СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОКАТАЛИЗАТОРА ДЛЯ СПИРТОВОГО БРОЖЕНИЯ
METHOD OF OBTAINING BIOCATALYST FOR ALCOHOLIC FERMENTATION

Изобретение относится к биохимической промышленности, а именно к способу получения иммобилизованных биокатализаторов на основе дрожжей для спиртового брожения для получения этилового спирта как химического продукта, используемого, в частности, в качестве топлива.
Традиционным биокатализатором спиртового сбраживания солодового и виноградного сусла, виноматериалов, фруктовых, овощных и иных растительных соков, сахаро- и крахмалосодержащих материалов и т.д., с целью получения спиртосодержащих композиций, являются свободные дрожжевые клетки.
Необходимость в повышении технологичности процесса сбраживания потребовала разработки новых биокатализаторов, обеспечивающих, в частности, повышение длительности их использования в ферментационных процессах, упрощение стадии отделения биокатализатора от ферментационной среды, возможность регенерации и повторного использования отработанного биокатализатора, улучшение технологичности непрерывных процессов спиртового сбраживания.
Известен широкий ряд запатентованных технических решений [например, JP 57-150385, JP 60153794, JP 1067189, US 5079011, US 5334229, DE 3432923, FR 2320349, FR 2359202, FR 2601687, FR 2600673, FR 2586256, ЕР 388588, FR 2668081, ES 2192986], включающих в свой состав способы получения биокатализаторов спиртового брожения на основе дрожжей, частично решающих проблемы, возникающие при использовании свободных дрожжевых клеток при производстве вин, пива, шипучих напитков с различным содержанием алкоголя, а также шампанизации виноматериала.
Общим существенным признаком этих известных способов является иммобилизация методом включения свободных дрожжевых клеток матрицей гелевого носителя с образованием твердых, как правило, сферических частиц, причем отверждение исходного гелеобразующего материала (например, натриевых или калиевых солей альгиновой кислоты) осуществляют либо методом ионного обмена с использованием ионов двухвалентных или трехвалентных металлов (хлористые кальций, барий, стронций, алюминий), либо полимеризацией включенного в исходную дрожжевую суспензию мономера, например акриламида, либо специфической обработкой исходной дрожжевой суспензии, включающей в свой состав полимер, например поливиниловый спирт, с образованием, так называемых, криогелей.
Однако вышеприведенная технология получения биокатализаторов спиртового брожения предназначена для получения биокатализаторов для приготовления спиртосодержащих напитков, таких как вино, пиво, шампанское, шипучие напитки с различным содержанием алкоголя, и, согласно информации, приведенной в описаниях к вышеприведенным патентам, не может обеспечить получение высокоактивного, сохраняющего в течение длительного времени взаимодействия с ферментационной средой свои как биохимические, так и механические свойства, биокатализатора, предназначенного для промышленного получения этилового спирта.
Наиболее близким к изобретению по совокупности существенных признаков является способ получения биокатализатора спиртового брожения, применяемый для получения этанола, описанный в патенте DE 3432923, характеризующийся следующей совокупностью существенных признаков.
+
++
++
Свободные дрожжевые клетки суспендируют в физиологическом растворе и смешивают с предварительно приготовленным стерильным водным раствором альгината натрия. Полученную суспензию раствора альгината натрия с клетками дрожжей подают в виде капель в ванну с раствором хлористого кальция. При попадании капель в ванну в результате обмена ионов Na на ионы Са образуются 3-х мм гелеобразные гранулы (жемчужины). Возникшие через ионотропное образование гелевые гранулы выдерживают в растворе хлористого кальция при постоянном перемешивании в течение 30 минут, отсеивают и многократно промывают проточной водой. Затем промытые гранулы в течение 15 минут при постоянном перемешивании полощут в растворе альгината натрия. Благодаря диффузии ионов Са из гелевых жемчужин в раствор альгината натрия вокруг гранул-жемчужин образуется достаточно толстая оболочка из Са-альгината. Гранулы вновь промывают проточной водой и погружают на 1 час в раствор хлористого кальция, после выдержки в растворе хлористого кальция гранулы вновь подвергают многократной промывке проточной водой. Полученные гранулы биокатализатора стерилизуют облучением в течение 5 минут 6 Вт-лампой УФ.
2
Недостатком описанного известного способа получения биокатализатора спиртового брожения является сложность его приготовления в промышленном масштабе с получением с высокими скоростями и низкой себестоимостью значительного количества биокатализатора высокого качества, в частности, из-за его многостадийности, а также сложности предотвращения агломерации образующихся на поверхности жидкости, содержащей сшивающий агент (CaCl), гелевых частиц с включенными свободными дрожжевыми клетками.
