СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ НЕВРОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ЭКСТРАКТОМ ИЗ ВИДОВ NERIUM ИЛИ ВИДОВ THEVETIA
METHOD OF TREATING NEUROLOGICAL CONDITIONS WITH EXTRACT OF NERIUM SPECIES OR THEVETIA SPECIES

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к способу лечения неврологических состояний экстрактом из видов Nerium или из видов Thevetia, или препаратами (композициями, составами), содержащими их. В частности, изобретение относится к способу лечения неврологического заболевания или расстройства путем введения экстракта субъекту, нуждающемуся в этом. Изобретение также включает фармацевтические композиции, содержащие фракции, или субфракции экстракта, а также способы их применения и получения.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Неврологические заболевания и расстройства влияют на функции мозга. Были предприняты значительные усилия по разработке лечебной терапии или улучшения состояния при этих заболеваниях и расстройствах, однако не было разработано полной или универсальной лечебной терапии, хотя существуют многочисленные фармакотерапевтические подходы, которые были доказаны как эффективные против множества различных заболеваний и расстройств.
Болезнь Хантингтона (HD) является наследственным заболеванием мозга, которое влияет на нервную систему. Это вызвано дефектным геном, который передается от родителей к детям. Ген HD вмешивается в продуцирование конкретного белка, известного как "хантингтон", который является важным для нормального развития мозга. Классические признаки HD включают эмоциональные, когнитивные и двигательные нарушения. Болезнь Хантингтона характеризуется непроизвольными судорожными движениями (хореей), но иногда она вызывает ригидность без аномальных движений, изменениями функционирования конечностей (апраксия), потерей контроля над функциями организма и слабоумием, в том числе постепенным ухудшением памяти, скорости мышления, суждения, и недостаточной осведомленностью о проблемах и возможностях планирования. Для болезни Хантингтона не известно никакого лечения. Хотя существует целый ряд лекарств, которые помогают контролировать симптомы, связанные с HD, такие как эмоциональные проблемы и проблемы, связанные с движением, не известно никакого лечения для того, чтобы остановить или изменить ход развития заболевания. Болезнь Хантингтона была признана как болезнь со значительными аномалиями мембран. У пациентов с болезнью Хантингтона, по сравнению с нормальными людьми, в мембранах эритроцитов и базальных ганглиях наблюдалось значительное повышение уровня и активности (10-кратное увеличение) Na/K-АТФазы (Butterfield DA, Oeswein JQ, Prunty ME, Hisle KC, Markesbery WR, Increased sodium, potassium adenosine triphosphatase activity in erythrocyte membranes in Huntington's disease. Ann Neurology, 4:60-62, 1978) и в мембранах фибробластов, полученных из кожи пациентов с болезнью Хантингтона (Schroeder F, Goetz IE, Roberts E, Membrane anomalies in Huntington's disease fibroblasts. J. Neurochem. 43: 526-539, 1984).
Болезнь Альцгеймера является одной из форм деменции - нейродегенеративного заболевания, которое разрушает интеллектуальные функции мозга (память, ориентация, способность к счету и т.п.), но при этом двигательные функции обычно сохраняются. При болезни Альцгеймера постепенно ухудшаются умственные способности, вызывая потерю памяти, спутанность сознания, дезориентацию, нарушение способности принимать взвешенные решения и другие проблемы, которые могут повлиять на способность человека выполнять нормальную повседневную деятельность. Тип, тяжесть, последовательность и развитие психических изменений сильно различаются у субъектов. Для болезни Альцгеймера не известно никакого лечения и никакого способа для того, чтобы замедлить ее прогрессирование. У некоторых людей на ранней или средней стадии болезни, лекарства, такие как такрин, могут облегчить некоторые когнитивные симптомы. Арисепт (донепезил) и экселон (ривастигмин) являются обратимыми ингибиторами ацетилхолинэстеразы, которые показаны для лечения легкой и умеренной деменции, протекающей по типу болезни Альцгеймера. Эти препараты (называемые ингибиторами холинэстеразы) работают за счет увеличения уровня мозгового нейромедиатора ацетилхолина, помогая восстанавливать связи между клетками мозга. Некоторые лекарства могут оказать помощь для контроля поведенческих симптомов, такие как бессонница, возбуждение, беспорядочные движения, тревога и депрессия. Эти терапевтические приемы направлены на то, чтобы сделать более комфортной жизнь пациента. Хотя не известно никаких лекарств, которые способны вылечить болезнь Альцгеймера, ингибиторы холинэстеразы могут улучшить повседневную жизнедеятельность или уменьшить поведенческие проблемы. В настоящее время проходящие испытания препараты для лечения болезни Альцгеймера включают эстрогены, нестероидные противовоспалительные средства, витамин Е, селегилин (карбекс, элдеприл) и продукт из растения гинкго билоба.
Nerium oleander представляет собой декоративное растение, которое широко распространено в субтропической Азии, на юго-западе США и в районе Средиземного моря. Его медицинские и токсикологические свойства известны давно. Оно использовалось, например, для лечения геморроя, язв, проказы, при укусах змей и даже для индукции аборта. Олеандрин, важный, но не единственный компонент экстракта олеандра, представляет собой сердечный гликозид.
