ШТАММ LACTOBACILLUS CRISPATUS KBL693 И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ
LACTOBACILLUS CRISPATUS KBL693 STRAIN AND ITS APPLICATION

Область техники
Lactobacillus crispatus
Lactobacillus crispatus
[1] Настоящее изобретение относится к штамму  KBL693 и к его применению. Конкретнее, настоящее изобретение относится к функциональной оздоровительной пищевой композиции, обладающей по меньшей мере одним эффектом, выбранным из группы, состоящей из смягчения симптомов аллергии, смягчения симптомов воспаления и иммунорегуляции; противогрибковой композиции; и фармацевтической композиции для лечения по меньшей мере одного заболевания, выбранного из группы, состоящей из аллергических заболеваний, включая атопический дерматит, и/или воспалительных или аутоиммунных заболеваний, содержащей по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из нового пробиотического штамма  KBL693, культур указанного штамма, лизатов указанного штамма и экстрактов указанного штамма.
[2]
Уровень техники
[3] Пробиотики относятся к микроорганизмам и полученным из них продуктам, обладающим антимикробной активностью и ферментативной активностью, помогающими соблюдать равновесие микроорганизмов кишечника. Кроме того, пробиотики по определению представляют собой живые бактерии в виде одного или нескольких штаммов, улучшающих кишечную микрофлору при введении человеку или животным в виде сухих клеток или продуктов ферментации. Пробиотики должны населять кишечник человека, являться непатогенными и нетоксичными и выживать в течение достаточно продолжительного времени до поступления в кишечник. Кроме того, пробиотики должны поддерживать жизнеспособность и активность до потребления с продуктами питания, являться чувствительными к антибиотикам, используемым для профилактики инфекций, а также не содержат плазмид устойчивости к антибиотикам. Кроме того, пробиотики должны быть устойчивы к кислотам, ферментам и желчи в среде, присутствующей в кишечнике.
Bacillus sp.
Lactobacillus sp.
фотосинтезирующие бактерии
[4] Такие пробиотики могут включать, например, , обладающие замечательной способностью продуцировать гидролизующие ферменты, например, амилазу, протеазу, липазу, целлюлазу и фосфатазу, , продуцирующие молочную кислоту, и , предотвращающие появление неприятного запаха за счет использования неприятно пахнущих веществ (например, аммиака, сероводорода и аминов), присутствующих в фекалиях скота, в процессах метаболизма. Согласно недавнему сообщению, пробиотики обладают различными эффектами, улучшающими функции организма, включая улучшение состояния кишечника, и поэтому активно рассматриваются в качестве основных терапевтических веществ, которые могут заменять существующие терапевтические агенты на основе соединений.
[5]
[6] Аллергия является биохимическим явлением, характеризующимся уникальным искаженным ответом на чужеродное вещество (антиген, аллерген). Чужеродное вещество, вызывающее симптомы, называют аллергеном, а заболевания, при которых развиваются эти симптомы, называют аллергическими заболеваниями. Аллергия представляет собой патологический процесс в живом организме, причиной которого является реакция «антиген-антитело». В целом существует четыре типа аллергии в зависимости от периода времени, в течение которого возникает реакция, и вовлеченности комплемента. Аллергия 1 типа представляет собой реакцию анафилактического (немедленного) типа, при которой органами-мишенями в основном являются органы пищеварительной системы, кожа и легкие, а распространенные симптомы включают желудочно-кишечную аллергию, крапивницу, атрофический дерматит, аллергический ринит, бронхиальную астму и т.д. Известно, что патологические механизмы аллергии 1 типа развиваются следующим образом: при контакте антигенов с антителами IgE, присоединенными к поверхности тучных клеток и базофилов, клетки-мишени активируются и секретируют химические медиаторы, например, гистамин, лейкотриены и PAF с последующим сокращением кровеносных сосудов и гладких мыщц. Такой механизм часто может наблюдаться в комбинации с аллергией 4 (замедленного) типа. Другими словами, такая анафилактическая и аллергическая реакция может возникать вследствие различных изменений в тучных клетках и т.д. Активация тучных клеток, ведущая к их дегрануляции, обусловлена связыванием антигена, антитела против IgE, лектина и т.д. с Fc-рецепторами, стимуляцией посредством анафилотоксина и т.д. или других лекарственных средств, например, кальциевого ионофора, соединения 48/80, кодеина и синтетического адренокортикотропина.
[7] Известно, что тучные клетки и базофилы крови являются основным клетками организма, вызывающими различные аллергические заболевания, например, аллергический ринит, аллергический дерматит, астму, пищевую аллергию и анафилактический шок. Эти клетки содержат на своей поверхности рецепторы (FcRI) для IgE, которые представляют собой антитела, вызывающие аллергию; данные клетки стимулируются веществами, вызывающими аллергию (антигенами, аллергенами), и секретируют собственные вещества, вызывающие аллергию (Kim K et al., Eur J Pharmacol, 581:191-203, 2008).
[8] Среди аллергических заболеваний широко известен атопический дерматит, представляющий собой хроническое рецидивирующее кожное заболевание, которое возникает у новорожденных или детей и может сохраняться до зрелого возраста. Как и астма или аллергический ринит, атопический дерматит представляет собой воспалительное заболевание кожи, ассоциированное с местной инфильтрацией Т-лимфоцитов, продуцирующих ИЛ-4 и ИЛ-5. ИЛ-4, как хорошо известно, контролирует развитие T-хелперов 2 фенотипа (Th2), что приводит к избыточной продукции иммуноглобулинов (Ig) и эозинофилии, а также увеличению уровня IgE в сыворотке. Атопический дерматит обнаруживается у 80-90% субъектов с положительными результатами кожной пробы на пищевые и ингаляционные аллергены.
[9] Существуют различные средства для лечения или профилактики аллергических заболеваний и атопического дерматита, однако эффективный способ лечения пока не найден. Известны некоторые варианты медикаментозной терапии, однако даже кратковременное применение лекарственного средства может привести к развитию устойчивости, а долговременное применение может вызвать серьезные побочные эффекты, и поэтому в последнее время таких вариантов медикаментозной терапии аллергических заболеваний и атопического дерматита избегают. В данных обстоятельствах при отсутствии вариантов лечения, обеспечивающих абсолютный очевидный эффект, попытки улучшения симптомов раздражения, например, зуда и гиперемии при аллергии часто не дают эффекта.
[10]
Lactobacillus crispatus
[11] В данных обстоятельствах авторы настоящего изобретения сосредоточились на исследованиях пробиотиков с целью поиска способа замены терапевтических средств на основе лекарственных веществ для лечения аллергических заболеваний (в том числе атопического дерматита) для которых отсутствуют удовлетворительные способы лечения. Таким образом, настоящее изобретение выполнено посредством подтверждения того, что новый штамм  демонстрировал исключительное терапевтическое действие по отношению к аллергическим заболеваниям, например, атопическому дерматиту, а также подтверждения того, что указанный штамм также демонстрировал превосходное действие в отношении противовоспалительной, иммунорегуляторной и противогрибковой активности.
[12]
[13] Краткое описание изобретения
[14] Цель настоящего изобретения - предложить новый штамм, демонстрирующий исключительное действие в отношении смягчения симптомов аллергии, например, атопического дерматита, смягчения симптомов воспаления и иммунорегуляции, а также ряд вариантов его применения.
Lactobacillus crispatus
[15] Для достижения этой цели в настоящем изобретении предложен штамм  KBL693 (идентификационный номер KCTC 13519BP).
[16] Кроме того, в настоящем изобретении предложена пищевая композиция или композиция пищевой добавки, содержащая по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из указанного штамма, культур указанного штамма, лизатов указанного штамма и экстрактов указанного штамма.
[17] Кроме того, в настоящем изобретении предложена кормовая композиция или композиция кормовой добавки, содержащая по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из указанного штамма, культур указанного штамма, лизатов указанного штамма и экстрактов указанного штамма.
[18] Кроме того, в настоящем изобретении предложена противогрибковая композиция, например, композиция для лечения перхоти, содержащая по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из указанного штамма, культур указанного штамма, лизатов указанного штамма и экстрактов указанного штамма.
[19] Кроме того, в настоящем изобретении предложена фармацевтическая композиция для лечения аллергических заболеваний, например, атопического дерматита, и/или воспалительных или аутоиммунных заболеваний, содержащая по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из указанного штамма, культур указанного штамма, лизатов указанного штамма и экстрактов указанного штамма.
[20] Кроме того, в настоящем изобретении предложен способ лечения аллергических заболеваний, в том числе атопического дерматита, и/или воспалительных или аутоиммунных заболеваний, включающий введение по меньшей мере одного компонента, выбранного из группы, состоящей из указанного штамма, культур указанного штамма, лизатов указанного штамма и экстрактов указанного штамма субъекту, нуждающемуся в этом.
[21] Кроме того, в настоящем изобретении предложена композиция, содержащая по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из указанного штамма, культур указанного штамма, лизатов указанного штамма и экстрактов указанного штамма, для применения при профилактике или лечении аллергических заболеваний, в том числе атопического дерматита, и/или воспалительных или аутоиммунных заболеваний.
[22] Кроме того, в настоящем изобретении предложено применение композиции для получения лекарственного средства для профилактики или лечения аллергических заболеваний, в том числе атопического дерматита, и/или воспалительных или аутоиммунных заболеваний, содержащей по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из указанного штамма, культур указанного штамма, лизатов указанного штамма и экстрактов указанного штамма.
[23] Кроме того, в настоящем изобретении предложена косметическая композиция, содержащая по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из указанного штамма, культур указанного штамма, лизатов указанного штамма и экстрактов указанного штамма.
[24] Кроме того, в настоящем изобретении предложен косметический пластырь или медицинский пластырь, содержащий по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из указанного штамма, культур указанного штамма, лизатов указанного штамма и экстрактов указанного штамма.
[25]
Краткое описание чертежей
Lactobacillus
Lactobacillus crispatus
[26] На фиг. 1 показан результат сравнения эффекта ингибирования секреции гистамина путем обработки различными штаммами , в том числе  KBL693, и антигистаминным агентом кетотифеном после индукции продукции гистамина реакцией антиген-антитело в линиях клеток RBL 2H3.
Lactobacillus
Lactobacillus crispatus
[27] На фиг. 2 показан результат, подтверждающий эффект ингибирования экспрессии ИЛ-4 за счет различных штаммов , в том числе штамма  KBL693, после индукции аллергической реакции в линиях клеток EL4.
Lactobacillus
Lactobacillus crispatus
[28] На фиг. 3 показан результат, подтверждающий эффект ингибирования экспрессии ИЛ-5 за счет различных штаммов , в том числе штамма  KBL693, после индукции аллергической реакции в линиях клеток EL4.
