СТАБИЛЬНЫЕ И РАСТВОРИМЫЕ АНТИТЕЛА, ИНГИБИРУЮЩИЕ TNFα
STABLE AND SOLUBLE ANTIBODIES, INHIBITING TNFα

Область техники, к которой относится изобретение
Данное изобретение относится к оптимизированным антителам и производным антител, которые связываются с фактором некроза опухолей альфа (TNFα) и блокируют функцию фактора некроза опухолей альфа и применимы для диагностики и/или лечения, предупреждения или уменьшения интенсивности симптомов TNFα-ассоциированных заболеваний; их кодирующим последовательностям, получению и применению в фармакологически подходящих композициях.
Уровень техники
Фактор некроза опухолей альфа (TNFα, также известный как кахектин) является природно-встречающимся цитокином млекопитающих, продуцируемым многочисленными типами клеток, в том числе моноцитами и макрофагами, в ответ на эндотоксин или другие стимулы. TNFα является основным медиатором воспалительных, иммунологических и патофизиологических реакций (Grell, M., et аl. (1995) Cell, 83: 793-802).
Растворимый TNFa образуется расщеплением трансмембранного белка-предшественника (Kriegler, et аl. (1988) Cell 53: 45-53) и сборкой секретированных полипептидов 17 кДа в растворимые гомотримерные комплексы (Smith, et аl. (1987), J. Biol. Chem. 262: 6951-6954; в отношении обзоров по TNF см. Butler, et аl. (1986), Nature 320: 584; Old (1986), Science 230: 630). Эти комплексы затем связываются с рецепторами, обнаруженными на различных клетках. Связывание производит ряд провоспалительных эффектов, в том числе: (i) высвобождение других провоспалительных цитокинов, таких как интерлейкины (IL) IL-6, IL-8 и IL-1, (ii) высвобождение матриксных металлопротеиназ и (iii) положительная регуляция экспрессии эндотелиальных молекул адгезии, дополнительно усиливая воспалительный и иммунный каскад аттрагированием лейкоцитов в экстраваскулярные ткани.
Большое число нарушений ассоциированы с повышенными уровнями TNFα, причем многие из них являются существенно важными с медицинской точки зрения. Было показано, что TNFα положительно регулируется в ряде заболеваний человека, в том числе в хронических заболеваниях человека, таких как ревматоидный артрит (RA), воспалительные нарушения пищеварительного тракта, в том числе болезнь Крона и язвенный колит, в сепсисе, застойной сердечной недостаточности, бронхиальной астме и рассеянном склерозе. Мыши, трансгенные в отношении TNFα человека, продуцируют высокие уровни TNFα конститутивно и развивают самопроизвольный деструктивный полиартрит, сходный с RA (Keffer et al. 1991, EMBO J., 10, 4025-4031). Таким образом, TNFα называют провоспалительным цитокином.
TNFα хорошо установлен в настоящее время в качестве ключевого фактора в патогенезе ревматоидного артрита (RA), который является хроническим, прогрессирующим и изнуряющим заболеванием, характеризующимся многосуставным воспалением и деструкцией суставов, с системными симптомами недомогания и усталости. RA часто приводит к хроническому синовиальному воспалению с частым прогрессированием до деструкции суставного хряща и костей. Увеличенные уровни TNFα обнаружены как в синовиальной жидкости, так и в периферической крови пациентов, страдающих от ревматоидного артрита (RA). При введении блокирующих TNFα-агентов пациентам, страдающим от RA, они уменьшают воспаление, улучшают симптомы и задерживают повреждение сустава (McKown et аl. (1999), Arthritis Rheum. 42: 1204-1208).
Физиологически TNFα ассоциирован также с защитой от конкретных инфекций (Cerami et al. (1988), Immunol. Today 9:29). TNFα высвобождается макрофагами, которые были активированы липополисахаридами грамотрицательных бактерий. Как таковой, TNFα является, по-видимому, эндогенным медиатором первостепенной важности, участвующим в развитии и патогенезе эндотоксинового (бактериально-токсического) шока, связанного с бактериальным сепсисом (Michie, et аl. (1989), Br. J. Surg. 76: 670-671; Debets et аl. (1989), Second Vienna Shock Forum, p.463-466; Simpson, et al. (1989) Crit. Care Clin. 5: 27-47; Waage et al. (1987) Lancet 1: 355-357; Hammerle et al. (1989) Second Vienna Shock Forum, p.715-718; Debats et al. (1989), Crit. Care Clin. 17: 489-497; Calandra et al. (1990), J. Infect. Dis. 161: 982-987; Revhaug et al. (1988), Arch. Surg. 123: 162-170).
Было обнаружено, что, как и в случае других систем органов, TNFα играет ключевую роль в центральной нервной системе, в частности, в воспалительных и аутоиммунных нарушениях нервной системы, включающих в себя рассеянный склероз, синдром Гийена-Барре и тяжелую псевдопаралитическую миастению, и в дегенеративных нарушениях нервной системы, включающих в себя болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и болезнь Гентингтона. TNFα участвует также в нарушениях родственных систем ретины и мышцы, включающих в себя ретробульбарный неврит, дерматомиозит, боковой амиотрофический склероз и мышечную дистрофию, а также в повреждениях нервной системы, включающих в себя травматическое повреждение головного мозга, острое повреждение спинного мозга и инсульт.
Гепатит является другим TNFα-связанным воспалительным нарушением, который среди других провоцирующих факторов может быть обусловлен вирусными инфекциями, в том числе вирусом Эпштейна-Барра, цитомегаловирусом и вирусами гепатита А-Е. Гепатит вызывает острое воспаление печени в портальной и дольчатой областях с последующими фиброзом и прогрессированием опухоли.
TNFα может опосредовать кахексию в случае рака, которая вызывает наибольшую болезненность и смертность (Tisdale M.J. (2004), Langenbecks Arch Surg. 389: 299-305).
Ключевая роль TNFα в воспалении, клеточных иммунных реакциях и патологии многих заболеваний, привела к поиску антагонистов TNFα.
TNFα является важным цитокином, системная блокада которого несет в себе риск увеличенной частоты и тяжести клинически манифестированных инфекций, в частности, повторной активации латентного туберкулеза, и, возможно, другие риски, в том числе индукцию лимфом, демиелинизирующих заболеваний и сердечной недостаточности.
Одним классом антагонистов TNFα, предназначенных для лечения TNFα-опосредованных заболеваний, являются антитела или фрагменты антител, которые специфически связывают TNFα и посредством этого блокируют их функцию. Применение анти-ТNFα-антител показало, что блокада TNFα может обращать эффекты, приписываемые TNFα, в том числе снижение IL-1, GM-CSF, IL-6, IL-8, молекул адгезии и деструкцию ткани (Feldman et al. (1997), Adv. Immunol. 1997: 283-350).
Антитела, направленные против TNFα, были предложены для профилактики и лечения эндотоксического шока (Beutler et аl. (1985) Science:234, 470-474). Применение aнти-TNFα-антител в лечении септического шока обсуждается Bodmer et аl., (Critical Care Medicine, 21:441-446, 1993), Wherry et al., 1993 (Critical Care Medicine, 21:436-440) и Kirschenbaum et al., 1998 (Critical Care Medicine, 26:1625-1626).
Способ лечения нейродегенеративного заболевания в человеке введением моноклонального анти-TNFα-aнтитела или его TNFα-связывающего фрагмента был описан в US 2003147891.
WO 0149321 описывает применение TNFα-блокаторов, в том числе анти-TNFα-антител, для лечения неврологических и родственных нарушений, вызываемых TNFα. Он обеспечивает способ лечения указанных заболеваний введением антагониста TNFα.
WO 03047510 описывает различные типы моноклональных и сконструированных антител, направленных против TNFα, их получение, соединения, содержащие их, и применение в медицине.
Антитела, применимые для терапий TNFα-опосредованных заболеваний, обычно являются либо моноклональными антителами (mAb), продуцируемыми технологией гибридом из природного источника, либо сконструированными антителами. Последние либо соответствуют природно-встречающимся антителам в том смысле, что они содержат полноразмерные тяжелые и легкие цепи, либо соответствуют Fab-фрагментам, которые могут быть также созданы из природных антител протеолитическим расщеплением, или одноцепочечным scFv-антителам, в которых фрагменты вариабельных областей тяжелых и легких цепей связаны пептидным линкером.
Как тяжелые, так и легкие цепи антитела содержат константные и вариабельные домены. Поскольку антитела не человека являются иммуногенными, количество последовательностей, подобных последовательностям человека, в антителе часто увеличивают в так называемом «гибридном» антителе, которое содержит константные области IgG человека и вариабельные области, соответствующие последовательностям антитела животного, в большинстве случаев мышиных антител, с желаемой специфичностью. Затем эти вариабельные области могут быть дополнительно адаптированы, чтобы они стали более сходными с типичным антителом человека, посредством мутагенеза, что приводит к «гуманизированному» антителу. В еще одном альтернативном подходе только антиген-связывающие части, т.е. определяющие комплементарность участки (CDR) вариабельных областей мышиного антитела, объединяют с каркасом антитела человека, что приводит к «CDR-привитому» антителу.
Моноклональные антитела против TNFα были описаны в известном уровне техники. Meager et al., 1987 (Hybridoma 6:305-311) описывают мышиные моноклональные антитела против рекомбинантного TNFα. Shimamoto et al., 1988 (Immunology Letters 17:311-318) описывают применение мышиных моноклональных антител против TNFα в предотвращении эндотоксического шока в мышах.
US 5919452 описывает химерные анти-ТNFα-антитела и их применение в лечении патологий, ассоциированных с присутствием TNFα.
Применение анти-TNFα-антител в лечении RA и болезни Крона обсуждается в Feldman et al., 1998 (Transplantation Proceedings 30:4126-4127), Adorini et al., 1997 (Trends in Immunology Today 18:209-211) и в Feldman et al., 1997 (Advanced Immunology 64:283-350). Антитела к TNFα, использованные в таких терапиях, являются обычно химерными антителами, такими как антитела, описанные в US 5919452.
US 2003187231 описывает гуманизированные анти-ТNFα-антитела, по меньшей мере, с одним CDR-районом не человека, которые улучшали характеристики связывания. Кроме того, в Международной заявке на патент WO 92/11383 описаны рекомбинантные антитела, в том числе CDR-привитые антитела, специфические в отношении TNFα. Rankin et al. (1995) (British J. Rheumatology 34:334-342) описывают применение таких CDR-привитых антител в лечении ревматоидного артрита (RA).
WO 9211383 описывает рекомбинантное, гуманизированное CDR-привитое антитело, специфическое в отношении TNFα, которое произведено из мышиного моноклонального антитела 61Е7, hTNFI, hTNF3 или 101.4, и описывает получение и применение указанных антител в диагностике и/или терапии TNFα-ассоциированных нарушений.
Среди специфических ингибиторов TNFα, которые стали коммерчески доступными лишь недавно, моноклональное, химерное мышиное-человеческое антитело, направленное против TNFα (инфликсимаб, Remicade™; Cenrtocor Corporation/Johnson & Johnson), продемонстрировало клиническую эффективность в лечении RA (Elliot et al. 1994, Lancet 344:1105-1110; Mani et al. (1998), Arthritis & Rheumatism 41:1552-1563). Инфликсимаб продемонстрировал также клиническую эффективность в лечении воспалительного нарушения пищеварительного тракта, болезни Крона (Baert et al. 1999, Gastroenterology 116: 22-28).
US 22002037934 описывает лечение гепатита введением анти-TNFα-aнтитела, такого как инфликсимаб.
US 6428787 описывает лечение неврологических и TNFα-ассоциированных заболеваний aнти-TNFα-aнтителами, в том числе инфликсимабом, CDP571 и D2E7.
D2E7 (адалицумаб), моноклональное анти-ТNFα-антитело человека (Abbot) было разработано для лечения RA и болезни Крона (WO 9729131). Celltech разрабатывает CDP571 (ЕР 0626389), гуманизированное анти-ТNFα-IgG4-антитело, для лечения болезни Крона и CDP870, фрагмент гуманизированного моноклонального анти-ТNFα-антитела, для лечения RA. Локальное введение указанных антител для лечения локализованных нарушений описано в US 2003185826.
Многие одноцепочечные (scFv) антитела были созданы против множества различных антигенов, в частности, вследствие того, что они могут быть легко отобраны на высокую способность связывания с использованием, например, таких способов, как фаговый дисплей или рибосомный дисплей. Кроме того, scFv-антитела могут быть получены в микробных системах, которые связаны с меньшими расходами в сравнении с получением терапевтических полноразмерных антител.
Кроме общепринятых внеклеточных и in vitro применений, scFv были также успешно использованы для внутриклеточных применений (Worn et al., 2000, JBC, 28; 275(4):2795-2803; Auf der Maur et al. 2002, JBC, 22; 277 (47):960-966); таким образом, были развиты scFv, направленные против внутриклеточных антигенов. Обычно внутриклеточная экспрессия функциональных scFv является ограниченной их нестабильностью, нерастворимостью и склонностью к образованию агрегатов. По этой причине были успешно разработаны системы скрининга in vivo на антитела scFv, которые являются особенно растворимыми и стабильными при восстанавливающих условиях, типичных для внутриклеточной среды (например, ядра, цитоплазмы), с использованием так называемого "Quality Control" скрининга (Скрининга с контролем качества) (WO 0148017); Auf der Maur et al. (2001), FEBS Lett. 508:407-412; Aus der Maur et al. (2004), Methods 34:215-224), и они привели к идентификации особенно стабильных и растворимых каркасных последовательностей scFv для таких целей (WO 03097697). Кроме того, эти каркасы обнаруживают исключительно высокие уровни экспрессии и усиленные свойства стабильности и растворимости также и при природных, окислительных условиях во внеклеточной среде. Таким образом, эти благоприятные биофизические и биохимические свойства приводят к благоприятным выходам получения и позволяют использовать эти фрагменты антител, направленных против специфических антигенов, локально и/или системно в качестве белковых терапевтических агентов в конкретных терапевтических зонах. Поскольку как scFv-антитела, так и Fab-фрагменты, в противоположность полноразмерным антителам, не имеют Fc-части, которые узнаются Fc-рецептором моноцитов, таких как природные клетки-киллеры, они не провоцируют антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC) и, следовательно, не провоцируют неспецифическую токсичность вследствие связывания с Fc-рецепторами на клетках, не являющихся мишенями.
