КОМБИНИРОВАННЫЙ ЛЕКАРСТВЕННЫЙ ПРЕПАРАТ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ИНФЕКЦИЙ, ПЕРЕДАЮЩИХСЯ ПОЛОВЫМ ПУТЁМ
COMBINED MEDICINAL PREPARATION FOR PREVENTION OF SEXUALLY TRANSMITTED INFECTIONS

ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[0001] Настоящее изобретение претендует на положительный эффект предварительной заявки США на патент №61/932,706, поданной 28 января 2014 г, содержание которой включено в данную заявку посредством отсылки.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0002] Во всем мире существует неудовлетворенная потребность в технологиях, которые одновременно защищают от инфекции, вызванной вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ, HIV), и других инфекций, передающихся половым путем (STIs). Бактерицидные средства, которые в настоящее время защищают от ВИЧ и других STIs, устраняют опасность для здоровья людей приемлемым и доступным образом и вносят основной вклад в состояние здоровья населения на глобальном уровне. Кроме того, бактерицидные средства, которые имеют показания к применению против STIs, отличающихся от ВИЧ, могут сделать использование таких бактерицидных средств более приемлемым для тех пациентов, которые не беспокоятся насчет развития ВИЧ и, следовательно, такие средства увеличивают приемлемость препаратов и соблюдение режима лечения.
[0003] К сожалению, предыдущие исследования, проведенные с одним из активных фармацевтических ингредиентов (APIs) с широким спектром противовирусной активности и способностью блокировать различные STIs in vitro или in vivo, не обнаружили его эффективность при проведении клинических испытаний. Причины такого отсутствия эффективности при проведении клинических испытаний неизвестны, но могут быть обусловлены разными причинами, включая, например, низкую активность, небольшой диапазон защиты, уменьшение активности в присутствии биологических жидкостей или появление изменений слизистой оболочки и микрофлоры. См. Romano, J.W., et al., Non-specific microbicide product development: then and now. Current HIV research, 2012, 10 (1): p.p. 9-18. Таким образом существует постоянная необходимость в идентификации более активных и безопасных APIs, которые могут быть использованы в бактериологии в отдельности или в комбинации.
[0004] Соединения с известной in vivo бактерицидной активностью, включают каррагинаны. Каррагинаны представляют собой полисахариды, которые могут быть получены из красных (багряных) водорослей, известных как морские водоросли. Они являются структурным компонентом морских водорослей и экстрагируются в виде водорослей трех основных типов, а именно, йота-, каппа- и лямбда-каррагинанов, хотя имеются также и другие типы каррагинанов, включая каппа-II-, мю- и ню-каррагинаны. Каррагинаны широко используются в пище, фармацевтических продуктах и в косметической промышленности как загустители, желирующие агенты, стабилизирующие и диспергирующие агенты. Были проведены широкие фармакологические и токсикологические исследования. Было установлено, что каррагинан является нетоксичным при пероральном, дермальном введении и при ингаляции даже в очень высоких дозах. Поэтому в 1972 г каррагинаны были классифицированы FDA (Управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарств, США) как "общепризнанные безопасными" (GRAS). Food and Drug Administration. GRAS (Generally recognized as safe) food ingredients: Carrageenan. FDA Publications PB-221 206, (1972).
[0005] Дальнейшие обширные оральные фармакокинетические исследования, проведенные на свиньях, крысах, мышах, карликовых песчанках, морских свинках, африканских хорьках, хомячках, собаках и обезьянах, показали, что расщепление каррагинанов в желудочно-кишечном тракте в лучшем случае было минимальным и что абсорбция практически отсутствовала. См. Benitz, K.F., et al., Toxicol. Appi. Pharmacol. 22, 282 (1972); Fox, M.R.S. & Jacobs, R.M. Metal Ions in Biological Systems., pp. 214-248 (Marcel Decker, Inc., 1986); Luscombe, D.K. & Nicholls, P.J. Fd. Cosmet. Toxicol. 11, 229-237 (1973); Naess, B. Acta Vet. Scand. 12, 592-600. 1971; Samman, S. & Roberts, D.C.K. Med. J. Australia 146, 246-249 (1987); U.S. EPA. Health Effects Assessment of for Zinc (and Compounds). EPA/540-1-96-048. 1984. Washington, D.C., US Environmental Protection Agency, Office of Research and Development; Walden, J.T. & Derreth, D. FDA New Release 72/55. FDA Publications 72/55, (1972); Walker, A.P. et al. Fd. Chem. Toxic. 35, 1099-1106 (1997); Weiner, M.L. Intestinal transport of some macromolecules in food. Fd. Chem. Toxic. 26, 10, 867-880 (1988).
[0006] В международной заявке WO 94/15624 описано применение сульфированных полисахаридов, таких как йота-каррагинан, сульфированный декстран, каппа-каррагинан, лямбда-каррагинан, миметики гепарина, гепаринсульфат, полисульфат пентозана, хондроитинсульфат, лентинансульфат, курдлансульфат, N-десульфированный гепарин и фукоидан, для ингибирования передачи ВИЧ от клетки к клетке и, следовательно, передачи синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД, AIDS) половым путем, а также передачи Chlamydia (хламидий) в организм. В этой публикации указано, что йота-каррагинан является наиболее эффективным из коммерчески доступных сульфированных каррагинанов при профилактике ВИЧ-инфекции и при блокировании инфекций, вызванных хламидиями in vitro и in vivo.
[0007] Цинк представляет собой другой известный ингибитор патогенов, передаваемых половым путем, таких как ВИЧ и вирус 2 простого герпеса (ВПГ-2). Было показано, что ацетат цинка (ZA) и сульфат цинка ингибируют инфекцию, вызванную ВИЧ, в клеточной культуре, и инфекцию, вызванную ВПГ-2 как в клеточной культуре, так и в организме лабораторных животных. Соли цинка оказались эффективными при блокировании ВИЧ-инфекции in vitro (см. Haraguchi, Y., et al. Antiviral Res. 43, 123-133 (1999)) и также инфекции, вызванной вирусом ящура, риновирусом человека, вирусом гриппа типа А и типа В, вирусом леса Семлики и вирусом Синдбис. Sergio, W. Medical Hypotheses 26, 253 (1988). Haraguchi et al. обнаружили, что хлорид цинка, ацетат кадмия и хлорид ртути ингибировали продуцирование ВИЧ-1 при проведении анализа ELISA (тест на антиген р24) и RT. Хлорид цинка не проявил значительной цитотоксичности при концентрации, составляющей до 550 мкг/мл.
50
[0008] Пектины представляют собой белки, связывающие углеводы, которые могут играть роль в иммунной системе путем связывания с углеводами, находящимися на поверхности инвазивных патогенных микроорганизмов. Сообщалось, что лектин, известный как Griffithsin (гриффитшин) (GFRT или r G), характеризуется высоко активностью по отношению к ВИЧ и может блокировать репликацию ВИЧ in vitro в субнаномолярных концентрациях (величины IC от 0.02 до 0.8 нМ). См. публикации Alexandre, К.В., et al., Virology, 2012. 423 (2): p. 175-86; Huskens, D. and D. Schols, Marine Drugs, 2012, 10 (7): p. 1476-97; Mori, Т., et al., The Journal of biological chemistry, 2005, 280 (10): p. 9345-53; а также патент США №8,088,729, содержание которых полностью включено в данную заявку посредством отсылки.
[0009] Лектин Griffithsin может образовываться в растениях табака в больших количествах. См. O'Keefe, B.R., et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2009, 106 (15): p.p. 6099-104. Примечательно, что GRFT является стойким к расщеплению несколькими протеазами, он очень стабилен даже при высоких температурах, не вызывает раздражения, не индуцирует активацию клеток и вызывает только минимальные изменения в секреции воспалительных цитокинов и хемокинов в крови и эпителиальных клетках. См. O'Keefe, B.R., et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2009, 106 (15): p.p. 6099-104; Kouokam, J.C., et al., PloS one, 2011. 6 (8): p. e22635; Moncla, B.J., et al., Advances in bioscience and biotechnology, 2011, 2 (6): p. 404-408.
[0010] Лектин Griffithsin (гриффитшин) является абсолютно безопасным и эффективным против ВИЧ на моделях эксплантантов, сообщалось, что модифицированные формы GRFT обладают повышенной активностью, стабильностью и растворимостью. См. O'Keefe, B.R., et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2009, 106 (15): p.p. 6099-104. Было также обнаружено, что он имеет in vivo активность против ВПГ-2. См. Nixon, В., et al., Journal of virology, 2013. 87 (11): p.p. 6257-69.
[0011] Заявители ранее сообщали, что комплекс водорастворимой соли металла и каррагинанов может оказывать антимикробное действие. Водорастворимая соль металла может представлять собой соль цинка, и согласно конкретному варианту комбинация ацетата цинка (ZA) и геля каррагинана является активной против ВИЧ, ВПГ-2, вируса папилломы человека (ВПЧ) и трихомонад, вызывающих Т. vaginalis. См. Fernandez-Romero, J.A., et al., Antimicrobial agents and chemotherapy, 2012, 56 (1): p.p. 358-68; Kenney, J., et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2013. 57 (8): p. 4001-9. См. также патент США №8,567,098, полное содержание которого включено в данную заявку посредством отсылки. Однако все еще существует потребность в активных бактерицидных веществах с дополнительным широким спектром действия, которые могут защитить от инфекции, вызванной ВИЧ и/или другими STIs.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0012] Заявители установили, что бактерицидные композиции с чрезвычайно высокой активностью в широком диапазоне могут быть получены путем соединения лектинов с водорастворимой солью металла и/или каррагинанами. Соответственно, согласно первому аспекту настоящего изобретения предусмотрена антимикробная композиция, содержащая эффективное количество антимикробного агента, включающего один или более лектинов и один или более дополнительных антимикробных агентов, выбранных из группы, состоящей из физиологически приемлемой водорастворимой соли металла, каррагинана или других полимеров типа дендримеров, целлюлозы, аналогов целлюлозы, производных целлюлозы и их комбинаций.
