СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ЛИМФОГЕННОГО МЕТАСТАЗИРОВАНИЯ ПРИ ИНВАЗИВНОЙ КАРЦИНОМЕ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОГО ТИПА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
METHOD FOR PREDICTION OF LYMPHATIC CANCER SPREAD ACCOMPANYING NON-SPECIFIC BREAST CARCINOMA

Изобретение относится к области медицины, конкретно к онкологии, и касается способов прогнозирования лимфогенного метастазирования при инвазивной карциноме неспецифического типа молочной железы.
В настоящее время одним из общепризнанных параметров, ассоциированных с частотой лимфогенного метастазирования при раке молочной железы, является размер опухоли. Известно, что по мере увеличения размера новообразования риск метастатического поражения возрастает. Так, при размере новообразования более 5 мм частота регионарного метастазирования увеличивается до 46%, опухоли менее 5 мм метастазируют в 18% [1, 2].
Гистологическим параметром, связанным с риском лимфогенного метастазирования, принято считать степень злокачественности, определяемую по модифицированной схеме P. Scarff, Н. Bloom и W. Richardson на основании степени тканевой и клеточной атипии (образование тубулярных и протокоподобных структур, число митозов и клеточный полиморфизм) [3]. Степень злокачественности отражается на частоте регионального метастазирования, так при первой степени злокачественности лимфогенное метастазирование наблюдается в 21%, при второй - в 44%, при третьей - в 33% [4]. Другим гистологическим параметром, связанным с риском лимфогенного метастазирования, является опухолевая эмболия в сосудах новообразования [5, 6].
Наиболее близким к настоящему способу прогнозирования лимфогенного метастазирования при раке молочной железы является способ, предложенный Ермиловой В.Д. с соавт. Суть этого способа основывается на определении уровня экспрессии Her2/neu иммуногистохимическим методом. При этом уровень экспрессии данного маркера оценивается полуколичественно по характеру, интенсивности мембранной реакции и пропорции иммунопозитивных клеток. Неr2/nеu негативными считаются случаи с отсутствием или слабым прерывистым окрашиванием менее чем в 30% клеток (0) или со слабым прерывистым мембранным окрашиванием более чем в 30% клеток (1+). Случаи с умеренным непрерывным мембранным окрашиванием более чем в 30% клеток или интенсивным непрерывным мембранным окрашиванием менее чем в 10% клеток считаются «сомнительными» (2+). Her2/neu позитивными считаются опухоли с непрерывным мембранным окрашиванием более чем в 30% клеток (3+). Установлено, что Неr2/nеu позитивные новообразования (3+) обладают склонностью к более частому метастатическому поражению регионарных лимфатических узлов [7].
Недостатком этого способа является достаточно частое обнаружение случаев с «сомнительной» (2+) экспрессией, требующей дополнительного выявления наличия амплификации гена HER2/neu методом FISH или CISH /SISH.
Новый технический результат - повышение точности и информативности при упрощении способа.
Для решения поставленной задачи в способе прогнозирования лимфогенного метастазирования при инвазивной карциноме неспецифического типа молочной железы проводят иммуногистохимическое исследование препаратов ткани первичной опухоли. На основании иммуногистохимического исследования определяют процент экспрессии нефосфорилированной формы молекулярного шаперона Hsp27 в ядре опухолевых клеток, также учитывают состояние менструальной функции пациентки, размер первичной опухоли и степень ее злокачественности, рассчитывают значение уравнения регрессии Y по формуле
1
2
3
4
Y=(24+12X-39,9Х-33,1Х+47,7X),
где Y - значение уравнения регрессии;
(24) - значение коэффициента регрессии свободного члена;
1
X - состояние менструальной функции пациентки (1 - сохранена; 2 - менопауза),
(12) - значение коэффициента регрессии этого признака;
2
Х - размер первичной опухоли (1 - до 2 см; 2 - 2-5 см; 3 - более 5 см),
(-39,9) - значение коэффициента регрессии этого признака;
3
Х - степень злокачественности (1 - низкая; 2 - умеренная; 3 - высокая),
(-33,1) - значение коэффициента регрессии этого признака;
4
X - наличие экспрессии нефосфорилированной формы молекулярного шаперона Hsp27 в ядре опухолевых клеток (1 - нет; 2 - есть),
(47,7) - значение коэффициента регрессии этого признака.
