ШТАММ БАКТЕРИЙ HISTOPHILUS SOMNI, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МОНО- И ПОЛИВАЛЕНТНЫХ ИММУНОГЕННЫХ КОМПОЗИЦИЙ, НАПРАВЛЕННЫХ НА СПЕЦИФИЧЕСКУЮ ПРОФИЛАКТИКУ ГИСТОФИЛЕЗА (СТАДНОГО БЕСПЛОДИЯ) РОГАТОГО СКОТА
STRAIN OF HISTOPHILUS SOMNI BACTERIA INTENDED FOR PRODUCTION OF MONO- AND POLYVALENT IMMUNOGENIC COMPOSITIONS AIMED AT SPECIFIC PREVENTION OF HISTOPHILOSIS (HERD INFERTILITY) IN CATTLE

Изобретение относится к области биотехнологии, ветеринарной микробиологии и иммунологии, и может быть использовано при производстве инактивированных иммунобиологических средств (в виде моно- и поливалентных препаратов), предназначенных для специфической профилактики инфекции рогатого скота, вызванной Histophilus somni. Штамм депонирован во Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных Федерального научного центра - Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской академии наук под номером В-1654.
Гистофилез - инфекционное заболевание преимущественно жвачных видов животных, проявляющееся поражением органов респираторной и/или репродуктивной систем, а также сепсисом [Markey, В. Haemophilus and Histophilus species. / В. Markey, F. Leonard, M. Archambault, A. DM. Cullinane // In: Clinical Veterinary Microbiology. 2013. p. 349-54]. Согласно современной классификации, возбудителем гистофилеза является вид микроорганизм Histophilus somni, относящийся к семейству Pasteurellaceae. Впервые Н. somni был выделен от быков с инфекционным менингоэнцефалитом в Калифорнии в 1960 году и описан как «Haemophilus - подобный микроорганизм». Поэтому в ранней литературе этот вид имеет синонимичное название Haemophilus somnus [Harris, F.W. The Haemophilus somnus disease complex (hemophilosis): a review. / F.W. Harris, E.D. Janzen // Can Vet J. 1989. №30(10). P.816-22].
Histophilus somni - это неподвижная аэробная грамотрицательная коккобацилла, не обладающая способностью образовывать споры и капсулу. В соответствии с научной литературой, Н. somni является комменсалом нижних и верхних дыхательных путей, а также органов репродуктивной системы рогатого скота. При этом возбудитель способен вызывать широкий спектр заболеваний, среди которых менингоэнцефалит, миокардит, отит, мастит, орхит, заболевания кишечного тракта у крупного рогатого скота, овец и американского бизона, а также эндометриты и сальпингиты у коров в послеродовой период [Andrews, J.J. Microscopic lesions associated with the isolation of Haemophilus somnus from pneumonic bovine lungs. / J.J. Andrews, T.D. Anderson, L.N. Slife, G.W. Stevenson // Vet Pathol. 1985. №22(2). Р. 131-6].
К гистофилезу восприимчив крупный рогатый скот всех возрастных групп, но наибольший процент заболеваемости и летальности наблюдается у телят в возрасте 1-2 месяцев. У молодняка этой возрастной группы заболевание протекает в респираторной форме и проявляется пневмониями с переменной лихорадкой, кашлем и т.д. Аналогичное течение гистофилеза может быть и у более взрослых животных на откорме. Источником Histophilus somni являются больные животные, а также бактерионосители, которые выделяют патоген с биологическими жидкостями. Возбудителя способен длительное время персистировать в организме, постепенно распространяясь по всему стаду восприимчивых животных. При этом распространение инфекции в стаде часто происходит без проявления явных клинических признаков, что затрудняет диагностику заболевания, основанную на клинико-морфологическом проявлении [Капустин, А.В. Гистофилез крупного рогатого скота / А.В. Капустин, Н.В. Моисеева, А.И. Лаишевцев, М.А. Лучко, СП. Яцентюк, Н.С.Горбачева // Russian Journal of Agricultural and Socio-Economic Sciences. 2017. №10 (70). C. 319-26].
На фоне быстрого развития и широкого распространения антибиотикорезистентности микроорганизмов, борьба с гистофилезом в первую очередь должна ориентироваться на его специфическую профилактику [Моисеева, Н.В. Антибиотикорезистентность возбудителя гистофилеза крс - Histophilus somni, изолированного на территории РФ / Н.В. Моисеева, А.В. Капустин // В сборнике: Актуальные вопросы биологии, биотехнологии, ветеринарии, зоотехнии, товароведения и переработки сырья животного и растительного происхождения Материалы национальной научно-практической конференции. 2019. С. 49-51]. Именно на решение этой задачи направленно данное изобретение.
