ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПРИГОДНОЙ ДЛЯ ХРАНЕНИЯ СУСПЕНЗИИ ЖИЗНЕСПОСОБНЫХ ЯИЦ ГЛИСТОВ
PREPARING STORAGE-STABLE SUSPENSION OF VITAL HELMINTH EGGS

Настоящее изобретение относится к способу приготовления суспензий, содержащих жизнеспособные, способные к развитию яйца паразитических червей (гельминтов) и пригодных для терапевтического применения.
Влияние паразитарных инфекций на активацию иммунной системы их животных организмов-хозяев является известным фактом (Review, D.M. McKay, Parasitology 132, 2006, с.1-12). Активация иммунной системы влияет также на встречаемость и течение ее заболеваний. Результаты эпидемиологических исследований свидетельствуют о том, что в регионах с высокой частотой глистных инвазий (гельминтозов) аутоиммунные заболевания встречаются реже, чем в регионах, в которых благодаря лучшим санитарно-гигиеническим условиям частота встречаемости подобных инфекций ниже. При изучении цитокинового профиля людей, страдающих болезнью Крона, представляющей собой хроническое воспалительное заболевание пищеварительного тракта, было установлено, что заражение гельминтами может вызывать стимуляцию Th2 иммуноцитов. Заражение гельминтами позволяет предупреждать болезнь Крона, которая является аутоиммунным заболеванием с доминированием Th1-клеток, соответственно влиять на это заболевание (Summers и др., Am. J. Gastroenterol. 98, 2003, с.2034-2041). Заражение гельминтами позволяет также влиять на иные вызываемые Th1-иммуноцитами заболевания, равно как и на вызываемый бактериями Helicobacter гастрит и аутоиммунный энцефаломиелит.
Еще в 1973 г. в литературе (Beer, Parasitology 67, 1973, сс.253-262) появились сообщения о том, что пригодной для иммунизации человека могла бы служить нематода Trichuris suis, которая, не являясь патогенной для человека, не приводит к возникновению нематодоза. Нематода Trichuris suis является близким родственником червя Trichuris humanis и способна, не размножаясь, выживать в желудочно-кишечном тракте человека. При такой самоограниченной инфекции никакие терапевтические мероприятия не требуются. Тем самым заражение нематодой Trichuris suis позволяет иммунизировать организм человека.
2
2
2
У R.J.S. Beer (Parasitology 65, 1972, сс.343-350) описан способ сбора и очистки яиц глистов. В соответствии с этим способом яйца глистов на стадии развития эмбрионов культивируют при 32°C в 0,2%-ном растворе дихромата калия и ежедневно аэрируют. Аналогичный способ очистки яиц глистов описан в DE 10163115. Согласно этой публикации яйца глистов очищают от возможно присутствующих микроорганизмов и вирусов путем химических реакций, при которых происходит образование гидроксильных или кислородных радикалов. В указанной публикации описана, в частности, так называемая реакция Фентона. В ходе такой реакции из HO при действии FeCl in statu nascendi ("в момент выделения") образуется кислород, обладающий дезинфицирующим действием, которое и используется для очистки яиц глистов.
У Boes и др. в Veterinary Parasitology, 1998, сс.181-190, описаны развитие эмбрионов в полученных из женских особей яйцах глиста Ascaris suum при их выдержке в серной кислоте и инфективность таких яиц.
У Summers и др. (GUT 54, 2005, сс.87-90) описан способ очистки яиц нематоды Т.suis, которые сначала для развития эмбрионов выдерживают в течение 5-6 недель в буферном растворе, содержащем антибиотики (пенициллин/стрептомицин/амфотерицин В), а затем также культивируют в 0,2%-ном растворе дихромата в фосфатном буфере при pH 6-7.
Применение подобных агентов, уничтожающих бактерии и вирусы, обладает целым рядом различных существенных недостатков, которые рассмотрены ниже.
