ПРЕПАРАТ ДЛЯ ИНЪЕКЦИЙ НА ОСНОВЕ САПОНИНА B4 PULSATILLA
DRUG FOR INJECTION BASED ON SAPONIN B4 PULSATILLA

Область техники
Настоящее изобретение относится к области фармацевтических препаратов, в частности, относится к препарату для инъекций с сапонином B4 Pulsatilla в качестве активного ингредиента.
Предшествующий уровень техники
Китайский травяной лекарственный препарат китайского Radix Pulsatiliae представляет собой высушенный корень Pulsatilla chinensis (Bge.) Regel семейства Ranunculaceae, его впервые зарегистрировали в Shennong’s Classic of Materia Medica, и который представляет собой обычно применяемый традиционный китайский лекарственный препарат. Он обладает горьковато-мятным вкусом и применяется при простуде, обладает функциями охлаждения и детоксикации, снижения температуры крови и борьбы с дизентерией, а также высушивания влаги и уничтожения насекомых, а также его применяют для лечения дизентерии с кровью в кале вследствие токсичности при повышенной температуре тела, малярии с ознобом и лихорадкой, носового кровотечения и геморроя с кровью в кале. В современных фармакологических исследованиях продемонстрировано, что китайский Radix Pulsatiliae обладает широким диапазоном видов антибактериальной активности и обладает подавляющими эффектами в отношении Staphylococcus aureus, Bacillus dysteriae, дерматофитов, дрожжей, Candida albicans и так далее. Противоопухолевый эффект китайского Radix Pulsatiliae также представляет предмет особого интереса для изучения. Кроме того, китайский Radix Pulsatiliae обладает противовоспалительными функциями и функциями стимуляции иммунной системы.
Китайский Radix Pulsatiliae насыщен тритерпеновыми сапонинами. Сапонин B4 Pulsatilla принадлежит к люпиновому типу пентациклических тритерпеновых сапонинов, обладающих структурой формулы 1:
1.
Сапонин B4 Pulsatilla обладает сильной активностью. Например, в публикации китайской патентной заявки № CN105213410A (дата публикации: 6 января 2016 г.) раскрыто применение сапонина B4 Pulsatilla в качестве иммуномодулятора в лечении острого воспаления, включающего острое повреждение почек, острое повреждение печени и острое повреждение легких, вызванное сверхэкспрессией факторов воспаления. В качестве другого примера, в публикации китайской патентной заявки № CN105535004A (дата публикации: 4 мая 2016 г.) раскрыто применение соединения в качестве ингибитора вируса EV71 при получении лекарственных средств против энтеровирусного везикулярного стоматита.
Сапонин B4 Pulsatilla обладает пятью гликозильными группами и характеризуется хорошей растворимостью в воде. При изучении продемонстрировано, что если соединение вводят перорально (например, с помощью желудочного зонда в экспериментах с животными), эффективная доза является большой, что приводит к узкому интервалу безопасности. Следовательно, необходимо разработать препарат на основе сапонина B4 Pulsatilla для неперорального введения с целью облегчить активное действие в безопасном диапазоне доз для удовлетворения клинических медицинских потребностей. Однако до настоящего момента не было сообщений об инъекциях сапонина B4 Pulsatilla.
Краткое описание изобретения
С целью преодоления недостатков предшествующего уровня техники в настоящем изобретении предусмотрен препарат для инъекций на основе сапонина B4 Pulsatilla. Препарат стабилен и легок в получении. По сравнению с пероральным введением, эффективная доза препарата для инъекций на основе сапонина B4 Pulsatilla, чтобы обратить индуцированное цисплатином повреждение почек, снижена в 20 раз, что тем самым обеспечивает улучшение в отношении безопасности лекарственного средства, следовательно, данный препарат является перспективным для обеспечения новой альтернативы для клинического лечения повреждения почек и почечной недостаточности.
С целью достижения вышеуказанной цели в настоящем изобретении предусмотрено следующее техническое решение:
препарат для инъекций на основе сапонина B4 Pulsatilla, содержащий сапонин B4 Pulsatilla и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, где препарат представляет собой водный раствор для инъекций или лиофилизированный порошок для инъекций.
Предпочтительно препарат для инъекций на основе сапонина B4 Pulsatilla состоит из сапонина B4 Pulsatilla, фармацевтически приемлемого вспомогательного вещества и неизбежных примесей.
Предпочтительно препарат для инъекций на основе сапонина B4 Pulsatilla вводят путем внутримышечной инъекции и/или внутривенной инъекции; более предпочтительно путем внутривенной инъекции.
Предпочтительно препарат для инъекций на основе сапонина B4 Pulsatilla представляет собой водный раствор для инъекций, где фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество представляет собой воду для инъекций.
Предпочтительно массовая процентная доля сапонина B4 Pulsatilla в водном растворе для инъекций составляет 0,5-5%, более предпочтительно 2-3%.
В настоящем изобретении также предусмотрен способ получения водного раствора для инъекций, включающий растворение, обесцвечивание с помощью активированного угля, фильтрование, доведение до конечного объема, разлив и стерилизацию.
Предпочтительно конкретный способ получения водного раствора для инъекций предусматривает следующее:
отбор требуемого количества сапонина B4 Pulsatilla, точное взвешивание, добавление части воды для инъекций, перемешивание с полным растворением сапонина B4 Pulsatilla, затем добавление к раствору 0,1-0,5% активированного угля в пересчете на общую массу водного раствора для инъекций, нагревание до кипения, перемешивание в течение 15 минут, доведение до конечного объема водой для инъекций, тщательное перемешивание, фильтрование в горячем состоянии с помощью микропористой фильтрующей мембраны с диаметром пор 0,22 мкм для удаления активированного угля с получением тем самым промежуточного раствора; разлив и стерилизацию с получением водного раствора для инъекций.
В способе получения водного раствора для инъекций операцию разлива и стерилизации проводят в соответствии с общепринятым способом в данной области техники. Например, операция стерилизации может представлять собой стерилизацию горячим прессованием, стерилизацию при 115˚C в течение 30 мин. или стерилизацию при 121˚C в течение 15 мин.
