НОВЫЙ ШТАММ PAENIBACILLUS, ПРОТИВОГРИБКОВЫЕ СОЕДИНЕНИЯ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
NEW PAENIBACILLUS STRAIN, ANTIFUNGAL COMPOUNDS AND THEIR APPLICATION METHODS

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
Данная заявка заявляет приоритет к Предыдущей патентной заявке США №62/138,765, поданной 26 марта 2015 г., и Предыдущей патентной заявке США №62/232,205, поданной 24 сентября 2015 г., и содержание обеих заявок включено в данное описание путем ссылки в полном объеме.
ССЫЛКА НА ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ, ПРЕДСТАВЛЕННЫЙ В ЭЛЕКТРОННОМ ФОРМАТЕ
Официальная копия перечня последовательности представлена в электронном формате через EFS-Web как ASCII-форматированный перечень последовательностей с файлом под названием "BCS159002WO_ST25.txt", который был создан 21 марта 2016 г., и который имеет размер 68 килобайт и подан одновременно с этим описанием. Перечень последовательностей, который содержится в этом ASCII-форматированном документе, является частью описания и, таким образом, включается в него в полном объеме.
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Данное изобретение касается области бактериальных штаммов и их способности к контролю над болезнями растений. В частности, данное изобретение является направленным против штамма Paenibacillus sp. с относительно высоким уровнем противогрибкового действия широкого спектра.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Фунгициды имеют множество назначений, включая применение в качестве средств защиты культур; в качестве консервантов для продуктов питания и кормов и косметических средств; в качестве терапевтических средств для лечения людей и животных. Снижение урожайности культур, наличие болезней пищевого происхождения и грибковых инфекций у людей и животных является проблемой как в развитых, так и в развивающихся странах.
Синтетические инсектициды или фунгициды часто являются неспецифическими, а следовательно, могут действовать на организмы, отличные от целевых, включая другие природные благоприятные организмы. По химическому характеру они также могут быть токсичными и такими, что не подвергаются биодеградации. Потребители во всем мире все больше осознают потенциальные проблемы для окружающего среды и здоровья, связанные с остатками химикатов, в частности, в пищевых продуктах. В результате потребители становятся более требовательными относительно снижения использования или по крайней мере уменьшения количества химических (то есть синтетических) пестицидов. Таким образом, существует потребность в контроле над требованиями к пищевой цепи при сохранении возможностей эффективной борьбы с вредителями.
Еще одной проблемой, которая возникает в связи с применением синтетических инсектицидов или фунгицидов, является то, что многоразовое и исключительное применение инсектицида или фунгицидов часто приводит к отбору резистентных патогенных микроорганизмов. По обыкновению такие штаммы также являются перекрестно резистентными к другим активным ингредиентам, которые имеют такой же образ действия. Эффективный контроль над патогенами при указанных активных соединениях в таком случае становится невозможным. Однако разработка активных ингредиентов, которые имеют новые механизмы действия, требует немалых усилий и затрат.
Риск вырабатывания резистентности в популяциях патогенов, а также проблемы, связанные с экологией и человеческим здоровьем, содействовали заинтересованности в поиске альтернатив синтетическим инсектицидам и фунгицидам для борьбы с болезнями растений. Применение средств биологического контроля является одной из альтернатив.
Нерибосомные пептиды, такие как фусарицидины, являются широко известными благодаря их антимикробным свойствам и применяются в области защиты культур. Их способ действия также позволяет применять их в биофармацевтике и других областях биотехнологий. Фусарицидины могут быть выделены из вида Paenibacillus и имеют кольцевую структуру, которая состоит из 6 аминокислотных остатков, дополнительно к 15-гуанидино-3-гидроксипентадекановой кислоте. К фусарицидинам, выделенным из Paenibacillus polymyxa, относятся LI-F03, LI-F04, LI-F05, LI-F07 и LI-F08 (Kurusu K., Ohba K, Arai Т and Fukushima K., J. Antibiotics, 40: 1506-1514, 1987), а также сообщается про дополнительные фусарицидины А, В, С и D (Kajimura Y and Kaneda M., J. Antibiotics, 49: 129-135, 1996; Kajimura Y and Kaneda M., J. Antibiotics, 50: 220-228, 1997).
Известно, что некоторые фусарицидины имеют гермицидную активность против патогенных для растений грибов, таких как Fusarium oxysporum, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae и Penicillium thomii. Некоторые фусарицидины также имеют гермицидную активность против грампозитивных бактерий, включая Staphylococcus aureus (Kajimura Y and Kaneda M., J. Antibiotics, 49: 129-135, 1996; Kajimura Y and Kaneda M., J. Antibiotics, 50: 220-228, 1997). Кроме того, было выявлено, что специфические фусарицидины имеют противогрибковую активность против Leptosphaeria maculans, что вызывает черную корневую гниль канолы (Beatty РН and Jensen SE., Can. J. Microbiol., 48: 159-169, 2002). Существует потребность в дальнейшей характеризации соединений фусарицидина и распознавании штаммов вида Paenibacillus, которые вырабатывают фусарицидины, которые обеспечивают широкий спектр противогрибковой активности при относительно низких нормах внесения.
Фусарицидины и другие противогрибковые метаболиты получают путем ферментации вида Paenibacillus. Однако много штаммов вида Paenibacillus также вырабатывают антибиотики, известные как полимиксины. Полимиксины являются выборочно токсичными для грамнегативных бактерий и могут иметь нейротоксическое или нефротоксическое влияние при введении человеку. Глобальная проблема развития резистентности к антимикробным средствам и относительной токсичности полимиксинов требует осторожного применения и внесения этих антибиотиков. По этой причине очень желательно, чтобы штамм вида Paenibacillus, разработанный для применения в сельском хозяйстве, экспрессировал относительно высокий уровень фусарицидинов без полимиксинов, которые подвергаются выявлению. Такой штамм не создает или почти не создает риска для работников и потребителей. Кроме того, существует потребность в определении штаммов вида Paenibacillus, которые бы демонстрировали широкий спектр активности. Существует большая потребность в улучшении эффективности существующих фунгицидов, в частности, тех, которые не являются восприимчивыми к вырабатыванию грибковой резистентности.
КОРОТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Данное изобретение касается композиции, которая включает биологически чистую культуру фунгицидного штамма вида Paenibacillus, который включает вариант фусарицидинсинтетазы без функционального домена аденилирования в третьем модуле (FusA-А3), причем недостаток функциональной FusA-A3 ингибирует синтез фусарицидинов с тирозином или фенилаланином в аминокислотном остатке (3) по сравнению с синтезом фусарицидинов штаммом вида Paenibacillus, который включает фусарицидинсинтетазу дикого типа. В некоторых аспектах вариантная фусарицидинсинтетаза включает делецию в FusA-А3 по крайней мере одного, по крайней мере двух, по крайней мере трех, по крайней мере четверых, по крайней мере пяти, по крайней мере шести, по крайней мере семи, по крайней мере восьми, по крайней мере девяти или десяти аминокислотных остатков, которые определяют субстратную специфичность. В одном аспекте аминокислотные остатки выбирают из группы, к которой относятся Asp235, Ala236, Ser239, Thr278, Leu299, Ala301, Ala/Gly322, Val330, Cys331, Lys517 и их комбинации.
В одном варианте воплощения аминокислотные остатки располагаются в положениях 3203, 3204, 3207, 3246, 3267, 3269, 3290, 3298, 3299 и/или 3486 последовательности SEQ ID NO: 11. В другом варианте воплощения вариантная фусарицидинсинтетаза включает делецию в FusA-А3 положений Asp235, Ala236, Ser239, Thr278, Leu299, Ala301, Ala/Gly322, Val330 и Cys331. В некоторых вариантах воплощения вариантная фусарицидинсинтетаза включает SEQ ID NO: 10.
Данное изобретение также обеспечивает композицию, которая включает биологически чистую культуру фунгицидного штамма вида Paenibacillus, или его бесклеточный экстракт, который включает по крайней мере один Paeniserine и по крайней мере один Paeniprolixin.
В некоторых аспектах по крайней мере один Paeniserine выбирают из группы, к которой относятся Paeniserine A1, Paeniserine А2, Paeniserine A3, Paeniserine A4, Paeniserine B1, Paeniserine B2, Paeniserine B3, Paeniserine B4, Paeniserine Cl, Paeniserine C2 и Paeniserine C3.
В других аспектах по крайней мере один Paeniprolixin выбирают из группы, к которой относятся Paeniprolixin Al, Paeniprolixin А2, Paeniprolixin Bl, Paeniprolixin B2, Paeniprolixin C1, Paeniprolixin D1, Paeniprolixin E1, Paeniprolixin E2, Paeniprolixin F1, Paeniprolixin F2, Paeniprolixin G1 и Paeniprolixin G2.
В некоторых вариантах воплощения композиция включает фусарицидин А, LiF08a, Paeniserine A1, Paeniserine B1, Paeniprolixin A2 и Paeniprolixin B2.
В некоторых вариантах воплощения композиция не включает LiF03a, LiF03b, LiF03c, LiF03d, LiF07a, LiF07b, LiF07c и/или LiF07d. В других вариантах воплощения композиция включает Paeniserine A1, Paeniserine B1, Paeniprolixin A2 и Paeniprolixin B2 в синергетически эффективном количестве.
В некоторых аспектах данное изобретение касается композиции, в которой штамм вида Paenibacillus представляет собой штамм вида Paenibacillus NRRL В-50972, штамм вида Paenibacillus NRRL В-67129 или его фунгицидный мутантный штамм. Композиция может включать продукт ферментации штамма вида Paenibacillus NRRL В-50972, штамма вида Paenibacillus NRRL В-67129 или его фунгицидного мутантного штамма.
В некоторых вариантах воплощения фунгицидный мутантный штамм имеет геномную последовательность, которая имеет больше, чем приблизительно 90% идентичности последовательности з штаммом вида Paenibacillus NRRL В-50972. В других вариантах воплощения фунгицидный мутантный штамм имеет фунгицидную активность и/или уровень фусарицидина, Paeniserine и/или Paeniprolixin, который является сравнимым или лучше уровня штамма вида Paenibacillus NRRL В-50972. В других вариантах воплощения продукт ферментации не включает полимиксин.
4
В некоторых аспектах продукт ферментации представляет собой жидкую композицию. Жидкая композиция может быть концентратом суспензии или масляной дисперсией. В одном варианте воплощения композиция включает по крайней мере приблизительно 1×10 КОЕ штамма/мл жидкой композиции. В другом варианте воплощения композиция включает от приблизительно 1% до приблизительно 25% твердых продуктов ферментации.
В других аспектах данное изобретение касается композиции, которая включает: а) по крайней мере один фусарицидин; и б) по крайней мере один Paeniserine или по крайней мере один Paeniprolixin в синергетически эффективном количестве. В одном варианте воплощения Paeniserine является по крайней мере одним из Paeniserine A1, Paeniserine А2, Paeniserine A3, Paeniserine A4, Paeniserine B1, Paeniserine B2, Paeniserine B3, Paeniserine B4, Paeniserine C1, Paeniserine C2 и Paeniserine С3. В другом варианте воплощения Paeniprolixin является по крайней мере одним из Paeniprolixin A1, Paeniprolixin А2, Paeniprolixin B1, Paeniprolixin B2, Paeniprolixin C1, Paeniprolixin D1, Paeniprolixin E1, Paeniprolixin E2, Paeniprolixin F1, Paeniprolixin F2, Paeniprolixin G1 и Paeniprolixin G2.
В частности, в одном варианте воплощения синергетическое соотношение по крайней мере одного фусарицидина и по крайней мере одного Paeniserine или по крайней мере одного Paeniprolixin составляет от 1:1000 до 1000:1, в оптимальном варианте - в границах от 1:500 до 500:1, в еще лучшем варианте -в границах от 1:250 до 250:1. В другом варианте воплощения синергетическое массовое соотношение по крайней мере одного фусарицидина и по крайней мере одного Paeniserine или по крайней мере одного Paeniprolixin составляет от 1:100 до 100:1, в оптимальном варианте - в границах от 1:100 до 10:1 или даже в границах от 1:50 до 25:1. В одном аспекте фусарицидин представляет собой Фусарицидин А. В другом аспекте Paeniserine представляет собой Paeniserine A1. В еще одном аспекте Paeniprolixin представляет собой Paeniprolixin С1.
В других аспектах данное изобретение касается выделенного соединения, которое имеет структуру (I):
где
1
2
3
2
3
2
3
R и R каждый независимо представляет собой -СН(СН) или -СН(СН)СНСН;
3
2
2
2
2
2
R представляет собой -CHC(O)NH или -(CH)C(O)NH; и
n представляет собой целое число от 13 до 20;
включая их соли, гидраты, сольваты, полиморфы, оптические изомеры, геометрические изомеры, энантиомеры, диастереомеры, ациклические аналоги и смеси.
3
3
2
2
2
2
2
2
2
3
2
3
2
3
3
2
3
2
3
В некоторых вариантах воплощения R представляет собой -CHC(O)NH В других вариантах воплощения R представляет собой -(CH)C(O)NH. В одном аспекте R1 представляет собой -СН(СН). В другом аспекте R1 представляет собой -СН(СН)СНСН. В одном аспекте R представляет собой -СН(СН). В еще одном аспекте R представляет собой -СН(СН)СНСН.
В других аспектах данное изобретение касается выделенного соединения, которое имеет структуру (II):
где
1
2
3
R представляет собой -СНОН или -СН(ОН)СН;
2
2
2
2
2
2
R представляет собой -CHC(O)NH или -(CH)C(O)NH; и
3
3
R представляет собой Н или СН;
1
3
2
2
2
2
при условии, что, если R представляет собой -СНОН, и R представляет собой -CHC(O)NH, тогда R представляет собой Н;
включая их соли, гидраты, сольваты, полиморфы, оптические изомеры, геометрические изомеры, энантиомеры, диастереомеры, ациклические аналоги и смеси.
3
3
1
1
2
2
3
2
3
2
2
2
2
В некоторых вариантах воплощения R представляет собой СН. В других вариантах воплощения R представляет собой Н. В одном аспекте R представляет собой -СНОН. В другом аспекте R представляет собой -СН(ОН)СН. В одном аспекте R представляет собой -CHC(O)NH. В еще одном аспекте R представляет собой -(СН)С(O)NH.
В одном варианте воплощения данное изобретение касается композиции, которая включает описанное авторами выделенное соединение и приемлемый для применения в сельском хозяйстве носитель.
В некоторых вариантах воплощения данное изобретение касается раствора, который включает соединение структуры (I), причем концентрация соединения составляет по крайней мере 0,001 мг/мл, по крайней мере 0,01 мг/мл или по крайней мере 0,1 мг/мл. В другом варианте воплощения данное изобретение касается раствора, который включает соединение структуры (II), причем концентрация соединения составляет по крайней мере 0,001 мг/мл, по крайней мере 0,01 мг/мл или по крайней мере 0,1 мг/мл. В некоторых аспектах описанные растворы также включают приемлемый для применения в сельском хозяйстве носитель.
10
12
В еще одном варианте воплощения данное изобретение касается способа обработки растения для борьбы с болезнью, причем способ включает нанесение эффективного количества описанной авторами композиции на растение, часть растения и/или место выращивания растения. В некоторых аспектах композиция представляет собой продукт ферментации штамма вида Paenibacillus NRRL В-50972, штамма вида Paenibacillus NRRL В-67129 или его фунгицидного мутантного штамма. В других аспектах способ включает нанесение композиции на части лиственных растений. В других аспектах композицию применяют в количестве от приблизительно 1×10 до приблизительно 1×10 колониеобразующих единиц (КОЕ) штамма вида Paenibacillus NRRL В-50972, штамма вида Paenibacillus NRRL В-67129 или его фунгицидного мутантного штамма на гектар. В одном варианте воплощения композицию применяют в количестве от приблизительно 0,5 кг до приблизительно 5 кг твердых продуктов ферментации на гектар.
В некоторых аспектах болезнь растений вызывается грибком. В других аспектах болезнью растений является мучнистая роса или ржавчинное заболевание. В одном варианте воплощения мучнистая роса является истинной мучнистой росой или псевдомучнистой росой. В другом варианте воплощения ржавчинное заболевание является выбранным из группы, к которой относится листовая ржавчина пшеницы, листовая ржавчина ячменя, листовая ржавчина ржи, бурая листовая ржавчина, корончатая ржавчина и стебельная ржавчина.
В некоторых вариантах воплощения грибок является выбранным из группы, к которой относятся Alternaria alternata, Alternaria solani, Botrytis cinerea, Colletotrichum lagenarium, Fusarium culmorum, Phaeosphaeria nodorum, Zymoseptoria tritici, Phytophthora cryptogea, Phytophthora infestans, Pythium ultimum, Magnaporthe oryzae, Thanatephorus cucumeris, Ustilago segetum var. avenae, Uromyces appendiculatus и Puccinia triticina.
В других вариантах воплощения болезнь растений вызывается бактериями. В одном аспекте бактерии являются выбранными из группы, к которой относятся Xanthomonas campestris, Pseudomonas syringae и Erwinia carotovora.
Данное изобретение также касается применения описанных композиций для борьбы с фитопатогенными организмами в полезных растениях. В некоторых аспектах фитопатогенный организм является выбранным из группы, к которой относятся Alternaria alternata, Alternaria solani, Botrytis cinerea, Colletotrichum lagenarium, Fusarium culmorum, Phaeosphaeria nodorum, Zymoseptoria tritici, Phytophthora cryptogea, Phytophthora infestans, Pythium ultimum, Magnaporthe oryzae, Thanatephorus cucumeris, Ustilago segetum var. avenae, Uromyces appendiculatus и Puccinia triticina. В других аспектах фитопатогенный организм является выбранным из группы, к которой относятся Xanthomonas campestris, Pseudomonas syringae и Erwinia carotovora.
В других аспектах полезные растения являются выбранными из группы, к которой относятся яблоня, бананы, цитрусы, киви, дыни, персики, груши, ананасы, семечковые плоды, гранаты, капуста, цветная капуста, огурцы, тыквы, томаты, картофель, пшеница, рис и соя.
КОРОТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
ФИГ. 1 показывает in planta фунгицидную активность сплошных бульонов штамма вида Paenibacillus против фитофтороза томатов (PHYTIN), серой гнили (BOTRCI) и листовой ржавчины пшеницы (PUCCRT).
ФИГ. 2 показывает in vitro противогрибковую активность экстрактов фусарицидина из сплошных бульонов штамма вида Paenibacillus против Alternaria alternata (ALTEAL), Botrytis cinerea (BOTRCI), Fusarium culmorum (FUSACU), Phaeosphaeria nodorum (LEPTNO), Zymoseptoria tritici (SEPPTR), Phytophthora cryptogea (PHYTCR), Phytophthora infestans (PHYTIN), Pythium ultimum (PYTHUL), Magnaporthe oryzae (PYRIOR), Thanatephorus cucumeris (RHIZSO), Ustilago segetum var. avenae (USTIAV) и Uromyces appendiculatus (UROMAP).
ФИГ. 3 показывает раскрытие кольцевой структуры в LiF04a (также известной как фусарицидин А) для образования ацикличного аналога, LiF04a. Подобным образом встречаются ациклические аналоги каждого из фусарицидинов и подобных фусарицидину соединений.
ФИГ. 4А представляет диаграмму, на которой показана структура известных фусарицидинов с консервативными аминокислотами в распознанных позициях (1), (4) и (6) и аминокислотами, которые меняются, которые обозначаются как АА (аминокислота). Хвост 15-гуанидино-3-гидроксипентадекановой кислоты (GHPD) образует амидную связь с N-концом L-треонина в положении (1). С-конец D-аланина в положении (6) образовывает эстерную связь с гидроксигруппой L-треонина в положении (1), обозначенном стрелками, которые указывают на "О". ФИГ. 4В показывает ВЕРХ/MS TOF-хроматограмму из экстракта клеток вида Paenibacillus, на которой распознано известные фусарицидины. ФИГ. 4С показывает известные фусарицидины, которые могут быть распознаны в экстракте клеток из штамма вида Paenibacillus NRRL В-50972 и/или производных от него штаммов.
ФИГ. 5А представляет диаграмму, на которой показана структура Paeniserine. Этот класс соединений является подобным фусарицидинам, за исключением того, что один или оба консервативных треонина в положениях (1) и (4) являются замещенными серином. ФИГ. 5В показывает ВЕРХ/MS TOF-хроматограмму экстракта клеток из штамма вида Paenibacillus  NRRL В-50972 и/или производных от него штаммов, на которой распознаются Paeniserine.
ФИГ. 5С показывает Paeniserine, которые могут быть выявлены в экстракте клеток из штамма вида Paenibacillus NRRL В-50972 и/или производных от него штаммов. Значение m/z и время удержания (RT) показано для всех выявленных соединений.
ФИГ. 6А показывает химическую структуру Paeniserine A1, определенную на основе UPLC/MS Triple TOF-спектра, показанного на ФИГ. 6В.
ФИГ. 7А показывает химическую структуру Paeniserine B1, определенную на основе UPLC/MS Triple TOF-спектра, показанного на ФИГ. 7В.
2
12
2
14
2
16
ФИГ. 8А представляет диаграмму, на которой показана структура Paeniprolixin. Этот класс соединений является подобным фусарицидинам, за исключением того, что длина хвоста GHPD является увеличенной с -(CH)- до -(СН)- или -(CH)-. ФИГ. 8В показывает BEPX/MS TOF-хроматограмму экстракта клеток из штамма вида Paenibacillus NRRL В-50972 и/или производных от него штаммов, на которой распознано Paeniprolixin. ФИГ. 8С показывает Paeniprolixin, которые могут быть выявлены в экстракте клеток из штамма вида Paenibacillus NRRL В-50972 и/или производных от него штаммов. Значение m/z и время удержания (RT) показано для всех выявленных соединений.
ФИГ. 9А показывает химическую структуру Paeniprolixin С1, определенную на основе UPLC/MS Triple TOF-спектра, показанного на ФИГ. 9 В.
ФИГ. 10А показывает химическую структуру Paeniprolixin D1, определенную на основе UPLC/MS Triple TOF-спектра, показанного на ФИГ. 10 В.
ФИГ. 11 показывает дискодиффузионный анализ Кирби-Бауэра на чувствительность к антибиотикам для фусарицидинов А и В ("АВ"), Paeniserine A1 и B1 ("868"), Paeniprolixin А2 и В2 ("938") или комбинации 868 и 938, которые наносили на культуру спор Colletotrichum lagenarium (COLLLA) на планшете с агаром. Диаметр каждого диска с его зоной ингибирования роста грибков указан в миллиметрах.
ФИГ. 12А показывает химическую структуру фусарицидина А упрощенное изображение этой структуры. ФИГУРЫ 12В - 12Е показывают упрощенные изображения комбинаций фусарицидинов, Paeniserine и/или Paeniprolixin, которые дают штамм вида Paenibacillus NRRL В-50972 и производные от него штаммы. Комбинации наподобие этих могут создавать синергетический противогрибковый эффект и отвечают за относительно высокую эффективность и широкий спектр противогрибковой активности, которые наблюдаются для штамма вида Paenibacillus NRRL В-50972 и производных от него штаммов.
ФИГ. 13 представляет множественное выравнивание последовательностей сегмента фусарицидинсинтетазы FusA, которая экспрессируется такими штаммами Paenibacillus: Paenibacillus peoriae A (SEQ ID NO: 1); Paenibacillus polymyxa A (SEQ ID NO: 2); Paenibacillus polymyxa PKB1 (GenBank ABQ96384.2; SEQ ID NO: 3); Paenibacillus polymyxa E681 (GenBank ADM67985.1; SEQ ID NO: 4); Paenibacillus polymyxa В (SEQ ID NO: 5); Paenibacillus polymyxa SQR (GenBank AHM63812.1; SEQ ID NO: 6); Paenibacillus polymyxa С (SEQ ID NO: 7); Paenibacillus polymyxa Ml (GenBank CCC83015.1; SEQ ID NO: 8); Paenibacillus polymyxa SC2 (GenBank ACA09733.2; SEQ ID NO: 9); штамм вида Paenibacillus NRRL B-50972 (SEQ ID NO: 10); и штаммом вида Paenibacillus A (SEQ ID NO: 11). Аминокислотные остатки, которые определяют субстратную специфичность, выделены черным контуром (см. также Таблицу 1). Эти аминокислотные остатки располагаются в положениях 3203, 3204, 3207, 3246, 3267, 3269, 3290, 3298, 3299 и 3486 последовательностей SEQ ID NO: 1-5 и 11 и в положениях 3204, 3205, 3208, 3247, 3268, 3270, 3291, 3299, 3300 и 3487 последовательностей SEQ ID NO: 6-9.
ФИГ. 14 показывает кластер генов фусарицидина в штамме вида Paenibacillus NRRL В-50972 и штамме вида Paenibacillus А ("Штамм А"). Стрелки представляют отдельные гены в кластере (то есть fusG представлен стрелкой "G", fusF представлен стрелкой "F", и т.д.). Самая большая стрелка представляет ген фусарицидинсинтетазы fusA с такими сокращениями и символами: А = домен аденилирования (распознавание и активация субстрата); С = домен конденсации (образование пептидной связи); Е = домен эпимеризации (рацемизация субстрата); ТЭ = домен тиоэстеразы (высвобождение продукта); овал без буквы = домен тиолирования (Т) (белок-носитель пептида). Ген fusA имеет шесть модулей, которые отвечают за включения аминокислот, указанных прямоугольниками выше или ниже каждого кластера генов. Штамм А имеет типичный кластер генов фусарицидина, тогда как кластер генов фусарицидина штамма вида Paenibacillus NRRL В-50972 не имеет функционального домена А в модуле 3. В результате фусарицидины, которые производятся штаммом вида Paenibacillus NRRL В-50972, не содержат тирозина и фенилаланина в положении (3) и включают лишь валин или изолейцин.
