Изучение изотопных эффектов тяжелой воды (D2O) в биологических системах на примере клеток прокариот и эукариот

The impact of biomechanical properties of the corneoscleral shell on eye hydrodynamics

E.N. Iomdina, O.A. Kiseleva, L.A. Nazarenko, N.Yu. Ignatieva, V.N. Bagratashvili

It is hypothesized that impaired biomechanical properties of the sclera around the optic disc and, largely, in the corneoscleral shell may play an essential role in the pathogenesis of primary open-angle glaucoma (POAG). The paper’s objective is to study experimentally the impact of elastic scleral properties on intraocular fluid (IF) outflow. We determined the mechanical characteristics and the crosslinking level of the sclera as well as hydrodynamic parameters in three groups of experimental animals: 1) intact eyes of young (2 months of age) and old (2 years) rabbits; 2) eyes treated in vivo by threose, which increases crosslinking of scleral collagen; 3a) eyes of young and old rabbits after they were treated by collalysin, a proteolytic enzyme, 3b) eyes of rabbits pre-treated by treose and subsequently treated by collalysin. The hydrodynamic parameters were measured using Glautest 60. Differential scanning calorimetry was used to reveal the crosslinking level of scleral collagen. The biomechanical parameters of sclera were determined by Autograph AGS-H. The normal age-related increase of scleral stiffness (Young’s modulus) from 23.1±4.2 MPa to 41.4±6.3 MPa (p<0.05) is followed by a moderate growth of cross links and a somewhat reduced IF outflow. At the same time, an increase of scleral stiffness (to 65.4±6.0 MPa) caused by threose, i.e. a pathological growth of crosslinking, is accompanied by a certain intraocular pressure increase and a significant impairment of IF outflow. Collalysin-treated old rabbits revealed a fall in scleral stiffness (to 27.9±4.9 MPa) and an improved IF hydrodynamics, whereas young animals showed only a slight change in these parameters. The sclera treated by threose and containing excessive cross links also became less stiff (43.4±4.5 MPa) and improved IF hydrodynamics after collalysin treatment. It may be assumed that the biomechanical properties of sclera affect the eye hydrodynamics: IF outflow is deteriorating with the increase of scleral stiffness that is caused by excessively generated cross links in its collagen structures, which may be a risk factor for POAG. Proteolytic therapy with collalysin helps reduce the amount of these links, make the sclera less stiff and improve hydrodynamic parameters of the eye.

Key words: sclera, intraocular fluid, collagen, crosslinking, elasticity modulus.

BnoMeAHi^HHa № 3,2012

34

Биомедицина • № 3,2012, С. 35-50

Изучение изотопных эффектов тяжелой воды (020) в биологических системах на примере клеток прокариот и эукариот

О.В. Мосин1, И. Игнатов2

1 - Московский государственный университет пищевых производств, Москва

2 - Научно-исследовательский центр медицинской биофизики НИЦ МБ, София, Болгария

Контактная информация: доктор наук Европейской академии естествознания Игнатов Игнат mbioph@dir.bg

Изучены изотопные эффекты дейтерия (Б) в клетках различных таксономических групп прокариотических и эукариотических микроорганизмов, реализующих метилотрофные, хемогетеротрофные, фотоорганогетеротрофные и фотосинтетические способы ассимиляции углеродных субстратов при росте на средах с тяжёлой водой (Б20). Разработан метод ступенчатой адаптации клеток к Б20, заключающийся в их рассеве на чашках Петри с твёрдыми (2% агар) питательными средами при ступенчатом увеличении градиента концентрации Б20 (от 0 до 98% Б20) и последующей селекции устойчивых к Б20 клеток. В результате этой техники на максимально дейтерированной среде с 98% Б20 получены адаптированные к Б20 клетки, биологический материал которых вместо атомов водорода содержит атомы дейтерия с уровнем дейтерированности молекул 92-97,5% Б. Использование адаптированных к Б20 клеток и выделенных из них дейтерированных природных соединений (белки, аминокислоты, нуклеозиды, пигменты, углеводы, липиды) может найти дальнейшее применение в биофизических исследованиях и биомедицинских технологиях.

Ключевые слова: дейтерий, тяжелая вода, изотопные эффекты, адаптация, бактерии, микроводоросли.

Введение

Одним из интереснейших биологических феноменов является способность некоторых микроорганизмов расти в искусственных условиях в тяжёлой воде 0X0) [В]. 1X0 обладает высоким экологическим потенциалом вследствие отсутствия радиоактивности, что способствует ее использованию в качестве изотопного индикатора в химии, биологии и медицине [18]. В природных водах соотношение 1)11 составляет 1:5500 (в предположении, что весь дейтерий находится в форме 1ХО) [20]. В действительности дейтерий присутствует в форме 1ХО лишь в концентрированных растворах. При небольших концентрациях в воде он

присутствует в форме НПО, поскольку в смесях 1ХО-11,0 с большой скоростью происходят реакции диссоциации и изотопного (11-1)) обмена, приводящие к образованию 111)0.

Изотопные эффекты, опосредованные разницей нуклеарных масс дейтерия и протия пары III), могут быть достаточно большими [4]. Химические реакции в 1X0 протекают с более медленной скоростью, чем в IЦ ), 1X0 слабее ионизирована, чем IЦ ), константа диссоциации 1X0 меньше таковой для IЦ ), растворимость органических и неорганических веществ в Б.,0, как правило, ниже, чем в Н^О, водородные связи с участием дейтерия несколько прочнее обычных, подвижность

ионов 1) 0 на 28,5% ниже НэО+, а ОБ -на 39,8% ниже ОН [24]. Для других ионов различие подвижностей в Н/) и 1X0 составляет около 18% [3]. Константы диссоциации слабых кислот и оснований К ( снижаются в 1X0 по сравнению с а растворимость и растворяющая способность 1X0 для многих неорганических и органических веществ, как правило, ниже, чем у Н/ ), хотя известны и обратные факты.

Систематическое изучение воздействия 1X0 на клетки животных, растений и микроорганизмов в нашей стране начато сравнительно недавно [1]. Эксперименты показали, что 1X0 действует негативно на жизненные функции организмов, замедляет клеточный метаболизм и ингибирует митоз в стадии профазы; это происходит даже при использовании обычной природной воды с повышенным содержанием 1X0 или 111)0 [14]. Клетки животных способны выдерживать до 30% 1X0, растений -50% 1X0, микроводорослей - 70% 1X0, а клетки простейших и микроорганизмов

- 95% I)/ ) [9].

