СПОСОБ И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ЭФФЕКТИВНОЙ ДОЗЫ ИЛИ ВОСПРИИМЧИВОСТИ К 5-ГИДРОКСИ-1Н-ИМИДАЗОЛ-4-КАРБОКСАМИДУ, СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА КСАНТОЗИНМОНОФОСФАТА, А ТАКЖЕ СРЕДСТВО И СПОСОБ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ МИЕЛОДИСПЛАСТИЧЕСКОГО СИНДРОМА
METHOD AND DEVICE FOR PREDICTING AN EFFECTIVE DOSE OR SUSCEPTIBILITY TO 5-HYDROXY-1H-IMIDAZOLE-4-CARBOXAMIDE, A METHOD FOR DETERMINING AMOUNT OF XANTHOSINE MONOPHOSPHATE, AND ALSO AN AGENT AND METHOD FOR TREATING MYELODYSPLASTIC SYNDROME

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
1. Область изобретения
[0001] Настоящее изобретение относится к способу прогнозирования эффективной дозы 5-гидрокси-1Н-имидазол-4-карбоксамида или его фармацевтически приемлемой соли или его гидрата для пациента, страдающего миелодиспластическим синдромом. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу прогнозирования того, восприимчив или нет пациент, страдающий миелодиспластическим синдромом, к лечению с использованием 5-гидрокси-1Н-имидазол-4-карбоксамида, или его соли, или его гидрата. Также настоящее изобретение относится к способу определения количества ксантозинмонофосфата в крови. Кроме того, настоящее изобретение относится к устройству для прогнозирования эффективной дозы 5-гидрокси-1Н-имидазол-4-карбоксамида для пациента, страдающего миелодиспластическим синдромом, и к устройству для прогнозирования того, восприимчив или нет пациент, страдающий миелодиспластическим синдромом, к лечению с использованием 5-гидрокси-1Н-имидазол-4-карбоксамида, или его соли, или его гидрата. Настоящее изобретение также относится к средству и способу лечения для использования в терапии пациента, страдающего миелодиспластическим синдромом, который предположительно восприимчив к лечению с использованием 5-гидрокси-1Н-имидазол-4-карбоксамида, или его соли, или его гидрата.
2. Описание предшествующего уровня техники
in vivo
[0002] Известно, что 5-гидрокси-1Н-имидазол-4-карбоксамид (далее обозначается как ʺсоединение Аʺ) или его соль или его гидрат используется в лечении миелодиспластического синдрома (MDS) (Cancer and Chemotherapy, 1989, Vol. 16, No. 1, pp. 123-130). Соединение А или его соль или его гидрат преобразуется  в рибозилмонофосфат (RMP) посредством аденинфосфорибозилтрансферазы (APRT) и ингибирует инозин-5'-монофосфат-дегидрогеназу (IMPDH). IMPDH представляет собой фермент, который продуцирует ксантозинмонофосфат (XMP) из инозинмонофосфата (IMP).
in vitro
[0003] В качестве ингибитора IMPDH известно иммуносупрессивное средство, такое как микофенольная кислота или микофенолята мофетил. В отношении указанных иммуносупрессивных средств сообщалось о методе оценки степени ингибирования ингибитором IMPDH, который включает добавление IMP  к клеточному лизату мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС), который представляет собой фракцию, содержащую лимфоциты, полученные из крови, с обеспечением ферментативной реакции посредством IMPDH, и определение количества XMP (Analytical Chemistry, 2012, Vol. 84, pp. 216-223).
[0004] В отношении анализа нуклеотидов сообщалось о способах с использованием гибридного метода жидкостной хроматографии, основанной на гидрофильном взаимодействии/масс-спектрометрии (HILIC-МС) и гибридного метода хроматографии с нормальными водными фазами/масс-спектрометрии (Analytical Chemistry, 2012, Vol. 84, pp. 1994-2001). Кроме того, в отношении анализа XMP сообщалось о способах, включающих хроматографию с обращенной фазой с использованием ион-парного реагента и ионообменной хроматографии.
in vivo
th
[0005] XMP, продуцированный IMPDH, дополнительно преобразуется путем ферментативной реакции  в гуанозинмонофосфат (GMP), гуанозиндифосфат (GDP) и гуанозинтрифосфат (GTP), которые, в свою очередь, служат в качестве вещества для синтеза нуклеиновых кислот (Stryer Biochemistry (7 edition), 2013, pp. 689-693).
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
in vivo
[0007] MDS является заболеванием, при котором может быть определена дисплазия морфологии клеток крови и снижение гематокритного числа, и терапевтические эффекты терапевтического средства оцениваются главным образом по гематологической ремиссии и положительной динамике заболевания. Тем не менее, поскольку для проявления эффектов терапевтического средства требуется некоторое время, трудно контролировать эффекты терапевтического средства в течение короткого промежутка времени. Способ, описанный в Analytical Chemistry, 2012, Vol. 84, pp. 216-223 требует сложных операций и времени для фракционирования мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC). Кроме того, указанный способ представляет собой способ, в котором для оценки добавляют неэндогенный IMP, а степень ингибирования IMPDH  отображается не точно.
[0008] Для анализа нуклеотидов был осуществлен ряд подходов. Тем не менее, поскольку нуклеотиды являются гидрофильными соединениями с низкой молекулярной массой, существует трудность в их удержании при обращенно-фазовой хроматографии, обычно используемой для анализа. Кроме того, поскольку нуклеотиды имеют фосфатную группу, они склонны к адсорбции и/или образованию размытых задних фонов во время анализа разделения. По этим причинам определение количества эндогенных нуклеотидов является затруднительным. Кроме того, существует много типов, обладающих аналогичными массой и структурой в метаболитах нуклеотидов. Так как во многих случаях эти метаболиты обладают весьма схожими свойствами и временем удерживания в жидкостной хроматографии (ЖХ), их трудно количественно различить методом тандемной масс-спектрометрии в сочетании с жидкостной хроматографией (ЖХ-МС). В Analytical Chemistry, 2012, Vol. 84, pp. 216-223 был описан анализ XMP. Тем не менее, этот метод относится главным образом к образцам, обогащенным XMP, и не является анализом эндогенного XMP, который присутствует в следовых количествах.
[0009] Целью настоящего изобретения является обеспечение простого и осуществляемого в течение короткого промежутка времени способа прогнозирования эффективной дозы соединения А или его соли или его гидрата для пациента, страдающего MDS.
Другой целью настоящего изобретения является обеспечение простого и осуществляемого в течение короткого промежутка времени способа прогнозирования того, восприимчив или нет пациент, страдающий миелодиспластическим синдромом, к лечению с использованием соединения А или его соли или его гидрата.
[0010] Следующей целью настоящего изобретения является разработка способа точного определения количества XMP, который присутствует в следовых количествах в крови.
Еще одной целью настоящего изобретения является разработка легко управляемого устройства для прогнозирования, в течение короткого промежутка, времени эффективной дозы соединения А или его соли или его гидрата для пациента, страдающего MDS, и устройства для прогнозирования того, восприимчив или нет пациент, страдающий миелодиспластическим синдромом, к лечению с использованием соединения А или его соли или его гидрата.
Еще одной целью настоящего изобретения является разработка лекарственного средства и способа для использования в лечении страдающего MDS пациента, теоретически восприимчивого к лечению с использованием соединения А или его фармацевтически приемлемой соли или его гидрата.
[0011] В результате интенсивных исследований с целью решения выше указанных задач, авторы настоящего изобретения обнаружили, что эффективная доза соединения А или его соли или его гидрата для пациента, страдающего MDS, и восприимчивость пациента, страдающего MDS, к лечению с использованием соединения А или его соли или его гидрата могут быть теоретически вычислены путем определения отклонения количества ХМР в крови. Кроме того, авторы настоящего изобретения обнаружили, что путем выбора условий определения в МС можно точно определить количество XMP, который присутствует в следовых количествах в крови. Настоящее изобретение было осуществлено на основе этих данных.
[0012] То есть в соответствии с настоящим изобретением предусмотрены следующие объекты.
[1] Способ прогнозирования эффективной дозы соединения А или его соли или его гидрата для пациента, страдающего MDS, включающий:
(a) Стадия определения (i) количества ХМР в крови, отобранной у пациента перед введением соединения А или его соли или его гидрата, и (ii) количества ХМР в крови, отобранной у пациента после введения соединения A, или его соли, или его гидрата, или количества ХМР в крови, полученной путем приведения крови, полученной у пациента перед введением соединения А или его соли или его гидрата, в контакт с соединением А или его солью или его гидратом;
(b) Стадия определения отклонения XMP от количества ХМР, полученного на стадии (а); и
(c) Стадия прогнозирования эффективной дозы соединения А или его фармацевтически приемлемой соли или его гидрата на основании отклонения XMP, полученного на стадии (b).
[0013] [2] Способ в соответствии с пунктом [1], в котором кровь представляет собой периферическую кровь.
[3] Способ в соответствии с пунктом [1] или [2], в котором стадия определения количества XMP представляет собой стадию, выполняемую с использованием условий, при которых примеси и XMP в крови можно количественно различать.
[4] Способ в соответствии с любым из пунктов [1]-[3], в котором стадия определения количества XMP представляет собой стадию определения количества XMP с помощью масс-спектрометрии (МС).
[0014] [5] Способ в соответствии с пунктом [4], в котором стадия определения количества XMP включает
(a1) стадию определения XMP в крови при двух различных условиях определения с помощью МС,
(a2) стадию определения соотношения ионной силы XMP в крови при двух различных условиях определения, полученных на стадии (а1), и
(a3) стадию проверки того, находится ли соотношение ионных сил ХМР в крови, полученное на стадии (а2), в пределах предварительно определенного диапазона.
[6] Способ в соответствии с пунктом [5], в котором стадия (a1) представляет собой стадию определения XMP в крови при двух различных условиях определения методом ЖХ-МС.
[7] Способ в соответствии с пунктом [6], в котором значение рН подвижной фазы, используемой для жидкостной хроматографии (ЖХ) составляет 7-11.
[8] Способ в соответствии с пунктом [6] или [7], в котором концентрация соли подвижной фазы, используемой для ЖХ, составляет 5 ммоль/л-300 ммоль/л.
[9] Способ по любому из пунктов [6]-[8], в котором подвижная фаза, используемая для ЖХ, является подвижной фазой, включающей водный раствор бикарбоната аммония.
[0015] [10] Способ по любому из [6]-[9], в котором ЖХ представляет собой жидкостную хроматографию, основанную на гидрофильном взаимодействии (HILIC).
[11] Способ по любому из пунктов [5]-[10], в котором два различных условия определения являются условиями обнаружения ионов и/или ионизации в МС.
[12] Способ в соответствии с любым из пунктов [1]-[11], в котором стадия (c) представляет собой стадию, включающую
(c1) стадию выражения отношения между временем после введения или временем контактирования соединения А или его соли или его гидрата и отклонением XMP, полученного на стадии (b), в виде функции между ними, и
(c2) стадию прогнозирования эффективной дозы соединения А или его фармацевтически приемлемой соли или его гидрата из функции, полученной на стадии (с1)
[13] Способ в соответствии с пунктом [12], в котором стадия (c2) представляет собой стадию, включающую стадию прогнозирования, что доза соединения А или его соли или его гидрата, в которой отклонение XMP больше или равно определенному отклонению в заданном периоде лечения, соответствует эффективной дозе.
[14] Способ в соответствии с пунктом [12], в котором стадия (c2) представляет собой стадию, включающую стадию прогнозирования, что доза соединения А или его соли или его гидрата, в которой отклонение XMP больше или равно заданному отклонению в период больший или равный определенной пропорции заданного периода лечения, соответствует эффективной дозе.
