Импорт нуклеазы Cas9 в митохондрии

импорт нуклеазы cas9 в митохондрии

К.Е. Орищенко 12, Ю.К. Софронова 2, Е.Г. Чупахин 2, Е.А. Лунев 2, И.О. Мазунин 2 1ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики СО РАН», Новосибирск, Россия

2 Балтийский федеральный университет им. И. Канта, Калининград, Россия Delivery Cas9 into mitochondria

К.Е. Orishchenko 12, J.K. Sofronova 2, E.G. Chupakhin 2, E.A. Lunev2, I.O. Маzunin 2

1 Federal Research Center Institute of Cytology and Genetics, the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, Novosibirsk, Russia

21. Kant Baltic Federal University, Kaliningrad, Russia

Технологии направленного редактирования ядерного генома активно и успешно используются в лабораториях по всему миру. Нуклеазы на основе доменов типа «цинковые пальцы» етШ) и нуклеазы на основе эффекторных ТА1_-белков (ТА1_Е№) уже адаптированы для внесения двух-цепочечных разрывов в митохондриальной ДНК (мтДНК). Появившаяся недавно более эффективная и универсальная технология CRiSPR\Cas9 находится на начальном этапе её адаптации для мтДНК.

Цель настоящей работы — модификация нуклеазы Cas9, одной из составляющих функциональных частей системы CRiSPR\Cas9, для специфического импорта во внутримито-хондриальное пространство. Адаптация второго компонента системы — направляющей РНК, позволяющая осуществлять ее специфическую доставку в митохондрии, даст возможность использовать данную систему для направленной деградации мтДНК содержащей мутации, а в перспективе позволит разработать подходы для её редактирования.

Ключевые слова: митохондрии, нуклеаза Cas9, редактирование мтДНК.

Введение

Митохондрии человека содержат двухцепочечную кольцевую молекулу ДНК (мтДНК), в структуре которой закодирована информация о комплексах окислительного фосфорилирования. Нарушения структуры мтДНК приводят к широкому спектру нейромышеч-ных и нейродегенеративных заболеваний. По современным представлениям частота встречаемости таких заболеваний составляет 9,2:100000 [1, 2]. Как правило, патогенные мутации в мтДНК находятся в состоянии гетероплазмии, то есть в митохондриях одновременно с мутантной ДНК присутствует мтДНК дикого типа. В таком состоянии негативное влияние мутации частично компенсируется за счет «здоровой» мтДНК. Превышение соотношения мтДНК с мутацией к дикому типу, примерно 4:1, приводит, как правило, к проявлению клинических признаков заболевания [3]. В связи с этим разрабатываются различные подходы для смещения этого соотношения в сторону мтДНК дикого типа за счет снижения количества мутантной мтДНК в митохондриях.

Для редактирования и модификации ядерной ДНК к настоящему времени разработано несколько систем, некоторые из которых довольно широко и успешно применятся. К ним относятся модифицированные мегануклеазы, нуклеазы на основе доменов типа «цинковые пальцы» — ZFNs (Zinc Finger Nucleases) и TALE белков — TALENs (Transcription Activator Like Effector Nucleases), а также система CRiSPR/Cas9. В случае мегануклеаз, ZFNs и TALENs, целевая последовательность в геноме распознается с помощью соответствующих ДНК-связывающих доменов белков. Система CRiSPR/Cas9 работает по другому принципу. Она включает в себя два компо-

e-mail: OrishchenkoKE@icg.sbras.ru

Genome editing technologies became tremendously useful in laboratories around the world. ZFN and TALENs were successfully adapted for production specific double-stranded breaks in mtDNA. Recently developed more efficient and universal CRiSPR\Cas9 based technology is still in the very beginning for its adaptation for mtDNA editing. in this article, we modified nuclease Cas9, protein part of functional CRiSPR\Cas9 system, for specific import into mitochondria inner compartment. Adaptation of the second system component — guide RNA, for specific delivery to the mitochondria, would allow to use it for directed degradation of mtDNA containing mutations and potentially develop approaches for mtDNA editing.

