ВЫДЕЛЕНИЕ НЕРАСТВОРИМЫХ ИСКОМЫХ БЕЛКОВ

1. Способ выделения нерастворимого искомого белка из суспензии целых или разрушенных клеток хозяев, включающий стадии:
a) получение суспензии целых или разрушенных клеток хозяев, содержащих нерастворимый искомый белок и нерастворимые части клеток хозяев,
b) добавление водного раствора по меньшей мере одного основания к данной суспензии в количестве, достаточном для разрушения данных клеток хозяев и/или солюбилизации нерастворимых частей клеток хозяев, и
c) отделение нерастворимого искомого белка от солюбилизированных нерастворимых частей клеток хозяев,
причем на стадии b) искомый белок остается нерастворимым, а по меньшей мере 80% нерастворимых частей клеток хозяев подвергаются солюбилизации.
2. Способ по п.1, в котором клетками хозяевами являются бактериальные, дрожжевые, растительные клетки хозяева или клетки-хозяева насекомых.
3. Способ по п.1, в котором выделенный нерастворимый искомый белок имеет чистоту по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 90% и более предпочтительно по меньшей мере 95%.
4. Способ по п.1, в котором основанием является гидроокись металла и/или аммония.
5. Способ по п.4, в котором гидроокись металла выбрана из группы, состоящей из гидроокиси натрия (NaOH), гидроокиси калия (KOH) и гидроокиси кальция (СаОН) или их комбинаций.
6. Способ по п.1, в котором конечная концентрация основания на стадии (b) составляет от 0,005 М до 1 М, предпочтительно от 0,01 М до 0,6 М, более предпочтительно от 0,02 М до 0,2 М и наиболее предпочтительно от 0,04 М до 0,06 М.
7. Способ по п.1, в котором способ дополнительно включает добавление по меньшей мере одного реагента (i) перед стадией b), (ii) на стадии b) и/или (iii) после стадии b).
8. Способ по п.7, в котором реагент выбран из группы, состоящей из денатурирующего средства, космотропного средства и детергента или их комбинаций.
9. Способ по п.8, в котором:
4
2
5
3
(i) денатурирующим средством является мочевина (CHNO) или гуанидиний гидрохлорид (CHN·HCl),
(ii) космотропным средством является соль фосфата или соль сульфата, а
(iii) детергентом является Tween 20, Triton X-100, SDS или Brij.
10. Способ по п.9, в котором конечная концентрация:
(i) мочевины составляет от 0,1 М до 10 М, предпочтительно от 1 М до 5 М, а
(ii) гуанидиния гидрохлорида составляет от 0,01 М до 3 М, предпочтительно от 0,1 М до 2 М.
11. Способ по п.1, в котором отделение нерастворимого искомого белка от солюбилизированных нерастворимых частей клеток хозяев на стадии с) осуществляется центрифугированием, седиментацией и/или фильтрацией.
12. Способ по п.1, в котором способ после стадии b) и перед стадией с) дополнительно включает стадию b') гомогенизации данной суспензии.
13. Способ по п.1, в котором способ после стадии с) дополнительно включает стадию d) промывки отделенного нерастворимого искомого белка, предпочтительно центрифугата, выпавшего осадка или ретентата, водным раствором, органическим раствором и/или мочевиной.
14. Способ по п.1, в котором искомый белок остается нерастворимым по меньшей мере на 90%, предпочтительно по меньшей мере на 95% после добавления на стадии b) водного раствора, содержащего по меньшей мере одно основание, в течение периода времени от 10 до 40 мин при температуре от 15°С до 25°С.
15. Способ по п.1, в котором нерастворимый искомый белок образует белковый агрегат, который включает по меньшей мере 85% данного искомого белка.
16. Способ по п.1, в котором нерастворимый искомый белок выбран из группы, состоящей из белка шелка, содержащего по меньшей мере два идентичных повторяющихся звена, коллагена и кератина.
17. Способ по п.16, в котором белок шелка включает по меньшей мере два идентичных повторяющихся звена, каждое из которых содержит по меньшей мере одну консенсусную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
i) GPGXX (SEQ ID NO:3), где X - любая аминокислота, предпочтительно в каждом случае выбранная независимо из числа A, S, G, Y, Р и Q;
ii) GGX, где Х - любая аминокислота, предпочтительно в каждом случае выбранная независимо из числа Y, Р, R, S, А, Т, N и Q; и
x
iii) A, где x - целое число от 5 до 10.
18. Способ по п.17, в котором повторяющиеся звенья выбраны независимо из модуля A (SEQ ID NO:20), модуля С (SEQ ID NO:21), модуля Q (SEQ ID NO:22), модуля K (SEQ ID NO:23), модуля sp (SEQ ID NO:24), модуля S (SEQ ID NO:25), модуля R (SEQ ID NO:26), модуля X (SEQ ID NO:27) или модуля Y (SEQ ID NO:28) либо их вариантов.
19. Способ по п.16, в котором белок шелка дополнительно содержит по меньшей мере одно неповторяющееся (NR) звено.
20. Способ по п.19, в котором NR-звеном является NR3 (SEQ ID NO:41) или его варианты либо NR4 (SEQ ID NO:42) или его варианты.
m
m
z
z
m
z
m
z
n
n
z
z
n
z
n
z
o
z
o
o
z
p
p
p
21. Способ по п.16, в котором белок шелка выбран из группы, состоящей из ADF-3 (SEQ ID NO:1) или его вариантов, ADF-4 (SEQ ID NO:2) или его вариантов, MaSp I (SEQ ID NO:43) или его вариантов, MaSp II (SEQ ID NO:44) или его вариантов, (С), (C)NR, NR(C), NR(C)NR, (AQ), (AQ)NR, NR(AQ), NR(AQ)NR, (QAQ), NR(QAQ), (QAQ)NR, Y, X и K, где m - целое число от 2 до 64, n - целое число от 6 до 24, o - целое число от 8 до 16, p - целое число от 8 до 16 и z - целое число от 1 до 3, а NR означает неповторяющееся звено.
16
32
12
24
12
24
16
32
16
32
16
32
12
24
12
24
8
16
22. Способ по п.21, в котором белок шелка представляет собой CNR4, CNR4, (AQ)NR3, (AQ)NR3, (AQ), (AQ), C, C, NR4CNR4, NR4CNR4, NR3CNR3, NR3CNR3, NR4(AQ)NR4, NR4(AQ)NR4, NR3(AQ)NR3, NR3(AQ)NR3, (QAQ) или (QAQ).
23. Способ по п.1, в котором способ выполняется при температуре от 4°С до 60°С, предпочтительно от 15°С до 40°С.
24. Способ по п.1, в котором способ выполняется при давлении от 10 кПа до 1000 кПа, предпочтительно от 50 кПа до 150 кПа.
25. Нерастворимый искомый белок, получаемый способом по пп.1-24.