ПЛАЗМИДНЫЙ ВЕКТОР pHYP С ПОВЫШЕННОЙ СЕГРЕГАЦИОННОЙ СТАБИЛЬНОСТЬЮ ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА, БАКТЕРИЯ - ПРОДУЦЕНТ ПРЕДШЕСТВЕННИКА РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА
PLASMID VECTOR pHYP WITH HIGH SEGREGATION STABILITY FOR EXPRESSION OF RECOMBINANT PROTEIN, BACTERIUM - PRODUCENT OF PRECURSOR OF RECOMBINANT PROTEIN AND METHOD TO PRODUCE RECOMBINANT PROTEIN

Область изобретения.
Изобретение относится к области биотехнологии и генетической инженерии и представляет собой плазмидный вектор с увеличенной сегрегационной стабильностью для экспрессии рекомбинантных белков со слитым в рамке N-концевым лидерным пептидом.
Предшествующий уровень техники
Поскольку современные промышленные системы биосинтеза гетерологичных белков в бактериальных клетках предполагают использование сильных индуцируемых промоторов, существенным ограничением их продуктивности является недостаточная сегрегационная стабильность экспрессионных плазмид, то есть заметная вероятность потери бактериальной клеткой всех копий плазмиды при делении. Потеря частью клеток экспрессионной плазмиды и вызванное этим падение продуктивности системы экспрессии особенно заметно при проведении продолжительной индукции целевого гена и при культивации штамма-продуцента при недостаточной концентрации (или полного отсутствия) в среде селективного антибиотика.
Для повышения сегрегационной стабильности плазмид Е.coli был разработан ряд векторов, включающих системы «позитивной селекции», основанные на нарушении образования цитотоксического продукта при встраивании целевого фрагмента - MCS в области SacB [Pierce, J. С., В. Sauer, et al. (1992). "A positive selection vector for cloning high molecular weight DNA by the bacteriophage P1 system: improved cloning efficacy." Proc Natl Acad Sci USA 89(6): 2056-2060], gpE фага ФХ174 [Henrich, B. and R. Plapp (1986). "Use of the lysis gene of bacteriophage phi X174 for the construction of a positive selection vector." Gene 42(3): 345-349], pKG2 плазмида, несущая расщепляющую геномную ДНК рестриктазу под контролем LacUV5 промотора [Kuhn, I., F. H. Stephenson, et al. (1986). "Positive-selection vectors utilizing lethality of the EcoRI endonuclease." Gene 42(3): 253-263], CcdB и Kid [Bernard, P. and M. Couturier (1991). "The 41 carboxy-terminal residues of the miniF plasmid CcdA protein are sufficient to antagonize the killer activity of the CcdB protein." Mol Gen Genet 226(1-2): 297-304; [Gabant, P., T. Van Reeth, et al. (2000). "New positive selection system based on the parD (kis/kid) system of the R1 plasmid." Biotechniques 28(4): 784-788; патенты США 6180407, 7176029, 5910438 (Universite Libre de Bruxelles)]. Такие системы не могут быть использованы в высококопийных плазмидах из-за невозможности полностью подавить образование токсического продукта. Кроме того, плазмидные векторы, содержащие вышеуказанные гены и генетические локусы, пригодны для трансформации только специальных, совместимых с ними, штаммов Е.coli и содержат протяженные участки активно транскрибируемой нецелевой ДНК, уменьшающие продуктивность системы биосинтеза гетерологичных белков.
Другой, более пригодный для промышленного использования, тип систем сегрегационной стабилизации плазмид представляет собой пару транскрибируемых генов, кодируемых плазмидой - ген токсичного для клетки белка со стабильной мРНК и ген специфического антитоксина с нестабильной мРНК. Общие сведения о таких системах "токсин-антитоксин" приведены в работе Cooper Т, Paixao Т, Heinemaim JA. (Within-host competition selects for plasmid-encoded toxin-antitoxin systems, Proc. R. Soc. В October 22, 2010 277:3149-3155).
Среди систем токсин-антитоксин наибольший практический интерес представляет генетический локус Hok/Sok (другое название - parB) природной плазмиды Е.coli R1.
Локус Hok/Sok, впервые описанный в работе (The parB (hok/sok) Locus of Plasmid R1: A General Purpose Plasmid Stabilization System. Nature Biotechnology 6, 1402-1405 (1988)); состоит из гена hok, который кодирует 52 аминокислотный токсин, вызывающий диссипацию мембранного потенциала (механизм аналогичен действию белков лизиса бактериофагов - холинов (holin - от hole «дыра»), которые встраиваются в мембрану и образуют поры). Второй ген фрагмента - sok не имеет полипептидного продукта. Он кодирует лабильные антисмысловые РНК, препятствующие трансляции гена hok. Механизм процесса направленного блокирования работы гена hok описан в работе [Thisted Т, Sorensen NS, Gerdes K (1995). "Mechanism of post-segregational killing: secondary structure analysis of the entire Hok mRNA from plasmid R1 suggests a fold-back structure that prevents translation and antisense RNA binding". J. Mol. Biol. 247 (5): 859-73. PMID 7536849].
При делении клеток Е.coli и потере дочерней клеткой всех копий несущей локус Hok/Sok плазмиды в нее переходит долгоживущий белковый токсин Hok и его РНК, а также короткоживущие антитоксические РНК Sok, которые быстро деградируют, после чего клетка погибает. Некоторые штаммы Е.coli могут быть более устойчивы к токсическому действию Hok, чем другие, из-за присутствия в их геноме локусов, гомологичных Hok/Sok (PMID: 10361310). Вероятность гибели клеток, потерявших плазмиду, также зависит от исходной копийности плазмиды с локусом Hok/Sok и может зависеть от положения и ориентации локуса Hok/Sok относительно других транскрипционно активных участков плазмиды.
В ряде работ было описано применение локуса Hok/Sok для повышения сегрегационной стабильности плазмид, кодирующих гетерологичные белки, в том числе под сильным индуцируемым промотором (патент США 6413768), однако оптимальная копийность такой стабилизированной плазмиды и оптимальное положение локуса Hok/Sok относительно других участков векторной плазмиды, получаемой в ходе настоящей работы, оставалось неизвестным.
Важной стадией получения рекомбинантных белков является метод их очистки. Аффинная хроматография является одним из наиболее селективных методов очистки белков. Одна ступень аффинной очистки позволяет уменьшить уровень примесей в растворе целевого белка в тысячи раз. Стандартным методом аффинной очистки белков является применение сорбентов с ковалентно иммобилизованными антителами к очищаемому белку или искусственно добавленным к последовательности целевого белка специальным эпитопам антител - тэгам. Примерами таких эпитопов, к которым были получены коммерчески доступные моноклональные антитела, являются FLAG (Einhauer, A. and Jungbauer, A. (2001) The FLAG peptide, a versatile fusion tag for the purification of recombinant proteins. J. Biochem. Biophys. Methods 49, 455-465) и с-myc (Evan GI, Lewis GK, Ramsay G, Bishop JM. Isolation of monoclonal antibodies specific for human c-myc proto-oncogene product. Mol Cell Biol. 1985 Dec; 5(12):3610-6.).