[0013] В соответствии с конкретным вариантом указанная композиция содержит один или более лектинов в комбинации с солью цинка (Z) и/или каррагинанами (С). Согласно конкретным вариантам антимикробная композиция по изобретению может содержать лектин Griffithsin в комбинации с солью цинка (GZ); или может содержать лектин Griffithsin в комбинации с каррагинанами (GC); или может содержать лектин Griffithsin в комбинации с солью цинка и каррагинанами (GZC). Согласно различным конкретным вариантам соль цинка представляет собой ацетат цинка (ZA) и/или цинковую соль каррагинана.
[0014] Согласно другим вариантам композиции по изобретению могут быть в любой физической форме, подходящей для доставки антимикробных агентов, включая гель или раствор, или твердую форму, или высушенную или порошкообразную форму.
[0015] Согласно еще одному аспекту настоящее изобретение направлено на композицию, ингибирующую инфекции, передающиеся половым путем, содержащую антимикробную композицию по данному изобретению. Данным изобретением предусмотрено, что эта композиция может предотвращать передачу STIs вагинальным или ректальным путем, и поэтому она имеет соответствующий состав.
[0016] Композиция по изобретению может также содержать один или более дополнительных антимикробных агентов и/или лекарство, включающее, например, но без ограничения, лекарство, вводимое вагинально или ректально, для получения многоцелевой композиции, которая вводится субъекту для лечения или профилактики одного или более состояний.
[0011] Следует иметь в виду, что профилактика других состояний, помимо антимикробных инфекций, также предусмотрена данным изобретением. Например, в соответствии с конкретным вариантом композиция может содержать один или более антимикробных агентов и может также содержать гормональное или негормональное противозачаточное средство от незапланированной беременности или может включать агент для гормонозаместительной терапии.
[0012] Согласно другому аспекту композиции по изобретению могут быть фармацевтическими композициями и, следовательно, могут содержать один или более антимикробных агентов или лекарств, описанных в данной заявке, в дополнение к одному или более фармацевтическим агентам или эксципиентам. Согласно конкретном варианту фармацевтическая композиция имеет состав, обычный для препарата, продаваемого без рецепта. Согласно другому конкретному варианту фармацевтически приемлемый агент или эксципиент представляет собой физиологический агент, регулирующий величин рН и/или физиологически приемлемый консервант. Согласно другому варианту фармацевтически приемлемый агент или эксципиент облегчает доставку фармацевтической композиции субъекту, нуждающемуся в этом. Согласно конкретном варианту фармацевтическая композиция может быть в виде лекарственной формы, подходящей для вагинального и/или ректального введения.
[0013] В соответствии с еще одним аспектом данное изобретение предусматривает способы ингибирования микробной инфекции у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение субъекту эффективного количества антимикробной композиции по изобретению. Так, согласно одному из вариантов такой способ включает введение антимикробной композиции, которая содержит эффективное количество GRFT и каррагинана, субъекту, нуждающемуся в этом, для ингибирования инфекции, вызванной ВИЧ.
[0014] Согласно другому варианту способ по изобретению включает введение антимикробной композиции, содержащей эффективное количество GRFT и соли цинка, субъекту, нуждающемуся в этом, для ингибирования инфекции, вызванной ВИЧ. Согласно конкретному варианту соль цинка представляет собой ZA.
[0015] Согласно другому варианту такой способ включает введение антимикробной композиции, содержащей эффективное количество GRFT, каррагинан и соли цинка, субъекту, нуждающемуся в этом, для ингибирования инфекции, вызванной ВПГ-2 (вирусом простого герпеса, ВПГ).
[0016] Согласно еще одному варианту такой способ включает введение антимикробной композиции, содержащей эффективное количество GRFT, каррагинана и соли цинка, субъекту, нуждающемуся в этом, для ингибирования инфекции, вызванной одним или более вирусами ВИЧ, ВПГ-2, ВПЧ (HPV) (вирусом папилломы человека), и других инфекций, передающихся половым путем (STIs).
[0017] Согласно еще одному варианту такой способ включает введение антимикробной композиции, содержащей эффективное количество GRFT, субъекту, нуждающемуся в этом, для ингибирования инфекции, вызванной ВПЧ. Согласно конкретному варианту указанная композиция содержит также каррагинан.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЙ
MN
ADA-M
NL4-3
50
[0024] На Фигуре 1 представлены логарифмические графики, которые показывают степень репликации вируса в присутствии GRFT (нМ). Данные, приведенные на Фигуре А и Фигуре 1В, подтверждают, что GRFT обладает высокой активностью против ВИЧ. Данные на Фигуре 1С показывают, что GRFT обладает умеренной in vitro активностью против псевдовирусов (PsV) ВПЧ 16, ВПЧ 18 и ВПЧ45. Активность против ВИЧ, показанная на Фигуре 1А, была определена в клетках TZM-bl с использованием метода анализа MAGI (R. Begay О, et al. AIDS Research and Human Retroviruses, 2011, Sep. 1; 27 (9): 1019-24) и в лабораторных штаммах ВИЧ-1 (вирус X) и ВИЧ-1 (вирус R5). Активность против ВИЧ, показанная на Фигуре 1В, была испытана в среде РВМС (Trkola A, et al., J. Virol. 1999, Nov; 73 (11): 8966-74) с использованием лабораторных штаммов ВИЧ-1. Активность против ВПЧ, показанная на Фигуре 1С, определяли в клетках HeLa с использованием метода анализа репортерного гена люциферазы (Buck СВ, et al. PLoS Pathog. 2006, Jul. 1; 2 (7): e69) и испытания активности против трех разных ВПЧ PsV типов (16, 18 и 45). На Фигурах 1А, 1В, 1С величины IC показаны в виде вертикальных пунктирных линий с доверительным интервалом 95%, их рассчитывали, используя определение дозозависимого эффекта ингибирования с помощью компьютерной программы GraphPad Prism v5.0. Все нетоксичные концентрации GRFT определяли в трипликатах, показаны их средние значения ± SD.
2
2
2
[0025] На Фигуре 2 приведены столбчатые графики, которые показывают, что GRFT препятствует проникновению ВПГ-2 в целевые клетки, но не предотвращает адсорбцию вирусов. На Фигуре 2А показано ингибирование адсорбции вирусов. Анализ подавления бляшкообразования осуществляли, как описано ранее. См. Ashley, R., Herpes simplex viruses, p. 375-395. In Schmidt NJ, Emmons RW (ed), Diagnostic procedures for viral, rickettsial and chlamydial infections, 7th ed. American Public Health Association, Washington, DC, 1995. Штамм ВПГ-2 (G) и GRFT или среду (вирусный контроль) предварительно инкубировали в течение 0, 0.5, 1 и 2 ч при температуре 37°С перед добавлением предварительно охлажденных клеток Vero (Веро) и выдерживали при температуре 4°С. Монослои промывали три раза холодной средой перед добавлением верхнего слоя метилцеллюлозы и инкубировали в течение 48 ч при температуре 37°С при наличии 5% СО и влажности равной 98% перед фиксацией, окрашиванием и определением числа бляшкообразующих единиц (БОЕ). % репликации вирусов определяют по сравнению с вирусным контролем. На Фигуре 2В показано ингибирование проникновения вируса в клетку. Проводили то же определение, что и показанное на Фигуре 2А., но после инкуб в течение 2 ч при температуре 4°С, температуру повышали до 37°С (5% СО и влажность 98%) и продолжали инкубацию еще в течение 2 ч. Затем монослои обрабатывали в течение 2 мин буферным раствором на основе лимонной кислоты (рН=3.0) для инактивации вирусов, оставшихся на поверхности клеток. Монослои промывали три раза холодной средой перед добавлением верхнего слоя метилцеллюлозы и инкубировали в течение 48 ч при температуре 37°С при наличии 5% СО и влажности равной 98% перед фиксацией, окрашиванием и определением числа бляшкообразующих единиц (БОЕ). На графике показана степень репликации вирусов в %% (средняя величина ± SD) по сравнению с вирусным контролем (каждое определение повторяли в трипликатах).
6
[0026] На Фигуре 3 приведен график, который показывает, что бактерицидная композиция, содержащая GZC, значительно снижает инфекцию, вызванную ВПГ-2, на "строгой" мышиной модели. Мышей линии Balb/C с введенными депо-препаратами заражали введением 10 БОЕ на мышь ВПГ-2 в течение 1 (А) или 2 (В) часов после введения указанных составов (GZC=GRFT+ZA+CG; ZC=ZA+CG; GC=GRFT+CG и C=CG, а именно, геля каррагинана) (n=15-30/состав). Количество неинфицированных животных во времени на основании выявленных симптомов показано для каждой подвергавшейся лечению группы. Значительная разница между комбинированными составами и одним С показана звездочками (р<0.037). Отмечена также значительная разница между GZC и ZC (p=x) и GC и ZC (р=Х) через 1 ч и между GZC и GC (р=Х) и ZC и GC (р=Х) через 2 ч. Был проведен статистический анализ при помощи точного критерия Фишера.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0027] Хотя в конце заявки представлена формула изобретения, в которой указаны и четко определены признаки данного изобретения, полагаем, что данное изобретение будет более понятно из следующего описания.
