Иммунологические маркеры воспалительного процесса при муковисцидозе у детей

Иммунологические маркеры воспалительного процесса при муковисцидозе у детей

Е.В. Яровенко, Е.И. Кондратьева, Г.Н. Янкина, Т.В. Перевозчикова, М.Н. Филимонова, Е.А. Файт, А.В. Недосеков

Immunological markers of an inflammatory process in children with cystic fibrosis

E.V. Yarovenko, E.I. Kondratyeva, G.N. Yankina, T.V. Perevozchikova, M.N. Filimonova, E.A. Fait, A.V. Nedosekov

Сибирский государственный медицинский университет, Томск

Проведено изучение содержания цитокинов (интерлейкинов-ip, -4, -10, фактора некроза опухолей-a, интерферона-у, антагониста рецептора интерлейкина-1) в крови, супернатанте культуры моноцитов-макрофагов у 24 детей с муковисцидозом. Осуществлена оценка функциональной активности моноцитов-макрофагов с определением экспрессии С3Ь- и Fcy-рецеп-торов, макрофагального фагоцитоза и количества лизосом. Выявлен дисбаланс между про- и противовоспалительными цитокинами: повышение уровня интерлейкина-1 в, фактора некроза опухолей-a на фоне снижения содержания интерлей-кинов-10 и -4. Полученные данные обосновывают использование стероидных и нестероидных лекарственных средств в терапии больных муковисцидозом. Снижение уровня интерферона-у в сыворотке крови и его продукции макрофагами на фоне стимуляции липополисахаридным комплексом у больных муковисцидозом может свидетельствовать о снижении клеточного иммунного ответа по Thl-пути и противовирусной защиты. Установлено снижение экспрессии С3Ь- и Fcy-рецепторов моноцитов-макрофагов и стимулированной продукции цитокинов у детей с муковисцидозом.

Ключевые слова: дети, муковисцидоз, цитокины, воспаление, макрофаги.

The levels of cytokines (interleukins-ip, -4, -10, tumor necrosis factor-a, interferon-y, interleukin-y receptor antagonist) in the blood and supernatant of cultured monocytes-macrophages were studied in 24 children with cystic fibrosis. The functional activity of monocytes-macrophages was evaluated, by determining the expression of C3b and Fcy receptors, macrophageal phagocytosis, and measuring the quantity of lysosomes. Imbalance was found between pro- and anti-inflammatory cytokines: increases in interleukin-ip and tumor necrosis factor and decreases in interleukins-10 and -4. The findings provided evidence for the use of steroidal and nonsteroidal drugs in the therapy of patients with cystic fibrosis. The reductions in the serum level of interferon-y and its macropha-geal production, by stimulating by a lipopolysaccharide complex in patients with cystic fibrosis, may suggest that a cellular immune response via the Thi pathway and antiviral protection is diminished. There were decreases in the expression of C3b and Fcy receptors of monocytes and macrophages and in the stimulated generation of cytokines in children with cystic fibrosis.

Key words: children, cystic fibrosis, cytokines, inflammation, macrophages.

Интенсивные иммунологические исследования позволили выявить общие закономерности в патогенезе ряда заболеваний, которые прежде не связывали друг с другом. Обобщение полученных данных привело к формированию концепции об иммуноопосредованных воспалительных болезнях. Выделяют заболевания, ассоциированные с 1Ъ1, 1Ъ2-лимфоцитами, и заболевания, ассоциированные с воспалительными цитокинами [1, 2]. В рамках последних обсуждается хроническая об-структивная болезнь легких. Существует мнение, что хронический воспалительный процесс при муковисцидозе поддерживается за счет дисбаланса про- и противовоспалительных цитокинов [3].

© Коллектив авторов, 2008

Ros Vestn Perinatal Pediat 2008; 2:55-59

Адрес для корреспонденции: 634050 Томск, Московский тракт, д. 2

Несомненный интерес представляет дальнейшее углубленное изучение детоксицирующих систем организма, в частности, микро- и макро-фагального звеньев иммунитета у больных, страдающих муковисцидозом. Причины изменения активности фагоцитирующих клеток (нейтрофи-лы, макрофаги) остаются недостаточно изученными. Используя современные методы исследования рецепторного аппарата клеток и ферментативного статуса фагоцитов на разных этапах развития патологического процесса, можно получить важную информацию о механизмах иммунного воспаления при этом заболевании и обосновать подходы к иммунокоррекции данного заболевания.

