Подбор оптимальных условий индукции биосинтеза рекомбинантной липазы LipA

УДК 575.27

АспирантВ.А. Анненков, студентЕ.А. Першина, доцент Д.А. Черенков, профессор О.С. Корнеева

(Воронеж. гос. ун-т инж. технол.) кафедра микробиологии и биохимии, тел. (473) 255-55-57

Подбор оптимальных условий индукции биосинтеза рекомбинантной липазы LipA

Рассмотрено влияние условий биосинтеза (рН, t°, времени культивирования, концентрации IPTG-индуктора, времени внесения IPTG и времени биосинтеза) на получение максимального количества фермента LipA.

The influence of the conditions of biosynthesis (pH, t °, the cultivation time, the concentration of IPTG-inducer, time of IPTG application and time of biosynthesis) on obtaining the maximum amount of the enzyme LipA.

Ключевые слова: рекомбинантная липаза, индуктор, IPTG, активность фермента, биосинтез.

При культивировании микроорганизмов наибольшее значение имеет выбор оптимальных условий для успешного роста продуцента и биосинтеза биологически активных веществ.

Это в полной мере относится как к на-тивным так и к рекомбинантным продуцентам. Кроме того, для рекомбинантных микроорганизмов, в которых целевой ген находится под контролем индуцибельного промотора, на первый план выходит оптимизация условий контролируемой индукции биосинтеза. Ранее нами была получена генетическая конструкция на основе вектора PET23b(+), содержащая ген липазы LipA из B.subtilis 168 под контролем индуцибельного промотора Т7 [1]. В данной системе индуктором биосинтеза является Изопропил-P-D-1 -тиогалактопиранозид (ИПТГ, англ. IPTG) используемый в качестве аналога аллолактозы, метаболита лактозы, который запускает транскрипцию lac-оперона.

С целью оптимизации условий биосинтеза целевого фермента было исследовано влияние температуры, исходного рН среды, времени внесения индуктора, времени биосинтеза после внесения IPTG-индуктора, концентрации IPTG, времени культивирования на уровень продукции липазы LipA трансформированными клетками E. coli TOP-IO.

Объектом исследований являлась культура микроорганизмов Escherichia coli, генетически модифицированная методом рекомбинантных ДНК [1]. Донором ДНК являлся штамм Bacillus subtilis 168. В качестве контроля использовались ^трансформированные клетки E. coli, штамм ТОР-10.

© Анненков В.А., Першина Е.А., Черенков Д.А., Корнеева О.С., 2013

Клетки E.coli выращивали на среде Лу-рия-Бертани (ЛБ), К среде для трансформированных клеток добавляли ампициллин в расчете 1 мкл антибиотика на 1 мл питательной среды. Ампициллин необходим для положительной селекции клеток, содержащих реком-бинантную плазмидную ДНК. Для выращивания культуры на орбитальном термостатиру-емом шейкере использовали пробирки объемом 50 мл. При посеве применяли ино-кулюм, выращенный за 16 часов, разбавленный 5-6 частями питательной среды с ампициллином. Клетки культивировали при 37°С и частоте вращения платформы 120 об/мин.

Так как нативные клетки E. coli практически не синтезируют липазу, дополнительно в качестве положительного контроля в эксперименте использовали ферментный препарат, полученный из Yarrowia lipolytica. Данный выбор объясняется доступностью и простотой культивирования микроорганизма. Эти дрожжи способны синтезировать липазы с высокой активностью.

Y. lipolytica выращивали на специальной питательной среде, состоящей из дрожжевого экстракта, мочевины, солей металлов (магния, калия и кальция), глюкозы, соевой муки и оливкового масла [2].

Культивирование Y. lipolytica проводили в течение 120 часов при 32 °С в стеклянных колбах емкостью 500 мл. Уровень биосинтеза липазы рекомбинантными клетками определяли по липолитической активности ферментов культуральной жидкости

Для определения активности фермента использовали титриметрический метод опре-

деления липазнои активности с применением субстрата оливкового масла [2].

Метод основан на учете количества образовавшихся жирных кислот в процессе гидролиза оливкового субстрата, в качестве которого в эксперименте выступает смесь оливкового масла с 2 %-ным раствором поливинилового спирта. рН оливковой смеси с помощью фосфатного буфера доводят до значения 7,0. Перед титрованием смесь выдерживают при температуре 37 °С.

За единицу активности липазы принимали количество фермента, которое образует 1 мкмоль олеиновой кислоты за 1 ч в стандартных условиях. Липазную активность рассчитывали по следующей формуле:

ЛА =

(V - V2) • 0,014123 -1

a

где VI и У2 - количество 0,05 н раствора гид-роксида натрия, израсходованное на опытную и контрольную пробы, см3; а - количество исследуемого препарата в реакционной среде, г; 0,014123 - титр 0,05 Н раствора №ОН по олеиновой кислоте.