++
Кроме того, по известному способу получают биокатализатор, частицы которого окружены «достаточно толстым слоем» геля Са-альгинат, дополнительно отвержденного ионами Са, не содержащего в своем составе иммобилизованных свободных дрожжевых клеток. Данный слой обеспечивает более длительный срок эксплуатации катализатора, затрудняя выход дрожжевых клеток из матрицы гелевого носителя, но затрудняя тем самым массоперенос между жидкой фазой питательной среды и гелевой фазой катализатора, содержащей, собственно, сам активный биокомпонент - дрожжевые клетки, что существенно снижает активность биокатализатора в целом.
Задача изобретения состоит в разработке более простого в исполнении, технологичного способа получения высокоактивного, обладающего повышенным сроком использования биокатализатора спиртового брожения на основе свободных дрожжевых клеток (иммобилизованные гранулированные дрожжи (далее - ИГД) для промышленного производства этилового спирта как химического продукта, используемого в качестве топлива за счет исключения протекания агломерации гелевых частиц с включенными свободными дрожжевыми клетками.
++
5
5
Поставленная задача решается тем, что в способе получения биокатализатора спиртового брожения, включающего наращивание биомассы дрожжей и ее иммобилизацию включением в гелевую матрицу путем смешения с раствором гелеобразующего материала с последующим его отверждением ионами Са, согласно изобретению в качестве гелеобразующего материала используют смесь экзополисахарида с молекулярной массой 1,5·10-2,5·10 Da, полученного из штамма бактерий Paracoccus denitrificans ВКПМ В-8617, и альгината натрия в массовом соотношении 0,1-0,9:3,5-4,5.
Используемый экзополисахарид получают из штамма бактерий Paracoccus denitrificans ВКПМ В-8617 (RU 2006127257, 2006).
Штамм Paracoccus denitrificans ВКПМ В-8617 характеризуется следующими признаками. В активной фазе клетки Paracoccus denitrificans ВКПМ В-8617 представляют собой толстые короткие палочки размером 1-1,5-1,5-2,0 мкм. Бактериальные клетки образуют колонии опалового цвета. Существует необходимость в дополнительных факторах роста (дрожжевой экстракт и пантотеновая кислота), растет на средах, содержащих метанол. Штамм Paracoccus denitrificans ВКПМ В-8617 не патогенен для мышей.
Указанный штамм размножается при 20-29°С; хранится при +4°С на скошенном глюкозокартофельном агаре или сусло-агаре. Среду стерилизуют при 0,75 атм и температуре 110°С. Частота пересевов -1 раз в 4-5 месяцев.
Культурально-морфологические признаки штамма Paracoccus denitrificans ВКПМ В-8617.
Клетки бактерий грамотрицательные, неподвижные. В логарифмической фазе культура представляет собой толстые короткие палочки, в стационарной - коккоиды, расположенные парами, реже - в коротких цепочках. Спор не образуют. Размножение клеток осуществляется путем бинарного деления.
При росте на сусло-агаре или на скошенном глюкозокартофельном агаре штамм образует выпуклые блестящие слизистые опаловые колонии правильной формы, 4-6 мм в диаметре. При росте на жидкой среде с этанолом, в качестве единственного источника углерода, образует высоковязкую тягучую суспензию светло-кремового цвета. При многократном рассеве на твердой богатой сахаросодержащей среде диссоциация штамма не была обнаружена. Стабильной является мукоидная форма бактериальных клеток, синтезирующая стабильный продукт со стабильных выходом. Колониально-морфологическая изменчивость - единообразие клеток.
Физиолого-биохимические признаки.
Аэроб. Каталазоположительный, оксидазоотрицательный, кислотонеустойчивый. Имеется супероксидисмутаза, пероксидаза отсутствует. Температурный диапазон роста 10-42°С. Оптимальная температура роста 24-30°С, рН 5,5-8,0, оптимум рН 7,0. Желатину не разжижает. Крахмал не гидролизует. Молоко не сбраживает. Нитраты не восстанавливает, сероводород, индол и ацетоин не образует.
Штамм Paracoccus denitrificans ВКПМ В-8617 относится к микроорганизмам, не патогенным для человека, согласно классификации микроорганизмов, приведенных в Санитарных правилах СП 1.2.731-99.
Штамм культивируется в аэробных условиях. Оптимум рН 7,0. Растет на средах, содержащих углеводы. Использует неорганические и органические источники азота. Нуждается в дополнительных факторах роста.
