СПОСОБ ОЦЕНКИ ИНДУЦИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ ОБОСТРЕНИЯ ЦИТОМЕГАЛОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ У БЕРЕМЕННОЙ НА ТРЕТЬЕМ ТРИМЕСТРЕ ГЕСТАЦИИ НА СОДЕРЖАНИЕ МЕТГЕМОГЛОБИНА И ОКСИГЕНАЦИЮ ГЕМОГЛОБИНА В ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ НОВОРОЖДЕННОГО
METHOD FOR ASSESSING INDUCING ACTION OF AGGRAVATED CYTOMEGALOVIRUS INFECTION IN PREGNANT WOMAN IN THIRD TRIMESTER OF GESTATION ON METHAEMOGLOBIN AND HAEMOGLOBIN OXYGENATION IN NEWBORN'S PERIPHERAL BLOOD

1. Цель работы - показать отрицательное действие обострения цитомегаловирусной инфекции у беременной на содержание метгемоглобина и оксигенацию гемоглобина в эритроцитах новорожденного.
2. Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для определения увеличения при обострении цитомегаловирусной инфекции метгемоглобина в эритроцитах периферической крови новорожденного как фактор, приводящий к снижению оксигенации гемоглобина, что создает угрозу формирования у новорожденного гемической анемии.
3. Раскрытие изобретения
3+++
2++
2
Поскольку в безъядерных эритроцитах утилизация глюкозы выполняется через пентозный цикл, в процессе которого одним из важных этапов является образование никотинамидадениннуклеотида (НАДФ) и переход его в восстановленную форму - НАДФ·Н [6], НАДФ·Н принимает участие в восстановлении метгемоглобина, в котором железо гема, окисленое до Fe , не способно переносить кислород. Вследствие подавления активности НАДФ·Н выключается из обменных процессов Fe и снижается в крови содержание HbO, а количество метгемоглобина увеличивается [1, 3]. В эритроцитах переносчиком водорода может быть метиленовый синий [5], который, выполнив свою функцию, обесцвечивается, переходя в бесцветную лейкоформу. При подавлении активности НАДФ·Н процесс переноса водорода резко снижается, поэтому эритроциты, окрашенные метиленовым синим, не будут обесцвечиваться, а количество метгемоглобина будет нарастать, препятствуя формированию оксигемоглобина.
В данной работе установлено, что обострение цитомегаловирусной инфекции подавляет формирование НАДФ·Н, так как задерживается обесцвечивание метиленового синего в эритроцитах, следовательно, нарушается перенос водорода и подавляется восстановление метгемоглобина, что и приводит к снижению процессов оксигенации гемоглобина с формированием в организме гемической анемии.
4. В доступной литературе аналогов по данному вопросу не отмечено.
5. Осуществление изобретения
5.1. Обследовано 25 беременных на сроке гестации 20-22 недели в возрасте 18-25 лет с хронической цитомегаловирусной инфекцией (ЦМВИ) в стадии обострения (основная группа) и 15 беременных на тех же сроках гестации без патологии (контрольная группа), а также забиралась пуповинная кровь у 15 новорожденных от матерей, перенесших обострение ЦМВИ, и 15 новорожденных от матерей, не болевших ЦМВИ. У беременных симптоматически обострение ЦМВИ проявлялась в виде острого респираторного заболевания, сопровождающегося ринофарингитом. Клинический диагноз обострения ЦМВИ устанавливался при комплексном исследовании периферической крови на наличие IgM или четырехкратного и более нарастания титра антител IgG в парных сыворотках в динамике через 10 дней, индекса авидности - более 65%, а также ДНК ЦМВ. Исследования проводились с учетом требований Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации «Этические принципы проведения научных исследований с участием человека» с поправками 2000 г. и правилами клинической практики в Российской Федерации, утвержденными приказом Министерства РФ №266 от 19.06.2003 г.
5.2. Верификация ЦМВ, определение типоспецифических антител, индекса авидности осуществлялись методами ИФА на спектрофотометре «Stat-Fax-2100» (USA) с использованием тест-систем ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск); выявление ДНК ЦМВ методами ПЦР на аппарате ДТ-96 с использованием наборов НПО «ДНК-технология» (Москва).
5.3. Содержание метгемоглобина в эритроцитах периферической крови определяли спектрофотометрическим методом по Кушаковскому М.С. (1968) [2].
5.4. Активность метиленового синего в эритроцитах периферической крови определяли следующим образом: гепаринизированную кровь, взятую из пуповинной крови новорожденных в количестве 0,5 мл, помещали в 0,5 мл 0,1% раствора метиленового синего, приготовленного на фосфатном буфере с pH 7,4. Полученную взвесь эритроцитов в течение 5 мин содержали в термостате при температуре 37°C. Затем каплю взвеси помещали на предметное стекло и накрывали покровным стеклом, окатовав его парафином. Приготовленный препарат эритроцитов в 0,1% растворе метиленового синего помещали на микроскоп и изучали при увеличении 10×100 при комнатной температуре в течение 45 мин.
5.5. Содержание оксигемоглобина оценивали по прописи Эвелина и Мэллой [4].