Была исследована зависимость уровня биосинтеза липазы от времени внесения индуктора. В качестве опыта использовали эмульсию субстрата, выдержанную в стандартных условиях, с добавлением испытуемого фермента и последующей инактивацией его этиловым спиртом через 1 час.

Отрицательным контролем служил оливковый субстрат с добавлением фермента и немедленной его инактивацией.

В качестве положительного контроля использовали культуральную жидкость, У. Иро1уИеа, разбавленную дистиллированной водой в пропорции 1:100.

Липазную активность измеряли через 0-7 ч после внесения индуктора. В результате эксперимента наибольшая активность липазы была отмечена при добавлении индуктора через 4 ч после начала культивирования. При этом, внесение 1РТО через 5 и 6 часов с момента посева оказалось менее эффективным, так же как и внесение в более ранние сроки культивирования. Полученные данные свидетельствуют о том, что наибольшим биосинтетическим потенциалом трансформированные клетки обладают через 4 часа после начала культивирования в данных условиях.

Результаты эксперимента представлены на рисунке 1.

1 2 3 4 5 6 7 Время биосинтеза(после внесения IPTG), ч

E.coli (опыт) —— E.coli (контроль) —А— Y.lipolytica

Рисунок 1 - Зависимость липазной активности культуры рекомбинантной E.coli от времени внесения индуктора.

Также допустимо добавлять индуктор и через 3 ч после посева (активность равна 89 ед/г).

Далее определяли зависимость активности липазы от времени биосинтеза (после внесения индуктора). Индуктор вносили через 4 часа после начала выращивания рекомбинантной Escherichia coli. В каждую пробирку вносили IPTG концентрацией 1 ммоль и определяли липолитическую активность в культуральной жидкости с периодичностью в 1 час. Как следует из данных, приведенных на рисунке 2, максимальная активность фермента наблюдается через 3 ч после внесения IPTG. При этом удельная активность липазы составляет 91,8 единиц на 1 г белка. Это значение примерно в 5,5 раз больше, максимальной активности Y. lipolytica в эксперименте и более, чем в 100 раз липазы, продуцируемой нативной E. coli. Через 5 ч после внесения IPTG липазная активность снижается, что может быть связано с частичной инактивацией наработанного фермента.

1 2 3 4 5 6 7 Время биосинтеза(после внесения 1РТО), ч

—♦— Б.соН (опыт) — Б.ооН (контроль) —А— У.Нро1уиоа Рисунок 2 - Зависимость активности липазы от времени биосинтеза (после внесения индуктора).

Кроме того, была определена зависимость активности липазы от концентрации вносимого индуктора. Известно, что для индукции лак-тозного оперона 1РТО используют в концентрациях от 0,1 до 2 мМ [3]. Концентрация ниже данного значения не позволит запустить транскрипцию 1ас-оперона. Если добавить индуктор в больших концентрациях, то это способствует снижению концентрации лактозы при ее метаболизме. В отсутствие или при низкой концентрации лактозы в клетке белок-репрессор, который является продуктом оперона Ьас1, обратимо соединяется с операторным районом и препятствует транскрипции. Поэтому одной из задач оптимизации условий биосинтеза являлось определение концентрации вносимого индуктора, вызывающей максимальный уровень транскрипции целевого гена.

Индуктор в различных концентрациях добавляли через 4 ч после начала культивирования трансформированных клеток. Отбор проб для определения активности липазы проводили через 3 ч после внесения индуктора, поскольку это время является оптималь -ным для биосинтеза.

Результаты представлены на рисунке 3.

120

о я я я н

и <

100 80 60 40 20 0

3

0,01 0,1 1

Концентрация ГРТО, ммоль

Рисунок 3 - Зависимость липазиой активности от концентрации вносимого индуктора

При обработке полученных данных, установленных экспериментально, активность липазы прямо пропорциональна концентрации внесенного индуктора. Минимальные значения активности, равные 71,1 ед/г и 71,6 ед/г, наблюдаются при концентрации 3 ммоль и 0,01 ммоль соответственно, максимальное - при 1 ммоль. Оно равно 106,6 ед/г. Отсюда следует, что благодаря увеличению концентрации 1РТО до допустимого значения (не более 2 ммоль), можно увеличить интенсивность биосинтеза липолитического фермента более чем на 50%.

Затем была определена зависимость активности липазы от температуры и pH. Известно, что оптимальными условиями культивирования E.coli является pH = 6.0-7.0, t°= 37 0C. Также кишечная палочка может развиваться при большем диапазоне активной кислотности и температур.

Многие штаммы E.coli выдерживают сильнокислые (pH от 2,4 и выше) и сильнощелочные (pH до 11,6) среды, причем воздействие кислот на культуру не так пагубно, как наличие сильного основания в субстрате [4].

Температура среды, при которой кишечная палочка может нормально развиваться, колеблется от 20 до 50 °С [4].