Ниже приведен перечень компонентов питательной среды для культивирования Paracoccus denitrificans ВКПМ В-8617 (мас.%):
КН<sub>2</sub>РO<sub>4</sub>·3Н<sub>2</sub>O
0,1-2
NaCl
0,05-1
NН<sub>4</sub>NО<sub>3</sub>·2Н<sub>2</sub>O
0,1-2
MgSO<sub>4</sub>·7Н<sub>2</sub>O
0,01-1
FeSO<sub>4</sub>·7Н<sub>2</sub>O
0,0001-0,01
CaCl<sub>2</sub>·2Н<sub>2</sub>O
0,005-0,05
Пантотеновая кислота
0,0001-0,001
Дрожжевой экстракт
0,001-0,1
Глюкоза
0,5-5.
В качестве дополнительного источника углерода используют этанол в количестве от 0,5 до 2 об.% на 100 об.% питательной среды.
Возможно получение экзополисахарида с идентичными свойствами на альтернативной питательной среде, достоинством которой является ее дешевизна по сравнению с вышеуказанной.
Ниже приведен перечень компонентов альтернативной питательной среды для культивирования Paracoccus denitrificans ВКПМ В-8617 (мас.%).
КН<sub>2</sub>РO<sub>4</sub>·3Н<sub>2</sub>O
0,1-2
NaCl
0,05-1
NH<sub>4</sub>NO<sub>3</sub>·2Н<sub>2</sub>O
0,01-0,5
MgSO<sub>4</sub>·7Н<sub>2</sub>O
0,01-1
СаСl<sub>2</sub>·2Н<sub>2</sub>O
0,005-0,1
Вода
до 100.
В качестве источников углерода и факторов роста использовались этанол в количестве 1,5 об.% и молочная сыворотка в количестве 30 об.%.
8
Культивирование Paracoccus denitrificans ВКПМ В-8617 для получения экзополисахарида осуществляют в ферментаторе при температуре 28-40°С в условиях аэрации и перемешивания при концентрации растворенного кислорода 20-40%, рН среды - 7,0, в течение 24-48 часов. Продуктивность штамма в описанных выше условиях оптимальна и составляет по биомассе (5,5±0,8)×10 клеток/мл, по количеству синтезируемого ЭПС - от 6 до 10 г/л.
Продуцируемый штаммом бактерий Paracoccus denitrificans ВКПМ В-8617 экзополисахарид выделяли из культуральной жидкости и очищали нижеописанным способом. Культуральную жидкость, содержащую ЭПС, диализовали против дистиллированной воды в течение 5 дней. Затем разводили дистиллированной водой в 3 раза и отделяли клетки ультрацентрифугированием. Супернатант концентрировали в вакууме при небольшом подогреве до начального объема, после чего ЭПС осаждали добавлением изопропанола. Осадок ЭПС промывали чистым изопропиловым спиртом и высушивали при температуре 40°С.
Выделенный описанным способом ЭПС представляет собой массу перепутанных коротких волокон (до 15 мм) от светло-желтого до белого цвета влажностью 10-12% и содержанием полисахарида 95-99%.
6
7
Экзополисахарид образован остатками глюкозы, галактозы, маннозы, рамнозы (соответственно 5:2:4:1), включает в свой состав глюкуроновую и пировиноградную кислоты, а также ацильные группы. Молекулярная масса экзополисахарида, определенная гель-фильтрацией на Sephadex G-200 (Швеция), лежит в 0,5×10-2×10 Д.
Экзополисахарид растворяется в воде и полярных органических растворителях, таких как диметилформамид и диметилсульфоксид, образуя высоковязкие истинные растворы. Водные растворы экзополисахарида обладают псевдопластичностью и тиксотропией. При увеличении концентрации водного раствора экзополисахарида до 0,1% резко возрастает его кинематическая вязкость.
2
ЭПС осаждается из водных растворов спиртами (например, метанолом, этанолом, изопропанолом) и кетонами, например ацетоном. Добавление в водный раствор ЭПС неорганических солей (CaCl) приводит к выделению или так называемому высаливанию ЭПС.
6
12
Характерным свойством экзополисахарида является его способность к структурированию не только водных, но и углеводородсодержащих систем. При смешении водных растворов ЭПС (0,2-0,7%) с нормальными углеводородами (С-С), например, при объемном соотношении соответственно 1:9 образуется стабильная, не расслаивающаяся во времени эмульсия, характеризующаяся псевдопластичностью и тиксотропией.
-1
Динамическая вязкость таких эмульсий при скорости сдвига 3 с составляет 2500-4000 мПа·с.
