ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ИСПЫТАТЕЛЬНАЯ ПОЛОСКА

Область применения полезной модели
Настоящая полезная модель имеет отношение к быстрому визуальному тесту с растеканием капли жидкости в радиальном направлении (с боковым потоком), для обнаружения аналитов в пробе.
Известный уровень техники
Испытательные устройства с растеканием капли жидкости в радиальном направлении известны и могут быть использованы в клинической диагностике для определения наличия представляющего интфрес аналита в пробе, такой как телесные жидкости. Однако такие устройства обычно требуют использования большого объема пробы и больших количеств конъюгата. Они также имеют большое время ожидания до момента, когда могут быть считаны результаты испытания.
Сущность полезной модели
Предлагается иммунодиагностическая испытательная полоска для обнаружения представляющего интерес аналита в пробе. В некоторых вариантах, аналит представляет собой антитело, такое как анти- вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) антитело или анти- вирус гепатита С (HCV) антитело. В других вариантах, аналит представляет собой антиген, такой как человеческий хорионический гонадотропин (hCG).
Диагностическая испытательная полоска преимущественно содержит область источника конъюгата, которая содержит конъюгат, конфигурированный для связывания представляющего интерес аналита, область нанесения пробы, расположенную ниже по течению от области источника конъюгата и конфигурированную для получения указанной жидкой пробы, и испытательный участок. Испытательный участок расположен ниже по течению от области источника конъюгата и содержит иммобилизированное связующее вещество, которое способно
специфически связываться с представляющим интерес аналитом. Например, если представляющий интерес; аналит представляет собой антитело, то положительный испытательный участок преимущественно содержит иммобилизированный антиген. Если представляющий интерес аналит представляет собой антиген, то положительный испытательный участок преимущественно содержит иммобилизированное антитело. Конъюгат содержит первый связующий компонент, который способен связывать представляющий интерес аналит, и второй компонент визуализации.
Использованная в тесте проба может быть любой жидкостью. В качестве примеров предпочтительных проб можно привести, например, кровь, сыворотку, плазму, слюну и мочу. Пробу наносят на положительный испытательный участок и затем побуждают конъюгат вытекать из области источника конъюгата. Конъюгат протекает через мембрану и контактирует с любым аналитом, связанным с положительным испытательным участком, создавая визуальный сигнал.
В соответствии с предпочтительным вариантом, испытательная полоска содержит испытательный участок с иммобилизированным ВИЧ антигеном и используется для обнаружения анти-ВИЧ ануитела. В этом варианте, тест полезен для диагностики ВИЧ инфекции пациента. В другом предпочтительном варианте, испытательная полоска содержит испытательный участок с иммобилизированным HCV антигеном и используется для обнаружения анти-HCV (HCV=вирус гепатита С) антител в пробе. В этом варианте, тест полезен для диагностики связанной с вирусом гепатита С инфекции пациента. В еще одном варианте, испытательная полоска содержит испытательный участок с иммобипизированными анти-hCG антителами. В этом варианте, тест полезен для диагностики наличия беременности.
Область источника конъюгата преимущественно содержит высушенный конъюгат. Например, областью источника конъюгата может быть подушка конъюгата,
на которой конъюгат был высушен. Подушка конъюгата преимущественно имеет флюидную связь с мембраной. В некоторых вариантах, подушку конъюгата перемещают и вводят в связь с мембраной после добавления пробы в область нанесения пробы. В другом варианте, область источника конъюгата представляет собой участок мембраны, на котором конъюгат был высушен.
TM
TM
Высушенный конъюгат преимущественно повторно суспендируют и побуждают к протеканию (течению) за счет контактирования области источника конъюгата с буфером промывки. В соответствии с одним из вариантов, буфер промывки содержит около 0.1% блокирующего агента, преимущественно блокирующего протеина, такого как казеин. Буфер промывки также преимущественно содержит около 0.1% детергента, преимущественно неионного детергента, такого как Triton X100. В соответствии с одним из вариантов, буфер промывки содержит около 0.025% HEPES, около 0.85% хлорида натрия, около 0.1% ЭДТА (этилендиаминтетраацетата), около 1% маннитола, около 0.1% казеина и около 1% детергента Triton X100.
В соответствии с еще одним вариантом, конъюгат суспендирован в буфере. Конъюгат побуждают втекать в испытательный участок за счет добавления в область источника конъюгата буфера, содержащего конъюгат.
В соответствии с предпочтительным вариантом, конъюгат содержит протеин А, конъюгированный с коллоидным золотом. В соответствии с другими вариантами, конъюгат содержит антитело, преимущественно моноклональное антитело, конъюгированное с коллоидным золотом. Преимущественно, коллоидное золото имеет размер частиц ориентировочно от 20 до 80 нм.
В соответствии с другим вариантом, испытательная полоска дополнительно содержит контрольный участок, расположенный на мембране ниже по течению от испытательного участка. Контрольный участок преимущественно содержит контрольное связующее вещество, которое способно связывать конъюгат. Например,
если представляющим интерес аналитом является антитело и конъюгат содержит связывающее антитело вещество, такое как протеин, то контрольным связующим веществом может быть IgG (IgG=иммуноглобулин G) кролика. Если представляющим интерес аналитом является антиген и конъюгат содержит моноклональное антитело, которое является специфическим для антигена, то контрольным связующим веществом может быть, например, протеин.
Испытательная полоска может содержать один или несколько дополнительных компонентов. Буферная подушка может иметь флюидную связь с областью источника конъюгата, так что добавление буфера промывки в буферную подушку побуждает конъюгат вытекать из области источника конъюгата и протекать через мембрану, чтобы контактировать с испытательным участком. Полоска абсорбента и подушка абсорбента могут быть расположены ниже по течению от мембраны, чтобы поглощать избыток буфера при его прохождении через мембрану. Таблетка десиканта может также находиться в непосредственной близости от мембраны, чтобы поглощать избыток жидкости и влаги.
Испытательная полоска при необходимости может быть помещена в корпус, например, в пластиковый. Корпус преимущественно содержит окно пробы, расположенное поверх испытательного и контрольного участков, и окно буфера, расположенное выше по течению от испытательного участка.
Способ обнаружения аналита в жидкой пробе, который предусматривает нанесение пробы на испытательный участок мембраны и последующее контактирование испытательного участка с конъюгатом, который способен связывать представляющий интерес аналит и создавать визуальный сигнал, свидетельствующий о связывании.
Краткое описание чертежей
На фиг.1 показана плата тестирования.
На фиг.2 показан вид сверху платы тестирования.
На фиг.3 показан вид сбоку платы.
На фиг.4 показан разрез компонентов, которые образуют испытательную полоску в соответствии с первым вариантом.
На фиг.5 показана плата тестирования с положительным результатом, указывающим, что представляющий интерес аналит был обнаружен в пробе.
На фиг.6 показана плата тестирования с отрицательным результатом, указывающим, что представляющий интерес аналит не был обнаружен в пробе.
На фиг.7 показана испытательная подоска с чашкой для пробы.
Подробное описание предпочтительного варианта полезной модели. Предлагаются диагностические устройства, предназначенные для быстрого определения наличия аналита в пробе. Несмотря на то, что эти устройства главным образом описаны со ссылкой на иммунодиагностическое устройство для обнаружения антитела или антигена в пробе, специалисты легко поймут, что устройство легко может быть модифицировано для обнаружения любого представляющего интерес аналит.
Ранее, в иммунодиагностических устройствах обычно использовали предварительное смешивание конъюгата с пробой, подлежащей анализу на наличие антитела. Например, в некоторых устройствах высушенный конъюгат растворяли путем добавления жидкой пробы, что позволяет произвести предварительное смешивание пробы и конъюгата. Подлежащее обнаружению антитело, если оно есть, связано с конъюгатом и может быть визуализировано ниже по течению от испытательного участка, содержащего иммюбилизированный антиген. Однако, в этой
системе не специфическое взаимодействие конъюгата с другими антителами или другими соединениями в пробе ведет к гашению сигнала конъюгата. В результате, требуется большое количество конъюгата. За счет использования большого количества конъюгата, требуется большое время реакции до ее завершения (очистки), что увеличивает время, необходимое для получения результатов испытания. Кроме того, чувствительность теста настолько низка, что требуется значительное количество антигена на испытательном участке, чтобы получить визуальный положительный сигнал.
Устройство позволяет решить проблемы известного уровня техники за счет прямого контактирования испытательного участка с пробой, что позволяет любому представляющему интерес аналиту связываться специфически с иммобилизированным связующим веществом. Например, представляющее интерес антитело может быть связано с иммобилизированным антигеном. Затем подают конъюгат на испытательный участок вместе с буфером. Фронт растворения буфера выталкивает несвязанные соединения к испытательному участку и снижает не специфическое взаимодействие с конъюгатом. В результате, требуемое количество конъюгата существенно снижается и за счет этого возрастает скорость реакции:. Кроме того, чувствительность реакции повышается, что позволяет использовать меньше антигена на испытательном участке.