2
Экстракция гликозидов из растений видов Nerium предоставила фармакологически/терапевтически активные ингредиенты из Nerium oleander. Среди них присутствуют олеандрин, нериифолин (нерифолин) и другие соединения, представляющие собой сердечные гликозиды. Экстракты олеандрина, полученные из Nerium oleander экстракцией горячей водой, продаются под торговой маркой ANVIRZEL™, и они содержат экстракт из Nerium oleander, полученный при помощи горячей воды, в концентрированном виде или порошкообразной форме. Фаза I испытаний экстракта из олеандра, полученного с помощью горячей воды (т.е. препарата Anvirzel™), была завершена (Mekhail et al., Am. Soc. Clin. Oncol., vol. 20, p. 82b, 2001). Был сделан вывод, что экстракт олеандра можно безопасно вводить в дозах до 1,2 мл/м/день, при этом эта доза обеспечивает около 57 мкг олеандрина в день. Не было выявлено дозы, ограниченной токсичностью.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение предоставляет способ лечения неврологического патологического состояния, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, композиции, содержащей экстракт из видов Nerium или видов Thevetia в количестве, эффективном для лечения указанного неврологического состояния. Изобретение предоставляет варианты выполнения, в которых фракция экстракта или субфракция фракция экстракта используется вместо нефракционированного экстракта, и где фракция или субфракция экстракта не включает олеандрин и нериифолин.
В одном аспекте, настоящее изобретение предоставляет способ лечения неврологического заболевания или расстройства у субъекта, нуждающегося в этом, композицией, содержащей экстракт из видов Nerium или видов Thevetia, где способ включает:
определение того, что субъект имеет неврологическое заболевание или расстройство, и
назначение субъекту введения композиции, содержащей экстракт из видов Nerium или видов Thevetia.
Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения включают воплощения, в которых: 1) субъекту назначена и вводится терапевтически релевантная доза композиции; 2) композиция вводится субъекту согласно предписанного режима дозирования; 3) экстракт содержит один или несколько терапевтически эффективных агентов, экстрагированных из видов Nerium или видов Thevetia; 4) композиция дополнительно содержит один или несколько других терапевтически эффективных агентов; 5) экстракт из видов Nerium или видов Thevetia получен экстракцией с использованием горячей воды, холодной воды, сверхкритической жидкости, органического растворителя или их комбинации; 6) экстракт не включает сердечный гликозид; 7) экстракт не включает терапевтически эффективного количества сердечного гликозида; 8) экстракт не включает олеандрин; 9) композиция содержит фракцию экстракта из видов Nerium или видов Thevetia; 10) композиция содержит фракцию экстракта из видов Nerium или видов Thevetia, где фракция была получена фракционированием экстракта с помощью жидкостной хроматографии; 11) видом Nerium является Nerium oleander и видом Thevetia является Thevetia neriifolia; 12) экстракт не включает нериифолин; 13) композиция содержит субфракцию из фракции экстракта из видов Nerium или видов Thevetia, где субфракция была получена фракционированием фракции экстракта с помощью жидкостной хроматографии, и субфракция не включает олеандрин и нериифолин; 14) экстракт из видов Nerium или видов Thevetia, если он содержит сердечный гликозид, обеспечивает улучшенный клинический ответ или клинический эффект при введении в дозированной форме субъекту, имеющему неврологическое заболевание или нарушение, по сравнению с чистым сердечным гликозидом, вводимым субъекту в схожей дозированной форме и в той же дозе, в части сердечного гликозида; или 15) имеет место их комбинация.
Настоящее изобретение также относится к способу лечения неврологического патологического состояния у субъекта, нуждающегося в этом, включающего:
определение того, является ли или нет неврологическое патологическое состояние у субъекта болезнью Альцгеймера, болезнью Хантингтона, инсультом или другим неврологическим патологическим состоянием;
назначение введения экстракта из видов Nerium или видов Thevetia;
введение начальной дозы экстракта субъекту в соответствии с предписанным начальным режимом дозирования в течение определенного периода времени;
периодическое определение адекватности клинического и/или терапевтического ответа у субъекта на лечение экстрактом; и
если клинический и/или терапевтический ответ субъекта является адекватным, то лечение экстрактом продолжают по мере необходимости, пока желаемый клинический результат не будет достигнут; или,
если клинический и/или терапевтический ответ у субъекта является неадекватным на начальную дозу и начальный режим дозирования, то дозу увеличивают или понижают до тех пор, пока желаемый клинический и/или терапевтический ответ у субъекта не будет достигнут.
Настоящее изобретение также относится к способу предотвращения или уменьшения вероятности возникновения неврологического патологического состояния у группы субъектов, имеющих риск его возникновения, где способ включает:
введение эффективной дозы экстракта из видов Nerium или видов Thevetia на постоянной основе в течение длительного периода времени одному или нескольким субъектам в группе субъектов с повышенным риском возникновения неврологического патологического состояния, такого как болезнь Альцгеймера, болезнь Хантингтона, инсульт и других неврологических патологических состояний, предотвращая или снижая тем самым уровень заболеваемости неврологическим патологическим состоянием в группе субъектов.