Lactobacillus
Lactobacillus crispatus
[29] На фиг. 4 показан результат, подтверждающий эффект ингибирования секреции IgE за счет различных штаммов , в том числе штамма  KBL693, после индукции аллергической реакции в линиях клеток U266B1.
Lactobacillus
[30] На фиг. 5 показан результат наблюдения значимого количественного увеличения секреции противовоспалительного цитокина ИЛ-10 посредством обработки штаммом KBL693 при обработке различными штаммами после индукции воспалительной реакции в линиях клеток RAW 264.7.
Lactobacillus
[31] На фиг. 6 показан результат, подтверждающий значимое иммунорегуляторное и противовоспалительное действие обработки штаммом KBL693 с учетом значения ИЛ-10/ФНО-α при обработке различными штаммами после индукции воспалительной реакции в линиях клеток RAW 264.7.
Lactobacillus
[32] На фиг. 7 показан результат, подтверждающий значимое иммунорегуляторное и противовоспалительное действие обработки штаммом KBL693 с учетом значения ИЛ-10/ИЛ-6 при обработке различными штаммами после индукции воспалительной реакции в линиях клеток RAW 264.7.
Lactobacillus crispatus
[33] На фиг. 8 показан результат капельного анализа, подтверждающий противогрибковую активность штамма  KBL693.
Lactobacillus crispatus
[34] На фиг. 9 показан результат, подтверждающий эффект снижения балльного показателя дерматита при пероральном введении штамма  KBL693 модели мыши с индуцированным атопическим дерматитом.
Lactobacillus crispatus
[35] На фиг. 10 показан результат, подтверждающий эффект смягчения зуда при пероральном введении штамма  KBL693 модели мыши с индуцированным атопическим дерматитом.
Lactobacillus crispatus
[36] На фиг. 11 показан результат, подтверждающий эффект уменьшения толщины уха при пероральном введении штамма  KBL693 модели мыши с индуцированным атопическим дерматитом.
Lactobacillus crispatus
[37] На фиг. 12 показан результат, подтверждающий эффект уменьшения толщины кожи при пероральном введении штамма  KBL693 модели мыши с индуцированным атопическим дерматитом.
[38] На фиг. 13(A) изображен план эксперимента с использованием модели мыши с астмой, индуцированной овальбумином (OVA), а на фиг. 13(B) показано наблюдение тканей легкого, собранных в каждой группе из обычной контрольной группы (контроль-PBS), контрольной группы с индуцированной астмой (OVA-PBS) и экспериментальной группы (OVA-LC206) посредством оптического микроскопа после окрашивания H&E.
[39] На фиг. 14 показан результат определения уровня экспрессии общего ИЛ-5 и общего ИЛ-13 в тканях легких, собранных в каждой группе из обычной контрольной группы (контроль-PBS), контрольной группы с индуцированной астмой (OVA-PBS) и экспериментальной группы (OVA-KBL693).
Lactobacillus crispatus
[40] На фиг. 15 показан результат, подтверждающий эффект снижения гиперчувствительности дыхательных путей (AHR) за счет штамма  KBL693, введенного моделям мыши с астмой, индуцированной клещом домашней пыли (HDM).
+
+
Lactobacillus crispatus
[41] На фиг. 16 показан результат, подтверждающий эффект снижения количества эозинофилов, IL-5 CD4 T-клеток и IL-13 CD4 T-клеток за счет введения штамма  KBL693.
[42]
[43] Оптимальный способ выполнения изобретения
[44] Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящей заявке, имеют значение, совпадающее с общепринятым среди специалистов в данной области техники. В целом номенклатура, используемая в настоящей заявке, хорошо известна и широко используется в данной области техники.
[45]
Lactobacillus crispatus
[46] Настоящее изобретение позволило обнаружить противоаллергическое действие микроорганизмов, полученных из организма человека, причем выбранный штамм  KBL693 (идентификационный номер KCTC 13519BP) обладает исключительным действием в отношении подавления аллергии. Анализ 16S рДНК указанного штамма демонстрирует, что указанный штамм является новым штаммом, который никогда не был известен общественности.
[47]
Lactobacillus crispatus
[48] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения, настоящее изобретение относится к новому пробиотическому штамму  KBL693 (идентификационный номер KCTC 13519BP), и указанный штамм характеризуется наличием последовательности 16S рДНК SEQ ID NO: 1.
[49]
Lactobacillus crispatus
[50] <SEQ ID NO: 1> Последовательность 16S рДНК штамма  KBL693 (идентификационный номер KCTC 13519BP)
[51]
CGCGGGGTGGCGCGAGCTATAATGCAGTCGAGCGAGCGGAACTAACAGATTTACTTCGGTAATGACGTTAGGAAAGCGAGCGGCGGATGGGTGAGTAACACGTGGGGAACCTGCCCCATAGTCTGGGATACCACTTGGAAACAGGTGCTAATACCGGATAAGAAAGCAGATCGCATGATCAGCTTTTAAAAGGCGGCGTAAGCTGTCGCTATGGGATGGCCCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTAAGGTAAAGGCTTACCAAGGCGATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTGGTGAAGAAGGATAGAGGTAGTAACTGGCCTTTATTTGACGGTAATCAACCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGAAGAATAAGTCTGATGTGAAAGCCCTCGGCTTAACCGAGGAACTGCATCGGAAACTGTTTTTCTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCTGCAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTGGGAGGTTTCCGCCTCTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTAGTGCCATTTGTAGAGATACAAAGTTCCCTTCGGGGACGCTAAGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTATTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTAATGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGGCAGTACAACGAGAAGCGAGCCTGCGAAGGCAAGCGAATCTCTGAAAGCTGTTCTCAGTTCGGACTGCAGTCTGCAACTCGACTGCACGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTCTGCAATGCCCAAAGCCGGTGGCCTAACCTTCGGAAGGAGCCGTCTAAGTAGACAATGTGCA
[52] Таким образом, при разработке настоящего изобретения выполнены эксперименты касательно эффективности указанного штамма, подтвердившие, что указанный штамм обладает исключительным действием в отношении подавления аллергических расстройств, например, атопического дерматита, иммунорегуляторными свойствами, ослабляет воспалительную реакцию и обладает противогрибковой активностью. Кроме того, авторы настоящего изобретения подтвердили, что указанные эффекты можно получить не только в условиях, подходящих для живых бактерий, но и в условиях низкотемпературной стерилизации или высокотемпературной стерилизации.
[53]
Lactobacillus crispatus
[54] Соответственно, в еще одном варианте реализации настоящего изобретения настоящее изобретение относится к пищевой композиции или композиции пищевой добавки, содержащей по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из штамма  KBL693 (идентификационный номер KCTC 13519BP), клеточных компонентов указанного штамма, культур указанного штамма, лизатов указанного штамма и экстрактов указанного штамма.
[55] Композиция может характеризоваться тем, что она представляет собой функциональную оздоровительную пищевую композицию, обладающую по меньшей мере одним эффектом, выбранным из группы, состоящей из смягчения симптомов аллергии, например, атопического дерматита, смягчения симптомов воспаления и иммунорегуляции.
[56] Указанную пищевую композицию или композицию пищевой добавки можно применять в качестве продукта питания, эффективно смягчающего симптомы аллергии, например, атопического дерматита, смягчающего симптомы воспаления и/или способствующего иммунорегуляции, а также профилактике вышеуказанных явлений, например, в качестве основного или второстепенных ингредиентов продуктов питания, пищевых добавок, функциональной оздоровительной пищевой композиции или функциональных напитков, но не ограничиваясь ими.
[57] Термин «пищевая композиция» относится к натуральному или искусственному продукту, содержащему по меньшей мере одно питательное вещество, и, более предпочтительно, относится к продукту, который стал съедобным в результате определенной обработки, и обычно охватывает все продукты питания, пищевые добавки, функциональную оздоровительную пищевую композицию и функциональные напитки.
[58] Продукт питания, который может содержать указанную пищевую композицию согласно настоящему изобретению в качестве добавки, может включать, например, различные типы продуктов питания, напитков, жевательной резинки, чая, витаминного комплекса или функциональных продуктов питания. Кроме того, продукты питания согласно настоящему изобретению включают специальные обогащенные продукты питания (например, модифицированное молоко, детское питание), переработанные мясные продукты, рыбные продукты, тофу, мук, лапшу (например, лапшу-рамен, азиатскую лапшу), хлебобулочные изделия, биологически активные пищевые добавки, приправы (например, соевый соус, соевую пасту, пасту из красного перца, смешанную пасту), соусы, кондитерские изделия (например, закусочные продукты), конфеты, шоколад, жевательные резинки, мороженое, молочные продукты (например, ферментированное молоко, сыр), другие обработанные пищевые продукты, кимчхи, соленые продукты (например, различные виды кимчхи, маринованные продукты), напитки (например, фруктовый сок, овощной сок, соевое молоко, напитки, получаемые при брожении) и натуральные приправы (например, бульонный порошок для лапши-рамен), но не ограничиваясь ими. Указанные продукты питания, напитки или пищевые добавки можно получать обычными способами.
in vivo
[59] Термин «функциональная оздоровительная пищевая композиция» представляет собой группу продуктов питания, эффективность которых повышается за счет возможности проявления и выражения их функции для заранее определенной цели с использованием физических, биохимических или биоинженерных методик, или обработанные пищевые продукты, разработанные с учетом того, чтобы регулирующие функции соответствующей пищевой композиции , например, функция регулировки ритма дефекации при профилактике заболевания и выздоровлении, проявлялись в достаточной степени. Такой функциональный продукт питания может содержать пищевые добавки, приемлемые с точки зрения диетологии, и может дополнительно содержать подходящие носители, вспомогательные вещества и разбавители, обычно используемые при их производстве.
[60] В настоящем изобретении термин «функциональные напитки» в совокупности относится к напиткам, предназначенным для утоления жажды или для наслаждения вкусом. Конкретные ограничения данного термина отсутствуют, за исключением того, что указанные напитки должны содержать композицию для смягчения симптомов аллергии, например, атопического дерматита, смягчения симптомов воспаления и/или иммунорегуляции, а также для профилактики указанных явлений в качестве основных ингредиентов в указанном соотношении, а также, как и обычные напитки, могут содержать различные вкусоароматические добавки или натуральные углеводы в качестве дополнительных ингредиентов.
[61] В дополнение к вышесказанному, продукт питания, содержащий пищевую композицию или композицию пищевой добавки согласно настоящему изобретению, может содержать различные питательные вещества, витамины, минералы (электролиты), вкусоароматические добавки, например, синтетические и натуральные вкусоароматические добавки, красители и наполнители (сыр, шоколад и т.д.), пектиновую кислоту и ее соли, альгиновую кислоту и ее соли, органические кислоты, коллоидные загустители, агенты для контроля pH, стабилизирующие агенты, консерванты, глицерин, спирт, агенты для карбонизации, используемые в газированных напитках, и т.п., причем каждый из вышеуказанных ингредиентов можно использовать отдельно или в комбинации друг с другом.
