АНТИМИКРОБНЫЕ КОМПОЗИЦИИ
ANTIMICROBIAL COMPOSITIONS

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННУЮ ЗАЯВКУ
[1] Данная заявка испрашивает приоритет по предварительной заявке на патент США №14/615527, поданной 6 февраля 2015, включенной в данный документ в полном объеме посредством ссылки.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[2] Настоящее изобретение относится к композициям для увеличения цветовой и/или микробной стабильности в продуктах питания и, в частности, к композициям, которые увеличивают цветовую и/или микробную стабильность в продуктах питания, включающих, но не ограничиваясь ими, мясо, рыбу или птицу (свежее/необработанное и обработанные). Данные композиции эффективны для увеличения цветовой и микробиологической стабильности продуктов питания.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[3] Продовольственная безопасность и предотвращение порчи продуктов питания всегда представляют интерес во всем мире, особенно в мясной промышленности. Порча продуктов питания является основной экономической проблемой для производителя продуктов питания. Производители продуктов питания должны защищать здоровье и безопасность населения, поставляя продукты, которые можно безопасно употреблять в пищу. Такие продукты питания должны иметь гарантированный срок годности, как при хранении в охлажденном виде, так и при комнатной температуре. Потребители предпочитают вкусные продукты питания высокого качества. Этого трудно достичь с помощью химических консервантов, агрессивных режимов нагрева и других технологических процессов. Безопасность и защита продуктов питания лучше всего достигается с помощью системы многократного сохранения, использующей комбинированный подход более мягкой обработки и естественных консервантов. Пищевые микроорганизмы также менее способны адаптироваться и расти в продуктах питания, сохраненных при помощи различных мер сохранения.
[4] Существует значительный интерес по поводу защиты продуктов питания и по поводу роста организмов, таких как Listeria monocytogenes, связанных с порчей продуктов питания. Этот конкретный вид является одним из наиболее проблемных микроорганизмов, вызывающих порчу мяса. Необычные физиологические характеристики, такие как исключительная устойчивость к антимикробным препаратам, в значительной степени ответственны за их способность вызывать порчу. Кроме того, организмы, вызывающие порчу, могут иногда адаптироваться к различным консервантам и условиям хранения, поэтому сочетание мер предохранения может быть более успешным, чем индивидуальные меры.
[5] Существует растущая потребность в разработке экономичных, естественных и эффективных систем консервирования для удовлетворения общественного спроса на удобные, натуральные, безопасные, здоровые и качественные продукты с гарантированным сроком годности. Антимикробные материалы, такие как полученные из растений, могут использоваться в качестве консервантов продуктов питания для удовлетворения этой потребности. Такие растительные экстракты считаются желательными, поскольку они являются естественными. Более того, с точки зрения регулирования, из-за длительного использования растительные экстракты обычно имеют статус GRAS (обычно считается безопасными). Также существует стремление обеспечить микробную защиту, используя меньшее количество антимикробных материалов. Таким образом, необходимо обеспечить новые антимикробные материалы или новые более эффективные комбинации антимикробных материалов.
[6] Несмотря на их естественное происхождение, желательно, чтобы антимикробные продукты из растений использовались в минимально возможных количествах. Это желательно не только по причинам стоимости, но и для удовлетворения желания потребителей минимизировать количество «добавок» в продуктах питания. Кроме того, многие растительные материалы обладают определенным вкусом. Поэтому во многих требовательных продуктах питания выгодно уменьшить количество защитного средства растительного происхождения.
[7] Производители мяса ищут способы, обеспечивающие возможность поставки в розничные магазины из эффективных, экономичных центров централизованной обработки. Для обеспечения этого необходимо увеличить срок хранения в отношении порчи (безопасность для потребителей), поскольку мясо поставляется через более длинные каналы распределения от производителя к розничному продавцу.
[8] Цвет во время срока хранения важен для принятия потребителем. Потребители оценивают свежесть мяса по наличию ярко-красного оксигемоглобинового пигмента. Уровень оксимиоглобина в свежем мясе уменьшается со временем во время хранения, так как он переходит в стабильный коричневый пигмент - метмиоглобин. Хотя оксигемоглобиновый пигмент исчезает во время хранения в темноте, например, в шкафу для мяса, потеря пигмента наиболее выражена в освещенных, холодильных витринах в торговых заведениях. Кроме того, потеря пигмента носящая преимущественно косметический характер, имеет серьезные экономические последствия. Потребители в поисках самых свежего кусков избегают покупки мяса, содержащего даже небольшое количество коричневого метмиоглобина.
[9] Срок хранения, связанный с порчей микроорганизмами, является серьезной проблемой. Потенциальная ответственность, связанная со вспышками болезней пищевого происхождения от продажи мяса, загрязненного микробами, огромна. Мясная промышленность и связанные с ней торговые точки ищут способы обеспечения безопасности потребителей путем предотвращения микробного загрязнения на протяжении всего производственного процесса. Усовершенствования процесса, такие как мытье туш и тщательно контролируемая низкотемпературная обработка, в настоящее время являются стандартными в отрасли. Один способ увеличения срока годности, связанный с порчей микроорганизмами, заключается в упаковке продуктов питания, например, мяса, при помощи упаковки в модифицированной атмосфере (MAP).
[10] В промышленности существует потребность в антимикробных способах и процессах, которые потребители воспринимают как более естественные. Основным предметом исследования была антимикробная активность композиции, содержащей экстракт Lamiaceae (Яснотковых) и гесперидин. Большая часть известного на дату публикации уровня техники указывает на то, что антимикробная активность трав сосредоточена в летучих эфиромасличных компонентах.
[11] P.M. Davidson и A.S. Naidu (в Natural Food Antimicrobial Systems, A. S. Naidu, ed., 2000, CRC Press, Boca Raton, pages 265-294) проанализировали антимикробные свойства фитофенольных соединений из эфирных масел специй, трав, съедобных зерен и семян. Авторы указывают, что антимикробные эффекты специй и трав связаны прежде всего с присутствием фенольных соединений во фракциях эфирного масла и что некоторые монотерпены, по-видимому, также проявляют некоторую активность. Карвакрол, п-цимен и тимол идентифицированы как основные летучие компоненты орегано, чабреца и чабера, которые, вероятно, проявляют наблюдаемую активность. Предполагается, что активными антимикробными агентами розмарина являются борнеол, камфара, 1,8-цинеол, альпинины, камфен, вербенон и борнилацетат. Предполагается, что активной составляющей шалфея является туйон. Показано, что минимальные летальные концентрации эфирных масел тимьянового масла колеблются от 225-900 частей на миллион в культурах. Эти концентрации эфирных масел в продуктах питания могут вызвать серьезные проблемы с ароматом. Поскольку эксперименты с культурой не учитывают концентрацию, необходимую для эффективности в продуктах питания, проблемы с ароматом в продуктах питания, вероятно, будут более серьезными, чем предполагают даже цифры в культурах. В другой части данной ссылки минимальные ингибирующие концентрации эфирных масел были указаны как 1-2% для розмарина, 0,12-2% для тимьяна, 0,12-2% для мяты колосистой, 0,5-2% для шалфея, 0,5-2% для мяты перечной и 0,12-2% для орегано. В реферате авторы заявляют, что концентрации антимикробных соединений в травах и специях слишком малы, чтобы эффективно использоваться без неблагоприятного воздействия на сенсорные характеристики продукта питания.
[12] Y. Kimura et al. в патенте США №4380506, указывают способ получения консерванта, обладающего антиоксидантной и антимикробной активностью. Данный процесс включает разделение экстракта травяных специй между полярными и неполярными растворителями. Некоторые из разделенных экстрактов демонстрировали антимикробную активность против грамотрицательных микроорганизмов Bacillus subtilis в культуральных средах. Единственным критерием вкуса, проверенным Kimura et al., была горечь. Kimura et al. умолчали в отношении восприятия эфирного масла. Kimura et al. не дезодорируют экстракт, а это означает, что экстракт содержит эфирные масла и влияет на вкус мяса. Это влияние на вкус обуславливает использование экстрактов розмарина, полученных при помощи процесса, указанного Kimura et al.
[13] D. Ninkov (WO 01/15680) указывает, что фармацевтические композиции могут быть получены путем объединения экстрактов эфирных масел с растениями семейства Lamiaceae с органической кислотой. Ninkov указывает, что антимикробная активность фармацевтической композиции обусловлена присутствием в масляном экстракте растения органических фенолов, таких как изопропил о-крезол.
[14] K. Shetty и R.G. Labbe, (Asia Pacific J. Clin. Nutr. (1998), 7(3/4), стр. 270-276., описывают работу по клонированию растений семейств Lamiacae для получения улучшенных уровней эфиромасличных компонентов, таких как карвакрол и тимол. Эти эфиромасличные компоненты обладают некоторыми антимикробными свойствами, но их коммерческое использование предотвращается сильными ароматизаторами, передаваемыми продуктами питания этими летучими соединениями.
[15] J. Campo, M. Amiot и C. Nguyen-the (2000, Journal of Food Protection 63, pages 1359-1368) указывают, что экстракт розмарина обладает антимикробными свойствами в исследованиях на культуре. Минимальные ингибирующие концентрации варьировали в зависимости от вида тестируемых бактерий, но варьировали от 0,06 до 1%. Данные исследователи предполагают, что экстракт розмарина может оказаться перспективным в продуктах питания с низким содержанием жиров и низким содержанием белков, против грамположительных организмов. В этой ссылке не изучались никакие пищевые системы. Данная ссылка не изучала конкретно Listeria.
[16] В статье E. Down, et al., “Comparison of Vitamin E, Natural Antioxidants and Antioxidant Combinations on the Lean Color and Retail Case-Life of Ground Beef Patties”, опубликованной в октябре 1999 года, описывается влияние экстракта розмарина в сочетании с другими природными антиоксидантами и добавкой витамина Е в рацион на сохранение цвета говяжьего фарша, отличного от MAP. Данная рекомендация не описывает, как продлить микробный срок хранения мяса. Авторы не смогли продемонстрировать улучшение красного цвета мяса с помощью розмарина, поскольку сохранение красного цвета в мясе с естественным антиоксидантом, содержащим розмарин, не могло статистически отличаться от контроля. Красный цвет в контроле изменяется в коммерчески желательном периоде. Потеря как красного цвета в контроле, так и в мясе с розмарином из данной ссылки обуславливает использование экстракта розмарина в качестве стабилизатора, способного сохранять красный цвет мяса.
[17] В Ahn et al. “Effects of plant extracts on microbial growth, color change, and lipid oxidation in cooked beef”, Food Microbiol., Vol. 24, Issue 1, (2007): 7-14 продемонстрировано, что экстракт розмарина или олеосмола розмарина, для которых содержание в фенольных дитерпенах неизвестно, оказывает антилистерический эффект. В данной ссылке экстракт виноградных косточек и экстракт сосновой коры имели больший антилистерический эффект, чем розмарин, что предостерегает от использования экстракта розмарина в качестве основного антилистерического натурального продукта в мясе. Кроме того, Ahn et al. 2007 показали, что добавление экстракта розмарина в мясо значительно ухудшило красный цвет мяса по сравнению с контролем, который потерял меньше красного цвета или по сравнению с экстрактом винограда, что значительно улучшило сохранение красного цвета мяса. Поэтому Ahn et al. В 2007 году предлагают не использовать экстракт розмарина в качестве стабилизирующего агента, способного сохранять красный цвет мяса.
[18] В публикациях патентной заявки США №2004/131709 показано, что экстракт розмарина отдельно, Herbalox Seasoning, в котором большинство компонентов летучего масла удалены, проявляет очень слабый, если таковой имеется, антимикробный эффект. В данной ссылке указано, как продлить грамположительный, а точнее антилистерический срок хранения мяса.
[19] Кроме того, растительные антимикробные препараты из цитрусовых, о которых сообщалось в известном на дату публикации уровне техники, представляют собой кислоты, а не флавоноиды. Например, известные на дату публикации патенты, указывают на соединения из цитрусовых, по существу относящиеся к кислотам. KR20040001441 описывает апельсиновый сок в качестве супрессора роста бактерий. Однако, только менее чем приблизительно 1/50 сока, указанного в KR20040001441, можно было использовать в мясе, не воспринимая мясо как кислое. Поскольку мясо занимает до 7,2% раствора, богатого лимонной кислотой, конечные уровни в гесперидине, потребляемом в мясе, тогда будут соответствовать менее чем 0,48%*1/50*7,2%=~0,0007%. В данной ссылке не указано, может ли гесперидин оказывать антилистериновый эффект на мясо.
[20] В Lorente, José et al. “Chemical guide parameters for Spanish lemon (Citrus limon (L.) Burm.) juices.” Food chemistry 162 (2014): 186-191 указано, что цитрусовый сок имеет титруемую кислотность, равную 52,4 г/л, причем основным компонентом является лимонная кислота. Согласно Lorente et al. (2014) в таком соке уровни гесперидина по сравнению с титруемой кислотностью ниже на два порядка (от 257 до 484,8 мг/л), что соответствует 0,26-0,48% гесперидина мас./об. Добавление таких кислотных композиций в мясо повлияло бы на вкус мяса уже при малых уровнях.
[21] В Aktaş, Nesimi, and Mükerrem Kaya. “The influence of marinating with weak organic acids and salts on the intramuscular connective tissue and sensory properties of beef.” European Food Research and Technology 213.2 (2001): 88-94 показано, что добавление раствора 1% слабой кислоты (включая лимонную кислоту) в мясо придает мясу кислый вкус. Также авторы показали, что при мариновании в пропорциях 1:1 мас./об. (мясо/маринад) мясо получает прибавку по массе не более 7,2% после маринования в маринадах, содержащих лимонную кислоту.
[22] В WO 2012/112337 сообщается, что флавоноиды, в том числе гесперидин, могут оказывать некоторую активную антимикробную активность, не информируя о природе микробов, независимо от того, являются ли они бактериями, являются ли они грамотрицательными бактериями и являются ли они видами рода Listeria. В WO 2012/112337 указано, что активные антимикробные соединения представляют собой кислоты.
[23] В Moulehi, Ikram, et al. “Variety and ripening impact on phenolic composition and antioxidant activity of mandarin (Citrus reticulate Blanco ) and bitter orange (Citrus aurantium L.) seeds extracts.” Industrial Crops and Products 39 (2012): 74-80 сообщается, что экстракты семян цитрусовых содержат флавоноиды в количестве от 1,31 до 2,52 мг эквивалента катехинов/г (сухая масса). Поскольку гесперидин составляет <16% от общего количества флавоноидов экстракта семян цитрусовых, это означает, что гесперидин присутствует в ~0,032% в экстракте семян цитрусовых (сухая масса).
[24] В Mandalari, G., et al. “Antimicrobial activity of flavonoids extracted from bergamot (Citris bergamia Risso) peel, a byproduct of the essential oil industry.” Journal of Applied Microbiology 103.6 (2007): 2056-2064 сообщается, что богатые флавоноидами экстракты цитрусовых in vitro ингибируют рост только грамотрицательных бактерий и не влияют на рост грамположительных бактерий и не влияют на рост Listeria. В Mandalari, G., et al. (2007) показано, что неогесперидин в чистой форме не оказывает эффекта на рост Listerial in vitro.
[25] В Fernandez-Lopez, J., et al. “Antioxidant and antibacterial activities of natural extracts: application in beef meatballs.” Meat science 69.3 (2005): 371-380 показано, что мясо, дополненное экстрактами цитрусовых, содержащими флавоноиды, основным из которых является гесперидин, не влияет на рост Listeria monocytogenes. Например, в Fernandez-Lopez et al. (2005) показано, что такие экстракты оказывают антимикробные эффекты на другие штаммы бактерий, включая Listeria innocua, но не на Listeria monocytogenes.
[26] В работах Mandalari et al. и Fernandez-Lopez et al. предостерегают от использования гесперидина в качестве антилистерического соединения и не предполагают очевидным использование какой-либо из них или комбинации флавоноидов из цитрусового экстракта против Listeria monocytogenes в мясе. Например, в Mandalari et al. (2007) предостерегают от использования гесперидина в качестве антилистерического соединения и не предпогают очевидным, что очищенный флавоноид может иметь антилистерический эффект.
[27] Экстракты Punica, богатые эллаговой кислотой, не оказывают антимикробных эффектов на сырое MAP мясо. Например, в Hayes et al. (Hayes, J.E., Stepanyan, V., Allen, P., O'Grady, M.N., & Kerry, J. p. 2010). “Effect of lutein, sesamol, ellagic acid and olive leaf extract on the quality and shelf-life stability of packaged raw minced beef patties”, Meat science, 84(4), 613-620.) (в дальнейшем “Hayes et al”) указано, что эллаговая кислота (одно из активных соединений из экстракта Punica) не оказывает антимикробного действия на сырое MAP мясо, хранящееся в холоде, при нанесении в количестве 300 ч/млн В Hayes et al. указано, что эллаговая кислота не улучшает сохранение красного цвета сырой MAP говядины, хранящейся в холодном состоянии, и при применении количестве 300 ч/млн или 600 ч/млн В Hayes et al. предостерегают от использования более низких концентраций, чем 300 ч/млн эллаговой кислоты для антимикробного эффекта. В Hayes et al. предостерегают от использования эллаговой кислоты для улучшения красного цвета мяса.
