Криоконсервирование ткани плаценты человека источник гемопоэтических прогениторных клеток и мультипотентных мезенхимных стромальных клеток

Криоконсервирование ткани плаценты человека -источник гемопоэтических прогениторных клеток и мультипотентных мезенхимных стромальных клеток

В.А. Шаблий 12, М.Д.Кучма 1 2, В.М. Кирик 3, А.Н. Онищенко 2, ЛЛ. Лукаш 1, Г.С. Лобынцева 2

1 Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев 2Институт клеточной терапии, Киев

3 Институт генетической и регенеративной медицины НАМН Украины, Киев

Cryopreservation human placental tissue as source of hematopoietic and mesenchymal stem cells

V.A. Shablii12, M.D. Kuchma 12, V.M. Kyryk 3, A.N. Onishchenko 2, L.L. Lukash 1, G.S. Lobitseva 2 11nstitute of Molecular Biology and Genetics NAS of Ukraine, Kiev

2 Institute of Cell Therapy, Kiev

3 State Institute of Genetics and Regenerative Medicine of NAM of Ukraine, Kiev

В работе показана возможность получения жизнеспособных гемопоэтических прогениторных и мультипотентных мезенхимных стромальных клеток из криоконсервирован-ной плаценты. Установлено, что относительное содержание БвО^-клеток в С034+/С045'°т-популяции, полученной из криоконсервированной плаценты, достоверно выше, чем из нативной. Также впервые описаны отличия экспрессии CD90 и CD31 на CD34+/CD45'ow/SSC'ow клетках пуповинной крови и плаценты. Клональный анализ клеток, выделенных из криоконсервированной плаценты, показал присутствие предшественников, образующих колонии гранулоцито-моноцитов, моноцитов, гранулоцитов и эритроцитов. Из криоконсервированной ткани плаценты можно получить культуру стромальных клеток с иммунофенотипом CD90/CD73VCD105VHLA-ABO°w/CD45-/CD34-/CD133-/CD14-и способностью к направленной дифференцировке in vitro в адипогенном и остеогенном направлениях.

Ключевые слова: плацента, криоконсервирование, ге-мопоэтические стволовые клетки, мультипотентные мезенхимные стромальные клетки.

In this paper we have show the possibility of cryopreservation of placental tissue for the reason to obtain viable hematopoietic progenitor cells and multipotent mesenchymal stromal cells. It is established, that the relative content of the cells of CD34+/ SSOow/CD45low cells significantly higher in the cryopreserved placental tissue. Also we first described the differences expression of CD90 and CD31on the CD34+/CD45low/SSClow cells of umbilical cord blood and placenta. Clonal analysis of cells revealed the presence in cryopreserved placental tissues of precursors of granulocytes, monocytes and erythrocytes that forming colonies of granulocyte-monocyte, monocytes, granulocytes and erythrocytes. Also it was obtained cultures of stromal cells from cryopreserved placental tissues with immunophenotype CD90+/CD73+/CD105+/HLA-ABDow/CD45-/ CD34-/CD133-/CD14- and adipogenic and osteogenic potential in vitro.

Key words: placenta, cryopreservation, hematopoietic stem cells, multipotent mesenchymal stem cells.

В последние годы плацента млекопитающих рассматривается не только как орган, выполняющий метаболическую, иммунную и гормональную функции для обеспечения развития плода. В работе А. Вагсепа (2009) было показано, что плацента человека играет большую роль во внутриутробном гемо-поэзе. В частности, из ворсинок хориона было выделено две популяции гемопоэтических прогениторных клеток (ГПК): Сй34+/Сй45|0“ и Сй34++/Сй45|0“. Исследования показали, что последняя популяция клеток обладает способностью формирования колоний миелоидной и эритроидной линий, может дифференцироваться в клетки фенотипа Сй56+ 1\1К и в клетки-предшественницы Сй19+ В-лимфоцитов [1].

Иммуногистохимический анализ тканей плаценты показал присутствие популяции клеток фенотипа Сй34+/Сй45 + в стромальной ткани волосков хориона, тогда как клетки фенотипа Сй45Ьг'д|л были найдены лишь в стенках сосудов. Суспензия клеток, полученная из сосудов плаценты, включала популяцию клеток с фенотипом Сй34+/Сй38-, трансплантация которых иммунодефицитным мышам приводила к восстановлению гемопоэза [2].

e-mail: Lobynceva@stemcellclinic.com.ua

По результатам современных исследований также установлено, что из тканей плацентарного хориона и амниона можно получить мультипотентные мезенхимные стромальные клетки (ММСК) и мультипотентные клетки цитотрофобласта, которые характеризуются высоким уровнем экспрессии маркеров эмбриональных стволовых клеток (0й-3/4, 1\1апод, 8БЕА-4) и щелочной фосфатазы [3, 4].

Несмотря на быстрые темпы развития данного научного направления, еще не разработана стандартизированная методология выделения из криоконсер-вированной ткани плаценты мультипотентных клеток и, соответственно, не описаны их молекулярнобиологические свойства, в том числе способность к мультилинейной дифференцировке. Не вызывает сомнений тот факт, что поиск оптимальных условий криоконсервирования ткани плаценты и дальнейшее получение определенных пулов мультипотентных стволовых клеток чрезвычайно актуальны как для научных целей, так и для практического применения. Именно поэтому важными задачами работы является разработка стандартных протоколов (согласно правилам 81_Р и ЭМР) криоконсервирования ткани

плаценты и выделения из нее мультипотентных прогениторных клеток.

