Способ диагностики глиальных опухолей головного мозга высокой степени злокачественности
METHOD FOR DIAGNOSING GLIAL BRAIN TUMORS OF HIGH DEGREE OF MALIGNANCY

Изобретение относится к медицине, а именно, к молекулярной онкологии, и может найти применение для неинвазивной диагностики глиальной опухоли головного мозга высокой степени злокачественности в случае невозможности оперативного вмешательства.
К глиальным опухолям высокой степени злокачественности (HGG) относят низкодифференцированные первичные образования головного мозга Grade III и IV. HGG III не имеют четких границ и инфильтрируя мозговую ткань, обычно имеют два признака злокачественности - клеточную атипию и высокий митотический индекс, за исключением некроза. HGG IV - глиобластомы - наиболее злокачественные опухоли, не имеют четких границ, так же растут быстро и, дополнительно отличаются наличием гипоксии, некроза, выраженной гетерогенности состава, быстрой пролиферацией с вовлечением путей неоангиогенеза (см. Hu L. S. et al. Imaging of intratumoral heterogeneity in high-grade glioma //Cancer Letters. - 2020.).
Современная диагностика опухолей головного мозга основывается на методах нейровизуализации: КТ (компьютерная томография), МРТ (магниторезонансная томография) и ПЭТ (позитронно-эмиссионная томография) (см. Louis D. N. et al. Classification and pathologic diagnosis of gliomas //Up To Date, Waltham, MA: Walters Kluwer Health. 2017 г.). Данные методы позволяют диагностировать опухоль, определить локализацию, метаболическую активность, биохимические параметры, но имеют ограничения в определении гистологического типа опухоли. Кроме того, выполнение МРТ диагностики может быть затруднено либо невозможно при наличии следующих факторов: избыточный вес, клаустрофобия, беременность, наличие металлических или электрических имплантов и т.д.
Диагностика и классификация глиальных опухолей основаны на морфологическом, имунногистохимическом и молекулярном анализе участков ткани опухоли, изъятых интраоперационно. Диагноз зависит от опыта нейроморфолога, отличается трудоемкостью и длительностью проведения (5-6 дней), иногда требует повторных исследований в других центрах, что удлиняет сроки установления конечного диагноза (см. Perry А., Wesseling P. Histologic classification of gliomas //Handbook of clinical neurology. - Elsevier, 2016. - T. 134. - C. 71-95.).
Для верификации труднодоступных либо неоперабельных глиальных опухолей используют метод стереотаксической биопсии, что негативно отражается на точности, учитывая, как малый объем получаемой опухолевой ткани, так и ее высокую морфологическую гетерогенность (см. Galban S. et al. MRI-guided stereotactic biopsy of murine GBM for spatiotemporal molecular genomic assessment // Tomography. - 2017. - T. 3. - №. 1. - C. 9.).
Известен способ диагностики злокачественных опухолей головного мозга, включающий взятие образца ткани мозга, выделение РНК и определение экспрессии генов GUSB и HPRT методом ПЦР в реальном времени. О наличии глиомы судят по положительной или равной нулю разнице пороговых циклов Ct HPRT - Ct GUSB (см. патент RU 2708074 C1, опубл. 04.12.2019 г., Бюл. №34). Недостатками известного способа является возможность проведения предлагаемого анализа только после оперативного вмешательства.
Наиболее близким к заявленному способу является способ диагностики глиом головного мозга человека, включающий определение уровней экспрессии микроРНК. При этом определяют уровни микроРНК-21, -128 и -342 в слюне и при повышении экспрессии микроРНК-21 и снижении экспрессии генов микроРНК-128 и -342 по сравнению с референсными значениями диагностируют церебральную глиому, причем степень изменения экспрессии генов по сравнению с референтными значениями соответствует степени прогрессии глиомы (см. патент RU 2656182 С1, опубл. 31.05.2018, Бюл. №16). Недостатком известного способа является использование в качестве референсного локуса RNU6, для которого установлено изменение экспрессии в глиобластомах (см. Manterola L. et al. А small noncoding RNA signature found in exosomes of GBM patient serum as a diagnostic tool //Neuro-oncology. - 2014. - T. 16. - №. 4. - C. 520-527.).
