Способ прогнозирования веса новорожденного с учетом полиморфного локуса гексокиназы 2, дифференциально экспрессирующегося в плаценте
METHOD FOR PREDICTING THE WEIGHT OF A NEWBORN TAKING INTO ACCOUNT THE POLYMORPHIC LOCUS OF HEXOKINASE 2, DIFFERENTIALLY EXPRESSED IN THE PLACENTA

Изобретение относится к области медицинской диагностики и предназначено для прогнозирования веса новорожденного с учетом полиморфного локуса гексокиназы 2 (полиморфного локуса rs10496196 HK2).
Начальный этап онтогенеза организма человека, включающий его внутриутробное развитие и имеющий ключевое значение в дальнейшей жизни организма, непосредственно зависит от тех условий, в которых развивается эмбрион и плод (Turco, M. Y. Development of the human placenta / M. Y. Turco, A. Moffett. – DOI: 10.1242/dev.163428 // Development. – 2019. – Vol. 146, № 22. – Art. dev163428. – URL: https://dev.biologists.org/content/develop/146/22/dev163428.full.pdf).
Возникновение различных нарушений гестации негативно сказывается на состоянии развивающегося организма (эмбриона, плода), обусловливая высокие показатели перинатальной заболеваемости и смертности новорожденных и приводя к неблагоприятным последствиям в дальнейшей их жизни (высокая заболеваемость в период детства и во взрослом возрасте и др.) (Ярыгина, Т. А. Задержка (замедление) роста плода: все, что необходимо знать практикующему врачу / Т. А. Ярыгина, А. И. Гус // Акушерство и гинекология. – 2020. – № 12. – С. 14-24.). В структуре новорожденных ежегодно регистрируется увеличение числа детей с низкой, очень низкой и экстремально низкой массой тела при рождении. Известно, что маловесные дети являются группой риска по перинатальной и младенческой смертности, а также развитию тяжелых инвалидизирующих состояний (Ancel PY. Epidemiology of preterm births. (In French). Rev Prat. 2012;62(3):362–365). Кроме того, низкая масса тела при рождении сопряжена с трудностями диспансеризации и реабилитации таких пациентов в различные возрастные периоды жизни. Поиск факторов, ассоциированных с рождением маловесных детей до  2500 г, необходим для фокусного формирования групп диспансерного наблюдения женщин, планирующих беременность (Soll R.F. Progress in the care of extremely preterm infants. JAMA. 2015; 314(10):1007–1008. doi: 10.1001/jama.2015.10911). В настоящее время опубликовано достаточное количество исследований, посвященных анализу различных факторов риска преждевременных родов, которые показали связь рождения маловесного ребенка не только с биологическим анамнезом матери, но и с ее социальными характеристиками (Деев И.А., Куликова К.В., Куликов Е.С., и др. Анализ факторов риска рождения ребенка с очень низкой и экстремально низкой массой тела при рождении // Мать и дитя в Кузбассе. — 2016. — №2 — С. 10–15).
Известно, что вес ребенка при рождении имеет огромное значение для последующего развития и влияет на его состояние здоровья в будущем. Дети, рожденные с низкой массой тела, больше подвержены акушерским осложнениям, у них чаще развиваются гипоксия и неврологические нарушения. Низкий вес новорожденного является характерным признаком синдрома задержки роста плода. (Серов, В. Н. Критические состояния в акушерстве: руководство для врачей /В. Н. Серов, С. А. Маркин. - Москва: Медиздат, 2003. - 704 с.)
Преэклампсия (ПЭ) и задержка роста плода (ЗРП) являются коморбидными осложнениями беременности, так как их развитие связано с аномальной плацентацией, развитием окислительного стресса, воспалительного процесса и формированием эндотелиальной дисфункции (Сидорова, И. С. Обоснование современной концепции развития преэклампсии / И. С. Сидорова, Н. А. Никитина // Акушерство и гинекология. – 2019. – № 4. – С. 26-33).
