СПОСОБ ВИДОВОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗА У ЛИЦ, ИНФИЦИРОВАННЫХ МИКОБАКТЕРИЯМИ ТУБЕРКУЛЕЗА
METHOD FOR SPECIES IDENTIFICATION OF TUBERCULOSIS MYCOBACTERIA IN INDIVIDUALS INFECTED WITH TUBERCULOSIS MYCOBACTERIA

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике туберкулеза, и может быть использовано для определения видовой идентификации микобактерий у лиц, инфицированных микобактериями туберкулеза.
Известен способ определения инфицирования микобактериями туберкулеза по внутрикожной пробе Манту 2ТЕ, суть которого заключается в том, что положительная проба Манту является фактом наличия в организме микобактерий туберкулеза (1).
Недостатком данного способа является сложность интерпретации положительного результата и невозможность идентифицировать микобактерий человеческого типа и микобактерий бычьего типа вакцинного штамма.
Известен способ видовой идентификации микобактерий туберкулеза с помощью внутрикожной пробы Диаскинтест. Проба Диаскинтест положительная только в случае активно размножающихся микобактерий человеческого типа (2).
Недостаток этого способа в том, что он идентифицирует микобактерий человеческого вида в фазе активного размножения и может быть сомнительным или отрицательным при доказанных случаях туберкулеза с бактериовыделением, при внелегочном туберкулезе.
Известен способ идентификации микобактерий туберкулеза с помощью бактериологического метода, посева на твердые питательные среды (3).
Недостатками данного способа является обязательное наличие микобактерий туберкулеза в исследуемом материале в большом количестве, длительность метода, ожидание результата до трех месяцев, низкая чувствительность метода, сложная последующая дифференцировка с дополнительными исследованиями.
Известен способ видовой идентификации микобактерий туберкулеза с помощью ниацинового теста (4).
Недостатками данного способа является обязательное наличие микобактерий туберкулеза при культуральном исследовании, длительные и трудоемкие биохимические исследования. Методика позволяет идентифицировать микобактерий туберкулеза от нетуберкулезных микобактерий, но не позволяет дифференцировать микобактерий внутри комплекса.
Известен способ идентификации микобактерий туберкулеза с помощью полимеразной цепной реакции (5). Недостатками данного способа является обязательное наличие микобактерий туберкулеза в исследуемом материале, дорогостоящее оборудование, постоянная потребность в дорогостоящих расходных материалах.
Известен способ QuantiFERON-ТВ Gold in Tube, который является тестом для диагностики in vitro, содержащим коктейль пептидов ESAT-6, CFP-10, ТВ7.7(р4) и стимулирующих клетки в гепаринизированной цельной крови. Для определения in vitro реакции на антигены к этим пептидам, образующейся при инфицировании микобактериями туберкулеза служит определение γ-интерферона с помощью метода иммуноферментного анализа ELISA. Основой заявляемого способа является определение и последующее количественное определение γ-интерферона, пептидные антигены стимулируют образование γ-интерферона в Т-клетках пациентов, инфицированных микобактериями туберкулеза и не вызывают никакой реакции у неинфицированных людей. Значительный выброс интерферона-γ, регистрируемый после инкубации периферической крови с видовым антигеном микобактерий туберкулеза, является показателем присутствия в организме обследуемого пациента лимфоцитов, сенсибилизированных к микобактериям туберкулеза человеческого вида и указывает на факт инфицирования этим видом микобактерий (6).
Недостатком данного способа является высокая стоимость, невозможность с его помощью оценить микобактерий бычьего типа вакцинного штамма и эффективность вакцинации. Данный метод и выбран как прототип.
Целью изобретения является создание способа видовой идентификации микобактерий туберкулеза у лиц, инфицированных микобактериями туберкулеза.
Сущность заявляемого изобретения заключается в том, что в крови определяют уровень лимфоцитов с рецепторами CD45+ маркеров, меченых флюороизотианатом и по снижению уровня флюоресценции меченых CD45+ лимфоцитов в опытной пробе относительно контрольной пробы более чем на 20% судят о видовой идентификации микобактерий туберкулеза.
