СПОСОБ ОЧИСТКИ НЕЙТРАЛЬНОГО ОЛИГОСАХАРИДА ГРУДНОГО МОЛОКА С ПРИМЕНЕНИЕМ ХРОМАТОГРАФИИ С СИМУЛИРОВАННЫМ ДВИЖЕНИЕМ НЕПОДВИЖНОЙ ФАЗЫ

1. Способ очистки нейтрального олигосахарида грудного молока методом непрерывной хроматографии из неочищенного раствора, содержащего нейтральный олигосахарид грудного молока и загрязняющие вещества,
в котором неочищенный раствор, содержащий нейтральный олигосахарид грудного молока и загрязняющие вещества, содержит раствор или состоит из раствора, который выбран из группы, состоящей из экстракта микробиологической ферментации, реакционного раствора биокатализа, раствора химического синтеза и их сочетаний, причем чистота нейтрального олигосахарида грудного молока в растворе составляет <80%,
отличающийся тем, что к неочищенному раствору применяют по меньшей мере одну стадию очистки с использованием хроматографии с симулированным движением неподвижной фазы, при этом обеспечивают очищенный раствор, содержащий нейтральный олигосахарид грудного молока с чистотой ≥80%.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что чистота нейтрального олигосахарида грудного молока в неочищенном растворе составляет ≤70%, ≤60%, ≤50%, ≤40%, ≤30%, ≤20%, ≤10% или ≤5% и/или очищенный раствор содержит нейтральный олигосахарид грудного молока с чистотой ≥85%, предпочтительно ≥90%.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что по меньшей мере одна стадия хроматографии с симулированным движением неподвижной фазы включает
+
2+
i) по меньшей мере 4 колонки, предпочтительно по меньшей мере 8 колонок, более предпочтительно по меньшей мере 12 колонок, где по меньшей мере одна колонка содержит слабую или сильную катионообменную смолу, предпочтительно катионообменную смолу в Н форме или Са форме, и/или
ii) четыре зоны I, II, III и IV с различными скоростями потока, и/или
iii) элюент, содержащий воду или состоящий из воды, предпочтительно этанола и воды, более предпочтительно 5-15% (об.) этанола и 85-95% (об.) воды, наиболее предпочтительно 9-11% (об.) этанола и 89-91% (об.) воды, где элюент возможно дополнительно содержит серную кислоту, предпочтительно ≤10 мМ серной кислоты или менее, и/или
iv) рабочую температуру от 15°C до 60°C, предпочтительно от 20°C до 55°C, более предпочтительно от 25°C до 50°C.
4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что к очищенному раствору применяют по меньшей мере одну дополнительную стадию очистки с применением хроматографии с симулированным движением неподвижной фазы, при этом обеспечивают очищенный раствор, содержащий нейтральный олигосахарид грудного молока с чистотой ≥92%.
5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что дополнительная стадия хроматографии с симулированным движением неподвижной фазы включает
+
2+
i) по меньшей мере 4 колонки, предпочтительно по меньшей мере 8 колонок, более предпочтительно по меньшей мере 12 колонок, где по меньшей мере одна колонка содержит слабую или сильную катионообменную смолу, предпочтительно катионообменную смолу в Н форме или Са форме, и/или
ii) четыре зоны I, II, III и IV с различными скоростями потока, и/или
iii) элюент, содержащий воду или состоящий из воды, предпочтительно этанола и воды, более предпочтительно 5-15% (об.) этанола и 85-95% (об.) воды, наиболее предпочтительно 9-11% (об.) этанола и 89-91% (об.) воды, где элюент возможно дополнительно содержит серную кислоту, предпочтительно ≤10 мМ серной кислоты или менее, и/или
iv) рабочую температуру от 15°C до 60°C, предпочтительно от 20°C до 55°C, более предпочтительно от 25°C до 50°C.
