Способ оценки специфической активности бактериофага c использованием клеточных культур
METHOD OF ASSESSING BACTERIOPHAGE SPECIFIC ACTIVITY USING CELL CULTURES

Изобретение относится к области медицины, микробиологии, биологии. Сущность способа сводится к тому, что в стандартных условиях монослоя культуры клеток легочных фибробластов эмбриона человека (ЛЭЧ-3) с оценкой результатов по степени снижения адгезии тест-штамма микроорганизма к клеткам монослоя и степени лизиса неадгезировавшихся бактериальных клеток проводят совместное культивирование тест-штамма микроорганизма с соответствующим бактериофагом в объеме 0,2 мл, результат учитывают в течение 1 часа. Использование способа позволяет проводить оценку эффективности лечебно-профилактического бактериофага в меньшем объеме препарата - 0,2 мл и сократить время проведения реакции до 1 часа.
За последние годы практически не появилось новых антибактериальных препаратов (АБП), в то время как устойчивость к «старым» АБП неуклонно растет и во многих случаях уже достигла критической отметки. В этой связи ключевыми задачами являются разработка и внедрение в клиническую практику дополнительных средств борьбы с инфекционными заболеваниями, в качестве которых, несомненно, можно рассматривать бактериофаги.
Доступность и эффективность фаготерапии находит все более широкое применение этого метода в клинической практике, включая тяжелые формы инфекционной патологии, так как антимикробный эффект бактериофагов обусловлен внедрением их в бактериальную клетку без нарушения нормальной микрофлоры. Простота культивирования, короткий период генерации, высокий выход фагового потомства и возможность точного количественного учета способствуют не только успешно решать многие проблемы молекулярной генетики и общей вирусологии, но и позволяют широко использовать бактериофаги с диагностической и лечебно-профилактической целью при оказании медицинской помощи.
При этом актуальным в клинической практике является получение быстрого результата, поскольку постановка реакции по оценке фагочувствительности установленного патогена дополнительно требует определенного времени.
В настоящее время известен способ определения чувствительности выделенного микроорганизма к бактериофагу путем посева бактериальной культуры на агаризиванную питательную среду (Методические рекомендации «Принципы использования бактериофагов для борьбы с инфекциями с оказанием медицинской помощи» М. 2014 г.). О чувствительности бактериальной культуры к фагу судят по образованию зон лизиса в местах нанесенной на плотную питательную среду суспензии бактериофага. Результаты оценивают по пятибалльной шкале (по количеству «крестов»): «++++» прозрачная зона лизиса без колоний вторичного роста, «+++» зона лизиса с единичными колониями вторичного роста, «++» образование зоны лизиса с большим количеством колониями вторичного роста, «+» низкая активность, «-» отсутствие литической активности.
Недостатками этого способа является постановка теста в искусственно созданных условиях на синтетических питательных средах (in vitro) и получение результата через 18-24 часов.
Техническим результатом представленного изобретения является приближение условий культивирования к организму человека (in vivo), а также быстрота получения ответа с меньшими затратами.
Ближайшим прототипом изобретения является патент № 2296163 от 2012 г. «Способ оценки специфической активности бактериофагов» (авторы: Тихолов Р.М., Афиногенова А.Г., Кравцов А.Г., Афиногенов Г.Е.).
Сущность способа сводится к тому, что в стандартных условиях монослоя культуры клеток эмбриона человека проводят совместное культивирование в течение 2 часов тест-штамма микроорганизма с соответствующим лечебным бактериофагом или комбинированным (поливалентным) бактериофагом, в состав которого входит соответствующий используемой тест-культуре микроорганизма фаг, а результат оценивают по степени снижения адгезии тест-штамма микроорганизма по сравнению с контролем.
Недостатками метода является объем бактериофага (1,8 мл), что экономически затратно и постановка эксперимента в течение 2-х часов, что не позволяет отнести представленную методику к экспресс-методу диагностики.
Результат изобретения достигается за счет того, что в стандартных условиях монослоя культуры клеток легочных фибробластов эмбриона человека (ЛЭЧ-3) с оценкой степени снижения адгезии тест-штамма микроорганизма и степени лизиса неадгезировавшихся бактериальных клеток по сравнению с контролем проводят совместное культивирование тест-штамма микроорганизма с соответствующим лечебно-профилактическим бактериофагом или комбинированным (поливалентным) бактериофагом в объеме 0,2 мл в течение 1 часа.
Способ осуществляется следующим образом.
8
Из пробирок на покровное стекло с монослоем легочных фибробластов (ЛЭЧ-3) эмбриона человека, сливают ростовую среду и добавляют 0,2 мл препарата бактериофага и 0,2 мл суточной культуры тест-штамма в дозе 10 КОЕ/мл. Пробирки с покровным стеклом инкубируют 1 часа при 37 ± 1 °С, периодически встряхивая. Затем клетки монослоя отмывают от неприкрепившихся бактерий 3-х кратно ФР (фосфатным буфером с pH 7,2). Препараты (покровное стекло) фиксируют 96° спиртом и окрашивают по Романовскому-Гимзе. Исследуют микроскопически, определяя степень инфицированности монослоя сравнительно с контролем. В контрольной пробирке  с покровным стеклом с монослоем ЛЭЧ-3 проводят совместное ингибирование 0,2 мл поддерживающей среды Игла  МЕМ с 0,2 мл суточной культуры тест-штамма. Интенсивность процесса адгезии оценивают по следующим показателям: 1) индекс адгезии (ИА) выражают средним числом бактериальных клеток на одной эукариотической клетке; 2) процент пораженных клеток монослоя (ПК%); 3) обсемененность 100 клеток монослоя - микробную нагрузку (МН) - определяют по формуле МН=ИА×ПК%. Процент адгезии микроба определяют по показателю микробной нагрузки относительно контроля, принимаемого за 100%.
