ШТАММ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ (ВАРИАНТЫ) ДЛЯ ПОЛНОГО РАЗЛОЖЕНИЯ ГЛЮТЕНА В МУКЕ И ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЕ
LACTIC ACID BACTERIA STRAIN (VERSIONS) FOR COMPLETE GLUTEN DECOMPOSITION IN FLOUR AND SUCH STRAIN USAGE

Настоящее изобретение касается применения микробиологической технологии для полного разложения глютена в муке. В частности, способ согласно изобретению включает применение в условиях ферментации в жидкой фазе выделенных молочных бактерий и грибковых протеаз, обычно используемых в производстве хлебобулочных изделий из дрожжевого теста, для полного разложения глютена (остаточная концентрация глютена ниже 20 ч./млн). Зерновая мука, получающаяся в результате ферментации, может применяться в качестве исходного материала для производства не содержащих глютена пищевых продуктов, предназначенных для питания пациентов, страдающих глютеновой болезнью. Предложенный биотехнологический способ приводит к получению различных экономических, социальных, питательных и органолептических преимуществ по сравнению с существующей технологией производства не содержащих глютена пищевых продуктов, изготавливаемых из ингредиентов, не содержащих глютена естественным образом или в результате обработки экстракционными способами.
Эпидемиологическая распространенность непереносимости глютена, или глютеновая болезнь, непрерывно растет. Последние обследования населения сообщают о подверженности этому состоянию каждого сотого жителя Европы и Соединенных Штатов (Rewers, 2005. Epidemiology of celiac disease; what are the prevalence, incidence, and progression of celiac disease (Эпидемиология глютеновой болезни: распространенность, частота возникновения и развитие глютеновой болезни). Gastroenterology 128:47-51). Согласно современным представлениям, единственным эффективным терапевтическим средством против этой пищевой непереносимости является полностью безглютеновая диета, которая должна строго соблюдаться на протяжении всей жизни (Hamer, 2005. Celiac Disease: Background and biochemical aspects (Глютеновая болезнь: предпосылки и биохимические аспекты). Biotechnol Advanc 23:401-408). Известно, например, применение молочных бактерий для приготовления хлебобулочных изделий из не содержащей белков муки (More и др. Cereal Chemistry, American Association of Cereal Chemists. Миннеаполис, США, том 84, №4, 1 января 2007, стр.357-364 и Moore и др., European Food Research and Technology, том 226, 6 июня 2007, стр.1309-1316). Однако не содержащая глютена диета также имеет очевидные недостатки. Не содержащие глютена продукты по сравнению с продуктами на основе зерновых оказываются слишком дорогими, демонстрируют пониженные органолептические качества и свойства при хранении, диета является трудной для строгого ее соблюдения и должна постоянно контролироваться диетологами, также принимающими во внимание дисбаланс питательных веществ (например, волокон, минеральных веществ и витаминов), являющийся следствием полного отсутствия злаков в пище (Grehn и др., 2001. Dietary habits of Swedish adult coeliac patients treated by a gluten-free diet for 10 years (Особенности питания взрослых страдающих глютеновой болезнью пациентов в Швеции, получавших терапию безглютеновой диетой на протяжении 10 лет). ScandJNutr 45: 178-182; Mariani и др., 1998. The gluten-free diet: a nutritional risk factor for adolescents with celiac disease (Безглютеновая диета: пищевой фактор риска для подростков с глютеновой болезнью). J Pediart Gastroenterol Nut 27: 519-523; Thompson и др., 2005. Gluten-free diet survey: are Americans with celiac disease consuming recommended amounts of fibre, iron, calcium and grain foods? (Обзор не содержащей глютена диеты: получают ли американцы с глютеновой болезнью рекомендованные количества волокон, железа, кальция и зерновых продуктов?) J. Human. Nutr. Diet. 18:163-169). Более того, в некоторых случаях (например, «стойкого синдрома мальабсорбции») строгое соблюдение не содержащей глютена диеты также не дает возможности полного восстановления функциональности кишечника (Sollid и Khosla, 2004. Future therapeutic options for celiac disease (Будущие возможные методы лечения глютеновой болезни). Gastroenterol. Hepatol. 2:140-147). В рамках альтернативных вариантов терапевтического лечения с применением безглютеновой диеты в различных исследованиях были использованы преимущества современных представлений о последовательностях токсических эпитопов, и рассматривалось применение микробиологических ферментов, в частности, пролилэндопептидазы (PEPs) для гидролиза этих полипептидов. Ферменты микроорганизмов были предложены в качестве диетических добавок (Shan и др., 2004. Comparative biochemical analysis of three bacterial prolyl-endopeptidases: implications for celiac sprue (Сравнительный биохимический анализ трех бактериальных пролилэндопептидаз: значение для целиакии). Biochem. J. 383:311-318) и/или для in vitro детоксикации глютена (Chen и др., 2003. Identification and characterization of Lactobacillus helveticus PePO2, an endopeptidase with post-proline specificity (Идентификация и определение характеристик Lactobacillus helveticus PePO2, постпролин-специфичной эндопептидазы). Appl. Environ. Microbiol. 69:1276-1282; Stepniak и др., 2005. Highly efficient gluten degradation with a newly identified prolyl-endoprotease: implications for celiac disease (Высокоэффективное разложение глютена с помощью недавно идентифицированной пролилэндопептидазы: значение для глютеновой болезни). Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 291:G621-G629).
Публикация WO 2008/010252 и Cagno и др. (Journal of Food Protection, том 71, №7, 2008, стр.1491-1495), раскрывают способ приготовления хлебоперакных изделий из не содержащей белков муки, ориентированный на улучшение питательных, органолептических свойств и характеристик хранения этих продуктов, приготавливаемых из не содержащих глютена ингредиентов.