Кроме того, RNU6 не является микроРНК, и, следовательно, не отражает тканеспецифичной экспрессии и биогенез молекул микроРНК в процессе их транскрипции, процессинга. Соответственно, эффективность экстракции, обратной транскрипции и амплификации молекул семейства RNUs может отличаться от таковых микроРНК. Более того было показано, что использование RNUs в качестве референсных локусов может вносить системную ошибку при профилировании экспрессии микроРНК (см. Chugh P., Dittmer D. P. Potential pitfalls in microRNA profiling //Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. - 2012. - Т. 3. - №. 5. - C. 601-616).
Другим недостатком этого способа может быть использование слюны в качестве источника опухолевых маркеров, так как в данный момент не известно, насколько достоверно пул микроРНК слюны отражает профиль экспрессии в злокачественной опухоли, локализованной в головном мозге, что ставит под угрозу научное и клиническое признание такого подхода (см. Rapado-Gonzalez 6. et al. Human salivary microRNAs in Cancer //Journal of Cancer. - 2018. - T. 9. - №. 4. - C. 638.).
Определяющими отличиями заявляемого способа, по сравнению с вышеописанным, являются:
- метод основан на оценке относительной экспрессии экспериментально подобранной сигнатуры микроРНК: hsa-miR-22-3р, hsa-miR-122-5p, hsa-miR-107, hsa-miR-324-5p, hsa-miR-155-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-330-3р, hsa-miR-146a-5p;
- определение уровня относительной экспрессии микроРНК в образцах плазмы проводят методом RT-PCR с использованием экзогенной референсной микроРНК cel-miR-39-5p (экзогенный контроль) с известной последовательностью, не характерной для человека, которая вносится перед проведением анализа в стандартном количестве во все образцы плазмы крови для нормализации эффективности выделения и обратной транскрипции (использование данного подхода повышает воспроизводимость и достоверность получаемых данных);
- заключение о наличии глиальной опухоли высокой степени злокачественности делают на основании тестирования образцов плазмы крови, прошедшей двухэтапную сепарацию при +4°С сразу после взятия;
- получение комплементарной ДНК реализуется при помощи poly(A)-RT технологии с использованием универсального RT-праймера.
В предварительных исследованиях был выявлен широкий диапазон варьирования уровня относительной экспрессии hsa-miR-22-3р, hsa-miR-122-5р, hsa-miR-107, hsa-miR-324-5p, hsa-miR-155-5р, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-330-3p, hsa-miR-146a-5p. Выявлены уровни относительной экспрессии микроРНК в плазме крови здоровых добровольцев - контрольные значения относительной экспрессии микроРНК. Исследование относительной экспрессии обозначенных микроРНК в образцах плазмы крови проводили по полуколичественному протоколу RT-PCR, с использованием cel-miR-39-5p в качестве экзогенного референсного локуса. Исследуемые группы больных и контрольной были статистически сопоставимы.
Техническим результатом заявляемого изобретения является создание нового, эффективного, специфичного способа малоинвазивной диагностики глиом высокой степени злокачественности согласно гистологическим критериям.
22
107
324
155
21
330
146a
(miR)
2
22
122
107
324
155
21
330
146a
-(CtmiR-Ct39)
Технический результат достигается тем, что проводят анализ экспрессии микро-РНК в образце плазмы, включающий внесение экзогенного контроля в образец плазмы и выделение тотальной РНК, обратную транскрипцию с последующей амплификацией в режиме реального времени, при этом используют высокоспецифичные праймеры для hsa-miR-22-3р, hsa-miR-122-5р, hsa-miR-107, hsa-miR-324-5p, hsa-miR-155-5р, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-330-3р, hsa-miR-146a-5p, cel-miR-39-5p, анализируют полученные данные и вычисляют коэффициенты относительной экспрессии RE: hsa-miR-22-3р, RE122: hsa-miR-122-5p, RE:hsa-miR-107, RE: hsa-miR-324-5p, RE: hsa-miR-155-5p, RE: hsa-miR-21-5p, RE: hsa-miR-330-3p, RE: hsa-miR-146a-5p с использованием референсного контроля cel-miR-39 по формуле: RE=log 2 где Ct - номер цикла, полученный в результате проведения полуколичественной RT-PCR, miR-одна из анализируемых микроРНК, 39 - cel-miR-39-5p и при значениях RE>- 3, RE>-3.35, RE>-4.5, RE>-7.5, RE>-9.5, RE>-1.5, RE>-8.5, RE>-8.5 диагностируют глиальную опухоль высокой степени злокачественности.