Таким образом, существует потребность в новых, эффективных формах антител для лечения TNFα-ассоциированных нарушений, таких как ревматоидный артрит (RA), в частности, лечений, которые могут обеспечить стойкую, регулируемую терапию местным введением с низкой степенью побочных действий. Данное изобретение обеспечивает антитела, композиции и способы для эффективного и непрерывного лечения воспалительных процессов артрита и других TNFα-опосредованных нарушений или патофизиологических механизмов, в частности различных форм боли.
Все публикации и ссылки, цитируемые здесь, включены тем самым в качестве ссылки в их полном объеме.
Раскрытие изобретения
Таким образом, главной целью данного изобретения является обеспечение стабильного и растворимого антитела или производного антитела, которое специфически связывает TNFα in vitro и in vivo. В предпочтительном варианте осуществления указанным производным антитела является scFv-антитело или Fab-фрагмент.
L
H
Теперь для осуществления этих и дополнительных целей этого изобретения, которые будут становиться все более очевидными по мере продолжения описания, указанное антитело или производное антитела характеризуются признаками, заключающимися в том, что они содержат вариабельный домен легкой цепи, имеющий последовательность SEQ ID NO:1 или производный из последовательности SEQ ID NO:1, который объединен с вариабельным доменом тяжелой цепи, имеющим последовательность SEQ ID NO:2 или производным из последовательности SEQ ID NO:2, причем в случае производной последовательности указанная последовательность имеет максимально до 5 изменений в каркасе указанного V-домена и/или максимально до 9 изменений в каркасе указанного V-домена.
L
H
L
H
Предпочтительным вариантом осуществления данного изобретения является указанное антитело или производное антитела, где одно или несколько аминокислотных изменений введены в любом из положений в этом каркасе, предпочтительно в одном или нескольких положениях, выбранных из положений 4, 46, 65, 67, 70 и 83 V-домена и/или в одном или нескольких положениях, выбранных из группы положений 11, 16, 28, 43, 48, 68, 70, 71, 72, 73, 76, 77, 79, 93 и 112 V-домена. Более предпочтительно, по меньшей мере, одно из этих превращений приводит к аминокислоте, присутствующей в SEQ ID NO:3 для V и/или SEQ ID NO:4 для V, и еще более предпочтительно максимально присутствуют 13 превращений в целом.
L
H
L
H
H
L
H
H
Наиболее предпочтительно указанное антитело или производные антитела содержат V-домен последовательности SEQ ID NO:1 и/или V-домен, имеющий последовательность SEQ ID NO:2 или произведенный из последовательности SEQ ID NO:2, или V-домен последовательности SEQ ID NO:11 и V-домен SEQ ID NO:4. Если V-домен антитела данного изобретения содержит V-домен SEQ ID NO:1, в предпочтительном варианте осуществления, V-последовательность произведена из SEQ ID NO:2 таким образом, что фенилаланин в положении 68 заменен на аланин, лейцин, изолейцин или валин. Дополнительные изменения в V являются необязательными. scFv-антитела этого типа приведены в SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36 и SEQ ID NO:37.
L
H
L
H
В другом предпочтительном варианте осуществления данного изобретения указанное антитело или производное антитела произведены из антитела с V-последовательностью SEQ ID NO:1 и V-последовательностью SEQ ID NO:2 и содержат, по меньшей мере, один аминокислотный остаток, который превращен, по меньшей мере, в одном из CDR в остаток, присутствующий в соответствующем CDR V-последовательности SEQ ID NO:5 и/или V-последовательности SEQ ID NO:6 или SEQ ID NO:25.
L
L
H
H
L
H
В одном очень предпочтительном варианте осуществления данного изобретения, по меньшей мере, один из CDR группы CDR2 V, CDR3 V, CDR2 V или CDR3 V превращен в соответствующий CDR V-последовательности SEQ ID NO:5 и/или V-последовательности 25 или SEQ ID NO:6.
L
H
Наиболее предпочтительно, указанное антитело или производное антитела содержат следующие комбинации V/V-последовательностей:
L
H
V SEQ ID NO:7/V SEQ ID NO:2,
L
H
V SEQ ID NO:8/V SEQ ID NO:2,
L
H
V SEQ ID NO:1/V SEQ ID NO:9,
L
H
V SEQ ID NO:1/V SEQ ID NO:25,
L
H
V SEQ ID NO:1/V SEQ ID NO:28,
L
H
V SEQ ID NO:1/V SEQ ID NO:29,
L
H
V SEQ ID NO:26/V SEQ ID NO:30,
L
H
V SEQ ID NO:27/V SEQ ID NO:30.
d
d
d
В другом предпочтительном варианте осуществления антитело или производное антитела данного изобретения имеют специфичность в отношении TNFα человека. Предпочтительно связывание антитела характеризуется К~100 нМ или менее. Более предпочтительным является антитело с K 10 нМ или менее и наиболее предпочтительным является антитело с K 1 нМ или менее.
Производными антитела в соответствии с этим изобретением являются, например, Fc-слияния, слияния с токсином, слияния с ферментативными активностями, различные форматы, такие как миниантитела, диантитела, линейные антитела, одноцепочечные антитела, биспецифические фрагменты антител, в частности, scFv- и Fab-фрагменты.
L
H
L
H
Другой предпочтительной целью данного изобретения является scFv-антитело, домены V и V которого соединены при помощи линкера, предпочтительно в виде V-линкер-V-последовательности SEQ ID NO:10.
Другой предпочтительной целью данного изобретения является scFv-антитело, произведенное из SEQ ID NO:40 (ТВ-А). Такое антитело может быть получено мутагенезом и содержит три или менее мутаций в каркасной, CDR- и/или линкерной последовательности. Предпочтительно, это scFv-антитело имеет последовательность SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37 или SEQ ID NO:38.
L
H
Другой предпочтительной целью данного изобретения является Fab-фрагмент, содержащий V-домен, который слит с константной областью каппа-цепи Ig человека, и V-домен, который слит с СН1-доменом IgG человека, посредством чего эти два слитых полипептида соединены межцепочечным дисульфидным мостиком.
Еще в одном аспекте это антитело или производное антитела, например, фрагмент антитела данного изобретения является меченым или химически модифицированным.
Данное изобретение обеспечивает также ДНК-последовательность, кодирующую любые из антител или производных антител данного изобретения, а также клонирующий или экспрессирующий вектор, содержащий указанную ДНК-последовательность. Кроме того, обеспечена подходящая клетка-хозяин, трансформированная указанной ДНК-последовательностью, которая предпочтительно является Е. coli, клеткой дрожжей или клеткой млекопитающего.
Кроме того, обеспечен способ получения антител или производных антител данного изобретения, предусматривающий культивирование клетки-хозяина, трансформированной ДНК, кодирующей любые из указанных антител или производных антител, в условиях, которые делают возможным синтез указанного антитела или производного антитела, и извлечение указанной молекулы из указанной культуры. Предпочтительно указанный способ обеспечивает scFv-антитело или Fab-фрагмент, очищенные из Е. coli.
Другим аспектом данного изобретения является применение антител или производных антител, обеспеченных данным изобретением, в качестве диагностического инструмента для диагностики in vitro и/или фармацевтического агента. Это применение является особенно предпочтительным в контексте любого связанного с TNFα состояния.
Данное изобретение включает в себя также композицию, содержащую антитело или производное антитела данного изобретения в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или эксципиентом, причем указанная композиция предназначена для применения в качестве лекарственного средства для лечения TNFα-ассоциированных заболеваний.
В дополнительном аспекте данное изобретение обеспечивает комбинированный препарат, содержащий антитело или производное антитела данного изобретения, предпочтительно со вторым соединением, которое не является антителом или производным антитела, специфическим в отношении TNFα.
Еще в одном аспекте данного изобретения вектор, содержащий ДНК-последовательность, кодирующую scFv-антитело данного изобретения, используют для генотерапии.
Лечение TNFα-ассоциированных заболеваний достигается блокированием TNFα вследствие сильного взаимодействия TNFα с этим антителом или производным антитела. Предпочтительно, предполагается лечение аутоиммунных, острых или хронических воспалительных состояний, связанных с раком заболеваний, боли, неврологических и нейродегенеративных нарушений, инфекционных заболеваний и сердечно-сосудистых заболеваний.
Краткое описание чертежей
Данное изобретение будет более понятным, и цели, другие, чем описанные выше цели, станут очевидными при рассмотрении со следующим подробным описанием. Такое описание делает ссылки на прилагаемый графический материал.
Фиг.1 показывает схему scFv-антитела с последовательностями ТВ-А и ТВ-В, определяющими границы диапазона наиболее частых вариаций. Звездочки обозначают положения, в которых допускаются аминокислотные изменения в каркасе антител данного изобретения. Аминокислоты, указанные ниже CDR (CDR выделены серым фоном), могут быть использованы в соответствующих CDR.
Фиг.2 показывает примерную схему для представления Fab-фрагмента.
Фиг.3 показывает продукционный выход scFv при экспрессии в Е. coli. A. Электрофорез в ДСН-полиакриламидном геле экспрессируемых белков. В. Аналитическая гель-фильтрация ТВ-А и TB-wt, показывающая превосходную растворимость ТВ-А.
Фиг.4 показывает сравнение аффинности различных scFv-антител к TNFα, определяемой при помощи ELISA.
50
Фиг.5 показывает ингибирование цитотоксичности, индуцированной TNFα человека, в фибробластах мыши L929. А. Зависимое от концентрации ингибирование ТВ-А в сравнении с TB-wt и инфликсимабом с величинами IC. В. Сравнение ТВ-А-производных в отношении блокирования TNFα-индуцированной цитотоксичности. С. Сравнение форматов scFv и Fab ТВ-А.
Фиг.6 показывает эффект лечения антителом индуцированного TNFα человека опухания сустава у крысы (эксперимент: 5.3., эксперимент 1).
Фиг.7 показывает схему балльных оценок для гистопатологической оценки воспаления.
Фиг.8 показывает эффект лечения антителом индуцированного TNFα человека воспалении сустава у крысы (эксперимент: 5.3., эксперимент 1).
Фиг.9 показывает эффект лечения антителом индуцированного TNFα человека опухания сустава у крысы (эксперимент: 5.3., эксперимент 2).
Фиг.10 показывает эффект лечения антителом индуцированного TNFα человека воспаления сустава у крысы (эксперимент: 5.3., эксперимент 2).
Фиг.11 показывает стабильность ТВ-А в различных жидкостях тела.
Осуществление изобретения
d
L
H
4
Было обнаружено, что антитела или производные антител, содержащие каркасы, идентифицированные в так называемом скрининге с контролем качества ("Quality Control") (WO 0148 017), характеризуются в целом высокой стабильностью и/или растворимостью и, следовательно, могут быть также применимы в контексте внеклеточных применений, таких как нейтрализация TNFα. Данное изобретение обеспечивает антитела или производные антител, отличающиеся повышенной стабильностью и растворимостью, которые специфически узнают и связывают TNFα и, следовательно, являются подходящими для блокирования функции TNFα in vivo. Указанные антитела или производные антител отличаются особым каркасом, произведенным с использованием скрининга с «контролем качества» на антитела с особенно стабильными и растворимыми каркасами независимо от их антиген-связывающего сайта, которые были описаны в ЕР 1479694. Если каркасами, используемыми в этом скрининге, являются каркасы антитела человека, они могут рассматриваться как неиммуногенные каркасы для применений в человеке. CDR этих антител данного изобретения являются идентичными CDR или произведены из CDR мышиного моноклонального антитела Di62 (Doring et аl., 1994), которое специфически связывается с TNFα человека с высокой аффинностью (K=0,4 нМ) и может блокировать связывание TNFα с его рецептором. Кроме того, Di62 ингибирует индуцированную TNFα человека цитотоксичность в клетках мыши L929. Вполне понятная стадия прививки CDR из мышиного антитела на, несомненно, наиболее подходящий акцепторный каркас человека с неопределенными антиген-связывающими свойствами, где указанный каркас имеет V-последовательность SEQ ID NO:5 и V-последовательность SEQ ID NO:6, причем указанные последовательности связаны (GGGGS)-линкером (SEQ ID NO:10), приводила к scFv-антителу с последовательностью:
причем указанное scFv-антитело названо ТВ-В. ТВ-В давало хорошие выходы в экспрессии белка (фиг.3А), но не было способно специфически связывать TNFα (фиг.4А).
L
H
L
4
H
d
Таким образом, для получения антитела или производного антитела, которое является (i) достаточно специфическим в отношении связывания TNFα, (ii) достаточно растворимым для возможности эффективного получения и очистки и для блокирования TNFα in vivo, (iii) достаточно стабильным для применения в качестве фармацевтического агента без быстрой деградации и (iv) достаточно неиммуногенным, искали компромисс между наилучшей растворимостью и наилучшими антиген-связывающими свойствами варьирования этого каркаса и этих CDR. Данное изобретение обеспечивает последовательность для V и V, которая оптимизирована в отношении комбинации критериев (i-iv). scFv-антитело, содержащее указанную V (SEQ ID NO:1, связанную (GGGGS)-линкером с указанной V (SEQ ID NO:2), названо ТВ-А. Последовательность ТВ-А представлена SEQ ID NO:40. Это антитело является все еще достаточно стабильным и растворимым для получения удовлетворительных выходов при экспрессии и очистке из Е. coli (фиг.3А), и оно не агрегируется (фиг.3В). Его характеристики связывания с TNFα являются превосходными, с K 0,8 нМ.
L
H
L
H
L
H
L
H
4
L
d
Данное изобретение описывает также V- и V-последовательности, произведенные из последовательностей, представленных в ТВ-А, различными способами. Во-первых, было обнаружено, что точковые мутации в положениях до пяти положений в каркасе V и/или в положениях до девяти положений в каркасе V являются приемлемыми, в частности, точковые мутации, которые делают эти каркасы более ТВ-В-подобными, т.е. более подобными SEQ ID NO:3 для V или SEQ ID NO:4 для V. scFv-антитело, содержащее V-домен последовательности SEQ ID NO:11 и V-домен последовательности SEQ ID NO:4, связанные (GGGGS)-линкером, названо ТВ-В R46L, так как оно отличается только в положении 46 V от ТВ-В. В отличие от ТВ-В это антитело все еще имеет хорошие связывающие свойства в отношении TNFα (K~100 нМ). Это предполагает, что количество изменений в ТВ-В R46L относительно ТВ-А представляет верхний предел для изменений в каркасе вариабельного домена.
