Штамм суспензионной культуры клеток растения тис валлиха (Taxus wallichiana Zucc.), депонированный в Российской коллекции культивируемых клеток высших растений под обозначением и регистрационным N 90 - продуцент таксоидов
STRAIN OF SUSPENSION CELL CULTURE OF TAXIS WALLICHIANA ZUCC. PLANTS, DEPOSITED IN RUSSIAN COLLECTION OF CULTIVATED CELLS OF HIGHER PLANTS UNDER DESIGNATION AND REGISTRATION N 90 - PRODUCER OF TAXOIDS

Область применения
Изобретение относится к биотехнологии, к штамму суспензионной культуры клеток растения тис валлиха (Taxus wallichiana Zucc.), продуценту широкого спектра таксоидов, и может использоваться как ценное сырье для фармацевтической промышленности для получения противоопухолевых средств.
Уровень техники
Тис валлиха (другое название - тис гималайский) - многолетнее древесное растение, произрастает в горных районах юго-восточной Азии.
th
Как и другие представители рода Taxus, является продуцентом специфичных дитерпеноидов: таксоидов, имеющих выраженную противоопухолевую активность (Beth A. Weaver. How Taxol/Paclitaxel kills Cancer Cells // Mol.Biol. Cell., 2014 Sep. 15; 25(18):2677-2681). Наибольшую противораковую активность показал таксоид паклитаксел. С 1994 года на его основе производится препарат таксол, широко используемый в терапии многих видов рака (С. Ballatore, K.R. Brunden, D.M. Huryn, J.Q. Trojnowski, V.M.-Y. Lee and A.B. Smith III. Microtuble Stabilizing Agent As Potential Treatment For Alzheimer Disease And Related Neurodegenerative Tauopathies. // J.Med Chem, 2012 nov 8; 55(21):8979-8996). Так как паклитаксел подавляет клеточное деление, препараты на основе этого соединения используются также в терапии ряда аутоиммунных заболевании, связанных с полифирацией клеток: псориаза, болезни Паркинсона и Альцгеймера На сегодняшний день паклитаксел находится в перечне наиболее эффективных и безопасных лекарственных препаратов ВОЗ. (WHO Model List of Essential Medicines, 19 list April 2015).
Тис является медленнорастущим видом, общее содержание таксоидов в интактном растении не превышает 0,075% от сухого веса растительного сырья. Наиболее ценными из них являются таксойды так называемого С13-гидроксилированного типа, к которым относятся паклитаксел, баккатин III и их производные. Эти соединения имеют высокую токсичность, прежде всего, для клеток растения-продуцента. В связи с этим, накопление данных веществ в интактном растении составляет доли процента от сухого веса, а наибольшее содержание обнаружено в периферических тканях, в частности, в коре (Mukherjee S., Ghosh В., Jha T.B., Jha S. Variation In Content Of Taxol And Related Taxanes In Eastern Himalayan Populations Of Taxus Wallichiana. // Planta Med. 2002 Aug; 68(8):757-9).
Следует заметить, что и другие таксоиды также могут проявлять выраженную антинеопластическую активность. В частности, весьма перспективными являются 14-гидроксилированные таксоиды (тип тайванксана - таксуюннанин С, юннанксан и др.) (Baloglu, Е., and Kingston, D. G. I. (1999) The Taxane Diterpenoids, Journal of Natural Products 62, 1448-1472). Механизм их действия основан на ингибировании активности транспортеров множественной лекарственной устойчивости, которые интенсивно экспрессируются в опухолевых клетках (Bai, J., Kitabatake, М., Toyoizumi, K., Fu, L., Zhang, S., Dai, J., Sakai, J., Hirose, K., Yamori, Т., Tomida, A., et al. (2004). Production Of Biologically Active Taxoids By Callus Culture Of Taxus Cuspidata. J Nat Prod 67, 58-63). В настоящее время в таксоиды группы тайванксана (14-гидроксилированные таксоиды) рассматриваются как весьма перспективные агенты для комплексной химиотерапии опухолевых заболеваний (Hasegawa, Т., Bai, J., Dai, J., Bai, L., Sakai, J., Nishizawa, S., Bai, Y., Kikuchi, M, Abe, M., Yamori, Т., Tomida, A., Tsuruo, Т., Hirose, K., and Ando, M. (2007) Synthesis And Structure-Activity Relationships Of Taxuyunnanine С Derivatives As Multidrug Resistance Modulator In MDR Cancer Cells. // Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 17, 3722-3728).
Потребность в дитерпеноидах тиса на сегодняшний день достаточно высока, а природные запасы тиса (Taxus brevifolia), из которого паклитаксел был выделен впервые, ограничены, поэтому все больше внимания привлекают к себе другие, менее распространенные, виды этого растения. Содержание таксоидов в интактном растении тиса валлиха (Taxus wallichiana Zucc.) составляет до 0,056% (Taxol Content In The Bark Of Himalayan Yew In Relation To Tree Age And Sex. // Nadeem M, Rickari H.C, Kumar A, Palni L.M., Nandi S.K. // Phytochemistry, 2002 jul, 60(6):627-31). Получение биомассы заявляемого штамма является весьма перспективным для биотехнологического производства. Литературных данных о получении суспензионной культуры тиса валлиха в нашей стране не обнаружено.