Более предпочтительно препарат для инъекций на основе сапонина B4 Pulsatilla в соответствии с настоящим изобретением представляет собой лиофилизированный порошок для инъекций, фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество представляет собой вспомогательное вещество для получения лиофилизированной формы, которое представляет собой одно или более вспомогательных веществ (можно в любом соотношении), выбранных из группы, состоящей из лактозы, сахарозы и маннита.
Предпочтительно массовое соотношение сапонина B4 Pulsatilla и вспомогательного вещества для получения лиофилизированной формы в лиофилизированном порошке для инъекций составляет от 3:10 до 3:16.
Более предпочтительно массовое соотношение сапонина B4 Pulsatilla и вспомогательного вещества для получения лиофилизированной формы в лиофилизированном порошке для инъекций составляет 3:14.
Кроме того, вспомогательное вещество для получения лиофилизированной формы предпочтительно представляет собой маннит.
В настоящем изобретении также предусмотрен способ получения лиофилизированного порошка для инъекций, включающий стадии получения и лиофилизации промежуточного раствора.
Предпочтительно конкретное получение промежуточного раствора предусматривает следующее:
растворение сапонина B4 Pulsatilla в воде для инъекций, перемешивание с обеспечением растворения, добавление вспомогательного вещества для получения лиофилизированной формы в соответствии с массовым соотношением, перемешивание, доведение значения pH до 6,0-8,5, добавление 0,05-0,1% активированного угля в пересчете на общую массу промежуточного раствора, нагревание до 100˚C и перемешивание в течение 10-20 мин., охлаждение до комнатной температуры, добавление воды для инъекций до достижения концентрации сапонина B4 Pulsatilla, составляющей 0,5-5%, фильтрование с помощью микропористой фильтрующей мембраны с диаметром пор 0,22 мкм с получением промежуточного раствора.
Более предпочтительно конкретное получение промежуточного раствора предусматривает следующее:
растворение сапонина B4 Pulsatilla в воде для инъекций, перемешивание с обеспечением растворения, добавление вспомогательного вещества для получения лиофилизированной формы в соответствии с массовым соотношением, перемешивание, доведение значения pH до 6,5-8,0, добавление 0,05% активированного угля в расчете на общую массу промежуточного раствора, нагревание до 100˚C и перемешивание в течение 10-20 мин., охлаждение до комнатной температуры, добавление воды для инъекций до достижения концентрации сапонина B4 Pulsatilla, составляющей 2-3%, фильтрование с помощью микропористой фильтрующей мембраны с диаметром пор 0,22 мкм с получением промежуточного раствора.
Предпочтительно лиофилизация промежуточного раствора включает предварительное замораживание, сублимацию и десорбционное высушивание; при этом температура предварительного замораживания составляет от -30˚C до -15˚C; вакуумметрическое давление во время стадии сублимации и десорбционного высушивания составляет 0,5-10 Па; температура сублимации составляет от -10˚C до 0˚C; и температура десорбционного высушивания составляет от 25˚C до 30˚C;
Более предпочтительно вакуумметрическое давление во время стадии сублимации и десорбционного высушивания составляет 5-10 Па.
Более предпочтительно температура сублимации составляет -10˚C.
В качестве предпочтительного варианта осуществления конкретная операция лиофилизации предусматривает следующее:
разлив промежуточного раствора, перенос в морозильную камеру, снижение температуры до значения от -30˚C до -15˚C со скоростью 3,0-5,0˚C/мин. или 1,0-1,5˚C/мин. и замораживание при данной температуре в течение 8-10 часов; затем помещение в закрытую камеру, равномерное повышение температуры до значения от -10˚C до 0˚C со скоростью 25-30˚C/3 ч. при вакуумметрическом давлении 0,5-10 Па, выдерживание при данной температуре в течение 8-10 ч., повышение температуры до значения от 25˚C до 30˚C со скоростью 1,0-1,5˚C/мин. при том же значении вакуумметрического давления и выдерживание при данной температуре в течение 4-6 часов.
В качестве более предпочтительного варианта осуществления конкретная операция лиофилизации предусматривает следующее:
разлив промежуточного раствора, перенос в морозильную камеру, снижение температуры до значения от -30˚C до -20˚C со скоростью 3,0-5,0˚C/мин. или 1,0-1,5˚C/мин. и замораживание при данной температуре в течение 8 часов; затем помещение в закрытый контейнер, равномерное повышение температуры до -10˚C со скоростью 25-30˚C/3 ч. при вакуумметрическом давлении 5-10 Па, выдерживание при данной температуре в течение 8 ч., повышение температуры до 25˚C со скоростью 1,0-1,5˚C/мин. при том же значении вакуумметрического давления и выдерживание при данной температуре в течение 4 часов.
В настоящем изобретении также предусмотрен лиофилизированный порошок для инъекций на основе сапонина B4 Pulsatilla, полученный с помощью данного способа получения.
Кроме того, в настоящем изобретении также предусмотрено применение препарата для инъекций на основе сапонина B4 Pulsatilla, водного раствора для инъекций на основе сапонина B4 Pulsatilla или лиофилизированного порошка для инъекций на основе сапонина B4 Pulsatilla, полученных посредством способа получения, для получения лекарственных средств, предназначенных для лечения острого повреждения почек, хронической почечной недостаточности и/или почечной недостаточности.
«Неизбежные примеси» в описании настоящего изобретения включают вещества, образующиеся посредством деградации небольшого количества сапонина B4 Pulsatilla, и небольшое количество воды в лиофилизированном порошке для инъекций на основе сапонина B4 Pulsatilla. Хотя неизбежные примеси присутствуют, их содержание должно удовлетворять предельным значениям содержания в фармакопее.
Препарат для инъекций на основе сапонина B4 Pulsatilla в соответствии с настоящим изобретением вводят млекопитающим, в частности, людям. Если препарат вводят человеку, суточная доза составляет 2-120 мг для взрослого с весом тела 60 кг.
Водный раствор для инъекций на основе сапонина B4 Pulsatilla или лиофилизированный порошок для инъекций на основе сапонина B4 Pulsatilla применяется путем внутримышечной инъекции или внутривенной инъекции сапонина B4 Pulsatilla, и при этом обеспечивается попадание активного ингредиента в кровеносную систему в его исходной форме и распространение по различным органам тела, особенно почкам и легким и т. д., в которых обеспечивается эффективное действие сапонина B4 Pulsatilla при более низкой дозе, тем самым обеспечивается расширение интервала безопасности для лечения и, наконец, обеспечивается безопасность лекарственного препарата.