Целью данного исследования было разработать метод криоконсервирования плаценты человека, охарактеризовать популяции ГПК и ММСК, полученные из нативной и криоконсервированой плаценты.

Материал и методы

Криоконсервирование плаценты. Плаценту получали в условиях родильного зала или операционной после физиологических родов и операции «кесарево сечение» на сроках беременности 39—41 нед. у пациенток в возрасте 23—36 лет на основании предварительно полученного письменного информированного согласия.

Плаценту промывали раствором Хэнкса с добавлением 50 ед/мл амфотерицина, 100 ед/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина, переносили в пробирки емкостью 50 мл с 2—3 мл раствора Хэнкса и измельчали на фрагменты 1—3 мм. К фрагментированной ткани добавляли ДМСО (Sigma, США] до конечной концентрации 0,7—1,4 M, помещали в криоампулы и проводили замораживание. Для исследования отбирали образцы ткани, которые не имели бактериальной и грибковой флоры, и по результатам ПЦР-анализа не содержали HCV, HBV, CMV, HSV 1/2, EBV, Tгepаnema pallidum, Toxoplasma gondii, HIV-1, Chlamidium trachomonis, Mycoplasma genitalium, Ureaplasma urealyticum и Uгеаplasma parvum. Крио-консервированные образцы хранили в жидком азоте при температуре -196°С. Размораживание осуществляли на водяной бане ( + 38...40°С) до появления жидкой фазы, ДМСО из ткани выводили путем медленного добавления раствора Хэнкса.

Выделение плацентарных ГСК. Нативную ткань промывали на шейкере раствором Хэнкса и измельчали, криоконсервированную ткань размораживали. Клетки плаценты выделяли путем ферментации в растворе 0,2% коллагеназы I (Serva, Германия], 0,35 мг/мл гиалуронидазы (Sigma, США) и 100 ед/мл ДНКазы I (Sigma, США), 1 мг/мл BSA в течение 30—40 мин при +37°С, пипетировали и фильтровали через клеточный фильтр с диаметром пор 70 мкм (Becton Dickinson, США). Оставшуюся после ферментации ткань заливали свежей порцией ферментов и инкубировали 20—40 мин, добавляли фетальную бычью сыворотку (ФБС) (Gibco, Германия], фильтровали, затем центрифугировали при 300g в течение 10 мин., супернатант удаляли и в осадок клеток вносили PBS с добавлением 0,125 % BSA. Фракции клеток после двух этапов ферментации объединяли. Суспензию клеток наносили на фи-колл (Biochrome, Германия) с плотностью 1,077 г/л и центрифугировали при 400 g в течение 30 мин. Полученную фракцию мононуклеаров 2 раза отмывали от фиколла в растворе PBS с добавлением 0,125% BSA, центрифугировали при 300 g в течение 10 мин.

Определение колониеобразующей активности. Выделенные по представленной выше методике клетки культивировали в среде AIM-V (Gibco, Германия) с добавлением 50 нг/мл SCF, 10 нг/мл G-CSF, 10 нг/мл GM-CSF, 10 нг/мл IL-3, 9 нг/мл Epo (Biochrom, Германия), 30% ФБС (Gibco, Германия) и 0,3% агара. Колонии подсчитывали на живых препаратах на 7-е и 14-е сут. культивирования. На 14-е сут. культивирования культуру фиксировали 2,5% раствором глютаральдегида в течение 10 мин и вы-

сушивали 24 ч при комнатной температуре. Перед покраской проводили дополнительное фиксирование метанолом в течение 10 мин. Окрашивали по Романовскому в течение 15 мин.

Получение плацентарных MMCK. Нативную ткань плаценты промывали раствором Хэнкса и измельчали. Криоконсервированную ткань размораживали. Клетки выделяли путем ферментации в растворе 0,2% коллагеназы I (Serva, Германия) и 0,8 ед/мл диспазы (Gibco, Германия) в течение 10—30 мин при температуре 37°С. Для снижения активности ферментов добавляли ФБС (Sigma, США) до конечной концентрации 10%. Полученную суспензию проводили через фильтр с диаметром пор 70 мкм (Becton Dickinson, США), фильтрат клеток отмывали путем центрифугирования в течение 10 мин. при 300g и вносили в ростовую среду альфа-МЕМ (Sigma, США), содержащую 15% ФБС (Gibco, Германия), 2 мМ глютамина, 5мм НЕРЕS (Biomedicals), 100 ед/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина, в культуральные флаконы для адгезивных клеток из расчета 300—400 тыс. клеток на 1 см2. Культивирование проводили при 37°С в атмосфере с 5% СО2 со сменой среды 2 раза в неделю, пересев осуществляли при достижении культурой 80—90% конфлю-энтности монослоя в соотношении 1:3, клетки для пересева обрабатывали в течении 3—5 мин 0,05% раствором трипсина-ЭДТА (Biochrom, Германия) до полного открепления.

