ШТАММ SACCHAROMYCES CEREVISIAE, ПОДХОДЯЩИЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕКАРСКИХ ДРОЖЖЕЙ, КОТОРЫЙ ЯВЛЯЕТСЯ ОСМОУСТОЙЧИВЫМ И КОТОРЫЙ ПРОЯВЛЯЕТ НАСЛЕДУЕМУЮ СОПРОТИВЛЯЕМОСТЬ К СЛАБЫМ ОРГАНИЧЕСКИМ КИСЛОТАМ (ВАРИАНТЫ), И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ
SACCHAROMYCES CEREVISIAE STRAIN SUITABLE FOR BAKERY YEAST MANUFACTURE, OSMOTOLERANT AND MANIFESTING HERITABLE RESISTANCE TO WEAK ORGANIC ACIDS (VERSIONS) AND SUCH STRAIN USAGE

Родительская заявка
В настоящей заявке испрашивается приоритет по французской заявке № FR 1151354, поданной 18 февраля 2011 года, содержание которой включено в настоящую заявку путем отсылки.
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретения относится к штаммам Saccharomyces cerevisiae, из которых можно получить пекарские дрожжи, к способам их получения, к пекарским дрожжам, полученным из этих штаммов, к тесту на дрожжах, содержащему их, а также к способам изготовления хлеба и к хлебным продуктам, которые могут быть получены из этого теста. Более конкретно, настоящее изобретение относится, в наиболее общем аспекте, к «промышленным» штаммам Saccharomyces cerevisiae, из которых можно получить пекарские дрожжи, которые являются осмоустойчивыми и которым присуща сопротивляемость к слабым органическим кислотам.
Предшествующий уровень техники
2
В документе WO 96/38538 сообщается о дрожжах, полученных из улучшенных штаммов S. cerevisiae, которые проявляли повышенную осмоустойчивость, потому что они эффективно выделяют газы (вырабатывают CO), и которые очень хорошо использовать в тесте для батонов, содержащем высокие концентрации сахаров от 16% до 25% (пекарские проценты). В этом документе ничего не говорится о поведении этих дрожжей в присутствии ингибиторов плесени, таких как слабые органические кислоты.
В документе US 4318991 описан способ получения пекарских дрожжей, которые обладают высокой ферментативной активностью в тесте на дрожжах даже в присутствии ингибирующих плесень агентов, таких как слабые органические кислоты, например в присутствии уксусной или пропионовой кислоты. Этот способ включает стадию добавления такой кислоты, в частности в ходе размножения дрожжей, в конечной стадии их культивирования, с тем, чтобы «адаптировать» дрожжи к указанной кислоте, в частности присутствующей в тесте на дрожжах в виде пропионата кальция (далее обозначается как Calpro или также как cpp). Этот документ не оговаривает поведение полученных таким образом дрожжей в тесте с высоким содержанием сахара.
В документе US 4346115, на имя заявителя, описан способ получения пекарских дрожжей, которые сделаны устойчивыми к слабым органическим кислотам, из осмоустойчивого штамма, путем периодического добавления мелассы, в ходе конечного цикла их размножения.
В другом документе, также на имя заявителя, EP 1559322, сообщается о штаммах, из которых получают, после адаптации к слабым кислотам, дрожжи, которые, согласно тестам, хорошо известны специалистам в данной области, являются еще более эффективными по сравнению с контрольным штаммом, который был эталонным для получения коммерческих дрожжей, эффективных в сладком тесте в присутствии ингибиторов плесени, в течение примерно двадцати лет.
Следует отметить тот факт, что упомянутая выше адаптация в ходе размножения дрожжей к слабым кислотам, например, в виде пропионата кальция, стоит определенных денег, а также она может оказывать отрицательное воздействие на ферментативную активность дрожжей, в частности, в сладком или очень сладком тесте.
У всех этих методов предшествующего уровня техники, имеющих целью улучшение устойчивости пекарских дрожжей к ингибирующим плесень слабым кислотам в сладком и несладком пекарском тесте, с помощью адаптации штаммов, из которых они получены, к указанным слабым кислотам, есть нежелательное общее свойство, заключающееся в том, что они придают дрожжам только временную/скоротечную и непостоянную устойчивость к слабым кислотам. Адаптация состоит из экспонирования дрожжевых клеток сублетальному количеству слабой кислоты в ходе их фазы роста; это предварительное экспонирование затем позволяет адаптированным клеткам в присутствии той же слабой кислоты быть более устойчивыми, когда они попадают в условия ферментации. В определенных случаях данная слабая кислота может придавать адаптацию и в отношении последующего присутствия другой слабой кислоты в фазе ферментации. Эти взгляды проиллюстрированы в статье Ferreira et al. (1997) International Journal of Food Microbiology 36, 145-153. Механизмы адаптации к слабым кислотам были объектом нескольких исследований. Некоторые из этих исследований сравнивались в обзорной статье Piper et al. (2001) Microbiology 147, 2635-2642. В вышеуказанном документе сообщается о том, что адаптация основана на клеточных механизмах, с участием различных белков, включая определенные мембранные насосы. Эти механизмы являются негенетическими и по существу временными: они развертываются клетками как реакция на стресс, представленный слабой кислотой, но пропадают в отсутствие этого стресса: клетки, ранее адаптированные, возвращаются в состояние неадаптированных клеток.
