Разработка и применение нового метода изучения контракции (ретракции) сгустка крови

Оригинальные исследования

99

РАЗРАБОТКА И ПРИМЕНЕНИЕ НОВОГО МЕТОДА ИЗУЧЕНИЯ КОНТРАКЦИИ (РЕТРАКЦИИ) СГУСТКА КРОВИ

А.П. Ложкин 1 2 А.Д. Пешкова 1 Ф.И. Атауллаханов 34Р.И. Литвинов15

1 Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань, Россия

2 Межрегиональный клинико-диагностический центр», Казань, Россия

3 Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН, Москва, Россия

4 ООО «ГемаКор», Москва, Россия

5 Медицинский факультет Пенсильванского университета, Филадельфия, Пенсильвания, США

Development and applications of a new technique to study blood clot contraction

A.P. Lozhkin 12, A.D. Peshkova 1, F.I. Ataullakhanov 34, R.I. Litvinov15

1 Kazan (Volga region) Federal University, Kazan, Russia

2 Inter-Region Clinical Diagnostic Center, Kazan, Russia

3 Center for Theoretical Problems of Physico-Chemical Pharmacology, Moscow, Russia

4 HemaCore LLC, Moscow, Russia

5 University of Pennsylvania School of Medicine, Philadelphia, Pennsylvania, USA

Контракция (ретракция) кровяного сгустка* — это его самопроизвольное сжатие под действием сократительных белков тромбоцитов. Несмотря на важность этого процесса для гемостаза и тромбоза, его систематическое изучение затрудняется отсутствием количественных методов. Целью данной работы стала разработка и апробация нового аппаратного метода оценки контракции кровяного сгустка. Метод основан на оптической регистрации изменений объема кровяного сгустка во времени с использованием коммерческого «Регистратора тромбодинамики» (ГемаКор, Москва). В соответствии с протоколом цитратная кровь ре-кальцифицируется, активируется тромбином и помещается в кювету регистратора, который автоматически сканирует размер сгустка с последующим расчетом кинетических параметров поцесса.

Контракция кровяного сгустка имеет как минимум две фазы, отличающиеся по кинетике. Добавление Ca2+ (2—5 мМ) стабилизирует сгустки и предотвращает «выпадение» эритроцитов, тогда как в более высокой концентрации (10 мМ) Ca2+ частично ингибирует контракцию. Тромбин оказывает прямой дозозависимый эффект на скорость и полноту контракции. Подавление активности фактора XIIIa йодоацетамидом не влияет на образование сгустка, но существенно снижает скорость и степень контракции. Таким образом, можно считать, что разработан новый количественный метод изучения контракции кровяного сгустка, который позволяет охарактеризовать степень сжатия и кинетику процесса.

Ключевые слова: свертывание крови, фибрин,

тромбоцит.

Свертывание крови, или гемокоагуляция, является одним из главных механизмов гемостаза. Вместе с тромбоцитами свернувшаяся кровь образует в месте повреждения сосуда желеобразный сгусток препятствующий истечению крови. Однако эта защитная реакция при определенных условиях может стать причиной болезни и даже смерти. Такой патологический сгусток называется тромбом*, а процесс его формирования — тромбозом. Гемостаз и тромбоз — два противоположных по последстви-

Despite the importance for hemostasis and thrombosis, platelet-governed clot shrinkage has not been systematically studied, partially due to the lack of methodology to follow and quantify clot contraction dynamics. We have developed a new technique based on the continuous tracking of clot size. An optical platform for this method is the commercially available Thrombodynamics Analyser System (HemaCore, Russia). A standard procedure includes recalcification of whole citrated blood and addition of thrombin to initiate blood clotting and platelet activation. The clot contraction is monitored by taking images every 15 seconds over 20 minutes or more followed by off-line computational analysis that provides a kinetic curve characterized by 6 numerical parameters.

