РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ Л-ИВП 1421ABJCN ВИРУСА ОСПОВАКЦИНЫ С НАРУШЕННЫМИ ГЕНАМИ ВИРУЛЕНТНОСТИ A56R, B8R, J2R, C3L, N1L ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЖИВОЙ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ АТТЕНУИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ НАТУРАЛЬНОЙ ОСПЫ И ДРУГИХ ОРТОПОКСВИРУСОВ, ПАТОГЕННЫХ ДЛЯ ЧЕЛОВЕКА
RECOMBINANT STRAIN L-IVP 1421ABJCN POX VIRUS VIRULENCE GENES WITH BROKEN A56R, B8R, J2R, C3L, N1L FOR PRODUCING LIVE CULTURE OF ATTENUATED SMALLPOX VACCINE AND OTHER ORTHOPOXVIRUSES, PATHOGENIC FOR HUMANS

Изобретение относится к рекомбинантному аттенуированному штамму вируса осповакцины (1421ABJCN) с нарушенными генами вирулентности A56R, B8R, J2R, C3L, NIL на основе клонированного вируса осповакцины штамм ЛИВП и может быть использовано в медицине, биотехнологии, в частности в генной инженерии для получения живой культуральной аттенуированной вакцины против натуральной оспы и других ортопоксвирусов, патогенных для человека.
Вирус осповакцины (ВОВ) является представителем рода Orthopoxvirus семейства Poxviridae [Moss В. Poxviridae: the viruses and their replication. In Fields Virology / edited by D.M. Knipe. - Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins, 2007. - 5th edn. - P. 2905-2946]. Подобно другим ортопоксвирусам BOB является сложно организованным цитоплазматическим вирусом с протяженным геномом, состоящим из двухцепочечной ДНК приблизительно 190 т.п.н. с ковалентно замкнутыми концами. Гены, расположенные в левом и правом концевых районах генома, кодируют белки, связанные, в частности, с функциями вирулентности, круга хозяев и иммуномодуляцией организма хозяина [Jacobs Ν., Bartlett N.W., Clark R.Η. and Smith G.L. Vaccinia virus lacking the Bcl-2-like protein N1 induces a stronger natural killer cell response to infection. // Journal of General Virology. - 2008. - №89. - P. 2877-2881].
Вследствие высококонсервативной природы структурных белков ортопоксвирусов иммунизация ВОВ обеспечивает перекрестную защиту против натуральной оспы и других представителей этого рода. Поэтому почти два столетия ВОВ применялся в качестве вакцины для защиты от вируса натуральной оспы, вплоть до ликвидации натуральной оспы в конце 1970-х годов [Wiser I., Balicer R.D., Cohena D. An update on smallpox vaccine candidates and their role in bioterrorism related vaccination strategies. // Vaccine. - 2007. - №25. - P. 976-984]. Эти вакцины, особенно первого поколения, вызывали редкие, но серьезные неблагоприятные последствия, в частности у людей с иммунодефицитом вследствие рака, терапии рака, трансплантации органов и различных заболеваний (ВИЧ/СПИД), а также с экземой или атопическим дерматитом в анамнезе. Хотя осложнения и наблюдались редко, но при этом страдали, а иногда и погибали (в 0,0001% случаев), здоровые до прививки люди [Jacobs B.L., Langland J.O., Kibler K.V., Denzler K.L., White S.D., Holechek S.A., Wong S., Huynh T., Baskin C.R. Vaccinia virus vaccines: past, present and future. // Antiviral Res. - 2009. - V. 84. P. 1-13]. В связи с этим, очень остро стоит вопрос о необходимости разработки современных безопасных вакцин против натуральной оспы и других ортопоксвирусных инфекций человека. Во время кампании по ликвидации оспы предпринимались попытки создать аттенуированный штамм ВОВ, который отличался бы протективной эффективностью при незначительной выраженности побочных эффектов [Fenner F., Henderson D.A., Arita I., Jezek Z., Ladnyi I.D. Smallpox and its eradication. // World Health Organization: Geneva. - 1988]. Наиболее распространенная технология для аттенуации вируса осповакцины включала многократные пассажи исходного вируса дикого типа на культурах клеток различных животных. Современная биотехнология позволяет вводить целевые вставки, делеции генов в нужных участках генома для получения более безопасной и иммуногенной вакцины против натуральной оспы [Jacobs B.L., Langland J.O., Kibler K.V., Denzler K.L., White S.D., Holechek S.A., Wong S, Huynh T., Baskin C.R. Vaccinia virus vaccines: past, present and future. // Antiviral Res. - 2009. - V. 84. P. 1-13]. Получение аттенуированного BOB может быть достигнуто делетированием генов, кодирующих модуляторы иммунного ответа, генов круга хозяев и генов, участвующих в метаболизме нуклеиновых кислот. К настоящему времени выполнен ряд работ по получению высокоаттенуированного вируса осповакцины с помощью генетической инженерии, относимого к вакцинам третьего поколения.
Одна из наиболее хорошо охарактеризованных вакцин на основе нереплицирующегося вируса осповакцины - NYVAC получена из штамма Copenhagen путем селективной делеции 18 генов/открытых рамок трансляции (ОРТ). Были делетированы гены, включая кассету из 12 ОРТ от C7L до K1L (район "генов круга хозяев"); ген, кодирующий тимидинкиназу; B13R и B14R (гены "геморрагического" района); A26L (кодирующий белок включения типа A); A56R (кодирует гемагглютинин); I4L (кодирует большую субъединицу рибонуклеотид редуктазы). В эксперименте на иммунодефицитных макаках NYVAC показал безопасность, но не смог обеспечить защиту от последующей летальной инфекции вирусом оспы обезьян [Edghill-Smith Y., Bray M., Whitehouse C.A., Miller D., Mucker Ε., Manischewitz J., King L.R., Robert-Guroff M., Hryniewicz Α., Venzon D., Meseda C, Weir J., Nalca Α., Livingston V., Wells J., Lewis M.G., Huggins J., Zwiers S.H., Golding H., Franchini G. Smallpox vaccine does not protect macaques with AIDS from a lethal monkeypox virus challenge. // J. Infect. Dis. - 2005. - V. 191. - P. 372-381].
В исследовании [Lee M.S., Roos J.M., McGuigan L.C, Smith Κ.Α., Cormier N., Cohen L.K., Roberts Β.Ε. and Paynet L.G. Molecular attenuation of vaccinia virus: mutant generation and animal characterization. // J. Virol. - 1992. - V. 66. - №5. - P. 2617-2630] на основе штамма NYCBH BOB были получены мутанты по генам тимидинкиназы (ТК), рибонуклеотид редуктазы (RR), гемагглютинина (НА) или вирусного фактора роста (VGF). В экспериментах на мышах было показано снижение иммуногенности рекомбинантных вирусов, требующее более высокие иммунизирующие дозы в сравнении с вирусом дикого типа для получения равных титров антител. Наблюдались снижение возможности исследуемых вариантов вируса к распространению внутри инфицированного организма и их значительная аттенуация: мутанта по гену ТК на 1.7 log10, гену RR на 2.9 log10, гену НА на 4.0 log10 и гену VGF на 5.4 log10.
