Клональное микроразмножение сортов Hemerocallis L. и Hosta L. при использовании эксплантов тканей и органов цветка

КЛОНАЛЬНОЕ МИКРОРАЗМНОЖЕНИЕ СОРТОВ HEMEROCALLIS L. И HOSTA L. ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ ЭКСПЛАНТОВ ТКАНЕЙ И ОРГАНОВ

ЦВЕТКА

А.Ю. НАБИЕВА, кандидат биологических наук Центральный сибирский ботанический сад СО РАН, Новосибирск, Россия

Введение

Гибридные сорта родов Hosta L. и Hemerocallis L. - высоко-декоративные, устойчивые к заболеваниям растения, хорошо приспособленные к условиям умеренного резко континентального климата Западной Сибири. В практике ботанических садов преобладают традиционные методы их размножения, при которых деление куста возможно только спустя 2-3 года. Вследствие этого в большинстве ботанических коллекций возникает дефицит новых высоко-декоративных сортов и весьма актуальной становится разработка методик размножения ценных генотипов родов Hemerocallis и Hosta в культуре in vitro.

При использовании пазушных почек, находящихся под землей, в качестве эксплантов при размножении хост многие исследователи неизбежно сталкивались с проблемой бактериального и грибного заражения [9, 10]. Кроме того, число образовавшихся растений-регенерантов было невелико [11]. В большинстве исследований по введению лилейников в стерильную культуру развитие растений происходило посредством образования каллуса на разных типах эксплантов [6, 7]. Авторами приведены данные о сомаклональной вариабельности среди регенерантов, полученных в культуре верхушек побегов хосты, где число измененных форм достигало 43,8% [10]. Большинство таких сомаклонов показывало различия по площади листьев, содержанию хлорофилла и длине черешков по сравнению с исходными растениями. Поскольку у регенерантов, полученных через каллусогенез, отмечается появление сомаклональной изменчивости [1, 5], изучение морфогенетических реакций при культивировании эксплантов является весьма актуальным.

Целью данной работы было апробирование методики введения в стерильную культуру тканей и органов цветка новых декоративных сортов Hemerocallis и Hosta, разработанной нами ранее на различных представителях рода Lilium [2], их размножение путем прямого органогенеза в условиях in vitro и выявление изменчивости в культуре ткани исследуемых растений.

Объекты и методы исследования

Объектами служили три сорта хосты - Krossa Regal, Christmas Tree, Streaptise и два сорта лилейника - Sabina Bayer и Bela Lugosi, растущих на интродукционном участке Центрального сибирского ботанического сада. В качестве эксплантов, имеющих высокую регенерационную способность, были взяты соматические ткани и органы цветка из еще нераскрытых бутонов высотой 15-25 мм, а именно: поперечные срезы оси соцветия, либо цветоножки - толщиной 1,5-2 мм; фрагменты цветоложа такой же толщины; тычиночные нити с пыльниками, имевшие в основании небольшой сегмент цветоложа и завязи.

Для инициации развития изолированные экспланты, выделенные из цветков, помещали на питательную среду МБм - модифицированную нами MS, к которой добавляли 40 г/л сахарозы, 7 г/л агара и регуляторы роста: ауксин 2,4-Д и цитокинин БАП. В контроле использовали среды этого же состава без регуляторов роста.

Первоначально объекты помещали в темноту в термостат при 26-28°С. Через 1,5 месяца экспланты с выраженной морфогенетической реакцией переносили для дифференциации на среду MS, в которую был добавлено 0,2 мг/л БАП, в дальнейшем их культивировали под люминесцентными лампами с фотопериодом 16 час при 20-25°С.

Для лучшего укоренения микропобеги переносили на безгормональную среду MS с уменьшенным в два раза содержанием макро- и микросолей MS). Количество сахарозы в данной среде не превышало 20 г/л, а количество агара составляло 4-5 г/л. В дальнейшем растения in vitro помещали при + 7оС в световой термостат фирмы Rumed (Германия) для прохождения регенерантами в течение 6-8 недель периода покоя и их лучшей предадаптации к условиям in vivo.

