СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТАТИВНОГО КОМПЛЕКСНОГО ПРЕПАРАТА, ОБЛАДАЮЩЕГО КОЛЛАГЕНАЗНОЙ АКТИВНОСТЬЮ
METHOD OF PRODUCING ENZYMATIC COMPLEX PREPARATION HAVING COLLAGENASE ACTIVITY

Заявляемое изобретение относится к биотехнологии, а точнее касается способа получения ферментативного комплексного препарата, обладающего коллагеназной активностью. Изобретение найдет применение, в частности, в медицине для лечения ожогов, гнойно-трофических язв, послеоперационных рубцов.
Известен способ получения коллагеназы, описанный в патенте РФ №2039819 (C12N 9/48, 1995.20.07). В качестве сырья для получения коллагеназы используют гепатопанкреас промысловых крабов, выделение проводят при смешивании гомогената гепатопанкреаса крабов, полученного в результате автолитического гидролиза за счет эндопротеаз с раствором хитозана рН 2,5-6,5, а полученный раствор после отделения нерастворимого материала последовательно подвергают 2-стадийной ультрафильтрации сначала на мембране, отсекающей примесные вещества с молекулярными массами 100 кДа и более, собирая проходящий через мембрану раствор, а затем на мембране, отсекающей вещества с молекулярными массами 30 кДа, собирая фермент, не проходящий через мембрану. Раствор, содержащий ферментативную активность, лиофилизируют. Удельная активность коллагеназы 9800-11200 ед/мг белка.
К недостаткам этого способа следует отнести невысокую очистку целевого продукта, что, по-видимому, связано с потерями активной коллагеназы, возникающими на стадии прибавления кислого раствора хитозана (рН 2,5-5,0), который приводит к частичной инактивации коллагенолитических ферментов, а также потерями коллагеназы при применении мембраны с проницаемостью пор 30 кДа. Работами последних лет по выделению генов коллагенолитических ферментов гепатопанкреаса камчатского краба, манящего краба, креветок было показано, что их молекулярные массы составляет 21,5-25,0 кДа, поэтому при проницаемости пор мембраны 30 кДа коллагеназы в значительной мере проходят через мембрану и суммарная активность конечного препарата снижается.
В качестве прототипа выбран способ получения ферментативного комплексного препарата, обладающего коллагеназной активностью, включающий гомогенизацию личинок жуков-кожеедов рода Dermestes в 3-4%-ном растворе хлорида натрия с добавлением 1-5 мкМ/л азида натрия при рН 6-7, при объемном соотношении биомассы и раствора 1:2-2,5. Последующее отделение супернатанта, включающего растворенный ферментативный комплексный препарат, обладающий коллагеназной активностью, осуществляют центрифугированием, а очистку супернатанта ведут путем ионообменной хроматографии, при этом сорбцию проводят на ДЕАЕ-сефарозе, уравновешенной MES-буфером с добавлением 0,005М хлорида кальция, элюцию активных ферментов проводят трисовым буфером с добавлением хлорида натрия, хлорида кальция и этилового спирта. В заключении проводят диализ элюата в 0,005 М растворе хлорида натрия при 2-6°С и концентририрование путем лиофильного высушивания препарата (патент РФ №2236460, МПК: C12N 9/64, опубл. 2004.09.20).
При выполнении указанного способа, в частности, в процессе центрифугирования часть активных белков исходного сырья утрачивается, кроме этого указанным способом получают конечный продукт, содержащий, помимо высокоактивных белков, большое количество примесных белков, не относящихся к коллагенолитическим ферментам. В результате ферментативный комплексный препарат имеет небольшую удельную коллагеназную активность. В связи с этим для практического использования получаемого препарата его необходимо подвергать сложным и трудоемким обработкам для выделения требуемых высокоактивных белков.
В основу заявляемого изобретения положена задача путем сокращения потерь ценных белков и сокращения количества неактивных белков, имеющихся в исходном продукте, создать способ получения ферментативного комплексного препарата, имеющего высокую удельную коллагеназную активность при высоком выходе целевого продукта.