С развитием новых биотехнологических подходов появилась возможность использовать в качестве биомоделей для научных целей и прикладных исследований, в т.ч. для направленного синтеза Б-меченных природных соединений, адаптированные к 1X0 клетки микроорганизмов и микроводорослей. Традиционным методом при этом является выращивание микроорганизмов в средах, содержащих максимальные концентрации Б,, О и дейтерированных субстратов,

- например, [Б]метанол [10]. В процессе роста клеток в Б,, О в них синтезируются молекулы биологически важных природных соединений (ДНК, белки, аминокислоты, нуклеозиды, пигменты, углеводы,

липиды), атомы водорода при углеродных скелетах которых полностью замещены на дейтерий. Их выделяют из дейтерированной биомассы, полученной на средах с высокими концентрациями 1X0 и дейтерированными субстратами, используя комбинацию физико-хими-ческих методов выделения - гидролиз, осаждение и экстракцию органическими растворителями и хроматографическую очистку методом колоночной хроматографии с применением различных сорбентов. Такие дейтерированные молекулы претерпевают структурно-адап-тационные модификации, необходимые для нормального функционирования клетки вБ,0.

Биологическая адаптация к 1X0 интересна не только с научной точки зрения, но она также позволяет получать уникальный дейтерированный биологический материал для диагностических биомедицинских целей, а также решения задач молекулярной организации клетки методом ЯМР-спектроскопии [17]. Тенденции к применению дейтерия в качестве изотопной метки обусловлены отсутствием радиационной опасности и возможностью определения локализации дейтерия в молекуле методами высокого разрешения: спектроскопией ЯМР [19], ИК-спектроскопией [21] и масс-спектрометрией [11]. Это позволило за последние годы существенно повысить эффективность проведения многочисленных биомедицинских исследований с 1X0 и дейтерированными природными соединениями de novo, а также изучать структуру и механизм их действия на молекулярном уровне.

Данная работа является продолжением наших исследований, связанных с принципиальной возможностью практического использования различных кле-

ток бактерий, микроводорослей и растений, для синтеза D-меченных природных соединений в условиях максимально дейтерированных сред с IXO. Целью работы являлось изучение изотопных эффектов D,Ob клетках различных таксономических групп микроорганизмов и микроводорослей, осуществляющих метилотрофный, хемогетеротрофный, фотоорганогетеротрофный и фотосин-тетический пути ассимиляции углеродных субстратов.

Материалы и методы

Объектами исследования являлись две хемогетеротрофные грамположительные бактерии Bacillus subtilis и Brevibacterium methylicum (последняя способна к мети-лотрофии), фотоорганогетеротрофная галобактерия Halobacterium halobium и фотосинтезирующая одноклеточная зеленая микроводоросль Chlorella vulgaris, полученные из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) Государственного научно-ис-следовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов ГосНИИГенетика.

1. Brevibacterium methylicum ВКПМ В 5652, лейцинзависимый штамм грам-положительных факультативных ме-тилотрофных бактерий, ассимилирующий метанол по РМФ-циклу фиксации углерода.

2. Bacillus subtilis В-3157, полиауксо-трофный по гистидину, тирозину, адени-ну и урацилу штамм грамположительных хемогетеротрофных бактерий, релизую-тттий гексозо-6-моно-фосфатный (ГМФ) путь ассимиляции углеводов.

3. Halobacterium halobium ЕТ 1001, фотоорганогетеротрофный каротиноид-

содержащий штамм экстремальных га-лобактерий, синтезирующий трансмем-бранный белок бактериородопсин.

4. Chlorella vulgaris В 8765, зеленая одноклеточная фотосинтезирующая микроводоросль.

Для приготовления питательных сред применяли D.,0 (99,8 ат.% D), DC1 (95,5 ат.% D) и [Б]метанол (97,5 ат.% D), полученные из Российского научно-иссле-довательского центра «Изотоп» (Санкт-Петербург, РФ). Неорганические соли и D, L- глюкозу (Reanal, Венгрия) предварительно перекристаллизовывали в IXO, IXO дистиллировали в присутствии КМп04 с последующим контролем изотопной чистоты *Н ЯМР-спектроскопией на приборе Brucker WM-250 (ФРГ) (рабочая частота 70 МГц, внутренний стандарт Me4Si).

Для выращивания использовали следующие питательные среды (количества компонентов приведены в г/л):

1. Минимальная среда М9 для выращивания факультативных метилотроф-ных бактерий В. methylicum, на основе ступенчато-увеличивающихся концентраций D.,0 (от 0; 24,5; 49,0; 73,5 до 98

об.%* IXO) и 2% метанолом/[Б]метано-лом (г/л): КН,Р04 3; \aJIP04 6; NaCl 0,5; NH4C1 1.

2. Среда ГС1 для выращивания хемо-гетеротрофной бактерии В. subtilis (на основе 99,8% IXO): глюкоза 120; гидролизат дейтеро-биомассы В. methylicum 25; NH4N03 30; MgS04.7H20 20; СаС0320.

3. Среда ГС2 для выращивания фото-органогетеротрофной галобактерии Н. halobium (на основе 99,8% IXO): NaCl 250; MgS04.7H20 20; КС1 2; СаС12.6Н20 0,065; цитрат натрия 0,5; гидролизат дей-теро-биомассы В. methylicum 20, витами-

* Здесь и далее использованы проценты по объему, об.%

ны (биотин - 1.10 4; фолиевая кислота -1,5.10 4; витамин - 2.105).

4. Среда Тамия для выращивания фотосинтезирующей зеленой микроводоросли С. vulgaris (на основе 99,8% IXO): KN03 - 5,0; MgS04.7H20 - 2,5; КН2ГО4

- 1,25; FeS04 - 0,003; микроэлементы (MnS04.2H,0 - 3.104; CaCl, 611/) -

0,065; ZnS04 711,0 - 4.10 s; CuS04.5H,0 -5.10s, CoCl2.6H20 -5.106).

Стартовым материалом для выращивания хемогетеротрофных бактерий и галобактерий являлась дейтеро-биомасса факультативных метилотрофных бактерий В. methylicum, полученная в условиях многоступенчатой адаптации на твердых (2% агар) средах М9 с IXO. Полученную дейтеро-биомассу В. methylicum (выход 100 г по влажному весу с 1 л среды) авто-клавировали в 0,5 н. НС1 (в IXO) (0,8 атм, 30 мин), нейтрализовали 0,1 н. КОН (в IXO) (pH 7,0) и использовали в качестве источника дейтерированных ростовых субстратов для адаптации и выращивания хемоорганогетеротрофных бактерий В. sublilis и галобактерий Н. halobium.

