Направленное клеточное перепрограммирование является стохастическим процессом и подвержено акселерации

I I I I I I

Новости клеточных технологий

I I I

19

увеличению их пролиферативной активности, а при обратной постановке эксперимента — к снижению регенераторных потенций миосателлитоцитов группы молодых людей.

В заключение, исследователи подтвердили положительное регулирующее влияние митоген-активированной протеинкиназы (mitogen-activated protein kinase, МАРК) на экспрессию генов, характерную для эмбрионального периода [8]. Внесение в культуральную среду агониста МАРК — фактора роста фибробластов-2, приводило к повышению продукции Delta и Notch и активации пролиферативных потенций клеток, полученных даже от пожилых людей, а введение антагониста — МАРК ингибитора — к снижению экспрессии Delta и Notch. В подтверждение реализации эффектов сигнального пути МАРК через Notch было показано, что положительное

влияние агонистов МАРК на пролиферативную активность миосателлитоцитов нивелируется введением блокатора Notch — ингибитора гамма-секретазы (gamma secretase inhibitor). Непосредственное введение в культуральную среду эндогенного Delta также приводило к активации регенераторного ответа миосателлитоцитов группы пожилых людей.

Таким образом, молекулярные механизмы, ответственные за процесс снижения регенераторных потенций миосателлитоцитов с возрастом, чрезвычайно сложны. Можно с уверенностью утверждать, что авторы в ходе ряда исследований выявили и обосновали один из них, общий для человека и животных, в который вовлечены МАРК, Delta/Notch, pSmad3/TGF-p, ингибиторы циклин-зависимых киназ, что может найти практическое применение в клеточных технологиях.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Grounds M.D. Age-associated changes in the response of skeletal muscle cells to exercise and regeneration. Ann. NY Acad. Sci. 1998; 854: 78-91.

2. Данилов P.К. Источники развития миобластов при регенерации скелетных мышц. Онтогенез 1983; 14С5): 551—5.

3. Carlson М.Е., Suetta С., Conboy M.J. et al. Molecular aging and rejuvenation of human muscle stem cells. EMBO Molecular Medicine 2009; 1: 381-91.

4. Gibson M.C., Schultz E. Age-related differences in absolute numbers of skeletal muscle satellite cells. Muscle Nerve 1983; 6[8): 574—80.

5. Collins C.A., Zammit P.S., Ruiz A.P. et al. A population of myogenic stem cells that survives skeletal muscle aging. Stem Cells 2007; 25[41: 885-94.

6. Schultz E., Lipton B.H. Skeletal muscle satellite cells: changes in proliferation potential as a function of age. Mech. Ageing Dev. 1982; 20C4): 377-83.

7. Conboy I.M., Conboy M.J., Smythe G.M. et al. Notch-mediated restoration of regenerative potential to aged muscle. Science 2DD3; 302: 1575-7.

8. Carmena A., Buff E., Halfon M.S. et al. Reciprocal regulatory interactions between the Notch and Ras signaling pathways in the Drosophila embryonic mesoderm. Dev. Biol. 2DD2; 244: 226—42.

Порготовип ИЯ. База

По материалам: Carlson М.Е., Suetta С., Conboy M.J. et al. Molecular aging and rejuvenation of human muscle stem cells, EMBO Molecular Medicine 2009; 1:381 - 91

Направленное клеточное перепрограммирование является стохастическим процессом и подвержено акселерации

Процесс перепрограммирования соматических клеток в плюрипотентные in vitro является достаточно сложным для изучения. Наиболее проблематично оценить количественные характеристики и временные рамки происходящих критических событий. Причиной этого является клеточная и генетическая гетерогенность полученных de novo трансформированных соматических клеток. Для того, чтобы обойти необходимость вирусной трансдукции и уменьшить гетерогенность экспрессии перепрограмирующих факторов, была изобретена «вторичная» перепрограммирующая трансгенная система, в которой все соматические клетки обладают одинаковым паттерном интеграции препарат-индуцируемых вирусных трансгенов 0ct4, Sox2, Klf4 и с-Мус [1-3].

Используя эту систему на клетках линии В-лимфо-цитов Nanog-GFP репортерных мышей, коллектив исследователей из Whitehead Institute for Biomedical Research и Massachusetts Institute of Technology взялся решить ряд актуальных вопросов эпигенетики:

— как происходит развитие процесса перепрограми-рования генетической системы клеток в течение времени и что происходит с преобладающим количеством

клеток, которые не становятся перепрограммированными в течение продолжительных клеточных делений на фоне экспрессии перепрограммирующих факторов?

