Жизнеспособность и функции плюрипотентных клеток и фибробластов дермально-эпидермального слоя животных в условиях их культивирования на коллаген-хитозановых покрытиях

© ЕРЕМЕЕВ А.В., СВЕТЛАКОВ А.В., БОЛЬШАКОВ И.Н., ВЛАСОВ А.А., АРАПОВА В. А.

ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ И ФУНКЦИИ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ КЛЕТОК И ФИБРОБЛАСТОВ ДЕРМАЛЬНО-ЭПИДЕРМАЛЬНОГО СЛОЯ ЖИВОТНЫХ В УСЛОВИЯХ ИХ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ НА КОЛЛАГЕН-ХИТОЗАНОВЫХ ПОКРЫТИЯХ

А.В. Еремеев, А.В. Светлаков, И.Н. Большаков, А. А. Власов, В. А. Арапова

Центр репродуктивной медицины, Красноярск, руководитель - к.б.н. А.В.

Светлаков; Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого, ректор - д.м.н., проф. И.П.Артюхов; кафедра оперативной хирургии с топографической анатомией, зав. - д.м.н., проф. П.А.

Самотесов.

Резюме. В представленной работе рассматривается возможность культивирования стволовых эмбриональных клеток и фибробластов на искусственно полученных матрицах на основе коллаген-хитозановых биополимеров, получения в эксперименте дермально-эпидермального эквивалента кожи животных, показаны функции клеток при длительном культивировании.

Ключевые слова: стволовые эмбриональные клетки и фибробласты,

дермально-эпидермальный эквивалент кожи, культивирование, коллаген-хитозановая матрица.

Восстановление кожных покровов является одной из важнейших проблем лечения больных с обширными и глубокими ожогами, трофическими язвами, другими травматическими повреждениями кожи. Традиционный метод -пересадка кожи, взятой у пострадавшего или донора, - в случаях обширного и глубокого поражения часто бывает осложнен состоянием пациента, размерами сохранившихся участков здоровой кожи и другими обстоятельствами. Аллотрансплантаты, полученные от трупов или добровольцев, отторгаются организмом пациента через одну или две недели и, следовательно, являются

только временной защитой пораженной поверхности. Использование кератиноцитов в свободной форме не приводит к высокой активности клеток из-за короткого времени их жизни и низкой адгезии к раневой поверхности. Покровные материалы на резорбирующей основе существенно удобнее при трансплантации и закрытии раневых поверхностей, они могут быть использованы для культивирования и последующей пересадки человеческих кератиноцитов и фибробластов. При этом наиболее оптимальным клеточным материалом для покровных матриц могут быть использованы плюрипотентные клетки, обладающие неограниченным пролиферативным потенциалом. Таким образом, создаются условия для наращивания большой клеточной массы и хранения такой конструкции в замороженном состоянии, готовом для дифференцировки и трансплантации. В этой связи разработка матриц на биосовместимой и резорбирующей основе, пригодной для культивирования клеток и их дифференцировки, высоко актуальна. Изначально было предположено, что разработанные ранее коллаген-хитозановые матрицы, содержащие гликозаминогликаны и факторы роста, и применение их с мультипотентными клетками позволит создать дермально-эпидермальный эквивалент кожи. Известно, что хитозаны определенных марок характеризуются высокой биосовместимостью, способностью к биодеградации, нетоксичностью, способствуют строгой ориентации волокон соединительной ткани при имплантации и регуляции синтеза коллагена, стимулируют размножение фибробластов, размножение клеток сосудистого эндотелия, новообразование микрососудов. В этой связи существует возможность создания адекватных условий микроокружения для дифференцировки плюрипотентных клеток. В частности, были поставлены задачи сравнения функциональной активности эмбриональных фибробластов и плюрипотентных (эмбриональных стволовых клеток, ЭСК) в различных условиях культивирования на раневом коллаген-хитозановом покрытии «Коллахит-бол», оценки хромосомной стабильности эмбриональных фибробластов человека при культивировании на раневых покрытиях в различных средах, а также

выявления количественной и качественной характеристик физиологической активности эмбриональных фибробластов кожи при культивировании в различных условиях на раневом покрытии Коллахит-бол [1,3,4].

