НОВЫЙ ЦИНКОВЫЙ КОМПЛЕКС, ЕГО ПОЛУЧЕНИЕ И ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ТЕРАПИИ ЗАБОЛЕВАНИЙ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ
NEW ZINC COMPLEX, ITS PREPARATION AND APPLICATION FOR THERAPY OF HUMAN AND ANIMAL DISEASES

Область техники
Данное изобретение относится к новому цинковому комплексу гамма-L-глутамилгистамина, восстанавливающему барьерные функции эпителиальной ткани и подавляющему аберрантную активность клеток иммунной системы. Настоящее изобретение также относится получению и применению указанного цинкового комплекса для терапии атопического дерматита и других заболеваний, ассоциированных с нарушением барьерных функций эпителиальной ткани и развитием аберрантного воспалительного ответа.
Уровень техники
Эпителиальный барьер играет важнейшую роль в организме человека и животных. Эпителиальный барьер предотвращает проникновение различных субстанций, аллергенов и бактерий во внутреннюю среду организма. Нарушение барьерных функций эпителиальной ткани вносит существенный вклад в патогенез целого ряда заболеваний, таких как: воспалительные заболевания полости рта (стоматит, гингивит, фарингит т.д.), заболевания желудочно-кишечного тракта (колиты, энтериты, кишечная аутоинтоксикация, синдром раздраженного кишечника, синдром нарушенного всасывания, рецидивирующая диарея и др.), аллергические заболевания (аллергический ринит, бронхиальная астма, атопический дерматит и др.) [Recent Pat Antiinfect Drug Discov. 2015; 10(2):84-97; Current Pediatrics. 2013; 12 (2): 12-19; Bulletin of Siberian Medicine. 2017; 16 (2) 32-46]. Учитывая ключевую роль барьерных функций эпителиальной ткани в развитии воспалительных и аллергических заболеваний, стратегия, направленная на восстановления барьерных функций эпителиальной ткани, является первой линией терапии многих патологических состояний человека. В частности, ведущее значение в терапии атопического дерматита занимает наружная терапия, целью которой является восстановление поврежденного эпителия, улучшение барьерных функций кожи, гидратация кожных покровов, а также профилактика и устранение вторичного инфицирования [Pediatrics. 2014 Dec;134(6):e1735-44].
Цинк является одним из ключевых микроэлементов, обеспечивающих сохранение барьерных функций кожи, а его противовоспалительные, антиоксидантные и антибактериальные свойства делают его одним из самых применяемых микроэлементов в дерматологии [FEMS Microbiol Lett. 2008 Feb; 279(1):71-76]. Цинк является неотъемлемым компонентом матриксных металлопротеиназ, контролирующих ремоделирование эпителия и играет ключевую роль в росте эпителиальных клеток, заживлении ран и сохранении барьерных функций кожи [Front Biosci (Landmark Ed). 2017 Mar 1; 22:1469-1492]. В недавних исследованиях было показано, что выраженность симптомов атопического дерматита отрицательно коррелирует с концентрацией цинка в эритроцитах пациентов [Postepy Dermatol Alergol. 2016 Oct; 33(5):349-352]. Более того, использование соединений цинка приводит к снижению выраженности симптоматики атопического дерматита в доклинических и клинических исследованиях [Biol Trace Elem Res. 2017 Sep;179(1):110-116; Clin Cosmet Investig Dermatol. 2013 May 6;6:115-21; Acta Derm Venereol. 2014 Sep;94(5):558-62]. В моделях атопического дерматита на животных было показано, что применение соединений цинка восстанавливает толщину эпителиальных тканей и снижает выраженность локального воспаления кожных покровов [Dermatol Ther. 2018 Jul 17:e12659].
S. Aureus
Необходимо отметить, что нарушение барьерных функций эпителиальной ткани во многих случаях ассоциировано с развитием аберрантного воспалительного ответа, который, в свою очередь, индуцирует дальнейшее разрушение клеток и деградацию барьерных функций эпителия. Так например, у пациентов с атопическим дерматитом нарушение барьерных функций кожи приводит к ее колонизации условно-патогенными бактериями, в том числе  [Br J Dermatol. 1998 Dec; 139 Suppl 53:13-6]. Бактериальное обсеменение кожи условно-патогенными микроорганизмами, приводит к развитию избыточной воспалительной реакции и аберрантного хемотаксиса клеток иммунной системы (преимущественно лимфоцитов, эозинофилов, дендритных и тучных клеток), продуцирующих провоспалительные цитокины. Провоспалительные цитокины и активные формы кислорода, секретируемые клетками иммунной системы, индуцируют дальнейшую деградацию барьерных функций кожи и образование самоподдерживающейся положительной обратной связи, обеспечивающей переход заболевания в хроническую фазу [J. Clin. Diagn. Res. 2013 Dec; 7(12):2683-2685]. Таким образом, подавление аберрантной активности клеток иммунной системы за счет ингибирования их хемотаксиса, может быть крайне востребовано для терапии атопического дерматита, а также других заболеваний человека и животных.
