Устойчивость актиномицетов-продуцентов к собственным антибиотикам

Устойчивость актиномицетов-продуцентов к собственным антибиотикам

В. Г. БУЛГАКОВА, Т. И. ОРЛОВА, А. Н. ПОЛИН

Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова

Resistance of Antibiotic-Producing Actinomycetes to Their Own Antibiotics

V. G. BULGAKOVA, T. I. ORLOVA, A. N. POLIN M. V. Lomonosov Moscow State University

Синтезирующие антибиотические вещества микроорганизмы обладают механизмами, защищающими их от собственный антибиотиков. Анализу механизмов резистентности продуцентов, большинство которых составляют стрептомицеты, посвящено большое количество публикаций, в том числе ряд обзоров [1—6]. Приведённый в данном обзоре список работ, касающихся механизмов и генетических основ устойчивости продуцентов к образуемым ими антибиотикам, далеко не исчерпывает имеющиеся публикации на эти темы.

Три основных, наиболее распространённых среди продуцентов способа защиты от собственный антибиотиков — модификация молекулы, приводящая к инактивации антибиотика, модификация мишени действия антибиотика и эфф-люкс (выброс) вещества из клеток. Кроме того, снижение внутриклеточной концентрации вещества может достигаться путём его связывания со специфическими белками. Для большинства продуцентов характерно сочетание нескольких механизмов самозащиты.

Биосинтез антибиотиков, как правило, начинается при замедлении роста продуцента и переходе культуры в стационарную фазу. К этому моменту клетки должны уже содержать белки, модифицирующие вещество или мишень, и (или) активные механизмы экспорта антибиотика из клетки. Ряд исследователей считает, что экспрессия генов устойчивости индуцируется сублеталь-ными концентрациями антибиотика или интермедиатами пути синтеза вещества.

Механизмы устойчивости продуцентов в основном аналогичны механизмам антибиотикоре-зистентности бактерий. Предполагается существование двух путей происхождения генов устойчивости бактерий. Большинство генов, определяющих устойчивость бактерий, в том числе патогенных, получено ими путем горизонтально-

© Коллектив авторов, 2010

Адрес для корреспонденции: 119899 Москва, Воробьевы горы. Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова

го переноса с помощью мобильных элементов (плазмид, транспозонов, интегронов) от продуцирующих антибиотические вещества почвенныгх актиномицетов. В то же время широкое использование антибиотиков привело и приводит к распространению детерминант устойчивости, происходящих от собственный генов бактерий [4—7]. Существует представление и о параллельной эволюции генов устойчивости продуцентов антибиотиков и непродуцирующих бактерий [8].

Ферментативная инактивация антибиотиков

Среди стрептомицетов-продуцентов широко распространена способность к инактивации образуемый ими антибиотиков, определяемая синтезом ферментов, ацетилирующих аминогруппы молекул с использованием в качестве кофактора ацетил-КоА или осуществляющих О-фосфори-лирование гидроксилов с использованием АТФ.

Образование ацетилтрансфераз и фосфотран-сфераз характерно для большинства продуцентов аминогликозидных антибиотиков. Аминоглико-зидацетилтрансферазы обнаружены у продуцентов канамицина S.kanamyceticus, небрамицина S.tenebrarius, касугамицина S.kasugaensis. Стрептомицеты, синтезирующие аминогликозиды нео-мициновой группы — неомицин (S.fradiae), паро-момицин (S.rimosus forma paromomycinus), ливидомицин (S.lividae), рибостамицин (S.ribo-sidificus), образуют одновременно ацетилтранс-феразы и фосфотрансферазы, кодируемые генами aac и aph соответственно [2, 3, 6].

Однако обнаружение ацетилтрансфераз у продуцентов не всегда свидетельствует о решающей роли этих ферментов для проявления устойчивости, часто ацетилтрансферазы яляются лишь дополнительным фактором устойчивости, или, как и некоторые фосфотрансферазы и гликозил-трансферазы, не связаны непосредственно с устойчивостью, но участвуют в процессе биосинтеза антибиотиков [2, 3, 9, 10].

О

Основной фермент, инактивирующий стрептомицин у S.griseus, стрептомицин-6-фосфо-транфераза, кодируемая геном арНБ, кроме того, продуцент синтезирует стрептомицин-3 -фосфо-трансферазу, определяемую геном агНЕ [2, 11]. Фосфотрансфераза, кодируемая геном spcN, инактивирует спектиномицин, синтезируемый S.flavopersicus [12].

Продуцент аминоциклитольного антибиотика гигромицина В S.Нygroscopicus образует инактивирующую антибиотик О-фосфотрансферазу [2]. Структурно не связанным с гигромицином В гигромицин А также инактивируется образуемой продуцентом О-фосфотрансферазой. Однако предполагается, что фермент не имеет решающего значения для устойчивости продуцента [13].

Исследованы гены, кодирующие ацетил-трансферазы, у продуцентов стрептотрицина S.lavendulae, нурсеотрицина S.noursei, пуроми-цина S.alboniger [2, 3]. Продуцент блеомицина S.verticillus синтезирует кодируемую геном Ь1тВ М-ацетилтрансферазу параллельно с процессом образования антибиотика [14]. Продуцент циклического пептида капреомицина S.capreolus образует определяемую геном сас ацетилтранс-феразу, инактивирующую все 4 компонента ка-преомицинового комплекса и кодируемую геном cpН фосфотрансферазу, инактивирующую некоторые компоненты комплекса [15].

