ШТАММ БАКТЕРИЙ PSEUDOMONAS AUREOFACIENS ДЛЯ ЗАЩИТЫ И УЛУЧШЕНИЯ РОСТА РАСТЕНИЙ, РАСТУЩИХ НА ПОЧВАХ, ЗАГРЯЗНЕННЫХ ПОЛИЦИКЛИЧЕСКИМИ АРОМАТИЧЕСКИМИ УГЛЕВОДОРОДАМИ
STRAIN OF BACTERIA PSEUDOMONAS AUREOFACIENS FOR PROTECTION AND IMPROVEMENT OF GROWTH OF PLANTS, GROWING ON SOILS, POLLUTED WITH POLYCYCLIC AROMATIC HYDROCARBONS

Изобретение относится к микробиологической промышленности и биотехнологии и касается нового бактериального штамма Pseudomonas aureofaciens ВКМ В-2391 Д, обладающего способностью подавлять рост фитопатогенных грибов родов Gaeumannomyces, Fusarium, Rhizoctonia, и способного к деградации полициклических ароматических углеводородов (ПАУ), который может быть использован для получения бактериального препарата для защиты растений от фитопатогенных грибов, токсичного воздействия ПАУ и для очистки почв от полиароматических углеводородов.
Свойство ризосферных микроорганизмов улучшать рост растений является очень важным для фиторемедиационных технологий, направленных на очистку почв от токсичных органических соединений с помощью растений и ассоциированной с растением микрофлорой.
Известно, что гибель и угнетение роста растений при загрязнении может происходить как из-за токсического действия на них вещества-загрязнителя, так и вследствие сильного повреждения растений фитофагами и фитопатогенными грибами (Киреева Н.А., Бакаева М.Д., А. М. Мифтахова. Литическая активность микромицетов нефтезагрязненных почв как один из факторов фитотоксичности. Агрохимия, №9, сентябрь 2006, с.75-81). Было показано, что при загрязнении почвы нефтепродуктами и ПАУ изменяется состав микробной популяции с доминированием фитопатогенных грибов (Назаров А.В., Иларионов С.А. Потенциал использования микробно-растительного взаимодействия для биоремедиации. Биотехнология. 2005. №5. С.54-62).
ПАУ являются приоритетными загрязнителями вследствие своего повсеместного распространения и отрицательного влияния на живые организмы. Они образуются в результате неполного сгорания органических соединений, пиролитических процессов, в результате разлива и переработки нефти и нефтепродуктов, уничтожения бытовых отходов (A.L.Juhasz, R.Naidu. Bioremediation of high molecular weight PAHs: a review of the microbial degradation of benzo[a]pyrene. International Biodeterioration and Biodegradation. 2000. 45. P.57-88).
Известен штамм бактерий Pseudomonas sp. ЦМПМ В-348, используемый для получения препарата при защите злаковых от возбудителя обыкновенной корневой гнили Helminthosporium sativum (Авторское свидетельство СССР 1464468, кл. A01N 63/00, 1988).
Однако этот штамм неэффективен для подавления корневой гнили злаков, вызываемой комплексом грибов Fusarium spp. и Helminthosporium sativum.
Известен штамм бактерий Pseudomonas putida ВКМ В-1743 Д, подавляющий рост грибов рода Fusarium, и предназначенный для получения препарата, используемого для стимуляции роста растений и защиты растений от грибных патогенов (Патент RU 1805849, кл. A01N 63/00, 1993).
Недостатком штамма является узкий спектр антагонистического действия.
Известен штамм бактерий Pseudomonas species B-696, проявляющий антагонистическую активность к фитопатогенным грибам Alternaria spp., Bipolaris sorokiniana, Fusarium oxysporum, Fusarium gibbosum, Fusarium sumbucinum, и препарат на его основе, используемый для стимуляции роста и защиты растений от фитопатогенных микроорганизмов (Патент RU 2130261, кл. A01N 63/00, C12N 1/20, 1999).
Однако отсутствуют сведения о действии этого штамма на такие широко распространенные возбудители болезней растений, как Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium nivale, Fusarium semitectum, Fusarium solani.
Кроме того, в указанных патентах отсутствуют сведения о способности штаммов антагонистов деградировать ПАУ.
