СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ САХАРНОГО ДИАБЕТА У МЛЕКОПИТАЮЩИХ И ИНТРАНАЗАЛЬНАЯ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ САХАРНОГО ДИАБЕТА У МЛЕКОПИТАЮЩИХ
METHOD OF TREATING DIABETES IN MAMMALS AND INTRANASAL PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR TREATING DIABETES IN MAMMALS

Изобретение относится к ветеринарии и касается способа лечения млекопитающих, кроме человека, а также лекарственных средств, применяемых при лечении сахарного диабета у млекопитающих.
Известен способ лечения диабета с помощью трипептида Pro-Gly-Pro (RU 2252778). Способ лечения диабета, представленный в RU 2252778, включает назначение трипептида Pro-Gly-Pro пациенту в эффективном количестве. Раствор трипептида в дозе 0,61-0,63 мл использовался в течение 10 дней. Однако данный способ не предусматривает интраназального введения вещества.
Известен пептид Arg-Pro-Gly-Pro, который обладает антитромбической, антикоагулянтной, фибриндеполимеризационной и фибринолитической активностью (RU 2286166). Однако из указанного документа не известно, что указанный пептид можно применять для лечения сахарного диабета, тем более не известна эффективная схема введения указанного вещества интраназально.
Согласно статистическим данным в настоящее время заболеваемость сахарным диабетом у млекопитающих (СД) II типа существенно возросла. Количество больных ежегодно увеличивается на 5-10%. СД II типа может быть обусловлен различными причинами: от преимущественной резистентности к инсулину с относительной инсулиновой недостаточностью до секреторного дефекта с инсулиновой резистентностью или без нее. Для лечения СД II типа обычно применяют пероральные гипогликемические препараты разных групп: 1) производные сульфонилмочевины при сохранении функциональной активности бета-клеток островкового аппарата поджелудочной железы. Препараты этой группы связываются со специфическими высокоаффинными рецепторами, которые локализованы на АТФ-чувствительных калиевых каналах на мембранах бета-клеток; 2) бигуаниды независимо от функционирующих бета-клеток поджелудочной железы, оказывая прямое стимулирующее влияние на гликолиз в периферических тканях, повышают связывание инсулина с тканевыми рецепторами и снижают уровень глюкагона в крови; 3) акарбоза, затрудняющая всасывание углеводов в кишечнике; 4) глитазоны, которые снижают инсулинорезистентность и повышают чувствительность периферических тканей к инсулину; 5) старликс (производное D-фенилаланина), который, подобно аргинину, стимулирует секрецию инсулина бета-клетками поджелудочной железы (Фисенко, 2001).
Задачей, решаемой настоящим изобретением, является повышение эффективности лечения диабета путем предоставления фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество пептида Arg-Pro-Gly-Pro, и путем более эффективного специфического введения композиции. При этом задачей, также решаемой настоящим изобретением, является предоставление такой фармацевтической композиции, которая бы исключала нежелательные побочные действия, и разработка такого способа лечения, который был бы более безопасным, без потери эффективности. Следовательно, задачей, решаемой настоящим изобретением, является повышение безопасности лечения при использовании короткого пептида.
Указанные задачи решаются использованием в качестве лекарственного средства пептида Arg-Pro-Gly-Pro в количестве 1 мг/кг массы тела. При этом указанное вещество вводят интраназально по определенной схеме.
Интраназальное введение препарата имеет ряд преимуществ:
- наличие центрального действия (за счет того, что оболочки обонятельных нервов лишены гематоэнцефалического барьера, вещества из носовой полости могут сразу же поступать в головной мозг);
- высокая биодоступность;
- отсутствие эффекта первого прохождения через печень и связанные с этим неблагоприятные реакции;
- удобство и легкость применения, что ведет к улучшению комплаентности пациентов;
- быстрота развития системного эффекта.
