Способ лечения онкологических заболеваний с помощью инъекций лекарственного препарата
METHOD OF TREATING ONCOLOGICAL DISEASES BY DRUG INJECTIONS

Изобретение относится к области медицины и ветеринарии и может быть использовано при лечении онкологических заболеваний у человека и животных с помощью инъекций противоопухолевого лекарственного препарата, предварительно инкапсулированного в липосомы.
Известен способ лечения онкологических заболеваний с помощью внутривенных инъекций раствора лекарственного противоопухолевого препарата - Доксорубицина пациенту с онкологическим заболеванием [Doxorubicin hydrochloride // European Pharmacopoeia. Sixth Edition: монография. 2005. С. 1389-1390.].
Данный способ содержит признаки, совпадающие с существенными признаками предлагаемого технического решения, такие, как использование внутривенных инъекций раствора лекарственного препарата для лечения онкологических заболеваний.
Известен способ лечения онкологических заболеваний людей с помощью внутривенных инъекций суспензии липосом с инкапсулированным противоопухолевым лекарственным препаратом (Цисплатином) [Boulikas Т., Clinical overview on Lipoplatin™: a successful liposomal formulation of cisplatin // Expert Opinion on Investigational Drugs. 2009. V. 18(8). P. 1197-1218. doi:10.1517/13543780903114168].
Данный способ содержит признаки, совпадающие с существенными признаками предлагаемого технического решения, такие, как лечение онкологических заболеваний с помощью инъекций лекарственного препарата путем внутривенного введения суспензии липосом с инкапсулированным противоопухолевым лекарственным препаратом.
Наиболее близким к заявляемому является известный способ лечения онкологических заболеваний с помощью инъекций лекарственного препарата путем введения водосодержащей суспензии липосом одинакового диаметра с инкапсулированным противоопухолевым лекарственным препаратом [Mikhaylov G., Mikac U., Magaeva A.A., Itin V.I., Naiden E.P., Psakhye I., Babes L., Reinheckel Т., Peters C., Zeiser R., Bogyo M., Turk V., Psakhye S.G., Turk В., Vasiljeva O.. Ferri-liposomes as an MRI-visible drug delivery system for targeting tumours and their microenviroment // Nat. Nanotechnol. 2011. V. 6(9). P. 594-602. см.стр. 600, Фиг. 4 (С)] - прототип.
in vivo
В данном способе осуществляют лечение онкологического заболевания рака молочной железы на ортотопически трансплантированной мышиной модели вышеуказанной опухоли (опухолевые клетки линии MMTV-PyMT, полученные из трансгенных мышей) с помощью инъекций противоопухолевого лекарственного препарата JPM-565, являющегося ингибитором цистеиновой протеазы катепсина и замедляющего скорость роста опухоли, предварительно инкапсулированного в липосомы со средним диаметром 92,3 нанометров (нм), имеющие липидный состав, при котором содержание яичного фосфатидилхолина составляет 95% и содержание 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[метокси-(полиэтиленгликоля)-2000] равно 5%. В данном способе лечение проводят в течение 20 дней путем внутрибрюшинного введения лекарственного препарата в количестве 100 мг/кг тела животного каждые два дня при содержании препарата JPM-565 в водосодержащей суспензии липосом 12,5 мг/мл. При этом используют липосомы, которые кроме лекарственного препарата дополнительно содержат магнитные наночастицы магнетита, имеющие средний диаметр 5-7 нм, используемые для визуализации опухоли и фокусировки (концентрирования) препарата в опухоли с помощью наложения (воздействия) внешнего постоянного магнитного поля. В данном способе об эффективности лечения судят по замедлению скорости роста опухоли. Так, для опухоли, имеющей объем 125 мм на момент начала лечения, спустя 18 дней после начала лечения объем опухоли составил 400 мм, в то время, как без использования противоопухолевого препарата (контрольная группа мышей) объем опухоли возрастал до 950 мм. Таким образом, известный способ лечения за 18 дней замедлял скорость роста опухоли в 2,4 раза.
