СПОСОБ УТИЛИЗАЦИИ ЦЕЛЛЮЛОЗОСОДЕРЖАЩИХ ОТХОДОВ
METHOD OF DISPOSING CELLULOSE-CONTAINING WASTES

Изобретение относится к области биотехнологии, точнее к способу утилизации целлюлозосодержащих отходов.
Известны способы усиления интенсивности утилизации отходов в системе микроорганизмы-дождевые черви по сравнению с действием этих организмов по отдельности / Терещенко Н.Н. Эколого-микробиологические аспекты вермикультивирования / Н.Н. Терещенко. - Новосибирск: Наука, 2003. - 113 с.2. Stom D.I. Transformation of Oil in Soil by a Microbial Preparation and Earthworms / D.I.Stom, D.S. Potapov, A.E. Balayan, O.N. Matveeva // Eurasian Soil Science. - 2003. - Vol.36, No.3. - P.329-331/.
4
8
Известен способ получения бактеризованного удобрения / Патент РФ №2186049 C05F 11/08, C12N 1/20, 2002 г./, включающем гуминосодержащую основу из биогумуса и бактериальную добавку, обладающую фунгицидной активностью, выбранную из группы бактерий Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Bacillus polymyxa с сохранением жизнеспособности в аммиачной среде с pH не менее 9, в количестве 7,5·10-7,5·10 кл/г гуминосодержащей основы.
Известен способ получения биоудобрения /Патент РФ №2125549 C05F 11/08, C05F 11/00, 1999 г./. Способ заключается в том, что субстрат на основе органических отходов сельского хозяйства и промышленности вермикомпостируют при помощи новой промышленной линии дождевых червей "Оболенский гибрид", полученных путем скрещивания "Красного калифорнийского гибрида" с российской популяцией дождевых червей Eisenia fetida при 16-24°C в течение 4-6 месяцев. От полученного биогумуса отделяют червей. Целесообразно после отделения червей биогумус выдержать в естественных условиях для дозревания. В биогумус после отделения червей или после дозревания вводят микроорганизмы, обладающие фунгицидной активностью. В качестве микроорганизмов вводят штамм Bacillus subtilis ИПМ-215 в концентрациях 1-109-1-1012 спор на 1 кг или культуру микофильного гриба Trichoderma viride Per sex S.F. Cray N 16 в концентрациях 1·104-1·108 колониеобразующих единиц на 1 кг. Биоудобрение, полученное предлагаемым способом, улучшает агрохимические показатели почвы, обладает фунгицидными и ростостимулирующими свойствами для растений.
5
6
Известен способ переработки органических отходов / Заявка РФ №2011107180 C05F 11/08, 2011 г./ с помощью вермикультуры с дождевыми червями Eisenia fetida, в исходный субстрат одновременно с червями вносят штамм Trichoderma asperellum МГ-97 (ВКПМ F-765) в виде спор и мицелия или препарат триходермин М в количестве 10-10КОЕ/кг исходного субстрата.
Ближайшим аналогом является способ получения биогумуса /Патент РФ №2408563 C05F 11/08, 2011 г. / заключающийся в том, что субстрат на основе органических отходов сельского хозяйства вермикомпостируют при помощи промышленной линии дождевых червей "Красный калифорнийский гибрид" и вводят культуру микофильного целлюлозолитического гриба Trichoderma viride. В качестве субстрата применяют смесь торфа и подстилочного соломистого навоза крупного рогатого скота в соотношении 1:4 по массе и влажностью 75-80%, а культуру микофильного целлюлозолитического гриба Trichoderma viride вносят на разваренном зерне пшеницы в количестве 2% от веса субстрата за 2 недели до запуска червей в количестве 40 половозрелых особей (30-35 г) на 1 кг субстрата. Вермикомпостирование осуществляют в условиях стеллажной культуры в течение 3-4 недель при температуре +20+250°С.
Недостатком известного способа является недостаточная интенсификация целлюлозосодержащих отходов.
Задачей предлагаемого изобретения является интенсификация целлюлозосодержащих утилизации отходов, путем получение популяции дождевых червей, обладающих повышенной целлюлазной активностью.
Поставленная задача достигается тем, что в способ утилизации целлюлозосодер-жащих отходов, с помощью вермикультуры с дождевыми червями Eisenia fetida и культуры грибов Trichoderma viride, предварительно производят пероральную инокуляцию дождевых червей Eisenia fetida инсулиновым шприцем со спиленным острием иглы суспензией мицелия и спор целлюлозоразрушающего штамма недельной культуры грибов Trichoderma viride с содержанием в ней колониеобразующих единиц (КОЕ) в количестве 10 КОЕ/мл в количестве 0,05 мл, или суточное выдерживание червей в субстрате, пропитанном такой суспензией.
Красный калифорнийский гибрид. Относится к типу Annelida, классу Oligochaeta, семейству Lumbricidae, роду Eisenia Malm 1877 Emend Michaelsen, 1900, виду Е. fetida andrei Bouche, 1963. В лаборатории червей разводили в ящиках при температуре 20-25°C и влажности 80-85%. В опытах использовали половозрелых, имеющих поясковую зону - clitellum, червей длиной 8-10 см. Красный калифорнийский червь был выведен в 1959 году в результате селекционной работы в США. В отличие от своих диких родственников, которые дают только 4-6-кратное воспроизводство, Е. fetida способны давать в год более чем 500-кратное воспроизводство / Викторов А.Г. Eisenia fetida Andrei - модельный вид для вермикультур / А.Г. Викторов // Современные экологические проблемы провинции: материалы международного экологического форума, 4 июля 1995 г. - Курск: РАН, 1995. - С.44-45./.