Уровень техники
В настоящее время известны следующие штаммы Histophilus somni, предназначенные, в том числе, для получения иммуногенных композиций и профилактики гистофилеза животных:
Белки внешней мембраны Histophilus somni и способ их получения (Outer membrane proteins of Histophilus somni and methods thereof) [патент - US 9597386 B2, опубл. 2017.03.21, США]. Изобретение относится к иммунобиологическим композициям на основе белков внешней мембраны, которые предназначены для специфической профилактики респираторных инфекций крупного рогатого скота, вызванных Histophilus somni. При получении обозначенной антигенной композиции используются штаммы Histophilus somni Lg2-OK08 и LgD1-TN08. Недостатком данного изобретения, на наш взгляд, является тот факт, что при получении вакцины на основе белков внешней мембраны (ОМР), не используются иные иммуногенные факторы вирулентности Histophilus somni, которые являются антигенами и, следовательно, также способны обладать высокой протективной эффективностью.
Иммунобиологические композиции, содержащие аттенуированные культуры Histophilus somni (Immunological compositions containing attenuated Histophilus somni) [патент - CA 2943786 A1, опубл. 2015.10.01, Канада]. Изобретение отражает аттенуированные штаммы Histophilus, а также способы их получения и применения. Аттенуированные штаммы могут экспрессировать более низкие уровни различных ассоциированных с вирулентностью генов или не экспрессировать их вообще по сравнению с соответствующими патогенными бактериями. Препараты на основе аттенуированных штаммов могут вводиться перорально, интраназально, интратрахеально или подкожно. В патенте приведены характеристики следующих аттенуированных штаммов: РТА-121029 и РТА-121030. Недостатком данного изобретения является то, что препараты изготовленные из аттенуированных живых штаммов, сложно сочетать с другими антигенами, например для получения ассоциированных вакцин. При этом ассоциированные вакцины удобнее моновалентных, поскольку минимизируют затраты на проведение профилактических обработок и одновременно позволяю профилактировать несколько инфекционных заболеваний.
Белковый экстракт наружной мембраны Haemophilus somnus, обогащенный железо-регулирующими белками (Haemophilus somnus outer membrane protein extract enriched with iron-regulated proteins) [патент CA 2099707 C, опубл. 2006.09.05, Канада]. Изобретение ориентировано на создании новой субъединичной вакцины против Haemophilus somnus, включающий экстракт белков внешней мембраны клеток возбудителя, дополнительно обогащенный железо-регулирующими белками. В качестве производственного штамма предложена культура HS25. Недостатком данного изобретения является то, что при производстве препарата, не используются иные антигенные компоненты бактериальной клетки, что снижает иммунный ответ у животных.
Помимо вышеобозначенных композиций известен штамм Histophilus somni АТСС 700025, широко используемый в качестве положительного контроля при оценке ростовых свойств питательных сред, а также для контроля специфичности диагностических наборов биохимической идентификации и наборов для определения антибиотикорезистентности бактерий [Bhatt, K., Timsit, Ε., Rawlyk, Ν., Potter, Α., & Liljebjelke, K. (2018). Integrative Conjugative Element ICEHsl Encodes for Antimicrobial Resistance and Metal Tolerance in Histophilus somni. Frontiers in veterinary science, 5, 153. https://doi.org/10.3389/fvets.2018.00153]. Недостатком данного штамма можно считать его не подтвержденные антигенные и иммуногенные свойства, необходимые при конструировании иммунобиологических средств.
8
8
Известны штаммы Histophilus somni Р-51 и Oklahoma, используемые при производстве вакцины Elite 9 HS (Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc.). Гистофилезный компонент входит в состав ассоциированного средства совместно с инактивированными вирусами ринотрахеита крупного рогатого скота (штамм Mckercher), парагриппа-3 (штамм SF-4), вирусной диареи (штамм Singer), респираторно-синцитиальной инфекции (штамм Tennessee), Leptospira canicola (штамм NADL), L. Grippotyphosa (штамм SC201), L. Hardjo (штамм hardjoprajitno), L. Icterohaemorrhagiae (штамм NADL) и L. pomona (штамм T-262) с добавлением 10% раствора алюмо-калиевых квасцов (1,25 мл) в качестве адъюванта, 14% раствора ЭДТА (0,0067 мл), 1,5% раствора неомицина (0,0042 мл), 2,5% раствора тимеросала (0,0084 мл), раствора едкого натрия и физиологического раствора до 5 мл. В одной иммунизирующей дозе содержится не менее 3,1*10 бактериальных клеток Histophilus somni штамм Р-51 и не менее 3,1*10 бактериальных клеток Histophilus somni штамм Oklahoma [https://galen.vetrf.ru/files/54e268d3-c3c0-4c35-allb-36eef51ef935]. Указанные штаммы рассматриваются нами как прототип предлагаемого изобретения. Важно отметить, что не смотря на наличие приведенных примеров, использования белков наружной мембраны для создания вакцины, или живых вакцин на основе аттенуированных культур, или субъединичных вакцин, на основе одного из фактора вирулентности Histophilus somni, во всем мире, наиболее широкое распространение нашли инактивированные вакцины, такие как: Bar Somnus 2Р (Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc.), Bar Vac 7/Somnus (Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc.), Elite 9 HS (Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc.), Express 5-HS (Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc.), Somnu Shield (Elanco Europe Ltd), Ultrabac 7/Somubac (Zoetis Inc.), Vira Shield 6+L5 HB Somnus (Elanco Europe Ltd), Vision 7 Somnus (w/Spur) (Merck & Co., Inc.), Vision 8 Somnus (w/Spur) (Merck & Co., Inc.), что в свою очередь говорит об достаточном уровне их протективной эффективности.