Настоящее изобретение включает варианты выполнения, в которых: а) способ дополнительно включает назначение введения экстракта одному или нескольким субъектам; b) способ дополнительно включает введение эффективной дозы экстракта субъекту в соответствии с предписанным режимом дозирования в течение определенного периода времени; с) способ дополнительно включает периодическое определение адекватности клинического и/или терапевтического ответа у одного или нескольких субъектов на лечение экстрактом; d) если клинический и/или терапевтический ответ у субъекта является адекватным, то способ дополнительно включает продолжение лечения экстрактом по мере необходимости, пока желаемый итоговый клинический результат не будет достигнут; е) если клинический и/или терапевтический ответ у субъекта на начальную дозу и начальный режим дозирования является неадекватным, то способ дополнительно включает увеличение или уменьшение дозы, до тех пор, пока желаемый клинический и/или терапевтический ответ у субъекта не будет достигнут; f) экстракт вводят множеству субъектов в группе; g) постоянная основа представляет собой выполнение операций ежедневно, через день, каждый второй день, каждый третий день, каждый четвертый день, каждый пятый день, каждый шестой день, еженедельно, через одну неделю, раз в две недели, раз в три недели, ежемесячно, раз в два месяца, два раза в месяц, через один месяц, раз в два месяца, ежеквартально, через один квартал, раз в три месяца, один раз в сезон, один раз в полгода и/или ежегодно; h) длительный период составляет одну или несколько недель, один или несколько месяцев, один или несколько кварталов и/или один год или более; i) эффективную дозу вводят один или несколько раз в день; j) способ дополнительно включает идентификацию группы субъектов с риском возникновения неврологического патологического состояния, такого как болезнь Альцгеймера, болезнь Хантингтона, инсульт, или другого неврологического патологического состояния; k) группа субъектов с риском возникновения неврологического патологического состояния характеризуется зрелым возрастом субъектов, наличием неврологических патологических состояний в семейной истории, генетической предрасположенностью к возникновению неврологического патологического состояния, наличием и экспрессией гена ApoE4 у субъекта, принадлежностью к женскому полу (болезнь Альцгеймера у женщин встречается в два раза чаще, чем у мужчин), наличием сердечно-сосудистых заболеваний (например, высокого кровяного давления и высокого уровня холестерина), наличием сахарного диабета (особенно типа 2, или форм этого заболевания, полученных во взрослом возрасте), наличием синдрома Дауна, наличием черепно-мозговой травмы, низким уровнем начального образования, курением, чрезмерным употреблением алкоголя и/или наркотиков; l) экстракт не включает терапевтически эффективного количества сердечного гликозида; m) экстракт не включает сердечный гликозид; или n) имеет место их комбинация.
Настоящее изобретение также относится к отсроченному во времени способу лечения инсульта у субъекта, включающего:
введение начальной дозы экстракта из видов Nerium или видов Thevetia в соответствии с начальным режимом дозирования в течение отсроченного периода времени после того, как субъект имел инсульт;
определение адекватности клинического и/или терапевтического ответа у субъекта на лечение экстрактом; и
если клинический и/или терапевтический ответ у субъекта является адекватным, то лечение экстрактом продолжают по мере необходимости, пока желаемый клинический результат не будет достигнут; или,
если клинический и/или терапевтический ответ у субъекта на начальную дозу и начальный режим дозирования является неадекватным, то дозу увеличивают или уменьшают до тех пор, пока желаемый клинический и/или терапевтический ответ у субъекта не будет достигнут.
Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения включают варианты выполнения, где: 1) отсроченный период составляет 10 часов или менее, 8 часов или менее, 6 часов или менее, 4 часа или менее, 3 часа или менее, 2 часа или меньше, 1 час или менее, 45 минут или менее, 30 минут или менее, 20 минут или менее, или 10 минут или менее; 2) определение адекватности клинического и/или терапевтического ответа у субъекта осуществляется путем определения наличия любой слабости мышц лица, руки и/или ноги на одной стороне тела, онемения лица, руки и/или ноги на одной стороне тела, отсутствия способности понимания устной речи, отсутствия способности говорить или говорить ясно, отсутствия способности писать, наличия головокружения и/или неустойчивой походки, двоения в глазах и необычно сильной головной боли; или 3) имеет место их комбинация.
Настоящее изобретение также относится к применению экстракта из видов Nerium или видов Thevetia для изготовления лекарственного средства для лечения неврологического патологического состояния у субъекта. В некоторых вариантах выполнения изобретения, изготовление таких лекарственных средств включает: получение экстракта из видов Nerium или видов Thevetia, в том числе дозы экстракта из видов Nerium или видов Thevetia или их фракций в фармацевтической дозированной форме; и упаковки фармацевтической дозированной формы. Изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей экстракт из видов Nerium или видов Thevetia для лечения неврологического патологического состояния у субъекта. В некоторых вариантах выполнения изобретения, изготовление может быть выполнено, как описано в международной заявке РСТ No. PCT/US06/29061, поданной 26 июля 2006 г., в патенте США No. 7402325 от 28 июля 2005 и заявке на патент США No. 12/019435, поданной 24 января 2008, полные описания которых включены сюда путем ссылки. Производство также может включать одну или несколько дополнительных стадий, таких как: доставку упакованной дозированной формы поставщику (для розничной, оптовой торговли и/или дистрибьютору), продажа или иное предоставление упакованной дозированной формы субъекту, имеющему неврологическое патологическое состояние; включение в состав изделия этикетки и вкладыша в упаковку лекарственного средства, которые содержат инструкции по применению, режиму дозирования, введению, содержанию ингредиентов и токсикологический профиль для дозированной формы. В некоторых вариантах выполнения изобретения, лечение неврологического патологического состояния включает: определение того, что субъект имеет неврологическое заболевание или расстройство; назначение введения экстракта или его фракции субъекту в соответствии с режимом дозирования; введение субъекту одной или нескольких фармацевтических дозированных форм, содержащих экстракт, где одну или несколько фармацевтических дозированных форм вводят в соответствии с режимом дозирования.
