Механизмы всасывания цинка в солевой и хелатной формах кишечником жвачных в условиях in vitro

Заключение. Таким образом, в результате проведенного исследования было установлено, что в основе «стрижки» волосяного покрова норок в условиях УП «Калинковичское зверохозяйство Бел-коопсоюза» лежит ломкость покровных волос. В свою очередь ломкость, вероятнее всего, обусловлена повышенным содержанием микроэлементов в волосяном стержне. Этиологическая составляющая данной патологии предположительно связана с нарушениями липидного обмена. В результате этого, в связи с недостатком холестерина, в растущем волосе увеличивается проницаемость клеточных мембран, что и облегчает попадание в стержень микроэлементов.

С точки зрения дифференциальной диагностики, описанную форму «стрижки», очевидно, можно рассматривать и как «сеченность». На сегодняшний день, единственной четкой диагностической границей между двумя патологиями, являются действия зверя, направленные на скусывание волосяного покрова. Если такие действия на начальной стадии не фиксируются или, вследствие недосягаемости очагов поражения, не могут быть выполнены, то на наш взгляд, имеет место «сеченность» («ломкость»). В свою очередь «ломкость», как понятие собирательное, может быть обусловлена множеством причин, требующих изучения в каждом конкретном случае.

ЛИТЕРАТУРА

1. Берестов, В. А. Клиническая биохимия пушных зверей : справ. пос. / В. А. Берестов. - Петрозаводск, Карелия, 2005 -159 с.

2. Бурдель, Л. А. «Стрижка» волосяного покрова / Л. А. Бурдель // Кролиководство и звероводство. - 1992. - № 5. - С. 11.

3. Гистохимическая характеристика печени и кожи норок-стригунов в зависимости витаминотерапии и включения пре-микса М в рацион / Е. А. Панковец [и др.] // Сельскохозяйственная биология, серия биология животных. - 1996. - № 4. -С. 115-118.

4. Исаева, Т. И. Некоторые биохимические и гистологические показатели органов норок со стриженным волосяным покровом / Т. И. Исаева, Л. П. Евсикова, Н. Е. Куликов // Биология и ветеринария пушных зверей и кроликов : сбор. науч. тр. НИИ ПЗК. - Москва, 1981. - Т. 26. - С. 117-118.

5. Квартникова, Е. Г. Еще раз о «стрижке» волосяного покрова / Е. Г. Квартникова // Кролиководство и звероводство. -1995. - №3. - С. 10.

6. Куликов, Н. Е. Биохимические показатели у норок со стриженным волосяным покровом / Н. Е. Куликов, В. В. Губ-ский // Клеточное пушное звероводство и промышленное кролиководство : сбор. науч. тр. НИИ ПЗК. - М., 1987. - Т. 35. -С. 39-43.

7. Мяделец, О. Д. Морфофункциональная дерматология / О. Д. Мяделец, В. П. Адаскевич. - М.: Медлит, 2006. - 752 с.

8. Установление закономерных связей элементов питания в этиологии «стрижки» норок (материал к изучению темы) / Н. Е. Куликов [и др.]. - М.: Российская академия менеджмента и агробизнеса, 1996. - 31 с.

УДК 636:612.33

МЕХАНИЗМЫ ВСАСЫВАНИЯ ЦИНКА В СОЛЕВОЙ И ХЕЛАТНОЙ ФОРМАХ КИШЕЧНИКОМ ЖВАЧНЫХ В УСЛОВИЯХ IN VITRO

Ю. К. КОВАЛЕНОК

УО «Витебская ордена «Знак Почета» государственная академия ветеринарной медицины»,

г. Витебск, Республика Беларусь, 210026

Резюме. В условиях модельного эксперимента in vitro установлены значимые (Р<0,001) различия механизмов кишечного транспорта Zn, находящихся в солевых и хелатных формах. Предполагается, что хелатирование Zn этилендиаминтетра-ацетатом приводит к всасыванию элемента по по парацеллюлярному пути.

Ключевые слова: животные, хелаты, цинк, всасываемость, биодоступность.

Summary. Carrying out in vitro model experiment we determined significant (Р<0.001) differences in mechanisms of intestinal Zn transport that were in salt and chelate forms. It is expected that chelation of Zn by ethylenediaminetetraacetate leads to the absorption of the element via paracellular pathway.

Key words: animals, chelates, zinc, absorptivity, bioavailability.

Введение. Микроэлементозы животных продолжают оставаться одной из актуальных проблем современного промышленного животноводства [1, 3, 4]. Последние десятилетия отечественные и иностранные ученые активно работают над конструированием и изучением свойств элементорганиче-ских препаратов второго поколения, в которых минеральные вещества содержатся в виде комплекса с веществами, подобными природным носителям микроэлементов [3, 4, 8, 9]. В этом плане особо инте-

ресны внутрикомплексные вещества, содержащие циклические группировки органических молекул -хелатные соединения.

