СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ УРОГЕНИТАЛЬНОГО ТРИХОМОНИАЗА
DIAGNOSTIC TECHNIQUE FOR UROGENICAL TRICHOMONIASIS

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и гинекологии, паразитологии, венерологии, медицинской микробиологии, гематологии, и может быть использовано для диагностики урогенитального трихомониаза.
Известны принципы лабораторной диагностики мочеполового трихомониаза, направленные на выявление типичной формы возбудителя. Они предусматривают достаточно полный алгоритм обследования пациентов с подозрением на трихомонадную инфекцию и включают комплекс основных и дополнительных методов исследования. К основным методам исследования относят: микроскопический анализ нативных препаратов, микроскопический анализ окрашенных препаратов, при недостаточности микроскопических методов используют культуральное исследование клинического материала, взятого со слизистых оболочек мочеполовых органов (Дмитриев Г.А., Глазко И.И. Диагностика инфекций, передаваемых половым путем. М.: «Издательство Бином», 2007, с. 178).
Однако патологический процесс при трихомониазе способен протекать в генерализованной форме с длительной персистенцией Trichomonas vaginalis в периферической крови, что приводит к локализации возбудителя в тканях органов малого таза у женщин или вне урогенитальной системы (Клименко Б.В., Авазов Э.Р., Барановская В.Б., Степанова М.С. Трихомониаз мужчин, женщин и детей. Санкт-Петербург. ООО «Сюжет», 2001, с. 50-52. Морева Ж.Г., Васильев М.М., Сащенко В.П., Миронов А.Ю. Морфологические особенности Trichomonas vaginalis у больных онкологическими заболеваниями на фоне воспалительных заболеваний органов малого таза. Российский медицинский журнал №2, 2013 г., с. 17-20, приложения).
Высокая инвазивность трихомонад в ткань с возможным распространением возбудителя через кровь и лимфу была описана еще в фундаментальных трудах ученых 60-70-х годов прошлого века (Вейнеров И.Б., Рожинский Л.М. Болезни мочеполовых органов у мужчин. Киев. Гос. Мед. Издательство УССР, 1961, с. 93-94.). В случае нахождения влагалищных трихомонад в несвойственном им месте обитания, которым является периферическая кровь, возбудитель проявляет способность к полиморфизму, принимая нетипичную форму, сходную с клетками крови, в частности с лимфоцитами. Микроскопическая диагностика трихомонад обычными микроскопическими приемами в мазках крови затрудняется из-за невозможности отличить Т. vaginalis от клеток крови.
Известно использование ферментов, например химотрипсина, трипсина, папаина, дезоксирибонуклеазы в клинической диагностике урогенитальных инфекций (патент RU №2117943, G01N 33/48, А61В 10/00, опубл. 20.08.1998; патент RU №2218413 C1, С12Q 1/04, опубл. 12.10.2003). При местном введении на тампоне ферменты способствуют увеличению проницаемости ткани, разжижению вязких секретов, что приводит к выходу возбудителей из далеких тканевых очагов инфекции, благодаря этому они становятся доступными для лабораторной диагностики со слизистых оболочек половых органов.
Наиболее близким по совокупности существенных признаков к заявляемому способу является способ выявления простейших в периферической крови (патент RU №2262104, С2, G 01 N 33/48, опубл. 10.10.2005, БИ №28).
Способ включает несколько стадий:
1. После забора крови из вены пациента в пробирку с антикоагулянтом проводят ее пробоподготовку и последующее ферментативное разрушение форменных элементов периферической крови с использованием одного протеолитического фермента. Это осуществляют в несколько этапов:
- кровь разливают в центрифужные пробирки в количестве не более 1 мл в каждую;
- пробы центрифугируют 20-30 минут при 3000 об/мин;
- сливают жидкую часть - плазму;
- к осадку добавляют в двойном количестве протеолитический фермент пепсин (трипсин), фермент используют в 1%-й концентрации;
- пробу крови с ферментом инкубируют при температуре +37°C 24-48 часов, для активного и более полного разрушения клеток крови через каждые 12 часов добавляют новую дозу фермента, предварительно слив старую.
2. Из обработанной таким образом смеси крови и фермента делают мазки на предметном стекле.
3. Проводят микроскопическое исследование мазков на наличие различных форм трихомонад.
В данном способе, посредством различных лабораторных манипуляций, осуществляют лизис форменных элементов периферической крови, что приводит к выявлению простейших, в частности, Т. vaginalis из крови микроскопическим путем.
