СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОГО РЕФЕРЕНТНОГО МАТЕРИАЛА ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА СТАНДАРТНЫХ ОБРАЗЦОВ СОСТАВА МОЧИ, СОДЕРЖАЩИХ ТОКСИЧНЫЙ МЕТАЛЛ, И МАТЕРИАЛ, ПОЛУЧЕННЫЙ ЭТИМ СПОСОБОМ
METHOD OF OBTAINING OF BIOLOGICAL REFERENTIAL MATERIAL FOR PRODUCTION OF STANDARD URINE COMPOSITION SAMPLES CONTAINING TOXIC METAL AND MATERIAL OBTAINED BY THIS METHOD

Группа изобретений относится к биотехнологии, а именно к способу получения биологического референтного материала для производства стандартных образцов состава мочи, содержащих ртуть, кадмий, свинец, а также к материалу, полученному предлагаемым способом, и может быть использовано в токсикологии, медицине, ветеринарии при определении содержания указанных токсичных металлов в моче.
В изобретении используется следующая терминология.
Биоматериал - часть органов, тканей, клеточных или субклеточных структур организма.
Затравка - введение токсичного металла тем или иным способом в организм животного.
Парентерально - введение вещества в организм, при котором оно минует желудочно-кишечный тракт.
Референтный материал - «в качестве материала (вещества) стандартного образца может быть использован референтный материал, т.е. материал (вещество) достаточно однородный и стабильный по отношению к одному или нескольким определенным свойствам, применяемый в соответствии с назначением в измерительном процессе [Р.50.2.056-2007. ГСИ. Образцы материалов и веществ стандартные. Термины и определения; ISO VIM: 1993»].
Стандартный образец (состава) - [термин указан с учетом его определений, приведенных в ГОСТ 8.315-97, а также в международных нормативных документах] образец вещества или материала, химический состав или физические свойства которых:
- типичны для конкретной группы веществ или материалов;
- определены с необходимой точностью;
- отличаются высоким постоянством;
- удостоверены сертификатом.
Токсичный - ядовитый, вызывающий негативные изменения в структурах и/или функциях молекулярных, надмолекулярных, клеточных образований, тканях, органах и организме в целом.
Токсичные металлы (далее - ТМ) - условная группа металлов, не несущих биологической функции в организме, но склонных к бионакоплению, токсичные даже в небольших количествах [Загрязнение Арктики 2002. Программа по мониторингу и оценке окружающей среды Арктики. АМАП. Осло. - 2002-110 с.], к которым относят свинец, ртуть, кадмий, мышьяк, таллий, ванадий, никель, хром, уран и иногда другие металлы.
Для определения содержания ТМ в различного вида материалах используются методы анализа, в частности, такие как нейтронно-активационный, атомно-эмисионный с дугой постоянного тока, атомно-эмисионный с индуктивно-связанной плазмой, масс-спектрометрический с индуктивно-связанной плазмой, атомно-абсорбционный с электротермической атомизацией, атомно-абсорбционный с атомизацией в пламени, инверсионный вольтамперометрический, которые требуют применения соответствующих материалов сравнения - стандартных образцов, содержащих анализируемый ТМ (аналит) в определенных количествах.
Для определения содержания ТМ известны стандартные образцы (далее СО), изготовленные на основе растворов солей ТМ.
3
Так, в частности, известен СО [см. Стандартный Образец Состава Раствора Ионов Ртути (II) - ГСО РР) 7343-96], который представляет собой раствор ионов ртути (II) в водном растворе азотной кислоты с концентрацией 1 моль/дм.
Рассматриваемый стандартный образец может обеспечить надежность результатов анализа в тех случаях, когда исследуемый материал также представляет собой водный раствор ТМ или близок к таковому по своим свойствам.
Однако указанные стандартные образцы мало пригодны для анализа биоматериалов таких, как моча, которые далеки по свойствам от водных растворов и имеют характерную молекулярную структуру (матрицу).