Clot contraction has at least two phases characterized by distinct rates. Exogenous Ca2+ is not indispensable for clot contraction to occur; however, the clots formed without addition of Ca2+ were less stable. Recalcification of blood with 2—5 mM [Ca2+] prevented the red blood cell fallout without an effect on the contraction kinetics. 10 mM [Ca2+] partially inhibited clot contraction. Iodoacetamide, an inhibitor of factor XIIIa, did not affect clot formation but abolished clot shrinkage, confirming that factor XIIIa is essential for clot contraction. Thrombin enhanced the rate and degree of clot contraction in a dose-dependent manner. Blood clot contraction was substantially delayed in patients on warfarin compared to healthy donors. We developed an accurate and simple assay for blood clot contraction which can be used for research and may be potentially useful for in vitro diagnostics.

Key words: blood clotting, fibrin, platelet function.

ям для здоровья и жизни результата свертывания крови [1].

Вскоре после образования желеобразный сгусток крови начинает уменьшаться в объеме; этот процесс получил название ретракции или контракции**. В процессе контракции сгустка in vitro из него «отжимается» сыворотка крови. Значение контракции сгустка in vivo не вполне выяснено, однако принято считать, что оно способствует гемостазу за счет стягивания краев раны, а также восстанавливает

* Приводимое суждение (термин) является точкой зрения авторского коллектива — примеч. ред.

** Сознавая, что 1) термины «контракция» и «ретракция» очень близки по значению и 2) выражение «ретракция кровяного сгустка» и в русскоязычной, и в англоязычной литературе используется чаще, чем «контракция кровяного сгустка», авторы, тем не менее, считают, что вполне однозначный термин «контракция» (стягивание, сжимание, сжатие) более точно отражает феномен самопроизвольного уменьшения объема сгустка крови, чем термин «ретракция», который имеет множественные толкования.

е-mail: litvinov@mail.med.upenn.edu

Гены & Клетки Том IX, № 3, 2014

100

Оригинальные исследования

кровоток в обход внутрисосудистого сгустка или тромба [2, 3].

Контракция ссгустка осуществляется за счет активного сокращения активированных тромбоцитов, которые прилипают к нитям фибрина, образующим трехмерный вязкоэластический каркас, и натягивают их. Основным сократительным белком тромбоцитов является немышечный миозин IIA [4]. Сила сокращения, которую развивают тромбоциты в свертке, может достигать 1500—4500 дин/см2 [2]. Прикрепление тромбоцитов к фибрину осуществляется через интегриновый рецептор aIIbp3 (прежнее название GPIIb/IIIa), который, в свою очередь, прочно связан с подвижными белками цитоскелета [5, 6]. Электронная микроскопия показала, что контракция сгустка сопровождается образованием ядра из сжатых, плотно упакованных эритроцитов в форме многогранника, или полиэдра, названных поэтому полиэдроцитами (polyhedrocytes). Кроме того, в процессе контракции происходит перераспределение тромбоцитов и фибрина на поверхность сгустка в результате сложных биохимических и биомеханических взаимодействий между тромбоцитами, сетью волокон фибрина и эритроцитами [7].

Контракцию можно визуально наблюдать in vitro по уменьшению объема сгустка свежесвернувшей-ся крови. Поскольку движущей силой контракции сгустка являются тромбоциты, этот процесс можно использовать как тест для характеристики их количества и функционального состояния. Снижение или отсутствие контракции сгустка описано при болезни Верльгофа, тромбоцитопении, эритремии, тромбастении Гланцмана и других тромбоцитопатиях. Помимо тромбоцитов, контракция сгустка может зависеть от других компонентов крови, таких как фибрин(-оген), про- и антикоагулянты, комплемент, антитела и другие.

Несмотря на научную важность и потенциальную диагностическую ценность этого явления, систематическое изучение контракции кровяного сгустка не получило широкого распространения, прежде всего из-за несовершенства существуюших методов регистрации и оценки этого процесса. Степень контракции в подавляющем большинстве исследований, сравнительно не многочисленных, рассчитывается очень примерно по отношению объема выделившейся сыворотки к объему взятой крови. Не удивительно, что при этом нормальные показатели степени контракции плохо сопоставимы, очень разнородны и колеблются, по разным источникам, от 20 до 80%. Приборные методы, позволяющие количественно оценивать кинетику контракции сгустков крови, нам не известны.