[62] Продукт питания, содержащий пищевую композицию согласно настоящему изобретению, может содержать композицию согласно настоящему изобретению в количестве от 0,001 масс.% 100 мл масс.%, предпочтительно от 1 масс.% до 99 масс.% в пересчете на общую массу продукта питания; в случае напитков оно может составлять от 0,001 г до 10 г, предпочтительно от 0,01 г до 1 г из расчета на 100 мл. Однако при длительном приеме в оздоровительных или гигиенических целях или в целях поддержания состояния здоровья количество продукта может быть ниже вышеуказанного диапазона; и поскольку у эффективных ингредиентов нет проблем с точки зрения профиля безопасности, их можно использовать в количестве, превышающем указанный диапазон, и их количество не ограничивается вышеуказанным диапазоном.
Lactobacillus crispatus
Saccharomyces
Candida
Pichia
Torulopsis
Aspergillus
Rhizopus
Mucor
Penicillium
Lactobacillus
Bifidobacterium
Leuconostoc
Lactococcus
Bacillus, Streptococcus, Propionibacterium, Enterococcus
Pediococcus
Saccharomyces cerevisiae, Bacillus coagulans, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus casei, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus delbruckii, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus farciminus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus sakei, Lactococcus lactis,
Pediococcus acidilactici
Lactobacillus crispatus
[63] Пищевая композиция согласно настоящему изобретению может содержать штамм  KBL693 сам по себе или в комбинации с приемлемым носителем, или может быть изготовлена в форме композиции, подходящей для употребления человеком или животными. Таким образом, указанную композицию можно добавлять к продукту питания, не содержащему пробиотических бактерий или пары пробиотических бактерий. Например, микроорганизмы, которые можно применять в комбинации со штаммом согласно настоящему изобретению при получении продуктов питания согласно настоящему изобретению, должны подходить для употребления человеком или животными и обладать пробиотической активностью в отношении подавления патогенных, вредных бактерий или улучшения баланса микрофлоры в кишечном тракте млекопитающих при приеме внутрь, но не ограничиваются этим. Такие пробиотические микроорганизмы могут включать, например, дрожжи, например, , ,  или , грибы, например, , ,  или , и бактерии родов , , , ,  или . Подходящие конкретные пробиотические микроорганизмы могут включать, например, or. Пищевая композиция согласно настоящему изобретению предпочтительно может дополнительно содержать смесь пробиотических микроорганизмов, обладающих выраженной пробиотической активностью и превосходной противоаллергической, противовоспалительной и/или иммунорегуляторной активностью, дополнительно усиливающей их эффекты. Носители, которые можно включать в пищевую композицию согласно настоящему изобретению, могут включать, например, наполнители, добавки с высоким содержанием клетчатки, инкапсулирующие агенты и липиды, широко известные в данной области техники. Штамм  KBL693 согласно настоящему изобретению может находиться в лиофилизированной или инкапсулированной форме, либо в форме суспензий или сухих порошков культуры.
[64]
[65] Композиция согласно настоящему изобретению также может быть представлена в форме кормовой добавки или корма, содержащих указанный штамм.
Lactobacillus crispatus
Bacillus subtilis
Lactobacillus
Aspergillus oryzae
Saccharomyces cerevisiae
[66] Кормовая добавка согласно настоящему изобретению может находиться в форме сухого или жидкого состава и, кроме того, содержать другие непатогенные микроорганизмы в дополнение к указанному штамму  KBL693. Микроорганизмы, которые можно добавлять к кормовой добавке, могут включать, например, , которая может продуцировать протеазу, липазу и ферменты, преобразующие углеводы, штамм , обладающий физиологической активностью и способностью к разложению органических соединений в анаэробных условиях, например, в желудке коровы, мицелиальные грибы, например, , демонстрирующие влияние на увеличение массы тела животных, надои и усвояемость корма (Slyter, L. L. J. Animal Sci.1976, 43. 910-926), и дрожжи, например,  (Johnson, D. E et al. J. Anim. Sci.1983, 56, 735-739 ; Williams, P. E. V. et al.,1990, 211).
Lactobacillus crispatus
[67] Кормовая добавка согласно настоящему изобретению может дополнительно содержать по меньшей мере один ферментативный агент в дополнение к указанному штамму  KBL693. Дополнительные ферментативные агенты могут находиться в сухой или жидкой форме и могут включать, например, стеатолитические ферменты, например, липазу, фитазу, образующую фосфат и инозитфосфат при разложении фитиновой кислоты, амилазу, т.е. фермент для гидролиза α-1,4-гликозидной связи в составе, например, крахмала и гликогена, фосфатазу, т.е. фермент для гидролиза сложного органического эфира фосфорной кислоты, карбоксиметилцеллюлазу для разложения целлюлозы, ксилазу для разложения ксилозы, мальтазу для гидролиза мальтозы на две молекулы глюкозы и ферменты, продуцирующие углеводы, например, инвертазу, образующую смесь глюкозы и фруктозы при гидролизе сахарозы.
Lactobacillus crispatus
[68] При использовании штамма  KBL693 согласно настоящему изобретению в качестве кормовых добавок можно применять кормовое сырье, например, арахис, горох, свеклу, жмых, продукты переработки зерна, порошок кишок животных и рыбную муку, а также различные зерновые и соевый белок. Они могут быть обработанными или необработанными, и их можно использовать без ограничений. Обработка может включать такой процесс, при котором кормовое сырье загружают и продавливают под давлением через заданное отверстие, а для белков предпочтительно можно использовать экструзию, при которой белки подвергают дегенерации для увеличения их доступности. Экструзия денатурирует белки за счет термообработки с целью разрушения антиферментных факторов, что является выгодным. Кроме того, перевариваемость белков сои можно улучшить путем экструзии с целью инактивации веществ, снижающих питательность корма, например, ингибитора трипсина, одного из ингибиторов протеаз, присутствующего в сое. Кроме того, экструзия может способствовать улучшению гидролизуемости под действием протеаз, что повышает питательную ценность белков сои.
[69]
[70] В соответствии с еще одним вариантом реализации настоящего изобретения, настоящее изобретение относится к противогрибковой композиции, содержащей по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из указанного штамма, культур указанного штамма, лизатов указанного штамма и экстрактов указанного штамма.
Malassezia furfur, Malassezia globosa
Malassezia restricta
[71] Композиция может характеризоваться проявлением противогрибковой активности по отношению к одному из организмов, выбранному из группы, состоящей из  и , но не ограничиваясь ими.
[72] Композиция может представлять собой композицию для профилактики, смягчения или лечения себорейного дерматита или перхоти, и указанный себорейный дерматит может располагаться на коже свода черепа.
[73] Кроме того, указанная композиция может представлять собой композицию для профилактики, смягчения или лечения крапивницы, сыпи, дерматофитоза туловища, пахового дерматофитоза или дерматофитоза стоп, вызванных грибковой инфекцией.
[74] Указанный штамм и культуры указанного штамма, лизаты указанного штамма и экстракты указанного штамма могут содержаться в композиции в количестве от 0,1 масс. % до 50 масс.% от общей массы композиции.
[75] Указанная противогрибковая композиция может представлять собой фармацевтическую композицию, косметическую композицию или оздоровительную пищевую композицию, а также может представлять собой вещество для наружной обработки кожи.
[76] Указанная косметическая композиция может быть представлена во всех лекарственных формах, подходящих для местного применения, например, в форме жидкости, эмульсии типа «масло в воде», эмульсии типа «вода в масле», суспензии, твердого вещества, геля, порошка, пасты, пены или аэрозоля. Указанные композиции вышеупомянутых лекарственных форм можно получить традиционными способами, используемыми в данной области техники.
[77] Кроме вышеупомянутых ингредиентов, указанная композиция может содержать другие ингредиенты в количестве, не мешающем проявлению основного эффекта, предпочтительно в количестве, обеспечивающем синергический эффект по отношению к основному эффекту. Композиция согласно настоящему изобретению может содержать вещество, выбранное из группы, состоящей из витаминов, полипептидов, полисахаридов и сфинголипида. Кроме того, косметическая композиции согласно настоящему изобретению может содержать увлажнитель, мягчительный агент, поверхностно-активное вещество, поглотитель ультрафиолета, консервант, стерилизатор, антиоксидант, рН-регулирующий агент, органические или неорганические пигменты, вкусоароматическую добавку, охлаждающий агент или агент-антиперспирант. Специалисты в данной области техники могут выбрать комбинированное процентное содержание указанных ингредиентов в диапазоне, не мешающем достижению цели и проявлению эффекта согласно настоящему изобретению, и оно может находиться в диапазоне от 0,01 масс.% до 5 масс.%, конкретнее, от 0,01 масс.% до 3 масс.% от общей массы композиции.
[78] Согласно вышеупомянутому варианту реализации, противогрибковая композиция согласно настоящему изобретению может представлять собой средство для наружной обработки кожи, например, крем, мазь, шампунь или лекарственное средство.
[79]
Lactobacillus crispatus
[80] Согласно еще одному варианту реализации настоящего изобретения, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для лечения или профилактики аллергических заболеваний, например, атопического дерматита, и/или воспалительных или аутоиммунных заболеваний, содержащей по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из клеточных компонентов штамма  KBL693, культур указанного штамма, лизатов указанного штамма и экстрактов указанного штамма.
[81] Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению может быть представлена в форме клеточных компонентов живых бактерий, сухого штамма, культур указанного штамма, лизатов указанного штамма или композиции в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем или средой. Носители или среды, которые можно использовать в настоящем изобретении, могут включать растворитель, диспергатор, покрытие, усилитель, состав с контролируемым высвобождением (т.е. состав с замедленным высвобождением) или по меньшей мере одно инертное вспомогательное вещество том числе крахмал, полиол, гранулы, мелкодисперсную целлюлозу, микрокристаллическую целлюлозу, например, Celphere, гранулы Celphere, разбавитель, смазывающее вещество, связующее, разрыхлитель. На таблетку из вышеуказанной композиции можно при желании нанести покрытие с использованием стандартной водной или неводной методики. Примеры фармацевтически приемлемого носителя и вспомогательного вещества для применения в качестве фармацевтически приемлемого инертного носителя и указанных дополнительных ингредиентов могут включать, например, связующее вещество, наполнитель, разрыхлитель, смазывающее вещество, противомикробный агент и агент для получения покрытия, но не ограничиваются ими.
