РАСТИТЕЛЬНЫЙ ЭКСТРАКТ И ЕГО ТЕРАПЕВТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ
VEGETABLE EXTRACT AND ITS THERAPEUTIC APPLICATION

Область, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к растительному экстракту и его терапевтическому применению, т.е. композиции, содержащей водный экстракт цветков ромашки, для лечения пролиферативного и/или воспалительного состояния, применению указанной композиции для производства лекарственного средства для лечения пролиферативного и/или воспалительного состояния, и к способу лечения пролиферативного и/или воспалительного состояния, который включает введение пациенту, представляющему собой человека или животное, эффективного количества указанной композиции.
Настоящее изобретение, в частности, относится к композиции, содержащей водный экстракт цветков ромашки для лечения пролиферативного и/или воспалительного состояния, в которой цветки ромашки представляют собой Flores tubiformis. Настоящее изобретение дополнительно относится к применению указанной композиции, характеризующемуся тем, что состоянием является злокачественное заболевание, предпочтительно глиобластома или рак легких, или рак предстательной железы. Настоящее изобретение также относится к применению указанной композиции для получения лекарственного средства для лечения воспалительного заболевания, более конкретно, хронических заболеваний, наиболее предпочтительно, рассеянного склероза.
Предпосылки к созданию изобретения
Терапевтические свойства различных растений были известны в течение тысячелетий. Даже сегодня, однако, природа эффективного компонента или компонентов и их свойств мало понятны, даже для тех растений, которые были изучены, поскольку фармацевтическая разработка фокусируется на молекулах с низкой молекулярной массой, которые, как полагают, имеют сравнительно предсказуемые свойства и синтез которых можно контролировать.
Uteshev et al., Eksp. Klin. Farmakol. (1999 Nov-Dec) 62(6):52-5, описывает иммуномодулирующую активность гетерополисахаридов, полученных из ромашки лекарственной (Matricaria chamomilla) во время охлаждения на воздухе и охлаждения погружением. Laskova и Uteshev, Antibiot. Khimioter. (1992 Jun) 37(6):15-8, описывает иммуномодулирующее действие гетерополисахаридов, выделенных из цветков ромашки. Водный экстракт вводили перорально или путем внутрибрюшинной инъекции. Авторы не высказывают мнения о какой-либо терапевтической применимости, а скорее сообщают о том, что стимулирующее действие зависит от режима дозирования и, прежде всего, способа и степени охлаждения испытуемых крыс.
WO 2005/070440 относится к применению формулы из трав для лечения аллергической астмы или хронической бронхиальной астмы, содержит особые количества высушенных и измельченных цветков ромашки, плодов аниса, черных семян и т.д., вводимых в виде заваривания чая.
В WO 03/101479 описаны ценные терапевтические свойства композиции, содержащей несколько компонентов, обычно вводимых вместе путем внутримышечной инъекции. Композиция, которая была использована, содержит экстракт ромашки, хотя терапевтическая активность ей не приписывается; скорее, эта композиция описана как не вызывающая раздражения, присутствие которой может облегчать неприятное действие инъекции как таковой.
В WO 2007/057651 описан способ удаления эндотоксинов из ромашки.
В US 6300370 B1 раскрыт способ получения масла ромашки, имеющего высокое содержание цис- или трансспироэфиров, характеризующийся дистилляцией паром или водной дистилляцией свежей ромашки или остатка после экстракции ромашки. Указанные спироэфиры имеют противовоспалительные и спазмолитические свойства.
Краткое изложение сущности изобретения
Неожиданно было обнаружено, что экстракт ромашки, полученный из соцветий, предпочтительно полученный путем дистилляции с водяным паром, обладает ценными терапевтическими свойствами. Известно, что такие водные экстракты состоят из летучих компонентов соцветий ромашки и описаны в Европейской фармакопее (Matricariae aetheroleum PhEur 5, corrected.5.1).
В частности, было обнаружено, что указанные экстракты могут снижать синтез ДНК в злокачественных клетках человека и ингибировать продукцию лейкотриенов и IL-6 (интерлейкина 6). Более неожиданно, было обнаружено, что ингибирование синтеза лейкотриенов эфирным маслом синергетически потенцировано в присутствии масла из семян чернушки посевной (Nigella sativa).
Было обнаружено, что чувствительными являются, в особенности, злокачественные клетки, которые, как известно, продуцируют интерлейкин 6 в качестве фактора роста сами, и злокачественные клетки которые, как известно, сами продуцируют лейкотриены. Можно сделать вывод о том, что эфирное масло только ромашки и сочетание с маслом из семян чернушки посевной обладает на сегодняшний день неожиданными противовоспалительными и противораковыми свойствами, например, при лечении воспаления, иммунопатии и рака.