Keywords: mitochondria, nuclease Cas9, mtDNA editing.

нента: собственно нуклеазу Cas9 и направляющую РНК. Эти компоненты взаимодействуют друг с другом, формируя комплекс, который достигает определенного места в геноме за счет направляющей РНК, часть которой комплементарна целевой нуклеотид-ной последовательности. Каждая из существующих систем имеет свои преимущества и недостатки, однако, именно система CRiSPR/Cas9 получила наибольшее распространение и широко применяется благодаря простоте использования и высокой эффективности. Данные системы подробно рассмотрены в нескольких обзорах [4, 5].

К настоящему времени система редактирования генома на основе нуклеазы Cas9 еще не адаптирована для супрессии патогенных мутаций мтДНК. Тем не менее, сайтспецифические нуклеазы ZFNs и TALENs уже прошли этот этап и успешно себя проявили. Специфичный импорт нуклеаз mtZFNs удалось обеспечить путем присоединения сигнальной последовательности, направляющей импорт белка в митохондрии [6]. Таким образом, удалось снизить уровень гетероплазмии мтДНК m.8993T^G на 10% (с 93 до 83%), а также основной делеции на 61% (с 85 до 24%). Объединение TALEN с сигнальной последовательностью, направляющей импорт белка в митохондрии (mitoTALENs), было использовано для уменьшения уровня гетероплазмии m.14459G^A и основной делеции [7]. Очевидно, что подобная стратегия могла бы быть использована для обеспечения импорта нуклеазы Cas9 в митохондрии, причем учитывая высокую эффективность данной системы для ядерной ДНК [8], можно также ожидать увеличение эффективности редактирования мтДНК по сравнению с mtZFN и mitoTALENs. Однако задача усложняется

тем, что система редактирования на основе нуклеазы Cas9 для специфического разрезания ДНК требует направляющей РНК. При этом импорт РНК в митохондрии ограничен в естественных условиях лишь несколькими функциональными молекулами [9].

Цель настоящей работы — модификация нуклеа-зы Cas9, одной из составляющих функциональных частей системы CRiSPR\Cas9, для специфического импорта во внутримитохондриальное пространство.

Материал и методы

Плазмидные конструкции

Карты плазмидных векторов pMitoCas9 и pMitoCas9-SV40 были построены с помощью программного обеспечения SnapGene (рис. 1). Для сборки использовали фрагмент 705-1403 п.н. плаз-миды pTurboGFP-mito (Евроген, Россия), фрагмент 761-2686 п.н. плазмиды pUC19 (NEB, США) и фрагмент 747-4863 п.н. плазмиды hCas9, которая была любезно предоставлена George Church (Addgene plasmid # 41815) [10], а также синтезированные на заказ двухцепочечные фрагменты ДНК — gBloks (iDT, США). Плазмида pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) любезно предоставлена Feng Zhang (Addgene plasmid # 48138). Амплификацию фрагментов ДНК проводили с применением полимеразы PfuTurbo Cx (Agilent Technologies, США) на амплификаторе C1000 Touch (Bio-Rad, США). Олигонуклеотидные праймеры синтезировали с помощью фосфорамидитного метода на AMS-2000 («Биоссет», Россия) и очищали методом обращено-фазовой хроматографии на 0PS-1000 («Биоссет»), используя реагенты компании «Glen Research» (США). Сборку плазмид осуществляли с применением ферментативной системы USER (NEB, США), а также классических методов молекулярного клонирования. «Бесшовное» соединение фрагментов ДНК проводили с помощью сборки по Гибсону (NEB, США) согласно инструкции фирмы-производителя.

