СПОСОБ ОЧИСТКИ РЕКОМБИНАНТНОГО ИЛ-36РА (ВАРИАНТЫ)
METHOD FOR PURIFICATION OF RECOMBINANT IL-36RA (EMBODIMENTS)

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способам очистки рекомбинантных белков из штаммов-продуцентов, а именно к очистке рекомбинантного рецепторного антагониста интерлейкина-36, и может быть использовано в фармацевтической промышленности.
Клинический интерес к рецепторному антагонисту интерлейкина-36 (ИЛ-36РА) вызван его ролью в развитии воспаления в коже, пораженной псориазом. Благодаря ингибиторной активности ИЛ-36РА в отношении провоспалительных цитокинов семейства ИЛ-36, он может рассматриваться в качестве перспективного кандидата на роль лекарственного средства для лечения дерматитов, например генерализованного пустулезного псориаза.
Известные из уровня техники способы очистки рекомбинантных ИЛ-36РА основаны на использовании методов аффинной хроматографии и пригодны только для очистки химерных молекул ИЛ-36РА, несущих аффинные метки [Clancy D.M. Production of biologically active IL-36 family cytokines through insertion of N-terminal caspase cleavage motifs / D.M. Clancy, С.M. Henry, P.B. Davidovich, G.P. Sullivan, E. Belotcerkovskaya, S.J. Martin // FEBS Open Bio - 2016. - T. 6 - №4 - с. 338-348]. При их осуществлении для получения препарата с полной биологической активностью необходимо проводить протеолитическое отщепление аффинной метки in vitro от уже очищенного белка [Towne J.E. Interleukin-36 (IL-36) ligands require processing for full agonist (IL-36α, IL-36β, and IL-36γ) or antagonist (IL-36Ra) activity / J.E. Towne, B.R. Renshaw, J. Douangpanya, В.P. Lipsky, M. Shen, C.A. Gabel, J.E. Sims // J. Biol. Chem. -2011. - T. 286 - №49 - 42594-42602 с.]. Таким образом, при использовании этих методов в случае постоянного производства ИЛ-36РА необходима постоянная закупка или наработка соответствующих протеаз. Это делает известные способы очистки ИЛ-36РА дорогими и сложными для промышленного использования. Кроме того, нельзя утверждать, что известные способы очистки обеспечивают получение ИЛ-36РА с достаточно низкой долей дезамидированной формы этого белка. Дело в том, что в белке ИЛ-36РА происходит спонтанное дезамидирование по остатку Asn139, если он находится в растворах с рН более 7,0 [Расе A.L. Asparagine deamidation dependence on buffer type, pH, and temperature / A.L. Pace, R.L. Wong, Y.T. Zhang, Y.-H. Kao, Y.J. Wang // J. Pharm. Sci. - 2013. - T. 102 - №6 - p. 1712-1723]. Несмотря на то, что дезамидирование Asn-139 в молекуле ИЛ-36РА не влияет напрямую на биологическую активность, оно все же является нежелательной модификацией, которую следует избегать. Показано, что дезамидирование остатков аспарагина, как правило, дестабилизирует пространственную структуру белка [Vlasak J. Identification and characterization of asparagine deamidation in the light chain CDR1 of a humanized IgG1 antibody / J. Vlasak, M.C. Bussat, S. Wang, E. Wagner-Rousset, M. Schaefer, C. Klinguer-Hamour, M. Kirchmeier, N. , R. Ionescu, A. Beck // Anal. Biochem. - 2009. - T. 392 - №2 - p.145-154], что является критичным при хранении препаратов, а также может явиться причиной иммуногенности белка.
Аналогов настоящего изобретения в уровне техники не было обнаружено.
Технической задачей, на решение которой направлено настоящее изобретение, является разработка способа очистки рекомбинантного ИЛ-36РА из биомассы штаммов-продуцентов на основе Escherichia coli, при котором выход белка составляет 34-57% от исходного количества белка в биомассе штамма-продуцента, чистота составляет не менее 95% от общего количества белка по ОФ-ВЭЖХ, а доля дезамидированной формы белка составляет менее 5% от общего количества белка.