В соответствии с этим, настоящее изобретение относится к
(1) композиции, содержащей водный экстракт цветков ромашки для лечения пролиферативного и/или воспалительного состояния;
(2) композиции по пункту (1), в которой водный экстракт представляет собой эфирное масло, которое получено способом экстракции, включающим дистилляцию с водяным паром цветков ромашки, предпочтительно под пониженным давлением;
(3) композиции по пункту (1) или (2), в которой цветки ромашки представляют собой Flores tubiformis;
(4) композиции по пункту (2) или (3), где дистилляцию с водяным паром проводят в атмосфере азота, и этот способ дополнительно включает стадии:
(i) контактирования композиции с поперечно сшитым повидоном, который образует комплекс с кумаринами;
(ii) удаления комплекса поперечно сшитого повидона и кумарина, образованного на стадии (i);
(iii) удаления остатков воды путем контактирования композиции, полученной на стадии (ii), с безводным сульфатом натрия; и
(iv) отделения сульфата натрия от композиции, полученной на стадии (iii);
(5) композиции по любому из пунктов с (1) по (4), где указанная композиция дополнительно содержит масло чернушки посевной;
(6) композиции по пункту (5), в которой масло чернушки посевной представляет собой очищенное масло чернушки посевной, получаемое процессом очистки, включающим стадии:
(i) контактирования масла чернушки посевной с поперечно сшитым повидоном, который образует комплекс с фенольными соединениями;
(ii) удаления комплекса кросс-повидона и фенольных соединений, образованных на стадии (i);
(iii) удаления остатков воды путем контактирования масла чернушки посевной, полученного на стадии (ii), с безводным сульфатом натрия; и
(iv) отделения сульфата натрия от масла чернушки посевной, полученного на стадии (iii);
(7) композиции по любому из пунктов с (1) по (6), отличающейся тем, что указанным состоянием является воспалительное состояние, предпочтительно выбранное из группы, состоящей из болезни Крона и рассеянного склероза;
(8) композиции по любому из пунктов с (1) по (6), отличающейся тем, что указанным состояние представляет собой злокачественное заболевание, предпочтительно выбранное из группы, состоящей из глиобластомы, рака легких и рака предстательной железы;
(9) композиции по любому из пунктов с (1) по (7), отличающейся тем, что воспалительное состояние вызвано аутоиммунопатией, предпочтительно запускаемой интерлейкином 6, более предпочтительно запускаемой лейкотриенами, наиболее предпочтительно обусловлено присутствием интерлейкина 6 и/или лейкотриенов;
(10) композиции по любому из пунктов с (1) по (6) и (8), отличающейся тем, что указанное состояние вызвано пролиферативным нарушением, предпочтительно запускаемым интерлейкином 6, более предпочтительно запускаемым лейкотриенами, наиболее предпочтительно обусловлено присутствием интерлейкином 6 и/или лейкотриенами;
(11) применению композиции, охарактеризованной в любом из пунктов с (1) по (6), для получения лекарственного средства для лечения пролиферативного и/или воспалительного состояния;
(12) применению по пункту (11), где указанное состояние является таким, как определено в любом из пунктов с (7) по (10);
(13) способу лечения пролиферативного и/или воспалительного состояния, который включает введение пациенту, представляющему собой человека или животное, композиции, охарактеризованной в любом из пунктов с (1) по (6), в эффективном количестве; и
(14) способу по пункту (13), где указанная композиция охарактеризована в любом из пунктов с (7) по (10).
Описание изобретения
Настоящее изобретение основано на данных, полученных при использовании водного экстракта соцветий ромашки, предпочтительно получаемого путем дистилляции с водяным паром. В точности водный экстракт состоит из летучих компонентов соцветий ромашки Matricaria recutita L., также известной специалистам в данной области как Matricariae aetheroleum, описанной в Европейской фармакопее 5.1. Настоящее изобретение дополнительно основано на данных, полученных путем использования сочетания масла семян чернушки посевной и эфирного масла соцветий ромашки.
Экстракт может быть получен любым подходящим способом, в том числе способами, известными специалистам в данной области. Этот экстракт может быть получен путем использования водной или органической среды и отделен от других компонентов фильтрацией, хроматографией, сверхкритической флюидной экстракцией и т.д. Например, материал, который может быть использован в настоящем изобретении, получен из высушенных соцветий растения семейства Астровых Matricaria recutita L. или одного или нескольких материалов этого растения, в том числе эфирных масел, хамазулена, бисаболола и других веществ. Предпочтительным способом является очистка исходно полученного эфирного масла путем контактирования его с кросс-повидоном (поперечно сшитым повидоном) и сульфатом натрия. Специалистам в данной области известно, что кросс-повидон образует комплексы с фенильными соединениями и кумаринами. Известно, что сульфат натрия связывает остатки воды. Отделение очищающих агентов приводит к получению экстракта, свободного или почти свободного от остатков кумарина, фенола и воды. Большое значение имеет источник экстракта ромашки. Это должно быть соцветие, предпочтительно трубчатые цветки Matricaria recutita L. (Flores tubiformis). Композиция может содержать помимо эфирного масла ромашки масло семян чернушки посевной и ацетилцистеин, и аскорбилпальмитат в качестве активных ингредиентов. Присутствия других агентов не требуется.
