Способ прогнозирования развития рецидива инфильтративного эндометриоза малого таза на основании результата экспрессии иммуногистохимического маркера Musashil в эндометриоидной ткани
METHOD TO PREDICT RECURRENCE OF INFILTRATIVE PELVIC ENDOMETRIOSIS BASED ON THE RESULT OF EXPRESSION OF IMMUNOHISTOCHEMICAL MUSASHIL MARKER IN ENDOMETRIOIDAL TISSUE

Изобретение относится к медицине, а именно к гинекологии, хирургии и патологической анатомии, предназначено для прогнозирования развития рецидива инфильтративного эндометриоза малого таза.
В настоящее время распространенность эндометриоза у женского населения составляет 10-15% (Bulun SE 2009, Guidice LC 2010). У женщин репродуктивного возраста он составляет 5-15%, в постменопаузе - от 3 до 5% (Modesitt SC, Tortolero-Luna G., Robinson JB, Gershenson DM, Wolf JK. 2002).
Глубокий инфильтративный эндометриоз, по данным разных авторов, встречается у 20-50% больных с генитальным эндометриозом (Cornilhe F.J.,1990; Konickx P., 1994; Martin D., 1996).
До настоящего времени не существует теории или комплекса теорий, полностью объясняющих патогенез эндометриоза. Авторами поддерживаются все гипотетические механизмы патогенеза, включающие ретроградную менструацию, метастатическое (лимфатическое и сосудистое) распространение, а также ятрогенную имплантацию клеток эндометрия, целомическую метаплазию / индуцированную мезенхимальную дифференцировку клеток, и развитие эндометриоидной ткани из остатков эмбриональных тканей.
В последнее время исследователи интенсивно изучают стволовые клетки эндометрия и их роль в возникновении эктопических эндометриоидных очагов (Isaac Е. Sassona and Hugh S. Taylora, b Stem Cells and the Pathogenesis of EndometriosisAnn N Y Acad Sci. 2008 Apr; 1127: 106-115.) Многочисленные эксперименты показали, что клетки, выделенные из эндометрия, способны перерасти в эндометриоидные имплантаты (Seli Е, et al. Pathogenesis of endometriosis. Obstet Gynecol Clinics North Am. 2003;30:61. [PubMed]; TeLinde RW, Scott RB. Experimental endometriosis. Am J Obstet Gynecol. 1950;60:1173. [PubMed]; D'Hooghe TM, et al. Intrapelvic injection of menstrual endometrium causesendometriosis in baboons (Papio cynocephalus and Papio anubis) Am J Obstet Gynecol. 1995; 173: 134. [PubMed]; Ridley JH, Edwards IK. Experimental endometriosis in the human. Am J Obstet Gynecol. 1958; 76: 790. [PubMed]
Для детекции стволовых клеток эндометрия и эндометриоидных очагов авторы использовали разные маркеры. Oct-4 является фактором транскрипции, играет большую роль в поддержке клеточной плюрипотентности в эмбриональных и взрослых стволовых клетках, зародышевых клетках и целых эмбрионах на разных стадиях развития. Авторы также сообщили, что данный маркер был выявлен в половине исследуемых образцов эндометрия (Matthai, Хорват и др., 2006). Экспрессия мРНК Oct4 была обнаружена во всех экспериментальных образцах эндометрия у женщин в фолликулярной или лютеиновой фазе менструального цикла (Bentz, Kenning et al. 2010). Экспрессия других маркеров стволовых клеток, таких как Bcl-2, С-комплект (CD117) и CD34, также были обнаружены в стволовых клетках эндометрия (Cho, Park et al. 2004). Экспрессия Musashi-1 (РНК-связывающего белка) была выявлена в образцах эндометрия, эндометриоидных очагах и эндометриоидной карциномы (, Wolf et al. 2008). Экспрессия Musashi-1 была обнаружена в эпителиальных и стромальных клетках пролиферативного эндометрия. В клетках эндометрия количество Musashi-1 положительных клеток базального слоя в стромальном компоненте в 1,5 раза и в эпителиальном компоненте в 3 раза выше, чем в функциональном слое. В эндометриоидных и раковых клетках эндометрия также выявлены высокие уровни Musashi-1 (, Wolf et al. 2008) Като и соавторы использовали два маркера для дифференцировки эпителиальных (CD13) и стромальных (CD9) стволовых клеток эндометрия (Kato, Yoshimoto et al. 2007).