Ген cpt определяет инактивацию хлорамфени-кола в клетках продуцента S.venezuelae О-фосфо-рилированием [6, 16].

Многие продуценты избегают летального воздействия образующихся антибиотиков, синтезируя неактивные промежуточные продукты и освобождая активную форму вещества лишь на последнем этапе биосинтеза. Рибосомы при этом могут сохранять чувствительность весь период синтеза антибиотика. Виды стрептомицетов, синтезирующие стрептомицин и близкие соединения, обладают фосфотрансферазами, появляющимися в клетках на ранних стадиях роста продуцента и фосфорилирующими интермедиаты пути биосинтеза антибиотических веществ [2]. Последняя стадия биосинтеза стрептомицина — превращение 6-фосфорилстрептомицина в активный антибиотик внеклеточными фосфатаза-ми. Показано образование культурой S.griseus выделяемых в среду фосфатаз, расщепляющих стрептомицин-6-фосфат и, более медленно, стрептомицин-3-фосфат [17].

В процессе синтеза культурой S.griseus 88р. griseus хромомицина А3 — антибиотика из группы ауреоловой кислоты — промежуточные продукты биосинтеза не активны и лишь на последнем этапе неактивныш дидеацетилированный хромоми-цин А3 правращается в ацетилированную активную форму ферментом, локализованным, как

предполагают, в клеточной мембране и кодируемым геном ^тЛ [18].

Ряд продуцентов осуществляет гликозилиро-вание активных молекул (или их предшественников) с последующим дегликозилированием [10, 19]. Клетки продуцента макролида олеандомици-на S.antibioticus синтезируют гликозилтрансфера-зы, инактивирующие этот антибиотик. Помимо генов oleD и oleL, кодирующих эти ферменты, геном продуцента содержит ген oleB, который кодирует транспортную систему, экскретирующую гликозилированный олеандомицин из клеток. Гликозидаза, синтез которой определяется геном oleR, превращает антибиотик в активную форму в культуральной жидкости. Рибосомы продуцента сохраняют чувствительность к олеандомицину на всем протяжении развития культуры [19, 20].

Макролиды метимицин и пикромицин синтезируются S.venezuelae как неактивные дигликози-ды. Продуцент образует гликозидазу, способную транспортироваться через клеточную мембрану и превращать дигликозиды в активную форму во внешней среде. Однако гликозилирование и дег-ликозилирование — только дополнительный способ защиты продуцента. Основной механизм резистентности — модификация 238 рРНК [10]. Продуцент макролидного антибиотика спирами-цина S.ambofaciens синтезирует гликозилтрансфе-разу [9]. При этом основной механизм устойчивости продуцента спирамицина — модификация рибосом [21].

Модификация мишеней действия антибиотиков

Один из наиболее эффективных способов защиты продуцентов от синтезируемых ими антибиотиков — модификация связывающих эти вещества специфических рецепторов.

Механизм антибактериального действия многих антибиотиков основан на ингибировании синтеза белка путем связывания активного вещества с рибосомальной РНК и нарушения функционирования рибосом. Модификация рибосом, обеспечивающая устойчивость к ингибиторам синтеза белка, широко распространена как среди бактерий, так и среди продуцентов этих антибиотиков.

Посттранскрипционная модификация рибосом осуществляется специфическими ферментами метилтрансферазами, метилирующими определенные сайты рибосомальной РНК. Происходит точечное метилирование 238 рРНК в субъединице 508 или 168 рРНК в субъединице 308. Модификация рибосомальной РНК резко снижает или устраняет способность рибосом связышать антибиотик.

Метилирование рибосомальной РНК определяет устойчивость продуцентов к большинству ами-ногликозидов и макролидов, антибиотикам группы

е

МЛС, включающей ряд макролидов, линкозамиды и стрептограмин В, и другим антибиотическим веществам. Кодируемые соответствующими генами метилазы осуществляют метилирование (или диметилирование) 238 рРНК или 168 рРНК [2, 3].

Рибосомальная устойчивость продуцентов аминогликозидныгх антибиотиков определяется метилированием 168 рРНК 308 субъединицы. У продуцента канамицина S.kanamyceticus ген ктт кодирует фермент, метилирующий остаток 01405 168 рРНК 308 субъединицы [2]. Метилирование остатков 01405 и А1408 168 рРНК осуществляют гены kgmB и kamB, клонированные из продуцента небрамицина S.tenebrarius [2, 22].

Виды Micromonospora, синтезирующие ами-ногликозиды, обладают высокой устойчивостью к собственным и структурно близким антибиотикам, обусловленной метилированием 168 рРНК. Кодирующие метилазы гены типа grm или sgm были клонированы из видов Micromonospora, синтезирующих гентамицин или сизомицин [2, 23, 24]. Продуцент фортимицина А M.olivasterospora содержит ген типа grm-fmrO, кодирующий 168 рРНК-метилтрансферазу [25].

Устойчивость продуцентов ингибиторов синтеза белка — макролидов, а также антибиотиков группы МЛС обусловлена метилированием 238 рРНК 308 субъединицы. Устойчивость определяется широко распространёнными среди продуцентов этих антибиотиков генами типа erm [26]. Эти гены кодируют метилтрансферазы, осуществляющие моно- и диметилирование остатка А2058 в 238 рРНК у продуцентов спирамицина, метимицина, мицинамицина, эритромицина, карбомицина, тилозина, линкомицина, линкоза-мида целестицетина [10, 21, 27,28].

