Протеом липопротеинов высокой плотности

© КУЛИКОВ В.А., 2011

ПРОТЕОМ ЛИПОПРОТЕИНОВ ВЫСОКОЙ ПЛОТНОСТИ

КУЛИКОВ В.А.

УО «Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет»,

кафедра общей и клинической биохимии

Резюме. В обзоре литературы суммированы результаты недавних научных исследований протеома липопротеинов высокой плотности с помощью масс-спектрометрических методов анализа. В составе этих липопротеинов обнаружено более ста белков. Однако присутствие только пятидесяти одного из них подтверждено двумя и более исследованиями. Обсуждается значение этих исследований для понимания молекулярных основ функции липопротеинов высокой плотности.

Ключевые слова: протеом, липопротеины высокой плотности.

Abstract. In this literature review the results of recent scientific researches of proteome of high-density lipoproteins by means of mass spectrometry methods of analysis are summarized. More than hundred proteins have been found in the composition of these lipoproteins. However, the presence of only fifty one of them has been confirmed by two or more researches. The value of these researches for understanding the molecular bases of high-density lipoproteins function is discussed.

Сегодня, когда геном человека уже сек-венирован, перед исследователями стоит задача изучения структуры и функции многих десятков тысяч белков, кодируемых геномом. Более того, предстоит обьяс-нить, как взаимодействуют белки в сложных биологических системах. Эти важные биологические проблемы являются центральной задачей стремительно развивающейся протео-мики - науки об экспрессии, структуре и функциях белков [1].

Адрес для корреспонденции: 210023, г.Витебск, пр-т Фрунзе, 27, Витебский государственный медицинский университет, кафедра общей и клинической биохимии, тел. 8 (0212) 37-24-52 - Куликов В.А.

Липопротеины - это сложные надмолекулярные комплексы липидов и белков, которые циркулируют в плазме крови и внеклеточной жидкости и играют главную роль в транспорте экзогенных и эндогенных липидов. Кроме того, липопротеины участвуют и в других процессах, отличных от транспорта липидов, например, являются важными медиаторами иммунного ответа и механизмов защиты организма [2]. Липопротеины давно привлекают внимание клинической медицины, так как их уровень связан с риском развития сердечно-сосудистой патологии. Так, высокий уровень холестерина липопротеинов низкой плотности (ЛИНИ) и/или низкий уровень холестерина липопротеинов высокой

плотности (ЛПВП) - важные факторы риска развития атеросклероза [3].

Метаболизм и функции липопротеинов плазмы крови большей частью определяются взаимодействием аполипопротеинов (апо) -белковой части липопротеинов - с рецепторами клеточных мембран, ферментами и липидопереносящими белками. Происхождение термина «аполипопротеин» ведет свое начало от названия белковой части сложных ферментов (апофермент). Греческая приставка «апо» означает «прочь от», или «отделяю от». Таким образом, белки, ассоциированные с липидами и выполняющие структурную функцию в составе липопротеинов, обозначаются термином аполипопротеины. Этим термином сегодня обозначают «классические» аполипопротеины, такие, как апоА, апоВ, апоС и др. Другие белки, такие, как ферменты и липидопереносящие белки, могут существовать в ассоциации с липопротеинами и в несвязанной с липопротеинами форме. Поэтому термин «ассоциированные белки» используется для подобных белков, которые остаются связанными с липопротеинами после их выделения из плазмы крови.

Целью данного обзора является обобщение последних научных исследований проте-ома липопротеинов высокой плотности сыворотки крови здоровых людей, а также пациентов с ишемической болезнью сердца (ИБС).

Методы изучения протеома липопротеинов

Для идентификации белков в липопротеиновых комплексах сегодня используют несколько общих методических подходов [4].