[28] Общая проблема увеличения срока годности свежего мяса без влияния на вкус остается в предотвращении роста вызывающих порчу организмов и патогенов и в сохранении красного цвета мяса в течение коммерчески желательного периода хранения.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[29] Согласно одному аспекту в соответствии с настоящим изобретением композиции содержат экстракт Lamiaceae (розмарина), содержащий фенольные дитерпены, причем экстракт практически не содержит нативного эфирного масла и/или гесперидинового экстракта. Преимущественно экстракт гесперидина представляет собой чистый гесперидин, то есть, имеющий концентрацию по меньшей мере 80%.
[30] Другие аспекты настоящего способа и композиции предназначены для применения с продуктами питания, включающими без ограничения, свежее мясо, птицу и рыбу, и включают компоненты композиции данного раскрытия, упакованный продукт питания и способ упаковки продукта питания.
[31] Настоящее изобретение в одной форме относится к композиции, содержащей гесперидин и/или экстракт Lamiaceae, причем большинство летучих компонентов удалены из экстракта Lamiaceae.
[32] Настоящее изобретение в другом виде относится к продукту питания, включающему, без ограничения, мясо, птицу и рыбу, включая как необработанное или свежее мясо, птицу и рыбу, а также обработанное мясо, птицу и рыбу, содержащие композицию, содержащую гесперидин и экстракт Lamiacea, причем большая часть летучих компонентов масла удалена из экстракта Lamiaceae.
[33] Настоящее изобретение в другой форме относится к способу упаковки продукта питания. Способ включает применение к или включение в продукт питания, включающий, без ограничения, свежее или необработанное мясо, рыбу или домашнюю птицу, а также обработанное мясо, рыбу и домашнюю птицу, композиции, содержащей гесперидин и экстракт Lamiaceae, причем большая часть летучих компонентов масла удалены из экстракта Lamiaceae. Способ, необязательно, дополнительно включает упаковку продукта питания в атмосфере, которая содержит 20% или более кислорода. В альтернативных дополнительных вариантах реализации изобретения количество кислорода может составлять до 70% кислорода. В еще одном альтернативном варианте реализации изобретения упакованный продовольственный продукт включает продукт питания, например, свежее/необработанное мясо, рыбу или птицу или обработанные мясо, рыбу или птицу, упакованные при стандартных условиях атмосферы.
[34] Настоящее изобретение в другой форме относится к способу упаковки продукта питания. Способ включает применение к или включение в продукт питания, который включает, без ограничения, мясо, рыбу или домашнюю птицу (свежую/необработанную и обработанную), композиции, содержащей гесперидин и экстракт Lamiaceae, причем большая часть летучих компонентов масла удалены из экстракта Lamiaceae, а продукт питания упакован в среде, которая содержит 20% или более кислорода.
[35] В одной форме настоящее изобретение относится к присутствию гесперидина, имеющего концентрацию, равную по меньшей мере от 80% до 99%, предпочтительно 95% и добавлению 56-5380 ч/млн в комбинации или нет с экстрактом розмарина в продукт питания для ингибирования роста Listerial monocytogenes.
[36] Настоящее изобретение в другой своей форме относится к продовольственному продукту, содержащему продукт питания и содержащему композицию, содержащую чистый гесперидин или экстракт Lamiaceae.
[37] Настоящее изобретение в другой своей форме относится к способу упаковки продукта питания включающему применение к или включение в продукт питания композиции, содержащей чистый гесперидин или экстракт Lamiaceae. Необязательно, может дополнительно включать упаковку продукта питания в атмосфере, которая содержит 20% или более кислорода.
[38] Настоящее изобретение в еще одной своей форме относится к антимикробной композиции, содержащей эффективное количество фенольного дитерпена и/или гесперидина.
[39] Настоящее изобретение в другой своей форме относится к антибактериальной композиции, содержащей эффективное количество фенольного дитерпена и/или гесперидина. В одной предпочтительной дополнительной форме композиция является эффективной против грамположительных бактерий, выбранных из группы, состоящей из Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Streptococcus mutans, Listeria monocytogenes, Clostridium perfringens, Enterococcus hirae и Mycobacterium bovis. В альтернативной дополнительной форме композиция является эффективной против грамотрицательных бактерий, выбранных из группы, состоящей из Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Salmonella typhimirium и Enterobacter cloacae.
[40] Настоящее изобретение в еще одной своей форме относится к фунгицидной/антидрожжевой композиции, содержащей эффективное количество фенольного дитерпена и гесперидина. В одной предпочтительной форме композиция является эффективной против дрожжей, включая Saccharomyces cerevisiae и Candida albicans.
[41] Экстракт розмарина в соответствии с настоящим изобретением улучшает сохранение красного цвета мяса и продлевает микробный срок хранения, не влияя на вкус мяса. Исследования настоящих изобретателей на реальных мясных системах используют дезодорированный экстракт розмарина: экстракт, из которого большая часть летучих компонентов эфирного масла удалена и не влияет на вкус мяса. В сочетании с гесперидином или экстрактом Punica неожиданно наблюдаются синергетические антилистерические и синергетические эффекты сохранения цвета, без какого-либо влияния на вкус продукта питания.
2
[42] Настоящий способ и композиция могут предоставить поставщикам продуктов питания любых продовольственных продуктов или напитков, включая производителей мяса, пути для предоставления розничным торговцам продуктов из экономичных и рентабельных центральных обрабатывающих центров. Настоящий способ и композиция могут продлить срок годности продуктов питания, включающих свежее и обработанное мясо, рыбу и домашнюю птицу, и обеспечить продукт питания, который имеет увеличенный микробный и «цветовой» сроки годности в атмосфере, содержащей 70% или более кислорода и 30% или более СО. Способ, в соответствии с данным раскрытием, в котором используют комбинации экстрактов, может быть использован для улучшения сохранения цвета мяса, блокирования роста Listeria в продукте питания, включающему мясо, рыбу и домашнюю птицу (свежее/необработанное и обработанные) и обеспечения использования более низких, но более эффективных, ингибирующих концентраций растительных экстрактов, без отрицательных эффектов на вкус.
[43] Настоящий способ в частности подходит для использования с мясом, упакованным в модифицированной атмосфере (MAP). Мясо МАР упаковывается в газонепроницаемые материалы, которые поддерживают атмосферу над продуктом. Смеси кислорода и диоксида углерода часто используются в мясе MAP. Смеси этих газов очень хорошо работают с настоящим способом.
[44] В отличие от настоящего способа и композиции, в известном на дату публикации уровне техники показано, что экстракты цитрусовых, содержащие гесперидин, не влияют на рост Listeria ни in vitro ни в продукте питания, включающему мясо. Чистые флавоноиды, такие как гесперитин или неогесперидин, не оказывают никакого влияния на рост Listeria ни in vitro ни в мясе. В Mandalari, G., et al. (2007) сообщается, что богатые флавоноидами экстракты цитрусовых in vitro ингибируют рост только грамотрицательных бактерий и не влияют на рост грамположительных бактерий и не влияют на рост Listeria. В Mandalari, G., et al. (2007) показано, что неогесперидин в чистой форме не оказывает эффекта на рост Listerial in vitro.
[45] В Fernandez-Lopez et al. (2005) показано, что мясо, дополненное экстрактами цитрусовых, содержащими флавоноиды, основным из которых является гесперидин, не влияет на рост Listeria monocytogenes. В Fernandez-Lopez et al. (2005) показано, что такие экстракты оказывают антимикробные эффекты на другие штаммы бактерий, включая Listeria innocua, но не на Listeria monocytogenes.
[46] В работах Mandalari et al. и Fernandez-Lopez et al. предостерегают от использования гесперидина в качестве антилистерического соединения и не предполагают очевидным использование какой-либо из них или комбинации флавоноидов из цитрусового экстракта против Listeria monocytogenes в продукте питания. Кроме того, в работах Mandalari et al. предостерегают от использования гесперидина в качестве антилистерического соединения и не предпогают очевидным, что очищенный флавоноид может иметь антилистерический эффект.
[47] В настоящем раскрытии показано, что когда гесперидин находится в концентрации, равной по меньшей мере от 80% до 99%, предпочтительно 95%, он ингибирует рост моноцитогенов Listeria monocytogenes в мясе. В известном на дату публикации уровне техники указано или по меньшей мере предполагается, что гесперидин не влияет на рост Listeria в продукте питания, включающему мясо. Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что гесперидин можно использовать в продовольственном продукте/пищевом продукте, таком как мясо (например, фарш), чтобы продлить его микробный, «цветовой» и «вкусовой» сроки годности. Когда используется только гесперидин, гесперидин требуется использовать в более высоких концентрациях для обеспечения адекватного антилистерического эффекта. Внезапно и неожиданно добавление растительных экстрактов, содержащих фенольные дитерпены, к гесперидину, синергетически улучшает антилистерические эффекты и позволяет использовать более низкие дозы каждого экстракта.
[48] Кроме того, внезапно обнаружено, что гесперидин и экстракты Lamiaceae сохраняют цвет говяжьего фарша MAP синергетическим образом. В образцах говяжьего фарша, хранящихся в течение шести (6) суток в холодных условиях, экстракт гесперидина совместно с экстрактом розмарина превышает суммарный эффект сохранения цвета у добавок только гесперидина или розмарина.
[49] Известный на дату публикации уровень техники изобилует утверждениями, что гесперидинсодержащие экстракты не оказывают ингибирующего действия на организмы Listeria monocytogenes. Удивительно, но авторы настоящего изобретения обнаружили, что гесперидин в присутствии высоких концентраций кислорода ингибирует грамположительный организм - Listeria monocytogenes. Комбинация гесперидина и богатой кислородом атмосферы ингибирует Listeria monocytogenes, грамположительный организм, выделенный в качестве основного вредоносного организма в говяжьем фарше. Еще более удивительно, что комбинации розмарина и гесперидина проявляют синергетическое ингибирование этих грамположительных организмов - Listeria monocytogenes в условиях атмосферы с повышенным содержанием кислорода.
[50] Комбинации экстракта Lamiaceae, содержащие фенольные дитерпены и гесперидин, сохраняют цвет мяса, рыбы и птицы (свежего/необработанного и обработанного) в присутствии кислорода синергетическим образом.
[51] Только один гесперидин при определенных концентрациях не сохраняет цвет свежего красного мяса и приводит к неприемлемому органолептическому признаку. Комбинация экстракта розмарина и гесперидина действует синергетически, чтобы продлить срок годности говядины в условиях холодного хранения. Комбинация не только аддитивная, но и синергетическая, потому что она превосходит аддитивный эффект только одного гесперидина и одного розмарина.
[52] Добавление экстракта Lamiaceae, содержащего фенольные дитерпены к гесперидину, дает приемлемый для вкуса состав, который эффективен при сохранении цвета и в ингибировании роста микроорганизмов в мясе, рыбе и домашней птице (как свежего, так и необработанного и обработанного).
[53] В соответствии с настоящим раскрытием, только гесперидин подавляет рост Listeria в продукте питания, включающему мясо. Удивительно, что комбинации экстракта Lamiaceae, предпочтительно экстракта розмарина и гесперидина, более эффективны в подавлении роста грамположительных бактерий, предпочтительно Listeria monocytogenes,, чем экстракт Lamiaceae или гесперидин, отдельно.
[54] Комбинация экстракта Lamiaceae, содержащего фенольные дитерпены и гесперидин в присутствии кислорода, не влияет на вкус говяжьего фарша в упаковке после коммерчески желательного периода хранения. Ни экстракт Lamiaceae, содержащий фенольные дитерпены, ни гресперидин отдельно, или только один кислород, или комбинация двух из этих факторов, сохраняет цвет, а также комбинация трех в конце коммерчески желательного периода хранения без воздействия на вкус.
[55] Внезапно добавление растительных экстрактов, содержащих фенольные дитерпены, к гесперидину, синергетически улучшает антилистерические эффекты и позволяет использовать более низкие дозы каждого экстракта.
[56] Кроме того, внезапно обнаружено, что гесперидин и экстракты Lamiaceae сохраняют цвет говяжьего фарша MAP синергетическим образом. В образцах говяжьего фарша, хранящихся в течение пяти (5) суток в холодных условиях, экстракт гесперидина совместно с экстрактом розмарина превышает суммарный эффект сохранения цвета у добавок только гесперидина или розмарина.
[57] Изобретатели внезапно обнаружили, что экстракт Punica, содержащий пуникалагины и эллаговую кислоту, можно использовать в фарше, чтобы продлить его микробный, «цветовой» и «вкусовой» сроки годности. Когда экстракт Punica, содержащий пуникалагины и эллаговую кислоту, используется отдельно (то есть без экстракта розмарина), для обеспечения адекватных антилистерических эффектов требуются более высокие концентрации экстракта Punica. Внезапно добавление экстрактов розмарина, или экстрактов других видов семейства Lamiaceae, синергетически улучшает антилистерические эффекты и позволяет использовать меньшие количества экстракта Punica (например, экстракты пуникалагинов и эллаговой кислоты).
[58] Кроме того, внезапно обнаружено, что экстракт Punica, содержащий пуникалагины и эллаговую кислоту, и экстракты Lamiaceae сохраняют цвет говяжьего фарша MAP синергетическим образом. В образцах говяжьего фарша, хранящихся в течение пяти (5) суток в холодных условиях, экстракт Punica, содержащий пуникалагины и эллаговую кислоту совместно с экстрактом розмарина превышает суммарный эффект сохранения цвета у добавок только Punica или розмарина. Данный синергетический эффект наблюдался при различных концентрациях каждого экстракта.
[59] Удивительно, но авторы настоящего изобретения обнаружили, что экстракт Punica, содержащий пуникалагины и эллаговую кислоту в присутствии высоких концентраций кислорода ингибирует грамположительный организм - Listeria monocytogenes. Комбинация экстракта Punica, содержащего пуникалагины и эллаговую кислоту и богатой кислородом атмосферы ингибирует Listeria monocytogenes, грамположительный организм, выделенный в качестве основного вредоносного организма в говяжьем фарше. Еще более удивительно, что комбинация розмарина и экстракта Punica, содержащего пуникалагины и эллаговую кислоту, проявляет синергетическое ингибирование этих грамположительных организмов - Listeria monocytogenes в условиях атмосферы с повышенным содержанием кислорода.
[60] Комбинации экстракта Lamiaceae, содержащие фенольные дитерпены и экстракт Punica, содержащий пуникалагины и эллаговую кислоту, увеличивают сохранность цвета во время срока годности мяса, рыбы и птицы (свежего/необработанного и обработанного) в присутствии кислорода синергетическим образом. Критически важным для данного изобретения является комбинация экстракта розмарина или другого эффективного экстракта Lamiaceae и экстракта Punica, содержащего пуникалагины и эллаговую кислоту, и присутствие кислорода.
[61] Экстракт Punica, содержащий только пуникалагины и эллаговую кислоту в определенных концентрациях, уменьшают длительность сохранения цвета красного мяса (например, свежего мяса) и приводит к неприемлемому органолептическому признаку. Комбинация экстракта розмарина и экстракта Punica, содержащего пуникалагины и эллаговую кислоту действует синергетически, чтобы продлить срок годности говядины в условиях холодного хранения. Комбинация не только аддитивная, но и синергетическая, потому что она превосходит аддитивный эффект только одного экстракта Punica, содержащего пуникалагины и эллаговую кислоту, и одного розмарина.
[62] Добавление экстракта Lamiaceae, содержащего фенольные дитерпены к экстракту Punica, содержащему пуникалагины и эллаговую кислоту, дает приемлемый для вкуса состав, который эффективен при сохранении цвета и в ингибировании роста микроорганизмов в мясе, рыбе и домашней птице (свежего/необработанного и обработанного).
[63] Комбинации экстракта Lamiaceae, предпочтительно экстракта розмарина и экстракта Punica, содержащий пуникалагины и эллаговую кислоту, более эффективны в подавлении роста грамположительных бактерий, предпочтительно Listeria monocytogenes, чем экстракт Lamiaceae или экстракт Punica, содержащий пуникалагины и эллаговую кислоту, отдельно.
[64] Комбинация экстракта Lamiaceae, содержащего фенольные дитерпены и экстракт Punica, содержащий пуникалагины и эллаговую кислоту в присутствии кислорода, не влияет на вкус говяжьего фарша в упаковке после коммерчески желательного периода хранения. Ни экстракт Lamiaceae, содержащий фенольные дитерпены, ни экстракт Punica, содержащий пуникалагины и эллаговую кислоту, отдельно, или только кислород отдельно, или комбинация двух из этих факторов отдельно, сохраняют цвет, а также и в синергетической манере, как по меньшей мере на шестые (6-е) сутки периода хранения, без воздействия на вкус.
[65] Внезапно добавление экстрактов розмарина, или экстрактов других видов семейства Lamiaceae, синергетически улучшает антилистерические эффекты и позволяет использовать меньшие дозы каждого экстракта.