Хемокины семейства CCL (CCL2, CCL7, CCL8, CCL13), являются мощными факторами хемотаксиса моноцитов, макрофагов, эозинофилов, Т-лимфоцитов и дендритных клеток в организме млекопитающих [Biochem. J. 2012 Mar 1; 442(2):403-12; Postepy Dermatol. Alergol. 2014 May;31(2):84-91]. Члены семейства CCL (CCL2, CCL7, CCL8, CCL13), фракталкин, а также ряд других гормонов и секретируемых белков, содержат остаток пироглутаминовой кислоты (pE), роль которого заключается в защите от деградации аминопептидазами [Chem Immunol. 1999;72:42-56; Biochemistry. 1999 Oct 5;38(40):13013-25]. Пироглутаминирование N-концевого остатка катализируется ферментом глутаминилциклазой (QPCT или QC) [J Biol Chem. 2003 Dec 12;278(50):49773-9; J Mol Biol. 2008 Jun 20;379(5):966-80]. В ходе экспериментальных исследований было показано, что ингибирование глутаминилциклаз приводит к резкому снижению хемоаттракторной активности непироглутаминированных форм хемокинов CCL2, CCL7, CCL8 и CCL13 [Biochem. J. (2012) 442, 403-412) и фракталкина (Biosci Rep. 2017 Aug 23;37(4)]. Таким образом, пироглутаминирование хемокинов семейства CCL, является необходимым этапом CCL-опосредованного хемотаксиса клеток иммунной системы, а стратегия, направленная на ингибирование глутаминилциклазы, является возможной стратегией модулирования аберрантного воспалительного ответа и снижения активности клеток иммунной системы.
К настоящему времени в литературе не описаны цинковые комплексы ингибиторов глутаминилциклазы, а также их получение и терапевтическое применение. В то же время, известны ингибиторы глутаминилциклазы, включающие сульфолипиды [WO 2017/046256, опубл. 23.03.2017, HOCHSCHULE ANHALT, DE], производные флаваноидов [Bioorg Med Chem. 2016 May 15;24(10):2280-6], производные, пиридина [US 2015/0291632, опубл. 15.10.2015, Dow AgroSciences LLC, US] и некоторые малые молекулы, описанные в недавних работах [J. Med. Chem. 2017 Mar 23; 60(6):2573-2590; WO 2014/193974, US 2015/0291557]. Также ингибиторы глутаминилциклазы описаны в публикациях компании Probiodrug Aktiengesellschaft [J. Biol. Chem. 2003 Dec 12;278(50):49773-9]. В данной работе описаны ингибиторы глутаминилциклазы на основе производных имидазола. Однако в работах компании Probiodrug Aktiengesellschaft не описаны цинковые комплексы ингибиторов глутаминилциклазы, а в структурах соединений, опубликованных компанией Probiodrug Aktiengesellschaft, имидазол содержит алифатический заместитель по одному из атомов азота. Введение алифатического заместителя снижает метаболическую стабильность соединений. Кроме того, введение алифатического заместителя увеличивает гидрофобность соединений и повышает системную биодоступность соединений, что по-видимому, излишне для терапии атопического дерматита и других заболеваний, ассоциированных с нарушением барьерных функций эпителиальной ткани.
На сегодняшний день не известно ни одного лекарственного средства на основе цинкового комплекса ингибитора глутаминилциклазы, который бы применяли в терапии атопического дерматита или других заболеваний, связанных с нарушением барьерных функций эпителиальной ткани и/или аберрантной активностью клеток иммунной системы, поэтому сохраняется потребность в создании и внедрении в терапервтическое применение новых эффективных лекарственных средств на основе цинковых комплексов ингибиторов глутаминилциклазы.
Задачей настоящего изобретения является разработка нового эффективного химического соединения, обладающего эффективностью в восстановлении барьерных функций эпителиальной ткани и ингибировании фермента глутаминилциклазы в терапии атопического дерматита или других заболеваний связанных с нарушением барьерных функций эпителия и аберрантной активностью клеток иммунной системы.
Сущность изобретения
Задачей настоящего изобретения является разработка нового лекарственного средства, эффективного для лечения заболеваний, связанных с нарушением барьерных функций эпителиальной ткани и аберрантной активностью клеток иммунной системы, в особенности атопического дерматита, а также прочих заболеваний.
Техническим результатом данного изобретения является предоставление нового химического соединения, эффективного для лечения атопического дерматита, а также других заболеваний, связанных с нарушением барьерных функций эпителиальной ткани и/или аберрантной активностью клеток иммунной системы.
Указанный технический результат достигается путем предоставления соединения цинкового комплекса гамма-L-глутамилгистамина (соотношение металл:лиганд=1:1).
Основываясь на проведенных исследованиях, которые подробно описаны в настоящем описании, Заявитель предполагает, что структуру полученного комплекса можно описать следующей структурной формулой:
Указанный цинковый комплекс (Соединение 1) или его гидрат, сольват, или фармацевтически приемлемая соль, является эффективным для лечения атопического дерматита, а так же других заболеваний, связанных с нарушением барьерных функций эпителиальной ткани и аберрантной активностью клеток иммунной системы.
Еще одним техническим результатом настоящего изобретения является применения полученного цинкового комплекса гамма-L-глутамилгистамина (Соединения 1) или его гидрата/сольвата для получения фармацевтической композиции для предупреждения и/или лечения атопического дерматита, а так же других заболеваний, связанных с нарушением барьерных функций эпителиальной ткани и аберрантной активностью клеток иммунной системы
Еще одним техническим результатом настоящего изобретения является применение нового цинкового комплекса гамма-L-глутамилгистамина или его гидрата, сольвата, или фармацевтичесски приемлемой соли для получения фармацевтической композиции для предупреждения и/или лечения расстройства, связанного с аберрантной активностью клеток иммунной системы, в частности с аберрантным хемотаксисом клеток иммунной системы.
Кроме того, изобретение предусматривает фармацевтические композиции для предупреждения и/или лечения атопического дерматита, а так же других заболеваний связанных с нарушением барьерных функций эпителиальной ткани и аберрантной активностью клеток иммунной системы и характеризующиеся тем, что они содержит эффективное количество соединения по изобретению и, по меньшей мере, одно фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество. В некоторых вариантах воплощениях изобретения вспомогательное вещество представляет собой фармацевтически приемлемый носитель и/или эксципиент.