5
1
Так как вес и рост плода является одним из показателей его развития, перспективным является полногеномный поиск ассоциаций (GWAS), ассоциированных с весом и ростом при рождении плода и поэтому влияющих на развитие плацентарной недостаточности. На данный момент проведено пять GWAS-исследований, в которых оценивали влияние генов на вес при рождении (Variants in ADCY and near CCNL are associated with fetal growth and birth weight / R. M. Freathy, D. O. Mook-Kanamori, U. Sovio [et al.] // Nat. Genet. – 2010. – Vol. 42, № 5. – P. 430-435; Genome-wide associations for birth weight and correlations with adult disease / M. Horikoshi, R. N. Beaumont, F. R. Day [et al.] // Nature. – 2016. – Vol. 538, № 7624. – P. 248-252.; Variants close to NTRK2 gene are associated with birth weight in female twins / S. J. Metrustry, M. H. Edwards, S. E. Medland [et al.] // Twin Res. Hum. Genet. – 2014. – Vol. 17, № 4. – P. 254-261.; New loci associated with birth weight identify genetic links between intrauterine growth and adult height and metabolism / M. Horikoshi, H. Yaghootkar, D. O. Mook-Kanamori [et al.] // Nat. Genet. – 2013. – Vol. 45, № 1. – P. 76-82.; Genome-wide association study ooffspring birth weight in 86 577 women identifies five novel loci and highlights maternal genetic effects that are independent of fetal genetics / R. N. Beaumont, N. M. Warrington, A. Cavadino [et al.] // Hum. Mol. Genet. – 2018. – Vol. 27, № 4. – P. 742-756.). В каждом из этих исследований были выявлены гены, ассоциированные с весом и ростом ребенка при рождении. Одной из групп генов-кандидатов, которые потенциально с высокой вероятностью могут быть вовлечены в развитие различных осложнений беременности, являются гены, дифференциально экспрессирующиеся в плаценте (Сереброва В.Н. и др., 2016; Kleinrouweler C.E. et al., 2013; Majewska M. et al., 2019). Это связано с тем, что именно плацента, вследствие выполняемых ею важнейших функций (барьерная, трофическая, эндокринная, иммунная, экскреторная и др.), напрямую определяет характер течения беременности и влияет на развитие плода (Burton G.J., Jauniaux E., 2018).
2
Нами выявлена вовлеченность полиморфного локуса rs10496196 HK2 в формирование веса новорожденного. Ген HK2 кодирует гексокиназу 2, которая катализирует первый этап метаболизма глюкозы – фосфорилирование с образованием глюкозо-6-фосфата (https://www.genecards.org/). Ассоциации полиморфного локуса rs10496196 HK2 с весом ребенка при рождении, могут быть обусловлены важными функциональными эффектами полиморфизма: rs10496196 HK2 локализован в ДНКаза-гиперчувствительном сайте в 19 тканях, сайте связывания с 3 регуляторными белками и области 3 регуляторных последовательностей. Также данный SNP связан с экспрессией гена HK2 в периферической крови и более низкой транскрипцией гена HK2 в висцеральной жировой ткани, а находящиеся с ним в сильном сцеплении (r≥0,8) 5 SNPs связаны с уровнем экспрессии мРНК гена HK2 в висцеральной жировой ткани, яичниках, генов POLE4 и AC104135.3 в трансформированных фибробластах, гена AC104135.2 в висцеральной жировой ткани. Также полиморфизм rs10496196 HK2 связан с уровнем альтернативного сплайсинга транскрипта гена MTHFD2 в крови (интрон ID: 74211866:74214079:clu_38697, β=-0,31). С практической точки зрения представляется крайне необходимым выделение критериев индивидуального прогнозирования риска развития низкого веса новорожденного на основе исследованных полиморфного локуса rs10496196 HK2, а так же других возможных факторов риска с целью выявления низкого веса новорожденного.
В Российской Федерации исследования о вовлеченности полиморфного локуса rs10496196 HK2 в формировании предрасположенности к риску развития низкого веса новорожденного  отсутствуют.
Для оценки сложившейся патентной ситуации был выполнен поиск по охранным документам за период с 1990 по 2021 гг. Анализ документов производился по направлению: способ прогнозирования риска рождения детей с низкой массой тела  в зависимости от полиморфного локуса rs10496196 HK2. Источники информации: сайты Федерального института промышленной собственности http://fips.ru.
В изученной научно-медицинской и доступной патентной литературе авторами не было обнаружено способа прогнозирования риска рождения детей с низкой массой тела на основе данных о полиморфном локусе rs10496196 HK2.