Проточная цитофлуориметрия. Иммунофеноти-пирование суспензии клеток проводили методом проточной цитометрии с использованием моноклональных антител, конъюгированных с флуорохрома-ми (Becton Dickinson, США) в рабочей концентрации 0,5 мкг на 106 клеток: anti-CD34 APC, anti-CD90 FITC, anti-CD45 APC-Cy7 , anti-CD105 PerCP-Cy 5.5, anti-CD73 PE, anti-CD14 Pacific Blue, anti-CD31 PE, anti-CD133 PE. Измерения проводили на лазерном проточном цитофлуориметр-сортере BD FACSAria (Becton Dickinson, США) с помощью программного обеспечения FACS Diva 6.1, анализируя одновременно 2 параметра светорассеяния и 6 параметров флуоресценции. Для настройки компенсации перекрытия спектров эмиссии флуорохромов при многопараметрическом анализе использовали контрольные образцы клеток без внесения антител (unstained control), образцы с каждым из антител отдельно (single stained control) и образцы с комбинацией нескольких антител без одного (fluorescence minus one control).

Дифференцировка ММСК. Для определения способности дифференцироваться в остеогенном направлении культуру клеток на 3 пассаже культивировали с дексаметазоном, p-глицерофосфатом и аскорбат-2-фосфатом в течение 21 сут. Минерализованный матрикс выявляли окрашиванием 1% раствором ализаринового красного. Хондроген-ную дифференцировку проводили в среде ДМЕМ с 6,25 мкг/мл инсулин-трансферрин-селенина (Sigma, США), 0,1 мкМ дексаметазона (Sigma, США),

0,1 мМ аскорбат-2-фосфата (Sigma, США) и 10 нг/мл TGF-P3 (Biochrom, Германия). Выявление протеогли-канов осуществляли окрашиванием альциановым синим (Sigma, США). Для адипогенной дифферен-цировки клетки культивировали в ДМЕМ с добавлением 10% ФБС, 1 мкМ дексаметазона, 0,5 мМ изобутил-метилксантина (Sigma, США), 100 мМ индометацина (Sigma, США) и 10 нг/мл инсулина в

течение 21 сут. Жировые включения выявляли окрашиванием Oil Red (Sigma, США).

Статистическая обработка данных. Уровень экспрессии поверхностных маркеров измеряли в процентах. Статистическую обработку осуществляли с помощью программы Statistics 6.0 (StatSoft) с использованием U-критерия Манна — Уитни.

Результаты

Анализ выделенных из нативной плаценты жизнеспособных мононуклеарных клеток по уровню экспрессии CD45 и параметрам прямого и бокового светорассеяния показал присутствие популяций, похожих на гранулоциты, лимфоциты и моноциты (рис. 1). Содержание гемопоэтических клеток в нативной плацентарной ткани составляло в среднем 81,5% (64,6—9З,8%) от фракции мононуклеарных клеток.

По характеру экспрессии CD34 среди CD34+CD45low-клетoк можно выделить две популяции: с низким и высоким уровнем экспрессии CD34. Обратное гейтирование плацентарных CD34low-клетoк показало, что они, в отличие от клеток пуповинной крови, являются морфологически неоднородной популяцией и лишь очень незначительное их количество по параметрам светорассеивания FSC/SSC соответствует ГПК (рис. 2).

Популяция CD34hi/CD45low-клетoк, содержание которой в нативной и криоконсервированной плаценте составляет 1,06% (0,З2—2,2%) и 0,78% (0,45—1,21%) соответственно, в большей степени соответствует ГПК пуповинной крови (см. рис. 2).

Анализ по протоколу ISHAGE позволяет оценить содержание популяции клеток с фенотипом CD34+/ CD45low/SSClow, которую, по литературным данным, можно отнести к ГПК. Кроме того, используя этот протокол, мы показали, что содержание популяции ГПК среди гемопоэтических клеток нативной и криоконсервированной плаценты человека существенно не отличается и составляет 0,66% (0,З6—1,05%, п = 6) и 1,11% (0,18—2,82%) соответственно (рис. З).

Нужно заметить, что содержание ГПК среди популяции CD34+/CD45low было статистически значимо выше (п = 6, p < 0,05) в суспензии клеток из криоконсервированной плаценты по сравнению с таковыми из нативной ткани и составляло 85,6% (68,9—96,5 %) и 60,8% (44,9—75,6 %) соответственно.

Уровень экспрессии CD90 ГПК из ткани плаценты статистически значимо выше (п = 9, p < 0,05), чем в случае ГПК пуповинной крови, а именно 24,52% (6,24—49,84%) и 2,27% (0,08—10,54%) соответственно.

Нами установлено, что CD34+-клетки и ГПК, выделенные из плацентарной ткани, характеризовались более высоким уровнем экспрессии CD31 по сравнению с соответствующими популяциями клеток пуповинной крови (рис. 4).

Клональный анализ показал, что в плаценте присутствуют предшественники гранулоцитов, эритроцитов и моноцитов, образующих колонии гранулоцито-моноцитов, моноцитов, гранулоцитов и эритроцитов (рис. 5).

