СПОСОБ ОЦЕНКИ ОСОБЕННОСТЕЙ КЛИНИЧЕСКОГО ТЕЧЕНИЯ ХРОНИЧЕСКОГО ГЛОМЕРУЛОНЕФРИТА
METHOD OF ASSESSING CLINICAL COURSE OF CHRONIC GLOMERULONEPHRITIS

Изобретение относится к области медицинской диагностики, может быть использовано для прогнозирования течения хронического гломерулонефрита на протяжении всей жизни человека.
В настоящее время хронический гломерулонефрит (ХГН) представляет серьезную проблему современной медицины в связи с тяжестью болезни и широкой распространенностью в разных регионах мира [1]. В нашей стране ежегодно с диагнозом хронический гломерулонефрит госпитализируется около 1-2% от всех терапевтических больных. В структуре всей почечной патологии, составляющей около 200 случаев на 100 тыс. населения, ХГН является наиболее частым заболеванием, доля которого достигает 40% [2]. Следует отметить, что заболевание поражает преимущественно лица трудоспособного возраста, что наносит значительный социальный и экономический ущерб [3]. ХГН нередко приводит к летальности в связи с достижением терминальной стадии хронической почечной недостаточности [4, 5].
Согласно экспериментальным и клиническим данным, важную роль в развитии ХГН играют интерлейкины и факторы роста [6]. Клинико-генетические работы, посвященные молекулярно-генетическим аспектам ХГН, в России немногочисленны и затрагивают в основном интегральные мембранные белки [7], ряд интерлейкинов [6], факторы некроза опухоли [8]. Исследования роли полиморфных маркеров ряда генов интерлейкинов в отношении ХГН до сих пор не проведены.
Основная задача молекулярно-генетического типирования локусов генов интерлейкинов - это определение единичных нуклеотидных замен в генах, которые вызывают изменения уровня продукции интерлейкинов, что может влиять на развитие хронического воспалительного процесса.
Авторами в доступной научно-медицинской и патентной литературе не обнаружен способ оценки клинического течения хронического гломерулонефрита.
Задачей настоящего исследования является разработка способа оценки патогенетической значимости полиморфизмов генов интерлейкинов в течение хронического гломерулонефрита.
Технический результат использования изобретения - получение критериев оценки течения хронического гломерулонефрита, позволяющих в кратчайшие сроки определить клинический прогноз и стратегию терапии данного заболевания.
В соответствии с поставленной задачей был разработан способ особенностей клинического течения хронического гломерулонефрита на основе данных о полиморфизме генов интерлейкинов, включающий выделение ДНК из периферической венозной крови больных хроническим гломерулонефритом, выявление полиморфизмов генов интерлейкинов и в случае:
- выявления генотипа - 4257АА гена IL-13 делают вывод о вероятности формирования тяжелой артериальной гипертензии и высокого уровня среднесуточной протеинурии в течение заболевания;
- в случае выявления аллеля - 4257А гена IL-13 делают вывод о вероятности протекания ХГН с умеренной протеинурией.
Новизна и изобретательский уровень заключаются в том, что из уровня техники не известна возможность определения особенностей течения хронического гломерулонефрита по наличию аллелей и генотипов генов интерлейкинов.
Способ осуществляют следующим образом.
ДНК выделяют из образцов периферической венозной крови больных хроническим гломерулонефритом методом фенол-хлороформной экстракции.
Выделенную ДНК затем подвергают полимеразной цепной реакции с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров.
2
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) синтеза полиморфных локусов интерлейкина 13-4257G/A IL-13 выполняется в 12,5 мкл общего объема смеси, содержащей 33,5 мМ трис-HCl (pH=8,8), 1,25 мМ MgCl, 0,5 мкг геномной ДНК, по 5 пМ каждого праймера, по 100 мкМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP и 1 единицу активной Taq-полимеразы.
Амплификат, наработанный при ПЦР полиморфных локусов генов интерлейкинов, подвергают рестрикции (ПДРФ-анализ) путем добавления к 12,5 мкл. амплификата 5 ед. активности рестриктазы и инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 16 часов. Для анализа полиморфизма гена интерлейкина 13-4257G/A IL-13 используют эндонуклеазу рестрикции BspLI ("СибЭнзим").