Известен штамм ВОВ с удаленным геном B8R, кодирующим гомолог рецептора ИНФ-γ, который вызывал сравнимый с исходным штаммом Lister гуморальный и клеточный иммунный ответ в мышах с ослабленным иммунитетом. Но наблюдалось снижение способности к репликации на определенных культурах клеток. В то же время в эксперименте на безтимусных мышах мутантный вирус, даже в более высоких дозах, вызывал меньшую заболеваемость по сравнению с диким штаммом, что проявлялось в менее заметном распространении вируса, меньшей потере веса и большей выживаемости [Denes В., Gridley D.S., Fodor Ν., Takatsy Ζ., Timiryasova T.M., Fodor I. Attenuation of a vaccine strain of vaccinia virus via inactivation of interferon viroceptor. // J. Gene Med. - 2006. - V. 8. - №7. - P. 814-823].
Наиболее близким аналогом (прототипом) является рекомбинантный штамм Copenhagen ВОВ (международная заявка №W092/15672, МПК C12N 7/00, опубл. 17.09.1992 г.), разработанный компанией Virogenetics Corporation. В штамм Copenhagen ВОВ рекомбинационно (рекомбинация специально созданных плазмид с вирусным геномом) вводили делеции по 6-ти областям генома ВОВ.
Однако в рекомбинантном штамме-прототипе наряду с нарушением индивидуальных генов введена протяженная делеция, которая охватывала 2 соседних гена, а также делеция с удалением сразу 10 генов ВОВ, что снизило способность ВОВ реплицироваться на разных линиях человеческих клеток, что снижает его технологические возможности при производстве вакцины. Комбинация генов вирулентности в прототипе отличается от заявляемого технического решения. Кроме того, рекомбинантный штамм-прототип вируса осповакцины не аттестован и не используются в России для производства классической противооспенной вакцины.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является создание высокоаттенуированного рекомбинантного штамма вируса осповакцины для получения более безопасной живой культуральной аттенуированной вакцины против натуральной оспы и других ортопоксвирусов за счет последовательного удаления из состава генома этого вируса пяти генов вирулентности с использованием плазмид интеграции.
Указанный технический результат достигается получением рекомбинантного штамма Л-ИВП 1421ABJCN вируса осповакцины с нарушенными генами вирулентности A56R, B8R, J2R, C3L, NIL, предназначенного для получения живой культуральной аттенуированной вакцины против вируса натуральной оспы и других ортопоксвирусов и депонированного в Государственной коллекции Роспотребнадзора возбудителей вирусных инфекций, риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», регистрационный №V-653 (справка о депонировании прилагается).
Для создания высокоаттенуированной осповакцины штамм Л-ИВП авторами был предложен подход последовательного удаления из состава генома этого вируса выбранных генов. В качестве наиболее перспективных для этой цели были предложены следующие гены: A56R, B8R, NIL, C3L и J2R.
A56R
50
10
Ген A56R кодирует гемагглютинин - поверхностный гликопротеин, обеспечивающий способность вируса присоединяться к клетке-хозяину, а также ингибирующий слияние инфицированных клеток и протеолитически активирующий инфекционность вирионов. Показано, что делеция этого гена у штамма BOB New-York City Board of Health (NYCBH) вызывает в моделях на мышах снижение внутричерепного и интраназального LD приблизительно на 4 log единиц по сравнению с родительским штаммом. Это сопровождается исчезновением оспенных образований на скарифицированной коже мышей, несмотря на уровень репликации вируса, близкий к дикому типу [Lee M.S., Roos J.M., McGuigan L.С., Smith Κ.Α., Cormier Ν., Cohen L.К., Roberts В.Ε. and Paynet L.G. Molecular attenuation of vaccinia virus: mutant generation and animal characterization. // Journal of Virology. - 1992. - Vol. 66, №5. - P. 2617-2630]. В других работах использовали штамм Western Reserve, изменения в гене гемагглютинина которого также приводили к значительной аттенуации вируса Zhang Q., Yu Υ.Α., Wang Ε., Chen Ν., Danner R.L., Munson P.J., Marincola F.M., Szalay A.A. Eradication of solid human breast tumors in nude mice with an intravenously injected light-emitting oncolytic vaccinia virus. // Cancer. Res. - 2007. - V. 67. - P. 10038-10046].
B8R
Ген B8R вируса осповакцины (BOB) штамм Western Reserve кодирует гликопротеин размером 43 кДа, секретируемый из зараженной клетки в виде гомодимера на ранней стадии развития инфекции. Этот белок имеет сходство по аминокислотной последовательности с внеклеточным доменом клеточного рецептора γ-интерферона (ИФН-γР), вследствие чего связывается и ингибирует γ-интерферон (ИФН-γ) у широкого круга видов (человека, коровы, кролика, крысы и курицы, но не мыши) [Alcami A. and Smith G.L. Vaccinia, cowpox, and camelpox viruses encode soluble gamma interferon receptors with novel broad species specificity. // J. Virol. - 1995. - V. 69. - P. 4633-4639].
Трансгенные мыши, лишенные ИФН-γ, показывали повышенную чувствительность к заражению ВОВ и другими вирусами. При этом лечение животных ИФН-γ повышала их резистентность к вирусной ифекции. На модели мышей ВОВ, лишенный ИФН-γР, показывал тот же уровень вирулентности, что и вирус дикого типа, что связано с низкой аффинностью ИФН-γР ВОВ к мышиному ИФН-γ. Однако экспрессия растворимого мышиного ИФН-γР немного увеличивала вирулентность вируса.
C3L
Ген C3L кодирует комплемент-связывающий белок (КСБ), секретируемый инфицированной клеткой [Kotwal G.J. and Moss В. Analysis of a large cluster of nonessential genes deleted from a vaccinia virus terminal transposition mutant. // Virology. - 1988. - V 167. - P. 524-537] и ингибирующий активность системы комплемента через взаимодействие с C3b и C4b. Этот белок размером 35 кДа содержит четыре коротких консенсусных повторяющихся домена, которые также присутствуют и в регуляторных белках системы комплемента хозяина и необходимы для активности КСБ. КСБ связывается с C3b и C4b и действует как кофактор в их ферментативной инактивации фактором I, препятствуя инициированию классического и альтернативного путей конвертации С3 и ускоряя их распад. Таким образом, КСБ ингибирует антитело-зависимую, усиленную комплементом нейтрализацию вирионов ВОВ. В опытах на животных мутанты, лишенные КСБ, обладали сниженной вирулентностью [Kotwal G.J., Isaacs S.Ν, McKenzie R., Frank M.M. and Moss В. Inhibition of the complement cascade by the major secretory protein of vaccinia virus. // Science. - 1990. - V. 250. - P. 827-830].
J2R
Ген J2R кодирует тимидинкиназу. Было продемонстрировано, что встройка чужеродных нуклеотидных последовательностей вместо гена тимидинкиназы (ТК) ВОВ значительно снижает патогенность вируса (в 1000 раз) [Smith G.L. Encyclopedia of Virology. - Elsevier Ltd., 2008. - P. 243-250].
