СОЗДАНИЕ ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ФИТОПАТОГЕНОВ МЕТОДОМ ТВЕРДОФАЗНОГО ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА

УДК 619:616.9:577.18

Н.Е. Павловская, доктор биологических наук, профессор N. Е. Pavlovsekaya, Doctor of Biological Sciences, professor Н.Ю. Солохина, кандидат биологических наук I.U. Solokhina, Candidate of Biological Sciences A.B. Лушников, научный сотрудник, аспирант A.V. Lushnikov, scientific researcher, postgraduate student

ФГБОУ ВО «Орловский государственный аграрный университет», Россия, Орёл Orel State Agricultural University, Russia, Orel

СОЗДАНИЕ ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ФИТОПАТОГЕНОВ МЕТОДОМ ТВЕРДОФАЗНОГО ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА

В настоящее время существует необходимость применения высокочувствительных и специфичных методов анализа растительного материала, зараженного фитопатогенами для выявления довизуальных признаков проявления болезней растений. Методы, основанные на иммуноферментном анализе, одним из которых является ELISA-тест (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA). Данный метод позволяет увеличить чувствительность анализа и сократить время тестирования до нескольких часов, является наиболее распространенным и широко используемым методом анализа растительного материала для диагностики и идентификации фитопатогенов. В после-денее время наблюдается повсеместное заражение овощных культур корневыми гнилями не только в открытых грунтах, но и в теплицах. Одним из распространенных повреждений растений является фузари-озное увядание, вызываемое грибами рода Fusarium spp. Была разработана тест-система с использованием метода иммуноферментного анализа на наличие фи-топатогена Fusarium oxysporum в овощных и зеленых культурах, обработанных различными препаратами. Выявлены образцы огурца сорта «Кураж», пораженные фузариозом.

Ключевые слова: твердофазный иммуноферментный анализ, фитопатогены, корневая гниль, Fusarium oxysporum, овощные культуры.

В настоящее время существует необходимость применения высокочувствительных и специфичных методов детекции для анализа растительного материала, зараженного фитопатогенами в низкой концентрации. Особенно важным является выявление довизуальных признаков проявления болезней растений. На сегодняшний день широкое применение находят методы, обеспечивающие чувствительность, специфичность и однозначность получаемых результатов

[3].

Первостепенное значение имеет производительность метода, т.е. возможность выполнять большое количество анализов за короткое время, которая определяется не только скоростью выполнения анализа и подготовительных процедур, но и удобством в работе при массовом применении. В наибольшей мере этим требованиям удовлетворяют методы, основан-

Currently, there is need for a highly sensitive and specific methods of analysis of the plant material infected with plant pathogens for identification dovizualnyh signs of the diseases of plants. Methods based on enzyme immunoassay, one of which is an ELISA-test (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA). This method allows to increase the sensitivity of the assay and to reduce testing time to a few hours, is the most common and widely used method for analysis of plant material for diagnosis and identification of plant pathogens. In posledenee there has been widespread contamination of vegetable root rot, not only in the open field, but in the greenhouses. One of the widespread damage plants is Fusarium wilt caused by fungi of the genus Fusarium spp. It was developed test system using a method of enzyme immunoassay for the presence of phytopathogen Fusarium oxysporum in vegetable and green cultures treated with different preparations. Revealed samples of cucumber variety "Courage", affected by Fusarium.

Key words: ELISA phytopathogens, root rot, Fusarium oxysporum, vegetable crops

ные на иммуноферментном анализе, одним из наиболее распространенных вариантов которого является ELISA. -тест (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA) - иммуноферментный твердофазный анализ [3; 4]. Данный метод позволяет увеличить чувствительность анализа и сократить время тестирования до нескольких часов. ELISA является наиболее распространенным и широко используемым методом анализа растительного материала для диагностики и идентификации фитопатогенов.

Диагностика фитопатогенов методом ИФА хорошо зарекомендована себя в широкомасштабных рутинных тестированиях растительного материала. В настоящее время специфичность иммуноферментного анализа в значительной степени увеличена за счет использования моноклональных и рекомбинантных антител [3; 5].

{ > }

Для определения антигенов и антител применяются твердофазный вариант иммуноферментного анализа. Использование твердой фазы позволяет упростить процесс разделения компонентов реакции за счет иммобилизации одного из компонентов на твердой фазе и удаления субстанций, не участвующих в реакции. Иммунохимические методы анализа, основанные на специфическом связывании определяемого соединения соответствующими антителами, широко вошли в аналитическую практику и используются в различных областях медицины, сельского хозяйства, микробиологической и пищевой промышленности [6].