При использовании раствора дихромата, равно как и при использовании раствора Фентона, и тот, и другой раствор необходимо удалять по истечении короткого периода времени во избежание повреждения яиц глистов. Помимо этого результаты проведенных экспериментов свидетельствуют о том, что в следующий за очисткой период развития эмбрионов (в течение 3 месяцев при 22-25°C) несмотря на такую предшествующую очистку происходит интенсивное инфицирование яиц. Последующее хранение яиц с развивающимися эмбрионами при 2-8°C также не позволяет избежать инфицирования яиц. Обусловлено это, вероятно, тем, что после удаления подобных агентов, уничтожающих микроорганизмы и вирусы, в суспензии яиц нематоды Т.suis вновь начинается размножение микроорганизмов.
Помимо этого из раствора необходимо полностью удалять дихромат. Однако соблюдение этого условия связано со значительными трудностями.
Описанное у Summers добавление антибиотиков во избежание сильного инфицирования яиц на стадии развития в них эмбрионов хотя и позволяет предотвратить интенсивное размножение микроорганизмов на этой стадии, однако не гарантирует полного их уничтожения. После удаления антибиотиков на последующих стадиях очистки яиц и при их хранении вплоть до момента применения вновь происходит интенсивное размножение микроорганизмов.
В основу настоящего изобретения была положена задача разработать способ приготовления суспензии яиц глистов с развивающимися эмбрионами, которую после ее очистки от загрязняющих вирусов и микроорганизмов, прежде всего бактерий, можно было бы хранить без опасности прорастания грибковых спор и размножения дрожжей. В приготовленной подобным способом суспензии яйца глистов должны сохранять свою способность к развитию из них взрослых особей. Помимо этого приготовленные таким способом суспензии яиц глистов должны быть пригодны для терапевтического применения.
2
2
7
При создании настоящего изобретения неожиданно было установлено, что для решения указанной выше задачи наиболее пригоден комбинированный способ очистки и консервирования, поскольку он в отличие от известных способов не требует применения токсических веществ (например, дихромата калия (KCrO)) и дезинфицирующих средств.
2
4
На стадии очистки выделенные яйца гельминтов, предпочтительно яйца гельминта Т.suis, в течение 1-72 ч инкубируют в растворе кислоты, предпочтительно в растворе HSO, со значением рН не более 2 (см. пример 1). Оптимальная продолжительность инкубации составляет от 2 до 8 ч, предпочтительно 3 ч. Инкубацию проводят при температуре в пределах от 4 до 37°C, предпочтительно от 25 до 35°C.
При приготовлении принимаемого внутрь фармацевтического препарата, содержащего пригодную для хранения суспензию жизнеспособных яиц паразитических, не патогенных для человека гельминтов, после приема которой развивается достаточное для стимуляции регуляторных человеческих Т-клеток количество гельминтов, сначала на первой стадии суспензию яиц гельминтов подвергают обработке кислотой при значении pH не более 2. На следующей стадии значение pH повышают до уровня не менее 4 и добавляют фармакологически приемлемый консервант. В принципе, возможна и обратная последовательность проведения указанных стадий, а именно: сначала можно добавлять консервант, а затем проводить обработку кислотой. Однако предпочтительно все же сначала проводить обработку кислотой и затем добавлять консервант.
Обработка кислотой в предпочтительном варианте заключается в добавлении серной кислоты. При обработке кислотой ее добавляют в количестве, достаточном для снижения значения pH до уровня в пределах от примерно 0,5 до 2. В еще одном варианте значение pH снижают до уровня в пределах от примерно 0 до менее 1. К числу пригодных для применения в этих целях кислот относятся соляная кислота, азотная кислота и серная кислота, предпочтительно, однако, использовать серную кислоту. Обработка кислотой должна продолжаться лишь в течение сравнительно короткого периода времени во избежание слишком сильного повреждения яиц глистов. В этом отношении существует также взаимосвязь между продолжительностью обработки кислотой и ее концентрацией. Значение pH предпочтительно снижать до менее 2, наиболее предпочтительно даже до уровня в пределах от 0,6 до 0,8. Продолжительность обработки кислотой составляет от нескольких минут до нескольких часов, предпочтительно от 120 до 360 мин. На протяжении такого еще допустимого короткого периода времени продолжается процесс развития эмбрионов в яйцах глистов (длящийся в общей сложности 3 месяца при 22-25°C).