Однако интраназально вводятся обычно препараты, преимущественно обладающие местным действием, в основном для облегчения симптомов ринитов. В последние годы показано, что в носовой полости может происходить активное всасывание ряда лекарственных веществ, которые подвергаются расщеплению и в желудочно-кишечном тракте, в частности это касается гормонов и веществ белково-пептидной природы. Скромное применение интраназального пути введения связано с рядом ограничений:
- возможно раздражение или контактная сенсибилизация слизистой носа, причиной которых является неблагоприятное взаимодействие активных или неактивных компонентов со слизистой;
- только небольшой процент лекарства может проникнуть в системный кровоток. Это означает, что лишнее количество лекарства должно быть изготовлено и введено в аэрозольный баллончик, что, в конечном итоге, ведет к увеличению стоимость препарата;
- интраназальная система доставки препаратов может быть использована для лекарств, обладающих определенными физико-химическими свойствами, для проникновения в системный кровоток в терапевтически эффективном количестве;
- невозможность обеспечения постоянной, без колебаний, концентрации препарата в крови и связанных с этим неблагоприятных реакций.
Таким образом, несмотря на всю привлекательность интраназального способа введения, его применение для каждого конкретного вещества требует тщательных исследований и клинических испытаний, так как реакция со стороны слизистой может быть непредсказуемой. Невозможно утверждать без проведения соответствующих экспериментов, будет ли достигаться необходимый терапевтический эффект на организм пациента.
Авторами настоящего изобретения было неожиданно обнаружена возможность использования интраназального ввода млекопитающему пептида Arg-Pro-Gly-Pro в низкой концентрации, не приводящей при этом к ухудшению системного ответа. Кроме того, при этом снижается возможность развития нежелательных побочных эффектов.
В способе лечения по изобретению используется фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного начала пептид Arg-Pro-Gly-Pro, которая также может содержать любые подходящие для интраназального ввода нейтральные носители, известные специалисту в данной области.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Примеры.
Используемый в работе пептид Arg-Pro-Gly-Pro синтезирован в Институте молекулярной генетики РАН (Москва).
Эксперименты были проведены на 48 беспородных белых крысах-самцах в возрасте 10 мес. с массой тела 270-350 г, содержащихся на естественном лабораторном рационе.
Сахарный диабет II-го типа у животных вызывали многократным внутрижелудочным введением 40%-го раствора глюкозы в дозе 0.5 мл на 200 г массы тела в течение 7-8 суток.
Проведено 2 серии экспериментов. В первой серии подопытным животным предварительно с профилактической целью в течение 4-х суток через каждые 24 ч вводили интраназально раствор пептида Arg-Pro-Gly-Рrо (из расчета 0.05 мл/200 мкг на 200 г массы тела, т.е. в количестве 1 мг/кг массы тела). Начиная с 5-х суток и до 7-х суток продолжали вводить пептид в указанной дозе и одновременно осуществляли сахарную нагрузку. Контрольным животным интраназально вводили вместо пептида тот же объем (0.05 мл/200 г массы тела) 0.85%-го раствора NaCl. Кровь на анализы брали через 1 ч после последнего введения препаратов.
Во второй серии экспериментов крысам сначала в течение первых 5-и суток вводили внутрижелудочно 40%-й раствор глюкозы в объеме 0.5 мл на 200 г массы тела и начиная с 6-х суток до 8-х суток (т.е. 3 суток), продолжая вводить глюкозу, через 30 -40 мин после введения глюкозы интраназально производили введение пептида ArgPGP (из расчета 0.05 мл/200 мкг на 200 г массы тела). Контрольным животным, как и подопытным, вводили глюкозу в течение 8 суток, а начиная с 6-х суток дополнительно интраназально вводили вместо пептида тот же объем (0.05 мл/200 г массы тела) 0.85%-го раствора NaCl. Кровь на анализы брали через 1 ч после последнего 8-го введения пептида (подопытным крысам) или 0.85%-го раствора NaCl (контрольным крысам).
Взятие крови осуществляли из v. jugularis в количестве 2 мл с использованием в качестве консерванта 3.8%-го раствора лимоннокислого натрия в соотношении кровь: консервант как 9:1.
