Способ получения средства, обладающего стресспротективной, антигипоксической и анксиолитической активностью
METHOD FOR PREPARING AN AGENT POSSESSING STRESS PROTECTIVE, ANTIHYPOXIC AND ANXIOLYTIC ACTIVITY

Изобретение относится к области фармации и касается способа получения средства, обладающего стресспротективной, антигипоксической и анксиолитической активностью.
Один из подходов в поиске эффективных растительных лекарственных средств заключается в исследование видов растений, близкородственных к официнальным. Известно, что многие систематически близкие виды зарекомендовали себя достаточно эффективными и равноценными по фармакологическим свойствам официнальным, при этом данные литературы подкрепляются экспериментальными исследованиями. Левзея сафлоровидная (Leuizea carthamoides (Willd.) является фармакопейным экдистероидсодержащим растением, на основе корневищ растения разработан препарат «Экдистен», основу которого составляет 20-гидроксиэкдизон. Rhaponticum uniflorum (левзеи одноцветковый) - восточноазиатский вид, широко распространенный на российском Дальнем Востоке и в Сибири и имеющий достаточные ресурсы. Надземная часть растения составляет значительную фитомассу, поэтому для комплексного и рационального использования лекарственного растительного сырья разработан экстракт сухой на основе травы левзеи одноцветковой и осуществлена оценка его фармакологической активности.
Разработано средство в виде экстракта сухого, обладающее стресспротективной, антигипоксической и анксиолитической активностью на основе травы левзеи одноцветковой.
Известен способ получения средства на основе корневищ с корнями левзеи одноцветковой в виде экстракта сухого. Препарат обладает стресспротективной и антигипоксической активностью [3]. Исследован химический состав надземной части левзеи одноцветковой. Установлено, что содержание основных действующих веществ в образцах травы левзеи одноцветковой примерно на 20-30% больше, чем в подземных органах. Содержание экдистерона в различных образцах травы левзеи одноцветковой - 1,68 до 1,82%, в образцах корневищ с корнями левзеи одноцветковой - 1,19 до 1,33% [6].
Недостатками указанного способа являются более низкое содержание основных действующих веществ, экдистероидов, а также слабо выраженная стресспротективная, антигипоксическая и анксиолитическая активность по сравнению со средством, полученным по предлагаемому способу.
Технический результат изобретения - расширение ассортимента лекарственных средств растительного происхождения, обладающих стресспротективной, активностью, повышение содержания экдистероидов, более выраженная стресспротективная, антигипоксическая и анксиолитическая активность, а также комплексное использование исходного растительного сырья.
Для этого растительный материал, состоящий из измельченной травы левзеи одноцветковой, экстрагируют трехкратно при отношении 1 мас. ч. сырья : 12 об. ч экстрагента при температуре 60°С. При первом контакте фаз используется экстрагент 60% этиловый спирт в течение 90 минут, при втором и третьем контакте фаз - экстракция 30% этиловым спиртом в течение 60 минут каждый. Спиртовые извлечения после экстракций упаривают до 1/3 первоначального объема. Объединенные кубовые остатки от трех извлечений сепарируют. Полученный продукт доупаривают приблизительно до 1/5 и высушивают в вакуум-сушильном шкафу. Выход готового продукта составляет 30,06% от массы растительного материала. Сухой экстракт, представляющий собой аморфный порошок коричневого цвета со специфическим запахом, потеря в массе при высушивании не более 5%.
Предлагаемый способ получения достаточно прост, не требует сложной схемы очистки, позволяет получить продукт постоянного состава. Технология может быть внедрена на предприятиях по выпуску лекарственных препаратов.
Изучены влияние природы экстрагента на извлечение экстрактивных веществ и экдистерона из исследуемого лекарственного растения. Для подбора типа экстрагента изучены процессы экстрагирования сырья водой очищенной, этиловым спиртом различной концентрации: 20, 30, 40, 50, 60, 70, 75, 95.
Количественная оценка содержания биологически активных веществ велась по выходу суммы экстрактивных веществ [2] и содержанию экдистерона [6] (табл. 1).
Наибольшее извлечение экстрактивных веществ при использовании 30% этанолового спирта и воды очищенной, 60% этанол обеспечивает максимальное извлечение экдистерона.