После обработки кислотой значение pH добавлением приемлемого основания, например NaOH, вновь повышают до более 4. Затем добавляют один или несколько консервантов, в качестве которых, в принципе, можно использовать все пригодные для консервирования пищевых продуктов или лекарственных препаратов вещества. Предпочтительно же использовать консерванты, хорошо переносимые именно теми людьми, которые страдают болезнью Крона.
Консервант предпочтительно выбирать из группы, включающей сорбиновую кислоту, бензойную кислоту, соли этих кислот, эфиры парабензойной кислоты, эфиры парагидроксибензойной кислоты, пропиленгликоль и комбинации таких консервантов.
Наиболее предпочтительно использовать один или несколько консервантов, выбираемых из группы, включающей сорбиновую кислоту в концентрации от 0,01 до 0,2%, прежде всего от 0,1 до 0,2%, бензойную кислоту в концентрации от 0,1 до 0,3 мас.%, эфиры парагидроксибензойной кислоты в концентрации от 0,02 до 0,3 мас.%, пропиленгликоль в концентрации от 5 до 20 мас.% и комбинации таких консервантов с концентрацией в указанных пределах.
Для быстрой инактивации микроорганизмов и вирусов вместо сильных кислот можно также использовать более слабые кислые растворы с добавлением указанных выше консервантов, предпочтительно сорбиновой кислоты и ее солей. Преимущество применения таких растворов перед применением сильных кислот состоит в возможности очистки яиц, их выдержки для развития в них эмбрионов (в течение 3 месяцев при 22-25°C) и введения в организм пациента в одной-единственной среде благодаря ее менее кислому значению pH. Столь длительное нахождение яиц в подобной среде не приводит к снижению их жизнеспособности (см. пример 5). Такой щадящий способ предполагает применение содержащих консерванты сред со значением pH не менее 1, предпочтительно не более 2, и не приводит к снижению микробиологической чистоты суспензии яиц глистов.
Получаемые в результате содержащие консервант суспензии яиц глистов с развивающимися эмбрионами пригодны для приема пациентом в виде жидкости (раствора) для питья. В состав таких суспензий яиц глистов при необходимости можно включать дополнительные фармацевтически приемлемые добавки, такие как красители, вкусовые вещества или загустители.
В соответствии с этим объектом изобретения являются также принимаемые внутрь фармацевтические препараты, содержащие пригодную для хранения суспензию жизнеспособных яиц паразитических, не патогенных для человека гельминтов, прежде всего гельминтов Т.suis, после приема которой развивается достаточное для стимуляции регуляторных Т-клеток количество гельминтов и содержание микроорганизмов в которой составляет менее 1000 колониеобразующих единиц (КОЕ) на мл ее объема. В предпочтительном варианте содержание микроорганизмов в принимаемом внутрь фармацевтическом препарате составляет менее 100 колониеобразующих единиц на мл объема суспензии. В наиболее предпочтительном варианте содержание микроорганизмов в принимаемом внутрь фармацевтическом препарате составляет менее 10 колониеобразующих единиц на мл объема суспензии. Количество колониеобразующих единиц определяют обычными микробиологическими методами.
Под микроорганизмами в данном контексте подразумеваются бактерии, вирусы, грибы, дрожжи и простейшие, при этом должно быть исключено присутствие тех микроорганизмов, которые могли бы нанести вред здоровью.