Недостатком известного способа является то, что он не позволяет обеспечить достаточно высокую эффективность лечения онкологического заболевания. Кроме того, данный способ неизбежно приводит к появлению побочного эффекта, обусловленного комбинацией относительной длительности противоопухолевого лечения и присутствием во всех липосомах кроме лекарственного препарата также наночастиц магнетита, медленно выводящихся из организма, накапливающихся в печени и требующих для их выведения из организма использования дополнительных препаратов.
Техническая проблема изобретения заключается в разработке способа лечения онкологических заболеваний с помощью инъекций лекарственного препарата, лишенного вышеуказанного недостатка.
Технический результат изобретения состоит в повышении эффективности лечения онкологических заболеваний, уменьшении времени ответа на терапию, скорости роста опухоли и ее объема.
Предварительно были проведены эксперименты с различными способами лечения онкологических заболеваний, которые показали, что указанный технический результат достигается в том случае, когда в способе лечения онкологических заболеваний с помощью инъекций лекарственного препарата, включающий введение водосодержащей суспензии липосом одинакового диаметра с инкапсулированным противоопухолевым лекарственным препаратом, перед введением суспензии липосом одинакового диаметра с инкапсулированным противоопухолевым лекарственным препаратом вводят внутривенно смесь трех суспензий липосом различного диаметра, имеющих одинаковый липидный состав, причем каждая липосома одного диаметра содержит один флуоресцентный краситель, причем красители подобраны так, что пики максимального испускания у них полностью не накладываются друг на друга, при этом первую суспензию получают путем пропускания суспензии липосом, содержащей один из красителей, через экструдер, снабженный мембраной с диаметром пор 200 нм, вторую суспензию получают путем пропускания суспензии липосом, содержащих другой краситель, через экструдер, снабженный мембраной с диаметром пор 100 нм, третью суспензию получают путем пропускания суспензии липосом, содержащих третий краситель, через экструдер, снабженный мембраной с диаметром пор 50 нм, после введения смеси суспензий липосом определяют интенсивность флуоресценции липосом, накопившихся в опухолевой ткани, в зависимости от диаметра липосом, затем выбирают диаметр липосом с наибольшей степенью накопления в опухолевой ткани, и лекарственный препарат вводят внутривенно, инкапсулированным в липосомы с тем же липидным составом и диаметром, обеспечивающим их наибольшую степень накопления в опухолевой ткани.
Предлагаемый способ является новым и не описан в патентной и научно-технической литературе.
Предлагаемый способ может быть использован как для лечения различных онкологических заболеваний поверхностной или глубокой локализации, так и на кожных покровах, например, таких как рак молочной железы, глиома, рак простаты и т.д. При этом для лечения могут быть использованы различные лекарственные препараты, например, такие, как JPM-565, Цисплатин, Иринотекан и т.д. Следует отметить, что в предлагаемом способе используемые лекарственные препараты обязательно должны селективно (избирательно) действовать на подлежащий лечению тип опухоли и быть предварительно инкапсулированы в липосомы, причем для лечения онкологических заболеваний пациенту или больному животному необходимо вводить водосодержащую суспензию таких липосом внутривенно, поскольку механизм всасывания липосом из желудочно-кишечного тракта при пероральном их введении до конца не ясен. При этом липосомы могут быстро деградировать под действием желудочного сока либо ферментов желчи, в результате чего лекарственный препарат, не обладающий селективностью по отношению к клеткам опухоли, но обладающий высокой токсичностью (например, Доксорубицин), неизбежно будет воздействовать как на опухолевые клетки, так и на здоровые клетки организма. Внутримышечное введение используемых липосом также может быть нецелесообразным ввиду того, что при этом создается депо липосом в месте введения, а скорость элиминации (выхода из мышечной ткани в кровоток) из депо зависит от размера липосом и составляет от нескольких часов (при диаметре липосом менее 50 нм) до нескольких дней (при диаметре липосом более 50 нм), что замедляет процесс лечения, а в некоторых случаях даже при минимальном диаметре липосом 30-50 нм такие липосомы ввиду малого диаметра капилляров организма могут вообще не дойти из мышцы до пораженного опухолью органа.