Результаты и обсуждение

Отличительной особенностью хост по сравнению с лилейниками, по мнению некоторых исследователей, является их более высокая регенерационная активность, обусловленная заложением нескольких (до трех) коллатеральных почек в пазухе листа экспланта в пределах одного аксиллярного комплекса [4]. Нами отмечено, что побегообразование у хосты in vitro происходило на возникающих на фрагментах цветоложа адвентивных корнях, закладывающихся из субэпидермальных тканей стебля (рис. 1).

Рис. 1. Ранние этапы развития почки Рис. 2. Образование цветоносного

(П) у основания завязи хосты сорта побега у основания завязи хосты сорта Krossa Regal в культуре in vitro St^p^se в культуре in vitro

Если экспланты выделяли из раскрывшихся бутонов, развитие регенерантов проходило, в основном, по пути флорального морфогенеза (рис. 2). Образование каллуса было отмечено в тех случаях, если экспланты были взяты из бутонов на стадии роспускания, имели значительную раневую поверхность, а также, если содержание ауксина 2,4-Д в среде превышало 1,5 мг/л.

У Hemerocallis в культуре in vitro образование адвентивных почек было отмечено в основании цветоложа, а также на поперечных срезах осей соцветий. У остальных типов эксплантов, выделенных из бутонов Hemerocallis и Hosta, процесса морфогенеза не наблюдали.

В результате экспериментов было установлено, что необходимым индуктором органогенеза как хост, так и лилейников в культуре in vitro было включение в состав инициирующей среды как 0,4-0,8 мг/л БАП, так и 0,5-1,5 мг/л 2,4-Д. Известно, что многими исследователями 2,4-Д используется, в основном, как индуктор каллусогенеза или эмбриоидогенеза, особенно у однодольных растений [3, 8].

Можно заключить, что процесса каллусообразования у хосты можно избежать, если вносить на начальном этапе в среду МБм не более 1,5 мг/л 2,4-Д (табл.). Однако, уже на стадии дифференциации нами отмечены изменения в морфологии листьев у полученных регенерантов (рис. 3).

Таблица

Влияние регулятора роста 2,4-Д (мг/л) на регенерационные процессы в культуре ткани цветоложа, выделенного из бутонов сортов Hosta и HemerocaШs

Объект Концентрация 2,4-Д

0 0,5 1,5

Кол-во микропобегов, шт./эксплант

Hosta: Christmas Tree 0 4,5 3,2 *

Krossa Regal 0 3,0 2,0 *

Strеаptise 0,2 2,5 1,5 *

Hemerocallis: Sabina Bayer 0 5,5* 4,0*

Bela Lugosi 0 7,5 6,4

Примечание: * - непрямой органогенез

Рис. 3. Измененная морфология листа Рис. 4. Цветение регенеранта

у сомаклонов Hosta, сорт Christmas Hemerocallis, сорт Sabina Bayer

Tree

С другой стороны, увеличение числа регенерантов Hemerocallis вплоть до 6-7 пассажа происходило как за счет прямого (сорт Bela Lugosi), так и непрямого органогенеза (сорт Sabina Bayer) путем образования новых адвентивных почек. Данная методика размножения позволила получить от одного бутона 35-70 регенерантов, в зависимости от сорта. Спустя год культивирования in vitro все регенеранты Hosta и Hemerocallis имели хорошо развитую корневую систему и были высажены в условия закрытого грунта.

После 2 лет выращивания в почвенных условиях у сорта Sabina Bayer не отмечено фенотипических и генотипических изменений (рис. 4).

