МОНИТОРИНГ ТЕРАПИИ ПРИ ЛЕЧЕНИИ СВЯЗЫВАЮЩИМ ВЕЩЕСТВОМ ПРОТИВ АДРЕНОМЕДУЛЛИНА (ADM)
THERAPY MONITORING IN TREATMENT WITH BINDING AGENT AGAINST ADRENOMEDULLIN (ADM)

Область техники, к которой относится изобретение
Объектом настоящего изобретения является способ мониторинга терапии у субъекта, при этом субъект проходит лечение связывающим веществом против адреномедуллина (ADM), выбранным из группы, включающей антитело, фрагмент антитела и/или не-Ig каркас, включающий определение уровня фрагмента пре-про-адреномедуллина, выбранного из группы, включающей среднерегиональный проадреномедуллин (MR-proADM), C-концевой проадреномедуллин (CT-proADM) и/или пептид из 20 N-концевых аминокислот проадреномедуллина (PAMP), или фрагменты указанного в биологической жидкости, полученной от указанного субъекта; и соотнесение уровня указанного фрагмента пре-про-адреномедуллина с клиническим/медицинским состоянием субъекта и/или риском неблагоприятного исхода и/или необходимостью регулирования терапевтических мер.
Описание изобретения
ADM представляет собой находящийся в кровообращении пептид, который, как известно, регулирует расширение сосудов и целостность сосудов. Повышенные концентрации ADM в плазме были описаны для нескольких угрожающих жизни состояний, включая сердечно-сосудистые заболевания и септический шок. Способ обнаружения и количественного определения биологически активного ADM (био-ADM) описан в WO2013072509. При этом моноклональные антитела против амидированного С-конца и средней части био-ADM были сгенерированы и применены для иммуноанализа для количественного определения биоактивного ADM в плазме.
Кроме того, было обнаружено, что введение антитела против ADM, или фрагмента антитела против ADM, или не-Ig-каркаса против ADM, связывающегося с ADM, может значительно снизить риск смертности у пациента, имеющего тяжелое острое заболевание или острое состояние.
В недавних исследованиях было показано, что индукция сепсиса приводит к увеличению био-ADM в плазме в экспериментах на животных. Удивительно, что после введения антитела против адреномедуллина (ADM) видимая концентрация ADM в плазме возрастала значительно быстрее и до более высокого уровня, чем у контрольных животных. Принимая во внимание огромный молярный избыток антитела против ADM по сравнению с эндогенным био-ADM, следует предположить, что измеренная концентрация ADM в плазме после введения антитела против ADM фактически представляет собой в основном био-ADM в комплексе с антителом против ADM. Однако диспропорциональное увеличение био-ADM в плазме, наблюдаемое после введения антитела против ADM, по сравнению с контрольными животными, не было связано с худшим исходом.
Фактически, было обнаружено, что, удивительно, при лечении антителом против ADM измерение био-ADM не подходит для мониторинга риска неблагоприятного исхода для субъекта. Напротив, измерение фрагментов, полученных из пептида-предшественника ADM, с которым указанное антитело против ADM не связывается, является подходящим для мониторинга стимуляции или пониженной регуляции системы ADM в таких условиях, поскольку на них не оказывает непосредственное влияние введение антитела против ADM, и такое измерение во временной зависимости коррелирует с клиническим исходом пациента, который находится на лечении указанным антителом против ADM.
Уровень техники
Kitamura, K., и соавт. 1993. "Adrenomedullin: A Novel Hypotensive Peptide Isolated From Human Pheochromocytoma", Biochemical and Biophysical Research Communications, Vol. 192 (2), pp. 553-560
Пептид адреномедуллин (ADM) был впервые описан в 1993 г. () в качестве нового гипотензивного пептида, содержащего 52 аминокислоты, который был выделен из феохромоцитома человека; SEQ ID NO.1. В том же году была также описана кДНК, кодирующая пептид-предшественник, содержащий 185 аминокислот, и полная аминокислотная последовательность этого пептида-предшественника. Пептид-предшественник, который включает, среди прочего, сигнальную последовательность из 21 аминокислоты на N-конце, называют «препроадреномедуллин» (pre-proADM). В настоящем описании все указанные аминокислотные позиции обычно относятся к pre-proADM, который содержит 185 аминокислот и имеет последовательность в соответствии с SEQ ID NO.2.
2
2
Зрелый пептид адреномедуллина представляет собой амидированный пептид (ADM-NH), который содержит 52 аминокислоты (SEQ ID NO.1) и который содержит аминокислоты от 95 до 146 pre-proADM, из которых он образуется путем протеолитического расщепления. Зрелые ADM, био-ADM и ADM-NHиспользуются как синонимы в данной заявке и представляют собой молекулу в соответствии с SEQ ID NO.1.
Editorial, Takahashi, K. 2001. Peptides, Vol. 22: 1691
Eto, T. 2001. Peptides Vol. 22: 1693-1711)
Hinson, и соавт. 2000. Endocrine Reviews Vol. 21(2): 138-167)
К настоящему времени, по существу, более точно были исследованы лишь несколько фрагментов из пептидных фрагментов, образуемых при расщеплении pre-proADM, в частности, физиологически активные пептиды адреномедуллин (ADM) и «PAMP», пептид, содержащий 20 аминокислот (22-41), которые следуют за 21 аминокислотой сигнального пептида в pre-proADM. Открытие и характеристика ADM в 1993 г. способствовали интенсивной исследовательской деятельности, результаты которой были обобщены в различных обзорных статьях, и в контексте настоящего описания, в частности, сделаны ссылки на статьи, которые можно найти в выпуске журнала «Peptides», посвященном, в частности, ADM (and . Другой обзор представлен в (.
Eto T. 2001. Peptides, Vol. 22: 1693-1711
Кроме того, было обнаружено, что концентрации ADM, которые можно измерять в кровотоке и других биологических жидкостях, при ряде патологических состояний значительно превышают концентрации, обнаруживаемые у здоровых людей из контрольной группы. Таким образом, уровень ADM у пациентов с застойной сердечной недостаточностью, инфарктом миокарда, заболеваниями почек, гипертонической болезнью, сахарным диабетом, в острой фазе шока и при сепсисе и септическом шоке значимо повышается, хотя и в разной степени. Концентрации PAMP также повышаются при некоторых из указанных патологических состояний, но уровни в плазме являются более низкими по сравнению с ADM ().
Eto и соавт. 2001. Peptides 22: 1693-1711; Hirata и соавт. 1996. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 81 (4).): 1449-1453; Ehlenz и соавт. 1997. Exp Clin Endocrinol Diabetes 105: 156-162; Tomoda и соавт. 2001. Peptides 22: 1783-1794; Ueda и соавт. 1999 Am. J. Respir. Crit. Care Med.160: 132-136; Wang и соавт. 2001. Peptides 22: 1835-1840
Wang, Shock 1998, 10(5):383-384; Wang и соавт. 1998. Archives of surgery 133(12): 1298-1304)
Parlapiano и соавт. 1999. European Review for Medical and Pharmacological Sciences 3:53-61; Hinson и соавт. 2000 Endocrine Reviews 21(2):138-167
Кроме того, известно, что необычно высокие концентрации ADM должны наблюдаться при сепсисе или при септическом шоке (). Полученные данные связаны с типичными изменениями гемодинамики, которые известны как типичные явления при течении заболевания у пациентов с сепсисом и другими тяжелыми синдромами, такими как, например, SIRS. Адреномедуллин играет ключевую роль во время развития сепсиса (и при многочисленных острых и хронических заболеваниях ().
Kitamura и соавт. 1998. Biochem. Biophys. Res. Commun. 244 (2): 551-555)
Pio и соавт. 2001. Journal of Biological Chemistry 276 (15): 12292-12300)
В научных исследованиях, проведенных до настоящего времени, было обнаружено, среди прочего, что ADM можно рассматривать как полифункциональный регуляторный пептид. Он высвобождается в кровоток частично в неактивной форме, удлиненной глицином (. Существует также связывающий белок (, который является специфичным для ADM и, вероятно, также модулирует эффект ADM.
Eto и соавт. 2001. Peptides 22: 1693-1711; Hinson и соавт., 2000 Endocrine Reviews 21 (2): 138-167; Kuwasako и соавт. 1997. FEBS Lett 414 (1): 105-110; Kuwasaki и соавт. 1999. Ann. Clin. Biochem. 36: 622-628; Tsuruda и соавт. 2001. Life Sci. 69 (2): 239-245; Kangawa и соавт. EP 0 622 458)
Кроме того, было обнаружено, что вышеупомянутый еще один физиологически активный пептид PAMP, образованный из pre-proADM, также демонстрирует гипотензивный эффект, даже если он, по-видимому, обладает механизмом действия, отличным от механизма действия ADM (.
Marino и соавт. 2014. Crit Care 18: R34)
Было описано несколько способов для измерения уровней ADM в крови: ADM либо прямо, либо косвенно путем определения более стабильного фрагмента его родственного пептида-предшественника. Недавно был опубликован способ, описывающий анализ для измерения циркулирующего в кровотоке зрелого ADM (.
Morgenthaler и соавт. 2005. Clin Chem 51 (10): 1823-9)
Washimine и соавт. 1994. Biochem Biophys. Res Commun 202 (2): 1081-7)
EP 2 111 552)
Caruhel и соавт. 2009. Clin Biochem 42 (7-8):725-8)
Были описаны другие способа количественного определения фрагментов, полученных из предшественника ADM, например, измерение MR-proADM (, PAMP (и CT-proADM (. Имеется коммерческий гомогенный флуороиммуноанализ с временным разрешением для измерения MR-proADM в плазме на полностью автоматизированной системе (BRAHMS MR-proADM KRYPTOR; BRAHMS GmbH, Hennigsdorf, Германия) (. Поскольку эти пептиды генерируются в стехиометрическом соотношении из одного и того же предшественника, их уровни в плазме коррелируют в определенной степени.
Hirayama и соавт. 1999. J Endocrinol 160: 297-303; Yu и соавт. 2001. Heart 86: 155-160)
Poyner и соавт. 2002. Pharmacol Rev 54: 233-246)
Концентрация ADM в плазме повышена у пациентов с сердечной недостаточностью и коррелирует с тяжестью заболевания (. Высокий ADM в плазме является независимым негативным прогностическим показателем у этих субъектов (.
Maisel и соавт. 2010. J. Am. Coll. Cardiol. 55: 2062-2076)
Shah и соавт. 2012. Eur. Heart J. 33:2197-2205)
van Haehling и соавт. 2010. European Journal of Heart Failure 12: 484-491; Adlbrecht и соавт. 2009. European Journal of Heart Failure 11: 361-366)
Роль MR-proADM в сердечной недостаточности была исследована в нескольких исследованиях. В исследовании BACH (MR-proADM имел высокую прогностическую ценность в отношении смерти в течение 90 дней, добавляя прогностическую ценность помимо натрийуретических пептидов. Последующие данные из исследования PRIDE (подтвердилипотенциальную прогностическую роль MR-proADM; для пациентов MR-proADM имел лучшую площадь под кривой (AUC) в отношении смертности в течение 1 года. Аналогично, уровни MR-proADM у пациентов с хронической сердечной недостаточностью (CHF) имели высокую корреляцию с тяжестью заболевания, а повышенные уровни пептида были сильно связаны с повышенным риском смерти в течение 12 месяцев последующего наблюдения (.
Boyer и соавт. 2012. Congest Heart Fail 18(2):91-97)
Kaiser и соавт. 2014. Europ J Heart Failure 16:1082-1088)
Eisenhut 2006. Crit Care 10: 418)
MR-proADM исследовали во время лечения у пациентов с острой декомпенсированной сердечной недостаточностью (: у пациентов, уровни MR-proADM у которых имели тенденцию к повышению во время интенсивной терапии, были обнаружены признаки, ассоциированные с постоянными застойными явлениями. В течение 12-24 часов после терапии у пациентов с повышением уровня MR-proADM наблюдался повышенный периферический отек. Kaiser и соавт. измеряли MR-proADM у пациентов с одножелудочковыми сердцами (. Уровни у пациентов с отказом контура Фонтена (демонстрирующих асцит и периферический отек) были значительно выше по сравнению с пациентами без отказа контура Фонтена. Более того, Eisenhut высказал предположение, что лечение, приводящее к снижению уровня адреномедуллина, может снизить тяжесть и степень альвеолярного отека при пневмонии и сепсисе (.
Christ-Crain и соавт. 2005. Crit Care 9: R816-824; Angeletti и соавт. 2013. Clin Chem Lab Med 51: 1059- 1067)
Christ-Crain и соавт. 2005. Crit Care 9: R816-824; Suberviola и соавт. 2012. Swiss Med Wkly 142: w13542; Guiginant и соавт. 2009. Intensive Care Med 35: 1859-1867; DE LA Torre-Prados и соавт. 2016. Minerva Anestesiol 82: 760-766; Andaluz-Ojeda и соавт. 2015. J Infect 71: 136-139)
Роль MR-proADM в диагностике и прогнозировании сепсиса была изучена в некоторых исследованиях. MR-proADM был описан как биомаркер для дифференциации пациентов с сепсисом и пациентов без сепсиса с SIRS (. Более того, в нескольких исследованиях сообщалось, что MR-proADM является прогностическим биомаркером при сепсисе, тяжелом сепсисе и септическом шоке (.
,
В WO-A1 2004/097423 описано применение антитела против адреномедуллина для диагностики, прогнозирования и лечения сердечно-сосудистых нарушений. Лечение заболеваний путем блокирования рецептора ADM также описано в данной области техники (напримерWO-A1 2006/027147, PCT/EP2005/012844), где указанными заболеваниями могут быть сепсис, септический шок, сердечно-сосудистые заболевания, инфекции, дерматологические заболевания, эндокринологические заболевания, заболевания, связанные с обменом веществ, гастроэнтерологические заболевания, рак, воспаление, гематологические заболевания, респираторные заболевания, заболевания мышечного скелета, неврологические заболевания, урологические заболевания.
WO2013/072510, WO2013072511, WO2013072512, WO2013072513, WO2013072514)
Было обнаружено, что введение антитела против ADM, или фрагмента антитела против ADM, не-Ig-каркаса против ADM, связывающегося с ADM, может значительно снизить риск смертности у пациента, имеющего тяжелое острое заболевание или острое состояние (.
Подробное описание изобретения
Объектом настоящего изобретения является способ мониторинга терапии у субъекта, при этом субъект проходит лечение связывающим веществом, выбранным из группы, включающей антитело против адреномедуллина (ADM), фрагмент антитела и/или не-Ig каркас, связывающийся с SEQ ID NO.1 (аминокислота 1-52), включающий:
- определение уровня фрагмента пре-про-адреномедуллина, выбранного из группы, включающей среднерегиональный проадреномедуллин (MR-proADM), C-концевой проадреномедуллин (CT-proADM) и/или пептид из 20 N-концевых аминокислот проадреномедуллина (PAMP), или фрагменты указанного, в биологической жидкости, полученной от указанного субъекта; и
- соотнесение указанного уровня фрагмента пре-про-адреномедуллина, выбранного из группы, включающей MR-proADM, CT-proADM и/или PAMP, с клиническим/медицинским состоянием субъекта и/или риском неблагоприятного исхода, и/или необходимостью регулирования терапевтических мер, и
- при этом для определения уровня указанных фрагментов по меньшей мере одно связывающее вещество связывается с областью внутри аминокислотной последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO.3, SEQ ID NO.4 и SEQ ID NO.5, соответственно.
Используемый в настоящем описании термин «субъект» относится к живому организму, являющемуся или не являющемуся человеком, предпочтительно, в настоящем описании субъект представляет собой человека, причем указанный субъект страдает заболеваниями или состояниями, например, хроническим или острым заболеванием или острым состоянием. Такое заболевание может быть выбрано из группы, включающей тяжелые инфекции, такие как, например, менингит, синдром системного воспалительного ответа (SIRS), сепсис; другие заболевания, такие как диабет, рак, острые и хронические сосудистые заболевания, такие как сердечная недостаточность, инфаркт миокарда, инсульт, атеросклероз; шок, например, септический шок и дисфункция органов, например, дисфункция почек, дисфункция печени, ожоги, хирургическое вмешательство, травмы.