L
H
L
H
H
L
L
H
H
L
В предпочтительном варианте осуществления данного изобретения в каркасы Vи/или V ТВ-А вводят лишь одно- или двухточковые мутации. Предпочтительные остатки каркаса для мутаций находятся в положениях 4, 46, 65, 67, 70 и 83 для V и в положениях 11, 16, 28, 43, 48, 68, 70, 71, 72, 73, 76, 77, 79, 93 и 112 для V. Эти положения нумеруются в соответствии с нумерацией в списке последовательностей. Аминокислотные замены являются предпочтительно либо «консервативными», либо такими, что заменяющие аминокислоты являются более сходными или предпочтительно даже идентичными с соответствующими аминокислотами, присутствующими в последовательности ТВ-В. Например, аминокислота А76 V в ТВ-А может быть изменена в 176, так как 176 присутствует в ТВ-В, но она может быть также изменена в другую аминокислоту со сходной, т.е. неполярной боковой цепью, такую как V или L. Этот пример является примером «консервативной» замены аминокислоты. Семейства аминокислотных остатков, имеющих сходные боковые цепи, подходящие для «консервативных» замен, обсуждаемых в данном контексте, были определены в данной области, в том числе основные боковые цепи (К, R, Н), кислотные боковые цепи (D, Е), незаряженные полярные боковые цепи (Q, N, S, Т, Y, С), неполярные боковые цепи (G, А, V, L, I, P, F, M, W), бета-разветвленные боковые цепи (Т, V, I) и ароматические боковые цепи (Y, F, W, Н). Предпочтительным консервативным изменением является изменение V в положении 83, в котором V заменен либо на F (SEQ ID NO:26), либо на A (SEQ ID NO:27). Однако в SEQ ID NO:32 неконсервативным изменением в V является V83E, которое комбинировано с изменением в CDR1, т.е. N31D, и в V с изменением V79A. Другим экстраординарным вариантом ТВ-А является вариант SEQ ID NO:33, с консервативным изменением F68L в V, связанной с V линкером, несущим R в положении 2, вместо G.
L
H
H
Очень предпочтительными заменами единственных аминокислот являются R65S или Y67S в V и K43Q или F68 на V, L или А в V. Очень предпочтительными двойными заменами являются F70L/L72R или A76I/S77G в V. scFv-антитела, содержащие последовательности ТВ-А с указанными изменениями, обнаруживают ингибирование TNFα-индуцированной цитотоксичности в клетках L929. Результаты некоторых из них показаны на фиг.5В. Их последовательности являются следующими:
SEQ ID NO:18=ТВ-А H_K43Q (ТВ-А-Н43)
SEQ ID NO:19=ТВ-А H_F68V (TB-A-H68)
SEQ ID NO:20=ТВ-А H_F70L/L72R (ТВ-А Н70/72)
SEQ ID NO:21=ТВ-А H_A76I/S77G (ТВ-А Н76/77)
SEQ ID NO:22=ТВ-А L_L46R (ТВ-А L46)
SEQ ID NO:23=ТВ-А L_R65S (ТВ-А L65)
SEQ ID NO:24=ТВ-А L_Y67S (ТВ-А L67).
H
L
В предпочтительном варианте осуществления любой из вышеупомянутых V-доменов может быть объединен с любым из вышеупомянутых V-доменов.
L
H
L
H
L
H
4
4
3
В другом предпочтительном варианте осуществления данного изобретения V- и V-домены ТВ-А и ТВ-В перетасованы таким образом, что V-домен ТВ-А (SEQ ID NO:1) объединен с V-доменом ТВ-В (SEQ ID NO:4) или V-домен ТВ-В (SEQ ID NO:4) объединен с V-доменом ТВ-А (SEQ ID NO:2). В очень предпочтительном варианте осуществления эти перетасованные версии, полученные в scFv, соединены (GGGGS)-линкером последовательности SEQ ID NO:10, что приводит к scFv-антителам ТВ-АВ (SEQ ID NO:12) или ТВ-ВА (SEQ ID NO:13) соответственно. Указанный (GGGGS)-линкер может иметь аминокислотную замену глицина на более гидрофильную, т.е. полярную или даже заряженную аминокислоту, которая может делать антитело более растворимым. Среди этих вариаций, предпочтительной является вариация с последовательностью GRGGS-(GGGGS) (SEQ ID NO:39).
L
H
H
L
В рамках данного изобретения находится также объединение V- или V-доменов ТВ-В-подобных последовательностей с V- или V-доменами ТВ-А-подобных последовательностей, вследствие чего ТВ-В/ТВ-А-подобные обозначают, что эти последовательности являются более близкими к одной, чем к другой последовательности.
L
H
L
H
L
L
L
H
L
H
Еще в одном предпочтительном варианте осуществления данного изобретения одна или несколько аминокислот изменены в CDR-районах V- и/или V-последовательностей ТВ-А таким образом, что они совпадают с соответствующими аминокислотами, присутствующими в выбранных последовательностях SEQ ID NO:5 V и/или SEQ ID NO:6 или SEQ ID NO:25 V. Очень предпочтительными являются изменения в одном из CDR V (CDR2 V или CDR3 V) и/или CDR V (CDR2 или CDR3), причем наиболее предпочтительные изменения приводят к последовательностям SEQ ID NO:7 или SEQ ID NO:8 V и/или последовательностям SEQ ID NO:25 или SEQ ID NO:9 V соответственно.
L
H
L
H
В другом предпочтительном варианте осуществления данного изобретения V-последовательности SEQ ID NO:26 или SEQ ID NO:27 объединяют с V-последовательностью SEQ ID NO:30. В еще одном предпочтительном варианте осуществления данного изобретения V-последовательность SEQ ID NO:1 объединяют с V-последовательностями SEQ ID NO:28 или SEQ ID NO:29.
L
H
Обычно любая из описанных V-последовательностей может быть объединена с любой из описанных V-последовательностей.
L
H
L
H
4
L
H
H
L
Объектами данного изобретения являются антитела и фрагменты антител, в частности V- или V-полипептиды, одноцепочечные антитела (scFv) или Fab-фрагменты. В случае scFv-антител, выбранный V-домен может быть связан с выбранным V-доменом в любой ориентации гибким линкером. Подходящий линкер существующего уровня техники состоит из повторяемых аминокислотных последовательностей GGGGS или их вариантов. В предпочтительном варианте осуществления данного изобретения используют (GGGGS)-линкер SEQ ID NO:10 или его производное SEQ ID NO:39, но возможны также варианты из 1-3-повторов (Holliger et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448). Другие линкеры, которые могут быть использованы для данного изобретения, описаны Alfthan et al. (1995), Protein Eng. 8:725-731, Choi et al. (2001), Eur. J. Immunol. 31:94-106, Hu et al. (1996), Cancer Res. 56:3055-3061, Kipriyanov et al. (1999), J. Mol. Biol. 293:41-56 и Roovers et al. (2001), Cancer Immunol. Immunother. 50:51-59. Расположение может быть либо V-линкер-V, либо V-линкер-V, причем первая ориентация является предпочтительной ориентацией.
L
H
L
H
L
В случае Fab-фрагментов, выбранные вариабельные домены легкой цепи V сливают с константной областью каппа-цепи Ig человека, тогда как подходящие вариабельные домены тяжелой цепи V сливают с первым (N-концевым) константным доменом СН1 IgG человека. В примерном варианте осуществления данного изобретения, Сκ-домен имеет последовательность SEQ ID NO:14, а домен СН1, используемый для конструирования Fab-фрагментов, имеет последовательность SEQ ID NO:15. Фиг.2 показывает пример Fab-фрагмента, в котором используют V- и V-домены ТВ-А таким образом, что V-домен непосредственно связан с константным доменом каппа человека, что приводит к последовательности:
H
а V-домен слит с первым константным доменом (СН1), что приводит к последовательности:
На С-конце образуется межцепочечный дисульфидный мостик между двумя константными доменами.
d
d
Антитела или производные антител данного изобретения могут иметь аффинности в отношении TNFα человека с константами диссоциации К в диапазоне 0,8-10000 нМ. В предпочтительном варианте осуществления данного изобретения K равна ≤10 нМ. Аффинность антитела в отношении антигена может быть определена экспериментально с использованием подходящего способа (Berzofsky et al. "Antibody-Antigen Interactions", in Fundamental Immunology, Paul, W.E., Ed, Raven Press: New York, NY (1992); Kuby, J. Immunology, W.H. Freeman and Company: New York, NY) и описанных в этих ссылках способов.
В одном аспекте данного изобретения антитела или производные антител, в частности scFv-антитела или Fab-фрагменты, являются мечеными. Детектируемое мечение TNFα-специфического антитела или производного антитела может выполняться связыванием его с ферментом для использования в ферментном иммуноанализе (EIA) или твердофазном иммуноферментном анализе (ELISA), которые хорошо известны специалисту в данной области (например, Current Protocols in Immunology, Coligan et al. Eds, John Wiley & Sons, 2005).
3
131
35
14
125
Посредством радиоактивного мечения TNFα-специфических антител или производных антител можно детектировать TNFα с использованием радиоиммуноанализа (RIA) (см., например. Work et аl., Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology, North Holland Publishing Company, N.Y. (1978). Радиоактивный изотоп может быть детектирован с использованием гамма-счетчика или сцинтилляционного счетчика или радиоавтографией. Особенно применимыми изотопами являются Н, I, S, С и предпочтительно I.
Антитела или производные антител данного изобретения могут быть также помечены флуоресцентными метящими соединениями, такими как флуоресцеин, изотиоцианат, родамин, фикоэритрин, фикоцианин, аллофикоцианин, о-фталевый альдегид и флуорескамин, или хемилюминесцентными соединениями, такими как люминол, изолюминол, ароматический сложный эфир акридиния, акридиниевая соль имидазола и оксалатный эфир.
Протоколы мечения и детектирования хорошо известны специалисту в данной области. Например, они доступны из Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol NO. I (Harlow, E. and Lane, D., 1998).
Меченые антитела или производные антител данного изобретения применимы для диагностических целей, в частности для детектирования TNFα в биологической пробе, взятой из пациента. Может быть использована любая проба, содержащая TNFα, например, биологические жидкости, такие как кровь, сыворотка, лимфа, моча, воспалительный экссудат, цереброспинальная жидкость, амниотическая жидкость, экстракт или гомогенат ткани и т.п., или гистологические препараты для детектирования in situ.
Фармацевтические препараты
Определения: Термин «фармацевтическая готовая форма» относится к препаратам, которые находятся в такой форме, которая позволяет биологической активности антитела или производного антитела быть недвусмысленно эффективной и которая не содержит дополнительных компонентов, которые являются токсичными для субъектов, которым должна вводиться эта готовая форма. «Фармацевтически приемлемые» эксципиенты (носители, адъюванты) являются эксципиентами, которые являются приемлемыми для введения субъекту-млекопитающему для обеспечения эффективной дозы используемого активного ингредиента.
«Стабильной» готовой формой является форма, в которой антитело или производное антитела, по существу, сохраняют его физическую стабильность и/или химическую стабильность, и/или биологическую стабильность после хранения. Различные аналитические способы измерения стабильности белков являются доступными в данной области и обсуждаются, например, в Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) и Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993). Стабильность может измеряться при выбранной температуре в течение выбранного периода времени. Предпочтительно эта готовая форма является стабильной при комнатной температуре (приблизительно 30°С) или при 40°С в течение, по меньшей мере, 1 месяца и/или стабильной при приблизительно 2-8°С в течение, по меньшей мере, 1 года - в течение, по меньшей мере, 2 лет. Кроме того, эта готовая форма является предпочтительно стабильной после замораживания (например, до -70°С) и оттаивания этой готовой формы.
Антитело или производное антитела «сохраняют его физическую стабильность» в фармацевтической готовой форме, если оно не обнаруживает признаков агрегации, преципитации и/или денатурации после визуального обследования цвета и/или прозрачности, или при измерении по рассеянию УФ-света, или при помощи гель-фильтрационной хроматографии.
Антитело или производное антитела «сохраняют его химическую стабильность» в фармацевтической готовой форме, если химическая стабильность в конкретное время является такой, что считается, что этот белок все еще сохраняет его биологическую активность, определенную ниже. Химическая стабильность может быть оценена детектированием и количественным определением химически измененных форм этого белка. Химическое изменение может включать в себя модификацию размера (например, сокращение размера), которая может быть оценена при помощи, например, гель-фильтрационной хроматографии, электрофореза в ДСН-ПААГ и/или лазерной десорбционной ионизации с использованием матрикса/масс-спектрометрии, основанной на времени пролета (MALDI/TOF MS). Другие типы химического изменения включают в себя изменение заряда (например, происходящее в результате деамидирования), которое может оцениваться, например, ионообменной хроматографией.
Антитело или производное антитела «сохраняют его биологическую активность» в фармацевтической готовой форме, если биологическая активность этого антитела в конкретный момент времени находится в пределах приблизительно 10% (в пределах ошибок данного анализа) от биологической активности, проявляемой во время приготовления, при определении, например, в антиген-связывающем анализе. Другие анализы «биологической активности» для антител описаны подробно здесь ниже.
«Изотоническая» обозначает, что представляющая интерес готовая форма имеет, по существу, такое же осмотическое давление, что и кровь человека. Изотонические готовые формы обычно будут иметь осмотическое давление приблизительно 250-350 мОсм. Изотоничность может быть определена, например, с использованием осмометра, основанного на измерении давления (упругости) пара, или осмометра, основанного на замораживании до образования льда.
«Полиол» является веществом с множеством гидроксильных групп и включает в себя сахара (восстанавливающие и невосстанавливающие), сахароспирты и сахарокислоты. Предпочтительные здесь полиолы имеют молекулярную массу, которая меньше, чем приблизительно 600 кДа (например, находится в диапазоне приблизительно от 120 до 400 кДа). «Восстанавливающий сахар» является сахаром, который содержит полуацетальную группу, которая может восстанавливать ионы металлов или реагировать ковалентно с лизином и другими аминогруппами в белках, а «невосстанавливающий сахар» является сахаром, который не имеет этих свойств восстанавливающего сахара. Примерами восстанавливающих сахаров являются фруктоза, манноза, мальтоза, лактоза, арабиноза, ксилоза, рибоза, рамноза, галактоза и глюкоза. Невосстанавливающие сахара включают в себя сахарозу, трегалозу, сорбозу, мелецитозу и раффинозу. Примерами сахароспиртов являются маннит, ксилит, эритрит, треитол, сорбит и глицерин. Что касается сахарокислот, они включают в себя L-глюконат и его соли металлов. Если желательно, чтобы эта готовая форма была стабильной при замораживании-оттаивании, этот полиол предпочтительно является полиолом, который не кристаллизуется при температурах замораживания (например, -20°С), так что он дестабилизирует антитело в готовой форме. Невосстанавливающие сахара, такие как сахароза и трегалоза, являются предпочтительными в данном изобретении, причем трегалоза является более предпочтительной, чем сахароза, вследствие превосходящей стабильности раствора трегалозы.