Настоящее изобретение также относится к экстракту из видов Nerium или видов Thevetia, или композиции, т.е. к фармацевтической композиции или к дозированной форме, содержащей экстракт из видов Nerium или видов Thevetia для лечения неврологического патологического состояния. В некоторых вариантах осуществления изобретения экстракт может быть получен из видов Nerium или видов Thevetia, как описано здесь или в патенте США No. 7402325, в международной заявке РСТ No. PCT/US06/29061, в заявке на патент США No. 12/019435 или в работе Newman et al. (Mol. Interven. (2008), 8, 36-49), полное содержание которых включено в настоящее описание посредством ссылки.
Настоящее изобретение относится к способу получения фракции экстракта из видов Nerium или видов Thevetia, включающий: экстрагирование массы, содержащую виды Nerium или виды Thevetia, с получением нефракционированного экстракта из нее, где экстракт содержит один или несколько фармакологически активных компонентов, для лечения неврологического патологического состояния; и фракционирование нефракционированного экстракта с получением двух или более фракций, в которой, по меньшей мере, одна фракция содержит один или несколько фармакологически активных компонентов, не являющимися сердечными гликозидами. В некоторых вариантах осуществления изобретения а) по меньшей мере, одна фракция не включает сердечный гликозид; b) по меньшей мере, одна фракция дополнительно содержит сердечный гликозид; с) экстракция проводится с помощью сверхкритической жидкости, воды, органического растворителя или их комбинации; d) фракционирование проводится с помощью жидкостной хроматографии или экстракции растворителем; е) по меньшей мере одна фракция не включает олеандрин и нериифолин; или f) используется их комбинация.
Настоящее изобретение также относится к способу фракционирования экстракта из видов Nerium или видов Thevetia для того, чтобы получить одну или несколько терапевтически эффективных фракций его. Способ включает: а) получение экстракта из видов Nerium или видов Thevetia; b) фракционирование экстракта для получения двух или нескольких различных фракций экстракта, где первая фракция экстракта содержит один или несколько фармакологически активных агентов, которые не являются сердечными гликозидами, и не включает сердечный гликозид (олеандрин и нериифолин), и вторая фракция экстракта содержит один или несколько сердечных гликозидов и один или несколько фармакологически активных агентов, которые не являются сердечными гликозидами. Фракционирование также может быть выполнено, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления изобретения, первую или вторую фракцию экстракта подвергают дальнейшему фракционированию для получения двух или более различных субфракций, где первая субфракция содержит один или несколько стероидов и вторая субфракция содержит один или несколько тритерпенов. В некоторых вариантах осуществления изобретения, фракционирование осуществляют с помощью жидкостной хроматографии с неподвижной фазой и подвижной фазой.
Настоящее изобретение также относится к композиции, содержащей фракцию экстракта, полученного из видов Nerium или видов Thevetia, где фракция была получена фракционированием экстракта, полученного из видов Nerium или видов Thevetia. В некоторых вариантах осуществления изобретения, фракция экстракта содержит один или несколько стероидов, один или несколько тритепенов и, не обязательно, не включает сердечных гликозидов (олеандрина и нериифолина).
Настоящее изобретение также относится к композиции, содержащей субфракцию из фракции экстракта, полученного из видов Nerium или видов Thevetia, где субфракция была получены дополнительным фракционированием фракции экстракта, полученного из видов Nerium или видов Thevetia. В некоторых вариантах осуществления изобретения, субфракция из фракции экстракта содержит один или несколько стероидов, сердечных гликозидов, агликонов, связанных с сердечными гликозидами, например, олеандригенин, карденолиды или тритерпеноиды, и один или несколько тритепенов. В некоторых вариантах осуществления изобретения, субфракция из фракции экстракта содержит один или несколько тритерпенов и не включает стероиды. Каждая субфракция независимо необязательно не включает сердечных гликозидов (олеандрин и нериифолин).
В некоторых вариантах осуществления изобретения: а) экстракт дополнительно содержит, по меньшей мере, два фармакологически активных агента, полученных (экстрагированных) из видов Nerium или видов Thevetia; b) по меньшей мере два фармакологически активных агента, действующих аддитивно или синергически для получения терапевтического эффекта экстракта, когда экстракт вводят субъекту; c) ни один из по меньшей мере двух фармакологически активных агентов не является сердечным гликозидом; и/или d) по меньшей мере, два фармакологически активных агента выбраны из группы, включающей сердечные гликозиды, агликоны, связанные с сердечными гликозидами, например олеандригенин, карденолиды или тритерпеноиды.