А Б В

Рис. 1. Гистограммы последовательного фенотипирования клеток нативной плаценты:

А - гейтирование популяции клеток путем исключения дебриса;б - гейтирование популяции клеток путем исключения нежизнеспособных клеток по связыванию с 7-АЛй; В - гейтирование популяции СП45+-клеток;

Г - распределение популяции СП45+-клеток по параметрам прямого [РБС) и бокового [ББС) светорассеивания; Д -гистограмма РБС/ББС для СП45+-клеток пуповинной крови, приведенная для сравнения

А Б В

FSC_A fsCjft #ідо} CD3iftPC*A

Рис. 2. Гистограммы популяций CD34hw/CD45-/hw и CD34hi/CD45dim клеток пуповинной крови [А, Б, Г] и плаценты [В, Д, Е], их распределение по параметрам прямого [FSC] и бокового [SSC] светорассеивания

В Г

Рис. 3. Гистограммы гейтирования популяции ГПК по параметрам прямого и бокового светорассеивания из популяции CD34+/CD45dim клеток нативной [А, Б] и криоконсервированной [В, Г] плаценты

В

ЭЕ-1

«С Я"! 6 4

я"»-

О

О

С034+31Ь*

С0Э+*-Э1Ь

й

^ т }Л11111II ПИ | ^ I 111111^ I I I 11 ИР] I- к I 11I I^ I ' & 1Г 1й3 10* М*

СО 31 РЕ*А

Г

о

о

V,

!

а,

Й <52

<3 <з«

о и* *г

Сто ГГГС-А

Рис. 4. Гистограммы популяций клеток пуповинной крови (А, В) и плаценты (Б, Г), экспрессирующих поверхностные маркеры 0034, 0031 и 009

Рис. 5. Колонии гемопоэтических клеток плаценты человека:

А, Г - БОЕ-Э; Б, Д - КОЕ-ГМ; В, Е - КОЕ-ГМЕМ. Световая микроскопия. Ув. х50

В

При культивировании плацентарных клеток на 9-12-е сут. образовывались агрегаты клеток, вокруг которых начинали распластываться эпителиальные и фибробластоподобные клетки. Такие агрегаты впоследствии давали растущие клоны фибробластопо-добных клеток. На 15-19-е сут. культура образовывала монослой (рис. 6).

Цитофлуориметрический анализ стромальных клеток показал высокий уровень экспрессии поверхностных маркеров: Сй105, Сй73, Сй90 и отсутствие

маркеров гемопоэтических клеток Сй34, Сй133, Сй45, Сй14 (рис. 7).

При окрашивании культуры плацентарных клеток на 21-е сут. после начала индукции дифференци-ровки в остеогенном и адипогенном направлениях ализарин красным и красным масляным, был обнаружен минерализованный матрикс и жировые включения, подтверждающие дифференцировку в целевых остеогенном и адипогенном направлениях соответственно (рис. 8).

V Л-

Гї,*.Гі

Рис. 6.

Культура клеток плаценты, 9 сут.:

А - агрегат клеток; Б - растущий клон фибробластоподобных клеток. Световая микроскопия. Ув. х50

А

Б

Рис. 7.

Гистограммы экспрессии поверхностных маркеров в культуре ММСК плаценты:

А - уровни экспрессии 0090, 0073, 00105, 0034,

0045, 0014,00133, НІА [черный контур - фоновый уровень флюоресценции клеток, красный цвет - интенсивность флюоресценции после инкубации с соответствующими антителами);

Б - двухмерные гистограммы популяции клеток с фенотипом 0090+/0073+/00105+/0034-/0045-

А “V Б

., , & |  .

... г, , -  " ' - ч  ^ т.»*  *

I  -* Х-.О,"- % ч

1 V  1 . * і ^ .  ' V

•  Л# V Ч -  Ч ' • «•«

л,   - л ~ -Л. • • •> V

1

л * .

, Ък£. ҐГЩ

"—.Г * * •  1

. л

<

Л(| 1 -Xі

Ж>. її

<ЧГ

П-

'  ” 'А* 1*г . ’ Я. V»

і

Рис. 8. Культуры стромальных клеток, 21 сут.:

А - контроль к дифференцировке в адипогенном направлении;

Б - дифференцировка в адипогенном направлении;

В - контроль к дифференцировке в остеогенном направлении;

Г - дифференцировка в остеогенном направлении.

Окраска: Б - красный масляный; Г - ализариновый красный . Ув. х50

Обсуждение

В результате проведенных исследований нами установлено, что в плацентарной ткани присутствуют гемопоэтические клетки, которые при цитометриче-ском исследовании в координатах прямого ^ЭС) и бокового (ББС) светорассеяния имеют морфологически сходные с пуповинной кровью характеристики. Среди Сй45+-плацентарных клеток присутствуют популяции Сй34|0'Л'/Сй45|0“ и Сй34ы/Сй45|0“, что также характерно для клеток пуповинной крови [5]. Содержание клеток с фенотипом Сй34ы/Сй45|т" составляло 0,46% (0,28—0,67%), что коррелирует с данными, полученными А. Вагсепа с соавт. (2010) [1].

Путем обратного гейтирования мы показали, что Сй34|0“/Сй45|0“-популяция клеток, в отличие от Сй34ы/Сй45|0“ является морфологически неоднородной и содержит небольшое количество клеток, которые морфологически соответствуют ГПК. Нужно отметить, что наличие Сй34|0“/Сй45|0“-клеток с высокой гранулярностью цитоплазмы может указывать на признаки дифференцировки и апоптоза [6]. При культивировании эти клетки образовывали небольшое количество эритроидных и гранулоцито-моноцитарных колоний, что свидетельствует об их более высокой коммитированности по сравнению с Сй34ы/Сй45|0“ [7].