Известны штаммы бактерий: Pseudomonas putida 9 (Патент RU 2134722, кл. C12N 1/20, 1999), Pseudomonas stutzeri MEV-S1 (Патент RU 2228952, кл. C12N 1/20, 20.05.2004) и Pseudomonas alcaligenes MEV (Патент RU 2228953, кл. C12N 1/20, 20.05.2004), используемые для очистки почв, грунтовых и поверхностных вод от нефти и продуктов ее переработки.
Данные штаммы утилизируют нефть, нефтепродукты (мазут, дизельное топливо), полициклические ароматические углеводороды, в том числе нафталин и фенантрен.
Однако отсутствуют сведения об антагонистическом действии этих штаммов на фитопатогенные грибы.
В качестве прототипа выбран штамм бактерий Pseudomonas aureofaciens ИБ 51, проявляющий антагонистическую активность по отношению к фитопатогенным грибам Alternaria alternata, Bipolaris sororiniana, Fusarium oxysporum, Fusarium gibbosum, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium nivale, Fusarium oxysporum, Fusarium semitectum, Fusarium solani, Penicillium funiculosum (Патент RU 2203945, кл. C12N 1/20, 2003.05.10).
Однако отсутствуют сведения о действии этого штамма на такой широко распространенный возбудитель заболевания корней пшеницы как Gaeumannomyces graminis var. tritici.
Кроме того, во всех перечисленных аналогах и прототипе нет сведений о способности штаммов улучшать рост растений, растущих на почвах, загрязненных ПАУ.
Задачей изобретения является выделение нового природного штамма бактерий, используемого для защиты растений от фитопатогенных грибов, токсичного воздействия ПАУ и для очистки почв от полиароматических углеводородов.
Техническим эффектом, который может быть получен при использовании предлагаемого штамма, является его способность деградировать ПАУ и улучшать рост растений на почвах, загрязненных ПАУ.
Поставленная задача достигается выявлением и использованием бактериального штамма Pseudomonas aureofaciens OV17.
Штамм выделен из ризосферы растений овса, растущих на загрязненной нефтепродуктами почве Западной Сибири.
Штамм Pseudomonas aureofaciens OV17 депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ им. Г.К.Скрябина РАН под номером ВКМВ-2391Д.
Он характеризуется следующими признаками.
Культурально-морфологические признаки.
Клетки подвижные, палочковидные, с полярными жгутиками, грамотрицательные, спор не образуют.
2
4
4
2
2
4
2
4
4
4
2
Штамм хорошо растет на следующих средах: LB (бакто-триптон 10 г/л, дрожжевой экстракт 5 г/л, хлористый натрий 10 г/л, рН 7,2), Кинг Б (пептон 20 г/л, КHPO 1,5 г/л, MgSO×7HO 1,5 г/л, глицерин 10 мл/л,), триптозо-соевом агаре (триптозо-соевый экстракт 30 г/л), минеральной синтетической среде М9 (NaHPO 6 г/л, КНPO 3 г/л, NHCl 1 г/л, NaCl 0,5 г/л, 1М MgSO 2 мл, 1М CaCl 1 мл, глюкоза 2 г/л, ), минимальной синтетической среде М9 с нафталином 1-2 г/л в качестве единственного источника углерода и энергии.
Морфологию колоний на питательных средах определяли после 4-5 сут роста при 28°С.
На LB - круглые с ровными краями, гладкие, слабовыпуклые, непрозрачные, оранжевые, не слизистой консистенции колонии, диаметр 4-5 мм, пигмент желто-оранжевый, диффундирующий в среду.
На триптозо-соевом агаре колонии крупнее, интенсивнее окрашены, более интенсивная диффузия в среду пигмента.
На Кинг Б - колонии желто-зеленые, флюоресцирующие, пигмент интенсивный, зеленый, флюоресцирующий, со временем приобретает желто-оранжевую окраску.
На М9 с нафталином - колонии округлые, слабовыпуклые, непрозрачные, матово-белые.
Физиолого-биохимические признаки.
Облигатный аэроб, температурный оптимум роста 24-30°С, растет при 4°С, растет в пределах рН среды от 5,2 до 8,0. В дополнительных факторах роста не нуждается (прототроф). Разжижает желатин.
В качестве источника углерода использует глюкозу, сахарозу, декстрозу, глицерин, бензойную кислоту, янтарную кислоту, салициловую кислоту, нафталин, фенантрен, 2-метил-нафталин.