В документах EP 645094 или WO 99/51746 сообщается о намного более сложных процессах - генетической модификации штаммов, способных продуцировать пекарские дрожжи с тем, чтобы сделать их устойчивыми к слабым кислотам, причем данный признак бы передавался по наследству.
Заявитель, продолжая свои исследования по поиску более эффективных штаммов, заметил, что определенный штамм, полученный из его коллекции осмоустойчивых штаммов, имеет такой генотип, что если этот штамм гибридизовать или мутировать, согласно обычным способам, то это приведет к появлению штамма, из которого можно получить пекарские дрожжи, которые чрезвычайно эффективны и которые, что совершенно удивительно, не требуют какой-либо адаптации перед введением в очень сладкое тесто, содержащее слабую кислоту в форме, например, пропионата кальция (обозначенного как Calpro, или срр).
Это открытие формирует основу для настоящего изобретения.
Сущность изобретения
Таким образом, в наиболее общем аспекте настоящее изобретения относится к процессу получения штамма S. cerevisiae, способного производить пекарские дрожжи, которые демонстрируют осмоустойчивость и наследуемую сопротивляемость к слабым органическим кислотам, из промышленного штамма S. cerevisiae, депонированного 8 июля 2010 года в CNCM (фр. Collection Nationale de Cultures de Microorganismes [Французской Национальной коллекции культур микроорганизмов], Institut Curie, 25 rue du docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) под номером I-4341, или из промышленного штамма, родственного этому согласно своему Ту-профилю и/или согласно картированию локусов количественных признаков (QTL картирование).
Насколько известно заявителю, впервые сообщается способ получения пекарских дрожжей, в котором указанным дрожжам придается как осмоустойчивость, так и наследуемая сопротивляемость к слабым кислотам, при этом обходясь без дорогих и/или сложных способов предшествующего уровня техники.
В первом варианте способа по настоящему изобретению способ получения включает стадию гибридизации указанного промышленного штамма и, по меньшей мере, одну стадию отбора полученного гибрида, выбранную из группы, состоящей из:
(i) по ферментативной активности, измеренной ферментометром Burrows and Harrison, по меньшей мере, в тесте A5′ или тестах A5 и A5′, при этом отобранный гибрид является таковым, что он выделяет газ, по меньшей мере, на 10%, предпочтительно, по меньшей мере, на 15%-25% больше, чем контрольный штамм, состоящий из штамма S. cerevisiae, депонированного 8 июля 2010 года в CNCM [Французская Национальная коллекция культур микроорганизмов] под номером I-4341;
(ii) по времени расстойки в схеме безопарного теста на тесте, содержащем 18% сахара (пекарские проценты) в присутствии 0,4% пропионата кальция, где отобранные гибриды способны продуцировать пекарские дрожжи размножением, в отсутствие адаптации к пропионату кальция, которые дают время расстойки от 85% до 105%, а предпочтительно от 95% до 105% от времени расстойки контрольных пекарских дрожжей, полученных из промышленного штамма S. cerevisiae, депонированного 8 июля 2010 года в CNCM [Французская Национальная коллекция культур микроорганизмов] под номером I-4341, размножением указанного штамма с адаптацией к присутствию пропионата кальция;
(iii) по времени расстойки в схеме безопарного теста на тесте, содержащем 23% сахара (пекарские проценты) в присутствии 0,4% пропионата кальция, где отобранные гибриды способны продуцировать пекарские дрожжи размножением, в отсутствие адаптации к пропионату кальция, которые дают время расстойки от 85% до 105%, а предпочтительно от 95% до 105% времени расстойки контрольных пекарских дрожжей, полученных из промышленного штамма S. cerevisiae, депонированного 8 июля 2010 года в CNCM [Французская Национальная коллекция культур микроорганизмов] под номером I-4341, размножением указанного штамма с адаптацией к присутствию пропионата кальция;
(iv) по времени расстойки в схеме безопарного теста на тесте, содержащем 25% сахара (пекарские проценты) в присутствии 0,4% пропионата кальция, где отобранные гибриды способны продуцировать пекарские дрожжи размножением, в отсутствие адаптации к пропионату кальция, которые дают время расстойки от 85% до 105%, а предпочтительно от 95% до 105% времени расстойки контрольных пекарских дрожжей, полученных из промышленного штамма S. cerevisiae, депонированного 8 июля 2010 года в CNCM [Французская Национальная коллекция культур микроорганизмов] под номером I-4341, размножением указанного штамма с адаптацией к присутствию пропионата кальция;
Настоящее изобретение также относится к следующим гибридам, полученным из штамма I-4341:
- штамм Saccharomyces cerevisiae, депонированный 11 мая 2010 года в CNCM [Французская Национальная коллекция культур микроорганизмов] под номером I-4312
и
- штамм Saccharomyces cerevisiae, депонированный 11 мая 2010 года в CNCM [Французская Национальная коллекция культур микроорганизмов] под номером I-4313.
