СРЕДСТВО ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ КЕРАТОКОНЪЮНКТИВАЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
THERAPEUTIC AGENT FOR KERATOCONJUNCTIVE DISORDERS

Область техники, к которой относится изобретение
[0001]
Настоящее изобретение относится к терапевтическому агенту, применяемому для лечения кератоконъюнктивального заболевания, которое в качестве эффективного ингредиента включает агонист RARγ.
Предпосылки создания изобретения
[0002]
Роговица представляет собой прозрачную, не содержащую сосудов ткань диаметром примерно 1 см, которая покрывает переднюю поверхность глазного яблока. Конъюнктива представляет собой слизистую оболочку, покрывающую заднюю поверхность века, а также поверхность глазного яблока, которая находится за роговичным лимбом. Роговица и конъюнктива выполняют важную роль в функции зрения. Известно, что, если в этих тканях возникает какое-либо расстройство, то зрительная способность серьезно ухудшается. Кератоконъюнктивальные расстройства, вызванные различными заболеваниями, такими как язва роговицы, кератит и сухость глаз, представляют собой такие расстройства, которые вызваны задержкой в восстановлении после нарушения, связанного с действием разных причинных факторов, таких как повреждение внешней поверхности, или после возникновения расстройства, которое перешло в хроническую фазу. Поскольку роговица представляет собой ткань, соединенную с конъюнктивой глаза, такие заболевания негативно отражаются на них обеих, выражаясь в изменении нормального строения эпителия, а в некоторых случаях, поражают даже структуру или функцию корнеальной стромы или эндотелия.
[0003]
Известно, что коллаген (в особенности, коллаген I типа) представляет собой один из основных стромальных компонентов паренхимы роговицы. Функциональное расстройство, относящееся к разложению стромы, возникает при заболеваниях, вызванных кератоконъюнктивальным расстройством или нарушением. Таким образом, подавление разложения коллагена (в особенности, коллагена I типа) рассматривается как эффективная мера, направленная против заболеваний, вызванных кератоконъюнктивальным расстройством.
[0004]
При кератоконъюнктивальном нарушении, как известно, возникают рубцовые изменения ткани, которым обычно предшествует развитие воспалительного процесса и которые могут ухудшить функцию зрения. По этой причине подавление сокращения коллагена, если это возможно, рассматривается как эффективный способ борьбы со сморщиванием и образованием рубцов (далее обозначаемые в настоящем тексте как процесс "образования рубцов"), как и в случае указанного выше подавления деградации коллагена.
[0005]
В патентном документе 1 указывается, что все транс-формы ретиноевой кислоты (далее также обозначаемые в совокупности как ATRA) способствуют регенерации роговицы. Однако их эффект выражен слабо и соответствующий механизм действия еще не понятен.
[0006]
Кроме того, ATRA представляет собой агонист рецепторов ретиноевой кислоты (далее, обозначаемые как RAR). Однако, поскольку ATRA не обладает селективностью в отношении подтипов RAR, а именно: RARα, RARβ и RARγ, нет данных о вкладе каждого из подтипов RAR в регенерацию роговицы.
[0007]
Тем не менее, RAR вовлекается в различные эффекты, такие как рост, морфогенез и дифференцировка, в различного рода клеток, таких как воспалительные клетки, иммунные клетки и структурные клетки. Кроме того, имеются данные, указывающие на существование различий в распределении разных подтипов RAR, в зависимости от ткани или органа млекопитающего.
[0008]
Некоторые эффекты RAR являются нежелательными, такие как повышение уровня триглицеридов, связанное с RARα. Таким образом, ожидается, что специфичность или селективность в отношении подтипов соединений с RAR-агонистской активностью может привести к снижению риска развития побочных реакций.
[0009]
По указанным выше причинам, в настоящее время имеется потребность в получении агонистов RAR, которые бы обладали мощным эффектом в направлении подавления кератоконъюнктивальных расстройств и которые бы характеризовались высокой безопасностью, определяемой селективностью в отношении определенного подтипа.
[0010]
В патентных документах 2 и 3 описан агонист RAR, представляющий собой (E)-4-(2-{3-[(lH-пиразол-1-ил)метил]-5,5,8,8-тетраметил-5,6,7,8-тетрагидронафталин-2-ил}винил)бензойная кислота и ее производные. Кроме того, в патентном документе 2 указывается, что (E)-4-(2-{3-[(lH-пиразол-1-ил)метил]-5,5,8,8-тетраметил-5,6,7,8-тетрагидронафталин-2-ил}винил)бензойная кислота используется при лечении эмфиземы легких, рака и дерматоза. В патентном документе 3 указывается, что приведенный выше агонист применяется при неврологической боли.
[0011]
Дополнительно, в непатентном документе 1 указывается, что агонист RAR, 6-[3-(1-адамантил)-4-гидроксифенил]-2-нафталиновая кислота, индуцирует апоптоз в раковых клетках легкого.
[0012]
Кроме того, в непатентном документе 4 указывается, что агонист RAR, 3-фтор-4-[2-гидрокси-2-(5,5,8,8-тетраметил-5,6,7,8-тетрагидронафталин-2-ил)ацетиламино]бензойная кислота применяется при для восстановления или регенерации мышечной ткани.
[0013]
Однако фармакологические эффекты на кератоконъюнктивальные расстройства или образование рубцовой ткани, в результате кератоконъюнктивальных расстройств, не обсуждалось и не сообщалось ни для одного из агонистов RAR. Кроме того, отсутствуют литературные данные, указывающие на такой эффект или предполагающие его существование.
