Влияние предварительной активации дрожжей пероксидом водорода на их адаптацию к кислотному стрессу

Т. А. Ямашев, О. А. Решетник ВЛИЯНИЕ ПРЕДВАРИТЕЛЬНОЙ АКТИВАЦИИ ДРОЖЖЕЙ ПЕРОКСИДОМ ВОДОРОДА НА ИХ АДАПТАЦИЮ К КИСЛОТНОМУ СТРЕССУ

Ключевые слова: дрожжи, активация, пероксид водорода, кислотный стресс.

Исследовано явление формирования устойчивости хлебопекарных дрожжей Saccharomyces cerevisiae к действию молочной кислоты в результате предварительной обработки нелетальными концентрациями пероксида водорода. Показано, что дрожжи, обработанные 0,5-3,0 мМрастворами пероксида водорода сохраняли более высокую бродильную активность в стрессовых условиях (2 % раствор молочной кислоты) по сравнению с контролем.

Keywords: yeast, activation, hydrogene peroxide, acid stress.

The phenomenon of formation of sustainability of baker's yeast Saccharomyces cerevisiae to the action of lactic acid as a result of pretreatment of non-lethal concentrations of hydrogen peroxide is studied. Shown that yeast treated with 0,5-3,0 mM hydrogen peroxide solution retains a higher fermentation activity in stressful conditions (2 % solution of lactic acid) compared with control.

Все живые организмы реагируют на изменения окружающей среды. Микроорганизмы вынуждены постоянно адаптироваться к колебаниям в содержании питательных веществ, температуры, осмотического давления и рН среды, а также к токсичным соединениям.

Промышленно используемые дрожжи регулярно подвергаются действию различных стрессоров [1, 2, 3, 4]. Хотя, как правило, они более устойчивы по сравнению с лабораторными штаммами [5], но современные условия производства предъявляют к ним повышенные требования.

В процессе эволюции микроорганизмы приобрели способность противодействовать стрессорам на разных уровнях клеточной организации. Механизмы адаптации к стрессу разнообразны: включение систем репарации ДНК, синтез и/или активация ферментов, образование внутриклеточных протекторных соединений и экзометаболитов, индукция транскрипции стрессовых белков, посттрансляционная модификация белков, изменение липидного состава клеточных мембран, изменение формы клеток и клеточной поверхности, формирование биопленок, цитодифференцировка, изменение трансмембранного транспорта, регуляция экспрессии различных генов [6, 7].

Адаптационный ответ дрожжей на действие стрессоров включает экспрессию более 200 генов, как специфичных к определенному неблагоприятному воздействию, так и универсальных [8].

Органические кислоты являются природными консервантами и способны ингибировать рост многих микроорганизмов, в том числе и дрожжей. Органические кислоты в недиссоциированной форме легко проникают через цитоплазматическую мембрану в клетку, и диссоциируют там вследствие более высокого значения рН. При накоплении протонов в клетке происходит подкисление цитоплазмы, это приводит к изменению активностей

ферментов, перестройке метаболических путей и т.д., а высокие концентрации анионов в клетках повышают внутриклеточное давление (тургор), что также не может не сказаться на жизнеспособности микроорганизмов. Для адаптации к органическим кислотам дрожжи повышают синтез АТФ-связанного белка транспортера Рёг12, который катализирует откачку ионов органических кислот из цитозоля [9, 10]. Данный процесс является энергозависимым и идет с гидролизом АТФ (на откачку 1 моля кислоты требуется 2 моля АТФ).

Известно, что в ответ на действие большинства стрессоров микроорганизмы активируют универсальные механизмы защиты, которые могут сохраняться некоторое время и после снятия стрессового воздействия. С данным эффектом связано явление перекрестной устойчивости, когда при обработке клеток нелетальными дозами одного стрессора у них развивается устойчивость к другим [11, 12, 13]. Обработка дрожжей cerevisiae сорбино-вой кислотой приводила к сильной индукции белка теплового шока Ивр30, оказывающего протекторное действие на микроорганизмы в стрессовых условиях [14]. Аналогичный эффект вызывали тепловой шок, этанол, органические кислоты, гиперосмотический стресс и недостаток питательных веществ [14].