Крайне важным для получения точных результатов анализа является обеспечение максимально возможного подобия матрицы стандартного образца и исследуемого биоматериала, за счет чего достигается сходство условий (химические связи, валентности, молекулярные структуры и пр.), в которых находится ТМ (аналит) в стандартном образце и в исследуемом биоматериале.
С этой точки зрения более надежными и перспективными являются референтные материалы для производства СО состава мочи, содержащих ТМ, изготовленные на основе мочи животного или человека.
Известен референтный материал на основе мочи человека, производства США, содержащий ртуть, и способ получения указанного материала, которые выбраны в качестве ближайших аналогов заявляемых изобретений [см. http:nist.gov/srm - SRM 3668 NIST].
Рассматриваемый референтный материал представляет замороженную мочу человека с заданным содержанием в ней ртути.
Способ получения данного материала (in vitro) включает добавление необходимого количества водорастворимой неорганической соли ртути в мочу человека с последующим ее замораживанием.
В ходе приготовления референтного материала исходная моча подвергается центрифугированию, при этом из нее удаляют часть естественных компонентов матрицы. Кроме того, в исходную мочу добавляют несвойственные этому биоматериалу компоненты, например азотную кислоту.
Таким образом, хотя рассматриваемый референтный материал изготавливают на основе человеческой мочи, вышеуказанные факторы не позволяют добиться высокой степени адекватности матрицы референтного материала и исследуемых образцов мочи, что может негативно сказаться на результатах определения содержания ТМ в моче. При этом нужно учесть, что по российским нормативам моча человека, донора, является условно инфицированным материалом, что налагает значительные ограничения на работу с ней так же как на импорт биологических материалов [Письмо Центра государственного санитарно-эпидемиологического надзора в Санкт-Петербурге от 05.01.2001. №13-10-3-1].
Задачей заявляемых изобретений является разработка референтного материала для производства СО состава мочи и способа его получения, обеспечивающих повышение надежности и точности результатов определения содержания ТМ в моче.
Сущность изобретения заключается в том, что в способе получения биологического референтного материала для производства стандартных образцов состава мочи, включающем использование мочи донора, содержащей токсичный металл, согласно изобретению используют мочу крыс, при этом осуществляют парентеральное введение в организм крыс токсичного металла в виде его водорастворимой соли путем инъекций крысам водного раствора, содержащего водорастворимую соль ртути, или водорастворимую соль кадмия, или водорастворимую соль свинца, сбор мочи после анализа на содержание в ней токсичного металла, замораживание собранной мочи и ее лиофилизацию.
3
3
3
3
3
3
В частном случае реализации способа парентеральное введение в организм крыс токсичного металла в виде его водорастворимой соли путем инъекций крысам водного раствора, содержащего водорастворимую соль ртути, или водорастворимую соль кадмия, или водорастворимую соль свинца, осуществляют до достижения содержания в моче ртути от 10 мкг/дм до 50 мкг/дм, или кадмия от 3 мкг/дм до 13 мкг/дм, или свинца от 150 мкг/дм до 600 мкг/дм.
Сущность изобретения в отношении биологического референтного материала заключается в том, что он получен заявляемым способом.
3
3
3
3
3
3
В частном случае реализации изобретения биологический референтный материал получен из мочи крыс, в организм которых парентеральное введение токсичного металла в виде его водорастворимой соли путем инъекций крысам водного раствора, содержащего водорастворимую соль ртути, или водорастворимую соль кадмия, или водорастворимую соль свинца, осуществляют до достижения содержания в моче ртути от 10 мкг/дм до 50 мкг/дм, или кадмия от 3 мкг/дм до 30 мкг/дм, или свинца от 150 мкг/дм до 600 мкг/дм, при этом содержание ртути, или кадмия, или свинца в референтном материале составляет соответственно от 0,33 мкг до 1,67 мкг, от 0,10 мкг до 1,0 мкг и от 5,0 мкг до 20,0 мкг на один грамм лиофилизата.
Принципиально важным в заявляемом способе является то, что для получения референтного материала используют мочу крыс, содержащую токсичный металл, внедренный в матрицу мочи в результате его естественной ассимиляции организмом крыс (in vivo).