CD45+ - общий лейкоцитарный антиген - трансмембранный гликопротеин, выполняет важную функцию в передаче сигнала внутрь клетки с Т-клеточного рецептора и представлен на поверхности Т-клеток разными изоформами, относится к антигенраспознающим клеткам системы иммунитета, которые за счет морфо-функциональных особенностей молекулы CD45+ и кооперации CD45+ с мембранными антигенно-рецепторными комплексами лимфоцитов осуществляют процессы распознавания, инициации и регуляции развития ответных иммунологических реакций на антигены (7).
В основу способа положена дифференциация нативных CD45+ - лимфоцитов периферической крови от сенсибилизированных с использованием меченых флюороизотианатом методом лазерной проточной цитофлюориметрии по динамике уровня флюоресценции опытной и контрольных проб.
После инкубации периферической крови в трех пробирках, одна из которых является контрольной и содержит физиологический раствор, а две пробирки диагностические, при этом одна пробирка содержит 200 мкл раствора Диаскинтест, представляющая антигены ESAT-6, CFP-10, ТВ7.7р4, позволяющая диагностировать заражение микобактериями человеческого вида, а другая пробирка содержит раствор вакцинного штамма, позволяющая диагностировать наличие микобактерий бычьего типа. Идентификация вида микобактерий устанавливается по снижению интенсивности флюоресценции меченных флюороизотианатом CD45+ - лимфоцитов более чем на 20% относительно контрольной пробирки. Снижение интенсивности флюоресценции меченных флюороизотианатом CD45+ - лимфоцитов менее чем на 20% относительно контрольной пробирки является возможной естественной флуктуацией в процессе постановки реакции.
В основе заявляемого способа находится положение о том, что снижение CD45+ - лимфоцитов после инкубации периферической крови с антигенами микобактерий человеческого вида или микобактерий бычьего типа вакцинного штамма являются показателем присутствия в организме обследованного пациента лимфоцитов, сенсибилизированных к указанным антигенам микобактерий. Если в опытной пробирке регистрируется снижение CD45+ лимфоцитов более чем на 20% относительно контрольной пробы, то можно заключить, что организм инфицирован тем видом микобактерий, чей антигенный материал использовался для инкубации с периферической кровью в опытной пробирке.
Методика обследования: У пациента в положении сидя берется 3 мл периферической венозной крови и разливается по 1 мл с антикоагулянтом гепарином в приготовленные пробирки №1, №2, №3
Пробирка №1, контрольная - содержит 200 мкл физиологического раствора + 1 мл гепаринизированной венозной крови.
Пробирка опытная №2 - содержит 200 мкл диаскинтест, представляющий антигены микобактерий человеческого вида + 1 мл гепаринизированной венозной крови.
Пробирка опытная №3 - содержит 200 мкл раствора вакцины, представляющая антигены микобактерий бычьего типа вакцинного штамма + 1 мл гепаринизированной венозной крови.
Содержимое каждой пробирки тщательно перемешивают, пробирки инкубируют в термостате при 37С° в течение 24 часов. После инкубации в каждой пробирке определяется показатель средней интенсивности флюоресценции меченных флюороизотианатом моноклональных антител к CD45+.
Определение уровня интенсивности флюоресценции CD45+ лимфоцитов в контрольных и опытных пробах проводят путем добавления к 100 мкл из каждой пробирки меченных флюороизотианатом моноклональных антител к CD45+. Далее все пробы инкубируют в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте. После инкубации все пробы обрабатывают гемолизирующей смесью, в результате чего получают взвесь лейкоцитов и лимфоцитов, меченных комплексом флюороизотианатом моноклональных антител. Каждую полученную лейковзвесь анализируют с помощью лазерного проточного цитофлюориметра в режиме лимфогейта и определяют уровень интенсивности флюоресценции меченных флюороизотианатом CD45+ лимфоцитов. Динамику интенсивности флюоресценции CD45+ лимфоцитов в опытной пробе относительно контрольной пробы оценивают по формуле:
Снижение интенсивности флюоресценции CD45+ лимфоцитов в опытной пробе с антигенами микобактерий относительно контрольной пробы более 20% рассматривают в качестве показателя инфицирования исследованным агентом. Заявляемый способ иллюстрируется примером.
Пациент П., 6 лет, направлен после очередной ежегодной пробы Манту для проведения дифференциальной диагностики послевакцинной и инфекционной туберкулиновой аллергии. Из анамнеза вакцинирован BCG в роддоме, поствакцинальный рубчик 8 мм. При оценке пробы Манту по годам: размер папулы по годам 10, 8, 7, 11, 11 мм, отмечается монотонный характер пробы. Решить инфицирован ребенок микобактериями туберкулеза или это поствакцинальная аллергия по пробе Манту не представляется возможным.
