ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ АНАЛИЗИРУЕМОГО ВЕЩЕСТВА В ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЙ ЖИДКОСТИ
TEST-SYSTEM FOR DETECTION OF ANALYSED SUBSTANCE CONCENTRATION IN PHYSIOLOGICAL LIQUID

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к количественному анализу содержания определенного вещества (анализируемого вещества) в физиологической жидкости, например концентрации глюкозы в крови. Изобретение относится, в частности к тест-системе и способу для количественного определения содержания анализируемого вещества в физиологической жидкости, а также к способу изготовления такой тест-системы.
Предпосылки создания изобретения
Определение концентрации тех или иных веществ в пробах физиологической жидкости играет очень важную роль при диагностике и лечении самых разнообразных заболеваний. К таким определяемым путем анализа веществам относятся, в частности, глюкоза, холестерин, свободные жирные кислоты, триглицериды, протеины, кетоны, фенилаланин, энзимы, антитела или пептиды, содержащиеся в крови, плазме, моче или слюне.
Обычно для определения концентрации анализируемого вещества в физиологической жидкости, взятой для проведения анализа пробой физиологической жидкости, например капиллярной кровью, смачивают специальную тест-полоску. Такие тест-полоски обычно используются вместе с анализатором (измерительным устройством), который при определении электрически активного соединения измеряет определенные электрические свойства, например электрический ток, а при проведении анализа фотометрическим методом измеряет отражение и/или пропускание света. В оптических системах тест-полоску смачивают смесью энзимов и окрашивающих материалов, известных как хромогены. В результате взаимодействия анализируемого вещества, содержащегося в пробе физиологической жидкости, которой смочена тест-полоска, с соответствующими реагентами происходит определенное изменение показателей отражения или пропускания света, по которому можно определить концентрацию анализируемого вещества во взятой для проведения анализа пробе.
Так, например, содержание глюкозы определяют количественно путем ее окисления глюкозооксидазой до глюконовой кислоты. Под действием образующегося в результате реакции пероксида водорода и пероксидазы, такой как пероксидаза хрена, субстрат тест-полоски, т.е. индикатор, становится хромогенным и окрашивается в определенный цвет пропорционально концентрации глюкозы, содержащейся в пробе взятой для проведения анализа жидкости.
Измерение концентрации глюкозы в пробах крови является особенно широко распространенной процедурой диагностики диабета. Связано это в первую очередь с очень опасными для жизни последствиями диабета, такими, например, как потеря зрения или почечная недостаточность. Лишь очень тщательное лечение и постоянное наблюдение за состоянием больного и ходом болезни позволяют свести к минимуму все опасные последствия диабета за счет определенных физических упражнений, соблюдения определенной диеты и приема соответствующих медикаментов. Некоторые больные диабетом должны достаточно часто, обычно четырежды в день или даже чаще, проверять содержание глюкозы в крови. Очевидно, что такие больные, а также поликлиники и больницы остро нуждаются в точном, надежном и дешевом способе анализа, позволяющем во избежание появления проблем, требующих сложного и длительного лечения, постоянно контролировать и при необходимости вносить соответствующие коррективы в схему лечения сахарного диабета.
Эффективность общепринятой в настоящее время благодаря достигнутым успехам концепции самоконтроля и самолечения существенным образом зависит от наличия появившихся в последнее время в большом количестве легкодоступных соответствующих устройств, предназначенных для индивидуального пользования и проведения соответствующих анализов. В качестве наиболее распространенных примеров самостоятельного определения содержания глюкозы в капиллярной крови можно назвать анализы, выполняемые при беременности, овуляции, плохой свертываемости крови и повышенном содержании в ней кетона и холестерина.
В качестве примера устройства, предназначенного для контроля концентрации анализируемых веществ в физиологических жидкостях, в частности содержания глюкозы в крови, можно назвать устройство, предложенное в патенте US 4935346. Предложенный в этом патенте способ анализа основан на измерении отражения света от поверхности инертной пористой матрицы, пропитанной реагентом, при взаимодействии которого с содержащимся в крови анализируемым веществом образуется поглощающее свет вещество. Большинство известных в настоящее время устройств имеют одну заполняемую пробой анализируемой жидкости напрямую или через специальный канал камеру или мембрану для измерений, в которой находятся все необходимые реагенты, соответствующим образом меняющие цвет пробы анализируемой жидкости.
В патенте US 5430542 предложена одноразовая оптическая кювета и способ ее изготовления. Такая кювета изготовлена из двух оптически прозрачных пропитываемых жидкостью пластиковых листов. Прозрачные пластиковые листы отделены друг от друга третьим, расположенным между ними липким листом, который при сжатии герметично соединяется с ними.
В патенте US 5268146 предложена панель для качественного анализа пробы и определения наличия в ней определенного анализируемого вещества, которая содержит все реагенты и элементы, необходимые для визуального определения наличия или отсутствия в пробе определенного анализируемого вещества.
В патентах US 4761381 и US 5997817 предложены устройства, в которых пробы анализируемых жидкостей через входные отверстия и капиллярные каналы проходят в реакционные камеры с материалом, способным зафиксировать наличие в пробе определенного анализируемого вещества.
В заявках US 2002/0110486 А1 и US 2003/0031594 A1 предложены предназначенные для определения концентрации определенного анализируемого вещества или свойств физиологической жидкости, в частности времени свертывания крови, медицинские диагностические устройства, на одном конце которых расположено отверстие для ввода пробы, а на другом конце - эластичная диафрагма, предназначенная для всасывания пробы через канал в зону измерений, в которой происходит измерение определенного физического параметра пробы, который зависит от концентрации в пробе определенного анализируемого вещества и от его свойств.
При массовом изготовлении таких полосок из-за разброса свойств исходных материалов и отклонений в технологическом процессе нет никаких гарантий, что тест-полоски из разных партий обладают одинаковыми свойствами. Поэтому для каждой партии готовых тест-полосок необходимо иметь определенный калибровочный код, который можно использовать для учета разброса их свойств. Такой калибровочный код можно напечатать на упаковке тест-полосок и вводить его в измерительное устройство для каждой новой партии имеющихся у пользователя тест-полосок. Если пользователь ошибется при вводе калибровочного кода или введет в измерительное устройство неправильный код, то результаты измерений окажутся недостоверными. В настоящее время известны также диагностические тест-полоски для диабетиков, например тест-полоска, предложенная в патенте US 6168957 В1, с калибровочным кодом, который считывается измерительным устройством до вычисления концентрации глюкозы. Выпускаемые в настоящее время одноразовые диагностические тест-полоски с реагентами, которые используются для измерений, предназначены только для деструктивного анализа, и поэтому изготовители могут только статистически (с определенной вероятностью) оценить свойства каждой партии тест-полосок и не могут со 100%-ной надежностью определить свойства каждой отдельной тест-полоски.
Более важным является то, что при использовании калибровочных кодов подобного типа считывающее коды с полосок во время анализов измерительное устройство получает только ретроспективную информацию. На основании этих данных, не содержащих сведений о всей предыстории, от которой зависит фактическое состояние тест-полоски с реагентом, в частности о ее хранении в условиях, не отвечающих необходимым требованиям, или повреждении упаковки, измерительное устройство выдает информацию об ошибке только в том случае, когда тест-полоска полностью непригодна для использования, и считываемая с нее информация не соответствует предварительно заложенным в память измерительного устройства данным и методам оценки пригодности тест-полоски для проведения анализов.
Проверить качество пропитанной реагентом тест-полоски и ее пригодность для проведения анализа пользователь может только с помощью специально приготовленного изготовителем контрольного раствора известной концентрации. Такой способ проверки качества полосок обладает определенными недостатками, связанными с повышенным расходом полосок и дополнительными затратами. При этом также не учитывается и возможный разброс свойств полосок в пределах одной партии.
Некоторые из известных устройств, предназначенных для проведения анализов физиологических жидкостей, имеют встроенные системы положительного и/или отрицательного контроля, которые активизируются при добавлении пробы. Так, например, в упомянутом выше патенте US 5268146 предложено несколько вариантов устройств для анализа физиологических жидкостей со встроенной системой положительного или отрицательного контроля, образованной дополнительными зонами измерений с реагентами, которые либо сами создают видимое изменение индикатора, либо препятствуют его изменению независимо от наличия или отсутствия в пробе определенного анализируемого вещества. Аналогичные зоны положительного или отрицательного контроля имеются и в устройстве, предложенном в патенте US 4578358, которое предназначено для определения наличия скрытой крови в субстанции, взятой для проведения анализа из организма пациента.