ФИГ. 15 показывает выравнивание последовательностей гена spoOA в штамме вида Paenibacillus NRRL В-50972 (SEQ ID NO: 12) и штамме вида Paenibacillus NRRL В-67129 (SEQ ID NO: 13).
ФИГ. 16 показывает выравнивание последовательностей ортологов SpoOA из образующих эндоспоры бактерий, которое указывает на то, что изменение нуклеотидов в кодирующей последовательности штамма вида Paenibacillus NRRL В-67129 в результате ведет к единой аминокислотной замене в консервативном участке. Выравненными ортологическими
последовательностями Spo0A являются: Spo0A Paenibacillus terrae (SEQ ID NO: 14), Spo0A штамма вида Paenibacillus NRRL B-50972 (SEQ ID NO: 15), Spo0A штамма вида Paenibacillus NRRL B-67129 (SEQ ID NO: 16), Spo0A Paenibacillus polymyxa (SEQ ID NO: 17), Spo0A Bacillus subtilis (SEQ ID NO: 18), Spo0A Bacillus cereus (SEQ ID NO: 19) и Spo0A Clostridium pasteurianum (SEQ ID NO: 20).
ФИГ. 17 показывает значение минимальной ингибирующей концентрации для 80% (MIC80) показателей нескольких фусарицидинов, Paeniserine и Paeniprolixin с грибковыми патогенами Alternaria solani (ALTESO) и Colletotrichum lagenarium (COLLLA).
ДЕТАЛЬНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Данное изобретение обеспечивает штамм вида Paenibacillus NRRL В-50972 или фунгицидный мутант (штамм), который от него происходит.Было выявлено, что штамм вида Paenibacillus NRRL В-50972 имеет широкий спектр активности против фитопатогенов.
Все микроорганизмы, в частности, описанные авторами штаммы, если конкретно не указано другого, берут в природе и выращивают в искусственных условиях, например, в колбах для культивирования со встряхиванием, или с применением производственных процессов в увеличенных масштабах, например, в биореакторах, для обеспечения максимального вырабатывания биологически активного метаболита. Выращивание при таких условиях ведет к "одомашниванию" штамма. По обыкновению такой "одомашненный" штамм отличается от своих природных аналогов тем, что его культивируют как однородную популяцию, которая не испытает давления отбора, который происходит в естественной среде, но подвергается давлению искусственного отбора.
В контексте этого описания термин "выделенный" касается соединения, которое было обогащено или концентрировано в сплошном бульоне или продукте ферментации, или которое является частично или существенно очищенным от сплошного бульона или продукта ферментации.
В одном варианте воплощения обеспечивается мутантный штамм вида Paenibacillus NRRL В-50972. Термин "мутант" означает генетический вариант, который происходит от штамма вида Paenibacillus NRRL В-50972. В одном варианте воплощения мутант имеет одну или несколько или все отличительные (функциональные) характеристики штамма вида Paenibacillus NRRL В-50972. В конкретном случае мутант или продукт его ферментации контролирует рост (что является его отличительной функциональной характеристикой) грибов, оомицетов и/или бактерий по крайней мере так же, как и родительский штамм вида Paenibacillus NRRL В-50972. Такие мутанты могут быть генетическими вариантами, которые имеют геномную последовательность, которая имеет больше, чем приблизительно 85%, больше, чем приблизительно 90%, больше, чем приблизительно 95%, больше, чем приблизительно 98%, или больше, чем приблизительно 99% идентичности последовательности со штаммом вида Paenibacillus NRRL В-50972. Мутанты получают путем обработки клеток штамма вида Paenibacillus NRRL В-50972 химикатами или облучением, или путем отбора спонтанных мутантов из популяции клеток штамма вида Paenibacillus NRRL В-50972 (таких как фагостойкие или стойкие к антибиотикам мутанты) или другими способами, хорошо известными специалистам в данной области.
Штамм вида Paenibacillus NRRL В-50972 и его мутанты имеют активность против широкого спектра растительных патогенов. В одном аспекте штамм имеет активность против грибов, таких как антракноз огурцов, истинная мучнистая роса огурцов, листовая ржавчина пшеницы, истинная мучнистая роса ячменя и ботритиоз; Оомицеты, такие как фитофтороз томатов, псевдомучнистая роса огурцов и псевдомучнистая роса капусты; и/или бактерии, такие как Pseudomonas, Xanthomonas и Erwinia.
В некоторых аспектах данное изобретение касается продукта ферментации, который включает штамм вида Paenibacillus, причем штамм вида Paenibacillus вырабатывает фусарицидины, Paeniserine и/или Paeniprolixin. Фусарицидины представляют собой семью депсипептидов с хвостом 15-гуанидино-3-гидроксипентадекановой кислоты (GHPD), а также их линейные аналоги. Конкретными консервативными характеристиками фусарицидинов являются этот хвост GHPD, а также три из шести аминокислот в такой последовательности: (1) треонин, (4) треонин и (6) аланин.
Первоначально выявленные, но не охарактеризованные в публикации Nakajima et al. (J. Antibiot. 1972, 25, 243-247) в середине 70-х лет, фусарицидины были описаны в публикации Kurusu et al. (J. Antibiot., 1987, 40, 1506-1514) в конце 1980-х. Они были дополнительно исследованы авторами Kajimura et al. (J. Antibiot., 1996, 49, 129-135; J. Antibiot., 1997 50, 220-228), Kuroda et al. (Heterocycles, 2000, 53, 1533-1549; J. Mass Spectrom., 2001, 36, 30-37) и Beatty et al. (Can. J. Microbiol., 2002, 48, 159-169) на протяжении периода с середины 1990-х до начала 2000-х. На протяжении этого периода активных исследований эти соединения несколько раз переименовывались, в зависимости от автора (Фусарицидин А также известен как LiF04a, Gatavalin или даже КТ-6291А). Хотя существует много публикаций по этой теме, каждый раз описывается отбор соединений из одной группы из 24-х известных фусарицидинов.
После несколько более спокойного периода относительно этой темы в публикации Vater et al. (J. Am. Soc. Mass Spectrom., 2015, 26, 1130-1141) были описаны выяснения структуры фусарицидинов путем массы-спектрометрии с описанием нескольких аналогов из этой семьи. Vater et al. Распознали новый класс подобных фусарицидину соединений с семью аминокислотами (то есть дополнительным аланином, соединенным с (4) треониновым остатком в пептидной последовательности). В контексте этого описания термин "ациклический аналог" касается соединения, которое отвечает фусарицидину или подобному фусарицидину соединению (например, Paeniserine или Paeniprolixin), но не имеет эстерной связи, результатом чего является линейная структура.
Аминокислотные цепи фусарицидинов соединяются и модифицируются нерибосомной пептидсинтетазой (NRPS). Многодоменная NRPS включает до 15000 аминокислот, а следовательно, считается одним из наиболее длинных белков в природе (Schwarzer et al., (2003) Nonribosomal Peptides: From Genes to Products. Nat. Prod. Rep.20, 275-287). Включение NRPS не ограничивается 21 стандартными аминокислотами, которые транслируются рибосомой, и эта неустроенность содействует большому структурному многообразию и биологической активности нерибосомных пептидов (Li and Jensen, (2008). Nonribosomal biosynthesis of fusaricidins by Paenibacillus polymyxa PKB1 involves direct activation of a d-amino acid. Chem. Biol. 15, 118-127).
В P. polymyxa E68 был охарактеризован биосинтетический кластер генов фусарицидина (fusGFEDCBA), и, по наблюдениям, кодирующая последовательность NRPS, самая большая кодирующая последовательность ДНК (CDS) в кластере, кодирует шестимодульный пептид (Choi et al., Identification and Functional Analysis of the Fusaricidin Biosynthetic Gene of Paenibacillus polymyxa E681. Biochem. Biophys. Res. Commun. 365, 89-95; Li and Jensen, Identification and Functional Analysis of the Fusaricidin Biosynthetic Gene of Paenibacillus polymyxa E681. Biochem. Biophys. Res. Commun. 365, 89-95; Li et al., (2013). Promoter Analysis and Transcription Regulation of fus Gene Cluster Responsible for Fusaricidin Synthesis of Paenibacillus polymyxa SQR-21. Appl. Microbiol. Biotechnol. 97, 9479-9489). Биосинтетический кластер включает другую CDS, которая отвечает за биосинтез липидного компонента, но не содержит гены-репортеры (Li and Jensen, (2008). Nonribosomal Biosynthesis of Fusaricidins by Paenibacillus polymyxa PKB1 Involves Direct Activation of a d-amino acid. Chem. Biol. 15, 118-127). В P. polymyxa был распознан промотор для оперона fus и выявлено, что он связывается транскрипционным репрессором (AbrB), который в предыдущих исследованиях рассматривался как регулятор споруляции; интерес к нему обусловлен тем, что фусарицидин по наблюдениям синтезируется во время споруляции, таким образом, координируя вторичный метаболизм микроба в его жизненном цикле (Li et al, (2013). Promoter Analysis and Transcription Regulation of fus Gene Cluster Responsible for Fusaricidin Synthesis of Paenibacillus polymyxa SQR-21. Appl. Microbiol. Biotechnol. 97, 9479-9489).
По обыкновению считается, что аллельное многообразие предопределяет наличие химического многообразия. Однако интересной особенностью кластера fus является то, что многообразие фусарицидинов, которые отличаются включенными аминокислотами (Туr, Val, Ilе, алло- Ilе, Phe), может быть создано единым аллелем fus А; механизм, который лежит в основе этого процесса, заключается в том, что А-домен NRPS, который отвечает за распознавание аминокислот, имеет ослабленную субстратную специфичность (Han et ah, (2012). Site-Directed Modification of the Adenylation Domain of the Fusaricidin Nonribosomal Peptide Synthetase for Enhanced Production of Fusaricidin Analogs. Biotechnol. Lett.34, 1327-1334; Mousa et al, (2015) Biodiversity of Genes Encoding Anti-Microbial Traits within Plant Associated Microbes, Front Plant Sci. 2015; 6: 231).
Структура А-домена, который отвечает за распознавание и активацию субстрата в гене fusA, была определена по GrsA с применением рентгеновской кристаллографии, и было распознано 10 аминокислотных остатков, которые определяют субстратную специфичность (Asp235, Ala236, Trp239, Thr278, Ile299, Ala301, Ala322, Ile330, Cys331 и Lys517) (Challis et al, (2000) Predictive, Structure-Based Model of Amino Acid Recognition by Nonribosomal Peptide Synthetase Adenylation Domains. Chem Biol 7: 211-224; Stachelhaus et al., (1999) The Specificity Conferring Code of Adenylation Domains in Nonribosomal Peptide Synthetases. Chem Biol 6: 493 - 505). Эти 10 сигнатурных остатков могут быть разделены на три подгруппы в зависимости от их функции в пределах сайта связывания с субстратом. Asp235 и Lys517 взаимодействовали с карбоксильным и аминным концами субстрата, соответственно, и анализ последовательности показал, что их позиция в А-домене NRPS является инвариантной. Ala236, Ala301 и Ile 330 являются умеренно вариабельными в пределах А-доменов, специфических к аминокислотным субстратам, которые имеют алифатическую боковую цепь. Trp239, Thr278, Ile 299, Ala322 и Cys331 являются высоковариабельными положениями и считаются важными для различения и отбора разных субстратов (Challis et al, (2000) Predictive, Structure-Based Model of Amino Acid Recognition by Nonribosomal Peptide Synthetase Adenylation Domains. Chem Biol 7: 211-224; Stachelhaus et al, (1999) The Specificity Conferring Code of Adenylation Domains in Nonribosomal Peptide Synthetases. Chem Biol 6: 493-505). Ile299 был наиболее вариабельным положением среди всех в пределах последовательности, которая предоставляет субстратную специфичность (Stachelhaus et al., (1999) The Specificity Conferring Code of Adenylation Domains in Nonribosomal Peptide Synthetases. Chem Biol 6: 493-505).
10 аминокислотных остатков, которые определяют субстратную специфичность в фусарицидинсинтетазе, показаны в Таблице 1. Домены аденилирования (А-домены) для каждого из шести модулей в синтетазе являются известными как FusA-A1 для первого модуля, FusA-A2 для второго модуля, FusA-А3 для третьего модуля и т.д. Эти 10 аминокислотных остатков также распознаются во множественном выравнивании последовательностей FusA из разных штаммов вида Paenibacillus, представленных на ФИГ. 13.
В некоторых аспектах фунгицидный штамм вида Paenibacillus экспрессирует вариантную фусарицидинсинтетазу, которая включает делецию по крайней мере одного, по крайней мере двух, по крайней мере трех, по крайней мере четверых, по крайней мере пяти, по крайней мере шести, по крайней мере семи, по крайней мере восьми, по крайней мере девяти или всех десяти аминокислотных остатков, которые определяют субстратную специфичность в FusA-А3. В других аспектах фунгицидный штамм вида Paenibacillus экспрессирует фусарицидинсинтетазу с делецией в FusA-А33 по крайней мере одного аминокислотного остатка, выбранного из группы, к которой относятся Asp235, Ala236, Ser239, Thr278, Leu299, Ala301, Ala/Gly322, Val330, Cys331, Lys517 и их комбинации.
Делеции в FusA-АЗ, описанные авторами, влияют на способность фусарицидинсинтетазы к включению конкретных аминокислот в аминокислотной позиции (3) пептидного кольца в фусарицидине или подобном фусарицидину соединении. Например, штамм вида Paenibacillus NRRL В-50972 включает делеции в FusA-А3 и не может образовывать соединения фусарицидина с аминокислотами тирозином или фенилаланином в аминокислотной позиции (3). Без привязывания к любой теории может произойти так, что делеции в FusA-А3 отдаляют метаболизм от биосинтеза классических фусарицидинов и приближают к биосинтезу подобных фусарицидину соединений, таких как Paeniserine и Paeniprolixin.
В некоторых вариантах воплощения данное изобретение касается композиции, которая включает биологически чистую культуру фунгицидного штамма вида Paenibacillus, которая включает вариантную фусарицидинсинтетазу без функционального домена аденилирования в третьем модуле (FusA-А3), а также включает по крайней мере один Paeniserine и по крайней мере один Paeniprolixin. В некоторых аспектах по крайней мере один Paeniserine и по крайней мере один Paeniprolixin являются выделенными или обогащенными в композиции.
В некоторых вариантах воплощения выделенное соединение или Paeniprolixin представляет собой
В некоторых вариантах воплощения выделенное соединение или Paeniserine представляет собой
или
В других аспектах данное изобретение касается способа распознавания фунгицидного штамма вида Paenibacillus и/или создания соответствующего продукта ферментации. Способ включает секвенирование FusA-А3 в штамме вида Paenibacillus для характеризации вариантной фусарицидинсинтетазы и анализа фунгицидной активности штамма вида Paenibacillus. В некоторых аспектах FusA-А3 секвенируют с применением праймеров на основе одной или нескольких последовательностей, показанных на ФИГ. 13 (то есть SEQ ID NO: 1-11). В некоторых вариантах воплощения перед скринингом осуществляют выращивание клеток и отбор клеток с одной или несколькими такими характеристиками: уровнем фусарицидинов с тирозином или фенилаланином в аминокислотном остатке (3) (например, LiF03a, LiF03b, LiF03c, LiF03d, LiF07a, LiF07b, LiF07c и/или LiF07d), который не подвергается выявлению или является сниженным сравнительно с фусарицидинами, подсчитанными в контрольном штамме вида Paenibacillus, который содержит фусарицидинсинтетазу дикого типа (то есть экспрессирует функциональную FusA-АЗ); и/или повышенным уровнем Paeniserine (например, Paeniserine A1 и/или Paeniserine Bl) и/или Paeniprolixin сравнительно с подсчитанными в контрольном штамме вида Paenibacillus, который включает фусарицидинсинтетазу дикого типа (то есть экспрессирует функциональную FusA-А3).
В одном аспекте данное изобретение включает способ получения продукта ферментации с широким спектром противогрибковой активности, причем способ включает культивирование штамма вида Paenibacillus с вариантной фусарицидинсинтетазой до споруляции.
В другом варианте воплощения данное изобретение касается способа распознавания фунгицидного штамма вида Paenibacillus с широким спектром противогрибковой активности, причем способ включает: а) секвенирование FusA-А3 в штамме вида Paenibacillus для характеризации вариантной фусарицидинсинтетазы; б) анализ фунгицидной активности штамма вида Paenibacillus с вариантной фусарицидинсинтетазой; и в) выбор фунгицидного штамма вида Paenibacillus как такого, что имеет широкий спектр противогрибковой активности, если штамм вида Paenibacillus включает вариантную фусарицидинсинтетазу и демонстрирует повышенную фунгицидную активность в сравнении с контрольным штаммом вида Paenibacillus, который включает фусарицидинсинтетазу дикого типа. Способ также может включать количественное определение Paeniserine и/или Paeniprolixin, которые продуцируются штаммом вида Paenibacillus, и выбор штамма вида Paenibacillus как такого, что имеет широкий спектр противогрибковой активности, если штамм вида Paenibacillus продуцирует повышенный уровень Paeniserine и/или Paeniprolixin сравнительно с контрольным штаммом вида Paenibacillus, который включает фусарицидинсинтетазу дикого типа. В другом аспекте способ также включает культивирование фунгицидного штамма вида Paenibacillus для получения фунгицидного продукта ферментации.
В одном варианте воплощения данное изобретение касается способа получения противогрибкового продукта ферментации, который включает фунгицидный штамм вида Paenibacillus с широким спектром противогрибковой активности, причем способ включает: а) секвенирование FusA-А3 в штамме вида Paenibacillus для характеризации вариантной фусарицидинсинтетазы; б) анализ фунгицидной активности штамма вида Paenibacillus с вариантной фусарицидинсинтетазой; в) выбор фунгицидного штамма вида Paenibacillus как такого, что имеет широкий спектр противогрибковой активности, если штамм вида Paenibacillus включает вариантную фусарицидинсинтетазу и демонстрирует повышенную фунгицидную активность сравнительно с контрольным штаммом вида Paenibacillus, который включает фусарицидинсинтетазу дикого типа; и г) культивирование фунгицидного штамма вида Paenibacillus для получения фунгицидного продукта ферментации.
В некоторых вариантах воплощения вариантная фусарицидинсинтетаза включает делецию по крайней мере одного, по крайней мере двух, по крайней мере трех, по крайней мере четверых, по крайней мере пяти, по крайней мере шести, по крайней мере семы, по крайней мере восьми, по крайней мере девяти или всех десяти аминокислотных остатков, которые определяют субстратную специфичность в FusA-А3. В других аспектах вариантная фусарицидинсинтетаза включает делецию в FusA-А3 по крайней мере одного аминокислотного остатка, выбранного из группы, к которой относятся Asp235, Ala236, Ser239, Thr278, Leu299, Ala301, Ala/Gly322, Val330, Cys331, Lys517 и их комбинации.
Данное изобретение также включает способ обработки растений для борьбы с болезнями растений путем применения к растения или части растения, такой как листва, стебли, цветы плоды, корни или семена, или внесение в место роста растения или части растения, например, в грунт, штамма вида Paenibacillus NRRL В-50972 или его мутантов или их бесклеточных препаратов или их метаболитов.
При осуществлении способа согласно изобретению композиция, которая содержит штамм вида Paenibacillus NRRL В-50972 или его фунгицидный мутант, может быть применена к любому растению или любой части любого растения, которое выращивают в любом типе сред, которое применяют для выращивания растений (например, в грунте, вермикулите, нарезанном картоне и воде), или наносят на растения или части растений, которые выращивают в воздухе, например, орхидеи или платицериум. Композицию наносят, например, путем разбрызгивания, распыления, выпаривания, рассеяния, опудривания, глазирования, впрыскивания, окропления, заливания или окуривания. Как уже было указано выше, применение может осуществляться в любом нужном месте, в котором находится данное растение, например, в поле, саду, лесу, на плантации, в рассаднике, на участке для органического возделывания, на газоне и в городской среде.
Композиции согласно данному изобретению могут быть полученные путем культивирования штамма вида Paenibacillus NRRL В-50972 или фунгицидного мутанта (штамма), который от него происходит, согласно способам, хорошо известным специалистам в данной области, включая применение сред и других способов, описанных ниже в примерах. К традиционным крупномасштабным процессам культивирования микробов принадлежат глубинная ферментация, твердофазная ферментация или жидкофазное культивирование. Ближе к концу ферментации, с исчерпанием питательных веществ, клетки начинают переходить от фазы роста к фазе споруляции, таким способом, что конечный продукт ферментации большей частью составляют споры, метаболиты и остаточная ферментационная среда. Споруляция является частью естественного жизненного цикла Paenibacillus и по обыкновению начинается клетками в ответ на ограничение питательных веществ. Ферментацию конфигурируют таким образом, чтобы достигался высокий уровень колониеобразующих единиц и обеспечивалось содействие споруляции. Бактериальные клетки, споры и метаболиты в культуральной среде, которая образовывается в результате ферментации, могут быть использованы непосредственно или сконцентрированы традиционными промышленными способами, такими как центрифугирование, тангенциальная поточная фильтрация, глубинная фильтрация и выпаривание.
Композиции согласно данному изобретению включают продукты ферментации. В некоторых вариантах воплощения концентрированный ферментационный бульон промывают, например, с применением процесса диафильтрации, для удаления остаточного ферментационного бульона и метаболитов. В контексте это описания термин "концентрат бульона" касается сплошного бульона (ферментационного бульона), который был сконцентрирован традиционными промышленными способами, как описано выше, но он остается в жидкой форме. Термин "ферментационное твердое вещество" в контексте этого описания означает твердый материал, который остается после высушивания ферментационного бульона. Термин "продукт ферментации" в контексте этого описания касается сплошного бульона, концентрата бульона и/или твердых продуктов ферментации. Композиции согласно данному изобретению включают продукты ферментации.
Ферментационный бульон или концентрат бульона высушивают с добавлением или без добавления носителей с применением традиционных процессов высушивания или таких способов, как высушивание распылением, высушивание замораживанием, высушивание на лотках, высушивание в псевдорразреженном пласте, высушивание в барабанной сушилке или выпаривание.
Образованные в результате сухие продукты могут подвергаться дальнейшей обработке, такой как перемалывание или грануляция, для достижения конкретного размера частичек или физического формата. После высушивания также могут добавляться описанные ниже носители.
Бесклеточные препараты ферментационного бульона штаммов согласно данному изобретению могут быть получены любым способом, известным специалистам в данной области, таким как экстракция, центрифугирование и/или фильтрация ферментационного бульона. Специалистам в данной области станет понятно, что так называемые бесклеточные композиции могут не быть лишены клеток, а быть большей частью бесклеточными или практически бесклеточными, в зависимости от технологии (например, скорости центрифугирования), применяемой для удаления клеток. Образованный в результате бесклеточный препарат может быть подвержен высушиванию и/или рецептированию с компонентами, которые содействуют его применению к растениям или средам роста растений. Способы концентрирования и высушивания, описанные выше для ферментационного бульона, также могут быть применены для бесклеточных препаратов.
4
5
6
7
В одном варианте воплощения продукт ферментации включает по крайней мере приблизительно 1×10 колониеобразующих единиц (КОЕ) микроорганизма (например, штамма вида Paenibacillus NRRL В-50972 или его фунгицидного мутантного штамма)/мл бульона. В другом варианте воплощения продукт ферментации включает по крайней мере приблизительно 1×10 колониеобразующих единиц (КОЕ) микроорганизма (например, штамма вида Paenibacillus NRRL В-50972 или его фунгицидного мутантного штамма)/мл бульона. В другом варианте воплощения продукт ферментации включает по крайней мере приблизительно 1×10 КОЕ микроорганизма (например, штамма вида Paenibacillus NRRL В-50972 или его фунгицидного мутантного штамма)/мл бульона. В еще одном варианте воплощения продукт ферментации включает по крайней мере приблизительно 1×10 КОЕ микроорганизма (например, штамма вида Paenibacillus NRRL В-50972 или его фунгицидного мутантного штамма)/мл бульона. В другом варианте воплощения продукт ферментации включает по
о
8
9
10
11
крайней мере приблизительно 1×10 КОЕ микроорганизма (например, штамма вида Paenibacillus NRRL В-50972 или его фунгицидного мутантного штамма)/мл бульона. В другом варианте воплощения продукт ферментации включает по крайней мере приблизительно 1×10 КОЕ микроорганизма (например, штамма вида Paenibacillus NRRL В-50972 или его фунгицидного мутантного штамма)/мл бульона. В другом варианте воплощения продукт ферментации включает по крайней мере приблизительно 1×10 КОЕ микроорганизма (например, штамма вида Paenibacillus NRRL В-50972 или его фунгицидного мутантного штамма)/мл бульона. В другом варианте воплощения продукт ферментации включает по крайней мере приблизительно 1×10 КОЕ микроорганизма (например, штамма вида Paenibacillus NRRL В-50972 или его фунгицидного мутантного штамма)/мл бульона.
Композиции согласно изобретению могут применяться как такие или, в зависимости от их конкретных физических и/или химических свойств, в форме их рецептур или приготовленных из них форм для применения, таких как аэрозоли, суспензии для капсул, концентраты для холодного распыления, концентраты для теплого распыления, гранулы в капсулах, тонкодисперсные гранулы, текучие концентраты для обработки семян, готовые для применения растворы, распыляемые порошки, эмульгированные концентраты, эмульсии "масло в воде", эмульсии "вода в масле", макрогранулы, микрогранулы, диспергированные в масле порошки, смешиваемые с маслом текучие концентраты, смешиваемые с маслом жидкости, газ (под давлением), газогенерирующий продукт, пены, пасты, покрытые пестицидами семена, концентраты суспензий, масляная дисперсия, суспоэмульсионные концентраты, растворимые концентраты, суспензии, смачиваемые порошки, растворимые порошки, дусты и гранулы, водорастворимые и диспергируемые в воде гранулы или таблетки, водорастворимые и диспергируемые в воде порошки для обработки семян, смачиваемые порошки, естественные продукты и синтетические вещества, пропитанные активным ингредиентом, а также микроинкапсуляции в полимерных веществах и в материалах покрытия для семян, а также УЛВ-композиции холодного распыления и теплого распыления.