[82] Кроме того, фармацевтическую композицию согласно настоящее изобретению можно применять в качестве средства для наружного применения, содержащего лекарственную форму, выбранную из группы, состоящей из мазей, кремов, паст, жидкостей и растворов для нанесения на кожу, глицерожелатинов, мазей для растирания, порошков для нанесения на кожу, аэрозолей и пластырей.
[83] В настоящем изобретении указанные аллергические заболевания относятся к состояниям, ассоциированным с экспрессией ИЛ-4 или ИЛ-5, и могут включать, например, экзему, аллергическую астму, атопический дерматит, аллергический ринит, аллергический конъюнктивит, крапивницу или анафилактическую реакцию. Настоящее изобретение предпочтительно может характеризоваться тем, что указанные заболевания выбраны из группы, состоящей из экземы у детей, аллергической астмы, аллергического ринита, атопического дерматита, аллергического конъюнктивита и пищевой аллергии, но не ограничиваются ими.
[84] В настоящем изобретении In указанные воспалительные или аутоиммунные заболевания или симптомы представляют собой заболевания или симптомы, которые можно лечить, смягчить или предотвратить путем стимуляции экспрессии или секреции ИЛ-10, представляющего собой противовоспалительный иммунорегуляторный цитокин, и могут включать, например, ревматоидный артрит, ревматическую лихорадку, волчанку, системную склеродермию, атопический дерматит, псориаз, псориатический артрит, астму, синдром Гийена-Барре, миастению гравис, дерматомиозит, полимиозит, рассеянный склероз, аутоиммунный энцефаломиелит, узелковый периартериит, тиреоидит Хашимото, височный артериит, юношеский диабет, очаговую алопецию, пузырчатку, афтозный стоматит, аутоиммунную гемолитическую анемию, гранулематоз Вегенера, синдром Шёгрена, болезнь Аддисона, болезнь Крона, болезнь Бехчета, отеки, конъюнктивит, периодонтит, ринит, отит среднего уха, хронический синусит, фаринголарингит, тонзиллит, бронхит, пневмонию, язву желудка, гастрит, колит, подагру, экзему, угри, контактный дерматит, себорейный дерматит, анкилозирующий спондилит, фибромиалгию, остеоартрит, периартрит плечевого сустава, тендинит, тендосиновит, миозит, гепатит, цистит, нефрит, сепсис, васкулит, бурсит и т.п., но не ограничиваются ими.
[85]
[86] Термин «лечение», относится к купированию или смягчению заболеваний или состояний, используемых вместе с указанным термином, или одного или более из их симптомов, подавлению их прогрессирования или их профилактике, если он не употребляется в ином смысле. Термин «терапия» в настоящем изобретении относится к акту «лечения», определение которого приведено выше. Соответственно, схемы лечения или терапии заболевания у млекопитающих могут включать одно или более из следующего:
[87] (1) Подавление прогрессирования заболевания, т.е. подавление его развития
[88] (2) Предотвращение распространения заболевания
[89] (3) Смягчение заболевания
[90] (4) Предотвращение рецидива заболевания и
[91] (5) Временное облегчение симптома заболевания
[92]
Lactobacillus crispatus
[93] Композиция согласно настоящему изобретению для профилактики или лечения аллергических заболеваний, например, атопического дерматита, и/или воспалительных или аутоиммунных заболеваний может содержать фармацевтически эффективное количество штамма  KBL693 самого по себе или в комбинации с по меньшей мере одним из фармацевтически приемлемых носителей, вспомогательных веществ или разбавителей.
[94]
[95] В настоящем изобретении термин «эффективное количество» означает количество, достаточно высокое для вызывания желательного эффекта, но достаточно низкое для предотвращения серьезных побочных эффектов, согласно оценкам медиков. Количество микроорганизмов, вводимых в организм с композицией согласно настоящему изобретению, можно корректировать соответственно пути введения и цели введения.
[96]
Lactobacillus crispatus
[97] Композицию согласно настоящему изобретению можно вводить субъекту один или более раз в день. Лекарственная форма означает физически дискретную единицу, подходящую для стандартного введения субъектам-людям и другим млекопитающим, причем каждая единица содержит подходящий фармацевтический носитель и заранее определенное количество штамма  KBL693 согласно настоящему изобретению, обеспечивающее терапевтический эффект. Лекарственная форма для перорального введения взрослому пациенту предпочтительно содержит 0,001 г или более микроорганизма согласно настоящему изобретению, и дозировка композиции согласно настоящему изобретению для перорального применения составляет о 0,001 г до 10 г, предпочтительно от 0,01 г до 5 г на дозу. Фармацевтически эффективное количество микроорганизма согласно настоящему изобретению составляет от 0,01 г до 10 г/день. В то же время дозировка зависит от тяжести заболевания пациента, микроорганизма и совместно используемых вспомогательных эффективных ингредиентов. Кроме того, общую суточную дозировку можно разделить в несколько раз и постоянно вводить по мере необходимости. Соответственно, вышеуказанные диапазоны дозировок никоим образом не ограничивают рамки настоящего изобретения.
[98]
[99] Кроме того, используемый выше термин «фармацевтически приемлемый» относится к композиции, которая является физиологически приемлемой и не вызывает аллергической реакции, например, желудочно-кишечного расстройства, головокружения или аналогичной реакции при введении человеку.
[100] Композицию согласно настоящему изобретению можно составить с использованием способов, известных в данной области техники, обеспечивающих быстрое, замедленное или отсроченное высвобождение активных ингредиентов после введения млекопитающему. Лекарственные формы могут представлять собой порошки, гранулы, таблетки, эмульсии, сиропы, аэрозоли, мягкие или твердые желатиновые капсулы, стерильные растворы для инъекций или стерильные порошки. Кроме того, композицию согласно настоящему изобретению для профилактики или лечения аллергических заболеваний, например, атопического дерматита, и/или воспалительных или аутоиммунных заболеваний можно вводить различными путями, включая пероральное, трансдермальное, подкожное, внутривенное или внутримышечное введение. Дозировку активных ингредиентов можно выбирать в зависимости от различных факторов, например, пути введения, возраста, пола, массы тела пациента и тяжести его состояния. Композицию согласно настоящему изобретению для лечения аллергических заболеваний, например, атопического дерматита, и/или воспалительных или аутоиммунных заболеваний можно вводить в комбинации с известным соединением, способным предотвращать, смягчать или лечить соответствующие симптомы.
[101]
2
4
[102] Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению может быть представлена, в частности, в виде лекарственной формы для перорального применения в составе с кишечнорастворимым покрытием. В настоящем документе термин «кишечнорастворимое покрытие» включает любое фармацевтически приемлемое покрытие, которое может сохраняться в желудке, не поддаваясь разрушению под действием кислого желудочного сока, и может в достаточной степени разрушаться в кишечнике, высвобождая там активные ингредиенты. «Кишечнорастворимое покрытие» согласно настоящему изобретению относится к покрытию, которое может сохраняться в течение 2 часов или более при контакте с искусственным желудочным соком, например, раствором HCl с pH 1 при 36-38°C, и в дальнейшем может разрушаться, предпочтительно в искусственном кишечном соке, например, буферном растворе KHPO с pH 6.8 в течение 30 минут.
rd
th
th
[103] Кишечнорастворимое покрытие согласно настоящему изобретению наносят на одно ядро в количестве от приблизительно 16 мг до 30 мг, предпочтительно от 16 мг до 20 мг или 25 мг или менее. При толщине кишечнорастворимого покрытия согласно настоящему изобретению от 5 мкм до 100 мкм, предпочтительно от 20 мкм до 80 мкм можно получить удовлетворительные результаты. Материал кишечнорастворимого покрятия можно выбрать из известных полимерных материалов. Подходящие полимерные материалы перечислены в ряде известных документов [L. Lachman et al., The Theory and Practice of Industrial Pharmacy, 3 ed., 1986, pp. 365~373; H. Sucker et al., Pharmazeutische Technologie, Thieme, 1991, pp. 355-359; Hagers Handbuchder pharmazeutischen Praxis, 4 ed., Vol. 7, pp. 739~742, and 766~778, (SpringerVerlag, 1971); and Remington's Pharmaceutical Sciences, 13 ed., pp. 1689~1691 (Mack Publ., Co., 1970)], и в них можно включать производные сложных эфиров целлюлозы, простые эфиры целлюлозы, сополимер акриловой смолы и метилакрилата и сополимер малеиновой кислоты и производных фталевой кислоты.
[104]
2
2
[105] Кишечнорастворимое покрытие согласно настоящему изобретению можно получить с использованием общепринятого способа нанесения кишечнорастворимого покрытия, при котором раствор кишечнорастворимого покрытия напыляют на ядро. Подходящие растворители, используемые в процессе получения кишечнорастворимого покрытия, представляют собой спирты, например, этанол, кетоны, например, ацетон, галогенированные углеводородные растворители, например, дихлорметан (CHCl), и смеси этих растворителей. Пластификатор, например, ди-n-бутилфталат или триацетилглицерин, добавляют к раствору покрытия в соотношении от приблизительно 1 : 0,05 до приблизительно 1 : 0,3 (материал покрытия : пластификатор) Допустимо выполнять процесс напыления непрерывно, и можно регулировать распыляемое количество с учетом условий нанесения покрытия. Давление распыления можно регулировать различным образом, и в общем случае удовлетворительные результаты можно получить при давлении распыления от приблизительно 1 бар до приблизительно 1,5 бар.
[106]
[107] В еще одном варианте реализации настоящего изобретения в настоящем изобретении предложено применение указанного штамма или указанной композиции для профилактики или лечения аллергических заболеваний, например, атопического дерматита, и/или воспалительных или аутоиммунных заболеваний, и применению указанного штамма или указанной композиции для получения терапевтического агента для лечения вышеупомянутых заболеваний.
[108] Конкретно, настоящее изобретение относится к композиции, содержащей по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из указанного штамма, культур указанного штамма, лизатов указанного штамма и экстрактов указанного штамма, для применения при профилактике или лечении аллергических заболеваний, в том числе атопического дерматита, и/или воспалительных или аутоиммунных заболеваний.
[109] Кроме того, настоящее изобретение относится к применению композиции для получения лекарственного средства для профилактики или лечения аллергических заболеваний, в том числе атопического дерматита, и/или воспалительных или аутоиммунных заболеваний, содержащей по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из указанного штамма, культур указанного штамма, лизатов указанного штамма и экстрактов указанного штамма.
[110] В настоящем документе термин «профилактика» связан с предотвращением, задержкой, препятствованием или замедлением заболеваний с целью ослабления их влияния.
[111] В настоящем документе термин «лечение» связан с уходом за субъектом, страдающим от заболеваний, с целью смягчения, излечивания или ослабления симптомов заболеваний или ослабления или остановки прогрессирования заболеваний.