[0028] Все количества и отношения, указанные в данной заявке, даны по весу от общего веса композиции, если не указано иное. Все измерения проводились при температуре 25°С и нормальном давлении, если не указано иное. Все температуры даны в градусах Цельсия, если не указано иное. Настоящее изобретение может включать (без ограничения) или состоять по существу из компонентов данного изобретения, а также из других ингредиентов или элементов, описанных в данной заявке. Используемый в данной заявке термин "содержащий" относится к перечисленным элементам или к их эквивалентам по структуре или функции плюс любой другой элемент или элементы, которые не перечислены. Термины "имеющий" и "включающий" также являются открытыми (не ограничивающими), если из контекста не следует другое.
[0029] Все интервалы, указанные в данной заявке, включают конечные значения, в том числе те, которые определяют интервал "между" двумя величинами. Такие термины как "примерно," "вообще", "по существу (практически)" и т.п. должны рассматриваться как модифицирующие термин или величину, чтобы они не были абсолютными, но не охватывали известный уровень техники. Такие термины будут определяться обстоятельствами и теми терминами, которые они модифицируют, так как последние понятны специалистам в данной области техники. По меньшей мере, они включают степень ожидаемой ошибки опыта, технические ошибки и ошибки приборов, используемых для данного метода измерения величины.
[0030] Если иное не указано, термины, используемые в данной заявке в единственном числе, включают также множественное число, например, термин "каррагинан" может означать по меньшей мере один каррагинан, а также несколько каррагинанов, то есть более, чем один каррагинан, включая, но без ограничения, каррагинаны разных типов.
[0031] Используемый в данной заявке термин "и/или", когда перечисляются два или более средств, означает, что любой из перечисленных компонентов может использоваться, или что может использоваться любая комбинация двух или более перечисленных компонентов. Например, если описана композиция как содержащая агенты А, В, и/или С, композиция может содержать только А; только В; только С; А и В в комбинации; А и С в комбинации; В и С в комбинации; или А, В и С в комбинации.
[0032] Все ссылки, указанные в настоящей заявке, включены в нее полностью посредством отсылки.
[0033] Было изучено антимикробное действие каррагинанов и цинка, в отдельности или в комбинации, например, в виде гелей, содержащих ацетат цинка/каррагинан, см., например, публикации Fernandez-Romero, J.A., et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2012, 56 (1): p.p. 358-68; Kenney, J., et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2013, 57 (8): p.p. 4001-9; и патент США №8,367,098, все из которых включены в данную заявку посредством отсылки.
[0034] Кроме того, сообщалось, что углеводные связующие агенты, такие как некоторые водорослевые лектины, имеют активность против ВИЧ. Считается, что самым активным из этих водорослевых лектинов является Griffithsin (GFRT), который, как сообщалось, имеет активность против ВИЧ, гепатита С и коронавируса, связанного с атипичной пневмонией (SARS). См. Huskens, D. and D. Schols, Marine drugs, 2012, 10 (7): p.p. 1476-97. Недавно было показано, что GRFT обладает ингибиторным действием в отношении ВПГ-2. См. Nixon, В., et al., Journal of virology, 2013, 87 (11): p.p. 6257-69.
[0035] Заявители совершенно неожиданно установили, что некоторые антимикробные агенты можно соединить с получением антимикробной композиции, которая является более активной и проявляет синергический ингибирующий эффект. Конкретно, как описано в данной заявке, заявители обнаружили, что активность GRFT против ВИЧ повышается в комбинации с ацетатом цинка (ZA), при этом проявляется синергический эффект против ВИЧ. Кроме того, GRFT в комбинации с ZA и CG (GZC) проявляет in vitro и in vivo активность против ВПГ-2. В дополнение, заявители также установили, что GRFT в комбинации с каррагинаном оказывает синергическое ингибирующее действие на ВПЧ.
[0036] Как уже упоминалось, композиции согласно настоящему изобретению могут быть приготовлены в виде геля, как это описано в Примере 1. Используемый термин "гель", например, "каррагинановый гель", относится к довольно вязкой форме композиции, которая может быть использована для введения антимикробных агентов способом, обеспечивающим доставку такой композиции с минимальной потерей при доставке, например, при интравагинальном или ректальном введении. Композиции по изобретению могут быть получены в виде других физических форм, известных специалисту в данной области, включая, но без ограничения, твердые формы, растворы или высушенные, или порошкообразные формы, которые могут быть особенно подходящими в зависимости от вида предполагаемой лекарственной формы. Таким образом, составы, отличающиеся от гелей, также предусмотрены данным изобретением и могут быть получены обычными способами. Например, компоненты композиции, содержащей GFRT, каррагинан и растворимую в воде соль металла, такую как ацетат цинка, могут быть соединены в растворе для получения композиции или могут быть соединены специалистом в данной области в виде высушенных или порошкообразных форм известными лабораторными методами.
[0037] Заявители также отмечают в данной заявке, что GRFT в отдельности может обладать ингибирующим действием на ВПЧ. Как известно заявителям, в данной заявке впервые показано, что GRFT, представляющий собой лектин с описанной противовирусной активностью по отношению к оболочечным вирусам, обладает активностью против ВПЧ, который является "раздетым" вирусом.
[0038] Как предусмотрено настоящим изобретением, данное изобретение включает антимикробные композиции, которые могут содержать два или более антимикробных агентов, которые в комбинации обеспечивают повышенное ингибирующее действие. Далее предусматривается, что такие бактерицидные композиции могут содержать по меньшей мере два разных антимикробных ингредиента, которые могут обеспечить синергическую противовирусную эффективность против одного или более целевых вирусов, включая ВИЧ, ВПГ-2, ВПЧ и вирусы, вызывающие другие STIs. В контексте данной заявки антимикробные агенты включают противовирусные агенты.
[0039] "Противовирусные агенты", используемые согласно изобретению, известны специалисту в данной области. Согласно данному изобретению такие агенты включают, но без ограничения, растворимые в воде соли металлов, в том числе, соли цинка, каррагинаны и лектины. Кроме того, "противовирусные агенты " включают другие соединения, известные специалисту в данной области, включая, например, различные полимеры, такие как на основе нафталинсульфонатов, и другие сульфированные или сульфонированные полимеры (McCormack S et al., Lancet, 2010, Oct 16; 376 (9749): 1329-37); дендримеры (Rupp R, et al., Int. J. Nanomedicine, 2007; 2 (4): 561-6); и целлюлозу, в том числе ее аналоги и производные (Chaobo Huanga, et al., Biomaterials, Volume 33, Issue 3, January 2012, pages 962-969).
[0040] Как предусмотрено настоящим изобретением, бактерицидные агенты, подходящие для применения по изобретению (включая, но без ограничения, другие противовирусные агенты) являются известными специалисту в данной области. Следует иметь в виду, что эти бактерицидные агенты включают соединения, которые могут быть использованы против инфекций, вызванных STIs, включая, но без ограничения, ВИЧ-инфекции, следует отметить, что антимикробные агенты, заявленные в данной заявке, необязательно все являются бактерицидами, действующими против ВИЧ. См. McCormack S et al., Lancet, 2010, Oct. 16; 376 (9749): 1329-37.
[0041] В соответствии с конкретным вариантом композиция по изобретению включает ZA, соединенный с каррагинаном, в комбинации с GRFT или другим лектином для получения композиции, которая обладает очень высокой активностью широкого спектра против ВИЧ, ВПГ-2, ВПЧ и, возможно, вирусов, вызывающих другие STIs. Согласно другим конкретным вариантам композиции могут включать GRFT в любой комбинации с ZA и/или каррагинаном. Данное изобретение предусматривает также, что композиции могут содержать Griffithsin с целью профилактики инфекций, вызванных ВПЧ.
[0042] Используемый в данной заявке термин "Griffithsin" (гриффитшин) в общем применяется для обозначения природного Griffithsin или любого родственного, функционально эквивалентного (то есть противовирусного) полипептида или его производного, включая, но без ограничения, формы лектина, описанные в патенте США №8,088,729.
[0043] Используемый в данной заявке термин "другие STIs" известен специалисту в данной области и включает, например, инфекцию, вызванную N. Gonorrhoeae (гонорея), С. Trachomatis (хламидиоз), бактериальный вагиноз, Т. Vaginalis (трихомониаз), гепатит В и другие.
[0044] Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, можно считать, что применение бактерицидных препаратов, доставляющих различные антимикробные агенты с различным механизмом действия, по всей видимости, будет являться более эффективной стратегией профилактики и/или лечения широкого спектра микробных инфекций, в том числе, инфекций, вызванных более, чем одним патогеном, и эти препараты могут обеспечить улучшенный и синергический ингибирующий эффект против вирусов, таких как ВИЧ и вирусы, вызывающие другие STIs, когда применяются один или более антимикробных агентов. Таким образом, различные антимикробные агенты могут быть соединены, как описано в данной заявке, для достижения различных уровней антимикробной защиты, и при применении этих агентов в различных дозах можно обеспечить различную продолжительность их действия. Данное изобретение охватывает также тот факт, что композиции по изобретению, являющиеся пригодными для профилактики STIs, включающих, но без ограничения, инфекцию, вызванную ВИЧ, обеспечивают стратегию профилактики инфекции, вызванной ВИЧ, которая может быть более приемлемой для применения отдельными лицами, не желающими идентифицировать или признавать себя потенциально рискующими заболеть ВИЧ-инфекцией, и, следовательно, тем самым обеспечивается большая польза для общественного здоровья во всем мире.