В предлагаемом техническом решении так же, как и в прототипе, используют водосодержащую суспензию липосом, которая в качестве дисперсионной среды может содержать воду или водные растворы различных добавок, например, таких, как компоненты буфера, соли, например, NaCl, сахара и т.д. При этом концентрация липосом с инкапсулированным в них лекарственным препаратом в каждом курсе лечения может быть различна.
Следует отметить, что получение липосом с инкапсулированным в них лекарственным препаратом описано в литературе [см.прототип]. Кроме того, коммерчески доступен ряд противоопухолевых препаратов, которые уже инкапсулированы в липосомы [Upendra Bulbake, Sindhu Doppalapudi, Nagavendra Kommineni and Wahid Khan. Liposomal Formulations in Clinical Use: An Updated Review // Pharmaceutics. 2017. V. 9. Р. 1-33].
Липидный состав используемых липосом может быть различен и определяется качественным и количественным соотношением смеси липидов, используемых в процессе получения липосом, однако в пределах одного курса лечения липидный состав всегда должен быть одинаков, поскольку степень и скорость накопления липосом зависят от их липидного состава. В предлагаемом способе перед курсом лечения больного человека или животного им предварительно необходимо внутривенно ввести смесь трех суспензий липосом различного диаметра, имеющих одинаковый липидный состав, которые могут быть получены путем пропускания суспенизии липосом через экструдер, снабженный мембраной с круглыми порами, диаметр которых выбран из группы, включающей 200, 100 и 50 нм. Экспериментально было показано, что полученные липосомы имеют сферическую форму и достаточно узкое распределение по размеру, причем их средний диаметр близок к диаметру пор в использованной мембране. Вводимые липосомы не должны содержать лекарственного препарата и каждая липосома одного диаметра должна содержать один флуоресцентный краситель, причем красители подобраны так, что пики максимального испускания у них полностью не накладываются друг на друга. Флуоресцентный краситель, вводимый в одну из липосом, может быть выбран, например, из группы, включающей красители с коммерческими (фирменными) названиями DiO, Alexa Fluor 488, Су3 и т.д. Флуоресцентный краситель, вводимый в липосому другого диаметра, может быть выбран, например, из другой группы, включающей красители с коммерческими названиями Dil, Alexa Fluor 568, Су5 и т.д. Флуоресцентный краситель, вводимый в третью липосому с другим диаметром, может быть выбран, например, из третьей группы, включающей красители с коммерческими названиями DiD, Alexa Fluor 647, Су7 и т.д. Вышеописанные флуоресцентные красители подобраны так, что пики максимального испускания у любого красителя, находящегося в одной из групп, полностью не накладывается на пик максимального испускания красителя, находящегося в любой другой группе. Все вышеуказанные красители коммерчески доступны.
При реализации способа каждая суспензия липосом может быть получена методом обращения фаз с последующей гомогенизацией суспензии методом экструзии. Загрузку красителя в липосомы проводят на стадии получения липосом. Гидрофобные красители (например, DiD) добавляют к липидам перед переводом липосом из органической фазы в водную, в то время как гидрофильные красители (например, Alexa Fluor 488) добавляют к липидам на стадии формирования липосом. После смешивания полученную суспензию липосом с флуоресцентным красителем проверяют на наличие свободного красителя и при необходимости отмывают не связавшийся с липосомами краситель методом гель-фильтрации.
При изготовлении смеси суспензий липосом различного диаметра, несущих различные флуоресцентные красители, следят, чтобы сохранялась концентрация липидов и при выборе концентрации каждого красителя в конечном объеме суспензии учитывают характеристики флуоресцентных красителей так, чтобы иметь возможность нормировать измеренное значения яркости флуоресценции опухолевой ткани на введенную дозу каждого красителя, измеренное, например, с использованием спектрофотометрии.
