СПОСОБ ОЦЕНКИ НАРУШЕНИЯ ТРАНСАМИНИРОВАНИЯ В СИНЦИТИОТРОФОБЛАСТЕ В ТРЕТЬЕМ ТРИМЕСТРЕ БЕРЕМЕННОСТИ ПРИ ОБОСТРЕНИИ ГЕРПЕС-ВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ ПУТЕМ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГИСТОХИМИЧЕСКИМ МЕТОДОМ АКТИВНОСТИ ПИРИДОКСАЛЬФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ В СИНЦИТИОТРОФОБЛАСТЕ ПЛАЦЕНТЫ
METHOD FOR ASSESSING DISTURBANCE OF TRANSAMINATION IN PLASMODIOTROPHOBLAST IN THIRD TRIMESTER OF PREGNANCY IN AGGRAVATED HERPES VIRAL INFECTION BY HISTOCHEMICAL METHOD OF PYRIDOXALPHOSPHATE DEHYDROGENASE ACTIVITY IN PLACENTAL PLASMODIOTROPHOBLAST

Изобретение относится к области медицины.
2
Трансаминазы - ферменты, катализирующие реакцию переноса аминогруппы (NH - группы) вместе с протоном (ионом водорода) и парой электронов от аминокислот к кетокислотам. Содержание некоторых аминотрансфераз в крови является важным диагностическим признаком ряда заболеваний (вирусные гепатиты и др.). При вирусном гепатите активность алатаминотрансферазы и аспаратаминотрансферазы резко увеличиваются и служат надежным диагностическим тестом, отличающим его от других заболеваний (Браунштейн А.Е., 1987; Мельникова В.В., 1987).
Активная форма аминотрансфераз образуется в результате присоединения пиридоксальфосфата к аминогруппе лизина прочной альдиминной связью:
Пиридоксальфосфат и его производные являются простетическими группами ряда ферментов, участвующих в обмене аминокислот (реакциях трансаминирования). При недостаточной активности пиридоксальфосфата нарушаются функции пиридоксальзависимых ферментов. При выполнении своей функции пиридоксальфосфат работает в тесной связи с пиридоксальфосфатдегидрогеназой, обеспечивающей ему перенос водорода на кислород (Браунштейн А.Е., 1987; Букин Ю.В., Иванова А.Л., 1976; DunathanH., 1966).
Задачей настоящего изобретения является исследование нарушений трансаминирования в синцитиотрофобласте плаценты у беременных при обострении герпес-вирусной инфекции, используя в качестве маркера этого процесса интенсивность гистохимической реакции на пиридоксальфосфатдегидрогеназу при нарастании в организме беременной агрессивности герпес-вирусной инфекции.
Достигаемым техническим результатом, является определение активности пиридоксальфосфатдегидрогеназы в синцитиотрофобласте ворсинок плаценты при обострении в третьем триместре беременности герпес-вирусной инфекции, приводящее к увеличению в гомогенате плаценты алаттрансаминазы.
Способ осуществляется следующим образом.
В периферической крови беременных во время обострения герпес-вирусной инфекции методом ИФА определяют титр антител к вирусу герпеса. При титре антител к вирусу герпеса 1:3200 определяют снижение содержания пиридоксальфосфатдегидрогеназы, до 8,9±0,25 усл. ед., а при титре антител к вирусу герпеса 1:12800 - снижение, соответствует 5,2±0,4 усл. ед.; контроль - 12,5±0,37 усл. ед. При этом увеличивается содержание в гомогенате плаценты количество алаттрансаминазы при титре 1:12800 и до 0,58±0,002 ммоль/л (контроль - 0,15±0,003 ммоль/л).
Для подтверждения причин, подтверждающих достоверность результатов предлагаемого метода исследовали синцитиотрофобласт у 20 беременных, перенесших обострение герпес-вирусной инфекции в третьем триместре гестации на предмет выявления гистохимическим методом активности пиридоксальфосфатдегидрогеназы. Контролем служила плацента от 10 беременных, не болевших на протяжении всего периода гестации.
Реакция выполнялась по следующему плану:
1. На замораживающем микротоме изготовлялись из нефиксированного материала плаценты срезы, которые монтировали на предметное стекло и помещали в инкубационный раствор, состоящий из следующих ингредиентов:
а) 0,1 М фосфатный буфер, рН 7,6;
б) Пиридоксальфосфат (фирмы «Serva») 25 мг / 1 мл фосфатного буфера;
в) Нитросиний тетразолий (фирма «ICN») 1 мг/мл фосфатного буфера (5 ммоль);
г) НАДФ (фирмы «Serva») 1 мг/мл фосфатного буфера (5 ммоль).