Предложенные в двух упомянутых выше патентах системы положительного или отрицательного контроля, которые в настоящее время широко применяются при проведении экспресс-анализов во время беременности, выдают полезную информацию только при их использовании вместе с панелями или тест-полосками для качественного и порогового анализа, которые служат индикатором наличия или отсутствия в пробе определенного анализируемого вещества, и совершенно не пригодны для надежного определения количества содержащегося в пробе анализируемого вещества, например, концентрации глюкозы в крови.
Кроме того, на процедуру измерений могут отрицательно влиять и другие переменные свойства взятой для проведения анализа пробы физиологической жидкости. Процедуру анализа крови, в частности, обычно усложняет изменение уровня содержащихся в ней эритроцитов, из-за которого результаты анализа не отражают реальной концентрации анализируемого вещества во взятой для анализа пробе.
Исходя из вышеизложенного, в основу настоящего изобретения была положена задача предложить тест-элемент со встроенной системой калибровки, которая путем выполнения соответствующих вычислений компенсирует любые отклонения, которые возникают в процессе изготовления тест-элемента или в самой пробе, и гарантирует должное выполнение анализа и получение пользователем точного и надежного результата.
В настоящее время не существует сухих, предназначенных для проведения анализов полосок с реагентом и встроенной системой калибровки, а большинство известных полосок со множеством зон реакции используются для обнаружения множества анализируемых веществ или, как указано выше, вместе с положительными или отрицательными системами контроля.
Определенный интерес из известных в настоящее время тест-полосок для проведения анализов с несколькими зонами реакции, используемыми для качественной оценки результатов анализа, без системы внутренней калибровки вызывает тест-полоска, предложенная в заявках US 2002/0110486 А1 и US 2003/0031594 А1. Для проведения анализов с помощью такой тест-полоски необходимо иметь около 20 мкл крови, используя ее для определения времени Квика, которое является важным параметром, характеризующим свертываемость крови. Однако при выполнении в течение дня нескольких анализов, необходимых, в частности, для больных сахарным диабетом, использование таких полосок становится непрактичным из-за большого объема проб, и по этому показателю такие тест-полоски намного уступают другим системам анализа содержания в крови глюкозы, требующим взятия пробы крови объемом всего около 1 мкл, хотя и не исключают при этом необходимости выполнения пациентом в полном объеме всей процедуры калибровки.
Уменьшение объема каналов и внутренних полостей, образующих измерительные камеры в описанных выше диагностических тест-полосках, требует существенного усложнения и удорожания технологии их изготовления, например использования метода "микролитья", который не предназначен для крупносерийного изготовления дешевых одноразовых датчиков.
Поэтому еще одна задача настоящего изобретения состояла в разработке тест-системы для сухих тест-полосок с реагентами, которая требовала бы взятия небольших по объему проб физиологической жидкости и позволяла бы путем выполнения небольшого количества операций изготавливать дешевые тест-элементы, с помощью которых пользователи могут сами надежно контролировать содержание глюкозы в крови или другие важные для здоровья физиологические показатели.
Краткое изложение сущности изобретения
В изобретении предлагается устройство для определения концентрации анализируемого вещества, такого как глюкоза, холестерин, свободные жирные кислоты, триглицериды, протеины, кетоны, фенилаланин или энзимы, в физиологической жидкости, такой как кровь, сыворотка, плазма, слюна, моча, интерстициальная и/или внутриклеточная жидкость, с новой системой распределения пробы и встроенной системой калибровки и качественного контроля, соответствующей предназначенным для проведения анализов сухим тест-полоскам с реагентами с очень небольшим объемом пробы около 0,5 мкл. Предлагаемый в изобретении тест-элемент, предназначенный для определения содержания в пробе определенного анализируемого вещества, имеет низкую стоимость, поскольку его изготовление требует выполнения сравнительно небольшого количества достаточно простых технологических операций.
Наличие встроенной системы калибровки в предлагаемом для проведения анализа устройстве обеспечивает возможность получения надежных результатов анализа независимо от типа крови, гематокрита, температуры и других различных факторов. Встроенная система калибровки позволяет компенсировать любые отклонения, возникающие в процессе изготовления. Предлагаемое в изобретении тест-устройство также позволяет определять и компенсировать старение активного компонента и/или получать информацию, которую можно использовать для продления срока годности устройства при его хранении в соответствующих условиях.
В настоящем изобретении предлагается тест-элемент для определения концентрации по меньшей мере одного анализируемого вещества в пробе физиологической жидкости, который имеет расположенные на расстоянии друг против друга первую и вторую поверхности, которые имеют два по существу одинаковых и в основном конгруэнтно совмещенных рельефных рисунка, образующих на первой и второй поверхностях участки с высокой и низкой поверхностной энергией (поверхностным натяжением), формирующие систему распределения пробы по меньшей мере с двумя чувствительными участками измерений, и в котором физиологическая жидкость удерживается участками с высокой поверхностной энергией.
Расположенная внутри предлагаемого в изобретении тест-элемента система распределения пробы не имеет никаких механических и/или конструктивных признаков, присущих стенкам, канавкам или каналам, которые обычно используются при анализе физиологических жидкостей или проб других содержащих воду жидкостей. В изобретении предлагается несколько вариантов конструктивного исполнения тест-элемента с разной процедурой калибровки и возможностью использования для анализа разных анализируемых веществ разных химических способов, включая тест-полоски для проведения одноразовых анализов или более сложные устройства, такие как диски или состоящие из отдельных тест-полосок сложенные ленты, которые можно использовать для проведения нескольких измерений.
Предлагаемый в предпочтительном варианте тест-элемент имеет n определенных чувствительных участков для измерений, расположенных на первой поверхности и покрытых каталитическим составом, ускоряющим процесс выявления в физиологической жидкости определенного анализируемого вещества, и n определенных чувствительных участков для измерений, расположенных на второй поверхности и покрытых n калибровочными составами, состоящими из m контрольных составов и n-m составов с различным содержанием калибровочного соединения, где n представляет собой целое число больше 2, m представляет собой целое число, равное или большее 1, и n>m, которые позволяют измерительному устройству получить n результатов из 2n определенных участков измерения оптической плотности и вычислить с помощью устройства обработки данных n-m калибровочных коэффициентов полиномиального уравнения калибровки вида
по коэффициентам регрессии которого проверяется достоверность вычисленных n-m калибровочных коэффициентов уравнения калибровки и определяется неизвестная концентрация определенного анализируемого вещества в пробе физиологической жидкости.
В изобретении предлагается также способ изготовления такого тест-элемента, при осуществлении которого на нижнем несущем слое, который имеет первую поверхность, формируют участки с высокой и низкой поверхностной энергией, первые из которых образуют систему гидрофильных каналов с n определенными чувствительными участками для измерений, где n представляет собой целое число больше 2, в верхнем слое, который имеет вторую поверхность, образуют расположенные по соответствующему рисунку участки с высокой и низкой поверхностной энергией, на n чувствительных участков первой поверхности наносят покрытие из каталитического состава, который служит промотором определения концентрации анализируемого вещества в пробе физиологической жидкости методом фотометрии путем измерения пропускания или поглощении света, на n чувствительных участков второй поверхности наносят покрытие из n калибровочных составов, состоящих из m контрольных составов и n-m составов с различным содержанием калибровочного соединения, где m представляет собой целое число, равное или большее 1, и n>m, которые идентичны или по существу эквиваленты содержащемуся в пробе анализируемому веществу и способны вызвать в каталитическом составе такую же химическую реакцию, что и анализируемое вещество, содержащееся в пробе физиологической жидкости; верхний и нижний слои первой и второй поверхностей укладывают на противоположные стороны центрального слоя, который имеет вырез, образующий внутри тест-элемента вместе с расположенными на первой и второй поверхности нижнего слоя и верхнего слоя участками с высокой и низкой поверхностной энергией системы распределения пробы заполняемую пробой полость, и из полученного ламинированного листа вырубают или вырезают имеющий необходимую форму готовый тест-элемент.
Другие особенности и преимущества настоящего изобретения более подробно рассмотрены ниже на примере предпочтительных вариантов его осуществления со ссылкой на прилагаемые к описанию чертежи.
Краткое описание чертежей
На фиг.1 в аксонометрии показан выполненный по одному из вариантов предлагаемый в изобретении тест-элемент в виде обычной тест-полоски.
На фиг.2 в аксонометрии в увеличенном масштабе показана система распределения пробы тест-элемента, изображенного на фиг.1.
На фиг.3 в аксонометрии показаны три отдельных слоя тест-элемента, изображенного на фиг.1.
На фиг.4 показаны различные формы выреза центрального слоя, образующего вместе с первой и второй поверхностями полость для распределения пробы.
На фиг.5 в поперечном сечении показан чувствительный участок системы распределения пробы, образованной гидрофобными элементами, направляющими течение пробы физиологической жидкости.
На фиг.6 в поперечном сечении показан выполненный по другому варианту чувствительный участок для измерений системы распределения пробы, образованной гидрофильными элементами, направляющими течение пробы физиологической жидкости.
