Влияние регуляторов роста на эффективность регенерации растений при клональном микроразмножении черешни ( Prunus avium L. )

Выводы

В результате анализа электрофореграмм различных фракций белков выявлено двенадцать полипептидов фракции легкорастворимых белков и три полипептида из фракции белков клеточных стенок, которые могут быть использованы в качестве потенциальных маркеров процесса побегообразования у Dendrobium sp.

Однако, полученные данные не дают целостного представления о начальных стадиях процесса побегообразования у Dendrobium sp в культуре in vitro. Поэтому в последующих экспериментах предполагается проанализировать количественные изменения в составе нуклеиновых кислот, изменения изоферментного состава ряда энзимов (в частности, пероксидазы), а так же провести цитологические исследования для более точного определения стадий развития новых побегов Dendrobium sp в культуре in vitro.

Список литературы

1. Василевко В.Т. Модель переноса гена бактериальной полиглюкангидголазы ф—1,4— глюканазы) в растения табака как способ защиты растений фитопатогенов: Автореф. дис. ... кандидата биол. наук / Центральный ботанический сад НАНБ. — Мн., 2002. — 23 с.

2. Моисеева Н. А. Молекулярные и клеточные механизмы морфогенеза в культуре клеток растений // Биология культивируемых клеток и биотехнология растений. — М.: Наука, 1991. — С. 166-185.

3. Шан Х., Ли С.В., Ли Д., Шао С., Лиу Б. Дифференциальная экспрессия специфических белков при органогенезе томата in vitro // Физиология растений. — 2004. — Вып.51. — № 3. — C. 422-328.

4. De Klerk G.-J., Arnhold-Schmitt B., Lieberei R., Neuman K.-H. Regeneration of roots, shoots and embryos: physiological, biochemical, molrcular aspects // Biologia Plantarum. — 1995. — Vol. 39. — № 1. — P. 53-66.

5. Murashige T., Skug F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture // Physiol. Plant. — 1962. — V.15. — P.473-497.

6. Jimenez V.M., Bangerth F. Endogenous hormone levels in explants and in embryogenic and non-embryogenic cultures of carrot // Physiol. Plant. — 2001. — Vol.111. — P. 389-395.

Рекомендовано к печати д.б.н., проф. Митрофановой О.В.

ВЛИЯНИЕ РЕГУЛЯТОРОВ РОСТА НА ЭФФЕКТИВНОСТЬ РЕГЕНЕРАЦИИ РАСТЕНИЙ ПРИ КЛОНАЛЬНОМ МИКРОРАЗМНОЖЕНИИ ЧЕРЕШНИ

Н.В. КУЗНЕЦОВА Никитский ботанический сад - Национальный научный центр

Введение

Черешня (Prunus avium L.) относится к числу экономически важных плодовых культур в Украине. Одной из главных проблем ее выращивания является внезапная гибель плодоносящих деревьев. На сегодня существует две серьезные причины этого. Первая - несовместимость подвоя с привоем [9]. Вторая, не менее важная причина, - это высокая степень поражения промышленных насаждений черешни вирусными, бактериальными и грибными болезнями. Решить первый вопрос можно было бы выращиванием черешни на собственных корнях. Однако, основываясь на литературных данных и исследованиях, выполненных в НБС-ННЦ (г. Ялта) на сортах Валерий Чкалов, Крупноплодная, Бигарро-Бурлат, Мелитопольская Черная, Сказка и других, можно считать, что черешня имеет низкую способность к ризогенезу как в условиях ex situ, так и in vitro [7-9, 11]. Рассматривая второй вопрос, следует отметить, что в южных регионах Украины, в том числе Крыму, на черешне выявлены наиболее вредоносные болезни, причиняющие значительный экономический ущерб плодоводству: скручивание листьев черешни (CLRV), мозаика резухи (ArMV), черная кольцевая пятнистость томатов (ТВRV) [4, 5]. Поэтому одним из эффективных способов получения здоровых корнесобственных сортов являются методы биотехнологии, которые позволяют значительно сократить сроки получения полноценных растений и повысить эффективность размножения в условиях in vitro по сравнению с традиционными методами. Несмотря на то, что первые

положительные результаты культивирования in vitro косточковых плодовых растений рода Prunus на примере сливы (сорт Pandora) были получены более 40 лет назад, многие вопросы клонального микроразмножения, такие как подбор питательных сред, установление эффективных концентраций регуляторов роста, введение и культивирование эксплантов, регенерация in vitro, до сих остаются недостаточно изученными.

Цель настоящего исследования - испытать составы питательных сред и выявить оптимальные из них для разных этапов морфогенеза, определить соотношение и концентрации регуляторов роста, способствующих повышению коэффициента размножения микропобегов и ризогенеза черешни (P. avium) для разработки клонального микроразмножения.

