Контроль гвл-1 и гвл-4 инфекции (ринопневмонии) при экспорте лошадей

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА

Контроль ГВЛ-1 и ГВЛ-4 инфекции (ринопневмонии) при экспорте лошадей

К.П. Юров1, доктор ветеринарных наук, С.В. Алексеенкова1, кандидат биологических наук,

М.Г. Савкова2, кандидат ветеринарных наук

1 Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко (ВИЭВ) (Москва).

2 Забайкальская краевая ветеринарная лаборатория (Чита).

Ключевые слова: герпесвирус, гликопротеин О, дифференциальная диагностика, иммунофермент-ный анализ, реакция нейтрализации, ринопневмо-ния лошадей

Сокращения: ГВЛ-1 — герпесвирус лошадей типа 1, ГВЛ-4 — герпесвирус лошадей типа 4, ГСТ — глута-тион-С-трансфераза, ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота, ИФА — иммуноферментный анализ, МЭБ — Международное эпизоотическое бюро, РДП— реакция диффузионной преципитации, РН — реакция нейтрализации, РСК — реакция связывания комплемента, СПФ — свободный от патогенной флоры, ТЦД — тканевая цитопатическая доза

Введение

После открытия вирусной природы такого массового заболевания лошадей, как ринопневмония — вирусный аборт, и идентификации возбудителя как герпетического вируса лошадей в работах ряда авторов отмечалось различие штаммов вируса, выделенных из респираторных органов и абортированных плодов («респираторных» и «фетальных») [5, 8]. «Фетальными» штаммами легко воспроизводили заболевание у лошадей; они хорошо культивировались в клеточных культурах, были более иммуногенными [3]. Эпизоото-логические наблюдения свидетельствовали, что в странах, где доминировали «респираторные» штаммы (в Англии, Австралии), число абортов у кобыл было незначительным [6, 9].

Современные методы молекулярной диагностики позволяют дифференцировать два отдельных типа вируса герпеса лошадей, а именно: первый и четвертый.

Наибольшую опасность для коневодческих хозяйств представляет инфекция, вызванная ГВЛ-1, или ринопневмония — вирусный аборт. Заболевание, возни-каюшее в ранее благополучных хозяйствах, часто принимает форму острой массовой вспышки, в течение которой инфицируется все поголовье. У 40...60 % жеребых кобыл (иногда показатель достигает 90 %) отмечают аборты. Такие взрывообразные случаи абортов известны как «шторм-аборты» [1].

Вследствие образования иммунитета у кобыл в последующие несколько лет аборты обычно не наблюдают. Если поголовье не вакцинируют, то вспышки эмбриональной смертности повторяются через несколько лет по мере снижения иммунитета. Периодически регистрируют нервно-паралитическую форму ринопнев-монии, которую наблюдают как осложнение после абортов или в виде самостоятельных вспышек заболевания. Вспышки нервно-паралитической инфекции связаны с распространением нейропатогенных штам-

мов возбудителя. Появление новых нейропатогенных вариантов вируса с измененной картиной рестрикции ДНК и вытеснение ими ранее доминировавших штаммов вируса установлено, в частности, американскими исследователями [7]. Условием появления нейро-паралитического заболевания служит инфицирование вирусом с нейропатогенными свойствами и сенсибилизация макрофагов лошади, возможно, в результате прививки вакцины. Вспышки нейропаралитической формы инфекции ГВЛ-1в последнее время (2012—2013 гг.) зарегистрированы в некоторых сопредельных с РФ странах балтийского региона.