Изобретение также включает способ предупреждения и/или лечения атопического дерматита, а так же других расстройств связанных с нарушением барьерных функций эпителиальной ткани и аберрантной активностью клеток иммунной системы в организме, включающий введение в указанный организм фармацевтической композиции по изобретению. В частных случаях воплощения изобретения организм представляет собой человека или животного.
Цинковые комплексы гамма-L-глутамилгистамина не описаны в уровне техники, однако известен псевдопептид гамма-L-глутамилгистамина, который был впервые выделен в следовых количествах из нервных тканей крысы и моллюска [J. Neurochem. -1976. -vol. 27. -pp. 1461-1463; J. Neurochemistry. -1977. -vol. 29. -pp. 633-638.]. Получениесамого гамма-L-глутамилгистамина описано в патенте на изобретение RU2141968, опубл. 27.11.1999. Использование крема на основе гамма-L-глутамилгистамина описано в патенте на изобретение RU 2233152, опубл. 27.07.2004.
Краткое описание фигур
Фиг. 1.
ИК-спектр образца псевдопептида гамма-L-глутамилгистамина (лиганда)
Фиг. 2.
ИК-спектр образца продукта, полученного в результате смешивания раствора хлорида цинка и гамма-L-глутамилгистамина по примеру 1.
Фиг. 3.
ИК-спектробразца цинкового комплекса гамма-L-глутамилгистамина по примеру 2.
Фиг. 4.
Спектр ядерного магнитного резонанса 1H образца цинкового комплекса гамма-L-глутамилгистамина по примеру 2
Фиг. 5.
Соединение 1
Фармакологическое действие крема, содержащего  (0.01%) на поражение кожи в модели атопического дерматита у мышей по данным гистологического анализа.
Фиг. 6.
Гистологические срезы кожи пораженного уха мышей в модели атопического дерматита.
Подробное раскрытие изобретения
Как указано выше,цинковый комплекс гамма-L-глутамилгистамина не был ранее описан в литературе, однако известен псевдопептид гамма-L-глутамилгистамин, который был впервые выделен в следовых количествах из нервных тканей крысы и моллюска [J. Neurochem. -1976. -vol. 27. -pp. 1461-1463; J. Neurochemistry. -1977. -vol. 29. -pp. 633-638]. Получение гамма-L-глутамилгистамина также описано в патенте за изобретение RU 2141968. В указанных работах описан гамма-L-глутамилгистамин, которые представляет собой псевдопептид, обладающий антиоксидантным, антирадикальным, липидрегулирующим, гипогликемическим, антиастматическим, противовирусным, антибактериальным, противоопухолевым, противовоспалительным, антиметастатическим, адаптогенным действием, а также способностью модулировать метаболизм арахидоновой кислоты, предупреждать проявления сахарного диабета, ожирения, ишемической болезни, стрессовых состояний, гепатита, цирроза, токсических поражений печени, алкоголизма, радиационных поражений, геронтологических изменений.
В то же время в указанных работах не приведены какие-либо данные о цинковых комплексах гамма-L-глутамилгистамина, методах их получения и исследования их биологической активности. При этом, необходимо отметить, что цинковый комплекс гамма-L-глутамилгистамина не может быть получен путем простого смешения солей цинка и гамма-L-глутамилгистамина, поскольку в данных условиях образуется смесь солей цинка и свободного гамма-L-глутамилгистамина.
Заявитель в ходе создания настоящего изобретения разработал способ получения устойчивого цинкового комплекса гамма-L-глутамилгистамина с соотношением металл/лиганд 1/1, или его гидрата, сольвата или фармацевтически приемлемой соли (cоединения 1).
В предпочтительном варианте способ получения цинкового комплекса гамма-L-глутамилгистамина включает перемешивание смеси ацетата цинка и гамма-L-глутамилгистамина в растворителе, в частности, в метаноле, выделение осадка продукта и сушку полученного продукта, который представляет собой цинковый комплекс гамма-L-глутамилгистамина с соотношением металл/лиганд 1/1.При этом перемешивание смеси осуществляют при температура от 15 до 40 градусов Цельсия.
Соединения 1
Соединение 1
оединения I
Соединение 1
В ходе исследований специфической фармакологической активности полученного заявителем цинкового комплекса гамма-L-глутамилгистамина () в модели атопического дерматита было показано, что обладает существенно большей терапевтической активностью, в сравнении со свободным лигандом гамма-L-глутамилгистамином. Нанесение на кожу с (крем 0,01 мас.%) снижало до уровня интактных животных приток клеток воспаления (моноцитов, дендритных клеток, эозинофилов и нейтрофилов) в эпидермис и дерму кожи, а также другие микроскопические проявления атопического дерматита. Таким образом, показано, что  влияет на хемотаксис клеток иммунной системы. Снижение притока клеток иммунной системы может применяться в терапии целого ряда заболеваний связанных с аберрантной активностью клеток иммунной системы.
Исследования Заявителя показали, что наблюдаемый терапевтический эффект Соединения 1 связан со способностью данного соединения ингибировать активность глутаминилциклазы.
Соединение 1
Таким образом, (цинковый комплекс гамма-L-глутамилгистамина с соотношением металл/лиганд 1/1) является новым химическим соединением, применимым для терапии атопического дерматита и других заболеваний, обусловленных нарушением барьерных функций эпителиальной ткани и аберрантной активностью клеток иммунной системы.
Термины и определения
«Соединение I»
Терминотносится к цинковому комплексу гамма-L-глутамилгистамина в соотношении метал:лиганд 1:1.
В частности, данный комплекс представлен структурной формулой:
С
Термин «», когда он используется со ссылкой на температуру, означает стоградусную шкалу или температурную шкалу Цельсия.