Первый подход базируется на различиях в изоэлектрической точке и размерах белковых молекул с использованием двумерного гель-электрофореза [5]. Белки визуализируются окрашиванием, экстрагируются из геля и после протеолитического расщепления анализируются масс-спектрометрическими методами. Данный методический подход используется для характеристики относительно несложных протеомов.

Во втором подходе используется матрично-активированная лазерная десорбция/ ионизация (MALDI , matrix-assisted laser desorption/ionization) с время-пролетным (TOF, time of flight) масс-анализатором. В этом методе лазерный луч вырывает ионы с поверхности мишени, на которую нанесен образец со специально подобранной матрицей. Метод позволяет идентифицировать отдельные белки и используется, в основном, для идентификации уже известных белков [6].

В третьем подходе применяется время-пролетный масс-спектрометр с усиливаемой поверхностью лазерной десорбцией/ионизацией (SELDI, surface-enhanced laser desorption/ ionization). Суть этого метода заключается в использовании в качестве масс-спектрометрической мишени селективных поверхностей, избирательно связывающих белки на основе специфических аффинных взаимодействий [7]. Метод применяется для идентификации белков в сложных смесях, а также отдельных классов белков.

Четвертый подход, называемый shotgun-протеомика, или метод «дробовика», использует высокоэффективную жидкостную хроматографию в сочетании с электроспрей-ионизацией и тандемной масс-спектрометрией [8]. Исследуемые белки расщепляют трипсином на короткие пептиды, которые разделяются с помощью жидкостной хроматографии, переводятся в газообразное состояние электроспрей-ионизацией и анализируются тандемной масс-спектрометрией. Этот мощный метод может детектировать более 1000 белков в сложных смесях.

Характеристика протеома ЛПВП

ЛПВП - гетерогенные белково-липидные комплексы с гидратированной плотностью 1,063 - 1,21 г/мл. Традиционно методом ультрацентрифугирования ЛПВП разделяют на два главных подкласса: ЛПВП2 (1,063-1,125 г/ мл) и ЛПВП3 (1,125-1,21 г/мл). Белки составляют около 50% массы ЛПВП. Среди белков 70% приходится на апоА-I и 15-20% на апоА-II. Композиционная гетерогенность ЛПВП обуславливает выполнение ими ряда различ-

ных биологических функций. Наиболее изученной функцией является участие ЛИВИ в процессе обратного транспорта холестерина [9]. Кроме этого, ЛИВИ предотвращают окислительную модификацию липопротеинов низкой плотности, способствуют репарации эндотелия и образованию оксида азота [10, 11]. Ингибируя экспрессию клеточных молекул адгезии на эндотелии и активность хемотак-тического фактора макрофагов, ЛИВИ препятствуют развитию воспаления [12].

ЛИВИ впервые изолировали из сыворотки крови 60 лет назад и сотни биохимических исследований были проведены для выяснения характеристики их белкового состава. До 2005 года в составе ЛИВИ выделяли четыре основные функциональные группы белков: 1) белки, ассоциированные с транспортом и метаболизмом липидов и структурой самого липопротеина - аполипопротеи-ны А-1, Л-П, А-ГУ, А-У, С-1, С-11, С-Ш, С-ГУ, D, Е, F, Н, L-Г, М; 2) ферменты, такие, как леци-тин-холестерин-ацилтрансфераза (ЛХАТ), па-раоксоназа и гидролаза тромбоцит-активиру-ющего фактора; 3) липидопереносящие белки, включая эфирохолестеринпереносящие белки (ЭХИБ) и фосфолипидопереносящие белки (ФЛИБ); 4) острофазовые белки - сывороточный амилоид А ^АА) и кластерин.

Ирименение масс-спектрометрических методов анализа привело к неожиданному открытию ряда новых белков, ассоциированных с ЛИВИ. Иервое подобное исследование, проведенное в 2005 году с использованием двумерного гель-электрофореза в комбинации с MALDГ-TOF-спектрометрией, позволило идентифицировать 12 белков в составе ЛПВП3 и 13 белков в составе общей фракции ЛИВИ [13]. Результаты этого исследования показали, что в ЛИВИ, кроме классических аполипопротеинов, присутствуют и другие белки, такие, как SAA, слюнная амилаза и а-1-антитрипсин.