Целью настоящего исследования явилось изучение содержания секреции цитокинов в крови, супернатанте культуры моноцитов-макрофагов и оценка их функциональной активности с определением экспрессии С3Ь- и FcY-рецепторов, ма-

крофагального фагоцитоза и количества лизосом у больных муковисцидозом.

Характеристика детей и методы исследования

В исследования были включены 24 больных с муковисцидозом (9 девочек и 15 мальчиков). По возрасту дети были распределены следующим образом: от 1 года до 4 лет — 5, от 5 до 15 лет — 14, от 15 до 18 лет — 2, старше 18 лет — 3. Все дети были обследованы по общим клиническим методикам согласно стандартам, рекомендованным для данной категории больных [4]. Оценку нутритивного статуса пациентов проводили путем определения массоростового индекса и индекса массы тела.

Углубленное иммунологическое исследование, включавшее оценку функциональной активности моноцитов-макрофагов, их структурно-метаболического статуса и определение цитокинового профиля (про- и противовоспалительные цитокины), проведено у 21 пациента (в возрасте от 5 до 17 лет). В контрольную группу для иммунологических исследований вошли 20 практически здоровых детей того же возраста, не имеющих ОРЗ в течение последних 2 мес перед обследованием.

Клиническое обследование детей проводили на базе детской больницы №1 Томска. Иммунологическое исследование осуществлялось в отделе гематологии, иммунологии и морфологии Центральной научно-исследовательской лаборатории Сибирского государственного медицинского университета.

Содержание цитокинов в сыворотке крови и супернатанте культуры моноцитов-макрофагов изучали с помощью иммуноферментного анализа. Уровень фактора некроза опухолей-а, интерлей-кинов-4, -10 определяли наборами фирмы ООО «Протеиновый контур» (Санкт-Петербург), антагониста рецептора интерлейкина-1 — наборами фирмы «Вектор-Бест» (Новосибирск). В качестве стимулятора моноцитов-макрофагов использовали липополисахаридный комплекс («Сигма», США).

Учитывая, что макрофаги являются прилипающими клетками, для определения их функциональной активности использовали монослой этих клеток на стекле [5]. Для характеристики макрофагов в работе определялся рецепторный аппарат клеток — С3b-рецепторы, FcY-рецепторы, их фагоцитарная активность [6], количество лизосом по суммарному показателю люминесценции [7].

Математическую обработку результатов исследования проводили с использованием описательных статистик: Ме (медиана) и Q1, Q3 ^шг^ 1—3). Для определения достоверности различий качественных признаков использовали анализ таблиц сопряженностей с вычислением точного

значения критерия х2 и точного критерия Фишера [8]. Для анализа количественных признаков при сравнении двух независимых выборок применяли критерий Манна—Уитни, при сравнении трех выборок и более— Н-критерий Краскола—Уолисса. При достоверности межгрупповых различий проводили попарные сравнения с использованием Z-критерия Краскола—Уолисса с поправкой на множественные сравнения [9]. При сравнении двух зависимых выборок применяли критерий Вил-коксона, при сравнении трех зависимых выборок и более — Q-критерий Фридмана; для попарных сравнений — критерий Ньюмена—Кейлса [9]. Расчеты осуществлялись с использованием статистического пакета SAS 8.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Преимущественно легочная форма муковисцидо-за выявлена у 5 из 24 пациентов, преимущественно кишечная форма — у 1 ребенка, смешанная форма — у 18. В возрасте до 1 года диагноз был установлен 5 детям, от 3 до 6 лет — 16, старше 6 лет — 3 больным. В результате неонатального скрининга диагноз был установлен 3 детям.

Хроническая синегнойная инфекция была диагностирована у 4 из 24 детей, все они имели сформировавшиеся бронхоэктазы. Дыхательная недостаточность была выявлена у 3 больных, хронический панкреатит — у 12, жировой гепатоз — у

3, формирующийся цирроз печени — у 4, нутри-тивная недостаточность — у 4, задержка роста — у

4, остеопенический синдром — у 2.