[112]
[113] В еще одном варианте реализации настоящего изобретения в настоящем изобретении предложен способ профилактики или лечения аллергических заболеваний, например, атопического дерматита, и/или воспалительных или аутоиммунных заболеваний, включающий введение фармацевтически эффективного количества указанного штамма или указанной композиции субъекту, нуждающемуся в профилактике или лечении указанных заболеваний или в смягчении указанных заболеваний.
[114] Кроме того, в настоящем изобретении предложен способ лечения аллергических заболеваний, например, атопического дерматита, и/или воспалительных или аутоиммунных заболеваний, включающий введение терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного компонента, выбранного из группы, состоящей из указанного штамма, культур указанного штамма, лизатов указанного штамма и экстрактов указанного штамма субъекту, нуждающемуся в этом.
[115] Поскольку фармацевтическая композиция, применяемая в способе профилактики или лечения указанных заболеваний, а также способ ее введения описаны выше, перекрывающиеся элементы композиции и способа не будут включены в настоящий документ во избежание избыточной сложности настоящего описания.
[116] Указанный субъект, которому можно вводить композицию для профилактики или лечения указанных заболеваний, включает всех животных, в том числе человека. Например, субъект может представлять собой животное, например, собаку, кошку или мышь.
[117]
Lactobacillus crispatus
[118] В еще одном варианте реализации настоящего изобретения настоящее изобретение относится к косметической композиции, содержащей фармацевтически эффективное количество по меньшей мере одного компонента, выбранного из группы, состоящей из клеточных компонентов штамма  KBL693, культур указанного штамма, лизатов указанного штамма и экстрактов указанного штамма.
[119] Косметическая композиция может характеризоваться функцией смягчения по меньшей мере одного состояния чувствительной кожи, выбранного из группы, состоящей из кожной аллергии, крапивницы, атопического дерматита, псориаза, грибковой инфекции и экземы, но не ограничивающегося ими.
Lactobacillus crispatus
[120] В настоящем документе термин «косметическая композиция» относится к композиции, содержащей по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из клеточных компонентов штамма  KBL693, культур указанного штамма, лизатов указанного штамма и экстрактов указанного штамма, которая может быть представлена в виде лекарственной формы любого типа. Например, косметика, полученная с использованием указанной косметической композиции, может включать кремы, тампоны, лосьоны, эссенции, тоники, кремы-основы и косметические основы, и может быть выпущена в продажу в виде любых вышеперечисленных лекарственных форм для достижения цели настоящего изобретения, но не ограничивается ими. Ингредиенты, содержащиеся в косметической композиции согласно настоящему изобретению, в дополнение к вышеупомянутым ингредиентам включают ингредиенты, обычно используемые в косметических композициях, например, традиционные адьюванты, например, антиоксиданты, стабилизаторы, солюбилизаторы, витамины, пигменты и ароматизаторы, а также носители.
[121]
Lactobacillus crispatus
[122] В еще одном варианте реализации настоящего изобретения настоящее изобретение относится к функциональному пластырю, содержащему по меньшей мере один компонент, выбранный из группы, состоящей из клеточных компонентов штамма  KBL693, культур указанного штамма, лизатов указанного штамма и экстрактов указанного штамма, причем указанный функциональный пластырь можно использовать для косметической или медицинской цели.
[123] Пластырь может характеризоваться функцией смягчения по меньшей мере одного состояния чувствительной кожи, выбранного из группы, состоящей из кожной аллергии, крапивницы, атопического дерматита, псориаза, грибковой инфекции и экземы, но не ограничивающегося ими.
[124] В настоящем изобретении пластырь обычно представляет собой небольшой липкий пластырь, содержащий доставляемые вещества, причем указанный пластырь может быть представлен в различных формах. Простейшая форма представляет собой липкое цельное изделие, содержащее резервуар, содержащий доставляемые вещества, помещенные на подложку. Резервуар обычно образован косметически или фармацевтически приемлемым самоклеящимся материалом, однако в некоторых случаях он также может быть образован неадгезивными материалами, представленными в тонком липком слое, подходящем для поверхности, контактирующей с кожей. Скорость введения веществ, доставляемых из пластыря в организм субъекта, носящего пластырь, можно изменить, поскольку проницаемость кожи для доставляемых веществ, обычно зависит от индивидов и места на коже, которое могут выбрать специалисты в данной области техники.
[125]
[126] Настоящее изобретение будет подробно описано далее в настоящем документе посредством примеров. Эти примеры приведены исключительно в целях иллюстрирования настоящего изобретения, и для специалистов в данной области техники очевидно, что не следует считать, что сущность настоящего изобретения ограничивается этими примерами.
[127]
[128] Пример 1. Эффекты смягчения и лечения, оказываемые KBL693 по отношению к аллергическим реакциям, обусловленные ингибированием секреции гистамина в базофилах.
Lactobacillus
[129] Согласно сообщениям, при аллергической реакции в тканях продуцируется гистамин, вызывающий воспалительную реакцию, и подавление секреции гистамина приводит к смягчению симптомов аллергии за счет блокирования реакции, вызываемой гистамином В настоящем изобретении сделана попытка отбора пробиотических щтаммов, которые могут проявлять эффект смягчения и лечения аллергических реакций за счет ингибирования секреции гистамина. С этой целью выполнена оценка способности в общей сложности восьми штаммов , полученных из влагалища человека, подавлять секрецию гистамина. Способность подавлять секрецию гистамина подтверждали путем индукции дегрануляции линии клеток RBL-2H3 после культивирования с последующим измерением активности β-гексозаминидазы, совместно секретируемой с гистамином, с помощью колориметрической реакции с субстратом.
[130]
[131] 1-1. Инкубирование линий клеток RBL-2H3
6
[132] Клетки RBL-2H3 (ATCC NO. CRL-2256) культивировали в среде DMEM с добавлением 10% FBS (эмбриональной телячьей сыворотки), пенициллина (100 мкг/мл), и стрептомицина (100 мкг/мл) при 37°C в атмосфере 5% CO2, а затем пересевали раз в три дня. Клетки RBL-2H3 высевали на 6-луночный планшет в концентрации 1×10 клеток/лунку, затем культивировали в течение 3 часов, а затем обрабатывали IgE (0.5 мкг/мл) и инкубировали в течение 16 - 20 часов.
[133]
[134] 1-2. Инкубирование штаммов и получение культурального раствора
Lactobacillus crispatus
g
[135] Используемые штаммы  культивировали в среде MRS с добавлением 0,5% цистеина, активировали на протяжении в общей сложности двух пересевов с 18-часовым интервалом, а затем использовали в экспериментах. Полученный культуральный раствор центрифугировали при 15000× в течение 3 минут, а затем собирали надосадочную жидкость.
[136]
[137] 1-3. Индукция дегрануляции после обработки штаммами
2
2
[138] После удаления среды для клеток RBL-2H3, ранее высеянных на 6-луночный планшет, клетки дважды промывали 1 мл буфера Сираганяна (pH 7,2). Затем клетки обрабатывали 120 мкл ранее полученного культурального раствора бактерий или, в группе положительного контроля - кетотифеном (20 мкг/мл) в каждой лунке, инкубировали в течение 20 минут в инкубаторе с атмосферой 5% CO при 37°C, а затем обрабатывали 60 мкл антигена (DNP-HAS, 1 мкг/мл) для индукции дегрануляции за счет реакции антиген-антитело. В качестве отрицательного контроля дегрануляцию индуцировали после обработки 120 мкл буфера Сираганяна. Реакцию выполняли в инкубаторе с атмосферой 5% CO при 37°C в течение 20 минут, а затем собирали надосадочную жидкость.
[139]
[140] 1-4. Выявление цветной реакции
p
Lactobacillus crispatus
2
[141] Для выявления активности β-гексозаминидазы 25 мкл надосадочной жидкости, собранной в примере 1-3, переносили в каждую лунку 96-луночного планшета, а затем в лунки добавляли 25 мкл каждого субстрата (-нитрофенил-N-ацетил-D-глюкозаминидазы) с последующей реакцией при 37°C в инкубаторе с атмосферой 5% COв течение 90 минут. Затем добавляли 200 мкл стоп-раствора (Na2CO3/NaHCO3) для остановки реакции и измеряли поглощение при 405 нм. Поглощение после обработки  каждого типа сравнивали с группой отрицательного контроля и преобразовывали в процентный показатель для демонстрации уровня ингибирования дегрануляции.
[142]
Lactobacillus crispatus
Lactobacillus crispatus
[143] В результате, как можно видеть на фиг. 1 и в таблице 1, десять типов штаммов , в том числе штамм KBL693, демонстрировали значимо более низкий количественный уровень секреции β-гексозаминидазы по сравнению с группой отрицательного контроля, и девять из них демонстрировали даже более низкий количественный уровень секреции β-гексозаминидазы по сравнению с уровнем при использовании доступного для приобретения антигистаминного агента кетотифена - положительного контроля. В результате обнаружено, что штаммы , в том числе штамм KBL693, демонстрировали замечательную активность в отношении предотвращения дегрануляции для эффективного смягчения симптомов аллергии, вызванных избыточной секрецией гистамина.
[144]
[145]
Таблица 1
Вид
Штамм или средство, использованные для обработки
β-гексозаминидаза (кратность изменения)
- (Отрицательный контроль)
Буфер Сираганяня
1,0
- (Положительный контроль)
Кетотифен
0,2569
Lactobacillus crispatus
KBL693
0,2140
Lactobacillus crispatus
KBL694
0,2063
Lactobacillus crispatus
KBL392
0,1904
Lactobacillus crispatus
KBL702
0,2065
Lactobacillus crispatus
KBL706
0,1943
Lactobacillus crispatus
KBL707
0,2008
Lactobacillus crispatus
KBL709
0,2128
Lactobacillus crispatus
KBL696
0,2331
Lactobacillus crispatus
KBL708
0,2464
Lactobacillus crispatus
SNUV272-1
0,3632
Lactobacillus fermentum
SNUV417
0,9284
Lactobacillus jensenii
SNUV221
0,7088
Lactobacillus vaginalis
SNUV351
1,0336
[146]
[147] Пример 2. Эффекты смягчения и лечения, оказываемые KBL693 по отношению к аллергическим реакциям, обусловленные ингибированием цитокинов Th2-типа в Т-клетках.