Выращивание грамположигельных бактерий В. subtilis проводили на ГС 1 среде при 34°С в колбах Эрленмейера вместимостью 250 мл с наполнением средой до 50 мл в условиях интенсивной аэрации на орбитальном шейкере Biorad (100 об/ мин) (Польша), используя в качестве источников дейтерированных субстратов IXO и гидролизат дейтеро-биомассы В. methylicum. Галобактерии Н. halobium выращивали в аналогичных условиях на ГС2 среде при 37°С при освещении лампами дневного света ЛБ-40. Выращивание микроводоросли С. vulgaris проводили на синтетической среде Тамия при 32°С в фотореакторе с барботажем СО,. Рост оценивали по способности к образованию отдельных колоний на по-

верхности твёрдых агаризованных сред с 1ХО, а также по величине ОП суспензии клеток, измеренной на спектрофотометре Вссктап-1)! "6 (США) при /.=620 нм. После 6-7 суток культивирования клетки отделяли центрифугированием (10000 об/мин, 20 мин) на центрифуге Т-24 (ФРГ). Биомассу промывали 1ХО и экстрагировали смесью органических растворителей хлороформ-метанол-ацетон (2:1:1) для отделения липидов и пигментов. Полученный осадок высушивали до постоянной массы (10-12 мг) и использовали в качестве фракции суммарных белков биомассы, а жидкий экстракт - в качестве липидной фракции. [1)|рибок-син выделяли из КЖ В. 5иЫШ5 адсорбцией активированным углем (12 ч, 4°С), экстракцией 0,3 М \114-формиатпым буфером (pH 8,9) и перекристаллизацией в 80% этаноле ([а]Б^О = +1,61°, выход 3,1 г/л (80%)). БР выделяли из фракции пурпурных мембран Н. 1ш1оЫит по методу Остерхельта, усовершенствованному нами [22].

Гидролиз дейтерированных белков биомассы проводили при 110°С в течение 24 ч в запаянных стеклянных ампулах в 50-ти-кратном избытке 6 н. 1)0 (в 1ХО), используя 10 мг сухой дейтеро-биомас-сы. Реакционную массу суспендировали в горячей 1ХО, фильтровали. Гидролизат упаривали в роторном испарителе РВО-64 (Венгрия) при 60°С. Остатки 1)0 удаляли в эксикаторе путем выдерживания над твердым ИаОН. Для проведения гидролиза внутриклеточных углеводов 50 мг сухой делипидизованной дейтеро-био-массы помещали в круглодонную колбу вмесимостью 250 мл, добавляли 50 мл Б,, О и 1,6 мл 25% Н^04 и кипятили с обратным водяным холодильником в течение 90 мин. По охлаждении реакционную смесь суспендировали в 50 мл 1X0 и ней-

трализовали 2 н. раствором Ва(ОН),, (в IXO) до pH 7,0. Выпавший осадок BaS04 отделяли центрифугированием (15000 об/мин, 5 мин), супернатант декантировали и упаривали в роторном испарителе при 60°С.

Аминокислотный анализ белковых гидролизатов проводили на приборе Biotronic LC 5001 (ФРГ); 230x3,2 мм; рабочее давление 50-60 атм; скорость подачи Na-цитратного буфера 18,5, нинги-дрина - 9,25 мл/ч; детекция при /.=570 нм и /.=-140 нм (для пролина).

Анализ углеводов осуществляли на жидкостном хроматографе Knauer (ФРГ), снабженным насосом Gilson (ФРГ) и рефрактометром Waters К 401 (ФРГ); неподвижная фаза: Separon NH,,,

10 мкм; подвижная фаза: CH3CN-H^O, (75:25); скорость подачи 0,6 мл/мин.

Липиды анализировали на хроматографе Beckman Gold System (США), снабжённым насосом Model 166 и детектором Model 126 (США); неподвижная фаза: Ultrasphere ODS 5 мкм; 4,6 х 250 мм; подвижная фаза: линейный градиент 5 мМ KH2P04-CH3CN; 100% в течение 50 мин; скорость подачи - 0,5 мл/мин; детекция при Х=210 нм.

Масс-спектры FAB регистрировали на импульсном масс-спектрометре VG-70 SEQ (Fisons, VG Analitical, США) с цезиевым источником Cs+ на глицериновой матрице с ускоряющем напряжением 5 кВ и ионным током 0,6-0,8 мА. Уровни включения дейтерия в молекулы аминокислот белковых гидролизатов определяли методом масс-спектрометрии ЭУ в виде метиловых эфиров \-(димстиламипо) нафтален-1-сульфонил хлоридных (дан-сильных) производных аминокислот на приборе MB-80A (Hitachi, Япония) при ионизирующем напряжении 70 эВ и температуре катодного источника 180-200°С

по ранее разработанной нами методике [12]. Расчет уровней дейтерированно-сти молекул проводили по соотношению вкладов пиков молекулярных ионов [М]+ дейтерированных соединений, выделенных с IXO-средах и контроля, полученного в Н^О-среде.

Результаты и их обсуждение

При воздействии воды на биологические объекты их реакция изменяется в зависимости от изотопного состава воды и величины изотопных эффектов, определяемых разницей констант скоростей химических реакций kh/kd. в Н.,0 и IXO. Самые большие изотопные эффекты с соотношением kh/kd. = 6-8 наблюдаются в D20 для C-H/C-D, N-H/N-D и O-H/O-D связей. Изотопные эффекты оказывают влияние не только на физико-химические свойства, но и на биологические свойства IXO. Эксперименты с IXO показали (рис. 1), что микроводоросли способны расти на 70% IXO, метилотрофные бактерии -75% IXO, хемогетеротрофные бактерии

- 82% Ъ.,0, а галофилы - 95% D.,0.

В ходе эксперимента были получены адаптированные к максимальным концентрациям IXO клетки относящихся к различным таксономическим группам микроорганизмов, реализующих мети-лотрофный, хемогетеротрофный, фото-органогетеротрофный и фотосинтети-ческий пути ассимиляции углеродных субстратов, - факультативные метилотрофные бактерии В. methylicum, хемогетеротрофные бактерии В. subtilis, галобактерии Н. halobium и микроводоросли С. vulgaris.

Выбор ассимилирующих метанол факультативных метилотрофных бактерий В. methylicum был связан с разработкой новых биотехнологий получения мети-лотрофной дейтеро-биомассы на [ I ) | ме-

so

20

І HrcrfwHTrtfW Н Hatebwe forrtpwi II МстмГ*/ЧЦчкгфсим и

ЬЪрфоккнрскдо С томата

Рис. 1. Выживаемость клеток изученных микроорганизмов в воде с различными содержаниями дейтерия.

таноле и І)/) и ее дальнейшего использования как источника дейтерированных ростовых субстратов для выращивания других штаммов-про дуцентов.