Y
Y
Значение вероятности развития лимфогенных метастазов рассчитывают по формуле Р=e/(1+e),
где Р - значение вероятности развития признака;
е - математическая константа, равная 2,72.
При Р≥50% прогнозируют высокий, а при Р<50% - низкий риск развития лимфогенных метастазов.
Способ осуществляют следующим образом.
Макроскопической оценке подвергают ткань первичной опухоли и все удаленные лимфатические узлы.
Материал фиксируют в 10-12% растворе нейтрального формалина. Проводку материала и изготовление гистологических препаратов осуществляют по стандартной методике. Препараты окрашивают гематоксилином и эозином. Гистологический тип рака устанавливают согласно рекомендациям ВОЗ, Женева, 2012.
Степень злокачественности оценивают по модифицированной схеме P. Scarff, H. Bloom и W. Richardson. Для определения степени злокачественности исследуют 3 гистологических параметра, каждый из которых оценивают в баллах от 1 до 3: количество тубулярных и протоковых структур (>75% - 1 балл, >10<75% - 2 балла, <10% - 3 балла), число митозов (<10 в 10 полях зрения - 1 балл, >10<20 - 2 балла, >20 - 3 балла), клеточный полиморфизм (клетки одного размера и формы, мелкие, с дисперсным распределением хроматина, без ядрышек - 1 балл, небольшой полиморфизм ядер, некоторое укрупнение клеток - 2 балла, ядра крупные различной формы с одним или несколькими ядрышками, с грубым хроматином - 3 балла). На основании суммы баллов 3 параметров определяют степень злокачественности (3-5 баллов - низкая степень, 6-7 баллов - умеренная степень, 8-9 баллов - высокая степень злокачественности).
Иммуногистохимическое исследование осуществляют по стандартной методике с использованием моноклональных антител Anti-Hsp27 antibody (клон G3.1, рабочее разведение 1:500, Abcam, ab5579). Отмечают наличие экспрессии Hsp27. Экспрессию оценивают по процентному содержанию позитивно окрашенных ядер клеток на 1000 клеток в 10 полях зрения при большом увеличении микроскопа (×400). Также учитывают состояние менструальной функции пациентки, размер первичной опухоли и степень ее злокачественности. Рассчитывают значение уравнения регрессии Y по формуле
1
2
3
4
Y=(24+12X-39,9Х-33,1Х+47,7X),
где Y - значение уравнения регрессии;
(24) - значение коэффициента регрессии свободного члена;
1
X - состояние менструальной функции пациентки (1 - сохранена; 2 - менопауза),
(12) - значение коэффициента регрессии этого признака;
2
Х - размер первичной опухоли (1 - до 2 см; 2 - 2-5 см; 3 - более 5 см),
(-39,9) - значение коэффициента регрессии этого признака;
3
Х - степень злокачественности (1 - низкая; 2 - умеренная; 3 - высокая),
(-33,1) - значение коэффициента регрессии этого признака;
4
Х - наличие экспрессии нефосфорилированной формы молекулярного шаперона Hsp27 в ядре опухолевых клеток (1 - нет; 2 - есть),
(47,7) - значение коэффициента регрессии этого признака.
Y
Y
Значение вероятности развития лимфогенных метастазов определяют по формуле Р=e/(1+e),
где Р - значение вероятности развития признака;
е - математическая константа, равная 2,72.
При Р≥50% прогнозируют высокий, а при Р<50% низкий риск развития лимфогенных метастазов.
Hsp27 (HspB1) является одним из представителей малых белков теплового шока (small heat shock proteins, sHsp), который ранее был изучен как р29, srp27 и р24 [8]. Основными функциями Hsp27 является фолдинг, мисфолдинг и рефолдинг белков. Шаперон Hsp27 влияет на регуляцию множества внутриклеточных процессов. Так, Hsp27 защищает клетки от запуска апоптоза, препятствуя образованию апоптосомы и нарушая активацию каспаз, участвует в балансе «спокойного» состояния и интенсивного роста опухоли, принимает участие в регуляции эпителиально-мезенхимального перехода и др. [9, 10, 11, 12]. В настоящее время шаперон Hsp27 рассматривают в качестве молекулярного маркера рака молочной железы [10, 13, 14].
