СПОСОБ ОЦЕНКИ КАЧЕСТВЕННЫХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ЭРИТРОЦИТСОДЕРЖАЩИХ СРЕД В ПРОЦЕССЕ ИХ ХРАНЕНИЯ
METHOD FOR ASSESSING QUALITATIVE VARIABLES OF STORED ERYTHROCYTE MEDIA

Изобретение относится к области медицины, в частности к трансфузиологии. Оно предназначено для определения качественных показателей эритроцитсодержащих сред, находящихся на хранении в банке крови.
В настоящее время в Российской Федерации действует Постановление Правительства РФ от 26 января 2010 г. N 29 "Об утверждении технического регламента о требованиях безопасности крови, ее продуктов, кровезамещающих растворов и технических средств, используемых в трансфузионно-инфузионной терапии" (с изменениями от 12 октября 2010 г.). В данном документе установлены значения результатов лабораторных исследований, проводимых отделами технического контроля учреждений службы крови РФ, соответствие которым позволяет говорить о качестве хранящихся компонентов крови. В частности, о качестве эритроцитных сред вывод делается на основании рутинной методики определения гематокрита, общего гемоглобина и свободного (внеэритроцитарного) гемоглобина среды в последний день срока годности компонента крови. Несомненно, уровень свободного гемоглобина косвенно демонстрирует процентную долю гемолизированных эритроцитов в дозе, но не даёт достаточно объективных данных о состоянии мембран  негемолизированных эритроцитов и их форме. Предложенный способ оценки качества эритроцитсодержащих сред с помощью атомно-силового микроскопа позволяет определить резистентность мембран эритроцитов. Атомно-силовая микроскопия является признанной во всём мире эталонной методикой для исследования нативных образцов таких клеток, мембраны которых наиболее доступны для исследования в сухих и водных средах (сперматозоиды, нейроны и эритроциты). Работами ряда авторов показаны изменения микроструктуры и упругости мембран эритроцитов людей с различной патологией [4, 5].
Авторы предложенного способа впервые изучили изменения упругости мембран эритроцитов эритроцитсодержащих сред  с помощью атомно-силового микроскопа в процессе их хранения в банке крови.
Известен способ определения осмотической резистентности эритроцитов  в модификации Л.И. Идельсона. Сущность метода состоит в том, что эритроциты под воздействием растворов с различной концентрацией натрия хлорида способны к разрушению в зависимости от своей осмотической стойкости. Метод основан на количественном определении степени гемолиза в забуференных гипотонических растворах хлорида натрия, в которых, как известно, происходят набухание и гемолиз эритроцитов. Используют 14 рабочих растворов, соответствующих растворам хлорида натрия концентраций от 1% до 0,10%. Оптическую плотность надосадочных жидкостей из каждой пробирки измеряют на фотоэлектроколориметре при длине волны 500-560 нм [1]. К недостаткам способа относятся: трудоемкость приготовления 14 растворов с различными концентрациями натрия хлорида, малая точность, необходимость повторной постановки теста на следующий день со второй порцией крови, при интерпретации результатов учитываются только концентрации натрия хлорида, вызывающие начало появления гемолиза и полный гемолиз.
Известен способ оценки резистентности эритроцитов. Сущность метода заключается в том, что при помещении взвеси эритроцитов в изотонические растворы с различным содержанием мочевины происходит частичный гемолиз. Степень его зависит от скорости фильтрации мочевины через поры (дефекты) плазматической мембраны. Создающаяся в результате пассивного транспорта гипоосмолярная концентрация мочевины внутри эритроцитов вызывает их осмотическое набухание и впоследствии гемолиз. Состояние проницаемости эритрорцитарных мембран определяется кривой мочевинного гемолиза, характеризующегося степенью гемолиза взвеси эритроцитов в смеси изотонических растворов мочевины и хлорида натрия, взятых в различных стандартных соотношениях, которую определяют с помощью фотометрии надосадочной жидкости в 6 пробирках [2]. Недостатками  способа являются: трудоёмкость, временная протяжённость и косвенность выводов о состоянии мембран эритроцитов.
Известен способ оценки механической резистентности эритроцитов А.А. Ненашева и И.М. Тимченко. Кровь набирают в гепаринизированный капилляр вместимостью 0,02 мл и помещают в ячейку, установленную в источнике вибрации. При включении источника вибрации в пробе крови распространяются акустические вибрации заданной частоты и амплитуды, воздействующие на эритроциты, которые под воздействием нагрузки начинают разрушаться. Эритроциты подвергаются нагрузке в течение 3 минут, затем в пробе крови на эритрогемометре определяют число уцелевших клеток и вычисляют процент гемолиза. По величине последнего судят о механической резистентности эритроцитов. Однако стойкость как показатель, суммирующий многие свойства структуры мембраны и цитоплазмы, трудно поддаётся однозначной интерпретации [3].
Предлагаемый способ лишен недостатков известных способов.
Технический результат от использования изобретения - оценка качественных показателей эритроцитсодержащих сред в процессе их хранения.
Заявленный технический результат достигается за счёт оценки упругости мембран эритроцитов  с помощью атомно-силового микроскопа и специализированного программного обеспечения. Количественная оценка упругости объекта производится с помощью вычисления модуля Юнга (МЮ). Для расчёта абсолютного значения МЮ по силовым кривым использовалась модель Герца, в которой рассматривается взаимодействие жёсткой полусферы (кантилевера) и бесконечной плоскости (поверхность биологического образца). В этом случае сила взаимодействия зонда в зависимости от глубины его проникновения в плоскость определяется выражением:
где F - сила, действующая на образец; R - радиус закругления зонда; h - глубина проникновения в поверхность; E - модуль Юнга.