Используемый в настоящем описании термин «PAMP» включает обе циркулирующие в кровотоке формы PAMP, а именно, биологически неактивный PAMP с удлинением глицином на С-конце (PAMP-Gly) и биологически активный PAMP с амидированным С-концом (PAMP-амид).
Во всем описании «антитела против ADM» или «фрагменты антител против ADM» или «не-Ig-каркасы против ADM» в соответствии с изобретением способны связывать ADM и, таким образом, направлены против ADM и, таким образом, могут называться «антитела против ADM», «фрагменты антител против ADM» или «не-Ig каркасы против ADM».
В соответствии с настоящим изобретением введение антитела против ADM или фрагмента антитела против ADM, связывающегося с ADM, или не-Ig-каркаса против ADM, связывающегося с ADM, предпочтительно, является системным применением.
В другом варианте осуществления настоящей заявки фрагменты пре-про-адреномедуллина, которые могут быть определены в биологической жидкости, выбирают из группы, включающей:
SEQ ID NO.3 (N-20 концевой пептид проадреномедуллина, PAMP): аминокислоты 22-41 из preproADM
ARLDVASEF RKKWNKWALS R
SEQ ID NO.4 (среднерегиональный проадреномедуллин, MR-proADM): аминокислоты 45-92 из preproADM
ELRMSS SYPTGLADVK AGPAQTLIRP QDMKGASRSP EDSSPDAARI RV
SEQ ID NO.5 (C-концевой проадреномедуллин, CT-proADM): аминокислоты 148-185 из preproADM
RRR RRSLPEAGPG RTLVSSKPQA HGAPAPPSGS APHFL
В другом варианте осуществления настоящей заявки указанный фрагмент пре-проадреномедуллина, имеющий по меньшей мере 5 аминокислот, выбирают из группы, включающей MR-proADM (SEQ ID NO.4), CT-proADM (SEQ ID NO.5) и/или PAMP (SEQ ID NO.3).
В одном из вариантов осуществления настоящей заявки уровень фрагментов pre-proADM и/или их фрагментов определяют с использованием по меньшей мере одного связывающего вещества, причем указанное связывающее вещество связывается с областью, содержащейся в последовательности MR-proADM (SEQ ID NO.4).
В другом варианте осуществления настоящей заявки уровень фрагментов pre-pro-ADM и/или их фрагментов определяют с использованием по меньшей мере одного связывающего вещества, причем указанное связывающее вещество связывается с областью, содержащейся в последовательности CT-proADM (SEQ ID NO.5).
В другом варианте осуществления настоящей заявки уровень фрагментов pre-proADM и/или их фрагментов определяют с использованием по меньшей мере одного связывающего вещества, причем указанное связывающее вещество связывается с областью, содержащейся в последовательности PAMP (SEQ ID NO.3).
Объектом изобретения в конкретном варианте осуществления настоящей заявки является способ, в котором указанный фрагмент могут выбирать из MR-proADM в соответствии с SEQ ID NO.4 и/или CT-proADM в соответствии с SEQ ID NO.5 и/или PAMP в соответствии с SEQ ID NO.3.
Другой вариант осуществления настоящей заявки относится к способу в соответствии с предшествующими вариантами осуществления, в котором антитело против ADM для лечения субъекта, которое связывается с N-концевой частью, аминокислотами 1-21, адреномедуллина, представляет собой CDR- привитое антитело человека, или фрагмент этого антитела, который связывается с ADM, при этом CDR-привитое антитело человека или фрагмент этого антитела содержит тяжелую цепь антитела (Н-цепь), содержащую:
SEQ ID NO.6:
GYTFSRYW
SEQ ID NO.7:
ILPGSGST
и/или
SEQ ID NO.8:
TEGYEYDGFDY
и/или дополнительно содержит легкую цепь антитела (L-цепь), содержащую:
SEQ ID NO.9:
QSIVYSNGNTY
SEQ ID NO.28: (не упоминается в списке последовательностей из-за длины в 3 аминокислоты)
RVS
и/или
SEQ ID NO.10:
FQGSHIPYT.
В другом конкретном варианте осуществления настоящей заявки антитело против ADM для лечения субъекта представляет собой человеческое моноклональное антитело, которое связывается с ADM, или фрагмент этого антитела, при этом тяжелая цепь содержит по меньшей мере одну CDR, выбранную из группы, включающей:
SEQ ID NO.6:
GYTFSRYW
SEQ ID NO.7:
ILPGSGST
SEQ ID NO.8:
TEGYEYDGFDY
и при этом легкая цепь содержит по меньшей мере одну CDR, выбранную из группы, включающей:
SEQ ID NO.9:
QSIVYSNGNTY
SEQ ID NO.28:
RVS
SEQ ID NO.10:
FQGSHIPYT.
В другом варианте осуществления настоящей заявки антитело против ADM для лечения субъекта представляет собой человеческое моноклональное антитело, которое связывается с ADM, или фрагмент этого антитела, при этом тяжелая цепь содержит последовательности
SEQ ID NO.6:
GYTFSRYW
SEQ ID NO.7:
ILPGSGST
SEQ ID NO.8:
TEGYEYDGFDY
и при этом легкая цепь содержит последовательности
SEQ ID NO.9:
QSIVYSNGNTY
SEQ ID NO.28:
RVS
SEQ ID NO.10:
FQGSHIPYT.
Другой вариант осуществления настоящей заявки относится к способу по предыдущему варианту осуществления, в котором указанное антитело или фрагмент для лечения представляет собой человеческое моноклональное антитело или его фрагмент, который связывается с ADM, или фрагмент этого антитела, при этом тяжелая цепь содержит последовательности
CDR1: SEQ ID NO.6:
GYTFSRYW
CDR2: SEQ ID NO.7:
ILPGSGST
CDR3: SEQ ID NO.8:
TEGYEYDGFDY
и при этом легкая цепь содержит последовательности
CDR1: SEQ ID NO.9:
QSIVYSNGNTY
CDR2: SEQ ID NO.28:
RVS
CDR3: SEQ ID NO.10:
FQGSHIPYT.
Другой вариант осуществления настоящей заявки относится к способу по предыдущему варианту осуществления, в котором указанное антитело или фрагмент для лечения содержит следующие последовательности в качестве области VH:
SEQ ID NO.11 (AM-VH-C):
QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFSRYWIEWVKQRPGHGLEWIGEILP
GSGSTNYNEKFKGKATITADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTEGYEYDGFD
YWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN
SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKR
VEPK
SEQ ID NO.12 (AM-VH1):
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWISWVRQAPGQGLEWMGRIL
PGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFD
YWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN
SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKR
VEPK
SEQ ID NO.13 (AM-VH2-E40):
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWMGRIL
PGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFD
YWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN
SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKR
VEPK
SEQ ID NO.14 (AM-VH3-T26-E55):
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKATGYTFSRYWISWVRQAPGQGLEWMGEIL
PGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFD
YWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN
SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKR
VEPK; или
SEQ ID NO.15 (AM-VH4-T26-E40-E55):
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKATGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWMGEIL
PGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFD
YWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN
SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKR
VEPK;
и содержит следующую последовательность в качестве области VL:
SEQ ID NO.16 (AM-VL-C):
DVLLSQTPLSLPVSLGDQATISCRSSQSIVYSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYR
VSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHIPYTFGGGTKLE
IKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNS
QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGE
С
SEQ ID NO.17 (AM-VL1):
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLNWFQQRPGQSPRRLIYR
VSNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGQGTKL
EIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGN
SQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRG
ЕС
SEQ ID NO.18 (AM-VL2-E40):
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLEWFQQRPGQSPRRLIYRVSNR DSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFP PSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLS KADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC.
Другой вариант осуществления настоящей заявки относится к способу по предыдущему варианту осуществления, в котором указанное антитело или фрагмент для лечения содержит следующую последовательность в качестве тяжелой цепи:
SEQ ID NO.26:
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWIGEILPGSGST NYNQKFQGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGT AALGCLVKDY FPEPVTVSWNSGALTSGVHT FPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPE LLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ YNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDEL TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
и содержит следующую последовательность в качестве легкой цепи:
SEQ ID NO.27
DVVLTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLEWYLQRPGQSPRLLIYRVSNRF SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPP SDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLS KADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Следует понимать, что уровень фрагмента пре-про-адреномедуллина, выбранного из группы, включающей MR-proADM (SEQ ID NO.4), CT-proADM (SEQ ID NO.5) и/или PAMP (SEQ ID NO.3), также охватывает их фрагменты, в которых отсутствует по меньшей мере одна аминокислота, и указанные фрагменты имеют длину по меньшей мере 5 аминокислот, более предпочтительно, по меньшей мере 10 аминокислот, наиболее предпочтительно, по меньшей мере 15 аминокислот.
Один из вариантов осуществления настоящей заявки относится к способу по предыдущему варианту осуществления, в котором уровень фрагментов пре-проадреномедуллина (по меньшей мере, из 5 аминокислот) определяют с использованием связывающего вещества для указанных фрагментов (по меньшей мере, из 5 аминокислот).
Другой вариант осуществления настоящей заявки относится к способу по предыдущему варианту осуществления, в котором связывающее вещество выбирают из группы, включающей антитело, фрагмент антитела или не-Ig-каркас, связывающийся с фрагментами пре-проадреномедуллина, или фрагменты указанного (по меньшей мере, из 5 аминокислот).
Биологическая жидкость в соответствии с настоящей заявкой представляет собой образец крови. Образец крови может быть выбран из группы, включающей цельную кровь, сыворотку и плазму. В одном из вариантов осуществления настоящей заявки указанный образец выбирают из группы, включающей цитратную плазму, гепаринизированную плазму и обработанную EDTA плазму человека.
1
2
3
4
2
Антитело по настоящему изобретению представляет собой белок, содержащий один или более полипептидов, по существу, кодируемых генами иммуноглобулина, которые специфически связывают антиген. Распознанные гены иммуноглобулина включают также гены константной области каппа, лямбда, альфа (IgA), гамма (IgG, IgG, IgG, IgG), дельта (IgD), эпсилон (IgE) и мю (IgM), а также множество генов вариабельной области иммуноглобулина. Полноразмерные легкие цепи иммуноглобулина обычно имеют длину около 25 кДа или 214 аминокислот. Полноразмерные тяжелые цепи иммуноглобулина обычно имеют длину около 50 кДа или 446 аминокислот. Легкие цепи кодируются геном вариабельной области на NH-конце (длиной около 110 аминокислот) и геном константной области каппа или лямбда на COOH-конце. Тяжелые цепи аналогичным образом кодируются геном вариабельной области (длиной около 116 аминокислот) и одним из других генов константной области.
2
Lanzavecchia и соавт. 1987. Eur. J. Immunol. 17: 105; Huston и соавт. 1988. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879-5883; Bird и и соавт. 1988. Science 242: 423-426; Hood и др. 1984 Immunology, Benjamin, NY, 2nd ed.; Hunkapiller and Hood 1986. Nature 323: 15-16)
Sequences of Proteins of Immunological Interest, E. Kabat и соавт., U.S. Department of Health and Human Services, 1983
Основной структурной единицей антитела обычно является тетрамер, который состоит из двух идентичных пар цепей иммуноглобулина, каждая из которых имеет одну легкую и одну тяжелую цепь. В каждой паре вариабельные области легкой и тяжелой цепи связываются с антигеном, а константные области обеспечивают эффекторные функции. Иммуноглобулины также существуют во множестве других форм, включая, например, Fv, Fab и (Fab'), а также бифункциональные гибридные антитела и единичные цепи (например, . Вариабельная область легкой или тяжелой цепи иммуноглобулина включает каркасную область, прерываемую тремя гипервариабельными областями, также называемыми областями, определяющими комплементарность (CDR) (см. ). Как отмечено выше, CDR в первую очередь ответственны за связывание с эпитопом антигена. Иммунный комплекс представляет собой антитело, такое как моноклональное антитело, химерное антитело, гуманизированное антитело или антитело человека, или фрагмент функционального антитела, специфически связанный с антигеном.
и соавт.
и соавт.
и соавт.
Химерные антитела представляют собой антитела, чьи гены легкой и тяжелой цепей были сконструированы, как правило, посредством генетической инженерии, из генов вариабельной и константной областей иммуноглобулина, принадлежащих разным видам. Например, вариабельные сегменты генов из моноклонального антитела мыши могут быть присоединены к константным сегментам человека, таким как каппа и гамма 1 или гамма 3. В одном из примеров терапевтическое химерное антитело, таким образом, представляет собой гибридный белок, состоящий из вариабельного или антигенсвязывающего домена из антитела мыши и константного или эффекторного домена из антитела человека, хотя можно использовать другие виды млекопитающих или вариабельную область можно получить молекулярными методами. Способы получения химерных антител хорошо известны в данной области техники, например, см. патент США №5807715. «Гуманизированный» иммуноглобулин представляет собой иммуноглобулин, включающий каркасную область человека и одну или несколько CDR иммуноглобулина, не являющегося человеческим (такого как мышиный, крысиный или синтетический). Не являющийся человеческим иммуноглобулин, предоставляющий CDR, называют «донором», а иммуноглобулин человека, предоставляющий каркас, называют «акцептором». В одном из вариантов осуществления все CDR в гуманизированном иммуноглобулине взяты из донорского иммуноглобулина. Константные области не обязательно должны присутствовать, но если они есть, они должны являться, по существу, идентичными константным областям человеческого иммуноглобулина, то есть должны быть идентичными,по меньшей мере, на около 85-90%, например, около 95% или более. Следовательно, все части гуманизированного иммуноглобулина, за исключением, возможно, CDR, являются, по существу, идентичными соответствующим частям последовательностей естественного иммуноглобулина человека. «Гуманизированное антитело» представляет собой антитело, содержащее гуманизированную легкую цепь и гуманизированный иммуноглобулин тяжелой цепи. Гуманизированное антитело связывается с тем же антигеном, что и донорное антитело, которое предоставляет CDR. Акцепторный каркас гуманизированного иммуноглобулина или антитела может иметь ограниченное количество аминокислотных замен, взятых из донорного каркаса. Гуманизированные или другие моноклональные антитела могут иметь дополнительные консервативные аминокислотные замены, которые, по существу, не влияют на связывание антигена или другие функции иммуноглобулина. Примерами консервативных замен являются такие, как gly, ala; val, ile, leu; asp, glu; asn, gln; ser, thr; lys, arg; и phe, tyr. Гуманизированные иммуноглобулины могут быть созданы с помощью генной инженерии (например, см. патент США №5580089). Антитело человека представляет собой антитело, в котором гены легкой и тяжелой цепи имеют человеческое происхождение. Человеческие антитела могут быть получены с применением способов, известных в данной области техники. Человеческие антитела могут быть получены путем иммортализации человеческой В-клетки, секретирующей интересующее антитело. Иммортализация может быть достигнута, например, с помощью инфекции EBV или путем слияния человеческой В-клетки с клеткой миеломы или гибридомы для получения клетки триомы. Человеческие антитела также могут быть получены методами фагового дисплея (см., например, Dower , публикация PCT WO91/17271; McCafferty , публикация PCT №WO92/001047; и Winter, публикация PCT WO92/20791), или выбраны из комбинаторной библиотеки моноклональных антител человека (см. веб-сайт Morphosys). Антитела человека также могут быть получены с использованием трансгенных животных, несущих ген человеческого иммуноглобулина (например, см. Lonberg , публикация PCT WO93/12227; и Kucherlapati, публикация PCT WO91/10741).