В данном контексте «буфер» обозначает забуференный раствор, который противостоит изменениям рН вследствие действия его компонентов конъюгата кислота-основание. Буфер этого изобретения имеет рН в диапазоне приблизительно от 4,5 до 6,0; предпочтительно приблизительно от 4,8 до 5,5; и наиболее предпочтительно имеет рН приблизительно 5,0. Примеры буферов, которые могут контролировать рН в этой области, включают в себя ацетатный (например, ацетат натрия), сукцинатный (например, сукцинат натрия), глюконатный, гистидиновый, цитратный буферы и другие содержащие органические кислоты буферы. Когда желательной является стабильная к замораживанию-оттаиванию готовая форма, этим буфером является предпочтительно фосфатный буфер.
В фармакологическом смысле, в контексте данного изобретения, «терапевтически эффективное количество» обозначает количество, эффективное в предупреждении или лечении нарушения, в отношении которого это антитело или производное антитела является эффективным. «Заболевание/нарушение» является любым состоянием, которое могло бы получать пользу от лечения этим антителом или производным этого антитела. Этот термин включает в себя хронические и острые нарушения или заболевания, в том числе нарушения и заболевания, патологические состояния которых предрасполагают млекопитающее к рассматриваемому нарушению.
«Консервант» является соединением, которое может быть включено в готовую форму для существенного уменьшения бактериального действия в ней, и, следовательно, для облегчения, например, получения готовой формы для множественного применения. Примеры потенциальных консервантов включают в себя хлорид октадецилдиметилбензиламмония, хлорид гексаметония, хлорид бензалкония (смесь хлоридов алкилбензилдиметиламмония, в которых алкильные группы являются группами с длинной цепью) и хлорид бензетония. Другие типы консервантов включают в себя ароматические спирты, такие как фенол, бутиловый и бензиловый спирт, алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен, катехин, резорцин, циклогексанол, 3-пентанол и м-крезол. Наиболее предпочтительным консервантом является здесь бензиловый спирт.
Данное изобретение обеспечивает также фармацевтические композиции, содержащие одно или несколько антител или производных антител, вместе, по меньшей мере, с одним физиологически приемлемым носителем или эксципиентом. Фармацевтические композиции могут содержать, например, один или несколько компонентов из воды, буферов (например, нейтрально забуференного солевого раствора или забуференного фосфатом солевого раствора), этанола, минерального масла, растительного масла, диметилсульфоксида, углеводов (например, глюкозы, маннозы, сахарозы или декстранов), маннита, белков, адъювантов, полипептидов или аминокислот, таких как глицин, антиоксидантов, хелатообразующих агентов, таких как ЭДТА, или глутатиона и/или консервантов. Как отмечалось выше, в обеспеченные здесь фармацевтические композиции могут быть (необязательно) включены другие активные ингредиенты.
Носитель является веществом, которое может быть связано с антителом или производным антитела перед введением пациенту, часто для цели контроля стабильности или биодоступности этого соединения. Носители для применения в таких готовых формах являются обычно биосовместимыми и могут быть также биодеградируемыми. Носители включают в себя, например, одновалентные или поливалентные молекулы, такие как сывороточный альбумин (например, человека или коровы), яичный альбумин, пептиды, полилизин и полисахариды, такие как аминодекстран и полиамидоамины. Носители включают в себя также твердые материалы-носители, такие как гранулы и микрочастицы, содержащие, например, полилактат-полигликолат, сополимер поли(лактид-гликолид), полиакрилат, латекс, крахмал, целлюлозу или декстран. Носитель может нести эти соединения различными способами, включающими в себя образование ковалентной связи (либо непосредственно, либо через линкерную группу), нековалентное взаимодействие или образование смеси.
Фармацевтические композиции могут быть составлены для любого подходящего способа введения, в том числе, например, местного, перорального, назального, ректального или парентерального введения. В некоторых вариантах осуществления, предпочтительными являются композиции в форме, подходящей для перорального применения. Такие формы включают в себя, например, пилюли, таблетки, пастилки, лепешки, водные или масляные суспензии, диспергируемые порошки или гранулы, эмульсию, твердые или мягкие капсулы или сиропы, или эликсиры. В других вариантах осуществления обеспеченные здесь композиции могут быть приготовлены в виде лиофилизата. Термин «парентеральный» включает в себя в данном контексте подкожную, внутрикожную, внутрисосудистую (например, внутривенную), внутримышечную, спинномозговую, внутричерепную, внутриоболочечную и внутрибрюшинную инъекцию, а также любую подобную инъекцию или инфузию.
Композиции, предназначенные для перорального применения, могут быть приготовлены в соответствии с любым способом, известным в данной области для приготовления фармацевтических композиций, и могут содержать один или несколько агентов, таких как подслащивающие агенты, улучшающие вкус и запах агенты, красящий агент и консервирующие агенты, для обеспечения привлекательных и годных в пищу препаратов. Таблетки содержат активный ингредиент в смеси с физиологически приемлемыми эксципиентами, которые являются подходящими для приготовления таблеток. Такие эксципиенты включают в себя, например, инертные разбавители (например, карбонат кальция, карбонат натрия, лактозу, фосфат кальция или фосфат натрия), гранулирующие и дезинтегрирующие агенты (например, кукурузный крахмал или альгиновую кислоту), связывающие агенты (например, крахмал, желатин или аравийскую камедь) и смазывающие агенты (например, стеарат магния, стеариновую кислоту или тальк). Таблетки могут не иметь покрытия или они могут иметь нанесенное известными способами покрытие для задержки дезинтеграции и абсорбции в желудочно-кишечном тракте и обеспечения посредством этого поддерживаемого действия на протяжении более продолжительного периода времени. Например, может быть использован материал для временного задерживания, такой как глицерилмоностеарат или глицерилдистеарат.
Готовые формы для перорального применения могут быть также представлены в виде твердых желатиновых капсул, в которых активный ингредиент смешан с инертным твердым разбавителем (например, карбонатом кальция, фосфатом кальция или каолином), или в виде мягких желатиновых капсул, в которых активный ингредиент смешан с водой или масляной средой (например, арахисовым маслом, жидким парафином или оливковым маслом). Водные суспензии содержат антитело или производное антитела в смеси с эксципиентами, подходящими для приготовления водных суспензий. Такие эксципиенты включают в себя суспендирующие агенты (например, натрий-карбоксиметилцеллюлозу, метилцеллюлозу, гидропропилметилцеллюлозу, альгинат натрия, поливинилпирролидон, трагакантовую камедь и аравийскую камедь); и диспергирующие или увлажняющие агенты (например, природно-встречающиеся фосфатиды, такие как лецитин, продукты конденсации этиленоксида с алифатическими спиртами с длинной цепью, такие как гептадекаэтиленоксицетанол, продукты конденсации этиленоксида с неполными эфирами, произведенными из жирных кислот и гексита, такие как моноолеат полиоксиэтиленсорбита, или продукты конденсации этиленоксида с неполными эфирами, произведенными из жирных кислот и ангидрогекситов, такие как моноолеат полиэтиленсорбитана. Водные суспензии могут также содержать один или несколько консервантов, например этил- или н-пропил-п-гидроксибензоат, один или несколько красящих агентов, один или несколько улучшающих вкус и запах агентов и один или несколько подслащивающих агентов, таких как сахароза или сахарин. Сиропы и эликсиры могут быть приготовлены с подслащивающими агентами, такими как глицерин, пропиленгликоль, сорбит или сахароза. Такие готовые формы могут также содержать один или несколько деэмульгаторов, консервантов, вкусовых агентов и/или красящих агентов.
Масляные суспензии могут быть приготовлены суспендированием активных ингредиентов в растительном масле (например, арахисовом масле, оливковом масле, кунжутном масле или какао-масле) или в минеральном масле, таком как жидкий парафин. Масляные суспензии могут содержать загущающий агент, такой как пчелиный воск, твердый парафин или цетиловый спирт. Подслащивающие агенты, такие как описанные выше агенты, и улучшающие вкус и запах агенты могут быть добавлены для обеспечения годных в пищу пероральных препаратов. Такие суспензии могут консервироваться добавлением антиоксиданта, такого как аскорбиновая кислота.
Диспергируемые порошки и гранулы, подходящие для приготовления водной суспензии добавлением воды, обеспечивают активный ингредиент в смеси с диспергирующим или увлажняющим агентом, суспендирующим агентом и одним или несколькими консервантами. Подходящие диспергирующие или увлажняющие агенты и суспендирующие агенты приведены выше в виде примеров вышеупомянутых агентов. Могут также присутствовать дополнительные эксципиенты, например, подслащивающие, улучшающие вкус и запах, и красящие агенты.
Фармацевтические композиции могут также находиться в форме эмульсий типа масло-в-воде. Масляной фазой может быть растительное масло (например, оливковое масло или арахисовое масло), минеральное масло (например, жидкий парафин) или их смесь. Подходящие эмульгирующие агенты включают в себя природно-встречающиеся камеди (например, аравийская камедь или трагакантовая камедь), природно-встречающиеся фосфатиды (например, лецитин сои и эфиры или неполные эфиры, полученные из жирных кислот и гексита), ангидриды (например, моноолеат сорбитана) и продукты конденсации неполных эфиров, полученных из жирных кислот и гексита, с этиленоксидом (например, моноолеат полиоксиэтиленсорбитана). Эмульсия может также содержать один или несколько подслащивающих и/или вкусовых агентов.
Фармацевтическая композиция может быть приготовлена в виде стерильной инъецируемой водной или масляной суспензии, в которой модулятор в зависимости от используемых носителя и концентрации либо суспендирован, либо растворен в носителе. Такая композиция может быть приготовлена в соответствии с известными в данной области способами, с использованием подходящих диспергирующих, увлажняющих агентов и/или суспендирующих агентов, таких как агенты, описанные выше. Среди приемлемых носителей и растворителей, которые могут быть использованы, находятся вода, 1,3-бутандиол, раствор Рингера и изотонический раствор хлорида натрия. Кроме того, в качестве растворителя или суспендирующей среды могут быть использованы стерильные, нелетучие масла. Для этой цели может быть использовано любое легкое нелетучее масло, в том числе синтетические моно- или диглицериды. Кроме того, жирные кислоты, такие как олеиновая кислота, могут быть использованы в приготовлении инъецируемых композиций, и в этом носителе могут быть растворены адъюванты, такие как локальные анестетики, консерванты и/или буферящие агенты.
Фармацевтические композиции могут быть составлены в виде форм пролонгированного высвобождения (т.е. формы, такой как капсула, которая выполняет медленное высвобождение модулятора после введения). Такие композиции могут обычно готовиться с использованием хорошо известной технологии и вводиться, например, перорально, ректально или подкожной имплантацией или имплантацией в желаемом участке-мишени. Носители для применения в таких готовых формах являются биосовместимыми и могут быть также биодеградируемыми; предпочтительно, эта готовая форма обеспечивает относительно постоянный уровень высвобождения модулятора. Количество антитела или производного антитела, содержащееся в форме пролонгированного высвобождения, зависит, например, от места имплантации, скорости и ожидаемой продолжительности высвобождения и от характера заболевания/нарушения, подлежащего лечению или предотвращению.
Антитело или производные антител, описанные здесь, обычно вводят в количестве, которое достигает концентрации в жидкости тела (например, крови, плазме, сыворотке, спинномозговой жидкости (CSF), синовиальной жидкости, лимфе, клеточной интерстициальной жидкости, слезах или моче), которая является достаточной для детектируемого связывания с TNFα и предотвращения или ингибирования TNFα-ассоциированных заболеваний/нарушений. Доза считается эффективной, если она приводит к заметной пользе для пациента, как описано здесь. Предпочтительные системные дозы находятся в диапазоне приблизительно 0,1 мг - приблизительно 140 мг/кг массы тела в день (приблизительно 0,5 мг - приблизительно 7 г на пациента в день), причем пероральные дозы обычно приблизительно в 5-20 раз превышают внутривенные дозы. Количество антитела или производного антитела, которое может быть объединено с материалами-носителями для получения формы однократной дозы, будет варьироваться в зависимости от проходящего лечение хозяина и конкретного способа введения. Единичные лекарственные формы будут обычно содержать приблизительно 1 мг - приблизительно 500 мг активного ингредиента.
Фармацевтические композиции могут быть упакованы для лечения состояний, отвечающих на антитело или производное антитела, направленное на TNFα. Упакованные фармацевтические композиции могут включать в себя контейнер, в котором находится эффективное количество, по меньшей мере, одного антитела или производного антитела, описанного здесь, и инструкция (например, этикетка), указывающая, что содержащаяся в упаковке композиция должна использоваться для лечения заболевания/нарушения, отвечающего на это одно антитело или производное антитела после введения в пациента.
Антитела или производные антител данного изобретения могут быть также химически модифицированы. Предпочтительными модифицирующими группами являются полимеры, например необязательно замещенный полиалкеновый, полиалкениленовый или полиоксиалкиленовый полимер с прямой или разветвленной цепью или разветвленный или неразветвленный полисахарид. Такая эффекторная группа может увеличивать полупериод существования этого антитела in vivo. Конкретные примеры синтетических полимеров включают в себя необязательно замещенные, имеющие прямую или разветвленную цепь поли(этиленгликоль) (ПЭГ), поли(пропиленгликоль), поли(виниловый спирт) или их производные. Конкретные природно-встречающиеся полимеры включают в себя лактозу, амилозу, декстран, гликоген или их производные. Размер полимера может варьироваться, если желательно, но обычно будет находиться в диапазоне средних молекулярных масс 500 Да - 50000 Да. Для локального применения, когда это антитело предназначено для проникновения в ткань, предпочтительная молекулярная масса этого полимера находится около 5000 Да. Эта молекула полимера может быть присоединена к антителу, в частности к С-концевой стороне тяжелой цепи Fab-фрагмента, через ковалентно связанный шарнирный пептид, как описано в WO 0194585. В отношении присоединения ПЭГ-группировок можно сослаться на "Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnological and Biomedical Applications", 1992, J. Milton Harris (ed). Plenum Press, New York и "Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences", 1998, M. Aslam and A. Dent, Grove Publishers, New York.
