МОДИФИЦИРОВАННЫЕ ПОСТТРАНСКРИПЦИОННЫЕ РЕГУЛЯТОРНЫЕ ЭЛЕМЕНТЫ ВИРУСОВ ГЕПАТИТА
MODIFIED POSTTRANSCRIPTION REGULATORY ELEMENTS OF HEPATITIS VIRUSES

Перекрестная ссылка на родственные заявки
[0001] По настоящей заявке испрашивается приоритет на основании предварительной заявки США № 62/102569, зарегистрированной 12 января 2015 года, озаглавленной "Modified Hepatitis Post-transcriptional Regulatory Elements", содержание которой полностью включено в настоящий документ в качестве ссылки.
Включение списка последовательностей в качестве ссылки
[0002] Настоящая заявка подана со списком последовательностей в электронном формате. Список последовательностей предоставлен в виде файла, озаглавленного 735042001840SeqList.txt, созданного 12 января 2016 года, с размером 152051 байт. Информация списка последовательностей в электронном формате полностью включена в качестве ссылки.
Область техники, к которой относится изобретение
[0003] Настоящее изобретение относится к способам экспрессии рекомбинантных молекул и к полинуклеотидам для применения в таких способах. В частности, изобретение относится к полинуклеотидам, содержащим посттранскрипционные регуляторные элементы (PRE), которые могут усиливать экспрессию рекомбинантных молекул, функционально связанных с ними, таким как цис-действующие посттранскрипционные регуляторные элементы и их модифицированные варианты. Модифицированные посттранскрипционные регуляторные элементы включают элементы, получаемые из вирусов гепатита, таких как вирус гепатита сурков (WHV), включая модифицированные варианты посттранскрипционного регуляторного элемента вируса гепатита сурков (WPRE). Как правило, модифицированные PRE содержат одну или несколько модификаций, которые снижают потенциал в отношении онкогенеза и/или иммуногенности при введении индивидууму для экспрессии рекомбинантной молекулы, например, предотвращая экспрессию определенных белков. В определенных вариантах осуществления такие модификации включают один или несколько стоп-кодонов, находящихся в последовательности в PRE, кодирующей вирусный белок X или его часть. В определенных вариантах осуществления полинуклеотид содержит одну или несколько последовательностей, кодирующих участок, способствующий посттрансляционной модификации, такой как разрушение, например, участок убиквитинилирования.
Уровень техники, предшествующий изобретению
[0004] Вирусные векторы могут обеспечивать эффективную систему доставки для переноса генетического материала в клетку. Нуклеиновые кислоты во многих вирусных векторах, таких как гамма-ретровирусные и лентивирусные векторы, могут интегрироваться в геном клетки-хозяина. Для усиления экспрессии генов в вирусных векторах использовали цис-действующие элементы, такие как вирусные посттранскрипционные регуляторные элементы (PRE), включая PRE вирусов гепатита и их варианты. Доступны нуклеиновые кислоты, экспрессирующие кассеты и векторы, содержащие такие элементы. Существует необходимость в улучшенных содержащих PRE нуклеиновых кислотах, кассетах и векторах. Предоставлены варианты осуществления направленных на удовлетворение такой необходимости.
Сущность изобретения
[0005] Предоставлены полинуклеотиды, содержащие модифицированный посттранскрипционный регуляторный элемент (PRE), который содержит вариант гена X, который содержит стоп-кодон и/или последовательность посттрансляционного разрушения, которая не присутствует в немодифицированном гене X вируса гепатита или в гене X вируса гепатита дикого типа, например, не присутствует в гене X вируса гепатита млекопитающих дикого типа, такого как WHV или HBV. В числе предоставляемых полинуклеотидов находятся полинуклеотиды, которые содержат содержащий модифицированный WPRE вариант гена X, который содержит стоп-кодон и/или последовательность посттрансляционного разрушения, которая не присутствует в немодифицированном гене X WHV или гене X WHV дикого типа. Предоставляемые полинуклеотиды включают экспрессирующие кассеты и вирусные векторы, содержащие такие модифицированные PRE. В конкретных вариантах осуществления модифицированный PRE функционально связан с нуклеиновой кислотой, кодирующей рекомбинантный белок, например, гетерологичный белок.
[0006] Предоставлены полинуклеотиды, содержащие модифицированный PRE, который содержит вариант гена X вируса гепатита дикого типа, где вариант гена X содержит стоп-кодон, например, по меньшей мере один стоп-кодон, не присутствующий в гене X дикого типа. В определенных вариантах осуществления по меньшей мере один стоп-кодон, например, первый стоп-кодон или каждый из множества стоп-кодонов, присутствующих в варианте гена X, начинается в положении в пределах 36 или 24 нуклеотидов в направлении 3'-конца от положения в варианте гена X, соответствующего положению на 5'-конце старт-кодона открытой рамки считывания белка X дикого типа. В определенных вариантах осуществления по меньшей мере один стоп-кодон, например, первый стоп-кодон или один или несколько из множества стоп-кодонов, присутствующих в варианте гена X, начинается в положении в пределах 36 или 24 нуклеотидов в направлении 3'-конца от положения, соответствующего остатку 411 последовательности PRE WHV, приведенной в SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125, и/или остатку 1503 последовательности, приведенной в SEQ ID NO:2. В таких определенных вариантах осуществления вариант гена X не содержит открытой рамки считывания длиной, большей или приблизительно равной 39 нуклеотидам, или длиной, большей или приблизительно равной 27 нуклеотидам.
[0007] Предоставлены полинуклеотиды, содержащие модифицированный PRE, который содержит вариант гена X вируса гепатита дикого типа, где вариант гена X содержит стоп-кодон, такой как по меньшей мере один стоп-кодон, не присутствующий в гене X дикого типа и начинающийся в положении в пределах 32 или 30 нуклеотидов от старт-кодона гена X. В определенных вариантах осуществления по меньшей мере один стоп-кодон, например, первый стоп-кодон или один или несколько из множества стоп-кодонов, присутствующих в варианте гена X, начинается в положении в пределах 32 или 30 нуклеотидов в направлении 3'-конца от положения в варианте гена X, соответствующего положению на 5'-конце старт-кодона открытой рамки считывания белка X дикого типа. В определенных вариантах осуществления по меньшей мере один стоп-кодон, например, первый стоп-кодон или один или несколько из множества стоп-кодонов, присутствующих в варианте гена X, начинается в положении в пределах 32 или 30 нуклеотидов в направлении 3'-конца от положения, соответствующего остатку 411 последовательности PRE WHV, приведенной в SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125, и/или остатку 1503 последовательности, приведенной в SEQ ID NO:2. В таких определенных вариантах осуществления вариант гена X содержит открытую рамку считывания длиной, меньшей или равной 33 нуклеотидам.
[0008] В любом из таких вариантов осуществления модифицированного PRE по меньшей мере один стоп-кодон, не присутствующий в гене X дикого типа, включает множество стоп-кодонов. Предоставлены полинуклеотиды, содержащие модифицированный PRE, который содержит вариант гена X вируса гепатита дикого типа, где вариант гена X содержит множество стоп-кодонов, не присутствующих в гене X дикого типа. В любом из таких вариантов осуществления модифицированный PRE содержит 2, 3, 4, 5 или 6 стоп-кодонов. В определенных вариантах осуществления множество стоп-кодонов содержит по меньшей мере один стоп-кодон в каждой рамке считывания, присутствующей в варианте гена X. В определенных вариантах осуществления множество стоп-кодонов содержит по меньшей мере два стоп-кодона в одной рамке считывания.
[0009] В любом из таких вариантов осуществления модифицированного PRE, содержащего множество стоп-кодонов, первый стоп-кодон из множества или один или несколько из множества стоп-кодонов начинается в положении в пределах 36, 30 или 24 нуклеотидов в направлении 3'-конца от положения в варианте гена X, соответствующего положению на 5'-конце старт-кодона открытой рамки считывания белка X дикого типа. В определенных вариантах осуществления модифицированного PRE, содержащего множество стоп-кодонов, первый стоп-кодон из множества или один или несколько из множества стоп-кодонов начинается в положении в пределах 36, 30 или 24 нуклеотидов в направлении 3'-конца от положения в варианте гена X, соответствующего остатку 411 последовательности посттранскрипционного регуляторного элемента WHV (WPRE), приведенной в SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125, и/или остатку 1503 последовательности WHV, приведенной в качестве SEQ ID NO:2. В таких определенных вариантах осуществления вариант гена X не содержит открытой рамки считывания длиной, большей или приблизительно равной 39 нуклеотидам, длиной, большей или приблизительно равной 30 нуклеотидам, или длиной, большей или приблизительно равной 27 нуклеотидам.
[0010] В любом из таких вариантов осуществления предоставляемые полинуклеотиды также могут содержать нуклеиновую кислоту, кодирующую рекомбинантный белок. В конкретных вариантах осуществления модифицированный PRE функционально связан с нуклеиновой кислотой, кодирующей рекомбинантный белок.
[0011] В определенных вариантах осуществления любого из предоставляемых полинуклеотидов по меньшей мере один стоп-кодон, например, первый стоп-кодон или один или несколько из множества стоп-кодонов, присутствующих в варианте гена X, начинается в положении в пределах, или в пределах по меньшей мере, или в 9, 12, 15, 18 или 21 нуклеотиде в направлении 3'-конца от положения в варианте гена X, соответствующего положению на 5'-конце старт-кодона открытой рамки считывания белка X дикого типа. В определенных вариантах осуществления любого из предоставляемых полинуклеотидов по меньшей мере один стоп-кодон, например, первый стоп-кодон или один или несколько из множества стоп-кодонов, присутствующих в варианте гена X, начинается в положении в пределах, или в пределах по меньшей мере, или в 9, 12, 15, 18, 21 нуклеотиде в направлении 3'-конца от положения в варианте гена X, соответствующего остатку 411 последовательности посттранскрипционного регуляторного элемента WHV (WPRE), приведенной в SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125, и/или остатку 1503 последовательности WHV, приведенной в качестве SEQ ID NO:2. В определенных вариантах осуществления модифицированный PRE содержит по меньшей мере один стоп-кодон, например, 1, 2, 3, 4 или 5 стоп-кодонов, где один или несколько стоп-кодонов множества начинаются в положении в пределах, или в пределах по меньшей мере, или в положении нуклеотида, соответствующего положению 420, 423, 426, 429 или 432 последовательности, приведенной в SEQ ID NO:1 или 125. В таких определенных вариантах осуществления вариант гена X не содержит открытой рамки считывания длиной, большей или равной или приблизительно равной 24 нуклеотидам, длиной, большей или приблизительно равной 21 нуклеотиду, длиной, большей или приблизительно равной 18 нуклеотидам, длиной, большей или приблизительно равной 15 нуклеотидам, или длиной, большей или приблизительно равной 12 нуклеотидам.
[0012] В определенных вариантах осуществления любого из предоставляемых полинуклеотидов по меньшей мере один стоп-кодон, например, первый стоп-кодон или один или несколько из множества стоп-кодонов, присутствующих в варианте гена X, начинается в положении в пределах, или в пределах по меньшей мере, или в 9, 13, 17 или 21 нуклеотиде в направлении 3'-конца от положения в варианте гена X, соответствующего положению на 5'-конце старт-кодона открытой рамки считывания белка X дикого типа. В определенных вариантах осуществления любого из предоставляемых полинуклеотидов по меньшей мере один стоп-кодон, например, первый стоп-кодон или один или несколько из множества стоп-кодонов, присутствующих в варианте гена X, начинается в положении в пределах, или в пределах по меньшей мере, или в 9, 13, 17 или 21 нуклеотиде в направлении 3'-конца от положения в варианте гена X, соответствующего остатку 411 последовательности посттранскрипционного регуляторного элемента WHV (WPRE), приведенной в SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125, и/или остатку 1503 последовательности WHV, приведенной в качестве SEQ ID NO:2. В определенных вариантах осуществления модифицированный PRE содержит по меньшей мере один стоп-кодон, например, 1, 2, 3 или 4 стоп-кодонов, где один или несколько из множества стоп-кодонов начинается в положении в пределах, или в пределах по меньшей мере, или в положении нуклеотида, соответствующего положению 420, 424, 428 или 432 последовательности, приведенной в SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125. В таких определенных вариантах осуществления вариант гена X не содержит открытой рамки считывания длиной, большей или приблизительно равной 24 нуклеотидам, длиной, большей или приблизительно равной 21 нуклеотиду, длиной, большей или приблизительно равной 16 нуклеотидам, или длиной, большей или приблизительно равной 12 нуклеотидам.
[0013] В определенных вариантах осуществления немодифицированный ген X или ген X дикого типа содержит последовательность нуклеотидов, приведенную в SEQ ID NO:221, и вариант гена X содержит внесенный в него по меньшей мере один стоп-кодон, например, 1, 2, 3, 4 или 5 стоп-кодонов. В определенных вариантах осуществления внесено множество стоп-кодонов, где в каждой рамке считывания в нее внесен по меньшей мере один стоп-кодон. В определенных вариантах осуществления внесено множество стоп-кодонов, где в одной рамке, присутствующей в нем, внесено по меньшей мере два стоп-кодона. В определенных вариантах осуществления модифицированный PRE содержит вариант гена X, который содержит по меньшей мере один стоп-кодон, например, 1, 2, 3 или 4 стоп-кодонов, где один или несколько кодонов начинается в положении в пределах, или в пределах по меньшей мере, или в положении 9, 13, 17 или 21 нуклеотида в направлении 3'-конца от положения в варианте гена X, соответствующего положению на 5'-конце старт-кодона ATG, приведенного в SEQ ID NO:221. В определенных вариантах осуществления модифицированный PRE содержит вариант гена X, который содержит последовательность нуклеотидов, приведенную в SEQ ID NO:28.
[0014] В определенных вариантах осуществления любого из предоставляемых полинуклеотидов модифицированный PRE содержит шпильку субэлемента бета, соответствующую остаткам нуклеотидов 448-470 SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125. В определенных вариантах осуществления любого из предоставляемых полинуклеотидов модифицированный PRE не содержит замен нуклеотидов в положениях в пределах шпильки субэлемента бета, соответствующих нуклеотидам 448-470 SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125. В определенных вариантах осуществления любого из предоставляемых полинуклеотидов стоп-кодон или стоп-кодоны не содержат нуклеотида в положениях в пределах шпильки субэлемента бета, соответствующих одному или нескольким из положений нуклеотидов 448-470 SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125.
[0015] В любом из таких вариантов осуществления модифицированный PRE содержит стоп-кодон, выбранный из: стоп-кодона, начинающегося в положении 9 в направлении 3'-конца от положения в варианте гена X, соответствующего положению на 5'-конце старт-кодона открытой рамки считывания белка X дикого типа, и/или в положении нуклеотида, соответствующем положению 420 в последовательности, приведенной в SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125; стоп-кодона, начинающегося в положении 13 в направлении 3'-конца от положения в варианте гена X, соответствующего положению на 5'-конце старт-кодона открытой рамки считывания белка X дикого типа, и/или в положении нуклеотида, соответствующем положению 424 в последовательности, приведенной в SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125; стоп-кодона, начинающегося в положении 17 в направлении 3'-конца от положения в варианте гена X, соответствующего положению на 5'-конце старт-кодона открытой рамки считывания белка X дикого типа, и/или в положении нуклеотида, соответствующем положению 428 в последовательности, приведенной в SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125; и/или стоп-кодона, начинающегося в положении 21 в направлении 3'-конца от положения в варианте гена X, соответствующего положению на 5'-конце старт-кодона открытой рамки считывания белка X дикого типа, и/или в положении нуклеотида, соответствующем положению 432 в последовательности, приведенной в SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125.
[0016] В любом из таких вариантов осуществления стоп-кодон может представлять собой стоп-кодон амбер (CAT), охра (TAA) или опал (TGA). В определенных вариантах осуществления стоп-кодон может представлять собой стоп-кодон амбер (CAT) или опал (TGA). В любом из таких вариантов осуществления стоп-кодон, такой как каждый из множества стоп-кодонов, внесен посредством замены, делеции или вставки нуклеотидов.
[0017] В определенных вариантах осуществления любого из таких полинуклеотидов длина варианта гена X в модифицированном PRE составляет не более 180 нуклеотидов, или длина составляет не более или составляет приблизительно 210 нуклеотидов. В определенных вариантах осуществления любого из таких полинуклеотидов вариант гена X длина составляет по меньшей мере или приблизительно 90 нуклеотидов, или длина составляет по меньшей мере приблизительно 120 нуклеотидов, или длина составляет по меньшей мере или приблизительно 180 нуклеотидов.
[0018] В определенных вариантах осуществления любого из таких полинуклеотидов вариант гена X может представлять собой вариант гена X вируса гепатита млекопитающих дикого типа или немодифицированного гена X вируса гепатита млекопитающих или его неполную или укороченную часть. В определенных вариантах осуществления ген X дикого типа или немодифицированный ген X может включать неполный ген X, кодирующий укороченный белок X, такой как присутствует в PRE дикого типа или немодифицированном PRE. В определенных вариантах осуществления ген X вируса гепатита млекопитающих дикого типа или немодифицированный ген X вируса гепатита млекопитающих или неполный ген X представляет собой или получают из гена X вируса гепатита сурков (WHV) дикого типа. В определенных вариантах осуществления ген X WHV дикого типа или немодифицированный ген X WHV содержит последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:9 или представляет собой неполный ген X на ее основе. В определенных вариантах осуществления ген X WHV дикого типа или немодифицированный ген X WHV содержит последовательность нуклеотидов, приведенную в качестве нуклеотидов 411-592 любой из SEQ ID NO: 1 и 12-20 или нуклеотидов 411-589 SEQ ID NO:125.
[0019] В определенных вариантах осуществления любого из таких полинуклеотидов модифицированный PRE может содержать по меньшей мере два или по меньшей мере три цис-действующих посттранскрипционных регуляторных субэлементов PRE вируса гепатита дикого типа или его функционального варианта(ов). В таких определенных вариантах осуществления по меньшей мере два или по меньшей мере три субэлемента содержат субэлемент альфа PRE дикого типа или его функциональный вариант, функциональный вариант субэлемента бета PRE дикого типа и/или субэлемент гамма PRE дикого типа или его функциональный вариант. В определенных вариантах осуществления модифицированный PRE содержит субэлемент альфа PRE вируса гепатита дикого типа или его функциональный вариант и функциональный вариант субэлемента бета PRE дикого типа. В любом из таких вариантов осуществления субэлемент альфа может содержать последовательность SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:5 или их варианты, субэлемент бета может содержать вариант последовательности SEQ ID NO:6 или SEQ ID NO:7, и/или субъединица гамма может содержать последовательность SEQ ID NO:8 или ее вариант.
[0020] В определенных вариантах осуществления любого из таких полинуклеотидов PRE вируса гепатита дикого типа или немодифицированный PRE вируса гепатита может представлять собой PRE вируса гепатита млекопитающих дикого типа. В определенных вариантах осуществления PRE вируса гепатита млекопитающих дикого типа или немодифицированный PRE вируса гепатита млекопитающих содержит последовательность нуклеотидов, приведенную в любой из SEQ ID NO: 1 и 12-27, или представляет собой ее функциональную часть, которая проявляет посттранскрипционную активность. В некоторых случаях один или несколько N- или C-концевых аминокислотных остатков можно удалять или убирать без существенного влияния на активность PRE. В определенных вариантах осуществления последовательность PRE вируса гепатита дикого типа или немодифицированного PRE вируса гепатита представляет собой последовательность, приведенную в SEQ ID NO:125. В определенных вариантах осуществления PRE вируса гепатита млекопитающих дикого типа представляет собой PRE вируса гепатита сурков дикого типа (WPRE).
[0021] В любом из таких вариантов осуществления предоставляемых полинуклеотидов модифицированный PRE можно модифицировать по отношению к PRE вируса гепатита дикого типа или немодифицированному PRE вируса гепатита, который содержит последовательность нуклеотидов, приведенную в SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125, последовательность нуклеотидов, которая по меньшей мере на 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична с последовательностью SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125, или ее функционально активную часть, которая проявляет посттранскрипционную активность, при условии, что вариант гена X содержит по меньшей мере один стоп-кодон, не присутствующий в соответствующем PRE вируса гепатита дикого типа.
[0022] В любом из таких вариантов осуществления предоставляемых полинуклеотидов PRE вируса гепатита дикого типа или немодифицированный PRE вируса гепатита может содержать последовательность нуклеотидов, приведенную в любой из SEQ ID NO: 1, 12-20 или 125. В определенных вариантах осуществления PRE вируса гепатита дикого типа или немодифицированный PRE вируса гепатита может содержать последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:1. В определенных вариантах осуществления PRE вируса гепатита дикого типа или немодифицированный PRE вируса гепатита может содержать последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:125.
[0023] В определенных вариантах осуществления любого из полинуклеотидов вариант гена X может содержать старт-кодон, начинающийся в положении, соответствующем положению 411 SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125. В определенных вариантах осуществления старт-кодон представляет собой старт-кодон ATG.
[0024] В определенных вариантах осуществления любого из полинуклеотидов вариант гена X может дополнительно содержать промотор, функционально связанный с вариантом гена X. В определенных вариантах осуществления промотор представляет собой промотор гена X дикого типа, содержащий последовательность, приведенную в SEQ ID NO:11, или последовательность промотора гена X WHV дикого типа.
[0025] В определенных вариантах осуществления любого из полинуклеотидов модифицированный PRE можно выбирать из: a) модифицированного PRE, содержащего последовательность нуклеотидов, которая по меньшей мере на 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична с последовательностью SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125, где модифицированный PRE содержит вариант гена X по меньшей мере с одним стоп-кодоном, не присутствующим в SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125; или b) модифицированного PRE, содержащего часть последовательности нуклеотидов a), в которой часть содержит вариант гена X, содержащий по меньшей мере один стоп-кодон, и эта часть проявляет посттранскрипционную активность. В определенных вариантах осуществления вариант гена X содержит по меньшей мере 2 стоп-кодона, по меньшей мере 3 стоп-кодона или по меньшей мере 4 стоп-кодона. В определенных вариантах осуществления вариант гена X содержит стоп-кодон в каждой рамке считывания, присутствующей в указанном варианте гена X.
[0026] В определенных вариантах осуществления вариант гена X содержит последовательность нуклеотидов, приведенную в любой из SEQ ID NO: 44-58 или 141-155. В определенных вариантах осуществления модифицированный PRE содержит последовательность нуклеотидов, приведенную в любой из SEQ ID NO:29-43 или 126-140.
[0027] В определенных вариантах осуществления любого из предоставляемых полинуклеотидов модифицированный PRE в дополнение по меньшей мере к одному стоп-кодону, не присутствующему в PRE дикого типа или немодифицированном PRE, например, не присутствующему в SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125, не содержит более никаких модификаций. В определенных вариантах осуществления любого из предоставляемых полинуклеотидов модифицированный PRE в дополнение по меньшей мере к одному стоп-кодону по сравнению с последовательностью PRE дикого типа или немодифицированного PRE, например, по сравнению с SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125, содержит дополнительные модификации.
[0028] В определенных вариантах осуществления любого из предоставляемых полинуклеотидов вариант гена X дополнительно содержит вариант старт-кодона, содержащий по сравнению со старт-кодоном гена X вируса гепатита дикого типа один или несколько отличающихся нуклеотидов. В определенных вариантах осуществления вариант старт-кодона содержит один или несколько отличающихся нуклеотидов по сравнению со старт-кодоном, соответствующим положению нуклеотидов 411-413 SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125. В таких определенных вариантах осуществления одно или несколько отличий приводят к ограничению или предотвращению инициации трансляции с указанного старт-кодона. В таких определенных вариантах осуществления вариант гена X содержит последовательность нуклеотидов, приведенную в любой из SEQ ID NO: 74-88 или 171-185, и/или модифицированный PRE содержит последовательность нуклеотидов, приведенную в любой из SEQ ID NO:59-73 или 156-170.
[0029] В определенных вариантах осуществления любого из предоставляемых полинуклеотидов вариант гена X содержит вариант промотора, функционально связанный с вариантом гена X, где вариант промотора содержит по сравнению с промотором гена X вируса гепатита дикого типа один или несколько отличающихся нуклеотидов. В определенных вариантах осуществления вариант промотора содержит один или несколько отличающихся нуклеотидов по сравнению с промотором, приведенным в качестве SEQ ID NO:11. В определенных вариантах осуществления одно или несколько отличий приводят к ограничению или предотвращению транскрипции с указанного промотора. В таких определенных вариантах осуществления модифицированный PRE содержит последовательность нуклеотидов, приведенную в любой из SEQ ID NO: 89-118 или 186-215.
[0030] В определенных вариантах осуществления любого из предоставляемых полинуклеотидов, после введения полинуклеотида в эукариотическую клетку не происходит продукции полипептида, кодируемого указанным вариантом гена X, длиной более 12, 11, 10, 9 или 8 аминокислот. В определенных вариантах осуществления любого из предоставляемых полинуклеотидов полинуклеотид не способен обуславливать продукцию полипептида, кодируемого указанным вариантом гена X, длиной более 12, 11, 10, 9 или 8 аминокислот.
[0031] В определенных вариантах осуществления любого из предоставляемых полинуклеотидов модифицированный PRE кодирует РНК, которая обеспечивает экспорт РНК из ядра и/или увеличивает стабильность иРНК. В определенных вариантах осуществления любого из предоставляемых полинуклеотидов модифицированный PRE кодирует полинуклеотид РНК, который обеспечивает экспорт РНК из ядра и/или увеличивает стабильность иРНК, где указанные обеспечение экспорта РНК из ядра и/или стабильности иРНК увеличивает экспрессию рекомбинантного белка. В определенных вариантах осуществления любого из предоставляемых полинуклеотидов модифицированный PRE сохраняет посттранскрипционную активность соответствующего PRE вируса гепатита дикого типа или немодифицированного PRE вируса гепатита и/или PRE, приведенного в SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:125, SEQ ID NO:119, SEQ ID NO:120 и/или SEQ ID NO:216. В таких определенных вариантах осуществления модифицированный PRE проявляет по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 110%, 120% или 130% или более посттранскрипционной активности соответствующего PRE вируса гепатита дикого типа или немодифицированного PRE вируса гепатита и/или PRE, приведенного в SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:125, SEQ ID NO:119, SEQ ID NO:120 и/или SEQ ID NO:216. В определенных вариантах осуществления посттранскрипционную активность модифицированного PRE можно оценивать, определяя экспрессию гена в функционально связанной нуклеиновой кислоте, кодирующей рекомбинантный белок.
[0032] В определенных вариантах осуществления любого из предоставляемых полинуклеотидов вариант гена X дополнительно содержит последовательность, кодирующую сигнал посттрансляционной модификации, не присутствующий в гене X вируса гепатита дикого типа.
[0033] Также предоставлены полинуклеотиды, содержащие модифицированный PRE, который содержит вариант гена X вируса гепатита дикого типа или немодифицированного гена X вируса гепатита, где вариант гена X содержит последовательность, кодирующую сигнал посттрансляционной модификации, не присутствующий в гене X вируса гепатита дикого типа или немодифицированном гене X вируса гепатита. В определенных вариантах осуществления любого из предоставляемых полинуклеотидов сигнал посттрансляционной модификации содержит участок убиквитинилирования.
[0034] В определенных вариантах осуществления любого из предоставляемых полинуклеотидов сигнал посттрансляционной модификации содержит первый кодон, начинающийся в положении в пределах или в пределах по меньшей мере 2, 3, 4, 5 или 6 нуклеотидов в направлении 3'-конца от положения в варианте гена X, соответствующего положению на 5'-конце старт-кодона открытой рамки считывания белка X, где первый кодон кодирует остаток глицина, аргинина, глутаминовой кислоты, фенилаланина, аспарагиновой кислоты, цистеина, лизина, аспарагина, серина, тирозина, триптофана, гистидина или лейцина в соответствии с правилом N-конца; и необязательно второй кодон, начинающийся в положении в пределах или в пределах по меньшей мере 2, 3, 4, 5 или 6 нуклеотидов в направлении 3'-конца от положения в варианте гена X, соответствующего положению на 5'-конце старт-кодона открытой рамки считывания белка X, где второй кодон кодирует остаток глутаминовой кислоты или аспарагина в соответствии с правилом N-конца.
[0035] В определенных вариантах осуществления любого из предоставляемых полинуклеотидов сигнал посттрансляционной модификации содержит один или несколько последовательностей PEST.
[0036] В определенных вариантах осуществления любого из предоставляемых полинуклеотидов полинуклеотид содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую рекомбинантный белок, функционально связанный с модифицированным PRE и вариантом гена X, содержащим последовательность, кодирующую сигнал посттрансляционной модификации, не присутствующий в гене X вируса гепатита дикого типа или немодифицированном гене X вируса гепатита.
[0037] В определенных вариантах осуществления любого из предоставляемых полинуклеотидов вариант гена X содержит последовательность, кодирующую сигнал посттрансляционной модификации, содержащий шпильку субэлемента бета, соответствующую остаткам нуклеотидов 448-470 SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125. В определенных вариантах осуществления любого из предоставляемых полинуклеотидов вариант гена X содержит последовательность, кодирующую сигнал посттрансляционной модификации, который не содержит замен нуклеотидов в положениях в пределах шпильки субэлемента бета, соответствующих нуклеотидам 448-470 SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125.
[0038] В определенных вариантах осуществления любого из предоставляемых полинуклеотидов длина варианта гена X составляет не более 180 нуклеотидов, или длина составляет не более или составляет приблизительно 210 нуклеотидов. В определенных вариантах осуществления любого из предоставляемых полинуклеотидов длина варианта гена X составляет по меньшей мере или приблизительно 90 нуклеотидов, или длина составляет по меньшей мере приблизительно 120 нуклеотидов, или длина составляет по меньшей мере или приблизительно 180 нуклеотидов.
[0039] В определенных вариантах осуществления любого из предоставляемых полинуклеотидов вариант гена X представляет собой вариант гена X вируса гепатита млекопитающих дикого типа или немодифицированного гена X вируса гепатита млекопитающих или его неполную или укороченную часть. В определенных вариантах осуществления ген X дикого типа или немодифицированный ген X может включать неполный ген X, кодирующий укороченный белок X, такой как присутствует в PRE дикого типа или немодифицированном PRE. В определенных вариантах осуществления любого из предоставляемых полинуклеотидов ген X вируса гепатита млекопитающих дикого типа, или немодифицированный ген X вируса гепатита млекопитающих, или неполный ген X представляет собой ген X вируса гепатита сурков (WHV) дикого типа или получен из него. В определенных вариантах осуществления ген X WHV дикого типа или немодифицированный ген X WHV содержит последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:9, последовательность нуклеотидов, приведенную в качестве нуклеотидов 1503-1928 SEQ ID NO:2 или представляет собой неполный ген X из него. В определенных вариантах осуществления любого из предоставляемых полинуклеотидов ген X WHV дикого типа или немодифицированный ген X WHV содержит последовательность нуклеотидов, приведенную в качестве нуклеотидов 411-592 любой из SEQ ID NO: 1 и 12-20 или нуклеотиды 411-589 SEQ ID NO:125.
[0040] В определенных вариантах осуществления любого из предоставляемых полинуклеотидов модифицированный PRE содержит по меньшей мере два или по меньшей мере три цис-действующих посттранскрипционных регуляторных субэлемента PRE вируса гепатита дикого типа или их функциональный вариант(ы). В определенных вариантах осуществления любого из предоставляемых полинуклеотидов по меньшей мере два или по меньшей мере три субэлемента содержат субэлемент альфа PRE дикого типа или его функциональный вариант, функциональный вариант субэлемента бета PRE дикого типа и/или субэлемент гамма PRE дикого типа или его функциональный вариант. В определенных вариантах осуществления любого из предоставляемых полинуклеотидов модифицированный PRE содержит субэлемент альфа PRE вируса гепатита дикого типа или его функциональный вариант и функциональный вариант субэлемента бета PRE дикого типа. В определенных вариантах осуществления любого из предоставляемых полинуклеотидов субэлемент альфа содержит последовательность SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:5 или ее вариант, субэлемент бета содержит вариант последовательности SEQ ID NO:6 или SEQ ID NO:7, и/или субъединица гамма содержит последовательность SEQ ID NO:8 или ее вариант.
[0041] В определенных вариантах осуществления любого из предоставляемых полинуклеотидов PRE вируса гепатита дикого типа или немодифицированный PRE вируса гепатита представляет собой PRE вируса гепатита млекопитающих дикого типа. В определенных вариантах осуществления любого из предоставляемых полинуклеотидов PRE вируса гепатита млекопитающих дикого типа или немодифицированный PRE вируса гепатита млекопитающих содержит последовательность нуклеотидов, приведенную в любой из SEQ ID NO: 1,12-27 или 125. В определенных вариантах осуществления любого из предоставляемых полинуклеотидов PRE вируса гепатита млекопитающих дикого типа представляет собой PRE вируса гепатита сурков дикого типа (WPRE).
[0042] В определенных вариантах осуществления любого из предоставляемых полинуклеотидов модифицированный PRE выбран из: a) модифицированного PRE, содержащего вариант гена X PRE вируса гепатита дикого типа или немодифицированного PRE вируса гепатита, где PRE вируса гепатита дикого типа или немодифицированного PRE вируса гепатита, содержит последовательность нуклеотидов, приведенную в SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125, или последовательность нуклеотидов, которая по меньшей мере на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична с последовательностью SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125, где вариант гена X содержит последовательность, кодирующую сигнал посттрансляционной модификации, не присутствующий в гене X вируса гепатита дикого типа или немодифицированном гене X вируса гепатита; и b) модифицированного PRE, содержащего часть последовательности нуклеотидов из a), где эта часть, содержит вариант гена X, содержащий последовательность, кодирующую сигнал посттрансляционной модификации, где эта часть проявляет посттранскрипционную активность.
[0043] В определенных вариантах осуществления любого из предоставляемых полинуклеотидов вариант гена X содержит старт-кодон, начинающийся в положении, соответствующем положению 411 SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125. В определенных вариантах осуществления любого из предоставляемых полинуклеотидов старт-кодон представляет собой старт-кодон ATG. В определенных вариантах осуществления любого из предоставляемых полинуклеотидов вариант гена X содержит промотор, функционально связанный с указанным вариантом гена X. В определенных вариантах осуществления любого из предоставляемых полинуклеотидов промотор представляет собой промотор гена X дикого типа, содержащий последовательность, приведенную в SEQ ID NO:11, или последовательность промотора гена X WHV дикого типа.
[0044] В определенных вариантах осуществления любого из предоставляемых полинуклеотидов модифицированный PRE выбран из: a) модифицированного PRE, содержащего последовательность нуклеотидов, которая по меньшей мере на 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична с последовательностью SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125, где модифицированный PRE содержит вариант гена X, содержащий последовательность, кодирующую сигнал посттрансляционной модификации, не присутствующий в SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125; и b) модифицированного PRE, содержащего часть последовательности нуклеотидов a), где эта часть содержит вариант гена X, содержащий последовательность, кодирующую посттрансляционную модификацию, где эта часть проявляет посттранскрипционную активность.
[0045] В определенных вариантах осуществления любого из предоставляемых полинуклеотидов вариант гена X содержит до 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 замен нуклеотидов.
[0046] В определенных вариантах осуществления любого из предоставляемых полинуклеотидов модифицированный PRE в дополнение к последовательности, кодирующей сигнал посттрансляционной модификации, не содержит никаких модификаций. В определенных вариантах осуществления любого из предоставляемых полинуклеотидов модифицированный PRE в дополнение к последовательности, кодирующей сигнал посттрансляционной модификации, не присутствующий в гене X вируса гепатита дикого типа или немодифицированном гене X вируса гепатита, содержит дополнительную модификацию(и). В определенных вариантах осуществления любого из предоставляемых полинуклеотидов дополнительная модификация(и) проведена в варианте гена X. В определенных вариантах осуществления любого из предоставляемых полинуклеотидов дополнительная модификация(и) приводит к варианту гена X, кодирующему неактивный белок X и/или укороченный белок X.
[0047] В определенных вариантах осуществления любого из предоставляемых полинуклеотидов модифицированный PRE кодирует РНК, которая обеспечивает экспорт РНК из ядра и/или увеличивает стабильность иРНК. В определенных вариантах осуществления любого из предоставляемых полинуклеотидов обеспечение экспорта РНК из ядра и/или стабильности иРНК увеличивает экспрессию рекомбинантного белка.
[0048] В определенных вариантах осуществления любого из предоставляемых полинуклеотидов модифицированный PRE сохраняет посттранскрипционную активность соответствующего PRE вируса гепатита дикого типа или немодифицированного PRE вируса гепатита и/или PRE, приведенного в SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:119, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:125 или SEQ ID NO:216. В таких определенных вариантах осуществления модифицированный PRE проявляет по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 110%, 120% или 130% или более посттранскрипционной активности соответствующего PRE вируса гепатита дикого типа или немодифицированного PRE вируса гепатита, и/или PRE, приведенного в SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:125, SEQ ID NO:119, SEQ ID NO:120 и/или SEQ ID NO:216. В определенных вариантах осуществления посттранскрипционную активность модифицированного PRE можно оценивать, определяя экспрессию гена в функционально связанной нуклеиновой кислоте, кодирующей рекомбинантный белок.
[0049] В определенных вариантах осуществления любой из предоставляемых полинуклеотидов может дополнительно содержать вирусную нуклеиновую кислоту, содержащую вариант Flap, где вариант Flap несет делецию всех или части нуклеотидов, соответствующих областям центрального полипуринового тракта (cPPT) и/или центральной последовательности терминации (CTS) последовательности Flap дикого типа или последовательности немодифицированного Flap. В таких вариантах осуществления полинуклеотиды содержат модифицированный PRE и вариант Flap. В определенных вариантах осуществления такие элементы функционально связаны с нуклеиновой кислотой, кодирующей рекомбинантный белок, и/или приводят к увеличению эффективности генного переноса гетерологичной нуклеиновой кислоты, кодирующей рекомбинантный белок, по сравнению с отсутствием таких элементов.
[0050] Также предоставлены полинуклеотиды, содержащие вариант Flap, где вариант Flap несет делецию всех или части нуклеотидов, соответствующих областям центрального полипуринового тракта (cPPT) и/или центральной последовательности терминации (CTS) последовательности Flap дикого типа или последовательности немодифицированного Flap. В определенных вариантах осуществления полинуклеотид, содержащий вариант Flap, может дополнительно содержать нуклеиновую кислоту, кодирующую рекомбинантный белок. В определенных вариантах осуществления присутствие полинуклеотида, содержащего вариант Flap с делецией всех или части cPPT и CTS, которые участвуют в формировании структуры Flap, тем не менее может успешно обеспечивать трансдукцию или транспорт в клетки нуклеиновой кислоты, кодирующей рекомбинантный белок.
[0051] В определенных вариантах осуществления любого из предоставляемых полинуклеотидов, содержащих вариант Flap, вариант Flap несет делецию всех или части нуклеотидов, соответствующих cPPT и CTS. В определенных вариантах осуществления удалены все из остатков нуклеотидов, соответствующих cPPT, и все из остатков нуклеотидов, соответствующих CTS, и/или вариант Flap не содержит остатков нуклеотидов, соответствующих cPPT, или остатков нуклеотидов, соответствующих CTS. В определенных вариантах осуществления любого из предоставляемых полинуклеотидов вариант Flap несет делецию всех или непрерывной части нуклеотидов, соответствующих нуклеотидам в области cPPT, приведенной в SEQ ID NO:123. В определенных вариантах осуществления любого из предоставляемых полинуклеотидов вариант Flap несет делецию всех или непрерывной части нуклеотидов, соответствующих нуклеотидам в области CTS, приведенной в SEQ ID NO:124. В определенных вариантах осуществления любого из предоставляемых полинуклеотидов вариант Flap несет делецию всех или непрерывной части нуклеотидов, соответствующих нуклеотидам в области cPPT, приведенной в SEQ ID NO:123, и делецию всех или непрерывную часть нуклеотидов, соответствующих нуклеотидам в области CTS, приведенной в SEQ ID NO:124.
[0052] В любом из таких вариантов осуществления полинуклеотида, содержащего вариант Flap, вариант Flap модифицирован или содержит модификации по сравнению с последовательностью, содержащей Flap дикого типа или немодифицированный Flap. В определенных вариантах осуществления последовательность Flap дикого типа или последовательность немодифицированного Flap содержит или приблизительно содержит от 80 до 200 последовательных нуклеотидов, которые включают области cPPT или CTS ретровируса, который необязательно представляет собой лентивирус. В определенных вариантах осуществления ретровирус представляет собой лентивирус. В определенных вариантах осуществления лентивирус представляет собой ВИЧ-1. В определенных вариантах осуществления Flap дикого типа или немодифицированный Flap содержит a) последовательность нуклеотидов, приведенную в SEQ ID NO:121; b) последовательность нуклеотидов, содержащую последовательность по меньшей мере на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичную с последовательностью нуклеотидов, приведенной в SEQ ID NO:121, который содержит области cPPT и CTS; или c) непрерывную часть a) или b), содержащую области cPPT и CTS.
[0053] В определенных вариантах осуществления вирусная нуклеиновая кислота, содержащая вариант Flap, представляет собой или содержит последовательность нуклеотидов, которая по меньшей мере на 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 85%, 90% или 95% идентична с последовательностью SEQ ID NO:121, где в указанном варианте Flap отсутствуют все или часть областей cPPT и CTS. В определенных вариантах осуществления любого из предоставляемых полинуклеотидов вирусная нуклеиновая кислота представляет собой или содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO:122.
[0054] В определенных вариантах осуществления любого из предоставляемых полинуклеотидов полинуклеотид содержит a) вариант Flap, который представляет собой или содержит последовательность SEQ ID NO:122 или последовательность, по меньшей мере или приблизительно на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичную с SEQ ID NO:122, где в указанном варианте Flap отсутствуют все или часть областей cPPT и CTS, соответствующего Flap дикого типа или немодифицированного Flap, или последовательности, приведенной в SEQ ID NO:121; и b) модифицированный PRE, который представляет собой или содержит последовательность SEQ ID NO:29 или 126 или последовательность, по меньшей мере или приблизительно на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичную с SEQ ID NO:29 или 126, где указанный модифицированный PRE в варианте гена X модифицированного PRE содержит по меньшей мере один стоп-кодон, не присутствующий в гене X дикого типа или немодифицированном гене X или не присутствует в PRE дикого типа или немодифицированном PRE, содержащем ген X, например, не присутствует в SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125.
[0055] В определенных вариантах осуществления любого из предоставляемых полинуклеотидов модифицированный WPRE и/или вариант Flap функционально связан с нуклеотидами, кодирующими рекомбинантный белок, который представляет собой или содержит рекомбинантный рецептор. В определенных вариантах осуществления любого из предоставляемых полинуклеотидов рекомбинантный рецептор представляет собой антигенраспознающий рецептор и/или химерный рецептор. В определенных вариантах осуществления любого из предоставляемых полинуклеотидов рекомбинантный рецептор представляет собой функциональный не являющийся TCR антигенраспознающий рецептор или трансгенный TCR. В определенных вариантах осуществления любого из предоставляемых полинуклеотидов рекомбинантный рецептор представляет собой химерный антигенраспознающий рецептор (CAR).
[0056] В определенных вариантах осуществления также предоставлена экспрессирующая кассета, которая содержит любой из предоставляемых полинуклеотидов и промотор, функционально связанный с нуклеиновой кислотой, кодирующей рекомбинантный белок. В определенных вариантах осуществления также предоставлен вектор, который содержит любой из предоставляемых полинуклеотидов или любую из предоставляемых экспрессирующих кассет. В определенных вариантах осуществления любого из предоставляемых векторов вектор представляет собой вирусный вектор. В определенных вариантах осуществления любого из предоставляемых векторов вектор представляет собой ретровирусный вектор. В определенных вариантах осуществления любого из предоставляемых векторов вектор представляет собой лентивирусный вектор. В определенных вариантах осуществления вирусный вектор представляет собой лентивирусный вектор, получаемый из ВИЧ-1.
[0057] В определенных вариантах осуществления также предоставлена клетка, которая содержит любой из предоставляемых полинуклеотидов, любую из экспрессирующих кассет или любой из предоставляемых векторов. В определенных вариантах осуществления любой из предоставляемых клеток, клетка представляет собой T-клетку, естественную киллерную (NK) клетку, клетку iPS или получаемую из iPS клетку.
[0058] В определенных вариантах осуществления также предоставлена вирусная частица, которая содержит любой из предоставляемых векторов.
[0059] В определенных вариантах осуществления также предоставлены способы, которые включают введение любого из предоставляемых полинуклеотидов, экспрессирующих кассет, векторов или вирусных частиц в клетку в условиях, при которых в клетке осуществляется экспрессия рекомбинантного белка. В определенных вариантах осуществления любого из предоставляемых способов введение проводят посредством трансдукции клетки вектором или вирусной частицей. В определенных вариантах осуществления введение проводят посредством трансфекции клетки вектором и/или введение проводят посредством электропорации клетки вектором. В определенных вариантах осуществления любого из предоставляемых способов рекомбинантный белок экспрессирован на уровне, который увеличен по сравнению с уровнем, достигаемым при введении вектора с отсутствием модифицированного PRE или соответствующего вектора, который не содержит модифицированного PRE или PRE.
[0060] Также предоставлена клетка или клетки, получаемые любым из предоставляемых способов.
[0061] Также предоставлена фармацевтическая композиция, которая содержит клетки по любому из предоставляемых вариантов осуществления и фармацевтически эффективный носитель.