,
,
2

Таким образом, антитело может иметь форматы, известные в данной области техники. Примерами являются человеческие антитела, моноклональные антитела, гуманизированные антитела, химерные антитела, CDR-привитые антитела. В предпочтительном варианте осуществления изобретения антитела по настоящему изобретению представляют собой рекомбинантно продуцируемые антитела, такие как, например,IgG, типичный полноразмерный иммуноглобулин, или фрагменты антител, содержащие по меньшей мере F-вариабельный домен тяжелой и/или легкой цепи, как, например,химически соединенные антитела (фрагменты, связывающие антиген), включая, но не ограничиваясь указанным, Fab-фрагменты, включая Fab-миниантитела, одноцепочечные Fab-антитела, моновалентные Fab-антитела с эпитопными метками, например, Fab-V5Sx2; двухвалентный Fab (мини-антитело), димеризованный с доменом СН3; двухвалентный Fab или поливалентный Fab, напримеробразованный путем мультимеризации с помощью гетерологичного домена, например,посредством димеризации доменов dHLX, например,Fab-dHLX-FSx2; F(ab’)-фрагменты, scFv-фрагменты, мультимеризованные многовалентные и/или мультиспецифичные scFv-фрагменты, двухвалентные и/или биспецифические диатела, BITE(биспецифический активатор T-клеток), трифункциональные антитела, поливалентные антитела, напримериз класса, отличного от G; однодоменные антитела, например, нанотела, полученные из верблюжьих или рыбьих иммуноглобулинов и многие другие.
В дополнение к антителам в данной области техники хорошо известны другие биополимерные каркасы для создания комплекса молекулы-мишени, которые использовались для получения специфичных для мишени биополимеров. Примерами являются аптамеры, шпигельмеры, антикалины и конотоксины.
2
В предпочтительном варианте осуществления формат антитела выбран из группы, включающей фрагмент Fv, фрагмент scFv, фрагмент Fab, фрагмент scFab, фрагмент (Fab) и слитый белок scFv-Fc. В другом предпочтительном варианте осуществления формат антитела выбран из группы, включающей фрагмент scFab, фрагмент Fab, фрагмент scFv и их конъюгаты, оптимизированные по биодоступности, такие как пегилированные фрагменты. Одним из наиболее предпочтительных форматов является формат scFab.
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
Не-Ig каркасы могут являться белковыми каркасами и могут использоваться в качестве имитаторов антител, поскольку они способны связываться с лигандами или антигенами. Не-Ig каркасы могут быть выбраны из группы, включающей не-Ig каркасы на основе тетранектина (напримерописанные в US 2010/0028995), каркасы из фибронектина (напримерописанные в ЕР 1266025; каркасы на основе липокалина (например описанные в WO 2011/154420); убиквитиновые каркасы (например описанные в WO 2011/073214), переносящие каркасы (напримерописанные в US 2004/0023334), каркасы с белком А (например,описанные в ЕР 2231860), каркасы на основе анкиринового повтора (напримерописанные в WO 2010/060748), каркасы на основе микробелков, предпочтительно, микробелков, образующих цистиновый узел) (напримерописанные в ЕР 2314308), каркасы на основе домена Fyn SH3 (напримерописанные в WO 2011/023685), каркасы на основе домена EGFR-A (напримерописанные в WO 2005/040229) и каркасы на основе доменов Куница (например описанные в ЕР 1941867).
Один из вариантов осуществления настоящей заявки относится к способу по предыдущему варианту осуществления, в котором связывающее вещество для лечения субъекта представляет собой антитело против ADM, или фрагмент антитела против адреномедуллина, или не-Ig белковый каркас против ADM, при этом указанное антитело, или его фрагмент, или каркас связывается с N-концевой частью, аминокислоты 1-21, адреномедуллина:
YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC; SEQ ID NO.19
Другой вариант осуществления настоящей заявки относится к способу по предыдущему варианту осуществления, в котором связывающее вещество для лечения субъекта представляет собой антитело против ADM, или фрагмент антитела против адреномедуллина, или не-Ig белковый каркас против ADM, при этом указанное антитело, или его фрагмент, или каркас связывается с С-концевой частью, аминокислоты 42-52-амид, адреномедуллина:
2
APRSKISPQGY-NH; SEQ ID NO.20
Другой вариант осуществления настоящей заявки относится к способу по предыдущему варианту осуществления, в котором связывающее вещество для лечения субъекта представляет собой антитело против ADM, или фрагмент антитела против адреномедуллина, или не-Ig белковый каркас против ADM, при этом указанный каркас антитела или фрагмента связывается со среднерегиональной частью, аминокислоты 21-42, адреномедуллина:
CTVQKLAHQIYQFTDKDKDNVA; SEQ ID NO.21
Другой вариант осуществления настоящей заявки относится к способу в соответствии с предшествующими вариантами осуществления, в котором определение уровня указанных фрагментов выполняют по меньшей мере один раз.
Другой вариант осуществления настоящей заявки относится к способу в соответствии с предшествующими вариантами осуществления, в котором определение уровня указанных фрагментов выполняют, по меньшей мере, один раз после начала лечения антителом против ADM, или фрагментом антитела против адреномедуллина, или не-Ig белковым каркасом против ADM.
Другой вариант осуществления настоящей заявки относится к способу в соответствии с предшествующими вариантами осуществления, в котором определение уровня указанных фрагментов выполняют более одного раза у одного пациента после начала лечения антителом против ADM, или фрагментом антитела против адреномедуллина, или не-Ig белковым каркасом против ADM.
Другой вариант осуществления настоящей заявки относится к способу в соответствии с предшествующими вариантами осуществления, в котором определение уровня указанных фрагментов выполняется более двух раз у одного пациента после начала лечения антителом против ADM, или фрагментом антитела против адреномедуллина, или не-Ig белковым каркасом против ADM.
Другой вариант осуществления настоящей заявки относится к способу в соответствии с предыдущими вариантами осуществления, в котором определение уровня указанных фрагментов проводят более трех раз после начала лечения антителом против ADM, или фрагментом антитела против адреномедуллина, или не-Ig белковым каркасом против ADM.
Другой вариант осуществления настоящей заявки относится к способу в соответствии с предшествующими вариантами осуществления, в котором неблагоприятный исход выбран из группы, включающей ухудшение клинического состояния, такое как ухудшение функции органов, и смертности.
Термин «ухудшение клинического состояния», используемый в настоящем описании, относится к ухудшению симптомов (например, изменению клинических параметров, определяющих прогрессирование заболевания), необходимости госпитализации, или смерти и может быть оценен по медицинскому показателю (например, система оценки острых функциональных и хронических изменений состояния здоровья (APACHE, APACHE II)).
Термин «ухудшение функции органов» в соответствии с настоящим изобретением включает ухудшение функции почек (WRF), ухудшение сердечно-сосудистой функции, ухудшение функции печени и ухудшение дыхательной функции, и ухудшение может быть оценено по динамической оценке органной недостаточности (SOFA), оценке полиорганной дисфункции (MODS) или упрощенной оценке острых физиологических изменений (SAPS, SAPS II).
Другой вариант осуществления настоящей заявки относится к способу в соответствии с предшествующими вариантами осуществления, в котором указанный субъект страдает сепсисом или септическим шоком.
Ниже будут определены клинические критерии синдрома системной воспалительной реакции (SIRS), сепсиса и септического шока:
1) Синдром системной воспалительной реакции (SIRS), характеризующийся как минимум двумя из следующих симптомов:
- у пациентов наблюдается гипотония (среднее артериальное давление <65 мм рт.ст.)
- повышенный уровень лактата в сыворотке, составляющий >4 ммоль/л
- уровень глюкозы в крови >7,7 ммоль/л (при отсутствии диабета)
- центральное венозное давление не в пределах 8-12 мм рт. ст.
-1
-1
- выход мочи <0,5 мл×кг×ч
- центральное венозное (верхняя полая вена) насыщение кислородом <70%, или смешанное венозное <65%
- частота сердечных сокращений >90 уд/мин
- температура <36°C или >38°C
- частота дыхания >20/мин
9/
- количество белых клеток крови <4 или >12×10л (лейкоциты); >10% юных нейтрофилов.
2) Сепсис
- наличие по меньшей мере двух симптомов, упомянутых в пункте 1), и, кроме того, клиническое подозрение на новую инфекцию:
- у пациентов наблюдается гипотония (среднее артериальное давление <65 мм рт.ст.)
- повышенный уровень лактата в сыворотке, составляющий >4 ммоль/л
- уровень глюкозы в крови >7,7 ммоль/л (при отсутствии диабета)
- центральное венозное давление не в пределах 8-12 мм рт.ст.
-1
-1
- выход мочи <0,5 мл×кг×ч
- центральное венозное (верхняя полая вена) насыщение кислородом <70%, или смешанное венозное <65%
- частота сердечных сокращений >90 уд/мин
- температура <36°C или >38°C
- частота дыхания >20/мин
9/
- количество белых клеток крови <4 или >12×10л (лейкоциты); >10% юных нейтрофилов,
и дополнительно клиническое подозрение на новую инфекцию:
- кашель/мокрота/боль в груди
- боль в животе/вздутие живота/диарея
- инфицирование через центральный катетер
- эндокардит
- дизурия
- головная боль с ригидностью шеи
- целлюлит/рана/инфекция суставов
- положительные микробиологические анализы на любую инфекцию.
3) Тяжелый сепсис
При условии, что сепсис проявляется у пациента и, кроме того, имеется клиническое подозрение на дисфункцию органа, а именно:
- систолическое артериальное давление <90/среднее; <65 мм рт.ст.
- лактат >2 ммоль/л
- билирубин >34 мкмоль/л
- выход мочи <0,5 мл/кг/час в течение 2 часов
- креатинин >177 мкмоль/л
9/
- тромбоциты <100×10л
2
- SpO>90%, если не давать O.
4) Септический шок
Проявляется по меньшей мере один признак дисфункции органа-мишени, в соответствии с упомянутым в 3). Септический шок определяют при наличии рефрактерной гипотензии, которая не поддается лечению, и когда одного лишь внутривенного введения жидкости недостаточно для поддержания артериального давления у пациента на уровне, не допускающем гипотонию.
Singer и соавт. 2016. JAMA 315 (8): 801-810)
Совсем недавно определения сепсиса и септического шока были пересмотрены и обновлены целевой группой по определению сепсиса (, которая включена в настоящее описание посредством ссылки. Сепсис определяют как опасную для жизни дисфункцию органов, вызванную неуправляемой реакцией хозяина на инфекцию, когда реакция организма на инфекцию повреждает его собственные ткани и органы. Дисфункция органа может быть идентифицирована как острое изменение общего балла SOFA≥2 балла в результате инфекции. Исходный балл SOFA можно предположить равным нулю у пациентов, у которых ранее не было выявленной дисфункции органов. Оценка SOFA≥2 отражает общий риск смертности, составляющий приблизительно 10% среди населения в целом с подозрением на инфекцию. Даже у пациентов с умеренной дисфункцией может наблюдаться дальнейшее ухудшение, что подчеркивает серьезность этого состояния и необходимость быстрого и целесообразного вмешательства, если оно еще не начато.
Септический шок представляет собой разновидность сепсиса, при котором лежащие в основе нарушения кровообращения и клеточные/метаболические нарушения являются достаточно глубокими для того, чтобы значительно повысить смертность. Пациенты с септическим шоком могут быть идентифицированы по клинической конструкции сепсиса с персистирующей гипотензией, требующей вазопрессоров для поддержания MAP ≥65 мм рт.ст. и имеющих уровень лактата >2 ммоль/л (18 мг/дл), несмотря на адекватное восполнение ОЦК.
Таблица 1:
Последовательная (связанная с сепсисом) шкала оценки недостаточности органов
Система/Балл
0
1
2
3
4
Респирация
PaO<sub>2</sub>/FiO<sub>2,</sub> мм рт.ст. (кПа)
≥400 (53,3)
<400 (53,3)
<300 (40)
<200 (26,7) с вспомогательной ИВЛ
<100 (13,3) с вспомогательной ИВЛ
Коагуляция
Тромбоциты, ×10<sup>3</sup>/мкл
≥150
<150
<100
<50
<20
Печень
Билирубин, мг/дл (мкмоль/л)
<1,2 (20)
1,2-1,9 (20-32)
2,0-5,9 (33-101)
6,0-11,9 (102-204)
>12,0 (204)
Сердечно-сосудистые параметры
MAP≥ 70 мм рт.ст.
MAP< 70 мм рт.ст.
Допамин<5 или добутамин (любая доза)<sup>b</sup>
Допамин 5,1-14, или эпинефрин≤0,1, или норэпинефрин≤0,1<sup> b</sup>
Допамин>15, или эпинефрин>0,1, или норэпинефрин>0,1<sup> b</sup>
Центральная нервная система
Балл по шкале комы Глазго<sup>c</sup>
15
13-14
10-12
6-9
<6
Почечные параметры
Креатин, мг/дл (мкмоль/л)
<1,2 (110)
1,2-1,9 (110-170)
2,0-3,4 (171-299)
3,5-4,9 (300-440)
>5,0 (440)
Выход мочи, мл/день
<500
<200
2
2
Сокращения: FIO, доля кислорода во вдыхаемом воздухе; MAP, среднее артериальное давление; PaO, парциальное давление кислорода.
a
27
адаптировано из Vincent и соавт.
b
доза катехоламинов приведена в качестве мкг/кг/мин в течение по меньшей мере 1 часа.
c
балл по шкале комы Глазго находится в диапазоне от 3 до 15; чем выше оценка, тем лучше неврологическая функция.
Knaus и соавт. 1985. Crit Care Med 13 (10): 818-29)
APACHE II («система оценки острых функциональных и хронических изменений состояния здоровья II») представляет собой систему классификации тяжести заболевания (, одну из нескольких для отделения интенсивной терапии. Ее применяют в течение 24 часов после поступления пациента в отделение интенсивной терапии: целое число от 0 до 71 вычисляют на основе нескольких измерений; более высокие оценки соответствуют более тяжелым заболеваниям и более высокому риску смерти.
Le Gall и соавт. 1993. JAMA 270: 2957-2963)
SAPS II представляет собой систему классификации тяжести заболевания (. Ее название расшифровывается как «упрощенная оценка острых физиологических изменений», она является одной из нескольких систем оценки в отделениях интенсивной терапии (ICU) и была разработана для измерения тяжести заболевания у пациентов, поступивших в ICU.
Другой вариант осуществления настоящей заявки относится к способу в соответствии с предшествующими вариантами осуществления, в котором указанные терапевтические меры выбраны из группы, включающей жидкостную реанимацию, вазопрессоры/инотропы, заместительную почечную терапию, антибиотики, гидрокортизон, инсулин, энтеральное питание/парентеральное питание.
Другой вариант осуществления настоящей заявки относится к способу в соответствии с предшествующими вариантами осуществления, в котором указанное антитело против ADM, или фрагмент антитела, или не-Ig каркас не связывается с фрагментом пре-про-адреномедуллина, выбранным из группы, включающей MR-proADM, CT-proADM и/или PAMP.
Другой вариант осуществления настоящей заявки относится к способу в соответствии с предшествующими вариантами осуществления, в котором указанный фрагмент пре-про-адреномедуллина, выбранный из группы, включающей MR-pro ADM, CT-proADM и/или PAMP, имеет длину по меньшей мере 5 аминокислот, соответственно.
Другой вариант осуществления настоящей заявки относится к способу в соответствии с предыдущими вариантами осуществления, в котором уровень указанного фрагмента пре-про-адреномедуллина, выбранного из группы, включающей MR-proADM, CT-proADM и/или PAMP или их фрагменты длиной, по меньшей мере, 5 аминокислот, определяют с помощью иммуноанализа с использованием по меньшей мере одного связывающего вещества, выбранного из группы, включающей связывающее вещество для MR-proADM или его фрагмента и/или для CT-proADM или его фрагмента и/или для PAMP или его фрагмента, соответственно.