Список цитированной литературы
Патентная литература
[00014]
[PTL 1] Публикация по выложенной заявке на патент Японии No. 2009-235031
[PTL 2] Международная публикация No. WO 2002/028810
[PTL 3] Международная публикация No. WO 2008/057930
[PTL 4] Публикация по выложенной заявке на патент Японии No. 2013-536855
Непатентная литература
[0015]
[NPL 1] Sun SY et al., Cancer Research 62(8): 2430-2436 (2002)
Краткое описание сущности изобретения
Техническая проблема
[0016]
Поиск лекарственного средства, эффективного против офтальмологических заболеваний, в особенности кератоконъюнктивальных расстройств, представляет собой задачу, решение которой представляется важным и интересным. Целью настоящего изобретения является разработка лекарственного средства, которое обладает активностью в отношении подавления кератоконъюнктивального расстройства и которое характеризуется высокой безопасностью, определяемой его селективностью в отношении определенного подтипа.
[Решение проблемы]
[0017]
В результате тщательных исследований, направленных на поиск лекарственного средства, эффективного для лечения кератоконъюнктивальных расстройств, авторы настоящего изобретения обнаружили, что агонист RARγ (E)-4-(2-{3-[(lH-пиразол-1-ил)метил]-5,5,8,8-тетраметил-5,6,7,8-тетрагидронафталин-2-ил}винил)бензойная кислота (R667: далее обозначаемый как "А агонист RARγ") демонстрирует прекрасный эффект по ослаблению кератоконъюнктивальных расстройств и образованию рубцовой ткани, ассоциированных с кератоконъюнктивальными расстройствами, по данным, полученным в рамках фармакологических тестов с использованием кератиноцитов и субконъюнктивальных фибробластов кролика, где наблюдался мощный эффект по подавлению деградации коллагена, а также выраженный эффект в направлении подавления сокращения коллагена. Дополнительно, было обнаружены, что другие агонисты RARγ, такие как 6-[3-(1-адамантилl)-4-гидроксифенил]-2-нафталиновая кислота (CD437: далее обозначаемый как "В агонист RARγ") и 3-фтор-4-[2-гидрокси-2-(5,5,8,8-тетраметил-5,6,7,8-тетрагидронафталин-2-ил)ацетиламино]бензойная кислота (BMS961: далее обозначаемый также как "С агонист RARγ C") также демонстрируют выраженный эффект по подавлению деградации коллагена, полученный в рамках фармакологических тестов с использованием кератиноцитов кролика, что и составило суть настоящего изобретения.
[0018]
Конкретно, настоящее изобретение относится [1] к терапевтическому средству, применяемому при кератоконъюнктивальном расстройстве, которое включает агонист RARγ в качестве эффективного ингредиента, [2] к терапевтическому агенту по п. [1], в котором указанный агонист RARγ представляет собой (E)-4-(2-{3-[(lH-пиразол-1-ил)метил]-5,5,8,8-тетраметил-5,6,7,8-тетрагидронафталин-2-ил}винил)бензойную кислоту, 6-[3-(1-адамантил)-4-гидроксифенил]-2-нафталиновую кислоту, 3-фтор-4-[2-гидрокси-2-(5,5,8,8-тетраметил-5,6,7,8-тетрагидронафталин-2-ил)ацетиламино]бензойную кислоту, их сложный эфир или их соль, [3] к терапевтическому средству по п. [1] или п. [2], где указанное кератоконъюнктивальное расстройство выбрано из группы, состоящей из язвы роговицы, царапины эпителия роговицы, кератита, сухости глаза, конъюнктивита, хронического поверхностного кератита, эрозии роговицы, персистирующих корнеальных расстройств, поверхностной точечной кератопатии, дефектов эпителия роговицы, дефектов эпителия конъюнктивы, сухого кератоконъюнктивита, верхнего лимбального кератоконъюнктивита, филаментозного кератоконъюнктивита, инфекционного кератита, неинфекционного кератита, инфекционного конъюнктивита, неинфекционного конъюнктивита, рубцевания роговицы и рубцевания конъюнктивы, [4] к терапевтическому средству по любому из указанных выше пп. [1]-[3], где в качестве формы введения применяют метод закапывания или пероральное введение, и [5] к терапевтическому средству по любому из указанных выше пп. [1]-[4], где в качестве дозированной формы применяют препарат для инстилляции, глазную мазь, инъецируемый препарат, таблетку, гранулу, измельченную гранулу, порошок или капсулу.
[Благоприятные эффекты настоящего изобретения]
[0019]
Агонисты RARγ, которые представляют собой эффективные ингредиенты лекарственного средства для использования при кератоконъюнктивальном расстройстве по настоящему изобретению, применяются в качестве лекарственного средства в случае кератоконъюнктивальных расстройств, таких как язва роговицы, царапина эпителия роговицы, кератит, сухость глаза, конъюнктивит, хронический поверхностный кератит, эрозия роговицы, персистирующие корнеальные расстройства, поверхностная точечная кератопатия, дефекты эпителия роговицы, дефекты эпителия конъюнктивы, сухой кератоконъюнктивит, верхний лимбальный кератоконъюнктивит, филаментозный кератоконъюнктивит, инфекционный кератит, неинфекционный кератит, инфекционный конъюнктивит, неинфекционный конъюнктивит, за счет мощного подавления деградации коллагена конъюнктивы.
[0020]
Кроме того, агонисты RARγ, которые представляют собой эффективные ингредиенты лекарственного средства для использования при кератоконъюнктивальном расстройстве по настоящему изобретению, применяются в качестве лекарственного средства в случае рубцевания роговицы или рубцевания конъюнктивы, ассоциированных с кератоконъюнктивальным расстройством, за счет мощного подавления сокращения коллагена кератоконъюнктивы.
[Краткое описание графического материала]
[0021]
[Фиг. 1] На фиг. 1 приведен график, показывающий взаимосвязь между концентрацией (нМ) А агониста RARγ (R667) и деградацией коллагена (количество (мкг) гидроксипролина на ячейку). Вертикальная ось указывает численное значение (%) в том случае, когда количество гидроксипролина в контроле установлено на отметке 100.