Устойчивость к антибиотикам.
Штамм проявляет устойчивость к стрептомицину (100 мкг/мл), триметоприму (100 мкг/мл), гентамицину (10 мкг/мл), карбеницилину (500 мкг/мл). Чувствителен к канамицину (100 мкг/мл), хлорамфениколу (100 мкг/мл), гентамицину (20 мкг/мл), тетрациклину (10 мкг/мл), карбеницилину (1000 мкг/мл).
Генетические признаки.
+
+
Содержит природную плазмиду деградации ПАУ размером около 90 т.п.н., Р-9 группы несовместимости. Плазмида достаточно стабильно поддерживается в штамме. На 6 сутки культивирования штамма в неселективных условиях фенотипический признак NahPhe определяется в 90% популяции штамма.
Штамм не обладает фитопатогенной активностью, о чем свидетельствует отсутствие мацерации на ломтиках картофеля при нанесении на них уколом живых клеток штамма.
Штамм бактерий Pseudomonas aureofaciens BKM В-2391 Д хранят на чашках или косяках со средами LB или Кинг Б при 4-7°С. Пересевы на свежие среды - один раз в месяц. Может храниться не более 4 месяцев на минимальной синтетической среде М9, не менее 1 года в 15% глицерине при -20°С, не более 10 лет под вазелиновым маслом в полужидкой среде следующего состава: питательный бульон (Difco, США) 4 г/л, NaCl 5 г/л, агар 6 г/л, рН 6,8.
Штамм бактерий Pseudomonas aureofaciens BKM В-2391 Д угнетает рост следующих фитопатогенных грибов: Gaeumannomyces graminis var. tritici штамм 1818, Gaeumannomyces graminis var. tritici штамм 119(2), Gaeumannomyces graminis var. tritici штамм PIT, Fusarium oxysporum, Fusarium graminearum, Fusarium maniliforum, Fusarium geterosporum, Rhizoctonia solani.
Штамм бактерий Pseudomonas aureofaciens BKM В-2391 Д может быть использован для улучшения роста растений на почвах, загрязненных ПАУ, путем подавления развития фитопатогенных грибов и уменьшения токсичного воздействия ПАУ в результате их деградации штаммом.
Пример 1. Получение биомассы бактериального штамма Pseudomonas aureofaciens BKM В-2391 Д.
9
Штамм выращивают в течение 24 ч при 24-30°С с аэрацией до титра 10 КОЕ/мл на среде LB следующего состава, г/л: пептон 10,0; дрожжевой экстракт 5,0; натрий хлористый 10,0; вода водопроводная до 1 л. При необходимости суспензию клеток разводят водой до необходимого титра.
Пример 2. Антагонистическая активность штамма Pseudomonas aureofaciens BKM В-2391 Д в отношении фитопатогенных грибов из родов Gaeumannomyces, Fusarium и Rhizoctonia.
Штамм бактерий Pseudomonas aureofaciens BKM В-2391 Д выращивают в жидкой среде LB 18ч. На чашку Петри с агаризованной средой Каннера сеют 5 мкл бактериального штамма Pseudomonas aureofaciens BKM В-2391 Д (пятном диаметром 5 мм на расстоянии 3-3,5 см от центра чашки) и выращивают в течение 2 суток для достижения полного синтеза вторичных метаболитов. Затем в центр чашки Петри на поверхность питательного агара помещают сегмент мицелия (диаметром 9 мм) грибного штамма. Мицелий для этого эксперимента выращивают на глюкозо-картофельном агаре при комнатной температуре в течение 7 суток.
Чашки Петри заклеивают парафильмом для поддержания необходимой влажности и инкубируют при комнатной температуре в течение 5-10 суток, после чего визуально оценивают наличие зоны подавления роста патогенов (таблица 1).
Из таблицы 1 следует, что бактериальный штамм Pseudomonas aureofaciens BKM В-2391 Д ингибирует, в той или иной степени, все используемые в данном эксперименте фитопатогенные грибы.
Пример 3. Способность бактериального штамма Pseudomonas aureofaciens BKM В-2391 Д расти на различных ПАУ.