На протяжении нескольких последних десятилетий также значительно изменилась биотехнология хлебобулочных изделий из дрожжевого теста, влияя тем самым на особенности питания целых групп населения, ранее сидевших на диете, основывающейся на глютене. В настоящее время дрожжевые хлебобулочные изделия производятся с помощью чрезвычайно быстрых технологических способов (например, с использованием химических разрыхлителей или хлебопекарных дрожжей), полностью заменяющих длительные процессы ферментации с помощью диких молочнокислых бактерий и дрожжей, образующихся из сырьевых материалов и применяющихся в качестве «закваски». При современных способах зерновые компоненты (например, белки) в ходе технологической обработки пищевых продуктов не подвергаются воздействию какой-либо гидролитической активности, сохраняя характеристики исходного сырья (Gobbetti, 1998. Trends Food Sci. Technol. 9:267-274). Различные исследования, основанные на этих рассмотрениях и использующие преимущества ферментативных способностей смеси выбранных молочных бактерий, продемонстрировали, что с помощью обычной биотехнологии, основанной на использовании выбранных молочнокислых бактерий и длительных периодах времени ферментации, оказывается возможным заметное снижение исходной концентрации глютена в зерновых продуктах (Di Cagno и др., 2002. Proteolysis by sourdough lactic bacteria: effects on wheat flour protein fractions and gliadin peptides involved in human cereal intolerance (Протеолиз заквасочными молочными бактериями: действие на белковые фракции пшеничной муки и пептиды глиадина, вовлеченные в непереносимость зерновых продуктов человеческим организмом). Appl. Environ. Microbiol. 68:623-633; Di Cagno и др., 2004. Sourdough bread made from wheat and non toxic flours and started with selected lactobacilli is tolerated in celiac sprue patients (Переносимый страдающими целиакией пациентами хлеб из теста на закваске, изготовленный из пшеничной нетоксичной муки и заквашенный с выделенными молочными бактериями). Appl. Environ. Microbiol. 70:1088-1096; Di Cagno и др., 2005. Pasta made from durum wheat semolina fermented with selected lactobacilli as a tool for a potential decrease of the gluten intolerance (Макаронные изделия, изготовленные из пшеничной крупчатки, ферментированные селекционными молочными бактериями, в качестве средства для потенциального ослабления непереносимости глютена). J. Agr. Food Спет.53:4393-44U2; De Angelis и др., 2005. VSL#3 probiotic preparation has the capacity to hydrolyze gliadin polypeptides responsible for celiac sprue (Препарат пробиотика VSL#3, обладающий способностью гидролизировать полипептиды глиадина, ответственные за целиакию). Biochim. Biophys. Acta. 1762: 80-93).
Кодекс Алиментариус, принятый WHO (Всемирная организация здравоохранения) и ФАО (Продовольственная и сельскохозяйственная организация), различает «не содержащие глютена продукты», содержащие ингредиенты с концентрацией глютена ниже 20 ч./млн и «продукты, сделанные без глютена», имеющие остаточную концентрацию глютена менее 200 ч./млн. Однако различные исследования, приведшие к созданию руководящих принципов, изданных «Рабочей группой по проламинам», предлагают, чтобы в любом случае порог содержания глютена поддерживался на уровне ниже 20 ч./млн (Stern и др., 2001. Analysis and clinical effects of gluten in celiac disease (Анализ и клинические эффекты глютена при глютеновой болезни). Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. 13:741-747). Недавнее исследование Rizzello и др. (Rizzello и др., 2007. Highly efficient gluten degradation by lactobacilli and fungal proteases during food processing: new perspectives for celiac disease (Высокоэффективное разложение глютена молочными бактериями и грибковыми протеазами в ходе технологической обработки пищевых продуктов: новые перспективы в отношении глютеновой болезни). Appl. Environ. Microbiol. 73:4499-4507) рассматривало применение более сложной смеси, состоящей из 10 видов выделенных молочнокислых бактерий, грибковых протеаз, и длительного времени ферментации (48 часов при 37°C) в условиях замешивания в полужидком состоянии. Согласно данным электрофоретического, хроматографического и иммунологического анализа, плотен, содержавшийся в пшеничной муке, разложился до пороговой концентрации ниже 20 ч./млн.
Известна, кроме того, патентная заявка WO 2006/097415, в которой, аналогично вышеупомянутому исследованию, описан способ разложения глютена посредством применения сложной смеси, состоящей из по меньшей мере шести видов молочнокислых бактерий и/или бифидобактерий, при длительном времени ферментации (24-31 час). Однако описанный в этом документе способ не является подходящим для обеспечения полного разложения глютена, следствием чего является невозможность его применения пациентами с глютеновой болезнью. Фигура 1В в патентной заявке WO 2006/097415 фактически показывает, что после гидролиза с помощью микроорганизмов все же сохраняются прозрачные пятна неразложившихся глиадинов и это подтверждается таблицей 2 в том же документе, из чего становится очевидно, что, в то время как некоторые глиадины частично гидролизуются, другие оказываются нечувствительными к процессу гидролиза.
Исходя из литературных и ранее описанных данных, можно сделать вывод, что основным предметом заботы при производстве не содержащих глютена пищевых продуктов из детоксифицированной зерновой муки являются некоторые следующие проблемы: (i) упрощение композиции выделенных молочных бактерий, предназначенных для применения в процессе разложения; (ii) значительное сокращение времени ферментации, что должно сделать данный способ подходящим для применения в промышленных процессах; (iii) демонстрация способности молочнокислых бактерий и ферментов плесневых грибов эффективно воздействовать на муку из мягкой и твердой пшеницы, принадлежащей к различным сортам, а также из ячменя, ржи и овса; (iv) обеспечение биотехнологического процесса гидролиза глютена, делающего возможным применение для получения не содержащих глютена продуктов детоксифицированной зерновой муки; и (v) демонстрация посредством длительных медицинских испытаний in vivo абсолютной переносимости пациентами с глютеновой болезнью продолжительного приема не содержащих глютена продуктов, основанных на детоксифицированной пшеничной муке.
Поэтому, в свете вышесказанного, очевидной является необходимость обеспечения материалов и способов для приготовления не содержащих глютена хлебобулочных изделий, изготавливаемых из детоксифицированной зерновой муки, которые, с одной стороны, не демонстрировали бы недостатков, выявленных из обзора литературных данных в отношении экономического, социального, питательного и органолептического аспектов, и, с другой стороны, недостатков, присущих не содержащим глютена продуктам, имеющимся в продаже в настоящее время.