Метилирование остатка А2058 ферментом, кодируемым геном smrЛ из продуцента спирамицина S.ambofaciens, выиышает высокую устойчивость к спирамицину и линкомицину, умеренную устойчивость к некоторым макролидам и низкую — к тилозину и эритромицину. При этом мутанты с инактивированным геном smrЛ способны синтезировать спирамицин. Видимо, устойчивость в данном случае связана с другим метилирующим рибосомы геном типа erm-smrD [21].

Отмечены фенотипические различия, наблюдаемые при моно- и диметилировании остатков А2058 генами типа erm. Монометилирование дает высокую устойчивость к линкозамидам и небольшую — к макролидам, диметилирование — дает устойчивость к макролидам, линкозамидам и стрептограмину В. Ряд продуцентов макролидов содержит гены типа erm, кодирующие монометилирование рибосом. Гены Ф, carB и srm у продуцентов целестицетина, карбомицина и спирамицина кодируют фермент, осуществляющий монометилирование остатков А2058 [28, 29] Ген

ermE продуцента эритромицина SaccНaropolyspora erytНraea, осуществляющий диметилирование А2058, дает высокую устойчивость ко всем антибиотикам группы МЛС [29].

Метилирование 238 рРНК происходит у продуцента авиламицина S.viridocНromogenes. Антибиотик относится к группе ортосомицинов и ингибирует синтез белка у бактерий. Устойчивость определяется тремя генами, один кодирует ме-тилтрансферазу, метилирующую остаток 02535 238 рРНК, второй модифицирует остаток и2479, в каждом случае происходит монометилирование. Третий ген кодирует АТФ-зависимую систему транспорта [30, 31].

У некоторых продуцентов имеется по нескольку генов, осуществляющих моно- и диметилирование остатков А2058 238 рРНК. Продуцент тилозина S.fradiae содержит ген trlЛ (ermCF), кодирующий диметилирование, ген trlD, осуществляющий монометилирование А2058 и ген trlB ^шЛ11), кодирующий монометилирование остатка 0748 238 рРНК [32]. При этом ген 1тШ дает устойчивость исключительно к тилозину из-за особенностей строения молекулы этого антибиотика [33, 34]. Показано [32, 35], что каждый из монометилирующих генов S.fradiae не может обеспечить устойчивость к собственному антибиотику, лишь синергидное действие генов trlB и 1гШ дает устойчивость продуцента.

Наличие нескольких генов, обеспечивающих устойчивость, часто встречается у образующих антибиотики актиномицетов. Среди продуцентов макролидов по два гена, дающих устойчивость, обнаружено у продуцентов карбомицина и мицинамицина, по 4 гена клонировано из продуцента тилозина, 5 — из продуцента олеандомицина [19, 21]. При этом множественность генов устойчивости часто обусловливает наличие у продуцентов нескольких различных механизмов, позволяющих избегать летального воздействия синтезиру-емыгх антибиотиков.

Некоторые продуценты, модифицирующие собственные рибосомы, обладают конститутивной устойчивостью, у других происходит индукция устойчивости. Для продуцентов макролидов и ряда аминогликозидов характерна индуцируемая устойчивость к собственному антибиотику — начало синтеза активирует гены, кодирующие трансметилазы [32, 36]. Продуцент тилозина S.fra-diae содержит и индуцируемый антибиотиком или его предшественниками ген ИгЛ (ermSF) и ген дающий конститутивную устойчивость [6, 36].

Большинство ингибиторов белкового синтеза действует непосредственно на рибосомы, чему соответствует широкое распространение модификации рибосом как механизма устойчивости. В то же время существует ряд антибиотиков, относящихся по структуре к различным типам, подав-

e

ляющих синтез бактериального белка путем воздействия на фактор элонгации полипептидной цепи Ти [37].

Исследование фактора Ти из высокоустойчивых к собственному антибиотику продуцентов кирромицинов S.cinnamoneus и Nocardia lactamdu-тт дало противоречивые результаты относительно значения устойчивости фактора Ти для устойчивости продуцентов [2, 38]. В дальнейшем более подробное изучение фактора Ти из продуцента кирромицина S.ramocissimus показало,что стрептомицет имеет три гена, кодирующих изоферменты — факторы Ти. Два гена кодируют чувствительные к кирромицину факторы Ти, ген 1цЗЗ кодирует устойчивый к этому антибиотику и близким соединеням изофермент Ти3 [39]. Образование двух форм мишени — чувствительной и устойчивой (последней — с началом синтеза антибиотика) — один из защитных механизмов стрептомицетов-продуцентов, в частности, продуцента новобиоцина [2, 40]. Однако транскрипция гена Ш^3 у S.ramocissimus не коррелирует с синтезом кирромицина и не индуцируется антибиотиком, на всём протяжении развития культуры в клетках доминирует чувствительная форма фактора Ти. Предполагается, что устойчивый фактор Ти не определяет резистентность S.ramo-cissimus к кирромицину [39].

Помимо продуцентов ингибиторов синтеза белка, модификация мишени действия антибиотика характерна и для продуцентов веществ с иным механизмом действия.

