СПОСОБ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ И КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ОЦЕНКИ ТРОМБОЦИТАРНО-МОНОЦИТАРНЫХ КОМПЛЕКСОВ В ОБРАЗЦАХ ЦЕЛЬНОЙ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ
METHOD FOR FUNCTIONAL AND QUANTITATIVE EVALUATION OF PLATELET-MONOCYTIC COMPLEXES IN WHOLE PERIPHERAL BLOOD SAMPLES

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для функциональной и количественной оценки тромбоцитарно-моноцитарных комплексов (ТМК) в образцах цельной периферической крови.
Повышенное тромбообразование служит одним из ключевых факторов, способствующих развитию тромбоза и его клинических проявлений. Вероятность развития тромбоза определяется рядом факторов, одним из которых является повышенная активность тромбоцитов.
Адекватный контроль функциональной активности тромбоцитов является в настоящее время нерешенной проблемой лабораторной диагностики.
Основным методом исследования функциональной активности тромбоцитов считается оптический метод оценки индуцированной агрегации тромбоцитов, предложенный Борном в 60-годы прошлого века. Метод основан на регистрации изменений светопропускания в суспензии тромбоцитов, обусловленных увеличением светопропускания при образовании тромбоцитарных агрегатов [Мазуров А.В. Физиология и патология тромбоцитов - М.: Литтерра, 2011, - 480 с]. До настоящего времени данный метод не претерпел существенных изменений и успешно применяется в клинико-лабораторной практике, хотя имеет ряд недостатков, связанных с тем, что для исследования необходима богатая тромбоцитами плазма.
Тромбоциты крайне чувствительны к сигналам различной природы и подвержены активации при минимальном внешнем воздействии. При получении богатой тромбоцитами плазмы кровь подвергается центрифугированию при 3000g, что, несомненно, приводит к активации клеток и, следовательно, к искажению достоверных данных. Все модификации метода, предложенного Борном, а именно импедансная агрегатометрия, лазерное светорассеяние, не позволяют избежать активации тромбоцитов ex vivo.
Одним из современных методов анализа структурных компонентов клеток является проточная цитометрия с использованием антител, меченных различными флуоресцентными красителями. Цитометрический анализ позволяет определять клеточный состав (форменные элементы) и прочие структуры, атигенные маркеры клеток в цельной крови, без дополнительного воздействия (центрифугирования, отмывок и иных манипуляций), что позволяет более адекватно оценить параметры, существующие in vivo.
На сегодняшний день для оценки функциональной активности тромбоцитов методом проточной цитометрии в клинической практике используется определение Р-селектина (CD62P), адгезионной молекулы, содержащейся в α-гранулах тромбоцитов в неактивной форме. В результате активации тромбоцитов происходит дегрануляция, и молекулы Р-селектина встраиваются в клеточную мембрану, оказываясь на поверхности клетки. Уровень экспрессии Р-селектина является косвенным показателем активации тромбоцитов, так как активированные тромбоциты образуют межклеточные комплексы с другими клетками, несущими рецепторы к Р-селектину (лейкоциты, клетки эндотелия сосудов). Таким образом, определение экспрессии Р-селектина лишь в свободных тромбоцитах не позволяет в полной мере количественно оценить активацию тромбоцитов, поскольку при этом не учитываются тромбоциты в составе межклеточных комплексов. Очевидно, что для адекватной оценки активации необходимо определять не только свободные тромбоциты, но и тромбоциты в составе межклеточных агрегатов, в частности, тромбоцитарно-лейкоцитарных комплексов (ТЛК).
Формирование ТЛК обусловлено, в первую очередь, взаимодействием экспрессируемого активированными тромбоцитами Р-селектина (CD62P) с конститутивно экспрессируемым лейкоцитами лигандом PSGL-1 (CD162).
Образовавшиеся ТЛК стабилизируются за счет связывания с экспонируемыми на тромбоцитах молекулами CD40L, ICAM-2, CD42b и находящимися на мембранах лейкоцитов молекулами CD40, Мас-1 (CD11b/CD18), LFA-1, соответственно.