В конкретном варианте осуществления настоящей заявки иммуноанализ применяют для определения уровня MR-proADM и/или его фрагментов (имеющих по меньшей мере 5 аминокислот), при этом такой иммуноанализ представляет собой сэндвич-анализ, предпочтительно, полностью автоматизированный анализ.
В конкретном варианте осуществления настоящий заявки иммуноанализ применяют для определения уровня CT-proADM и/или его фрагментов (имеющих по меньшей мере 5 аминокислот), при этом такой иммуноанализ представляет собой сэндвич-анализ, предпочтительно, полностью автоматизированный анализ.
В конкретном варианте осуществления настоящий заявки иммуноанализ применяют для определения уровня PAMP и/или его фрагментов (имеющих по меньшей мере 5 аминокислот), при этом такой иммуноанализ представляет собой сэндвич-анализ, предпочтительно, полностью автоматизированный анализ.
В одном из вариантов осуществления заявки иммуноанализ, который применяют для определения уровня MR-proADM и/или CT-proADM и/или PAMP, соответственно, может представлять собой так называемый POC-тест (в месте лечения), который представляет собой технологию тестирования, позволяющую проводить тестирование менее чем за 1 час рядом с пациентом, и не требующую полностью автоматизированной системы анализа. Одним из примеров этой технологии является технология иммунохроматографического теста.
В одном из вариантов применения такой иммуноанализ представляет собой сэндвич-иммуноанализ с использованием технологии обнаружения любого типа, включая, но не ограничиваясь этим, ферментную метку, хемилюминесцентную метку, электрохемилюминесцентную метку, предпочтительно, полностью автоматизированный анализ.
В одном из вариантов осуществления изобретения такой иммуноанализ представляет собой сэндвич-анализ с ферментной меткой. Примеры автоматизированного или полностью автоматизированного анализа включают анализы, которые можно использовать для одной из следующих систем: Roche Elecsys, Abbott Architect, Siemens Centauer, Brahms Kryptor, BiomerieuxVidas, Alere Triage.
Разнообразные иммуноанализы известны и могут быть использованы для анализов и способов по настоящему изобретению, к ним относятся: радиоиммуноанализы («RIA»), гомогенные ферментативно усиленные иммуноанализы («EMIT»), твердофазные иммуноферментные анализы («ELISA»), иммуноанализ на основе реактивации апофермента («ARIS»), иммуноанализы с использованием тест-полосок (dipstick) и иммунохроматографические анализы.
В конкретном варианте осуществления изобретения, по меньшей мере, одно из указанных двух связывающих веществ помечено для обнаружения.
Предпочтительные способы обнаружения включают иммуноанализы в различных форматах, таких как, например, радиоиммуноанализ (RIA), хемилюминесцентный и флуоресцентный иммуноанализ, твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), наборы шариков на основе Luminex, белковые микрочипы и форматы быстрого теста, такие как, например, тесты с использованием иммунохроматографических полосок.
В предпочтительном варианте осуществления указанная метка выбрана из группы, включающей хемилюминесцентную метку, ферментную метку, флуоресцентную метку, метку, представляющую собой радиоактивный йод.
The Immunoassay Handbook, Ed. David Wild, Elsevier LTD, Oxford; 3rd ed. (May 2005), ISBN-13: 978-0080445267; Hultschig C и соавт., Curr Opin Chem Biol. 2006 Feb;10(1):4-10. PMID: 16376134)
Анализы могут представлять собой гомогенные или гетерогенные анализы, конкурентные и неконкурентные анализы. В одном из вариантов осуществления изобретения анализ проводят в формате сэндвич-анализа, который представляет собой неконкурентный иммуноанализ, в котором подлежащая обнаружению и/или количественной оценке молекула связывается с первым антителом и вторым антителом. Первое антитело может быть связано с твердой фазой, например, гранулой, поверхностью лунки или другого контейнера, чипа или полоски, а второе антитело представляет собой антитело, которое метят, например, красителем, радиоизотопом или реакционноспособным или обладающим каталитической активностью фрагментом. Затем с помощью подходящего способа измеряют количество меченого антитела, связанного с анализируемым веществом. Обычные композиции и процедуры, применяемые в таких «сэндвич-анализах», хорошо разработаны и известны специалисту в данной области техники (.
В другом варианте осуществления изобретения в анализе используют две захватывающие молекулы, предпочтительно антитела, которые обе присутствуют в виде дисперсий в жидкой реакционной смеси, где первый служащий для мечения компонент присоединен к первой захватывающей молекуле, при этом указанный первый служащий для мечения компонент представляет собой часть системы мечения на основе гашения или амплификации флуоресценции или люминесценции, а второй служащий для мечения компонент указанной маркерной системы присоединен ко второй захватывающей молекуле, благодаря чему при связывании обеих захватывающих молекул с анализируемым веществом генерируется измеряемый сигнал, который позволяет обнаруживать образовавшиеся сэндвич-комплексы в растворе, содержащем образец.
В другом варианте осуществления изобретения указанная система мечения содержит криптаты редкоземельного металла или хелаты редкоземельного металла в комбинации с флуоресцентным красителем или хемилюминесцентным красителем, в частности, красителем цианинового типа.
В контексте настоящего изобретения анализ на основе флуоресценции включает применение красителей, которые можно выбирать, например, из группы, включающей FAM (5- или 6-карбоксифлуоресцеин), VIC, NED, флуоресцеин, флуоресцеинизотиоцианат (ФИТЦ), IRD-700/800, цианиновые красители, такие как CY3, CY5, CY3.5, CY5.5, Су7, ксантен 6-карбокси-2'4'7'4'7'-гексахлорфлуоресцеин (HEX), ТЕТ, 6-карбокси-4',5'-дихлор-2',7'-диметодифлуоресцеин (JOE), N,N,N',N'-тетраметил-6-карбоксиродамин (TAMRA), 6-карбокси-Х-родамин (ROX), 5-карбоксиродамин-60 (R6G5), 6-карбоксиродамин-6G (RG6), родамин, родамин зеленый, родамин красный, родамин 110, красители BODIPY, такие как BODIPY TMR, Oregon Green, кумарины, такие как умбеллиферон, бензимиды, такие как Hoechst 33258; фенантридины, такие как Texas Red, Yakima Yellow, Alexa Fluor, PET, этидийбромид, акридиниевые красители, карбазольные красители, феноксазиновые красители, порфириновые красители, полиметиновые красители и т.п.
Kirk-Othmer, Encyclopedia of chemical technology, 4th ed., executive editor, J. I. Kroschwitz; editor, M. Howe-Grant, John Wiley & Sons, 1993, vol.15, p. 518-562,
551-562)
В контексте настоящего изобретения анализы на основе хемилюминесценции включают применение красителей, основанных на физических принципах, описанных для хемилюминесцентных материалов в работе (включенной в настоящее описание посредством ссылки, включая цитаты на страницах. Предпочтительными хемилюминесцентными красителями являются сложные эфиры акридиния.
8
-1
Как указано в настоящем описании, «анализ» или «диагностический анализ» может представлять собой анализ любого типа, который можно применять в области диагностики. Такой анализ может быть основан на связывании подлежащего обнаружению анализируемого вещества с одним или несколькими захватывающими зондами, обладающими определенной аффинностью. С точки зрения взаимодействия между захватывающими молекулами и молекулами-мишенями или представляющими интерес молекулами константа аффинности предпочтительно должна превышать 10М.
В контексте настоящего изобретения «связывающие молекулы» представляют собой молекулы, которые можно применять для связывания с молекулами-мишенями или представляющими интерес молекулами, т.е. анализируемыми веществами, присутствующими в образце. Таким образом, связывающие молекулы должны иметь адекватную форму, как с пространственной точки зрения, так и с позиций характеристик поверхности, таких как поверхностный заряд, гидрофобность, гидрофильность, наличие или отсутствие доноров и/или акцепторов Льюиса, для того, чтобы специфически связываться с молекулами-мишенями или представляющими интерес молекулами. При этом связывание может опосредоваться, например, ионными, ван-дер-Ваальсовыми, pi-pi, sigma-pi, гидрофобными взаимодействиями или водородными связями, или комбинацией двух или более указанных выше взаимодействий между захватывающими молекулами и молекулами-мишенями или представляющими интерес молекулами. В контексте настоящего изобретения связывающие молекулы можно выбирать, например, из группы, включающей молекулу нуклеиновой кислоты, молекулу углевода, молекулу ПНК, белок, антитело, пептид или гликопротеин. Предпочтительно, связывающие молекулы представляют собой антитела, включая их фрагменты, обладающие достаточной аффинностью в отношении мишени или представляющей интерес молекулы, и включая рекомбинантные антитела или фрагменты рекомбинантных антител, а также химически и/или биохимически модифицированные производные указанных антител или фрагментов, выведенных из вариабельной цепи, которые имеют длину по меньшей мере 12 аминокислот.
Хемилюминесцентная метка может представлять собой метку, являющуюся сложным эфиром акридиния, стероидные метки, включая изолюминольные метки и т.п.
Ферментные метки могут представлять собой лактатдегидрогеназу (LDH), креатинкиназу (CPK), щелочную фосфатазу, аспартатаминотрансферазу (AST), аланинаминотрансферазу (ALT), кислую фосфатазу, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу и так далее.
В конкретном варианте осуществления изобретения пороговое значение находится в пределах порогового диапазона для плазменного MR-proADM, которое составляет от 0,5 до 1,5 нмоль/л, предпочтительно, от 0,7 до 1 нмоль/л, наиболее предпочтительно, применяется пороговое значение 0,8 нмоль/л.
В конкретном варианте осуществления изобретения порог находится в пределах порогового диапазона для плазменной CT-proADM, который составляет от 85 до 350 пмоль/л, предпочтительно, от 100 до 250 пмоль/л, наиболее предпочтительно, применяется пороговое значение в 150 пмоль/л.
В конкретном варианте осуществления изобретения пороговое значение для PAMP-амида в плазме составляет от 0,3 до 1,2 пмоль/л, предпочтительно, от 0,4 до 1,0 пмоль/л, наиболее предпочтительно, применяется пороговое значение 0,8 пмоль/л.
В конкретном варианте осуществления изобретения применяется пороговое значение для PAMP-глицина в плазме, которое составляет от 0,5 до 2,0 пмоль/л, предпочтительно, от 0,7 до 1,8 пмоль/л, наиболее предпочтительно, применяется пороговое значение 1,5 пмоль/л.
Другой вариант осуществления настоящей заявки относится к способу в соответствии с предшествующими вариантами осуществления, в котором связывающее вещество выбирают из группы, включающей антитело, фрагмент антитела или не-Ig-каркас, связывающийся с MR-proADM или его фрагментом и/или с CT-proADM или его фрагментом и/или PAMP или его фрагментом, соответственно.
Другой вариант осуществления настоящей заявки относится к способу в соответствии с предшествующими вариантами осуществления, в котором указанное антитело против адреномедуллина (ADM) или фрагмент антитела против ADM, связывающиеся с адреномедуллином, или не-Ig белковый каркас против ADM, связывающийся с адреномедуллином, является моноспецифичным.
-7
Другой вариант осуществления настоящей заявки относится к способу в соответствии с предшествующими вариантами осуществления, в котором указанное антитело, или его фрагмент, или каркас демонстрируют аффинность связывания с ADM, составляющую, по меньшей мере, 10М.
-7
Другой вариант осуществления настоящей заявки относится к способу в соответствии с предшествующими вариантами осуществления, в котором указанное антитело против адреномедуллина (ADM), или фрагмент антитела против ADM, или не-Ig белковый каркас против ADM, связывающийся с адреномедуллином, демонстрирует аффинность связывания с ADM, составляющую по меньшей мере 10М, где указанную аффинность связывания определяют посредством поверхностного плазмонного резонанса без меток с использованием системы Biacore 2000.
Другой вариант осуществления настоящей заявки относится к способу в соответствии с предшествующими вариантами осуществления, в котором для корреляции повышенный уровень указанного фрагмента пре-про-адреномедуллина, выбранного из группы, включающей MR-proADM, CT-proADM и/или PAMP, или их фрагментов, превышающий определенный порог, является прогностическим фактором для повышенного риска неблагоприятного исхода, и/или уровень указанного фрагмента пре-про-адреномедуллина или его фрагментов ниже определенного порога является прогностическим фактором для сниженного риска неблагоприятного исхода.
Используемый в настоящем описании термин «повышенный уровень» означает уровень выше определенного порогового уровня.
Другой вариант осуществления настоящей заявки относится к способу в соответствии с предшествующими вариантами осуществления, в котором указанный порог представляет собой верхнюю концентрацию, определенную для здоровой контрольной популяции, такую как 90-й, 95-й или 99-й процентиль.
Другой вариант осуществления настоящей заявки относится к способу в соответствии с предшествующими вариантами осуществления, в котором для корреляции уровня фрагмента пре-про-адреномедуллина определение уровня выполняют, по меньшей мере, два раза, и при этом понижение второго измеренного уровня указанного фрагмента по сравнению с первым измеренным уровнем указанного фрагмента является прогностическим фактором для пониженного риска неблагоприятного исхода.
Другой вариант осуществления настоящей заявки относится к способу в соответствии с предшествующими вариантами осуществления, в котором для корреляции уровня фрагмента пре-про-адреномедуллина определение уровня выполняют, по меньшей мере, два раза, и при этом повышение второго измеренного уровня указанного фрагмента по сравнению с первым измеренным уровнем указанного фрагмента является прогностическим фактором для повышенного риска неблагоприятного исхода.
Используемый в настоящем описании термин «риск» относится к вероятности появления нежелательного события или эффекта (например, заболевания).
Другой вариант осуществления настоящей заявки относится к способу согласно предшествующим вариантам осуществления, в котором снижение уровня фрагмента пре-про-адреномедуллина, выбранного из группы, включающей MR-proADM, CT-proADM и/или PAMP, или их фрагментов, является прогностическим фактором пониженного риска неблагоприятного исхода.
Другой вариант осуществления настоящей заявки относится к способу согласно предшествующим вариантам осуществления, в котором повышение уровня фрагмента пре-про-адреномедуллина, выбранного из группы, включающей MR-proADM, CT-proADM и/или PAMP, или их фрагментов, является прогностическим фактором повышенного риска неблагоприятного исхода.
Другой вариант осуществления настоящей заявки относится к способу в соответствии с предшествующими вариантами осуществления, в котором указанное снижение характеризуется улучшением клинического/медицинского состояния пациента и/или уменьшением вдвое концентрации указанного фрагмента пре-про-адреномедуллина.
Другой вариант осуществления настоящей заявки относится к способу в соответствии с предшествующими вариантами осуществления, в котором указанное повышение характеризуется ухудшением клинического/медицинского состояния пациента и/или удвоением концентрации указанного фрагмента пре-про-адреномедуллина.
Другой вариант осуществления настоящей заявки относится к способу в соответствии с предшествующими вариантами осуществления, в котором анализ применяют для определения уровня MR-proADM, при этом чувствительность анализа для указанного анализа позволяет количественно определять MR-proADM у здоровых субъектов и составляет <0,5 нмоль/л, предпочтительно, <0,4 нмоль/л и, более предпочтительно, <0,2 нмоль/л.
Другой вариант осуществления настоящей заявки относится к способу в соответствии с предшествующими вариантами осуществления, в котором анализ применяют для определения уровня CT-proADM, при этом чувствительность анализа для указанного анализа позволяет количественно определять CT-proADM у здоровых субъектов и составляет <100 пмоль/л, предпочтительно, <75 пмоль/л и, более предпочтительно, <50 пмоль/л.
Другой вариант осуществления настоящей заявки относится к способу в соответствии с предшествующими вариантами осуществления, в котором анализ применяют для определения уровня PAMP-амида, при этом чувствительность анализа для указанного анализа позволяет количественно определять PAMP-амид у здоровых субъектов и составляет <0,3 пмоль/л, предпочтительно, <0,2 пмоль/л и, более предпочтительно, <0,1 пмоль/л.