Технической проблемой, на решение которой направлено данное изобретение, является получение новых культур Histophilus somni, отвечающих требованиям, предъявляемым к производственным штаммам (по культуральным, ростовым, морфологическим, тинкториальным, биологическим, антигенным, иммуногенным и т.д. свойствам) и пригодных для конструирования и производства высокоэффективных иммунобиологических средств, в частности моно и поливалентных вакцин против гистофилеза (стадного бесплодия) рогатого скота.
Раскрытие сущности изобретения
Технический результат изобретения заключается в стандартизации технологии производства иммунобиологических средств специфической профилактики гистофилеза рогатого скота за счет использования изученного и охарактеризованного штамма Histophilus somni, отвечающего требованиям, предъявляемым к производственным культурам (по культуральным, ростовым, морфологическим, тинкториальным, биологическим, антигенным, иммуногенным и т.д. свойствам). Изобретение служит средством расширения арсенала штаммов, предназначенных для получения моно и поливалентных вакцин, направленных на специфическую профилактику инфекционных болезней сельскохозяйственных животных, с высокой стабильностью, антигенной, иммуногенной и протективной активностью.
Для производства иммунобиологических средств против гистофилеза рогатого скота предлагается новый хорошо изученный и охарактеризованный штамм Histophilus somni, депонированный во Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН под номером В-1654. Использование предложенного штамма при производстве иммунобиологических средств позволит повысить уровень эпизоотического благополучия по гистофилезу рогатого скота на территории страны.
Осуществление изобретения
Приведенные ниже примеры являются иллюстративными и тем самым не ограничивают рамки настоящего изобретения.
Пример №1. Авторский штамм микроорганизма Histophilus somni В-1654.
1. Номер штамма в «Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных»: В-1654.
2. Дата депонирования: 15.07.2020.
3. Вид микроорганизма: Histophilus somni.
4. Основание для депонирования: предназначен для изготовления и контроля вакцин против гистофилеза рогатого скота.
5. Патогенность: в соответствии с классификацией микроорганизмов - возбудителей инфекционных заболеваний человека, простейших, гельминтов и ядов биологического происхождения по группам патогенности санитарных правил 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» бактерия вида Histophilus somni не относится ни одной из четырех групп патогенности.
6. Дата, источник и место выделения: выделен из абсцесса легких свиней, на свиноводческом предприятии Свердловской области в 2018 г.
7. Где идентифицирована культура: лаборатория микробиологии с музеем типовых культур ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН.
8. Методы идентификации: культурально-морфологические, биохимические и молекулярно-генетические методы, масс-спектрометрические.
9. Морфологические признаки: в мазках окрашенных по Грому обнаруживаются неподвижные грамотрицательные коккобациллы, короткие палочки или нити.
10. Культуральные особенности: на кровяном агаре микроорганизм формирует гладкие, выпуклые колонии размером 0,5-1,0 мм спустя 24 часа культивирования при температуре +37°С в условиях поддержания 5-10% углекислого газа. Через 72 часа культивирования размер колоний может достигать 1-2 мм. Штамм не растет на агаре Мак-Конки. Не требует присутствия в питательной среде V и X факторов.
11. Биохимические свойства: культура оксидазоположителъная, но каталазоотрицательная, аргининдекарбоксилаза, лизиндекарбоксилаза и орнитиндекарбоксилаза отрицательны, восстанавливает нитрат, продуцирует индол, кислота продуцируется при ферментации глюкозы, ксилозы, маннита, сорбита, фруктозы, маннозы, мальтозы, трегалозы, но не грицерина, рамнозы, целлобиозы, лактозы, мелибиозы, сахарозы, раффинозы, инулина, эскулина.
50
8
12. Вирулентность для лабораторных животных: вызывает гибель белых мышей, Ld - 2,09*10 м.к.
13. Условия культивирования: растет на сердечно-мозговом бульоне, триптон-соевом бульоне, а также на агаризированных питательных средах с добавлением 10% крови крупного или мелкого рогатого скота в присутствии 5-10% углекислого газа.