NIL - фактор вирулентности, секретируемый из клеток [Kotwal G.J., Hugin A.W. and Moss B. Mapping and insertional mutagenesis of a vaccinia virus gene encoding a 13,800-Da secreted protein. // Virology. - 1989. - №171. - P. 579-587]. Ген NIL относится к группе ранне-поздних генов ВОВ и несущественен для размножения вируса in vitro, но важен для проявления свойств вирулентности in vivo [Маренникова С.С., Щелкунов С.Н. Патогенные для человека ортопоксвирусы. - М.: КМК Scientific Press Ltd., 1988. - 386 с.]. Несмотря на расположение этого гена в терминальной (вариабельной) области генома, он сохранен у многих представителей рода Orthopoxvirus. Исключением является высокоаттенуированный штамм ВОВ - Modified Vaccinia Ankara (MVA), который кодирует неполный белок. Продукт этого гена представляет собой внутриклеточный гомодимер размером около 14kDa (117 а.о.). Белок N1 относится к семейству Bcl-2-антиапоптических белков и ингибирует как апоптоз, так и сигнал от рецептора IL-1, приводящий к активации NF-κВ-пути (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated В cells - универсальный фактор транскрипции, контролирующий экспрессию генов иммунного ответа, апоптоза и клеточного цикла). Было показано, что сверхэкспрессия N1 в неинфицированных клетках ингибирует активацию NF-κB и IRF3 связыванием ингибитора комплекса IKK и ТВК1, соответственно.
10
Изобретение поясняется следующими графическими материалами. На фиг. 1 приведена общая схема получения вирусов осповакцины с делецией генов вирулентности (на примере гена A56R). На фиг. 2 представлена общая схема конструирования плазмид интеграции для получения делеционных вариантов ВОВ (на примере гена A56R). На фиг. 3 приведены данные ПНР анализа 21-го клона рекомбинантного вируса осповакцины ΔA56RΔC3LΔB8RΔN1LΔJ2R, а именно электрофореграмма фрагментов ДНК, полученных в результате ПНР: А - с праймерами на ген A56R, В - с праймерами на ген B8R, С - с праймерами на ген C3L, N - с праймерами на ген NIL, Τ - с праймерами на ген J2R. L - lkb ДНК-маркер. На фиг. 4 изображены результаты ПНР анализа 3-х серий вакцинного штамма вируса осповакцины 1421ABJCN с электрофоретической детекцией нарушенных генов: A56R, B8R, J2R, C3L, NIL: серия 1, дата изготовления 21.03.2014 (1 пассаж); серия 2, дата изготовления 10.04.2014 (5 пассаж); серия 3, дата изготовления 05.05.2014 (10 пассаж); 14 кл. Л-ИВП - родительский вирус осповакцины. Электрофореграмма фрагментов ДНК, полученных в результате ПЦР: А - с праймерами на ген A56R, В - с праймерами на ген B8R, С - с праймерами на ген C3L, N - с праймерами на ген NIL, J - с праймерами на ген J2R, L - 1kb ДНК-маркер. На фиг. 5 представлен сравнительный анализ динамики роста штаммов вирусов осповакцины (14 кл. Л-ИВП и вакцинного штамма вируса осповакцины 1421ABJCN) на культуре клеток CV-1. На фиг. 6 приведен протокол контроля генетической однородности и сравнение нуклеотидных последовательностей районов делеций в генах A56R, B8R, J2R, C3L, NIL вируса осповакцины исходного родительского штамма 14 кл. Л-ИВП и вакцинного штамма 1421ABJCN. Идентичные нуклеотиды в сравниваемых последовательностях обозначены точками, делеций - прочерком. На фиг. 7 представлена динамика изменения среднего веса мышей, инфицированных тремя сериями вакцинного штамма 1421ABJCN и родительским 14 кл. Л-ИВП ВОВ. На фиг. 8 изображена диаграмма уровня вируснейтрализующих антител при иммунизации мышей линии BALB/c подкожно (п/к) родительским 14 кл. Л-ИВП вирусом осповакцины и тремя сериями вакцинного штамма 1421ABJCN, выявляемого методом нейтрализации ВОВ на культуре клеток 4647. Представлены среднегеометрические значения, рассчитанные как -lg от наибольшего разведения сыворотки, при котором достигается 50% нейтрализация ВОВ ± стандартное отклонение. На фиг. 9 представлена гистограмма среднегеометрических значений титров вакцинных штаммов в виде log/г органа ± стандартное отклонение, определенных методом бляшек в гомогенате головного мозга инфицированных новорожденных мышей при интрацеребральном введении.
Для получения технического результата используют методику временной доминантной селекции [Falkner F.G., Moss В. Transient dominant selection of recombinant vaccinia viruses. Journal of Virology. // - 1990. - Vol. 64. - P. 3108-3111]. Для реализации этой методики создается рекомбинантная плазмида, которая несет как доминантный селективный маркер (ген gpt E.coli под контролем 7.5К-промотора ВОВ), расположенный вне протяженных областей гомологии с ДНК вируса, так и последовательности генома ВОВ, фланкирующие делетируемый ген. Бактериальный фермент ксантин-гуанин-фосфорибозилтрансфераза (gpt), синтезируемый в клетках млекопитающих, способен восстанавливать метаболизм пуриновых нуклеотидов, блокируемый микофеноловой кислотой (МРА). В результате единичного кроссинговера плазмиды интеграции и вирусной ДНК образуется рекомбинантный вирусный геном, содержащий как ген gpt, так и последовательности, представляющие собой сегмент вирусного генома с целевой делецией и этот же сегмент без делеции. Такая генетическая конструкция нестабильна и может существовать лишь под селективным давлением. При снятии селективных условий происходит внутримолекулярная рекомбинация по областям гомологии, в результате которой образуется два вида вирусов - с делецией и без нее, причем выщепляется вся плазмидная часть (фиг. 1), что позволяет получать в дальнейшем двойные, тройные и т.д. рекомбинантные вирусы по различным участкам генома, используя эту же методику и тот же самый селективный маркер. Следует отметить, что в результате внутримолекулярной рекомбинации, удаляются из генома вируса все чужеродные последовательности, что очень важно при создании направленно аттенуированного ВОВ.
Конструирование плазмид. Для получения плазмид интеграции с делециями генов ВОВ использовали ранее разработанную нами схему (фиг. 2). Выполнение этой технической задачи обеспечивалось применением метода ПНР, ферментативного гидролиза, последующей лигазной сшивки и трансформации клеток E.coli штамм JM-109 [Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning. 2nd ed. - Cold Spring Harbor Laboratory Press., 1989].
Авторами были получены пять плазмид интеграции - pMGCgpt-ΔA56R, pMGCgpt-ΔB8R, pMGCgpt-ΔJ2R, pMGCgpt-ΔC3L, pMGCgpt-ΔN1L, предназначенные для делеции выбранных генов ВОВ.
Полученные плазмиды интеграции использовали на следующем этапе работы для решения технической задачи: получения вариантов вируса осповакцины с направленно делетированными генами ВОВ. Конструирование мутантных вариантов ВОВ.
В работе был использован вирус осповакцины штамм Л-ИВП (инв. № V-401 из коллекции ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»). Для того чтобы исключить влияние «генетического фона» и гетерогенности вирусной популяции, все делеционные варианты получали на основе клонированного варианта 14 ВОВ Л-ИВП. Клонирование исходного штамма проводили методом бляшек на монослое клеток линии CV-1 (перевиваемая культура клеток почки африканской зеленой мартышки).
Для получения вирусов осповакцины с делецией генов вирулентности использовали методику временной доминантной селекции. Авторами была проведена серия экспериментов по трансфекции зараженных ВОВ штамм ЛИВП клеток CV-1 плазмидой интеграции pMGQgpt-ΔB8R. После четырех пассажей в условиях селекции вирус клонировали под агарозным покрытием методом бляшек. Были выделены 12 клонов предполагаемых делеционных мутантов. Далее эти клоны подращивали в неселективных условиях и реклонировали. По результатам ПЦР отбирали по одному стабильно реплицирующемуся реклону от 2-3-х клонов, нарабатывали, расфасовывали на отдельные аликвоты, титровали методом окрашивания бляшек кристаллическим фиолетовым, замораживали и использовали для дальнейшей работы.