Быстрое развитие и применение shotgun-протеомики за следующие пять лет увеличило число идентифицированных в ЛИВИ белков с 13 до 100 и более. Однако присутствие в ЛИВИ только пятидесяти одного из них подтверждено двумя и более исследованиями (табл. 1).

Второе исследование протеома ЛИВИ, проведенное тоже в 2005 году с использованием двумерного электрофореза и MALDI-масс-спектрометрии, выявило в составе ЛИВИ 24 белка, включая большинство белков, найденных в предыдущем исследовании [14]. Сывороточный трансферрин и а-2-макрогло-булин были отмечены в качестве новых белков, ассоциированных с ЛИВИ.

В 2006 году впервые было показано, что 56 белков, идентифицированных с использованием двумерного электрофореза в сочетании с МALDI-TOF-масс-спектрометрией, могут быть разделены на несколько функциональных кластеров. Таковыми являются белки транспорта и метаболизма липидов, иммунной системы и системы комплемента, белки гемостаза и фибринолиза, а также факторы роста, рецепторы и гормон-связываю-щие белки [15].

В 2007 году применение метода shotgun-протеомики позволило обнаружить в составе ЛИВИ 48 белков [16]. Они включали в себя 22 из 23 известных белков ЛИВИ, участвующих в метаболизме липидов. Количество острофазовых белков (23 из 48), концентрация которых заметно меняется при остром воспалении, превышало число белков, вовлеченных в метаболизм липидов. Впервые были обнаружены факторы системы комплемента С4А, С4В, С9, а также витронектин - белок из семейства пексинов, ингибирующий мембраноповреждающий эффект конечного цитолитического комплекса системы комплемента. Обнаружение белков, участвующих в системе комплемента вместе с белками, образующими комплекс, убивающий простейших (апоА-Г, L-I и гаптоглобин-родственный белок), предполагает, что ЛИВИ могут служить платформой для сборки белковых ансамблей, вовлеченных во врожденный иммунный ответ [17].

Иротеолиз структурных белков в атеросклеротических очагах может играть ключевую роль в механизмах разрыва бляшки - главной причине инфаркта миокарда у больных с ишемической болезнью сердца (ИБС) [18]. Ингибиторы сериновых протеаз, называемые сер-пинами, являются регуляторами ряда биологических путей, вовлеченных в свертывание