Известно, что микроэлементные препараты второго поколения обладают более высоким потенциалом усвояемости в сравнении с солями. При этом абсолютное большинство исследователей [1, 3, 4] констатируют значительный производственный эффект использования хелатных форм микроэлементов для лечения и профилактики микроэлементозов у животных и птиц, однако системных исследований механизмов, обеспечивающих данный процесс, в доступной литературе нами не обнаружено. Вместе с тем имеются сообщения [5, 6], указывающие на возможную опасность применения подобных соединений ввиду вероятных социальных последствий, противоречивости позиций всасываемости минеральных веществ из соединений хелатного типа и сорбции лигандами других, находящихся в химусе элементов, т. е. группы факторов, определяющих низкую степень изученности механизмов действия хелатов.

Анализ источников. Исходными позициями методологии нижеизлагаемых исследований послужили данные многочисленных исследователей, указывающих на то, что сам процесс всасываемости главным образом сопряжен с диссоциацией ионов и собственно их переносом (транспортом) через кишечный эпителий, осуществляющийся посредством специальных транспортных систем энтероци-та. При этом в зависимости от различных вариантов сочетания факторов - стадией, лимитирующей процесс ассимиляции элемента в целом, может быть как первая, так и вторая.

Цель работы - определение истоков статистически значимых различий в уровнях кишечного транспорта цинка из хелатных и традиционно использующихся солевых форм микроэлемента.

Материал и методика исследований. Работа проводилась на базе кафедры клинической диагностики УО «Витебская ордена «Знак Почета» государственная академия ветеринарной медицины» и лаборатории физиологии питания Института физиологии им. И. П. Павлова РАН. В опытах использовалось разработанное и запатентованное нами устройство (рисунок) для изучения всасываемости веществ кишечником животных [7].

В основу модели положен принцип изучения всасываемости веществ на изолированном из организма кишечном сегменте, исходные положения которого выдвинул крупнейший представитель Павловской школы нутрицинологии, основоположник мембранного пищеварения А. М. Уголев.

1 - корпус устройства; 2 - отверстие для погружного циркуляционного термостата; 3 - автономные рабочие камеры; 4 - фиксирующая пластина; 5 - собственно пластина; 6 - нижнее и 7 - верхнее отверстие собственно пластины; 8 - нижний и 9 - верхний штуцер; 10 - уплотнительные кольца; 11 - глухая гайка; 12 - основание станины; 13 - платформа станины;

14 - верхнее и 15 - нижнее основание корпуса; 16 - отверстие для нижнего штуцера, 17 - резьба нижнего штуцера;

18 - участок кишечника.

Рис. Устройство для изучения всасываемости веществ кишечником животных

Основываясь на сложившейся концепции взглядов о реализации механизма усвояемости микроэлементов по пути вторичного активного транспорта, серия исследований строилась на модели, в которой инкубация кишечных препаратов с испытуемыми веществами осуществлялась не в условиях предусмотренной оксигенации, а в условиях аноксии. Логика подобной модели эксперимента сопряжена с тем, что активный транспорт веществ через апикальную мембрану энтероцита означает движение ионов через мембрану в комбинации с белком-переносчиком, заставляющим вещество двигаться против энергетического градиента. Такое движение, помимо кинетической энергии, требует дополнительного ее источника. Об уровне (наличии) активного транспорта испытуемого субстрата судили по разнице аккумуляции его кишечной стенкой в условиях оксигенации и аноксии, поскольку

известно, что подача азота в инкубационную смесь неизбежно приводит к окислительному стрессу и блокирует возможные механизмы активного транспорта веществ, в т. ч. и катионов [1, 6, 9].

В качестве объектов исследования выступал цинк, находящийся в составе соли (ZnSO4) и хелатно-го его соединения с этилендиаминтетрауксусной кислотой (NaZnH(Hedta).

Количество элемента в исследуемых субстратах определяли методом масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой (ICP-MS), используя спектрометр Varían ICP-810-MS.