[0062] Также предоставлены способы лечения, которые включают введение индивидууму с заболеванием или патологическим состоянием любого из предоставляемых полинуклеотидов, векторов, вирусных частиц, клеток или фармацевтических композиций.
[0063] В определенных вариантах осуществления любого из предоставляемых способов лечения способ приводит к экспрессии рекомбинантного белка, кодируемого полинуклеотидом. В определенных вариантах осуществления рекомбинантный белок содержит рекомбинантный рецептор, который специфически связывается с лигандом, экспрессируемым при заболевании или патологическом состоянии или соответствующими клетками или тканями. В определенных вариантах осуществления любого из предоставляемых способов рецептор представляет собой антигенраспознающий рецептор, а лиганд представляет собой антиген, специфичный для заболевания или патологического состояния и/или ассоциированный с ними. В определенных вариантах осуществления любого из предоставляемых способов заболевание или патологическое состояние представляет собой злокачественную опухоль и аутоиммунное нарушение или инфекционное заболевание.
Краткое описание чертежей
фигуре 1
[0064] На  представлена последовательность нуклеиновой кислоты иллюстративного WPRE, приведенная в SEQ ID NO:1. Нуклеиновые кислоты, соответствующие опубликованным субэлементам PRE (Donello et al. (1998) J. Virol., 72:5085; Smith et al. (1998) Nucleic Acids Research, 26:4818) обозначены следующим образом: субэлемент гамма, субэлемент альфа и субэлемент бета обозначены сплошными линиями со стрелками, обозначающими начальное и конечное положения; нуклеотиды, соответствующие иллюстративным формирующим шпильки частям субэлементов альфа и бета, обозначены пунктирной линией и курсивом, соответственно; нуклеотиды, соответствующие промотору белка WHX обозначены пунктирно-точечной линией и курсивом; и нуклеотиды, соответствующие укороченному гену X, содержащемуся в этом иллюстративном WPRE, подчеркнуты. Следует понимать, что описание его элементов получены теоретически или эмпирически. Таким образом, точный локус может варьировать (например, быть более длинным или более коротким) и соответствующий элемент не обязательно является одинаковым для каждого PRE, например, PRE каждого вида или подвида.
фигурах 2A-2E
фигуре 2A
фигуре 2B
фигуре 2C
фигуре 2D
фигуре 2E
[0065] На  представлены иллюстративные выравнивания последовательности WPRE, приведенной в SEQ ID NO:1, с другими иллюстративными PRE гепатита и обозначены соответствующие остатки. Символ "|" между двумя выровненными нуклеотидами означает, что выровненные нуклеотиды идентичны. Отсутствие "|" между двумя выровненными нуклеотидами означает, что выровненные нуклеотиды не идентичны. Символ "-" означает пропуск в выравнивании. Иллюстративные неограничивающие положения, соответствующие старт-кодону гена X обозначены жирным и курсивным текстом. Иллюстративные неограничивающие положения в гене X, соответствующие положениям, в которые можно ввести стоп-кодон, помещены в рамки. Такие положения соответствуют иллюстративному начальному остатку (например, 3'-коложению стоп-кодона) для размещения вводимого стоп-кодона. Например, на  представлено выравнивание последовательности иллюстративного WPRE, приведенной в SEQ ID NO:1, с нуклеиновыми кислотами, соответствующими последовательности иллюстративного WPRE, приведенной в SEQ ID NO:12. На  представлено выравнивание последовательности иллюстративного WPRE, приведенной в SEQ ID NO:1, с нуклеиновыми кислотами, соответствующими последовательности иллюстративного WPRE, приведенной в SEQ ID NO:13. На  представлено выравнивание последовательности иллюстративного WPRE, приведенной в SEQ ID NO:1, с нуклеиновыми кислотами, соответствующими последовательности иллюстративного модифицированного WPRE, приведенной в SEQ ID NO:119. На  представлено выравнивание последовательности иллюстративного WPRE, приведенной в SEQ ID NO:1, с нуклеиновыми кислотами, соответствующими последовательности иллюстративного PRE вируса гепатита B суслика, приведенной в SEQ ID NO:27. На  представлено выравнивание последовательности иллюстративного WPRE, приведенной в SEQ ID NO:1, с нуклеиновыми кислотами, соответствующими последовательности иллюстративного PRE вируса гепатита B человека (HBV), приведенной в SEQ ID NO:21.
Подробное описание
I. Полинуклеотиды и вирусные векторы, содержащие модифицированный посттранскрипционный регуляторный элемент (PRE)
[0066] Предоставлены полинуклеотиды, пригодные для усиления экспрессии рекомбинантных молекул, таких как рекомбинантные белки. Полинуклеотиды содержат модифицированные посттранскрипционные регуляторные элементы (модифицированные PRE), такие как цис-действующие посттранскрипционные регуляторные элементы, включая модифицированные версии вирусных посттранскрипционных регуляторных элементов, такие как модифицированные версии PRE, получаемых из вирусов гепатита, таких как вирус гепатита сурков (WHV) и вирус гепатита B (HBV).
[0067] В определенных вариантах осуществления модифицированные PRE включают модифицированные версии посттранскрипционных регуляторных элементов WHV (WPRE) дикого типа или модифицированные версии посттранскрипционных регуляторных элементов HBV (HBVPRE), включая версии с модификациями, снижающими риск того, что белок(ки) или полипептид(ы), в частности, белки и полипептиды с онкогенным или иммуногенным потенциалом для индивидуумов-хозяев, будут экспрессированы с кодирующей последовательности в PRE, и/или того, что если они будут продуцированы, такие белки будут сохраняться. Как правило, последовательности PRE дикого типа содержат открытую рамку считывания (ORF), кодирующую неполный ген X, кодирующий укороченный белок X, который в некоторых случаях, при экспрессии, может быть вовлечен в образование опухоли. Также, так как PRE в основном используют для усиления экспрессии трансгенов с экспрессирующего вектора, доставка вектора, содержащего PRE, также может приводить к экзогенной экспрессии укороченного белка X, который при введении индивидууму может вносить вклад в иммуногенность.
[0068] Предоставляемые модифицированные PRE включают вариант гена X, где вариант гена X по сравнению с немодифицированным геном X вируса гепатита или геном X вируса гепатита дикого типа содержит одну или несколько модификаций нуклеотидов. Как правило, такие модификации снижают потенциал онкогенеза и/или иммуногенность при введении индивидууму полинуклеотида (например, вирусного вектора), содержащего такой модифицированный PRE, функционально связанный с нуклеиновой кислотой, кодирующей рекомбинантную молекулу для экспрессии рекомбинантной молекулы, например, предотвращая экспрессию определенных белков, кодируемых PRE. Например, модификация(и), как правило, включает модификации, разработанные для предотвращения или снижения вероятности экспрессии полипептидов с варианта гена X модифицированного PRE. Модификации являются такими, что модифицированный PRE сохраняет по меньшей мере некоторую посттранскрипционную регуляторную активность, например, всю или часть посттранскрипционной регуляторной активности соответствующего PRE дикого типа. В определенных вариантах осуществления сохраняется по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или более посттранскрипционной регуляторной активности.
[0069] Несмотря на то, что вирусные векторы могут обеспечивать эффективную систему введения генетического материала в клетки, использование определенных вирусных векторов не всегда может обеспечивать желаемые уровни экспрессии этого генетического материала. В некоторых случаях для усиления экспрессии используют вставку интронов, но в определенных вирусных векторах это не всегда походит. Для усиления экспрессии гена использовали посттранскрипционные регуляторные элементы вируса гепатита (HPRE), такие как посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита сурков (WPRE).
[0070] Как правило, получаемые из вируса гепатита PRE, включая WPRE и HBVPRE, стимулируют, например, усиливают экспрессию трансгенов, функционально связанных с ними, облегчая экспорт посттранскрипционной РНК из ядра. Содействовать таким функциям могут вторичные и третичные структуры, формируемые цис-действующими последовательностями или элементами, содержащимися в PRE. Например, получаемые из вируса гепатита PRE дикого типа, как правило, содержат субэлемент альфа и субэлемент бета, каждый из которых независимо формирует структуры шпилек, которые влияют и/или вовлечены в посттранскрипционную активность целого PRE (Smith et al. (1998) Nucleic Acids Research, 26:4818-4827). Некоторые PRE не поражающих человека вирусов гепатита дикого типа, такие как WPRE, также содержат субэлемент гамма, который может дополнительно усиливать посттранскрипционную активность. Такие субэлементы могут содержать или кодировать РНК со структурами, которые обеспечивают экспорт РНК из ядра, например, посредством взаимодействия с зависимым и/или независимым от CRM1 аппаратом экспорта, обеспечивая участки связывания для клеточных белков, увеличивая общее количество РНК, например, рекомбинантной и/или гетерологичной РНК, транскриптов, увеличивая стабильность РНК, увеличивая количество полиаденилированных транскриптов и/или увеличивая размер полиаденилированных концов в таких транскриптах.
[0071] В дополнение к обеспечению усиливающей экспрессию функции посредством этих цис-действующих последовательностей, PRE вирусов гепатита дикого типа и немодифицированные PRE вирусов гепатита, включая получаемые из вируса гепатита млекопитающих PRE, такие как HBVPRE или WPRE, содержат часть вирусного гена X, включая по меньшей мере неполную открытую рамку считывания, кодирующую по меньшей мере укороченный белок X. Как правило, эта область по меньшей мере частично перекрывается с цис-действующими регуляторными субэлементами. Однако X-белки, даже некоторые укороченные X-белки, при включении в векторы для экспрессии генов у индивидуумов могут обладать онкогенным потенциалом. Мутации, проводимые в области гена X PRE, например, в участке старт-кодона и/или области промотора, не всегда полностью достаточны для решения этих проблем. Например, даже мутантный промотор со сниженной активностью может обеспечивать определенную степень экспрессии белка X PRE или другого полипептида, кодируемого этой областью. Реверсивная или дополнительная мутация в одном или нескольких положениях в гене X может восстанавливать или повышать уровни экспрессии белка X, способствуя онкогенности. Даже не беря в расчет онкогенный потенциал, риск экспрессии любого полипептида, особенно по меньшей мере определенной длины (например, длиной по меньшей мере 8, 9, 10, 11 или 12 аминокислот или более), белка X или другой рамки считывания в этой области или функционально связанной с этим промотором, может способствовать иммуногенности при введении индивидууму. Предоставлены нуклеиновые кислоты с модифицированными PRE, решающие эти проблемы.
[0072] Как правило, область X PRE включает неполную рамку считывания, кодирующую укороченный белок X, длина которого является меньшей, чем у полноразмерного белка X вируса гепатита, например, с длиной, составляющей менее 141 аминокислоты, например, длиной менее 130 нуклеотидов, менее 120 нуклеотидов, менее 110 нуклеотидов, менее 100 нуклеотидов, менее 90 нуклеотидов, менее 80 нуклеотидов, менее 70 нуклеотидов и, как правило, менее 60, 50, 40, 30, 20, 10 или менее нуклеотидов. На примере иллюстративного WPRE дикого типа, представленного на фигуре 1, промотор и неполная рамка считывания X перекрываются с цис-действующими последовательностями альфа и бета. Трансляция такой неполной открытой рамки считывания может приводить к продукции кодируемого укороченного белка X, который может обладать потенциалом к стимулированию образования опухоли и/или иммуногенной реакции после введения индивидууму.
[0073] Например, со ссылкой на иллюстративный WPRE, приведенный в SEQ ID NO:1 (соответствующий нуклеотидам 1093-1684 SEQ ID NO:2 или номеру доступа GenBank J04514.1), нуклеотиды 411-592 соответствуют неполной открытой рамке считывания белка X под функциональным контролем промотора X, указанного как нуклеотиды 391-410. Трансляция с транскриптов, инициированных с промотора X, кодирует укороченный белок X. Хотя, как правило, она не представлена полностью в PRE, соответствующая иллюстративная полноразмерная открытая рамка считывания белка X составляет 425 пар оснований и соответствует нуклеотидам 1503-1928 иллюстративной последовательности вируса гепатита, приведенной в SEQ ID NO:2, под функциональным контролем промотора X, соответствующего нуклеотидам 1483-1502. Другие PRE вирусов гепатита млекопитающих дикого типа или немодифицированные PRE вирусов гепатита млекопитающих также могут содержать неполную открытую рамку считывания белка X. Иллюстративные немодифицированные PRE вирусов гепатита млекопитающих или PRE вирусов гепатита млекопитающих дикого типа и соответствующая неполная открытая рамка считывания белка X приведены в таблице 1. Остатки в любом PRE, таком как любой PRE млекопитающих, которые соответствуют остаткам в иллюстративном WPRE, приведенном в SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125 (который содержит нуклеотиды 1-589 SEQ ID NO:1), можно идентифицировать посредством выравнивания каждой полноразмерной последовательности PRE, как проиллюстрировано на фигуре 2A-2E для иллюстративных последовательностей. Неограничивающие примеры соответствующих остатков, которые можно идентифицировать, включают, например, остатки любого цис-действующего элемента или его части (например, альфа, бета или гамма или их частей), остатки открытой рамки считывания белка X, остатки старт-кодона, остатки для введения стоп-кодона.
<b>ТАБЛИЦА 1: Иллюстративные PRE вирусов гепатита млекопитающих</b>
<b>PRE</b>
<b>SEQ ID NO</b>
<b>Ссылка (нуклеотиды PRE)</b>
<b>область X в SEQ ID NO</b>
<b>промотор</b>
<b>ORF гена X</b>
WPRE (WHV8)
1
номер GenBank J04514.1 (1093-1684)
391-410
411-592
WPRE
125
номер GenBank J04514.1 (1093-1681)
391-410
411-589
WPRE
12
номер GenBank J02442.1 (1093-1684)
391-410
411-592
WPRE (WHV2)
13
номер GenBank M11082.1 (1093-1684)
391-410
411-592
WPRE (WHV7)
14
номер GenBank M18752.1 (1093-1684)
391-410
411-592
WPRE (WHV59)
15
номер GenBank M19183.1 (1093-1684)
391-410
411-592
WPRE (WHV34)
16
номер GenBank KF874491.1 (1093-1684)
391-410
411-592
WPRE
17
номер GenBank AY628100.1 (1093-1684)
391-410
411-592
WPRE
18
номер GenBank AY628099.1 (1093-1684)
391-410
411-592
WPRE
19
номер GenBank KF874493.1 (1093-1684)
391-410
411-592
WPRE
20
номер GenBank GU734791.1 (1093-1684)
391-410
411-592
HBVPRE
21
номер GenBank D00329.1 (963-1684)
412-722
HBVPRE
22
номер GenBank AF100309.1 (965-1686)
412-722
Вирус гепатита B орангутана
23
номер GenBank AF193863.1 (963-1684)
412-722
Вирус гепатита B шимпанзе
24
номер GenBank D00220.2 (964-1684)
411-721
Вирус гепатита B гориллы
25
номер GenBank AJ131567.1 (2333-3053)
411-721
Вирус гепатита B американского суслика
26
номер GenBank U29144.1 (2475-3056)
401-582
Вирус гепатита B суслика
27
номер GenBank NC_001484.1 (2474-3065)
411-592
Мутантный по промотору/старт-кодону WPRE
119
нуклеотиды 2058-2649 "клонирующего вектора pLV.MCS.WHVPRE, полной последовательности" (GenBank: JN622008.1; GI:373501904); нуклеотиды 5700-6291 SEQ ID NO:5 из патента США № 7384738
391-410
411-592
Мутантный по промотору/старт-кодону WPRE
120
патент США № 7419829
391-410
411-592
[0074] В вариантах осуществления предоставляемых модифицированных PRE варианты гена X, содержащиеся в них, представляют собой варианты немодифицированного гена X или гена X дикого типа. Немодифицированный ген X, может представлять собой любой ген X, который содержит неполную рамку считывания гена X, такую как открытая рамка считывания гена X, находящаяся в немодифицированном PRE или PRE дикого типа. Например, варианты гена X модифицированного PRE включают части гена X вирусов гепатита млекопитающих, которые могут содержать неполную открытую рамку считывания белка X и кодировать укороченный белок X, как правило, дополнительно модифицированную, включая один или несколько стоп-кодонов или другие модификации, для снижения риска онкогенности и/или иммуногенности. Например, варианты гена X включают варианты части гена X дикого типа. В определенных вариантах осуществления вариант гена X может содержать по меньшей мере 180 нуклеотидов, но меньше нуклеотидов, чем содержится в полноразмерном гене X вируса гепатита, например, меньше, чем 425 нуклеотидов. Как правило, модифицированный PRE, в котором содержится вариант гена X, содержит достаточную часть цис-регулирующих последовательностей (например, один или несколько из субэлементов альфа, бета и/или гамма, их части и/или их функциональные варианты) для регуляции посттранскрипционной активности транскрипта РНК.
[0075] Модификации нуклеотидов в варианте гена X модифицированного PRE могут включать делеции, вставки и/или замены нуклеотидов. Такие модификации могут включать замены нуклеотидов в области PRE, кодирующей вирусный белок X или его часть, которые в качестве неограничивающих примеров включают замены нуклеотидов, приводящие к получению стоп-кодона, последовательности, которая помечает белок для разрушения и их сочетания. Как правило, модификации являются такими, что модифицированный PRE сохраняет по меньшей мере часть посттранскрипционной регуляторной активность, например, всю или часть посттранскрипционной регуляторной активности соответствующего PRE дикого типа или немодифицированного PRE (например, SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125) или другого модифицированного PRE, известного в данной области, как обладающего достаточной степенью активности для применения в трансдукции вирусных векторов, например, PRE с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO:119 или SEQ ID NO:120. В определенных вариантах осуществления модифицированные PRE предоставлены в экспрессирующем векторе (например, вирусном векторе), функционально связанным с нуклеиновой кислотой, кодирующей рекомбинантный белок, такой как гетерологичный белок. Под гетерологичным в этом контексте подразумевают белок, который в норме не экспрессируется с вируса и/или не кодируется вирусным геномом. В определенных вариантах осуществления гетерологичный белок не экспрессирует вирус гепатита, из которого получен PRE. В любом из таких вариантов осуществления предоставляемые модифицированные PRE могут усиливать экспрессию нуклеиновой кислоты, кодирующей рекомбинантный белок, например, по сравнению с экспрессией рекомбинантного белка с экспрессирующего вектора, не содержащего PRE.
[0076] В определенных вариантах осуществления предоставляемые модифицированные PRE проявляют посттранскрипционную активность, например, с усилением экспрессии функционально связанной нуклеиновой кислоты, избегая или снижая вероятность онкогенеза после введения и/или экспрессии у индивидуума. Например, нежелательная экспрессия функциональных полноразмерных или укороченных белков X, кодируемых PRE, может способствовать онкогенезу. В определенных вариантах осуществления модифицированные PRE содержат вариант гена X, который содержит модификации, которые предотвращают или снижают вероятность экспрессии нежелательного белка, такого как вирусный белок X или его функциональная часть, таким образом, снижая риск онкогенеза. Например, такие модификации могут включать замены нуклеотидов, которые вводят в варианте гена X один или несколько стоп-кодонов, таких как стоп-кодон(ы), не присутствующий в немодифицированном гене X или гене X дикого типа, так, что нежелательный белок, такой как белок X или его функциональная часть, достаточная для провоцирования онкогенеза, и/или любой пептид с онкогенным потенциалом не экспрессируются. В других примерах такие модификации включают замены нуклеотидов, которые вводят в вариант гена X сигнал посттрансляционной модификации, такой как участок убиквитинилирования, не присутствующий в немодифицированном гене X или гене X дикого типа, так, что кодируемый белок X помечается для разрушения.
[0077] В определенных вариантах осуществления предоставляемые модифицированные PRE по сравнению с немодифицированным PRE или PRE дикого типа дополнительно содержат модификацию(и) (например, вставку, замену или замещение или делецию нуклеотидов) в промоторе и/или старт-кодоне гена X. В определенных вариантах осуществления предоставляемый модифицированный PRE не содержит модификаций в промоторе гена X. В определенных вариантах осуществления предоставляемый модифицированный PRE не содержит модификаций в старт-кодоне гена X. В определенных вариантах осуществления предоставляемый модифицированный PRE не содержит модификаций в промоторе гена X и старт-кодоне гена X. В других вариантах осуществления промотор и/или старт-кодон гена X являются промотором и/или старт-кодоном гена X дикого типа.
[0078] В определенных вариантах осуществления в модифицированном PRE присутствует более одной модификации, влияющей на экспрессию белка X, кодируемого вариантом гена X. Например, в определенных вариантах осуществления модифицированный PRE содержит вариант гена X, который содержит множество стоп-кодонов, не присутствующих в соответствующем немодифицированном PRE или PRE дикого типа, например, по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6 или более стоп-кодонов. Вследствие присутствия нескольких замен нуклеотидов, например, приводящих к введению множества стоп-кодонов, предоставляемые модифицированные PRE могут снижать вероятность экспрессии белка X, являющейся результатом реверсии к немодифицированной последовательности, такой как последовательность дикого типа. В определенных вариантах осуществления множество стоп-кодонов может включать стоп-кодон в каждой рамке считывания варианта гена X и/или несколько стоп-кодонов в одной рамке считывания, таким образом снижая вероятность нежелательной экспрессии белка. В определенных вариантах осуществления включено по меньшей мере 3 стоп-кодона, например, для закрытия всех трех рамок считывания, которые в определенных вариантах осуществления могут быть последовательными.
[0079] Предоставляемые модифицированные PRE обладают свойствами, которые могут снижать риск онкогенности вследствие реверсии гена X или его стартового участка или промотора, присутствующего в PRE, к последовательности дикого типа и/или экспрессии других онкогенных полипептидов вследствие других мутаций. Такие свойства могут обеспечивать преимущества над доступными модифицированными посттранскрипционными регуляторными последовательностями, такими как посттранскрипционные регуляторные последовательности, содержащие модификации только в промоторе и/или старт-кодоне белка X (см. патент США № 7419829). Например, даже мутированные промоторы не обязательно могут приводить к полному отсутствию экспрессии белка с этого промотора. Вводя несколько модификаций с получением нескольких стоп-кодонов в варианте гена X, предоставляемые модифицированные PRE в определенных вариантах осуществления предотвращают или снижают вероятность продукции онкогенных или иммуногенных пептидов, даже в случае таких пропускающих промоторов.
[0080] В определенных вариантах осуществления предоставляемые модифицированные PRE, содержащие вариант гена X, могут снижать вероятность иммуногенности белка X после введения индивидууму. Например, для снижения шанса образования иммуногенного эпитопа из экспрессируемого варианта белка X, один или множество стоп-кодонов могут начинаться достаточно близко к старт-кодону открытой рамки считывания белка X, предотвращая экспрессию полипептида, содержащего эпитоп, который может индуцировать нежелательный иммунный ответ. В определенных вариантах осуществления такие свойства обеспечивают или увеличивают вероятность того, что после введения индивидууму вариант гена X в модифицированном PRE не приведет к экспрессии никакого полипептида с потенциально иммуногенным эпитопом. В определенных вариантах осуществления полинуклеотид, содержащий модифицированный PRE, содержит по меньшей мере один стоп-кодон, например, первый стоп-кодон или каждый из множества введенных стоп-кодонов, присутствующих в варианте гена X модифицированного PRE, начинающийся в положении в пределах по меньшей мере 18, или 21, или 24, или 27, или 30, или 33, или 36 нуклеотидов от старт-кодона варианта гена X (например, первого положения такого старт-кодона) или кодона, соответствующего старт-кодону в соответствующей последовательности дикого типа или немодифицированной последовательности. В определенных примерах таких вариантов осуществления такие свойства обеспечивают отсутствие продукции кодируемого PRE полипептида длиннее длиной более 6, или 7, или 8, или 9, или 10, или 11, или 12 аминокислот, например, даже в случае старт-кодона или промотора дикого типа или немодифицированных старт-кодона или промотора или их реверсии или другой мутации, приводящей к функциональному старт-кодону и/или промотору. В определенных вариантах осуществления полинуклеотид, содержащий модифицированный PRE, содержит стоп-кодон, например, первый стоп-кодон или каждый из множества стоп-кодонов, присутствующих в варианте гена X модифицированного PRE, начинающийся в положении в пределах по меньшей мере 9, 12 или 15 нуклеотидов от старт-кодона варианта гена X (например, первого положения такого старт-кодона) или кодона, соответствующего старт-кодону в соответствующей последовательности дикого типа или немодифицированной последовательности.
[0081] Предоставляемые полинуклеотиды включают полинуклеотиды с модифицированными PRE, сконструированные для обеспечения преимуществ в безопасности, например, снижения онкогенеза и/или иммуногенности, при сохранении существенной степени посттранскрипционной активности, например, усиливающей экспрессию функции. Таким образом, модифицированные PRE предоставляемых полинуклеотидов, как правило, также сконструированы с сохранением достаточной величины посттранскрипционной активности, например, усиливающей экспрессию функции, соответствующего немодифицированного PRE или PRE дикого типа. Как описано выше, область вируса гепатита, такого как WHV, кодирующая белок X, как правило, перекрывается со структурными компонентами PRE такого вируса, которые важны для его усиливающей экспрессию функции. В определенных вариантах осуществления участки и/или характер модификаций в модифицированных PRE, например, такие, которые вносят стоп-кодон(ы) и/или кодирующую посттрансляционный сигнал последовательность(и), как описано, сконструированы так, чтобы минимизировать изменения в определенную вторичную или третичную структуру, кодируемую PRE. В определенных вариантах осуществления такие модификации внесены в области PRE, отличные от областей, кодирующих структуру шпильки субэлемента PRE, такую как структуры шпилек субэлементов альфа и/или бета PRE. В определенных вариантах осуществления в пределах минимального субэлемента альфа, кодирующего структуру шпильки субэлемента альфа, или в пределах части субэлемента бета, кодирующего структуру шпильки субэлемента бета, не внесено стоп-кодонов или модификаций. В определенных вариантах осуществления если модификация внесена в структуру шпильки, модификации проводят, выбирая нуклеиновые основания, которые отличаются от соответствующих нуклеиновых оснований дикого типа или немодифицированных нуклеиновых оснований и при этом сохраняют вторичную или третичную структуру(ы) PRE. Например, в определенных вариантах осуществления где проведены модификации в определенном положении в пределах формирующей шпильку структуры, например, для внесения стоп-кодона, можно провести комплементарную модификацию в другом положении, обеспечивающую формирование вторичной или третичной структуры, сходной или такой же, как структура в последовательности дикого типа или немодифицированной последовательности, например, структура шпильки.
[0082] Также в ряду предоставляемых полинуклеотидов находятся полинуклеотиды, содержащие вариант последовательности Flap (полинуклеотиды "вариантов Flap"). Полинуклеотиды вариантов Flap содержат полинуклеотиды, такие как полинуклеотиды, содержащие одну или несколько вирусных нуклеиновых кислот, где удалены одна или несколько последовательностей Flap или их частей. Такие полинуклеотиды вариантов Flap включают экспрессирующие кассеты и векторы, такие как вирусные векторы, для экспрессии рекомбинантных молекул, таких как рекомбинантные, например, гетерологичные белки. В определенных вариантах осуществления полинуклеотиды, содержащие модифицированные PRE дополнительно содержат вариации последовательностей Flap и/или представляют собой полинуклеотиды вариантов Flap. В общем, вариация(и) во Flap являются такими, что они все еще обеспечивают и/или по существу не нарушают доставку вируса или экспрессию рекомбинантной молекулы, например, в клетке-хозяине.
[0083] Также предоставлены экспрессирующие кассеты, содержащие полинуклеотиды, как правило, дополнительно содержащие промотор, функционально связанный с последовательностью, кодирующей рекомбинантный белок, такой как гетерологичный белок, и векторы, содержащие такие полинуклеотиды и экспрессирующие кассеты, включающие ретровирусные векторы, такие как лентивирусные и гамма-ретровирусные векторы. Также предоставлены вирусы и клетки, содержащие такие полинуклеотиды, кассеты и/или векторы, включая упаковывающие клетки и клетки-хозяева, такие как T-клетки, и композиции, содержащие их. Также предоставлены способы и применения таких вариантов осуществления, включая терапевтические способы и применения, такие как способы и применения, включающие введение вируса, вектора и/или клеток индивидууму в количестве, эффективном для лечения или предотвращения заболевания или патологического состояния.
A. Модифицированные PRE
[0084] Модифицированные PRE в предоставляемых полинуклеотидах содержат варианты генов X. Варианты генов X представляют собой варианты немодифицированных, как правило, дикого типа, генов X вирусов гепатита. Варианты генов X содержат одну, а, как правило, более одной модификации по сравнению с геном X дикого типа или другим немодифицированным геном X. В частности, вариант гена X, как правило, содержит одну или несколько модификаций, разработанных для предотвращения или снижение вероятности экспрессии и/или сохранения нежелательного белка или пептида, кодируемого последовательностью в гене X и/или PRE, например, после введения индивидууму. Модификации по сравнению с немодифицированной последовательностью, например, последовательностью дикого типа, могут содержать делецию(и), замены и/или вставки нуклеотидов.
[0085] В определенных вариантах осуществления модификации включают мутации, которые приводят к присутствию в варианте гена X модифицированного PRE стоп-кодона, не присутствующего в соответствующем гене X дикого типа или не модифицированном другим способом гене X, например, не присутствует в соответствующем PRE дикого типа или не модифицированный другим способом PRE, содержащем неполный ген X. В определенных вариантах осуществления такие модификации укорачивают кодирующую белок X открытую рамку считывания по сравнению с геном X дикого типа или фрагментом гена X в PRE дикого типа или немодифицированном PRE. В определенных вариантах осуществления модификации приводят к модифицированному PRE, где вариант гена X содержит открытую рамку считывания белка X с длиной не более 9, 12, 15, 18 или 21 нуклеотидов. В определенных вариантах осуществления модификации в варианте гена X модифицированного PRE предотвращают экспрессию с содержащейся в нем рамки считывания белка X любого белка, обладающего длиной более 3, 4, 5, 6 или 7 аминокислот или способного быть иммуногенным для индивидуума или обладать онкогенными потенциалом или активностью. В определенных вариантах осуществления, если вариант гена X также содержит мутантный или модифицированный старт-кодон или промотор, модификации с внесением стоп-кодонов предотвращают такую экспрессию даже в случае мутации, приводящей к реверсии до функционального промотора или старт-кодона.
[0086] В определенных вариантах осуществления модификации в варианте гена X модифицированного PRE предотвращают экспрессию любых нежелательных полипептидов, находящихся в кодирующей рамка считывания белка X или не находящихся в ней. Например, в определенных вариантах осуществления модификации в варианте гена X модифицированного PRE предотвращают экспрессию любого пептида(ов) или пептида(ов) из содержащегося в нем гена X, обладающего длиной, большей, чем определенная длина, например, длиной, большей чем 3, 4, 5, 6 или 7 аминокислот, и/или способного быть иммуногенным после экспрессии у индивидуума.
[0087] В определенных вариантах осуществления модификации включают модификации, которые вносят кодирующие последовательности, вносящие или приводящие к образованию аминокислотных последовательностей посттрансляционного разрушения, которые помечают экспрессируемый белок(ки), кодируемый вариантом гена X модифицированного PRE или его частью, для разрушения. Иллюстративные последовательности разрушения включают сигналы убиквитинилирования. Таким образом, модификации в варианте гена X модифицированного PRE могут дополнительно включать модификации, приводящие к образованию последовательностей посттрансляционного разрушения, таких как последовательность убиквитинилирования, не присутствующих в соответствующем белке, кодируемым немодифицированным геном X или геном X дикого типа, например, не присутствующих в соответствующем PRE дикого типа или немодифицированном PRE, содержащем неполный ген X.
[0088] Как правило, вариант гена X модифицированного PRE содержит часть гена X, которая содержит меньше нуклеиновых оснований, чем соответствующий полноразмерный ген X дикого типа, присутствующий в соответствующем вирусе гепатита дикого типа. В определенном варианте осуществления в части гена X отсутствуют нуклеотиды гена X, которые не перекрываются с участками для посттранскрипционной регуляторной функции(й) PRE и/или которые не важны или не существенны для нее. В определенных вариантах осуществления в части гена X отсутствуют остатки гена X вируса гепатита дикого типа вне субэлементов альфа, бета и/или гамма PRE и/или их функциональных областей. Таким образом, модифицированные PRE по настоящему документу, как правило, не содержат полноразмерных генов X или их полноразмерных вариантов. В таких определенных вариантах осуществления вариант гена X в модифицированном PRE, как правило, содержит менее или приблизительно 425, 400, 300, 200 или 180 нуклеиновых оснований.
[0089] Как правило, модифицированный PRE содержит один или несколько субэлементов альфа, бета и/или гамма, которые в некоторых случаях могут представлять собой вариант такого субэлемента PRE дикого типа или немодифицированного PRE или его функциональную часть, например, часть, которой достаточно для посттранскрипционной активности и/или формирования шпильки или другой вторичной или третичной структуры. В некоторых случаях по меньшей мере некоторые из таких частей, как правило, перекрываются с частью варианта гена X модифицированного PRE. Таким образом, в некоторых случаях часть варианта гена X может содержаться в части субэлемента альфа и/или часть варианта гена X может содержаться субэлементе бета или перекрываться с ним. В определенных вариантах осуществления модификации в варианте гена X предоставляемых модифицированных PRE по сравнению с геном X или PRE дикого типа или немодифицированным геном X или PRE не устраняют, не снижают и/или не препятствуют посттранскрипционной активности, контролирующей экспрессию функционально связанной нуклеиновой кислоты (например, рекомбинантной молекулы или трансгена), опосредуемой субэлементом(ами) альфа, и/или бета, и/или гамма модифицированного PRE, и/или по существу не делают этого по сравнению с посттранскрипционной активностью, опосредуемой субэлементом(ами) соответствующего PRE дикого типа или немодифицированного PRE без модификации(й), или по сравнению с другим модифицированным PRE, для которого известно, что он сохраняет существенную активность, таким как модифицированный PRE с последовательностью SEQ ID NO:119, 120 или 216.
[0090] В одном из вариантов осуществления замены нуклеотидов, которые вносят стоп-кодоны и/или последовательность посттрансляционного разрушения, являются такими, что на уровне РНК они не изменяют вторичную и/или третичную структуру последовательностей цис-действующих элементов в PRE и/или они в значительной степени сохраняют вторичную и/или третичную структуру последовательностей цис-действующих элементов в PRE по сравнению с соответствующим PRE дикого типа или немодифицированным PRE и/или PRE, не содержащим таких модификаций. В другом варианте осуществления замены нуклеотидов, которые вносят стоп-кодоны и/или последовательность посттрансляционного разрушения, являются такими, что на уровне РНК замены нуклеотидов не изменяют активность PRE, например, его способность обеспечивать экспорт РНК из ядра, например, посредством взаимодействия с зависимым и/или независимым от CRM1 аппаратом экспорта, обеспечивая участки связывания для клеточных белков, увеличивая общее количество РНК, например, трансгенной РНК, транскриптов, увеличивая стабильность РНК, увеличивая количество полиаденилированных транскриптов и/или увеличивая размер полиаденилированных концов в таких транскриптах, по сравнению с соответствующим PRE дикого типа и/или PRE, не содержащим таких модификаций, и/или по сравнению с другими модифицированным PRE, известными в данной области, как обладающими значительной степенью активности для применения в трансдукции вирусных векторов или принятых для применения в ней и/или принятых для таких применений в рамках генотерапии. В определенных вариантах осуществления другие немодифицированные PRE обладают последовательностями, приведенными в SEQ ID NO:119, SEQ ID NO:120 или SEQ ID NO:216.
[0091] В определенных вариантах осуществления субэлемент бета в модифицированном PRE содержит по меньшей мере часть варианта гена X. В таких определенных вариантах осуществления субэлемент бета представляет собой функциональный вариант субэлемента бета PRE дикого типа или немодифицированного PRE или его часть так, что модифицированный PRE, содержащий функциональный вариант или часть субэлемента бета проявляет посттранскрипционную активность. В определенных вариантах осуществления функциональный вариант субэлемента бета представляет собой вариант субэлемента бета, приведенный в SEQ ID NO:6 или его функциональную часть. В определенных вариантах осуществления функциональный вариант или часть субэлемента бета содержит достаточное количество остатков нуклеотидов для формирования шпильки субэлемента бета. Например, в определенных вариантах осуществления функциональный вариант или часть субэлемента бета содержит остатки нуклеотидов, соответствующие остаткам нуклеотидов 448-470 SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125, такие как последовательность нуклеотидов, приведенная в SEQ ID NO:7. В разновидностях модифицированного PRE, предоставленных в настоящем документе, вариант гена X не содержит никаких замен нуклеотидов в пределах нуклеотидов, соответствующих нуклеотидам 448-470 SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125 и/или в области нуклеотидов, соответствующих нуклеотидам, приведенных в SEQ ID NO:7. В определенных вариантах осуществления, когда модификацию, например, вносящую стоп-кодон, проводят по нуклеотидному основанию, соответствующему одному или нескольких нуклеотидам 448-470 SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125 и/или одному или нескольким нуклеотидам, соответствующим нуклеотидам, приведенным в SEQ ID NO:7, можно проводить комплементарную модификацию в другом положении с обеспечением формирования вторичной или третичной структуры, сходной или одинаковой с шпилькой субэлемента бета последовательности дикого типа или немодифицированной последовательности.
[0092] В определенных вариантах осуществления модифицированного PRE, содержащего субэлемент альфа, модифицированный субэлемент альфа может представлять собой субэлемент альфа из немодифицированного PRE вируса гепатита, такого как PRE вируса гепатита дикого типа, или может представлять собой его функциональный вариант так, что модифицированный PRE, содержащий функциональный вариант субэлемента альфа, проявляет посттранскрипционную активность. В определенных вариантах осуществления субэлемент альфа приведен в SEQ ID NO:3 или приведен в SEQ ID NO:4 или представляет собой функциональный вариант или часть SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:4. В определенных вариантах осуществления функциональный вариант или часть субэлемента альфа содержит достаточное количество остатков нуклеотидов для формирования шпильки субэлемента альфа. Например, в определенных вариантах осуществления функциональный вариант субэлемента альфа содержит остатки нуклеотидов, соответствующие остаткам нуклеотидов 329-366 SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125, такие как последовательность нуклеотидов, приведенная в SEQ ID NO:5. В разновидностях модифицированного PRE, предоставленных в настоящем документе, модифицированный PRE не содержит никаких замен нуклеотидов в пределах нуклеотидов, соответствующих нуклеотидам 329-366 SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125 и/или в области нуклеотидов, соответствующих нуклеотидам, приведенным в SEQ ID NO:5. В определенных вариантах осуществления, когда модификацию проводят по нуклеотидному основанию, соответствующему одному или нескольких нуклеотидам 329-366 SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125 и/или одному или нескольким нуклеотидам, соответствующим нуклеотидам, приведенным в SEQ ID NO:5, можно проводить комплементарную модификацию в другом положении с обеспечением формирования вторичной или третичной структуры, сходной или одинаковой с шпилькой субэлемента альфа последовательности дикого типа или немодифицированной последовательности.
[0093] В одном из вариантов осуществления модифицированный PRE содержит по меньшей мере субэлементы альфа и бета, например, функциональные варианты субэлементов альфа и бета, где по меньшей мере определенная их часть, как правило, перекрывается с вариантом гена X. В определенных вариантах осуществления модифицированный PRE содержит субэлемент гамма или его функциональный вариант. В вариантах осуществления модифицированного PRE, содержащего субэлемент гамма, модифицированный субэлемент гамма может представлять собой субэлемент гамма из немодифицированного PRE вируса гепатита, такого как PRE вируса гепатита дикого типа, или может представлять собой его функциональный вариант, такой, что модифицированный PRE, содержащий функциональный вариант субэлемента гамма, сохраняет посттранскрипционную активность. В определенных вариантах осуществления субэлемент гамма приведен в SEQ ID NO:8 или представляет собой функциональный вариант или часть SEQ ID NO:8.
[0094] Модификации нуклеотидов, такие как модификации нуклеотидов в варианте гена X, модифицированного PRE, могут включать делеции, вставки и/или замены нуклеотидов. Вариант гена X может содержать по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45 или 50 замен нуклеотидов по сравнению с геном X немодифицированного PRE, такого как PRE дикого типа. В определенных вариантах осуществления вариант гена X содержит не более 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 замен нуклеотидов. В определенных вариантах осуществления вариант гена X содержит последовательность нуклеотидов, которая по меньшей мере на 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична с последовательностью гена X, приведенной в SEQ ID NO:10, с последовательностью нуклеотидов 391-592 любой из SEQ ID NO:1, 12-20, 119 или 120 или с последовательностью нуклеотидов 391-589 SEQ ID NO:125 или 216, где вариант гена X содержит по меньшей мере один стоп-кодон, не присутствующий в них, и/или последовательность, кодирующую сигнал посттрансляционной модификации или последовательность разрушения, не присутствующие в них. Например, в определенных вариантах осуществления вариант гена X содержит последовательность нуклеотидов, которая по меньшей мере на 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична с последовательностью гена X, приведенной в SEQ ID NO:10, с последовательностью нуклеотидов 391-592 SEQ ID NO:1 или с последовательностью нуклеотидов 391-589 SEQ ID NO:125, где вариант гена X содержит по меньшей мере один стоп-кодон, не присутствующий в них, и/или последовательность, кодирующую сигнал посттрансляционной модификации или последовательность разрушения, не присутствующие в них. В определенных вариантах осуществления модифицированный PRE содержит последовательность нуклеотидов, которая по меньшей мере на 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична с последовательностью PRE, приведенной в любой из SEQ ID NO:1, 12-20, 119, 120, 125 или 216, где модифицированный PRE содержит по меньшей мере один стоп-кодон, не присутствующий в них, и/или последовательность, кодирующую сигнал посттрансляционной модификации или последовательность разрушения, не присутствующие в них. Например, в определенных вариантах осуществления модифицированный PRE содержит последовательность нуклеотидов, которая по меньшей мере на 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична с последовательностью PRE, приведенной в SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125, где модифицированный PRE содержит по меньшей мере один стоп-кодон, не присутствующий в них и/или последовательность, кодирующую сигнал посттрансляционной модификации или последовательность разрушения, не присутствующие в них.
[0095] В определенных вариантах осуществления вариант гена X представляет собой неполный ген X, такой как часть гена X дикого типа, с последовательностью, меньшей полноразмерной последовательности гена X вируса гепатита, такой как вирус гепатита дикого типа, такой как вирус гепатита млекопитающих. Например, в определенных вариантах осуществления модифицированный PRE содержит вариант гена X с длиной менее, или не более, или приблизительно 250 нуклеотидов, например, с длиной менее, или не более, или приблизительно 240 нуклеотидов, 230 нуклеотидов, 220 нуклеотидов, 210 нуклеотидов, 200 нуклеотидов, 190 нуклеотидов, 180 нуклеотид, 170 нуклеотидов, 160 нуклеотидов, 150 нуклеотидов, 140 нуклеотидов, 130 нуклеотидов, 120 нуклеотидов, 110 нуклеотидов, 100 нуклеотидов, 90 нуклеотидов, 80 нуклеотидов или 70 нуклеотидов. В определенных вариантах осуществления модифицированный PRE содержит вариант гена X, длина которого составляет по меньшей мере 60 нуклеотидов, но является меньшей, чем полноразмерная последовательность гена X вируса гепатита, такого как вирус гепатита дикого типа, такого как вирус гепатита млекопитающих. Например, в определенных вариантах осуществления модифицированный PRE содержит вариант гена X, длина которого составляет по меньшей мере 60 нуклеотиды, но составляет менее, или не более, или приблизительно 250 нуклеотидов, например, менее, или не более, или приблизительно 240 нуклеотидов, 230 нуклеотидов, 220 нуклеотидов, 210 нуклеотидов, 200 нуклеотидов, 190 нуклеотидов, 180 нуклеотид, 170 нуклеотидов, 160 нуклеотидов, 150 нуклеотидов, 140 нуклеотидов, 130 нуклеотидов, 120 нуклеотидов, 110 нуклеотидов, 100 нуклеотидов, 90 нуклеотидов, 80 нуклеотидов или 70 нуклеотидов. В определенных вариантах осуществления модифицированный PRE содержит вариант гена X с длиной по меньшей мере или приблизительно по меньшей мере 180 нуклеотидов.
[0096] В определенных вариантах осуществления модифицированный PRE, содержащий вариант гена X, представляет собой вариант немодифицированного PRE, такого как PRE вируса гепатита дикого типа, который содержит ген X или его часть. Например, вариант гена X может представлять собой вариант PRE вируса гепатита дикого типа, который содержит ген X, меньший чем полноразмерная последовательность соответствующего гена X вируса гепатита, такого как вирус гепатита дикого типа, такого как вирус гепатита млекопитающих. Немодифицированный ген X или ген X дикого типа может содержать ген X, с длиной, составляющей менее, или не более, или приблизительно 250 нуклеотидов, например менее, или не более, или приблизительно 240 нуклеотидов, 230 нуклеотидов, 220 нуклеотидов, 210 нуклеотидов, 200 нуклеотидов, 190 нуклеотидов, 180 нуклеотид, 170 нуклеотидов, 160 нуклеотидов, 150 нуклеотидов, 140 нуклеотидов, 130 нуклеотидов, 120 нуклеотидов, 110 нуклеотидов, 100 нуклеотидов, 90 нуклеотидов, 80 нуклеотидов или 70 нуклеотидов.