[0045] Как подразумевается в данной заявке, согласно конкретному варианту антимикробные композиции по изобретению не включают любые другие антиретровирусные препараты (ARVs). Таким образом, в случае, когда введение композиции по изобретению приводит к появлению резистентности к лекарству, это не будет являться резистентностью к ARV. Как таковые, композиции по изобретению менее вероятно вызывают резистентность к лекарству, которая могла бы негативно сказаться на применении альтернативного лечения с использованием обещающих ARVs. Таким образом, как заявлено в данной заявке, применение описанных композиций позволяет избежать выбора ВИЧ-резистентных штаммов (что иногда происходит при применении ARVs) и, следовательно, композиции по изобретению обеспечивают предпочтительную альтернативу для профилактики ВИЧ-инфекции.
[0046] Как подразумевается в данной заявке, поскольку композиции по настоящему изобретению могут быть использованы для лечения множественной инфекции, вызванной более, чем одним видом микробов, в идеальном случае они могут быть использованы без необходимости проведения первого скрининга субъекта на наличие ВИЧ. Кроме того, как предусмотрено данным изобретением, композиции по изобретению могут быть получены для безрецептурного отпуска (ОТС). Таким образом, предполагается, что такие композиции, включая композиции против ВИЧ-инфекции, обеспечат увеличение доступности и приемлемости этих бактерицидных композиций, и, следовательно, принесут большую пользу общественному здоровью.
[0047] Когда каррагинан содержится в композициях по изобретению, каррагинан может представлять собой лямбда-каррагинан. В случае, если содержатся не лямбда-каррагинаны (тогда каррагинановый компонент композиции можно назвать "каррагинанами" или "смесью каррагинанов"), смесь каррагинанов включает по меньшей мере примерно 50% (и предпочтительно по меньшей мере 50%) лямбда-каррагинана в расчете на общий сухой вес каррагинанов в композиции. Согласно более предпочтительным вариантам количество лямбда-каррагинана составляет по меньшей мере примерно 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% в расчете на общий сухой вес каррагинанов (то есть, лямбда-каррагинана и не лямбда-каррагинанов). Другие предпочтительные количества лямбда-каррагинана равны по меньшей мере примерно 75%, по меньшей мере примерно 85%, по меньшей мере примерно 95%, от примерно 85 до примерно 99%, и от примерно 94 до примерно 97%. Каррагинаны, подходящие для применения согласно данному изобретению, являются доступными у коммерческих фирм-поставщиков (например, Sigma Aldrich, St. Louis, МО.)
[0048] Остальные каррагинаны в композициях по изобретению могут включать по меньшей мере один не лямбда-каррагинан. Под термином "не лямбда-каррагинан" подразумевают любой каррагинан, который отличается от лямбда-каррагинана, такой как каппа-каррагинан, йота-каррагинан, каппа-II-каррагинан (который включает каппа- и йота-каррагинаны), мю-каррагинан и ню-каррагинан. Не лямбда-каррагинаны также доступны у коммерческих фирм-поставщиков (например, Sigma Aldrich, St. Louis, МО) или могут быть получены из экстракта морских водорослей стандартными методами. Согласно предпочтительным вариантам не лямбда-каррагинаны включают каппа-каррагинан, йота-каррагинан и каппа-II-каррагинан и смеси любых двух или более указанных каррагинанов. Согласно более предпочтительным вариантам не лямбда-каррагинаны включают каппа-II-каррагинан. Согласно предпочтительным вариантам не лямбда-каррагинан в смеси каррагинанов составляет менее примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,20, 21, 22, 23, 24 или примерно 25% в расчете на общий сухой вес каррагинанов. Согласно более предпочтительным вариантам не лямбда-компонент составляет менее примерно 25%, менее примерно 15%, менее примерно 5%, от примерно 1 до примерно 15%, или примерно от 3 до примерно 6% в расчете на общий сухой вес каррагинанов. Согласно другим предпочтительным вариантам смесь каррагинанов практически или полностью не содержит декстрозы, ингредиента, который обычно обнаруживается в каррагинанах, применяемых в пищевой промышленности.
[0049] Могут быть использованы композиции, содержащие лямбда-каррагинан или каррагинаны в количествах менее, чем 1% или более, чем 5%, пока они обеспечивают антимикробное действие и сохраняют фармацевтическую приемлемость, например, приемлемость для вагинального введения. Под "приемлемостью для вагинального введения" подразумевают, что реологические свойства, такие как вязкость композиции, позволяют использовать ее для намеченной цели (например, эта композиция сохраняет такую вязкость, что она может быть применена пользователем и оставаться в куполе влагалища, а также имеет эстетические свойства, такие как практическое отсутствие запаха, эластичность, прозрачность, бесцветность и отсутствие вкуса). Вязкость выбирается таким образом, чтобы композиция покрывала ровным слоем эпителиальную выстилку купола влагалища. В общем, вязкость композиций составляет от примерно 10,000 до примерно 50,000 сП, предпочтительно от примерно 20,000 до примерно 50,000 сП, и более предпочтительно от примерно 30,000 до примерно 50,000 сП.
3
6
5
[0050] Каррагинан представляет собой полисахарид, состоящий из повторяющихся единиц D-галактозы и 3,6-ангидро-D-галактозы, расположенных в линейной цепи. Полимер является сульфированным в высокой степени, содержит три группы SO на каждую единицу дисахарида каррагинана и имеет молекулярную массу в большом диапазоне. В общем, смеси каррагинанов для использования в композициях по изобретению могут иметь молекулярную массу до примерно 2×10 дальтон, при этом менее 1% молекул каррагинана имеют молекулярную массу, составляющую 1×10дальтон (при определении молекулярной массы методом газ- (видимо, гель)-проникающей хроматографии и методом светорассеяния). Более конкретно, лямбда-каррагинан по изобретению имеет средневесовую молекулярную массу от примерно 600,000 до примерно 1,200,000 дальтон. Это физическое свойство придает конечной композиции свойство не абсорбироваться, что в свою очередь обеспечивает пролонгированную антимикробную активность.
[0051] Каррагинаны согласно настоящему изобретению могут обеспечить несколько других преимуществ. Они остаются стабильными, если их подвергают замораживанию, воздействию комнатных температурили, кипячения. Смесь каррагинанов совместима со средой, имеющейся в женском влагалище. Не ограничиваясь какой-либо теорией, можно полагать, что каррагинаны совместимы с вагинальной средой человека и не действуют как субстрат и не вызывают или не стимулируют другим образом рост естественной вагинальной флоры, и не являются токсичными в той степени, чтобы нарушить естественный баланс микрофлоры во влагалище. Помимо свойств, присущих каррагинанам, используемым по изобретению, следует отметить, что их антимикробная активность сохраняется в течение определенного времени, так как они не абсорбируются или расщепляются систематически с получением любых абсорбируемых побочных продуктов, вредных для людей.
[0052] Как указывалось выше, заявители ранее сообщали о противовирусном действии комплекса водорастворимой соли металла и каррагинанов. Такие комплексы соли металла и каррагинанов могут применяться в композициях согласно данному изобретению в комбинации с одним или более лектинами. В соответствии с предпочтительными вариантами соль металла представляет собой соль цинка (и антимикробную композицию можно назвать "каррагинат цинка").
[0053] Цинк является ингибитором патогенов, передаваемых половым путем, таких как ВИЧ и ВПГ-2. Было показано, что ацетат цинка и сульфат цинка ингибируют ВИЧ-инфекцию в клеточной культуре, а ВПГ-2 - и в клеточной культуре, и в организме лабораторных животных. Было обнаружено, что соли цинка эффективны при блокировании инфекции, вызванной ВИЧ, in vitro (Haraguchi, Y., et al. Antiviral. Res. 43, 123-133 (1999) и также блокировании инфекции, вызванной вирусом ящура, человеческим риновирусом, вирусом гриппа типов А и В, вирусом леса Семлики и вирусом Синдбис (Sergio, W. Medical Hypotheses 26, 253 (1988)). Haraguchi et al. обнаружили, что хлорид цинка, ацетат кадмия и хлорид ртути ингибировали продуцирование ВИЧ-1, что было показано при проведении анализа ELISA (р24) и RT. Хлорид цинка не обладает значительной цитотоксичностью в концентрациях до 550 мкг/мл. Далее, Fenstermacher и DeStefano предположили, что цинк образует очень стабильный комплекс обратная транскриптаза ВИЧ-(праймер-матричный комплекс) со значительно сниженной каталитической активностью. См. Fenstermacher KJ, Destefano JJ. Journal of Biological Chemistry, 2011, Nov 18; 286 (47): 40433-12.
[0054] Таким образом, помимо использования в комбинации с каррагинанами и лектинами данное изобретение предусматривает, что растворимые в воде соли цинка могут быть применены в комбинации с одним или более лектинами в композициях по данному изобретению. Конкретно, композиция, содержащая комбинацию GFRT и ацетат цинка, может быть использована для повышения активности GFRT против ВИЧ.