6. В процессе исследования были получены следующие результаты
При обострении цитомегаловирусной инфекции в третьем триместре гестации в периферической крови новорожденного отмечался высокий титр антител к цитомегаловирусу 1:1600. Количество окрашенных 0,1 раствором метиленового синего эритроцитов в начальном для исследования периоде насчитывалось 73,0±3,5% через 45 мин наблюдения количество окрашенных эритроцитов метиленовым синим на этом же препарате сохранялось до 62,5±1,9% (фигура 2). Параллельные исследования крови новорожденных от матерей, не болевших в период гестации показали (фигура 1), что на исходном отрезке времени на препарате было окрашено метиленовым синим 44,0±1,8% эритроцитов, а к 45 мин наблюдения их осталось только 8,8±0,6%. Количество метгемоглобина в крови новорожденных, родившихся от матерей, перенесших обострение цитомегаловирусной инфекции, составило 1,8±0,08%, у новорожденных, родившихся от здоровых беременных - 0,65±0,03%. Полученные показатели свидетельствуют, что при обострении цитомегаловирусной инфекции в период гестации подавляет активность НАДФ·Н, в результате чего задерживается обесцвечивание метиленового синего эритроцитов и увеличивается содержание метгемоглобина до 1,8±0,08%; в контроле - 0,65±0,03%. Это сказывается на оксигенации гемоглобина у новорожденных, родившихся от матерей с обострением цитомегаловирусной инфекции, в период гестации количество оксигемоглобина определялось в количестве 96,5±2,9% у новорожденных, родившихся от здоровых матерей - 99,0±1,8%, что создает угрозу развития у новорожденного при обострении ЦМВИ гемической анемии.
Пример 1.
Беременная А., 18 лет. Роды - в срок.
Обострение цитомегаловирусной инфекции в третьем триместре гестации с титром антител 1:1600 к цитомегаловирусу. Приводило к увеличению в крови новорожденного увеличение титра антител к цитомегаловирусу 1:1600. На мазках периферической крови новорожденного, окрашенных 0,1 раствором метиленового синего, через 45 мин наблюдения под микроскопом, сохранялось до 65,5% эритроцитов, окрашенных метиленовым синим. В периферической крови новорожденного количество метгемоглобина составило 1,8%, содержание оксигемоглобина снижалось до 96,5%. Это свидетельствовало, что плод при обострении во время беременности цитомегаловирусной инфекции с титром антител к цитомегаловирусу 1:1600 развивался в условиях гемической анемии, сохранившейся даже после рождения, что заставляет принимать для него коррегирующие лечебные мероприятия.
Пример 2.
Беременная Ш. 23 лет. Роды - в срок.
2
В течение гестации беременность протекала без осложнений. Признаков обострения цитомегаловирусной инфекции не отмечалось. В крови новорожденного признаков обострения цитомегаловирусной инфекции не отмечено. Проведенные исследования показали, что на окрашенном 0,1% раствором метиленового синего на мазке крови новорожденного первоначально было подсчитано 44,0% эритроцитов, окрашенных метиленовым синим. Через 45 мин наблюдения, под микроскопом окрашенных осталось только 8,8%. Следовательно, в крови было достаточно НАДФ·Н, чтобы выполнить восстановление метгемоглобина, что и подтверждается его низким содержанием - 0,65%. Оксигенация гемоглобина выполнялась в полном объеме, поскольку количество HbO насчитывалось 99,0%. Причин развития анемии не было.
Литература
1. Галоян А.А., Симонян М.А. и др. Влияние обогащенного пролином полипептида на восстановление метгемоглобина и образование супероксида под действием металлопротеинов-цитохрома b558111 и супрола in vitro // Нейрохимия. - 2007. - №1. - С.37-40.
2. Кушаковский М.С. Клинические формы повреждения гемоглобина // Лен. отделение. - «Медицина». - 1968. - С.324.
3. Новицкий В.В., Сапрыкина Э.В. и др. Механизмы повреждения эритроцитов при токсическом действии метгемоглобинообразователей // Бюллетень Сибирской медицины. - 2006. - №1. - С.32-37.
4. Покровский А.А. Биохимические методы исследования // Справочник М.: «Медицина», 1969. - С.337.
5. Энгельгардт В.А., Саков Н.Е. О механизме пастеровского эффекта // «Биохимия». - 1943. - Т.8. - С.9-12.
14
6. Murphy J.R. Erythrocyte metabolism I The equilibration of giucose - C between serum and erythrocytes // J. Lab. Clin. Med. - 1960. - vol.55. - p.281-286.
На фигуре 1 изображена реакция окраски эритроцитов периферической крови новорожденного, родившегося от здоровой беременной. В периферической крови на исходный момент исследования насчитывалось 44,0±1,8% эритроцитов, окрашенных 0,1% раствором метиленовой сини. Через 45 мин наблюдения их число снизилось до 8,8±0,6%, поскольку путь для восстановления метгемоглобин - свободен, а в крови отмечается высокий уровень оксигемоглобина - 99,0±1.8%.
На фигуре 2 изображена реакция окраски эритроцитов периферической крови новорожденного, родившегося от матери, перенесшей в третьем триместре гестации обострение цитомегаловирусной инфекции с титром антител 1:1600. В силу ингибирования цитомегаловирусом процесса восстановления метгемоглобина число окрашенных эритроцитов остается высоким - 62,5±1,9%, исходное число - 73,0±3,5%, так как блокируется восстановление метгемоглобина - 1,8±0,08% (контроль - 0,65±0,03%) и снижается формирование оксигемоглобина до 96,5±2,9%, контроль - 99,0±1.8%.