Описанные здесь устройства и способы могут быть использованы, например, для диагностики заболеваний или расстройств пациента, таких как вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) или вирус гепатита. Они также могут быть использованы для определения беременности пациентки. Другие возможные применения станут понятны специалистам из приведенного ниже описания.
Определения
"Представляющий интерес аналит" является молекулой или соединением, присутствие которого необходимо идентифицировать в пробе. Аналитами могут быть,
безо всякого ограничения, вирусные антигены, бактериальные антигены, гормоны, такие как инсулин, фолликулостимулирующий гормон (FSH), тиреотропин, релаксин, соматотропин и гонадотропин, ферменты, иммуноглобулины, цитокины, лекарственные средства, антигены рака, антигенные полисахариды и нуклеиновые кислоты. Специалисты легко поймут, что и другие аналиты могут быть идентифицированы в пробах с использованием предложенных способов и устройств. Особенно предпочтительными представляющими интерес аналитами являются анти-ВИЧ антитело, анти-HCV антитело (HCV=вирус гепатита С) и человеческий хорионический гонадотропин (hCG).
Термин "конъюгат" относится к композиции, которая конфигурирована для связывания с представляющим интерес аналитом и создает различимый сигнал. Конъюгат обычно содержит связующий компонент, конъюгированный с меткой. Связующий компонент позволяет конъюгату связываться с представляющим интерес аналитом и, возможно, с контрольным соединением. Метка создает различимый сигнал, а преимущественно визуальный сигнал. В соответствии с одним из вариантов, визуальный сигнал создается только после связывания конъюгата с аналитом. В соответствии с предпочтительным вариантом, представляющий интерес аналит представляет собой антитело, а конъюгат содержит связующий компонент, который способен связывать антитела. Например, первым связующим компонентом может быть протеин, хотя могут быть использованы и другие молекулы, которые способны связывать антитела. В соответствии с другим вариантом, представляющий интерес аналит представляет собой антиген, а связующий компонент конъюгата содержит антитело, которое способно связывать антиген. Преимущественно, антитело представляет собой моноклональное антитело.
Метка представляет собой любую молекулу или соединение, которые могут быть прикреплены к связующему компоненту или конъюгированы с ним и которые
могут создавать различимый сигнал. Предпочтительной меткой является коллоидное золото. Альтернативно, меткой могут быть, например, частицы сухого латекса, коллоидное серебро или другие коллоидные металлы, коллоидная сажа, или же другие известные соединения. Преимущественно, метка имеет размер частиц, которые не ухудшают способность связующего компонента связывать представляющий интерес аналит. Например, когда связующим компонентом является протеин, метка преимущественно имеет размер частиц, ориентировочно от 5 до 120 нм, а предпочтительнее ориентировочно от 20 до 80 нм.
Конъюгат преимущественно приготавливают в "буфере конъюгата", который может стабилизировать и защищать конъюгат. В соответствии с одним из вариантов, после приготовления в буфере конъюгата, конъюгат может быть высушен на "подушке конъюгата," как это обсуждается далее более подробно. Конъюгат, который высушен на подложке (основе), считают "диффузно связанным." Конъюгат является "диффузно связанным", если он способен диффундировать или течь, например, за счет его контактирования с буфером. Например, конъюгат, который был диффузно связан с областью источника конъюгата за счет сушки, может быть растворен в буфере и за счет этого может протекать вдоль мембраны испытательной полоски.
"Контрольный конъюгат" представляет собой конъюгат, в котором связующий компонент является специфическим для контрольного соединения. Контрольный конъюгат преимущественно используют тогда, когда существует вероятность того, что весь конъюгат будет связан с аналитом на испытательной линии и его не будет хватать для контроля. Контрольным соединением обычно является соединение, имеющееся в подлежащей анализу пробе, которое способно связывать контрольное связующее вещество на контрольной полоске. Возможно, связующий компонент контрольного конъюгата может быть специфическим для соединения, которое присутствует на контрольном участке испытательной мембраны.
Конъюгат преимущественно присутствует в "области источника конъюгата." Область источника конъюгата обычно содержит конъюгат, который диффузно связан с ней, такой как высушенный конъюгат. Альтернативно, область источника конъюгата может содержать конъюгат, который был суспендирован в буфере, таком как буфер промывки или буфер конъюгата. В соответствии с одним из вариантов, область источника конъюгата представляет собой подушку конъюгата, содержащую высушенный конъюгат, которая имеет флюидную связь с испытательной мембраной. В соответствии с другим вариантом, область источника конъюгата представляет собой участок испытательной мембраны, на котором был высушен конъюгат. В соответствии с еще одним вариантом, область источника конъюгата представляет собой буферную подушку, в которую может быть введен буфер, содержащий конъюгат, которая имеет флюидную связь с испытательной мембраной. Область источника конъюгата обычно расположена выше по течению от испытательного участка на испытательной мембране, так что после введения раствора, содержащего конъюгат, или растворения диффузно связанного конъюгата, конъюгат протекает через испытательную мембрану и контактирует с испытательным участком.
Конъюгат преимущественно растворяют в "буфере промывки," как это обсуждается далее более подробно. Вкратце, буфер промывки представляет собой забуференный раствор, который преимущественно содержит "блокирующий агент." Блокирующие агенты хорошо известны сами по себе и содержат любые молекулы или соединения, которые снижают не специфические взаимодействия, такое как не специфические связывание антитела. Преимущественными блокирующими агентами являются протеины, такие как казеин и альбумин коровьей сыворотки (BSA). Другими блокирующими агентами, которые могут быть использованы, являются имеющиеся в продаже агенты, которые хорошо известны специалистам.
"Буфер пробы" представляет собой забуференный раствор, который
преимущественно не содержит конъюгата. В соответствии с некоторыми вариантами, буфер пробы содержит блокирующий агент, в то время как в других вариантах он его не содержит. Буфер пробы факультативно может быть нанесен на мембрану ранее введения пробы, как это обсуждается далее более подробно.
"Испытательная мембрана" представляет собой твердую подложку, имеющую испытательный участок и, возможно, контрольный участок. Подлежащую анализу пробу обычно наносят непосредственно на испытательную мембрану, так что она контактирует с испытательным участком и с контрольным участком. Испытательной мембраной может быть любая твердая подлoжкa, с которой могут быть сцеплены связывающее аналит вещество и контрольное связующее вещество. Преимущественно, испытательная мембрана изготовлена из нитроцеллюлозы.
Испытательная мембрана обеспечивает растеканием капли жидкости в радиальном направлении. Говорят, что испытательная мембрана и другие компоненты испытательной полоски находятся во "флюидной связи", если жидкость, такая как жидкая проба или буфер, может протекать от одного компонента к другому. Если компоненты испытательной полоски находятся в контакте друг с другом, то они имеют флюидную связь. Однако специалисты легко поймут, что прямой контакт между двумя конкретными компонентами не требуется для флюидной связи.
Термины "испытательный участок," "испытательная полоска" и "испытательная линия" являются взаимозаменяемыми и относятся к области на испытательной мембране, с которой сцеплено связывающее аналит вещество.
"Связывающее аналит вещество," "специфический связующий партнер" или "связующий компонент" представляет собой любую молекулу или соединение, которые конфигурированы так, чтобы обеспечивать специфическую связь с представляющим интерес аналитом. Например, и безо всякого ограничения, связывающее аналит вещество может содержать антигены, антитела, рецепторы, другие полипептиды,
пептиды, гаптены, лектины, нуклеиновую кислоту, содержащую олигонуклеотиды, или небольшие молекулы. В соответствии с одним из вариантов, связывающее аналит вещество представляет собой антиген, который является специфическим для антитела, которое должно быть обнаружено в пробе. В соответствии с другим вариантом, связывающее соединение представляет собой антитело, которое является специфическим для представляющего интерес антигена.
Термины "контрольный участок," "контрольная полоска" и "контрольная линия" являются взаимозаменяемыми и относятся к области на испытательной мембране, с которой сцеплено контрольное связующее вещество.
"Контрольное связующее вещество" представляет собой любую молекулу или соединение, которое способны обеспечивать специфическую связь с конъюгатом или с контрольным конъюгатом.
"Испытательная полоска" представляет собой укомплектованное устройство, которое может быть использовано для обнаружения наличия аналита в пробе. Испытательная полоска преимущественно содержит по меньшей мере одну испытательную мембрану с испытательным участком и контрольным участком. Как это обсуждается далее более подробно, испытательная полоска может быть установлена в корпусе, таком как пластиковый корпус. Альтернативно, испытательная полоска может быть использована без корпуса. При установке в корпусе, испытательная полоска и корпус вместе могут быть названы "платой тестирования."
"Окном платы тестирования" или "окном пробы" называют отверстие в пластиковом корпусе платы тестирования, через которое может быть введена проба. Окно платы тестирования преимущественно расположено над испытательным участком и контрольным участком. Окно платы тестирования также преимущественно позволяет осуществлять визуализацию результатов теста.
"Окном буфера" называют отверстие в пластиковом корпусе платы
тестирования, через которое может быть введен буфер. В соответствии с одним из вариантов, окно буфера преимущественно расположено таким образом, что позволяет наносить буфер на буферную подушку. В соответствии с другим вариантом, окно буфера расположено таким образом, что позволяет наносить буфер непосредственно на испытательную мембрану.
