Оценка потенциальной патогенности клинических штаммов Pseudomonas aeruginosa биолюминесцентным методом

Оценка потенциальной патогенности клинических штаммов Pseudomonas aeruginosa биолюминесцентным методом

1 "2 1 "2 "2 Кузнецова М.В. ' , Масленникова И.Л. , Карпунина Т.И. , Николаева Н.В.

Assessment of potential pathogenicity among clinical strains of Pseudomonas aeruginosa using bioluminescent technique

Kuznetsova M. V., Maslennikova I.L., Karpunina T.I., Nikolayeva N. V.

1 Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, г. Пермь

2 Пермская государственная медицинская академия им. акад. Е.А. Вагнера, г. Пермь

© Кузнецова М.В., Масленникова И.Л., Карпунина Т.И., Николаева Н.В.

Изучено влияние метаболитов штаммов P. aeruginosa на биолюминесценцию E. coli lux+ и экспериментально обосновано целесообразность использования биолюминесцентного метода для оценки их потенциальной патогенности. В работе использованы экзометаболиты клинических изолятов P. aeruginosa (n = 27). Индекс потенциальной патогенности (ИПП) вычисляли по формуле ИПП = (Ik — Io)/Ik • 100%, где Ik — интенсивность биолюминесценции Escherichia coli lux+ контрольной пробы (LB), Io — интенсивность биолюминесценции опытной пробы (экзометаболиты). Определены условия проведения анализа и продолжительность экспозиции. Согласно индексу потенциальной патогенности штаммы P. aeruginosa разделены на три группы: штаммы с низкой степенью патогенности, умеренно и высоко патогенные штаммы. Группа с ИПП не менее 70% характеризовалась достоверно высоким коэффициентом корреляции с уровнем продукции пиоцианина, пленкообразующей способностью. Это указывает на возможность использования биолюминесцентного метода в качестве скринингового или дополнительного способа оценки степени агрессивности изолятов P. aeruginosa, в частности при гнойно-септических инфекциях (ГСИ).

Ключевые слова: P. aeruginosa, патогенность, биолюминесценция, E. coli lux+.

The aim: to study the influence of P. aeruginosa exometabolites on E. coli lux+ bioluminescence and experimentally prove the expediency of use of a bioluminescent method for an estimation of their potential pathogenicity. Objectives and Methods. Exometabolites of P. aeruginosa (n = 27) nosocomial strains were used. Index of potential pathogenicity (IPP) was calculated with the formula: IPP = (Ik — Io)/Ik • 100%, where Ik — intensity of Escherichia coli lux+ bioluminescence in control test (LB), Io — intensity of a bioluminescence in experimental test (exometabolites). Results. Protocol of analysis implementation and exposure duration has been determined. According to IPP, P. aeruginosa strains were subdivided into 3 groups: strains with low degree of pathogenicity, moderate and highly pathogenic. The group of IPP > 70% was characterized by reliably high correlation coefficient relatively to pyocyanin production, film-forming ability. This indicates the possibility of bioluminescent method application as screening or additional method of the assessment of P. aeruginosa isolate aggressiveness, and in purulent-septic infections (PSI) in particular.

Key words: P. aeruginosa, pathogenicity, bioluminescence, E. coli lux+.

УДК 616-022.7:579.841.11.063.8]-073.584

Введение

Pseudomonas aeruginosa является хорошо известным возбудителем внутрибольничных инфекций, занимая первое место в этиологии нозокомиальных пневмоний и других гнойно-септических инфекций (ГСИ), с высоким уровнем летальности [7—9]. Очевидно, что условия стационаров с учетом иммунодефицитного состояния пациентов, обилием инвазивных процедур на фоне селективного воздействия антибиотиков и дезинфицирующих средств провоцируют и закрепляют агрессивность циркулирующих в них штаммов синегнойной палочки. Патогенность P. aeruginosa детерминирована способностью к инвазии и персистенции в тканях, а также набором цитотоксиче-ских веществ, таких как экзотоксин А, пиоцианин, фосфолипаза С, продуктов системы экскреции III типа, обеспечивающих выведение экзоэнзимов из внутренней среды бактериальной клетки и их транслокацию внутрь эукарио-

Кузнецова М.В., Масленникова И.Л., Карпунина Т.И., Николаева Н.В. Оценка потенциальной патогенности... P. aeruginosa

тической клетки непосредственно к мишеням (ExoS, ExoT, ExoY, ExoU) [8]. Активное изучение Р. aeruginosa показало гетерогенность ее популяции по способности к синтезу и секреции факторов токсигенности [11, 14, 16]. В настоящее время существует необходимость экспрессной, экономичной оценки и дифференцировки большого числа штаммов P. aeruginosa, изолируемых в лечебно-профилактических учреждениях. Однако традиционные микробиологические методы оценки отдельных свойств этих бактерий не позволяют составить целостного представления о патогенном потенциале P. aeruginosa, что обусловлено в том числе известными в биологии эффектами взаимовлияния токсических веществ при их совместном действии.

