Холодоадаптированный донор аттенуации - штамм вируса гриппа В/СССР/60/69/5252, предназначенный для получения штаммов живой интраназальной гриппозной вакцины
COLD-ADAPTED ATTENUATION DONOR, STRAIN OF INFLUENZA VIRUS B/SSSR/60/69/5252, INTENDED FOR PRODUCTION OF STRAINS OF LIVE INTRANASAL INFLUENZA VACCINE

Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано при производстве живой гриппозной интраназальной холодоадаптированной аттенуированной реассортантной вакцины.
Наиболее близким к заявленному изобретению является холодоадаптированный штамм В/СССР/60/69 - прототип [Патент РФ №2078817 от 27.11.1992. - Опубл. 10.05.1997]. Прототип был получен двумя этапами. Первый этап заключался в последовательных пассажах «дикого» вируса В/СССР/69 в развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ) при оптимальной температуре инкубации 32°С (17 пассажей), в результате чего был получен вирус В/СССР/17/69, который использовался в СССР в начале 1970-х годов в качестве штамма живой гриппозной вакцины (ЖГВ) для взрослых. Вирус В/СССР/17/69 (В17) приобрел свойство температурочувствительности репродукции (ts фенотип), но сохранил присущий «дикому» родителю чувствительный к пониженной температуре инкубации (поп-са) фенотип. Второй этап состоял в дополнительном 60-кратном пассировании вируса В/СССР/17/69 в развивающихся куриных эмбрионах при пониженной до 25-28°С температуре. Полученный ts/ca вирус В/СССР/60/69 использовался как штамм ЖГВ для детей, а с 1980-х годов по настоящее время успешно применяется при подготовке реассортантной ЖГВ [Александрова Г.И., Климов А.И. Живая вакцина против гриппа. СПб: Наука. - 1994. - 151 с.] и является единственным в России донором аттенуации, официально разрешенным Министерством здравоохранения Российской Федерации для получения реассортантных вакцинных штаммов типа В.
Однако, прототип - донор В/СССР/60/69 (В60) - обладает рядом недостатков:
(1) авторы никогда не клонировали этот вирус, поэтому прототип представляет собой гетерогенную популяцию клонов, отличающихся по набору мутаций в генах, кодирующих внутренние белки, (2) изучение генетической последовательности генома не проводили (вирус не секвенировали), что не позволяло установить степень генетической неоднородности штамма, (3) не были описаны аттенуирующие мутации, появившиеся в результате пассирования «дикого» предшественника при оптимальной и пониженной температуре инкубации.
Штамм ЖГВ, полученный на неклонированном доноре аттенуации, является продуктом реассортации дикого вируса с одним клоном из гетерогенной популяции донора. Невозможно предугадать, какой из клонов передаст в геном вакцинного штамма гены, кодирующие внутренние белки вируса. В результате, стабильность характеристик реассортантных вирусов не может быть обеспечена. Только чистота популяции донора может гарантировать наследование реассортантом генов донора с оптимальным набором аттенуирующих мутаций. Клонирование донора, секвенирование генома клонов из гетерогенной популяции, определение роли отдельных мутаций необходимо для отбора оптимального клона для использования в качестве донора аттенуации для живых гриппозных вакцин.
Технический результат заявленного изобретения: получение аттенуированного холодоадаптированного штамма - донора аттенуации вируса гриппа В, обладающего генетической однородностью, известным набором аттенуирующих мутаций, способного к активному размножению в РКЭ при оптимальной температуре инкубации (32°С) и при пониженной до 25°С температуре и проявляющего ts фенотип при температурах выше 37°С.
Из гетерогенной популяции донора аттенуации В/СССР/60/69 отобрана и охарактеризована чистая линия, обладающая наиболее удачным сочетанием полезных признаков и позволяющая создавать генетически стабильные реассортантные вакцинные штаммы.
