НОВЫЕ МОЛОЧНОКИСЛЫЕ БАКТЕРИИ И СОДЕРЖАЩИЕ ИХ СОСТАВЫ ПРОТИВ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ПРОСТУДНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
NOVEL LACTIC ACID BACTERIA AND COMPOSITIONS CONTAINING THEM AGAINST BACTERIAL COLDS

Настоящее изобретение относится к микроорганизму отряда молочнокислых бактерий или его аналогу, фрагменту, производному, мутанту или их сочетанию, при этом микроорганизм или его аналог, фрагмент, производное, мутант или их сочетание может коагрегировать с Streptococcus pyogenes. Кроме того, изобретение относится к составам, содержащим указанные микроорганизмы, в частности для использования в личной гигиене и при лечении заболеваний. В частности, настоящее изобретение относится к применению новых молочнокислых бактерий и/или содержащих их составов для лечения и/или профилактики всех заболеваний, которые могут быть вызваны Streptococcus pyogenes.
Дополнительно, в настоящем изобретении представлен новый биологический продукт в виде признанных безопасными микроорганизмов и/или молочнокислых бактерий, который может использоваться в качестве антибактериальной добавки, обладающей специфическим действием, для профилактики и местного лечения воспалений в области рта и горла, то есть орофарингеального пространства, инфекций верхних дыхательных путей и кожи.
Кроме того, настоящее изобретение относится к применению микроорганизма по настоящему изобретению, его аналога или фрагмента в составах, фармацевтических продуктах или лекарственных препаратах (гигиена полости рта), например в форме спреев, растворов для полоскания полости рта или в виде леденцов от боли в горле и кашля или таблеток, пастилок, драже, аэрозолей, зубных паст, соков, сиропов или в виде добавки к продуктам питания и/или пищевых добавок.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Большинство людей болели ангиной или тонзиллитом (фарингитом). Эти болезни могут быть вызваны как вирусами, так и бактериями. Приблизительно 20-30% случаев ангины и тонзиллита имеют бактериальное происхождение. В любом случае это связано с инфекцией Streptococcus pyogenes. Streptococcus pyogenes является одной из самых распространенных патогенных для человека бактерий. Бактериальный фарингит распространяется воздушно-капельным инфицированием. Дети и подростки в возрасте от 5 до 15 лет являются группой, наиболее часто страдающей от этой инфекции, однако в условиях скопления людей для пожилых людей также имеется риск заражения (Bisno 1995). Количество инфекций S. pyogenes в Соединенных Штатах по оценкам составляет 10 миллионов в год (Kilian 2002). Соответствующие затраты в Соединенных Штатах по оценкам составляют приблизительно 1 миллиард долларов ежегодно (Reid et al. 2001). Количество случаев острого стрептококкового фарингита в Германии по оценкам составляет от 1 до 1,5 миллионов в год. Только часть инфекций имеет клинически выраженное течение, то есть состав передаваемых патогенов шире.
Streptococcus pyogenes (стрептококки группы А, также упоминаемые как GAS) является патогеном человека, относящимся к грамположительным коккам, которые образуют длинные цепи. Как многие другие патогены, стрептококки также обладают способностью экспрессировать различные факторы вирулентности. Первой стадией в процессе патогенез Streptococcus pyogenes является адгезия бактерий к поверхности клеток хозяина. Согласно широко распространенной модели, адгезия происходит в две стадии: первая стадия включает слабое, относительно неспецифическое взаимодействие с поверхностью человеческих клеток, которое непосредственно влечет за собой тканеспецифическое взаимодействие с высоким сродством (Hasty et al. 1992; Courtney et al. 1999; Cunningham 2000). Еще в 1976 г. Beachey и др. смогли установить, что липотейхоевая кислота (LTA) является молекулой, которая является посредником начальной адгезии на бактериальном уровне. На эпителиальном уровне, было установлено, что рецептором для LTA является фибронектин (Simpson and Beachey 1983). Установлено, что по меньшей мере 11 других структур на поверхности бактерии обеспечивают связывание с эпителиальными клетками на второй стадии адгезии. Второй стадией патогенеза, обусловленного Streptococcus pyogenes, является инвазия бактерий в эпителиальные клетки хозяина (LaPenta et al. 1994). LaPenta с коллегами показали, что GAS может инфицировать человеческие эпителиальные клетки с частотами, которые иногда выше, чем для традиционных внутриклеточных патогенов человека, таких как Salmonella или Listeria.
Внутри клетки хозяина патогенные бактерии имеют большую возможность для репликации, что может привести к острой инфекции. Выживание в неактивном состоянии может привести к повторному возникновению бактериальной инфекции слизистых оболочек и эпителия, что может объяснить рецидивирующую инфекцию слизистой оболочки орофарингеальной области. В частности, рецидивирующей инфекцией является ангина, причиной которой у детей очень часто являются GAS.
Streptococcus pyogenes является возбудителем многих острых заболеваний, таких как фарингит, скарлатина, импетиго, панникулит. Инвазивные токсикогенные инфекции, такие как некротический фасциит, миозит и вызываемый стрептококками токсический шок, а также развитие иммуноопосредованных осложнений, таких как ревматизм и гломерулонефрит, все вызывается Streptococcus pyogenes.
По приблизительным оценкам, от 5 до 15% всего населения являются носителями этой бактерии (как правило в горле) без каких-либо признаков заболевания. Как компонент нормальной флоры, Streptococcus pyogenes может вызывать инфекцию при ослаблении иммунной системы. Заселение ткани (например, дыхательных путей или кожи) Streptococcus pyogenes происходит после внезапного начала болезни, связанного с соответствующими симптомами, такими как саднение в горле, боль в горле и затруднение глотания.
Кроме того, инфекции Streptococcus pyogenes могут привести к осложнениям в результате распространения инфекции на нижние дыхательные пути (средний отит, синусит, пневмония) или в кровоток и менингиту, а также к инфекциям костей (остеомиелит) и суставов (артрит).
Одним из элементов процесса заселения является адгезия бактерий к клеточной поверхности и/или поверхности слизистой оболочки. Бактерия имеет широкий набор адгезинов, посредством которых происходит связывание с клеточными поверхностями (например, М-белок, фибронектин-связьшающий белок, LTA [липотейхоевая кислота], коллаген-связывающий белок). Взаимодействие, то есть связывание с клеточными поверхностями, играет важную роль в заселении клеток хозяина, а также в патогенезе инфекции Streptococcus pyogenes.
Соответственно, своевременное применение терапевтических средств для предупреждения и лечения имеет решающее значение для уменьшения общего количества GAS-микроорганизмов и для эффективного предотвращения связывания, то есть инвазии Streptococcus pyogenes.
Терапевтические средства, способные ослабить симптомы, вызванные Streptococcus pyogenes в области горла, описаны в технике.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Стандартным методом лечения острых заболеваний является применение антибиотиков. Наряду с другими причинами, из-за увеличения числа случаев устойчивости к пенициллину в последние десятилетия начиная с середины 1980-х годов в промышленно развитых странах количество этих заболеваний снова повышается (Kaplan 1991; Musser and Krause 1998). Профилактика отсутствует, так как до сих пор не разработана действующая вакцина. Причиной этого является изменчивость основного используемого антигена, М-белка из клеточных стенок бактерий, и перекрестная иммунологическая реактивность других возможных антигенов с человеческими белками.
Показано, что обычно у большинства пациентов инфекция в любом случае проходит независимо от лечения антибиотиками (обычно пенициллином или эритромицином), которые могут иметь тяжелые побочные действия.
Лекарства, доступные на данный момент в продаже, включают главным образом леденцы, таблетки, средства для полоскания горла и спреи для горла, в некоторых случаях смешанные с местными анестетиками (лидокаином, бензокаином), которые ненадолго избавляют от симптомов в области горла, но эти лекарства не убивают Streptococcus pyogenes.
Молочнокислые бактерии в основном используются как пробиотические бактерии для предохранения от желудочно-кишечных заболеваний, вызываемых патогенами, так как в · дополнение к молочной кислоте они часто также продуцируют антибактериальные вещества. Лактобациллы (молочнокислые бактерии) являются грамположительными анаэробными или аэротолерантными бактериями, которые способны метаболизировать сахар до молочной кислоты (молочнокислое брожение). Они включают семейства Lactobacillaceae, Aerococcaceae, Carnobacteriaceae, Enterococcaceae, Leuconostocaceae и Streptococcaceae. Данные бактерии считаются непатогенными и используются в качестве пробиотических бактерий, в основном для улучшения флоры желудочно-кишечного тракта и лечения желудочно-кишечных симптомов. Лактобациллы важны в частности для пищевой промышленности, где они играют важную роль в области "функциональных пищевых продуктов". В прошлом, к лактобациллам относили вид Bifidobacterium bifidum (Lactobacillus bifidum), но согласно современным представлениям этот вид филогенетически не является близкородственным данной группе. Тем не менее, он все еще считается принадлежащим к молочнокислым бактериям в отношении метаболизма. Молочнокислые бактерии также исключительно важны для пищевой промышленности, так как они используются для производства молочных продуктов, но они также могут быть вредными (например, на пивоваренных заводах). Молочнокислые бактерии относятся к непатогенным бактериям.
В технике описано использование пробиотических бактерий для различных применений. Например, в WO 2010/130563 раскрыто применение пробиотических бактерий в средствах для мытья посуды, что уменьшает негативные последствия для кожи мытья посуды вручную. Кроме того, эти бактерии оказывают защитное действие на кожу.
Уже известно применение таких микроорганизмов в косметических средствах для ухода за кожей. Например, в патенте США 6790434 описано применение таких микроорганизмов в косметических средствах для ухода за кожей в сочетании с экстрактом внеклеточного матрикса растений для предупреждения повреждения кожи, вызванного УФ-излучением. Однако там не раскрыто использование этих микроорганизмов в моющих и чистящих средствах.
Кроме того, также известно использование некоторых видов Bacillus в санитарных чистящих средствах. Так, в WO 97/25865 описано использование видов Bacillus в чистящих средствах для санитарных целей, в которых они служат для предотвращения размножения патогенов и расщепления органических загрязнений. Раскрытые применения часто относятся к инактивированным бактериям в форме спор. Споры реактивируются субстратами и не должны репродуцироваться из-за генетических дефектов. Однако недостатком в данном случае является то, что нельзя полностью исключить размножение и/или мутацию бактерий, следовательно сохраняется остаточный риск того, что бактерии также могут неконтролируемо размножаться.
В то же время, в WO 2005/117921 раскрыта пероральная лекарственная форма пробиотических бактерий, содержащая по меньшей мере один род пробиотических микроорганизмов, при этом лекарственная форма и/или бактерии имеют покрытие, содержащее эфир целлюлозы.
Эксперименты in vitro показали, что некоторые штаммы Lactobacillus способны предотвратить связывание GAS с линиями клеток человека. Штаммы Lactobacillus конкурируют с GAS за структуры на поверхности клеток и таким образом предотвращают проникновение GAS в клетки хозяина. Адгезия Streptococcus pyogenes к клеткам хозяина является первой стадией патогенеза, и инвазия в клетки хозяина происходит за очень короткий срок, так что указанный способ не подходит для лечения GAS-инфекций. В данном случае, желательна коагрегация планктонных клеток Streptococcus pyogenes до того, как происходит связывание с клеточной поверхностью и может быть вызван иммунный ответ.
Целью настоящего изобретения является создание средства или состава для лечения и предупреждения инфекций, вызываемых Streptococcus pyogenes, не имеющих известных в технике изъянов или недостатков.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Указанная цель достигается независимыми пунктами формулы изобретения. Предпочтительные варианты следуют из зависимых пунктов формулы изобретения.
В одном аспекте, изобретение относится к микроорганизму отряда молочнокислых бактерий или его аналогу, фрагменту, производному, мутанту или их сочетанию, при этом микроорганизм или его аналог, фрагмент, производное, мутант или их сочетание может коагрегировать по меньшей мере с одним патогенным микроорганизмом, которым является Streptococcus pyogenes. Было полной неожиданностью, что может существовать микроорганизм, который связывается с Streptococcus pyogenes, таким микроорганизмом является молочнокислая бактерия. В особенно предпочтительном варианте микроорганизм или его аналог, фрагмент, производное, мутант или их сочетание принадлежит к роду Lactobacillus.
Также было полной неожиданностью, что в предпочтительном варианте способность микроорганизма или его аналога, фрагмента, производного, мутанта или их сочетаний к коагрегации с патогенным микроорганизмом существует даже после биологической, химической или физической обработки. Способность к коагрегации с патогенным микроорганизмом существует даже при рН примерно от 3 до 8. Предпочтительно, микроорганизм или его аналог, фрагмент, производное, мутант или их сочетание обладает способностью ингибировать образование биопленки патогенного микроорганизма. Также предпочтительно, микроорганизм или его аналог, фрагмент, производное, мутант или их сочетание имеет способность предотвращать связывание Streptococcus pyogenes с фибронектином. В предпочтительном варианте, микроорганизм или его аналог, фрагмент, производное, мутант или их сочетание не способен коагрегировать с комменсальными микроорганизмами кожи или слизистых оболочек.
Указанный микроорганизм предпочтительно выбран из группы, включающей Lactobacillus lactis, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus jensenii, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus amylovorus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus casei, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus pentosus, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus fructivorans, Lactobacillus hilgardii, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus viridescens, Bifidobacterium bifidum, Lactobacillus ingluviei или их аналоги, производные, фрагменты или мутанты.
Микроорганизм предпочтительно выбран из группы, включающей следующие микроорганизмы, депонированные в Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур под номерами DSM 25972, DSM 25987, DSM 25988, DSM 25989 и DSM 25973.
