистически значимо (р<0,01) повысил урожайность сои на 41,4%.
Согласно Постановлению Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 28.01.2021 №4 "Об утверждении санитарных правил и норм СанПиН 3.3686-21 "Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней" Bacillus atrophaeus не относится к патогенным микроорганизмам, и, следовательно, не представляет опасности для человека.
Таким образом, штамм бактерий Bacillus atrophaeus В-13893 является новым, пригоден для получения биопрепарата против фитопатогенных грибов и грибоподобных протистов и расширяет арсенал средств защиты сои от экономически значимых болезней.