"Окном индикатора объема" называют отверстие в пластиковом корпусе платы тестирования, через которое можно увидеть визуальный индикатор объема пробы. Окно индикатора объема расположено ниже по течению от окна пробы. Индикатор объема пробы сигнализирует, что приемлемый объем пробы введен в контакт с испытательным участком. Индикатором объема пробы может быть, например, метиленовая синь или другой окрашенный компонент, который наносят на мембрану непосредственно выше по течению от окна индикатора объема. Индикатор объема пробы перемещается через окно индикатора объема за счет движения пробы, создавая визуальный сигнал в окне. В других вариантах, индикатор объема пробы представляет собой соединение, которое изменяет цвет при контакте с пробой, такое как рН индикатор. Обычно индикатор объема пробы используют тогда, когда необходим большой объем пробы, например, когда полагают, что представляющий интерес аналит присутствует при низкой концентрации в пробе. Например, индикатор объема пробы преимущественно используют тогда, когда производят анализ мочи на наличие hCG.
"Пробой" называют любой материал, который подлежит анализу на наличие представляющего интерес аналита. Проба преимущественно находится в жидком виде. В качестве примеров проб можно привести (но без ограничения) телесные жидкости, такие как цельная кровь, плазма, сыворотка, слюна и моча. Как это обсуждается далее более подробно, проба может быть твердой. Однако, в таком случае пробу преимущественно растворяют или экстрагируют ранее ее использования.
"Область нанесения пробы" представляет собой местоположение на мембране, в
которое наносят пробу. Область нанесения пробы преимущественно расположена ниже по течению от области источника конъюгата и выше по течению от контрольного участка. Предпочтительнее, область нанесения пробы содержит испытательный участок. Проба может быть нанесена на область нанесения пробы непосредственно, например, при помощи пипетки, или опосредованно, например, через фитиль, который находится в контакте с мембраной.
Термин "антитело" используют в широком понимании и он включает в себя, например, и безо всякого ограничения, целые антитела, а также единичную цепь антител, фрагменты антитела и химерические антитела, при условии, что они сохраняют желательную специфичность связывания.
Плата тестирования
Раскрытые здесь диагностические устройства преимущественно содержат плату тестирования 1, как это показано на фиг.1-3. На фиг.1 показана плата тестирования 1, которая содержит пластиковый корпус 10 с верхним участком 15 и нижним участком 18, которые соединены за счет защелкивания друг с другом. Имеются два отверстия в верхнем участке 15 пластикового корпуса 10: окно пробы 20 и окно буфера 30. Окно пробы 20 позволяет наносить пробу на зону нанесения пробы мембраны, которая находится внутри пластикового корпуса 10. Зона нанесения пробы преимущественно содержит испытательный участок 140. Контрольный участок 150 преимущественно расположен ниже по течению от испытательного участка 140 на мембране. Окно буфера 30 позволяет наносить буфер на область 50 источника конъюгата. Мембрана представляет собой часть испытательной полоски, которая описана далее более подробно.
В некоторых вариантах используют дополнительное факультативное окно индикатора объема (не показано), которое расположено ниже по течению от контрольного участка. Окно индикатора объема, если оно есть, позволяет пользователю
визуализировать индикатор, такой как изменение цвета, на мембране ниже по течению от контрольного участка. Индикатор сигнализирует, что достаточный объем пробы был введен в контакт с испытательным участком, так что пользователь может начинать контактирование испытательного участка с конъюгатом для обнаружения связанного аналита, как это обсуждается далее более подробно, например, за счет нанесения буфера в область источника конъюгата.
На фиг.2 показан вид сверху платы тестирования 1, где можно видеть окно пробы 20 и окно буфера 30 внутри пластикового корпуса 10. Доступ к испытательному участку мембраны 140 возможен через окно пробы 20, а доступ к области источника конъюгата 50 возможен через окно буфера 30. Контрольный участок 150 расположен ниже по течению от испытательного участка 140. Несмотря на то, что окно пробы 40 показано прямоугольным, а окно буфера 30 показано круглым, следует иметь в виду, что эти окна могут иметь любую форму и размер. Однако, их форму и размер преимущественно выбирают таким образом, чтобы направлять пробу в область нанесения пробы мембраны 40 и направлять буфер в область источника конъюгата 50. Кроме того, окно пробы конфигурировано для того, чтобы позволить визуализировать испытательный участок 140, если получая положительный результат испытания, и контрольный участок 150.
На фиг.3 показан вид сбоку примерной платы тестирования 1. Показаны верхний участок 15 и нижний участок 18 пластикового корпуса 10. Расширенный конец (60) верхнего участка 15 пластикового корпус, который удален от окна буфера (не показано), предназначен для размещения материала абсорбента, такого как подушка абсорбента или таблетка десиканта на плате тестирования (1). Размер расширенного конца (60) может быть различным в зависимости от количества использованного материала абсорбента, которое, в свою очередь, зависит от объема пробы и буфера, использованных при испытании.
Испытательная полоска
Испытательная полоска содержит испытательную мембрану по меньшей мере с одним испытательным участком. Связующее вещество для аналита  (связывающее аналит вещество), которое является специфическим для представляющего интерес аналита, связано или иным образом иммобдлизировано на испытательном участке. По меньшей мере один участок (зона) испытательного участка становится видимым по завершении теста, если представляющий интерес аналит присутствует в пробе. В специфическом варианте, испытательный участок содержит иммобилизированный антиген, и тест позволяет произвести идентификацию специфического антитела в пробе, такой как биологическая жидкость. В соответствии с другим вариантом, испытательный участок содержит связанное антитело и тест позволяет произвести идентификацию специфического антигена в пробе.
Пробу наносят на область нанесения пробы, которая расположена ниже по течению от области источника конъюгата, например ниже по течению от подушки конъюгата. В соответствии с предпочтительным вариантом, область нанесения пробы содержит испытательный участок. Однако в других вариантах область нанесения пробы расположена выше по течению от испытательного участка и проба протекает от области нанесения пробы к испытательному участку.
Предпочтительный вариант испытательной полоски схематично показан на фиг.4. Испытательная полоска 100 для проверки пробы на наличие представляющего интерес аналита, такого как антитело, преимущественно содержит буферную подушку 110, которая находится в контакте с подушкой 120 конъюгата. В свою очередь, подушка 120 конъюгата находится в контакте с испытательной мембраной 130, которая содержит испытательный участок 140 и контрольный участок 150. В свою очередь, мембрана 130 находится в контакте с подушкой 160 абсорбента. Подушка 160 абсорбента может находиться в контакте с дополнительной впитывающей бумагой 170.
Подушка 160 абсорбента и/или факультативная впитывающая бумага 170 могут находиться в дополнительном контакте с факультативным десикантом 180, например, с таблеткой десиканта.
В некоторых вариантах к испытательной полоске 100 прикреплен съемный фильтродержатель 190. Фильтродержатель 190 содержит фильтровальную бумагу 200. Когда фильтродержатель 190 прикреплен к испытательной полоске 100, фильтровальная бумага 200 расположена непосредственно над областью нанесения пробы, которая преимущественно содержит испытательный участок 140 и контрольный участок 150.
Достаточный объем пробы должен быть нанесен на испытательный участок, чтобы обеспечить визуальное положительное считывание после завершения теста, если аналит присутствует в пробе. Таким образом, для аналитов, которые предположительно находятся в пробе при низкой концентрации, например, для антигенов, таких как hCG в моче, требуется более значительный объем пробы. Испытательная полоска 100 может быть конфигурирована для приема больших объемов пробы. Один такой вариант показан на фиг.7, где чашка 500 для пробы прикреплена к испытательной полоске 100. Чашка 500 для пробы содержит контейнер, в котором содержится объем жидкой пробы. Обычно чашка для пробы имеет отверстие на дне, через которое проба может вытекать из чашки 500 для пробы и контрактовать с испытательной мембраной 130. Таким образом, чашка 500 для пробы расположена таким образом, что проба вытекает из чашки 500 для пробы в область нанесена пробы испытательной мембраны 130 и контактирует с испытательным участкам 140 и контрольным участком 150. Преимущественно, область нанесения пробы содержит испытательный участок 140 и контрольный участок 150, и чашка 500 для пробы расположена непосредственно над испытательным участком 140 и контрольным участком 150. Чашка 500 для пробы факультативно может иметь фильтр, через который проходит проба ранее
контактирования с испытательной мембраной.
Проба может быть введена в чашку для пробы после ее прикрепления к плате тестирования.
В соответствии с другим вариантом, сначала пробу вводят в чашку для пробы, а затем чашку прикрепляют к плате тестирования и создают условия для протекания пробы в область нанесения пробы.