Целью данного исследования стала разработка простого и объективного аппаратного метода регистрации и количественной оценки контракции кровяного сгустка. В качестве апробации метода, он был использован для изучения зависимости кинетики контракции кровяного сгустка от концентрации ионов кальция, активности тромбина и фактора ХШа. Возможность клинико-диагностического применения метода оценивалась на образцах крови здоровых людей и больных на фоне приема антикоагулянтов непрямого действия. В результате этой работы разработан новый способ регистрации и количественной характеристики контракции кровяного сгустка на основе «Регистратора тромбодинамики» — прибора, который создан и производится российской

компанией «ГемаКор» для изучения свертывающей системы крови. Метод основан на оптической регистрации изменений объема кровяного сгустка во времени с последующим автоматическим расчетом целого ряда кинетических параметров поцесса. Это позволяет использовать контракцию сгустка in vitro крови как количественный высокоинформативный тест для интегральной оценки гемостатического потенциала крови.

Материал и методы

Исследуемая кровь. Образцы крови 67 условно здоровых человек и 11 пациентов, принимавших антикоагулянты непрямого действия (варфарин), получены согласно требованиям этического комитета ГАУЗ «Межрегиональный клинико-диагностический центр» (Казань). Лабораторный контроль за применением варфарина проводился с использованием протромбинового времени, значения МНО находились в интервале 1,57—3,32. Кровь брали венепункцией в вакутейнеры с 3,2% цитратом натрия BD Vacutainer (Becton, Dickinson and Co., США) и смешивали в соотношении 9:1 по объему. Образцы крови хранили при комнатной температуре и использовали не позднее 4 ч после взятия. Контрольные исследования показали, что хранение крови до 5 ч не оказывало влияния на параметры контракции кровяного сгустка и другие лабораторные показатели.

Клинико-лабораторные исследования крови. Коа-гулограмму определяли с применением автоматизированного коагулометра Sysmex CA-1500 (Sysmex, Канада). Для оценки состояния свертывающей системы крови использовали активированное частичное тромбопластиновое время, протромбиновое время с расчетом международного нормализованного отношения (МНО), тромбиновое время и уровень фибриногена по методу Клаусса. Для гематологических измерений применяли вакуумные пробирки с ЭДТА BD Vacutainer (Becton, Dickinson and Co., США). Подсчет количества тромбоцитов и оценку гематокрита осуществляли на автоматизированном гематологическом анализаторе ABX Pentra 60 (Horiba, Япония).

Прибор для оптической регистрации динамики сгустка крови. «Регистратор тромбодинамики» был изначально разработан для видеорегистрации направленного свертывания крови и ее компонентов в пространстве [8, 9]. Прибор оснащен термостатом, в который помещается двухканальная плоская измерительная кювета размером 12x7x1 мм с исследуемым образцом крови или плазмы. Кювета освещается красными источниками и фиксируется цифровой видеокамерой в рассеянном свете (рис. 1A). Система управления прибором позволяет варьировать частоту сканнирования и общее время регистрации. Конструкция позволяет применять данную систему для фиксации не только роста, но и сжатия кровяного сгустка. На рис. 1Б показаны образцы изображений сгустка крови до, в процессе и по окончании процесса контракции. На рис. 1В представлена типичная кривая кинетики контракции кровяного сгустка.

Оценка кинетики контракции кровяного сгустка. Чтобы предотвратить прилипание сгустка крови к стенкам кюветы и сделать возможным его спонтанное сжатие, перед исследованием внутреннюю поверхность пластиковой кюветы ополаскивали 4 об% раствором тритона X-100 на 150 мМ

Гены & Клетки Том IX, № 3, 2014

Оригинальные исследования

101

хлориде натрия с последующим тщательным удалением видимых остатков детергента. К 0,4 мл цитратной крови добавляли 0,4 М хлорида кальция до конечной концентрации 2 мМ, 5 мМ или 10 мМ. Для образования сгустка и активации тромбоцитов к 0,4 мл рекальцифицированной цитратной крови добавляли свежеразмороженный раствор тромбина (50 U/мл, Sigma, США) до конечной концентрации 0,1 U/мл, 0,5 U/мл или 1 U/мл, тщательно перемешивали и сразу переносили 80 /лл образца в измерительную кювету. Кювету помещали в предварительно прогретую до 37°С термостатируемую камеру прибора «Регистратор Тромбодинамики Т2» (ГемаКор, Москва) и включали автоматическую фоторегистрацию. Прибор фиксировал двумерные изображения сгустка (12x7 мм) каждые 15 с в течение 20 мин.