Антибиотики ансамицины (рифамицин, стреп-товарицин, стрептолидигин и др.) подавляют активность бактериальной ДНК-зависимой РНК-полимеразы, связываясь с этим ферментом и образуя прочный комплекс с его В субъединицей. У продуцентов рифамицина Nocardia mediterranei, стрептоварицина S.spectabilis, стреп-толидигина S.lydius обнаружена модификация РНК-полимеразы, препятствующая образованию комплекса с антибиотиком и обеспечивающая высокую устойчивость продуцентов к собственным антибиотикам [41].

Антибиотик новобиоцин, образуемый S.spНaeroides, ингибирует бактериальную ДНК-гиразу — фермент, осуществляющй АТФ-зависи-мое образование отрицательных витков суперспирали ДНК. Устойчивость продуцента связана с двумя генами: ген gyrBS кодирует чувствительную к новобиоцину ДНК-гиразу, синтезирующуюся конститутивно, ген gyrBR — устойчивый фермент с модифицированной субъединицей В, синтез фермента начинается в присутствии новобиоцина как ответ на воздействие антибиотика на чувствительную ДНК-гиразу [40].

Антибиотики гликопептиды подавляют синтез бактериальной клеточной стенки, связышаясь с С-

концевыми дипептидами Б-аланил-Б-аланин, входящими в состав дисахарид-пентапептидов — предшественников пептидогликана. В результате происходит ингибирование трансгликозилирова-ния и транспептидазной реакции и блокирование последних стадий синтеза пептидогликана — включения предшественника в растущие цепи полимера и образования поперечных сшивок Устойчивые к гликопептидным антибиотикам бактерии модифицируют дипептид-мишень, специфически заменяя ее дипептидом Б-аланил-Б-лактат. Изменение биосинтетических процессов в клеточной стенке осуществляется кластерами генов van, кластеры включают до семи генов типа van [42, 43].При этом ген vanH кодирует редуктазу, превращающую пируват в Б-лактат, ген vanA кодирует фермент, синтезирующий дипептид Б-аланил-Б-лактат, ген vanX ответственен за синтез высокоспецифичной Б,Б-дипептидазы, гидролизующей Б-аланил-Б-аланин, но не Б-аланил-Б-лактат В геномах актиномицетов — продуцентов гликопептидов идентифицированы гомологи генов типа van, обеспечивающих устойчивость к этим антибиотикам энтерококков и стафилококков [44, 45].

Замена Б-аланина на Б-лактат у продуцентов гликопептидов обеспечивается кодируемыми кластером генов vanHAX ферментами, обнаруживаемыми у продуцента антибиотика А47934 S.toy-ocaensis, продуцента ванкомицина Amycolatopsis orientalis и других подвидов A.orientalis — продуцентов ристоцетина, тейкопланина, авопарцина, а также продуцента тейкопланина Actinoplanes tei-chomyceticus [44, 45]. Анализ предшественников пептидогликана у A.teichomyceticus показал наличие концевых структур Б-аланил-Б-лактат, структур Б-аланил-Б-аланин обнаружено не было. Продуцент устойчив как к собственному антибиотику, так и к ванкомицину [45].

Эффлюкс антибиотиков из клеток продуцентов

Большую роль в антибиотикоустойчивости микроорганизмов, в т. ч. продуцентов, играют системы активного выброса (эффлюкса) веществ из клеток — АТФ-зависимые транспортные белки (ATP-binding cassette (ABC) — transporters). Системы эффлюкса включают АТФ-связывающие гидрофильные белки и гидрофобные трансмембранные белки, обеспечивающие сочетание энергии гидролиза АТФ и транспорта веществ через мембрану [46, 47]. У большинства продуцентов гены АВС-транспортеров ассоциированы с кластером генов биосинтеза антибиотиков.

Системы эффлюкса осуществляют выщеление антибиотических веществ во внешнюю среду и, соответственно, имеют большое значение для устойчивости продуцентов [2, 48]. Часто устойчи-

e

вость продуцентов обеспечивается одновременным действием системы эффлюкса и каким-либо иным механизмом резистентности, например, метилированием рРНК [30]. Сочетание гликозили-рования олеандомицина продуцентом S.antibioti-cus, выщеления неактивной формы антибиотика в среду АТФ-зависимой транспортной системой, кодируемой геном Ole B [20], и внеклеточной реактивации антибиотика описано выше.

Практически любой продуцент должен экспортировать образуемый им антибиотик в среду и обеспечивать защиту от ранее выделенного вещества. Для тех продуцентов, у которыж не образуются инактивирующие антибиотик ферменты, а мишени действия антибиотика сохраняют чувствительность в период биосинтеза, активный эфф-люкс имеет особенно большое значение.

Продуценты антибиотиков-макролидов, резистентность которыж к собственным антибиотикам связана с модификацией рибосом, также обладают системой активного транспорта, обеспечивающей выброс антибиотиков или их гликозилированных предшественников [48].

АВС-транспортеры обнаружены и у стрептоми-цетов, устойчивость которыж к образуемым ими антибиотикам обыгано связыгаают с ферментативной инактивацией этих соединений. Из синтезирующего ацетилтрансферазу продуцента касугамицина S.kasugaensis клонирован ген kasK, кодирующий АТФ-связыгаающий белок, и гены kasL и kasM, кодирующие мембранные белки [49]. Стрептомицет S.capreolus образует капреомицин и антибиотик А201А и инактивирует эти соединения путем ацети-лирования и фосфорилирования [15], при этом ген ardl обеспечивает специфическую устойчивость к антибиотику А201А, кодируя белок, аналогичный белкам АВС-транспортеров [50].