4
2
2
2
[0055] Соли цинка, подходящие для осуществления настоящего изобретения, включают и неорганические соли, и органические соли, которые проявляют антимикробные свойства, не вызывая неприемлемого раздражения при использовании согласно данному изобретению. Возможные для применения по данному изобретению водорастворимые соли цинка включают ацетат цинка, пропионат цинка, бутират цинка, формиат цинка, глюконат цинка, глицерат цинка, гликолят цинка, лактат цинка, сульфат цинка, хлорид цинка и бромид цинка. Применение ZnSO, ZnCl, ZnBr, Zn(Ac) и т.д. также предусмотрено данным изобретением. Соответствующие соли меди и серебра также можно применять по изобретению, при условии, что они не раздражают in vivo и не вызывают разложения любых абсорбируемых побочных продуктов, вредных для людей. Как предусмотрено настоящим изобретением, композиции по изобретению могут включать от примерно 0.03% до 1.5% растворимых в воде солей металлов и, в частности, от примерно 0.3% до 1.0%, в расчете на общий вес композиции.
[0056] Комплексы каррагинана и соли цинка, и особенно ацетат цинка, для применения согласно настоящему изобретению могут быть получены в соответствии со способами, известными из предшествующего уровня техники, например, как описано в патенте США №8,367,098. См. также публикации  JA, et al. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2012 Jan; 56 (1): 358-68; Kenney, J., et al., Antimicrobial agents and chemotherapy, 2013, 57 (8): p. 4001-9, все из которых включены в данную заявку посредством отсылки. Вкратце, такие комплексы могут быть получены стандартными способами, согласно которым ионы металлов замещают катионы, которые по природе содержатся в основной цепи полисахарида. Например, каррагинат цинка (который относится к комплексу катионов цинка и каррагинанов по изобретению) представляет собой соединение, синтезируемое способом, когда цинк нековалентно присоединяется к сульфатным группам каррагинанов. См. Kenney, J., et al., Antimicrobial agents and chemotherapy, 2013, 57 (8): p.p. 4001-9.
[0057] Вышеописанный способ позволяет получить соединение, которое растворяется в воде и является активным против оболочечных вирусов, таких как ВИЧ и ВПГ-2 или простые (безоболочечные) вирусы типа ВПЧ. В отличие от неорганических или обычных органических солей цинка каррагинат цинка сохраняет предпочтительные реологические свойства и имеет высокую молекулярную массу (до 2,000,000 Да), что позволяет использовать его в составе вагинального или ректального продуктов, которые не вызывают раздражения и не абсорбируются. Такую композицию можно называть "комплексом" вследствие наличия молекулярных взаимодействий между металлом и каррагинанами, которые неблагоприятны для его диссоциации с получением свободных катионов металлов или препятствуют ей. Данные комплексы соли металла и отрицательно заряженных сульфированных полисахаридов отличаются от смесей водорастворимых солей металлов и каррагинанов своими физическими, химическими и/или антимикробными свойствами.
[0058] Как описано в данной заявке, добавление одного или более лектинов к комбинации водорастворимой соли цинка и каррагинанов или комбинация лектина или с солью цинка, или с каррагинанами может обеспечить получение композиций с повышенной противовирусной активностью. Лектины, подходящие для использования в композициях согласно данному изобретению, включают, но без ограничения, Griffithsin (гриффитшин), циановирин, сцитовирин, актиногивин и другие антивирусные лектиновые белки. См., например, Brichacek В, et al., In Vivo Evaluation of Safety and Toxicity of a Lactobacillus jensenii Producing Modified Cyanovirin-N in a Rhesus Macaque Vaginal Challenge Model. Bereswill S, editor. PLoS ONE. 2013 Nov 12; 8 (11): e78817; Takebe Y, et al. Antiviral Lectins from Red and Blue-Green Algae Show Potent In Vitro and In Vivo Activity against Hepatitis С Virus. Choi J, editor. PLoS ONE. 2013 May 21; 8 (5): e64449; Tanaka H, et al. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2009 Sep 15; 106 (37): 15633-8; and O'Keefe, B.R., et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2009, 106 (15): p. 6099-104.
[0059] Особенно следует отметить, что заявители обнаружили, что добавление GFRT к композициям каррагинана и к композициям ацетата цинка (одного или в комбинации) может обеспечить неожиданную и синергическую противовирусную активность. Конкретно, как показано в приведенных ниже примерах, активность GFRT против ВИЧ в значительной степени повышается в присутствии ацетата цинка. Кроме того, ингибирующая активность каррагинана против ВИЧ, а также ингибирующее действие комбинации каррагинанов и ацетата цинка на ВПГ-2 синергически повышаются в присутствии GFRT.
[0060] Таким образом, как предусмотрено данным изобретением, антимикробные композиции могут содержать один или более лектинов в комбинации с одной или более солями цинка и с каррагинаном. Антимикробные агенты могут быть использованы в различных комбинациях, указанных в данной заявке, с получением бактерицидных композиций с повышенной и синергической антимикробной активностью. Такие композиции могут быть получены обычными способами. Например, дополнительные агенты, в том числе GFRT и/или ZA, могут содержаться в смеси с каррагинанами и/или быть соединены с ними, например, в виде комплекса. Например, каррагинаны могут быть в виде комплекса с цинком, как описано в патенте США №8,367,098.
[0061] Комбинация каррагинанов, водорастворимых солей металлов и лектинов, предусмотренная данным изобретением, предпочтительно включает каррагинаны, описанные в данной заявке, в том числе лямбда-каррагинан, в количествах, составляющих по меньшей мере 50% в расчете на сухой вес каррагинанов, остальные каррагинаны представляют собой по меньшей мере один не лямбда-каррагинан, и большинство из них является комбинацией 95% лямбда-каррагинана и 5% каппа-каррагинана, при этом вся композиция находится в виде геля, включающего от 1% до 5% каррагинана, предпочтительно примерно 3% каррагинана; композиции включают водорастворимые соли металлов, предпочтительно, соли цинка, наиболее предпочтительно в виде ацетата цинка или лактата цинка, содержащие от примерно 0.1 вес. % до 1.5вес.% металла, такого как цинк, в расчете на общий вес композиции, наиболее предпочтительно примерно 0.3 вес. % металла; и могут включать также один или более лектинов. Согласно конкретному варианту количество лектинов может быть от примерно 0.01 до 1%, и в частности, от примерно 0.05% до 0.2%, в расчете на общий вес композиции. Как предусмотрено в данной заявке, лектин, например, GRFT, может содержаться в композиции в количестве, составляющем, например, 0.1% в расчете на общий вес композиции.
[0062] Как предусмотрено в данной заявке термин "эффективное количество антимикробного агента" означает количество достаточное для ингибирования инфективности одной или более микробных инфекций у субъекта, нуждающегося в этом. Однако, как известно специалисту в данной области, эффективное количество антимикробного агента или фактический вес такого агента, применяемого в композициях, сильно зависит от ряда факторов, включающих, например, истинную антимикробную активность лектинов и других антимикробных агентов в композиции в отношении целевых микробов, которые должны быть уничтожены. Такая активность может быть определена в соответствии с обычными методами и, соответственно, может быть определено количество активных агентов. Например, противовирусная активность вещества может быть измерена методами, описанными в данной заявке (см. Фигуру 1 и Таблицу 2). Другие факторы, рассматриваемые при определении количества активного антимикробного агента, известны специалисту в данной области и включают вид фактической лекарственной формы и способ доставки фармацевтической композиции, например, вопрос, предназначена ли лекарственная форма для пролонгированного высвобождения.
[0063] Следует иметь в виду, что отдельные активные антимикробные агенты в композиции, например, противовирусные компоненты, которые составляют антимикробный агент в композициях по изобретению, могут содержаться в композиции в количестве, достаточном для получения бактерицидного, например, противовирусного эффекта при введении этих композиций субъекту, нуждающемуся в этом. Как описано в данной заявке и подробно рассмотрено в следующих ниже примерах, повышенная и синергическая бактерицидная активность может быть достигнута при применении комбинации определенных противовирусных агентов.
[0064] Таким образом, как уже обсуждалось выше, для того, чтобы достичь антимикробного эффекта, лямбда-каррагинан или каррагинаны обычно вводятся в количествах от примерно 1 до примерно 5% в расчете на общий вес композиции. При наличии каррагинанов в композиции по изобретению, согласно предпочтительным вариантам, каррагинаны содержатся в количестве примерно 3% в расчете на общий вес композиции. Однако эти количества, а также количества лектина, солей металлов и других агентов могут меняться и могут быть определены специалистом в данной области обычными методами.
[0065] Под терминами "антимикробная композиция" или "антимикробный эффект" подразумевают, что эта композиция ингибирует или уменьшает вероятность передачи половым путем инфекции, вызванной бактерией, простейшим, вирусом или другим микробом. Композиции согласно данному изобретению полезны при защите против инфекций, передающихся половым путем, например, путем ингибирования инфекции, вызванной ВИЧ, ВПЧ и ВПГ-2. С другой стороны, термины "антимикробная композиция" или "антимикробный эффект" не выражают, не подразумевают или не ограничивают какой-либо конкретный путь ингибирования передачи инфекции.
[0066] Заявитель также неожиданно установил, что GFRT обладает противовирусным действием на ВПЧ. Таким образом, композиции, содержащие GFRT в отдельности или в комбинации с другими антимикробными или фармацевтическими агентами, а также способы лечения ВИЧ-инфекции у субъекта, нуждающегося в этом, путем введения таких композиций включены в объем настоящего изобретения. Эффективное количество GFRT в таких композициях и такие лекарственные формы могут быть определены специалистом в данной области в соответствии с обычными способами, например, описанными в данной заявке.