[66] Кроме того, внезапно обнаружено, что экстракт Punica, содержащий пуникалагины и эллаговую кислоту, и экстракты Lamiaceae сохраняют цвет говяжьего фарша MAP синергетическим образом. В образцах говяжьего фарша, хранящихся в течение пяти (5) суток в холодных условиях, экстракт Punica, содержащий пуникалагины и эллаговую кислоту совместно с экстрактом розмарина превышает суммарный эффект сохранения цвета у добавок только гесперидина или розмарина.
[67] Удивительно, но авторы настоящего изобретения обнаружили, что экстракт Punica, содержащий пуникалагины и эллаговую кислоту в присутствии высоких концентраций кислорода ингибирует грамположительный организм - Listeria monocytogenes. Комбинация экстракта Punica, содержащего пуникалагины и эллаговую кислоту и богатой кислородом атмосферы ингибирует Listeria monocytogenes, грамположительный организм, выделенный в качестве основного вредоносного организма в говяжьем фарше. Еще более удивительно, что комбинация розмарина и экстракта Punica, содержащего пуникалагины и эллаговую кислоту, проявляет синергетическое ингибирование этих грамположительных организмов - Listeria monocytogenes в условиях атмосферы с повышенным содержанием кислорода.
[68] Комбинации экстракта Lamiaceae, содержащие фенольные дитерпены и экстракт Punica, содержащий пуникалагины и эллаговую кислоту, сохраняют цвета во время срока годности мяса, рыбы и птицы (свежего/необработанного и обработанного) в присутствии кислорода синергетическим образом. Соответственно, преимуществом некоторых из настоящих способов и композиций настоящего описания является комбинация экстракта розмарина или другого эффективного экстракта Lamiaceae и экстракта Punica, содержащего пуникалагины и эллаговую кислоту, и присутствие кислорода.
[69] Экстракт Punica, содержащий только пуникалагины и эллаговую кислоту в определенных концентрациях, уменьшают длительность сохранения цвета красного мяса (например, свежего мяса) и приводит к неприемлемому органолептическому признаку. Комбинация экстракта розмарина и экстракта Punica, содержащего пуникалагины и эллаговую кислоту действует синергетически, чтобы продлить срок годности говядины в условиях холодного хранения. Комбинация не только аддитивная, но и синергетическая, потому что она превосходит аддитивный эффект только одного экстракта Punica, содержащего пуникалагины и эллаговую кислоту, и одного розмарина.
[70] Добавление экстракта Lamiaceae, содержащего фенольные дитерпены к экстракту Punica, содержащему пуникалагины и эллаговую кислоту, дает приемлемый для вкуса состав, который эффективен при сохранении цвета и в ингибировании роста микроорганизмов в мясе, рыбе и домашней птице (свежего/необработанного и обработанного).
[71] Комбинации экстракта Lamiaceae, предпочтительно экстракта розмарина и экстракта Punica, содержащий пуникалагины и эллаговую кислоту, более эффективны в синергетической манере в подавлении роста грамположительных бактерий, предпочтительно Listeria monocytogenes, чем экстракт Lamiaceae или экстракт Punica, содержащий пуникалагины и эллаговую кислоту, отдельно. Ни экстракт Lamiaceae, содержащий фенольные дитерпены, ни экстракт Punica, содержащий только пуникалагины и эллаговую кислоту, или только кислород, или комбинация двух из этих факторов, не сохраняют мясо от Listeria monocytogenes, также как и комбинация трех в коммерчески желательный периоде хранения, без воздействия на вкус.
[72] Комбинация экстракта Lamiaceae, содержащего фенольные дитерпены и экстракт Punica, содержащий пуникалагины и эллаговую кислоту в присутствии кислорода, не влияет на вкус говяжьего фарша в упаковке после коммерчески желательного периода хранения. Ни экстракт Lamiaceae, содержащий фенольные дитерпены, ни экстракт Punica, содержащий только пуникалагины и эллаговую кислоту, или только кислород, или комбинация двух из этих факторов, не сохраняют цвет, также как и комбинация трех после пяти (5) суток в периоде хранения, без воздействия на вкус.
[73] Чтобы сохранить количество добавок в разумных пределах по отношению к мясу, рыбе или домашней птице, выгодно использовать ботанические экстракты, которые обеспечивают свойство ингибирования роста Listeria monocytogenes, и, более конкретно, выгодно комбинировать ботанические экстракты, которые обеспечивают синергетические антилистерические эффекты и сохраняют красный цвет мяса, не влияя на вкус мяса. Предпочтительно композиции различных ботанических экстрактов в соответствии с данным описанием действуют синергетически для увеличения общей антилистерической активности и сохранения красного цвета мяса, без воздействия на вкус мяса, комбинированных экстрактов, которые превосходят сумму их индивидуальных эффектов.
[74] Способы и композиции в соответствии с настоящим изобретением проявляют синергетический эффект, как описано выше, и будут более подробно рассмотрены ниже. Отмечается, что в отличие от синергетического эффекта способов и композиций в соответствии с настоящим изобретением, когда два соединения вызывают один и тот же явный ответ, независимо от механизма действия, а объединенный эффект является алгебраической суммой их индивидуальных эффектов, говорят, что соединения проявляют эффект суммации (Levine et al., 1996). Однако при синергизме совместное действие двух соединений больше, чем алгебраическая сумма их индивидуальных эффектов.
[75] Методики в Levine et al. (1996) были использованы для оценки биологических эффектов комбинаций соединений. Показанный на Фиг. 1 (обозначенный как «Известный уровень техники» и взятый из Basic Principles of Pharmacology, Университет Тулан), верхний график, эффектов комбинированной комбинации иллюстрируют, что, когда два соединения с похожими механизмами приведены вместе, они обычно производят аддитивные эффекты. Это также называется суммация. Однако, если эффект двух соединений превышает сумму их индивидуальных эффектов, это является неожиданным эффектом, связанным с синергизмом.
[76] По аналогии, синергетический ответ на половинной дозы, как показано на нижнем графике на фиг. 1, возникает, если комбинация половинной дозы соединения А и В дает ответ больше, чем А или В.
[77] Специалисты в области антимикробных препаратов для пищевых матриц, таких как мясо, знают, что антимикробная синергия в мясе не предсказуема. Ни одна синергия не может быть раскрыта для разных комбинаций между тремя естественными ботаническими экстрактами. Gutierrez, J., Barry-Ryan, C., & Bourke, P. (2008). “The antimicrobial efficacy of plant essential oil combinations and interactions with food ingredients.” International journal of food microbiology, 124(1), 91-97). Синергетические эффекты комбинаций редко раскрываются для сочетаний между синтетическими и натуральными экстрактами (см., например, WO 2013/169231).
[78] Одно из преимуществ некоторых композиций и способов в соответствии с данным раскрытием достигается способом, который удаляет летучие соединения путем дезодорации. В процессе дезодорации удаляются летучие соединения, в том числе борнеол, камфора, 1,8-цинеол, альфа-пинен, камфен, вербенон и борнилацетат.
[79] Дополнительное преимущество в соответствии с некоторыми аспектами настоящих способов, систем и композиций данного раскрытия достигается посредством комбинации гесперидина или экстракта Punica с экстрактом Lamiaceae. Кроме того, в отличие от способа, описанного в патенте США №4380506, способы в соответствии с данным раскрытием не требуют процесса разделения, а в способах избегают использования дополнительных расходов на обработку.
[80] Дополнительным преимуществом в соответствии с одним аспектом настоящего способа и системы является композиция, которая снижает концентрацию летучих соединений до низкого уровня, чтобы не влиять на вкус продукта питания, к которому применяется композиция, такому как мясо, тем самым не влияя на вкус мяса.
[81] Дополнительным преимуществом некоторых аспектов настоящего изобретения является наличие экстракта Punica с более чем в 60 раз более низкой концентрацией эллаговой кислоты (чем ранее сообщалось Hayes et al), что привело к антилистерическим эффектам в сочетании с экстрактом розмарина.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
[82] На Фиг. 1 представляет собой адаптацию из «Basic Principles of Pharmacology» (Университет Тулан), в котором верхняя часть «Суммация: Соединения A и B производят равные эффекты, а их эффекты являются аддитивными при комбинировании», а нижняя часть - «Синергизм: Комбинация половинной дозы соединения А и соединения В дает ответ, отличный от А или В в отдельности».
[83] На Фиг. 2 изображен график, демонстрирующий рост Listeria monocytogenes в мясе в соответствии с настоящим изобретением.
[84] На Фиг. 3 изображен график, демонстрирующий синергетические антилистерические эффекты комбинаций гесперидина и экстракта розмарина в соответствии с настоящим изобретением.
[85] На Фиг. 4 изображен график, демонстрирующий антимикробный поверхностный ответ различных комбинаций экстракта розмарина и гесперидина ингибирующих и снижающих рост Listeria monocytogenes в соответствии с настоящим изобретением.
[86] На Фиг. 5 изображена гистограмма, демонстрирующая значения красного цвета мяса в соответствии с настоящим изобретением в отношении комбинаций экстракта розмарина и гесперидина в соответствии с настоящим изобретением.
[87] На Фиг. 6 изображена гистограмма, демонстрирующая значения красного цвета мяса в соответствии с настоящим изобретением в отношении различных комбинаций экстрактов розмарина и Punica в соответствии с настоящим изобретением.
[88] На Фиг. 7 изображена диаграмма, демонстрирующая ингибирование роста Listeria monocytogenes растительными экстрактами в говяжьем фарше.
[89] На Фиг. 8 изображен график, демонстрирующий ингибирование роста Listeria monocytogenes растительными экстрактами в говяжьем фарше при 8°C на 9 сутки.
[90] На Фиг. 9 изображена диаграмма, демонстрирующая ингибирование роста Listeria monocytogenes растительными экстрактами в говяжьем фарше при 8°C на 6 сутки.
[91] На Фиг. 10 изображена диаграмма, демонстрирующая ингибирование Listeria monocytogenes растительными экстрактами в говяжьем фарше при 8°C на 9 сутки в соответствии с настоящим изобретением.
[92] На Фиг. 11 изображен график, демонстрирующий в соответствии с настоящим изобретением антимикробный поверхностный ответ различных комбинаций розмарина и гесперидина ингибирующих и снижающих рост Listeria monocytogenes.
[93] На Фиг. 12 изображен график, демонстрирующий Listeria monocytogenes в колбасах из домашней птицы.
[94] На Фиг. 13 изображен график, демонстрирующий ингибирование роста Listeria в колбасах из домашней птицы при помощи комбинации экстрактов R/P в соответствии с настоящим изобретением.
[95] На Фиг. 14 изображен график, демонстрирующий ингибирование роста Listeria в колбасе из домашней птицы при помощи комбинации экстрактов R/H.
[96] На Фиг. 15 изображен график, демонстрирующий Listeria monocytogenes в колбасах из свинины (контроль).
[97] На Фиг. 16 изображен график, демонстрирующий ингибирование роста Listeria в колбасах из свинины при помощи комбинации экстрактов R/P.
[98] На Фиг. 17 изображен график, демонстрирующий ингибирование роста Listeria в колбасе из свинины при помощи комбинации экстрактов R/H.
[99] На Фиг. 18 изображен график, демонстрирующий рост Listeria monocytogenes в копченом лососе.
[100] На Фиг. 19 изображен график, демонстрирующий ингибирование Listeria monocytogenes в копченом лососе на 30-е сутки роста.
[101] На Фиг. 20 изображен график, демонстрирующий ингибирование Listeria monocytogenes в копченом лососе на 30-е сутки роста.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[102] Композиции в соответствии с данным раскрытием содержат экстракт Lamiaceae и гесперидин и способы применения композиций для продления срока хранения продуктов питания, включающих мясо, рыбу и домашнюю птицу (как свежее/необработанное, так и обработанные), не влияя на вкус.
[103] Настоящее изобретение в другой форме включает композиции, содержащие экстракт Lamiaceae и экстракт Punica, и способы применения этих композиций для продления срока хранения продуктов питания, включающих мясо, рыбу и домашнюю птицу (как свежее/необработанное, так и обработанные), не влияя на вкус.
[104] Настоящие способы и композиции основаны на открытии, что экстракты розмарина, богатые фенольными дитерпенами, отдельно или в сочетании с гесперидином или экстрактами Punica, богатыми эллаговой кислотой и пуникалагинами, сохраняют красный цвет мяса в коммерчески значимый период. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что обработка мяса чистым гесперидином, то есть флавоноидом, экстрагированным из кожуры цитрусовых, а затем очищенным, предотвращает рост Listeria monocytogenes в мясе. Экстракты Lamiaceae, содержащие фенольные дитерпены в сочетании с гесперидином или экстрактом Punica, содержащим эллаговую кислоту и пуникалагины, синергетически обеспечивают новые растворы для подавления роста микроорганизмов в коммерчески желательный период и для сохранения красного цвета мяса без воздействия на вкус мяса. Было обнаружено, что композиции согласно настоящему изобретению ингибируют рост грамположительных микроорганизмов. Было обнаружено, что композиции согласно настоящему изобретению ингибируют рост Listeria. Было обнаружено, что композиции согласно настоящему изобретению ингибируют рост Listeria monocytogenes.
[105] Комбинации, содержащие: растительные экстракты, стандартизированные по фенольным дитерпенам карнозавровой кислоты и карнозола, и гесперидин, или растительные экстракты, стандартизированные по фенольным дитерпенам карнозавровой кислоты и карнозола, и растительные экстракты, стандартизированные по эллаговой кислоте и пуникалагинам, которые использовались бы для синергетического предотвращения роста Listeria monocytogenes в продукте питания, включающему мясо, рыбу и домашнюю птицу (как свежее/необработанное, так и обработанные), не влияя на вкус продукта питания и которые синергетически улучшают сохранение цвета продукта питания (например, цвета мяса), не могут быть получены из известного уровня техники.
[106] Ни в одном из известных из уровня техники антимикробных применений комбинации розмарина или других экстрактов Lamiaceae, содержащих фенольные дитерпены с гесперидином или с экстрактами Punica, содержащими пуникалагины и эллаговую кислоту, либо предвосхищает, либо делает очевидными существующие способы и композиции. В известном уровне техники основное внимание уделяется использованию эфирных масел из трав или использованию органических кислот, таких как лимонная кислота. Экстракты розмарина, используемые в настоящем изобретении, обрабатывают таким образом, что они практически не содержат нативного эфирного масла и богаты фенольными дитерпенами. В известном уровне техники не предвидится и не проявляется синергетическая комбинация экстрактов Lamiaceae, богатых фенольными дитерпенами, и экстрактов Punica, богатых пуникалагинами и эллаговой кислотой.
[107] В известном уровне техники не предвидится и не проявляется синергетическая комбинация экстрактов Lamiaceae, богатых фенольными дитерпенами и гесперидином. В известном уровне техники не предвосхищается и не делается очевидным удивительно полезный антимикробный эффект комбинации экстрактов Lamiaceae, содержащих фенольные дитерпены с экстрактами Punica, содержащими пуникалагины и эллаговую кислоту, или с гесперидином, в отношении грамположительных организмов: Listeria monocytogenes. В известном уровне техники не предвосхищается и не делается очевидным удивительно полезный эффект сохранения цвета за счет комбинации экстрактов Lamiaceae, содержащих фенольные дитерпены с экстрактом Punica, пуникалагины и эллаговую кислоту, или с гесперидином.
[108] В известном уровне техники не предвосхищается и не делается очевидным отсутствие влияния на вкус продукта питания комбинации экстрактов Lamiaceae, содержащих фенольные дитерпены с экстрактом Punica, пуникалагины и эллаговую кислоту, или с гесперидином.
[109] Другие флавоноиды, которые имеют такой же эффект, включают, но не ограничиваются ими: наригин, изокураметин, неогесперид, гесперидин, понцирин, небилетин и тангеретин.
Определения
[110] Ниже приведен список определений, используемых в данном раскрытии:
[111] «Эффективное количество» представляет собой количество, необходимое для достижения определенного эффекта, в соответствии с тем, что обычный специалист в данной области техники легко сможет определить посредством рутинного эксперимента. Например, в отношении настоящего раскрытия эффективное количество композиции, содержащей гесперидин и экстракт Lamiaceae для применения к продовольственному продукту или пищевому продукту, например, мясу, рыбе и домашней птице (как свежим/необработанным так и обработанным), чтобы продлить срок годности продукта питания, например. красный цвет для свежего мяса, рыбы и птицы, представляет собой количество, которое определяется для обеспечения долговечности красного цвета на основе известных параметров, которые включают, но не ограничиваются ими, концентрацию гесперидина и экстракта Lamiaceae, объемную и/или поверхностную площадь мяса, рыбы и птицы и атмосферные условия окружающей среды мяса, рыбы и птицы. Аналогичным образом, определяется эффективное количество розмарина/Punica для увеличения долговечности красного цвета мяса, рыбы и домашней птицы.
[112] “Продукт питания”, “продовольственный продукт” и “пищевой продукт” обозначают продукты, которые люди или животные употребляют в пищу. Продукты питания, продовольственные продукты и пищевые продукты включают, без ограничения, свежее и/или необработанное мясо, рыбу и домашнюю птицу, а также обработанные мясо, рыбу и домашнюю птицу.
