СПОСОБ ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ КОМПЛЕКСА БИОФЛАВОНОИДОВ ОБЛЕПИХОВОГО ШРОТА
METHOD FOR FRACTIONATION OF BIOFLAVONOID COMPLEX OF SEA BUCKTHORN MEAL

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, в частности к способам фракционирования комплекса биофлавоноидов облепихового шрота на родственные группы веществ на примере выделения фракции флавонолов, и может быть применено на предприятиях отрасли.
Импортозамещение лекарственных средств, наметившееся в последнее время, является благоприятной основой для разработки отечественных оригинальных фармацевтических субстанций и создания лекарственных препаратов на их основе. Изыскание и исследование новых веществ природного происхождения, обладающих фармакологической активностью, является одной из актуальных задач фармакогнозии и фармацевтической отрасли в целом. В приоритете при этом не только местное растительное сырье, но и крупнотоннажные отходы его переработки.
Hippophae rhamnoides
Плоды облепихи крушиновидной () довольно широко используются в народной и официнальной медицине, благодаря содержанию значительного количества витаминов А, С, Е, каротиноидов, органических кислот, Сахаров, а также фитостеринов, микроэлементов, фосфолипидов и др. [1]. Особое место занимают Р-витаминные вещества плодов облепихи. Согласно литературным данным полифенольный комплекс плодов облепихи представлен флавонолами, лейкоантоцианами, катехинами и дубильными веществами - производными галловой кислоты. Из суммарного количества флавоноидов на долю катехинов приходится в среднем 42-45%, лейкоантоцианов - 38-40%, флавонолов и их гликозидов - 16-20%, из них рутин (гликозид кверцетина) - 1,55-3,65%, кверцетин - 2,90%, изорманетин - 0,37-14,70%, кемпферол - 0,43-5,46%, мирицетин - 2,71-16,20% [2]. В результате традиционного использования - извлечения из плодов масла и сока, - остается крупнотоннажный отход производства - обезжиренный шрот, который обладает высокой биологической ценностью, благодаря содержанию ряда физиологически активных веществ, наиболее ценными из которых являются биофлавоноиды [3-5].
in silico, in vitro и in vivo
Биофлавоноиды плодового сырья, в том числе облепихового шрота, являются потенциальными источниками фармацевтических субстанций, так как обладают широким спектром доказанной  фармакологической активностью: антиоксидантная, противовирусная, антибактериальная, адаптогенная, иммуномоделирующая, противоопухолевая, гипогликемическая (антидиабетическая), гепатопротекторная, противовоспалительная, нейропротекторная, кардиопротекторная и антиканцерогенная активность при отсутствии токсичности. Известно, что фармакологическая активность комплекса биофлавоноидов ниже, чем у индивидуальных соединений, так как каждое из них способно воздействовать на множество структурных и функциональных систем клетки и организма в целом [6-10]. Поэтому очевидна необходимость в научно-обоснованном высокоэффективном и надежном способе фракционирования комплекса биофлавоноидов облепихового шрота на родственные группы веществ, в частности флавонолы, для реализации в промышленных масштабах. На решение этой задачи направлено данное техническое решение.
Фракционирование комплекса биофлавоноидов растительного материала является довольно сложной задачей, обусловленной рядом факторов: во-первых, многообразием биофлавоноидов (флавоны, флавонолы, изофлавоны, катехины и т.д.); во-вторых, данные соединения могут находиться в образцах в различных концентрациях в смеси, представленной относящимися к разным группам соединениями; в-третьих, их разнообразными физическими свойствами, в частности, - растворимость, которая является одной из основных биофармацевтических характеристик и определяет как биоэквивавлентность препарата, так и возможность создания лекарственной формы с эффективной дозой лекарственного средства, скоростью и полнотой всасывания. При этом известно, что многие биофлавоноиды обладают довольно низкой растворимостью в водных средах и биологических жидкостях организма [11].
С учетом вышеизложенного фракционирование комплекса биофлавоноидов с выделением фракции флавонолов, как наиболее активной группы природных фенольных соединений, разрешит проблему их рационального использования в качестве сырья для фармацевтических субстанций.
