Характеристика изолятов вируса кустистой карликовости малины, распространенных в Брянской области

до 284 и 324 ц/га сортов Рождественский и Брянский деликатес соответственно. Самый низкий урожай обеспечили сорта на переходной технологии -287; 257 и 258 ц/га.

По общему количественному выходу клубней наиболее высокие результаты получили на биологизированной технологии: Рождественский - 701; Брянский деликатес - 709 тыс.шт./га. Эти сорта обеспечили и максима-льный выход семенных клубней фракции 25-125 г (28-60 мм), Брянский деликатес - 462, Рождественский - 490 тыс.шт./га или 65,2 и 69,9% к общему их числу. Относительно высокие показатели по выходу клубней как общему, так и семенной фракции получили по сорту Аспия на биологизированной технологии.

В производственных условиях самый высокий урожай получен по сортам на биологизированной технологии: 270 ц/га у сорта Архидея и 240 ц/га у сорта Скарб. На традиционной технологии урожай ниже: Архидея - 234 ц/га; Скарб - 218 ц/га. Прибавка урожая по сорту Архидея на биологизированной технологии составила 36 ц/га или 15%, по сорту Скарб - 22 ц/га или 10%. Средний урожай сортов по технологиям составил: традиционная - 226 ц/га, биологизированная - 255 ц/га или на 12,8% выше.

Выводы

1. Сидеральные удобрения, различаясь биологическим составом, количеством запахиваемой растительной массы и элементов питания, способны заменить навоз в системе удобрения картофеля, повышают продуктивность и качество клубней.

2. В условиях дефицита органических удобрений в семеноводческих хозяйствах следует переходить к производству семенного картофеля по биологизированной технологии возделывания с использованием узколистного люпина на сидерат или по переходной - с промежуточным посевом озимой ржи на зеленое удобрение.

3. При биологизированной технологии по сравнению с традиционной можно уменьшить дозы азотных, фосфорных и калийных удобрений на 60,50 и 40 кг/га д.в., следует применять двухкратное фрезерование почвы гребней и вносить гербицид зенкор - 1,2 кг/га. Это позволяет полностью исключить механизированные междурядные обработки посевов.

4. При переходной технологии по сравнению с традиционной можно уменьшить дозы азотных, фосфорных и калийных удобрений на 30,20,20 кг/га д.в., следует применять гербицид зенкор - 1,2 кг/га. Это позволяет сокращать по одной довсходовой и послевсходовой механической междурядной обработке посевов.

Green manure fertizers raise producfivify and quality of tubers and can veplace straw caffle manure in the system of potato fertilizinq. At the seed - qrominq farms they should use bioloqical potato cultivation technoloqy mith usinq of lupin. Keywords: Potato, cultivar, productivity, qreen manure fertizers.

Об авторах

Молявко А.А. - доктор сельскохозяйственных наук, профессор ВНИИКХ имени А.Г. Лорха

Марухленко А.В. - кандидат сельскохозяйственных наук, ВНИИКХ имени А.Г. Лорха

Еренкова Л.А. - кандидат сельскохозяйственных наук, ВНИИКХ имени А.Г. Лорха

Борисова Н.П. - кандидат сельскохозяйственных наук, ВНИИКХ имени А.Г. Лорха, rosniikartofel@yandex.ru

УДК 578.89

ХАРАКТЕРИСТИКА ИЗОЛЯТОВ ВИРУСА КУСТИСТОЙ КАРЛИКОВОСТИ МАЛИНЫ, РАСПРОСТРАНЕННЫХ В БРЯНСКОЙ ОБЛАСТИ

Е.В. Немцова, Ю.Ф. Мытницкая, В.В. Заякин, И.Я. Нам

Вирус кустистой карликовости малины (ВККМ) широко распространен по всему миру и является одним из самых вредоносных патогенов малины. С помощью разработанного ранее набора праймеров для определения ВККМ методом ПЦР было показано, что вирус содержится во всех проанализированных образцах посадочного материала Кокинского селекционного питомника (Брянск) и в пробирочных растениях этих сортов in vitro. Сравнение нуклеотидных последовательностей амплифицированных фрагментов белка оболочки и транспортного белка изолятов, полученных в разное время (2008 - 2012гг.), свидетельствует об их близком сходстве со штаммом R15 преодолевающем резистентность (resistance break) ранее устойчивых к ВККМ сортов. Полученные данные свидетельствуют о том, что накопление изменений в генетическом материале вируса продолжается.