На фиг.7 показаны различные варианты выполнения системы распределения пробы с разной траекторией течения жидкости и соответствующими разным методам калибровки чувствительными участками для измерений.
На фиг.8 в поперечном сечении показана изображенная на фиг.6 система распределения пробы с излучателем света и фотоприемником.
На фиг.9 приведен график, на котором показана концентрация анализируемого вещества, вычисленная методом стандартных добавок.
На фиг.10 приведен график, иллюстрирующий метод оценки результата вычислений и данных калибровки.
На фиг.11 показаны различные формы предлагаемых в изобретении тест-элементов (тест-полосок).
На фиг.12 проиллюстрирован процесс установки предлагаемой в изобретении тест-полоски в измерительный прибор (анализатор).
На фиг.13 показан измерительный прибор со вставленной в него тест-полоской, предлагаемой в настоящем изобретении.
На фиг.14 показана конструкция предлагаемого в изобретении диска для проведения анализов.
На фиг.15 показан предлагаемый в изобретении диск в сопоставлении с отдельными предназначенными для этой же цели тест-полосками.
На фиг.16 показан измерительный прибор (анализатор) со вставленным в него диском, предлагаемым в настоящем изобретения для проведения анализов.
На фиг.17 показан измерительный прибор левостороннего и правостороннего действия со вставленной в него тест-полоской, предлагаемой в настоящем изобретении.
На фиг.18 показана лента в разложенном и сложенном виде, состоящая из отдельных тест-полосок, предлагаемых в настоящем изобретении.
На фиг.19 проиллюстрированы отдельные стадии технологического процесса изготовления ленты, состоящей из отдельных тест-полосок, предлагаемых в настоящем изобретении.
Отдельные слои 16, 17, 18 и 19 предлагаемого в изобретении выполненного в виде тест-полоски ламинированного тест-элемента на фиг.5, 6 и 8 изображены не в масштабе и, в частности, с преувеличенно большой толщиной.
Подробное описание изобретения
Как показано на фиг.1 и 2, предлагаемая в настоящем изобретении тест-полоска 1 имеет многослойную конструкцию и состоит из несущего (нижнего) слоя 2, расположенного над несущим слоем 2 центрального (среднего) слоя 3 и расположенного над центральным слоем 3 верхнего слоя 4. Центральный слой 3 имеет вырез 5, который вместе с нижним и верхним слоями 2 и 4 образует внутреннюю полость тест-полоски. Образованная этой полостью система 6 распределения пробы сообщается с расположенным на краю тест-полоски участком 9 для взятия пробы. Используемый пользователем для взятия пробы участок 9 тест-полоски имеет предпочтительно форму расположенного на одной из главных сторон полоски скругленного выступа 10, удобного для взятия пробы. На другой главной стороне тест-полоски непосредственно против выполненного в виде скругленного выступа 10 участка 9 для взятия пробы расположено вентиляционное отверстие 11, через которое заполняющая чувствительные участки 6а, 6'а (см. фиг.3) системы распределения пробы физиологическая жидкость вытесняет наружу находящийся в системе распределения воздух. Необходимо отметить, что независимо от количества чувствительных участков в диагностической тест-полоске, предлагаемой в настоящем изобретении, достаточно иметь всего одно вентиляционное отверстие для выхода воздуха. Описанные выше элементы системы распределения пробы с участками с высокой поверхностной энергией (поверхностным натяжением), участок для взятия пробы, вентиляционное отверстие для выхода воздуха и центральный слой с вырезом образуют предлагаемый в изобретении тест-элемент с обладающей капиллярными свойствами системой распределения, направляющей взятую пробу физиологической жидкости в определенные чувствительные участки.
Предлагаемая в изобретении тест-полоска 1 имеет регистрирующие элементы 7, 8, по которым тест-полоски разного типа, предназначенные для определения концентрации разных анализируемых веществ в физиологических жидкостях, можно отличить друг от друга. Для этого в измерительном приборе, предназначенном для проведения разных анализов, необходимо запустить специальную программу или выполнить определенные действия, позволяющие по регистрирующим элементам вставленной в прибор тест-полоски определить, для анализа какого конкретного анализируемого вещества она предназначена. Как показано на фиг.3, где приведено поэлементное изображение предлагаемого в изобретении многослойного тест-элемента, показанного на фиг.1 и 2, его первая поверхность 2а образована нижним (несущим) слоем 2, а его вторая поверхность 4а образована верхним слоем 4. На первой и второй поверхностях 2а и 4а выполнен рельефный рисунок с участками, образующими систему 6 распределения пробы. Система 6 распределения пробы состоит из определенного количества конгруэнтно совмещенных в многослойной тест-полоске выполненных на первой и второй поверхностях нижнего и верхнего слоев, а также чувствительных участков 6а и каналов 6b. Центральный слой 3, от толщины которого зависит расстояние между первой поверхностью 2а нижнего слоя 2 и второй поверхностью 4а верхнего слоя 4, имеет вырез 5, который вместе с первой поверхностью 2а нижнего слоя 2 и второй поверхностью 4а верхнего слоя 4 образует внутреннюю полость тест-полоски. В образованной вырезом 5 центрального слоя и первой поверхностью 2а нижнего слоя 2 и второй поверхностью 4а верхнего слоя 4 внутренней полости тест-полоски расположена образованная рельефным рисунком первой поверхности 2а и второй поверхности 4а система 6 распределения пробы. Размеры внутренней полости тест-полоски должны быть существенно больше размеров системы 6 распределения пробы.
Вырез 5 в центральном слое, предназначенный только для образования внутри тест-полоски полости для системы 6 распределения пробы, может иметь различную форму, несколько примеров которой показаны на фиг.4. Показанная на фиг.4а внутренняя полость 12 для пробы имеет форму зонтика, показанная на фиг.4б полость имеет прямоугольную форму, а показанная на фиг.4в полость имеет круглую форму. Размеры и форма выреза 5 центрального слоя 3 не влияют на размеры чувствительных участков 6а и размеры каналов 6b системы 6 распределения пробы и никак не определяют объем пробы. По сравнению с системой 6 распределения пробы показанные на фиг.4 внутренние полости имеют более простую форму и поэтому их можно выполнить с помощью более простого инструмента и с меньшими затратами времени при низких требованиях к точности их расположения.
Система 6 распределения пробы, расположенная в полости, образованной вырезом 5 центрального слоя 3 и первой поверхностью 2а нижнего слоя 2 и второй поверхностью 4а верхнего слоя 4, образована участками первой и второй поверхностей 2а и 4а с высокой и низкой поверхностной энергией (поверхностным натяжением). Во время ламинирования слоев участки с высокой и низкой поверхностной энергией на первой поверхности 2а нижнего слоя 2 и второй поверхности 4а верхнего слоя 4 конгруэнтно совмещают друг с другом. Физиологическая жидкость или другая водная проба смачивает только участки с высокой поверхностной энергией и поэтому после взятия пробы остается в каналах 6b и чувствительных участках 6а системы 6 распределения пробы между первой поверхностью 2а нижнего слоя 2 и второй поверхностью 4а верхнего слоя 4.
На фиг.5 показан пример выполнения системы 6 распределения пробы с гидрофобными "направляющими течение жидкости элементами". В выполненном по этому варианту тест-элементе нижний слой 2 и верхний слой 4, за исключением чувствительных участков и каналов для прохода пробы, покрыты слоем 16 гидрофобного материала. Гидрофобный слой 16 создает участок с низкой поверхностной энергией, оказывающей отталкивающее действие на пробу жидкости, и ограничивает ее распределение обладающими высоким поверхностным натяжением участками, которые образуют систему распределения пробы.
Слой 16 гидрофобного покрытия наносят на гидрофильную поверхность, которая смачивается физиологической жидкостью и пропускает свет, в частности, в ультрафиолетовой области, в ближней инфракрасной области и/или в видимой области электромагнитного спектра. Описанная выше процедура требует наличия в предлагаемом в изобретении тест-элементе гидрофильной поверхности, которой может быть поверхность природного гидрофильного полимера, например целлофана или стекла, а также поверхность обычных (перечисленных в качестве примера ниже) гидрофобных полимеров, на которую физическим или химическим плазменным осаждением наносят покрытие из испаряющегося в вакууме гидрофильного мономера, например этиленоксида, этиленгликоля, пиррола или акриловой кислоты. "Направляющие течение жидкости элементы" системы распределения пробы выполняют на такой гидрофильной поверхности нижнего и верхнего слоев печатанием с использованием соответствующим образом выбранной гидрофобной краски.