В другом аспекте, изобретение относится к составу, содержащему по меньшей мере один микроорганизм или его аналог, фрагмент, производное, мутант или их сочетание по настоящему изобретению. Состав предпочтительно может содержать фармацевтически или косметически приемлемые основу или наполнитель. Предпочтительно, состав может быть в твердой, жидкой или вязкой форме или в виде аэрозоля. Состав предпочтительно имеет форму паст, мягких желатиновых капсул, твердых желатиновых капсул, порошков, гранул, шариков, пастилок, шипучих таблеток, леденцов, буккальных таблеток, жевательных таблеток, подъязычных таблеток, растворов, настоек, эмульсий, соков, концентратов, сиропов, спреев, питьевых ампул, гелей, жидкостей для полоскания рта, зубных порошков, зубных паст, жевательных резинок, таблеток, покрытых оболочкой пилюль или конфет.
Состав предпочтительно может содержать пробиотики, антисептики или другие активные антибактериальные вещества и/или предпочтительно может также содержать одно или несколько веществ, выбранных из антиоксидантов, витаминов, коэнзимов, жирных кислот, аминокислот и кофакторов.
В предпочтительном варианте изобретения состав содержит фармацевтическую, ветеринарную или косметическую композицию или пищевую добавку или композицию пищевых добавок. Состав предпочтительно содержит один или несколько загустителей, один или несколько подсластителей и/или один или несколько искусственных подсластителей, при этом загуститель предпочтительно выбран из простого эфира целлюлозы, полисахаридов, из группы, включающей ксантановую камедь, желатин, мелкодисперсный диоксид кремния, крахмал, альгинаты, трагакант, агар, аравийскую камедь, пектин и поливиниловые эфиры, а подсластитель выбран из группы, включающей глюкозу, фруктозу, сахарозу и крахмальную патоку, сорбит, маннит, ксилит и мальтит, сахарин, цикламат натрия, ацесульфам калия и/или аспартам.
Предпочтительные фармацевтические продукты по настоящему изобретению включают средства для промывания носа, средства для полоскания рта и зубов, растворы для полоскания горла, спреи для носа, спреи для рта, спреи для горла, капли для носа, капли, тинктуры, соки или сиропы от кашля, боли в горле, простуды или инфекции в области рта, горла или шеи, таблетки для горла, конфеты, жевательные конфеты, драже и пастилки от симптомов в горле или боли в горле, а также аэрозоли.
Предпочтительные медицинские препараты по настоящему изобретению включают средства для промывания носа, средства для полоскания рта и зубов, растворы для полоскания горла, спреи для носа, спреи для рта, спреи для горла, капли для носа, капли, тинктуры, соки или сиропы от кашля, боли в горле, простуды или инфекции в области рта, шеи или горла, таблетки для горла, конфеты, жевательные конфеты, драже и пастилки от симптомов в горле или боли в горле, а также аэрозоли.
Предпочтительные косметические продукты по настоящему изобретению включают зубные пасты, лосьоны, взбалтываемые смеси, порошки, средства для промывания носа, средства для полоскания горла и средства для полоскания зубов, растворы для полоскания горла, спреи для носа, спреи для рта, спреи для горла, жевательную резинку, гидрогель, кремы, препарата типа "cresa", мазь, мазь или пасту на жировой основе для нанесения на поверхность кожи.
Предпочтительные пищевые продукты и пищевые добавки по настоящему изобретению включают шипучие таблетки, витамины в таблетках, минеральные вещества в таблетках, таблетки с микроэлементами, порошки для приготовления напитков, напитки, соки, молочные напитки, йогурты, минеральную воду, негазированную воду, конфеты, жевательные конфеты, жевательную резинку, сок или сироп, таблетки для горла, драже и пастилки, а также аэрозоли. Кроме того, состав может также содержать наполнители, ферменты, электролиты, регуляторы рН, загустители, грязеотталкивающие агенты, оптические отбеливатели, замедлители посерения, замедлители переноса красителей, регуляторы пены и/или красящие вещества.
Микроорганизмы в составе предпочтительно могут быть в живой или убитой форме. Кроме того, микроорганизм предпочтительно может быть в инкапсулированной, высушенной распылением или лиофилизированной форме, а также микроорганизм предпочтительно может быть в форме клеточного лизата. Кроме того, весовое содержание микроорганизма в составе предпочтительно составляет 0,001-20 вес. %, предпочтительно 0,005-10 вес. %, особенно предпочтительно 0,01-5 вес. %.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу идентификации и/или выбора молочнокислой бактерии, обладающей свойством коагрегации с Streptococcus pyogenes, который содержит по меньшей мере следующие стадии:
a. Инкубирование патогенного микроорганизма для образования биопленки,
b. Добавление исследуемой молочнокислой бактерии и инкубирование смеси для стимулирования коагрегация между патогенным микроорганизмом и исследуемой молочнокислой бактерией,
c. Отделение несвязанных молочнокислых бактерий посредством удаления супернатанта и
d. Исследование биопленки на наличие коагрегированных молочнокислых бактерий. Кроме того, способ может дополнительно содержать следующие стадии:
- Исследование ингибирования биопленки патогенных микроорганизмов, при этом исследуемые молочнокислые бактерии добавляют в течение инкубирования патогенных микроорганизмов, образующих биопленку, и/или предпочтительно
- Количественный анализ образования биопленки после удаления несвязанных клеток посредством измерения оптической плотности в сравнении с контрольным образцом, в который исследуемые молочнокислые бактерии не добавлялись.
Дополнительно, изобретение относится к применению состава для получения фармацевтического препарата, лекарственного препарата или косметического средства для лечения, профилактики и/или терапии бактериальных заболеваний кожи, слизистых оболочек и ротовой полости.
Предпочтительный состав может также применяться для местной профилактики и/или лечения бактериальных или воспалительных заболеваний кожи, слизистых оболочек и ротовой полости. Состав предпочтительно применяется для предупреждения и/или лечения бактериальных заболеваний ротовой полости и дополнительно содержит одно или несколько ароматических веществ. Кроме того, состав предпочтительно применяется для местной профилактики и/или лечения бактериальных или воспалительных заболеваний, предпочтительно бактериальных или воспалительных заболеваний ротовой полости, при этом состав используют в форме жевательной композиции, жевательной резинки, конфеты, пастилки, зубной пасты, спрея или средства для полоскания рта.
Целесообразным может быть использование в составе одного или нескольких противовоспалительных или антибактериальных веществ. Кроме того, может быть предпочтительным применение состава в сочетании с растворителями, основами, вспомогательными веществами, наполнителями, вкусовыми веществами, ароматическими веществами и/или дополнительными ингредиентами. В предпочтительном варианте состав может применяться для получения чистящего или дезинфицирующего средства для обработки поверхностей. Также предпочтительно применение состава для получения продукта, который используется в сфере лекарственных препаратов и/или профилактики. Также предпочтительно применение состава для получения средства для перорального, подъязычного или буккального приема.
В предпочтительном варианте состав может применяться для получения антибактериальной добавки для местного лечения воспалений в ротоглоточном пространстве или инфекций верхних дыхательных путей и кожи. Предпочтительный состав применяют в частности для профилактики или лечения. Может быть предпочтительным пероральное, подъязычное или буккальное применение состава.
Кроме того, изобретение относится к комплекту для гигиенической обработки, содержащему предпочтительные микроорганизмы или предпочтительный состав, а также устройства, приборы или оборудование для физической гигиены, средства для полоскания и/или пасты. Комплект может использоваться для лечения бактериальных инфекций в области рта или горла, когда инфекции вызваны в частности Streptococcus pyogenes или этот вид, по меньшей мере, участвует в инфекции.
Настоящее изобретение предпочтительно относится к новым молочнокислым бактериям, их аналогам, мутантам, производным или фрагментам, а также к содержащим их составам, используемым в частности для лечения или профилактики заболеваний у новорожденных, детей младшего дошкольного возраста, несовершеннолетних, здоровых людей, пожилых людей, людей с ослабленным иммунитетом, людей с первичными или повторными инфекциями Streptococcus pyogenes и/или людей с бактериальными инфекциями горла и миндалин (фарингит). Изобретение может также использоваться для животных.
Соответственно, предпочтительно использовать состав для получения лекарственного препарата, который может применяться для лечения или профилактики симптомов в горле, боли в горле, покраснения горла, а также гнойных и негнойных воспалений горла и миндалин, при которых желательно применение молочнокислых бактерий. Предпочтительный состав может использоваться для лечебных или профилактических целей, например как пробиотик.
Предпочтительные микроорганизмы, а именно микроорганизмы, принадлежащие к роду молочнокислых бактерий или их аналоги, производные, мутанты или фрагменты, в частности обладают способностью к коагрегации и специфическому связыванию со Streptococcus pyogenes. Было полной неожиданностью, что предпочтительные молочнокислые бактерии не вызывают коагрегации или связывания комменсальных микроорганизмов, таких как Streptococcus salivarius. Streptococcus salivarius найден на слизистых оболочках в области горла здоровых людей и способствует здоровому бактериальному равновесию, поэтому в контексте настоящего изобретения его агрегация нежелательна.
Другими словами, предпочтительные молочнокислые бактерии специфически коагрегируют с патогенными бактериями Streptococcus pyogenes. Ничего подобного не известно из уровня техники. В известном уровне техники описаны только молочнокислые бактерии, которые предотвращают инвазию Streptococcus pyogenes в клеточные линии человека и его репликацию этими клеточными линиями. Однако необходимой первой стадией в бактериальном патогенезе является адгезия, так что этот подход не может применяться без побочных эффектов. В отличие от этого, предпочтительные молочнокислые бактерии обладают способностью к специфической коагрегации с планктонными клетками Streptococcus pyogenes, примером которых являются штаммы, имеющие DSM-номера АТСС 12344 и АТСС 19615 (Немецкий банк микроорганизмов), прежде чем они смогут связаться с клетками хозяина. Таким образом, настоящее изобретение может рассматриваться как нестандартное, поскольку общим направлением в известном уровне техники является ослабление связывания Streptococcus pyogenes с эпителиальными клетками. Однако, ничего не сообщается о том, что патогенные клетки могут коагрегировать в полости рта, в результате чего связывание с эпителиальными клетками не может происходить с самого начала. Важным преимуществом этого является также то, что клеточные агрегаты проглатываются со слюной или с помощью средства для полоскания рта, и клетки Streptococcus pyogenes убиваются при прохождении через желудочно-кишечный тракт. Следовательно, это удобно для использования, например, также потому, что обычно считается неприятным и неудобным выплевывать жидкость для полоскания рта. Для предпочтительного применения что-либо подобное не является необходимым.
Специалисты знают, что здоровая кожа и/или слизистые оболочки плотно заселены микроорганизмами, такими как бактерии и грибки, которые известны как комменсальные и/или мутуалистические. Эти микроорганизмы являются естественным компонентом поверхности кожи и вместе известны в частности как кожная флора. Микроорганизмы, относящиеся к основной автохтонной флоре, являются важным условием для защиты самой кожи и организма в целом от патогенных микроорганизмов и являются частью микробиома. В связи с этим, особым преимуществом является то, что предпочтительные молочнокислые бактерии не нарушают баланс кожной флоры, а только связываются и/или коагрегируют с патогенной бактерией Streptococcus pyogenes.
Не в меньшей степени микроорганизмы по настоящему изобретению предотвращают связывание с фибронектином и таким образом предотвращают инвазию клеток. В результате того, что предпочтительные молочнокислые бактерии коагрегируют с Streptococcus pyogenes и/или обладают адгезионными свойствами в отношении этих бактерий, происходит в частности маскировка и таким образом блокирование патогенных факторов, что приводит к уменьшению бактериальной нагрузки и/или ингибированию связывания с фибронектином и/или клетками в области горла.
Хотя в частности настоящее изобретение относится к группе молочнокислых бактерий, однако идея настоящей патентной заявки является универсальной. Заявленные микроорганизмы обладают общим свойством или действием. Совокупность структурных или функциональных общих свойств имеет следствием функциональную взаимосвязь между коагрегацией с Streptococcus pyogenes, несвязыванием с комменсальными микроорганизмами кожи и/или слизистой оболочки и предотвращением связывания Streptococcus pyogenes с фибронектином. Общие свойства, следовательно, не являются произвольным сочетанием свойств, а составляют, если можно так сказать, общий характерный признак заявленных микроорганизмов, который преимущественно делает возможной и характеризует пригодность этих микроорганизмов для данной цели. Кроме того, неожиданно обнаружилось, что удивительное свойство микроорганизмов по настоящему изобретению, а именно коагрегация с Streptococcus pyogenes, не ингибируется ни в слюне, ни в присутствии Сахаров. Это ценно в частности потому, что предпочтительное место применения микроорганизмов и состава является полость рта, а из техники известно, что процесс коагрегации как правило ингибируется высокой концентрацией сахара. Однако тесты показали, что это не относится к микроорганизмам по настоящему изобретению, в частности молочнокислым бактериям, поскольку они будут продолжать коагрегировать с Streptococcus pyogenes даже при высоких концентрациях сахара (таких, которые могут быть, например, в слюне, а также в возможных лекарственных формах, таких как шипучие таблетки, витамины в таблетках, таблетки с минеральными веществами, таблетки с микроэлементами, порошки для приготовления напитков, напитки, сок, молочные напитки, йогурты, конфеты, жевательные конфеты, жевательная резинка, сок или сироп, таблетки для горла, драже и аэрозоли).
Неожиданным оказалось также то, что предпочтительный микроорганизм может также применяться на коже, где он также будет коагрегировать с Streptococcus pyogenes. Специалисты знают, что Streptococcus pyogenes также известен как патогенный организм ран, поэтому особым преимуществом является то, что способность предпочтительных микроорганизмов к коагрегации не ограничивается полостью рта, а может также применяться в области кожи.