[0016] [15] Способ прогнозирования того, восприимчив или нет пациент, страдающий миелодиспластическим синдромом, к лечению с использованием соединения А или его соли или его гидрата, включающий:
(a) Стадию определения (i) количества ХМР в крови, отобранной у пациента перед введением соединения А или его соли или его гидрата, и (ii) количества ХМР в крови, отобранной у пациента после введения соединения А или его соли или его гидрата, или количества ХМР в крови, полученной путем приведения крови, взятой у пациента перед введением соединения А или его соли или его гидрата, в контакт с соединением А или его солью или его гидратом;
(b) Стадию определения отклонения XMP от количества ХМР, полученного на стадии (a); и
(c) Стадию прогнозирования того, является пациент восприимчивым или нет к лечению с использованием соединения А или его фармацевтически приемлемой соли или его гидрата, исходя из отклонения XMP, полученного на стадии (b).
[0017] [16] Способ в соответствии с пунктом [15], в котором кровь представляет собой периферическую кровь.
[17] Способ в соответствии с пунктом [15] или [16], в котором стадия определения количества XMP представляет собой стадию, осуществляемую с использованием условий, при которых примеси и XMP в крови могут количественно отличаться.
[18] Способ в соответствии с любым из пунктов [15]-[17], в котором стадия определения количества XMP представляет собой стадию определения количества XMP с помощью масс-спектрометрии.
[0018] [19] Способ в соответствии с пунктом [18], в котором стадия определения количества XMP представляет собой стадию, включающую:
(a1) стадию определения XMP в крови при двух различных условиях определения с помощью МС,
(a2) стадию определения соотношения ионной силы XMP в крови при двух различных условиях определения, полученного на стадии (a1), и
(a3) стадию проверки того, находится ли соотношение ионных сил ХМР в крови, полученной на стадии (а2), в пределах предварительно определенного диапазона.
[20] Способ в соответствии с пунктом [19], в котором стадия (a1) представляет собой стадию определения XMP в крови при двух различных условиях определения посредством ЖХ-МС.
[21] Способ в соответствии с пунктом [20], в котором значение pH подвижной фазы, используемой для ЖХ, составляет 7-11.
[22] Способ в соответствии с пунктом [20] или [21], в котором концентрация соли подвижной фазы, используемой для ЖХ, составляет 5 ммоль/л-300 ммоль/л.
[23] Способ в соответствии с любым из пунктов [20]-[22], в котором подвижная фаза, используемая для ЖХ, является подвижной фазой, включающей водный раствор бикарбоната аммония.
[0019] [24] Способ в соответствии с любым из пунктов [20]-[23], в котором ЖХ представляет собой HILIC.
[25] Способ в соответствии с любым из пунктов [19]-[24], в котором два различных условия определения представляют собой условия обнаружения ионов и/или ионизации в МС.
[26] Способ в соответствии с любым из пунктов [15]-[25], в котором стадия (c) представляет собой стадию, включающую:
(c1) Стадию выражения отношения между временем после введения или временем контактирования соединения А или его соли или его гидрата и отклонением XMP, полученным на стадии (b) в виде функции между ними, и
(c2) Стадию прогнозирования того, является пациент восприимчивым или нет к лечению с использованием соединения А или его фармацевтически приемлемой соли или его гидрата из функции, полученной на стадии (c1).
[27] Способ в соответствии с пунктом [26], в котором стадия (c2) представляет собой стадию, включающую стадию прогнозирования того, что пациент является восприимчивым к лечению с использованием соединения А или его фармацевтически приемлемой соли или его гидрата, в том случае, когда отклонение ХМР больше или равно предварительно установленномуотклонению в заданном периоде лечения.
[28] Способ в соответствии с пунктом [26], в котором стадия (c2) представляет собой стадию, включающую стадию прогнозирования того, что пациент является восприимчивым к лечению с использованием соединения А или его фармацевтически приемлемой соли или его гидрата, в том случае, когда отклонение ХМР больше или равно определенному отклонению в период больший или равный определенной части заданного периода лечения.
[0020] [29] Способ определения количества XMP в крови, включающий:
(a1) стадия определения XMP в крови при двух различных условиях определения с помощью МС;
(a2) стадия определения соотношения ионной силы XMP в крови при двух различных условиях определения, полученного на стадии (a1); и
(a3) стадия проверки того, находится ли соотношение ионных сил ХМР в крови, полученной на стадии (а2), в пределах предварительно определенного диапазона.
[30] Способ в соответствии с пунктом [29], в котором стадия (a1) представляет собой стадию определения XMP в крови при двух различных условиях определения посредством ЖХ-МС.
[0021] [31] Способ в соответствии с пунктом [30], в котором значение pH подвижной фазы, используемой для ЖХ, составляет 7-11.
[32] Способ в соответствии с пунктом [30] или [31], в котором концентрация соли подвижной фазы, используемой для ЖХ, составляет 5 ммоль/л-300 ммоль/л.
[33] Способ в соответствии с любым из пунктов [30]-[32], в котором подвижная фаза, используемая для ЖХ, является подвижной фазой, включающей водный раствор бикарбоната аммония.
[34] Способ в соответствии с любым из пунктов [30]-[33], в котором ЖХ представляет собой HILIC.
[35] Способ в соответствии с любым из пунктов [29]-[34], в котором два различных условия определения представляют собой условия обнаружения ионов и/или ионизации в МС.
[0022] [36] Устройство для прогнозирования эффективной дозы соединения А или его соли или его гидрата для пациента, страдающего MDS, включающее:
(A) средство определения (i) количества XMP в крови, отобранной у пациента перед введением соединения А или его соли или его гидрата, и (ii) количества ХМР в крови, отобранной у пациента после введения соединения А или его соли или его гидрата, или количества ХМР в крови, полученной путем приведения крови, взятой у пациента перед введением соединения А или его соли или его гидрата, в контакт с соединением А или его солью или его гидратом;
(B) средство определения отклонения XMP, исходя из количества XMP, полученного с помощью средства, описанного в (A); и
(C) средство прогнозирования эффективной дозы соединения А или его фармацевтически приемлемой соли или его гидрата, исходя из отклонения XMP, полученного с помощью средства, описанного в (B).
[37] Устройство в соответствии с пунктом [36], в котором средство определения количества XMP представляет собой средство, использующее прибор для МС.
[38] Устройство в соответствии с пунктом [37], в котором прибор для МС представляет собой прибор для ЖХ, соединенный с прибором для МС (прибор для ЖХ-МС).
[0023] [39] Прибор для прогнозирования того, восприимчив или нет пациент, страдающий миелодиспластическим синдромом, к лечению с использованием соединения А или его соли или его гидрата, включающий:
(A) средство определения (i) количества XMP в крови, отобранной у пациента перед введением соединения А или его соли или его гидрата, и (ii) количества ХМР в крови, отобранной у пациента после введения соединения А или его соли или его гидрата, или количества ХМР в крови, полученного путем приведения соединения А или его соли или его гидрата в контакт с кровью, отобранной у пациента перед введением соединения А или его соли или его гидрата;
(B) средство определения отклонения XMP, исходя из количества XMP полученного с помощью средства, описанного в пункте (A); и
(C) средство прогнозирования того, является пациент восприимчивым или нет к лечению с использованием соединения А или его соли или его гидрата исходя из отклонения XMP, полученного с помощью средства, описанного в пункте (B).
[40] Устройство в соответствии с пунктом [39], в котором средство, описанное в пункте (A) представляет собой средство с использованием прибора для МС.
[41] Устройство в соответствии с пунктом [40], в котором прибор для МС представляет собой прибор для ЖХ, соединенный с прибором для МС (Прибор для ЖХ-МС).
[0024] [42] Лекарственное средство для лечения пациента, страдающего MDS, где лечение включает стадию прогнозирования того, восприимчив или нет пациент, страдающий миелодиспластическим синдромом, к лечению с использованием соединения А или его соли или его гидрата,
где активный ингредиент представляет собой соединение A,
где стадия прогнозирования представляет собой стадию, включающую
(a) стадию определения (i) количества ХМР в крови, отобранной у пациента перед введением соединения А или его соли или его гидрата, и (ii) количества ХМР в крови, отобранной у пациента после введения соединения А или его соли или его гидрата, или количества ХМР в крови, полученной путем приведения крови, взятой у пациента перед введением соединения А или его соли или его гидрата, в контакт с соединением А или его солью или его гидратом,
(b) стадию определения отклонения XMP от количества ХМР, полученного на стадии (a), и
(c) стадию прогнозирования того, является пациент восприимчивым или нет к лечению с использованием соединения А или его соли или его гидрата, исходя из отклонения XMP, полученного на стадии (b), и
где пациент является пациентом, который теоретически восприимчив к лечению с использованием соединения А или его соли или его гидрата.
[0025] [43] Способ лечения MDS для использования в лечении пациента, страдающего MDS, включающий стадию прогнозирования того, восприимчив или нет пациент, страдающий миелодиспластическим синдромом, к лечению с использованием соединения А или его соли или его гидрата,
где активный ингредиент представляет собой соединение A,
где стадия прогнозирования представляет собой стадию, включающую
(a) стадию определения (i) количества ХМР в крови, отобранной у пациента перед введением соединения А или его соли или его гидрата, и (ii) количества ХМР в крови, отобранной у пациента после введения соединения А или его соли или его гидрата, или количества ХМР в крови, полученной путем приведения крови, взятой у пациента перед введением соединения А или его соли или его гидрата, в контакт с соединением А или его солью или его гидратом,
(b) стадию определения отклонения количества XMP от количества ХМР, полученного на стадии (a), и
(c) стадию прогнозирования того, является пациент восприимчивым или нет к лечению с использованием соединения А или его соли или его гидрата, исходя из отклонения XMP, полученного на стадии (b), и
где пациент является пациентом, теоретически восприимчивым к лечению с использованием соединения А или его фармацевтически приемлемой соли или его гидрата.
[0026] Способ прогнозирования согласно настоящему изобретению представлет способ, использующий кровь в качестве образца, посредстом которого возможно просто и в течение короткого промежутка времени определить эффективную дозу соединения А или его соли или его гидрата для пациента, страдающего MDS. Кроме того, возможно просто и в течение короткого промежутка времени прогнозировать восприимчив или нет пациент, страдающий миелодиспластическим синдромом, к лечению с использованием соединения А или его соли или его гидрата.
[0027] При теоретическом определении эффективной дозы, можно соответствующим образом установить дозу, необходимую для проявления достаточной эффективности лекарственного средства. Введение большего, чем необходимо, количества возможно избежать, и соответственно становится возможным уменьшить побочные эффекты. Кроме того, путем прогнозирования того является ли пациент восприимчивым или нет, возможно избежать ненужного введения пациенту, который не демонстрирует восприимчивость к соединению А или его соли или его гидрату.
[0028] С помощью способа прогнозирования согласно настоящему изобретению может точно определить количество XMP, который присутствует в следовых количествах в крови.
[0029] Устройство для прогнозирования в соответствии с настоящим изобретением представляет собой устройство, использующее кровь в качестве образца, и тем самым может быть использовано для простого и осуществляемого в течение короткого промежутка времени прогнозирования дозы соединения А или его соли или его гидрата для пациента, страдающего MDS. Кроме того, оно может быть использовано для простого и осуществляемого в течение короткого промежутка времени прогнозирования того, восприимчив или нет пациент, страдающий миелодиспластическим синдромом, к лечению с использованием соединения А или его соли или его гидрата.
[0030] Поскольку лекарственное средство и способ лечения в соответствии с настоящим изобретением используются в лечении пациента, страдающего MDS, который теоретически восприимчив к лечению с использованием соединения А или его фармацевтически приемлемой соли или его гидрата, можно избежать ненужного введения пациенту, который не демонстрирует восприимчивость к соединению А или его соли или его гидрату.
Способ и лекарственное средство по настоящему изобретению могут применяться к наборам для лечения пациентов, страдающих MDS, в соответствии с обычными способами.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0031] На фиг. 1 показан противоопухолевый эффект соединения A.
На фиг.2 показаны результаты PK/PD анализа (PK параметр: Cmax).
50
На фиг.3 показаны результаты PK/PD анализа (PK параметр: период выше IC).
На фиг.4 показаны результаты PK/PD анализа (PK параметр: AUC0-48).
На фиг.5 показаны результаты определения XMP в XMP стандарте и человеческой крови (образец) (условия определения: A и B).
На фиг.6 показаны результаты определения XMP в XMP стандарте и человеческой крови (образец) (условия определения: C и D).