[0067] Специалисту в данной области понятно, что любая одна или более бактерицидных композиций, описанных в данной заявке, могут обладать ингибирующим действием в отношении других STIs, и, следовательно, введение этих композиций субъекту, нуждающемуся в этом, может быть использовано одновременно для лечения или профилактики других STIs как часть технологии многоцелевой профилактики и таким образом способствует улучшению общественного здоровья.
[0068] Таким образом, данное изобретение предусматривает, что заявленные антимикробные композиции могут вводиться субъекту, такому как человек, для лечения или профилактики микробной инфекции, включая, но без ограничения, вирусную инфекцию, например, путем ингибирования роста или репликации микроба. Вирусы, представляющие интерес, для лечения и профилактики появления которых применяют такие композиции, включают, но без ограничения, различные штаммы ВИЧ, ВПЧ, ВПГ, в том числе, ВПГ-2.
[0069] Согласно данному изобретению субъект, нуждающийся в лечении или профилактике, включает людей, которые находятся в зоне риска заразиться микробной, например, вирусной инфекцией или уже являются инфицированными. Данная заявка в особенности предусматривает случаи риска развития в качестве микробной инфекции вирусной инфекции и включает, но без ограничения, случаи развития инфекции, передающейся половым путем. Используемый в данной заявке термин "лечение" субъекта понятен специалисту в данной области и охватывает уменьшение симптомов и/или удаление патогенов у уже инфицированного субъекта. Такое уменьшение может быть связано со снижением вероятности передачи патогена другому субъекту, а также снижением вероятности развития другой микробной инфекции у подвергающегося лечению субъекта, например, ВИЧ-инфекции. Например, было обнаружено, что субъект с инфекцией, вызванной вирусом герпеса, имеет повышенную склонность к заражению ВИЧ-инфекцией. Таким образом, полагают, что лечение STI в соответствии со способами по изобретению сделает пациента менее восприимчивым к другим инфекциям, например, к ВИЧ-инфекции.
[0070] Используемый в данной заявке термин "профилактика" относится к профилактическому лечению, осуществляемому для уменьшения вероятности развития микробной инфекции, включая, но без ограничения, инфекцию у неинфицированного восприимчивого пациента, которая передается половым путем.
[0071] Используемый в данной заявке термин "другие STIs" известен специалисту в данной области и включает, например, инфекции, вызванные гонококками, N. gonorrhoeae, хламидиями С. trachomatis, бактериальный вагиноз, трихомониаз (T. Vaginalis), гепатит В и другие.
[0072] В дополнение к каррагинанам и солям металлов, описанным в данной заявке, в композициях по изобретению могут быть также использованы другие антимикробные соединения, включая полимеры, такие как полимеры нафталинсульфонатов и другие сульфированные и сульфонированные полимеры (McCormack S et al., Lancet. 2010 Oct. 16; 376 (9749): 1329-37; дендримеры (Rupp R, et al., Int. J. Nanomedicine, 2007; 2 (4): 561-6; и целлюлозу, включая целлюлозу и ее аналоги и производные (Chaobo Huanga, et al., Biomaterials, Volume 33, Issue 3, January 2012, pages 962-969. Эти и другие антимикробные агенты, включая, но без ограничения, противовирусные соединения, подходящие для применения в данных композициях, известны специалисту в данной области.
[0073] Соединения согласно данному изобретению могут содержать в своем составе другие активные агенты и/или инертные ингредиенты в зависимости от намеченного применения (как описано ниже). Например, фармацевтические препараты, содержащие один или более терапевтических агентов, включая, например, один или более активных антимикробных агентов или другие терапевтические агенты или лекарства, в фармацевтически приемлемом носителе охвачены настоящим изобретением. Подходящие носители для использования в фармацевтических композициях и особенно в вагинально и ректально приемлемых лекарственных формах, охваченные данным изобретением, известны специалисту в данной области и включают, например, различные коммерчески доступные, физиологически приемлемые носители, адъюванты, эксципиенты и разбавители.
[0074] Такие композиции могут быть рецептурными, а также безрецептурными. Как известно, "безрецептурные" фармацевтические композиции (известные также как "ОТС" или продаваемые без рецепта) известны специалисту в данной области, и они относятся к препаратам, которые можно купить без рецепта.
[0075] Согласно конкретным вариантам композиции по изобретению могут также содержать лекарство, вводимое вагинально. Такие предпочтительные лекарства включают, например, контрацептивные агенты, такие как стероидные гормоны, в том числе, те, которые описаны в патенте США №5,972,372 (Saleh, et al, "Saleh"), который включен в данную заявку посредством отсылки. Примеры контрацептивных агентов, применяемых согласно данному изобретению, включают прогестины, АСТН, андрогены, эстрогены, гонадотропин, гормон роста человека, менотропины, прогестерон, прогестины (например, левоноргестрел, норэтиндрон, 3-кето-дезогестрел и гестоден), прогестоген, урофоллитропин, вазопрессин и их комбинации. Предпочтительными агентами являются прогестациональные соединения (например, норэтиндрона ацетат и NESTORONE™ ("NES"), (а именно, 16-метилен-17альфа-ацетокси-19-норпрегнен-3,20-дион)), и прогестины (например, левоноргестрел (LNG)).
[0076] Предпочтительным контрацептивным агентом является Nestorone, 16-метилен-17альфа-ацетокси-19-норпрегнен-3,20-дион (далее "NES"), который в литературе обозначается как "ST-1435". При проведении сравнительных опытов с использованием классического метода измерения прогестациональной активности было установлено, что NES обладает прогестациональной активностью, в 100 раз превышающей соответствующую активность прогестерона и в 10 раз превышающей такую же активность левоноргестрела. См. Kumar, N., et al. Steroid, 65, 629-636 (2000). Следовательно, для достижения ингибирования овуляции требуются меньшие количества NES. Эта активность, соединенная с отсутствием андрогенной, эстрогенной и глюкокортикоид-подобной (отложение гликогена в печени) активности и отсутствием действия на липидные параметры или параметры клинической химии, придает особые преимущества применению NES в качестве контрацептивного агента. См. Kumar, N., et al. Steroid, 65, 629-636 (2000); Odlind, V., et al. Contraception, 31, 130 (1985); Robins, A. & Bardin, C. Ann. NY Acad. Sci. 828, 38-46 (1997). Однако, было обнаружено, что NES подвергается быстрому метаболизму и инактивации при пероральном введении, но он подходит для применения для кормящих женщин, когда его вводят при помощи имплантов или вагинальных колец. См. Massai, R., et al. Steroid, 65, 703-707 (2000); Lahteenmaki PLA, et al. Contraception, 42, 555-562 (1990). Предпочтительная доза доставки NES в комбинации со смесью к/λ каррагинанов в виде геля составляет от примерно 75 до примерно 100 мкг в день, это количество обеспечивает уровень NES в плазме равный примерно 200 пмол/л и приводит к обильному кровотечению во время менструаций. Другие предпочтительные лекарства, вводимые вагинально, включают агенты для гормонозаместительной терапии, такие как эстрогенные вещества (например, этинилэстрадиол) и другие стероидные соединения.
[0077] Не ограничиваясь какой-либо одной теорией, можно предположить, что каррагинаны выполняют двойную функцию придания бактерицидных свойств и в то же время обеспечения высвобождения системы доставки контрацептивного агента или агента для гормонозаместительной терапии. Кроме того, полагают, что каррагинаны могут придавать бактерицидные свойства, стабилизируя эмульсии белков. Хотя они могут быть использованы в виде геля, композиции, описанные в данной заявке, не ограничены только применением каррагинанов в виде гелей. Могут быть получены составы для других систем доставки и, следовательно, эти композиции могут быть в любой физической форме, которая подходит для доставки антимикробных агентов, включая гели или раствор, или твердую форму, или высушенную или порошкообразную форму.
[0078] Композиция может также содержать физиологически приемлемый агент, регулирующий величину рН, подходящий для использования в композициях, описанных в данной заявке. Подходящие буферные агенты могут быть подобраны специалистом в данной области стандартными методами. Согласно конкретному варианту буфер является ацетатным буфером. Согласно другому варианту ацетатный буфер содержит смесь уксусной кислоты и ацетата натрия.
[0079] Согласно конкретному варианту композиции могут также содержать консервант. Согласно другому конкретному варианту консервант представляет собой метилпарабен. Другие подходящие консерванты включают, например, алкиловые эфиры пара-оксибензойной кислоты, такие как метил-пара-оксибензоат, пропилоксибензоат, производные гидантоина, парабены, такие как метилпарабен, соли пропионовой кислоты, триклозана трикарбоанилид, масло чайного дерева, спирты, фарнезол, фарнезола ацетат, гексахлорофен и четвертичные аммонийные соли, такие как соли бензалкония, цинка и алюминия, бензоат натрия, бензиловый спирт, бензалконийхлорид и хлорбутанол. В общем, консервант содержится в количестве до примерно 0.3% в расчете на общий вес композиции.
[0080] Помимо ингибирования роста микроорганизмов, которые могут быть непреднамеренно введены во время получения, консервант может предотвратить любые нежелательные явления, которые могут возникнуть в композиции из-за присутствия нормальной флоры в организме, как только композиция вводится в организм. Это приведет к увеличению промежутка времени, в течение которого активные агенты в композиции остаются активными. Композиции включают от примерно 5 мМ до примерно 25 мМ агента, регулирующего величину рН, и от 0.1% до 0.3% консерванта.