Предлагаемый в изобретении способ позволяет получать пригодную для хранения суспензию яиц паразитических, не патогенных для человека гельминтов в форме, пригодной для фармацевтического применения. Предлагаемая в изобретении обработка, с одной стороны, позволяет благодаря практически полному уничтожению загрязняющих микроорганизмов, прежде всего бактерий, а также грибов, вирусов и при определенных условиях простейших, получать пригодный для фармацевтического применения препарат. С другой стороны, подобная обработка является столь щадящей, что яйца глистов после приема содержащего их препарата сохраняют свою способность созревать в пищеварительном тракте пациента и обеспечивать тем самым необходимую стимуляцию иммунной системы.
Предлагаемые в изобретении препараты пригодны главным образом для лечения различных воспалительных заболеваний пищеварительного тракта, прежде всего хронических воспалительных заболеваний пищеварительного тракта. Предлагаемые в изобретении препараты наиболее предпочтительно применять для лечения воспалительных заболеваний пищеварительного тракта, называемых болезнью Крона.
Пример 1: Снижение содержания микроорганизмов в суспензии яиц гельминта Т.suis
2
4
В соответствии с рекомендациями Германской фармакопеи (DAB, Deutsches Arzneibuch, раздел 2.6.12, последнее обновление с 24-м дополнительным выпуском в 2006 г.) определяли количество микроорганизмов в суспензии яиц гельминта Trichuris suis (TSO-суспензии) в фосфатном буфере (pH 7) в концентрации 2400 яиц/мл. По результатам анализа количество микроорганизмов в суспензии составило 190000 КОЕ/мл. Эту суспензию затем повторно забуферивали разбавленным раствором HSO до pH 2. После 3-часовой выдержки при 30°C количество микроорганизмов снизилось до менее 20 КОЕ/мл.
После этого проверяли качество приготовленной описанным выше способом суспензии. Для этого в соответствии с рекомендациями Германской фармакопеи (DAB) использовали определенные тест-штаммы бактерий, дрожжей и грибов. Результаты этой проверки представлены в примерах 2а, 2б и 2в.
Пример 2: Определение количества микроорганизмов
2
4
а) Питательную суспензию, состав которой соответствовал представленному в DAB 2.6.13, инокулировали указанными ниже в таблице 1 спорообразующими и не спорообразующими тест-бактериями. Затем суспензию повторно забуферивали разбавленным раствором HSO до pH 2 и выдерживали в течение 6 ч при 30°C. После этого определяли количество микроорганизмов, получив представленные в таблице 1 результаты.
Таблица 1
Микроорганизм
T<sub>0</sub>
H<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>, pH 2, через 6 ч
Clostridium sporog.
8000000
<10
Bacillus subtilis
1400000
20*
Escherichia coli
130000
<10
Staphylococus aureus
800000
<10
Salmonella typhymurium
250000
<10
*Примечание: более длительная обработка кислотой в течение примерно 6-10 ч позволила снизить количество колониеобразующих единиц до менее 10.
2
4
б) Питательную суспензию, состав которой соответствовал представленному в DAB 2.6.13, инокулировали указанными ниже в таблице 2 тест-дрожжами. Затем суспензию повторно забуферивали разбавленным раствором HSO до рН 2, соответственно до pH 1 и выдерживали в течение 3 ч, соответственно 48 ч при 25°C. После этого определяли количество микроорганизмов, получив представленные в таблице 2 результаты.
Таблица 2
Микроорганизм
T<sub>0</sub>
T<sub>3 ч</sub>
T<sub>48 ч</sub>
T<sub>3 ч</sub>
T<sub>48 ч</sub>
H<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>, рН 2
H<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>, рН 1
Saccharomyces cer.
470000
380000
220000
39000
40*
Candida albicans
690000
380000
32000
26000
<10
*Примечание: более длительная обработка кислотой продолжительностью до 72 ч позволила снизить количество КОЕ до 5.