IC
50
Термин «» означает концентрацию тестируемого соединения, при которой достигается полумаксимальное ингибирование фермента.
«сольват»
«гидрат»
Термин  используется для описания молекулярного комплекса, содержащего соединение по изобретению и одну или более молекул фармацевтически приемлемого растворителя, например этанола. Термин  используется, когда указанным растворителем является вода.
«аберрантная активность»
Термин  клеток иммунной системы в настоящем документе означает активность, существенно отличающуюся от базового уровня активности клеток иммунной системы в организме при отсутствии патологии. Аберрантная активность может быть вызвана избыточным притоком клеток иммунной системы к органу или ткани, нарушением процессов, приводящих к активации клеток иммунной системы, дерегулированием процессов связанных с гибелью клеток иммунной системы, а также другими факторами.
«вспомогательное вещество»
Термин  означает любое фармацевтически приемлемое вещество неорганического или органического происхождения, входящее в состав лекарственного препарата или используемое в процессе производства, изготовления лекарственного препарата для придания ему необходимых физико-химических свойств.
глутаминилциклаза
Термин «» означает фермент аминоацилтрансферазу, участвующую в преобразовании N-концевой глутамина в пироглутамин в различных пептидных субстратах. Образование N-концевого пироглутамата защищает биологически активные пептиды, гормоны и хемокины (например, тиреотропин-высвобождающий гормон, β-хемокиновый лиганд-2) от деградации экзопептидазами и в некоторых случаях может увеличивать аффинность лигандов к их рецепторам.
хемотаксис
Термин «» означает направленное движение клеток в ответ на химический раздражитель. В основе хемотаксиса лежит способность клетки отвечать на градиент концентрации хемотаксического медиатора. Хемотаксис является тем процессом, благодаря которому клетки иммунной системы покидают сосудистое русло и мигрируют в поврежденную ткань. Ведущую роль в хемотаксисе играют хемотаксические вещества (хемоатрактанты). Одним из наиболее мощных хемоатрактантов для моноцитов и макрофагов является хемокин CCL2.
лечение
терапия
Термины «», «» охватывают лечение патологических состояний у млекопитающих, предпочтительно у человека, и включают: а) снижение, б) блокирование (приостановку) течения заболевания, в) облегчение тяжести заболевания, т.е. индукцию регрессии заболевания, г) реверсирование заболевания или состояния, к которому данный термин применяется, или одного или более симптомов данного заболевания или состояния.
профилактика
предотвращение
Термин «», «» охватывает устранение факторов риска, а также профилактическое лечение субклинических стадий заболевания у млекопитающих, предпочтительно у человека, направленное на уменьшение вероятности возникновения клинических стадий заболевания. Пациенты для профилактической терапии отбираются на основе факторов, которые, на основании известных данных, влекут увеличение риска возникновения клинических стадий заболевания по сравнению с общим населением. К профилактической терапии относится а) первичная профилактика и б) вторичная профилактика. Первичная профилактика определяется как профилактическое лечение у пациентов, клиническая стадия заболевания у которых еще не наступила. Вторичная профилактика - это предотвращение повторного наступления того же или близкого клинического состояния заболевания.
Соединение I,
являющееся предметом данного изобретения, перспективно для лечения заболеваний, связанных с нарушением барьерных функций эпителиальной ткани и аберрантной активностью клеток иммунной системы, в особенности заболеваний, связанных с аберрантным хемотаксисом клеток иммунной системы, предпочтительно терапии атопического дерматита. В некоторых частных вариантах соединения по изобретению могут быть использованы для лечения других заболеваний, обусловленных нарушением барьерных функций эпителиальной ткани и аберрантной активностью клеток иммунной системы.
Способ терапевтического применения соединений
Предмет данного изобретения также включает введение субъекту, нуждающемуся в соответствующем лечении, терапевтически эффективного количества соединения по изобретению. Под терапевтически эффективным количеством подразумевается такое количество соединения, вводимого или доставляемого пациенту, при котором у пациента с наибольшей вероятностью проявится желаемая реакция на лечение (профилактику). Точное требуемое количество может меняться от субъекта к субъекту в зависимости от возраста, массы тела и общего состояния пациента, тяжести заболевания, методики введения препарата, комбинированного лечения с другими препаратами и т.п.
Соединение по изобретению или фармацевтическая композиция, содержащая соединение, может быть введено в организм пациента в любом количестве и любым путем введения (предпочтителен топический путь введения), эффективным для лечения или профилактики заболевания.
После смешения лекарственного препарата с конкретным подходящим фармацевтически допустимым носителем в желаемой дозировке, композиции, составляющие суть изобретения, могут быть введены в организм человека или других животных местно и т.п.
Введение может осуществляться как разово, так и несколько раз в день, неделю (или любой другой временной интервал), или время от времени. Кроме того, соединение может вводиться в организм пациента ежедневно в течение определенного периода дней (например, 2-10 дней), а затем следует период без приема вещества (например, 1-30 дней).
В том случае, когда соединение по изобретению используется как часть режима комбинированной терапии, дозу каждого из компонентов комбинированной терапии вводят в течение требуемого периода лечения. Активные ангредиенты, составляющие комбинированную терапию, могут вводиться в организм пациента как единовременно, в виде дозировки, содержащей все компоненты, так и в виде индивидуальных дозировок компонентов.
Фармацевтические композиции
Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, которые содержат соединение по изобретению (или пролекарственную форму или другое фармацевтически приемлемое производное) и один или несколько фармацевтически приемлемых носителей, адъювантов, растворителей и/или наполнителей, таких, которые могут быть введены в организм пациента совместно с соединением, составляющем суть данного изобретения, и которые не влияют на фармакологическую активность этого соединения, и являются нетоксичными при введении в дозах, достаточных для доставки терапевтического количества соединения.