Сущность предлагаемого способа иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Больная Т., 56 лет, с инвазивной карциномой неспецифического типа молочной железы, в менопаузе (2), с размером опухоли 1,5 см (1), со второй степенью злокачественности (2), с наличием экспрессии нефосфорилированной формы молекулярного шаперона Hsp27 в ядре опухолевых клеток (2).
Рассчитывали значение уравнения регрессии Y:
Y=24+12×2-39,9×1-33,1×2+47,7×2=37,3.
Y
Y
37,3
37,3
Значение вероятности развития лимфогенных метастазов определяли по формуле Р=e/(1+e)=2,72/(1+2,72)=0,99.
Таким образом, вероятность развития лимфогенных метастазов составила 99%. В операционном материале в исследованных аксиллярных лимфатических узлах определялось метастатическое поражение.
Пример 2. Больная К., 65 лет, с инвазивной карциномой неспецифического типа молочной железы, в менопаузе (2), с размером опухоли 1,5 см (1), с первой степенью злокачественности (1), с отсутствием экспрессии нефосфорилированной формы молекулярного шаперона Hsp27 в ядре опухолевых клеток (1).
Рассчитывали значение уравнения регрессии Y
Y=24+12×2-39,9×1 -33,1×1+47,7×1=22,7.
Y
Y
22,7
22,7
Значение вероятности развития лимфогенных метастазов определяли по формуле Р=e/(1+e)=2,72/(1+2,72)=0,01.
Вероятность развития лимфогенных метастазов составила 1%. В операционном материале в исследованных аксиллярных лимфатических узлах метастатического поражения обнаружено не было.
Предлагаемый способ основан на анализе результатов клинических наблюдений, данных морфологического и иммуногистохимического исследования биопсийного и операционного материала.
Изучался биопсийный материал от 36 больных инвазивной карциномой неспецифического типа молочной железы стадии T1-3N0-3M0. Средний возраст больных составил 49,1±8,5 лет. Больные не получали неоадъювантной терапии. Операция выполнялась в объеме радикальной мастэктомии или радикальной резекции молочной железы.
Макроскопической оценке подвергалась ткань первичной опухоли и все удаленные аксиллярные лимфатические узлы.
Материал фиксировали в 10-12% растворе нейтрального формалина. Проводка материала и изготовление гистологических препаратов осуществляли по стандартной методике. Препараты окрашивали гематоксилином и эозином. Гистологический тип рака устанавливали согласно рекомендациям ВОЗ, Женева, 2012.
Степень злокачественности оценивали по модифицированной схеме P. Scarff, H. Bloom и W. Richardson. При этом учитывали количество тубулярных и протоковых структур, число митозов и клеточный полиморфизм.
Иммуногистохимическое исследование осуществляли по стандартной методике с использованием моноклональных антител Anti-Hsp27 antibody (клон G3.1, рабочее разведение 1:500, Abcam, ab5579). Отмечали наличие экспрессии Hsp27. Экспрессию оценивали по процентному содержанию позитивно окрашенных ядер клеток на 1000 клеток в 10 полях зрения при большом увеличении микроскопа (×400).
Статистическую обработку результатов выполняли с помощью пакета программ «Statistica 6.0 for Windows». Обсуждали результаты с достоверностью различий при р<0,05, и с тенденцией при р<0,1.
Для предсказания риска развития лимфогенных метастазов использовали метод логистической регрессии. Была определена формула
1
2
3
4
Y=(24+12Х-39,9Х-33,1Х+47,7X),
где Y - значение уравнения регрессии;
(24) - значение коэффициента регрессии свободного члена;
1
X - состояние менструальной функции пациентки (1 - сохранена; 2 - менопауза), (12) - значение коэффициента регрессии этого признака;
2
Х- размер первичной опухоли (1 - до 2 см; 2 - 2-5 см; 3 - более 5 см),
(-39,9) - значение коэффициента регрессии этого признака;
3
Х - степень злокачественности (1 - низкая; 2 - умеренная; 3 - высокая),
(-33,1) - значение коэффициента регрессии этого признака;
4
Х - наличие экспрессии нефосфорилированной формы молекулярного шаперона Hsp27 в ядре опухолевых клеток (1 - нет; 2 - есть),
(47,7) - значение коэффициента регрессии этого признака.