Song и соавторы изучили транскрипцию факторов плюрипотентности (SOX2, NANOG (Nanog homeobox) и ОСТ4 у женщин репродуктивного возраста, страдающих эндометриозом яичников, и у женщин без данной патологии. Результаты исследования показали, что в эндометрии у женщин с эндометриозом яичников указанные маркеры были значительно выше, чем в эндометрии у женщин без эндометриоза. Кроме того, было выявлено, что в очагах эндометриоза экспрессия данных маркеров значительно превышала показатели эутопического эндометрия (Song Y, Xiao L, Fu J, Huang W, Wang Q, Zhang X, Yang S. Increased expression of the pluripotency markers sex-determining region Y-box 2 and Nanog homeobox in ovarian endometriosis.Reprod Biol Endocrinol 2014; 12: 42). Также установлено, что стволовые клетки / клетки-предшественники костного мозга при внедрении в эндометрий способствуют ремоделированию сосудов (Pittatore G, Moggio A, Benedetto С, Bussolati В, Revelli A. Endometrial adult/progenitor stem cells: pathogenetic theory and new antiangiogenic approach for endometriosis therapy. Reprod Sci (2014) 21(3): 296-304. doi.10.1177/1933719113503405) или могут трансдифференцироваться в клетки эндометрия (Du Н, Taylor HS. Stem cells and reproduction. Curr Opin Obstet Gynecol (2010) 22(3): 235-41. doi:10.1097/GCO.0b013e328338c152; 8 Zhang WB, Cheng MJ, Huang YT, Jiang W, Cong Q, Zheng YF, et al. A study in vitro on differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into endometrial epithelial cells in mice. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol (2012) 160(2): 185-90. doi:10.1016/j.ejogrb.2011.10.012). Выявлено также, что регенеративные клетки эндометрия, выделенные из менструальной крови, могут дифференцироваться в различные клеточные линии, такие как клетки, синтезирующие инсулин (Li, Chen et al. 2010), остеобласты (Ai, Mehrabani 2010), одонтобласты (Ai, Tabatabaei et al. 2009) и нейроны (Wolff, Gao et al. 2011 and Ai, Esfandiari et al. 2009a). Эндометриальные стволовые клетки (ЭнСК) были недавно использованы для замены дофаминергических нейронов в мышиной модели болезни Паркинсона (Wolff, Gao et al. 2011). Hida и соавторы изучали кардиогенный потенциал ЭнСК (Hida, Nishiyama et al. 2008). Также известен ангиогенный потенциал ЭнСК, чем обусловлена высокая регенеративность эндометрия (Esfandiari, Ai et al. 2007; Esfandiari, Khazaei et al. 2007; Esfandiari, Ai et al. 2008 and Ai, Esfandiari et al 2009a and 2009b). Антиогенез может играть не только ключевую роль в процессе регенерации эндометрия, но и может участвовать в формировании и развитии очагов эндометриоза (Donnez, Smoes et al. 1998; Fujishita, Hasuo et al. 2000). В нашей работе мы провели анализ экспрессии иммуногистохимических маркеров стволовости клеток Musashil, CD15 и ALDHl в очагах инфильтративного эндометриоза мочевыводящих путей у пациенток, обратившийся впервые по поводу заболевания эндометриоз и у пациенток, которые уже получали гормональную, оперативную или сочетанную терапию по поводу эндометриоза. Эти исследования были проведены в рамках научно исследовательских работ, проводимых в НЦАГиП им. Кулакова.
Реализацией изобретения является прогнозирование возникновения рецидива инфильтративного эндометриоза малого таза на основании оценки экспрессии иммуногистохимического маркера Musashil в эндометриоидных очагах.
Исследование проводилось на клинической базе 1 патологоанатомического отделения ФГБУ «НЦ АГиП им. В.И. Кулакова» Минздрава России и кафедры акушерства, гинекологии, репродуктологии и перинатологии ГБОУ ВПО Первого МГМУ им. И.М. Сеченова,
В исследование были включены 62 пациентки, проходившие обследование и лечение в НЦАГиП имени В.И. Кулакова по поводу инфильтративнного эндометриоза с поражением мочевыводящих путей в период с февраля 2010 по май 2015. Возраст пациенток в обеих группах находился в пределах от 23 до 50 лет, средний возраст составил 35±1 лет. Критерием включения являлось наличие инфильтративного эндометриоза с вовлечением мочевыводящих путей. Критериями исключения являлись отсутствие инфильтративного эндометриоза с поражением мочевыводящих путей и злокачественные образования.