Получение готовой формы
После получения представляющего интерес антитела или производного антитела, как описано выше, готовят содержащую его фармацевтическую готовую форму. Антитело, которое должно быть приготовлено, не подвергали предварительной лиофилизации, и представляющая интерес в данном изобретении готовая форма является водной готовой формой. Предпочтительно, антитело или производное антитела в этой готовой форме является фрагментом антитела, таким как scFv. Терапевтически эффективное количество антитела, присутствующее в этой готовой форме, определяют с учетом, например, желаемых объемов доз и способа (способов) введения. Примерная концентрация антитела в этой готовой форме была равна приблизительно 0,1 мг/мл - приблизительно 50 мг/мл, предпочтительно приблизительно 0,5 мг/мл - приблизительно 25 мг/мл и наиболее предпочтительно приблизительно 2 мг/мл - приблизительно 10 мг/мл.
Готовят водную готовую форму, содержащую антитело или производное антитела в рН-забуференном растворе. Буфер этого изобретения имеет рН в диапазоне приблизительно 4,5 приблизительно 6,0, предпочтительно приблизительно 4,8 - приблизительно 5,5 и наиболее предпочтительно имеет рН 5,0. Примеры буферов, которые могут контролировать рН в этом диапазоне, включают в себя ацетатный (например, ацетат натрия), сукцинатный (например, сукцинат натрия), глюконатный, гистидиновый, цитратный буферы и другие содержащие органические кислоты буферы. Концентрация буфера может быть приблизительно 1 мМ - приблизительно 50 мМ, предпочтительно приблизительно 5 мМ - приблизительно 30 мМ, в зависимости, например, от конкретного буфера и желаемой изотоничности готовой формы. Предпочтительным буфером является натрий-ацетатный буфер (приблизительно 10 мМ), рН 5,0.
В эту готовую форму включают полиол, который действует в качестве регулирующего изотоничность агента и может стабилизировать это антитело. В предпочтительных вариантах осуществления, эта готовая форма не содержит количества соли, такой как хлорид натрия, достаточного для создания изотоничности, так как это может заставить антитело или производное антитела осаждаться и/или может приводить к окислению при низком рН. В предпочтительных вариантах осуществления этим полиолом является невосстанавливающий сахар, такой как сахароза или трегалоза. Полиол добавляют в готовую форму в количестве, которое может варьироваться в зависимости от желаемой изотоничности этой готовой формы. Предпочтительно, водная готовая форма является изотонической, и в этом случае подходящие концентрации полиола в готовой форме находятся, например, в диапазоне приблизительно 1% - приблизительно 15% масса/объем, предпочтительно в диапазоне приблизительно 2% - приблизительно 10% масса/объем. Однако могут быть также подходящими гипертонические или гипотонические готовые формы. Количество добавляемого полиола может также изменяться в зависимости от молекулярной массы полиола. Например, может добавляться более низкое количество моносахарида (например, маннита) в сравнении с дисахаридом (таким как трегалоза).
К готовой форме антитела или производного антитела добавляют также поверхностно-активное вещество. Примерные поверхностно-активные вещества включают в себя неионогенные поверхностно-активные вещества, такие как полисорбаты (например, полисорбаты 20, 80 и т.д.) или полоксамеры (например, полоксамер 188). Количество добавляемого поверхностно-активного вещества является таким, что оно уменьшает агрегацию приготовленного в виде готовой формы антитела/производного антитела и/или минимизирует образование частиц в готовой форме и/или уменьшает адсорбцию. Например, поверхностно-активное вещество может присутствовать в готовой форме в количестве приблизительно 0,001% - приблизительно 0,5%, предпочтительно приблизительно 0,05% - приблизительно 0,2% и наиболее предпочтительно приблизительно 0,01% - приблизительно 0,1%.
st
В одном варианте осуществления эта готовая форма содержит вышеуказанные агенты (т.е. антитело или производное антитела, буфер, полиол и поверхностно-активное вещество) и является, по существу, не содержащей одного или нескольких консервантов, таких как бензиловый спирт, фенол, м-крезол, хлорбутанол и бензетонийхлорид. В другом варианте осуществления в эту готовую форму может быть включен консервант, в частности, когда эта готовая форма является многодозовой готовой формой. Концентрация консерванта может находиться в диапазоне приблизительно 0,1% - приблизительно 2%, наиболее предпочтительно приблизительно 0,5% - приблизительно 1%. Один или несколько других фармацевтически приемлемых носителей, эксципиентов или стабилизаторов, таких как носители, эксципиенты и стабилизаторы, описанные в Remington's Pharmaceutical Sciences 21 edition, Osol, A. Ed. (2006), могут быть включены в готовую форму при условии, что они не влияют вредным образом на желаемые характеристики этой готовой формы. Приемлемые носители, эксципиенты или стабилизаторы являются нетоксичными для реципиентов в используемых дозах и концентрациях и включают в себя дополнительные буферные агенты; сорастворители; антиоксиданты, включающие в себя аскорбиновую кислоту и метионин; хелатирующие агенты, такие как ЭДТА; комплексы металлов (например, комплексы Zn-белок); биодеградируемые полимеры, такие как сложные полиэфиры; и/или образующие соль противоионы, такие как натрий.
Готовые формы, которые должны использоваться in vivo, должны быть стерильными. Это легко выполняется фильтрованием через стерильные фильтровальные мембраны перед приготовлением готовой формы или после приготовления готовой формы.
Введение готовой формы
Готовую форму вводят млекопитающему, нуждающемуся в лечении этим антителом, предпочтительно человеку, в соответствии с известными способами, такими как внутривенное введение в виде болюса или непрерывная инфузия на протяжении некоторого периода времени, с использованием внутримышечного, внутрибрюшинного, интрацереброспинального, подкожного, внутрисуставного, внутрисиновиального, внутриоболочечного, перорального, местного или ингаляционного способов. В предпочтительных вариантах осуществления готовую форму вводят млекопитающему внутривенным введением. Для таких целей эта готовая форма может, например, инъецироваться с использованием шприца или через IV-линию.
Подходящая доза («терапевтически эффективное количество») этого антитела будет зависеть, например, от подлежащего лечению состояния, тяжести и хода этого состояния, независимо от того, вводят ли это антитело для превентивной или терапевтической целей, предыдущей терапии, клинической истории пациента и реакции на это антитело, типа используемого антитела и суждения лечащего врача. Антитело или производное антитела подходящим образом вводят пациенту один раз или на протяжении ряда введений, и его могут вводить в любое время от момента установления диагноза и далее. Антитело или производное антитела может вводиться в виде единственного способа лечения или вместе с другими лекарственными средствами или терапиями, применимыми в лечении рассматриваемого состояния.
В качестве общего предложения, терапевтически эффективное количество вводимого антитела или производного антитела будет находиться в диапазоне приблизительно 0,1 - приблизительно 50 мг/кг массы тела пациента, независимо от того, выполняют ли одно или несколько введений, причем типичным диапазоном используемого антитела является, например, диапазон приблизительно 0,3 - приблизительно 20 мг/кг, более предпочтительно приблизительно 0,3 - приблизительно 15 мг/кг, при введении один раз в день. Однако могут быть применимы и другие схемы введения. Прогресс этой терапии легко наблюдать с использованием общепринятых способов.
Изделия
В другом варианте осуществления этого изобретения обеспечено изделие, содержащее контейнер, который вмещает водную фармацевтическую готовую форму данного изобретения и необязательно инструкции по ее применению. Подходящие контейнеры включают в себя, например, склянки, флаконы и шприцы. Контейнер может быть изготовлен из различных материалов, таких как стекло или пластик. Примерным контейнером может быть стеклянный флакон на 3-20 мл для одноразового использования. Альтернативно для многодозовой готовой формы этот контейнер может быть стеклянным флаконом на 3-100 мл. Этот контейнер вмещает готовую форму, и этикетка, находящаяся на контейнере или прилагаемая к контейнеру, может содержать инструкцию по применению. Это изделие может дополнительно включать в себя другие материалы, желательные с коммерческой точки зрения или с точки зрения пользователя, в том числе другие буферы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы и вкладыши упаковки с инструкциями по применению.
Получение антител данного изобретения
L
H
L
H
Антитела или производные антител данного изобретения могут быть получены с использованием рутинных способов, используемых в области рекомбинантной генетики. Если последовательности полипептидов известны, кДНК, кодирующие их, могут быть получены при помощи синтеза генов (www.genscript.com). Эти кДНК могут быть клонированы в подходящие векторные плазмиды. После получения ДНК, кодирующих V- и/или V-домен, может быть выполнен сайт-специфический мутагенез, например, при помощи ПЦР, использующей мутагенные праймеры, для получения различных производных. Наилучшая «стартовая последовательность» может быть выбрана в зависимости от числа изменений, желаемых в V- и/или V-последовательностях. Предпочтительной последовательностью являются последовательности ТВ-А и их производные, например, scFv-последовательности или последовательности Fab-слитого пептида могут быть выбраны в качестве матриц для ПЦР-опосредованного мутагенеза и/или клонирования.
rd
Стандартные способы клонирования и мутагенеза, хорошо известные специалисту в данной области, могут быть использованы для присоединения линкеров, доменов перетасовки или сконструированных слияний для получения Fab-фрагментов. Основные протоколы, описывающие общие способы этого изобретения, описаны в Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Sambrook & Russel, 3 ed. 2001) и в Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., 1999).
L
H
L
H
ДНК-последовательность, несущую ген, кодирующий полипептид scFv, или, в случае Fab-фрагментов, кодирующий либо два отдельных гена, либо бицистронный оперон, содержащий эти два гена для слияний V-Cκ и V-CH1 (фиг.2), клонируют в подходящий экспрессирующий вектор, предпочтительно вектор с индуцируемым промотором. Следует позаботиться, чтобы перед каждым геном присутствовал бы подходящий сайт связывания рибосом (RBS на фиг.2), который гарантирует трансляцию. Должно быть понятно, что антитела данного изобретения содержат описанные последовательности, а не состоят из них. Например, стратегии клонирования могут требовать, чтобы была приготовлена конструкция, из которой получают антитело, в котором на N-концевой стороне присутствуют один или несколько дополнительных остатков. Конкретно, метионин, происходящий из стартового кодона, может присутствовать в конечном белке в тех случаях, когда он не был отщеплен после трансляции. Большинство конструкций для scFv-антител приводят к дополнительному аланину на N-концевой стороне. В предпочтительном варианте осуществления данного изобретения выбран экспрессирующий вектор для экспрессии в периплазме Е. coli (Krebber, 1997). Указанный вектор содержит промотор перед отщепляемой сигнальной последовательностью. Затем кодирующую последовательность для пептида антитела сливают в рамке считывания с отщепляемой сигнальной последовательностью. Это делает возможным нацеливание экспрессируемого полипептида на бактериальную периплазму, где эта сигнальная последовательность отщепляется. Затем антитело укладывают. В случае Fab-фрагментов как слитые пептиды V-Cκ, так и слияния V-CH1 должны быть слиты с сигналом экспорта. После того как эти пептиды достигают периплазмы, образуется ковалентная связь S-S при С-концевых цистеинах. Если предпочтительной является цитоплазматическая экспрессия антител, указанные антитела получают обычно в высоких выходах из телец включения, которые могут быть легко отделены от других клеточных фрагментов и белка. В этом случае эти тельца включения солюбилизируют в денатурирующем агенте, таком как гидрохлорид гуанидина (GndHCL), и затем подвергают рефолдингу при помощи процедур ренатурации, хорошо известных специалистам в данной области.
Плазмиды, экспрессирующие полипептиды scFv или Fab, вводят в подходящего хозяина, предпочтительно бактериальную, дрожжевую клетку или клетку млекопитающего, наиболее предпочтительно в подходящий штамм Е. coli, например JM83, для экспрессии в периплазме или штамм BL21 для экспрессии в тельцах включения. Полипептид может быть собран из периплазмы или может образовывать тельца включения, и может быть очищен с использованием стандартных способов, таких как ионообменная хроматография, обращенно-фазовая хроматография, аффинная хроматография и/или гель-фильтрация, известных специалистам в данной области.
off
d
-3
-1
Антитела или производные антител данного изобретения могут быть охарактеризованы в отношении выхода, растворимости и стабильности in vitro. Связывающие активности в отношении TNFα, в частности в отношении TNFα человека, могут быть тестированы in vitro при помощи ELISA или поверхностного плазменного резонанса (BIACore) с использованием рекомбинантного TNFα человека, как описано в WO 9729131, причем последний способ позволяет также определить константу диссоциации k, которая должна быть предпочтительно меньшей, чем 10с. Величины K≤10 нМ являются предпочтительными.
50
-1
Нейтрализующая активность in vivo антитела или производного антитела данного изобретения может быть определена с использованием анализа цитотоксичности с использованием L929. Рекомбинантный TNFα человека проявляет цитотоксическое действие в отношении культивируемых фибробластных клеток мыши L929 зависимым от концентрации образом. Эта TNFα-индуцированная цитотоксичность может ингибироваться нейтрализующими TNFα антителами (Doring, 1994). Предпочтительная величина IC, соответствующая полумаксимальной концентрации ингибитора, равна ≤100 нг мл.
Поскольку TNFα имеет доказанную патофизиологическую роль в различных заболеваниях человека, в частности воспалительных заболеваниях, иммунных и иммуно-регулируемых нарушениях, инфекциях, вызывающих септический, эндотоксиновый и сердечно-сосудистый шок, нейродегенеративных заболеваниях и злокачественных заболеваниях, и поскольку предполагается, что TNFα играет связанную с заболеваниями роль в постоянно растущем числе дополнительных заболеваний человека, трудно дать исчерпывающий перечень показаний, который также гарантирует полное представление спектра клинических применений ингибиторов TNFα в будущем. Таким образом, антитела или производные антител данного изобретения могут применяться для лечения заболеваний, перечисленных в следующем каталоге, который не должен рассматриваться как полный или эксклюзивный перечень. Включены также другие заболевания, не упоминаемые конкретно, на которые прямо или опосредованно влияет TNFα.