Используемая композиция должна подходить для инъекции. С этой целью желательно удалить эндотоксины, полифенолы, кумарины и (любыми подходящими средствами, известными специалистам в данной области) компоненты большой молекулярной массы, например компоненты, имеющие молекулярную массу более 1000 или 10000.
Композиции для использования в настоящем изобретении могут быть получены способами, известными специалистам в данной области. Следуют использовать фармацевтически приемлемые компоненты. Термин «фармацевтически приемлемый» относится к тем свойствам и/или веществами, которые приемлемы для пациента с фармакологической/токсикологической точки зрения и для производящего химика-фармацевта с физической/химической точки зрения в отношении факторов, таких как технология получения лекарственного средства, стабильность, прием пациентом и биодоступность.
Введение предпочтительно осуществляют внутривенной или, более предпочтительно, внутримышечной инъекцией, еще более предпочтительно, с помощью ингалятора в виде аэрозоля или микро/наноэмульсии через дыхательные пути.
Фармацевтическая композиция, содержащая активный ингредиент, может быть в форме, подходящей для перорального применения, например в виде таблеток, пастилок, леденцов, водных или масляных суспензий, диспергируемых порошков или гранул, эмульсий, твердых или мягких капсул, или сиропов или эликсиров. Такие композиции могут содержать один или несколько агентов, выбранных из группы, состоящей из подсластителей, вкусовых ароматических веществ, красителей и консервантов для получения фармацевтических препаратов, приятных на вкус. Таблетки содержат активный ингредиент в смеси с нетоксичными фармацевтически приемлемыми эксципиентами, например такими, как инертные разбавители, такие как карбонат кальция, карбонат натрия, лактоза, фосфат кальция или фосфат натрия; гранулирующие и дезинтегрирующие агенты, например кукурузный крахмал или альгиновая кислота; связующие агенты, например крахмал, желатин или акация; и смазывающими агентами, например стеаратом магния, стеариновой кислотой или тальком. Таблетки могут быть без покрытия или на них может быть нанесено покрытие с помощью известных методик для задержки дезинтеграции и абсорбции в желудочно-кишечном тракте, и тем самым обеспечивается длительное действие на протяжении более длительного периода времени. Например, может быть использовано замедляющее вещество, такое как глицерилмоностеарат или глицерилдистеарат. На них также может быть нанесено покрытие для получения осмотических терапевтических таблеток для контролируемого высвобождения.
Композиции для перорального применения также могут быть представлены в виде твердых желатиновых капсул, в которых активный ингредиент смешивают с инертным твердым разбавителем, например карбонатом кальция, фосфатом кальция или каолином, или в виде мягких желатиновых капсул, в которых активный ингредиент смешивают с водной или масляной средой, например ореховым маслом, жидким парафином или оливковым маслом.
Водные суспензии могут содержать активные вещества в смеси с подходящими эксципиентами. Такими эксципиентами являются суспендирующие агенты, например карбоксиметилцеллюлоза натрия, метилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, альгинат натрия, поливинилпирролидон, трагакантовая камедь и акациевая камедь; диспергирующие или увлажняющие агенты, например природные фосфатидиды, такие как лецитин, или продукты конденсации алкиленоксида с жирными кислотами, например полиоксиэтилен стеарат, или продукты конденсации этиленоксида с длинноцепочечными алифатическими спиртами, например гептадекаэтиленоксицетанолом, или продукты конденсации этиленоксида с неполными сложными эфирами, полученными из жирных кислот и гекситола, например полиоксиэтилена с неполными сложными эфирами, полученными из жирных кислот и ангидридов гекситола, например полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат. Водные суспензии также могут содержать один или несколько консервантов, например этил или н-пропил п-гидроксибензоат, один или несколько красителей, одно или несколько вкусовых ароматических веществ, и один или несколько подсластителей, таких как сахароза или сахарин.
Масляные суспензии могут быть получены путем суспендирования активного ингредиента в растительном масле, например ореховом масле, оливковом масле, кунжутном масле или кокосовом масле, или в минеральном масле, таком как жидкий парафин. Масляные суспензии могут содержать загуститель, например пчелиный воск, твердый парафин или цетиловый спирт. Подсластители (такие, которые описаны выше) и вкусовые ароматические вещества могут быть добавлены для получения приятного на вкус препарата для перорального применения. Эти композиции могут сохраняться путем добавления антиоксиданта, такого как аскорбиновая кислота.