Культивирование клеток и трансфекция

Клетки линии Phoenix любезно предоставлены Фишманом В.С. (лаборатория генетики развития ИЦиГ СО РАН). Клетки культивировали в питательной среде DMEM (Gibco, США) с добавлением 10% эмбриональной сыворотки коров (invitrogen, США) и 100 мкг/мл смеси антибиотиков пенициллина и стрептомицина 1:1 (invitrogen, США). Трансфек-цию клеток проводили с помощью Lipofectamine 3000 (invitrogen, США) в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя. Уровень флуоресценции клеток оценивали на проточном цитометре BD FACSAria (Becton Dickinson, США) с использованием программного обеспечения BD FACSDiVa в ЦКП «Проточной цитометрии» ИЦиГ СО РАН.

Иммуноцитохимический анализ

Клетки выращивали на покровных стеклах 15x15 мм в 12-луночных планшетах. Через 48 ч. после трансфекции митохондрии окрашивали 150 нМ красителем MitoTracker Red CMXRos (Life Technologies, США) в течение 30 мин. при 37°С согласно инструкции фирмы-производителя. Далее клетки промывали фосфатно-солевым буфером (PBS), фиксировали в течение 15 мин. при комнатной температуре в 4% растворе параформальдеги-

да, приготовленном на PBS, промывали 2 раза по 5 мин. раствором PBS, обрабатывали клетки 0,2% Triton X-100 на PBS в течение 10 мин. и промывали клетки 2 раза по 5 мин. PBS. Для блокирования неспецифического связывания антител клетки инкубировали в течение 30 мин. с 10% раствором бычьего сывороточного альбумина (Sigma, США) в фосфат-но-солевом буфере при 37°С. Инкубирование с первичными антителами против эпитопа 3xFLAG (Sigma, США) в разведении 1:500 в 3% BSA проводили при 37°С в течение двух ч. После трехкратной промывки раствором PBS в течение 5 мин, добавляли вторичные антитела (Life Technologies, США), конъюгиро-ванные с Alexa Fluor 488 в разведении 1:500 в 3% BSA на PBS и инкубировали при 37°С в течение 45 мин. Клетки промывали 3 раза по 5 мин. буфером PBS, ядра окрашивали раствором 1 мкг/мл DAPi в PBS в течение 5 мин, промывали два раза по 5 мин. в PBS и под покровное стекло наносили по 10 мкл раствора антифейда (90% глицерин, 0,1 М Tris-HCl и 23,3 мг/мл DABCO (1,4диазабисцикло(2,2,2)октан). Изображения получали с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа Axio Observer.Z1 (Carl Zeiss, Германия) в центре коллективного пользования клеточных технологий ИЦиГ СО РАН.

Конфокальная микроскопия

Клетки выращивали на конфокальных чашках со стеклянным дном. Через 48 ч. после трансфек-ции митохондрии окрашивали 200 нМ красителем MitoTracker Red CMXRos (Life Technologies, США) в течение 30 мин. при 37°С согласно инструкции фирмы-производителя. Изображения получали с помощью лазерного сканирующего микроскопа LSM 780 NLO (Carl Zeiss, Германия) в центре коллективного пользования микроскопического анализа биологических объектов СО РАН.

Результаты

Дизайн конструкций

Для того чтобы направить импорт нуклеазы Cas9 в митохондрии, была разработана и собрана генетическая конструкция pMitoCas9 (рис. 1А). Данная плазмида включает в себя ген cas9 бактерии Streptococcus pyogenes с оптимизированным кодон-ным составом для экспрессии в клетках человека, к которому c 5"-конца присоединена нуклеотидная последовательность, кодирующая сигнал митохондри-альной локализации от субъединицы Vi^ цитохром с-оксидазы (COX8A MTS). Регуляция транскрипции cas9 осуществляется под контролем конститутивного промотора CMv, что позволяет добиться высокого уровня экспрессии в клетках млекопитающих. Для детекции внутриклеточной локализации нукле-азы, с 5"-конца непосредственно перед геном cas9 вставлена последовательность, кодирующая пептид 3xFLAG, а для прижизненной визуализации с 3"-кон-ца добавлен ген TurboGFP. Причем TurboGFP расположен в одной открытой рамке считывания с cas9 и отделен от него последовательностью, кодирующей пептид T2A. Таким образом, в результате транскрипции синтезируется единая мРНК, однако, при трансляции за счет присутствия T2A образуются два отдельных белка, в результате чего в клетках после трансфекции можно детектировать экспрессию cas9 по флуоресценции TurboGFP и при этом максимально

