СПОСОБ ДЕТЕКЦИИ АНАЛИТА ИЗ РАСТВОРА НА ЧАСТИЦАХ И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ЕГО РЕАЛИЗАЦИИ
METHOD FOR DETECTING ANALYTE FROM PARTICLE SOLUTION AND DEVICE FOR IMPLEMENTING IT

Область техники
Изобретение относится к биологии и медицине, а именно - к качественной и/или количественной индикации аналитов в растворе, в частности в иммунобиологической пробе, содержащей аналит белкового и/или нуклеинового происхождения (белки, пептиды, ДНК, вирусы, клетки, клеточные мембраны). Устройство и способ позволяют осуществлять ускорение детекции аналита, что достигается за счет концентрирования заряженного аналита на магнитных частицах, находящихся в потоке раствора аналита и помещенных за счет действия магнитного или электрического поля в канал устройства с полупроницаемыми стенками.
Устройство и способ позволяют осуществить принципиально новый метод ускорения детекции аналитов в пробах, в том числе содержащих низкую концентрацию аналита, либо в случае использования антител с низкой афинностью, в том числе со слабой специфичностью. Изобретение позволяет улучшить предел детекции не только за счет ускорения времени обнаружения аналита в растворе, но и за счет повышения чувствительности диагностических тестов.
Уровень техники
Известен способ диагностики аналита в пробах, основанный на системе магнитного распознавания (заявка RU 2009120688). Изобретение предусматривает использование метки для аналита, которая присоединена к магнитному или намагничиваемому веществу, включающая распознающую составляющую для присоединения метки к аналиту, и составляющую для связывания или инкапсулирования магнитного или намагничиваемого вещества, - металлсвязывающего белка, полипептида или пептида. В данном изобретении отсутствует возможность концентрации аналита, что снижает возможность применения метода в случае низкой концентрации последнего. По этой причине данное изобретение не способствует ускорению индикации аналита.
Известно устройство для высокочувствительной магнитной детекции аналитов в биологической пробе (заявка на патент RU 98120854; публикация WO 97/40377). В описываемом изобретении детекция белковых аналитов, основанная на связывании рецепторов и лигандов, осуществляется с помощью двух приспособлений - одного для намагничивания с целью создания магнитного поля в месте пробы, второго - детекторного приспособления для измерения магнитных свойств пробы. Несмотря на использование магнитного поля, формируемого приспособлением для намагничивания, изобретение не предусматривает использование магнитных частиц, а также метода ускорения сбора аналита в измеряемой пробе. Кроме того, данное изобретение настроено на осуществление измерений in vivo.
Известен многоаналитный иммуноанализ с использованием микрочастиц (Заявка RU 2008127246). В нем предполагается смешивание различных категорий микрочастиц, покрытых биоспецифическими реагентами, для связывания различных искомых аналитов и меченных одним или несколькими флуорохромами в различных концентрациях. Детекция происходит на основании разницы соотношений концентраций длительно флуоресцирующих флуорохромов в микрочастицах, отличающихся у разных видов аналитов. Изобретение не предусматривает концентрирования аналита и, следовательно, не позволяет получить выигрыш по времени при его индикации.
Наиболее близким к заявляемому изобретению является изобретения US 7960184 и US 7824927 (прототип). В прототипах охарактеризован иной тип устройства, применяемый для анализа биологической пробы. Изобретения описывают детекцию биологических аналитов в пробе, в основе которого, в отличие от заявляемого, лежит использование иммобилизованных пробных молекул с использованием микрочипов. Данные способы предусматривают иммобилизацию детектируемых молекул на поверхности раздела, вблизи которой происходит концентрирование аналита. Реакция в прототипе идет между реагентом, иммобилизованным на поверхности, и свободным аналитом, что не позволяет достичь ускорения детекции аналита.
Таким образом, несмотря на тот факт, что отдельные способы и устройства для детекции аналитов в пробах с применением тех или иных методов детекции известны из уровня техники, устройство для детекции аналита, позволяющее концентрировать аналит на частицах и тем самым ускорять его индикацию, предложено авторами впервые.