Кинетику роста бактериального штамма Pseudomonas aureofaciens BKM В-2391 Д при утилизации различных ПАУ изучают в периодической культуре на жидкой минеральной среде М9 (Перт С.Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. М. «Мир». 1978. С.14-33). Рост микроорганизмов контролируют путем измерения оптической плотности ростовой среды, для чего через определенные интервалы роста культур (2-12 часов) отбирают пробы культуральной жидкости. Измерения оптической плотности проводят на UV-160A спектрофотометре (Shimadzu, Япония), при длине волны 540 нм и толщине кюветы 0,5 см.
Удельную скорость роста (µ) вычисляют по формуле:
0
µ=ln(x/x)/t,
0
где x - оптическая плотность культуры в начальный момент времени t=0, x -оптическая плотность культуры, измеренная через определенный промежуток времени; t - время роста культуры, через которое измеряют оптическую плотность.
Качественный анализ метаболитов, накапливающихся в культуральной жидкости при росте на различных ароматических соединениях, проводят методом тонкослойной хроматографии.
Культуральную жидкость предварительно освобождают от микроорганизмов и механических примесей центрифугированием (5000 g, 10 мин). 4 мл супернатанта переносят в пробирки для экстракции с плотной крышкой. Экстракцию проводят равным объемом хлороформа в кислых условиях при рН 2 при интенсивном встряхивании. Хлороформенную фазу выпаривают до 15-20 мкл и используют для хроматографии. Применяют пластинки Silufol UV 254 и систему растворителей гексан:этилацетат:уксусная кислота (10:3:1).
3
Для идентификации метаболитов пластинки опрыскивают 3% раствором FeCl, специфически окрашивающим фенольные соединения.
Результаты представлены в таблице 2.
Наилучшие параметры роста наблюдаются у штамма Pseudomonas aureofaciens BKM В-2391 Д при использовании нафталина и салицилата как единственных источников углерода и энергии. Низкие скорости роста на других ПАУ возможно связаны с их слабой растворимостью в воде (растворимость фенантрена составляет 1,29 мг/л).
Пример 4. Удельная активность ключевых ферментов деградации нафталина у бактериального штамма Pseudomonas aureofaciens BKM В-2391 Д.
Определение активностей ферментов проводят в бесклеточных экстрактах. Для этого штамм выращивают на синтетической среде М9 с нафталином 2 г/л в качестве единственного источника углерода и энергии. Клетки осаждают центрифугированием (5000 g, 0°C, 10 мин), дважды отмывают 0,05М калий-фосфатным буфером рН 7,0. Отмытые клетки ресуспендируют в 4 мл 0,05М калий-фосфатного буфера рН 7,0, замораживают и разрушают на ИБФМ-прессе (Россия) (7 атм). После дезинтеграции клеточный дебрис и неразрушенные клетки удаляют центрифугированием (32000 g, 0°С, 60 мин).
Супернатант немедленно используют в качестве клеточного экстракта для определения активностей ферментов. В реакционную смесь с конечным объемом 3 мл вносят 100-200 мкл экстракта. Определение активностей проводят при 30°С, начиная реакцию внесением клеточного экстракта, на UV-160A спектрофотометре (Shimadzu, Япония).
-1
-1
Активность нафталин диоксигеназы определяют спектрофото-метрически по уменьшению экстинкции NADH реакционной смеси, содержащей 100 мкМ NADH и 100 мкМ нафталина (спиртовой раствор), бесклеточный экстракт и 0,05М фосфатный буфер рН 7,5, учитывая эндогенное потребление NADH бесклеточным экстрактом (λ=340 нм, ε=6,220 мМ см) (Dua D. and Meera S. 1981. Purification and characterization of naphthalene oxygenase from Corynebacterium renale. Eur. J. Biochem. 120 (3), 461-465).
-1
-1
Активность салицилат гидроксилазы определяют спектрофотометрически по уменьшению экстинкции NADH реакционной смеси, содержащей 100 мкМ NADH и 100 мкМ салицилат, бесклеточный экстракт и 0,05 М фосфатный буфер рН 7,5, учитывая эндогенное потребление NADH бесклеточным экстрактом (λ=340 нм, ε=6,220 мМ см) (Shamsuzzaman K.M. and Barnsley E.A. 1974. The regulation of naphthalene catabolism in pseudomonads. Biochem. Biophys. Res. Communs. 60, 582-587).