сохраняется нативная структура нуклеазы. Дополнительно, чтобы повысить эффективность импорта нуклеазы в митохондрии, с 3"-конца cas9 была добавлена последовательность длиной 214 п.н. 3"-не-транслируемого района гена sod2, которая направляет транспорт синтезированной мРНК к поверхности митохондрий, где и происходит трансляция, что дополнительно должно способствовать импорту синтезированного белка в матрикс митохондрий [11].

Параллельно была собрана вторая конструкция — pMitoCas9-SV40 (рис. 1Б), нуклеотидная последовательность которой идентична плазмиде pMitoCas9 за исключением 3"-нетранслируемой области cas9 и селективного гена устойчивости к антибиотику. В данной конструкции в качестве 3"иТ1Т был использован сигнал полиаденилирования вируса SV40, что должно влиять на стабильность мРНК и эффективность трансляции.

А

Б

CMV enhancer

CMV enhancer

В

GFP

MitoTracker

Совмещение

pEGFP-Nl

pMitoCas9

pMitoCas9-SV40

pTurboGFP-Mito

А м л * * . t . ^ к 1 . » r* Ц 41

« 4Л.  > v; 4* J .1 ' •• - «" > "V «r. • л • • •> • 1 1 ->

у "г  КС .>: л' £ «р"» И ь'* • . fc С *vSh .Ulfa-, ! r-StUn. Jb.. % A i У  <• у , - W > U&r0

0*4 % ^v tmt

Рис. 1.

Схемы плазмидных конструкций и прижизненная визуализация их экспрессии в клетках Phoenix: А — схема плазмиды pMitoCas9; Б — схема плазмиды pMitoCas9-SV40; В — конфокальная микроскопия клеток Phoenix, трансфицированных плазмидами pMitoCas9 и pMitoCa9-SV40, а также плазмидами pEGFP-N1 и pTurboGFP-mito, экспрессирующих GFP с цитоплазматической и митохондриальной локализацией, соответственно

Анализ экспрессии конструкций

и внутриклеточной локализации нуклеазы Cas9

Культуру клеток линии Phoenix трансфицировали конструкциями pMitoCas9 и pMitoCas9-SV40. Через 48 ч. после трансфекции синтез нуклеазы Cas9 оценивали посредством прижизненной конфокальной микроскопии по экспрессии GFP. Учитывая, что cas9 и TurboGFP разделены последовательностью T2A, в случае эффективной экспрессии конструкций GFP должен локализоваться в цитоплазме клетки. В качестве контроля внутриклеточной локализации GFP были использованы плазмидные векторы pTurboGFP-mito и pEGFP-N1 с митохондриальной и цитоплаз-матической локализацией GFP, соответственно. Для прижизненного окрашивания митохондрий использовали краситель MitoTracker Red CMXRos. Результаты прижизненной конфокальной микроскопии представлены на рис. 1В. Видно, что в случае конструкций pMitoCas9 и pMitoCas9-Sv40 для GFP характерно ожидаемое равномерное распределение сигнала в цитоплазме клетки.

Эффективность экспрессии разработанных конструкций оценивалась при помощи проточной ци-тометрии. Клетки Phoenix трансфицировали равным количеством плазмидной ДНК pMitoCas9 и pMitoCas9-SV40. Через 48 ч. анализировали количество GFP-позитивных клеток и интенсивность флуоресценции GFP. Результаты представлены в табл.