Взаимодействие тромбоцитов с моноцитами рассматривается как ключевой патофизиологический механизм, связывающий процессы тромбообразования и воспаления, и опосредующий провоспалительные эффекты, индуцированные активированными тромбоцитами [Rayes J, Bourne JH, Brill A, Watson SP. The dual role of platelet-innate immune cell interactions in thrombo-inflammation. Res Pract Thromb Haemost. 2019;4(1):23-35. Published 2019 Oct 17. doi:10.1002/rth2.12266].
+
-
low
+
+
+
Циркулирующие моноциты представлены тремя субпопуляциями, которые классифицируются по степени экспрессии двух поверхностных маркеров - CD14 и CD16, а именно: "классические" (CD14CD16), "неклассические" (CD14CD16) и "промежуточные" (CD14CD16) [L. Ziegler-Heitbrock, P. Ancuta, S. Crowe, M. Dalod, V. Grau, D.N. Hart, P.J. Leenen, Y.J. Liu, G. MacPherson, G.J. Randolph, J. Scherberich, J. Schmitz, K. Shortman, S. Sozzani, H. Strobl, M. Zembala, J.M. Austyn, M.B. Lutz, Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood, Blood 116(16) (2010) e74-80.]. При этом, классические моноциты обладают выраженной фагоцитарной активностью и не рассматриваются как клетки, обеспечивающие регулирование воспалительных реакций, в то время как неклассические, наоборот, имеют провоспалительный фенотип и не показывают способности к фагоцитозу, промежуточная субпопуляция обладает, в той или иной степени, обоими типами функциональной активности [Ziegler-Heitbrock, L., Ancuta, P., Crowe, S., Dalod, M., Grau, V., Hart, D.N. et al. Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood. Blood. 2010; 116: е74-80]. Определение комплексов с тромбоцитами в этих группах и их фенотипическая характеристика дают дополнительную информацию, позволяющую оценить участие каждой из этих субпопуляций моноцитов во взаимодействии с тромбоцитами и их активационный статус.
Таким образом, определение тромбоцитарно-моноцитарных комплексов (ТМК) более точно характеризует активацию тромбоцитов in vivo. Определение этого параметра, а также уровней экспрессии антигенных маркеров, характеризующих провоспалительный, протромботический и адгезионный потенциал тромбоцитов и моноцитов, способствует выяснению физиологической и патогенетической роли ТМК, а также имеет важное диагностическое значение.
Известен способ определения тромбоцитарно-моноцитарных комплексов [A.J. Gerrits, A.L. Frelinger, A.D. Michelson, WholeBloodAnalysisofLeukocyte-PlateletAggregates, CurrProtocCytom78:6.15.1-6.15.10. doi: 10.1002/cpcy.8.]. Сущность методики, предлагаемой авторами, заключается в том, что цельную кровь фиксируют в течение 20 минут после забора. Окрашивают антителами специфичными для тромбоцитов и лейкоцитов, и анализируют на проточном цитофлюориметре количество образованных лейкоцитарно-тромбоцитарных агрегатов.
Недостатком данного способа, является длительное время до фиксации образцов - 20 минут. После забора крови активация тромбоцитов нарастает в геометрической прогрессии, следовательно, необходима немедленная фиксация образца после забора крови в течение не более одной минуты. Также данный способ отличается тем, что в нем предполагается фенотипирование моноцитарно-тромбоцитарных комплексов только по основным маркерам тромбоцитарным и лейкоцитарным CD41/CD14/CD45. Использование данной панели антител, предлагаемой авторами, позволяет фенотипировать только количество общих ТМК. Важное же значение имеет именно определение фенотипа ТМК. Так как моноциты являются фагоцитирующими клетками, то в данной ситуации очень важно отличить фагоцитоз тромбоцитов моноцитами от истинных тромбоцитарно-моноцитарных комплексов.
Техническим результатом изобретения является создание способа определения тромбоцитарно-моноцитарных комплексов в образцах цельной периферической крови, позволяющего оценить их активационный статус, как в общей популяции моноцитов, так и в отдельных их субпопуляциях. Способ может быть использован для изучения механизмов участия тромбоцитов и моноцитов в процессах тромбогенеза, для определения и характеристики ТМК при акушерских осложнениях и при других патологиях, сопровождающихся воспалением и нарушениями гемостаза, с целью диагностики.
