Штамм бактерий Lactobacillus paracasei 1, используемый для приготовления пробиотического препарата
LACTOBACILLUS PARACASEI 1 BACTERIAL STRAIN USED FOR PROBIOTIC PREPARATION PRODUCTION

Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии и представляет собой новый бактериальный штамм Lactobacillus paracasei 1, который может быть использован в микробиологической промышленности и при производстве пробиотиков.
Из уровня техники известен штамм бактерий Bacillus licheniformis ВКПМ В-2414Д [Коротченя И.Н., Кобурнеев И.В., Гинзбург А.С., Лухвич К.А. Штамм бактерий Bacillus licheniformis ВКМ, используемый для получения пробиотической кормовой добавки, предназначенной для производства высококачественных кормов, повышающих продуктивность и снижающих риск желудочно-кишечных заболеваний животных, птицы и рыб. Патент RU 2398872, опубл. 10.09.2010, бюл. №25, заявл. 2008149890/13, 18.12.2008]. Он обладает высоким уровнем выживаемости за счет образования споровых форм бактерий, что обеспечивает возможность хранения его в жидком виде при положительных температурах в течение одного года. Недостатком данного штамма является то, что он выделен из почвы и является нетипичным для микрофлоры желудочно-кишечного тракта животных, поэтому быстро элиминируется и оказывает непродолжительный пробиотический эффект.
9
Известен штамм бактерий Lactobacillus amylovorus БТ - 24/88 ВКПМ В-6253, выделенный из содержимого слепой кишки молочного поросенка [Тараканов Б.В. Штамм бактерий LACTOBACILLUS AMYLOVORUS, используемый для производства пробиотика лактоамиловорина. Патент RU №2054478, опубл. 20.02.1996, заявл. 5063804/13, 01.10.1992], используемый для приготовления ветеринарного пробиотического препарата «Лактоамиловорин». Данный штамм характеризуется высокой скоростью образования биомассы (биологическая концентрация на 14-16 час культивирования достигает (3,0±1,5)⋅10 КОЕ/мл), высоким уровнем кислотообразования. Недостатками данного штамма является низкая адгезивная активность и уровень антагонистической активности в отношении разных видов условно-патогенных энтеробактерий (см. Таблицы 1 и 2). Кроме того, использование штаммов Bacillus licheniformis ВКМ В-2414Д и Lactobacillus amylovorus БТ - 24/88 ВКПМ В-6253 ограничивается ветеринарной практикой. В составе пробиотических препаратов, предназначенных для нормализации микрофлоры человека, они не применяются.
9
Известен штамм Lactobacillus plantarum 8Р-А3. Данный штамм входит в состав пробиотического препарата «Лактобактерин» [http://www.gastroscan.ru/handbook/145/1878]. Он обладает высокой адгезивной активностью в отношении эритроцитов человека. Недостатком данного штамма являются низкий уровень кислотообразования, низкая скорость нарастания биомассы: биологическая концентрация лактобацилл через 54 часа культивирования достигает (3,0±0,6)⋅10 КОЕ/мл. [Динамика содержания лактобацилл, микробных метаболитов и антибактериальной активности растущей культуры Lactobacillus plantarum 8Р-А3 / Чичерин И.Ю., Погорельский И.П., Лундовских И.А., Малов А.А., Шабалина М.Р, Дармов И.В. / Журнал инфектологии. - 2013. - №3. - С. 50-55]. Кроме того, уровни антагонистической и адгезивной активностей данного штамма низкие.
Задачей изобретения является расширение номенклатуры бактериальных штаммов с выраженными пробиотическими свойствами, обладающих высокой антагонистической активностью, высоким уровнем кислотообразования, повышенными адгезивными свойствами, устойчивостью к ряду антибиотических препаратов и высокой скоростью накопления биомассы.