3
14. Условия хранения: в лиофилизированном виде в ампулах. Среда высушивания - декстриновый стабилизатор. Объем лиофилизата составляет 1 см. Температура хранения (4-8)°С. Перезакладка через 5 лет.
15. Организация-депозитор: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Федеральный научный центр - Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской академии наук», (ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН). 109428, г.Москва, Рязанский проспект д. 24, корпус 1. Тел./факс +7 (495) 970-03-69. E-mail: admin@viev.ru
16. Авторы: Лаишевцев А.И., Капустин А.В., Якимова Э.А.
Пример №2. Получение бульонной культуры Histophilus somni для последующей лиофилизации
2
2
9
Для промышленного использования производственного штамма Histophilus somni целесообразно обеспечить его сохранность в лиофилизированном виде. Данный подход позволяет стандартизировать качество производимой продукции и обеспечивать возможность его длительного хранения культуры без пассажа. Для лиофилизации предложенного штамма гистофил предварительно получали бульонную культуру. Для этого с поверхности агара в чашках Петри, на которых поддерживалась живая культура, производился отсев отдельных колоний на пробирки с сердечно-мозговым бульоном (возможно использование триптон соевого бульона или иных ростобеспечивающих сред). После пересева пробирки с бульоном культивировались при 37-38°С в течении 24 часов в присутствия 5-10% СО. По окончании культивирования, проводился контроль бульонной культуры на типичность роста, морфологические и тинкториальные свойства клеток гистофил, а также отсутствие роста посторонней микрофлоры. Все обозначенные свойства соответствовали паспортных. В течении 24 часов культивирования в пробирках концентрация клеток достигает 0,5-0,7*10. Следующим этапом работы являлся пересев бульонной культуры из пробирки во флакон с 250 мл сердечно-мозгового или триптон-соевого бульона. Данный этап позволяет одновременно получить большое количество бульонной культуры с идентичными свойствами. Культивирование флаконов производилось при 37-38°С в течении 24 часов, в присутствии 5-10% СО. По окончании культивирования, проводился контроль бульонной культуры на типичность роста, морфологические и тинкториальные свойства клеток гистофил, а также отсутствие роста посторонней микрофлоры. Все обозначенные свойства полностью соответствовали паспортным.
Получив бульонную культуру во флаконе, в него вносился декстриновый стабилизатор (или сахаро-желатиновую среду) в объеме 30%. Так, например, к 250 мл бульонной культуры Histophilus somni добавлялся стабилизатор в количестве 75 мл, после чего полученную суспензию тщательно размешивали. Суспензию расфасовывали в ампулы или флаконы в объеме 1-3 мл, в зависимости от типа используемой тары, и подвергали высушиванию.
Пример №3. Получение агаровой культуры Histophilus somni для последующей лиофилизации
2
2
3
3
3
9
3
Для поддержания штаммов гистофилл в лиофилизированном виде помимо бульонной культуры возможно использование агаровой суспензии, предварительно полученной с плотных питательных сред. Получение суспензии проводилось в следующей последовательности: с чашек Петри, на которых поддерживалась живая культура гистофил, отсевались отдельные колонии на чашки Петри с кровяным агаром (основой колумбийского агара с добавление 10% дефибринированной крови барана) для получения свежей суточной культуры. Культивирование посевов проводили при 37-38°С в течении 24 часов, в присутствии 5-10% СО. Спустя сутки культивирования проводили оценку типичности роста штамма, оценку морфологических и тинкториальных свойств, а также подтверждалось отсутствие роста посторонней микрофлоры. Все свойства соответствовали паспортным. Полученная агаровая культура смывалась стерильным физиологическим раствором из расчета 15 см на одну чашку Петри. В последующем данная суспензия использовалась для засева матрацов (объемом 300 см) с кровяным агаром (этап необходим для получения большого количества бактериальной суспензии с идентичными свойствами). Засев производился из расчета 5 мл суспензии на 1 матрац. Культивирование матрацов производилось при 37-38°С в течении 24 часов в присутствии 5-10% СО. Спустя сутки культивирования проводилась оценка типичности роста штамма, оценка морфологических и тинкториальных свойств, а также подтверждается отсутствие роста посторонней микрофлоры. Все свойства соответствовали паспортным. Полученная культура смывалась с поверхности матрацов стерильным физиологическим раствором в объеме 50 см на один матрац. После чего суспензию бактериальных клеток разводили до концентрации 1*10 м.к./см физиологическим раствором (возможно использование для лиофилизации суспензии в исходной концентрации, т.е. без дополнительного разведения). В качестве среды высушивания использовалась сахаро-желатиновая среда (возможно использование декстринового стабилизатора) в объеме 30% от объема бактериальной суспензии. Суспензию расфасовывали в ампулы или флаконы в объеме 1-3 мл, в зависимости от типа используемой тары, и подвергали высушиванию.