[Фиг. 2] На фиг. 2 приведен график, показывающий взаимосвязь между концентрацией (нМ) А агониста RARγ (R667) и сокращением коллагена (диаметр (мм) коллагенового геля в чашке Петри), в случае использования субконъюнктивных фибробластов, где символ "*" указывает на наличие статистически значимого различия (p<0,05).
[Фиг. 3] На фиг. 3 приведен график, показывающий взаимосвязь между концентрацией (нМ) А агониста RARγ (R667) и сокращением коллагена (диаметр (мм) коллагенового геля в чашке Петри), в случае использования кератиноцитов, где символ "*" указывает на наличие статистически значимого различия (p<0,05).
[Фиг. 4] На фиг. 4 приведен график, показывающий взаимосвязь между концентрацией (нМ) А агониста RARγ (R667), В агониста RARγ (BMS961), С агониста RARγ (CD437) и деградацией коллагена при использовании кератиноцитов. Вертикальная ось обозначает отношение (коэффициент) количества (мкг) гидроксипролина на ячейку, в том случае, когда добавлены агонист RARγ и стимулятор, где количество (мкг) гидроксипролина на ячейку, в тех случаях, когда агонист RARγ и стимулятор не добавляют, устанавливают равным 1, где символ "*" указывает на наличие статистически значимого различия (p<0,05).
[Фиг. 5] На фиг. 5 приведен график, показывающий взаимосвязь между концентрацией (нМ) А агониста RARγ (R667) и экспрессией и активацией матричных металлопротеиназ (MMP), в случае использования кератиноцитов. В верхнем ряду на фиг. 5A приведены данные по экспрессии и активации MMP-1, в нижней части на фиг. 5A приведены данные по экспрессии и активации MMP-3, и на фиг 5B приведены данные по экспрессии и активации MMP-2 и MMP-9.
[Фиг. 6] На фиг. 6 показаны результаты испытания, в ходе которого проводили введение липополисахарида (ЛПС) и А агониста RARγ (R667) в корнеальную строму одного глаза у самцов белого японского кролика. Верхний ряд (носитель) относится к результату введения только раствора, который не содержит А агонист RARγ (R667) по настоящему изобретению, а в нижней части (0,1% R667) проиллюстрирован результат введения раствора, содержащего А агонист RARγ (R667).
[Описание вариантов осуществления настоящего изобретения]
[0022]
Лекарственное средство, применяемое при лечении кератоконъюнктивального расстройства по настоящему изобретению, конкретно не ограничивается и может представлять собой любое лекарственное средство, активный ингредиент которого обладает активностью агониста RARγ. Агонист RARγ по настоящему изобретению относится к соединению, которое может способствовать активации рецептора RARγ за счет его связывания с рецептором RARγ в большей степени, чем с рецепторами RARα или рецепторами RARβ.
[0023]
Примеры такого рода агонистов RARγ включают (E)-4-(2-{3-[(lH-пиразол-1-ил)метил]-5,5,8,8-тетраметил-5,6,7,8-тетрагидронафталин-2-ил}винил)бензойную кислоту (R667), описываемую приведенной ниже формулой (I), 6-[3-(1-адамантил)-4-гидроксифенил]-2-нафталиновую кислоту (CD437), описываемую приведенной ниже формулой (II), 3-фтор-4-[2-гидрокси-2-(5,5,8,8-тетраметил-5,6,7,8-тетрагидронафталин-2-ил)ацетиламино]бензойную кислоту (BMS961), описываемую приведенной ниже формулой (III), оксим(2E)-3-(4-карбоксифенил)-1-(5,5,8,8-тетраметил-5,6,7,8-тетрагидронафталин-2-ил)-2-пропен-l-она (NRX204647: далее обозначаемый также как "D агонист RARγ"), описываемый приведенной ниже формулой (IV), 4-[7-(1-адамантил)-6-гидроксинафталин-2-ил]бензойную кислоту (CD1530: далее обозначаемую также как "Е агонист RARγ"), описываемую приведенной ниже формулой (V), сложные эфиры таких соединений (A, B, C, D и E агонисты RARγ) и соли таких соединений (A, B, C, D и E агонисты RARγ). Предпочтительные примеры агонистов RARγ включают А агонист RARγ, В агонист RARγ, С агонист RARγ, сложные эфиры таких соединений (A, B и C агонисты RARγ) и соли таких соединений (A, B и C агонисты RARγ).
[0024]
[Формула химического соединения 1]
[0025]
[Формула химического соединения 2]
[0026]
[Формула химического соединения 3]
[0027]
[Формула химического соединения 4]
[0028]
[Формула химического соединения 5]
[0029]
Дополнительно, другие варианты осуществления настоящего изобретения относятся к способу лечения кератоконъюнктивального расстройства, включающему введение субъекту агониста RARγ по настоящему изобретению, к агонисту RARγ по настоящему изобретению, применяемому в качестве терапевтического средства при кератоконъюнктивальном расстройстве, и к применению агониста RARγ по настоящему изобретению при изготовлении указанного лекарственного средства для лечения кератоконъюнктивального расстройства.
[0030]
А агонист RARγ, который является одним из эффективных ингредиентов лекарственного средства, применяемого при лечении кератоконъюнктивального расстройства по настоящему изобретению, его сложный эфир и его соль представляют собой известные соединения, описанные в патентном документе 2. Они могут быть получены согласно способу, описанному в патентном документе 2, или могут быть приобретены как коммерчески доступный продукт. Примеры коммерчески доступных продуктов включают: паловаротен (palovarotene) (наименование продукта), производимый компанией manufactured by Shanghai Haoyuan Chemexpress.