Овощные культуры, как известно, поражаются многочисленными вирусными, бактериальными и грибными заболеваниями. Некоторые болезни являются серьезной угрозой при выращивании овощей.

При возделывании таких овощных и зеленых культур потери от фитопатогенов были и остаются основным фактором, оказывающим негативное влияние на урожайность и продуктивность. Причинами увеличения количества штаммов фитопатогенов, поражающих культуры: влияние климатических условий, высокая влажность, возделывание сортов со слабой устойчивостью к патогенам, появление новых штаммов.

За последние десятилетия наблюдается повсеместное заражение овощных культур корневыми гни-лями не только в открытых грунтах, но и в теплицах. Одним из распространенных повреждений растений является фузариозное увядание, вызываемое грибами рода Fusarium spp. [6].

Корневая гниль томата распространена как в закрытом, так и в открытом грунте и проявляется в течение всей вегетации. Заболевание является комплексным и возникает в результате неблагоприятных условий выращивания, которые ослабляют растения и этим самым способствуют развитию паразитных почвенных патогенов. Основными возбудителями заболевания являются грибы рода Fusarium. IIa пораженных фузариозом сеянцах заболевание проявляется в побурении корневой шейки и корня, стебель утончается, семядольные и молодые листочки увядают, растение погибает. У более взрослых растений желтеют и увядают листья, на нижней части стебля и и корне буреет кора, стебли размочаливаются, растение увядает и засыхает. IIa срезе корня хорошо видны побуревшие сосуды, в которых развивается мицелий гриба. Мицелий белый паутинистый, с розовым или желтоватым оттенком. Конидиеносцьт хорошо выраженные, простые или разветвленные. Макроконидии образуются на простых или разветвленных конидиенос-цах, обычно серповидные с различным характером и степенью изогнутости, с 3-5 перегородками. Микроконидии обильно образуются на длинных цилиндрических конидиеносцах, имеют овально-цилиндрическую форму и размеры 10,8 - 18,6 х 1,5 - 3 мкм. Хламидоспорьт одно-двухклеточньте, неокрашенные. Зараженные сеянцы отстают в росте (при сильном заражении часто погибают), семядоли желтеют и увядают [1] .IIa более крупных взрослых рас-

тениях первые симптомы болезни проявляются как пожелтение более старых нижних листьев и привяда-ния верхушек побегов, затем увядают целые побеги и гриб распространяется по растению вверх. Жилки листьев становятся более светлыми, черешки листьев деформируются. Листовая пластинка закручивается, а позже опадает, но может просто увядать и отмирать, без опадения с растения. Целые ветви приобретают желтую окраску, что в полевых условиях напоминает "желтые флаги". Часто наблюдается пожелтение листочков с одной стороны сложного листа или листьев с одной стороны ветки [2] .

Корневые гнили, вызываемые почвообитающими патогенами, являются наиболее вредоносными и распространенными заболеваниями огурца в защищенном грунте. Они распространены повсеместно в зоне выращивания культуры. Признаки проявляются во всех фазах развития растения. Зараженные проростки погибают, не достигая поверхности почвы, у молодой рассады наблюдаются задержка роста, пожелтение, опадение семядолей и полегание. Наиболее характерные симптомы наблюдаются в период цветения и начата плодоношения. Вначале верхняя часть растения увядает днем, а в ночные часы восстанавливается. Позднее растения увядают полностью и не могут восстановить свой тургор ни ночью, ни после полива. Наблюдается и острая форма развития болезни, при которой растение внезапно увядает и быстро засыхает. На разрезе основных междоузлий стебля наблюдается темное окрашивание тканей. На корневой шейке могут формироваться язвы, из-за которых она продольно растрескивается. Плоды пораженных растений очень горькие [2].

Фузариозное увядание перца начинается через несколько дней после его инфицирования. Течение болезни и ее проявления зависят от устойчивости растения и болезнетворности гриба, а также от условий среды. В растение инфекция проникает через корни, вызывая в дальнейшем их отмирание. Грибница развивается внутри сосудов стеблей. При осмотре диагонального среза стебля или корней, в проводящих тканях видны красновато-коричневые полосы. Вследствие этого растение увядает и погибает. Симптомы фузариозного увядания вначале проявляются в виде увядания и незначительного пожелтения верхних листьев. По мере развития болезни, увядающие листья приобретают окраску от бледно-зеленой до желто-коричневой. На поверхности зараженных плодов вокруг плодоножки появляются вдавленные сохнущие участки более темной окраски. Часто во влажных условиях на поверхности некрозов развивается спороношение розоватого цвета [2].