2
4
в) Питательную суспензию, состав которой соответствовал представленному в DAB 2.6.13, инокулировали указанными ниже в таблице 2 видами тест-плесени. Затем суспензию повторно забуферивали разбавленным раствором HSO до pH 2, до pH 1 и до pH 0 и выдерживали в течение 3 ч, соответственно 48 ч при 25°C. После этого определяли количество микроорганизмов, получив представленные в таблице 3 результаты.
Таблица 3
Микроорганизм
T<sub>0</sub>
T<sub>3 ч</sub>
T<sub>48 ч</sub>
T<sub>3 ч</sub>
T<sub>48 ч</sub>
T<sub>3 ч</sub>
T<sub>48 ч</sub>
H<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>,
pH 2
H<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>,
pH 1
H<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>,
pH 0
Penicillium brevicomp.
490000
90000
32000
39000
14000
70
<10
Aspergillus niger
800000
370000
700000
500000
500000
50
<10
При недостаточном снижении количества КОЕ в случае некоторых микроорганизмов продолжительность обработки кислотой соответственно увеличивали вплоть до 72 ч.
2
4
Представленные в примерах 1 и 2а-2в данные свидетельствуют о том, что использование разбавленного раствора HSO с pH 2 позволяет эффективно уничтожать бактерии за короткий период времени. Для эффективного же уничтожения дрожжей и грибов требуется либо увеличивать продолжительность инкубации, либо снижать pH до более кислых значений.
Описанные выше стадии очистки неожиданно пригодны и для приготовления не содержащей вирусы суспензии яиц гельминта Т.suis.
Пример 3: Снижение содержания вирусов
В этом примере рассмотрена инактивация вируса лейкемии мышей (MuLV-вируса), вируса псевдобешенства (PRV-вируса), парвовируса свиней (PPV-вируса) и кошачьего калицивируса (FCV-вируса) при приготовлении суспензии яиц гельминта Trichuris suis (TSO-суспензии). Под используемыми вирусами при этом подразумеваются вирусы-модели.
Титры вирусов в инокулированных образцах определяли путем титрования до конечной точки. При титровании этим, хорошо известным методом разбавленные образцы помещают на титрационные микропланшеты с легко идентифицируемыми индикаторными клетками. После такого заражения индикаторных клеток вуруссодержащими образцами изменяется морфология клеток в результате их лизиса. Подобный лизис клеток количественно легко определить под микроскопом.
2
4
Тест-вирусы, имеющие и не имеющие оболочку, добавляли в высокой концентрации в 0,01 н. раствор HSO (рН 2, 30°C), содержавший также TSO-суспензию. Активность вирусов определяли затем через 10 мин, 3 ч и 72 ч. Через 10 мин не заразными становились PRV- и MuLV-вирусы, имеющие оболочку, а через 3 ч - FCV- и PPV-вирусы, не имеющие оболочку. В нейтрализованном 1 н. раствором NaOH контрольном образце даже после 3-часовой инкубации вирусы всех 4-х видов все еще оставались вирулентными. Проведение эксперимента с этим раствором в сравнительных целях было невозможным из-за цитотоксичности 0,2%-ного раствора дихромата калия в 0,01 н. серной кислоте.
Значительного же уменьшения количества грибов и дрожжей (см. пример 2, таблицы 2 и 3) удалось добиться лишь путем длительной инкубации и снижения значения рН до 0, предпочтительно до менее 1. Такой по существу новый способ очистки в очень кислой среде обладает тем недостатком, что при этом снижается выживаемость яиц глистов в содержащей такие яйца суспензии.
В качестве второй отличительной особенности настоящего изобретения неожиданно было установлено, что благодаря добавлению пригодных для приема внутрь используемых для консервирования химических веществ удалось сохранить коэффициент выживаемости яиц глистов, рассчитываемый как процентное отношение яиц с нормально развившимися эмбрионами к общему количеству яиц. Подобный коэффициент выживаемости яиц глистов однозначно характеризует способность яиц сохранять свою жизнеспособность в содержащих их суспензиях. Помимо этого благодаря применению консервантов инактивация загрязняющих микроорганизмов наблюдалась уже при pH 4. В качестве оптимальных пригодных для приема внутрь консервантов зарекомендовали себя бензойная кислота, сорбиновая кислота, их соли и пропиленгликоль (см. примеры 4а-4д).