Согласно второму варианту способа настоящего изобретения, способ включает стадию мутагенеза промышленного штамма S. cerevisiae, депонированного 8 июля 2010 года в CNCM [Французская Национальная коллекция культур микроорганизмов] под номером I-4341, или штамма, родственного этому согласно Ту-профилю и/или картированию локусов количественных признаков (QTL картирование), и, по меньшей мере, одну стадию отбора полученного мутанта, выбранную из группы, состоящей из:
(i) по ферментативной активности, измеренной ферментометром Burrows and Harrison в тесте A5′; где отобранный мутант является таковым, что он выделяет газ, по меньшей мере, на 5%-20% больше, чем контрольный штамм, включающий штамм S. cerevisiae, депонированный 8 июля 2010 года в CNCM [Французская Национальная коллекция культур микроорганизмов] под номером I-4341;
(ii) по времени расстойки в схеме безопарного теста на тесте, содержащем 15% сахара (пекарские проценты) в присутствии 0,4% пропионата кальция, где отобранный мутант способен продуцировать пекарские дрожжи размножением, в отсутствие адаптации к пропионату кальция, которые дают время расстойки от 95% до 105% от времени расстойки контрольных пекарских дрожжей, получаемых из промышленного штамма S. cerevisiae, депонированного 8 июля 2010 года в CNCM [Французская Национальная коллекция культур микроорганизмов] под номером I-4341, размножением указанного штамма с адаптацией к присутствию пропионата кальция;
(iii) по времени расстойки в схеме безопарного теста на тесте, содержащем 18% сахара (пекарские проценты) в присутствии 0,4% пропионата кальция, где отобранный мутант способен продуцировать пекарские дрожжи размножением, в отсутствие адаптации к пропионату кальция, которые дают время расстойки от 90% до 105% от времени расстойки контрольных пекарских дрожжей, получаемых из промышленного штамма S. cerevisiae, депонированного 8 июля 2010 года в CNCM [Французская Национальная коллекция культур микроорганизмов] под номером I-4341, размножением указанного штамма с адаптацией к присутствию пропионата кальция;
(iv) по времени расстойки в схеме безопарного теста на тесте, содержащем 23% сахара (пекарские проценты) в присутствии 0,4% пропионата кальция, где отобранный мутант способен продуцировать пекарские дрожжи размножением, в отсутствие адаптации к пропионату кальция, которые дают время расстойки от 90% до 105% от времени расстойки контрольных пекарских дрожжей, получаемых из промышленного штамма S. cerevisiae, депонированного 8 июля 2010 года в CNCM [Французская Национальная коллекция культур микроорганизмов] под номером I-4341, размножением указанного штамма с адаптацией к присутствию пропионата кальция.
Объектом настоящего изобретения также являются штаммы Saccharomyces cerevisiae, депонированные 8 декабря 2010 года в CNCM [Французская Национальная коллекция культур микроорганизмов] под номерами I-4409 и I-4410.
Объектом настоящего изобретения также являются пекарские дрожжи, которые могут быть получены размножением, без адаптации к присутствию слабой(ых) кислоты(от), штамма по настоящему изобретению, или полученные способом по настоящему изобретению.
Заявитель заметил, что когда указанные пекарские дрожжи получают с адаптацией, преимущество, проявляющееся как уменьшение времени расстойки, усиливается.
Объектами настоящего изобретения, кроме того, являются:
тесто на дрожжах, содержащее пекарские дрожжи, заявленные в настоящем изобретении;
указанное тесто на дрожжах предпочтительно выбирают из теста, в котором ферментация проводится как при осмотическом давлении из-за присутствия, по меньшей мере, 15% сахара, предпочтительно, по меньшей мере, 18% сахара, более предпочтительно, по меньшей мере, 23% сахара, и еще более предпочтительно, по меньшей мере, 25% сахара (пекарские проценты), и в присутствии ингибитора плесени типа слабой органической кислоты, предпочтительно в виде пропионата кальция.
Объектом настоящего изобретения также является способ получения испеченного хлебного продукта с использованием указанного теста на дрожжах.
Объектом настоящего изобретения также является хлебный продукт, который может быть получен посредством указанного способа приготовления.
Другие характеристики и преимущества более подробно будут описаны с помощью примеров воплощений изобретения, которые даны сугубо для иллюстрации и не являются ограничивающими.
Подробное описание настоящего изобретения
В настоящем изобретении термин «осмоустойчивые пекарские дрожжи» предназначен для обозначения дрожжей, которые имеют, по меньшей мере, одно из следующих свойств:
- активность инвертазы меньше чем 35 единиц, предпочтительно меньше чем 30, а еще более предпочтительно меньше чем 20, где единица инвертазы определена как выработка одного микромоля восстановленных сахаров в течение 5 минут на мг сухого вещества дрожжей при 30°C и при pH 4,7 без плазмолиза дрожжей, а именно половина микромоля инвертированной сахарозы (тест определен в патенте США 4318929);
- проходят, по меньшей мере, один из тестов в ферментометре Burrows and Harrison, описанных в «Journal of Institute of Brewing», vol. LXV, No. 1, January-February 1959 и которые определены в патенте EP 1559322 как A5, A5′, A6 и A6′;
- проходят, по меньшей мере, один и тестов по изготовлению хлеба при сравнении с адаптированным штаммом I-4341 и всегда в присутствии в дрожжевом тесте 0,4% пропионата кальция и высокого содержания сахаров, при этом указанные тесты названы в настоящем изобретении NT15%+, NT18%+, NT23%+, NT25%+: они соответствуют измерениям времени расстойки в схемах «безопарного теста», а именно прямых процессах, в которых практически нет первого брожения между интенсивным перемешиванием и разделением теста, а полученные куски теста ферментируются в формах в диапазоне температур от 35°C до 40°C. Последующая ферментация, которая является существенной ферментацией в таком процессе, называется «расстойкой». Время расстойки определяется как время, необходимое дрожжевому тесту для достижения заданной высоты в форме, соответствующей искомому расширению теста для помещения в печь.