Из генома продуцента олигопептидного антибиотика нетропсина S.flavopersicus выщелен и клонирован фрагмент ДНК, определяющий устойчивость продуцента к собственному антибиотику. Гены, входящие в этот фрагмент, кодируют белки типа белков-транспортеров. Каждый белок содержит трансмембранный и АТФ-связыгаающий домены, формирующие систему эффлюкса нетропсина [51].

Гены типа tet кодируют элементы системы эффлюкса у продуцентов тетрациклина и оксите-трациклина S.aureufaciens и S.rimosus [52].

Устойчивость продуцента актинородина S.coelicolor обеспечивается системой транспорта, функционирование которой определяется двумя генами — actA и actR. Ген actA кодирует транс-мембранную систему эффлюкса, ген actR — ре-прессор гена actA. При этом неактивный предшественник актинородина может дерепрессировать транскрипцию гена actA при концентрациях более низких, чем сам антибиотик. Таким образом,

еще до появления в клетках актинородина предшественник-сигнал снимает репрессию гена actЛ и индуцирует синтез системы эффлюкса [53]. Предполагается возможность существования аналогичных механизмов координации биосинтеза и экспорта антибиотиков у продуцентов, устойчивость которыж зависит от эффлюкса, а также возможность координации биосинтеза и других механизмов самозащиты продуцентов, например, модификации мишеней, которые должны быть защищены до появления антибиотика в клетке [4]. Образование же неактивныж интермедиатов пути синтеза антибиотиков характерно для многих продуцентов.

У продуцента противоопухолевого антибиотика митрамицина S.argillaceus ген ш1гЛ кодирует АТФ-связыгаающий белок АВС-транспортера, ген т^ кодирует интегральный мембранный белок. Система эффлюкса обеспечивает высокую устойчивость к митрамицину, но не дает резистентности к хромомицину и оливомицину [54]. Устойчивость к даунорубицину и доксорубицину продуцента этих антибиотиков S.peucetius определяется генами ddrЛ и ddrB, кодирующими соответственно АТФ-связыгаающий и трансмембранный белок, взаимодействие этих белков обеспечивает эффективный выброс веществ из клеток [55].

У некоторыж продуцентов механизмы самозащиты включают синтез белков, которые связыгаают образующийся антибиотик, нейтрализуя его таким способом. Продуцент блеомицина S.ver1icil-1ш содержит два гена, определяющих устойчивость — ген Ь^, кодирующий ацетилтрансферазу, и ген bleЛ, кодирующий блеомицин-связыгаающий белок [14].

Связывание с внутриклеточным белком — один из механизмов (или часть общего механизма) устойчивости продуцента митомицина С S.lavendulae к собственному антибиотику. Активность митомицина С обусловлена способностью этого вещества взаимодействовать с ДНК с образованием поперечныж сшивок, что приводит к прекращению синтеза и к деградации ДНК. Синтезируемые молекулы митомицина С не обладают активностью, но становятся активными после ферментативного восстановления, превращающего антибиотик в эффективный алкилирующий агент. Устойчивость продуцента определяют три генетических фрагмента. Локус шсг, содержащий ген т^Л, кодирует флавофермент, который окисляет восстановленным митомицин С, инактивируя его. Белок, кодируемый геном тМ, связывает инактивированный митомицин С и предотвращает восстановление и реактивацию антибиотика. Однако значительная часть синтезируемого митомицина С обнаруживается в культуральной жидкости. Установлено, что ген mct кодирует ассоциированный с мембраной интегральный бе-

Є

лок, участвующий, видимо, в экспорте антибиотика. Предполагается функциональное взаимодействие генов mcrA, mrd и mct и их продуктов, обеспечивающее внутриклеточное окисление митомицина С, связывание его белком и экспорт из клеток [5б—58].

У большинства продуцентов гены резистентности локализованы в кластере биосинтетических генов. Показана тесная связь, согласованное функционирование и совместная регуляция этих генов [3, 31, 52, 59, б0], у некоторых продуцентов ферменты, кодируемые генами устойчивости, непосредственно участвуют в процессе биосинтеза антибиотика [48, 5б, 59—б1].

Для ряда стрептомицетов отмечена корреляция уровня устойчивости к собственному антибиотику и продуктивности. Например, инактивация гена, кодирующего систему эффлюкса у высокопродуктивного мутанта продуцента тетрациклина S.aureofaciens, приводит к резкому снижению устойчивости и антибиотической активности [52]. Увеличение уровня устойчивости продуцентов используется как способ повышения их продуктивности [б2]. Мутанты S.kanamyceticus с повышенной устойчивостью к канамицину и гентами-цину обнаруживают увеличение антибиотической активности [3].

На примере продуцента актинородина S.coeli-color описан новый подход к повышению продуктивности — получение мутантов, устойчивых к различным антибиотикам (не синтезируемым этим стрептомицетом). Устойчивость к стрептомицину, гентамицину и рифампину увеличивает продуктивность вдвое, у мутантов с устойчивостью к 7—8 антибиотикам антибиотическая активность повышается в 180 раз по сравнению с исходным штаммом [бЗ, б4].

Изучение механизмов устойчивости актино-мицетов к собственным антибиотикам позволяет

ЛИТЕРАТУРА

1. Demain A. L. How do antibiotic-producing micro-organisms avoid suicide? Ann. NY Acad. Sci 1974; 235: б01-б12.

2. Cundliff E. How antibiotic-producing organisms avoid suicide. Annu Rev Microbiol 1989; 43: 207-233.

3. Федоренко В. A. Генетические механизмы устойчивости актино-мицетов к аминогликозидным антибиотикам. Антибиотики и хи-миотер 1999; 44: 9: 29—Зб.