Таким же образом был получен вариант ВОВ с делециями двух генов вирулентности ΔB8RΔC3L. Для трансфекции зараженных ВОВ штамм vΔB8R ЛИВП клеток CV-1 брали плазмиду интеграции pMGC gpt-ΔC3L. После проведенных процедур селекции и клонирования вируса с предполагаемым мутантным генотипом, выделяли ДНК и проводили их анализ методом ПНР. Были выявлены реклоны, полученные фрагменты которых показали соответствие длин теоретически расчетным.
Далее с использованием тех же процедур и плазмидой интеграции pMGCgpt-ΔA56R авторами был получен ВОВ с делециями трех генов вирулентности ΔB8RΔC3LΔA56R, а затем вариант ВОВ ЛИВП с четырьмя делетированными генами, используя плазмиду интеграции pMGCgpt-ΔN1L.
Вариант ВОВ ЛИВП с пятью нарушенными генами вирулентности был получен по отработанной ранее методике с использованием четверного мутанта 21-й клон ΔB8RΔC3LΔA56RΔN1L и плазмиды интеграции pMGCgpt-ΔJ2R, в которой ген тимидинкиназы нарушен встройкой синтетического фрагмента ДНК. После шести пассажей под селективной средой, содержащей микофеноловую кислоту, вирусная суспензия была обработана ультразвуком и проведено клонирование под агарозным покрытием. Выделенные клоны далее пассировали под средой без селекции, затем их реклонировали, подращивали, выделяли ДНК, проводили ПЦР-анализ с использованием внутренних праймеров. Проведенный ПНР-анализ выбранного 14-го реклона однозначно доказывает получение целевых ВОВ с одновременной делецией генов C3L, B8R, A56R, NIL и встройкой в ген J2R (фиг. 3).
Таким образом, авторами получен аттенуированный вирус осповакцины штамм Л-ИВП с пятью нарушенными генами вирулентности - 1421ABJCN.
Штамм депонирован в Государственной коллекции Роспотребнадзора возбудителей вирусных инфекций, риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» регистрационный номер V-653 от 16.09.2013.
Была разработана оптимальная методика наработки и очистки вирусных препаратов для последующей иммунизации мышей. Для этого была использована перевиваемая линия культуры клеток 4647. Посевной и рабочий банки клеток этой линии на уровне 108-го и 128-го пассажей рекомендованы для производства вакцины против натуральной оспы. Были наработаны три серии вакцинного штамма 1421ABJCN вируса осповакцины на различных пассажах. Πоскольку вирус рабочего посевного материала должен обладать теми же характеристиками, что и штамм, который был использован для приготовления главного посевного материала (Европейская фармакопея 7.0), нами были отобраны образцы вакцинного штамма вируса осповакцины 1421ABJCN на следующих пассажах:
8
серия 1, дата изготовления 21.03.2014 (1 пассаж) - 3 пробирки по 2 мл. Титр вируса составил 4.5×10 БОЕ/мл;
8
серия 2, дата изготовления 10.04.2014 (5 пассаж) - 3 пробирки по 2 мл. Титр вируса составил 5.0×10 БОЕ/мл;
8
серия 3, дата изготовления 05.05.2014 (10 пассаж) - 3 пробирки по 2 мл. Титр вируса составил 6.0×10 БОЕ/мл.
Было показано, что вакцинный штамм 1421ABJCN вируса осповакцины сохраняет стабильность и биологические свойства в течение исследуемых 10 пассажей. Образцы вакцинного штамма после 1-го, 5-го и 10-го пассажа прошли аттестацию в ОБТК ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» и имеют паспорта №84, №85, №86 от 23.10.2014 г. соответственно.
Морфологические признаки.
Подлинность подтверждена в соответствии с требованиями ЕФ 7.0, с. 1152, методами ПЦР и титрованием на культуре клеток 4647. Определено, что при титровании в монослое культуры клеток 4647 вакцинный штамм вируса осповакцины 1421ABJCN продуцирует однотипные БОЕ диаметром от 0.5 до 1.0 мм. Длины фрагментов, полученные в результате ПНР анализа трех серий вакцинного штамма вируса осповакцины, соответствуют расчетным данным, приведенным в таблице 1 и на фиг. 4.
8
Штамм прошел 4 пассажа на культуре клеток CV-1, 10 пассажей на культуре клеток 4647. При исследовании свойств полученного штамма были изучены его основные свойства: подлинность, генетическая однородность, стерильность, безвредность, иммуногенная активность, специфическая безопасность, нейровирулентность, остаточная вирулентность. Установлено, что при титровании в монослое культуры клеток 4647 концентрация (титр) вируса составляет не менее 10 БОЕ/мл.
Результаты испытаний репликативных свойств вариантов ВОВ в культуре клеток CV-1 показали, что кривые развития вирусов достоверно не различаются (фиг. 5). Это указывает на то, что делеции одиночных, двух, трех, четырех и пяти генов вирулентности ВОВ не влияют на репродуктивные функции вирусов в изученной культуре клеток.
Генетическая однородность показана методом секвенирования (фиг. 6).
Штамм стерилен и безвреден при подкожном введении для морских свинок и белых мышей.
7
Авторами были проведены лабораторные эксперименты по изучению остаточной вирулентности трех серий вакцинного штамма 1421ABJCN вируса осповакцины после 1-го (1 серия), 5-го (2 серия) и 10-го (3 серия) пассажа в сравнении с родительским кл. 14 штамма Л-ИВП вируса осповакцины при иммунизации животных двумя способами: подкожно или внутрибрюшинно. Для этого мышам линии Balb/c с массой тела 14-16 г вводили препараты вакцинных штаммов в дозе 10 БОЕ/мышь, что соответствует иммунизирующей дозе вакцины. Животные контрольной группы получали инъекцию физиологического раствора.
Была определена динамика изменения среднего веса мышей при иммунизации животных вакцинными штаммами подкожно. Мышей взвешивали перед инфицированием и затем в течение 14 сут после иммунизации. Изменение веса рассчитывали как разницу показателя веса перед заражением и показателя веса в определенный день после инфицирования, выраженное в процентах. Как видно из данных, приведенных на фиг. 7, изменение веса иммунизированных вакцинными штаммами 1421ABJCN вируса осповакцины мышей не отличалось от родительского кл. 14 штамма Л-ИВП вируса осповакцины.
При определении остаточной вирулентности проводили три последовательных пассажа на культуре клеток 4647 10% тканевой суспензии. В результате проведенных экспериментов было установлено, что при подкожной и внутрибрюшинной иммунизации мышей линии BALB/c тремя сериями вакцинного штамма 1421ABJCN и родительским кл. 14 штамма Л-ИВП ВОВ на 3, 7 и 14-е сутки после инъекции вирусы не размножаются, не распространяются и не задерживаются в организме привитых животных в исследуемых органах (табл. 2).
Авторами были определены титры вируснейтрализующих антител в сыворотках крови мышей, полученных после второй иммунизации их тремя сериями вакцинного штамма 1421ABJCN вируса осповакцины и родительским кл. 14, штамм Л-ИВП вируса освповакцины. Мыши были инфицированы разными титрами вирусов: превышающей, равной человеческой и меньшей дозами. Для иммунизации был использован способ, которым препарат предлагается вводить человеку, т.е. подкожный.