Однако, этот способ выявления простейших в периферической крови, в частности, трихомонад, является недостаточно эффективным, что выражается:
- в длительности проведения лабораторной диагностики трихомониаза, поскольку полный анализ крови на выявление Т. vaginalis длится 1-2 суток;
- в недостаточном ферментативном разрушении форменных элементов крови, так как используется только один фермент протеолитического действия, что затрудняет микроскопический анализ крови на выявление Т. vaginalis;
- в большом расходе применяемого препарата фермента, который добавляется в двойном количестве по отношению к осадку из клеток крови. Кроме того, в ходе лабораторного анализа добавляется новая доза фермента, после предварительного сливания старой, это приводит также к необходимости осуществления дополнительных действий в лабораторном исследовании.
Задачей изобретения является разработка способа диагностики урогенитального трихомониаза, который позволил бы усовершенствовать диагностику трихомониаза и повысить ее эффективность за счет сокращения длительности диагностики, повышения ее точности, связанной с более полным разрушением клеток крови, уменьшения расхода применяемого ферментативного препарата и упрощения хода лабораторного исследования.
Сущность изобретения заключается в том, что заявляемый способ диагностики урогенитального трихомониаза, включает забор крови, ее пробоподготовку и ферментативное разрушение форменных элементов периферической крови при добавлении комплекса ферментов различного действия, содержащихся, по крайней мере, в одной таблетке, растворенной в воде, изготовление мазков и их микроскопическое исследование на выявление влагалищных трихомонад из крови, при этом в качестве комплекса ферментов различного действия используют препарат Вобэнзим в виде 0,1-0,5%-ного раствора, который добавляют к пробе крови однократно в соотношении 1:1, а мазки из полученной смеси делают через 6-12 часов после добавления Вобэнзима. Вобэнзим представляет собой комплекс ферментов растительного и животного происхождения, взятых в оптимальных соотношениях, панкреатина, папаина, рутозида, бромелаина, трипсина, липазы, амилазы, химотрипсина, оказывающих одновременно протеолитическое, амилолитическое и липолитическое действие. Вобэнзим в таблетированной форме растворяют в дистиллированной воде и получают различные концентрации препарата.
Достигаемый технический результат заключается в том, что предлагаемый способ позволяет получить следующее преимущество: усовершенствовать диагностику и значительно повысить эффективность выявления урогенитальных трихомонад из крови за счет:
- существенного сокращения длительности проведения лабораторной диагностики трихомониаза из крови до 6-12 часов, что позволяет ускорить выдачу результата и планирования тактики лечения;
- повышения точности диагностики трихомониаза из крови за счет более полного лизиса форменных элементов периферической крови с использованием препарата Вобэнзим, состоящего из комплекса ферментов различного действия, одновременно воздействующих на белковый, полисахаридный и липидный компонент оболочки клеток крови;
- уменьшения расхода ферментативного препарата, так как Вобэнзим добавляется к пробе крови однократно в соотношении 1:1, это упрощает ход лабораторного исследования.
К тому же изобретение позволяет дополнительно получить следующие преимущества:
- предлагаемый способ обладает большой чувствительностью, так как позволяет диагностировать генерализованную трихомонадную инфекцию, как сложную форму патологического процесса, и, как следствие, тканевое нахождение Т. vaginalis, в этом случае возбудитель, находясь в крови и ткани, имеет атипичную форму, сходную с клетками крови или ткани, такую форму клетки трихомонады трудно выявлять другими микроскопическими приемами диагностики;
- предлагаемый способ является экспресс-способом диагностики нетипично протекающей трихомонадной инфекции (имеется в виду не локальная инфекция слизистых оболочек- типичный случай, а инфекция в кровяном потоке), доступен в исполнении, это позволяет широко использовать его в клинических лабораториях;
- использование препарата Вобэнзим в качестве литического средства при диагностике трихомониаза из крови позволяет диагностировать и других простейших, находящихся в крови, так как на поверхности клеток простейших, в их оболочке, особенно у цист или цистоподобных форм влагалищных трихомонад, находятся вещества, например, антитрипсин и другие, способствующие устойчивости клеток простейших к разрушительному действию ферментов;
- предлагаемый способ позволяет диагностировать трихомонады в крови не только при наличии воспалительных заболеваний урогенитального тракта, но и при не воспалительных гинекологических заболеваниях, так как гормональный и иммунный дисбаланс, который часто наблюдается у женщин с такой патологией, нарушает защитные механизмы слизистых оболочек половых органов, это способствует активному проникновению Т. vaginalis в кровь.