Фузариоз лука, или гниль донца лука проявляется в виде следующих симптомов: в период созревания лука наблюдается его быстрое отмирание, большинство корней сгнивает, в области донца луковицы развивается обильная белая грибница, луковицы размягчаются. В период созревания луковиц заболевание проявляется в виде быстрого отмирания листьев, которое начинается с усьтхания верхушки. В период

{ в }

хранения поражённые луковицы становятся мягкими, водянистыми, в области донца появляется сильно разросшаяся грибница. Иногда между чегпуями появляется розовый мицелий гриба в виде подуптечек [2].

Таким образом, актуальным является выявление довизуальных признаков развития болезней растения на ранних стадиях развития. Данную проблему успешно решает метод иммуноферментного анализа растений. Поэтому целью наптих исследований была разработка тест-системы с помощью метода иммуноферментного анализа на наличие фитопатогена Рг/яагшт охуярогит в овощных и зеленых культурах.

Материалы и методы исследований

Измельчали навеску растительного материала (листья и плоды) с фосфатно-солевым буферным раствором, рН 7,4 и стеклянным песком в ступке, центрифугировали при 10ОО об./мин. Отбирали из супер-натанта аликвоту в микропробирки и замораживали (-

20°С).

Для проведения анализа использовали стерильные планшеты Терассаки на 96 лунок, с адгезивным покрытием и И-образным дном. Готовили антитела 200 мг/л, нагружали по 100 мкл каждую лунку планшета, инкубировали 2 часа при 4°С, в атмосфере с 5% СО2. Троекратно отмывали 300 мкл раствора №С1 (0,15М), и 7 раз дистиллированной водой.

Вносили по 100 мкл раствора бычьего сывороточного альбумина (10 г/л) в 0,0IM фосфатном буферном растворе, содержащем NaCI (0,15М) и ТВИН 20 (0,05% w/v), pH 7,3±0,1, инкубировали 1 час при комнатной температуре. Промывали по той же схеме.

Подготовленные аликвоты доводили до комнатной температуры. В лунки планшета вносили 25 мкл контрольных и опытных образцов, инкубировали 1 час при 37°С на термостатируемом птейкере, с частотой встряхивания 650 оборотов в минуту, троекратно отмывали 300 мкл фосфатно-солевого буфера (ФСБ-Т, «Вектор Бест»),

Вносили 100 мкл раствора конъюгата, меченного пероксидазой хрена, инкубировали 30 минут при 37°С на термостатируемом птейкере, с частотой встряхивания 650 оборотов в минуту. Несвязавтпийся конъюгат декантировали, лунки планшета отмывапи фосфатно-солевым буфером, троекратно по 300 мкл.

Вносили 100 мкл хромогена в субстратно-буферном растворе (ТМБ+СБР, «Вектор Бест»), инкубировали 15 минут при комнатной температуре в темном месте. Добавляли 100 мкл HCl IN (Стоп-реагент, «Вектор Бест») для остановки реакции. Измеряли оптическую плотность при длине волны 450620 нм против холостой пробы на планшетном фотометре Multiscan EX.

Расчет критической и оптической плотности (Cut off) проводили по уравнению Cut off = А-К + В-К + С-КК + D. Результаты исследований приведены в таблице 1.

№ Позиция на плашнеге Образцы ГЭ450-620 Результат

- А ил Blank (холостая) X X

- ВР, К. (контроль полож.) 1,537 X

- С,. 2.1 КДконгроль отриц.) 0.130 X

- Di.v. КК (контроль качества) 1.425 X

Cut off 1,314 X

Огурцы сорт «Кураж»