Из области техники известен патент РФ № 2472446 от 20.10. 2011 «Способ прогнозирования массы тела новорожденного», который включает оценку питания матери во время беременности и комплекса социально-экономических и медико-биологических факторов риска, оказывающих влияние на родителей. Массу тела новорожденного определяют по формуле: Y1=2477,41-59,63X1+82,46X2+46,1X3+0,88X4-0,44X5+1,63X6-5,005X7-86,53X8+345,93X9+152,06X10+1,56X11-3,5X12+493,13X13+834,11X14-127,71X15+90,32X16+397,68X17-245,04X18+418,51X19-446,33X20+174,90X21, где Y1- масса тела новорожденного; X1- количество в рационе белка животного происхождения (г), X2- количество общего белка в рационе (г), X3- жиры в рационе (г), X4- натрий в рационе (мг), X5- калий в рационе (мг), X6- кальций (мг), X7- фосфор (мг); X8- железо (мг), X9- рибофлавин (мг), X10- ниацин (мг), X11- витамин С (мг), X12- калорийность рациона (ккал), X13- общий стаж работы матери: до 4 лет - 1 балл, от 5 до 9 лет - 2 балла, от 10 до 14 лет - 3 балла, от 15 до 19 лет - 4 балла, от 20 до 24 лет - 5 баллов, более 25 лет - 6 баллов, X14- семейное положение: замужем - 1 балл, не замужем - 2 балла; X15- индекс массы тела женщины, до наступления беременности; X16- условия труда матери во время беременности: нет вредностей - 1 балл, перегревание - 2 балла, переохлаждение - 3 балла, вибрация - 4 балла, шум - 5 баллов, загазованность - 6 баллов, запыленность - 7 баллов, психоэмоциональные нагрузки - 8 баллов; X17- стрессовые нагрузки на производстве и в семье - 1 балл, 2 балла - отсутствие; X18- социальные условия: доход на одного члена семьи до 5000 рублей - 1 балл, от 5000-10000 рублей - 2 балла, от 10000-15000 рублей - 3 балла, свыше 15000 рублей - 4 балла; X19- режим питания: 1 раз в день - 1 балл, 2 раза - 2 балла, 3 раза в день - 3 балла, 4 раза - 4 балла, 5 и более раз - 5 баллов; X20- стаж работы отца ребенка на момент зачатия: до 4 лет - 1 балл, от 5 до 9 лет - 2 балла, от 10 до 14 лет - 3 балла, от 15 до 19 лет - 4 балла, от 20 до 24 лет - 5 баллов, более 25 лет - 6 баллов, X21- характер трудовой деятельности отца на момент зачатия: без особенностей - 1 балл, преимущественно сидячий 2 балла, преимущественно стоячий - 3 балла, преимущественно активный - 4 балла, поднятие тяжести - 5 баллов, с нервно-эмоциональным напряжением - 6 баллов.
Недостатками данного метода являются: 1) учет большого количества критериев, что является сложным и дорогостоящим процессом;
2) способ не включает генетические маркеры, что исключает раннюю диагностику и проведение профилактических мероприятий по предотвращению рождения детей с низкой массой тела.
За прототип выбран патент РФ № 2557952 по заявке № 2014124787/15 от 18.06.2014 «Способ прогнозирования веса новорожденного с учетом полиморфных вариантов локуса 10976 G/A FVII». Способ включает выделение ДНК из периферической венозной крови и проведение анализа полиморфизма генов VII фактора коагуляции 10976G/A FVII. Вес тела новорожденного определяют при рождении на сроке 37 и более недель беременности. У женщин, рожающих не в первый раз, вес тела новорожденного определяют по уравнению: y=6123,431-25,579x1+0,267x2+205,739x3, где y - прогнозируемый вес новорожденного, x1- рост женщины в сантиметрах; x2- вес ребенка в предыдущих родах в граммах, x3- генетический вариант локуса 10976G/A FVII, при этом x3=1 для генотипа 10976 GG FVII, x3=2 для генотипов 10976 GA и 10976 AA FVII. У первородящих женщин вес тела новорожденного определяют по уравнению: y=6278,037-21,739x1+232,170x2, где x1- рост женщины в сантиметрах; x2- генетический вариант локуса 10976 G/A FVII, при этом x2=1 для генотипа 10976 GG FVII, x2=2 для генотипов 10976 GA и 10976 AA FVII.
Недостатком способа является невозможность прогнозирования веса новорожденного на ранних сроках беременности у женщин с ПЭ и ЗРП, которые относятся к группе высокого риска по рождению детей с низкой массой тела, не учитываются другие полиморфные локусы.
Задачей настоящего изобретения является расширение арсенала методов диагностики, а именно создание способа прогнозирования риска рождения детей с низкой массой тела на основе данных о полиморфном локусе rs10496196 HK2, дифференциально экспрессирующегося в плаценте.