-1
-1
Активность катехол-2,3-оксигеназы определяют по скорости образования 2-гидроксимуконового полуальдегида в реакционной смеси, содержащей 0,5 мМ катехола, бесклеточный экстракт и 0,05 М Трис-HCl буфер рН 7,5 (λ=375 нм, ε=33,4 мМ см) (Feist C.F. and Hegeman G.D. 1969. Phenol and benzoate metabolism by Pseudomonas putida of tangential pathways. J. Bacteriol. 100 (2), 869-877).
-1
-1
Активность катехол-1,2-оксигеназы определяют по скорости образования цис-цис-муконата, в реакционной смеси, содержащей 5 мМ Na ЭДТА, 1 мМ катехола, бесклеточный экстракт, 0,05 М фосфатный буфер рН 7,0 (λ=260 нм, ε=16,9 мМ см) (Hegeman G.D. 1966. Synthesis of the enzymes of the mandelate pathway by Pseudomonas putida. Synthesis of enzymes by the wild type. J. Bacteriol. 91, 1140-1154).
Удельную активность ферментов выражают в микромолях потребленного кофактора или образующегося продукта в минуту на 1 мг общего бактериального белка. Определение концентрации белка проводят спектрофотометрически (Kalb V.F., Bernlohr R.W. 1977. A new spectrophotometric assay for protein in cell extract. Anal. Biochem. 82, 362).
Полученные значения, представленные в таблице 3, показывают, что в штамме Pseudomonas aureofaciens BKM В-2391 Д имеются активности всех ключевых ферментов деградации нафталина. Высокая активность катехол-2,3-оксигеназы свидетельствует о расщеплении катехола по мета-пути, и, как следствие этого, о способности данного штамма утилизировать метилированные производные нафталина и салицилата.
Пример 5. Способность штамма бактерий Pseudomonas aureofaciens BKM В-2391 Д деградировать нафталин и улучшать рост растений в стерильном микровегетационном эксперименте.
8
Семена рапса (Brassica napus ssp. oleifera, L.) стерилизуют 10% раствором гипохлорита натрия в течение 60 мин, затем промывают 4 раза стерильной водопроводной водой в течение 2 часов. Семена раскладывают на агаризованную среду Кинг Б и инкубируют 48 ч при 24° С, для контроля стерильности семян. Стерильные проростки инокулируют суспензией штамма, взятого с экспоненциальной фазы роста, плотностью около 10 КОЕ/мл в течение 15 мин.
Выращивание проростков проводят в закрытых пластиковых сосудах размером 77 мм × 77 мм × 97 мм фирмы "Sigma" (Sigma Chemical Co, США) в 150 г песка при влажности 10%. Нафталин вносят в виде пудры до конечной концентрации 200 мкг/г песка и тщательно перемешивают. Для обеспечения минерального питания растений используют среду Мурашиге-Скуга (Murashige Т. and F. Skoog. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 1962. V.15. P.473-497) без добавления в нее аминокислот и углеводов (Sigma Chemical Co, США).
Положительным контролем служат растения, выросшие без внесения нафталина и без инокуляции. Отрицательным контролем служат растения, выросшие с добавлением нафталина и без инокуляции.
В один горшок высевают 20 проростков. Растения выращивают со следующим режимом: 12-часовой световой период и 12-часовой темповой период при температуре 20 и 10°С, соответственно.
Остаточное содержание нафталина в стерильных модельных системах с растениями определяют на 7 сутки. Для этого все содержимое пластикового сосуда экстрагируют 100 мл метанола в течение суток при периодическом перемешивании. Отбирают 1 мл экстракта и определяют содержание нафталина с помощью ВЭЖХ в следующих условиях: колонка С 18, Nova Pak Waters, система 50% метанол 50% вода, УФ-детектор, 254 нм, скорость протока 1 мл/мин. Расчет концентрации нафталина производят по площади пика по сравнению с площадью пика контрольного образца.
Результаты, представленные в таблице 4, показывают, что инокуляция семян рапса предлагаемым штаммом бактерий Pseudomonas aureofaciens ВКМ В-2391 Д способствует уменьшению содержания нафталина в 28 раз по сравнению с необработанными растениями.
Инокуляция также положительно влияет на высоту растений. Инокулированные предлагаемым штаммом растения, выращенные в присутствии нафталина, в 3 раза выше, чем растения без инокуляции.