1 Е,.2.1 Настоящий лист (предлагаемое средство) 0.975 -

2 F,.2.1 Настоящий лист (контроль) 0,793 -

3 Gp 1 Настоящий лист («Фи госпорин М») 1,320 +

4 Н] 7 1 Настоящий лист (ТгШоскгта уш<!ае) 1,498 +

5 А4.5.6 Начало цветения 0.691 -

Огурцы сорт «Кураж» (2 сбор)-листья

6 В4.5.6 Контроль зараженный 1,375 +

7 С4.5.6 Контроль незараженный 0,624 -

8 ГЭ4.5.6 «Фи госпорин М» (рекомендованный фон) 0,542 -

9 Е4.5.6 Препарат «ТпсЫзскшт уш<!ае» 100% фон 1.584 +

10 F4.5.6 Комплексное средство (рекоменд.фон) 0,697 -

11 G4.5.6 Контроль зараженный на 50% пестициде 1,584 +

12 Н4.5.6 Контроль незараженный на 50% пестициде 0,752 -

13 А7.8.4 «Фи госпорин М» (50% фон) 1.476 +

14 В?.8.ч Препарат «ТпсЫзскшт уш<!ае (50% фон) 1.741 +

15 С7.8.4 Комплексное средство на 50% фоне 0,890 -

Огурцы сорт «Кураж» (3 сбор)-листья

16 1^7.8.4 Контроль на 100% фоне 0,751 -

17 Е7.8.9 «Фи госпорин М» на 100% фоне 0,272 -

18 1*7.8.4 препарат «Тпс1юсЬгта уш<!ае (на100% фоне) 1,368 +

19 G7.8.') Комплексное средство на 100% фоне 0,774 -

{ ' }

Таблица 1 - Результаты критической и оптической плотности исследуемых образцов методом ИФА