4. Hopwood D. A. How do antibiotic-producing bacteria ensure their selfresistance before antibiotic biosynthesis incapacitates them? Mol Microbiol 2007; б3: 4: 937—940.

5. Davies J. Origins and evolution of antibiotic resistance. Microbiologia 199б; 12: 1: 9-1б.

6. Миндлин С. 3.,Петрова M. А.,Басс И. А.,Горленко Ж. M. Происхождение, эволюция и миграция генов лекарственной устойчивости. Генетика 200б; 42: 11: 1495-1511.

7. Martinez J. L. Antibiotics and antibiotic resistance genes in natural environments. Science 2008; 321: 5887: 3б5—3б7.

8. Woo P. C., Lau S. K., Huang Y., Yuen K. Y. Genomic evidence for antibiotic resistance genes of actinomycetes as origins of antibiotic resistance genes in pathogenic bacteria simply because actinomycetes

выявить возможности увеличения активности продуцентов значимых антибиотиков и получения мутантов с повышенной устойчивостью и более активным синтезом антибиотических веществ.

Большой интерес представляют продуценты как резервуар детерминант антибиотикоустойчиво-сти для бактерий, в том числе патогенных. Многие стрептомицеты способны образовывать несколько антибиотиков. Эти продуценты, соответственно, имеют гены, обеспечивающие устойчивость к синтезируемым ими веществам. Однако в некоторых случаях в геноме продуцентов обнаруживаются детерминанты устойчивости к антибиотикам, не синтезируемым данным микроорганизмом. S.coelicolor не образует гликопептидных антибиотиков, однако геном стрептомицета содержит кластер из семи генов vanSRJKHAX, дающий высокую устойчивость к ванкомицину, индуцируемую гликопептидами (кроме тейкопланина) [б0, б5]. Более того, исследования последних лет показывают, что почвенные изоляты стрептомицетов могут синтезировать ферменты, инактивирующие полусинтетические и синтетические антимикробные вещества. Практически каждый штамм из выделенных из разных почв 480 стрептомицетов был достаточно высокоустойчив к 7—8 и более антибиотикам, в том числе не только к природным и полусинтетическим препаратам, но и к полностью синтетическим веществам (ципрофлоксацин, линезолид), а также к совершенно новым антибиотикам (телитромицин, тигециклин) [бб].

Проблемы, связанные с возникновением устойчивости актиномицетов-продуцентов, с взаимозависимостью и взаимосвязью биосинтеза антибиотиков и устойчивостью к ним, а также «предсуществующая» устойчивость этих микроорганизмов еще недостаточно изучены и будут, несомненно, являться предметом дальнейших исследований.

are more ancestral than pathogenic bacteria. Med.Hypotheses 200б; б7: б: 1297-1304.

9. Gourmelen A., Blondelet-Rouault M-H., Pernodet J-L. Characterization of a glycosyl transferase inactivating macrolides, encoded by gimA from Streptomyces ambofaciens. Antimicrob Agents Chemother 1998, 42: 10: 2б12—2б19.

10. Zhao L., Beyer N. J., Borisova S. A., Liu H. W. Beta-glucosylation as a part of self-resistance mechanism in methymycin/picromycin producing strain Streptomyces venezuelae. Biochemistry 2003; 42: 50: 14794—14804.

11. Lim C. K, Smith M. C., Petty J. et al. Streptomyces griseus streptomycin phosphotransferase: expression of its gene in Escherichia coli and sequence homology with other antibiotic phosphotransferases and with eukariotic protein kinases. J Gen Microbiol 1989; 135: 12: 3289—3302.

12. Lyutzkanova D., Distler J., Altenbuchner J. A spectinomycin resistance determinant from the spectinomycin producer Streptomyces flavopersi-cus. Microbiology 1997: 143: 7: 2135-2143.

13. Dhote V., Gupta S., Reinolds K. A. An O-phosphotransferase catalyzes phosphorylation of hygromycin A in the antibiotic-producing organism Streptomyces hygroscopicus. Antimicrob Agents Chemother 2008; 52: 10: 3580—3588.

14. Sugiyama M., Thompson C. J., Kumagai T. et al. Characterisation by molecular cloning of two genes from Streptomyces verticillius encoding resistance to bleomycin. Gene 1994; 151: 1—2: 11—1б.

Є

15. Thiara A. S., Cundliffe E. Analysis of two capreomycin-resistance determinants from Streptomyces capreolus and characterization of the action of their products. Gene 1995; 1б7: 1—2: 121—12б.

16. Izard T. Structural basis for chloramphenicol tolerance in Streptomyces venezuelae by chloramphenicol phosphotransferase activity. Protein Sci 2001; 10: 8: 1508—1513.

17. Mansouri K., Piepersberg W. Genetics of streptomycin production in

Streptomyces griseus: nucleotide sequence of five genes, strFGHIK, including a phosphatase gene. Mol Gen Genet 1991; 228: 3: 459—4б9.

18. Menendez N., Nur-e-Alam M., Brana A. F. et al. Tailoring modification

of deoxysugars during biosynthesis of antitumor drug chromomycin A3 by Streptomycesgriseus ssp. griseus. Mol Microbiol 2004; 53: 3: 903—915,

19. Quiros L. M., Aquirrezabalaga I., Olano C. et al. Two glycosyltransferases and a glycosidase are involved in oleandomycin modification during its biosynthesis by Streptomyces antibioticus. Ibid 1998; 28: б: 1177—1185.