Поставленная задача решается двумя вариантами.
В одном варианте способа очистки рекомбинантного ИЛ-36РА клетки штамма Escherichia coli - продуцента ИЛ-36РА лизируют при рН от примерно 5,5 до примерно 7,0, затем проводят негативную анионообменную хроматографию лизата при рН от примерно 5,5 до примерно 7,0, после чего проводят гидрофобную хроматографию несвязавшейся фракции, причем связывание с гидрофобным сорбентом проводят при рН от примерно 3,0 до примерно 7,0 и электропроводности от примерно 30 до примерно 150 мСм/см, промывание проводят при рН от примерно 3,0 до примерно 7,0 и электропроводности от примерно 30 до примерно 65 мСм/см, а элюирование ИЛ-36РА с гидрофобного сорбента проводят при рН от примерно 3,0 до примерно 7,0 и электропроводности менее 25 мСм/см.
В другом варианте способа клетки штамма Escherichia coli - продуцента ИЛ-36РА лизируют при рН от примерно 5,5 до примерно 7,0, затем проводят катионообменную хроматографию лизата, причем связывание с катионообменным сорбентом и промывание проводят при рН от примерно 2,5 до примерно 4,2 и электропроводности от примерно 2 до примерно 10 мСм/см, элюирование с катионообменного сорбента проводят при рН от примерно 4,0 до примерно 6,5, после чего проводят гидрофобную хроматографию несвязавшейся фракции, причем связывание с гидрофобным сорбентом проводят при рН от примерно 3,0 до примерно 7,0 и электропроводности от примерно 30 до примерно 150 мСм/см, промывание проводят при рН от примерно 3,0 до примерно 7,0 и электропроводности от примерно 30 до примерно 65 мСм/см, а элюирование ИЛ-36РА с гидрофобного сорбента проводят при рН от примерно 3,0 до примерно 7,0 и электропроводности менее 25 мСм/см
Электропроводность используется как функция ионной силы растворов, удобная для измерения кондуктометром.
Лизирование клеток можно проводить любым способом, например с помощью циклов замораживания и размораживания, обработкой УЗ волнами, механически, химически и т.п. В результате лизирования клеток при рН от примерно 5,5 до примерно 7,0 снижается количество дезамидированной формы ИЛ-36РА (пример 15).
При указанных условиях анионобменной хроматографии ИЛ-36РА не связывается с сорбентом, этот этап позволяет очистить ИЛ-36РА от части примесных белков, а также липополисахаридов и ДНК. Чистота образца ИЛ-36РА, полученного на этом этапе, позволяет эффективно очистить его от остатков примесных белков на следующем этапе хроматографической очистки с использованием гидрофобного сорбента.
При указанных условиях катионнообменной хроматографии рецепторный антагонист ИЛ-36 связывается с сорбентом. Этот этап позволяет очистить ИЛ-36РА от части примесных белков, а также липополисахаридов и ДНК. Чистота образца ИЛ-36РА, полученного на этом этапе, позволяет эффективно очистить его от остатков примесных белков на следующем этапе хроматографической очистки с использованием гидрофобного сорбента.
Описанная в заявляемом способе последовательность операций, выбранные режимы и вещества, используемые при этом, обеспечивают решение поставленной задачи и позволяет получать ИЛ-36РА с выходом 34-57% от исходного количества белка в биомассе штамма-продуцента, чистотой не менее 95% по ОФ-ВЭЖХ и содержанием дезамидированной формы ИЛ-36РА менее 5%. Первый вариант заявленного способа позволяет получить до 0,5 г и удобен для применения в масштабе лабораторного производства, а второй - до 5 г очищенного ИЛ-36РА за один производственный цикл и удобен для дальнейшего масштабирования производства.