2. Инкубация производилась при 37°С в течение 30 мин.
3. Срезы ополаскивались в дистиллированной воде и заключались в глицерин-желатину.
4. Контрольные срезы инкубировались в среде, содержащей вместо пирицоксальфосфата буферный фосфатный раствор рН 7,6.
Прототипом подобного типа реакций на выявление дегидрогеназ нами использована рекомендация, предложенная Lojda Z. (1965).
5. После изготовления срезы просматривались под электрофотомикроскопом «Opton» (Германия), а участки срезов, как контрольных, так и опытных препаратов фотографировали на одну пленку «Kodak color» (USA). После проявки сфотографированные участки цитофотометрировали помощью компьютерной программы, предложенной «Mekos» (цитофотометрическая установка). Регистрационное удостоверение МЗ РФ 29/10010198/1282-01, изделие не подлежит обязательной сертификации. Руководство по эксплуатации 27543786.9443 001 РЭ.
6. Цитофотометрирование производилось при одном и том же зонде - 0,1 мм × 0,1 мм.
7. Титр антител к вирусу герпеса определяли иммуноферментным методом на спектрофотометре «Stat-Fax-2100» (USA).
8. Содержание алаттрансаминазы в гомогенате плаценты определяли на спектрофотометре «Stat-Fax-2100» (USA) с наборами фирмы «Вектор Бест».
Исследования показали, что при обострении герпес-вирусной инфекции в третьем триместре гестации в синцитиотрофобласте ворсинок плаценты при титре антител к вирусу герпеса 1:3200 интенсивность реакции на пиридоксальфосфатдегидрогеназу снижалась и составляла 8,9±0,25 усл. ед., а при титре антител к вирусу герпеса 1:12800 интенсивность реакции на пиридоксальфосфатдегидрогеназу снижалась до 5,2±0,4 усл. ед.; контроль - 12,5±0,37 усл. ед. Это приводило к увеличению содержания алаттрансаминазы в гомогенате плаценты при титре антител 1:3200 до 0,25 ммоль/л и при титре антител к вирусу герпеса до 0,58±0,002 ммоль/л; контроль - 0,15±0,003 ммоль/л.
Таким образом, оценивая интенсивность активности пиридоксальфосфатдегидрогеназы в синцитиотрофобласте плаценте беременных при обострении герпес-вирусной инфекции, было установлено, что при обострении герпесной инфекции происходят процессы, нарушающие трансаминирования белков в синцитиотрофобласте ворсинок плаценты, так как снижается активность пиридоксальфосфатдегидрогеназы, что приводит к увеличению содержания алаттрансаминазы до 0,58±0,002 ммоль/л.
На основании проведенных исследований, установлено, что при обострении во время беременности герпес-вирусной инфекции в третьем триместре гестации интенсивность реакции на пиридоксальфосфатдегидрогеназу в синцитиотрофобласте ворсинок плаценты снижается по мере нарастания агрессивности инфекции. При титре антител к вирусу герпеса 1:3200 интенсивность реакции на пиридоксальфосфатдегидрогеназу снижается и составляет 8,9±0,25 усл. ед. При титре антител к вирусу герпеса 1:12800 - 5,2±0,4 усл. ед. Контроль - 12,5±0,37 усл. ед.
Таким образом, при активизации герпес-вирусной инфекции в третьем триместре беременности подавляется в синцитиотрофобласте реакция на пиридоксальфосфатдегидрогеназу и при активности ее ниже 12,5±0,37 усл. ед. отмечается нарушение трансаминирования в синцитиотрофобласте плаценты, что проявляется увеличением в гомогенате плаценты алаттрансаминазы до 0,58±0,002 ммоль/л; контроль - 0,15±0,003 ммоль/л.
Источники информации
1. Браунштейн А.Е, Шемякин М.М. Теория процессов аминокислотного обмена, катализируемых пиридоксалевыми энзимами. Биохимия. - 1953. - т.18, №4. - 393 с.
2. Браунштейн А.Е. Процессы и ферменты клеточного метаболизма. М., 1987, 250 с.
3. Букин Ю.В., Иванова А.Л. Распределение и активность пиридоксалькиназы в мозге человека в процессе онтогенеза. Биохимия. - 1976, т.41. - 81 с.
4. Мельникова В.В. Лабораторные методы исследования в клинике. М., 1987. - 186 с.
5. Dunathan H. Conformation and reaction specificity in pyridoxal phosphate enzymes. Proc. nat. Acad. Sci. (Wash), 1966. - vol.55. - 712 p.
6. Lojda Z. Remarks on histochemical detection of dehydrogenases. Intracellular localization. Folia Morphology, 1965, №3, p.84-96.