СПОСОБЫ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ МИЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК

1. Способ получения клеток-производных мезенхимальных стволовых клеток (МСК) хондро-остеобластической линии из МСК, включающий:
(a) культивирование МСК, выделенных из биологического образца субъекта, в культуральной среде, содержащей фактор роста фибробластов-2 (FGF-2), трансформирующий фактор роста бета (TGFβ) и гепарин или его производное, или аналог в концентрации по меньшей мере 0,01 МЕ/мл, получая таким образом клетки-производные мезенхимальных стволовых клеток (МСК);
(b) пассирование клеток-производных МСК в первый раз и дальнейшее культивирование клеток-производных МСК в среде, как определено в (а); и
(c) пассирование клеток-производных МСК во второй раз и дальнейшее культивирование клеток-производных МСК в среде, как определено в (а), получая таким образом клетки-производные МСК хондро-остеобластической линии,
где клетки-производные МСК культивируют на стадии (b) в течение периода «x» дней, где день «x» является последним днем, в который по меньшей мере 20% клеток-производных МСК пролиферируются.
2. Способ по п.1, где клетки-производные МСК культивируют на стадии (b) в течение периода от примерно 8 дней до примерно 12 дней, предпочтительно в течение периода примерно 10 дней.
3. Способ по п.1 или 2, где клетки-производные МСК культивируют на стадии (а) в течение периода от примерно 13 дней до примерно 15 дней, предпочтительно в течение периода примерно 14 дней.
4. Способ по любому из пп.1-3, где клетки-производные МСК культивируют на стадии (с) в течение периода от примерно 10 дней до примерно 14 дней, предпочтительно в течение периода примерно 12 дней.
5. Способ по любому из пп.1-4, где пролиферирующие клетки-производные МСК находятся в S-фазе, G2-фазе или M-фазе клеточного цикла.
6. Способ получения клеток-производных МСК хондро-остеобластической линии из МСК, включающий:
(a) культивирование МСК, выделенных из биологического образца субъекта, в культуральной среде, содержащей FGF-2, TGFβ и гепарин или его производное, или аналог в концентрации по меньшей мере 0,01 МЕ/мл, получая таким образом клетки-производные МСК;
(b) пассирование клеток-производных МСК в первый раз и дальнейшее культивирование клеток-производных МСК в среде, как определено в (а); и
(c) пассирование клеток-производных МСК во второй раз и дальнейшее культивирование клеток-производных МСК в среде, как определено в (а), получая таким образом клетки-производные МСК хондро-остеобластической линии,
2
3
2
2
2
2
где клетки-производные МСК высевают для дальнейшего культивирования на стадии (b) при плотности от 3×10 до 1×10 клеток/см, предпочтительно при плотности от 3×10 до 8×10 клеток/см.
2
3
2
2
2
2
7. Способ по п.6, где клетки-производные МСК высевают для дальнейшего культивирования на стадии (с) при плотности от 3×10 до 1×10 клеток/см, предпочтительно при плотности от 3×10 до 8×10 клеток/см.
8. Способ получения клеток-производных МСК хондро-остеобластической линии из МСК, включающий:
(a) культивирование МСК, выделенных из биологического образца субъекта, в культуральной среде, содержащей FGF-2, TGFβ и гепарин или его производное, или аналог в концентрации по меньшей мере 0,01 МЕ/мл, получая таким образом клетки-производные МСК;
(b) пассирование клеток-производных МСК в первый раз и дальнейшее культивирование клеток-производных МСК в среде, как определено в (а);
(c) пассирование клеток-производных МСК во второй раз и дальнейшее культивирование клеток-производных МСК в среде, как определено в (а), получая таким образом клетки-производные МСК хондро-остеобластической линии;
(d) ресуспендирование клеток-производных МСК хондро-остеобластической линии в среде для криоконсервации, подходящей для введения субъекту; и
(e) криоконсервацию клеток-производных МСК хондро-остеобластической линии.
7
8
7
7
9. Способ по п.8, где клетки-производные МСК хондро-остеобластической линии ресуспендируют в среде для криоконсервации на стадии (d) в концентрации между примерно 1×10/мл и примерно 1×10/мл, предпочтительно в концентрации между примерно 2×10/мл и примерно 4×10/мл.