В настоящее время в биомедицинских исследованиях и клинической медицине широко используются методики на основе биолюминесцентной реакции [17]. Высокая чувствительность и быстрый ответ на действие различных агентов делают их эффективным инструментом для оценки большого числа ингибиторов биологической активности. Рекомби-нантные штаммы E. coli с генами свечения значительно расширяют сферу использования биолюминесценции в медицине и помогают решать задачи скринингового анализа [2, 3, 5]. Однако данные об использовании биолюминесценции как показателя токсигенности P. aeruginosa отсутствуют.

Цель работы — изучить влияние метаболитов референтного и клинических штаммов P. aeruginosa на биолюминесценцию E. coli lux+ и экспериментально обосновать целесообразность использования биолюминесцентного метода для оценки их потенциальной патогенности.

Материал и методы

Клинические изоляты P. aeruginosa (n = 27) выделены из различного биологического материала больных с признаками воспаления в крупных хирургических стационарах г. Перми. Для сравнения использовали штамм P. aeruginosa АТСС 27853.

Рекомбинантный биолюминесцентный штамм E. coli lux+ (полный lux-регулон Vibrio fischeri) [2] регидратирова-ли охлажденной H2O (1 мл на ампулу) 30 мин при температуре 4 °С. Затем взвесь сенсора разводили 0,9% NaCl до рабочего объема и выдерживали 30 мин при температуре 20 °С.

Клинические и референтный штаммы P. aeruginosa с исходным числом клеток 6 • 108 КОЕ/мл (до 2,0 по стандарту Мак-Фарленда) засевали в соотношении 1 : 4 в Луриа—Бертани-бульон (LB, рН 7,0) и статически выращивали 18 ч при температуре 37 °С. Экзометаболиты получали путем центрифугирования 1—2 мл ночной культуры P. aeruginosa при 13 000 об/мин 10 мин на микроцентрифуге «Эппендорф» (Германия) и фильтрованием (диаметр пор 0,22 мкм). Надосадочную жидкость использовали в анализе немедленно или после замораживания при температуре -18 °С в течение 1 ч. По 50 мкл цельных экзометаболитов добавляли к 50 мкл сенсора, предварительно разлитого в лунки белого 96-луночного полистиролового планшета. Смесь выдерживали 60 мин при температуре 20 °С. Измерения проводили через 15, 30, 45, 60 мин на планшетном люминометре Luminoscan Ascent (Финляндия).

Поскольку подавление люминесценции E. coli lux+ рассматривается как средство оценки потенциальной пато-генности P. aeruginosa, для анализа ингибирующего эффекта предложен индекс потенциальной патогенности (ИПП), вычисляемый по формуле ИПП =

= (Ik - Io)/Ik • 100%, где Ik — интенсивность люминесценции контрольной пробы (E. coli lux+ + LB); Io — интенсивность биолюминесценции опытной пробы (E. coli lux+ + метаболиты). Образование биопленок изучали в лунках плоскодонного 96-луночного полистиролового планшета согласно И.А. Шагиняну и соавт. [10]. Гемолитическую активность определяли на 5%-м кровяном агаре после 24 ч инкубации по величине зоны просветления в миллиметрах вокруг колоний исследуемых штаммов. Продукцию пиоцианина оценивали согласно E. Deziel и соавт. путем измерения оптической плотности (ОП) супернатантов суточных культур при длине волны 695 нм на планшетном спектрофотометре Benchmark Plus (Bio-Rad, США) [12]. Для исследования антагонистических свойств бактерий использовали метод отсроченного антагонизма по P. Muriana и T. Klaenhammer [14] с модификацией [6]. Антагонистическую активность штамма выражали как процент прироста тест-культуры (E. coli lux+) при ее культивировании в течение 5 ч с экзометаболитами антагониста.