[0097] В определенных вариантах осуществления немодифицированный PRE, такой как PRE вируса гепатита дикого типа, представляет собой PRE, который содержит ген X с открытой рамкой считывания, кодирующей функциональный белок X, например, укороченный белок X. В таком варианте осуществления вариант гена X содержит старт-кодон для инициации трансляции белка X. В определенных вариантах осуществления старт-кодон представляет собой старт-кодон ATG. В определенных вариантах осуществления вариант гена X содержит старт-кодон, соответствующий старт-кодону, начинающемуся в положении, соответствующем положению 411 SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125. В определенных вариантах осуществления немодифицированный PRE, такой как PRE дикого типа, може содержать открытую рамку считывания, кодирующую белок X длиной по меньшей мере 30 аминокислот, например по меньшей мере 40 аминокислот, 50 аминокислот, 60 аминокислот, 70 аминокислот или 80 аминокислот.
[0098] Как правило, модифицированный PRE содержит вариант гена X, который содержит модификацию, например, одну или несколько модификаций нуклеотидов, которые вносят один или несколько стоп-кодонов и/или последовательность посттрансляционного разрушения, не присутствующие в немодифицированном гене X вируса гепатита, например, не присутствующие в гене X вируса гепатита дикого типа или его соответствующей укороченной версии (например, как присутствует в PRE). В определенных вариантах осуществления вариант гена X содержит модификацию, не присутствующую в гене X вируса гепатита млекопитающих дикого типа или его соответствующей укороченной версии (например, как присутствует в PRE). В определенных вариантах осуществления немодифицированный ген X вируса гепатита или ген X вируса гепатита дикого типа или его укороченная версия представляет собой ген X, который по меньшей мере или приблизительно по меньшей мере на 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или более идентичен с последовательностью SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:10 или с нуклеотидам 411-592 SEQ ID NO:1 или с нуклеотидами 411-589 SEQ ID NO:125. В определенных вариантах осуществления ген X вируса гепатита млекопитающих дикого типа или немодифицированный ген X вируса гепатита млекопитающих или его соответствующая укороченная версия содержит последовательность нуклеотидов, соответствующую нуклеотидам 411-592 любой из SEQ ID NO: 1 или 12-20, нуклеотидам 411-589 SEQ ID NO:125, нуклеотидам 412-722 любой из SEQ ID NO:21-23, нуклеотидам 411-721 SEQ ID NO:25, нуклеотидам 401-582 SEQ ID NO:26 или нуклеотидам 411-592 SEQ ID NO:27. В определенных вариантах осуществления немодифицированный ген X вируса гепатита или ген X вируса гепатита дикого типа представляет собой ген X WHV или его соответствующую укороченную версию, которая по меньшей мере или приблизительно по меньшей мере на 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичен с последовательностью SEQ ID NO:9, нуклеотидами 411-592 SEQ ID NO:1 или нуклеотидами 411-589 SEQ ID NO:125. В определенных вариантах осуществления немодифицированный ген X WHV или ген X WHV дикого типа или его соответствующая укороченная версия содержит последовательность нуклеотидов, соответствующую нуклеотидам 411-592 любой из SEQ ID NO: 1, 12-20, 119 или 120 или нуклеотидам 411-589 SEQ ID NO:125 или 216. В определенных вариантах осуществления ген X вируса гепатита представляет собой ген X WHV, приведенный в SEQ ID NO:9, или его соответствующую укороченную версию, приведенную в SEQ ID NO:10.
[0099] В определенных вариантах осуществления вариант гена X модифицированного PRE отличается от гена X или его части, находящихся в немодифицированном PRE вируса гепатита, таком как PRE вируса гепатита дикого типа. В определенных вариантах осуществления такой PRE вируса гепатита дикого типа представляет собой PRE вируса гепатита млекопитающих. В определенных вариантах осуществления PRE дикого типа или немодифицированный PRE млекопитающих содержит последовательность нуклеотидов по меньшей мере или приблизительно по меньшей мере на 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или более идентичную с последовательностью SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125. В определенных вариантах осуществления PRE дикого типа или немодифицированный PRE вируса гепатита млекопитающих содержит последовательность нуклеотидов, приведенную в любой из SEQ ID NO: 1 или 12-27. В определенных вариантах осуществления немодифицированный PRE вируса гепатита или PRE вируса гепатита дикого типа представляет собой WPRE, который по меньшей мере или приблизительно по меньшей мере на 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичен с последовательностью SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125. Например, в определенных вариантах осуществления немодифицированный WPRE или WPRE дикого типа содержит последовательность нуклеотидов, приведенную в любой из SEQ ID NO: 1, 12-20, 119, 120, 125 или 216.
[0100] В определенных вариантах осуществления вариант гена X функционально связан с промотором. В определенных вариантах осуществления промотор представляет собой немодифицированный промотор гена X или промотор гена X дикого типа. Например, промотор может содержать последовательность нуклеотидов, приведенную в SEQ ID NO:11 или ее функциональные вариант или часть. Промотор может содержать последовательность нуклеотидов 7-20 SEQ ID NO:11. В определенных вариантах осуществления промотор представляет собой мутантный или модифицированный промотор гена X, как описано в подразделе I.A.3 ниже.
[0101] В определенных вариантах осуществления модифицированный PRE проявляет посттранскрипционную активность опосредуя, например усиливая, экспрессию нуклеиновой кислоты, кодирующей рекомбинантный белок, такой как гетерологичный белок, функционально связанный с ней, например, по сравнению с экспрессией нуклеиновой кислоты, которая функционально не связана с PRE и/или не связана с какой-либо цис-действующей регуляторной последовательностью. В определенных вариантах осуществления модифицированный PRE проявляет активность, обеспечивая экспорт РНК из ядра, обеспечивая участки связывания для клеточных белков, увеличивая общее количество транскриптов РНК, увеличивая стабильность РНК, увеличивая количество полиаденилированных транскриптов и/или увеличивая размер полиаденилированных концов в таких транскриптах. В определенных вариантах осуществления модифицированный PRE сохраняет активность или существенную и/или достаточную степень активности соответствующего немодифицированного PRE вируса гепатита, такого как PRE вируса гепатита дикого типа, и/или другого модифицированного PRE, известного в данной области, как обладающего значительно степенью активности для применения в трансдукции вирусных векторов, например, PRE с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO:119, SEQ ID NO:120 или SEQ ID NO:216. В определенных вариантах осуществления модифицированный PRE проявляет по меньшей мере или приблизительно по меньшей мере или приблизительно 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200% или более посттранскрипционной активности немодифицированного PRE или PRE дикого типа, приведенного в любой из SEQ ID NO: 1, 12-27, 119,120, 125 или 216. В определенных вариантах осуществления модифицированный PRE проявляет по меньшей мере или приблизительно по меньшей мере или приблизительно 80%, 85%, 90%, 95% или 100% активности WPRE, приведенного в SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125.
[0102] В таких определенных вариантах осуществления представляющей интерес активностью (например, модифицированного PRE и/или другого PRE, такого как немодифицированный PRE или PRE дикого типа, с которым его сравнивают), является усиление или обеспечение экспрессии рекомбинантного белка, кодируемого нуклеиновой кислотой, функционально связанной с модифицированным PRE. В определенных вариантах осуществления такое усиление или обеспечение оценивают, определяя уровень экспрессии рекомбинантного белка, функционально связанным с модифицированным PRE в векторе, после трансдукции или другой формы переноса вектора в клетку-хозяина. Усиление можно определять, измеряя относительную степень такой экспрессии по сравнению с вектором, не содержащим соответствующего PRE. Вопрос о наличии у модифицированного PRE такого же уровня активности или ее степени или существенной или приемлемой степени по сравнению с немодифицированным PRE, можно решать с использованием векторов, содержащих соответствующие PRE. Можно использовать ряд хорошо известных способов оценки уровня экспрессии рекомбинантных молекул, таких как детекция способами на основе аффинности, например, способами на основе иммуноаффинности, например, в отношении белков клеточной поверхности, такими как проточная цитометрия. В некоторых примерах экспрессию определяют, измеряя уровень маркера трансдукции и/или репортерной конструкции. В определенных вариантах осуществления в вектор включают нуклеиновую кислоту, кодирующую укороченный поверхностный белок, и используют в качестве маркера экспрессии и/или ее усиления под действием модифицированного PRE.
1. Стоп-кодоны
[0103] Стоп-кодон в модифицированных PRE, например, в варианте гена X (например, стоп-кодон не присутствующий в соответствующем положении в соответствующем гене X дикого типа или немодифицированном гене X или PRE) может представлять собой стоп-кодон амбер (CAT), охра (TAA) или опал (TGA). В одном из вариантов осуществления стоп-кодон представляет собой стоп-кодон амбер (CAT). В одном из вариантов осуществления стоп-кодон представляет собой стоп-кодон опал (TGA).
[0104] Стоп-кодон можно вносить посредством замены, делеции или вставки нуклеотидов. В одном из вариантов осуществления стоп-кодон внесен посредством замены нуклеотидов. Замена нуклеотидов минимизирует такие замены нуклеотидов, как при сдвиге рамки считывания, которые могут происходить при делеции или вставке остатков нуклеотидов. Таким образом, замены нуклеотидов могут минимизировать структурные изменения в цис-действующих регуляторных последовательностях, участвующих в активности PRE, таких как элемент бета или его функциональная часть. В определенных вариантах осуществления стоп-кодон получают посредством замены только одного нуклеотида так, что два положения в стоп-кодоне представляют собой немодифицированные нуклеотиды, присутствующие в соответствующих положениях в последовательности дикого типа или немодифицированной последовательности. В определенных вариантах осуществления стоп-кодон получают посредством замены двух нуклеотидов так, что только одно положение в стоп-кодоне представляют собой немодифицированный нуклеотид, присутствующий в соответствующем положении в последовательности дикого типа или немодифицированной последовательности. В определенных вариантах осуществления стоп-кодон получают посредством замены трех нуклеотидов так, что от соответствующего кодона последовательности дикого типа или немодифицированной последовательности отличаются все положения в стоп-кодоне.
[0105] Вариант гена X может содержать по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6 или более стоп-кодонов, не присутствующих в немодифицированном гене X или гене X дикого типа или не присутствующих в немодифицированном PRE или PRE дикого типа. Как правило, по меньшей мере один стоп-кодон находится в одной рамке считывания с рамкой считывания белка X. В определенных вариантах осуществления вариант гена X содержит множество стоп-кодонов, например, по меньшей мере 2, 3, 4, 5 или 6 стоп-кодонов.
[0106] В определенных вариантах осуществления множество стоп-кодонов содержит по меньшей мере два стоп-кодона, где один находится в одной рамке считывания с рамкой считывания белка X, а другой находится в другой рамке считывания. В других вариантах осуществления множество стоп-кодонов содержит по меньшей мере три стоп-кодоны в каждой рамке считывания, присутствующей в варианте гена X.
[0107] В определенных вариантах осуществления множество стоп-кодонов содержит по меньшей мере два стоп-кодона в одной рамке считывания. Как правило, по меньшей мере два стоп-кодона находятся в одной рамке считывания с рамкой считывания белка X.
[0108] В определенных вариантах осуществления каждый по меньшей мере из одного стоп-кодонов начинается в положении в пределах или не более 36 нуклеотидов в направлении 3'-конца от положения, соответствующего положению на 5'-конце старт-кодона открытой рамки считывания белка X, например, кодона, соответствующего старт-кодону в соответствующей открытой рамке считывания белка X дикого типа или немодифицированного белка X, такого как соответствующее старт-кодону в открытой рамке считывания белка X, приведенной в SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125, который начинается в положении 411. Как правило, первый стоп-кодон и, в некоторых случаях, каждый из множества внесенных стоп-кодонов, присутствующих в варианте гена X после 5'-положения старт-кодона открытой рамки считывания белка X, начинается в пределах или не более 36 нуклеотидов в направлении 3'-конца от положения, соответствующего положению на 5'-конце старт-кодона. Например, в определенных вариантах осуществления каждый по меньшей мере из одного стоп-кодона, например, первый стоп-кодон или один или несколько из множества стоп-кодонов, присутствующих в варианте гена X после положения, соответствующего положению на 5'-конце старт-кодона открытой рамки считывания белка X, начинается в положении в пределах или не более 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 или 9 нуклеотидов в направлении 3'-конца от положения, соответствующего положению на 5'-конце старт-кодона открытой рамки считывания белка X. В определенных вариантах осуществления каждый по меньшей мере из одного стоп-кодона начинается в положении в пределах не более 9, 12, 15, 18 или 21 нуклеотида в направлении 3'-конца от положения, соответствующего положению на 5'-конце старт-кодона открытой рамки считывания белка X, например, не более 21 нуклеотида от такого положения.
[0109] В отношении иллюстративного WPRE, приведенного в SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125, положение, соответствующее положению на 5'-конце старт-кодона открытой рамки считывания белка X соответствует остатку 411 (соответствующему остатку 1503 последовательности WHV, приведенной в SEQ ID NO:2). В определенных вариантах осуществления по меньшей мере один стоп-кодон, например, первый стоп-кодон или один или несколько из множества стоп-кодонов, присутствующих в варианте гена X после положения, соответствующего положению на 5'-конце старт-кодона открытой рамки считывания белка X, начинается в положении в пределах или не более 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 или 9 нуклеотидов в направлении 3'-конца от положения, соответствующего остатку 411 в WPRE, приведенном в SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125, например, не более 9, 12, 15, 18 или 21, например, не более 21 нуклеотида в направлении 3'-конца от этого положения. Специалист в данной области легко идентифицирует остаток, который соответствует остатку 411, в другом PRE вируса гепатита, таком как другой WPRE, с идентификацией положения на 5'-конце кодона, который соответствует старт-кодону иллюстративного PRE дикого типа, приведенного в SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125 (которая представляет собой часть SEQ ID NO:1, содержащая остатки 1-589 SEQ ID NO:1). На фигуре 2A-2E приведен пример идентификации соответствующих остатков в иллюстративных PRE вирусов гепатита.
[0110] В определенных вариантах осуществления модифицированного PRE, содержащего вариант гена X со множеством стоп-кодонов, стоп-кодоны могут располагаться последовательно в каждой рамке считывания гена X. В определенных вариантах осуществления модифицированного PRE, содержащего вариант гена X со множеством стоп-кодонов, стоп-кодоны могут располагаться последовательно в одной рамке считывания.
[0111] В определенных вариантах осуществления модифицированного PRE, вариант гена X не содержит открытой рамки считывания длиной, большей или приблизительно равной 39 нуклеотидам, например, длиной, большей или приблизительно равной 36 нуклеотидам, 33 нуклеотидам, 30 нуклеотидам, 27 нуклеотидам, 24 нуклеотидам, 21 нуклеотиду, 18 нуклеотидам, 15 нуклеотидам или 12 нуклеотидам.
[0112] В определенных вариантах осуществления по меньшей мере один стоп-кодон, например, первый стоп-кодон или один или несколько из множества стоп-кодонов, присутствующих в варианте гена X после положения, соответствующего положению на 5'-конце старт-кодона открытой рамки считывания белка X, начинается в положении, котор находится в одной рамке считывания с рамкой считывания белка X. Например, в определенных вариантах осуществления по меньшей мере один стоп-кодон, например, первый стоп-кодон или один или несколько из множества стоп-кодонов, присутствующих в варианте гена X после положения, соответствующего положению на 5'-конце старт-кодона открытой рамки считывания белка X, начинается в положении в пределах или не более 36, 33, 30, 27, 24, 21, 18, 15, 12 или 9 нуклеотидов в направлении 3'-конца от положения, соответствующего положению на 5'-конце старт-кодона открытой рамки считывания белка X, например, не более 9, 12, 15, 18 или 21, например, не более 21 нуклеотиду в направлении 3'-конца от этого положения. В определенных вариантах осуществления по меньшей мере один стоп-кодон, например, первый стоп-кодон или один или несколько из множества стоп-кодонов, присутствующих в варианте гена X после положения, соответствующего положению на 5'-конце старт-кодона открытой рамки считывания белка X, начинается в положении в пределах или не более 36, 33, 30, 27, 24, 21, 18, 15, 12 или 9 нуклеотидов в направлении 3'-конца от положения, соответствующего остатку 411 в WPRE, приведенном в SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125.
[0113] В определенных вариантах осуществления модифицированный PRE содержит вариант гена X, который содержит стоп-кодон или множество стоп-кодонов, начинающихся в положениях 9, 13, 17 и/или 21 в направлении 3'-конца от положения, соответствующего положению на 5'-конце старт-кодона открытой рамки считывания белка X. В отношении иллюстративного WPRE, приведенного в SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125, модифицированный PRE содержит вариант гена X, который содержит стоп-кодон или множество стоп-кодонов, начинающихся в положениях нуклеотидов, соответствующих положениям 420, 424, 428 и/или 432 в последовательности, приведенной в SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125. В таких вариантах осуществления один, два, три или все четыре положения могут представлять собой начало стоп-кодона.
[0114] В определенных вариантах осуществления модифицированный PRE содержит вариант гена X, который содержит четыре стоп-кодона, начинающиеся в каждом из положений 9, 13, 17 и 21 в направлении 3'-конца от положения, соответствующего положению на 5'-конце старт-кодона открытой рамки считывания белка X. В отношении иллюстративного WPRE, приведенного в SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125, модифицированный PRE содержит вариант гена X, который содержит стоп-кодон, начинающийся в положении нуклеотида, соответствующем положению 420, 424, 428 и 432 в последовательности, приведенной в SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125.
[0115] В определенных вариантах осуществления модифицированный PRE содержит последовательность нуклеотидов, которая по меньшей мере на 65%, например, по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентична последовательности SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125, при условии, что модифицированный PRE содержит вариант гена X, содержащий по меньшей мере один стоп-кодон, не присутствующий в гене X, приведенном в SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125. В определенных вариантах осуществления модифицированный PRE отличается от SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125 только заменой нуклеотидов. В других вариантах осуществления модифицированный PRE отличается от SEQ ID NO:1 или 125 вставкой или делецией нуклеотидов. В определенных вариантах осуществления модифицированный PRE может быть более длинным или более коротким, чем SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125.
[0116] В определенных вариантах осуществления модифицированный PRE в дополнение по меньшей мере к одному стоп-кодону, не присутствующему в PRE дикого типа или немодифицированном PRE, не содержит никаких модификаций.
[0117] В таблицах 2A и 2B указаны иллюстративные положения для внесения по меньшей мере одного стоп-кодона в вариант гена X или модифицированный PRE, соответственно. Также приведены соответствующие SEQ ID NO последовательностей иллюстративных полинуклеотидов. В определенных вариантах осуществления предоставлены полинуклеотиды, содержащие модифицированный PRE, содержащий вариант гена X, содержащий последовательность нуклеотидов, приведенную в любой из SEQ ID NO: 44-58 или 141-155. В определенных вариантах осуществления предоставлены полинуклеотиды, содержащие модифицированный PRE, содержащий последовательность нуклеотидов, приведенную в любой из SEQ ID NO: 29-43 или 126-140. В определенных вариантах осуществления предоставлены полинуклеотиды, содержащие такие PRE, функционально связанный с нуклеиновыми кислотами, кодирующими рекомбинантные молекулы, такие как рекомбинантные антигенраспознающие рецепторы, CAR, TCR, химерные рецепторы, иммуномодуляторы, иммуностимулирующие молекулы и/или маркеры трансдукции или экспрессии, и экспрессирующие кассеты и векторы, содержащие их.
<b>ТАБЛИЦА 2A: Иллюстративные варианты гена X по меньшей мере с одним внесенным стоп-кодоном</b>
<b>SEQ ID NO</b>
<b>5'-положение внесенного стоп-кодона(ов)</b>
<b>относительно 3'-положения старт-кодоном гена X</b>
<b>Старт-кодон гена X</b>
44, 141
9, 13, 17, 21
немодифицированный
45, 142
9, 13, 17
немодифицированный
46, 143
9, 13, 21
немодифицированный
47, 144
9, 17, 21
немодифицированный
48, 145
13, 17, 21
немодифицированный
49, 146
9, 13
немодифицированный
50, 147
9, 17
немодифицированный
51, 148
9, 21
немодифицированный
52, 149
13, 17
немодифицированный
53, 150
13, 21
немодифицированный
54, 151
17, 21
немодифицированный
55, 152
9
немодифицированный
56, 153
13
немодифицированный
57, 154
17
немодифицированный
58, 155
21
немодифицированный
<b>Таблица 2B: Иллюстративные модифицированные PRE по меньшей мере с одним внесенным стоп-кодоном</b>
<b>SEQ ID NO</b>
<b>5'-положение внесенного стоп-кодона(ов)</b>
<b>Старт-кодон гена X</b>
<b>Промоторная последовательность</b>
<b>Относительно 3'-положения старт-кодона гена X</b>
<b>Остаток, соответствующий SEQ ID NO: 1 или 125</b>
29, 126
9, 13, 17, 21
420, 424, 428, 432
Немодифицированный
Немодифицированная
30, 127
9, 13, 17
420, 424, 428
Немодифицированный
Немодифицированная
31, 128
9, 13, 21
420, 424, 432
Немодифицированный
Немодифицированная
32, 129
9, 17, 21
420, 428, 432
Немодифицированный
Немодифицированная
33, 130
13, 17, 21
424, 428, 432
Немодифицированный
Немодифицированная
34, 131
9, 13
420, 424
Немодифицированный
Немодифицированная
35, 132
9, 17
420, 428
Немодифицированный
Немодифицированная
36, 133
9, 21
420, 432
Немодифицированный
Немодифицированная
37, 134
13, 17
424, 428
Немодифицированный
Немодифицированная
38, 135
13, 21
424, 432
Немодифицированный
Немодифицированная
39, 136
17, 21
428, 432
Немодифицированный
Немодифицированная
40, 137
9
420
Немодифицированный
Немодифицированная
41, 138
13
424
Немодифицированный
Немодифицированная
42, 139
17
428
Немодифицированный
Немодифицированная
43, 140
21
432
Немодифицированный
Немодифицированная
2. Последовательности разрушения
[0118] В определенных вариантах осуществления укороченный ген X содержит сигнал посттрансляционной модификации, который может содержать последовательности разрушения, которые известны как увеличивающие скорость, с которой этот белок разрушает протеасома, таким образом, снижая время полужизни белка. Неограничивающие примеры таких последовательностей включают внесение нуклеотидов, кодирующих последовательности PEST, связывающие убиквитин домены или аминокислот, подчиняющихся правилу N-конца.
[0119] Последовательности PEST представляют собой области аминокислот, богатые пролином (P), глутаминовой кислотой (E), серином (S) и треонином (T). (Rogers S., Wells R., Rechsteiner M. (1986). "Amino acid sequences common to rapidly degraded proteins: the PEST hypothesis". Science (journal) 234 (4774): 364-8. doi:10.1126/science.2876518). Присутствие областей PEST может приводить к быстрому внутриклеточному разрушению содержащих их белков. Таким образом, в определенных вариантах осуществления вариант гена X содержит нуклеиновые кислоты, кодирующие области PEST.
[0120] В определенных вариантах осуществления вариант гена X содержит нуклеиновые кислоты, кодирующие связывающие убиквитин домены. Связывающие убиквитин домены (UBD) представляют собой группу модульных белковых доменов, которые нековалентно связываются с убиквитином. Эти мотивы воспринимают и передают информацию, предоставляемую посредством убиквитинилирования белка, контролируя различные события в клетке, включая разрушение в протеасомах. Таким образом, в определенных вариантах осуществления вариант гена X может быть функционально связан с нуклеиновыми кислотами, кодирующими связывающие убиквитин домены так, что убиквитинлигазы помечают вариант белка X для мечения убиквитином и, таким образом, разрушения протеасомами, более быстро. Неограничивающие примеры связывающих убиквитин доменов включают CUE, GAT, GLUE, NZF, PAZ, UBA, UEV, UIM и VHS. См. Hicke, Ubiquitin-Binding Domains, doi:10.1038/nrm1701.
[0121] В определенных вариантах осуществления вариант гена X содержит мутации, соответствующие заменам аминокислот, которые снижают стабильность белка X в соответствии с правилом N-конца. В правиле N-конца особенности аминокислоты, которая находится на N-конце полипептида, после удаления начального метионина может влиять на метаболическую стабильность и время полужизни полипептида. (Varshavsky, A, 1996 The N-end rule: functions, mysteries, uses. Proc Natl Acad. Sci. USA 93(22):12142-12149). Эту аминокислоту можно называть дестабилизирующей аминокислотой. Таким образом, в определенных вариантах осуществления модифицированный PRE содержит мутации в варианте гена X, где непосредственно за старт-кодоном расположен кодон, кодирующий дестабилизирующую аминокислоту. Неограничивающие примеры дестабилизирующих аминокислот включают глицин, аргинин, глутаминовую кислоту, фенилаланин, аспарагиновую кислоту, цистеин, лизин, аспарагин, серин, тирозин, триптофан, гистидин и лейцин. См. Varshavsky, 1996; также см. Gonda et al. (1989). "Universality and Structure of the N-end Rule". Journal of Biological Chemistry 264 (28): 16700-16712. В определенных вариантах осуществления модифицированный PRE содержит мутации в варианте гена X, где непосредственно за старт-кодоном расположены кодоны, кодирующие первую дестабилизирующую аминокислоту и вторую дестабилизирующую аминокислоту. Эти мутации могут соответствовать таким парам аминокислот, как аргинин-глутаминовая кислота, или аргинин-аспарагин. В определенных вариантах осуществления первой дестабилизирующей аминокислотой является аргинин, а второй дестабилизирующей аминокислотой являются глутаминовая кислота или аспарагин.
3. Другие модификации
[0122] Предоставлены полинуклеотиды, содержащие модифицированные PRE, которые в дополнение к любым, описанным выше, содержат дополнительные модификации. В определенных вариантах осуществления дополнительные модификации могут представлять собой любую модификацию гена X, содержащегося в модифицированном PRE, которая может снизить или предотвратить одно или несколько из экспрессии, разрушения, стабильности, онкогенности и/или иммуногенности гена X или кодируемого им белка X. В определенных вариантах осуществления дополнительные модификации изменяют, например, снижают, транскрипцию варианта гена X и/или трансляцию белка X, кодируемого вариантом гена X.
[0123] В одном из вариантов осуществления модифицированный PRE дополнительно содержит вариант старт-кодона гена X, который в некоторых случаях внесен для ограничения или предотвращения инициации трансляции. В определенных вариантах осуществления вариант старт-кодона по сравнению с немодифицированным старт-кодоном гена X, такого как старт-кодон гена X вируса гепатита дикого типа содержит один или несколько отличающихся нуклеотидов. Например, в отношении SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125 модифицированный PRE может дополнительно содержать вариант старт-кодона, содержащий один или несколько отличающихся нуклеотидов по сравнению со старт-кодоном, соответствующим положениям нуклеотидов 411-413 SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125. Специалист в данной области может легко идентифицировать остаток в другом PRE вируса гепатита, таком как другой WPRE, который соответствует старт-кодону положения 411-413 SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125 (см. например, фигуру 2A-2E). Различия в нуклеотидах могут приводить к ограничению или предотвращению инициации трансляции.
[0124] В определенных вариантах осуществления вариант старт-кодона может представлять собой вариант кодона, находящегося в положении, соответствующем старт-кодону гена X в рамке считывания варианта гена X последовательности модифицированного WPRE, приведенной в SEQ ID NO:119 или SEQ ID NO:216. Например, вариант старт-кодона может представлять собой кодон, соответствующий остаткам нуклеотидов 411-413 (TTG) последовательности нуклеотидов, приведенной в SEQ ID NO:119 или SEQ ID NO:216. В определенных вариантах осуществления вариант старт-кодона может представлять собой кодон рамки считывания гена X в модифицированном WPRE, приведенном в SEQ ID NO:120. Например, вариант старт-кодона может представлять собой кодон, соответствующий остаткам нуклеотидов 411-413 (GGG) последовательности нуклеотидов, приведенной в SEQ ID NO:120.
[0125] В таблицах 3A и 3B приведены иллюстративные варианты гена X и модифицированные полинуклеотиды PRE, содержащие вариант гена X, соответственно, в котором содержится по меньшей мере один внесенный стоп-кодон и вариант старт-кодона, не присутствующий в гене X дикого типа или немодифицированном гене X или PRE. В таблице в вариантах гена X или модифицированных PRE указаны иллюстративные положения для внесения по меньшей мере одного стоп-кодона. Также приведены соответствующие SEQ ID NO для последовательностей иллюстративных полинуклеотидов. В определенных вариантах осуществления вариант гена X содержит последовательность нуклеотидов, приведенную в любой из SEQ ID NO: 74-88 или 171-185. В определенных вариантах осуществления модифицированный PRE содержит последовательность нуклеотидов, приведенную в любой из SEQ ID NO: 59-73 или 156-170. В определенных вариантах осуществления предоставлены полинуклеотиды, содержащие такие PRE, функционально связанные с нуклеиновыми кислотами, кодирующими рекомбинантными молекулы, такие как рекомбинантные антигенраспознающие рецепторы, CAR, TCR, химерные рецепторы, иммуномодуляторы, иммуностимулирующие молекулы и/или маркеры трансдукции или экспрессии и экспрессирующие кассеты и векторы, содержащие их.
[0126] В другом варианте осуществления модифицированный PRE может дополнительно содержать вариант промотора, функционально связанный с вариантом гена X в нем. Вариант промотора по сравнению с немодифицированным промотором гена X вируса гепатита, таким как промотор гена X вируса гепатита дикого типа, может содержать один или несколько отличающихся нуклеотидов. Например, в отношении SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125 вариант гена X может содержать один или несколько отличающихся нуклеотидов по сравнению с промотором гена X WPRE, приведенным в SEQ ID NO:11 или приведенном как нуклеотиды 7-20 SEQ ID NO:11. В определенных вариантах осуществления различия в нуклеотидах могут приводить к одному или нескольким отличиям, которые приводит к ограничению или предотвращению транскрипции с промотора.
[0127] В определенных вариантах осуществления модифицированный PRE может содержать вариант промотора, содержащий последовательность варианта промотора, функционально связанного с модифицированным геном X в последовательности модифицированного PRE, приведенного в качестве SEQ ID NO:119 или SEQ ID NO:216. Например, вариант промотора может представлять собой вариант промотора, содержащий остатки нуклеотидов, соответствующие остаткам 391-411 (GGGGAAATCATCGTCCTTTCC; SEQ ID NO:217) или остаткам нуклеотидов 397-410 (ATCATCGTCCTTTC; SEQ ID NO:218), каждой последовательности нуклеотидов, приведенной в SEQ ID NO:119 или SEQ ID NO:216. В определенных вариантах осуществления модифицированный PRE может содержать вариант промотора с последовательностью варианта промотора, функционально связанного с модифицированным геном X в модифицированном PRE, приведенном в SEQ ID NO:120. Например, вариант промотора может представлять собой вариант промотора, содержащий остатки нуклеотидов, соответствующие остаткам 391-411 (GGGGAAGGTCTGCTGAGACTC; SEQ ID NO:219) или остаткам нуклеотидов 397-410 (GGTCTGCTGAGACT; SEQ ID NO:220), каждой последовательности нуклеотидов, приведенной в SEQ ID NO:120.
[0128] В определенных вариантах осуществления вариант промотора может представлять собой вариант промотора, который представляет собой промотор белка X вируса гепатита, известный в данной области, например, любой, описанный в Sugata et al. (1994) Virology, 205:314-320. В определенных вариантах осуществления вариант промотора X может представлять собой вариант промотора, приведенный в SEQ ID NO:11, или промотор, который содержит нуклеотиды 6-22 SEQ ID NO:10, несущий мутацию на треонин (T) в положении, соответствующем положению 9 SEQ ID NO:10, или мутацию на глицин (G) в положении, соответствующем положению 10 SEQ ID NO:10.
[0129] В таблицах 3A и 3B приведены иллюстративные варианты гена X и полинуклеотиды модифицированных PRE, содержащие варианты гена X, соответственно, в которых содержится по меньшей мере один внесенный стоп-кодон, вариант промотора и, необязательно, вариант старт-кодона, не присутствующие в PRE дикого типа или немодифицированном PRE. В таблицах указаны иллюстративные положения для внесения по меньшей мере одного стоп-кодона в вариант гена X или модифицированный PRE. Также указаны соответствующие SEQ ID NO для последовательностей иллюстративных полинуклеотидов. В определенных вариантах осуществления модифицированный PRE содержит последовательность нуклеотидов, приведенную в любой из SEQ ID NO: 89-118 или 186-215. В определенных вариантах осуществления предоставлены полинуклеотиды, содержащие такие PRE, функционально связанные с нуклеиновыми кислотами, кодирующими рекомбинантные молекулы, такие как рекомбинантные антигенраспознающие рецепторы, CAR, TCR, химерные рецепторы, иммуномодуляторы, иммуностимулирующие молекулы и/или маркеры трансдукции или экспрессии и экспрессирующие кассеты и векторы, содержащие их.
<b>Таблица 3A: Иллюстративные варианты гена X по меньшей мере с одним внесенным стоп-кодоном и модифицированным старт-кодоном гена X</b>
<b>SEQ ID NO</b>
<b>5'-положение внесенного стоп-кодона(ов)</b>
<b>Относительно 3'-положения старт-кодона гена X</b>
<b>Старт-кодон гена X</b>
74, 171
9, 13, 17, 21
Модифицированный
75, 172
9, 13, 17
Модифицированный
76, 173
9, 13, 21
Модифицированный
77, 174
9, 17, 21
Модифицированный
78, 175
13, 17, 21
Модифицированный
79, 176
9, 13
Модифицированный
80, 177
9, 17
Модифицированный
81, 178
9, 21
Модифицированный
82, 179
13, 17
Модифицированный
83, 180
13, 21
Модифицированный
84, 181
17, 21
Модифицированный
85, 182
9
Модифицированный
86, 183
13
Модифицированный
87, 184
17
Модифицированный
88, 185
21
Модифицированный
<b>Таблица 3B: Иллюстративные варианты гена X по меньшей мере с одним внесенным стоп-кодоном и модифицированными старт-кодоном и/или промотором гена X</b>
<b>SEQ ID NO</b>
<b>5'-положение внесенного стоп-кодона(ов)</b>
<b>Старт-кодон гена X</b>
<b>Промоторная последовательность</b>
<b>Относительно 3'-положения старт-кодона гена X</b>
<b>Остаток, соответствующий SEQ ID NO: 1 или 125</b>
59, 156
9, 13, 17, 21
420, 424, 428, 432
Модифицированный
Немодифицированная
60, 157
9, 13, 17
420, 424, 428
Модифицированный
Немодифицированная
61, 158
9, 13, 21
420, 424, 432
Модифицированный
Немодифицированная
62, 159
9, 17, 21
420, 428, 432
Модифицированный
Немодифицированная
63, 160
13, 17, 21
424, 428, 432
Модифицированный
Немодифицированная
64, 161
9, 13
420, 424
Модифицированный
Немодифицированная
65, 162
9, 17
420, 428
Модифицированный
Немодифицированная
66, 163
9, 21
420, 432
Модифицированный
Немодифицированная
67, 164
13, 17
424, 428
Модифицированный
Немодифицированная
68, 165
13, 21
424, 432
Модифицированный
Немодифицированная
69, 166
17, 21
428, 432
Модифицированный
Немодифицированная
70, 167
9
420
Модифицированный
Немодифицированная
71, 168
13
424
Модифицированный
Немодифицированная
72, 169
17
428
Модифицированный
Немодифицированная
73, 170
21
432
Модифицированный
Немодифицированная
89, 186
9, 13, 17, 21
420, 424, 428, 432
Немодифицированный
Модифицированная
90, 187
9, 13, 17
420, 424, 428
Немодифицированный
Модифицированная
91, 188
9, 13, 21
420, 424, 432
Немодифицированный
Модифицированная
92, 189
9, 17, 21
420, 428, 432
Немодифицированный
Модифицированная
93, 190
13, 17, 21
424, 428, 432
Немодифицированный
Модифицированная
94, 191
9, 13
420, 424
Немодифицированный
Модифицированная
95, 192
9, 17
420, 428
Немодифицированный
Модифицированная
96, 193
9, 21
420, 432
Немодифицированный
Модифицированная
97, 194
13, 17
424, 428
Немодифицированный
Модифицированная
98, 195
13, 21
424, 432
Немодифицированный
Модифицированная
99, 196
17, 21
428, 432
Немодифицированный
Модифицированная
100, 197
9
420
Немодифицированный
Модифицированная
101, 198
13
424
Немодифицированный
Модифицированная
102, 199
17
428
Немодифицированный
Модифицированная
103, 200
21
432
Немодифицированный
Модифицированная
104, 201
9, 13, 17, 21
420, 424, 428, 432
Модифицированный
Модифицированная
105, 202
9, 13, 17
420, 424, 428
Модифицированный
Модифицированная
106, 203
9, 13, 21
420, 424, 432
Модифицированный
Модифицированная
107, 204
9, 17, 21
420, 428, 432
Модифицированный
Модифицированная
108, 205
13, 17, 21
424, 428, 432
Модифицированный
Модифицированная
109, 206
9, 13
420, 424
Модифицированный
Модифицированная
110, 207
9, 17
420, 428
Модифицированный
Модифицированная
111, 208
9, 21
420, 432
Модифицированный
Модифицированная
112, 209
13, 17
424, 428
Модифицированный
Модифицированная
113, 210
13, 21
424, 432
Модифицированный
Модифицированная
114, 211
17, 21
428, 432
Модифицированный
Модифицированная
115, 212
9
420
Модифицированный
Модифицированная
116, 213
13
424
Модифицированный
Модифицированная
117, 214
17
428
Модифицированный
Модифицированная
118, 215
21
432
Модифицированный
Модифицированная
B. Нуклеиновые кислоты, кодирующие рекомбинантные молекулы
[0130] В определенных вариантах осуществления модифицированные PRE в предоставляемых полинуклеотидах функционально связаны с одной или несколькими нуклеиновыми кислотами, кодирующими одну или несколько представляющих интерес молекул, таких как одна или несколько рекомбинантных и/или гетерологичных молекул, например, рекомбинантных белков, таких как гетерологичные белки. Такие рекомбинантные и/или гетерологичные молекулы могут включать растворимые белки, например, секретируемые белки и/или белки клеточной поверхности. В определенных вариантах осуществления молекула представляет собой или содержит рекомбинантный рецептор. Такие рекомбинантные рецепторы могут включать антигенраспознающие рецепторы, такие как функциональные не являющиеся TCR антигенраспознающие рецепторы, включая химерные антигенраспознающие рецепторы (CAR), и другие антигенсвязывающие рецепторы, такие как трансгенные T-клеточные рецепторы (TCR). Рецепторы также могут включать другие рецепторы, такие как другие химерные рецепторы, такие как рецепторы, которые связываются с конкретными лигандами и содержащие трансмембранные домены и/или внутриклеточные сигнальные домены, сходные с доменами, присутствующими в CAR.
[0131] В определенных вариантах осуществления молекула представляет собой растворимую молекулу, такую как иммуномодулирующая и/или иммуностимулирующая молекула, такая как цитокин, например, IL-2, IL-12, IL-6, 41BBL, CD40L, и/или растворимый лиганд или рецептор, такие как растворимый лиганд костимулирующей молекулы клетки иммунной системы, например, CD40L, 41BBL, или растворимая антигенсвязывающая молекула, такая как scFv. Также в числе молекулы находятся маркеры экспрессии или трансдукции и любая другая молекула(ы), известная как применяемая в экспрессирующих векторах и/или кассетах.
[0132] В определенных вариантах осуществления рекомбинантный антигенраспознающый рецептор, например, CAR, специфически связывается с одним или несколькими лигандами на клетке или ассоциированными с заболеваниями, которые являются мишенью, например, злокачественной опухолью, инфекционным заболеванием, воспалительным или аутоиммунным заболеванием или другим заболеванием или патологическим состоянием, включая заболевания или патологические состояния, описываемые в настоящем документе для направленного воздействия предоставляемыми способами и композициями. Иллюстративные антигены представляют собой орфанный рецептор тирозинкиназы ROR1, tEGFR, Her2, Ll-CAM, CD19, CD20, CD22, мезотелин, CEA и поверхностный антиген гепатита B, рецептор фолиевой кислоты, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, 0EPHa2, ErbB2, 3 или 4, FBP, рецептор фетального ацетилхолина e, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-альфа, IL-13R-альфа 2, kdr, легкую цепь каппа, антиген Льюиса Y, молекулу клеточной адгезии L1, MAGE-A1, мезотелин, MUC1, MUC16, PSCA, лиганды NKG2D, NY-ESO-1, MART-1, gp100, онкофетальный антиген, ROR1, TAG72, VEGF-R2, раково-эмбриональный антиген (CEA), специфический антиген предстательной железы, PSMA, Her2/neu, рецептор эстрогена, рецептор прогестерона, эфрин B2, CD123, CS-1, c-Met, GD-2 и MAGE A3, CE7, антиген опухоли Вильмса 1 (WT-1), циклин, такой как циклин A1 (CCNA1) и/или биотинилированные молекулы и/или молекулы, экспрессируемые и/или характерные или специфические для ВИЧ, HCV, HBV, HPV и/или других патогенных микроорганизмов, и/или их онкогенные версии.
1. Химерные антигенраспознающие рецепторы
[0133] В определенных вариантах осуществления рекомбинантная молекула представляет собой или содержит химерный антигенраспознающий рецептор (CAR). Как правило, CAR представляет собой генетически сконструированный рецептор с внеклеточным лигандсвязывающим доменом, связанным с одним или несколькими внутриклеточными сигнальными компонентами. Как правило, такие молекулы имитируют или апроксимируют сигнал от природного антигенраспознающего рецептора и/или сигнал от такого рецептора в комбинации с костимулирующим рецептором.
[0134] В определенных вариантах осуществления CAR конструируют со специфичностью к конкретному маркеру, такому как маркер, экспрессируемый в конкретном типе клеток, являющемся мишенью адоптивной терапии, например, маркер злокачественной опухоли и/или любой из описываемых антигенов. Таким образом, как правило, CAR содержит один или несколько антигенсвязывающих фрагментов, домен или часть антитела или один или несколько вариабельных доменов антитела и/или молекул антител. В определенных вариантах осуществления CAR содержит антигенсвязывающую часть или части молекулы антитела, такие как вариабельная область тяжелой цепи (VH) или ее антигенсвязывающая часть или одноцепочечный фрагмент антитела (scFv), получаемый из вариабельной области тяжелой цепи (VH) и вариабельной области легкой цепи (VL) моноклонального антитела (mAb).
[0135] Как правило, компонент специфического связывания или распознавания антигена связан с одним или несколькими трансмембранными доменами и внутриклеточными сигнальными доменами. В определенных вариантах осуществления CAR содержит трансмембранный домен, слитый с внеклеточным доменом. В одном из вариантов осуществления используют трансмембранный домен, который в естественных условиях ассоциирован с одним из доменов в рецепторе, например, CAR. В некоторых случаях трансмембранный домен выбран или модифицирован посредством замены аминокислот так, чтобы избежать связывания таких доменов с трансмембранными доменами таких же или других белков поверхностной мембраны для минимизации взаимодействий с другими участниками рецепторного комплекса.
[0136] В определенных вариантах осуществления трансмембранный домен получают из природного или синтетического источника. Когда источник является природным, в определенных аспектах домен получают из любого мембраносвязанного или трансмембранного белка. Трансмембранные области включают области, получаемые из (т.е. содержащие по меньшей мере трансмембранную область(и)) альфа-, бета- или зета-цепи T-клеточного рецептора, CD28, CD3 эпсилон, CD45, CD4, CD5, CDS, CD9, CD 16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD154. В определенных вариантах осуществления трансмембранный домен является синтетическим. В определенных аспектах синтетический трансмембранный домен преимущественно содержит гидрофобные остатки, такие как лейцин и валин. В определенных аспектах на каждом из концов синтетического трансмембранного домена находится триплет из фенилаланина, триптофана и валина. В определенных вариантах осуществления связь осуществляют посредством линкеров, спейсеров и/или трансмембранного домена(ов).
[0137] В определенных вариантах осуществления между трансмембранным доменом и цитоплазматическим сигнальным доменом CAR присутствует и формирует связь короткий олиго- или полипептидный линкер, например, линкер длиной от 2 до 10 аминокислот, такой как линкер, содержащий остатки глицина и серина, например, глицинсериновый дублет.
[0138] Рецептор, например, CAR, как правило, содержит по меньшей мере один внутриклеточный сигнальный компонент или компоненты. В определенных вариантах осуществления рецептор содержит внутриклеточный компонент комплекса TCR, такой как цепь CD3 TCR, которая опосредует активацию и цитотоксичность T-клеток, например, зета-цепь CD3. Таким образом, в определенных аспектах антигенсвязывающая часть связана с одним или несколькими клеточными сигнальными модулями. В определенных вариантах осуществления клеточные сигнальные модули включают трансмембранный домен CD3, внутриклеточные сигнальные домены CD3 и/или трансмембранные домены других CD. В определенных вариантах осуществления рецептор, например, CAR, дополнительно содержит часть одной или нескольких дополнительных молекул, таких как рецептор Fc γ, CD8, CD4, CD25 или CD16. Например, в определенных аспектах CAR или другой химерный рецептор содержит химерную молекулу между CD3-zeta (CD3-ζ) или рецептором Fc γ и CD8, CD4, CD25 или CD16.
