СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ МИКРОКРИСТАЛЛОВ В СУСТАВНОМ ХРЯЩЕ И ДРУГИХ БИОЛОГИЧЕСКИХ ТКАНЯХ
METHOD FOR MICROCRYSTALLINE DETECTION IN ARTICULAR CARTILAGE AND OTHER BIOLOGICAL TISSUES

Изобретение относится к медицине, а именно, к ревматологии и может быть использовано для получения информации о наличии кристаллических образований и их химической структуре в суставном хряще и других биологических тканях.
Обнаружение кристаллов в суставных тканях как метод диагностики на сегодняшний день во всем мире значительно ограничен. «Золотым стандартом» диагностики является метод поляризационной микроскопии синовиальной жидкости, в основе которого лежит явление лучепреломления кристаллов. Исследование синовиальной жидкости методом поляризационной микроскопии не позволяет обнаружить в большинстве случаев кристаллы ввиду их очень маленьких размеров. Другие кристаллы, имеющие большую диагностическую ценность, не являются лучепреломляющими и не всегда могут попадать в суставную жидкость, что также не дает возможность исследовать их с помощью данного метода.
Известны способы диагностики патологических кристаллических депозитов при помощи рентгенографии и ультразвукового исследования (Васильев А.Ю. Рентгенография с прямым многократным увеличением в клинической практике. М., ИПТК «ЛОГОС». 1998; 148 с.; Сенча А.Н., Евсеева Е.В., Петровский Д.А., Патрунов Ю.Н., Сергеева Е.Д. Методики ультразвукового исследования в диагностике рака молочной железы. М., ВИДАР, 2011, 152 с.). Данные этих исследований позволяют получить важные сведения для врача на пути постановки диагноза болезни и назначения лечения больному.
Недостатки рентгенологического и ультразвукового исследований связаны со сложностью интерпретации полученных изображений, которые зависят от уровня подготовки специалиста, выполняющего исследования и анализирующего результаты, невозможностью идентификации микрокристаллических образований, потенциальным риском для здоровья пациента в случае использования рентгеновских лучей, а так же эти исследования не дают данных о морфологии и химической структуре депонированных кристаллов.
Известен способ применения рамановской спектроскопии с целью обнаружения кристаллов в биологических тканях (Esmonde-White K.A., Mandair G.S., Raaii F. etal.Raman spectroscopy of synovial fluid as a tool for diagnosing osteoarthritis.J BiomedOpt. 2009,14(3),034013). Способ заключается в применении конфокальных микроспектрометров, с помощью которых анализируют биологические жидкости и мягкие ткани. Линии получаемых при этом спектров, позволяют идентифицировать разнообразные химические соединения.
Недостатками известного способа являются: возникновение фоновой флюоресценции, которая в ряде случаев не позволяет считывать спектры, не дает возможность анализировать плотные объекты и не обнаруживает микрокристаллы, расположенные в толще ткани, а также не дает информации о наличии и структуре кристаллической решетки.
Известен способ оценки состава тканей с использованием электронной сканирующей микроскопии (Lee R.S., Kayser M.V., Ali S.Y. Calciumphosphatemicrocrystaldepositioninthehumanintervertebraldisc. J.Anat. 2006, 208, 13-19.). Суть этого вида микроанализа заключается в фокусировании пучка электронов на поверхности образца, что приводит к вторичной эмиссии электронов с поверхности изучаемого объекта. В результате получают данные о химическом составе ткани в виде спектра. О предполагаемом типе кристаллов судят по соотношению Ca:P.
Недостатками данного способа являются невозможность идентификации наличия кристаллической решетки, в то время как соотношение Ca:P может давать ложные результаты при анализе биологических тканей, так как Сa и P являются облигатными компонентами клеток и межклеточного вещества.
Известен способ применения феномена рентгеновской дифракции (KR №20080004729, A61B 6/00; G01N 23/00; G01T 1/00, 2008) для диагностики дегенеративных заболеваний суставов, заключающийся в пропускании через биологический объект дифрагированного рентгеновского пучка с получением изображения в виде рентгенограммы.
Недостаток известного способа заключается в ограничении использования препаратов биологических тканей, а также отсутствии микроанализа на наличие кристаллов.
Наиболее близкими техническим решением является способ визуализации объектов, состоящих из мягких тканей (WO №0179823, A61B 6/00; G01N 23/20; G01N 23/00, 2001), взятый за прототип, сущность которого заключается в выполнении нескольких операций, а именно, пропускании через биологический объект рентгеновского луча, его дифрагировании, то есть использовании рентгеновской дифракции, получении рентгеновского снимка, позволяющего идентифицировать различные дефекты в виде образований, нарушений волокнистой структуры ткани, изменения объемов, а также наличие инородных включений в виде обломков суставного хряща и крупных макрокристаллических наложений без возможности дифференцировки их типа.