Сапонин B4 Pulsatilla обладает хорошей растворимостью в воде, и его легко получать в виде водного раствора для инъекций; но его стабильность изменяется в случае различных растворителей, следовательно, растворитель для водного раствора для инъекций необходимо тщательно исследовать и выбирать.
Сапонин B4 Pulsatilla сам по себе и его водный раствор чувствительны к температуре и свету; например, после помещения водного раствора сапонина B4 Pulsatilla на 14 дней при 60˚C чистота сапонина B4 Pulsatilla снизилась с 98,90% в день 0 до 93%, общее содержание примесей повысилось с 0,64% в день 0 до 0,94%. Лиофилизированный порошок для инъекций на основе сапонина B4 Pulsatilla является предпочтительным, так как низкое содержание воды является более благоприятным для стабильности препарата.
Однако, учитывая сложность лиофилизированной дисперсной системы, нелегко получать порошок для инъекций эффективно и быстро, чтобы удовлетворять требованиям для инъекций. До настоящего времени окончательная теория в отношении выбора лиофилизированного состава еще не сформирована, и необходимы отдельные или совместные исследования различных факторов, которые могут оказывать влияние на поведение при лиофилизации и эффект лиофилизации. Вспомогательные вещества и другие добавки в лиофилизированном составе будут взаимодействовать с активными ингредиентами, и композиция и концентрация состава будут в значительной степени оказывать влияние на отвердевание во время замораживания и поведение при дегидратации во время стадии сублимации в системе, например, на температуру перехода к стеклованию при максимальной концентрации во время замораживания (важный показатель для измерения того, происходит ли разрушение во время высушивания), минимальную температуру замораживания, скорость охлаждения и время отжига при замораживании и т. д. Кроме того, тип и концентрация добавок будут в значительной степени оказывать влияние на время, затрачиваемое на стадии высушивания, и свойства конечного продукта. В настоящем изобретении такие параметры, как тип и количество вспомогательных веществ для получения лиофилизированной формы, значение pH промежуточного раствора, температура предварительного замораживания, способ предварительного замораживания, температура сублимации, вакуумметрическое давление и температура десорбционного высушивания исследуют по отдельности или в комбинации для получения наиболее предпочтительных параметров с получением тем самым лиофилизированного порошка для инъекций на основе сапонина B4 Pulsatilla с желаемыми физическими свойствами, хорошей повторной растворимостью и стабильным качеством.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение дополнительно поясняется со ссылкой на конкретные примеры ниже. Специалисты в данной области техники поймут, что данные примеры применяются только для иллюстрации настоящего изобретения, но не для ограничения объема настоящего изобретения каким-либо образом.
Если не указано иное, экспериментальные способы в следующих примерах являются общепринятыми способами. Если не указано иное, материалы для лечения и реагенты и т. д. в следующих примерах являются коммерчески доступными. Источники некоторых реагентов и исходных материалов показаны следующим образом:
сапонин B4 Pulsatilla: полученный самостоятельно, с чистотой не менее 98%, определенной с помощью HPLC;
маннит (для инъекций): F949A, Guangxi Nanning Chemistry & Pharmaceutical Co., Ltd.;
глюкоза (для инъекций): P20160118, Beijing Fengli Jingqiu Pharmaceutical Co., Ltd.;
сахароза (для инъекций): Lot No. 20150701, J.TBaker;
вода для инъекций: полученная самостоятельно;
магнитный перемешиватель: IKA Model: R015PS25;
лиофилизатор: GZLY-1.0, Beijing Songyuan Huaxing Technology Development Co., Ltd.
Содержание сапонина B4 Pulsatilla в следующих экспериментальных примерах и примерах определяли в соответствии со следующим способом.
Условия хроматографии
18
Хроматографическая колонка: C, 250 мм×4,6 мм, 5 мкм
Подвижная фаза: ацетонитрил-вода (26:74）(объемное соотношение)
Скорость потока: 1,0 мл/мин.
Длина волны: 201 нм
Получение контрольного раствора
Отбирали соответствующее количество контрольного образца сапонина B4 Pulsatilla, точно взвешивали, помещали в мерную колбу объемом 10 мл, добавляли до метки метанол для растворения и разбавления, раствор хорошо встряхивали и фильтровали с получением раствора с концентрацией 1 мг контрольного образца сапонина B4 Pulsatilla/1 мл раствора.
Получение тестируемого раствора
Отбирали приблизительно 25 мг тестируемого образца, точно взвешивали, помещали в мерную колбу объемом 25 мл, добавляли до метки подвижную фазу для растворения и разбавления, раствор хорошо встряхивали и фильтровали через микропористую мембрану с диаметром пор 0,22 мкм, фильтрат отбирали с получением тестируемого образца.
Способ определения
Отбирали 10 мкл тестируемого раствора и вводили в жидкостный хроматограф, хроматограмму регистрировали.
Формула расчета была следующей:
где:
контрольного образца
C - концентрация контрольного образца (мг/мл);
контрольного образца
S - чистота контрольного образца;
контрольного образца
A - площадь основного пика контрольного раствора;
тестируемого образца
A - площадь основного пика тестируемого раствора.
Экспериментальный пример 1. Эффективность сапонина B4 Pulsatilla при различных путях введения
Сапонин B4 Pulsatilla параллельно вводили перорально и внутривенно, исследовали эффект сапонина B4 Pulsatilla при различных путях введения в отношении острого нефрита в сыворотке крови мышей, стимулируемых цисплатином (CDDP).
1. Материалы для эксперимента
1.1. Животные: мыши линии ICR, 16-18 г, самцы, Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd., разрешение №  SCXK(Xiang)2016-0002.
1.2. Реагенты: цисплатин, 5 мг/кг исходного раствора, который получали в виде раствора с концентрацией 1,5 мг/мл посредством добавления подходящего количества физиологического раствора в цисплатин перед использованием для последующего применения.
1.3. Лекарственные средства: сапонин B4 Pulsatilla (полученный самостоятельно, далее в данном документе называемый «B4»), № партии: 20161107; дексаметазон, 0,75 г/таблетка, Anhui Golden Sun Biochemical Pharmaceutical Co., Ltd., № партии: 15032521.