Диспергируемые порошки и гранулы, подходящие для получения водной суспензии путем добавления воды, предоставляют активный ингредиент в смеси с дипергирующим или увлажняющим агентом, суспендирующим агентом и одним или несколькими консервантами. Подходящие диспергирующие или увлажняющие агенты проиллюстрированы выше. Также могут присутствовать подсластители, вкусовые ароматические вещества и красители.
Фармацевтическая композиция для применения в настоящем изобретении также может находиться в форме эмульсии масло-в-воде. Масляной фазой может быть растительное масло, например оливковое масло или ореховое масло, или минеральное масло, например жидкий парафин, или их смеси. Подходящими эмульгирующими агентами могут быть природные камеди, например акациевая камедь или трагакантовая камедь, природные фосфатиды, например соевые бобы, лецитин и сложные эфиры или неполные сложные эфиры, полученные из жирных кислот и ангидридов гекситола, например сорбитан моноолеат и продукты конденсации указанных неполных сложных эфиров с этиленоксидом, например полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат. Эмульсии также могут содержать подсластители и вкусовые ароматические вещества.
Сиропы и эликсиры могут быть получены с использованием подсластителей, например глицерина, пропиленгликоля, сорбита или сахарозы. Такие композиции также могут содержать успокоительное средство, консервант и вкусовые ароматические и красящие вещества. Фармацевтические композиции могут быть в форме стерильной инъецируемой водной или масляной суспензии. Эта суспензия может быть получена с использованием подходящих диспергирующих или увлажняющих агентов, примеры которых были упомянуты выше. Стерильный инъецируемый препарат также может быть в стерильном инъецируемом растворе или суспензии в нетоксичном, приемлемом для парентерального введения, разбавителе или, например, в виде раствора в 1,3-бутандиоле. Среди приемлемых носителей и растворителей, которые могут быть использованы, находятся вода, раствор Рингера и изотонический раствор хлорида натрия. Кроме того, стерильные жирные масла обычно используют в качестве растворителя или суспендирующей среды. Для этой цели может быть использовано любое легкое жирное масло, в том числе синтетические моно- или диглицериды. Кроме того, жирные кислоты, такие как олеиновая кислота, находят применение в получение инъецируемых составов.
Композицию также можно вводить в форме суппозиториев для ректального применения лекарственного средства. Такие композиции могут быть получены путем смешивания лекарственного средства с подходящим нераздражающим эксципиентом, который является твердым при обычных температурах, но жидким при ректальной температуре и, следовательно, будет плавиться в прямой кишке с высвобождением лекарственного средства. Такими веществами являются кокосовое масло и полиэтиленгликоли.
Для топического применения подходящие композиции находятся в форме, например, кремов, мазей, желе, растворов или суспензий.
Как указано выше, композицию по настоящему изобретению можно вводить путем инъекции. Предпочтительной является внутримышечная инъекция, хотя подходит любое парентеральное введение.
Также может быть предпочтительным, чтобы композицию вводили перорально. В этом случае, и в случае применения средства для повышения проницаемости, инсулин не следует включать в пероральную композицию. Пероральное введение может быть особенно предпочтительным для ветеринарной медицины.
Пациенту также можно вводить другие активные вещества. Хотя считается, что дополнительные вещества не являются обязательными, было обнаружено, что некоторые стероиды и витамины, обычно вводимые перорально, могут поддерживать или усиливать действие лекарственного средства. Подходящие стероидные гормоны могут повышать синтез специфических белков путем раскрытия определенных цистронов при содействии необходимых метаболитов, таких как витамины и аминокислоты. Примерами подходящих стероидов являются эстрадиол, нандролон и эстриол. Также можно вводить такие витамины, как A, D и/или E. Функцией витамина А может быть сохранение целостности эпителиальной ткани, роль в синтезе белка и стабилизация клеточных мембран, а также субклеточных мембран.
Хотя некоторые указания были даны относительно подходящих доз определенных веществ, точная доза и частота введения зависит от нескольких факторов. Эти факторы включают в себя конкретные компоненты, которые используются, конкретное состояние, подвергаемое лечению, тяжесть этого заболевания, возраст, массу тела и общее физическое состояние конкретного пациента, и другую лекарственную терапию, которую может принимать индивидуум, как хорошо известно специалистам в данной области.