Недостатками прототипа являются невозможность анализировать биоптаты, аутоптаты тканей и послеоперационный материал, идентифицировать тип и морфологию кристаллов, поскольку данный способ не предполагает анализа трехмерной кристаллический решетки, а основан лишь на визуализации дефектов тканей сустава. Способ-прототип не обладает необходимыми свойствами и техническими характеристиками для обнаружения микрокристаллических структур, их дифференциации и изучения морфологии структуры кристаллической решетки.
Задача заявляемого изобретения заключается в повышении точности диагностики заболеваний и состояний, сопровождающихся образованием микрокристаллических депозитов в тканях за счет возможности оценить морфологическую структуру кристаллической решетки методом рентгеновской дифракции.
Поставленная задача достигается заявляемым способом, заключающимся в рентгеновском структурном анализе суставного хряща или любой другой биологической ткани, полученной при биопсии, аутопсии во время операции. В результате получают электронную дифрактограмму, с помощью которой посредством электронно-вычислительного анализа осуществляют построение рентгеновского спектра, сравнивают полученный спектр с параметрами известных спектров в базе данных. В итоге получают химическую формулу кристалла и его название. Таким образом, может быть произведен анализ как монокристаллов, так и поликристаллических образований.
Техническим результатом заявляемого способа является повышение точности диагностики за счет возможности идентифицировать микрокристаллические депозиты в суставном хряще и других биологических тканях, тем самым обеспечить научные и клинико-диагностическое потребности в области ревматологии, гистологии, онкологии, патологической анатомии, в том числе, для диагностики микрокристаллических артропатий, асептического некроза головки бедренной кости, остеоартроза и других состояний, сопровождающихся образованием и депонированием кристаллических структур в суставном хряще и других тканях.
Сопоставительный анализ заявляемого способа в сравнении с прототипом показывает, что при использовании данного метода отсутствуют ложные результаты, так как в отличие от прототипа исследуется не Ca:P отношение, а трехмерная кристаллическая решетка. Кроме того, известный метод решает проблему анализа биоптатов и аутоптатов на предмет наличия микрокристаллов с идентификацией их морфологического типа, что невозможно при использовании известных способов.
Сущность изобретения заключается в следующем.
Образец ткани суставного хряща, получаемый во время биопсии, аутопсии, операции опускают в физиологический раствор хлорида натрия на 5-10 секунд для удаления биологических жидкостей и возможных загрязнений. Затем образец герметично упаковывают и доставляют в лабораторию. Срок хранения не более 20 дней при температуре не выше -5°C.
С образца острым режущим предметом, предварительно обработанным 70% раствором этилового спирта, удаляют необходимое количество ткани для анализа размером от 0,3 до 10 см. Полученный материал подвергают любому виду неразрушающего высушивания, после чего немедленно приступают к исследованию или упаковывают на хранение. Рентгеноструктурный анализ осуществляют на приборе для рентгеновской дифрактометрии D8 DISCOVER ("Bruker AXS GmbH", Германия) в соответствии с инструкцией по эксплуатации и рекомендациями по технике безопасности. Исследуемый образец фиксируют на пластиковую подложку с помощью некристаллического клея. Предпочтительно применение латексного клея. Образец с подложкой помещают в прибор и фиксируют на держателе. При помощи видеорегистратора и ручного пульта устанавливают область анализа так, что бы лазер и перекрестие камеры находились в одной точке, которая будет подвергаться измерению. Затем, с помощь программы GADDS (General Area Detector Sistem) любой версии (в нашем случае V4.1.27) устанавливают параметры анализа: 3 фрейма, углы 2-Theta=15 deg, Omega=7,5 deg, количество секунд от 150 до 3000 в зависимости от сложности исследования, количество осей, по которым будет идти измерение, оставляют по умолчанию, осцилляцию образца также выбирают по необходимой амплитуде в зависимости от поставленной задачи и сложности исследования, при поточных измерениях осцилляцией не пользуются. После установки базовых параметров исследования указывают имя файла, в котором будут сохраняться данные исследования. В результате произведенных измерений получают 3 фрейма с дифрактограммами, их интегрируют по площади с помощью GADDS и сохраняют данные. После чего склеивают проинтегрированные фреймы в программе «Marge» и получают файл с кристаллической спектрогаммой, готовый для анализа, который проводят в программном пакете «EVA». На полученной дифрактограмме выделяют значимые пики и сравнивают по базе данных известных спектров кристаллов. По результатам анализа программа определяет тип и химическую формулу кристалла.
Примеры реализации способа.