Программная обработка данных. Для построения кинетической кривой контракции и расчета параметров применяли специальную программу, которая

определяет площадь сгустка (сумму пикселей с надпороговой интесивностью) в каждом изображении и представляет его как долю от площади исходного (не сжатого) сгустка. Рассчитывали следующие параметры: 1) конечная степень контракции сгустка (%) — величина, отражающая разницу между начальной и конечной площадью сгустка в процентах; 2) лаг-период — время, необходимое для уменьшение площади сгустка менее 95% от исходной; 3) время, за которое сгусток сжимается до 1/4 от исходного размера; 4) время достижения 1/2 от конечного размера; 5) площадь под кривой; 6) средняя скорость контракции, определенная как разница исходного и конечного процента контракции на единицу времени. Пример кинетической кривой и ее параметры показаны на рис. 1В.

Статистический анализ. Статистический анализ осуществляли с использованием программного пакета GraphPad Prism 5.

А

Цифровая

фотокамера

Осветитель

Б

Кювета

Сгусток

В

О мин

10 мин

20 мин

Рис. 1.

А — схема устройства для оптической регистрации контракции сгустка крови;

Б — изображения сгустка крови на разных стадиях контракции;

В — типичная кинетическая кривая контракции сгустка крови и ее параметры: 1 — лаг-период;

2 — время, за которое сгусток сжимается до 1/4 от исходного размера;

3 — время достижения 1/2 от конечного размера;

4 — площадь под кривой;

5 — конечная площадь сгустка в процентах от начальной, определяет конечную степень контракции сгустка

Результаты

Влияние ионов кальция на контракцию кровяного сгустка. Изучение зависимости контракции кровяного сгустка от концентрации ионов Ca2+ проводилось параллельно на одних и тех же образцах крови (n = 25) в одинаковых условиях, с добавлением 1 U/мл тромбина, но с разным количеством внесенного хлорида кальция. Варьирование [Ca2+] от 0 до 10 мМ показало, что для контракции кровяного сгустка искусственная рекальцификация не обязательна. Тем не менее, без экзогеного Ca2+ сгустки были не стабильны, что проявлялось «выпадением» эритроцитов из сгустка в процессе контракции в 32% случаев. При добавлении Ca2+ в концентрациях 2 мМ и 5 мМ значительных изменений кинетики контракции в сравнении с контролем (без добавления

Ca2+) не происходило, хотя сгустки были стабильны (рис. 2). Более высокая концентрация Ca2+ (10 мМ) вела к частичному ингибированию процесса, а именно: к достоверному снижению средней скорости и степени контракции. Исходя из этих данных, концентрация Ca2+ 2 мМ была признана оптимальной и использовалась во всех последующих экспериментах.

Влияние тромбина на контракцию кровяного сгустка. Зависимости контракции кровяного сгустка от активности тромбина также изучалась параллельно на одних и тех же образцах крови (n = 11) в одинаковых условиях, с добавлением 2 мМ хлорида кальция, но с разным количеством внесенного тромбина. Как и следовало ожидать, контракция кровяного сгустка прямо зависела от концентрации вносимого тромбина (рис. 3).

Гены & Клетки Том IX, № 3, 2014

102

Оригинальные исследования

Рис. 2. Влияние различных концентраций ионов кальция на параметры контракции сгустка крови: А — степень контракции сгустка через 20 мин после инициации свертывания тромбином;

Б — лаг-период; В — время, за которое сгусток сжимается до 1/4 от исходного размера;

Г — время достижения 1/2 от конечного размера; Д — площадь под кривой; Е — средняя скорость контракции. Точки представляют собой единичные измерения. Положение горизональной линии соответствует среднему арифметическому. Звездочкой обозначены статистически достоверные различия средних значений

Рис. 3.