-4
3
-4
3
-4
3
Beijing Ding ShengXiong Di Technology Co., Ltd
Известен «Способ концентрирования и разделения флавоноидов» (Патент РФ 2646805 С1) [12], включающий сорбционно-хроматографическое фракционирование ацетонитрильных растворов флавоноидов: кверцетин с концентрацией 1×10 моль/дм, нарингин - 1×10 моль/дм, (+)-катехин - 1×10 моль/дм на предварительно модифицированном триметилхлорсиланом наностркуктурированном мезопористом сорбенте МСМ-41. Недостатком данного способа является использование сорбента, характеризующегося сложностью получения, а также использование в процессе подготовки сорбента высокой температуры и дополнительного модификатора триметилхлорсилана. Кроме того, подготовка сорбента сопряжена с длительными временными затратами и высокой стоимостью его импортных аналогов - 44-55 дол. США/1 шт. (по данным официального сайта веб-портала Alibaba.com: - URL: https://Russian.alibaba.com/product-detail/new-mcm-41-molecular-seive-mesoporous-structere-mcm-41-full-silicon-type-demoulding-60801723730.html?spm=a2700.galleryofferist.0.0.71d61f00DFmlZF найден единственный поставщик сорбента типа МСМ-41 - «.», Китай), а способ регенерации сорбента в изобретении не раскрыт.
Method for extracting, fractionating and purifying polyphenolic compounds originating from fresh plant sorting deviations using a high adsorption and elution performance resi
Compositae
Liliaceae
Mtsubishi Chemical Corporation,
Известен «n» (Patent US 2002187207 Al) [13], в котором фракционирование и очистку полифенольных соединений из растительного пищевого сырья, в частности: листовых растений семейства или луковичных растений семейства , осуществляют адсорбцией на стирольных дивинилбензольных смолах ТМ Resindion SP70 и SP700 ( Япония), являющихся селективными по отношению к полифенольным соединениям, с последующим элюированием, удерживаемых на смоле соединений, низшими спиртами (метанол или этанол). Недостатком данного способа является использование в качестве адсорбента смол импортного производства, что повышает себестоимость метода и его зависимость от поставок. Кроме того, в патенте не указаны параметры фракционирования и очистки полифенольных соединений, что не дает возможности определить продолжительность процесса элюации и скорость элюации.
Liquid Chromatographic Fraction of Enzymatically Polymerized Flavonoid as an Antioxidant
Agilent
Zorbax Eclipse XDB-phenyl
2
В патенте США «)) (Patent US 20110218252 Al) [14] раскрыт способ фракционирования водного раствора ферментативно полимеризованных флавоноидов, таких как катехины или эпикатехины, на две и более фракции. Разделение фракций осуществлялось методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на хроматографе серии  1200 на колонке быстрого разрешения , 4,6×150 мм, 3,5 мкм, заполненной диметилфенэтилсиланом, связанным со сверхвысокочистым носителем кремнеземом SiO (размер пор 80 ). Температура колонки поддерживалась 35-60°С, растворитель - водный раствор ацетонитрила при нейтральном рН. Объем вводимой пробы полифлавоноида - 40 мкл. Недостатком данного способа является увеличение массы полифенола посредством ферментативного синтеза с получением полимерных флавоноидов; использование в качестве элюента токсичного ацетонитрила, являющегося прекурсором; необходимость подогрева смеси и колонки (температурный диапазон 35-60°С); возможность разделения только микроколичеств водорастворимых флавоноидов, что существенно ограничивает использование метода в промышленных условиях.
Daidzein
Daidzein separation and purification method
Известен метод получения изофлавона дайдзеина (), источником которого являются соевые продукты, фасоль, горох, орехи, зерновые продукты, кофе, чай, красный клевер и др. «» (Patent CN 105367615 A) [15], в котором выделение и очистка дайдзеина осуществляется фракционированием экстракта на высокоскоростном центробежном противоточном хроматографе. Метод, по описанию авторов, непродолжительный, с хорошей разделительной способностью и низким расходом растворителя, выделенный дайдзеин отличается высокой чистотой. Недостатками предлагаемого способа являются: во-первых, выделение лишь одного специфического флавоноида, при этом его степень чистоты не указана, во-вторых, элюентом является труднорегенерируемая четырехкомпонентная смесь этилацетата, н-бутанола, этанола и воды, и, в-третьих, высокоскоростная центробежная хроматография достаточно дорогой метод, не приемлемый в промышленных условиях.