Inflamm. Res
Lactobacillus crispatus
[148] Согласно сообщениям, цитокины, имеющие отношение к T-хелперам 2 типа (Th2), например, ИЛ-4 и ИЛ-5, вносят вклад в хронические аллергические реакции за счет усиления иммунных реакций, имеющих отношение к Th2, и увеличения продукции IgE (Passante E, . 2009). В настоящем изобретении выполнена попытка дальнейшего сравнения эффектов подавления хронических аллергических реакций среди штаммов , продемонстрировавшая замечательный эффект ингибирования секреции гистамина в примере 1. С этой целью эффект ингибирования секреции ИЛ-4 и ИЛ-5 тестировали следующим образом, используя линию клеток EL4, представлявшую собой линию T-клеток мыши.
[149]
[150] 2-1. Инкубирование линий клеток EL-4
5
[151] Клетки EL4 (ATCC NO. TIB -39) культивировали в среде DMEM с добавлением 10% FBS, пенициллина (100 мкг/мл), и стрептомицина (100 мкг/мл) при 37°C в атмосфере 5% CO2, а затем пересевали раз в три дня. Клетки EL4 высевали на 24-луночный планшет в концентрации 4×10 клеток/лунку, затем культивировали в течение 16-20 часов для индукции аллергических реакций и обрабатывали штаммами.
[152]
[153] 2-2. Инкубирование штаммов и восстановление
Lactobacillus crispatus
g
[154] В общей сложности девять штаммов , в том числе используемый KBL693 (KBL693, KBL709, KBL702, KBL696, KBL708, KBL707, KBL692, KBL694 и KBL706) культивировали в среде MRS с добавлением 0,5% цистеина, активировали на протяжении в общей сложности двух включая пересевов с 18-часовым интервалом, а затем использовали в экспериментах. Полученный культуральный раствор центрифугировали при 15000× в течение 3 минут, осадок промывали PBS-буфером. Штаммы окрашивали в течение 15 минут SYTO9 и PI с использованием набора для подсчета и оценки жизнеспособности бактерий LIVE/DEAD™ BacLight™ для проточной цитометрии (Thermo Fisher Scientific, США). Затем добавляли гранулы, содержащиеся в наборе, и рассчитывали количество окрашенных живых бактерий с использованием анализа на основе проточной цитометрии.
[155]
[156] 2-3. Обработка штаммов и количественное измерение секреции ИЛ-4 и ИЛ-5 после индукции аллергических реакций
2
[157] Для индукции аллергических реакций в клетках EL4, ранее высеянных на 24-луночный планшет, каждую лунку обрабатывали 100 мкл PMA (20 нг/мл) и иономицина (1 мкг/мл). Затем выполняли обработку 300 мкл ранее полученных штаммов в соотношении клетки:штамм, равном 1:10. После инкубирования в течение 24 часов в инкубаторе с атмосферой 5% CO при 37°C собирали надосадочную жидкость и использовали наборы для твердофазного ИФА Mouse IL-4 (№ в каталоге 555232, BD OptEIA™) и Mouse IL-5 (№ в каталоге 555236, BD OptEIA™) для измерения количества секретированных ИЛ-4 и ИЛ-5 в соответствии с инструкциями производителя.
[158]
Lactobacillus crispatus
[159] В результате, как показано на фиг. 2 и 3, эти штаммы  в целом демонстрировали эффекты ингибирования секреции ИЛ-4 и ИЛ-5; в частности, обнаружено, что при использовании штамма KBL693 количество секретированного ИЛ-4 было самым низким, а количество секретированного ИЛ-5 - вторым по величине в порядке возрастания. Соответственно, обнаружено, что KBL693 мог оказывать терапевтическое и профилактическое действие по отношению к аллергии за счет ингибирования секреции цитокинов Th2-типа, опосредующих аллергические реакции.
[160]
[161] Пример 3. Влияние KBL693 на смягчение и лечение аллергических реакций в результате ингибирования IgE
[162] Иммуноглобулин E (IgE) представляет собой тип иммуноглобулинов; известно, что он вовлечен в развитие аллергических заболеваний. В целом, измерение общего количества IgE в сыворотке является одним из наиболее приоритетных способов диагностики аллергических заболеваний. Таким образом, в настоящем изобретении выполнена попытка проверки эффекта ингибирования секреции IgE штаммом KBL693 с использованием линии клеток U266B1, представляющей собой линию В-клеток человека.
[163]
[164] 3-1. Инкубирование линий клеток U266B1
5
[165] Клетки U266B1 (ATCC NO. TIB-196) культивировали в среде RPMI-1640 с добавлением 10% FBS, пенициллина (100 мкг/мл), и стрептомицина (100 мкг/мл) при 37°C в атмосфере 5% CO2, а затем пересевали раз в три дня. Клетки U266B1 высевали на 24-луночный планшет в концентрации 1×10 клеток/лунку, затем культивировали в течение 16-20 часов для индукции воспалительных реакций, а затем обрабатывали штаммами.
[166]
[167] 3-2. Инкубирование штаммов и восстановление
[168] Используемые штаммы в настоящем эксперименте получали таким же образом, как в примере 2-2.
[169]
[170] 3-3. Обработка штаммов и количественное измерение секреции IgE после индукции аллергических реакций
2
[171] Для индукции аллергических реакций в клетках U266B1, ранее высеянных на 24-луночный планшет, каждую лунку обрабатывали 100 мкл LPS (10 нг/мл) и ИЛ-4 (5 нг/мл). Затем выполняли обработку 300 мкл ранее полученных штаммов в соотношении клетки:штамм, равном 1:10. После инкубирования в течение 48 часов в инкубаторе с атмосферой 5% CO при 37°C собирали надосадочную жидкость и использовали наборы для твердофазного ИФА IgE человека (№ в каталоге Е88-108, Bethyl Laboratories) для измерения в соответствии с инструкциями производителя.
[172]
Lactobacillus crispatus
[173] В результате, как показано на фиг. 4, получили подтверждение того, что группы, обработанные семью штаммами , в том числе KBL693, демонстрировали эффекты ингибирования секреции IgE по сравнению с группой отрицательного контроля. Настоящий эксперимент показал, что KBL693 мог оказывать терапевтическое и профилактическое действие по отношению к аллергическим заболеваниям за счет ингибирования IgE - основного фактора, вовлеченного в аллергические реакции.
[174]
[175] Пример 4. Анализ иммунорегуляторных эффектов и эффектов ингибирования воспаления KBL693
[176] В дополнение к антиаллергической эффективности KBL693, также проверяли его иммунорегуляторные эффекты и эффекты ингибирования воспаления. С этой целью измеряли соотношение между ИЛ-10, типичным цитокином, обладающим иммунорегуляторной функцией, и ФНО-α и ИЛ-6, представляющими собой цитокины - основные индикаторы воспалительной реакции (ИЛ-10/ФНО-α, ИЛ-10/ИЛ-6), с использованием макрофагов, играющих важную роль в воспалительной реакции.
[177]
[178] 4-1. Инкубирование линий клеток RAW264.7
5
[179] Клетки RAW264.7 (ATCC NO. TIB -71) культивировали в среде DMEM с добавлением 10% FBS, пенициллина (100 мкг/мл), и стрептомицина (100 мкг/мл) при 37°C в атмосфере 5% CO2, а затем пересевали раз в три дня. Инкубированные клетки RAW264.7 высевали на 24-луночный планшет в концентрации 1×10 клеток/лунку, затем культивировали в течение 16-20 часов, а затем использовали для примера 4-3.
[180]
[181] 4-2. Инкубирование штаммов и получение образцов
[182] Культуральные растворы корректировали из расчета одинакового количества живых бактерий, а затем получали в виде трех образцов: живых бактерий, бактерий после пастеризации и бактерий, убитых нагреванием. Образцы живых бактерий, бактерий после пастеризации и бактерий, убитых нагреванием получали в соответствии со способом, использованным в примере 2-2.
[183] Затем на образец для пастеризации воздействовали температурой 70°C в течение 30 минут, и получали образец с использованием того же процесса центрифугирования. Образец бактерий, убитых нагреванием, стерилизовали при 121°C в течение 15 минут, и получали с использованием того же процесса. В качестве группы отрицательного контроля использовали среду MRS с добавлением 0,5% цистеина.
[184]
[185] 4-3. Обработка штаммов и измерение количества секретированных воспалительных цитокинов после индукции воспалительных реакций
2
[186] Для индукции воспалительных реакций в клетках RAW264.7 ранее высеянных на 24-луночный планшет, каждую лунку обрабатывали 500 мкл LPS (20 нг/мл). Затем выполняли обработку 300 мкл ранее полученных штаммов в соотношении клетки:штамм, равном 1:10, и инкубировали в течение 24 часов в инкубаторе с атмосферой 5% CO при 37°C. Надосадочную жидкость культивированной смеси клетки-штамм собирали и использовали набор для твердофазного ИФА ФНО мыши (Mouse TNF ELISA Set II, № в каталоге 558534, BD OptEIA™), набор для твердофазного ИФА ИЛ-6 мыши (Mouse IL-6 ELISA Set, № в каталоге 555240, BD OptEIA™) и набор для твердофазного ИФА ИЛ-6 мыши (Mouse IL-10 ELISA Set, Cat No. 555252, BD OptEIA™) для измерения количества каждого цитокина в соответствии с инструкциями производителя.
[187]
Lactobacillus crispatus
[188] В результате, как показано на фиг. 5, получили подтверждение того, что среди штаммов  KBL693 особенно эффективно индуцировал секрецию ИЛ-10 и тем самым оказывал замечательный эффект с точки зрения иммунорегуляции и подавления воспалительной реакции. Как показано на фиг. 6 и 7, на основании способности к секреции ИЛ-10 с поправкой на провоспалительные цитокины ФНО-α и ИЛ-6 получили подтверждение того, что группа, обработанная KBL693, демонстрировала значительно усиленный эффект подавления воспаления способность к иммунорегуляции по сравнению с контрольной группой. Соответственно, обнаружено, что KBL693 обладал иммунорегуляторной и противовоспалительной активностью за счет секреции IL-10. Кроме того, эти эффекты аналогичным образом подтвердили не только у живых бактерий, но и у бактерий после пастеризации или бактерий, убитых нагреванием (см. таблицу 2 и таблицу 3), что указывает на возможность использования KBL693 для регуляции иммунитета и подавления воспалительных реакций в различных формах, например, в форме мертвых бактерий.
[189]
[190] Таблица 2
ИЛ-10/ФНО-α
Живые
Убитые нагреванием
Пастеризованные
Контроль
-1,7574022 (Н/О)
-1,6268471 (Н/О)
-1,9978721 (Н/О)
KBL693
4,22079378
3,82025311
4,97474621
Н/О: не определяли.
[191] Таблица 3
ИЛ-10/ИЛ-6
Живые
Убитые нагреванием
Пастеризованные
Контроль
-3,5789041 (Н/О)
-4,2268549 (Н/О)
-4,712413 (Н/О)
KBL693
4,95082596
4,9303055
6,46882207
Н/О: не определяли.