20. Olano C., Rodriquez A. M., Mendes C., Salas J. A. A second ABC transporter is involved in oleandomycin resistance and its secretion by

Streptomyces antibioticus. Ibid 1995; 1б: 2: 333—343.

21. Pernodet J-L., Gourmelen A., Blonde let-Rouault M-H., Cundliff E. Dispensable ribosomal resistance to spiramycin conferred by srmA in the spiramycin producer Streptomyces ambofaciens. Microbiology 1999; 145: 9: 2355—23б4.

22. Vajic S., Anastasov N., Vasiljevic B. The kgvB gene, encoding ribosomal RNA methylase from Streptomyces tenebrarius, is autogenously regulated. Arch Microbiol 2004; 182: б: 475—481.

23.

24.

25.

2б

31,

32

Cundliffe E. Resistance to macrolides and lincosamides in Streptomyces lividans and to aminoglycosides in Micromonospora purpurea. Gene 1992; 115: 1—2: 75—84.

Kojic M., Topisirovic L., Vasiljevic B. Cloning and characterization of an aminoglycoside resistance determinant from Micromonospora zionensis. J Bacteriol 1992; 174: 23: 78б8—7872.

Ohta T.,Hasegawa M. Analysis of the self-defense gene (fmrO) of a for-timicin A (astromicin) producer, Micromonospora olivasterospora: comparison with other aminoglycoside-resistance-encoding genes. Gene 1993; 127: 1: б3—б9.

Weisblum B. Erythromycin resistance by ribosome modification. Antimicrob Agents Chemother 1995; 39: 3: 577—585.

27. Zalacain M, CundliffE. Methylation of 23S ribosomal RNA due to carB, an antibiotic-resistance determinant from the carbomycin producer, Streptomyces thermotolerans. Eur J Biochem 1990; 1189: 1: 67—72.

28. Calcutt M. J., Cundliff E. Cloning of a lincosamide resistance determinant from Streptomyces caelestis, the producer of celesticetin, and characterization of the resistance mechanism. J Bacteriol 1990; 172: 8: 4710—4704.

29. Pernodet J-L., Fish S., Blondelet-Rouault M-H., CundliffE. The macrolide-lincosamide-streptogramin B resistance phenotypes characterized by using a specifically deleted, antibiotic-sensitive strain of Streptomyces lividans. Antimicrob Agents Chemother 1996; 40: 3: 581—585.

30. Weitnauer G, Gaisser S., Treezer A. et al. An ATP-binding cassette transporter and two rRNA methyltransferases are involved in resistance to avilamycin in the producer organism Streptomyces viridochromogenes Tu57. Ibid 2001; 45: 3: 690—695.

Treede I., Jacobsen L, Kirpekar F. et al. The avilamycin resistance determinants AviRa and AviRb methylate 23S rRNA at the guanosine 2535 base and the uridine 2479 ribose. Mol Microbiol 2003; 49: 2: 309—318.

Liu M, Kirpekar F, Van Wezel G.P., Douthwaite S. The tylosin resistance gene trlB of Streptomyces fradiae encodes a methyltransferase that targets G748 in 23S rRNA. Ibid 2000; 37: 4: 811—820.

33. Lebars I., Hasson C., Yoshizawa S. et al. Recognition elements in rRNA for the tylosin resistance methyltransferase RimA (II). J Mol Biol 2007; 372: 2: 525—534.

34. Douthwaite S., Jakobsen l., Yoshizawa S., Fourmy D. Interaction of the tylosin-resistance methyltransferaseRlmA II at its rRNA target differs from the orthologue RimA I. Ibid 2008; 378: 5: 969—975.

35. Wilson V. T. W, Cundliffe E. Molecular analysis of tlrB, an antibiot-ic-resistance gene from tylosin-producing Streptomyces fradiae, and discovery of a novel resistance mechanism. J. Antibiot 1999; 52: 3: 288—296.

36. Memili E., Weisblum B. Essential role endogenously synthesized tylosin for induction of ermSF in Streptomyces fradiae. Antimicrob Agents Chemother 1997; 41: 5: 1203—1205.

37. Parmeggiani A., Nissen P. Elongation factor Tu-targeted antibiotics: four different structures, two mechanisms of action. FEBS Lett 2006; 580: 19: 4576—4581.

38. Cappellano C., Monti F., Sosio M. et al. Natural kirromycin resistance of elongation factor Tu from the kirrothricin producer Streptomyces cinna-moneus. Microbiology 1997; 143: 2: 617—624.

39. Olsthoorn-Tieleman L. N., Palstra R. J., van Wezel G. P. Elongation factor Tu3 from the kirromycin producer Streptomyces ramocissimus is resistant to three classes of EF-Tu-specific inhibitors. J Bacteriol 2007; 189: 9: 3581—3590.

40. Thiara A. S., Cundliffe E. Interplay of novobiocin-resistant and -sensitive BNA gyrase activities in self-protection of the novobiocin producer, Streptomyces sphaeroides. Gene 1989; 81: 1: 65—72.

41. Roza J., Blanco M. G., Hardisson C., Salas J. A. Self-resistance in actin-omycetes producing inhibitors of RNA polymerase. J Antibiot 1986; 39: 4: 609—612.