Осуществление изобретения
Штамм Lactobacillus paracasei 1 выделен из кишечного содержимого здорового молочного поросенка. Данный штамм обладает высокой антагонистической активностью в отношении условно-патогенной микрофлоры, выраженным кислотообразованием, природной устойчивостью к ряду антимикробных препаратов. Высокий уровень адгезивной активности как в отношении эритроцитов человека, так и в отношении эритроцитов свиньи открывает перспективы использования данного штамма в составе биопрепаратов как в медицинской, так и в ветеринарной практике. Lactobacillus paracasei 1 активно размножается в жидких и на плотных питательных средах, обладает хорошей выживаемостью с сохранением пробиотических свойств в процессе длительного хранения в виде суспензии. Штамм Lactobacillus paracasei 1 депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов (ФГУП ГосНИИгенетика) под регистрационным номером ВКПМ В-11821 в 2014 году.
Штамм можно использовать для приготовления жидкой и сухой форм пробиотика, а также для приготовления биопрепарата в виде культуральной жидкости, освобожденной от микроорганизмов. При скармливании поросятам в период отъема повышает сохранность и привесы живой массы поросят, ингибирует в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ) гемолитические формы бактерий, патогенные стафилококки, патогенные и условно-патогенные энтеробактерии, восстанавливает качественный и количественный состав микрофлоры.
Предлагаемый штамм бактерий характеризуется следующими признаками.
Культурально-морфологические признаки
На плотной питательной среде MRS через двое суток инкубирования формирует колонии диаметром 1-2 мм, непрозрачные, белого цвета, блестящие, круглые по форме с выпуклой бугристой поверхностью. Край колонии неровный. При микроскопировании выявлены грамположительные палочки, прямой и закругленной формы. В жидкой питательной среде MRS-4 формирует диффузный рост, на дне пробирки образует рыхлый осадок.
Физиолого-биохимические признаки
Неподвижный, бесспоровый факультативный анаэроб, каталазоотрицательный, обладает амилолитической активностью. Оптимальные условия культивирования: температура (37±2)°С, микроаэрофильные условия с содержанием углекислого газа 5%. Способен расти при температурах (15±2)°С и (45±2)°С, сбраживает углеводы: глюкозу, крахмал, фруктозу, декстрозу, маннозу, инулин, эскулин.
Штамм непатогенен, не обладает вирулентностью и токсичностью.
Культура хранится в полужидкой среде MRS при температуре 6-8°С и в лиофильно высушенном состоянии.
Штамм проявляет устойчивость к стрептомицину в концентрации более 50 мкг/мл, гентамицину (более 20 мкг/мл) и канамицину (более 25 мкг/мл).
Изобретение поясняется следующими примерами.
Пример 1. Выделение штамма Lactobacillus paracasei 1 ВКПМ В-11821
Штамм Lactobacillus paracasei 1 ВКПМ В-11821 выделен из кишечного содержимого молочного поросенка в Кировской области в 2012 году следующим образом:
3
2
6
9
7
4
2
2
4
4
2
4
2
1,0 г каловых масс вносили в пробирки с 9 мл физраствора, готовили десятикратные разведения и проводили высевы из 3, 4 и 5 разведений на чашки с плотной питательной средой MRS следующего состава (г/л): гидролизат казеина - 10,0; пептон - 10,0; дрожжевой экстракт - 5,0; глюкоза - 20,0; ацетат натрия трехводный (CHCOONa⋅3HO) - 5,0; цитрат аммония двухзамещенный (СНОH(NН)) - 2,0; калий фосфорнокислый двухзамещенный (KНРО) - 2,0; магний сернокислый семиводный (MgSO⋅7HO) - 0,02; марганец сернокислый четырехводный (MnSO⋅HO) - 0,05; твин 80-1,0; агар - 15,0, дистиллированная вода до 1 л; рН среды - 7,0-7,2. Культивирование проводили при температуре 37°С в микроаэрофильных условиях с содержанием углекислого газа в атмосфере 5% в течение 24 часов. По окончании культивирования на поверхности агара наблюдали появление белых непрозрачных колоний диаметром 1-2 мл.
Чистую культуру бактерий получали из накопительной культуры с помощью рассева по методу Дригальского при аналогичных условиях культивирования. По фенотипическим, культурально-морфологическим, биохимическим признакам в соответствие с [Dworkin, М. Procaryotes. Third edition / М. Dworkin., S. Falkow, E. Rossenberg, K.-H. Schleifer, E. Stackebrandt. - 2001. - Vol. 1] и по результатам анализа нуклеотидных последовательностей 16S рРНК идентифицирована как штамм Lactobacillus paracasei 1.