В предлагаемом способе после внутривенного введения смеси трех суспензий липосом различного диаметра, имеющих одинаковый липидный состав, с помощью системы визуализации IVIS и специального программного обеспечения определяют наибольшую степень накопления липосом в опухолевой ткани в зависимости от диаметра липосом. Накопление липосом в опухолевой ткани обусловлено известным эффектом повышенной проницаемости кровеносных сосудов опухоли и удерживания наночастиц (EPR-эффектом) [Nichols J.W.; Bae Y. Н. EPR: Evidence and fallacy // Journal of Controlled Release. 2014. V. 190. P. 451-464]. После этого выбирают диаметр липосом с наибольшей степенью накопления в опухолевой ткани и лекарственный препарат вводят внутривенно инкапсулированным в липосомы с тем же липидным составом и диаметром, обеспечивающим их наибольшую степень накопления в опухолевой ткани.
Из научно-технической литературы известно, что накопление липосом зависит как от размеров самих липосом, так и от размера пор сосудов в опухолевой ткани и стадии онкологического заболевания. Поскольку накопление липосом варьируется от пациента к пациенту, заранее нельзя достоверно предсказать оптимальную методику лечения [Гуревич Д.Г., Меерович И.Г., Меерович Г.А., Воробьев С.И., Певгов В.Г., Смирнова З.С., Оборотова Н.А., Лукьянец Е.А., Барышников А.Ю. Влияние размеров липосом на уровень и селективность накопления тиосенса в опухоли // Российский биотерапевтический журнал. 2007. Т. 2. С. 45-49]. При использовании описанного в прототипе способа в клинической практике могут наблюдаться случаи нерационального введения лекарственного препарата, инкапсулированного в липосомы, одновременно содержащие магнитные наночастицы. Учитывая относительную длительность курса лечения вышеописанными противоопухолевыми препаратами это неизбежно может приводить к накоплению в организме критических концентраций железа и лекарственного препарата, требующих дополнительных манипуляций по их выведению из организма, что осложняет известный способ лечения. В предложенном способе вводят суспензии липосом, не содержащие магнитные наночастицы на основе железа, что исключает вероятность накопления предельно допустимой концентрации железа в организме, сокращает курс лечения и повышает эффективность лечения за счет оптимального выбора диаметра используемых в процессе лечения липосом. Используемые в предлагаемом способе различные флуоресцентные красители в составе липосом малотоксичны и вводятся всего один раз.
При реализации предлагаемого способа диаметр и степень полидисперсности используемых липосом контролируют методом динамического светорассеяния.
Одновременное введение смеси суспензий липосом различного размера не создает конкуренции в процессе накопления липосом в опухолевой ткани ввиду того, что количество клеток в опухоли не менее 1 миллиона и быстро растет в процессе ее развития.
Интервал времени между введением смеси суспензий липосом и моментом определения наибольшей степени накопления липосом в опухолевой ткани зависит от типа опухоли, используемых красителей и т.д., и может составлять, например, 6-24 ч.
2
Об эффективности лечения судят либо по уменьшению скорости роста опухоли в процессе лечения, либо по уменьшению объема опухоли в процессе лечения. При этом объем опухоли рассчитывают по формуле V=(а×b) / 2, где а и b - это самый большой и самый маленький диаметры опухоли. Начинать лечение целесообразно непосредственно после принятия решения о наиболее подходящем диаметре липосом с лекарственным препаратом. Для этого необходимо иметь заранее приготовленные лекарственные препараты, инкапсулированные в липосомы различного диаметра, чтобы не тратить время на их приготовление и сразу перейти к лечению.
Преимущества предлагаемого способа иллюстрируют следующие примеры.
Пример 1.