Существенным для использования в ряде областей производства свойством продуцируемого штаммом бактерий Paracoccus denitrificans ВКПМ В-8617 полисахарида является независимость динамической вязкости (при малых скоростях сдвига) его водных растворов от температуры раствора вплоть до 90°С. Реологические свойства водных растворов практически не изменяются и при неоднократном предварительном их нагревании вплоть до 130°С с последующим охлаждением до исходной температуры (обычно 20°С).
Примечательными свойствами данного полисахарида являются также его пленкообразующие и волокнообразующие свойства.
Уникальные структурирующие свойства этого экзополисахарида, а также его химический состав, позволяют при его смешении с водным раствором альгината натрия предварительно сформировать такую структуру раствора полисахаридов (за счет высокой вязкости исходного раствора экзополисахарида при малой его концентрации) для формирования последующей структуры матрицы включения в результате ионотропного обмена с ионами отверждающего агента, которая обеспечивает отсутствие протекания процесса агломерации образующимся на поверхности отверждающего раствора частицам биокатализатора. Кроме того, при эксплуатации биокатализатора (ИГД) в процессе спиртового сбраживания физическая структура и химический состав отвержденной гелевой матрицы обеспечивают ей свойство в течение длительного времени удерживать в своем составе иммобилизованные ею свободные дрожжевые клетки, предотвращая их вымывание при взаимодействии с ферментационной средой, и облегчают при этом массоперенос между жидкой фазой питательной среды и гелеобразной фазой частиц биокатализатора.
Сущность изобретения заключается в следующем.
4
2
4
4
2
2
4
Для наращивание биомассы, культивирование дрожжей, например, рода Saccharomyces cerevisiae, осуществляют в ферментерах в условиях аэрации на питательной среде, включающей: глюкозу 15-20 г/л; (NH)SO 15-18 г/л; MgSO·7HO - 4-5 г/л; КНРО 5-6 г/л; дрожжевой экстракт - 1-1,5 г/л; вода - до 1 л. Оптимальная температура для роста поддерживается в интервале 28-32°С, оптимальное рН - от 3,5 до 6,5. Время культивирования 36-48 часов. Результатом осуществления культивирования названных бактерий является получение биомассы в виде суспензии свободных дрожжевых клеток, используемой далее в способе получения биокатализатора спиртового брожения по изобретению (ИГД).
Порошкообразный альгинат натрия вводят в 0,1-0,9% (мас.) водный раствор экзополисахарида в количестве, обеспечивающем получение концентрации альгината натрия в растворе полисахаридов 3,5-4,5% (мас.), динамическая вязкость раствора составляет 500-1000 сП. Полученный раствор стерилизуют путем его автоклавирования в течение 18-22 мин при температуре 118-124°С, затем охлаждают до комнатной температуры.
Равные объемы полученного стерильного раствора полисахаридов и суспензии свободных дрожжевых клеток смешивают. Полученную суспензию в виде капель с помощью насоса подают через откалиброванный капилляр диаметром от 0,5 до 5 мм с высоты 10-30 см (вертикально) в раствор сшивающего агента - 2-2,5%-ный водный раствор хлористого кальция, взятый в избытке. В результате взаимодействия капель суспензии раствора полисахаридов и свободных дрожжевых клеток с раствором хлористого кальция в результате поверхностного обмена ионов натрия альгината натрия и ионов кальция из раствора сшивающего агента образуются гелевые гранулы сферической формы диаметром 1-4 мм (высота 10-30 см является оптимальной для образования сферических гранул). Образовавшиеся гелевые гранулы выдерживают в растворе хлористого кальция в течение 30-40 мин для окончательного их (утверждения, после чего промывают водой, предварительно подвергнутой стерилизации путем автоклавирования в течение 30 мин при 118-124°С.
Полученные упругие белые полупрозрачные сферические гранулы диаметром 1-4 мм и являются биокатализатором спиртового брожения (ИГД), которые используют в ферментационном сбраживании сахаров для получения этилового спирта как химического продукта, применяемого, в частности, в качестве топлива.
Гранулы биокатализатора (ИГД) включают в свой состав отвержденную в результате ионотропного обмена двухвалентными ионами кальция гелевую матрицу, состоящую из смеси экзополисахарида и Na-Са-альгината, и иммобилизованные отвержденной гелевой матрицей свободные дрожжевые клетки.
Данный биокатализатор проявляет высокую сбраживающую активность в продолжительных бродильных процессах и высокую конверсию Сахаров. Данный биокатализатор успешно может быть использован как в периодических, так и в непрерывных ферментационных процессах.