Авторы настоящего изобретения в данное время обнаружили, что с помощью всего лишь двух выделенных молочнокислых бактерий в комбинации с грибковыми протеазами время ферментации, необходимое для разложения глютена, может быть заметно уменьшено. Более того, была доказана способность молочнокислых бактерий и грибковых протеаз к полному разложению глютена в муке из различных сортов мягкой и твердой пшеницы, ячменя, ржи и овса; был представлен биотехнологический протокол для производства различных дрожжевых хлебобулочных изделий из детоксифицированной пшеничной муки; продемонстрирована абсолютная переносимость продукта пациентами с глютеновой болезнью, таким образом, совершенно новаторским способом делая возможным применение пшеничной муки в качестве ингредиента для производства не содержащих глютена дрожжевых хлебобулочных изделий.
Молочнокислые бактерии согласно настоящему изобретению принадлежат к роду Lactobacillus и были выделены из «заквасок», используемых для производства сортов хлеба, типичных для Южной Италии. Lactobacillus sanfranciscensis DPPMA12 (депонирован как DSMZ N. DSM22063 28 ноября 2008) и Lactobacillus plantarum DPPMA125 (депонирован как DSMZ N. DSM22064 28 ноября 2008).
Был стандартизирован и оптимизирован биотехнологический протокол, включающий применение выделенных молочнокислых бактерий и грибковых протеаз в чрезвычайно быстром процессе ферментации (12-20 часов при 30-37°C) зерновой муки, ресуспендированной в воде до достижения концентрации в 20-50 масс.%, и последующее применение их в различных, согласно требуемым показателям, процентных долях в качестве ингредиента для быстрого (около 1-3 час) разрыхления с помощью хлебопекарных дрожжей в производстве не содержащих глютена дрожжевых хлебобулочных изделий (остаточное содержание глютена менее 20 ч./млн).
Ниже представлена схема биотехнологического протокола для получения дрожжевых хлебобулочных изделий из детоксифицированной, не содержащей глютена пшеничной муки.
Выращивание, промывка и суспендирование в воде культур молочнокислых бактерий
↓
8
Смешивание зерновой муки (30%) с водой (70%), содержащей два вида выделенных молочнокислых бактерий (плотность клеток 10 КОЕ/г) и грибковые протеазы (по 400 ч./млн)
↓
Ферментация в течение 18 часов при 37°C
↓
Смешивание с нативной кукурузой (10%), рисовой мукой (10%), яйцом (5%), сахаром (3%), маслом (1%) и хлебопекарными дрожжами (1,5%)
↓
Ферментация в течение 1,5 часов при 30°C
↓
Выпекание в течение 50 мин при 250°C
Пациентам с глютеновой болезнью ежедневно в течение 60 дней давали хлебобулочные изделия согласно одной из возможных рецептур, содержащие 10 г эквивалента исходного глютена. Иммунохимические и гистологические пробы показали абсолютную переносимость препарата, полученного из не содержащей глютена детоксифицированной муки.
Согласно дополнительным анализам, использующим электрофоретические, хроматографические и иммунологические методы, способ ферментации согласно настоящему изобретению с помощью выделенных молочнокислых бактерий, не применявшихся в предыдущих исследованиях, а также грибковых протеаз делает возможным: (i) полную детоксикацию глютена (содержание остаточного глютена ниже 20 ч./млн); (ii) производство гидролизованной муки, состоящей из смеси низкомолекулярных пептидов и, особенно, аминокислот (приблизительно 15000 мг/кг по сравнению с <1000 мг/кг в пшеничной муке), что улучшает питательные характеристики по сравнению с обычными не содержащими глютена продуктами; (iii) заметное сокращение времени процесса по сравнению с опубликованными литературными данными, что делает указанный способ подходящим для преобразования до уровня промышленного масштаба; (iv) производство не содержащих глютена хлебобулочных изделий с различными рецептурами ингредиентов, включающими применение детоксифицированной пшеничной муки в различных концентрациях (20-50%); и (v) абсолютную переносимость после продолжительного приема данных продуктов пациентами с глютеновой болезнью, согласно первичным медицинским данным.
Продукты, получаемые согласно способу настоящего изобретения, демонстрируют предпочтительные органолептические, реологические и химические свойства, не предлагаемые продуктами существующего уровня техники (не содержащие глютена продукты, полученные из муки, не содержащей белков естественным образом). Продукты согласно настоящему изобретению фактически сохраняют пищевые качества содержащей глютен муки и тем самым предлагают лучшие питательные характеристики по сравнению с продуктами, полученными из не содержащей белков муки.
Более того, в результате процесса разложения глютена, осуществляемого являющими предметом изобретения молочнокислыми бактериями, продукты согласно изобретению являются полностью не содержащими глютена, в противоположность продуктам, получаемым с помощью известных молочнокислых бактерий (WO 2006/097415, WO 2008/010252). Молочнокислые бактерии согласно патентной заявке WO 2008/010252 применялись в тех же условиях, что и молочнокислые бактерии согласно настоящему изобретению, и оказались не подходящими для разложения глютена, фактически остаточное содержание глютена составило приблизительно 6000-10000 ч./млн (Фигура 5). Поэтому указанные бактерии могут использоваться только для удаления следов глютена, однако эффективности бактерий согласно настоящему изобретению они не демонстрируют.
Что касается статьи Rizzello и др. (Appl. Environ. Microbiol. 73:4499-4507, 2007), то возможность достижения полного разложения глютена в течение заметно более короткого времени (18 час по сравнению с 48 час) влечет за собой, во-первых, значительное технологическое преимущество, делающее процесс преобразования сопоставимым с наиболее частыми и обычными промышленными способами производства хлебобулочных продуктов. К тому же слишком длительный (48 час) процесс ферментации, помимо увеличения технологических издержек, может приводить к появлению санитарно-гигиенических рисков. Кроме того, более быстрый способ разложения глютена неизбежно приводит к получению исходного материала (мука с полностью гидролизованным глютеном), отличающегося иным профилем свободных аминокислот и поэтому подходящего для обеспечения других органолептических показателей не содержащих глютена продуктов по сравнению с более длительным процессом, отличающимся неизбежно другой ферментативной кинетикой.