Процедуры анализа полученных данных осуществляли с помощью статистических пакетов SAS 9.2, STATISTICA 9 и SPSS-19. Критическое значение уровня статистической значимости при проверке нулевых гипотез принималось равным 0,05. Выбор критерия оценки значимости парных различий проверяли соответствием формы распределения нормальному, используя критерий %2, а также контролировали равенство генеральных дисперсий с помощью F-критерия Фишера. Проверка нормальности распределения вероятности количественных признаков осуществлялась также с помощью критерия Колмогорова и критерия Шапиро-Уилки. Применение указанных критериев показало, что более 80 % всех количественных признаков в группах сравнения не имели нормального распределения. Поэтому для сравнения центральных параметров групп использовались непараметрические методы: дисперсионный анализ Краскела-Уоллиса с ранговыми метками Вилкоксона и критерий Ван дер Вардена, а также медианный критерий. Для всех количественных признаков в сравниваемых группах проводилась оценка средних арифметических (M) и среднеквадратических (стандартных) ошибок среднего (m), и 95 % доверительного интервала (95 % ДИ) выборочных средних.

Результаты исследований и их обсуждение. Инкубация свежеполученных участков тощей кишки крупного рогатого скота в условиях оксигенации и аноксии (таблица) в разработанном устройстве по методике его функционирования [7] показала, что позиции кишечного транспорта изучаемого элемента в разных его химических формах имеют принципиальные отличия.

Показатели кишечного транспорта цинка в различных его химических формах

Испытуемый субстрат Условия опыта

Оксигенация Аноксия

ZnSO4 NaZnH

Контрольный раствор а 54,0±4,56 59,1±4,79 54,0±4,56 59,1±4,79

Серозный раствор б 0,466±0,021 0,852±0,0509 0,53±0,0313 0,94±0,0707

Мукозный раствор в 37,9±1,91 36,9±2,27 50,5±3,39 36,3±2,16*

Контрольный кишечник г 22,3±1,48 26,3±1,43 22,9±1,85 26,8±2,09

Опытный кишечник д 80,7±4,63 113±6,2** 29,3±1,56 100±5,4***

Примечание:

1) а Контрольный раствор - исходный испытуемый раствор соответствующего препарата; б Серозный раствор - раствор со стороны серозной оболочки после экспозиции устройства; в Мукозный раствор - раствор со стороны слизистой оболочки после экспозиции устройства; г Контрольный кишечник - участок тощей кишки крупного рогатого скота в начале проведения исследований; д Опытный кишечник - участок тощей кишки крупного рогатого скота после его инкубации;

2) *, **, *** - р< 0,05, 0,01 и 0,001 (соответственно) - результаты проверки гипотезы о равенстве межгрупповых средних в сравнении с соответствующими значениями проб солей посредством параметрического F-критерия Фишера и непараметрических критериев Ван дер Вардена, Краскала-Валлиса и медианного критерия.

Так, в условиях подачи кислорода в рабочие камеры устройства по истечении экспозиции констатировалось 30-37 % снижение уровня испытуемого элемента в контрольных растворах. В условиях же аноксии изменение было на уровне 6,5 % для ZnSO4 и 38,6 % для хелатированной формы цинка. Уместным будет отметить и статистическую значимость (Р<0,05) данных различий.

В серии экспериментов с кишкой крупного рогатого скота предположение о движении цинка из мукозного раствора в серозный подтверждения не получено. Уровень элемента в серозном растворе варьировал от 0,46 до 0,94 мг/кг. Причем это справедливо как для солевой, так и хелатной форм Zn, что в целом не логично, поскольку выше указано на « 30 % статистически значимые различия убывания элемента из мукозного раствора. Количественные значения Zn в серозной жидкости демонстрируют крайне низкую степень сквозной диффузии испытуемого вещества и возможно указывают на то, что индуктором этого движения не являются (или являются в весьма малом удельном значении) законы диффузии и осмоса. Можно предположить, что данное обстоятельство связано с наличием барьеров для транспорта веществ: стромы ворсинок, подслизистой основы, более мощной в сравнении с лабораторными животными, мышечной и серозной оболочек, которые не являются барьером для всасывания in vivo. В обычных условиях всасываемые вещества непосредственно поступают в

кровь и лимфу сети капилляров, располагающейся под кишечным эпителием. Резонно полагать, что отсутствие крово- и лимфотока на пути транспортируемых веществ приводит к кумуляции в кишечной стенке (гипотетически в мышечной или серозной оболочке) при его транспорте через нее.

Результаты определения концентрации цинка в кишечной стенке на старте эксперимента показали, что в исследуемых образцах содержание данного элемента варьировало в диапазоне 95 % ДИ от 21,42 до 29,б8 мг/кг. После инкубации в условиях оксигенации данные значения статистически значимо выросли причем для хелатной формы элемента на 2б1 %, а для солевой - на 329 %, причем при межгрупповом сравнения данные различия показали достаточно высокую (Р<0,01) степень статистической значимости.