Объекты и методы исследования

В качестве объектов исследования использовали сорта черешни с разными сроками созревания плодов: Рубиновая Ранняя, Сказка, Талисман, Анонс, Валерий Чкалов, Крупноплодная, Бигарро-Бурлат, Мелитопольская Черная, произрастающие в коллекционных насаждениях степного отделения НБС-ННЦ (п. Гвардейское, АР Крым) и в опытном хозяйстве «Мелитопольское» Института орошаемого садоводства им. Н.Ф. Сидоренко (г. Мелитополь). В исследованиях применяли как общепринятые, так и разработанные в отделе биотехнологии и биохимии растений НБС-ННЦ методы [1-3]. Опыты проводились в 2006-2008 гг. Экспланты помещали на поверхность агаризированной питательной среды в условиях ламинарного бокса Fatran Lf. Микропобеги культивировали на питательных средах Gamborg и Eveleigh (В5) [6], Quoirin и Lepoivre (QL) [10], в нашей модификации, и средах PS, Зу, Уч4, Чу4, Чу3, разработанных в отделе биотехнологии и биохимии растений НБС-ННЦ. Для изучения морфогенетических потенций органов и тканей в питательную среду добавляли 6-бензиламинопурин (БАП) в концентрациях 1,0-4,4 мкМ, гибберелловую кислоту (ГК3) - 0,152,89 мкМ, ß-3-индолилмасляную кислоту (ИМК) — 2,46-7,35 мкМ и а-нафтилуксусную кислоту (НУК) - 1,34-8,06 мкМ. Пробирки с эксплантами помещали в культуральную комнату с заданным режимом интенсивности освещения (2,0-2,5 клк), 16-часовым фотопериодом и температурой 24±1°С.

Результаты и обсуждение

Для снятия апикального доминирования и индукции образования множественных адвентивных микропобегов питательные среды PS, В5 и QL дополняли БАП и ГК3 в концентрации 1,0-4,4 мкМ и 0,44-2,89 мкМ соответственно. Появление адвентивных микропобегов отмечали через 25-30 суток культивирования эксплантов на питательных средах PS и В5 с добавлением 1,0-2,22 мкМ БАП и 1,44-2,89 мкМ ГК3 (рис. 1).

а б

Рис. 1. Образование дополнительных почек сорта Сказка на среде PS с ГК3: а - конгломерат микропобегов; б - разделенные микропобеги

На питательной среде PS, содержащей 1,0-2,22 мкМ БАП и 0,44-1,44 мкМ ГК3, микропобеги развивались через 40-60 суток культивирования. Образовавшиеся конгломераты микропобегов, высота которых достигала 0,4-0,6 см, а длина листьев не превышала 0,3-0,4 см, имели шаровидную форму.

Установлено, что с увеличением числа пассажей (до 6) коэффициент размножения возрастал. Дальнейшее пассирование приводило к постепенному угасанию процесса массового побегообразования. Однако на микропобегах, предварительно регенерировавших на

питательной среде с низкими концентрациями регуляторов роста, при повторном пассаже на среду, содержащую БАП и ГК3, вновь формировались дополнительные микропобеги (табл. 1).

Таблица 1

Зависимость коэффициента размножения микропобегов черешни сорта Сказка от длительности их культивирования и концентрации БАП и ГК3 в питательной среде

Номер пассажа Концентрация регуляторов роста (мкМ) и их соотношение Коэффициент размножения

БАП ГК3

2-3 1,0-2,22 0,44-1,44 1:6 - 1:7

4-5 2,22-4,44 1,44-2,89 1:8 - 1:9

6-7 1,0-2,22 0,44-1,44 1:3 - 1:1

8-9 1,0 0,15 0

10-11 1,0 0,15 1:1

12-13 1,0-2,22 0,44-1,44 1:1 - 1:2

14-15 1,0-2,22 0,44-1,44 1:3 - 1:5

Коэффициент размножения у сорта Сказка составлял 1:6-1:8. Значительно ниже он был отмечен у сортов Рубиновая Ранняя и Талисман - 1:2-1:3.

Установлено, что увеличение концентрации БАП и ГК3 (до 4,44 и 2,89 мкМ соответственно) способствовало интенсивной закладке дополнительных почек. Однако 10-35% сформированных на этой питательной среде адвентивных микропобегов не развивались. Кроме того, такое соотношение регуляторов роста приводило к оводнению тканей у эксплантов сортов Рубиновая Ранняя, Анонс и Талисман.

Снижение концентрации БАП в питательной среде до 1,0 мкМ и ГК3 до 0,15 мкМ уменьшало количество адвентивных микропобегов и способствовало их удлинению.

Проведенные опыты по черенкованию микропобегов в условиях in vitro показали, что сегменты с 1-2 междоузлиями продолжали развиваться на питательной среде PS, содержащей 1,0-2,22 мкМ БАП и 0,44-0,73 мкМ ГК3. Сегмент, изолированный с верхушечной (апикальной) части микропобега, регенерировал, вытягиваясь в длину. При этом на сегменте, взятом с базальной части побега, наблюдалось образование адвентивных микропобегов в соотношении 1:1-1:4. На питательных средах В5, QL и PS, дополненных 2,22-4,44 мкМ БАП и 0,44-1,44 мкМ ГК3, сегменты не развивались. Также выявлено, что развитие эксплантов черешни исследуемых сортов (вытягивание в длину, увеличение размеров листовой пластинки) на питательной среде QL происходило медленее по сравнению с вышеуказанными питательными средами.