На фиг.7 показаны результаты определения XMP в XMP стандарте и человеческой крови (образец) (условия определения: Aʹ и Bʹ).
На фиг.8 показаны результаты определения XMP в человеческой крови (условия ЖХ: a и b).
ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
[0032] Далее настоящее изобретение будет описано подробно. При этом выражение "(нижняя предельная величина)-(верхняя предельная величина)" означает диапазон, включительно, от первого числа, обозначающего нижнюю предельную величину, до второго числа, обозначающего верхнюю предельную величину.
Термин "лечение" означает профилактику или лечение заболевания.
Термин "лекарственное средство" означает вещество, которое используется в целях предупреждения или лечения заболевания.
Термин "период лечения" означает период воздействия лечения.
Ионная сила включает, например, силу соответствующего иона на площади пика или МС спектра, полученного из хроматограммы в ЖХ-МС.
Термин "XMP стандарт" означает препарат, который используется при определении XMP в крови. XMP стандарт может быть, например, натриевой солью ксантозинмонофосфата, которая является коммерчески доступной.
[0033] (1) Способ прогнозирования эффективной дозы соединения А или его соли или гидрата для пациента, страдающего MDS, а также способ прогнозирования того, восприимчив или нет пациент, страдающий миелодиспластическим синдромом, к лечению с использованием соединения А или его соли или его гидрата.
В способе в соответствии с настоящим изобретением стадия (а) включает определение (i) количества XMP в крови, отобранной у пациента перед введением соединения А или его соли или его гидрата, и (ii) количества ХМР в крови, отобранной у пациента после введения соединения А или его соли или его гидрата, или количества ХМР в крови, полученной путем приведения крови, полученной от пациента перед введением соединения А или его соли или его гидрата, в контакт с соединением А или его солью или его гидратом.
[0034] Примеры соли соединения А включают общеизвестные соли по основной группе или кислотной группе. Примеры солей по основной группе могут включать соли с минеральными кислотами, такими как хлористоводородная кислота, бромистоводородная кислота, фосфорная кислота и серная кислота; соли с органическими карбоновыми кислотами, такими как винная кислота, муравьиная кислота, уксусная кислота, фумаровая кислота, малеиновая кислота, лимонная кислота, трихлоруксусная кислота и трифторуксусная кислота; и соли с сульфоновыми кислотами, такими как метансульфоновая кислота, бензолсульфоновая кислота, п-толуолсульфоновая кислота, мезитиленсульфоновая кислота и нафталинсульфоновая кислота. Примеры солей по кислотной группе могут включать соли с щелочными металлами, такими как натрий и калий; соли с щелочно-земельными металлами, такими как кальций и магний; соли аммония; и соли с азотсодержащими органическими основаниями, такими как триметиламин, триэтиламин, трибутиламин, трометамол, пиридин, N,N-диметиланилин, N-метилпиперидин, N-метилморфолин, диэтиламин, дициклогексиламин, прокаин, дибензиламин, N-бензил-β-фенилэтиламин и N,N'-дибензилэтилендиамин. В числе вышеуказанных солей, предпочтительными солями соединения А являются их фармакологически приемлемые соли.
[0035] Соединение A или его соль или его гидрат могут быть получены способом, описанным, например, в JP1978-32124A (JP-S53-32124A), JP1983-24569A (JP-S58-24569A), WO2009/035168A или WO2013/047758A.
[0036] Отличительным признаком настоящего изобретения является применение в качестве индикатора количества XMP в крови. Ингибирующее действия IMPDH желательно оценивать с использованием клеток костного мозга, который подвержен патологическому изменению, для точного определения эффективной дозы лекарственного средства в MDS и восприимчивости к лекарственному средству. Тем не менее, поскольку при извлечении клеток костного мозга пациент переносит тяжелые физические и умственные нагрузки, частота извлечения является ограниченной. По этой причине для оценки ингибирующего эффекта IMPDH клетки костного мозга обычно недоступны. В настоящем изобретении впервые было обнаружено, что ингибирующий эффект IMPDH соединения А или его соли или его гидрата эквивалентен в клетках костного мозга и клетках периферической крови. Это дает возможность прогнозировать ингибирующий эффект IMPDH в отношении клеток костного мозга, исходя из ингибирующего действия IMPDH в отношении клеток крови, и поэтому стало возможным прогнозировать эффективную дозу лекарственного средства для лечения MDS и восприимчивости к лекарственному средству. Характеристики крови, используемой в настоящем изобретении, не имеют конкретных ограничений, и она может быть, например, периферической кровью, кровью, которая наполняет костный мозг, селезенку или печень, лимфатической жидкостью, тканевой жидкостью или пуповинной кровью, предпочтительно, периферической кровью. Отбор крови у пациента может быть осуществлен обычными способами, хорошо известными специалистам в данной области техники. Кроме того, кровь, используемая в настоящем изобретении, является, с точки зрения прогнозирования, простого и осуществляемого в течение короткого промежутка, предпочтительно, цельной кровью.
[0037] Стадия (а) по настоящему изобретению может быть осуществлена в любом одном из следующих двух вариантов осуществления. Первый вариант осуществления представляет собой вариант определения количества XMP в крови, отобранной у пациента перед введением соединения А или его соли или его гидрата, и количества XMP в крови, отобранной у пациента после введения соединения А или его соли или его гидрата.
Второй вариант осуществления представляет собой вариант определения количества XMP в крови, отобранной у пациента перед введением соединения А или его соли или его гидрата, или количества ХМР в крови, полученной путем приведения соединения А или его соли или его гидрата в контакт с кровью, отобранной у пациента перед введением соединения А или его соли или его гидрата.
in vitro
[0038] В первом варианте осуществления соединение А или его соль или его гидрат при введении пациенту оказывает свое действие при контакте с клетками крови в организме пациента. Во втором варианте осуществления при приведении крови, взятой у пациента перед введением соединения А или его соли или его гидрата, в контакт с соединением А или его солью или его гидратом  соединение А или его соль или его гидрат оказывает свое действие на клетки крови.
[0039] В настоящем изобретении количество XMP можно определить, например, с помощью масс-спектрометрии. Перед определением с помощью масс-спектрометрии проба крови может быть подвергнута грубому разделению пробы, например, удалением белка, или могут быть подвергнута разделению компонентов в пробе, например, с помощью ЖХ.
[0040] Поскольку белки, пептиды и липиды, содержащиеся в крови, являются типичными интерферирующими компонентами определения МС, эти интерферирующими компоненты могут быть предварительно удалены путем грубого разделения пробы. Например, грубое разделение может быть осуществлено посредством процесса фракционирования (например, фракционирование клеточных компонентов центрифугированием и удаление жидких компонентов и/или эритроцитов посредством процесса гемолиза), фильтрации, обработки удаленных белков, жидкофазной экстракции и/или твердофазной экстракции. Кроме того, грубое разделение пробы крови, наряду с операциями разделения и обнаружения компонентов, которые будут описаны ниже, также может быть осуществлено в реальном масштабе времени с переключением в положение предварительной колонки или основной колонки, и тому подобное.
[0041] Кроме того, в настоящем изобретении, после ЖХ разделения компонентов в пробе крови, пробу предпочтительно подают в прибор для МС.
В качестве способа разделения компонентов в пробе крови можно использовать HILIC, хроматографию с обращенной фазой (RP), хроматографию с использованием ион-парного реагента или ионнообменную хроматографию. Режимы и условия определения не имеют конкретных ограничений в тех рамках, пока обеспечиваются необходимое разделение и производительность, и элюирование может быть выполнено с композицией подвижной фазы, которая может быть введена в МС. Кроме того, может быть использован метод разделения, такой как капиллярный электрофорез или газовая хроматография.
[0042] Примеси, которые могут быть обнаружены при определении XMP, могут включать, например, соединение, имеющее массу аналогичную массе ХМР, соединение, которое продуцирует соединение, имеющее массу, аналогичную массе XMP путем деградации или т.п., и/или соединение, имеющее время элюирования ЖХ, аналогичное XMP. Соединение, имеющее массу, аналогичную XMP, может быть, например, изотопом GMP. Соединение, которое продуцирует соединение, имеющее массу, аналогичную массе XMP, путем деградации или тому подобное, может представлять собой, например, изотоп GDP и изотоп GTP. Соединение, имеющее время элюирования ЖХ, аналогичное XMP, может представлять собой, например, восстановленный никотинамидадениндинуклеотидфосфат (NADPH).
[0043] Стадию определения количества XMP с помощью масс-спектрометрии, предпочтительно, осуществляют с использованием условий, при которых примеси и XMP в крови могут количественно отличаться. При анализе настоящего изобретения было обнаружено, что примеси, которые могут быть обнаружены при определении XMP (масса 364,04), включают изотопы (масса 364,06 и масса 364,06) GMP (масса 363,06), имеющие аналогичную структуру и массу меньше на 1, изотопы исходного продукта распада GDP и GTP (что обеспечивает GMP путем распада в фрагмент ионизации), а двухвалентные ионы получают из NADPH.
[0044] В процессе определения методом ЖХ-МС предпочтительным является устранение влияния примесей и избирательное обнаружение XMP. В настоящем изобретении путем установления метода проверки, несмотря на то, что XMP обнаруживается достаточно конкретно, становится возможным избирательно и удобно определить количество XMP с высокой точностью даже в условиях, когда присутствуют широкий набор и большое количество примесей.
[0045] Предпочтительно, стадия определения XMP представляет собой стадию, включающую
(a1) стадию определения XMP в крови при двух различных условиях определения с помощью МС,
(a2) стадию определения соотношения ионных сил XMP в крови при двух различных условиях определения, полученных на стадии (a1), и
(a3) стадию проверки того, находится ли соотношение ионных сил ХМР в крови, полученное на стадии (а2), в пределах предварительно определенного диапазона.
[0046] Описание метода определения XMP, включая пункты (a1)-(a3), будет представлено в настоящем документе ниже.
[0047] Количественная оценка XMP может быть осуществлена известным количественным методом, таким как метод калибровочной кривой (метод внешнего стандарта, метод стандартной добавки или метода внутреннего стандарта), или методом изотопного разбавления, при этом количественный метод не имеет конкретных ограничений.
[0048] В настоящем изобретении, после стадии (а) на стадии (b) осуществляется стадия определения отклонения XMP от количества ХМР, полученного на стадии (а).
[0049] Способ определения отклонения ХМР специально не ограничивается, и отклонение XMP может быть вычислено, например, в соответствии со следующим уравнением.
Отклонение (%)=(1-(количество XMP после введения соединения А или его соли или его гидрата/количество XMP перед введением соединения А или его соли или его гидрата))×100
или
Отклонение (%)=(1-(количество XMP после приведения в контакт с соединением А или его солью или его гидратом/количество XMP перед приведением в контакт с соединением А или его солью или его гидратом))×100
Кроме того, в качестве количества ХМР может также использоваться величина на единицу объема крови, однако предпочтительно используется величина на единицу количества клеток крови.
[0050] В настоящем изобретении после стадии (b) на стадии (c) прогнозируют эффективную дозу соединения A, или его соли, или его гидрата исходя из отклонения XMP, полученного на стадии (b), или прогнозируют, является ли пациент восприимчивым или нет к лечению, с использованием соединения А или его фармацевтически приемлемой соли или его гидрата, исходя из отклонения XMP, полученного на стадии (b).
[0051] Например, стадия (c) может быть выполнена в соответствии со (c1) стадией выражения отношения между временем после введения соединения A, или его соли, или его гидрата и отклонением XMP, полученным на стадии (b), в виде функции между ними, и (c2) стадией прогнозирования эффективной дозы соединения А или его соли или его гидрата из функции, полученной на стадии (c1). Кроме того, стадия (c) может быть выполнена в соответствии со (c1) стадией выражения отношения между временем после введения соединения A, или его соли, или его гидрата и отклонением XMP, полученным на стадии (b), в виде функции между ними, и (c2) стадией прогнозирования того, является пациент восприимчивым или нет к лечению с использованием соединения А или его соли или его гидрата, исходя из функции, полученной на стадии (c1).