Учитывая радиус закругления кантилеверов, которые использовались в данном исследовании, выводится формула определения МЮ:
где F - y силового графика; h - x силового графика.
Для  x и y на графике силовых кривых выбиралась область линейного изменения значений силовой кривой нажатия кантилевера на поверхность эритроцита (Фиг.1).
Для оценки изменений количественных показателей МЮ в процессе хранения эритроцитсодержащих сред в банке крови были отобраны 5 групп исследуемых образцов. В первую были сгруппированы сухие препараты Er, приготовленные из эритроцитсодержащих сред в день донации, заготовленные в гемаконы Baxter с консервантом CPDA - 1. Во вторую, третью, четвёртую и пятую группы были включены сухие препараты Er, приготовленные из эритроцитсодержащих сред (также заготовленных с использованием консерванта CPDA - 1), которые находились на хранении в банке крови при T - 4°С в течение 7, 14, 21 и 35 суток соответственно. Сканирование проводилось с помощью атомно-силового микроскопа фирмы NT - MDT (Москва), модель Solver D47 - Pro, оснащённого титановым кантилевером с радиусом закругления 10 нм и специализированного программного обеспечения Nova V1.1.0.1847. Использовался полуконтактный метод с генерируемой частотой 300 kHz. На каждом препарате в случайном порядке выбирались пять эритроцитов, на каждом эритроците упругость исследовалась в 9 точках. В первой, второй, третьей и четвёртой группах было сканировано по 35 клеток от 7 доноров, в пятой группе 100 клеток от 20 доноров.
Среднее значение МЮ в первой группе составило 1,81 ± 0,45 KPa. Форма эритроцитов типичная - дискоциты. Среднее значение диаметра эритроцитов - 9,4 ± 0,49 um, высоты - 0,49 ± 0,11 um (Фиг.2 и Фиг.3).
Среднее значение МЮ во второй группе составило 2,20 ± 0,38 KPa. Форма основной части эритроцитов типичная - дискоциты. Среднее значение диаметра эритроцитов - 9,3 ± 0,54 um, высоты - 0,51 ± 0,09 um.
Среднее значение МЮ в третьей группе составило 2,34 ± 0,33 KPa. Форма части эритроцитов изменена - эхиноциты. Среднее значение диаметра эритроцитов - 9,0 ± 0,89 um, высоты - 0,53 ± 0,11 um.
Среднее значение МЮ в четвёртой группе составило 2,67 ± 0,39 KPa. Форма части эритроцитов изменена - эхиноциты и сфероэхиноциты. Среднее значение диаметра эритроцитов - 8,87 ± 0,74 um, высоты - 0,60 ± 0,12 um.
Среднее значение МЮ в пятой группе составило 3,23 ± 0,75 KPa. Форма эритроцитов изменена - эхиноциты. Среднее значение диаметра эритроцитов - 7,6 ± 1,07 um, высоты - 0,66 ± 0,13 um (Фиг.4 и Фиг.5).
В процессе хранения эритроцитных сред наблюдается как выраженное увеличение значений модуля Юнга, так и нарастание разнородности упругости в разных точках измерения на поверхности эритроцита. Неоднородность биофизических свойств мембраны эритроцитов говорит об уменьшении их пластичности и повышенной склонности к гемолизу.
С помощью программного обеспечения Statistica 8.0 был построен график линейной регрессии средних значений МЮ описанных пяти групп образцов (p = 0,000000) и составлено уравнение зависимости значения МЮ мембран эритроцитов от срока хранения эритроцитной среды (Фиг.6)
МЮ = 1,81 + 0,04 * x,
где МЮ - модуль Юнга [KPa]; x - срок хранения эритроцитсодержащей среды, измеряемый в сутках, прошедших с момента изготовления компонента крови.
Предлагаемая формула позволяет вычислить нормальное значение МЮ мембраны эритроцита на любые сутки хранения в течение всего срока годности эритроцитсодержащей среды. Сопоставив МЮ мембран эритроцитов исследуемых эритроцитных сред с полученными с помощью данной формулы значениями, можно сделать вывод об их качестве и пригодности для клинического использования.
В результате анализа описаний изобретений к патентам, отобранных при проведении патентного поиска, и на основании проведенных патентных исследований установлено, что данные по оценке качественных показателей эритроцитных сред с помощью атомно-силовой микроскопии не встречаются. На основании этого можно считать, что различные решения в данной области могут быть патентоспособными и оформлены заявками на изобретения. Следовательно, заявленное изобретение соответствует условию «новизна».
Литература
1. Карпищенко А.И.//Медицинские лабораторные технологии. - 2002. - Т.1. - С.408.
2. Колмакова Е.В.//Лаб. дело. - 1988. - N 7. - С.11-14.
3. Неашев А.А, Тимщенко И.М. // Лаб. дело. - 1988. - N 3. - С.134-135.
4. Engel A., Muller D.J.//Nature structural biology. - 2000. - Vol. 7. - num.9.
5. Kamruzzahan A.S.M., Kienberger F., Stroh S.M., Berg J.// Biol. Chem. - 2004. - Vol.385. - Рp.955-960.