[113] «Свежее мясо, рыба и домашняя птица» означает мясо, рыбу и домашнюю птицу, целые туши, их разрезанные части и их измельченные части. Свежее мясо, рыба и домашняя птица включают как необработанное мясо, рыбу и домашнюю птицу, так и мясо, рыбу и домашнюю птицу, которые содержат добавки, такие как полифосфаты, соль, вода, ароматизаторы, бульоны, добавленные белки, сахар, крахмалы и тому подобное, которые содержатся в мясе, рыбе или домашней птице. Важно различать свежее мясо, рыбу или домашнюю птицу, которые могут содержать эти ингредиенты, от «обработанного» мяса, рыбы и домашней птицы, которые включают заготовленные мясо, рыбу и домашнюю птицу, которые могут содержать те же ингредиенты, но также содержат один или более из следующих: эриторбаты, эриторбиновая кислота, аскорбаты, аскорбиновая кислота, нитриты, нитраты или культуры. Свежее мясо, рыбу и птицу следует отличать от, и в отличие от них, и не включают заготовленные мясо, рыбу или домашнюю птицу, известные как обработанные мясо, рыбу и домашнюю птицу.
[114] «Гесперидин» означает соединение, извлеченное из природы или синтезированное.
[115] «Экстракт Lamiaceae» означает экстракт из растения семейства Lamiaceae, предпочтительно розмарина, шалфея, орегано, тимьяна, мяты и следующих родов: Salvia, Rosmarinus, Lepechinia, Oreganum, Thymus, Hyssopus и их смеси. Наиболее предпочтительным является розмарин.
[116] «Мясо, рыба и домашняя птица» означают: а) обработанные мясо, рыбу и домашнюю птицу и б) необработанное мясо, рыбу и домашнюю птицу.
[117] «Фенольные дитерпены» означают карнозную кислоту, карнозол, метилкарнозат и другие фенольные производные дитерпена (розманол, изоросманол, 11,12-ди-О-метилизоросманол, 12-О-метилкарнозную кислоту, розманол-9-этиловый эфир, циркумаритин, метилированный моноокисленный продукт карноэфирной кислоты, гекванин, эпиросманол, эпиорисосманол, производное карнозной кислоты, этиловый эфир эпиросманол, криптотансинон) и их смеси.
[118] «Обработанные», такие как «обработанные продовольственные продукты» и «обработанные мясо, рыба и домашняя птица», представляют собой продукты, образующиеся в результате обработки продуктов питания, таких как мясо, рыба или домашняя птица, или от дальнейшей переработки таких обработанного продуктов, что продукт больше не имел характеристик свежего мяса, рыбы или домашней птицы. Обработка означает любое действие, которое существенно изменяет исходный продукт, включая нагрев, копчение, консервирование, созревание, сушку, маринование, экстракцию, экструзию или комбинацию этих процессов. Процессы включают процессы без термической обработки и c термической обработкой.
[119] «Экстракт Punica» означает экстракт из растения рода Punica, предпочтительно Punica granatum и Punica protopunica, и их смесь. Наиболее предпочтительным является Punica granatum.
[120] «Чистый экстракт гесперидина» означает экстракт гесперидина, который имеет концентрацию гесперидина, равную по меньшей мере 80%.
[121] «Необработанное» (такие как мясо, рыба и домашняя птица) означают, что они не подверглись какой-либо обработке, что привело к существенному изменению исходного состояния пищевых продуктов (например, мяса, рыбы и домашней птицы). Однако пищевые продукты могут быть, например, разделенными, раздробленными, обрезанными, обжаренными, измельченными, порезанными, обжаренными, очищенными, измельченными, перемолотыми, очищенными, подрезанными, глубокозамороженными, замороженными, охлажденными, измельченными или шелушащимися, упакованными или неупакованными. Необработанное пищевые продукты, включая мясо, рыбу и домашнюю птицу, включают необработанное сырые мясо, рыбу и домашнюю птицу, а также свежее мясо, рыбу и домашнюю птицу, которые были измельчены или перемолоты, в которые были добавлены пищевые специи или добавки, добавленные к нему или которые подверглись недостаточной обработке для модификации внутреннего мышечного волокна мяса, рыбы или птицы и, таким образом, исключают характеристики свежего мяса, рыбы или домашней птицы.
[122] При разработке настоящего способа и состава было обнаружено, что гесперидин оказывает антилистерический эффект на мясо при приготовлении в определенных пределах концентраций.
[123] При разработке настоящего способа и композиции было обнаружено, что экстракт розмарина, содержащий фенольные дитерпены в сочетании с гесперидином или экстрактом Punica, оказывает превосходное влияние на подавление роста Listeria monocytogenes в мясе, чем при применении экстрактов отдельно.
[124] При разработке настоящего способа и композиции было обнаружено, что некоторые смеси экстрактов розмарина в сочетании с гесперидином или экстрактом Punica, содержащим пуникалагины и эллаговую кислоту, обеспечивают синергетический антилистерический эффект при приготовлении в определенных диапазонах концентраций.
[125] При разработке настоящего способа и композиции было обнаружено, что экстракт розмарина, содержащий фенольные дитерпены в сочетании с гесперидином или экстрактом Punica, оказывает превосходное влияние на сохранение красного цвета мяса, чем при применении экстрактов отдельно.
[126] При разработке настоящего способа и композиции было обнаружено, что некоторые смеси экстрактов розмарина в сочетании с гесперидином или экстрактом Punica, содержащим пуникалагины и эллаговую кислоту, обеспечивают синергетический эффект сохранения красного цвета мяса при приготовлении в определенных диапазонах концентраций.
СМЕСИ ЭКСТРАКТОВ, БОГАТЫЕ ФЕНОЛЬНЫМИ ДИДЕРПЕНАМИ И ГЕСПЕРИДИНОМ ИЛИ ЭКСТРАКТОМ PUNICA
2
[127] Фенольные дитерпены, такие как карнозная кислота или карнозол, встречаются конкретно в Lamiaceae. На сегодняшний день карнозная кислота была идентифицирована только в нескольких видах, все они включены в Lamiaceae. По данным изобретателей, только семь из семидесяти (70) родов трибы Mentheae содержат карнозную кислоту: Salvia (Brieskorn and Dumling, 1969), Rosmarinus (Luis and Johnson, 2005), Lepechinia (Bruno et al., 1991), Oreganum (Hossain et al., 2010) и Thymus (Achour et al., 2012). Она может присутствовать в Hyssopus, где было идентифицировано одно из ее возможных производных, розманол-9-этиловый эфир (7) (Djarmati et al., 1991). Карнозная кислота также встречается в качестве минорного соединения в одном роде трибы Ocimeae - Ocimum (Jayasinghe et al., 2003). Brieskorn, C.H., Dumling, H.J., 1969. Carnosolsaure, der wichtige antioxydativ wirksame Inhaltsstoff des Rosmarin-und Salbeiblattes. Zeitschrift fur Lebensmittel-Untersuchung und Forschung 141, 10-16; Luis, J.C., Johnson, C.B., 2005; Bruno, Maurizio, et al. “Abietane diterpenoids from Lepechinia meyeni and Lepechinia hastata.” Phytochemistry 30.7 (1991): 2339-2343; Hossain, Mohammad B., et al. “Characterization of phenolic composition in Lamiaceae spices by LC-ESI-MS/MS.” Journal of agricultural and food chemistry 58.19 (2010): 10576-10581; Achour, S., Khelifi, E., Attia, Y., Ferjani, E., Noureddine Hellah A., 2012. Concentration of Antioxidant Polyphenols from Thymus capitatus extracts by Membrane Process Technology. Journal of food science 77, C703-C709; Djarmati, Z., Jankov, R.M., Schwirtlich, E., Djulinac, B., Djordejevic, A., 1991. High antioxidant activity of extracts obtained from sage by supercritical CO extracton. Journal of the American Oil Chemists Society 68, 731-734; Jayasinghe, C., Gotoh, N., Aoki, T., Wada, S., 2003. Phenolic composition and antioxidant activity of sweet basil (Ocimum basilicum L.). Journal of agricultural and food chemistry 51, 4442-4449. Seasonal variations of rosmarinic and carnosic acids in rosemary extracts. Analysis of their in vitro antiradical activity. Spanish Journal of Agricultural Research 3, 106-112.
[128] В настоящем документе эти фенольные дитерпены экстрагировали из розмарина с целью извлечения и концентрирования по существу фенольных дитерпенов: 44-85 %. Полученный таким образом экстракт затем дезодорировали, чтобы избавиться от эфирных масел и летучих соединений, которые влияют на вкус продукта питания.
[129] Экстракт розмарина
[130] Листья розмарина (Rosmarinus officinalis) можно экстрагировать различными растворителями с получением экстрактов, богатых различными соединениями. Например, водные экстракты довольно многочисленны в розмариновой кислоте, тогда как экстракты с использованием органических растворителей скорее получаются в экстрактах, богатых фенольными дитерпенами, такими как карнозная кислота и карнозол. Детальная методика получения композиции экстракта розмарина описана в патенте США №5859293 и WO 96/34534, оба включены посредством ссылки во всей своей полноте в данный документ.
3
[131] Лист розмарина экстрагировали ацетоном при комнатной температуре. После завершения экстракции ацетоновый экстракт отфильтровывают для отделения раствора от листьев розмарина и концентрируют при пониженном давлении с получением концентрированного нативного экстракта. В это время концентрированный экстракт можно высушить непосредственно в вакуумной печи при умеренном нагревании, чтобы получить порошкообразный экстракт, который представляет собой композицию, содержащую около 15%-30% карнозной кислоты и 1%-3% карнозола. Альтернативно, в концентрированный нативный экстракт добавляли водный карбонат натрия (NaHCO) для растворения карнозной кислоты и других органических кислот, в то время как основные нерастворимые вещества осаждались.
3
4
[132] Раствор фильтруют для отделения от твердого вещества и фильтрат дополнительно концентрируют при пониженном давлении. После достижения конечной концентрации добавляют фосфорную кислоту (HPO) и из концентрированного раствора осаждают нерастворимые в кислоте вещества (в том числе карнозную кислоту, карнозол и производные карнозной кислоты). Активированный уголь используется во время процесса для обесцвечивания экстракта розмарина в растворе перед фильтрованием. Через фильтрование осажденное твердое вещество затем отделяли от жидкости и промывали водой для удаления примесей.
[133] Наконец, твердое вещество сушили в вакуумной печи и затем измельчали в порошок, чтобы получить композицию, содержащую около 40-65% карнозной кислоты, 2-10% карнозола и 2-10% 12-О-метилкарнозной кислоты. Используемый в данной документе экстракт содержал >48 % карнозной кислоты + карнозол. Последний шаг был сделан для дезодорации экстракта розмарина. Это соответствовало последующей экстракции предыдущего твердого вещества смесью ацетон/гексан. Целью этой стадии было удаление жирных молекул и летучих соединений. Фильтрат концентрируют при пониженном давлении и непосредственно готовят на жидком носителе.
[134] В соответствии с настоящим описанием и формулой изобретения этот экстракт, стандартизованный по фенольным дитерпенам карнозной кислоты и карнозола, будет упоминаться или как розмарин, или экстракт розмарина, или розмарин (порошок), или розмарин (жидкость).
[135] Экстракция гесперидина
[136] Сушеные незрелые плоды (Citrus aurantium L.) подвергались воздействию пара, чтобы удалить пектины до экстракции водой. Затем в раствор добавляли гидроксид натрия и гидроксид кальция для стабилизации значения рН. После стадии фильтрации подкисление фильтрата индуцировали с использованием HCl. После этой стадии гесперидин выпадает в осадок, жидкий раствор удаляют, а осадок сушат. Конечный продукт (чистый гесперидин) содержит от 90% до 99% гесперидина, предпочтительно более 95% гесперидина, что измерено с помощью ВЭЖХ.
[137] Полученные экстракты содержат по существу гесперидин (>80%) и считаются чистыми. На протяжении всего данного раскрытия этот экстракт, стандартизованный по гесперидину при >95%, будет упоминаться как гесперидин или гесперидин (порошок) или гесперидин (жидкость).
[138] Экстракция Punica
[139] Биттер из кожуры граната (Punica granatum L.) экстрагировали этанолом/водой. Экстракт фильтровали, затем концентрировали. Экстракт смешивали с носителем в этом примере с мальтодекстрином перед сушкой. Различные технологии сушки могут применяться. Данный экстракт был стандартизован по следующим полифенолам: пиналагины (>7,5% по ВЭЖХ) и эллаговая кислота (1,5-2,5%), как определено с помощью ВЭЖХ.
[140] В течение всего данного раскрытия этот экстракт, стандартизованный по пиналагинах (>7,5% по ВЭЖХ) и эллаговой кислоте (1,5-2,5%), будет называться или Punica, или экстракт Punica, или Punica (порошок) или Punica (жидкость).
[141] Приготовление продуктов и смесей экстракт розмарина/гесперидин и экстракт розмарина/экстракт Punica
[142] Экстракты растений и их комбинации высушивались в порошки. Мальтодекстрин использовали для обеспечения подходящего процесса сушки комбинаций экстрактов. Мальтодекстрины представляют собой обычно используемые эксципиенты или носители для процессов сушки.
[143] Мальтодекстрины определяются как продукты гидролиза крахмала с эквивалентом декстрозы менее 20. Эквивалент декстрозы (значение DE) является мерой восстановительной способности олигосахаридов, полученных из крахмала, выраженных в процентах от D-глюкозы по сухому веществу гидролизата и является обратной величиной средней степени полимеризации (DP) единиц ангидроглюкозы. В качестве продуктов гидролиза крахмала мальтодекстрины содержат линейные амилозные и разветвленные продукты разложения амилопектина, поэтому они рассматриваются как D-глюкозные полимеры, соединенные a-(1,4) и a-(1,6) связями.
[144] Хотя мальтодекстрины получены из природного соединения (крахмала), их структура отличается от исходной структуры естественной молекулы, из которой они происходят (крахмал). Это различие вызвано процессом гидролиза. Таким образом, структура мальтодекстрина не встречается в природе.
[145] Другие возможные эксципиенты или носители включают мальтодекстрин, аравийскую камедь, декстрозу, соль, моно- и диглицериды жирных кислот, МПГ, полисорбат 80, растительное масло, моно- и диглицериды жирных кислот, глюкозный сироп, глицерин, воду и спирт.
[146] Композиции добавляли в сырой говяжий фарш с содержанием 15% жира.
2
2
2
[147] В ходе работы, ведущей к настоящему способу и составу, смеси экстракта розмарина и гесперидина или экстракта Punica в ряде различных концентрационных соотношений были проверены на антилистерическую эффективность с использованием классических микробиологических методов. Бактериальный учет во всех исследованных нами образцах проводили на среде Алоа в соответствии со стандартным методом (NF EN ISO 11-290). Рост Listeria monocytogenes оценивали в мясе без какого-либо антилистерического агента и без какого-либо растительного экстракта (контроль). Данные роста Listeria в контрольном мясе представлены на Фиг. 2. Следует отметить, что через 6 суток роста Listeria вырастала медленно, только на 0,29 log КОЕ/мл. Через 9 суток роста Listeria выросла на 2,42 log КОЕ/мл. Эксперименты на мясе проводились в упаковке с модифицированной атмосферой (MAP), которая содержала более 20% O, а точнее 70% O и 30% CO.
[148] После изготовления мяса партия мяса отбиралась сразу после процесса измельчения и транспортировалась в охлажденных условиях в лабораторию. В лаборатории мясо разделяли на 2 кг образцы и кондиционировали в вакууме при -20°C, за 24 часа до эксперимента, 2 кг образцы мяса переносили при 2-4°С и выдерживали при данной температуре для 24 ч ± 3 ч, пока внутренняя температура не достигнет -1°С.
[149] На этом этапе 2 кг образцы мяса инокулировали Listeria monocytogenes в лаборатории биобезопасности уровня 3, чтобы избежать загрязнения другими микроорганизмами. Дальнейшее добавление к мясу проводилось в такой лаборатории. После гомогенизации инокулята при 4°С инокулированные 2 кг образцы мяса дополняли растительными экстрактами и гомогенизировали. Экстракты растений были в виде порошка и были добавлены как таковые к мясу. Чтобы сохранить их в виде сухих порошков, растительные экстракты дополнили мальтодекстрином до процесса сушки.
[150] Экстракты растений можно добавлять в виде липофильных или гидрофильных жидкостей или их сочетаний с мясом. Для этого необходимо лизировать липофильный или гидрофильный экстракт, чтобы он был солюбилизированным или жидким, нерастворенные экстракты можно было использовать непосредственно без прохождения стадии сушки.
[151] Сразу после добавления растительных экстрактов и гомогенизации в лотки были помещены две 100 г части полученного таким образом мясного фарша. Контрольные кусочки мяса, без обработки экстрактом, подвергали той же процедуре.
2
2
[152] Затем лотки были кондиционированы в модифицированной атмосфере 20% или более кислорода, предпочтительно 70% О и 30% CO при 4 или при 8°С. Упакованное мясо хранилось в темноте в течение определенного количества времени.