Выбор фотоорганогетеротрофных галобактерий Н. ІшІоЬіит был обусловлен перспективами дальнейшего выделения ретинальсодержащего трансмембранного белка бактериородопсина

- хромопротеида из 248 аминокислотных остатков, содержащего в качестве хромоформной группы эквимолекулярную смесь 13-цис- и полностью 13-транс-ретинольного С^-каротипоида, связанного с остатком Ьув-216 и определяющего пурпурно-красный цвет галобактерий [5]. БР выполняет в клетках галобактерий роль АТФ-зависимой транслоказы, создающей электрохимический градиент протонов Н+ на поверхности клеточной мембраны, энергия которого используется клеткой для синтеза АТФ в анаэробном фотосинтетическом фосфори-лировании.

Использование хемогетеротрофных бактерий В. зиЫШ-з определялось необходимостью препаративного выделения

продуцируемого этой бактерией дейте-рированного рибонуклеозида - рибоксина (уровень дейтерированности 62,5% D) для медицинской диагностики, а использование фотосинтезирующей микроводоросли С. vulgaris было связано с исследованием биосинтеза в I)/) дейтерированных хлорофилловых и каротино-идных пигментов (уровень дейтерированности 95-97% D) для их последующего использования для реконструкции искусственных мембран.

Для адаптации клеток к I)/) использовали ступенчато увеличивающийся градиент концентрации I)/), поскольку предполагалось, что постепенное привыкание организма к дейтерию будет оказывать благоприятный эффект на ростовые и физиологические параметры. Стратегия адаптации к I)/) показана в табл. 1 на примере метилотрофных бактерий В. methylicum, дейтеро-биомасса которых использовалась в дальнейших экспериментах в качестве D-меченных ростовых субстратов для выращивания хемогетеротрофных и фотоорганогетеротрофных бактерий.

Таблица 1

Изотопный состав ростовых сред и характеристики роста метилотрофных бактерий В. теЛуИсшп в процессе адаптации к Б20

Номер опыта Компоненты среды, об. % Лаг-период, ч Выход микробной биомассы, % от контроля Время генерации, ч

н2о о2о метанол [0] метанол

1 98,0 0 2 0 20 100 2,2

2 98,0 0 0 2 30 92,3 2,4

3 73,5 24,5 2 0 32 90,6 2,4

4 73,5 24,5 0 2 34 85,9 2,6

5 49,0 49,0 2 0 40 70,1 3,0

6 49,0 49,0 0 2 44 60,5 3,2

7 24,5 73,5 2 0 45 56,4 3,5

8 24,5 73,5 0 2 49 47,2 3,8

9 0 98,0 2 0 58 32,9 4,4

10 0 98,0 0 2 60 30,1 4,9

10' 0 98,0 0 2 40 87,0 2,8

Примечание: Данные опытов 1-10 приведены при выращивании бактерий в минимальных средах М9, содержащих 2% метанол/[В]-метанол и указанные концентрации Б20. Данные опыта 10' приведены для адаптированных к максимальному содержанию дейтерия в среде бактерий при выращивании в среде с максимальными концентрациями Б20. В качестве контроля использовали опыт 1, где применяли обычную воду и метанол.

Стратегия адаптации к 1X0 заключалась в рассеве исходных клеток микроорганизмов на чашках Петри с твёрдыми агаризованными средами с 2%-м агаром при ступенчатом увеличении концентрации в них (от 0; 24,5; 49,0; 73,5 до 98% П/)) и последующей селекции устойчивых к 1ХО клеток. Выросшие на средах с низким градиентом концентрации 1X0 клетки переносили на среды с большим градиентом концентрации, вплоть до 98% 1X0. На конечном этапе на максимально дейтерированной среде с 98% 1X0 были выделены отдельные клеточные колонии, представляющие собой потомство одной единственной клетей, устойчивой к действию 1X0. Затем колонии переносили в жидкие питательные

среды такого же состава, приготовленные на основе 1X0, и культивировали в течение 5 сут при 34°С. Уровень выживаемости клеток на полностью дейтерированной среде составил не более 40-50%. За ходом адаптации наблюдали по изменениям продолжительности лаг-периода, времени клеточной генерации и выходов микробной биомассы, а также по способности к образованию отдельных колоний на поверхности твёрдых агаризованных сред с 1X0 и подсчету клеток.

Все адаптированные к 1X0 клетки сохранили способность размножаться в Б^О-средах, а также биосинтетические способности к синтезу аминокислот, белков и нуклеозидов. Общей особенностью адаптированных к 1X0 клеток микроор-

ганизмов при росте в Б^О-средах было увеличение лаг-периода и времени клеточной генерации при уменьшении выходов микробной биомассы. Значения этих параметров коррелировали с уровнями содержания І)/) в ростовых средах, с фиксированием самых низких значений в максимально дейтерированной среде (опыты 9, 10, табл. 1). В отличие от адаптированных к І)/) микроорганизмов, рост исходных микроорганизмов в максимально дейтерированных средах с І)/) ингибировался дейтерием. Выходы биомассы в максимально дейтерированных средах составили 85-90% для разных таксономических групп микроорганизмов. Адаптированные микроорганизмы имели несколько сниженные уровни накопления микробной биомассы и увеличенные времена клеточной генерации при росте в ІХО-срсдах.

Полученный результат в опытах по адаптации метилотрофных бактерий В. теіїїуіісит к ІХО позволил использовать гидролизаты метилотрофной дейтеро-биомассы, полученной в процессе многоступенчатой адаптации к ІХО, в качестве дейтерированных ростовых субстратов для выращивания хемогетеротрофных бактерий В. зиШ-Иія и фотоорганогете-ротрофных галобактерий Н. ІшїоЬиит. Усваиваемость биомассы метилотрофов клетками простейших и эукариот составляет 85-99%, а производительность метилотрофов, измеренная по уровню конверсии метилового спирта, достигает 50-60% [23]. При разработке питательных сред на основе дейтеро-биомассы метилотрофных бактерий учитывалось, что метилотрофные бактерии при росте на метаноле способны синтезировать большое количество полноценных белков (до 55% от веса сухого вещества), 15-17% полисахаридов, 10-12% липидов (в основном, фосфолипидов) и 18% золь-

ных веществ [13]. Причем эта способность сохраняется при росте на средах, содержащих 1X0 и [1)|мстапол. Чтобы обеспечить высокие выходы этих соединений и минимизировать реакции обратного изотопного (Н-1)) обмена в аминокислотных остатках молекул белков, гидролиз дейтеро-биомассы проводили автоклавированием в 0,5 н. 1)0 (в 1X0).