20 Нтжо Контроль па 50% фоне 0.501 -

21 Л|0.1 I.I2 «Фигоспорип М» па 50% фоне 1.546 +

22 B|i).l I.I2 Препарат «ТпсЫккгта ( па 50% фоне) 1.925 +

23 С|0.| I.I2 Предлагаемое средство па 50% фоне 0.600 -

Огурцы сорт «Кураж» - плоды

24 D|0.| I.I2 Контроль па 100% фоне 0.356 -

25 Е|0.| I.I2 «Фитоспорип» па 100% фоне 0.735 -

26 F|0.l I.I2 препарат «Тпс1юсЬгта па100% фоне) 1.483 +

27 G|0.l I.I2 Комплексное средство па 100% фоне 0.835 -

28 II|0.II.I2 Контроль па 50% фоне 1.375 +

29 А|.2.3 «Фигоспорип М» па 50% фоне 1.374 +

30 В|.2.3 препарат «Тпс1юсЬгта \'шёае>Кпа 50% фоне) 1.963 +

31 с,.2.3 Предлагаемое средство па 50% фоне 0.956 -

Перец «Калифорнийское чудо» - листья

32 D,.2.3 Всходы без опрыскивания 1.069 -

33 Е|.2.3 Всходы с опрыскиванием 0.535 -

34 F|.2.3 До цветения без опрыскивания 1.298 -

35 Gi2.:,. До цветения с опрыскиванием 0.216 -

36 И.2.3 Цветение без опрыскивания 0.539 -

37 А4.5.6 Цветение с опрыскиванием 0.422 -

Перец «Клаудио»-листьн, плоды

38 04.5.6 Всходы без опрыскивания 1.069 -

39 С4.5.6 Всходы с опрыскиванием 0.978 -

40 D4.5.6 До цветения без опрыскивания 0.349 -

41 Е4.5.6 До цветения с опрыскиванием 0.892 -

42 F4.5.6 Цветение без опрыскивания 0.514 -

43 G4.5.6 Цветение с опрыскиванием 0.970 -

44 ' '4.5.6 Всходы (пестициды) 0.250 -

45 А7.8.Ч Всходы («Эпип») 0.429 -

46 В7.8.О До цветения (пестицид) 0.610 -

47 Cy.S.«) До цветения («Эпип») 1.006 -

48 Dy.s.«) Цветение (пестицид) 1.006 -

49 E7.S.4 Цветение («Эпип») 0.632 -

50 Пподы (пестицид) 0.901 -

51 G 7.8.9 Пподы («Эпип») 0.862 -

Томаты - листья и плоды

52 Н7.8.<, Пподы (пестициды) 0.591 -

53 Л|{).| |.|2 Пподы (пестицид + комплексное средство) 0.402 -

54 В|0.| I.I2 Пподы (комплексное средство) 0.429 -

55 С|0.| I.I2 Пподы контроль 0.414 -

56 D|0.| |.|2 Листья без обработки 0.734 -

57 El0.ll.l2 Листья, обработанные пестицидом 0.648 -

58 Flil.ll.l2 Листья, обработанные комплексным средством 0.820 -

Лук «Золотистый» и «Стригуновский» 14-е сутки

59 Gl0.ll.l2 Аммиачная селитра + «Эпип» (контроль) 0.930 -

60 "l0.ll.l2 Аммиачная селитра + комплексное средство (10"'' М) 0.495 -

61 А|.2.3 'А нормы аммиачной селитры + комплексное средство (10"'' М) 0.774 -

62 Bl.2.3 Предлагаемое средство (10_ч М) 0.501 -

63 с,.2.3 Аммиачная селитра + «Эпин» (контроль) 0.751 -

64 D |.2.з Аммиачная селитра + комплексное средство (10"'' М) 0.272 -

65 E|. 2.3 'А нормы аммиачной селитры + комплексное средство (10"'' М) 0.356 -

66 F 1.2.3 Комплексное средство (10"'' М) 0.735 -

Лук «Золотистый» и «Стригуновский» 25-е сутки

67 G 1.2.3. Аммиачная селитра + «Эпин» (контроль) 0.954 -

68 H,.2.3 Аммиачная селитра + комплексное средство (10~ч М) 0.422 -

69 A4.5.6 А нормы аммиачной селитры + комплексное средство (10"'' М) 0.833 -

70 B4.5.6 Комплексное средство (10~ч М) 0.508 -

71 C4.5.6 Аммиачная селитра + «Эпин» (контроль) 0.860 -

72 D4.5.6 Аммиачная селитра + комплексное средство (10~ч М) 0.261 -

73 E4.5.6 А нормы аммиачной селитры + комплексное средство (10"'' М) 0.393 -

74 F4.5.6 Комплексное средство (10"'' М) 0.672 -

Примечание: « + » положительный результат; « - » отрицательный результат; х-отсутствие результата -{ » )-

Результаты и их обсуждение

Полученные результаты свидетельствуют о наличии, либо отсутствии грибной инфекции в овощных и зеленых культурах. Разработанный метод им-муноферменного анализа является качественным

В ходе проведенных исследований установлены образцы овощных культур, давших положительную реакцию на возбудитель фузариоза: огурец сорта «Кураж»: первый сбор (листья) - при обработке препаратом «Фитоспорин М» на 50% фоне и препаратом «Тпс1тос1егта \тс1ае» на 50% и 100% фоне; второй сбор (листья) - контроль зараженный, образцы, обработанный препаратом «Тпс1тос1егта \тс1ае»на 50% и 100% фоне, контроль зараженный на 50% пестициде, при обработке препаратом «Фитоспорин М» на 50% фоне; третий сбор (листья) - образцы, обработанные

препаратом «Trichoderma viridae» на 50% и 100% фоне, препаратом «Фитоспорин М» на 50% фоне; плоды - выявлены образцы, обработанные препаратом «Trichoderma viridae» на 50% и 100% фоне, препаратом «Фитоспорин М»на 50% фоне, контроль на 50% фоне.

При обработке образцов комплексным средством, пестицидами, препаратом «Эпин» выявлены образцы овощных культур: перец сорта «Клаудио» и «Калифорнийское чудо», томаты, давшие стабильный отрицательный результат на возбудитель фузариоза.

Таким образом, создание тест-системы на основе иммуноферментного анализа может применяться в качестве метода определения фитопатогена Fusarium oxysporum, вызывающего корневые гнили овощных культур в условиях закрытого грунта.

Литература

1. Ахатов А.К. Мир томата глазами фитопатолога. -

М.: КМК. - 2012; 296 е., ил

2.Станчева И. Атлас болезней сельскохозяйственных культур. Том 1. Болезни овощных культур. -Пенсофт. - София-Москва. - 2005. - 2-е изд.

3. Нетесова И.Г., Бобкова М.Р. Внутрилабораторный

контроль качества неколичественных методов ИФА: информационно-методическое пособие / И.Г. Нетесова, М.Р. Бобкова. - Новосибирск: Вектор-Бест, 2011 ;20 с.

4. Crowther J.H.. Monoclonal antibodies. Methods in

Mol. Biol. The ELI SA Guidebook 516, 225-289. -2009.

5. Clark, MF and AN Adams (1977). Characteristics of

the microplate method of enzyme linked immunosorbent assay for the detection of plant viruses. J. Gen. Virol 34:475-483.

6. Martin R.R., James D., Lcvesque C.A. 2000. Impact

of molecular diagnostic technologies on plant disease management.Annu.Rev.Phytopathol., 38:207239.

Поступила в редакцию: 01.12.15 г.

Н.Е. Павловская, доктор биологических наук, профессор, зав. кафедрой биотехнологии ФГБОУ ВО «Орловский государственный аграрный университет» tel.: 8-960-651-77-39, e-mail: ninel.pavlovsckaya@yatidex.ru

{