Возможность осуществления изобретения
Скорость адсорбции аналитов на поверхности активированных частиц определяется произведением их концентраций в растворе или суспензии. Поэтому время сбора можно существенно уменьшить, сконцентрировав как раствор аналита, так и суспензию частиц. Необходимость в реализации данного метода может диктоваться, к примеру, с целью определения антигена малой концентрации, либо в целях использования антител с низкой афинностью.
Одним из основных способов ускорения сорбции аналита является традиционное интенсивное перемешивание, которое способствует уменьшению толщины неперемешиваемого слоя вокруг частиц. Вариант такого же перемешивания реализуется в потоке раствора аналита, пропускаемого через колонку частиц (например, через хроматографическую колонку). Однако в этом случае отсутствует возможность концентрации самого аналита.
Анализ следовых количеств различных аналитов, таких как токсины и вирусы, сталкивается с рядом физических ограничений. Во первых, скорость реакции почти всегда пропорциональная концентрации аналита, поэтому она так мала, что для связывания аналита требуются многие часы и даже дни.
-9
-11
Во-вторых, любая пробная молекула, с помощью которой «узнается» аналит (специфичное антитело или комплементарная последовательность нуклеотидов), имеет определенное сродство к аналиту, определяемое константой диссоциации, смысл которой состоит в том, что при концентрации аналита, равной константе диссоциации, половина пробных молекул будет связана с аналитом, а при меньших концентрациях аналита доля таких комплексов будет уменьшаться примерно пропорционально отношению концентрации к константе диссоциации. Из этого прямо вытекает требование очень прочного связывания (малой константы диссоциации) для пробных молекул, предназначенных для анализа следовых количеств аналита. Молекулы иммуноглобулинов имеют константу диссоциации порядка 10 - 10 М, что ограничивает предельные концентрации белковых аналитов на уровне 10 пг/мЛ. Учитывая, что многие биологические токсины действуют в существенно меньших концентрациях, данное обстоятельство серьезно затрудняет использование стандартных методов для их анализа.
Таким образом, задачей является создание более универсального и эффективного устройства для сбора аналита из раствора, позволяющего осуществить ускорение и концентрированно частиц.
Изобретательская задача решается тем, что предлагается устройство для быстрой детекции и сбора аналита (белков - природных или рекомбинантных, возбудителя инфекции или компонента возбудителя инфекции - вирусов или бактерий, ДНК, клетки или клеточного компонента, клеточной мембраны) на магнитных частицах в канале с полупроницаемыми стенками в потоке раствора аналита, смешанного с суспензией частиц, на поверхности частиц, состоящее из канала с полупроницаемыми стенками, электродных проточных камер, магнитного концентратора.
Технический результат заключается, во-первых, в ускорении времени обнаружения аналита в растворе, а во-вторых - в повышении чувствительности диагностических тестов. Известно, что любое антитело может связать аналит, только если его концентрация больше определенного значения, при котором образование комплексов аналит-антитело идет быстрее, чем их распад. При описываемом подходе, за счет увеличения локальной концентрации аналита, предел определения аналита значительно снижается, что минимизирует стоимость реакционно-способной смеси, а также способствует выигрышу по времени, необходимому для определения анализа.
Краткое описание чертежей
Фигура 1. Схематическое изображение сечения проточной камеры для сбора налита на магнитных частицах. 1 - электродные каналы, 2 - канал из полупроницаемой мембраны; 3 - электроды; 4 - магнит; 5 - концентратором магнитного поля.
Осуществление изобретения
Предлагаемое устройство состоит из канала, образуемого диализной мембраной, к обеим сторонам которого прилегают электродные камеры (Фиг 1). Сбор аналита осуществляется из потока жидкости, содержащей частицы и аналит. Для осуществления детекции магнитные частицы должны попасть в желоб, для чего прикладывают магнитное либо электрическое поле, гравитационную (инерционную) силу. В частности, для создания магнитного поля к одной стороне канала прикреплен концентратор магнитного поля, создающий неоднородное магнитное поле, которое вызывает движение магнитных частиц к стенке канала. Электрическое и магнитное поле может меняться как по величине, так и по направлению, что будет способствовать лучшей концентрации частиц. Например, поле прикладывается таким образом, чтобы заставить как аналит, так и частицы перемещаться к одной стенке канала, концентрироваться вблизи этой стенки и быстро реагировать. В данном изобретении используются частицы с плотностью, превышающей плотность жидкости. Образовавшиеся комплексы аналита и магнитных частиц удаляются потоком жидкости в канале.