Задача изобретения
Задача изобретения: создание нового суспензионного штамма растения тис валлиха (Taxus wallichiana Zucc.), который является продуцентом таксоидов, со стабильными ростовыми характеристиками, высокой жизнеспособностью, наличию синтеза 14-гидроксилированных таксоидов, отсутствием сезонной зависимости их получения.
Решение задачи
Поставленная задача решается созданием нового штамма суспензионной культуры клеток растения тис валлиха (Taxus wallichiana Zucc.), депонированного в Всероссийской коллекции культивируемых клеток высших растений при Федеральном государственном учреждении Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук под обозначением Тw106П и регистрационным №90 - продуцента таксоидов.
Штамм суспензионной культуры клеток (Taxus wallichiana Zucc.) Тw106П представляет собой гомогенную биомассу клеток кремово-розового цвета, культуральная жидкость прозрачная, слабо окрашена в розовый цвет. Популяция состоит из меристемоподобных клеток, собранных в некрупные агрегаты (не более 50) и одиночных паренхимных клеток.
2
Первым этапом поучения штамма суспензионной культуры клеток растения тис валлиха (Taxus wallichiana Zucc.) является получение каллуса. В качестве экспланта используют одревесневшие побеги с иглами, обработанные детергентом 7Х (фосфатные комплексы щелочных металлов) и многократно промытые водопроводной, а затем дистиллированной водой. Далее побеги стерилизуют в 0,1% растворе сулемы (HgCl) в течение 10 минут и промывают три раза дистиллированной водой с выдержкой по 20 минут. Стерильные побеги разрезают скальпелем на кусочки 07-1,5 см, листья на побегах часто надсекают, чтобы увеличить площадь раневой поверхности. Экспланты помещают в чашки Петри на твердую питательную среду. Первичный каллус культивируют в течение 4 недель, далее пересаживают на свежую питательную среду. Для эксперимента используют питательную среду следующего состава:
3
KNO  3000,000±2,0000 мг
2
Са Cl(безвод)  113,240±1,0000 мг
4
2
MnSOx7HO  500,000±1,0000 мг
2
4
NaHPO  150,000±0,1000 мг
4
2
4
(NH)SO  134,000±0,1000 мг
3
3
НВО  6,200±0,0100 мг
4
2
ZnSOx7HO  8,600±0,0100 мг
KI  0,830±0,0010 мг
2
4
2
NaMoOx2HO  0,250±0,0010 мг
4
2
CuSOx5HO  0,025±0,0001 мг
2
2
CoClx6HO  0,025±0,0001 мг
4
2
FeSOx7HO  2,785±0,001 мг
Na-ЭДТА  3,725±0,001 мг
Гидролизат казеина  500,000±0,1000 мг
Мезо-инозит  80,000±0,0500 мг
Тиамин  0,100±0,0010 мг
Пиридоксин  0,100±0,0010 мг
Никотиновая кислота  0,500±0,0010 мг
6-бензиламинопурин  0,300±0,0010 мг
α-нафтилуксусная кислота  2,000±0,0010 мг
Сахароза  30000,000±100,0000 мг
Вода  1000 мл
Агар  5500 мг
Штамм суспензионной культуры клеток (Taxus wallichiana Zucc.) Tw106П получают путем переноса каллуса с твердой питательной среды в жидкую аналогичного состава, но без добавления агара. Культивирование проводят в темноте на качалке (100±10 об./мин.), при температуре 26°±1°С и относительной влажности 70±5%. Используют колбы объемом 250, 500 и 1000 мл, с количеством питательной среды 40, 80 и 160 мл. В качестве инокулюма используют упакованный объем клеток 1 мл, 2 мл и 4 мл соответственно объему колбы. Цикл выращивания культуры составляет 21 сутки, после чего ее пересаживают на новую питательную среду. Штамм суспензионной культуры клеток (Taxus wallichiana Zucc.) Tw106П поддерживался в лаборатории Биологии культивируемых клеток Федерального государственного учреждения науки Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук более 15 циклов выращивания.
Индекс роста культуры определяют как кратность прироста биомассы относительно начальной плотности. Для определения сырого веса суспензию определенного объема отделяют от культуральной среды на бумажных фильтрах с помощью вакуумного водяного насоса, промывают дистиллированной водой, собирают и взвешивают. Для определения сухого веса собранную биомассу сушат не менее суток в сушильном шкафу при температуре 60С° и взвешивают. Для определения количества клеток 1 мл суспензии смешивают с 4 мл 20% хромовой кислоты, выдерживают в течение 20 минут в сушильном шкафу при 60С°, далее не менее трех раз шприцуют шприцем с широкой иглой, заполняют камеру Фукса-Розенталя и посчитывают три биологические пробы в двух повторностях. Жизнеспособность определяют как процент неокрашенных клеток 0,1% раствором феносафранина.