Поэтому конкретным объектом настоящего изобретения является смесь, содержащая или состоящая из молочнокислых бактерий Lactobacillus sanfranciscensis DSM 22063 и Lactobacillus plantarum DSM 22064. Данная смесь может дополнительно содержать грибковые протеолитические ферменты, такие как, например, протеазы Aspergillus oryzae, Aspergillus niger или их смеси.
Следующим объектом настоящего изобретения является применение указанной выше смеси для полного разложения глютена в муке как из мягкой, так и твердой пшеницы, из ячменя, ржи и овса.
Настоящее изобретение, кроме того, относится к способу приготовления жидкого теста из муки с полностью разложенным глютеном, подходящего для производства дрожжевых не содержащих глютена продуктов, содержащего или состоящего из следующих этапов:
а) размножение культуры молочнокислых бактерий Lactobacillus sanfranciscensis DSM 22063 и Lactobacillus plantarum DSM 22064;
8
b) смешивание муки в концентрации 20-50%, предпочтительно 30% и воды в концентрации 50-80%, предпочтительно 70%, содержащей смесь двух бактерий этапа а) с плотностью клеток приблизительно 10 КОЕ/г;
c) добавление одной или нескольких грибковых протеаз, каждой в концентрации 200-500 ч./млн, предпочтительно 400 ч./млн;
d) ферментирование в течение 8-20 час, предпочтительно 12 час при 30-37°C.
Способ может, кроме того, содержать этап е) сушки жидкого теста, полученного на этапе d). К муке, подходящей для применения при данном способе, относится мука как из мягкой, так и твердой пшеницы, из ячменя, ржи, овса или их смеси, предпочтительными являются мягкая и твердая пшеница.
Грибковые протеолитические ферменты могут быть выбраны из группы, состоящей из протеаз Aspergillus oryzae, Aspergillus niger или их смесей.
Поэтому изобретение также относится к жидкому или сухому мучному тесту, в котором глютен является полностью разложенным согласно обозначенному выше способу.
Следующим объектом изобретения является смесь, содержащая или состоящая из обозначенного выше теста в комбинации с одним или несколькими видами муки, не содержащей белков естественным образом, как, например, выбранные из группы, состоящей из муки, полученной из нативной кукурузы, белой кукурузы, риса, лебеды-квиноа, тэффа или амаранта и гречихи. Вышеупомянутые виды муки могут использоваться, в частности, в следующих процентах: мука из нативной кукурузы 5-15%, предпочтительно 10%, белой кукурузы 5-15%, предпочтительно 10%, риса, лебеды-квиноа, тэффа или амаранта 10-30%, предпочтительно 20% и гречихи 1-10%, предпочтительно 5%, при этом указанные проценты выражают массовые проценты по отношению к общей массе композиции муки. Другие ингредиенты, которые могут быть добавлены к рецептуре не содержащих глютена хлебобулочных изделий, основанных на детоксифицированной пшеничной муке, представлены, например, сахаром, маслом, яйцами и животными сливками в жидкой форме.
Дополнительным объектом изобретения является способ приготовления дрожжевых хлебобулочных изделий с применением глютен-детоксифицированной муки согласно обозначенному выше способу, содержащему или состоящему из следующих этапов:
а) добавление смеси естественным образом не содержащей белков муки (10-40%, предпочтительно 30%), хлебопекарных дрожжей (1-2%), соли (0,1-1,0%) и структурирующих агентов (0,5-1%) к глютен-детоксифицированному жидкому мучному тесту с помощью описанного выше способа и замешивание;
b) прохождение ферментации в течение приблизительно 1-3 час, предпочтительно 1,5 час при 30°C;
c) выпекание в течение 50 минут при 220°C. Когда глютен-детоксифицированное мучное тесто сушится, процентное отношение ингредиента к воде составляет приблизительно 1,2:0,8.
Естественным образом не содержащая белков мука может быть выбрана из группы, состоящей из муки, приготовленной из природной кукурузы, белой кукурузы, риса, лебеды-квиноу, тэффа, амаранта, гречихи или их смеси. С другой стороны, глютен-детоксифицированная мука может быть выбрана из группы, состоящей из муки, приготовленной как из мягкой, так и твердой пшеницы, ячменя, ржи, овса или их смеси, предпочтительной является мука из мягкой или твердой пшеницы.
Поэтому объектом настоящего изобретения также являются хлебобулочные изделия из дрожжевого теста, получаемые с помощью обозначенного выше способа.
Следующим объектом настоящего изобретения является способ получения хлебобулочных изделий из дрожжевого теста, содержащий или состоящий из следующих этапов:
a) прямое добавление нативной кукурузы, рисовой муки, яиц, сахара, масла и хлебопекарных дрожжей к глютен-детоксифицированному мучному тесту согласно обозначенному выше способу и замешивание;
b) прохождение ферментации в течение 1,5 час при 30°C и
c) выпекание дрожжевого теста в течение 50 минут при 250°C.
В частности, на этапе а) процентное содержание ингредиентов является следующими: нативная кукуруза 10%, рисовая мука 10%, яйца 5%, сахар 3%, масло 1% и хлебопекарные дрожжи 1,5%.
Поэтому объект настоящего изобретения также составляют дрожжевые хлебобулочные изделия, получаемые с помощью обозначенного выше способа.
Следующим объектом настоящего изобретения также является применение продуктов согласно настоящему изобретению, то есть мучного теста, смеси теста с не содержащей белков мукой, дрожжевых хлебобулочных изделий, подходящих для покрытия дисбаланса питательных веществ, возникающего в результате соблюдения безглютеновой диеты.
Наконец, объект настоящего изобретения представляют молочнокислые бактерии Lactobacillus sanfranciscensis DSM 22063 и Lactobacillus plantarum DSM 22064.
Далее настоящее изобретение описывается иллюстративным, но не ограничительным образом, согласно его предпочтительным воплощениям с конкретной привязкой к прилагаемым чертежам.