В качестве фармацевтически приемлемых солей соединения по настоящему изобретению могут быть использованы аддитивные соли органических кислот (например, формиат, ацетат, малеат, тартрат, метансульфонат, бензолсульфонат, толуолсульфонат и др.), аддитивные соли неорганических кислот (например, гидрохлорид, гидробромид, сульфат, фосфат и др.), соли с аминокислотами (например, соль аспарагиновой кислоты, соль глутаминовой кислоты и т.д.), предпочтительно, хлоргидраты и ацетаты.
Фармацевтические композиции, заявляемые в данном изобретении, содержат соединение данного изобретения совместно с фармацевтически приемлемыми носителями, которые могут включать в себя любые растворители, разбавители, дисперсии или суспензии, поверхностно-активные вещества, изотонические агенты, загустители и эмульгаторы, консерванты, вяжущие вещества, скользящие материалы и т.д., подходящие для конкретной формы дозирования. Материалы, которые могут служить фармацевтически приемлемыми носителями, включают, но не ограничиваются, моно- и олигосахаридами, а также их производными; желатин; тальк; эксципиенты, такие как какао-масло и воск для суппозиториев; масла, такие как арахисовое, хлопковое, сафроловое, кунжутное, оливковое, кукурузное и соевое масло; гликоли, такие как пропиленгликоль; сложные эфиры, такие как этилолеат и этиллаурат; агар; буферные вещества, такие как гидроксид магния и гидроксид алюминия; альгиновая кислота; апирогенная вода; изотонический раствор, раствор Рингера; этиловый спирт и фосфатные буферные растворы. Также в составе композиции могут быть другие нетоксичные совместимые скользящие вещества, такие как лаурилсульфат натрия и стеарат магния, а также красители, пленкообразователи, подсластители, вкусовые добавки и ароматизаторы, консерванты и антиоксиданты.
Предметом данного изобретения являются также лекарственные формы - класс фармацевтических композиций, состав которых оптимизирован для определенного пути введения в организм в терапевтически эффективной дозе, например, для введения в организм местно.
Лекарственные формы данного изобретения могут содержать составы, полученные методами использования липосом, методами микрокапсулирования, методами приготовления наноформ препарата, или другими методами, известными в фармацевтике.
Для обеспечения топического введения используются мази, крема и суспензии, которые содержат фармакологически совместимые агенты, например пропиленгликоль или бутиленгликоль.
Примеры фармацевтических композиций
Вещество, описанные в данном изобретении, может быть использовано для профилактики и/или лечения болезней человека, или животных в виде следующих составов:
Мазь мл
Активный ингредиент 40 мг
Этанол 300 мкл
Вода 300 мкл
1-додецилазациклогептанон 50 мкл
Пропиленгликоль до 1 мл
Крем I мас.%
Активный ингредиент 0,005-0,5
Масляный компонент 10,0-15,0
Стеарин косметический 2,0-3,0
Эмульгатор 1,0-3,0
Эмульсионный воск 1,0-3,0
Триэтаноламин 0,1-0,6
Витамин А 0,003-0,05
Глицерин дистиллированный 2,0-3,0
Антиоксидант 0,05-0,075
Консервант 0,15-0,25
Масло чайного дерева 0,3-0,5
Вода очищенная питьевая до 100%
Крем II мас.%
Активный ингредиент 0,01
Масло растительное 15,0
Стеарин косметический 0,75
Эмульгатор ПГ-3 2,25
Эмульсионный воск 2,25
Триэтаноламин 0,1
Витамин А 0,028
Сорбитол 2,0-3,0
Витамин Е 1,5
Мономульс 90-018 0,75
Нипазол 0,2
Нипагин 0,3
Масло чайного дерева 0,3-0,5
Вода очищенная питьевая до 100%
Крем III мас.%
Активный ингредиент 0,1
Масло растительное 15,0
Стеарин косметический 0,75
Эмульгатор ПГ-3 2,25
Эмульсионный воск 2,25
Триэтаноламин 0,1
Витамин А 0,028
Сорбитол 2,0-3,0
Витамин Е 1,5
Мономульс 90-018 0,75
Нипазол 0,2
Нипагин 0,3
Масло чайного дерева 0,3-0,5
Вода очищенная питьевая до 100%
Крем IV мас.%
Активный ингредиент 0,3
Масло растительное 15,0
Стеарин косметический 0,75
Эмульгатор ПГ-3 2,25
Эмульсионный воск 2,25
Триэтаноламин 0,1
Витамин А 0,028
Сорбитол 2,0-3,0
Витамин Е 1,5
Мономульс 90-018 0,75
Нипазол 0,2
Нипагин 0,3
Масло чайного дерева 0,3-0,5
Вода очищенная питьевая до 100%
В случае использования крема, предпочтительным масляным компонентом является масло растительное, минеральное или их смесь. Растительным маслом может быть оливковое, подсолнечное масло или их смесь. Минеральным маслом может быть вазелиновое масло. В качестве эмульгатора могут использоваться полиэфиры ненасыщенных жирных кислот с глицерином (эмульгатор ПГ-3). Витамин А может присутствовать в виде ретинола пальмитата. Предпочтительным антиоксидантом является токоферола ацетат, а консервантом - по меньшей мере один низший алкиловый эфир параоксибензойной кислоты, например метиловый или пропиловый эфиры.
Данные составы могут быть приготовлены в соответствии со стандартными фармацевтическими методиками.