Таким образом, настоящее изобретение также относится к микроорганизмам, в частности молочнокислым бактериям, их аналогам, мутантам, производным или фрагментам, а также к содержащему их составу, используемым в частности для лечения или профилактики болезней у новорожденных, детей младшего дошкольного возраста, несовершеннолетних, здоровых людей, пожилых людей, людей с ослабленным иммунитетом, людей с патологическими поражениями кожи (включающими в частности стафилококковый ожогоподобный кожный синдром, контагиозное импетиго, поверхностный фолликулит, импетигинизацию, абсцессы кожи, фурункулы (фурункулез), карбункулы (абсцессы), флегмоны, сухую кожу, кожный зуд, покраснение кожи, раздраженную кожу, очень жирную кожу, акне, диабетическую стопу, пролежни, нейродермит, острый лимфаденит, пилонидальную кисту (в том числе дермоидную фистулу, пилонидальный синус, копчиковый свищ, копчиковую кисту), другие локальные инфекции кожи и подкожной ткани (например, пиодермию, гнойничковый дерматит, инфекционный дерматит, гнойный дерматит)); они также могут использоваться для лечения различных форм дерматита и экземы (например, атопической экземы, себорейной экземы, опрелости или пеленочного дерматита, аллергического контактного дерматита, себорейного дерматита, эксфолиативного дерматита, токсического контактного дерматита, простого хронического лишая, пруриго, зуда и других форм дерматита), а также папулосквамозных кожных заболеваний (псориаза, парапсориаза), болезней придатков кожи (например, рубцовой алопеции, включая декальвирующий фолликулит) и других болезней кожи и подкожной ткани (например, варикозных язв), для лечения людей с изначальным дефектом кожи (например, сухой кожи), травм кожи (например, струпьев, ран, в том числе после несчастных случаев или хирургических операций) у людей или у коммерческих животных и домашних питомцев.
В контексте предпочтительных вариантов настоящего изобретения под кожей подразумевают в частности внешний орган тела человека или животного, который отделяет внутреннюю часть от внешнего мира. В предпочтительных вариантах настоящего изобретения кожа включает компоненты верхнего слоя кожи, кориум или дерму и подкожную ткань. Верхний слой кожи (эпидермис) согласно настоящему изобретению также состоит из следующих слоев: stratum corneum (роговой слой), stratum lucidum (прозрачный слой), stratum granulosum (зернистый слой), stratum spinosum (шиповатый слой) и/или stratum basale (базальный слой). В настоящем изобретении каждая модификация клеток в данной области является модификацией клеток в области кожи. Дерма или кориум, который согласно настоящему изобретению также может быть компонентом области кожи, предпочтительно состоит из волокон соединительной ткани и служит для обеспечения питания и опоры для эпидермиса. В настоящем изобретении капиллярная кровеносная система в граничащей с эпидермисом зоне также относится к области кожи, как и сальные и потовые железы. В настоящем изобретении дерма может подразделяться на stratum papillare (сосочковый слой) и stratum reticulare (сетчатый слой). Кроме того, в настоящем изобретении областью кожи может быть любая область, то есть любой участок в или на подкожной ткани (субкутис) или ткани внутри тела или любого органа или составной части органа. В настоящем изобретении кожей может быть тканевый барьер, отделяющий орган от соседних структур. Кроме того, в концепции изобретения подразумевается, что область кожи может также включать придатки кожи, такие как волосы, сальные железы, гладкие мышцы, ногти, роговидные отростки и потовые железы, в частности эккриновые и апокриновые потовые железы, а также молочные железы. Любые клеточные изменения, в частности клеточный рост, который отличается от нормального, можно лечить средствами по настоящему изобретению, предпочтительно не ограничиваясь внешними областями кожи. Вместе с тем, области кожи в настоящем изобретении могут также включать кориум, такой как на пальцах или подошвах, а также покрытую волосами кожу и связанные с ней придатки кожи.
Предпочтительный состав может быть в частности включен в мыло, лосьон, порошок, синтетическое моющее или чистящее средство, пену, помаду, эмульсию, спрей, крем, гель, шампунь, жидкое мыло или дезодорант. Также предпочтительно состав может в частности использоваться как пробиотик, который можно добавлять в моющее средство, средство для полоскания, чистящее средство или дезинфицирующее средство (например, мыло, порошки, пасты, растворы, эмульсии, лосьоны), чистящие и/или дезинфицирующие салфетки или полотенца, шампуни, средства для промывания кожи, волос и/или кожи головы или для нанесения на кожу, волосы и/или кожу головы, кремы, мази, лосьоны для очистки кожи и/или для ухода за кожей, растворы (например, капли, спреи, средства для полоскания), используемые для глаз, ушей, рта, носа или горла, а также состав может содержаться в бинтах или раневых повязках с целью препятствования появлению патогенных микроорганизмов, связывания их, удаления их в виде агрегатов и/или ингибирования или уничтожения их и таким образом уменьшения их количества.
Было полной неожиданностью, что полезность состава по настоящему изобретению может быть еще увеличена посредством включения его в вышеуказанные фармацевтические формы. Специалистам знакомы другие способы приготовления лекарственных препаратов для введения состава по настоящему изобретению в основу, такую как, например, эмульсия или другие продукты для нанесения на кожу, например жидкие формы, которые предпочтительно могут быть водными или безводными, при этом согласно изобретению могут водные формы разделяться на однофазные и многофазные системы. Кроме того, могут использоваться полужидкие безводные или водные формы, при этом также их можно разделить на однофазные и многофазные системы, в которых также возможны полужидкие формы, содержащие воду. Предпочтительно могут также использоваться твердые формы, липофильные или гидрофильные. В дополнение к вышеперечисленным формам, примеры таких форм включают, например, мази на основе жиров, пены, порошки, карандаши, гель-кремы, водно-дисперсионные гели, тонкие (невязкие) эмульсии, лосьоны, мази, спреи и кремы. Специалистам известно, что такие основы могут, во-первых, разделяться на питательные/полезные и свежие и легкие в зависимости от ощущения на коже, и во-вторых, в зависимости от вязкости их можно разделить на основы с низкой вязкостью и основы с высокой вязкостью, поскольку гидрогели или гидрокремы и/или эмульсии масло/вода или эмульсии вода/масло имеют высокую вязкость. Когда используются жидкие формы для нанесения, их можно подразделить, как показано выше, на водные и безводные системы. Что касается безводных систем, наиболее предпочтительны неполярные системы, полярные системы без эмульгаторов и полярные системы с эмульгаторами. Что касается водных систем, предпочтительны однофазные системы, такие как растворы и микроэмульсии; что касается многофазных систем, предпочтительны сложные эмульсии вода/масло или масло/вода. Что касается систем твердое вещество/жидкость, предпочтительные формы включают в себя суспензии или системы жидкость/твердое вещество/жидкость, такие как суспензионные системы/эмульсионные системы. Специалистам известны различные способы получения таких основ. Касательно эмульсий масло/вода, основные предпочтительные фармацевтические вещества включают эмульгаторы масло/вода, эмульгаторы вода/масло, жидкие гидрофильные компоненты и жидкие липофильные компоненты. Касательно эмульсий вода/масло, основные предпочтительные фармацевтические вещества включают эмульгаторы вода/масло, эмульгаторы масло/вода, жидкие и полужидкие липофильные компоненты, гелеобразующие агенты, жидкие гидрофильные компоненты и/или соли.
Что касается предпочтительных полужидких основ, для различных применений предпочтительны как водные системы, так и безводные системы. Безводные системы могут содержать полярные системы или неполярные системы без эмульгаторов, такие как липогели, олеогели или полиэтиленгликолевые гели, и/или могут содержать неполярные системы с эмульгаторами на основе абсорбции масло/вода или вода/масло. Водные системы могут предпочтительно содержать однофазные системы, такие как гидрогели или микроэмульсионные гели, или многофазные системы, такие как кремы масло/вода, кремы вода/масло или амфифильные системы. Предпочтительные полужидкие препараты являются пастообразными препаратами для нанесения на кожу в диапазоне температур между комнатной температурой и температурой кожи или для нанесения на слизистые оболочки, при этом они оказывают местное действие, перенося активные компоненты или оказывая смягчающее или защитное действие на кожу. Предпочтительные препараты включают мази в узком понимании, кремы, гели и/или пасты. В дополнение к мазям, кремам, гелям и пастам, в качестве полужидких прозрачных однофазных систем могут также использоваться олеогели. Из патента США 6,187,323 или Aiache et al, 2001 специалистам известны различные безводные составы для изготовления полужидких систем, в том числе, например, состав из олеогеля и гидрогеля, который согласно настоящему изобретению может упоминаться как двойной гель. Кроме того, в качестве основ по настоящему изобретению могут использоваться гидродисперсионные гели или различные липиды. При использовании липидов, для создания липидных фаз в дисперсионных системах могут использоваться кремнийорганические соединения, подобные органическим углеродным соединениям, при этом органические углеродные соединения можно обеспечить, например, с помощью негидролизуемых липидов, гидролизуемых липидов (глицеринов) или восковых эфиров. Преимущества таких систем включают в себя повышение упругости и эластичности кожи, а также способность повышать выход веществ и степень их проникновения в зависимости от липидного состава. Специалистам известно, какие из липидов они должны использовать для повышения или понижения, например, проникновения в пределах временного параметра.
Дополнительные предпочтительные основы включают в себя, например, гидродисперсионные гели и/или микрокапсулы, микрошарики или таблетки (макрогранулы). Указанные основы служат для повышения стабильности и обеспечивают минимальный период нанесения на кожу. Предпочтительные полужидкие однофазные системы могут быть приготовлены с помощью следующих основных фармацевтических субстанций: жидкие гидрофильные компоненты, в частности вода и (поли)спирты, гидрофильные гелеобразующие вещества, солеобразующие вещества и эмульгаторы вода/масло, эмульгаторы масло/вода, жидкие, полужидкие или твердые липофильные компоненты, а также липофильные гелеобразующие вещества и компоненты. Специалистам известно, как им нужно будет скомбинировать эти субстанции, чтобы достигнуть определенного действия.
Специалистам также известны другие фармацевтические препараты для продуктов, предназначенных для кожи. Например, согласно настоящей патентной заявке, это все фармацевтические соединения, раскрытые авторами Daniels и Knie в JDDG; 2007, 5:367-383. Специалисты знают, что разные фармацевтические препараты оказывают на кожу различное действие и будут наносить на кожу галеновые составы в различных количествах. Содержание JDDG; 2007, 5:367-383, таким образом, включено в описание идеи настоящей патентной заявки. Согласно изобретению предпочтительные продукты включают в себя, например, липофильные или гидрофильные растворы, липофильные или гидрофильные эмульсии, липофильные или гидрофильные суспензии, специальные жидкие препараты, гидрофобные или гидрофильные мази, водоэмульсионные мази, липофильные, гидрофильные или амфифильные кремы, гидрогели, гидрофобные или гидрофильные пасты и/или порошки.
Предпочтительные микроорганизмы, в частности молочнокислые бактерии, выбраны из группы, включающей Lactobacillus lactis, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus jensenii, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus amylovorus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus casei, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus pentosus, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus fructivorans, Lactobacillus hilgardii, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus viridescens, Bifidobacterium bifidum, Lactobacillus ingluviei или их аналоги, производные, фрагменты или мутанты, указанные микроорганизмы объединены на основании их функциональности, связанной с единой идеей изобретения, заключающейся в том, что они имеют общие свойства и/или действие, а именно в том, что они специфически коагрегируют с патогенной бактерией Streptococcus pyogenes, не связываются ни с какими комменсальными микроорганизмами кожи и/или слизистых оболочек, а также предотвращают связывание Streptococcus pyogenes с фибронектином и/или нейтрализуют связанные с фибронектином клетки Streptococcus pyogenes. Указанные молочнокислые бактерии включают в частности микроорганизмы или их аналоги, фрагменты, производные, мутанты или их сочетания, выбранные из группы, включающей следующие микроорганизмы, депонированные в Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур под кодовыми номерами: DSM 25972, DSM 25987, DSM 25988, DSM 25989, DSM 25973. Было полной неожиданностью, что может быть идентифицирована группа молочнокислых бактерий, имеющих одинаковые полезные свойства. Не было описано никаких бактерий, в частности никаких молочнокислых бактерий, которые сочетают все указанные свойства и в то же время являются непатогенными и не наносят какого-либо вреда естественной флоре кожи и не влияют на нее. Также было обнаружено, что применение предпочтительных молочнокислых бактерий, либо в виде состава, либо иначе, предотвращает связывание Streptococcus pyogenes с клетками хозяина и проникновение в них. Причина этого до сих пор неизвестна, но должна быть установлена с помощью дополнительных экспериментов.
Другим неожиданным преимуществом предпочтительных микроорганизмов, в частности молочнокислых бактерий, является то, что их также можно применять профилактически. Это означает, что молочнокислые бактерии и/или содержащие их составы можно применять профилактически (предпочтительно в форме пастилок или конфет) без вреда для слизистых оболочек рта и горла или для автохтонной флоры.
В предпочтительных вариантах настоящего изобретения под кожей и/или слизистыми оболочками подразумевается в частности внешний орган тела человека или животного, который отделяет внутреннюю часть от внешнего мира. В предпочтительных вариантах настоящего изобретения область кожи включает компоненты слизистых оболочек.
Переносимость молочнокислых бактерий для кожи и слизистых оболочек является одним из условий успешного лечения бактериальных воспалений, инфекций, болезней или симптомов в области горла, вызываемых микроорганизмами группы Streptococcus. Предпочтительный состав должен вводиться в частности как пробиотик в форме пастилок, конфет или драже, сока или сиропа, средства для полоскания, спрея или аэрозоля, с целью препятствовать появлению основного патогенного микроорганизма и его связыванию с клетками хозяина, связывать этот патоген, удалять его в виде агрегатов и/или ингибировать и/или уничтожать его и таким образом снижать его количество.