Таблица 1

Белки, идентифицированные в составе ЛПВП с помощью масс-спектрометрииа

Название белка Функция

АпоА-Г 1,5

АпоА-ГГ 1

АпоА-ГУ 1

АпоВ-100 1

АпоС-Г 1

АпоС-ГГ 1

АпоС-ГГГ 1

АпоС-ГУ 1

АпоD 1

АпоЕ 1

АпоF 1

АпоН 1,5

АпоJ (кластерин) 1,3

АпоL-I 1

АпоМ 1

Альбумин 6

Альфа-1-кислый гликопротеин 2 5

Альфа-1 -антитрипсин 2,5

Альфа- 1В-гликопротеин 6

Альфа-1 -микроглобулин/бикунин 2,5

Альфа-2-антиплазмин 2,4

Альфа-2-макроглобулин 2,4,5

Альфа-2Н8-гликопротеин 2,5

Ангиотензиноген 2,6

Витамин Д-связывающий глобулин 6

Витронектин 3,5

Г аптоглобин-родственный белок 2,5,6

Г емопексин 5,6

Интер-альфа-трипсин ингибитор цепь Н4 2,5

Калликреин 4

Кининоген 1 2,5

Комплемент С3 3,5

Комплемент С4А 3,5

Комплемент С4В 3,5

Комплемент С9 3,5

Комплемент фактор Н 3

Иараоксоназа 1 1,5

Иараоксоназа 3 1,6

Иротромбин 4

Ретинол-связывающий белок 5,6

Серпин F1 2,6

Сывороточный амилоид А 1 1,5

Сывороточный амилоид А 2 1,5

Сывороточный амилоид А 4 1

Сывороточный амилоид Р 6

Транстиретин 5,6

Трансферрин 5,6

Фибриноген 4,5

ФЛИБ 1

Церулоплазмин 5,6

ЭХИБ 1

Примечание: а - по результатам, подтвержденным двумя и более исследованиями [13-16, 20, 23]. 1 - транспорт и метаболизм липидов; 2 - ингибиторы протеиназ; 3 - система комплемента и ее регуляция; 4 - гемостаз/ фибринолиз; 5 - острофазовый ответ; 6 - другие функции.

крови, ремoделирование матрикса и воспаление [19]. Присутствие их в составе ЛПВП указывает на то, что кардиопротективный эффект ЛПВП отчасти связан с ингибированием протеолиза.

Используя для выделения ЛПВП-фракции быструю жидкостную хроматографию белков с последующим анализом белкового состава ЛПВП методом shotgun-протеомики, в 2010 году идентифицировано около 80 белков [20]. Примечательно, что было обнаружено около 30 новых белков, ассоциированных с ЛПВП. Среди них - некоторые новые компоненты системы комплемента (С2, С5, С8) и гемостаза/фиб-ринолиза (плазминоген, антитромбин III), гор-моно- и витаминосвязывающие белки (секс-гормон-связывающий и кортикостероид-связы-вающий глобулины, афазин), ферменты (аттрак-тин, биотинидаза), коллагеносвязывающие белки (фибронектин, люмикан), ядерный шаперон - мидазин и другие.

Окисление ЛПНП - значимое событие в атерогенезе, а ЛПВП ингибируют их окисление in vivo [21, 22]. В 2010 году методом shotgun-протеомики был изучен белковый состав разных подклассов ЛПВП с оценкой способности каждой фракции ЛПВП ингибировать окисление ЛПНП in vitro [23]. 28 белков, обнаруженных в составе ЛПВП, были разделены на 5 кластеров с разным преобладанием их в каждом подклассе ЛПВП. Установлена четкая корреляционная связь между уровнем компонентов белковых кластеров и их антиоксидантными свойствами. Обнаружено, что три специфических белка (апо L-I, параоксоназа 1 и 3) находятся почти эксклюзивно в ЛПВП3. Способность ЛПВП ингибировать окисление ЛПНП связано с содержанием в ЛПВП именно этих белков. ЛПВП3 являются также уникальными переносчиками апоА-IV, ФЛПБ, апоJ и апоF. Все вышеперечисленные белки и составили кластер А. Предпочтительно локализуются в ЛПВП3 (кластер В) - апоD, апоМ и SAA-1 и 2. Распределяются равномерно среди субклассов ЛПВП (кластер С) - апоА-I, апоА-II, апоС-I, апоС-IV и SAA-4. Находятся предпочтительно в ЛПВП2 - апоЕ, апоС-II и апоС-III (кластер D). Наконец, кластер Е представлен дву-

мя белками апоВ-100 и апо(а), локализованными почти исключительно во фракции ЛИВИ2.