Эта задача решается при создании способа получения ферментативного комплексного препарата, обладающего коллагеназной активностью, включающего образование в водно-солевом растворе гомогената биомассы частей личинок жуков рода Dermestes с последующим отделением супернатанта, включающего растворенный ферментативный комплексный препарат, обладающий активностью, очистку супернатанта путем ионообменной хроматографии с сорбцией и элюцией ферментативного комплексного препарата, последующее обессоливание элюированного ферментативного комплексного препарата и концентрирование целевого продукта, в котором, согласно изобретению, в качестве частей личинок жуков используют их кишечники и головы, образование гомогената биомассы кишечников и голов личинок жуков осуществляют в растворе Рингера, содержащем азид натрия и дитиотриэтол, отделение супернатанта ведут путем декантирования гомогената, а перед очисткой супернатанта осуществляют его гель-фильтрацию на сефадексе с сорбцией и элюцией ферментативного комплексного препарата, который затем подвергают обессоливанию и концентрированию, при этом каждое обессоливание проводят с помощью колоночной хроматографии на сефадексе, и каждое концентрирование ведут путем ультрафильтрации на мембранах с проницаемостью от 5 тысяч до 50 тысяч дальтон.
Технический результат, достигаемый при реализации заявляемого способа, состоит в том, что с высоким выходом получают ферментативный комплексный препарат, состоящий из высокоактивных белков, способных, в том числе, эффективно гидролизовать гипертрофические, келоидные и гипертрофические келоидные рубцы различной этиологии in vitro.
Особенность заявляемого способа состоит в том, что в качестве кишечников и голов личинок жуков рода Dermestes используют кишечники и головы личинок жуков вида Dermestes frischii или вида Dermestes maculates.
Другая особенность заявляемого способа состоит в том, что в качестве сефадекса при гель-фильтрации используют сефадекс G-150 в присутствии дитиотриэтола, а в качестве сефадекса при каждом обессоливании используют сефадекс G-25.
Согласно заявляемому изобретению целесообразно образование гомогената биомассы осуществлять при объемном соотношении биомассы и раствора Рингера, равном 1:(0,5- 5,0).
Особенность заявляемого способа состоит в том, что на каждой стадии осуществления способа определяют активность ферментативного комплексного препарата по методу Мандла и по гидролизу синтетического хромогенного субстрата карбобензоксиаланилаланилпролин-n-нитроанилида.
Другие особенности и преимущества заявляемого изобретения станут ясны из последующего подробного описания способа получения ферментативного комплексного препарата, обладающего коллагеназной активностью, и примеров осуществления этого способа.
Сущность заявляемого способа получения ферментативного комплексного препарата, обладающего коллагеназной активностью, заключается в следующем.
В качестве исходного продукта, содержащего комплекс белков с коллагеназной активностью, используют гомогенат биомассы частей личинок жуков рода Dermestes, а точнее гомогенат биомассы отделенных кишечников и голов личинок жуков видов Dermestes frischii и Dermestes maculates, что обеспечивает исходный продукт более широким спектром ферментов.
Пищеварительные трубки и головы личинок жуков видов Dermestes frischii и Dermestes maculates, то есть биомассу, гомогенизируют, согласно изобретению, в растворе Рингера, содержащем азид натрия и дитиотриэтол, при объемном соотношении биомассы и раствора 1:(0,5-5,0), соответственно, обеспечивая солюбилизацию водорастворимых белков. При объемном соотношении биомассы и раствора ниже 1:0,5 активные белки в растворе практически отсутствуют - наблюдают только следовые количества, при объемном соотношении биомассы и раствора выше 1: 5,0 препарат невозможно выделить, так как при хроматографии детектировать белки не представляется возможным.
Исследования показали, что гомогенизирование в растворе Рингера в присутствии дитиотриэтола обеспечивает повышение активности белков, содержащихся в биомассе.
Полученный гомогенат декантируют в течение, например, 3 часов для отделения супернатанта, включающего растворенный ферментативный комплексный препарат, обладающий активностью. Отделение супернатанта путем декантирования позволяет сохранить в супернатанте то количество белков, которое ранее при центрифугировании гомогената выпадало в осадок.
410
Особенность заявляемого изобретения состоит в том, что после каждого этапа заявляемого способа определяют активность растворенного ферментативного комплексного препарата по эффективности гидролиза Z-Ala-Ala-Pro-pNA, ход гидролиза определяют спектрофотометрически. Активность измеряют по изменению поглощения А.