[0031]
Входящий в число эффективных ингредиентов лекарственных средств для лечения кератоконъюнктивальных расстройств по настоящему изобретению, В агонист RARγ представляет собой известное соединение, описанное в непатентном документе 1 и патентном документе 4, С агонист RARγ представляет собой известное соединение, описанное в патентном документе 4, и D и Е агонисты RARγ также представляют собой известные соединения, описанные в приведенном ниже документе (Shimono K. et al., Nat Med. 17(4): 454-460 (2011)). Такого рода соединения, их сложные эфиры и их соли могут быть получены с использованием стандартного способа или могут быть приобретены как коммерчески доступный продукт. Примеры коммерчески доступных продуктов включают: CD437 (abl413 05) (наименование продукта), производство компании Abeam и CD437 (наименование продукта), производство компании Tocris Bioscience, применительно к В агонисту RARγ, BMS961 (наименование продукта), производство компании Tocris Bioscience, применительно к В агонисту RARγ, CD1530 (наименование продукта), производство компании Santa Cruz biotechnology и CD1530 (наименование продукта), производство компании Tocris Bioscience, применительно к В агонисту RARγ.
[0032]
Сложные эфиры в приведенных выше сложноэфирных соединениях A, B, C, D и E агонистов RARγ, которые являются эффективными ингредиентами лекарственных средств для лечения кератоконъюнктивальных расстройств по настоящему изобретению, конкретно не ограничиваются и могут представлять собой любой сложный эфир, превращаемый в A, B, C, D или E агонисты RARγ в ходе реакции, проводимой с использованием фермента или осуществляемой в физиологических условиях in vivo. Такого рода сложные эфиры включают: сложные эфиры, полученные путем реакции с первичным спиртом, таким как метанол, этанол, пропанол, гексанол или додеканол; сложные эфиры, полученные путем реакции со вторичным спиртом, таким как изопропанол, втор-бутанол или 1-этилпропанол; сложные эфиры, полученные путем реакции с третичным спиртом, таким как трет-бутанол или 1-метил-1-этилпропанол; сложные эфиры, полученные путем реакции с аминоспиртом, таким как 2-аминоэтанол.
[0033]
Указанные выше сложные эфиры могут быть получены с использованием стандартных способов из указанных выше A, B, C, D, E агонистов RARγ или промежуточного продукта, образуемого в ходе их синтеза.
[0034]
Соли, относящиеся к указанным выше солям A, B, C, D и E агонистов RARγ, которые являются эффективными ингредиентами лекарственных средств для лечения кератоконъюнктивальных расстройств по настоящему изобретению, конкретно не ограничиваются и могут представлять собой любые фармацевтически приемлемые соли. Такие соли включают (1) в качестве соли присоединения кислоты, соли неорганической кислоты, такие как гидрохлорид, соль бромистоводородной кислоты, соль йодистоводородной кислоты, соль азотной кислоты, соль серной кислоты и соль фосфорной кислоты; и соли органической кислоты, такие как соль уксусной кислоты, соль трифторуксусной кислоты, соль бензойной кислоты, соль щавелевой кислоты, соль малоновой кислоты, соль янтарной кислоты, соль малеиновой кислоты, соль фумаровой кислоты, соль винной кислоты, соль лимонной кислоты, соль метансульфоновой кислоты, соль этансульфоновой кислоты, соль трифторметансульфоновой кислоты, соль бензолсульфоновой кислоты, соль п-толуолсульфоновой кислоты, соль глютаминовой кислоты и соль аспарагиновой кислоты, и (2) в качестве соли присоединения основания, соли металла, такие как соль натрия, соль калия, соль кальция, соль магния; неорганические соли, такие как аммониевая соль; и соли органического амина, такие как триэтиламиновая соль и гуанидиновая соль.
[0035]
В контексте настоящего изобретения, термин «кератоконъюнктивальное расстройство» относится к состоянию, при котором имеет место повреждение роговицы или конъюнктивы в результате действия разного рода факторов, таких как аномалии в слезной жидкости, метаболические аномалии или внешнее повреждение. Примеры указанных выше расстройств включают язву роговицы, царапины эпителия роговицы, кератит, сухость глаза, конъюнктивит, хронический поверхностный кератит, эрозию роговицы, персистирующие корнеальные расстройства, поверхностная точечная кератопатия, дефекты эпителия роговицы, дефекты эпителия конъюнктивы, сухой кератоконъюнктивит, верхний лимбальный кератоконъюнктивит, филаментозный кератоконъюнктивит, инфекционный кератит, неинфекционный кератит, инфекционный конъюнктивит и неинфекционный конъюнктивит. Подавление деградации коллагена на счет воздействия на разные вызывающие его факторы оказывает прекрасный эффект по ослаблению указанных выше расстройств. Кроме того, в настоящем изобретении, рубцевание роговицы (образование рубцовой ткани на роговице) и рубцевание конъюнктивы (образование рубцовой ткани на конъюнктиве), связанные с кератоконъюнктивальным расстройством, также рассматриваются как примеры кератоконъюнктивальных расстройств. Подавление сокращения коллагена на счет воздействия на разные вызывающие его факторы оказывает прекрасный эффект по ослаблению указанных выше расстройств.
[0036]
Лекарственное средство для лечения кератоконъюнктивального расстройства по настоящему изобретению может вводиться через рот или парентеральным способом (внутривенное введение, внутримышечное введение, внутрибрюшинное введение, чрескожное введение, интратрахеальное введение, внутрикожное введение или подкожное введение) в виде таблетки, капсулы, порошка, сиропа, гранулы, гранулы с тонкоизмельченным содержимым, пилюли, жидкой композиции, суспензии, эмульсии, средства для чрескожной абсорбции, суппозитория, мази (предпочтительно, глазной мази), лосьона, средства для ингаляции, инъецируемого препарата, которые получают при перемешивании с фармакологически подходящей добавкой.
[0037]
Указанные выше композиции получают по хорошо известному способу с использованием добавки, такой как эксципиент, замасливатель, связующее вещество, средство, способствующее разложению, эмульгатор, стабилизатор, вкусовое вещество или разбавитель.