Желательно обеспечить, чтобы объем пробы, содержащий обнаруживаемое количество аналита, если он есть, был введен в контакт с испытательным участком 140 ранее создания условий для протекания конъюгата в испытательный участок 140. Индикатор объема пробы, такой как индикаторный краситель, расположенный ниже по течению от испытательного участка 140 к контрольного участка 150, может быть использован для определения того факта, что достаточное количество пробы было введено в контакт с испытательным участком 140 и контрольным участком 150. Например, индикаторный краситель, такой как метиленовая синь, может быть нанесен на подушку 160 абсорбента или на впитывающую бумагу 170 ниже по течению от испытательной мембраны. Течение жидкой пробы через подушку 160 абсорбента или впитывающую бумагу 170 вызывает течение красителя и создает визуальный сигнал, например, видимую синюю окраску. Этот сигнал можно наблюдать через окно индикатора объема на плата тестирования (не показано).
В некоторых вариантах, особенно в таких, в которых следует наносить большой объем пробы (ориентировочно свыше 50 мкл), подушка 120 конъюгата не находится во флюидной связи с испытательной мембраной 130. Один такой вариант показан на фиг.7. Разделение подушки 120 конъюгата и испытательной мембраны 130 предотвращает перемешивание конъюгата и пробы ранее контактирования пробы с испытательным участком 140. После контактирования пробы с испытательным участком 140 и с контрольным участком 150, подушку конъюгата 120 перемещают и вводят во
флюидную связь с испытательной мембраной 130. Затем буфер наносят на буферную подушку 110, чтобы запустить испытание. Буфер может быть нанесен на буферную подушку 110 непосредственно через окно буфера, или за счет  разрезания содержащей буфер ампулы 300, в результате чего буфер может втекать в буферную подушку 110. В соответствии с одним из вариантов, буфер наносят на буферную подушку 110 ранее перемещения подушки 120 конъюгата и ее введения во флюидную связь с мембраной 130. В соответствии с альтернативными вариантами, буфер наносят непосредственно на подушку 120 конъюгата.
Способ, при помощи которого подушку 120 конъюгата побуждают перемещаться и входить во флюидную связь с мембраной 130, не имеет никаких ограничений. В соответствии с одним из вариантов, пользователь сдвигает подвижный участок корпуса, к которому прикреплена подушка 120 конъюгата и, возможно, буферная подушка 110, за счет чего подушка 120 конъюгата входит в контакт с мембраной 130. Механизм перемещения подушки 120 конъюгата для создания флюидной связи с испытательной мембраной 110 преимущественно заставляет также разрываться ампулу 300 буфера. Этот механизм может также удалять чашку 500 для пробы от испытательной полоски 140.
Таблетка 180 десиканта преимущественно находится во флюидной связи с впитывающей бумагой 170. Размер таблетки 180 десиканта выбирают таким образом, чтобы поглощать полный объем пробы, нанесенной на испытательную мембрану 130. Таблетка десиканта и любые другие поглощающие материалы расположены ниже по течению от области нанесения пробы и обличают течение пробы через испытательный участок.
В других вариантах, чашка для пробы заменена фитилем, который находится в контакте с жидкой пробой. Проба протекает вдоль фитиля в область нанесения пробы испытательной мембраны и контактирует с испытательным участком и контрольным
участком. В специфическом варианте, фитиль помещают в струю мочи для анализа мочи на наличие аналита, такого как hCG. В этих вариантах, подушка конъюгата преимущественно не находится во флюидной связи с испытательной мембраной во время нанесения пробы на фитиль. После того, как достаточный объем пробы вошел в контакт с испытательным участком, подушку конъюгата перемещают для создания контакта с испытательной мембраной. Механизм перемещения подушки конъюгата может также служить для удаления фитиля. Затем вводят буфер в буферную подушку или непосредственно в подушку конъюгата, чтобы начать испытание. Буфер может быть введен непосредственно в буферную подушку через окно буфера, как уже было описано здесь выше. Альтернативно, буфер может находиться в ампуле на плате тестирования и могут быть созданы условие для его протекания к буферной подушке и/или к подушке конъюгата за счет разрезания ампулы или ее открывания иным образом.
Испытательная полоска преимущественно находится внутри корпуса, как это показано на фиг.2 и описано здесь выше.
На фиг.5 показан положительный результат испытания, свидетельствующий о наличии представляющего интерес аналита в пробе. Испытательный участок 140 мембраны 130 виден как линия через окно 30 пробы. Кроме того, контрольный участок 150 виден как линия через окно 20 пробы, что свидетельствует о том, что конъюгат протекал из области 50 источника конъюгата через испытательный участок 140. Для сравнения, на фиг.6 показан отрицательный результат. При отрицательном результате, только контрольный участок 150 виден как линия через окно 20 пробы. И в этом случае контроль свидетельствует о том, что конъюгат протекал из области 50 источника конъюгата через испытательный участок 140. Таким образом, отсутствие линии на испытательном участке 140 является результатом отсутствия связанного представляющего интерес аналита.
Использование испытательной полоски
Пробу, которую проверяют на наличие специфического представляющего интерес аналит, наносят на область нанесенная пробы испытательной мембраны, таким образом, что она контактирует с испытательным участком. В соответствии с предпочтительным вариантом, пробу наносят на мембрану и создают условия для контакта с испытательным участком ранее контактирования конъюгата с испытательным участком. Таким образом, представляющий интерес аналит в пробе, если он есть, имеет возможность связывания со связывающим аналит веществом в испытательном участке, ранее связывания с конъюгатом.
Если испытательная полоска находится в корпусе, то пробу преимущественно наносят через окно пробы. В этом случае мембрана содержит область нанесения пробы, доступ к которой обеспечен через окно пробы. Преимущественно, область нанесения пробы содержит по меньшей мере один положительный испытательный участок. Предпочтительнее, область нанесения пробы содержит испытательный участок и контрольный участок. Альтернативно, проба может быть нанесена через фитиль или чашку, так что она может втекать в область нанесения пробы мембраны и контактировать с испытательным и контрольным участками.
Если испытательная полоска не находится в корпусе, проба может быть нанесена непосредственно на область нанесения пробы мембраны, преимущественно содержащую испытательный участок и контрольный участок. Альтернативно, проба может быть нанесена на мембрану у области нанесения пробы выше по течению от испытательного участка и может протекать через мембрану для контактирования с испытательным участком. Преимущественно, однако, пробу вводят в контакт с испытательным участком ранее введения конъюгата в мембрану.
В соответствии с первым вариантом, пробу накапливают в чашке для пробы или
вводят в нее. Чашку прикрепляют к корпусу и создают условия для протекания пробы к области нанесения пробы мембраны и для контактирования с испытательным участком и с контрольным участком. Чашку для пробы преимущественно используют в том случае, когда объем пробы составляет ориентировочно больше чем 10 мкл. Чашка для пробы факультативно может содержать фильтр, через который пробу пропускают ранее контактирования с мембраной.
В соответствии с дополнительный вариантом, пробу наносят на фитиль, который находится в контакте с мембраной. Фитиль позволяет пробе мигрировать к области нанесения пробы мембраны и контактировать с испытательным и контрольным участками. Фитиль преимущественно содержит бумагу из стекловолокна, сложный полиэфир, целлюлозу или другой материал, который позволяет пробе мигрировать к мембране, содержащей испытательный участок. Если плата тестирования находится в корпусе, фитиль может выступать из корпуса, что обеспечивает доступ к фитилю, для нанесения пробы. Например, если требуемся определить наличие специфического аналита в моче, такого как hCG, то фитиль может быть введен в струю мочи проверяемого пациента. В соответствии с другим вариантом, фитиль может быть введен в контакт с пробой, подлежащая анализу, например, с телесными жидкостями, такими как слюна.
Проверяемую пробу преимущественно наносят на область нанесения пробы мембраны в жидком виде. Примерными проверяемыми пробами могут быть, например, (но без ограничения), сыворотка, плазма, цельная кровь, слюна и моча. Твердые или полутвердые пробы могут быть растворены и нанесены на мембрану, или экстрагированы ранее нанесения.
В соответствии с другими вариантами, буфер пробы, который преимущественно не содержит конъюгата, наносят на мембрану ранее нанесения пробы. В некоторых
вариантах буфер пробы содержит блокирующий агент. Преимущественно, буфер пробы наносят на мембрану у области нанесения пробы. Ориентировочно от 1 до 25 мкл буфера пробы преимущественно наносят на мембрану, предпочтительнее, ориентировочно от 1 до 10 мкл, а еще лучше, ориентировочно от 1 до 5 мкл. В специфическом варианте, 5 мкл буфера пробы наносят на область нанесения пробы мембраны, после чего наносят 5 мкл сыворотки, плазмы, цельной крови или другой жидкой пробы. Добавка буфера пробы ранее нанесения буфера промывки особенно предпочтительна при проверке на вирус гепатита С, как это обсуждается далее более подробно, и когда используют вязкие пробы. Использование буфера пробы повышает чувствительность теста и заставляет вязкие пробы течь быстрее.