Пример 2. Исследование адгезивности штамма
9
Оценку адгезивных свойств лактобактерий осуществляли с помощью фотоколориметрического экспресс-метода. [Оборин, В.А. Бактериофиксирующая активность эритроцитов в отношении вакцинных штаммов возбудителей чумы, сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза и обоснование ее роли в патогенезе данных заболеваний: дис. … д-ра мед. наук: 14.03.03 / Оборин В.А. - Саратов, 2011. - 261 с: ил.]. Субстратом для адгезии лактобацилл служили эритроциты человека 0(I) Rh+ группы крови и эритроциты свиньи. Лактобациллы выращивали в течение 24 часов на плотной питательной среде MRS при температуре (37±1)°С. Выросшие культуры смывали фосфатно-буферным раствором (рН 7,2-7,3 ед.) и готовили суспензии с оптической плотностью, равной 1,0. В пробирки вносили по 1 мл взвеси трижды отмытых эритроцитов в фосфатном буфере с концентрацией 10 кл/мл и 2,5 мл суспензии исследуемых культур лактобактерий. Контролем служили пробы, содержащие 2,5 мл суспензии микробных клеток и 1 мл фосфатно-буферного раствора (контрольная проба №1); 1 мл суспензии эритроцитов и 2,5 мл фосфатно-буферного раствора (контрольная проба №2). Опытные и контрольные пробы инкубировали при температуре (37±1)°С в течение 30 мин. Для осаждения эритроцитов пробы центрифугировали со скоростью 1000 об/мин в течение 2 мин, затем отбирали надосадочную жидкость в объеме 2 мл и измеряли ее оптическую плотность. В каждой серии опытов выполняли по пять независимых определений.
Использовали следующие критерии оценки выраженности адгезивных свойств у лактобактерий в отношении человеческих и свиных эритроцитов: при показателе адгезии более 40% - высокий уровень адгезивной активности, при показателе адгезии от 15 до 40% - средний уровень адгезивной активности, при показателе адгезии от 5 до 15% - низкий уровень адгезивной активности, при показателе адгезии менее 5% степень адгезии бактерий считалась нулевой.
Адгезивные свойства лактобактерий в отношении эритроцитов человека и свиньи оценивали по формуле:
где ПА - показатель адгезии,
к1
Д - оптическая плотность надосадочной жидкости в 1-й контрольной пробе,
к2
Д - оптическая плотность надосадочной жидкости во 2-й контрольной пробе,
оп
Д - оптическая плотность надосадочной жидкости в опытной пробе.
Средние значения полученных результатов представлены в таблице 1.
Анализируя данные таблицы 1, можно сделать заключение о том, что уровень адгезивной активности штамма L. paracasei 1 как в отношении эритроцитов человека, так и в отношении эритроцитов свиньи - высокий, штамм L. plantarum 8P-A3 обладает высокой адгезивной активностью только в отношении эритроцитов человека. Уровень адгезии L. amylovorus БТ - 24/88 к эритроцитам свиньи - высокий, но на 8% (по показателю адгезии) ниже, чем у заявляемого штамма.
Адгезивная активность бактерий является важным фактором в процессе колонизации бактериями слизистых оболочек организма, в частности, слизистой желудочно-кишечного тракта. Высокий уровень адгезивной активности обеспечивает длительную персистенцию лактобацилл в желудочно-кишечном тракте, следовательно, более выраженное ингибирующее воздействие на условно-патогенную микрофлору за счет антагонистической активности, также создаются благоприятные условия для преимущественного развития бенефициантной микрофлоры. Высокий уровень адгезивной активности как в отношении эритроцитов человека, так и в отношении эритроцитов свиньи открывает перспективы использования данного штамма в составе биопрепаратов как в медицинской, так и в ветеринарной практике.
Пример 3. Антагонистические свойства штамма
Оценку антагонистических свойств штаммов лактобацил осуществляли в условиях in vitro с помощью двухслойной методики по Фредерику. [Fridericq P. Actions antibiotiques reciproques chez les Enterobacteriacees Revue Belge de Patologie et de Medicine Experimentale, 19, Supp.4 1-107 (1948)].