Влияние тромбина на параметры контракции сгустка крови:

А — степень контракции сгустка через 20 мин после инициации свертывания тромбином;

Б — лаг-период;

В — время, за которое сгусток сжимается до 1/4 от исходного размера;

Г — время достижения 1/2 от конечного размера;

Д — площадь под кривой;

Е — средняя скорость контракции. Точки представляют собой единичные измерения. Положение горизональной линии соответствует среднему арифметическому. Звездочкой обозначены статистически достоверные различия средних значений

Тромбин в концентрации 0,1 U/ml был недостаточно активен для инициации свертывания крови и образования полноценного сгустка в 5 образцах крови из 11. В диапазоне концентраций 0,5—1 U/мл, достаточных для образования полноценного сгустка, был обнаружен дозозависимый эффект тромбина на скорость и степень контракции. Наиболее чувствительными к стимулирующему действию тромбина оказались такие параметры, как конечная степень контракции сгустка, площадь под кривой и средняя скорость контракции.

Влияние активности фактора Xllla на контракцию кровяного сгустка. Известно, что образующийся при свертывании крови фибрин подвергается ковалентной сшивке фактором XIIIa, активной трансглутами-назой, которая образуется под действием тромбина из неактивного фактора XIII. Чтобы установить, влияет ли ковалентная сшивка фибрина на стабильность и контракцию кровяного сгустка, мы исследовали этот процесс в отсутствие и в присутствии йодо-

ацетамида, алкилирующего агента, который ингибирует трансглутаминазную активность фактора XIIIa (рис. 4). Установлено, что внесение йодоацетамида не влияет на образование сгустка, но значительно снижает скорость и степень контракции по таким параметрам, как конечная степень контракции сгустка; время, за которое сгусток сжимается до 1/4 от исходного размера; площадь под кривой и средняя скорость контракции.

Контракция кровяного сгустка на фоне действия варфарина. Варфарин относится к группе непрямых антикоагулянтов, подавляющих синтез витамин К-зависимых факторов свертывания крови, зависящих от посттрансляционного у-карбоксилирования остатков глутаминовой кислоты. Варфарин широко применяется в клинике для профилактики тромбоза, т. к. существенно снижает способность крови к свертыванию. Снижается ли при этом вызываемая тромбоцитами контракция кровяного сгустка, не известно. Для ответа на этот вопрос мы исследовали

Гены & Клетки Том IX, № 3, 2014

Оригинальные исследования

103

контракцию сгустка крови, полученной у здоровых людей и пациентов, принимавших варфарин. Параллельно определяли состояние свертывающей системы крови, а также количество тромбоцитов и гематокрит. В образцах крови пациентов, полу-

чавших варфарин, не было признаков пониженной свертываемости крови или тромбоцитопении в сравнении с группой контроля, однако скорость и степень контракции были значительно снижены (рис. 5).

Рис. 4. Влияние йодоацетамида (И), ингибитора фактора XIIIa, на параметры контракции сгустка крови по сравнению с контролем (К):

А — степень контракции сгустка через 20 мин после инициации свертывания тромбином;

Б — лаг-период;

В — время, за которое сгусток сжимается до 1/4 от исходного размера;

Г — время достижения 1/2 от конечного размера;

Д — площадь под кривой;

Е — средняя скорость контракции.

Точки представляют собой единичные измерения. Положение горизонтальной линии соответствует среднему арифметическому.

Звездочкой обозначены статистически достоверные различия средних значений

Рис. 5.

Параметры контракции сгустка, образованного из крови здоровых людей (К) и пациентов, принимающих варфарин (В):

А — степень контракции сгустка через 20 мин после инициации свертывания тромбином;

Б — лаг-период;

В — время, за которое сгусток сжимается до 1/4 от исходного размера;

Г — время достижения 1/2 от конечного размера;

Д — площадь под кривой;

Е — средняя скорость контракции.

Точки представляют собой единичные измерения. Положение горизональной линии соответствует среднему арифметическому.