Другой вариант осуществления настоящей заявки относится к способу в соответствии с предшествующими вариантами осуществления, в котором анализ применяют для определения уровня PAMP-глицина, при этом чувствительность анализа для указанного анализа позволяет количественно определять PAMP-глицин у здоровых субъектов и составляет <0,5 пмоль/л, предпочтительно, <0,25 пмоль/л и, более предпочтительно, <0,1 пмоль/л.
Другой вариант осуществления настоящей заявки относится к способу в соответствии с предшествующими вариантами осуществления, в котором анализ применяют для определения уровня MR-proADM и/или CT-proADM и/или PAMP, и при этом чувствительность анализа составляет <0,5 нмоль/л, предпочтительно, <0,4 нмоль/л и, более предпочтительно, <0,2 нмоль/л для MR-proADM и/или <100 пмоль/л, предпочтительно, <75 пмоль/л и, более предпочтительно, <50 пмоль/л для CT-proADM, и/или <0,3 пмоль/л, предпочтительно, <0,2 пмоль/л и, более предпочтительно, <0,1 пмоль/л для PAMP.
2
Уровни proADM или его фрагментов по настоящему изобретению были определены с помощью описанных анализов, как показано в примерах. Упомянутые выше пороговые значения могут отличаться в других анализах, если они были откалиброваны иначе, чем в аналитических системах, применяемых в настоящем изобретении. Следовательно, вышеупомянутые пороговые значения, указанные выше, должны применяться для таких иначе откалиброванных анализов в соответствии с учетом различий в калибровке. Одной из возможностей количественного определения разницы в калибровке является сравнительный анализ (корреляция) рассматриваемого способа анализа с соответствующим анализом биомаркеров, применяемым в настоящем изобретении, посредством измерения, соответствующего биомаркера (например, био-ADM) в образцах с применением обоих способов. Другая возможность состоит в определении с помощью исследуемого анализа, при условии что этот тест имеет достаточную аналитическую чувствительность, среднего уровня биомаркеров репрезентативной нормальной популяции, сравнении результатов со средними уровнями биомаркеров, описанными в литературе, и пересчете калибровки на основе полученной по этому сравнению разности. С помощью калибровки, использованной в настоящем изобретении, были измерены образцы от нормальных (здоровых) субъектов: медианный уровень био-ADM в плазме (зрелый ADM-NH) составлял 24,7 пг/мл, самое низкое значение составляло 11 пг/мл и 99-йпроцентиль составлял 43 пг/мл. Альтернативно, коммерчески доступные контрольные образцы могут быть использованы для настройки различных калибровок (например, ICI Diagnostics, Берлин, Германия).
(Smith и соавт. 2009. Clin Chem 55: 1593-1595)
Caruhel и соавт. 2009. Clin Biochem 42: 725-8)
Медианная концентрация MR-proADM в плазме у нормальных (здоровых) субъектов составляла 0,41 (межквартильный интервал 0,23-0,64) нмоль/л с применением автоматического флуоресцентного сэндвич-анализа для обнаружения MR-proADM, как описано в Caruhel и соавт. (.
Медианная концентрация CT-proADM в плазме у нормальных здоровых людей (n=200) составляла 77,6 пмоль/л (мин 46,6 пмоль/л, макс 136,2 пмоль/л), а 95%-ный процентиль составлял 113,8 пмоль/л (EP 2 111 552 B1).
Hashida и соавт. 2004. Clin Biochem 37: 14-21)
Концентрация PAMP-амида в плазме у нормальных здоровых людей (n=51) составляла 0,51±0,19 пмоль/л (среднее значение ± стандартное отклонение) (.
Hashida и соавт. 2004. Clin Biochem 37: 14-21)
Концентрация PAMP-глицина в плазме у нормальных здоровых людей (n=51) составляла 1,15±0,38 пмоль/л (среднее значение ± стандартное отклонение) (.
Другой вариант осуществления настоящей заявки относится к способу в соответствии с предшествующими вариантами осуществления, в котором указанная биологическая жидкость может быть выбрана из группы, включающей кровь, сыворотку, плазму, мочу, спинномозговую жидкость (CSF) и слюну.
3-
2
2
Другой вариант осуществления настоящей заявки относится к способу в соответствии с предшествующими вариантами осуществления, в котором дополнительно определяют, по меньшей мере, один клинический параметр и дополнительно учитывают в корреляциях параметры, выбранные из группы, включающей возраст, пол, оценку SOFA (или ее подклассы), оценку SAPSII, BUN, натрий, калий, креатинин, билирубин, количество тромбоцитов, артериальный pH, гематокрит, лейкоцит, HCO, инвазивная механическая вентиляция/неинвазивная механическая вентиляция легких, гемодинамические характеристики (включая артериальное давление, систолическое и диастолическое, среднее артериальное давление, центральное венозное давление, частота сердечных сокращений), баланс жидкости, выделение мочи, избыток оснований, хлорид, CRP, PCT, BNP или NT-proBNP, тропонин T или тропонин I, про-энкефалин, гемоглобин, глюкоза, лактат, INR, щелочная фосфатаза, AST, ALT, Gamma GT, общий белок, альбумин, температура, частота дыхания, PaOи FiO, терапевтические меры (жидкостная реанимация, вазопрессоры/инотропы, заместительная почечная терапия, антибиотики, гидрокортизон, инсулин, энтеральное питание/парентеральное питание, сопутствующие заболевания, хронические лекарства.
Другой вариант осуществления настоящей заявки относится к способу в соответствии с предшествующими вариантами осуществления для отнесения указанных субъектов к группам риска.
Другой вариант осуществления настоящей заявки относится к способу согласно предшествующим вариантам осуществления, в котором указанного субъекта относят к группе пациентов, при этом одна группа включает пациентов, нуждающихся в терапии, а другая группа включает пациентов, которые не нуждаются в терапии.
Дополнительные варианты осуществления в пределах объема настоящего изобретения изложены ниже:
1. Способ мониторинга терапии у субъекта, при этом субъект проходит лечение связывающим веществом, выбранным из группы, включающей антитело против адреномедуллина (ADM), фрагмент антитела и/или не-Ig каркас, связывающийся с SEQ ID NO.1 (аминокислота 1-52), включающий:
- определение уровня фрагмента пре-про-адреномедуллина, выбранного из группы, включающей среднерегиональный проадреномедуллин (MR-proADM), C-концевой проадреномедуллин (CT-proADM) и/или пептид из 20 N-концевых аминокислот проадреномедуллина (PAMP), или фрагменты указанного, в биологической жидкости, полученной от указанного субъекта; и
- соотнесение указанного уровня фрагмента пре-про-адреномедуллина, выбранного из группы, включающей MR-proADM, CT-proADM и/или PAMP, с клиническим/медицинским состоянием субъекта и/или риском неблагоприятного исхода, и/или необходимостью регулирования терапевтических мер, и
- при этом для определения уровня указанных фрагментов по меньшей мере одно связывающее вещество связывается с областью внутри аминокислотной последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO.3, SEQ ID NO.4 и SEQ ID NO.5, соответственно.
2. Способ в соответствии с вариантом осуществления 1, в котором связывающее вещество для лечения представляет собой антитело против ADM или фрагмент антитела против адреномедуллина, или каркасный фрагмент не-Ig белка против ADM, при этом указанное антитело, или фрагмент, или каркас связывается с N-концевой частью, аминокислоты 1-21, адреномедуллина:
YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC; SEQ ID NO.19
3. Способ в соответствии с вариантом осуществления 1-2, в котором связывающее вещество для лечения представляет собой антитело против ADM, или фрагмент антитела против адреномедуллина, или не-Ig белковый каркас против ADM, при этом указанное антитело, или его фрагмент, или каркас связывается с С-концевой частью, аминокислоты 42-52-амид, адреномедуллина:
2
APRSKISPQGY-NH; SEQ ID NO.20
4. Способ в соответствии с вариантом осуществления 1-3, в котором связывающее вещество для лечения представляет собой антитело против ADM, или фрагмент антитела против адреномедуллина, или не-Ig белковый каркас против ADM, при этом указанный каркас антитела или фрагмента связывается со среднерегиональной частью, аминокислоты 21-42, адреномедуллина:
CTVQKLAHQIYQFTDKDKDNVA; SEQ ID NO.21
5. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, в котором определение уровня указанных фрагментов выполняют, по меньшей мере, один раз.
6. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, в котором неблагоприятный исход выбирают из группы, включающей ухудшение клинического состояния, такое как ухудшение функции органов и смертность.
7. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, в котором ухудшение клинического состояния относится к ухудшению симптомов (например, изменению клинических параметров, определяющих прогрессирование заболевания), необходимости госпитализации, или смерти, и может быть оценен по медицинскому показателю (например, система оценки острых функциональных и хронических изменений состояния здоровья (APACHE, APACHE II)).
8. Способ в соответствии с вариантами осуществления 1-6, в котором ухудшение функции органа включает ухудшение функции почек (WRF), ухудшение сердечно-сосудистой функции, ухудшение функции печени и ухудшение дыхательной функции, и может быть оценено по динамической оценке органной недостаточности (SOFA), оценке полиорганной дисфункции (MODS) или упрощенной оценке острых физиологических изменений (SAPS, SAPS II).
9. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, в котором указанный субъект страдает заболеванием или состоянием, например, хроническим или острым заболеванием, или острым состоянием.
10. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, в котором заболевание, которым страдает субъект, может быть выбрано из группы, включающей тяжелые инфекции, такие как, например, менингит, синдром системного воспалительного ответа (SIRS), сепсис; другие заболевания, такие как диабет, рак, острые и хронические сосудистые заболевания, такие как сердечная недостаточность, инфаркт миокарда, инсульт, атеросклероз; шок, например, септический шок и дисфункция органов, например, дисфункция почек, дисфункция печени, ожоги, хирургическое вмешательство, травмы.
11. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, в котором указанные терапевтические меры выбраны из группы, включающей жидкостную реанимацию, вазопрессоры/инотропы, заместительную почечную терапию, антибиотики, гидрокортизон, инсулин, энтеральное питание/парентеральное питание.
12. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, в котором уровень указанного фрагмента пре-про-адреномедуллина, выбранного из группы, включающей MR-proADM, CT-proADM и/или PAMP или их фрагменты длиной, по меньшей мере, 5 аминокислот, определяют с помощью иммуноанализа с использованием по меньшей мере одного связывающего вещества, выбранного из группы, включающей связывающее вещество для MR-proADM или его фрагмента и/или для CT-proADM или его фрагмента и/или для PAMP или его фрагмента, соответственно.
13. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, в котором для корреляции повышенный уровень указанного фрагмента пре-про-адреномедуллина, выбранного из группы, включающей MR-proADM, CT-proADM и/или PAMP, или их фрагментов, превышающий определенный порог, является прогностическим фактором для повышенного риска неблагоприятного исхода, и/или уровень указанного фрагмента пре-про-адреномедуллина или его фрагментов ниже определенного порога является прогностическим фактором для сниженного риска неблагоприятного исхода.
14. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, в котором указанный порог представляет собой верхнюю концентрацию, определенную для здоровой контрольной популяции, такой как 90-й, 95-й или 99-й процентиль.
15. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, в котором для корреляции уровня фрагмента пре-про-адреномедуллина определение уровня выполняют, по меньшей мере, два раза, и при этом понижение второго измеренного уровня указанного фрагмента по сравнению с первым измеренным уровнем указанного фрагмента является прогностическим фактором для пониженного риска неблагоприятного исхода.
16. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, в котором для корреляции уровня фрагмента пре-про-адреномедуллина определение уровня выполняют, по меньшей мере, два раза, и при этом повышение второго измеренного уровня указанного фрагмента по сравнению с первым измеренным уровнем указанного фрагмента является прогностическим фактором для повышенного риска неблагоприятного исхода.
17. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, в котором анализ применяют для определения уровня MR-proADM и/или CT-proADM и/или PAMP, и при этом чувствительность анализа составляет <0,5 нмоль/л, предпочтительно, <0,4 нмоль/л и, более предпочтительно, <0,2 нмоль/л для MR-pro ADM и/или <100 пмоль/л, предпочтительно, <75 пмоль/л и, более предпочтительно, <50 пмоль/л для CT-proADM, и/или <0,3 пмоль/л, предпочтительно, <0,2 пмоль/л и, более предпочтительно, <0,1 пмоль/л для PAMP.
18. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, в котором указанная биологическая жидкость может быть выбрана из группы, включающей кровь, сыворотку, плазму, мочу, спинномозговую жидкость (CSF) и слюну.
3-
2
2
19. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, в котором дополнительно определяют, по меньшей мере, один клинический параметр и дополнительно учитывают в корреляциях параметры, выбранные из группы, включающей возраст, пол, оценку SOFA (или ее подклассы), оценку SAPSII, BUN, натрий, калий, креатинин, билирубин, количество тромбоцитов, артериальный pH, гематокрит, лейкоцит, HCO, инвазивная механическая вентиляция/неинвазивная механическая вентиляция легких, гемодинамические характеристики (включая артериальное давление, систолическое и диастолическое, среднее артериальное давление, центральное венозное давление, частота сердечных сокращений), баланс жидкости, выделение мочи, избыток оснований, хлорид, CRP, PCT, BNP или NT-proBNP, тропонин T или тропонин I, про-энкефалин, гемоглобин, глюкоза, лактат, INR, щелочная фосфатаза, AST, ALT, Gamma GT, общий белок, альбумин, температура, частота дыхания, PaOи FiO, терапевтические меры (жидкостная реанимация, вазопрессоры/инотропы, заместительная почечная терапия, антибиотики, гидрокортизон, инсулин, энтеральное питание/парентеральное питание, сопутствующие заболевания, хронические лекарства.
20. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления для отнесения указанных субъектов к группам риска.
Пример 1
Создание антител и определение их констант аффинности
Было получено несколько антител человека и мыши и определены их константы аффинности (см. таблицу 2).
Пептиды/конъюгаты для иммунизации:
Пептиды для иммунизации синтезировали, см. таблицу 2 (JPT Technologies, Берлин, Германия) с включением дополнительного N-концевого остатка цистеина для конъюгации пептидов с бычьим сывороточным альбумином (БСА). Пептиды ковалентно сшивали с БСА с использованием Sulfolink-связывающего геля (Perbio-science, Бонн, Германия). Процедуру сочетания осуществляли согласно руководству фирмы Perbio.
Мышиные антитела
были получены в соответствии со следующим способом:
Мышь линии BALB/c иммунизировали путем введения 100 мкг конъюгата пептид-БСА в дни 0 и 14 (эмульгированного в 100 мкл полного адъюванта Фрейнда) и 50 мкг в дни 21 и 28 (в 100 мкл неполного адъюванта Фрейнда). За три дня до осуществления эксперимента по слиянию животному вводили 50 мкг конъюгата, растворенного в 100 мкг физиологического раствора, путем одной внутрибрюшинной и одной внутривенной инъекции.
Осуществляли слияние спленоцитов иммунизированной мыши с клетками миеломы линии SP2/0 с использованием 1 мл 50% полиэтиленгликоля в течение 30 с при 37°С. После промывки клетки высевали в 96-луночные планшеты для клеточных культур. Гибридные клоны отбирали путем выращивания в среде HAT [питательная среда RPMI 1640, дополненная 20% сыворотки плода коровы и HAT-добавкой]. Через две недели среду HAT заменяли средой HT и после осуществления трех пересевов возвращали в стандартную среду для клеточных культур.
Lane, RD 1985. J. Immunol. Meth. 81: 223-228; Ziegler и соавт. 1996. Horm. Metab Рез. 28: 11-15)
Через три недели после осуществления слияния проводили первичный скрининг супернатантов клеточной культуры в отношении антигенспецифических антител IgG-типа. Положительные по данным тестам микрокультуры переносили в 24-луночные планшеты для размножения. После повторного тестирования осуществляли клонирование и повторное клонирование отобранных культур с применением метода серийных разведений и определяли изотипы (см. также .