1
2
Производили определение следующих биохимических параметров плазмы крови: суммарной (СФА) и неферментативной (НФ) фибринолитической активности (Kudrjashov, Lyapina, 1986), активности тканевого активатора плазминогена (ТАП) (Astrop, Mtillertz, 1952), активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ) (Долгов и др., 1996). В плазме крови, обогащенной тромбоцитами, определяли агрегацию тромбоцитов по методу Берковского и др. (2003) с использованием 2-5 мкМ раствора АДФ в качестве агреганта; определение проводили на агрегометре (производство МГУ, Москва). Кроме того, записывали параметры коагулограммы (T-начало образования сгустка, Т - конец образования сгустка, Т - время свертывания) на коагулометре отечественного производства (Россия). Концентрацию сахара в крови измеряли модифицированным методом Хагедорна-Иенсена (Канторович, 1963). Образцы крови центрифугировали в разных режимах: для определения агрегации тромбоцитов - при 1000g в течение 5 мин (получали богатую тромбоцитами плазму), а для проведения коагулологических тестов и уровня сахара крови в бедной тромбоцитами плазме - при 3000g в течение 10-12 мин.
Все данные были обработаны статистически по методу Стьюдента.
В первой серии опытов после интраназального введения исследуемого пептида в течение 7-и суток с дополнительной сахарной нагрузкой в последние 3 суток установлено, что в данных условиях эксперимента пептид оказывал активирующее влияние на показатели СФА и ТАП крови подопытных животных. При этом в опыте СФА увеличилось в 1,5 раза, ТАП - в 1,4 раза по сравнению с теми же показателями у контрольных крыс. Показатели НФ, агрегации тромбоцитов подопытных и контрольных крыс были сходны. Однако показатель АЧТВ подопытных крыс имел тенденцию к снижению по сравнению с контролем (табл.1).
Таблица 1.Показатели гемостаза у крыс при интраназальном введении Arg-Pro-Gly-Рrо в дозе 1 мг/кг массы тела (7 сут) с одновременным в течение последних 3-х суток внутрижелудочным применением 40%-ой глюкозы в объеме 0.5 мл на 200 г массы тела.
Условия эксперимента
СФА, мм<sup>2</sup>
НФ мм<sup>2</sup>
ТАП, MM<sup>2</sup>
Агрегация тромбоцитов, %
АЧТВ, с
Уровень глюкозы, мг%
Контроль (0.85%-ный NaCl+глюкоза) n=6
26.4±2.1
20.0±1.3
28.8±3.1
215±4.5<sup>##</sup>
32.8±2.5
151.6±10.7
Опыт (Arg-Pro-Gly-Рrо+глюкоза) n=6
38.3±2.2**
23.8±1.7
40.0±3.6**
228±6.5<sup>##</sup>
24.7±1.9
98.0±7.3**
Норма
34±1.4
24.6±1,0
33.3±1,7
100±2.0
31.7±1.9
68.0±5,47
Примечание: статистические показатели рассчитаны относительно соответствующих проб контроля (**-р<0.01) или нормы (<sup>##</sup> -р<0.01) (для табл.1-2).
При измерении уровня глюкозы в крови подопытных крыс установлено его достоверное снижение по сравнению с тем же показателем у контрольных крыс в 1,5 раза.
Поскольку в первой серии экспериментов очень резко (более чем на 100%) повысилась агрегация тромбоцитов при развитии СД II-го типа как у контрольных, так и у подопытных крыс, то использование данных условий для выявления противосвертывающего действия пептида требовало изменений в проведении экспериментов.
И во второй серии экспериментов было установлено, что через 1 ч после 3-кратного интраназального введения пептида на фоне развития СД II типа (после 5-и суток введения глюкозы и последующего продолжения ее введения совместно с пептидом) активируется функция противосвертывающей системы (ПСС) и снижается уровень сахара крови (табл.2).
1
2
Как видно из данных табл.2, при СД II типа интраназальное в течение 3-х суток введение пептида Arg-Pro-Gly-Pro на фоне постоянного поступления глюкозы в кровоток достоверно увеличивало в плазме крови подопытных животных СФА в 1.2 раза, НФ- в 1.4 раза, ТАП- в 2.9 раза, АЧТВ-1.18 раза, T коагулограммы - в 2.3 раза, Т- в 1.3 раза.