Тем самым обеспечивается высокая степень адекватности матрицы получаемого референтного материала и матрицы исследуемых образцов мочи, при этом внедренный в матрицу референтного материала ТМ, в частности ртуть, приобретает естественное многообразие форм, в которых ТМ может находиться в живом организме.
Согласно заявляемому способу введение ТМ в организм крыс осуществляют парентерально путем инъекций крысам водного раствора, содержащего водорастворимую соль ртути, или кадмия, или свинца.
Как показали исследования динамики бионакопления ТМ в моче крыс, при инъекционном методе введения ртути, или кадмия, или свинца в организм крыс происходит достаточно быстрое (в течение 5-8 дней) накопление указанных ТМ в моче крыс с выходом на необходимый уровень концентраций.
Парентеральное введение указанного инъекционного раствора может осуществляться, в частности, с помощью внутримышечных или внутрибрюшинных инъекций.
Конкретное требуемое содержание ТМ в референтном материале обеспечивается дозированным введением животному инъекционного раствора, содержащего определенное количество ТМ, и отбором мочи по достижении содержания в ней ТМ, обеспечивающего требуемую концентрацию ТМ в референтном материале. Содержание ТМ в моче крыс определяют путем анализа собираемой мочи.
Операция замораживания собранной мочи с последующей ее лиофилизацией обеспечивает получение референтного материала в форме, удобной для хранения, транспортировки и для производства получаемых из референтного материала СО.
Таким образом, техническим результатом, достигаемым при реализации изобретения в отношении заявляемого способа, является получение референтного материала, содержащего ТМ в формах, соответствующих естественному спектру его форм в живом организме, и имеющего матрицу, близкую по свойствам к матрице исследуемых нативных образцов мочи.
Это позволяет при использовании СО, изготавливаемых из референтого материала, получаемого по заявляемому способу, обеспечить надежность и точность результатов определения содержания ТМ в моче.
3
3
3
3
3
3
В случае введения в организм крыс инъекционного водного раствора, содержащего водорастворимую соль ртути, или водорастворимую соль кадмия, или водорастворимую соль свинца, до достижения содержания в моче ртути от 10 мкг/дм до 50 мкг/дм, или кадмия от 3 мкг/дм до 13 мкг/дм, или свинца от 150 мкг/дм до 600 мкг/дм, заявляемый способ обеспечивает получение референтного материала с содержанием в нем указанных ТМ, пригодного для изготовления СО состава мочи, используемых при диагностике отравлений ртутью, кадмием или свинцом.
Заявляемый биологический референтный материал представляет собой органо-минеральную матрицу (лиофилизат) мочи в виде пористой массы серого цвета с внедренными в нее ртутью, или кадмием, или свинцом и характеризуется тем, что он получен в соответствии с заявляемым способом.
Заявляемый референтный материал может иметь различное содержание ТМ, которое обеспечивает изготовление СО состава мочи с требуемой концентрацией ТМ.
Техническим результатом, достигаемым при реализации заявляемого изобретения в отношении материала, является получение предназначенного для приготовления СО состава мочи референтного материала, содержащего ртуть, или кадмий, или свинец в формах, соответствующих естественному спектру форм ТМ в живом организме, имеющего матрицу, близкую по свойствам к матрице исследуемых образцов мочи.
3
3
3
3
3
3
В случае, когда биологический референтный материал получен из мочи крыс, в организм которых парентеральное введение токсичного металла осуществляют до достижения содержания в моче ртути от 10 мкг/дм до 50 мкг/дм, или кадмия от 3 мкг/дм до 30 мкг/дм, или свинца от 150 мкг/дм до 600 мкг/дм, обеспечивается содержание ртути, или кадмия, или свинца в референтном материале соответственно от 0,33 мкг до 1,67 мкг, от 0,10 мкг до 1,0 мкг и от 5,0 мкг до 20,0 мкг на один грамм лиофилизата.
Это позволяет использовать такой референтный материал для производства СО состава мочи, используемых при проведении анализа мочи для диагностики интоксикаций указанными ТМ.