Наиболее яркие, статистически значимые (Р<0,001) различия, коснулись кумуляции испытуемого субстрата кишечной стенкой после ее инкубации в условиях аноксии. Количественные значения испытуемого элемента в кишечной стенке кумулирующей Zn из солевой формы возросло до 95 % ДИ 26,2-32,4 мг/кг, что в целом превышало исходное значение на 27,9 % и в сравнении с условиями эксперимента, осуществляемого в условиях оксигенации можно охарактеризовать как ничтожно малый рост показателя, поскольку в последнем увеличение количества элемента констатировано практически на порядок.

Вместе с тем анализируя полученные числовые значения испытуемого элемента, входившего в рабочие растворы этилендиаминтетраацетата цинка, можно отметить сохранившуюся (в сравнении с условиями оксигенации) закономерность. Так, 95 % ДИ составил 89,4-110,б мг/кг, что превышало исходный уровень на 273 % и определило весьма значимый (Р<0,001) уровень различий как в сравнении с исходными величинами, так и с конечными, полученными для соли.

Сопоставляя научные наработки ученых [б], указывающие на преимущественно белково-опосредованный механизм кишечной резорбции цинка, поступающего в желудочно-кишечный тракт в виде солей, с результатами собственных исследований (практическое отсутствие всасываемости элемента из ZnSO4 в условиях аноксии, можно предположить, что всасываемость солевых форм испытанных элементов реализуется преимущественно по трансцеллюлярному пути, главным образом за счет реализации механизмов вторичного активного транспорта.

Вместе с тем экспериментально показанный кишечный транспорт цинка из NaZnH (Hedta) в тех же условиях аноксии выступает свидетельством принципиально иных путей и механизмов их всасываемости. Прежде всего можно предположить, что всасываемость элемента из NaZnH (Hedta) не сопряжена трансцеллюлярным путем и его активными механизмами, поскольку подача азота в инкубационную смесь по сути не повлияла позиции кишечного транспорта данного элемента (таблица). А это в свою очередь может служить свидетельством только того, что данный феномен реализуется по парацеллюлярному пути.

Заключение. Таким образом, серия экспериментов в условиях аноксии позволяет предполагать белково-опосредованный (вторичный активный) механизм кишечного всасывания цинка в солевой форме и его блокировку подачей в систему азота. Вместе с тем аноксия не оказала значимого влияния на позиции кишечного транспорта хелатной формы элемента в виде натрийэтилендиаминтетраацета-та цинка, что может выступать свидетельством принципиальных различий в механизмах всасывания солей и хелатов.

ЛИТЕРАТУРА

1. Бушов, А. В. Анемия молодняка свиней / А. В. Бушов, Э. В. Теп // Ветеринария сельскохозяйственных животных. -2007. - № 10. - С. 45-49.

2. Всасывание и секреция в топкой кишке: субмикроскопические аспекты / И. А. Морозов и др. АМН СССР. - М.: Медицина, 1988. - 224 с.

3. Кабиров, Г. Ф. Хелатные формы биогенных металлов в животноводстве / Г. Ф. Кабиров, Г. П. Логинов, Н. З. Хази-пов - Казань: ФГОУ ВПО «КГАВМ», 2004. - 248 с.

4. Кузнецов, С. Микроэлементы в кормлении животных [Электронный ресурс] / С. Кузнецов, А. Кузнецов. - Режим доступа: http://www.webpticeprom.ruru/articles-birdseed.htmr?pagero=1273837506 - 07.02.2015.

5. Логипов, Г. П. Влияние хелатов металлов с аминокислотами и гидролизатами белков па продуктивные функции и обменные процессы организма животных: дис. д-ра биол. паук: 03.00.13. - Логипов Г. П.: Казань, 2005. - 359 c.

6. Мазо, В. К. Новые пищевые источники эссенциальных микроэлементов-антиоксидантов / В. К. Мазо, И. В. Гмошин-ский, Л. И. Ширина // М.: Миклош, 2009. - 208 с.

7. Устройство для изучения всасываемости веществ кишечником животных: пат. 111427 Рос. Федерация. МПК: A61D 99/00/ Ю. К. Коваленок и др.: заявл. 28.07.11; опубл. 20.12.2011, Бюл. № 35. 2 с.

8. Surai, P. F. Selenium in poultry nutrition: a new look at an old element.Antioxidant properties, deficiency and toxicity / P. F. Surai // World's Poultry Science Journal. - 2002. - Vol. 58. - P. 333-347.

9. Wu, L. Evidence for the Role of Reactive Nitrogen Species in Polymicrobial Sepsis-Induced Renal Peritubular Capillary Dysfunction and Tubular Injury / L. Wu., N. Gokden, P. Mayeux R // J. Am. Soc. Nephrol., 2007, - V. 18, - P. 1807-1815.