СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ ИЗОМЕРИЗОВАННОГО АСПАРТАТА В БЕТА-АМИЛОИДЕ
METHOD OF IDENTIFYING ISOMERISED ASPARTATE IN BETA-AMYLOID

Область техники, к которой относится изобретение.
Настоящее изобретение относится к аналитической химии белков, более конкретно к анализу белков посредством масс-спектрометрии. Изобретение относится к масс-спектрометрическому способу идентификации изомеризованного аспартата в белках, отличающийся тем, что определение изоформ аспартата производится с помощью масс-спектрометрии с преобразованием Фурье.
Уровень техники.
Самопроизвольное образование изоаспартата из аспартата (изомеризация аспартата) является одной из наиболее распространенных пост-трансляционных модификаций белковых молекул. Изомеризация аспартата лежит в основе так называемого «белкового старения» и, как правило, предшествует физиологически обусловленной деградации соответствующего белка [1]. В случае появления в организме избыточных количеств изомеризованных белков могут инициироваться различные патологические процессы, например изомеризация аспартатов в бета-амилоиде тесно связана с развитием болезни Альцгеймера [2]. Соответственно мониторинг уровня изомеризованных по аспартату белков в различных тканях (особенно в крови и спинномозговой жидкости) является одним из возможных средств для молекулярной диагностики целого ряда заболеваний [3].
Для определения изоаспартатных остатков в составе белковых молекул могут быть использованы методы энзиматического метилирования, автоматизированной деградации по Эдману, спектроскопии ядерного магнитного резонанса [4]. Однако масс-спектрометрия является наилучшим аналитическим средством в силу своей высокой чувствительности и производительности. Масс-спектрометрический метод уже был использован для качественного определения изоаспартата в модельных белковых фрагментах и в специально сконструированных олигопептидах [5, 6]. Также была показана принципиальная возможность использования масс-спектрометрии для количественной оценки содержания изоаспартата в белках [7]. Учитывая, что большинство растворимых белков содержатся в биологических жидкостях в наномолярных (или ниже) концентрациях, существует потребность в аналитическом методе с соответствующей чувствительностью [8].
Сущность изобретения.
Настоящее изобретение относится к способу идентификации изомеризованного аспартата в белках, отличающийся тем, что определение изоформ аспартата производится с помощью масс-спектрометрии с преобразованием Фурье и с различными техниками ионизации вводимого образца, в результате чего с помощью двух различных методов фрагментации («при захвате медленного электрона» и «столкновительной») идентифицируются маркерные сигналы, отличающие изомеризованный белок от нативного (неизомеризованного) белка. Преимущество указанного способа состоит в использовании низких наномолярных концентраций (0,5-5 нМ) исходных изоформ. Кроме того, указанный способ позволяет увеличить достоверность анализа вследствие одновременного использования двух независимых методов фрагментации.
Технический результат.
Технический результат, достигаемый при использовании патентуемого изобретения, заключается в выявлении достоверных отличий между изоформами белка, содержащих нативную (альфа-аминокислоту) или изомеризованную (бета-аминокислоту) форму аспарагиновой кислоты.
Пример осуществления изобретения.
5
10
15
5
10
15
10
276
276
300
276
В качестве объектов исследования были использованы высокочистые (>95%) синтетические пептиды, соответствующие фрагменту 1-16 бета-амилоида (человеческого пептида Альцгеймера) с обычным и изомеризованными аспартатами в положении 7. Пептиды были закуплены на фирме Сигма-Генозис (США) в количестве по 25 мг. Аминокислотные последовательности пептидов (в однобуквенных кодах): [ACE]-DAEFR HDSGY EVHHQ K-[NH2] и [ACE]-DAEFR H[isoD]SGY EVHHQK-[NH2] - были верифицированы методом прямого масс-спектрометрического секвенирования. Экспериментальные образцы пептидов (общий объем индивидуальной пробы составлял 100-200 микролитров) готовились в концентрациях 0,5-8000 нМ в одной из следующих систем: в смеси метанол:вода (от 0:100 об.% до 97:3 об.%), в смеси вода:изопропанол (10:90 об.%), в буферных системах (рН 6-8) 2-10 мМ формиата аммония:метанол (95:5 об.%). Для приготовления образцов использовали последовательные разведения из стокового раствора, концентрация пептида в котором была определена спектрофотометрически в кварцевой кювете (длина оптического пути 2 мм) с использованием молярного коэффициента экстинкции ε=1450 (соответствует поглощению Туr) по формуле с=(А-А)/(ε*0,2 cm). Для подачи образца с постоянной скоростью (100 микролитров в час) во время масс-спектрометрических экспериментов использовался плунжерный насос, подсоединенный к источнику ионизации соответствующего инструмента.