Все лекарственные средства получали в виде раствора с указанной концентрацией в соответствии с разделом «Способ тестирования» с применением бидистиллированной воды и вводили требуемым способом.
1.4. Приборы: настольная низкоскоростная центрифуга; автоматический биохимический анализатор
2. Способ тестирования
2.1. Подготовка к получению эталонных групп: всех животных пронумеровывали и взвешивали.
2.2. Способ проведения исследования: эталонным животным вводили цисплатин при дозе 15 мл/кг, мышам в нормальной группе интраперитонеально вводили физиологический раствор и мышам в других группах интраперитонеально вводили цисплатин.
2.3. Распределение по группам и введение: животных произвольным образом разделяли на семь групп по 10-12 животных в каждой группе.
① Нормальная группа: бидистиллированную воду вводили с помощью желудочного зонда при дозе 20 мл/кг веса тела.
② Эталонная группа: равный объем физиологического раствора вводили в хвостовую вену.
③ Дексаметазон-положительная группа (0,5 мг/кг веса тела), раствор дексаметазона вводили с помощью желудочного зонда при дозе 20 мл/кг веса тела.
④ Группа с высокой дозой B4, введенной внутривенно (5 мг/кг веса тела), раствор B4 вводили в хвостовую вену при дозе 5 мл/кг веса тела.
⑤ Группа с низкой дозой B4, введенной внутривенно (2,5 мг/кг веса тела), раствор B4 вводили в хвостовую вену при дозе 5 мл/кг веса тела.
⑥ Группа с высокой дозой B4, введенной с помощью желудочного зонда (100 мг/кг веса тела), раствор B4 вводили с помощью желудочного зонда при дозе 20 мл/кг веса тела.
⑦ Группа с низкой дозой B4, введенной с помощью желудочного зонда (50 мг/кг веса тела), раствор B4 вводили с помощью желудочного зонда при дозе 20 мл/кг веса тела.
Лекарственные средства вводили непрерывно в течение 4 дней со дня проведения исследования.
2.4. Определение показателей
Мочу собирали через 0,5 часа после последнего введения и измеряли количество белка в моче; кровь собирали из глазного яблока через 1 час после введения, и цельную кровь мышей помещали в условия комнатной температуры на 2 часа, центрифугировали при 3500 об./мин. в течение 15 минут, 200 мкл супернатанта измеряли с помощью автоматического биохимического анализатора для определения общего содержания белка (TP), азота мочевины (BUN) и креатинина (Cre).
3. Результаты тестирования
Определение результатов различных показателей в каждой группе показано в таблице 1.
Таблица 1. Эффекты B4 в отношении индуцированного цисплатином острого повреждения почек у мышей (SD±среднее значение)
#: по сравнению с нормальной группой, P<0,05; *: по сравнению с эталонной группой, P<0,05.
Данные из таблицы 1 указывали на следующее.
① По сравнению с нормальной группой уровни белка в моче, азота мочевины (BUN) и креатинина (Cre) в сыворотке крови в эталонной группе повышались в значительной степени (P<0,05), это указывает на то, что эталонная группа успешно установлена.
② По сравнению с эталонной группой уровни азота мочевины (BUN) и белка в моче в группе положительного контроля снижались в значительной степени (P<0,05).
③ По сравнению с эталонной группой, когда B4 вводили внутривенно при 5 мг/кг веса тела, уровни азота мочевины (BUN) и креатинина (Cre) в значительной степени снижались (P<0,05). Хотя значительная разница отсутствует, уровень белка в моче демонстрирует тенденцию к снижению.
④ По сравнению с эталонной группой, когда B4 вводили с помощью желудочного зонда при 100 мг/кг веса тела, только уровень азота мочевины (BUN) снижался у мышей в значительной степени (P<0,05).
4. Заключение
Сапонин B4 Pulsatilla обладает эффектом против индуцированного цисплатином повреждения почек, это указывает на то, что он обладает перспективами для разработки в качестве лекарственного средства для лечения острого и хронического нефрита и почечной недостаточности в клинических условиях. И путь введения сапонина B4 Pulsatilla оказывает значительный эффект в отношении его эффективности, где эффекты B4, введенного внутривенно при дозе 5 мг/кг·веса тела более выражены, чем при введении с помощью желудочного зонда при дозе 100 мг/кг·веса тела, чтобы обратить показатели патологического функционирования почек, вызванного цисплатином, в то время как доза снижается в по меньшей мере 20 раз. Следовательно, введение путем инъекции, особенно путем внутривенной инъекции, имеет большое значение для улучшения в отношении эффективности и безопасности сапонина B4 Pulsatilla.
Пример 1. Водный раствор для инъекций на основе сапонина B4 Pulsatilla
Состав 100 мл водного раствора для инъекций в примере была следующим.
Препарат для инъекций получали посредством способа, приведенного ниже.
Отбирали указанное в составе количество сапонина B4 Pulsatilla и точно взвешивали, добавляли (соответствующее количество) часть воды для инъекций, исходный материал, представляющий собой сапонин B4 Pulsatilla, полностью растворяли при перемешивании с помощью магнитного перемешивателя, добавляли в раствор 0,10% активированного угля в пересчете на общую массу раствора, затем нагревали и перемешивали при 100˚C на водяной бане в течение 15 мин., разбавляли водой для инъекций до 100 мл, хорошо встряхивали, фильтровали с помощью микропористой фильтрующей мембраны с диаметром пор 0,22 мкм для удаления активированного угля, точно отмеряли 2 мл промежуточного раствора и переливали в ампулу объемом 5 мл, и стерилизовали при 115˚C в течение 30 мин., затем получали водный раствор для инъекций.
Экспериментальный пример 2. Исследование способа лиофилизации порошка на основе сапонина B4 Pulsatilla
1.1. Тестирование совместимости исходных материалов и вспомогательных веществ
Исходный материал сапонина B4 Pulsatilla смешивали с различными вспомогательными веществами (водой для инъекций, физиологическим раствором, маннитом, лактозой, сахарозой и глюкозой) в соотношении 1:5 (по массе) и затем помещали в условия высокой температуры (60˚C и 40˚C) и освещения (4500 люкс ± 500), образцы отбирали в дни 0, 7 и 14 для исследования чистоты сапонина B4 Pulsatilla и родственных веществ. Результаты показаны в таблице 2, таблице 3 и таблице 4.