Как показано на Фигуре 1, проточная камера состоит из электродных каналов (1), между которыми помещен проточный канал с желобом (2), изготовленный из полупроницаемой мембраны. В каналы (1) помещены электроды (3), позволяющие создавать электрическое поле, перпендикулярное к потоку жидкости в канале (2). В нижний электродный канал (1) помещен магнитный концентратор поля (5), изготовленный из магнитомягкого материала. Магнит (4) создает магнитный момент в концентраторе (5). Проточный канал (2) выполнен в виде желоба с углублением, расположенным над концентратором магнитного поля (5), что позволяет собирать магнитные частицы в желобе, существенно увеличивая их концентрацию по сравнению с проточным каналом с плоским дном.
Сбор заряженного аналита осуществляется при подаче напряжения на электроды (3), приводящие к появлению электрического поля поперек потока. Направление поля выбирается таким образом, чтобы аналит смещался из потока вниз и собирался в желобе канала (2). Поле может быть магнитным, электрическим, гравитационным.
Удаление магнитных частиц из канала может производиться в непрерывном режиме потоком жидкости, подбирая скорость потока и величину магнитного поля. В другом режиме магнитное поле периодически выключается путем удаления магнита (4). Такой режим удобно осуществить, заменив постоянный магнит (4) на электромагнит и периодически выключая ток в электромагните.
Пример осуществления изобретения
Изобретение иллюстрируется (но не ограничивается) следующим примером.
Пример 1. Быстрое обнаружение следовых количеств энтеротоксина стафиллокока в пробе с использованием устройства.
Для эксперимента были приготовлены следующие растворы: Рабочий буферный раствор: 10 мМ имидазола, 20 мМ глицина, 1% поливинилпирролидона, 1% поливинилового спирта, рН=9.0, а также суспензия магнитных частиц (MyOne, Invitrogen, с иммобилизованным на поверхности стрептавидином) с иммобилизованными на поверхности моноклональными антителами к стафиллококовому энтеротоксину. Биотинилированные антитела были привязаны к поверхности через молекулы стрептавидина.
Растворы разных концентраций энтеротоксина А стафиллокока на рабочем буферном растворе.
Растворы №2 и №3 были помещены в шприцевые насосы, которые подавали их в смеситель со скоростью 30 и 10 мкл в минуту, соответственно. Смеситель представлял собой Т-образный переходник. Сразу после смесителя смесь растворов поступала в устройство. На платиновые электроды устройства подавали напряжение в 100 В, что сопровождалось появлением тока в 6 мА. Для охлаждения реактора и удаления продуктов гидролиза через электродные каналы прокачивали раствор №1 со скоростью 6 мл/мин. Вытекающую из реактора жидкость собирали небольшими порциями в микропробирку. Чтобы исключить возможность реакции энтеротоксина с магнитными сферами после их прохождения через реактор, была применена специальная процедура сбора с немедленным отделением рствора энтеротоксина от магнитных микросфер. Для этого в микропробирках создавали градиент плотности, помещая 50% раствор глицерина на дно пробирок и наслаивая на него раствор №1. Конец трубки из реактора помещали в верхний слой, а к дну пробирки подносили сильный редкоземельный постоянный магнит, так что выходящие из конца трубки магнитные частицы притягивались на дно пробирки, в то время как свободный энтеротоксин оставался в верхнем растворе. Затем верхний раствор удаляли, а магнитные частицы отмывали раствором №1.
Собранные отмытые пробы магнитных частиц анализировали на проточном биочипе в режиме сканирования. Сканировали поверхность биочипа, прокачивая суспензию магнитных частиц со скоростью 20 микролитров в минуту. Регистрацию магнитных частиц, связанных с пятнами вторичных антител, производили под микроскопом, оборудованным темнопольным осветителем и цифровой фотокамерой.