Указанный технический результат достигается в способе функциональной и количественной оценки ТМК в образцах цельной периферической крови методом проточной цитометрии с использованием диагностических маркеров, включающем стабилизацию цельной крови после ее забора с последующим окрашиванием диагностическими маркерами и анализом их экспрессии в образованных ТМК, в котором образец цельной крови стабилизируют в течение не более 1 минуты после забора из локтевой вены, проводят исследование методом проточной цитометрии с использованием панели диагностических маркеров CD45/CD14/CD41a/CD16/CD62P/CD40/CD11b/CD162/CD142 и соответствующих им изотипических контролей: АРС Mouse IgG1 для CD41a, PEMouse IgG1 для CD16/CD40/CD11b/CD162/CD142, AlexaFluor700 Mouse IgG2a для CD14, FITC Mouse IgG1 для CD62P, при этом CD40 служит для идентификации ТМК с функцией провоспалительной активности, маркер CD11b - для идентификации ТМК с функцией адгезионной активности, маркеры CD62P/CD162/CD142 - для идентификации ТМК с функцией протромботической активности, маркеры CD45/CD14/CD41a/CD16 - для идентификации образованных ТМК из общего пула клеточных элементов периферической крови с определением их количества.
Главным существенным отличительным признаком заявляемого способа является фиксация образцов крови сразу же после ее взятия - не более 1 минуты после взятия. Исследования показали, что при таком способе стабилизации цельной крови увеличение времени фиксации до 1 часа не оказывает существенного влияния на основные измеряемые показатели, такие как количество ТМК и уровень экспрессии тромбоцитарных и моноцитарных маркеров.
Нами были проанализированы 14 образцов периферической крови, взятых у женщин с привычным невынашиванием беременности в первом триместре беременности.
Медианное значение доли образованных ТМК в общей популяции моноцитов составило 12,5% (5,5-16,7%).
+
-
low
+
+
+
+
+
low
+
+
+
+
+
low
+
Анализ ТМК в трех субпопуляциях моноцитов: "классической" (CD14CD16), "неклассической" (CD14CD16) и "промежуточной" (CD14CD16) продемонстрировал возможность использования данного способа для выявления количественных различий между этими субпопуляциями и способности клеток образовывать соответствующие ТМК: CD14CD167CD41a, CD14CD16/CD41a, CD14CD16/CD41a. Нами установлено, что во фракции "неклассических" моноцитов с фенотипом CD14CD16количество сформировавшихся ТМК более чем в два раза превышает аналогичный показатель для двух других фракций "классической" и "промежуточной", - а также для популяции моноцитов в целом.
+
+
+
+
-
Заявляемый способ определения ТМК в образцах цельной периферической крови, позволяет не только оценить их долю в общей популяции и субпопуляциях моноцитов, но и количественно охарактеризовать взаимодействие тромбоцитов и моноцитов в составе этих комплексов посредством определения экспрессии молекул, участвующих в этом взаимодействии. Основную роль в формировании ТМК играет связывание молекулы CD62P тромбоцитов с молекулой CD162 на поверхности моноцитов. В большинстве исследованных нами образцов периферической крови, полученных у женщин в первом триместре беременности, уровень экспрессии CD62P в ТМК не превышал 5% (медиана - 3,6%), тогда как практически все моноциты, как свободные, так и в составе ТМК, имели фенотип CD162. Однако, в двух образцах наблюдалось значительное увеличение экспрессии CD62P и одновременное снижение экспрессии CD162 примерно на 50%. Примечательно, что эти изменения наблюдались только в ТМК (CD14CD41a), но не в свободных моноцитах (CD14CD41a); при этом увеличивалось относительное количество ТМК и снижалась доля свободных моноцитов.
В исследуемых нами образцах не было выявлено существенной экспрессии CD40 и CD142. Экспрессия CD11b в ТМК характеризовалась высокой вариабельностью (от 1,2% до 35,1%), составляя в среднем 14%.
Способ иллюстрируется фиг. 1-2, где: на фиг. 1 представлена стратегия гейтирования при анализе ТМК в общей популяции моноцитов (фиг. 1А, 1Б) и при анализе ТМК в субпопуляциях моноцитов (фиг. 1А, 1 В, 1Г, 1Д, 1Е);
на фиг. 2 представлена стратегия гейтирования при анализе активационных и конститутивных маркеров тромбоцитов и моноцитов, участвующих в тромбоцитарно-моноцитарном взаимодействии.