[0139] В определенных вариантах осуществления при лигировании CAR или другого химерного рецептора цитоплазматический домен или внутриклеточный сигнальный домен рецептора активирует по меньшей мере одну из нормальных эффекторных функций или видов ответа клетки иммунной системы, например, T-клетки, сконструированной для экспрессии CAR. Например, в определенных случаях CAR индуцирует такую функцию T-клетки, как цитолитическая активность или T-хелперная активность, такую как секреция цитокинов или других факторов. В определенных вариантах осуществления вместо интактной иммуностимулирующей цепи используют укороченную часть внутриклеточного сигнального домена компонента антигенраспознающего рецептора или костимулирующей молекулы, например, если она передает сигнал эффекторной функции. В определенных вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен или домены включают цитоплазматические последовательности T-клеточного рецептора (TCR), а в определенных аспектах также цитоплазматические последовательности корецепторов, которые в природном окружении действуют во взаимодействии с этими рецепторами, инициируя передачу сигнала после связывания антигенраспознающего рецептора с антигеном, и/или любое производное или вариант таких молекул и/или любую синтетическую последовательность, которая обладает теми же функциональными возможностями.
[0140] В случае природного TCR для полной активации, как правило, необходима не только передача сигнала через TCR, но также необходим костимулирующий сигнал. Таким образом, в определенных вариантах осуществления для обеспечения полной активации в CAR включают компонент для генерации вторичного или костимулирующего сигнала. В определенных аспектах активацию T-клеток описывают, как опосредуемую двумя классами цитоплазматических сигнальных последовательностей: последовательностями, которые инициируют зависимую от антигена первичную активацию через TCR (первичные цитоплазматические сигнальные последовательности), и последовательностями, которые действуют независимым от антигена образом, обеспечивая вторичный или костимулирующий сигнал (вторичные цитоплазматические сигнальные последовательности). В определенных аспектах CAR содержит один или оба из таких сигнальных компонентов.
[0141] Первичные цитоплазматические сигнальные последовательности в определенном отношении могут стимулирующим образом или ингибирующим образом регулировать первичную активацию комплекса TCR. Первичные цитоплазматические сигнальные последовательности, которые действуют стимулирующим образом, могут содержать сигнальные мотивы, которые известны как иммунорецепторные тирозиновые активирующие мотивы или ITAM. Примеры содержащих ITAM первичных цитоплазматических сигнальных последовательностей включают сигнальные последовательности, получаемые из зета-цепи TCR, FcR гамма, FcR бета, CD3 гамма, CD3 дельта, CD3 эпсилон, CDS, CD22, CD79a, CD79b и CD66d. В определенных вариантах осуществления цитоплазматическая сигнальная молекула(ы) в CAR содержит цитоплазматический сигнальный домен, его часть или последовательность, получаемую из зета-цепи CD3.
[0142] В определенных вариантах осуществления CAR содержит сигнальный домен и/или трансмембранную часть костимулирующего рецептора, такого как CD28, 4-1BB, OX40, DAP10 и ICOS.
+
+
+
+
[0143] В определенных вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит трансмембранный и сигнальный домены CD28, связанные с внутриклеточным доменом CD3. В определенных вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит химерный CD28 и костимулирующие домены CD137, связанные с внутриклеточным доменом CD3. В определенных вариантах осуществления CAR также содержит маркер трансдукции (например, tEGFR). В определенных вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен CD8 цитотоксических T-клеток является таким же, что и внутриклеточный сигнальный домен CD4 хелперных T-клеток. В определенных вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен CD8 цитотоксических T-клеток отличается от внутриклеточного сигнального домена CD4 хелперных T-клеток.
[0144] В определенных вариантах осуществления CAR в цитоплазматической части содержит один или несколько, например, два или более, костимулирующих домена и активирующий домен, например, первичный активирующий домен. Одним из примеров является рецептор, содержащий внутриклеточные компоненты зета-цепи CD3, CD28 и 4-1BB.
[0145] В определенных вариантах осуществления рекомбинантная молекула(ы), кодируемая нуклеиновой кислотой(ами) в предоставляемых полинуклеотидах дополнительно содержит один или несколько маркеров, например, с целями подтверждения трансдукции или конструирования клетки с экспрессией рецептора и/или отбора и/или определения клеток, экспрессирующих молекулу(ы), кодируемую полинуклеотидом. В определенных аспектах такой маркер может кодировать другая нуклеиновая кислота или полинуклеотид, которые также можно вносить в процесс генетического конструирования, как правило, тем же способом, например, трансдукцией такого же вектора или типа вектора.
[0146] В определенных аспектах маркер, например, маркер трансдукции представляет собой белок и/или представляет собой молекулу клеточной поверхности. Иллюстративные маркеры представляют собой укороченные варианты природных, например, эндогенных маркеров, такие как природные молекулы клеточной поверхности. В определенных аспектах варианты обладают сниженной иммуногенностью, сниженной функция миграции и/или сниженной сигнальной функцией по сравнению с природной или эндогенной молекулой клеточной поверхности.
[0147] В определенных аспектах маркер включает весь или часть (например, укороченную форму) CD34, NGFR или рецептор эпидермального фактора роста (например, tEGFR).
[0148] В определенных вариантах осуществления маркер представляет собой молекулу, например, белок клеточной поверхности, не встречаемую в природе на T-клетках или не находящуюся в природе на поверхности T-клеток, или ее часть.
[0149] В определенных вариантах осуществления молекула представляет собой чужеродную молекулу, например, чужеродный белок, т.е. белок, который не распознается как "собственный" иммунной системой хозяина, в клетки которого осуществлен адоптивный перенос.
in vivo
[0150] В определенных вариантах осуществления маркер не служит терапевтической функции и/или не проявляет действия, отличного от использования в качестве маркер для генетической инженерии, например, для отбора успешно сконструированных клеток. В других вариантах осуществления маркер может представлять собой терапевтическую молекулу или молекулу, иным образом оказывающую определенное желаемое действии, такую как лиганд для клетки, встречаемый , такой как костимулирующая молекула или молекула контрольной точки иммунного ответа для усиления и/или ослабления ответа клеток после адоптивного переноса и взаимодействия с лигандом.
[0151] Антигенраспознающие рецепторы, включая CAR и рекомбинантные TCR, и их получение и введение в определенных вариантах осуществления включают рецепторы и их получение и введение, описанные, например, в публикациях международных патентных заявок с номерами WO200014257, WO2013126726, WO2012/129514, WO2014031687, WO2013/166321, WO2013/071154, WO2013/123061, публикациях патентных заявок США с номерами US2002131960, US2013287748, US20130149337, патентах США №№: 6451995, 7446190, 8252592, 8339645, 8398282, 7446179, 6410319, 7070995, 7265209, 7354762, 7446191, 8324353 и 8479118 и европейской патентной заявке с номером EP2537416, и/или рецепторы и их получение и введение, описанные Sadelain et al., Cancer Discov. 2013 April; 3(4): 388-398; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338; Turtle et al., Curr. Opin. Immunol., 2012 October; 24(5): 633-39; Wu et al., Cancer, 2012 March 18(2): 160-75.
2. T-клеточные рецепторы (TCR)
[0152] В определенных вариантах осуществления рекомбинантная молекула(ы), кодируемая нуклеиновой кислотой(ами), представляет собой или содержит рекомбинантный T-клеточный рецептор (TCR). В определенных вариантах осуществления рекомбинантный TCR специфичен для антигена, как правило, антигена, находящегося на клетке-мишени, такой как опухолеспецифичный антиген, антиген, экспрессируемый на конкретном типе клеток, ассоциированном с аутоиммунным или воспалительным заболеванием, или антиген, получаемый из патогенного вирусного микроорганизма или патогенного бактериального микроорганизма.
[0153] В определенных вариантах осуществления TCR представляет собой TCR, который клонирован из природных T-клеток. В определенных вариантах осуществления высокоаффинный T-клеточный клон для антигена-мишени (например, антиген злокачественной опухоли) идентифицируют и выделяют у пациента. В определенных вариантах осуществления клон TCR для антиген-мишень получают у трансгенных мышей, которым посредством генной инженерии введены гены человек иммунной системы человека (например, систему лейкоцитарных антигенов человека или HLA). См., например, опухолевые антигены (см., например, Parkhurst et al. (2009) Clin. Cancer Res. 15:169-180 and Cohen et al. (2005) J. Immunol. 175:5799-5808. В определенных вариантах осуществления для выделения TCR к антигену-мишени используют фаговый дисплей (см., например, Varela-Rohena et al. (2008) Nat. Med. 14:1390-1395 и Li (2005) Nat. Biotechnol. 23:349-354).
[0154] В определенных вариантах осуществления после получения T-клеточного клона, выделяют цепи альфа и бета TCR и клонируют в экспрессирующий гены вектор. В определенных вариантах осуществления гены альфа и бета TCR связаны посредством пептида рибосомального разрыва 2A пикорнавируса так, что происходит коэкспрессия обеих цепей. В определенных вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая TCR, дополнительно содержит маркер для подтверждения трансдукции или конструирования клеток, экспрессирующих рецептор.
[0155] В определенных вариантах осуществления рекомбинантная или гетерологичная молекула(ы), кодируемая нуклеиновой кислотой в предоставляемом полинуклеотиде представляет собой или содержит молекулу нуклеиновой кислоты, такую как РНК, ДНК или последовательность искусственной нуклеиновой кислоты, например, последовательность, сконструированную для препятствия экспрессии или активности иРНК-мишени, например, такая как малая интерферирующая РНК (миРНК), короткошпилечная РНК (кшРНК), или микроРНК (мкРНК). Такие молекулы могут включать молекулы, сконструированные для препятствия экспрессии или активности молекул, ассоциированных с активностью клеток иммунной системы, стимулирующих или ингибирующих ее, например, иммуномодуляторов, иммуноингибирующих молекул и молекул контрольных точек иммунного ответа. В определенных вариантах осуществления последовательность нуклеотидов миРНК или мкРНК (например, длиной 21-25 нуклеотидов) можно получать, например, из экспрессирующего вектора посредством транскрипции последовательности короткошпилечной РНК (кшРНК), более протяженной (например, 60-80 нуклеотидов) последовательности-предшественника, которую затем процессируют аппарат клеточной РНКи с получением последовательности миРНК или мкРНК. Альтернативно, последовательность нуклеотидов миРНК или мкРНК (например, длиной 21-25 нуклеотидов) можно синтезировать, например, химически. Химический синтез последовательностей миРНК или мкРНК коммерчески доступен в таких корпорациях как Dharmacon, Inc. (Lafayette, CO), Qiagen (Valencia, CA) и Ambion (Austin, TX). Длина РНК может составлять от 10 до 30 нуклеотиды, например 19-25 или 21-25 нуклеотидов. Например, последовательность миРНК как правило связывается с уникальной последовательностью в иРНК-мишени с точной комплементарностью и приводит к разрушению молекулы иРНК-мишени. Последовательность миРНК может связываться в любом месте молекулы иРНК; последовательности, к которым направлена миРНК, включают гены, гены, экспрессирующие представляющий интерес полипептид или вышерасположенный или нижерасположенный по каскаду модулятор такого гена, например, вышерасположенный или нижерасположенный по каскаду модулятор гена, такой как фактор транскрипции, который связывается с промотором гена, киназа или фосфатаза, которая взаимодействует с представляющим интерес полипептидом, и полипептиды, вовлеченные в регуляторные каскады, способные влиять на представляющий интерес полипептид. Последовательность мкРНК, как правило, связывается с уникальной последовательностью в иРНК-мишени с точной или менее точной комплементарностью и приводит к репрессии трансляции молекулы иРНК-мишени. Последовательность мкРНК может связываться в любом месте последовательности иРНК, но, как правило, связывается в 3'-нетранслируемой области молекулы иРНК.
C. Экспрессирующие кассеты и вирусные векторы
[0156] В определенных вариантах осуществления полинуклеотид предоставлен в виде экспрессирующей кассеты или в экспрессирующей кассете. Полинуклеотид или экспрессирующая кассета для экспрессии рекомбинантной и/или гетерологичной молекулы, кодируемой нуклеиновой кислотой, могут содержаться в экспрессирующем векторе, таком как вирусный вектор.
1. Экспрессирующая кассета
[0157] В определенных вариантах осуществления экспрессирующая кассета может содержать гетерологичную и/или рекомбинантную нуклеиновую кислоту под контролем промотора и функционально связанную с модифицированным PRE, таким как любой PRE из описанных выше. Экспрессирующая кассета также может содержать один или несколько других регуляторных элементов. В дополнение к модифицированному PRE нуклеиновая кислота может быть функционально связана с другими последовательностями нуклеиновых кислот, включая в качестве неограничивающих примеров, промоторы, энхансеры, другие посттранскрипционные регуляторные элементы, сигналы полиаденилирования, участки распознавания рестрикционных ферментов, участки множественного клонирования или кодирующие участки.
a. Промоторы
[0158] В определенных вариантах осуществления экспрессирующая кассета содержит промотор, функционально связанный с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей рекомбинантный или гетерологичный белок. Промотор может включать любой промотор, необходимый пользователю в зависимости от случая экспрессии. В определенных вариантах осуществления промотор может включать промотор эукариотического или прокариотического происхождения, который может обеспечивать высокие уровни конститутивной экспрессии в ряде типов клеток и достаточен для контроля транскрипции в клетке нуклеиновой кислоты, кодирующей рекомбинантный или гетерологичный белок. В определенных вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая рекомбинантный или гетерологичный белок, представляет собой дистально расположенную последовательность, которая представляет собой последовательность, функционально связанную с 5'-концом последовательности промотора. Область промотора также может включать контрольные элементы для усиления или подавления транскрипции, и ее можно модифицировать как необходимо пользователю и в зависимости от случая.
[0159] В определенных вариантах осуществления промотор содержит последовательность, которая функционирует, указывая участок старта синтеза РНК. В определенных вариантах осуществления промотор содержит TATA-бокс. В определенных вариантах осуществления в промоторе TATA-бокс отсутствует, например так, как в промоторе гена терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы млекопитающих и промоторе поздних генов SV40. В таком варианте осуществления, промотор может содержать дискретный элемент, перекрывающий сам участок старта транскрипции, который помогает фиксировать место инициации. Дополнительные промоторные элементы регулируют частоту инициации транскрипции. В определенных вариантах осуществления они расположены в области на 30-110 п.н. выше участка старта транскрипции, хотя показано, что ряд промоторов также содержат функциональные элементы ниже участка старта транскрипции. Для приведения кодирующих последовательностей "под контроль" промотора 5'-конец участка инициации транскрипции транскрипционной рамки считывания помещают "ниже" (т.е. с 3'-конца) выбранного промотора. "Расположенный выше" промотор стимулирует транскрипцию ДНК и обеспечивает экспрессию кодируемой РНК.
[0160] В определенных вариантах осуществления расстояния между элементами промотора не являются фиксированным так, что когда элементы инвертируют или перемещают относительно друг друга, функция промотора сохраняется. В определенных вариантах осуществления, когда промотор представляет собой промотор tk, расстояния между элементами промотора, прежде чем его активность начнет снижаться, могут увеличиваться до 50 п.н. В зависимости от промотора, отдельные элементы для активации транскрипции могут функционировать совместно или независимо. В определенных вариантах осуществления промотор можно использовать в сочетании с "энхансером", который относится к цис-действующей регуляторной последовательности, вовлеченной в активацию транскрипции последовательности нуклеиновой кислоты.
[0161] В определенных вариантах осуществления промотор может представлять собой промотор, который в природе ассоциирован с последовательностью нуклеиновой кислоты, которую можно получать, выделяя 5'-некодирующие последовательности, расположенные выше кодирующего участка и/или экзона. Такой промотор можно обозначать как "эндогенный". В определенных вариантах осуществления энхансер может представлять собой энхансер, ассоциированный с последовательностью нуклеиновой кислоты в природе, располагаясь ниже или выше этой последовательности.
[0162] Альтернативно, в определенных вариантах осуществления участок кодирующей нуклеиновой кислоты может находиться под контролем рекомбинантного и/или гетерологичного промотора и/или энхансера, который в природных условиях в норме не ассоциирован с кодирующей последовательностью нуклеиновой кислоты. Такие промоторы или энхансеры могут включать промоторы или энхансеры, которые в природе функционально связаны с другими генами у видов, у которых получена нуклеиновая кислота, и промоторы или энхансеры, выделенные у других видов, например, из клеток других прокариот или эукариот, и промоторы или энхансеры, которые не являются "природными", т.е. которые по сравнению с тем, что находится в любом из промоторов или энхансеров в природе содержат отличающиеся элементы разных областей регуляции транскрипции и/или мутации, которые изменяют экспрессию. Например, иллюстративные промоторы, используемые в конструкциях рекомбинантных ДНК в качестве неограничивающих примеров включают промоторы β-лактамазы (пенициллиназы), лактозы, триптофана (trp), РНК-полимеразы (pol) III, включая, промоторы U6 pol III человек и мыши, а также промоторы H1 РНК pol III человека и мыши; промоторы РНК-полимеразы (pol) II; предранний промотор цитомегаловируса (pCMV), фактор элонгации-1 альфа (EF-1 альфа) и системы промоторов длинного концевого повтора вируса саркомы Рауса (pRSV). В дополнение к получению последовательностей нуклеиновых кислот промоторов и энхансеров синтетическим способом, последовательности можно получать с использованием рекомбинантного клонирования и/или технологии амплификации нуклеиновых кислот, включая ПЦР™, с использованием композиций и способов, описываемых в настоящем документе (см. патенты США №№ 4683202 и 5928906, каждый из которых включен в настоящий документ в качестве ссылки). Кроме того, в определенных вариантах осуществления также можно использовать контрольные последовательности, которые контролируют транскрипцию и/или экспрессию последовательностей в безъядерных органеллах, таких как митохондрии, хлоропласты и т.п. Контрольные последовательности, содержащие промоторы, энхансеры и другие контролирующие/модулирующие локусы или транскрипцию элементы также обозначают как "транскрипционные кассеты".
[0163] В определенных вариантах осуществления промотор и/или энхансер функционально связывают для эффективного контроля экспрессии участка ДНК в органелле, типе клеток, ткани, органе или организме, выбранном для экспрессии. Как правило, специалистам в данной области молекулярной биологии известно использование комбинаций промоторов, энхансеров и типов клеток для экспрессии белка (см., например, Sambrook et al., 1989, включенное в настоящий документ в качестве ссылки). Применяемые промоторы могут быть конститутивными, тканеспецифическими, индуцибельными и/или применимыми в подходящих условиях, обеспечивая высокий уровень экспрессии внесенного участка ДНК, так, как подходит для генотерапии или для таких применений, как крупномасштабное производство рекомбинантных белков и/или пептидов. Промотор может быть гетерологичным или эндогенным.
[0164] В определенных вариантах осуществления можно использовать цитоплазматические экспрессирующие системы T3, T7 или SP6. Эукариотические клетки могут поддерживать цитоплазматическую транскрипцию с определенных бактериальных промоторов, если предоставить подходящую бактериальную полимеразу, в качестве комплекса доставки или в качестве дополнительной генетической экспрессирующей конструкции.
[0165] В определенных вариантах осуществления можно использовать индуцибельный промотор. Как используют в настоящем документе, "индуцибельный промотор" относится к контролирующему транскрипцию элементу, который можно регулировать в ответ на специфические сигналы. Индуцибельный промотор является транскрипционно активным при связывании с активатором транскрипции, который в свою очередь активируется при определенном наборе условий, например, в присутствии конкретной комбинации химических сигналов, которые влияют на связывание активатора транскрипции с индуцибельным промотором и/или влияют на саму функцию активатора транскрипции. Таким образом, индуцибельный промотор представляет собой промотор, который в отсутствие индуктора не обеспечивает экспрессию или обеспечивает низкие уровни экспрессии последовательности нуклеиновой кислоты, с которой функционально связан индуцибельный промотор; или обеспечивает низкий уровень экспрессии в присутствии регулирующего фактора, который при удалении обеспечивает высокий уровень экспрессии с промотора, например, систему tet. В присутствии индуктора индуцибельный промотор обеспечивает повышенный уровень транскрипции.
Escherichia coli
[0166] В определенных вариантах осуществления модифицировать для применения в системах млекопитающих и использовать в качестве регулируемого элемента для экспрессирующих кассет можно регулируемую тетрациклином (tet) систему, которая основана на ингибирующем действии репрессора tet (tetr)  на последовательность оператора tet (TECO). Эти системы хорошо известны специалистам в данной области. (См., Goshen and Badgered, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5547-51 (1992), Shockett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6522-26 (1996), Lindemann et al., Mol. Med. 3:466-76 (1997)).
b. Другие регуляторные элементы
[0167] В определенных вариантах осуществления экспрессирующая кассета может дополнительно содержать энхансер, который функционально связан с нуклеиновой кислотой, кодирующей рекомбинантный белок, например, гетерологичный белок.
[0168] В определенных вариантах осуществления с экспрессирующими кассетами функционально связаны элементы внутренних участков связывания рибосом (IRES) с получением полигенных или полицистронных транскриптов. Элементы IRES могут обходить модель сканирования рибосомы в зависимой от 5'-метилированного кэпа трансляции и начинать трансляцию на внутренних участках (Pelletier and Sonenberg, 1988). Неограничивающие примеры элементов IRES в качестве неограничивающих примеров включают элементы IRES семейства пикорнавирусов (полиомиелит и энцефаломиокардит) (Pelletier and Sonenberg, 1988) или IRES транскриптов млекопитающих (Macejak and Sarnow, 1991). Элементы IRES можно лигировать с гетерологичными открытыми рамками считывания. Можно транскрибировать несколько открытых рамок считывания вместе, где каждая отделена IRES, получая полицистронный транскрипт. Благодаря элементу IRES каждая открытая рамка считывания доступна рибосомам для эффективной трансляции. Можно эффективно экспрессировать несколько генов с использованием одного промотора/энхансера, транскрибируя один транскрипт.
in vivo
[0169] В определенных вариантах осуществления векторы или конструкции содержат по меньшей мере один сигнал терминации, функционально связанный с нуклеиновой кислотой, кодирующей рекомбинантный белок, такой как гетерологичный белок. "Сигнал терминации" или "терминатор" состоит из последовательности ДНК, участвующей в специфической терминации транскрипта РНК РНК-полимеразой. Таким образом, в определенных вариантах осуществления предусмотрен сигнал терминации, который заканчивает образование транскрипта РНК. В определенных вариантах осуществления терминатор можно использовать  с обеспечением желаемых уровней транскриптов.
[0170] В определенных вариантах осуществления, включающих эукариотические системы, область терминатора также может содержать специфические последовательности ДНК, которые обеспечивают сайт-специфическое расщепление нового транскрипта, экспонируя участок полиаденилирования. Это дает специализированной эндогенной полимеразе сигнал добавить на 3'-конец транскрипта участок приблизительно 200 остатков A (полиA). Молекулы РНК, модифицированные этим полиA-хвостом являются более стабильными и транслируются более эффективно. Таким образом, в определенных вариантах осуществления, включающих эукариот, терминатор содержит сигнал расщепления РНК. В определенных вариантах осуществления терминирующих сигнал обеспечивает полиаденилирование транскрипта. Элементы терминатора и/или участка полиаденилирования могут служить для повышения уровней транскриптов и минимизации сквозного прохождения из кассеты в другие последовательности.
[0171] Терминаторы включают любой известный терминатор транскрипции, описываемый в настоящем документе или известный специалисту в данной области, включая в качестве неограничивающих примеров, например, последовательности терминации генов, такие как, например, терминатор бычьего гормона роста, или последовательности терминации вирусов, такие как, например, терминатор SV40. В определенных вариантах осуществления сигнал терминации может представлять собой отсутствие транскрибируемой или транслируемой последовательности, например, вследствие укорочения последовательности.
[0172] В определенных вариантах осуществления включающих экспрессия эукариотических генов, экспрессирующая кассета для осуществления надлежащего полиаденилирования транскрипта может быть функционально связана с сигналом полиаденилирования. Можно применять любую такую последовательность. Некоторые примеры включают сигнал полиаденилирования SV40 или сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста, удобные и известные как хорошо функционирующие в различных клетках-мишенях. Полиаденилирование может увеличивать стабильность транскрипта или может облегчать цитоплазматический транспорт.
[0173] В определенных вариантах осуществления экспрессирующая кассета или вектор содержат один или несколько участков начала репликации (часто обозначаемых "ori") для размножения в клетке-хозяине. Участок начала репликации представляет собой специфическую последовательность нуклеиновой кислоты, в которой происходит инициация репликации. Альтернативно, если клетка-хозяин представляет собой дрожжи, можно использовать автономно реплицирующуюся последовательность (ARS).
2. Вирусные векторы
[0174] В определенных вариантах осуществления модифицированные PRE, нуклеиновые кислоты и/или кассеты предоставлены в вирусных векторах. Нуклеиновую кислоту в векторе можно предоставлять в виде экспрессирующей кассеты под контролем промотора. Вирусные векторы можно использовать для переноса молекулы нуклеиновой кислоты в клетки для экспрессии в ней гетерологичного или рекомбинантного белка.
[0175] Иллюстративные вирусные векторы включают ретровирусные векторы, такие как лентивирусные или гамма-ретровирусные векторы, векторы, получаемые из вируса обезьян 40 (SV40), аденовирусы и аденоассоциированный вирус (AAV). В определенных вариантах осуществления рекомбинантные нуклеиновые кислоты переносят в клетки с использованием ретровирусных векторов, таких как лентивирусные векторы или гамма-ретровирусные векторы (см., например, Koste et al. (2014) Gene Therapy 2014 Apr 3. doi: 10.1038/gt.2014.25; Carlens et al. (2000) Exp Hematol 28(10): 1137-46; Alonso-Camino et al. (2013) Mol Ther Nucl Acids 2, e93; Park et al., Trends Biotechnol. 2011 November 29(11): 550-557. Ретровирусы пригодны в качестве доставляющих векторов вследствие их способности интегрировать свои гены в геном хозяина, переносить большое количество чужеродного генетического материала, инфицировать широкий спектр видов и типов клеток и способности к упаковке в специализированных линиях клеток (Miller, 1992).
[0176] В определенных вариантах осуществления генетический перенос проводят посредством лентивирусных векторов. Лентивирусы в отличие от других ретровирусов в определенных случаях можно использовать для трансдукции определенных неделящихся клеток.
[0177] Неограничивающие примеры лентивирусных векторов включают векторы, получаемые из такого лентивируса, как вирус иммунодефицита человека 1 (ВИЧ-1), ВИЧ-2, вирус иммунодефицита обезьян (SIV), T-лимфотропный вирус человека 1 (HTLV-1), HTLV-2 или вирус инфекционной анемии у лошадей (EIAV). Например, лентивирусные векторы получали посредством множественной аттенуации генов вирулентности ВИЧ, например, производя делецию генов env, vif, vpr, vpu и nef, делая вектор более безопасным для терапевтических целей. Лентивирусные векторы известны в данной области, см. Naldini et al., (1996 и 1998); Zufferey et al., (1997); Dull et al., 1998, патенты США №№ 6013516 и 5994136). В определенных вариантах осуществления эти вирусные векторы основаны на плазмидах или на вирусах и сконфигурированы для транспортировки необходимых последовательностей для встраивания чужеродной нуклеиновой кислоты, для отбора и для переноса нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина. Известные лентивирусы можно легко получать из депозитариев и коллекций, таких как the American Type Culture Collection ("ATCC"; 10801 University Blvd., Manassas, Va. 20110-2209) или выделять из известных источников общедоступными способами.
[0178] В определенных вариантах осуществления в получении системы доставки генов на основе вируса участвуют два компонента: первый, пакующие плазмиды, содержащие структурные белки, а также ферменты, необходимые для получения частиц вирусного вектора, и второй, сам вирусный вектор, т.е. генетический материал для переноса. В конструкцию одного или обоих этих компонентов можно вводить средства обеспечения биологической безопасности. В определенных вариантах осуществления пакующая плазмида может содержать все белки ВИЧ-1, отличные от белков оболочки (Naldini et al., 1998). В определенных вариантах осуществления в вирусных векторах могут отсутствовать дополнительные вирусные гены, такие как гены, которые ассоциированы с вирулентностью, например, vpr, vif, vpu и nef и/или Tat, первичным трансактиватором ВИЧ. В определенных вариантах осуществления пакующие системы для лентивирусных векторов, таких как лентивирусные векторы на основе ВИЧ, включают отдельные пакующие плазмиды, которые вместе содержат только три гена исходного вируса: gag, pol и rev, что снижает или устраняет возможность восстановления вируса дикого типа посредством рекомбинации.
in vitro
in vivo
[0179] В определенных случаях предоставляемых вирусных векторов гетерологичная нуклеиновая кислота, кодирующая рекомбинантный белок, такая как предоставлена в виде части экспрессирующей кассеты, содержащей трансген под контролем промотора, содержится и/или расположена между последовательностями 5'-LTR и 3'-LTR генома вектора, включая LTR дикого типа или их части или химерные части. В определенных вариантах осуществления в вирусном векторе, таком как вирусный вектор ВИЧ, отсутствуют дополнительные транскрипционные единицы. В определенных вариантах осуществления геном вектора может нести делецию в области U3 3'-LTR ДНК, используемой для получения РНК-содержащего вирусного вектора, что может приводить к получению самоинактивирующегося (SIN) вектора. Затем эту делецию при обратной транскрипции можно переносить в 5'-LTR провирусной ДНК. В определенных вариантах осуществления 3'-LTR удалена для промотора и энхансера U3. В определенных вариантах осуществлениям для устранения транскрипционной активности LTR можно удалять достаточную часть последовательности, включая удаление TATA-бокса. Это может предотвратить продукцию полноразмерного РНК-содержащего вектора в трансдуцированных клетках. Таким образом, определенные варианты осуществления включают делецию в области U3 3'-LTR ДНК. В определенных вариантах осуществления это не влияет на титры вектора или свойства вектора  или .
[0180] В определенных вариантах осуществления геном вирусного вектора также может содержать дополнительные генетические элементы. Типы элементов, которые могут содержаться в конструкциях, никаким образом не ограничены, и их можно выбирать специалист в данной области. В определенных вариантах осуществления геном вектора содержит последовательности, получаемые из вирусного генома (например, лентивирусного генома), которые представляют собой некодирующие области генома, которые стимулируют или обеспечивают сигналы распознавания для синтеза и процессинга ДНК или РНК. В определенных вариантах осуществления такие последовательности могут включать цис-действующие последовательности, которые могут участвовать в упаковке или инкапсуляции, обратной транскрипции и транскрипции и/или в переносе генов или интеграции. В определенных вариантах осуществления цис-активирующие последовательности, предоставленные в качестве части вирусного вектора, получают из того же лентивируса или подобного ретровирусу организма.
[0181] В определенных вариантах осуществления можно включать сигнал, который способствует вхождению вирусного генома в ядро клетки-мишени. Примером такого сигнала является последовательность Flap (также называемая последовательность ДНК Flap), формируемая из компонентов cPPT и CTS, которые представляют собой часть гена pol генома вирусного вектора, такого как геном лентивирусного вектора. В определенных вариантах осуществления последовательность Flap содержит часть нуклеиновой кислоты вируса, которая содержит области cPPT и/или CTS, но в которой удалены 5'- и 3'-части гена pol, которые не являются необходимыми для функции Flap. В некоторых случаях вирусный вектор не содержит функциональной области Flap. Как описано ниже, в определенных вариантах осуществления вирусный вектор содержит нуклеиновую кислоту вируса, содержащую вариант Flap, в котором отсутствуют все или части одной или обеих областей cPPT и CTS.
[0182] В определенных вариантах осуществления геном лентивирусного вектора может содержать элементы, выбираемые из участка донора сплайсинга (SD), участок акцептора сплайсинга (SA) и/или отвечающего на Rev элемента (RRE). В определенных вариантах осуществления RRE предоставлен для обеспечения экспорта вирусной информационной РНК из ядра в цитозоль после связывания белка Rev, предоставляемого как часть плазмиды-помощника при упаковке вируса. В определенных вариантах осуществления геном вектора может содержать сигнал упаковки пси (ψ), который в некоторых случаях можно получать из N-концевого фрагмента ORF gag. В определенных вариантах осуществления сигнальную последовательность упаковки пси можно модифицировать посредством мутации(й) сдвига рамки для предотвращения любой интерференции возможной транскрипции/трансляции пептида gag с транскрипцией/трансляцией трансгена.
[0183] В определенных вариантах осуществления предоставлен вирусный вектор, такой как лентивирусный вектор, который содержит рекомбинантный геном, содержащий между последовательностями 5'- и 3'-LTR генома вектора по порядку: RRE; полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту вируса, содержащий функциональную ДНК Flap, содержащую cPPT и CTS, которые встроены выше промотора, контролирующего экспрессию полинуклеотида, кодирующего рекомбинантный белок; трансген, содержащий промотор, контролирующий экспрессию полинуклеотида, кодирующего рекомбинантный белок, такой как любой рекомбинантный белок, описанный выше, и полинуклеотид, кодирующий рекомбинантный белок, такой как антигенраспознающий рецептор (например, CAR); и полинуклеотид, содержащий модифицированный PRE, такой как любой PRE, предоставляемый по настоящему документу, функционально связанный с нуклеиновой кислотой, кодирующей рекомбинантный белок, такой как любой рекомбинантный белок, предоставляемый по настоящему документу. В определенных вариантах осуществления рекомбинантный геном содержит последовательность 5'-LTR-RRE-cPPT-CTS-трансген(ы)-модифицированный PRE-3'-LTR. В определенных вариантах осуществления модифицированный PRE представляет собой вирусный вектор, такой как лентивирусный вектор, содержащий последовательность нуклеотидов, приведенную в любой из SEQ ID NO: 29-43, 59-73, 89-118, 126-140, 156-170 или 186-215. В определенных вариантах осуществления модифицированный PRE представляет собой или содержит последовательность нуклеотидов, приведенную в SEQ ID NO:29 или SEQ ID NO:126. В определенных вариантах осуществления cPPT и CTS встроены в качестве фрагмента последовательности вирусной нуклеиновой кислоты, содержащей немодифицированную ДНК Flap или ДНК Flap дикого типа, например, которая представляет собой или содержит иллюстративную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:121, или ее функциональный фрагмент, который содержит последовательности cPPT и CTS. В определенных вариантах осуществления лентивирусный вектор представляет собой получаемый из ВИЧ-1 лентивирусный вектор.
[0184] В определенных вариантах осуществления в числе предоставляемых полинуклеотидов, включающих вирусные векторы, находятся полинуклеотиды, содержащие вариации вирусных последовательностей Flap (обозначаемых полинуклеотиды или последовательности "вариантов Flap"). Такие полинуклеотиды включают полинуклеотиды, содержащие в вирусной последовательности Flap в полинуклеотиде одну или несколько модификаций, например, делецию(и). Вариации могут включать полную делецию последовательности Flap в вирусной последовательности полинуклеотида или ее подчасти. Такие полинуклеотиды включают вирусные векторы, такие как лентивирусный вектор, содержащие такие варианты последовательностей Flap.
[0185] Как правило, последовательность вирусного Flap представляет собой вирусную регуляторную область, содержащую полинуклеотидную последовательность, содержащую два компонента: центральный полипуриновый тракт (cPPT) и центральную последовательность терминации (CTS). См., например, Iglesias et al., Retrovirology 2011, 8:92. Неограничивающая иллюстративная последовательность cPPT предоставлена в SEQ ID NO:123. Неограничивающая, иллюстративная последовательность CTS предоставлена в SEQ ID NO:124. В иллюстративном ВИЧ-1 дикого типа cPPT и CTS могут быть функционально связаны посредством приблизительно 70-100 нуклеотидов. Опубликовано, что cPPT и CTS располагаются в центре или приблизительно в центре генома лентивирусного вектора так, что после обратной транскрипции ДНК, кодируемая последовательностями cPPT и CTS, формирует в центре генома перекрывающийся фрагмент размером приблизительно 100 нуклеотидов или "флэп ДНК". При вставке в вирусные векторы, такие как полученные из лентивирусов векторы, полинуклеотид, обеспечивающий продукцию флэпа ДНК при ретротранскрипции, повышает эффективность переноса генов и дополняет уровень импорта в ядро до уровней дикого типа.
[0186] В определенных вариантах осуществления полинуклеотид варианта Flap содержит делеции всех или части нуклеотидов в CTS, cPPT или и CTS, и cPPT относительно последовательности Flap дикого типа или немодифицированной последовательности Flap. В определенных вариантах осуществления последовательность Flap дикого типа или немодифицированная последовательность Flap представляет собой последовательность вирусной нуклеиновой кислоты, содержащая cPPT и CTS, которые получены из ретровируса, такого как лентивирус, или из подобного ретровирусу организма, такого как ретротранспозон. В определенных вариантах осуществления последовательность Flap дикого типа или немодифицированного Flap получают из ретровируса или лентивируса человека, такого как ретровирус ВИЧ (например, ВИЧ-1 или ВИЧ-2). В определенных вариантах осуществления последовательность ДНК Flap дикого типа или немодифицированной ДНК Flap получают из вируса CAEV (лентивируса артроэнцефалита коз), вируса EIAV (вируса инфекционной анемии лошадей), вируса висна, вируса SIV (вируса иммунодефицита обезьян) или вируса FIV (вируса иммунодефицита кошек). В определенных вариантах осуществления последовательность вирусной нуклеиновой кислоты, содержащая Flap дикого типа или немодифицированный Flap, может содержать дополнительную фланкирующую последовательность, присутствующую в вирусном геноме. В определенных вариантах осуществления полинуклеотид, содержащий Flap дикого типа или немодифицированный Flap, может содержать последовательность длиной приблизительно от 80 до приблизительно 200 нуклеотидов в зависимости от ее происхождения и получения. В определенных вариантах осуществления последовательность Flap дикого типа или последовательность немодифицированного Flap можно получать синтетически (химический синтез) или посредством амплификации полинуклеотидов, содержащих Flap из любого ретровируса, например, из нуклеиновой кислоты лентивируса, например, посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР).
[0187] В определенных вариантах осуществления последовательность Flap дикого типа или последовательность немодифицированного Flap можно получать из полинуклеотидной последовательности, присутствующей в ВИЧ-1, например, соответствующей фрагменту из 178 пар оснований от положения 4757 до положения 4935 или фрагменту из 179 пар оснований от положения 4746 до положения 4935 иллюстративного вектора ВИЧ-1 pNL4-3 (номер GenBank AF324493), или из более короткой или длинной последовательности, присутствующей в нем, содержащей cPPT и CTS, с которой можно получать Flap при обратной транскрипции. В определенных вариантах осуществления иллюстративная полинуклеотидная последовательность, содержащая Flap дикого типа или немодифицированный Flap, представляет собой или содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO:121, последовательность, которая по меньшей мере на 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична с последовательностью SEQ ID NO:121 или ее функциональный фрагмент, содержащий cPPT и CTS, для получения структуры Flap после обратной транскрипции. В определенных вариантах осуществления cPPT представляет собой или содержит последовательность, соответствующую нуклеотидам 30-45 SEQ ID NO:121 (приведенную в SEQ ID NO:123), а CTS представляет собой или содержит последовательность, соответствующую нуклеотидам 117-143 SEQ ID NO:121 (приведенную в SEQ ID NO:124).
[0188] В определенных вариантах осуществления предоставляемых полинуклеотидов или вирусных векторов, содержащих вариант, например, с удалением в последовательности Flap, вариант последовательности Flap может представлять собой последовательность, в которой вся или часть области Flap нуклеиновой кислоты(кислот) вируса в векторе удалена и/или подвергнута мутированию, включая целые или части cPPT и/или CTS. В определенных вариантах осуществления вариант последовательности Flap включает вирусные последовательности с полностью отсутствующей или по существу полностью отсутствующей последовательностью Flap или ее частью. В определенных вариантах осуществления вариант Flap несет делецию(и) в cPPT, CTS или и в cPPT, и в CTS. В определенных вариантах осуществления вариант Flap, по сравнению с последовательностью cPPT дикого типа или последовательностью немодифицированного cPPT, например, по сравнению с иллюстративным немодифицированным cPPT, приведенным в SEQ ID NO:123, может содержать cPPT по меньшей мере с 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 делециями нуклеотидов, которые могут представлять собой делеции последовательных нуклеотидов. В определенных вариантах осуществления cPPT может быть удален полностью. В определенных вариантах осуществления вариант ДНК Flap по сравнению с последовательностью CTS дикого типа или последовательностью немодифицированного CTS, например, по сравнению с иллюстративным немодифицированным CTS, приведенным в SEQ ID NO:124, может содержать CTS по меньшей мере с 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 или 27 делециями нуклеотидов, которые могут представлять собой делеции последовательных нуклеотидов. В определенных вариантах осуществления CTS может быть удален полностью.
[0189] В определенных вариантах осуществления полинуклеотид варианта Flap несет делецию всего или непрерывной части cPPT и содержит CTS дикого типа. В определенных вариантах осуществления полинуклеотид варианта Flap содержит cPPT дикого типа и несет делецию всего или непрерывной части CTS.
[0190] В определенных вариантах осуществления вариант Flap несет делецию всего или части cPPT и несет делецию всего или части CTS. В определенных вариантах осуществления вариант ДНК Flap, по сравнению с cPPT дикого типа или немодифицированным cPPT, например, по сравнению с иллюстративным немодифицированным cPPT, приведенным в SEQ ID NO:123, может содержать cPPT по меньшей мере с 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 делециями нуклеотидов, которые могут представлять собой делеции последовательных нуклеотидов, или может содержать полностью удаленный cPPT, и, по сравнению с CTS дикого типа или немодифицированным CTS, например, по сравнению с иллюстративным немодифицированным CTS SEQ ID NO:124, может содержать CTS по меньшей мере с 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 или 27 делециями нуклеотидов, которые могут представлять собой делеции последовательных нуклеотидов, или может содержать полностью удаленный CTS.
[0191] В определенных вариантах осуществления полинуклеотид, содержащий вариант последовательность Flap представляет собой или содержит последовательность нуклеотидов, которая по меньшей мере на 65%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 78%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 90% или 95% идентична с последовательностью SEQ ID NO:121, но в которой отсутствует весь или часть cPPT и/или CTS, присутствующих в SEQ ID NO:121. В определенных вариантах осуществления полинуклеотид, содержащий вариант последовательность или полинуклеотид Flap, представляет собой или содержит часть с последовательностью нуклеотидов по меньшей мере или приблизительно по меньшей мере на 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% или более идентичной с последовательностью SEQ ID NO:122, в которой часть или весь cPPT и/или CTS удален. Неограничивающий, иллюстративный полинуклеотид варианта Flap предоставлен в виде SEQ ID NO:122.
[0192] В определенных вариантах осуществления делецию всех или части нуклеотидов в CTS и/или cPPT в предоставленном варианте Flap проводят в полинуклеотидной последовательности, содержащей немодифицированный Flap или Flap дикого типа, посредством технологии рекомбинантных ДНК. В определенных вариантах осуществления полинуклеотид варианта Flap получают синтетически, например, посредством химического синтеза.
[0193] В определенных вариантах осуществления полинуклеотид, например, вирусный вектор, содержит вариант последовательности Flap и PRE. В определенных вариантах осуществления PRE может представлять собой модифицированный PRE, такой как любой из описанных выше. Таким образом, в определенных вариантах осуществления полинуклеотиды содержат последовательности нуклеотидов, содержащие полинуклеотиды вариантов Flap, и содержащие полинуклеотиды модифицированных PRE. В определенных вариантах осуществления такой полинуклеотид и/или вирусный вектор содержит последовательность SEQ ID NO:122 или последовательность, по меньшей мере или приблизительно на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичную с SEQ ID NO:122, в которой все или части cPPT и CTS удалены, и последовательность модифицированного PRE, приведенную в SEQ ID NO:29 или SEQ ID NO:126, или последовательность, по меньшей мере или приблизительно на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичную с SEQ ID NO:29 или SEQ ID NO:126, содержащую внесенные модификации со стоп-кодонами.
[0194] В определенных вариантах осуществления предоставлен вирусный вектор, такой как лентивирусный вектор, который содержит рекомбинантный геном, содержащий между последовательности 5'- и 3'-LTR генома вектора по порядку: RRE; полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту вируса, содержащий вариант ДНК Flap, содержащий делецию всех или частей cPPT и CTS, где этот вариант ДНК Flap встроены выше промотора, контролирующего экспрессию полинуклеотида, кодирующего рекомбинантный белок; трансген, содержащий промотор, контролирующий экспрессию полинуклеотида, кодирующего рекомбинантный белок, такой как любой белок, описанный выше, и полинуклеотид, кодирующий рекомбинантный белок, такой как антигенраспознающий рецептор (например, CAR); и полинуклеотид, содержащий модифицированный PRE, такой как любой PRE, предоставляемый по настоящему документу, функционально связанный с нуклеиновой кислотой, кодирующей рекомбинантный белок, такой как любой белок, предоставляемый по настоящему документу. В определенных вариантах осуществления рекомбинантный геном содержит последовательность 5'-LTR-RRE-вариант ДНК Flap-трансген(ы)-модифицированный PRE-3'-LTR. В определенных вариантах осуществления модифицированный PRE в вирусном векторе, таком как лентивирусный вектор, содержит последовательность нуклеотидов, приведенную в любой из SEQ ID NO: 29-43, 59-73, 89-118, 126-140, 156-170 или 186-215. В определенных вариантах осуществления модифицированный PRE представляет собой или содержит последовательность нуклеотидов, приведенную в SEQ ID NO:29 или SEQ ID NO:126. В определенных вариантах осуществления полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту вируса, содержащую вариант ДНК Flap, представляет собой или содержит последовательность нуклеотидов, приведенную в SEQ ID NO:122. В определенных вариантах осуществления лентивирусный вектор представляет собой получаемый из ВИЧ-1 лентивирусный вектор.