2
Суть данной методики заключается в следующем: на чашку с плотной питательной средой MRS наносят 0,01 мл суточной бульонной культуры лактобактерий. Посевы инкубируют в течение 24 ч при температуре (36±2°С) при содержании СO в газовой смеси 5%. Для лизиса бактерий в колониях на крышку перевернутой чашки Петри помещают фильтровальную бумагу и наливают 1 мл хлороформа и экспонируют в течение 30 минут. Затем чашки проветривают в течение 3-5 мин. Индикаторные тест-штаммы, в отношении которых определяется антагонистическая активность, в течение суток подращивают в мясопептонном бульоне, затем добавляют по 0,5 мл к 2,5 мл расплавленному и охлажденному до (56±2)°С полужидкого агара, быстро перемешивают и выливают на поверхность питательного агара с колониями исследуемых штаммов. Наклоняя чашку из стороны в сторону равномерно распределяют полужидкий агар по поверхности. Затем посевы инкубируют в течение 24 ч при температуре (36±2)°С. Вокруг колоний лактобактерий должны появиться зоны ингибирования роста тест-штаммов.
В качестве тест-штаммов был использован набор культур разных видов энтеробактерий, выделенных из кишечного содержимого поросят-отъемышей, сильно отстающих в росте. В качестве контрольного тест-штамма использовали штамм E.coli С 600, который является универсальным индикаторным штаммом и используется для оценки антагонистических свойств разных видов микроорганизмов. В таблице 2 представлены данные об уровне антагонистической активности штаммов L. paracasei 1, L. plantarum 8Р-А3, L. amylovorus БТ - 24/88.
Анализируя данные таблицы 2, можно сделать заключение о том, что наиболее выраженными антагонистическими свойствами из числа изученных обладает штамм L. Paracasei 1, в среднем превышая уровень антагонистической активности штаммов (по диаметру зоны задержки роста) L. plantarum 8Р-А3, на 5-40%, L. amylovorus БТ- 24/88 на 5-25%.
Пример 4. Исследование уровня кислотообразования
Известно, что антагонистические свойства лактобацилл в значительной мере обусловлены кислотообразующей активностью. В связи с этим представлялось целесообразным изучить это свойство у лактобактерий исследуемых штаммов по методике Тернера (см. Таблицу 3).
3
Для выявления способности к кислотообразованию Lactobacillus paracasei 1 ВКПМ В-11821 засевали во флаконы с 25 мл жидкой питательной среды MRS и инкубировали при температуре (37±1)°С в течение 48 часов. По окончании инкубации определяли кислотообразующую активность лактобактерий титрометрическим методом Тернера. Каждую пробу культуральной жидкости объемом 10,0 см титровали 0,1М раствором NaOH. При этом показатель рН раствора NaOH контролировали потенциометрически, значение его должно составлять (8,5±0,1) ед.
Расчеты производили по формуле:
где а - объем 0,1М раствора NaOH, пошедший на титрование, мл;
К - поправка к титру NaOH;
0
Т - градус Тернера, условная величина, выраженная в количестве щелочи использованном при титровании 1,0 мл исследуемой суспензии.
Пример 5. Использование штамма Lactobacillus paracasei 1 для приготовления жидкой, сухой и фугатной (освобожденной от микроорганизмов культуральной жидкости) форм пробиотического препарата
10
Для приготовления жидкой формы пробиотического препарата в качестве посевного материала использовали замороженную в 10% растворе глицерина культуру L. paracasei 1 (биологическая концентрация составляет (1,2±0,4)⋅10 КОЕ/мл), полученную путем глубинного культивирования в биореакторе LiFlus GX (Bio-Tron Inc, Корея) с последующим концентрированием методом центрифугирования. Для выращивания лактобацилл использовали жидкую питательную среду МРС на капустном отваре, рН (7,0±0,5) ед. Культивирование лактобацилл проводили при температуре (37±1)°С с аэрированием (4 л/мин) со скоростью вращения мешалки 60 об/мин. В качестве источника углерода использовали глюкозу, которую вносили в питательную среду в процессе ее приготовления до конечной концентрации 2%. Процесс выращивания осуществляли в течение 16 часов, каждые три часа проводили отбор проб с целью определения биологической концентрации и отсутствия посторонней микрофлоры. Корректировку рН культуральной жидкости в процессе выращивания лактобацилл не проводили.