Буфер пробы преимущественно содержит буферный агент и антикоагулянт. Факультативно, он может содержать один или несколько детергентов и/или Сахаров. Может быть использован любой буферный агент, преимущественно, в таком количестве, которое поддерживает желательный рН буфера пробы. Преимущественно, рН буфера пробы ориентировочно составляет от 7.2 до 7.6. Например, и безо всяких ограничений, буфер может быть выбран ив группы, в которую входят HEPES, Tris и фосфат буферы. В соответствии с предпочтительным вариантом, буфер пробы содержит ориентировочно от 0.01% до 0.5% HEPES, а еще лучше, ориентировочно от 0.02 до 0.05% HEPES. В соответствии с другим вариантом, буфер пробы содержит ориентировочно от 0.01% до 0.5% фосфата, а еще лучше, ориентировочно от 0.02 до 0.05% фосфата. Специалисты легко поймут, как следует регулировать количество буферного агента для поддержания желательного рН.
Буфер пробы также преимущественно содержит антикоагулянт, такой как азид натрия или Proclin. В соответствии с предпочтительным вариантом, буфер пробы содержит ориентировочно от 0.1% до 1.0% азида натрия, предпочтительнее,
ориентировочно от 0.1% до 0.2%, а еще лучше, преимущественно около 0.2% азида натрия.
TM
В зависимости от природы подлежащей проверки пробы, проба может быть также факультативно нанесена на мембрану через фильтр. Примерные материалы пробы, которые преимущественно фильтруют, включают в себя цельную кровь, фекальные пробы, мочу, пищевые экстракты и экстракты отходов. В соответствии с одним из вариантов, цельную кровь наносят через мембранный фильтр. Фильтр удаляет загрязнения и позволяет аналитам, таким как антитела, проходить через него, за счет чего повышается чувствительность теста. Фильтр преимущественно вставляют в держатель, который прикрепляют к плате тестирования или к испытательной полоске требуемым образом. При креплении к плате тестирования, фильтр преимущественно прикрепляют непосредственно над окном пробы. Фильтрующее средство выбирают на основании типа пробы, подлежащей фильтрации. Специалисты легко поймут, как произвести такой выбор. Например, для проб цельной крови, фильтрующим материалом может быть (но без ограничение) Pall BTS-SP300.
Как уже было упомянуто здесь выше, фильтр преимущественно прикрепляют к испытательной полоске при помощи схемного фильтродержателя, однако для специфических применений фильтр может быть прикреплен постоянно. Фильтродержатель обычно представляет собой устройство, которое защелкивают на корпусе платы тестирования. Конструкция и тип устройства могут быть различными, но обычно оно изготовлено из полистирола, полиэтилена, полипропилена или другого пластика.
Испытательный участок представляет собой участок мембраны, который покрыт связующим веществом, преимущественно протеином, который способен специфически связываться с представляющим интерес аналитом. Например, положительный испытательный участок может быть покрыт антигеном, который является
специфическим для представляющего интерес антитела. В соответствии со специфическими вариантами, испытательный участок содержит связанный ВИЧ антиген или антиген гепатита, как это описано далее более подробно в Примерах. Когда испытательный участок содержит антиген, то преимущественно используют ориентировочно от 0.025 мкг до 0.4 мкг антигена.
В других вариантах, антитело, которое является специфическим для представляющего интерес антигена, иммобилизировано испытательном участке. Антителом может быть поликлональное или моноклональное антитело. Когда испытательный участок содержит антитело, то преимущественно наносят ориентировочно от 0.1 до 20 мкг антитела, предпочтительнее ориентировочно от 0.2 до 2 мкг, а еще лучше, ориентировочно от 0.5 до 1 мкг. В специфическом варианте, испытательный участок содержит антитело для hCG, а преимущественно моноклональное антитело для hCG.
Связующее вещество может быть нанесено на мембрану в соответствии с любым желательным рисунком; таким образом, видимый результат положительного теста может иметь любую форму. В соответствии с предпочтительным вариантом, испытательный участок является линейном и образует линию, идущую от одной стороны мембраны до другой, так что появляется вертикальная линия, которая идет поперек через окно пробы, если получен положительный результат, что свидетельствует о присутствии аналита в пробе. В других вариантах, испытательный участок имеет форму в виде символа, например, такого как "+."
Можно тестировать несколько типов аналита в единственной испытательной полоске. В этом случае, подготавливают дополнительные положительные испытательные участки на испытательной мембране. Например, второй положительный испытательный участок может содержать антиген для второго типа антитела, или антитело для второго типа антигена. Связующее вещество на
дополнительном положительном испытательном участке не обязательно является связующим веществом такого же типа, как на первом испытательном участке. Так, например, связующим веществом на первом испытательном участке может быть антитело, в то время как связующим веществом на втором испытательном участке может быть антиген. Указанным образом проба может быть проанализирована на присутствие нескольких типов аналита.
Каждый дополнительный положительный испытательный участок может иметь форму, отличающуюся от формы первого испытательного участка, чтобы позволить пользователю легко различить природу положительного результата. В зависимости от типа подлежащих тестированию дополнительных аналитов, могут быть необходимы дополнительные конъюгаты, которые связывают различные аналиты. Например, если представляющие интерес аналиты представляют собой два различных антитела, то может быть использован единственный конъюгат, содержащий протеин. Однако, если один аналит представляет собой антитело, а второй аналит представляет собой антиген, то потребуются два различных конъюгата, один из которых специфически связывает антитело, а другой специфически связывает антиген.
Контрольный участок преимущественно содержит контрольное связующее вещество, которое будет связываться с конъюгатом. Так как контрольный участок расположен ниже по течению от положительного испытательного участка, то реакция на контрольном участке будет показывать, что конъюгат мигрировал через испытательный участок, где он находился для реакции при наличии представляющего интерес аналита. Если конъюгат предназначен для распознавания антитела, то контрольный участок преимущественно содержит иммуноглобулин, такой как IgG кролика. Если конъюгат содержит антитело, то контрольный участок преимущественно содержит связывающее антитело вещество, такое как протеин. Контрольный участок может иметь любую желательную форму, такую как линия или символ, например "-."
В других вариантах, контрольный участок содержит связующее вещество, которое связывается с контрольным конъюгатом. Например, контрольный участок может содержать β-гал, а контрольный конъюгат может содержать β-галактозу, конъюгированную с золотом.
Связующее вещество и контрольное связующее вещество могут быть нанесены на испытательную мембрану при помощи любого известного способа. Обычно их наносят путем контактирования испытательной мембраны со связующим веществом, например, путем распыления или контактирования на испытательной мембране с использованием системы распределения с насосом. Такие системы имеются в продаже, например, поставляются фирмой Kinematic Automation.
Когда проба контактирует с испытательным участком, и если представляющий интерес аналит присутствует в пробе, он будет связываться со связующим веществом на испытательном участке. Избыток не связанного аналита смывают с испытательного участка путем миграции буфера вдоль мембраны, как это обсуждается далее более подробно.
После нанесения пробы на мембрану, буфер промывки наносят на испытательную мембрану. Преимущественно, сначала наносят ориентировочно от 1 до 20, а еще лучше, ориентировочно от 1 до 5 капель буфера промывки. Дополнительный буфер промывки может быть нанесен позднее, если необходимо очистить реакцию.
Буфер промывки преимущественно несет (транспортирует) конъюгат в испытательный участок. Буфер промывка может быть нанесен непосредственно на испытательную мембрану. Однако, в соответствии с предпочтительным вариантом, буфер промывки наносят выше по течению от буферной подушки, откуда он втекает в испытательную мембрану. Буферная подушка может быть изготовлена из любого материала, который может содержать буфер и позволяет ему протекать через подушку в мембрану с желательной скоростью. Например, буферная подушка может содержать
один или несколько материалов, выбранных из группы, в которую входят бумага из стекловолокна, целлюлоза и сложный полиэфир. В соответствии с предпочтительным вариантом, буферная подушка представляет собой бумагу из стекловолокна типа Whatman GF/DVA. Специалисты легко поймут, как следует выбирать соответствующий материал для буферной подушки с учетом таких факторов, как конструкция корпуса испытательной полоски с растеканием капли жидкости в радиальном направлении, желательная скорость течения и количество буфера, который должен удерживаться в буферной подушке.
Буфер промывки может быть нанесет непосредственно на буферную подушку, например, при помощи пипетки или капельницы. Однако, в соответствии с другим вариантом, соответствующее количество буфера промывки присутствует в контейнере, расположенном в непосредственной близости от буферной подушки. Например, буфер промывки может храниться в стеклянной или пластиковой ампуле. После введения испытательной пробы, содержащий буфер промывки контейнер разрезают или открывают иным образом, что позволяет буферу промывки контактировать с буферной подушкой.
Композиция буфера промывки может варьировать для повышения чувствительности теста. Преимущественно, буфер промывки содержит буферный агент, антикоагулянт, детергент, сахар и другие материалы, которые позволяют понижать фоновое и/или не специфическое связывание.
Может быть использован любой буферный агент, который поддерживает желательный рН буфера, составляющий преимущественно ориентировочно от 7.2 до 7.6. Например, и безо всякого ограничение, буфер может быть выбран из группы, в которую входят HEPES, Tris и фосфатный буфер. В соответствии с предпочтительным вариантом, буфер промывки содержит ориентировочно от 0.01% до 0.5% HEPES, предпочтительнее, ориентировочно от 0.02 до 0.2% HEPES, а еще лучше,
ориентировочно от 0.02 до 0.05% HEPES. В соответствии с особенно предпочтительньш вариантом, буфер промывки содержит 0.025% HEPES.