[0195] В определенных вариантах осуществления полинуклеотид, такой как вирусный вектор, содержащий вариант ДНК Flap, как предоставлено, и/или модифицированный PRE, как предоставлено, можно использовать для переноса содержащейся в нем молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей рекомбинантный или гетерологичный белок, в клетки для трансдукции и экспрессии этого белка. В определенных вариантах осуществления, при том, что все еще происходит успешная трансдукция клеток, такая трансдукция предоставляемыми вирусными векторами в некоторых случаях может представлять собой трансдукцию, меньшую, например, до или приблизительно до 1,1 раза, 1,2 раза, 1,5 раза, 2,0 раз, 3,0 раз, 4,0 раз или еще менее, или снижение трансдукции по сравнению с трансдукцией с использованием такого же или по существу сходного количество и концентрации соответствующего вирусного вектора, содержащего по существу такой же геном, но содержащего немодифицированную последовательность ДНК Flap или последовательность ДНК Flap дикого типа, в которой присутствует cPPT и CTS для формирования структуры ДНК Flap. В некоторых случаях, когда желательна более высокая эффективность трансдукции, эффективность трансдукции можно повышать, увеличивая объем или концентрацию вирусного вектора, используемые для трансдукции клеток. В других случаях можно проводить обогащение или увеличивать количество трансдуцированных клеток посредством сортировки клеток и наращивания трансдуцированных клеток.
[0196] В определенных вариантах осуществления вектор также может содержать последовательности для размножения в клетке-хозяине, такой как прокариотическая клетка-хозяин. В определенных вариантах осуществления нуклеиновая кислота вирусного вектора содержит один или несколько участков начала репликации для размножения в прокариотической клетке, такой как бактериальная клетка. В определенных вариантах осуществления векторы, которые содержат прокариотический участок начала репликации, также могут содержать ген, экспрессия которого обеспечивает детектируемый или селектируемый маркер, такой как устойчивость к лекарственному средству.
3. Получение частиц вирусных векторов
[0197] В определенных вариантах осуществления нуклеиновая кислота, например, нуклеиновая кислота, кодирующая желаемую последовательность, такая как полинуклеотид или экспрессирующая кассета, встроена в вирусный геном вместо определенных вирусных последовательностей с получением вируса, который является дефектным по репликации. Для получения вирионов можно конструировать линию упаковывающих клеток, содержащих гены gag, pol и env, но не содержащих LTR и компоненты упаковки. Также можно использовать рекомбинантную плазмиду, содержащую полинуклеотид, такой как экспрессирующая кассета, содержащая нуклеиновую кислоту, кодирующую рекомбинантный белок под функциональным контролем модифицированного PRE. Когда рекомбинантную плазмиду вместе с ретровирусными LTR и пакующими последовательностями вносят в специальную линию клеток (например, посредством осаждения с фосфатом кальция), пакующая последовательность может обеспечивать получение транскрипта РНК рекомбинантной плазмиды с упаковкой в вирусные частицы, которые затем могут секретироваться в среды для культивирования. Затем, в определенных вариантах осуществления, среды, содержащие рекомбинантные ретровирусы, собирают, необязательно концентрируют и используют для переноса генов.
[0198] В определенных вариантах осуществления линию упаковывающих клеток трансфицируют одним или несколькими плазмидными векторами, содержащими компоненты, необходимые для получения частиц. Линия упаковывающих клеток может экспрессировать или можно сделать так, чтобы она экспрессировала необходимые лентивирусные (например, ВИЧ-1) гены, обеспечивающие получение лентивирусных частиц. Эти гены можно экспрессировать посредством нескольких плазмид. В определенных вариантах осуществления для разделения различных генетических компонентов, которые позволяют получать частицы ретровирусных векторов, используют несколько векторов. В таких определенных вариантах осуществления предоставление для упаковывающей клетки раздельных векторов снижает шанс событий рекомбинации, которые в ином случае могут приводить к получению компетентных по репликации вирусов.
[0199] В определенных вариантах осуществления линию упаковывающих клеток можно трансфицировать лентивирусной экспрессирующей плазмидой, содержащей цис-действующую последовательность упаковки пси (ψ) и трансген, встроенный между лентивирусными LTR, что обеспечивает интеграцию в клетку-мишень; пакующей плазмидой или плазмидами, кодирующими вирусные гены pol, gag, rev и/или tat и, в некоторых случаях, содержащий отвечающий на rev элемент (RRE) и псевдотипирующую плазмиду, такую как плазмида, кодирующая белок оболочки, такой как белок G гена оболочки вируса везикулярного стоматита (VSV-G).
gag
pol
rev,
env
[0200] В определенных вариантах осуществления линию упаковывающих клеток трансфицируют плазмидой, содержащей геном вирусного вектора, содержащий LTR, цис-действующую последовательность упаковки и представляющую интерес последовательность, т.е. нуклеиновую кислоту, кодирующую рекомбинантный белок, (например, антигенраспознающий рецептор, такой как CAR), вместе с несколькими хелперными плазмидами, кодирующими ферментативные и/или структурные компоненты вируса, такие как Env, Gag, pol и/или rev. В определенных вариантах осуществления в линию упаковывающих клеток раздельно вводят пакующую плазмиду GagPol, содержащую гены  и , кодирующую структурные и ферментативные компоненты, и плазмиду Rev, содержащую ген кодирующую регуляторный белок Rev. В определенных вариантах осуществления можно использовать один плазмидный вектор, содержащий все ретровирусные компоненты. В определенных вариантах осуществления можно вводить плазмиду с компонентами оболочки, также кодирующую гена , который в некоторых случаях может приводить к получению вирусных частиц, псевдотипированных альтернативными белками Env. В определенных вариантах осуществления частица ретровирусного вектора, такая как частица лентивирусного вектора, является псевдотипированной для увеличения эффективности трансдукции клеток-хозяев. Например, частица ретровирусного вектора, такая как частица лентивирусного вектора, псевдотипирована гликопротеином VSV-G, который обеспечивает широкий диапазон клеток-хозяев, расширяя диапазон типов клеток, которые можно трансдуцировать.
[0201] Ген env можно получать из любого подходящего вируса, такого как ретровирус. В определенных вариантах осуществления env представляет собой амфотропный белок оболочки, который обеспечивает трансдукцию клеток человека и других видов. В определенных вариантах осуществления используют гены env, полученные из ретровирусов, включая в качестве неограничивающих примеров: вирус лейкоза мышей Молони (MoMuLV или MMLV), вирус саркомы мышей Харви (HaMuSV или HSV), вирус опухоли молочной железы мыши (MuMTV или MMTV), вирус лейкоза гиббонов (GaLV или GALV), вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) и вирус саркомы Рауса (RSV). В определенных вариантах осуществления можно использовать другие гены env, такие как белок G вируса везикулярного стоматита (VSV) (VSVG), белки G вирусов гепатита, а также гриппа.
[0202] В определенных вариантах осуществления пакующая плазмида, предоставляющая последовательность вирусной нуклеиновой кислоты env ассоциирована, функционально связана с регуляторными последовательностями, например, промотором или энхансером. В определенных вариантах осуществления регуляторная последовательность может представлять собой любой эукариотический промотор или энхансер, например, включая EF1α, PGK, промоторный-энхансерный элемент вируса лейкоза мышей Молони, энхансер цитомегаловируса человека, промотор P7.5 вируса коровьей оспы или т.п. В некоторых случаях, например, в случае промоторного-энхансерного элемента вируса лейкоза мышей Молони, промоторные-энхансерные элементы расположены внутри или рядом с последовательностями LTR. В определенных вариантах осуществления регуляторная последовательность представляет собой последовательность, которая не является эндогенной для лентивируса, из которого конструируют вектор. Таким образом, если вектор получают из SIV, регуляторную последовательность SIV, находящуюся в LTR SIV, можно заменять регуляторным элементом, не происходящим из SIV.
[0203] В определенных вариантах осуществления вирусные векторы и пакующие плазмиды вводят в линию упаковывающих клеток посредством трансфекции или инфекции. Линия упаковывающих клеток продуцирует частицы вирусного вектора, которые содержат геном вирусного вектора. Способы трансфекции или инфекции хорошо известны. Неограничивающие примеры включают способы с фосфатом кальция, DEAE-декстраном и липофекции, электропорацию и микроинъекцию. После совместной трансфекции пакующих плазмид и вектора для переноса в линию упаковывающих клеток, из среды для культивирования выделяют частицы вирусного вектора и титруют стандартными способами, используемыми специалистами в данной области. Таким образом, в определенных вариантах осуществления пакующие плазмиды вводят в линии клеток человека этими способами, как правило, вместе с доминантным селектируемым маркером, таким как неомицин, DHFR, глутаминсинтетаза или ADA, с последующим отбором в присутствии соответствующего лекарственного средства и выделением клонов. Ген селективного маркера можно физически лигировать с генами для упаковки в конструкции.
Xenopus
Drosophila
S. cerevisiae
S. pombe
Pichia pastoris
E. coli
[0204] В определенных вариантах осуществления частицы вирусного вектора можно получать посредством стабильных линий клеток, где сконфигурирована экспрессия функций упаковки. Подходящие упаковывающие клетки известны, включая, например, патент США № 5686279 и Ory et al., (1996). Упаковывающие клетки со встроенным в них лентивирусным вектором формируют продуцирующие клетки. Таким образом, продуцирующие клетки представляют собой клетки или линии клеток, которые могут продуцировать или высвобождать частицы вирусного вектора, несущие представляющий интерес ген. В определенных вариантах осуществления эти клетки могут быть зависимыми от прикрепления, что означает, что эти клетки оптимально растут, выживают или поддерживают функцию при прикреплении к поверхности, такой как стекло или пластик. В определенных вариантах осуществления продуцирующие клетки могут представлять собой неопластически трансформированные клетки. В определенных вариантах осуществления клетки-хозяева для трансфекции лентивирусным вектором и пакующими плазмидами включают, например, первичные клетки млекопитающих; стабильные линии клеток млекопитающих, такие как клетки COS, CHO, HeLa, NIH3T3, 293T и PC12; клетки амфибий, такие как эмбрионы и ооциты ; клетки других позвоночных; клетки насекомых (например, ), клетки дрожжей (например, ,  или ) и клетки прокариот (например, ).
[0205] В определенных вариантах осуществления лентивирусные векторы можно получать в линии упаковывающих клеток, такой как иллюстративная линия клеток HEK 293T, посредством введения плазмид, обеспечивающих получение лентивирусных частиц. Приблизительно через двое суток после трансфекции клеток, например, клеток HEK 293T, клеточный супернатант содержит рекомбинантные лентивирусные векторы, которые можно использовать для трансдукции клеток-мишеней. После попадания в клетки-мишени вирусная РНК подвергается обратной транскрипции, импорту в ядро и стабильно интегрируется в геном хозяина. Через одни или двое суток после интеграции вирусной РНК можно детектировать экспрессию рекомбинантного белка.
D. Способы получения и способы конструирования клеток
[0206] Также предоставлены способы получения полинуклеотидов, содержащих модифицированные PRE, и/или кассет, векторов и/или сконструированных клеток, содержащих их. В определенных вариантах осуществления способы включают внесение модификации(й) в последовательность PRE дикого типа или немодифицированного PRE или другую исходную последовательность модифицированного PRE, такую как последовательность, для которой известно наличие определенной степени активности. В определенных вариантах осуществления такие модификации проводят посредством мутаций существующего вектора.
[0207] Способы дополнительно включают способы конструирования клеток посредством введения в клетки полинуклеотида, содержащего модифицированный PRE, как предоставлено в настоящем документе, функционально связанного с нуклеиновой кислотой, кодирующей рекомбинантную молекулу, такую как рекомбинантный белок, такой как гетерологичный белок, например, антигенраспознающий рецептор, такой как TCR или CAR, или другой химерный рецептор. Полинуклеотид можно вводить в клетки в частице вирусного вектора, содержащего в своем геноме предоставленный полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую рекомбинантную молекулу, такую как гетерологичный белок. Также предоставлены клетки, содержащие полинуклеотиды, кассеты и/или векторы с модифицированными PRE, и нуклеиновые кислоты и композиции, содержащие их и/или полученные предоставленными способами.
+
+
[0208] Как правило, клетки представляют собой эукариотические клетки, такие как клетки млекопитающих, и, как правило, представляют собой клетки человека. В определенных вариантах осуществления клетки получают из крови, костного мозга, лимфы или лимфоидных органов, они представляют собой клетки иммунной системы, такие как клетки врожденного или приобретенного иммунитета, например, миелоидные или лимфоидные клетки, включающие лимфоциты, как правило, T-клетки и/или NK клетки. Другие иллюстративные клетки включают стволовые клетки, такие как мультипотентные и плюрипотентные стволовые клетки, включая индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC). В определенных вариантах осуществления клетки представляют собой первичные клетки, такие как клетки, выделяемые непосредственно у индивидуума и/или выделяемые у индивидуума и замораживаемые. В определенных вариантах осуществления клетки включают один или несколько подклассов T-клеток или других типов клеток, такие как целые популяции T-клеток, CD4-клетки, CD8-клетки и их субпопуляции, такие как субпопуляции, определяемые функцией, состоянием активации, степенью зрелости, потенциалом к дифференцировке, способностями к размножению, рециркуляции, локализации и/или персистенции, антигенной специфичностью, типом антигенраспознающего рецептора, присутствием в конкретном органе или компартменте, профилем секреции маркеров или цитокинов и/или степенью дифференцировки. В отношении индивидуума, подлежащего лечению, клетки могут быть аллогенными и/или аутологичными. В число способов включены стандартные способы. В определенных аспектах, например, для стандартных технологий, клетки являются плюрипотентными и/или мультипотентными, такими как стволовые клетки, такие как индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs). В определенных вариантах осуществления способы включают выделение клеток у индивидуума, их подготовка, обработка, культивирование и/или конструирование и обратное их введение тому же индивидууму с предшествующей или последующей криоконсервацией.
+
+
N
SCM
CM
EM
H
H
H
H
H
H
[0209] В числе подтипов и субпопуляций T-клеток и/или CD4- и/или CD8-T-клеток находятся наивные T (T) клетки, эффекторные T-клетки (ТЭФФ), T-клетки памяти и их подтипы, такие как стволовые T-клетки памяти (T), центральные T-клетки памяти (T), эффекторные T-клетки памяти (T) или окончательно дифференцированные эффекторные T-клетки памяти, инфильтрирующие опухоль лимфоциты (TIL), незрелые T-клетки, зрелые T-клетки, хелперные T-клетки, цитотоксические T-клетки, ассоциированные со слизистыми инвариантные T-клетки (MAIT), природные и адаптивные регуляторные T-клетки (Treg), хелперные T-клетки, такие как T1 клетки, T2 клетки, T3 клетки, T17 клетки, T9 клетки, T22 клетки, фолликулярные хелперные T-клетки, альфа/бета-T-клетки и дельта/гамма-T-клетки.
[0210] В определенных вариантах осуществления клетки представляют собой естественные киллерные (NK) клетки. В определенных вариантах осуществления клетки представляют собой моноциты или гранулоциты, например, миелоидные клетки, макрофаги, нейтрофилы, дендритные клетки, тучные клетки, эозинофилы и/или базофилы.
[0211] Как правило, генетическая инженерия включает введение полинуклеотида(ов) в клетка, например, посредством ретровирусной трансдукции, трансфекции или трансформации, как описано выше.
[0212] В определенных вариантах осуществления перенос генов проводят сначала посредством стимуляции клеток, например, посредством комбинации их со стимулом, который индуцирует ответ, например, пролиферацию, жизнеспособность и/или активацию, например, измеряемые по экспрессии цитокина или маркера активации, с последующей трансдукцией активированных клеток и размножением их в культуре до количеств, достаточных для клинических применений.
in vivo
in vivo
[0213] В определенных случаях сверхэкспрессия стимулирующего фактора (например, лимфокина или цитокина) может являться токсичной для индивидуума. Таким образом, в определенных случаях конструированные клетки содержат генные сегменты, которые делают клетки чувствительными к отрицательному отбору , например, при введении при адоптивной иммунотерапии. Например, в определенных аспектах клетки конструируют так, что их можно удалять в результате изменения состояния индивидуума, которому их вводят, . Фенотип для отрицательного отбора может представлять собой результат вставки гена, который придает чувствительность к вводимому средству, например, соединению. Гены для отрицательного отбора включают ген тимидинкиназы вируса простого герпеса типа I (HSV-I TK) (Wigler et al., Cell II:223, I977), который придает чувствительность к ганцикловиру; ген клеточной гипоксантинфосфорибозилтрансферазы (HPRT), ген клеточной аденинфосфорибозилтрансферазы (APRT), ген бактериальной цитозиндезаминазы (Mullen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:33 (1992)).
[0214] В определенных аспектах клетки дополнительно конструируют для обеспечения экспрессии цитокинов или других факторов. Хорошо известны и с помощью предоставляемых способов и композиций можно использовать различные способы введения генетически сконструированных компонентов, например, антигенраспознающих рецепторов, например, CAR.
[0215] В определенных вариантах осуществления рекомбинантные нуклеинов кислоты переносят в T-клетки посредством электропорации (см., например, Chicaybam et al., (2013) PLoS One 8(3): e60298 и Van Tedeloo et al. (2000) Gene Therapy 7(16): 1431-1437). В определенных вариантах осуществления рекомбинантные нуклеиновые кислоты переносят в T-клетки посредством транспозиции (см., например, Manuri et al. (2010) Hum Gene Ther 21(4): 427-437; Sharma et al. (2013) Molec. Ther. Nucl. Acids 2, e74; и Huang et al. (2009) Methods Mol. Biol. 506: 115-126). Другие способы введения и экспрессии генетического материала в клетки иммунной системы включают трансфекцию с фосфатом кальция (например, как описано в Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York. N.Y.), слияние протопластов, опосредуемую катионными липосомами трансфекцию; бомбардировку микрочастицами вольфрама (Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990)) и соосаждение ДНК с фосфатом стронция (Brash et al., Mol. Cell Biol., 7: 2031-2034 (1987)).
[0216] Другие подходы и векторы для переноса нуклеиновых кислот, кодирующих рекомбинантные продукты, представляют собой подходы и векторы, описываемые, например, в публикации международной патентной заявки № WO2014055668 и в патенте США № 7446190.
in vivo
in vivo
[0217] В числе дополнительных нуклеиновых кислоты, например, генов для внесения, присутствуют гены для улучшения эффективности терапии, например, обеспечения жизнеспособности и/или функции подвергаемых переносу клеток; гены, обеспечивающие генетический маркер для отбора и/или оценки клеток, например, для оценки жизнеспособности или локализации ; гены для улучшения безопасности, например, обеспечивая чувствительность клеток к отрицательному отбору , как описано в Lupton S. D. et al., Mol. and Cell Biol., 11:6 (1991); и Riddell et al., Human Gene Therapy 3:319-338 (1992); также см. публикации PCT/US91/08442 и PCT/US94/05601 Lupton et al., где описано применение бифункциональных селектируемых слитых генов, получаемых посредством слияния доминантного положительного селектируемого маркера с отрицательно селектируемым маркером. См., например, Riddell et al., патент США № 6040177, колонки 14-17.
[0218] В определенных вариантах осуществления получение конструированных клеток включает один или несколько этапов культивирования и/или подготовки. Клетки для введения нуклеиновой кислоты, кодирующей модифицированный PRE, можно выделять из образца, такого как биологический образец, например, образец, получаемый у индивидуума. В определенных вариантах осуществления индивидуум, у которого выделяют клетки, представляет собой индивидуума с заболеванием или патологическим состоянием или индивидуума, нуждающегося в клеточной терапии, или индивидуума которому проводили клеточную терапию. В определенных вариантах осуществления индивидуум представляет собой человека, нуждающегося в конкретном терапевтическом вмешательстве, таком как адоптивная клеточная терапия, для которой выделяют, обрабатывают и/или конструируют клетки.
[0219] Таким образом, в определенных вариантах осуществления клетки представляют собой первичные клетки, например, первичные клетки человека. Образцы включают образцы тканей, жидкостей и другие образцы, получаемые непосредственно у индивидуума, а также образцы, получаемые после одного или нескольких этапов обработки, например, разделения, центрифугирования, генетической инженерии (например, трансдукции вирусным вектором), отмывки и/или инкубации. Биологический образец может представлять собой образец, получаемый непосредственно из биологического источника или образец, который является обработанным. Биологические образцы в качестве неограничивающих примеров включают жидкости организма, такие как кровь, плазма, сыворотка, цереброспинальная жидкость, синовиальная жидкость, моча и пот, образцы тканей и органов, включая обработанные образцы, получаемые из них.
[0220] В определенных аспектах образец, из которого получают или выделяют клетки, представляет собой кровь или получаемый из крови образец или представляет собой или его получают из продукта афереза или лейкафереза. Иллюстративные образцы включают цельную кровь, мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC), лейкоциты, костный мозг, тимус, биопсию ткани, опухоль, лейкоз, лимфому, лимфоузел, ассоциированную с кишечником лимфоидную ткань, ассоциированую со слизистыми лимфоидную ткань, селезенку, другие лимфоидные ткани, печень, легкое, желудок, кишечник, толстую кишку, почку, поджелудочную железу, молочную железу, кости, предстательную железу, шейку матки, семенники, яичники, миндалину или другой орган и/или клетки, получаемые из них. Образцы в контексте клеточной терапии, например адоптивной клеточной терапии, включают образцы из аутологичных и аллогенных источников.
[0221] В определенных вариантах осуществления клетки получают из линий клеток, например, линий T-клеток. В определенных вариантах осуществления клетки получают из ксеногенного источника, например, у мыши, крысы, не являющегося человеком примата и свиньи.
[0222] В определенных вариантах осуществления выделение клеток включает один или несколько этапов получения и/или не основанных на аффинности разделения клеток. В определенных примерах клетки отмывают, центрифугируют и/или инкубируют в присутствии одного или нескольких реагентов, например, для удаления нежелательных компонентов, обогащения желательными компонентами, лизиса или удаления клеток, чувствительных к конкретным реагентам. В определенных примерах клетки разделяют на основе одного или нескольких свойств, таких как плотность, адгезионные свойства, размер, чувствительность и/или устойчивость к конкретным компонентам.
[0223] В определенных примерах клетки из циркулирующей кровь индивидуума получают, например, посредством аферез или лейкаферез. В определенных аспектах образцы содержат лимфоциты, включая T-клетки, моноциты, гранулоциты, B-клетки, другие ядросодержащие лейкоциты, эритроциты и/или тромбоциты, а в определенных аспектах образцы содержат клетки, отличные от эритроцитов и тромбоцитов.
++
++
[0224] В определенных вариантах осуществления клетки крови, получаемые у индивидуума, отмывают, например, для удаления плазматической фракции и помещения клеток в подходящий буфер или среду для последующих этапов обработки. В определенных вариантах осуществления клетки отмывают фосфатно-солевым буфером (PBS). В определенных вариантах осуществления в отмывочном растворе отсутствуют кальций, и/или магний, и/или многие или все двухвалентные катионы. В определенных аспектах этап отмывки проводят в полуавтоматической "фильтровальной" центрифуге (например, Cobe 2991 cell processor, Baxter) по инструкциям производителя. В определенных аспектах этап отмывки проводят посредством фильтрования тангенциальным потоком (TFF) по инструкциям производителя. В определенных вариантах осуществления клетки после отмывки ресуспендируют в различных биосовместимых буферах, например, таких как PBS без Ca/Mg. В определенных вариантах осуществления удаляют компоненты образца клеток крови и клетки непосредственно ресуспендируют в средах для культивирования.
[0225] В определенных вариантах осуществления способы включают основанные на плотности способы разделения клеток, такие как получение лейкоцитов из периферической крови посредством лизиса эритроцитов и центрифугирование в градиенте перколла или фиколла.
[0226] В определенных вариантах осуществления способы выделения включают разделение различных типов клеток на основе экспрессии или присутствия в клетках одной или нескольких конкретных молекул, таких как поверхностные маркеры, например, поверхностные белки, внутриклеточные маркеры или нуклеиновая кислота. В определенных вариантах осуществления можно использовать любой известный способ разделения на основе таких маркеров. В определенных вариантах осуществления разделение представляет собой основанное на аффинности или иммуноаффинности разделение. Например, в определенных аспектах выделение включает разделение клеток и клеточных популяций на основе экспрессии или уровня экспрессии в клетках одного или нескольких маркеров, как правило, поверхностных клеточных маркеров, например, посредством инкубации с антителом или партнером по связыванию, который специфически связывается с такими маркерами, как правило, с последующими этапами отмывки и разделения клеток со связанным антителом или партнером по связыванию от клеток, не связавших антитела или партнера по связыванию.
[0227] Такие этапы разделения могут основываться на положительном отборе, при котором для дальнейшего использования сохраняют клетки со связанными реагентами, и/или отрицательном отборе, при котором сохраняют клетки не связавшие антитела или партнера по связыванию. В определенных примерах для дальнейшего использования сохраняют обе фракции. В определенных аспектах отрицательный отбор может являться особенно пригодным, когда не существует ни одного доступного антитела, которое специфически идентифицирует данный тип клеток в гетерогенной популяции так, что разделение лучше проводить на основе маркеров, экспрессируемых клетками, отличными от клеток требуемой популяции.
[0228] Разделение не должно приводить к 100% обогащению или удалению конкретной популяции клеток или клеток, экспрессирующих конкретный маркер. Например, положительный отбор или обогащение клетками конкретного типа, такими как клетки, экспрессирующими маркер, относится к увеличению количества или процентного содержания таких клеток, но не обязательно приводит к полному отсутствие клеток, не экспрессирующих маркер. Подобным образом, отрицательный отбор, удаление или истощение клеток конкретного типа, таких как клетки, экспрессирующие маркер, относится к уменьшению количества или процентного содержания таких клеток, но не обязательно приводит к полному удалению всех таких клеток.
[0229] В определенных примерах проводят несколько циклов из этапов разделения, где положительно или отрицательно отобранную фракцию после одного этапа используют в другом этапе разделения, таком как последующий положительный или отрицательный отбор. В определенных примерах в одном из этапов разделения одновременно можно удалять клетки, экспрессирующие несколько маркеров, например, инкубируя клетки с множеством антител или партнеров по связыванию, где каждое специфично к маркеру, намеченному для отрицательного отбора. Подобным образом, можно подвергать одновременному положительному отбору несколько типов клеток посредством инкубации этих клеток с множеством антител или партнеров по связыванию, экспрессируемых различными типами клеток.
+
+
+
+
+
+
+
+
+
[0230] Например, в определенных аспектах способами положительного или отрицательного отбора выделяют конкретные субпопуляции T-клеток, такие как клетки, положительные или экспрессирующие высокие уровни одного или нескольких поверхностных маркеров, например, CD28, CD62L, CCR7, CD27, CD127, CD4, CD8, CD45RA и/или CD45RO T-клетки.
+
+
[0231] Например, CD3, CD28 T-клетки положительно отбирать с использованием конъюгированных с CD3/CD28 магнитных гранул (например, DYNABEADS M-450 CD3/CD28 T Cell Expander).
+
high
[0232] В определенных вариантах осуществления выделение проводят посредством обогащения конкретных популяций клеток посредством положительного отбора или удаления конкретных популяций клеток посредством отрицательного отбора. В определенных вариантах осуществления положительный или отрицательный отбор проводят посредством инкубации клетки с один или несколькими антителами или другими связывающими средствами, которые специфически связываются с одним или несколькими поверхностными маркерами, экспрессируемыми (маркер) или экспрессируемыми на относительно высоких уровнях (маркер) на положительно или отрицательно отбираемых клетках, соответственно.
+
+
+
+
+
+
[0233] В определенных вариантах осуществления T-клетки отделяют от образца PBMC посредством отрицательного отбора маркеров, экспрессируемых на клетках, не являющихся T-клетками, таких как B-клетки, моноциты или другие лейкоциты, такие как CD14-лейкоциты. В определенных аспектах для разделения CD4-хелперных и CD8-цитотоксических T-клеток используют этап отбора по CD4 или CD8. Такие популяции CD4-клеток и CD8-клеток можно дополнительно сортировать по субпопуляциям посредством положительного или отрицательного отбора по маркерам, экспрессируемым или экспрессируемым в относительно высокой степени на одной или нескольких субпопуляций наивных T-клеток, T-клеток памяти и/или эффекторных T-клеток.
+
+
+
CM
CM
[0234] В определенных вариантах осуществления CD8-клетки дополнительно обогащают или из них удаляют наивные клетки, центральные клетки памяти, эффекторные клетки памяти и/или центральные стволовые клетки памяти, например, посредством положительного или отрицательного отбора на основе поверхностных антигенов, ассоциированных с соответствующей субпопуляцией. В определенных вариантах осуществления обогащение центральными T-клетками памяти (T) проводят для увеличения эффективности, например, для улучшения длительности жизнеспособности, размножения и/или приживления после введения, что в определенных аспектах особенно функционально в таких субпопуляциях. см. Terakuraet al. (2012) Blood. 1:72-82; Wang et al. (2012) J. Immunother. 35(9):689-701. В определенных вариантах осуществления комбинация обогащенных T-клетками CD8-T-клеток и CD4-T-клеток дополнительно увеличивает эффективность.
+
-
+
-
+
+
+
[0235] В определенных вариантах осуществления в обоих подклассах CD62L и CD62L CD8-лимфоцитов периферической крови присутствуют T-клетки памяти. PBMC можно обогащать или из них можно удалять фракции CD62LCD8 и/или CD62LCD8, например, с использованием антител к CD8 и к CD62L.
CM
CM
CM
+
+
+
[0236] В определенных вариантах осуществления обогащение центральными T-клетками памяти (T) основано на положительной или высокой поверхностной экспрессии CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3 и/или CD127; в определенных аспектах оно основано на отрицательном отборе клеток, экспрессирующих или высоко экспрессирующих CD45RA и/или гранзим B. В определенных аспектах выделение CD8-популяции, обогащенной T-клетками, проводят посредством удаления клеток, экспрессирующих CD4, CD14, CD45RA, и положительного отбора или обогащения клетками, экспрессирующими CD62L. В одном из аспектов обогащение центральными T-клетками памяти (T) проводят, начиная с отрицательной фракции клеток, отобранных на основе экспрессии CD4, которую подвергают отрицательному отбору на основе экспрессии CD14 и CD45RA и положительному отбору на основе CD62L. В определенных аспектах такие отборы проводят одновременно, а в других аспектах их проводят последовательно в любом порядке. В определенных аспектах тот же этап отбора на основе экспрессии CD4, используемый при получении CD8-популяции или субпопуляции клеток, также используют для получения CD4-популяции или субпопуляция клеток так, что и положительную и отрицательную фракцию после этого разделения на основе CD4 сохраняют и используют на последующих этапах способов, необязательно после одного или нескольких дополнительных этапах положительного или отрицательного отбора.
+
[0237] В конкретном примере образец PBMC или другой образец лейкоцитов подвергают отбору CD4-клеток, где сохраняют и отрицательную, и положительную фракции. Затем отрицательную фракцию подвергают отрицательному отбору на основе экспрессии CD14 и CD45RA или CD19 и положительному отбору на основе маркера, характерного для центральных T-клеток памяти, такого как CD62L или CCR7, где эти положительный и отрицательный отборы проводят в любом порядке.
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
-
-
[0238] Хелперные CD4-T-клетки сортируют по наивным клеткам, центральным клеткам памяти и эффекторным клеткам, идентифицируя клеточные популяции, несущие поверхностные клеточные антигены. CD4-лимфоциты можно получать стандартными способами. В определенных вариантах осуществления наивные CD4-T-лимфоциты представляют собой CD45RO-, CD45RA-, CD62L-, CD4-T-клетки. В определенных вариантах осуществления центральные CD4-клетки памяти представляют собой CD62L- и CD45RO-клетки. В определенных вариантах осуществления эффекторные CD4-клетки представляют собой CD62L-клетки и CD45RO-клетки.
[0239] В одном из примеров для обогащения CD4+-клетками посредством отрицательного отбора, смесь моноклональных антител, как правило, содержит антитела к CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR и CD8. В определенных вариантах осуществления антитело или партнер по связыванию связаны с твердой подложкой или матриксом, такими как магнитные гранулы или парамагнитные гранулы, обеспечивая разделение клеток для положительного и/или отрицательного отбора. Например, в определенных вариантах осуществления клетки и клеточные популяции разделяют или выделяют с использованием способов иммуномагнитного (или аффиномагнитного) разделения (рассмотрено в Methods in Molecular Medicine, vol. 58: Metastasis Research Protocols, Vol. 2: Cell Behavior In Vitro и In vivo, p 17-25 Edited by: S. A. Brooks and U. Schumacher © Humana Press Inc., Totowa, NJ).
[0240] В определенных аспектах образец или композицию клеток для разделения инкубируют с small, намагничиваемый или реагирующим на магнитное поле материалом небольшого размера, таким как реагирующие на магнитное поле частицы или микрочастицы, такие как парамагнитные гранулы (например, такие как гранулы Dynabeads или MACS). Реагирующий на магнитное поле материал, например, частицы, как правило, прямо или опосредованно связаны с партнером по связыванию, например, антителом, который специфически связывается с молекулой, например, поверхностным маркером, находящимся на клетке, клетках или популяции клеток, которые необходимо разделить, например, которые необходимо подвергнуть отрицательному или положительному отбору.
[0241] В определенных вариантах осуществления магнитная частица или гранула содержит реагирующий на магнитное поле материал, связанный со участником специфического связывания, таким как антитело или другой партнер по связыванию. Существует множество хорошо известных реагирующих на магнитное поле материалов, используемых в способах магнитного разделения. Подходящие магнитные частицы включают частицы, описанные в патенте США № 4452773, выданном Molday, и в описании европейского патента EP452342B, которые, таким образом, включены в качестве ссылки. Другими примерами являются коллоидные частицы, такие как частицы, описанные в патенте США № 4795698, выданном Owen, и в патенте США № 5200084, выданном Liberti et al.
[0242] Как правило, инкубацию проводят в условиях, в которых антитела или партнеры по связыванию или такие молекулы, как вторичные антитела или другие реагенты, которые специфически связываются с такими антителами или партнерами по связыванию, которые связаны с магнитными частицами или гранулами, специфически связываются с молекулами клеточной поверхности, если они присутствуют на клетках в образце.
[0243] В определенных аспектах образец помещают в магнитное поле, и клетки, со связанными с ними реагирующими на магнитное поле или намагничиваемыми частицами, притягиваются к магниту и отделяются от немеченных клеток. Для положительного отбора сохраняют клетки, связанные с магнитом; для отрицательного отбора сохраняют несвязанные клетки (немеченные клетки). В определенных аспектах в одном этапе отбора проводят комбинацию положительного и отрицательного отборов, когда положительную и отрицательную фракцию сохраняют и в дальнейшем обрабатывают или подвергают дальнейшим этапам разделения.
[0244] В определенных вариантах осуществления реагирующие на магнитное поле частицы покрывают первичными антителами или другими партнерами по связыванию, вторичными антителами, лектинами, ферментами или стрептавидином. В определенных вариантах осуществления магнитные частицы связывают с клетками, покрывая первичными антителами, специфичными к одному или нескольким маркерам. В определенных вариантах осуществления первичными антителами или партнерами по связыванию метят клетки, а не гранулы, а затем добавляют покрытые специфичными к типам клеток вторичными антителами или другими партнерами по связыванию (например, стрептавидином) магнитные частицы. В определенных вариантах осуществления покрытые стрептавидином магнитные частицы используют в сочетании с биотинилированными первичными или вторичными антителами.
[0245] В определенных вариантах осуществления реагирующие на магнитное поле частицы остаются прикрепленными к клеткам, которые затем необходимо инкубировать, культивировать и/или подвергать инженерии; в определенных аспектах частицы остаются прикрепленными к клеткам для введения пациенту. В определенных вариантах осуществления намагничиваемые или реагирующие на магнитное поле частицы удаляют с клеток. Способы удаления намагничиваемых частиц с клеток известны и включают, например, использование конкурирующих немеченых антител и намагничиваемых частиц или антител, конъюгированных с расщепляемыми линкерами. В определенных вариантах осуществления намагничиваемые частицы являются биоразлагаемыми.
[0246] В определенных вариантах осуществления отбор на основе аффинности проводят посредством активируемой магнитным полем сортировки клеток (MACS) (Miltenyi Biotech, Auburn, CA). Системы активируемой магнитным полем сортировки клеток (MACS) способны к отбору клеток с прикрепленными к ним намагниченными частицами с высокой чистотой. В определенных вариантах осуществления MACS функционирует в режиме, где после приложения внешнего магнитного поля последовательно элюируют не являющиеся мишенью и являющиеся мишенью компоненты. Т.е., когда элюируют несвязанные компоненты, клетки, прикрепленные к намагниченным частицам, удерживаются на месте. Затем, после завершения этого первого этапа элюции, компоненты, которые были захвачены в магнитном поле и лишены возможности элюировать, определенным образом высвобождаются так, что их можно элюировать и выделять. В определенных вариантах осуществления не являющиеся мишенями клетки метят и удаляют из гетерогенной популяции клеток.
[0247] В определенных вариантах осуществления выделение или разделение проводят с использованием системы, устройства или установки, которая позволяет проводить один или несколько из этапов выделения, получения, разделения, обработки, инкубации, культивирования и/или составления клеток способов. В определенных аспектах систему используют для проведения каждого из этих этапов в закрытой или стерильной среде, например, для минимизации ошибки, обработки пользователем и/или загрязнения. В одном из примеров, система представляет собой систему, как описано в публикации международной патентной заявки № WO2009/072003 или US 20110003380 A1.
[0248] В определенных вариантах осуществления на системе или устройстве проводят один или несколько, например, все из этапов выделения, обработки, инженерии и составления в интегрированной или изолированной системе и/или в автоматическом или программируемом режиме. В определенных аспектах система или устройство включает компьютер и/или компьютерную программу, связанные с системой или устройством, которые позволяют пользователю программировать, контролировать, оценивать исход и/или регулировать различные параметры этапов обработки, выделения, инженерии и составления.
[0249] В определенных аспектах разделение и/или другие этапы проводят с использованием системы CliniMACS (Miltenyi Biotic), например, для автоматизированного разделения клеток на уровне клинических масштабов в закрытой и стерильной системе. Компоненты могут включать интегрированный микрокомпьютер, блок магнитного разделения, перистальтический насос и различные запорные клапаны. В определенных аспектах все компоненты устройства контролирует интегрированный компьютер и заставляет систему проводить повторяющиеся процедуры в стандартизированной последовательности. В определенных аспектах блок магнитного разделения включает съемный постоянный магнит и держатель колонки для отбора. Скорость потока на всем протяжении системы трубок контролирует перистальтический насос, и совместно с запорными клапанами он обеспечивает контролируемый поток буфера через систему и непрерывное суспендирование клеток.
[0250] В определенных аспектах в системе CliniMACS используют связанные с антителами намагничиваемые частицы, которые поставляют в стерильном, апирогенном растворе. В определенных вариантах осуществления после мечения клеток магнитными частицами клетки отмывают с удалением избытка частиц. Затем резервуар с полученными клетками соединяют с системой трубок, которую в свою очередь связывают с резервуаром, содержащим буфер, и резервуаром для сбора клеток. Система трубок состоит из предварительно собранных стерильных трубок, включая предколонку и колонку для разделения, и предназначена только для одноразового использования. После начала программы разделения система автоматически наносит образец клеток на колонку для разделения. Меченые клетки остаются в колонке, тогда как немеченые клетки удаляют посредством ряда этапов отмывки. В определенных вариантах осуществления клеточные популяции для применения в способах, описываемых в настоящем документе, являются немечеными и не остаются в колонке. В определенных вариантах осуществления клеточные популяции для применения в способах, описываемых в настоящем документе, являются мечеными и остаются в колонке. В определенных вариантах осуществления клеточные популяции для применения в способах, описываемых в настоящем документе, элюируют из колонки после снятия магнитного поля и собирают в резервуаре для сбора клеток.
[0251] В определенных вариантах осуществления разделение и/или другие этапы проводят с использованием системы CliniMACS Prodigy (Miltenyi Biotec). В определенных аспектах систему CliniMACS Prodigy оборудуют блоком обработки клеток, который обеспечивает автоматизированные отмывку и фракционирование клеток посредством центрифугирования. Система CliniMACS Prodigy также может включать встроенную камеру и программное обеспечение распознавания изображений, которое определяет оптимальную конечную точку фракционирование клеток, распознавая макроскопические слои продукта-источника клеток. Например, периферическ кровь may be automatically separated into эритроциты, лейкоциты и плазма layers. Также система CliniMACS Prodigy может включать интегрированную камеру для культивирования клеток, в которой проводят протоколы культивирования клеток, например, такие как дифференцировка и размножение клеток, нагрузка антигенами и длительное культивирование клеток. Входные порты могут обеспечивать стерильное удаление и обновление сред, а клетки можно контролировать с использованием интегрированного микроскопа. См., например, Klebanoff et al. (2012) J. Immunother. 35(9): 651-660, Terakuraet al. (2012) Кровь.1:72-82, и Wang et al. (2012) J. Immunother. 35(9):689-701.
[0252] В определенных вариантах осуществления популяцию клеток, описанную в настоящем документе, собирают и обогащают (или истощают) посредством проточной цитометрии, при которой клетки, окрашенные на несколько поверхностных клеточных маркеров, переносит поток жидкости. В определенных вариантах осуществления популяцию клеток, описанную в настоящем документе, собирают и обогащают (или истощают) посредством сортировки FACS в препаративном масштабе. В определенных вариантах осуществления популяцию клеток, описанную в настоящем документе, собирают и обогащают (или истощают), используя чипы микроэлектромеханических систем (MEMS) в комбинации с системой детекции на основе FACS (см., например, WO 2010/033140, Cho et al. (2010) Lab Chip 10, 1567-1573 и Godin et al. (2008) J. Biophoton. 1(5):355-376. В обоих случаях клетки можно метить несколькими маркерами, обеспечивая выделение хорошо определенных подклассов T-клеток с высокой чистотой.
[0253] В определенных вариантах осуществления для облегчения разделения при положительном и/или отрицательном отборе антитела или партнеры по связыванию метят одним или несколькими детектируемыми маркерами. Например, разделение можно проводить на основе связывания с флуоресцентно мечеными антителами. В определенных примерах разделение клеток на основе связывания антител или других партнеров по связыванию, специфичных к одному или нескольким поверхностным клеточным маркерам, проводят в потоке жидкости, например, посредством активируемой флуоресценцией сортировки клеток (FACS), включая препаративный масштаб (FACS) и/или чипы микроэлектромеханических систем (MEMS), например, в комбинации с проточно-цитометрической системой детекции. Такие способы обеспечивают положительный и отрицательный отбор на основе несколько маркеров одновременно.
[0254] В определенных вариантах осуществления способы получения включают этапы замораживания, например, криоконсервации клеток, до или после выделения, инкубации и/или инженерии. В определенных вариантах осуществления этап замораживания и последующего оттаивания удаляет из популяции клеток гранулоциты и, до некоторой степени, моноциты. В определенных вариантах осуществления клетки суспендируют в растворе для замораживания, например, после этапа отмывки, для удаления плазмы и тромбоцитов. В определенных аспектах можно использовать любой из множества известных растворов и параметров для замораживания. Один из примеров включает использование PBS, содержащего 20% DMSO и 8% сывороточный альбумин человека (HSA), или другой подходящей среды для замораживания клеток. Затем ее разбавляют средой 1:1 до конечной концентрации DMSO и HSA 10% и 4%, соответственно. Как правило, клетки затем замораживают до -80°C. со скоростью 1° в минуту и хранят в газообразной фазе резервуаре жидкого азота.
[0255] В определенных вариантах осуществления предоставляемые способы включают этапы культивирования, инкубации, ведения культуры и/или генетической инженерии. Например, в определенных вариантах осуществления предоставлены способы инкубации и/или инженерии истощенных клеточных популяций и инициирующих культуру композиций.
[0256] Таким образом, в определенных вариантах осуществления клеточную популяцию инкубируют в инициирующей культуру композиции. Инкубацию и/или конструирование можно проводить в резервуаре для культивирования, таком как блок, камера, лунка, колонка, пробирка, система трубок, клапан, флакон, чашка для культивирования, мешок или другой контейнер для ведения культуры или культивирования клеток.
[0257] В определенных вариантах осуществления клетки до или вместе с генетической инженерией инкубируют и/или культивируют. Этапы инкубации могут включать ведение культуры, культивирование, стимулирование, активацию и/или размножение. В определенных вариантах осуществления композиции или клетки инкубируют в стимулирующих условиях или в присутствии стимулирующего средства. Такие условия включают условия, предназначенные для индукции пролиферации, размножения, активации и/или выживания клеток в популяции, для имитации экспозиции антигена и/или для примирования клеток для генетической инженерии, например, для введения рекомбинантного антигенраспознающего рецептора.
[0258] Условия могут включать одну или несколько конкретных сред, температуру, содержание кислорода, содержание диоксида углерода, время, средства, например, питательные вещества, аминокислоты, антибиотики, ионы и/или стимулирующие факторы, такие как цитокины, хемокины, антигены, партнеры по связыванию, слитые белки, рекомбинантные растворимые рецепторы и любые другие средства, предназначенные для активации клеток.