В одном из вариантов осуществления способа лизат осветляют любым известным способом, например центрифугированием при 7000 до 15000 g в течение в течение не менее 45 минут. Эта стадия подготовки сырья позволяет удалить большую часть механических примесей, это приводит к дополнительному результату - увеличению количества циклов использования хроматографического сорбента.
Изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами.
Фиг. 1. Карта плазмидного вектора pBAD15A, несущего последовательность гена метионинаминопептидазы, где:
MAP - ген метионинаминопептидазы Е. coli
pBADara promoter - прокариотический промотор, необходимый для инициации транскрипции генов
rrnB Т1Т2 terminators - терминаторы транскрипции гена rrnB E.coli
araBAD operon - регуляторная последовательность araBAD оперона, необходимая для регуляции экспрессии генов, находящихся под контролем промотора pBADara
р15А origin - сайт начала репликации плазмид
CamR - последовательность гена хлорамфеникол ацетилтрансферазы, обеспечивающей устойчивость бактерий к хлорамфениколу
SalI, HindIII, XhoI, NdeI - рестрикционные сайты, необходимые для объединения отдельных фрагментов в векторе
Фиг. 2-5 ОФ-ВЭЖХ хроматограмма образца ИЛ-36РА после анионообменной хроматографии при разных условиях. Пик на 14,5 минут соответствует ИЛ-36РА.
Фиг. 6 Типовая ОФ-ВЭЖХ хроматограмма образца ИЛ-36РА после гидрофобной хроматографии. Пик на 10,2 минут соответствует ИЛ-36РА.
Фиг. 7. Электрофореграмма фракций, полученных при хроматографической очистке ИЛ-36РА. Стрелкой отмечена полоса, соответствующая ИЛ-36РА.
1 - осветленный лизат биомассы штамма-продуцента ИЛ-36РА Escherichia coli BL21Star[DE3](pET-IL36Raf, pBAD15A)
2 - фракция, не связавшаяся с Q
3 - фракция, не связавшаяся с Butyl-650
4 - фракция, элюировавшаяся с Butyl-650
6 - маркер молекулярных весов
Фиг. 8. Электрофореграмма разделения нативной (1) и дезамидированной (2) форм ИЛ-36РА в КЗЭФ.
Фиг. 9 ОФ-ВЭЖХ хроматограмма образца ИЛ-36РА после катионообменной хроматографии при разных условиях. Пик на 10,2 минут соответствует ИЛ-36РА.
Фиг. 10-11 ОФ-ВЭЖХ хроматограмма образца ИЛ-36РА после катионообменной хроматографии при разных условиях. Пик на 14,5 минут соответствует ИЛ-36РА.
Фиг. 12 Типовая ОФ-ВЭЖХ хроматограмма образца ИЛ-36РА после гидрофобной хроматографии. Пик на 10,2 минут соответствует ИЛ-36РА.
Фиг. 13 Типовая ОФ-ВЭЖХ хроматограмма образца ИЛ-36РА после гидрофобной хроматографии. Пик на 14,5 минут соответствует ИЛ-36РА.
Способ осуществляли следующим образом.
Пример 1. Культивирование штамма - продуцента ИЛ-36РА.
Штамм Escherichia coli BL21Star[DE3](pET-IL36Raf, pBAD15A) получали путем трансформации штамма Escherichia coli BL21Star[DE3]. Электрокомпетентные клетки Е. coli BL21 [DE3] трансформировали смесью плазмид pET-IL36Raf и pBAD15A (Фиг. 1) в эквимолярном соотношении. Трансформацию проводили с помощью аппарата Bio-Rad MicroPulser (Bio-Rad, США) согласно инструкции производителя. Положительные трансформанты отбирали на агаризованной среде, содержащей смесь двух антибиотиков (ампициллин в конечной концентрации от 50 до 125 мкг/мл, предпочтительно 100 мкг/мл; и хлорамфеникол в конечной концентрации от 20 до 40 мкг/мл, предпочтительно 25 мкг/мл), что гарантировало содержание обеих плазмид в отобранных колониях. Наличие в трансформантах обеих плазмид также подтверждали путем ПЦР с использованием двух пар праймеров, специфических для гена ИЛ-36РА и гена МАП, соответственно. Полученный штамм получил название Escherichia coli BL21Star[DE3](pET-IL36Raf, pBAD15A).