В некоторых вариантах воплощения композиции согласно изобретению являются жидкими композициями. Неограничивающими примерами жидких композиций являются концентрированные суспензии и масляные дисперсии. В других вариантах воплощения композиции согласно изобретению являются твердыми композициями. Неограничивающими примерами жидких композиций могут быть высушенные замораживанием порошки и высушенные распылением порошки.
Композиции согласно данному изобретению могут включать инертные компоненты для рецептирования, которые прибавляют к содержащим клетки композициям бесклеточных препаратов или метаболитов для улучшения эффективности, стойкости та пригодности до использования и/или для облегчения обработки, упаковывания та конечного применения. К таким инертным компонентам и ингредиентам для рецептирования могут относится носители, стабилизаторы, питательные вещества или модификаторы физических свойств, которые могут добавляться отдельно или в комбинации. В некоторых вариантах воплощения носители могут включать жидкие материалы, такие как вода, масло и другие органические или неорганические растворители, и твердые материалы, такие как минералы, полимеры или полимерные комплексы, полученные биологически или путем химического синтеза. В некоторых вариантах воплощения носителем является связующее вещество или адгезив, что содействует прилипанию композиции к части растения, такой как семена или корни. См., например, Taylor, A.G., et al., "Concepts and Technologies of Selected Seed Treatments", Annu. Rev. Phytopathol. 28: 321-339 (1990). К стабилизаторам могут относится средства против комкования, антиоксиданты, сиккативы, протравщики или консерванты. К питательным веществам могут относиться источники углерода, азота и фосфора, такие как сахара, полисахариды, масла, белки, аминокислоты, жирные кислоты и фосфаты. К модификаторам физических свойств могут относиться объемообразующие агенты, смачивающие агенты, загустители, модификаторы рН, модификаторы реологических свойств, диспергаторы, адъюванты, поверхностно-активные вещества, антифризы или красители. В некоторых вариантах воплощения композиция, которая включает клетки, бесклеточный препарат или метаболиты, полученные путем ферментации, могут применяться непосредственно с водой как разбавителем или без нее и без дальнейшего приготовления композиции. В некоторых вариантах воплощения инертные компоненты для рецептирования прибавляют после концентрирования ферментационного бульона и во время и/или после высушивания.
Все растения и части растений могут подвергаться обработке согласно изобретению. В данном контексте под растениями следует понимать все растения и популяции растений, такие как желательные и нежелательные дикие растения или культурные растения (включая естественные культурные растения). Культурными растениями могут быть растения, которые могут быть получены с применением традиционных способов селекции и оптимизации или биотехнологических и рекомбинантных способов или комбинаций этих способов, включая трансгенные растения и сорта растений, которые могут или не могут быть защищены Правами растениеводов-селекционеров. Под частями растений следует понимать все надземные и подземные части и органы растений, такие как побеги, листва, цветы и корни, примерами которых могут быть листва, хвоя, ножки, стебли, цветы, плодовые тела, плоды и семена, а также корни, клубнеплоды и корневища. К частям растений также принадлежит выращенный материал и материал вегетативного и генеративного размножения, например, живцы, клубнеплоды, корневища, побеги и семена.
Как уже было упомянуто выше, все растения и их части могут подвергаться обработке согласно изобретению. В оптимальном варианте воплощения обработке подвергают виды и сорта растений и их части, которые растут в диких условиях, или которые получают традиционными способами биологической селекции, такими как гибридизация или слияния протопластов. В другом оптимальном варианте воплощения обработке подвергают трансгенные растения и сорта растений, которые были получены рекомбинантными способами, в случае целесообразности - в комбинации с традиционными способами (генетически модифицированные организмы) и их части. Термин "части" или "части растений" объяснялся выше. Согласно изобретению, особое предпочтение отдают растениям сортов, которые во всяком случае являются доступными через торговую сеть или находятся в использовании. Под сортами растений следует понимать растения с новыми свойствами, которые были выведены путем традиционной селекции, путем мутагенеза или с применением технологий рекомбинантных ДНК. Они могут приобретать формы сортов, разновидностей, биотипов и генотипов.
Обработку растений и частей растений композициями согласно изобретению осуществляют непосредственно или путем влияния на среду, ареал или место хранения с применением традиционных способов обработки, например, путем погружения, разбрызгивания, распыления, напыления, выпаривания, опудривания, мелкокапельного опрыскивания, рассеяния, вспенивания, нанесения кистью, разбрасывания, впрыскивания, просачивания, струйного орошения и, в случае материала для размножения, в частности, в случае семян, а именно при осуществлении способов сухого протравливания семян, мокрого протравливания семян, полусухого протравливания, инкрустации, укрывания одним или несколькими пластами покрытия и т.д. Кроме того, существует возможность нанесения активных веществ с применением способа ультрамалообъемного опрыскивания или впрыскивания композиции активного вещества или самого активного вещества в землю.
Оптимальным способом непосредственной обработки растений является нанесение на листву, то есть композиции согласно изобретению наносят прямо на листву, причем существует возможность регулирования частоты обработки и нормы внесения согласно степени инфицирования данным патогеном.
В случае системно активных соединений композиции согласно изобретению достигают растения через корневую систему. В этом случае обработку растений осуществляют, позволяя композициям согласно изобретению действовать на среду растения. Это может осуществляться, например, путем просачивания, внедрения в землю или раствор питательных веществ, то есть место роста растения (например, земля или гидропонические системы) пропитывают жидкой формой композиций согласно изобретению, или внесение в землю, то есть композиции согласно изобретению внедряют в место роста растений в твердой форме (например, в форме гранул). В случае рисовых культур это также может осуществляться путем внесения вымеренного количества композиций согласно изобретению в залитый рисовый чек в твердой форме (например, в форме гранул).
Оптимальными растениями являются растения из группы полезных растений, декоративных растений, дерновых растений, обычных деревьев, которые используют как декоративные растения в общественном и бытовом секторах, и лесных деревьев. К лесным деревьям относятся деревья для производства лесоматериала, целлюлозы, бумаги и продуктов, которые вырабатывают из частей деревьев.
Термин "полезные растения" в контексте этого описания касается культурных растений, которые применяют для получения продуктов питания, кормов, топлива или для промышленных целей.
К полезным растениям, которые могут быть подвергнуты обработке и/или улучшению с применением композиций и способов согласно данному изобретению, относятся, например, такие типы растений: дерновые растения, виноград, злаки, например, пшеница, ячмень, рожь, овес, рис, кукуруза и просо/ сорго; свекла, например, сахарная свекла и кормовая свекла; плодовые растения, например, семечковые плоды, косточковые плоды и сочные плоды, например, яблони, груши, сливы, персики, миндаль, вишни и ягоды, например, клубника, малина, ежевика; бобовые, например, фасоль, чечевица, горох и соя; масляные культуры, например, масляный рапс, горчица, мак, оливки, подсолнечник, кокос, клещевина, какао и арахис; тыквы или кабачки, огурцы и дыни; волокнистые растения, например, хлопок, лен, конопля и джут; цитрусовые плоды, например, апельсины, лимоны, грейпфруты и мандарины; овощные культуры, например, шпинат, салат, спаржа, виды капусты, морковь, лук, томаты, картофель и болгарский перец; лавровые, например, авокадо, корица, камфара или другие растения, такие как табак, орехи, кофе, баклажан, сахарный тростник, чай, перец, виноград, хмель, бананы, каучуконосные растения и декоративные растения, например, цветковые растения, кустарники, листопадные деревья и хвойные деревья. Этот перечень является неограничивающим.
Указанные ниже растения считаются особенно подходящими как целевые культуры для применения композиций и способов согласно данному изобретению: хлопок, баклажан, дерновые растения, семечковые плоды, косточковые плоды, сочные плоды, кукуруза, пшеница, ячмень, огурцы, табак, виноград, рис, злаки, горох, фасоль, соя, масляный рапс, томаты, болгарский перец, дыни, капуста, картофель и яблоня.
Примерами деревьев, которые могут быть улучшены с применением способа согласно изобретению, могут быть: Abies sp., Eucalyptus sp., Picea sp., Pinus sp., Aesculus sp., Platanus sp., Tilia sp., Acer sp., Tsuga sp., Fraxinus sp., Sorbus sp., Betula sp., Crataegus sp., Ulmus sp., Quercus sp., Fagus sp., Sa/Zx sp., Populus sp.
Оптимальными деревьями, которые могут быть улучшены с применением способа согласно изобретению, являются представители видов деревьев Aesculus: A. hippocastanum, A. pariflora, А. сагпеа; представители видов деревьев Platanus: P. aceriflora, P. occidentalis, P. racemosa; представители видов деревьев Picea: P. abies; представители видов деревьев Pinus: P. radiata, P. ponderosa, Р. contorta, P. sylvestre, P. elliottii, P. montecola, P. albicaulis, P. resinosa, Р. palustris, P. taeda, P. flexilis, P. jeffregi, P. baksiana, P. strobus; представители видов деревьев Eucalyptus: Е. grandis, Е. globulus, Е. camadentis, Е. nitens, Е. obliqua, Е. regnans, Е. pilularus.
Особое предпочтение среди деревьев, которые могут быть улучшены с применением способа согласно изобретению, отдают таким представителям видов деревьев, как Pinus: P. radiata, P. ponderosa, P. contorta, P. sylvestre, Р. strobus; представителям видов деревьев Eucalyptus: Е. grandis, Е. globulus, Е. camadentis.
Самое большое предпочтение среди деревьев, которые могут быть улучшены с применением способа согласно изобретению, отдают таким видам, как лошадиный каштан, платан, липа, клен.
Данное изобретение также может применяться для любых дерновых трав, включая холодоустойчивые дерновые травы и теплолюбивые дерновые травы. Примерами холодоустойчивых дерновых трав могут быть тонконог (Роа spp.), такой как тонконог луговой (Роа pratensis L.), тонконог обычный (Роа trivialis L.), тонконог сплющенный (Роа compressa L.), тонконог одногодичный (Роа annua L.), тонконог рощевой (Роа glaucantha Gaudin), тонконог лесной (Роа nemoralis L.) и тонконог клубневой (Роа bulbosa L.); метлицы (Agrostis spp.), такие как метлица болотная (Agrostis palustris Huds.), метлица тонкая (Agrostis tenuis Sibth.), метлица собачья (Agrostis canina L.), южнонемецкая смешанная метлица (виды Agrostis, включая Agrostis tenuis Sibth., Agrostis canina L. и Agrostis palustris Huds.) и полевица (Agrostis alba L.);
Кострики (Festuca spp.), такие как кострика красная (Festuca rubra L., виды rubra), кострика ползучая (Festuca rubra L.), кострика красная изменчивая (Festuca rubra commutata Gaud.), кострика овечья (Festuca ovina L.), кострика жестковатая (Festuca longifolia Thuill.), кострика аметистовая (Festucu capillata Lam.), кострика камышовая (Festuca arundinacea Schreb.) и кострика луговая (Festuca elanor L.);
плевелы (Lolium spp.), такие как плевел многоцветковый (Lolium multiflorum Lam.), плевел многолетний (Lolium perenne L.) и плевел итальянский (Lolium multiflorum Lam.);
и житняки (Agropyron spp.), такие как житняк гребенчатый (Agropyron cristatum (L.) Gaertn.), житняк пустынный (Agropyron desertorum (Fisch.) Schult.) и житняк Смита (Agropyron smithii Rydb.)
Примерами других холодоустойчивых дерновых трав являются аммофилы (Ammophila breviligulata Fern.), костер безостый (Bromus inermis Leyss.), рогозовые, такие как тимофеевка (Phleum pratense L.), тимофеевка шиловидная (Phleum subulatum L.), ежа сборная (Dactylis glomerata L.), бескильница расставленная (Puccinellia distans (L.) Pari.) и гребенник обыкновенный (Cynosurus cristatus L.)
Примерами теплолюбивых дерновых трав являются бермудская трава (Cynodon spp.L. С.Rich), цойсия (Zoysia spp.Willd.), августиновая трава (Stenotaphrum secundatum Walt Kuntze), еремохлоя змеехвостая (Eremochloa ophiuroides Munro Hack.), аксонопус афинский (Axonopus affinis Chase), гречка заметная (Paspalum notatum Flugge), кикуйя (Pennisetum clandestinum Hochst. ex Chiov.), бизонья трава (Buchloe dactyloids (Nutt.) Engelm.), бутелуа изящная (Bouteloua gracilis (TLB.K.) Lag. ex Griffiths), паспалум влагалищный (Paspalum vaginatum Swartz) и бутелуа отвисшая (Bouteloua curtipendula (Michx. Torr.). По обыкновению холодоустойчивым дерновым травам отдают предпочтение согласно изобретению. Особое преимущество отдают таким растениям, как тонконог, метлица и полевица, кострики и плевел. Особое преимущество отдают полевице.
Композиции согласно изобретению имеют мощную бактерицидную активность и могут применяться для борьбы с нежелательными микроорганизмами, такими как грибки и бактерии, для защиты культур и защиты материалов.
Изобретение также касается способа борьбы с нежелательными микроорганизмами, который характеризуется тем, что композиции согласно изобретению применяют к фитопатогенным грибам, фитопатогенным бактериям и/или их средам.
Фунгициды применяют для защиты культур в борьбе с фитопатогенными грибами. Они характеризуются замечательной эффективностью против широкого спектра фитопатогенных грибов, включая грунтовые патогены, которые являются конкретными представителями классов
Plasmodiophoromycetes, Peronosporomycetes (Syn. Оомицеты), Chytridiomycetes, Zygomycetes, Ascomycetes, Basidiomycetes и Deuteromycetes (синоним Fungi imperfecti). Некоторые фунгициды являются системно активными и могут применяться для защиты растений в качестве фунгицида для обработки листвы, протравливания семян или внесения в грунт.Кроме того, они являются приемлемыми для борьбы с грибками, которые, кроме другого, поражают древесную часть или корни растений.
Бактерициды применяют для защиты культур в борьбе с Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae, Enterobacteriaceae, Corynebacteriaceae и Streptomycetaceae.
Неограничивающими примерами патогенов грибковых заболеваний, которые подвергаются лечению согласно изобретению, могут быть:
болезни, вызванные патогенами истинной мучнистой росы, например, видов Blumeria, например, Blumeria graminis; видов Podosphaera, например, Podosphaera leucotricha; видов Sphaerotheca, например, Sphaerotheca fuliginea; видов Uncinula, например, Uncinula necator;
болезни, вызванные патогенами других заболеваний, например, видов Gymnosporangium, например, Gymnosporangium sabinae; видов Hemileia, например, Hemileia vastatrix; видов Phakopsora, например, Phakopsora pachyrhizi и Phakopsora meibomiae; видов Puccinia, например, Puccinia recondite, P. triticina, P. graminis или P. striiformis; видов Uromyces, например, Uromyces appendiculatus;
болезни, вызванные патогенами из группы, к которой принадлежат оомицеты, например, видов Albugo, например, Algubo Candida; видов Bremia, например, Bremia lactucae; видов Peronospora, например, Peronospora pisi или P.
brassicae; видов фитофтор, например, Phytophthora infestans; видов Plasmopara, например, Plasmopara viticola; видов Pseudoperonospora, например, Pseudoperonospora humuli или Pseudoperonospora cubensis; видов питиозной корневой гнили, например, Pythium ultimum;
болезни пятнистости листвы и болезни вилта листвы, вызванные, например, видами Alternaria, например, Alternaria solani; видами Cercospora, например, Cercospora beticola; видами Cladiosporium, например, Cladiosporium cucumerinum; видами Cochliobolus, например, Cochliobolus sativus (форма конидий: Drechslera, синоним: Helminthosporium), Cochliobolus miyabeanus; видами Colletotrichum, например, Colletotrichum lindemuthanium; видами Cyclocpnium, например, Cycloconium oleaginum; видами Diaporthe, например, Diaporthe citri; видами Elsinoe, например, Elsinoe fawcettii; видами Gloeosporium, например, Gloeosporium laeticolor; видами Glomerella, например, Glomerella cingulata; видами Guignardia, например, Guignardia bidwelli; видами Leptosphaeria, например, Leptosphaeria maculans, Leptosphaeria nodorum; видами Magnaporthe, например, Magnaporthe grisea; видами Marssonia, например, Marssonia coronaria; видами Microdochium, например, Microdochium nivale; видами Mycosphaerella, например, Mycosphaerella graminicola, M. arachidicola и M. Jijiensis; видами Phaeosphaeria, например, Phaeosphaeria nodorum; видами Pyrenophora, например, Pyrenophora teres, Pyrenophora tritici repentis; видами Ramularia, например, Ramularia collo-cygni, Ramularia areola; видами Rhynchosporium, например, Rhynchosporium secalis; видами Septoria, например, Septoria apii, Septoria lycopersii; видами Typhula, например, Typhula incarnata; видами Venturia, например, Venturia inaequalis;
болезни корней и стеблей, вызванные, например, видами Corticium, например, Corticium graminearum; видами Fusarium, например, Fusarium oxysporum; видами Gaeumannomyces, например, Gaeumannomyces graminis; видами Rhizoctonia, такими как, например, Rhizoctonia solani; болезни Sarocladium, вызванные, например, Sarocladium oryzae; болезни Sclerotium, вызванные, например, Sclerotium oryzae; видами Tapesia, например, Tapesia acuformis; видами Thielaviopsis, например, Thielaviopsis basicola;
болезни колосьев и метелок (включая кочаны кукурузы), вызванные, например, видами Alternaria, например, Alternaria spp.; видами Aspergillus, например, Aspergillus flavus; видами Cladosporium, например, Cladosporium cladosporioides; видами Claviceps, например, Claviceps purpurea; видами Fusarium, например, Fusarium culmorum; видами Gibberella, например, Gibberella zeae; видами Monographella, например, Monographella nivalis; видами Septoria, например, Septoria nodorum;
болезни, вызванные садковыми грибами, например, видов Sphacelotheca, например, Sphacelotheca reiliana; видов Tilletia, например, Tilletia caries, Т. controversa; видов Urocystis, например, Urocystis occulta; видов Ustilago, например, Ustilago nuda, U. nuda tritici;
плодовая гниль, вызванная, например, видами Aspergillus, например, Aspergillus flavus; видами Botrytis, например, Botrytis cinerea; видами Penicillium, например, Penicillium expansum и P. purpurogenum; видами Sclerotinia, например, Sclerotinia sclerotiorum; видами Verticilium, например, Verticilium alboatrum.
Болезни, связанные с плесенью, вилтом, гнилью и полеганием, которые передаются через семена и грунт и вызываются, например, видами Alternaria, вызываются, например, Alternaria brassicicola; видами Aphanomyces, вызываются, например, Aphanomyces euteiches; видами Ascochyta, вызываются, например, Ascochyta lentis; видами Aspergillus, вызываются, например, Aspergillus flavus; видами Cladosporium, вызываются, например, Cladosporium herbarum; видами Cochliobolus, вызываются, например, Cochliobolus sativus; (форма конидии: Drechslera, Bipolaris, синоним: Helminthosporium); видами Colletotrichum, вызываются, например, Colletotrichum coccodes; видами Fusarium, вызываются, например, Fusarium culmorum; видами Gibberella, вызываются, например, Gibberella zeae; видами Macrophomina, вызываются, например, Macrophomina phaseolina; видами Monographella, вызываются, например, Monographella nivalis; видами Penicillium, вызываются, например, Penicillium expansum; видами Phoma, вызываются, например, Phoma lingam; видами Phomopsis, вызываются, например, Phomopsis sojae; видами Phytophthora, вызываются, например, Phytophthora cactorum; видами Pyrenophora, вызываются, например, Pyrenophora graminea; видами Pyricularia, вызываются, например, Pyricularia oryzae; видами Pythium, вызываются, например, Pythium ultimum; видами Rhizoctonia, вызываются, например, Rhizoctonia solani; видами Rhizopus, вызываются, например, Rhizopus oryzae; видами Sclerotium, вызываются, например, Sclerotium rolfsii; видами Septoria, вызываются, например, Septoria nodorum; видами Typhula, вызываются, например, Typhula incarnata; видами Verticillium, вызываются, например, Verticillium dahliae;
опухоли, галлы и ведьмовские метлы, вызванные, например, видами Nectria, например, Nectria galligena;
болезни вилта, вызванные, например, видами Monilinia, например, Monilinia laxa;
болезни пузырчатости листвы или кудрявости листвы, вызванные, например, видами Exobasidium, например, Exobasidium vexans; видами Taphrina, например, Taphrina deformans;
болезни, связанные с ослаблением древесных растений, вызванные, например, болезнью эска, вызванные, например, Phaemoniella clamydospora, Phaeoacremonium aleophilum и Fomitiporia mediterranea; эутипоз, вызванный, например, Eutypa lata; болезни генодерма, вызванные, например, Ganoderma boninense; болезни Rigidoporus, вызванные, например, Rigidoporus lignosus;
болезни цветков и семян, вызванные, например, видами Botrytis, например, Botrytis cinerea;
болезни клубнеплодов растений, вызванные, например, видами Rhizoctonia, например, Rhizoctonia solani; видами Helminthosporium, например, Helminthosporium solani;
Кила крестоцветных, вызванная, например, видами Plasmodiophora, например, Plamodiophora brassicae;
болезни, вызванные бактериальными патогенами, например, видами Xanthomonas, например, Xanthomonas campestris pv. oryzae; видами Pseudomonas, например, Pseudomonas syringae pv. lachrymans; видами Erwinia, например, Erwinia amylovora.
Преимущественно контролируют нижеприведенные болезни сои:
Грибковые заболевания листвы, стеблей, стручков и семян, вызванные, например, пятнистостью листвы Alternaria (Alternaria spec, atrans tenuissimd), Anthracnose (Colletotrichum gloeosporoides dematium var. truncatum), бурой пятнистостью (Septoria glycines), церкоспорозной пятнистостью и повреждением листвы (Cercospora kikuchii), вызванной хоанефорной пятнистостью листвы (Choanephora infundibulifera trispora (Syn.)), вызванной дактулиофорной пятнистостью листвы (Dactuliophora glycines), псевдомучнистой росой (Peronospora manshurica), пятнистостью Дрехслера (Drechslera glycini), селеноморфозной пятнистостью листвы {Cercospora sojina), вызванной лептосферулинной пятнистостью листвы (Leptosphaerulina trifolii), филостиктозной пятнистостью листвы (Phyllosticta sojaecola), гнилью бобов и стеблей (Phomopsis sojae), истинной мучнистой росой (Microsphaera diffusa), вызванной пиренохетной пятнистостью листвы (Pyrenochaeta glycines), ризоктониозом надземных частей и листвы (Rhizoctonia solani), ржавчиной {Phakopsora pachyrhizi, Phakopsora meibomiae), паршой (Sphaceloma glycines), стемфилиозом (Stemphylium botryosum), мишенеподобной пятнистостью листвы (Corynespora cassiicola).
Грибковые заболевания корней и основ стеблей, вызванные, например, черной корневой гнилью (Calonectria crotalariae), угольной гнилью (Macrophomina phaseolina), фузариозной гнилью или увяданием, корневой гнилью и гнилью бобов и ветвей (Fusarium oxysporum, Fusarium orthoceras, Fusarium semitectum, Fusarium equiseti), вызванной миколептодискусом корневой гнилью (Mycoleptodiscus terrestris), неокосмоспорой (Neocosmospora vasinfecta), гнилью бобов и стеблей (Diaporthe phaseolorum), стебельным раком (Diaporthe phaseolorum var. caulivora), фитофторозом (Phytophthora megasperma), бурой гнилью стеблей (Phialophora gregata), грибной гнилью (Pythium aphanidermatum, Pythium irregulare, Pythium debaryanum, Pythium myriotylum, Pythium ultimum), ризоктониозной корневой гнилью, гнилью стеблей и полеганием (Rhizoctonia solani), склероциальной гнилью стеблей (Sclerotinia sclerotiorum), южной склероциальной гнилью (Sclerotinia rolfsii), вызванной тиелавиопсисом корневой гнилью (Thielaviopsis basicola).
Фунгицидные композиции согласно изобретению применяют для лечебного или защитного / профилактического контроля над фитопатогенными грибами. Таким образом, изобретение также касается лечебных и защитных способов для борьбы с фитопатогенными грибами путем применения композиций согласно изобретению, которые применяют к семенам, растению или частям растения, плодам или грунту, в котором выращивают растение.
Тот факт, что композиции хорошо переносятся растениями в концентрации, которая требуется для контроля над болезнями растений, позволяет обрабатывать надземные части растений, материал для размножения и семян, а также грунт.
Согласно изобретению, обработке подвергаются все растения и части растений, включая разновидности и сорта растений (независимо от того, защищенные ли они законами об охране сортов или защите прав селекционеров). Разновидности и сорта растений могут быть растениями, полученными традиционными способами размножения и селекции, которым могут содействовать или которые могут сопровождать один или несколько биотехнологических способов, таких как применение двойных гаплоидов, слияние протопластов, случайный и направленный мутагенез, молекулярные или генетические маркеры, или способами биоинженерии и способами генной инженерии.
8
14
9
13
10
12
В некоторых аспектах композиции в соответствии с настоящим изобретением применяют в количестве от приблизительно 1×10 до приблизительно 1×10 колониеобразующих единиц (КОЕ) фунгицидного штамма вида Paenibacillus NRRL В-50972 или его фунгицидного мутантного штамма на гектар. В других аспектах композиции в соответствии с настоящим изобретением применяют в количестве от приблизительно1×10 до приблизительно 1×10 колониеобразующих единиц (КОЕ) фунгицидного штамма вида Paenibacillus NRRL В-50972 или его фунгицидного мутантного штамма на гектар. В других аспектах композиции в соответствии с настоящим изобретением применяют в количестве от приблизительно 1×10 до приблизительно 1×10 колониеобразующих единиц (КОЕ) фунгицидного штамма вида Paenibacillus NRRL В-50972 или его фунгицидного мутантного штамма на гектар.