Аcinetobacter baumannii и Pseudomonas aeriginosa
В качестве примера использовали официальные препараты стафилококковый, синегнойный бактериофаг (псевдомонас аеругиноза) и экспериментальную серию бактериофага «Дифаг» против .
бактериолитической
Ps.aeriginosa
A. baumannii
Пример 1. Определение  активности препаратов: стафилококкового бактериофага в отношении S.aureus №456, синегнойного бактериофага против № 461, двухкомпонентного бактериофага «Дифаг» в отношении  № 31 на культуре клеток (КК) ЛЭЧ-3. Среда для культивирования тест-микроорганизма - мясо-пептонный бульон (МПБ), для культивирования фибробластов - питательная среда Игла МЕМ.
8
-5
-7
В пробирку на покровное стекло с монослоем  ЛЭЧ- 3 наносят 0,2 мл суточной культуры соответствующего микроорганизма в дозе ~1,5х10 КОЕ/мл (0,5 по МакФарланду) с добавлением 0,2 мл бактериофага с литической активностью 10-(опытный инокулят). В качестве контрольного инокулята использовали смесь 0,2  мл питательной среды Игла МЕМ с 0,2 мл суточной тест-культуры соответствующего микроорганизма в той же дозе, помещенную в пробирку на покровное стекло с монослоем ЛЭЧ-3. Пробирки инкубировали 1 часа при  t 37 ± 1 °С, периодически встряхивая, затем клетки монослоя отмывали от неприкрепившихся микроорганизмов 3-х кратно ФР, фиксировали 96° этиловым спиртом, окрашивали по Романовскому-Гимза и исследовали под микроскопом, определяя степень инфицированности монослоя и процент адгезии микроба по сравнению с соответствующим контролем без бактериофага по показателю микробной нагрузки (таблица 1,2,3).
Таблица 1.
S.aureus
Адгезивная активность  в присутствии специфического  стафилококкового бактериофага.
Показатели процесса адгезии <i>S.aureus</i>
ИА
ПК%
МН
% адгезии от контроля
опыт:
КК + бактерий +бактериофаг
10
10
100
1,3
контроль:
КК+ бактерий
25
30
750
100
Примечание: КК- клеточная культура
Таблица 2.
P.aeriginosa
Адгезивная активность   в присутствии специфического синегнойного бактериофага
Показатели процесса адгезии <i>P.aeriginosa</i>
ИА
ПК%
МН
% адгезии от контроля
опыт:
КК + бактерий + бактериофаг
2
7
14
2,3
контроль:
КК+ бактерий
10
30
300
100
Таблица 3.
A.baumannii
Адгезивная активность  в присутствии специфического бактериофага «Дифаг»
Показатели процесса адгезии <i>A.baumannii</i>
ИА
ПК%
МН
% адгезии от контроля
опыт:
КК + бактерий +бактериофаг
5
5
25
5,3
контроль:
КК+ бактерий
16
30
480
100
S.aureus
P.aeriginosa
A.baumannii
Как видно из данных таблиц, процент адгезии тест-штаммов достоверно снизился относительно контроля соответственно: на 98,7%,   на  97,7%,  на 94,7%.
Снижение адгезивной активности бактерий происходило за счет бактериолитического эффекта бактериофага. Это подтверждали результатами проведенного дополнительного теста.
Производили высев инокулятов из пробирок на чашки Петри с МПА (мясо-пептонный агар) до начала инкубации и после 1 часа термостатирования при t=37 ± 1°С (таблица 4). Результаты высева инокулятов из соответствующих контрольных и опытных пробирок.
Таблица 4.
Присутствие  тест-штамма микроорганизма в МПБ
(в контроле и в опыте)
Наличие микроорганизмов в МПБ*  (КОЕ/мл)
<i>S.aureus</i>
<i>P.aeriginosa  </i>
<i>A.baumannii</i>
контроль
опыт
контроль
опыт
контроль
опыт
Инкубация микроорганизма без бактериофага (контроль)
5<sup>.</sup>10<sup>8</sup>
4<sup>.</sup>10<sup>8</sup>
4<sup>.</sup>10<sup>8</sup>
3<sup>.</sup>10<sup>8</sup>
3<sup>.</sup>10<sup>8</sup>
2<sup>.</sup>10<sup>8</sup>
Инкубация микроорганизма с бактериофагом (опыт)
0
0
0
0
0
0
* Учёт результата по высеву на мясо-пептонный агар.
Представленные в таблице данные свидетельствуют об отсутствии жизнеспособных клеток микроорганизмов как в контрольной, так и в опытной пробирках после 1 часа инкубации. Отсутствие роста микрофлоры на плотной питательной среде в контроле связано со 100% адгезией тест-штаммов к культуре клеток фибробластов в пробирках. В то же время отсутствие роста тест-культур на МПА после 1 часа инкубации в опыте свидетельствует о гибели тест-штаммов за счет бактериолитического действия бактериофага в связи с отсутствием адгезированных клеток микроорганизмов к культуре клеток фибробластов в пробирках.