Применение Соединения I в комбинированной терапии
Соединение I
Несмотря на то, что поданному изобретению может вводиться в качестве индивидуального активного ингредиента, его также можно использовать в сочетании с одним или несколькими другими агентами, в частности, другой агент может представлять собой антибиотик, НПВС (нестероидное противовоспалительное средство) или другое противовоспалительное средство, глюкокортикостероид, ингибитор кальциневрина, антигистаминный препарат, мембраностабилизирующий препарат, иммуннотропное средство и т.д. При совместном приеме терапевтические агенты могут представлять собой разные лекарственные формы, которые вводятся одновременно или последовательно в разное время, либо терапевтические агенты могут быть объединены в одну лекарственную форму.
Фраза «комбинированная терапия» в отношении соединения данного изобретения в сочетании с другими фармацевтическими агентами, означает одновременный или последовательный прием всех агентов, который так или иначе обеспечит благоприятное воздействие сочетания лекарств. Совместное введение подразумевает, в частности, совместную доставку, например, в одной мазе, креме, таблетке, капсуле, инъекции или в другой форме, имеющий фиксированное соотношение активных веществ, также как и одновременную доставку в нескольких, отдельных лекарственных формах для каждого соединения соответственно.
Таким образом, введение соединения по данномуизобретению может быть осуществлено в сочетании с дополнительными методами лечения, известными специалистам в области профилактики и лечения соответствующих заболеваний, включающими применение антибактериальных, цитостатических и цитотоксических препаратов, препаратов для подавления симптомов или побочных эффектов одного из лекарственных средств.
Соединение I
Если лекарственная форма представляет собой дозированную форму, такая комбинация использует соединение данного изобретения в приемлемом дозовом диапазоне. поданному изобретению также может быть введено в организм пациента последовательно с другими агентами, в том случае, когда комбинация этих препаратов невозможна. Изобретение не ограничено последовательностью введения; соединение данного изобретения может быть введено в организм пациента совместно, до или после введения другого препарата.
Примеры
Пример 1 (не по изобретению). смешивание хлорида цинка с гамма-L-глутамилгистамином
Данный пример доказывает, что цинковый комплекс гамма-L-глутамилгистамина не может быть получен путем простого смешения солей цинка и гамма-L-глутамилгистамина поскольку в данных условиях образуется смесь солей цинка и свободного гамма-L-глутамилгистамина. Так например при смешении водного раствора хлорида цинка с гамма-L-глутамилгистамином в соотношении 1:2 и высаживанием образовавшегося продукта добавлением водного аммиака (до слабощелочной реакции среды) приводит к образованию белого кристаллического вещества. Данные элементного анализа (см. Таблицу 1), хоть и близки к расчетным значениям для комплексного соединения, однако не могут рассматриваться в качестве свидетельства образования комплексов. Заниженное содержание углерода и азота в образцах свидетельствует о вероятном образовании гидроксида цинка, который частично теряет воду в процессе проведения анализа, что и приводит к заниженным значениям прочих элементов. Повторный элементный анализ комплексов после дополнительной промывки холодной водой приводит к еще большему завышению количества водорода в образцах.
Таблица 1 - Данные элементного анализа образца выделенного из реакции хлорида цинка с гамма-L-глутамилгистамином
C
H
N
Найдено (до обработки водой)
40.12
5.81
18.61
Найдено (после обработки водой)
39.62
5.99
18.03
Вычислено
44.17
5.56
20.60
Далее, согласно данным ИК-спектроскопии, ИК-спектры исходного гамма-L-глутамилгистамина и продукта смешивания совпадают (см. Фиг. 1 и 2). Отсутствие сдвигов и совпадение относительной интенсивности полос поглощения С=О, -ОН и -NH групп свидетельствует о том, что при смешивании хлорида цинка и гамма-L-глутамилгистамина был выделен исходный гамма-L-глутамилгистамин, а цинк выделяется в форме неорганического соединения.
Пример 2. Получение цинкового комплекса по изобретению
Заявителем в ходе дальнейших исследований была разработана методика получения цинкового комплекса гамма-L-глутамилгистамина, включающая использование водного ацетата цинка.
3
2
2
2,20 г (0,01 моль) Zn(CHCOO)*2HO растворяют в 20 мл метанола и приливают по каплям, при интенсивном перемешивании к раствору 2,40 г (0,01 моль) гамма-L-глутамилгистамина и 1,08 г (0,02 моль) свежеприготовленного метилата натрия в 50 мл метанола при комнатной температуре. После того, как приблизительно половина объема раствора ацетата цинка добавлена, наблюдают образование белого осадка. После прибавления всего раствора ацетата цинка перемешивание продолжают около 4 часов, продукт отфильтровывают, промывают водой (4×10 мл) и сушат в вакууме при 65°С до постоянной массы. Выход 2.67 г (88%).
По данным элементного анализа, выполненным для двух синтезированных образцов, полученных в результате двух независимых экспериментов осуществления реакции ацетата цинка с гамма-L-глутамилгистамином с мольным соотношением гамма-L-глутамилгистамин/цинк - 1/1 (см. Таблицу 2)
Таблица 2 - Данные элементного анализа образца, выделенного из реакционной смеси ацетата цинка с гамма-L-глутамилгистамином
C
H
N
Найдено1
39.17
4.73
18.02
Найдено2
37.26
4.80
18.110
Вычислено
39.56
4.65
18.45
полученном продукте
Для подтверждения состава комплекса и полученного соотношения металл/лиганд было проведено комплексонометрическое титрование цинка. Для определения содержания цинка была проведена минерализация продукта: навеску продукта массой ~70мг нагревали с пятикратным количеством концентрированной серной кислоты до полного обугливания образца. Затем к остатку добавляли ~1,5 мл 30 об.% перекиси водорода и кипятили в течение ~10 минут. Остаток перенесли в коническую колбу объемом 25 мл добавили ~10 мл аммиачной буферной смеси (рН=10) и небольшое количество сухого индикатора эриохрома черного Т. Содержимое колбы тщательно перемешивали до полного растворения индикатора и образования раствора малинового цвета. Пробу титровали 0,02 М раствором ЭДТА до перехода малиновой окраски через фиолетовую в ярко-синюю. В результате было показано, что содержание цинка в  составляет 21,5%, что согласуется с теоретически рассчитанным значением (21,1%) советующем цинковому комплексу, имеющему соотношение металл:лиганд 1:1.