Предлагаемый способ диагностики урогенитального трихомониаза осуществляют следующим образом.
После клинического обследования мочеполовых органов и лабораторного анализа клинического материала, взятого со слизистых оболочек половых органов, на обнаружение влагалищных трихомонад, из вены пациента забирают кровь, не менее 2,0 мл, смешивают ее с 15 Ед/мл гепарина или помещают в специальную пробирку с антикоагулянтом. Затем кровь разливают в центрифужные пробирки в количестве не более 1 мл в каждую. Пробы центрифугируют 10-20 мин при 1500-3000 об/мин. После образовавшуюся жидкую часть - плазму сливают, а осадок, содержащий форменные элементы крови и клетки влагалищных трихомонад, подвергают ферментативному разрушению. Для этого к осадку добавляют однократно препарат Вобэнзим в виде 0,1-0,5%-ного водного раствора в соотношении 1:1. Раствор препарата Вобэнзим нужной концентрации получают путем растворения таблетки в дистиллированной воде. Раствор препарата Вобэнзим должен быть подогретым до температуры +37°C. Это улучшает ферментативную активность препарата и создает более благоприятные условия для сохранения клеток Т. vaginalis. Осадок крови и ферментов перемешивают, помещают в термостат и инкубируют при температуре +37°C в течение 6-12 часов. Время инкубации зависит от взятой концентрации ферментативного препарата. По истечении срока инкубации из аликвоты смеси крови и ферментов делают мазки на предметном стекле, высушивают на воздухе, фиксируют 3 минуты в 98%-ном этаноле, снова высушивают и окрашивают 1%-ным водным раствором метиленового синего в течение 1-2 минут. Далее краситель смывают, мазки высушивают на воздухе. При исследовании путем световой микроскопии в мазках гемолизированной крови среди небольшого количества фрагментов клеток крови (чаще всего они отсутствуют), наблюдают клетки трихомонад, имеющие размер лимфоцита, округлой или овальной формы сине-зеленого цвета с хорошо выраженными и более интенсивно окрашенными структурами: клеточной оболочкой и ядром. При микроскопии в мазках можно наблюдать и округлые клетки трихомонад более крупного размера, не имеющие ядра, обладающие толстой оболочкой, проявляющие низкие тинкториальные свойства. Такие клетки трихомонад выглядят «блестящими». Для более подробной дифференцировки клеточных структур Т. vaginalis используют сложные методы окраски - окраску по Романовскому - Гимзе или ее модификации. При окрашивании по Романовскому - Гимзе приготовленные мазки фиксируют 3-5 минут в метиловом спирте или смеси Никифорова. После фиксации мазки высушивают на воздухе и окрашивают приготовленным рабочим раствором краски Романовского - Гимзе 20-25 минут. Далее краситель смывают, мазки высушивают на воздухе. При микроскопии в мазках среди небольшого количества фрагментов разрушенных клеток крови (чаще всего они отсутствуют) наблюдают клетки трихомонад округлой или овальной формы с различно окрашенными структурами: голубой протоплазмой, красно-фиолетовым ядром, розовыми жгутиками при их наличии.
Примеры, подтверждающие назначение заявленного способа диагностики урогенитального трихомониаза.