2
4
2
4
4
4
2
Для культивирования полученного штамма использовали 1-2х (предпочтительно 1,5х) среду LB (10-20 г/л (предпочтительно 15 г/л) триптона, 5-10 г/л (предпочтительно 7,5 г/л) дрожжевого экстракта, 4-6 (предпочтительно 5 г/л) хлорида натрия) в 0,8-1,2х (предпочтительно 1х) среде М9 (NaHPO 3,84-5,76 мМ (предпочтительно 4,8 мМ), KHРO 1,76-2,64 мМ (предпочтительно 2,2 мМ); NaCl 0,68-1,02 мМ (предпочтительно 0,85 мМ), NHCl 1,5-2,24 мМ (предпочтительно 1,87 мМ), MgSO 0,8-1,2 мМ (предпочтительно 1 мМ), CaCl 0,08-0,12 мМ (предпочтительно 0,1 мМ) с добавлением антибиотиков в указанных выше концентрациях. Культуру засевали до плотности 0,05-0,5 ОЕ (предпочтительно 0,1 ОЕ), растили 12-18 часов (предпочтительно 16 часов) при температуре 35-38°С (предпочтительно +37°С) и скорости перемешивания 150-300 об/мин (предпочтительно 250 об/мин). Затем эти культуры инокулировали в 1-2х LB (предпочтительно 1,5х LB) + 0,8-1,2х (предпочтительно 1x) М9 объемом 50-2500 мл (предпочтительно 200 мл) до плотности 0,1-1 ОЕ (предпочтительно 0,3 ОЕ) и растили в колбах объемом 0,5-2,5 л (предпочтительно 2 л) при температуре 35-38°С (предпочтительно +37°С) при скорости перемешивания 150-300 об/мин (предпочтительно 250 об/мин) до плотности 2-5 ОЕ/мл (предпочтительно 3 ОЕ/мл). При этой оптической плотности вносили индукторы - IPTG 0,1-1 мМ (предпочтительно 0,5 мМ) и арабинозу до 0,2%.
Индукцию продолжали в течение 2-4 ч (предпочтительно 3 ч) при температуре 27-37°С (предпочтительно +30°С) при скорости перемешивания 150-300 об/мин (предпочтительно 250 об/мин). Затем биомассу бактерий собирали центрифугированием со скоростью 2000-12000 g (предпочтительно 8000 g) при температуре 3-18°С (предпочтительно +4°С) в течение 15-60 мин (предпочтительно 30 мин).
Пример 2. Лизис биомассы штамма-продуцента.
Лизис осуществлялся с помощью замораживания биомассы бактерий при температуре от -60 до -80°С, затем размораживания ее до комнатной температуры. После этого к ней добавляли необходимый объем буферного раствора из расчета 10 мл буфера на 1 г биомассы. Состав растворов для лизиса, использовавшийся в конкретных вариантах осуществления способа, описан в соответствующих примерах и, как правило, совпадает с составом раствора для уравновешивания анионообменной хроматографической колонки, если не указано иначе. Затем биомассу ресуспендировали в буферном растворе и перемешивали на электрической мешалке до получения гомогенного раствора, обычно в течение 45-75 минут. Далее лизат при необходимости осветляли центрифугированием при ускорении от 7000 до 15000 g в течение не менее 45 минут. Осадок удаляли. Эта стадия подготовки сырья позволяет удалить большую часть механических примесей, которые необратимо загрязняют хроматографический сорбент и снижают время использования одной хроматографической колонки. Лизат использовали в хроматографической очистке.