Состав по настоящему изобретению предпочтительно используется в виде конфеты, пастилки или драже. Во-первых, лекарственная форма в виде конфеты, пастилки или драже позволяет создать средство, которое будет иметь приятный вкус (содержащее добавку в виде Сахаров, заменителей сахара, ароматизирующие вещества) и получит широкое признание среди пациентов и потребителей. Во-вторых, слюна, которая также выделяется при сосании пастилки, смачивает слизистую оболочку, в результате чего, при симптомах боли в горле или тонзиллите ощущается некоторое облегчение. При сосании конфет, пастилок или драже происходит медленное высвобождение состава по настоящему изобретению в течение длительного периода времени, и это является предпочтительным в аспекте заявки. Кроме того, технически очень просто осуществить введение состава по настоящему изобретению в состав конфет, пастилок или драже. В этом отношении, было полной неожиданностью, что можно обеспечить микроорганизмы, которые проявляли бы активность при температуре тела, но могли бы перенести термообработку при 70-90°C и даже после обработки сохранить предпочтительные способности, в частности способность к коагрегации с Streptococcus pyogenes. Это в частности является преимуществом, поскольку при изготовлении конфет температуры часто достигают 70°C, так что то, что даже после изготовления конфет микроорганизмы все еще сохраняют способность коагрегировать, удобно для использования микроорганизмов или состава в форме конфет. Ничего подобного не известно из известного уровня техники. Таким образом, предпочтительные микроорганизмы обладают способностями, которые явно отличают их от известных микроорганизмов. Кроме того, неожиданным было то, что конфеты, содержащие состав с микроорганизмами, будут растворяться во рту более медленно, благодаря чему конфета будет обеспечивать лучшее и более продолжительное действие. Для изобретателей это было полной неожиданностью. Кроме того, эксперименты показали, что в частности при медленном высвобождении микроорганизма, в полости рта могут быть коагрегированы по существу все клетки Streptococcus pyogenes.
nd
Специалистам известно, что нужно понимать под термином "температура тела" и как ее можно определить. Температура тела в настоящем изобретении по сути относится к людям или животным. Специалистам также известен термин "конфета", а также известно, в какой стандартной литературе посмотреть ингредиенты или способ изготовления конфет. Настоящее изобретение не ограничено простыми конфетами, а по существу может относиться ко всем конфетам, которые известны специалистам. Конфеты и способ их изготовления раскрыты для специалистов в соответствующей свободно доступной технической литературе, например в Candy Ind. 27, 161 (1996); Η. Hoffmann, W. Mauch, W. Untze, Sugar and Sugar Products, 2 edition, Behrʹs: Hamburg (2002); R. Lees, B. Jackson, Sugar Confectionery and Chocolate Manufacture, Leonard Hill Books: Plymouth (1999); Federal Association of the German Confectionery Industry (BDSI), editors, Confectionerʹs Handbook, Molberg, Bonn (2001); Handbook for the Food Chemist, Food Leader, Thieme, Stuttgart (1995).
Могут быть предпочтительны конфеты различной формы, с различными вкусом, консистенцией и цветом. Обычно они сделаны в виде небольших кусочков. Конфеты могут быть сплошными или с наполнителем, круглыми, овальными, кубовидными или в форме куба. В зависимости от остаточного содержания воды, они твердые (твердая карамель) или мягкие и жевательные (мягкая карамель). В зависимости от добавок различают в частности конфеты для горла и конфеты от кашля, фруктовые, карамельные и освежающие конфеты. Действие и вкус конфет можно регулировать посредством использования экстрактов трав, эфирных масел (например, эвкалиптового) и активных ингредиентов, например ментола. В случае фруктовых конфет, ароматические вещества и кислотные компоненты могут придать характерный вкус. Для придания конфетам цвета также могут добавляться натуральные фрукты и растительные экстракты или пищевые красители. Карамельные конфеты изготавливают в частности из молочных продуктов, таких как сгущенное молоко, масло и сливки. С помощью ароматизации и добавления различных добавок можно получить различный вкус, например ореховый, миндальный, медовый, шоколадный, кокосовый и подобные. Кроме того, предпочтительны жевательные конфеты, конфеты в виде кусочков, рельефные, фигурные или в оболочке. Предпочтительные конфеты могут содержать разнообразные ингредиенты, например витамины, аминокислоты, масла, травы, жиры, различные углеводы или сахарозаменители, усилители вкуса и/или эмульгаторы. Твердые конфеты содержат в частности сахарозу и глюкозу, которые предпочтительно получены с использованием веществ, придающих аромат и вкус, красящих веществ и веществ, влияющих на свойства конфет. Из-за низкого остаточного содержания воды, составляющего 1-3%, твердая карамель имеет твердую и часто стекловидную консистенцию. Твердую карамель можно также изготавливать без сахара с использованием подсластителей и сахарозаменителей.
Мягкая карамель означает группу кондитерских изделий, которые в отличие от твердой карамели имеют жевательную консистенцию и содержание воды в которых составляет 6-10%, их получают из основных компонентов, представляющих собой сахарозу, другие виды сахара, подсластители и/или сахарные спирты, а также сироп глюкозы посредством периодической или непрерывной варки, предпочтительно, в качестве добавок они также содержат жир, молочные компоненты, загустители, эмульгаторы, вещества, придающие аромат и вкус. Они также могут иметь большое разнообразие форм и вкуса, содержать или не содержать начинку.
Кроме того, установлено, что предпочтительной является многокамерная структура конфет, при этом витамины или другие кофакторы находятся в одной камере, а предпочтительные микроорганизмы и/или состав расположены в одной или более дополнительных камерах. С помощью такой многокамерной системы можно обеспечить высвобождение микроорганизмов в оптимальный момент времени и возможно в различных дозах. Витамины или другие кофакторы могут также усиливать действие микроорганизмов. Например, неожиданно было установлено, что клюква препятствует росту биопленки, поэтому она является оптимальным дополнением к предпочтительным микроорганизмам. Тесты показали, что в присутствии компонентов или раствора клюквы коагрегация с Streptococcus pyogenes эффективнее на 50%.
Тесты показали, что предпочтительные молочнокислые бактерии, в частности клетки Lactobacillus, при контактировании с клетками Streptococcus pyogenes образуют коагрегаты. Посредством образования коагрегатов в частности предотвращается колонизация бактериями Streptococcus pyogenes клеток в области горла и проникновение в них. Клетки Streptococcus pyogenes, в частности их клеточная поверхность, маскируются молочнокислыми бактериями, в частности клетками лактобактерий, в результате чего, клетки Streptococcus pyogenes преимущественно больше не способны связываться с эпителиальными клетками кожи и слизистых оболочек. Затруднение связывания Streptococcus pyogenes с эпителиальными клетками кожи и слизистых оболочек предотвращает воспалительную реакцию. Было полной неожиданностью, что можно обеспечить микроорганизмы, которые коагрегировали бы с Streptococcus pyogenes на очень ранней стадии и таким образом с самого начала предотвращали связывание Streptococcus pyogenes с эпителиальными клетками. Это было полной неожиданностью и не известно в технике. Предпочтительные микроорганизмы могут таким образом коагрегировать с Streptococcus pyogenes уже в полости рта. Кроме того, было полной неожиданностью, что предпочтительные микроорганизмы не ингибируются ферментами или другими факторами, присутствующими в слюне, то есть не ингибируется их способность к коагрегации с Streptococcus pyogenes.
Натуральная слюна содержит, среди прочего, антибактериальные вещества, такие как лизоцим, которые служат в качестве защиты против бактерий и в частности могут непосредственно атаковать клеточные стенки грамположительных бактерий. Однако, предпочтительные микроорганизмы характеризуются тем, что несмотря на присутствие натуральной слюны и содержащиеся в ней антибактериальные вещества, они остаются способными к специфической коагрегации с Streptococcus pyogenes. Это было полной неожиданностью и является значительным преимуществом по сравнению с известным уровнем техники.
В настоящем изобретении, пробиотические микроорганизмы содержат клетки, оказывающие полезное действие на организм человека и/или животных. Предпочтительный состав используется как пробиотический состав и содержит молочнокислые бактерии, которые оказывают полезное действие на организм человека и/или животных. Полезное действие может заключаться в частности в снижении бактериальной нагрузки Streptococcus pyogenes в области шеи и горла. В частности, нежелательные микроорганизмы, такие как Streptococcus pyogenes, в автохтонной флоре могут ингибироваться непрямым взаимодействием пробиотических микроорганизмов и нежелательных микроорганизмов, и в частности непрямым взаимодействием, основанным на ингибировании метаболизма нежелательных микроорганизмов посредством экспрессии продуктов пробиотического микроорганизма. Тесты показали, что патогенный микроорганизм Streptococcus pyogenes больше не обнаруживает какого-либо роста, то есть после коагрегации с предпочтительными молочнокислыми бактериями отсутствует дальнейшее воспроизведение клеточной массы, вместо этого клетки в частности маскируются и/или уничтожаются.
Другой аспект настоящего изобретения относится к аналогам, мутантам, производным или аналогам или фрагментам молочнокислых бактерий, описанных в настоящем изобретении, которые получены в частности посредством биологической, химической или физической обработки молочнокислых бактерий и, к удивлению, проявляют полезные свойства даже после обработки. Молочнокислые бактерии предпочтительно выбраны из группы, включающей Lactobacillus lactis, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus jensenii, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus amylovorus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus casei, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus pentosus, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus fructivorans, Lactobacillus hilgardii, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus viridescens, Bifidobacterium bifidum, Lactobacillus ingluviei, и предпочтительно выбраны из группы, включающей следующие микроорганизмы, депонированные в Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур под номерами DSM 25972, DSM 25987, DSM 25988, DSM 25989, DSM 25973.
Кроме того, неожиданным было то, что молочнокислые бактерии, их фрагменты, производные, мутанты, аналоги или сочетания сохраняли полезные свойства даже после физического, химического и/или биологического киллинга. Например, предпочтительные штаммы, а именно DSM 25972, DSM 25987, DSM 25988, DSM 25989 и DSM 25973 коагрегируют с патогенами, предотвращают связывание с фибронектином, а также не демонстрируют какого-либо связывания с комменсальными микроорганизмами даже после термической обработки при 70°C в течение 20 минут или после обработки ультразвуком. Таким образом, в предпочтительном варианте состава молочнокислые бактерии, их фрагменты, производные, мутанты, аналоги или их сочетания могут быть с успехом представлены в убитой форме. Этим можно значительно продлить период времени, в течение которого состав будет стабильным и годным к применению. Кроме того, состав может использоваться в дополнительных областях применения, в которых нельзя использовать жизнеспособные микроорганизмы, для получения используются биологические, химические или физические способы киллинга, в частности термический киллинг или лиофилизация, благодаря которым аналоги или фрагменты сохраняют способность к специфическому связыванию с патогенными микроорганизмами, выбранными из группы Streptococcus pyogenes, даже после киллинга или высушивания распылением. Было полной неожиданностью, что молочнокислые бактерии могут присутствовать в составе как в жизнеспособной, так и в неживой (мертвой) форме, в которой они тем не менее сохраняют способность специфически связывать патогенный микроорганизм и/или коагрегировать с ним.
Кроме того, настоящее изобретение также относится к составам, содержащим микроорганизм по настоящему изобретению или его аналоги, фрагменты или производные, которые обладают способностью специфически связывать указанный выше патогенный микроорганизм и используются в частности как продукты питания, пищевые добавки, корм для животных или напитки. Предпочтительный состав содержит молочнокислые бактерии по настоящему изобретению или его аналоги, фрагменты, мутанты или производные, которые обладают способностью специфически связываться и/или коагрегировать по меньшей мере с одним патогенным микроорганизмом из группы Streptococcus pyogenes, благодаря чему состав используется для лечения и профилактики простудных заболеваний.
Предпочтительные микроорганизмы по настоящему изобретению относятся к роду молочнокислых бактерий, то есть грамположительных бактерий, которые продуцируют молочную кислоту посредством сбраживания глюкозы. Микроорганизмы по настоящему изобретению характеризуются тем, что, с одной стороны, они обладают способностью специфически связываться, то есть коагрегировать, по меньшей мере с одним патогенным микроорганизмом, выбранным из группы Streptococcus pyogenes. Данное связывание приводит к образованию агрегатов из микроорганизмов по настоящему изобретению и специфически связанных патогенных микроорганизмов. Благодаря образованию агрегатов последние, то есть патогенные микроорганизмы, можно механически удалить, например путем их смывания посредством целенаправленной простой процедуры, что было невозможно с помощью известных в прошлом средств.
В настоящем изобретении, а также как правило в области микробиологии и гигиены, в частности в области относящейся к человеку микробиологии и гигиены тела, термин «специфическое связывание» или «коагрегация» означает взаимное распознавание и адгезию клеток, принадлежащих к генетически разным типам клеток. В настоящем изобретении, коагрегация в частности означает адгезию, взаимодействие, связывание, специфическое связывание, сродство или взаимодействие и характеризует в частности способность предпочтительных микроорганизмов образовывать агломераты с Streptococcus pyogenes. На поверхности своих клеток бактерии экспрессируют рецепторы и адгезиновые структуры для других типов клеток, которые используются для адгезии между клетками. Данная адгезия играет значительную роль в заселении патогенными микроорганизмами, а также комменсальными микроорганизмами, поэтому вмешательство в адгезию может привести к далеко идущим последствиям. Благодаря тому, что микроорганизмы по настоящему изобретению имеют способность специфически связываться, в частности коагрегировать, по меньшей мере с одним микроорганизмом из группы Streptococcus pyogenes, они образуют агрегаты, состоящие из микроорганизмов по настоящему изобретению и патогенных микроорганизмов. Образующиеся коагрегаты можно легко удалить, например, промыванием поверхности, кожи, ткани и/или каких-нибудь других мест или резервуаров колонизации, что однозначно приводит к уменьшению числа патогенных микроорганизмов. Кроме того, посредством маскировки поверхностных структур патогенных микроорганизмов предотвращается и/или уменьшается первичная и/или вторичная адгезия к поверхностям, коже, тканям и/или другим местам или резервуарам колонизации. Если клетки связываются друг с другом и образуют агрегаты, этот процесс называется в частности агрегацией. Если в таком образовании агрегатов участвуют клетки только одного вида, этот процесс называется аутоагрегацией или самоагрегацией. Если в образовании агрегатов участвуют по меньшей мере два различных вида клеток, этот процесс известен в частности как коагрегация.