Таблица 2. Результаты тестирования совместимости исходных материалов и вспомогательных веществ в день 0
*
:API представляет собой сапонин B4 Pulsatilla, следующий API имеет такое же значение.
Данные в таблице 2 указывают на то, что чистота сапонина B4 Pulsatilla во всей композиции, содержащей исходные материалы и вспомогательные вещества, была эквивалентной в день 0, и не было очевидной разницы в содержании родственных веществ.
Таблица 3. Результаты тестирования совместимости исходных материалов и вспомогательных веществ в день 7
Данные в таблице 3 указывают на то, что сапонин B4 Pulsatilla сам по себе и в композиции с различными вспомогательными веществами более чувствителен к температуре и освещению, на его стабильность при высокой температуре (60˚C), в частности, оказывали влияние вода для инъекций, физиологический раствор и глюкоза.
Таблица 4. Результаты тестирования совместимости исходных материалов и вспомогательных веществ в день 14
По сравнению с результатами в день 7 чистота сапонина B4 Pulsatilla самого по себе и в композиции с маннитом, сахарозой и лактозой соответственно в дальнейшем в значительной степени не снижалась при 60˚C, это указывает на то, что сапонин имеет тенденцию к стабильности; однако значения чистоты сапонина B4 в воде для инъекций или физиологическом растворе и в композиции с глюкозой в дальнейшем снижались, это указывает на то, что сапонин все еще деградировал.
Результаты тестирования совместимости исходных материалов и вспомогательных веществ указывают на то, что совместимость сапонина B4 Pulsatilla с различными вспомогательными веществами была достаточно хорошей в условиях 40˚C и при освещении, чистота и содержание родственных веществ не имели очевидных изменений и были относительно стабильными. Однако основные активные ингредиенты деградировали с различной степенью, когда исходные материалы сапонина B4 Pulsatilla смешивали с водой для инъекций, физиологическим раствором или глюкозой при 60˚C; следовательно, в случае водного раствора для инъекций или лиофилизированного порошка для инъекций на основе сапонина B4 Pulsatilla необходимо избегать воздействия высокой температуры в течение длительного периода времени во время изготовления, хранения и транспортировки.
1.2. Выбор вспомогательных веществ
Обычно применяемые вспомогательные вещества для получения лиофилизированной формы включают лактозу, маннит, сахарозу и глюкозу. Сапонин B4 Pulsatilla, маннит, лактозу, глюкозу и сахарозу взвешивали соответственно в соответствии с составом, показанным в таблице 5, и получали промежуточный раствор и лиофилизировали с применением следующего способа:
сапонин B4 Pulsatilla растворяли в подходящем количестве воды для инъекций, перемешивали с обеспечением растворения, добавляли вспомогательные вещества для получения лиофилизированной формы, перемешивали, значение pH доводили до ~7,0, добавляли 0,05 г активированного угля, раствор нагревали и перемешивали при 100˚C в течение 15 мин., охлаждали до комнатной температуры, добавляли воду для инъекций до 100 г, фильтровали с помощью микропористой фильтрующей мембраны с диаметром пор 0,22 мкм с получением промежуточного раствора. Точно отмеряли 2 мл промежуточного раствора и переливали во флакон объемом 10 мл, температуру снижали до -20˚C со скоростью 5,0˚C/мин. в приборе для замораживания, флакон замораживали при данной температуре в течение 8 часов; затем переносили в лиофилизатор, температуру повышали до -10˚C с постоянной скоростью 25˚C/3 ч. при вакуумметрическом давлении 5 Па и поддерживали в течение 8 ч., температуру повышали до 25˚C со скоростью 1,0˚C/мин. при том же значении вакуумметрического давления и поддерживали в течение 6 ч.
Наблюдали физические свойства лиофилизированного продукта, полученного в соответствии с различными составами, и исследовали чистоту сапонина B4 Pulsatilla и содержание родственных веществ в одно и то же время. Результаты показаны в таблице 6.
Таблица 5. Составы
Таблица 6. Результаты отбора вспомогательных веществ
Из результатов, показанных в таблице 6, можно увидеть, что сапонин B4 Pulsatilla деградировал с различной степенью после лиофилизации при применении в качестве вспомогательного вещества лактозы, сахарозы или глюкозы, порядок деградации был следующим: глюкоза > сахароза > лактоза; однако когда в качестве вспомогательного вещества применяли маннит, его содержание и содержание родственных веществ не изменялось в значительной степени. Следовательно, сахароза, лактоза или маннит были предпочтительными в качестве вспомогательных веществ для получения лиофилизированной формы, и маннит был наиболее предпочтительным.
1.3. Выбор количества вспомогательных веществ
Сапонин B4 Pulsatilla и маннит взвешивали соответственно в соответствии с составом, показанным в таблице 7, получали промежуточный раствор и лиофилизировали с применением следующего способа:
сапонин B4 Pulsatilla растворяли в подходящем количестве воды для инъекций, перемешивали с обеспечением растворения, добавляли маннит, перемешивали, значение pH доводили до ~7,0, добавляли 0,05 г активированного угля, раствор нагревали и перемешивали при 100˚C в течение 15 мин., охлаждали до комнатной температуры, добавляли воду для инъекций до 100 г, фильтровали с помощью микропористой фильтрующей мембраны с диаметром пор 0,22 мкм с получением промежуточного раствора. Точно отмеряли 2 мл промежуточного раствора и переливали во флакон объемом 10 мл, температуру снижали до -20˚C со скоростью 5,0˚C/мин. в камере для замораживания, флакон замораживали при данной температуре в течение 8 часов; затем переносили в лиофилизатор, температуру повышали до -10˚C с постоянной скоростью 25˚C/3 ч. при вакуумметрическом давлении 5 Па и поддерживали в течение 8 ч., температуру повышали до 25˚C со скоростью 1,0˚C/мин. при том же значении вакуумметрического давления и поддерживали в течение 6 ч.
Наблюдали физические свойства лиофилизированного продукта, полученного в соответствии с различными составами, и исследовали чистоту сапонина B4 Pulsatilla и содержание родственных веществ. Результаты показаны в таблице 7.