Продукты ПДРФ-анализа оцениваются путем разделения при помощи электрофореза в 2%-ном агарозном геле, приготовленном на основе ТВЕ-буфера, окрашенном раствором бромистого этидия (0,01%). В качестве электрофорезного буфера используют 1×TAE (трис-ацетатный буфер). Визуализация фореграмм осуществляется в темном боксе с трансиллюминатором фирмы UVP (Швеция).
Фрагменты длиной 156 п.н. соответствовали аллелю - 4257А гена IL-13, 138 и 18 п.н. - аллелю - 4257G, фрагменты длиной 156, 138 и 18 п.н. наблюдались у гетерозигот - 4257AG. Мутантный аллель - 4257А обусловливает повышение продукции интерлейкина 13 и IgE и, соответственно, обладает противовоспалительным и атопическим эффектами.
2
2
Формирование базы данных и статистические расчеты осуществляют с использованием программы «STATISTICA 6.0». Для оценки соответствия наблюдаемого распределения генотипов ожидаемому, исходя из равновесия Харди-Вайнберга, использован критерий χ, наблюдаемая гетерозиготность, ожидаемая гетерозиготность, индекс фиксации Райта. Ассоциации аллелей и генотипов изученных ДНК-маркеров с предрасположенностью к хроническому гломерулонефриту, а также с качественными признаками, характеризующими его клинические особенности, оценивали с помощью анализа таблиц сопряженности 2×2 с расчетом критерия χ с поправкой Йетса на непрерывность и отношения шансов (OR) с 95% доверительными интервалами (CI). Взаимосвязи между количественными патогенетически значимыми признаками ХГН и полиморфизмами генов цитокинов изучали с помощью однофакторного и двухфакторного дисперсионного анализа.
Возможность использования предложенного способа для определения клинического прогноза и стратегии терапии данного заболевания подтверждает анализ результатов наблюдений 238 больных хроническим гломерулонефритом и 241 человек популяционного контроля. Пациенты включались в соответствующую группу больных только после установления диагноза заболевания, подтвержденного с помощью клинических и лабораторно-инструментальных методов обследования. Контрольную группу составили индивидуумы русской национальности, являющиеся уроженцами Белгородской области и не имеющие родства между собой.
Впервые выявлено, что генотип - 4257АА гена IL-13 является маркером:
2
- тяжелой артериальной гипертензии, частота встречаемости которого у больных с уровнем артериального давления >160/110 более чем в 3 раза превысила долю этого генотипа в контрольной группе (20,69% и 6,54% соответственно; χ=3,99, р=0,05) (табл.1);
- высокого уровня среднесуточной протеинурии (4,70 г/сут. против 2,03 г/сут. и 2,37 г/сут. у пациентов с генотипами - 4257GG и - 4257AG соответственно; р=0,05), что подтверждает анализ ассоциации генотипов полиморфных генетических маркеров интерлейкинов со среднесуточной протеинурией у больных ХГН, проведенный с использованием дисперсионного анализа (табл.2). Коэффициент детерминации, показывающий какая доля изменчивости протеинурии обусловлена генотипами гена интерлейкина 13, составил 5,08% (табл.2).
Полученные данные согласуются с результатами анализа распределения генов и генотипов изучаемых полиморфных генетических систем в группах больных ХГН с разным уровнем протеинурии (незначительная протеинурия - до 1 г/сут, умеренная - 1-3 г/сут, выраженная - более 3 г/сут).
Таблица 1
Сравнительный анализ частот аллелей и генотипов полиморфных маркеров генов интерлейкинов у больных ХГН в зависимости от уровня артериального давления (%) (начало)
ен
Аллели, генотипы
Контрольная группа (n=241)
Уровень АД
Критерий различий, χ<sup>2</sup> (p)
<140/90 (n=79)
140/90-159/109 (n=92)
>160/110 (n=52)
1
2
3
4
1-2
1-3
1-4
-4257G/A IL-13
-4257G
76,10
76,74
74,60
65,52
0,00 (1,00)
0,00 (1,00)
1,97 (0,16)
-4257А
23,90
23,26
25,40
34,48
-4257GG
59,56
65,12
58,73
51,72
0,22 (0,64)
0,00 (1,00)
0,32 (0,57)
-4257AG
33,09
23,26
31,75
27,59
1,06 (0,30)
0,00 (0,98)
0,13 (0,72)
-4257АА
6,54
11,63
9,52
20,69*
0,32 (0,57)
0,06 (0,81)
3,99 (0,05)
* - различия достоверны между больными и контрольной группой (р<0,05)
Таблица 2
Средний уровень протеинурии в зависимости от полиморфных маркеров генов интерлейкинов
Гены
Полиморфизм и его локализация в гене
Генотипы
Среднесуточная протеинурия (г)
IL-13
-4257G/A (4 экзон)
-4257GG
2,01±0,34
-4257AG
2,37±0,43
-4257АА
4,70±1,10
h<sup>2</sup>
5,08
Р
0,05
Примечание: h<sup>2</sup> - коэффициент детерминации (%)
2
Также впервые выявлено, что аллель - 4257А гена IL-13 является маркером умеренного уровня протеинурии. Пациенты с умеренной протеинурией характеризуются наибольшей частотой аллеля - 4257А гена IL-13 по сравнению с больными с незначительной протеинурией и выраженной протеинурией (42,86% против 22,73% и 26,76% соответственно; χ=4,95-8,16, р=0,03-0,005) (табл.3).