Ключевые слова: Вирус кустистой карликовости малины (ВККМ), белок оболочки, транспортный белок, обратная транскрипция - поли-меразная цепная реакция.

Введение. На территории Брянской области активно осуществляется селекция ремонтантной малины. Одной из основных проблем при возделывании данной культуры является ее восприимчивость к вирусным заболеваниям [1]. Наиболее вредоносным и опасным вирусом малины является вирус кустистой карликовости (ВККМ). Инфицированные растения характеризуются измененным габитусом, наличием хлорозов и некрозов. При поражении ВККМ формируются недоразвитые рассыпчатые плоды, что приводит к значительному снижению урожайности [2].

Диагностика ВККМ, профилактические мероприятия и методы борьбы зависят от типа изолята вируса, распространенного в посадках. В настоящее время описано 3 семейства изолятов ВККМ: S изоляты (наиболее распространенные); RB изоляты, подобные S изолятам серологически, но отличающиеся от них способностью инфицировать сорта малины, устойчивые к S изолятам; В изоляты (наименее распространенные) [3].

Для быстрого и эффективного обнаружения ВККМ в растениях малины нами была разработана система праймеров для анализа вируса с помощью обратной транскрипции - ПЦР, получен патент на изобретение [4].

В данной работе обобщены результаты исследования распространения ВККМ в Брянской области и характеристики амплифицированных последовательностей обнаруженных изолятов.

Материалы и методы. Образцами для исследования служили полевые растения ремонтантной малины и растения,

находящиеся на различных этапах клонального микроразмножения. Скрининг ВККМ проводился в растениях ремонтантной малины различных сортов и генотипов (Бабье лето-2, Геракл, Надежная, Брянская юбилейная, 18-183-1, 37-15-4, 8-2021 и др.) селекции акад. РАСХН Казакова И.В.

Определение ВККМ в растительных тканях малины проводили методом RT-PCR [5]. Выделение суммарных нуклеиновых кислот проводили модифицированным гуанидин изотиоцианатным методом с дополнительной очисткой [5]. Праймеры комплементарны участку вирусной РНК-2 ВККМ, кодирующему ген белка оболочки (синтезированы фирмой «Syntol», Россия).

Обратную транскрипцию проводили с использованием ревертазы M-MLV. Отжиг со специфическим обратным прай-мером выполняли при температуре +480С в течение 10 мин, обратную транскрипцию - в течение 1,5 часа при +370С. Амплификацию синтезированной в ходе обратной транскрипции кДНК проводили с использованием Taq-полимеразы в следующем режиме: предварительная денатурация - 940С, 3 мин; денатурация - 940С, 1 мин, отжиг - 480С, 1 мин, элонгация - 720С, 1 мин (30 циклов). Продукты RT-PCR подвергали гель-электрофорезу,результаты фиксировали с помощью системы гель-документации GelDoc (BioRad, USA).