[153] Были проведены серии экспериментов с экстрактами розмарина и гесперидина, экстрактами розмарина и Punica, типичными антилистерическими соединениями (лактатом натрия или ацетатом натрия) и необработанным контролем. Смеси или отдельные экстракты розмарина и гесперидина добавляли в количестве 1,18% к мясу. Смеси или отдельные экстракты розмарина и Punica добавляли в количестве 0,48% к мясу. Типичные антилистерические соединения, лактат натрия и ацетат натрия добавляли в классических концентрациях 25 г/кг и 3 г/кг, соответственно, в отдельных экспериментах.
[154] Сочетания экстрактов готовили и добавляли к мясу в соответствии со следующими пропорциями и дозами перед тестированием:
Контроль LM
0,5R
R
0,5H
H
0,5R + 0,5H
0,5R + H
R + 0,5H
R + H
Композиция экстрактов (%)
Экстракт розмарина
0,00
1,28
2,56
0,00
0,00
1,28
1,28
2,56
2,56
Карнозная кислота
0,00
0,56
1,13
0,00
0,00
0,56
0,56
1,13
1,13
Карнозная кислота + карнозол
0,00
0,62
1,24
0,00
0,00
0,62
0,62
1,24
1,24
Экстракт гесперидина
0,00
0,00
0,00
24,00
49,00
24,00
48,00
24,00
48,00
Гесперидин
0,00
0,00
0,00
22,80
46,55
22,80
45,60
22,80
45,60
Композиция в говяжьем фарше (ч/млн)
Экстракт розмарина
0
151
302
0
0
151
151
302
302
Карнозная кислота
0
66
133
0
0
66
66
133
133
Карнозная кислота + карнозол
0
73
146
0
0
73
73
146
146
Экстракт гесперидина
0
0
0
2832
5782
2832
5664
2832
5664
Гесперидин
0
0
0
2690
5493
2690
5381
2690
5381
R: экстракт розмарина; H: экстракт гесперидина; 0,5R: половинная концентрация экстракта розмарина; 0,5H: половинная концентрация экстракта гесперидина
R: экстракт розмарина; P: экстракт Punica; 0,5R: половинная концентрация экстракта розмарина; 0,5P: половинная концентрация экстракта Punica
Контроль LM
0,5R
R
0,5P
P
0,5R + 0,5P
0,5R + P
R + 0,5P
R + P
Композиция экстрактов (%)
Экстракт розмарина
0,00
3,33
6,65
0,00
0,00
3,33
3,33
6,65
6,65
Карнозная кислота
0,00
1,47
2,93
0,00
0,00
1,47
1,47
2,93
2,93
Карнозная кислота + карнозол
0,00
1,61
3,22
0,00
0,00
1,61
1,61
3,22
3,22
Экстракт граната
0,00
0,00
0,00
13,50
27,00
13,50
27,00
13,50
27,00
Эллаговая кислота
0,00
0,00
0,00
0,27
0,54
0,27
0,54
0,27
0,54
Пуникалагины
0,00
0,00
0,00
1,22
2,43
1,22
2,43
1,22
2,43
Композиция в говяжьем фарше (ч/млн)
Экстракт розмарина
0
160
319
0
0
160
160
319
319
Карнозная кислота
0
70
140
0
0
70
70
140
140
Карнозная кислота + карнозол
0
77
154
0
0
77
77
154
154
Экстракт граната
0
0
0
648
1296
648
1296
648
1296
Эллаговая кислота
0
0
0
13
26
13
26
13
26
Пуникалагины
0
0
0
58
117
58
117
58
117
2
2
[155] Сразу после добавления и гомогенизации в лотки помещали два 100 г кусочка фарша в форме гамбургеров. Затем лотки кондиционировали в модифицированной атмосфере, содержащей 70% О и 30% СО, и хранили при 8°С до анализа роста Listeria и органолептических признаков, включая красный цвет. Такие анализы проводились на 0-е, 6-е и 9-е сутки хранения.
-1
[156] Рост Listeria monocytogenes оценивали в мясе в охлажденных условиях для каждого экстракта или соединения и для их комбинаций. Рост Listeria monocytogenes измеряли в начале эксперимента при 2/3 коммерческого срока хранения (6 суток) и в момент времени, соответствующий коммерческой продолжительности срока годности (9 суток). Логарифмические значения роста Listeria (log КОЕ/мл) рассчитывались для каждого эксперимента и лечения. Различия логарифмических значений роста Listeria (log КОЕ/мл) между мясом, обработанным растительными экстрактами, и необработанным контролем, были рассчитаны для получения конечного результата. Чем более отрицательное значение было получено, тем выше был антилистерический эффект экстракта или комбинации экстрактов. В научной мясной микробиологии в течение определенного времени значения считаются значимыми между двумя сериями, если наблюдается разница 0,5 log10 КОЕ г (Chaillou et al., 2014); (Guide pour la validation de méthodes d’essais microbiologiques et l’évaluation de leur incertitude de mesure dans les domaines de la microbiologie alimentaire et de l’environnement), Schweizerische Eidgenossenschaft, Confédération suisse, Département fédéral de l'économie, de la formation et de la recherche DEFR, Document No. 328, April 2013, Rev. 03). В микробиологии следует отметить, что обработка имеет значительный антибактериальный эффект, если ее эффект превышает -0,5 log КОЕ/мл по сравнению с необработанным контролем.
[157] Во время роста Listeria отслеживался цвет мяса, и изображения брали сразу после добавления экстракта (0-е сутки) и на 6-е сутки роста). Изображения были сделаны в стандартизованных условиях освещения экспозиции и с использованием системы под названием «PackShot Creator». Действительно, это профессиональное оборудование состоит из оптимизированной световой коробки, содержащей четыре флуоресцентные лампы, рассеивающие однородный свет, что приводит к тому, что изображения всегда создаются в тех же условиях с минимальным отражением.
[158] Каждое изображение, представляющее «образец» в другом масштабе времени, загружалось в программу анализа изображений с открытым исходным кодом ImageJ. Программное обеспечение обычно используется в пищевой промышленности для измерения различных параметров пищи, таких как цвет или плотность (Reineke et al. “The Influence of Sugars on Pressure Induced Starch Gelatinization, Procedia Food Science, 1, 2011, 2040-3046; Kelkar et al. “Developing novel 3D measurement techniques and prediction method for food density determination , Procedia Food Science, 1, 2011, 483-491). Чтобы получить репрезентативные значения красного цвета, использовался цветной блок красного цвета (R) из трех цветовых единиц красного (R) зеленого (G) и синего (B) модели RGB, а цвет был измерен для каждого пикселя линии, которая была нарисована на образце. Встроенный плагин графика профиля RGB использовался для определения различных значений цвета каждого пикселя вдоль этой линии, особенно значений красного цвета. Результаты представлены как изменение разного значения цвета в зависимости от количества пикселей вдоль этой линии. Результаты статистически проанализированы для значимых различий с использованием теста ANOVA (дисперсионный анализ) при p<0,05. Таким образом, на выборку было проанализировано более 1000 пикселей.
[159] Чтобы оценить влияние экстрактов растений на цвет мяса, красный цвет обработанного мяса сравнивали с необработанным контролем. Эффект был рассчитан как [красный цвет в мясе с экстрактом] - [красный цвет в контрольном мясе (без экстракта)]. Отрицательный эффект означает, что добавление экстрактов не сохраняет красный цвет мяса. Положительный эффект означает, что добавление экстрактов улучшает красный цвет мяса по сравнению с контролем.
СМЕСИ РОЗМАРИНА И ГЕСПЕРИДИНА
[160] Рост Listeria monocytogenes в сыром мясе
[161] Результаты такого тестирования на 6-е и 9-е сутки представлены на Фиг. 7 и Фиг. 8. Данные представляют собой средние значения от 2 до 6 повторов. Данные представляют собой логарифмические различия в росте L. monocytogenes в обработанном мясе по сравнению с инокулированным контролем (необработанное мясо). Данные были статистически проанализированы для уровня значимости при p<0,05 с использованием ANOVA. Различные буквы указывают на значительные различия при p<0,05.
[162] Результаты такого тестирования на 6-е сутки с использованием экстракта розмарина и/или гесперидина приведены в следующей Таблице 1.
Таблица 1:
Экстракт розмарина (%)
Гесперидин (%)
Ожидаемый эффект
Измеренный эффект
R
0
-0,08
0
H
-0,09
R
H
от -0,08 до -0,17
0,07*
*Неожиданный эффект
Экстракт розмарина и/или гесперидин: эффекты полной концентрации на рост Listeria monocytogenes после 6-суточного роста в мясе: [(log (КОЕ/мл) в мясе, обработанном экстрактами растений) - (контрольное мясо (log (КОЕ/мл)) (без обработки))]
[163] Следует отметить, что в такой короткий срок (шесть (6) суток роста в холодных условиях) разница в росте Listeria в мясе, обработанном экстрактами растений по сравнению с необработанным мясом, выраженная в log, не достигала -0,5 log, что означает, что в такое короткое время роста антилистерические эффекты не могут быть оценены. Следует отметить, что в такой короткий срок (шесть (6) суток роста в холодных условиях), Listeria monocytogenes вырос в контрольном мясе только на 0,29 log КОЕ/мл (Фиг. 2).
[164] Следует отметить, что при объединении измеренный эффект комбинации экстракта розмарина и гесперидина не соответствует синергетическому эффекту при вышеуказанных концентрациях после 6 суток роста, поскольку комбинаторный эффект неожиданно антагонистичен.
[165] Когда концентрации были уменьшены вдвое, были получены следующие ожидаемые эффекты, рассчитанные из приведенной выше таблицы и измеренных эффектов, и приведенные в Таблице 2.
Таблица 2:
Экстракт розмарина (%)
Гесперидин (%)
Ожидаемый эффект
Измеренный эффект
0,5R
0
-0,04
0,04*
0
0,5H
-0,045
-0,37*
0,5R
0,5H
от -0,045 до -0,085
0,11*
R
0,5H
от -0,045 до -0,125
-0,07
0,5R
H
от -0,04 до -0,13
0*
*Неожиданный эффект
Экстракт розмарина и гесперидин: эффекты половинной концентрации и комбинации половинной и полной концентрации на рост Listeria monocytogenes после 6-суточного роста в мясе: [(log (КОЕ/мл) в мясе, обработанном экстрактами растений) - (log (КОЕ/мл) контрольное мясо (без обработки))]
[166] Следует отметить, что в такой короткий срок (6 суток роста в холодных условиях) разница в росте Listeria в мясе, обработанном экстрактами растений по сравнению с необработанным мясом, выраженная в log, не достигала -0,5 log, что означает, что в такое короткое время роста антилистерические эффекты не могут быть оценены. Следует отметить, что в такой короткий срок (6 суток роста в холодных условиях), Listeria monocytogenes вырос в контрольном мясе только на 0,29 log КОЕ/мл (Фиг. 2).
[167] Следует отметить, однако, что в приведенной выше Таблице 2 гесперидин, применяемый только в половинной дозе, имеет удивительно больший антилизистерический эффект, чем при полной дозе. Неожиданный эффект обозначается звездочкой. С другой стороны, эффекты половинной дозы розмарина и комбинации половинной дозы розмарина с полной дозой гесперидина были антагонистическими по отношению к ожидаемому. Наконец, последствия сочетания розмарина с половинной дозой и половинной дозы гесперидина и комбинации розмарина с полной дозой и половинной дозы гесперидина оставались в дополнительном диапазоне, как и ожидалось.
[168] Результаты такого тестирования на 9-е сутки с использованием экстракта розмарина и/или гесперидина приведены в следующей Таблице 3.
Таблица 3:
Экстракт розмарина (%)
Гесперидин (%)
Ожидаемый эффект
Измеренный эффект
R
0
-1,12
0
H
-0,64
R
H
-1,76
-0,85
*Неожиданный эффект
Экстракт розмарина и гесперидин: эффекты полной концентрации на Listeria monocytogenes после 9-суточного роста в мясе: [(log (КОЕ/мл) в мясе, обработанном экстрактами растений) - (log (КОЕ/мл) контрольное мясо (без обработки))]
[169] Следует отметить, что после девяти (9) суток роста в холодных условиях разница в росте Listeria, выраженная в log КОЕ/мл, превышала -0,5 log КОЕ/мл, что означает, что антилистерическое действие всех экстрактов и их концентраций и комбинаций, представленное в приведенной выше таблице может быть оценено в коммерчески желательном периоде.
Таблица 4:
Экстракт розмарина (%)
Гесперидин (%)
Ожидаемый эффект
Измеренный эффект
0,5R
0
-0,56
-1,61*
0
0,5H
-0,32
-0,71*
0,5R
0,5H
-0,88
-1,64*
R
0,5H
-1,83
-1,68
0,5R
H
-2,28
-0,82
*Неожиданный эффект
Экстракт розмарина и гесперидин: эффекты половинной концентрации и комбинации половинной и полной концентрации на рост Listeria monocytogenes после 9-суточного роста в мясе: [(log (КОЕ/мл) в мясе, обработанном экстрактами растений) - (log (КОЕ/мл) контрольное мясо (без обработки))]
[170] После девяти (9) суток роста в мясе экстракты отдельно или их комбинации во всех тестируемых концентрациях ингибировали рост Listeria monocytogenes более чем на 0,5 log, что означает, что они оказывают антилистерический эффект на мясо.
[171] Неожиданно с учетом известного уровня техники и с учетом данных in vitro гесперидин оказывает антилистерический эффект во всех тестируемых концентрациях. Кроме того, неожиданно, экстракт розмарина или гесперидин отдельно проявляли больший антилистерический эффект при использовании в половинных концентрациях по сравнению с полными концентрациями. Кроме того, неожиданно, экстракт розмарина в сочетании с гесперидином в половинной концентрации имел больший антилисиерический эффект, чем каждый отдельный экстракт в полной концентрации. Что является синергией (Фиг. 3).
[172] Различные концентрации и их поверхности реакции были проанализированы с использованием метода поверхностного ответа, факториального экспериментального проектирования, который был разработан на трех уровнях. Данные результаты представлены на Фиг. 4. Они указывают на следующие диапазоны концентраций, которые обеспечивают антилистерический ответ в мясе, который определяется как: [(log (КОЕ/мл) в мясе, обработанном экстрактами растений) - (контрольное мясо (без обработки) (log (КОЕ/мл))]<0,5, как указано в Таблице 5.
Таблица 5:
Экстракт
Пропорция экстракта в комбинации (%)
Гесперидин
0,5-48,0
Экстракт розмарина
0,2-3,0
Пропорции экстрактов в комбинации, которые обеспечивают антилистерический ответ в мясе (%)
[173] Следует отметить, что для обеспечения антилистерического эффекта любая из вышеуказанных концентраций экстракта (Таблица 5) может быть добавлена в комбинации или отдельно в мясо. Общий процент добавленного в мясо экстракта (отдельно или в комбинации) не превышал 1,18%.
[174] Во время роста Listeria отслеживался цвет мяса, и изображения брали сразу после добавления экстракта (0-е сутки) и на 6-е сутки роста).
[175] Каждое изображение, представляющее «образец» в другом масштабе времени, загружалось в программу анализа изображений с открытым исходным кодом ImageJ. Программное обеспечение обычно используется в пищевой промышленности для измерения различных параметров пищи, таких как цвет или плотность (Reineke et al. 2011; Kelkar et al. 2011. Чтобы получить репрезентативные значения трех цветовых единиц красного (R), зеленого (G) и синего (B) моделей RGB, по образцу была проведена линия. Встроенный плагин графика профиля RGB использовался для определения для определения различных значений цвета каждого пикселя вдоль этой линии. Результаты представлены как изменение разного значения цвета в зависимости от количества пикселей вдоль этой линии. Результаты статистически проанализированы для значимых различий с использованием теста ANOVA (дисперсионный анализ) при p<0,05. На выборку было проанализировано более 1000 пикселей.
[176] Красный цвет сырого мяса
[177] Цвет мяса был оценен при помощи панели сенсорного анализа. Эта панель отличала цвет мяса между ярко-красным, красным, коричневым и зеленым оттенками. Все образцы мяса были ярко-красными на 0-е сутки экспериментов.
[178] На 6-е сутки при помощи общей оценки панели описали цвет различных образцов мяса, подвергнутых различным способам обработки мяса, следующим образом:
Цвет мяса на 6-е сутки
Контроль
коричневый
Ацетат натрия
коричневый
Лактат натрия
коричневый
0,5R
коричневый
R
красный
0,5H
зеленый
H
коричневый
0,5R + 0,5H
красный
0,5R + H
коричневый
R + 0,5H
красный
R + H
коричневый
[179] Во время роста Listeria отслеживался цвет мяса, дополненного или нет экстрактами растений, и изображения брали сразу после добавления экстракта (0-е сутки) и на 6-е сутки роста).
[180] Результаты такого наблюдения на 6-е сутки с использованием экстракта розмарина и гесперидина отдельно или в комбинации приведены в следующей Таблице 6:
Таблица 6:
Экстракт розмарина (%)
Гесперидин (%)
Ожидаемый эффект
Измеренный эффект
R
0
11,05
0
H
10,69
R
H
21,75
15,39
[181] Экстракт розмарина и гесперидин в полной концентрации воздействуют на красный цвет мяса после 6-суточного роста в мясе. Эффект был рассчитан как: [красный цвет мяса с экстрактом] - [красный цвет контрольного мяса (без экстракта)].