Заявляемый способ осуществляют следующим образом.
Проводят подготовку крыс к процессу получения биологического референтного материала, выдерживая крыс в виварии в течение времени, необходимого для их адаптации к условиям содержания.
Осуществляют дезинфекцию и промывку клеток, поилок, весов, емкостей для сбора мочи.
Выбирают суточную затравочную дозу - количество вводимого в течение суток ТМ на 1 кг массы животного. При этом величина затравочной дозы должна обеспечить требуемое содержание ТМ в референтном материале и определяется на основании опытных данных по изучению влияния величины дозы на содержание ТМ в моче экспериментального животного.
Готовят инъекционный раствор, содержащий водорастворимую соль ртути, или водорастворимую соль кадмия, или водорастворимую соль свинца.
В качестве водорастворимых солей ртути, кадмия, свинца могут быть использованы, в частности, ацетаты или нитраты указанных ТМ, характеризующиеся достаточно высокой стойкостью и растворимостью в воде.
3
Чтобы избежать инфильтрации тканей при инъекции, в качестве основы для инъекционного раствора используют физиологический раствор, в частности,раствор, полученный из расчета растворения одной таблетки реактива Рингера-Локка в 100 см теплой дистиллированной воды (физиологический раствор Рингера-Локка).
3
Концентрацию водорастворимой соли ТМ в инъекционном растворе выбирают, исходя из величины суточной затравочной дозы с учетом обеспечения физиологически приемлемого объема инъекционного раствора для одной инъекции. Указанный объем для крыс составляет 0,1 см на 1 кг массы животного.
Осуществляют парентеральное введение в организм крыс ТМ путем внутримышечных инъекций водного раствора, содержащего водорастворимую соль ртути, или водорастворимую соль кадмия, или водорастворимую соль свинца.
Проводят анализ проб мочи на содержание в ней токсичного металла.
По достижении требуемого содержания ТМ в моче отсаживают крыс в обменные клетки и осуществляют сбор мочи в течение 24 часов.
3
3
Собранную мочу расфасовывают по 5,0 см во флаконы и добавляют в каждый флакон по 0,1 см пеногасителя, в качестве которого используют, в частности, изопропанол.
Замораживают мочу с последующей ее лиофилизацией при режимах, обычно применяемых для указанных операций.
В частности, замораживают мочу в течение не менее 4-х часов при температуре не выше -15°С, а затем осуществляют ее лиофилизацию при температуре ниже -50°С в условиях вакуума при давлении менее 0,20 mBar до постоянного веса.
В результате осуществления способа получают биологический референтный материал, представляющий собой лиофилизат мочи крыс в виде пористой массы серого цвета с требуемым содержанием ртути, или кадмия, или свинца.
Материал хранят и транспортируют в укупоренной стеклянной таре при температуре +4±2°С.
Ниже приведены примеры осуществления группы изобретений.
Пример 1
Получали биологический референтный материал для приготовления стандартных образцов состава мочи, содержащих ртуть.
Использовали беспородных белых крыс линии Vistar в количестве 32 особей. Средняя масса крыс составляла 237±32 г.
3
3
Для парентерального введения готовили инъекционный раствор на основе физиологического раствора Рингера-Локка, для чего к 100 см теплого (40-50°С) физиологического раствора добавляли 0,10 см уксусной кислоты и навеску ацетата ртути.
3
Концентрация ртути в инъекционном растворе соответствовала затравочной дозе 0,5 мг/кг при введении 0,1 см инъекционного раствора на 1 кг массы крысы.
3
В течение 3-х дней осуществляли ежесуточное парентеральное внутримышечное введение в мышцы задних лап крысы инъекционного раствора из расчета 0,1 см на 1 кг массы крысы.
3
На 8-е сутки крыс отсаживали в обменные клетки и в течение 24 часов собирали мочу, при этом получали по 14,7±6,1 см мочи от каждой крысы.
3
Моча крыс была подвергнута анализу на содержание ртути, которое составляло около 50 мкг/дм. Вся моча крыс была объединена, таким образом был получен банк крысиной мочи. В этой моче были выявлены три формы ртути - органическая (73%), неорганическая (25%) и металлическая (2%).