Как следует из проведенных экспериментов, данный способ введения пептида является наиболее эффективным для проявления антикоагулянтно-фибринолитической и антиагрегационной его активности.
Оказалось, что и для проявления гипогликемического действия пептида условия второй серии экспериментов наиболее приемлемы.
Как видно из табл.3, уровень сахара крови у подопытных крыс претерпел следующие изменения. Через 1 ч после однократного введения Arg-Pro-Gly-Pro на фоне сахарной нагрузки у крыс повысился уровень сахара на 24.8 мг% по сравнению с нормой, в контроле - на 22.4 мг%.
Таблица 3.
Уровень сахара (в мг%) в крови крыс в разные сроки после введения после введения пептида Arg-Pro-Gly-Pro на фоне развития СД II-го типа.
Условия опыта
Уровень сахара в крови крыс в мг%
Через 1 ч после однократного введения пептида на фоне сахарной нагрузки
Через 1 ч. после трехкратного введения пептида на фоне сахарной нагрузки
Через 5 суток после отмены введения пептида
Контроль NaCl+глюкоза
102.4±4.2р<0.01
172.0±6.1р<0.01
80.8±3.1р>0.1
Опыт Arg-Pro-Gly-Pro +глюкоза
114.8±6.1р<0.01p<sub>1</sub>>0.1
124.0±4.6р<0.05p<sub>1</sub><0.01
81.0±23.9р>0.1p<sub>1</sub>>0.1
Норма
80.0±2.7
92.0±5.5
61.3±33.1
Через 1 ч после трехкратного введения пептида подопытным крысам на фоне сахарной нагрузки уровень сахара практически оставался прежним, однако превышал нормальные значения на 26 мг%. У контрольных крыс он был достоверно повышен до 172 мг% и превышал нормальные значения на 89 мг%.
Через 5 суток после отмены применения пептида установлено снижение уровня сахара крови до 80-81 мг% и в опыте, и в контроле, причем эти величины недостоверно отличались от нормальных значений.
Таким образом, только 3-суточное применение пептида Arg-Pro-Gly-Pro на фоне развития СД II типа (на фоне сахарной нагрузки) приводило к недостоверному повышению уровня сахара крови, в то время как в отсутствие пептида (введение физиологического раствора вместо пептида) отмечалась значительная гипергликемия, и сахарный диабет II типа продолжал развиваться. При этом показатели гемостаза активированное частичное тромбопластиновое время, параметры коагулограммы, суммарная и неферментативная фибринолитическая активность, активность тканевого активатора плазминогена и агрегация тромбоцитов у подопытных крыс соответствовали или гипокоагуляции на фоне введенного пептида, или повышенной свертываемости крови - на фоне физиологического раствора, применяемого вместо пептида.
Следовательно, пептид RPGP даже при однократном применении на фоне сахарной нагрузки оказывает антикоагулянтное и фибринолитическое действие ферментативной и неферментативной природы, снижает агрегацию тромбоцитов, а его трехкратное применение одновременно препятствует развитию сахарного диабета II типа.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Ашмарин И.П., Каменский А.А„ Ляпина Л.А. и др. Глипролины как самостоятельные регуляторы и стабилизаторы других пептидов // Вопр. биол., мед. и фармацевт. химии. 2002. №1. С.24-27.
2. Ашмарин И.П., Ляпина Л.А., Андреева Л.А. и др. Лечебный эффект глипролинов Pro-Gly и Pro-Gly-Pro при развитии экспериментального инсулинзависимого диабета // Тромбоз, гемостаз и реология. 2008. №2 (34). С.38-43.
3. Берковский А.Л., Васильев С.А., Жердева Л.В. и др. Пособие по изучению адгезивно-агрегационной активности тромбоцитов. М.: РАМН. НПО "Ренам". 2003. С.3-28.