Предпочтительно, если осмоустойчивые дрожжи по изобретению имеют, по меньшей мере, два свойства, определенных в вышеупомянутых тестах.
В настоящем изобретении выражение «наследуемая сопротивляемость дрожжей к слабым органическим кислотам, например, присутствующим в виде пропионата кальция» предназначено для обозначения сопротивляемости, которая не является ни индуцированной, например, путем адаптации, ни приобретенной после генетической модификации указанных дрожжей, за исключением гибридизации или мутации штамма, из которого они получены, и как описано ниже.
В настоящем изобретении термин «промышленный штамм» предназначен для обозначения штамма, который в отличие от «лабораторных» штаммов не является обязательно гаплоидным или диплоидным, но плоидность которого зачастую является более сложной.
В настоящем изобретении термин «Ту-профиль» штамма предназначен для обозначения любого профиля, полученного при ПЦР с помощью праймеров, направленных на последовательности-мишени, которые соответствуют генетическим «штаммам», возникшим вследствие движений транспозонов (Ту). Примерно 100 копий этих последовательностей присутствует в геноме Saccharomyces cerevisiae, конкретнее в последовательностях, прилегающих к генам, кодирующим тРНК. Количество и распределение по геному Ту-элементов варьирует от штамма к штамму и позволяет продемонстрировать существенный полиморфизм между штаммами. Этот метод в настоящее время описан в стандартном DIN CEN/TS 15790 (март 2009 г.) для идентификации пробиотических дрожжей для кормов для животных.
В настоящем изобретении выражение «картирование локусов количественных признаков (QTL картирование)» предназначено для обозначения метода, который состоит из конструирования генетических карт, которые делают возможным локализовать локусы (области хромосом), вовлеченные в изменчивость количественных признаков, связанных с маркерами - локусами, более легко поддающимися идентификации.
В контексте настоящего изобретения все проценты, упомянутые в тестах по отбору, если не указано иное, даны в «пекарских» процентах, которые хорошо известны специалистам в данной области; эти проценты представляют собой массовые проценты ингредиентов (например, сахаров, пропионата кальция и т.п.), представленные относительно массы муки, принятой за 100%.
Примеры
Пример 1: Получение гибридов
Гибридные штаммы I-4312 и I-4313, которые являются объектами настоящего изобретения, получали систематическим скрещиванием друг с другом штаммов из собственной коллекции заявителя, выбранных как осмоустойчивые и/или осмоустойчивые и не очень чувствительные к присутствию слабых органических кислот или их солей, используемых в качестве ингибиторов плесени, таких как те, что депонированы в Collection Nationale de Cultures de Microorganismes [Французской Национальной коллекции культур микроорганизмов] института Пастера, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France, 8 июля 2010 года под номером I-4341 и 9 февраля 2011 года под номером I-4448.
Программу гибридизации проводили согласно обычным методам, таким как те, что описаны в главах 2I-23 «Методы и Протоколы» руководства «Methods in Yeast Genetics, A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, 2000 Edition» by D. Burke, D. Dawson and T. Stearns, Cold Spring Harbor Laboratory Press (ISBN 0-87969-588-9).
Пример 2: Получение дрожжей по изобретению из гибридов примера 1
Для получения пекарских дрожжей по изобретению гибридные штаммы, полученные в примере 1, помещали в культуру в колбы или в ферментеры в известные среды, которые не содержат слабых кислот.
В колбах может быть использована культуральная среда YPD, описанная в приложении А руководства «Methods in Yeast Genetics, A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, 2000 Edition» by D. Burke, D. Dawson and T. Stearns, Cold Spring Harbor Laboratory Press (ISBN 0-87969-588-9), посвященном культуральным средам.
Обычно в ферментерах условия культивирования таковы, что метаболизм штамма дрожжей по существу является дыхательным, и/или таковым, при котором по существу отсутствует выработка этанола.
Термин «по существу» обозначает, что эти условия поддерживаются в течение всего времени существования культуры, но возможно, что время от времени эти условия не поддерживаются в режиме периодической культуры с подпиткой, например, в течение первых часов культуры, что эквивалентно длительности 1/4-1/3 длительности культуры, и в частности в течение первых 5 часов культуры в режиме периодической культуры с подпиткой.
Выражение «метаболизм штамма дрожжей по существу является дыхательным» означает, что углерод окисляется, а не ферментируется, в течение всего времени существования культуры, часть углерода возможно временно ферментируется.
Выражение «по существу отсутствует выработка этанола» означает, что концентрация этанола в конце культивирования составляет меньше чем 1%, предпочтительно меньше чем 0,1%, более предпочтительно меньше чем 0,01%, и наиболее предпочтительно меньше чем 0,001%.