[0038]
Примеры эксципиентов включают органические эксципиенты и неорганические эксципиенты. Примеры органических эксципиентов включают: производные сахаров, такие как лактоза, сахароза, глюкоза, маннит и сорбит; производные крахмала, такие как кукурузный крахмал, картофельный крахмал, α-крахмал и декстрин; производные целлюлозы, такие как кристаллическая целлюлоза; аравийскую камедь; декстран; и пуллулан. Примеры неорганических эксципиентов включают: легкую безводную кремниевую кислоту; и соли серной кислоты, такие как сульфат кальция.
[0039]
Примеры замасливателей включают: стеариновую кислоту; стеариновые соли металлов, такие как стеарат кальция и стеарат магния; тальк; коллоидный кремнезем; воск, такой как пчелиный воск и спермацет, борную кислоту; адипиновую кислоту; соли серной кислоты, такие как сульфат натрия; гликоль; фумаровую кислоту; бензоат натрия; D,L-лейцин, лаурилсульфат натрия; кремниевые кислоты, такие как кремнезем и гидрат кремниевой кислоты; и производные крахмала, включающие те производные, которые были указаны выше применительно к эксципиентам.
[0040]
Примеры связующих веществ включают: гидроксипропилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, поливинилпирролидон, макрогол и соединения, описанные выше применительно к эксципиентам.
[0041]
Примеры средств, способствующих разложению, включают: производные целлюлозы, такие как низкозамещенная гидроксипропилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза, кальций-карбоксиметилцеллюлоза и сшитая кальций-карбоксиметилцеллюлоза; сшитый поливинилпирролидон и химически модифицированный крахмал или производные крахмала, такие как карбоксиметил-крахмал и натрий-карбоксиметил-крахмал.
[0042]
Примеры эмульгаторов включают: коллоидную глину, такую как бентонит и вигум; анионные поверхностно-активные вещества, такие как лаурилсульфат натрия; катионные поверхностно-активные вещества, такие как хлорид бензалкония; и неионные поверхностно-активные вещества, такие как полиоксиэтиленалкиловый эфир, сложный эфир полиоксиэтиленсорбитана и жирной кислоты и сложный эфир сахарозы и жирной кислоты.
[0043]
Примеры стабилизаторов включают: сложные эфиры пара-гидроксибензойной кислоты, такие как метилпарабен и пропидпарабен; спирты, такие как хлорбутанол, бензиловый спирт и фенилэтиловый спирт; хлорид бензалкония; фенолы, такие как фенол и крезол; тимеросал; уксусный ангидрид и сорбиновую кислоту.
[0044]
Примеры вкусовых веществ включают: подсластители, такие как натрий-сахарин и аспартам; подкислители, такие как лимонная кислота, яблочная кислота и винная кислота; и вкусовые добавки, такие как экстракт лимона и экстракт апельсина.
[0045]
Разбавители включают в основном те соединения, которые используются для разбавления. Примеры таких соединений включают лактозу, маннит, глюкозу, сахарозу, сульфат кальция, гидроксипропилцеллюлозу, микрокристаллическую целлюлозу, воду, этанол, полиэтиленгликоль, пропиленгликоль, глицерин, крахмал, поливинилпирролидон и их смеси.
[0046]
Лекарственное средство для лечения кератоконъюнктивального расстройства по настоящему изобретению включает также, кроме указанных выше дозированных форм, такие средства, которые представлены в форме, подходящей для инстилляции. Указанное средство может быть получено по известному способу путем соответствующего перемешивания с использованием, в качестве добавки, агента изотонического действия, буфера, регулятора рН, солюбилизатора, загустителя, стабилизатора, консерванта (антисептического действия) или т.п. Кроме того, можно получить стабильный препарат для инстилляции при добавлении регулятора pH, загустителя, диспергирующего вещества или т.п., с получением в результате суспензии лекарственного средства.
[0047]
Примеры средств изотонического действия включают глицерин, пропиленгликоль, хлорид натрия, хлорид калия, сорбит и маннит.
[0048]
Примеры буферов включают фосфорную кислоту, фосфат, лимонную кислоту, уксусную кислоту и ε-аминокапроновую кислоту.
[0049]
Примеры регуляторов рН включают хлористоводородную кислоту, лимонную кислоту, фосфорную кислоту, уксусную кислоту, гидроксид натрия, гидроксид калия, борную кислоту, тетраборат натрия, гидрофосфат динатрия, дигидрофосфат натрия, карбонат натрия и бикарбонат натрия.
[0050]
Примеры стабилизаторов включают полисорбат 80, полиоксиэтилен-содержащее гидрогенизированное касторовое масло 60 и макрогол 4000.
[0051]
Примеры загустителей и диспергирующих веществ включают: полимеры на основе целлюлозы, такие как гидроксипропилметилцеллюлоза и гидроксипропилцеллюлоза; поливиниловые спирты и поливинилпирролидон. Дополнительно, примеры стабилизаторов включают эдетовую кислоту и эдетат натрия.
[0052]
Примеры консервантов (антисептического действия) включают обычно используемые консерванты, такие как сорбиновая кислота, сорбат калия, хлорид бензалкония, хлорид бензетония, метил-пара-гидроксибензоат, пропил-пара-гидроксибензоат и хлорбутанол. Можно также использовать указанные консерванты в сочетании.
[0053]
Препарат для инстилляции может иметь любой рН в пределах диапазона, подходящего для средства, используемого для закапывания в глаз, но желательно значение рН устанавливают на уровне 4,0-8,5.
[0054]
В случае мазей (предпочтительно, глазных мазей), для их получения может использоваться стандартная основа, такая как белый вазелин или жидкий парафин.