В некоторых вариантах осуществления изобретения: 1) сердечный гликозид выбран из группы, состоящей из олеандрина, одорозида, нериталозида, уабаина, буфалина, дигитоксина, цинобуфаталина, цинобуфагина и резибуфогенина; 2) экстракт находится в фармацевтическом препарате или композиции; 3) экстракт получен из массы олеандра или массы олеандролистных растений; 4) растительная масса включает виды Nerium, такие как Nerium oleander, или виды Thevetia, такие как Thevetia neriifolia или Thevetia Peruviana (иначе известный как желтый олеандр); 5) экстракт получен экстракцией с использованием сверхкритической жидкости (SCF), необязательно в присутствии модификатора; 6) сердечный гликозид представляет собой олеандрин; 7) экстракт получен экстракцией с использованием горячей воды, холодной воды, органического растворителя, или водной экстракцией с использованием органического растворителя.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, экстракт (или фракция, или субфракция) содержит полисахарид в количестве менее 1% по массе, менее 0,5% по массе, менее 0,1% по массе, менее 0,05% по массе или менее 0,01% по массе. В некоторых вариантах, экстракт (или фракция, или субфракция) содержит бетулин (урс-12-ен-3β,28-диол); 28-норурс-12-ен-3β-ол; урс-12-ен-3β-ол; 3β,3β-гидрокси-12-олеанен-28-оевую кислоту; 3β,20α-дигидроксиурс-21-ен-38-оевую кислоту; 3β,27-дигидрокси-12-урсен-38-оевую кислоту; 3β,13β-дигидроксиурс-11-ен-28-оевую кислоту; 3β,12α-дигидроксиолеанан-28,13β-олид и 3β,27-дигидрокси-12-олеанан-28-оевую кислоту. В некоторых вариантах осуществления изобретения, экстракт (или фракция, или субфракция) содержит один или несколько предшественников сердечных гликозидов, выбранных из гликонов, составляющих сердечный гликозид. В некоторых вариантах осуществления изобретения, гликон выбран из группы, состоящей из глюкозида, фруктозида и глюкуронида. В некоторых вариантах осуществления изобретения, экстракт (или фракция, или субфракция) включает олеандригенин, урсоловую кислоту, бетулиновую кислоту, одорозид, нериталозид, олеаноловую кислоту, один или несколько тритерпенов, а также полисахарид, в количестве менее 0,5% по массе.
В некоторых вариантах выполнения изобретения, субъект, имеющий неврологическое патологическое состояние, т.е. субъект, нуждающийся в лечении, является частью группы таких субъектов. Настоящее изобретение относится к способу улучшения клинического состояния статистически значимого числа субъектов в группе субъектов, имеющих неврологическое патологическое состояние, где способ включает: введение субъектам в группе экстракта из видов Nerium или видов Thevetia или композиции, содержащей экстракт из видов Nerium или видов Thevetia; и определение клинического статуса субъектов. В некоторых вариантах осуществления изобретения статистически значимое количество субъектов составляет по меньшей мере менее 5% группы.
В некоторых вариантах изобретения, неврологическое патологическое состояние представляет собой болезнь Альцгеймера, болезнь Хантингтона, инсульт, таупатию или другое неврологическое патологическое состояние, такое, как описано здесь. Лекарственное средство может быть изготовлено путем включения экстракта в фармацевтическую дозированную форму, содержащую один или несколько фармацевтически приемлемых наполнителей.
Лечение субъекта экстрактом или композицией, содержащей экстракт, продолжается по мере необходимости. Дозы или режим дозирования можно регулировать по мере необходимости, пока пациент не достигнет желаемого клинического результата(ов), такого как уменьшение или облегчение конкретных неврологических симптомов, связанных с заболеванием. Определение адекватности клинического и/или терапевтического ответа может быть осуществлено клиницистом, знакомым с неврологическим патологическим состоянием, требующего лечения.
В некоторых вариантах выполнения изобретения, неврологическое патологическое состояние выбирается из группы, состоящей из неврологического заболевания, неврологического расстройства, таупатии и инсульта. В некоторых вариантах осуществления изобретения неврологическое заболевание представляет собой нейродегенеративное заболевание. В некоторых вариантах осуществления изобретения нейродегенеративное заболевание выбирается из группы, состоящей из болезни Хантингтона, болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, бокового амиотрофического склероза, губчатой энцефалопатии крупного рогатого скота, рассеянного склероза, диабетической невропатии, аутизма и юношеского нейронального цероидного липофусциноза. В некоторых вариантах выполнения изобретения, инсульт представляет собой инсульт-опосредованное ишемическое повреждение. В некоторых вариантах осуществления изобретения, неврологическое патологическое состояние представляет собой таупатию, которая представляет собой нейродегенеративное заболевание, имеющее этиологию, связанную с дисбалансом соотношения Tau3R/Tau4R у субъекта. Таупатии представляют собой класс нейродегенеративных заболеваний, связанных с патологической агрегацией тау-белков в мозге человека. В некоторых вариантах осуществления изобретения, таупатия представляет собой синдром Дауна, болезнь Пика, кортикобазальную дегенерацию, некоторые варианты прионного заболевания, болезнь Альцгеймера, прогрессирующий супрануклеарный паралич или лобно-височную деменцию. Отдельные стадии способов по изобретению можно проводить для отдельных объектов или в пределах одного объекта.
В некоторых вариантах выполнения изобретения, нейроны представлены in vitro, ex vivo или in vivo. В некоторых вариантах осуществления изобретения, нейроны представляют собой СА-1 нейроны.
