МЕТОДЫ АСИММЕТРИЧНОЙ ПЦР

1. Способ получения одноцепочечных ампликонов ДНК с помощью асимметричной полимеразной цепной реакции (ПЦР), включающий стадии:
(а) воздействия на исходную смесь на первой стадии термоциклирования в условиях амплификации ПЦР, причем указанная исходная смесь содержит:
(i) образец нуклеиновой кислоты;
(ii) пару асимметричных праймеров,
(iii) термостабильную ДНК-полимеразу, и
(iv) реагенты ПЦР,
где первая стадия термоциклирования включает чередование по меньшей мере трех температур, а именно:
m
(1) первой температуры выше T целевой нуклеиновой кислоты, предназначенной для денатурации,
m
(2) второй температуры ниже T неудлиненного праймера для отжига праймера, и
(3) третьей температуры, подходящей для удлинения с помощью термостабильной ДНК-полимеразы,
тем самым формируя промежуточную смесь, которая включает ампликоны ДНК, удлиненные как от неудлиненного праймера, так и от удлиненного праймера, если нуклеиновая кислота-мишень присутствует в образце;
(б) воздействия на промежуточную смесь на второй стадии термоциклирования, причем указанная вторая стадия термоциклирования включает чередование:
m
(1) четвертой температуры выше T двухцепочечных ампликонов ДНК для денатурации,
(2) пятой температуры, которая
m
(i) ниже T удлиненного праймера,
m
(ii) выше T неудлиненного праймера и
(iii) применима для удлинения с помощью термостабильной ДНК-полимеразы,
таким образом получают итоговую смесь, включающую одноцепочечные ампликоны ДНК, если в образце присутствует нуклеиновая кислота-мишень.
2. Способ по п. 1, в котором стадии (а) предшествует период начальной денатурации, в котором необязательно начальную денатурацию осуществляют при первой температуре.
3. Способ по п. 1, в котором за стадией (б) следует период дополнительного удлинения, необязательно в котором дополнительное удлинение осуществляют при пятой температуре.
4. Способ по п. 1, в котором первая и четвертая температуры равны и/или третья и пятая температуры равны.
5. Способ по п. 1, в котором область «В» удлиненного праймера является комплементом инвертированного повтора по меньшей мере части области «А» или комплементом прямого повтора по меньшей мере части области «А».
6. Способ по п. 1, в котором неудлиненный праймер не имеет удлинения с 5'-конца или имеет удлинение с 5'-конца из 3 нуклеотидов или менее.
7. Способ по п. 1, в котором удлиненный праймер содержит область «С», которая необязательно одна или в комбинации с нуклеотидами фланкирующей области «А» и/или «В», образует сайт распознавания для эндонуклеазы рестрикции.
m
m
8. Способ по п. 1, в котором T удлиненного праймера больше, чем T неудлиненного праймера по меньшей мере на 8°С.
m
m
9. Способ по п. 1, в котором T области «А» удлиненного праймера и T неудлиненного праймера варьируют не более чем на 3°С.
10. Способ по п. 1, в котором
(а) первая температура равна 95°С;
(б) вторая температура равна 58°С;
(в) третья температура равна 72°С;
(г) четвертая температура равна 95°С;
(д) пятая температура равна 72°С;
(е) какая-либо комбинация (а)-(д).
11. Способ по п. 1, в котором ампликоны ДНК, удлиненные как от неудлиненного праймера, так и от удлиненного праймера в промежуточной смеси гибридизируются друг с другом с образованием двухцепочечных ампликонов ДНК.
12. Способ по п. 1, в котором образец нуклеиновой кислоты является образцом исследуемой нуклеиновой кислоты.
13. Способ по п. 1, в котором образец нуклеиновой кислоты является образцом контрольной нуклеиновой кислоты.
14. Способ по п. 1, в котором реакция является множественной ПЦР.
15. Способ по п. 1, в котором ПЦР осуществляют в отсутствие универсального праймера.
16. Способ по п. 1, в котором первая стадия приводит к экспоненциальной амплификации обеих цепей нуклеиновой кислоты-мишени и/или вторая стадия приводит к линейной амплификации одной цепи нуклеиновой кислоты-мишени.
17. Способ по п. 1, в котором пара асимметричных праймеров включает последовательности, комплементарные бактериальным последовательностям или грибным последовательностям ДНК.
18. Способ по п. 1, в котором образец является биологическим образцом, который необязательно является:
(а) кровью или образцом, переработанным, экстрагированным или фракционированным из нее;
(б) перитонеальной диализированной жидкостью или образцом, переработанным, экстрагированным или фракционированным из нее;
(в) мочой или образцом, переработанным, экстрагированным или фракционированным из нее;
(г) мокротой или образцом, переработанным, экстрагированным или фракционированным из нее;
(д) отделяемым из раны или образцом, переработанным, экстрагированным или фракционированным из этого материала.
19. Способ по п. 1, в котором образец является образцом из окружающей среды.
20. Способ по п. 1, который дополнительно включает обнаружение одноцепочечного ампликона ПЦР.