Как видно из таблицы, в случае конструкции pMitoCas9-SV40 количество GFP-позитивных клеток было в 4 раза больше. Кроме этого геометрическое среднее интенсивности флуоресценции также превышало аналогичный показатель для конструкции pMitoCas9 более чем в 2 раза. Эти результаты указывают на то, что конструкция pMitoCas9-SV40 экс-прессируется на более высоком уровне по сравнению с pMito-Cas9.

Внутриклеточное распределение нуклеазы Cas9 анализировали при помощи иммуноцитохимическо-го окрашивания с использованием антител против эпитопа 3xFLAG, расположенного на N-конце белка (рис. 2). Иммунофлуоресцентный анализ показал, что в основной массе клеток сигнал точечно распределен по цитоплазме и солокализуется с митохондриями, окрашенными специфическим красителем MitoTracker Red CMXRos. В некоторых клетках кроме точечного распределения был выявлен равномерный сигнал в цитоплазме клетки, что можно объяснить очень высоким уровнем экспрессии Cas9 в результате того, что в некоторые клетки при трансфекции попало большее количество плазмидной ДНК. В этом случае часть белка может оставаться в цитоплазме, что приводит к наложению сигналов. Необходимо отметить, что как в случае конструкции pMitoCas9, так и pMitoCas9-Sv40 внутриклеточное распределение Cas9 было одинаковым.

Таблица. Эффективность экспрессии конструкций

Конструкция % GFP-позитивных клеток

pMitoCas9 4,7

pMitoCas9-SV40 18,4

Геометрическое среднее интенсивности флуоресценции GFP

430 1010

Рис. 2.

Внутриклеточная локализация нуклеазы Cas9. Иммунофлуоресцентное окрашивание препаратов клеток Phoenix, трансфицированных конструкцией pMitoCas9, антителами к 3xFLAG. Митохондрии окрашивали красителем MitoTracker Red CMXRos, для окрашивания ядер использовали DAPI

3xFLAG MitoTracker

DAPI Совмещение

A *

ä i

./ f

'' IP> я

Щг

г .vfc'i

Обсуждение

Несмотря на то, что системы направленного редактирования очень широко используются, применение наиболее эффективной и перспективной из них системы CRiSPR/Cas9 в настоящее время ограничено только ядерной ДНК. Кроме ядерной ДНК в клетке присутствует митохондриальная ДНК, выполняющая важные функции, и с мутациями в которой ассоциированы многочисленные заболевания человека. Разработка способов элиминирования и редактирования мутантной мтДНК откроет новые возможности для изучения фундаментальных процессов функционирования митохондрий, а также будет способствовать развитию новых подходов лечения митохондриаль-ных заболеваний.

Для того чтобы адаптировать систему CRiSPR/ Cas9 для работы с мтДНК необходимо перенаправить в митохондрии две составных части системы: нуклеазу Cas9 и направляющую РНК. В данной работе были созданы генетические конструкции, кодирующие нуклеазу Cas9, способную импортироваться во внутреннее пространство митохондрий человека.

Известно, что белки импортируются в митохондрии благодаря наличию митохондриальной лидер-ной последовательности, кодирующей сигнальный пептид [12]. Неоднократно показано, что добавление такого пептида к Ы-концу белка позволяет последнему успешно импортироваться в митохондрии [7]. Одной из таких последовательностей является часть гена СОХ8А, кодируемого ядерной ДНК, но функционирующего в митохондриях в качестве субъединицы комплекса М окислительного фосфорилирования. В разработанных конструкциях именно данная последовательность была присоединена к Ы-концу ну-клеазы Cas9.