1
В некоторых вариантах выполнения, настоящее изобретение предоставляет экстракт из видов Nerium или видов Neriifolia, или его фракцию, или субфракцию, имеющих H-ЯМР спектр такой, как описано здесь. В некоторых вариантах выполнения, настоящее изобретение предоставляет экстракт из видов Nerium или видов Neriifolia, или его фракцию, или субфракцию, проявляющих при введении субъекту терапевтическую активность, как описано выше. В некоторых вариантах выполнения, настоящее изобретение предоставляет экстракт из видов Nerium или видов Neriifolia, или его фракцию, или субфракцию, имеющих хроматограмму, полученную при высокоэффективной жидкостной хроматографии, такую как описано здесь. В некоторых вариантах выполнения, в способах по изобретению используется экстракт, его фракция или субфракция, как описано здесь. В некоторых вариантах осуществления, композиции по изобретению содержат экстракт, его фракцию или субфракцию, как описано здесь.
Настоящее изобретение включает все комбинации аспектов, варианты осуществления и субварианты осуществления изобретения, которые описаны здесь. Если не указано иное, то термин "экстракт" может относиться к нефракционированному экстракту или к фракционированному экстракту, т.е. к фракции экстракта или к субфракции экстракта, т.е. к субфракции из фракции экстракта.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Чертежи, представленные ниже, являются частью настоящего описания, и они описывают иллюстративные варианты осуществления настоящего изобретения. Специалист в данной области, в свете этих чертежей и описания, приведенного здесь, сможет реализовать изобретение на практике без излишнего экспериментирования.
Фиг. 1А показывает данные "концентрация-ответ", полученные при сравнительной оценке олеандрина в условиях отсутствия кислорода или недостатка глюкозы (OGD) и контроля, по нейропротекции инсульта на основе анализа срезов мозга (Пример 8), где количество здоровых корковых нейронов определяется после 5-6 минут недостатка кислорода и глюкозы (OGD=инсульт), в присутствии или в отсутствие олеандрина.
Фиг. 1B показывает результаты анализа "концентрация-ответ" для нефракционированного SCF экстракта Nerium oleander по нейропротекции инсульта на основе анализа срезов мозга, как описано здесь (Пример 8), где отсутствие кислорода или недостаток глюкозы используется в качестве контроля.
На Фиг. 2А-2С показаны результаты сравнительной оценки олеандрина по отношению к нефракционированному SCF экстракту из Nerium oleander по нейропротекции болезни Альцгеймера на основе анализа срезов мозга (Пример 9), где количество здоровых нейронов коры мозга определяется после ΑΡΡ/Αβ-индуцированной дегенерации в отсутствие или в присутствии различных количество этих агентов.
Фиг. 3A-3D показаны результаты эксперимента, выполненного дважды, по сравнительной оценке олеандрина (Фиг.3А-3В) (Фиг. 3C-3D) по нейропротекции болезни Хантингтона при анализе кортико-стриарной совместной культуры нейронов (Пример 10), где процент спасения, по сравнению с контролем, корковых нейронов по отношению к стриальным нейронам, трансфицированных мутантной формой белка Хантингтона (htt), определяют в отсутствие или в присутствии различных количеств олеандрина.
Фиг. 4A-4E показывает результаты по нейропротекции инсульта на основе анализа срезов мозга, как описано здесь, где SCF экстракт, содержащий олеандрин, был фракционирован с помощью жидкостной хроматографии (Пример 13), и пять различных фракций (описанных ниже) подвергались этому анализу (Пример 15): Фракция O-H (Фиг. 4А), фракция О-2 (Фиг. 4В), фракция О-3 (Фиг. 4C), фракции О-4 (Фиг. 4D), фракция О-5 (Фиг. 4E).
Фиг. 5 показывает результаты "концентрация-ответ" по нейропротекции инсульта на основе анализа срезов мозга (Пример 15) для фракции О-4 SCF экстракта из Nerium oleander по отношению к исходному, нефракционированному SCF экстракту из Nerium oleander (PBI или PBI-05204).
Фиг. 6 показывает результаты сравнительной оценки фракции (О-4 или О-4А) SCF экстракта из Nerium oleander по сравнению с необработанным контролем (клетки не были трансфицированы ΑΡΡ/Αβ) в случае болезни Альцгеймера при анализе на основе APP (Пример 11), где количество здоровых нейронов коры мозга определяется после ΑΡΡ/Αβ-индуцированной дегенерации в отсутствие или в присутствии различных количество этих агентов.
Фиг. 7 показывает результаты сравнительной оценки фракции (О-4) SCF экстракта из Nerium oleander по сравнению с необработанным контролем (клетки не были трансфицированы ΑΡΡ/Αβ) в случае болезни Альцгеймера при анализе на основе Tau4R (Пример 12), где количество здоровых и поврежденных нейронов коры мозга определяются после Tau4R, в отсутствии или в присутствии различных количеств этих веществ.
Фиг. 8A-8D показывают хроматограммы ВЭЖХ-анализа фракций, полученных согласно Примеру 13.