Специалистам в данной области известно, как скорректировать параметры культивирования конкретного дрожжевого штамма, так чтобы условия культивирования были таковы, при которых метаболизм штамма дрожжей по существу являлся дыхательным, и/или таковы, при которых по существу отсутствует выработка этанола.
Штамм дрожжей по изобретению помещается в культуральную среду в аэробных условиях.
Предпочтительно, если штамм дрожжей по изобретению помещают в культуральной среде в ферментер, подходящий для выработки дрожжей. Объем ферментера находится в пределах от нескольких миллилитров до нескольких кубометров.
Ферментер также далее называется реактором.
Ферментер предпочтительно подходит для культивирования в аэробных условиях.
Дрожжевой штамм предварительно помещается в культуральную среду при культивировании в режиме периодической культуры с подпиткой и/или в непрерывном режиме.
Выражение «культивирование в режиме периодической культуры с подпиткой» или «периодическое культивирование с подпиткой» или «режим периодической культуры с подпиткой» в данном документе обозначает культивирование в ферментере, который постепенно подпитывается культуральной средой, но из которого среда не удаляется. В таком способе культуральный объем является переменным (и увеличивающимся) в ферментере. Скорость подачи подпитки при культивировании в режиме периодической культуры с подпиткой является постоянной или переменной.
Примером периодического культивирования с подпиткой является культивирование, проводимое в условиях, описанных в справочнике «Yeast Technology», 2nd edition, 1991, G. Reed and T.W. Nagodawithana, published by Van Nostrand Reinhold, ISBN 0-442-31892-8.
Культуральная среда в качестве составляющих содержит смесь сахаров и других элементов, требуемых для роста дрожжей.
Другими элементами, необходимыми для роста дрожжей, являются: по меньшей мере, один источник азота, по меньшей мере, один источник серы, по меньшей мере, один источник фосфора, по меньшей мере, один источник витаминов и/или, по меньшей мере, один источник минеральных веществ.
Эти другие элементы представлены в достаточных количествах для того, чтобы не являться факторами, ограничивающими рост дрожжей.
Источник азота, например, представлен в виде сульфата аммония, гидроксида аммония, фосфата диаммония, аммиака, мочевины и/или их комбинации.
Источник серы представлен, например, в виде сульфата аммония, сульфата магния, серной кислоты и/или их комбинации.
Источник фосфора представлен, например, в виде фосфорной кислоты, фосфата калия, фосфата диаммония, фосфата моноаммония и/или их комбинации.
Источник витаминов, представлен, например, в форме мелассы, дрожжевого гидролизата, раствора чистого витамина или смеси чистых витаминов и/или их комбинации.
Источник витаминов обеспечивает дрожжи всеми витаминами в количествах, которые, по меньшей мере, равны количествам, рекомендованным в справочных руководствах. Несколько источников витаминов могут быть объединены.
Источник минеральных веществ представлен, например, в форме мелассы, смеси минеральных солей и/или их комбинации.
Источник минеральных веществ обеспечивает дрожжи всеми макроэлементами и микроэлементами в количествах, которые, по меньшей мере, эквиваленты количествам, рекомендованным в справочных руководствах. Несколько источников минеральных веществ могут быть объединены.
Одно и то же вещество может быть представлено несколькими различными элементами.
Условия для выработки в ферментере пекарских дрожжей подробно объяснены А. Loiez в главе «Production of baker′s yeast by biotechnology» of the Techniques de Nngenieur [Techniques for the Engineer], Reference J6013 of March 10, 2003.
Культуральная среда гибридов согласно изобретению используется также для эталонного штамма I-4341, с которым они будут сравниваться, хотя и с проведением, в отношении указанного эталонного штамма, дополнительной стадии «адаптации» согласно методу, описанному в патентах США 4318991 или 4346115 или согласно объединенному описанию этих двух документов.
Способ приготовления пекарских дрожжей включает, по меньшей мере, первые две стадии ряда представленных ниже стадий, состоящего из:
- размножения чистого штамма в полуаэробных, а затем в аэробных условиях,
- отделения с помощью центрифугирования дрожжей, полученных таким образом, из культуральной среды для получения жидкого «дрожжевого молока», содержащего от 14% до 25% сухого вещества или больше, если дрожжевое молоко смешано с осмотическими продуктами,
- фильтрования полученного таким образом жидкого дрожжевого молока предпочтительно на ротационном фильтре под вакуумом, и получения обезвоженных свежих дрожжей, содержащих от 26% до 35% сухого вещества, - смешивания полученных таким образом дрожжей, в том числе свежих дрожжей в форме кусков, или рассыпчатых свежих дрожжей, содержащих примерно 30% сухого вещества, или также в форме частиц, предпочтительно гранул, если дрожжи предназначены для сушки,
- сушки, в щадящем режиме, в пару горячего воздуха, например, псевдоожижением, дрожжевых частиц, полученных экструзией,
- упаковки перед продажей.
Пример 3: Сравнение эффективности неадаптированных дрожжей по изобретению с адаптированным контрольным штаммом
Пример 3.1: Описание тестов
3.1.1. Тесты на ферментометре
Тесты проводили с помощью ферментометра Burrows and Harrison, описанного в «Journal of Institute of Brewing», vol. LXV, No. 1, January-February 1959, и определяли следующим образом:
Тест A5
Суспензию дрожжей готовят следующим образом:
1. 200 мг сухого вещества дрожжей для тестирования.