Пример 1
Больная З.О.С., возраст 56 лет, 5.11.2016 г. находилась на осмотре у гинеколога. Клинический диагноз: хронический двухсторонний сальпингоофорит в стадии обострения, хронический метроэндометрит, подострое течение, спаечная болезнь органов малого таза. Сопутствующие заболевания: гипертоническая болезнь, сахарный диабет 2-го типа, ожирение I ст., заболевания пищеварительной системы, частые воспалительные заболевания верхних дыхательных путей, аллергическая реакция на пенициллин. Больная жаловалась на ноющую боль в обеих паховых областях с иррадиацией в поясницу и крестец. Во время гинекологического осмотра отмечено: наружные половые органы развиты правильно, передняя стенка влагалища незначительно опущена, слизистая оболочка влагалища с участками гиперемии, выделения обильные, слизисто-гнойные, желтого цвета с запахом. Своды влагалища глубокие, безболезненные. Шейка матки цилиндрической формы, деформированная. Матка в положении anteflexio, anteversio, слегка чувствительная при пальпации. Маточные трубы тяжистые, инфильтрированные, при пальпации резко болезненные с обеих сторон. Пациентке рекомендована госпитализация в гинекологическое отделение больницы. Гинекологический анамнез пациентки: было 7 беременностей, закончившихся 2 родами, 5 абортами. В 2000 г. поставлен диагноз бактериального вагинита, во влагалищном отделяемом микроскопическим методом обнаружена Т. vaginalis. В 2002 г. диагностирован хронический двухсторонний сальпингоофорит. В 2003 г. выявлен метроэндометрит, по поводу которого пациентка проходила лечение в гинекологическом отделении больницы. В 2006 г. по результатам УЗИ диагностирован фиброматоз матки, в 2010 г. произведено диагностическое выскабливание, после которого гистологическим методом диагностирована железисто-кистозная гиперплазия эндометрия, в 2011 г. на приеме у гинеколога диагностированы перитонеальные спайки, наблюдался воспалительный процесс во влагалище, во влагалищном отделяемом микроскопическим методом обнаружена Т. vaginalis. Каждый год у больной наблюдались эпизоды бактериального вагиноза и вагинита, часто кандидоз. Лабораторные показатели у больной на момент обследования ноябрь 2016 г.: в мазке, взятом со слизистой оболочки влагалища, присутствуют лейкоциты в большом количестве, более 25 клеток в поле зрения (п/з), эпителий - 15 клеток в п/з, микрофлора обильная, вариабельная при окраске по Граму, встречаются палочки и кокки; в мазке, взятом с шейки матки, присутствуют лейкоциты в количестве более 15 клеток в п/з, эпителий - 10 клеток в п/з, микрофлора вариабельная при окраске по Граму, встречаются палочки и кокки в количестве более 50% в п/з. Методом ПЦР в отделяемом с шейки матки обнаружена Ureaplasma urealiticum, Mycoplasma hominis, микроскопическим и культуральным методами из влагалища и цервикального канала выявлена Т. vaginalis. В общем анализе крови наблюдалась лимфопения. Учитывая клинический диагноз, сложный гинекологический анамнез и множество сопутствующих заболеваний, ведущих к снижению реактивности со стороны иммунной системы и гормональному дисбалансу, предположили наличие восходящей смешанной трихомонадной инфекции с нахождением трихомонад и в периферической крови. Пациентке производили забор крови из локтевой вены в количестве 3,0 мл, кровь смешивали с антикоагулянтом, далее пробы центрифугировали, плазму крови сливали, а к полученному осадку в соотношении 1:1 добавляли однократно препарат Вобэнзим в виде 0,1%-ного водного раствора. После перемешивания осадок крови и ферментов помещали в термостат и инкубировали при температуре +37°C в течение 12 часов. По истечении срока инкубации из аликвоты смеси крови и ферментов делали мазки на предметном стекле, высушивали на воздухе, фиксировали 3 минуты в 98%-ном этаноле, снова высушивали и окрашивали 1%-ным водным раствором метиленового синего в течение 2 минут, далее мазок промывали и высушивали на воздухе. При исследовании путем световой микроскопии в мазках наблюдали на сине-фиолетовом фоне хорошо гемолизированной крови клетки трихомонад, имеющие размер лимфоцита, округлой и овальной формы сине-зеленого цвета с хорошо выраженными и более интенсивно окрашенными структурами: клеточной оболочкой и ядром. Таким образом, у больной с воспалительными заболеваниями органов малого таза на фоне не воспалительных гинекологических заболеваний влагалищные трихомонады были выделены не только со слизистых оболочек половых органов, но и из периферической крови.