Пример 6. Способность штамма бактерий Pseudomonas aureofaciens ВКМ В-2391 Д деградировать фенантрен и улучшать рост растений в загрязненной фенантреном торфо-песчаной смеси.
Готовят торфо-песчаную смесь. Приготовленную смесь (соотношение торфа и песка 3:1, рН водной вытяжки 6,2) стерилизуют прокаливанием при 120°С в течение 3 ч. Фенантрен добавляют в сухом виде до конечной концентрации 5 мг/г смеси и тщательно перемешивают. Торфо-песчаную смесь с фенантреном раскладывают по 300 г в пластиковые сосуды и поливают 100 мл водопроводной воды (влажность около 40%).
8
Семена ячменя инокулируют в течение 2 ч суспензией штамма, плотностью 10 КОЕ/мл. В 1 сосуд сеют 30 семян ячменя. Через 4 суток после появления проростков оставляют по 20 растений/сосуд.
Положительным контролем служат растения, выросшие на торфо-смеси без внесения фенантрена и без бактеризации. Отрицательным контролем служат растения, выросшие на торфо-смеси с добавлением фенантрена и без бактеризации. Растения поливают через 1 сутки 100 мл водопроводной воды. Растения выращивают при естественном температурном и световом режиме при среднесуточной температуре 25°С. Через 28 суток определяют содержание фенантрена в торфо-песчаной смеси, численность микроорганизмов в ризосфере и среднюю высоту растений (таблица 5).
Определение содержания фенантрена в торфо-песчаной смеси проводят следующим образом. Навеску торфо-песчаной смеси массой 1 г экстрагируют 20 мл метанола в течение суток при интенсивном перемешивании. 1 мл метанольного экстракта центрифугируют на микроцентрифуге «Beckman» (США) в течение 3 мин для удаления механических примесей. Анализ концентрации фенантрена проводят с помощью ВЭЖХ. Экстракт почвенных образцов в объеме 25-200 мкл наносят на колонку и проводят анализ в следующих условиях: обращенно-фазная колонка Nucleosil С-18 (3 мкм, 4,6 мм × 125 мм, «Marcherey-Nagel», США); предколонка - HPLC Column («Serva», США); носитель - октадецил Si-60 (20-40 мкм, 4,6 мм × 75 мм); элюент 83%-ный метанол, 17%-ная деионизованная дистиллированная вода; длина детектирования 254 нм; скорость протока 0,8 мл/мин; температура колонки 50°С.
Анализ проводят на жидкостном хроматографе высокого давления (модель 2150, «LKB», Швеция). Регистрацию пиков поглощения фенантрена производят с помощью интерфейса Nelson Analytical 900 и PC Olivetty M-24 («Hewlett-Packard», США). Обработку результатов осуществляют при помощи пакета прикладных программ «Nelson Analytical». Расчет концентраций фенантрена производят по площади пика, по сравнению с площадью пика контрольного образца.
Повторность всех экспериментов трехкратная.
Результаты, представленные в таблице 5, показывают, что концентрация фенантрена в почве в варианте «ячмень + Pseudomonas aureofaciens ВКМ В-2391 Д» уменьшается в 3 раза по сравнению с контрольным вариантом -неинокулированными растениями.
Инокуляция семян ячменя предлагаемым штаммом Pseudomonas aureofaciens ВКМ В-2391 Д также способствует улучшению роста растений в загрязненной фенантреном почве. Высота инокулированных растений составляет в среднем около 30 см, а неинокулярованных 22 см.
Таким образом, бактериальный штамм Pseudomonas aureofaciens ВКМ В-2391 Д обладает способностью к подавлению роста широкого спектра фитопатогенных грибов и является деструктором ряда ПАУ. Штамм не токсичен для растений в рекомендуемых для обработок концентрациях. Он может быть использован для создания на его основе специального препарата, предназначенного для профилактической обработки растений, как на чистых почвах, так и на почвах, загрязненных ПАУ с целью защиты растений от фитопатогенных грибов и для очистки почв от полиароматических углеводородов.