Sabia parviflora
Separation and extraction method of seven flavonoid chemical components in Sabia parviflor
Sabia parviflora
Метод фракционирования экстракта флавоноидов надземной части кустарника сабии (), предлагаемый в патенте «a» (Patent CN 109879844 A) [16], основан на хроматографическом разделении экстракта цветков сабии () на 7 фракций флавоноидов, окрашенных в желтый цвет.При разделении применялись такие хроматографические методы, как разделение на хроматографических колонках с макропористой синтетической смолой D-101 и силикагелем, обращенно-фазовая хроматографическая колонка ODS-A-HG и полупрепаративная высокоэффективная жидкостная хроматография. Полученные флавоноиды идентифицированы как: кверцетин-3-О-гликозид горечавки, камеллианозид, рутин, цубакиозид А, кемпферол-3-О-рутинозид, изорамнетин-3-О-рутинозид и кемпферол. Смесь флавоноидов элюировали градиентом дихлорметан-метанол и метанол-вода последовательно на различных хроматографических колонках. Недостатками данного изобретения являются: сложность технологического решения, которая заключается в последовательном использовании для разделения смеси флавоноидов нескольких хроматографических колонок; применение в качестве элюентов токсичных растворителей; все полученные соединения, за исключением кемпферола, являются гликозидами.
Separation and purification method of hawthorn leafflavone
В изобретении «» (Patent CN 105853534 A) [17] рассмотрен способ выделения и очистки флавоновой фракции листьев боярышника. В процессе очистки экстракт измельченных листьев боярышника растворяют в этиловом спирте и подвергают реэкстракции этилацетатом для удаления примесей. Этиловый спирт упаривают досуха, остаток растворяют в воде, отфильтровывают, а затем очищенный промежуточный продукт подвергают адсорбционному разделению через макропористую смолу АВ-8 или NKA-9: промежуточный продукт смешивают с обработанной водно-этанольным раствором смолой в соотношении 1:4, взбалтывают в течение 2 ч, затем настаивают в течение 24 часов для достижения насыщенной адсорбции, по окончании этого времени растворитель декантируют, а макропористую смолу элюируют 20%-ым этанолом 3-4 раза, отфильтровывают, фильтрат высушивают. Степень чистоты флавоноидов составила 65,40-67,23%. Данное изобретение имеет такие недостатки как необходимость дополнительной стадии реэкстракции этилацетатом и подготовки сорбентов; продолжительность адсорбции флавоноидов на ионообменных смолах (более суток); низкая степень чистоты флавоноидов.
Вышеизложенные способы предусматривают использование в качестве сорбента смол, имеющих либо высокую адсорбционную эффективность, либо высокую элюционную способность, не обладая ими одновременно. Силикагель, в отличие от ионообменных смол, обладает и высокой адсорбционной способностью и избирательностью адсорбционного действия, а также относительно большой прочностью зерен и термостойкостью, что позволяет многократно регенерировать его без потери адсорбционной активности. Стоимость силикагеля для хроматографических колонок составляет от 3000 руб./кг (по данным официального сайта ООО «ДВ-ЭКСПЕРТ» - URL: https://dv-expert.ru/proizvoditeli/macherev-nagel/815330-25-Macherey-Nagel-Silica-gel-60-0-063-0-2-mm-25-kg).
Separation method of flavone compounds in Clinopodium chinense (Benth.) O. Kuntze, and flavone composition
Rotundula
Clinopodium chinense (Benth.) О. Kuntze
Sephadex LH-20
Agilent
В изобретении «» (Patent CN 106279318 A) [18] предложен способ разделения флавоновой композиции из растений рода губоцветных (). Фракционирование проводится в несколько этапов различными способами. На подготовительном этапе водное извлечение из  концентрировали, остаток хроматографировали на макропористой смоле D101 водно-спиртовым раствором, элюат осаждали кислотой для обогащения извлечения флавоноидами. Затем суммарное извлечение флавоноидов разделяли методом колоночной хроматографии на силикагеле, отбирая 320 фракций элюата. Для получения фракций 1-90; 91-190; 191-260; 261-310 и 311-320 проводили градиентное элюирование растворами 100:5, 100:10, 100:15, 100:20 и 100:25 по объему хлороформа и метанола, соответственно. Дальнейшее разделение объединенных фракций проводили методом гель-фильтрации на колонках, заполненных , элюируя смесью хлороформ-метанол в соотношении 4:6 (фракции 12-48; фракции 49-55, фракции 79-86); на силикагеле, элюируя хлороформом и ацетоном (фракции 133-176); на колонке с полимерным сорбентом MCI, элюируя системой метанол-вода 60:40 (фракции 231-260, фракции 295-310). Идентификацию полученных фракций проводили методом обращено-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ) на колонке С-18 (, геометрия колонки 9,4×250 мм; размер частиц наполнителя 5 мкм; элюент метанол-вода 40:60; УФ-детектирование при длине волны 210 нм; скорость потока 2 мл/мин). Существенными недостатками способа являются: необходимость предварительной очистки растительного экстракта на макропористой смоле D101; сложность процесса разделения флавоноидов, которая заключается в отборе большого количества фракций (320) при различных условиях элюирования; необходимость дополнительного разделения объединенных фракций методом гель-фильтрации; использование смесей токсичных, требующих регенерации, растворителей. Несмотря на получение индивидуальных флавоноидов, перечисленные недостатки ограничивают применение предлагаемого способа в промышленном масштабе.