Лошади-вирусоносители служат источником новых штаммов возбудителя для неиммунного поголовья. В связи с тем, что перевозки лошадей, в том числе международные, могут служить причиной распространения новых вариантов ГВЛ-1, в нормативных документах МЭБ содержатся рекомендации по предупреждению распространения инфекции ГВЛ-1, которыми определяется изоляция лошадей, положительно реагирующих на вирус, запрещение вывода и ввода лошадей в неблагополучное хозяйство, необходимые лабораторные исследования и т. д. Положительный результат тестирования лошадей в РН на ринопневмо-нию исключает возможность экспорта животного. Ограничения не распространяются на хозяйства, неблагополучные по инфекции ГВЛ-4, поскольку этот вирус вызывает в основном кратковременную, с доброкачественным течением респираторную инфекцию и в отдельных случаях ассоциируется со спорадическими абортами.

Цель исследования

Провести дифференциальную серологическую диагностику инфекций ГВЛ-1 и ГВЛ-4 в хозяйствах Забайкальского края у лошадей, предназначенных для экспорта.

Материалы и методы

Вирус. Штамм «ПП-1» ГВЛ-1 из музея лаборатории. Накопление вируса и постановку РН проводили в культуре клеток почки кролика RK-13.

Сыворотки. Пробы сыворотки крови лошадей, предназначенных для экспорта в Монгольскую Народную Республику в целях селекционной работы, предоставлены ГУ «Забайкальская краевая ветеринарная лаборатория» из различных районов Забайкальского края.

РН. Уровень специфических антител определяли в РН на 96-луночных культуральных планшетах («Согш:^», США) методом двукратных разведений испытуемой сыворотки против 100.300 ТЦД50/мл вируса на лунку согласно стандарту МЭБ.

Контроль ГВЛ-1 и ГВЛ-4 инфекции (ринопневмонии) при экспорте лошадей

1. Результаты РН и ИФА с пробами сыворотки крови лошадей (п= 74) Забайкальского края

Положительные результаты, %

Районы Число проб m* РН ИФА для дифференциации антител

(титр > 1:32) Герпес 1 Герпес 4

Агинский район, Колхоз «Кункур» 11 9,66 27,27 0 27,27

Агинский район, Племсовхоз «Имени Калинина» 14 11,89 21,43 0 28,57

Моготуйский район, АКФ «Имени Ленина» 5 16 40 0 40

Моготуйский район, ПЗ «Догой», табун Б. Харанутова 7 32 71,43 0 71,43

Карымский район, ООО «Урульгинское» 5 16 60 0 40

Нерченский район, МУП «Нерченский конезавод» 5 18,38 20 0 0

ГУ «Читинская ГЗК с ипподромом имени Х. Хакимова» 9 43,55 88,89 11,11 100

Борзинский район, КФХ «Русь» 5 10,56 20 0 0

Ононский район, СПК «Рассвет» 5 18,38 20 0 20

Шилкинский район, Конеферма МУ «Управление сельского хозяйства муниципального района «Шилкинский район» 8 22,63 37,5 0 50

Примечание. * m — средний геометрический титр вируснейтрализующих антител по группе.

ИФА для обнаружения и дифференциации антител

к ГВЛ-1 и ГВЛ-4. Сыворотки крови лошадей тестировали трехкратно против химерного белка ГСТ и гликопротеина G ГВЛ-1, химерного белка ГСТ и гликопротеина G ГВЛ-4, а также нативного белка ГСТ по методу, предложенному Crabb B.B., Studdert M.J.

[4]. Контрольные сыворотки были получены от СПФ жеребят (B. Klingeborn, «Svanova», Швеция).

Статистические методы. Иммунологические показатели оценивали с помощью средних геометрических величин компьютерной программой «Microsoft Office Excel 2003» для Windows.

Результаты и обсуждение

Данные, приведенные в таблице, свидетельствуют, что в крови лошадей, предназначенных на экспорт, были обнаружены в РН в диагностических титрах антитела к возбудителю ринопневмонии. Количество положительных проб колебалось от 20 до 88,9 %. При этом в регионе не регистрировали аборты у кобыл. Поскольку результаты РН не позволяли дифференцировать типовую принадлежность вируса, пробы были исследованы в ИФА. Результаты этого тестирования свидетельствуют о циркуляции в поголовье ГВЛ-4, количество положительно реагирующих составляет 20.100 %. Отмечена корреляция данных, полученных в обоих тестах.