Пример 3. Очистка ИЛ-36РА на сорбенте Q FF (GE, США)
150 г биомассы штамма-продуцента ИЛ-36РА лизировали по описанному выше методу в 1500 мл буфера с рН 7,0 и имеющего электропроводность 1,5 мСм/см, который содержал 15 мМ Tris-HCl. Колонку, содержащую 300 мл сорбента Q FF (GE, США) уравновешивали тем же буфером. После нанесения лизата, колонку отмывали тем же буфером. ИЛ-36РА содержался в несвязавшейся фракции, которую собирали начиная с момента повышения УФ-поглощения при 280 нм на 30 mAU по сравнению с уравновешивающим буфером. После очистки ИЛ-36РА сорбент регенерировали 15 мМ Tris-HCl с 2 М NaCl, а затем 0,2 М NaOH.
Чистота полученного образца была определена с помощью ОФ-ВЭЖХ. Содержание дезамидированной формы ИЛ-36РА определяли только для образцов после очистки с использованием гидрофобной хроматографии.
Полученная несвязавшаяся фракция содержала ИЛ-36РА с чистотой 70% по ОФ-ВЭЖХ (Фиг. 2), что позволило очистить его до более 95% чистоты по ОФ-ВЭЖХ с помощью гидрофобной хроматографии в дальнейшем.
Пример 4. Очистка ИЛ-36РА на сорбенте Q FF (GE, США)
ИЛ-36РА очищали по методу, аналогичному изложенному в Примере 3, но в качестве лизирующего и уравновешивающего использовали буфер с рН 5,5, имеющий электропроводность 8 мСм/см, который содержал 20 мМ цитрата натрия.
Полученная несвязавшаяся фракция содержала ИЛ-36РА с чистотой 37% по ОФ-ВЭЖХ (Фиг. 3), что позволило очистить его до более 95% чистоты по ОФ-ВЭЖХ с помощью гидрофобной хроматографии в дальнейшем.
Пример 5. Очистка ИЛ-36РА на сорбенте Q FF (GE, США)
ИЛ-36РА очищали по методу, аналогичному изложенному в Примере 3, но в качестве лизирующего и уравновешивающего использовали буфер с рН 7,0, имеющий электропроводность 25 мСм/см, который содержал 20 мМ Tris-HCl и 230 мМ NaCl.
Полученная несвязавшаяся фракция содержала ИЛ-36РА с чистотой 61% по ОФ-ВЭЖХ (Фиг. 4), что позволило очистить его до более 95% чистоты по ОФ-ВЭЖХ с помощью гидрофобной хроматографии в дальнейшем.
Пример 6. Очистка ИЛ-36РА на сорбенте Q FF (GE, США)
ИЛ-36РА очищали по методу, аналогичному изложенному в Примере 3, но в качестве лизирующего и уравновешивающего использовали буфер с рН 7,0, имеющий электропроводность 50 мСм/см, который содержал 20 мМ Tris-HCl и 480 мМ NaCl.
Полученная несвязавшаяся фракция содержала ИЛ-36РА с чистотой 7% по ОФ-ВЭЖХ (Фиг. 5), что не позволило очистить его до более 95% чистоты по ОФ-ВЭЖХ с помощью гидрофобной хроматографии в дальнейшем.
Пример 7. Очистка ИЛ-36РА на сорбенте Butyl-650S (Tosoh, Япония)
На 100 мл сорбента Butyl-650S (Tosoh, Япония) наносили не связавшуюся с сорбентом Q FF (GE, США) фракцию, полученную по методу, изложенному в Примере 3, после доведения электропроводности раствора до 30 мСм/см с помощью добавления аммония сульфата до 0,15 М, рН раствора 7,0. Сорбент предварительно уравновешивали соответвующим уравновешивающим буфером, использовавшимся на прошлом шаге хроматографической очистки, с добавлением аммония сульфата. Примесные белки при этом не связывались с сорбентом и отмывались при промывке сорбента буфером для нанесения (см. выше). Элюцию ИЛ-36РА проводили 50 мМ цитратным буфером рН 6,0. После очистки ИЛ-36РА сорбент регенерировали дистиллированной водой.