Для определения типов изолятов ВККМ проводилось конструирование векторов, содержащих нуклеотидные последовательности ВККМ. В результате RT-PCR на РНК малины различных сортов амплифицировались вирусспецифичные фрагменты РНК-2 вируса длиной 383 bp (праймеры RBDV+3 и RBDV-3, комплементарные гену, кодирующему белок оболочки) и 503 bp (праймеры RBDV+5 и RBDV-5, комплементарные гену, кодирующему транспортный белок). ДНК данных ампликонов элюировались из геля и использовалась для лигирования в pal-TA вектор (16ч, 160С), молярное соотношение вектора к вставке - 1:3. Полученный продукт клонировался в клетках E. coli, штамм JM109 (электропорация по прописи BioRad). Бело-голубая селекция клонов проводилась на среде LB + 2% агар + X-Gal (50 мкг/мл) + IPTG (30 мкг/мл) + ампициллин (100 мкг/мл). Выросшие белые колонии проверялись на наличие специфичной вставки рестрикцией плазмидной ДНК по сайтам BamHI и Sali. Плазмидная ДНК отдельных клонов E. coli использовалась для секвенирования. Полученные нуклеотидные последовательности клонированных фрагментов сравнивались с последовательностью гена транспортного белка и гена белка оболочки РНК-2 различных штаммов ВККМ, имеющихся в международном банке генов GenBank (с использованием программ BioEdit, MEGA4) [6].

Результаты и обсуждение. Систематическое обследование посадок, проводимое с помощью данного метода, показало наличие ВККМ в различных формах ремонтантной малины, в том числе в перспективных сортах, таких как Пингвин, Брянское диво, Атлант и Золотая осень (Рис. 1). Разработанная методика успешно применялась также и для анализа пробирочных растений, культивируемых in vitro.

UOObp

SOObp»

12 J 4 5 67 89 10

Рис. 1. Инфицированность ВККМ цветущих растений различных сортов ремонтантной малины в полевых условиях:

треки 1 - маркер Gene Ruler™ 3 kb DNA Ladder; 2,6 - Атлант; 3, 7 - Пингвин; 4, 8 - Золотая осень; 5, 9 - Брянское диво; 10 - отрицательный контроль

Сорта ремонтантной малины, в которых по данным RT-PCR была обнаружена инфекция, отображены в таблице 1. Среди них имелись сорта и формы с явными признаками поражения ВККМ («рассыпчатость» плодов) - Бальзам, Надежная, Брянская юбилейная, Золотые купола, Бриллиантовая. В растениях таких форм вирусные фрагменты идентифицированы в 100 % случаев, что исключало другие возможные причины возникновения «рассыпчатых» плодов (например, физиологические).

Также обнаружены сорта ремонтантной малины без видимых признаков поражения ВККМ - Атлант, Золотая осень, Геракл, Жар-птица, Пингвин. При их анализе методом RT-PCR обнаружена вирусная инфекция. Данные сорта являются перспективными в селекции - для них отмечена высокая урожайность, отсутствие «рассыпчатости» ягод и других признаков поражения вирусом. Поэтому возможно, что они являются толерантными к ВККМ.

_Таблица 1 - Сорта и формы малины, инфицированные ВККМ в полевых условиях и in vitro

№ Сорт Номер Наличие ВККМ в полевых условиях (по результатам RT-PCR) Наличие ВККМ в культуре in vitro (по результатам RT-PCR) Наличие «рассыпчатых» плодов

1. Атлант 25-15-1 + + нет

2. Бальзам + + да

3. Бабье лето-2 8-242-1 + + да

4. Бриллиантовая 22-15-1 + + да

5. Брянское диво 8-79-2 + + да

6. Брянская юбилейная 5-159-2 + + да

7. Геракл 50-253-1 + + нет

8. Жар птица 3-72-2 + + нет

9. Золотая осень 24-139-2 + не изуч. нет

10. Золотые купола 8-225-2 + не изуч. да

11. Надежная 2-200-20 + + да

12. Пингвин 4-43-1 + + нет

В результате анализа нуклеотидных последовательностей определена степень гомологии клонированных фрагментов изолята ВККМ, распространенного в посадках ремонтантной малины Кокинского ОП, с геном белка оболочки и геном транспортного белка всех известных изолятов ВККМ, последовательности которых имеются в банке генов [6-28]. Наибольшее сходство обнаружено при сравнении с изолятами из Белоруссии - степень гомологии анализируемого изолята из Брянска с геном белка оболочки изолятов ВККМ BY1, BY8, BY22 составила 100 %.

Таблица 2.