Таблица 7. Составы для выбора дозировки вспомогательного вещества и результаты
Из результатов, показанных в таблице 7, можно увидеть, что большое количество маннита не является лучшим, его необходимо контролировать в подходящем диапазоне. Когда массовое соотношение B4 и маннита составляет от 3:10 до 3:14, стабильность B4 имеет тенденцию к повышению с повышением количества маннита; после этого, когда количество маннита дополнительно повышается, деградация B4 в лиофилизированном продукте ускоряется. Следовательно, предпочтительно, чтобы массовое соотношение сапонина B4 Pulsatilla и маннита по настоящему изобретению составляло от 3:10 до 3:16, наиболее предпочтительно 3:14.
1.4. Выбор значения pH промежуточного раствора
Сапонин B4 Pulsatilla относительно чувствителен к значению pH, и степень его деградации изменяется со значением pH. Следовательно, исследовали деградацию сапонина B4 Pulsatilla при различных значениях pH, соответственно выбирали оптимальный диапазон значений pH. Конкретные экспериментальные стадии предусматривали следующее:
8 частей сапонина B4 Pulsatilla и маннита взвешивали соответственно согласно составу F8 в таблице 7. Сапонин B4 Pulsatilla растворяли в подходящем количестве воды для инъекций, перемешивали с обеспечением растворения, добавляли маннит, перемешивали, значение pH доводили в соответствии с таблицей 8, добавляли 0,05 г активированного угля, раствор нагревали и перемешивали при 100˚C в течение 15 мин., охлаждали до комнатной температуры, добавляли воду для инъекций до 100 г; фильтровали с помощью микропористой фильтрующей мембраны с диаметром пор 0,22 мкм с получением промежуточного раствора. Отмеряли 2 мл промежуточного раствора во флакон объемом 10 мл, температуру снижали до -20˚C со скоростью 5,0˚C/мин. в морозильной камере, флакон замораживали при данной температуре в течение 8 часов; затем переносили в лиофилизатор, температуру повышали до -10˚C с постоянной скоростью 25˚C/3 ч. при вакуумметрическом давлении 5 Па и поддерживали в течение 8 ч., температуру повышали до 25˚C со скоростью 1,0˚C/мин. при том же значении вакуумметрического давления и поддерживали в течение 6 ч.
Результаты показаны в таблице 8.
Таблица 8. Результаты тестирования различных условий pH
Из результатов, показанных в таблице 8, можно увидеть, что принимая содержание связанных веществ в качестве показателя, значение pH промежуточного раствора предпочтительно составляет от 6,0 до 8,5 и наиболее предпочтительно от 6,5 до 8.0.
1.5. Выбор количества активированного угля
Исследовали эффект количества активированного угля и время поглощения основного ингредиента, конкретные стадии предусматривают следующее.
Взвешивали соответственно 3 части сапонина B4 Pulsatilla и маннита согласно составу F8 в таблице 7. Сапонин B4 Pulsatilla растворяли в соответствующем количестве воды для инъекций, перемешивали с обеспечением растворения, добавляли маннит, перемешивали, добавляли воду для инъекций до 100 мл, значение pH доводили до ~7,0, определяли чистоту сапонина B4 Pulsatilla; затем в раствор добавляли активированный уголь в соответствии с таблицей 8, нагревали и перемешивали при 100˚C в течение 15 мин., охлаждали до комнатной температуры, часть раствора фильтровали с помощью микропористой фильтрующей мембраны с диаметром пор 0,22 мкм и определяли значение pH фильтрата и чистоту сапонина B4 Pulsatilla; оставшийся раствор перемешивали при 100˚C до полного поглощения, продолжавшегося в течение 30 мин., часть раствора фильтровали с помощью микропористой фильтрующей мембраны с диаметром пор 0,22 мкм и определяли значение pH фильтрата и чистоту сапонина B4 Pulsatilla.
Результаты показаны в таблице 9.
Таблица 9. Результаты тестирования эффекта количества активированного угля и продолжительности поглощения в отношении основного ингредиента
Результаты в таблице 9 показывают, что повышение количества активированного угля и увеличение продолжительности поглощения приведет к снижению чистоты сапонина B4 Pulsatilla. Следовательно, в пересчете на объем промежуточного раствора, количество (масса) активированного угля предпочтительно составляет 0,05-0,1%, более предпочтительно 0,05%.
1.6. Исследование способа лиофилизации
Способ лиофилизации непосредственно оказывает влияние на физические свойства, скорость повторного растворения, влажность и стабильность продукта. Следовательно, исследовали параметры температуры предварительного замораживания, способа предварительного замораживания, температуры сублимации, вакуумметрического давления и температуры десорбционного высушивания, конкретные стадии предусматривают следующее.
Взвешивали 4 части сапонина B4 Pulsatilla и маннита соответственно согласно составу F8 в таблице 7. Сапонин B4 Pulsatilla растворяли в подходящем количестве воды для инъекций, перемешивали с обеспечением растворения, добавляли маннит, перемешивали, значение pH доводили до ~7, добавляли 0,05 г активированного угля, раствор нагревали и перемешивали при 100˚C в течение 15 мин., охлаждали до комнатной температуры, добавляли воду для инъекций до 100 г; фильтровали с помощью микропористой фильтрующей мембраны с диаметром пор 0,22 мкм с получением промежуточного раствора. Точно отмеряли 2 мл промежуточного раствора и переливали во флакон объемом 10 мл, флакон замораживали в морозильной камере в соответствии с параметрами и условиями в таблице 10; затем переносили в лиофилизатор, сублимацию и десорбционное высушивание проводили в соответствии с параметрами и условиями в таблице 10. Наблюдали физические свойства лиофилизированного продукта, определяли содержание родственных веществ, а также проводили тестирование повторного растворения и регистрировали время повторного растворения. Результаты показаны в таблице 10.
Таблица 10. Результаты тестирования эффекта различных параметров способа лиофилизации в отношении лиофилизированных продуктов
Из результатов, показанных в таблице 10, можно увидеть, что вакуумметрическое давление во время стадии сублимации и десорбционного высушивания является ключевым параметром. Если вакуумметрическое давление слишком низкое (например, 0,1 Па в способе 3), полученный лиофилизированный продукт обладает худшими физическими свойствами и высоким содержанием воды, и содержание родственных веществ в значительной степени выше, чем в продуктах, полученных другими способами, это указывает на то, что сапонин B4 Pulsatilla является более деградированным. Следовательно, вакуумметрическое давление составляет предпочтительно от 0,5 до 10 Па и более предпочтительно от 5 до 10 Па.