Аффинная хроматография с использованием иммобилизованных антител или других иммобилизованных белков, способных образовывать прочные комплексы с белками-лигандами, имеет ряд существенных ограничений, препятствующих ее использованию при промышленном получении рекомбинантных белков в микробиологических системах экспрессии. Основным ограничением является высокая стоимость самих антител или других чистых белков и низкая стабильность полученных на их основе сорбентов. Также существенными ограничениями являются: невозможность регенерации и дезинфицирования сорбентов раствором гидроксида натрия, невозможность вести очистку денатурированных и восстановленных целевых белков, утечка иммуногенного лиганда, необходимость вести элюцию целевых белков кислыми или щелочными растворами.
Некоторые недостатки обычных вариантов аффинной хроматографии могут быть преодолены путем дериватизации поверхности хроматографического сорбента малыми химическими молекулами - лигандами белков, которые, в свою очередь, являются частью слитного с целевым белка и отделяются от целевого белка после аффинной очистки обработкой сайт-специфическими протеиназами. Такие сорбенты во многих случаях недороги в производстве и выдерживают обработку раствором гидроксида натрия. Типичные примеры систем - белок, связывающий мальтозу (maltose binding protein, MBP), глютатион-S-трансфераза (GST), белок, связывающий кальмодулин (calmodulin binding protein, CBP), strep II (STR). Прямое сравнение применимости данных систем для очистки слитных белков приведено в работе (Lichty JJ, Malecki JL, Agnew HD, Michelson-Horowitz DJ, Tan S. Comparison of affinity tags for protein purification. Protein Expr Purif. 2005 May; 41(1):98-105). Системы аффинной очистки из данной группы обладают двумя существенными и неустранимыми недостатками - неизбежным загрязнением целевого белка нерасщепленным слитным белком, содержащим иммуногенные белки-партнеры и падением продуктивности системы экспрессии из-за необходимости вести биосинтез больших количеств белка-партнера.
Единственным распространенным методом аффинной хроматографии, пригодным для разделения денатурированных белков, содержащих только короткий тэг, является металлохелатная хроматография. (металлоаффинная хроматография, Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography, IMAC), основанная на образовании координационных устойчивых комплексов между ионом переходного металла, координированного привитым к поверхности сорбента хелатирующим агентом, и двумя-тремя близкорасположенными остатками гистидина в составе очищаемого белка. (Porath J, Carlsson J, Olsson I, Belfrage G. Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation. Nature. 1975 Dec 18; 258(5536):598-9; Gaberc-Porekar V, Menart V. Perspectives of immobilized-metal affinity chromatography. J Biochem Biophys Methods. 2001 Oct 30;49(1-3):335-60). При проведении металлохелатной хроматографии в денатурирующих условиях сближение в пространстве остатков гистидина (или других аминокислот - доноров электронов), расположенных в различных местах полипептидной цепи, становится затруднительным и высокое сродство к сорбенту проявляют только белки, имеющие в своем составе искусственно созданные олигогистидиновые кластеры в составе тэгов.
Стандартным лигандом для металлохелатной хроматографии является пептид 6xHis (гексагистидиновый кластер), описанный в патенте США 4,569,794. Наиболее распространенный тип сорбента для металлохелатной хроматографии представляет собой иммобилизованные на поверхности декстрановых сферических гранул химические группы иминодиуксусной кислоты (IDA), другие коммерчески доступные сорбенты используют группы нитрилотриуксусной кислоты (NTA) или карбоксиметиласпартата.
Поскольку сверхэкспрессия гетерологичных белков в клетках Е.coli в большинстве случаев приводит к накоплению целевого белка в цитоплазме бактерий в нерастворимой форме и присутствию в составе целевого белка по крайней мере одного дополнительного N-концевого аминокислотного остатка, унифицированный набор методов биосинтеза, выделения, первичной очистки и ферментативного процессинга рекомбинантных белков медицинского применения, минимально зависящих от природы целевого белка (так называемая технологическая платформа) представляет большой практический интерес.
Предпочтительным вариантом реализации такой технологической платформы является применение короткого N-концевого тэга для аффинной очистки целевого белка в денатурирующих условиях и последующее отделение такого тэга от целевого белка при помощи рекомбинантной сайт-специфической протеиназы человека, то есть протеиназы, обладающей минимальной иммуногенностью. Примером такой протеиназы является фермент пищеварительного тракта энтерокиназа, а точнее ее легкая цепь, расщепляющая полипептидную цепь после сайта узнавания Asp-Asp-Asp-Asp-Lys- и перед любым аминокислотным остатком, кроме остатка пролина. В то же время, расположение кластера отрицательно заряженных аминокислотных остатков сайта узнавания энтерокиназы вблизи олигогистидинового кластера приводит к ослаблению взаимодействия олигогистидинового кластера с металлохелатным сорбентом.
В литературе описан ряд вариантов олигогистидиновых кластеров, обеспечивающих более плотное связывание очищаемых белков с поверхностью металлохелатного сорбента, чем первоначально описанный кластер 6xHis. В частности, относительно высокой аффинностью обладают кластеры, включающие 6-14 остатков гистидина, перемежающихся остатками заряженных или гидрофобных аминокислот и описанные в патентных заявках США 20100286070 и 20060030007. Существенным недостатком данных кластеров, а особенно их наиболее протяженных вариантов является появление в кодирующих эти кластеры плазмидных ДНК прямых повторов, уменьшающих стабильность плазмид. Другой известной альтернативой кластеру 6xHis является кластер MAT с последовательностью HNHRHKH, включающий положительно заряженные аминокислоты и описанный в патентной заявке США 20060257927, однако его аффинность к металлохелатным сорбентам при расположении вблизи кластера отрицательно заряженных аминокислот и проведении металлохелатной хроматографии в денатурирующих условиях неизвестна.
Подробное описание изобретения
Технической задачей, решаемой авторами настоящего изобретения, являлась разработка высокоэффективного экспрессионного вектора, обеспечивающего повышенную по сравнению с традиционно используемой копийность вектора при одновременной повышенной сегрегационной устойчивости при продолжительной индукции, позволяющей увеличить уровень продукции целевого белка путем проведения продуктивной индукции целевого гена в течение большего времени и начала индукции при более высокой плотности культуры, чем в общепринятых системах.
Другой технической задачей, решаемой авторами настоящего изобретения, являлось использование указанного выше вектора для экспрессии рекомбинантных белков, слитых в рамке с коротким N-концевым пептидом, с последующим обеспечением высокой эффективности очистки слитного белка методом металлохелатной хроматографии и последующим контролируемым отделением всех аминокислот указанного пептида сайт-специфичной протеиназой.
Еще одной технической задачей, решаемой в рамках настоящего изобретения, являлось определение минимальной длины олигогистидинового кластера, располагаемого в полипептидной цепи вблизи кластера отрицательно заряженных аминокислот и обладающего высокой аффинностью к металлохелатному сорбенту на основе хелатирующих групп иминодиуксусной кислоты при проведении хроматографии в денатурирующих условиях.
Технический результат достигался за счет создания плазмидного вектора на основе плазмиды рЕТ28а, содержащего делецию области элемента ограничения копийности (ROP), замену области, кодирующей дополнительный N-концевой пептид на область, кодирующую более эффективный пептид 10Е, содержащий 10 остатков гистидина и сайт узнавания энтерокиназы, а также содержащий элемент сегрегационной стабильности Hok/Sok, расположенный по ходу транскрипции целевого гена после терминатора транскрипции целевого гена и ориентированный таким образом, что направление транскрипции гена sok совпадает с направлением транскрипции целевого гена.