4. Долгов В.В., Авдеева Н.А., Щетникович К.А. Методы исследования гемостаза. Пособие для врачей клинической лабораторной диагностики. М.: Изд-во м-ва здравоохранения и мед. пром-сти РФ. 1996. 58 с.
5. Канторович Л.С. Способ определения сахара в крови и других биологических жидкостях. Бюлл. изобретений и товарных знаков. 1963. №21.
6. Ляпина Л.А., Андреева Л.А., Ульянов A.M. и др. Исследование антидиабетогенных и противосвертывающих эффектов трипептида Gly-Pro-Arg при развитии экспериментального инсулинзависимого диабета // Тромбоз, гемостаз и реология. 2009.
7. Ляпина Л.А., Пасторова В.Е., Оберган Т.Ю. и др. Сравнение противосвертывающих эффектов регуляторных пролин-содержащих пептидов. Специальность действия глипролинов, Семакса и Селанка, возможности их практического применения // Изв. РАН. 2006. №2. С.193-203.
8. Ляпина Л.А., Пасторова В.Е., Ульянов A.M. и др. Влияние желатина и пептида Pro-Gly-Pro на состояние противосвертывающей системы и на развитие экспериментального диабета // Веста. Моск. ун-та. Сер. 16. Биология. 2002. №1. С.7-10.
9. Пасторова В.Е., Ляпина Л.А., Ашмарин И.П. Предупреждение тромбообразования глипролинами на различных моделях предтромбоза и тромбоза у крыс // Бюлл. эксперим. биол. и мед. 2003. Т.138. №10. С.364-357.
10. Ульянов A.M. Функциональное состояние инсулярной и противосвертывающей систем у животных при развитии устойчивого аллоксанового диабета // Вести. Моск. ун-та, сер. 16. Биология. 1994. №4. С.32-37.
11. Ульянов A.M., Ляпина Л.А., Шубина Т.А. Влияние пептида Phe-Pro-Gly-Pro на развитие аллоксанового диабета и состояние противосвертывающей системы // Вопр. биол. мед. и фармацевт. химии. 2005. №4. С.19-21.
12. Фисенко В.П. Принципы действия лекарственных средств, применяемых при сахарном диабете 2-го типа // Врач. 2001. №6.
13. Шубина Т.А., Ульянов A.M., Ляпина Л.А. Влияние регуляторных пептидов на систему фибринолиза при развитии инсулинзависимого сахарного диабета // Тромбы, кровоточивость и болезни сосудов. 2008. Приложение №6. С.152-153.
14. Astrup Т., Mullertz S. The fibrin plate method for estimating fibrinolytic activity // Arch. Biochem. Biophys. 1952. V.40. С.346-351.
15. Kudrjashov B.A., Lyapina L.A. Nonenzymatic fibrinolysis and its role in the organism. In book: Thrombosis and thrombolysis. Ed. Chazov, E.I., Smirnov V.N. Consultants Bureau New York.: 1986. P.33-65.
16. Lu W. M, Lei S. Т., Zhang Q. et. al. Effect of L-arginine on diabetic rats // Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao.2006. Oct. Vol.26(10). P. 1434-1445.
17. McConell G.K. Effects of L-arginine supplementationon exertcise metabolism// Curr. Opin.CHn.Nutr.Metab.Care. 2007. V.10. №1. P.46-51.
18. Mendez J.D., Balder as F.L. Inhibition by L-arginine and spermidine of hemoglobin glycation and lipid peroxidation in rats with induced diabetes // Biomed. Pharmacother. 2006. Jan. Vol.60(1). P.26-31.
74
19. Molinero C., Martinez В., Rubio В., Gonzalez-Fermandez, M.D. Garda-Cachan, Jaime I. The anatomical origin of raw meat affecta the sensory and chemical characteristics of a dry-cured beef product Cecina de Lion // Food Science and Technology International. 2008. V.14. P.225-232.
20. Piatti P.M., Monti L.D., Valcecchi G. et. al. Long-term oral L-arginine administration improves peripheral and hepatic insulin sensitivity in type 2 diabetic patients // Diabetes Care. 2001. 24. P.875-880.