Y
Y
Значение вероятности развития лимфогенных метастазов определяли по формуле Р=e/(1+e), где Р - значение вероятности развития признака, е - математическая константа, равная 2,72.
При вероятности Р≥50% определяется высокий риск развития лимфогенных метастазов, а при вероятности Р<50% - низкий риск развития лимфогенных метастазов.
2
Модель имеет высокую степень достоверности (х=34,3; р=0,00000). Чувствительность 100%, специфичность 90%.
При анализе частоты возникновения лимфогенных метастазов от признаков, вошедших в прогностическую модель, оказалось, что метастатическое поражение регионарных лимфатических узлов чаще возникало у больных с более крупными опухолями, размеры которых варьировали в пределах от 2 до 5 см, а также при наличии ядерной экспрессии нефосфорилированной формы молекулярного шаперона Hsp27 в ткани опухоли, что показано в табл. 1, 2 и на фигуре 1, где изображена ядерная локализация нефосфорилированной формы шаперона Hsp27 в опухолевых клетках инвазивной карциномы неспецифического типа молочной железы (указана стрелкой) на основании применения метода иммуногистохимического окрашивания с использованием моноклональных антител Anti-Hsp27 (клон G3.1, рабочее разведение 1:500).
Кроме того, обнаруживалась зависимость лимфогенного метастазирования от процента клеток с позитивной ядерной экспрессией Hsp27. В случаях с метастатическим поражением регионарных лимфатических узлов процент был выше (табл. 3). Изолированно, вне прогностической модели, связи лимфогенного метастазирования с состоянием менструальной функции и со степенью злокачественности опухоли обнаружено не было (табл. 4, 5).
Таким образом, предлагаемый способ позволяет с большей точностью и информативностью прогнозировать развитие лимфогенных метастазов при инвазивной карциноме неспецифического типа молочной железы и оптимизировать тактику ведения таких больных.
Источники информации, принятые во внимание
1. Завьялова М.В. Зависимость лимфогенного метастазирования от морфологического строения первичного опухолевого узла при уницентическом инфильтрирующем протоковом раке молочной железы у больных с разным состоянием менструальной функции / М.В. Завьялова, В.М. Перельмутер, Е.М. Слонимская, С.В. Вторушин / Сибирский онкологический журнал. - 2008. - №3 (27). - С. 5-9.
2. Page D.L. Prognosis and breast cancer. Recognition of lethal and favourable prognostic types / D. L. Page // The American journal of surgical pathology. -1991. - Vol. 15. - P. 334-346.
3. Ганцев Ш.Х. Онкология: учебник для студентов медицинских вузов. - 2-е изд., испр. и доп. - М.: ООО «Медицинское информационное агентство», 2006. - 488 с.
4. Elston C.W. Pathological prognostic factors in breast cancer. I. The value of histological grade in breast cancer: experience from a large study with long term follow up / C.W. Elston, I.O. Ellis // Histopathology. - 1991. - Vol. 19. - P. 403-410.
5. 3анкин B.B., Лазаревский M.M., Кометова B.B. Клинико-морфологические факторы прогноза (на примере рака молочной железы) // Тезисы научно-практической конференции «Модниковские чтения». Ульяновский государственный университет. 2009. Режим доступа:  (дата обращения 14.05.2014).
6. Mascarel I. D2-40 in breast cancer: should we detect more vascular emboli? /I. Mascarel, G. MacGrogan, M. Debled, G. Sierankowski1, V. Brouste, S. Mathoulin-Pélissier, L. Mauriac // Modern Pathology. - 2009. - Vol. 22. - P. 216-222.
7. Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей человека / под ред. С.В. Петрова, Н.Т. Райхлина. - 4-е изд., перераб. и доп. - Казань, 2012. 624 с.
8. Ciocca D.R.; Luque, Е.Н. Immunological evidence for the identity between the Hsp27 estrogen-regulated Heat-Shock Protein and the P29 estrogen receptor-associated protein in breast and endometrial cancer / D.R. Ciocca, E.H. Luque // Breast Cancer Research and Treatment. - 1991. - Vol. 20, №1. - P. 33-42.