Лишь добавление консервантов позволяет использовать гораздо менее кислые и тем самым лучше переносимые яйцами глистов среды. Благодаря этому яйца глистов можно очищать, выдерживать для развития в них эмбрионов, хранить и вводить в организм пациента в одной-единственной среде. В соответствии с этим появляется возможность долговременного использования одной и той же среды. Возможное повторное заражение TSO-суспензий новыми микроорганизмами удается предотвратить за счет применения разбавленных кислот и добавления консервантов. Описанный выше комбинированный способ инактивации микроорганизмов и консервирования TSO-суспензии позволяет избежать размножения новых микроорганизмов. Тем самым подобный, предельно щадящий способ однозначно обладает явными преимуществами перед способом, основанным на применении сильных кислот.
Пример 4: Определение количества колоний различных микроорганизмов
В этом примере рассмотрены повышение значений pH с 2 до 4 и добавление консервантов.
Эксперименты в примерах 4а-4д проводили в следующих условиях. Опытные образцы содержали по 10000 TSO/мл (±10%) в фосфатном буфере с pH 4, а также содержали либо 0,2% бензойной кислоты, либо 0,1% сорбиновой кислоты, либо 15% пропиленгликоля. К опытным образцам добавляли следующие микроорганизмы:
- Aspergillus niger в виде отдельного микроорганизма;
- Pseudomonas aruginosa, Staphylococcus aureus, Candida albicans и Escherichia coli в виде комбинации.
Температура инкубации составляла 25°C. Опытные планшеты анализировали через 1-7 дней. При этом были получены следующие результаты:
4а. Pseudomonas aeruginosa
Консервант
T<sub>0</sub> (КОЕ/мл)
Т<sub>1день</sub> (КОЕ/мл)
Т<sub>7дней</sub> (КОЕ/мл)
Бензойная кислота, 0,2%
180000
<10
<10
Сорбиновая кислота, 0,1%
180000
30
<70
Пропиленгликоль, 15%
180000
10
<70
4б. Staphylococcus aureus
Консервант
Т<sub>0</sub> (КОЕ/мл)
Т<sub>1день</sub> (КОЕ/мл)
Т<sub>7дней</sub> (КОЕ/мл)
Бензойная кислота, 0,2%
130000
<10
<10
Сорбиновая кислота, 0,1%
130000
240
<10
Пропиленгликоль, 15%
130000
14000
<10
4в. Escherichia coli
Консервант
Т<sub>0</sub> (КОЕ/мл)
Т<sub>1день</sub> (КОЕ/мл)
Т<sub>7дней</sub> (КОЕ/мл)
Бензойная кислота, 0,2%
140000
<10
<10
Сорбиновая кислота, 0,1%
140000
490
<10
Пропиленгликоль, 15%
140000
7100
<10
4г. Candida albicans
Консервант
Т<sub>0</sub> (КОЕ/мл)
Т<sub>1день</sub> (КОЕ/мл)
Т<sub>7дней</sub> (КОЕ/мл)
Бензойная кислота, 0,2%
240000
<10
<10
Сорбиновая кислота, 0,1%
240000
190
<10
Пропиленгликоль, 15%
240000
8600
30
4д. Aspergillus niger
Консервант
Т<sub>0</sub> (КОЕ/мл)
Т<sub>1день</sub> (КОЕ/мл)
Т<sub>7дней</sub> (КОЕ/мл)
Бензойная кислота, 0,2%
120000
90
<10
Сорбиновая кислота, 0,1%
120000
20000
<10
Пропиленгликоль, 15%
120000
30000
9000
При сильном заражении грибами предпочтительно использовать сорбиновую кислоту, бензойную кислоту и/или эфиры парагидроксибензойной кислоты либо использовать пропиленгликоль в комбинации с этими консервантами.