Вместе с тем комплексных теоретических и экспериментальных исследований по фракционированию комплекса биофлавоноидов с получением флавонолов, необходимых в качестве сырья для фармацевтических субстанций, в том числе при масштабировании, в настоящий момент не проводилось. Техническая сложность известных методик хроматографического разделения полифенольного комплекса растительных экстрактов заключается в продолжительности и многоэтапности процедур (необходимо собрать до 320 фракций), что является серьезным препятствием использования метода в промышленном масштабе.
Наиболее близким к заявленному решению является способ, представленный в [19], согласно которому полученный сухой экстракт биофлаваноидов «подвергли хроматографическому разделению. Хроматографическую колонку (силикагель L 40/100), элюировали для удаления простых фенольных соединений водой и затем 40% этиловым спиртом с повышением концентрации. В работе не представлено сведений по продолжительности фракционирования, количеству и составу полученных в результате хроматографического разделения фракций, за исключением того, что на первом этапе элюирования водой удаляются гидрофильные простые фенольные соединения. Однако, известно, что вязкость воды выше вязкости водно-этанольных растворов, что снижает скорость элюирования из-за заполнения пор сорбента и при понижении полярности элюента необходимо время для достижения динамического равновесия сорбента и растворителя [20].  Что касается экстракции неполярным растворителем (хлороформом), то выход флавонолов на 28% ниже, чем в заявленном способе.
Технический результат - разработка насколько возможно простого и непродолжительного способа фракционирования комплекса биофлавоноидов облепихового шрота на родственные группы веществ, в частности флавонолы.
Для решения этой задачи предлагается способ адсорбционной колоночной хроматографии. В качестве неподвижной фазы использован силикагель с диаметром матричных пор 0,063-0,2 мм. Подвижная фаза - этиловый спирт с понижающейся концентрацией: 96%, 75%, 50%, 25%. Геометрия хроматографической колонки: диаметр d=32 мм, длина l=500 мм. Скорость элюирования - 1 мл/мин. Общая продолжительность элюирования составила 240 мин.
Пример 1. Навеску 1,0 г сухого экстракта комплекса биофлавоноидов облепихового шрота растворяют в этиловом спирте 96% (об.) в соотношении 1:10 при нагревании до полного растворения. Полученный раствор биофлавоноидов наносят на хроматографическую колонку, заполненную силикагелем. В качестве элюента используют этиловый спирт 96% (об.). Контроль за процессом фракционирования осуществляют методом тонкослойной хроматографии (ТСХ). После отбора каждой фракции полярность элюента повышают разбавлением дистиллированной водой. В результате хроматографического разделения получено 5 фракций. По данным ТСХ анализа и УФ-спетроскопии 2 и 3 фракция элюата идентичны, в 1, 4 и 5 фракциях элюата флавонолы не обнаружены. Качественная реакция на содержание флавонолов - цианидиновая проба (проба Шинода) - подтверждает подлинность 2 и 3 фракции. Фракции элюата, содержащие флавонолы, объединяют и отгоняют растворитель «досуха». Выход флавонолов составил 51,25% от суммарного количества полифенольных соединений.
Shimadzu «LC-20 Prominence
Symmetry С 18
3
Анализ качественного и количественного состава фракции флавонолов, полученной по предлагаемому способу, проводят методом ОФ ВЭЖХ с фотометрическим детектированием на приборе )), с последующей компьютерной обработкой полученных результатов. Условия хроматографического анализа: колонка: октадецилсиликагель, , размер колонки 4,6×250 мм, размер частиц 5 мкм. В качестве подвижной фазы использовали ацетонитрил - раствор трифторуксусной кислоты рН=2,6 (40:60), скорость подвижной фазы 1,0 мл/мин. Детектирование: УФ, λ=365 нм; объем вводимой пробы: 10 мм (фиг. 1).