Пример №4. Лиофилизация производственного штамма Histophilus somni Полученную смесь культуры производственного штамма Histophilus somni со стабилизатором (полученные согласно примерам №2 и/или №3) расфасовывали по 1,0 мл в стеклянные флаконы вместимостью 3 мл, по ТУ 10.09.202 и ГОСТ 10782 вручную с использованием автоматических дозаторов. Фасовку проводили в ламинарном потоке стерильного воздуха с соблюдением правил асептики. Емкость с расплодкой перед розливом обтирали салфеткой, смоченной 2%-ным раствором хлорамина. Перед розливом и в его процессе фасуемый материал периодически перемешивался.
Флаконы с расплодкой штамма укупоривали стерильными резиновыми пробками на ножке до соответствующей риски по ТУ 38-006-108. При розливе в ампулы их горлышко закрывали стерильной ватой. Флаконы и ампулы после фасовки распределялись на специальные металлические кассеты, которые помещали в морозильные камеры с температурой не выше минус 45°С.
После замораживания кассеты помещали в сублимационный аппарат, вынимая поддоны так, чтобы дно флаконов соприкасалось с греющими поверхностями сублиматора. Использовали сублимационные установки модели Christ epsilon 1-4.
Технология сублимации включает в себя два основных этапа: замораживание и сушку (первичную и вторичную). Сублимационное высушивание проводили в асептических условиях, согласно инструкции к соответствующей сублимационной установке. Управление процессом вели в зависимости от сублимационного аппарата в ручном или автоматическом режиме.
Во время сушки контролировали следующие параметры:
а) температуру в материале;
б) температуру греющих поверхностей;
в) температуру конденсатора;
г) давление в сублимационной камере;
д) относительное электрическое сопротивление материала.
Изменение этих параметров во времени фиксировалось на ленте самописца и/или на мониторе компьютера.
Основные контрольные точки процесса сублимационной сушки штаммов:
а) температура замораживания материала - не выше минус 45°С;
б) время достижения температуры полного замораживания для всей партии жидкого материала - не менее 5 часов при скорости охлаждения 1 градус в минуту;
в) при сублимации (первичная сушка) длительность поддержания температуры плит на уровне минус 22°С составляет не менее 55 часов, без учета длительности нагрева плит.
Величина массоудаления характеризует качество проведения процесса по показателю удаленной влаги. Стандартность величины этого показателя гарантирует надежное воспроизведение приемлемого уровня влажности в готовом продукте.
Параметры контроля после процесса сублимационной сушки.
После процесса сушки и укупоривания флаконов оценивали следующие параметры качества сухого препарата:
а) внешний вид таблетки;
б) величина массоудаления;
в) наличие вакуума;
г) полнота и скорость растворения сухой таблетки;
д) величина остаточной влажности.
Обкатка алюминиевыми колпачками, поклейка этикеток.
После сублимационного высушивания флаконы с сухим компонентом вручную подвергались обкатке алюминиевыми колпачками по ГОСТ Ρ 51314-99.
При изготовлении лиофилизированных ампул в ампулах, их запаивали в день разгрузки в вакуумных коллекторах при остаточном давлении в пределах 0,1-0,25 мкм рт.ст.
В запаянных ампулах проверяли наличие вакуума аппаратом типа Д’Арсонваль. Ампулы без вакуума выбраковывали с последующим автоклавированием. Первичный визуальный контроль и отбор брака.
Расфасованную и укупоренную расплодку штамма подвергали визуальному контролю. Отбраковывали флаконы/ампулы с посторонними включениями, трещинами, измененным цветом, несоответствующим объемом фасовки, нарушением укупорки.
Этикетированную расплодку укладывали в контейнеры для последующего хранения. Производился визуальный контроль физических свойств и отбирались образцы для проведения контрольных испытаний и закладки в коллекцию ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН на хранение.
Процесс фасовки и этикетирования материала регистрировали в журнале учета изготовления и движения штаммов, где записывали дату, объем расфасованной продукции, количество флаконов, номер серии.
Пример №5. Контроль внешнего вида, цвета, наличия посторонних примесей, полученной расплодки производственного штамма гистофилл
Внешний вид, цвет, наличие посторонней примеси, плесени, следов оттаивания, трещин определяли визуально по каждому флакону/ампуле всей серии штамма. Одновременно проверяли качество запайки ампул, наличие во флаконах/ампулах вакуума, правильность маркировки.
Лиофилизированные посевные материалы по внешнему виду представляли собой однородную сухую мелкопористую массу белого или светло-желтого цвета с сероватым оттенком без посторонней примеси. Все несоответствующие по данному параметру ампулы/флаконы подвергались выбраковке методом автоклавирования.