В продолжении исследований изучили влияние различных факторов на извлечение экстрактивных веществ. Степень измельчения растительного сырья 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 5,0 мм. Соотношение сырье: экстрагент 1:5; 1:7; 1:8; 1:10; 1:12; 1:13; 1:14; 1:15; 1:16; 1:17 при однократной экстракции. Подбор температуры экстракции проводился при комнатной температуре (22°С), 30°;С 40°С, 50°С 60°С, 70°С 80°С, 90°С и температуре кипения водяной бани (около 100°С) (табл. 2).
Примечание: в таблице приведены средние данные из трех определений.
Примечание: в таблице приведены средние данные из трех определений
В результате проведенных исследований установлены оптимальные условия экстрагирования травы левзеи одноцветковой: соотношение количества сырья к объему экстрагента - 1:12, температурный режим - 60°С, степень измельчения сбора - 1 мм.
Для определения продолжительности и кратности числа экстракций изучена зависимость времени достижения равновесной концентрации в системе сырье-экстрагент при трехкратной экстракции сырья. Для этого проводили экстракцию измельченного сырья 60% этанолом в соотношении 1:12 на водяной бане при температуре 70°С при постоянном перемешивании с обратным холодильником. Через заданные промежутки времени (15, 30, 60, 90, 120 мин.) извлечения фильтровали (1-ый контакт фаз), определяя содержание суммы экстрактивных веществ. Аналогичным образом проводили две последующие экстракции отжатого сырья при том же промежутке времени, подавая каждый раз 60% этанол или 30% этанол в количестве, равном объему слитого извлечения (2-ой и 3-ий контакт фаз), полученные извлечения также анализировали на содержание суммы экстрактивных веществ. Экспериментальные данные свидетельствуют, что равновесное состояние наступает при 1-ом контакте фаз через 90 мин, при 2-ом и 3-ем контакте фаз через 60 мин (табл. 3), в качестве экстрагента рекомендуем использовать при 1-ом контакте фаз - 60% этанол, при 2-ом и 3-ем контакте фаз - 60% этанол.
Примечание: в таблице приведены средние данные из трех определений.
В течение 1-ого контакта фаз экстрагируется около 50-60% экстрактивных веществ, 2-ой контакт обеспечивает выход 25-30%, и 3-ий контакт - 10-25%. Таким образом, трехкратная экстракция обеспечивает полное истощение сырья. В целях ускорения экстракционного процесса экстракционный баллон периодически встряхиваем, так как перемешивание ведет к обновлению поверхности контактирующих фаз и к увеличению движущей силы процесса.
Все подобранные оптимальные параметры процесса экстракции были положены в основу первой серии балансовых загрузок, на основании которой была разработана технологическая схема получения экстракта сухого из корневищ с корнями левзеи одноцветковой.
Способ получения иллюстрируется следующим примером. 1 кг травы левзеи одноцветковой измельчают на мельнице до размера частиц диаметром 1 мм. Измельченное сырье загружают в экстракционный аппарат с мешалкой и внешним паровым обогревом. Заливают 12 л 60%-ным спиртом этиловым в соотношении сырье-экстрагент 1:12 с учетом коэффициента водопоглощения. Экстрагируют при 60°С и постоянном перемешивании. Первый контакт фаз в течение 90 мин. Извлечение фильтруют через серошинельное сукно в сборник. Проводят еще две экстракции в течение 60 мин каждая, подавая в экстрактор 30% спирт этиловый в количестве, равном объему слитого. 1-ый слив 10,1 л; 2-й слив 10,3 л; 3-й слив 10,5 л. Водно-спиртовое извлечение после первого контакта фаз последовательно порциями упаривают примерно до 1/3 первоначального объема. Водное извлечение после второго и третьего контакта фаз также упаривают до 1/3 объема. Объединенные кубовые остатки от трех извлечений подвергают очистке сепарированием. Очищенный экстракт доупаривают до 1/5 первоначального объема и сушат на нержавеющих противнях в вакуумной сушилке при 65-70°С 8 ч. Получают 306,0 г готового продукта, что составляет 30,06% сухого экстракта от массы исходного сырья.
Сухой экстракт представляет собой аморфный порошок коричневого цвета и со специфическим запахом, комкуется, потеря в массе при высушивании не превышает 5%.
Сравнительная характеристика заявляемого способа с выбранным прототипом представлена в таблице 4.