[0055]
Дозировка лекарственного средства для лечения кератоконъюнктивального расстройства по настоящему изобретению может быть соответствующим образом откорректирована в соответствии с конкретной дозированной формой препарата, тяжестью симптомов расстройства у пациента, которому вводится указанное средство, а также с учетом его возраста, веса, принятого лечащим врачом решения и т.п. В случае пероральных средств, в основном рассматривается возможность введения 0,01-5000 мг, предпочтительно, 0,1-2500 мг, и более предпочтительно, 0,5-1000 мг в день, в случае взрослого пациента, в виде одной или нескольких доз. В случае препаратов для инстилляции, возможно вводить такие дозы, в которых концентрация эффективного ингредиента составляет 0,000001-10% (вес/объем), предпочтительно, 0,00001-3% (вес/объем), и более предпочтительно, 0,0001-1% (вес/объем), в виде одной или нескольких ежедневно вводимых доз. В случае глазных мазей, возможно вводить такие дозы, в которых концентрация эффективного ингредиента составляет 0,00001-10 вес. %, предпочтительно, 0,0001-3 вес. %, и более предпочтительно, 0,001-1 вес. %, в виде одной или нескольких ежедневно вводимых доз.
[0056]
Ниже приводится более подробное описание настоящего изобретения с использованием соответствующих примеров (тест-примеры и примеры получения композиции). Однако, область настоящего изобретения не ограничивается приведенными здесь примерами.
(Пример 1)
[0057]
(Тест-пример) Тест на подавление деградации геля трехмерного коллагена в нормальных первичных кератиноцитах кролика при использовании А агониста RARγ
Использовали нормальные корнеальные клетки кролика для оценки супрессорного эффекта исследуемого соединения на деградацию геля трехмерного коллагена, в соответствии с методом Nishida et al. (Investigative Ophthalmology & Visual Science 42: 1247-1253 (2001)).
[0058]
5
Отобранные из нормального глазного яблока кролика первичные кератиноциты растили до слияния и отделяли от пластины для культивирования с использованием 0,05% трипсин-ЭДТА. После промывки бессывороточной (номер продукта 11095; Gibco), подсчитывали число клеток. Полученные первичные кератиноциты смешивали с раствором коллагена типа I CellmatrixType I-A (номер продукта 637-00653; Nitta Gelatin Inc.) и буфером для восстановления (номер продукта 635-00791; Nitta Gelatin Inc.), после чего распределяли по лункам 24-луночного планшета, так чтобы конечная концентрация была 1×10 клеток/лунку, для получения геля коллагена.
[0059]
2
После получения геля начинают культивирование (при температуре 37°C и 5% CO) при добавлении к MEM среде раствора диметилсульфоксида, содержащего А агонист RARγ (R667) (концентрация R667: 0,1 нМ, 1 нМ, 10 нМ, 100 нМ или 1000 нМ), или раствора диметилсульфоксида без А агониста RARγ и 10 нг (до конечной концентрации 10 нг/мл) IL-lβ (номер продукта 201-LB-005; R&D Systems) и 60 мкг (до конечной концентрации 60 мкг/мл) Плазминогена (Plasminogen) (номер продукта P9156; Sigma), в качестве стимулятора, и наслаивают указанную среду на полученный ранее гель коллагена.
[0060]
Через 48 часов после начала культивирования супернатант подвергают ультрафильтрации, добавляют к нему 100 мкл концентрированной хлористоводородной кислоты и нагревают, после чего коллаген гидролизуют. Полученный после гидролиза реакционный раствор сушат в атмосфере газа азота с использованием аппарата Dry Thermo Unit (DTU-2C, Taitec Co. Ltd.) и кристаллизатора (El-20 Taitec Co. Ltd.), после чего растворяют в 500 мкл сверхчистой воды. Количество гидроксипролина в растворе, представляющего собой продукт разложения коллагена, определяют по методу Bergman et al. (Analytical Chemistry 35(12): 1961-1965 (1963)) для оцени эффекта А агониста RARγ в направлении подавления деградации коллагена. Полученные результаты приведены на фиг. 1.
[0061]
По результатам данного теста А агонист RARγ продемонстрировал дозозависимый эффект в направлении подавления деградации коллагена, связанной с кератоконъюнктивитом.
[0062]
(Пример получения композиции)
[0063]
(Пример 1 получения лекарственного средства) Препарат для инстилляции/закапывания
В 100 мл содержится
А агонист RARγ 100 мг
Хлорид натрия 800 мг
Полисорбат 80 соответствующее, подбираемое количество
Гидрофосфат динатрия соответствующее, подбираемое количество
Дигидрофосфат натрия соответствующее, подбираемое количество
Стерильная очищенная вода соответствующее, подбираемое количество
А агонист RARγ и другие описанные выше компоненты добавляют к стерильной очищенной воде. Раствор хорошо перемешивают с получением состава для инстилляции. Можно получить средство для инстилляции с концентрацией 0,05% (вес/объем), 0,3% (вес/объем), 0,5% (вес/объем) или 1% (вес/объем) за счет изменения количества добавляемого А агониста RARγ или другого аналогичного компонента.
[0064]
(Пример 2 получения лекарственного средства) Глазная мазь
В 100 мг содержится
А агонист RARγ 0,3 г
Жидкий парафин 10,0 г
Белый вазелин соответствующее, подбираемое количество
А агонист RARγ добавляют к размягченным до гомогенного состояния белому вазелину и жидкому парафину. Смесь хорошо перемешивают и затем медленно охлаждают с получением глазной мази. Можно получить глазную мазь с концентрацией 0,05 вес. %, 0,1 вес. %, 0,5 вес. % или 1 вес. % за счет изменения количества добавляемого А агониста RARγ или другого аналогичного компонента.