Вектор содержит следующие элементы, перечисленные в порядке расположения:
pBR322 ori - участок инициации репликации плазмиды;
lacI - ген репрессора лактозного оперона;
промотор;
N-leader - область, кодирующая N-концевой лидерный пептид, содержащий декагистидиновый кластер и, необязательно, сайт узнавания протеиназой;
участок клонирования (полилинкер);
участок терминации транскрипции;
фрагмент, кодирующий негеномную пару токсин-антитоксин - генетический элемент, обеспечивающий сегрегационную стабильность; и
ген, кодирующий маркер селекции.
Элементы вектора перечислены в порядке их расположения. Порядок расположения функциональных элементов является существенным для эффективной работы вектора.
L
tac
Промотором может быть любой сильный конститутивный или индуцибельный промотор, функционирующий в бактериальной клетке, например промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7, P, P, но не ограничивается ими. Промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7 является предпочтительным.
N-leader - это область, кодирующая N-концевой лидерный пептид, содержащий декагистидиновый кластер и, необязательно, сайт узнавания протеиназой.
Наличие декагистидинового кластера позволяет проводить металлохелатную хроматографию предшественника целевого рекомбинантного белка.
Наличие сайта протеиназы в N-концевом лидерном пептиде предшественника целевого рекомбинантного белка является необходимым. Указанный сайт позволяет проводить отделение N-концевого лидерного пептида. Однако наличие фрагмента, кодирующего сайт узнавания протеиназой, в описанном выше векторе не является обязательным. Указанный фрагмент, кодирующий сайт узнавания протеиназой, может быть внедрен в конструкцию для экспрессии предшественника целевого белка вместе с открытой рамкой считывания (ОРС) целевого белка. Для этого используют адапторные праймеры, один из которых содержит подходящий сайт рестрикции для клонирования, фрагмент, кодирующий сайт узнавания протеиназой, расположенный в одной рамке считывания рядом с первой аминокислотой целевого белка, либо непосредственно перед ней, и участок, идентичный 5′-области ОРС целевого белка; а второй праймер содержит подходящий сайт рестрикции для клонирования, и участок, комплементарный 3′-области ОРС целевого белка. Фрагмент ДНК, содержащий фрагмент, кодирующий сайт узнавания протеиназой, и ОРС целевого белка, может быть получен методом ПЦР с использованием описанных выше адапторных праймеров.
Дизайн таких адапторных праймеров для конкретного целевого гена является рутинной процедурой и специалист в данной области техники с легкостью может сконструировать и синтезировать подобные праймеры.
В случае, когда фрагмент, кодирующий сайт узнавания протеиназой, находится в описанном выше векторе (в области N-leader), OPC целевого белка лигируют в указанный вектор так, чтобы N-leader и OPC были в одной рамке считывания. Экспрессия гена целевого белка в полученной плазмиде приводит к образованию предшественника, расщепление которого протеиназой приводит к образованию целевого белка, содержащего несколько дополнительных аминокислот на N-конце.
В случае, когда фрагмент, кодирующий сайт узнавания протеиназой, расположенный непосредственно перед первой аминокислотой целевого белка, лигируют в составе фрагмента, содержащего OPC целевого белка и полученного с использованием адапторных праймеров как описано выше, экспрессия гена целевого белка в полученной плазмиде приводит к образованию предшественника, расщепление которого протеиназой приводит к образованию целевого белка, не содержащего никаких дополнительных аминокислот на N-конце. Подобный подход позволяет получать нативные целевые белки, которые могут быть использованы для терапевтических целей.
В качестве специфической протеиназы, используемой для отщепления лидерного пептида от полученного гибридного белка после его очистки методом металлохелатной хроматографии, может быть использована энетерокиназа человека, энтерокиназа крупного рогатого скота, специфические протеиназы человека тромбин, фактор Ха, специфическая протеиназа вируса гравировки табака TEV, спцифическая протеиназа риновируса человека HRV3C (для продукции терапевтических белков предпочтительно использовать специфические протеиназы человека, так как примеси гетерологичных белков в терапевтическом белке будут иммуногенны). Однако специфические протеиназы не ограничиваются только указанными протеиназами.
Участком терминации транскрипции может быть участок терминации транскрипции бактериофага Т7 (T7term), участки терминации транскрипции Е.coli rrnC, rrnBt1 и rrnBt2, последовательность вируса везикулярного стоматита VSV, гена препропаратиреоидного гормона человека (РТН)), но не ограничивается ими. Участок терминации транскрипции бактериофага Т7 (T7term) является предпочтительным.
Примерами негеномных пар токсин-антитоксин является система hok/sok стабилизирующая плазмиду R1 в Е.coli, система FlmA/FlmB, гомолог hok/sok, стабилизирующая плазмиду F в Е.coli, и подобные им. Система hok/sok является предпочтительной.
В качестве маркера селекции может использоваться ген устойчивости к антибиотику, например, канамицину, ампициллину, тетрациклину, хлорамфениколу, но не ограничивается ими. Ген устойчивости к канамицину является предпочтительным.
Конкретным воплощением вектора согласно настоящему изобретению является вектор pHYP, в котором указанным промотором является промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7, участком терминации транскрипции является участок терминации транскрипции бактериофага Т7, сайт узнавания специфической протеиназы представляет собой сайт узнавания энтерокиназы, а геном, кодирующим селекционный маркер, является ген устойчивости к канамицину.
Вектор состоит из 5151 по и содержит уникальные (то есть единственные) сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции: XhoI (529), HindIII (544), NheI (602).
Функциональная схема вектора с указанием координат функциональных элементов представлена на Фиг.9, а полная нуклеотидная последовательность этого вектора представлена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:40. Вектор был получен с использованием стандартных методов генной инженерии и химически синтезированных олигонуклеотидов [Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning. 2nd ed. New York, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1989].
При помощи созданного вектора можно трансформировать бактериальную клетку, предпочтительно бактерию, принадлежащей к роду Escherichia, восприимчивую к подобной трансформации указанным вектором. Выбор конкретной клетки не является критическим, поскольку методология и приемы трансформации хорошо известны специалисту в данной области техники.
«Трансформация клетки вектором» означает введение вектора в клетку с помощью методов, хорошо известных специалисту в данной области техники. Трансформация этой плазмидой приводит к экспрессии гена, кодирующего белок, и к синтезу белка в бактериальной клетке. Методы трансформации включают любые стандартные методы, известные специалисту в данной области техники, например метод, описанный в Jac A. Nickoloff, Electroporation Protocols for Microorganisms (Methods in Molecular Biology) // Humana Press; 1st edition (August 15, 1995).
Согласно настоящему изобретению, «бактериальная клетка - продуцент предшественника рекомбинантного белка» означает бактериальную клетку, обладающую способностью к продукции и накоплению предшественника рекомбинантного белка, содержащего декагистидиновый кластер и сайт узнавания энтерокиназы, когда бактериальная клетка согласно настоящему изобретению выращивается в указанной питательной среде. Указанный предшественник рекомбинантного белка может накапливаться в указанной клетке предпочтительно в виде телец включения.
Термин «бактерия, принадлежащая к роду Escherichia» может означать, что бактерия относится к роду Escherichia в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. В качестве примера микроорганизма, принадлежащего к роду Escherichia, может быть упомянута бактерия Escherichia coli (Е.coli).
Круг бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, не ограничен каким-либо образом, однако, например, бактерии, описанные в книге Neidhardt, F.C. et al. (Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Таблица 1), могут быть приведены в качестве примеров.
Конкретным примером штамма - реципиента согласно настоящему изобретению является штамм Escherichia coli BL21[DE3], но круг подходящих штаммов не ограничивается им.