ГВЛ-1 и ГВЛ-4 идентичны по последовательности нуклеотидов в пределах гомологичных генов на 55.84 %, по последовательности аминокислот — на 55.96 %. Существующие генетические различия между ГВЛ-1 и ГВЛ-4 достаточны для дифференцирования вирусов по главным биологическим особенностям: антигенной активности, рестриктному профилю, спектру хозяев и вирулентности для лошадей. Это доказывает, что возбудители родственны, но при этом являются разнотипными вирусами герпеса лошадей. ГВЛ-1 и ГВЛ-4 имеют сходные антигенные детерминанты и перекрестно реагируют в разных серологических реакциях (РН, ИФА, РСК, РДП, иммуноблот-тинге) с поликлональными антителами. У молодых лошадей, вакцинированных против ГВЛ-1 или ГВЛ-4,

наблюдают неполную перекрестную защиту от экспериментальной инфекции гетерологичным вирусом. Гликопротеины ГВЛ-1 и ГВЛ-4 в составе антигенных детерминант имеют группоспецифические и типоспецифические эпитопы, исключение — гликопротеин gG, который выявляется только типоспецифическими антителами. В лабораторной практике моноклональные типоспецифические антитела к gG используют для дифференциальной диагностики ГВЛ-1 и ГВЛ-4 [2].

Указанное служит основанием действующих в настоящее время рекомендаций МЭБ по проведению ограничительных мероприятий, которые относятся исключительно к заболеванию, вызываемому ГВЛ-1, то есть к ринопневмонии — вирусному аборту Ограничительные мероприятия относительно инфекции, вызванной ГВЛ-4, не предусмотрены. В связи с этим лошади с положительной реакцией на ГВЛ-4 транспортируются на общих основаниях в соответствии с Кодексом здоровья наземных животных МЭБ, 2012.

Выводы

Комплексное исследование сыворотки крови от лошадей, предназначенных на экспорт, в РН и ИФА позволяет дифференцировать иммунную реакцию на ГВЛ-1 и ГВЛ-4. Полученные данные свидетельствуют о доминировании в поголовье лошадей Забайкальского края ГВЛ-4. Результаты лабораторного исследования согласуются с результатами эпи-зоотологических наблюдений — отсутствию абортов у кобыл.

Библиография

1. Юров К.П., Косминков Н.Е., Заблоцкий В.Т. Инфекционные и паразитарные болезни лошадей. — М.: Зоомедлит, 2010.

2. Allen G.P. Respiratory Infections by Equine Herpesvirus Types 1 and 4 / In Book: Respiratory Infections by Equine Herpesvirus Types 1 and 4 (edited by P. Lekeux). — http://www.ivis.org/special_books/ Lekeux/allen/ivis.pdf

РВЖ • СХЖ • № 3/2013

К.П. Юров, С.В. Алексеенкова, М.Г. Савкова

3. Burrows R., Goodridge D. In vivo and in vitro studies of equine rhinopneumonitis virus strains / In Proceedings of the Third International Conference on Equine Infectious Diseases (edited by J.T. Bryans & H. Gerber. — Basel: S. Karger, 1973.

4. Crabb B.B., Studdert M.J. Epitopes of glycoprotein G of equine herpesviruses 4 and 1 located near the C termini elicit type-specific antibody responses in the natural host // Journal of Virology, 1993; 67 (10): 6332-6338.

5. Dimock W.W., Edwards P.R. Is there a filterable virus of abortion in mares? // Kentucky Agricultural Experiment Station Bulletin, 1933; 33: 297-30I.