Получение мышиных моноклональных антител:
Marx и соавт., 1997. Monoclonal Antibody Production, ATLA 25, 1997, с.121)
Антитела получали с использованием стандартных методов получения антител (и очищали на белке А. Чистота антител составляла >95% по данным анализа методом гель-электрофореза в присутствии ДСН.
Человеческие антитела
Человеческие антитела получали с помощью фагового дисплея согласно следующей процедуре:
Hust и соавт. 2011. Journal of Biotechnology 152, 159-170; Schütte и соавт. 2009. PLoS One 4, e6625)
Для выделения рекомбинантных одноцепочечных фрагментов вариабельной области (scFv) к пептиду адреномедуллина применяли библиотеки человеческих наивных генов антител HAL7/8. Библиотеки генов антител подвергали скринингу, используя стратегию пэннинга, предусматривающую применение пептидов, которые содержали биотиновую метку, сцепленную через два различных спейсера с последовательностью пептида адреномедуллина. Для минимизации фона неспецифических связывающих агентов применяли комбинацию циклов пэннинга с использованием неспецифически связанного антигена и связанного со стрептавидином антигена. Фаги, элюированные после третьего цикла пэннинга, применяли для получения экспрессирующих моноклональный scFv штаммов E. coli. Для оценки антигена с помощью ELISA использовали непосредственно супернатанты, полученные после культивирования указанных клональных штаммов (см. также .
и соавт., J. Biotechn. 2011)
Положительные клоны отбирали на основе ELISA-сигнала, положительного в отношении антигена, и отрицательного в отношении сенсибилизированных стрептавидином титрационных микропланшетов. Для дополнительной характеризации открытую рамку считывания scFv клонировали в экспрессионной плазмиде рОРЕ107 (Hust , выделяли из супернатанта культуры с помощью аффинной хроматографии с иммобилизованными ионами металлов и очищали с помощью гель-фильтрации.
Константы аффинности:
Lorenz и соавт. 2011. Antimicrob Agents Chemother. 55 (1): 165-173)
Для определения аффинности антител к адреномедуллину оценивали кинетику связывания адреномедуллина с иммобилизованным антителом с помощью метода поверхностного плазмонного резонанса без меток с использованием системы Biacore 2000 (GE Healthcare Europe GmbH, Фрайбург, Германия). Для осуществления обратимой иммобилизации антител применяли антитело к мышиному Fc, ковалентно связанное с высокой плотностью с сенсорным СМ5-чипом согласно инструкциям производителя (набор мышиных антител для иммобилизации; GE Healthcare) (.
Получали моноклональные антитела к указанным ниже областям ADM человеческого и мышиного ADM соответственно. Ниже в таблице представлены антитела, отобранные из полученных антител, которые применяли в последующих экспериментах. Выбор был основан на области-мишени:
Таблица 2:
Номер последовательности
Антиген/Иммуноген
Область ADM
Обозначение
Константы аффинностиKd (М)
SEQ ID: 19
YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC
1-21
NT-Н
5,9×10<sup>-9</sup>
SEQ ID: 24
CTVQKLAHQIYQ
21-32
MR-Н
2×10<sup>-9</sup>
SEQ ID: 20
CAPRSKISPQGY-NH<sub>2</sub>
С-42-52
CT-Н
1,1×10<sup>-9</sup>
SEQ ID: 25
YRQSMNQGSRSNGCRFGTC
1-19
NT-M
3,9×10<sup>-9</sup>
Получение фрагментов антител путем ферментативного расщепления:
2
2
2
Для получения Fab- и F(ab)-фрагментов применяли ферментативное расщепление мышиного полноразмерного антитела NT-M. Антитело NT-M расщепляли, используя a) набор на основе пепсина для получения F(ab)(Pierce, 44988) и b) набор на основе папаина для получения Fab (фирма Pierce, 44985). Процедуры фрагментации осуществляли согласно инструкциям, предоставленным поставщиком. В случае F(ab)-фрагментации процедуру осуществляли в течение 8 ч при 37°C. Расщепление с получением Fab-фрагментов осуществляли в течение 16 ч, соответственно.
Процедура получения и очистки Fab:
Coulter and Harris 1983. J. Immunol. Meth. 59, 199-203; Lindner и соавт. 2010. Cancer Res. 70, 277-87; Kaufmann и соавт. 2010. PNAS. 107, 18950-5. ; Chen и соавт. 2010. PNAS. 107, 14727-32; Uysal и соавт. 2009 J. Exp. Med. 206, 449-62; Thomas и соавт. 2009. J. Exp. Med. 206, 1913-27; Kong и соавт. 2009 J. Cell Biol. 185, 1275-840)
Иммобилизованный папаин уравновешивали путем отмывки смолы с помощью 0,5 мл буфера для расщепления и центрифугирования на колонке при 5000×g в течение 1 мин. После этого буфер отбрасывали. Подготавливали обессоливающую колонку путем удаления раствора, в котором она хранилась, и отмывки ее буфером для расщепления с последующим центрифугированием ее каждый раз при 1000×g в течение 2 мин. В трубу вращающейся колонки, содержащую уравновешенный иммобилизованный папаин, добавляли по 0,5 мл полученного образца IgG. Расщепляемую реакционную смесь инкубировали в течение 16 ч на лабораторном шейкере при 37°C. Колонку центрифугировали при 5000×g в течение 1 мин для отделения продукта расщепления от иммобилизованного папаина. Затем смолу отмывали с помощью 0,5 мл PBS и центрифугировали при 5000×g в течение 1 мин. Полученную при отмывке фракцию добавляли к расщепленному антителу, в результате общий объем образца составлял 1,0 мл. Колонку, заполненную Nab-белком А, уравновешивали PBS и буфером для элюции IgG при комнатной температуре. Колонку центрифугировали в течение 1 мин для удаления раствора, в котором осуществляли хранение (содержащем 0,02% азида натрия), и уравновешивали, добавляя 2 мл ЗФР, вновь центрифугировали в течение 1 мин и отбрасывали прошедший через колонку элюат. Образец вносили на колонку и ресуспендировали путем переворачивания. Инкубацию проводили при комнатной температуре, осуществляя смешение путем переворачивания в течение 10 мин. Колонку центрифугировали в течение 1 мин, получая элюат, содержащий Fab-фрагменты. (Ссылки: .
2
Процедура получения и очистки F(ab')-фрагментов:
Mariani и соавт. 1991. Mol. Immunol. 28: 69-77; Beale 1987. Exp Comp Immunol 11: 287-96; Ellerson и соавт. 1972. FEBS Letters 24 (3): 318-22; Kerbel and Elliot 1983. Meth Enzymol 93: 113-147; Kulkarni и соавт. 1985. Cancer Immunol Immunotherapy 19: 211-4; Lamoyi 1986. Meth Enzymol 121: 652-663; Parham и соавт. 1982. J Immunol Meth 53: 133- 73; Raychaudhuri и соавт., 1985. Mol Immunol. 22 (9): 1009-19; Rousseaux и соавт., 1980. Mol Immunol. 17: 469-82; Rousseaux и и соавт., 1983. J Immunol. Meth 64: 141-6; Wilson и соавт., 1991. J. Immunol. Meth 138: 111-9)
Иммобилизованный пепсин уравновешивали путем отмывки смолы с помощью 0,5 мл буфера для расщепления и центрифугировали на колонке при 5000×g в течение 1 мин. После этого буфер отбрасывали. Подготавливали обессоливающую колонку путем удаления раствора, в котором она хранилась, и отмывки ее буфером для расщепления с последующим центрифугированием каждый раз при 1000×g в течение 2 мин. В трубу вращающейся колонки, содержащую уравновешенный иммобилизованный пепсин, добавляли по 0,5 мл полученного образца IgG. Расщепляемую реакционную смесь инкубировали в течение 16 ч на лабораторном шейкере при 37°C. Колонку центрифугировали при 5000×g в течение 1 мин для отделения продукта расщепления от иммобилизованного пепсина. Затем смолу отмывали с помощью 0,5 мл PBS и центрифугировали при 5000×g в течение 1 мин. Полученную при промывке фракцию добавляли к расщепленному антителу, в результате общий объем образца составлял 1,0 мл. Колонку, заполненную Nab-белком А, уравновешивали PBS и буфером для элюции IgG при комнатной температуре. Колонку центрифугировали в течение 1 мин для удаления раствора, в котором осуществляли хранение (содержащего 0,02% азида натрия), и уравновешивали, добавляя 2 мл PBS, вновь центрифугировали в течение 1 мин и отбрасывали прошедший через колонку элюат. Образец вносили на колонку и ресупендировали путем переворачивания. Инкубацию проводили при комнатной температуре, осуществляя смешение путем переворачивания в течение 10 мин. Колонку центрифугировали в течение 1 мин, получая элюат, содержащий Fab-фрагменты. (Ссылки: .
Гуманизация фрагмента антитела NT-H
Jones и соавт. 1986. Nature 321, 522-525)
Фрагмент антитела гуманизировали методом трансплантации CDR (.
Для получения гуманизированной последовательности осуществляли следующие стадии:
Экстракция тотальной РНК: тотальную РНК экстрагировали из NT-H-гибридом с использованием набора фирмы Qiagen.
Первый цикл ОТ-ПЦР: Применяли набор QIAGENOneStep RT-PCR (каталожный №210210). ОТ-ПЦР осуществляли с использованием набора праймеров, специфических в отношении тяжелых и легких цепей. Для каждого образца РНК осуществляли ОТ-ПЦР-реакции для 12 индивидуальных тяжелых цепей и 11 легких цепей, используя смесь вырожденных «прямых» праймеров, перекрывающих лидерные последовательности вариабельных областей. «Обратные» праймеры локализовали в константных областях тяжелых и легких цепей. В праймеры не встраивали никакие сайты рестрикции.
Набор для осуществления реакции: 5×буфер из набора QIAGENOneStep RT-PCR, 5,0 мкл; смесь дНТФ (содержащая по 10 мМ каждого дНТФ), 0,8 мкл; набор праймеров, 0,5 мкл; смесь ферментов из набора QIAGENOneStep RT-PCR, 0,8 мкл; матричная РНК, 2,0 мкл; не содержащая РНКазу вода до 20,0 мкл; общий объем 20,0 мкл. Условия осуществления ПЦР: обратная транскрипция: 50°C, 30 мин; начальная активация ПЦР: 95°C, 15 мин; Программа циклической реакции: 20 циклов при 94°C, 25 с; 54°C, 30 с; 72°C, 30 с; конечное удлинение: 72°C, 10 мин. Второй цикл с использованием «полугнездовой» ПЦР: ОТ-ПЦР-продукты, полученные с помощью первого цикла реакций, дополнительно амплифицировали с использованием второго цикла ПЦР. Осуществляли ОТ-ПЦР-реакции для 12 индивидуальных тяжелых цепей и 11 легких цепей с использованием наборов «полугнездовых» праймеров, специфических в отношении вариабельных областей антител.
Набор для осуществления реакции: 2×смесь для ПЦР, 10 мкл; набор праймеров, 2 мкл; продукт, полученный в первом цикле ПЦР, 8 мкл; общий объем 20 мкл; отчет о клонировании полученных с использованием гибридомы антитела (Hybridoma Antibody Cloning Report). Условия осуществления ПЦР: начальная денатурация в течение 5 мин при 95°C; 25 циклов при 95°C в течение 25 с, 57°C в течение 30 с, 68°C в течение 30 с; конечное удлинение в течение 10 мин при 68°C.
Padlan 1991. Mol. Immunol. 28, 489-498; Harris и Bajorath.1995. Protein Sci. 4, 306-310)
После завершения ПЦР осуществляли анализ образцов, полученных с помощью ПЦР-реакций, в агарозном геле для визуализации амплифицированных ДНК-фрагментов. После секвенирования более 15 клонированных ДНК-фрагментов, амплифицированных с помощью «гнездовой» ОТ-ПЦР, клонировали несколько тяжелых и легких цепей мышиных антител, и они оказались правильными. С помощью сравнительного анализа белковой последовательности и анализа CDR идентифицировали одну тяжелую цепь и одну легкую цепь. После сравнительного анализа с гомологичными человеческими каркасными последовательностями определяли полученную в результате гуманизирования последовательность вариабельной области тяжелой цепи, которая представлена на фигуре 5. Поскольку аминокислоты в положениях 26, 40 и 55 в вариабельной области тяжелой цепи и аминокислота в положении 40 в вариабельной области легкой цепи имеют решающее значение для способности к связыванию, их можно превращать вновь в исходные мышиные аминокислоты. Полученные кандидаты представлены ниже (.
Аннотация к последовательностям фрагментов антител (SEQ ID NO.11-18 и 26-27): выделены жирным шрифтом и подчеркнуты CDR 1, 2, 3, расположенные в хронологическом порядке; курсивом обозначены константные области; шарнирные области выделены жирным шрифтом, а гистидиновая метка выделена жирным шрифтом и курсивом
SEQ ID NO.11 (AM-VH-C):
GYTFSRYW
ILPGSGS T
TEGYEYDGFDY
EPK
HHHHHH
NTAYMQLSSLTSEDSAVYYC
WGQGTTLTVSSASTK GPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRV
QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATIEWVKQRPGHGLEWIGENYNEKFKGKATITADTSS
SEQ ID NO.12 (AM-VH1):
GYTFSRYW
ILPGSG ST
TEGYEYDGFDY
EPK
HHHHHH
STSTAYMELSSLRSEDTAVYYC
WGQGTTVTVSSASTK GPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRV
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASISWVRQAPGQGLEWMGRNYAQKFQGRVTITADE
SEQ ID NO.13 (AM-VH2-E40):
GYTFSRYW
ILPGSG ST
TEGYEYDGFDY
EPK
HHHHHH
STSTAYMELSSLRSEDTAVYYC
WGQGTTVTVSSASTK GPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRV
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASIEWVRQAPGQGLEWMGRNYAQKFQGRVTITADE
SEQ ID NO.14 (AM-VH3-T26-E55):
GYTFSRYW
ILPGSG ST
TEGYEYDGFDY
EPK
HHHHHH
STSTAYMELSSLRSEDTAVYYC
WGQGTTVTVSSASTK GPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRV
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKATISWVRQAPGQGLEWMGENYAQKFQGRVTITADE
SEQ ID NO.15 (AM-VH4-T26-E40-E55):
GYTFSRYW
ILPGSG ST
TEGYEYDGFDY
EPK
HHHHHH
STSTAYMELSSLRSEDTAVYYC
WGQGTTVTVSSASTK GPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRV
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKATIEWVRQAPGQGLEWMGENYAQKFQGRVTITADE
SEQ ID NO.16 (AM-VL-C):
QSIVYSNGNTY
RVS
FQGSHIPYT
DVLLSQTPLSLPVSLGDQATISCRSSLEWYLQKPGQSPKLLIYNR FSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTL SKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO.17 (AM-VL1):
QSIVYSNGNTY
RVS
FQGSHIPYT
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSLNWFQQRPGQSPRRLIYNR DSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTL SKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO.18 (AM-VL2-E40):
QSIVYSNGNTY
RVS
FQGSHIPYT
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSLEWFQQRPGQSPRRLIYNR DSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTL SKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO.26 (тяжелая цепь HAM8101):
GYTFSRYW
ILPGSGS T
TEGYEYDGFDY
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASIEWVRQAPGQGLEWIGENYNQKFQGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCWGQGTTVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY SLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCL VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO.27 (легкая цепь HAM8101):
QSIVYSNGNTY
RVS
FQGSHIPYT
DVVLTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSLEWYLQRPGQSPRLLIYNR FSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTL SKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Пример 2
E. coli
Влияние антитела HAM8101 (адрецизумаб) против NT-H-адреномедуллина было изучено на клинических и лабораторных параметрах септических свиней в модели с двумя вмешательствами. Первым вмешательством был геморрагический шок, а вторым вмешательством была индукция сепсиса путем применения фибринового сгустка (перитонеальное загрязнение и инфекция; PCI). HAM8101 вводили в момент, когда был индуцирован сепсис.