Пример №6. Определение наличия вакуума в ампулах
Сущность метода испытания заключается в способности высокочастотного электрического тока при большом напряжении вызывать в газах свечение. Для проведения испытания используется аппарат типа «Д’Арсонваль». Перед использованием аппарата его выдерживали в течении 10 минут после включения. Испытуемые ампулы устанавливались в штативе, после чего к ним подводили электроды на расстоянии 1 см, с экспозицией искрового разряда у каждой ампулы не более 1 с.
Наличие вакуума в ампулах подтверждали по наличию свечения внутри ампулы и характерному потрескиванию при подведении к ним электродов. В ходе выполнения данного исследования ампулы, не содержащие вакуум, были выбракованы с последующим автоклавированием.
Пример №7. Определение растворимости лиофилизата
3
Для испытания использовали 3 флакона/ампулы с полученным лиофилизатом, в который вносили стерильный физиологический раствор (рН 7,2) в объеме, соответствующем объему культуры штамма до высушивания (1 см), после чего флаконы/ампулы встряхивали. В течение не более 4 минут должна образоваться равномерная взвесь без хлопьев, комочков и осадка. Произведенная расплодка (полученная согласно примерам №2, №3, №4) соответствовала данному параметру.
Пример №8. Определение массовой доли влаги в ампуле
Исследование данного параметра проводят согласно ГОСТ 24061-2012 «Средства лекарственные биологические лиофилизированные для ветеринарного применения». Сущность метода заключается в определении уменьшения массы пробы препарата после ее высушивания в течение 1 ч при температуре (105±1)°С. Определение массовой доли влаги проводили в трех повторностях, для каждого из которых использовалось по 3 флакона/ампулы. Отобранные пробы помещали в фарфоровые ступки и с помощью пестика их доводили до равномерного порошкообразного состояния, после чего данный порошок помещали ровным слоем в предварительно взвешенные с крышкой бюксы. Бюксы с пробами закрывали крышками, взвешивали, снимали с них крышки и устанавливали в сушильный шкаф на полку. Начало сушки считали с момента достижения 105°С в соответствии с контрольным термометром. Продолжительность сушки составляла 60 минут. После окончания сушки бюксы быстро закрывали крышками и переносили в эксикатор для охлаждения до комнатной температуры в течении 30 минут, после чего бюксы взвешивали, а результаты взвешивания записывали в журнал с точностью до четвертого десятичного знака. Массовая доля влаги в образце должна быть в пределах 1,0-4,0%.
В результате испытания массовая доля влаги лиофилизированного штамма гистофил, подготовленного согласно примеру №2, составляла 2,6%, примера №3 - 2,3%.
Пример №9. Определение контаминации ампул посторонней микрофлорой Контаминацию посторонней микрофлорой определяли в соответствии с ГФ XIV ОФС.1.2.4.0002.15 «Микробиологическая чистота» методом прямого посева.
Для получения первичного разведения использовалось три ампулы лиофилизированной культуры. Содержимое каждого флакона разводили стерильным 0,9% раствором натрия хлорида из расчета 1 мл на 1 флакон. Затем объединяли полученную суспензию из 3 флаконов, перемешивали 8-10 раз и получали исходное разведение.
2
Исходное разведение культуры использовалось для посева на агаризированные питательные среды (кровяной агар, мясопептонный агар (ΜΠΑ), агар Эндо, агар Сабуро) методом Дригальского. Для этого чашки Петри с питательной средой визуально делили на 4 сектора, посев из исходного разведения испытуемого образца начинали в первом секторе, тщательно втирая взвесь петлей в агар. Затем этой же петлей продолжали посевы во втором и последующих секторах. Данная манипуляция позволяла получать в последних секторах изолированные колонии Histophilus somni, и зафиксировать возможные контаминирующие виды микроорганизмов. Инкубировании посевов на ΜΠΑ и агаре Эндо производили в течении 72 часов при температуре 37°С в аэробных условиях. Культивирование посевов на кровяном агаре проводилось в СО инкубаторе, при 5-10% уровне углекислого газа. Чашки с агаром Сабуро культивировались в течении 7 дней при 25-28°С. Контроль роста посторонней микрофлоры на всех средах проводился каждые 24 часа.
В результате проведения обозначенного испытания было определено, что в лиофилизированных ампулах (полученных согласно примерам №2, №3) со штаммами гистофил отсутствует рост посторонней микрофлоры, в том числе грибов.
Пример №10. Определение культуральных и морфологических свойств, а также подтверждение типичности роста на питательных средах
2
Для подтверждения свойств штамма гистофил после проведенной лиофилизации проводился отбор флаконов/ампул от каждой расплодки. После чего их содержимое ресуспендировали в 9 мл стерильного физиологического раствора, а затем проводили посев методом Дригальского на кровяной агар (основа колумбийского агара, триптон-соевый агар, сердечно-мозговой агар и т.д.). Культивирование посевов проводят в течении 24-72 часов при 37°С в СО инкубаторе при поддержании уровня углекислого газа в диапазоне 5-10%. На кровяном агаре микроорганизм формировал гладкие, выпуклые колонии размером 0,5-1,0 мм спустя 24 часа культивирования. Через 72 часа культивирования размер колоний достигал 1-2 мм. В мазках, окрашенных по Граму, обнаруживались грамотрицательные коккобациллы, короткие палочки или нити, расположенные в мазках одиночно и в виде скоплений клеток.