Коллагеназная активность в единицах Мандла: 1 единица Мандла эквивалентна активности, освобождающей 1 µmol аминокислот в коллагене, определяющихся как лейцин, при инкубации фермента с коллагеном 5 часов при 37°С, рН 7.5.
Для исследования используют коллаген первого типа хвостов крыс по методике Мандла с колориметрическим измерением результатов по нингидриновому методу Moore and Stein.
Таким образом, согласно изобретению, после отделения супернатанта указанным образом определяют активность растворенного ферментативного комплексного препарата.
При получении положительных результатов активности ферментативного комплексного препарата, находящегося в растворе, согласно изобретению, осуществляют гель-фильтрацию супернатанта на сефадексе, в том числе на сефадексе G-150. Эта стадия заявляемого способа является первым этапом очистки ферментативного комплексного препарата. Целесообразно гель-фильтрацию супернатанта на сефадексе осуществлять в присутствии дитиотриэтола.
Исследования показали, что благодаря указанному приему обеспечено отделение от ферментативного комплексного препарата веществ, имеющих молекулярную массу, не соответствующую активным ферментам. Таким образом, найдена возможность выделить по значениям молекулярных масс в ферментативном комплексном препарате активные белки.
Как указано выше, по завершению гель-фильтрации супернатанта определяют активность растворенного ферментативного комплексного препарата.
На данном этапе заявляемого способа выход ферментного препарата по активности составляет порядка 70% при измерении ферментативной активности по эффективности гидролиза Z-Ala-Ala-Pro-pNA; порядка 85% - при измерении активности по Мандлу, препарат переносят на следующую стадию заявляемого способа.
Для удаления из очищенного ферментного комплексного препарата солей осуществляют, согласно заявляемому способу, обессоливание с помощью колоночной хроматографии, где в качестве носителя используют сефадекс, преимущественно сефадекс G-25. Указанный прием обеспечивает получение в более короткие сроки ферментного комплексного препарата более высокого качества.
Обессоленный ферментный комплексный препарат далее подвергают концентрированию путем, согласно заявляемому способу, ультрафильтрации, например, на мембранах с проницаемостью от 5 тысяч до 50 тысяч дальтон, выпускаемых, например, фирмой "Millipor", при давлении не более 3 атм и температуре +4°С.
Далее проводят второй этап очистки ферментативного комплексного препарата, осуществляя ионообменную хроматографию преимущественно на N′-1,2-диэтиламиноэтил-сефарозе в присутствии дитиотриэтола.
2
Элюцию сорбированного ферментативного комплексного препарата производят в градиенте рН со сменой буферной системы: 0,1 М аммоний-ацетатный буфер, рН 6,4 - 0,05 М трис-HCl, рН 8,0, 2,5 мМ CaCl, затем в двойном градиенте NaCl 0-1,5 М, этанол 0-20%.
Как указано выше, по завершению ионообменной хроматографии и элюции определяют активность растворенного ферментативного комплексного препарата.
На данном этапе способа выход ферментного комплексного препарата по активности составляет порядка 96% при измерении ферментативной активности по эффективности гидролиза Z-Ala-Ala-Pro-pNA; порядка 134% - при измерении активности по Мандлу, препарат переносят на следующую стадию заявляемого способа.
Для удаления из очищенного ферментного комплексного препарата солей и спирта осуществляют, согласно заявляемому способу, обессоливание с помощью колоночной хроматографии, где в качестве носителя используют сефадекс, преимущественно сефадекс G-25. Указанный прием обеспечивает в более короткие сроки получение более высокого качества ферментного комплексного препарата.
Обессоленный ферментный комплексный препарат далее подвергают концентрированию путем, согласно заявляемому способу, ультрафильтрации, например, на мембранах с проницаемостью от 5 тысяч до 50 тысяч дальтон, выпускаемых, например, фирмой "Millipor", при давлении не более 3 атм и температуре +4°С.
При использовании ультрафильрации для концентрирования отсутствуют используемые стадии замораживания и лиофилизации, при которых коллагеназная активность целевого продукта значительно снижается.