Аутоиммунное или хроническое воспаление
Хронические и/или аутоиммунное состояния воспаления в целом, иммунно-опосредованные воспалительные нарушения в целом, воспалительное заболевание центральной нервной системы, воспалительные заболевания, поражающие глаза, суставы, кожу, слизистую оболочку, желудочно-кишечный тракт, мочеполовую систему или легкие; состояния увеита в целом, ретинита, HLA-B27+ увеита, заболевание Бехчета, синдром сухих глаз, глаукома, синдром Шегрена, сахарный диабет (в том числе диабетическая невропатия), инсулинорезистентность, состояния артрита в целом, ревматоидный артрит, остеоартрит, реактивный артрит и синдром Рейтера, ювенильный артрит, анкилозирующий спондилит, рассеянный склероз, синдром Гийена-Барре, тяжелая псевдопаралитическая миастения, амиотрофический боковой склероз, саркоидоз, гломерулонефрит, хроническое заболевание почек, цистит, псориаз (в том числе псориатический артрит), гнойный гидраденит, панникулит, гангренозная пиодермия, синдром SAPHO (синовит, акне, пустулезное высыпание, гиперостоз и остит), акне, синдром Свита, пузырчатка обыкновенная, болезнь Крона (в том числе внекишечные проявления), язвенный колит, бронхиальная астма, аллергический пневмонит, общие аллергии, аллергический ринит, аллергический синусит, хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ), фиброз легкого, гранулематоз Вегенера, синдром Кавасаки, гигантоклеточный артериит, васкулит Чарга-Страусса, нодозный полиартериит, ожоги, болезнь трансплантат против хозяина, реакции «хозяин против трансплантата», явления отторжения после трансплантации органа или костного мозга, системные и локальные состояния васкулита в целом, системная и дискоидная красная волчанка, полимиозит и дерматомиозит, склеродермия, преэклампсия, острый и хронический панкреатит, вирусный гепатит, алкогольный гепатит.
Острое воспаление и/или предотвращение послеоперационных и посттравматических воспалений и боли
Предупреждение послеоперационного воспаления в целом, хирургия глаза (например, хирургия катаракты (замены хрусталика глаза) или глаукомы), суставная хирургия (в том числе артроскопическая хирургия), хирургия в связанных с суставами структурах (например, связках), челюстно-лицевая и стоматологическая хирургия, минимально инвазивные сердечно-сосудистые процедуры (например, чрескожная катетерная коронаропластика, РТСА, атерэктомия, помещение стента), лапароскопические и/или эндоскопические внутрибрюшные и гинекологические процедуры, эндоскопические урологические процедуры (например, хирургия предстательной железы, уретроскопия, цистоскопия, интерстициальный цистит), периоперационное воспаление (предупреждение) в целом.
Неврологические и нейродегенеративные заболевания
Болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Гентингтона, паралич Белла, болезнь Крейтцфельда-Якоба.
Рак
Связанный с раком остеолиз, связанное с раком воспаление, связанная с раком боль, связанная с раком кахексия, костные метастазы.
Боль
Острые и хронические формы боли, независимо от того, вызваны ли они центральными или периферическими эффектами TNFα и классифицируются ли они как воспалительные, ноцицептивные или невропатические формы боли; ишиалгия, боль в нижней части спины, синдром канала запястья, комплексный регионарный болевой синдром (CRPS), подагра, постгерпетическая невралгия, фибромиалгия, локальные болевые состояния, синдромы хронической боли вследствие метастатической опухоли, дисменорея.
Инфекция
Бактериальный, вирусный или грибковый сепсис, туберкулез, СПИД.
Сердечно-сосудистые заболевания
Атеросклероз, заболевание коронарной артерии, гипертензия, дислипидемия, сердечная недостаточность и хроническая сердечная недостаточность.
В предпочтительном варианте осуществления данного изобретения лечение остеоартрита или увеита или воспалительного заболевания кишечника может быть достигнуто с использованием антител или производных антител данного изобретения.
Данное изобретение обеспечивает также фармацевтическую композицию, содержащую молекулу антитела или производного антитела данного изобретения в комбинации с фармацевтически приемлемым эксципиентом, разбавителем или носителем.
Фармацевтическая композиция должна предпочтительно содержать терапевтически эффективное количество антитела данного изобретения, т.е. количество указанного антитела, которое необходимо для лечения, ослабления симптомов или предупреждения TNFα-связанного заболевания или состояния или для проявления детектируемого терапевтического или превентивного действия. Терапевтически эффективная доза может быть определена либо в анализах на культуре клеток, либо в моделях животных, обычно грызунов, кроликов, собак, свиней или приматов. Модель животного может быть также использована для определения подходящего диапазона концентраций и способа введения. Подходящей моделью животного для наблюдения действия антитела или производного антитела данного изобретения является крысиная модель для острого моноартрита (Bolon et аl. (2004), Vet. Pathol. 41:235-243). TNFα человека инъецируют внутрисуставно в коленный сустав крысы, что приводит к острому, самокупирующемуся моноартриту в инъецированном суставе. Биоактивность анти-TNFα-антитела (производного) может быть определена количественно по уменьшению TNFα-индуцированного опухания и/или по уменьшению гистологических параметров воспаления.
Поскольку антитела или производные антител данного изобретения являются высокорастворимыми, высокие концентрации антител (60 мг/мл или более) позволяют использовать малые объемы применения.
Антитело или производное антитела данного изобретения могут быть использованы в любой терапии, где желательно уменьшение уровня биологически активного TNFα, присутствующего в теле человека или животного. Этот TNFα может находиться в кровотоке в теле или присутствовать при нежелательно высоком уровне, будучи локализованным в конкретном участке в этом теле. Данное изобретение обеспечивает способы системных, а также местных применений в целом, которые включают в себя, но не ограничиваются ими, следующие способы: пероральное применение, внутривенную, подкожную, внутримышечную, внутрисуставную, интравитреальную, интрадермальную или интрапаренхиматозную инъекцию, аэрозольную ингаляцию, местное нанесение на кожу, слизистую оболочку или в глаза, системное или локальное высвобождение посредством имплантируемого мининасоса или локальное высвобождение с использованием имплантируемой формы/устройства, позволяющих замедленное высвобождение, местное нанесение на серозные поверхности, внутриоболочечное или внутрижелудочковое применение, пероральное применение в виде композиций, делающих возможным регулируемое внутрипросветное высвобождение в выбранных участках желудочно-кишечного тракта, локализованное интравазальное высвобождение из подходящих форм/устройств (например, стентов), локальную доставку в мочевой пузырь, локализованное внутрипросветное высвобождение (например, в желчные пути, мочеточник) или локальную доставку через эндоскопические устройства или высвобождение из контактных линз. Предпочтительным применением является локальное применение, такое как внутрисуставная инъекция, или местное применение, например в глаз. Для обоих предпочтительных применений антитело данного изобретения должно находиться в растворе.
Данное изобретение описывает также применение антитела или производного антитела данного изобретения для приготовления лекарственного средства для лечения TNFα-ассоциированных заболеваний. В этом случае антитело или производное антитела содержатся в терапевтической композиции. Указанную композицию используют в качестве лекарственного средства, наиболее предпочтительно для предупреждения или терапии связанных с TNFα заболеваний.
+
В другом аспекте scFv-антитела данного изобретения используют в генотерапии, в частности в адоптивной клеточной генотерапии. Аутоиммунные нарушения представляют собой самопроизвольные иммунные реакции, направленные на собственную ткань. Антигенспецифические CD4Т-клетки и антигенпрезентирующие дендритные клетки (DC) являются важными медиаторами в патогенезе аутоиммунного заболевания и, следовательно, идеальными кандидатами для адоптивной клеточной генотерапии, ex vivo подхода к терапевтическому переносу генов. С использованием трансдуцированных ретровирусом клеток и биолюминесценции люциферазы (Tarner et al., 2003, Ann. N.Y.Acad. Sci. 998:512-519) продемонстрировали, что первичные Т-клетки, гибридомы Т-клеток и DC быстро и преимущественно возвращаются к местам воспаления в моделях животных рассеянного склероза, артрита и диабета. Эти клетки, трансдуцированные ретровирусными векторами, которые запускают экспрессию различных «регуляторных белков», таких как интерлейкины и анти-TNF-scFv, доставляют эти иммунорегуляторные белки в воспаленные повреждения, обеспечивая терапию для экспериментального аутоиммунного энцефалита, индуцированного коллагеном артрита и не имеющих ожирения диабетических мышей. Стабильные и растворимые каркасы антител или производных антител данного изобретения являются особенно подходящими для внутриклеточной доставки этого антигена, например, когда это антитело или производное антитела экспрессируются из трансгена, несомого подходящим ретровирусным вектором. Адоптивная клеточная генотерапия приводит к локализованной экспрессии и секреции анти-TNFα-scFv. Smith et аl. (2003) показали, что scFv, произведенные из TNFα-нейтрализующего моноклонального антитела (i) могут нейтрализовать TNFα in vitro и (ii) изменяют распределение экспрессии цитокинов в мышах, страдающих от коллаген-индуцированного артрита, локально в суставах, но не системно. Альтернативно прямая системная или локальная инъекция подходящих векторов (например, вирусов), делающая возможной непрерывную экспрессию анти-TNFα-scFv-антитела, рассматривается как другой возможный подход генотерапии.
Данное изобретение будет более понятным со ссылкой на следующие примеры. Однако они не должны рассматриваться как ограничивающие рамки этого изобретения. Все литературные и патентные цитирования включены здесь в качестве ссылки.
Эксперимент 1. Конструирование scFv-антител
d
Исходным материалом для генерирования гуманизированных антител против TNFα человека или производных этих антител, таких как одноцепочечные фрагменты (scFv) или Fab-фрагменты, было мышиное моноклональное антитело Di62. Последовательности вариабельной области легкой цепи и тяжелой цепи описаны в Doring et al. (1994, Mol. Immunol. 31:1059-1067). Свойства этого моноклонального антитела также обсуждаются в этой публикации. Вкратце, Di62 специфически связывается с TNFα человека зависимым от концентрации образом. Это антитело является высокоаффинным антителом (К=0,4 нМ) и может блокировать связывание TNFα с его рецептором. Кроме того, Di62 ингибирует индуцируемую TNFα человека цитотоксичность в клетках мыши L929.
L
H
4
4
L
H
На основе его опубликованной последовательности Di62 конструировали в форме производного одноцепочечного антитела (scFv) в ориентации V-линкер-V, в котором последовательность линкера состоит из четырех повторов из четырех остатков глицина и одного остатка серина (GlySer). Здесь этот scFv называют TB-wt, с V SEQ ID NO:16 и V SEQ ID NO:17.
L
H
L
H
L
H
L
H
H
L
H
th
Для гуманизации этого производного антитела с целью а) сделать его более сходным с последовательностями человека для минимизации потенциальной иммуногенности и б) сделать его более стабильным и растворимым, CDR-последовательности TB-wt прививали на стабильные и растворимые каркасные последовательности иммуноглобулина человека (Auf der Maur et al. (2001), FEBS Lett. 508:407-412; Auf der Maur et al. (2004), Methods 34:215-224). Подгруппу I V-каппа и подгруппу I V человека идентифицировали в качестве ближайшего подсемейства человека. Подходящий акцепторный каркас выбирали из пула V- и V-последовательностей человека, отбирали на предпочтительные биохимические и биофизические свойства, такие как, например, стабильность и растворимость, и экспрессионные свойства (Auf der Maur et al. (2001), FEBS Lett. 508:407-412; Auf der Maur et al. (2004), Methods 34:215-224). Выделение и свойства этих каркасов антител описаны в WO 03097697/ЕР 1506236. Из этого пула в качестве подходящего акцептора был идентифицирован каркас одноцепочечного антитела с неопределенными антиген-связывающими свойствами. Этот акцептор состоит из домена V-каппа I человека (SEQ ID NO:14) в комбинации с доменом VI человека (SEQ ID NO:15). Здесь этот акцепторный каркас называется FW2.3. Среди 81 остатка V-каркаса, TB-wt и FW2.3 имеют 55 идентичных аминокислотных остатков, что соответствует 67% идентичности. Среди 87 остатков V-каркаса, TB-wt и FW2.3 имеют 55 идентичных остатков, что соответствует 63% идентичности. Оба одноцепочечных производных антител имеют идентичные длины CDR, кроме CDR3 V, который является более длинным в FW2.3. Аминокислотный состав в остатках CDR является разным для обоих scFv. Описаны различные способы гуманизации вариабельных доменов антител (Riechmann et al. (1998), Nature 332:323-327; Padlan, E.A. (1991). Mol. Immunol. 28:489-498; Roguska et al. (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:969-973; Gonzales et al. (2005), Numor Biol. 26:31-43; Ewert, S., et al. (2004), Methods 34:184-199). Сначала проводили минимальный подход, а именно, консервативный перенос всех петель CDR мыши из TB-wt на FW2.3. Полученный scFv назван ТВ-В и имеет V-последовательность SEQ ID NO:3 и V-последовательность SEQ ID NO:4. Петли CDR в TB-wt определены в соответствии со схемой нумерации Кабата (Kabat et al. (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5 Ed, Natl. Inst. Health, Dethesda, MD) и включают в себя следующие остатки (см. фиг.1):
L
V
CDR1: L24-L34 (та же самая нумерация Кабата)
CDR2: L50-L56 (та же самая нумерация Кабата)
CDR3: L89-L97 (та же самая нумерация Кабата)
H
V
CDR1: Н31-Н35 (та же самая нумерация Кабата)
CDR2: Н50-Н66 (нумерация Кабата Н50-Н65)
CDR3: Н99-Н106 (нумерация Кабата Н95-Н102).
Это антитело было неспособно связывать эффективно TNFα (фиг.4А). Следующей стадией было определение, какой остаток или какие остатки из этих компонентов должны быть заменены для оптимизации свойств полученного гуманизированного антитела.