— за счет чего некоторые соматические клетки, обошедшие механизмы клеточного старения и апоптоза в результате экспрессии 0^4, Бох2, КН4 и с-Мус, превращаются в индуцированные плюрипотентные стволовые ПРБ) клетки раньше других?

— все ли взрослые донорские клетки, экспрессирующие факторы 0^4, Бох2, КН4 и с-Мус, в конечном счете станут !РБ-клетками, или это может быть достигнуто за счет дополнительных генетических или молекулярных манипуляций?

— ограничена ли высокая перепрограммирующая способность только для клеток, не принадлежащих к каким-либо линиям дифференцировки, и взрослым стволовым клеткам?

Авторы исследовали характеристики процесса перепрограммирования путем изменения генетической программы клеток. Было использовано индуцированное выключение ряда генов с помощью метода малых интерферирующих РНК. В ходе экспериментов проводился по-

Новости клеточных технологий

стоянный контроль экспрессии факторов 0й4, Бох2, К№4 и с-Мус. Генами-мишенями для выключения были выбраны р53 и р21. Белок р21, который является основной эффекторной мишенью р53, регулирует прогрессию клеточного цикла и является ингибитором циклин-зависимых киназ. Также было оценено влияние ове-рэкспрессии гена Уп28, усиливающего перепрограммирование фибробластов человека и действующего как онкоген, модулирующий экспрессию регуляторов клеточного цикла.

В результате оказалось, что совместное выключение (нокдаун) обоих генов р53 и р21, или оверэкспрессия Уп28 ускоряют процесс перепрограммирования, увеличивая совокупную вероятность скорейшего возникновения стохастических событий. Оказывается, в случае ингибирования р53/р21 задействован механизм, зависимый от уровня пролиферации клеток. Механизм действия белка Уп28 несколько иной — акселерация появления !РЭ-клеток проявляется за счет более быстрого увеличения клеточной популяции в результате сокращения продолжительности времени клеточного цикла и ускоренного деления клеток.

Следующим шагом стало исследование влияния на перепрограммирование клеток гена №под, являющегося фактором плюрипотентности и экспрессирующегося во время эмбрионального развития в клетках внутренней

клеточной массы бластоцисты. Эмбриональные стволовые клетки и !РБ-клетки нуждаются в присутствии функциональной эндогенной аллели №под [4].

Установлено, что усредненное число клеточных делений до появления !РБ-клеток существенно снизилось с 70 у контроля и линий с выключенными генами р53 и р21 до 50 делений у линии с оверэкспрессией №под. Такие данные позволяют сделать вывод о том, что оверэкспрессия №под ускоряет кинетику перепрограммирования за счет внутриклеточных механизмов, независимых от уровня клеточной пролиферации. Авторы отмечают, что дальнейшее изучение молекулярного механизма, за счет которого белок №под управляет системой поддержания плюрипотентности клеток, представляет несомненный интерес.

Следует отметить, что число клеточных делений, необходимых для получения !РБ-клеток, не является ключевым параметром при использовании других стратегий перепрограммирования. В случае переноса ядра соматической клетки в яйцеклетку ген 0й4, являющийся маркером плюрипотентности и молчащий в соматическом ядре, реактивируется в течение 1—2 клеточных делений [5—6]. Это свидетельствует о том, что в цито-плазме яйцеклетки содержатся пока неизвестные детерминанты, посредством которых стойкое перепро-граммирование достигается за единичные клеточные циклы [7].

Модели возникновения индуцированных плюрипотентных стволовых [РБ] клеток

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, 1У» 1, 2010

I I I I I I

I I I

Новости клеточных технологий

В результате исследований оказалось возможным сделать следующие выводы:

1) перепрограммирование соматических клеток в плюрипотентные является стохастическим процессом, при этом практически все соматические клетки имеют возможность стать !РБ-клетками при непрерывном делении на фоне экспрессии факторов Скл4, Бох2, К№4 и с-Мус;

2) хотя перепрограммированные клетки появляются не ранее чем на 8—10-е сут. экспрессии 0сЬ4, Бох2, КН4 и с-Мус [8], время экспозиции в доксициклине (запускающем экспрессию лентивирусного вектора с факторами 0сЬ4, Бох2, КН4 и с-Мус) и число клеточных делений, прошедших до появления популяции клонов !РБ-клеток, сильно варьирует;

3) данные исследования не подтверждают гипотезу «элитных компонентов» для перепрограммирования клеток [9]: большинство, если не все, клеток линии В-лим-фоцитов и моноцитов с устойчивой экспрессией всех четырех факторов перепрограммирования оказалось способны произвести !РБ-клетки;

4) соматические клетки перепрограммируются с реализацией различных латентностей, что не может быть объяснено только разницей в темпе пролиферации и временем экспозиции в доксициклине. Подтверждается участие неопределенных стохастических событий, происходящих во время процесса перепрограммирования клеток.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Hanna J., Markoulaki S., Schorderet P. et al. Direct reprogramming of terminally differentiated mature В lymphocytes to pluripotency. Cell 2008; 133: 250-64.