10
4
6
2
10
4
6
2
Пример 1. Для анализа на наличие и тип кристаллов в лабораторию была доставлена головка бедренной кости, полученная в ходе операции «Тотальное эндопротезирование левого тазобедренного сустава» от больной Ч., 60 лет. Прооперирована по поводу «Деформирующий левосторонний коксартроз, 4 рентгенологическая стадия, нарушение функции суставов 4 степени». Препарат головки бедренной кости был предварительно промыт в физиологическом растворе, герметично упакован и доставлен в лабораторию в течение трех часов с момента иссечения. Препарат был осмотрен, срезан участок хряща скальпелем однократного применения, предварительно обработанным 70% этилового спирта. Полученный таким образом образец последовательно был высушен в струе горячего воздуха, фиксирован на ребре пластиковой подложки силиконовым клеем и установлен в держателе прибора D8 DISCOVER ("Bruker AXS GmbH", Германия). С помощью ручного пульта под контролем видеорегистратора луч лазера и камеры соединены в единой точке, которая определена исследователем как диагностически значимая. В программе GADDS были выбраны стандартные параметры измерения, задано имя исследовательского файла - «patient_Ch». Произведено измерение. В результате были получены 3 фрейма с дифрактограммами, интегрированы по области спектра последовательно и склеены в программе «Marge» с получением спектрограммы. Полученный файл подвергался анализу в программе «EVA», а именно, были отмечены значимые пики спектра и произведен программный поиск на соответствия. В итоге получено одно соответствие, указывающее на Hydroxyapatite с химической формулой Ca(РO)(OH). Исследователем было дано диагностическое заключение: суставной хрящ головки правого бедра содержит депозиты гидрокисапатита (Са(PO)(OH)).
Пример 2. Для анализа на наличие и тип кристаллов в лабораторию были доставлены фрагменты камней, полученных от больного П. 40 лет во время дистанционной литотрипсии, которая проводилась по поводу: «Мочекаменная болезнь, конкремент правой почки». Препарат камня был предварительно промыт в физиологическом растворе, герметично упакован, после чего доставлен в лабораторию в течение полутора часов с момента получения. Где был осмотрен, высушен в струе горячего воздуха, фиксирован на ребре пластиковой подложки силиконовым клеем гранью с наибольшей площадью поверхности наружу и установлен в держателе прибора D8 DISCOVER ("Bruker AXS GmbH", Германия). С помощью ручного пульта под контролем видеорегистратора луч лазера и камеры соединены в единой точке, которая определена исследователем как диагностически значимая. В программе GADDS были выбраны стандартные параметры измерения, задано имя исследовательского файла - «patient_P». В результате были получены 3 фрейма с дифрактограммами, интегрированы по области спектра последовательно и склеены в программе «Marge». Полученный файл подвергся анализу, а именно, были отмечены значимые пики спектра и произведен программный поиск на соответствия. В итоге получено одно соответствие, указывающее на Cistin с химической формулой [-S-CH2-CH(NH2)-COOH]2. Исследователем дано диагностическое заключение: камень представляет собой единое образование, состоящее из цистина [-S-CH2-CH(NH2)-COOH]2.
Пример 3. Для анализа на наличие и тип кристаллов в лабораторию был доставлен послеоперационный макропрепарат участка молочной железы, полученных от больной О. 37 лет во время диагностической секторальной резекции молочной железы, которая проводилась по поводу: «Дисгормональная фиброма правой молочной железы». Препарат ткани был предварительно промыт в физиологическом растворе, герметично упакован, после чего доставлен в лабораторию в течение двух часов с момента иссечения. Был осмотрен, иссечен наиболее плотный участок ткани, высушен в струе горячего воздуха, фиксирован на ребре пластиковой подложки силиконовым клеем наибольшей площадью поверхности вверх и установлен в держателе прибора D8 DISCOVER ("Bruker AXS GmbH", Германия). При осмотре с помощью видеорегистратора с увеличением в 100 раз были обнаружены 3 участка неоднородных вкраплений. Принято решение раздельного исследования каждого такого включения. С помощью ручного пульта под контролем видеорегистратора луч лазера и камеры соединены в единой точке, которая определена исследователем диагностически значимой. В программе GADDS были выбраны стандартные параметры измерения, задано имя исследовательского файла - «patient_O». В результате изменений были получены 3 фрейма с дифрактограммами, последовательно интегрированы по области спектра и склеены в программе «Marge». Полученный файл подвергся анализу, а именно были отмечены значимые пики спектра и произведен программный поиск на соответствия. В итоге получено одно соответствие, указывающее на Hydroxyapatite-AL с химической формулой Ca10(РO4)6(OH)Al2. После чего были последовательно исследованы остальные включения на поверхности образца, которые соответствовали в одном случае Octacalciumfosfat с химической формулой Ca8(НРO4)2(РO4)4·5Н2O, в другом обнаружен Hydroxyapatite с формулой Ca3(РO4)2·Сa(OH)2. Исследователем дано диагностическое заключение: образец правой молочной железы поликристаллический - инкрустирован октакальция фосфатом (Сa8(НРO4)2(РO4)4·5Н2O), гидроксиапатитом алюминия (Ca10(РO4)6(OH)Al2), гидрокисиапатитом (Ca3(РO4)2Сa(OH)2).
Заявляемый способ помогает изучить эпидемиологию микрокристаллических артропатий, позволяет оценить степень ассоциации остеоартроза с отложением микрокристаллов и ведет к новым методам профилактики, терапии, снижению финансовых затрат.