СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЗМЕТИОНИНОВОГО РЕЦЕПТОРНОГО АНТАГОНИСТА ИНТЕРЛЕЙКИНА-36, ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI BL21[DE3] - ПРОДУЦЕНТ БЕЗМЕТИОНИНОВОГО РЕЦЕПТОРНОГО АНТАГОНИСТА ИНТЕРЛЕЙКИНА-36 (ВАРИАНТЫ), СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ, ПЛАЗМИДНЫЕ ВЕКТОРЫ pBAD15A и pET15A И ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ДНК ДЛЯ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ

1. Способ получения безметионинового рекомбинантного рецепторного антагониста интерлейкина-36 человека, включающий в себя культивирование штаммов-продуцентов, лизис клеток штаммов-продуцентов и хроматографическое выделение целевого продукта, отличающийся тем, что культивируют штамм Escherichia coli, трансформированный плазмидным вектором, содержащим ген метионинаминопептидазы, хроматографическое выделение целевого продукта проводят двухстадийно, сначала с использованием сорбента Q FF, а затем, после чего добавления сульфата аммония, на сорбенте Butyl-650 с последующим концентрированием с помощью ультрафильтрации и диализа.
2. Способ получения безметионинового рекомбинантного рецепторного антагониста интерлейкина-36 человека по п. 1, отличающийся тем, что он дополнительно включает в себя стабилизацию рекомбинантного рецепторного антагониста интерлейкина-36 человека, введением в раствор, содержащий 1-10 мг/мл антагониста, 1-100 мМ цитрата натрия, 0,01-1% твина-80, 0,1-10 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты при pH 5,5-6,5.
3. Способ получения безметионинового рекомбинантного рецепторного антагониста интерлейкина-36 человека по п. 1, отличающийся тем, что он дополнительно включает в себя стабилизацию рекомбинантного рецепторного антагониста интерлейкина-36 человека, введением в раствор, содержащий 1-10 мг/мл антагониста, 1-100 мМ фосфата натрия, 0,01-1% твина-80, 0,1-10 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты при pH 5,5-6,5.
4. Способ получения безметионинового рекомбинантного рецепторного антагониста интерлейкина-36 человека по п. 1, отличающийся тем, что первую стадию хроматографии проводят на сорбенте Q FF уравновешенном
буферным раствором, содержащим 30-70 мМ Tris-HCl при рН 6,8-7,2, с последующей отмывкой буферным раствором, содержащим 30-70 мМ Tris-HCl, 0-0,3M NaCl при pH 6,8-7,2.
2
4
4
2
4
2
4
5. Способ получения безметионинового рекомбинантного рецепторного антагониста интерлейкина-36 человека по п. 1, отличающийся тем, что вторую стадию хроматографии проводят на сорбенте Butyl-650 (Tosoh) уравновешенном буферным раствором, содержащим 30-70 мМ NaHPO; 0,15-0,5 М (NH)SO при pH 5,8-6,2 с последующим элюированием целевого продукта буферным раствором, содержащим 30-70 мМ NaHPO при pH 5,8-6,2.
6. Способ получения безметионинового рекомбинантного рецепторного антагониста интерлейкина-36 человека по п. 1, отличающийся тем, что концентрирование проводят методом ультрафильтрации с помощью ячейки с перемешиванием Millipore Amicon Stirred Cell с установленной мембраной Sartorius Ultracel PLC10, а затем проводят смену раствора диализом белка против раствора, содержащего 30-70 мМ натрия цитрата при pH 5,8-6,2.
7. Штамм Escherichia coli BL21Star[DE3] (pET-IL36Raf, pBAD15A) - продуцент безметионинового рецепторного антагониста интерлейкина-36 человека для осуществления способа по п. 1.
8. Плазмидный экспрессионный вектор pBAD15A, содержащий ген метионинаминопептидазы Е. coli (MAP), промотор pBADara, терминаторы транскрипции гена rrnB (rrnB Т1Т2), регуляторную последовательность araBAD оперона, ориджин репликации плазмид p15A, ген хлорамфеникол ацетилтрансферазы (CamR) и рестрикционные сайты, необходимые для объединения отдельных фрагментов в векторе, карта которого приведена на фиг. 2.
9. Способ получения штамма Escherichia coli BL21Star[DE3] (pET-IL36Raf, pBAD15A) по п. 7, заключающийся в трансформации штамма
Escherichia coli BL21Star[DE3], плазмидным вектором по п. 8 и плазмидным вектором pET-IL36Raf с индукцией экспрессии генов рецепторного антагониста интерлейкина-36 человека (ИЛ-36РА) и метионинаминопептидазы (МАП).
10. Штамм Escherichia coli BL21Star[DE3] (pET-IL36Raf, pET15A) - продуцент безметионинового рецепторного антагониста интерлейкина-36 человека для осуществления способа по п. 1.
11. Плазмидный экспрессионный вектор рЕТ15А, содержащий ген метионинаминопептидазы Е. coli (MAP), промотор фага Т7, терминатор транскрипции генов фага Т7, регуляторную последовательность гена lacI, ориджин репликации плазмид p15A, ген хлорамфеникол ацетилтрансферазы (CamR) и рестрикционные сайты, необходимые для объединения отдельных фрагментов в векторе, карта которого приведена на фиг. 3.
12. Способ получения штамма Escherichia coli BL21Star[DE3] (pET-IL36Raf, рЕТ15А) по п. 10, заключающийся в трансформации штамма Escherichia coli BL21Star[DE3], плазмидным вектором по п. 11 и плазмидным вектором pET-IL36Raf с индукцией экспрессии генов рецепторного антагониста интерлейкина-36 человека (ИЛ-36РА) и метионинаминопептидазы (МАП).
13. Последовательность ДНК для получения векторов по п. 8 или 11, приведенная на фиг. 1.