[192]
[193] Пример 5. Анализ противогрибкового действия KBL693
Malassezia furfur
M. furfur
M. furfur
[194] Противогрибковое действие KBL693 подтверждали с помощью капельного анализа. Приблизительно 1% KBL693 инокулировали в жидкую среду MRS, а затем инкубировали в инкубаторе при 37°C в течение приблизительно 24 часов в анаэробных условиях для стационарного культивирования. Капли культурального раствора, в котором инкубировали клетки, наносили на твердую среду MRS, полученную в анаэробных условиях, в количестве 10 мкл за раз, а затем инкубировали при 37°C в анаэробных условиях в течение приблизительно 24 часов.  KCTC 7545, микроскопический грибок, получали путем посева в жидкую среду mYPG, полученную в аэробных условиях, в количестве 1% с последующим инкубированием в инкубаторе при 37°C в течение приблизительно 24-48 часов. Мягкий агар mYPG для использования при оценке противогрибковой эффективности получали с добавлением компонентов, указанных в таблице 4, и 2,5 мл полученной культуральной среды засевали культуральным раствором, в котором инкубировали 500 мкл . 2,5 мл мягкого агара mYPG, засеянного , выливали на среду MRS с нанесенными каплями KBL693 и высушивали в течение 1 часа. Высушенную среду инкубировали в аэробных условиях в инкубаторе при 37°C в течение 24-48 часов. При выявлении чистой зоны в культуральной среде определяли противогрибковую активность путем измерения расстояния от внешней границы нанесенной капли с молочнокислыми бактериями до чистой зоны. Чистая зона представляет собой область с ингибированным ростом грибов, и противогрибковую активность молочнокислых бактерий определяли на основании расстояния до чистой зоны.
[195] В результате трех повторных экспериментов выявили чистые зоны с интервалом приблизительно 4,33 мм в области нанесенных капель KBL693 (фиг. 8), что указывало на способность KBL693 эффективно подавлять рост микроскопических грибов.
[196]
[197] Таблица 4
Компоненты
Доля (г/л)
Солодовый экстракт
5,0
Пептон
10,0
Глюкоза
20,0
Твин-40
1,0
Твин-80
1,0
Агар
4,5
[198]
[199] Пример 6. Влияние KBL693 на смягчение атопических состояний
in vitro
Lactobacillus crispatus
[200] На основании всестороннего обзора результатов скрининга  выполнили анализы на животных, выбрав  KBL692, KBL693 и KBL702, обладавшие наиболее выраженным иммунорегуляторным действием. С целью проверки смягчающего влияния на атопические состояния в ряду эффектов KBL693, улучшающих состояние при аллергии, использовали мышей NC/Nga - модель атопического заболевания кожи у животных.
9
[201] После разделения мышей NC/Nga на группы по пять мышей на спине каждой мыши от нижней части уха до верхней части хвоста удаляли шерсть и оставляли мышей на 24 часа. Затем на область с удаленной шерстью наносили 200 мкл 1% раствора DNCB (динитрохлорбензола) (ацетон: оливковое масло = 3:1) два раза в неделю для индукции атопического дерматита. С третьей недели индукции дерматита мышам в контрольной группе раз в день перорально вводили 200 мкл PBS; культивируемый испытываемый штамм центрифугировали, промывали путем разбавления PBS и восстановления, а затем получали образцы, содержавшие 2×10 КОЕ на 200 мкл PBS, которые перорально вводили мышам в экспериментальной группе в количестве 200 мкл/день. При этом мышам в группе положительного контроля вводили 200 мкл дексаметазона (60 мкг/мл). Затем в течение трех недель введения бактерий еженедельно измеряли балльный показатель дерматита у мышей в контрольной и экспериментальной группах, и на 3 неделе после введения бактерий измеряли время почесывания мышей и толщину кожи.
[202]
[203] 6-1. Выполнение балльной оценки дерматита
[204] Для оценки поражений кожи, вызванных DNCB, измеряли балльный показатель дерматита следующим образом. Состояние кожи отслеживали, получая снимки в течение 3 недель с недельным интервалом, начиная с 3 недели после введения штамма. Проверяли четыре показателя - сухость, отек, эритему/кровотечение и эрозию/отделение кожи. Состояние без поражений оценивали как 0 баллов, легкое состояние - как 1 балл, умеренное состояние - как 2 балла, а тяжелое состояние - как 3 балла, и выполняли оценку общего балльного показателя.
Lactobacillus crispatus
[205] В результате, как показано на фиг. 9, балльный показатель дерматита, вызванного DNCB, значимо снижался в группе, получавшей штамм KBL693, по сравнению с контрольной группой (отрицательный контроль), где индуцировали атопический дерматит, и группами, получавшими другие штаммы . В результате проверили эффект лечения атопического дерматита при введении штамма KBL693.
[206]
[207] 6-2. Влияние на облегчение зуда
[208] С целью проверки смягчающего влияния на зуд при введении штамма KBL693 моделям мышей, страдающим атопическим дерматитом, вызванным DCNB, измеряли время почесывания, снимая видеозапись моделей мыши в течение 10 минут через 3 недели после введения штамма.
Lactobacillus crispatus
[209] В результате, как можно видеть на фиг. 10, оказалось, что время почесывания значимо снизилось в экспериментальной группе, получавшей KBL693, по сравнению с контрольной группой (отрицательный контроль), где индуцировали атопический дерматит, и группами, получавшими другие штаммы , что подтвердило выраженное смягчение симптомов зуда при атопическом дерматите за счет введения штамма KBL693.
[210]
[211] 6-3. Уменьшение толщины кожи
[212] С целью проверки эффекта уменьшения толщины кожи после введения KBL693 моделям мышей, страдающим атопическим дерматитом, вызванным DCNB, штангенциркулем измеряли толщину уха мыши и толщину кожи на спине через три недели после введения штамма и наблюдали снижение симптомов отека вследствие атопического дерматита.
7
8
9
[213] В результате, как можно видеть на фиг. 11 и 12, наблюдали значимое снижение толщины уха и кожи на спине в экспериментальной группе, получавшей KBL693, и группе положительного контроля. На фиг. 11 и 12 693-7, 693-8 и 693-9, соответственно, означают экспериментальные группы, в которых использовали образцы KBL693, содержавшие 2×10, 2×10 и 2×10 КОЕ на 200 мкл PBS, которые вводили мышам в экспериментальной группе в количестве 200 мкл/день.
[214]
[215] Пример 7. Влияние KBL693 на лечение и профилактику астмы у моделей мышей с астмой, индуцированной овальбумином (OVA)
[216] С целью проверки влияния KBL693 (LC206) на аллергическую астму получали модели мышей с астмой, индуцированной OVA, как указано ниже, выполняли гистопатологическое обследование и оценку уровня экспрессии ИЛ-5 и ИЛ-13.
[217]
[218] 7-1. Получение моделей мышей с астмой, индуцированной OVA
9
[219] Мышей Balb/c в возрасте пяти недель со средней массой тела приблизительно 15 г подвергали акклиматизации в течение одной недели, а затем отбирали мышей, не демонстрировавших патологий при обычном физикальном обследовании. Как показано на фиг. 13(A), используемых мышей вносили в обычную контрольную группу (контроль-PBS; без введения или ингаляции OVA; n=8), контрольную группу с индуцированной астмой (OVA-PBS; введение или ингаляция OVA; n=9), и экспериментальную группу (OVA-LC206; n=8). До умерщвления мышей в 31 день с начала эксперимента обычной контрольной группе и контрольной группе с индуцированной астмой раз в день перорально вводили 200 мкл PBS, а экспериментальной группе раз в день перорально вводили 200 мкл KBL693, разбавленного PBS до концентрации по меньшей мере 2×10 КОЕ/0,2 мл.
[220] Сенсибилизацию мышей выполняли путем внутрибрюшинной инъекции 200 мкл фосфатного буфера (pH 7,4), в котором суспендировали 2 мг гидроксида алюминия (Imject™ Alum Adjuvant, Thermofisher) и 20 мкг OVA (овальбумин, Sigma-aldrich), через одну неделю (D7) и через три недели (D21) после акклиматизации в течение одной недели, соответственно. С 28 по 30 день с начала эксперимента выполняли ингаляцию 1% OVA в легкие посредством интраназального введения (три стимуляции). Через 24 часа после последней стимуляции (D31) вводили пентобарбитал, а затем выполняли рассечение бронха для сбора образцов ткани легкого.
[221]
[222] 7-2. Гистопатологическое обследование
[223] В бронхах, обработанных антигеном, можно было наблюдать инфильтрацию воспалительными клетками, состоящими из эозинофилов, нейтрофилов и макрофагов. Так, с целью проверки влияния KBL693 на астму выполнили гистопатологическое обследование образцов ткани легких в каждой группе, полученной в примере 7-1. Образцы ткани легких, полученные в примере 7-1, подготавливали в виде срезов ткани толщиной 4 мкм посредством традиционной процедуры получения срезов ткани, фиксированной формалином и включенной в парафин (FFPE), а затем выполняли окрашивание H&E гематоксилином и эозином Y (эозин Y; ThermoShandon, Питтсбург, штат Пенсильвания, США). После окрашивания H&E срезы тканей в каждой группе осматривали с помощью оптического микроскопа (фиг. 13(B)).
[224] В результате, как показано на фиг. 13(B), в контрольной группе с индуцированной астмой (OVA-PBS) обнаружили инфильтрацию большого количества воспалительных клеток, в том числе эозинофилов, вокруг бронхиол, а также гиперпролиферацию эпителиальных клеток и утолщение гладких мышц бронхов. С другой стороны, в экспериментальной группе, получавшей KBL693 (OVA-LC206), наблюдали значимое снижение инфильтрации воспалительных клеток, в том числе эозинофилов, толщины ткани бронхов и тяжелое повреждение эпителиальных клеток. В результате подтвердили терапевтическое влияние KBL693 на аллергическую астму, индуцированную OVA.
[225]
[226] 7-3. Анализ уровня экспрессии общего ИЛ-5 и общего ИЛ-13
+
+
+
+
+
+
[227] Для оценки иммуноцитов в образцах ткани легких, собранных в каждой группе, использовали проточный цитометр (LSRFortessa X-20, BD). Для окрашивания ИЛ-5CD4 T-клеток и ИЛ-13CD4 T-клеток использовали антитела к нескольким маркерам (антитело против CD45 мыши, BioLegend; антитело против Cd3ε мыши, BD; антитело против ИЛ-5 мыши/человека, BioLegend; антитело против ИЛ-13 мыши, Invitrogen). ИЛ-5- и ИЛ-13-клетки определяли путем подсчета клеток, продуцирующих ИЛ-5 или ИЛ-13 среди лимфоцитов с маркерами CD45 и CDε (фиг. 14).