[0081] Композиции по изобретению могут быть введены в виде различных лекарственных форм, известных специалисту в данной области, что охвачено данным изобретением. Таким образом, следует отметить, что фармацевтические составы антимикробных композиций по данному изобретению включают обычные составы, пригодные для применения в лекарственных формах, и способы введения, соответствующие режиму лечения с применением антимикробных агентов, описанных в данной заявке. Такие составы могут включать, например, жидкие растворы, жидкие суспензии, таблетки, капсулы, гелькапы, аэрозоли и трансдермальные пластыри, содержащие эффективное количество одного или более антимикробных агентов для перорального, назального или топического введения. Таким образом, данное изобретение предусматривает, что композиции можно вводить для лечения или профилактики системной инфекции. Однако согласно конкретным вариантам предусмотрено, что фармацевтические составы и композиции согласно данному изобретению предназначены для вагинального и/или ректального введения для профилактики или лечения инфекции.
[0082] Такие композиции и могут быть получены, например, в виде гелей, кремов, пен, пленок, таблеток и суппозиториев, интравагинальных колец, внутриматочных устройств или систем и нановолокон, специалистом в данной области при помощи стандартных методов фармацевтической промышленности.
[0083] Как предусмотрено данным изобретением, способы по изобретению включают введение описанных композиций согласно способу и в соответствии с частотой введения, выбранными специалистом в данной области для введения терапевтических доз в количестве и в течение какого-то промежутка времени, которые лучше всего подходят для профилактики или лечения микробной инфекции у субъекта, нуждающегося в этом, при этом вводимая форма может быть предназначена, например, для немедленного или пролонгированного высвобождения.
[0084] Следующие ниже примеры предназначены для иллюстрации некоторых вариантов настоящего изобретения и не ограничивают никоим образом это изобретение. В экспериментах, описанных ниже, используются обычные способы и коммерчески доступные реагенты за исключением GFRT, который был любезно предоставлен В. O'Keefe (Molecular Targets Development Program, National Cancer Institute at Frederick, Frederick, MD).
ПРИМЕРЫ
[0085] Пример 1. Получение состава GZC в виде геля.
[0086] Способ получения комбинации каррагинаны + ацетат цинка, пригодной для применения согласно данному изобретению, был описан ранее и изложен ниже. См., например, Kenney J, et al. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2013, July 15; 57 (8): 4001-9.
[0087] Получение каррагинана: На стадии 1 в 4-литровый смеситель с планетарной мешалкой двойного действия (Charles Ross & Son, Hauppauge, NY) загружали 2,829 г стерильной отфильтрованной воды и 3.923 г тригидрата ацетата натрия (Sigma). Раствор нагревали при 69°С в течение 5 мин при перемешивании со скоростью 40 об/мин. Добавляли каррагинан (102 г, конечная концентрация 3.4%), и смесь перемешивали в течение 3 ч при температуре 69°С. На стадии 2 состав охлаждали до 25°С, и добавляли раствор 6 г метилпарабена (Spectrum, Gardena, СА) в 60 мл пропиленгликоля (Sigma) и полученный раствор перемешивали еще в течение 1 ч при скорости 40 об/мин. рН состава доводили до величины 6.8, и реакционную смесь перемешивали в течение 15 мин в условиях вакуума для удаления пузырьков.
[0088] Получение комбинации ацетат цинка/каррагинан: На стадии 1 для получения комбинации ацетат цинка/каррагинан применяли протокол, использовавшийся при получении каррагинана, со следующими изменениями: использовали 894 мл 10 мМ буфера (ацетат натрия) (рН 6.4). Каррагинан (31 г) добавляли до получения конечной концентрации равной 3%. Затем добавляли раствор 3 г дигидрата ацетата цинка в 50 мл указанного выше буфера, и полученный раствор перемешивали в течение 20 мин со скоростью 40 об/мин. Использовали также смесь 2 г метилпарабена и 20 мл пропиленгликоля.
[0089] С помощью известных методов, таких как описанные в публикации Fernandez-Romero J. A. et al., 2012, Antimicrob. Agents Chemother. 56: 358-368, определяли содержание метилпарабена, цинка и физико-химические свойства (осмоляльность, рН, вязкость).
[0090] Определение стабильности. Аликвоты (25 г) геля хранили в полипропиленовых флаконах объемом 30 мл (Qorpak, Bridgeville, РА) в следующих условиях: 30°С/65% относительная влажность (RH), 40°С/75% RH и 50°С/влажность окружающей среды. Флаконы периодически удаляли и анализировали гель на содержание метилпарабена, осмоляльность, рН, вязкость и содержание цинка, например, как описано в публикации Fernandez-Romero J. A. et al., 2012, Antimicrob. Agents Chemother. 56: 358-368.
[0091] Получение состава Griffithsin (гриффитшин)/ацетат цинка/каррагинан: Повторяли методику получения состава ацетат цинка/каррагинан, описанную выше, с добавлением третьей стадии, когда к комбинации ацетат цинка/каррагинан добавляли водный раствор GRFT (O'Keefe, В. R., et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2009, 106 (15): p.p. 6099-104; патент США №8,088,729) и перемешивали, как на стадии 2, в течение 20 мин при скорости 40 об/мин и температуре 25°С.
[0092] Пример 2. Активность GRFT против ВИЧ и ВПЧ при проведении in vitro анализов.
MN
ADA-M
[0093] Активность GRFT против ВИЧ была определена стандартным методом in vitro анализа. Вкратце, это определение осуществляли следующим образом. GRFT был предоставлен Dr. Barry O'Keefe (NCI), и его активность против ВИЧ была испытана на клетках TZM-bl (NIH AIDS Research and Reference Reagent Program) с использованием метода MAGI, описанного, например, в публикации Begay О, et al. AIDS Research and Human Retroviruses. 2011 Sep 1; 27 (9): 1019-24, с использованием лабораторных штаммов HIV-1 (вирус Х4) и HIV-1 (вирус R5); см. Фигуру 1А.
MN
ADA-M
50
[0094] Лабораторные штаммы ВИЧ-1 (вирус Х4) и ВИЧ-1 (вирус R5) были предоставлены Dr. J.D. Lifson at the AIDS and Cancer Virus Program, SAIC-Frederick, Inc., National Cancer Institute, Frederick, MD. Клетки TZM-bl обрабатывали GRFT с различными нетоксичными концентрациями непосредственно перед добавлением вирусов ВИЧ-1 (100-200 инфекционных единиц) и затем осуществляли инкубацию в течение 72 ч перед фиксацией и окрашиванием монослоев клеток. Величины IC (показаны на графике вертикальной пунктирной линией с 95% доверительным интервалом) были определены с применением определения дозозависимого эффекта ингибирования с помощью компьютерной программы GraphPad Prism v5.0. Все нетоксичные концентрации GRFT определяли в трипликатах, показаны их средние значения ± SD.
NL4-3
50
50
6
[0095] Активность против ВИЧ была также определена в моноядерных клетках периферической крови (РВМС) с использованием лабораторных штаммов ВИЧ-1 и стандартных методов. См. Trkola A, et al., J. Virol. 1999 Nov; 73 (11): 8966-74. Активированные PBMCs (2×10/мл) обрабатывали GRFT с различными нетоксичными концентрациями перед добавлением 100 доз TCID (инфицирующей дозы для тканевой культуры) вируса с последующей инкубацией в течение ночи. Супернатант заменяли свежей стимулирующей средой в дни 1 и 4 после инфицирования. Уровень антигена р24 в супернатанте определяли спустя 7 дней после инфицирования, используя метод профилированного для р24 ядра ВИЧ-1 анализа ELISA. Величины IC (показаны на графике вертикальной пунктирной линией с 95% доверительным интервалом) были рассчитаны с применением определения дозозависимого эффекта ингибирования с помощью компьютерной программы GraphPad Prism v5.0. Все нетоксичные концентрации GRFT определяли в трипликатах (см. Фигуру 1В), на графике показаны их средние значения ± SD.
Данные обоих методов анализа подтвердили, что GRFT обладает высокой in vitro активностью против ВИЧ.
50
[0096] Была также определена активность GRFT против псевдовирусов ВИЧ. Конкретно, противовирусная активность в отношении псевдовирусов (PsV) ВПЧ16, ВПЧ18 и ВПЧ45 была определена с помощью анализа репортерного гена люциферазы в клетках HeLa (Buck СВ, et al. PLoS Pathog. 2006 July. 1; 2(7): e69). В этом опыте клетки HeLa были обработаны GRFT с различными нетоксичными концентрациями непосредственно перед добавлением PsV ВПЧ 16, ВПЧ 18 или ВПЧ45 (в количестве, которое продуцирует ~300-700 относительных люминесцентных единиц) и затем проводили инкубацию в течение 72 ч. Анализ репортерного гена люциферазы осуществляли для построения кривой зависимости доза-эффект, показанной на Фигуре 1С. Величины IC (показаны на графике вертикальной пунктирной линией с 95% доверительным интервалом) были определены с применением определения дозозависимого эффекта ингибирования при помощи компьютерной программы GraphPad Prism v5.0. Все нетоксичные концентрации GRFT определяли в трипликатах, на графике показаны их средние значения ± SD. Полученные данные показали, что GRFT обладает умеренной in vitro активностью против PsVs ВПЧ 16, 18 и 45.