В результате проведенных экспериментов было установлено, что подкожная иммунизация мышей линии BALB/c тремя сериями вакцинного штамма 1421ABJCN вызывает наработку вируснейтрализующих антител, уровень которых составляет от 0.92±0,11 до 1.69±0,1 БОЕ/мышь, что сопоставимо с уровнем вируснейтрализующих антител при подкожной иммунизации животных родительским вирусом осповакцины кл. 14 Л-ИВП (таблица 3).
Было показано, что значения нейтрализующей активности сывороток носит дозозависимый характер: с увеличением титра вводимого вакцинного штамма увеличивается титр нейтрализующих антител (фиг. 8).
50
Был показан защитный эффект трех серий вакцинного штамма 1421ABJCN вируса осповакцины через 56 дней после иммунизации. В контрольной группе на седьмые сутки после заражения высоковирулентным для мышей вирусом эктромелии в дозе 10 LD/мышь у большинства животных были отмечены признаки заболевания: взъерошенная шерсть, падение аппетита и общей активности. В последующие сутки эти признаки наблюдались уже у всех животных в группе, а также началась их гибель. На 12 сутки у некоторых мышей в группе наблюдались изъязвления под хвостом. На 14 сутки все животные в контрольной группе погибли.
Гибели животных в опытных группах не наблюдалось. Однако необходимо отметить, что на восьмые-девятые сутки у некоторых животных, иммунизированных вакцинными штаммами, были зарегистрированы признаки заболевания (взъерошенная шерсть и незначительное падение аппетита), которые проходили к 13-14 суткам.
Таким образом, как свидетельствуют результаты исследования в течение всего срока наблюдения, гибели животных, иммунизированных образцами вакцинного штамма после 1-го, 5-го и 10-го пассажей на культуре клеток 4647, не отмечалось, в то время как контрольная группа мышей, которым был введен физиологический раствор, полностью погибла (таблица 4).
4
2
3
4
5
6
7
Штамм не вызывает некрозов при подкожном введении кроликам в дозе 10 БОЕ/0,1 мл (специфическая безопасность). Испытание проводили на 2-х белокожих кроликах породы «Шиншилла» массой от 2,5 до 3,5 кг, полученных из питомника лабораторных животных ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор». Шерсть на боках в местах предполагаемых прививок удаляли. Для проведения испытания вакцинный штамм вируса осповакцины разводили стерильным физиологическим раствором до содержания 10, 10, 10, 10, 10 и 10 БОЕ в 0,1 мл. Каждое разведение вводили кролику внутрикожно по 0,1 мл, в два разных участка кожи.
2
3
4
5
6
7
Для сравнения, тем же кроликам аналогичным образом на другом боку вводили по 0,1 мл растворов родительского кл. 14 вируса осповакцины штамм Л-ИВП с концентрацией 10, 10, 10, 10, 10 и 10 БОЕ/0,1 мл. Наблюдение за животными проводили в течение 14 суток. Определяли время появления и заживления инфильтратов в зависимости от титра и исследуемого вирусного штамма. Сравнивали показатели исходного и исследуемого вакцинных штаммов (таблица 5).
2
Штамм не обладает нейровирулентностью: не вызывает гибель новорожденных мышей линии Balb/c при интрацеребральном заражении. Мышам-сосункам интрацеребрально вводили по 10 мкл вируса кл. 14 Л-ИВП ВОВ и три серии вакцинного штамма 1421ABJCN в дозе 10 БОЕ/мышь. Через 3 сут после введения извлекали пробы головного мозга, гомогенизировали с последующим приготовлением 10 % тканевой суспензии. Полученный гомогенат титровали в монослое культуры клеток 4647, сравнивали исходный вакцинный и исследуемые штаммы.
3
6
10
Показали снижение нейровирулентности вакцинного штамма 1421ABJCN (титр вируса БОЕ/г органа ± стандартное отклонение - (0.93±0.35)×10) на три порядка в сравнении с родительским кл. 14 штамма Л-ИВП вируса осповакцины (1.32±0.53)×10. Представлены среднегеометрические значения вирусной нагрузки в виде log/г органа ± стандартное отклонение (фиг. 9).
Изучены условия и сроки хранения штамма:
- хранение при температуре от минус 70°C до минус 18°C.
Культура клеток
Для наработки вакцинного штамма и для определения титра вируснейтрализующих антител использовали: культура клеток 4647, перевиваемая линия клеток почки африканской зеленой мартышки, получена из коллекции культур клеток ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор", аттестована ГИСК им. Л.А. Тарасевича в соответствии с требованиями РД 42-28-10-89 и рекомендована для производства профилактических МИБП (протокол №14 от 28.10.03. заседания Ученого Совета ГИСК им. Л.А. Тарасевича; протокол №9 от 20.11.03. Комитета МИБП).
Животные
В зависимости от задач эксперимента для оценки специфической активности и безвредности были использованы мыши линии Balb/c, самки, весом 14-16 г или сосунки этой же линии весом 5-6 г, полученные из питомника ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор".
Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.
Пример 1. Получение плазмид интеграции.
Методом ПЦР получали два фрагмента генома ВОВ, фланкирующие делетируемый ген слева (L-flank) и справа (R-flank). Олигонуклеотидные праймеры для ПЦР рассчитывали таким образом, чтобы делеция целевого гена не приводила к нарушению прилегающих к нему генов. Нуклеотидная последовательность ДНК ВОВ штамма Л-ИВП была получена из базы данных с идентификационным номером DQ121394 (http://www.poxvirus.org). Расчет олигонуклеотидных праймеров для ПЦР и подбор условий реакции выполняли с помощью программы "Oligo" (версия 3.3) фирмы Borland International. В работе использовали следующие праймеры, которые были синтезированы на автоматическом синтезаторе ABI-394 («Applied Biosystems», США) в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (Новосибирск):
Для делеций гена B8R
L-flank:
R-flank:
Для делеций гена C3L
L-flank:
R-flank:
Для делеций гена A56R
L-flank:
R-flank:
Для делеций гена N1b
L-flank:
R-flank:
Участки узнавания эндонуклеаз рестрикции, названия которых указаны справа в скобках, подчеркнуты.
Клонировали одновременно обе фланкирующие области каждого гена в векторную плазмиду pMGC20-gpt. Для этого ПЦР-фрагменты и векторная плазмида были обработаны соответствующими ферментами и подвергнуты электрофорезу в 1% агарозном геле. Фрагменты ДНК были вырезаны из геля и очищены на колонках производства QIAGene. По 2 мкл из 30 мкл каждого элюата были анализированы электрофорезом в 1.2% агарозном геле. На лигирование было взято по 5 мкл каждого фрагмента и 2 мкл векторной плазмиды. Далее лигазные смеси были использованы для электротрансформации электрокомпетентных клеток E.coli штамм JM-109. На чашки Петри с 1% агаром и антибиотиком (ампициллин 50 мкг/мл) было высеяно по 1/10 части трансформированного материала. Индивидуальные колонии с каждой чашки были засеяны в пробирки с LB. Плазмидные ДНК выделяли щелочным способом и негидролизованные ДНК анализировали в 1% агарозном геле. По результатам анализа отбирали нужные клоны и дополнительно анализировали их гидролизом эндонуклеазами рестрикции. Препаративные количества трех клонов нарабатывали в 50 мл LB-среды с антибиотиком (ампициллин 50 мкг/мл). Плазмиды выделяли щелочным способом. Очистка плазмид проводилась следующим способом: обработка 2.5 M LiCl полчаса при -18 градусах, обработка 2.5 M LiCl 10 мин при +65 градусах, далее двухкратное осаждение этиловым спиртом. Обработка РНКазой 10 мин при +37 градусах, экстракция фенолом, двухкратная реэкстракция изоамиловым спиртом с последующим двухкратным осаждением этиловым спиртом. Осадки плазмид растворяли в 500 мкл ТЕ-буфера и анализировали гидролизом ферментами рестрикции.