4
2
4
2. 5 мл раствора, содержащего 108 г/л NaCl и 16 г/л (NH)SO.
3. Доводили объем до 20 мл дистиллированной водой.
15 мл вышеуказанной суспензии (т.е. 150 мг сухого вещества дрожжей) уравновешивали при температуре 30°C в течение 15 минут. К этой суспензии добавляли смесь 20 мг муки и 4 г сахарозы, уравновешенную заблаговременно в течение ночи при 30°C. Цельную смесь гомогенизировали в течение 35 секунд.
Формованное тесто инкубировали в герметично закрытом контейнере, помещенном на 30°C. Высвобождение газа (выраженное в мл при 760 мм рт.ст.) записывали в течение общего периода 120 минут (этот период может быть скорректирован).
Тест A5′
Протокол идентичен A5, за исключением того, что: 1. 500 мкл раствора с 16% (масс./об.) пропионата кальция (calpro) добавляли поверх смеси мука + сахар сразу перед 35-секундной фазой смешивания.
Тест A5′′
Протокол идентичен A5, за исключением того, что: 1. 1 мл раствора с 16% (масс./об.) пропионата кальция добавляли поверх смеси мука + сахар сразу перед 35-секундной фазой смешивания.
Тест A6
Протокол идентичен PS4g, за исключением того, что:
1. Суспензию дрожжей готовят из 400 мг сухого вещества (вместо 200 мг), что дает 300 мг сухого вещества дрожжей используемого в тесте.
2. Смесь муки + сахар состоит из 25 г муки (вместо 20 г) и 6,5 г сахарозы (вместо 4 г).
Тесты A51 и A5′ (с пропионатом кальция)
Для свежих дрожжей
Суспензию дрожжей получали следующим образом:
1. 400 мг сухого вещества дрожжей для тестирования.
2. Смешивали с объемом дистиллированной воды, необходимой для достижения общего объема воды 6,8 мл, с учетом воды, привносимой свежими дрожжами (как правило, 70% массы прессованных дрожжей).
3. Уравновешивали при 30°C в течение 22 минут.
4. Добавляли 4,5 мл раствора, содержащего 73,6 г/кг NaCl, и гомогенизировали. 20 г муки и 3 г сахарозы добавляли к вышеуказанной суспензии. Цельную смесь смешивали в течение 35 секунд.
Высвобождение газа (выраженное в мл при 760 мм рт.ст.) записывали в течение общего периода 120 минут (этот период может быть скорректирован). Измерение начинали через 36 минут после начала протокола.
Этот протокол существует в виде варианта, включающего наличие пропионата кальция. В этом случае, в стадии 4 получения суспензии дрожжей, раствор, содержащий 73,6 г/кг NaCl, также содержит 17,4 г/кг пропионата кальция.
Для сухих дрожжей
Смешали 20 г муки, 3 г сахарозы и 400 мг сухого вещества дрожжей для тестирования. Уравновесили при 30°C в течение 12 минут.
Добавили 6,8 мл дистиллированной воды и 4,5 мл раствора, содержащего 73,6 г/кг NaCl, гомогенизировали в течение 35 секунд.
Через 36 минут после добавления дистиллированной воды проводили вторую гомогенизацию, идентичную первой.
Высвобождение газа (выраженное в мл при 760 мм рт.ст.) записывали в течение общего периода 120 минут (этот период может быть скорректирован). Измерение начинали через 60 минут после начала протокола.
Тесты A61 и A61′ (с пропионатом кальция)
Для свежих дрожжей
Суспензию дрожжей готовят следующим образом:
1. 700 мг сухого вещества дрожжей для тестирования.
2. Смешивали с объемом дистиллированной воды, необходимой для достижения общего объема воды 7,5 мл с учетом воды, привносимой свежими дрожжами (как правило, 70% массы прессованных дрожжей).
3. Уравновешивали при 30°C в течение 22 минут.
4. Добавляли 5,75 мл раствора, содержащего 73,6 г/кг NaCl, и гомогенизировали. К вышеуказанной суспензии добавляли 25 г муки и 6,5 г сахарозы.
Цельную смесь смешивали в течение 35 секунд.
Высвобождение газа (выраженное в мл при 760 мм рт.ст.) записывали в течение общего периода 120 минут (этот период может быть скорректирован). Измерение начинали через 36 минут после начала протокола.
Этот протокол существует в виде варианта, включающего наличие пропионата кальция. В этом случае, в стадии 4 получения суспензии дрожжей, раствор, содержащий 73,6 г/кг NaCl, также содержит 17,4 г/кг пропионата кальция.
Для сухих дрожжей
Смешивали 25 г муки, 6,5 г сахарозы и 700 мг сухого вещества дрожжей для тестирования. Уравновешивали при 30°C в течение 12 минут.
Добавляли 7,5 мл дистиллированной воды и 5,75 мл раствора, содержащего 73,6 г/кг NaCl, гомогенизировали в течение 35 секунд.
Через 36 минут после добавления дистиллированной воды проводили вторую гомогенизацию, идентичную первой.