Нами было показано, что под влиянием низких концентраций пероксида водорода повышалась устойчивость дрожжей £. cerevisiae к органическим кислотам, высшим спиртам и этанолу в условиях спиртового брожения [15, 16, 17]. В связи, с чем представилось целесообразным провести исследования влияния обработки дрожжей нелетальными концентрациями пероксида водорода на их бродильную активность в условиях кислотного и осмотического стрессов.

Экспериментальная часть

Объект исследования - дрожжи хлебопекарные прессованные (ОАО Буинский сахарный завод).

Количество образующегося при брожении углекислого газа определяли волюмометрическим методом на приборе Яго-Островского по количеству вытесняемого насыщенного раствора хлорида натрия, в котором углекислый газ не растворяется.

При определении количества выделяющегося углекислого газа дрожжи помещали в питательную среду, состав которой был приближен к составу хлебобулочного изделия с повышенным содержанием сахара (20 % сахарозы, 1,5 % ЫаО!). Эксперимент проводили в двух вариантах:

1) дрожжи после активации отделяли центрифугированием (5000 об/мин, 15 мин) и вносили в виде навески, ресуспензированной в водопроводной воде, чтобы исключить влияние пероксида водорода на газообразование;

2) дрожжи не отделяли от активирующего раствора ввиду того, что на производстве центрифугирование проводить нецелесообразно, и вносили в виде суспензии. Для создания стрессовых условий в среду дополнительно добавляли молочную кислоту в концентрациях 1 и 2 %. Эксперимент проводили в двух вариантах:

В контрольном опыте раствор пероксида водорода заменяли водопроводной водой.

Результаты и их обсуждение

В процессе брожения в тесте накапливается достаточно большое количество молочной кислоты, в связи с чем представилось целесообразным изучить влияние активации дрожжей пероксидом водорода на их способность выделять углекислый газ при повышенных содержаниях данной кислоты. Результаты представлены на рис. 1, 2, 3, 4.

Негативное действие молочной кислоты на клетки дрожжей достаточно сильно выражено, особенно в концентрации 2 %. Общий объем, выделившегося углекислого газа сокращался в 1,5-2 раза в зависимости от концентрации молочной кислоты в среде. На бродильную активность влияло также и центрифугирование: данная операция приводила к

дополнительному снижению объема выделившегося углекислого газа, примерно на 50 %. Однако, было отмечено интересное явление: бродильная активность дрожжей, обработанных пероксидом водорода в концентрации 3 мМ и подвергнутых центрифугированию, превышала контрольные показатели, тогда как в отсутствие центрифугирования картина менялась на противоположную. Данный эффект указывает на то, что активация дрожжей пероксидом водорода повышает их устойчивость при последовательном воздействии нескольких неблагоприятных факторов.

Рис. 1 - Образование углекислого газа культурой дрожжей S. еегег1я1ае, предобрабо-танных пероксидом водорода в течение 30 мин в условиях повышенной концентрации молочной кислоты

о

ев

ю

О

Время, мин

-О- - 0 мМ пероксида водорода  —Л— 3,0 мМ пероксида водорода

0,5 мМ пероксида водорода

Рис. 2 - Образование углекислого газа культурой дрожжей S. еегег1Э1ае, предобрабо-танных пероксидом водорода в течение 30 мин в условиях повышенной концентрации молочной кислоты

Рис. 3 - Образование углекислого газа культурой дрожжей S. еегег1Э1ае, предобрабо-танных пероксидом водорода в течение 30 мин в условиях повышенной концентрации молочной кислоты

Время, мин

- -О1  0 мМ пероксида водорода —— 0,5 мМ пероксида водорода —й— 3,0 мМ пероксида водорода

Рис. 4 - Образование углекислого газа культурой дрожжей S. cerevisiae, предобрабо-

танных пероксидом водорода в течение 30 мин в условиях повышенной концентрации молочной кислоты

Литература

1. Perez-Torrado, R. Monitoring stress-related genes during the process of biomass propagation of Saccharomyces cerevisiae strains used for wine making / R. Perez-Torrado, J.M. Bruno-Barcena, E. Matal-lana // Appl. Environ. Microbiol. - 2005. - Vol. 71, № 11. - P. 6831-6837.