В настоящем изобретении под "специфическим связыванием по меньшей мере одного патогенного микроорганизма" в частности понимают свойство микроорганизмов по настоящему изобретению специфически связывать по меньшей мере один вид бактерий из группы Streptococcus pyogenes.
Согласно предпочтительному варианту микроорганизмов по настоящему изобретению, они также характеризуются тем, что способность специфически связываться по меньшей мере с одним патогенным микроорганизмом существует даже после биологической, химической или физической обработки, например после термической обработки как минимум при 70°C. Другими словами, предпочтительные молочнокислые бактерии предпочтительно могут быть включены в предпочтительный состав в убитой форме, так как их способность к специфическому взаимодействию или связыванию с патогенными бактериями, в частности Streptococcus pyogenes, не нарушается и следовательно может возникать связывание или взаимодействие.
Вышеуказанная термическая обработка и/или "устойчивость к термической обработке" или "термостойкость" понимаются как относящиеся к свойству бактерии сохранять способность специфически связываться по меньшей мере с одним патогенным микроорганизмом, выбранным из группы Streptococcus pyogenes, даже после некоторого периода времени, составляющего по меньшей мере 30 минут, при повышенной температуре, равной 70° или выше. Мертвые или убитые клетки молочнокислых бактерий могут быть особенно предпочтительны, поскольку эти клетки молочнокислых бактерий не могут проявлять какую-либо метаболическую активность. В настоящем изобретении, "мертвые" или "убитые" формы характеризуются в частности тем, что эти формы микроорганизмов по настоящему изобретению больше не способны к делению, например, они не могут быть окрашены красителями для живых клеток, не являются метаболически активными и в них не происходит репликация каких-либо ДНК, биосинтез белков или выделение, например, продуктов метаболизма.
В соответствии с другим предпочтительным свойством молочнокислых бактерий, в дополнение к вышеописанному свойству, а именно способности специфически связываться по меньшей мере с одним патогенным микроорганизмом, выбранным из группы Streptococcus pyogenes, микроорганизмы по настоящему изобретению могут также характеризоваться термостойкостью, они могут выдерживать обработку при высоких температурах, предпочтительно как минимум около 60°C, более предпочтительно как минимум 65°C и еще более предпочтительно как минимум 70°C, в течение по меньшей мере 20 минут, предпочтительно 25 минут и более предпочтительно по меньшей мере около 30 минут, и сохранять неизменной свою способность к коагрегации или специфическому связыванию с вышеуказанными патогенными микроорганизмами.
В предпочтительном варианте состава предпочтительны молочнокислые бактерии, которые являются жизнеспособными или убитыми, или их части и фрагменты, например продукты ферментативного или механического расщепления (например, с помощью френч-пресса и др.), или продукты метаболизма этих бактерий, поскольку они по-прежнему обладают способностью к коагрегации и/или предотвращению связывания с фибронектином. Также предпочтительно использование молочнокислых бактерий в инкапсулированной, высушенной распылением и/или лиофилизированной форме, т.е. в предпочтительном составе они могут присутствовать в инкапсулированной, высушенной распылением и/или лиофилизированной форме. Кроме того, может быть предпочтительно использовать молочнокислые бактерии в виде клеток, обработанных ферментами.
Кроме того, предпочтительно, если способность молочнокислых бактерий по настоящему изобретению специфически связываться с патогенными микроорганизмами сохраняется даже при рН между приблизительно 3 и 8. Это означает, что молочнокислые бактерии могут находиться в среде, имеющей рН от 3 до 8, и сохранять свою способность связывать Streptococcus pyogenes. Предпочтительные молочнокислые бактерии могут с успехом использоваться в широком диапазоне рН и/или они обладают предпочтительными свойствами в предпочтительном диапазоне. Таким образом, предпочтительные молочнокислые бактерии могут использоваться универсально в различных областях тела. Молочнокислые бактерии по настоящему изобретению неожиданно проявили коагрегационные свойства в частности в отношении Streptococcus pyogenes в широком диапазоне температур, приблизительно 25-42°C. Специалистам ясно, что в этом случае, а также во всех формулировках диапазона, указанных в настоящем изобретении, характеризуемых такими терминами как "около" или "приблизительно", с такими выражениями как "около", "прибл." или "приблизительно" нет необходимости указывать точный числовой диапазон, и даже если имеются небольшие отклонения вверх или вниз относительно указанного числа, они находятся в пределах объема настоящего изобретения. Связывание молочнокислых бактерий по настоящему изобретению с патогенными микроорганизмами, указанными выше, предпочтительно приводит к ингибированию роста этих патогенных микроорганизмов.
Неожиданным оказалось то, что при связывании патогенного микроорганизма и молочнокислых бактерий по настоящему изобретению образуются агрегаты, которые можно в частности подвергнуть центрифугированию в течение 10 секунд при центробежной силе предпочтительно 300 г, после чего они будут представлять собой осадок, в частности после выдерживания предпочтительно в течение 10 минут при комнатной температуре без перемешивания.
Согласно другому предпочтительному варианту, молочнокислые бактерии по настоящему изобретению не способны связываться с комменсальной орофарингеальной флорой, например с Streptococcus salivarius, где Streptococcus salivarius в частности является как правило обычным комменсалом кожной флоры. Во взаимодействии с различными микроорганизмами, представленными в или на коже, вид Streptococcus pyogenes присутствует в здоровой кожной флоре многих млекопитающих и находится в бактериальном равновесии с ними, по меньшей мере на здоровой коже. Воздействие на данную бактерию посредством, например, агрегации и таким образом воздействие на другие микроорганизмы, которые могут иметь специальное назначение для гигиены тела, не является предпочтительным в рамках настоящего изобретения.
В предпочтительном варианте, настоящее изобретение относится к молочнокислым бактериям, их аналогам, фрагментам или производным, при условии, что молочнокислые бактерии в предпочтительном варианте, включая их аналоги, фрагменты, мутанты, производные и их сочетания, предпочтительно обладают по меньшей мере одним из следующих свойств: а) термоустойчивостью или устойчивостью после биологической и/или химической и/или физической обработки или Ь) способностью ингибировать прилипание Streptococcus pyogenes к клеткам хозяина. Было полной неожиданностью, что молочнокислые бактерии по настоящему изобретению даже после биологической и/или химической и/или физической обработки сохраняли способность специфически связываться с Streptococcus pyogenes.
Другим свойством молочнокислых бактерий по настоящему изобретению является способность ингибировать связывание Streptococcus pyogenes с клетками хозяина, заключающаяся в том, что клетки Streptococcus pyogenes, которые уже присутствуют в планктонной форме, специфически коагрегируют и затем смываются в виде агрегатов. В результате указанной коагрегации, эти патогенные бактерии больше не могут колонизировать биологические поверхности и проникать в них, и следовательно они также не могут вызывать какие-либо заболевания.
Таким образом, в настоящем изобретении фраза "ингибирование связывания Streptococcus pyogenes с клетками хозяина (орофарингеальными клетками)" относится в частности к свойству молочнокислых бактерий по настоящему изобретению взаимодействовать с Streptococcus pyogenes, то есть связываться с ними или как либо иначе воздействовать на них таким образом, чтобы они больше не могли связываться с орофарингеальными клетками.
Следовательно, согласно предпочтительному варианту, микроорганизм по настоящему изобретению может обладать по меньшей мере одним из перечисленных свойств, то есть устойчивостью к биологической, химической и/или физической обработке, термоустойчивостью, способностью к специфическому связыванию, коагрегации с Streptococcus pyogenes. Предпочтительное сочетание свойств желательно включает, например, два или три свойства, то есть, например, устойчивость к биологической, химической и/или физической обработке, термоустойчивость и способность связываться с Streptococcus pyogenes или устойчивость к биологической, химической и/или физической обработке, термоустойчивость и ингибирование связывания Streptococcus pyogenes с орофарингеальными клетками.
В данном случае, как уже указывалось, выражение "микроорганизм, принадлежащий к роду молочнокислых бактерий" также включает его производные, мутанты, аналоги или фрагменты, которые сохраняют характеристики и/или признаки или свойства микроорганизмов по настоящему изобретению. Молочнокислые бактерии по настоящему изобретению предпочтительно являются бактериями вида Lactobacillus paracasei подвида paracasei, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus crispatus и Lactobacillus ingluviei.
Соответственно, "мутант или производное" вышеуказанных микроорганизмов, принадлежащих к роду молочнокислых бактерий, в частности мутант или производное лактобактерий, депонированных в Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур, как часть настоящей патентной заявки имеет те же характеристики, которые в данном случае заявлены для молочнокислых бактерий по настоящему изобретению, в частности вышеупомянутых штаммов, депонированных в Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур, это относится по меньшей мере к способности к специфическому связыванию, коагрегации по меньшей мере с одним патогенным микроорганизмом, выбранным из группы Streptococcus pyogenes. Кроме того, предпочтительно наличие по меньшей мере одного из следующих свойств: (i) устойчивость способности к специфическому связыванию к биологической, химической и/или физической обработке, в частности к тепловой обработке при более чем 70°C в течение по меньшей мере 30 минут; (ii) отсутствие связывания с Streptococcus salivarius; (iii) способность к специфическому связыванию с Streptococcus pyogenes; (iv) способность ингибировать связывание Streptococcus pyogenes с орофарингеальными клетками; (v) существование специфического связывания при рН 3-8; (vi) способность к специфическому связыванию в естественной слюне. Такие предпочтительные производные можно получить, например, посредством генной инженерии. В настоящем изобретении, термин "полученный посредством генной инженерии" включает в частности все известные специалистам в области генной инженерии способы модификации нуклеиновых кислот in vitro и in vivo, так что вызвать генетическую модификацию и модифицировать гены можно с использованием технологии рекомбинантных ДНК.
Соответственно, настоящее изобретение также в частности включает фрагменты молочнокислых бактерий по настоящему изобретению, которые сохраняют свойства молочнокислых бактерий по настоящему изобретению. В настоящем изобретении, "фрагмент" в частности представляет собой клеточный компонент микроорганизмов по настоящему изобретению и предпочтительно является частью клеточной мембраны. Из известного уровня техники специалистам хорошо известны способы получения фракций клеточных мембран.
Микроорганизмы по настоящему изобретению находятся предпочтительно в выделенной или очищенной форме, при этом термин "выделенный" означает в частности то, что молочнокислые бактерии извлечены из их культуральной среды, в том числе, например, из их естественной среды. Термин "очищенный" не означает абсолютную чистоту.
Предпочтительно, кроме микроорганизмов по настоящему изобретению в жизнеспособной форме, в объем настоящего изобретения также входят убитые формы микроорганизмов по настоящему изобретению. Подходящие способы киллинга (например, биологические, химические или физические способы киллинга) хорошо известны специалистам. В данном случае, однако, могут также использоваться микроорганизмы в лиофилизированной форме. Лиофилизированные клетки могут снова расти после культивирования в подходящей жидкой или твердой среде. Это было полной неожиданностью и относится к новой изобретательской области. В известном уровне техники известны, например, растворы для очистки поверхностей, которые содержат споры, при этом бактерии реактивируются, когда споры входят в соприкосновение с соответствующими субстратами. Ничего подобного не требуется для предпочтительных микроорганизмов и состава. Предпочтительные микроорганизмы также активны, то есть они коагрегируют с Streptococcus pyogenes и также обладают другими вышеописанными свойствами, но они больше не проявляют никакой метаболической активности, и специалисты в микробиологии называют их "мертвыми". Таким образом, микроорганизмы больше не способны к росту, делению, воспроизведению или секретированию продуктов метаболизма, поэтому значительно расширена их область применения.