Учитывая способы ассимиляции углеродных субстратов, адаптацию хемогетеротрофных В. зиЫШ-з и галобактерий

Н. 1ш1оЫит проводили путем рассева исходных бактерий до отдельных колоний на соответствующих твердых (2% агар) питательных ГС1 и ГС2 средах на основе 99,8% 1X0 и гидролизата дейте-ро-биомассы В. теМуНсит и последующей селекцией колоний по признаку устойчивости к 1X0. В отличие от 1X0, Б-субстраты из гидролизата дейтеро-биомассы не оказывали существенного влияния на параметры роста исследуемых микроорганизмов. Выход [1)|ри-боксина, зафиксированный при росте

В. зиЫШз на максимально дейтерированной ГС 1 среде, составил 3,9 г/л при уровне ассимиляции глюкозы из КЖ 40 г/л. Фракционирование [1)|ри6оксипа из КЖ штамма продуцента производили адсорбцией/десорбцией на поверхности активированного угля, экстракцией 0,3 М \114-формиатпым буфером (pH 8,9) с последующей перекристаллизацией в 80% этаноле и колоночной ионообменной хроматографии на катионообменнике А050’\¥Х 4, уравновешенным 0,3 М \114-формиатным буфером с 0,045 М \114С1. Уровень дейтерированности рибоксина по данным масс-спектрометрии 1ЛН составил пять атомов дейтерия (62,5% Б) с включением трех атомов дейтерия в ри-бозный и двух атомов дейтерия в гипок-сантиновый фрагменты молекулы.

Для адаптации к I)/) микроводоросли

С. vulgaris использовали жидкие минеральные среды Тамия, содержащие 25, 50, 75 и 98% I)/). В случае с С. vulgaris и Н. halobium и использовали освещение лампами дневного света ЛБ-40, поскольку оба микроорганизма развиваются в присутствии света. Выделенные селекцией отдельные колонии клеток, устойчивые к I)/), выращивали в жидких средах аналогичного состава с 99,8 ат. % I)/) для наработки дейтеро-биомассы.

При выращивании Н. halobium в ГС

2 среде в клетках синтезировался каро-тиноидсодержащий фиолетовый пигмент, по спектральному соотношению белкового и хромофорного фрагментов молекулы 1Ххоах 1,5:1 идентичный природному БР. Рост галобактерий в D^O-среде ингибировался незначительно по сравнению с контрольной протониро-ванной средой, что существенно упрощает оптимизацию условий наработки дейтерированной биомассы галобактерий, заключающейся в выращивании галобактерий в дейтерированной среде с 20% гидролизатом дейтеро-биомассы В. methylicum, выделением фракции пурпурных мембран, отделением низко- и высокомолекулярных примесей, клеточной РНК, каротиноидов и липидов с последующим растворением белка в 0,5% SDS-Na и осаждением метанолом. Суммарный уровень дейтерированности БР, рассчитанный по уровням дейтерированности аминокислот белкового гидролизата, составил 95% D.

Проведённые нами исследования свидетельствуют, что способность к адаптации к I)/) у разных таксономических групп микроорганизмов различная и определяется как таксономической принадлежностью микроорганизмов, так и особенностями метаболизма, функцио-

нированием различных путей ассимиляции субстратов, а также эволюционной нишей, которую занимает исследуемый объект. При этом чем ниже уровень эволюционного развития организма, тем лучше он приспосабливается к присутствию дейтерия в среде. Так, из изученных объектов наиболее примитивными в эволюционном плане (строение клеточной мембраны, биохимия, устойчивость к внешним факторам среды) являются галобактерии, относящиеся к археобак-териям, стоящие обособленно как от прокариотических, так и от эукариотических микроорганизмов, обнаруживающих повышенную устойчивость к О/), и практически не нуждающиеся в адаптации к 1X0, что нельзя сказать о микроводорослях, которые, будучи эукариотами, труднее всех адаптируются к 1X0 и проявляют ингибирование роста в 70-75% 1X0.

В процессе адаптации к 1X0 немаловажную роль играет состав питательной среды, поскольку причинами ингибирования роста клеток и их гибели могут стать изменения соотношения синтезируемых метаболитов: аминокислот, белков и углеводов в 1ХО-срсдах. Отмечено, что адаптация к 1X0 проходит легче в комплексных средах, содержащих БВК дрожжей, при постепенном увеличении содержания дейтерия в среде, так как чувствительность к 1X0 разных жизненно важных систем различна. Как правило, даже высокодейтерированные среды содержат протоны от 0,2-10% Н. Остаточные протоны в момент адаптации к 1X0 облегчают перестройку к изменившимся условиям, предположительно встраиваясь именно в те участки, которые наиболее чувствительны к замене атомов водорода на дейтерий. Также были выявлены существенные различия в морфологии дейтерированных

и протонированных клеток С. vulgaris. Клетки С. vulgaris, выращенные на IXO-средах, имели в 2-3 раза большие размеры и более толстую клеточную стенку, чем контрольные клетки, выращенные на обычной протонированной среде Та-мия с обычной водой; распределение в них ДНК было неравномерным. В некоторых случаях на поверхности мембран наблюдались участки, состоящие из плотно упакованных складок цитоплазматической мембраны, напоминающие мезосомы. Кроме того, для дейтериро-ванной С. vulgaris было также характерно резкое изменение формы клеток и направления их деления. Наблюдавшееся деление не заканчивалось обычным расхождением дочерних клеток, а приводило к образованию атипичных клеток, описанных в работах других авторов [2]. Наблюдаемые морфологические изменения, связанные с торможением роста дейтерированных клеток, обусловлены перестройкой в процессе адаптации к I)/). Факт, что дейтерированные клетки имеют более крупные размеры (кажущийся размер в 2-4 раза превосходит размер протонированных клеток), является общебиологическим и наблюдается при выращивании в I)/) целого ряда других адаптированных нами прокариотических и эукариотических клеток.