[228]
[229] В результате, как показано на фиг. 14, обнаружено, что уровни ИЛ-5 и ИЛ-13 у мышей в контрольной группе с индуцированной астмой (OVA-PBS) были значимо повышены по сравнению с обычной контрольной группой (PBS), в то время как уровни общего ИЛ-5 и общего ИЛ-13 у мышей в экспериментальной группе, получавшей KBL693 (OVA-KBL693) были значимо понижены по сравнению с контрольной группой с индуцированной астмой. Соответственно, обнаружено, что KBL693 согласно настоящему изобретению мог оказывать терапевтическое и профилактическое действие по отношению к аллергической астме за счет ингибирования секреции ИЛ-5 и ИЛ-13, являющихся цитокинами Th2-типа, опосредующими аллергические реакции.
[230]
[231] Пример 8. Влияние KBL693 на лечение и профилактику астмы у моделей астмы, индуцированной клещом домашней пыли (HDM)
+
+
+
+
+
[232] Клещи домашней пыли представляют собой аллерген, являющийся ведущей причиной экзогенной астмы. С целью проверки влияния KBL693 на аллергическую астму получали моделей мышей с астмой, индуцированной HDM, как описано ниже, выполняли оценку гиперчувствительности дыхательных путей и определяли долю эозинофилов среди CD45-клеток, долю ИЛ-5 CD4 T-клеток среди CD4 T-клеток и долю ИЛ-13 CD4 T-клеток среди CD4 T-клеток.
[233]
[234] 8-1. Получение моделей мышей с астмой, индуцированной HDM
[235] Мышей Balb/c в возрасте пяти недель со средней массой тела приблизительно 15 г подвергали акклиматизации в течение одной недели, а затем отбирали мышей, не демонстрировавших патологий при обычном физикальном обследовании. Используемых мышей вносили в обычную контрольную группу (контроль-PBS; без введения HDM), контрольную группу с индуцированной астмой (HDM-PBS; введение HDM), и экспериментальную группу HDM-KBL693), пять мышей из каждой группы использовали для оценки гиперреактивности дыхательных путей (AHR), и восемь мышей из каждой группы использовали для оценки иммуноцитов в легких.
[236] Сенсибилизацию мышей выполняли путем интраназального введения 50 мкл фосфатного буфера (pH 7,4), в котором суспендировали 10 мкг HDM (Greer), через одну неделю после акклиматизации в течение одной недели. Через одну неделю после сенсибилизации выполняли ингаляцию 50 мкл фосфатного буфера, в котором суспендировали 10 мкг HDM, в легкие путем интраназального введения в течение пяти дней (D14~D18) (пять стимуляций). Через 24 часа после последней стимуляции (D19) вводили пентобарбитал, а затем выполняли оценку гиперреактивности дыхательных путей (AHR, пример 8-2) и рассечение бронха для сбора образцов ткани легкого.
[237]
[238] 8-2. Оценка AHR
[239] Мышь, анестезированную пентобарбиталом, подключали к измерителю AHR (FinePointe Resistance and Compliance, DSI-Buxco), и вводили ей различные концентрации метахолина, растворенного в PBS (0, 5, 10, 20 и 40 мг/мл). Затем рассчитывали значение AHR, измеряя объем воздуха, прошедший через дыхательные пути (фиг. 15).
L
[240] В результате, как показано на фиг. 15, подтвердили, что с ростом концентрации метахолина AHR (R) медленно увеличивалась в обычной контрольной группе (CTRL) и быстро увеличивалась в контрольной группе с индуцированной астмой (HDM). С другой стороны, в экспериментальной группе, получавшей KBL693 (HDM+KBL693), AHR была значимо понижена по сравнению с группой с индуцированной астмой (HDM) во всем диапазоне концентраций метахолина. Это различие было более очевидным при введении высоких концентраций метахолина по сравнению с областью его низких концентраций. Соответственно, обнаружено, что KBL693 мог эффективно подавлять AHR, вызывающую астму, и, таким образом, мог эффективно использоваться для лечения и профилактики аллергической астмы.
[241]
[242] 8-3. Определение доли эозинофилов среди CD45
-клеток, доли ИЛ-5
CD4 T-клеток среди CD4
T-клеток и доли ИЛ-13
CD4 T-клеток среди CD4
T-клеток.
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
[243] Для оценки иммуноцитов в легких использовали проточный цитометр (LSRFortessa X-20, BD). Для окрашивания эозинофилов, ИЛ-5CD4 T-клеток и ИЛ-13CD4 T-клеток использовали антитела к нескольким маркерам (антитело против CD45 мыши, BioLegend; антитело крысы против Siglec-F мыши, BD; антитело против Cd11b мыши, BD; антитело против Cd3ε мыши, BD; антитело против TCRβ мыши, BioLegend; антитело против CD4 мыши, BioLegend; антитело против ИЛ-5 мыши/человека, BioLegend; антитело против ИЛ-13 мыши, Invitrogen). Эозинофилы определяли путем подсчета Siglec-fCd11b+-клеток-клеток среди клеток, экспрессирующих CD45, общий маркер лейкоцитов, а ИЛ-5CD4T-клетки и ИЛ-13CD4 T-клетки определяли путем подсчета клеток, продуцирующих ИЛ-5 или ИЛ-13 среди CD4 T-клеток с маркерами CDε, TCRβ и CD4 (фиг. 16).
+
+
+
+
+
+
[244] В результате, как показано на фиг. 16, подтвердили, что в случае контрольной группы с индуцированной астмой (HDM) доли иммуноцитов, т.е. эозинофилов, ИЛ-5 CD4 T-клеток и ИЛ-13 CD4 T-клеток были значимо повышены по сравнению с обычной контрольной группой (PBS), в то время как в случае экспериментальной группы, получавшей KBL693 (HDM+KBL693) доли эозинофилов, ИЛ-5 CD4 T-клеток и ИЛ-13 CD4 T-клеток были значимо понижены по сравнению с контрольной группой с индуцированной астмой. Соответственно, обнаружено, что KBL693 мог оказывать терапевтическое и профилактическое действие по отношению к аллергической астме за счет ингибирования воспалительных клеток, т.е. эозинофилов, ИЛ-5 CD4 T-клеток и ИЛ-13 CD4 T-клеток.
[245]
[246] Специфические аспекты настоящего изобретения подробно описаны выше, и для специалистов в данной области техники очевидно, что эти специфические аспекты являются лишь конкретными вариантами реализации, которые не ограничивают рамки настоящего изобретения. Таким образом, рамки настоящего изобретения в значительной степени определяются следующей формулой изобретения с эквивалентами пунктов формулы.
[247]
[248] Название депонирующей организации:
Корейский исследовательский институт биологических наук и биотехнологии (Korea Research Institute of Bioscience & Biotechnology)
[249] Идентификационный номер:
KCTC13519BP
[250] Дата доступа:
20180427
[251]
Возможность промышленного применения
Lactobacillus crispatus
[252] Штамм  KBL693 (идентификационный номер KCTC 13519BP) в соответствии с настоящим изобретением ослабляет аллергические клеточные реакции, значительно улучшает симптомы атопического дерматита и обладает противовоспалительным, иммунорегуляторным и противогрибковым действием. Таким образом, этот одиночный штамм сам по себе может обеспечивать достижение всех целей смягчения аллергических заболеваний и улучшения состояния при воспалительных заболеваниях и аутоиммунных заболеваниях и за счет этого успешно находить применение в качестве пробиотического вещества. Кроме того, этот штамм на основании его противогрибковой активности можно успешно использовать в качестве средства для наружной обработки кожи против различных заболеваний кожи, вызванных грибками, а также в косметической композиции и функциональном пластыре для смягчения чувствительности кожи.
Текст списка последовательностей
[253] Электронный файл прилагается
[254]
--->
<110>    Ko BioLabs, Inc.
<120>    Штамм Lactobacillus crispatus KBL 693 и его применение
<130>    P18-B095
<160>    1
<170>    KoPatentIn 3.0
<210>    1
<211>    1470
<212>    ДНК
<213>    Lactobacillus crispatus
<400>    1
cgcggggtgg cgcgagctat aatgcagtcg agcgagcgga actaacagat ttacttcggt         60
aatgacgtta ggaaagcgag cggcggatgg gtgagtaaca cgtggggaac ctgccccata        120
gtctgggata ccacttggaa acaggtgcta ataccggata agaaagcaga tcgcatgatc        180
agcttttaaa aggcggcgta agctgtcgct atgggatggc cccgcggtgc attagctagt        240
tggtaaggta aaggcttacc aaggcgatga tgcatagccg agttgagaga ctgatcggcc        300
acattgggac tgagacacgg cccaaactcc tacgggaggc agcagtaggg aatcttccac        360
aatggacgca agtctgatgg agcaacgccg cgtgagtgaa gaaggttttc ggatcgtaaa        420
gctctgttgt tggtgaagaa ggatagaggt agtaactggc ctttatttga cggtaatcaa        480
ccagaaagtc acggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt ggcaagcgtt        540
gtccggattt attgggcgta aagcgagcgc aggcggaaga ataagtctga tgtgaaagcc        600
ctcggcttaa ccgaggaact gcatcggaaa ctgtttttct tgagtgcaga agaggagagt        660
ggaactccat gtgtagcggt ggaatgcgta gatatatgga agaacaccag tggcgaaggc        720
ggctctctgg tctgcaactg acgctgaggc tcgaaagcat gggtagcgaa caggattaga        780
taccctggta gtccatgccg taaacgatga gtgctaagtg ttgggaggtt tccgcctctc        840
agtgctgcag ctaacgcatt aagcactccg cctggggagt acgaccgcaa ggttgaaact        900
caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgaagcaacg        960
cgaagaacct taccaggtct tgacatctag tgccatttgt agagatacaa agttcccttc       1020
ggggacgcta agacaggtgg tgcatggctg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt       1080
aagtcccgca acgagcgcaa cccttgttat tagttgccag cattaagttg ggcactctaa       1140
tgagactgcc ggtgacaaac cggaggaagg tggggatgac gtcaagtcat catgcccctt       1200
atgacctggg ctacacacgt gctacaatgg gcagtacaac gagaagcgag cctgcgaagg       1260
caagcgaatc tctgaaagct gttctcagtt cggactgcag tctgcaactc gactgcacga       1320
agctggaatc gctagtaatc gcggatcagc acgccgcggt gaatacgttc ccgggccttg       1380
tacacaccgc ccgtcacacc atgggagtct gcaatgccca aagccggtgg cctaaccttc       1440
ggaaggagcc gtctaagtag acaatgtgca                                        1470
<---