Звездочкой обозначены статистически достоверные различия средних значений

Обсуждение

Контракция кровяного сгустка — это последняя, заключительная стадия свертывания крови, предшествующая ферментативному растворению сгустка (фибринолизу). Контракция сгустка представляет многосторонний интерес. Во-первых, это важный процесс in vivo, от него существенно зависит эффективность гемостаза и заживления ран. Во-вторых, сжатие внутрисосудистого сгустка может иметь клиническое значение и определять течение и исход тромбоза. Здесь важны как минимум два механизма: восстановление кровотока в обход сжатого тромба и плохая проницемость уплотненного сгустка или тромба, снижающая чувствительность к тромболитической терапии. В-третьих, контракция кровяного сгустка in vitro является интегральным тестом для оценки гемостатического и тромбогенного потенци-

ала крови и может использоваться для исследовательских и клинико-диагностических целей. Лабораторное изучение контракции сгустка крови упирается в отсутствие адекватных методов регистрации и количественной оценки процесса. Разработка и апробация нового метода изучения контракции кровяного сгустка составили цель и задачи настоящей работы.

Идея метода основана на оптической регистрации изменяющегося объема сгустка крови в процессе контракции. Обычно для этих целей используют фотоаппарат и демонстрируют снимки сгустка до и после сжатия, оценивая на глаз соотношение объемов сгустка и сыворотки [10, 11]. Помимо технических неудобств, субъективности и неточности при определении степени контракции сгустка, такой подход не предусматривает возможность изучения динамики процесса и определения кинетических параметров.

Гены & Клетки Том IX, № 3, 2014

104

Оригинальные исследования

Наш метод предполагает динамическую регистрацию размеров сгустка и построение кинетической кривой, параметры которой характеризуют не только полноту сжатия сгустка, но и дополнительные показатели, указывающие на фазность и скорость реакции. Для динамической фоторегистрации размера сгустка мы предлагаем использовать прибор «Регистратор тромбодинамики», который изначально предназначен для изучения пространственного свертывания крови и ее компонентов [8, 9]. Этот прибор производится серийно московской компанией «ГемаКор» и разрешен к применению в клиникодиагностических лабораториях России, что делает наш метод доступным для широкого круга врачей и исследователей.

Визульное исследование кинетики сжатия сгустка крови позволило впервые обнаружить, что процесс не монотонен и состоит как минимум из двух фаз с разной скоростью (см. рис. 1В). Этот феномен нуждается в дальнейшем изучении, однако, вполне возможно, он отражает две стадии фосфорилирования миозина IIA, обнаруженные в процессе контракции сгустка крови [12].

Предлагаемый метод оказался пригодным для решения конкретных задач, связанных с изучением механизмов контракции кровяного сгустка. В частности, наши результаты свидетельствуют о том, что Ca2+ в концентрации 2—5 мМ механически стабилизирует сгусток и снижает «выпадение» из него эритроцитов в процессе контракции (см. рис. 2). Феномен экструзии эритроцитов из сгустка в процессе сжатия является неожиданной находкой и описан в литературе совсем недавно [11]. Вполне вероятно, что стабилизирующий эффект Ca2+ обусловлен активностью фактора XIIIa, образование которого из неактивного фактора XIII зависит от присутствия Ca2+ [13].

Значение поперечной сшивки фибрина под действием фактора XIIIa для контракции сгустка было показано ранее. Например, степень контракции тромбоцитарного сгустка, полученного из богатой тромбоцитами плазмы мышей с дефицитом фактора XIIIa, была значительно снижена в сравнении с контролем [10]. Мы также установили, что подавление трансглутаминазной активности фактора XIIIa снижало скорость и степень контракции кровяного сгустка (см. рис. 4). Эти данные подтверждают важность активности фактора XIIIa для протекания полноценной контракции сгустка в цельной крови.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Undas A., Robert A.S. Fibrin clot structure and function: A role in the pathophysiology of arterial and venous thromboembolic diseases. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2011; 31(12): e88-99.

2. Carr M.E. Development of platelet contractile force as a research and clinical measure of platelet function. Cell Biochem. Biophys. 2003; 38(1): 55-78.

3. Leon C., Eckly A., Hechler B. et al. Megakaryocyte-restricted MYH9 inactivation dramatically affects hemostasis while preserving platelet aggregation and secretion. Blood 2007; 110(9): 3183-9.

4. Johnson G.J., Leis L.A., Krumwiede M.D. et al. The critical role of myosin IIA in platelet internal contraction. J. Thromb. Haemost. 2007; 5(7): 1516-29.