Протеом ЛПВП у пациентов с ИБС

Анализ протеома ЛИВИ^ полученных из крови мужчин с установленным диагнозом ИБС, обнаружил селективное накопление пяти белков [16]. Эти белки связаны с метаболизмом липидов (апоЕ, апоС-ГУ и апоА-ГУ), окислительным стрессом (параоксоназа-1) и системой комплемента (фактор С3). Иримеча-тельно, что апоЕ, апоС-ГУ и фактор С3 экспрессируются макрофагами [24, 25]. Более того, апоЕ и апоС-ГУ - белки генного кластера, экспрессия которого индуцируется в макрофагах через холестериночувствительные ядерные рецепторы. АпоА-ГУ вместе с апоА-Г и апоС-Ш принадлежит другому кластеру генов, который замедляет развитие атеросклероза, если экспрессируется у мышей [26]. ЛИВИ2, обогащенные апоЕ, - эффективные акцепторы холестерина из макрофагов [27], а у пациентов с ИБС обнаружено снижение уровня апоЕ в их составе. Накопление апоЕ в составе ЛИВИ3 у пациентов с ИБС, возможно, связано с перераспределением апоЕ от ЛИВИ2 к ЛИВИ3 с сопутствующим замедлением оттока холестерина из макрофагов [16].

Иервое исследование, изучавшее влияние липидоснижающей терапии у пациентов с ИБС на протеом ЛИВИ, показало, что ЛИВИ3 у пациентов с ИБС значительно обогащены апоЕ и апоС-П и содержат меньше апоJ и ФЛИБ. Терапия статинами и ниацином снижает уровень апоЕ и одновременно повышает содержание апоJ и ФЛИБ, то есть частично ремоделирует протеомный профиль пациентов с ИБС в профиль здоровых людей [28].

Заключение

Ирименение методов масс-спектрометрического анализа с высокой разрешающей способностью позволило обнаружить в составе ЛИВИ большое количество новых белков. Эти находки не оставляют сомнений, что ЛИВИ не только транспортируют липиды, но и вовлечены в процессы ингибирования протеиназ,

регуляцию системы комплемента, острофазовый ответ, а также являются составной частью системы врожденного иммунитета.

Литература

1. Anderson, N. G. Adventures in clinical chemistry and proteomics: a personal account / N. G. Anderson // Clinical Chemistry. - 2010. - Vol. 56, N 2. - P. 154-160.

2. Getz, G. S. Bridging the innate and adaptive immune

systems / G. S. Getz // J. Lipid Res. - 2005. - Vol. 46. -P 619-622.

3. Stephen, J. N. Relationship between LDL, HDL, blood pressure and atheroma progression in the coronaries / J. N. Stephen // Curr. Opin. Lipid. - 2009. - Vol. 20. - P. 491-496.

4. Hoofnagle, A.N. Lipoproteomics: using mass spectrometry-based proteomics to explore the assembly, structure, and function of lipoproteins / A. N. Hoofnagle, J. W. Heinecke // J. Lipid Res. - 2009.

- Vol. 50. - P. 1967-1975.

5. O’Farrell, P. H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins / P. H. O’Farrell // J. Biol. Chem. - 1975. - Vol. 250. - P. 4007-4021.

6. Farwig, Z. N. Analysis of high-density lipoprotein apolipoproteins recovered from specific immobilized pH gradient gel pI domains by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry / Z. N. Farwig, A. V Campbell, R. D. Macfarlane // Anal. Chem. - 2003. - Vol. 75. - P 3823-3830.

7. SELDI-TOF mass spectrometry of high-density lipoprotein / J.H.M. Levels [et al.] // Proteome Science.

- 2007. - Vol. 5. - P15-23.

8. Direct analysis of protein complexes using mass spectrometry / A. J. Link [et al.] // Nature Biotechnology.

- 1999. - Vol. 17. - P 676-682.

9. The roles of different pathways in the release of cholesterol from macrophages / M. P. Adorni [et al.] // J. Lipid Res. - 2007. - Vol. 48. - P 2453-2462.

10. Normal high density lipoprotein inhibits three steps in the formation of mildly oxidized low density lipoprotein. Steps 2 and 3 / M. Navab [et al.] // J. Lipid Res. - 2000. - Vol. 41. - P. 1495-1508.