[0259] В определенных вариантах осуществления стимулирующие условия или средства включают одно или несколько средств, например, лиганд, который способен активировать внутриклеточный сигнальный домен комплекса TCR. В определенных аспектах средство запускает или инициирует в T-клетках каскад внутриклеточной сигнализации TCR/CD3. Такие средства могут включать антитела, такие как антитела, специфичные к компоненту и/или костимулирующему рецептору TCR, например, антитела к CD3, антитела к CD28, например, связанные с твердой подложкой, такой как гранулы, и/или один или несколько цитокинов. Необязательно, способ размножения может дополнительно включать этап добавления в среду для культивирования антител к CD3 и/или антител к CD28 (например, в концентрации по меньшей мере приблизительно 0,5 нг/мл). В определенных вариантах осуществления стимулирующие средства включают IL-2 и/или IL-15, например, концентрацию IL-2 по меньшей мере приблизительно 10 единиц/мл.
[0260] В определенных аспектах инкубацию проводят такими способами, как способы, описанные в патенте США № 6040177, выданном Riddell et al., Klebanoff et al.(2012) J. Immunother. 35(9): 651-660, Terakuraet al. (2012) Blood. 1:72-82 и/или Wang et al. (2012) J. Immunother. 35(9):689-701.
[0261] В определенных вариантах осуществления T-клетки размножают, добавляя в инициирующую культуру композицию фидерных клеток, например, неделящихся мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC), (например, так, что получаемая в результате популяция клеток содержит по меньшей мере приблизительно 5, 10, 20 или 40 или более фидерных клеток PBMC на каждый T-лимфоцит в исходной популяции, подвергаемой размножению); и инкубируя культуру (например, в течение периода времени, достаточного для размножения больших количеств T-клеток). В определенных аспектах неделящиеся фидерные клетки могут содержать подвергнутые гамма-облучению фидерные клетки PBMC. В определенных вариантах осуществления PBMC для предотвращения деления клеток облучают гамма-лучами в диапазоне приблизительно от 3000 до 3600 рад. В определенных аспектах фидерные клетки добавляют в среду для культивирования перед добавлением популяций T-клеток.
[0262] В определенных вариантах осуществления стимулирующие условия включают температура, подходящую для роста T-лимфоцитов человека, например, по меньшей мере, приблизительно 25 градусов Цельсия, как правило, по меньшей мере приблизительно 30 градусов, и, как правило, 37 градусов Цельсия или приблизительно 37 градусов Цельсия. Необязательно, инкубацию можно дополнительно включать добавление в качестве фидерных клеток неделящихся трансформированных EBV лимфобластоидных клеток (LCL). LCL можно облучать гамма-лучами в диапазоне приблизительно от 6000 до 10000 рад. В определенных аспектах фидерные клетки LCL предоставляют в любом подходящем количестве, таком как отношение фидерных клеток LCL к исходным T-лимфоцитам по меньшей мере приблизительно 10:1.
+
+
in vitro
[0263] В определенных вариантах осуществления антигенспецифические T-клетки, такие как антигенспецифические CD4- и/или CD8-T-клетки, получают, стимулируя наивные или антигенспецифические T-лимфоциты антигеном. Например, можно получать линии или клоны антигенспецифических T-клеток к антигенам цитомегаловируса, выделяя T-клетки у инфицированных индивидуумов и стимулируя клетки  тем же антигенрм.
II. Композиции, способы и применения
A. Фармацевтические композиции и составы
[0264] Также предоставлены композиции, содержащие полинуклеотиды, кассеты, векторы, вирусные частицы и/или клетки, в которые введены такие полинуклеотиды или иным способом содержащие их. В определенных вариантах осуществления предоставлены фармацевтические композиции, содержащие клетки, которые способами трансдукции сконструированы для экспрессии рекомбинантного белка с использованием любого из предоставляемых векторов или вирусных частиц, содержащих их. В числе композиций находятся композиции для введения, содержащие фармацевтические композиции и составы, такие как композиции в стандартных лекарственных формах, содержащих определенное количество клеток для введения в вводимой дозе или ее части. Как правило, фармацевтические композиции и составы содержат один или несколько необязательных фармацевтически приемлемых носителей или эксципиентов. В определенных вариантах осуществления композиция содержит по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство.
[0265] Термин "фармацевтический состав" относится к препарату, который находится в такой форме, чтобы обеспечить эффективную биологическую активность активного ингредиента, содержащегося в нем, и который не содержит дополнительных компонентов с неприемлемой токсичностью для индивидуума, которому вводят этот состав.
[0266] "Фармацевтически приемлемый носитель" относится к ингредиенту в фармацевтическом составе, отличному от активного ингредиента, который является нетоксичным для индивидуума. Фармацевтически приемлемый носитель в качестве неограничивающих примеров включает буфер, эксципиент, стабилизатор или консервант.
[0267] В определенных аспектах выбор носителя частично определен конкретными клетками и/или способом введения. Таким образом, существует множество подходящих составов. Например, фармацевтическая композиция может содержать консерванты. Подходящие консерванты могут включать, например, метилпарабен, пропилпарабен, бензоат натрия и хлорид бензалкония. В определенных аспектах используют смесь двух или более консервантов. Как правило, консерванты или их смеси присутствуют в количестве приблизительно от 0,0001% до приблизительно 2% по массе от всей композиции. Носители описаны, например, в Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980). Как правило, фармацевтически приемлемые носители являются нетоксичными для реципиентов в применяемых дозах и концентрациях и в качестве неограничивающих примеров включают: буферы, такие как фосфат, цитрат и другие органические кислоты; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как октадецилдиметилбензилхлорид аммония; хлорид гексаметония; хлорид бензалкония; хлорид бензетония; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехол; резорцинол; циклогексанол; 3-пентанол и м-крезол); низкомолекулярные (менее чем приблизительно 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие средства, такие как ЭДТА; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; формирующие соли противоионы, такие как натрий; комплексные соединения с металлами (например, комплексы Zn-белок) и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как полиэтиленгликоль (PEG).
st
[0268] В определенных аспектах в композиции включены буферные средства. Подходящие буферные средства включают, например, лимонную кислоту, цитрат натрия, фосфорную кислоту, фосфат калия и другие различные кислоты и соли. В определенных аспектах используют смесь двух или более буферных средств. Как правило, буферное средство или их смеси присутствуют в количестве приблизительно от 0,001% до приблизительно 4% по массе от всей композиции. Способы получения, вводимых фармацевтических композиций известны. Иллюстративные способы более подробно описаны, например, в Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21 ed. (1 мая 2005 года).
[0269] Составы могут включать водные растворы. Состав или композиция также может содержать более одного активного ингредиента, пригодного при конкретном показании, заболевании или патологическом состоянии, подвергаемых лечению клетками, предпочтительно активные ингредиенты с активностью, комплементарной для клеток, где соответствующие виды активности не мешают один другому. Такие активные ингредиенты, соответственно, присутствуют в комбинации в количествах, которые эффективны для заданной цели. Таким образом, в определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция дополнительно содержит другие фармацевтически активные средства или лекарственные средства, такие как химиотерапевтические средства, например, аспарагиназа, бусульфан, карбоплатин, цисплатин, даунорубицин, доксорубицин, фторурацил, гемцитабин, гидроксимочевина, метотрексат, паклитаксел, ритуксимаб, винбластин и/или винкристин.
[0270] В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит клетки в количествах, эффективных для лечения или профилактики заболевания или патологического состояния, например, в терапевтически эффективном или профилактически эффективном количестве. В определенных вариантах осуществления терапевтическую или профилактическую эффективность контролируют посредством периодического обследования подвергаемых лечению индивидуумов. Желаемую дозу можно доставлять посредством одного болюсного введения клеток, посредством нескольких болюсных введений клеток или посредством непрерывного инфузионного введения клеток.
[0271] В определенных вариантах осуществления композиция содержит клетки в количестве, эффективном для снижения тяжести заболевания или патологического состояния, и/или в количестве, которое не приводит к CRS или тяжелому CRS у индивидуума, и/или для получения любого из других результатов способов, как описано в настоящем документе.
in vivo
ex vivo
in vitro
[0272] Клетки и композиции можно вводить стандартными способами введения, с использованием стандартных составов и/или устройств. Введение клеток может являться аутологичным или аллогенным. Например, у индивидуума можно получать иммунореактивные клетки или их предшественники и вводить тому же индивидууму или другому, совместимому индивидууму. Полученные из периферической крови иммунореактивные клетки или их потомство (например, полученное ,  или ) можно вводить посредством местной инъекции, включая введение через катетер, системной инъекции, местной инъекции, внутривенной инъекции или парентерального введения. Как правило, при введении терапевтической композиции (например, фармацевтической композиции, содержащей генетически модифицированные иммунореактивные клетки), ее формулируют в инъецируемой стандартной лекарственной форме (раствор, суспензия, эмульсия).
[0273] Составы включают составы для перорального, внутривенного, интраперитонеального, подкожного, легочного, трансдермального, внутримышечного, интраназального, буккального, сублингвального введения или введения посредством суппозиториев. В определенных вариантах осуществления клеточные популяции вводят парентерально. Парентеральные инфузии могут включать внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, интраперитонеальное, интраторакальное, внутричерепное и/или подкожное введение. В определенных вариантах осуществления вводимую дозу вводят посредством одного болюсного введения клеток. В определенных вариантах осуществления клетки вводят индивидууму с использованием периферической системной доставки посредством внутривенной, интраперитонеальной или подкожной инъекции.
[0274] В определенных вариантах осуществления композиции предоставляют в виде стерильных жидких препаратов, например, изотонических водных растворов, суспензий, эмульсий, дисперсий или вязких композиций, который в определенных аспектах можно буферировать до выбранного pH. Как правило, получать жидкие препараты легче, чем гели, другие вязкие композиции и твердые композиции. Кроме того, жидкие композиции в определенной степени более удобны для введения, особенно посредством инъекции. С другой стороны, вязкие композиции можно формулировать в подходящем диапазоне вязкости для обеспечение более длительного периода контакта с конкретными тканями. Жидкие или вязкие композиции могут содержать носители, которые могут представлять собой растворитель или дисперсионную среду, содержащие, например, воду, солевой раствор, фосфатно-солевой буфер, полиoл (например, глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль) и их подходящие смеси.
[0275] Стерильные инъецируемые растворы можно получать посредством введения клеток в растворитель, например, в смеси с подходящим носителем, разбавителем или эксципиентом, таким как стерильная вода, физиологический солевой раствор, глюкоза, декстроза или т.п. Композиции в зависимости от необходимых маршрута введения и препарата могут содержать вспомогательные вещества, такие как увлажняющие, диспергирующие средства или эмульгаторы (например, метилцеллюлозу), средства для буферирования pH, желирующие или увеличивающие вязкость добавки, консерванты, ароматизаторы и/или красители. Для получения подходящих препаратов в определенных аспектах можно консультироваться в стандартных руководствах.
[0276] Можно добавлять различные добавки, которые увеличивают стабильность и стерильность композиций, включая противомикробные консерванты, антиоксиданты, хелатирующие средства и буферы. Предотвращение действия микроорганизмов можно обеспечивать различными антибактериальными и противогрибковыми средствами, например, парабенами, хлорбутанолом, фенолом и сорбиновой кислотой. Пролонгированного всасывания инъецируемой фармацевтической формы можно добиваться, используя средства, замедляющие всасывание, например, моностеарат алюминия и желатин.
in vivo
[0277] Как правило, составы, используемые для введения , являются стерильными. Стерильности можно легко добиться, например, посредством фильтрации через стерильные фильтрационные мембраны.
B. Терапевтические и профилактические способы и применения
[0278] Предоставлены способы лечения заболевания или патологического состояния у индивидуума с применением предоставляемых полинуклеотидов, кассет, векторов, клеток, содержащих их, белков и других молекул, кодируемых ими, и их композиций, таких где рекомбинантная или гетерологичная молекула, кодируемая нуклеиновой кислотой представляет собой рекомбинантный рецептор, такой как антигенраспознающий рецептор, например, CAR или TCR. В определенных вариантах осуществления предоставляемые способы включают введение индивидууму с заболеванием или патологическим состоянием предоставляемых клеток или популяций клеток или их фармацевтических композиций, способами трансдукции с использованием любого из предоставляемых векторов или содержащих их вирусных частиц сконструированных для экспрессии рекомбинантного белка. Также предоставлены применения и композиции для применения при лечении заболевания или патологического состояние у индивидуума с использованием предоставляемых клеток или популяций клеток или их композиций, сконструированных для содержания рекомбинантного рецептора, такого как антигенраспознающий рецептор, например, CAR или TCR.
[0279] В определенных вариантах осуществления подвергаемое лечению или профилактике заболевание или патологическое состояние представляет собой злокачественную опухоль, аутоиммунное нарушение и/или инфекционное заболевание, такое как вирусное заболевание, и/или представляет собой одно или несколько других заболеваний, патологических состояний и/или нарушений.
[0280] В определенных вариантах осуществления клетки, композиции и/или полинуклеотиды, например, векторы, вводят индивидууму или пациенту с конкретным подлежащим лечению заболеванием или патологическим состоянием, например, посредством адоптивной клеточной терапии, так как адоптивная T-клеточная терапия. В определенных вариантах осуществления клетки и композиции, получаемые предоставляемыми способами, такие как сконструированные композиции и готовые композиции после инкубации и/или других этапов обработки, вводят индивидууму, например, индивидууму с наличием или с риском заболевания или патологического состояния. Таким образом, в определенных аспектах этими способами лечат, например, улучшают состояние при одном или нескольких симптомах заболевания или патологического состояния, например, снижая опухолевую нагрузку при злокачественной опухоли, экспрессирующей антиген, распознаваемый сконструированными T-клетками.
[0281] В предоставляемых способах или применениях рекомбинантный или гетерологичный белок может содержать рекомбинантный рецептор, такой как антигенраспознающий рецептор, например, CAR или TCR, который специфически связывается с лигандом, экспрессируемым при заболевании или патологическом состоянии или пораженными ими клетками или тканью. Например, в определенных вариантах осуществления рецептор представляет собой антигенраспознающий рецептор, а лиганд представляет собой антиген, специфичный для заболевания или патологического состояния и/или ассоциированный с ними.
[0282] Способы введения клеток для адоптивной клеточной терапии известны и их можно использовать вместе с предоставляемыми способами и композициями. Например, способы адоптивной T-клеточной терапии описаны, например, в публикации патентной заявки США № 2003/0170238 Gruenberg et al; патенте США № 4690915, выданной Rosenberg; Rosenberg (2011) Nat. Rev. Clin. Oncol. 8(10):577-85). См., например, Themeli et al. (2013) Nat. Biotechnol. 31(10): 928-933; Tsukahara et al. (2013) Biochem. Biophys. Res. Commun.438(1): 84-9; Davila et al. (2013) PLoS One 8(4): e61338.
[0283] В определенных вариантах осуществления клеточную терапию, например, адоптивную клеточную терапию, например, адоптивную T-клеточную терапию, проводят посредством аутологичного переноса, при котором клетки выделяют и/или иным способом получают у индивидуума, которому необходимо проводить клеточную терапию, или из образца, полученного у такого индивидуума. Таким образом, в определенных аспектах клетки получают у индивидуума, например, пациента, нуждающегося в лечении, и клетки, после выделения и обработки вводят тому же индивидууму.
[0284] В определенных вариантах осуществления клеточную терапию, например, адоптивную клеточную терапию, например, адоптивную T-клеточную терапию, проводят посредством аллогенного переноса, при котором клетки выделяют и/или иным способом получают у индивидуума, отличного от индивидуума, которому необходимо проводить или которому в конечном итоге проводят клеточную терапию, например, первого индивидуума. В таких вариантах осуществления клетки затем вводят другому индивидууму, например, второму индивидууму того же вида. В определенных вариантах осуществления первый и второй индивидуумы являются генетически идентичными. В определенных вариантах осуществления первый и второй индивидуумы являются генетически сходными. В определенных вариантах осуществления второй индивидуум экспрессирует тот же класс или супертип HLA, что и первый индивидуум.
[0285] Индивидуум, например, пациент, которому вводят клетки, клеточные популяции или композиции, представляет собой млекопитающее и, как правило, является приматом, таким как человек. В определенных вариантах осуществления примат представляет собой обезьяну или человекообразную обезьяну. Индивидуум может представлять собой мужчину или женщину и может находиться в любом подходящем возрасте, включая грудных детей, подростков до пубертатного периода, подростков пубертатного периода, взрослых и пожилых индивидуумов. В определенных вариантах осуществления индивидуум представляет собой не являющегося приматом млекопитающего, такого как грызун. В определенных примерах пациент или индивидуум представляет собой обоснованная модель на животных заболевания, адоптивной клеточной терапии и/или оценки токсических последствий, таких как синдром высвобождения цитокинов (CRS).
[0286] В числе заболеваний, патологических состояний и нарушения находятся опухоли, включая солидные опухоли, злокачественные новообразования гематологического происхождения и меланомы, и инфекционные заболевания, такие как инфекция вирусом или другим патогенным микроорганизмом, например, ВИЧ, HCV, HBV, HPV, CMV, и паразитарные заболевания. В определенных вариантах осуществления заболевание или патологическое состояние представляет собой опухоль, злокачественную опухоль, злокачественное новообразование, неоплазию или другое пролиферативное заболевание. Такие заболевания в качестве неограничивающих примеров включают лейкоз, лимфому, например, хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), ALL, неходжкинскую лимфому, острый миелолейкоз, множественную миелому, устойчивую фолликулярную лимфому, лимфому мантийных клеток, вялотекущую B-клеточную лимфому, B-клеточные злокачественные новообразования, злокачественные опухоли кишечника, легких, печени, молочной железы, предстательной железы, яичника, кожи (включая меланому), костей и злокачественную опухоль головного мозга, рак яичника, эпителиальные злокачественные опухоли, почечноклеточную карциному, аденокарциному поджелудочной железы, лимфому Ходжкина, карциному шейки матки, колоректальный рак, глиобластому, нейробластому, саркома Юинга, медуллобластому, остеосаркому, синовиальную саркому и/или мезотелиому.
[0287] В определенных вариантах осуществления заболевание или патологическое состояние представляет собой инфекционное заболевание или патологическое состояние, в качестве неограничивающих примеров, такое как вирусные, ретровирусные, бактериальные и протозойные инфекции, иммунодефицит, цитомегаловирус (CMV), вирус Эпштейна-Барр (EBV), аденовирус, полиомавирус BK. В определенных вариантах осуществления заболевание или патологическое состояние представляет собой аутоиммунное или воспалительное заболевание или патологическое состояние, такое как артрит, например, ревматоидный артрит (RA), диабет I типа, системная красная волчанка (SLE), воспалительное заболевание кишечника, псориаз, склеродермия, аутоиммунное заболевание щитовидной железы, болезнь Грейва, болезнь Крона, рассеянный склероз, астму и/или заболевание или патологическое состояние, ассоциированное с трансплантатом.
[0288] В определенных вариантах осуществления антиген, ассоциированный с заболеванием или нарушением, выбран из группы, состоящей из орфанного рецептора тирозинкиназы ROR1, tEGFR, Her2, Ll-CAM, CD19, CD20, CD22, мезотелина, CEA и поверхностного антигена гепатита B, рецептора фолиевой кислоты, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, 0EPHa2, ErbB2, 3 или 4, FBP, рецептора фетального ацетилхолина e, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-альфа, IL-13R-альфа 2, kdr, легкой цепи каппа, антигена Льюиса Y, молекулы клеточной адгезии L1, MAGE-A1, мезотелина, MUC1, MUC16, PSCA, лигандов NKG2D, NY-ESO-1, MART-1, gp100, онкофетального антигена, ROR1, TAG72, VEGF-R2, раково-эмбрионального антигена (CEA), специфического антигена предстательной железы, PSMA, Her2/neu, рецептора эстрогена, рецептора прогестерона, эфрина B2, CD123, CS-1, c-Met, GD-2 и MAGE A3, CE7, антигена опухоли Вильмса 1 (WT-1), циклина, такого как циклин A1 (CCNA1) и/или биотинилированных молекул и/или молекул, экспрессируемых ВИЧ, HCV, HBV и/или другими патогенными микроорганизмами.
[0289] Как используют в настоящем документе, "посттранскрипционный регуляторный элемент (PRE)", такой как PRE вируса гепатита, относится к последовательности ДНК, которая при транскрипции формирует третичную структуру, способную демонстрировать посттранскрипционную активность, усиливая или стимулируя экспрессию ассоциированного гена, функционально связанного с ней.
[0290] Как используют в настоящем документе, "посттранскрипционная активность" относится к активности регуляторного элемента, контролирующей или регулирующий экспрессию гена на уровне РНК. Посттранскрипционная активность может проявляться активностью, которая способствует экспорту РНК из ядра, обеспечивая участки связывания клеточных белков, увеличивает общее количество РНК, например, рекомбинантной и/или гетерологичной РНК, транскриптов, увеличивает стабильность РНК, увеличивает количество полиаденилированных транскриптов и/или увеличивает размер полиаденилированных концов в таких транскриптах.
[0291] Как используют в настоящем документе "функционально связанные" относится к ассоциации компонентов, таких как последовательность ДНК (например, гетерологичная нуклеиновая кислота), и регуляторная последовательность(и) таким образом, чтобы обеспечить экспрессию гена при связывании с регуляторной последовательностью соответствующих молекул (например, белков-активаторов транскрипции). Таким образом, это означает, что описанные компоненты являются зависимыми, позволяя им функционировать запланированным для них образом.
[0292] Как используют в настоящем документе, "немодифицированный" в отношении PRE, гена X или последовательности Flap относится к исходному полинуклеотиду, который выбран для модификации предоставляемым способом. Исходный полинуклеотид может являться природной формой полинуклеотида, дикого типа. В определенных вариантах осуществления исходный полинуклеотид можно изменять или подвергать мутированию так, что он отличается от нативной формы дикого типа, но тем не менее его обозначают как исходный немодифицированный полинуклеотид относительно модифицированных после этого полинуклеотидов предоставляемым способом. Немодифицированный полинуклеотид не содержит в своей последовательности приводимых модификаций (например, стоп-кодона, последовательности разрушения или делеции всех или части cPPT или CTS предоставляемым способом). В определенных вариантах осуществления немодифицированная нуклеиновая кислота, например, PRE, представляет собой нуклеиновую кислоту, для которой известно, что она обладает или демонстрирует необходимую степень функциональности или активности, такую как PRE с известной степенью посттранскрипционной активности, например, способностью усиливать экспрессию гена. Иллюстративные немодифицированные последовательности PRE представляют собой последовательности, приведенные SEQ ID NO:1,12-27, 119, 120, 125 или 216. Иллюстративная последовательность немодифицированного Flap приведена в SEQ ID NO: 121.
[0293] Как используют в настоящем документе, "дикого типа" в отношении PRE или гена X относится к последовательности, получаемой из природной последовательности нуклеиновой кислоты PRE или гена X, которая фактически присутствует в вирусе или геноме вируса, такого как гепаднавирус, например, ортогепаднавирус, такой как гепаднавирус, выделенный у млекопитающего, в природе. Указание дикого типа без указания вида предназначено для включения вирусной последовательности, которая содержит ген X, выделенный у любого вида. Иллюстративные PRE или ген X дикого типа представляют собой любые PRE или ген X с последовательностью нуклеиновой кислоты, получаемой из последовательностей PRE или гена X, находящейся в гепаднавирусе, включая любой гепаднавирус, выявленный или выделенный из такого вида млекопитающих, как человек, примат или беличьи, например, сурок, или с последовательностью, которая является такой же, как и эти последовательности PRE или гена X. Примеры PRE дикого типа представляют собой PRE, приведенные в SEQ ID NO:1, 12-27 или 125.
[0294] Как используют в настоящем документе, "дикого типа" в отношении последовательности Flap относится к последовательности, получаемой из природной последовательности вирусной нуклеиновой кислоты, которая содержит области cPPT и CTS для формирования ДНК Flap, которые фактически присутствуют в вирусе или геноме вируса, такого как ретровирус, например, лентивирус, такой как ВИЧ-1. Иллюстративная последовательность Flap дикого типа представляют собой любую последовательность, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты, полученную из последовательности вирусной нуклеиновой кислоты, содержащей области cPPT и CTS, находящиеся в ретровирусе, включая лентивирус (например, ВИЧ-1), или с последовательностью, которая является такой же как и эта последовательность вирусной нуклеиновой кислоты, содержащая области cPPT и CTS. Иллюстративная нуклеиновая кислота вируса, содержащего последовательность ДНК Flap дикого типа приведена в SEQ ID NO:121.
[0295] Как используют в настоящем документе, "процент (%) идентичности последовательностей" и "процент идентичности" при использовании по отношению к последовательности нуклеотидов (эталонной последовательности нуклеотидов) определен как процент остатков нуклеотидов в последовательности-кандидате (например, предоставляемые PRE или ген X, такие как модифицированный PRE или вариант гена X), которые идентичны с остатками нуклеотидов в эталонной последовательности после выравнивания последовательностей и внесения, если необходимо, пропусков для достижения максимального процента идентичности последовательностей. Выравнивание с целью определения процента идентичности последовательностей можно проводить различными способами, которые известны специалистам в данной области, например, с использованием общедоступного компьютерного программного обеспечения, такого как программное обеспечение BLAST, BLAST-2, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области могут определять подходящие для выравнивания последовательностей параметры, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания сравниваемых полноразмерных последовательностей.
[0296] Как используют в настоящем документе, "в положении, соответствующем" или описание того, что нуклеотиды, положения аминокислот или областей "соответствуют" нуклеотидам, положениям аминокислот или областям в описываемой последовательности, как указано в списке последовательностей, относится к положениям нуклеотидов или аминокислот или области или домена, содержащих нуклеотиды или аминокислоты, идентифицированные при выравнивании с описанной последовательностью для максимизации процента идентичности с использованием стандартного алгоритма выравнивания, такого как алгоритм GAP. Иллюстративные описанные соответствующие остатки или области можно идентифицировать посредством выравнивания последовательности с иллюстративной последовательностью PRE, приведенной в SEQ ID NO:1 (или SEQ ID NO:125, которая представляет собой остатки 1-589 SEQ ID NO:1). Посредством выравнивания последовательностей специалист в данной области может идентифицировать соответствующие остатки, например, с использованием консервативных и идентичных остатков аминокислот в качестве направляющих. Как правило, для идентификации соответствующих положений последовательности аминокислот выравнивают так, чтобы получить совпадение наивысшего порядка (см., например,: Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; и Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; Carrillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48: 1073). На фигурах 2A-2E приведены примеры иллюстративных выравниваний и идентификации иллюстративных соответствующих остатков.
[0297] Как используют в настоящем документе, термин "вектор" относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной к размножению другой нуклеиновой кислоты с которой она лигирована. Термин включает вектор в виде самореплицирующейся структуры нуклеиновой кислоты, а также вектор, встроенный в геном клетки-хозяина, в которую его ввели. Определенные векторы способны к контролю экспрессии нуклеиновых кислот, с которыми они функционально связаны. Такие векторы обозначают в настоящем документе как "экспрессирующие векторы". В числе векторов находятся вирусные векторы, такие как лентивирусные векторы.
[0298] Термины "клетка-хозяин", "линия клеток-хозяев" и "культура клеток-хозяев" используют взаимозаменяемо, и они относятся к клеткам, в которые введены экзогенные нуклеиновые кислоты, включая потомство таких клеток. Клетки-хозяева включают "трансформанты" и "трансформированные клетки", которые включают первичные трансформированные клетки и потомство, получаемое из них, независимо от количества пересевов. Потомство может не являться полностью идентичным родительским клеткам по содержанию нуклеиновых кислот, но может содержать мутации. В настоящее изобретение включено мутантное потомство, которое выполняет ту же функцию или обладает такой же биологической активностью, как продемонстрирована или отобрана у исходно трансформированных клеток.
[0299] Как используют в настоящем документе, если из контекста явно не следует иначе, формы единственного числа включают указание на множественное число. Например, формы единственного числа означают "по меньшей мере один" или "один или несколько". Следует понимать, что аспекты и варианты, описываемые в настоящем документе, включают аспекты и варианты, "состоящие" и/или "по существу состоящие" из аспектов и вариантов.
[0300] На всем протяжении настоящей заявки, различные аспекты заявляемого объекта изобретения присутствуют в формате диапазонов. Следует понимать, что описание в формате диапазонов приведено исключительно для удобства и краткости, и его не следует рассматривать, как неизменное ограничение области заявляемого объекта изобретения. Таким образом, описание диапазона следует рассматривать, как конкретно описывающего все возможные поддиапазоны, а также отдельные числовые значения в этом диапазоне. Например, когда приводят диапазон значений, следует понимать, что в заявляемый объект изобретения включено каждое промежуточное значение между верхним и нижним пределом этого диапазона и любое другое указанное или промежуточное значение в этом указанном диапазоне. Верхний и нижний пределы этих меньших диапазонов можно независимо включать в эти меньшие диапазоны, и они также включены в заявляемй объект изобретения, с учетом любого конкретно исключенного предела в указанном диапазоне. Когда указанный диапазон включает один или оба предела, диапазоны, где исключен любой или оба из этих включенных пределов, также включены в заявляемый объект изобретения. Это применимо вне зависимости от ширины диапазона.
[0301] Как используют в настоящем документе, термин "приблизительно" относится к стандартному диапазону ошибок для соответствующего значения хорошо известному специалисту в этой области техники. Указание на "приблизительные" значение или параметр в настоящем документе включает (и описывает) варианты осуществления, которые относятся к самому этому значению или параметру. Например, описание, относящееся к "приблизительно X" включает описание "X".
[0302] Как используют в настоящем документе, композиция относится к любой смеси двух или более продуктов, веществ или соединений, включая клетки. Она может представлять собой раствор, суспензию, жидкость, порошок, пасту, водную композицию, неводную композицию или любое их сочетание.
[0303] Как используют в настоящем документе, "индивидуум" представляет собой млекопитающее, такое как человек или другое животное, и, как правило, он представляет собой человека.
[0304] Если не определено иначе, полагают, что все специализированные термины, обозначения и другие технические и научные термины или терминология, используемые в настоящем документе, обладают тем же значением, как обычно понимает специалист в области, к которой принадлежит заявляемый объект изобретения. В некоторых случаях для ясности и/или для справки в настоящем документе определены термины с понимаемыми как обычно значениями, и включение таких определений в настоящий документ не обязательно следует рассматривать, как отражение существенного отличия по сравнению с тем, что общепринято в данной области.
[0305] Все публикации, включая патентные документы, научные статьи и базы данных, указанные в настоящей заявке, полностью включены в качестве ссылки для всех целей в той же степени как если бы каждая конкретная публикация была отдельно включена в качестве ссылки. Если определение, приведенное в настоящем документе отличается от или иным образом не соответствует определению, приводимому в патентах, заявках, опубликованных заявках и других публикациях, которые включены в настоящий документ в качестве ссылки, определение, приводимое в настоящем документе, имеет приоритет над определениями, которые включены в настоящий документ в качестве ссылки.
[0306] Заголовки разделов, используемые в настоящем документе, сделаны исключительно в организационных целях, и их не следует рассматривать, как ограничения описываемого объекта изобретения.
III. Иллюстративные варианты осуществления
[0307] В числе вариантов осуществления, предоставляемых в настоящем документе, находятся:
1. Полинуклеотид, содержащий:
нуклеиновую кислоту, кодирующую рекомбинантный белок;
модифицированный посттранскрипционный регуляторный элемент (PRE), функционально связанный с указанной нуклеиновой кислотой, где указанный модифицированный PRE содержит вариант гена X вируса гепатита дикого типа или немодифицированный гена X вируса гепатита, где указанный вариант гена X содержит стоп-кодон, не присутствующий в гене X дикого типа или немодифицированном гене X.
2. Полинуклеотид по варианту осуществления 1, где стоп-кодон содержит по меньшей мере один стоп-кодон, выбранный из:
стоп-кодона, начинающегося в положении в пределах 36 или 24 нуклеотидов в направлении 3'-конца от положения в варианте гена X, соответствующего положению на 5'-конце старт-кодона открытой рамки считывания белка X дикого типа; и/или
стоп-кодона, начинающегося в положении в пределах 36 или 24 нуклеотидов в направлении 3'-конца от положения, соответствующего остатку 411 последовательности посттранскрипционного регуляторного элемента WHV (WPRE), приведенной в SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125, и/или остатку 1503 последовательности WHV, приведенной в качестве SEQ ID NO:2.
3. Полинуклеотид по варианту осуществления 1 или варианту осуществления 2, где указанный вариант гена X не содержит открытой рамки считывания длиной, большей или приблизительно равной 39 нуклеотидам, или длиной, большей или приблизительно равной 27 нуклеотидам.
4. Полинуклеотид, содержащий модифицированный посттранскрипционный регуляторный элемент (PRE), где указанный модифицированный PRE содержит вариант гена X вируса гепатита дикого типа или немодифицированного гена X вируса гепатита, где указанный вариант гена X содержит стоп-кодон, не присутствующий в гене X дикого типа или немодифицированном гене X, где стоп-кодон содержит по меньшей мере один стоп-кодон, выбранный из:
стоп-кодона, начинающегося в положении в пределах 32 или 30 нуклеотидов в направлении 3'-конца от положения в варианте гена X, соответствующего положению на 5'-конце старт-кодона открытой рамки считывания белка X дикого типа; и/или
стоп-кодона, начинающегося в положении в пределах 32 или 30 нуклеотидов в направлении 3'-конца от положения в варианте гена X, соответствующего остатку 411 последовательности посттранскрипционного регуляторного элемента WHV (WPRE), приведенной в SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125, и/или остатку 1503 последовательности WHV, приведенной в качестве SEQ ID NO:2.
5. Полинуклеотид по варианту осуществления 4, где указанный вариант гена X содержит открытую рамку считывания длиной, меньшей или равной 33 нуклеотидам.
6. Полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 1-5, где указанный стоп-кодон включает множество стоп-кодонов.
7. Полинуклеотид по варианту осуществления 6, где указанное множество стоп-кодонов содержит по меньшей мере один стоп-кодон в каждой рамке считывания, присутствующей в указанном варианте гена X, и/или содержит по меньшей мере два стоп-кодона в одной рамке считывания.
8. Полинуклеотид, содержащий модифицированный посттранскрипционный регуляторный элемент (PRE), где указанный модифицированный PRE содержит вариант гена X вируса гепатита дикого типа или немодифицированного гена X вируса гепатита, где указанный вариант гена X содержит множество стоп-кодонов, не присутствующий в гене X дикого типа или немодифицированном гене X.
9. Полинуклеотид по варианту осуществления 8, где множество стоп-кодонов содержит по меньшей мере один стоп-кодон, выбранный из:
стоп-кодона, начинающегося в положении в пределах 36, 30 или 24 нуклеотидов в направлении 3'-конца от положения в варианте гена X, соответствующего положению на 5'-конце старт-кодона открытой рамки считывания белка X дикого типа; и/или
стоп-кодона, начинающегося в положении в пределах 36, 30 или 24 нуклеотидов в направлении 3'-конца от положения в варианте гена X, соответствующего остатку 411 последовательности посттранскрипционного регуляторного элемента WHV (WPRE), приведенной в SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125, и/или остатку 1503 последовательности WHV, приведенной в качестве SEQ ID NO:2.
10. Полинуклеотид по варианту осуществления 9, где указанный вариант гена X не содержит открытой рамки считывания длиной, большей или приблизительно равной 39 нуклеотидам, длиной, большей или приблизительно равной 33 нуклеотидам, или длиной, большей или приблизительно равной 27 нуклеотидам.
11. Полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 8-10, где вариант гена X содержит по меньшей мере 2 стоп-кодона, по меньшей мере 3 стоп-кодона или по меньшей мере 4 стоп-кодона.
12. Полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 8-11, где вариант гена X содержит стоп-кодон в каждой рамке считывания, присутствующей в указанном варианте гена X.
13. Полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 4-12, дополнительно содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую рекомбинантный белок, функционально связанный с модифицированным PRE.
14. Полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 1-13, где стоп-кодон содержит по меньшей мере один стоп-кодон, выбранный из:
стоп-кодона, начинающегося в положении в пределах или в пределах по меньшей мере 9, 12, 15 или 18 нуклеотидов в направлении 3'-конца от положения в варианте гена X, соответствующего положению на 5'-конце старт-кодона открытой рамки считывания белка X дикого типа или немодифицированного белка X; и/или
стоп-кодона, начинающегося в положении в пределах или в пределах по меньшей мере 9, 12, 15 или 18 нуклеотидов в направлении 3'-конца от положения в варианте гена X, соответствующего остатку 411 последовательности посттранскрипционного регуляторного элемента WHV (WPRE), приведенной в SEQ ID NO:1, и/или остатку 1503 последовательности WHV, приведенной в качестве SEQ ID NO:2.
15. Полинуклеотид по варианту осуществления 14, где указанный вариант гена X не содержит открытой рамки считывания длиной, большей или приблизительно равной 21 нуклеотиду, длиной, большей или приблизительно равной 18 нуклеотидам, длиной, большей или приблизительно равной 15 нуклеотидам, или длиной, большей или приблизительно равной 12 нуклеотидам.
16. Полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 1-15, где:
модифицированный PRE содержит шпильку субэлемента бета, соответствующую остаткам нуклеотидов 448-470 SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125; и/или
модифицированный PRE не содержит замен нуклеотидов в положениях в пределах шпильки субэлемента бета, соответствующих нуклеотидам 448-470 SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125; и/или
указанный стоп-кодон или стоп-кодоны не содержат нуклеотидов в положениях в пределах шпильки субэлемента бета, соответствующих нуклеотидам 448-470 SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125.
17. Полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 1-16, где указанный стоп-кодон выбран из стоп-кодонов амбер (CAT), охра (TAA) или опал (TGA).
18. Полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 1-17, где указанный стоп-кодон внесен посредством замены, делеции или вставки нуклеотидов.
19. Полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 1-18, где указанный стоп-кодон выбран из:
стоп-кодона, начинающегося в положении 9 в направлении 3'-конца от положения в варианте гена X, соответствующего положению на 5'-конце старт-кодона открытой рамки считывания белка X дикого типа или немодифицированного белка X, и/или в положении нуклеотида, соответствующем положению 420 в последовательности, приведенной в SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125;
стоп-кодона, начинающегося в положении 13 в направлении 3'-конца от положения в варианте гена X, соответствующего положению на 5'-конце старт-кодона открытой рамки считывания белка X дикого типа или немодифицированного белка X, и/или в положении нуклеотида, соответствующем положению 424 в последовательности, приведенной в SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:125;
стоп-кодона, начинающегося в положении 17 в направлении 3'-конца от положения в варианте гена X, соответствующего положению на 5'-конце старт-кодона открытой рамки считывания белка X дикого типа или немодифицированного белка X, и/или в положении нуклеотида, соответствующем положению 428 в последовательности, приведенной в SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:125;
стоп-кодона, начинающегося в положении 21 в направлении 3'-конца от положения в варианте гена X, соответствующего положению на 5'-конце старт-кодона открытой рамки считывания белка X дикого типа или немодифицированного белка X, и/или в положении нуклеотида, соответствующем положению 432 в последовательности, приведенной в SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:125.
20. Полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 17-19, где указанный стоп-кодон представляет собой стоп-кодон амбер (CAT) или опал (TGA).
21. Полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 1-20, где:
указанная длина варианта гена X составляет не более 180 нуклеотидов, или длина составляет не более или составляет приблизительно 210 нуклеотидов; и/или
указанная длина варианта гена X составляет по меньшей мере или приблизительно 90 нуклеотидов, или длина составляет по меньшей мере приблизительно 120 нуклеотидов, или длина составляет по меньшей мере или приблизительно 180 нуклеотидов.
22. Полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 1-21, где:
указанный вариант гена X представляет собой вариант гена X вируса гепатита млекопитающих дикого типа или немодифицированного гена X вируса гепатита млекопитающих или его укороченную часть, которая необязательно представляет собой укороченную часть, присутствующую в PRE; или
модифицированный PRE содержит вариант гена X, содержащий SEQ ID NO:28.
23. Полинуклеотид по варианту осуществления 22, где указанный ген X вируса гепатита млекопитающих дикого типа или немодифицированный ген X вируса гепатита млекопитающих представляет собой ген X вируса гепатита сурков (WHV) дикого типа или его укороченную часть, которая необязательно представляет собой укороченную часть, присутствующую в PRE дикого типа или немодифицированном PRE.
24. Полинуклеотид по варианту осуществления 23, где ген X WHV дикого типа, или немодифицированный ген X WHV, или укороченная часть гена X PRE дикого типа, присутствующие в PRE, содержат последовательность нуклеотидов, приведенную в качестве нуклеотидов 411-592 любой из SEQ ID NO: 1 и 12-20 или приведенные как нуклеотиды 411-589 SEQ ID NO:125.
25. Полинуклеотид по варианту осуществления 23 или варианту осуществления 24, где указанный ген X WHV дикого типа содержит последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:9 или представляет собой его укороченную часть, которая необязательно приведена в SEQ ID NO:10 или представляет собой укороченную часть, присутствующую в PRE дикого типа или немодифицированном PRE.
26. Полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 1-25, где указанный модифицированный PRE содержит по меньшей мере два или по меньшей мере три цис-действующих посттранскрипционных регуляторных субэлемента PRE вируса гепатита дикого типа или немодифицированного PRE вируса гепатита или их функциональный вариант(ы).
27. Полинуклеотид по варианту осуществления 26, где указанные по меньшей мере два или по меньшей мере три субэлемента содержат субэлемент альфа PRE дикого типа или немодифицированного PRE или его функциональный вариант, функциональный вариант субэлемента бета PRE дикого типа или немодифицированного PRE и/или субэлемент гамма PRE дикого типа или немодифицированного PRE или его функциональный вариант.
28. Полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 1-27, где указанный модифицированный PRE содержит субэлемент альфа PRE вируса гепатита дикого типа или немодифицированного PRE вируса гепатита или его функциональный вариант и функциональный вариант субэлемента бета PRE дикого типа или немодифицированного PRE.
29. Полинуклеотид по варианту осуществления 27 или варианту осуществления 28, где указанный субэлемент альфа содержит последовательность SEQ ID NO:3 или ее вариант, указанный субэлемент бета содержит вариант последовательности SEQ ID NO:6, и/или указанная субъединица гамма содержит последовательность SEQ ID NO:8 или ее вариант.
30. Полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 1-29, где модифицированный PRE по сравнению с PRE вируса гепатита дикого типа или немодифицированного PRE вируса гепатита, который представляет собой PRE вируса гепатита млекопитающих дикого типа, содержит модификации нуклеотидов.
31. Полинуклеотид по варианту осуществления 30, где указанный PRE вируса гепатита млекопитающих дикого типа или немодифицированный PRE вируса гепатита млекопитающих содержит последовательность нуклеотидов, приведенную в любой из SEQ ID NO: 1, 12-27 и 125.
32. Полинуклеотид по варианту осуществления 30 или варианту осуществления 31, где указанный PRE дикого типа или немодифицированный PRE вируса гепатита млекопитающих представляет собой PRE вируса гепатита сурков дикого типа (WPRE).
33. Полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 1-32, где PRE вируса гепатита дикого типа или немодифицированный PRE вируса гепатита содержит:
a) последовательность нуклеотидов, приведенную в SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125 или последовательность нуклеотидов, которая по меньшей мере на 94% идентична с последовательностью SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125, которая проявляет по существу такую же, например, по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% от посттранскрипционной активности SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125; и
b) модифицированный PRE, содержащий часть последовательности нуклеотидов a), где эта часть проявляет или сохраняет посттранскрипционную активность.
34. Полинуклеотид по варианту осуществления 33, где PRE вируса гепатита дикого типа или немодифицированный PRE вируса гепатита содержит последовательность нуклеотидов, которая по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентична с последовательностью SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125.
35. Полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 1-34, где указанный PRE вируса гепатита дикого типа или немодифицированный PRE вируса гепатита содержит последовательность нуклеотидов, приведенную в любой из SEQ ID NO: 1, 12-20 и 125.
36. Полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 1-35, где указанный PRE вируса гепатита дикого типа или немодифицированный PRE вируса гепатита содержит последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125.
37. Полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 1-36, где указанный вариант гена X содержит старт-кодон, начинающийся в положении, соответствующем положению 411 SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125.
38. Полинуклеотид по варианту осуществления 37, где указанный старт-кодон представляет собой старт-кодон ATG.
39. Полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 1-38, где вариант гена X дополнительно содержит промотор, функционально связанный с указанным вариантом гена X.
40. Полинуклеотид по варианту осуществления 39, где указанный промотор представляет собой промотор гена X дикого типа или немодифицированного гена X, содержащий последовательность, приведенную в SEQ ID NO:11, или последовательность промотора гена X WHV дикого типа.
41. Полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 1-40, где модифицированный PRE выбран из:
a) модифицированного PRE, содержащего последовательность нуклеотидов, которая по меньшей мере на 65% идентична с последовательностью SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125, где указанный модифицированный PRE содержит вариант гена X, содержащий по меньшей мере один стоп-кодон, не присутствующий в SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125; и
b) модифицированного PRE, содержащего часть последовательности нуклеотидов a), где указанная часть содержит вариант гена X, содержащий по меньшей мере один стоп-кодон, где эта часть проявляет посттранскрипционную активность.
42. Полинуклеотид по варианту осуществления 41, где модифицированный PRE содержит последовательность нуклеотидов, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична с последовательностью SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125.