[0065]
(Пример 3 получения лекарственного средства) Таблетка
В 100 мг содержится
А агонист RARγ 1 мг
Лактоза 66,4 мг
Кукурузный крахмал 20 мг
Кальций-карбоксиметилцеллюлоза 6 мг
Гидроксипропилцеллюлоза 6 мг
Стеарат магния 0,6 мг
А агонист RARγ, кукурузный крахмал и лактозу перемешивают в смесителе. К полученной смеси добавляют кальций-карбоксиметилцеллюлозу и гидроксипропилцеллюлозу для гранулирования. После сушки смеси, корректируют размер полученных гранул. Добавляют стеарат магния и перемешивают его с полученными гранулами определенного размера, после чего смесь формируют в таблетки на таблеточной машине. При этом, можно получать таблетки с содержанием 0,1 мг, 10 мг или 50 мг в общем количестве 100 мг, за счет изменения содержания добавляемого А агониста RARγ или другого аналогичного соединения.
Пример 2
[0066]
(Тест-пример) Тест на подавление сокращения геля трехмерного коллагена под действием А агониста RARγ в различных первичных клетках, полученных от нормальных кроликов
Использовали первичные субконъюнктивальные фибробласты и первичные кератиноциты для оценки эффекта исследуемого соединения применительно к сокращению геля трехмерного коллагена, по методу Nishida et al.
[0067]
7
Как и в примере 1, первичные субкоъюнктивальные фибробласты растили и отделяли от пластины для культивирования. После промывки, получали клеточную суспензию. Полученную суспензию (1,1×10 клеток/лунку в MEM), раствор коллагена типа I (5 мг/мл), 10×MEM, буфер для восстановления и воду перемешивали на льду в соотношении 0,2:7:1:1:1,8 (объемное соотношение). В культуральную чашку со слоем 1% БСА инокулировали 0,5 мл смеси, с последующим инкубированием в течение одного часа при температуре 37°C с получением геля коллагена.
[0068]
Затем к указанному выше гелю добавляют аликвоты по 0,5 бессывороточной среды, к которым были добавлены определенное количество (1 нг/мл) TGF-β1 (R&D Systems) и А агониста RARγ, каждый из них в следующих концентрациях: 1 нМ, 10 нМ и 100 нМ. Далее гель, вместе с гелем, к которому была добавлена бессывороточная среда без исследуемого агента, инкубируют при температуре 37°C. По истечении 24 часов, начинают измерять диаметры гелей. Результаты измерения диаметров гелей, полученных через 48 часов, показаны на фиг. 2.
[0069]
Измеряют диаметр первичных кератиноцитов по процедуре, аналогичной описанной выше для первичных субконъюнктивальных фибробластов. Полученные результаты показаны на фиг. 3.
[0070]
Как видно из данных, проиллюстрированных на фиг. 2 и 3, при использовании для тестирования субконъюнктивальных фибробластов или кератиноцитов, А агонист RARγ подавлял не только деградацию коллагена, но также сокращение геля коллагена в связи с TGF. Этот результат указывает на то, что А агонист RARγ способствует восстановлению коллагена и оказывает эффект по подавлению ремоделирования ткани, которая происходит после воспаления, геморрагии, инфекции, хирургического вмешательства или повреждения в области глазной ткани, т.e. процессы образования волокон или рубцевания.
Пример 3
[0071]
(Тест-пример) Тест на подавление, под действием А, В или С агонистов RARγ, деградации геля трехмерного коллагена в первичных кератиноцитах, полученных от нормальных кроликов
Использовали первичные кератиноциты кролика для оценки эффекта исследуемого соединения в направлении подавления деградации геля трехмерного коллагена, с использованием той же процедуры, что и в случае примера 1, по методу Nishida et al.
[0072]
7
Как и в примере 1, первичные кератиноциты, после культивирования, отделяли их от пластины для культивирования. После промывки, получали клеточную суспензию. Смешивали на льду полученную суспензию (1,1×10 клеток/лунку в MEM), раствор коллагена типа I (5 мг/мо), 10×MEM, буфер для восстановления и воду в соотношении 0,2:7:1:1:1,8 (объемное соотношение). В чашку для культуры со слоем 1% БСА инокулировали 0,5 мл смеси, с последующим инкубированием в течение одного часа при температуре 37°C с получением геля коллагена.
[0073]
2
После получения геля, начинали культивирование (при температуре 37°C и 5% CO) при добавлении к MEM среде раствора диметилсульфоксида, содержащего А агонист RARγ (R667) (1 нМ), раствора диметилсульфоксида, содержащего В агонист RARγ (CD437) (1 нМ, 10 нМ), раствора диметилсульфоксида, содержащего С агонист RARγ (BMS961) (10 нМ) или раствора диметилсульфоксида без агониста RARγ, в качестве контроля, и 10 нг (до конечной концентрации 10 нг/мл) IL-1β (номер продукта 201-LB-005; R&D Systems) и 60 мкг (до конечной концентрации 60 мкг/мл) Плазминогена (Plasminogen) (номер продукта P9156, Sigma Aldrich), в качестве стимулятора, и наслаивали указанную среду на полученный ранее гель коллагена.
[0074]
Через 48 часов после начала культивирования, проводили гидролиз коллагена и определяли количество гидроксипролина, который представляет собой продукт деградации коллагена, с использованием для его определения того же способа, что и в примере 1, для оценки эффекта каждого из исследуемых агонистов RARγ по подавлению деградации коллагена. Полученные результаты показаны на фиг. 4.
[0075]
В настоящем тесте, было показано, что не только А агонист RARγ, но также В и С агонисты RARγ оказывали эффект в направлении подавления деградации коллагена, связанной с кератоконъюнктивитом.
Пример 4
[0076]
(Тест-пример) Тест на подавление, под действием А агониста RARγ, экспрессии и активации MMP-1, 2, 3 и 9
Считается, что секреция или экспрессия протеазы, т.e. в данном случае матричных металлопротеиназ (MMP), ассоциирована с деградацией коллагена типа I. В этой связи, исследовали эффект А агониста RARγ, применительно к подавлению экспрессии и активации MMP-1, 2, 3 и 9.