Для индукции ризогенеза микропобеги длиной 1,6-2,2 см помещали на поверхность агаризированной среды, не содержащей БАП и ГК3. Из испытанных 4 составов питательных сред Зу, Уч4, Чу4, Чу3 успешное укоренение происходило на питательной среде Чу3 с добавлением ИМК в концентрации 2,46-7,35 мкМ и НУК 1,34-8,06 мкМ. Появление первых корней (до 6 штук) на регенеранте наблюдали у сортов Сказка, Валерий Чкалов и Талисман на 20-35 сутки культивирования (рис. 2).

Рис. 2. Ризогенез микропобегов черешни in vitro: а - регенеранты черешни с развитой корневой системой; б - развитая корневая система

Вместе с тем, на среде Чу3, одновременно с развитием корней, отмечено увядание верхних листьев, отмирание верхушечной части регенеранта.

Спустя 28-40 суток культивирования у регенерантов формировалась нормально развитая корневая система. Такие растения высаживали в стерильный субстрат на адаптацию в условия in vivo.

Выводы

Таким образом, экспериментально установлено соотношение ГК3 и БАП в питательной среде, их сочетание и концентрации, индуцирующие множественное адвентивное побегообразование черешни исследуемых сортов в культуре in vitro. Лучшие результаты регенерации микропобегов были получены на питательных средах PS и В5, дополненных 2,224,44 мкМ БАП и 0,73-2,1б мкМ ГК3. В результате изучения ризогенеза выявлена зависимость корнеобразования от регуляторов роста, а также от генотипа исходного растения-донора.

Список литературы

1. Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений. -М.: Шука., 19б4. - 272 с.

2. Калинин Ф.Л. Технология микроклонального размножения растений / Ф.Л. Калинин, Г.П. Кушнир, В.В. Сарнацкая. - К.: Шукова думка, 1992. - 232 с.

3. Методы биотехнологии в селекции и размножении субтропических и косточковых плодовых культур / Митрофанова О.В., Митрофанова И.В., Смыков А.В., Лесникова H.^ // Труды Шкот. ботан. сада. - 1999. - Т. 118. - С. 189-199.

4. Изучение вирусов и вирусных болезней косточковых плодовых культур на юге Украины и особенности оздоровления растений in vitro / Митрофанова О.В., Митрофанова И.В., Ежов ВЛ. и др. // Тр. Шкот. ботан. сада. - 2GG5. - Вып. 91 - С. 111-12G.

5. Вирусы, поражающие косточковые плодовые культуры, и биотехнологические пути создания устойчивых форм / Митрофанова О.В., Лесникова-Седошенко H.^, Митрофанова И.В., Кузнецова H^. // Бюресурси та вiруси: V Miжнар. конф. Кшв, 10-13 верес. 2007 р. - Кшв: Фггосоцюцентр, 2007. - С. 182.

6. Gamborg O.L., Eveleigh D.E. Culture methods and detection of glucanases in cultures of wheat and barley // Can. J. Biochem. - 19б8. - Vоl. 4б. - № 5. - Р. 417-421.

7. Gregor Osters, Luthar Zlata, Stampak Franci. The importance of the sterilization proceducing vigorous cherry plants (Prunus sp.) in vitro // Acta agriculturae slovenica. - 2GG4. - Vol. 83. - P. 45-51.

8. Sauer Annemarie. In vitro - Vermehrung verschiedener genotypen von Prunus avium L. // Gartenbauwissenschaft. - 1983. - Вd. 48. - S.124-127.

9. Snir Iona. In vitro micropropagation of sweet cherry cultivars // Hort. Science. - 1982. - Vol. 17. - № 2. - P. 735-73б.

1G. Quoirin M., Lepoivre Ph. Etude de milieux adaptés aux cultures in vitro de Prunus // Acta Hort. - 1977. - Vol. 78. - Р. 437-442.

11. Yang H. Einflub verschiedener Auxine auf die in vitro - Bewurzelung von Subkirschen // Gartenbauwissenschaft. - 1994. - Вd. 59. - S. 45-47.

Рекомендовано к печати д.б.н., проф. Митрофановой О.В.

РОСТОВАЯ И БИОСИНТЕТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ СУСПЕНЗИОННОЙ КУЛЬТУРЫ AGASTACHERUGOSA O. KUNTZE

Т.В. МАЗУР

Центральный ботанический сад HAH Беларуси, г.Минск, Республика Беларусь

Введение

В настоящее время для получения биологически активных веществ растительного происхождения успешно используют культуру клеток и тканей in vitro [1, 7, 1G]. При культивировании клеток in vitro возможно создание условий, позволяющих выделить отдельные новые штаммы клеток с устойчивой направленностью метаболизма на синтез веществ вторичного происхождения. Особое внимание уделяется исследованиям, в которых