8
Штамм Lactobacillus paracasei 1 обладает высокой скоростью накопления биомассы. При изучении скорости накопления биомассы при начальной посевной дозе штамма (0,9±0,1)⋅10 КОЕ/мл каждые три часа проводили отбор проб и определяли биологическую концентрацию бактерий в культуральной жидкости. Результаты определений представлены в таблице 4.
Графическое отображение динамики роста лактобактерий при культивировании в биореакторе представлено на Фигуре.
9
По завершении процесса глубинного культивирования отбирали пробы нативной культуры и определяли показатель концентрации водородных ионов в жидком биопрепарате. Биологическая концентрация лактобактерий была не менее 6⋅10 КОЕ/мл (см. Таблицу 5). Для обеспечения хорошей выживаемости лактобактерий в процессе хранения до 1 месяца при температуре (6±2)°С в культуральную жидкость вносили сахарозу до конечной концентрации 10%.
Использование штамма Lactobacillus paracasei 1 для приготовления сухой формы пробиотического препарата
10
Для получения сухой формы биопрепарата использовали культуральную жидкость, полученную как в вышеописанном примере. Для концентрирования бактериальной массы использовалась центрифуга Avanti JE (Beckman Coulter, США) при режиме центрифугирования 3000 об/мин в течение 8 мин при 25°С. Надосадочную жидкость декантировали, после чего к полученной суспензии лактобацилл добавляли защитную среду для лиофилизации, содержащую 20% сахарозы и 2% желатина в соотношении 1 объем защитной среды к 1 объему концентрата микробной культуры. На следующем этапе проводили лиофилизацию по общепринятой технологии с использованием сушилки лиофильной Freezone 12 (Labconco, США). В 1 г полученного сухого препарата содержалось не менее 19⋅10 млрд живых микробных клеток (см. Таблицу 5).
Приготовление фугата культуральной жидкости Lactobacillus paracasei 1
Фугат представляет собой вторичный продукт, полученный при производстве сухой формы пробиотического препарата. Он содержит продукты метаболизма, компоненты питательной среды и лизированные бактерии. Для получения фугата культуральной жидкости Lactobacillus paracasei 1 использовали надосадочную жидкость, полученную после концентрирования бактерий методом центрифугирования.
Пример 6. Ростостимулирующие и лечебно-профилактические свойства препарата на основе Lactobacillus paracasei 1.
Ростостимулирующие и лечебно-профилактические свойства биопрепарата проверяли на поросятах-отъемышах в возрасте (25±4) дней сразу после отъема от свиноматки. В этот период в связи со сменой рациона кормов и стрессом они наиболее восприимчивы к различным инфекциям, особенно к желудочно-кишечным.
В опыте использовали три формы биопрепарата, полученные как описано в примере 3: жидкий, сухой и фугат культуральной жидкости. Всего в эксперименте было задействовано 120 поросят, из которых были сформированы 4 группы по 25-30 голов в каждой: 3 опытные и 1 контрольная. Каждую группу животных помещали в отдельную секцию. Препараты выпаивали один раз в сутки в течение двух циклов по 10 дней каждый. Перерыв между циклами составлял 10 дней
Первой опытной группе поросят в течение первого цикла выпаивали жидкий препарат в количестве 3-4 мл на голову и 8-10 мл - в течение второго цикла выпаивания; вторая группа получала сухую форму препарата в количестве 0,2-0,3 г на голову в течение первого цикла приема биопрепарата и 0,4-0,6 г - в течение второго цикла приема; третья группа поросят получала фугат микробной культуры в количестве 10-15 мл на голову в течение первого цикла приема препарата и в количестве 20-25 мл - в течение второго цикла, четвертая группа поросят - контрольная - не получала пробиотический препарат. Рацион питания и условия содержания поросят во всех секциях были одинаковыми. Проводили ежедневное клиническое наблюдение и учет живой массы поросят с периодичностью раз в неделю в каждой группе. Также оценивалась выживаемость поросят (см. Таблицу 6) и проводился анализ качественного и количественного видового состава микрофлоры кишечного содержимого (см. Таблицу 7).