2. Marks, V.D. Dynamics of the yeast transcriptome during wine fermentation reveals a novel fermentation stress response / V.D. Marks [et all.] // FEMS Yeast Res. - 2008. - Vol. 8, № 1. - P. 35-52.

3. Wu, H. Global gene expression analysis of yeast cells during sake brewing / H. Wu [et all.] // Appl. Environ. Microbiol. - 2006. - Vol. 72, № 11. - P. 7353-7358.

4. Gibson, B.R. Yeast responses to stresses associated with industrial brewery handling / B.R. Gibson [et all.] // FEMS Microbiology Reviews. - 2007. - Vol. 31, № 5. - P. 535-569.

5. Garay-Arroyo, A. Response to different environmental stress conditions of industrial and laboratory Saccharomyces cerevisiae strains / A. Garay-Arroyo [et all.] // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2004. -Vol. 63, № 6. - P. 734-741.

6. Николаев, Ю.А. Ауторегуляция стрессового ответа микроорганизмов / Ю.А. Николаев [и др.] // Микробиология. - 2006. - Т. 75. - № 4. - С. 489-496.

7. Воробьева, Л.И. Стрессоры, стрессы и выживаемость бактерий (обзор) / Л.И. Воробьева // Прикладная биохимия и микробиология. - 2004. - Т. 40. - № 3. - С. 261-269.

8. Шелемех, О.В. «Кислородная регуляция» состава дыхательной цепи дрожжей Debaryomyces han-senii при множественном стрессе / О.В. Шелемех [и др.] // Микробиология. - 2006. - Т. 75. - № 4. -С. 562-569.

9. Bauer, B.E. Weak organic acid stress inhibits aromatic acid uptake by yeast, causing a strong influence of amino acid auxotrophies on the phenotypes of membrane transporter mutants / B.E. Bauer [et all.] // Eur. J. Biochem. - 1999. - Vol. 270, N 15. - P. 3189-3195.

10. Holyoak, C.D. The Saccharomyces cerevisiae weak-acid-inducible ABC transporter Pdr12 transports fluorescein and preservative anion from the cytosol by an energy-dependent mechanism / C.D. Holyoak [et all.] // J. Bacteriol. - 1999. - Vol. 181, N 15. - P. 4644-4652.

11. Бирюкова, Е.Н. Устойчивость дрожжей Yarrowia lipolytica к окислительному стрессу / Е.Н. Бирюкова [и др.] // Микробиология. - 2006. - Т. 75. - № 3. - С. 293-298.

12. Николаев, Ю.А. Внеклеточные факторы адаптации бактерий к неблагоприятным условиям среды / Ю.А. Николаев // Прикладная биохимия и микробиология. - 2004. - Т. 40. - № 4. -С. 387-397.

13. Chen, D. Global Transcriptional Responses of Fission Yeast to Environmental Stress / D. Chen [et all.] // Molecular Biology of the Cell. - 2003. - Vol. 14, № 1. - P. 214-229.

14. Piper, P.W. Hsp30, the integral plasma membrane heat shock protein of Saccharomyces cerevisiae, is a stress-inducible regulator of plasma membrane H+ -ATPase / P.W. Piper [et all.] // Cell Stress & Chaperones. - 1997. - Vol. 2, № 1. - P. 12-24.

15. Ямашев, Т.А. Антимикробная обработка ржаного замеса в технологии этилового спирта / Т.А. Ямашев [и др.] // Вестник Казанского технологического университета. - 2006. - № 4. - С. 169175.

16. Ямашев, Т.А. Дезинфекция пшеничного замеса на стадии гидротермической обработки / Т.А. Ямашев [и др.] // Производство спирта и ликероводочных изделий. - 2006. - № 4. - С. 13-15.

17. Ямашев, Т.А. Влияние пероксида водорода на микробиологические и физико-химические показатели полупродуктов спиртового производства / Т.А. Ямашев [и др.] // Производство спирта и ликероводочных изделий. - 2008. - № 2. - С. 9-12.

© Т. А. Ямашев - канд. техн. наук, доц. каф. технологии пищевых производств ЮТУ; О. А. Решетник - д-р техн. наук, профессор, зав. каф. технологии пищевых производств КГТУ,

reshetnik@kstu.ru.