В качестве гидрофобной краски, которой на гидрофильной поверхности печатают элементы системы распределения пробы, обычно используют краску с краевым углом более 70° и поверхностным натяжением обычно менее 33 мН/м, например краску, содержащую обладающие гидрофобными свойствами мономеры, олигомеры и форполимеры, такие как изооктилакрилаты, додецилакрилаты, производные стирола или соединения с частично фторированными углеродными цепями.
На фиг.6 показан другой вариант выполнения системы распределения пробы с использованием гидрофильных каналов. У предлагаемого в этом варианте тест-элемента нижний несущий слой 2 и верхний слой 4 покрыты слоем 17 гидрофильного материала, образующего участки с высоким поверхностным натяжением.
Нанесенное печатанием на гидрофобную поверхность гидрофильное покрытие хорошо смачивается физиологической жидкостью, и образующие гидрофильные каналы системы распределения пробы участки с высоким поверхностным натяжением создают капиллярную силу, под действием которой взятая проба физиологической жидкости попадает в отдельные чувствительные участки системы распределения.
Гидрофильный рисунок можно выполнить печатанием на гидрофильной поверхности с использованием сшиваемого и/или частично нерастворимого гидрофильного или амфифильного агента. В качестве печатной краски, обладающей гидрофильными свойствами, можно использовать большое количество сшиваемых растворимых в воде полимеров, предпочтительно акрилатные производные полиспиртов, полиэтиленгликолей, полиэтиленоксидов, винилпирролидона, производных алкилфосфохолина и других, а также органомодифицированные силиконакрилаты, которые являются разновидностью сшиваемых органомодифицированных полисилоксанов. Обычно у таких гидрофильных покрытий краевой угол не превышает 25°, а поверхностное натяжение составляет более 70 мН/м.
Нижний несущий слой 2 и верхний слой 4, которые служат подложкой для процесса печати, можно изготовить из материалов типа стекла, поливинилацетата, полиметилметакрилата, полидиметилсилоксана, сложных полиэфиров и полиэфирных смол с флуореновыми кольцами, поликарбонатов и привитых сополимеров поликарбоната и стирола, поликарбонатов с модифицированными концевыми группами, полиолефинов, циклоолефинов и сополимеров циклоолефина и/или сополимеров олефинов с малеимидом.
В предлагаемых в изобретении тест-элементах с подложками с промежуточными гидрофобными свойствами можно использовать комбинацию вариантов, показанных на фиг.5 и 6, с напечатанными гидрофильной краской каналами, окруженными участками, обладающими гидрофобными свойствами.
В предлагаемом в изобретении тест-элементе систему распределения пробы можно также выполнить только на первой или второй поверхности путем соответствующего формирования на ней гидрофильных/гидрофобных участков. Однако для более надежного распределения пробы в гидрофильных каналах системы распределения пробы более предпочтительно использовать одинаковые по форме и расположению участки с высокой и низкой поверхностной энергией, выполненные симметрично и на первой, и на второй поверхностях соответственно нижнего и верхнего слоев предлагаемого в изобретении тест-элемента.
Кроме того, путем травления или тиснения можно участки с высокой поверхностной энергией на первой и второй поверхности расположить выше участков с низкой поверхностной энергией.
При образовании участков с высокой и низкой поверхностной энергией гидрофобными элементами, направляющими течение жидкости, или гидрофобными каналами либо теми и другими для проведения анализов с помощью предлагаемого в предпочтительном варианте тест-элемента достаточно иметь всего около 0,5-1,0 мкл пробы и всего около 100-150 нл пробы в каждом чувствительном участке системы распределения пробы. Для специалистов в данной области очевидно, однако, что в каждом конкретном случае в зависимости от назначения предлагаемые в изобретении тест-элементы могут иметь разный объем и конструкцию системы распределения пробы и разное количество чувствительных участков.
Как уже отмечалось выше, изготовление тест-элементов с таким объемом системы распределения пробы, состоящей из множества каналов и чувствительных участков, известными в настоящее время способами, используемыми при изготовлении обычных полосок для проведения анализов, связано с очень большими трудностями или вообще практически невозможно. Количество физиологической жидкости, необходимой для проведения анализов с помощью предлагаемого в изобретении тест-элемента, в 40 раз меньше объема пробы, необходимой для проведения анализов с помощью устройства, предложенного у Shartel и др. в заявках US 2002/0110486 А1 и US 2003/0031594 A1, и в 10 раз меньше объема пробы, необходимой для проведения анализов с помощью известных микрокювет (HemoCue Glucose System).
На фиг.7 показаны различные варианты выполнения системы распределения пробы, образованной, как показано на фиг.6, гидрофильными каналами или, как показано на фиг.5, гидрофобными "направляющими течение жидкости элементами" либо одновременно теми и другими. В ячейке А1 на фиг.7 показаны все варианты выполнения простейшей системы распределения пробы. В столбце А показаны варианты выполнения системы распределения пробы без фоновой коррекции, в столбце В показаны варианты выполнения системы распределения с фоновой коррекцией, в столбце С указаны значения порядка полиномиального уравнения калибровки для разных вариантов выполнения системы распределения пробы, а в столбце n указано необходимое количество чувствительных участков на каждой поверхности или количество необходимых измерений. Буквами и цифрами в каждом варианте выполнения системы распределения пробы обозначено положение участка фоновой коррекции (с), участка для пробы (1) и все ассоциированные участки калибровки (2, 3, 4, 5, 6) с возрастающим содержанием количества калибровочного соединения. Наиболее простой вариант калибровки описывается линейным уравнением с прямо пропорциональной зависимостью между результатом измерений и концентрацией в пробе определенного анализируемого вещества. Калибровку предлагаемого в изобретении тест-элемента выполняют методом стандартных добавок путем добавления к пробе калибровочного соединения в разных чувствительных участках с последующим расчетом линейного или монотонно нелинейного уравнения калибровки. Более подробно процесс калибровки предлагаемого в изобретении тест-элемента с системой распределения пробы, выполненной по варианту I, проиллюстрирован на фиг.9. Модель калибровки или порядок уравнения (фиг.7, столбец С) должны соответствовать определенному анализируемому веществу и используемым для анализа химическим соединениям и поэтому линейную калибровку нельзя использовать для химической реакции, которая описывается моделью четвертого порядка, и наоборот. При этом, однако, увеличение количества стандартных добавок в предлагаемом в изобретении тест-элементе, рассчитанном на пять стандартных добавок для линейной калибровки, позволит повысить точность измерений и статистическую достоверность в части коэффициента корреляции, стандартного отклонения и стандартной ошибки по сравнению с вариантом с двумя стандартными добавками для такой же линейной калибровки.
Предлагаемый в изобретении тест-элемент в варианте, показанном в IV-ой строке описанной выше таблицы, позволяет путем повторного взятия пробы и выполнения стандартных измерений выполнить для каждой конкретной пробы физиологической жидкости независимо две линейные калибровки. При этом один и тот же предлагаемый в изобретении тест-элемент можно использовать и для определения концентрации в пробе двух анализируемых веществ.
С другой стороны, если используемые для проведения анализов химические соединения имеют разный химический состав и образуют при взаимодействии с пробой разные продукты реакции, поглощающие свет в существенно разном диапазоне длин волн, то одну и ту же группу чувствительных участков можно использовать для проведения множества анализов.
Показанные на фиг.3 чувствительные участки 6' системы 6 распределения пробы, расположенные на первой поверхности 2а нижнего слоя 2, отличаются наличием показанного на фиг.5 и 6 покрытия из каталитического состава 18. Каталитический состав 18 содержит в качестве реактивных компонентов промотор каталитической или некаталитической реакции с содержащимся в пробе анализируемым веществом, при необходимости вместе с коферментом, и индикатор, образующий вещество с определенными оптическими свойствами, которое методом фотометрии по пропусканию или поглощению света позволяет определить концентрацию в пробе 15 определенного анализируемого вещества.
В качестве промотора предпочтительно использовать фермент, выбранный из группы, включающей дегидрогеназы, киназы, оксидазы, фосфатазы, редуктазы и/или трансферазы. В качестве кофермента, который можно добавлять к ферменту, используют вещество, необходимое для того, чтобы определенные ферменты могли ускорять ферментативную реакцию, например добавляемый к глюкозодегидрогеназе 3-никотинамидаденин-динуклеотид.
2
2
2
2
При определении содержания глюкозы в крови содержащуюся в пробе глюкозу окисляют кислородом и глюкозооксидазой с получением глюконовой кислоты и HO. Количество образовавшегося в результате окисления глюкозы HO затем определяют количественно реакцией (1) или реакцией (2).
