СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БАКТЕРИОСТАТИЧЕСКОГО, БАКТЕРИЦИДНОГО И СТИМУЛИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ АНТИБИОТИКА НА МИКРООРГАНИЗМЫ
METHOD OF DETERMINING BACTERIOSTATIC, BACTERICIDAL AND STIMULATING EFFECT OF ANTIBIOTIC ON MICROORGANISM

Изобретение относится к медицине, микробиологии, а именно к бактериологии и относится к способам определения действия антибиотика на микроорганизмы.
7
Известен способ определения чувствительности микроба к антибиотику [РФ, п. 2121678, МПК G01N 33/48, А61К 38/19, C12Q 1/18, опубл. 10.11.1998 г.], включающий сравнение зон задержек роста исследуемого микроорганизма после контакта с бумажным диском с ампициллином с одной стороны и диском совместно с цитокином с другой стороны чашки Петри.
Недостатки способа заключаются в том, что единовременно может исследоваться только одна культура и данный способ не предусматривает количественного учета результатов. Отсутствуют контрольные данные.
Наиболее близким к заявляемому изобретению является способ определения бактериостатического и бактерицидного действия антибиотика [РФ, п. 2213780, МПК 7 C12Q 1/04, C12N 1/20, опубл. 10.10.2003 г., (прототип)], включающий разведение исследуемого антибиотика в питательной среде с индикатором и добавление в эту среду суспензии бактерий. О бактерицидном и бактериостатическом действии антибиотика в данном способе судят по отсутствию или наличию помутнения и изменению цвета среды в планшете.
Недостатками способа являются недостаточная точность регистрируемых результатов, так как учет проводится визуально. Определение действия антибиотика на микроорганизм требует проведения нескольких учетов результатов и дополнительных затрат на реагенты. В способе-прототипе невозможно определение стимулирующего действия антибиотика на микроорганизм.
Техническим результатом изобретения является повышение точности качественной и количественной оценки бактериостатического, бактерицидного и стимулирующего действия антибиотика на микроорганизмы.
Технический результат достигается тем, что в способе определения бактериостатического, бактерицидного и стимулирующего действия антибиотика на микроорганизмы, включающем приготовление разведений исследуемого антибиотика в питательной среде и регистрацию наличия роста микроорганизмов, новым является то, что используют 50 разных культур микроорганизмов, одновременно нанесенных на поверхность твердой питательной среды (ПА) с разными концентрациями антибиотиков, измеряют диаметр выросших колоний исследуемых микроорганизмов и определяют действие антибиотика как бактерицидное, бактериостатическое или стимулирующее при достоверном увеличении или снижении диаметра колоний по сравнению с контролем.
Заявляемый способ использует 50 разных культур микроорганизмов, одновременно нанесенных на поверхность твердой питательной среды (ПА) с разными концентрациями антибиотиков, позволяет дать количественную оценку действию антибиотика на исследуемые культуры, все это дает возможность статистической обработки результатов и, следовательно, повышает точность и достоверность получаемых результатов.
Это отличие позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию «новизна».
Признаки, отличающие заявляемое техническое решение от прототипа, не выявлены в других технических решениях при изучении данной и смежных областей техники и, следовательно, обеспечивают заявляемому решению соответствие критерию «изобретательский уровень».
Сущность изобретения поясняется чертежами:
На фиг.1 представлено действие разных концентраций гентамицина на рост исследуемых бактерий, где 1 - контроль; 2, 3 и 4 - концентрации антибиотика: 40, 120 и 240 мкг/мл. На фиг.2 представлено действие антибиотиков дискодиффузным методом на Staphylococcus aureus 206. На фиг.3 представлено действие разных концентраций цефтазидима на рост исследуемых бактерий, где 1 - контроль; 2, 3 и 4 - концентрации антибиотика: 10, 30 и 100 мкг/мл.
Предлагаемый способ выполняется в три этапа, исследование проводят в чашках Петри.
Первый этап - в пробирках со стерильным физиологическим раствором готовят разведения антибиотика в трех разных концентрациях. В пептонный агар (1% пептона, 0,5% NaCl на дистиллированной воде с 2%-ным агаром, рН 7,4), предварительно остуженный до 40°С, добавляют приготовленный ранее раствор антибиотика. Среду перемешивают и мерно (по 30 мл) разливают по чашкам Петри. Разное количество среды в чашках может исказить получаемые результаты.
Второй этап - стерилизуют ручку и станину репликатора. Из суточных испытуемых культур по оптическому стандарту мутности на 10 единиц на стерильном 0,9%-ном растворе хлорида натрия готовят суспензию, которой пастеровскими пипетками заполняют лунки станины репликатора. Затем с помощью репликатора делают реплики (Miller, 1972) до 50 исследуемых культур одновременно на поверхность незасеянной среды с антибиотиком. Параллельно с опытом ставят контроль. Контролем служат чашки с пептонным агаром, не содержащим антибиотик, засеянными теми же испытуемыми микроорганизмами. Опытные и контрольные чашки с испытуемыми культурами в течение 18 часов инкубируют в термостате при 37°С.