Высвобождение газа (выраженное в мл при 760 мм рт.ст.) записывали в течение общего периода 120 минут (этот период может быть скорректирован). Измерение начинали через 60 минут после начала протокола.
3.1.2. Тесты по изготовлению хлеба, протестированы 4 рецепта:
- рецепт PT1, содержащий 15 масс.% (пекарские проценты) сахарозы и 0,4 масс.% (пекарские проценты) пропионата кальция;
- рецепт PT2, содержащий 18 масс.% (пекарские проценты) сахарозы и 0,4 масс.% (пекарские проценты) пропионата кальция;
- рецепт PT3, содержащий 23 масс.% (пекарские проценты) сахарозы и 0,4 масс.% (пекарские проценты) пропионата кальция;
- рецепт PT4, содержащий 25 масс.% (пекарские проценты) сахарозы и 0,4 масс.% (пекарские проценты) пропионата кальция;
В тестах I-4 разница во времени расстойки между сухими дрожжами, полученными из оцениваемого штамма, и сухими дрожжами, полученными из контрольного штамма «C», измеряется в конкретном способе изготовления хлеба с конкретными рецептами. Эффективность измеряется как процентная разница между тестируемым штаммом и контрольным штаммом. Отрицательная разница соответствует большей эффективности, чем у контрольного штамма.
Рецепты, использованные в тестах, и выраженные в пекарских процентах даны в представленной ниже таблице. Эта таблица также включает подробности различных использованных протоколов.
Безопарное тесто 15%+
Безопарное тесто 18%+
Роти мани 23%+
Безопарное тесто 25%+
ТЕСТ
PT1
PT2
PT3
PT4
Состав
Рецепт 1
Рецепт 2
Рецепт 3
Рецепт 4
Мука
100%
100%
100%
100%
Вода
54%
52%
45%
50%
Сахароза
15%
18%
23%
25%
Соль
1,7%
1%
1,5%
1,7%
Сухие дрожжи
1,5%
1%
2,3%
2%
Жир
7,5%
5%
10%
7,5%
Улучшитель
-
0,5%
0,3%
-
1%
-
-
1%
Сухое молоко
-
4%
3%
-
Яйца
-
6%
10%
-
Calpro
0,4%
0,4%
0,3%
0,4%
ТЕМПЕРАТУРЫ
Рецепт 1
Рецепт 2
Рецепт 3
Рецепт 4
Вышеуказанное + мука + вода
64°C
70°C
70°C
64°C
Тестомесильная машина с водяной баней
22,5°C
23,5°C
24,5°C
22,5°C
Тесто
27°C
28°C
29°C
27°C
ДИАГРАММА
Рецепт 1
Рецепт 2
Рецепт 3
Рецепт 4
тестомешалка «Маc Duffy»
L5 R5 H4
L1 + MG1 L1 H4
L1 + MG1 L1 H5.5
L5 R5 H4
Периодическая ферментация
10 мин
15 мин
10 мин
10 мин
Деление
320 г
320 г
320 г
320 г
Округление - ослабление
Время с конца замеса до начала формования
25 мин
50 мин
25 мин
25 мин
Формовочная машина «Shaping US»
Расстойка, Печь для форм
35°C 90% RH
35°C 90% RH
35°C 90% RH
35°C 90% RH
Выпекание Печь «Reed»
21 мин 190°C
21 мин 190°C
21 мин 190°C
21 мин 190°C
Подробности процедуры:
Тестовый протокол, примененный к различным вышеуказанным рецептам в тестах PT1-PT4:
1. Взвешивали различные ингредиенты.
2. Измеряли температуру окружающей среды и температуру муки.
3. Корректировали температуру воды с тем, чтобы получить температуру теста при +/-0,5°C, равную 27°C для рецептов 1 и 4; 28°C для рецепта 2 и 29°C для рецепта 3.
4. Помещали ингредиенты в дежу «Mac Duffy» тестомешалки «Hobart A200», рубашка которой термостатируется заблаговременно водой при 22,5°C (рецепты 1 и 4), или 23,5°C (рецепт 2), или 24,5°C (рецепт 3).
5. Смешивали сухие ингредиенты на первой скорости в течение 1 минуты.
6. Схема замеса зависит от используемого рецепта:
- Рецепты 1 и 4:
- жир включали после сухого предварительного смешивания
- добавляли проточную воду
- смешивание проводили в течение 5 минут на первой скорости (L5)
- полученный продукт оставляли на 5 минут (R5)
- замес проводили в течение 4 минут на второй скорости (H4)
- Рецепт 2:
- проточную воду добавляли после предварительного смешивания в сухом виде
- смешивание проводили в течение 1 минуты на первой скорости (L1)
- полученный продукт оставляли на 1 минуту для добавления жира (+MG1)
- смешивание проводили в течение 1 минуты на первой скорости (L1)
- замес проводили в течение 4 минут на второй скорости (H4)
- Рецепт 3:
- проточную воду добавляли после предварительного смешивания в сухом виде
- смешивание проводили в течение 1 минуты на первой скорости (L1)
- полученный продукт оставляли на 1 минуту для добавления жира (+MG1)
- смешивание проводили в течение 1 минуты на первой скорости (L1)
- замес проводили в течение 5 минут 30 секунд на второй скорости (H5.5).
7. Проверяли температуру полученного теста в конце замеса.