Расчет содержания индикаторных компонентов проведен по градуировочному графику, построенному в координатах S (площадь пика) - С (концентрация), г/100 г. Методом ОФ ВЭЖХ в составе фракций флавонолов обнаружены изорамнетин - 67,97%, кверцетин - 29,56% и небольшое количество кемпферола - 2,47%.
Simadzu UV1800
Пример 2. Регенерацию силикагеля проводят кипячением в 50%-ом растворе азотной кислоты при гидромодуле 1:2, в течение 30 мин. Затем силикагель отфильтровывают и промывают на фильтре горячей дистиллированной водой до нейтральной реакции фильтрата, осадок высушивают при температуре 105°С до постоянной массы. Степень чистоты регенерированного сорбента контролируют методом Фолина-Чокальтеу и по оптической плотности раствора ДМФА, после обработки им силикагеля, на спектрофотометре  при длине волны 520 нм.
Таким образом, заявляемый способ фракционирования комплекса биофлавоноидов облепихового шрота позволяет отказаться от использования токсичных элюентов - метанол, ацетонитрил, хлорорганические растворители - и их труднорегенирируемых смесей. Упрощение технологии заключается в сокращении количества вспомогательных операций (исключение операций пробоподготовки и дополнительной очистки фракции флавонолов) и количества отбираемых фракций элюата с 320 до 5. За счет упрощения технологии продолжительность фракционирования составляет 4 часа.
В настоящее время в лаборатории синтеза и выделения природных и биологически активных веществ Бийского технологического института (филиал) ФГБОУ ВО «Алтайский государственный технический университет им. И.И. Ползунова» успешно прошли испытания по реализации предложенного способа фракционирования комплекса биофлавоноидов облепихового шрота, а также подписано соглашение по апробации предлагаемого технического решения в условиях действующего производства АО «Алтайвитамины» (г. Бийск), профилем которого является производство лекарственных препаратов, в том числе из плодов облепихи крушиновидной.
Источники информации, используемые при составлении заявки
1. Koshelev, Yu.A. Sea Bukthorn: monograph / Yu.A. Koshelev, L.D. Ageeva, E.S. Batashov, V.P. Sevodin, E.D. Rozhnov, N.I. Kuleshova. - Biysk: Publishing house of Polzunov Altai State Technical (Printedby С JSC «Altayvitaminy»), 2015. - 401 p.
2. Аверьянова, E.B. Биологическая ценность облепихи как основа ее комплексной безотходной переработки/Е.В. Аверьянова//Современная наука и инновации. - 2018-№3 (23). - С. 129-139.
3. Дугарова, И.К. Комплексное использование плодов облепихи в производстве пищевых продуктов/И.К. Дугарова, Г.Ц. Цыбикова, И.Т. Александрова//Известия вузов. Прикладная химия и биотехнология. - 2016. - Т. 6, №3. - С. 128-134.
4. Аверьянова, Е.В. Перспективы и направления использования ягодных шротов/Е.В. Аверьянова, М.Н. Школьникова, Е.Д. Рожнов//Индустрия питания. - 2019. - Т. 4 (№2). - С. 20-27. DOI 10.29141/2500-1922-2019-4-2-3.
5. Никулина, Е.О. Облепиховый шрот как функциональный ингредиент для создания продуктов функционального назначения/Е.О. Никулина, Г.В. Иванова, О.Я. Кольман//Вестник КрасГАУ. - 2015. - №10. - С. 98-105.
6. Kim, Ju-Sung Phamalogical effect and component of sea buckthorn (Hippophae rhamnoides L.)/Ju-Sung Kim, Chang-Yeon Yu, Myong-Jo Kim//J Plant Biotechnol. - 2010. - V. 37. - P. 47-56. DOI:10.5010/JPB.2010.37.1.047.
7. Теплова, B.B. Природные полифенолы: биологическая активность, фармакологический потенциал, пути метаболической инженерии/В.В. Теплова, Е.П. Исакова, О.И. Кляйн, Д.И. Дергачева и др.//Прикладная биохимия и микробиология. - 2018. - Т. 54. - №3. - С. 215-235.