Материалы и методы
Штамм животных: Sus scrofa domestica (Deutsche Landrasse) 14-16 недель, 30-35 кг.
Размер группы: 6
Группы:
а) PCI+носитель
б) PCI+HAM8101
Тестируемые материалы
HAM8101 (адрецизумаб) № партии: HAM-160714-FiB в 20 мМ His/HCl pH 6,0
Носитель: 20 мМ His/HCl pH 6,0
Выполнение исследования
Животные
Мы анестезировали и подвергали вентиляции 16 самок свиней породы German Landrace (n=16; среднее±стандартное отклонение (SD) 33±1,5 кг массы тела (BW)) и следовали стандартным процедурам по уходу за лабораторными животными. Это исследование было одобрено институциональным и местным комитетом по уходу и использованию животных (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen, Германия, 84-02.04.2015.A037).
Общая анестезия и катетеризация
2
2
Животным предварительно назначали азаперон (1-2 мг/кг массы тела) и кетамин (10 мг/кг массы тела), а общую анестезию индуцировали посредством внутривенной инъекцией пропофола (1-2 мг/кг массы тела). Животных перорально интубировали и помещали в положение лежа на спине. Общая анестезия поддерживалась инфузиями пропофола и фентанила. Режим вентиляции с контролируемым давлением был выбран для вентиляции животных с долей кислорода на вдохе 0,5, соотношением вдох/выдох 1:1,5, PEEP, установленным на 5 см HO, и дыхательным объемом 8-10 мл/кг массы тела. Частота дыхания была установлена для поддержания давления PaCO3,5-4,5 кПа. Внутреннюю температуру тела поддерживали выше 37,5°С с помощью согревающего одеяла. Два центральных венозных катетера были введены в наружную яремную вену и бедренную вену, а артериальный катетер PICCO был введен в бедренную артерию путем чрескожной пункции.
В конце исследования животных умерщвляли в присутствии ветеринара посредством летальной дозы наркорена (Merial, Hallbergmoos, Германия), пока они еще находились под глубоким наркозом.
Escherichia coli
Фибриновый сгусток
E. coli
11
В этой модели мы использовали фибриновый сгусток с7-9×10колониеобразующими единицами (КОЕ) на кг/массы тела, для индукции септического шока.
Гемодинамические измерения
Все измерения внутрисосудистого давления были привязаны к уровню середины грудной клетки, и значения были получены в конце выдоха. Частота сердечных сокращений, среднее артериальное давление (MAP), центральное венозное давление (CVP) и вариация систолического объема кровотока (SVV) регистрировались непрерывно. Сердечный выброс измеряли с помощью транспульмональной термодилюции (PICCO, Puls medical systems, Фельдкирхен, Германия). Внесосудистая вода в легких (EVLW), внутригрудной объем крови (ITBV) и глобальный конечно-диастолический объем (GEDV) рассчитывались по стандартной формуле.
Лаборатория
Анализ газов крови проводился с использованием стандартной системы оксиметрии газов крови (ABL 800; Radiometer, Копенгаген, Дания) с кооксиметром. Формулу крови, электролиты, креатинин, мочевину и ферменты печени определяли с использованием стандартных лабораторных методов. Мы измерили липофалин, связанный с нейтрофильной желатиназой (NGAL), с помощью иммуноферментного анализа с использованием коммерчески доступного набора (Pig NGAL ELISA Kit, BioPorto, Hellerup, Дания). Клиренс креатинина измеряли как оценку скорости клубочковой фильтрации (ClCrea=Ucrea×Uvol/Pcrea×продолжительность периода сбора мочи; Ucrea=концентрация креатинина в моче; Uvol=объем мочи в течение периода сбора; Pcrea=концентрация креатинина в сыворотке). Мы измеряли массу тела животных до и после эксперимента. Соотношение влажности/сухости легких определяли путем взвешивания части левой верхней доли сразу после эксперимента и через 5 дней. Коагуляцию крови анализировали с помощью ротационной тромбоэластометрии (ROTEM delta, TEM international, Базель, Швейцария). Уровни цитокинов (IL-6 и TNF-α) в плазме оценивали с помощью иммуноферментного анализа с использованием коммерчески доступных наборов, специфичных для свиней.
Marino и соавт. 2014. Crit Care 18: R34)
Weber и соавт. 2017. J Appl Lab Medicine, в печати)
Биоактивный адреномедуллин (био-ADM) измеряли с использованием нового иммунохимического иммуноанализа, предоставленного Sphingotec GmbH (Hennigsdorf, Германия), как описано ранее (. Вкратце, в одностадийном хемилюминесцентном сэндвич-иммуноанализе, основанном на маркировке NHS-сложным эфиром акридиния для обнаружения биологически активного ADM в необработанной, чистой плазме, используются два мышиных моноклональных антитела, одно из которых направлено против среднего региона (твердая фаза), и другое направлено против амидированного С-концевого фрагмента ADM (меченое антитело). В анализе используются 50 мкл образцов/калибраторов плазмы и 200 мкл меченого детектирующего антитела. Чувствительность аналитического анализа составляет 2 пг/мл. Анализ подходит для измерения био-ADM у многочисленных видов млекопитающих, включая людей и свиней, и обнаруживает как свободный био-ADM, так и био-ADM, когда с ним связано HAM 8101 (адрецизумаб) (.
MR-proADM в плазме измеряли с помощью анализа MR-proADM KRYPTOR B·R·A·H·M·S в соответствии с инструкциями производителя (Thermo Fisher, Hennigsdorf, Германия).
Протокол эксперимента
Во время катетеризации животные получали 10 мл/кг массы тела/час сбалансированного кристаллоидного раствора. Геморрагический шок был вызван посредством вызывания кровотечения у животных через катетер бедренной вены. У животных брали кровь до тех пор, пока не была достигнута половина исходного MAP. Геморрагический шок сохранялся в течение 45 минут, после чего проводили жидкостную реанимацию с помощью сбалансированного кристаллоидного раствора для восстановления исходного среднего артериального давления. Через 2 часа после геморрагического шока кровь, собранную во время геморрагического шока, повторно переливали. В качестве второго вмешательства сепсис индуцировали с использованием сгустка, содержащего большое количество E. coli, помещенного в брюшную полость через 6 часов после геморрагического шока. Животных рандомизировали для получения либо антитела к адреномедуллину, либо раствора носителя. Растворы доставляли в нейтральных пакетах, и группы не был известны исследователям и были отмечены буквами А или В. Терапия раствором антитела или носителя начиналась сразу после индукции сепсиса. 2 мг/кг массы тела раствора антитела/носителя вводили в течение 30 минут. Через 4 часа после возникновения сепсиса терапия септического шока началась с использованием сбалансированных кристаллоидов и норадреналина по требованию. Объемное замещение и вазопрессор титровали для поддержания центрального венозного давления равным 8-12 мм рт.ст., среднего артериального давления выше 65 мм рт.ст. и центрального венозного насыщения кислородом, составляющего 70%, как рекомендовано в кампании «пережить сепсис» (Surviving Sepsis Campaign). Терапию сепсиса продолжали еще 8 часов. Измерения проводили до геморрагического шока, до индукции сепсиса и через 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10 и 12 часов после индукции сепсиса. Геморрагический и септический шок не вызывался для животных из групп SHAM, но кроме этого они получали такое же лечение, включая все внутрисосудистые катетеры, срединную лапаротомию и слепое применение раствора антитела/носителя.
Результаты:
Как и ожидалось, индукция сепсиса приводила к повышению био-ADM в плазме у животных-носителей. Удивительно, что после введения HAM 8101 видимая концентрация био-ADM в плазме возрастала значительно быстрее и до более высокого уровня, чем у животных, которым вводили носитель (фиг. 2A). Принимая во внимание огромный молярный избыток HAM 8101 по сравнению с эндогенным био-ADM, следует предположить, что измеренная концентрация ADM в плазме после введения HAM 8101 фактически представляет собой в основном био-ADM в комплексе с антителом HAM 8101. Чтобы выяснить, было ли наблюдаемое индуцированное HAM8101 более быстрое и более выраженное повышение био-ADM в плазме обусловлено повышенной экспрессией гена ADM и/или высвобождением продуктов гена ADM, измеряли плазменные концентрации другого пептида, полученного из пептида-предшественника ADM, а именно, MR-proADM (среднерегиональный про-адреномедуллин). Как показано на фиг. 2В, уровни MR-proADM в плазме повышались аналогичным образом при индукции сепсиса независимо от того, лечили животных HAM8101 или носителем. Таким образом, представляется, что индуцированное HAM8101 более быстрое и более выраженное увеличение ADM в плазме не связано с повышенной экспрессией гена ADM и/или высвобождением продуктов гена ADM.
Сверхпропорциональное повышение био-ADM в плазме, наблюдаемое после введения HAM 8101 по сравнению с животными, которым вводили носитель, не было связано с худшим исходом:
Животные, получившие HAM 8101, нуждались в меньшей объемной реанимации для достижения целевого среднего артериального давления, чем животные, которым вводили носитель (фиг. 3).
Только треть животных, получавших HAM 8101, нуждались в введении норадреналина помимо объемной реанимации для достижения целевого среднего артериального давления, в то время как всем животным, которым вводился носитель, был необходим норадреналин (фиг. 4).
Как показано на фиг. 4, среди животных, обработанных HAM 8101, одной трети был необходим норадреналин, тогда как двум третям он не был необходим. Эти две группы различались по уровню концентрации MR-proADM в плазме (фиг. 5). У тех животных, у которых развился шок, например, требующий норадреналина в дополнение к жидкостной реанимации, концентрации MR-proADM были значительно выше, чем у других животных. И последнее, у успешно пролеченных животных концентрация MR-proADM была ниже, чем в группе с носителем.
Взятые вместе, данные демонстрируют, что - удивительно - при лечении HAM 8101 измерение био-ADM не подходит для мониторинга риска неблагоприятного исхода для субъекта. Напротив, измерение MR-proADM, в качестве примера другого фрагмента, полученного из пептида-предшественника ADM, с которым HAM 8101 не связывается, подходит для мониторинга стимуляции или подавления системы ADM в таких условиях, и на него не оказывает немедленного влияния введение HAM 8101, и оно с течением времени коррелирует с клиническим исходом.
Пример 3
Исследовано влияние моноклонального антитела против С-концевого адреномедуллина, сгенерированного против SEQ ID NO.20 (HAM23 02), на уровни ADM у самцов крыс Wistar (Charles River, Sulzfeld).
3
Отбор образцов крови (K-EDTA-плазма ≤ 150 мкл или 3-4 мл при терминальном кровотечении (-80°C)) проводился в моменты времени -3 д, 12 мин, 1 ч, 3 ч, 6 ч, 24 ч, 48, 4 д, 7 д, 10 д. Животных лечили одной внутривенной инъекцией (5 мл/кг массы тела).
Инъецирование и отбор образцов были успешными для всех животных. Животные, получавшие антитело, не проявляли явных признаков токсического воздействия.
Лечение
Доза
Количество животных
HAM 2302
20 мг/кг
6
PBS
0 мг/кг
6
Измерение ADM и свободного HAM2302 в плазме
2
2
Для измерения адреномедуллина в образцах плазмы, содержащих HAM2302, применяли tADM-анализ. В этом анализе используют N-концевое антитело против ADM, сгенерированное против SEQ ID NO.25, в качестве твердой фазы (HAM 1112) и среднерегиональное антитело против ADM, сгенерированное против аминокислот с 27 по 39 ADM (AHQIYQFTDK DKD; SEQ ID NO.22) (HAM 2903) в качестве индикатора. Калибраторы, полученные из синтетического крысиного био-ADM (1-50)-H(YRQSMNQGSRSTGCRFGTCTMQKLAHQIYQFTDKDKDGMAPRNKISPQGY-NH, SEQ ID NO.23) использовались для количественного определения ADM в образце. В отличие от анализа био-ADM, упомянутого выше, анализ tADM не измеряет конкретно амидированную форму ADM, но может обнаруживать все формы ADM.
Очищенное моноклональное антитело HAM 2903 (1 г/л) метили путем инкубации в 10%-ном буфере для мечения (500 ммоль/л фосфата натрия, pH 8,0) с соотношением 1:5 моль/л MACN-NHS-эфира акридиния (1 г)/л, InVent GmbH) в течение 30 мин при 22°С в темноте. После добавления 5% 1 моль/л трис-HCl, рН 8,0 в течение 10 минут антитело HAM 2903 отделяли от свободной метки через колонки CentriPure P5 (emp Biotech GmbH) и посредством экслюзионной ВЭЖХ по белку KW-803 (Shodex, Showa Denko Europe).
Планшеты для микротитрования из белого полистирола (Greiner Bio-One International AG) покрывали (18 ч при 22°C) моноклональным антителом HAM 1112 (1,5 мкг/0,2 мл на лунку 50 ммоль/л трис-HCl, 100 ммоль/л NaCl, pH 7,8). После промывки и блокирования с помощью 30 г/л кариона, 5 г/л бычьего сывороточного альбумина (без протеазы), 6,5 ммоль/л монокалийфосфата, 3,5 ммоль/л дигидрогенфосфата натрия (рН 6,5) в течение 1,5 часов планшеты подвергались вакуумной сушке.
Синтетический крысиный ADM (rADM) (Peptides & elephants) серийно разводили с использованием 20 ммоль/л гидрофосфата калия, 0,5 г/л бычьего сывороточного альбумина (BSA), 6 ммоль/л натрия EDTA, 50 мкмоль/л амастатина, 100 мкмоль/л лейпептина; рН 8.
Пятьдесят мкл образцов/калибраторов пипетировали в покрытые планшеты для микротитрования. После добавления 150 мкл меченого C-концевого антитела HAM 2302 планшеты для микротитрования инкубировали в течение 20 часов при 2-8°C при перемешивании. Несвязанный индикатор удаляли путем пятикратной промывки (каждая по 350 мкл на лунку) моющим раствором (400 ммоль/л Трис, 1 г/л Твин 20, 3 моль/л NaCL, pH 7,5). Измерение хемилюминесценции в лунках со связыванием проводили в течение 1 с на лунку с помощью считывателя люминесценции планшетов для микротитрования Centro LB 960 (Berthold Technologies).
Для определения свободного HAM2302 использовали анализ адреномаб-1. Антитело против среднерегионального ADM, генерируемое против аминокислот 21-32 (SEQ ID NO.24), функционирует в качестве твердой фазы. MACN-помеченное C-концевое антитело (HAM 2302) выполняет функции индикатора. Для количественного определения HAM 2302 в образце применяют схему конкурентного анализа. Калибраторы, изготовленные из немеченого HAM 2302, вместе с постоянной концентрацией hADM (10 нг/мл), используются для получения стандартной кривой для определения концентрации в неизвестных образцах. С увеличением концентрации калибратора/антитела в образце измеренный световой сигнал снижается, поскольку меньшее количество индикатора может связываться с адреномедуллином.
Очищенное моноклональное HAM 2302 (1 г/л) метили путем инкубации в 10%-ном буфере для мечения (500 ммоль/л фосфата натрия, pH 8,0) с соотношением MACN-NHS-эфира акридиния 1:4,5 моль/л (1 г/л), InVent GmbH) в течение 30 мин при 22°С в темноте. После добавления 5% 1 моль/л трис-HCl, pH 8,0, в течение 10 минут, HAM 2302 отделяли от свободной метки через колонки CentriPure P10 (emp Biotech GmbH) и посредством экслюзионной ВЭЖХ по белку KW-803 (Shodex, Showa Denko Europe).