Таблица 3
Сравнительный анализ частот аллелей и генотипов полиморфных маркеров генов интерлейкинов у больных ХГН в зависимости от степени протеинурии (%) (начало)
Гены
Аллели, генотипы
Уровень протеинурии
Критерий различий, χ<sup>2</sup> (р)
<1 г/сут
1-3 г/сут
>3 г/сут
1
2
3
1-2
1-3
2-3
-4257G/A IL-13
-4257G
77,27
57,14*
73,33
8,16 (0,005)
0,24 (0,62)
4,95 (0,03)
-4257А
22,73
42,86*
26,67
-4257GG
68,18
42,86
60,0
0,57 (0,45)
0,03 (0,87)
0,09 (0,77)
-4257AG
18,18
28,57
26,67
0,00 (0,96)
0,04 (0,84)
0,00 (1,00)
-4257АА
13,64
28,57
13,33
0,11 (0,74)
0.00 (1,00)
0,07 (0,79)
*- различия достоверны (р<0,05)
Таким образом, наличие у больных ХГН генотипа - 4257АА гена IL-13 обусловливает формирование тяжелой артериальной гипертензии и высокого уровня среднесуточной протеинурии в течение заболевания.
Аллель - 4257А гена IL-13 ассоциирован с умеренной протеинурией.
Литература.
1. Полещук Л.А. Характеристика почечной гемодинамики у детей с заболеваниями почек (Обзор литературы) // Нефрология и диализ. - 2006. - Т.8, №3. - С.225-232.
2. Мартынов С.А., Швецов М.Ю., Кутырина И.М. Нарушения суточного ритма артериального давления у больных хроническим гломерулонефритом // Терапевтический архив. - 2006. - Том 78, №1. - С.23-28.
3. Кутырина И.М., Руденко Т.Е., Швецов М.Ю., Кушнир В.В. Факторы риска сердечно-сосудистых осложнений у больных на додиализной стадии хронической почечной недостаточности // Терапевтический архив. - 2006. - Том 78, №5. - С.45-50.
4. Картамышева Н.Н., Чумакова О.В., Кучеренко А.Г., Сергеева Т.В. Прогрессирование хронического гломерулонефрита: клинико-морфологические взаимосвязи // Нефрология и диализ. - 2003. - т.5, №4. - С.395-398.
5. Ермоленко В.М., Козлова Т.А., Михайлова Н.А. Значение малобелковой диеты в замедлении прогрессирования хронической почечной недостаточности: обзор литературы // Нефрология и диализ. - 2006. - Т.8, №4. - С.310-321.
6. Петросян Э.К., Цыгин А.Н., Шестаков А.Е., Носиков В.В. Роль генетического полиморфизма интерлейкинов 4 и 13 в развитии нефротического синдрома с минимальными изменениями у детей и подростков // Педиатрия. - 2006. - №5. - С.7-10.
7. Шестаков А.Е., Камышова Е.С., Кутырина И.М. и др. Ассоциация полиморфных маркеров D6S2414 и D6S1271, расположенных в локусе МНС (6р21.31), с хроническим гломерулонефритом среди русских г.Москвы // Генетика. - 2006. - Т.42, №12. - С.1727-1730.
8. Некипелова Е.В., Чурносов М.И. Влияние генетических факторов на скорость прогрессирования хронического гломерулонефрита // Нефрология и диализ. - 2007. - Т.9, №3. - С.340.