5. Bodin S., Soulet C., Tronchere H. et al. Integrin-dependent interaction of lipid rafts with the actin cytoskeleton in activated human platelets. J. Cell. Sci. 2005; 118(4): 759-69.

6. Podolnikova N.P., Yakovlev S., Yakubenko V.P. et al. The interaction of integrin aIIbp3 with fibrin occurs through multiple binding sites in the aIIb р-propeller domain. J. Biol. Chem. 2014; 289(4): 2371-83.

7. Cines D.B., Lebedeva T., Nagaswami C. et al. Clot contraction:

compression of erythrocytes into tightly packed polyhedra and redistribution of platelets and fibrin. Blood 2014; 123(10):

1596-603.

Имеются сообщения о чувствительности тромбоцитов не только к антиагрегантным препаратам, но и антикоагулянтам. К примеру, контрактильная сила тромбоцитов значительно подавлялась не только применением аспирина и блокаторов интегрина aIIbp3, но и гепарина [2]. Чтобы проверить предположение о возможном влиянии приема антикоагулянтов непрямого действия на контракцию кровяного сгустка, нами проанализированы образцы крови пациентов, принимавших варфарин. Оказалось, что показатели скорости и степени контракции у данной группы пациентов значительно ниже (см. рис. 5), что свидетельствует о подавлении процесса варфарином. Что касается предполагаемого механизма влияния варфарина на контракцию сгустка, то одним из наиболее вероятных является снижение генерации эндогенного тромбина, который, наряду с экзогенным, в нашей тест-системе выполняет двоякую функцию: образует из фибриногена фибрин и активирует тромбоциты. Результаты, показывающие прямую зависимость контракции сгустка от концентрации тромбина (см. рис. 3), подтверждают такую возможность. Кроме того, данное наблюдение согласуется с прямой зависимостью контрактильной силы тромбоцитов от концентрации тромбина [14].

Таким образом, разработан новый метод изучения контракции кровяного сгустка, основанный на использовании коммерческого прибора для оптической регистрации размеров сгустка в процессе сжатия. Анализ получаемых изображений позволяет охарактеризовать кинетику процесса контракции по ряду количественных параметров. Предлагаемый метод упешно апробирован для решения ряда научных и прикладных задач. Показана зависимость контракции сгустков крови от концентрации Ca2+, тромбина и активности фактора XIIIa. Кроме того, обнаружено снижение способности к контракции сгустка у пацентов на фоне лечения непрямыми антикоагулянтами, что позволяет рекомендовать предлагаемый метод для лабораторного контроля за антикоагулянтной терапией и для оценки гемостатического потенциала в целом.

Благодарности

Работа выполнена в рамках государственной программы повышения конкурентоспособности Казанского (Приволжского) федерального университета среди ведущих мировых научно-образовательных центров.

8. Soshitova N.P., Karamzin S.S., Balandina A.N. et al. Predicting prothrombotic tendencies in sepsis using spatial clot growth dynamics. Blood Coagul Fibrinolysis 2012; 23(6): 498-9.

9. Lipets E., Vlasova O., Urnova E. et al. Circulating contact-pathway-activating microparticles together with factors IXa and XIa induce spontaneous clotting in plasma of hematology and cardiologic patients. Plos One. 2014; 9(1): e87692.

10. Kasahara K., Souri M., Kaneda M. et al. Impaired clot retraction in factor XIII A subunit-deficient mice. Blood 2010; 115(6): 1277-9.

11. Aleman M.M., Bymes J.R., Wang J.G. et al. Factor XIII activity mediates red blood cell retention in venous thrombi. J. Clin. Invest. 2014; 124(8): 3590-600.

12. Egot M., Kauskot A., Lasne D., (et al.). Biphasic myosin II light chain activation during clot retraction. Thromb. Haemost. 2013; 110(6) 1215-22.

13. Hornyak T.J., Shafer J.A. Role of calcium ion in the generation of factor XIII activity. Biochemistry. 1991; 30(25): 6175-82.

14. Liang X.M., Han S.J., Reems J.-A., (et al.). Platelet retraction force measurements using flexible post force sensors. Lab. Chip. 2010; 10(8): 991-8.

Поступила: 02.08.2014

Гены & Клетки Том IX, № 3, 2014