Материалы и методы

В работе использовали первичную культуру эмбриональных фибробластов крысы после 3-х пассажей, полученную из 7-10 дневных фетусов, стромальные клетки крысы из подкожной жировой ткани после ее диспергирования. Для культивирования использовали среду ДМЕМ с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 100 мкг/мл канамицина сульфата, 1мМ L-глутамина, в которую дополнительно вносили еще 4нг/мл основного фактора роста фибробластов (bFGF), 1 мМ раствор незаменимых аминокислот. Для дифференцировки плюрипотентных клеток их высевали на уже предварительно посаженные на раневое покрытие эмбриональные фибробласты кожи крысы в среду со всеми добавками, кроме bFGF. В ряде экспериментов использовали культуры ЭСК и фибробластов человека. Получение первичной культуры эмбриональных фибробластов и последующую процедуру получения метафазных пластинок для кариотипирования проводили по стандартной методике [2], используя вместо плодных оболочек - кожу.

Раневые покрытия «Коллахит-бол» в качестве клеточных матриц помещались во флаконы, а сверху осторожно наслаивалась на них суспензия клеток в среде ДМЕМ со всеми компонентами, указанными выше. В опытах

через 24, 48 и 72 часа в клетках определялись признаки апоптоза, уровень иона

2+

Ca и рН. Апоптоз определялся с помощью маркеров Hoechst 33342 и Propidium iodide на микроскопе Olympus BX51. Достоверность различий средних значений оценивалась с помощью непараметрического критерия Колмагорова-Смирнова.

Результаты и обсуждение

В состав биополимерной матрицы «Коллахит-бол» входит рекомбинантный фактор роста - PDGF. Однако использование

рекомбинантных факторов роста при добавлении в матрицу не только значительно увеличивает ее стоимость, но также увеличивает возможность иммунного ответа на чужеродный белок. Известно, что культивируемые клетки секретируют в среду различные факторы, поддерживающие пролиферативную активность или состояние дифференцировки клеток. Использование

кондиционированной клетками среды в качестве добавки к матрице может помочь избежать вышеуказанных проблем и дать предпосылки для создания подложек для культивирования клеток разных типов, в том числе и стволовых. Для проверки этого предположения при культивировании фибробластов каждые третьи сутки отбиралась культуральная среда. Эта кондиционированная среда фильтровалась через фильтр 0,22 мкм, затем переносилась во флакон с биоматрицей «Коллахит-бол». В эту систему, кроме фибробластов, добавлялась среда для плюрипотентных клеток в соотношении 1:1, затем высевались плюрипотентные клетки. Оценивалась возможность таких клеток

дифференцироваться в кератиноциты в присутствии культивируемых на матрице фибробластов (рис. 1, а,б,в,г).

Посев на матрицы вызывал апоптоз фибробластов в культуре через 24 часа (52% апоптотических клеток). До обработки клеток в состоянии апоптоза было 16% (p<0,05). В дальнейшем происходило уменьшение числа

апоптотических клеток через 48 часов до 36%, а через 72 часа до 8% (p<0,05). Пролиферация фибробластов возобновлялась и продолжалась в течение последующих 9 суток инкубации, количество клеток в состоянии апоптоза при этом уменьшалось практически до 0%. Доля клеток в состоянии некроза практически не менялась на протяжении всего эксперимента и составляла в среднем 10%. Большой процент клеток в состоянии апоптоза, вероятно, связан со стрессом при пересеве клеток из различных условий и воздействием процедуры обработки раствором Версена.

Очевидно, что динамика таких показателей как Са2+, рНіп характеризует изменение функционального состояния клеток в ходе культивирования на матрицах. Поэтому одной из вспомогательных задач нашего исследования было определение показателей клеточного метаболизма.

Известно, что внутриклеточный кальций является одним из вторичных

мессенджеров, регулирующих процессы пролиферации, дифференцировки,

2+

апоптоза и др. [5,8]. До культивирования клеток концентрация Ca в фибробластах была 12,4 нМ, а через 24 часа инкубации увеличивалась до 67 нМ (p<0,01), возможно вследствие интенсификации апоптотических процессов. Однако на 3 сутки, несмотря на то, что количество клеток в апоптозе все еще оставалось достаточно большим, концентрация Ca2+ в клетках была сравнима с контролем и составляла 12,3 нМ. При дальнейшем инкубировании фибробластов на матрицах содержание кальция в клетках не менялось (около 5 нМ).

Величина рНіп регулирует активность факторов, контролирующих экспрессию генов и клеточный цикл. Доказано, что снижение рНіп тормозит G2/M переход клеточного цикла, а его повышение, наоборот, активирует [6,7]. В нашем случае, через 24 часа культивирования на матрицах возникало снижение внутриклеточного уровня рН в фибробластах, которая далее восстанавливалась на третьи сутки до контрольного значения.