-1
-1
-1
В ИК-спектре продукта (см. Фиг. 3) наблюдается две сильных полосы карбонильной группы: 1616 см и 1646 см. При этом, структура и частоты поглощения существенно отличаются от таковых в спектре свободного гамма-L-глутамилгистамина (см. фиг. 1) При этом за счет координации с цинком полоса карбоксильной группы смещается в сторону более высоких частот. Так же, в ИК-спектре продукта возникает интенсивная полоса поглощения при 3276 см, отсутствующая в спектре гамма-L-глутамилгистамина. Ее можно отнести к колебаниям N-H связи в амидном фрагменте, либо N-H связи системы имидазола. Кроме того, в ИК-спектрах продукта, по сравнению со спектром гамма-L-глутамилгистамина, имеются множественные изменения в областях «отпечатков пальцев» и колебаний С-Н связей, указывающие на отсутствие свободного гамма-L-глутамилгистамина в образце.
Полученный продукт нерастворим в растворителях, используемых для регистрации спектров ЯМР.
2
В качестве примера, на фиг.4 приведен ЯМР-спектр в DO, зарегистрированный на приборе Bruker DRX500,13400, с рабочей частотой 500,13 МГц, в растворителе ДМСО-d6.
Он в основном, содержит остаточный сигнал недейтерированного растворителя, и малоинтенсивные сигналы, соответствующие исходному гамма-L-глутамилгистамину.
Это свидетельствует не только об отсутствии примесей, но и о незначительной диссоциации полученного продукта в водных суспензиях.
Характеристика биологической активности комплекса соединения 1 по изобретению
Соединения 1
Соединения 1
Соединения 1
Соединения 1
Соединение 1
Соединения 1
in vitro
in vivo
in vivo
in vitro
Биологическая активность , являющегося предметом настоящего изобретения, была изучена в различных  и  экспериментах. В частности, при изучении активности  в  модели атопического дерматита было показано ингибирующее действие  на хемотаксис клеток иммунной системы. Исследования биологической активности , позволили установить, что является ингибитором фермента глутаминилциклазы и, таким образом, действие  на хемотаксис клеток иммунной системы может быть опосредованно ингибированием активности глутаминилциклазы.
Пример 3. Исследование влияния Соединения 1 на ферментативную активность глутаминилциклазы человека
in vitro
.
Соединения 1
Соединения 1
В ходе исследований влияния , являющегося предметом настоящего изобретения, на ферментативную активность глутаминилциклазы in vitro впервые было обнаружено прямое ингибирующее действие  на рекомбинантную внутриклеточную глутаминилциклазу человека.
Соединения 1
Соединением 1
Активность глутаминилциклазы при различных концентрациях изучалась при 25°C с использованием флуоресцентного субстрата L-глутаминил 2-нафтиламида (Gln-bNA) [Anal Biochem. 2002 Apr 1;303(1):49-56]. Реакционная смесь объемом 100 мкл содержала 50 мкМоль флуорогенного субстрата; ~0,2 единицы пироглутаминил аминопептидазы человека (1 единица определяется как количество, гидролизующее 1 микромоль pGlu-bNA в минуту), и аликвоту рекомбинантной внутриклеточной глутаминилциклазы человека (gQC) в 50 микромоль трисаминометан-HCl и 5% глицерине, pH 8,0. Реакцию инициировали добавлением к реакционной смеси аликвоты глутаминилциклазы, инкубированной с в течение 5 минут.
50
Дальнейшее протекание реакции отслеживали спектрофотометрически (длина волны возбуждения и эмиссии составляли 320 и 410 нм). Ферментативную активность определяли по количеству выделившегося 2-нафтиламида (bNA), рассчитанному по калибровочной кривой. Значения IC рассчитывали с помощью нелинейной регрессии кривой ʺконцентрация ингибитораʺ-ʺферментативная активностьʺ. В качестве вещества сравнения использовали известный ингибитор глутаминилциклаз -- соединение PBD150 [J Med Chem. 2006 Jan 26;49(2):664-77].
Соединение 1
В результате эксперимента было установлено, что  ингибирует активность глутаминилциклазы с IC50=26 мкМ.
Пример 4. Исследование активности Соединения 1 на модели атопического дерматита у мышей
Методика эксперимента
Соединения 1
. Исследование активности  на модели атопического дерматита было проведено с помощью стандартной методики [Evidence-based Complementary and Alternative Medicine. 2012. Article ID 545497, 9 pages]. В экспериментальную группу были отобраны животные без признаков отклонений внешнего вида, таким образом, чтобы индивидуальное значение массы отклонялось от среднего значения в пределах пола не более чем на ±20%.