[0052] Кроме того, стадия (c) может быть выполнена в соответствии со (c1) стадией выражения отношения между временем контакта соединения A, или его соли, или его гидрата и отклонением XMP, полученным на стадии (b), в виде функции между ними, и (c2) стадией прогнозирования эффективной дозы соединения А или его фармацевтически приемлемой соли или его гидрата из функции, полученной на стадии (c1). Кроме того, стадия (c) может быть выполнена в соответствии со (c1) стадией выражения отношения между временем контакта соединения A, или его соли, или его гидрата и отклонением XMP, полученным на стадии (b), в виде функции между ними, и (c2) стадией прогнозирования того, является пациент восприимчивым или нет к лечению с использованием соединения А или его соли или его гидрата, исходя из функции, полученной на стадии (c1).
[0053] На стадии (c2) прогнозируют, что доза соединения A, или его соли, или его гидрата, при которой отклонение ХМР больше или равно предварительно установленному отклонению (скорость снижения) в определенный период лечения, представляет собой эффективную дозу.
Кроме того, на стадии (c2) прогнозируют, что пациент является восприимчивым к лечению с использованием соединения А или его фармацевтически приемлемой соли или его гидрата в том случае, когда отклонение ХМР больше или равно определенному отклонению (скорость снижения) в определенный период лечения.
[0054] Предварительно установленный период лечения может быть соответствующим образом выбран в зависимости от вида организма. Например, заданный период лечения может быть составлять от одного дня до двух месяцев, или может также быть больше или равен заданному периоду лечения.
Период, больший или равный определенной части заданного периода лечения, может соответствующим образом быть выбран в зависимости от вида организма, и, например, он может соответствовать периоду, большему или равному 40% от заданного периода лечения.
Предварительно установленное отклонение может быть соответствующим образом выбрано в зависимости от вида организма, и, например, оно может составлять 45% или больше (предпочтительно, 50% или больше и, более предпочтительно, 55% или больше).
[0055] Например, может быть прогнозировано, что в период больший или равный 40% от периода лечения с использованием соединения А или его фармацевтически приемлемой соли или его гидрата, доза, при которой отклонение XMP (скорость снижения) соответвтвует 45% или больше (предпочтительно, 50% или больше и, более предпочтительно, 55% или больше), представляет собой эффективную дозу. Эффективная доза соединения A, или его соли, или его гидрата, полученная в соответствии снастоящим изобретением, может быть введена пациенту, страдающему MDS.
Кроме того, например, может быть прогнозировано, что в период больший или равный 40% периода лечения с использованием соединения А или его фармацевтически приемлемой соли или его гидрата, пациент является восприимчивым к лечению с использованием соединения А или его фармацевтически приемлемой соли или его гидрата в том случае, если отклонение XMP (скорость снижения) составляет 45% или больше (предпочтительно, 50% или больше и, более предпочтительно, 55% или больше). Соединение А или его соль или его гидрат могут быть введены пациенту, который спрогнозирован как воприимчивый.
[0056] (2) Способ определения количества XMP в крови
Способ определения количества XMP в крови в соответствии с настоящим изобретением представляет собой способ, включающий
(a1) стадию определения XMP в крови при двух различных условиях определения с помощью МС,
(a2) стадию определения соотношения ионной силы XMP в крови при двух различных условиях определения, полученных на стадии (a1), и
(a3) стадию проверки того, находится ли соотношение ионных сил ХМР в крови, полученное на стадии (а2), в пределах предварительно определенного диапазона.
[0057] На стадии (a1), XMP обнаруживают с помощью масс-спектрометрии. Стало возможным количественно различать XMP и примеси путем осуществления определения при двух различных условиях определения на стадии (а1), определения соотношения ионных сил XMP в крови при двух различных условиях определения на стадии (а2), и проверки того, находится ли соотношение ионных сил в пределах предварительно установленного диапазона на стадии (а3).
На стадии (a1) разделение пробы предпочтительно осуществляется с помощью ЖХ, и XMP обнаруживается с помощью масс-спектрометрии (ЖХ-МС).
[0058] В другом варианте осуществления, способ определения количества XMP в крови в соответствии с настоящим изобретением может представляет собой способ, включающий
(a11) стадию определения XMP стандарта и XMP в крови при двух различных условиях определения с помощью МС,
(a12) стадию определения соотношения ионных сил XMP стандарта и соотношения ионных сил XMP в крови при двух различных условиях определения, полученных на стадии (a11), и
(a13) стадию сравнения соотношения ионных сил XMP стандарта и соотношения ионных сил XMP в крови, полученных в (А12).
На стадии (a12) определяют соотношение ионных сил XMP стандарта и соотношение ионных сил XMP в крови при двух различных условиях определения, полученных на стадии (a11), и на стадии (a13) сравнивают соотношение ионных сил XMP стандарта и соотношение ионных сил XMP в крови, полученных на стадии (a12).
Здесь, в случае, когда соотношение ионных сил образца крови и соотношение ионных сил XMP стандарта находятся в предварительно установленном диапазоне, можно определить, что XMP в крови может быть обнаружен с высокой точностью. И наоборот, в случае, когда соотношение ионных сил образца крови и соотношение ионных сил XMP стандарта выходит за рамки предварительно установленного диапазона, определяли, что селективность была недостаточной при одном или обоих условиях, которые относятся к соотношению.
[0059] В ЖХ может использоваться HILIC, RP, хроматография с использованием ион-парного реагента или ионнообменная хроматография и, предпочтительно, HILIC.
[0060] В качестве подвижной фазы, используемой для ЖХ, может быть использована, предпочтительно, подвижная фаза А основного водного раствора и подвижная фаза В, содержащая органический растворитель.
Значение pH подвижной фазы А составляет, предпочтительно, 7-11, более предпочтительно, 8-11, еще более предпочтительно, 8,4-10,4 и, особенно предпочтительно, 9,0-9,8.
Значение pH подвижной фазы A может быть установлено в соответствии с типом колонки, которая будет использована.
Концентрация соли в подвижной фазе, используемой для ЖХ, составляет, предпочтительно, 5 ммоль/л-300 ммоль/л, и, более предпочтительно, 20 ммоль/л-200 ммоль/л.
В определении ЖХ-МС обычно используют низкую концентрацию соли для обеспечения высокой чувствительности (например, 10 ммоль/л), в то время как в настоящем изобретении используется более высокая концентрация соли по сравнению с типичной концентрацией соли, в результате чего стало возможным отделить XMP от примесей.
Подвижная фаза A, используемая для ЖХ, предпочтительно содержит водный раствор бикарбоната аммония.
[0061] Органический растворитель, используемый в подвижной фазе B, может представлять собой, например, ацетонитрил, метанол, 2-пропанол или этанол, и, предпочтительно, представляет собой ацетонитрил или метанол, и, более предпочтительно, ацетонитрил.
[0062] В одном из примеров в соответствии с настоящим изобретением XMP может быть отделен от примесей путем осуществления элюирования с использованием градиентного метода на HILIC колонке (например, SeQuant ZIC-pHILIC, производство Merck Ltd.) и 50 ммоль/л водного раствора бикарбоната аммония (доведенного до рН 9,4 с помощью 25 масс% водного раствора аммиака) и ацетонитрила в качестве подвижных фаз, с зависящим от времени изменением соотношения подвижной фазы и подвижной фазы B, или изократного метода с фиксированным соотношением подвижной фазы А и подвижной фазы B.
[0063] В том случае, когда в качестве подвижной фазы В используется ацетонитрил, концентрация ацетонитрила в подвижной фазе составляет, предпочтительно, от 20% по объему до 90% по объему, более предпочтительно, от 35% по объему до 70% по объему, и, еще более предпочтительно, 65% по объему. Элюирование может быть осуществлено путем градиентного элюирования с переменным соотношением подвижной фазы В и подвижной фазы А с течением времени, но изократический метод без изменения соотношения подвижной фазы А и подвижной фазы В является предпочтительным в том смысле, что улучшается разделение примесей, а анализ может быть осуществлен в условиях, когда вводимый объем повышается.
[0064] В настоящем изобретении методом МС определяется XMP в крови при двух различных условиях определения.
[0065] В методе МС компоненты образца ионизируются, и XMP-полученные ионы выбирают и обнаруживают с помощью прибора для МС. Для того чтобы обнаружить селективно XMP в большом количестве и широком ряде примесей, имеющих массу и структуры, аналогичные XMP, предпочтительно обеспечить эффекты фильтра высокой массы при помощи (1) определения в режиме МС/МС, (2) использование МС прибора высокого разрешения, или (3) использование обоих, (1) и (2). Кроме того, способ в соответствии с настоящим изобретением характеризуется установкой условий разделения и условий МС (условия обнаружения ионов и/или ионизации) таким образом, чтобы могла быть достигнута высокая селективность. В методе в соответствии с настоящим изобретением условия, в которых XMP и примеси могут количественно отличаться, могут быть использованы в комбинации разделения и обнаружения МС. Достаточность селективности может быть оценена способом, показанным на стадии (а1), стадии (а2) и стадии (а3). В настоящем изобретении, если достаточное разделение достигается в ЖХ, можно точно определить количество ХМР в крови, даже в случае использования МС прибора низкого разрешения, обычно используемого в фармакокинетике.
[0066] В случае использования МС прибора низкого разрешения, такого как трехквадрупольный МС прибор, для обеспечения специфичности количество XMP может быть определено методом МС/МС, таким как режим мониторинга множественных реакций (MRM). Предпочтительно определение при ряде условий, таких как обнаружение ион-продуктов методом многостадийной МС/МС, полученных из объекта для определения. Может быть выбрано условие, обеспечивающее хорошую специфичность в процессе анализа, и может быть выполнена описанная далее проверка специфичности.
[0067] Определения методом МС/МС или методом МС с использованием МС прибора с высокой разрешающей способностью, такого как Orbitrap MS (например, Q-Exactive, производство Thermo Co., Ltd.) и TOF MS (например, 6550iFunnelQ-TOF, производство компании Agilent Inc., и SYNAPT, производство Waters Corporation) способны выполнять определения с более высокой точностью. Несмотря на то, что разрешение прибора является предпочтительно высоким, предпочтительно использовать прибор, который может обеспечить чувствительность и динамический диапазон, необходимые для количественного анализа XMP.
[0068] На стадии (a1) в соответствии с настоящим изобретением определяется XMP в крови при двух различных условиях определения с помощью МС. Другими словами, ионы, полученные из XMP, определяются при двух различных условиях МС. В отношении двух различных условий определения, предпочтительно, чтобы условия обнаружения ионов и/или условия ионизации в МС представляли собой два разных условия определения. В частности, два разных условия определения могут представлять собой, например, определения ион-продуктов методом многостадийной МС/МС, которые встречаются в определениях методом МС/МС, определения в различных условиях ионизации (например, температура источника ионов (температура газа в турбонагревателе) или напряжение вводного ионного блока (диафрагма)) или определения в положительном и отрицательном режимах. Например, в случае определения ионов-продуктов методом многостадийной МС/МС, можно использовать сочетание иона-продукта с 97,0 (m/z), когда 365,0 (m/z) принимается в качестве иона-предшественника, и иона-продукта с 153,0 (m/z), когда 365,0 (m/z) принимается в качестве иона-предшественника, и сочетание иона-продукта с 97,0 (m/z), когда 365,0 (m/z) принимается в качестве иона-предшественника и иона-продукта с 213,0 (m/z), когда 365,0 (m/z) принимается в качестве иона-предшественника. В случае определения количества XMP в цельной крови, предпочтительно использовать сочетание иона-продукта с 97,0 (m/z), когда 365,0 (m/z) принимается в качестве иона-предшественника, и иона-продукта с 213,0 (m/z), когда 365,0 (m/z) принимается в качестве иона-предшественника. В случае определения количества XMP в гемолизе, предпочтительно использовать сочетание иона-продукта с 97,0 (m/z), когда 365,0 (m/z) принимается в качестве иона-предшественника, и иона-продукта с 153,0 (m/z), когда 365,0 (m/z) принимается в качестве иона-предшественника.