Статистический анализ проводили с использованием программы Excel 2003. Результаты представлены в виде среднего арифметического M и стандартной ошибки среднего m. Статистическая достоверность коэффициента корреляции рассчитывалась при уровне значимости p < 0,05.

Результаты и обсуждение

В результате проведенных исследований установлено, что однократное замораживание бесклеточных экзоме-таболитов P. aeruginosa не приводило к достоверному снижению их действия на свечение E. coli lux+. Более того, в ряде случаев заморозка незначительно усиливала ингибирующие свойства экзометаболитов, что, возможно, обусловлено преобладающим влиянием экзотоксина А, активность которого увеличивается при многократном замораживании-оттаивании [11]. Для унификации методики в дальнейших экспериментах экзометаболиты проходили обязательный этап замораживания-оттаивания, что может быть рекомендовано при использовании данного метода в клинических и референтных лабораториях, где не всегда есть возможность анализа ex tempore. Хотя экзометаболи-ты большей части штаммов P. aeruginosa ингибировали свечение E. coli lux+ в пределах 66,0—96,8% уже через 15 мин контакта без последующего усиления (таблица), ряд супернатантов обусловливали максимальное снижение уровня биолюминесценции в течение 30 мин без достоверных изменений при пролонгации экспозиции. Это время и было использовано во всех последующих экспериментах.

Индекс потенциальной патогенности типового и клинических штаммов P. aeruginosa при разных сроках контакта

Штамм P. aeruginosa Срок контакта, мин

15 30 45 60

АТСС 27853 48,52 ± 3,71 49,10 ± 3,46 47,57 ± 3,83 49,96 ± 3,48

801 96,89 ± 0,35 98,19 ± 0,38 98,39 ± 0,28 96,39 ± 0,27

797 90,82 ± 0,10 93,06 ± 0,27 93,39 ± 0,12 93,46 ± 0,16

836 66,03 ± 0,92 66,96 ± 0,96 64,09 ± 0,77 59,20 ± 1,31

8-7 89,50 ± 0,79 93,10 ± 0,52 93,65 ± 0,43 93,49 ± 0,49

ИТТ 25,96 ± 2,21 37,38 ± 0,95 40,80 ± 1,09 39,50 ± 1,27

711 64,81 ± 1,92 67,05 ± 1,15 65,11 ± 1,34 61,20 ± 1,68

Выявлено, что экзометаболиты клинических штаммов P. aeruginosa по-разному влияли на биолюминесценцию сенсора E. coli lux+. На основе сравнительного анализа ряда клинических и референтного штаммов P. aeruginosa по уровню влияния их экзометаболитов на свечение E. coli lux+, изолированные культуры были распределены согласно ИПП по группам (рисунок): I группа ИПП < 30% — штаммы с низкой степенью, II группа 30% < ИПП < 70% — с умеренной степенью, III группа ИПП > 70% — с высокой степенью ингибирования люминесценции. Сопоставление клинических штаммов P. aeruginosa с учетом принадлежности к группе по проявлению ими традиционно учитываемых в практике факторов патогенности показало, что ИПП умеренно коррелирует с уровнем продукции пиоциа-нина во II группе (r = 0,40) и значительно в большей степени — в III группе (r = 0,61; р < 0,05), а наиболее сильная положительная связь между этими показателями отмечена для всей совокупности изолятов (r = 0,81; р < 0,05). Кроме того, показана умеренная положительная корреляция ИПП штаммов III группы с уровнем гемолитической активности (r = 0,48). Участие данных факторов (пиоцианин, фосфолипаза С, рамнолипид) в развитии воспалительного процесса бесспорно, так как они непосредственно влияют на формирование локального и системного воспаления посредством цитотоксического эффекта и стимуляции генерализованной воспалительной реакции [8, 18].