Таким образом, заявляемый способ позволяет с высоким выходом получать ферментативный комплексный препарат, состоящий только из высокоактивных белков, что обеспечивает более широкие возможности применения этого препарата, в том числе для эффективного воздействия на гипертрофические, келоидные и гипертрофические келоидные рубцы различной этиологии.
6
Получаемый, согласно заявляемому способу, очищенный ферментный комплексный препарат обладает высокой коллагенолитической активностью - выход по активности (определенный методом Мандла) составляет 110%. Удельная активность ферментного комплексного препарата составляет 5·10 единиц Мандл/мг белка.
Пример 1.
Отделенные кишечники и головы 1000 личинок жуков вида Dermestes frischii растирают в фарфоровой ступке фарфоровым пестиком с целью солюбилизации водорастворимых белков, полученную биомассу гомогенизируют в растворе Рингера (содержащем азид натрия и дитиотриэтол) при объемном соотношении биомассы и раствора 1:1 в течение 20 мин при температуре +4°С.
Полученный гомогенат декантируют при температуре +4°С в течение 3 часов. Надосадочную жидкость - супернатант объемом 155 мл, образовавшийся в результате осаждения твердых частиц, фильтруют через фильтр с диаметром пор 0,2 мкм. Получают 150 мл супернатанта с концентрацией ферментов, составляющей 9,2-9,5 мг/мл.
410
Определяют активность растворенного ферментативного комплексного препарата в полученном супернатанте. Для этого определяют активность растворенного ферментативного комплексного препарата по эффективности гидролиза Z-Ala-Ala-Pro-pNA, ход гидролиза определяют спектрофотометрически. Активность измеряют по изменению поглощения А.
Коллагеназная активность в единицах мандла: 1 единица Мандла эквивалентна активности, освобождающей 1 µmol аминокислот в коллагене, определяющихся как лейцин, при инкубации фермента с коллагеном 5 часов при 37°С, рН 7.5.
Для исследования используют коллаген первого типа хвостов крыс по методике Мандла с колориметрическим измерением результатов по нингидриновому методу Moore and Stein.
Далее путем гель-фильтрации осуществляют первый этап очистки активного ферментативного комплексного препарата в полученном супернатанте. Для этого по 10 мл полученного супернатанта наносят на хроматографическую колонку размером 2×80 см, содержащую сефадекс G-150, уравновешенный 0,1 М аммоний-ацетатным буфером, рН 6,4, содержащим дитиотриэтол в следовых количествах.
В результате осуществленной очистки выход ферментного препарата по активности составляет порядка 70% при измерении ферментативной активности по эффективности гидролиза Z-Ala-Ala-Pro-pNA; порядка 85% - при измерении активности по Мандлу.
Активные фракции элюата объединяют, суммарно получая 85-95 мл элюата, содержащего ферментативный комплексный препарат на основе белков с определенными молекулярными массами. Концентрация белков составляет 0,3-0,5 мг/мл.
Элюат, содержащий ферментативный комплексный препарат, очищенный путем гель-фильтрации на сефадексе G-150 от продуктов, имеющих несоответствующую молекулярную массу, далее порционно обессоливают с помощью колоночной хроматографии, где используют сефадекс G-25, затем концентрируют ультрафильтрацией, для чего препарат пропускают через мембраны фирмы "Millipor" проницаемостью 10.000 дальтон при давлении не более 3 атм и температуре +4°С.
В результате получают 135 мл ферментативного комплексного препарата с концентрацией фермента 3-5 мг/мл.
Осуществляют хроматографическую очистку на ионообменном сорбенте полученного раствора, содержащего ферментативный комплексный препарат. Для этого по 10 мл полученного раствора наносят на колонку размером 1,5×25 см, содержащей N′-1,2-диэтиламиноэтил-сефарозу, уравновешенную 0,1М аммоний-ацетатным буфером, рН 6,4.
2
Элюцию проводят в градиенте рН со сменой буферной системы: 0,1М аммоний-ацетатный буфер, рН 6,4 - 0,05 М трис-HCl, рН 8,0, 2,5 мМ CaCl, затем в двойном градиенте NaCl 0-1,5 М, этанол 0-20% в присутствии дитиотриэтола.
По завершению ионообменной хроматографии и элюции определяют активность растворенного ферментативного комплексного препарата.