Исследование антигипоксической активности экстракта сухого из травы левзеи одноцветковой
Исследования выполнены на 72 белых крысах линии Wistar обоего пола с исходной массой 180-200 г. Содержание животных соответствовало «Правилам лабораторной практики (GLP) и Приказу МЗ РФ №199Н от 01.04.2016 г. «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики». Перед началом экспериментов животных, отвечающих критериям включения в эксперимент, распределяли на группы с учетом принципа рандомизации. Экспериментальную работу осуществляли в соответствии с «Правилами проведения работ с «Правилами, принятыми в Европейской конвенции по защите позвоночных животных» (Страсбург, 1986 г.).
100
100
Водный раствор экстракта сухого из травы левзеи одноцветковой (Rhaponticum uniflorum (L.) вводили животным первой опытной группы per os в дозе 150 мг/кг за 30 мин до кормления в течение 7 дней до проведения экспериментов. В качестве препарата сравнения использовали экстракт сухой из корней (или корневищ) левзеи одноцветковой, обладающий стресспротективной, антигипоксической и анксиолитической активностью [3; 5]. Экстракт сухой из корневищ с корнями левзеи одноцветковой водили животным второй опытной группы в эквивалентной дозе по аналогичной схеме. Крысы контрольной группы получали воду очищенную. Антигипоксическое действие экстрактов исследовали на трех моделях: гемическая, гистотоксическая и нормобарическая гипоксии. Модель острой гемической гипоксии воспроизводили путем однократного внутрибрюшинного введения натрия нитрита в дозе DL (200 мг/кг); гистотоксической гипоксии - однократным внутрибрюшинным введением натрия нитропруссида в дозе DL (20 мг/кг); нормобарической гипоксии с гиперкапнией - помещением крыс в герметичные емкости объемом 1 л [2]. Данные экспериментов обработаны статистически для малой выборки с определением средней величины (М) и средней ошибки (m). Для оценки значимости различий между средними значениями использовали параметрический критерий Стьюдента. Различия считались значимыми при вероятности 95% (Р<0,05).
Данные, представленные в таблице 5, показывают, что экстракт сухой из корневищ с корнями левзеи одноцветковой в дозе 150 мг/кг увеличивает продолжительность жизни животных при нормобарической гипоксии на 33%, в условиях гемической гипоксии - на 37% и при острой тканевой гипоксии - на 49% по сравнению с данными крыс контрольной группы. Введение экстракта сухого из травы левзеи одноцветковой оказывало более выраженное антигипоксическое действие, увеличивая резервное время жизни животных при гипоксиях различного генеза в среднем на 52% относительно показателей контрольных животных.
Примечание. Здесь и далее: * - различие достоверно по сравнению с данными в контрольной группе животных при Р≤0,05; n - количество животных в группе.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют, что экстракты сухие из левзеи одноцветковой в дозе 150 /кг повышают устойчивость белых крыс к кислороддефицитным состояниям различного генеза. Наиболее выраженное антигипоксическое действие проявляет экстракт, полученный из травы левзеи одноцветковой.
Исследование антистрессорной активности экстракта сухого из травы левзеи одноцветковой на фоне 24-часового иммобилизационного стресса
Эксперименты проведены на 40 белых крысах линии Wistar обоего пола массой 180-200 г. Содержание животных соответствовало «Правилам лабораторной практики (GLP) и Приказу МЗ РФ №199Н от 01.04.2016 г. «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики». Перед началом экспериментов животных, отвечающих критериям включения в эксперимент, распределяли на группы с учетом принципа рандомизации. Экспериментальную работу осуществляли в соответствии с «Правилами проведения работ с «Правилами, принятыми в Европейской конвенции по защите позвоночных животных» (Страсбург, 1986 г.).
Иммобилизационный стресс воспроизводили путем фиксации животных в положении на спине в течение 24 ч [1]. Крысам первой и второй опытных группы внутрижелудочно вводили водный раствор экстрактов сухих, полученных соответственно из травы и корневищ с корнями левзеи одноцветковой, в дозе 150 мг/кг в объеме 10 мл/кг в течение 7 дней до стрессорного воздействия (1 раз в день за 30 минут до кормления). Животные контрольной группы получали воду очищенную в эквиобъемном количестве по аналогичной схеме. На 7 сутки эксперимента животных контрольной и опытных групп подвергали 24-часовому иммобилизационному стрессу, после чего животных декапитировали под легким эфирным наркозом и определяли выраженность стресс-индуцированных изменений во внутренних органах: гипертрофию надпочечников, состояние иммунокомпетентных органов и появление деструктивных повреждений в слизистой оболочке желудка с подсчетом «язвенного индекса Паулса» [1]. Данные экспериментов обработаны статистически для малой выборки с определением средней величины (М) и средней ошибки (m). Для оценки значимости различий между средними значениями использовали параметрический критерий Стьюдента. Различия считались значимыми при вероятности 95% (Р<0,05).