Сущность изобретения: Холодоадаптированный штамм В/СССР/60/69/5252 был трижды клонирован в РКЭ методом предельных разведений и генетически полностью охарактеризован. Было проведено полногеномное секвенирование штамма по Сэнгеру. Сравнительный анализ последовательностей генома эпидемических вирусов гриппа В, доступных в базах данных генетических последовательностей, показал наличие 6-ти уникальных и 2-х не уникальных мутаций во внутренних генах, кодирующих белки РВ2, PA, M1, ВМ2 и NS1, что отличает его от современных и ранее циркулировавших эпидемических вирусов гриппа В, сиквенсы которых на настоящий момент имеются в базах данных. Полученный штамм В/СССР/60/69/5252 обладает высокой репродуктивной активностью в РКЭ при оптимальной (32°С) и пониженной (25°С) температурах и сниженной репродуктивностью при температурах выше 37°С.Штамм В/СССР/60/69/5252 депонирован в Государственную коллекцию вирусов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России под №2973.
Согласно Приказу №156/29 МЗ РФ холодоадаптированный донор аттенуации должен иметь комплекс генетических маркеров и быть исследован в молекулярно-биологических и биохимических тестах, включая секвенирование «внутренних» генов; геном донора аттенуации должен иметь мутации всех (или большей части) генов, кодирующих негликозированные белки [Приказ №156/29 МЗ РФ от 07.05.1998 «О подготовке новых вакцинных производственных и диагностических штаммов вируса гриппа и их внедрении в производство вакцинных и диагностических препаратов».- 1998. - 14 с.]. Примеры подготовки и изучения биологических и генетических свойств холодоадаптированного штамма В/СССР/60/69/5252 приведены ниже.
Пример 1. Получение штамма В/СССР/60/69/5252.
Прежде всего, была определена нуклеотидная последовательность донора аттенуации В/СССР/60/69. Была выявлена гетерогенность его популяции по ряду позиций. Для получения чистой линии потребовалось клонирование донора В/СССР/60/69. Всего было получено 8 групп, различающихся по нуклеотидному составу клонов, получивших условные номера по своему представителю: 5252, 5253, 5254, 5255, 5272, 5273, 5274 и 5277.
Все клоны, выделенные из популяции донора аттенуации В/СССР/60/69, характеризовались са-фенотипом, но отличались по температурочувствительности, что нашло отражение в разбросе данных при титровании неклонированного донора в РКЭ (Табл. 1).
По высокой температурочувствительности к 38°С клоны между собой не различаются (признак: ts38°), однако, при снижении температуры инкубации до 37°С образуют две группы: температурочувствительные и температуроустойчивые к 37°С (признак: ts37° и non-ts37°). При этом дикие вирусы гриппа В, выделенные в тот же временной период, что и предшественник донора В60, характеризуются non-ts фенотипом при 38°С (признак: non-ts38°).
-7
-10
-8
-9
-9
Отобранный клон В/СССР/60/69/5252 хорошо размножался при оптимальной и пониженной температуре (са-фенотип) и не размножался при повышенной температуре 38°С (ts-фенотип). Для обеспечения генетической однородности ts/ca клон В/СССР/60/69/5252 прошел дополнительные три клонирования предельными разведениями от 10 до 10 при температуре 32°С в свободных от патогенной флоры (SPF) РКЭ. Каждым разведением вируса было заражено по 20 куриных эмбрионов. Аллантоисную жидкость единственного положительного в реакции гемагглютинации эмбриона, зараженного разведением вируса 10, использовали для второго раунда клонирования. Клон, выделенный из 10 разведения второго раунда клонирования, прошел третье клонирование. Выделенный из 10 разведения 3-го клонирования вирус, получил название В/СССР/60/69/5252.