В результате был получен образец ИЛ-36РА в количестве 344 мг (57% от исходного количества белка в биомассе штамма-продуцента) с чистотой более 95% по ОФ-ВЭЖХ (Фиг. 6) и содержанием дезамидированной формы ИЛ-36РА менее 5%. Электрофореграмма образцов с различных этапов очистки ИЛ-36РА представлена на Фиг. 7. На Фиг. 8 представлена типовая электрофореграмма разделения нативной (А) и дезамидированной (Б) форм ИЛ-36РА в КЗЭФ после успешной очистки на сорбенте Butyl-650S (Tosoh, Япония).
Пример 8. Очистка ИЛ-36РА на сорбенте Butyl-650S (Tosoh, Япония)
ИЛ-36РА очищали по методу, аналогичному изложенному в Примере 7, но использовали в качестве уравновешивающего использовали раствор с электропроводностью 18 мСм/см и рН 6,7, полученной с помощью добавления аммония сульфата до 0,1 М к несвязавшейся фракции, полученной на этапе очистки ИЛ-36РА на анионообменном сорбенте.
В результате не произошло связывания ИЛ-36РА с сорбентом, что не позволило его очистить.
Пример 9. Очистка ИЛ-36РА на сорбенте Butyl-650S (Tosoh, Япония)
ИЛ-36РА очищали по методу, аналогичному изложенному в Примере 7, но использовали в качестве уравновешивающего использовали раствор с электропроводностью 43 мСм/см и рН 3,0, полученной с помощью добавления аммония сульфата до 0,2 М к элюату, полученному на этапе очистки ИЛ-36РА на катионообменном сорбенте.
В результате был получен образец ИЛ-36РА с чистотой более 95% по ОФ-ВЭЖХ и содержанием дезамидированной формы ИЛ-36РА менее 5%.
Пример 10. Очистка ИЛ-36РА на сорбенте Butyl-650S (Tosoh, Япония)
ИЛ-36РА очищали по методу, аналогичному изложенному в Примере 7, но использовали в качестве уравновешивающего использовали раствор с электропроводностью 150 мСм/см и рН 6,5, полученной с помощью добавления аммония сульфата до 1,1 М к несвязавшейся фракции, полученной на этапе очистки ИЛ-36РА на анионообменном сорбенте. После нанесения образца и отмывки сорбента уравновешивающим буфером, примесные белки были отмыты раствором с электропроводностью 65 мСм/см и рН 6,3, содержащим 20 мМ Tris-HCl и 0,4 М аммония сульфата. Элюцию ИЛ-36РА проводили раствором с электропроводностью 5 мСм/см и рН 6,0, содержащим 50 мМ натрия цитрат.
В результате был получен образец ИЛ-36РА с чистотой более 95% по ОФ-ВЭЖХ и содержанием дезамидированной формы ИЛ-36РА менее 5%.
Пример 11. Очистка ИЛ-36РА на сорбенте SP FF (GE, США)
900 г биомассы штамма-продуцента ИЛ-36РА лизировали по описанному выше методу в 9000 мл буфера с рН 7,0 и имеющего электропроводность 2 мСм/см, который содержал 20 мМ Tris-HCl. После удаления осадка, образовавшегося в результате центрифугирования, супернатант помещали в емкость достаточного объема, погружали в нее электрическую мешалку и электрод рН-метра. Затем к супернатанту добавляли 50% уксусную кислоту до достижения раствором рН 4,2 и электропроводности примерно 10 мСм/см. Полученный раствор перемешивали на электрической мешалке в течение 20 минут. Далее лизат осветляли центрифугированием при ускорении 12000 g в течение в течение 60 минут. Осадок удаляли. Эта стадия подготовки сырья позволила получить лизат с кислым рН, пригодный для нанесения на катионообменный сорбент, а также удалить большую часть механических и белковых примесей. Осветленный лизат использовали в хроматографической очистке.