Было получено, что с использованием 30000 магнитных частиц удается зарегистрировать 10 фемтограммов энтеротоксина (или 200000 молекул) в пробе объемом 100 мкл.
-15
-9
-15
-9
-6
4
d
Следует отметить, что на пределе детекции с использованием активного реактора (предельно малая концентрация составляла 0,1 пикограмм в 1 мл) молярная концентрация энтеротоксина составляла примерно 3×10 M. В отсутствие устройства при типичной для моноклональных антител константе диссоциации комплекса антиген-антитело К=10 М доля связавших энтеротоксин молекул антител на поверхности магнитных сфер составила бы только 3×10/10=3×10, что недостаточно для их детекции. Электроконцентрирование на диализной мембране способно увеличить локальную концентрацию вблизи мембраны в 10 раз, что соответственно поднимет долю связанных антигенов до вполне измеримой величины в 3%.
2
2
4
Еще одно преимущество устройства состоит в значительном уменьшении времени, требуемого для проведения реакции вследствие сближения реагентов. Так, при использованной в данном примере концентрации суспензии микросфер среднее расстояние между сферами составляло около а=150 µm. При таком рассянии для молекул иммуноглобулинов с коэффициентом диффузии D=5.5 µm/sec требуется время τ=(а/2)/2D=8 минут для завершения реакции связывания вне устройства. В устройстве только увеличение концентрации энтеротоксина в 10 раз уменьшит время реакции до 50 милисекунд. С учетом же сближения магнитных сфер в проточном желобе время реакции будет еще уменьшено на несколько порядков. Таким образом, устройство позволяет существенно сократить скорость и уменьшить передел чувствительности по концентрации токсинов.
Библиографические данные
1. Groves, S., Turell, M. J., Bailey, C., Morozov, V.N. (2008) Rapid active assay of pathogen-specific antibodies in chickens infected with West Nile Virus. Am. J. Trop. Med. Hyg., 78, 63-69.
2. Morozov V.N., Morozova T.Ya. Methods and devices for active bioassay US Patent 7,960,184.
3. Morozov, V., Bailey, C., Evanskey, M. Analyte detection using an active assay. US 7,824,927 B2, November 2, 2010.
4. Morozov, V.N., Evanskey, M., Tan, Y.K., Shaffer, D., Morozova, T.Y., Bailey, C. (2006) Ultra-filtration membrane for electrophoretic capturing of pathogens for AFM imaging. Langmuir 22, 1742-1748.
5. Morozov, V.N., Groves, S., Turell, M. J., Bailey, C., (2007) Three minutes-long electrophoretically assisted zeptomolar microfluidic immunoassay with magnetic beads detection. J. Am. Chem. Soc., 129, 12628 -12629.
6. Morozov, V.N., Groves, S., Turell, M. J., Bailey, C., (2007) Three minutes-long electrophoretically assisted zeptomolar microfluidic immunoassay with magnetic beads detection. J. Am. Chem. Soc., 129, 12628-12629. Morozov, V.N., Morozova, T.Ya. (2003) Electrophoresis-assisted active immunoassay. Anal. Chem. 75, 68-13-6819.
7. Morozov, V.N., Morozova, T.Ya. (2006) Active bead-linked immunoassay on protein microarrays. Anal. Chim. Acta, 564, 40-52.
8. Morozov, V.N., Shlyapnikov, Y.M., Kidd, J., Morozova, T.Y., Shlyapnikova, E.A. (2011) Conic Electrophoretic Concentrator for Charged Macromolecules. Anal. Chem. 83, 5548-5555.
9. Morozova, T.Ya., Morozov, V.N. Recognition of closely related antigens by active immunoassay. (2008) Anal. Biochem. 374, 263-271.
10. Shlyapnikov, Y.M., Shlyapnikova, E.A., Morozova, T.Y., Beletsky, I.P., Morozov, V.N. (2010) Detection of microarray-hybridized oligonucleotides with magnetic beads. Anal. Biochem. 399, 125-131.