Способ основан на патогенетическом факторе канцерогенеза -аберрантной экспрессии микроРНК, ассоциированных с инициацией и развитием злокачественного процесса, что приводит к прогрессированию опухоли.
Заявленный способ включает следующие этапы: отбор и сепарация крови для выделения плазмы, внесение экзогенного контроля в плазму, выделение тотальной РНК из плазмы; проведение обратной транскрипции для наработки комплементарной ДНК (кДНК), RT-PCR полученной кДНК в присутствии специфичных праймеров; обработку данных для оценки изменения относительной экспрессии в плазме.
Заявляемый способ осуществляется следующим образом.
2
8
У пациента производят отбор крови в пробирки, содержащие ЭДТА К. Из полученного образца крови сепарируют плазму центрифугированием 2000 об./мин при температуре +4°С. В образец плазмы объемом 200 мкл вносят 3.5 мкл экзогенного контроля (начальная концентрация 1*10 копий/мкл). Выделение тотальной РНК из ткани проводят подходящим методом экстракции. Выделенную РНК подвергают обратной транскрипции. Обратная транскрипция микроРНК проводится одновременно с полиаденилированием РНК, с использованием универсального RT-праймера (таблица 1).
Анализируемые последовательности генетических локусов амплифицируют в 20 мкл PCR-смеси, содержащей 1х PCR-буфер, 1х EvaGreen, 0.25 mM dNTPs, 2 мМ MgCl2, 1 ед.акт. Taq-DNАполимеразы, по 0,5 мкМ прямого и обратного праймеров. Программа амплификации: 95°С - 5 минут, затем 40 циклов (60°С - 60 секунд и 95°С- 15 сек.). Последовательности PCR-праймеров собственного дизайна, подобранные с использованием баз данных MirBase (http://www.mirbase.org/) приведены в таблице 1. Постановку RT-PCR каждого образца проводят в трех повторах.
miR)
2
-(CtmiR-Ct39)
Для оценки относительной экспрессии в плазме для каждой микроРНК рассчитывают коэффициент RE по формуле RE(=log 2, где Ct - средне арифметическое трех повторов цикла, зафиксированного в результате проведения полуколичественной RT-PCR, miR - одна из анализируемых микроРНК, 39 - cel-miR-39-5p.
22
122
107
324
155
21
330
146a
При значениях RE>-3, RE>-3.35, RE>-4.5, RE>-7.5, RE>-9.5, RE>-1.5, RE>-8.5, RE>-8.5 диагностируют глиальную опухоль высокой степени злокачественности.
В целях оценки потенциальной значимости выбранных маркеров была рассчитана их чувствительность и специфичность, которые составили 100% и 80% соответственно.
Для доказательства диагностической ценности предложенного способа приводим клинические примеры применения способа.
Пример №1.
Больной Щ., 51 год, пол мужской, обратился к неврологу по месту жительства по поводу слабости в левых конечностях, больше в ноге и чувства онемения в левой руке. Проводилось симптоматическая терапия по месту жительства. Лечение - без эффекта.
Обратился в ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России, где была выполнена МРТ головного мозга в стандартных режимах с контрастным усилением и выявлена внемозговая опухоль правой теменной области, прилежащая к фальксу и верхнему сагиттальному синусу мозга.
При соматической оценке пациента патологии не выявлено. Предварительный диагноз: фалькс-менингиома задней трети справа.