Таблица 1Антагонистическая активность штамма Pseudomonas aureofaciens ВКМ В-2391 Д в отношении фитопатогенных грибов
Гриб-патоген
Заболевание
Антагонистическая активность
Gaeumannomyces graminis var. tritici штамм 1818
офиоболезная гниль корней пшеницы
++
Gaeumannomyces graminis var. tritici штамм 119(2)
офиоболезная гниль корней пшеницы
++
Gaeumannomyces graminis var. tritici штамм PIT
офиоболезная гниль корней пшеницы
++
Fusarium graminiarum
фузариоз
++
Fusarium maniliforum
листовые гнили
+
Fusarium oxysporum
корневые гнили
+
Fusarium geterosporum
листовые пятнистости
+
Rhizoctonia solani
ризоктониоз
++
+ зона угнетения роста мицелия гриба небольшая (диаметр менее 15 мм), при продолжительном культивировании возможно зарастание штамма Pseudomonas aureofaciens ВКМ В-2391 Д мицелием гриба;
++ обширная зона угнетения роста мицелия гриба (диаметр зоны 15-25 мм).
Таблица 2Ростовые характеристики штамма Pseudomonas aureofaciens ВКМ В-2391 Д при выращивании на минеральной среде М9 с различными ПАУ
Субстрат
Лаг-фаза, ч
µмакс, Ч<sup>-1</sup>
КОЕмакс/МЛ
Интермедиаты
Нафталин
3
0,35
1,5×10<sup>9</sup>±2,2×10<sup>7</sup>
-
2-Метилнафталин
12
0,04
1,5×10<sup>7</sup>±1,2×10<sup>6</sup>
Н.о.
Салицилат
4
0,30
1,0×10<sup>9</sup>±2,0×10<sup>7</sup>
-
Фенантрен
24
0,02
1,4×10<sup>8</sup>±1,5±10<sup>7</sup>
1Г2Н, салицилат
Флюорен
48
0,01
1,8×10<sup>7</sup>±3,3×10<sup>6</sup>
Н.о.
Аценафтен
48
0,01
1,0×10<sup>7</sup>±2,8×10<sup>6</sup>
Н.о.
µ<sub>макс</sub> - максимальная удельная скорость роста, ч<sup>-1</sup>КОЕ<sub>макс</sub> - максимальный титр клеток, КОЕ/мл,1Г2Н - 1-гидрокси-2-нафтойная кислота;Н.о. - образующиеся продукты не были идентифицированы.
Таблица 3Удельная активность ключевых ферментов деградации нафталина у штамма Pseudomonas aureofaciens ВКМ В-2391 Д при выращивании на минеральной среде М9 с нафталином
Удельная активность ферментов (нмоль/мин мг белка)
Нафталин диоксигеназа
Салицилат гидроксилаза
Катехол-1,2-оксигеназа
Катехол-2,3-оксигеназа
8,83±0,03
10,79±0,08
57,77±3,50
305,28±11,33
Среднее значение и стандартное отклонение вычисляют исходя из 3-х повторностей каждого эксперимента.
Таблица 4Влияние штамма бактерий Pseudomonas aureofaciens ВКМ В-2391 Д на рост растений и деградацию нафталина в стерильном микровегетационном эксперименте
Варианты выращивания растений
Высота растений, см
Содержание нафталина, мкг/г
Численность штамма, КОЕ/г ризосферы
Без нафталина, без инокуляции семян штаммом (положительный контроль)
4,8±0,2
-
-
В присутствии нафталина, без инокуляции семян штаммом (отрицательный контроль)
0,9±0,1
95,66
-
В присутствии нафталина, при инокуляции семян штаммом
2,9±0,4
3,44
1,2×10<sup>8</sup>±4,8×10<sup>7</sup>
Повторность всех экспериментов 3-х кратная.
Таблица 5Влияние штамма бактерий Pseudomonas aureofaciens ВКМ В-2391 Д на рост растений ячменя и деградацию фенантрена в торфо-песчаной смеси
Варианты выращивания растений
Высота растений, см
Концентрация фенантрена, мг/г
Численность штамма, КОЕ/г ризосферы
Без фенантрена, без инокуляции семян штаммом (положительный контроль)
28,2±2,2
-
-
В присутствии фенантрена, без инокуляции семян штаммом (отрицательный контроль)
22,0±2,0
1,2±0,2
-
В присутствии фенантрена, при инокуляции семян штаммом
30,0±2,1
0,4±0,05
1,5±10<sup>5</sup>±2,0×10<sup>3</sup>
Повторность всех экспериментов 3-х кратная.