Реакция (1):
Реакция (2):
2
2
2
2+
3+
HO+Fe→Fe+НО
3+
3+
Fe+краситель → комплекс Fe-краситель
2
2
2
2
2
2+
3+
3+
3+
В реакции (1) фермент пероксидаза (POD, например пероксидаза хрена, микропероксидаза) катализирует окисление красителя с превращением HO в НО. Интенсивность окрашивания прямо пропорциональна концентрации содержащейся в пробе глюкозы. В качестве примеров красителей можно назвать о-дианизидин, 4-аминоантипирин и 3,3',5,5'-тетраметилбензидин. В реакции (2) НО окисляет Fe до Fe. Fe образует окрашенный хелатный комплекс с характерным пиком поглощения света. В качестве примера солей железа можно назвать сульфат железа и ферроцианид калия. В качестве примера хелатного красителя можно назвать ксиленоловый оранжевый. Количество образующегося хелатного комплекса Fe пропорционально количеству содержащейся в пробе глюкозы.
Определять концентрацию глюкозы в физиологической жидкости можно и другим способом в соответствии с реакцией (3) с использованием глюкозодегидрогеназы (GDH), которая специфически взаимодействует с содержащейся в пробе глюкозой в присутствии кофермента (3-никотинамидаденин-динуклеотида (3-NAD)) с образованием NADH, который представляет собой восстановленную форму 3-NAD. NADH вступает затем в реакцию с электроноакцепторным красителем, например, 3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолийбромидом (МТТ), в присутствии катализатора, которым служит фермент диафораза, и приобретает темно-красную окраску с пурпурным оттенком. Интенсивность цвета, измеренная на длине волне 640 нм, прямо пропорциональна концентрации содержащейся в пробе глюкозы.
Реакция (3):
Альтернативным реагентом для GDH дикого типа является глюкозодегидрогеназа-пирролохинолинхинон (GDH-PQQ), который часто используют для электрохимического определения содержания глюкозы в крови и который можно также использовать для оптических методов анализа с индикаторными красителями, образующимися в процессе восстановления аналогично МТТ или индикаторными хелатными комплексами, образующимися в соответствии со второй половиной реакции (2).
При использовании предлагаемой в изобретении тест-полоски для определения концентрации глюкозы в физиологической жидкости в каталитический состав 18 включают, таким образом, глюкозооксидазу или глюкозодегидрогеназу.
В зависимости от анализируемого вещества в состав каталитического состава включают тот или иной фермент, в частности холестеролоксидазу для определения холестерина, алкогольоксидазу для определения спирта, лактатоксидазу для определения лактата и т.д.
В качестве индикаторов, способных к образованию оптически определяемого продукта, или индикаторов, используемых вместе с другими химическими соединениями и в сочетании с соответствующим промотором, в частности с ферментом, предпочтительно использовать соединения, выбранные из группы, включающей ароматические амины, ароматические спирты, азины, бензидины, гидразоны, аминоантипирины, сопряженные амины, сопряженные спирты и ароматические и алифатические альдегиды. В качестве конкретных примеров индикаторов можно назвать гидрохлорид 3-метил-2-бензотиазолинонгидразона, гидрохлорид 3-метил-2-(сульфонил)-бензотиазолонгидразона (ГМБТ), 8-амино-1-нафтол-5,7-дисульфоновую кислоту (Чикаго-кислоту), 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (ТМБ), 4,5-дигидрокси-2,7-нафталиндисульфоновую кислоту, 1-гидрокси-2-нафталинсульфоновую кислоту, N,N-диметиланилин, о-толидин, 3-диметиламинобензойную кислоту (ДМАБ), диаммониевую соль 2,2'-азино-бис-(3-этилбензотиазолин-6-сульфоновой кислоты) (АБТС), 3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолийбромид (МТТ) и/или 3,5-дихлор-2-гидроксибензолсульфоновую кислоту. В том случае, когда химическим соединением является кислота, для приготовления каталитического состава можно использовать растворимую в воде соль этой кислоты, например аммониевую соль.
Различные ферментные красители, которые можно использовать в каталитическом составе, описаны в различных публикациях, например у Wong и др. (US 6312888), у Philips и др. (US 4935346) и у Berti и др. (US 4247297). Пригодные для применения в соответствии с изобретением каталитические составы состоят из
нереакционноспособной (химически инертной) основы, индикаторных компонентов (красителей) и фермента или нескольких ферментов в качестве промотора.
Нереакционноспособная основа служит носителем, пригодным для нанесения на него необходимого покрытия, предпочтительно струйной печатью, стабилизации фермента и фиксации состоящей из фермента и индикатора системы в чувствительных участках на поверхности носителя. Ниже в качестве примера перечислены компоненты, используемые для приготовления 100 мл каталитического состава:
Нереакционноспособная основа:
дистиллированная вода
65 мл
лимонная кислота
2,4 г (буфер)
цитрат натрия ·2Н<sub>2</sub>О
3,2 г (буфер)
полиэтиленгликоль
1,0 г (ингибитор образования корки)
N-метилпирролидон
2,0 г (сорастворитель некоторых
индикаторных красителей (необязательно)
BAS
3,0 г (стабилизатор фермента)
Gafquart 440 (ISP)
1,0 мл (пленкообразователь)
Advantage S (ISP)
1,0 г (пленкообразователь)
PVA (с низкой мол. массой)
1,5 г (стабилизатор фермента)
Значение pH устанавливают на 6,5 и объем доводят до 100 мл.
Каталитический состав (все компоненты добавляли к 100 мл
нереакционноспособной):
GOD (Aspergillus niger)
2,0 мг (250 ед./мл)
POD (хрен)
2,0 г (250 ед./мл)
Индикаторная система а)
ТМБ
0,801 г
Индикаторная система б)
АБТС
0,915 г
Индикаторная система в)
МБТГ
0,719 г
ДМАБ
0,551 г
Индикаторная система г)
МБТГ
0,359 г
Чикаго-кислота
1,064 г
Каталитический состав может состоять из индикаторных систем а)-г) в комбинации с различными ферментами, образующими пероксид водорода, такими как GOD. При замене GOD другим катализатором pH нереакционноспособной основы необходимо скорректировать в соответствии с новым ферментом.
В качестве примера неферментативных каталитических реакций можно назвать определение альбумина с помощью тетрабромфенолового синего и определение кетонов с помощью забуференной фосфатом смеси глицина и нитропруссида в видимой части электромагнитного спектра.
В тест-элементах, предназначенных для выполнения n анализов, где n представляет собой целое число больше 2, все n чувствительных участков 6' первой поверхности покрывают каталитическим составом 18, промотирующим определение концентрации анализируемого вещества в пробе физиологической жидкости.
На фиг.3, 5 и 6 показаны чувствительные участки 6а второй поверхности 4а верхнего слоя 4 предлагаемого в изобретении тест-элемента (тест-полоски), покрытые калибровочным составом 19, содержащим калибровочное соединение.
Калибровочное соединение, которое содержится в калибровочном составе 19, которым покрыты определенные чувствительные участки 6а второй поверхности 4а, предпочтительно идентично или по существу аналогично анализируемому веществу и может вызывать в каталитическом составе такую же химическую реакцию, что и анализируемое вещество, содержащееся в пробе физиологической жидкости. В том случае, когда содержащимся в пробе физиологической жидкости анализируемым веществом является глюкоза, калибровочное соединение предпочтительно представляет собой также глюкозу.
Для приготовления калибровочного состава используют такую же
нереакционноспособную основу, что и при приготовлении описанного выше каталитического состава, к которой просто добавляют необходимое количество калибровочного соединения. N-метилпирролидон, который используют в качестве сорастворителя для некоторых индикаторных красителей, в калибровочный состав можно не добавлять.
Точность процесса калибровки и соответственно точность расчета концентрации анализируемого вещества в пробе физиологической жидкости существенно зависят от точности дозирования калибровочного соединения в разных чувствительных участках. Поэтому для нанесения покрытия калибровочного состава, как и для нанесения покрытия из каталитического состава, в изобретении предлагается использовать метод струйной печати. Струйная печать позволяет точно дозировать количество калибровочного соединения и наносить его в виде покрытия на определенный чувствительный участок системы распределения пробы.
В предлагаемых в изобретении тест-элементах, предназначенных для выполнения n анализов, где n представляет собой целое число больше 2, n чувствительных участков второй поверхности 4а покрывают n калибровочными составами, приготовленными из n-m составов с разным содержанием калибровочного соединения или анализируемого вещества, и m контрольных составов, где m представляет собой целое число, равное или большее 1, a n>m. Иными словами, в изготовленных таким образом тест-элементах по меньшей мере один из n чувствительных участков системы распределения пробы не содержит калибровочного соединения.