2
8
3
Оценка типичности роста гистофил на бульонных средах проводится путем пересева отдельных суточных колоний с кровяного агара в пробирки с сердечно-мозговым бульоном или триптон-соевым бульоном. Культивирование пробирок проводилось в течении 24-72 часов при 37°С в СО инкубаторе при поддержании уровня углекислого газа в диапазоне 5-10%. В результате культивирования в пробирках образовалась равномерная взвесь бактериальных клеток. Средняя концентрация выращенных клеток при таком культивировании составило 5,0-7,0*10 м.к./см.
Пример №11. Определение биохимических свойств штамма Histophilus somni Определение биохимических свойств штаммов гистофил позволяет подтвердить их видовую принадлежность. Данное испытание проводится с использованием рутинных методов бактериологии. Для изучения биохимических свойств культуры Histophilus somni были использованы коммерческие тест системы: API NH, API 20Е с сопутствующими расходными принадлежностями и электронной базой для интерпретации полученного результата. Помимо коммерческих биохимических тест-систем были использованы углеводы в дисках для определения сахаролитических свойств: глюкоза, ксилоза, маннит, сорбитол, фруктоза, манноза, мальтоза, трегалоза, грицерина, рамноза, целлобиоза, лактоза, мелибиоза, сахароза, раффиноза, инулин, эскулин производства ООО «Himedia». Испытание проводили согласно инструкции на набор и углеводы.
В результате испытания культура предложенного штамма гистофил обладала следующими свойствами: оксидазоположительная, каталазоотрицательная, аргининдекарбоксилаза, лизиндекарбоксилаза и орнитиндекарбоксилаза отрицательная, восстанавливает нитрат, продуцирует индол, кислота продуцируется при ферментации глюкозы, ксилозы, маннита, сорбита, фруктозы, маннозы, мальтозы, трегалозы, но не грицерина, рамнозы, целлобиозы, лактозы, мелибиозы, сахарозы, раффинозы, инулина, эскулина.
3
Пример №12. Определение концентрации живых бактерий в 1,0 см сухой культуры гистофил после ее лиофилизации
3
-1
-8
Определение количества живых микробных клеток штамма Histophilus somni проводили в трехкратной повторности (использовали по 3 ампулы/флакона). Вскрытие ампул/флаконов проводили в стерильных условиях, в каждую вносили стерильный физиологический раствор до первоначального объема (1,0 см). После восстановления лиофилизата, суспензию тщательно перемешивали. Из полученных первичных разведений (каждый флакон отдельно) готовили последовательные десятикратные разведения штамма в 8 пробирках от 10 до 10. Для каждого разведения культуры использовалась отдельная пипетка.
-6
-7
-8
3
Для высева использовали три последних разведения штамма: 10, 10, 10. Из каждого разведения проводили посевы по 0,1 см на поверхность 3 чашек Петри с кровяным агаром, предварительно выдержанных при температуре 37±1°С в течение часа (для полного удаления конденсата). Для получения равномерного газона культуры использовался шпатель (отдельный на каждую чашку).
2
3
Посевы инкубировали при температуре 37±1°С в течение 72 ч. в условиях 5-10% СО, проводя учет результатов каждые 24 часа. Затем подсчитывали количество выросших колоний и определяли концентрацию живых бактерий в 1 см по формуле (1):
0)
Где:
3
X - число живых бактерий в 1 см;
-6
Ρ - количество колоний на всех чашках из разведения 10;
-6
о - количество чашек с разведением 10;
1
-7
P - количество колоний во всех чашках из разведения 10;
-6
10 - перерасчет на разведение 10;
1
-7
о - количество чашек с разведением 10;
2
-8
Р - количество колоний во всех чашках из разведения 10;
-6
100 - перерасчет на разведение 10;
2
-8
о - количество чашек с разведением 10;
3
10 - перерасчет количества живых бактерий на 1 см;
-6
10 - степень разведения штамма.
3
Количество живых бактерий в 1,0 см сухой культуры штамма гистофил должна быть не менее 150 млн микробных клеток. При сравнении результатов исследования, количество живых бактерий в каждом флаконе не должно различаться более чем на 15%.
8
3
8
3
В результате проведенного испытания установлено, что концентрация жизнеспособных клеток во флаконах, полученных согласно примеру №2, составило 5,4*10 м.к./см, а в ампулах, полученных согласно примеру №3 - 6,7*10 м.к./см.