Выход ферментного комплексного препарата по активности составляет 96% при измерении ферментативной активности по эффективности гидролиза Z-Ala-Ala-Pro-pNA; 134% - при измерении активности по Мандлу. После этого осуществляют удаление из растворенного ферментативного комплексного препарата солей и спирта. Для этого растворенный ферментативный комплексный препарат порционно обессоливают с помощью колоночной хроматографии, где в качестве носителя используют сефадекс G-25, после чего концентрируют ультрафильтрацией, для чего препарат пропускают через мембраны фирмы "Millipor" проницаемостью 10.000 дальтон при давлении не более 3 атм и температуре +4°С.
В результате получают 10 мл комплексного ферментного препарата с концентрацией белка 0,5-1,0 мг/мл.
Выход комплексного ферментного препарата по активности составляет 70% при измерении ферментативной активности по эффективности гидролиза Z-Ala-Ala-Pro-pNA; 85% - при измерении активности по Мандлу.
3
Удельная активность полученного комплексного ферментного препарата составляет 0,95 ед. акт./мг белка при измерении ферментативной активности по эффективности гидролиза Z-Ala-Ala-Pro-pNA, 450×10 ед. Мандла/мг белка при измерении активности по Мандлу, 2000 мг рубцовой ткани в сутки на 0,1 мг препарата при определении активности ферментативного комплексного препарата по эффективности гидролиза рубцовой ткани.
Пример 2.
Отделенные кишечники и головы 1500 личинок жуков вида Dermestes maculates растирают в фарфоровой ступке фарфоровым пестиком с целью солюбилизации водорастворимых белков, полученную биомассу гомогенизируют в растворе Рингера (содержащем азид натрия и дитиотриэтол) при объемном соотношении биомассы и раствора 1:1 в течение 20 мин при температуре +4°С.
Полученный гомогенат декантируют при температуре +4°С в течение 3 часов. Надосадочную жидкость - супернатант объемом 230 мл, образовавшийся в результате осаждения твердых частиц, фильтруют через фильтр с диаметром пор 0,2 мкм. Получают 220 мл супернатанта с концентрацией ферментов, составляющей 2,5-3,0 мг/мл.
410
Определяют активность растворенного ферментативного комплексного препарата в полученном супернатанте. Для этого определяют активность растворенного ферментативного комплексного препарата по эффективности гидролиза Z-Ala-Ala-Pro-pNA, ход гидролиза определяют спектрофотометрически. Активность измеряют по изменению поглощения А.
Коллагеназная активность в единицах мандла: 1 единица Мандла эквивалентна активности, освобождающей 1 µmol аминокислот в коллагене, определяющихся как лейцин, при инкубации фермента с коллагеном 5 часов при 37°С, рН 7.5.
Для исследования используют коллаген первого типа хвостов крыс по методике Мандла с колориметрическим измерением результатов по нингидриновому методу Moore and Stein.
Далее путем гель-фильтрации осуществляют первый этап очистки активного ферментативного комплексного препарата в полученном супернатанте. Для этого по 10 мл полученного супернатанта наносят на хроматографическую колонку размером 2×80 см, содержащую сефадекс G-150, уравновешенный 0,1 М аммоний-ацетатным буфером, рН 6,4, содержащий дитиотриэтол в следовых количествах.
В результате осуществленной очистки выход ферментного препарата по активности составляет порядка 70% при измерении ферментативной активности по эффективности гидролиза Z-Ala-Ala-Pro-pNA; порядка 85% - при измерении активности по Мандлу.
Активные фракции элюата объединяют, суммарно получая 70-80 мл элюата, содержащего ферментативный комплексный препарат с белками определенных молекулярных масс. Концентрация белков составляет 0,1-0,2 мг/мл.
Элюат, содержащий ферментативный комплексный препарат, очищенный путем гель-фильтрации на сефадексе G-150 от продуктов, имеющих несоответствующую молекулярную массу, далее порционно обессоливают с помощью колоночной хроматографии, где в качестве носителя используют сефадекс G-25, после чего концентрируют ультрафильтрацией, для чего препарат пропускают через мембраны фирмы "Millipor" проницаемостью 10.000 дальтон при давлении не более 3 атм и температуре +4°С.
В результате получают 150 мл ферментативного комплексного препарата с концентрацией белка 1-2 мг/мл.