L
H
L
H
L
d
Поскольку замена аминокислотных остатков человека другими аминокислотами должна быть минимизирована, так как введение чужеродных аминокислотных последовательностей увеличивает риск иммуногенности антитела или производного антитела в людях (Gonzales et al. (2005), Tumor Biol. 26:31-43), конструировали несколько вариантов. Один из указанных вариантов - здесь называемый ТВ-В L46 (V SEQ ID NO:11; V SEQ ID NO:4) - конструировали с целью минимизации риска его иммуногенности, но все еще с сохранением достаточной активности связывания. Этот вариант основан на ТВ-В и содержит изменение единственной аминокислоты в положении 46 в V, а именно R→L. Эта аминокислота расположена в пределах верхней сердцевины легкой цепи и занимает часть в границе раздела димера. Она участвует в создании конформации L-CDR1 и влияет на упаковку V/V. Сообщалось, что остаток лейцина является предпочтительным в этом конкретном положении (PCT/US 03/19333). В отличие от ТВ-В, scFv TB-B L46 сохраняет некоторое TNFα-специфическое связывание (фиг.4А; К~100нМ)).
L
H
L
H
Для дополнительного улучшения TNFα-связывающей активности одно или несколько дополнительных изменений производили в одном или нескольких из V-остатков 4, 46, 65, 67, 70 и/или V-остатков 28, 43, 68, 70, 71, 72, 73, 76, 77. Здесь этот вариант с заменами во всех положениях называют ТВ-А (V SEQ ID NO:1; V SEQ ID NO:2).
Кроме того, что касается конкретных aнти-TNFα-антител данного изобретения, конкурентные анализы с пептидами, произведенными из L-CDR1 и L-CDR2, показали, что обе петли CDR являются важными для связывания этих scFv с антигеном (Doring et al. (1994), Mol. Immunol. 31:1059-1067).
L
H
В следующих экспериментах, нацеленных на минимизацию числа остатков не человека, требуемых для сохранения связывания, и на оптимизацию биофизических свойств (стабильности и растворимости), использовали систематический мутагенез и перетасовку доменов, которые позволяют выяснить функциональные различия между мышиными и гуманизированными V- и V-доменами.
L
H
L
H
Посредством перетасовки доменов получали два варианта. Первый вариант состоял из V-домена из ТВ-А, соединенного через глицин-сериновый линкер (SEQ ID NO:10) с V-доменом из ТВ-В, что приводило к ТВ-АВ (SEQ ID NO:12). Второй вариант, ТВ-ВА, является обращением первого варианта, а именно V-домен из ТВ-В в комбинации с V-доменом ТВ-А (SEQ ID NO:13).
L
H
L
H
Дополнительные варианты генерировали систематическим мутагенезом ТВ-А. Фиг.1 показывает сравнение последовательностей V- и V-последовательностей ТВ-А и ТВ-В. В целом 14 каркасных остатков различаются между ТВ-А и ТВ-В (звездочки). Только пять из них, V-остатки 4 и 70 и V-остатки 28, 71 и 73, обнаруживают только минорные различия в размере и свойствах и, следовательно, не рассматривались для мутагенеза в этой точке. Следующие положения каркаса заменяли соответствующими аминокислотами из ТВ-В. Эти мутанты ТВ-А с одной или двумя мутациями являются следующими:
ТВ-В Н43
K→Q
граница раздела
(SEQ ID NO:18)
ТВ-А Н68
F→V
наружная петля V<sub>H</sub>
(SEQ ID NO:19)
ТВ-А Н70/72
F→L, L→R
наружная петля V<sub>H</sub>
(SEQ ID NO:20)
TB-A H76/77
А→I, S→G
наружная петля V<sub>H</sub>
(SEQ ID NO:21)
TB-A L46
L→R
граница раздела
(SEQ ID NO:22)
TB-A L65
R→S
наружная петля V<sub>L</sub>
(SEQ ID NO:23)
TB-A L67
Y→S
наружная петля V<sub>L</sub>
(SEQ ID NO:24).
L
H
Многие факторы могут влиять на иммуногенность антитела или производного антитела (Gonzales et al. (2005), Tumor Biol. 26:31-43). Для дополнительного уменьшения содержимого иммуноглобулина не человека вариабельных областей гуманизированного scFv TB-A, мышиные петли CDR2 и CDR3 V и мышиную петлю CDR2 V заменяли соответствующими петлями CDR человека из FW2.3. Полученные конструкции называют здесь TB_L2 (SEQ ID NO:7), TB_L3 (SEQ ID NO:8) и ТВ_Н2 (SEQ ID NO:9) соответственно.
H
кДНК, кодирующую мышиную одноцепочечную версию моноклонального антитела Di62 и две гуманизированные версии ТВ-В и TB-A, генерировали синтезом генов (www.genscript.com). Все точковые мутации в других вариантах (ТВ-В L46, TB-A Н43, TB-A Н67, TB-A Н69/71, TB-A Н75/76, TB-A-L46, TB-A L65, TB-A L67, TB-A V83F, TB-A V83A, TB-A D66G) вводили ПЦР-запускаемым сайт-направленным мутагенезом в соответствии со стандартными процедурами клонирования. Замену мышиных петель CDR TB-A петлями CDR человека из FW2.3 выполняли с использованием ПЦР и процедур клонирования, существующих в данной области. кДНК, кодирующие все вариации V ТВ-А, описанные в SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29 и SEQ ID NO:30, получали синтезом полных генов.
Некоторые еще более предпочтительные TB-A описаны в SEQ ID NO:31 - SEQ ID NO:38. Было обнаружено, что эти антитела являются особенно стабильными и растворимыми, как показано ниже в таблице I.
Все scFv-фрагменты клонировали в экспрессирующий вектор для получения в периплазме Е. coli (Krebber et al. (1997), J.Immunol. Methods 201:35-55).
L
H
Кроме описанных выше одноцепочечных производных антител (scFv) соответствующие Fab-фрагменты генерировали следующим образом. Выбранные вариабельные домены легкой цепи (V) сливали с константной областью каппа-цепи Ig человека, тогда как подходящие вариабельные домены тяжелой цепи (V) сливали с первым (N-концевым) константным доменом (СН1) IgG человека. Оба константных домена человека амплифицировали при помощи ПЦР из кДНК-библиотеки селезенки человека и получали в виде последовательности SEQ ID NO:14 для Сκ- и SEQ ID NO:15 для СН1.
Эксперимент 2. Экспрессия, выход и стабильность гуманизированных scFv- или Fab-антител
Плазмиды, кодирующие TB-wt, его гуманизированные производные или Fab-фрагменты, вводили в подходящий штамм Е. coli (например, JM83) для экспрессии в периплазме. scFv-варианты также экспрессировали в виде телец включения, например, в штамме Е. coli BL21. Функциональные одноцепочечные антитела получали рефолдингом телец включения и последующей очисткой, например, гель-фильтрацией.
Выходы экспрессии после периплазматической экспрессии scFv находились в диапазоне 0,5-12 мг на литр культуры при стандартных лабораторных условиях культивирования (среда dYT, со временем индукции приблизительно 3 ч при 30°С, со встряхиванием при 200 об/мин) с использованием общепринятых встряхиваемых колб. Обычно авторы наблюдали, как и ожидалось из предварительного анализа каркасов, отобранных на стабильность и растворимость (Auf der Maur, et al. (2004), Methods 34:215-224), что чем ближе последовательность гуманизированного производного к последовательности акцепторного каркаса (FW2.3), тем выше выход, получаемый после экспрессии в бактериях. Например, выход, полученный из экспрессии ТВ-В, является гораздо лучшим, чем выход, полученный из экспрессии ТВ-А. В соответствии с этими открытиями, уменьшение числа различающихся аминокислотных остатков, присутствующих в ТВ-А, оказывало положительное действие на выходы экспрессии (фиг.3А).
max
max
22
22
22
Другой важной характеристикой антител или производных антител данного изобретения является их растворимость. Фиг.3В показывает превосходство каркаса ТВ-А над донорским каркасом (TB-wt) в отношении растворимости в забуференном фосфатом солевом растворе. В аналитической гель-фильтрации ТВ-А мигрирует преимущественно в мономерном состоянии (пик при 70 мл), тогда как TB-wt показывает сильную тенденцию к образованию агрегатов (пик при 50 мл). Кроме этого, максимальную растворимость ТВ-А и некоторых его производных оценивали преципитацией с использованием ПЭГ (Athat D.H. et al., JBC. 1981, 256; 23.12108-12117). Вкратце, кажущуюся растворимость тест-белков измеряли в присутствии полиэтиленгликоля 3000 (ПЭГ3000). Кривые растворимости определяли измерением концентрации белка в супернатанте центрифугированных смесей белок-ПЭГ3000. Все кривые показали линейную зависимость log S (мг/мл) на концентрации ПЭГ3000 (%, масса/объем). Максимальную растворимость (S) тест-белка определяли экстраполяцией линейной регрессии в направлении 0% ПЭГ (табл.I). Было рассчитано, что для ТВ-А S была равна приблизительно 70 мг/мл. Все тест-белки обнаруживали исключительно хорошую растворимость. Во втором подходе для оценки межмолекулярного притяжения/отталкивания ТВ-А (SEQ ID NO:40), ТВ-А Линкер_G2R H_+F68L (SEQ ID NO:33) и ТВ-А H_F68L (SEQ ID NO:35) в концентрации 1 мг/мл в ЗФР (50 мМ фосфат рН 6,5, 150 мМ NaCl) применяли способ, названный хроматографией самовзаимодействия (SIC). В этом способе представляющий интерес белок иммобилизуют на пористую стационарную фазу и упаковывают в колонку. Взаимодействия между свободным (подвижная фаза) и иммобилизованным белком детектируют в виде смещений в объеме удерживания. Осмотический второй вириальный коэффициент B белка, который является мерой для межмолекулярного притяжения/отталкивания, рассчитывали в соответствии с Tessier, PM et al. Biophys. J. 2002, 82: 1620-1632 (табл.I). Чем более положительным является В, тем ниже межмолекулярное притяжение тест-белка и, следовательно, тем выше его растворимость. Вследствие высокого сходства последовательностей тест-белков предполагается, что величины B разных белков могут непосредственно сравниваться друг с другом.
Таблица I: Свойства растворимости производных ТВ-А
Последовательность
pI
Log S<sub>max</sub>
Величина В<sub>22</sub> (SIC)
ТВ-А
7,8
1,84±0,13
-24,5×10<sup>-4</sup>±3,8×10<sup>-4</sup>
ТВ-А Н_M48L/F68I
7,8
не опред.
не опред.
TB-A L_V83E H_V79A
6,58
не опред.
не опред.
ТВ-А линкер_G2R Н_F68L
8,2
1,91±0,09
1,59×10<sup>-3</sup>±5,9×10<sup>-5</sup>
ТВ-А H_K43R/F68I
7,8
1,86±0,02
1,28×10<sup>-3</sup>±3,0×10<sup>-4</sup>
ТВ-А H_F68L
7,8
1,88±0,07
1,06×10<sup>-4</sup>±2,9×10<sup>-5</sup>
ТВ-А Н_F68A
7,8
не опред.
не опред.
ТВ-А Н_F68V/F70L
7,8
не опред.
не опред.
ТВ-А Н_F70L
7,8
не опред.
не опред.
Другим релевантным признаком антител или производных антител данного изобретения является их высокая стабильность. Стабильность белков ТВ-А, ТВ-А H_M48L/F68I (SEQ ID NO:31), ТВ-А Линкер_G2R H_F68L (SEQ ID NO:33), ТВ-А H_K43R/F68I (SEQ ID NO:34) и ТВ-А H_F68L SEQ ID NO:35) оценивали определением температуры для начала развертывания белка посредством кругового дихроизма и рассеяния света при 218 и 292 нм (табл.II). В этом эксперименте ТВ-А начинал развертываться при температуре 53°С, тогда как его производные ТВ-А H_M48L/F68I (SEQ ID NO:31), ТВ-А Линкер_G2R H_F68L (SEQ ID NO:33), ТВ-А H_K43R/F68I (SEQ ID NO:34) и ТВ-А H_F68L SEQ ID NO:35) обнаруживали увеличенную теплостойкость (56°С и 58°С). Все тест-белки обнаруживали необратимую денатурацию и осаждались после развертывания, делая невозможным определение температуры плавления. Для определения средней точки перехода в обратимом процессе развертывание индуцировали гидрохлоридом гуанидина (GdnHCL) для сохранения неразвернутых белков в растворе. В этом подходе максимумы испускания флуоресценции определяли при помощи флуорометрии для прослеживания развертывания. В этой постановке ТВ-А показал опять хорошую стабильность со средней точкой конформационного перехода при 2,07 М GdnHCL. В соответствии с результатами из теплового развертывания производные ТВ-А Линкер_G2R H_F68L (SEQ ID NO:33) и ТВ-А H_K43R/F68I (SEQ ID NO:34) показали увеличенную стабильность, отражаемую более высокими средними точками конформационного перехода, 2,33 и 2,3 М GdnHCL соответственно.
Таблица II: Свойства растворимости производных ТВ-А
Последовательность
Начало денатурации (°С)
[GdnHCl] в средней точке конформационного перехода
ТВ-А
53
2,07 М
ТВ-А Н_M48L/F68I
58
не опред.
TB-A L_V83E H_V79A
не опред.
не опред.
ТВ-А линкер_G2R Н_F68L
58
2,33 М
TB-A-QC15.2
56
2.30 М
TB-A-QC23.2
58
не опред.
ТВ-А-Н_F68A
не опред.
не опред.
ТВ-А Н_F68V/F70L
не опред.
не опред.
ТВ-А Н_F70L
не опред.
не опред.
d
d
Стабильность ТВ-А в сыворотке человека, моче человека, жидкости стекловидного тела свиньи и жидкости передней камеры глаза свиньи оценивали измерением TNFα-связывающей активности ТВ-А после инкубации в течение трех дней при температуре 37°С в соответствующей жидкости тела или в буфере для анализа (TBSTM) в качестве положительного контроля. ТВ-А разбавляли в жидкостях тела до конечной концентрации 10 мкМ. После периода инкубации серии разведении этих проб анализировали при помощи ELISA для определения константы связывания К ТВ-А (фиг.11). При сравнении проб жидкостей тела с пробой положительного контроля TBSTM, смещение К в направлении более высоких концентраций указывало бы на уменьшение активного белка во время периода инкубации. Однако в экспериментах авторов такое смещение не детектировалось, что свидетельствует о том, что количество полностью активного ТВ-А оставалось постоянным в анализе каждой жидкости тела вследствие высокой стабильности этого антитела.