[0069] При каждом условии для оценки возможности конкретно обнаружить XMP (из опасения обнаружить примеси) соотношение ионных сил XMP, которое находится в пределах предварительно установленного диапазона, проверяется путем вычисления соотношения ионных сил при двух условиях определения, которые выбраны произвольно. То есть, на стадии (а2) в соответствии с настоящим изобретением определяют соотношение ионных сил XMP в крови при двух различных условиях определения, полученных на стадии (а1), и на стадии (a3) осуществляют проверку того, находится ли соотношение ионных сил XMP в крови, полученное на стадии (а2), в пределах предварительно установленного диапазона.
[0070] Соотношение ионных сил может быть вычислено, например, с помощью следующего уравнения.
Соотношение ионных сил=(сила ионов в условиях определения)/(сила иона-продукта с 97,0 (m/z), когда 365,0 (m/z) принимается в качестве иона-предшественника)
Здесь, в качестве силы ионов другого условия может быть использована, например, сила иона-продукта с 153,0 (m/z), когда 365,0 (m/z) принимается в качестве иона-предшественника, или сила ион-продукта с 213,0 (m/z), когда 365,0 (m/z) принимается в качестве иона-предшественника.
[0071] Здесь, в том случае, когда соотношение ионных сил образца крови находится в пределах предварительно установленного диапазона, можно определить, что XMP в крови может быть обнаружен с высокой точностью. И наоборот, в том случае, когда соотношение ионных сил образца крови находится за рамками предварительно установленного диапазона, то определяется, что селективность была недостаточной при одном или обоих условиях, которые определяются соотношение. Выражение "в предалах предварительно установленного диапазона" относится к случаю, когда соотношение ионных сил меньше 1 при вычислении соотношения ионных сил в соответствии с описанным выше уравнением. Когда интенсивность ионов другого условия соответствует силе иона-продукта с 213,0 (m/z), когда 365,0 (m/z) принимается в качестве иона-предшественника, соотношение ионных сил, предпочтительно, равно от 0,1 до 0,3. Для повышения точности определения проверка также может быть осуществлена в нескольких комбинациях, изменяя партнера, принимающего соотношение, относительно определенных условий. Для примесей, таких как GMP, которые могут быть обнаружены в момент определения ХМР, можно таким образом оценить присутствие или отсутствие частичного перекрытия. Проверка специфичности не ограничивается соотношением площадей пиков на хроматограмме или соотношением ионных сил в спектре, а метод проверки специально не ограничивается до тех пор, пока с помощью этого метода можно полностью опеделить специфичность. Если специфичность достаточна при конкретном условии определения, можно использовать результаты при таком условии определения. В том случае, когда специфичность недостаточна при конкретном условии определения, может быть достаточным рассмотреть условия разделения и обнаружения. Например, авторами настоящего изобретения было обнаружено, что детекция примесей может ослабляться изменением обнаруживамых МС/МС ионов-продуктов или снижением температуры источника ионов (температуры газа в турбонагревателе) и напряжения элемента введения ионов (диафрагма).
Кроме того, выражение "в пределах предварительно установленного диапазона", в случае сравнения соотношения ионных сил XMP стандарта и соотношения ионных сил XMP в крови, является случаем, когда соотношение ионных сил XMP в крови составляет 0,5-1,5 соотношения ионных сил XMP стандарта.
[0072] Как было описано выше, можно количественно определить XMP, исходя из ионов, обнаруженных при определении методом МС, который определил, что специфичность является достаточной.
[0073] (3) Прибор для прогнозирования эффективной дозы соединения A, или его соли, или его гидрата, и прибор для вычисления восприимчивости к соединению A или его соли или его гидрату
Кроме того, настоящее изобретение относится к устройству для прогнозирования эффективной дозы соединения А или его соли или его гидрата для пациента, страдающего MDS, и прибору для прогнозирования того, восприимчив или нет пациент, страдающий миелодиспластическим синдромом, к лечению с использованием соединения А или его соли или его гидрата. Прибор в соответствии с настоящим изобретением представляет собой прибор, включающий
(A) средство определения (i) количества XMP в крови, отобранной у пациента перед введением соединения А или его соли или его гидрата, (ii) количества ХМР в крови, отобранной у пациента после введения соединения A, или его соли, или его гидрата, или количества ХМР в крови, полученной путем приведения соединения А или его соли или его гидрата в контакт с кровью, отобранной у пациента перед введением соединения А или его соли или его гидрата,
(B) средство определения отклонения XMP от количества XMP, полученных с помощью средства, описанного в пункте (A), и
(C) средство прогнозирования эффективной дозы соединения А или его фармацевтически приемлемой соли или его гидрата или средство прогнозирования того, является или нет пациент восприимчивым к лечению с использованием соединения А или его фармацевтически приемлемой соли или его гидрата, исходя из отклонения XMP, полученного с помощью средства, описанного в пункте (B).
[0074] Средство, описанное в (А), специально не ограничивается до тех пор, как оно является средством, которое может определить количество ХМР в крови. Например, может быть использован прибор для МС. Кроме того, может также быть использован прибор с сочетанием сепаратора и прибор для МС. Например, может быть использован прибор для высокопроизводительной жидкостной хроматографии, прибор для капиллярного электрофореза или прибор для газовой хроматографии в качестве сепаратора. Предпочтительным является прибор для ЖХ-МС.
[0075] Прибор для МС обычно включает блок введения образца, источник ионов, блок анализа, блок детектирования ионов и блок обработки данных.
Блок введения образца представляет собой камеру для введения образца в прибор для МС. Например, при соединении прибора для МС с прибором для высокоэффективной жидкостной хроматографии, с прибором для электрофореза или с прибором для газовой хроматографии, из этих приборов также можно ввести образец пробы в прибор для МС.
[0076] Источник ионов представляет собой элемент для придания образцу электрического заряда, при этом известным методом придания электрического заряда является, например, метод электронной ионизации (EI), метод химической ионизации (CI), метод полевой десорбции (FD), метод с бомбардировкой ускоренными атомами (FAB), метод лазерной десорбции/ионизация при помощи матрицы (MALDI), метод фотоионизации при атмосферном давлении (APPI), метод ионизация при атмосферном давлении (APCI) или метод ионизации электрораспылением (ESI). В качестве источника ионов, применяемого в ЖХ-МС, могут быть использованы APPI, APCI или ESI. Предпочтительным является ESI.
[0077] Блок анализа представляет собой элемент, который отделяет ионизированный образец. В этом отношении известен анализатор, например, типа магнитного отклонения, квадрупольного типа, типа ионной ловушки, времяпролетного типа, типа ионный циклотронный резонанс с преобразованием Фурье и тандемного типа.
[0078] Блок детектирования представляет собой элемент, который обнаруживает отсортированные ионы с помощью блока анализа, затем подвергает их сенсибилизации с помощью электронного умножителем или микроканальной пластины.
Блок обработки данных представляет собой элемент для получения масс-спектра из полученных данных.
[0079] В качестве средства определения отклонения XMP, описанного в пункте (В), может быть любое средство, способное определить отклонение исходя из полученного количества XMP и описанного выше уравнения. Например, может быть использован электронный калькулятор (компьютер) с программным обеспечением расчета или программой.
[0080] Средство прогнозирования эффективной дозы соединения А или его фармацевтически приемлемой соли или его гидрата или средство прогнозирования того, является пациент восприимчивым или нет к лечению с использованием соединения А или его фармацевтически приемлемой соли или его гидрата, исходя из отклонения XMP, полученного с помощью средства, описанного в (B), каждое из которых описано в пункте (С), не имеет конкретных ограничений до тех пор, пока оно является средством, которое может прогнозировать эффективную дозу или чувствительность, исходя из отклонения ХМР на основе предварительно определенных критериев. Например, оно может быть выполнено с помощью универсального программного обеспечения. Например, можно использовать электронный калькулятор (компьютер), имеющий программу, включающую средство выражения отношения между временем после введения или временем контактирования соединения или его соли или его гидрата и отклонением XMP в виде функции между ними, и средство прогнозирования эффективной дозы соединения А или его фармацевтически приемлемой соли или его гидрата, или наличия или отсутствия восприимчивости к лечению с использованием соединения А или его фармацевтически приемлемой соли или его гидрата из полученной функции.
[0081] (4) Лекарственное средство для лечения MDS, в котором активный ингредиент представляет собой соединение A, и способ лечения MDS, в котором активный ингредиент представляет собой соединение A
Кроме того, настоящее изобретение относится к лекарственному средству для лечения MDS, в котором активный ингредиент представляет собой соединение A, и к способу лечения MDS, в котором активный ингредиент представляет собой соединение A, каждый из которых включает стадию прогнозирования того, восприимчив или нет пациент, страдающий миелодиспластическим синдромом, к лечению с использованием соединения А или его соли или его гидрата.
Стадия прогнозирования в соответствии с настоящим изобретением того, восприимчив или нет пациент, страдающий миелодиспластическим синдромом, к лечению с использованием соединения А или его соли или его гидрата, является такой, как описано выше.
В том случае, когда пациент, страдающий MDS, был определен как восприимчивый к лечению с использованием соединения А или его фармацевтически приемлемой соли или его гидрата, для лечения пациента используется лекарственное средство для лечения MDS, в котором активный ингредиент представляет собой соединение A.
[0082] В том случае, когда соединение A или его соль или его гидрат используется в качестве лекарственного средства для лечения MDS, обычно в композицию, при необходимости, могут быть добавлены фармацевтические добавки, такие как наполнители, носители и разбавители. Эти вспомогательные средства могут быть введены перорально или парентерально в соответствии с обычным способом, в форме, например, таблеток, капсул, порошков, сиропов, гранул, пилюль, суспензий, эмульсий, растворов, порошкообразных препаратов, свечей, глазных капель, капель в нос, ушных капель, пластырей, мазей или инъекций. Кроме того, хотя способ введения, доза и частота введения могут быть соответствующим образом выбраны в зависимости от возраста, веса и состояния пациента, предпочтительно выбрать такую дозу, при которой период, соответствующтй 40% или больше от периода лечения, отклонение XMP (скорость снижения) составляет 45% или больше (предпочтительно, 50% или больше, и, более предпочтительно, 55% или больше).
[0083] Настоящее изобретение далее описано более подробно со ссылкой на следующие примеры, однако настоящее изобретение ими не ограничивается.
Для анализа метаболома (Metabolome Analysis) использовали пробирку для ультрафильтрации UltrafreeMC-PLHCC 250/pk (производство Human Metabolome Technologies Inc.).
В качестве центробежного испарителя использовали miVac Duo HV (производство Genevac Inc.).
Использовали фосфатно-солевой буферный раствор, pH 7,4 (производство Thermo Fisher Scientific Inc.).
ПРИМЕРЫ
[0084] Пример 1. Ингибирующая рост клеток активность соединения А
В качестве исследуемого соединения использовали 3/4 гидрат соединения A.
SKM-1 (доступные от National Institute of Biomedical Innovation JCRB Cell Bank) использовали в качестве клеток линии миелолейкоза человека.
2
[0085] В 96-луночный планшет высеивали 90 мкл (5000 клеток) человеческих клеток линии миелолейкоза SKM-1. Добавляли 10 мкл фосфатно-солевого буферного раствора исследуемого соединения (0 мкмоль/л, 1 мкмоль/л, 3 мкмоль/л, 10 мкмоль/л, 30 мкмоль/л, 100 мкмоль/л, 300 мкмоль/л, 1000 мкмоль/л, 3000 мкмоль/л или 10000 мкмоль/л относительно соединения А) в планшет, который затем инкубировали в атмосфере 5% CO при 37°C в течение 72 часов. Для получения клеточного лизата в каждую лунку добавляли 100 мкл CellTiter-Glo (производство Promega).
Относительную величину интенсивности хемилюминесценции определяли с помощью планшета-ридера.
50
[0086] Значение IC соединения А составляло 21,5 мкмоль/л (2,73 мкг/мл соединения А). Соединение А демонстрировало превосходную антипролиферативную активность.
[0087] Пример 2 Определение концентрации лекарственного средства с помощью PK/PD анализа (фармакокинетический/фармакодинамический анализ)
(1) Противоопухолевые эффекты соединения A
В качестве исследуемого соединения использовали 3/4 гидрат соединения A.