Известно, что одним из главных механизмов, определяющих экспрессию факторов вирулентности синегнойной палочки, является феномен кооперативной чувствительности (Quorum sensing). Под контролем данной системы находится синтез всех экзотоксинов (Las-система), пиоцианина (Rhl-система), а также образование биопленки [18]. В исследовании зафиксирована сильная положительная корреляция с пленкообразующей способностью у штаммов III группы (r = 0,87; р = 0,05). Можно полагать, что обнаружение совокупности факторов с высокой активностью у штаммов с ИПП > 70% будет сочетаться с выраженными проявлениями других вирулентных свойств. В соответствии с современными представлениями о госпитальных штаммах они не только должны проявлять множе-

Кузнецова М.В., Масленникова И.Л., Карпунина Т.И., Николаева Н.В. Оценка потенциальной патогенности. P. aeruginosa

ственную лекарственную устойчивость, но и иметь широкий набор экспрессируемых факторов патогенности, а также проявлять антагонистическую активность по отношению к другим микроорганизмам [1, 4]. При оценке антагонистической активности выявлено, что уровень прироста биомассы E. coli lux+ имел сильную отрицательную корреляционную связь со степенью ингибирования биолюминесценции при учете воздействия метаболитов всех штаммов (r = -0,81; р < 0,05), но в особенности в III группе (r = -0,87; р < 0,05). Высокая вирулентность и антагонистическая активность обеспечивают конкурентоспособность штамма по сравнению с другими микроорганизмами и, как следствие, способствуют его закреплению и распространению в стационаре.

Штамм

ИПП штаммов P. aeruginosa (ингибирование свечения E. coli lux+ после экспозиции с экзометаболитами через 30 мин контакта): 1 — АТСС 27853; 2 — 801; 3 — 797; 4 — 836; 5 — 8-7; 6 — ИТТ; 7 — 711; 8 — 8-4; 9 — 3-7; 10 — 9-3; 11 — дренаж; 12 — 88р; 13 — 9-8; 14 — 8-3; 15 — 5

Таким образом, показана возможность оценки потенциальной патогенности P. aeruginosa, основанной на изменении свечения люминесцентного тест-штамма при действии экзометаболитов. Такой подход основывается, по крайней мере, на двух соображениях. Во-первых, основной фактор патогенности P. aeruginosa — экзотоксин А — катализирует реакцию аденозинтрифосфат-рибозилирования и инактивации фактора элонгации II, что приводит к нарушению биосинтеза белка и других метаболических процессов прокариот и эукариот [11]. Свечение рекомбинантного штамма E. coli lux+ отражает характер изменения внутриклеточного содержания основных восстановительных эквивалентов (NAD(P), аденозинтрифосфат), длинноцепочечных алифатических альдегидов, молекулярного кислорода — субстратов люциферазы, с

учетом рецепторного комплекса реципиента — E. coli. Во-вторых, пигмент пиоцианин и другие факторы также способны оказывать токсическое действие на оба типа клеток посредством промежуточных активных форм кислорода, таких как супероксид-радикал и перекись водорода с последующим снижением внутриклеточного циклического аденозинмонофосфата. В литературе показан высокий уровень корреляции между значениями EC50 (ингибирование биолюминесценции на 50% от контроля) тест-системы Microtox (ISO № 11348) и LD50 (median lethal dose), EC50 эукариот [13].

При лабораторной диагностике инфекций, ассоциированных с условно патогенными бактериями, такими как P. aeruginosa, их обнаружение в исследуемом патологическом материале требует ответа на во-

прос, является ли изолируемый микроб этиопатогеном либо это случайная контаминация анализируемого образца. Оценка по степени обсемененности изучаемого образца далеко не всегда является адекватной. Учитывая, что P. aeruginosa обладает большим набором факторов патогенности, их полный учет и интегральная оценка возможного вклада данного микроорганизма в патологический процесс при культуральном исследовании требует значительных материальных и временных затрат. Предлагаемый метод быстрый, унифицированный, позволяет комплексно оценить патогенный потенциал выделенного штамма для определения его роли в этиологии ГСИ, дать прогноз в отношении возможного развития инфекционного процесса. Индекс потенциальной патогенности целесообразно использовать в качестве дополнительного критерия госпитальной природы штаммов.

Литература

1. Брусина Е.Б., Рычагов И.П. Внутрибольничные инфекции, обусловленные формированием госпитального штамма // Стерилизация и госпит. инфекция. 2006. № 2. С. 32—34.

2. Данилов В.С., Зарубина А.П., Ерошникова Г.Е. и др. Сенсорные биолюминесцентные системы на основе lux-оперонов разных видов люминесцентных бактерий // Вестн. МГУ. Сер. 16. Биология. 2002. № 3. С. 20—24.

3. Дерябин Д.Г. Бактериальная биолюминесценция: фундаментальные и прикладные аспекты. М.: Наука, 2009. 246 с.

4. Зуева Л.П., Яфаев РХ. Эпидемиология. СПб.: Фолиант, 2005. 752 с.