Химический анализ биомассы штамма суспензионной культуры клеток (Taxus wallichiana Zucc.) Тw106П проводят с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии совмещенной с масс-спектрометрическим детектором при ионизации электрораспылением (ВЭЖХ-МС). Воздушно-сухую биомассу (37 мг) экстрагируют 3 раза по 1 мл 96% этилового спирта в течение 30 минут на ультразвуке (УЗВ-12, Сапфир, Россия), после чего центрифугируют при 11000 об./мин в течение 5 минут и отбирают супернатант в коническую колбу. Объединенные спиртовые экстракты упаривают под вакуумом при температуре 45°С. Полученный сухой остаток растворяют в 1 мл дистиллированной воды и наносят на патрон для твердофазной экстракции Supelclean ENVI-18 («Supelco», США). Патрон промывают 3 мл воды, аналиты смывают 3 мл этанола. Очищенный экстракт упаривают под вакуумом при 45°С. Перед анализом пробы растворяют в смеси ацетонитрил-вода (1:1, по объему).
ВЭЖХ-МС анализ проводят на хроматографе Waters Aquity UPLC (Waters, США), оснащенном гибридным квадрупольным времяпролетным масс-спектрометром XEVO QTOF (Waters, США). Условия хроматографического разделения: колонка ACQUITY UPLC ВЕН Phenyl (50×2.1 мм, 1.7 мкм; Waters, Ирландия), температура колонки - 40°С, скорость потока подвижной фазы - 0.4 мл/мин. Компоненты подвижной фазы: 0.1% (по объему) раствор муравьиной кислоты в воде (растворитель А) и 0.1% (по объему) раствор муравьиной кислоты в ацетонитриле (растворитель Б). В процессе анализа состав подвижной фазы менялся следующим образом (растворитель Б, % по объему): 0-1 мин - 35%, 1-7 мин - 35-45%, 7-17 мин - 45%. Анализ осуществляют в режиме детектирования положительных ионов (диапазон m/z 100-1200). Параметры источника ионизации: температура источника ионизации - 120°С, температура десольвации - 250°С, напряжение на капилляре - 3.0 кВ, напряжение на конусе ввода пробы - 30 В, скорость подачи азота (десольвационный газ) 600 л/час. Объем инжекции 1 мкл.
Структурную идентификацию компонентов проводят на основе расшифровки результатов масс-спектрометрии (МС).
Перечень иллюстративных материалов
Фиг. 1. Ростовые характеристики штамма суспензионной культуры клеток (Taxus wallichiana Zucc.) Tw106П.
ЖС - Жизнеспособность, %
N - количество клеток мл х 10000
Сух. М - сухая масса г/л/10
Сыр. М - сырая масса г/л
Фиг. 2. ВЭЖХ-МС хроматогрмма спиртового экстракта из биомассы штамма суспензионной культуры клеток (Taxus wallichiana Zucc.) Tw106П.
Обозначения:
1 - изомер 7-гидрокси-2,4,10,14-тетраацетокси-таксадиена;
2 - юннанксан;
3 - таксуюннанин С;
4 - синенксан С.
Фиг. 3. МС-спектры (положительные ионы) основных пиков на хроматограмме спиртового экстракта из биомассы штамма суспензионной культуры клеток (Taxus wallichiana Zucc.) Тw106П.
А - МС спектр пика №1 фиг. 2; Б - МС спектр пика №2 фиг. 2
Фиг. 4. МС-спектры (положительные ионы) основных пиков на хроматограмме спиртового экстракта из биомассы штамма суспензионной культуры клеток (Taxus wallichiana Zucc.) Tw106П (спектр пика 4).
А - МС спектр пика №3; Б - МС спектр пика №4
Результаты изобретения
Согласно полученным данным (фиг. 1-4), биомасса штамма суспензионной культуры клеток растения тис валлиха (Taxus wallichiana Zucc.) является стабильно растущей, с высокой жизнеспособностью и ростовыми показателям. Ростовые параметры культуры позволяют использовать ее в дальнейшем для аппаратурного крупномасштабного выращивания. По результатам препаративного выделения содержание юннанксана в биомассе данной культуры клеток было не менее 0,01% от сухой массы клеток. По данным химического анализа, штамм суспензионной культуры Tw 106П является продуцентом С14-гидроксилированных таксоидов (изомера 7-гидрокси-2,4,10,14-тетраацетокси-таксадиена, юннанксана, таксуюннанина С и синенксана С) и может служить сырьем для получения биологически активных веществ на ее основе.
Удобство использования настоящего изобретения состоит в отсутствии технологических трудностей сбора растительного сырья, сезонности, получении экологически чистой биомассы.