Клетки SKM-1 использовали в качестве клеток миелолейкоза человека.
6
Самкам голых мышей (BALB/cAJcl-Nu/Nu) подкожно трансплантировали 5,0×10клеток миелолейкоза человека в правую боковую часть брюшка с образованием подкожной опухоли. На 9-й день после трансплантации, животных распределяли на 7 групп, каждая из которых состояла из 10 мышей. В таблице 1 показан состав групп. Для оценки противоопухолевых эффектов на 10-ый день после трансплантации периодически перорально вводили (в общей сложности пять курсов через 2 дня дозирования + четыре дня выведения в качестве лекарственного курса препаратов) контрольный растворитель (0,5 масс/объем% водный раствор метилцеллюлозы 400, далее обозначается как "0,5% МЦ") или исследуемое соединение, и объем опухоли определяли на 39-ый день после трансплантации. Степень ингибирования вычисляли по следующему уравнению.
Степень ингибирования (%)=(1-(объем опухоли на 39-ый день после трансплантации)/(объем опухоли в группе 1 на 39-ый день после трансплантации))×100
[0088]
Таблица 1
Группа №
Количество животных (особи)
Доза (мг/кг/день)
Доза (мг/кг/раз)
Частота дозирования (раз/день)
1
10
0<sup>*1</sup>
0
3
2
10
240
240
1
3
10
240
120
2
4
10
240
80
3
5
10
240
40
6
6
10
120
20
6
7
10
480
160
3
*1) вводили 0,5% МЦ
[0089] На фигуре 1 показан объем опухоли на 39-ый день после трансплантации.
В группе 4, группе 5, группе 6 и группе 7 демонстрировались превосходные противоопухолевые эффекты.
[0090] (2) PK тест соединения A
max
max
1/2
0-24
Самкам мышей (BALB/cAJcl) однократно не натощак перорально вводили исследуемое соединение (10 мг/кг, 40 мг/кг, 80 мг/кг и 160 мг/кг соединения А). Через 5 минут, 15 минут, 30 минут, 1 час, 2 часа, 5 часов, 10 часов или 24 часа гепаринизированную кровь собирали, и затем определяли концентрацию соединения А в плазме методом ЖХ/МС/МС, вычисляя таким образом PK параметры (t, C, t и AUC).
[0091] (3) PK/PD анализ
1
01
10
12
21
max
0-48
50
50
max
50
0-48
Фармакокинетические параметры V/F, K, K, K и K, двухкомпонентной модели вычисляли, исходя из динамики концентрации в плазме соединения А при однократном пероральном введении соединения А. Эти параметры использовали для определения динамики концентрации в плазме соединения А при повторном введении при различных схемах приема лекарственного средства. Кроме того, поскольку линейность определяли для 10 мг/кг-80 мг/кг, параметр 10 мг/кг дозирования использовали для определения во время повторного введения 20 мг/кг, 40 МГ/кг и 80 мг/кг. Параметр 160 мг/кг использовали для проведения прогнозирования для 120 мг/кг и 240 мг/кг. Исходя из полученной динамики концентрации в плазме соединения А вычисляли C (нг/мл), AUC (нг раз/мл) и период выше IC(%, значение IC: 21,5 мкмоль/л (2,73 мкг/мл соединения А)). PK параметры (C, период выше IC и AUC) откладывали на графике по оси X, а степень ингибирования объема опухоли откладывали по оси Y. Результаты представлены на фигурах 2, 3 и 4.
max
50
0-48
50
[0092] Исходя из того, что коэффициент корреляции между C и степенью ингибирования составляет -0,5447, коэффициент корреляции между периодом выше IC и степенью ингибирования составляет 0,9814, и коэффициент корреляции между AUC и степенью ингибирования составляет 0,4684, период выше IC представлял собой параметр, который максимально коррелирует со степенью ингибирования.
50
[0093] Кроме того, объем опухоли был статистически значимо ингибирован в группах, в которых период выше IC составляет 40% или больше. Таким образом, было прогнозировано, что важно, что концентрация лекарственного средства в плазме крови человека поддерживается на уровне 2,73 мкг/мл или выше в виде соединения А, в период 40% или больше от периода лечения.
[0094] Пример 3. Количественное определение XMP
(1-1) В пробирку добавляли 450 мкл крови, взятой у здоровых людей путем отбора гепаринизированной крови, и 50 мкл фосфатно-солевого буферного раствора, с последующим перемешиванием в инкубаторе при 37°C в течение 8 часов.
(1-2) К 100 мкл образца, полученного в (1-1), добавляли 400 мкл метанола. После перемешивания с помощью вортекс-миксера, добавляли 400 мкл хлороформа и перемешивали с помощью вортекс-миксера, затем добавляли 120 мкл сверхчистой воды. После перемешивания с помощью вортекс-миксера, реакционный раствор центрифугировали при 4°C и 10000×g в течение 15 мин. Извлекали 400 мкл водной фазы и добавляли в пробирку для ультрафильтрации, затем центрифугировали при 12°C и 9200×g в течение 2 часов. Фильтраты объединяли и потом сушили при пониженном давлении при 40°C в течение 2 часов с использованием центробежного испарителя. После сушки полученный продукт хранили в морозильной камере при -80°C.
(1-3) Образец растворяли в воде с последующим центрифугированием, и супернатант извлекали для использования в качестве образца определения. Образец определения и XMP стандарт подвергали ЖХ-МС/МС. Используемым XMP стандартом был XMP (ксантозин-5'-монофосфат, натриевая соль) (производство Jena Bioscience). Конфигурация прибора и условия определения приведены ниже.
[0095] (ЖХ-МС/МС)
LC: УВЭЖХ (производство Shimadzu Corporation)
МС: QTRAP 5500 (производство AB SCIEX)
(LC)
Колонка: SeQuant ZIC-pHILIC 5 мкм, полимерная PEEK 150×2,1 мм не содержащая металл ВЭЖХ колонка (производство Merck Ltd.)
Температура колоночного термостата: 40°C
Подвижная фаза A: 50 ммоль/л бикарбоната аммония (доводили до рН 9,4 с помощью 25% по массе водного раствора аммиака)
Подвижная фаза B: ацетонитрил
Скорость потока: 0,3 мл/мин
Градиентные циклы показаны в таблице 2. % в таблице 2 обозначают % по объему
[0096]
Таблица 2
Время (мин)
0
5,83
5,84
9,83
9,84
13,83
Подвижная фаза A (%)
30
65
100
100
30
30
Подвижная фаза B (%)
70
35
0
0
70
70
[0097] (МС/МС)
Ионизация: ESI положительная (положительная ионизация электрораспылением)
Режим сканирования: MRM (мониторинг множественных реакций)
Условия определения показаны в таблице 3.
[0098]
Таблица 3
Объект определения
Условия определения
Ион-предшественник (m/z)/Ион-продукт (m/z)
Температура (температура газа турбонагревателя)(°C)
Напряжение блока введения ионов (диафрагма) (В)
XMP
A
365,0/97,0
600
50
B
365,0/153,0
На фиг. 5 представлены результаты определения, полученные в (1-3).
[0099] (1-4) Анализ 1
Наблюдали множественные смежные пики на хроматограмме образца. Пик XMP в образце оценивали исходя из пика стандарта XMP для вычисления его площади. Для проверки специфичности, вычисляли соотношение площади пика в условии определения А и площади пика в условии определения B (B/A).
Результаты представлены в таблице 4.
[0100]
Таблица 4
Условия определения
Ион-предшественник (m/z)/ион-продукт (m/z)
Площадь пика
XMP стандарт
Образец (человеческая кровь)
A
365,0/97,0
83000
15000
B
365,0/153,0
29200
18700
Соотношение площадей пиков (B/A)
0,4
1,2
[0101] Соотношение площадей пиков образца (В А) составляло 1,2. Поскольку соотношение площадей пиков образца составляло 1 или больше, было определено, что специфичность является недостаточной в одном или обоих условиях определения А и В (примеси обнаружены с перекрытием).
[0102] (1-5) Анализ 2
В условия определения С и D, определяли XMP стандарт и образец, полученный в (3). Условия определения C и D представлены в таблице 5. Результаты определения XMP стандарта и образца показаны на фиг. 6 и в таблице 6.
[0103]
Таблица 5
Объект определения
Условия определения
Ион-предшественник (m/z)/Ион-продукт (m/z)
Температура (температура газа турбонагревателя)(°C)
Напряжение блока введения ионов (диафрагма) (В)
XMP
C
365,0/97,0
350
20
D
365,0/153,0
[0104]
Таблица 6
Условия определения
Ион-предшественник (m/z)/Ион-продукт (m/z)
Площадь пика
XMP стандарт
Образец (человеческая кровь)
C
365,0/97,0
94500
10300
D
365,0/153,0
33000
4540
Соотношение площадей пиков (D/C)
0,3
0,4
[0105] Соотношение площадей пиков образца (D/C) составляло 0,4. С точки зрения того, что соотношение площадей пиков образца составляет меньше 1, было определено, что обеспечивается хорошая специфичность.
Исходя из этого результата, было установлено, что количество XMP может быть определено при условиях определения С и D.
[0106] (2-1) Образец получали способом, аналогичным описанным в (1-1)-(1-3), за исключением того, что определение проводят при условиях определения, приведенных в таблице 7. Затем определяли XMP образца.
[0107]
Таблица 7
Объект определения
Условия определения
Ион-предшественник (m/z)/Ион-продукт (m/z)
Температура (температура газа турбонагревателя)(°C)
Напряжение блока введения ионов (диафрагма)(В)
XMP
Aʹ
365,0/97,0
350
20
Bʹ
365,0/213,0
[0108] На фиг.7 показаны результаты определения, полученные в (2-1)
[0109] (2-2) Анализ
Для оценки специфичности, вычисляли соотношение площадь пика при условии определения А' и площади пика при условии определения В' (В'/А'). Результаты представлены в таблице 8.
[0110]
Таблица 8
Условия определения
Ион-предшественник (m/z)/Ион-продукт (m/z)
Площадь пика
XMP стандарт
Образец (человеческая кровь)
Aʹ
365,0/97,0
20000
25000
Bʹ
365,0/213,0
6000
5000
Соотношение площадей пиков (Bʹ/Aʹ)
0,3
0,2
[0111] Соотношение площадей пиков образца (Bʹ/Aʹ) составляло 0,2. Поскольку соотношение площадей пиков образца находится в пределах диапазона 0,1-0,3, было определено, что обеспечивается очень хорошая специфичность.
На основании этого результата, было установлено, что количество XMP может быть определено при условиях определения A 'и B'.
[0112] Пример 4 XMP в миелолейкозных клетках человека и XMP в клетках крови здорового человека
В качестве исследуемого соединения использовали 3/4 гидрат соединения A.
K562 (доступные от Riken BioResource Center) использовали в качестве миелолейкозных клеток человека.
(1)
7
2
2×10 миелолейкозных клеток человека суспендировали в колбе для культур, содержащей 18 мл среды RPMI1640 (производство компании Life Technologies, Inc.). Добавляли 2 мл фосфатно-солевого буферного раствора исследуемого соединения (0 мкг/мл, 10 мкг/мл, 100 мкг/мл или 1000 мкг/мл соединения А) в колбу, которую затем инкубировали при 37°C под 5% СО в течение 24 часов. После центрифугирования при 20°C и 300×g в течение 3 мин, удаляли супернатант и суспендировали в 10 мл фосфатно-солевого буферного раствора. Затем, после центрифугирования при 4°C и 300×g в течение 5 мин, супернатант удаляли. После перемешивания с добавлением 1000 мкл метанола, добавляли 500 мкл сверхчистой воды, с последующим дополнительным перемешиванием. 600 мкл реакционного раствора распределяли на каждую из двух пробирок, и в каждую пробирку добавляли 400 мкл хлороформа. Реакционный раствор перемешивали и затем центрифугировали при 4°C и 10000×g в течение 15 мин. Извлекают 400 мкл водной фазы и добавляли в пробирку для ультрафильтрации, с последующим центрифугированием при 12°C и 9200×g в течение 2 часов. Фильтраты объединяли и затем сушили при пониженном давлении при 40°C в течение 2 часов с использованием центробежного испарителя. После сушки полученный продукт хранили в морозильной камере при -80°C.