Полученные нами данные, в целом, подтверждают устойчивое представление о том, что адаптация к I)/) является фенотипическим явлением, поскольку адаптированные к I)/) клетки возвращаются после их переноса в обычные водные среды к нормальному росту после некоторого лаг-периода. В то же время эффект обратимости роста на H,0/D,,0 средах не исключает возможности того, что определенный генотип детерминирует проявление одного и того же фенотипического

признака в средах различного изотопного состава. При попадании клетки в тяжёловодородную среду, лишённую протонов, из неё не только удаляется протониро-ванная вода за счет реакции обмена Н.,0-

I)/ ), но и происходит быстрый изотопный (H-D) обмен в гидроксильных (-ОН), сульфгидрильных (-SH) и аминогруппах (-NHJ молекул всех органических соединений, включая белки, нуклеиновые кислоты, углеводы и липиды. Известно, что в этих условиях только ковалентная С-Н связь не подвергается изотопному обмену, и вследствие этого только соединения со связями типа С-D могут синтезироваться de novo [7]. В зависимости от положения атома дейтерия в молекуле, различают первичные и вторичные изотопные эффекты, опосредованные межмолекулярными взаимодействиями. В этом аспекте наиболее важными для структуры макромолекулы являются динамические короткоживущие водородные (дейтериевые) связи, формирующиеся между соседними атомами дейтерия (водорода) и гетероатомами кислорода, углерода, азота, серы и I)/) из окружающей среды, играющие главную роль в поддержании пространственной структуры макромолекул и в межмолекуляр-ных взаимодействиях. Другое важное свойство определяется пространственной структурой I)/), имеющей тенденцию сближать гидрофобные группы макромолекул, чтобы минимизировать их эффект на водородную (дейтериевую) связь в I)/). Поэтому структура макромолекул белков и нуклеиновых кислот в присутствии 1X0 стабилизируется [15].

Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что клетка реализует особые адаптивные механизмы, способствующие функциональной реорганизации работы жизненно важ-

ных систем в 1X0. Так, нормальному синтезу и функционированию в 1X0 таких жизненно важных соединений как нуклеиновые кислоты и белки способствует поддержание их структуры посредством формирования водородных (дейтериевых) связей в молекулах. Связи, сформированные атомами дейтерия, различаются по прочности и энергии от аналогичных водородных связей. Несколько большая прочность связи Б-О по сравнению с Н-0 обуславливает различия в кинетике реакций в 1X0 и Н,0. По теории абсолютных скоростей разрыв С-Н-связей происходит быстрее, чем С-Б-связей, подвижность иона I) меньше, чем подвижность Н+, константа ионизации 1X0 несколько меньше константы ионизации Н00 [6]. Эти факторы приводят к замедлению скоростей ферментативных реакций в 1X0 [16]. Однако существуют и такие реакции, скорость которых в 1X0 выше, чем в Н/). В основном, это реакции, катализируемые ионами Б(0 или 11,0 или ОБ и ОН .

Отмечено, что вследствие изотопных эффектов дейтерия в Б.,0 синтезируются молекулы с другими структурнофункциональными свойствами и активностью, чем молекулы, образованные с участием водорода. Они также могут стать причиной различий в синтезах нуклеиновых кислот, которые могут приводить к структурным и функциональным изменениям в клетке и её орга-неллах. Так, структурно-динамические свойства клеточной мембраны, которые в большинстве зависят от качественного и количественного состава липидов, также могут изменяться в присутствии 1X0. В клетках бактерий мембрана является одним из важнейших инструментов регуляции метаболизма, объединяя в себе аппараты биосинтеза полисахари-

дов, трансформации энергии, снабжения клетки питательными веществами и участвуя в биосинтезе белков, нуклеиновых кислот и липидов. Очевидно, при адаптации к 1X0 мембраны играют важную роль. Однако окончательно не выяснено, что происходит с мембранами, как они реагируют на замену Н+ на Б+ и какое это имеет значение для выживания клеток в Б^О-среде, лишенной протонов.

Сравнительный анализ липидного состава дейтерированных клеток хе-могетеротрофной бактерии В. полученных при росте в максимально дейтерированной Б^О-среде (ГС 1-среда), осуществлённый методом ВЭЖХ, показал существенные различия в количественном составе мембранных липидов по сравнению с липидами, полученными на обычной воде (рис. 2а, б). Характерно, что в образце, полученном в Б ,,0-среде, соединения, имеющие времена удерживания 33,38; 33,74; 33,26 и 36,03 мин, не детектируются (рис. 26). Полученный результат, по-видимому, объясняется тем, что клеточная мембрана является одной из первых органелл клетки, испытывающей воздействие 1X0, и тем самым компенсирует реалогические параметры мембраны (вязкость, текучесть, струк-турированность) изменением не только количественного, но и качественного состава липидов. Аналогичная ситуация наблюдалась и с разделением других природных соединений (белки, аминокислоты, углеводы), выделенных из дейтерированной биомассы с Б^О-среды.

Анализ аминокислот белковых гидролизатов и внутриклеточных углеводов, выделенных из клеток В. янЬНая, также выявил заметные различия в биосинтезе этих природных соединений в максимально дейтерированной 1X0-среде (ГС 1-среда). Белковый гидролизат

СО

Поглощение, 210 нч

І.1ІЧ *-Ж

IToriDiutiiHf, 210 нч

-Г.ЙІЇ -+.Ш2 *4713 1.Ы* I .(Чв

ш

В. виЫШв представлен пятнадцатью идентифицированными аминокислотами (за исключением пролина, который детектировался при /.=-140 нм) при выходах аминокислот, сопоставимых с потребностями используемых бактерий в источниках углерода и аминного азота (табл.

2). Индикатором, определяющим высокую эффективность включения дейтерия в белковый гидролизат, служат высокие

уровни дейтерированности молекул аминокислот, которые варьируют от 49% Б для лейцина/изолейцина до 97,5% Б для аланина.

Фракция внутриклеточных углеводов В. виЫШв при росте в максимально дейтерированной Б^О-среде (ГС 1-среда) в табл. 3 (нумерация приведена по последовательности их элюции с колонки) представлена моносахаридами (глюкоза,

Таблица 2

Аминокислотный состав белкового гидролизата В. зиЫШя, полученный с максимально дейтерированной среды', и уровни дейтерированности молекул

Аминокислота Выход, % от сухого веса 1 г биомассы Величина молекулярного иона производных аминокислот [М]+** Количество включенных атомов дейтерия в углеродный скелет молекулы"' Уровень дейтерирован ности молекул, % от общего количества атомов водорода' "'

Глицин 9,69 324 2 90,0

Аланин 13,98 340 4 97,5

Валин 3,74 369 4 50,0

Лейцин 7,33 383 5 49,0

Изолейцин 3,64 383 5 49,0

Фенилаланин 3,94 420 8 95,0

Тирозин 1,82 669 7 92,8

Серин 4,90 355 3 86,6

Треонин 5,51 не детектировался - -

Метионин 2,25 не детектировался

Аспарагин 9,59 396 2 66,6

Глутаминовая кислота 10,38 411 4 70,0

Лизин 3,98 632 5 58,9

Аргинин 5,27 не детектировался - -

Г истидин 3,72 не детектировался - -

Примечания:

' Данные получены на ГС1 среде с 99,8% Б20 и 2% гидролизатом дейтеро-биомассы В. теШуНсит.