Соединения 1
На 0 и 12 сутки эксперимента мышам-самцам линии balb/c на предварительно выбритые участки спины наносили 100 мкл 2% раствора 1-хлор-2,4-динитробензола (ДНХБ) в этаноле с целью сенсибилизации организма. На 17 сутки на правое «опытное» ухо животным наносили 20 мкл 2% спиртового раствора ДНХБ дважды с интервалом 1 час. Крем с содержанием действующего вещества 0,01 мас.% наносили накожно, на правое "опытное" ухо, дважды: через 1 и через 13 ч после последнего нанесения ДНХБ на ухо. В качестве препаратов сравнения использовали метилпреднизолона ацепонат (0,1% мазь для наружного применения), пиритион цинка (0,2% крем для наружного применения), пимекролимус (1% крем для наружного применения) и крем для наружного применения с содержанием гамма-L-глутамилгистамина 0,01%. На 18 сутки проводили эвтаназию животных и гистологический анализ пораженного уха. Гистологические срезы толщиной 5 мкм окрашивали гематоксилин-эозином. Оценку микроскопических изменений проявлений дерматита проводили по следующей шкале:
1) Акантоз - утолщение эпидермиса и эпителия с удлинением межсосочковых отростков:
0 баллов - отсутствие патологии;
0,5 баллов - патология есть, но очень слабо выражена;
1 балл - умеренно выраженная патология;
2 балла - выраженная патология.
2) Гиперкератоз - это патологическое состояние кожи невоспалительного характера, характеризующееся значительным утолщением рогового слоя или задержкой его нормального отторжения:
0 баллов - отсутствие патологии;
0,5 баллов - патология есть, но очень слабо выражена;
1 балл - наличие указанной патологии.
3) Пустулы (гнойнички) - полостные островоспалительные элементы с гнойным содержимым:
0,5 балла - единичные проявления патологии;
1 балл - слабо выраженная патология;
2 балла - умеренно выраженная патология;
3 балла - сильно выраженная патология;
4 балла - тотальная патология.
4) Киста - структура округлой или овальной формы, выстланных изнутри ороговевающим плоским эпителием и заполненных слоистыми роговыми массами. возникают при гиперплазии эпителия (акантоза):
0 баллов - отсутствие патологии;
0,5 баллов - патология есть, но очень слабо выражена;
1 балл - наличие указанной патологии.
5) Воспаление:
0 баллов - отсутствие патологии;
0,5 балла - единичные проявления патологии;
1 балл - слабо выраженная патологии;
2 балла - умеренно выраженная патология;
3 балла - сильно выраженная патология;
4 балла - тотальная патология.
6) Отек:
0 баллов - отсутствие патологии;
0,5 балла - единичные проявления патологии;
1 балл - слабо выраженная патологии;
2 балла - умеренно выраженная патология;
3 балла - сильно выраженная патология;
4 балла - тотальная патология.
Полученные данные были проверены с использованием теста Граббса на наличие в выборке наибольшего или наименьшего аномального наблюдения (выброса). Значения, определенные как «вылетающие» в данном тесте, не использовались для дальнейшего анализа. Для всех данных применялась описательная статистика: подсчитаны среднее значение (М) и стандартная ошибка среднего (m). С помощью критерия Колмогорова-Смирнова была проверена нормальность распределения полученных в ходе эксперимента значений. В случае нормального распределения для оценки межгрупповых различий использовался критерий Стьюдента (t-тест). В случае отличного от нормального распределения для сравнения нескольких групп использовался критерий Краскела-Уоллиса (с постанализом Данна). Статистический анализ проводился с использованием программы GraphPad Prism. 5.0. Различия определялись при 5% уровне достоверности.
Соединение 1
Результаты проведенных экспериментов приведены на Фигурах 5 и 6. Как видно из приведенных на фиг.5 данных, исследовано фармакологическое действие крема, содержащего (0,01 мас.%) на поражение кожи в модели атопического дерматита у мышей по данным гистологического анализа: а) акантоз (баллы), б) гиперкератоз (баллы), в) пустулы (баллы), г) кисты (баллы), д) воспаление (баллы), е) отек (баллы). Эксперименты проведены в соответствии с: Evidence-based Complementary and Alternative Medicine. 2012. Article ID 545497, 9 pages. Примечание: *- достоверность различия (P < 0,05) с интактной группой, & -достоверность различия (P < 0,05) с контролем.
На фиг.6 изображены гистологические срезы кожи пораженного уха мышей в модели атопического дерматита, окрашенные гематоксилин-эозином, с увеличением х20.
Соединение I
A - Группа интактных животных; B - Контроль патологии; C - Адвантан (Метилпреднизолона ацепонат, мазь 0.1%); D - Пимекролимус (Элидел 1% крем); E - Крем  0,01%. 1- эпидермис; 2 - дерма; 3-воспалительный инфильтрат. Эксперименты проведены в соответствии с: Evidence-based Complementary and Alternative Medicine. 2012. Article ID 545497, 9 pages.
При этом нанесение на кожу Соединения 1 (крем 0,01 мас.%) снижало до уровня интактных животных приток клеток воспаления (моноцитов, дендритных клеток, эозинофилов и нейтрофилов) в эпидермис и дерму кожи, а также другие микроскопические проявления атопического дерматита. Важно отметить, что по выраженности действия Соединение 1 (цинковый комплекс гамма-L-глутамилгистамина) существенно превосходил действие лиганда гамма-L-глутамилгистамина. Таким образом, терапевтическая активность Соединения 1 не может быть объяснена активностью гамма-L-глутамилгистамина. По выраженности действия крем Соединения 1 превосходил препараты сравнения метилпреднизолона ацепонат, пиритион цинка и пимекролимус. Полученные результаты позволяют заключить, что соединение 1 оказывает улучшенное терапевтическое действие при атопическом дерматите.
Выводы
Соединение 1
Соединение
50
in vivo
Таким образом проведенные исследования показали, что  обладает эффективностью в ингибировании фермента глутаминилциклазы (IC=26 мкМ). На модели атопического дерматита показано, что 1 ингибирует приток клеток воспаления (моноцитов, дендритных клеток, эозинофилов и нейтрофилов) , а также подавляет другие микроскопические проявления атопического дерматита.
Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные эксперименты приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.