Пример 2. Получение рекомбинантных вирусов.
Рекомбинантные вирусы осповакцины получали в клетках CV-1 с помощью набора Lipofectine (Gibco BRL) и селективной среды, содержащей МРА, ксантин и гипоксантин. Для этого монослой клеток CV-1 инфицировали вирусом с множественностью заражения 0.1 БОЕ на клетку, выдерживали 1 ч при 37°C, отмывали средой без сыворотки и проводили трансфекцию рекомбинантной плазмидой интеграции: 3 мкл плазмиды в концентрации 1 мкг/мкл смешивали с 15 мкл липофектина в концентрации 1 мг/мл, добавляли 1 мл среды ДМЕМ, содержащей: МРА в концентрации 25 мкг/мл, ксантин - 250 мкг/мл и гипоксантин - 15 мкг/мл, и оставляли на 15 мин при комнатной температуре, затем наносили по каплям на монослой. Через 20 ч клетки заливали селективной средой, которая содержала МРА, ксантин и гипоксантин и оставляли еще на сутки. После четырех-пяти пассажей в условиях селекции (до получения ЦПД), вирус клонировали под агарозным покрытием. Для этого вирусную суспензию обрабатывали ультразвуком в течение 30 с, титровали на монослое клеток CV-1 и выделяли клоны, используя 2-кратную поддерживающую среду ДМЕМ с 2% агарозой. Далее эти клоны подращивали в неселективных условиях и реклонировали как указано выше. По результатам ПЦР отбирали по одному стабильно реплицирующемуся реклону от 2-3-х клонов, нарабатывали, расфасовывали на отдельные аликвоты, титровали методом окрашивания бляшек кристаллическим фиолетовым, замораживали и использовали для дальнейшей работы.
Пример 3. Выделение вирусной ДНК.
3
Для выделения вирусной ДНК монослой клеток CV-1 в стеклянных флаконах (25 см) заражали вирусными клонами с множественностью 0.1-1 БОЕ на клетку, инкубировали 1 ч при 37°C. Через 1-2 дня, при появлении ЦПД, поддерживающую среду удаляли, монослой отмывали промывочным раствором, добавляли 1 мл/флакон этого же раствора и замораживали. Вирус высвобождали из клеток путем двукратной заморозки/оттаивания. К вирусной суспензии добавляли 100 мкл 10% тритона Х-100 и 2,5 мкл меркаптоэтанола и осаждали 10 мин при 10000 об/мин в роторе JA-20 в центрифуге J2-21 (Beckman, США). Супернатант отбирали и осаждали при 18000 об/мин 60 мин в роторе JA-20 в центрифуге J2-21 (Beckman, США). Растворяли в 100 мкл холодного ТЕ и добавляли:
170 мкл 46% сахарозы
6 мкл 5М NaCl
6 мкл 250 мМ ЭДТА
1,5 мкл меркаптоэтанола
10 мкл 30% саркозила
20 мкл протеиназы К (50-100 мкг/мл) Инкубировали 2 часа при 55°C. ДНК очищали от белков смесью фенол/хлороформ (1:1), отбирали верхнюю фазу и добавляли 2,5 объема спирта и 0,1 объема 3 M КАс и осаждали ДНК ночь при -20°C. Центрифугировали 5 мин при 10000 об/мин в центрифуге типа «Эппендорф», тщательно промывали осадок этанолом и растворяли в 30 мкл деионизованной воды.
Клоны анализировали методом ПЦР на наличие целевых делеций/инсерций с использованием соответствующих пар праймеров.
Пример 4. ПЦР анализ ДНК рекомбинантных вирусов.
Клоны анализировали методом ПЦР на наличие целевых делеций/инсерций в их ДНК с использованием соответствующих пар праймеров, которые были синтезированы на автоматическом синтезаторе ABI-394 («Applied Biosystems», США) в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (Новосибирск):
Для ΔB8R:
Для AC3L:
Для ΔA56R:
Для ΔN1L:
Для J2R-MCS:
Полимеразную цепную реакцию проводили в 0,2 мл тонкостенных микропробирках («Applied Biosystems», США) в амплификаторе «GeneAmp PCR System 9700» («Applied Biosystems», США). Реактивы для реакции: SE-буфер для Taq ДНК-полимеразы, трифосфаты, Taq Д НК-полимеразу, производства фирмы «СибЭнзим» (г. Новосибирск, Россия), стерильную деионизованную воду размораживали. Готовили смесь компонентов тест-системы из расчета на одну пробу (25 мкл):
2
- 2.5 мкл SE-буфера для Taq ДНК-полимеразы (рН 8,5 при 25°C: 60 мМ Tris-HCl, 25 мМ KCl, 1.5 мМ MgCl, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 0,1% Тритон Х-100);
- 2.5 мкл смеси трифосфатов (по 0.2 мМ, dNTP);
- по 1 мкл прямого и обратного праймеров (0,7 мкМ);
- 0.5 мкл Taq ДНК-полимеразы (2.5 ед.);
- 5 мкл ДНК-матрицы (около 2-10 нг);
2
ди
- 13.5 мкл воды стерильной деионизованной (НО).
2
ди
В пробирку, помеченную как отрицательный контроль, вместо ДНК-матрицы вносили НО. Затем пробирки переносили в амплификатор и проводили ПНР по программе, включающей следующие этапы:
- предварительная денатурация ДНК при 94°C, 1 мин 30 с;
- 20 циклов, состоящих из:
1. денатурации ДНК при температуре 94°C, 20 с,
2. отжига праймеров при 55°C в течение 30 с,
3. синтеза комплементарной цепи при 72°C, 1 мин,
- после последнего цикла пробирки прогревают в течение 5 мин при 72°C.
Продукты амплификации хранили при температуре 4°C до проведения электрофоретического анализа.
Анализ фрагментов проводили электрофорезом в 1% агарозном геле в буфере ТАЕ с бромистым этидием в концентрации 0.2 мкг/мл.
Для приготовления 1% агарозного геля к 0.5 г агарозы добавляли 50 мл буферного раствора для электрофореза. Смесь в термостойкой колбе нагревали в кипящей водяной бане, пока агароза не расплавится, после охлаждения до температуры 50°C агарозу выливали на подготовленный столик аппарата для электрофореза (типа ПГ-9), при этом образуется слой агарозы высотой 4 мм. С помощью специального штампа - "гребенки" на катодном конце геля формировали лунки для нанесения проб. Между дном лунок и основанием геля должен оставаться слой агарозы 0.5-1.0 мм. Буферные емкости аппарата ПГ-9 заполняли буферным раствором для электрофореза, при этом он должен покрывать гель слоем 4-5 мм.
Для контроля размера полученного амплифицированного фрагмента вносили 20 мкл маркера молекулярных весов в диапазоне 100-10000 п. о. («СибЭнзим»). Электрофорез проводили при градиенте напряжения 10 В/см в течение 45-90 мин, пока краситель - бромфеноловый синий - не пройдет от катодного конца геля 6-8 см.