Описание чертежей
На Фиг.1A показаны результаты ингибирования IL-6 повтор 1 в Примере 1 для эфирного масла Matricaria:
VIP_Matr`07_78
IC50=5 мкг/мл (определено графически)
PRISM IC50=7,782 мкг/мл (рассчитано с помощью GraphPad Prism)
95% интервал от 3,169 до 19,11
На Фиг.1B показаны результаты ингибирования IL-6 повтор 2 в Примере 1 для эфирного масла Matricaria:
VIP_Matr`07_78
IC50=8 мкг/мл (определено графически)
PRISM IC50=8,78 мкг/мл (рассчитано с помощью GraphPad Prism)
95% интервал от 6,248 до 12,35 мкг/мл
Фиг.1C показаны результаты ингибирования IL-6 повтор 1 в Примере 1 для эфирного масла Nigella:
VIP_Nig'07_8
IC50=не установлено
PRISM IC50=не сходится (GraphPad Prism)
95% интервал
На Фиг.1D показаны результаты ингибирования IL-6 повтор 2 в Примере 1 для эфирного масла Nigella:
VIP_Nig'07_8
IC50=не установлено
PRISM IC50=не сходится (GraphPad Prism)
95% интервал
На Фиг.2 показаны результаты, полученные из исследования ингибирования 5-LOX в Примере 2 тестирования ингибирования активности 5-LOX под действием NICHA (среднее от 2 до 4 независимых исследований (результаты 3 независимых анализов 5-lox для ViP_E_Nig'07_8, 4 независимых анализа 5-lox для VIP_Matr`07_78 и 2 независимых анализа 5-lox для смеси 1:1).
Фиг.2A: ViP_Matr'07_78 (масло ромашки), повтор 1
Фиг.2B: ViP_Nig'07_8 (мало Nigella sativa), повтор 1
Фиг.2C: ViP_Matr'07_78 (масло ромашки), повтор 2
Фиг.2D: ViP_Nig'07_8 (масло Nigella sativa), повтор 2
Фиг.2E: Смесь 1:1 (VIP_Matr`07_78 : ViP_E_Nig'07_8)
На Фиг.3 показаны результаты, полученные из анализа жизнеспособности клеток HL-60 с WST-1 под действием NICHA в Примере 2.
Фиг.3A: ViP_Matr'07_78 (масло ромашки)
Фиг.3B: ViP_Nig'07_8 (масло Nigella sativa)
На Фиг.4 показаны результаты, полученные в отношении действия NICHA на синтез ДНК в злокачественных клетках предстательной железы DU145 в Примере 3.
Фиг.4A: 24 часа инкубирования, ViP_Matr'07_78 (масло ромашки)
Фиг.4B: 24 часа инкубирования, ViP_Nig'07_8 (масло Nigella sativa)
Фиг.4C: 48 часов инкубирования, ViP_Matr'07_78 (масло ромашки)
Фиг.4D: 48 часов инкубирования, ViP_Nig'07_8 (масло Nigella sativa)
На Фиг.5 показаны результаты, полученные в отношении действия NICHA на синтез ДНК в клетках U-87MG при 48 часах инкубирования в Примере 3.
Фиг.5A: ViP_Matr'07_78 (масло ромашки)
Фиг.5B: ViP_Nig'07_8 (масло Nigella sativa)
Фиг.5C: Смесь 1:1 (VIP_Matr`07_78:ViP_E_Nig'07_8)
ПРИМЕРЫ
Следующие примеры дополнительно иллюстрируют изобретение.
Пример 1 - ингибирующая активность в THP1 (макрофагах) в отношении высвобождения интерлейкина 6
Образцы и препараты сравнения
Тестируемые образцы
Описание
Поставщик
Номер
№ партии
Номер VIP
Масло Nigella
Nigellae oleum
Hänseler AG
26-4150-1
2006.08.0537
ViP_Nig'07_8
Эфирное масло Matricaria
Matricariae Aetheroleum PhEur
Hänseler AG
1-4925-2
2006.09.0181
ViP_Matr'07_78
Препараты
Порядковый №
№ партии
Поставщик
Исследование
NDGA
74540
422 780/1 5400
Fluka
5-LOX ингибирование на дифф. клетках HL-60
Исследование ингибирования IL-6
Исследование
Клеточная линия
Образец
Концентрация образца в исследовании (исходя из массы масла)
Растворитель
Повтор
Ингирование IL-6*
ТНР дифференциро-ванные
ViP_Nig<sup>,</sup>07_8
300 нг, 3 мкг, 30 мкг/мл
EtOH абс.
2
ViP_Matr<sup>,</sup>07_78
300 нг, 3 мкг, 30 мкг/мл
s.o.
2
* Исследование проводили в двух независимых повторах
Исследование ингибирования IL-6 на клетках THP-1
6
Образцы предварительно инкубировали в течение 30 минут при 37°C с клетками (THP-1 человека), предварительно дифференцированными с использованием PMA (0,125×10 клеток/лунку). Реакцию начинали под действием LPS (1 мкг/мл) и инкубирование проводили на протяжении 24 часов при 37°C. Отрицательные контроли t(0) проводили путем анализа смеси без стимуляции LPS [контроль 1].