Как следует из данных, представленных в таблице 6, 24-часовой иммобилизационный стресс у белых крыс сопровождается развитием классической «триады Селье», в виде гипертрофии надпочечников, инволюции иммунокомпетентных органов, появлением язвенных повреждений в слизистой оболочке желудка. Применение экстрактов сухих, полученных из травы и корневищ с корнями левзеи одноцветковой, в дозе 150 мг/кг способствовало уменьшение выраженности признаков «триады Селье». На фоне введения животным испытуемых экстрактов наблюдалось ограничение инволюции лимфоидных органов. Так у животных первой и второй опытных групп масса тимуса была выше на 74% и 65%, масса селезенки - на 42% и 35% соответственно таковых показателей животных контрольной группы. Также более выраженное влияние на ограничение гипертрофии надпочечников оказывал экстракт, полученный из травы левзей одноцветковой, снижая массу органа на 38% по отношению к значению контрольных животных, тогда как экстракт из корневищ с корнями уменьшал данный показатель лишь на 30%.
Введение животным испытуемых экстрактов способствовало ограничению развития деструкции в слизистой оболочке желудка (табл. 7). У 100% животных первой и второй опытных групп, также как и в контрольной группе, наблюдались точечные кровоизлияния, при этом среднее число данных деструкций и индекс Паулса для них были ниже таковых в контроле на 47% и 44% соответственно. Экстракт, полученный из травы левзеи одноцветковой, проявлял более выраженное гастропротективное влияния, препятствуя развитию более грубых деструкций в слизистой оболочке желудка. Так, в первой опытной группе ни у одного животного не отмечались полосовидные язвы, эрозии встречались лишь у 40% животных, тогда как в контрольной группе соответственно в 60% и 90% случаях. При этом у животных, получавших экстракт из травы левзеи одноцветковой, среднее число эрозий и индекс Паулса для них были ниже в 3,4 и 7,8 раза соотвевтенно таковых у контрольных животных; получавших экстракт из корневищ с корнями, - в 2,6 и 3,9 раза соответственно. У одного животного из десяти во второй опытной группе наблюдались полосовиные язвы.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют, что экстракты сухие из левзеи одноцветковой обладают стресс-протективным влиянием на фоне 24-часового иммобилизационного стресса, препятствуя развитию признаков стресс-реакции: гипертрофии надпочечников, инволюции иммунокомпетентных органов и появлению деструкций в слизистой оболочке желудка крыс опытной группы. При этом экстракт, полученный из травы, обладает более выраженным стресс-протективным влиянием по сравнению с экстрактом, полученном из корневищ с корнями растения.
Исследование анксиолитического действия экстракта сухого из травы левзеи одноцветковой
Экспериментальная работа выполнена на 60 белых крысах линии Wistar обоего пола с исходной массой 180-200 г. Содержание животных соответствовало «Правилам лабораторной практики (GLP) и Приказу МЗ РФ №199Н от 01.04.2016 г. «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики». Перед началом экспериментов животных, отвечающих критериям включения в эксперимент, распределяли на группы с учетом принципа рандомизации. Экспериментальную работу осуществляли в соответствии с «Правилами проведения работ с «Правилами, принятыми в Европейской конвенции по защите позвоночных животных» (Страсбург, 1986 г.).
Животные были разделены на 3 группы. Животным I - II опытных групп в течение 7 дней до проведения экспериментов вводили внутрижелудочно экстракты сухие левзеи олноцветковой в дозе 150 мг/кг, полученные соответственно из травы и корневищ с корнями. Животные контрольной группы получали воду очищенную в эквивалентном объеме по аналогичной схеме введения. Тестирование животных в экспериментальных установках проводили через 1 час после последнего введения исследуемых средств. Анксиолитическое (противотревожное) действие экстракта сухого из травы левзеи одноцветковой исследовали согласно методическим указаниям по изучению транквилизирующего (анксиолитического) действия фармакологических веществ [4] в тестах приподнятый крестообразный лабиринт (ПКЛ) и «черно/белая камера». В тесте ПКЛ регистрировали время пребывания животных в открытых и закрытых рукавах, а также на центральной площадке, количество заходов в открытые и закрытые рукава, число свещиваний и вертикальных стоек, а также количество дефекаций и актов груминга; в тесте «темно/светлая камера» - число заходов и длительность пребывания в светлом и темном отсеках установки.