“ Данные получены для метиловых эфиров Ы-(диметиламино)нафтален-1-сульфонил хлоридных (дансильных) производных аминокислот.

“ При подсчёте уровня дейтерированности протоны (дейтероны) при карбоксильных СООН- и амино ЫН2 группах молекул аминокислот не учитывались из-за лёгкости изотопного (Н-Б) обмена.

Прочерк означает отсутствие данных.

фруктоза, рамноза, арабиноза), дисахаридами (мальтоза, сахароза), а также четырьмя другими неидентифицированны-ми углеводами с временами удерживания 3,08 (15,63%); 4,26 (7,46%); 7,23 (И,72%) и 9,14 (7,95%) мин (не показаны). Выход глюкозы в дейтерированном образце составляет 21,4% от сухого веса, то есть выше, чем фруктозы (6,82%), рамнозы

емые изменения клеток при росте на О/ ) сопровождались изменениями физиологических и морфологических параметров клетки, а также соотношения синтезируемых белков, аминокислот, углеводов и липидов, по-видимому, обусловлены структурно-функциональной перестройкой в процессе адаптации к 1X0. Суммируя полученные данные, можно сделать

Таблица 3

Качественный и количественный состав внутриклеточных углеводов В. зиЫШя при росте в максимально дейтерированной среде' и уровни дейтерированности молекул

Углевод Содержание в биомассе, в % от сухого веса 1 г биомассы Уровни дейтерированности молекул, %

Протонированный образец (контроль) Образец, полученный в 99,8% 0,0

Глюкоза 20,01 21,40 80,6

Фруктоза 6,12 6,82 85,5

Рамноза 2,91 3,47 90,3

Арабиноза 3,26 3,69 90,7

Мальтоза 15,30 11,62 -

Сахароза 8,62 не детектировалась -

Примечания:

' Данные получены на ГС1 среде с 99,8% Б20 и 2% гидролизатом дейтеро-биомассы В. теЛуИсшп.

(3,47%), арабинозы (3,69%) и мальтозы (11,62%). Их выходы существенно не отличались от контроля вН,0,за исключением сахарозы, которая в дейтерированном образце не детектировалась (табл.

3). Уровни дейтерированности углеводов составили от 90,7% Б для арабинозы до 80,6% Б для глюкозы.

Выводы

Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что эффекты, наблюдаемые при клеточной адаптации к 1X0, относятся к комплексному многофакторному воздействию, влияющему на многие системы организма. Наблюда-

вывод, что чувствительности различных клеточных систем К ІХО отличны. С точки зрения физиологии, наиболее чувствительными к замене Н+ на Б+ являются аппарат биосинтеза и дыхательная цепь, т.е. именно те клеточные системы, которые используют высокую подвижность протонов и высокую скорость разрыва водородных связей. Последний факт позволяет рассматривать адаптацию к ІХО как к неспецифическому фактору, действующему одновременно на функциональное состояние большого числа систем: метаболизм, пути ассимиляции углеродных субстратов, биосинтетические процессы, структуру и функции макромолекул.

Нам представляется целесообразным выбор микроорганизмов в качестве биомоделей в этих исследованиях, поскольку они очень хорошо адаптируются к внешним условиям и способны выдерживать высокие концентрации П/) в ростовых средах.

Список литературы

1. Денько ЕМ. Действие тяжёлой воды О)/)) на клетки животных, растений и микроорганизмы II Усп. совр. биол. 1970. Т. 70. № 4. 41 с.

2. Ерёмин В А., Чекулаева Л.П. Выращивание бактерий Мюгососсш ^восЫкйсш на дейтерированной среде II Микробиология. 1978. Т. 14. С. 125-136.

3. Кишенбаум И. Тяжелая вода II В кн: Физические свойства и методы анализа: Пер. с англ. - М.: Атомиздат. 1953. 98 с.

4. Лобышев В.Н, Калиниченко Л.П.

Изотопные эффекты 1X0 в биологических системах. - М.: Наука. 1978. 215 с.

5. Мосин О.В., Складнее ДА., Швец В.И. Включение дейтерированных ароматических аминокислот в молекулу бактериородопсина 11а1оЬас1спит Ьа1оЬшт II Прикл. биохим. Микробиол. 1999. Т. 35. № 1. С. 34-42.

6. Мосин О.В., Складнее ДА., Швец

B.И. Исследование физиологической адаптации бактерий на тяжёловодородной среде II Биотехнология. 1999. № 8.

C. 16-23.

7. Мосин О.В., Складнее ДА., Швец

В.И. Методы получения белков и аминокислот, меченных стабильными изотопами 2Н, 13С и 15\ II Биотехнология. 1996. № 3. С. 12-32.

8. Мосин О.В. Дейтерий, тяжелая вода, эволюция и жизнь II Водоочистка, водоподготовка, водоснабжение. 2009. № 8. С. 64-70.

9. Мосин О.В., Игнатов И. Изотопные эффекты дейтерия в клетках бактерий и микроводорослей II Вода: химия и экология. 2012. № 3. С. 83-94.

10. Мосин О.В., Казаринова Л.А., Преображенская К.А., Складнее ДА., Чеботаев Д.В., Юркевич А.М., Швец В.И. Рост бактерии Bacillus subtilis на высокодейтерированной среде II Биотехнология. 1996. № 4. С. 19-27.

11. Мосин О.В., Складнее ДА., Егорова Т.А., Швец В.И. Масс-спектрометрическая оценка уровня включения 2Н и 13С в молекулы аминокислот бактериальных объектов II Биоорган. химия. 1996. Т. 22. № 10-11. С. 856-869.

12. Мосин О.В., Складнее Д.А., Егорова ТА., Юркевич А.М., Швец В.И. Изучение биосинтеза аминокислот штаммом Brevibacterium methylicum при росте на средах, содержащих тяжелую воду и дейтерометанол II Биотехнология. 1996. №3. С. 3-12.

13. Складнее ДА., Мосин О.В.Егорова Т.А., Еремин С.В., Швец В.И. Ме-тилотрофные бактерии - источники изотопномеченых 2Н- и 13С-аминокислот II Биотехнология. 1996. № 5. С. 25-34.

14. Стом ДМ., Пономарева АЛ., Вятчина О.Ф. Влияние воды с измененным количеством дейтерия на красного калифорнийского гибрида (Eusenia fetida Andrei Bouche) // Бюлл. ВСНЦ СО РАМН. 2006. Т. 6. № 52. С. 167-169.

15. Cioni P., Strambini G.B. Effect of Heavy Water on Protein Flexibility II Biophysical J. 2002. V. 82(6). P. 3246-3253.