Взятая проба физиологической жидкости под действием капиллярных сил по каналам системы распределения пробы попадает в чувствительные участки и растворяет каталитические составы в n чувствительных участках первой поверхности 2а и n калибровочных составов в n чувствительных участках второй поверхности 4а, образуя смесь анализируемого вещества, калибровочного соединения (которым может быть дополнительное анализируемое вещество), промотора и индикаторного красителя. Разная оптическая плотность n образовавшихся смесей, которая зависит от разного количества калибровочного соединения в разных чувствительных участках и неизвестного содержания анализируемого вещества, обеспечивает возможность получения методом фотометрии путем измерения пропускания и/или поглощения света n результатов, используемых для вычисления концентрации анализируемого вещества. Каталитический состав и калибровочные составы, нанесенные в предлагаемом в изобретении тест-элементе на определенные чувствительные участки системы распределения пробы, хорошо растворяются физиологической жидкостью и/или водой и, будучи расположены очень близко друг к другу, обеспечивают быстрое диффузионное перемешивание обоих компонентов и быстрое взаимодействие всех компонентов образующейся на чувствительных участках реакционной смеси и быстрое определение фотометрическим методом концентрации анализируемого вещества в пробе физиологической жидкости.
На фиг.8 показано устройство для измерения оптической плотности пробы в предлагаемом в изобретении тест-элементе, показанном на фиг.6. Это устройство состоит из источника 20 света, который излучает свет 24 определенной длины волны в направлении чувствительного участка системы распределения пробы. Излучаемый источником 20 свет проходит через оптическое устройство 21, например диффузор или линзу, диафрагму 22, несущий слой 2, пробу 15 и верхний слой 4 чувствительного участка 4 и попадает в расположенный на другой стороне фотоприемник 23.
Наличие в системе распределения пробы минимум двух чувствительных участков с разным содержанием калибровочного состава позволяет устройству, предназначенному для обработки данных, вычислить неизвестную концентрацию анализируемого вещества по результатам n измерений, полученных при анализе находящейся в тест-элементе пробы физиологической жидкости.
На фиг.9 приведен пример вычисления концентрации анализируемого вещества в пробе физиологической жидкости методом стандартных добавок для линейной калибровки, который является широко распространенным методом калибровки и обычно используется в различных областях аналитической химии, но в первый раз предлагается для использования при определении концентрации анализируемого вещества с помощью предлагаемых в изобретении тест-полосок с сухими реагентами. Для определения концентрации анализируемого вещества в этом примере использовали тест-полоску с тремя чувствительными участками, два из которых были покрыты калибровочным составом с разной концентрацией калибровочного соединения. После заполнения пробой физиологической жидкости системы распределения пробы и возникновении в чувствительных участках каталитической реакции по сигналу, принимаемому фотоприемником оптического измерительного устройства, определяли первый коэффициент 25а поглощения света пробой, находящейся в чувствительном участке с первой концентрацией калибровочного соединения. Полученный сигнал был пропорционален сумме концентрации первого калибровочного соединения в первом чувствительном участке и концентрации содержащегося в пробе анализируемого вещества. Одновременно по второму принимаемому фотоприемником сигналу определяли другой коэффициент 26а поглощения света пробой, находящейся в чувствительном участке со второй концентрацией калибровочного соединения, пропорциональный сумме концентрации второго калибровочного соединения во втором чувствительном участке и концентрации содержащегося в пробе анализируемого вещества. Кроме этих двух коэффициентов поглощения для чувствительного участка, заполненного только пробой физиологической жидкости с неизвестной концентрацией анализируемого вещества, определяли третий коэффициент поглощения 27а.
0
1
При линейной корреляции между оптической плотностью и концентрацией анализируемого вещества в соответствии с законом Ламберта-Бера устройство для обработки данных тест-системы может вычислить методом линейного регрессионного анализа полученных в описанном выше примере результатов измерений коэффициенты для уравнения калибровки вида у=с+cx. Концентрация анализируемого вещества в пробе физиологической жидкости определяется для нулевой точки 28 (у=0) уравнения калибровки с вычисленными значениями коэффициентов.
Уравнения калибровки можно представить в следующем общем виде:
где y=f (результаты оптических измерений), x=f (концентрация калибровочных соединений), n - количество измерений.
Это полиномиальное уравнение вместе с n-значениями, указанными на фиг.7, является сущностью наиболее полезных моделей калибровки для показанных на этом чертеже различных схем системы распределения пробы. Значения y и x могут представлять собой вычисленные этой функцией данные, которые можно использовать для предварительной обработки исходных данных, полученных измерительным устройством. Поэтому для линеаризации исходных данных можно использовать логарифмическую функцию.
Необходимо отметить, что настоящее изобретение неограничено показанными на фиг.7 вариантами выполнения системы распределения пробы и на основании приведенной выше информации можно разработать системы, количество чувствительных участков в которых больше 6.
Подробную информацию о методах стандартных добавок для линейной и нелинейной калибровки можно найти у Frank и др. (Anal. Chem., т.50, №9, август 1978) и у Saxberg и др. (Anal. Chem., т.51, №7, июнь 1979).
1
1
2
2
3
3
Предлагаемый в предпочтительном варианте осуществления изобретения тест-элемент, показанный на фиг.3, имеет один чувствительный участок, в котором содержатся только каталитические соединения (6a и 6'a соответственно), один чувствительный участок с каталитическими соединениями и первой концентрацией калибровочного соединения (6а и 6'а соответственно), один чувствительный участок с каталитическими соединениями и второй концентрацией калибровочного соединения (6а и 6'а соответственно) и один участок для измерения фонового поглощения (6с и 6'с соответственно). Наличие последних участков без калибровочного соединения и без каталитических соединений позволяет определить фоновое поглощение пробы и учесть его в процессе калибровки.
0
(n-1)
На фиг.10 проиллюстрирован предварительно запрограммированный метод оценки достоверности результатов расчетов и данных калибровки, основанный на построении области, или "окна достоверности" 29, в границах которого находятся достоверные и точные результаты измерений. Такой способ позволяет ограничить все возможные результаты измерений определенным диапазоном достоверных и полезных данных, например диапазон концентрации глюкозы значениями от 30 до 600 мг/дл, а диапазон оптической плотности значениями от 0,1 до 0,9. Равным образом и устройство обработки данных может ограничить оптимальными значениями достоверный диапазон наклона и пересечения или в более общем случае другие коэффициенты c-c нелинейных полиномиальных уравнений калибровки. На фиг.10 показана область достоверных измерений с проходящей в области 29 достоверности через соответствующие точки 25b-27b линией 30 калибровки.
2
Более эффективным методом оценки достоверности результатов анализа является метод статистической оценки и линейный регрессионный анализ. Судить о качестве калибровки можно по коэффициенту корреляции r и доверительному интервалу. Так, в частности, при снижении коэффициента корреляции ниже запрограммированного порогового значения система анализа не выводит на дисплей результаты измерений. Можно также использовать устройство обработки данных, вычисляющее в соответствии с рассчитанным доверительным интервалом допустимый разброс или диапазон достоверных значений концентрации анализируемого вещества. Такие методы позволяют повысить качество полученных пациентом результатов анализа до уровня результатов, получаемых при использовании сложного и дорогого оборудования. Не менее важным для пациента/пользователя, особенно в больницах, является возможность получения точных и достоверных результатов анализа непосредственно во время измерений.
Повысить надежность результатов анализа можно и иным путем с помощью предлагаемой в другом варианте осуществления изобретения системы анализа, в которой концентрация инертного красителя соотносится с количеством калибровочного соединения, используемого на стадии калибровки. Калибровочный состав состоит из приготовленной до нанесения на чувствительные участки тест-элемента смеси из определенного количества калибровочного соединения и строго соответствующего ему количества инертного красителя. При наличии в системе анализа измерительного устройства, которое может определить концентрацию инертного красителя на длине волны, отличной от длины волны, на которой производят оценку реакции индикатора с анализируемым веществом, это устройство может отслеживать и при необходимости корректировать незначительные изменения в количестве калибровочного соединения, нанесенного на чувствительные участки тест-элемента.
Такой вариант выполнения предлагаемого в изобретении тест-элемента позволяет более надежно контролировать во время изготовления тест-элемента весь процесс дозировки и нанесения покрытия на его чувствительные участки. В качестве инертного красителя предпочтительно использовать растворимый в воде краситель, выбранный из группы, включающей бриллиантовый голубой G, бриллиантовый черный BN, новый кокцин, тартразин, индигокармин, сансет желтый, кармоизин, пунцовый 4R, абсолютно голубой 2В и/или растворимое в воде производное малахитового зеленого.