В опыте используют подопытных животных - иммунокомпетентных FVB/N мышей с привитой опухолью молочной железы мыши (опухолевые клетки линии MMTV-PyMT, полученные из трансгенной мыши). Подопытных животных с привитой опухолью делят на две группы по 6 особей в каждой - контрольную (мыши, которых не лечат) и опытную (мыши, которых лечат). Об эффективности лечения заболевания следят по замедлению скорости роста опухоли.
В качестве флуоресцентных красителей используют красители с коммерческими названиями DiO, DiI и DiD, пики максимального испускания у которых полностью не накладываются друг на друга. Навеску красителя DiO (0,4 мг) растворяют в диметилсульфоксиде (ДМСО), а далее в 7,5 мл хлороформа. Навеску красителя DiI (0,3 мг) растворяют в ДМСО, а далее в 10 мл хлороформа. Навеску красителя DiD (0,35 мг) растворяют в ДМСО, а далее в 8,6 мл хлороформа. Липосомы с тем же липидным составом, что и в прототипе, получают методом обращения фаз путем диспергирования в круглодонной колбе 95 мг фосфатидилхолина и 5 мг 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[метокси-(полиэтиленгликоля)-2000] в смеси, содержащей 7,5 мл хлороформа и 2,5 мл метанола, после чего в полученный раствор добавляют 7,5 мл раствора красителя DiO. Полученную смесь в течение 5 мин обрабатывают ультразвуком (УЗ) с частотой 16 кГц на ультразвуковой бане до образования устойчивого коллоидного раствора, затем на роторном испарителе отгоняют органические растворители. К полученному гелю добавляют 3 мл водосодержащего 10 мМ натрий-фосфатного буфера (рН=7.4) и перемешивают до получения суспензии. Липофильный краситель DiO полностью входит в состав липосом, отмывка не связавшегося красителя не требуется. Для получения первой суспензии липосом с красителем DiO вышеописанную суспензию пропускают через экструдер с мембраной с диаметром пор 200 нм. Вторую суспензию липосом с красителем DiI получают аналогичным образом, пропуская через экструдер с мембраной с диаметром пор 100 нм. Третью суспензию липосом с красителем DiD также получают аналогично путем пропускания через экструдер с мембраной с диаметром пор 50 нм. Методом динамического светорассеяния было показано, что в опыте были получены три различные дисперсии липосом, имеющие средние диаметры 196, 108 и 52 нм, с индексом полидисперсности, равном или меньшем 0,1. Смесь трех суспензий липосом различного диаметра получают путем смешения 1 мл первой суспензии с 1 мл второй суспензии и 1 мл третьей суспензии.
Перед началом лечения на 5-й день после привития опухоли животным из опытной группы внутривенно вводят 150 мкл смеси суспензий липосом различного диаметра, затем через 24 ч с помощью системы IVIS определяют, что краситель DiI дает максимальный сигнал в области опухолевой ткани, из чего делают вывод, что максимальную степень накопления имеют липосомы с диаметром 108 нм.
После этого с использованием экструдера, снабженного мембраной с диаметром пор 100 нм, получают липосомы с вышеописанным липидным составом и оптимальным средним диаметром, близким к 100 нм, не содержащие флуоресцентного красителя, но содержащие внутри противоопухолевый препарат - ингибитор цистеиновой протеазы катепсина JPM-565. Получение данных липосом осуществляют путем упаривания на роторном испарителе раствора липидов в смеси хлороформ-метанол в соотношении 3:1 по объему до образования на стенках колбы равномерной пленки. Полученную пленку суспендируют в водном растворе противоопухолевого препарата, содержащего 12,5 мг JPM-565 в 1 мл раствора, до образования суспензии липосом, которую после этого пропускают через экструдер. Для очистки от не загрузившегося в липосомы противоопухолевого препарата полученную суспензию пропускают через обессоливающую колонку марки NAP-25 (GE Healthcare illustra™ NAP™ Columns) с подвижной фазой, представляющей собой 10 мМ натрий-фосфатный буфер (рН=7,4).