5.Медведева С£., Тюлькова Н.А., Кузнецов А.М. и др. Биолюминесцентные биотесты на основе светящихся бактерий // Журн. Сиб. федерального ун-та. Сер. Биология. 2009. Т. 2, № 4. С. 418—452.

6. Перунова Н.Б. Характеристика биологических свойств микроорганизмов в бактериально-грибковых ассоциациях кишечника: дис. ... канд. мед. наук. Оренбург, 2003. 127 с.

7. Решедько Г.К., Рябкова Е.Л., Фаращук А.Н. и др. Не-ферментирующие грамотрицательные возбудители но-зокомиальных инфекций в ОРИТ России: проблемы ан-

Поступила в редакцию 20.12.2011 г.

Утверждена к печати 05.03.2012 г.

Сведения об авторах

М.В. Кузнецова — канд. биол. наук, науч. сотрудник лаборатории химического мутагенеза ИЭГМ УрО РАН, доцент кафедры микробиологии

и вирусологии ПГМА им. ак. Е.А. Вагнера» (г. Пермь).

тибиотикорезистентности // Клинич. микробиология и антимикроб. химиотерапия. 2006. Т. 8, № 3. С. 243—259.

8. Руднов В.А. Антибиотикотерапия госпитальных инфекций, вызванных P. aeruginosae // Рус. мед. журн. 2005. Т. 13, № 7. С. 485—490.

9. Сидоренко С.В., Резван С.П., Стерхова Г.А., Грудини-на С.А. Госпитальные инфекции, вызванные Pseudomonas aeruginosa. Распространение и клиническое значение антибиотикорезистентности // Антибиотики и химиотерапия. 1999. № 3. С. 25—34.

10. Шагинян И.А., Данилина Г.А., Чернуха М.Ю. и др. Формирование биопленок клиническими штаммами бактерий комплекса Burkholderia cepacia в зависимости от их фенотипических и генотипических характеристик // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 2007. № 1. С. 3—8.

11. Armstrong S., Yates S.P., Merrill A.R. Insight into the catalytic mechanism of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A. Studies of toxin interaction with eukaryotic elongation factor-2 // J. Biol. Chem. 2002. V. 277, № 48. P. 46669—46675.

12. Deziel E., Comeau Y., Villemur R. Initiation of biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa 57RP correlates with emergence of hyperpiliated and highly adherent phenotypic variants deficient in swimming, swarming and twitching motilities // Bacteriol. 2001. V. 183, № 4. P. 1195—1204.

13. Kaiser K. Correlation of Vibrio fischeri bacteria test data with bioassay data for other organisms // Environ. Health. Perspect. 1998. V. 106, № . P. 583—591.

14.Muriana P.M., Klaenhammer T.R. Conjugal transfer of plasmid-encoded determinants for bacteriocin production and immunity in Lactobacillus acidophilus 88 // Appl. Environ. Microbiol. 1987. V. 53, № 3. Р. 553—560.

15. Riese M.J., Goehring U.M., Ehrmantraut M.E. et al. Auto-ADP-ribosylation of Pseudomonas aeruginosa ExoS // J. Biol. Chem. 2002. V. 277, № 14. P. 12082—12088.

16. Roy-Burman A., Savel R.H., Racine S. et al. Type III protein secretion is associated with death in lower respiratory and systemic Pseudomonas aeruginosa infections. // J. Infect. Dis. 2001. V. 183, № 12. P. 1767—1774.

17. Simon L., Fremaux C., Cenatiempo Y. et al. Luminescent method for the detection of antibacterial activities // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001. V. 57, № 5—6. P. 757—63.

18. Smith R.S., Iglewski B.H. P. aeruginosa quorum-sensing systems and virulence // Curr. Opin. Microbiol. 2003. V. 6, № 1. P. 56—60.

И.Л. Масленникова — канд. биол. наук, ст. науч. сотрудник лаборатории иммунорегуляции ФНБУ ИЭГМ УрО РАН (г. Пермь).

Т.И. Карпунина — д-р биол. наук, профессор кафедры микробиологии и вирусологии ПГМА им. акад. Е.А. Вагнера (г. Пермь).

Н.В. Николаева — ассистент кафедры микробиологии и вирусологии ПГМА им. акад. Е.А. Вагнера (г. Пермь).

Для корреспонденции

Кузнецова Марина Валентиновна, тел. (342) 282-80-91; (342) 21244-76; e-mail: mar@iegm.ru