Буфер промывки также может содержать антикоагулянт, такой как азид натрия или Proclin. В соответствии с предпочтительным вариантом, буфер промывки содержит ориентировочно от 0.1 до 0.5% азида натрия, а преимущественно ориентировочно от 0.1 до 0.2% азида натрия.
Хлорид натрия или аналогичная роль преимущественно присутствует при концентрации около 1%, а еще лучше, около 0.85%. ЭДТА может преимущественно присутствовать при концентрации около 0.1%. Также может присутствовать сахар, такой как маннитол. Предпочтительные концентрации маннитола составляют ориентировочно от 1% до 5%. В соответствии с предпочтительным вариантом, концентрация маннитола составляет около 1%.
Блокирующий агент также преимущественно присутствует в буфере промывки. Блокирующим агентом может быть любой известный блокирующий агент. Преимущественным блокирующим агентов является протеин, такой как казеин или альбумин коровьей сыворотки (BSA). Блокирующий агент преимущественно присутствует в буфере промывки при концентрации ориентировочно от 0.01 до 0.5%, а еще лучше, ориентировочно от 0.02 до 0.2%. В соответствии с особенно предпочтительным вариантом, казеин присутствует в буфере промывки при концентрации около 0.1%.
TM
Буфер промывки обычно также содержит детергент, преимущественно неионный детергент, такой как Triton X100 или Tween. Преимущественно, детергент присутствует при концентрации ориентировочно от 0.05 до 1%, а еще лучше, ориентировочно от 0.1 до 0.5%. В соответствии с особенно предпочтительным вариантом, буфер промывки содержит Triton X100 при концентрации около 0.1%.
Регулировку рН буфера промывки производят так, что он составляет
ориентировочно от 7 до 8, а преимущественно ориентировочно от 7.2 до 7.6. В соответствии с особенно предпочтительным вариантом, рН буфера промывки составляет ориентировочно 7.2.
Испытательная полоска также содержит область источника конъюгата. В соответствии с предпочтительным вариантом, испытательная полоска содержит подушку конъюгата, на которой конъюгат был высушен, как уже было описано здесь выше. Буфер промывки протекает от буферной подушки к подушке конъюгата, с которой она находится в контакте. Подушка конъюгата, в свою очередь, находится в контакте с испытательной мембраной. Однако, в некоторых вариантах, подушку конъюгата вводят в контакт с мембраной после добавления пробы. В частности, когда используют большой объем пробы, подушку конъюгата преимущественно вводят в контакт с мембраной после контактирования пробы с испытательным участком.
Достаточный объем буфера промывки наносят на буферную подушку, чтобы растворить конъюгат, диффузно связанный с подушкой конъюгата, и вызвать течение конъюгата вдоль испытательной мембраны к испытательной линии и контрольной линии. Количество буфера, которое необходимо использовать, может быть определено специалистами на основании таких факторов, как количество конъюгата, связанного на подушке конъюгата, размер мембраны и количество пробы, подлежащей анализу. Преимущественно, от 1 до 10 капель буферного раствора наносят на буферную подушку, когда буферная подушка имеет размер ориентировочно 2 см × 5 мм, а предпочтительнее, от 2 до 5 капель, а еще лучше, от 3 до 4 капель буферного раствора.
В альтернативных вариантах, подушку конъюгата не используют. В соответствии с одним из альтернативных вариантов, конъюгат присутствует в буфере промывки при концентрации в диапазоне ориентировочно от 0.2 OD/мл до 1.0 OD/мд. Содержащий конъюгат буфер промывки может быть нанесен на буферную подушку. Таким образом, конъюгат протекает вместе с буфером промывки от буферной подушки
к мембране, где он контактирует с испытательным участком и с контрольным участком. В соответствии с другим вариантом, содержащий конъюгат буфер промывки наносят непосредственно на испытательную мембрану. Содержащий конъюгат буфер промывки может храниться в ампуле, и может протекать к мембране после разрезания или открывания иным образом ампулы. Содержащий конъюгат буфер промывки преимущественно наносят на мембрану в точке, расположенной выше по течению от контрольного участка. Однако, в некоторых вариантах, содержащий конъюгат буфер промывки наносят непосредственно на испытательный участок после нанесения пробы.
В соответствии с другим вариантом, конъюгат диффузно связан, например, при помощи сушки, непосредственно с мембраной, которая содержит испытательный участок и контрольный участок. Буфер промывки затем может быть нанесен на буферную подушку, которая находится в контакте с мембраной, или может быть нанесен непосредственно на испытательную мембрану. Буфер промывки растворяет высушенный конъюгат и несет его вдоль испытательной мембраны на испытательный участок и контрольный участок.
Содержащий конъюгат буфер промывки преимущественно контактирует с испытательным участком после того, как проба уже была нанесена, и любой аналит, присутствующий в пробе, уже имел возможность для связывания иммобилизированного связующего вещества. Таким образом, буфер промывки преимущественно наносят на испытательную полоску после нанесения пробы на испытательный участок.
Конъюгат, подробно описанный здесь выше, приготавливают, для использования в тесте, путем разведения в буфере конъюгата. Преимущественно, рабочий конъюгат приготавливают путем разведения конъюгата в буфере конъюгата ориентировочно до 3 OD/мл. Композиция буфера конъюгата может варьировать в
зависимости от природы конъюгата. Примерный буфер конъюгата представляет собой такой буфер, как HEPES, Tris, фосфат или другие аналогичные буферы, известные сами по себе. Предпочтительный буфер конъюгата содержит ориентировочно от 0.02 до 0.2% буфера HEPES, а преимущественно около 0.025% HEPES. Буфер конъюгата может также содержать соль, преимущественно хлорид натрия. Хлорид натрия добавляют в концентрации ориентировочно до 0.1%, а преимущественно около 0.85%. Буфер конъюгата может также содержать антикоагулянт, такой как азид натрия или Proclin при концентрации ориентировочно от 0.1 до 0.2%.
Буфер конъюгата также преимущественно содержит ЭДТА (около 0.1%), казеин при концентрации ориентировочно от 0.02 до 0.2%, а преимущественно около 0.15%, альбумин коровьей сыворотки (BSA) при концентрации ориентировочно от 0.5 до 3%, а преимущественно около 1%, маннитол при концентрации ориентировочно от 1% до 5%, а преимущественно около 1%, и сахарозу при концентрации ориентировочно от 1% до 5%, а преимущественно около 1%. Triton X100 также может присутствовать в буфере, преимущественно при концентрацией ориентировочно от 0.1 до 0.5%, а еще лучше, около 0.1%.
Буфер конъюгата преимущественно регулируют так, что его рН составляет ориентировочно от 7.2 до 7.6, а преимущественно около 7.2.
В соответствии с одним из вариантов, после приготовления рабочего конъюгата путем разведения конъюгата в буфере конъюгата, рабочий конъюгат сушат на подушке конъюгата, например, при помощи сушки в вакууме. Подушку конъюгата преимущественно разрезают на полоски соответствующего размера для использования в качестве испытательных полосок. В приведенных далее примерах используют полоски размерами 5 мм × 105 мм, полученные за счет разрезания подушки конъюгата.
Подушка конъюгата преимущественно содержит стекловолокно, бумагу из
стекловолокна, сложного полиэфира или целлюлозы. Такие материалы известны сами по себе и могут быть закуплены, например, на фирмах Millipore, S&S и Whatman. В соответствии с предпочтительным вариантом, подушка конъюгата представляет собой покупную подушку конъюгата типа GFCP203000 (фирма Millipore) из стекловолокна.
Как уже было описано здесь выше, буфер промывки растворяет высушенный конъюгат и побуждает его протекать из подушки конъюгата и по испытательной мембране через испытательный участок и контрольный участок.
Испытательная мембрана может бить изготовлена из любого материала, с которым может сцепляться протеин или другое связующее вещество, ковалентно или не ковалентно, и по которому может протекать конъюгат с буфером промывки. Испытательная мембрана преимущественно изготовлена из нитроцеллюлозы. Специалистами могут быть использованы у другие мембраны, с более высокими или более низкими скоростями потока, в качестве испытательных мембран, на основании таких факторов, как желательная чувствительность, время тестирования и стоимость.
Когда конъюгат протекает вместе с буфером промывки через мембрану, он контактирует с испытательным  участком. Если представляющий интерес аналит присутствует и связан со связующим веществом на испытательном участке, конъюгат в буфере будет связан с аналитом.
Содержащий конъюгат буфер промывки, который не был связан на испытательном участке, будет продолжать протекать через мембрану к контрольному участку. Конъюгат будет связываться с контрольным связующим веществом. Буфер промывки будет также нести (вымывать) несвязанную пробу из испытательного и контрольного участков.