Способ согласно настоящему изобретению включает культивирование в подходящей питательной среде бактерии, содержащей описанный выше вектор, содержащий целевой ген, кодирующий целевой рекомбинантный белок, слитый с N-концевым пептидом, содержащим декагистидиновый кластер и сайт узнавания протеиназой человека; очистку слитного белка методом металлохелатной хроматографии; и отделение пептида от целевого рекомбинантного белка с использованием сайт-специфичной протеиназы человека.
Особенности полученного вектора, экспрессионных плазмид на его основе, промежуточных плазмид и результаты их практического применения приведены на следующих Фигурах.
Краткое описание Фигур
-
-
-
На Фигуре 1 показана схема получения плазмид р6Е, р8Е, рМЕ, p10E, p10E-HU, р10Е-HD, p10E-HDR, p10Erop, p10E-HUrop, pHYP, p10E-HDRrop. Обозначения: пунктирной линией обозначены стадии ПЦР, сплошной линией обозначены стадии рестрикции-лигирования, эндонуклеазы рестрикции, использовавшиеся для клонирования указаны под названием плазмид, HS-PCR - продукт ПЦР, кодирующий участок hok/sok (host killing/suppressor of killing) природной плазмиды R1 Escherichia coli.
На Фигуре 2 показана карта экспрессионной плазмиды р10Е. Используются следующие обозначения: «pBR322ori» область начала репликации плазмиды pBR322; «ROP» - ген РНК-организующего белка Rop; «f1 ori» - участок инициации репликации бактериофага f1; «KanR2» - последовательность, кодирующая аминогликозид-3'-фосфотрансферазу, обеспечивающую устойчивость бактерий к канамицину; «Т7 prom» - промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7; «T7term» - участок терминации транскрипции; «lacI» - последовательность, кодирующая репрессор лактозного оперона; «N-leader» - открытая рамка считывания (ОРС) N-концевого лидерного, содержащий декагистидиновый кластер. Стрелками указаны направления транскрипции генов, в скобках указаны номера первого и последнего нуклеотидов фрагментов. Курсивом выделены сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, в скобках указаны номера нуклеотидов в точках разрезания.
На Фигуре 3 показана карта экспрессионной плазмиды p10E-HU. Используются следующие обозначения: «pBR322ori» область начала репликации плазмиды pBR322; «ROP» - ген РНК-организующего белка Rop; «f1 ori» - участок инициации репликации бактериофага f1; «KanR2» - последовательность, кодирующая аминогликозид-3′-фосфотрансферазу, обеспечивающую устойчивость бактерий к канамицину; «Т7 prom» - промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7; «T7term» - участок терминации транскрипции; «lacI» - последовательность, кодирующая репрессор лактозного оперона; «N-leader» - открытая рамка считывания (ОРС) N-концевого лидерного, содержащий декагистидиновый кластер. Hok/Sok - участок hok/sok (host killing/suppressor of killing) природной плазмиды R1 Escherichia coli; Hok - продукт гена hok (токсин), Sok - продукт гена sok. Стрелками указаны направления транскрипции генов, в скобках указаны номера первого и последнего нуклеотидов фрагментов. Курсивом выделены сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, в скобках указаны номера нуклеотидов в точках разрезания.
На Фигуре 4 показана карта экспрессионной плазмиды p10E-HD. Используются следующие обозначения: «pBR322ori» область начала репликации плазмиды pBR322; «ROP» - ген РНК-организующего белка Rop; «KanR2» - последовательность, кодирующая аминогликозид-3'-фосфотрансферазу, обеспечивающую устойчивость бактерий к канамицину; «Т7 prom» - промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7; «T7term» - участок терминации транскрипции; «lacI» - последовательность, кодирующая репрессор лактозного оперона; «N-leader» - открытая рамка считывания (OPC) N-концевого лидерного, содержащий декагистидиновый кластер. Hok/Sok - участок hok/sok (host killing/suppressor of killing) природной плазмиды R1 Escherichia coli; Hok - продукт гена hok (токсин), Sok - продукт гена sok. Стрелками указаны направления транскрипции генов, в скобках указаны номера первого и последнего нуклеотидов фрагментов. Курсивом выделены сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, в скобках указаны номера нуклеотидов в точках разрезания.
На Фигуре 5 показана карта экспрессионной плазмиды p10E-HDR. Используются следующие обозначения: «pBR322ori» область начала репликации плазмиды pBR322; «ROP» - ген РНК-организующего белка Rop; «KanR2» - последовательность, кодирующая аминогликозид-3'-фосфотрансферазу, обеспечивающую устойчивость бактерий к канамицину; «Т7 prom» - промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7; «T7term» - участок терминации транскрипции; «laci»-последовательность, кодирующая репрессор лактозного оперона; «N-leader» - открытая рамка считывания (OPC) N-концевого лидерного, содержащий декагистидиновый кластер. Hok/Sok - участок hok/sok (host killing/suppressor of killing) природной плазмиды R1 Escherichia coli; Hok - продукт гена hok (токсин), Sok - продукт гена sok. Стрелками указаны направления транскрипции генов, в скобках указаны номера первого и последнего нуклеотидов фрагментов. Курсивом выделены сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, в скобках указаны номера нуклеотидов в точках разрезания.
На Фигуре 6 показана карта экспрессионной плазмиды p10Erop-. Используются следующие обозначения: «pBR322ori» область начала репликации плазмиды pBR322; «KanR2» - последовательность, кодирующая аминогликозид-3'-фосфотрансферазу, обеспечивающую устойчивость бактерий к канамицину; «Т7 prom» - промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7; «T7term» - участок терминации транскрипции; «lacI»-последовательность, кодирующая репрессор лактозного оперона; «N-leader» - открытая рамка считывания (OPC) N-концевого лидерного, содержащий декагистидиновый кластер. Hok/Sok - участок hok/sok (host killing/suppressor of killing) природной плазмиды R1 Escherichia coli; Hok - продукт гена hok (токсин), Sok - продукт гена sok. Стрелками указаны направления транскрипции генов, в скобках указаны номера первого и последнего нуклеотидов фрагментов. Курсивом выделены сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, в скобках указаны номера нуклеотидов в точках разрезания.
На Фигуре 7 показана карта экспрессионной плазмиды p10E-HUrop-. Используются следующие обозначения: «pBR322ori» область начала репликации плазмиды pBR322; «KanR2» - последовательность, кодирующая аминогликозид-3'-фосфотрансферазу, обеспечивающую устойчивость бактерий к канамицину; «Т7 prom» - промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7; «T7term» - участок терминации транскрипции; «lacI» - последовательность, кодирующая репрессор лактозного оперона; «N-leader» - открытая рамка считывания (ОРС) N-концевого лидерного, содержащий декагистидиновый кластер. Hok/Sok - участок hok/sok (host killing/suppressor of killing) природной плазмиды R1 Escherichia coli; Hok - продукт гена hok (токсин), Sok - продукт гена sok. Стрелками указаны направления транскрипции генов, в скобках указаны номера первого и последнего нуклеотидов фрагментов. Курсивом выделены сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, в скобках указаны номера нуклеотидов в точках разрезания.