Третий этап - оценивают реакции исследуемых культур на действие антибиотика путем измерения и сравнения диаметров колоний в опыте и контроле. Проводят статистическую обработку результатов. Действие антибиотика на микроорганизмы определяют как бактерицидное, бактериостатическое или стимулирующее при достоверном увеличении или снижении диаметра колоний по сравнению с контролем.
Пример 1. Определение действия гентамицина на бактерии, предоставленные бак. лабораторией Городской клинической больницы №6 им. Н.С.Карповича (бывшая ГБСМП) г.Красноярска.
В эксперименте испытуемыми культурами были бактериальные штаммы: Bacillus cereus 262, Acinetobacter baumanii 190, Escherichia coli 247, Enterobacter aerogenes 264, Klebsiella pneumonii 181, Providenciae rettgeri 257, Pseudomonas aeruginosa 202, Pseudomonas aeruginosa 190, Corynebacterium xerosis 313, Enterococcus faecium 263, Staphylococcus aureus 206, Staphylococcus aureus 179. В качестве питательной среды использовали пептонный агар. Гентамицин брали в виде 4% раствора в ампулах. Готовили разведения антибиотика в физиологическом растворе в трех концентрациях - 40, 120 и 240 мкг/мл. Для последующего сравнения полученных результатов с известным дискодиффузным методом одну из концентраций (120 мкг/мл) брали равной концентрации гентамицина в бумажном диске. Приготовленные растворы добавляли в чашки Петри с предварительно остуженным до 40°С пептонным агаром. Из суточных испытуемых культур по оптическому стандарту мутности на 10 единиц на стерильном физиологическом растворе готовили суспензию. Приготовленной суспензией заполняли лунки станины репликатора и с помощью репликатора делали реплики испытуемых культур в трех повторностях на поверхность питательной среды с антибиотиком (опыт). Параллельно с опытными чашками делали реплики исследуемых культур на поверхность питательной среды без антибиотика (контроль). Далее в течение 18 часов культуры инкубировали в термостате при 37°С. Затем проводили оценку полученных результатов: измеряли и сравнивали диаметры колоний в опыте и контроле (фиг.1), проводили статистическую обработку данных. Учитывали в опыте и контроле среднюю арифметическую величину измерений диаметра колоний, ошибку средней арифметической и достоверность сравнения полученных результатов. В таблице 1 представлены результаты сравнения диаметра колоний (в мм) исследуемых бактерий в опыте (при действии гентамицина) и контроле (без гентамицина).
Результаты, полученные заявляемым способом, сравнили с результатами по определению действия гентамицина на бактерии диско-диффузным методом. Для этого суспензией исследуемых бактерий засевали чашку Петри с пептонным агаром и раскладывали диски, пропитанные антибиотиками (фиг.2). Далее в течение 18 часов культуры инкубировали в термостате при 37°С. Результаты учитывали путем измерения диаметров зон задержки роста в опыте и контроле. В таблице 1 дан диаметр зон задержки роста (мм) испытуемых культур при использовании дискодиффузного метода.
При сравнении действия гентамицина на рост исследуемых бактерий предлагаемым способом с дискодиффузным выявлено, что действия совпали в четырех случаях. В одном случае выявлено достоверное бактерицидное действие гентамицина на рост Acinetobacter baumanii 190. В трех случаях действие отсутствовало (Enterobacter aerogenes 264, Providenciae rettgeri 257, Pseudomonas aeruginosa 190). В остальных случаях результаты не совпали. Предлагаемым способом выявлено еще четыре достоверных бактерицидных действия и одно достоверное стимулирующее.
Пример 2. Определение действия цефтазидима на бактерии, предоставленные бак. лабораторией Городской клинической больницы №6 им. Н.С.Карповича (бывшая ГБСМП) г.Красноярска, по приведенной на примере 1 схеме. Цефтазидим брали в виде порошка. Готовили разведения антибиотика в физиологическом растворе в трех концентрациях - 10, 30 и 100 мкг/мл. Для последующего сравнения результатов двух методов одну из концентраций (30 мкг/мл) брали равной концентрации цефтазидима в бумажном диске. В таблице 2 представлены результаты сравнения диаметра колоний (в мм) исследуемых бактерий в опыте (при действии цефтазидима) и контроле (без цефтазидима).
При сравнении действия цефтазидима на рост исследуемых бактерий предлагаемым способом с дискодиффузным выявлено, что действия совпали в четырех случаях. В одном случае выявлено достоверное бактерицидное действие цефтазидима на рост Corynebacterium xerosis 313. В трех случаях действие отсутствовало (Escherichia coli 247, Enterobacter aerogenes 264, Enterococcus faecium 263). В остальных случаях результаты не совпали. Предлагаемым способом выявлено еще пять достоверных бактерицидных действий и два достоверных стимулирующих.
Заявляемый способ позволяет дать количественную оценку действия антибиотика на исследуемые культуры. Оценка проводится путем измерения диаметра колоний испытуемых микроорганизмов в опыте и контроле с последующей статистической обработкой данных. Способ позволяет выявить не только бактериостатическое и бактерицидное действие антибиотика на микроорганизм, но и стимулирующее действие. Результаты могут быть выражены как в абсолютных, так и относительных величинах. Данным способом возможно изучение действия антибиотика на 50 исследуемых культур одновременно.