Фиг. 9A-9I показывают спектры Н-ЯМР для различных компонентов, присутствующих во фракции О-4 SCF экстракта из Nerium oleander. Фиг. 9 изображает спектр Н-ЯМР фракции О-4 перед субфракционированием в соответствии с Примером 17. Фиг. 9B-9I изображают показывают спектры Н-ЯМР для различных субфракций, полученных из О-4 фракции путем хроматографии на силикагеле в соответствии с Примером 17.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к способу лечения неврологического заболевания путем введения эффективной дозы экстракта из видов Nerium или видов Thevetia субъекту, нуждающемуся в этом. Экстракт вводят в соответствии с режимом дозирования, который лучше всего подходит для субъекта, где пригодность дозы и режима дозирования определяют клинически в соответствии с обычной клинической практикой и клиническими результатами лечения неврологического патологического состояния, подлежащего лечению.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, нейродегенеративное расстройство или неврологические патологическое состояние, подлежащее лечению, имеет этиологию, связанную с сверхэкспрессией тау-белков и/или с дисбалансом в соотношении Tau3R/Tau4R у субъекта. Такое состояние называется таупатией. Примеры таупатий включают синдром Дауна, болезнь Пика, некоторые варианты прионного заболевания, болезнь Альцгеймера, прогрессирующий супрануклеарный паралич или лобно-височную деменцию, кортикобазальную дегенерация, комплексную паркинсонизм деменцию с синдромом Гуама, деменцию с аргирофильными зернами, болезнь Ниманна-Пика типа С и деменцию боксеров.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, нейродегенеративное расстройство или неврологические патологического состояние, подлежащее лечению, имеет этиологию, связанную с аномальным или атипичным протеолизом бета-амилоидного белка-предшественника, с накоплением бета-амилоидного белка в синапсах нейронов, с образованием амилоидных фибрилл в синапсах нейронов, или с образованием амилоидных бляшек в синапсах нейронов. Примерами таких расстройств или патологических состояний является болезнь Альцгеймера. Субъект, которого подвергают лечению в соответствии с изобретением, проявляет терапевтический ответ. Термин "терапевтический ответ" означает, что субъект, страдающий от заболевания или расстройства, в результате обработки экстрактом будет иметь, по меньшей мере, одно из следующих клинических преимуществ: облегчение течения заболевания или расстройства, снижение случаев возникновения и тяжести симптомов, связанных с заболеванием или расстройством, частичную ремиссию заболевания или нарушения, полную ремиссию заболевания или нарушения, или увеличение времени до момента прогрессирования заболевания. Другими словами, терапевтический эффект может быть полным или частичным терапевтическим ответом (реакцией).
Терапевтический эффект также может быть описан как такой, когда качество жизни пациента, страдающего от нейродегенеративного заболевания, улучшается. Улучшение качества жизни может происходить, например, путем снижения случаев возникновения, частоты и тяжести симптомов, связанных с заболеванием (например, таких как тремор, непроизвольные движения мышц, потеря или частичная потеря нервно-мышечной координации, сохранение памяти и т.п.).
"Предотвращение вероятности возникновения неврологического патологического состояния у группы субъектов, имеющих риск его возникновения" означает, что неврологическое патологическое состояние не возникнет в течение заданного периода времени в демографически заданной группе субъектов, которые имеют риск возникновения у них неврологического патологического состояния. Предотвращение в течение заданного периода времени происходит в результате того, что субъектам в этой группе вводили экстракт по настоящему изобретению. В качестве одного примера, когда экстракт или композицию, содержащую экстракт, вводят в течение заданного периода времени субъектам из группы субъектов, имеющих риск возникновения инсульта, то у субъектов, в течение заданного периода времени, инсульт не будет возникать. В частности, когда композицию, содержащую экстракт, вводят на постоянной основе в течение периода от одного года субъектам, имеющих риск возникновения болезни Альцгеймера или любого заболевания, связанного с тау-патологией, то у субъектов в этой группе не проявятся симптомы, связанные с болезнью Альцгеймера в течение этого одного года.
"Уменьшение вероятности возникновения неврологического патологического состояния у группы субъектов, имеющих риск его возникновения" связано по значению с "предотвращением возникновения", за исключением того, что "снижение вероятности возникновения" допускает возникновение неврологического патологического состояния в демографически заданной группе субъектов, но с вероятностью (частотой) возникновения или степенью тяжести, сниженной по сравнению с иной демографически аналогичной заданной группе субъектов с риском возникновения патологии, которой не вводили композицию, содержащую экстракт, в соответствии с изобретением.
Как используется здесь, "время до момента прогрессирования" является периодом, сроком или продолжительностью времени, от момента, когда болезнь была диагностирована (или начато лечение), до момента, когда состояние, вызванное болезнью, начинает ухудшаться. Это период времени, в течение которого у субъекта не происходит дальнейшего прогрессирования заболевания, и этот период времени заканчивается, когда болезнь начинает прогрессировать снова. Прогрессирование заболевания определяется "началом" проявления патологий неврологического заболевания у субъекта, до лечения или в начале терапии. Например, состояние неврологического здоровья у субъекта определяют до лечения или во время начала терапии. Затем субъекту начинают вводить экстракт, и периодически контролируют состояние неврологического здоровья. В некоторый более поздний момент времени симптомы неврологического состояния могут ухудшиться, что указывает на прогрессирование заболевания и конец "времени до начала прогрессирования заболевания». Период времени, в течение которого болезнь не прогрессировала, или в течение которого уровень или тяжесть заболевания не ухудшается, является "временем до момента прогрессирования".