В некоторых вариантах воплощения композиции в соответствии с настоящим изобретением применяют в количестве от приблизительно 0,1 кг до приблизительно 10 кг твердых продуктов ферментации на гектар. В других вариантах воплощения композиции в соответствии с настоящим изобретением применяют в количестве от приблизительно 0,25 кг до приблизительно 7,5 кг твердых продуктов ферментации на гектар. В других вариантах воплощения композиции в соответствии с настоящим изобретением применяют в количестве от приблизительно 0,5 кг до приблизительно 5 кг твердых продуктов ферментации на гектар. Композиции в соответствии с настоящим изобретением также могут применяться в количестве приблизительно 1 кг или приблизительно 2 кг твердых продуктов ферментации на гектар.
Композиции согласно изобретению, если они хорошо переносятся растениями, имеют благоприятную гомеотермную токсичность и хорошо переносятся средой, являются пригодными для защиты растений и органов растений, для повышения урожайности, для улучшения качества собранного материала. В оптимальном варианте они могут применяться как композиции для защиты культур. Они являются активными против нормально чувствительных и резистентных видов и против всех или некоторых стадий развития.
К растениям, которые могут подвергаться обработке согласно изобретению, относятся такие основные культурные растения: кукуруза, соя, люцерна, хлопок, подсолнечник, масляные культуры Brassica, такие как Brassica napus (например, канола, рапс), Brassica гара, В. juncea (например, горчица(полевая)) и виды Brassica carinata, Arecaceae (например, масляная пальма, кокос), рис, пшеница, сахарная свекла, сахарный тростник, овес, рожь, ячмень, просо и сорго, тритикале, лен, орехи, разные сорта винограда и разные фрукты и овощные культуры из разных ботанических таксонов, например, видов Rosaceae (например, семечковые плодовые культуры, такие как яблони и груши, а также косточковые плодовые культуры, такие как абрикосы, вишня, миндаль, сливы и персики, и ягодные культуры, такие как клубника, малина, смородина и черная смородина и крыжовник), Ribesioidae sp., Juglandaceae sp., Betulaceae sp., Anacardiaceae sp., Fagaceae sp., Moraceae sp., Oleaceae sp.(например, оливковое дерево), Actinidaceae sp., Lauraceae sp. (например, авокадо, корица, камфара), Musaceae sp. (например, банановые деревья и плантации), Rubiaceae sp. (например, кофейное дерево), Theaceae sp. (например, чай), Sterculiceae sp., Rutaceae sp. (например, лимоны, апельсины, мандарины и грейпфруты); Solanaceae sp. (например, томаты, картофель, перец, красный перец, баклажаны, табак), Liliaceae sp., Compositae sp. (например, салат, артишоки и цикорий, включая цикорий корневой, эндивий или цикорий обычный), Umbelliferae sp. (например, морковь, петрушка, сельдерей), Cucurbitaceae sp. (например, огурцы, включая корнишоны, а также тыквы, арбузы, горлянки и дыни), Alliaceae sp. (например, порей и лук), Cruciferae sp. (например, капуста белокочанная, капуста краснокочанная, брокколи, цветная капуста, брюссельская капуста, пекинская капуста, кольраби, редис, хрен, кресс-салат и петсай), Leguminosae sp. (например, арахис, горох, чечевица и фасоль, например, фасоль обычная и кормовые бобы), Chenopodiaceae sp. (например, листовая свекла, кормовая свекла, шпинат, красная свекла), Linaceae sp. (например, конопля), Cannabeacea sp. (например, конопля посевная), Malvaceae sp. (например, окра, какао), Papaveraceae (например, мак), Asparagaceae (например, спаржа); полезные растения и декоративные растения в садах и лесах, включая дерновые и газонные травы и Stevia rebaudiana; и, в любом случае, генетически модифицированные типы этих растений.
В некоторых аспектах продукт ферментации также включает ингредиент для рецептирования. Ингредиентом для рецептирования может быть увлажняющий агент, наполнитель, растворитель, средство, которое содействует текучести, эмульгатор, диспергатор, антифриз, загуститель и/или адъювант. В одном варианте воплощения ингредиентом для рецептирования является увлажняющий агент. В других аспектах продуктом ферментации является высушенный замораживаниям порошок или высушенный распылениям порошок.
Композиции согласно данному изобретению могут включать ингредиенты для рецептирования, которые прибавляют к композициям согласно данному изобретению для улучшения восстановления, эффективности или физических свойств и/или для содействия обработке, упаковке и введению. Такие ингредиенты для рецептирования могут добавляться отдельно или в комбинации.
Ингредиенты для рецептирования прибавляют к композициям, которые включают клетки, бесклеточные препараты, выделенные соединения та/или метаболиты, для улучшения эффективности, стойкости и физических свойств, пригодности для использования та/или для содействия обработке, упаковке та конечному применению. К таким ингредиентам для рецептирования могут относится приемлемые для применения в сельском хозяйстве носители, инертные компоненты, стабилизаторы, консерванты, питательные вещества или модификаторы физических свойств, которые могут добавляться отдельно или в комбинации. В некоторых вариантах воплощения носители могут включать жидкие материалы, такие как вода, масло и другие органические или неорганические растворители, и твердые материалы, такие как минералы, полимеры или полимерные комплексы, полученные биологически или путем химического синтеза. В некоторых вариантах воплощения ингредиентом для рецептирования является связующее вещество, адъювант или адгезив, который содействует прилипанию композиции к части растения, такой как листва, семена или корни. См., например, Taylor, A.G., et al., "Concepts and Technologies of Selected Seed Treatments," Annu. Rev. Phytopathol., 28: 321-339 (1990). Стабилизаторы могут включать средства против комкования, антиоксиданты, противоосадительные средства, противовспенивающие, сиккативы, протравщики или консерванты. Питательные вещества могут включать источники углерода, азота и фосфора, такие как сахара, полисахариды, масло, белки, аминокислоты, жирные кислоты и фосфаты. Модификаторы физических свойств могут включать объемообразующие агенты, смачивающие агенты, загустители, модификаторы рН, модификаторы реологических свойств, диспергаторы, адъюванты, поверхностно-активные вещества, пленкообразовывающие агенты, гидротропы, наполнители, антифризы или красители. В некоторых вариантах воплощения композиция, которая включает клетки, бесклеточный препарат та/или метаболиты, образованные шляхом ферментации, может быть примененная непосредственно с водой как разбавителем или без нее и без дальнейшего приготовления композиции. В конкретном варианте воплощения увлажняющий агент или диспергатор прибавляют к ферментационному твердому веществу, такому как высушенный замораживаниям или высушенный распылениям порошок. Увлажняющий агент улучшает свойства растекания и проникновения, а диспергатор повышает диспергируемость и растворимость активного ингредиента (уже разбавленного), когда его наносят на поверхности. Типичные смачивающие агенты являются известными специалистам в данной области, и к ним принадлежат сульфосукцинаты и производные, такие как MULTIWETTM MO-70R (Croda Inc., Edison, NJ); силоксаны, такие как BREAK-THRU (Evonik, Germany); неионные соединения, такие как ATLOXTM 4894 (Croda Inc., Edison, NJ); алкилполиглюкозиды, такие как TERWET 3001 (Huntsman International LLC, The Woodlands, Texas); C12-C14 этоксилаты спиртов, такие как TERGITOL 15-S-15 (The Dow Chemical Company, Midland, Michigan); эстеры фосфорной кислоты, такие как RHODAFAC BG-510 (Rhodia, Inc.); и карбоксилаты алкиловых этеров, такие как EMULSOGENTM LS (Clariant Corporation, North Carolina).
ИНФОРМАЦИЯ О ДЕПОНИРОВАНИИ Образец штамма вида Paenibacillus согласно изобретению был депонирован в Коллекции культур Службы сельскохозяйственных исследований, которая располагается в Национальном центре исследований использования сельскохозяйственной продукции Службы сельскохозяйственных исследований Министерства сельского хозяйства США (NRRL), 1815 North University Street, Peoria, IL 61604, U.S.A., согласно Будапештскому соглашению 28 августа 2014 г., и ему был присвоен такой номер доступа: NRRL В-50972.
Образец штамма вида Paenibacillus, который происходит от штамма вида Paenibacillus NRRL В-50972, что демонстрирует стойкую структуру колоний, был депонирован в Коллекции культур Службы сельскохозяйственных исследований, которая располагается в Национальном центре исследований использования сельскохозяйственной продукции Службы сельскохозяйственных исследований Министерства сельского хозяйства США (NRRL), 1815 North University Street, Peoria, IL 61604, U.S.A., согласно Будапештскому соглашению 1 сентября 2015 г. и ему был присвоен такой номер доступа: NRRL В-67129.
Штамм вида Paenibacillus был депонирован на условиях, которые гарантируют доступ к культуре на протяжении периода рассмотрения этой патентной заявки лицу, определенному Комиссаром из патентов и товарных знаков как такое, что имеет на это право согласно Кодексу федеральных правил США 37 C.F.R. § 1.14 и Кодекса законов США 35 U.S.C. §122. Однако следует понимать, что доступность депонированного образца не предусматривает лицензии на практическое осуществление данного изобретения в порядке отступления от патентных прав, которые предоставляются правительственными органами.
Представленные ниже примеры являются лишь объяснительными и не ограничивают объема данного изобретения.
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Выбор Paenibacillus sp.NRRL В-50972
Геномы нескольких штаммов вида Paenibacillus подвергали секвенированию. Геномные данные анализировали для распознавания штаммов с кластером генов биосинтеза фусарицидина, но без кластера генов полимиксинсинтетазы. Кластер генов, который отвечает за биосинтез фусарицидина (fusA), был распознан и охарактеризован раньше, так же, как и кластер генов полимиксинсинтетазы. См., например, Li et al., "Nonribosomal Biosynthesis of Fusaricidins by Paenibacillus polymyxa PKB1 Involves Direct Activation of a D-Amino Acid," Chemistry & Biology, 15: 118 - 127 (2008); Li et al, "Promoter Analysis and Transcription Regulation of fus Gene Cluster Responsible for Fusaricidin Synthesis of Paenibacillus polymyxa SQR-21," Applied Microbiol Biotechnol, 97: 9479-9489 (2013); и Choi et al, "Identification of a Polymyxin Synthetase Gene Cluster of Paenibacillus polymyxa and Heterologous Expression of the Gene in Bacillus subtilis" Journal of Bacteriology, 191(10): 3350-3358 (2009).
Штаммы, распознанные путем этого анализа, подвергали дальнейшей оценке для подтверждения изготовления фусарицидина. В общих чертах, каждый штамм культивировали в среде на основе сои и липофильную фракцию сплошного бульона экстрагировали. Экстракт сплошного бульона анализировали путем высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и присутствие фусарицидина А определяли на основе профиля ВЭЖХ, полученного со стандартным образцом, который содержал фусарицидин А.
Пример 2. In planta противогрибковая активность сплошных бульонов штаммов вида Paenibacillus
Выбранные штаммы вида Paenibacillus, которые включали штамм вида Paenibacillus NRRL В-50972, выращивали в среде на основе сои для продуцирования культур в сплошных бульонах. Дистиллированную воду прибавляли к каждому из сплошных бульонов для получения 10% конечного разведения.
Разбавленные сплошные бульоны наносили на листву молодых растений, которые потом подвергали действию грибкового инокулума фитофтороза томатов (PHYTIN), серой гнили (BOTRCI) или листовой ржавчины пшеницы (PUCCRT). Необработанный контрольный образец включали в каждый анализ в качестве сравнения. Через несколько дней после подвергания действию грибковых инокулумов определяли показатели каждого растения для процентного контроля патогенов относительно необработанных контрольных растений. Каждую обработку оценивали в трех экземплярах, и средний процентный контроль для сплошного бульона каждого штамма вида Paenibacillus показан на ФИГ. 1.
Из 23 штаммов, исследованных на противогрибковую активность против PHYTIN, BOTRCI и PUCCRT штамм вида Paenibacillus NRRL В-50972 был одним из немногих штаммов, который имел относительно высокий уровень активности против всех трех грибковых патогенов.
Пример 3. In vitro биологическая эффективность фусарицидинового экстракта штамма вида Paenibacillus NRRL В-50972
Культуры в сплошных бульонах нескольких штаммов вида Paenibacillus, включая Paenibacillus sp.NRRL В-50972, приготавливали, используя среду на основе сои. Липофильные фракции, которые содержали фусарицидины, экстрагировали из сплошных бульонов. Три отдельных фракции, которые содержали разные фусарицидины и противогрибковые метаболиты, получали из экстракта сплошного бульона из первого штамма вида Paenibacillus (то есть Фракцию 1, Фракцию 2 и Фракцию 3). Экстракт из штамма вида Paenibacillus NRRL В-50972 не подвергали дальнейшему выделению.
Фракции, которые содержали фусарицидин, из каждого штамма подвергли испытанию на таких двенадцати грибковых патогенах: Alternaria alternata (ALTEAL), Botrytis cinerea (BOTRCI), Fusarium culmorum (FUSACU), Phaeosphaeria nodorum (LEPTNO), Zymoseptoria tritici (SEPPTR), Phytophthora cryptogea (PHYTCR), Phytophthora infestans (PHYTIN), Pythium ultimum (PYTHUL), Magnaporthe oryzae (PYRIOR), Thanatephorus cucumeris (RHIZSO), Ustilago segetum var. avenae (USTIAV) и Uromyces appendiculatus (UROMAP). Ингибирование роста грибковых клеток разными фракциями определяли в среде на основе сои и сравнивали с ростом необработанных контрольных образцов. Подвергли испытанию восемь доз каждой фракции от 0,005 ррт до 100 ррт.Эффективные дозы, которые обеспечивают 50% ингибирование (ED50) и 80% ингибирование (EDgo), указаны в таблице на ФИГ. 2.
Фракция, которая содержала фусарицидин, штамма вида Paenibacillus NRRL В-50972, демонстрировала широкий спектр противогрибковой активности в двенадцати анализах, что не наблюдалось для фракций из другого штамма вида Paenibacillus. Фракция штамма вида Paenibacillus NRRL В-50972 также демонстрировала значительно большую активность в анализах сравнительно с той, которая наблюдалась для фракций из другого штамма вида Paenibacillus (см. ФИГ. 2).
Пример 4. In vivo профилактическое испытание на томатах, инфицированных фитофторой
В этом осуществляемом в оранжерее испытании растительного патогена продукт ферментации штамма вида Paenibacillus NRRL В-50972 подвергли испытанию в сравнении с тремя другими штаммами вида Paenibacillus, которые продемонстрировали относительно высокую противогрибковую активность в предыдущих отборочных анализах. Для приготовления пригодной композиции соединений 1 часть по массе высушенного распылением порошка сплошного бульона из каждого штамма, культивированного в среде на основе сои, смешивали с водой и 0,1 части по массе эмульгатора (полигликолевого этера аралкила), а потом разводили водой до нужной концентрации.
Для исследования профилактической активности молодые растения опрыскивали композицией соединения при указанной норме применения. После высыхания нанесенного опрыскиванием покрытия, растения инокулировали водной суспензией спор Phytophthora infestans. После этого растения помещали в инкубационную камеру при приблизительно 20°С и относительной влажности атмосферы 100%.
Результаты исследования оценивали через 3 дня после инокуляции. 0% означает эффективность, которая отвечает показателю необработанного контрольного образца, тогда как эффективность 100% означает, что болезнь не наблюдалась.
Пример 5. In vivo профилактическое исследование на винограде, инфицированном Plasmopara
В этом осуществляемом в оранжерее исследовании растительного патогена продукт ферментации штамма вида Paenibacillus NRRL В-50972 подвергли испытанию в сравнении с тремя другими штаммами вида Paenibacillus, которые продемонстрировали относительно высокую противогрибковую активность в предыдущих отборочных анализах. Для приготовления пригодной композиции соединений 1 часть по массе высушенного распылением порошка, приготовленного, как в Примере 5, смешивали с водой и 0,1 части по массе эмульгатора (полигликолевого этера аралкила), а потом разводили водой до нужной концентрации.
Для исследования профилактической активности молодые растения опрыскивали композицией соединения при указанной норме применения. После высыхания нанесенного опрыскиванием покрытия, растения инокулировали водной суспензией спор Plasmopara viticola, а потом оставляли на 1 день в инкубационной камере при приблизительно 20°С и относительной влажности атмосферы 100%. После этого растения помещали на 4 дня в оранжерее при приблизительно 21°С и относительной влажности атмосферы приблизительно 90%. После этого растения опрыскивали и помещали на 1 день в инкубационную камеру.
Результаты испытания оценивали через 6 дней после инокуляции. 0% означает эффективность, которая отвечает показателю необработанного контрольного образца, тогда как эффективность 100% означает, что болезнь не наблюдалась.
Пример 6. In vivo профилактическое исследование фасоли, инфицированной Uromyces
В этом осуществляемом в оранжерее исследовании растительного патогена продукт ферментации штамма вида Paenibacillus NRRL В-50972 подвергли испытанию в сравнении с тремя другими штаммами вида Paenibacillus, которые продемонстрировали относительно высокую противогрибковую активность в предыдущих отборочных анализах. Для приготовления пригодной композиции соединений 1 часть по массе высушенного распылением порошка, приготовленного, как в Примере 5, смешивали с водой и 0,1 части по массе эмульгатора (полигликолевого этера аралкила), а потом разводили водой до нужной концентрации.
Для исследования профилактической активности молодые растения опрыскивали композицией соединения при указанной норме применения. После высыхания нанесенного опрыскиванием покрытия, растения инокулировали водной суспензией спор возбудителя ржавчины бобовых (Uromyces appendiculatus), а потом оставляли на 1 день в инкубационной камере при приблизительно 20°С и относительной влажности атмосферы 100%.
После этого растения помещали в оранжерею при приблизительно 21°С и относительной влажности атмосферы приблизительно 90%.
Результаты исследования оценивали через 10 дней после инокуляции. 0% означает эффективность, которая отвечает показателю необработанного контрольного образца, тогда как эффективность 100% означает, что болезнь не наблюдалась.
Пример 7. Сравнение штаммов Paenibacillus в полевом испытании цуккини, инфицированного истинной мучнистой росой (Sphaerotheca fulieinea)
Осуществляли два полевых испытания на цуккини, искусственно инокулированного Sphaerotheca fuliginea. Пять образцов для обработки с высушенным распылением порошком сплошного бульона из каждого штамма вида Paenibacillus, который культивировали в среде на основе сои, повторно суспендировали в воде в объеме для применения 1000 л/га и наносили на растения с 15 июля по 8 августа на стадии роста с ВВСН59 по ВВСН72 с 8-дневными интервалами, как указано в Таблице 6. Процент контроля над болезнью, показанный в Таблице 5, является результатом последней оценки, осуществленной через 10 дней после конечного применения, которую осуществляли путем визуального наблюдения за симптомами болезни. 0% означает эффективность, которая отвечает показателю необработанного контрольного образца, тогда как эффективность 100% означает, что болезнь не наблюдалась.
Результаты в Таблице 4 четко демонстрируют, что активность штамма вида Paenibacillus NRRL В-50972, которая наблюдается, превышает показатели других штаммов, которые подвергли испытанию в этом полевом испытании, которые продемонстрировали относительно высокую противогрибковую активность в предыдущих отборочных анализах.
Пример 8. Сравнение штаммов Paenibacillus в полевом испытании на винограде, инфицированном истинной мучнистой росой (Uncinula Necator)
Осуществляли два полевых испытания на винограде, естественно инфицированном Uncinula necator. Шесть образцов для обработки с высушенными распылением порошками, которые описаны в Примере 8, повторно суспендировали в воде в объеме для применения 1000 л/га и наносили на растения с 3 июня по 1 июля на стадии роста с ВВСН57 по ВВСН75 с 7-дневными интервалами, как указано в Таблице 8. Процент контроля над болезнью, показанный в Таблице 7, является результатом последней оценки, осуществленной 15 дней после конечного применения, которую осуществляли путем визуального наблюдения за симптомами болезни. 0% означает эффективность, которая отвечает показателю необработанного контрольного образца, тогда как эффективность 100% означает, что болезнь не наблюдалась.
Результаты в Таблице 7 четко демонстрируют, что активность штамма вида Paenibacillus NRRL В-50972, которая наблюдается, превышает показатели других штаммов, которые подвергли испытанию в этом полевом испытании, которые продемонстрировали относительно высокую противогрибковую активность в предыдущих отборочных анализах.
Пример 9. Сравнение штаммов Paenibacillus в полевых испытаниях на томатах, инфицированных альтернариозом (Alternaria solani)
Осуществляли два полевых испытания на растениях томатов, искусственно инокулированных Alternaria solani. Три образца для обработки с высушенными распылением порошками, которые описаны в Примере 8, повторно суспендировали в воде в объеме для применения 1000 л/га и наносили на растения с 26 июня по 10 июля на стадии роста с ВВСН51 по ВВСН59 с 8-дневными интервалами, как указано в Таблице 10. Процент контроля над болезнью, показанный в Таблице 9, является результатом последней оценки, осуществленной 8 дней после конечного применения, которую осуществляли путем визуального наблюдения за симптомами болезни. 0% означает эффективность, которая отвечает показателю необработанного контрольного образца, тогда как эффективность 100% означает, что болезнь не наблюдалась.
Результаты в Таблице 9 четко демонстрируют, что активность штамма вида Paenibacillus NRRL В-50972, которая наблюдается, превышает показатели других штаммов, которые подвергли испытанию в этом полевом испытании, которые продемонстрировали относительно высокую противогрибковую активность в предыдущих отборочных анализах.
Пример 10. Сравнение штаммов Paenibacillus в полевых испытаниях на картофеле, инфицированном альтернариозом (Alternaria solani)
Осуществляли полевое испытание на растениях картофеля, искусственно инокулированных Alternaria solani. Пять образцов для обработки с высушенными распылением порошками, которые описаны в Примере 8, повторно суспендировали в воде в объеме для применения 500 л/га и наносили на растения с 25 июня по 19 июля на стадии роста с ВВСН37 по ВВСН55 с 8-дневными интервалами, как указано в Таблице 12. Процент контроля над болезнью, показанный в Таблице 11, является результатом последней оценки, осуществленной 6 дней после конечного применения, которую осуществляли путем визуального наблюдения -за симптомами болезни. 0% означает эффективность, которая отвечает показателю необработанного контрольного образца, тогда как эффективность 100% означает, что болезнь не наблюдалась.
Результаты в Таблице 11 четко демонстрируют, что активность штамма вида Paenibacillus NRRL В-50972, которая наблюдается, превышает показатели других штаммов, которые подвергли испытанию в этом полевом испытании, которые продемонстрировали относительно высокую противогрибковую активность в предыдущих отборочных анализах.
Пример 11. Сравнение штаммов Paenibacillus в полевых испытаниях на картофеле, инфицированном альтернариозом (Alternaria solani)
Осуществляли полевое испытание на растениях картофеля, искусственно инокулированных Alternaria solani. Три образца для обработки с высушенными распылением порошками, которые описаны в Примере 8, повторно суспендировали в воде в объеме для применения 500 л/га и наносили на растения с 24 июля по 5 августа на стадии роста с ВВСН37 по ВВСН51 с 6-дневными интервалами, как указано в Таблице 14. Процент контроля над болезнью, показанный в Таблице 13, является результатом последней оценки, осуществленной 6 дней после конечного применения, которую осуществляли путем визуального наблюдения за симптомами болезни. 0% означает эффективность, которая отвечает показателю необработанного контрольного образца, тогда как эффективность 100% означает, что болезнь не наблюдалась.
Результаты в Таблице 13 четко демонстрируют, что активность штамма вида Paenibacillus NRRL В-50972, которая наблюдается, превышает показатели других штаммов, которые подвергли испытанию в этом полевом испытании, которые продемонстрировали относительно высокую противогрибковую активность в предыдущих отборочных анализах.
Пример 12. Распознавание вариации fusA в штамме вида Paenibacillus NRRL В-50972
Для дополнительной характеризации штамма вида Paenibacillus NRRL В-50972 геномную последовательность гена fusA, который кодирует FusA фусарицидинсинтетазу, определяли стандартными способами секвенирования и распознавали соответствующую аминокислотную последовательность. Аминокислотную последовательность с FusA, что экспрессируется штаммом вида Paenibacillus NRRL В-50972, сравнивали с последовательностью нескольких других штаммов Paenibacillus, включая те, которые описываются в таких публикациях:
Li S., et al., (2014). "Complete Genome Sequence of Paenibacillus polymyxa SQR-21, a Plant Growth-Promoting Rhizobacterium with Antifungal Activity and Rhizosphere Colonization Ability," Genome Announc, 2(2):HASH(0x743db288);
Niu В., et al, (2011). "The Genome of the Plant Growth-Promoting Rhizobacterium Paenibacillus polymyxa M-l Contains Nine Sites Dedicated to Nonribosomal Synthesis of Lipopeptides and Polyketides," J. Bacteriol. 193(20): 5862 - 3;
Ma M., et al, (2011) "Complete Genome Sequence of Paenibacillus polymyxa SC2, A Strain of Plant Growth-Promoting Rhizobacterium with Broad-Spectrum Antimicrobial Activity," J. Bacteriol. 193(1): 311 - 2; и
Li and Jensen, (2008). Nonribosomal Biosynthesis of Fusaricidins by Paenibacillus polymyxa PKB1 Involves Direct Activation of a d-amino Acid. Chem. Biol. 15, 118-127.