Эксперимент 3: Связывающие свойства гуманизированных производных антител
d
Связывающие свойства всех гуманизированных scFv-вариантов испытывали в ELISA на рекомбинантном TNFα человека. Константы диссоциации (K) для всех вариантов лежат в пределах диапазона 0,8 - более 10000 нМ. По-видимому, существует обратная корреляция между степенью гомологии с акцепторным каркасом человека и аффинностью соответствующего связывающего компонента (фиг.4А). Тем не менее, некоторые варианты ТВ-А, содержащие мутации в ТВ-А-последовательности, обнаруживают уровни аффинности в отношении TNFα человека, которые сравнимы с уровнями аффинности ТВ-А. Фиг.4 В показывает два производных ТВ-А с улучшенным выходом экспрессии (сравните фиг.3А), которые проявляют сходные аффинности с ТВ-А при сравнении в ELISA.
ТВ-А представляет собой хороший пример явного компромисса выхода экспрессии и аффинности. Что касается аффинности, не было детектировано значимое различие между одноцепочечным форматом и форматом Fab-фрагмента ТВ-А (данные не показаны).
d
off
on
-4
-1
5
-1
-1
Аффинность в отношении TNFα и кинетики связывания определяли также для ТВ-А с использованием поверхностного плазменного резонанса (BIACore), что привело к константе диссоциации K=0,8 нМ, скорости диссоциации k=4,4×10 с и скорости ассоциации k=5×10 сМ.
Эксперимент 4. Анализ цитотоксичности L929
50
50
50
50
Функция антител или производных антител в нейтрализации TNFα in vivo может быть испытана измерением ингибирования цитотоксичности TNFα в отношении культивируемых фибробластов мыши L929 или альтернативно в отношении клеток миелосаркомы человека KYM-1 (табл.III). Гуманизированные scFv-производные Di62 проявляют различную эффективность в анализе L929, как показано на фиг.5В. Некоторые scFv-производные обнаруживают величины IС (ингибирующей концентрации для получения 50% ингибирования) в диапазоне 5 нг/мл, тогда как другие не действуют в анализе L929. Данные ELISA и результаты из анализа L929 не всегда коррелируют друг с другом. Однако данные KYM-1 и результаты L929 хорошо коррелируют с единственным различием, что требовались гораздо более высокие концентрации рекомбинантного TNFα человека и, следовательно, также этого антагониста для наблюдения этого действия. Таким образом, KYM-1 использовали в основном для подтверждения результатов L929. Для прямого сравнения тест-белков эффективность выражали в виде относительной величины, нормализованной относительно ТВ-А (ЕСХ/ЕСТВ-А). Однако обычно величины IС становились опять тем более высокими, чем ближе была последовательность связывающего компонента к акцепторному каркасу человека (FW2.3). Фиг.5 сравнивает эффективность различных производных ТВ-А в блокировании индуцированной TNFα цитотоксичности в отношении фибробластных клеток мыши L929. Поглощение при 450 нм коррелирует с выживанием клеток.
50
ТВ-А и анти-hTNFα-IgG Инфликсимаб обнаруживают сходную величину IС в анализе L929, тогда как эффективность TB-wt в блокировании индуцированной TNFα человека цитотоксичности является значимо более низкой (фиг.5А). При сравнении производных ТВ-А с ТВ-А в отношении их потенциала в блокировании индуцированной TNFα человека цитотоксичности большинство из этих производных, за исключением ТВ-Н43, имеют уменьшенную эффективность в L929 (фиг.5В).
Таблица III: Функциональные свойства производных ТВ-А
Последовательность
Относительная эффективность ЕС<sub>50</sub>Х/ЕС<sub>50</sub>ТВ-А
Клетки L929s
Клетки KYM-1
ТВ-А
1,0
1,0
ТВ-А Н_M48L/F68I
1,1
1,6
TB-A L_V83E H_V79A
не опред.
не опред.
ТВ-А Линкер_G2R H_F68L
0,8
1,3
TB-A-QC15.2
1,37
1,5
TB-A-QC23.2
1,32
1,5
ТВ-А-Н_F68A
1,14
не опред.
ТВ-А Н_F68V/F70L
1,28
не опред.
ТВ-А Н_F70L
2,7
не опред.
50
50
В соответствии с данными ELISA, нет существенного различия в способности блокировать TNFα-индуцированную цитотоксичность между форматами scFv и Fab ТВ-А (фиг.5С). Величина IC для Fab-формата ТВ-А приблизительно в два раза выше, чем величина IС для scFv-формата ТВ-А (фиг.5С), наиболее вероятно, в результате более высокой молекулярной массы Fab-фрагмента.
Эксперимент 5. Эксперименты на животных с производными анти-TNFα-антител
5.1. Описание эксперимента
Для тестирования на эффективность производных анти-ТNFα-антител (scFv и Fab) ESBATech в функционально нейтрализующей биоактивности TNFα человека в ситуации in vivo использовали недавно опубликованную крысиную модель острого моноартрита. Эта модель была подробно описана Bolon et аl. (см. Bolon et аl. (2004), Vet. Pathol. 41:235-243). Вкратце, в этой модели артрита животного TNFα человека инъецируют внутрисуставно в коленный сустав самцов крыс Lewis. Инъекция TNFα человека приводит к острому, самокупирующемуся моноартриту получившего инъекцию сустава. Артрит может оцениваться количественно измерением опухания сустава и гистологической оценкой. Затем биоактивность соответствующих антагонистов TNFα может быть определена количественно по уменьшению TNFα-индуцированного опухания сустава и/или по уменьшению гистологических параметров воспаления.
5.2. Материалы и способы
План эксперимента
Эти исследования предназначались для испытания соответствующего потенциала репрезентативного scFv-антитела и репрезентативного Fab-антитела вышеописанного ряда с коммерчески доступным антителом Инфликсимабом (Remigade) в отношении ингибирования биоактивности TNFα человека в подходящей модели артрита животного. Болон и сотрудники показали ранее, что внутрисуставное введение 10 микрограммов рекомбинантного TNFα человека в коленный сустав крысы провоцирует острый самокупирующийся моноартрит, который может быть определен количественно стандартным макроскопическим и микроскопическим анализом. Таким образом, эта модель животного служила в качестве идеальной системы для оценки терапевтического действия локально предоставляемых производных антитела. Два эксперимента выполняли последовательно (табл.IV и V). 1) Исследование фоновой эффективности, оценивающее общий потенциал этих антител в блокировании индуцированного TNFα человека моноартрита; 2) исследование зависимости ответа от дозы, оценивающее относительную эффективность производных этих антител в сравнении между ними. Цитокины и производные антител, в каждом случае, предоставляли один раз в виде раздельных инъекций, как описано ниже. Используемую дозу цитокина выбирали на основе публикации Болона и сотрудников, тогда как диапазон доз производных антитела определяли на основе доступных данных по культуре клеток и на основе догадки, основанной на знании. Эти эксперименты проводили в соответствии с общими руководствами по уходу за животными.
Животные и содержание животных
Молодых, взрослых самцов крыс Lewis (6-7-недель, 175-200 г) случайным образом относили к группам обработки (n=3 на группу (когорту)) и содержали в соответствии с Bolon et аl. (2004), Vet. Pathol. 41:235-243.
Инстилляция цитокина и антитела
Анестезию и инъекции цитокина выполняли, как описано Болоном и сотрудниками. Чтобы не превышать общий внутрисуставно инъецируемый объем 50 микролитров, цитокины и производные антител вводили в двух отдельных внутрисуставных инъекциях, посредством которых 10 микрограммов рекомбинантного TNFα человека инъецировали в 10 микролитрах стерилизованного фильтрованием забуференного фосфатом солевого раствора (ЗФР) и соответствующую дозу соответствующего антитела инъецировали в 40 микролитрах стерилизованного фильтрованием забуференного фосфатом солевого раствора. Животных, получавших внутрибрюшинно Инфлисксимаб/Remigade, инъецировали производными антитела за три часа перед внутрисуставной инъекцией TNFα человека. Во всех животных, обработанных вводимым внутрисуставно антителом, соответствующую дозу антитела инъецировали за пять минут перед инъекцией TNFα человека. Контрольным животным инъецировали 10 микролитров ЗФР без TNFα человека.
Инфлисксимаб/Remigade, используемый в этих экспериментах, покупали в признанной в медицине и фармакопее швейцарской аптеке. scFv- и Fab (ТВ-А)-антитела, специфические в отношении TNFα человека, а также необработанный каркас scFv-антитела, используемый в качестве неспецифического контроля, в эксперименте доза-ответ экспрессировали в Е. coli и очищали стандартными способами. Загрязнение эндотоксинами поддерживали ниже 10 ME на миллиграмм белка во всех препаратах, так как липополисахаридный компонент является сильным индуктором TNFα.
Рекомбинантный TNFα человека покупали из PeproTech EC Ltd.
Измерение диаметра сустава
Непосредственно перед инъекцией соответствующего, вводимого внутрибрюшинно или внутрисуставно производного антитела или, в случае контрольных животных, перед инъекцией ЗФР или TNFα, диаметр коленного сустава, в который должна быть сделана инъекция, определяли при помощи стандартного штангенциркуля. Спустя 48 часов после инъекции TNFα (или ЗФР в контрольных животных) и непосредственно перед умерщвлением этих животных диаметр инъецированного коленного сустава опять измеряли и рассчитывали опухание сустава вычитанием величины второго измерения диаметра из величины первого измерения диаметра (фиг.6 и 9).
Обработка ткани
Спустя 48 часов после инъекции TNFα (или ЗФР в контрольных животных) животных эвтанизировали. При аутопсии инъецированные коленные суставы отделяли от стопы и бедра, фиксировали интактно погружением в 70% этанол и обрабатывали для стандартного окрашивания гематоксилином и эозином (НЕ), как описано Болоном и сотрудниками.
Морфологический анализ
Гистологический балльный анализ для измерения воспаления суставов выполняли, как описано Болоном и сотрудниками. Гистопатологические критерии для оценивания воспаления суставов использовали в соответствии с критериями Болона и сотрудников (фиг.7, 8 и 10).
5.3. Результаты
В первой серии экспериментов репрезентативное вводимое внутрисуставно scFv-антитело, ТВ-А, ESBATech и соответствующее вводимое внутрисуставно Fab-антитело ESBATech сравнивали на их способность блокировать индукцию острого моноартрита с внутрисуставно и внутрибрюшинно вводимым Инфлисксимабом/Remigade в соответствии с таблицей IV.
Таблица IV: Схема инъекций эксперимента 1
Группа
TNFα (мкг) в ЗФР
Ингибитор
Доза (мкг)
1 (n=3)
0
отсутствует
2 (n=3)
10
отсутствует
3 (n=3)
0
ТВ-А scFv
180
4 (n=3)
10
ТВ-А scFv
180
5 (n=3)
0
ТВ-А Fab-антитело
450
6 (n=3)
10
ТВ-А Fab-антитело
450
7 (n=3)
10
ТВ-А Fab-антитело
180
8 (n=3)
0
Infliximab (i.a.)
450
9 (n=3)
10
Infliximab (i.a.)
450
10 (n=3)
10
Infliximab (i.a.)
180
11 (n=3)
10
Infliximab (i.p.)
450
12 (n=3)
10
Infliximab (i.p.)
180
Результаты, полученные в отношении действий лечения (обработки) на изменение диаметра коленного сустава (в качестве индикатора TNFα-индуцированного опухания сустава), представлены на фиг.6. Все антитела полностью блокировали TNFα-индуцированное опухание сустава.
Для оценивания действий лечения (обработки) на воспаление сустава выполняли гистологическое балльное оценивание предметных стекол с неокрашенной тканью. Воспаление сустава оценивали в баллах с использованием следующих критериев (см. фиг.7 в отношении репрезентативных примеров оценивания в баллах):
Балл 0 - нормальное состояние
Балл 1 - слабое утолщение синовиальной выстилки
Балл 2 - утолщение синовиальной выстилки и слабое утолщение нижележащей выстилки
Балл 3 - утолщение синовиальной выстилки и умеренное воспаление нижележащей выстилки
Результаты, полученные в отношении эффекта лечения на гистопатологические оценки воспаления, показаны на фиг.8.
Наблюдали сравнимые эффекты всех обработок на оценки гистопатологического воспаления.
Во второй серии экспериментов сравнивали относительную зависимость от дозы реакции на оцениваемые производные антитела. Репрезентативное вводимое внутрисуставно scFv-антитело ТВ-А ESBATech и соответствующее вводимое внутрисуставно Fab-антитело ESBATech эксперимента 1 сравнивали с вводимым внутрисуставно и внутрибрюшинно Инфлисксимабом/Remigade и неродственным scFv-антителом, не имеющим связывающей активности в отношении TNFα человека, в широком диапазоне доз, отличающемся от диапазона доз в эксперименте 1, в соответствии с таблицей V.
Таблица V. Схема инъекций эксперимента 2
Группа
TNFα (мкг) в ЗФP
Ингибитор
Доза (мкг)
1 (n=3)
0
отсутствует
2 (n=3)
10
отсутствует
3 (n=3)
10
неродственное scFv-антитело
180
4 (n=3)
10
scFv-антитело ТВ-А
156
5 (n=3)
10
scFv-антитело ТВ-А
45
6 (n=3)
10
scFv-антитело ТВ-А
11
7 (n=3)
10
Fab-антитело ТВ-А
156
8 (n=3)
10
Fab-антитело ТВ-А
45
9 (n=3)
10
Fab-антитело ТВ-А
11
10 (n=3)
10
Infliximab (i.a.)
156
11 (n=3)
10
Infliximab (i.a.)
45
12 (n=3)
10
Infliximab (i.a.)
11
13 (n=3)
10
Infliximab (i.p.)
156
14 (n=3)
10
Infliximab (i.p.)
45
15 (n=3)
10
Infliximab (i.p.)
11
Результаты, полученные в отношении эффекта лечения на изменение диаметра коленного сустава (в качестве индикатора эффекта на TNFα-индуцированное опухание сустава), показаны на фиг.9.
Результаты, полученные в отношении эффекта лечения на гистопатологические оценки воспаления, представлены на фиг.10.
В целом, как репрезентативное анти-ТNFα-sсFv-антитело ESBATech, так и репрезентативное анти-ТNFα-Fаb-антитело ESBATech были высокоэффективными в блокировании индуцированного TNFα человека моноартрита после локального (внутрисуставного) введения.
Хотя здесь описаны предпочтительные в настоящее время варианты осуществления этого изобретения, следует ясно понимать, что это изобретение не ограничивается ими и может иным образом осуществляться и воплощаться разнообразно в рамках следующей формулы изобретения.