Нами была изучена характеристика цитоки-нового статуса у больных муковисцидозом. Обнаружено увеличение в сыворотке крови уровня фактора некроза опухолей-a, на фоне снижения содержания противовоспалительных цитокинов, в частности, интерлейкина-10 и в большей степени антагониста рецептора интерлейкина-1 (табл. 1). Повышенное содержание фактора некроза опухо-лей-a в изучаемых средах имеет важное значение в поддержании воспаления. Известно, что при остром воспалении этот цитокин стимулирует хемотаксис нейтрофилов в очаг воспаления, увеличивает тропность последних к эндотелиоцитам за счет индукции молекул адгезии на поверхности эн-дотелиальных клеток и нейтрофилов [10, 11]. Фактор некроза опухолей-a играет роль в хронизации процесса за счет повышения адгезии макрофагов (которые являются основными клетками-эффекторами хронического воспаления) и опосредовано за счет активации тромбоцитов, индукции синтеза оксида азота [12, 13]. Избыточное образование ци-токина способствует развитию токсического септического шока, гипертермии, кахексии, полиор-

Таблица 1. Сравнительная характеристика содержания цитокинов в сыворотке крови, в супернатанте культуры моноцитов-макрофагов до и после стимуляции липополисахаридным комплексом (Ме/Q1—Q3) у здоровых (контроль) и у больных муковисцидозом

Цитокин, нг/мл Ме^- ^3) р

больные здоровые

29,6 17,7

сыворотка (4,2—107,6) (11,7—26,1) 0,053

ИЛ-1Р спонтанная продукция 6,5 (5,2—10,9) 55,0 (34,8—92,5) <0,001

стимулированная продукция 7,0 (5,4—10,8) 32,5 (23,9—66,1) <0,001

сыворотка 3,9 (3,6—9,6) 13,7 (5,6—22,8) 0,002

ИЛ-4 спонтанная продукция 4,3* (3,6—5,6) 15,5 (9,9—18,5) <0,001

стимулированная продукция 5,4* (4,4—8,7) 14,4 (10,5—24,0) <0,001

сыворотка 7,4 (1,7—149,3) 19,4 (12,9—44,1) 0,608

ИЛ-10 спонтанная продукция 163,6 (119,4—176,3) 62,3 (28,0—79,3) 0,003

стимулированная продукция 147,1 (93,58—155,7) 59 (44,1—86,3) 0,020

сыворотка 57,2 (45,2—102,4) 38,3 (27,8—51,8) 0,054

ФНО-а спонтанная продукция 39,5 (11,0—75,7) 37,6 (24,7—52,5) 0,657

стимулированная продукция 43,1 (26,1—50,9) 39,6 (23,1—49,7) 0,506

сыворотка 17,0 (11,0—23,3) 50,8 (49,9—51,4) <0,001

ИФН-у спонтанная продукция 12,7 (11,0—15,7) 49,3 (49,0—49,7) <0,001

стимулированная продукция 11,1 (10,5—12,2) 50,4 (49,2—52,2) <0,001

сыворотка 2,6 (1,5—6,5) 11,7 (9,9—13,3) 0,009

ЮЯа спонтанная продукция 0,8 (0,7—1,5) 17,3 (14,9—20,3) <0,001

стимулированная продукция 0,9 (0,6—2,2) 19,7 (16,1—25,2) <0,001

Примечание. ИЛ — интерлейкин; ФНО-а — фактор некроза опухолей; ИФН — интерферон; ГЬ1Ка — антагонист рецептора интерлейкина-1. * — Достоверное различие между спонтанной и стимулированной секрецией (р<0,05).

ганной недостаточности, что может наблюдаться у больных при тяжелом течении муковисцидоза.

До недавнего времени одной из главных причин неблагоприятного течения тяжелых форм му-ковисцидоза, хронических заболеваний легких с

гнойно-септическими осложнениями считали неконтролируемую продукцию различных медиаторов воспаления и, в первую очередь, провоспали-тельных цитокинов (фактора некроза опухолей-а, интерлейкинов-1р, -6, -8, интерферона-у), с дей-

ствием которых связывали развитие бактериально-токсического шока, дистресс-синдрома, синдрома диссеминированного внутрисосудистого свертывания [14—17].