Дополнительно импорт белков в митохондрии усиливается, когда трансляция мРНК осуществляется вблизи поверхности митохондрий [11]. Поэтому конструкция pMitoCas9 была разработана таким образом, чтобы в конце полицистронной мРНК находился 3'-нетранслируемый район гена супероксид-дисмутазы 2 ^ОШ2 З'-иТГ). Ген sod2 имеет ядерную локализацию. После его транскрипции в ядре, мРНК выходит в цитоплазму клетки и транслируется вблизи поверхности митохондрий. Далее белок, благодаря наличию пептида для импорта, направляется в митохондрии, где участвует в процессе метаболизма активных форм кислорода.

Кроме основных элементов, ответственных за импорт Cas9 в митохондрии, разработанные конструкции содержат ряд вспомогательных элементов (3xFLАG и GFP), позволяющих визуализировать экспрессию конструкций, а также анализировать внутриклеточную локализацию нуклеазы. В итоге, разработанная конструкция pMitoCas9 должна работать по следующему принципу. С промотора цито-мегаловируса в ядре клетки запускается транскрипция мРНК, которая кодирует несколько элементов: пептид для импорта в митохондрию, эпитоп 3xFLАG, нуклеазу Cas9, пептид Т2А, зеленый флуоресцентный белок ТuгboGFP, 3'-нетранслируемый район гена супероксид-дисмутазы. После выхода из ядра в цитоплазму, мРНК, благодаря наличию SО2 З'-иТГ, направляется к поверхности митохондрий, где происходит процесс трансляции. Линкер Т2А в процессе трансляции обеспечивает синтез двух независимых белков: модифицированной нуклеазы Cas9

и ТuгboGFP. Зеленый флуоресцентный белок остается в цитоплазме, тогда как нуклеаза Cas9 импортируется в митохондрии. Конструкция pMitoCas9-SV40 должна работать аналогичным образом, за исключением того, что в ней район SО2 3'-иТГ заменен на последовательность полиаденилирования вируса SV40.

При трансфекции разработанных конструкций pMitoCas9 и pMitoCas9-SV40 было показано, что обе конструкции экспрессируются в клетках человека (рис.1В), причем, кодируемая ими нуклеаза способна импортироваться в митохондрии (рис. 2). Необходимо отметить, что количество GFP-позитивных клеток и интенсивность флуоресценции были значительно выше в случае pMitoCas9-SV40 (табл.), что свидетельствует о более высоком уровне экспрессии этой плазмиды. При этом замена SО2 3'-иТГ на последовательность полиаденилирования вируса SV40 не влияла на внутриклеточную локализацию нуклеазы Cas9. Это можно объяснить тем, что наличие в мРНК последовательности, отвечающей за ее транспорт к поверхности митохондрий, не является обязательным и основную роль в транспорте выполняет сигнал митохондриальной локализации, представляющий собой короткий пептид на Ы-конце нуклеазы (СОХ8А MТS). Увеличение уровня экспрессии конструкции pMitoCas9-SV40, скорее всего, связано с повышенной стабильностью мРНК и эффективностью трансляции, что достигается за счет присутствия последовательности полиаденилирова-ния вируса SV40 [13]. Также следует отметить, что при иммуноцитохимическом анализе клеток, транс-фицированных разработанными конструкциями, в случае pMitoCas9 детектировалось большее количество клеток с митохондриальной локализацией Cas9. Таким образом, можно предположить, что, несмотря на более низкий уровень экспрессии pMitoCas9 нуклеаза Cas9 за счет наличия SО2 3'-иТГ импортируется из цитоплазмы клетки в митохондрии более эффективно, чем в случае pMitoCas9-SV40. Однако, чтобы подтвердить данное предположение, требуются дополнительные исследования.