Буфер промывки, содержащий несвязанный конъюгат и несвязанную пробу, затем будет втекать в подушку абсорбента, которая находится в контакте с
TM
расположенным ниже по течению концом мембраны. Подушка абсорбента может быть изготовлена из любого известного поглощающего материала. Преимущественно, подушка абсорбента представляет собой впитывающую бумагу, такую как бумага S&S 900. Известны и другие впитывающие бумаги, которые могут быть выбраны специалистами в зависимости от окончательной конфигурации испытательной полоски.
Буфер промывки может продолжать протекать через подушку абсорбента и втекать во впитывающую бумагу, которая находится в контакте с подушкой абсорбента. Впитывающую бумагу преимущественно используют в том случае, когда необходимо поглощать большое количество буфера.
Таблетка десиканта, образующая молекулярное сито, также может быть встроена в испытательную полоску. В соответствии с одним из вариантов, буфер с несвязанным конъюгатом протекает из впитывающей бумаги в таблетку десиканта, с которой бумага находится в контакте. Таблетка десиканта задерживает поглощенную жидкость и исключает обратное течение в испытательную полоску.
Таблетка десиканта может также сохранять испытательную полоску сухой до ее использования. Предпочтительной таблеткой десиканта является таблетка 0.395 г. Tri-Sorb, которую можно купить на фирме Sud-Chemie (номер продукта 43-01).
Специалисты легко поймут, как выбрать соответствующий размер подушки абсорбента и материал для ее изготовления, впитывающую бумагу и таблетку десиканта, в зависимости от окончательной конфигурации испытательной полоски, включая полный объем пробы и буфера, которые необходимо использовать.
Испытательная полоска целиком преимущественно находится внутри корпуса, такого как пластиковый корпус. Как уже было описано здесь выше, в одном из вариантов корпус содержит окно пробы, через которое проба может быть введена в мембрану, содержащую испытательный и контрольный участки. Корпус может также
содержать окно буфера, через которое буфер может быть нанесен на буферную подушку или на мембрану. Корпус может также содержать окно индикатора объема, через которое можно увидеть сигнал, показывающий, что достаточный объем пробы содержится на испытательном участие. Достаточным объемом пробы является объем пробы, который полагают содержащим достаточное количество представляющего интерес аналита, если он есть, который создает визуальный сигнал по завершении теста, если аналит присутствует в пробе. Например, в тесте обнаружения hCG в моче, достаточным объемом пробы является ориентировочно 200 мкл мочи.
Результаты теста преимущественно учитывают по истечении ориентировочно от 1 до 5 минут после добавления буфера промывки на испытательную полоску. В соответствии с одним из вариантов, результаты считывают по истечении ориентировочно от 2 до 4 минут после добавления буфера промывки, а преимущественно ориентировочно по истечении от 3 до 4 минут после добавления буфера промывки. В соответствии с особенно предпочтительным вариантом, результаты считывают по истечении 1 минуты после добавления буфера промывки. Как это показано на фиг, 7, в случае положительного результата, испытательная линия (300) становится видимой. Видимая контрольная полоса (400) показывает, что тест проведен правильно. Как это показано на фиг.6, если контрольная линия (400) видна, а испытательная линия не видна, то это говорит об отрицательном результате.
Пример 1 Конструкция ВИЧ испытательной платы
Был подготовлен быстрый визуальный тест с растеканием капли жидкости в радиальном направлении для обнаружения антител к вирусу иммунодефицита человека. Построение испытательных полосок главным образом соответствует показанному на фиг.1.
Испытательные полоски имеют пластиковую основу (6 см × 5 мм) с клеем на
обеих сторонах. Пластиковая основа имеет толщину ориентировочно от 2 до 20 мил.
Были образованы испытательная линия и контрольная линия на мембране из нитроцеллюлозы (Millipore HF09004) путем напыления при помощи насосной распределительной системы (Kinematic Automation). Испытательная линия представляет собой вертикальную линию ВИЧ антигена. ВИЧ антиген представляет собой смесь ВИЧ-1 рекомбинантных гликопротеиновых антигенов (GP120 (около 0.15 мг/мл) и Р24 (около 0.1 мг/мл)) и ВИЧ-2 рекомбинантного гликопротеинового антигена (GP36 (около 0.5 мг/мл), при концентрации ориентировочно от 0.5 до 1.0 мг/мл, приготовленной в PBS (сополимер стирола и бутадиена), содержащем 5% трегалозы. Полное количество ориентировочно от 0.1 до 0.5 мкг антигена было нанесено на испытательный участок в вертикальной линии.
Были приготовлены также и другие испытательные полоски, которые содержат только ВИЧ-1 или ВИЧ-2 антиген на испытательной линии.
Для всех испытательных полосок контрольный участок содержит вертикальную линию контрольного антитела. Контрольное антитело представляет собой IgG кролика, разведенный до 1 мг/мл в PBS, содержащем 5% трегалозы. На контрольный участок было нанесено полное количество контрольного антитела, достаточное для создания видимой контрольной линии после связывания конъюгата.
Для каждой испытательной  поломки соответствующую нитроцеллюлозную мембрану разрезали на полоски размеров ориентировочно 2.5 см × 5 мм, которые прикрепляли к пластиковой основе,
Протеин А, связанный с коллоидным золотом, который может быть закуплен на фирме Sigma, был использован в качестве конъюгата для проведения испытаний. Конъюгат был разведен в буфере конъюгата до концентрации ориентировочно 3 OD/мл. Буфер конъюгата содержит 0.25% HEPES, 0.85% хлорида натрия, 0.1% азида
натрия, 0.1% ЭДТА, 0.1% казеина, 1% альбумина коровьей сыворотка, 1% маннитола, 5% сахарозы и 0.1% Triton X100. Буфер регулировали до рН 7.2.
Конъюгат был нанесен на подушку конъюгата из стекловолокна (Millipore GFCP203000), которая была высушена и разрезана на куски 5 мм × 5 мм. Эти куски были прикреплены соответственно к концу фитроцеллюлозной мембраны, ближайшему к испытательному участку каждой испытательной полоски.
Буферная подушка из бумаги из стекловолокна Whatman GF/DVA (2 см × 5 мм) затем была прикреплена к высушенной подушке конъюгата каждой испытательной полоски.
Подушка абсорбента (2 см × 5 мм), изготовленная из бумаги S&S 900, была прикреплена к концу нитроцеллюлозной мембраны, ближайшему к контрольному участку, причем дополнительный кусок вписывающей бумаги (2.5 см × 5 мм; S&S 470) был прикреплен к подушке абсорбента. В свою очередь, впитывающая бумага находилась в контакте с 0.395 г таблеткой десиканта (Tri-Sorb, Sud-Chemie).
Испытательная полоска была помещена в пластиковый корпус, чтобы получить плату тестирования, аналогичную показанной на фиг.1-6. Пластиковый корпус (10) имеет испытательное окно (20), которое открывает испытательный участок (140) и контрольный участок (150), а также окно буфера (30), расположенное непосредственно над буферной подушкой. Пластиковый корпус имеет метки для указания местоположения испытательной линии и контрольной линии. Платы тестирования были индивидуально упакованы в фольгу.
Пример 2 Проверка на ВИЧ
Сыворотка или плазма были приготовлены из пробы цельной крови, отобранной у пациента, проверяемого на ВИЧ, с использованием надлежащей техники венопункции. Пробы хранили при температуре от 2°С до 8°С и использовали в течение 24 часов или замораживали при -20°С для использования в течение 2 недель.
Замороженные пробы оттаивали перед использованием.
Извлекали из упаковки в фольгу BИЧ плату тестирования, описанную в Примере 1, которая содержит смесь ВИЧ-1 и ВИЧ-2 антигенов на контрольном участке.
Около 5 мкл буфера пробы, содержащего 0.025% HEPES и 0.2% азида натрия, были нанесены на мембрану через центр окна платы тестирования.
Пипетку с пробой, которая содержат подлежащую проверке сыворотку или плазму, держали в вертикальном положении над испытательным окном плата тестирования и вводили 5 мкл пробы в мембрану в центре окна.
Четыре капли раствора буфера промывки (0.025% HEPES, 0.85% хлорида натрия, 0.1% ЭДТА, 1% маннитола, 0.1% казеина, 1% Triton X100, рН 7.2) вводили в буферную подушку. По истечении 3 минут, если реакция не завершена, добавляли еще одну каплю буфера в буферную подушку.
Результаты проверки считывали по истечении времени от 1 до 5 минут после введения первого буфера. Как это показано на фиг.5, положительный результат представляет собой две видимые линии, идущие через окно пробы: испытательную линию (140) и контрольную линию (150). Положительный результат получают, если видны обе линии, даже если одна из них темнее, чем другая. Отрицательным результатом является только контрольная линия, видимая через окно пробы, как это показано на фиг.6.
Пример 3 Испытательная плата на вирус гепатита С
Испытательная полоска для диагностики вируса гепатита С (HCV) была приготовлена аналогично описанному в Примере 1. Однако смесь антигена гепатита С, которая содержит сердечник (0.3 мг/мл), NS3 (0.4 мг/мл) и NS4 (0.1 мг/мл) была напылена в виде испытательной линии на мембране, чтобы получить испытательный участок, вместо ВИЧ антигена. Всего около 0.4 мкг смеси антигена гепатита С было нанесено в виде испытательной линии. IgG кролика, разбавленный до 1 мг/мл,
напыляли в качестве контрольной линии.