Пациентки были разделены на две группы. I группу составили пациентки с инфильтративным эндометриозом мочевыводящих путей, обратившиеся впервые по поводу заболевания. II группу составили пациентки с инфильтративным эндометриозом мочевыводящих путей, которые ранее получали лечение по поводу эндометриоза.
Пациентки I и II группы проходили физикальное обследование, были проведены все необходимые клинико-лабораторные и инструментальные  исследования (УЗИ, MPT, КТ, колоноскопия, цистоскопия) для уточнения диагноза и подготовки к оперативному лечению.
Хирургическое лечение проведено у 61 пациентки, 1 пациентка была выписана домой накануне оперативного лечения по семейным обстоятельствам. Предоперационная подготовка, вид анестезии и послеоперационное ведение пациенток проведено в соответствии с планируемым и проведенным объемом оперативного лечения.
Для данного исследования использовали резецированные части или иссеченные участки стенок мочевого пузыря, резецированные отделы мочеточников и эндометриоидные инфильтраты, прилегающие и сдавливающие мочеточники. Гистологическое исследование проведено у 61 пациентки. Материал для гистологического исследования фиксировали в забуферном (фосфатном) 10% нейтральном формалине, затем образцы были обработаны по общепринятой стандартной методике и заключены в парафин. Для морфологических исследований с каждого блока делали не менее 10 ступенчатых срезов толщиной 4 мкм, после чего проводили окрашивание гемотоксилином и эозином по общепринятой методике, далее ставили иммуногистохимические реакции.
Иммуногистохимическое исследование проведено у 15 пациенток: у 5 из I группы и у 10 из II.
Иммуногистохимическое исследование проводили на депарафинированных срезах толщиной 4-5 мкм по общепринятым протоколам (DAKO protocols).
Иммунгистохимическим методом выявляли маркеры CD15- monoclonal mouse antibody (clone MMA), 1:50, Cell Marque, ALDH1- rabbit monoclonal antibody (clone EP1933Y), 1:400, GeneTex, Musashi- rabbit monoclonal antibody (clone EP1302), 1:200, GeneTex с помощью моноклональных антител. В качестве вторичных антител и агентов для детекции ставили отрицательные контрольные реакции.
Результаты ИГХ реакции оценивали полуколичественным методом в баллах по общепринятой методике: отсутствие иммуноокрашенных клеток (-) - 0 баллов; менее 5% иммуноокрашенных клеток (+) - 0,5 балла, менее 20% иммуноокрашенных клеток (+) - 2 балла; от 20 до 40% окрашенных клеток (++) - 4 балла; более 40% окрашенных клеток (+++) - 6 баллов.
Полученные данные были статистически обработаны.
Все полученные данные были обработаны на персональном компьютере с использованием программы Statistica for Windows v. 8.0, StatSoft Inc. (США). Для каждого количественного параметра были определены: среднее значение (М), среднеквадратическое отклонение (δ), ошибка среднего (m), 95% доверительный интервал, медиана (Me), интерквартильный размах (Q1-Q3), для качественных данных - частота (%).
Перед проведением сравнительного анализа количественных данных в исследуемых группах определяли вид распределения данных (тест Колмогорова-Смирнова). При нормальном виде распределения данных для оценки различий в группах использованы методы параметрической статистики (критерий Стьюдента). При отсутствии нормального распределения данных применялись методы непараметрической статистики - тест Манна-Уитни для сравнения данных в группах.
Для сравнения числовых данных (после проверки количественных данных на нормальное распределение) использовали t-критерий Стьюдента для 2 независимых выборок: ,
1
2
1
2
1
2
где M, М - средние арифметические; σ и σ - стандартные отклонения; N, N - размеры выборок.
В случае несоответствия закону нормального распределения или при сравнении в малых выборках сравнение числовых показателей между двумя группами осуществляли с помощью критерия Манна-Уитни для несвязанных совокупностей:
,
1
2
х
x
где n - количество единиц в первой выборке; n - количество единиц во второй выборке; Т - большая из двух ранговых сумм, соответствующая выборке с n - единиц.
Статистически значимыми считались отличия при р<0,05 (95% уровень значимости) и при р<0,01 (99% уровень значимости).