Грибы рода Trichoderma имеют важное хозяйственное значение в связи с широким использованием многих видов для получения ферментов, биологически активных веществ и препаратов для защиты растений. С другой стороны, почти все виды Trichoderma образуют сильные токсины и могут быть причиной аллергии, а некоторые способны вызывать глубокие микозы у людей с подавленным иммунитетом. В связи с этим точная идентификация видов этого рода важна как для специалистов, занимающихся практическим использованием, так и для изучения распространения этих грибов в природе. Представление о таксономии этого важного рода значительно отстает от масштабов промышленного использования и взаимодействия Trichoderma с человеком. Успешная работа биотехнологов, фитопатологов и медицинского персонала с видами этого рода невозможна без их точной идентификации. Т. viride обладает целлюлозоразрушающими свойствами. Штамм был предоставлен д.б.н. Огарковым Б.Н. / Огарков Б.Н. Биотехнология на основе грибов / Б.Н. Огарков, Г.Р. Огаркова, Л.В. Самусенок // моногр. - Иркутск: Иркут. ун-т, 2005. - 234 с/.
Способ осуществляется следующим образом.
3
Приготавливают суспензию мицелия и спор целлюлозоразрушающего штамма недельной культуры грибов Trichoderma viride с содержанием в ней колониеобразующих единиц (КОЕ) в количестве 10 КОЕ/мл. Затем половозрелых особей дождевых червей, прошедших 3-х суточное голодание, инокулируют инсулиновым шприцем данной суспензией. Далее червей помещают на увлажненную фильтровальную бумагу в чашки Петри.
Создавалась контрольная группа червей. В течение 30 суток отбирали копролиты, описывали их внешний вид, микроструктуру, интенсивность питания подстилающим бумажным диском.
3
3
Для получения кишечного сока (жидкой фракции гомогената кишечника) дождевых червей пятьдесят олигохет с наполненным почвой кишечником замораживали при - 3°С в течение 2-х часов. Ледяных червей вскрывали, вынимали кишечник. Кишечники перетирали в ступке с добавлением мелкого речного песка. Полученную массу центрифугировали для отделения жидкой фракции. Преципитат тщательно перемешивали в 5 см цитратного буфера (ацетат натрия - лимонная кислота, pH 4,4) и вновь центрифугировали с той же целью. Первый супернатант смешивали со вторым и для осаждения белка 1 см полученной смеси разбавляли в 9 см воды и добавляли 3,9 г сульфата аммония. После тщательного перемешивания и полного растворения соли смесь помещали в холодильник на 60 минут. Далее смесь центрифугировали в течение 5 минут при 10 тысячах об/мин. После супернатант сливали, а осадок растворяли в 1 см цитратного буфера. У полученного раствора определяли количество белка биуретовой реакцией и определяли целлюлазную активность с динитросалициловым реактивом по методу Мендельс-Вебера / Mandels M. The production ofcellulases / M.Mandels, J.Weber // Advances in Chemistry. - 1969. №95. - P.391-414./
3
С помощью указанных методов измеряли и сравнивали целлюлазную активность кишечного сока червей, которым скармливали с почвенным субстратом Т. viride (2,5×10КОЕ/г почвенного субстрата).
3
3
Пероральная инокуляция особей E.fetida суспензией 3-суточной культуры Т. viride (с титром ~10 КОЕ/см) интенсифицировала переваривание целлюлозы. Бумажный диск, на котором червей содержали без корма в течение 40 суток, черви съедали в 2 раза быстрее, чем в контроле. В этом случае копролиты были более крупными, плотными, имели характерную веретеновидную форму, начинали темнеть через 2-3 суток, а спустя 15 дней чернели. В контроле копролиты имели более светлый цвет и округлую форму, что говорит об их слабой спрессованности (Фиг.1).
7
5
6
6
7
Культура микромицета Trichoderma viride сохранялась в кишечнике червей Е. fetida в течение 40 суток. На 1-е сутки инкубирования червей жизнеспособные споры Т. viride были выделены из переднего и среднего отделов кишечника (1,2±0,1×10 и 4,0±0,3×10КОЕ/г, соответственно). В дальнейшем споры микромицета обнаруживались во всех отделах кишечника, преобладая в количественном отношении в заднем отделе кишечника. Следует отметить, что численность популяции Т. viride в кишечнике червя оставалась достаточно высокой на протяжении всего эксперимента. Так, на 40-е сутки инкубации червей количество спор микромицета в переднем отделе кишечника составляло 8,0±0,2×10, в среднем - 7,0±0,3×10, в заднем - 3,0±0,6×10 КОЕ/г (Фиг.2).
Известно, что Т. viride активный целлюлозолитик, в связи с этим определяли изменение целлюлазной активности червей Е. fetida, контаминированных спорами триходермы. После содержания олигохет в течение суток в почве, обработанной споровой суспензией Т. viride, целлюлазная активность червей увеличилась с 0,005±0,0008 до 0,07±0,01 МЕ/см (в 14 раз) и превышала таковую в контроле (см. таблицу).
Изменение целлюлазной активности Е. fetida после контаминации культурой Т. viride
Проба
Удельная активность, МЕ/см<sup>3</sup>
Примечание
Жидкая фракция гомогената кишечника червей, инкубируемых в почве, обработанной споровой суспензией Т. viride (2,5×10<sup>3</sup> КОЕ/г почвенного субстрата)
0,07±0,01
Из преципитата пробы выделялась культура Т. viride
Жидкая фракция гомогената кишечника червей (контроль)
0,005±0,0008
Кудьтура T. viride в преципитате отсутствовала
Предлагаемый способ позволит интенсифицировать утилизацию целлюлозе - и лигнинзосодержащих отходов и позволяет получить промышленную популяцию дождевых червей с повышенной целлюлазной ферментативной активностью.