Пример 4 Проверка на вирус гепатита С
Извлекали из упаковки в фольгу HCV плату тестирования, описанную в Примере 3, которая содержит HCV антиген на испытательном участке.
Около 5 мкл буфера пробы, который содержит фосфатный буфер и 0.2% азида натрия, были нанесены на мембрану через центр окна платы тестирования.
Сыворотка или плазма были приготовлены из пробы цельной крови. Пипетку с пробой, которая содержит подлежащую проверке сыворотку или плазму, держали в вертикальном положении над испытательном окном плата тестирования и вводили 5 мкл пробы в мембрану в центре окна.
Четыре капли раствора буфера промывки (0.025% фосфата, 0.85% хлорида натрия, 0.1% ЭДТА, 1% маннитола, 0.1% казеина, 1% Triton X100, рН 7.2) вводили в буферную подушку. По истечении 3 минут, если реакция не завершена (не очищена), добавляли еще 2 капли буфера в буферную подушку.
Результаты проверки считывали по истечении времени от 1 до 5 минут после введения первого буфера.
Как это показано на фиг.5, положительный результат представляет собой две видимые линии, идущие через окно пробы: испытательную линию (140) и контрольную линию (150). Положительный результат получают, если видны обе линии, даже если одна из них темнее, чем другая. Отрицательным результатом является только контрольная линия, видимая через окно пробы, как это показано на фиг.6.
Пример 5 Тест на наличие беременности
Тесты на наличие беременности представляют собой быстрые визуальные тесты с растеканием капли жидкости в радиальном направлении. Построение испытательных полосок главным образом соответствует показанному на фиг.7.
Каждая испытательная полоска содержит пластиковую основу (6 см × 5 мм) с
клеем на обеих сторонах. Пластиковая основа имеет толщину ориентировочно от 2 до 20 мил.
Были образованы испытательная линия и контрольная линия на мембране из нитроцеллюлозы (Millipore HF09004) путем напыления при помощи насосной распределительной системы (Kinematic Automation). Испытательная линия представляет собой вертикальную линию антитела к человеческому хорионическому гонадотропину (hCG), преимущественно моноклонального антитела. Антитела к hCG широко известны и могут быть закуплены, например, на фирмах Research Diagnostics Inc. (RDI-CBL74; New Jersey, США) и Charles River Labs, или могут быть приготовлены с использованием стандартных процедур. Полное количество ориентировочно от 0.2 до 1 мкг антитела наносят на испытательный участок в виде вертикальной линии.
Контрольная линия содержит вертикальную линию протеина А. Полное количество протеина А, достаточное для создания визуального сигнала после связывания конъюгата, которое наносят на контрольную линию, обычно составляет около 0.25 мкг.
Для каждой испытательной полоски соответствующую нитроцеллюлозную мембрану разрезали на полоски размеров ориентировочно 2.5 см × 5 мм, которые прикрепляли к пластиковой основе.
Второе антитело к hCG связывали с коллоидным золотом, чтобы получить конъюгат для проведения испытания. Коллоидные конъюгаты антитела золото-hCG могут быть закуплены на фирме Research Diagnostics Inc. Альтернативно, конъюгаты hCG антитела могут быть приготовлены с использованием известных методик (см., например, патент США No. 6,485,982, который включен в данное описание в качестве ссылки). Конъюгат разводят в буфере конъюгата до концентрации около 3 OD/мл. Буфер конъюгата преимущественно содержит 0.25% HEPES, 0.85% хлорида натрия, 0.1% азида натрия, 0.1% ЭДТА, 0.1% казеина, 1% альбумина коровьей сыворотки, 1%
маннитола, 5% сахарозы и 0.1% Triton X100. Буфер регулировали до рН 7.2.
Конъюгат наносят на подушку конъюгата из стекловолокна (Millipore GFCP203000), которая была высушена и разрезана на куски 5 мм × 5 мм.
Буферная подушка из бумаги из стекловолокна Whatman GF/DVA (2 см × 5 мм) затем была прикреплена к высушенной подушке конъюгата каждой испытательной полоски.
Подушка абсорбента (2 см × 5 мм) изготовленная из бумаги S&S 900, была прикреплена к концу нитроцеллюлозной мембраны, ближайшему к контрольному участку, причем дополнительный кусок вплывающей бумаги (2.5 см × 5 мм; S&S 470) был прикреплен к подушке абсорбента. В свою очередь, впитывающая бумага находилась в контакте с таблеткой десиканта (Tri-Sorb, Sud-Cheinie), которая способна поглощать существенную порцию объема пробы и, таким образом, вытягивать пробу и аналит через испытательный участок.
Метиленовую синь, или другой индикатор, наносят на подушку абсорбента или на впитывающую бумагу, ниже по течению от испытательного участка. Движение этого индикатора объема свидетельствует в том, что достаточный объем пробы вступил в контакт с испытательным участком, что позволяет получить точные результаты испытания.
Испытательную полоску помещает в пластиковый корпус, чтобы получить плату тестирования. Пластиковый корпус имеет испытательное окно над испытательным участком и контрольные участком, обеспечивающее визуализацию результатов испытания. Корпус имеет также окно индикатора объема, через которое можно наблюдать движение индикатора объема.
В некоторых платах тестирования, чашку для пробы закрепляют над испытательным окном. Чашка для пробы имеет контейнер для пробы с выпускным
отверстием, позволяющим пробе втекать в область нанесения пробы испытательной мембраны через окно пробы. Чашка для пробы также имеет фильтр на выходе. После введения пробы в мембрану, чашку удаляют, так что результаты испытания могут быть видны.
В других платах тестирования используют фитиль, который выступает с одного конца или с одной стороны корпуса. Фитиль создает тракт, вдоль которого может протекать проба в область нанесения пробыли на испытательный участок.
Корпус имеет также механизм, который позволяет перемещать подушку конъюгата для создания флюидной связи с мембраной.
В некоторых платах тестирования, ампулу, содержащую буфер промывки, также размещают в корпусе, выше по течению от подушки конъюгата. В других платах тестирования, буфер вводят в буферную подушку через окно буфера.
Запуск механизма движения подушки конъюгата, чтобы создать контакт с испытательной мембраной, разрезает ампулу, что позволяет буферу втекать в подушку конъюгата. Преимущественно, около 5 капель буфера промывки контактируют с подушкой конъюгата. Запуск механизма движения также удаляет чашку для пробы или фитиль из корпуса.
Пластиковый корпус имеет метки для указания местоположения испытательной линии и контрольной линии в окне пробы.
Пример 6 Тест на наличие беременности с чашкой для пробы.
Быстрые визуальные тесты на наличие беременности с растеканием капли жидкости в радиальном направлении, проходимые с чашкой для пробы, проводят в соответствии с описанным в Примере 5.
Ориентировочно 500 мкл мочи пациентки вводят в чашку для пробы, которую прикрепляют к плате тестирования над окном пробы. Когда появляется синяя окраска в окне индикатора объема, механизм запускается, что создает флюидную связь подушки
конъюгата с мембраной. При этом разрезают ампулу, содержащую буфер, и начинают испытание. Чашку для пробы удаляют и визуальные результаты испытания наблюдают в окне пробы через 1-5 минут.
Как это показано на фиг.5, положительным результатом являются две видимые линии через окно пробы: испытательная линия 140 и контрольная линия 150. Результат считают положительным, если видны две линии, даже если одна из них темнее, чем другая. Отрицательным результатом являемся одна контрольная линия 150, которую видно через окно пробы, как это показано на фиг.6.
Пример 6 Тест на наличие беременности с фитилем
Быстрые визуальные тесты на наличие беременности с растеканием капли жидкости в радиальном направлении, проводимые с фитилем, проводят в соответствии с описанным в Примере 5.
Пациентка вводит конец фитиля в свою струю мочи. Синяя окраска, которая появляется в окне индикатора объема, свидетельствует о том, что достаточный объем пробы введен в контакт с испытательным участком.
Запуск механизма в корпусе производит введение подушки конъюгата во флюидную связь с мембраной. Разрезают ампулу, содержащую буфер, и начинают испытание при протекании буфера к подушке конъюгата. Фитиль удаляют и визуальные результаты испытания наблюдают в окне пробы через 1-5 минут.
Как это показано на фиг.5, положительным результатом являются две видимые линии через окно пробы: испытательная линия 140 и контрольная линия 150. Результат считают положительным, если видны две линии, даже если одна из них темнее, чем другая. Отрицательным результатом является одна контрольная линия 150, которую видно через окно пробы, как это показано на, фиг.6.
Несмотря на то, что были описаны некоторые предпочтительные варианты осуществления полезной модели, совершенно ясно, что специалистами в данной
области могут быть внесены изменения и дополнения, которые не выходят однако за рамки формулы полезной модели. Кроме того, многочисленные модификации могут быть проведены для того, чтобы адаптировать предложенные решения к специфической ситуации, не выходя за рамки объема полезной модели.