42. Егоров А. М.,Сазыкин Ю. О. Резистентность к гликопептидным антибиотикам. Новые горизонты и проблемы. Антибиотики и хи-миотер 2001; 46: 6: 3—5.

43. Reynolds P. E., Courvalin P. Vancomycin resistance in enterococci due to synthesis of precursors terminating in B-alanyl-B-serine. Antimicrob Agents Chemother 2005; 49: 1: 21—25.

44. Marshall C. G., Lessard I. A. D., Park I-S., Wright G. D. Glycopeptide antibiotic resistance genes in glycopeptide-producing organisms. Ibid 1998; 42: 9: 2215—2220.

45. Beltrametti B., Consolandi A., Carran L. et al. Resistance to glycopeptide antibiotics in the teicoplanin producer is mediated by van gene homo-logue expression directing the synthesis of a modified cell wall peptido-glycan. Ibid 2007; 51: 4: 1135—1141.

46. Егоров А. М., Сазы1кин Ю. О. Реальность нового направления комбинированной химиотерапии. Скрининг ингибиторов эффлюкс-ных помп. Антибиотики и химиотер 2001; 46: 4: 3—5.

47. Locher K. P. Structure and mechanism of ATP-binding cassette transporters. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 2009; 364: 1514: 239—245.

48. Mendez C., Salas J. A. The role of ABC transporters in antibiotic-producing organisms: drug secretion and resistance mechanisms. Res Microbiol 2001; 152: 3—4: 341—350.

49. Ikeno S., Yamane Y., Ohishi Y. et al. ABC transporter genes, kasKLM, responsible for self-resistance of a kasugamycin producer strain. J Antibiot 2000; 53: 4: 373—384.

50. Barrasa M. I., Tercero J. A., Lacalle R. A., Jimenez A. The ardl gene from Streptomyces capreolus encodes a polypeptide of the ABC-trans-porters superfamily which confers resistance to the aminonucleoside antibiotic A201A. Eur J Biochem 1995; 228: 3: 562—569.

51. Stumpp T., Himbert S., Altenbuchner J. Cloning of the netropsin resistance genes from Streptomyces flavopersicus NRRL2820. J Basic Microbiol 2005; 45: 5: 355—362.

52. Dairi T., Aisaka K., Katsumata R., Hasegawa M. A self-defense gene homologous to tetracycline effluxing gene essential fom antibiotic production in Streptomyces aureofaciens. Biosci Biotechnol Biochem 1995; 59: 10: 1835—1841.

53. Tahlan K., Ahn S. K., Sing A. et al. Initiation of actinorhodin export in Streptomyces coelicolor. Mol Microbiol 2007; 63: 4: 937—940.

54. Fernandez E., Lombo F., Mendez C., Salas J. A. An ABC transporter is essential for resistance to the antitumor agent mithramycin in the producer Streptomyces argillaceus. Mol Gen Genet 1996; 251: 6: 692—698.

55. Kaur P., Rassell J. Biochemical coupling between the DrrA and DrrB proteins of the doxorubicin efflux pump of Streptomycespeucetius. J Biol Chem 1998; 273: 28: 17933-17939.

56. August P. R., Rahn J. A., Flickinger M. C., Sherman D. H. Inducible synthesis of the mitomycin C resistance gene product from Streptomyces lavendulae. Gene 1996; 175: 1—2: 261—267.

57. Sheldon P. J., Johnson D. A., August P. R. et al. Characterization of mitomycin-binding drug resistance mechanism from the producing organism, Streptomyces lavendulae. J Bacteriol 1997; 179: 5: 1796—1804.

58. Sheldon P. J., Mao Y., Sherman D. H. Mitomycin resistance in Streptomyces lavendulae includes a novel drug-binding-protein-dependent export system. J Bacteriol 1999; 181: 8: 2507—2512.

59. Martin J.F., Liras P. Organization and expression of genes involved in the biosynthesis of antibiotics and other secondary metabolites. Annu Rev Microbiol 1989; 43: 173—206.

e

60. Nodwell J. R. Novel links between antibiotic resistance and antibiotic 64. Wang G., Hosaka T.,Ochi K. Oramatic activation of antibiotic produc-

production. J Bacteriol 2007; 189: 10: 3683—3685. tion in Streptomyces coelicolor by cumulative drug resistance mutation.

61. Kim K. R, Kim T. J., Suh J. W. The gene cluster for spectinomycin Appl Environ Microbio1 2008; 74: 9: 2834—284°.

biosynthesis and the aminoglycoside-resistance function of 65. Hong H. J., Hutchings M. I., Neu J. M. et al. Characterization of an

Streptomyces spectabilis. Curr Microbiol 2008; 57: 4: 371—374. inducible vancomycin resistance system in Streptomyces coelicolor

62. Alderson G, Ritchie D. A, Cappellano C. et al. Physiology and genetics reveals a novel gene (vanK) re4uired for drug resistance. Mo1 Microbi°l

of antibiotic production and resistance. Res Microbiol 1993; 144: 8: 2004; 52: 4: 1107—1121.

665—672. 66. D Costa V. M., McGrann K. M., Hughes D. W., Wright G. D. Sampling

63. Hu H, OchiK Novel approach for improving the productivity ofantibi- the antibiotic resistome. Science 2006; 311: 5759: 374—377.

otic-producing strains by inducing combined resistant mutation. Appl

Environ Microbiol 2001; 67: 4: 1885—1892.