Термины "убитая" или "мертвая форма", а также "производные", "аналоги" или "мутанты" в данном случае также включают лизаты, фракции или экстракты микроорганизмов по настоящему изобретению, причем эти лизаты, фракции или экстракты предпочтительно обладают свойствами молочнокислых бактерий, при этом термин "лизат", также как и термин "экстракт", относится в частности к раствору или суспензии в водной среде клеток микроорганизма по настоящему изобретению, содержащим, например, макромолекулы, такие как ДНК, РНК, белки, пептиды, липиды, углеводы и т.д., а также обломки клеток. Предпочтительно, лизаты также содержат клеточные стенки или компоненты клеточных стенок. Способы получения лизатов достаточно хорошо известны специалистам и включают, например, использование "Французского пресса" или ферментативного лизиса, шаровой мельницы со стеклянными или стальными шариками. Клетки могут быть разломаны ферментативными, физическими или химическими способами. Примеры ферментативного лизиса клеток могут включать как отдельные ферменты, так и смеси ферментов, например протеазы, протеиназу K, липазы, гликозидазы; химический лизис может быть вызван ионофорами, детергентами, например додецилсульфатом натрия, кислотами или основаниями; физические способы могут также быть реализованы с использованием высокого давления, например с помощью Французского пресса, осмотического давления, температур или чередования тепла и холода. Кроме того, химические, физические и ферментативные способы можно конечно комбинировать. "Убитые формы" или "мертвые формы" и "производные", "аналоги" или "мутанты" микроорганизмов по настоящему изобретению предпочтительно обладают такими же свойствами, как и вышеуказанные штаммы. "Убитая форма" или "мертвая форма" и "производное" или "аналог" предпочтительно больше не проявляют какой-либо метаболической активности. Аналоги микроорганизмов по настоящему изобретению представлены в форме лизата или фрагментов. Фрагмент микроорганизмов по настоящему изобретению является частью клеток, такой как клеточная мембрана, макромолекулы, такие как ДНК, РНК, белки, пептиды, липиды, углеводы и т.д., и обломки клеток. Мутанты и/или генетически измененные варианты или производные являются генетически измененными, ,, с помощью технологий рекомбинантных ДНК (клонирование, секвенирование, перенос в клетку рекомбинантных нуклеиновых кислот), а также с помощью физического мутагенеза, например посредством ультрафиолетового излучения, или с помощью химических агентов, таких как этилметансульфонат (ЭМС). Изменения положительных свойств можно выбирать. Генетически измененные мутанты включают в себя клетки микроорганизмов по настоящему изобретению и содержат рекомбинантные нуклеиновые кислоты в своих бактериальных хромосомах и/или плазмидах. Модификации вследствие точечных мутаций также могут влиять на экспрессию/транскрипцию/трансляцию, а также спонтанную мутацию, даже без какой-либо прямой генетической манипуляции. Аналоги или фрагменты могут включать термически убитые (мертвые) или лиофилизированные формы микроорганизмов по настоящему изобретению, которые сохраняют свои свойства согласно изобретению или даже улучшают их, например, посредством увеличения площади поверхности. После лиофилизации (сублимационной сушки) при определенных условиях клетки все еще жизнеспособны. Эти клетки можно убить посредством специального процесса хранения при различных температурах. Мертвые клетки могут иметь, например, неповрежденные или разорванные клеточные мембраны, но они не проявляют никакой метаболической активности. Способы получения убитых клеток могут включать, например, обработку стеклянными шариками, при этом разрушение клетки происходит в результате воздействия сдвигающего усилия между клетками и стеклянными шариками. К уничтожению клеток и образованию фрагментов микроорганизмов по настоящему изобретению также приводят другие физические способы, такие как Французский пресс, гомогенизация при высоком давлении, шаровая мельница или процесс замораживания-оттаивания и автоклавирование, а также УФ-излучение, автолитические способы или специальный процесс хранения при различных температурах.
Имеют ли микроорганизмы, принадлежащие к роду молочнокислых бактерий, свойства по настоящему изобретению, специалисты могут проверить и подтвердить, например, на основе тестов, описанных ниже. В настоящем изобретении, термин "клетки Lactobacillus" может также использоваться в отношении молочнокислых бактерий или лактобактерий и микроорганизмов, которым для молочнокислого брожения требуются углеводы, в частности глюкоза и лактоза, и которые обычно используют путь биосинтеза Эмбдена-Мейергофа. Клетки Lactobacillus таксономически относятся к семейству Lactobacteriaceae. Они являются грамположительными, неспорообразующими и в целом неподвижными. Клетки Lactobacillus являются анаэробными, но аэротолерантньгми, хотя они не содержат каких-либо геминов (цитохром, каталаза) (Schleifer et al., System. Appl. Microb. 18, 461-467 (1995) или Ludwiq et al., System. Appl. Microb. 15, 487-501 (1992). Клетки и/или виды Lactobacillus можно определить на основе пути утилизации углеводов, в частности с использованием API-теста (от компании Biomerieux). Согласно изобретению, они в частности включают виды, которые могут использоваться для гомоферментативного молочнокислого брожения или гетероферментативного молочнокислого брожения. Такие клетки Lactobacillus также предпочтительно выбраны из группы, включающей Lactobacillus lactis, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus jensenii, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus amylovorus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus casei, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus pentosus, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus curvatus and Lactobacillus plantarum (все гомоферментативные), также Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus fructivorans, Lactobacillus hilgardii, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus viridescens as well as Bifidobacterium bifidum, Lactobacillus ingluviei (все гетероферментативные). Клетки Lactobacillus, которые могут использоваться в качестве примера и были депонированы заявителем, включают: Lactobacillus paracasei подвид paracasei (DSM 25972), Lactobacillus crispatus (DSM 25987, DSM 25988), Lactobacillus plantarum (DSM 25989), Lactobacillus ingluviei (DSM 25973), все они согласно изобретению являются предпочтительными.
В предпочтительном варианте настоящего изобретения, микроорганизм по настоящему изобретению выбран из Lactobacillus paracasei подвид paracasei, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus ingluviei, каждый из которых депонирован в Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур в Брауншвейге под номерами DSM 25972, DSM 25987, DSM 25988, DSM 25989, DSM 25973. Указанное депонирование осуществлено в соответствии с Будапештским договором о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры.
Как указано выше, настоящее изобретение также относится к составам, содержащим микроорганизмы, предпочтительно жизнеспособные, или их аналоги, мутанты, производные или фрагменты, а также предпочтительно по меньшей мере одну основу или наполнитель, являющиеся по меньшей мере одним из следующих: косметически приемлемая основа или наполнитель, фармацевтически приемлемая основа или наполнитель или дерматологически приемлемая основа или наполнитель.
В настоящем изобретении, термин "состав" означает в частности только состав, содержащий по меньшей мере один микроорганизм по настоящему изобретению или его фрагмент, производное, аналог или мутант, а также другие дополнительные ингредиенты, такие как основы или наполнители, или необязательно другие активные ингредиенты и соли. Косметически, фармацевтически или дерматологически приемлемые добавки, основы или наполнители означают любые вещества для косметического или фармацевтического использования в основном в области косметики, фармацевтики или стоматологии с целью введения или эффективного применения активного ингредиента или состава, т.е. в данном случае по меньшей мере одного микроорганизма, его аналога или его производного или мутанта или фрагмента.
Термин «слизистая» или «слизистая оболочка» в рамках настоящего изобретения и его формулы понимается как относящийся к внутреннему слою, выстилающему полые органы, в котором поддерживается влажность за счет секреции желез. В частности, это относится к слизистой оболочке полости рта и носа, соединительной ткани, слизистым оболочкам желудочно-кишечного тракта и слизистым оболочкам зон химического воздействия.
«Воспалительное заболевание» понимается в контексте настоящего описания и формулы изобретения как относящееся к заболеваниям, включающим острые, подострые, хронически ослабляющие или хронически стойкие болезненные состояния, поражающие кожу, слизистые оболочки или ротовую полость. Воспалительные заболевания клинически характеризуются покраснением, опуханием, болью, зудом, экссудацией, вазикуляцией, гиперкератозом, повышенным образованием чешуек, эрозиями, язвами и другими дефектами, а также струпьями, везикулами и другими образованиями. Гистологически воспалительные клетки можно обнаружить в кориуме и/или в эпидермисе. «Воспалительные заболевания» или «воспалительные состояния» в рамках настоящего изобретения и формулы изобретения понимаются как относящиеся, в частности, к заболеваниям и состояниям, таким как, например, (включая, но не ограничиваясь) экзема, атопический дерматит, аллергическая или токсическая контактная экзема, псориаз и другие гиперкератозные заболевания, острые и хронические раны, кожные заболевания, вызывающие зуд, а также редкие воспаления, такие как красный плоский лишай, гранулематозные и парапсориазные изменения кожи, а также большая группа аутоиммунных заболеваний с кожными проявлениями. Термин «профилактика» или «предупреждение» понимается в настоящем описании и формуле изобретения как включающий все типы предупреждения, а именно, профилактическое лечение здоровых пользователей и/или пациентов, а также профилактическое лечение тех пользователей и/или пациентов, которые склонны к заболеваниям кожи, слизистых оболочек или ротовой полости бактериального происхождения или пользователей и/или пациентов (лиц с так называемой «предрасположенностью»), которые склонны к воспалительным заболеваниям. Кроме того, предупреждение также понимается как включающее профилактическое лечение пользователей и/или пациентов, которые уже перенесли заболевания бактериального происхождения кожи, слизистых оболочек или ротовой полости или воспалительное заболевание и преодолели заболевание, например, с помощью успешного лечения, такого как лечение, представленное в настоящем описании и формуле изобретения (так называемое «предупреждение рецидива»). Кроме того, предупреждение в значении настоящего описания и формулы изобретения также понимается как включающее косметическое лечение, а также уход и реконструктивное лечение кожи, склонной к развитию воспаления.
Предпочтительно, чтобы состав содержал не только один из микроорганизмов согласно изобретению или его аналог, мутант, производное, фрагмент, но также сочетание микроорганизмов согласно изобретению или сочетание аналогов, мутантов или фрагментов или сочетание микроорганизмов согласно изобретению и их фрагменты, производные, мутанты или аналоги.
Состав может быть предпочтительно в твердой или жидкой или вязкой форме или виде аэрозоли и может использоваться, например, в форме порошков, таблеток, растворов, гранул, суспензий, эмульсий, капсул, паст, гелей, спреев и т.д., т.е. в любой форме, пригодной к введению. Также предпочтительно, если состав включает дополнительные пробиотики, антисептики или другие антибактериальные вещества и предпочтительно, но необязательно, сахариды и консерванты, вкусовые добавки, подсластители, витамины, минералы, ароматизаторы и т.д. В ЕР 2133414 А1 перечислен ряд ингредиентов, которые можно использовать для предпочтительных составов. Ссылка сделана непосредственно на настоящую публикацию. Кроме того, наполнители, вещества, регулирующие расход продукта, реологические модификаторы, смягчители, стабилизаторы или реактивно перекрестно связанные мономеры, например, метакрилаты могут присутствовать в предпочтительном составе. В этом отношении желательно, чтобы состав содержал вещества, такие как ЭДТК, магний, кальций, ДСН или их соли или подобные соли. Оказалось полной неожиданностью, что эти вещества не только ингибируют образование биопленки бактерией Streptococcus pyogenes, но также стимулируют способность к коагрегации предпочтительных микроорганизмов. Состав согласно изобретению используется, в частности, для применения в физической гигиене, в лечении и профилактике и содержит не менее одного микроорганизма согласно изобретению или его производные, мутанты, фрагменты или аналоги.
В частности, предпочтительно использовать состав в качестве пробиотика, т.е. в качестве препарата, содержащего живые микроорганизмы, который принимается перорально и оказывает лечебный эффект на человека, принимающего данный пробиотик и/или человека, которому он вводится. Такие препараты могут являться продуктами питания, пищевыми добавками, кормом для животных, кормовыми добавками или лекарственными препаратами. Согласно изобретению состав может использоваться для всех сельскохозяйственных животных и домашних питомцев, т.е., кроме людей также для собак, кошек, лошадей, верблюдов, соколов и т.д. Микроорганизмы и/или состав, их содержащий, может использоваться для этих целей разными способами. Например, желательно будет включить данный состав в жевательные кости, жевательные палочки, лакомства для животных, корм для животных, гранулы, и продукты для разгрызания и жевания или игрушки для животных и т.д. В частности, желательно, чтобы микроорганизмы или состав использовался для лечения и/или профилактики бактериальных инфекций в области горла, вызываемых, в частности, Streptococcus pyogenes, у животных и человека.
Дозировка и введение в чистом виде согласно изобретению будет зависеть от конкретного использования и конкретного пациента, в частности, от возраста, веса, общего состояния и т.д. и находится в сфере ведения и оценки специалистов, которые решают вопросы использования данного состава.
Состав согласно изобретению может быть косметическим средством, лекарственным препаратом или фармацевтическим препаратом. Состав предпочтительно содержит молочнокислые бактерии в количестве от 0,001% масс, до 20% масс, предпочтительно от 0,005% масс, до 10% масс, особенно предпочтительно от 0,01% масс, до 5% масс. Оказалось совершенно неожиданным, что использование количества от 0,001% масс, до 20% масс, в частности, привело к разложению, сделав препарат годным к использованию в течение более продолжительного периода времени, т.е. к сохранению стабильности. Если молочнокислые бактерии используются в количестве от 0,005% масс, до 10% масс, это, как ни удивительно, приводит к положительному влиянию на реологические свойства состава и приводит к тому, что состав имеет более низкую вязкость и, таким образом, лучше распределяется по коже или легче вводится в ротовую полость. Использование молочнокислых бактерий в количестве от 0,01% масс, до 5% масс, как ни удивительно, приводит к лучшему связыванию компонентов состава друг с другом и возможности производства однородного состава с сокращением рабочего времени, что, в свою очередь, приводит к сокращению производственных затрат. Очевидно, однако, что другие количества, отличные от указанных здесь, также могут использоваться для специфических областей применения. Но что особенно удивительно, молочнокислые бактерии согласно изобретению обладают чрезвычайно высокой коагрегационной активностью в слюне человека. Образующиеся в результате агрегаты с Streptococcus pyogenes обладают очень хорошей стабильностью и поэтому легко и эффективно удаляются полосканием или проглатыванием.
2
2
Коагрегационная эффективность может, на удивление, значительно увеличиваться в присутствии сопутствующих факторов (ЭДТК, MgCl, CaCl, ДСН). Оказалось совершенно неожиданным, что ЭДТК, в частности, оказывает сильное положительное влияние на коагрегацию молочнокислых бактерий с Streptococcus pyogenes согласно изобретению. Как уже было отмечено выше, согласно предпочтительному варианту выполнения состав и/или микроорганизм может использоваться в сфере профилактики и лечения инфекций горла и миндалевидных желез для агрегации вышеупомянутых патогенных микроорганизмов, т.е. связывать их. Эту коагрегацию можно легко устранить проглатыванием или полосканием и/или в случае суспензии, ее можно, в частности, смыть, благодаря чему происходит сокращение количества патогенов. Молочнокислые бактерии и/или состав их содержащий может использоваться для этой цели различными способами. Например, их можно использовать в спреях, растворах для полоскания или жидкостях для полоскания рта, в качестве леденцов или таблеток для горла, пастилок, покрытых оболочкой пилюль, аэрозолей, зубных паст, соков, сиропов или пищевых добавок и/или в качестве биодобавок. Поэтому настоящее изобретение также относится ко всем продуктам, используемым в сфере физической гигиены, лекарственным препаратам, профилактике и продуктам, содержащим молочнокислые бактерии, согласно изобретению. Варианты выполнения, описанные выше, учитываются соответственно для областей лечения, терапии и профилактики у млекопитающих. Поэтому микроорганизмы и/или составы их содержащие могут быть использованы различными способами.