Пример 2. Репродукция в РКЭ при разных температурах инкубации и генетическая стабильность
50
50
Оценку фенотипических свойств клона В/СССР/60/69/5252 проводили путем его параллельного титрования в РКЭ при 32, 25 и 38°С. Клон В/СССР/60/69/5252 обладает выраженным температурочувствительным и холодоадаптированным фенотипом. Его инфекционная активность при температуре 38°С составила 1,7±0,2 lg ЭИД/мл (ts фенотип), а инфекционная активность при пониженной до 25°С температуре инкубации составила 7,7±0,3 lg ЭИД/мл (са фенотип), что свидетельствует о его безвредности для человека. По этим показателям он идентичен донору аттенуации В/СССР/60/69, но обладает значительно более стабильными характеристиками, что отражается в незначительном разбросе данных при статистической обработке результатов титрования в РКЭ при разных температурах (см. табл. 1).
Фенотипические свойства клона В/СССР/60/69/5252 не изменились после его пятикратного пассирования в развивающихся куриных эмбрионах при использовании больших заражающих доз (табл. 2), что свидетельствует о генетической стабильности препарата.
Пример 3. Безвредность для мышей.
Доклинические исследования острой токсичности штамма В/СССР/60/69/5252 проводили на белых беспородных мышах в соответствии Европейской директивой [Директива 2010/63/EU Европейского парламента и совета Европейского Союза от 22 сентября 2010 года по охране животных, используемых в научных целях], Межгосударственным стандартом [Межгосударственным стандартом ГОСТ 33044-2014 «Принципы надлежащей лабораторной практики»] и Руководством по проведению доклинических исследований лекарственных средств [Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств (Иммунобиологические лекарственные препараты); Часть вторая. - М.: Гриф и К, 2012. - 536 с]. Исследования были одобрены для проведения локальным этическим комитетом при ФГБНУ «ИЭМ» (заключение №1/20 от 27.02.2020).
50
Мышам вводили однократно внутрибрюшинно 0,5 мл вируса В/СССР/60/69/5252 с титром 7,0 lg ЭИД/мл, что соответствовало одной человеческой дозе вакцинного штамма ЖГВ. Животным контрольной группы вводили внутрибрюшинно фосфатно-солевой буферный раствор (PBS). Ежедневно в течение всего исследования (7 дней) проводился контроль общего состояния каждого животного.
Данные физиологического обследования (подвижность, поведенческие реакции, кинетика массы тела) показали, что внутрибрюшинное введение вируса В/СССР/60/69/5252 не вызывало гибели экспериментальных животных (табл. 3) и не приводило к изменению их внешнего вида, поведения, не отражалось на потреблении ими пищи и воды, что свидетельствует о безвредности вакцинного препарата.
Пример 4. Безвредность и иммуногенность для хорьков.
50
Исследования проводили на серонегативных самках хорьков, по 6 животных в группе. Животных иммунизировали вакцинным штаммом вируса гриппа В/60/Брисбен/2008/83, полученным на основе клонированного донора аттенуации В/СССР/60/69/5252, по 0,5 мл интраназально в дозе вируса 6,0 lg ЭИД на животное.
Работа осуществлялась с соответствии с Европейской директивой [Директива 2010/63/EU Европейского парламента и совета Европейского Союза от 22 сентября 2010 года по охране животных, используемых в научных целях], Межгосударственным стандартом [Межгосударственный стандарт ГОСТ 33044-2014 «Принципы надлежащей лабораторной практики»] и Руководством по проведению доклинических исследований лекарственных средств [Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств (Иммунобиологические лекарственные препараты); Часть вторая. - М.: Гриф и К, 2012. - 536 с]. Исследования проводились на базе ООО «Институт доклинических исследований» (Санкт-Петербург) и были одобрены для проведения локальным этическим комитетом при ООО «Институт доклинических исследований» (заключение №1.4/17 от 18.01.2017).
Контрольных хорьков заражали «диким» родительским вирусом В/Брисбен/60/2008 в той же дозе, что и вакцинную группу. Третью группу представляли интактные животные (не получали ничего). Клинический осмотр всех животных проводили на 0-3 дни эксперимента. Состояние животных оценивали по следующим параметрам: температура тела, активность, появление респираторных симптомов (кашель, чихание, выделения из носа). Клиническую картину заболевания оценивали в баллах: активный - 0 баллов, вялый - 1 балл, чихание - 1 балл, выделения из носа - 1 балл. Была подсчитана сумма баллов для каждого животного. Для определения уровня репродукции вируса у трех животных каждой группы на 3-й день опыта производили забор назальных смывов, а затем, после эвтаназии - образцы легких. Репродукцию вирусов определяли путем заражения развивающихся куриных эмбрионов.