Испытания показали, что биокатализатор по изобретению в течение полугодового использования в процессах спиртового сбраживания для получения этанола как химического продукта, применяемого в качестве топлива, не претерпел существенных изменений не только в своих биокаталитических свойствах, но и в механических характеристиках. При этом этанол по своим характеристикам полностью соответствовал требованиям ASTM D 5798-99 Standard Specification for Fuel Ethanol for Automotive Spark-Ignition Engines.
Сырьем для производства этилового спирта могут служить различные растительные материалы, содержащие в достаточном количестве сбраживаемые сахара или другие осахариваемые углеводы, в число которых входят традиционно используемые для этой цели крахмалсодержащие материалы - зерно (рожь, пшеница, кукуруза, ячмень, овес, просо) и картофель, сахаросодержащие материалы - меласса (отход сахарного и крахмало-паточного производства), дефектная сахарная свекла, а также древесина и отходы сельскохозяйственных растений.
Использование экзополисахарида с молекулярной массой, а также массового соотношения экзополисахарида и альгината натрия, выходящих за пределы указанных выше значений не приводит к получению биокатализатора желаемых характеристик.
Приведенные ниже примеры иллюстрируют вариант заявленного изобретения, но не ограничивают его.
Пример 1
4
2
4
4
2
2
4
Дрожжи Saccharomyces cerevisiae SL 100 выращивают в колбах в микроаэрофильных условиях (в стационарном режиме) на питательной среде следующего состава: Глюкоза - 20 г/л; (NH)SO - 18 г/л; MgSO·7HO - 4 г/л; KHPO - 5 г/л; дрожжевой экстракт - 1 г/л; при температуре 30°С, рН - 5,5. Время культивирования 36 часов. Конечная концентрация сухой биомассы в 100 мл составляет 12,3 г. Клетки дрожжей находятся в экспоненциальной фазе роста.
5
5
2
В 0,1 мас.% водный раствор экзополисахарида с молекулярной массой 1,5·10-2,5·10 Da, добавляют альгинат натрия в количестве 4 г на 100 мл раствора (массовое соотношение 0,5:4) и перемешивают до полного его растворения. Полученный раствор полисахаридов автоклавируют в течение 20 мин при температуре 121°С. Охлажденный до комнатной температуры раствор полисахаридов (при полном отсутствии пузырьков воздуха) смешивают с равным объемом (по 100 мл) суспензии клеток. Полученную суспензию гомогенизируют и с помощью насоса через калиброванные капилляры с внутренним диаметром 1,5 мм со скоростью 5 мл/ч вертикально с высоты 20 см подают в реактор, заполненный 2 литрами 2,2%-ного водного раствора хлористого кальция. Образовавшиеся при соприкосновении капелек суспензии с раствором отверждающего агента (CaCl) твердые сферические гранулы далее выдерживают в растворе хлористого кальция в течение 30 мин, после чего промывают стерильной водой. Биокатализатор (ИГД) представляет собой белые (иногда прозрачные) упругие сферические гранулы диаметром 1-4 мм.
Пример 2
4
2
4
4
2
2
4
2
2
Промытые гранулы биокатализатора (ИГД), полученные по примеру 1, загружают в реактор и добавляют 2 л стерильной питательной среды следующего состава: глюкоза - 150 г/л; (NH)SO- 5,2 г/л; MgSO·7HO - 0,55 г/л; КНРO - 1,5 г/л, вода - до 2 л рН питательной среды 4,0. Температура культивирования 30°С. Процесс ферментации осуществляют с контролем рН, температуры и скорости выделения СО (бродильная активность). После прекращения выделения СO (через 72 часа), что свидетельствует об окончании процесса сбраживания, определяют объемное содержание спирта в бражке и конверсию сахара.
Постферментационную жидкость отделяют от гранул биокатализатора и направляют на дистилляцию и ректификацию, а в реактор с оставшимся катализатором вновь подают питательную среду и осуществляют процесс сбраживания.
Дистилляцию и ректификацию постферментационной жидкости осуществляют любыми известными способами с получением этилового спирта необходимой плотности.
В нижеприведенной таблице приведены основные характеристики ферментационного процесса по примеру 2.
Вид биокатализатора
Максимальная бродильная активность, мл СО<sub>2 </sub>/ (л среды·час)
Конверсия сахара, %
Выход этанола, % от теоретического
Конечное содержание спирта, %
ИГД
956
95,4
92,3
7,3
Таким образом, способ согласно изобретению позволяет повысить активность и срок службы биокатализатора вследствие отсутствия процесса агломерации при одновременном упрощении технологии процесса за счет сокращения его стадий.