Количественное определение IL-6 проводили с использованием набора для иммуноферментного анализа Enzyme Immuno Assay (EIA) Kit от Cayman No: 583361. Оптические плотности измеряли при длине волны = 415 нм. Количественные показатели рассчитывали, используя стандартную кривую по меньшей мере 5 различных концентраций.
Каждую точку измерения определяли в двух повторах. Дозы, соответствующие значениям ингибирования, выражали как процент от значений положительного контроля. Значения IC50 (соответствующие концентрации образца, при которой уровень ингибирования составляет 50%) определяли с помощью программы GraphPad-Prism (Version 4, GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA).
Результаты
Результаты Примера 1 показаны на Фиг.1.
Пример 2 - Ингибирующая активность NICHA 001 в линиях злокачественных клеток человека в отношении высвобождения лейкотриенов
Исследовали ответ двух линий клеток человека (гранулоцитов) под действием различных концентраций NICHA на высвобождение лейкотриенов. Каждый эксперимент проводили с маслом Nigella, с маслом ромашки и с сочетанием этих двух масел.
Образцы
Тестируемые образцы
Описание
Поставщик
номер
№ партии
Номер ViP
Масло Nigella
Nigellae oleum
Hänseler AG
26-4150-1
2006.08.0537
ViP_Nig'07_8
Эфирное масло Matricaria
MatricariaeAetheroleum PhEur
Hänseler AG
1-4925-2
2006.09.0181
ViP_Matr'07_78
Исследования
Исследования
Клеточные линии
Образцы
Тестируемые концентрации
Ингибирование 5-LOX
Гранулоциты
ViP_Nig'07_8
0,3/3/30 мкг/мл
дифференцированные HL60
ViP_Matr'07_78
0,1/0,3/1/3/10/30 мкг/мл
Смесь
0,3/3/30 мкг/мл
Исследование WST-1
Клетки HL-60
ViP_Nig'07_8
0,3/3/30 мкг/мл
ViP_Matr'07_78
Исследование ингибирования 5-LOX
2
2+
6
Клетки HL-60 человека (миелоидный лейкоз, DSMZ No ACC 3) держали при 37°C в увлажненной атмосфере с 5% CO и культивировали в полной среде RPMI1640, дополненной 10% эмбриональной сывороткой теленка и 1% (об./об.) раствором пенициллин/стрептомицин. Клетки дифференцировали в течение 6-8 дней с использованием DMSO (1,2% об./об.). Исследование активности 5-LOX проводили, как описано у Bennet et al. [контроль: 2]. Вкратце, дифференцированные клетки собирали, суспендировали в PBS, содержащем Ca(1 мМ) и глюкозу (1 мМ), и размещали в 96-луночном микротитровальном планшете (1×10 клеток/лунку).
4
После предварительного инкубирования с образцом или носителем в течение 15 мин при комнатной температуре реакцию начинали путем добавления ионофора кальция A 23187 (5 мкМ) и арахидоновой кислоты (10 мкМ). Все величины представляют собой конечные концентрации. Отрицательные контроли проводили без стимуляции ионофором кальция. Исследуемую смесь инкубировали в течение 15 мин при 37°C и завершали добавлением 100 мкл HCl, содержащей метанол (1 M, 3% об./об.), и микротитровальный планшет помещали на лед. После нейтрализации с использованием 50 мкл PBS и центрифугирования (340×g) в течение 10 мин определяли концентрацию LTB в супернатанте.
4
4
4
50
Действия образцов и эталонного соединения [контроль: 3] на активность 5-LOX измеряли путем определения количества лейкотриена B, продуцированного в условиях исследования. Количественное определение лейкотриена Bпроводили с использованием набора для иммуноферментного анализа Enzyme Immuno Assay (EIA) Kit от Cayman No 520111 (LTB). Оптические плотности измеряли при длине волны = 415 нм. Количества рассчитывали, используя стандартную кривую по меньшей мере 5 различных концентраций. Каждую точку измерения определяли в двух повторах. Дозы, соответствующие значениям ингибирования, выражали как процент от значений положительного контроля. По возможности, значения IC(соответствующие концентрации образца, при которой уровень ингибирования составляет 50%) определяли с помощью программы GraphPad-Prism (Version 4, GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA).
Анализ жизнеспособности на клетках HL60 с использованием WST-1
Функцию клетки/митохондрий: снижение метаболической активности [контроль: 4] тестировали на гепатоцитах человека (Hep G2), гранулоцитах человека (дифференцированные HL60), моноцитах человека (THP-1) и макрофагах человека (дифференцированные THP-1) с использованием набора Tetrazoliumsalt WST-1 Kit (Biovision, K301-500, CA USA). Клетки предварительно инкубировали с экстрактом в течение 24 часов.