Как уже было сказано, до настоящего времени система редактирования генома на основе нуклеазы Cas9 все еще не адаптирована для супрессии патогенных мутаций мтДНК. В ходе настоящего исследования структура нуклеазы Cas9 была модифицирована так, что белок получил возможность импортироваться в митохондрии. Задача, однако, усложняется комплексностью системы CRiSPR\ Cas9, особенно, если речь идет о коррекции мутации мтДНК, используя процесс гомологичной рекомбинации, где потребуется ДНК матрица, в качестве которой можно применить, например, олигонуклеотид. Доставка направляющей РНК в митохондрии могла бы быть обеспечена слиянием с РНК молекулой, обеспечивающей ее импорт в митохондрии [14, 15]. Структура олигонуклеотида для гомологичной рекомбинации могла бы представлять собой химерную молекулу, состоящую из фрагмента ДНК и фрагмента РНК, формирующего шпилечную структуру, благодаря которой олигонуклеотид и будет проникать в митохондрию [16, 17]. ДНК-часть химерной нуклеиновой кислоты будет обладать последовательностью, комплементарной фрагменту мтДНК, содержащему патогенную мутацию, за исключением одного нукле-отида — самой мутации, то есть данный нуклеотид будет иметь последовательность, характерную для

мтДНК без мутации. Несмотря на то, что сам факт наличия гомологичной рекомбинации в митохондриях остается спорным, использование этого процесса, очевидно, имеет высокий потенциал для разработки методов коррекции патогенных мутаций в мтДНК, ассоциированных с широким спектром нейромышеч-ных и нейродегенеративных патологий [2].

Полученные результаты являются лишь первым шагом на пути использования системы на основе ну-клеазы Cas9 для направленного редактирования генома митохондрий и элиминации мутантной мтДНК. Помимо модификации РНК для функционирования в митохондриях, необходимо повысить эффективность импорта нуклеазы Cas9, сравнив различные варианты детерминант импорта белков в митохондрию. Открытые недавно новые нуклеазы кластера CRISPR [18—20] также могут быть адаптированы для функционирования в митохондриях. Поскольку они обладают меньшим по сравнению с SpCas9 размером, возможно, их уровень экспрессии и импорт будут более эффективны.

В заключение стоит отметить, что корейские ученые предприняли попытку доставки системы на основе нуклеазы Cas9 и направляющей РНК в митохондрию [21]. В этой работе утверждается, что нуклеаза SpCas9 способна импортироваться в матрикс митохондрий независимо от сигнала митохондриаль-ной локализации. Кроме этого было показано, что направляющая РНК, как и нуклеаза Cas9, не нуждается в дополнительной модификации детерминантой импорта, поскольку проникает внутрь митохондрий, вероятно, в комплексе с нуклеазой. К сожалению,

ЛИТЕРАТУРА:

1. Schaefer A.M., McFarland R., Blakely E.L. et al. Prevalence of mitochondrial DNA disease in adults. Ann. Neurol. 2008; 63: 35-9.

2. DiMauro S., Schon E.A., Carelli V. et al. The clinical maze of mitochondrial neurology. Nat. Rev. Neurol. 2013; 9: 429-44.

3. Schon E.A., DiMauro S., Hirano M. Human mitochondrial DNA: roles of inherited and somatic mutations. Nat. Rev. Genet. 2012; 13: 878-90.

4. Sander J.D., Joung J.K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat. Biotechnol. 2014; 32: 347-55.

5. Harrison M.M., Jenkins B.V., O'Connor-Giles K.M. et al. CRISPR view of development. Genes Dev. 2014; 28: 1859-72.

6. Gammage P.A., Rorbach J., Vincent A.I. et al. Mitochondrially targeted ZFNs for selective degradation of pathogenic mitochondrial genomes bearing large-scale deletions or point mutations. EMBO Mol. Med. 2014; 6: 458-66.

7. Bacman S.R., Williams S.L., Pinto M. et al. Specific elimination of mutant mitochondrial genomes in patient-derived cells by mitoTALENs. Nat. Med. 2013; 19: 1111-3.

8. Yang L., Guell M., Byrne S. et al. Optimization of scarless human stem cell genome editing. Nucleic Acids Res. 2013; 41: 9049-61.