Морфологическое исследование: эндометриоидные гетеротопии локализовались в стенке мочевого пузыря, мочеточников, околомочеточниковой жировой клетчатке и прорастали в просветы мочевого пузыря и мочеточников, а также периневрально и периваскулярно распространялись до крестцовых сплетений и подвздошных костей. Очаги обладали свойствами активных очагов, описанных нами ранее (16). В I группе (n=22) у 9 (41%) эпителий очагов был пролиферативного типа, в 4 (18%) наблюдениях обнаружен периваскулярный рост эндометриоидного инфильтрата. Во II группе кистозные трансформации выявлены у 12 (30,7%) пациентов, пролиферативная форма эпителия у 15 (38,4%) и у 12 (30,7%) гиперпластическая форма эпителия. В 4 (10,2%) наблюдениях обнаружен периневральный рост инфильтрата с разрушением ганглиев. У 8 (20,5%) пациентов в очагах эндометриоза обнаружены признаки воспаления.
При изучении результатов иммуногистохимических исследований обнаружены особенности экспрессии маркера Musashil в эндометриоидных гетеротопиях II группы по сравнении с I группой.
Aldh Al определяли в цитоплазме и в ядрах клеток эпителиальных и стромальных компонентов I и II группы. Экспрессия маркера в эпителии эндометриоидных гетеротопий была достоверно выше по сравнению с аутологичным эндометрием в обеих группах (р<0,05). Однако его экспрессия была выше в очагах эндометриоза больных II группы по сравнению с I группой.
юCD15 выявлена только в эпителиальных клетках очагов эндометриоза и аутологичном эндометрии I и II группы. Во II группе экспрессия была более выражена. В I группе в очаге эндометриоза экспрессия оценена на 4 балла, а в аутологичном эндометрии на 2 балла. Во II группе в очаге эндометриозаэкспрессия CD15 оценена на 4,8 балла, в аутологичном эндометрии 3,1 балла.
Экспрессия Musashi1 определяли в ядрах эпителиальных и стромальных клеток очагов эндометриоза и аутологичного эндометрия обеих групп. Экспрессия данного маркера была более высокой в эпителиальном компоненте. В эпителиальном компоненте эндометриоидного очага I группы экспрессия в среднем была оценена на 2,2 балла, а в стромальном 1,2 балла. Во II группе экспрессия в эпителиальном компоненте оценена в 5 и в стромальном 2,4 балла. Таким образом, между группами, выявлена статически достоверная разница по экспрессии Musashi1 в эпителиальном компоненте эндометриоидных очагов (р=0,0021). (фигура 1).
Особенности
Эпителиальный компонент очагов эндометриоза достоверно интенсивней экспрессирует маркеры стволовости CD15, ALDH1 и Musashi1, особенно при рецидивирующем эндометриозе.
Таким образом, эндометриоидные гетеротопы отличаются от аутологического эндометрия не только структурой, но и молекулярной организацией по Musashi, ALDH1 и CD15. Эндометриоидные гетеротопии обладают более высокой экспрессией маркеров стволовости, что свидетельствует об их относительной незрелости, которая выражается в более активной пролиферации и инфильтративном росте.
Учитывая статистический достоверную разницу между группами по экспрессии маркера Musashi1 в эпителиальном компоненте эндометриоидных очагов, можно прогнозировать рецидив заболевания. Данный метод позволит в дальнейшем усовершенствовать схемы профилактических осмотров и обследований, кроме того при нереализованной репродуктивной функции позволит своевременно планировать беременность.
Клинический пример 1
Больная Ю. 35 лет, обратилась с жалобами на ноющие боли в левой подвздошной области с иррадиацией в ногу, периодические боли в крестцово-поясничной области.
Из анамнеза: В течение 4 лет беспокоили вышеуказанные жалобы, в связи с чем многократно была консультирована гинекологами и урологами. Получала лечение по поводу апоплексии левого яичника, альгоменореи. Через месяц жалобы возобновилялись. Урологам неоднократно были назначены уроантисептики. В течении последних 2 лет по УЗИ и МРТ данным была диагностировано гидронефротическая трансформация левой почки и блокада нижней трети левого мочеточника объемным образованием в связи с чем была проведена цистоскопия. Катетеризация левого мочеточника. Направлена в МНИОИ им. П.А. Герцена с диагнозом «рак левого мочеточника?». Выполнена трепан-биопсия образования под УЗИ контролем. Гистологический диагноз: цитограмма соответствовала эндометриозу. Была направлена в НЦАГиП им Кулакова после проведения дообследования был поставлен диагноз: эндометриоз левой боковой стенки малого таза с вовлечением в инфильтрат нижней трети левого мочеточника, стеноз нижней трети левого мочеточника, гидронефроз слева. Эндометриоиные очаги правой боковой стенки малого таза и Дугласово пространства. Состояние после катетеризации левого мочеточника. Была проведена контролная цистоскопия. Лапароскопия, уретеролиз слева, иссечение эндометриоидного инфильтрата левой боковой стенки малого таза и очагов с левого яичника и тазовой брюшины.