[182] Вопреки сообщениям из известного уровня техники, неожиданно, экстракт розмарина лучше сохранил красный цвет мяса по сравнению с контролем. Гесперидин имел несколько более низкий, но сходный эффект.
[183] Комбинированный эффект остается в пределах дополнительного диапазона и, следовательно, не был найден синергетическим при этих концентрациях.
[184] Сочетание экстрактов по сравнению с контролем значительно улучшает сохранение красного цвета больше, чем каждый отдельный экстракт.
Таблица 7:
Экстракт розмарина (%)
Гесперидин (%)
Ожидаемый эффект
Измеренный эффект
0,5R
0
5,53
14,143*
0
0,5H
5,35
-1,63*
0,5R
0,5H
12,51
17,16*
R
0,5H
9,42
15,03*
0,5R
H
16,22
13,33
*Неожиданный эффект
Экстракт розмарина и гесперидин в полных и половинных концентрациях и комбинации половинной и полной концентрации влияют на красный цвет мяса после 6-суточного роста в мясе. Каждый эффект был рассчитан как: [красный цвет мяса с экстрактом] - [красный цвет контрольного мяса (без экстракта)].
[185] На Фиг. 5 показано, что, когда концентрация в гесперидине, добавленного к мясу, уменьшается вдвое, это значительно уменьшает сохранение красного цвета мяса по сравнению с контролем.
[186] Добавление розмарина значительно улучшило сохранение цвета мяса по сравнению с необработанным контрольным мясом. Неожиданно снижение концентрации розмарина в два раза вызывало больший эффект при сохранении красного цвета мяса, чем полная концентрация розмарина. Кроме того, неожиданно, снижение концентрации гесперидина в два раза не приводило к сохранению эффекта красного цвета, как ожидалось, но при этой концентрации гесперидин ухудшал сохранение красного цвета по сравнению с контролем. Кроме того, неожиданно, влияние на сохранение красного цвета мяса комбинации полной концентрации розмарина и половинной концентрации гесперидина превышало ожидаемые дополнительные эффекты розмарина при полной концентрации или только гесперидина при половинной концентрации. Что является синергией.
[187] Кроме того, неожиданно, влияние на сохранение красного цвета мяса комбинации половинной концентрации розмарина и половинной концентрации гесперидина превышало ожидаемые дополнительные эффекты половинной концентрации розмарина или только гесперидина при половинной концентрации. Что является синергией.
[188] Что касается экстракта розмарина с половинной концентрацией и гесперидином при полной концентрации, их эффект сочетания оставался в пределах дополнительного диапазона и, следовательно, не оказывался синергетическим.
[189] На Фиг. 5 показано, что все комбинации между розмарином и гесперидином при любой представленной в настоящем документе концентрации значительно улучшают сохранение красного цвета мяса по сравнению с контролем и по сравнению с типичными антилистерическими соединениями, такими как ацетат натрия и лактат натрия.
СМЕСИ РОЗМАРИНА И PUNICA
[190] Рост Listeria monocytogenes в сыром мясе
[191] Результаты такого тестирования на 6-е и 9-е сутки представлены на Фиг. 9 и Фиг. 10. Данные представляют собой средние значения от 2 до 6 повторов. Данные представляют собой логарифмические различия в росте L. monocytogenes в обработанном мясе по сравнению с инокулированным контролем (необработанное мясо). Данные были статистически проанализированы для уровня значимости при p<0,05 с использованием ANOVA. Различные буквы указывают на значительные различия при p<0,05.
Таблица 8:
Экстракт розмарина (%)
Экстракция Punica (%)
Ожидаемый эффект
Измеренный эффект
R
0
0,26
0
P
0,05
R
P
0,31
0,12
*Неожиданный эффект
Экстракт розмарина и/или экстракт Punica: эффекты полной концентрации на рост Listeria monocytogenes после 6-суточного роста в мясе: [(log (КОЕ/мл) в мясе, обработанном экстрактами растений) - (контрольное мясо (log (КОЕ/мл)) (без обработки))]
[192] Следует отметить, что в такой короткий срок (6 суток роста в холодных условиях) разница в росте Listeria в мясе, обработанном экстрактами растений по сравнению с необработанным мясом, выраженная в log, не достигала -0,5 log, что означает, что в такое короткое время роста антилистерические эффекты не могут быть оценены.
[193] Следует отметить, что при объединении измеренный эффект комбинации экстракта розмарина и экстракта Punica не соответствует синергетическому эффекту.
[194] Когда концентрации были уменьшены вдвое, были получены следующие ожидаемые эффекты, рассчитанные из приведенной выше таблицы и измеренных эффектов:
Таблица 9:
Экстракт розмарина (%)
Экстракция Punica (%)
Ожидаемый эффект
Измеренный эффект
0,5R
0
0,13
0,28
0
0,5P
0,025
0,27
0,5R
0,5P
0,55
0,11*
R
0,5P
0,53
-0,03*
0,5R
P
0,33
0,26*
*Неожиданный эффект
Экстракт розмарина и экстракт Punica: эффекты половинных концентраций и комбинации половинной и полной концентрации на рост Listeria monocytogenes после 6-суточного роста в мясе: [(log (КОЕ/мл) в мясе, обработанном экстрактами растений) - (log (КОЕ/мл) контрольное мясо (без обработки))]
[195] Следует отметить, что в такой короткий срок (6 суток роста в холодных условиях) разница в росте Listeria, выраженная в log, не достигала -0,5 log, что означает, что в такое короткое время роста антилистерические эффекты не могут быть оценены.
[196] Неожиданный эффект обозначается звездочкой.
[197] Неожиданно антилистерический эффект сочетания половинной концентрации розмарина и половинной концентрации Punica превышал ожидаемые дополнительные эффекты розмарина при половинной концентрации или только Punica при половинной концентрации. Что является синергией.
[198] Также, неожиданно антилистерический эффект комбинации полной концентрации розмарина и половинной концентрации Punica превышал ожидаемые дополнительные эффекты розмарина при полной концентрации или только Punica при половинной концентрации. Что является синергией.
[199] Также, неожиданно антилистерический эффект комбинации половинной концентрации розмарина и полной концентрации Punica превышал ожидаемые дополнительные эффекты розмарина при половинной концентрации или только Punica при полной концентрации. Что является синергией.
[200] Результаты такого тестирования на 9-е сутки с использованием экстракта розмарина и/или экстракта Punica приведены в Таблице 10.
Таблица 10:
Экстракт розмарина (%)
Экстракция Punica (%)
Ожидаемый эффект
Измеренный эффект
R
0
-0,39
0
P
-0,53
R
P
-0,92
-0,63
*Неожиданный эффект
Экстракт розмарина и экстракт Punica: эффекты полной концентрации на рост Listeria monocytogenes после 9-суточного роста в мясе: [(log (КОЕ/мл) в мясе, обработанном экстрактами растений) - (контрольное мясо (log (КОЕ/мл)) (без обработки))]
[201] Как указано ранее, в микробиологии следует отметить, что обработка имеет антибактериальный эффект, если ее эффект превышает -0,5 log КОЕ/мл по сравнению с необработанным контролем. Следует отметить, что после 9 суток роста в холодных условиях по сравнению с контролем разница в росте Listeria, выраженная в log КОЕ/мл, превышала -0,5 log КОЕ/мл, когда мясо обрабатывалось Punica в полной концентрации или сочетанием розмарина в полной концентрации и Punica в полной концентрации. Только розмарин в полной концентрации не оказывал существенного влияния на листерический рост по сравнению с необработанным контрольным мясом. Однако сочетание розмарина в полной концентрации с Punica в полной концентрации имело более сильный антилистерический эффект, чем когда экстракты использовались отдельно и позволяло превышать порог -0,5 log КОЕ/мл, что требуется для значительного эффекта при антилистерическом росте.
Таблица 11:
Экстракт розмарина (%)
Экстракция Punica (%)
Ожидаемый эффект
Измеренный эффект
0,5R
0
-0,195
-0,35*
0
0,5P
-0,265
-0,84*
0,5R
0,5P
-1,19
-1,47*
R
0,5P
-1,23
-1,45*
0,5R
P
-0,88
-0,69
*Неожиданный эффект
Экстракт розмарина и/или экстракт Punica: эффекты половинных концентраций и комбинации половинной и полной концентрации на рост Listeria monocytogenes после 9-суточного роста в мясе: [(log (КОЕ/мл) в мясе, обработанном экстрактами растений) - (log (КОЕ/мл) контрольное мясо (без обработки))]
[202] После 9-суточного роста в мясе все, кроме одного экстракта, или их комбинации почти во всех тестируемых концентрациях ингибировали рост Listeria monocytogenes более чем на 0,5 log КОЕ/мл по сравнению с контролем, что означает, что они оказывают антилистерический эффект на мясо. Экстракт розмарина, отдельно при тестировании в половинной концентрации не достигал разницы в -0,5 log КОЕ/мл по сравнению с контролем.
[203] Неожиданно экстракт Punica, отдельно имел больший антилистерический эффект при использовании в половинной концентрации по сравнению с полной концентрацией. Кроме того, неожиданно, при использовании в половинной концентрации экстракт розмарина имел больший антилистерический эффект, чем ожидалось. Также неожиданно антилистерический эффект сочетания половинной концентрации розмарина и половинной концентрации экстракта Punica превышал их ожидаемые дополнительные эффекты розмарина при половинной концентрации или только экстракта Punica при половинной концентрации. Что является синергией.
[204] Кроме того, неожиданно антилистерический эффект комбинации полной концентрации розмарина и половинной концентрации экстракта Punica превышал ожидаемые дополнительные эффекты розмарина при полной концентрации или только гесперидина при половинной концентрации. Что является синергией.
[205] Кроме того, неожиданно, экстракт розмарина в сочетании с экстрактом Punica в половинной концентрации имел больший антилисиерический эффект, чем каждый отдельный экстракт в полной концентрации. Что является синергией (См, например, Фиг. 1).
[206] Различные концентрации и их поверхности реакции были проанализированы с использованием метода поверхностного ответа, факториального экспериментального проектирования, который был разработан на трех уровнях. Данные результаты представлены на Фиг. 11. Они указывают на следующие диапазоны концентраций, которые обеспечивают антилистерический ответ в мясе, который определяется как: [(log (КОЕ/мл) в мясе, обработанном экстрактами растений] - [контрольное мясо (без экстракта растения)] (log (КОЕ/мл))]<-1, как указано в Таблице 12.
Таблица 12:
Экстракт
Экстракт (%)
Экстракт Punica
5,0-24,0
Экстракт розмарина
0,5-8,0
* Экстракт  %
[207] Следует отметить, что для обеспечения антилистерического эффекта любая из вышеуказанных концентраций экстракта (Таблица 12) может быть добавлена в комбинации или отдельно в мясо. Общий процент добавленного в мясо экстракта (отдельно или в комбинации) не превышал 0,18 %.
[208] Красный цвет сырого мяса
[209] Цвет мяса был оценен при помощи панели сенсорного анализа. Эта панель отличала цвет мяса между ярко-красным, красным, коричневым и зеленым оттенками. Все образцы мяса были ярко-красными на 0-е сутки экспериментов.
[210] На 6-е сутки при помощи общей оценки панели описали цвет различных образцов мяса, подвергнутых различным способам обработки мяса, следующим образом:
Цвет мяса на 6-е сутки
Контроль
коричневый
Ацетат натрия
коричневый
Лактат натрия
коричневый
0,5R
коричневый
R
коричневый
0,5P
красный
P
красный
0,5R + 0,5P
красный
0,5R + P
коричневый
R + 0,5P
красный
R + P
коричневый
[211] Во время роста Listeria отслеживался цвет мяса, дополненного или нет экстрактами растений, и изображения брали сразу после добавления экстракта (0-е сутки) и на 6-е сутки роста). Красные пиксели были определены количественно, как описано выше в разделе «Методы».
[212] Результаты такого наблюдения на 6-е сутки с использованием экстракта розмарина и экстракта Punica отдельно или в комбинации приведены в следующей:
Таблица 13:
Экстракт розмарина (%)
Экстракция Punica (%)
Ожидаемый эффект
Измеренный эффект
R
0
-3,72
0
P
-5,60
R
P
-9,32
1,27*
*Неожиданный эффект
Экстракт розмарина и экстракт Punica: эффекты полной концентрации на сохранение красного цвета мяса после 6 суток роста в мясе. Эффект был рассчитан как: [красный цвет мяса с экстрактом] - [красный цвет контрольного мяса (без экстракта)].
[213] При вышеуказанных концентрациях (Табл. 13) при добавлении отдельно экстракты розмарина или Punica ухудшали сохранение красного цвета мяса по сравнению с контролем. Поэтому ожидалось, что в сочетании эти экстракты еще более ухудшат сохранение красного цвета мяса. Неожиданно при сочетании экстракты розмарина и Punica улучшали сохранение красного цвета мяса по сравнению с контролем.
[214] Кроме того, неожиданно, влияние на сохранение красного цвета мяса комбинации полной концентрации розмарина и полной концентрации Punica превышало ожидаемые дополнительные эффекты розмарина при полной концентрации или только Punica при полной концентрации. Что является синергией.
Таблица 14:
Экстракт розмарина (%)
Экстракция Punica (%)
Ожидаемый эффект
Измеренный эффект
0,5R
0
-1,86
1,07*
0
0,5P
-2,80
-0,34*
0,5R
0,5P
0,73
4,45*
R
0,5P
-4,04
-2,71*
0,5R
P
-4,53
6,37*
*Неожиданный эффект
[215] Экстракт розмарина и экстракт Punica: полные и половинные концентрации и комбинации половинных и полных концентраций влияют на сохранение красного цвета мяса после 6 суток роста Listeria в мясе. Каждый эффект был рассчитан как: [красный цвет мяса с экстрактом] - [красный цвет контрольного мяса (без экстракта)].
[216] Поскольку полные концентрации экстрактов розмарина и Punica ухудшали сохранение красного цвета мяса, ожидалось, что половинные концентрации также ухудшат сохранение красного цвета мяса. Неожиданно уменьшение доли добавленного розмарина значительно улучшило сохранение красного цвета мяса по сравнению с необработанным контролем.
[217] Добавление розмарина значительно улучшило сохранение цвета мяса по сравнению с необработанным контрольным мясом. Неожиданно снижение концентрации добавленного экстракта Punica в два раза не ухудшало, насколько это ожидалось, сохранение красного цвета мяса.
[218] Также неожиданно улучшение сохранения красного цвета сочетания половинной концентрации розмарина и половинной концентрации экстракта Punica превышало их ожидаемые дополнительные эффекты розмарина при половинной концентрации или только экстракта Punica при половинной концентрации. Что является синергией.
[219] Кроме того, неожиданно улучшение сохранения красного цвета комбинации полной концентрации розмарина и половинной концентрации экстракта Punica превышал ожидаемые дополнительные эффекты розмарина при полной концентрации или только гесперидина при половинной концентрации. Что является синергией.
[220] Кроме того, неожиданно улучшение сохранения красного цвета комбинации полной концентрации экстракта Punica и половинной концентрации экстракта розмарина превышал ожидаемые дополнительные эффекты экстракта Punica при полной концентрации или только экстракта розмарина при половинной концентрации. Что является синергией.
[221] Неожиданно, комбинация полной концентрации экстракта Punica и половинной концентрации экстракта розмарина улучшило сохранение цвета мяса, тогда как ожидалось, что сохранение цвета будет ухудшаться при применении такой комбинации.
[222] На Фиг. 6 показано, что все комбинации между розмарином и экстрактом Punica при любой представленной в настоящем документе концентрации значительно улучшают сохранение красного цвета мяса по сравнению с контролем и по сравнению с классическими антилистерическими агентами, такими как ацетат натрия и лактат натрия.
[223] Специалист в данной области техники признает, что дополнительные варианты реализации изобретения также возможны без отхода от учений, раскрытых в настоящем объекте. Данное подробное описание и, в частности, конкретные детали типичных вариантов реализации изобретения, раскрытых в настоящем документе, дается в первую очередь для ясности понимания, и из него не следует понимать никаких ненужных ограничений, поскольку модификации станут очевидными для специалистов в данной области после прочтения данного раскрытия и могут быть выполнены без отклонения от сущности и объема, раскрытых в настоящем объекте.
[224] Эксперименты in vitro:
50% конечн
[225] Антимикробная активность экстрактов розмарина, Punica и геспердина отдельно и в комбинации. Растительные экстракты розмарина, гесперидина, Punica и их комбинации розмарин/гесперидин, розмарин/Punica были приготовлены в 10% в ДМСОв соответствии со следующим протоколом, в котором были подготовлены комбинации экстрактов, доведены до 100% с мальтодекстрином и добавлены перед тестированием к тестовым растворам в соответствии со следующими пропорциями и дозами.
Таблица 15:
°
R/H
Композиция экстрактов (%)
Экстракт розмарина
3,05
Карнозная кислота
1,34
Карнозная кислота + карнозол
1,48
Экстракт гесперидина
56,7
Гесперидин
53,87
R: экстракт розмарина; H: экстракт гесперидина
Таблица 16:
°
R
P
R/P
Композиция экстрактов (%)
Экстракт розмарина
5,33
0
5,33
Карнозная кислота
2,35
0
2,35
Карнозная кислота + карнозол
2,58
0
2,58
Экстракт граната
0
21,60
21,60
Эллаговая кислота
0
0,43
0,43
Пуникалагины
0
1,94
1,94
R: Экстракт розмарина; P: Экстракт Punica
[226] Приготовление рабочего/тестового раствора
50% конечн.