9. Sieber F., Duchene A.M., Marechal-Drouard L. Mitochondrial RNA import: from diversity of natural mechanisms to potential applications. Int. Rev. Cell Mol. Biol. 2011; 287: 145-90.

10. Mali P., Yang L., Esvelt K.M. et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science 2013; 339: 823-6.

11. Kaltimbacher V., Bonnet C., Lecoeuvre G. et al. mRNA localization to the mitochondrial surface allows the efficient translocation inside the organelle of a nuclear recoded ATP6 protein. RNA 2006; 12: 1408-17.

молекулярные механизмы такого импорта системы CRISPR/Cas9 в работе не изучались и даже не обсуждаются, поэтому их еще предстоит выяснить, подтвердить либо опровергнуть. Стоит отметить, что параллельно нами была проанализирована внутриклеточная локализация нуклеазы SpCas9, кодируемой конструкцией pSpCas9(BB)-2A-GFP (Addgene plasmid # 48138) [22] и не содержащей сигнала митохондриальной локализации. Так как на N-конце этой нуклеазы находится эпитоп 3xFLAG, иммуно-цитохимический анализ проводился так же, как для конструкций pMitoCas9 и pMitoCas9-SV40. В результате нам не удалось обнаружить локализации SpCas9, кодируемой pSpCas9(BB)-2A-GFP, в митохондриях, что дополнительно подтверждает предположение о том, что импорт белков в митохондрии без соответствующих сигналов локализации либо невозможен, либо неэффективен.

Благодарности

Авторы глубоко признательны всем сотрудникам своих лабораторий в Новосибирске и в Калининграде за помощь в написании данной работы. Авторы выражают благодарность заведующему ЦКП микроскопического анализа биологических объектов СО РАН Байбородину С.И. за помощь в конфокальной микроскопии. Работа выполнена при поддержке бюджетного проекта ИЦиГ СО РАН. Исследования в лаборатории И.О. Мазунина поддержаны субсидией в рамках Соглашения № 14.575.21.0016 (уникальный идентификатор RFMEFI57514X0016).

12. Neupert W., Herrmann J.M. Translocation of proteins into mitochondria. Annu. Rev. Biochem. 2007; 76: 723-49.

13. Fink M., Flekna G., Ludwig A. et al. Improved translation efficiency of injected mRNA during early embryonic development. Dev. Dyn. 2006; 235: 3370-8.

14. Wang G., Chen H.W., Oktay Y. et al. PNPASE regulates RNA import into mitochondria. Cell 2010; 142: 456-67.

15. Wang G., Shimada E., Koehler C.M. et al. PNPASE and RNA trafficking into mitochondria. Biochim. Biophys. Acta 2012; 1819: 998-1007.

16. Tonin Y., Heckel A.M., Dovydenko I. et al. Characterization of chemically modified oligonucleotides targeting a pathogenic mutation in human mitochondrial DNA. Biochimie 2014; 100: 192-9.

17. Tonin Y., Heckel A.M., Vysokikh M. et al. Modeling of antigenomic therapy of mitochondrial diseases by mitochondrially addressed RNA targeting a pathogenic point mutation in mitochondrial DNA. J. Biol. Chem. 2014; 289: 13323-34.

18. Ran F.A., Cong L., Yan W.X. et al. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature 2015; 520: 186-91.

19. Zetsche B., Gootenberg J.S., Abudayyeh O.O. et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell 2015; 163: 759-71.

20. Shmakov S., Abudayyeh O.O., Makarova K.S. et al. Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2 CRISPR-Cas Systems. Moll. Cell 2015; 60: 385-97.

21. Jo A., Ham S., Lee G.H. et al. Efficient Mitochondrial Genome Editing by CRISPR/Cas9. Biomed. Res. Int. 2015; 2015: 305716.

22. Ran F.A., Hsu P.D., Wright J. et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat. Protoc. 2013; 8: 2281-308.

Поступила: 09.04.2016