6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что неочищенный раствор, содержащий нейтральный олигосахарид грудного молока и загрязняющие вещества, содержит экстракт микробиологической ферментации или состоит из экстракта микробиологической ферментации, причем экстракт микробиологической ферментации получают в по меньшей мере одной стадии микробиологической ферментации, за которой предпочтительно следует по меньшей мере одна из следующих стадий:
а) фильтрации раствора, предпочтительно неочищенного раствора, для отделения растворимого материала от нерастворимого материала после микробиологической ферментации,
б) ионообменной хроматографии, предпочтительно катионообменной хроматографии, более предпочтительно катионообменной хроматографии, за которой следует анионообменная хроматография раствора, предпочтительно раствора, полученного на стадии а),
в) концентрирования раствора, предпочтительно раствора, полученного на стадии б), более предпочтительно путем упаривания воды и/или путем нанофильтрации, факультативно путем концентрирования более одного раза,
г) диализа раствора, предпочтительно раствора, полученного на стадии в), более предпочтительно путем электродиализа и/или диафильтрации, наиболее предпочтительно диафильтрации с помощью нанофильтрационной мембраны, факультативно путем диализа более одного раза,
д) хроматографии раствора с применением хроматографии с симулированным движением неподвижной фазы, предпочтительно раствора, полученного на стадии г),
е) фильтрации раствора, предпочтительно раствора, полученного на стадии д), для отделения нейтрального олигосахарида грудного молока от окрашенных загрязнителей, более предпочтительно путем фильтрации через активированный уголь, и
ж) сушки распылением очищенного раствора, содержащего нейтральный олигосахарид грудного молока, предпочтительно очищенного раствора, полученного на стадии е),
при этом наиболее предпочтительно, если все стадии от а) до ж) осуществляют последовательно.
7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что перед тем, как подвергнуть раствор по меньшей мере одной стадии хроматографии с симулированным движением неподвижной фазы, раствор, содержащий нейтральный олигосахарид грудного молока,
i) фильтруют для удаления любого нерастворимого материала, предпочтительно фильтруют через активированный уголь, древесный уголь и/или целит для удаления любого нерастворимого материала и органических загрязняющих веществ, более предпочтительно фильтруют методом поперечноточной фильтрации, наиболее предпочтительно фильтруют методом поперечноточной фильтрации с применением микрофильтрационной мембраны, и/или
ii) применяют по меньшей мере одну стадию очистки с использованием катионообменной и/или анионообменной хроматографии, предпочтительно сначала по меньшей мере одну стадию катионообменной хроматографии и затем по меньшей мере одну стадию анионообменной хроматографии.
8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что перед тем, как подвергнуть раствор по меньшей мере одной стадии очистки с применением хроматографии с симулированным движением неподвижной фазы или после стадии очистки с применением хроматографии с симулированным движением неподвижной фазы, раствор, содержащий нейтральный олигосахарид грудного молока, подвергают электродиализу и/или диафильтрации, предпочтительно диафильтрации с использованием нанофильтрационной мембраны, более предпочтительно диафильтрации с использованием нанофильтрационной мембраны, имеющей размер эксклюзионного предела ≤20 Å, причем наиболее предпочтительно раствор подвергают диализу до проводимости ≤15 мСм/см, предпочтительно ≤10 мСм/см, более предпочтительно ≤5 мСм/см.
9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что после диализа раствор, содержащий нейтральный олигосахарид грудного молока концентрируют
i) до концентрации ≥100 г/л, предпочтительно ≥200 г/л, более предпочтительно ≥300 г/л, и/или
ii) применяя вакуумный концентратор, и/или
iii) методом нанофильтрации, и/или
iv) при температуре от 4°C до 50°C, предпочтительно от 10°C до 45°C, возможно от 20°C до 40°C или от 30°C до 35°C.
10. Способ по п. 1, отличающийся тем, что очищенный раствор подвергают стерилизующему фильтрованию и/или удалению эндотоксинов, предпочтительно путем фильтрации очищенного раствора через 3 кДа фильтр.
11. Способ по п. 1, отличающийся тем, что очищенный раствор сушат распылением, в частности сушат распылением при концентрации нейтрального олигосахарида грудного молока, составляющей 20-60% (масс./об.), предпочтительно 30-50% (масс./об.), более предпочтительно 35-45% (масс./об.), температуре форсунки 110-150°C, предпочтительно 120-140°C, более предпочтительно 125-135°C и/или температуре на выходе 60-80°C, предпочтительно 65-70°C.