10. Способ по п.8 или 9, где среда для криоконсервации содержит диметилсульфоксид (ДМСО), сывороточный альбумин человека (HSA), аденозин, полипептид, бензопиран или их комбинацию.
11. Способ по любому из пп.1-10, где TGFβ выбран из группы, состоящей из TGFβ1, TGFβ2, TGFβ3 и их смесей; где предпочтительно TGFβ представляет собой TGFβ1.
12. Способ по любому из пп.1-11, где:
- концентрация гепарина или его производного или аналога составляет примерно 0,1 МЕ/мл; и/или
- гепарин или производное гепарина, или его аналог выбран из группы, состоящей из нефракционированного гепарина (UFH); низкомолекулярного гепарина (LMWH), такого как эноксапарин, далтепарин, надропарин, тинзапарин, цертопарин, ревипарин, ардепарин, парнапарин, бемипарин или их смеси; гепариноида, такого как гепарансульфат, дерматансульфат, хондроитинсульфат, ачарансульфат, кератансульфат или их смеси, такой как данапароид; соли гепарина; соли гепариноида; фрагмента гепарина; фрагмент гепариноида; и их смесей.
13. Способ по любому из пп.1-12, где МСК или клетки-производные МСК дополнительно контактируют с такой средой, которая дополнительно включает одну или более плазм, сывороток или их заменителей.
14. Способ по любому из пп.1-13, где субъектом является человек.
90
15. Популяция клеток-производных МСК хондро-остеобластической линии, получаемых или полученных путем экспансии МСК in vitro или ex vivo, при этом по меньшей мере 90% клеток-производных МСК хондро-остеобластической линии в суспензии имеют диаметр 25 мкм или менее (D ≤ 25 мкм), и при этом не более 1% клеток-производных МСК хондро-остеобластической линии в суспензии имеют диаметр более 35 мкм.
16. Популяция клеток-производных МСК хондро-остеобластической линии по п.15, где клетки-производные МСК хондро-остеобластической линии являются получаемыми или полученными способами, как определено в любом из пп.1-14.
17. Фармацевтический препарат, содержащий популяцию клеток-производных МСК хондро-остеобластической линии, как определено в п.15 или 16.
18. Фармацевтический препарат по п.17, где фармацевтический препарат дополнительно содержит компонент с остеопроводящими свойствами, такой как трикальцийфосфат, гидроксиапатит, комбинация частиц гидроксиапатита/трикальцийфосфата, полимолочная кислота, полимолочная гликолевая кислота, гиалуроновая кислота или их производное, хитозан, поли-L-лизин, желатин, коллаген, остеонектин, фибриноген, остеокальцин или их комбинация.
19. Применение популяции клеток-производных МСК хондро-остеобластической линии по п.15 или 16 в лечении субъекта, нуждающегося в трансплантации клеток хондро-остеобластической линии.
20. Применение по п.19, где:
7
8
7
7
- клетки-производные МСК хондро-остеобластической линии присутствуют в концентрации между примерно 1×10/мл и примерно 1×10/мл, предпочтительно между примерно 2×10/мл и примерно 4×10 клеток/мл; и/или
- популяция клеток-производных МСК хондро-остеобластической линии подходит для подкожного, внутрикостного, внутрисуставного, межпозвонкового или внутрисосудистого введения;
- популяция клеток-производных МСК хондро-остеобластической линии подходит для введения в участок костного дефекта.
21. Применение популяции клеток-производных МСК хондро-остеобластической линии по п.15 или 16 в качестве лекарственного средства.
22. Применение фармацевтического препарата по п.17 или 18 в лечении субъекта, нуждающегося в трансплантации клеток хондро-остеобластической линии.
23. Применение по п.22, где
7
8
7
7
- клетки-производные МСК хондро-остеобластической линии присутствуют в концентрации между примерно 1×10/мл и примерно 1×10/мл, предпочтительно между примерно 2×10/мл и примерно 4×10 клеток/мл; и/или
- фармацевтический препарат подходит для подкожного, внутрикостного, внутрисуставного, межпозвонкового или внутрисосудистого введения
- фармацевтический препарат подходит для введения в участок костного дефекта.
24. Применение фармацевтического препарата по п.17 или 18 в качестве лекарственного средства.