Осуществляют второй этап очистки - проводят хроматографическую очистку на ионообменном сорбенте полученного раствора, содержащего ферментативный комплексный препарат. Для этого по 10 мл полученного раствора наносят на колонку размером 1,5×25 см, содержащей N′-1,2-диэтиламиноэтил-сефарозу, уравновешенную 0,1М аммоний-ацетатным буфером, рН 6,4.
2
Элюцию проводят в градиенте рН со сменой буферной системы: 0,1М аммоний-ацетатный буфер, рН 6,4-0,05 М трис-HCl, рН 8,0, 2,5 мМ CaCl, затем в двойном градиенте NaCl 0-1,5 М, этанол 0-20% в присутствии дитиотриэтола.
По завершению ионообменной хроматографии и элюции определяют активность растворенного ферментативного комплексного препарата.
На этом этапе выход ферментного комплексного препарата по активности составляет 96% при измерении ферментативной активности по эффективности гидролиза Z-Ala-Ala-Pro-pNA; 134% - при измерении активности по Мандлу. Далее осуществляют удаление из растворенного ферментативного комплексного препарата солей и спирта. Для этого растворенный ферментативный комплексный препарат порционно обессоливают с помощью колоночной хроматографии, где в качестве носителя используют сефадекс G-25, после чего концентрируют ультрафильтрацией, для чего препарат пропускают через мембраны фирмы "Millipor" проницаемостью 10.000 дальтон при давлении не более 3 атм и температуре +4°С.
В результате получают 15 мл комплексного ферментного препарата с концентрацией белка 0,3-0,5 мг/мл.
3
Выход комплексного ферментного препарата по активности составляет 60% при измерении ферментативной активности по эффективности гидролиза Z-Ala-Ala-Pro-pNA; 75% - при измерении активности по Мандлу. Удельная активность полученного комплексного ферментного препарата составляет 0,15 ед. акт./мг белка при измерении ферментативной активности по эффективности гидролиза Z-Ala-Ala-Pro-pNA, 50×10 ед. Мандла/мг белка при измерении активности по Мандлу, 250 мг рубцовой ткани в сутки на 0,1 мг препарата при определении активности ферментативного комплексного препарата по эффективности гидролиза рубцовой ткани.
Пример 3.
Получение комплексного ферментного препарата осуществляют в условиях, аналогичных уазанным в примере 1, однако подготовленную биомассу кишечников и голов личинок жуков вида Dermestes frischii гомогенизируют в растворе Рингера (содержащем азид натрия и дитиотриэтол) при объемном соотношении биомассы и раствора 1:0,5.
Выход полученного комплексного ферментного препарата по активности составляет 70% при измерении ферментативной активности по эффективности гидролиза Z-Ala-Ala-Pro-pNA; 85% - при измерении активности по Мандлу.
3
Удельная активность полученного комплексного ферментного препарата составляет 0,95 ед. акт./мг белка при измерении ферментативной активности по эффективности гидролиза Z-Ala-Ala-Pro-pNA, 450×10 ед. Мандла/мг белка при измерении активности по Мандлу, 2000 мг рубцовой ткани в сутки на 0,1 мг препарата при определении активности ферментативного комплексного препарата по эффективности гидролиза рубцовой ткани.
Пример 4.
Получение комплексного ферментного препарата осуществляют в условиях, аналогичных указанным в примере 2, однако подготовленную биомассу кишечников и голов личинок жуков вида Dermestes maculates гомогенизируют в растворе Рингера (содержащем азид натрия и дитиотриэтол) при объемном соотношении биомассы и раствора 1: 5,0.
Выход полученного комплексного ферментного препарата по активности составляет 60% при измерении ферментативной активности по эффективности гидролиза Z-Ala-Ala-Pro-pNA; 75% - при измерении активности по Мандлу.
3
Удельная активность полученного комплексного ферментного препарата составляет 0,15 ед. акт./мг белка при измерении ферментативной активности по эффективности гидролиза Z-Ala-Ala-Pro-pNA, 50×10 ед. Мандла/мг белка при измерении активности по Мандлу, 250 мг рубцовой ткани в сутки на 0,1 мг препарата при определении активности ферментативного комплексного препарата по эффективности гидролиза рубцовой ткани.