50
50
9
8
7
6
3
9
8
7
6
Пример №13. Определение вирулентности штамма Histophilus somni При определении вирулентности культуры гистофил, выраженном в значении показателя LD, использовали белых мышей массой 22-25 гр. в количестве 40 голов. Для исследования подготавливался ряд десятикратных разведений бактериальной суспензии клеток гистофил на основе физиологического раствора, а именно ~3x10 м.к., ~3х10 м.к., ~3х10 м.к., ~3х10 м.к. Мышей заражали внутрибрюшинно по 0,5 см, срок наблюдения составлял 10 суток. Таким образом, заражающая доза составляла ~1,5х10 м.к., ~1,5х10м.к., ~1,5x10 м.к., ~1,5x10 м.к. Параллельно, для точного определения дозы (концентрации живых клеток) возбудителя в заражающей культуры проводили раститровку и высев на чашки с ростообеспечивающими средами (чашечный метод Коха) аналогично примеру №12. Срок наблюдения за инфицированными животными составлял 10 дней. Статистическую обработку результатов осуществляли в программах BioStat 2009 («AnalystSoft, Inc.», США) и Microsoft Excel. Расчет LD проводили посредством пробит-анализа. Результаты испытаний приведены в таблице №1.
Полученные результаты свидетельствуют, что предлагаемый производственный штамм является вирулентным и способен вызывать гибель лабораторных животных, что в дальнейшем будет использовано для контроля иммуногенной активности средств специфической профилактики гистофилеза.
50
50
9
После установления величины LD, дополнительно было проведено заражение белых мышей (n=10) в дозе 5LD, которое должно было вызвать гибель не менее 80% подопытных животных. Заражение мышей проводили культурой с концентрацией 1,04*10 м.к. Инфицирование мышей данной дозой вызывало 100%-ную смертность лабораторных животных. Сразу после гибели проводили патологоанатомическое вскрытие мышей с последующим бактериологическим исследованием образцов внутренних органов. В ходе исследования из всех исследованных проб были выделены культуры заражающего штамма возбудителя гистофилеза рогатого скота.
Пример №14. Изготовление экспериментальной серии вакцины против гистофилеза рогатого скота
2
9
3
9
3
Экспериментальная серия вакцины против гистофилеза изготовлена в лабораторных условиях ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН с использованием поверхностного метода культивирования на одноразовых стерильных матрасах. Для культивирования штаммов гистофил использовался триптон-соевый агар («HiMedia Laboratories Pvt Ltd», Индия) и колумбийский агар («Oxoid Ltd», Великобритания) с добавлением 10% дефибринированной крови барана. Культивирование проводилось в течении 48 часов в СО - инкубаторе при постоянном поступлении 5-10% углекислого газа. После культивирования проводили оценку типичности культуральных, морфологических и тинкториальных свойств штамма, при соответствии которых, а также при отсутствии в посевах роста посторонней микрофлоры, бактериальную массу смывали стерильным физиологическим раствором в объеме 15 мл. Концентрация бактериальных клеток возбудителя при снятии бактериальной массы составляла 20-25*10 м.к./см. Инактивировали культуры путем добавления 0,3% формалина к общему объему бактериальной суспензии. Продолжительность инактивации равна 3 суткам при температуре +37°С. После инактивации проводили составление серии вакцины с использованием 3% геля гидроокиси алюминия (ФКП «Армавирская биофабрика», Россия) в качестве адъюванта в объеме 15% от компонуемой серии. Концентрация бактериальных клеток в вакцине составила 3*10 м.к./см. Концентрацию водородных ионов полученного лекарственного средства регулировали с использованием раствора щелочи до значения 7,2 ед.
Пример №15. Контроль иммуногенной активности экспериментальной серии вакцины против гистофилеза рогатого скота
50
Исследование иммуногенной активности экспериментальной вакцины (полученной согласно примеру №14) проводили в условиях вивария опытной базы ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН на о. Лисий Вышневолоцкого района Тверской области с использованием белых мышей. Таким образом была сформирована 1 опытная группа животных (n=10), и 1 контрольная группа (n=10). Иммунизация животных опытной группы проводилась подкожно, в объеме 0,5 мл, двукратно с интервалом 14 дней. Животным контрольных групп подкожно вводился стерильный физиологический раствор в объеме 0,5 мл. Спустя 14 дней после второй вакцинации, животные опытной и контрольной групп были подвергнуты инфицированию штаммом №1654-ВИЭВ в дозе 5LD. Срок наблюдения за животными составлял 14 дней.
50
В результате реализации данного эксперимента было установлено, что вакцинация белых мышей позволяет обеспечить их 100%-ную защиту от инфицирования вирулентным штаммом Histophilus somni в дозе 5LD, в то время как смертность в контрольной группе составила 100%, что говорит о необходимом уровне иммуногенной активности препарата, изготовленного из штамма, предлагаемого настоящим изобретением.