Фигура 1 показывает аминопептидазную N-типа (PepN), дипептидазную (PepV) и трипептидазную (РерТ) (а), и пролиниминопептидазную (РерГ), пролидазную (PepQ), пролиназную (PepR), дипептидилпептидазную (РерХ) (b) активность Lactobacillus sanfranciscensis DPPMA12 (DSM22063) и Lactobacillus plantarum DPPMA125 (DSM22064) на Leu-p-NA, Leu-Leu, Leu-Leu-Leu и Pro-p-NA, Val-For-Gly и Gly-For-Wing синтетических субстратах, соответственно. В качестве контроля применялись молочнокислые бактерии, использовавшиеся в исследовании Rizzello и др. (Rizzello и др., 2007. Appl. Environ. Microbiol. 73:4499-4507): Lactobacillus alimentarius 15M, Lactobacillus brevis 14G, L. sanfranciscensis 7 A, Lactobacillus hilgardii 5IB и L. sanfranciscensis LS3, LS10, LSI9, LS23, LS38 и LS47. Ферментативная активность выражалась в единицах активности (U), то есть в количествах фермента, необходимых для высвобождения 1 мкмоль/мин п-нитроанилида или 1 мкмоль/мин аминокислоты при определении активности на субстратах, отличных от п-нитроанилида.
Фигура 2 показывает двухмерные электрофоретические профили различных сортов твердой пшеницы (Svevo и Duilio) до и после обработки селекционными молочнокислыми бактериями и грибковыми протеазами.
Фигура 3 показывает белковый состав пшеничной муки до и после процесса гидролиза селекционными молочнокислыми бактериями и грибковыми протеазами.
Фигура 4 показывает аминопептидазную (А), пролиниминопептидазную (В) и пролилдипептидиламинопептидазную (С) активность молочнокислых бактерий, применяемых согласно WO 2008/010252 (Lactobacillus sanfranciscensis LS40, LS13, LS44, LS35, LS14, LSI 1, LS18, LS4, LS15 и LS41) и согласно настоящему изобретению [L. sanfranciscensis DPPMA12 (DSM22063) и Lactobacillus plantarum DPPMA125 (DSM22064)]. Сокращения 15М, 14G, 7А, 51 В, LS3, LS10, LS19 LS23, LS38 и LS47 означают биотипы так, как это используется в публикации Rizzello и др., 2007.
Фигура 5 показывает остаточную концентрацию глютена (ч./млн) в тесте, ферментированном Lactobacillus sanfranciscensis LS40, LS13, LS44, LS35, LS14, LSI 1, LSI8, LS4, LSI5 и LS41 (WO2008/010252), L. sanfranciscensis DPPMA12 (DSM22063) и Lactobacillus plantarum DPPMA125 (DSM22064) в течение 12 час при 37°C.
Фигура 6 показывает общую концентрацию свободных аминокислот (мг/кг) в ферментированном тесте при использовании различных комбинаций молочных бактерий согласно WO 2008/010252 (тесто 1, 2, 3, 4 и 5) и пшеничном тесте, ферментированном двумя молочнокислыми бактериями (DDPPMA12 и DPPMA125) настоящего изобретения.
Фигура 7 приводит обработку методом главных компонент (РСА) данных, полученных при органолептическом анализе хлебов (1, 2, 4 и 5) согласно WO 2008/010252 и хлеба (DPPMA12 и DPPMA125), полученного с применением детоксифицированной пшеничной муки согласно изобретению.
Пример 1. Пептидазная активность выделенных молочных бактерий.
L. sanfranciscensis DPPMA12 и L. plantarum DPPMA125 из коллекции культур Dipartimento di Protezione delle Piante и Microbiologia Applicata dell'Universita degli Studi di Bari, предварительно выделенные из «заквасок», были размножены при 30°C в течение 24 час в модифицированной среде MRS (mMRS), содержащей в дополнение к обычным ингредиентам 5% мальтозы и 10% дрожжевой воды, имеющей итоговый pH 5,6. В качестве контроля при оценке пептидазной активности молочнокислых бактерий применялись Lactobacillus alimentarius 15М, Lactobacillus brevis 14G, L. sanfranciscensis 7A, Lactobacillus hilgardii 51 В и L. sanfranciscensis LS3, LS10, LS19, LS23, LS38 и LS47, использовавшиеся в недавней публикации Rizzello и др. (Rizzello и др., 2007. Appl. Environ. Microbiol. 73:4499-4507).
620
8
Для ферментных проб использовались выращенные в течение 24 час клетки, которые отделялись центрифугированием (10000 об/мин, 4°C), дважды промывались в фосфатном буфере 50 мМ, pH 7,0 и ресуспендировались в том же самом буфере до оптической плотности 2,5 (А нм), соответствующей 10 КОЕ/мл. Были определены аминопептидазная N-типа (PepN) и пролиниминопептидазная (PepI) активность с помощью Leu-p-NA и Pro-p-NA синтетических субстратов, соответственно. Реакционная смесь состояла из 0,9 мл К-фосфатного буфера 50 мМ, pH 7,0, содержащего растворенный синтетический субстрат (конечная концентрация 2 мМ) и 100 мл клеточной суспензии. Ферментативная активность, выраженная в единицах активности (U), соответствует количеству фермента, необходимому для высвобождения 1 мкмоль/мин п-нитроанилида (Gobbetti и др., 1996. The proteolytic system of Lactobacillus sanfranciscensis CB1: purification and characterization of a proteinase, a dipeptidase, and an aminopeptidase (Протеолитическая система Lactobacillus sanfranciscensis CB1: очистка и определение характеристик протеиназы, дипептидазы и аминопептидазы). Appl. Environ. Microbiol. 62: 3220-3226). Пролидаза (PepQ), пролиназа (PepR) и дипептидилпептидаза (РерХ) определялись, как описано Cagno и сотрудниками (Di Cagno и др., 2004. Sour dough bread made from wheat and nontoxic flours and starter with selected lactobacilli is tolerated in celiac sprue patients (Переносимый страдающими целиакией пациентами хлеб из теста на закваске, изготовленный из нетоксичных сортов пшеничных муки и заквашенный с селекционными молочными бактериями), Appl. Environ. Microbiol. 70: 1088-1096) на, соответственно, Val-Pro, Pro-Gly и Gly-Pro-Ala. Дипептидаза (PepV) и трипептидаза (РерТ) определялись согласно Cd-нингидринному способу (Gobbetti и др., 1999. Study of the effects of temperature, pH, NaCl, and aw on the proteolytic and lipolytic activities of cheese-related lactic bacteria by quadratic response surface methodology (Исследование действия температуры, pH, NaCl и aw на протеолитическую и липолитическую активность используемых в сыроделии молочных бактерий в соответствии с методом квадратичной поверхности отклика), Enzyme Microbial Technol 25: 795-809) с использованием, соответственно, Leu-Leu и Leu-Leu-Leu. Одна единица активности (U) определяется как количество фермента, необходимое для высвобождения 1 мкмоль/мин аминокислоты.