Выравнивание, показанное на ФИГ. 13, выявило значительные делеции в вариантной FusA фусарицидинсинтетазе, которая экспрессируется Paenibacillus sp.NRRL В-50972. Первая делеция простирается от позиции 3009 до позиции 3037 соответствующей последовательности в штамме вида Paenibacillus A (SEQ ID NO: 11). Вторая делеция простирается от позиции 3047 до позиции 3317 соответствующей последовательности в штамме вида Paenibacillus A (SEQ ID NO: 11). Обе делеции ограничиваются А доменом третьего модуля фусарицидинсинтетазы FusA (то есть FusA-А3).
Как объяснялось выше, каждый из А доменов содержит десять консервативных аминокислотных остатков, которые отвечают за распознавание и активацию субстрата (см. Таблицу 1). Эти консервативные аминокислотные остатки являются обведенными в выравнивании, показанном на ФИГ. 13. Делеции, распознанные в вариантной FusA фусарицидинсинтетазе, которая экспрессируется штаммом вида Paenibacillus NRRL В-50972, удаляют все консервативные аминокислотные остатки, кроме последнего (то есть Lys517, расположенного в положении 3486 последовательности SEQ ID NO: 11).
Эти две делеции в вариантной FusA фусарицидинсинтетазе присутствуют в штаммах, которые происходят от штамма вида Paenibacillus NRRL В-50972, включая вариантный штамм со стойкой структурой колоний, обозначенный авторами как штамм вида Paenibacillus NRRL В-67129. Случайные мутантные штаммы, которые происходят от штамма вида Paenibacillus NRRL В-50972, по обыкновению сохраняют делеции в варианте FusA-А3, поскольку обратная мутация к дикому типу FusA-А3 является очень маловероятной из-за широкого характера делеции.
Пример 13. Сравнение изготовления фусарицидина в штамме вида Paenibacillus NRRL В-50972 и штамме А вида Paenibacillus
Для определения влияния варианта FusA-А3 количественно определяли панель фусарицидинов и Paeniserine в штамме вида Paenibacillus NRRL В-50972 (который экспрессирует вариант FusA-А3) и штамме вида Paenibacillus А (который экспрессирует FusA-А3 дикого типа) с применением способа, описанного в Примере 14. Подлинность каждого соединения определяли за его уникальными временем удержания и массой. Относительная интенсивность сигнала каждого пика в спектрах представлена в Таблице 15. Абсолютное количественное определение было невозможно при отсутствии очищенных стандартов. Правда, каждый экстракт клеток вводили почти в одинаковом количестве, и относительное количество соединений может быть определено по полученной интенсивности сигнала.
В FusA фусарицидинсинтетазе дикого типа FusA-А3 отвечает за включение L-Tyr, L-Phe, L-Val, L-Ile или L-allo-Ile в соединения фусарицидина в аминокислотной позиции (3) (см. Таблицу 1). Вариант FusA-А3 в штамме вида Paenibacillus NRRL В-50972 дает экстракт без любого заметного фусарицидина С, фусарицидина D, LiF07a или LiF07b. Фусарицидин С и фусарицидин D имеют тирозин в аминокислотной позиции (3), тогда как LiF07a и LiF07b имеют фенилаланин в аминокислотной позиции (3). Эти экспериментальные данные демонстрируют, что генетическая вариация в FusA-А3, что экспрессируется штаммом вида Paenibacillus NRRL В-50972, ингибирует биосинтез фусарицидинов с тирозином или фенилаланином в аминокислотной позиции (3) (см. ФИГ. 14).
Таким образом, штамм вида Paenibacillus NRRL В-50972 и мутантные штаммы, которые происходят от штамма вида Paenibacillus NRRL В-50972, не являются способными продуцировать заметное количество фусарицидинов или подобных фусарицидину соединений с тирозином или фенилаланином в аминокислотной позиции (3) (например, Фусарицидинов С и D или LiF07a и LiF07b). Анализ варианта FusA-аЗ в штамме вида Paenibacillus NRRL В-50972 указывает, что этот штамм и его мутанты генетически не способны продуцировать фусарицидины или аналоги фусарицидина с пептидными кольцами, которые включают аминокислоту тирозин или аминокислоту фенилаланин в аминокислотной позиции (3).
Из двух проанализированных Paeniserine лишь один оказывался в штамме вида Paenibacillus А, и интенсивность его сигнала была меньше чем половина соответствующей интенсивности сигнала, которую наблюдали в экстракте штамма вида Paenibacillus NRRL В-50972. Без привязывания к любой теории оказывается, что одна или несколько из первых девяти консервативных аминокислот в FusA-а3 (то есть Asp235, Ala236, Ser239, Thr278, Leu299, Ala301, Ala/Gly322, Val330 и Cys331) отвечают за распознавание и активацию тирозина и фенилаланина в положении (3) в соединениях фусарицидина. Кроме того, вариант FusA-аЗ, который экспрессируется штаммом вида Paenibacillus NRRL В-50972, может сдвигать промежуточные продукты обмена веществ от продуцирования некоторых фусарицидинов в направлении биосинтеза более широкого круга подобных фусарицидину соединений (например, Paeniserine).
Пример 14. Сравнение биоактивности штамма вида Paenibacillus NRRL В-50972 и штамм вида Paenibacillus А
Штамм вида Paenibacillus NRRL В-50972 ('который экспрессирует вариант FusA-а3) и штамм вида Paenibacillus А (который экспрессирует дикого типа FusA-а3) культивировали в среде на основе сои для получения сплошных бульонов. Сплошные бульоны разводили в смеси воды и органического растворителя до концентрации 10%, 5%, 2,5% и 1,25%. Разбавленные сплошные бульоны применяли к молодым растениям, которые потом подвергали действию инокулума Puccinia triticina (PUCCRT), Botrytis cinerea (BOTRCI) или Phytophthora infestans (PHYTIN). Через несколько дней после подвергания действию инокулума растительного патогена, определяли показатели каждого растения для процентного контроля патогенов относительно необработанных контрольных растений. Каждую обработку оценивали в трех экземплярах и указывали средний процент контроля (см. Таблицы 16-18).
В каждом из анализов штамм вида Paenibacillus NRRL В-50972 демонстрировал лучший контроль в сравнении со штаммом вида Paenibacillus А. Эти экспериментальные данные свидетельствуют, что вариантная фусарицидинсинтетаза и вызванные в результате изменения в биосинтезе фусарицидинов и подобных фусарицидину соединений обеспечивают лучший контроль над растительными патогенами со штаммом вида Paenibacillus NRRL В-50972.
Пример 15. Распознавание фусарицидинов в экстракте клеток вида Paenibacillus
Штамм вида Paenibacillus NRRL В-50972 и/или производные от него штаммы выращивали в среде на основе сои до тех пор, пока они не достигали стационарной фазы, после чего культуру сплошного бульона собирали и экстрагировали органическим растворителем для получения экстракта клеток.
Хроматографический способ с применением высокоэффективной жидкостной хроматографии / времяпролетной масс-спектрометрии (BEPX/MS TOF) был разработан для обособления многих подобных фусарицидину молекул от экстракта клеток: колонка: YMCTM Basic 4,6×250 мм, 5 мкм; вода (0,1% FA) и ацетонитрил (0,1% муравьиной кислоты (FA)); градиент (%В): 0-9 мин 28-30%; 9-14 мин 30-33%; 14-34 мин 33-50%; промывание.
Хроматограмму экстракта клеток, в котором распознаны известные фусарицидины, показано на ФИГ. 4В. Общая структура фусарицидинов представлена на ФИГ. 4А. Каждый циклический фусарицидин имеет соответствующий ациклический аналог.
Все фусарицидины в экстракте клеток, которые подвергаются выявлению, распознавали на основе их времени удержания и значений m/z (см. ФИГ. 4С). Интересным является то, что фусарицидины С и D и другие фусарицидины, в которых аминокислотой в положении (3) является тирозин или фенилаланин, в экстракте клеток не оказывались.
Приклад 16. Характеризация Paeniserine в экстракте клеток вида Paenibacillus
Для распознавания других соединений в экстракте клеток штамма вида Paenibacillus NRRL В-50972 и/или производных от него штаммов был разработан хроматографический способ с применением сверхэффективной жидкостной хроматографии / масс-спектрометрии с тройным временем пролета (UPLC/MS Triple TOF) для фрагментации многих подобных фусарицидину молекул: колонка: ZORBAX™ Eclipse Plus, 2,1 х 100 мм, 1,8 мкм; вода (0,1% FA); градиент (%В): 0-5 мин 10 - 95%; промывание.
Таким образом, заявителем была охарактеризована новая семья Paeniserine, что относится к фусарицидинам, путем исследования масс-спектров фрагментации, полученных с помощью масс-спектрометра АВ SCIEX TRIPLE TOF, а также путем сравнения спектров с данными, опубликованными в литературе. Заявитель назвал эту новую семью Paeniserine. Типичные масс-спектры фрагментации с применением UPLC/MS Triple TOF и соответствующие химические структуры для Paeniserine A1 и Paeniserine В1 показаны на ФИГУРАХ 5 и 6, соответственно. Подобный анализ выполняли для каждого Paeniserine, выявленного в экстракте клеток.
Paeniserine был так назван из-за значительного отклонения от фусарицидинового скелета с одним или несколькими сериновыми замещениями (см. ФИГ. 5А). Традиционно для того, чтобы считаться фусарицидином, пептидная последовательность содержала три консервативные аминокислоты: (1) треонин, (4) треонин и (6) аланин. Однако Paeniserine демонстрируют новые замещения одного или обоих треониновых остатков (1) и (4), замененных на серии. Аминокислоты в позициях (2) и (3) обе являются валином в Paeniserine, охарактеризованных Заявителем. Хроматограмма, на которой распознаны пики, которые отвечают Paeniserine, показана на ФИГ. 5В.
Заявитель также охарактеризовал эту семью серин-замещенных подобных фусарицидину соединений в экстракте клеток на основе их времени удержания и значений m/z (см. ФИГ. 5С). Хотя Paeniserine С4 не выявлялся, логически было бы ожидать его продуцирования, основываясь на структурах охарактеризованных раньше фусарицидинов. Так же, как фусарицидины, каждый циклический Paeniserine имеет соответствующий ациклический аналог.
Важно заметить, что хотя Paeniserine, охарактеризованные Заявителем, имеют аминокислоту валин в остатках (2) и (3), очевидно, существуют соединения с вариациями в этих позициях. Эти возможные вариации должны быть подобны аналогам фусарицидина / LiF с такими аминокислотами, как изолейцин, фенилаланин и тирозин как остатками (2) и (3). Кроме того, хотя хвост GHPD был описан выше, есть вероятность существования соединений с вариациями в длине хвоста, которые являются подобными семье Paeniprolixin (см. Пример 17).
Пример 17. Характеризация Paeniprolixin в экстракте клеток вида Paenibacillus
Экстракт клеток штамма вида Paenibacillus NRRL В-50972 и/или производных от него штаммов дополнительно анализировали, применяя хроматографический способ, описанный в Примере 14. Новую семью фусарицидинов характеризовали путем исследования массы-спектра фрагментации, полученного с помощью масс-спектрометра АВ SCIEX TRIPLE TOF, а также путем сравнения спектров с опубликованными в литературе. Заявитель назвал эту новую семью Paeniprolixin. Типичные масс-спектры фрагментации UPLC/MS Triple TOF и соответствующие химические структуры для Paeniprolixin С1 и Paeniprolixin D1 показаны на ФИГУРАХ 8 и 9, соответственно. Подобный анализ выполняли для каждого из Paeniprolixin, выявленных в экстракте клеток.
Paeniprolixin был назван за латинским словом "prolix" ("длинный") из-за еще одного значительного отклонения от скелета фусарицидина в алифатическом хвосте, то есть Paeniprolixin имеют более длинный хвост, чем у фусарицидинов. Раньше наблюдались лишь фусарицидины, которые имеют конкретный хвост GHPD. Это было отображено даже в наиболее поздней публикации по данной теме (то есть Vater et al., J. Am. Soc. Mass Spectrom., 2015, 26, 1130-1141), в которой авторы заявляют, что "это открытие [четко консервативный хвост GHPD] контрастирует со многими другими липопептидами, о которых сообщается в литературе, в которых жирнокислотная часть является главным объектом структурной вариации, например, как в сурфактинах, итуринах и фенгицинах". Заявитель распознал семью подобных фусарицидину соединений с более длинным хвостом (то есть 3-гидроксигептадекановая кислота или GHPD+2СНг и 3-гидроксинонадекановая кислота или GHPD+4СНг) (см. ФИГ. 8А) в экстракте клеток вида Paenibacillus NRRL В-50972. В отличие от Paeniserine, Paeniprolixin сохраняют консервативные аминокислотные остатки L-треонина в положении (1) и D-allo-треонина в положении (4).
Важно отметить, что хотя Paeniprolixin, охарактеризованные Заявителем, имели аминокислоты валин или изолейцин в остатках (2) и (3), существует вероятность существования соединений с вариациями в этих положениях. Эти возможные вариации должны быть подобны аналогам фусарицидина / LiF, например, с другими комбинациями валина, изолейцина или других аминокислот, таких как фенилаланин и тирозин, как остатков (2) и (3). Кроме того, существует вероятность существования гибридных комбинаций с Paeniserine, описанных выше, которые имеют большую длину хвоста.
Хроматограмма, на которой распознаны пики, которые отвечают Paeniprolixin, показана на ФИГ. 8В. Эта семья подобных фусарицидину соединений с более длинными хвостами GHPD также была охарактеризована на основе их времени удержания и значений m/z (см. ФИГ. 8С). Хотя Paeniprolixin С2 и D2 не выявлялись, логически было бы ожидать их продуцирование, основываясь на структурах охарактеризованных раньше фусарицидинов. Так же как фусарицидины, каждый циклический Paeniprolixin имеет соответствующий ациклический аналог.
Пример 18. Профили противогрибковой биоактивности Paeniserine, Paeniprolixin и других фусарицидинов
Образцы, показанные в Таблице 19, выделяли из клеток вида Paenibacillus. Ферментированный сплошной бульон центрифугировали для удаления супернатанта. Образованный осадок потом экстрагировали в метаноле. Полученный в результате экстракт фракционировали, применяя жидкостную хроматографию среднего давления с обращением фаз. Потом фракции подвергали дальнейшему очищению, применяя препаративную хроматографию высокого давления с обращением фаз.
Для in vitro анализа на противогрибковую активность в 96-лунковом планшете применяют реагент для определения жизнеспособности клеток на основе резазурина PRESTOBLUE в качестве индикатора роста грибов. Начиная с грибковых спор, анализ позволяет измерять способность образца к ингибированию прорастания грибковых спор и/или роста грибковых клеток.
Анализ осуществляли для трех связанных с сельским хозяйством грибковых заболеваний: Alternaria solani (ALTESO), Colletotrichum lagenarium (COLLLA) и Botrytis cinerea (BOTRCI).
Все образцы, указанные в Таблице 19, оказались активными против связанных с сельским хозяйством грибковых заболеваний (см. минимальную ингибирующую концентрацию для 80% (MIC80) значений, представленных в единицах на миллион (ррт) для каждого образца в Таблице 20). Интересным является то, что некоторые соединения, очевидно, имеют непостоянную активность против определенных болезней. Например, хотя аналоги аспарагина в Образце 3, очевидно, являются важными для контроля над ALTESO, глутаминовые аналоги такого же типа соединения в Образце 4 были более задействованными в контроле над COLLLA. Аналоги с длиннее хвостом в Образце 6 были наиболее мощными ингибиторами COLLLA. Это свидетельствует о том, что, хотя все они являются активными сами по себе, комбинация этих составляющих является важной для конечной эффективности готового продукта и спектра его контроля над болезнью.
Пример 19. Профили антибактериальной биоактивности Paeniserine. Paeniprolixin и других фусарицидинов
Для in vitro анализа на антибактериальную активность в 96-лунковом планшете используют поглотительную способность как индикатор бактериального роста. Анализ позволяет измерять эффективность образца в ингибировании бактериального роста путем сравнения поглотительной способности необработанных лунок и лунок с образцом. Последнее разведение/концентрация, которая ингибирует рост бактерий, называется MIC (минимальная ингибирующая концентрация), и это значение может использоваться для сравнения эффективности разных образцов. Анализ оценивали с тремя связанными с сельским хозяйством бактериальными болезнями: Xanthomonas campestris (XANTAV), Pseudomonas syringae (PSDMTM) и Erwinia carotovora (ERWICA).
Образцы, указанные в Таблице 19, применяли в антибактериальных анализах для определения значений MIC80 для каждого бактериального патогена. Результаты анализа представлены в Таблице 21. Образцы 1-5 оказались активными против связанных с сельским хозяйством бактериальных болезней. Интересным является то, что некоторые соединения, очевидно, имеют непостоянную активность против определенных болезней. Например, Paeniserine хорошо дополняют Фусарицидин А, поскольку они способны контролировать PSDMTM, а это является слабой стороной Фусарицидина А. С другой стороны, Фусарицидин А компенсирует недостаточный контроль над ERWICA, который наблюдается для Paeniserine. Так же, как в анализах для грибковых болезней, оказывается, что, хотя все они являются активными сами по себе, комбинация этих составляющих является важной для конечной эффективности готового продукта и спектра его контроля над болезнью.
*NDR: результат не выявляется (то есть отсутствует ингибирование бактериального роста при наиболее высокой исследуемой концентрации)
**Образец был нерастворимым в микробной среде и не подвергался испытанию.
Пример 20. Выявление синергизма путем дискодиффузионного анализа Кирби-Бауэра на чувствительность к антибиотикам
Для получения первоначальной оценки синергизма между разными классами подобных фусарицидину соединений выполняли биоанализ, используя растительный патоген COLLLA. Биоанализ представлял собой классический дискодиффузионный анализ Кирби-Бауэра на чувствительность к антибиотикам на агаре (Bauer, A. W., et al, 1966 Am. J. Clin. Pathol. 36: 493 - 496). В общих чертах, чистые стерильные диски, загруженные одинаковым количеством разных образцов, помещали на чашку Петри, инокулированную культурой спор COLLLA. Чашку Петри инкубировали и активность записывали как размер диаметра зоны ингибирования, которая оказывалась вокруг каждого диска. Результаты показаны на ФИГ. 11.
Результаты этого предыдущего анализа указывают на то, что синергетический эффект возникает тогда, когда некоторые Paeniserine и Paeniprolixin применяют вместе. Paeniserine A1 и B1 ("868") или Paeniprolixin А2 и В2 ("938") при отдельном применении в этом анализе демонстрируют относительно малые зоны ингибирования. Однако их комбинация ("868/938") показывает самую большую и чистейшую зону ингибирования, что превосходит результаты, полученные при применении 868, 938 или фусарицидинов А и В ("АВ"). Вообще приблизительно 0,1 мг материала наносили на каждый стерильный диск для образцов АВ, 868 и 938. Диск, который содержал образцы 868 и 938, содержал приблизительно 0,05 мг каждого образца, таким образом, чтобы общее количество материала на диске 868/938 составляло приблизительно 0,1 мг.
Ограничением этого анализа является требование, согласно которому соединения фусарицидина должны диффундировать сквозь агар для ингибирования роста грибов. Этот первоначальный признак синергетического эффекта должен быть дополнительно подвержен оценке путем применения in vitro анализов противогрибкового действия в жидких средах.
Пример 21. In vitro анализы противогрибкового действия для демонстрации синергизма комбинаций фусарицидина
Кроме комбинаций фусарицидинов, указанных в Примере 17, in vitro анализы на противогрибковое действие в жидких средах выполняют для демонстрации предложенного синергизма, который является результатом применения комбинаций фусарицидинов и/или подобных фусарицидину соединений, как показано на ФИГ. 12. Каждую из групп, показанных на ФИГ. 12, оценивают сначала отдельно для того, чтобы оценить структурные характеристики, а потом в комбинациях для оценки синергизма. Оценивают как двойные, так и тройные смеси.
Хотя отдельные соединения могут демонстрировать недостатки относительно фунгицидной активности, комбинации имеют активность, которая превосходит простую сумму значений их активности.
Синергетический эффект фунгицидов всегда присутствует, когда фунгицидная активность комбинаций активных соединений превосходит сумму показателей активности активных соединений при их отдельном применении.
Ожидаемая активность для данной комбинации из двух или трех активных соединений может быть рассчитана представленным ниже способом (ср. Colby, S.R., "Calculating Synergistic and Antagonistic Responses of Herbicide Combinations", Weeds 1967, 15, 20-22):
Если
X является эффективностью в случае, если активное соединение А применяют при норме внесения m ppm (или г/га),
Y является эффективностью в случае, если активное соединение В применяют при норме внесения n ppm (или г/га),
Z является эффективностью в случае, если активное соединение В применяют при норме внесения г ppm (или г/га),
Ei является эффективностью в случае, если активные соединения А и В применяют при норме внесения тип ррт (или г/га), соответственно,
Ег является эффективностью в случае, если активные соединения А, В и С применяют при норме внесения m, п и г ррт (или г/га), соответственно,
то для двойной смеси:
и для тройной смеси:
Указывается степень эффективности, выраженная в %. 0% означает эффективность, которая отвечает показателю контроля, тогда как эффективность 100% означает, что болезнь не наблюдалась.
Если фактическая фунгицидная активность превышает рассчитанное значение, активность комбинации является супераддитивной, то есть, присутствует синергетический эффект. В этом случае эффективность, которая фактически может наблюдаться, должна быть больше чем значения ожидаемой эффективности (Е), рассчитанные по вышеупомянутой формуле.
Еще одним способом демонстрации синергетического эффекта является способ, описанный в публикации Tammes (ср. "Isoboles, A Graphic Representation of Synergism in Pesticides" in Neth. J. Plant Path., 1964, 70, 73-80).
Пример 22. Выбор варианта штамма вида Paenibacillus NRRL В-50972
При стандартных лабораторных условиях штамм вида Paenibacillus NRRL В-50972 продуцирует много структур колонии на твердой агаровой среде. Несколько морфологически отличных колоний распознавали и сохраняли в глицерине при -80°С. Культуры в жидкой среде инокулировали с использованием этих запасов, которые происходят от разных фенотипов колоний, и после нескольких циклов выращивания в жидкой среде повторно инокулировали на твердую агаровую среду. Из нее распознавали один изолят, который имел стойкий фенотип колонии при условиях исследования, при этом сохраняя способность к продуцированию термостойких спор и составляющих фусарицидина. Изолят со стойкой структурой колоний является желательным для дальнейшего улучшения штамма (см. Пример 23). Этот изолят был депонирован в NRRL 1 сентября 2015 г., и ему был присвоен такой номер доступа: NRRL В-67129.
Пример 23. Случайный мутагенез для получения улучшенных мутантов вида Paenibacillus
Химический мутагенез
Для создания пула генетически отличных изолятов штамма вида Paenibacillus NRRL В-67129, выращенную в жидкости культуру штамма осаживали путем центрифугирования и ресуспендировали в буфере, который содержал 1-метил-3-нитро-1-нитрогуанидин (NTG) в конечной концентрации 400 мкг/мл. Как контроль приготавливали второй образец без NTG. Образцы инкубировали в течение 1 часа при 30°С и 220 об/мин. Через 1 час образцы осаживали путем центрифугирования, промывали буфером, который не содержал NTG, и окончательно ресуспендировали в таком же объеме свежего буфера. Аликвоты неразведенной культуры замораживали в глицерине при -80°С. Образцы разбавляли и помещали на чашки с агаром для определения колониеобразующих единиц, и процент уничтожения определяли как эталон для степени мутаций на геном. Улучшенные изоляты, выбранные из первого цикла отбора, подвергали одному или нескольким следующим циклам обработки NTG, как описано выше, и отбирали для дальнейшего улучшения в продуцировании фусарицидина. Продуцирование фусарицидина определяли по относительному количеству нескольких соединений, включая фусарицидин А (также известный как LiF04a или "Fus A"); LiF08a; Paeniserine A1 и В1 (также известный как "М868" или "868"); и Paeniprolixin А2 и В2 (также известный как "М938" или "938").
Высокопродуктивный скрининг и характеризаиия изолята Обработанные NTG образцы разводили и помещали на чашки с агаром для получения отдельных колоний. Отдельные колонии инокулировали в 96-лунковые блоки с глубокими лунками, которые содержали среду для посева, которые инкубировали с взбалтыванием на протяжении 2 дней при 30°С. После этого новые 96-лунковые блоки с глубокими лунками, которые содержали среду на основе сои для продуцирования, инокулировали и инкубировали со взбалтыванием на протяжении 5 дней при 30°С. Через 5 дней приготавливали образцы в глицерине из каждого образца в отдельной лунке и хранили при -80°С и образец подвергали химическому анализу четверых биомаркеров фусарицидина, которые были распознаны раньше. В этом первичном отборе отдельные изоляты рассматривали как совпадения, если их "общее значение фусарицидина" (то есть сумма четверых анализируемых биомаркеров фусарицидина относительно среднего показателя значений дикого типа) было выше чем средний показатель значений дикого типа плюс 3х стандартное отклонение от значений дикого типа. 8 экземпляров каждого изолята, выбранных на основе этого критерия, выращивали и анализировали, как описано выше. Образцы, в которых подтверждалось сверхпродуцирование фусарицидина, дальше подвергали увеличению масштаба в 50 мл объеме в 250 мл колбах для культивирования со взбалтыванием и характеризовали относительно споруляции, продуцирования фусарицидина и биоактивности. Приоритетные изоляты подвергали дальнейшему увеличению масштаба с перенесением в биореакторы и снова характеризовали относительно споруляции, вязкости, продуцирования фусарицидина и биоактивности. Несколько мутантных штаммов получали от второго цикла обработки NTG и скрининга, и было выявлено, что они имеют прекрасное продуцирование биомаркеров фусарицидина и биоактивность.
