Морфофункциональные особенности перитонеальных макрофагов у животных с экспериментальным гепатитом

ГИСТОЛОГИЯ И ГИСТОФИЗИОЛОГИЯ

С В, Барышева, Г. В, Брюхин

МОРФОФУШОЩОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ПЕРИТОНЕАЛЬНЫХ МАКРОФАГОВ У ЖИВОТНЫХ С ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫМ ГЕПАТИТОМ

У животных с экспериментальным Д-галактозаминовым поражением печени изучены пластические свойства перитонеальных макрофагов, а также исследована лизосомалъная и фагоцитарная активность данных клеток. Установлено изменение морфофункциональных особенностей перитонеальных макрофагов у экспериментальных животных с поражением печени, которое проявилось, снижением активности лизоса, способности макрофагов к фагоцитозу Staph aureus и нарушением адгезивных свойств.

В основе нормальной жизнедеятельности лежат процессы реактивности и резистентности организма. Важными эффекторными клетками неспецифической иммунной системы, выполняющими свою функцию посредством способности к фагоцитозу, являются макрофаги. Помимо этого макрофаги участвуют в реакциях специфической защиты, обеспечивая антигенпрезентацию. Посредством секреции большого количества биологически активных веществ, ферментов и цитокинов макрофаги выполняют роль регулирующих клеток, поддерживают тканевый гомеостаз, участвуют в неспецифическом звене защиты организма, индуцируя и развивая воспалительные реакции, направленные на удаление чужеродного агента [4; 6; 8].

Кроме того, макрофаги имеют важное значение в хронизации воспалительного процесса, Многими исследователями установлено изменение функциональной активности макрофагов при различных заболеваниях печени. Целью нашего исследования явилось изучение морфофункциональных особенностей перитонеальных макрофагов у животных с экспериментальным Д-галактозаминовым поражением печени.

Материалы и методы исследования. Объектом исследования явились половозрелые белые лабораторные крысы-самцы. Исходя из поставленных задач, у экспериментальных животных нами моделировалось Д-галактозаминовое поражение печени. Экспериментальные животные были разбиты на две группы. В первую группу выделены интактные животные — «контрольная группа», во вторую — животные с поражением печени — «опытная группа».

Перитонеальные макрофаги получали общепринятым методом. В ходе работы нами исследованы адгезивные свойства перитонеальных макрофагов, проведена оценка лизо-сомальной и фагоцитарной активности.

Адгезивные свойства исследуемых макрофагов оценивали по нединамическому методу, который основан на способности клеток прикрепляться к чистой стеклянной поверхности. Для этого клеточную суспензию, содержащую МО5 клеток, наносили на чистое предметное стекло и инкубировали во влажной камере в термостате при t = 37 °С в течение 60 минут. После удаления неприкрепившихся клеток фиксированные мазки окрашивали раствором эозината метиленового синего в метиловом спирте по МаЙ-Грюнвальду [7]. г

Оценку адгезии и распластывания проводили при световой микроскопии (объектив ’ 0КУЛЯР х ?)* Показатель адгезии перитонеальных макрофагов оценивали путем

подсчета клеток, прикрепившихся к стеклу, и выражали это значение в процентах от количества всех клеток, нанесенных на стекло. Оценку распластывания проводили путем подсчета количества распластанных и нерасиластанных макрофагов. При этом не-распластанными считали макрофаги округлой формы без отростков» а за распластанные принимались клетки неправильной формы с тем или иным количеством отростков. Результат теста распластывания перитонеальных макрофагов оценивали путем определения процентного соотношения распластанных форм к общему количеству прикрепившихся клеток.

Для определения активности лизосомального аппарата в цитоплазме перитонеальных макрофагов к полученному монослою клеток добавляли ОД мл акридинового оранжевого в концентрации 2 мкг/мл. Инкубировали в темноте в течение 10 мин, после чего промывали физиологическим раствором. Полученный влажный препарат под покровным стеклом изучали в люминесцентном микроскопе. При оценке результатов данного теста учитывалось процентное содержание клеток с разной лизосомальной активностью. Оценку проводили визуально полуколичественным методом с вычислением среднего гистохимического показателя (СГП) Astaldi и Verga по формуле

СГП=(0хА-Н хБ + 2хВ + 3 *Г)/п,

где 0,1,2,3 — коэффициенты люминесцентного свечения лизосом;

А, Б, В, Г — количество клеток с разным уровнем лизосомальной активности;

п — общее количество учтенных клеток.

При этом за «А» принимали клетки без видимого свечения; за «Б» — макрофаги с единичными светящимися лизосомами; в качестве «В» учитывали клетки с умеренным свечением лизосом в цитоплазме; за «Г» — макрофаги с ярко выраженным свечением лизосом, занимающих всю цитоплазму клетки.

Фагоцитарную активность оценивали по способности макрофагов поглощать Staph, aureus, который инкубировали с монослоем макрофагов в течение часа при 37 °С [2]. Исследование проводили под люминесцентным микроскопом. Учитывали процент клеток, поглотивших бактерии, количество поглощенных бактерий и процент убитых микроорганизмов. При этом живые микроорганизмы имели зеленое свечение, а мертвые — красное.