[227] 200 мг экстракта (комбинация) смешивали с 1 мл 100% ДМСО, перемешивали на вортексе, обрабатывали ультразвуком в течение 10 мин при мощности 100%, 45 кГц, нормальный режим, хорошо перемешивали на вортексе, обрабатывали ультразвуком и разбавляли 1:2 в стерильной воде в конечной концентрации 100 мг/мл ДМСО
[228] Данные препараты при 100 мг/мл были получены в стерильной 5 мл пробирке Эппендорфа. Образец был взят до подготовки чашек минимальной бактерицидной концентрации (МБК). МБК, Минимальная фунгицидная концентрация (МФК) и Минимальная ингибирующая концентрация (МИК).
[229] Основа
10
50% конечн.
[230] Минимальная бактерицидная концентрация (МБК) представляет собой самую низкую концентрацию образцов, необходимую для уничтожения не менее 99,99 % инокулята (-4log). Минимальная бактерицидная концентрация (МБК) представляет собой самую низкую концентрацию антибактериального агента необходимую для уничтожения конкретной бактерии. Минимальная ингибирующая концентрация (МИК) может быть определена при помощи анализа разведения бульона путем субкультивирования на агаровых пластинках, которые не содержат тестирующего агента. МБК идентифицируют, определяя самую низкую концентрацию антибактериального агента, которая снижает жизнеспособность исходного бактериального инокулята на ≥99,9%. МБК дополняет МИК; тогда как тест МИК демонстрирует самый низкий уровень антимикробного агента, который ингибирует рост, МБК демонстрирует самый низкий уровень антимикробного агента, который приводит к смерти микроорганизмов. Это означает, что даже если конкретный МИК демонстрирует ингибирование, нанесение бактерий на агар может все же привести к пролиферации организма, потому что антимикробный препарат не вызывает смерти. Антибактериальные средства обычно считаются бактерицидными, если МБК не более чем в четыре раза превышает МИК. Данный тест был основан на подсчете микроорганизмов в лунках, которые были слабо видны или визуально не росли, а затем высеивании в чашки. Образцы, приготовленные в 10% ДМСО, были испытаны в концентрациях 2,5, 0,5 и 0,1% против одного эквивалентного контроля ДМСО (соответственно 12,5, 2,5 и 0,5%).
[231] В случае дрожжей минимальные фунгицидные концентрации (МФК) предоставлялись как WCD (интенсивность окрашивания). В случае штамма A. brasiliensis, гриба, простое наличие роста интерпретировалось как отсутствие фунгицидной активности. Минимальная ингибирующая концентрация (МИК) представляет собой самую низкую концентрацию антимикробного средства, которая будет препятствовать видимому росту микроорганизма после адаптированного периода инкубации. Минимальные ингибирующие концентрации обычно используются для определения эффективности новых антимикробных агентов, таких как растительные экстракты или их комбинации. Минимальная ингибирующая концентрация или МИК является самой низкой концентрацией, которая достаточна для ингибирования роста микробов с помощью протестированных экстрактов. Данный тест основан на визуальном наблюдении лунок, которые содержат микробиологический штамм, который изучается с тестируемыми экстрактами или без (контроль). Длину времени и условия микробного роста проводили в соответствии с классическими методами, хорошо известными специалисту в данной области.
5
6
5
[232] Испытания проводили на следующих бактериальных штаммах: E. coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enterica ser typhimurium, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Streptococcus mutans, Clostridium perfringens, Enterococcus hirae, Enterobacter cloacae, Moraxella bovis и двое дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Candida albicans, а также микромицет Aspergillus brasiliensis. Оценка бактерицидной и фунгицидной активности проводилась в соответствии с внутренней процедурой в богатых питательных средах с калиброванным инокулятом 10-10 КОЕ/мл для бактерий и дрожжей и 10 спор/мл для A. brasiliensis.
[233] До антимикробной оценки экстрактов стерильность экстрактов проверяли путем высевания в чашки. Отсутствие какого-либо микробного роста было обязательным.
Микробные культуры выращивались классически, как показано в Таблице 17.
Таблица 17: Условия роста и коллекции микроорганизмов
Организм
Коллекция
Условия культивирования
Bacillus cereus
ATCC 11.778
TS-30°C - 24 ч
Staphylococcus aureus
CIP 4.83
TS-37°C - 18 ч
Listeria monocytogenes
ATCC 19.115
TS-37°C - 24 ч
Salmonella typhimurium
CIP 103.799
TS-37°C - 18 ч
Escherichia coli
CIP 53.126
TS-37°C - 18 ч
Pseudomonas aeruginosa
CIP 82.118
TS-37°C - 18 ч
Streptococcus mutans
ATCC 35.668
COS 5 % sang/бульон Streptos-37°C - 24 ч
Enterococcus hirae
ATCC 8043
Бульон TS-37°C - 24 ч
Enterobacter cloacae
CIP 103.475
Бульон TS-37°C - 24 ч
Moraxella bovis
CIP 70.40 T
TS/бульон Col 10 % лошадиной сыворотки - 30°C - 24 ч
Clostridium perfringens
ATCC 13.124
RCM/37°C/анаэробиоз/48 ч
Candida albicans
UMIP 48.72
Сабуро/30°C/48 ч
Saccharomyces cerevisiae
UMIP 1181.79
Сабуро/30°C/48 ч
Aspergillus niger
IP 1431.83
Сабуро/30°C/48 ч
[234] Результаты
Таблица 18: Концентрации МБК и МФК (0,1; 0,5 или 2,5%) розмарина (R), Punica (Р), розмарин/Punica (R/P) и розмарин/гесперидин (R/H), эффективные против представленных в настоящем документе микроорганизмов.
R/H
R/P
S. aureus
0,5
0,1
S. mutans
2,5
0,5
S. typhimirium
2,5
0,1
P. aeruginosa
2,5
0,1
E. coli
2,5
0,5
L. monocytogenes
0,5
B. cereus
2,5
0,1
C. perfringens
0,5
0,1
E. hirae
2,5
E. cloacae
0,5
M. bovis
0,1
0,1
Комбинация R/H экстрактов розмарина и гесперидина в соответствии с Таблицей 15; R: экстракт розмарина, P: экстракт Punica, R/P: комбинация экстрактов розмарина и Punica в соответствии с Таблицей 16. Пустые клетки: минимальные концентрации (если таковые имеются) были бы выше, чем самая высокая концентрация измеренная здесь (2,5 %).
Таблица 19: Неожиданные / синергетические эффекты МБК и МФК R и P (% в тестовом растворе)
МБК/МФК R (%)
МБК/МФК P (%)
Предполагаемая МБК/МФК R/P (%)
Фактическая МБК/МФК R/P (%)
S. typhimirium
0,5
0,5
0,25-0,5
0,1*
P. aeruginosa
0,5
0,5
0,25-0,5
0,1*
C. perfringens
0,03
>0,016
>0,016
0,0078*
*: Неожиданный результат
Неожиданно при применении в комбинации минимальная концентрация комбинации R/P для уменьшения микробного роста на 4 log, S. typhimirium и P. aeruginosa является неожиданно низкой; она в 2,5-5 раз ниже предполагаемой. Удивительно, но когда эти два экстракта объединены, их активность синергетически увеличивается в 2,5-5 раз.
[235] Неожиданно эффект против сальмонеллы комбинации экстрактов розмарина и Punica превышал ожидаемые дополнительные эффекты, когда экстракты применялись отдельно. Действительно, можно было ожидать, что для достижения того же эффекта против салмонеллы и уменьшения микробного роста на 4 log МБК был бы в лучшем случае уменьшен в два раза, когда экстракты объединяются по сравнению с МБК, когда экстракты применялись отдельно. Удивительно, но в настоящем документе МБК уменьшились в 2,5-5 раз. Что является синергией.
[236] Также неожиданно эффект против псевдомонас комбинации экстрактов розмарина и Punica превышал ожидаемые дополнительные эффекты, когда экстракты применялись отдельно. Действительно, можно было ожидать, что для достижения того же эффекта против салмонеллы и уменьшения микробного роста на 4 log МБК был бы в лучшем случае уменьшен в два раза, когда экстракты объединяются по сравнению с МБК, когда экстракты применялись отдельно. Удивительно, но в настоящем документе МБК уменьшились в 2,5-5 раз. Что является синергией.
[237] Также неожиданно эффект против клостридиума комбинации экстрактов розмарина и Punica превышал ожидаемые дополнительные эффекты, когда экстракты применялись отдельно. Действительно, можно было ожидать, что для достижения того же эффекта против псевдомонас и уменьшения микробного роста на 4 log МИК был бы в лучшем случае уменьшен в два раза, когда экстракты объединяются по сравнению с МИК, когда экстракты применялись отдельно. Что является синергией. Примечание, экстракт Punica имеет эффект МИК 0,016%. Это означает, что его МБК должен быть выше чем МИК, что означает более 0,016%. В любом случае, еще более неожиданно, что МБК комбинации экстрактов розмарина и Punica более чем в два раза ниже, чем МИК экстрактов отдельно.
Таблица 20: Неожиданные/синергетические эффекты МИК R и P (% в тестовом растворе)
МИК R (%)
МИК P (%)
Предполагаемая МИК R/P (%)
Фактическая МИК R/P (%)
S. mutans
0,25
>1
0,25
0,0625*
S. aureus
0,125
0,5
0,125-0,325
0,0625*
C. albicans
1
>1
1
0,25*
S. cerevisiae
0,25
>1
0,25
0,0625*
[238] Неожиданно при применении в комбинации минимальная концентрация комбинации R/P для ингибирования микробного роста бактерий или дрожжей, S. mutans, S. aureus, C. albicans и S. cerevisiae являлась неожиданно низкой; в 2-4 раза ниже, чем ожидалось. Удивительно, но когда эти два экстракта объединены, их активность синергетически увеличивается в 2,5-5 раз, чем ожидалось.
[239] Также неожиданно эффект против стрептококка комбинации экстрактов розмарина и Punica превышал ожидаемые дополнительные эффекты, когда экстракты применялись отдельно. Действительно, можно было ожидать, что для достижения того же эффекта против стрептококка и подавления микробного роста МИК должны быть в лучшем случае с самой низкой МИК по сравнению с МИК, когда экстракты применялись отдельно. Удивительно, но в данном случае МИК снизилась в 4 раза, по сравнению с ожидаемой. Что является синергией.
[240] Также неожиданно эффект против стафилококка комбинации экстрактов розмарина и Punica превышал ожидаемые дополнительные эффекты, когда экстракты применялись отдельно. Действительно, можно было ожидать, что для достижения такого же антистафилококкового эффекта и ингибирования микробного роста МИК должны быть в лучшем случае сокращены в два раза, когда экстракты объединялись по сравнению с MIC, когда экстракты применялись отдельно. Удивительно, но в данном случае МИК снизилась в 2-4,5 раза, по сравнению с ожидаемой. Что является синергией.
[241] Также неожиданно эффект против кандида комбинации экстрактов розмарина и Punica превышал ожидаемые дополнительные эффекты, когда экстракты применялись отдельно. Действительно, можно было ожидать, что для достижения того же эффекта против кандида и подавления микробного роста МИК должны быть в лучшем случае с самой низкой МИК по сравнению с МИК, когда экстракты применялись отдельно. Удивительно, но в данном случае МИК снизилась в 4 раза, по сравнению с ожидаемой. Что является синергией.
[242] И также неожиданно эффект против кандида комбинации экстрактов розмарина и Punica превышал ожидаемые дополнительные эффекты, когда экстракты применялись отдельно. Действительно, можно было ожидать, что для достижения того же эффекта против сахаромицетов и подавления микробного роста МИК должны быть в лучшем случае с самой низкой МИК по сравнению с МИК, когда экстракты применялись отдельно. Удивительно, но в данном случае МИК снизилась в 4 раза, по сравнению с ожидаемой. Что является синергией.
[243] Отмечается, что P. aeruginosa и S. typhimirium являются грамотрицательными бактериями. C. perfringens, S. mutans, S.aureus и L. monocytogenes являются грамположительными бактериями. C. albicans и S. cerevisiae являются дрожжами.
[244] Розмарин в сочетании с экстрактом Punica явно проявляет синергетические антимикробные эффекты против роста грамположительных бактерий (включая L. monocytogenes (в мясе), C. perfringens, S. mutans, S.aureus), грамотрицательных бактерий (включая S. typhimirium, P. Aeruginosa) и дрожжей (включая C. albicans, Saccharomyces cerevisiae).
Таблица 21: Неожиданные/синергетические эффекты комбинации экстрактов R/P на различные микроорганизмы приведены в настоящем документе
Микроорганизм
Природа микроорганизма
Грам (+ или -)
Антимикробный эффект
L. monocytogenes
Бактерии
G+
Неожиданный, Синергия
S. typhimirium
Бактерии
G-
Неожиданный, Синергия
P. aeruginosa
Бактерии
G-
Неожиданный, Синергия
C. perfringens
Бактерии
G+
Неожиданный, Синергия
S. mutans
Бактерии
G+
Неожиданный, Синергия
S. aureus
Бактерии
G+
Неожиданный, Синергия
C. albicans
Дрожжи
Неожиданный, Синергия
S. cerevisiae
Дрожжи
Неожиданный, Синергия
[245] Обратите внимание, что гесперидин в сочетании с розмарином не проявлял бактерицидного эффекта in vitro в отношении Listeria monocytogenes даже при самых высоких тестируемых концентрациях в данном документе: 2,5%
[246] Однако удивительно, что такая комбинация экстрактов значительно и эффективно ингибировала рост Listeria monocytogenes в мясных продуктах синергетическим образом.
[247] Аналогичное наблюдение можно было бы провести при сравнении эффектов гесперидина in vitro, как сообщалось в известном уровне техники в отношении роста Listeria monocytogenes и в мясе (данное исследование). Действительно, хотя гесперидин in vitro не имел антилистерических эффектов, он ингибировал рост Listeria в говядине.
[248] ПРИМЕНЕНИЕ ЭКСТРАКТОВ РОЗМАРИН/PUNICA И РОЗМАРИН/ГЕСПЕРИДИН В МАТРИЦАХ МЯСА/ПТИЦЫ/РЫБЫ
Способы обработки, включение экстракта, заражение Listeria и ингибирование роста
[249] Свежее свиные колбасы и домашняя птица были изготовлены в соответствии со стандартными рецептами, используемыми промышленностью. Что касается рыбы и морепродуктов, то в настоящем документе, в качестве примера используется копченый лосось, его обработка также проводилась в соответствии с промышленными процедурами.
[250] Партии мяса/птицы/рыбы
[251] По возможности, для преодоления изменчивости сырья с точки зрения рН и эндогенной флоры (скорость и характер составляющей флоры) для каждого мяса/категории, обработка производилась на трех партиях сырья, происходящего из разных мясных ферм/птицеферм/рыбных хозяйств/(лососевых) ферм. Экстракты растений или их комбинации были включены в начале каждого рецепта вместе с основными ингредиентами для обработки. Экстракты растений или их комбинации были включены в пищевые матрицы в 1-3 различных концентрациях, как описано в таблицах 23, 24, 26, 27, 29 и 30 ниже.
[252] Что касается каждой категории продуктов, были проверены контроли, то есть продукты, не содержащие растительные экстракты.
[253] Природа и происхождение штаммов Listeria monocytogenes/условия подготовки бактерий
[254] Два штамма Listeria monocytogenes в смеси (50/50) изучались в соответствии со стандартной процедурой NF V01-009 и в отношении любого мясного/птичьего/рыбного продукта. Что касается тестов в мясных продуктах: были использованы эталонный штамм CIP 7838 (серовар 4b) и так называемый полевой штамм, выделенный из свинины (коллекция ADIV) серотип 1/2a, который преобладает более чем на 50% на свежей свинине.
[255] Что касается мяса птицы, то эталонный штамм 7838 был объединен со штаммом Listeria monocytogenes, выделенным из тушки домашней птицы (коллекция ADIV, серотип 1/2b). Что касается тестов на лососе, то контрольный штамм CIP 7838 был объединен со штаммом, выделенным из лосося, который был передан партнером сети ADIV. Что касается любого рассматриваемого в данном документе пищевого матрикса, то два штамма были подготовлены и засеяны в соответствии с руководством Standard Operating Procedures NF V01-009 (версия 2014).
[256] Замороженные штаммы, сохранившиеся в виде криобиллов (cryobilles) (-80°C), восстанавливались и культивировались индивидуально. Каждый штамм восстанавливали путем переноса 0,1 мл в 10 мл культуральной среды BHI (в течение 24 ч при 30°С). Две последовательные субкультуры привели к предварительной культуре каждого штамма. Затем каждый штамм снова культивировали в течение 24 часов при 30°С. Последняя культура использовалась при загрязнении матричного продукта (в конце экспоненциальной фазы или в начале стационарной фазы). После двух последовательных центрифугирований гранулы суспендировали в 10 мл буферизованной пептонной воды (BPW), подсчитывали количество на среде BHI и бактериальный раствор выдерживали при 0°C в течение 24 часов перед инокуляцией. После считывания бактериального роста концентрации затем корректировали таким образом, чтобы инокулировать продукт пищевой матрицы смесью двух штаммов (50/50) при 2-3 log КОЕ/г.