Пример 24. Характеризация чувствительности к антибиотикам штамма вида Paenibacillus NRRL В-50972
Штамм вида Paenibacillus NRRL В-50972 инокулировали на твердой sLB агаровой среде и sLB агаровой среде, дополненной антибиотиками в типичной концентрации. Чашки с агаром инкубировали при 30°С и рост оценивали через 24, 48 и 72 часов. Чувствительность штамма вида Paenibacillus NRRL В-50972 к каждому из исследованных антибиотиков показана в Таблице 22.
Пример 25. Характеризация spo0A в штамме вида Paenibacillus NRRL В-50972 и штамме вида Paenibacillus NRRL В-67129
Геномы штамма вида Paenibacillus NRRL В-50972 и штамма вида Paenibacillus NRRL В-67129 подвергали секвенированию. Сравнение двух геномных последовательностей выявило характерное различие в spo0A гене в двух штаммах. Как показано в выравнивании последовательностей на Фигуре 15, штамм вида Paenibacillus NRRL В-50972 и штамм вида Paenibacillus NRRL В-67129 отличаются одним нуклеотидом в направлении 3'-конца spo0A гена. Различие в один нуклеотид было распознано и указано красной стрелкой под последовательностью на Фигуре 15. Номера нуклеотидов относительно первого нуклеотида spo0A гена указаны над последовательностями.
Выравнивание Spo0A ортологов от образующих эндоспоры бактерий указывало, что изменение нуклеотида в кодирующей последовательности штамма вида Paenibacillus NRRL В-67129 в результате ведет к замещению одной аминокислоты в консервативном участке (см. Фигуру 16). Аминокислотные последовательности Spo0A с Paenibacillus terrae ('эталонная последовательность NCBI: WP_044647644.1), Paenibacillus polymyxa SQR-21 (Genbank: AHM66630.1), подвида Bacillus subtilis штамма subtilis 168 (эталонная последовательность NCBI: NP 390302.1), Bacillus cereus E33L (Genbank: AJI26924.1) и Clostridium pasteurianum DSM 525 (Genbank: AAA18883.1) выравнивали в сопоставлении с аминокислотными последовательностями Spo0A из штамма вида Paenibacillus NRRL В-50972 и штамма вида Paenibacillus NRRL В-67129. Стрелка на Фигуре 16 указывает на единое аминокислотное замещение в Spo0A из штамма вида Paenibacillus NRRL В-67129.
Пример 26. Исследование зависимости активности от структуры фусарицидинов, Paeniserine и Paeniprolixin
Зависимость активности от структуры нескольких очищенных фусарицидинов, Paeniserine и Paeniprolixin, исследовали с применением in vitro анализа, описанного в Примере 16. В первом эксперименте сравнивали наиболее распространенные пары фусарицидинов. Вариация в этих фусарицидинах случается в аминокислотной позиции (5) кольца/цепи с аспарагином или глутамином. В этом исследовании Фусарицидин А сравнивали с Фусарицидином В, a LiF08a сравнивали с LiF08b относительно растительного патогена Alternaria solani (ALTESO). В обоих случаях аналог аспарагина был более, чем вдвое более эффективным чем его глутаминовый аналог (см. ФИГ. 17).
В другом эксперименте сравнивали циклические формы фусарицидинов с ациклическими. Осталось невыясненным, являются ли ациклические формы фусарицидинов предшественниками или продуктами распада конечного соединения; однако они везде случаются в ферментационном бульоне штамма вида Paenibacillus NRRL В-50972 и является распространенным загрязнителем очищенных фусарицидинов из этого ферментационного бульона. Противогрибковую активность фусарицидина А сравнивали со смесью LiF04c и LiF04d (ациклических аналогов Фусарицидинов А и В) в in vitro анализе с растительным патогеном ALTESO. Существует значительное влияние раскрытия пептидного кольца в эстерной связи. Ациклические аналоги были неактивными в наивысшей испробованной концентрации (см. ФИГ. 17). Это является важным с точки зрения структурной информации и для демонстрации того, что эти соединения, которые по обыкновению являются примесями в очищенных в целом фусарицидинах, очевидно, не принимают участие в противогрибковой активности.
Также исследовали аминокислотные замещения в аминокислотных позициях (2) и (3) кольца/цепи. Аналоги Фусарицидина A, LiF05a, LiF06a и LiF08a отличаются в этих позициях комбинациями валина или изолейцина. Их подвергли испытанию в in vitro анализе с растительным патогеном ALTESO. Двумя наиболее эффективными аналогами были Фусарицидин А (валин / валин) и LiF08a (изолейцин / изолейцин). Другие два аналога, которые состояли из смеси валина / изолейцина, были более, чем в три раза более слабыми (см. ФИГ. 17).
Также исследовали расхождения в противогрибковой активности с новыми Paeniserine. В этом случае также оценивали действие против ALTESO и отличие в аминокислотных позициях (1) и (4) кольца/цепи. Классические фусарицидины ограничиваются треонином в этих позициях, тогда как в Paeniserine могут чередоваться треонин и серии. В этом анализе Paeniserine продемонстрировали противогрибковую активность, подобную действию фусарицидину А (см. ФИГ. 17).
2
Противогрибковую активность Paeniprolixin (то есть аналогов с разной длиной боковой цепи) также исследовали путем in vitro анализов на действие против грибковых патогенов ALTESO и Colletotrichum lagenarium (COLLLA). Классический фусарицидин включает 3-гидроксипентадекановую кислоту как боковую цепь. Было выявлено, что Paeniprolixin имеют 2 из 4 дополнительных метиленовых групп в цепи. Было продемонстрировано, что длина боковой цепи имеет явное влияние на биоактивность, и выявлено расхождения с конкретными грибковыми патогенами. Против ALTESO неизменная длина GHPD была наиболее эффективной, уменьшаясь с каждой дополнительной метиленовой группой. Против COLLLA наиболее эффективной длиной была GHPD + 2СН (см. ФИГ. 17).
Пример 27. Синергетическая противогрибковая активность смесей Фусарицидина А с Paeniserine Al или Paeniprolixin CI
In vitro анализ противогрибкового действия на 96-лунковом планшете с реагентом для определения жизнеспособности клеток на основе резазурина PRESTOBLUE (см. Пример 18) применяли для оценки противогрибковой активности фусарицидинов, Paeniserine и Paeniprolixin, отдельно и в двух комбинациях. Противогрибковую активность рассчитывали относительно показателей необработанного контрольного образца по такому уравнению:
Эффективность = (100 - относительный рост необработанного контрольного образца)
100% эффективность указывала на отсутствие роста грибов сравнительно с необработанным контрольным образцом, а 0% эффективность указывала на отсутствие ингибирования роста грибков сравнительно с необработанным контрольным образцом.
В Таблицах 23 и 24 четко показано, что активность комбинаций активных соединений согласно изобретению, которая наблюдалась, была больше чем рассчитанная активность, то есть присутствовал синергетический эффект.
* выявл. = выявленная активность
** рассчит. = активность, рассчитанная по формуле Колби
* выявл. = выявленная активность
** рассчит. = активность, рассчитанная по формуле Колби
Если нет другого определения, все технические и научные термины в тексте имеют значения, которые являются общепринятыми среди специалистов в области, к которой принадлежит данное изобретение. Все приведенные публикации, патенты и патентные публикации включены в это описание путем ссылки в полном объеме с любой точки зрения.
Следует понимать, что описанное изобретение не ограничивается описанными способами, протоколами и материалами, поскольку они могут меняться. Также следует понимать, что примененная авторами терминология употреблена лишь с целью описания конкретных вариантов воплощения, но не для ограничения объема данного изобретения, которое ограничивается лишь сопроводительной формулой изобретения.
Специалисты в данной области на основе обычных экспериментов смогут признать и убедиться в существовании многих эквивалентов описанных авторами конкретных вариантов воплощения изобретения. Такие эквиваленты охватываются представленной ниже формулой изобретения.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  Bayer CropScience LP
<120>  НОВЫЙ ШТАММ PAENIBACILLUS, ПРОТИВОГРИБКОВЫЕ
СОЕДИНЕНИЯ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
<130>  BCS159002 WO
<150>  US 62/138,765
<151>  2015-03-26
<150>  US 62/232,205
<151>  2015-09-24
<160>  20
<170>  PatentIn версия 3.5
<210>  1
<211>  550
<212>  PRT
<213>  Paenibacillus peoriae
<400>  1
Asn Ala Leu Val Tyr Asp Pro Val Thr Ile Glu Gln Ile Lys Gly His
1               5                   10                  15
Leu Val His Leu Met Glu Gln Ile Val Glu Asn Pro Ala Ile Ser Val
20                  25                  30
Asp Ala Leu Glu Leu Val Thr Pro Gln Glu Arg Glu Gln Ile Leu Asn
35                  40                  45
Val Trp Gly Asn Thr Lys Gly Ile Tyr Glu His Cys Asn Thr Phe His
50                  55                  60
Gly Leu Leu Glu Glu Gln Ala Gly Arg Thr Pro Asp Ala Thr Ala Ile
65                  70                  75                  80
Trp Phe Glu Asp Glu Ser Leu Thr Tyr Ala Glu Leu Asn Ala Lys Ala
85                  90                  95
Asn Gly Leu Ala Arg Arg Leu Arg Thr Gln Gly Ile Lys Thr Gly Asp
100                 105                 110
Leu Val Gly Leu Ile Ala Glu Arg Ser Leu Glu Met Ile Val Gly Ile
115                 120                 125
Tyr Gly Ile Met Lys Ala Gly Gly Ala Tyr Val Pro Ile Asp Pro Glu
130                 135                 140
Tyr Pro Lys Glu Arg Ile Ser Tyr Met Leu Glu Asp Ser Gly Ala Lys
145                 150                 155                 160
Leu Ile Leu Thr Gln Ala His Phe Leu Glu His Leu Gly Trp Thr Glu
165                 170                 175
Asn Val Leu Leu Leu Asp Glu Ser Ser Thr Tyr Asp Ala Asp Thr Ser
180                 185                 190
Asn Leu Glu Asp Thr Ala Gly Pro Asp Asp Leu Ala Tyr Val Ile Tyr
195                 200                 205
Thr Ser Gly Thr Thr Gly Gln Pro Lys Gly Val Leu Val Glu His Arg
210                 215                 220
Gly Leu Pro Asn Leu Ser Asp Val Tyr Gly Ala His Phe Glu Val Thr
225                 230                 235                 240
Pro Gln Asp Arg Ile Val Gln Phe Ala Ser Leu Ser Phe Asp Ala Ser
245                 250                 255
Val Ser Glu Ile Leu Thr Ala Leu Ser His Gly Gly Val Leu Cys Ile
260                 265                 270
Pro Ser Thr Glu Asp Ile Leu Asp His Ala Leu Phe Glu Gln Phe Met
275                 280                 285
Asn Asp Lys Gly Val Thr Val Ala Thr Leu Pro Pro Ala Tyr Ala Ile
290                 295                 300
His Leu Asp Pro Glu Arg Leu Pro Thr Leu Arg Cys Leu Leu Thr Ala
305                 310                 315                 320
Gly Ser Ala Ala Ser Val Glu Leu Ile Glu Glu Trp Arg Lys His Val
325                 330                 335
Arg Tyr Ser Asn Gly Tyr Gly Pro Thr Glu Asp Ser Val Cys Thr Thr
340                 345                 350
Ile Trp Ser Val Pro Asp Ser Glu Glu Ala Thr Asp Ile Val Ser Ile
355                 360                 365
Gly Arg Pro Ile Ala Asn His Ser Val Tyr Ile Leu Asp Asp His Phe
370                 375                 380
Arg Leu Gln Pro Val Gly Val Ala Gly Glu Leu Cys Ile Ser Ser Ile
385                 390                 395                 400
Gly Leu Ala Arg Gly Tyr His Asn Gln Pro Glu Leu Met Asp Glu Lys
405                 410                 415
Phe Val Asp Asn Pro Phe Ala Pro Gly Glu Arg Met Tyr Arg Thr Gly
420                 425                 430
Asp Leu Val Arg Trp Leu Pro Asn Gly Thr Ile Glu Tyr Leu Gly Arg
435                 440                 445
Ile Asp His Gln Val Lys Ile Arg Gly Tyr Arg Ile Glu Leu Gly Glu
450                 455                 460
Val Glu Ala Gln Met Leu Arg Val Pro Ser Val Gln Glu Val Val Ala
465                 470                 475                 480
Met Ala Ala Glu Gly Glu Asp Gly Tyr Lys Asp Leu Val Ala Tyr Phe
485                 490                 495
Val Ala Ala Gln Lys Leu Glu Val Ser Glu Leu Arg Ala Val Leu Ser
500                 505                 510
Glu Met Leu Pro Gly Tyr Met Ile Pro Ser Arg Phe Ile Gln Leu Glu
515                 520                 525
Asp Met Pro Leu Thr Ser Asn Gly Lys Ile Asp Arg Lys Ala Leu Gln
530                 535                 540
Gly Glu Arg Gly Trp Ala
545                 550
<210>  2
<211>  550
<212>  PRT
<213>  Paenibacillus polymyxa
<400>  2
Asn Ala Leu Val Tyr Asp Gln Val Thr Ile Gly Gln Ile Lys Gly His
1               5                   10                  15
Leu Val His Leu Met Glu Gln Ile Val Glu Asn Pro Ala Ile Ser Val
20                  25                  30
Asp Ala Leu Glu Leu Val Thr Pro Gln Glu Arg Glu Gln Ile Leu Asn
35                  40                  45
Val Trp Gly Asn Met Lys Gly Ile Tyr Glu His Cys Asn Thr Phe His
50                  55                  60
Gly Leu Leu Glu Glu Gln Ala Gly Arg Thr Pro Asp Ala Thr Ala Ile
65                  70                  75                  80
Trp Phe Glu Asp Glu Ser Leu Thr Tyr Ala Glu Leu Asn Ala Lys Ala
85                  90                  95
Asn Gly Leu Ala Arg Arg Leu Arg Thr Gln Gly Ile Lys Thr Gly Asp
100                 105                 110
Leu Val Gly Leu Ile Ala Glu Arg Ser Leu Glu Met Ile Val Gly Ile
115                 120                 125
Tyr Gly Ile Met Lys Ala Gly Gly Ala Tyr Val Pro Ile Asp Pro Glu
130                 135                 140
Tyr Pro Lys Glu Arg Ile Ser Tyr Met Leu Glu Asp Ser Gly Ala Lys
145                 150                 155                 160
Leu Ile Leu Thr Gln Ala His Leu Leu Glu His Leu Gly Trp Thr Glu
165                 170                 175
Asn Val Leu Leu Leu Asp Glu Ser Ser Thr Tyr Asp Ala Asp Thr Ser
180                 185                 190
Asn Leu Glu Asp Thr Ala Gly Pro Asp Asp Leu Ala Tyr Val Ile Tyr
195                 200                 205
Thr Ser Gly Thr Thr Gly Gln Pro Lys Gly Val Leu Val Glu His Arg
210                 215                 220
Gly Leu Pro Asn Leu Ser Asn Val Tyr Gly Ala His Phe Glu Val Thr
225                 230                 235                 240
Pro Gln Asp Arg Ile Val Gln Phe Ala Ser Leu Ser Phe Asp Ala Ser
245                 250                 255
Val Ser Glu Ile Leu Thr Ala Leu Ser His Gly Gly Val Leu Cys Ile
260                 265                 270
Pro Ser Thr Glu Asp Ile Leu Asp His Ala Leu Phe Glu Gln Phe Met
275                 280                 285
Asn Asp Lys Gly Ile Thr Val Ala Thr Leu Pro Pro Ala Tyr Ala Ile
290                 295                 300
His Leu Asp Pro Glu Arg Leu Pro Thr Leu Arg Cys Leu Leu Thr Ala
305                 310                 315                 320
Gly Ser Ala Ala Ser Val Glu Leu Ile Glu Glu Trp Arg Lys His Val
325                 330                 335
Arg Tyr Ser Asn Gly Tyr Gly Pro Thr Glu Asp Ser Val Cys Thr Thr
340                 345                 350
Ile Trp Ser Val Pro Asp Ser Glu Glu Ala Thr Asp Ile Val Ser Ile
355                 360                 365
Gly Arg Pro Ile Ala Asn His Ser Val Tyr Ile Leu Asp Asp His Phe
370                 375                 380
Arg Leu Gln Pro Val Gly Val Ala Gly Glu Leu Cys Ile Ser Ser Ile
385                 390                 395                 400
Gly Leu Ala Arg Gly Tyr His Asn Arg Pro Glu Leu Met Asp Glu Lys
405                 410                 415
Phe Val Asp Asn Pro Phe Ala Pro Gly Glu Arg Met Tyr Arg Thr Gly
420                 425                 430
Asp Leu Val Arg Trp Leu Pro Asn Gly Thr Ile Glu Tyr Leu Gly Arg
435                 440                 445
Ile Asp His Gln Val Lys Ile Arg Gly Tyr Arg Ile Glu Leu Gly Glu
450                 455                 460
Val Glu Ala Gln Met Leu Arg Val Pro Ser Val Gln Glu Val Val Ala
465                 470                 475                 480
Met Ala Val Glu Gly Asp Asp Gly Tyr Lys Asp Leu Val Ala Tyr Phe
485                 490                 495
Val Ala Ala Gln Lys Leu Glu Val Ser Glu Leu Arg Ala Val Leu Ser
500                 505                 510
Glu Ile Leu Pro Gly Tyr Met Ile Pro Ser Arg Phe Ile Gln Leu Glu
515                 520                 525
Asp Met Pro Leu Thr Ser Asn Gly Lys Ile Asp Arg Lys Ala Leu Gln
530                 535                 540
Gly Glu Arg Gly Trp Ala
545                 550
<210>  3
<211>  550
<212>  PRT
<213>  Paenibacillus polymyxa
<400>  3
Asn Ala Leu Val Tyr Asp Pro Val Thr Ile Glu Gln Ile Lys Gly His
1               5                   10                  15
Leu Val His Leu Met Glu Gln Ile Val Glu Asn Pro Ala Ile Ser Val
20                  25                  30
Asp Ala Leu Glu Leu Val Thr Pro Gln Glu Arg Glu Gln Ile Leu Asn
35                  40                  45
Val Trp Gly Asn Thr Lys Gly Ile Tyr Glu His Cys Asn Thr Phe His
50                  55                  60
Gly Leu Leu Glu Glu Gln Ala Gly Arg Thr Pro Asp Ala Thr Ala Ile
65                  70                  75                  80
Trp Phe Glu Asp Glu Ser Leu Thr Tyr Ala Glu Leu Asn Ala Lys Ala
85                  90                  95
Asn Gly Leu Ala Arg Arg Leu Arg Thr Gln Gly Ile Lys Thr Gly Asp
100                 105                 110
Leu Val Gly Leu Ile Ala Glu Arg Ser Leu Glu Met Ile Val Gly Ile
115                 120                 125
Tyr Gly Ile Met Lys Ala Gly Gly Ala Tyr Val Pro Ile Asp Pro Glu
130                 135                 140
Tyr Pro Lys Glu Arg Ile Ser Tyr Met Leu Glu Asp Ser Gly Ala Lys
145                 150                 155                 160
Leu Ile Leu Thr Gln Ala His Leu Leu Glu His Leu Gly Trp Thr Glu
165                 170                 175
Asn Val Leu Leu Leu Asp Glu Ser Ser Thr Tyr Asp Ala Asp Thr Ser
180                 185                 190
Asn Leu Glu Asp Thr Ala Gly Pro Asp Asp Leu Ala Tyr Val Ile Tyr
195                 200                 205
Thr Ser Gly Thr Thr Gly Gln Pro Lys Gly Val Leu Val Glu His Arg
210                 215                 220
Gly Leu Pro Asn Leu Ser Asp Val Tyr Gly Thr His Phe Glu Val Thr
225                 230                 235                 240
Pro Gln Asp Arg Ile Val Gln Phe Ala Ser Leu Ser Phe Asp Ala Ser
245                 250                 255
Val Ser Glu Ile Leu Thr Ala Leu Ser His Gly Gly Val Leu Cys Ile
260                 265                 270
Pro Ser Thr Gln Asp Ile Leu Asp His Ala Leu Phe Glu Gln Phe Met
275                 280                 285
Asn Asp Lys Gly Ile Thr Val Ala Thr Leu Pro Pro Ala Tyr Ala Ile
290                 295                 300
His Leu Asp Pro Glu Arg Leu Pro Thr Leu Arg Cys Leu Leu Thr Ala
305                 310                 315                 320
Gly Ser Ala Ala Ser Val Glu Leu Ile Glu Glu Trp Arg Lys His Val
325                 330                 335
Arg Tyr Ser Asn Gly Tyr Gly Pro Thr Glu Asp Ser Val Cys Thr Thr
340                 345                 350
Ile Trp Ser Val Pro Asp Ser Glu Glu Ala Thr Asp Ile Val Ser Ile
355                 360                 365
Gly Arg Pro Ile Ala Asn His Ser Val Tyr Ile Leu Asp Asp His Phe
370                 375                 380
Arg Leu Gln Pro Val Gly Val Ala Gly Glu Leu Cys Ile Ser Ser Ile
385                 390                 395                 400
Gly Leu Ala Arg Gly Tyr His Asn Arg Pro Glu Leu Met Asp Glu Lys
405                 410                 415
Phe Val Asp Asn Pro Phe Ala Pro Gly Glu Arg Met Tyr Arg Thr Gly
420                 425                 430
Asp Leu Val Arg Trp Leu Pro Asn Gly Thr Ile Glu Tyr Leu Gly Arg
435                 440                 445
Ile Asp His Gln Val Lys Ile Arg Gly Tyr Arg Ile Glu Leu Gly Glu
450                 455                 460
Val Glu Ala Gln Met Leu Arg Val Pro Ser Val Gln Glu Val Val Ala
465                 470                 475                 480
Met Ala Val Glu Gly Asp Asp Gly Tyr Lys Asp Leu Val Ala Tyr Phe
485                 490                 495
Val Ala Ala Gln Lys Leu Glu Val Ser Glu Leu Arg Ala Val Leu Ser
500                 505                 510
Glu Met Leu Pro Gly Tyr Met Ile Pro Ser Arg Phe Ile Gln Leu Glu
515                 520                 525
Asp Met Pro Leu Thr Ser Asn Gly Lys Ile Asp Arg Lys Ala Leu Lys
530                 535                 540
Gly Glu Arg Gly Trp Ala
545                 550
<210>  4
<211>  550
<212>  PRT
<213>  Paenibacillus polymyxa
<400>  4
Asn Ala Leu Val Tyr Asp Pro Val Thr Ile Gly Gln Ile Lys Gly His
1               5                   10                  15
Leu Val His Leu Met Glu Gln Ile Val Glu Asn Pro Ala Ile Ser Val
20                  25                  30
Asp Ala Leu Glu Leu Ile Thr Pro Gln Glu Arg Glu Gln Ile Leu Asn
35                  40                  45
Val Trp Gly Asn Thr Lys Ala Ile Tyr Glu His Tyr Asn Thr Phe His
50                  55                  60
Gly Leu Leu Glu Glu Gln Ala Gly Arg Thr Pro Asp Ala Ala Ala Ile
65                  70                  75                  80
Trp Phe Glu Asp Glu Ser Leu Thr Tyr Ala Glu Leu Asn Ala Lys Ala
85                  90                  95
Asn Gly Leu Ala Arg Arg Leu Arg Thr Gln Gly Ile Lys Thr Gly Asp
100                 105                 110
Leu Val Gly Leu Ile Ala Glu Arg Ser Leu Glu Met Ile Val Gly Ile
115                 120                 125
Tyr Gly Ile Met Lys Ala Gly Gly Ala Tyr Val Pro Ile Asp Pro Glu
130                 135                 140
Tyr Pro Gln Glu Arg Ile Ser Tyr Met Leu Glu Asp Ser Gly Ala Lys
145                 150                 155                 160
Leu Ile Leu Thr Gln Ala His Leu Leu Glu His Leu Gly Trp Thr Glu
165                 170                 175
Asn Val Leu Leu Leu Asp Glu Ser Ser Thr Tyr Asp Ala Asp Thr Ser
180                 185                 190
Asn Leu Glu Asp Thr Ala Gly Pro Asp Asp Leu Ala Tyr Val Ile Tyr
195                 200                 205
Thr Ser Gly Thr Thr Gly Gln Pro Lys Gly Val Leu Val Glu His Arg
210                 215                 220
Gly Leu Pro Asn Leu Ser Asp Val Tyr Gly Ala His Phe Glu Val Thr
225                 230                 235                 240
Pro Gln Asp Arg Ile Val Gln Phe Ala Ser Leu Ser Phe Asp Ala Ser
245                 250                 255