В результате исследования выявлено выраженное снижение уровня противовоспалительного ци-токина — антагониста рецептора интерлейкина-1 до 2,6 (1,5—6,5) нг/мл, в контроле 11,7 (9,9—13,3) нг/мл (р<0,009), который ингибирует пути связывания интерлейкинов-1а и -1р с соответствующими клеточными рецепторами. Полученные результаты свидетельствуют о выраженном и плохо контролируемом воспалительном процессе в организме больных муковисцидозом. Содержание антагониста рецептора интерлейкина-1 в сыворотке крови и супернатанте культуры моноцитов-макрофагов при стимуляции бактериальным агентом (липополисахаридным комплексом) статистически значимо отличалось от соответствующих показателей у детей контрольной группы (р<0,001).

В 1996—1997 гг. сформировалась концепция [18], согласно которой вслед за начальным высвобождением провоспалительных медиаторов в организме больного индуцируется запуск противовоспалительной реакции, которая получила наименование синдром компенсаторного противовоспалительного ответа (CARS, compensatory anti-inflamatory response syndrome). Противовоспалительная реакция направлена на снижение синтеза или модуляцию эффектов провоспалительных медиаторов, ослабление проявления системного воспаления и восстановление исходного гомеоста-за. Однако ее чрезмерная выраженность может индуцировать развитие глубокой иммунодепрессии, что приводит к полной неспособности организма противостоять бактериальной агрессии и часто обозначается как состояние «иммунопаралича»

[19]. Свидетельством несостоятельности иммунной защиты в этом случае являются хронизация или диссеминация инфекции, смена патогенной флоры с развитием микст- или нозокомиальной инфекции, нарушение процессов репарации. В свете такого представления патогенеза инфекци-онно-воспалительного процесса и полученных нами данных становится ясно, что баланс про- и противовоспалительных реакций должен учитываться при выборе средств и методов иммунокор-ригирующей терапии.

У больных муковисцидозом уровень интер-ферона-у был снижен в сыворотке крови — 17,0 (11,0—23,3) нг/мл против 50,6 (49,9—51,4) нг/мл, а также в стимулированном липополисахаридным комплексом супернатанте культуры моноцитов-макрофагов по сравнению с контрольными значениями (^<0,001), что играет роль в ослаблении противовирусного и клеточного иммунитета. Моноциты-макрофаги после стимуляции липополиса-харидным комплексом, имитирующим бактериальный агент, начинают более активно продуцировать интерлейкин-4, но показатель остается ниже уровня у здоровых детей (см. табл. 1). Секреция этого ци-токина моноцитами-макрофагами у здоровых детей контрольной группы на стимуляцию липополиса-харидным комплексом не изменялась. Таким образом, моноциты-макрофаги у больных муковисцидо-зом на стимуляцию бактериальным агентом активно продуцируют интерлейкин-4, запускающий 1Ъ2-путь иммунного ответа, это в свою очередь определяет повышенную выработку IgE и способствует формированию гиперреактивности бронхов. Полученные данные подтверждают мнение о формировании бронхообструкции [2] при повторных встречах с бактериальными агентами и необходимости включения в стандарты терапии Р2-агонистов.

Таблица 2. Сравнительная характеристика показателей структурного статуса и функциональной активности моноцитов-макрофагов в крови у здоровых и у больных муковисцидозом

Показатель (рецепторы, лизосомы, фагоцитоз) Ме^г больные -Q3) здоровые Р

С3Ь, % 3 (0—7) 21 (19—24) <0,001

Fcy, % 2 (0—4) 13 (11—16) <0,001

Суммарный показатель люминесценции, ед. 35 (20—49) 26 (12—31) 0,065

Макрофагальный фагоцитоз, ед.опт.пл.

610

460

0,087

При оценке функциональной активности моноцитов-макрофагов и их рецепторного аппарата у детей с муковисцидозом отмечено достоверное уменьшение показателей экспрессии С3Ь- и Fcy-рецепторов (р<0,001) по сравнению со здоровыми (табл. 2). Суммарный показатель люминесценции макрофагов не отличался от нормы, а в некоторых случаях превышал нормальные значения по сравнению с группой контроля. Макрофагальный фагоцитоз у детей с муковисцидозом имел некоторую тенденцию к повышению (см. табл. 2). Низкая экспрессия С3Ь- и Fcy-рецепторов, снижение суммарного показателя люминесценции макрофагов, вероятно, способствуют прогрессирующему волнообразному течению хронического процесса при муковисцидозе.