3
3
Собранную мочу по 5,0 см расфасовывали во флаконы и в каждый флакон добавляли по 0,1 см пеногасителя - изопропанола.
Замораживали мочу в течение не менее 4-х часов при температуре -20°С, а затем осуществляли ее лиофилизацию при температуре -50°С при давлении 0,20 mBar в течение 10 часов (до постоянного веса).
Получили биологический референтный материал, представляющий собой лиофилизат мочи крыс в виде пористой массы серого цвета с содержанием ртути 1,67 мкг на один грамм лиофилизата.
Пример 2
Получали биологический референтный материал для приготовления стандартных образцов состава мочи, содержащих кадмий.
Использовали беспородных белых крыс линии Vistar в количестве 25 особей. Средняя масса крыс составляла 223±26 г.
3
3
Для парентерального введения готовили инъекционный раствор на основе физиологического раствора Рингера-Локка, для чего к 100 см теплого (40-50°С) физиологического раствора добавляли 0,10 см уксусной кислоты и навеску ацетата кадмия.
3
Концентрация кадмия в инъекционном растворе соответствовала затравочной дозе 0,5 мг/кг при введении 0,1 см инъекционного раствора на 1 кг массы крысы.
3
В течение 3-х дней осуществляли ежесуточное парентеральное внутримышечное введение в мышцы задних лап крысы инъекционного раствора из расчета из расчета 0,1 см на 1 кг массы крысы
3
На 8-е сутки крыс отсаживали в обменные клетки и в течение 24 часов собирали мочу. Было получено по 15,3±10,3 см мочи от каждой крысы.
3
Моча крыс была подвергнута анализу на содержание кадмия, которое составляло около 13 мкг/дм. Вся моча крыс была объединена, таким образом был получен банк крысиной мочи.
3
3
Собранную мочу по 5,0 см расфасовывали во флаконы и в каждый флакон добавляли по 0,1 см пеногасителя - изопропанола.
Замораживали мочу в течение не менее 4-х часов при температуре -20°С, а затем осуществляли ее лиофилизацию при температуре -50°С при давлении 0,20 mBar в течение 10 часов (до постоянного веса).
Получили биологический референтный материал, представляющий собой лиофилизат мочи крыс в виде пористой массы серого цвета с содержанием кадмия 0,43 мкг на один грамм лиофилизата.
Пример 3
Получали биологический референтный материал для приготовления стандартных образцов состава мочи, содержащих свинец.
Использовали беспородных белых крыс линии Vistar в количестве 16 особей. Средняя масса крыс составляла 205±15 г.
3
3
Для парентерального введения готовили инъекционный раствор на основе физиологического раствора Рингера-Локка, для чего к 100 см теплого (40-50°С) физиологического раствора добавляли 0,1 см уксусной кислоты и навеску ацетата свинца.
3
В течение 3-х дней осуществляли ежесуточное парентеральное внутримышечное введение в мышцы задних лап крысы инъекционного раствора в дозе 45 мг/кг из расчета 0,1 см на 1 кг массы крысы.
3
На 8-е сутки крыс отсаживали в обменные клетки и в течение 24 часов собирали мочу. Было получено по 12,6±3,2 см мочи от каждой крысы.
3
Моча крыс была подвергнута анализу на содержание свинца, которое составляло около 315 мкг/дм. Вся моча крыс была объединена, таким образом был получен банк крысиной мочи.
3
3
Собранную мочу по 5,0 см расфасовывали во флаконы и в каждый флакон добавляли по 0,1 см пеногасителя - изопропанола.
Замораживали мочу в течение не менее 4-х часов при температуре -20°С, а затем осуществляли ее лиофилизацию при температуре -50°С при давлении 0,20 mBar в течение 10 часов (до постоянного веса).
Получили биологический референтный материал, представляющий собой лиофилизат мочи крыс в виде пористой массы серого цвета с содержанием свинца 10,5 мкг на один грамм лиофилизата.