Предпочтительно, в частности, чтобы состав согласно изобретению и/или микроорганизмы согласно изобретению использовались для производства лекарственного препарата, для лечения или профилактики симптомов ангины, Pharyngitis atrophicans et sicca, Pharyngitis sicca, Angina lateralis, тонзиллитов, вызванных Streptococcus pyogenes. Микроорганизмы и составы согласно изобретению их содержащие имеют в своем составе вещества, с помощью которых данные заболевания можно вылечить и/или успешно предупредить. Микроорганизмы и/или составы их содержащие могут использоваться как у человека, так и в ветеринарной медицине, в частности, у собак, кошек, лошадей и соколов, как уже отмечалось. Состав и/или микроорганизмы согласно изобретению - или их фрагменты, производные или мутанты - могут быть использованы, в частности, в пищевых добавках, предметах личной гигиены и/или в качестве предметов личной гигиены, содержащих микроорганизмы, или в качестве лекарственного препарата.
Настоящее изобретение также относится к способу идентификации и/или выбора микроорганизма рода Lactobacillus sp., имеющего свойства в соответствии с изобретением, такому как способ, включающий по меньшей мере следующие этапы: а) выдерживание в термостате партии патогенных микроорганизмов, выбранных из Streptococcus pyogenes, для связывания с фибронектином, Ь) добавление микроорганизма рода Lactobacillus, подлежащего исследованию, и выдерживание в термостате партии для образования специального соединения между патогенным микроорганизмом и микроорганизмом данного рода бактерий, подлежащим исследованию, с) отделение несвязанных микроорганизмов рода Lactobacillus путем удаления супернатанта и d) определение связывания фибронектина в отношении связанных и сгруппированных в агрегаты микроорганизмов рода Lactobacillus.
В предпочитаемом варианте выполнения способ согласно изобретению также включает этап исследования предупреждения связывания фибронектина бактерией Streptococcus pyogenes. Исследуемые микроорганизмы рода Lactobacillus были добавлены сюда во время выдержки в термостате фибронектина связывающих флуоресцентно-меченых патогенных микроорганизмов. После удаления несвязанных клеток выполняется специальный количественный анализ связывания с фибронектином предпочтительно путем измерения флуоресценции в сравнении с контрольными партиями путем добавления микроорганизмов для анализа.
Очевидно, что свойства, упомянутые выше, и свойства, которые будут описаны ниже, могут использоваться не только в определенной заданной комбинации, но также и отдельно в пределах настоящего изобретения.
ПЕРЕЧЕНЬ ЧЕРТЕЖЕЙ
Дополнительные преимущества понятны из следующих чертежей и соответствующих экспериментов, а также примеров осуществления изобретения. Хотя в настоящем описании представлены только несколько экспериментов, эксперименты проводились с использованием всех предпочтительных молочнокислых бактерий. Специалисты могут воспроизвести изобретение на основании примеров.
Фиг. 1 - специфическое связывание и/или агрегация микроорганизмов по одному из иллюстративных вариантов настоящего изобретения (DSM 25972, DSM 25989, DSM 25973) с биопленкой, образованной Streptococcus pyogenes (анализ связывания) после трехкратной промывки несвязанных клеток и, для сравнения, дополнительных штаммов Lactobacillus, не входящих в состав настоящего изобретения и не способных связываться с Streptococcus pyogenes (штамм 1 Lactobacillus и штамм 2 Lactobacillus); количественный анализ связывания и/или агрегации помеченных КФДА (карбоксифлуоресцеин диацетатом) штаммов Lactobacillus по настоящему изобретению с биопленкой S. pyogenes в 96-луночном планшете для микротитрования на основе измерения флуоресценции (возбуждение 485/эмиссия 535 нм). Таким образом, специалисты узнают, что предпочтительные микроорганизмы могут применяться при бактериальных инфекциях, которые встречаются чаще всего в орофарингеальной области.
Фиг. 2 показывает макроскопические контрольные партии (фотография 24-луночного титрационного микропланшета) специфического связывания иллюстративного варианта использования микроорганизма согласно изобретению (DSM 25972, DSM 25987, DSM 25988, DSM 25989 и DSM 25973) с Streptococcus pyogenes в партии коагрегации в 24-луночной линейке, а также штамм Lactobacillus согласно изобретению и целевой штамм Streptococcus pyogenes в системе фотодокументации. Белый осаждающий реактив образован коагрегацией (и связанным с ним осаждением). Агломерат, в дальнейшем приводящий к образованию Streptococcus pyogenes, в частности, не может связываться с эпителиальными клетками горла. Исследования на пациентах показали, что бактериальные инфекции можно предупредить или снизить посредством предпочтительных микроорганизмов.
Фиг. 3 показывает микроскопическое изображение специфического связывания для иллюстративного варианта использования микроорганизма согласно изобретению (DSM 25987 и DSM 25973) с клетками Streptococcus pyogenes после коагрегации, а также штамм Lactobacillus согласно изобретению и Streptococcus pyogenes. Микроскопическое изображение (фазовый контраст, тысячекратное увеличение); коагрегаты можно увидеть как большие агломераты клеток.
Фиг. 4 показывает макроскопические контрольные партии (фотография 24-луночного титрационного микропланшета) специфического связывания иллюстративного варианта использования микроорганизма согласно изобретению (DSM 25972, DSM 25987, DSM 25988, DSM 25989 и DSM 25973) с клетками Streptococcus pyogenes (коагрегация) в слюне человека, а также штамм Lactobacillus согласно изобретению и Streptococcus pyogenes в системе фотодокументации. Белый осаждающий реактив образован коагрегацией (и связанным с ним осаждением). Удивительно, что предпочтительные микроорганизмы уже связались с Streptococcus pyogenes в слюне, в частности, образуя там коагрегаты и, таким образом, предупреждая связывание Streptococcus pyogenes с эпителиальными клетками. Также удивительно, что предпочтительные микроорганизмы не потеряли свои свойства из-за ферментов, содержащихся в слюне. Поэтому предпочтительные микроорганизмы могут успешно использоваться для перорального введения, в частности, в качестве леденцов.
Фиг. 5 показывает влияние иллюстративного варианта использования микроорганизмов согласно изобретению (DSM 2 5972, DSM 25987, DSM 25988, DSM 25989 и DSM 25973) на предупреждение связывания с фибронектином штамма Streptococcus pyogenes Американская коллекция типовых культур 19615 через 2 часа выдерживания в термостате при температуре 37°C с суспензией Lactobacillus (живой), промытой ФСБ, и суспензией Lactobacillus (мертвой), убитой путем тепловой обработки. Специфический количественный анализ является связыванием карбокси-флуоресцеин диацетат-маркированной бактерии Streptococcus pyogenes в 96-луночном титрационном микропланшете, покрытом фибронектином. Рисунок показывает связывание Streptococcus pyogenes в процентах, где 100% представляет связывание S. pyogenes (Американская коллекция типовых культур 19615) с фибронектиновым покрытием титрационного микропланшета без добавления суспензии Lactobacillus. Обнаружено, что предпочтительные микроорганизмы предупреждают связывание Streptococcus pyogenes с эпителиальными клетками в горле и, таким образом, также предупреждают бактериальную инфекцию.
Фиг. 6 показывает влияние иллюстративного варианта использования микроорганизмов согласно изобретению (DSM 25972, DSM 25987, DSM 25988, DSM 25989 и DSM 25973) на связывание Streptococcus pyogenes (Американская коллекция типовых культур 12344) с фибронектином через 2 часа выдерживания в термостате при температуре 37°C (с суспензией Lactobacillus (живой), промытой ФСБ, и суспензией Lactobacillus (мертвой), в которой Lactobacillus убита путем тепловой обработки). Данный рисунок показьшает специфический количественный анализ связывания карбокси-флуоресцеин диацетат-маркированной бактерии Streptococcus pyogenes в 96-луночном титрационном микропланшете, покрытом фибронектином. Рисунок показьшает связывание Streptococcus pyogenes в процентах, где 100% представляет связывание S. pyogenes с фибронектиновым покрытием титрационного микропланшета без добавления суспензии Lactobacillus.
Фиг. 7 показывает микроскопическое изображение (фотография 24-луночного титрационного микропланшета) коагрегации одного иллюстративного варианта использования микроорганизма согласно изобретению (DSM 25972, DSM 25987, DSM 25988, DSM 25989 и DSM 25973) с клетками Streptococcus pyogenes в фосфатно-солевом буфере, а также штамм Lactobacillus согласно изобретению и Streptococcus salivarius в системе фото документации. Белый осаждающий реактив образован коагрегацией (и связанным с ним осаждением).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРИМЕРОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
Пример 1
Для идентификации и выбора микроорганизмов согласно изобретению с помощью четырехэтапного метода проверки были протестированы различные штаммы из банка штаммов Lactobacillus. В процессе тестирования они были сначала проверены в отношении способности связываться с целевым патогенным микроорганизмом Streptococcus pyogenes (далее также именуемым «целевой микроорганизм») (анализ связывания), а затем штаммы, идентифицированные на первом этапе, были протестированы в анализе коагрегации в линейке титрационного микропланшета, где коагрегация с соответствующим целевым микроорганизмом была измерена качественно с использованием бинокулярного стереомикроскопа. В значении настоящего исследования термин «ко-агрегация» используется как синонимичный термину «коагрегация». Более того, были исследованы интенсивность коагрегации и стабильность связывания с целевым микроорганизмом, а также способность предупредить связывание с фибронектином, что, в конечном счете, привело к идентификации иллюстративных микроорганизмов согласно изобретению (Lactobacillus).
Анализ связывания
Анализ связывания был введен, чтобы разрешить количественный анализ связывания выбранных штаммов Lactobacillus, позволяющий провести количественное обнаружение связывания штаммов Lactobacillus с патогенными микроорганизмами в 96-луночном планшете. Связывающая активность клеток Lactobacillus с целевыми микроорганизмами согласовывается с коагрегативной активностью и/или коагрегативной способностью. Это было проверено экспериментальным путем. В этом отношении Рис. 2 показывает пример коагрегации Lactobacillus DSM 25972, DSM 25987, DSM 25988, DSM 25989 и DSM 25973 и Streptococcus pyogenes Американской коллекции типовых культур 19615.
Метод измерения основан на специфическом связывании штаммов согласно изобретению с целевым штаммом, связанном в биопленке. Определенные количества штаммов согласно изобретению были маркированы флуоресцентным красителем (раствор карбокси-флуоресцеин диацетат, инвитроген) и смешаны с определенным количеством целевых микроорганизмов, связанных с биопленкой, для анализа. Персистенция связанных штаммов согласно изобретению с целевым штаммом измеряется с помощью флуоресцентного фотометра после промывания несколько раз.
2
2
Чтобы выполнить эти анализы целевые микроорганизмы Streptococcus pyogenes были выращены согласно стандартному протоколу. Штамм был выращен в бульоне Тодда-Гевитта в аэробных условиях при температуре 37°C в атмосфере 5% CO. Штаммы Lactobacillus были выращены анаэробно при температуре 37°C в среде Мозера-Рогоза-Шарпа (см. de Man et al. (1960) «Среда для выращивания Lactobacilli», J. Appl. Bact. 23 (130-135)). Для исследования целевого микроорганизма клетки были собраны через 5-6 часов выращивания в средней экспоненциальной фазе роста, затем трижды промыты ФСБР (фосфатно-солевой буферный раствор, рН 7,4) и растворены в ФСБР. Для этого 100 мкл суспензии было помещено в каждую лунку 96-луночного титрационного микропланшета. В течение 16 часов выращивания при температуре 37°C в 5% CO целевыми микроорганизмами была сформирована биопленка. После выращивания несвязанные клетки были удалены путем трехкратного промывания фосфатно-солевым буферным раствором (ФСБР, рН 7,4). Для обработки штамма Lactobacillus клетки были собраны после выращивания в течение 24 часов, затем трижды промыты ФСБР, помещены в ФСБР и маркированы флуоресцентным красителем путем добавления раствора карбокси-флуоресцеин диацетата (Инвитроген). Для выполнения анализа связывания в каждую лунку к целевому штамму, связанному в биопленке, было добавлено 100 мкл маркированной флуоресцентным красителем суспензии Lactobacillus. Одновременно был проведен анализ контрольных партий без добавления суспензии Lactobacillus. После выращивания в термостате в течение 1 часа при температуре 37°C несвязанные клетки были отделены и трижды промыты ФСБР. После каждого этапа промывки флуоресценция измерялась в планшетном фотометре для флуоресцентных исследований (эмиссия 485 нм/возбуждение 535 нм). Увеличение флуоресценции (эмиссия 485 нм/возбуждение 535 нм) в партии со штаммом Lactobacillus в сравнении с контрольными партиями без клеток Lactobacillus согласовывалось с количеством связанных с биопленкой клеток Lactobacillus. Измеренная флуоресценция после связывания клеток Lactobacillus соответствовала интенсивности связывания. Чем выше этот показатель, тем лучше связывание помеченных клеток Lactobacillus с целевым штаммом, связанным в биопленке, и тем выше связывающая активность исследуемых клеток Lactobacillus.