Степень гомологии клонированных фрагментов с участком гена транспортного белка и гена белка оболочки ВККВ, штамм R-15

Номера клонов, содержащих фрагменты гена транспортного белка Степень гомологии клонированных фрагментов с геном транспортного белка Номера клонов, содержащих фрагменты гена белка оболочки Степень гомологии клонированных фрагментов с геном белка оболочки

26 MP 98.9% 1 СР 98.1%

4 MP 98.2% 3 СР 98.7%

29 MP 99.3% 4 СР 98.9%

2 MP 98.2% 8 СР 98.9%

12 СР 98.9%

27 СР 92.7%

Также высокая степень гомологии обнаружена с изолятом ВККМ R15 (таблица 2). Степень гомологии клонированных фрагментов гена транспортного белка с последовательностями РНК-2 изолята R15 колебалась от 98.2% до 99.3 %, степень гомологии участков, комплементарных гену белка оболочки - от 98.1% до 98.9%.

Вариант вируса R15, относящийся к семейству RB, признан наиболее опасным, так как у малины отсутствует сопротивляемость к данному изоляту, в отличие, например от S и B изолятов ВККМ [3]. Наиболее эффективным методом, позволяющим предотвратить распространение данной формы вируса в естественных условиях, является строгий контроль и выбраковка инфицированного материала, а также использование сортов с искусственной устойчивостью к ВККМ.

Созданные генетические конструкции, содержащие участки генов РНК-2 изолята ВККМ, распространенного на территории питомника, могут быть использованы для создания сортов ремонтантной малины, невосприимчивых к вирусу в полевых условиях.

-RBDV Bryansk

R. bushy dwarf virus BY1

_ R. bushy dwarf virus BY22

R. bushy dwarf virus BY8

R. bushy dwarf virus RBDVs2gp1+RBDVs2gp2

^__R. bushy dwarf virus BY3

-R. bushy dwarf virus R 15

-R. bushy dwarf virus J3

-R. bushy dwarf virus SE3

I-R. bushy dwarf virus D200

' R. bushy dwarf virus Can

--I R. bushy dwarf virus Z13-b

'-R. bushy dwarf virus Z13-a

-R. bushy dwarf virus Ec Az

--R. bushy dwarf virus M

- R. bushy dwarf virus CmRR-1

R. bushy dwarf virus RR-1

I-R. bushy dwarf virus 114

\ r R. bushy dwarf virus GR-2

'-R. bushy dwarf virus GR-4

0.005

Рис 2. Филогенетические связи, выявленные на основе анализа нуклеотидных последовательностей гена белка оболочки РНК-2 ВККМ методом NJ (программа Mega4): RBDV Bryansk - консенсусная нуклеотидная последовательность клонированных фрагментов гена белка оболочки, остальные - нуклеотидные последовательности различных изолятов ВККМ по данным GenBank [6] На основе сравнения последовательностей клонированных фрагментов с последовательностями гена белка оболочки и гена транспортного белка различных изолятов ВККМ, имеющимися в банке генов, построены дендрограммы, отображающие филогенетические связи (рис. 2, 3). Природные S изоляты ВККМ из Европы образовывали ряд отдельных кластеров совместно с изолятом М из черной малины.

Нуклеотидные последовательности клонированных фрагментов гена белка оболочки с высокой степенью достоверности (98%) образовывали отдельный кластер совместно с изолятом R15 (RB-семейство) и изолятами, распространенными

на территории Белоруссии. Все остальные S изоляты находились на некотором расстоянии от данного кластера.

Из рис. 2 следует, что нуклеотидная последовательность изолята, распространенного на территории Брянской области имеет более тесную связь с изолятами из Белоруссии, чем и R-15 вариантом из семейства RB.