[0113] (2)
450 мкл крови, отобранной у двух здоровых индивидуумов путем сбора гепаринизированной крови (анализируемое вещество A и анализируемое вещество B), добавляли в каждую из 1,5 мл-ых пробирок, и 50 мкл фосфатно-солевого буферного раствора исследуемого соединения добавляли в каждую пробирку (0 мкг/мл, 10 мкг/мл, 30 мкг/мл, 100 мкг/мл, 300 мкг/мл или 1000 мкг/мл соединения А) для каждой концентрации. Реакционную смесь перемешивали в инкубаторе при 37°C в течение 8 часов. Затем BD Pharm Lyse (555899, Dickinson and Company, Inc.) добавляли в кровь (2 мл BD Pharm Lyse добавляли к 0,2 мл крови). После перемешивания с помощью вортекс-миксера, реакционный раствор защищали от света и оставляли отстаиваться при комнатной температуре в течение 15 мин. После центрифугирования при 20°C и 1000×g в течение 5 мин, супернатант удаляли и суспендировали в 10 мл фосфатно-солевого буферного раствора. После центрифугирования при 4°C и 1000×g в течение 5 мин, супернатант удаляли и в каждую пробирку добавляли 1000 мкл метанола с последующим перемешиванием. Затем добавляли 500 мкл сверхчистой воды с последующим перемешиванием. 600 мкл реакционного раствора разделяли на каждую из двух пробирок, и в каждую пробирку добавляли 400 мкл хлороформа. Реакционный раствор перемешивали и затем центрифугировали при 4°C и 10000×g в течение 15 мин. Извлекали 400 мкл водной фазы и добавляли в пробирку для ультрафильтрации, с последующим центрифугированием при 12°C и 9200×g в течение 2 часов. Фильтраты объединяли и затем сушили при пониженном давлении при 40°C в течение 2 часов с использованием центробежного испарителя. После сушки полученный продукт хранили в морозильной камере при -80°C.
[0114] (3)
Температуру образцов, полученных в (1) и (2), обратно повышали до комнатной температуры и к каждому образцу добавляли 40 мкл сверхчистой воды. Смесь перемешивали и центрифугировали при 4°C и 21500×g в течение 5 мин. В пробирку переносили 35 мкл супернатанта. После хранения при 4°C, XMP в образцах определяли с помощью ЖХ-МС/МС прибора, при ЖХ условиях и МС/МС условиях, описанных в примере 3 (3).
[0115] (4)
Вычисляли количества XMP (%) при условии, что значение XMP в группе, не обработанной соединением А (значение площадь пика), определяли как 100%.
Результаты представлены в таблице 9.
[0116]
Таблица 9
Концентрация соединения А (мкг/мл)
Количество XMP (%)
Анализируемое вещество A
Анализируемое вещество B
K562
0
100
100
100
1
60
51
52
3
45
37
-
10
37
25
15
30
27
18
-
100
16
10
6
[0117] Отклонения от количества ХМР в клетках крови здорового человека и миелолейкозных клетках человека были аналогичны друг другу. Было высказано предположение о том, что отклонение количества ХМР относительно соединения А в бластных клетках костного мозга пациентов, страдающих MDS, можно теоретически оценить путем определения их отклонения в клетках крови периферической крови.
[0118] Пример 5 XMP в клетках крови после гемолиза и XMP в цельной крови
В качестве исследуемого соединения использовали 3/4 гидрат соединения A.
(1)
450 мкл крови, отобранной у двух здоровых индивидуумов путем сбора гепаринизированной крови (анализируемое вещество А и анализируемое вещество B) добавляли в каждую пробирку, и в каждую пробирку добавляли 50 мкл фосфатно-солевого буферного раствора исследуемого соединения (0 мкг/мл, 10 мкг/мл, 30 мкг/мл, 100 мкг/мл, 300 мкг/мл или 1000 мкг/мл соединения А) для каждой концентрации. Реакционную смесь перемешивали в инкубаторе при 37°C в течение 8 часов.
[0119] (2-1)
BD Pharm Lyse (555899, производство Becton, Dickinson and Company, Inc.) добавляли к образцу крови, полученному в (1) (2 мл BD Pharm Lyse добавляли к 0,2 мл крови). После перемешивания с помощью вортекс-миксера, реакционный раствор защищали от света и оставляли отстаиваться при комнатной температуре в течение 15 мин. После центрифугирования при 20°C и 1000×g в течение 5 мин, супернатант удаляли и суспендировали в 10 мл PBS. После центрифугирования при 20°C и 1000×g в течение 5 мин, супернатант удаляли и суспендировали в 10 мл PBS. После центрифугирования при 4°C и 1000×g в течение 5 мин, супернатант удаляли и в каждую пробирку добавляли 1000 мкл метанола с последующим перемешиванием. Потом добавляли 500 мкл сверхчистой воды с последующим перемешиванием. 600 мкл реакционного раствора разделяли на каждую из двух пробирок, и в каждую пробирку добавляли 400 мкл хлороформа. Реакционный раствор перемешивали и затем центрифугировали при 4°C и 10000×g в течение 15 мин. Извлекали 400 мкл водной фазы и добавляли в пробирку для ультрафильтрации (UltrafreeMC-PLHCC 250/pk для анализа метаболома (производство Human Metabolome Technologies)), с последующим центрифугированием при 12°C и 9200×g в течение 2 часов. Фильтраты объединяли и затем сушили при пониженном давлении при 40°C в течение 2 часов с использованием центробежного испарителя. После сушки полученный продукт хранили в морозильной камере при -80°C.
[0120] (2-2)
К 100 мкл образца крови, полученного в (1), добавляли 400 мкл метанола. После перемешивания добавляли 400 мкл хлороформа с последующим перемешиванием. Добавляли 120 мкл сверхчистой воды, затем перемешивали и центрифугировали при 4°C и 10000×g в течение 15 мин. Извлекали 400 мкл водной фазы и добавляли в ультрафильтрационную пробирку с последующим центрифугированием при 12°C и 9200×g в течение 2 часов. Фильтрат сушили при пониженном давлении при 40°C в течение 2 часов с использованием центробежного испарителя. После сушки полученный продукт хранили в морозильной камере при -80°C.
[0121] (3)
Температуру образцов, полученных в (2-1) и (2-2), обратно повышали до комнатной температуры и к каждому образцу добавляли 40 мкл сверхчистой воды. Смесь перемешивали и центрифугировали при 4°C и 21500×g в течение 5 мин. В пробирку переносили 35 мкл супернатанта. После хранения при 4°C, XMP в образцах определяли с помощью ЖХ-МС/МС прибора, при ЖХ условиях и МС/МС условиях, описанных в примере 3 (3).
[0122] (4)
Вычисляли количества XMP (%) при условии, что значение XMP в группе, не обработанной соединением А определяли как 100%.
Результаты представлены в таблице 10.
[0123]
Таблица 10
Концентрация соединения А (мкг/мл)
Количество XMP (%)
Анализируемое вещество A
Анализируемое вещество B
Гемолиз
Цельная кровь
Гемолиз
Цельная кровь
0
100
100
100
100
1
60
57
51
44
3
45
53
37
27
10
37
47
25
15
30
27
26
18
11
100
16
15
10
9
[0124] Количество XMP в клетках крови после гемолиза и количество XMP в цельной крови почти сопоставимы друг с другом. Количество XMP в цельной крови соответствует количеству XMP в клетках крови.
[0125] Пример 6 XMP в клетках крови и XMP в клетках костного мозга
В качестве исследуемого соединения использовали 3/4 гидрат соединения A.
(1)
0,5% МЦ или 0,5% МЦ исследуемого соединения (100 мг/кг относительно соединения А) перорально вводили самкам мышей (BALB/cAJcl).
[0126] (2-1)
Цельную кровь отбирали под анестезией ингаляцией изофлураном из нижней полой вены животных через 1, 4, 8 или 24 час после введения дозы, используя полипропиленовый шприц, обработанный динатриевой солью этилендиаминтетрауксусной кислоты, и иглу для инъекций калибра 25. В кровь добавляли BD Pharm Lyse (555899, производство Becton, Dickinson and Company, Inc.) (2 мл BD Pharm Lyse добавляли относительно 0,2 мл крови). После перемешивания с помощью вортекс-миксера реакционный раствор защищали от света и оставляли отстаиваться при комнатной температуре в течение 15 мин. После центрифугирования при 20°C и 1000×g в течение 5 мин супернатант удаляли и суспендировали в 10 мл фосфатно-солевого буферного раствора. После центрифугирования при 4°C и 1000×g в течение 5 мин супернатант удаляли, и в каждую пробирку добавляли 1000 мкл метанола с последующим перемешиванием. Затем добавляли 500 мкл сверхчистой воды с последующим перемешиванием. 600 мкл реакционного раствора распределяли в каждую из двух пробирок, и в каждую пробирку добавляли 400 мкл хлороформа. Реакционный раствор перемешивали и затем центрифугировали при 4°C и 10000×g в течение 15 мин. Извлекали 400 мкл водной фазы и добавляли в пробирку для ультрафильтрации с последующим центрифугированием при 12°C и 9200×g в течение 2 часов. Фильтраты объединяли и затем сушили при пониженном давлении при 40°C в течение 2 часов, используя центробежный испаритель. После сушки полученный продукт хранили в морозильной камере при -80°C.
[0127] (2-2)
Правую и левую бедренные кости животных изымали под анестезией ингаляцией изофлураном через 1, 4, 8 или 24 час после введения дозы с последующим отсечением концов костей и центрифугированием при 4°C и 3000 оборотов в минуту в течение 1 мин для извлечения клеток костного мозга. Извлеченные клетки костного мозга суспендировали в 1 мл PBS, и определяли количество клеток. После центрифугирования при 4°C и 1000×g в течение 5 мин супернатант удаляли и в каждую пробирку добавляли по 1000 мкл метанола с последующим перемешиванием. Затем добавляли 500 мкл сверхчистой воды и перемешивали. 600 мкл реакционного раствора распределяли в каждую из двух пробирок, и в каждую пробирку добавляли по 400 мкл хлороформа. Реакционный раствор перемешивали и затем центрифугировали при 4°C и 10000×g в течение 15 мин. Извлекали 400 мкл водной фазы и добавляли в пробирку для ультрафильтрации с последующим центрифугированием при 12°C и 9200×g в течение 2 часов. Фильтраты объединяли и затем сушили при пониженном давлении при 40°C в течение 2 часов с использованием центробежного испарителя. После сушки полученный продукт хранили в морозильной камере при -80°C.
[0128] (3)
Температуру образцов, полученных в (2-1) и (2-2), вновь повышали до комнатной температуры, и к гемолитическому образцу добавляли 40 мкл сверхчистой воды, а к образцу костного мозга добавляли 150 мкл сверхчистой воды. Смесь перемешивали и затем центрифугировали при 4°C и 21500×g в течение 5 мин. Для гемолитическиго образца в пробирку переносили 35 мкл супернатанта. Для образца костного мозга в пробирку переносили 140 мкл супернатанта. После хранения при 4°C в образцах с помощью ЖХ-МС/МС прибора определяли XMP в условиях ЖХ и условиях МС/МС, описанных в примере 3 (3).
[0129] (4)
Вычисляли количества XMP (%) при условии, что значение XMP в группе, не обработанной соединением А (значение площадь пика), определяли как 100%.
Результаты представлены в таблице 11.
[0130]
Таблица 11
Время после введения дозы (час)
Количество XMP (%)
Клетка крови
Клетка костного мозга
Не обрабатывали
100
100
1
3,4
8,7
4
7,2
16,5
8
26,4
25,9
24
70,7
82,7
[0131] Отклонения XMP в клетках крови и клетках костного мозга были эквивалентны друг другу. Для отображения отклонения в клетках костного мозга рассматривали отклонение XMP относительно соединения А в клетках крови.