Val Ser Glu Ile Leu Thr Ala Leu Ser His Gly Gly Val Leu Cys Ile
260                 265                 270
Pro Ser Ala Gln Asp Ile Leu Asp His Ala Leu Phe Glu Gln Phe Met
275                 280                 285
Asn Asp Lys Gly Ile Thr Val Ala Thr Leu Pro Pro Ala Tyr Ala Ile
290                 295                 300
His Leu Asp Pro Glu Arg Leu Pro Thr Leu Arg Cys Leu Leu Thr Ala
305                 310                 315                 320
Gly Ser Thr Ala Ser Ile Glu Leu Ile Glu Glu Trp Arg Lys His Val
325                 330                 335
Arg Tyr Ser Asn Gly Tyr Gly Pro Thr Glu Asp Ser Val Cys Thr Thr
340                 345                 350
Ile Trp Ser Val Pro Asp Ser Glu Glu Ala Thr Asn Ile Val Ser Ile
355                 360                 365
Gly Arg Pro Ile Ala Asn His Ser Val Tyr Ile Leu Asp Asp His Phe
370                 375                 380
Arg Leu Gln Pro Val Gly Val Ala Gly Glu Leu Cys Ile Ser Ser Ile
385                 390                 395                 400
Gly Leu Ala Arg Gly Tyr His Asn Arg Pro Glu Leu Met Asp Glu Lys
405                 410                 415
Phe Val Asp Asn Pro Phe Ala Pro Gly Glu Arg Met Tyr Arg Thr Gly
420                 425                 430
Asp Leu Val Arg Trp Leu Pro Asn Gly Asn Ile Glu Tyr Leu Gly Arg
435                 440                 445
Ile Asp His Gln Val Lys Ile Arg Gly Tyr Arg Ile Glu Leu Gly Glu
450                 455                 460
Val Glu Ala Gln Met Leu Arg Val Pro Ser Val Gln Glu Val Val Ala
465                 470                 475                 480
Met Ala Val Glu Gly Asp Asp Gly Tyr Lys Asp Leu Val Ala Tyr Phe
485                 490                 495
Val Ala Ala Gln Lys Leu Glu Val Ser Glu Leu Arg Ala Val Leu Ser
500                 505                 510
Glu Met Leu Pro Gly Tyr Met Ile Pro Ser Arg Phe Ile Gln Leu Glu
515                 520                 525
Asp Met Leu Leu Thr Ser Asn Gly Lys Ile Asp Arg Lys Ala Leu Gln
530                 535                 540
Gly Glu Arg Gly Trp Ala
545                 550
<210>  5
<211>  550
<212>  PRT
<213>  Paenibacillus polymyxa
<400>  5
Asn Ala Leu Val Tyr Asp Gln Val Thr Ile Glu Gln Ile Lys Glu His
1               5                   10                  15
Leu Val His Leu Met Glu Gln Ile Ile Glu Asn Pro Ala Thr Ser Val
20                  25                  30
Asp Ala Leu Glu Leu Val Thr Pro Gln Glu Arg Glu Gln Ile Leu Asn
35                  40                  45
Val Trp Gly Asn Thr Asn Val Cys Tyr Glu His Asn Ser Thr Phe His
50                  55                  60
Gly Leu Leu Glu Glu Gln Ala Gly Arg Thr Pro Asp Ala Thr Ala Leu
65                  70                  75                  80
Leu Phe Gly Asp Glu Met Leu Thr Tyr Ala Glu Leu Asn Ala Lys Ala
85                  90                  95
Asn Gly Leu Ala Arg Arg Leu Arg Thr Gln Gly Ile Lys Thr Gly Asp
100                 105                 110
Leu Val Gly Leu Ile Ala Glu Arg Ser Leu Glu Met Ile Val Gly Ile
115                 120                 125
Tyr Gly Ile Met Lys Ala Gly Gly Ala Tyr Val Pro Ile Asp Pro Glu
130                 135                 140
Tyr Pro Lys Glu Arg Ile Ser Tyr Met Leu Glu Asp Ser Gly Ala Lys
145                 150                 155                 160
Leu Ile Leu Thr Gln Ala His Leu Leu Glu His Leu Gly Trp Thr Glu
165                 170                 175
Ser Val Leu Leu Leu Asp Glu Ser Ser Thr Tyr Asp Ala Asp Thr Ser
180                 185                 190
Lys Leu Glu Asp Thr Ala Gly Pro Asp Asp Leu Ala Tyr Val Ile Tyr
195                 200                 205
Thr Ser Gly Thr Thr Gly Gln Pro Lys Gly Val Leu Val Glu His Arg
210                 215                 220
Gly Leu Pro Asn Leu Ser Asp Val Tyr Gly Ala His Phe Glu Val Thr
225                 230                 235                 240
Pro Gln Asp Arg Ile Val Gln Phe Ala Ser Leu Ser Phe Asp Ala Ser
245                 250                 255
Val Ser Glu Ile Leu Thr Ala Leu Ser His Gly Gly Val Leu Cys Ile
260                 265                 270
Pro Ser Thr Gln Asp Ile Leu Asp His Val Leu Phe Glu Gln Phe Met
275                 280                 285
Asn Asp Lys Gly Ile Thr Val Ala Thr Leu Pro Pro Ala Tyr Ala Ile
290                 295                 300
His Leu Asp Pro Glu Arg Leu Pro Thr Leu Arg Cys Leu Leu Thr Ala
305                 310                 315                 320
Gly Ser Ala Ala Ser Val Glu Leu Ile Glu Glu Trp Arg Lys His Val
325                 330                 335
Arg Tyr Ser Asn Gly Tyr Gly Pro Thr Glu Asp Ser Val Cys Thr Thr
340                 345                 350
Ile Trp Ser Val Pro Asp Ser Glu Gly Ala Thr Asp Ile Val Ser Ile
355                 360                 365
Gly Arg Pro Ile Ala Asn His Ser Val Tyr Ile Leu Asp Asp His Phe
370                 375                 380
Arg Leu Gln Pro Val Gly Val Ala Gly Glu Leu Cys Ile Ser Gly Ile
385                 390                 395                 400
Gly Leu Ala Arg Gly Tyr His Asn Gln Pro Glu Leu Met Asp Glu Lys
405                 410                 415
Phe Val Asp Asn Pro Phe Ala Pro Gly Glu Arg Met Tyr Arg Thr Gly
420                 425                 430
Asp Leu Val Arg Trp Leu Pro Asn Gly Thr Ile Glu Tyr Leu Gly Arg
435                 440                 445
Ile Asp His Gln Val Lys Ile Arg Gly Tyr Arg Ile Glu Leu Gly Glu
450                 455                 460
Val Glu Ala Gln Ile Leu Arg Val Pro Ser Val Gln Glu Val Val Ala
465                 470                 475                 480
Met Ala Val Glu Gly Asp Asp Gly Tyr Lys Asp Leu Val Ala Tyr Phe
485                 490                 495
Val Ala Ala Gln Lys Leu Glu Val Ser Glu Leu Arg Ala Val Leu Ser
500                 505                 510
Glu Met Leu Pro Gly Tyr Met Ile Pro Ser Arg Phe Ile Gln Leu Asp
515                 520                 525
Asp Met Pro Leu Thr Ser Asn Gly Lys Val Asp Arg Lys Ala Leu Gln
530                 535                 540
Gly Glu Arg Gly Trp Ala
545                 550
<210>  6
<211>  550
<212>  PRT
<213>  Paenibacillus polymyxa
<400>  6
Asn Ala Leu Val Tyr Asp Pro Ala Thr Ile Glu Gln Ile Lys Gly His
1               5                   10                  15
Leu Phe His Leu Met Glu Gln Ile Val Glu Asn Pro Ala Ile Ser Val
20                  25                  30
Asp Ala Leu Glu Leu Val Thr Pro Gln Glu Arg Glu Gln Ile Leu Ser
35                  40                  45
Val Trp Gly Glu Thr Glu Ala Ser Ser Lys His Arg Thr Thr Phe His
50                  55                  60
Gly Leu Leu Glu Glu Gln Ala Ala Arg Thr Pro Asp Ala Thr Ala Ile
65                  70                  75                  80
Leu Phe Glu Asn Glu Met Leu Thr Tyr Ala Glu Leu Asn Ala Lys Ala
85                  90                  95
Asn Gly Leu Ala Arg Arg Leu Arg Ala Glu Gly Ile Lys Thr Gly Asp
100                 105                 110
Leu Val Gly Leu Leu Val Glu Arg Ser Thr Asp Met Ile Val Gly Met
115                 120                 125
Tyr Gly Ile Met Lys Ala Gly Gly Ala Tyr Val Pro Ile Asp Pro Glu
130                 135                 140
Tyr Pro Lys Glu Arg Ile Asn Tyr Met Leu Glu Asp Ser Gly Thr Lys
145                 150                 155                 160
Met Ile Leu Thr Gln Ala His Leu Leu Glu His Ile Gly Trp Met Gly
165                 170                 175
Asn Val Leu Leu Leu Glu Glu Pro Ser Thr Tyr Asp Ala Asp Glu Ser
180                 185                 190
Asn Leu Lys Asp Thr Ala Asp Ser Asp Asp Leu Ala Tyr Val Ile Tyr
195                 200                 205
Thr Ser Gly Thr Thr Gly Gln Pro Lys Gly Val Leu Val Glu His Arg
210                 215                 220
Gly Leu Arg Asn Leu Ser Asp Val Tyr Arg Gly Leu Phe Glu Val Thr
225                 230                 235                 240
Pro Gln Asp Arg Ile Val Gln Phe Ala Ser Leu Ser Phe Asp Ala Ser
245                 250                 255
Val Ser Glu Ile Ile Thr Ala Leu Ser His Gly Ala Thr Leu Cys Ile
260                 265                 270
Pro Ser Thr Gln Asp Ile Leu Asp His Ala Leu Phe Glu Gln Phe Met
275                 280                 285
Asn Ser Lys Ala Ile Thr Ile Ala Thr Leu Pro Pro Ala Tyr Ile Ile
290                 295                 300
His Leu Glu Pro Glu Arg Leu Pro Ala Leu Arg Cys Leu Leu Thr Ala
305                 310                 315                 320
Gly Ser Ala Thr Ser Val Glu Leu Ile Glu Lys Trp Arg Lys His Val
325                 330                 335
Gln Tyr Phe Asn Gly Tyr Gly Pro Thr Glu Asp Ser Val Cys Thr Thr
340                 345                 350
Met Trp Thr Val Pro Asp Ser Glu Glu Thr Met Glu Arg Val Ser Ile
355                 360                 365
Gly Gln Pro Ile Ala Asn His Arg Val Tyr Ile Leu Asp Asp His Phe
370                 375                 380
Arg Val Leu Pro Val Gly Val Ala Gly Glu Leu Cys Ile Ser Gly Ile
385                 390                 395                 400
Gly Leu Ala Arg Gly Tyr His Asn Gln Pro Ala Leu Met Asp Glu Lys
405                 410                 415
Phe Val Asp Asn Pro Phe Thr Pro Gly Glu Arg Met Tyr Arg Thr Gly
420                 425                 430
Asp Leu Val Arg Trp Leu Pro Asp Gly Thr Ile Glu Tyr Leu Gly Arg
435                 440                 445
Ile Asp His Gln Val Lys Ile Arg Gly Tyr Arg Ile Glu Leu Gly Glu
450                 455                 460
Val Glu Ala His Met Leu Arg Val Pro Phe Val Gln Glu Val Val Ala
465                 470                 475                 480
Leu Ala Val Glu Ser Glu Asp Gly Tyr Lys Asp Leu Val Ala Tyr Phe
485                 490                 495
Val Ala Ala Gln Lys Leu Glu Val Ser Glu Leu Arg Ala Val Leu Ser
500                 505                 510
Glu Met Leu Pro Gly Tyr Met Ile Pro Ser Arg Phe Val Gln Leu Glu
515                 520                 525
Asp Met Pro Leu Thr Ser Asn Gly Lys Ile Asp Arg Lys Ala Leu Gln
530                 535                 540
Gly Glu Gln Gly Trp Ala
545                 550
<210>  7
<211>  550
<212>  PRT
<213>  Paenibacillus polymyxa
<400>  7
Asn Ala Leu Val Tyr Asp Pro Ser Thr Ile Glu Gln Ile Lys Gly His
1               5                   10                  15
Leu Phe His Leu Met Glu Gln Ile Val Glu Asn Pro Ala Ile Ser Val
20                  25                  30
Asp Ala Leu Glu Leu Val Thr Pro Gln Glu Arg Glu Gln Ile Leu Asn
35                  40                  45
Val Trp Gly Glu Thr Glu Ala Ser Ser Lys His Arg Thr Thr Phe His
50                  55                  60
Gly Leu Leu Glu Glu Gln Ala Ala Arg Thr Pro Asp Ala Thr Ala Ile
65                  70                  75                  80
Leu Phe Glu Asn Glu Met Leu Thr Tyr Ala Glu Leu Asn Ala Lys Ala
85                  90                  95
Asn Gly Leu Ala Arg Arg Leu Arg Ala Glu Gly Ile Lys Thr Gly Asp
100                 105                 110
Leu Val Gly Leu Leu Val Glu Arg Ser Thr Asp Met Ile Val Gly Met
115                 120                 125
Tyr Gly Ile Met Lys Ala Gly Gly Ala Tyr Val Pro Met Asp Pro Glu
130                 135                 140
Tyr Pro Lys Glu Arg Ile Asn Tyr Met Leu Glu Asp Ser Gly Thr Lys
145                 150                 155                 160
Met Ile Leu Ala Gln Ala His Leu Leu Glu His Ile Asp Trp Met Gly
165                 170                 175
Asn Val Leu Leu Leu Glu Glu Pro Ser Thr Tyr Asp Ala Asp Glu Ser
180                 185                 190
Asn Leu Lys Asp Thr Ala Asn Ser Asp Asp Leu Ala Tyr Val Ile Tyr
195                 200                 205
Thr Ser Gly Thr Thr Gly Gln Pro Lys Gly Val Leu Val Glu His Arg
210                 215                 220
Gly Leu Arg Asn Leu Ser Asp Val Tyr Arg Gly Leu Phe Glu Val Thr
225                 230                 235                 240
Pro Gln Asp Arg Ile Val Gln Phe Ala Ser Leu Ser Phe Asp Ala Ser
245                 250                 255
Val Ser Glu Ile Ile Thr Ala Leu Ser His Gly Ala Thr Leu Cys Ile
260                 265                 270
Pro Ser Thr Gln Asp Ile Leu Asp His Ala Leu Phe Glu Gln Phe Met
275                 280                 285
Asn Ser Lys Ala Ile Thr Ile Ala Thr Leu Pro Pro Ala Tyr Ile Ile
290                 295                 300
His Leu Glu Pro Glu Arg Leu Pro Ala Leu Arg Cys Leu Leu Thr Ala
305                 310                 315                 320
Gly Ser Ala Thr Ser Val Glu Leu Ile Glu Lys Trp Arg Lys His Val
325                 330                 335
Gln Tyr Phe Asn Gly Tyr Gly Pro Thr Glu Asp Ser Val Cys Thr Thr
340                 345                 350
Met Trp Thr Val Pro Asp Ser Glu Glu Thr Met Glu Arg Val Ser Ile
355                 360                 365
Gly Gln Pro Ile Ala Asn His Arg Val Tyr Ile Leu Asp Asp His Phe
370                 375                 380
Arg Val Leu Pro Val Gly Val Ala Gly Glu Leu Cys Ile Ser Gly Ile
385                 390                 395                 400
Gly Leu Ala Arg Gly Tyr His Asn Gln Pro Ala Leu Met Asp Glu Lys
405                 410                 415
Phe Val Asp Asn Pro Phe Thr Pro Gly Glu Arg Met Tyr Arg Thr Gly
420                 425                 430
Asp Leu Val Arg Trp Leu Pro Asp Gly Thr Ile Glu Tyr Leu Gly Arg
435                 440                 445
Ile Asp His Gln Val Lys Ile Arg Gly Tyr Arg Ile Glu Leu Gly Glu
450                 455                 460
Val Glu Ala His Met Leu Arg Val Pro Phe Val Gln Glu Val Val Ala
465                 470                 475                 480
Leu Ala Val Glu Ser Glu Asp Gly Tyr Lys Asp Leu Val Ala Tyr Phe
485                 490                 495
Val Ala Ala Gln Lys Leu Glu Val Ser Glu Leu Arg Ala Val Leu Ser
500                 505                 510
Glu Met Leu Pro Gly Tyr Met Ile Pro Ser Arg Phe Val Gln Leu Glu
515                 520                 525
Asp Met Pro Leu Thr Ser Asn Gly Lys Ile Asp Arg Lys Ala Leu Gln
530                 535                 540
Gly Glu Gln Gly Trp Ala
545                 550
<210>  8
<211>  550
<212>  PRT
<213>  Paenibacillus polymyxa
<400>  8
Asn Ala Leu Val Tyr Asp Pro Ala Thr Ile Glu Gln Ile Lys Gly His
1               5                   10                  15
Leu Phe His Leu Met Glu Gln Ile Val Glu Asn Pro Ala Ile Ser Val
20                  25                  30
Asp Ala Leu Glu Leu Val Thr Pro Gln Glu Arg Glu Gln Ile Leu Asn
35                  40                  45
Val Trp Gly Asp Thr Gly Ala Ser Ser Lys His Arg Thr Thr Phe His
50                  55                  60
Gly Leu Leu Glu Glu Gln Ala Gly Arg Thr Pro Asp Ala Thr Ala Ile
65                  70                  75                  80
Val Phe Glu Asn Glu Val Leu Thr Tyr Ala Glu Leu Asn Ala Lys Ala
85                  90                  95
Asn Gly Leu Ala Arg Arg Leu Arg Ala Glu Gly Ile Lys Thr Gly Asp
100                 105                 110
Leu Val Gly Leu Ile Val Glu Arg Ser Thr Asp Met Ile Val Gly Met
115                 120                 125
Tyr Gly Ile Met Lys Ala Gly Gly Ala Tyr Val Pro Ile Asp Pro Glu
130                 135                 140
Tyr Pro Lys Glu Arg Ile Asn Tyr Met Leu Glu Asp Ser Gly Thr Lys
145                 150                 155                 160
Met Ile Leu Ala Gln Ala His Leu Leu Glu His Arg Gly Trp Thr Gly
165                 170                 175
Asn Val Leu Leu Leu Asp Glu Pro Ser Thr Tyr Asp Ala Asp Thr Ser
180                 185                 190
Asn Leu Lys Asp Thr Ala Asp Pro Asp Asp Leu Ala Tyr Val Ile Tyr
195                 200                 205
Thr Ser Gly Thr Thr Gly Arg Pro Lys Gly Val Leu Val Glu His Arg
210                 215                 220
Gly Leu Gln Asn Leu Ser Asp Val Tyr Arg Gly Leu Phe Glu Val Thr
225                 230                 235                 240
Pro Gln Asp Arg Ile Val Gln Phe Ala Ser Leu Ser Phe Asp Ala Ser
245                 250                 255
Val Ser Glu Ile Leu Thr Thr Leu Ser His Gly Ala Thr Leu Cys Ile
260                 265                 270
Pro Ser Thr Gln Glu Ile Leu Asp His Ala Leu Phe Glu Gln Phe Met
275                 280                 285
Asn Asp Lys Gly Ile Thr Val Ala Thr Leu Pro Pro Ala Tyr Ala Ile
290                 295                 300
His Leu Glu Pro Glu Arg Leu Pro Thr Leu Arg Cys Leu Leu Thr Ala
305                 310                 315                 320
Gly Ser Ala Thr Ser Val Glu Leu Ile Glu Lys Trp Arg Lys His Val
325                 330                 335
Gln Tyr Phe Asn Ala Tyr Gly Pro Thr Glu Asp Ser Val Cys Thr Thr
340                 345                 350
Ile Trp Asn Ala Gln Asn Ser Glu Glu Thr Val Gly Ile Val Ser Ile
355                 360                 365
Gly Gln Pro Ile Ala Asn His Arg Val Tyr Ile Leu Asp Glu His Phe
370                 375                 380
Arg Leu Leu Pro Val Gly Val Ala Gly Glu Leu Cys Ile Ser Gly Ile
385                 390                 395                 400
Gly Leu Ala Arg Gly Tyr His Asn Arg Pro Glu Leu Met Asp Glu Lys
405                 410                 415
Phe Val Asp Asn Pro Tyr Ala Pro Gly Glu Arg Met Tyr Arg Thr Gly
420                 425                 430
Asp Leu Val Arg Trp Leu Ser Asn Gly Thr Ile Glu Tyr Leu Gly Arg
435                 440                 445
Ile Asp His Gln Val Lys Ile Arg Gly Tyr Arg Ile Glu Leu Gly Glu
450                 455                 460
Val Glu Ala His Met Leu Arg Val Pro Ser Val Gln Glu Val Val Val
465                 470                 475                 480
Leu Ala Val Glu Ser Asp Asp Gly Tyr Lys Asp Leu Val Ala Tyr Phe
485                 490                 495
Val Ala Ala Gln Lys Leu Glu Val Ser Glu Leu Arg Ala Asp Leu Ser
500                 505                 510
Glu Met Leu Pro Gly Tyr Met Ile Pro Ser Arg Phe Ile Gln Leu Glu
515                 520                 525
Asp Met Pro Leu Thr Ser Asn Gly Lys Ile Asp Arg Lys Ala Leu Gln
530                 535                 540
Gly Glu Arg Gly Trp Ala
545                 550
<210>  9
<211>  550
<212>  PRT
<213>  Paenibacillus polymyxa
<400>  9
Asn Ala Leu Val Tyr Asp Pro Ala Thr Ile Glu Gln Ile Lys Gly His
1               5                   10                  15
Leu Phe His Leu Met Glu Gln Ile Val Glu Asn Pro Ala Ile Ser Val
20                  25                  30
Asp Ala Leu Glu Leu Val Thr Pro Gln Glu Arg Glu Gln Ile Leu Asn
35                  40                  45
Val Trp Gly Asp Thr Gly Ala Ser Ser Lys His Arg Thr Thr Phe His
50                  55                  60
Gly Leu Leu Glu Glu Gln Ala Gly Arg Thr Pro Asp Ala Thr Ala Ile
65                  70                  75                  80
Val Phe Glu Asn Glu Val Leu Thr Tyr Ala Glu Leu Asn Ala Lys Ala
85                  90                  95
Asn Gly Leu Ala Arg Arg Leu Arg Ala Glu Gly Ile Lys Thr Gly Asp
100                 105                 110
Leu Val Gly Leu Ile Val Glu Arg Ser Thr Asp Met Ile Val Gly Met
115                 120                 125
Tyr Gly Ile Met Lys Ala Gly Gly Ala Tyr Val Pro Ile Asp Pro Glu
130                 135                 140
Tyr Pro Lys Glu Arg Ile Asn Tyr Met Leu Glu Asp Ser Gly Thr Lys
145                 150                 155                 160
Met Ile Leu Ala Gln Ala His Leu Leu Glu His Arg Gly Trp Thr Gly
165                 170                 175
Asn Val Leu Leu Leu Asp Glu Pro Ser Thr Tyr Asp Ala Asp Thr Ser
180                 185                 190
Asn Leu Lys Asp Thr Ala Asp Pro Asp Asp Leu Ala Tyr Val Ile Tyr
195                 200                 205
Thr Ser Gly Thr Thr Gly Arg Pro Lys Gly Val Leu Val Glu His Arg
210                 215                 220
Gly Leu Gln Asn Leu Ser Asp Val Tyr Arg Gly Leu Phe Glu Val Thr
225                 230                 235                 240
Pro Gln Asp Arg Ile Val Gln Phe Ala Ser Leu Ser Phe Asp Ala Ser
245                 250                 255
Val Ser Glu Ile Leu Thr Thr Leu Ser His Gly Ala Thr Leu Cys Ile
260                 265                 270
Pro Ser Thr Gln Glu Ile Leu Asp His Ala Leu Phe Glu Gln Phe Met
275                 280                 285
Asn Asp Lys Gly Ile Thr Val Ala Thr Leu Pro Pro Ala Tyr Ala Ile
290                 295                 300
His Leu Glu Pro Glu Arg Leu Pro Thr Leu Arg Cys Leu Leu Thr Ala
305                 310                 315                 320
Gly Ser Ala Thr Ser Val Glu Leu Ile Glu Lys Trp Arg Lys His Val
325                 330                 335
Gln Tyr Phe Asn Ala Tyr Gly Pro Thr Glu Asp Ser Val Cys Thr Thr
340                 345                 350
Ile Trp Asn Ala Gln Asn Ser Glu Glu Thr Val Gly Ile Val Ser Ile
355                 360                 365
Gly Gln Pro Ile Ala Asn His Arg Val Tyr Ile Leu Asp Glu His Phe
370                 375                 380
Arg Leu Leu Pro Val Gly Val Ala Gly Glu Leu Cys Ile Ser Gly Ile
385                 390                 395                 400
Gly Leu Ala Arg Gly Tyr His Asn Arg Pro Glu Leu Met Asp Glu Lys
405                 410                 415
Phe Val Asp Asn Pro Tyr Ala Pro Gly Glu Arg Met Tyr Arg Thr Gly
420                 425                 430
Asp Leu Val Arg Trp Leu Ser Asn Gly Thr Ile Glu Tyr Leu Gly Arg
435                 440                 445
Ile Asp His Gln Val Lys Ile Arg Gly Tyr Arg Ile Glu Leu Gly Glu
450                 455                 460
Val Glu Ala His Met Leu Arg Val Pro Ser Val Gln Glu Val Val Val
465                 470                 475                 480
Leu Ala Val Glu Ser Asp Asp Gly Tyr Lys Asp Leu Val Ala Tyr Phe
485                 490                 495
Val Ala Ala Gln Lys Leu Glu Val Ser Glu Leu Arg Ala Asp Leu Ser
500                 505                 510
Glu Met Leu Pro Gly Tyr Met Ile Pro Ser Arg Phe Ile Gln Leu Glu
515                 520                 525
Asp Met Pro Leu Thr Ser Asn Gly Lys Ile Asp Arg Lys Ala Leu Gln
530                 535                 540
Gly Glu Arg Gly Trp Ala
545                 550
<210>  10
<211>  250
<212>  PRT
<213>  Paenibacillus sp.