Через 21 день после заражения/вакцинации у оставшихся хорьков забирали кровь для определения гуморального иммунного ответа в РТГА и в реакции микронейтрализации.
Интраназальное введение вируса В/60/Брисбен/2008/83 не приводило к изменению внешнего вида и активности экспериментальных животных, не вызывало повышения температуры тела, респираторные симптомы у хорьков отсутствовали (табл. 4), что свидетельствует о безвредности вакцинного препарата на основе клонированного донора В/СССР/60/69/5252.
В отличие от хорьков, зараженных «диким» вирусом В/Брисбен/60/2008, у вакцинированных хорьков отсутствовала репликация вируса в легких. При этом штамм ЖГВ В/60/Брисбен/2008/83 успешно реплицировался в верхних дыхательных путях (в носу) хорьков (табл. 5), что приводило к выработке выраженного иммунного ответа у хорьков к 21 дню после вакцинации (табл. 6).
Пример 5. ИДЕНТИФИКАЦИЯ МУТАЦИЙ В ГЕНОМЕ ШТАММА В/СССР/60/69/5252. Для выявления мутаций в геноме донора аттенуации необходимо его сравнение с исходным эпидемическим (WT) вирусом, из которого он был получен. К сожалению, «дикий» предшественник донора аттенуации В/СССР/60/69 не сохранился, поэтому было проведено множественное выравнивание нуклеотидных и аминокислотных последовательностей полученных клонов донора аттенуации В/СССР/60/69 с соответствующими последовательностями эпидемических вирусов гриппа В, выделенных в период с 1940 по 2006 год и депонированных в Базах данных генетических последовательностей http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/TLU/FLU.htlm, https://www.gisaid.org/, и http://www/flu.lanl.gov. Для сравнения последовательностей использован вирус гриппа В/Яманаши/166/98. Количество проанализированных сиквенсов и результаты анализа всех значащих мутаций в геноме клонов донора аттенуации В/СССР/60/69 отражены в таблице 7.
Установлено, что 5 клонов, идентичных клону 5252, содержат в генах, кодирующих внутренние белки, 8 мутаций: РВ2 (L-3190Q; E467G; R639K), PA (S149N; T524K), M1 (R167K), ВМ2 (I87V), и NS1 (C104S). Два клона, аналогичные клону 5253, содержат в генах, кодирующих внутренние белки, 6 мутаций: РВ2 (L-3190Q; R639K), РВ1 (I644V); M1 (S218N), и NS2 (А54Т; L103F). Клон 5272 содержит в генах, кодирующих внутренние белки, 11 мутаций: РВ2 (Y104H; I269V; L3190Q; E467G; R639K), PA (S149N; I459V), ВМ2 (I87V), и NS1 (R272H) и NS2 (А54Т; L103F).
Были проанализированы внутренние гены 6 вакцинных штаммов, подготовленных в разное время на основе неклонированного донора аттенуации В/СССР/60/69. Все эти вакцинные штаммы использовались в производстве сезонной ЖГВ, зарекомендовали себя безвредными для человека и иммуногенными и соответствовали требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам. По наличию мутаций в различных внутренних генах эти вакцинные штаммы распределились следующим образом: 4 штамма соответствовали набору мутаций, описанному для клона 5252, один - клону 5253 и один - клону 5272 (см. табл. 7). Таким образом, и среди клонов донора В/СССР/60/69, и среди вакцинных штаммов, полученных на его основе, большинство представляло собой аналог клона 5252, что позволило нам выбрать его в качестве нового потенциального клонированного донора аттенуации ЖГВ типа В.