Окрашенную бромистым этидием ДНК в геле просматривали под ультрафиолетовым излучением, для чего использовали трансиллюминатор с максимальной длиной волны 254 нм. Гель фотографировали в проходящем ультрафиолете при помощи цифрового фотоаппарата.
Пример 5. Титрование вируса и клонирование через бляшку.
2
3
4
5
6
Вирусную суспензию предварительно обрабатывали на ультразвуковом дезинтеграторе типа "MSE 500" мощностью 22 кГц импульсивно 2-3 раза по 10-15 с. Титрование вируса проводили, используя 6-луночный планшет, на 90-100% монослое клеток CV-1 и Vero. Готовили разведения вируса: 1:10, 1:10, 1:10, 1:10, 1:10, 1:10 на среде ДМЕМ. Сорбцию вируса проводили 1 час при 37°C. Затем отбирали вирусную суспензию и добавляли 2 мл среды ДМЕМ с 2% сыворотки в лунку.
Клонирование вируса через бляшку проводили на 6-луночных планшетах. Для этого монослой клеток CV-1 заражали вирусной суспензией в таком разведении, чтобы образовывались отдельно расположенные бляшки, и проводили адсорбцию в течение 60 мин при 37°C. Отбирали вирус и заливали 2 мл/лунку поддерживающей среды ДМЕМ, содержащей 1%-ую легкоплавкую агарозу (Sigma). Выдерживали 15 мин при комнатной температуре. После застывания добавляли 1 мл/лунку поддерживающей среды DMEM. Инкубировали в термостате при 37°C 48-72 час. Отбирали верхнюю жидкую фазу и добавляли по 1 мл/лунку водный раствор нейтрального красного, разведенного в среде DMEM в соотношении 1:20. Инкубировали при 37°C в течение 1-2 час. После этого отбирали среду с краской и отмечали бляшки, образованные вирусными частицами. Затем выделяли индивидуальную бляшку, переносили ее в 100 мкл среды DMEM и замораживали.
Пример 6. Определение динамики роста мутантных вариантов ВОВ.
Для изучения динамики развития исходного ВОВ ЛИВП и мутантных штаммов с делециями генов вирулентности C3L, B8R, A56R, NIL и J2R 90-100% монослой культуры клеток CV-1, полученный на 6-луночных планшетах, инфицировали вирусами с множественностью заражения 0,1 БОЕ/кл. Время после инфекции составляло 24, 48 и 72 час.На каждом временном этапе определяли титр вируса, как описано выше.
Достоверность результатов определяли по t-критерию Стьюдента с использованием программы Origin Professional 8.1.10.86. Достоверными считали значения при уровне значимости Ρ<0.05.
Пример 7. Наработка и очистка вирусов:
- монослой культуры клеток 4647, выращенный на культуральных матрасах 650 мл, 175 см (Griener, Австрия), инфицировали исходным вирусом осповакцины, штамм ЛИВП или полученными сериями вакцинного штамма вируса осповакцины 1421ABJCN, с множественностью 1,0 БОЕ/кл.;
- инкубировали 48 час при температуре 37°C до образования полного ЦПД, в 20 мл поддерживающей среды, затем получали криолизат (три цикла замораживания-оттаивания) инфицированных клеток;
- объединяли криолизат из 15 культуральных матрасов и центрифугировали 14000 об/мин, 1,5 час в роторе JA-14 в центрифуге J2-21;
- осадок растворяли в среде ДМЕМ, проводили еще один цикл замораживания-оттаивания, обрабатывали на ультразвуковом дезинтеграторе типа "MSE 500" мощностью 22 кГц импульсивно 2-3 раза по 10-15 с;
- дебрис осаждали центрифугированием 10 мин при 5000 об/мин, в роторе JA-14 в центрифуге J2-21;;
- супернатант (120 мл) центрифугировали 14000 об/мин, 1,5 час в роторе JA-14 в центрифуге J2-21;
- осадок восстанавливали в 4 мл физиологического раствора, обрабатывали ультразвуком и расфасовывали по 1,5 мл пробиркам.
- Инфекционный титр всех образцов проверяли методом бляшек в монослое клеток CV-1 или 4647. Показано, что все выбранные варианты ВОВ нарабатываются с помощью описанной выше методики в достаточном для иммунизации мышей количестве.
Пример 8. Измерение титра вируснейтрализующих антител.
Титры вируснейтрализующих антител после второй иммунизации мышей определяли следующим образом, у мышей каждой группы после наркотизации пипеткой с наконечником на 200 мкл отбирали кровь из ретробульбарного венозного сплетения, объединяли внутри группы и инкубировали при 4°C в течение 20 час. Сыворотку получали последующим центрифугированием в течение 10 мин при 5000 об/мин в центрифуге типа «Эппендорф»,. Препараты сывороток хранили при минус 20°C.
3
2
Для измерения титра вируснейтрализующих антител клетки 4647 растили в среде DMEM с 10% эмбриональной сывороткой коров в 6-луночных планшетах до получения 90-100% монослоя клеток. К 100 мкл сывороток крови мышей, последовательно разведенных с шагом пять - 1:5, 1:25, 1:125 и т.д., добавляли равный объем вирусной суспензии осповакцины штамм Л-ИВП с титром 10 БОЕ/мл в среде DMEM и инкубировали при 37°C в течение 1 час. 200 мкл смеси сывороток с ВОВ наносили на монослой клеток 4647, проводили сорбцию в течение часа, после чего добавляли 2 мл среды DMEM с 2% эмбриональной сыворотки коров, 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина на лунку и инкубировали 72 час при 37°C в атмосфере, содержащей 5% СО. Затем удаляли среду и добавляли 0,2% красителя кристаллического фиолетового, разведенного в 10% этаноле. Подсчитывали число бляшек и рассчитывали эффективность нейтрализации относительно числа бляшек в лунках без сывороток.
Пример 9. Оценка протективного иммунного ответа.
6
7
8
50
Для определения протективного иммунного ответа группы из 10 мышей линии BALB/c были инфицированы родительским кл. 14 Л-ИВП вируса осповакцины и тремя сериями вакцинного штамма 1421ABJCN в дозах 10, 10 и 10 БОЕ/мышь, подкожно, в объеме 100 мкл. Животные контрольной группы получали инъекцию физиологического раствора в том же объеме. Иммунизация проводилась дважды с интервалом в 28 дней. Спустя 28 дней после второй иммунизации штаммами вируса осповакцины мышей подвергали интраназальной инокуляции вирусом эктромелии с целью заражения через дыхательные пути. Для этого животных вводили в состояние легкого наркоза с помощью эфира. Затем, держа мышь за кожу шеи указательным и большим пальцами левой руки, а безымянным пальцем и мизинцем той же руки придерживая хвост и левую заднюю лапку, растягивали ее брюшком вверх. В этом положении вводили по 20 мкл суспензии ВЭ в каждую ноздрю с помощью микропипетки, согласно методике [Martinez M.J., Bray M.P., Huggins J.W. A mouse model o f aerosol-transmitted orthopoxviral disease: morphology of experimental aerosol-transmitted orthopoxviral disease in a cowpox virus-BALB/c mouse system. // Arch. Pathol. Lab. Med. - 2000. - V. 124. - P. 362-377]. Суммарный титр вируса, вводимого животному, составлял 10 LD/мышь. Животные контрольной группы получали инъекцию физиологического раствора в том же объеме. Наблюдение за мышами вели в течение двух недель, учитывая количество выживших и погибших животных.