Технический результат использования изобретения – получение критериев оценки риска рождения детей с низкой массой тела у беременных русской национальности, уроженок Центрально – Черноземного региона РФ, на основе данных о полиморфном локусе rs10496196 HK2, включающий:
- выделение ДНК из периферической венозной крови;
- анализ полиморфного локуса rs10496196 HK2;
- прогнозирование высокого риска рождения детей с низкой массой тела у беременных при выявлении аллеля А полиморфного локуса rs10496196 HK2.
Новизна и изобретательский уровень заключаются в том, что из уровня техники не известна возможность прогноза развития низкого веса новорожденного у беременных на основе данных об аллеле А полиморфного локуса rs10496196 HK2, дифференциально экспрессирующегося в плаценте.
Способ осуществляют следующим образом:
2
Выделение геномной ДНК из периферической крови осуществляют методом фенольно-хлороформной экстракции (Miller, S. A. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells / S. A. Miller, D. D. Dykes, H. F. Polesky // Nucleic. Acids. Res. – 1988. – Vol. 16, № 3. – P. 1215) в два этапа. На первом этапе к 4 мл крови с ЭДТА добавляют 25 мл лизирующего буфера, содержащего 320мМ сахарозы, 1% тритон Х-100, 5мМ MgCl, 10мМ трис-HCl (pH=7,6). Полученную смесь перемешивают и центрифугируют при 4ºС, 4000 об./мин. в течение 20 минут. После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 4 мл раствора, содержащего 25 мМ ЭДТА (рН=8,0) и 75 мМ NaCl, ресуспензируют. Затем прибавляют 0,4 мл 10% SDS, 35 мкл протеиназы К (10мг/мл) и инкубируют образец при 37ºС в течение 16 часов.
0
На втором этапе из полученного лизата последовательно проводят экстракцию ДНК равными объемами фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием при 4000 об./мин. в течение 10 минут. После каждого центрифугирования производят отбор водной фазы. ДНК осаждают из раствора двумя объемами охлажденного 96% этанола. После лиофилизации полученную ДНК растворяют в бидистиллированной, деионизованной воде и хранят при -20С.
Генотипирование образцов ДНК было выполнено в Центре коллективного пользования «Медицинская геномика» Томского национального исследовательского медицинского центра РАН на базе НИИ медицинской генетики (использовался метод MALDI и масс-спектрометр MassARRAY Analyzer 4 (фирма производитель “Seqeunom”, страна производства США). Для генотипирования использовали образцы ДНК в концентрации 10-20 нг в микролитре общим объемом 10 мкл. В процессе экспериментального анализа образцов выполняли следующие этапы: проведение мультиплексной ПЦР; осуществление SAP-реакции; выполнение iPLEX реакции с последующим обессоливанием и нанесением на SpectroCHIP; процедуры ионизации и анализа спектров с помощью масс-спектрометрии MALDI-TOF (Степанов, В. А. Мультиплексное генотипирование однонуклеотидных полиморфных маркеров методом масс-спектрометрии MALDI-TOF: частоты 56 SNP в генах иммунного ответа в популяциях человека / В. А. Степанов, Е. А. Трифонова // Молекулярная биология. – 2013. – Т. 47, № 6. – С. 976-986).
perm
perm
adj
adj
adj
adj
Ассоциации SNPs генов-кандидатов c формированием преэклампсии и задержки роста плода оценивали при помощи логистической регрессии с включением в расчеты трех моделей – аддитивной (модель 1), рецессивной (модель 2) и доминантной (модель 3), и поправкой на ковариаты (выявленные в работе средовые факторы риска) и множественные сравнения (использовались адаптивные пермутационные процедуры с расчетом показателя p). Финальную оценку статистической значимости выявленных ассоциаций выполняли с учетом дополнительно введенной поправки на множественные сравнения – поправки Бонферрони, равной 3, учитывающей число тестируемых генетических моделей (модели 1, 2 и 3). В конечном итоге, при рассмотрении самостоятельных эффектов SNPs показатель p<0,017 принимался за статистически значимый. Для оценки направленности ассоциации использовался показатель отношения шансов (ОR) и его 95% доверительный интервал (95%CI). При показателе ОR больше единицы связь оценивали как положительную (рассматриваемый генетический маркер является рисковым), а значение ОR меньше единицы указывало на отрицательную ассоциацию (изучаемый маркер выполняет «протективную роль»).
adj
adj
Ассоциации SNPs генов-кандидатов с весом новорожденного оценивали при помощи лог-линейного регрессионного анализа. Для данного анализа использовались трансформированные значения веса новорожденного, так как его распределение в исследуемой выборке (оценивалось на основе критерия Шапиро-Уилка) не соответствовало нормальному. Методика проведения лог-линейной регрессии полностью соответствовала аналогичной методике логистической регрессии, описанной выше. Для оценки направленности ассоциативной связи был использован коэффициент регрессии (β) и его ошибка (SE) (описывают изменение трансформированного показателя веса новорожденного на минорный аллель).