Анализируя данные таблицы 6, можно сделать заключение о том, что исследуемые формы биопрепарата на основе штамма L. paracasei 1 повышают среднесуточные привесы поросят на 7,6-20,3% по сравнению с контрольными группами, среднее значение живой массы на 2,1-10,5%, а сохранность на 2,7-10%. По результатам ежедневного клинического наблюдения было отмечено, что заболеваемость и тяжесть протекания болезней в опытных группах ниже по сравнению с контрольными.
Микрофлору фекалий поросят исследовали на протяжении всего срока выпаивания пробиотических препаратов. Определяли популяционный состав бактерий группы кишечной палочки, лактобацилл, бифидумбактерий, стафилококков, гемолитических форм бактерий, условно-патогенных и патогенных энтеробактерий, дрожжеподобных бактерий. Результаты микробиологических исследований представлены в таблице 7.
Данные таблицы 7 показывают, что сразу после отъема поросят от свиноматки и первого цикла пробиотикотерапии наблюдалось снижение содержания кишечной палочки с нормальной ферментативной активностью во всех группах поросят. В опытных группах к концу пробиотикотерапии содержание лактозопозитивной кишечной палочки повышалось: в первой и второй группах - практически до исходного значения, в третьей опытной группе также повышалось, но осталось на порядок ниже нормы. В контрольной группе содержание лактозопозитивной кишечной палочки после отъема понижалось и осталось ниже нормы почти на 3 порядка.
Содержание лакто- и бифидобактерий в первой и второй опытных группах к концу пробиотикотерапии нормализовалось. В третьей опытной группе содержание лактобацилл и бифидобактерий к концу пробиотикотерапии также увеличивалось, но осталось ниже нормы почти на порядок. В контрольной группе содержание лактобацилл после отъема поросят снижалось и оставалось ниже нормы более чем на два порядка. Содержание бифидобактерий в контрольной группе осталось почти на порядок ниже нормы.
Содержание непатогенных стафилококков в кишечном содержимом поросят первой и второй опытных групп осталось на начальном уровне, в третьей опытной и контрольной группе возрастало к концу пробиотикотерапии.
Содержание энтеробактерий со слабовыраженной ферментативной активностью в контрольной группе поросят находилось на уровне (6,95±2,04) lg КОЕ/г на протяжении всего опыта. В опытных группах до приема пробиотика содержание энтеробактерий со слабовыраженной ферментативной активностью находилось на уровне (4,50±2,54) lg КОЕ/мл, а в конце опыта патогенные энтеробактерий и энтеропатогенные и лактозонегативные кишечные палочки не высевались.
Содержание гемолитических форм бактерий в кишечнике поросят-отъемышей контрольной группы составило - (8,1±1,6)% на начало опыта, в первой, второй и третьей опытной группе: (7,3±0,83)%, (7,29±0,56)% и (7,0±0,16)% соответственно. К концу опыта гемолитические формы бактерий обнаруживались только у поросят контрольной группы (6,15±1,91%).
Содержание энтерококков в фекалиях поросят всех групп находилось на уровне (7,21±1,19) lg КОЕ/мл и достоверно не изменялось на протяжении всего курса пробиотикотерапии. Содержание цитратредуцирующих микроорганизмов {Pseudomonas aeruginosa) до приема пробиотика во всех группах составляло (4,49±1,07) lg КОЕ/мл, после приема пробиотика из кишечного содержимого поросят опытных групп данная категория микроорганизмов не высевалась, в контрольной группе концентрация составляла (4,58±0,71) lg КОЕ/мл.
Таким образом, штамм Lactobacillus paracasei 1 обладает выраженной антагонистической активностью в отношении энтеропатогенных микроорганизмов, высоким уровнем кислотообразования, высокой адгезивной активностью в отношении эритроцитов человека и эритроцитов свиньи, нормализует микрофлору кишечника поросят, оказывает ростостимулирующий эффект, повышает сохранность поголовья.