<400>  10
Asn Thr Leu Val Tyr Asp Ser Ser Asn Ile Glu Arg Ile Arg Gly His
1               5                   10                  15
Leu Val His Leu Met Glu Gln Ile Val Lys Asn Pro Gly Ile Ser Val
20                  25                  30
Asp Ala Leu Glu Leu Val Thr Pro Gln Glu Arg Asp His Ile Leu Asn
35                  40                  45
Ile Trp Lys Asp Ile Ala Val Pro Tyr Glu His Tyr Ala Glu Leu His
50                  55                  60
Ala Gln Ala Gln Thr Ala Pro Ile Gly Gln Pro Asn Val Tyr Ile Val
65                  70                  75                  80
Asp Asp His Phe Arg Leu Leu Pro Val Gly Val Ala Gly Glu Leu Cys
85                  90                  95
Ile Ala Gly Val Gly Phe Thr Arg Glu His His Asn His Pro Glu Leu
100                 105                 110
Thr Asp Glu Lys Phe Val Asp Asn Pro Phe Ala Pro Gly Glu Arg Met
115                 120                 125
Tyr Arg Thr Gly Asp Leu Ala Arg Trp Leu Pro Asp Gly Thr Ile Gln
130                 135                 140
Tyr Leu Gly Arg Val Asp His Gln Val Lys Ile Arg Gly Tyr Arg Val
145                 150                 155                 160
Glu Leu Ser Glu Val Glu Ala Gln Met Leu Lys Val Gln Ser Val Gln
165                 170                 175
Asp Val Val Val Met Ala Val Glu Gly Asp Asp Gly His Lys Asp Leu
180                 185                 190
Phe Ala Tyr Phe Val Ala Asp Gln Thr Ile Glu Ile Ser Glu Leu Arg
195                 200                 205
Ala Val Leu Ser Glu Leu Leu Pro Val Tyr Met Ile Pro Ser His Phe
210                 215                 220
Val Gln Leu Glu Asn Pro Leu Leu Thr Pro Ser Gly Lys Ile Asp Arg
225                 230                 235                 240
Lys Ala Leu Gln Gly Glu Arg Gly Trp Ala
245                 250
<210>  11
<211>  550
<212>  PRT
<213>  Paenibacillus sp.
<400>  11
Asn Ala Leu Val Tyr Asp Gln Val Thr Ile Glu Gln Ile Lys Gly His
1               5                   10                  15
Leu Val His Leu Met Glu Gln Ile Val Glu Asn Pro Ala Ile Ser Val
20                  25                  30
Asp Ala Leu Glu Leu Val Thr Pro Gln Glu Arg Glu Leu Ile Leu Asp
35                  40                  45
Val Trp Gly Asn Thr Lys Val Ser Tyr Glu His Cys Asn Thr Phe His
50                  55                  60
Gly Leu Leu Glu Glu Gln Ala Gly Arg Thr Pro Glu Ala Thr Ala Ile
65                  70                  75                  80
Val Phe Glu Asp Glu Met Leu Thr Tyr Ala Glu Leu Asn Ala Lys Ala
85                  90                  95
Asn Gly Leu Ala Arg Lys Leu Arg Asn Gln Gly Ile Gln Thr Gly Asp
100                 105                 110
Leu Val Gly Leu Ile Ala Asp Arg Ser Ser Glu Met Ile Val Gly Ile
115                 120                 125
Tyr Gly Ile Met Lys Ala Gly Gly Ala Tyr Val Pro Ile Asp Pro Glu
130                 135                 140
Tyr Pro Lys Glu Arg Ile Ser Tyr Met Leu Glu Asp Ser Gly Ala Lys
145                 150                 155                 160
Leu Val Leu Thr Gln Ala Arg Leu Leu Glu His Leu Gly Trp Thr Glu
165                 170                 175
Asn Val Leu Leu Leu Asp Glu Pro Ser Thr Tyr Asp Ala Asp Thr Ser
180                 185                 190
Asn Leu Lys Asp Thr Val Gly Pro Asp Asn Leu Ala Tyr Val Ile Tyr
195                 200                 205
Thr Ser Gly Thr Thr Gly Gln Pro Lys Gly Val Leu Val Glu His Arg
210                 215                 220
Gly Leu Gln Asn Leu Ser Asp Val Tyr Gly Thr Tyr Phe Glu Val Thr
225                 230                 235                 240
Pro Gln Asp Arg Ile Val Gln Phe Ala Ser Leu Ser Phe Asp Ala Ser
245                 250                 255
Val Ser Glu Val Leu Thr Ala Leu Ser His Gly Ala Ala Leu Cys Ile
260                 265                 270
Pro Ser Thr Gln Asp Ile Leu Asp Tyr Ala Leu Phe Glu Gln Phe Ile
275                 280                 285
Asn Asp Lys Gly Ile Thr Ile Ala Thr Leu Pro Pro Ala Tyr Ala Ile
290                 295                 300
His Leu Glu Pro Glu Arg Leu Pro Ala Leu Arg Cys Leu Leu Thr Ala
305                 310                 315                 320
Gly Ser Ala Ala Ser Val Glu Leu Ile Glu Lys Trp Arg Lys His Val
325                 330                 335
Arg Tyr Ser Asn Gly Tyr Gly Pro Thr Glu Asp Ser Ile Cys Thr Thr
340                 345                 350
Ile Trp Ser Val Pro Asp Ser Glu Glu Thr Leu Glu Thr Val Ser Ile
355                 360                 365
Gly Arg Pro Ile Ala Asn His Ser Val Tyr Val Leu Asp Glu His Leu
370                 375                 380
Arg Leu Gln Pro Val Gly Val Val Gly Glu Leu Cys Ile Ser Gly Ile
385                 390                 395                 400
Gly Leu Ala Arg Gly Tyr His Asn Arg Pro Ala Leu Met Asp Glu Lys
405                 410                 415
Phe Val Glu Asn Pro Phe Thr Pro Gly Glu Arg Met Tyr Arg Thr Gly
420                 425                 430
Asp Leu Val Arg Trp Leu Pro Asn Gly Thr Ile Glu Tyr Val Gly Arg
435                 440                 445
Ile Asp His Gln Val Lys Ile Arg Gly Tyr Arg Ile Glu Leu Gly Glu
450                 455                 460
Val Glu Ala Gln Met Leu Arg Val Gln Ser Val Gln Glu Val Val Ala
465                 470                 475                 480
Met Ala Val Glu Gly Asp Asp Gly Gln Lys Asp Leu Val Ala Tyr Phe
485                 490                 495
Val Ala Ala Arg Glu Leu Glu Val Ser Glu Leu Gln Thr Val Leu Ser
500                 505                 510
Glu Met Leu Pro Gly Tyr Met Ile Pro Ser Arg Phe Ile Gln Leu Glu
515                 520                 525
Asp Met Pro Leu Thr Ser Asn Gly Lys Ile Asn Arg Lys Ala Leu Gln
530                 535                 540
Gly Glu Arg Gly Trp Ala
545                 550
<210>  12
<211>  804
<212>  ДНК
<213>  Paenibacillus sp.
<400>  12
ttgcaaaaaa ttgaggtatt gttggctgat gacaaccggg aatttacgaa tctgcttgcc       60
gaatatattt ccgatcagga gcatatggaa gttacaggaa tcgcctataa tggtgaagaa      120
gtgctccaac acatcgcaga atcccgcaac gtacctgatg tacttatttt agatattatc      180
atgcctcatc tggatggtct cggcgtattg gagcgcttga gagaaatgaa cctgtctcca      240
cagccgaaaa tcattatgct gactgcattc ggtcaagaaa atattacgca aagagccgta      300
cagctcgggg catcttatta tattttgaag ccgtttgaca tggaagtgct tcccaaccgt      360
gttcgtcaat tggtgggacc acaattagtc agcagcagtc cggtgacggt ttcttccatg      420
cggtctaatg tggtgccaat cggcaaaacg aaaaacctgg atgccagtat tacggccatt      480
atccatgaaa tcggtgtgcc agctcatatt aagggctatc aatatttacg cgaagccatt      540
actatcgtgt acaataatat cgaaattttg ggtgccatca ccaaaacatt atatcccgca      600
atcgccgaaa aatttaaaac gacggcatcc cgcgtggaac gcgccattcg tcatgccatc      660
gaggtagcat ggacacgtgg caacatcgac agcatctctc atctgttcgg ctacaccatt      720
aatatctcca aatccaagcc gaccaactca gagtttattg cgatggtagc tgacaagctt      780
cggattgaga ataaggtgtc ctga                                             804
<210>  13
<211>  804
<212>  ДНК
<213>  Paenibacillus sp.
<400>  13
ttgcaaaaaa ttgaggtatt gttggctgat gacaaccggg aatttacgaa tctgcttgcc       60
gaatatattt ccgatcagga gcatatggaa gttacaggaa tcgcctataa tggtgaagaa      120
gtgctccaac acatcgcaga atcccgcaac gtacctgatg tacttatttt agatattatc      180
atgcctcatc tggatggtct cggcgtattg gagcgcttga gagaaatgaa cctgtctcca      240
cagccgaaaa tcattatgct gactgcattc ggtcaagaaa atattacgca aagagccgta      300
cagctcgggg catcttatta tattttgaag ccgtttgaca tggaagtgct tcccaaccgt      360
gttcgtcaat tggtgggacc acaattagtc agcagcagtc cggtgacggt ttcttccatg      420
cggtctaatg tggtgccaat cggcaaaacg aaaaacctgg atgccagtat tacggccatt      480
atccatgaaa tcggtgtgcc agctcatatt aagggctatc aatatttacg cgaagccatt      540
actatcgtgt acaataatat cgaaattttg ggtgccatca ccaaaacatt atatcccgca      600
atcgccgaaa aatttaaaac gacggcatcc cgcgtggaac gcgccattcg tcatgccatc      660
gaggtagcat ggacacgtgg caacatcgac agcatctctc atctgttcgg ctacaccatt      720
aatatctcca aatccaagcc gaccaactca gagtttattg cgatggtagt tgacaagctt      780
cggattgaga ataaggtgtc ctga                                             804
<210>  14
<211>  267
<212>  PRT
<213>  Paenibaciluss terrae
<400>  14
Met Gln Lys Ile Glu Val Leu Leu Ala Asp Asp Asn Arg Glu Phe Thr
1               5                   10                  15
Asn Leu Leu Ala Glu Tyr Ile Ser Asp Gln Glu Asp Met Glu Val Thr
20                  25                  30
Gly Ile Ala Tyr Asn Gly Glu Glu Val Leu Gln His Ile Ala Glu Ser
35                  40                  45
Arg Asn Val Pro Asp Val Leu Ile Leu Asp Ile Ile Met Pro His Leu
50                  55                  60
Asp Gly Leu Gly Val Leu Glu Arg Leu Arg Glu Met Asn Leu Ser Pro
65                  70                  75                  80
Gln Pro Lys Ile Ile Met Leu Thr Ala Phe Gly Gln Glu Asn Ile Thr
85                  90                  95
Gln Arg Ala Val Gln Leu Gly Ala Ser Tyr Tyr Ile Leu Lys Pro Phe
100                 105                 110
Asp Met Glu Val Leu Ala Asn Arg Val Arg Gln Leu Val Gly Pro Gln
115                 120                 125
Leu Val Ser Ser Ser Pro Leu Thr Val Ser Ser Met Arg Ser Asn Val
130                 135                 140
Val Pro Met Gly Lys Thr Lys Asn Leu Asp Ala Ser Ile Thr Ala Ile
145                 150                 155                 160
Ile His Glu Ile Gly Val Pro Ala His Ile Lys Gly Tyr Gln Tyr Leu
165                 170                 175
Arg Glu Ala Ile Thr Met Val Tyr Asn Asn Ile Glu Ile Leu Gly Ala
180                 185                 190
Ile Thr Lys Thr Leu Tyr Pro Ala Ile Ala Glu Lys Phe Lys Thr Thr
195                 200                 205
Ala Ser Arg Val Glu Arg Ala Ile Arg His Ala Ile Glu Val Ala Trp
210                 215                 220
Thr Arg Gly Asn Ile Asp Ser Ile Ser His Leu Phe Gly Tyr Thr Ile
225                 230                 235                 240
Asn Ile Ser Lys Ser Lys Pro Thr Asn Ser Glu Phe Ile Ala Met Val
245                 250                 255
Ala Asp Lys Leu Arg Ile Glu Asn Lys Val Ser
260                 265
<210>  15
<211>  267
<212>  PRT
<213>  Paenibacillus sp.
<400>  15
Leu Gln Lys Ile Glu Val Leu Leu Ala Asp Asp Asn Arg Glu Phe Thr
1               5                   10                  15
Asn Leu Leu Ala Glu Tyr Ile Ser Asp Gln Glu Asp Met Glu Val Thr
20                  25                  30
Gly Ile Ala Tyr Asn Gly Glu Glu Val Leu Gln His Ile Ala Glu Ser
35                  40                  45
Arg Asn Val Pro Asp Val Leu Ile Leu Asp Ile Ile Met Pro His Leu
50                  55                  60
Asp Gly Leu Gly Val Leu Glu Arg Leu Arg Glu Met Asn Leu Ser Pro
65                  70                  75                  80
Gln Pro Lys Ile Ile Met Leu Thr Ala Phe Gly Gln Glu Asn Ile Thr
85                  90                  95
Gln Arg Ala Val Gln Leu Gly Ala Ser Tyr Tyr Ile Leu Lys Pro Phe
100                 105                 110
Asp Met Glu Val Leu Ala Asn Arg Val Arg Gln Leu Val Gly Pro Gln
115                 120                 125
Leu Val Ser Ser Ser Pro Val Thr Val Ser Ser Met Arg Ser Asn Val
130                 135                 140
Val Pro Met Gly Lys Thr Lys Asn Leu Asp Ala Ser Ile Thr Ala Ile
145                 150                 155                 160
Ile His Glu Ile Gly Val Pro Ala His Ile Lys Gly Tyr Gln Tyr Leu
165                 170                 175
Arg Glu Ala Ile Thr Met Val Tyr Asn Asn Ile Glu Ile Leu Gly Ala
180                 185                 190
Ile Thr Lys Thr Leu Tyr Pro Ala Ile Ala Glu Lys Phe Lys Thr Thr
195                 200                 205
Ala Ser Arg Val Glu Arg Ala Ile Arg His Ala Ile Glu Val Ala Trp
210                 215                 220
Thr Arg Gly Asn Ile Asp Ser Ile Ser His Leu Phe Gly Tyr Thr Ile
225                 230                 235                 240
Asn Ile Ser Lys Ser Lys Pro Thr Asn Ser Glu Phe Ile Ala Met Val
245                 250                 255
Ala Asp Lys Leu Arg Ile Glu Asn Lys Val Ser
260                 265
<210>  16
<211>  267
<212>  PRT
<213>  Paenibacillus sp.
<400>  16
Leu Gln Lys Ile Glu Val Leu Leu Ala Asp Asp Asn Arg Glu Phe Thr
1               5                   10                  15
Asn Leu Leu Ala Glu Tyr Ile Ser Asp Gln Glu Asp Met Glu Val Thr
20                  25                  30
Gly Ile Ala Tyr Asn Gly Glu Glu Val Leu Gln His Ile Ala Glu Ser
35                  40                  45
Arg Asn Val Pro Asp Val Leu Ile Leu Asp Ile Ile Met Pro His Leu
50                  55                  60
Asp Gly Leu Gly Val Leu Glu Arg Leu Arg Glu Met Asn Leu Ser Pro
65                  70                  75                  80
Gln Pro Lys Ile Ile Met Leu Thr Ala Phe Gly Gln Glu Asn Ile Thr
85                  90                  95
Gln Arg Ala Val Gln Leu Gly Ala Ser Tyr Tyr Ile Leu Lys Pro Phe
100                 105                 110
Asp Met Glu Val Leu Ala Asn Arg Val Arg Gln Leu Val Gly Pro Gln
115                 120                 125
Leu Val Ser Ser Ser Pro Val Thr Val Ser Ser Met Arg Ser Asn Val
130                 135                 140
Val Pro Met Gly Lys Thr Lys Asn Leu Asp Ala Ser Ile Thr Ala Ile
145                 150                 155                 160
Ile His Glu Ile Gly Val Pro Ala His Ile Lys Gly Tyr Gln Tyr Leu
165                 170                 175
Arg Glu Ala Ile Thr Met Val Tyr Asn Asn Ile Glu Ile Leu Gly Ala
180                 185                 190
Ile Thr Lys Thr Leu Tyr Pro Ala Ile Ala Glu Lys Phe Lys Thr Thr
195                 200                 205
Ala Ser Arg Val Glu Arg Ala Ile Arg His Ala Ile Glu Val Ala Trp
210                 215                 220
Thr Arg Gly Asn Ile Asp Ser Ile Ser His Leu Phe Gly Tyr Thr Ile
225                 230                 235                 240
Asn Ile Ser Lys Ser Lys Pro Thr Asn Ser Glu Phe Ile Ala Met Val
245                 250                 255
Val Asp Lys Leu Arg Ile Glu Asn Lys Val Ser
260                 265
<210>  17
<211>  267
<212>  PRT
<213>  Paenibacillus polymyxa
<400>  17
Met Gln Lys Ile Glu Val Leu Leu Ala Asp Asp Asn Arg Glu Phe Thr
1               5                   10                  15
Asn Leu Leu Ala Glu Tyr Ile Ser Asp Gln Glu Asp Met Glu Val Thr
20                  25                  30
Gly Ile Ala Tyr Asn Gly Glu Glu Val Leu Gln Arg Ile Ala Glu Ser
35                  40                  45
Arg Asn Val Pro Asp Val Leu Ile Leu Asp Ile Ile Met Pro His Leu
50                  55                  60
Asp Gly Leu Gly Val Leu Glu Arg Leu Arg Glu Met Asn Leu Thr Pro
65                  70                  75                  80
Gln Pro Lys Ile Ile Met Leu Thr Ala Phe Gly Gln Glu Asn Ile Thr
85                  90                  95
Gln Arg Ala Val Gln Leu Gly Ala Ser Tyr Tyr Ile Leu Lys Pro Phe
100                 105                 110
Asp Met Glu Val Leu Ala Asn Arg Val Arg Gln Leu Val Gly Pro Gln
115                 120                 125
Leu Val Ser Ser Ser Pro Val Thr Val Ser Ser Met Arg Ser Asn Val
130                 135                 140
Val Pro Met Gly Lys Thr Lys Asn Leu Asp Ala Ser Ile Thr Ala Ile
145                 150                 155                 160
Ile His Glu Ile Gly Val Pro Ala His Ile Lys Gly Tyr Gln Tyr Leu
165                 170                 175
Arg Glu Ala Ile Thr Met Val Tyr Asn Asn Ile Glu Ile Leu Gly Ala
180                 185                 190
Ile Thr Lys Thr Leu Tyr Pro Ala Ile Ala Glu Lys Phe Lys Thr Thr
195                 200                 205
Ala Ser Arg Val Glu Arg Ala Ile Arg His Ala Ile Glu Val Ala Trp
210                 215                 220
Thr Arg Gly Asn Ile Asp Ser Ile Ser His Leu Phe Gly Tyr Thr Ile
225                 230                 235                 240
Asn Ile Ser Lys Ser Lys Pro Thr Asn Ser Glu Phe Ile Ala Met Val
245                 250                 255
Val Asp Lys Leu Arg Ile Glu Asn Lys Val Ser
260                 265
<210>  18
<211>  267
<212>  PRT
<213>  Bacillus subtilis
<400>  18
Met Glu Lys Ile Lys Val Cys Val Ala Asp Asp Asn Arg Glu Leu Val
1               5                   10                  15
Ser Leu Leu Ser Glu Tyr Ile Glu Gly Gln Glu Asp Met Glu Val Ile
20                  25                  30
Gly Val Ala Tyr Asn Gly Gln Glu Cys Leu Ser Leu Phe Lys Glu Lys
35                  40                  45
Asp Pro Asp Val Leu Val Leu Asp Ile Ile Met Pro His Leu Asp Gly
50                  55                  60
Leu Ala Val Leu Glu Arg Leu Arg Glu Ser Asp Leu Lys Lys Gln Pro
65                  70                  75                  80
Asn Val Ile Met Leu Thr Ala Phe Gly Gln Glu Asp Val Thr Lys Lys
85                  90                  95
Ala Val Asp Leu Gly Ala Ser Tyr Phe Ile Leu Lys Pro Phe Asp Met
100                 105                 110
Glu Asn Leu Val Gly His Ile Arg Gln Val Ser Gly Asn Ala Ser Ser
115                 120                 125
Val Thr His Arg Ala Pro Ser Ser Gln Ser Ser Ile Ile Arg Ser Ser
130                 135                 140
Gln Pro Glu Pro Lys Lys Lys Asn Leu Asp Ala Ser Ile Thr Ser Ile
145                 150                 155                 160
Ile His Glu Ile Gly Val Pro Ala His Ile Lys Gly Tyr Leu Tyr Leu
165                 170                 175
Arg Glu Ala Ile Ser Met Val Tyr Asn Asp Ile Glu Leu Leu Gly Ser
180                 185                 190
Ile Thr Lys Val Leu Tyr Pro Asp Ile Ala Lys Lys Phe Asn Thr Thr
195                 200                 205
Ala Ser Arg Val Glu Arg Ala Ile Arg His Ala Ile Glu Val Ala Trp
210                 215                 220
Ser Arg Gly Asn Ile Asp Ser Ile Ser Ser Leu Phe Gly Tyr Thr Val
225                 230                 235                 240
Ser Met Thr Lys Ala Lys Pro Thr Asn Ser Glu Phe Ile Ala Met Val
245                 250                 255
Ala Asp Lys Leu Arg Leu Glu His Lys Ala Ser
260                 265
<210>  19
<211>  264
<212>  PRT
<213>  Bacillus cereus
<400>  19
Met Glu Lys Ile Lys Val Cys Leu Val Asp Asp Asn Lys Glu Leu Val
1               5                   10                  15
Ser Met Leu Glu Ser Tyr Val Ala Ala Gln Asp Asp Met Glu Val Ile
20                  25                  30
Gly Thr Ala Tyr Asn Gly Gln Glu Cys Leu Asn Leu Leu Lys Asp Lys
35                  40                  45
Gln Pro Asp Val Leu Val Leu Asp Ile Ile Met Pro His Leu Asp Gly
50                  55                  60
Leu Ala Val Leu Glu Lys Met Arg His Ile Glu Arg Leu Arg Gln Pro
65                  70                  75                  80
Ser Val Ile Met Leu Thr Ala Phe Gly Gln Glu Asp Val Thr Lys Lys
85                  90                  95
Ala Val Asp Leu Gly Ala Ser Tyr Phe Ile Leu Lys Pro Phe Asp Met
100                 105                 110
Glu Asn Leu Thr Ser His Ile Arg Gln Val Ser Gly Lys Ala Asn Ala
115                 120                 125
Thr Ile Lys Arg Pro Leu Pro Ser Phe Arg Ser Ala Thr Thr Val Asp
130                 135                 140
Gly Lys Pro Lys Asn Leu Asp Ala Ser Ile Thr Ser Ile Ile His Glu
145                 150                 155                 160
Ile Gly Val Pro Ala His Ile Lys Gly Tyr Met Tyr Leu Arg Glu Ala
165                 170                 175
Ile Ser Met Val Tyr Asn Asp Ile Glu Leu Leu Gly Ser Ile Thr Lys
180                 185                 190
Val Leu Tyr Pro Asp Ile Ala Lys Lys Tyr Asn Thr Thr Ala Ser Arg
195                 200                 205
Val Glu Arg Ala Ile Arg His Ala Ile Glu Val Ala Trp Ser Arg Gly
210                 215                 220
Asn Ile Asp Ser Ile Ser Ser Leu Phe Gly Tyr Thr Val Ser Met Ser
225                 230                 235                 240
Lys Ala Lys Pro Thr Asn Ser Glu Phe Ile Ala Met Val Ala Asp Lys
245                 250                 255
Leu Arg Leu Glu His Lys Ala Ser
260
<210>  20
<211>  273
<212>  PRT
<213>  Clostridium pasteurianum
<400>  20
Met Glu Tyr Ser Lys Ile Ser Val Leu Ile Ala Asp Asp Asn Lys Glu
1               5                   10                  15
Phe Cys Asn Ile Leu Asn Asp Tyr Leu Leu Asn Gln Ser Asp Ile Val
20                  25                  30
Val Val Gly Ile Ala Lys Asp Gly Ile Glu Ala Leu Lys Leu Ile Glu
35                  40                  45
Glu Lys Lys Pro Asp Leu Val Ile Leu Asp Ile Ile Met Pro Asn Met
50                  55                  60
Asp Gly Leu Val Val Leu Glu Lys Leu Ala Asn Ile Asn Ile Asp Pro
65                  70                  75                  80
Val Pro Asn Val Ile Val Leu Ser Ala Val Gly Gln Asp Lys Ile Thr
85                  90                  95
Gln Arg Ala Ile Thr Leu Gly Ala Asp Tyr Tyr Val Val Lys Pro Phe
100                 105                 110
Asp Met Asp Val Phe Thr Lys Arg Ile Arg Gln Met Phe Asn Asn Thr
115                 120                 125
Ile Leu Asp Ser Glu Thr Lys Lys Thr Met Pro Ile Ser Glu Lys Ala
130                 135                 140
Ala Asp Val Lys Ile Ser Gln Ser Val Pro Leu Asp Leu Glu Asp Glu
145                 150                 155                 160
Ser Ile Ile His Glu Ile Gly Val Pro Ala His Ile Lys Gly Tyr Met
165                 170                 175
Tyr Leu Arg Glu Ala Ile Asn Met Val Val Asp Asn Ile Glu Leu Leu
180                 185                 190
Ser Ala Val Thr Lys Glu Leu Tyr Pro Ser Ile Ala Lys Lys Tyr Asn
195                 200                 205
Thr Thr Ala Ser Arg Val Glu Arg Ala Ile Arg His Ala Ile Glu Val
210                 215                 220
Ala Trp Ser Arg Gly Gln Val Asp Thr Ile Asn Lys Leu Phe Gly Tyr
225                 230                 235                 240
Thr Ile His Asn Gly Lys Gly Lys Pro Thr Asn Ser Glu Phe Ile Ala
245                 250                 255
Met Ile Ala Asp Lys Leu Arg Leu Lys Asn Lys Val Lys Asn Val Ala
260                 265                 270
Gln
<---