На Фигуре 8 показана карта экспрессионной плазмиды p10E-HDrop-. Используются следующие обозначения: «pBR322ori» область начала репликации плазмиды pBR322; «KanR2» - последовательность, кодирующая аминогликозид-3'-фосфотрансферазу, обеспечивающую устойчивость бактерий к канамицину; «Т7 prom» - промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7; «T7term» - участок терминации транскрипции; «lacI» - последовательность, кодирующая репрессор лактозного оперона; «N-leader» - открытая рамка считывания (ОРС) N-концевого лидерного, содержащий декагистидиновый кластер. Hok/Sok - участок hok/sok (host killing/suppressor of killing) природной плазмиды R1 Escherichia coli; Hok - продукт гена hok (токсин), Sok - продукт гена sok. Стрелками указаны направления транскрипции генов, в скобках указаны номера первого и последнего нуклеотидов фрагментов. Курсивом выделены сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, в скобках указаны номера нуклеотидов в точках разрезания.
На Фигуре 9 показана карта экспрессионной плазмиды pHYP. Используются следующие обозначения: «pBR322ori» область начала репликации плазмиды pBR322; «KanR2» - последовательность, кодирующая аминогликозид-3'-фосфотрансферазу, обеспечивающую устойчивость бактерий к канамицину; «Т7 prom» - промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7; «T7term» - участок терминации транскрипции; «lacI» - последовательность, кодирующая репрессор лактозного оперона; «N-leader» - открытая рамка считывания (ОРС) N-концевого лидерного, содержащий декагистидиновый кластер. Hok/Sok - участок hok/sok (host killing/suppressor of killing) природной плазмиды R1 Escherichia coli; Hok - продукт гена hok (токсин), Sok - продукт гена sok. Стрелками указаны направления транскрипции генов, в скобках указаны номера первого и последнего нуклеотидов фрагментов. Курсивом выделены сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, в скобках указаны номера нуклеотидов в точках разрезания.
+
На Фигуре 10 представлены результаты измерения доли клеток, содержащих ROP плазмиды после 8 и 24 ч индукции 2 мМ ИПТГ. Число независимых экспериментов 7-12, приведены доверительные интервалы для р=0,05.
+
На Фигуре 11 представлены результаты измерения доли клеток, содержащих ROP плазмиды без вставки после 24 ч индукции 0,2 мМ ИПТГ. Число независимых экспериментов 3-4, приведены доверительные интервалы для р=0,05.
-
На Фигуре 12 представлены результаты измерения доли клеток, содержащих ROP плазмиды без вставки после 24 ч индукции 0,2 мМ ИПТГ. Число независимых экспериментов 3-4, приведены доверительные интервалы для р=0,05.
Сущность и промышленная применимость настоящего изобретения иллюстрируются следующими примерами.
Пример 1. Получение плазмиды pAL-HS
Участок hok/sok(host killing/suppressor of killing) природной плазмиды R1 Escherichia coli, последовательность которого депонирована в публичной базе данных GeneBank (GenBank X05813), получали методом полимеразной цепной реакции с использованием синтетических олигонуклеотидов AS-HOS-F5 (SEQ ID NO:1); AS-HOS-F4 (SEQ ID NO:2); AS-HOS-F3 (SEQ ID NO:3); AS-HOS-F2 (SEQ ID NO:4); AS-HOS-F1 (SEQ ID NO:5); AS-HOS-R1 (SEQ ID NO:6); AS-HOS-R2 (SEQ ID NO:7); AS-HOS-R3 (SEQ ID NO:8); AS-HOS-R4 (SEQ ID NO:9); AS-HOS-R5 (SEQ ID NO:10) на приборе Терцик МС2 («ДНК-технология», Россия). Нуклеотидные последовательности праймеров 5'-3':
Участок hok/sok плазмиды R1 E coli (GenBank X05813) представлен в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:11.
Ген hok кодирует 52 аминокислотный полипептидный токсин (SEQ ID NO:12), вызывающий диссипацию мембранного потенциала и имеющий стабильную мРНК, тогда как транскрипция гена "антитоксина" sok приводит к появлению короткоживущих коротких антисмысловых РНК, связывающихся с мРНК гена hok и препятствующих его трансляции. При потере бактериальной клеткой плазмиды, содержащей локус Hok/Sok, происходит прекращение транскрипции элемента sok и быстрый распад его мРНК и восстановление трансляции долгоживущей мРНК гена Hok, приводящее к смерти бактериальной клетки.
Последовательность ПЦР-продукта, содержащего участок hok/sok плазмиды R1 E.coli, приведена в списке последовательностей под номером SEQ ID NO:13. Внешние праймеры AS-HOS-F5 (SEQ ID NO:1) и AS-HOS-R5 (SEQ ID NO:10) содержат сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции PspCI, BamHI, SphI.
Продукт полимеразной цепной очищали из 1% агарозного геля набором Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System" (Promega, США) по протоколу производителя. Очищенные продукты лигировали в плазмиду PAL-TA (ЗАО Евроген, Россия) ДНК-лигазой фага Т4 (Fermentas, Литва). Лигирование вели в объеме 10 или 20 мкл, при молярном соотношении вектора и вставки 1:10, в течение 2-20 часов при комнатной температуре. Полученными лигазными смесями трансформировали клетки Е.coli штамма DH5α и высевали на твердую агаризованную среду, содержащую ампициллин в концентрации 100 мкг/1 мл агара, и помещали в термостат на 18 часов при 37 С. Колонии Е.coli, отобранные в результате бело-голубого скрининга, анализировали методом ПЦР с клонов, с использованием праймеров к последовательностям реципиентной плазмиды M13rev (SEQ ID NO:14) и M13dir (SEQ ID NO:15). Отобранные клоны наращивали в 5 мл питательного бульона 2xYT-Amp и выделяли плазмидную ДНК набором GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Fermentas, Литва) по протоколу производителя. Для полученных конструкций PAL-HS определяли нуклеотидную последовательность методом ПЦР-секвенирования с использованием праймеров к последовательности вектора SP6 (SEQ ID NO:16) и T7prom (SEQ ID NO:17).
Пример 2. Получение экспрессионных плазмид р6Е, р8Е, рМЕ, р10Е и сравнение свойств лидерных пептидов при металлохелатной хроматографии в денатурирующих условиях
Последовательности, кодирующие фрагменты N-концевых дополнительных пептидов (тэгов) 6Е (SEQ ID NO:18), 8Е (SEQ ID NO:19), 10E (SEQ ID NO:20), MAT (SEQ ID NO:21), получали методом отжига двух частично комплементарных олигонуклеотидов с образованием выступающих «липких» 5′-концов. Для этого вносили в пробирку соответствующие пары олигонуклеотидов, по 100 пмоль каждого в общем объеме 10 мкл, нагревали до 95°С и медленно охлаждали до комнатной температуры.
Для получения тэга 6Е использовали праймеры AD-6H-NcoF (SEQ ID NO:22) и AD-6H-NheR (SEQ ID NO:23); для получения тэга 8Е использовали праймеры AD-8H-NcoF (SEQ ID NO:24) и AD-8H-NheR (SEQ ID NO:25); для получения тэга 10E использовали праймеры AD-10H-NcoF (SEQ ID NO:26) и AD-10H-NheR (SEQ ID NO:27); для получения тэга MAT использовали праймеры AD-MAT-NcoF (SEQ ID NO:28) и AD-MAT-NheR (SEQ ID NO:29).