Колонку, содержащую 500 мл сорбента SP FF (GE, США) уравновешивали тем же буфером - 20 мМ Tris-HCl, доведенным 50% уксусной кислотой до рН 4,2 и имеющим электропроводность примерно 6 мСм/см. После нанесения лизата, колонку отмывали тем же буфером. ДНК и ЛПС не связывались с сорбентом и оставались в несвязавшейся фракции. ИЛ-36РА элюировали раствором с рН 5,2-20 мМ Tris-HCl, доведенным 50% уксусной кислотой до рН 5,2 и имеющим электропроводность примерно 5 мСм/см. После очистки ИЛ-36РА сорбент регенерировали 15 мМ Tris-HCl с 2 М NaCl, а затем 0,2 М NaOH.
Чистота полученного образца была определена с помощью ОФ-ВЭЖХ. Содержание дезамидированной формы ИЛ-36РА определяли только для образцов после очистки с использованием гидрофобной хроматографии.
Полученный элюат содержал 1,81 г (50% от исходного количества белка в биомассе штамма-продуцента) ИЛ-36РА с чистотой 83% по ОФ-ВЭЖХ (Фиг. 9), что позволило очистить его до более 95% чистоты по ОФ-ВЭЖХ с помощью гидрофобной хроматографии в дальнейшем.
Пример 12. Очистка ИЛ-36РА на сорбенте SP FF (GE, США)
ИЛ-36РА очищали по методу, аналогичному изложенному в Примере 11, но со следующими отличиями:
- Использовали 20 г биомассы штамма-продуцента, объемы использованных буферных растворов и сорбента также кратно уменьшены.
- Сорбцию ИЛ-36РА проводили при рН 4,5. Для этого к лизату добавляли 50% уксусную кислоту до достижения раствором рН 4,5 и электропроводности примерно 10 мСм/см. В качестве уравновешивающего буфера использовали 20 мМ Tris-HCl, доведенным 50% уксусной кислотой до рН 4,5 и имеющим электропроводность примерно 6 мСм/см.
В результате не произошло связывания ИЛ-36РА с сорбентом, что не позволило его очистить.
Пример 13. Очистка ИЛ-36РА на сорбенте SP FF (GE, США)
ИЛ-36РА очищали по методу, аналогичному изложенному в Примере 11, но со следующими отличиями:
- Использовали 20 г биомассы штамма-продуцента, объемы использованных буферных растворов и сорбента также кратно уменьшены.
- Элюцию ИЛ-36РА проводили раствором, имеющим электропроводность примерно 35 мСм/см и рН 4,0-20 мМ Tris-HCl, доведенным 50% уксусной кислотой до рН 4,0 с 0,3 М NaCl.
Полученный элюат содержал 1,62 г (45% от исходного количества белка в биомассе штамма-продуцента) ИЛ-36РА с чистотой 52% по ОФ-ВЭЖХ (Фиг. 10), что позволило очистить его до более 95% чистоты по ОФ-ВЭЖХ с помощью гидрофобной хроматографии в дальнейшем.
Пример 14. Очистка ИЛ-36РА на сорбенте SP FF (GE, США)
ИЛ-36РА очищали по методу, аналогичному изложенному в Примере 11, но со следующими отличиями:
- Использовали 20 г биомассы штамма-продуцента, объемы использованных буферных растворов и сорбента также кратно уменьшены.
- Элюцию ИЛ-36РА проводили раствором, имеющим электропроводность примерно 5 мСм/см и рН 6,5 - 20 мМ Tris-HCl, доведенным 50% уксусной кислотой до рН 6,5.