Статистическая обработка проводилась с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни.

Результаты исследования и их обсуждения. Важным свойством макрофагов, отличающим их от ряда других клеток, является способность прикрепляться к различным субстратам и постепенно распластываться. Эта особенность используется в качестве критерия при оценке активности и зрелости макрофагов [3]. Адгезия фагоцитирующих клеток к субстрату является одним из факторов их активации. Адгезия необходима для осуществления всех стадий .фагоцитоза, начиная от распластывания макрофага на поверхности объекта-мишени и заканчивая перевариванием субстрата. При этом чем выше способность клеток к адгезии, тем больше фагоцитарная активность макрофагов. Клеточная адгезия и расспластыванне важнейшие характеристики, обусловливающие межклеточную кооперацию, экстравазацию и другие свойства фагоцитов [1].

В результате проведенного исследования нами установлено, что у экспериментальных животных с Д-галактозаминовым поражением печени способность клеток прикрепляться к чистой стеклянной поверхности снижена в 1,3 раза по сравнению с контрольной группой (табл.1).

Оценка адгезии перитонеальных макрофагов экспериментальных животных

Группа Количество клеток, подвергшихся адгезии

абсолютное относительное, %

Контрольная п = 6 1356 ±16 1,36 ±0,016

Опытная п =6 1047 ±15* 1,05 ±0,015*

* Результаты статистически достоверны по сравнению с контролем (р< 0,05),

Анализ способности перитонеальных макрофагов к распластыванию у животных с экспериментальным гепатитом показал снижение пластических свойств данных клеток в 1,86 раза, по сравнению с аналогичными показателями контрольной группы животных (табл. 2).

Таблица 2

Оценка распластывания перитонеальных макрофагов экспериментальных животных

Группа Количество распластанных макрофагов, %

Контрольная п-6 52,6 ±2,01

Опытная п = 6 28,3 ± 2,97*

* Результаты статистически достоверны по сравнению с контролем (р <0,05).

Таким образом, у животных с экспериментальным Д-галактозаминовым поражением печени происходит нарушение пластических свойств перитонеальных макрофагов по сравнению с контролем, что может обусловить нарушение функциональной активности макрофагов при поражении печени.

Перитонеальные макрофаги являются активно фагоцитирующими клетками. Для осуществления конечной стадии фагоцитоза — переваривания чужеродного агента или патологически измененного субстрата им необходима высокая активность лизосомаль-ного аппарата. Состояние мембран лизосом и набор гидролитических ферментов обусловливают функциональную активность макрофагов. Нарушение лизосомальной активности макрофагов приводит к снижению неспецифической резистентности организма [5]. Недостаток лизосом в макрофагах может привести к нарушению восприимчивости организма к различным бактериальным и вирусным инфекциям.

В результате проведенного исследования нами установлено снижение лизосо-мальной активности перитонеальных макрофагов у животных с экспериментальным Д-галактозаминовым поражением печени. У опытных животных произошло увеличение количества неактивных макрофагов (А) и макрофагов е единичными лизосомами соответственно в %6и 1,7 раза по сравнению с контролем. Напротив, количество макрофагов И ЯРК° внрюкенным учением лизосом, занимающим всю цитоплазму 2Д5 раза^габл* ^ивотнь1х оюоил<*ь по сравнению с контролем соответственно в 1,21 и

сни“ в >>56 среднего гистохимичес-

рольной группе животных по сравнению с аналогичным показателем в конт-

Характеристика лизосомальной активности перитонеальных макрофагов экспериментальных животных

Группа Содержание клеток с различной лизосомальной активностью, % СГП

А Б В Г

Контроль п = 6 5,2 ±1,20 16,6 ± 1,73 32,2 ±3,30 46,0 ±3,2 2,18 ±0,141

Опытная п = 6 24Д ±3,11* 28,0 ± 4,30 26,5 ±2,31 21,4 ±6,53* 1,40 ± 0,141*

* Результаты статистически достоверны по сравнению с контролем (р<0,05).

Анализ показателей фагоцитарной активности выявил нарушение у животных с Д-галактозаминовым поражением печени одной из важных функций макрофагов. У животных с поражением печени происходит снижение в 1,34 раза фагоцитарного показателя (то есть процента клеток поглотивших бактерии). В опытной группе произошло выраженное снижение — в 2,35 раза — фагоцитарного индекса (количество микроорганизмов, поглощенных одним макрофагом). Аналогичная тенденция выявлена при оценке киллинговой активности (процент убитых поглощенных микроорганизмов). У животных с поражением печени показатель киллинговой активности снизился в 1,17 раза по сравнению с контролем (табл. 4).