Реципиентную плазмиду рЕТ28а (+) (Novagen, США) расщепляли последовательно эндонуклеазами NcoI и NheI. Для этого две акликвоты по 0,5 мкг очищенной плазмиды инкубировали 2 часа в водном термостате при 37°C с одной из двух эндонуклеаз рестрикции, контролировали электрофорезом в агарозном геле полноту линеаризации плазмид, после чего добавляли вторую рестриктазу и инкубировали еще 2 часа. Затем образцы объединяли, рестриктазы инактивировали прогреванием при 65°С в течение 20 минут. Расщепленную рестриктазами плазмиду обрабатывали равным объемом смеси фенол-хлороформ 1:1 и переосаждали водную фазу тремя объемами охлажденного этанола. Центрифугировали 10 минут на скорости 13200 об/мин при комнатной температуре, промывали осадок 70% раствором этанола, растворяли в воде и использовали для постановки реакции дотирования в рабочей концентрации 10 нг/мкл, вставки - соответствующие дуплексы олигонуклеотидов использовали в молярном соотношении вектор:вставка 1:10. Реакцию вели с использованием Т4 ДНК лигазы (Fermentas, Литва) по методике производителя. Инактивировали лигазу прогреванием реакционной смеси 20 мин при +65°С и проводили трансформацию компетентных клеток Е.coli штамма DH5α по методике, приведенной в [Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning. 2nd ed. New York, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1989]. Выращивали колонии трансформантов Е.coli на агаризованной среде, содержащей 30 мкг/мл канамицина и анализировали колонии методом "ПЦР с клонов", с использованием олигонуклеотидов T7t (SEQ ID NO:30) и T7prom (SEQ ID NO:17). Отобранные колонии, содержащие вставку ожидаемого размера, использовали для инокуляции жидких культур по 5 мл питательного бульона 2xYT-канамицин, выделяли плазмидные ДНК набором GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Fermentas, Литва) по протоколу производителя и определяли нуклеотидную последовательность для области вставки методом ПЦР-секвенирования с использованием праймера T7t (SEQ ID NO:30).
Последовательности полученных векторов р6Е, р8Е, р10Е, рМЕ представлены в Перечне последовательностей под номерами SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34 соответственно.
Для проверки свойств кодируемых векторами N-концевых пептидов были получены экспрессионные плазмиды, кодирующие синтетический ген делеционного варианта тканевого активатора плазминогена человека, содержащий 355 из 527 аминокислот природного ТАП человека (аминокислоты 1-3 и 176-527) и сайт расщепления энтерокиназой (SEQ ID NO:43), слитый в рамке с соответствующими пептидами.
Экспресионную плазмиду p10E-tPA получали, как описано в Справочном примере, приведенном ниже, плазмиды p6E-tPA, p8E-tPA и pME-tPA получали аналогично p10E-tPA. Для всех четырех полученных плазмид проводили секвенирование области вставки, в дальнейшей работе использовали клоны, не содержащие точечных мутаций.
Получали штаммы-продуценты слитных белков путем трансформации экспрессионных плазмид в клетки штамма BL21[DE3] (Novagen, США) методом электропорации. Проводили аналитические экспрессии целевых генов. Во всех четырех случаях большая часть целевых белков накапливалась в нерастворимой форме в составе телец включения, уровни экспрессии генов не имели существенных отличий. Препараты телец включения для четырех целевых слитных белков 6E-tPA, ME-tPA, 8E-tPA, 10Е-tPA - продуцируемых штаммами BL21[DE3]/p6E-tPA, BL21[DE3]/pME-tPA, BL21[DE3]/p8E-tPA, BL21[DE3]/p10E-tPA, соответственно, получали следующим образом. Отделяли осадки биомассы центрифугированием, осадки клеток ресуспендировали в 20 мл раствора А (50 мМ Трис рН 7,4 2 мМ ЭДТА), добавляли лизоцим до 10 мкг/мл и Тритон X100 до 0,1%, инкубировали 30 мин на льду. Проводили разрушение клеток и геномной ДНК при помощи ультразвукового диспергатора пульсами по 10 с до исчезновения повышенной вязкости суспензии. Отделяли осадки центрифугированием 10 мин при 18000 об/мин. Осадки ресуспендировали в 20 мл раствора А, добавляли детергент NP-40 до 1%, суспензии обрабатывали ультразвуковым диспергатором до исчезновения частиц осадка крупнее 1 мм, отделяли тельца включения центрифугированием 10 мин при 20000 об/мин. Полученные осадки телец включения ресуспендировали в растворе А, добавляли NaCl до 500 мМ, суспензию обрабатывали ультразвуковым диспергатором до исчезновения частиц осадка крупнее 1 мм, отделяли осадок центрифугированием 10 мин при 20000 об/мин. Полученные препараты обогащенных телец включения хранили при -70°С.
Солюбилизировали навески по 50 мг телец включения каждого из вариантов белка в растворе 6М гуанидина гидрохлорида, 50 мМ Трис-HCl, 50 мМ β-меркаптоэтанола, рН=8,0. Инкубировали 10% суспензии телец включения 30 мин при +37°С при перемешивании и отделяли осадок клеточного дебриса центрифугированием. Готовили к работе колонку для металлохелатной хроматографии 1 мл HisTrap (GE Healthcare, США), содержащую агарозный сорбент с привитыми группами иминодиуксусной кислоты (IDA) и иммобилизованными ионами никеля. Колонку уравновешивали раствором А, содержащим 6М гуанидина гидрохлорида, 50 мМ Трис-HCl, 5 мМ β-меркаптоэтанола, рН=7,5 и наносили растворы соответствующих слитных белков на скорости потока 0,2 мл/мин. Собирали фракцию не связавшихся с колонкой белков и промывали колонку раствором А до стабилизации базовой линии детектора (около 10 объемов колонки) на скорости потока 1 мл/мин. Проводили ступенчатую элюцию белков порциями по 5 мл растворов, содержащих 50, 100, 200, 500 мМ имидазола в растворе А, рН=7,5. Собирали элюаты и удаляли иммобилизованные ионы никеля (и координированные ими белковые молекулы) с колонки 5 мл раствора А, дополнительно содержащего 50 мМ ЭДТА-Na, элюат собирали.
Проводили осаждение белков из растворов гуанидина гидрохлорида для проведения ДСН-ПААГ анализа белков, для этого к равным аликвотам всех элюатов и эквивалентной им аликвоте фракции проскока добавляли трихлоруксусную кислоту до 7%, перемешивали растворы, инкубировали 30 мин при комнатной температуре, отделяли осадки белков центрифугированием, дважды промывали осадки охлажденным ацетоном и подсушивали осадки при комнатной температуре.
Проводили ДСН-ПААГ анализ белковых фракций, гель окрашивали коллоидным раствором Кумасси синего (Fermentas, Литва), отмывали избыток красителя очищенной водой и определяли содержание белков в пластине геля методом денситометрии при помощи планшетного сканера в просвечивающем режиме. Полученное цифровое изображение геля с глубиной цвета 16 бит/канал анализировали с помощью программы TotalLab (Nonlinear Dynamics, Великобритания) и определяли объемы пиков, соответствующих полосам целевого белка во фракциях. Распределение целевого белка во фракциях для исследуемых тэгов приведено в таблице 1.
Таблица 1
Доля целевых белков во фракциях элюции при металлохелатной хроматографии в денатурирующих условиях.