Лечение подопытных животных так же, как и в прототипе, проводят после того, как объем опухоли достигнет 125 мм, и начинают через 24 ч после инъекции смеси суспензии липосом различного диаметра. Лечение проводят путем внутривенного введения водосодержащей суспензии липосом, содержащих противоопухолевый препарат в дозе 100 мг/кг тела мыши (по количеству JPM-565). Контрольной группе мышей вместо суспензии липосом с лекарственным препаратом внутривенно вводят вышеописанный раствор натрий-фосфатного буфера. Внутривенные инъекции проводят каждые два дня, при этом общее количество инъекций в каждой группе мышей было равно 10. Объем опухоли у мышей измеряют каждый день и об эффективности лечения судят по изменению скорости роста опухоли.
Опыт показал, что в экспериментальной группе мышей объем опухоли на 18-й день лечения составлял 200 мм, что в 4,75 раза меньше, чем у контрольной группы мышей, не получающих лекарство. При этом достигнутый в прототипе эффект замедления скорости роста опухоли в 2,4 раза в нашем случае наблюдают уже на 12-й день лечения.
Пример 2.
В опыте используют подопытных животных - мышей с привитой опухолью предстательной железы человека (клеточная линия 22Rv1). Подопытных животных с привитой опухолью делят на две группы по 6 особей в каждой - контрольную (мыши, которых не лечат) и опытную (мыши, которых лечат). Об эффективности лечения заболевания следят по замедлению скорости роста опухоли.
Липосомы различного диаметра получают через липидную пленку. В качестве флуоресцентных красителей используют красители с коммерческими названиями Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 568 и Alexa Fluor 647, пики максимального испускания у которых полностью не накладываются друг на друга. Навеску красителя Alexa Fluor 488 (0,1 мг) растворяют в 3 мл натрий-фосфатного буфера PBS. Навеску красителя Alexa Fluor 568 (0,25 мг) растворяют в 3 мл натрий-фосфатного буфера PBS. Навеску красителя Alexa Fluor 647 (0,3 мг) растворяют в 3 мл натрий-фосфатного буфера PBS. Липосомы получают путем диспергирования в круглодонной колбе 80 мг лецитина, 15 мг холестерина и 5 мг 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[метокси-(полиэтиленгликоля)-2000] в смеси, содержащей 7,5 мл хлороформа и 2,5 мл метанола с последующим упариванием на роторном испарителе полученного раствора липидов до образования на стенках колбы равномерной пленки. Полученную пленку суспендируют 3 мл водосодержащего раствора Alexa Fluor 488 в 10 мМ натрий-фосфатном буфере (рН=7.4) и перемешивают до получения суспензии. Для получения первой суспензии липосом с красителем Alexa Fluor 488 вышеописанную суспензию пропускают через экструдер с мембраной с диаметром пор 200 нм. Для очистки от не загрузившегося в липосомы флуоресцентного красителя полученную суспензию пропускают через обессоливающую колонку марки NAP-25 с подвижной фазой, представляющей собой 10 мМ натрий-фосфатный буфер (рН=7,4). Вторую суспензию липосом с красителем Alexa Fluor 568 получают аналогичным образом, пропуская через экструдер с мембраной с другим диаметром пор 100 нм. Третью суспензию липосом с красителем Alexa Fluor 647 также получают аналогично, путем пропускания через экструдер с мембраной с диаметром пор 50 нм. Методом динамического светорассеяния было показано, что в ходе опыта были получены три различные дисперсии липосом, имеющие средние диаметры 203, 98 и 53 нм, с индексом полидисперсности, равном или меньшем 0,1.
Смесь трех суспензий липосом различного диаметра получают путем смешения 1 мл первой суспензии с 1 мл второй суспензии и 1 мл третьей суспензии.
Перед началом лечения на 7-й день после привития опухоли животным из опытной группы внутривенно вводят 150 мкл смеси суспензий липосом различного диаметра, затем через 6 ч с помощью системы IVIS определяют что краситель Alexa Fluor 488 дает максимальный сигнал в области опухолевой ткани, из чего делают вывод что максимальную степень накопления имеют липосомы с диаметром 203 нм.