Благодаря встроенной системе калибровки и оценке достоверности полученных результатов предлагаемая в изобретении система для проведения анализов позволяет компенсировать не предусмотренные нормальной процедурой обстоятельства, возникающие в процессе анализа, такие как разные типы крови и разный гематокрит, а также экзогенные изменения, возникающие в крови в результате, например, приема пищевых добавок типа витамина С или лекарственных препаратов, которые так или иначе влияют на результаты измерений, и позволяет получить надежные результаты анализа. Возможность проведения калибровки тест-элемента одновременно с проведением измерений позволяет избежать влияния на точность полученных в результате измерений результатов различных внешних факторов, например температуры окружающего воздуха в момент проведения измерений,
Кроме того, наличие встроенной системы калибровки позволяет компенсировать различные отклонения, возникающие в процессе изготовления тест-элементов, например изменение толщины центрального слоя, и следить и компенсировать старение их активного компонента, в частности потерю активности фермента, и тем самым соответствующим образом увеличить срок их годности.
На фиг.11 показаны разные варианты выполнения и формы предлагаемых в изобретении тест-полосок для различных систем анализа.
На фиг.12 показано, каким образом предлагаемую в изобретении тест-полоску вставляют в предназначенное для проведения анализов устройство (анализатор). Предлагаемая в предпочтительном варианте тест-полоска имеет выпуклый выступ 10, расположенный сбоку на одной из главных сторон тест-полоски в том месте, где находится отверстие участка 9 для взятия пробы. Наличие такого выпуклого выступа упрощает взятие проб капиллярной крови из руки или пальца пациента, как это показано на фиг.13.
В другом, показанном на фиг.14 варианте предлагается предназначенный для проведения анализов диск 31 с несколькими расположенными симметрично вокруг центра диска тест-элементами и наружным выступом 39 для взятия пробы. Показанный на фиг.14а в качестве примера диск 31 имеет девять предлагаемых в изобретении тест-элементов. Как показано на фиг.14б, где приведено поэлементное изображение диска, диск 31 с тест-элементами с двух сторон сверху и снизу закрывают круглыми тонкослойными пластинками 32 и 33. На нижнюю тонкослойную пластинку 33 можно нанести покрытие 34 из поглощающего влагу материала. Закрывающие диск сверху и снизу круглые тонкослойные пластинки 32 и 33 имеют конгруэнтно расположенные отверстия, образующие оптическое окно 35 для используемого в данный момент для проведения измерений тест-элемента.
Рядом с оптическим окном 35 на наружном диаметре верхней и нижней тонкослойных пластинок 32 и 33 выполнены вырезы 36, открывающие выступ 39 для взятия пробы центрального диска с тест-элементами. Центральный диск 31 с тест-элементами имеет регистрирующий вырез 38, выполненный на внутреннем диаметре диска 31. Во время измерений через оптическое окно виден только тот тест-элемент, который в это время используется для проведения анализа и определения концентрации анализируемого вещества, как это показано на фиг.14в. Для проведения другого анализа и совмещения с окном другого тест-элемента диск 31 с тест-элементами необходимо повернуть вокруг его центра на соответствующий угол.
Использование для проведения анализов предлагаемого в изобретении диска позволяет на сравнительно небольшой площади расположить несколько тест-элементов. Показанное на фиг.15 сравнение размеров диска и тест-полосок свидетельствует о том, что при одном и том же количестве тест-элементов тест-полоски занимают намного больше места, чем диск, и требуют для их изготовления большего расхода материалов. Если на единице площади 40 диска 31 можно расположить девять тест-элементов 41, то на таком же по размерам участке 42 можно расположить только три тест-полоски. Очень небольшие по размерам тест-полоски неудобны для пользователя и создают много проблем в обращении, и поэтому дальнейшее уменьшение их размеров практически невозможно.
На фиг.16а и 16б показан вставленный в измерительный прибор диск с тест-элементами и выступающими из прибора наружу участками 39, 43b для взятия пробы.
Предлагаемые в изобретении тест-полоски и диски с тест-элементами позволяют определять концентрацию анализируемого вещества с помощью измерительного прибора (анализатора), которым можно пользоваться и левой и правой рукой, как это показано на фиг.17. При работе левой рукой согласно фиг.17а тест-полоску 57 вставляют в измерительный прибор снизу таким образом, чтобы ее участок 43а для взятия пробы физиологической жидкости выступал наружу с правой стороны корпуса 58. По окончании измерений на дисплее 54 измерительного прибора появляются цифры, означающие значение концентрации анализируемого вещества. При работе правой рукой согласно фиг.17б прибор 59 вместе с переключаемым на работу в обратном режиме дисплеем 54 поворачивают на 180°, а тест-полоску 57 вставляют в него не снизу, а сверху.
На фиг.18 показан еще один вариант возможного компактного расположения предлагаемых в изобретении тест-элементов. В этом варианте расположенные рядом и соединенные между собой тест-элементы с выступающими сбоку участками 9 для взятия пробы образуют длинную узкую ленту 44. Соседние тест-элементы разделены перфорацией или линиями 46 разрыва, которые позволяют оторвать использованный тест-элемент 45 от остальной состоящей из неиспользованных тест-элементов части ленты 44. Состоящую из соединенных между собой тест-элементов ленту 44 можно согнуть по перфорации или линиям 46 разрыва и сложить в пачку 48, которую можно поместить в специальный небольшой по размерам контейнер, удобный для извлечения из него отдельных отрываемых от пачки тест-элементов.
Способ изготовления предлагаемого в изобретении тест-элемента
Предлагаемый в изобретении тест-элемент в виде диска или полоски можно легко изготовить хорошо известными специалистам методами печати, вырубки в специальном штампе и ламинирования. Конструкция предлагаемого в изобретении тест-элемента позволяет изготавливать его простым и дешевым и предпочтительно, но необязательно, непрерывным способом.
На первой стадии на поверхности подложки путем образования участков с высокой и низкой поверхностной энергией формируют систему распределения пробы. В предпочтительном варианте участки с высокой поверхностной энергией, образующие каналы и чувствительные участки системы распределения пробы на первой и второй поверхностях, образуют путем нанесения на гидрофобную поверхность подложки покрытия из гидрофильного состава. Как уже говорилось выше, для образования участков с высокой и низкой поверхностной энергией можно также нанести на гидрофильную поверхность по определенному рисунку гидрофобное покрытие в виде "направляющих течение жидкости элементов". При использовании подложек с промежуточными гидрофобными свойствами на поверхности подложки можно напечатать гидрофильные каналы с окружающими их участками с гидрофобными свойствами.
Подложку предлагаемого в изобретении тест-элемента можно изготовить из стекла, поливинилацетата, полиметилметакрилата, полидиметилсилоксана, сложных полиэфиров и полиэфирных смол с флуореновыми кольцами, поликарбонатов и привитых сополимеров поликарбоната с полистиролом, поликарбонатов с модифицированными концевыми группами, полиолефинов, циклоолефинов и их сополимеров и/или сополимеров олефинов с малеимидом.
Нанесение гидрофильного покрытия по определенному рисунку на гидрофобную поверхность и/или нанесение гидрофобного покрытия, образующего "направляющие течение жидкости элементы", на гидрофильную подложку предпочтительно выполняют флексографией или литографией.
Флексографская печать, выполняемая на ротационных печатных машинах, обладает высокой разрешающей способностью и является высокопроизводительным способом печати. Печать на подложках из полимерных пленок широко используется в упаковочной промышленности. Оптический метод измерения концентрации анализируемого вещества, проиллюстрированный на фиг.8, требует выполнения гидрофильного рисунка прозрачной и чистой печатной краской, обладающей низкой вязкостью. Низкая вязкость краски обеспечивает возможность нанесения тонкого равномерного покрытия толщиной порядка 2-4 мкм. Оптическое окно прозрачности печатной краски должно лежать в определенном диапазоне волн, в котором индикаторный краситель после химической реакции поглощает свет. Для изготовления предлагаемых в изобретении тест-элементов можно использовать и гидрофобные красители, которые при менее жестких требованиях используются для окрашивания тест-полоски или диска в необходимый цвет. Выпускаемые в настоящее время промышленностью машины для четырехцветной флексографской печати находят достаточно широкое распространение и работают по существу без всяких проблем. То же самое относится и к машинам для литографской печати.
Для изготовления предлагаемого в изобретении тест-элемента можно использовать растворенные в соответствующем растворителе печатные краски или печатные краски, которые закрепляются под действием ультрафиолетового излучения, а предпочтительно использовать краски, которые закрепляются в потоке электронов. Такие печатные краски обладают высокой механической прочностью и химической стойкостью и на 100% состоят из полимеров, в некоторых случаях с добавкой пигментов, и не содержат никаких летучих органических растворителей и фотоинициаторов, которые, как известно, снижают устойчивость чувствительных соединений. Хорошие свойства таких печатных красок обусловлены способностью электронов к образованию сшитых полимерных пленок и проникать в поверхность подложки.