ВЫВОДЫ

1. При муковисцидозе в детском возрасте отмечается дисбаланс между про- и противовоспалительными цитокинами: повышение уровня ин-

терлейкина-lß, фактора некроза опухолей-a на фоне снижения содержания интерлейкинов-10 и -4. В связи с этим в терапии больных оправдано использование стероидных и нестероидных лекарственных средств, в том числе альтернирующего курса преднизолона.

2. Снижение уровня интерферона-у в сыворотке крови и его продукции макрофагами на фоне стимуляции липополисахаридным комплексом у больных муковисцидозом может свидетельствовать о снижении клеточного иммунного ответа по Th1-пути и противовирусной защиты. Полученные результаты предполагают назначение препаратов интерферона или его индукторов для профилактики и лечения обострений заболевания.

3. Нарушение функциональной активности моноцитов-макрофагов в виде снижения экспрессии С3Ь- и Fcy-рецепторов и стимулированной продукции цитокинов вносит вклад в течение заболевания, определяя его тяжесть.

ЛИТЕРАТУРА

1. Ильина Н.И., Гудима Г.О. Воспаление и иммунитет в общеклинической практике. Общая концепция. Ци-токины и воспаление 2005; 4: 3: 42—44.

2. Кетлинский С.А., Калинина Н.М. Цитокины монону-клеарных фагоцитов в регуляции реакции воспаления и иммунитета. Иммунология 1995; 3: 30—44.

3. Пухальский А.Л., Шмарина Г.В. Особенности воспаления при муковисцидозе — мифы и реальность. Национальный конгресс по муковисцидозу, 7-й: Сборник статей и тезисов. М 2005; 69—71.

4. Капранов Н.И., Каширская Н.Ю. Муковисцидоз (современные достижения и актуальные проблемы): Метод. рекомендации. М 2005; 104.

5. Земсков В.М., Родионов С.В., Пантин В.И. и др. Количественный биохимический анализ макрофагов мышей, стимулированных нуклинатом натрия. Иммуно-логия1985; 6: 53—56.

6. Фрейдлин И.С. Система мононуклеарных фагоцитов. М: Медицина 1984; 272.

7. Khavkina J.H., Freidlin I.S. et al. Method of colouring of lysosomes. Acta microbiol Acad Sci Hun 1977; 24: 281— 291.

8. Гланс С. Медико-биологическая статистика. М: Практика 1999; 459.

9. Лакин Г.Ф. Биометрика. М: Высшая школа 1983; 343.

10. Потапнев М.П. Цитокиновая сеть нейтрофилов при воспалении. Иммунология 1995; 4: 34—40.

11. Фрейдлин И. С., Назаров П.Г. Регуляторные функции провоспалительных цитокинов и острофазных белков. Вестн РАМН 1999; 5: 28—32.

12. Rabinovitch A. Immunoregulation by cytokines in autoimmune diabetes. Adv Exp Med Biol 2003; 520: 159—193.

13. Sibille Y., Marchandise F.-X. Pulmonary immune cells in health and disease: Polymorphonuclear neutrophils. Eur Res J 1993; 6: 1529—1543.

14. Giroir B.P. Mediators of septic shock: new approaches for interruption the endogenous inflammatory cascade. Crit Care Med 1993; 21: 5: 7680—7689.

15. Glauser M.P., Heumann D., Baumgarrtner J.D., Cohen J. Pathogenesis and potential strategies for prevention and treatment of septic shock. Clin Infect Dis 1994; 18: 2: 205—206.

16. Heumann D., Glausey M.P. Pathogenesis of sepsis. Scientific Am Sci Med 1994; 1: 5: 28—37.

17. Parrilo J.E., Parker M.M., Natanson C. et al. Septic shock in human: advances in the understanding of pathogenesis, cardiovascular dysfunction, and therapy. Ann Int Med 1990; 28A: 1038—1044.

18. Козлов В.А., Останин А.А., Леплина О.Ю. и др. Экстракорпоральная иммунотерапия в коррекции состояния «иммунопарализиса» у больных с хирургической инфекцией. Int J Immunorehabilitation 1997; 6: 135—138.

19. Docke W.-D., Randow F., Syrbe U. et al. Monocyte deactivation in septic patients: restoration by IFN-y treatment. Nature Med 1997; 3: 6: 678—681.

Поступила 04.12.07