Еще одно преимущество, связанное с комбинированием процесса инактивации микроорганизмов разбавленными кислотами с применением консервантов, состоит в возможности предотвратить при дальнейшем применении TSO-суспензии ее возможное повторное заражение новыми микроорганизмами. Описанный выше комбинированный способ инактивации микроорганизмов и консервирования TSO-суспензии позволяет избежать размножения новых микроорганизмов.
Подготовительные операции для дальнейшего приготовления суспензии и ее применения пациентом требуют повышения значения pH до 2-7, предпочтительно до 4-6. Для выполнения этой третьей стадии также необходимо добавление приемлемых консервантов. Применяемые консерванты должны быть при этом пригодны для приема внутрь. В качестве пригодных для применения в этих целях консервантов зарекомендовали себя сорбиновая кислота в концентрации 0,1-0,2%, бензойная кислота в концентрации 0,1-0,3%, эфиры парагидроксибензойной кислоты в концентрациях 0,02-0,3% или пропиленгликоль в виде 5-20%-ного водного раствора. Указанные консерванты можно также использовать в виде их смесей.
При создании изобретения неожиданно было установлено, что подобный способ очистки не приводит к снижению жизнеспособности находящихся в суспензии яиц глистов.
Пример 5: Жизнеспособность яиц глистов
Яйца глистов с еще не развившимися эмбрионами суспендировали в концентрации 40000 яиц/мл в различных средах и выдерживали в них для развития эмбрионов (при 22-25°С). По завершении периода инкубации длительностью 60 и 90 дней отдельные суспензии исследовали под микроскопом и на основании общего количества яиц глистов, а также количества морфологически интактных яиц с развивающимися эмбрионами рассчитывали коэффициент выживаемости. Коэффициент выживаемости (KB) является при этом показателем жизнеспособности яиц глистов. К началу процесса развития эмбрионов их развитие в яйцах глистов еще не началось, и поэтому коэффициент выживаемости в этот момент равен нулю. По мере же развития эмбрионов коэффициент выживаемости возрастает и при данных условиях инкубации достигает своих максимальных значений, начиная с 60-го дня. Обычно коэффициент выживаемости составляет порядка 90%.
Жидкая дисперсионная среда суспензии
KB в 0-й день
KB на 60-й день
КВ на 90-й день
Серная кислота с pH 1 с добавкой 0,01% сорбата калия
0
0,91
0,91
Серная кислота с pH 1 с добавкой 0,07% сорбата калия
0
0,93
0,91
Серная кислота с pH 0,8
0
0,94
0,90
Серная кислота с pH 0,5
0
0,92
0,77
Во всех средах доля яиц с развивающимися эмбрионами по истечении 60 дней составила более 90%. В отличие от сред, которые содержали консервант и при нахождении яиц в которых коэффициент выживаемости вне зависимости от концентрации консерванта не снижался в течение последующих 30 дней, в серной кислоте с pH 0,5 отмечалось уменьшение доли яиц глистов с нормально развивающимися эмбрионами. Тем самым добавление пригодного для приема внутрь консерванта, предпочтительно сорбиновой кислоты и ее солей, позволяет использовать жидкие дисперсионные среды с безвредными для яиц глистов значениями pH. В соответствии с этим такой способ можно использовать для приготовления стойкого при хранении препарата (щадящий способ).
Подготовительные операции для дальнейшего приготовления суспензии требуют повышения значения pH до 2-7, предпочтительно до 4-6, а также добавления приемлемых консервантов. Применяемые консерванты должны быть при этом пригодны для приема внутрь. В качестве пригодных для применения в этих целях консервантов зарекомендовали себя сорбиновая кислота в концентрации 0,01-0,2%, бензойная кислота в концентрации 0,1-0,3% или пропиленгликоль в виде 5-20%-ного водного раствора. Указанные консерванты можно также использовать в виде их смесей.