Продукт экспрессии
6E-tPA
ME-tPA
8E-tPA
10Е-tPA
Элюция 50 мМ имидазола
37,3%
16,0%
2,3%
1,2%
Элюция 100 мМ имидазола
20,8%
22,7%
1,0%
3,0%
Элюция 200 мМ имидазола
27,7%
29,1%
19,5%
15,6%
Элюция 500 мМ имидазола
7,3%
27,2%
71,1%
72,5%
Элюция ЭДТА
6,9%
5,0%
6,1%
7,7%
Было установлено, что наибольшей устойчивостью к элюции возрастающими концентрациями имидазола обладает белок 10EtPA, при этом доля целевого белка, не элюированного 500 мМ имидазола и элюировавшаяся при удалении иммобилизованных ионов никеля при помощи ЭДТА, практически не зависит от длины и типа олигогистидинового кластера и остается незначительной. Поскольку большая часть видимых на геле белков Е.coli, связывающихся с металлохелатным сорбентом в денатурирующих условиях, элюируется при концентрации имидазола до 200 мМ включительно, предпочтительным вариантом очистки целевых белков является элюция примесных белков при концентрации имидазола 200 мМ и последующая элюция целевого белка при концентрации имидазола 500 мМ. При таком режиме хроматографии наилучший выход фиксируется для белков с тэгом 10Е.
Для верификации полученных данных был получен штамм-продуцент, кодирующий tPA без тэга, но с дополнительным остатком метионина на N-конце белка. При проведении металлохелатной хроматографии в денатурирующих условиях для данного белка была установлено, что целевой белок не связывается с металлохелатным сорбентом и целиком обнаруживается во фракции несвязавшихся белков. Таким образом, собственные свойства денатурированного полипептида tPA с восстановленными дисульфидными связями не влияют значимым образом на связывание слитных белков с металлохелатной колонкой.
Предположительно, при использовании тэгов, не содержащих кластер кислых аминокислот (сайт узнавания энтерокиназы DDDDK) вблизи олигогистидинового кластера, профиль элюции полипептидов с олигогистидиновыми кластерами различной длины будет отличаться от приведенного выше и устойчивость слитных белков к элюции может возрасти вплоть до невозможности провести элюцию целевого белка раствором с 500 мМ имидазола.
Пример 3. Получение векторных плазмид p10E-HU, p10E-HD, p10E-HDR и сравнение их сегрегационной стабильности
Для получения вектора p10E-HU реципиентную плазмиду р10Е расщепляли эндонуклеазами BglII и SphI. Донорную плазмиду PAL-HS, расщепляли эндонуклеазами BamHI и SphI. Продукты рестрикции выделяли из 1% агарозного геля набором WizardSV Gel and PCR Cean-Up System (Promega, США), после чего лигировали Т4 ДНК лигазой и трансформировали клетки Е.coli штамма DH5a. Колонии E.coli анализировали методом ПЦР с клонов, с использованием олигонуклеотидов AS-HOS-F5 (SEQ ID NO:1) и AS-HOS-R5 (SEQ ID NO:10). Отобранные клоны наращивали в 5 мл 2xYT-Kan, выделяли плазмидную ДНК набором GeneJET Plasmid Miniprep Kit. Последовательность p10EHU определяли методом ПЦР-секвенирования с использованием праймера T7t (SEQ ID NO:30).
Для получения векторов p10E-HD и p10E-HDR реципиентную плазмиду р10Е расщепляли эндонуклеазой PsiI. Донорную плазмиду PAL-HS, расщепляли эндонуклеазой PspCI (Fermentas, Литва). Продукты рестрикции выделяли из 1% агарозного геля, дотировали и трансформировали клетки Е.coli штамма DH5α, как описано выше. Колонии Е.coli анализировали методом ПЦР с клонов, с использованием олигонуклеотидов AS-HOS-F5 (SEQ ID NO:1) и AS-HOS-R5 (SEQ ID NO:10). Для определения ориентации вставки при первичном скрининге клонов использовали ПЦР с праймеров T7prom (SEQ ID NO:17) и AS-HOS-F5 (SEQ ID NO:1) или AS-HOS-R5 (SEQ ID NO:10). Плазмида p10E-HD содержала вставку в прямой ориентации, плазмида p10E-HDR - в обратной ориентации. Отобранные клоны наращивали в 5 мл питательного бульона 2xYT-Kan, выделяли плазмидную ДНК набором Gene JET Plasmid Miniprep Kit. Последовательность p10EHD и p10EHDR определяли методом ПЦР-секвенирования с использованием праймера T7prom (SEQ ID NO:17).
Последовательности полученных плазмид p10E-HU, p10E-HD, p10E-HDR представлены в Перечне последовательностей под номерами SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37 соответственно. Плазмиды различаются между собой положением и ориентации локуса сегрегационной стабилизации Hok/Sok. Поскольку локус находится вблизи активных промоторов Т7, lac и kanR, было предположено, что инициированная этими промоторами транскрипция участков плазмидной ДНК, захватывающих область вставки локуса Hok/Sok, может существенно повлиять на относительный уровень транскрипции генов hok и sokSok и, таким образом, изменять свойства локуса.
Для сравнения сегрегационной стабильности полученных плазмид в них клонировали вставку малотоксичного для E.coli белка делеционного варианта тканевого активатора плазминогена с дополнительным N-концевым тэгом 10Е (tPA). Клонирование минигена tPA в созданные вектора проводили, как указано в примере 2. Штаммы-продуценты tPA в соответствующих векторах и штаммы, несущие исследуемые плазмиды без кодирующей белок вставки, получали путем трансформации штамма Е.coli BL21 [DE3] методом электропорации.
Вели культивацию исследуемых штаммов по следующей общей схеме:
1. Высевали штамм из замороженного музея истощающим штрихом на чашку Петри с агаризованной средой 2xYT, содержащей 30 мкг/л канамицина и 1% глюкозы. Растили культуры в течение 14-18 ч.
2. Отбирали одиночные колонии типичного для BL21 [DE3] фенотипа и переносили их в пробирки с 5 мл жидкой среды 2xYT, содержащей 30 мкг/л канамицина и 1% глюкозы. Вели рост культуры в течение 16 ч. Переносили 1 мл культуры в стерильную микропробирку и отделяли среду с остатками антибиотика центрифугированием. Ресуспендировали осадок клеток в 1 мл среды 2xYT.
3. Инокулировали 50 мкл полученной суспензии бактериальных клеток в 5 мл среды 2xYT, содержащей 0,1% глюкозы, но не содержащей канамицин, вели рост 2 ч, после чего добавляли ИПТГ до 2 мМ и продолжали культивирование в течение 24 ч.
4. Через 8 ч после начала индукции отбирали аликвоту культуры, при помощи стерильной среды 2xYT делали разведения в кратностью 10 тыс и 1 млн. Высевали по 100 мкл полученных разведении на чашки со средой 2xYT с и без добавления 30 мг/л канамицина Культуры растили в течение 14-18 ч и подсчитывали выросшие колонии.
5. Проводили отбор аликвот жидкой культуры с шага 4 через 24 ч после индукции, готовили и высевали разведения по п.4 и проводили подсчет колоний.
Результаты измерения доли клеток, сохранивших плазмиды через 8 и 24 ч после начала индукции, приведены на Фиг.10. Для всех вариантов вставки локуса Hok/Sok не наблюдалось статистически значимого изменения сегрегационной стабильности плазмиды. Измерение сегрегационной устойчивости повторили для штаммов, трансформированных плазмидами без кодирующей вставки, при этом применяли выращивание культуры без антибиотика в присутствии 0,2 мМ ИПТГ в течение 24 ч. Результаты измерения долей клеток, сохранивших плазмиду, приведены на Фиг.11. Сегрегационная стабильность плазмид, не содержавших вставки, также не имела статистически значимых различий и не имела значимых отличий от стабильности плазмид, кодирующих нетоксичный белок. Было сделано предположение о том, что уровень экспрессии гена hok недостаточен для индукции гибели клеток при потере плазмиды, либо уровень экспрессии гена антитоксина sok слишком велик, либо функционирование гена hok затруднено экспрессией генов, гомологичных sok и расположенных в геноме клеток BL21[DE3]. Наиболее очевидным способом повышения уровня экспрессии генов hok и sok, присутствующих в конструируемых плазмидах, является повышение копийности плазмид в клетках, реализуемое путем удаления генетического элемента контроля копийности ROP.