Способ осуществляют, например, следующим образом:
I. Порядок исследования.
1. Подготовка рабочих растворов и реагентов:
1.1 Фиксирующий раствор CellFix™ (BDBiosciences).
1.2. Антитела для проточной цитометрии для идентификации клеток, копмлексов CD41a, CD45, CD14 и активационных молекул CD62P, CD40, CD16, CD11b, CD162, CD142.
1.3. Изотипические контрольные антитела к соответствующим флюорохромам
1.4. Лизирующий раствор BDFACS™Lysing Solution (BDBiosciences)
2. Подготовка необходимых материалов:
2.1 Пробирки для проточной цитометрии
2.2 Одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема до 1000 мкл.
2.3. Одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема до 200 мкл.
2.4. Одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема до 10 мкл.
3. Подготовка необходимого оборудования:
3.1. Вертикальный ламинарно-потоковый шкаф.
3.2. Набор механических дозаторов переменного объема.
3.3. Холодильник 6+2°С.
3.4. Проточный цитофлюориметр оборудованный 488 нм и 633 нм лазером.
II. Порядок работы.
1. Подготовить пробирки для проточной цитометрии, подписать, пронумеровать в соответствии с количеством пациентов.
2. В эппендорф объемом 1,5 мл добавить 500 мкл фиксирующего раствора (Cellfix)
3. Произвести забор крови у пациента из локтевой вены с помощью систем заборы крови «Vacuette» в следующем порядке:
А) первые 2-3 мл крови забрать в пустую пробирку (пробирка идет на сброс, это необходимо для исключения попадания в экспериментальную пробирку тромбопластина и других активирующих факторов, образуемых при проколе кожи и вены иглой)
Б) далее производить забор крови в пробирку-вакутейнер с антикоагулянтом цитрат-натрия.
4. Перемешать, плавно покачивая пробирку с кровью, на 180° 5-6 раз, для смешивания крови с антикоагулянтом.
5. Незамедлительно, в течение 1-2-х минут после забора крови отобрать 500 мкл крови из пробирки и перенести в эппендорф с фиксирующей жидкостью. Аккуратно перемешать. Зафиксированную таким образом кровь необходимо исследовать в течение 2-3-х часов.
6. В подготовленные пробирки для проточной цитометрии внести антитела меченые флюорохромами для фенотипирования тромбоцитарно-мноноцитарных комплексов: CD14, CD45, CD41a; активационных и конститутивных молекул: CD16, CD162, CD142, CD40, CD11b; изотипические контрольные антитела, в соответствии с выбранными флюорохромами, в количестве, соответствующему рекомендациям производителя антител.
7. Добавить к антителам зафиксированную кровь в объеме 50 мкл.
8. Инкубировать в темноте, в течение 15 минут
9. Добавить 450 мкл лизирующего раствора
10. Инкубировать в темноте, в течение 15 минут
III. Проведение анализа и учет результатов.
Анализ клеток проводят с использованием проточного цитофлуориметра. Анализируется 10000 событий. На двумерной гистограмме с координатами SSC-CD45PerCP выделяют регион cells соответствующий морфологии моноцитов (Фиг. 1А). Для определения содержания ТМК, события из региона cells проецируют на двумерную гистограмму с координатами CD41aAPC-CD14AlexaFluor700 (Фиг. 1Б). Границу квадрантов на графике устанавливают на основании предшествующего измерения контрольной пробы, с изотипическим контролем (АРС Mouse IgG1). Определяют количество событий в квадранте ТМК (Фиг. 1Б) - оно соответствует количеству тромбоцитарно-моноцитарных комплексов.
+
-
low
+
+
+
Для определения количества ТМК в различных субпопуляциях моноцитов клетки из региона cells проецируют на двумерную гистограмму с координатами CD16PE- CD14AlexaFluor700 (Фиг. 1 В) Границы квадрантов на графике устанавливают на основании предшествующего измерения контрольной пробы, с изотипическими контролями PEMouse IgGl и AlexaFluor700 Mouse IgG2a и морфологическими характеристиками клеток, соответствующих фенотипу субпопуляций моноцитов: "классической" (CD14CD16), "неклассической" (CD14CD16) и "промежуточной" (CD14CD16). Затем события из квадрантов, соответствующих субпопуляциям моноцитов, проецируют на двумерную гистограмму с координатами CD41aAPC-CD14AlexaFluor700 (Фиг. 1Г, 1Д, 1Е). Границу квадрантов на графике устанавливают на основании предшествующего измерения контрольной пробы с изотипическим контролем (АРС Mouse IgG1). Определяют количество событий в квадранте ТМК (Фиг. 1Г, 1Д, 1Е) - оно соответствует количеству тромбоцитарно-моноцитарных комплексов в соответствующих субпопуляциях моноцитов.