8. Slobodnikova, L. Antibiofilm Activity of Plant Polyphenols/L. Slobodnikova, S. Fialova, K. Rendekova//Molecules. - 2016. - №12. - P. 753-766.
9. Teleszko, M. Analysis of Lipophilic and Hydrophilic Bioactive Compounds Contentin Sea Buckthorn (Hippophae rhamnoides L.) Berries/M. Teleszko, A.Wojdylo, M. Rudzifiska, J. Oszmianski, T. Golis // Journal of Agricultural and Food Chemistry. - 2015. - №63. - pp. 4120-4129. DOI: 10.1021/acs.jafc.5b00564.
10. Куркин, B.A. Флавоноиды лекарственных растений: прогноз антиоксидантной активности/В.А. Куркин, В.В. Поройков, А.В. Куркина, Е.В. Авдеева, О.Е. Правдивцева//Современные проблемы науки и образования. - 2015. - №2-2; URL: http://science-education.ru/ru/article/view?id=23252 (дата обращения: 10.06.2020).
11. Липковская Н.А. Зависимость растворимости природных флавоноидов в воде от концентрации мирамистина, поливинилпирролидона и сывороточного альбумина человека/Н.А. Липковская, В.Н. Барвинченко, Т.В. Федянина//Журнал физической химии. Биофизическая химия. - 2014. - Т. 88, №5. - С. 882-886.
12. Патент 2646805 РФ Способ концентрирования и разделения флавоноидов/Л.А. Беланова, СИ. Карпов, В.Ф. Селеменев [и др.] (Россия); заявл. 15.12.2016 №2016149469; опубл. 07.03.2018, бюл. №7.
13. Patent 2002187207 A1 US A23L 33/105; C07C 37/00; (IPC 1-7): A61K 35/78; A23L 33/105 (ЕР); C07H 17/07 (EP); A23V 2002/00 (EP) Method for extracting, fractionating and purifying polyphenolic compounds originating from fresh plant sorting deviations using a high adsorption and elution performance resin / Amiot-Carlin Marie-Josephe, Escudier Jean-Louis, Goupy Pascale, Martin Michel, Mikolajczak Michel (FR); priority date 15.02.2001 №US7722502 A; publication info 12.12.2002.
14. Patent 20110218252 A1 US AA61K4734FI Liquid Chromatographic Fraction of Enzymatically Polymerized Flavonoid as an Antioxidant / Favreau N., Bruno F. F. (US); priority date 08.03.2010 №12/641368; publication info 08.09.2011.
15. Patent 105367615A CN C07H 1/08,C07H 17/07 Daidzein separation and purification method / Hu Xiao, Huang Chunyue, Sun Bailing, Xie Xinxin, Yang Vifang (CN); priority date 29.08.2014 № CN 201410438060 A; publication info 02.03.2016.
16. Patent 109879844 A CN C07D 311/30, C07D 311/40, C07H 1/08, C07H 17/07 Separation and extraction method of seven flavonoid chemical components in Sabia parviflora / Pan Quoji, Sun Qingwen, Xu Wenfen (CN); priority date 17.01.2019 № CN 201910044061 A; publication info 14.06.2019.
17. Patent 105853534 A CN A61K 36/734, A61P 3/10, A61P 39/06 Separation and purification method of hawthorn leaf flavone / Dong Huaqiang, Hou Yi (CN); priority date 26.05.2016 № CN 201610356829 A; publication info 17.08.2016.
18. Patent 106279318 A CN A61K 31/352, A61K 31/7048; A61P 9/00, A61P 9/14, C07D 311/30, C07D 311/32, C07D 311/40, C07H 1/08, C07H 17/07Separation method of flavone compounds in Clinopodium chinense (Benth.) O. Kuntze, and flavone composition/Ma Guoxu, Wu Haifeng, Xu Xudong, Yu Shichun, Zhang Xiaopo, Zhong Mingliang, Zhu Vindi (CN); priority date 29.05.2015 № CN 201510291110 A; publication info 04.01.2017.
19. Averyanova E.V., Danilchenko Y.V., Fedorova N.V. Chromatographic study of the component composition and antioxidant activity of polyphenol complex in biological raw materials//Journal of Physics: Cjnference Series. – IOP Publishing, 2019. – T. 1353. – N. 1. – C. 012094.
20. Рудаков О.Б., Селеменев В.Ф. Физико-химические системы сорбат-сорбент-элюент в жидкостной хроматографии// Воронеж: ВГУю – 2003. – 240 с.