В качестве экспериментального метода была задействована масс-спектрометрия ионного циклотронного резонанса с преобразованием Фурье с ионным источником на основе метода электрораспыления в вакуум (ИЦР ПФ). Метод электрораспыления в вакуум позволяет получать ионы биологических молекул, не разрушая их. В основе метода лежит процесс удаления растворителя из аэрозолей растворов исследуемых веществ с одновременной ионизацией. Этот метод позволяет с высокой чувствительностью (до нескольких пикограммов) и высоким разрешением (до 500000 при m/z=1000) определять химические компоненты (в том числе пептидной природы) сложных смесей. Данный метод успешно используется для идентификации биологических пептидов с помощью методик «столкновительной фрагментации» (СФ) и «фрагментации при захвате медленного электрона» (ФЗМЭ). Суть этих подходов состоит в последовательном расщеплении получаемых молекулярных ионов по лабильным ковалентным связям с фиксацией масс получаемых фрагментов исходного иона.
Ионизационная электрораспылительная масс-спектрометрия с Фурье-преобразованием сигнала, использованная в исследованиях, была реализована на приборах 7Т LTQ FT (Thermo Electron, Бремен, Германия) и 7Т Apex Qe BRUKER (Bruker Daltonics, Беллерика, Массачусетс, США). Растворы исследуемых веществ изучались в условиях генерации позитивных ионов с отношением масса:заряд в интервале 200 - 1800 Томсонов. Спектры обычно записывались при напряжении на капилляре в 2,5 кВ. Параметры ионного источника были оптимизированы таким образом, чтобы обеспечить максимальную эффективность ионизации.
После оптимизации выбранных параметров ФЗМЭ-фрагментации ионов были получены масс-спектры двух исследуемых пептидов, нормального (фиг.1а) и изомеризованного по аспартату-7 (фиг.1б). После идентификации пиков и сравнения данных масс-спектров были найдены значимые различия в относительных интенсивностях образующихся фрагментов. Именно, при фрагментации нормального пептида пик, соответствующий фрагменту z9, более интенсивен, чем пик, соответствующий фрагменту с9 (фиг.1а), в то время как при фрагментации пептида, содержащего изомеризованный аспартат-7, пик, соответствующий фрагменту с9, более интенсивен, чем пик, соответствующий фрагменту z9 (фиг.1б). Однако наиболее существенное различие между масс-спектрами фрагментации двух пептидов состоит в том, что пик, соответствующий фрагменту z10-57 (продукт разрыва связи Сα-Сβ), и пик, соответствующий фрагменту с6+57 (комплементарного фрагмента), присутствует в спектре ФЗМЭ-фрагментации изомеризованного пептида (фиг.1б и 1г) и отсутствует в спектре фрагментации нормального пептида (фиг.1а и 1в). Таким образом, обнаружены два комплементарных фрагмента, z10-57 и с6+57, которые однозначно идентифицируют изомеризованный пептид в условиях проведения анализа.
2
2
После оптимизации выбранных параметров СФ-фрагментации ионов были получены масс-спектры двух исследуемых пептидов, нормального (фиг.2б и 2г) и изомеризованного по аспартату-7 (фиг.2а и 2в). После идентификации пиков и сравнения данных масс-спектров были найдены значимые различия в относительных интенсивностях пиков, соответствующих следующим фрагментам: сигналы b6 (m/z=798.36) и у10 (m/z=1198.45) изомеризованного пептида являются гораздо более интенсивными, чем соответствующие пики на спектре фрагментации нормального пептида. Однако наиболее ярким различием между спектрами столкновительной фрагментации двух пептидов является то, что для изомеризованного пептида присутствует интенсивный пик (m/z=816,5), соответствующий фрагменту b6+НО, который полностью отсутствует в масс-спектре фрагментации нормального пептида. Таким образом, пик b6+НО является однозначным маркером изомеризованного пептида в условиях эксперимента.