Для определения активационных и конститутивных маркеров, участвующих в тромбоцитарно-моноцитарном взаимодействии на двумерной гистограмме с координатами SSCA-CD45PerCP, выделяют регион cells, соответствующий морфологии моноцитов (Фиг. 2А). Клетки из региона cells проецируют на двумерную гистограмму с координатами CD41aAPC-CD14AlexaFluor700 (Фиг. 2Б). Границу квадрантов на графике устанавливают на основании предшествующего измерения контрольной пробы, с изотипическим контролем (АРС Mouse IgGl). Выделяют регион, соответствующий ТМК. Для определения Р-селектина проецируют регион ТМК на однопараметрическую гистограмму - CD62PFITC (Фиг. 2 В). Границу квадранта на графике устанавливают на основании предшествующего измерения контрольной пробы, с изотипическим контролем (FITC Mouse IgG1). Определяют количество событий в квадранте CD62P (Фиг. 2 В), данное количество соответствует экспрессии активационного маркера CD62P на тромбоцитарно-моноцитарных комплексах. Для определения конститутивно экспрессируемого лейкоцитами лиганда PSGL-1 (CD162) регион ТМК проецируют на однопараметрическую гистограмму - CD162PE (Фиг. 2Г). Границу квадранта на графике устанавливают на основании предшествующего измерения контрольной пробы, с изотипическим контролем (PEMouse IgG1). Определяют количество событий в квадранте CD162 (Фиг. 2Г) - оно соответствует экспрессии лиганда PSGL-1 (CD162) на тромбоцитарно-моноцитарных комплексах.
Для определения CD40 - рецептора CD40L, - участвующего во взаимодействии моноцитов с тромбоцитами при тромбозе и воспалении и характеризующего провоспалительный и протромботический фенотип моноцитов, регион ТМК проецируют на однопараметрическую гистограмму - CD40PE (Фиг. 2Д). Границу квадранта на графике устанавливают на основании предшествующего измерения контрольной пробы, с изотипическим контролем (PEMouse IgG1). Далее определяют количество событий в квадранте CD40 (Фиг. 2Д) - оно соответствует экспрессии CD40 на тромбоцитарно-моноцитарных комплексах.
Для определения антигена CD142 - тканевого фактора, играющего ключевую роль в инициации каскада свертывания крови, - регион ТМК проецируют на однопараметрическую гистограмму - CD142PE (Фиг. 2Е). Границу квадранта на графике устанавливают на основании предшествующего измерения контрольной пробы, с изотипическим контролем (PEMouse IgG1). Определяют количество событий в квадранте CD142 (Фиг. 2Е) - оно соответствует экспрессии CD142 на тромбоцитарно-моноцитарных комплексах.
Для определения антигена CD11b, характеризующего адгезивные свойства свободных моноцитов и ТМК, регион ТМК проецируют на однопараметрическую гистограмму - CD11bPE (Фиг. 2Ж). Границу квадранта на графике устанавливают на основании предшествующего измерения контрольной пробы, с изотипическим контролем (PEMouse IgG1). Определяют количество событий в квадранте CD11bPE (Фиг. 2Ж) - оно соответствует экспрессии CD11b на тромбоцитарно-моноцитарных комплексах.
Таким образом, определение ТМК более точно характеризует активацию тромбоцитов in vivo. Определение этого параметра, а также уровней экспрессии антигенных маркеров, характеризующих провоспалительный, протромботический и адгезионный потенциал тромбоцитов и моноцитов, способствует выяснению физиологической и патогенетической роли ТМК. Способ позволяет оценить активационный статус ТМК как в общей популяции моноцитов, так и в отдельных их субпопуляциях, позволяет проводить исследования для понимания и уточнения механизмов образования ТМК, имеет диагностическую и прогностическую ценность при различных патологиях, сопровождающихся воспалением и нарушениями гемостаза, может способствовать разработке лекарственных препаратов для антиагрегантной терапии.