Однако температура и pH среды культивирования могут оказывать влияние на интенсивность биосинтеза рекомбинантного фер -мента. В связи с этим необходимо экспериментальным путем определить оптимальные значения данных параметров.

Для определения влияния температуры на липолитическую активность фермента ре-комбинантные клетки E.Coli выращивали на жидкой питательной среде Лурия-Бертани с добавлением ампициллина. Культивирование проводили в орбитальном шейкере при температурах 21 °С, 28 °С, 30 °С, 32 °С, 34 °С, 36 °С, 38 °С, 40 °С, 42 °С, 50 °С, 60 °С.

Максимально активный ферментный препарат был получен при t° = 40-42 °C (активность 103 ед/г). Зависимость активности фермента от температуры представлена на рисунке 4. Стоит отметить, что при низких температурах активность фермента крайне мала (при 20 °С активность менее 20 ед/г).

120

100

и*

80

н п 60

о

и

ш я 40

и

и

< 20

0

0 7 14 21 28 30 32 34 36 38 40 42 50 60 Температура, С

Рисунок 4 - Зависимость активности липазы от температуры

Аналогичным образом определяли оптимальный для биосинтеза уровень рН среды. Регулирование необходимого значения рН в субстрате проводили путем добавления

в питательную среду щелочи (КаОИ), либо кислоты (Н28О4).

Определение липолитической активности проводили в диапазоне рН=2-13 с шагом в 1 единицу активной кислотности.

В результате эксперимента установлено, что наиболее активный ферментный препарат можно получить путем культивирования продуцента при рН=6 (107,4 ед/г). При рН<3 активность липазы близка к 0.

Результаты эксперимента отображены на рисунке 5.

120

100

1-е

* 80

<U

Л

H

о 60

К

Ü 40

M

<

20

0

— — —

—

п

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

pH

Рисунок 5 - Зависимость липолитической активности от pH

Результаты подбора оптимальных условий индукции биосинтеза рекомбинантной липазы LipA, продуцируемой трансформированными клетками E. coli TOP-10 представлены в таблице 1.

Таблица 1

Оптимальные условия для биосинтеза рекомбинантной липазыклетками E.coli

Параметр оптимизации Величина

Время внесения ГРТв 4ч

Время биосинтеза после внесения 4ч

индуктора

Общее время культивирования 8ч

Концентрация индуктора 1ммоль

Температура 42°С

рН 6

В результате выполнения данной работы были оптимизированы условия биосинтеза рекомбинантной липазы клетками E.coli. Полученные результаты могут быть использованы для разработки лабораторного регламента получения рекомбинантной липазы ЫрЛ [5].

ЛИТЕРАТУРА

1 Черенков, Д. А. Получение термостабильной липазы с помощью методов компьютерного моделирования и генной инженерии [Текст] / Д. А. Черенков, В. А. Анненков,

E. В. Першина и др. // Актуальная биотехнология. - 2013. - №3. - С. 34-35.

2 Полыгалина, Г. В. Определение активности ферментов [Текст] / Г. В. Полыгалина, В. С. Чередниченко, Л. В. Римарева. - М.: ДеЛи принт, 2003 - 375 с.

3 Ahmad, S. Thermostable Bacillus subtilis lipases: in vitro evolution and structural insight [Text] / S. Ahmad, M. Z. Kamal, R. Sankarana-rayanan et al // J. Mol. Biol. - 2008. -№ 381 (2). -P. 324-340.

4 Don, S. M. Optimal conditions for the growth of E. coli [Text] / S. M. Don // Biology EEI- 2008. - № 4. - P. 3-18.

5 Shariff F. M. A newly isolated thermostable lipase from Bacillus sp [Text] /

F. M. Shariff, R. N. Rahman, M. Basri et al // J. Mol. Sci. - 2011. - № 12(5). - P. 2917 - 34.

REFERENCES

1 Cherenkov, D. A. Production of thermostable lipases using computer modeling and genetic engineering [Text] / D. A. Cherenkov, V. A. Annenkov, E. V. Pershyna et al // Actual biotechnology. - 2013. - № 3. - P. 34-35.

2 Polygalina, G. V. Determination of enzyme activity [Text] / G. V. Polygalina, V. S. Chered-nychenko, L. V. Rimareva. - M.: DeLee print, 2003 - 375 p.

3 Ahmad, S. Thermostable Bacillus subtilis lipases: in vitro evolution and structural insight [Text] / S. Ahmad, M. Z. Kamal, R. Sankarana-rayanan et al // J. Mol. Biol. - 2008. -№ 381 (2). -P. 324-340.

4 Don, S. M. Optimal conditions for the growth of E. coli [Text] / S. M. Don // Biology EEI.- 2008. - № 4. - P. 3-18.

5 Shariff, F. M. A newly isolated thermostable lipase from Bacillus sp [Text] / F. M. Shariff, R.N. Rahman, M. Basri et al // J. Mol. Sci. -2011. - № 12(5). - P. 2917 - 34.