Пример 2
Больная Р.Е.О., возраст 36 лет, 12.09.2016 г. находилась на осмотре у гинеколога. Клинический диагноз: обострение хронического метроэндометрита, хронический двухсторонний сальпингоофорит вне обострения, нарушение менструальной функции; сопутствующие заболевания: ожирение I ст., пиелонефрит, мочекаменная болезнь. Больная жаловалась на усиление ноющей боли по средней линии живота с иррадиацией в крестец и прямую кишку. Боль усиливалась после физической нагрузки или незначительной ходьбы. Во время гинекологического осмотра отмечено: наружные половые органы развиты правильно, влагалище без особенностей, слизистая оболочка влагалища не гиперемированная, выделения обильные, серозно-гнойные, желтого цвета с характерным запахом. Своды влагалища глубокие, безболезненные. Шейка матки цилиндрической формы, слегка гиперемированная. Матка в положении anteflexio, anteversio, тело матки инфильтрированное, резко болезненное при пальпации. Маточные трубы при пальпации инфильтрированные, болезненные с обеих сторон. Пациентке рекомендована госпитализация в гинекологическое отделение больницы. Гинекологический анамнез пациентки: было 4 беременности, закончившиеся 2 родами, 2 абортами. В 2012 г. поставлен диагноз острого цервицита, во влагалищном отделяемом и отделяемом с шейки матки микроскопическим методом обнаружена Т. vaginalis. В 2013 г. диагностирован хронический двухсторонний сальпингоофорит, по поводу которого больная лечилась в стационаре. В 2014 г. поставлен диагноз метроэндометрита, пациентка пролечилась в больнице. Через некоторое время по результатам УЗИ выявлен внутренний эндометриоз, также наблюдалось обострение хронического сальпингоофорита слева. В 2015 г. диагностирована спаечная болезнь органов малого таза во время осмотра гинекологом, наблюдалось обострение метроэндометрита, выявлено нарушение менструальной функции по типу меноррагии. Наблюдался бактериальный вагинит с выделением из влагалища микроскопическим методом Т. vaginalis. В январе 2016 г. больная лечилась по поводу обострения хронического метроэндометрита. Каждый год больная проходила лечение в стационаре по поводу воспалительных заболеваний половых органов. Лабораторные показатели у больной на момент обследования сентябрь 2016 г.: в отделяемом из влагалища присутствуют лейкоциты в количестве 15-20 клеток в п/з, эпителий - 13 клеток в п/з, микрофлора обильная, вариабельная при окраске по Граму, встречаются палочки и кокки в количестве более 75% в п/з.; в мазке с шейки матки присутствуют лейкоциты в количестве более 30 клеток в п/з, эпителий - 11 клеток в п/з, микрофлора вариабельная при окраске по Граму, встречаются палочки и кокки в количестве более 50% в п/з. Методом ПЦР в отделяемом с шейки матки обнаружена U.urealiticum, M.hominis, Gardnerella vaginalis, вирус папилломы человека 45 тип, микроскопическим и культуральным методами из влагалища и цервикального канала выявлена Т. vaginalis. В общем анализе крови наблюдается лимфоцитоз. У пациентки выявлена бактериально-вирусно-протозойная инфекция. Учитывая клинический диагноз, сложный гинекологический анамнез, наличие сопутствующих заболеваний, что приводит к иммунному дисбалансу, предположили наличие восходящей смешанной трихомонадной инфекции с нахождением трихомонад и в периферической крови. Пациентке производили забор крови из локтевой вены в количестве 3,0 мл, кровь смешивали с антикоагулянтом, далее пробы центрифугировали, плазму крови сливали, а к полученному осадку в соотношении 1:1 добавляли однократно препарат Вобэнзим в виде 0,5%-ного водного раствора. После перемешивания осадок крови и ферментов помещали в термостат и инкубировали при температуре +37°C в течение 12 часов. По истечении 6 часов инкубации из аликвоты смеси крови и ферментов делали мазки на предметном стекле, высушивали на воздухе, фиксировали 3 минуты в 98%-ном этаноле, снова высушивали и окрашивали 1%-ным водным раствором метиленового синего в течение 2 минут, далее мазок промывали и высушивали на воздухе. При исследовании путем световой микроскопии, в мазках наблюдали на сине-фиолетовом фоне хорошо гемолизированной крови клетки трихомонад, имеющие размер лимфоцита, округлой формы сине-зеленого цвета с хорошо выраженными и более интенсивно окрашенными структурами: клеточной оболочкой и ядром. Таким образом, у больной с обострением хронических воспалительных заболеваний органов малого таза на фоне не воспалительных гинекологических заболеваний влагалищные трихомонады были выделены не только со слизистых оболочек половых органов, но и из периферической крови.
Пример 3
.