50
50
2
3
4
5
Для определения LD мышей подвергали интраназальной инокуляции вирусом эктромелии, как описано выше. Титры вируса, вводимого каждой группе животных, составляли 10, 10, 10, 10, 10 БОЕ/мышь. Наблюдение за мышами вели в течение двух недель, учитывая количество выживших и погибших животных. Расчет летальной дозы, вызывающей гибель 50% животных (LD) вычисляли по методу Кербера.
Пример 10. Методы исследования остаточной вирулентности вакцинного штамма.
7
Мышам линии Balb/c в возрасте 6-8 недель с массой тела 14-16 г вводили препараты вируса осповакцины подкожно или внутрибрюшинно в объеме 0,1 мл на животное в область спины с помощью шприца на 1 мл с иглой 26G. Доза препаратов составляла 10 БОЕ/мышь, что соответствует иммунизирующей дозе вакцины. Животные контрольной группы получали инъекцию физиологического раствора в объеме 0,1 мл. Каждая экспериментальная группа состояла из 10 особей. Через 3, 7 и 14 сут после инъекции у мышей брали пробу крови из ретробульбарного венозного сплетения путем вырывания глаза с предварительной анестезией эфиром, после чего мышей подвергали эвтаназии методом цервикальной дислокации, стерильно извлекали селезенку, легкие, печень и головной мозг. Пробы одинаковых органов от трех мышей из одной группы помещали в одну пробирку и хранили при минус 70°C до титрования. Непосредственно перед титрованием пробы размораживали, гомогенизировали с последующим приготовлением 10% тканевой суспензии (на среде DMEM), затем после двух актов замораживания-оттаивания проводили озвучивание и центрифугирование (5000 об/мин, 10 мин, 4°C) полученного гомогената. После чего определяли концентрацию вирусов титрованием методом бляшек в монослое культуры клеток 4647. При определении остаточной вирулентности проводили три последовательных пассажа на культуре клеток 4647.
Пример 11. Методы исследования нейровирулентности вакцинного штамма.
4
2
Мышам-сосункам интрацеребрально вводили по 10 мкл вируса кл. 14 ЛИВП ВОВ и три серии вакцинного штамма 1421ABJCN в дозе 10 БОЕ/мл или 10 БОЕ/мышь. Через 3 сут после введения мышей подвергали эвтаназии методом цервикальной дислокации, стерильно извлекали пробы головного мозга, помещали в пробирку и хранили при минус 80°C до титрования. Непосредственно перед титрованием пробы размораживали, гомогенизировали с последующим приготовлением 10% тканевой суспензии (на среде DMEM), затем после трех актов замораживания-оттаивания проводили озвучивание и центрифугирование (5000 об/мин, 10 мин, 4°C) полученного гомогената. После чего определяли концентрации вирусов титрованием методом бляшек в монослое культуры клеток 4647, сравнивали исходный вакцинный и исследуемый штаммы.
Пример 12. Анализ данных.
50
Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с помощью программы Excel из пакета Microsoft Office 2010 (Microsoft Corp., USA). С использованием t-критерия Стьюдента оценивали обнаруженные межгрупповые различия. Расчет летальной дозы, вызывающей гибель 50% животных (LD), осуществляли по методу Кербера. Статистически значимыми результатами эксперимента считали значения при уровне значимости Ρ<0.05 (Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. - Гос. изд. мед. лит., Л. - 1962.- 186 с.).
Титры антител рассчитывали как среднее геометрическое в предположении, что элементы выборки распределены по логнормальному закону, и определяли его как -lg от наибольшего разведения сыворотки, при котором достигается 50% нейтрализация ВОВ ± стандартное отклонение.
Таким образом, результаты приведенных выше исследований демонстрируют возможность создания безопасной вакцины третьего поколения против натуральной оспы и предсказывают высокую вероятность защиты населения от возможных актов биотерроризма, связанных с применением вируса натуральной оспы, а также от вспышек заболеваний, обусловленных зоонозными ортопоксвирусами, при использовании кандидатной живой вакцины на основе заявляемого аттенуированного вируса осповакцины штамм Л-ИВП с пятью нарушенными генами вирулентности (1421ABJCN). В материалах заявки показано, что:
- штамм может быть использован в качестве живой культуральной аттенуированной вакцины против натуральной оспы и других ортопоксвирусов;
- штамм получен с помощью сконструированных авторами пяти плазмид интеграции - pMGCgpt-ΔA56R, pMGCgpt-ΔB8R, pMGCgpt-ΔJ2R, pMGCgpt-ΔC3L, pMGCgpt-ΔN1L с использованием методики временной доминантной селекции и выявлено, что метод временной доминантной селекции обеспечивает выход делеционных вариантов ВОВ с высокой частотой и все полученные делеционные варианты являются жизнеспособными и стабильно сохраняют генотип в течение 10 пассажей;
- в исследованиях для сравнения использован родительский (клон 14) кл. 14 вируса осповакцины, штамм Л-ИВП. Штамм получен методом клонирования вируса осповакцины, штамм Л-ИВП, который принят в России для производства классической противооспенной вакцины первого поколения;
- проведено изучение репликативных свойств полученных вариантов ВОВ в культуре клеток CV-1 путем определения динамики роста вируса. Полученные результаты позволяют заключить, что удаление выбранных генов вирулентности не влияет на продуктивные свойства вируса осповакцины на культурах клеток, что важно с точки зрения технологии наработки высокоаттенуированной противооспенной вакцины нового поколения;
- наработано три серии вакцинного штамма 1421ABJCN, который сохраняет стабильность и биологические свойства в течение исследуемых 10 пассажей. Образцы вакцинного штамма после 1-го, 5-го и 10-го пассажа прошли аттестацию в ОБТК ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» и имеют паспорта №84, №85, №86 от 23.10.2014 г. соответственно;
- в экспериментах на животных авторами было установлено, что препараты вакцинного штамма 1421ABJCN, полученные после 1-го, 5-го и 10-го пассажей на культуре клеток 4647, наравне с родительским вирусом осповакцины вызывают наработку высоких титров ВОВ-нейтрализующих антител и обеспечивают полную защиту животных против летальной дозы высокопатогенного вируса эктромелии, что свидетельствует о стабильности иммуногенных свойств вакцинного штамма 1421ABJCN в течение 10 пассажей, проведенных на культуре клеток 4647, а вируснейтрализующая активность сывороток крови животных, иммунизированных разными дозами вакцинного штамма 1421ABJCN, имеет дозозависимый характер для всех трех изученных серий вакцинного штамма;
- отсутствие вируса в исследуемых органах 8-10-недельных мышей линии Balb/c на 3, 7 и 14-е сутки после инъекции вакцинными штаммами осповакцины подкожно или внутрибрюшинно;
- динамика изменения веса тела у мышей, иммунизированных тремя сериями вакцинного штамма 1421ABJCN вируса осповакцины подкожно, не отличалась от родительского кл. 14 штамма Л-ИВП вируса осповакцины;
3
6
- выявлено снижение нейровирулентности трех серий вакцинного штамма 1421ABJCN на три порядка по сравнению с родительским ВОВ. Титр вакцинного штамма 1421ABJCN в головном мозге инфицированных новорожденных мышей на третьи сутки после интрацеребрального введения составил (0.93±0.35)×10 БОЕ/г органа, в то время как у родительского 14 кл. штамма Л-ИВП вируса осповакцины - (1.32±0.53)×10 БОЕ/г органа.