[0097] Пример 3. Комбинация GRFT с ZA и С обеспечивает синергизм активности против ВИЧ и ВПЧ.
50
50
92BR014
50
50
50
50
50
50
[0098] Активность комбинации GRFT с ацетатом цинка (ZA) и каррагинаном (С) против ВИЧ и ВПЧ была испытана методами, которые описаны выше. Вкратце, это определение осуществляли следующим образом. Для определения активности против ВИЧ активированные клетки PBMCs обрабатывали различными эквипотентными дозами (на основе IC каждого API (активного фармацевтического ингредиента)) GRFT, ZA или GRFT+ZA при температуре 37°С за 1 ч до воздействия 100 доз TCID вируса ВИЧ-1 в присутствии тех же самых доз каждого соединения или их комбинации (в трипликатах). Обработанные средой (только вирус) клетки использовали как контрольные. Через 18 ч клетки промывали и высевали на чашки в присутствии среды с IL-2 (с единственным исключением для тех образцов, которые были обработаны ZA, когда ZA заменяли). Эту стадию повторяли на день 4 и собирали супернатанты на день 7 для измерения уровней р24 ядра ВИЧ-1 методом ELISA. Для определения активности против ВПЧ клетки HeLa обрабатывали различными эквипотентными дозами GRFT, С или GRFT+C (на основе IC каждого API) при температуре 37°С и сразу же подвергали действию PsV ВПЧ 16 (в трипликатах). Обработанные средой (только вирус) клетки использовали как контрольные. Анализ репортерного гена люциферазы проводили через 72 ч после инфицирования. Показатели аддитивности (комплексный показатель) (CI) рассчитывали по методу Chou-Talalay (Chou, Т.С. Pharmacological Reviews, 2006, 58 (3): p. 621-81) при помощи программы CacuSyn для Windows (Biosoft, Cambridge, United Kingdom). Результаты показаны в Таблице 1. В данной заявке "CI" относится к комплексному показателю взаимодействия лекарств: аддитивный эффект (CI=1); синергизм (СI<1) или антагонизм (CI>1). "Dm" относится к средней эффективной дозе (IC); "m" относится к измерению сигмоидности кривой зависимости доза-эффект и также отражает наклон кривой зависимости средней эффективной дозы; и "r" относится к коэффициенту линейной корреляции графика зависимости полумаксимальный эффект-доза. Используемое обозначение % уменьшения IC=1-[IC комбинации/IC GRFT]*100. Величины % уменьшения IC основаны на данных для API (данные выделены программой жирным шрифтом. N/A=нет данных.
[0099] Данные, приведенные в Таблице 1 показывают, что наблюдался неожиданный синергизм действия между ZA и GRFT против ВИЧ и также между С и GRFT против псевдовируса ВПЧ16 (Table 1; величины CI менее 1). Кроме того, важно отметить, что никакого антагонизма между GRFT и С или ZA не наблюдалось.
[0100]
[0101] Пример 4. GRFT предотвращает вход ВПГ-2 в целевые клетки, но не адсорбцию вируса.
2
2
2
[0102] Недавнее исследование Nixon et al. (Nixon, В., et al., Journal of virology, 2013, 87 (11): p. 6257-69) показало, что GRFT блокирует распространение инфекции, вызванной ВПГ-2 in vitro и in vivo, в этой публикации высказано предположение, что ингибирование передачи вируса от клетки к клетке является механизмом действия GRFT. Мы поставили эксперименты на клетках линии Vero, которые позволяют предположить наличие ингибирования проникновения ВПГ-2 в клетку, но не адсорбции в целевых клетках. С целью выявления ингибирования адсорбции вируса проводили анализ бляшкообразования, как было описано ранее. См. публикацию Ashley, R., Herpes simplex viruses, p. 375-395. In Schmidt NJ, Emmons RW (ed), Diagnostic procedures for viral, rickettsial, and chlamydial infections, 7th ed. American Public Health Association, Washington, DC. 1995. Вкратце, этот анализ осуществляли следующим образом. ВПГ-2-штамм G и GRFT в различных концентрациях или среду (вирусный контроль) предварительно инкубировали в течение 0, 0.5, 1 и 2 ч при температуре 37°С перед добавлением к предварительно охлажденной культуре клеток линии Vero и выдерживали при температуре 4°С. Полученные монослои промывали три раза холодной средой перед добавлением верхнего слоя метилцеллюлозы и инкубировали в течение 48 ч при 37°С (в присутствии 5% СО и при влажности 98%) перед фиксацией, окрашиванием, и результаты выражали в бляшкообразующих единицах (БОЕ). Степень репликации вирусов определяли по сравнению с вирусным контролем. См. Фигуру 2А. Определяли также ингибирование проникновения вируса. Вкратце, проводили тот же анализ, как и при определении адсорбции, описанном выше (см. Фигуру 2А), однако, после инкубации в течение 2 ч при температуре 4°С, температуру повышали до 37°С (в присутствии 5% СО и при влажности 98%) и выдерживали еще в течение 2 ч. Монослои обрабатывали в течение 2 мин буферным раствором лимонной кислоты (рН=3.0) для инактивации вирусов, оставшихся на клеточной поверхности. Полученные монослои промывали три раза холодной средой перед добавлением верхнего слоя метилцеллюлозы и инкубировали в течение 48 ч при 37°С (в присутствии 5% СО и при влажности 98%) перед фиксацией, окрашиванием, и результаты выражали в бляшкообразующих единицах (БОЕ). График на Фигуре 2В показывает степень репликации вируса в %% (среднее значение ± SD) по сравнению с контролем (в трипликатах).
[0103] Пример 5. Комбинации GRFT/ZA/C проявляют повышенную активность против ВПГ-2.
50
50
2
клет. контроль
соединения
клет. контроль
вирусн. контроль
50
50
50
[0104] Ранее мы сообщали, что комбинация ZA и CG обеспечивают синергическую противовирусную активность против ВПГ-2. См. Fernandez-Romero, J.A., et al., Antimicrobial agents and chemotherapy, 2012, 56 (1): p.p. 358-68. Совсем недавно мы изучили совместимость GRFT, ZA и С на уровне in vitro активности против ВПГ-2 и обнаружили, что наблюдается значительное снижение величин IC, когда два или три из этих соединений применяются в комбинации. ВПГ-2-штамм G и каждое из этих соединений или их комбинации в различных концентрациях (на основе эквипотентности IC) предварительно инкубировали при 37°С и добавляли к культуре клеток линии Vero с последующей инкубацией в течение 6 дн при 37°С, в присутствии 5% СО и влажности равной 98%. Осуществляли анализ по поглощению красителя PrestoBlue для определения противовирусной активности. Определяли относительные единицы флуоресценции (ОЕФ, RFU) при длине волны 570 нм для возбуждения и 600 нм для эмиссии. Степень репликации вируса в %% рассчитывали по следующей формуле: степень репликации вируса = [(O.D - О.D)/(О.D - О.D)]*100. Величины IC values были рассчитаны на основании проведения анализа зависимости ответа от дозы и статистической обработки результатов с помощью программы GraphPad Prism v5.0. Результаты приведены в Таблице 2 ниже. IC или степень снижения IC в % основаны на параметрах API, выделенных программой жирным шрифтом; NA = нет данных.
[0105]
[0106] Пример 6. GZC значительно уменьшает степень инфицирования ВПГ-2 на "строгой" мышиной модели
6
[0107] Для того, чтобы определить, является ли комбинация GZC эффективной против ВПГ-2 in vivo, мы использовали очень "строгую" модель, в которой мышам, получившим гестагенный препарат Депо-Провера (DepoProvera), вводили гели ацетат цинка/каррагинан за 1 или 2 часа до вагинального введения провокационной пробы, составляющей 10 БОЕ ВПГ-2. См. , et al. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2012 Jan; 56 (1): 358-68.
6
[0108] Эксперимент вкратце проводили следующим образом. Мышам линии Balb/C, получившим Depo, вводили провокационную пробу 10 БОЕ ВПГ-2 через 1 ч (Фигура 3А) или 2 ч (Фигура 3В) после введения указанных составов (GZC=GRFT+ZA+C; ZC=ZA+C; GC=GRFT+C), причем в этом примере С означает каррагинан. Все составы в этом примере вводили в виде гелей (n=15-30/состав). На основании симптомов регистрировали количество неинфицированных животных с течением времени, результаты для каждой группы мышей показаны на Фигуре 3. Значимая разница между комбинированными составами и одним С обозначена звездочками (p<0.037). Проводили статистический анализ, используя точный критерий Фишера. Используя указанный подход, мы установили, что композиция, содержащая 0.1% GRFT, 0.3% ZA и 3% CG, в гелевой форме (GZC) в значительной степени снижала распространение инфекции, вызванной ВПГ-2 (относительно контрольного опыта с CG; Фигура 3). Примечательно, что частота инфекции у мышей, получившим GZC, была ниже, чем соответствующий показатель в группах, которым вводили GC или ZC.
[0109] Хотя настоящее изобретение было описано на примере конкретных вариантов, следует отметить, что эти варианты являются просто иллюстративными для отражения принципов и применения данного изобретения. Следовательно, могут быть осуществлены многочисленные модификации иллюстративных вариантов и могут быть использованы другие условия без выхода за существо и объем данного изобретения, который определяется прилагаемой формулой изобретения.