Нуклеотидные последовательности гена транспортного белка изолята, распространенного на территории Брянской области, также образовывали отдельный кластер совместно с белорусскими изолятами (рис. 3).

|- Consensus MP RBDV - R. bushy dwarf virus BY22 MP+CP R. bushy dwarf virus BY8 MP+CP

_ R. bushy dwarf virus BY1 MP+CP

I R. bushy dwarf virus BY3 MP+CP

- ' R. bushy dwarf virus R15

-R. bushy dwarf virus SE3 MP+CP

- — R. bushy dwarf virus Ec Az

--I R. bushy dwarf virus CmRR-1

' R. bushy dwarf virus RR-1

-R. bushy dwarf virus GR-6

- -R. bushy dwarf virus GR-4

I R. bushy dwarf virus CmGR-2 ' R. bushy dwarf virus GR-2 -R. bushy dwarf virus CHINA

0.01

Рис 3. Филогенетические связи, выявленные на основе анализа нуклеотидных последовательностей гена транспортного белка РНК-2 ВККМ методом NJ (программа Mega4): Consensus MP RBDV - консенсусная нуклеотидная последовательность клонированных фрагментов гена тарнспортного белка, остальные - нуклеотидные последовательности различных изолятов ВККМ по данным GenBank [6]

Вывод. Анализ нуклеотидных последовательностей гена белка оболочки и гена транспортного белка вируса кустистой карликовоти малины показавает, что на территории Брянской области предположительно распространены изоляты из семейства RB, имеющие высокое сходство с изолятами ВККМ из Белоруссии.

Raspberry bushy dwarf virus is widely spread all aver the world. It is the most harmful raspberry pathogen. A survey was done in raspberry plantations in Bryansk region by means of a new set of primers for RT-PCR detection. All samples of raspberry cultivated in plantations and in vitro were infected by RBDV The nucleotide sequences of coat protein gene and moving protein gene of RBDV strain spread in Bryansk region were compared to the ones in Genbank. They were similar to a resistance-breaking (RB) isolate that infects raspberry cultivars that have resistance gene (homology level is among 100%). Keywords: raspberry bushy dwarf virus (RBDV), coat protein, moving protein, reverse transcription - PCR

Список литературы

1. Адаптивный и продуктивный потенциал новых сортов и форм ремонтантной малины в условиях, Брянской области. Евдокименко С.Н., Кулагина В.Л., Якуб И.А. Плодоводство и ягодоводство России. 2014. т. XXXVIII. № -1. с. 124-131.

2. Скрининг вируса кустистой карликовости малины методом RT-PCR in vitro и в полевом материале / Немцова Е.В., Заякин В.В., Казаков И.В., Евдокименко С.Н., Нам И.Я. // С.-х.биология. Сер. Биология растений. 2007. № 5. С. 119-123.

3. Comparisons of some properties of two laboratory variants of Raspberry bushy dwarf virus (RBDV) with those of three previously characterized RBDV isolates / Jones A.T., McGavin W.J., Mayo M.A., Angel-Diaz J.E., Karenlampi S.O., Kokko H. // European Journal of Plant Pathology. 2000. Vol. 106, №7. P. 623-632.

4. Заякин В. В., Немцова Е.В., Нам И.Я. Набор олигонуклеотидов-праймеров для идентификации РНК вируса кустистой карликовости малины // Патент России 2007139202/13. 2009.

5. Немцова Е.В. Оптимизация диагностики вируса кустистой карликовости малины методом RT-PCR [текст]: Диссертация на соискание степени кандидата биологических наук (03.00.23). Москва, РГАУ-МСХА им. К.А. Тимирязева, 2009.

6. GenBank. [Электронный ресурс]. URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank (дата обращения - 25.12.2014).

Об авторах

Немцова Е.В. - кандидат биологических наук, старший преподаватель кафедры ботаники Брянского государственного университета имени академика И.Г. Петровского

Мытницкая Ю.Ф. - аспирант 3 года обучения кафедры биологии Брянского государственного университета имени академика И.Г. Петровского, mytnickaya yulia@mail.ru

Заякин В.В. - доктор биологических наук, профессор кафедры биологии Брянского государственного университета имени академика И.Г. Петровского

Нам И.Я. — доктор биологических наук, директор Инновационного научно-образовательного центра биотехнологии и экологии, профессор кафедры ботаники Брянского государственного университета имени академика И.Г. Петровского, iyanaml @yandex.ru