Метаболическую активность клеток измеряли по способности жизнеспособных клеток восстанавливать соль тетразолия WST-1 до формазана. Количество формазана измеряли напрямую путем определения оптической плотности (OD) с помощью планшетного ридера (BioRad, USA) при длине волны λ=450 нм.
Оптические измерения проводили в трех повторах и вычисляли стандартные отклонения. Для каждой тестируемой концентрации величины OD контроля (исследуемой смеси с образцами, но без клеток) вычитали из среднего измерений OD с клетками. Величины OD450 переводили в процентные значения с показателями жизнеспособности 100%, соответствующими измерениям контроля без образца.
Результаты
Результаты Примера 2 показаны на Фиг.2 и 3.
50
Значения IC, полученные в результате исследования ингибирования 5-LOX:
Образец
Повтор
IC<sub>50 </sub>(мкг/мл)
95% достоверность(мкг/мл)
ViP_Matr'07_78
1
0,30
От 0,06 до 2,84
ViP_Nig'07_8
1
3,00
От 1,33 до 10,76
ViP_Matr'07_78
2
0,38
От 0,21 до 0,68
ViP_Nig'07_8
2
3,02
От 1,57 до 5,82
Смесь 1:1
1
0,53
От 0,23 до 1,24
Контроль
IC<sub>50</sub> (нМ)
95% достоверность (нМ)
Дексаметазон
0,28
От 0,21 до 0,39
Пример 3 - Влияние NICHA 001 на пролиферацию линий злокачественных клеток человека
Исследовали пролиферативную реакцию клеток глиобластомы и злокачественных клеток предстательной железы под действием различных концентраций NICHA. Каждый эксперимент проводили с маслом Nigella, с маслом ромашки и с сочетанием этих двух масел.
Образцы
Тестируемые образцы
Описание
Поставщик
Номер
№ партии
Номер ViP
Масло Nigella
Nigellae oleum
Hänseler AG
26-4150-1
2006.08.0537
ViP_Nig'07_8
Эфирное масло Matricaria
MatricariaeAetheroleum PhEur
Hänseler AG
1-4925-2
2006.09.0181
ViP_Matr'07_78
Исследования
Исследования
Клеточные линии
Образцы
Тестируемые концентрации
Синтез ДНК
Злокачественные клетки предстательной железы
ViP_Nig'07_8
0,3/3/30 мкг/мл
DU145
ViP_Matr'07_78
0,3/3/30/60 мкг/мл
Клетки глиобластомы
ViP_Nig'07_8
0,3/3/30 мкг/мл
U-87 MG
ViP_Matr'07_78
Смесь
Синтез ДНК
3
3
2
ВключениеH-тимидина: клетки DU145 и U-87MG собирали путем трипсинизации и высевали при 10000 клеток/лунку в 96-луночный планшет. Клетки инкубировали с образцами в требуемых концентрациях в течение 24 часов и/или 48 часов при 37°C и 5% CO. Клетки сенсибилизировали H-тимидином (1 мкКю/мл) (Perkin Elmer) в течение 24 часов. После чего, их промывали, используя PBS, и фиксировали дважды метанолом в течение 5 мин. Белок осаждали, используя 0,3 н TCA. После стадии промывания добавляли 150 мкл 0,3 н NaOH в течение 15 мин для лизиса клеток. Фоновые контроли измеряли с образцами без клеток.
3
Для обнаружения включенного H-тимидина для синтеза ДНК образцы переносили в сцинтилляционные пробирки со сцинтиллятором. Количественное определение проводили в жидкостном сцинтилляционном счетчике Tri-Carb 1900 TR (Packard, USA).
Действие нескольких концентраций образцов измеряли путем определения количества радиоактивной метки (dpm) в условиях исследования. Величины, соответствующие дозам, выражали как процент от значений положительного контроля. Точки измерения определяли в четырех повторах, ошибки выражали в виде стандартных отклонений.
Результаты, полученные для злокачественных клеток предстательной железы DU145
Результаты действия NICHA на синтез ДНК в злокачественных клетках предстательной железы (DU145) показаны на Фиг.4А-4D.
50
Значение IC эталонных соединений в отношении синтеза ДНК представляют собой следующее:
Контроль
Инкубирование 24 ч
Инкубирование 48 ч
IC<sub>50</sub> (нМ)
95% достоверность (нМ)
IC<sub>50</sub> (нМ)
95% достоверность (нМ)
Компототецин
152
От 115,9 до 199,4
7,5
От 5,1 до 11,0
Результаты, полученные в отношении клеток глиобластомы U87MG
Результаты действия NICHA на синтез ДНК в клетках U-87MG (48 часов инкубирования) показаны на Фиг. 5A-5C.