43. Полинуклеотид по варианту осуществления 41 или варианту осуществления 42, где вариант гена X содержит по меньшей мере 2 стоп-кодона, по меньшей мере 3 стоп-кодона или по меньшей мере 4 стоп-кодона.
44. Полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 41-43, где вариант гена X содержит стоп-кодон в каждой рамке считывания, присутствующей в указанном варианте гена X.
45. Полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 1-44, где вариант гена X содержит последовательность нуклеотидов, приведенную в любой из SEQ ID NO: 44-58 или SEQ ID NO: 141-155, и/или модифицированный PRE содержит последовательность нуклеотидов, приведенную в любой из SEQ ID NO:29-43 или SEQ ID NO: 126-140.
46. Полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 1-45, где модифицированный PRE в дополнение по меньшей мере к одному стоп-кодону, не присутствующему в PRE дикого типа или немодифицированном PRE, не содержит никаких модификаций.
47. Полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 1-46, где модифицированный PRE в дополнение по меньшей мере к одному стоп-кодону, не присутствующему в PRE дикого типа или немодифицированном PRE, содержит дополнительные модификации.
48. Полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 1-47, где указанный вариант гена X дополнительно содержит вариант старт-кодона, содержащий один или несколько отличающихся нуклеотидов по сравнению со старт-кодоном гена X дикого типа или немодифицированного гена X вируса гепатита и/или по сравнению со старт-кодоном, соответствующим положениям нуклеотидов 411-413 SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125.
49. Полинуклеотид по варианту осуществления 48, где указанные одно или несколько отличий приводят к ограничению или предотвращению инициации трансляции с указанного старт-кодона.
50. Полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 47-49, где указанный вариант гена X содержит последовательность нуклеотидов, приведенную в любой из SEQ ID NO: 74-88 или 171-185, и/или модифицированный PRE содержит последовательность нуклеотидов, приведенную в любой из SEQ ID NO:59-73 или 156-170.
51. Полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 1-50, где указанный вариант гена X содержит вариант промотора, функционально связанный с указанным вариантом гена X, где указанный вариант промотора содержит один или несколько отличающихся нуклеотидов по сравнению с промотором гена X дикого типа или немодифицированного гена X вируса гепатита и/или по сравнению с промотором SEQ ID NO:11.
52. Полинуклеотид по варианту осуществления 51, где указанные одно или несколько отличий приводят к ограничению или предотвращению транскрипции с указанного промотора.
53. Полинуклеотид по варианту осуществления 51 или 52, где указанный модифицированный PRE содержит последовательность нуклеотидов, приведенную в любой из SEQ ID NO: 89-118 или 186-215.
54. Полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 1-53, где
после введения в эукариотическую клетку не происходит продукции полипептида длиной более 12, 11, 10, 9 или 8 аминокислот, кодируемого указанным вариантом гена X; и/или
указанный полинуклеотид не способен к продукции полипептида длиной более 12, 11, 10, 9 или 8 аминокислот, кодируемого указанным вариантом гена X.
55. Полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 1-54, где указанный модифицированный PRE кодирует РНК, которая обеспечивает экспорт РНК из ядра и/или увеличивает стабильность иРНК.
56. Полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 1-55, где указанный модифицированный PRE кодирует полинуклеотид РНК, который обеспечивает экспорт РНК из ядра и/или увеличивает стабильность иРНК, где указанные обеспечение экспорта РНК из ядра и/или стабильности иРНК увеличивают экспрессию рекомбинантного белка.
57. Полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 1-56, где модифицированный PRE сохраняет посттранскрипционную активность соответствующего PRE вируса гепатита дикого типа, или немодифицированного PRE вируса гепатита, и/или PRE, приведенного в SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:119, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:125 и/или SEQ ID NO:216, который в некоторых случаях обладает по меньшей мере или приблизительно по меньшей мере 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% посттранскрипционной активности PRE вируса гепатита дикого типа, или немодифицированного PRE вируса гепатита, и/или PRE, приведенного в SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:119, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:125 или SEQ ID NO:216.
58. Полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 1-57, где вариант гена X дополнительно содержит последовательность, кодирующую сигнал посттрансляционной модификации, не присутствующий в гене X вируса гепатита дикого типа или немодифицированном гене X вируса гепатита.
59. Полинуклеотид, содержащий модифицированный посттранскрипционный регуляторный элемент (PRE), где указанный модифицированный PRE содержит вариант гена X вируса гепатита дикого типа или немодифицированного гена X вируса гепатита, где указанный вариант гена X содержит последовательность, кодирующую сигнал посттрансляционной модификации, не присутствующий в гене X вируса гепатита дикого типа или немодифицированном гене X вируса гепатита.
60. Полинуклеотид по варианту осуществления 58 или варианту осуществления 59, где указанный сигнал посттрансляционной модификации содержит участок убиквитинилирования.
61. Полинуклеотид по варианту осуществления 58 или варианту осуществления 59, где указанный сигнал посттрансляционной модификации содержит:
первый кодон, начинающийся в положении в пределах или в пределах по меньшей мере 2, 3, 4, 5 или 6 нуклеотидов в направлении 3'-конца от положения в варианте гена X, соответствующего положению на 5'-конце старт-кодона открытой рамки считывания белка X, где первый кодон кодирует остаток глицина, аргинина, глутаминовой кислоты, фенилаланина, аспартата, цистеина, лизина, аспарагина, серина, тирозина, триптофана, гистидина или лейцина в соответствии с правилом N-конца; и необязательно
второй кодон, начинающийся в положении в пределах или в пределах по меньшей мере 2, 3, 4, 5 или 6 нуклеотидов в направлении 3'-конца от положения в варианте гена X, соответствующего положению на 5'-конце старт-кодона открытой рамки считывания белка X, где второй кодон кодирует остаток глутаминовой кислоты или аспарагина в соответствии с правилом N-конца.
62. Полинуклеотид по варианту осуществления 58 или варианту осуществления 59, где указанный сигнал посттрансляционной модификации содержит одну или несколько последовательностей PEST.
63. Полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 59-62, дополнительно содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую рекомбинант или белок, функционально связанный с модифицированным PRE.
64. Полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 59-63, где:
указанный вариант гена X, содержащий последовательность, кодирующую сигнал посттрансляционной модификации, содержит шпильку субэлемента бета, соответствующую остаткам нуклеотидов 448-470 SEQ ID NO:1; и/или
указанный вариант гена X, содержащий последовательность, кодирующую сигнал посттрансляционной модификации, не содержит замен нуклеотидов в положениях в пределах шпильки субэлемента бета, соответствующих нуклеотидам 448-470 SEQ ID NO:1.
65. Полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 59-64, где:
указанная длина варианта гена X составляет не более 180 нуклеотидов, или длина составляет не более или составляет приблизительно 210 нуклеотидов; и/или
указанная длина варианта гена X составляет по меньшей мере или приблизительно 90 нуклеотидов, или длина составляет по меньшей мере приблизительно 120 нуклеотидов, или длина составляет по меньшей мере или приблизительно 180 нуклеотидов.
66. Полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 59-65, где указанный вариант гена X представляет собой вариант гена X вируса гепатита млекопитающих дикого типа или немодифицированного гена X вируса гепатита млекопитающих или его укороченную часть, которая необязательно представляет собой укороченную часть, присутствующую в PRE.
67. Полинуклеотид по варианту осуществления 66, где указанный ген X вируса гепатита млекопитающих дикого типа или немодифицированный ген X вируса гепатита млекопитающих представляет собой ген X вируса гепатита сурков (WHV) дикого типа или его укороченную часть, которая необязательно представляет собой укороченную часть, присутствующую в PRE дикого типа или немодифицированном PRE.
68. Полинуклеотид по варианту осуществления 67, где ген X WHV дикого типа, или немодифицированный ген X WHV, или укороченная часть гена X PRE дикого типа, присутствующая в PRE, содержит последовательность нуклеотидов, приведенную в качестве нуклеотидов 1503-1928 SEQ ID NO:2, последовательность нуклеотидов, приведенную в качестве нуклеотидов 411-592 любой из SEQ ID NO: 1 и 12-20, или последовательность нуклеотидов, приведенную в качестве нуклеотидов 411-589 SEQ ID NO:125.
69. Полинуклеотид по варианту осуществления 67 или варианту осуществления 68, где указанный ген X WHV дикого типа содержит последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:9 или представляет собой ее укороченную часть, которая необязательно приведена в SEQ ID NO:10, или представляет собой укороченную часть, присутствующую в PRE дикого типа или немодифицированном PRE.
70. Полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 59-69, где указанный модифицированный PRE содержит по меньшей мере два или по меньшей мере три цис-действующих посттранскрипционных регуляторных субэлемента PRE вируса гепатита дикого типа или немодифицированного PRE вируса гепатита или их функциональный вариант(ы).
71. Полинуклеотид по варианту осуществления 70, где указанные по меньшей мере два или по меньшей мере три субэлемента содержат субэлемент альфа PRE дикого типа или немодифицированного PRE или его функциональный вариант, функциональный вариант субэлемента бета PRE дикого типа или немодифицированного PRE и/или субэлемент гамма PRE дикого типа или немодифицированного PRE или его функциональный вариант.
72. Полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 59-71, где указанный модифицированный PRE содержит субэлемент альфа PRE вируса гепатита дикого типа или немодифицированного PRE вируса гепатита или его функциональный вариант и функциональный вариант субэлемента бета PRE дикого типа или немодифицированного PRE.
73. Полинуклеотид по варианту осуществления 71 или варианту осуществления 72, где указанный субэлемент альфа содержит последовательность SEQ ID NO:3 или ее вариант, где указанный субэлемент бета содержит вариант последовательности SEQ ID NO:6, и/или указанная субъединица гамма содержит последовательность SEQ ID NO:8 или ее вариант.
74. Полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 1-73, где модифицированный PRE содержит модификации нуклеотидов по сравнению с PRE вируса гепатита дикого типа или немодифицированного PRE вируса гепатита, который представляет собой PRE вируса гепатита млекопитающих дикого типа.
75. Полинуклеотид по варианту осуществления 74, где указанный PRE вируса гепатита млекопитающих дикого типа или немодифицированный PRE вируса гепатита млекопитающих содержит последовательность нуклеотидов, приведенную в любой из SEQ ID NO: 1, 12-27 и 125.
76. Полинуклеотид по варианту осуществления 74 или варианту осуществления 75, где указанный PRE дикого типа или немодифицированный PRE вируса гепатита млекопитающих представляет собой PRE вируса гепатита сурков дикого типа (WPRE).
77. Полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 1-76, где PRE вируса гепатита дикого типа или немодифицированный PRE вируса гепатита содержит:
a) последовательность нуклеотидов, приведенную в SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125, или последовательность нуклеотидов, которая по меньшей мере на 94% идентична с последовательностью SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125, которая проявляет по существу такую же, например, по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% от посттранскрипционной активности SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125; и
b) модифицированный PRE, содержащий часть последовательности нуклеотидов a), где эта часть проявляет или сохраняет посттранскрипционную активность.
78. Полинуклеотид по варианту осуществления 77, где PRE вируса гепатита дикого типа или немодифицированный PRE вируса гепатита содержит последовательность нуклеотидов, которая по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентична с последовательностью SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125.
79. Полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 59-78, где указанный PRE вируса гепатита дикого типа или немодифицированный PRE вируса гепатита содержит последовательность нуклеотидов, приведенную в любой из SEQ ID NO: 1, 12-20 и 125.
80. Полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 59-79, где указанный PRE вируса гепатита дикого типа или немодифицированный PRE вируса гепатита содержит последовательность нуклеотидов SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125.
81. Полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 59-80, где указанный вариант гена X содержит старт-кодон, начинающийся в положении, соответствующем положению 411 SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125.
82. Полинуклеотид по варианту осуществления 81, где указанный старт-кодон представляет собой старт-кодон ATG.
83. Полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 59-82, где вариант гена X дополнительно содержит промотор, функционально связанный с указанным вариантом гена X.
84. Полинуклеотид по варианту осуществления 83, где указанный промотор представляет собой промотор гена X дикого типа или немодифицированного гена X, содержащий последовательность, приведенную в SEQ ID NO:11, или последовательность промотора гена X WHV дикого типа.
85. Полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 59-84, где модифицированный PRE выбран из:
a) модифицированного PRE, содержащего последовательность нуклеотидов, которая по меньшей мере на 65% идентична с последовательностью SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125, где указанный модифицированный PRE содержит вариант гена X, содержащий последовательность, кодирующую сигнал посттрансляционной модификации, не присутствующий в SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125; и
b) модифицированного PRE, содержащего часть последовательности нуклеотидов a), где указанная часть содержит вариант гена X, содержащий последовательность, кодирующую посттрансляционную модификацию, где эта часть проявляет посттранскрипционную активность.
86. Полинуклеотид по варианту осуществления 85, где модифицированный PRE содержит последовательность нуклеотидов, которая по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична с последовательностью SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:125.
87. Полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 1-86, где вариант гена X содержит до 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 замен нуклеотидов.
88. Полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 59-87, где модифицированный PRE в дополнение к последовательности, кодирующей сигнал посттрансляционной модификации, не содержит никаких модификаций.
89. Полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 59-88, где модифицированный PRE в дополнение к последовательности, кодирующей сигнал посттрансляционной модификации, не присутствующий в гене X вируса гепатита дикого типа или немодифицированном гене X вируса гепатита, содержит дополнительную модификацию(и).
90. Полинуклеотид по варианту осуществления 89, где дополнительная модификация(и) присутствует в варианте гена X.
91. Полинуклеотид по варианту осуществления 90, где дополнительная модификация(и) приводит к варианту гена X, кодирующему неактивный белок X и/или укороченный белок X.
92. Полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 59-91, где указанный модифицированный PRE кодирует РНК, которая обеспечивает экспорт РНК из ядра и/или увеличивает стабильность иРНК.
93. Полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 59-92, где указанный модифицированный PRE кодирует полинуклеотид РНК, который обеспечивает экспорт РНК из ядра и/или увеличивает стабильность иРНК, где указанные обеспечение экспорта РНК из ядра и/или стабильности иРНК увеличивают экспрессию рекомбинантного белка.
94. Полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 59-93, где модифицированный PRE сохраняет посттранскрипционную активность соответствующего PRE вируса гепатита дикого типа, или немодифицированного PRE вируса гепатита, и/или PRE, приведенного в SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:119, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:125 и/или SEQ ID NO:216, который в некоторых случаях обладает по меньшей мере или приблизительно по меньшей мере 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% посттранскрипционной активности PRE вируса гепатита дикого типа, или немодифицированного PRE вируса гепатита, и/или PRE, приведенного в SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:119, SEQ ID NO:120, SEQ ID NO:125 или SEQ ID NO:216.
95. Полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту вируса, содержащую вариант Flap, где вариант Flap несет делецию всех или части нуклеотидов, соответствующих областям центрального полипуринового тракта (cPPT) и/или центральной последовательности терминации (CTS) последовательности Flap дикого типа или последовательности немодифицированного Flap.
96. Полинуклеотид по варианту осуществления 95, где вариант Flap несет делецию всех или части, которая может представлять собой непрерывную часть, нуклеотидов, соответствующих cPPT и CTS.
97. Полинуклеотид варианта Flap по варианту осуществления 95 или 96, где:
последовательность Flap дикого типа или последовательность немодифицированного Flap содержит или приблизительно содержит от 80 до 200 последовательных нуклеотидов, содержащих области cPPT или CTS ретровируса, который необязательно представляет собой лентивирус, который необязательно представляет собой ВИЧ-1; и/или
последовательность Flap дикого типа или последовательность немодифицированного Flap содержит a) последовательность нуклеотидов, приведенную в SEQ ID NO:121; b) последовательность нуклеотидов, содержащих последовательность по меньшей мере на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичную с последовательностью нуклеотидов, приведенной в SEQ ID NO:121, которая содержит области cPPT и/или CTS; или c) непрерывную часть a) или b), которая содержит области cPPT и/или CTS.
98. Полинуклеотид варианта Flap по любому из вариантов осуществления 95-97, где:
вариант Flap несет делецию всех или части, которая может представлять собой непрерывную часть, нуклеотидов, соответствующих нуклеотидам области cPPT, приведенной в SEQ ID NO:123; и/или
вариант Flap несет делецию всех или части, которая может представлять собой непрерывную часть, нуклеотидов, соответствующих области CTS, приведенной в SEQ ID NO:124.
99. Полинуклеотид варианта Flap по любому из вариантов осуществления 95-98, где вариант Flap несет делецию всех или части, которая может представлять собой непрерывную часть, области cPPT, приведенной в SEQ ID NO:123, и несет делецию всех или части, которая может представлять собой непрерывную часть, области CTS, приведенной в SEQ ID NO:124.
100. Полинуклеотид варианта Flap по любому из вариантов осуществления 95-99, где:
нуклеиновая кислота вируса, содержащая вариант Flap, содержит последовательность нуклеотидов, которая по меньшей мере на 65%, 70%, 75%, 80%, 85% или 90% идентична с последовательностью SEQ ID NO:121, где у указанного варианта Flap отсутствует все или часть областей cPPT и/или CTS; и/или
нуклеиновая кислота вируса содержит вариант Flap, содержащий последовательность, приведенную в SEQ ID NO:122.
101. Полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 1-94, дополнительно содержащий полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту вируса, содержащую вариант Flap по любому из вариантов осуществления 95-100.
102. Полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 95-101, содержащий:
вариант Flap, содержащий последовательность SEQ ID NO:122 или последовательность по меньшей мере на или приблизительно на 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичную с последовательностью SEQ ID NO:122; и
последовательность SEQ ID NO:29 или SEQ ID NO:126 или последовательность по меньшей мере на или приблизительно на 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичную с последовательностью SEQ ID NO:29 или SEQ ID NO:126; и
необязательно, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую рекомбинантный белок.
103. Полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 1-94 и 101-102, где рекомбинантный белок содержит рекомбинантный рецептор.
104. Полинуклеотид по варианту осуществления 103, где рекомбинантный рецептор представляет собой антигенраспознающий рецептор и/или химерный рецептор.
105. Полинуклеотид по варианту осуществления 104, где рекомбинантный рецептор представляет собой функциональный не являющийся TCR антигенраспознающий рецептор или трансгенный TCR.
106. Полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 103-105, где рекомбинантный рецептор представляет собой химерный антигенраспознающий рецептор (CAR).
107. Экспрессирующая кассета, содержащая полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 1-106 и промотор, функционально связанный с нуклеиновой кислотой, кодирующей рекомбинантный белок.
108. Вектор, содержащий полинуклеотид по любому из вариантов осуществления 1-106 или экспрессирующую кассета по варианту осуществления 107.
109. Вектор по варианту осуществления 108, который представляет собой вирусный вектор.
110. Вектор по варианту осуществления 109, где вирусный вектор представляет собой лентивирусный вектор, который необязательно получают из ВИЧ-1.
111. Вектор по варианту осуществления 109, где вирусный вектор представляет собой ретровирусный вектор.
112. Клетка, содержащая экспрессирующую кассету по варианту осуществления 107 или вектор по любому из вариантов осуществления 108-111.
113. Клетка по варианту осуществления 112, где клетка представляет собой T-клетку, естественную киллерную (NK) клетку, iPS клетку или получаемую из iPS клетку.
114. Вирусная частица, содержащая вектор по любому из вариантов осуществления 108-111.
115. Способ, включающий введение экспрессирующей кассеты по варианту осуществления 107, вектора по любому из вариантов осуществления 108-111 или вирусной частицы по варианту осуществления 114 в клетку, в условиях когда в клетке осуществляется экспрессия рекомбинантного белка.
116. Способ по варианту осуществления 115, где:
указанное введение проводят посредством трансдукции указанной клетки указанным вектором или вирусной частицей;
указанное введение проводят посредством трансфекции указанной клетки указанным вектором; и/или
указанное введение проводят посредством электропорации указанной клетки указанным вектором.
117. Способ по варианту осуществления 116, где рекомбинантный белок экспрессирован на уровне, который увеличен по сравнению с уровнем, достигаемым при введении вектора, который является таким же, но который не содержит модифицированного PRE или не содержит PRE.
118. Клетка, полученная способом по любому из вариантов осуществления 115-117.
119. Фармацевтическая композиция, содержащая клетки по вариантам осуществления 112, 113 или 118 и фармацевтически эффективный носитель.
120. Способ лечения, где способ включает введение индивидууму с заболеванием или патологическим состоянием вектора по любому из вариантов осуществления 108-111, вирусной частицы по варианту осуществления 114, клетки по варианту осуществления 112, 113 или 118 или композиции по варианту осуществления 119.
121. Способ по варианту осуществления 120, где рекомбинантный белок содержит рекомбинантный рецептор, который специфически связывается с лигандом, экспрессируемым при заболевании или патологическом состоянии или соответствующими клетками или тканями.
122. Способ по варианту осуществления 121, где рецептор представляет собой антигенраспознающий рецептор, а лиганд представляет собой антиген, специфичный для заболевания или патологического состояния и/или ассоциированный с ними.
123. Способ по варианту осуществления 122, где заболевание или патологическое состояние представляет собой злокачественную опухоль и аутоиммунное нарушение или инфекционное заболевание.
124. Применение фармацевтической композиции по варианту осуществления 119 для лечения заболевания или патологического состояния.
125. Фармацевтическая композиция по варианту осуществления 119 для применения в получении лекарственного средства для лечения заболевания или патологического состояния.
126. Применение варианта осуществления 124 или фармацевтической композиции по варианту осуществления 125, где рекомбинантный белок, экспрессируемый клеткой, содержит рекомбинантный рецептор, который специфически связывается с лигандом, экспрессируемым при заболевании или патологическом состоянии или соответствующими клетками или тканями.
127. Применение или фармацевтическая композиция по любому из вариантов осуществления 124-126, где рекомбинантный рецептор представляет собой антигенраспознающий рецептор, а лиганд представляет собой антиген, специфичный для заболевания или патологического состояния и/или ассоциированный с ними.
128. Применение или фармацевтическая композиция по любому из вариантов осуществления 124-127, где заболевание или патологическое состояние представляет собой злокачественную опухоль, аутоиммунное нарушение или инфекционное заболевание.
IV. ПРИМЕРЫ
[0308] Приводимые ниже примеры включены исключительно с иллюстративными целями и не предназначены для ограничения объема изобретения.
Пример 1: Модифицированный посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита сурков
tag
tg
a
t
a
g
tga
[0309] Получили иллюстративный полинуклеотид модифицированного посттранскрипционного регуляторного элемента вируса гепатита сурков (WPRE), который содержал модификации по остаткам, соответствующим положениям в иллюстративной последовательности WPRE дикого типа (SEQ ID NO:1). В каждую рамку считывания, соответствующую области SEQ ID NO:1, кодирующей укороченную часть белка X WHV (фрагмент гена X), вводили стоп-кодоны. Конкретно, в этой области, вводили два стоп-кодона в открытой рамке считывания, кодирующей укороченный белок X (начиная с 9 и 21 нуклеотидов от участка, соответствующего положению на 5'-конце старт-кодона гена X), и один в каждую из двух других рамок считывания (начиная с 13 и 17 нуклеотидов от участка, соответствующего положению на 5'-конце старт-кодона). Модифицированный WPRE содержал последовательность нуклеотидов, приведенную в SEQ ID NO:126. В приводимой далее части этой последовательности стоп-кодоны указаны жирным шрифтом, а внесенные мутации относительно SEQ ID NO:1 подчеркнуты: atggctgctcgc (SEQ ID NO:28). Также получили контрольный функциональный модифицированный WPRE, содержащий последовательность, приведенную в SEQ ID NO:216. Этот контрольный функциональный модифицированный WPRE по сравнению с последовательностью WPRE дикого типа SEQ ID NO:1 содержит мутации в области промотора гена X WHV и старт-кодон. Его использовали в ряде вирусных векторов для трансдукции, чтобы продемонстрировать активность, достаточную для стимуляции экспрессии рекомбинантных молекул, кодируемых такими векторами (см., например, "Cloning vector pLV.MCS.WHVPRE, complete sequence", GenBank: JN622008.1; патент США № 7384738).
[0310] Каждый из полинуклеотида модифицированного WPRE, содержащего последовательность нуклеотидов, приведенную в SEQ ID NO:126, и контрольного модифицированного WPRE, содержащего последовательность нуклеотидов, приведенную в SEQ ID NO:216 раздельно встраивали в иллюстративный получаемый из ВИЧ-1 лентивирусный вектор, содержащий мутации в области Flap вируса. Конкретно, лентивирусный вектор, содержащий вариант области Flap, в которой удалены области, соответствующие SEQ ID NO:123 и SEQ ID NO:124, приводил к получению вектора с вариантом Flap с частью, содержащей последовательность нуклеотидов, приведенную в SEQ ID NO:122 (обозначенную Flap -/-).
[0311] Также получали лентивирусный вектор, в который в иллюстративный получаемый из ВИЧ-1 лентивирусный вектор, содержащий полную область Flap, встраивали контрольный модифицированный WPRE с SEQ ID NO:119. Лентивирусный вектор, содержащий полную область Flap (полинуклеотид Flap дикого типа), содержащий последовательность нуклеотидов приведен в SEQ ID NO:121 (обозначен Flap +/+).
[0312] Последовательности, содержащиеся в получаемых лентивирусных векторах, обобщены в таблице 4 ниже:
Таблица 4:
WPRE (SEQ ID NO)
Область Flap
Контрольный модифицированный WPRE, Flap +/+
216
121
Контрольный модифицированный WPRE, Flap -/-
216
122
Модифицированный WPRE, Flap -/-
126
122
gagpol
rev
[0313] Вектор содержал полинуклеотиды, кодирующие химерный антигенраспознающий рецептор и маркер трансдукции, укороченный эпидермальный фактор роста (EGFRt), разделенные линкером T2A (см. патент США № 8802374). Псевдотипированные частицы лентивирусного вектора получали стандартными способами посредством транзиторной трансфекции клеток HEK-293T полученными векторами, плазмидами-помощниками (включающими плазмиды  и плазмиду ) и плазмидой для псевдотипирования и использовали для трансдукции клеток.
Пример 2: Трансдукция клеток вирусными векторами, содержащими модифицированный WPRE
[0314] Частицы лентивирусного вектора, описанные в примере 1 использовали для трансдукции клеток линия клеток фибросаркомы человека (HT1080 ATCC No. CCL-121™) и первичных T-клеток человека. Эффективность трансдукции оценивали, определяя поверхностную экспрессию рекомбинантного маркера EGFRt, кодируемого вектором.
2A. Клетки HT1080
[0315] В двух повторных исследованиях (A и B), клетки HT1080 трансдуцировали в 24-луночных планшетах в объеме 250 мкл или 125 мкл вируса в присутствии 8 мкг/мл полибрена с центрифужной инокуляцией (1200×g в течение 30 минут). В качестве отрицательного контроля использовали образец нетрансдуцированных клеток.
[0316] После культивирования клеток в течение 48-72 часов определяли поверхностную экспрессию маркера EGFRt посредством проточной цитометрии с дискриминационным окном, установленным на основе нетрансдуцированного контрольного образца. EGFRt детектировали с использованием конъюгированного с биотином антитела к EGFR (цетуксимаб) с последующей детекцией со вторичным конъюгированным с V450 стрептавидином. В таблице 5 приведены проценты жизнеспособных клеток, демонстрирующих поверхностную экспрессию EGFRt, для каждых из различных условий в двух повторениях A и B.
[0317] Как продемонстрировано, трансдукция клеток HT1080 с использованием лентивирусного вектора с вариантом области Flap и модифицированным WPRE со стоп-кодонами во фрагменте гена X приводила к сравнимой с экспрессией с использованием вектора с вариантом области Flap и контрольным модифицированным WPRE экспрессии EGFRt. Таким образом, по сравнению с модификации в старт-кодоне и области промотора гена X, присутствие стоп-кодонов во фрагменте гена X не ухудшает способность WPRE стимулировать экспрессию рекомбинантного белка, кодируемого вектором.
[0318] Также, как продемонстрировано, клетки HT1080 успешно трансдуцировали лентивирусным вектором с вариантом области Flap, как выявляли по экспрессии EGFRt.
Таблица 5:
<b>WPRE в векторе</b>
<b>Вирус (объем)</b>
<b>Процент жизнеспособных клеток, экспрессирующих EGFRt на поверхности</b>
<b>A</b>
<b>B</b>
Нетрансдуцированный контроль
N/A
0,3%
0,1%
Модифицированный WPRE, Flap -/-
250 мкл
58,9%
56,3%
125 мкл
26,2%
20,5%
Контрольный модифицированный WPRE, Flap -/-
250 мкл
62,1%
41,4%
125 мкл
34,2%
18,7%
Контрольный модифицированный WPRE, Flap +/+
250 мкл
81%
56,7%
125 мкл
56,9%
48,4%
2B. T-клетки человека
[0319] Первичные T-клетки человека обогащали посредством положительного отбора из мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC), полученных из образцов афереза человека. Клетки активировали с использованием гранул с антителами к CD3/антителами к CD28 в присутствии IL-2 (100 IU/мл). Активированные T-клетки трансдуцировали одним объемом вируса в присутствии полибрена (8 мкг/мл) и посредством центрифужной инокуляции (1200×g в течение 30 мин) в 24-луночных планшетах для каждого из векторов, описанных в пример 1. В качестве отрицательного контроля служил образец нетрансдуцированных клеток.
[0320] Поверхностную экспрессию EGFRt определяли, как описано выше в примере 2A. Результаты приведены в таблице 6, включая результаты дублированных исследований (A и B). Как продемонстрировано, трансдукция первичных T-клеток человека с использованием лентивирусного вектора с вариантом области Flap и модифицированным WPRE со стоп-кодонами во фрагменте гена X приводило к сравнимой с экспрессией с использованием вектора с вариантом области Flap и контрольным модифицированным WPRE экспрессии EGFRt. Таким образом, по сравнению с модификациями в старт-кодоне гена X и областью промотора присутствие стоп-кодонов во фрагменте гена X не ухудшало способность WPRE индуцировать экспрессию рекомбинантного белка, кодируемого вектором. Эти результаты согласовывались для нескольких активирующих реагентов, поскольку получены сходные результаты при активации первичных T-клеток человека различными типами гранул с антителами к CD3/антителами к CD28.
[0321] Так же, как продемонстрировано, T-клетки успешно трансдуцировали лентивирусным вектором с вариантом области Flap, как наблюдали по экспрессии EGFRt.
Таблица 6:
<b>WPRE в векторе</b>
<b>Процент жизнеспособных клеток, экспрессирующих EGFRt на поверхности</b>
<b>A</b>
<b>B</b>
Нетрансдуцированный
0,1%
н.о.
Модифицированный WPRE, Flap -/-
24,4%
22,5%
Контрольный модифицированный WPRE, Flap -/-
20,9%
25,8%
Контрольный модифицированный WPRE, Flap +/+
39,1%
н.о.
Пример 3: Трансдукция клеток вирусными векторами, содержащими полную область Flap или вариант области Flap
[0322] Частицы лентивирусного вектора получали по существу, как описано в примере 1, где каждая кодировала химерный антигенраспознающий рецептор (CAR), содержащий отличный от других векторов антигенсвязывающий домен scFv к CD19. Каждый лентивирусный вектор также содержал полинуклеотиды WPRE контрольного функционального модифицированного WPRE, у которого отсутствовала ORF гена X, функционально связанный с полинуклеотидами, кодирующими CAR, и или полинуклеотид Flap дикого типа (Flap +/+) (SEQ ID NO:121), или полинуклеотид варианта Flap (Flap -/-) (SEQ ID NO:122). Для определения экспрессии CAR, лентивирусные векторы также кодировали маркер трансдукции укороченный EGFR (EGFRt), отделенный от CAR саморасщепляющимся линкером T2A.
+
+
[0323] Первичные CD8-T-клетки человека обогащали посредством положительного отбора из мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC), получаемых из образцов афереза человека. Для трансдукции CD8-T-клеток использовали частицы лентивирусного вектора (по существу как описано в Yam et al. (2002) Mol. Ther. 5:479; WO2015/095895). В качестве отрицательного контроля служил образец нетрансдуцированных клеток.
+
[0324] Для подтверждения экспрессии на поверхности T-клеток маркера трансдукции EGFRt посредством проточной цитометрии, как описано в примере 2A, после трансдукции и размножения использовали окрашивание антителом к EGFR. Дискриминационное окно устанавливали на основе нетрансдуцированного контрольного образца. В таблице 7 приведены проценты жизнеспособных клеток, демонстрирующих поверхностную экспрессию EGFRt для каждых из различных условий. Как продемонстрировано, результаты подтверждали, что лентивирусные векторы с полинуклеотидом Flap -/- могут успешно трансдуцировать CD8-T-клетки.
Таблица 7:
<b>№. CAR</b>
<b>Процент содержания жизнеспособных CD8</b><sup><b>+</b></sup><b>-клеток, экспрессирующих поверхностный EGFRt</b>
<b>Flap +/+</b>
<b>Flap -/-</b>
1
48%
26%
2
38%
24%
3
51%
21%
4
35%
23%
5
45%
25%
6
47%
17%
7
59%
23%
8
55%
24%
9
41%
21%
10
50%
22%
11
60%
27%
+
[0325] После трансдукции T-клетки, трансдуцированные каждой из конструкций CAR, включая конструкции, содержащие полинуклеотид варианта Flap -/-, успешно селективно обогащали и размножали (при 100% EGFRt+ или близко к этому, как подтверждали проточной цитометрией) посредством стимуляции в присутствии линии облученных CD19-клеток.
[0326] Не следует понимать, что объем настоящего изобретения ограничен конкретными описанными вариантами осуществления, которые предоставлены, например, для иллюстрации различных аспектов изобретения. из описания и указаний в настоящем документе очевидны различные модификации описанных композиций и способов. Такие вариации можно применять на практике без отклонения от настоящего объема и сущности изобретения, и их следует включать в объем настоящего изобретения.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Juno Therapeutics, Inc.