6. Greenwood R.E. Equine rhinopneumonitis outbreak in Newmarket // Veterinary Research, 1979; 104 (23): 534-535.

7. Nugent J., Birch-Machin I., Smith K.C., Mumford J.A., Swann Z., Newton J.R., Bowden R.J., Allen G.P., Davis-Poynter N. Analysis of Equid Herpesvirus 1 Strain Variation Reveals a Point Mutation of the DNA Polymerase Strongly Associated with Neuropatho-genic versus Nonneuropathogenic Disease Outbreaks // Journal of Virology, 2006; 80 (8): 4047-4060.

8. Randall C.C., Ryden F.W., Doll E.R. and Schell F.S. Cultivation of equine abortion virus in fetal horse tissue in vitro // American Journal of Pathology, I953; 29: I39-I53.

9. Studdert M.J., Fitzpatrick D.R., Horner G.W., Westbury H.A., Glee-son L.J. Molecular epidemiology and pathogenesis of some equine herpesvirus type 1 (equine abortion virus) and type 4 (equine rhinopneumonitis virus) isolates // Australian Veterinary Journal, 1984; 61 (11): 345-348.

Summary

K.P. Yurov., S.V. Alexeyenkova, M.G. Savkova. Control of EHV-1 and EHV-4 Infections Due Horses Export. Some probes of sera from breeding horses out of different districts of the Trans-Baikal region were tested with purpose to reveal antibodies to equine rhinopneumonitis virus in NT and gG (Ab) ELISA due the horses export to Mongolia. Antibodies in diagnostic titer to respiratory EHV-4 were dominated in most probes. The obtained results allow to eliminate the restrictive measures necessary for EHV-1 on export of these horses.

УДК 619:615.9: 616-076

Экспрессный способ определения афлатоксинов В1, B2, G1, G2 в зерне и кормах

В.Г. Амелин, доктор химических наук, Т.Б. Никешина, кандидат биологических наук, Н.М. Карасева, аспирант Федеральный центр охраны здоровья животных (Владимир).

Ключевые слова: афлатоксины В1, В2, G1, G2, ВЭЖХ, дисперсионная жидкостно-жидкостная микроэкстракция, зерно, корма, QuEChERS Сокращения: ВЭЖХ — высокоэффективная жидкостная хроматография, ДЖЖМЭ — дисперсионная жидкостно-жидкостная микроэкстракция, ПДК— предельно допустимая концентрация, QuEChERS— Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe

Введение

Актуальность проблемы загрязнения зерновых кормов и комбикормов микотоксинами, а также заболевание животных и птицы микотоксикозами на сегодняшний день общеизвестна. Среди микотоксинов наиболее широко распространены афлатоксины В1, В2, G1, G2, продуцируемые микроскопическими грибами Aspergillus flavus и Aspergillus раrasiticus [6].

Предложено большое число методик определения афлатоксинов посредством ВЭЖХ с флуориметри-ческим детектором [4.8]. Для очистки экстрактов

в данных случаях применяют иммуноаффинные колонки [4, 8].

В последнее время для извлечения афлатоксинов стали использовать методы QuEChERS [4] и ДЖЖМЭ

[5]. Метод QuEChERS основан на растворении пробы в водном ацетонитриле и добавлении органических солей, которые являются буферирующими смесями и высаливателями. Полученный экстракт очищают на насыпном сорбенте, что позволяет удалить оставшиеся примеси (жирные кислоты, жиры и сахара).

Суть метода ДЖЖМЭ заключается в использовании системы растворителей: диспергатор, экстрагент, вода (водный раствор). При выборе растворителей важно, чтобы диспергатор неограниченно растворялся в воде, а экстрагент, наоборот, не растворялся в ней. Смесь диспергатора и экстрагента вводят в воду, после чего экстрагент выделяется в виде микрочастиц отдельной фазы, концентрирующей аналиты. Оба эти способа появились сравнительно недавно, однако уже имеют широкую популярность в области исследования микотоксинов.