Эти эксперименты показали, что для целевого микроорганизма Streptococcus pyogenes в анализе связывания после удаления несвязанных клеток штаммы Lactobacillus согласно изобретению приводили к увеличению флуоресценции фактором до 17 единиц вследствие связывания маркированных клеток Lactobacillus с целевыми штаммами, связанными в биопленке после трех промываний. Рис. 1 показывает результаты анализа связывания для Lactobacillus DSM 25972, DSM 25989 и DSM 25973 с Streptococcus pyogenes в качестве примера для микроорганизмов согласно изобретению. Для целей сравнения Рис. 1 также показывает данные по штаммам Lactobacillus не в соответствие с настоящим изобретением (род Lactobacillus 1 и 2), которые не способны к специфическому связыванию с целевым микроорганизмом. Обнаружено, что предпочтительные микроорганизмы способны предупредить бактериальные инфекции у людей и животных и/или используются для лечения такого инфицирования, поскольку они образуют коагрегаты специфично с Streptococcus pyogenes. Таким образом, связывание Streptococcus pyogenes с эпителиальными клетками, с одной стороны, можно предупредить, тогда как, с другой стороны, можно предупредить образование биопленки бактерией Streptococcus pyogenes или растворить или разрушить любую уже образовавшуюся биопленку.
Пример 2
Анализ коагрегации
Следующая проверка в объеме 1,0 мл и/или в 24-луночном планшете использовалась для иллюстрирования коагрегационной активности выбранных штаммов Lactobacillus.
2
600
600
В этом методе коагрегационное поведение лактобациллы и целевого штамма учитывалось отдельно и окончательно учитывалась коагрегация Lactobacillus и целевого штамма в смесь. Этот анализ выполнялся макроскопически с использованием фотографий 24-луночного планшета, а также микроскопически. Для выполнения этих анализов был выращен целевой микроорганизм Streptococcus pyogenes согласно стандартному протоколу. Штамм был выращен в бульоне Тодда-Гевитта в аэробных условиях при температуре 37°C в атмосфере 5% CO. Штаммы Lactobacillus были выращены анаэробно при температуре 37°C в среде Мозера-Рогоза-Шарпа (см. de Man et al. (1960) «Среда для выращивания Lactobacilli», J. Appl. Bact. 23 (130-135)). Для исследования целевого микроорганизма клетки были собраны в средней экспоненциальной фазе роста через 5-6 часов выращивания, дважды промыты ФСБР (фосфатно-солевой буферный раствор, рН 7,4) и доведены до OD (оптическая плотность, измеренная при 600 нм) =4. Для исследования штаммов Lactobacillus они были собраны после выращивания в питательной среде в течение 16 часов, промыты дважды ФСБР, затем помещены в аликвоту ФСБР и доведены до OD=4 соответственно. Для выполнения анализа коагрегации 500 мкл частей суспензии целевого микроорганизма на лунку были соединены с 500 мкл суспензии Lactobacillus в 24-луночном планшете. Одновременно был проведен анализ контрольных партий с 500 мкл целевого микроорганизма плюс 500 мкл ФСБР (контрольная партия 1). После выращивания в термостате в течение 10 минут при температуре 25°C на настольном смесителе партии были исследованы макроскопически с использованием системы фотодокументации в дополнение к микроскопическому исследованию. Для анализа коагрегационной способности убитых клеток Lactobacillus они сначала были убиты тепловой обработкой при температуре 70°C в течение 30 минут на водяной бане, а затем использованы в анализе коагрегации.
Эти эксперименты показали, что выбранный штамм Lactobacillus коагрегирует с целевым микроорганизмом Streptococcus pyogenes, что делает возможным наблюдение за образованием группировок (агрегатов) в смеси, которые визуально макроскопически различимы неравномерно расположенными сгустками и/или зернистыми участками в лунке. В лунках, содержащих целевой штамм и/или штаммы Lactobacillus отдельно согласно изобретению, не происходило образования группировок или агрегатов. Клеточная суспензия в лунке оставалась однородной. Рис. 2 показьшает макроскопические результаты в партии коагрегации для выбранных штаммов Lactobacillus, живых и убитых для целевого микроорганизма Streptococcus pyogenes. В микроскопическом наблюдении отмечается отчетливо выраженное сходство для целевого микроорганизма во всех штаммах Lactobacillus согласно изобретению, что приводит к различным размерам агрегатов в микроскопическом наблюдении коагрегации. На Рис. 3 показаны микроскопические результаты в партии коагрегации для штаммов Lactobacillus DSM 25987 и DSM 25973 согласно изобретению, например, для целевого микроорганизма Streptococcus pyogenes. Предпочтительные микроорганизмы способны предупредить или побороть бактериальные инфекции, вызванные Streptococcus pyogenes, и/или заболевания с участием Streptococcus pyogenes, в частности у человека и животных.
Пример 3
Коагрегация в слюне человека
Для исследования коагрегационной способности штаммов Lactobacillus согласно изобретению в слюне человека, они были собраны после 16 часов выращивания в среде, как описано в Примере 2, дважды промыты в ФСБР и помещены в слюну человека. Слюна предварительно была собрана у нескольких человек, смешана и отделена от частиц путем центрифугирования при 8000 г в течение 20 минут. Целевой микроорганизм был обработан, как описано в Примере 2, и подобным образом помещен в слюну человека после двукратного промывания в ФСБР. Для выполнения анализа коагрегации 500 мкл частей суспензии целевого микроорганизма были соединены с 500 мкл суспензии Lactobacillus в слюне на лунку в 24-луночном планшете. Одновременно был проведен анализ контрольных партий с 500 мкл целевого микроорганизма плюс 500 мкл слюны или 500 мкл соответствующей суспензии Lactobacillus плюс 500 мкл слюны (контрольная партия 1). После выращивания в термостате в течение 10 минут при температуре 25°C на настольном смесителе партии были исследованы макроскопически с использованием системы фотодокументации, и, кроме того, были исследованы микроскопически.
Анализы показали, что штаммы Lactobacillus согласно изобретению в натуральной слюне способны к специфической коагрегации с целевым микроорганизмом Streptococcus pyogenes. Это обеспечивает наилучшие предпосылки для применения штаммов Lactobacillus согласно изобретению в ротоглоточном пространстве. Предпочтительные микроорганизмы для этой цели можно вводить перорально в виде, например, леденцов, что ведет к облегчению состояния и даже полному излечению от бактериальных инфекций. Рис. 4 показывает макроскопические результаты коагрегации в натуральной слюне человека для штаммов Lactobacillus согласно изобретению с целевым микроорганизмом Streptococcus pyogenes.
Пример 4
Предупреждение связывания с фибронектином
600nm
Для исследования влияния штаммов Lactobacillus согласно изобретению на связывание целевого патогенного микроорганизма Streptococcus pyogenes (Американская коллекция типовых культур 19615) с фибронектином был проведен анализ связывания, который позволяет выполнить количественное определение связывания флуоресцентно-меченого целевого микроорганизма в 96-луночном планшете с фибронектиновым покрытием. Штаммы Lactobacillus согласно изобретению были добавлены непосредственно к меченному карбокси-флуоресцеин диацетатом целевому микроорганизму в начале связывания и выдержаны в термостате в течение 2 часов при температуре 37°C. После удаления несвязанных клеток и двукратного промывания ФСБР был проведен специфический количественный анализ связанных клеток целевого микроорганизма посредством измерения флуоресценции при эмиссии 485 нм/возбуждении 535 нм в планшетном фотометре для флуоресцентных исследований. Для выполнения этих анализов целевые штаммы и штаммы Lactobacillus согласно изобретению выращивались в питательной среде согласно стандартному протоколу. Для исследования штаммов Lactobacillus они были дважды промыты в ФСБР после выращивания в питательной среде, а затем помещены в ФСБР. Некоторые штаммы Lactobacillus были убиты с помощью пастеризации при температуре 70°C в течение 30 минут после промывания в ФСБР. Для исследования целевого штамма он выращивался в питательной среде в течение 16 часов до достижения фазы стационарного роста, затем собран, помечен путем добавления флуоресценции карбокси-флуоресцеин диацетата и доведен до OD=3,0. Для выполнения анализа связывания клетки Lactobacillus были добавлены непосредственно к флуоресцентно-меченому целевому микроорганизму в начале связывания и выдержаны в термостате в течение 2 часов в условиях, благоприятных для микроаэрофилов при температуре 37°C. Одновременно был проведен анализ контрольных партий без добавления суспензии Lactobacillus. После удаления планктонных клеток и промывания клеток, обнаруженных в биопленке, был проведен специфический количественный анализ связанных клеток целевого микроорганизма посредством измерения флуоресценции с клетками Lactobacillus и без них. Уменьшение флуоресценции в сравнении с контрольными партиями целевого микроорганизма без Lactobacillus согласовывалось с интенсивностью связывания целевого микроорганизма Streptococcus pyogenes с фибронектиновым покрытием титрационного микропланшета. Это уменьшение представлено в процентном соотношении препятствий для образования биопленки. Рис. 5 показывает результаты, полученные со штаммами Lactobacillus DSM 25972, DSM 25987, DSM 25988, DSM 25989 и DSM 25973, при препятствовании связыванию с фибронектином; эти штаммы были проанализированы в качестве примера микроорганизмов согласно настоящему изобретению, а именно Streptococcus pyogenes Американской коллекции типовых культур 19615. Эксперименты показали, что это приводит к торможению связывания целевых микроорганизмов с фибронектином из-за штаммов Lactobacillus согласно изобретению, перечисленных выше, как живых, так и убитых. Поэтому данное исследование показывает, что штаммы Lactobacillus согласно изобретению способны предупреждать связывание Streptococcus pyogenes с клетками-хозяевами. Кроме того, были также проведены эксперименты с дополнительными микроорганизмами того же рода и вида, для того чтобы изобразить специфику свойств связывания и/или свойств агрегации штаммов Lactobacillus согласно изобретению, а также их способность предупреждать связывание с фибронектином как функцию целевых микроорганизмов того же рода и вида. Для этой цели, среди прочего, был выбран Streptococcus pyogenes Американской коллекции типовых культур 12344. Для исследования его влияния на связывание целевого микроорганизма Streptococcus pyogenes, Американская коллекция типовых культур 12344, с фибронектином штаммы Lactobacillus согласно изобретению и целевой микроорганизм были выращены в питательной среде в стандартных условиях, как описано выше, затем обработаны и использованы в анализе.
Анализы показали, что другие микроорганизмы того же рода и вида также могут быть агрегированы штаммами Lactobacillus согласно изобретению и что штаммы Lactobacillus согласно изобретению также могут препятствовать другим целевым микроорганизмам связываться с фибронектином. Рис. 6 показывает результаты препятствования связыванию Streptococcus pyogenes (штамм Американской коллекции типовых культур 12344) с фибронектином штаммами Lactobacillus DSM 25972, DSM 25987, DSM 25988, DSM 25989 и DSM 25973 в качестве примера микроорганизмов согласно изобретению. Оказалось совершенно неожиданным, что введение предпочтительных микроорганизмов человеку или животным можно использовать для предупреждения или лечения бактериальных инфекций, при этом дополнительные микроорганизмы того же вида и рода, что и Streptococcus pyogenes, также могут участвовать в инфицировании.
Пример 5
Коагрегация Streptococcus salivarius
Штаммы Lactobacillus согласно изобретению и Streptococcus salivarius были выращены в питательной среде в соответствии со стандартными условиями, трижды промыты в ФСБР и использованы в слюне человека в анализе коагрегации. Результаты показывают, что Streptococcus salivarius не коагрегируется штаммами Lactobacillus согласно изобретению (Рис. 7). Таким образом, может быть исключена возможность того, что условно-патогенные штаммы, представленные Streptococcus salivarius в качестве примера, не коагрегируются штаммами Lactobacillus и удаляются из их естественной среды обитания. Это показывает, что предпочтительные молочнокислые бактерии оказывают специфическое действие на бактериальные инфекции.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Beachey and Ofek (1976) Epithelial cell binding of Group A Streptococci by lipotelchoic acid on fimbriae denuded of M protein. Journal of experimental medicine 143:759-771.
Bisno (1995) Streptococcus pyogenes. Page 1786ff in Mandell, Bennett and Dolin (Ed.) Principles and practice of infectious diseases. Vol 2. Churchill Livingstone, New York.
Courtney et al (1999) Strategies for prevention of group A streptococcal adhesion and infection. Page 553 ff. In An and Friedman (Ed.) Handbook of bacterial adhesion: principles, methods, and applications. Humana Press, Totowa, N.J.
Cunningham (2000) Pathogenesis of group A streptococcal infections. Clin Microbiol Rev 13:470-511.
Hasty et al. (1992) Multiple adhesins of streptococci. Infect Immun 60:2147-2152.
Kaplan (1991) The resurgence of group A streptococcal infections and their sequelae. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 10:55-57.
Kilian (2002) Streptococcus and Enterococcus. In: Medical Microbiology. Greenwood, D.: Slack, RCA.; Peutherer, J.F. (Ed.) Chapter 16. Churchill Livingstone, Edingburgh. UK: pp. 174-168, 2002.
LaPenta et al. (1994). Group A streptococci efficiently invade human respiratory epithelial cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:12115-12119.
Musser and Krause (1998) The revival of group A streptococcal diseases, with a commentary on staphylococcal toxic shock syndrome. In Emerging Infections. Krause (Ed.) Academic Press, New York.
Reid et al. (2001) Group A Streptococcus: Allelic variation, population genetics, and host pathogen interactions. J Clinic Invest 107:393-399.
Simpson and Beachey (1983) Adherence of group A streptococci to flbronectin on oral epithelial cells. Infect Immun 39:275-279.