-
-
-
Пример 4. Получение плазмид p10Erop, p10E-HUrop, p10E-HDRrop, pHYP и сравнение их сегрегационной стабильности
Удаление фрагмента ДНК, кодирующего ROP элемент, проводили рестрикцией плазмид p10E (SEQ ID NO:33), p10E-HU (SEQ ID NO:35), p10E-HD (SEQ ID NO:36), p10E-HDR (SEQ ID NO:37) двумя эндонуклеазами рестрикции, расщепляющих ДНК с образованием «тупых» концов - FspAI (Fermentas Литва) и Bst1107I (Fermentas Литва). Фрагменты после расщепления выделяли из агарозного геля набором "Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System" (Promega, США), после чего лигировали Т4 ДНК лигазой (Fermentas, Литва) по методике производителя. Продукты лигирования расщепляли теми же эндонуклеазами, после этого трансформировали Е.coli штамма DH5α. Клоны трансформантов наращивали в 5 мл питательного бульона 2xYT-Kan и выделяли плазмидную ДНК набором реактивов GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Fermentas, Литва). Идентичность клонов подтверждали рестрикционным анализом с использованием тех же эндонуклеаз FspAI и Bst1107I по отсутствию выщепления фрагмента.
-
-
-
Последовательности полученных плазмид p10Erop, p10E-HUrop, pHYP, p10E-HDRrop представлены в Перечне последовательностей под номерами SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40 и SEQ ID NO:41, соответственно.
Анализ сегрегационной стабильности полученных плазмид проводили, как указано в примере 3. Результаты измерений представлены на Фигуре 12. Было установлено, что плазмида pHYP (элемент Hok-Sok в положении HD) обеспечивает приблизительно двукратное и статистически значимое (p<0,05) увеличение доли клеток, несущих плазмиду, по сравнению со всеми остальными исследованными плазмидами, при продолжительной индукции штаммов при помощи ИПТГ. Таким образом, был создан экспрессионный вектор, обеспечивающий повышенную сегрегационную стабильность при культивировании в отсутствие антибиотика и в присутствии индуктора экспрессии целевого гена, также позволяющий вести очистку целевых белков металлохелатной хроматографией в денатурирующих условиях с увеличенным выходом продукта.
Справочный пример. Получение плазмиды p10E-tPA
Последовательность, кодирующую фрагмент N-концевого лидерного пептида, включающего декагистидиновый кластер, получали методом отжига двух частично комплементарных олигонуклеотидов AD-10H-NcoF (SEQ ID NO:44) и AD-10H-NheR (SEQ ID NO:45) с образованием выступающих «липких» 5'-концов. Для этого вносили в пробирку по 100 пм каждого олигонуклеотида, нагревали до 95°С и медленно охлаждали до комнатной температуры.
-2
Реципиентную плазмиду рЕТ28а (+) (Novagen) расщепляли последовательно каждой из эндонуклеаз NcoI и NheI. Сначала аликвоты плазмиды инкубировали 2 часа при 37°C с каждой из рестриктаз, затем контролировали электрофорезом в агарозном геле полную линеаризацию плазмид (в пределах чувствительности метода), после чего добавляли вторую рестриктазу и инкубировали еще 2 часа. Затем пробы объединяли, рестриктазы инактивировали прогреванием при 65°С в течение 20 минут. Рестрицированную плазмиду переосаждали 3 объемами этанола, центрифугировали 10 минут на скорости 13200 об/мин при комнатной температуре, промывали осадок 70% спиртом, растворяли в воде и использовали для постановки реакции лигирования в рабочей концентрации 10 мкг/мкл. Выделенные фрагменты дотировали с использованием Т-4 ДНК лигазы («Fermentas», Литва) по методике производителя. После этого проводили трансформацию клеток Е.coli штамма DH5α, как описано выше. Колонии Е.coli анализировали методом ПЦР с клонов с использованием олигонуклеотидов AD-10H-NcoF (SEQ ID NO:44) и T7t (SEQ ID NO:46). Отобранные клоны наращивали в 5 мл питательного бульона 2xYT-Kan, выделяли плазмидную ДНК набором «Gene JET Plasmid Miniprep Kit» («Fermentas», Литва) по протоколу производителя. Для полученных генетических конструкций р10Е определяли нуклеотидную последовательность ДНК методом ПЦР-секвенирования с праймера T7t (SEQ ID NO:46).
-2
Реципиентную плазмиду р10Е расщепляли последовательно каждой из эндонуклеаз NheI и HindIII. Сначала аликвоты плазмиды инкубировали при 37°С в течение 2 часов с каждой из рестриктаз, контролировали электрофорезом в агарозном геле полную линеаризацию плазмид, затем добавляли вторую рестриктазу и инкубировали еще 2 часа. Затем пробы объединяли, ферменты инактивировали прогреванием при 65°С в течение 20 минут и проводили дефосфорилирование щелочной фосфатазой («Fermentas», Литва) по протоколу производителя. Щелочную фосфатазу инактивировали прогреванием до 85°С в течение 20 минут. Расщепленную и дефосфорилированную плазмиду переосаждали 3 объемами этанола, центрифугировали 10 минут на скорости 13200 об/мин при комнатной температуре, промывали осадок 70% спиртом, растворяли в воде и использовали для постановки реакции лигирования в рабочей концентрации 10 мкг/мкл.
Реакцию лигирования предварительно расщепленного рестриктазами NheI и HindIII фрагмента SEQ ID NO:43, соответствующего минигену tPA и содержащего сайт расщепления энтерокиназы, и реципиентной плазмиды проводили, как описано выше. После этого проводили трансформацию клеток Е.coli штамма DH5α, как описано выше. Фрагмент SEQ ID NO:43, соответствующий минигену tPA и содержащий сайт расщепления энтерокиназы, получали методом ПЦР с использованием набора перекрывающихся праймеров. В качестве альтернативы указанный фрагмент может быть получен с использованием технологии клонирования фирмы Sloning BioTechnology, описанной в заявке РСТ WO2005071077.
Колонии Е.coli анализировали методом ПЦР с клонов с праймеров T7prom (SEQ ID NO:47) и T7t (SEQ ID NO:46). Отобранные клоны наращивали в 5 мл питательного бульона 2xYT-Kan, проводили выделение плазмидной ДНК с набором «Wizard Plus SV Minipreps» («Promega», США) по протоколу производителя. При помощи ПЦР-секвенирования для конструкции p10E-tPA определяли нуклеотидную последовательность обеих комплементарных цепей ДНК для области вставки с использованием праймеров T7prom (SEQ ID NO:47) и T7t (SEQ ID NO:46). В результате секвенирования установили, что в полученном препарате плазмиды не содержатся мутации в области вставки, то есть кодируется корректная последовательность гена ТАП.
Хотя указанное изобретение описано в деталях со ссылкой на Примеры, для специалиста в указанной области техники очевидно, что могут быть совершены различные изменения и произведены эквивалентные замены, и такие изменения и замены не выходят за рамки настоящего изобретения.