50
Значения IC эталонных соединений в отношении синтеза ДНК с клетками B-87MG представляют собой следующее:
Контроль
Инкубирование 48 ч
IC<sub>50</sub> (нМ)
95% достоверность (нМ)
Камптотецин
3,32
От 2,5 до 4,4
Заключение по результатам примеров
Эфирное масло ромашки (Matricaria recutita: VIP_Matr07_78) и масло семян чернушки посевной (Nigella sativa: VIP_Nig07_8) исследовали в отношении их эффективности в отношении ингибирования синтеза лейкотриенов в дифференцированной клеточной линии гранулоцитов человека HL 60 (острый миелоидный лейкоз человека). Масло семян Nigella sativa показало впечатляющее ингибирование активности 5-Lox со значением IC 50 3,02 мкг/мл (Пример 2, Фиг.2d). Неожиданно, смесь двух соединений ингибировала синтез лейкотриенов в клеточной линии гранулоцитов HL60 сверхсуммарно. Вместо ожидаемой IC50 0,76 мкг/мл, в результате IC 50 составила 0,53 мкг/мл (Пример 2, Фиг.2e). Может быть сделан вывод о том, что сочетание двух соединений потенцирует активность отдельных компонентов.
VIP_Matr07_78 показало еще более высокую ингибирующую активность в отношении ингибирования синтеза лейкотриенов, и показало значение IC 50 0,38 мкг/мл (Пример 2, Фиг.2c). Следовательно, эфирное масло Matricaria по-видимому является чрезвычайно мощным ингибитором 5-LOX.
Для оценки, является ли наблюдаемая ингибирующая активность только результатом цитотоксических действий, клетки инкубировали с выбранными концентрациями для экспериментов с 5-LOX, и измеряли митохондриальную активность (WST). Как показано на Фигурах 3a и 3b, цитотоксичность не наблюдалась с VIP_Nig07_8 или с VIP_Matr07_78 при выбранных концентрациях (Пример 2, Фиг.3a и 3b). Можно сделать вывод о том, что наблюдаемая активность в отношении ингибирования синтеза лейкотриенов является результатом специфического взаимодействия с 5-липоксигеназой.
Дополнительные результаты также были получены в отношении высвобождения интерлейкина 6 линией клеток макрофагов человека THP1. Хотя у Nigella sativa не было показано активности (Пример 1 Фиг.1c и 1d), Matricaria recutita ингибировала высвобождение интерлейкина 6 из клеток THP1 дозозависимым образом и со значением IC50 5 мкг/мл (Пример 1, Фиг.1a и 1b). Повторные эксперименты (повтор 2) показали воспроизводимость результатов повтора 1 (Пример 1).
Эти результаты указывают на то, что эфирное масло Matricaria recutita демонстрирует сильную ингибирующую активность в отношении синтеза лейкотриенов в клетках острого миелоидного лейкоза человека HL60 (Пример 2, Фиг.2c). Далее, результаты указывают на то, что высвобождение интерлейкина 6 могло быть супрессировано в клеточной линии макрофагов человека THP1 (Пример, Фиг.1a и 1b).
Поскольку концентрации, необходимые для получения эффекта ингибирования, являются достаточно низкими, предполагается, что у людей терапевтически эффективные дозы будут достигаться без труда, тем более что эфирные масла являются очень липофильными и должны легко поглощаться.
В совокупности с характерным для эфирного масла эффективным ингибированием образования эйкозаноидов (лейкотриенов) концентрациями в наномолярном диапазоне в клеточной линии гранулоцитов человека HL60, эфирное масло Matricaria recutita по-видимому является очень ценным кандидатом для разработки лекарственных средств для лечения воспалительных/аутоиммунных заболеваний и некоторых типов рака.
in vitro
В третьей серии экспериментов (пример 4) исследовали, ингибирует ли масло семян Nigella sativa или эфирное масло Matricaria recutita синтез ДНК в линии злокачественных клеток предстательной железы DU 145 и линии клеток глиобластомы U87MG . Тогда как Matricaria recutita (VIP_Matr07_78) ингибировала обе клеточные линии через 48 часов в отношении синтеза ДНК дозозависимым образом (пример 4, Фиг.4c), Nigella sativa (VIP_Nig07_8) не показала ингибирующего действия на обе линии злокачественных клеток (пример 4, Фиг.4d). Поскольку известно, что DU145 продуцирует интерлейкин 6 в качестве фактора роста, кажется вероятным, что суппрессия синтеза ДНК (по меньшей мере частично) вызвана ингибирующей активностью в отношении высвобождения интерлейкина 6 эфирного масла Matricaria recutita. Ингибирование синтеза ДНК линии клеток глиобластомы U87MG очевидно является действием сильной супрессии синтеза лейкотриенов под действием эфирного масла Matricaria recutita.