Целью лабораторного обследования является видовая идентификация микобактерий туберкулеза человеческого типа и микобактерий бычьего типа вакцинного штамма.
В соответствии с прилагаемой методикой у пациента взято 3 мл периферической венозной крови и разлили по 1 мл в 3 пробирки с антикоагулянтом (гепарином) в соответствие с изложенной методикой.
- Пробирка №1 контрольная - содержала 200 мкл физ. раствора.
- Пробирка опытная №2 - содержала 200 мкл диаскинтест.
- Пробирка опытная №3 - содержала 200 мкл раствора вакцины BCG, предварительно разведенной в 1 мл дистиллированной воды.
Получили результаты. Пробирка №1 контрольная - 67,0%
Пробирка опытная №2 - 34,6%
Пробирка опытная №3 - 66,8%
1. Расчет для пробирки №2
<mrow><mi>Д</mi><mi>и</mi><mi>н</mi><mi>а</mi><mi>м</mi><mi>и</mi><mi>к</mi><mi>а</mi><mtext> ИФ CD45</mtext><mo>+</mo><mtext> </mtext><mo>=</mo><mtext> </mtext><mfrac><mrow><mn>67,0</mn><mo>−</mo><mn>34,6</mn></mrow><mrow><mn>67,0</mn></mrow></mfrac><mo>×</mo><mn>100</mn><mi>%</mi><mo>=</mo><mn>48,4</mn><mi>%</mi></mrow>
2. Расчет для пробирки №3
<mrow><mi>Д</mi><mi>и</mi><mi>н</mi><mi>а</mi><mi>м</mi><mi>и</mi><mi>к</mi><mi>а</mi><mtext> ИФ CD45</mtext><mo>+</mo><mtext> </mtext><mo>=</mo><mtext> </mtext><mfrac><mrow><mn>67,0</mn><mo>−</mo><mn>66,8</mn></mrow><mrow><mn>67,0</mn></mrow></mfrac><mo>×</mo><mn>100</mn><mi>%</mi><mo>=</mo><mn>0,29</mn><mi>%</mi></mrow>
Регистрируется снижение ИФср CD45+ - клеток крови в пробирке №2 в тест-системе с антигенами микобактерий туберкулеза человеческого типа на 48,4%.
Заключение. Инфицированность микобактериями туберкулеза человеческого типа.
Преимущество заявляемого способа перед известными заключается в том, что он позволяет подтвердить факт инфицированности микобактериями, позволяет установить видовую принадлежность инфекционного агента, позволяет установить эффективность вакцинации, выполняется в короткие сроки в течение нескольких часов и является значительно дешевле прототипа QuantiFERON-ТВ Gold.
Данный способ может применяться в диагностических лабораториях, в противотуберкулезных учреждениях, в общей лечебной сети для видовой идентификации микобактерий туберкулеза человеческого типа и микобактерий бычьего типа вакцинного штамма.
Источники
1. Фтизиатрия: Национальное руководство / под ред. Перельмана М.И. - М.: ГЕОТАР-Медиа, 2007. - С.184-195.
2. Кожная проба с препаратом «Диаскинтест» - новые возможности идентификации туберкулезной инфекции / Под ред. Академика РАН и РАМН М.А.Пальцева. - М.: ОАО «Издательство «Медицина», 2011. - С.40-96.
3. Приказ от 21 марта 2003 года №109 О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской федерации. - Москва, 2003. - С.47-62.
4. Фтизиатрия: Национальное руководство / под ред. Перельмана М.И. - М.: ГЕОТАР-Медиа, 2007. - С.165-166.
5. Фтизиатрия: Национальное руководство / под ред. Перельмана М.И. - М.: ГЕОТАР-Медиа, 2007. - С.177.
6. Desem, N., Jones, S.L. // Development of a human interferon - y enzyme immunoassay and comparison with tuberculin skin testing for detection of Mycobacterium tuberculosis infection / Clin. Diag. Lab. Immunol. 1998. - №5. - Р.5316.
7. Koretzky G.A. // Role of the CD45 tyrosine phosphatase in signal transduction in the immune system / FASEB J. - 1993. - №7. - P.420-426.