[0132] Для отображения отклонения XMP в бластных клетках костного мозга пациентов, страдающих MDS, из результатов примера 4, примера 5 и примера 6 было показано отклонение ХМР в периферической цельной крови.
[0133] Пример 7. XMP в клетках миелолейкоза человека
В качестве исследуемого соединения использовали 3/4 гидрат соединения A.
В качестве клеток миелолейкоза человека использовали клетки SKM-1.
[0134] (1)
7
2
2×10 клеток миелолейкоза человека суспендировали в колбе для культур, содержащей 18 мл среды RPMI1640 (производство компании Life Technologies, Inc.). В колбу добавляли 2 мл фосфатно-солевого буферного раствора исследуемого соединения (0 мкг/мл, 10 мкг/мл, 100 мкг/мл или 1000 мкг/мл соединения А), затем инкубировали при 37°C под 5% СО в течение 24 часов. После центрифугирования при 20°C и 300×g в течение 3 мин удаляли супернатант и суспендировали в 10 мл фосфатно-солевого буферного раствора. 10 мкл суспензии делили на аликвоты, и клетки подсчитывают с использованием TC10 (изготовитель BioRad). После центрифугирования при 300×g в течение 5 мин супернатант удаляли. После перемешивания с добавлением 1000 мкл метанола добавляли 500 мкл сверхчистой воды с последующим дополнительным перемешиванием. 600 мкл реакционного раствора распределяли в каждую из двух пробирок, и в каждую пробирку добавляли по 400 мкл хлороформа. Реакционный раствор перемешивали и затем центрифугировали при 4°C и 10000×g в течение 15 мин. Извлекают 400 мкл водной фазы и добавляли в пробирку для ультрафильтрации с последующим центрифугированием при 12°C и 9200×g в течение 2 часов. Фильтраты объединяли и затем сушили при пониженном давлении при 40°C в течение 2 часов с использованием центробежного испарителя. После сушки полученный продукт хранили в морозильной камере при -80°C.
[0135] (2)
Температуру образцов, полученных в (1), возвращали к комнатной, к каждому из указанных образцов добавляли по 50 мкл 5 ммоль/л формиата аммония, содержащего 4 нг/мкл 2'-фтор-2'-дезоксицитидин монофосфата, с последующим перемешиванием. В пробирку переносили 12,5 мкл супернатанта, и XMP в образцах определяли в следующих условиях определения.
[0136] (ЖХ-МС/МС)
ЖХ: УВЭЖХ (производство Shimadzu Corporation)
МС: QTRAP3200 (производство AB-Sciex Inc.)
(ЖХ)
Колонка: SeQuant ZIC-pHILIC 5 мкм, полимерная PEEK 150×2,1 мм не содержащая металл ВЭЖХ колонка(производство Merck Ltd.)
Температура колоночного термостата: 40°C
Подвижная фаза A: 10 ммоль/л бикарбоната аммония (доводили до рН 9,4 с помощью 25% по массе водного раствора аммиака)
Подвижная фаза B: ацетонитрил
Скорость потока: 0,5 мл/мин
Градиентные циклы показаны в таблице 12. % в таблице 12 обозначают % по объему.
[0137]
Таблица 12
Время (мин)
0
5,83
5,84
9,83
9,84
12,00
Подвижная фаза A (%)
30
65
100
100
30
30
Подвижная фаза B (%)
70
35
0
0
70
70
[0138]
(МС/МС)
Ионизация: ESI положительная
Режим сканирования: MRM
Условия определения представлены в таблице 13.
[0139]
Таблица 13
Ион-предшественник(m/z)/Ион-продукт(m/z)
Температура (температура газа турбонагревателя) (°C)
Напряжение блока введения ионов (диафрагма) (В)
365,0/213,0
500
50
[0140] (3)
Количество XMP (%) вычисляли в соответствии со следующим уравнением, при условии, что значение XMP в группе, не обработанной соединением А, определяется как 100%.
Количество XMP (%)=((площадь пика XMP)/((площадь пика 2'-фтор-2'-дезоксицитидин монофосфата) x (количество клеток)))/((площадь пика XMP необработанной группы)/((площадь пика 2'-фтор-2'-дезоксицитидин монофосфата необработанной группы) (количество клеток необработанной группы)))×100
Скорость снижения XMP (%) вычисляли в соответствии со следующим уравнением.
Скорость снижения XMP (%)=100-количество XMP (%)
Результаты представлены в таблице 14.
[0141]
Таблица 14
Концентрация соединения А (мкг/мл)
Количество XMP (%)
Скорость снижения XMP
0
100
0
1
57
43
10
45
55
100
17
83
50
50
[0142] Значение IC в клетках SKM-1 соединения A составляет 2,73 мкг/мл (пример 1). Соответственно, скорость снижения XMP в нгепосредственной близости к значению IC составляла 43%-55%.
[0143] Из результатов примеров 2 и 7 может быть прогнозированое, что доза является эффективной в случае, когда XMP скорость снижения составляет 45% или больше в период, соответствующий 40% или больше от периода лечения.
[0144] Пример 8. XMP, GMP и GTP в цельной крови
В качестве исследуемого соединения использовали 3/4 гидрат соединения A.
(1)
В каждую пробирку добавляли по 450 мкл крови, взятой у здоровых людей путем отбора гепаринизированной крови, и в каждую пробирку добавляли по 50 мкл фосфатно-солевого буферного раствора исследуемого соединения (0 мкг/мл, 1 мкг/мл, 10 мкг/мл или 100 мкг/мл соединения А) для каждой концентрации. Реакционную смесь перемешивали в инкубаторе при 37°C в течение 8 часов.
[0145] (2)
К 100 мкл образца крови, полученного в пункте (1), добавляли 400 мкг этанола. После перемешивания добавляли 400 мкл хлороформа с последующим перемешиванием. Добавляли 120 мкл сверхчистой воды, затем перемешивали и потом центрифугировали при 4°C и 10000×g в течение 15 мин. Извлекали 400 мкл водной фазы и помещали в ультрафильтрационную пробирку, затем центрифугировали при 12°C и 9200×g в течение 2 часов. Фильтрат сушили при пониженном давлении при 40°C в течение 2 часов с использованием центробежного испарителя. После сушки полученный продукт хранили в морозильной камере при -80°C.
[0146] (3)
Полученные в пункте (2) образцы охлаждали до комнатной температуры и к каждому образцу добавляли 40 мкл сверхчистой воды. Смесь перемешивали и центрифугировали при 4°C и 21500×g в течение 5 мин. В пробирку переносили 35 мкл супернатанта. После хранения при 4°C, в образцах определяли XMP, GMP и GTP в условиях с использованием ЖХ-МС/МС прибора и условиях ЖХ, описаных в примере 3 (3), и условиях МС/МС, приведенных в таблице 15.
[0147]
[Таблица 15]
Объект определения
Условия определения
Ион-предшественник (m/z)/ион-продукт (m/z)
Температура (температура газа турбонагревателя)(°C)
Напряжение блока введения ионов (диафрагма) (В)
XMP
A
365,0/97,0
600
50
B
365,0/153,0
GMP
E
364,0/152,0
GTP
F
524,0/152,0
[0148] (4)
Количества XMP, GMP и GTP (%) вычисляли при условии, что значения XMP, GMP и GTP в группе, не обработанной соединением А (значение площади пика), определяли как 100%. Результаты представлены в таблице 16.
[0149]
Таблица 16
Концентрация соединения А (мкг/мл)
Количество каждого соединения в цельной крови (%)
XMP
GMP
GTP
0
100
100
100
1
55
85
89
10
30
85
86
100
13
91
79
[0150] Количество XMP в цельной крови понижалось с повышением концентрации соединения А. В то же время, не наблюдали больших изменений количества GMP и GTP в цельной крови, даже при повышении концентрации соединения А. Этот результат показывал, что терапевтический эффект соединения А не может характеризоваться уменьшением метаболитов ХМР, таких как GMP или GTP, а терапевтический эффект соединения А может оцениваться по XMP.
[0151] Пример 9. Условия градиентной ЖХ
Образец получали способом, аналогичным способу получения образцов, которые описаны в примерах 3 (1-1) и (1-2). Образец растворяли в воде с последующим центрифугированием, и супернатант извлекали для использования в качестве образца определения. Образец определения и XMP стандарт подвергали ЖХ-МС/МС. Конфигурация прибора и условия определения приведены ниже.
[0152] (ЖХ-МС/МС)
LC: УВЭЖХ (производство Shimadzu Corporation)
МС: QTRAP 5500 (производство AB SCIEX)
(ЖХ)
Колонка: SeQuant ZIC-pHILIC 5 мкм, полимерный PEEK 150×2,1 мм, не содержащая металл ВЭЖХ колонка(производство Merck Ltd.)
Температура колоночного термостата: 40°C
Подвижная фаза A: 50 ммоль/л бикарбоната аммония (доводили до рН 9,4 с помощью 25% по массе водного раствора аммиака)
Подвижная фаза B: ацетонитрил
Скорость потока: 0,3 мл/мин
Вводимый объем: 2 мкл (условие a), 5 мкл (условие b)
Градиентные циклы условий a и b представлены в таблицах 17 и 18. % в таблицах 17 и 18 обозначают % по объему.
[0153] Условие a
Таблица 17
Время (мин)
0
5,83
5,84
9,83
9,84
13,83
Подвижная фаза A (%)
30
65
100
100
30
30
Подвижная фаза B (%)
70
35
0
0
70
70
[0154] Условие b
Таблица 18
Время (мин)
0
2,5
10
13
16
16,01
21
Подвижная фаза A (%)
20
35
35
100
100
20
20
Подвижная фаза B (%)
80
65
65
0
0
80
80
[0155] (МС/МС)
Ионизация: ESI положительная
Режим сканирования: MRM
Условия определения показаны в таблице 19.
[0156]
Таблица 19
Объект определения
Условия определения
Ион-предшественник (m/z)/Ион-продукт (m/z)
Температура (температура газа турбонагревателя) (°C)
Напряжение блока введения ионов (диафрагма) (V)
XMP
A
365,0/97,0
600
50
B
365,0/153,0
[0157] Полученные результаты определения показаны на фиг. 8.
Было подтверждено, что степень разделения между XMP и примесями в образце повышается, и, таким образом, XMP в образце может быть обнаружен с более высокой специфичностью в случае использования изократического метода в XMP элюировании при ЖХ условии b, по сравнению со случаем использования градиентного метода при ЖХ условии а. Кроме того, при ЖХ условии b, можно увеличить объем вводимого образца в 2,5 раза, как при ЖХ условии а.
ПРОМЫШЛЕННАЯ ПРИМЕНИМОСТЬ
[0158] Способ прогнозирования в соответствии с настоящим изобретением может обеспечить простое и осуществляемое в течение короткого промежутка времени определение эффективной дозы соединения A, или его соли, или его гидрата для пациента, страдающего MDS. Кроме того, возможно просто и в течение короткого промежутка времени прогнозировать, является ли пациент, страдающий миелодиспластическим синдромом, восприимчивым к лечению с использованием соединения А, или его соли, или его гидрата или нет.
[0159] Способ определения в соответствии с настоящим изобретением может обеспечить точное определение количества XMP, которые присутствует в следовых количествах в крови.
[0160] Устройство для прогнозирования в соответствии с настоящим изобретением может быть использовано для простого и осуществляемого в течение короткого промежутка времени прогнозирования дозы соединения А или его соли или его гидрата для пациента, страдающего MDS. Кроме того, оно может быть использовано для простого и осуществляемого в течение короткого промежутка времени прогнозирования того, восприимчив или нет пациент, страдающий миелодиспластическим синдромом, к лечению с использованием соединения А или его соли или его гидрата.
[0161] Поскольку лекарственное средство и способ лечения в соответствии с настоящим изобретением используются при лечении пациента, страдающего MDS, который является теоретически восприимчивым к лечению с использованием соединения А или его фармацевтически приемлемой соли или его гидрата, можно избежать ненужного введения пациенту, который не демонстрирует восприимчивость к соединению или его соли или его гидрату.