Сравнение полученных результатов показало, что наибольшей степенью накопления в опухолевой ткани обладают липосомы, полученные с использованием экструдера, снабженного мембраной с диаметром пор 200 нм.
4
2
4
После этого получают липосомы с вышеописанным липидным составом и оптимальным средним диаметром, близким к 200 нм, не содержащие флуоресцентного красителя, но содержащие внутри противоопухолевый препарат - Доксорубицин. Получение данных липосом осуществляют путем упаривания на роторном испарителе раствора липидов в смеси хлороформ-метанол, взятых в соотношении 3:1 по объему, до образования на стенках колбы равномерной пленки. Полученную пленку суспендируют 120 мМ водным раствором (NH)SO, до образования суспензии липосом, которую после этого пропускают через экструдер, снабженный мембраной с диаметром пор 200 нм. Далее полученную суспензию очищают от сульфата аммония во внешнем буфере с помощью обессоливающей колонки марки NAP-25, затем к ней добавляют водный раствор доксорубицина с концентрацией 12 мг/мл и инкубируют в течение 2 ч. Для очистки от не загрузившегося в липосомы противоопухолевого препарата полученную суспензию пропускают через обессоливающую колонку марки NAP-25 с подвижной фазой, представляющей собой 10 мМ натрий-фосфатный буфер (рН=7,4).
Лечение подопытных животных начинают через 20 ч после инъекции смеси суспензий липосом различного диаметра. Лечение проводят путем внутривенного введения водосодержащей суспензии липосом, содержащих противоопухолевый препарат в дозе 9 мг/кг тела животного (по концентрации доксорубицина). Суспензию липосом внутривенно вводят на 7, 12 и 17 дни после имплантации опухоли. Контрольной группе мышей вместо суспензии липосом с лекарственным препаратом внутривенно вводят вышеописанный раствор натрий-фосфатного буфера. Объем опухоли у мышей измеряют каждый день и об эффективности лечения судят по уменьшению объема опухоли.
Опыт показал, что в экспериментальной группе мышей объем опухоли на 17-й день лечения оказался в 5,5 раза меньше, чем у контрольной группы мышей. При этом в среднем опухоль у мышей, получающих противоопухолевый препарат, с момента лечения уменьшилась на 82%.
Пример 3.
В опыте используют подопытных животных - крыс с привитой опухолью глиомы головного мозга (клеточная линия С6). Подопытных животных с привитой опухолью делят на две группы по 6 особей в каждой - контрольную (крысы, которых не лечат) и опытную (крысы, которых лечат). Об эффективности лечения заболевания судят по замедлению скорости роста опухоли.
Липосомы различного диаметра получают аналогично Примеру 2. В качестве флуоресцентных красителей используют красители с коммерческими названиями коммерческими названиями Су3, Су5 и Су7, пики максимального испускания у которых полностью не накладываются друг на друга. Перед введением в липосомы навеску красителя Су3 (0,7 мг) растворяют в 2 мл натрий-фосфатного буфера PBS. Навеску красителя Су5 (0,8 мг) растворяют в 2 мл натрий-фосфатного буфера PBS. Навеску красителя Су7 (0,6 мг) растворяют в 2 мл натрий-фосфатного буфера PBS.