При иммуногистохимическом исследовании эндометриоидных очагов экспрессия Musashil в эпителиальном компоненте была оценена на 2 балла, а в стромальном экспрессии не обнаружена.
Клинический пример 2
Больная М. 28 лет, обратилась с жалобами на боли внизу живота с иррадиацией в правую ногу, учащенное, болезненное, затрудненное мочеиспускание до и во время менструации. Год назад в связи указанными жалобами было проведено обследование, по результатам УЗИ и МРТ было диагностировано объемное образование мочевого пузыря. В связи с чем была госпитализирована ФГБУ НИИ урологии. Была проведена ТУР биопсия мочевого пузыря. Гистологический диагноз инвертированная папилома мочевого пузыря на фоне хронического цистита. При обращении в НЦАГи П была дообследована, поставлен диагноз: распространенная форма эндометриоза органов малого таза. Эндометриоз мочевого пузыря. Спаечный процесс в малом тазу. Выполнена: цистоскопия. Лапароскопия, адгезиолизис, иссечение эндометриоза мочевого пузыря (со вскрытием полости). Иссечение очагов эндометриоза тазовой брюшины. При иммуногистохимическом исследовании эндометриодных очагов экспрессия Musashil в эпителиальном компоненте оценена на 2 балла, в стромальном компоненте экспрессии не обнаружена.
Клинический пример 3
Больная Н. 30 лет, обратилась с жалобами на боли в промежности с иррадиацией в правую ногу, боли в нижних отделах живота, запоры, диспареунию. Из анамнеза: 2009 г проведена лапароскопия адгезиолизис, резекция яичников по поводу эндометриоидных кист, иссечение очага эндометриоза ректовагинальной пространства с резекцией задней стенки влагалища. Послеоперационном периоде получала Бусерилин №5, после чего гормональная терапия была продолжена Жанином. 2010 диагностирован рецидив.
В 2013 г при обращении в НЦАГи П диагностирован инфильтративный эндометриоз малого таза: ретроцервикальный эндометриоз с прорастанием в прямую кишку, влагалище и правую боковую стенку таза с вовлечением правого мочеточника. Уретерогидронефроз справа. Нефункционирующая, вторично сморщенная правая почка. Спаечный процесс в малом тазу. Эндометриоз мочевого пузыря. Тубоовариальное образование справа.
Была выполнена лапаротомия, иссечение эндометриоидного инфильтрата малого таза, правосторонняя аднексэктомия. Передняя низкая резекция прямой кишки. Цистоскопия. Резекция мочевого пузыря, цисто-уретеронеоанастмоз. Трансверзостомия.
Экспрессия Musashil и в эпителиальных, и в стромальных компонентах оценена на 6 баллов.
Клинический пример 4
Больная Э. 36 лет. Обратилась в НЦАГиП по поводу обильных и болезненных менструаций, тянущих болей внизу живота, диспареунии и частых запоров. Из анамнеза: в 2010 г. была выполнена лапаротомия, удаление эндометриоидных кист яичников и иссечение эндометриоидного инфильтрата мочевого пузыря. В послеоперационном периоде был назначен Диферелин №4. В том же году был диагностирован рецидив эндометриоза мочевого пузыря. В связи с чем была выполнена трансуретральная резекция мочевого пузыря. В 2013 г. был диагностирован очередной рецидив.
В 2013 при обращении в НЦАГиП были диагностированы: Распространенная форма наружного генитального эндометриоза. Ретроцервикальный эндометриоз с прорастанием и стенозом прямой кишки, прорастанием крестцово - маточных связок, клетчатки малого таза. Эндометриоз мочевого пузыря с прорастанием слизистой и устья левого мочеточника. Эндометриоидные кисты яичников больших размеров. Аденомиз. Двусторонние гидросальпинксы. Спаечная болезнь в малом тазу. Бесплодие 1.
Была выполнена: Нижне-срединная лапаротомия, адгезиолизис, резекция яичников, двусторонняя тубэктомия, иссечение ретроцервикального эндометриоидного инфильтрата, резекция сигмовидной и прямой кишки. Цистоскопия. Резекция мочевого пузыря с реконструкцией устья левого мочеточника. Коагуляция очагов наружного генитального эндометриоза. При иммуногистохимическом исследовании в эндометриоидных очагахэкспрессия Musashil в эпителиальном компоненте оценена на 4 балла, а в стромальном компоненте не обнаружена.