Для сравнительных целей испытание было также повторено и для молочных бактерий, описанных в WO2008/010252 (L. sanfranciscensis LS40, LS13, LS44, LS35, LS14, LS11, LSI8, LS4, LSI5 и LS41).
Пример 2. Экстракция белков пшеничной муки и электрофоретический анализ.
Белки экстрагировались из пшеничной муки согласно способу, описанному Weiss и др. (Weiss и др., 1993. Electrophoretic characterization of wheat grain alergens from different cultivars involved in bakers' asthma (Электрофоретическое исследование аллергенов пшеничного зерна различных культиваров, вовлеченных в астму пекарей). Electrophoresis. 14:805-816). Был выполнен двухмерный электрофоретический анализ приблизительно 30 мкг экстрагированной белковой фракции согласно иммобулин-полиакриламидному методу (De Angelis и др., 2005. Biochim. Biophys. Acta. 1762:80-93). Для каждой независимой ферментации было проанализировано по четыре геля и полученные данные подвергнуты нормализации согласно методике, предложенной Bini и др. (Bini и др., 1997. Профили экспрессии белков при протоковой карциноме груди человека и в случае гистологически нормальной ткани. Electrophoresis. 18:2831-2841).
Пример 3. Иммунологический и MALDI-TOF масс-спектрометрический анализы.
Иммунологические анализы были выполнены при использовании антител R5 и «сэндвич»-ИФА и конкурентного ИФА-метода (Transia Plate, Diffchamb) (Valdez и др., 2003. Innovative approach to low-level gluten determination in foods using sandwich enzyme-linked immunosorbent assay protocol (Инновационный подход к определение низких уровней глютена в пищевых продуктах с помощью «сэндвич»-метода твердофазного иммуноферментного анализа). Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. 15:465-474). Был выполнен MALDI-TOF спектрометрический анализ на установке Voyager-De Pro-workstation (PerSeptive Biosystems, Великобритания) согласно способу, представленному Hernando и др. (Hernando и др., 2003. New strategy for the determination of gliadin in maize or rice-based foods matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry fractionation of gliadin from maize or rice-prolamins by acid treatment (Новая стратегия определения глиадина в пищевых продуктах на основе кукурузы или риса фракционированием времяпролетной масс-спектрометрией с лазерной ионизацией и десорбцией из жидкой матрицы глиадина кукурузы или проламинов риса при обработке кислотой. J. Mass Spectrom. 38:862-871).
Концентрация белка была определена согласно методу Брэдфорда (Bradford, 1976. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quanties of protein utilizing the principle of protein-dye binding (Быстрый и чувствительный способ определения микрограммовых количеств белка, основанный на связывании белками красителя). Anal. Biochem. 72:248-254). Концентрация органического азота была определена по методу Кьельдаля. Концентрация свободных аминокислот определялась с помощью аминокислотного анализатора (Biochrom Ltd., Cambridge Science Park, Великобритания) (Di Cagno и др., 2004. Appl. Environ. Microbiol. 70:1088-1096).
Для сравнительных целей была также определена концентрация свободных аминокислот в тесте, полученном с применением молочных бактерий, описанных в WO2008/010252 (L. sanfranciscensis LS40, LS13, LS44, LS35, LS14, LS11, LS18, LS4, LS15 и LS41), после ферментации в течение 24 часов при 30°C согласно методикам, изложенным в протоколе, представленном на Фигуре 8 указанного документа.
Пример 4. Производство дрожжевых хлебобулочных изделий с применением детоксифицированной пшеничной муки.
Культуры двух выделенных молочнокислых бактерий были размножены в питательной среде, промыты и ресуспендированы в воде, как описано выше. Пшеничная мука (30%) была смешана с водой (70%), содержащей смесь двух указанных молочнокислых бактерий с клеточной плотностью приблизительно 108 КОЕ/г, и были добавлены ферменты плесневых грибов в концентрации по 400 ч./млн. В течение 12 часов при 37°C проводилась ферментация. После ферментации непосредственно к жидкому тесту были добавлены нативная кукуруза (10%), рисовая мука (10%), яйцо (5%), сахар (3%), масло (1%) и хлебопекарные дрожжи (1,5%). Величины концентрации представлены по отношению к общей массе теста. После замешивания и перед выпечкой дрожжевого теста в течение 50 минут при 250°C проводилась ферментация в течение 1,5 час при 30°C.
Способ может дополнительно включать этап сушки жидкого пшеничного теста. Также при изготовлении не содержащего глютена хлеба применялись и различные другие ингредиенты.
Для целей сравнения были также изготовлены варианты хлеба №№1, 2, 4 и 5 согласно протоколу патентной заявки WO 2008/010252. Был проведен сенсорный анализ хлебов, полученных согласно изобретению и по известной в данной области технологии, рассматривались, в частности, следующие признаки: упругость, кислый запах, кислый вкус, сладость, сухость и аромат. Каждый признак оценивался по шкале от 0 до 100 баллов. Результаты сенсорного анализа были подвергнуты обработке методом главных компонент. Кроме того, хлеба были проанализированы на удельный объем, структуру мякиша, плотность и содержание волокон согласно стандартным методикам Американской ассоциации по химии зерновых культур (ААСС).
Пример 5. Прием пациентами с глютеновой болезнью дрожжевых хлебобулочных изделий, изготовленных из детоксифицированной пшеничной муки.