Липосомы получают фаз путем диспергирования в круглодонной колбе 250 мг фосфатидилхолина, 225 мг дипальмитоилфосфатидилхолина и 25 мг 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[метокси-(полиэтиленгликоля)-2000] в смеси, содержащей 37,5 мл хлороформа и 12,5 мл метанола, после чего в полученный раствор добавляют 2 мл раствора красителя Су3. Полученную смесь в течение 5 мин обрабатывают УЗ с частотой 16 кГц на ультразвуковой бане до образования устойчивого коллоидного раствора, затем на роторном испарителе отгоняют органические растворители. К полученному гелю добавляют 3 мл водосодержащего 10 мМ натрий-фосфатного буфера (рН=7.4) и перемешивают до получения суспензии. Для получения первой суспензии липосом с красителем Су3 вышеописанную суспензию пропускают через экструдер с мембраной с диаметром пор 200 нм. Для очистки от не загрузившегося в липосомы флуоресцентного красителя полученную суспензию пропускают через обессоливающую колонку марки NAP-25 с подвижной фазой, представляющей собой 10 мМ натрий-фосфатный буфер (рН=7,4). Вторую суспензию липосом с красителем Су5 получают аналогичным образом, пропуская через экструдер с мембраной с другим диаметром пор 100 нм. Третью суспензию липосом с красителем Су7 также получают аналогично, путем пропускания через экструдер с мембраной с диаметром пор 50 нм. Методом динамического светорассеяния было показано, что в опыте были получены три различные дисперсии липосом, имеющие средние диаметры 212, 96 и 48 нм, с индексом полидисперсности, равном или меньшем 0,1. Смесь трех суспензий липосом различного диаметра получают путем смешения 2 мл первой суспензии с 2 мл второй суспензии и 2 мл третьей суспензии.
Перед началом лечения на 7-й день после привития опухоли животным из опытной группы внутривенно вводят 600 мкл смеси суспензий липосом различного диаметра, затем через 10 ч с помощью системы IVIS определяют что краситель Су7 дает максимальный сигнал в области опухолевой ткани, из чего делают вывод что максимальную степень накопления имеют липосомы с диаметром 48 нм.
Сравнение полученных результатов показало, что наибольшей степенью накопления в опухолевой ткани обладают липосомы, полученные с помощью экструдера, снабженного мембраной с диаметром пор 50 нм.
После этого получают липосомы с вышеописанным липидным составом и оптимальным средним диаметром, близким к 50 нм, не содержащие флуоресцентного красителя, но содержащие внутри противоопухолевый препарат - Иринотекан. Получение данных липосом осуществляют путем упаривания на роторном испарителе раствора вышеуказанных липидов общей массой липидов 4,0 г в смеси хлороформ-метанол, взятых в соотношении 3:1 по объему, до образования на стенках колбы равномерной пленки. Полученную пленку суспендируют в водном раствором противоопухолевого препарата, содержащего 750 мг Иринотекана в 50 мл водного 5% раствора декстрозы с рН=6,2. При этом проводят три цикла, каждый из которых включает заморозку и разморозку смеси, до образования суспензии липосом, которую после этого пропускают через экструдер, снабженный мембраной с диаметром пор 50 нм. Для очистки от не загрузившегося в липосомы противоопухолевого препарата полученную суспензию пропускают через обессоливающую колонку марки NAP-25 с подвижной фазой, представляющей собой 10 мМ натрий-фосфатный буфер (рН=7,4).
Лечение подопытных животных проводят через 18 ч после инъекции смеси суспензий липосом. Лечение проводят путем внутривенного введения водосодержащей суспензии липосом, содержащих противоопухолевый препарат в дозе 50 мг/кг тела животного (по концентрации Иринотекана). Суспензию липосом вводят по схеме 2 раза в неделю в течение 4-х недель. Контрольной группе крыс вместо суспензии липосом с лекарственным препаратом внутривенно вводят вышеописанный раствор натрий-фосфатного буфера. Объем опухоли у крыс измеряют каждый день и об эффективности лечения судят по изменению скорости роста опухоли.
Объем опухоли у леченых крыс на 28-й день лечения оказался в 4,5 раза меньше, чем у контрольных не леченных крыс.
3
3
Таким образом, из приведенных примеров видно, что предложенный способ по сравнению с прототипом на 18-й день лечения замедляет рост опухоли с 400 мм (в прототипе) до 250 мм, действительно повышая тем самым эффективность лечения онкологического заболевания в 2 раза.