[257] Способ инокуляции
[258] Как указано в NF V01-009, режим инокуляции продуктов должен соответствовать реальности промышленного загрязнения. Таким образом, колбасы (свинина или птица) были заражены путем инокуляции в массе мясной смеси для имитации загрязнения мяса. Поскольку загрязнение копченого лосося происходит во время обработки сырья или при резке/упаковке, в настоящем документе загрязнение применялось к поверхности срезов лосося.
[259] Способ инокуляции на поверхности продуктов был разработан ADIV и обеспечил точную массу инокулюма, рассчитанную таким образом, чтобы получить желаемую концентрацию на поверхности продуктов. Независимо от способа инокуляции (измельчение или поверхность) для поддержания адекватной водной активности пищевых продуктов объем воды, добавляемый в пищевую матрицу, рассчитывали таким образом, чтобы не превышать отношение массы к объему 1/100 (NF V01-009).
[260] Разработка продукта на основе мяса/птицы/ рыбы и включение экстракта
[261] Свиные колбасы
[262] Свиные колбасы были изготовлены в соответствии с обычным процессом в соответствии со сводом правил, из постной свинины (86 %) и свиного жира (14 %). Первоначальная мясная смесь, предназначенная для изготовления колбасных изделий, была получена путем измельчения/перемалывания жира и сухих частей мяса свинины при низкой температуре через сетку (сетка 6 мм). Затем тестируемые в настоящей документ растительные экстракты добавляли, когда это применимо, в соответствии с таблицей 24 и таблицей 25. После гомогенизации смесь затем набивали в натуральные оболочки (овечья кишка, диаметр 24/26).
[263] Заражение/упаковка
2
2
[264] Для данной партии была приготовлена мясная смесь из 42 кг, а затем была разделена на разные наборы по 5 кг каждый для производства серии испытаний. Пять (5) кг мясной смеси добавляли к полученной смеси, которая не содержала ни антимикробный агент, ни добавку (Mix Fraiche 230 South при 23 г/кг) и 50 г воды/кг. После гомогенизации полученную таким образом смесь разделяли на части. Часть без искусственного загрязнения Listeria была помещена в лотки (6 колбас на лоток), которые были упакованы в условиях MAP (70 % O/30 % CO) со временем сохранения, равным 1/3 времени сохранения при 4°C и 2/3 времени сохранения при 8°C. Другая часть была искусственно загрязнена Listeria monocytogenes со средней количеством, равным 3 log КОЕ/г (инокуляция в массе мясного фарша) перед упаковкой и консервацией, как описано выше. Образцы зараженного мяса, которые не содержали экстракты растений, назывались контрольными.
[265] Аналитический мониторинг во время консервирования
[266] Микробиологические анализы проводились на D0 и JDLC (D14), и они состояли в подсчете Listeria monocytogenes, общей мезофильной подкисляющей флоры (FAM) и молочнокислой флоры. В каждой точке анализа одна партия-повторность была выполнена путем анализа лотка (n=3 для 3 партий).
[267] Производство колбас из домашней птицы
[268] Колбасы из домашней птицы производились в соответствии с теми же экспериментальными условиями, что и свиные колбасы. Единственная разница остается в характере используемого сырья и природе соединений, которые могут быть добавлены. Действительно, в этом случае колбаска был сделана с использованием верхних частей куриных бедер 85% и жира, представленного кожей.
[269] Смесь измельченного мяса не содержала классического противомикробного средства, но содержала смесь, из которой были удалены любые ингредиенты, обладающие антимикробной или антиокислительной активностью (Mix Chipo Flight 310 до 31 г/кг). Таким образом, приготовленная смесь либо содержала экстракты растений, либо нет (контроль), а затем подвергалась тем же экспериментальным условиям и анализам Listeria/бактерии, как описано для свинины.
[270] Подготовка и инокуляция копченого лосося
[271] Производство копченого лосося проводили в соответствии с классическими процедурами, хорошо известными и доступными специалисту в данной области техники. Что касается мясных продуктов, то в течение той же недели были приготовлены три разных партии лосося из трех разных источников. Продукты были упакованы нарезанными на поддонах под вакуумом (около 200 г на лоток) на промышленной площадке до инокуляции Listeria/бактериями и анализа.
[272] Протестированные морепродукты, то есть копченый лосось, содержали комбинации экстракта розмарина и экстракта геспердина, а также экстракты розмарина и Punica в соответствии с пропорциями и концентрациями, описанными в Таблицах 29 и 30. Лосось взвешивали, а затем инокулировали путем напыления смесью двух штаммов (50/50) со средним количеством 3±0,5 log/г. После инокуляции поддоны снова упаковывают в вакууме и помещают на хранение при 8°С в течение 30 дней. Рост Listeria контролировался при инокуляции (0-е сутки) и на 30-е сутки роста. Неконсервированные контрольные образцы хранились в холодильном хранилище для всех матриц мяса/птицы/рыбы, которые были протестированы в настоящем документе для целей сравнения.
[273] pH, общая мезофильная подкисляющая флора, молочнокислая флора измерялись во всех экспериментах в говядине, свинине, мясе птицы или рыбе. Присутствие в настоящем документе протестированных ботанических экстрактов в этих пищевых матрицах не оказало значительного влияния на рН, общую мезофильную подкисляющую флору, молочнокислую флору.
[274] ПРИМЕР: АНТИМИКРОБНЫЕ ЭФФЕКТЫ R/P И R/H В КОЛБАСАХ ИЗ ПТИЦЫ
[275] Классический метод, доступный для специалистов в данной области и основанный на протоколе, описанном для фарша говядины и выше, был применен для обработанного колбас из домашней птицы.
[276] Как описано выше, вкратце, три различные партии свежей домашней птицы, перерабатываемые в колбасы, содержащие комбинации R/P и R/H экстрактов в разных концентрациях, инокулировали Listeria monocytogenes. Контроль не содержал растительных экстрактов. Свежее образцы мяса птицы содержались в прохладных условиях, а рост Listeria измерялся на 14-е сутки.
Таблица 22: Начальная нагрузка Listeria в партии колбас из домашней птицы
Партия
L. monocytogenes (КОЕ/г)
Партия 1
1,95E+03
Партия 2
2,93E+03
Партия 3
2,75E+03
[277] Экстракты были приготовлены следующим образом: Половинные количества R (0,5 R) и половинные количества H (0,5H) или половинные количества экстрактов P (0,5P), как определено выше, смешивали вместе в соответствии с Таблицей 21, и смесь была доведена до 100% мальтодекстрином. Эти порошкообразные смеси добавляли к свежему мясу птицы при переработке в колбасы в пропорциях, как описано в Таблицах 23 и 24. В таблицах 23 и 24 также указано окончательное содержание экстрактов и экстрактов в % и в ч/млн в экстракте и в мясной матрице.
[278] Обратите внимание, что 0,5 % от 0,5R + 0,5H соответствовали количествам в экстрактах, называемым 0,5R + 0,5H, которые были протестированы в говяжьем фарше. Также отмечалось, что 0,3 % от 0,5R + 0,5P соответствовали количествам в экстрактах, называемым 0,5R + 0,5P, которые были протестированы в говяжьем фарше. Все полученные данные анализировались и выражались (т.е. дельта log и т.д.) в соответствии с пояснениями, касающимися говяжьего фарша.
Таблица 23:
Контроль
0,5R + 0,5H
Композиция экстрактов (%)
Экстракт розмарина
0,00
3,05
Карнозная кислота
0,00
1,34
Карнозная кислота + карнозол
0,00
1,48
Экстракт гесперидина
0,00
56,70
Гесперидин
0,00
53,87
0,6 %
Композиции в домашней птице (ч/млн)
Экстракт розмарина
0
183
Карнозная кислота
0
80
Карнозная кислота + карнозол
0
89
Экстракт гесперидина
0
3402
Гесперидин
0
3232
Таблица 24:
Контроль LM
0,5R + 0,5P
Композиция экстрактов (%)
Экстракт розмарина
0,00
5,33
Карнозная кислота
0,00
2,35
Карнозная кислота + карнозол
0,00
2,58
Экстракт граната
0,00
21,60
Эллаговая кислота
0,00
0,43
Пуникалагины
0,00
1,94
0,2 %
0,4 %
Композиции в домашней птице (ч/млн)
Экстракт розмарина
0
107
213
Карнозная кислота
0
47
94
Карнозная кислота + карнозол
0
52
103
Экстракт граната
0
432
864
Эллаговая кислота
0
9
17
Пуникалагины
0
39
78
[279] Результаты:
[280] L. monocytogenes явно вырос в контрольном мясе (Фиг. 12). Когда к мясу добавляли комбинации экстрактов, они эффективно ингибировали рост Listeria (Фиг. 13 и Фиг. 14). Эти данные подтверждают данные, обнаруженные в говяжьем фарше, которые ясно демонстрируют синергетический антилистерический эффект экстрактов розмарина и гесперидина, а также розмарина и Punica.
[281] ПРИМЕР: АНТИМИКРОБНЫЕ ЭФФЕКТЫ R/P И R/H В КОЛБАСАХ ИЗ СВИНИНЫ
[282] Классический метод, доступный для специалистов в данной области и основанный на протоколе, описанном для фарша говядины и выше, был применен для обработанного колбас из свинины.
[283] Вкратце, три различные партии свежей свинины, перерабатываемые в колбасы, содержащие комбинации R/P и R/H экстрактов в разных концентрациях, инокулировали Listeria monocytogenes. Контроль не содержал растительных экстрактов. Свежее образцы свинины содержались в прохладных условиях (8°C), а рост Listeria измерялся на 14-е сутки.
Таблица 25: Начальная нагрузка Listeria на партию
Партия
L. monocytogenes (КОЕ/г)
Партия 1
1,55E+03
Партия 2
2,96E+03
Партия 3
2,36E+03
[284] Экстракты были приготовлены следующим образом: Половинные количества R (0,5 R) и половинные количества H (0,5H) или половинные количества экстрактов P (0,5P), как определено выше, смешивали вместе в соответствии с Таблицей 24, и смесь была доведена до 100 % мальтодекстрином. Эти порошкообразные смеси добавляли к свежей свинине при переработке в колбасы в пропорциях, как описано в Таблицах 26 и 27. В таблицах 26 и 27 также указано окончательное содержание экстрактов и экстрактов в % и в ч/млн в экстракте и в мясной матрице.
[285] Обратите внимание, что 0,5 % от 0,5R + 0,5H соответствовали количествам в экстрактах, называемым 0,5R + 0,5H, которые были протестированы в говяжьем фарше. Также отмечалось, что 0,3 % от 0,5R + 0,5P соответствовали количествам в экстрактах, называемым 0,5R + 0,5P, которые были протестированы в говяжьем фарше. Все полученные данные анализировались и выражались (т.е. дельта log и т.д.) в соответствии с пояснениями, указанным выше, касающимися говяжьего фарша.
Таблица 26:
Контроль
0,5R + 0,5H
Композиция экстрактов (%)
Экстракт розмарина
0,00
3,05
Карнозная кислота
0,00
1,34
Карнозная кислота + карнозол
0,00
1,48
Экстракт гесперидина
0,00
56,70
Гесперидин
0,00
53,87
Контроль
0,4 %
0,5 %
0,6 %
Композиция в свинине (ч/млн)
Экстракт розмарина
0
122
153
183
Карнозная кислота
0
54
67
80
Карнозная кислота + карнозол
0
59
74
89
Экстракт гесперидина
0
2268
2835
3402
Гесперидин
0
2155
2694
3232
Контроль
0,5R + 0,5H
Композиция экстрактов (%)
Экстракт розмарина
0,00
3,05
Карнозная кислота
0,00
1,34
Карнозная кислота + карнозол
0,00
1,48
Экстракт гесперидина
0,00
56,70
Гесперидин
0,00
53,87
0,4 %
0,5 %
0,6 %
Композиция в свинине (ч/млн)
Экстракт розмарина
0
122
153
183
Карнозная кислота
0
54
67
80
Карнозная кислота + карнозол
0
59
74
89
Экстракт гесперидина
0
2268
2835
3402
Гесперидин
0
2155
2694
3232
Таблица 27:
Контроль LM
0,5R + 0,5P
Композиция экстрактов (%)
Экстракт розмарина
0,00
5,33
Карнозная кислота
0,00
2,35
Карнозная кислота + карнозол
0,00
2,58
Экстракт граната
0,00
21,60
Эллаговая кислота
0,00
0,43
Пуникалагины
0,00
1,94
0,2 %
0,3 %
0,4 %
Композиция в свинине (ч/млн)
Экстракт розмарина
0
107
160
213
Карнозная кислота
0
47
71
94
Карнозная кислота + карнозол
0
52
77
103
Экстракт граната
0
432
648
864
Эллаговая кислота
0
9
13
17
Пуникалагины
0
39
58
78
[286] Результаты:
[287] L. monocytogenes явно вырос в контрольном мясе (Фиг. 15). Когда к мясу добавляли комбинации экстрактов, они эффективно ингибировали рост Listeria во всех протестированных в данном документе концентрациях (Фиг. 16 и Фиг. 17). Эти данные подтверждают данные, обнаруженные в говяжьем фарше, которые ясно демонстрируют синергетический антилистерический эффект экстрактов розмарина и гесперидина, а также розмарина и Punica.
[288] Классический метод, доступный для специалистов в данной области и основанный на протоколе, описанном для фарша говядины и выше, был применен для копченого лосося.
[289] Как описано выше, вкратце, три различные партии копченого лосося, содержащие комбинации R/P и R/H экстрактов в разных концентрациях, инокулировали Listeria monocytogenes. Контроль не содержал растительных экстрактов. Копченый лосось содержался в прохладных условиях, а рост Listeria измерялся на 14-е сутки.
[290] Начальная нагрузка Listeria в партии копченого лосося представлена в Таблице 28:
Таблица 28: Начальная нагрузка Listeria в копченом лососе
Партия
L. monocytogenes (КОЕ/г)
Партия 1
1,46E+03
Партия 2
4,93E+03
Партия 3
5,64E+03
Таблица 29:
Контроль
0,5R + 0,5H
Композиция экстрактов (%)
Экстракт розмарина
0,00
3,05
Карнозная кислота
0,00
1,34
Карнозная кислота + карнозол
0,00
1,48
Экстракт гесперидина
0,00
56,70
Гесперидин
0,00
53,87
Контроль
0,4%
0,5%
Композиция в копченом лососе (ч/млн)
Экстракт розмарина
0
122
153
Карнозная кислота
0
54
67
Карнозная кислота + карнозол
0
59
74
Экстракт гесперидина
0
2268
2835
Гесперидин
0
2155
2694
Таблица 30:
Контроль LM
0,5R + 0,5P
Композиция экстрактов (%)
Экстракт розмарина
0,00
5,33
Карнозная кислота
0,00
2,35
Карнозная кислота + карнозол
0,00
2,58
Экстракт граната
0,00
21,60
Эллаговая кислота
0,00
0,43
Пуникалагины
0,00
1,94
0,3 %
Композиция в копченом лососе (ч/млн)
Экстракт розмарина
0
160
Карнозная кислота
0
71
Карнозная кислота + карнозол
0
77
Экстракт граната
0
648
Эллаговая кислота
0
13
Пуникалагины
0
58
[291] Следует отметить, что 0,3 % 0,5R + 0,5P соответствует тем же пропорциям и дозе комбинации экстрактов, добавленной в говяжий фарш и называемой 0,5R + 0,5P.
[292] Результаты:
[293] L. monocytogenes явно вырос в контрольном копченом лососе (Фиг. 18). Когда к мясу добавляли комбинации экстрактов, они эффективно ингибировали рост Listeria (Фиг. 19 и Фиг. 20). Эти данные подтверждают данные, обнаруженные в говяжьем фарше, которые ясно демонстрируют синергетический антилистерический эффект экстрактов розмарина и гесперидина, а также розмарина и Punica.
ЛИТЕРАТУРНЫЕ ИСТОЧНИКИ
[294] Во всем данном описании упоминалось множество ссылок. Все ссылки, приведенные в данном описании, включая три дополнительные ссылки, перечисленные ниже, включены посредством ссылки.
[295] Kai Reineke, Henning Weich, Dietrich Knorr, “The Influence of Sugars on Pressure Induced Starch Gelatinization”, Procedia Food Science, Vol. 1, (2011), pages 2040-2046.
[296] Shivangi Kelkar, Scott Stella, Carol Boushey, Martin Okos, “Developing novel 3D measurement techniques and prediction method for food density determination”, Procedia Food Science, Vol. 1, (2011), pages 483-491.
S. Chaillou, S.Christieans, M. Rivollier, I. Lucquin,  M. Zagorec; “Quantification and efficiency of Lactobacillus sakei strain mixtures used as protective cultures in ground beef”; Meat Science 97, (3) (2014), pages 332-338.