Хлебобулочные изделия, основанные на детоксифицированной пшеничной муке, полученной как описано ранее, давались 5 пациентам с глютеновой болезнью. Диагноз наличия целиакии устанавливался согласно критериям, предложенным Европейским обществом педиатрической гастроэнтерологии, гепатологии и питания (European Society for Pediatric Gastroenterology, Hepatology and Nutrition). Средний возраст пациентов составлял приблизительно 15 лет.Пациенты с глютеновой болезнью находились в состоянии ремиссии в течение по меньшей мере двух лет и выдерживали контролируемую безглютеновую диету. Все пациенты при отборе продемонстрировали отрицательные показатели по данным серологических анализов, а также отрицательные результаты гистохимических проб. Каждый пациент в течение периода в 60 дней ежедневно потреблял хлебобулочные изделия, которые содержали детоксифицированную пшеничную муку в количествах, соответствующих 10 г эквивалента нативного глютена. Иммунохимические и гистологические исследования были выполнены в Dipartimento di Pediatria е Gastroeneterologia dell'Universita degli Studi di Napoli, Federico II. Набор пациентов-участников исследования производился на основе информированного согласия родителей, которым был представлен план проведения экспериментов, предварительно одобренный Этическим комитетом Университета Неаполя.
Результаты.
(1) Пептидазная активность выделенных молочнокислых бактерий
Пептидазная активность определялась на синтетических субстратах, относительно специфичных по отношению к активности пептидаз, которые играют важную роль в разложении получаемых из глютена олигопептидов (Фигура 1). Видно, что L. sanfranciscensis DPPMA12 и L. plantarum DPPMA125 демонстрируют все рассматриваемые типы ферментативной активности. За исключением триптидазного (РерТ) типа активности, две выделенные молочнокислые бактерии и, в частности, L. plantarum DPPMA125 демонстрируют в отношении других типов пептидазной активности показатели значительно (Р<0,05) более высокие, чем биотипы, применявшиеся в исследовании Rizzello и др. (Rizzello и др., 2007. Appl. Environ. Microbiol. 73:4499-4507). Были обнаружены значительные различия, в частности, в отношении активности PepI, PepQ, PepR и РерХ, с нахождением остатков пролина в различных положениях. Глютенин и, в частности, птиалины имеют очень высокую и необычную процентную долю содержания (45 - 60%) остатков пролина и глютамина. Вследствие этого эта последняя аминокислота, в частности, встречается в токсичных эпитопах, образующихся из пшеничной муки, и является ответственной за связываемую с целиакией патологию. При обеспечении микроорганизмов, подходящих для глубокого разложения соединения, в которое включен пролин, эта ферментативная активность является обязательной предпосылкой интенсивного разложения глютена и быстро протекающего процесса гидролиза. Поэтому для получения не являющихся широко распространенными выделенных штаммов требуется доступность для тщательной проверки крупных коллекций культур и проведение большого количества исследований ферментативной активности. Пептидазная активность выделенных молочных бактерий усилена добавочным применением грибковых протеаз, обычно используемых в процессах хлебопекарного производства. Такие ферменты используются в хлебопекарной промышленности для модифицирования концентрации белка и, вследствие этого, «силы» муки, в зависимости от тех хлебобулочных изделий, для которых она предназначается.
Фигура 4 представляет сравнение пептидазной активности для известных в данной области молочнокислых бактерий и двух молочнокислых бактерий (DPPMA12 и DPPMA125) согласно изобретению, соответственно, при этом очевидно, что последние демонстрируют заметно более высокую аминопептидазную, пролиниминопептидазную и пролилдипептидиламинопептидазную активность.
(2) Определение характеристик гидролизованной муки
После ферментации в течение 12 час при 37°C белковые фракции были селективно экстрагированы и подвергнуты дополнительным аналитическим исследованиям. Как становится совершенно очевидно при использовании двухмерного электрофоретического анализа (Фигура 2), после завершения процесса ферментации никаких следов глиадинов в муке, полученной из сортов твердой пшеницы Svevo и Duilio, обнаружить не удается. Подобные результаты были получены и в глютениновой фракции муки из мягкой, предлагаемой в продаже пшеницы «00» типа, других исследованных сортов твердой пшеницы (Arcangelo, Ciccio, Colosseo, Gargano и Simeto), ячменя, ржи и овса. Белки пшеничной муки, экстрагированные 60% этанолом, были подвергнуты анализу методом MALDI-TOF MS (масс-спектрометрия с лазерной ионизацией и десорбцией из жидкой матрицы). После ферментации в течение 12 час при 37°C пики, соответствующие глиадину по европейскому стандарту, полностью исчезли. Спектрометрическим анализом было обнаружено только несколько пиков с молекулярной массой ниже 8 кДа. Иммунологические анализы, выполненные с помощью антител R5, и испытания ИФА подтвердили, что никаких следов глиадина в ферментированном образце обнаружить не удается. Определенная тем же способом остаточная концентрация глютена в муке из представленной в продаже мягкой пшеницы типа «00», муке из различных сортов твердой пшеницы и ячменя, ржи и овса во всех случаях составляла менее 20 ч./млн. Использовавшийся при этих определениях метод является официальным способом AIC (Associazione Italiana Celiachia - Итальянская ассоциация целиакии), WHO (Всемирная организация здравоохранения) и FAO (Продовольственная и сельскохозяйственная организация). Что касается представленных в литературе данных (Rizzello и др., 2007. Appl. Environ. Microbiol. 73:4499-4507), то процесс гидролиза выполняется с такой же эффективностью (остаточный глютен<20 ч./млн), но в заметно более короткое время (12 против 48 час). Этот способ является высокорезультативным вследствие, с одной стороны, применения более высокой концентрации каждого из грибковых протеолитических ферментов (400 ч./млн) и, с другой стороны, главным образом благодаря более высокой пептидазной активности биотипов выделенных молочных бактерий. К тому же, в сравнении с указанной литературной ссылкой, в которой рассматривается только мука из мягкой пшеницы с низкой исходной концентрацией глютена, настоящее изобретение демонстрирует эффективность данного подхода также и на муке из различных сортов твердой пшеницы, а также муке из ячменя, ржи и овса, также имеющих увеличенные исходные концентрации белка.