Tareen, Semih
<120> МОДИФИЦИРОВАННЫЕ ПОСТТРАНСКРИПЦИОННЫЕ РЕГУЛЯТОРНЫЕ ЭЛЕМЕНТЫ ВИРУСОВ ГЕПАТИТА
<130> 735042001840
<140> Not Yet Assigned
<141> Concurrently Herewith
<160> 221
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 592
<212> ДНК
<213> Вирус гепатита сурков
<400> 1
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc atggctgctc 420
gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg         592
<210> 2
<211> 3323
<212> ДНК
<213> Вирус гепатита сурков
<400> 2
aattcgggac ataccacgtg gtttagttcc gcctcaaact ccaacaaatc gagatcaagg 60
gagaaagcct actcctccaa ctccacctct aagagatact cacccccact taactatgaa 120
aaatcagact tttcatctcc aggggttcgt agacggatta cgagacttga caacaacgga 180
acgccaacac aatgcctatg gagatccttt tacaacacta agccctgcgg ttcctactgt 240
atccaccata ttgtctcctc cctcgacgac tggggaccct gcactgtcac cggagatgtc 300
accatcaagt ctcctaggac tcctcgcagg attacaggtg gtgtatttct tgtggacaaa 360
aatcctaaca atagctcaga atctagattg gtggtggact tctctcagtt ttccaggggg 420
cataccagag tgcactggcc aaaattcgca gttccaaact tgcaaacact tgccaacctc 480
ctgtccacca acttgcaatg gctttcgttg gatgtatctg cggcgtttta tcatatacct 540
attagtcctg ctgctgtgcc tcatcttctt gttggttctc ctggactgga aaggtttaat 600
acctgtctgt cctcttcaac ccacaacaga aacaacagtc aattgcagac aatgcacaat 660
ctctgcacaa gacatgtata ctcctcctta ctgttgttgt ttaaaaccta cggcaggaaa 720
ttgcacttgt tggcccatcc cttcatcatg ggctttagga aattacctat gggagtgggc 780
cttagcccgt ttctcttggc tcaatttact agtgcccttg cttcaatggt taggaggaat 840
ttccctcatt gcgtggtttt tgcttatatg gatgatttgg ttttgggggc ccgcacttct 900
gagcatctta ccgccattta ttcccatatt tgttctgttt ttcttgattt gggtatacat 960
ttgaatgtca ataaaacaaa atggtggggc aatcatctac atttcatggg atatgtgatt 1020
actagttcag gtgtattgcc acaagacaaa catgttaaga aaatttcccg ttatttgcac 1080
tctgttcctg ttaatcaacc tctggattac aaaatttgtg aaagattgac tggtattctt 1140
aactatgttg ctccttttac gctatgtgga tacgctgctt taatgccttt gtatcatgct 1200
attgcttccc gtatggcttt cattttctcc tccttgtata aatcctggtt gctgtctctt 1260
tatgaggagt tgtggcccgt tgtcaggcaa cgtggcgtgg tgtgcactgt gtttgctgac 1320
gcaaccccca ctggttgggg cattgccacc acctgtcagc tcctttccgg gactttcgct 1380
ttccccctcc ctattgccac ggcggaactc atcgccgcct gccttgcccg ctgctggaca 1440
ggggctcggc tgttgggcac tgacaattcc gtggtgttgt cggggaagct gacgtccttt 1500
ccatggctgc tcgcctgtgt tgccacctgg attctgcgcg ggacgtcctt ctgctacgtc 1560
ccttcggccc tcaatccagc ggaccttcct tcccgcggcc tgctgccggc tctgcggcct 1620
cttccgcgtc ttcgccttcg ccctcagacg agtcggatct ccctttgggc cgcctccccg 1680
cctgtttcgc ctcggcgtcc ggtccgtgtt gcttggtctt cacctgtgca gacttgcgaa 1740
ccatggattc caccgtgaac tttgtctcct ggcatgcaaa tcgtcaactt ggcatgccaa 1800
gtaaggacct ttggactcct tatataaaag atcaattatt aactaaatgg gaggagggca 1860
gcattgatcc tagattatca atatttgtat taggaggctg taggcataaa tgcatgcgac 1920
ttctgtaacc atgtatcttt ttcacctgtg ccttgttttt gcctgtgttc catgtcctac 1980
ttttcaagcc tccaagctgt gccttggatg gctttggggc atggacatag atccctataa 2040
agaatttggt tcatcttatc agttgttgaa ttttcttcct ttggacttct ttcctgacct 2100
taatgctttg gtggacactg ctactgcctt gtatgaagaa gagctaacag gtagggaaca 2160
ttgctctccg caccatacag ctattagaca agctttagta tgctgggatg aattaactaa 2220
attgatagct tggatgagct ctaacataac ttctgaacaa gtaagaacaa tcatagtaaa 2280
tcatgtcaat gatacctggg gacttaaggt gagacaaagt ttatggtttc atttgtcatg 2340
tctcactttc ggacaacata cagttcaaga atttttagta agttttggag tatggatcag 2400
aactccagct ccatatagac ctcctaatgc acccattctc tcgactcttc cggaacatac 2460
agtcattagg agaagaggag gtgcaagagc ttctaggtcc cccagaagac gcactccctc 2520
tcctcgcagg agaagatctc aatcaccgcg tcgcagacgc tctcaatctc catctgccaa 2580
ctgctgatct tcaatgggta cataaaacta atgcaattac aggtctttac tctaaccaag 2640
ctgctcagtt caatccgaat tggattcaac ctgagtttcc tgaacttcat ttacataatg 2700
atttaattca aaaattgcaa cagtattttg gtcctttgac tataaatgaa aagagaaaat 2760
tgcaattaaa ttttcctgcc agatttttcc ccaaagctac taaatatttc cctttaatta 2820
aaggcataaa aaacaattat cctaattttg ctttagaaca tttctttgct accgcaaatt 2880
atttgtggac tttatgggaa gctggaattt tgtatttaag gaagaatcaa acaactttga 2940
cttttaaagg taaaccatat tcttgggaac acagacagct agtgcaacat aatgggcaac 3000
aacataaaag tcaccttcaa tccagacaaa atagcagcat ggtggcctgc agtgggcact 3060
tattacacaa ccacttatcc tcagaatcag tcagtgtttc aaccaggaat ttatcaaaca 3120
acatctctga taaatcccaa aaatcaacaa gaactggact ctgttcttat aaacagatac 3180
aaacagatag actggaacac ttggcaagga tttcctgtgg atcaaaaatt ttcattggtc 3240
agcagggatc ctcccccaaa accttatata aatcaatcag ctcaaacttt cgaaatcaaa 3300
cctgggccta taatagttcc cgg                                         3323
<210> 3
<211> 80
<212> ДНК
<213> Вирус гепатита сурков
<400> 3
gccacggcgg aactcatcgc cgcctgcctt gcccgctgct ggacaggggc tcggctgttg 60
ggcactgaca attccgtggt                                             80
<210> 4
<211> 208
<212> ДНК
<213> Вирус гепатита сурков
<400> 4
gtgtgcactg tgtttgctga cgcaaccccc actggttggg gcattgccac cacctgtcag 60
ctcctttccg ggactttcgc tttccccctc cctattgcca cggcggaact catcgccgcc 120
tgccttgccc gctgctggac aggggctcgg ctgttgggca ctgacaattc cgtggtgttg 180
tcggggaagc tgacgtcctt tccatggc                                    208
<210> 5
<211> 38
<212> ДНК
<213> Вирус гепатита сурков
<400> 5
gccttgcccg ctgctggaca ggggctcggc tgttgggc                         38
<210> 6
<211> 177
<212> ДНК
<213> Вирус гепатита сурков
<400> 6
tgctcgcctg tgttgccacc tggattctgc gcgggacgtc cttctgctac gtcccttcgg 60
ccctcaatcc agcggacctt ccttcccgcg gcctgctgcc ggctctgcgg cctcttccgc 120
gtcttcgcct tcgccctcag acgagtcgga tctccctttg ggccgcctcc ccgcctg    177
<210> 7
<211> 23
<212> ДНК
<213> Вирус гепатита сурков
<400> 7
gggacgtcct tctgctacgt ccc                                         23
<210> 8
<211> 158
<212> ДНК
<213> Вирус гепатита сурков
<400> 8
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggtt                         158
<210> 9
<211> 426
<212> ДНК
<213> Вирус гепатита сурков
<400> 9
atggctgctc gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc 60
ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct 120
tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc 180
tgtttcgcct cggcgtccgg tccgtgttgc ttggtcttca cctgtgcaga cttgcgaacc 240
atggattcca ccgtgaactt tgtctcctgg catgcaaatc gtcaacttgg catgccaagt 300
aaggaccttt ggactcctta tataaaagat caattattaa ctaaatggga ggagggcagc 360
attgatccta gattatcaat atttgtatta ggaggctgta ggcataaatg catgcgactt 420
ctgtaa                                                            426
<210> 10
<211> 182
<212> ДНК
<213> Вирус гепатита сурков
<400> 10
atggctgctc gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc 60
ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct 120
tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc 180
tg                                                                182
<210> 11
<211> 21
<212> ДНК
<213> Вирус гепатита сурков
<400> 11
ggggaagctg acgtcctttc c                                           21
<210> 12
<211> 592
<212> ДНК
<213> Вирус гепатита сурков
<400> 12
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg atattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tgtgtggata tgctgcttta atgcctctgt atcatgctat tgcttcccgt 120
acggctttcg ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tccgtcaacg tggcgtggtg tgctctgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggctggggca ttgccaccac ctgtcaactc ctttctggga ctttcgcttt ccccctcccg 300
atcgccacgg cagaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctaggttg 360
ctgggcactg ataattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc atggctgctc 420
gcctgtgttg ccaactggat cctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggctctc 480
aatccagcgg acctcccttc ccgaggcctt ctgccggttc tgcggcctct cccgcgtctt 540
cgctttcggc ctccgacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg         592
<210> 13
<211> 592
<212> ДНК
<213> Вирус гепатита сурков
<400> 13
aatcaacctc tggattacaa aatttctgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcaactc ctttccggga cttacgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc atggctgctc 420
gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgac tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg         592
<210> 14
<211> 592
<212> ДНК
<213> Вирус гепатита сурков
<400> 14
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tacttcccgt 120
acggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctatcaactc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat tgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc atggctgctc 420
gcctgtgttg ccaactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggttc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg         592
<210> 15
<211> 592
<212> ДНК
<213> Вирус гепатита сурков
<400> 15
aatcaacctc tagattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tgtgtggata tgctgcttta atgcctctgt atcatgctat tgcttcccgt 120
acggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttac tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggctggggca ttgccaccac ctgtcaactc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
atcgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc atggctgctc 420
gcctgtgttg ccaactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg acctcccttc ccgcggcctg ctgccggttc tgcggcctct tccacgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg         592
<210> 16
<211> 592
<212> ДНК
<213> Вирус гепатита сурков
<400> 16
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tgtgtggata tgctgcttta atacctctgt atcatgctat tgcttcccgt 120
acggctttcg ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tccgccaacg tggcgtggtg tgctctgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggctggggca ttgccaccac ctgtcaactc ctttctggga ctttcgcttt ccccctcccg 300
atcgccacgg cagaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctaggttg 360
ttgggcactg ataattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc atggctgctc 420
gcctgtgttg ccaactggat cctacgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcagctctc 480
aatccagcgg acctcccttc ccgaggcctt ctgccggttc tgcggcctct cccgcgtctt 540
cgctttcggc ctccgacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg         592
<210> 17
<211> 592
<212> ДНК
<213> Вирус гепатита сурков
<400> 17
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tgtgtggata tgctgcttta atgcctctgt atcatgctat tgcttcccgt 120
acggctttcg ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tccgccaacg tggcgtggtg tgctctgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggctggggca ttgccaccac ctgtcaactc ctttctggga ctttcgcttt ccccctcccg 300
atcgccacgg cagaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacggg ggctaggttg 360
ttgggcactg ataattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc atggctgctc 420
gcctgtgttg ccaactggat cctacgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcagctctc 480
aatccagcgg acctcccttc ccgaggcctt ctgccggttc tgcggcctct cccgcgtctt 540
cgctttcggc ctccgacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg         592
<210> 18
<211> 592
<212> ДНК
<213> Вирус гепатита сурков
<400> 18
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tgtgtggata tgctgcttta atgcctctgt atcatgctat tgcttcccgt 120
acggctttcg ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tccgccaacg tggcgtggtg tgctctgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggctggggca ttgccaccac ctgtcaactc ctttctggga ctttcgcttt ccccctcccg 300
atcgccacgg cagaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacggg ggctaggttg 360
ttgggcactg ataattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc atggctgctc 420
gcctgtgttg ccaactggat cctacgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcagctctc 480
aatccagcgg acctcccttc ccgaggcctt ctgccggttc tgcggcctct cccgcgtctt 540
cgctttcgac ctccgacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg         592
<210> 19
<211> 592
<212> ДНК
<213> Вирус гепатита сурков
<400> 19
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tgtgtggata tgctgcttta atacctctgt atcatgctat tgcttcccgt 120
acggctttcg ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tccgccaacg tggcgtggtg tgctctgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggctggggca ttgccaccac ctgtcaactc ctttctggga ctttcgcttt ccccctcccg 300
atcgccacgg cagaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacggg ggctaggttg 360
ttgggcactg ataattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc atggctgctc 420
gcctgtgttg ccaactggat cctacgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcagctctc 480
aatccagcgg acctcccttc ccgaggcctt ctgccggttc tgcggcctct cccgcgtctt 540
cgctttcggc ctccgacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg         592
<210> 20
<211> 592
<212> ДНК
<213> Вирус гепатита сурков
<400> 20
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tgtgtggata tgctgcttta atacctctgt atcgtgctat tgcttcccgt 120
acggctttcg ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tccgccaacg tggcgtggtg tgctctgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggctggggca ttgccaccac ctgtcaactc ctttctggga ctttcgcttt ccccctcccg 300
atcgccacgg cagaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacggg ggctaggttg 360
ttgggcactg ataattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc atggctgctc 420
gcctgtgttg ccaactggat cctacgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcagctctc 480
aatccagcgg acctcccttc ccgaggcctt ctgccggttc tgcggcctct cccgcgtctt 540
cgctttcggc ctccgacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg         592
<210> 21
<211> 722
<212> ДНК
<213> Вирус гепатита B человека
<400> 21
aaacaggcct attgattgga aagtttgtca acgaattgtg ggtcttttgg ggtttgctgc 60
cccttttacg caatgtggat atcctgcttt aatgccttta tatgcatgta tacaagcaaa 120
acaggctttt actttctcgc caacttacaa ggcctttctc agtaaacagt atatgaccct 180
ttaccccgtt gctcggcaac ggcctggtct gtgccaagtg tttgctgacg caacccccac 240
tggttggggc ttggccatag gccatcagcg catgcgtgga acctttgtgt ctcctctgcc 300
gatccatact gcggaactcc tagccgcttg ttttgctcgc agcaggtctg gagcaaacct 360
catcgggacc gacaattctg tcgtactctc ccgcaagtat acatcgtttc catggctgct 420
aggctgtgct gccaactgga tcctgcgcgg gacgtccttt gtttacgtcc cgtcggcgct 480
gaatcccgcg gacgacccct cccggggccg cttggggctc taccgcccgc ttctccgtct 540
gccgtaccgt ccgaccacgg ggcgcacctc tctttacgcg gactccccgt ctgtgccttc 600
tcatctgccg gaccgtgtgc acttcgcttc acctctgcac gtcgcatgga gaccaccgtg 660
aacgcccacc ggaacctgcc caaggtcttg cataagagga ctcttggact ttcagcaatg 720
tc                                                                722
<210> 22
<211> 722
<212> ДНК
<213> Вирус гепатита B человека
<400> 22
aaacaggcct attgattgga aagtatgtca acgaattgtg ggtctattgg ggtttgccgc 60
cccttttaca caatgtggat atcctgctct aatgccttta tatgcatgta tacaagcaaa 120
acaggctttt actttctcgc caacttacaa ggcctttcta agtaaacagt atctgaacct 180
ttaccccgtt gctcggcaac ggcctggtct gtgccaagtg tttgctgacg caacccccac 240
tggttggggc ttggcgatag gccatcagcg catgcgtggg acctttctgt ctcctctgcc 300
gatccatact gcggaactcc tagcagcttg ttttgctcgc agcaggtctg gggcaaaact 360
catcgggact gacaattctg tcgtactctc ccgcaagtat acatcatttc catggctgct 420
aggctgtgct gccaactgga tcctgcgcgg gacgtccttt gtttacgtcc cgtcggcgct 480
gaatcccgcg gacgacccct cgcggggccg cttggggctc taccgcccgc ttctccgcct 540
gttctaccga ccgaccacgg ggcgcacctc tctttacgcg gactccccgt ctgtgccttc 600
tcatctgccg gaccgtgtgc acttcgcttc acctctgcac gtcgcatgga gaccaccgtg 660
aacgcccaca ggaacctgcc caaggtcttg cataagagga ctcttggact ttcagcaatg 720
tc                                                                722
<210> 23
<211> 722
<212> ДНК
<213> Вирус гепатита B орангутана
<400> 23
caacaggcct attgattgga aagtatgtca acgaattgta ggactattgg gctttgccgc 60
tccttttact caatgtggct atcctgcttt aatgcctttg tataactgta tacacaatcg 120
tcaggctttt actttctcgc caacttacaa ggcctttctg cgtacacaat atctgaccct 180
ttaccccgtt gctcggcaac gaccgggact gtgccaagtg tttgctgacg caacccccac 240
tggctggggc ttggcgctag gtccccagcg catgcgtgga acctttgtgg ctcctctgcc 300
gatccatact gcggaactcc tagccgcttg ttttgctcgc agcaggtctg gagcaaacat 360
tatcggtact gacaactctg ttgtgttgtc gcggaaatat acatcttttc catggctgct 420
aggttgtgct gccaactgga tactgcgcgg gacgtccttt gtctacgtcc cgtcggcgct 480
gaatcccgcg gacgaccctt ctcggggtcg gttggggctc taccgccctc ttctccgcct 540
gccgttccgg ccgaccacgg ggcgcacctc tctttacgcg gtctccccgt ctgtgccttc 600
tcatctgccg gtccgtgtgc acttcgcttc acctctgcac gttgcatgga gaccaccgtg 660
aacgcccccc ggaacttgcc aaaggtcttg cataagagga ctcttggact gtcaacaatg 720
tc                                                                722
<210> 24
<211> 721
<212> ДНК
<213> Вирус гепатита B шимпанзе
<400> 24
aacagaccta tagattggaa agtatgtcaa agaattgtgg gtcttttggg atttgctgcc 60
ccttttacgc aatgtggtta tcctgcgtta atgccattgt atgcatgtat acaagcaaaa 120
caggctttca ctttctcgcc aacttataag gcctttctaa gtcaacaata ttcgaccctt 180
taccccgttg cccggcaacg gtccggtctg tgccaagtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggctggggct tggtcatggg ccatcagcgc atgcgtggaa cctttgtggc tcctctgccg 300
atccatactg cggaactcct agcagcttgt tttgctcgca gccggtctgg agcaaaactt 360
atcggaactg acaattctgt cgtcctctct cggaaatata catcttttcc atggctgcta 420
ggttgtgctg ccaactggat acttcgcggg acgtcctttg tttacgtccc gtcggcgctg 480
aatcctgcgg acgacccttc tcggggccgc ttagggctct accgccctct catccgtctg 540
ctcttccaac cgactacggg gcgcacctct ctttacgcgg tctccccgtc tgtgccttct 600
catctgccgg tccgtgtgca cttcgcttca cctctgcacg ttgcatggag accaccgtga 660
acgccccacg gaacctgcca aaagtcttgc ataagaggac tcttggactt tcagcaatgt 720
c                                                                 721
<210> 25
<211> 721
<212> ДНК
<213> Вирус гепатита B гориллы
<400> 25
aacagaccta ttgattggaa ggtatgtcaa agaattgtgg gtcttttagg atttgctgcc 60
ccttttacac aatgtggtta tcctgccttg atgcctttgt atgcatgtat acaagctaag 120
caggctttca ctttctcgcc aatttacaag gcctttctaa gtaaacaata tgcaaccctt 180
taccccgttg ctcggcaacg ggccggtctg tgccaagtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggytggggct tggtcatagg ccagcagcgc atgcgtggaa cctttgtggc tcctctgccg 300
atccatactg cggaactcct agcagcttgt tttgctcgca gcaggtctgg ggcaaacatt 360
atcgggactg acaattctgt cgtcctttca cggaaatata catcctttcc atggctgcta 420
ggctgtgctg ccaactggat cctgcgcggg acgtcctttg tttacgtccc gtcggcgctg 480
aaccctgccg acgacccgtc tcggggtcgc ttaggactct cccgtcctct ctgccgtctg 540
ccgttccagc cgaccacggg gcgcacctct ctttacgcgg tctccccgtc tgtgccttct 600
catctgccgg accgtgtgca cttcgcttca cctctgcacg ttgcatggag accaccgtga 660
acgcccctcg gaacctgcca acagtcttac ataagaggac tcttggactt tcagcaatgt 720
c                                                                 721
<210> 26
<211> 582
<212> ДНК
<213> Вирус гепатита B американского суслика
<400> 26
aacctttaga ttataaaatc tgtgaaaggt taacaggcat tctgaattat gttgctcctt 60
ttactaaatg tggttatgct gctctccttc ctttgtatca agctacttcg cgtacggcat 120
ttgtgttttc ttctctctac cacagctggt tgctgtccct ttatgctgag ttgtggcctg 180
ttgccaggca acgtggcgtg gtgtgctctg tgtctgacgc aacccccact ggttggggca 240
tttgcaccac ctatcaactc atttccccga cgggcgcttt tgccctgccg atcgccaccg 300
cggacgtcat cgccgcctgc cttgctcgct gctggacagg agctcggctg ttgggcactg 360
acaactccgt ggttctttcg ggcaaactga cttcctatcc atggctgctc gcctgtgttg 420
ccaactggat tcttcgcggg acgtcgttct gctacgtccc ttcggcagcg aatccggcgg 480
acctgccgtc tcgaggcctt ctgccggctc tgcatcccgt gccgactctc cgcttccgtc 540
cgcagctgag tcgcatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg                    582
<210> 27
<211> 592
<212> ДНК
<213> Вирус гепатита B суслика
<400> 27
aatcaaccct tagattataa aatatgtgaa aggttgacgg gcattcttaa ttatgttgct 60
ccttttacca aatgtggtta tgctgcttta ctgcctttat atcaagctat tgcttctcat 120
actgcttttg ttttctcctc cttatataaa aactggttac tgtcacttta tggtgagttg 180
tggcccgttg ccagacaacg tggtgtggtg tgctctgtgt ttgctgacgc aactcccact 240
ggttggggca tttgcaccac ctgtcaactc atttccggta ctttcggttt ctcacttccg 300
attgctaccg cggagcttat agccgcctgc cttgctcgct gctggacagg agctcggttg 360
ttgggcactg ataactccgt ggtcctctcc ggtaagctaa cttcgtttcc atggctgctc 420
gcctgtgttg ccaactggat tcttcgcggg acgtccttct gttacgtccc ctccgcggac 480
aacccagcgg accttccgtc tcggggactt ctgccggctc tccgtcctct gccgcttctg 540
cgttttcgtc cggtcaccaa gcggatatcc ctgtgggccg cctccccgcc tg         592
<210> 28
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированная часть ORF белка X
<400> 28
atggctgctt agctgagtag ctga                                        24
<210> 29
<211> 592
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE с четырьмя стоп-кодонами (1,2,3,4)
<400> 29
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc atggctgctt 420
agctgagtag ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg         592
<210> 30
<211> 592
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE с тремя стоп-кодонами (1,2,3)
<400> 30
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc atggctgctt 420
agctgagtag ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg         592
<210> 31
<211> 592
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE с тремя стоп-кодонами (1,2,4)
<400> 31
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc atggctgctt 420
agctgagttg ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg         592
<210> 32
<211> 592
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE с тремя стоп-кодонами (1,3,4)
<400> 32
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc atggctgctt 420
agctgtgtag ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg         592
<210> 33
<211> 592
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE с тремя стоп-кодонами (2,3,4)
<400> 33
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc atggctgctc 420
gcctgagtag ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg         592
<210> 34
<211> 592
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE с двумя стоп-кодонами (1,2)
<400> 34
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc atggctgctt 420
agctgagttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg         592
<210> 35
<211> 592
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE с двумя стоп-кодонами (1,3)
<400> 35
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc atggctgctt 420
agctgtgtag ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg         592
<210> 36
<211> 592
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE с двумя стоп-кодонами (1,4)
<400> 36
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc atggctgctt 420
agctgtgttg ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg         592
<210> 37
<211> 592
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE с двумя стоп-кодонами (2,3)
<400> 37
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc atggctgctc 420
gcctgagtag ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg         592
<210> 38
<211> 592
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE с двумя стоп-кодонами (2,4)
<400> 38
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc atggctgctc 420
gcctgagttg ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg         592
<210> 39
<211> 592
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE с двумя стоп-кодонами (3,4)
<400> 39
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc atggctgctc 420
gcctgtgtag ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg         592
<210> 40
<211> 592
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE с одним стоп-кодоном (1)
<400> 40
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc atggctgctt 420
agctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg         592
<210> 41
<211> 592
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE с одним стоп-кодоном (2)
<400> 41
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc atggctgctc 420
gcctgagttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg         592
<210> 42
<211> 592
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE с одним стоп-кодоном (3)
<400> 42
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc atggctgctc 420
gcctgtgtag ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg         592
<210> 43
<211> 592
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE с одним стоп-кодоном (4)
<400> 43
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc atggctgctc 420
gcctgtgttg ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg         592
<210> 44
<211> 182
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Укороченный ген X с четырьмя стоп-кодонами (1,2,3,4)
<400> 44
atggctgctt agctgagtag ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc 60
ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct 120
tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc 180
tg                                                                182
<210> 45
<211> 182
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Укороченный ген X с тремя стоп-кодонами (1,2,3)
<400> 45
atggctgctt agctgagtag ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc 60
ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct 120
tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc 180
tg                                                                182
<210> 46
<211> 182
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Укороченный ген X с тремя стоп-кодонами (1,2,4)
<400> 46
atggctgctt agctgagttg ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc 60
ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct 120
tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc 180
tg                                                                182
<210> 47
<211> 182
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Укороченный ген X с тремя стоп-кодонами (1,3,4)
<400> 47
atggctgctt agctgtgtag ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc 60
ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct 120
tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc 180
tg                                                                182
<210> 48
<211> 182
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Укороченный ген X с тремя стоп-кодонами (2,3,4)
<400> 48
atggctgctc gcctgagtag ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc 60
ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct 120
tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc 180
tg                                                                182
<210> 49
<211> 182
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Укороченный ген X с двумя стоп-кодонами (1,2)
<400> 49
atggctgctt agctgagttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc 60
ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct 120
tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc 180
tg                                                                182
<210> 50
<211> 182
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Укороченный ген X с двумя стоп-кодонами (1,3)
<400> 50
atggctgctt agctgtgtag ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc 60
ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct 120
tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc 180
tg                                                                182
<210> 51
<211> 182
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Укороченный ген X с двумя стоп-кодонами (1,4)
<400> 51
atggctgctt agctgtgttg ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc 60
ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct 120
tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc 180
tg                                                                182
<210> 52
<211> 182
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Укороченный ген X с двумя стоп-кодонами (2,3)
<400> 52
atggctgctc gcctgagtag ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc 60
ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct 120
tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc 180
tg                                                                182
<210> 53
<211> 182
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Укороченный ген X с двумя стоп-кодонами (2,4)
<400> 53
atggctgctc gcctgagttg ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc 60
ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct 120
tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc 180
tg                                                                182
<210> 54
<211> 182
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Укороченный ген X с двумя стоп-кодонами (3,4)
<400> 54
atggctgctc gcctgtgtag ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc 60
ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct 120
tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc 180
tg                                                                182
<210> 55
<211> 182
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Укороченный ген X с одним стоп-кодоном (1)
<400> 55
atggctgctt agctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc 60
ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct 120
tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc 180
tg                                                                182
<210> 56
<211> 182
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Укороченный ген X с одним стоп-кодоном (2)
<400> 56
atggctgctc gcctgagttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc 60
ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct 120
tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc 180
tg                                                                182
<210> 57
<211> 182
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Укороченный ген X с одним стоп-кодоном (3)
<400> 57
atggctgctc gcctgtgtag ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc 60
ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct 120
tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc 180
tg                                                                182
<210> 58
<211> 182
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Укороченный ген X с одним стоп-кодоном (4)
<400> 58
atggctgctc gcctgtgttg ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc 60
ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct 120
tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc 180
tg                                                                182
<210> 59
<211> 592
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE со старт- и стоп-кодонами
<400> 59
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc ggggctgctt 420
agctgagtag ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg         592
<210> 60
<211> 592
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE со старт- и стоп-кодонами
<400> 60
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc ggggctgctt 420
agctgagtag ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg         592
<210> 61
<211> 592
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE со старт- и стоп-кодонами
<400> 61
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc ggggctgctt 420
agctgagttg ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg         592
<210> 62
<211> 592
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE со старт- и стоп-кодонами
<400> 62
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc ggggctgctt 420
agctgtgtag ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg         592
<210> 63
<211> 592
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE со старт- и стоп-кодонами
<400> 63
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc ggggctgctc 420
gcctgagtag ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg         592
<210> 64
<211> 592
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE со старт- и стоп-кодонами
<400> 64
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc ggggctgctt 420
agctgagttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg         592
<210> 65
<211> 592
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE со старт- и стоп-кодонами
<400> 65
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc ggggctgctt 420
agctgtgtag ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg         592
<210> 66
<211> 592
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE со старт- и стоп-кодонами
<400> 66
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc ggggctgctt 420
agctgtgttg ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg         592
<210> 67
<211> 592
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE со старт- и стоп-кодонами
<400> 67
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc ggggctgctc 420
gcctgagtag ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg         592
<210> 68
<211> 592
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE со старт- и стоп-кодонами
<400> 68
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc ggggctgctc 420
gcctgagttg ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg         592
<210> 69
<211> 592
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE со старт- и стоп-кодонами
<400> 69
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc ggggctgctc 420
gcctgtgtag ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg         592
<210> 70
<211> 592
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE со старт- и стоп-кодонами
<400> 70
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc ggggctgctt 420
agctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg         592
<210> 71
<211> 592
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE со старт- и стоп-кодонами
<400> 71
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc ggggctgctc 420
gcctgagttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg         592
<210> 72
<211> 592
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE со старт- и стоп-кодонами
<400> 72
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc ggggctgctc 420
gcctgtgtag ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg         592
<210> 73
<211> 592
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE со старт- и стоп-кодонами
<400> 73
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc ggggctgctc 420
gcctgtgttg ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg         592
<210> 74
<211> 182
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Укороченный ген X с модифицированными старт- и стоп-кодонами
<400> 74
ggggctgctt agctgagtag ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc 60
ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct 120
tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc 180
tg                                                                182
<210> 75
<211> 182
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Укороченный ген X с модифицированными старт- и стоп-кодонами
<400> 75
ggggctgctt agctgagtag ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc 60
ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct 120
tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc 180
tg                                                                182
<210> 76
<211> 182
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Укороченный ген X с модифицированными старт- и стоп-кодонами
<400> 76
ggggctgctt agctgagttg ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc 60
ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct 120
tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc 180
tg                                                                182
<210> 77
<211> 182
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Укороченный ген X с модифицированными старт- и стоп-кодонами
<400> 77
ggggctgctt agctgtgtag ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc 60
ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct 120
tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc 180
tg                                                                182
<210> 78
<211> 182
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Укороченный ген X с модифицированными старт- и стоп-кодонами
<400> 78
ggggctgctc gcctgagtag ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc 60
ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct 120
tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc 180
tg                                                                182
<210> 79
<211> 182
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Укороченный ген X с модифицированными старт- и стоп-кодонами
<400> 79
ggggctgctt agctgagttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc 60
ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct 120
tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc 180
tg                                                                182
<210> 80
<211> 182
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Укороченный ген X с модифицированными старт- и стоп-кодонами
<400> 80
ggggctgctt agctgtgtag ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc 60
ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct 120
tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc 180
tg                                                                182
<210> 81
<211> 182
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Укороченный ген X с модифицированными старт- и стоп-кодонами
<400> 81
ggggctgctt agctgtgttg ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc 60
ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct 120
tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc 180
tg                                                                182
<210> 82
<211> 182
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Укороченный ген X с модифицированными старт- и стоп-кодонами
<400> 82
ggggctgctc gcctgagtag ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc 60
ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct 120
tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc 180
tg                                                                182
<210> 83
<211> 182
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Укороченный ген X с модифицированными старт- и стоп-кодонами
<400> 83
ggggctgctc gcctgagttg ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc 60
ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct 120
tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc 180
tg                                                                182
<210> 84
<211> 182
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Укороченный ген X с модифицированными старт- и стоп-кодонами
<400> 84
ggggctgctc gcctgtgtag ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc 60
ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct 120
tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc 180
tg                                                                182
<210> 85
<211> 182
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Укороченный ген X с модифицированными старт- и стоп-кодонами
<400> 85
ggggctgctt agctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc 60
ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct 120
tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc 180
tg                                                                182
<210> 86
<211> 182
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Укороченный ген X с модифицированными старт- и стоп-кодонами
<400> 86
ggggctgctc gcctgagttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc 60
ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct 120
tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc 180
tg                                                                182
<210> 87
<211> 182
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Укороченный ген X с модифицированными старт- и стоп-кодонами
<400> 87
ggggctgctc gcctgtgtag ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc 60
ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct 120
tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc 180
tg                                                                182
<210> 88
<211> 182
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Укороченный ген X с модифицированными старт- и стоп-кодонами
<400> 88
ggggctgctc gcctgtgttg ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc 60
ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct 120
tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc 180
tg                                                                182
<210> 89
<211> 592
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE с последовательностью промотора и стоп-кодонами
<400> 89
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaggtct gctgagactc atggctgctt 420
agctgagtag ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg         592
<210> 90
<211> 592
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE с последовательностью промотора и стоп-кодонами
<400> 90
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaggtct gctgagactc atggctgctt 420
agctgagtag ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg         592
<210> 91
<211> 592
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE с последовательностью промотора и стоп-кодонами
<400> 91
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaggtct gctgagactc atggctgctt 420
agctgagttg ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg         592
<210> 92
<211> 592
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE с последовательностью промотора и стоп-кодонами
<400> 92
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaggtct gctgagactc atggctgctt 420
agctgtgtag ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg         592
<210> 93
<211> 592
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE с последовательностью промотора и стоп-кодонами
<400> 93
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaggtct gctgagactc atggctgctc 420
gcctgagtag ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg         592
<210> 94
<211> 592
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE с последовательностью промотора и стоп-кодонами
<400> 94
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaggtct gctgagactc atggctgctt 420
agctgagttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg         592
<210> 95
<211> 592
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE с последовательностью промотора и стоп-кодонами
<400> 95
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaggtct gctgagactc atggctgctt 420
agctgtgtag ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg         592
<210> 96
<211> 592
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE с последовательностью промотора и стоп-кодонами
<400> 96
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaggtct gctgagactc atggctgctt 420
agctgtgttg ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg         592
<210> 97
<211> 592
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE с последовательностью промотора и стоп-кодонами
<400> 97
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaggtct gctgagactc atggctgctc 420
gcctgagtag ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg         592
<210> 98
<211> 592
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE с последовательностью промотора и стоп-кодонами
<400> 98
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaggtct gctgagactc atggctgctc 420
gcctgagttg ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg         592
<210> 99
<211> 592
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE с последовательностью промотора и стоп-кодонами
<400> 99
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaggtct gctgagactc atggctgctc 420
gcctgtgtag ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg         592
<210> 100
<211> 592
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE с последовательностью промотора и стоп-кодоном
<400> 100
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaggtct gctgagactc atggctgctt 420
agctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg         592
<210> 101
<211> 592
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE с последовательностью промотора и стоп-кодоном
<400> 101
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaggtct gctgagactc atggctgctc 420
gcctgagttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg         592
<210> 102
<211> 592
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE с последовательностью промотора и стоп-кодоном
<400> 102
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaggtct gctgagactc atggctgctc 420
gcctgtgtag ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg         592
<210> 103
<211> 592
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE с последовательностью промотора и стоп-кодоном
<400> 103
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaggtct gctgagactc atggctgctc 420
gcctgtgttg ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg         592
<210> 104
<211> 592
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE с последовательностью промотора и старт- и стоп-кодонами
<400> 104
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaggtct gctgagactc ggggctgctt 420
agctgagtag ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg         592
<210> 105
<211> 592
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE с последовательностью промотора и старт- и стоп-кодонами
<400> 105
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaggtct gctgagactc ggggctgctt 420
agctgagtag ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg         592
<210> 106
<211> 592
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE с последовательностью промотора и старт- и стоп-кодонами
<400> 106
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaggtct gctgagactc ggggctgctt 420
agctgagttg ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg         592
<210> 107
<211> 592
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE с последовательностью промотора и старт- и стоп-кодонами
<400> 107
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaggtct gctgagactc ggggctgctt 420
agctgtgtag ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg         592
<210> 108
<211> 592
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE с последовательностью промотора и старт- и стоп-кодонами
<400> 108
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaggtct gctgagactc ggggctgctc 420
gcctgagtag ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg         592
<210> 109
<211> 592
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE с последовательностью промотора и старт- и стоп-кодонами
<400> 109
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaggtct gctgagactc ggggctgctt 420
agctgagttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg         592
<210> 110
<211> 592
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE с последовательностью промотора и старт- и стоп-кодонами
<400> 110
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaggtct gctgagactc ggggctgctt 420
agctgtgtag ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg         592
<210> 111
<211> 592
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE с последовательностью промотора и старт- и стоп-кодонами
<400> 111
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaggtct gctgagactc ggggctgctt 420
agctgtgttg ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg         592
<210> 112
<211> 592
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE с последовательностью промотора и старт- и стоп-кодонами
<400> 112
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaggtct gctgagactc ggggctgctc 420
gcctgagtag ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg         592
<210> 113
<211> 592
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE с последовательностью промотора и старт- и стоп-кодонами
<400> 113
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaggtct gctgagactc ggggctgctc 420
gcctgagttg ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg         592
<210> 114
<211> 592
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE с последовательностью промотора и старт- и стоп-кодонами
<400> 114
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaggtct gctgagactc ggggctgctc 420
gcctgtgtag ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg         592
<210> 115
<211> 592
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE с последовательностью промотора и старт- и стоп-кодонами
<400> 115
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaggtct gctgagactc ggggctgctt 420
agctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg         592
<210> 116
<211> 592
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE с последовательностью промотора и старт- и стоп-кодонами
<400> 116
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaggtct gctgagactc ggggctgctc 420
gcctgagttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg         592
<210> 117
<211> 592
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE с последовательностью промотора и старт- и стоп-кодонами
<400> 117
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaggtct gctgagactc ggggctgctc 420
gcctgtgtag ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg         592
<210> 118
<211> 592
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE с последовательностью промотора и старт- и стоп-кодонами
<400> 118
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaggtct gctgagactc ggggctgctc 420
gcctgtgttg ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg         592
<210> 119
<211> 592
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE с последовательностью промотора и старт-кодоном
<400> 119
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaatcat cgtcctttcc ttggctgctc 420
gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tg         592
<210> 120
<211> 593
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE с последовательностью промотора и старт-кодоном
<400> 120
aatcaacctc tggattacaa aaatttgtga aagattgact ggtattctta actatgttgc 60
tccttttacg ctatgtggat acgctgcttt aatgcctttg tatcatgcta ttgcttcccg 120
tatggctttc attttctcct ccttgtataa atcctggttg ctgtctcttt atgaggagtt 180
gtggcccgtt gtcaggcaac gtggcgtggt gtgcactgtg tttgctgacg caacccccac 240
tggttggggc attgccacca cctgtcagct cctttccggg actttcgctt tccccctccc 300
tattgccacg gcggaactca tcgccgcctg ccttgcccgc tgctggacag gggctcggct 360
gttgggcact gacaattccg tggtgttgtc ggggaaggtc tgctgagact cggggctgct 420
cgcctgtgtt gccacctgga ttctgcgcgg gacgtccttc tgctacgtcc cttcggccct 480
caatccagcg gaccttcctt cccgcggcct gctgccggct ctgcggcctc ttccgcgtct 540
tcgccttcgc cctcagacga gtcggatctc cctttgggcc gcctccccgc ctg        593
<210> 121
<211> 179
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Область ДНК FLAP
<400> 121
tacaaatggc agtattcatc cacaatttta aaagaaaagg ggggattggg gggtacagtg 60
caggggaaag aatagtagac ataatagcaa cagacataca aactaaagaa ttacaaaaac 120
aaattacaaa aattcaaaat tttcgggttt attacaggga cagcagagat ccagtttgg  179
<210> 122
<211> 136
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Область ДНК модифицированного FLAP
<400> 122
tacaaatggc agtattcatc cacaattttt tggggggtac agtgcagggg aaagaatagt 60
agacataata gcaacagaca tacaaactaa agaattacaa cgggtttatt acagggacag 120
cagagatcca gtttgg                                                 136
<210> 123
<211> 16
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Центральный полипуриновый тракт (cPPT)
<400> 123
aaaagaaaag ggggga                                                 16
<210> 124
<211> 27
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Центральная последовательность терминации (CTS)
<400> 124
aaacaaatta caaaaattca aaatttt                                     27
<210> 125
<211> 589
<212> ДНК
<213> Вирус гепатита сурков
<400> 125
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc atggctgctc 420
gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc             589
<210> 126
<211> 589
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE со стоп-кодонами
<400> 126
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc atggctgctt 420
agctgagtag ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc             589
<210> 127
<211> 589
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE со стоп-кодонами
<400> 127
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc atggctgctt 420
agctgagtag ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc             589
<210> 128
<211> 589
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE со стоп-кодонами
<400> 128
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc atggctgctt 420
agctgagttg ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc             589
<210> 129
<211> 589
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE со стоп-кодонами
<400> 129
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc atggctgctt 420
agctgtgtag ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc             589
<210> 130
<211> 589
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE со стоп-кодонами
<400> 130
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc atggctgctc 420
gcctgagtag ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc             589
<210> 131
<211> 589
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE со стоп-кодонами
<400> 131
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc atggctgctt 420
agctgagttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc             589
<210> 132
<211> 589
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE со стоп-кодонами
<400> 132
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc atggctgctt 420
agctgtgtag ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc             589
<210> 133
<211> 589
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE со стоп-кодонами
<400> 133
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc atggctgctt 420
agctgtgttg ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc             589
<210> 134
<211> 589
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE со стоп-кодонами
<400> 134
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc atggctgctc 420
gcctgagtag ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc             589
<210> 135
<211> 589
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE со стоп-кодонами
<400> 135
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc atggctgctc 420
gcctgagttg ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc             589
<210> 136
<211> 589
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE со стоп-кодонами
<400> 136
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc atggctgctc 420
gcctgtgtag ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc             589
<210> 137
<211> 589
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE со стоп-кодоном
<400> 137
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc atggctgctt 420
agctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc             589
<210> 138
<211> 589
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE со стоп-кодоном
<400> 138
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc atggctgctc 420
gcctgagttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc             589
<210> 139
<211> 589
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE со стоп-кодоном
<400> 139
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc atggctgctc 420
gcctgtgtag ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc             589
<210> 140
<211> 589
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE со стоп-кодоном
<400> 140
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc atggctgctc 420
gcctgtgttg ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc             589
<210> 141
<211> 179
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Укороченный ген X со стоп-кодонами
<400> 141
atggctgctt agctgagtag ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc 60
ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct 120
tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc  179
<210> 142
<211> 179
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Укороченный ген X со стоп-кодонами
<400> 142
atggctgctt agctgagtag ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc 60
ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct 120
tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc  179
<210> 143
<211> 179
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Укороченный ген X со стоп-кодонами
<400> 143
atggctgctt agctgagttg ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc 60
ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct 120
tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc  179
<210> 144
<211> 179
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Укороченный ген X со стоп-кодонами
<400> 144
atggctgctt agctgtgtag ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc 60
ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct 120
tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc  179
<210> 145
<211> 179
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Укороченный ген X со стоп-кодонами
<400> 145
atggctgctc gcctgagtag ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc 60
ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct 120
tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc  179
<210> 146
<211> 179
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Укороченный ген X со стоп-кодонами
<400> 146
atggctgctt agctgagttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc 60
ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct 120
tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc  179
<210> 147
<211> 179
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Укороченный ген X со стоп-кодонами
<400> 147
atggctgctt agctgtgtag ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc 60
ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct 120
tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc  179
<210> 148
<211> 179
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Укороченный ген X со стоп-кодонами
<400> 148
atggctgctt agctgtgttg ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc 60
ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct 120
tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc  179
<210> 149
<211> 179
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Укороченный ген X со стоп-кодонами
<400> 149
atggctgctc gcctgagtag ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc 60
ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct 120
tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc  179
<210> 150
<211> 179
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Укороченный ген X со стоп-кодонами
<400> 150
atggctgctc gcctgagttg ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc 60
ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct 120
tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc  179
<210> 151
<211> 179
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Укороченный ген X со стоп-кодонами
<400> 151
atggctgctc gcctgtgtag ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc 60
ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct 120
tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc  179
<210> 152
<211> 179
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Укороченный ген X со стоп-кодоном
<400> 152
atggctgctt agctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc 60
ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct 120
tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc  179
<210> 153
<211> 179
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Укороченный ген X со стоп-кодоном
<400> 153
atggctgctc gcctgagttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc 60
ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct 120
tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc  179
<210> 154
<211> 179
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Укороченный ген X со стоп-кодоном
<400> 154
atggctgctc gcctgtgtag ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc 60
ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct 120
tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc  179
<210> 155
<211> 179
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Укороченный ген X со стоп-кодоном
<400> 155
atggctgctc gcctgtgttg ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc 60
ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct 120
tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc  179
<210> 156
<211> 589
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE со старт- и стоп-кодонами
<400> 156
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc ggggctgctt 420
agctgagtag ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc             589
<210> 157
<211> 589
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE со старт- и стоп-кодонами
<400> 157
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc ggggctgctt 420
agctgagtag ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc             589
<210> 158
<211> 589
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE со старт- и стоп-кодонами
<400> 158
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc ggggctgctt 420
agctgagttg ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc             589
<210> 159
<211> 589
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE со старт- и стоп-кодонами
<400> 159
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc ggggctgctt 420
agctgtgtag ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc             589
<210> 160
<211> 589
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE со старт- и стоп-кодонами
<400> 160
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc ggggctgctc 420
gcctgagtag ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc             589
<210> 161
<211> 589
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE со старт- и стоп-кодонами
<400> 161
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc ggggctgctt 420
agctgagttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc             589
<210> 162
<211> 589
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE со старт- и стоп-кодонами
<400> 162
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc ggggctgctt 420
agctgtgtag ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc             589
<210> 163
<211> 589
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE со старт- и стоп-кодонами
<400> 163
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc ggggctgctt 420
agctgtgttg ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc             589
<210> 164
<211> 589
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE со старт- и стоп-кодонами
<400> 164
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc ggggctgctc 420
gcctgagtag ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc             589
<210> 165
<211> 589
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE со старт- и стоп-кодонами
<400> 165
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc ggggctgctc 420
gcctgagttg ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc             589
<210> 166
<211> 589
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE со старт- и стоп-кодонами
<400> 166
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc ggggctgctc 420
gcctgtgtag ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc             589
<210> 167
<211> 589
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE со старт- и стоп-кодонами
<400> 167
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc ggggctgctt 420
agctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc             589
<210> 168
<211> 589
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE со старт- и стоп-кодонами
<400> 168
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc ggggctgctc 420
gcctgagttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc             589
<210> 169
<211> 589
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE со старт- и стоп-кодонами
<400> 169
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc ggggctgctc 420
gcctgtgtag ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc             589
<210> 170
<211> 589
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE со старт- и стоп-кодонами
<400> 170
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc ggggctgctc 420
gcctgtgttg ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc             589
<210> 171
<211> 179
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Укороченный ген X с модифицированными старт- и стоп-кодонами
<400> 171
ggggctgctt agctgagtag ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc 60
ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct 120
tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc  179
<210> 172
<211> 179
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Укороченный ген X с модифицированными старт- и стоп-кодонами
<400> 172
ggggctgctt agctgagtag ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc 60
ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct 120
tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc  179
<210> 173
<211> 179
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Укороченный ген X с модифицированными старт- и стоп-кодонами
<400> 173
ggggctgctt agctgagttg ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc 60
ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct 120
tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc  179
<210> 174
<211> 179
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Укороченный ген X с модифицированными старт- и стоп-кодонами
<400> 174
ggggctgctt agctgtgtag ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc 60
ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct 120
tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc  179
<210> 175
<211> 179
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Укороченный ген X с модифицированными старт- и стоп-кодонами
<400> 175
ggggctgctc gcctgagtag ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc 60
ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct 120
tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc  179
<210> 176
<211> 179
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Укороченный ген X с модифицированными старт- и стоп-кодонами
<400> 176
ggggctgctt agctgagttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc 60
ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct 120
tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc  179
<210> 177
<211> 179
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Укороченный ген X с модифицированными старт- и стоп-кодонами
<400> 177
ggggctgctt agctgtgtag ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc 60
ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct 120
tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc  179
<210> 178
<211> 179
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Укороченный ген X с модифицированными старт- и стоп-кодонами
<400> 178
ggggctgctt agctgtgttg ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc 60
ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct 120
tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc  179
<210> 179
<211> 179
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Укороченный ген X с модифицированными старт- и стоп-кодонами
<400> 179
ggggctgctc gcctgagtag ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc 60
ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct 120
tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc  179
<210> 180
<211> 179
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Укороченный ген X с модифицированными старт- и стоп-кодонами
<400> 180
ggggctgctc gcctgagttg ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc 60
ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct 120
tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc  179
<210> 181
<211> 179
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Укороченный ген X с модифицированными старт- и стоп-кодонами
<400> 181
ggggctgctc gcctgtgtag ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc 60
ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct 120
tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc  179
<210> 182
<211> 179
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Укороченный ген X с модифицированными старт- и стоп-кодонами
<400> 182
ggggctgctt agctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc 60
ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct 120
tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc  179
<210> 183
<211> 179
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Укороченный ген X с модифицированными старт- и стоп-кодонами
<400> 183
ggggctgctc gcctgagttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc 60
ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct 120
tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc  179
<210> 184
<211> 179
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Укороченный ген X с модифицированными старт- и стоп-кодонами
<400> 184
ggggctgctc gcctgtgtag ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc 60
ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct 120
tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc  179
<210> 185
<211> 179
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Укороченный ген X с модифицированными старт- и стоп-кодонами
<400> 185
ggggctgctc gcctgtgttg ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc 60
ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct 120
tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc  179
<210> 186
<211> 589
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE с последовательностью промотора и стоп-кодонами
<400> 186
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaggtct gctgagactc atggctgctt 420
agctgagtag ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc             589
<210> 187
<211> 589
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE с последовательностью промотора и стоп-кодонами
<400> 187
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaggtct gctgagactc atggctgctt 420
agctgagtag ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc             589
<210> 188
<211> 589
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE с последовательностью промотора и стоп-кодонами
<400> 188
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaggtct gctgagactc atggctgctt 420
agctgagttg ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc             589
<210> 189
<211> 589
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE с последовательностью промотора и стоп-кодонами
<400> 189
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaggtct gctgagactc atggctgctt 420
agctgtgtag ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc             589
<210> 190
<211> 589
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE с последовательностью промотора и стоп-кодонами
<400> 190
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaggtct gctgagactc atggctgctc 420
gcctgagtag ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc             589
<210> 191
<211> 589
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE с последовательностью промотора и стоп-кодонами
<400> 191
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaggtct gctgagactc atggctgctt 420
agctgagttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc             589
<210> 192
<211> 589
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE с последовательностью промотора и стоп-кодонами
<400> 192
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaggtct gctgagactc atggctgctt 420
agctgtgtag ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc             589
<210> 193
<211> 589
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE с последовательностью промотора и стоп-кодонами
<400> 193
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaggtct gctgagactc atggctgctt 420
agctgtgttg ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc             589
<210> 194
<211> 589
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE с последовательностью промотора и стоп-кодонами
<400> 194
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaggtct gctgagactc atggctgctc 420
gcctgagtag ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc             589
<210> 195
<211> 589
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE с последовательностью промотора и стоп-кодонами
<400> 195
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaggtct gctgagactc atggctgctc 420
gcctgagttg ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc             589
<210> 196
<211> 589
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE с последовательностью промотора и стоп-кодонами
<400> 196
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaggtct gctgagactc atggctgctc 420
gcctgtgtag ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc             589
<210> 197
<211> 589
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE с последовательностью промотора и стоп-кодоном
<400> 197
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaggtct gctgagactc atggctgctt 420
agctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc             589
<210> 198
<211> 589
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE с последовательностью промотора и стоп-кодоном
<400> 198
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaggtct gctgagactc atggctgctc 420
gcctgagttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc             589
<210> 199
<211> 589
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE с последовательностью промотора и стоп-кодоном
<400> 199
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaggtct gctgagactc atggctgctc 420
gcctgtgtag ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc             589
<210> 200
<211> 589
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE с последовательностью промотора и стоп-кодоном
<400> 200
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaggtct gctgagactc atggctgctc 420
gcctgtgttg ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc             589
<210> 201
<211> 589
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE с последовательностью промотора и стоп-кодоном
<400> 201
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaggtct gctgagactc ggggctgctt 420
agctgagtag ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc             589
<210> 202
<211> 589
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE с последовательностью промотора и старт- и стоп-кодонами
<400> 202
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaggtct gctgagactc ggggctgctt 420
agctgagtag ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc             589
<210> 203
<211> 589
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE с последовательностью промотора и старт- и стоп-кодонами
<400> 203
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaggtct gctgagactc ggggctgctt 420
agctgagttg ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc             589
<210> 204
<211> 589
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE с последовательностью промотора и старт- и стоп-кодонами
<400> 204
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaggtct gctgagactc ggggctgctt 420
agctgtgtag ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc             589
<210> 205
<211> 589
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE с последовательностью промотора и старт- и стоп-кодонами
<400> 205
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaggtct gctgagactc ggggctgctc 420
gcctgagtag ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc             589
<210> 206
<211> 589
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE с последовательностью промотора и старт- и стоп-кодонами
<400> 206
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaggtct gctgagactc ggggctgctt 420
agctgagttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc             589
<210> 207
<211> 589
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE с последовательностью промотора и старт- и стоп-кодонами
<400> 207
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaggtct gctgagactc ggggctgctt 420
agctgtgtag ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc             589
<210> 208
<211> 589
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE с последовательностью промотора и старт- и стоп-кодонами
<400> 208
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaggtct gctgagactc ggggctgctt 420
agctgtgttg ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc             589
<210> 209
<211> 589
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE с последовательностью промотора и старт- и стоп-кодонами
<400> 209
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaggtct gctgagactc ggggctgctc 420
gcctgagtag ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc             589
<210> 210
<211> 589
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE с последовательностью промотора и старт- и стоп-кодонами
<400> 210
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaggtct gctgagactc ggggctgctc 420
gcctgagttg ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc             589
<210> 211
<211> 589
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE с последовательностью промотора и старт- и стоп-кодонами
<400> 211
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaggtct gctgagactc ggggctgctc 420
gcctgtgtag ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc             589
<210> 212
<211> 589
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE с последовательностью промотора и старт- и стоп-кодонами
<400> 212
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaggtct gctgagactc ggggctgctt 420
agctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc             589
<210> 213
<211> 589
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE с последовательностью промотора и старт- и стоп-кодонами
<400> 213
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaggtct gctgagactc ggggctgctc 420
gcctgagttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc             589
<210> 214
<211> 589
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE с последовательностью промотора и старт- и стоп-кодонами
<400> 214
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaggtct gctgagactc ggggctgctc 420
gcctgtgtag ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc             589
<210> 215
<211> 589
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE с последовательностью промотора и старт- и стоп-кодонами
<400> 215
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaggtct gctgagactc ggggctgctc 420
gcctgtgttg ctgactggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc             589
<210> 216
<211> 589
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный PRE с последовательностью промотора и старт- и стоп-кодонами
<400> 216
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaatcat cgtcctttcc ttggctgctc 420
gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc             589
<210> 217
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный промотор гена X
<400> 217
ggggaaatca tcgtcctttc c                                           21
<210> 218
<211> 14
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный промотор гена X
<400> 218
atcatcgtcc tttc                                                   14
<210> 219
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный промотор гена X
<400> 219
ggggaaggtc tgctgagact c                                           21
<210> 220
<211> 14
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Модифицированный промотор гена X
<400> 220
ggtctgctga gact                                                   14
<210> 221
<211> 24
<212> ДНК
<213> Вирус гепатита сурков
<400> 221
atggctgctc gcctgtgttg ccac                                        24
<---