8. Проводили ферментацию порциями при 23°C в течение 10 минут (рецепты 1, 3 и 4) или 15 минут (рецепт 2).
9. Разделяли на 320 г куски.
10. Придавали круглую форму и накрывали.
11. Оставляли стоять на 10 минут (рецепты 1, 3 и 4) или 30 минут (рецепт 2).
12. Формовали тесто.
13. Помещали 320 г куски теста в формы (размеры: основание формы 185×75 мм; верхняя часть формы 200×90 мм; высота формы 75 мм).
14. Определяли время расстойки в инкубаторе «Stericult» при 35°C и 90% относительной влажности. Время расстойки является временем, прошедшим между помещением формы в инкубатор, и моментом, в который тесто в форме достигает высоты 85 мм.
15. Выпекали в люлечной печи «Reed» в течение 21 минуты при 190°C.
Пример 3.2: Результаты
Таблица 1:
Тесты на ферментометре: различия между гибридом по изобретению и родителем I-4341
Биомасса, полученная в колбе, оценка по свежим дрожжам
Тест
Родитель 1 I-4341 без адаптации
Родитель 2 I-4448 без адаптации
I-4312 без адаптации
I-4313 без адаптации
A5
122
120
137
132
A5′
92
98
114
115
Прирост/родители
17&24%
18&24%
Биомасса, полученная в 7 л ферментере, оценка по сухим дрожжам
Тест
I-4341 без адаптации
I-4341 с адаптацией
I-4312 без адаптации
I-4313 без адаптации
A5
96
99
121
126
A5′
79
108
114
107
A61
139
179
209
225
A6′
88
105
121
131
Биомасса, полученная в 20 л ферментере, оценка по сухим дрожжам
Тест
I-4341 без адаптации
I-4341 с адаптацией
I-4312 без адаптации
I-4313 без адаптации
A5
102
105
105
97
A5′′
99
107
90
80
A51
159
214
173
209
A51′
124
160
107
134
A61
167
232
169
241
A61′
95
114
97
125
Таблица 2:
Тест по схеме безопарного теста, гибрид по изобретению против дрожжей, полученных из неадаптированного штамма, депонированного 8 июля 2010 года в CNCM [Французская Национальная коллекция культур микроорганизмов] под номером I-4342
Биомасса, полученная в 20 л ферментере, оценка по сухим дрожжам
Тест
I-4342 без адаптации
I-4313 без адаптации
PT1
Т
-14%
PT2
Т
-9%
PT3
T
-17%
Таблица 3:
Схема безопарного теста, гибриды по изобретению против адаптированного контроля (=адаптированный I-4341)
Биомасса, полученная в 20 л ферментере, оценка по сухим дрожжам
Тест
I-4341 с адаптацией
I-4343 без адаптации
PT2
Т
1%
PT3
Т
-5%
PT4
Т
3%
Вывод: неадаптированные дрожжи по изобретению ведут себя фактически идентично или даже лучше по сравнению с адаптированными контрольными дрожжами, полученными скрещиванием одного из лучших осмотолерантных штаммов, доступных в собственной коллекции заявителя, и депонированного под номером I-4341, и коммерческого штамма, не очень чувствительного к слабым кислотам.
Эти результаты являются удивительными, поскольку заранее абсолютно не прогнозировалось накопление ранее существовавших преимуществ двух родителей при гибридизации промышленных штаммов, особенно превышение на 15-25% значений высвобождения газа обоими родителями.
Таким образом, в настоящем изобретении предлагаются гибриды, способные продуцировать пекарские дрожжи при более низкой цене, которые при этом остаются такими же эффективными в очень сладком пекарском тесте, и в присутствии ингибиторов плесени, таких как пропионат кальция.
Пример 4: Получение мутантов I-4409 и I-4410
Штамм I-4341 подвергали мутагенезу посредством экспонирования ультрафиолетовому облучению. Популяцию мутантов оценивали в тестах A5 и A5′ после продуцирования в колбах. Штаммы I-4409 и I-4410 изначально выбирали из этой популяции.
Пример 5: Получение дрожжей из мутантов примера 4
(аналогично примеру 2)
Пример 6: Сравнение эффективности с контрольными дрожжами
Биомасса, полученная в колбе, оценка по свежим дрожжам
Тест
I-4341 без адаптации
I-4409 без адаптации
I-4410 без адаптации
A5
121
117
126
A5′′
88
105
96
Прирост/I-4341 в A5′′ (%)
19
9
Биомасса, полученная в 20 л ферментере. Оценка по сухим дрожжам
Тест
I-4341 с адаптацией
I-4409 без адаптации
Различие (%)
A5
101
101
0
A5′
104
100
-4
A51
104
114
10
A51′
136
159
17
Тест
I-4341 без адаптации
I-4410 без адаптации
Различие (%)
A5
96
106
10
A5′
101
97
-4
Результаты изготовления хлеба, полученные с этими дрожжами, представлены ниже (тесты PT2 и PT3)
Тест
I-4341 без адаптации
I-4410 без адаптации
I-4410 без адаптации
PT2
Т
2%
-11%
PT3
Т
2%
-4%
Тест
I-4341 без адаптации
I-4409 без адаптации
PT1
Т
3%
PT2
Т
5%
PT3
Т
-1%