Данные экспериментов обработаны статистически для малой выборки с определением средней величины (М) и средней ошибки (m). Для оценки значимости различий между средними значениями использовали параметрический критерий Стьюдента. Различия считались значимыми при вероятности 95% (Р<0,05).
Результаты тестирования животных в крестообразном лабиринте показали (табл. 8), что контрольные животные предпочитают большую часть времени проводить в закрытых рукавах, чем открытых. Курсовое введение животным экстракта сухого из корневищ с корнями левзеи одноцветковой в дозе 150 мг/кг снижало чувство страха открытого пространства, в результате чего, количество заходов в открытые рукава установки и время, проведенное в них, были в 2,3 и 3,9 раза соответственно выше данных контрольных животных. Экстракт сухой из травы левзеи одноцветковой проявлял более выраженное противотревожное действия, увеличивая данные показатели соответственно в 3,2 и 5,4 раза. При этом время нахождения на центральной площадке у животных первой и второй опытных групп было в 2,7 и 2,0 раза выше показателя контрольных животных. У животных, получавших фитоэкстракты, наблюдалась и более высокая общая двигательная активность по сравнению с контрольными животными (табл. 8). Так, на фоне введения животным испытуемых экстрактов из травы и корневищ с корнями левзеи одноцветковой количество заходов в закрытые рукава лабиринта увеличилось в 1,7 и 1,5 раза соответственно по сравнению с показателем контрольных животных.
Результаты, полученные в тесте ПКЛ, подтверждаются данными теста «темно/светлая камера» (табл. 9). Курсовое введение животным экстрактов сухих, полученных из травы и корневищ с корнями растения, увеличивало количество заходов в светлый отсек установки в 2,6 и 2,0 раза и время, пребывания в нем, в 3,7 и 2,2 раза соответственно по сравнению с таковыми у контрольных животных.
Таким образом, экстракт сухой из травы левзеи одноцветковой оказывает более выраженное анксиолитическое (противотревожное) действие в условиях ненаказуемого поведения, чем экстракт сухой, полученные из корневищ с корнями данного растения.
Список литературы:
1. Багинская А.И., Ферубко Е.Ф., Курманова Е.Н., Воскобойникова И.В., Колхир В.К., Сидельников Н.И. Экспериментальные модели эрозивно-язвенных поражений желудка и двендацатиперстной кишки. - М., 2017. - 96 с.
2. ОФС.1.5.3.0006.15 Определение содержания экстрактивных веществ в лекарственном растительном сырье и лекарственных растительных препаратах [Электронный ресурс]. URL: http://pharmacopoeia.ru/ofs-1-5-3-0006-15-opredelenie-soderzhaniya-ekstraktivnyh-veshhestv-v-lekarstvennom-rastitelnom-syre-i-lekarstvennyh-rastitelnyh-preparatah/.
3. Патент №2582282 Российская Федерация, МПК А61К. Способ получения средства, обладающего стресспротективной и антигипоксической активностью» [текст] / Николаев С.М., Николаева И.Г., Шантанова Л.Н., Николаева Г.Г., Гармаева Л.Л., Татаринова Н.Н., Разуваева Я.Г., Матханов И.Э., Сенг Ли; Сонг Панг; заявитель и патентообладатель Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН (RU) - №2015107164; заявл. 2.03.2015; опубл. 20.04.2016, Бюл. №11.
4. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под ред. Р.У. Хабриева. - М., 2005. - 832 с.
5. Татаринова Н.К., Разуваева Я.Г., Шантанова Л.Н. Противотревожное действие экстракта из корней Rhaponticum unlflorum II Бюллетень Восточно-Сибирского научного центра СО РАМН. - 2015. - №2 (102). - С. 92-94.
6. Nikolaeva I.G., Tsybiktarova L.P., Garmaeva L.L., Nikolaeva G.G., Olennikov D.N., Matkhanov I.E. Determination of ecdysteroids in Fornicium unflorum (L.) and Serratula centauroides (L.) raw materials by chromatography-UV spectrophotometry // Journal of analytical chemistry. - Vol. 72. - №8. - P. 854-861.