Предпочтительно стадии лиофилизации в соответствии с настоящим изобретением предусматривают следующее.
Промежуточный раствор разливали, температуру снижали до значения от -30˚C до -15˚C со скоростью 3-5˚C/мин. или 1,0-1,5˚C/мин. и раствор замораживали при данной температуре в течение 8-10 часов; затем помещали в закрытую камеру, температуру повышали до значения от -10˚C до 0˚C с постоянной скоростью 25-30˚C/3 ч. при вакуумметрическом давлении 0,5-10 Па и поддерживали в течение 8-10 ч, температуру повышали до значения от 25˚C до 30˚C со скоростью 1,0-1,5˚C/мин. при том же значении вакуумметрического давления и поддерживали в течение 4-6 часов.
Предпочтительно стадии лиофилизации в соответствии с настоящим изобретением предусматривают следующее.
Промежуточный раствор разливали, температуру снижали до значения от -30˚C до -20˚C со скоростью 3,0-5,0˚C/мин. или 1,0-1,5˚C/мин. в морозильной камере и раствор замораживали при данной температуре в течение 8-10 часов; затем помещали в закрытую камеру, температуру повышали до -10˚C с постоянной скоростью 25-30˚C/3 ч. при вакуумметрическом давлении 5-10 Па и поддерживали в течение 8 ч., температуру повышали до значения от 25˚C до 30˚C со скоростью 1,0-1,5˚C/мин. при том же значении вакуумметрического давления и поддерживали в течение 4 ч.
На основе результатов настоящего экспериментального примера лиофилизированный порошок для инъекций на основе сапонина B4 Pulsatilla в соответствии с настоящим изобретением содержит сапонин B4 Pulsatilla и вспомогательное вещество для получения лиофилизированной формы, где вспомогательное вещество для получения лиофилизированной формы представляет собой одно или более вспомогательных веществ в любом соотношении, выбранных из группы, состоящей из маннита, сахарозы и лактозы, предпочтительно маннит; и массовое соотношение сапонина B4 Pulsatilla и вспомогательного вещества для получения лиофилизированной формы составляет от 3:10 до 3:16, более предпочтительно 3:14.
Предпочтительно лиофилизированный порошок для инъекций на основе сапонина B4 Pulsatilla содержит сапонин B4 Pulsatilla и вспомогательное вещество для получения лиофилизированной формы в массовом соотношении от 3:10 до 3:16 и, кроме того, содержит небольшое количество неизбежных примесей, таких как вода и продукты деградации сапонина B4 Pulsatilla.
Способ получения лиофилизированного порошка для инъекций на основе сапонина B4 Pulsatilla в соответствии с настоящим изобретением предусматривает следующее.
I. Получение промежуточного раствора
Сапонин B4 Pulsatilla растворяли в подходящем количестве воды для инъекций, перемешивали с обеспечением растворения, добавляли вспомогательное вещество для получения лиофилизированной формы в соответствии с весовым соотношением, перемешивали, значение pH доводили до 6,0-8,5, к раствору добавляли 0,05-0,1% активированного угля в пересчете на общую массу промежуточного раствора, нагревали и перемешивали при 100˚C в течение 10-20 мин., охлаждали до комнатной температуры, добавляли воду для инъекций до достижения концентрации сапонина B4 Pulsatilla 0,5-5% и фильтровали с помощью микропористой фильтрующей мембраны с диаметром пор 0,22 мкм с получением промежуточного раствора;
II. Лиофилизация
Промежуточный раствор, полученный на стадии I, разливали, переносили в морозильную камеру, температуру снижали до значения от -30˚C до -15˚C со скоростью 3,0-5,0˚C/мин. или 1,0-1,5˚C/мин. и раствор замораживали при данной температуре в течение 8-10 часов; затем помещали в закрытую камеру, температуру повышали до значения от -10˚C до 0˚C с постоянной скоростью 25-30˚C/3 ч. при вакуумметрическом давлении 0,5-10 Па и поддерживали в течение 8-10 ч., температуру повышали до значения от 25˚C до 30˚C со скоростью 1,0-1,5˚C/мин. при том же значении вакуумметрического давления и поддерживали в течение 4-6 часов.
Предпочтительно способ получения предусматривает следующее.
I. Получение промежуточного раствора
Сапонин B4 Pulsatilla растворяли в воде для инъекций, перемешивали с обеспечением растворения, добавляли вспомогательные вещества для получения лиофилизированной формы в соответствии с весовым соотношением, перемешивали, значение pH доводили до 6,5-8,0, в раствор добавляли 0,05% активированного угля в пересчете на общую массу промежуточного раствора, нагревали и перемешивали при 100˚C в течение 10-20 мин., охлаждали до комнатной температуры, добавляли воду для инъекций до достижения концентрации сапонина B4 Pulsatilla 2-3% и фильтровали с помощью микропористой фильтрующей мембраны с диаметром пор 0,22 мкм с получением промежуточного раствора;
II. Лиофилизация
Промежуточный раствор, полученный на стадии I, разливали; переносили в морозильную камеру, температуру снижали до значения от -30˚C до -20˚C со скоростью 3,0-5,0˚C/мин. или 1,0-1,5˚C/мин. и раствор замораживали при данной температуре в течение 8 часов; затем помещали в закрытую камеру, температуру повышали до -10˚C с постоянной скоростью 25-30˚C/3 ч. при вакуумметрическом давлении 5-10 Па и поддерживали в течение 8 ч., температуру повышали до 25˚C со скоростью 1,0-1,5˚C/мин. при том же значении вакуумметрического давления и поддерживали в течение 4 ч.
Пример 2. Лиофилизированный порошок для инъекций на основе сапонина B4 Pulsatilla
Состав промежуточного раствора:
Лиофилизированный порошок для инъекций получали посредством способа, приведенного ниже.
I. Получение промежуточного раствора
Отбирали требуемое количество сапонина B4 Pulsatilla и точно взвешивали, добавляли подходящее количество воды для инъекций, исходный материал, представляющий собой сапонин B4 Pulsatilla, полностью растворяли при перемешивании с помощью магнитного перемешивателя, в данный раствор добавляли требуемое количество маннита, перемешивали для полного растворения и перемешивание продолжали в течение приблизительно 10 минут, добавляли 0,05 г активированного угля, затем систему нагревали и перемешивали на водяной бане при 100˚C в течение 15 мин., охлаждали до комнатной температуры, добавляли воду для инъекций до 100 мл, хорошо встряхивали, фильтровали с помощью микропористой фильтрующей мембраны с диаметром пор 0,22 мкм для удаления активированного угля, затем получали промежуточный раствор.