11. High-density lipoproteins enhance progenitor-mediated endothelium repair in mice / C. Tso [et al.] // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. - 2006. - Vol. 26. - P. 1144-1149.

12. Monocyte transmigration induced by modification of low density lipoprotein in cocultures of human aortic wall cells is due to induction of monocyte chemotactic protein 1 synthesis and is abolished by high density lipoprotein / M. Navab [et al.] // J. Clin. Invest. - 1991.

- Vol. 88. - P 2039-2046.

13. Lipoproteomics II: mapping of proteins in high-density lipoprotein using two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry / H. Karlsson [et al.] // Proteomics. - 2005. - Vol. 5. - P 1431-1445.

14. Mass spectrometry based analytical tools for the molecular protein characterization of human plasma

lipoproteins / M. Heller [et al.] // Proteomics. - 2005. -Vol. 5. - P 2619-2630.

15. Proteomic analysis of high density lipoprotein / F. Rezaee [et al.] // Proteomics. - 2006. - Vol.6. - P721-730.

16. Shotgun proteomics implicates protease inhibition and complement activation in the antiinflammatory properties of HDL / T. Vaisar [et al.] // J. Clin. Invest. -2007. - Vol. 117. - P 746-756.

17. Human high density lipoproteins are platforms for assembly of multi-component innate immune complexes / A. M. Shiflett [et al.] // J. Biol. Chem. -2005. - Vol. 280. - P. 32578-32585.

18. The molecular mechanisms of the thrombotic complications of atherosclerosis / A. M. Shiflett [et al.] // J. Intern. Med. - 2008. - Vol.263. - P 517-527.

19. Richardson, J. Serpins, the vasculature, and viral therapeutics / J. Richardson, K. Viswanathanand, A. Lucas // Front. Biosci. - 2006. - Vol. 11. - P. 1042-1056.

20. Collins, L. A. Quantitative comparison of lipoprotein fractions derived from human plasma and serum by liquid chromatography-tandem mass spectrometry / L. A. Collins, M. Olivier // Proteome Science. - 2010. -Vol. 8. - P 42-50.

21. Stocker, R. Role of Oxidative Modifications in Atherosclerosis / R. Stocker, J.F. Keaney // Physiol. Rev. - 2004. - V 84. - P.1381-1478.

22. Antiinflammatory properties of HDL / P J. Barter [et al.] // Circ. Res. - 2004. - Vol. 95. - P. 764-772.

23. Proteomic analysis of defined HDL subpopulations reveals particle-specific protein clusters: relevance to antioxidative function / W. S. Davidson [et al.] // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. - 2009. - Vol. 29. -P.870-876.

24. Strunk, R.C. Human peripheral blood monocyte-derived macrophages produce haemolytically active C3 in vitro / R.C. Strunk, K.S. Kunke, PC. Giclas // Immunology. -1983. - Vol. 49. - P 169-174.

25. Regulated expression of the apolipoprotein E/C-I/C-IV/C-II gene cluster in murine and human macrophages. A critical role for nuclear liver X receptors alpha and beta / P. A. Mak [et al.] // J. Biol. Chem. - 2002. - Vol. 277. - P 31900-31908.

26. Expression of human apolipoprotein A-I/C-III/A-IV gene cluster in mice induces hyperlipidemia but reduces atherogenesis / L. Vergnes [et al.] // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. - 2000. - Vol. 20. - P. 2267-2274.

27. HDL from CETP-deficient subjects shows enhanced ability to promote cholesterol efflux from macrophages in an apoE- and ABCG1-dependent pathway / F. J. Matsuura [et al.] // Clin. Invest. - 2006. - Vol. 116.

- P 1435-1442.

28. Combined statin and niacin therapy remodels the high-density lipoprotein proteome / P. S. Green [et al.] // Circulation. - 2008. - Vol. 118. - P 1259-1267.

Поступила 10.01.2011 г. Принята в печать 03.06.2011 г.