16. Cleland W.N., O'Leary M.H, Northrop DD. Isotope Effects on Enzyme-Catalyzed Reactions. - Baltimore, London, Tokyo: University Park Press. 1976. 303 p.

17. Crespi H.L. Fully deuterated

microorganisms: tools in magnetic

resonance and neutron scattering. Synthesis and Applications of Isotopically Labeled Compounds II In: Proceedings of an International Symposium. Baillie T, Jones J.R eds. - Amsterdam: Elsevier. 1989. P. 329-332.

18. Kushner DJ., Baker A., Dunstall

T.G. Pharmacological uses and perspectives of heavy water and deuterated compounds II Can. J. Physiol. Pharmacol. 1999. V. 77(2). P. 79-88.

19. LeMaster DM. Uniform and selective deuteration in two-dimensional NMR studies of proteins II Ann. Rev. Biophys. Chem. 1990. V. 19. P. 243-266.

20. Lis G., Wassenaar I,.I., Hendry MJ. High-Precision Laser Spectroscopy D/H and 180/160 Measurements of Microliter Natural Water Samples II Anal. Chem. 2008. V. 80(1). P. 287-293.

21. MacCarthy P. Infrared spectroscopy of deuterated compounds: an undergraduate

experiment II J. Chem. Educ. 1985. V. 62(7). 633 p.

22. Mosin O.V., Karnaukhova EJS., Pshenichnikova A.B., Reshetova O.S. Electron impact mass-spectrometry in bioanalysis of stable isotope labeled bacteriorhodopsin II In: 6th Intern. Conf. on Retinal proteins. - Leiden, the Netherlands: Springer Verlag. 1994. 115 p.

23. Mosin O.V., Skladnev DA., Shvets V.I. Biosynthesis of 2H-labeled phenylalanine by a new methylotrophic mutant Brevibacterium methylicum

II Bioscience, biotechnology, and biochemistry. 1998. V. 62(2). P. 225-229.

24. Vertes A. Physiological effects of heavy water. Elements and isotopes: formation, transformation, distribution. -Dordrecht: KluwerAcad. Publ. 2004. 112 p.

Studying of isotopic effects of heavy water (D20) in biological systems on example of prokaryotic and eukaryotic cells

O. V. Mosin, I. Ignatov

Isotope effects of deuterium (D) in cells of various taxonomic groups of prokaryotic and eucaryotic microorganisms realizing methylotrophical, chemoheterotrophical, photoorganotrophical, and photosynthetic ways of assimilation of carbon substrates (methylotrophic bacteria, halobacteria, green microalgae) are investigated at growth on media with heavy water (D20). The method of step by step adaptation technique of cells to D20 is developed, consisting in plating of ctlls on 2% agarose nutrient media containing increasing gradient of concentration of D20 (from 0 up to 98% D20) and the subsequent selection of stable to D20 cells. Obtained from growth media with a low gradient of D20 concentration, cells were further transferred on growth media with higher gradient of D20 concentration, up to 98% D20. In the result of that technique it were obtained adapted to maximum concentration of D20 cells, biological material of which instead of hydrogen contained deuterium with levels of enrichment 95% D. Usage of cells adapted to D20 and deuterated natural compounds (protein, amino acids, nucleosides, pigments, carboxydrates, lipids), extracted from them, can find further application in biophysical researches and biomedical technologies.

Key words: deuterium, heavy water, adaptation, isotopic effects, bacteria, microalgae.

BnoMeAHi^HHa № 3,2012

50

Биомедицина • № З,2012, С. 51-62

Структурная реорганизация бедренной и большеберцовой артерий, малоберцового нерва и хряща коленного сустава при экспериментальных переломах костей голени у собак и их лечении методом чрескостного остеосинтеза

Н.А. Щудло, Т.Н. Варсегова, Т.А. Ступина, И.В. Борисова

ФГБУ «РНЦ «ВТО» им. акад. Г. А. Илизарова Минздравсоцразвития России», г. Курган Контактная информация: к.б.н. Варсегова Татьяна Николаевна varsln@mail.ru

У 18 взрослых беспородных собак моделировали оскольчатые переломы голени. Проведено комплексное гистологическое исследование с применением компьютерной морфометрии бедренных и передних большеберцовых артерий, поверхностного малоберцового нерва, хряща коленного сустава в разные сроки фиксации голени в аппарате Г. А. Илизарова (14, 21,35-37 и 48-50 суток), через 30 и 90 суток после снятия аппарата (80 и 140 суток эксперимента, соответственно). Признаки механического повреждения передней большеберцовой артерии выявлены в 22,2% опытов, повреждения малоберцового нерва - в 11,1% случаев. Установлено, что динамика изменений среднего диаметра передней большеберцовой артерии оперированной конечности, диаметра просвета и толщины её стенки зависела от интенсивности остеогенеза. Увеличение абсолютной величины морфометрических показателей наблюдается у животных с ускоренной консолидацией перелома (35-37 суток), при фиксации в аппарате в течение 48-50 дней все морфометрические показатели имели тенденцию снижения по сравнению с периодом 14-21 дней фиксации. Увеличение калибра и просвета артерий сопровождалось формированием дефектов внутренней эластической мембраны, протяжённость которых в поперечных срезах превышала 30% периметра лю-минальной поверхности. В опытах с отсутствием признаков механического повреждения малоберцового нерва выявлены изменения эпиневрия и периневрия, которые свидетельствуют об усилении структурно-функциональных характеристик периневрального барьера и гистогенезе структур, обеспечивающих механическую прочность нерва и поддержание гомеостаза среды микроокружения нервных волокон. В суставном хряще выявлены деструктивные изменения, выражающиеся разволокнением межклеточного вещества поверхностной зоны, гибелью части хондроцитов, снижением толщины хряща и численной плотности хондроцитов. Вплоть до 140 суток опыта репаративная регенерация хряща имела незавершённый характер. Полученные экспериментальные данные необходимы для разработки эффективных методов поддерживающей терапии и функциональной реабилитации пострадавших с переломами костей.

Ключевые слова: переломы, ремоделирование артерий, регенерация нервов, хряща.

Введение

Переломы большеберцовой кости печально известны как повреждения, которые «нечасто отбирают жизнь, но часто её меняют» [17]. Анатомические особенности голени предопределяют высокую частоту открытых переломов, создающих риск инвалидизирующих осложнений. Ранний остеосинтез аппаратом

Г. А. Илизарова признаётся методом выбора в лечении этих переломов, поскольку он обеспечивает оптимальные условия для костного сращения и восстановления утраченных функций [5, 8, 19]. Однако функциональная реабилитация таких пострадавших относится к трудным проблемам травматологии.

Принято считать, что главная причина