Полученный элюат содержал 1,69 г (47% от исходного количества белка в биомассе штамма-продуцента) ИЛ-36РА с чистотой 28% по ОФ-ВЭЖХ (Фиг. 11), что позволило очистить его до более 95% чистоты по ОФ-ВЭЖХ с помощью гидрофобной хроматографии в дальнейшем.
Пример 15. Анализ чистоты и гомогенности полученного ИЛ-36РА
Для определения количества белковых примесей в полученном ИЛ-36РА пробы ИЛ-36РА разделяли методом ВЭЖХ в обратной фазе на колонке Jupiter С18 (Phenomenex). 10 мкг (±2 мкг) ИЛ-36РА в 20 мкл (±4 мкл) раствора наносили на колонку в 50 мМ (±5 мМ) фосфатном буфере, рН 6,0 (допустимый интервал рН 5,8-6,2). Элюцию проводили градиентом ацетонитрила с 30% до 70% в 0,1% ТФУ, рН 2,5 (±0,2), за 20 минут (±5 мин) при скорости потока 1,5 мл/мин и температуре +35°С (±2°С). Детектирование проводили на УФ-детекторе при длине волны 220 нм. Типовая хроматограмма ОФ-ВЭЖХ разделения ИЛ-36РА по этой методике представлена на Фиг.12.
В ряде случаев проводили ОФ-ВЭЖХ по методу, описанному выше, с модификациями. Элюцию проводили градиентом ацетонитрила с 39,6% до 40,8%, в остальном условия были такими же. Типовая хроматограмма ОФ-ВЭЖХ разделения ИЛ-36РА по этой методике представлена на Фиг. 13.
Для определения примеси дезамидированной формы ИЛ-36РА проводили капиллярный зонный электрофорез (КЗЭФ) на приборе «Капель-105М» (Люмэкс, Россия). Для анализа использовали непокрытые кварцевые капилляры с внутренним диаметром 50 мкм и полной длиной 50 см (+5 см) (эффективная длина 40 см (±5 см) (Люмэкс, Россия). Капилляр термостатировали при 25°С (±2°С), детекцию осуществляли на длине волны 214 нм. В качестве фонового электролита использовали 0,12 М (±20 мМ) раствор дигидрофосфата калия (рН 3 ((±0,2)). Перед проведением анализа капилляр промывали 0,1М (±20 мМ) раствором гидроксида натрия, деионизованной водой и фоновым электролитом по 3 мин под давлением 2000 мбар ((±100 мбар). Проба для капиллярного зонного электрофореза представляла собой водный раствор рекомбинантного рецепторного антагониста интерлейкина-36 человека с концентрацией 0,5 мг/мл (допустимый диапазон концентраций 0,4 мг/мл - 0,6 мг/мл), содержащий 2 мкг (±0.2 мкг) внутреннего стандарта - синтезированного пептида Trp-Glu-His-Arg. Ввод пробы осуществляли гидродинамически под давлением 40 мбар в течение 5 с. Анализ проводили при напряжении 10 кВ (±2 кВ) в течение 35 минут (±5 мин). Инструментальный контроль, сбор и регистрацию электрофоретических данных производили с помощью системы «Эльфоран» (Люмэкс, Россия). Для идентификации пиков интактного белка и его дезамидированной формы рассчитывали относительное время миграции каждого из этих пиков (RMT), равное отношению времени миграции пика белка ко времени миграции внутреннего стандарта. Содержание дезамидированной формы белка рассчитывали по относительной площади пика (в процентах), равной отношению площади пика дезамидированной формы к сумме площадей пиков, соответствующих рекомбинантному рецепторному антагонисту интерлейкина-36 человека. На Фиг. 10 представлена электрофореграмма разделения нативной (А) и дезамидированной (Б) форм ИЛ-36РА в КЗЭФ.
После всех стадий очистки по результатам анализов получаемый ИЛ-36РА имеет чистоту >95% по ВЭЖХ и <5% дезамидированной формы.