Таким образом, для количественной оценки ГПК из ткани плаценты мы считаем необходимым использовать протокол 18НАЭЕ [8] и оценивать Сй34+/ С0451о«/22С'О“ среди всех жизнеспособных Сй45+-клеток.

Кроме того, нами показано, что содержание ГПК (Сй34+/Сй45|О“/88С|О“) в нативной и криоконсерви-рованной ткани плаценты достоверно не отличалось, но содержание клеток ЭЭС10™ среди Сй34+/Сй45|О“ было выше в суспензии клеток, полученной из размороженной плаценты, что может свидетельствовать о разрушении высокогранулярных клеток при замораживании-оттаивании ткани аналогично гранулоцитам в костном мозге и пуповинной крови [5].

В связи с тем, что Сй34|0“-популяция по морфологической характеристике неоднородна и вызывает псевдофлюоресценцию на каналах FITC и РЕ, определение относительного содержания Сй90+ и Сй31+-клеток в этой популяции нельзя считать достоверным в данном исследовании.

ГПК, выделенные из нативной и криоконсервован-ной плаценты, имеют высокий уровень экспрессии Сй90 и Сй31, что также было отмечено в работе А. Вагсепа с соавт. (2009) [7]. Нами показано, что плацентарные ГПК имеют достоверно более высокий уровень экспрессии этих маркеров по сравнению с образцами пуповинной крови, что может говорить о

различной функциональной активности этих популяций клеток.

Есть данные о том, что клетки с фенотипом CD34+/CD90+/Lirr имеют более высокую клоногенную активность по сравнению с CD34+/CD90-/Lir-, а сортировка популяции CD34+/CD90+ клеток костного мозга ведет к обогащению на LTC-IC (long term culture-initiating cell) и HPP-CFC (high proliferative potential-colony forming cells), и эти клетки имеют мультилинейный потенциал [9]. Также известно, что CD90 экспрессируется ГПК пуповинной крови [10] и фракция клеток с фенотипом Lm-/CD34+/CD38-/ CD90+/CD45RA содержит гемопоэтические стволовые клетки [11].

CD31 экспрессируется на гемопоэтических стволовых клетках желточного мешка мышей [12], мультилинейных прогениторах, предшественниках миелоидных и В-лимфоидных клеток костного мозга человека [13]. Функция CD31 ГПК недостаточно изучена, но выяснено что этот белок обеспечивает взаимодействие со стромальными клетками ниши и участвует в трансэндотелиальной миграции [14]. Таким образом, высокий уровень экспрессии CD31 плацентарными ГПК, возможно, связан с их взаимодействием со стромальными клетками микроокружения. Также добавление блокирующих антител против CD31 к клеткам пуповинной крови в культуре приводило к значительному повышению количества БОЕ-Э и КОЕ-ГМ, что указывает на роль CD31 в процессах дифференцировки [15].

Нами показано, что при культивировании плацентарных клеток как до, так и после криоконсервирования, наблюдается рост КОЕ-ГМ и БОЕ-Э, что также описано в работах других авторов [2, 16].

В работе V. Serikov с соавт. (2009) описан метод криоконсервирования целостной плаценты с использованием перфузии раствором криопротекторов (15% пропилен гликоля, 14% DMSO, 14% формамид и 57% PBS) с пенициллином 100 U/мл, стрептомицином 100 мг/мл, фунгизоном 0,25 мг/мл и замораживанием при -80°C в течение 12 ч, после чего ткань переносили в жидкий азот для хранения при -196°C. Трансплантация мобилизованных ГПК из криоконсервованной плаценты с использованием AMD-3100 облученным иммунодефицитным мышам линии NOD/SCID приводит к восстановлению гемо-поэза и химеризму клеточного состава крови и костного мозга [16].

Недостатком данного метода является использование мобилизирующих агентов и замораживание цельной плаценты, что требует проведения перфузии, при которой необходимо использовать антикоагулянты. Такой метод технически более сложен, чем механическое измельчение плаценты ножницами, а также не предусматривает возможность долговре-

ЛИТЕРАТУРА:

1. Barcena A., Muench M.O., Kapidzic M. et al. A new role for the human placenta as a hematopoietic site throughout gestation. Reprod. Sci. 2009; 16(2): 178-87.

2. Robin C., Bollerot K., Mendes S. et al. Human placenta is a potent hematopoietic niche containing hematopoietic stem and progenitor cells throughout development. Cell Stem Cell 2009; 385-95.

3. Parolini O., Alviano F., Bagnara G. P. et al. Concise review: isolation and characterization of cells from human term placenta: outcome of the first international Workshop on Placenta Derived Stem Cells. Stem Cells 2008; 26: 300-11.

4. Spitalieri P., Cortese G., Pietropolli A. et al. Identification of multipotent cytotrophoblast cells from human first trimester chorionic

менной транспортировки плацент (несколько часов] с места получения до места, где производится выделение и(или) банкирование.

Следует отметить, что использование предложенной нами методики криоконсервирования позволяет порционно использовать материал, обеспечивает лучшее проникновение криопротекторов и не требует использования высоких концентраций криопротекторов, которые являются токсичными для клеток.

Результаты наших исследований продемонстрировали, что ММСК, выделенные из криоконсерво-ванной плаценты, характеризуются следующим иммунофенотипом: Cd90+/CD73+/CD105+/HLA-ABCIow/ CD45-/CD34-/CD133-/CD14-, что согласуется с данными других авторов [17, 18].