9. Кайгородова E.В. Молекулярные механизмы регуляторного влияния белка теплового шока 27 кДа на апоптоз опухолевых клеток // Бюллетень сибирской медицины. - 2011. - Т. 10. №4. - С. 71-76.
10. Straume О. Suppression of heat shock protein 27 induces long-term dormancy in human breast cancer / O. Straume, T. Shimamura, M.J. Lampa, J. Carretero, A.M. Oyan, D. Jia, C.L. Borgman, M. Soucheray, S.R. Downing, S.M. Short, et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. - 2012. - Vol. 109. N. 22. - P. 8699-8704.
11. Wei L. Hsp27 participates in the maintenance of breast cancer stem cells through regulation of epithelial-mesenchymal transition and nuclear factor-kappa В / L. Wei, T.T. Liu, Н.H. Wang, H.M. Hong, A.L. Yu, H.P. Feng, W.W. Chang // Breast Cancer Res. - 2011. - Vol. 13. - R101.
12. Arrigo A.P., Gibert, B. HspB1, HspB5 and HspB4 in Human Cancers: Potent Oncogenic Role of Some of Their Client Proteins // Cancers (Basel). - 2014. - Vol. 6. N. 1. - P. 333-365.
13. Targeting heat shock protein 27 (HspB1) interferes with bone metastasis and tumour formation in vivo / B. Gibert, B. Eckel, V. Gonin, D. Goldschneider, J. Fombonne, B. Deux, P. Mehlen, A-P. Arrigo, P. Clézardin, C. Diaz-Latoud // Br. J. Cancer. - 2012. - Vol. 107, №1. - P. 63-70.
14. Upregulated HSP27 in human breast cancer cells reduces Herceptin susceptibility by increasing Her2 protein stability / Kang SH, Kang KW, Kim KH, Kwon B, Kim SK, Lee HY, Kong SY, Lee ES, Jang SG, Yoo B.C. // BMC Cancer. - 2008. Oct 4;8:286. doi: 10.1186/1471-2407-8-286.
Таблица 1. Частота лимфогенного метастазирования при инвазивной карциноме неспецифического типа в зависимости от размера опухоли.
Таблица 2. Частота лимфогенного метастазирования при инвазивной карциноме неспецифического типа в зависимости от наличия экспрессии нефосфорилированной формы молекулярного шаперона Hsp27 в ядре опухолевых клеток.
Таблица 3. Процент экспрессии нефосфорилированной формы молекулярного шаперона Hsp27 в ядре опухолевых клеток в зависимости от наличия лимфогенного метастазирования при инвазивной карциноме неспецифического типа.
Таблица 4. Частота лимфогенного метастазирования при инвазивной карциноме неспецифического типа в зависимости от состояния менструальной функции.
Таблица 5. Частота лимфогенного метастазирования при инвазивной карциноме неспецифического типа в зависимости от степени злокачественности.
Таблица 1
Размер опухоли
Наличие лимфогенных метастазов
Нет (N0)
Есть (N+)
До 2 см
14/24 (58%)
1/12 (8%)
2-5 см
10/24 (42%)
11/12 (92%)
χ2=8,2; р=0,004
Таблица 2
Наличие экспрессии нефосфорилированной формы молекулярного шаперона Hsp27 в ядре опухолевых клеток
Наличие лимфогенных метастазов
p
Нет (N0)
Есть (N+)
Нет
18/24 (75%)
6/12 (50%)
0,07
Есть
6/24 (25%)
6/12 (50%)
0,07
Таблица 3
Наличие лимфогенных метастазов
Процент экспрессии молекулярного шаперона Hsp27(M±SD)
Нет (N0)
0,5±1,1 (n=24)
Есть (N+)
5,5±11,6 (n=12)
F=4,4; р=0,04
Таблица 4
Состояние менструальной функций
Наличие лимфогенных метастазов
Нет (N0)
Есть (N+)
сохранена
5/24 (21%)
3/12 (25%)
менопауза
19/24 (79%)
9/12 (75%)
χ2=0,08; р=0,77
Таблица 5
Степень злокачественности
Наличие лимфогенных метастазов
Нет (N0)
Есть (N+)
первая
2/24 (8%)
1/12 (8%)
вторая
19/24 (79%)
10/12 (84%)
третья
3/24 (13%)
1/12 (8%)
χ2=0,06; р=0,96