Таблица 4

Фагоцитарная активность перитонеальных макрофагов экспериментальных животных

Группа Фагоцитарный показатель, % Фагоцитарный индекс Киллинговая активность, %

Контроль п = 6 82,8 ±2,414 8,63 ± 1,052 81,0 ± 4,637

Опытная п = 6 61,67 ±9,387 3,67 ±0,757* 69,44 і 5,030

* Результаты статистически достоверны по сравнению с контролем (р<0,05).

Таким образом, в ходе исследования у животных с экспериментальным поражением печени выявлены морфофункциональные изменения, а именно нарушение пластических свойств, снижение лизосомальной и фагоцитарной активности, что может способствовать развитию неадекватных защитных реакций организма на внедрение чужеродного агента.

Список литературы

1. Адаменко, Г. П. Роль адгезии клеток в рецепторных механизмах взаимодействия поли- и мононуклеарных фагоцитов крови человека / Г. П. Адаменко // Иммунология. 2000. № 1. с. 57.

2. Брюхин, Г. В. Фагоцитарная активность моноцитов периферической крови и перитонеальных макрофагов у потомства самок крыс с хроническим экспериментальным поражением печени / Г. В. Брюхин, А. Ю, Грачев // Физиолог, журн. 1990. № 6. С. 99-102.

3. Гудима, Г О. Клеточный центр макрофагов, гранулоцитов и лимфоцитов при распластывании, поляризации и движении клеток in. vitro / Г. О. Гудима, И. А. Воробьев, Ю. С. Ченцов // Цитология. 1984, Т. 26, № 9. С. 1002-1007.

4. Луговская, С. А. Структура и функции моноцитов и макрофагов / С, А. Луговская

// Клвдич. и лаборатор. диагностика. 1997. № 9. С. 10.

5. Маянский, А. Н, Очерки о нейтрофиле и макрофаге I А. Н. Маянский, Д. Н. Маянский. Новосибирск, 1989. С. 166-195.

6. Олиферук, Н. С. Оценка фагоцитарной и бактерицидной активности нейтрофилов и макрофагов / Н. С. Олиферук, А. Н. Ильинская, Б. В. Пинегин // Иммунология. 2005. № 1. С. 10-12.

7. Роскин, Г. И. Микроскопическая техника / Г. И. Роскин, JI Б. Левинсон. М., 1957. 467 с.

8. Balleux, R. Е. The mind and the immune system / R. E. Balleux // Theor. Med. 1995. Vol. 15, №40. P. 387.

Т. И. Бирюкова, Г. В, Брюхин

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ТУЧНЫХ КЛЕТОК ВИЛОЧКОВОЙ ЖЕЛЕЗЫ ПОТОМСТВА САМОК КРЫС С ХРОНИЧЕСКИМ ПОРАЖЕНИЕМ ПЕЧЕНИ РАЗЛИЧНОГО ГЕНЕЗА

Рассмотрены морфофункциональные особенности тучных клеток тимуса потомства самок крыс с хроническим поражением печени различного генеза. Установлено, что в тимусе потомства самок крыс с хроническим поражением гепатобилиарной системы имеет место увеличение числа тучных клеток и усиление их функциональной активности, о чем свидетельствует увеличение индекса гранулярного насыщения, а также индекса дегрануляции.

Тучные клетки, или мастоциты, привлекают все большее внимание исследователей, обусловленное тем, что этот тип клеток широко представлен практически во всех органах и тканях. Они участвуют в развитии воспалительных, иммунных, аллергических реакций и многих других патологических процессов, секретируя разнообразные биологически активные вещества [1]. Тучные клетки в тимусе животных представляют компонент специфического микроокружения, способствующего процессам созревания и дифференциров-ки лимфоцитов [4]. В связи с этим целью данного исследования явилось изучение морфофункциональных особенностей тучных клеток тимуса как центрального органа иммуногенеза у потомства самок крыс с хроническим поражением печени различного генеза.

Материалы и методы. В эксперименте были использованы белые лабораторные крысы-самки «Вистар» и их потомство на 1, 15, 30, 45-е и 60-е сутки достнатального онтогенеза. Все животные были разбиты на две группы — «контрольную» и «опытную». В группу контроля входило 50 животных, а в опытную — 97.

Опытную группу 1 составило потомство животных с хроническим О-галактозаминовым поражением печени, а опытную группу 2 — потомство животных с поражением печени, соответствующим гепатиту А. Моделирование хронического поражения в опытной группе 1 осуществляли введением взрослым половозрелым животным гепатотропного яда 0(+) — галактозаминатидрохлорида («SІgma-G0500», США) по общепринятой методике (Н, П. Сугробова и др., 1992), По совокупности морфологических и биохимических критериев данная модель поражения печени соответствует вирусному гепатиту В человека. Для воспроизводства модели поражения печени гепатитом А (опытная группа 2) в экспериментальных условиях применялась методика сенсибилизации животных культурой Е. СоН (Б. А. Саков и др., 1967).

Для выявления тучных клеток депарафинированные серийные гистологические срезы окрашивали 0,1 %-м раствором толуидинового синего при pH 4,9 [2]. Для комплексной морфометрической оценки тучноклеточной популяции использовали следующие