Пример 6. Установление роли отдельных мутаций в формировании аттенуирующего фенотипа штамма В/СССР/60/69/5252
Для выявления роли уникальных мутаций в геноме донора аттенуации в формировании его ts/ca фенотипа было проведено его сравнение с промежуточным вариантом на пути от «дикого» вируса к современному донору аттенуации - вирусом В/СССР/17/69, обладающим ts/non-ca фенотипом. Общий предшественник вакцинного штамма В17 и донора аттенуации В60 обладал non-ts/non-ca фенотипом, как и другие эпидемические вирусы гриппа В тех лет выделения. Сравнительный молекулярно-генетический анализ ts/non-ca и ts/ca вариантов дает возможность выявить мутации, определяющие холодоустойчивость репродукции донора аттенуации В60.
Чтобы определить уникальные мутации, специфичные для становления температурочувствительности донора В60, было проведено сравнение нуклеотидных и аминокислотных последовательностей донора аттенуации с соответствующими последовательностями эпидемических вирусов гриппа В, выделенных в период с 1940 до 2006 года и депонированных в базах данных генетических последовательностей (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU.htlm и http://wvvw/flu.lanl.gov).
Для сравнения первичных последовательностей «диких» и мутантных вирусов гриппа В использован вирус гриппа В/Яманаши/166/98. Количество проанализированных сиквенсов и результаты анализа отражены в таблице 8.
В первичной структуре генома донора В/СССР/60/69/5252 установлено восемь кодирующих мутаций, предположительно появившихся в результате пассирования эпидемического родительского вируса в РКЭ при оптимальной и пониженной до 26°С температуре.
В гене РВ2 - три мутации, приведшие к замене L-319-Q, E-467-G и R-639-K, в РА - две мутации, приведшие к замене S-149-N и Т-524-K, в М - две мутации, приведшие к одной аминокислотной замене в белке M1 R-167-K и одной в белке ВМ2 I-87-V, в NS1 - одна мутация C-104-S.
Две из восьми мутаций: в белке РВ2 (R-639-K), и в белке ВМ2 (I-87-V), не могут считаться абсолютно уникальными, так как присутствуют у некоторых более поздних эпидемических вирусов. С другой стороны, они не были обнаружены у вирусов, циркулировавших в тот же временной период - в 1960-1970-х годах (вирусы В/Энн Арбор/1/66, В/Россия/69, В/Гонконг/5/72, В/Гонконг/8/73, В/Сингапур/222/79).
В общей сложности гены, кодирующие РНП комплекс клонированного донора аттенуации В60, содержат четыре уникальных и одну неуникальную мутацию.
Не было обнаружено ни одной кодирующей мутации ни в гене РВ1, ни в гене NP донора аттенуации В60/69/5252, что указывает на отсутствие участия генов РВ1 и NP в формировании ts/ca фенотипа. Роль мутаций в генах М и NS1 пока не ясна, возможно, они имеют значение для аттенуации донора, но не связаны с его температурными характеристиками.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В результате проведенных исследований установлено, что заявляемый штамм В/СССР/60/69/5252 характеризуется сочетанием полезных признаков, необходимых донору аттенуации: генетической гомогенностью популяции, а также характерной для донора аттенуации температурочувствительностью и холодоадаптированностью, что коррелирует с аттенуацией для человека. Это отражено в прилагаемом ниже Паспорте штамма.
Штамм безвреден для мышей и хорьков, аттенуирован и иммуногенен для хорьков.
Полученный штамм В/СССР/60/69/5252 депонирован 11.11.2020 в Государственную коллекцию вирусов Института вирусологии им. Д. И. Ивановского ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России под №2973.
ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММА
50
Инфекционная активность при репродукции в развивающихся куриных эмбрионах при 32°С в течение 72 часов - 9,7 lg ЭИД/мл.
Гемагглютинирующая активность - 1:512.
Штамм проявляет генетическую стабильность биологических признаков после 5 пассажей на куриных эмбрионах (при использовании больших заражающих доз).
Характеристики холодоадаптированного штамма В/СССР/60/69/5252 представлены в прилагаемом паспорте.