Культура стромальных клеток плаценты в присутствии индукторов адипогенеза и остеогенеза дифференцируется в целевых направлениях, хотя нужно отметить ее относительно низкий остеогенный потенциал in vitro, что также описано в работе G.A. Pilz с соавт. (2011).

Все представленные выше данные доказывают, что плацента человека является важным органом гемопоэза и может служить еще одним перспективным источником как ГПК, так и ММСК для нужд регенеративной медицины.

Таким образом, разработка научно и экономически обоснованной технологии получения ГСК и ММСК из криоконсервированной ткани плаценты, а также внедрение широкомасштабной программы по организации криобанка таких клеток является актуальным направлением в области практической медицины, включая онкогематологию.

Выводы

1. Разработанный метод криоконсервирования дает возможность выделить из размороженной ткани плаценты функционально активные ГПК и ММСК.

2. В ткани нативной и криоконсервированной плаценты присутствуют популяции клеток CD34low/ CD45low и CD34hi/CD45low.

3. Относительное содержание клеток SSClow в популяции CD34+/CD45low, полученных из криокон-сервированной плаценты, достоверно выше, чем из нативной.

4. Выделенные из ткани плаценты ГПК с фенотипом CD34+/CD45low/SSClow характеризуются более высоким уровнем экспрессии маркеров CD90 и CD31 по сравнению с ГПК пуповинной крови.

5. Из криоконсервованной ткани плаценты может быть получена культура стромальных клеток с иммунофенотипом CD90+/CD73+/CD105+/HLA-ABClow/ CD45-/CD34-/CD133-/CD14-и способностью к направленной дифференцировке in vitro в адипогенном и остеогенном направлениях.

villi. Clon. Stem Cells. 2009; 11(4): 535-56.

5. Куртова А.В., Зуева Е.Е.. Количественный учет CD34+ гемопоэтических стволовых клеток в цельной пуповинной крови. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2006; 1(3): 66-71.

6. Serke S., van Lessen A., Pardo I. et al. Selective susceptibility of CD34-expressing cells to acquire flow cytometric features of apoptosis/necrosis on exposure to an ammonium chloride-based red blood cell lysing reagent. J Hematother. 1998; 7: 315-8.

7. Barcenaa A., Kapidzica M., Muenchb M.O. et al. The human placenta is a hematopoietic organ during the embryonic and fetal periods of development. Dev. Biol. 2009; 327(1): 24-33.

8. Sutherland D.R, Anderson L., Keeney M. The ISHAGE guidelines for CD34+ cell determination by flow cytometry. J Hematother. 1996; 5: 213-36.

9. Murray L., Chen B., Galy A. et al. Enrichment of human hematopoietic stem cell activity in the CD34+ Thy-1 + Lin-subpopulation from mobilized peripheral blood. Blood 1995; 85: 368-78.

10. Mayani H., Lansdorp P.M. Thy-l Expression is linked to functional properties of primitive hematopoietic progenitor cells from human umbilical cord blood. Blood 1994; 83(9): 2410-7.

11. Majeti R., Park C.Y., Weissman I.L. et al. Identification of a hierarchy of multipotent hematopoietic progenitors in human cord blood. Cell Stem Cell 2007; 131: 635-45.

12. Baumann C.I., Bailey A.S., Li W. et al. PECAM-1 is expressed on hematopoietic stem cells throughout ontogeny and identifies a population of erythroid progenitors. Blood 2004; 104(4): 1010-6.

13. Watt S.M., Williamson J., Genevier H. et al. The Heparin binding PECAM-1 adhesion molecule is expressed by CD34+ hematopoietic precursor cells with early myeloid and B-lymphoid cell phenotypes. Blood 1993; 82 (9): 2649-63.

14. Watt S. Adhesion receptors on hematopoietic progenitor cells. British J. Haemat. 2001; 112: 541-57.

15. El-Marsafy S., Carosella E.D., Agrawal S.G. et al. Functional role of PECAM-1/CD31 molecule expressed on human cord blood progenitors. Leukemia 1996; 10(8): 1340-6.

16. Serikov V., Hounshell C., Larkin S. et al. Human term placenta as a source of hematopoietic cells. Experim. Biol. Med. 2009; 234: 813-23.

17. Maier C.L., Pober J.S. Human placental pericytes poorly stimulate and actively regulate allogeneic CD4 T-cell responses. Arterioscl. Thromb. Vasc. Biol. 2011; 31: 183-9.

18. Bartosh T.J., Ylostalo J.H., Mohammadipoor A. et al. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. PNAS 2010; 107(31): 13724-9.

19. Pilz G.A., Ulrich C., Ruh M. et al. Human term placenta-derived mesenchymal stromal cells are less prone to osteogenic differentiation than bone marrow-derived mesenchymal stromal cells. Stem Cells Dev. 2011; 20(4): 635-46.