12. Способ по п. 1, отличающийся тем, что нейтральный олигосахарид грудного молока представляет собой нейтральный олигосахарид грудного молока, содержащий более 3-х моносахаридных звеньев, предпочтительно нейтральный трисахарид, тетрасахарид, пентасахарид или гексасахарид грудного молока, более предпочтительно нейтральный олигосахарид грудного молока, выбранный из группы, состоящей из 2'-фукозиллактозы, 3-фукозиллактозы, 2',3-дифукозиллактозы, лакто-N-триозы II, лакто-N-тетраозы, лакто-N-неотетраозы, лакто-N-фукопентаозы I, лакто-N-неофукопентаозы I, лакто-N-фукопентаозы II, лакто-N-фукопентаозы III, лакто-N-фукопентаозы V, лакто-N-неофукопентаозы V, лакто-N-дифукогексаозы I, лакто-N-дифукогексаозы II, 6'-галактозиллактозы, 3'-галактозиллактозы, лакто-N-гексаозы, лакто-N-неогексаозы, пара-лакто-N-гексаозы, пара-лакто-N-неогексаозы и дифокузил-лакто-N-неогексаозы, наиболее предпочтительно нейтральный олигосахарид грудного молока является 2'-фукозиллактозой или лакто-N-тетраозой.
13. Способ по одному из пп. 1-12, отличающийся тем, что способ очистки нейтрального олигосахарида грудного молока в непрерывной хроматографии представляет собой способ очистки нейтрального олигосахарида грудного молока в непрерывном режиме, при этом нейтральный олигосахарид грудного молока предпочтительно является 2'-фукозиллактозой или лакто-N-тетраозой.
14. Нейтральный олигосахарид грудного молока, получаемый с помощью способа по любому из пп. 1-13, где нейтральный олигосахарид грудного молока предпочтительно высушен распылением.
15. Нейтральный олигосахарид грудного молока по п. 14, где нейтральный олигосахарид грудного молока имеет
i) форму твердых гранул, и/или
ii) температуру стеклования от 60 до 90°C, предпочтительно от 62 до 88°C, более предпочтительно 64 до 86°C, определенную методом дифференциальной сканирующей калориметрии, и/или
iii) размер частиц от 5 до 500 мкм, предпочтительно от 10 до 300 мкм, определенный методом лазерной дифракции, и/или
iv) средний размер частиц от 10 до 100 мкм, предпочтительно от 20 до 90 мкм, более предпочтительно от 30 до 80 мкм, наиболее предпочтительно от 40 до 70 мкм, определенный методом лазерной дифракции, и/или
v) аморфное состояние, предпочтительно аморфное состояние без каких-либо характеристических пиков кристаллического вещества в методов порошковой рентгеновской дифракции, и/или
vi) содержание влаги ≤10%, предпочтительно ≤8%, более предпочтительно <5%.
16. Нейтральный олигосахарид грудного молока по п. 14 для применения в медицине, предпочтительно для применения при профилактике или в терапии расстройства желудочно-кишечного тракта.
17. Нейтральный олигосахарид грудного молока по одному из пп. 14-16, отличающийся тем, что нейтральный олигосахарид грудного молока представляет собой нейтральный олигосахарид грудного молока, содержащий более 3-х моносахаридных звеньев, предпочтительно нейтральный трисахарид, тетрасахарид, пентасахарид или гексасахарид грудного молока, более предпочтительно нейтральный олигосахарид грудного молока, выбранный из группы, состоящей из 2'-фукозиллактозы, 3-фукозиллактозы, 2',3-дифукозиллактозы, лакто-N-триозы II, лакто-N-тетраозы, лакто-N-неотетраозы, лакто-N-фукопентаозы I, лакто-N-неофукопентаозы I, лакто-N-фукопентаозы II, лакто-N-фукопентаозы III, лакто-N-фукопентаозы V, лакто-N-неофукопентаозы V, лакто-N-дифукогексаозы I, лакто-N-дифукогексаозы II, 6'-галактозиллактозы, 3'-галактозиллактозы, лакто-N-гексаозы, лакто-N-неогексаозы, пара-лакто-N-гексаозы, пара-лакто-N-неогексаозы и дифокузил-лакто-N-неогексаозы, наиболее предпочтительно нейтральный олигосахарид грудного молока является 2'-фукозиллактозой или лакто-N-тетраозой.
18. Применение нейтрального олигосахарида грудного молока по одному из пп. 14-17 в качестве добавки в пищу, предпочтительно в качестве добавки в продукты питания, предназначенные для человека, и/или пищу домашних животных, более предпочтительно в качестве добавки в детское питание.