2. Wernig М., Lengner C., Hanna J. et al. A drug-inducible transgenic system for direct reprogramming of multiple somatic cell types. Nature Biotechnol. 2008; 26: 916-24.

3. Markoulaki S., Hanna J., Beard C. et al. Transgenic mice with defined combinations of drug-inducible reprogramming factors. Nature Biotechnol. 2009; 27: 169-71.

4. Silva J., Nichols J., Theunissen T. et al. Nanog is the gateway to the pluripotent ground state. Cell 2009; 138: 722—37.

5. Boiani М., Gentile L., Gambles V. et al. Variable reprogramming of the pluripotent stem cell marker 0ct4 in mouse clones: distinct

developmental potentials in different culture environments. Stem Cells 2005; 23: 1089-104.

6. Egli D., Rosains J., Birkhoff G., Eggan K. Developmental reprogramming after chromosome transfer into mitotic mouse zygotes. Nature 2007; 447: 679—85.

7. Egli D., Birkhoff G., Eggan K. Mediators of reprogramming: transcription factors and transitions through mitosis. Nature Rev. Mol. Cell Biol. 2008; 9: 505-16.

8. BrambrinkT., Foreman R., Welstead G. et al. Sequential expression of pluripotency markers during direct reprogramming of mouse somatic cells. Cell Stem Cell 2008; 2: 151-9.

9. Yamanaka S. Elite and stochastic models for induced pluripotent stem cell generation. Nature 2009; 460: 49—52.

Порготовип A.B. Иванов

По материалам: Hanna J„ Saha K.: Pando B. et al. Direct cell reprogramming is a stochastic process amenable to acceleration. Nature 2009; 462: 595-601

Первая успешная попытка создания искусственной кожи человека с использованием эмбриональных стволовых клеток

Более двух десятилетий исследователи и клиницисты пытаются разработать метод лечения, который гарантировал бы эффективное восстановление кожных покровов пациентам, получившим тяжелые ожоговые и травматические повреждения либо страдающим трофическими язвами различной этиологии. На сегодняшний день наиболее эффективной является операция аутотрансплантации кожи. В перспективе, на смену ей может прийти аутотрансплантация выделенных из биоптатов неповрежденных участков кожи и размноженных в культурах in vitro клеток-предшественниц кератиноцитов на трехмерных матриксах [1]. Главным недостатком этого подхода остается то, что на экспансию кератиноцитов в культурах in vitro перед трансплантацией требуется около 3 недель [2]. В течение всего этого времени пациент подвергается риску инфицирования и обезвоживания открытой ожоговой раны. Недели перед проведением аутотрансплантации остаются тем критическим периодом, в котором необходимо обеспечить максимальную защиту поврежденных покровов. В качестве временного покрова возможно использование децеллюляризован-ного трупного кожного лоскута, однако доступность по-

добного материала ограниченна, а его применение нередко приводит к развитию реакций воспаления.

Чтобы избежать применения временных трансплантатов и операций аутотрансплантации, предпринимается множество попыток разработки «эквивалентов кожи» на основе инертных синтетических и тканеинженерных матриксов, обычно содержащих коллаген I типа и алло-генные клетки (дермальные фибробласты и реже — фибробласты и кератиноциты) [3]. Однако до настоящего времени ни один из этих продуктов не продемонстрировал высокой эффективности в лечении пациентов с обширными глубокими ожогами [4].

Использование эмбриональных стволовых клеток (ЗСК) человека могло бы стать решением проблемы создания эквивалентов кожи, пригодных для трансплантации, позволив получать необходимые типы клеток (дермальные фибробласты и кератиноциты) в неограниченном количестве. Основным препятствием использования данного подхода остается недостаточная эффективность протоколов дифференцировки ЗСК в требующиеся типы клеток и потенциальная туморогенность ЗСК [5—7]. Единственная оставшаяся в предназначенной для