Больная М.Л.И., возраст 48 лет, 29.08.2016 г., находилась на осмотре у гинеколога. Клинический диагноз: обострение хронического двухстороннего сальпингоофорита, хронический метроэндометрит подострое течение, острый вагинит; сопутствующие заболевания: вегетососудистая дистония по гипотоническому типу, ДЭП I ст., фиброзно-кистозная мастопатия слева, остеохондроз поясничного и крестцового отделов позвоночника, частые воспалительные заболевания верхних дыхательных путей, хронический гастродуоденит. Больная жаловалась на усиление ноющей боли в обеих паховых областях с иррадиацией в поясницу и крестец, боль усиливается после физической нагрузки. Во время гинекологического осмотра отмечено: наружные половые органы развиты правильно, слизистая оболочка влагалища гиперемированная, выделения обильные, слизисто-гнойные, желтого цвета с запахом. Своды влагалища глубокие, безболезненные. Шейка матки цилиндрической формы, не деформированная. Матка в положении anteflexio, anteversio, слегка чувствительная при пальпации. Маточные трубы тяжистые, инфильтрированные, резко болезненные с обеих сторон при пальпации. Пациентке рекомендована госпитализация в гинекологическое отделение больницы. Гинекологический анамнез пациентки: было 6 беременностей, закончившихся 2 родами, 3 абортами, 1 выкидышем. В 2002 году поставлен диагноз вагинита, во влагалищном отделяемом микроскопическим методом обнаружена Т. vaginalis. В 2002 году диагностирован метроэндометрит, по поводу которого пациентка проходила лечение в стационаре, через 2 месяца диагностирован хронический двухсторонний сальпингоофорит. В 2003 году наблюдалось обострение хронического двухстороннего сальпингоофорита, пациентка проходила лечение, немного позднее диагностирован острый бартолинит и грибковый вагинит. В 2004 году наблюдалось обострение хронического двухстороннего сальпингоофорита и метроэндометрита, пациентка лечилась в стационаре. В 2005 году наблюдался воспалительный процесс во влагалище, во влагалищном отделяемом микроскопическим методом обнаружена Т. vaginalis. В 2013 году диагностирована фиброзно-кистозная мастопатия слева, воспалительный процесс во влагалище, во влагалищном отделяемом микроскопическим методом обнаружена Т. vaginalis, пациентка проходила лечение. Каждый год у больной наблюдались эпизоды бактериального вагиноза и вагинита. Лабораторные показатели у больной на момент обследования август 2016 г.: в отделяемом из влагалища присутствуют лейкоциты в большом количестве, 30-40 клеток в п/з, эпителий - 14 клеток в п/з, микрофлора обильная, встречаются грамположительные кокки; в отделяемом с шейки матки присутствуют лейкоциты в количестве более 10 клеток в п/з, эпителий - 12 клеток в п/з, микрофлора кокковая встречается в количестве более 50% в п/з. Методом ПЦР в отделяемом с шейки матки обнаружена U. urealiticum, М. hominis, М. genitalium, микроскопическим и культуральным методами из влагалища и цервикального канала выявлена Т. vaginalis. В общем анализе крови наблюдается повышенная СОЭ. Учитывая клинический диагноз, сложный гинекологический анамнез и множество сопутствующих заболеваний, ведущих к снижению реактивности со стороны иммунной системы, предположили наличие восходящей смешанной трихомонадной инфекции с нахождением трихомонад и в периферической крови. Пациентке производили забор крови из локтевой вены в количестве 3,0 мл, кровь смешивали с антикоагулянтом, далее пробы центрифугировали, плазму крови сливали, к полученному осадку первой пробы в соотношении 1:2 добавляли 1%-ный водный раствор пепсина, через каждые 12 часов добавляли новый раствор пепсина, слив старый, к полученному осадку второй пробы в соотношении 1:1 добавляли однократно препарат Вобэнзим в виде 0,5%-ного водного раствора. После перемешивания осадка крови и ферментативного препарата, пробы помещали в термостат и инкубировали при температуре +37°C в течение 48 часов. В процессе инкубации проб из аликвоты смеси крови и ферментов через 6,10,12,18,24,48 часов делали мазки на предметном стекле, высушивали на воздухе, фиксировали 3 минуты в 98%-ном этаноле, снова высушивали и окрашивали 1%-ным водным раствором метиленового синего в течение 2 минут, далее мазки промывали и высушивали на воздухе. При исследовании путем световой микроскопии первой пробы в мазках наблюдали гемолиз крови только через 24 часа инкубации, клетки трихомонад невозможно было различить среди большого количества фрагментов клеток крови даже через 48 часов инкубации с пепсином. При исследовании второй пробы в мазках наблюдали хороший полный гемолиз крови уже через 6 часов инкубации, фрагментов разрушенных клеток крови не было обнаружено, клетки трихомонад были хорошо различимы и имели размер лимфоцита, были овальной формы сине-зеленого цвета с хорошо выраженными и более интенсивно окрашенными структурами: клеточной оболочкой и ядром. Таким образом, у больной со смешанной трихомонадной инфекцией влагалищные трихомонады были выделены из периферической крови только с помощью заявляемого способа, что подтверждает его высокую чувствительность.