II. Лиофилизация
Разливали промежуточный раствор, полученный на стадии I, 2 мл промежуточного раствора точно отмеряли и переливали во флакон объемом 10 мл; флакон переносили в морозильную камеру, охлаждали до -20˚C на полной скорости и температуру поддерживали в течение 8 ч.; затем флакон переносили в лиофилизатор, температуру повышали до -10˚C с постоянной скоростью 25˚C/3 ч. при вакуумметрическом давлении 5 Па, температуру -10˚C поддерживали в течение 8 ч., температуру повышали до 25˚C с постоянной скоростью, поддерживали в течение 4 ч., соответственно получали лиофилизированный порошок для инъекций.
Полученный лиофилизированный порошок для инъекций на основе сапонина B4 Pulsatilla представлял собой белое рыхлое вещество, время восстановления в воде составляло 6 с, содержание воды составляло 1,3%, чистота сапонина B4 Pulsatilla составляла 99,74%, максимальное содержание единичной примеси составляло 0,12% и общее содержание примесей составляло 0,26%.
Пример 3.
Лиофилизированный порошок для инъекций на основе сапонина B4 Pulsatilla
Состав промежуточного раствора:
Лиофилизированный порошок для инъекций получали посредством способа, приведенного ниже.
I. Получение промежуточного раствора
Отбирали требуемое количество сапонина B4 Pulsatilla и точно взвешивали, добавляли подходящее количество воды для инъекций, исходный материал, представляющий собой сапонин B4 Pulsatilla, полностью растворяли при перемешивании с помощью магнитного перемешивателя, в данный раствор добавляли требуемое количество лактозы, перемешивали для полного растворения и перемешивание продолжали в течение приблизительно 10 минут, добавляли 0,1 г активированного угля, затем систему нагревали и перемешивали на водяной бане при 100˚C в течение 20 мин., охлаждали до комнатной температуры, добавляли воду для инъекций до 100 мл, хорошо встряхивали, фильтровали с помощью микропористой фильтрующей мембраны с диаметром пор 0,22 мкм для удаления активированного угля, затем получали промежуточный раствор.
II. Лиофилизация
Промежуточный раствор, полученный на стадии I, разливали, точно отмеряли 2 мл промежуточного раствора и переливали во флакон объемом 10 мл; флакон переносили в камеру для замораживания, охлаждали до -30˚C со скоростью 3˚C/мин. и температуру поддерживали в течение 10 ч.; затем флакон переносили в лиофилизатор, температуру повышали до -10˚C с постоянной скоростью 25˚C/3 ч. при вакуумметрическом давлении 10 Па, температуру -10˚C поддерживали в течение 10 ч., температуру повышали до 30˚C со скоростью 1,5˚C/мин., температуру поддерживали в течение 6 ч., соответственно получали лиофилизированный порошок для инъекций.
Полученный лиофилизированный порошок сапонина B4 Pulsatilla для инъекций представлял собой белое рыхлое вещество, время восстановления в воде составляло 6 с, содержание воды составляло 1,07%, чистота сапонина B4 Pulsatilla составляла 99,51%, максимальное содержание единичной примеси составляло 0,28% и общее содержание примесей составляло 0,39%.
Пример 4.
Лиофилизированный порошок для инъекций на основе сапонина B4 Pulsatilla
Состав промежуточного раствора
Лиофилизированный порошок для инъекций получали посредством способа, приведенного ниже.
I. Получение промежуточного раствора
Отбирали требуемое количество сапонина B4 Pulsatilla и точно взвешивали, добавляли подходящее количество воды для инъекций, исходный материал, представляющий собой сапонин B4 Pulsatilla, полностью растворяли при перемешивании с помощью магнитного перемешивателя, в данный раствор добавляли требуемое количество сахарозы, перемешивали с полным растворением и перемешивание продолжали в течение приблизительно 10 минут, добавляли 0,15 г активированного угля, затем систему нагревали и перемешивали на водяной бане при 100˚C в течение 15 мин., охлаждали до комнатной температуры, добавляли воду для инъекций до 100 мл, хорошо встряхивали, фильтровали с помощью микропористой фильтрующей мембраны с диаметром пор 0,22 мкм для удаления активированного угля, затем получали промежуточный раствор;
II. Лиофилизация
Промежуточный раствор, полученный на стадии I, разливали, 2 мл промежуточного раствора точно взвешивали и переливали во флакон объемом 10 мл; флакон переносили в камеру для замораживания, охлаждали до -15˚C со скоростью 5˚C/мин. и температуру поддерживали в течение 9 ч.; затем флакон переносили в лиофилизатор, температуру повышали до 0˚C с постоянной скоростью 30˚C/3 ч. при вакуумметрическом давлении 0,5 Па, температуру 0˚C поддерживали в течение 8 ч., температуру повышали до 25˚C со скоростью 1˚C/мин., поддерживали в течение 5 ч., соответственно получали лиофилизированный порошок для инъекций.
Полученный лиофилизированный порошок для инъекций на основе сапонина B4 Pulsatilla представлял собой белое рыхлое вещество, время восстановления в воде составляло 6 с, содержание воды составляло 1,39%, чистота сапонина B4 Pulsatilla составляла 99,68%, максимальное содержание единичной примеси составляло 0,22%, и общее содержание примесей составляло 0,32%.
Вкратце, в настоящем изобретении предусмотрен препарат для инъекций на основе сапонина B4 Pulsatilla, в том числе водный раствор для инъекций и лиофилизированный порошок для инъекций. По сравнению с препаратом для перорального введения, препарат для инъекций, предусмотренный в настоящем изобретении, обеспечивает значительное снижение эффективной дозы сапонина B4 Pulsatilla при обращении индуцированного цисплатином повреждения почек, что улучшает безопасность лекарственного препарата. Кроме того, показатели препарата для инъекций по настоящему изобретению являются стабильными и контролируемыми посредством оптимизации параметров способа получения.