На Фигуре 3 представлены сведения о содержании органического азота в предлагаемой в продаже муке из мягкой пшеницы типа «00» до и после проведения процесса ферментации. Гидролизованная мука почти полностью состоит из смеси низкомолекулярных пептидов и аминокислот. Лишь менее 20% от исходного количества глютенинов все еще присутствует в гидролизованной муке. Концентрация аминокислот в гидролизованной муке составляет около 15000 мг/кг по сравнению с <1000 мг/кг, наблюдающимися в пшеничной муке. Более высокая биологическая доступность свободных аминокислот делает эту гидролизованную пшеничную муку сырьем с высокой пищевой ценностью, сохраняя в то же самое время и другие пищевые показатели зерновых культур, относящиеся к минеральным солям, витаминам и волокнам. Когда гидролизованная пшеничная мука применяется в качестве ингредиента для получения не содержащих глютена пищевых продуктов, она покрывает пищевой дисбаланс, возникающий вследствие применения безглютеновой диеты (Grehn и др., 2001. Scand J Nutr 45: 178-182; Mariani и др., 1998. J Pediart Gastroenterol Nut 27: 519-523; Thompson и др., 2005. J. Human. Nutr. Diet. 18:163-169).
Сравнительное испытание с известными в данной области молочнокислыми бактериями показывает, что концентрация аминокислот в тесте в этом случае оказывается заметно более низкой и составляющей даже после гидролиза в самых жестких условиях до около 2000 мг/кг (Фигура 6). Это подтверждает наличие различных степеней гидролиза пшеничных белков. Более того, поскольку высвобождающиеся аминокислоты являются предшественниками летучих соединений, которые образуются во время процесса выпекания и являются ответственными за вкус хлебобулочных изделий, заметно более высокая концентрация свободных аминокислот (как в случае настоящего изобретения), служит признаком более интенсивного синтеза летучих соединений и, вследствие этого, лучшего вкуса продуктов согласно изобретению.
(3) Изготовление дрожжевых хлебобулочных изделий с применением детоксифицированной пшеничной муки
Выше представлен пример применения биотехнологического протокола для производства дрожжевых хлебобулочных изделий, основанных на детоксифицированной пшеничной муке. В дополнение к производству хлебобулочных изделий, данный протокол был также стандартизирован и оптимизирован для изготовления с использованием описанных выше ингредиентов не содержащего глютена хлеба. В дополнение к возможному прямому применению детоксифицированной пшеничной муки, также возможна ее обработка распылительной сушкой и последующее использование в виде сухого материала. Эта дополнительная технологическая возможность позволяет легко сохранять сырье в течение длительного времени без какого-либо изменения пищевых характеристик пшеничной муки.
Фигура 7 показывает превосходство сенсорных качеств хлеба согласно настоящему изобретению (DPPMA12+DPPMA125) над сортами хлеба известного уровня техники. Более того, таблица 1 показывает, что хлеб согласно настоящему изобретению отличается более высоким удельным объемом, большей пористостью мякиша, более низкой плотностью и более высоким содержанием волокон по сравнению с сортами хлеба известного уровня техники. Эти различия являются следствием присутствия пшеничной муки, которая, хотя и является детоксифицированной, но способна содействовать улучшению реологических и химических показателей.
Таблица 1
Реологические иХимическиепараметры
ХлебЗаквасочная культура 1 *
Хлеб(DPPMA12+DPPMA125)
Удельный объем (см<sup>3</sup>/г)
1,35±0,04
1,48±0,07
Пористость мякиша (%)
39,2±0,34
42,3±0,47
Плотность (Н)
16,62±0,27
14,75±0,21
Содержание волокон (%)
1,5±0,44
2,0±0,52
*Lactobacillus sanfranciscensis DSM18426, DSM18427, Lactobacillus plantarum DSM18430.
(4) Прием пациентами с глютеновой болезнью хлебобулочных изделий, изготовленных из детоксифицированной пшеничной муки
Хлебобулочные изделия, приготовленные согласно описанному выше биотехнологическому протоколу, ежедневно давались пациентам с глютеновой болезнью в соответствующей дозировке, эквивалентной 10 г нативного глютена. В Таблице 2 представлены сведения об иммунохимических и гистологических индексах у находящихся в ремиссии пациентов с глютеновой болезнью, употреблявших продукты, основанные на детоксифицированной пшеничной муке (по 10 г в глютеновом эквиваленте в день на протяжении 60 дней).
Таблица 2
Антитела tTG
Иммунохимия
Стадия по Маршу
CD3
CD25
γδ
T<sub>0</sub>
Т<sub>60</sub>
T<sub>0</sub>
Т<sub>60</sub>
T<sub>0</sub>
Т<sub>60</sub>
T<sub>0</sub>
Т<sub>60</sub>
T<sub>0</sub>
T<sub>60</sub>
F.I.
1,6
1
39
38
6
5
5,6
8,6
0
0
i.e.
1,9
1,1
3,7
11
11
9
0,9
3,8
0
0
R.R.
0,3
0,3
53
56
3
4
11,5
17,8
1
1
I.I.
0,5
0,3
31
36
21
21
8,4
12,8
0
0
0
60
Можно видеть, что все пациенты в момент набора испытуемых (Т) демонстрировали нормальные серологические и гистологические показатели (стадия по Маршу). За период 60 дней (Т) ни один из биохимических или иммуногистохимических показателей после каждого суточного приема 10 г эквивалента глютена не отличался по сравнению со своей исходной величиной. В частности, видно, что стадия по Маршу, которая представляет степень целостности и функциональности слизистой оболочки кишечника, определяемой оптическими методами на биологическом образце, является абсолютно идентичной ее исходной величине. Ни у одного из пациентов не развивалось атрофии кишечных ворсинок во время выполнения провокационных проб. Только один из каждых пяти вовлеченных в исследование пациентов прервал испытания по личным причинам, не связанным с развитием каких-либо потенциально возможных патологических состояний. На основании полученных результатов, базирующихся на самых тщательных in vivo клинических анализах, можно констатировать, что детоксифицированная пшеничная мука оказалась переносимой всеми пациентами. В заключение, детоксифицированная пшеничная мука может применяться для приготовления не содержащих глютена пищевых продуктов.