Выводы

У всех изученных представителей родов Hosta и Hemerocallis были получены жизнеспособные регенеранты при использовании способа культивирования изолированных тканей и органов цветков. Выявлено, что путь морфогенеза в культуре in vitro у эксплантов, выделенных из нераскрытых бутонов сортов Hosta и Hemerocallis, определяется концентрацией и соотношением регуляторов роста в инициальной среде, а также зависит от генотипа. Несмотря на то, что растения Hemerocallis сорт Sabina Bayer были получены путем непрямого органогенеза, среди регенерантов не выявлено сомаклональной изменчивости, в то время как у регенерантов Hosta сорта Christmas Tree

отмечены изменения в морфологии листьев, что, возможно, связано с нестабильностью данного сорта.

Список литературы

1. Кунах В.А. Генетическая изменчивость соматических клеток растений. 3. Каллусообразование in vitro II Биополимеры и клетка. - 1997. - Т. 13, № 5. - С. 362-366.

2. Набиева А.Ю., Дорогина О.В., Красников А.А. Размножение и сохранение в культуре in vitro двух редких видов лилий - Lilium distichum Nakai и L. cernuum Kom. // Раст. ресурсы. - 2008. - Т. 44, Вып. 2 - С. 23-29.

3. Швецов С.Г., Гамбург К.З. Поглощение и метаболизм 2,4-Д в суспензионной культуре клеток кукурузы и сои // Физиология растений. - 1980. - Т. 27, № 4. - С. 746755.

4. Чурикова О.А. Изучение закономерностей функционирования верхушечной меристемы побега и особенностей морфогенетических процессов в культурах in vitro растений разных таксономических групп // Вестн. Моск. ун-та. Сер. Биология. - 2005. - № 3.- С. 52-64.

5. Nuclear fragmentation followed by mitosis as a mechanism for wide number variation in tissue culture; its implications for plant regeneration / D'Amato F., Bennici A., Cionini P.G., Barocelli S., Lupi M.C. // Plant Cell Culture: Results and Perspectives. - Amsterdam: Elsevier, 1980. - P. 62-72.

6. Heuser C.W., Apps D.A. In vitro plantlet formation from flower petal explants of Hemerocallis cv. Chipper Cherry // Can. J. Bot. - 1976. - V. 54. - P. 616-618.

7. Hussey G. Totipotency in tissue explants and callus of some members of the Liliaceae, Iridaceae and Amaryllidaceae // J. Exp. Bot. - 1975. - 26. - P. 253-262.

8. A method for inflorescence proliferation / Lin C.-S., Chen C.-T, Lin C.-C., Chang WC. // Plant Cell Rep. - 2003. - V. 21. - P. 838-843.

9. Lubomski M. Shoot multiplication and rooting of Hosta sieboldiana cv. Gold Standard using cultured shoot tips // Acta Hort. - 1989. - N 251. - P. 223-228.

10. Paek K.Y., Ma S.H. In vitro propagation of hosta using cultured shoot tips and somaclonal variability of regenerants // Acta Hort. - 1996. - N 440. - P. 576-581.

11. Papachatzi P.M., Hammer P. A., Hasegava P.M. In vitro propagation of Hosta decorata "Thomas Hogg" using cultured shoot tips // J. Am. Soc. Hort. Sci. - 1981. - V. 106, N 2. - P. 232236.

КЛОНАЛЬНОЕ МИКРОРАЗМНОЖЕНИЕ РЕДКОГО СИБИРСКОГО ВИДА GUELDENSTAEDTIA MONOPHYLLA FISCH.

Г.Г. МАИСТРЕНКО , кандидат биологических наук; Т.И. НОВИКОВА1, доктор биологических наук;

И.Ю. СЕЛЮТИНА1, кандидат биологических наук; К.К. СИДОРОВА , доктор биологических наук

Центральный сибирский ботанический сад СО РАН, Новосибирск, Россия, Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск, Россия

Введение

Гюльденштедтия однолистная (Gueldenstaedtia monophylla Fisch.) семейства Fabaceae - реликт третичного периода, эндем центральной Азии. Вид имеет дизъюнктивный ареал и встречается в горностепном поясе центрального, реже юго-восточного Алтая, а также в Туве и Монголии [8, 16] (рис. 1). Обычно он представлен небольшим числом популяций, строго приуроченным к засушливым каменистым