Поступила 28.11.2011

I m. 1 4 ЧИ .'LPH Лршмлсшги ILS. 111.11.1  (.41 11 j iLMUiib

("IliffraLm-, t ill \|

i i i|if *, tin

.L-4flUIIHil .IcitkJiKfv Li al Mi ЬчШЦЛ JH. --------— ------

ч. фй|и£СЩ'11&1ЫН UhlfKHl IK-Uipl KL’UIKCfU.KaiU I,

..Mi+rpr.. - 1 YWYP* I

4p|Hf(. Гф€-Мйри

лгчс! anuil hi

irfpidLlEfiUrtUX ll_^,______,--------------—r-r

4 'Jlil ill СН£11Ш JII.IIU U.ill Л ! : 'O 4441 it U I

IHlriCrb |1]1ИЖНГНН1‘

ирллифераптпы ц исктоолий

ОТЬЛКП T*fta№Mturi ЯИнфочв

s '.ЧгИЫПцЧПк' peu.141111 Г|ШЫ.£| ШИЛ EJffclEI* tIMllluiJi I E11 I ^ I

jipr ill (рзикпик; 'VtfiifianWiB -.^i *ljup |кл£.щ iftim Haiti .cUiiik

..ttqiuiiiiiu

[trpuailTKHlbfiH фгрягЕ

IlLlipiI.I I

OwlttllhKiilt 4Н!Г!ГМ|М1 hcHiwutwib i in

ilи*iipa hiiiii citnncua pafuu-iuA unL'piM.u*

№.'t.1,«.VKMIIC pHi'VJ IhTtlJ IllliOII iu6cLlf1lll ~r

it:i ixivHiie рна ырожс uni WyffgFMBUlf ИМфГЦ! Пйстушши втШШТТИИП! ктрад

iliII I |Ъ) i L l ka'rpi'iij l li UihifU II kirUfUqlil'-irilit kfViliii fL*J|PL-|IT;|

fail 11й.!*ииС1ъ innrcihi'r liri nJpfaiWrpi'iB nfUIICGCJ Ji TL4C1llie r'l'HilaiTkpLi irfni imWkwiiuL'VTih fliniTUjm'ircoi fi wuijvetn гютсыы runu i 11|liM.' IIII J h [iifcl'iM I r H lirtf. IL Л II h л HJ111L:

у.тийшк шшлкннишк i n fi|i£|uicfu

MMn, rp*>llll! mu: ip?1 i 4 ptij. «1.1 "larrfMij -rip i(K ш nkiiijiijnx j |. 4l1UltfiKH

при kJI ipv 1КГ

14 IlklKpilllIJll ЮН.1^ 11ШЕЦ11Й

гноила нгпгкагнтлпки прч1С.Т}тч!

ЛшН.'Е|М«е II ftu'KHIKlliK IllUCUHIIE UHIIH Weil 1«Ш |»lilln kuftifld 1КЧИС

_1И171П|1ГМИВ *tp«Kayf4J

' IKLIII'UH [I 1NU ЛЛ1ИШХ. 11Л ШГМрО» фт-Л^ПГП.! КЛ 1И|||чфЧЛи I* О пр^щалин

Ipwtrtra

тЁ

Therakos

С ЛГ1П1Э I II РМК' КИЛЯ СЕРП НФГ-Н К. If I lit - ЧГ|Н 4 ) r Rw.S i |V-.. 111 ВГ11114 |1Я1Г|<

C/iS'll vOepOJEIlllfli. КШ11ШК1Ч1Ж1. ыибилыцш ntcircua, оошшнлш

HIUIIliJNlK. I h'UL'lii.- i I Iiii.-L k.lb- С I hi HlliUh! ЬЛГГЬ II II k £14 IkifclllllHilk. ПС^кферПч*), Ы1П кропи, рин-лнНи «ШН*. Л FB**F L?fiTi|ft.-p|criTii 4П nruumcV H№£№ *РЧР*furafaincf 4 11. ... l.iti j.« i. ncit xu 6i*: i-pc* hpi ulinmct.ичл обрабагки iptiHii jlih «

UihjlhLllliilTllil С мыслены >рОШ1СЫ Ж1ПНГСП|>Сй6|НкГП1 t»IO£ li.Hltt Орт.!:.- JypU

- Sopikl. fK* iteLiVff |«Jbin,l. Ill И- У nJ4nUH* ! tp («Mlinrilltf Cl N1 R*M1 ИГЧ.Ч . HCUIIICinpJUIII LlkVSuHLn Idem* И in CIEUUHIlI^

- ] I (in ihm 'i tfihf 141 извилин in i^iupniwtt дапрт'фртнрдеш'иец,

№ПМК1ЯНШ0П< pj LlHlllt .1Ы1КЛ1С1Гrw rpiMII i (ООГЙПСШИН С Ill'S лштнкгме II ритаьфеш

- 6 щчстии. ДН Ш|Ч!М1М1Ш1 * ШМКМПОЛН НИ Ы 4№|9ЧН0Л>

I суилпи IpaaicfunuMJip чг.ипшис I, mi? пс^Ёихтиы^ runviL'ii пг нчгрс.и: lrii'iui

Idi*ilh,-IIL-Il I iib Lpi 'kil

< Ктр^ыГч 1-^11 lijS-TMi MTJl ЛГ KiKUjHiffCHgi» 4ipr*ff-*Гь1РГ! P 1 PTptfгiifi.i||rftnfDHii|

ПЕрилытЬ ciiciksk

kklUlliiU^i |U kffc'RlI fo6*i|k«Hl1iJJ  l IilMi,ili'I| Jil^.- МЛНКИ И I UHIUM .i-i*

iiiNduicru worn.ц-лчюшш ^^(к'азлкхрчния!. мараишннпс iw

rpeilCILU l Alllll. ijl j

мр.1.111.«н lulJIHI -iliiiuqinniui wiimnniE irtnotun -Г* Li..n> +рлн^. л, 4, k-*pn «Л, re.k t*k-r:

. .pnrftilnmkp4»jilipnii4liiir.ni. m’nmlriiiii'i ipiklmiiri

\  i H--UJI1M 1прсл.ан1ЕЯИ ГРГ« r kja .tT* г^л|*Ц|яи n»nmiut К4ТГ4К p*hm»4 *РП

Нам \rrhil F I'- I Iut III I'fillf h'-i i III 4 i.