Неврологический статус при поступлении в стационар: сознание ясное. Черепно-мозговые нервы без нарушения иннервации. Левосторонний гемипарез: рука 4 балла, нога 3 балла. Менингиальных знаков не определяется. Оценка по шкале Карновского 90 баллов. В соматическом статусе без особенностей.
Пациенту выполнено исследование относительной экспрессии микроРНК в плазме крови. Результаты молекулярно-генетического исследования, приведенные в таблице 2, свидетельствуют об отсутствии у пациента глиальной опухоли высокой степени злокачественности.
В отделении нейроонкологии ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России выполнена операция в объеме: костнопластическая краниотомия в правой теменной области, удаление опухоли (I степень радикальности по Симпсону).
Иммуногистохимическое исследование характеризует опухоль как менинготелиоматозную менингиому.
При плановом МРТ-обследовании головного мозга с контрастным усилением через 6 месяцев продолженного роста или рецидива опухоли не выявлено. Установленный окончательный диагноз и дальнейшее течение заболевания согласуется с данными молекулярно-генетического исследования.
Пример №2.
Больной П., 64 года, пол мужской, обратился в ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России с жалобами на диффузные головные боли в течение 4х месяцев. МРТ-исследование головного мозга в стандартных режимах с контрастным усилением выявило глиальную опухоль правой лобной доли с распространением в колено и клюв мозолистого тела. При комплексном обследовании других органов и систем патологии не выявлено. Предварительный диагноз: диффузная глиальная опухоль правой лобной доли с распространением в колено и клюв мозолистого тела. Без стадии. Клиническая группа 2.
В неврологическом статусе: сознание ясное. Элементы лобного психопатологического синдрома (апатико-абулия). Сухожильные рефлексы симметричные. Верхний и нижний симптом Барре отрицательный. Менингиальных знаков нет. Оценка по шкале Карновского 90 баллов.
В соматическом статусе: артериальная гипертензия I степени.
На этапе госпитализации выполнено исследование относительной экспрессии микроРНК в плазме крови пациента. Результаты молекулярно-генетического исследования свидетельствуют о высоком риске наличия глиальной опухоли высокой степени злокачественности.
В отделении нейроонкологии ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России выполнена операция в объеме: костнопластическая краниотомия в правой лобной области, циторедуктивное удаление глиальной опухоли правой лобной доли головного мозга с применением флуоресцентной микроскопии (5-аминолевулиновая кислота), оптической навигации границ опухоли, коммисуральных и проекционных трактов в условиях нейрофизиологического мониторинга. Иммуногистохимическое исследование характеризует опухоль как первичную глиобластому GIV IDH1/2 WT.
Таким образом, показатели относительной экспрессии микроРНК в плазме крови пациента на этапе обследования демонстрировали наличие глиальной опухоли высокой степени злокачественности, что впоследствии было подтверждено морфологическими, иммуногистохимическими и молекулярными методами исследований.
Анализ представленных клинических случаев свидетельствует о возможности проведения диагностики глиом высокой степени злокачественности с использованием оценки экспрессии микроРНК hsa-miR-22-3р, hsa-miR-122-5р, hsa-miR-107, hsa-miR-324-5p, hsa-miR-155-5р, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-330-3р, hsa-miR-146a-5p относительно экзогенного контроля cel-miR-39-5p.
Предлагаемым способом было осуществлено определение наличия глиальной опухоли у 20 больных, результаты молекулярно-генетических исследований в дальнейшем подтверждены данными иммуногистохимического анализа.
«Способ диагностики глиальных опухолей головного мозга высокой степени злокачественности» позволяет диагностировать глиому высокой степени злокачественности без оперативного вмешательства, что способствует малоинвазивной и оперативной диагностики, выбору тактики лечения.
Заявляемый способ является экономически оправданным для диагностики и дает возможность формирования тактики лечения еще в дооперационном периоде пациента; обладает высокой чувствительностью (99%) и специфичностью (80%), его осуществление возможно малоинвазивным способом с использованием плазмы крови, реализация способа на базе стандартной ПЦР-лаборатории занимает менее 8 часов.