Возможность использования предложенного способа для оценки прогнозирования риска развития низкого веса новорожденного у беременных подтверждает анализ результатов наблюдений 716 пациенток. Основные медико-биологические и клинико-анамнестические характеристики беременных отражены в таблице 1.
Таблица 1
Медико-биологические и клинико-анамнестические характеристики матерей, влияющие на вес новорожденного
В выборку для исследования вошли женщины с преэклампсией и/или задержкой роста плода и женщины с физиологическим течением беременности, давшие свое информированное согласие на участие в данной исследовательской работе и соответствующие ряду критериев: русский этнос, место рождения и проживания – регион Центрального Черноземья России. Основаниями для исключения женщин из исследовательской выборки были отказ от участия в данной работе, наличие родства между ними различной степени, выявление тяжелых хронических заболеваний, приводящих к декомпенсации, нерусский этнос и иные (нежели Центральное Черноземье России) места рождения и/или проживания.
Клиническое, клинико-лабораторное, клинико-инструментальное обследование беременных и новорожденных детей, верификация диагноза осложнений беременности – ПЭ, ЗРП (или их отсутствие), сбор медико-биологической информации, результатов клинического, клинико-лабораторного, клинико-инструментального обследования беременных и новорожденных детей в специально разработанные анкеты и формирование электронной базы данных проводилось сертифицированными врачами профильных отделений перинатального центра Белгородской областной клинической больницы Святителя Иоасафа.
perm
При расчете частот аллелей и анализе их ассоциаций  у индивидуумов установлена связь с формированием низкого веса новорожденного, включающий полиморфный локус rs10496196 HK2. Аллель А полиморфного локуса rs10496196 HK2, дифференциально экспрессирующегося в плаценте, ассоциирован с низким весом новорожденного в рамках доминантной модели (β=-0,11, р=0,030, р=0,032).
В качестве примеров конкретного применения разработанного способа приведено обследование русских пациенток, уроженок Центрально-Черноземного региона РФ и не являющихся родственницами между собой:  проведено генетическое исследование по полиморфному локусу rs10496196 HK2.
1. У женщины М., русской национальности, уроженки Центрального Черноземья, на ранних сроках беременности была взята венозная кровь, при генотипировании ДНК-маркеров был выявлен аллель С полиморфного локуса rs10496196 HK2, что позволило отнести ее в группу беременных с пониженным риском рождения детей с низкой массой тела. Дальнейшее наблюдение за данной пациенткой показало, что вес новорожденного, родившегося на сроке 38 недель, составил 2800 грамм.
2. У женщины Ю., при прегравидарной подготовке, была взята венозная кровь, при генотипировании ДНК-маркеров был выявлен аллель А полиморфного локуса rs10496196 HK2, что позволило отнести ее в группу беременных с повышенным риском рождения детей с низкой массой тела. Дальнейшее наблюдение за данной пациенткой показало, что вес новорожденного, родившегося на сроке 39 недель, составил 1820 грамм.
3. У беременной Д., русской национальности, уроженки Центрального Черноземья, на ранних сроках беременности была взята венозная кровь, при генотипировании ДНК-маркеров был выявлен аллель С полиморфного локуса rs10496196 HK2, что позволило отнести ее в группу беременных с пониженным риском рождения детей с низкой массой тела. Дальнейшее наблюдение за данной пациенткой показало, что вес новорожденного, родившегося на сроке 38 недель, составил 3250 грамм.
4. У женщины Ч., русской национальности, уроженки Центрального Черноземья, при прегравидарной подготовке была взята венозная кровь. При генотипировании ДНК-маркеров был выявлен аллель А полиморфного локуса rs10496196 HK2.  Дальнейшее наблюдение за данной пациенткой показало, что вес новорожденного, родившегося на сроке 40-41 неделя, составил 2150 грамм.
Прогнозирование рождения детей с низкой массой поможет улучшить комплекс мероприятий, направленных на профилактику и лечение осложнений беременности, что позволит улучшить перинатальные исходы.