Исследование морфологии дифференциально окрашенных хромосом в культурах, культивируемых и не культивируемых на матрицах, показало, что используемые коллаген-хитозановые матрицы на сроках до 5-х суток не вызывали изменения числа хромосом и их морфологии.

Исследование морфологии ЭСК показало, что культивирование на указанных подложках может поддерживать в течение 7 суток нормальное морфологическое состояние колоний плюрипотентных клеток, характерное для ЭСК человека.

Таким образом, использование коллаген-хитозанового комплекса Коллахит-бол приводило к обратимым изменениям физико-химических свойств

клеток, к селективному отбору клеток в культуре. Процесс культивирования клеток на матрицах приводит к уменьшению массы клеток в состоянии апоптоза и возобновлению пролиферации. Это свидетельствует об отсутствии цитотоксической реакции при контакте с матрицами. По-видимому, целесообразно перед процедурой трансплантации, с целью улучшения эффективности приживления образца, использовать клетки на этапе восстановления их функций и пролиферативной активности. Совместное культивирование на раневых покрытиях эмбриональных фибробластов и стволовых клеток подкожно-жировой клетчатки формирует признаки дермально-эпидермального эквивалента кожи, что может иметь прикладное значение для реконструкции пораженной или отсутствующей кожи при глубокой и обширной ожоговой травме.

FUNCTIONS OF PLURIPOTENT CELLS AND FIBROBLASTS OF AN ANIMAL DERMAL-EPIDERMAL LAYER BY CULTIVATION IN DIFFERENT CONDITIONS ON COLLAGENE-CHITOSANE MATRIX A.V. Eremeev, A.V. Svetlakov, I.N. Bolshakov, A.A.Vlasov, Arapova V.A.

Center for Reproductive Medicine

In the submitted work the opportunity of cultivation of stem embryonic cells and embryonic fibroblasts on received artificial matrixes on basis collagen-chitosan biopolymers is available. Moreover receptions in experiment of a dermal-epidermal equivalent of a skin of animals, stability of functional potentialities of cells are shown at long cultivation.

Литература

1. Еремеев А.В., Зотова Н.В., Власов А.А. и др. Способ культивирования эмбриональных клеток и получения клеточной матрицы. Заявка на изобретение. МПК8 A61 K35/32, A61 K35/12, A61 K35/28, C12 N5/08, приоритет № 2008131742/15 (039611) от 31.07.2008.

2. Назаренко С.А., Васильева Е.О. Тест-система внешнего контроля качества цитогенетических исследований в учреждениях медико-генетической службы: пособ. для врачей. - Томск: «Печатная мануфактура», 2003. - 34с.

3. Патент РФ № 2254145, A61 L 15/28, 15/32, 26/00, БИПМ №17 от 20.06.2005.

4. Патент РФ № 2252787, А61 L 15/28, 15/32, 27/60, БИПМ №15 от 27.05.2005.

2 +

5. Azhar M., Kennady P.K., Pande G. et al. Cell Cycle phase, cellular Ca and development in Dictyostelium discoideum // Int. J. Dev. Biol. -2001 -Vol. 45. - P. 405-414.

6. Reshkin S.J., Bellizzi A., Caldeira S. et al. Na+/H+ exchanger-dependent intracellular alkalinization is an early event in malignant transformation and plays an essential role in the development of subsequent transformation-associated phenotypes // The FASEB J.-2000.-Vol. 14.-P. 2185-2197.

7. Wakabayashi S., Shigekawa M., Pouyssegur J. Molecular physiology of vertebrate Na+/H+ exchangers // Physiol. Rev.-1997.-Vol. 77.-P. 51-74.

8. Whitaker M., Larman M.G. Calcium and mitosis // Sem. Cell Dev. Biol. -2001.-Vol. 21.-P. 53-58.

а - культивирование на матрице б - культивирование на матрице фибробластов в свежей среде ДМЕМ со фибробластов в кондиционированной среде всеми добавками. ДМЕМ со всеми добавками.

в - культивирование мезенхимных г - образование слоя кератиноцитов на стволовых клеток на фибробластах и фибробластах (4-й день культивирования) и матрице в среде для стволовых клеток с матрице в среде для стволовых клеток без добавлением bFGF добавления bFGF

Рис.1. Образование дермально-эпидермального эквивалента кожи крысы на коллаген-хитозановой матрице