Печатные краски, которые закрепляются в потоке электронов, позволяют использовать способность акриловых мономеров и олигомеров к полимеризации. Использование акриловых соединений для приготовления печатных красок в настоящее время становится все более и более актуальным (см. J.T.Kunjappu. "The Emergence of Polyacrylates in Ink Chemistry", Ink World, февраль 1999 г., с.40). Простейшее акриловое соединение, а именно: акриловая кислота имеет следующую формулу (I):
Двойная связь в акриловом фрагменте при взаимодействии с электронами (инициация) раскрывается и образует свободный радикал, в результате взаимодействия которого с другими образующими цепь (развитие цепи) мономерами образуются высокомолекулярные полимеры. Как уже было отмечено выше, радиационная полимеризация не требует никакого внешнего инициатора, поскольку излучение высокой энергии само генерирует свободные радикалы, благодаря чему в покрытии не остается никаких остатков инициаторов.
К акриловым мономерам, которые закрепляются в потоке электронов, относится большое количество акриловых мономеров, начиная от простых акрилатов типа 2-феноксиэтилакрилата и изооктилакрилата и заканчивая форполимерами типа эпоксиакрилата бисфенола А и акрилатов сложных/простых полиэфиров (R.Golden. J. Coatings Technol., 69, 1997, с.83). Подобный (электронно-лучевой) способ закрепления печатных красок позволяет создать "функциональные печатные краски" с определенными химическими и физическими свойствами без использования растворителя и необходимых при работе с другими печатными красками систем закрепления, которые заметно усложняют весь технологический процесс изготовления предлагаемых в изобретении тест-элементов.
В качестве обладающих гидрофобными свойствами печатных красок для изготовления предлагаемого в изобретении тест-элемента можно использовать различные мономеры, олигомеры и форполимеры с гидрофобными свойствами, такие как изооктилакрилаты, додецилакрилаты, производные стирола или соединения с частично фторированными углеродными цепями.
В качестве обладающих гидрофильными свойствами печатных красок для изготовления предлагаемого в изобретении тест-элемента можно использовать различные сшиваемые растворимые в воде полимеры, такие как акрилатные производные полиспиртов, гликолей, полиэтиленоксидов, винилпирролидона, производных аклкилфосфохолина и других, а наибольший интерес представляют органомодифицированные силиконакрилаты, которые являются сшиваемыми разновидностями органомодифицированных полисилоксанов. Обычно у выполненных из таких красок покрытий краевой угол при смачивании водой не превышает 25°, а поверхностное натяжение составляет более 70 мН/м.
На второй стадии на определенные чувствительные участки системы распределения пробы, расположенной на образующей первую поверхность подложке, наносят покрытие из каталитического состава, содержащего фермент или другое соединение, вступающее в каталитическую или некаталитическую реакцию с анализируемым веществом, и при необходимости кофермент, и индикаторный краситель, а на определенные чувствительные участки системы распределения пробы, расположенной на образующей вторую поверхность подложке, наносят покрытие из калибровочного состава с разным содержанием калибровочного соединения или анализируемого вещества.
От точности нанесения этих покрытий существенно зависит качество тест-элемента и достоверность полученных результатов анализа. Для нанесения обоих составов предпочтительно использовать прецизионные системы струйной печати или пьезоэлектрические печатные головки. Каталитический и калибровочный составы должны легко растворяться пробой физиологической жидкости. В качестве каталитического и калибровочного составов предпочтительно использовать составы на водной основе. Такие состоящие из воды, ферментов, индикаторов или калибровочных соединений составы легко высыхают при небольшом повышении температуры. Основной особенностью таких печатных составов является быстрое разбавление содержащихся в них химических соединений после взятия пробы и отсутствие всякого нежелательного воздействия на гидрофобные участки тест-элемента.
На следующей стадии в процессе ламинирования нижний и верхний слои с первой и второй поверхностями системы распределения пробы ламинируют с центральным слоем, от толщины которого зависит расстояние между первой и второй поверхностями нижнего и верхнего слоев. Центральный слой имеет вырез, расположенный в том месте, где на первой и второй поверхностях находятся участки системы распределения пробы, и образующий внутри тест-элемента полость для системы распределения пробы. Для образования эффективной системы распределения пробы между первой и второй поверхностями участки с высокой и низкой поверхностной энергией, расположенные на первой поверхности нижнего слоя, должны быть конгруэнтно совмещены с соответствующими участками с высокой и низкой поверхностной энергией, расположенными на второй поверхности верхнего слоя.
Точное совмещение нижнего и верхнего слоев в системе координат х-у является очень важным фактором, от которого зависит распределение пробы и работа всего предлагаемого в изобретении тест-элемента. Для нормальной работы системы распределения пробы точность совмещения верхнего и нижнего слоев должна лежать в пределах ±5% от ширины гидрофильных каналов. К точности расположения центрального слоя, который может быть изготовлен из липкой с двух сторон ленты толщиной порядка 80 мкм, предъявляются меньшие требования, поскольку размеры имеющегося в нем выреза, образующего внутри тест-элемента полость для системы распределения пробы, намного превышают размеры ее гидрофильных каналов. Точное совмещение верхнего и нижнего слоев особенно важно при изготовлении тест-элементов на поточной линии и скорости перемещения подложки от нескольких метров в минуту до нескольких десятков метров в минуту. Из-за возможного удлинения и натяжения подложек их совмещение в направлении оси х (направлении движения) представляется более сложной задачей, чем в направлении оси у, перпендикулярной направлению движения.
Отдельные стадии предлагаемого в изобретении непрерывного способа изготовления тест-элементов из гибких полимерных пленок с точным совмещением различных участков системы распределения пробы, выполненных на первой и второй поверхностях, показаны на фиг.19. На первой стадии, показанной на фиг.19а, на изготовленной из соответствующего полосового материала подложке 49 тест-элементов и тест-полосок, предназначенных для проведения анализов, по определенному рисунку на нижнем и верхнем слоях печатают каналы и чувствительные участки для измерения оптической плотности систем 6 распределения пробы. Как показано на фиг.19, напечатанные на верхнем и нижнем слоях части систем 6 распределения пробы попарно расположены на подложках 49 точно друг против друга и соединены между собой участками, которые в готовых тест-элементах используются для взятия пробы. В напечатанных таким образом системах распределения пробы чувствительные участки 6а, 6'а для измерения оптической плотности верхнего и нижнего слоев оказываются расположены в строго определенном положении друг относительно друга, которое не меняется при растяжении и натяжении полосы.
Пунктирными линями 50 изображены линии, по которым из полосы вырезают отдельные тест-полоски, а штрихпунктирной линией 51 изображена линия сгиба полосы.
1
После печати чувствительные участки 6а, 6'а (участки для измерения оптической плотности) покрывают каталитическими и калибровочными составами. Так, в частности, нижний ряд чувствительных участков 6'а полосы 49, которые расположены на первой поверхности тест-элементов, покрывают каталитическим составом, содержащим фермент и индикатор, а верхний ряд чувствительных участков 6а полосы 49, которые расположены на второй поверхности тест-элементов, покрывают калибровочным составом с разным содержанием калибровочного соединения, при этом один из участков (в частности 6a) не покрывают калибровочным составом и используют для измерения оптической плотности взятой пробы физиологической жидкости.
После этого на одну из поверхностей, в частности поверхность 2а нижнего слоя 2, в изготавливаемых тест-элементах ламинируют третий, или центральный, слой 52, как это показано на фиг.19б. Центральный слой 52 изготавливают из липкой с двух сторон ленты с вырезами 5, которые образуют после окончательной сборки тест-элементов их внутренние полости для систем 6 распределения пробы.
Предлагаемые в изобретении тест-элементы собирают, как показано на фиг.19в, сгибанием полосы по центральной продольной линии 51, например, с помощью специального приспособления, с получением показанной на фиг.19г ламинированной полосы 53 с совмещенными друг с другом двумя рядами выполненных на первой и второй поверхностях тест-элементов систем распределения пробы. После сгибания полосы центральный, нижний и верхний слои можно плотно прижать друг к другу специальным прижимным роликом.
В полученной ламинированной полосе 53 затем по линии 50 вырезают или вырубают готовые тест-полоски требуемой формы. Изготовление предназначенных для проведения анализов тест-полосок проиллюстрированным на фиг.19 способом, при осуществлении которого верхнюю часть подложки отгибают и прижимают к нижней части, более просто по сравнению с изготовлением тест-полосок из одного плоского листа, поскольку при этом обеспечивается точное совмещение первой и второй поверхностей и расположенных на них элементов систем распределения пробы в направлении х.
В заключение следует отметить, что в настоящем изобретении предлагается система для проведения анализов, содержащая средства для калибровки и качественного контроля процедуры анализа с помощью тест-полосок с сухими реагентами, простая в изготовлении и исключающая необходимость вмешательства пользователя в процесс калибровки и контроля за процедурой анализа и одновременно позволяющая точно контролировать состояние и свойства тест-полоски в момент проведения анализа.