Планшеты для микротитрования из белого полистирола (Greiner Bio-One International AG) покрывали (18 ч при 20°C) моноклональным среднерегиональным антителом против аминокислот 21-32 ADM (1 мкг/0,2 мл на лунку 50 ммоль/л трис-HCl, 100 ммоль/л NaCl, pH 7,8). После блокирования с помощью 30 г/л кариона, 5 г/л BSA (без протеазы), 6,5 ммоль/л монокалийфосфата, 3,5 ммоль/л дигидрофосфата натрия (рН 6,5) в течение 1,5 часов планшеты подвергались вакуумной сушке.
Использовали серийное разведение HAM 2302, приготовленного с фосфатно-солевым буфером (PBS), 2,5 г/л бычьего сывороточного альбумина, pH 7,4.
Пятьдесят мкл образцов/калибраторов и 100 мкл 10 нг/мл hADM в фосфатно-солевом буфере (PBS), 2,5 г/л бычьего сывороточного альбумина pH 7,4 пипетировали в покрытые планшеты для микротитрования. После одночасовой инкубации при 2-8°C при перемешивании 100 мкл меченого HAM 2302 пипетировали в покрытые планшеты для микротитрования. После инкубации планшетов в течение еще 2,5 часов при 2-8°C при перемешивании Несвязанный индикатор удаляли путем пятикратной промывки (каждая по 350 мкл на лунку) моющим раствором (20 ммоль/л PBS, 1 г/л Triton X-100, рН 7,4). Измерение хемилюминесценции в лунках со связыванием проводили в течение 1 с на лунку с помощью считывателя люминесценции планшетов для микротитрования Centro LB 960 (Berthold Technologies).
Результаты:
В образцах от животных, подвергавшихся лечению HAM2302, концентрации свободного HAM2302 в плазме, измеренные через 3 ч после введения, составили 481,9 мкг/мл (±46,8 мкг/мл). Средняя концентрация ADM у животных, которым вводился носитель, составляла 14,6±3,75 пг/мл. Концентрация адреномедуллина у животных, получавших HAM2302, была примерно в 100 раз выше (1411±67 пг/мл) по сравнению с животными, которым вводили носитель (фиг. 6).
Список последовательностей
2
SEQ ID NO.1 (зрелый адреномедуллин (зрелый ADM); амидированный ADM; био-ADM): аминокислоты 95-146-CONHиз preproADM
2
YRQSMN NFQGLRSFGC RFGTCTVQKL AHQIYQFTDK DKDNVAPRSK ISPQGY - CONH
SEQ ID NO.2 (пре-про-адреномедуллин (pre-proADM)): аминокислоты 1-185
MKLVSVALMYLGSLAFLGADTARLDVASEFRKKWNKWALSRGKRELRMSSSYPTGL ADVKAGPAQTLIRPQDMKGASRSPEDSSPDAARIRVKRYRQSMNNFQGLRSFGCRFGTCTVQ KLAHQIYQFTDKDKDNVAPRSKISPQGYGRRRRRSLPEAGPGRTLVSSKPQAHGAPAPPSGS APHFL
SEQ ID NO.3 (N-20 концевой пептид проадреномедуллина, PAMP): аминокислоты 22-41 из preproADM
ARLDVASEF RKKWNKWALS R
SEQ ID NO.4 (среднерегиональный проадреномедуллин, MR-proADM): аминокислоты 45-92 из preproADM
ELRMSS SYPTGLADVK AGPAQTLIRP QDMKGASRSP EDSSPDAARI RV
SEQ ID NO.5 (С-концевой проадреномедуллин, CT-proADM): аминокислоты 148-185 из preproADM
RRR RRSLPEAGPG RTLVSSKPQA HGAPAPPSGS APHFL
SEQ ID NO.6:
GYTFSRYW
SEQ ID NO.7:
ILPGSGST
SEQ ID NO.8:
TEGYEYDGFDY
SEQ ID NO.9:
QSIVYSNGNTY
SEQ ID NO.10:
FQGSHIPYT.
SEQ ID NO.11 (AM-VH-C):
QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFSRYWIEWVKQRPGHGLEWIGEILP
GSGSTNYNEKFKGKATITADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTEGYEYDGFD
YWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN
SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKR
VEPK
SEQ ID NO.12 (AM-VH1):
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWISWVRQAPGQGLEWMGRIL
PGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFD
YWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN
SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKR
VEPK
SEQ ID NO.13 (AM-VH2-E40):
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWMGRIL
PGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFD
YWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN
SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKR
VEPK
SEQ ID NO.14 (AM-VH3-T26-E55):
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKATGYTFSRYWISWVRQAPGQGLEWMGEIL
PGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFD
YWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN
SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKR
VEPK
SEQ ID NO.15 (AM-VH4-T26-E40-E55):
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKATGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWMGEIL
PGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFD
YWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN
SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKR
VEPK
SEQ ID NO.16 (AM-VL-C):
DVLLSQTPLSLPVSLGDQATISCRSSQSIVYSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYR
VSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHIPYTFGGGTKLE
IKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNS
QESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGE
С
SEQ ID NO.17 (AM-VL1):
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLNWFQQRPGQSPRRLIYR
VSNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGQGTKL
EIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGN
SQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRG
ЕС
SEQ ID NO.18 (AM-VL2-E40):
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLEWFQQRPGQSPRRLIYRVSNR DSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFP PSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO.19 (N-концевая часть, аминокислоты 1-21, адреномедуллина)
YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC
SEQ ID NO.20 (С-концевая часть, аминокислоты 42-52, адреномедуллина)
2
APRSKISPQGY-NH
SEQ ID NO.21 (средняя часть, аминокислоты 21-42 адреномедуллина)
CTVQKLAHQIYQFTDKDKDNVA
SEQ ID NO.22 (средняя часть, аминокислоты 27-39 адреномедуллина)
AHQIYQFTDK DKD
SEQ ID NO.23 (крысиный адреномедуллин, аминокислоты 1-50)
2
YRQSMNQGSRSTGCRFGTCTMQKLAHQIYQFTDKDKDGMAPRNKISPQGY-NH
SEQ ID NO.24 (среднерегиональная часть адреномедуллина, аминокислоты 21-32)
CTVQKLAHQIYQ
SEQ ID NO.25 (N-концевая часть мышиного адреномедуллина, аминокислоты 1-19)
YRQSMNQGSRSNGCRFGTC
SEQ ID NO.28: (не указана в списке последовательностей из-за длины в 3 аминокислоты)
RVS
SEQ ID NO.26 (тяжелая цепь HAM8101)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWIGEILPGSGST NYNQKFQGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGT AALGCLVKDY FPEPVTVSWNSGALTSGVHT FPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPE LLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ YNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDEL TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO.27 (легкая цепь HAM8101)
DVVLTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLEWYLQRPGQSPRLLIYRVSNRF SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPP SDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLS KADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Описание чертежей
Фиг. 1: План-график исследования в модели свиньи с двумя вмешательствами
Фиг. 2: био-ADM (A) и MR-proADM (B) в плазме: для обеих групп показаны средние значения±SEM. Для био-ADM (A), взаимодействие (7 ч - 19 ч, мультивар. Время * Группа): 0,003
Фиг. 3: Жидкостная реанимация: для обеих групп показаны средние значения±SEM.
Фиг. 4: Частота потребности в норадреналине. Процент животных, нуждающихся в норадреналине в дополнение к жидкостной реанимации, показан для достижения целевой MAP на группу. Критерий хи-квадрат (19 ч): 0,014.
Фиг. 5: MR-proADM в плазме в зависимости от успеха терапии: показаны средние значения±SEM для трех групп: лечение HAM 8101, требующее норадреналина (шок), лечение HAM 8101, не требующее норадреналина (нет шока), носитель (все требуют норадреналина).
Фиг. 6: Сравнение концентраций адреномедуллина через 3 ч после инъекции 20 мг/кг HAM2302 (n=3). Средние концентрации антитела для подвергавшихся лечению животных указаны под графиком.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  Адреномед AG
<120>  МОНИТОРИНГ ТЕРАПИИ ПРИ ЛЕЧЕНИИ СВЯЗЫВАЮЩИМ ВЕЩЕСТВОМ ПРОТИВ
АДРЕНОМЕДУЛЛИНА (ADM)
<130>  A75177WO
<150>  EP17197177.3
<151>  2017-10-18
<160>  27
<170>  PatentIn версия 3.5
<210>  1
<211>  52
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  1
Tyr Arg Gln Ser Met Asn Asn Phe Gln Gly Leu Arg Ser Phe Gly Cys
1               5                   10                  15
Arg Phe Gly Thr Cys Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln
20                  25                  30
Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp Asn Val Ala Pro Arg Ser Lys Ile Ser
35                  40                  45
Pro Gln Gly Tyr
50
<210>  2
<211>  185
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  2
Met Lys Leu Val Ser Val Ala Leu Met Tyr Leu Gly Ser Leu Ala Phe
1               5                   10                  15
Leu Gly Ala Asp Thr Ala Arg Leu Asp Val Ala Ser Glu Phe Arg Lys
20                  25                  30
Lys Trp Asn Lys Trp Ala Leu Ser Arg Gly Lys Arg Glu Leu Arg Met
35                  40                  45
Ser Ser Ser Tyr Pro Thr Gly Leu Ala Asp Val Lys Ala Gly Pro Ala
50                  55                  60
Gln Thr Leu Ile Arg Pro Gln Asp Met Lys Gly Ala Ser Arg Ser Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ser Ser Pro Asp Ala Ala Arg Ile Arg Val Lys Arg Tyr Arg
85                  90                  95
Gln Ser Met Asn Asn Phe Gln Gly Leu Arg Ser Phe Gly Cys Arg Phe
100                 105                 110
Gly Thr Cys Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln Phe Thr
115                 120                 125
Asp Lys Asp Lys Asp Asn Val Ala Pro Arg Ser Lys Ile Ser Pro Gln
130                 135                 140
Gly Tyr Gly Arg Arg Arg Arg Arg Ser Leu Pro Glu Ala Gly Pro Gly
145                 150                 155                 160
Arg Thr Leu Val Ser Ser Lys Pro Gln Ala His Gly Ala Pro Ala Pro
165                 170                 175
Pro Ser Gly Ser Ala Pro His Phe Leu
180                 185
<210>  3
<211>  20
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  3
Ala Arg Leu Asp Val Ala Ser Glu Phe Arg Lys Lys Trp Asn Lys Trp
1               5                   10                  15
Ala Leu Ser Arg
20
<210>  4
<211>  48
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  4
Glu Leu Arg Met Ser Ser Ser Tyr Pro Thr Gly Leu Ala Asp Val Lys
1               5                   10                  15
Ala Gly Pro Ala Gln Thr Leu Ile Arg Pro Gln Asp Met Lys Gly Ala
20                  25                  30
Ser Arg Ser Pro Glu Asp Ser Ser Pro Asp Ala Ala Arg Ile Arg Val
35                  40                  45
<210>  5
<211>  38
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  5
Arg Arg Arg Arg Arg Ser Leu Pro Glu Ala Gly Pro Gly Arg Thr Leu
1               5                   10                  15
Val Ser Ser Lys Pro Gln Ala His Gly Ala Pro Ala Pro Pro Ser Gly
20                  25                  30
Ser Ala Pro His Phe Leu
35
<210>  6
<211>  8
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  6
Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Tyr Trp
1               5
<210>  7
<211>  8
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  7
Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr
1               5
<210>  8
<211>  11
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  8
Thr Glu Gly Tyr Glu Tyr Asp Gly Phe Asp Tyr
1               5                   10
<210>  9
<211>  11
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  9
Gln Ser Ile Val Tyr Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
1               5                   10
<210>  10
<211>  9
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  10
Phe Gln Gly Ser His Ile Pro Tyr Thr
1               5
<210>  11
<211>  219
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  11
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Tyr
20                  25                  30
Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50                  55                  60
Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Thr Glu Gly Tyr Glu Tyr Asp Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115                 120                 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130                 135                 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145                 150                 155                 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165                 170                 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180                 185                 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195                 200                 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys
210                 215
<210>  12
<211>  219
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  12
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Tyr
20                  25                  30
Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Arg Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Thr Glu Gly Tyr Glu Tyr Asp Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115                 120                 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130                 135                 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145                 150                 155                 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165                 170                 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180                 185                 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195                 200                 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys
210                 215
<210>  13
<211>  219
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  13
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Tyr
20                  25                  30
Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Arg Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Thr Glu Gly Tyr Glu Tyr Asp Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115                 120                 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130                 135                 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145                 150                 155                 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165                 170                 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180                 185                 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195                 200                 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys
210                 215
<210>  14
<211>  219
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  14
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Tyr
20                  25                  30
Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Thr Glu Gly Tyr Glu Tyr Asp Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115                 120                 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130                 135                 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145                 150                 155                 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165                 170                 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180                 185                 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195                 200                 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys
210                 215
<210>  15
<211>  219
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  15
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Tyr
20                  25                  30
Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Thr Glu Gly Tyr Glu Tyr Asp Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115                 120                 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130                 135                 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145                 150                 155                 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165                 170                 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180                 185                 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195                 200                 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys
210                 215
<210>  16
<211>  219
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  16
Asp Val Leu Leu Ser Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Asp Gln Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Tyr Ser
20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85                  90                  95
Ser His Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115                 120                 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130                 135                 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145                 150                 155                 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165                 170                 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180                 185                 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195                 200                 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210                 215
<210>  17
<211>  219
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  17
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1               5                   10                  15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Tyr Ser
20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85                  90                  95
Ser His Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115                 120                 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130                 135                 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145                 150                 155                 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165                 170                 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180                 185                 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195                 200                 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210                 215
<210>  18
<211>  219
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  18
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1               5                   10                  15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Tyr Ser
20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85                  90                  95
Ser His Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115                 120                 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130                 135                 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145                 150                 155                 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165                 170                 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180                 185                 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195                 200                 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210                 215
<210>  19
<211>  21
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  19
Tyr Arg Gln Ser Met Asn Asn Phe Gln Gly Leu Arg Ser Phe Gly Cys
1               5                   10                  15
Arg Phe Gly Thr Cys
20
<210>  20
<211>  11
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  20
Ala Pro Arg Ser Lys Ile Ser Pro Gln Gly Tyr
1               5                   10
<210>  21
<211>  22
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  21
Cys Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln Phe Thr Asp Lys
1               5                   10                  15
Asp Lys Asp Asn Val Ala
20
<210>  22
<211>  13
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  22
Ala His Gln Ile Tyr Gln Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp
1               5                   10
<210>  23
<211>  50
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  23
Tyr Arg Gln Ser Met Asn Gln Gly Ser Arg Ser Thr Gly Cys Arg Phe
1               5                   10                  15
Gly Thr Cys Thr Met Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln Phe Thr
20                  25                  30
Asp Lys Asp Lys Asp Gly Met Ala Pro Arg Asn Lys Ile Ser Pro Gln
35                  40                  45
Gly Tyr
50
<210>  24
<211>  12
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  24
Cys Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln
1               5                   10
<210>  25
<211>  19
<212>  PRT
<213>  Mouse
<400>  25
Tyr Arg Gln Ser Met Asn Gln Gly Ser Arg Ser Asn Gly Cys Arg Phe
1               5                   10                  15
Gly Thr Cys
<210>  26
<211>  448
<212>  PRT
<213>  Гуманизированная мышиная
<400>  1
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Tyr
20                  25                  30
Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Thr Glu Gly Tyr Glu Tyr Asp Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115                 120                 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130                 135                 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145                 150                 155                 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165                 170                 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180                 185                 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195                 200                 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210                 215                 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225                 230                 235                 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245                 250                 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260                 265                 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275                 280                 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290                 295                 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305                 310                 315                 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325                 330                 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340                 345                 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355                 360                 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370                 375                 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385                 390                 395                 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405                 410                 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420                 425                 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435                 440                 445
<210>  27
<211>  219
<212>  PRT
<213>  Гуманизированная мышиная
<400>  2
Asp Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1               5                   10                  15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Tyr Ser
20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85                  90                  95
Ser His Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115                 120                 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130                 135                 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145                 150                 155                 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165                 170                 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180                 185                 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195                 200                 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210                 215
<---