[0077]
-6
-5
-4
-3
-2
Первичные кератиноциты, отобранные из нормального глазного яблока кролика, культивировали в течение 24 часов в бессывороточной среде MEM. К полученному культуральному раствору добавляли А агонист RARγ (R667) (концентрация R667: 1×10 мкМ, 1×10 мкМ, 1×10 мкМ, 1×10 мкМ, 1×10 мкМ) и проводили предварительную обработку в течение 12 часов. В качестве положительного контроля использовали вариант, в случае которого добавляли 10 нМ синтетического стероида дексаметазона (Dex) и аналогичным образом проводили предварительную обработку. Затем, добавляли IL-lβ (0,1 нг/мл), для стимуляции, и через 24 часа отбирали супернатант. С использованием полученного таким образом культурального раствора, проводили вестерн-блот анализ и желатиновую зимографию.
[0078]
(Вестерн-блот анализ)
После разделения супернатанта указанного выше культурального раствора по методу ДСН-ПААГ с использованием для анализа 10% полиакриламидного геля, разделенные в результате анализа белки переносили на нитроцеллюлозный фильтр. Затем проводили блокирование неспецифических сайтов на нитроцеллюлозном фильтре, с последующим инкубированием в течение 24 часов при температуре 4°C с использованием антител против MMP-l человека (R&D Systems) и антител против MMP-3 кролика (Daiichi Fine Chemical Co., Ltd) . Для детекции использовали ECL реактив (GE Healthcare).
[0079]
Полученные результаты показаны на фиг. 5A. Из приведенных данных видно, что происходит уменьшение полосы, соответствующей неактивным Pro-MMP-1 и Pro-MMP-3, как и активным MMP-1 и MMP-3, и степень такого уменьшения зависит от концентрации А агониста RARγ. Таким образом, было показано, что А агонист RARγ подавляет, в зависимости от используемой концентрации, экспрессию и активацию MMP-1 и MMP-3.
[0080]
(Желатиновая зимография)
После разделения супернатанта указанного выше культурального раствора по методу ДСН-ПААГ с использованием для анализа 10% полиакриламидного геля, содержащего 0,1% желатин, проводили инкубацию в течение одного часа при комнатной температуре с раствором TBS, содержащим 2,5% Тритон X-100. Полученный после инкубации гель сушат с использованием раствора Coomassie Brilliant Blue (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) и затем обесцвечивают 5% раствором, содержащим метанол и 7,5% уксусную кислоту (Nacalai Tesque, Inc).
[0081]
Полученные результаты показаны на фиг. 5B. Из приведенных данных видно, что наблюдается уменьшение полосы, соответствующей неактивным Pro-MMP-2 и Pro-MMP-9, а также активным MMP-2 и MMP-9, и степень такого уменьшения зависит от концентрации А агониста RARγ. Таким образом, было показано, что А агонист RARγ подавляет, в зависимости от используемой концентрации, экспрессию и активацию MMP-2 и MMP-9.
Пример 5
[0082]
(Тест-пример) Тест на подавление, под действием А агониста RARγ, помутнения и изъязвления роговицы
Проводили системную анестезию для используемых в тесте самцов японского белого кролика (вес тела 2,5-3,5 кг, 27 кроликов) путем внутримышечного введения раствора смеси кетамина и ксилазина. Затем проводили местную анестезию путем инстилляции 0,4% гидрохлорида оксибупрокаина. Далее инъецировали 30 мкл 1% ЛПС (Sigma Aldrich) в корнеальную строму одного глаза кролика, но не инъецировали в другой глаз.
[0083]
Кроликам с инъецированным ЛПС закапывали с помощью микропипетки по 50 мкл 0,1% раствора ФБР/0,1% полисорбата 80, содержащего А агонист RARγ (R667: 0,1%, 24 мМ), два раза после инъекции в день инъекции ЛПС и далее по четыре раза ежедневно до 10 дня. В качестве контрольного варианта, проводили введение, в аналогичном режиме, 0,1% раствора ФБР/0,1% полисорбата 80, не содержащего А агониста RARγ (носитель). На фиг. 6 приведены репрезентативные примеры, относящиеся к контролю и варианту введения А агониста RARγ.
[0084]
Как видно из данных, показанных на фиг. 6, помутнение роговицы и изъязвление наблюдаются в контрольном варианте (носитель), показанном в верхнем ряду. Тогда как в варианте введения А агониста RARγ (0,1% R667), который проиллюстрирован в нижней части графика, не наблюдаются ни помутнение роговицы, ни ее изъязвление. Таким образом, было показано, что А агонист RARγ подавляет помутнение роговицы и ее изъязвление.
[Промышленная применимость]
[0085]
Агонисты RARγ, которые являются эффективными ингредиентами лекарственного средства для лечения кератоконъюнктивального расстройства по настоящему изобретению, применяются при профилактике или в качестве лекарственного средства при лечении кератоконъюнктивальных расстройств, таких как язва роговицы, царапина эпителия роговицы, кератит, сухость глаза, конъюнктивит, хронический поверхностный кератит, эрозия роговицы, персистирующие корнеальные расстройства, поверхностная точечная кератопатия, дефекты эпителия роговицы, дефекты эпителия конъюнктивы, сухой кератоконъюнктивит, верхний лимбальный кератоконъюнктивит, филаментозный кератоконъюнктивит, инфекционный кератит, неинфекционный кератит, инфекционный конъюнктивит, неинфекционный конъюнктивит, за счет их выраженной способности подавлять деградацию коллагена. Кроме того, указанные агонисты RARγ также применяются в качестве лекарственного средства в случаях рубцевания роговицы или рубцевания конъюнктивы, связанных с кератоконъюнктивальным расстройством, за счет их выраженной способности подавлять сокращение коллагена.