Сктсил pj-CiinaiM in ЗД2Гк пюи (гмпшп lmmiii

« IГ и i :а г i .1' i I M «HKI^IIIIIIHIIi'i i lipi|ir<V 4 ] I II 1КПП [VkAO.l *11.Li Ml !.1 Л331Я. П DXIII CH'ipiKIE BO BfV Ц»* ipniK'IUtl ii ptii|uiiHiiam u4>:fijjBMibJHiii

- i Ii I illi.'f I I.Li Rfermuiil lllfklfLUIIMlL Jlfk^lJ^v L-iM,jUiitu?* циГя>ш IS

« t Hii^iMv HitifalFvjUWilifti

- IU* TprOycEci GuiuKVirHbimrtiH п.кчцч1И .tur «fmr.'iini

<й.Т1Ш -nicruwj IlhhArdlil G UWTOCT IVT ItHk ifb Vf 11л,»1ЧМС ,1Нр ICi piMlillUl llf»'il P'J'il UllUi LikJi>JVl_h:i>.kJ Ik! iL'lb

• Немнемктьн miuiii

- i UTaj-mrpUlai L‘iiilni irfltpililfl itntu'ilsrlwc л нпа м» nn>.*pfliiap»

Ik'Tv^iiiHK 6c4rnqKf4H«iiiH!Li iimiihuh m.-mii.iirE римссгпгЬШнлгть

•-tfipd U'lL » nri-'lhJ»ieH*U k Itf M:pil>dIIIJ

- 11 UfktUcTPM j4-t ШНП ri )Ц|Ыа.к|йп .m^iyni^ к mfuill k

\li iilMCigpilir ур!ЗЖЭ|в л.м,1%11| M tUiB lljpik iv j.i« .mmi.i

HI 1Р.1Ы.Ф J.iri utK|MH>f4' ^pilrir.lll».  1 М4Ч .iJJMiui, tin ) tfl 4ifc|tubtiNliU«l Ырй1 p J klull iJh иииЦИШНим Мк

• \ 3111111 -LT1111.  p  Г1 Wl№ptll)pilMr *1» 1ПМ1П11

< Frvvi rrnvr« этап ручнил» arf4HiH:i <ч!ря hi innpvfiuiw.4i«riu ыис^ лрлплии k pdii*.iil< I с II lirp IU 4. k

- 1 |гч-Г!Ш|тЫЛ I nail pLi.nacfi

Нш'ирч’м i»-ljIiiiuip npxirtk: lhim j.m гакич* пшнпн

• Пи пела *wii,4v ponmi BipiMaiiHiii'ii m нуд на i^anuiiHC л ттшя I'opsinua

• CiUHH-UriC* fcrpun IIIIICI1. «ИИнПна, iiu UIIIIIW С ЧСМЬ№СК11Ы [juK'lufHltl Г|МПГЧ1 ji Н||А1|.|ч:НЧ1* -fipilHlil*

- !||,I;&I I!,KI9J|)!PC riupn U.IJJ MLVIUTI.ITC 1чммйкм гфм яп-ргьчшгМи м na?f4LllUI Ог'игг ihn . ^ipa nrt.

KlilOfHIR iWt(U.H|d lliafifTRpiiiipmtfe Г'рм|м1к. чшфдаргачНй

аниюн

www.imt-stemc tHs, m

ГВСХШИЫР ,L*№ M> iMpiiHpip.MiH4 * ...... К«Л*И 'HIGilil** 11

Km-4Il li-h | PI i rUIilD i. 1U k> ii. I hd ii^iiiii.i iniai k.lL |nk  <Pk |l>ii«Uk rflCWUt « ("HKini НГС .LI? *> м.-i I.iip -tjit.iu irurifci i III", ьпг I I -II ч

NX ’Е.НГ111К. T-H.wrvifc

* <(llilru lH in k.y ili 11нi*341iujihi .mupiEinun LimiK bcii Ubiifiii 111‘iH Ш-11|||- qU i ctifiniL

S4 < . M I N L. II.I IrpiljllllUlilLIP I L'LIIIIUI II IIV.;. «Ill lljtfll ГМ1 111 |‘i ill I

+.«rnw. NK-B.urltl*, T-Linw

* LH 111 е\ПкТ1ЕН1[Ч№11№Н лсп.трпттлк. К.ТС1Г4 Kviunpm kl.llkli Ml IIIL'U ViUHkJh

ic.W iillM in HT3' fk'fliwi C.'<n(jrii HlHh lllliy

Дт }K.iH4ciiii-i 1ЧГЧОМ1.1 mi'icvKiLi up и ппгпф%1ил илгп». „Sk-ыг Г-ЧеГУА Н L'JII ipillliu.1. IlICIOIl