Режим дозирования включает терапевтически релевантную дозу (или эффективную дозу) экстракта, который вводится в соответствии со схемой дозирования. Таким образом, терапевтически релевантная доза представляет собой терапевтическую дозу, при которой наблюдается терапевтический ответ заболевания или расстройства при лечении с помощью экстракта, и при которой экстракт можно вводить субъекту без чрезмерных нежелательных или вредных побочных эффектов. Терапевтически релевантная доза не является летальной для субъекта, даже если она может вызвать некоторые побочные эффекты у пациента. Она представляет собой дозу, при которой уровень клинической пользы для субъекта, которому вводят экстракт, превышает уровень вредных побочных эффектов, испытываемых субъектом из-за введения экстракта. Терапевтически релевантная доза будет варьировать от субъекта к субъекту в зависимости от различных известных фармакологических, фармакодинамических и фармакокинетических причин. Тем не менее, терапевтически релевантная доза обычно находится в диапазоне от 0,1 до 100 мкг экстракта в день, при этом экстракт может быть в твердой, жидкой или полутвердой форме. Как известно в данной области техники, фактическое количество фармакологически активного агента, которое обеспечивает целевой терапевтический результат у субъекта, может варьироваться от субъекта к субъекту в соответствии с основными принципами фармации.
Терапевтически релевантная доза может вводиться в соответствии с любым режим дозирования, обычно используемым при лечении неврологических или нейродегенеративных заболеваний или расстройств. Терапевтически релевантную дозу по схеме дозирования можно вводить один раз, два раза, три или более раз в день. Ее можно вводить через день, каждый третий день, каждый четвертый день, каждый пятый день, два раза в неделю, один раз в неделю, раз в две недели, раз в три недели, каждые четыре недели, ежемесячно, раз в два месяца, два раза в месяц, раз в три месяца, раз в четыре месяца, раз в полгода, ежегодно или путем комбинации любого из вышеуказанных режимов, с целью достижения подходящего режима дозирования. Например, терапевтически релевантную дозу можно вводить один раз в день в течение одной или нескольких недель.
Приведенные ниже примеры содержат доказательные данные об эффективности экстракта в случае неврологических патологических состояний, таких как неврологические заболевания, неврологические расстройства и инсульт. Пример 3 поясняет способ лечения болезни Альцгеймера при помощи экстракта из видов Nerium или композиции на его основе, экстракта из видов Thevetia или композиции на его основе, или при помощи их комбинации с одним или несколькими другими терапевтическими агентами. Пример 4 поясняет способ лечения болезни Хантингтона при помощи экстракта или комбинации экстракта с одним или несколькими другими терапевтическими агентами. Пример 5 поясняет способ лечения ишемического повреждения мозга, опосредованного и неопосредованного инсультом, при помощи экстракта или комбинации экстракта с одним или несколькими другими терапевтическими агентами.
В целом, субъекта, который имеет неврологическое патологическое состояние, подвергают лечению следующим образом. Субъекта с неврологическим патологическим состоянием подвергают обследованию для определения того, является или нет неврологическое патологическое состояние болезнью Альцгеймера, болезнью Хантингтона, инсультом или другим неврологическим патологическим состоянием. Если субъект имеет положительный диагноз, то назначают введение экстракта или композиции, содержащей экстракт. Начальные дозы экстракта или композиции, содержащей экстракт, вводят субъекту в соответствии с предписанным режимом дозирования в течение предписанного периода времени. Периодически контролируют клиническую реакцию субъекта и уровень терапевтического ответа у субъекта. Если уровень терапевтической реакции на одну дозу слишком низкий, то, в соответствии с предопределенной схемой увеличения доз, увеличивают дозу, пока у субъекта не будет достигнут желаемый уровень терапевтического ответа. Если у субъекта проявляются нежелательные побочные эффекты или уровень побочных эффектов является неприемлемым, то дозу понижают до тех пор, пока у субъекта не будет достигнут желаемый баланс между уровнем терапевтического ответа и профилем побочных эффектов. Лечение субъекта экстрактом или композицией продолжают по мере необходимости. Дозы или режим дозирования можно регулировать по мере необходимости, пока у пациента не будет достигнут желаемый клинический результат(ы), такой как прекращение болезни как таковой, снижение уровня симптомов, ассоциированных с заболеванием и/или снижение прогрессирования заболевания.
Экстракт, в частности нефракционированный экстракт, содержит одно или несколько фармакологически активных соединений. Некоторые из этих соединений еще не идентифицированы и некоторые из них могут представлять собой олеандрин или другие сердечные гликозиды, олеазид, олеандригенин, нериталозид, одорозид (Wang X, Plomley JB, Newman RA and Cisneros A. LC/MS/MS analyses of an oleander extract for cancer treatment, Analytical Chem. 72: 3547-3552, 2000) и другие растительные материалы. Нефракционированный SCF экстракт, полученный способами с использованием сверхкритической жидкости (SCF), обычно теоретически содержит от 0,9% до 2,5% по массе олеандрина. Были получены SCF экстракты, содержащие варьирующее количество олеандрина. В одном варианте осуществления изобретения, SCF экстракт содержал приблизительно 2% по массе олеандрина.
Экстрагируемые неидентифицированные компоненты экстракта из видов Nerium или видов Thevetia могут включать по меньшей мере один фармакологически активный компонент (не являющийся сердечным гликозидом), который вносит свой вклад в эффективность SCF экстракта или его фракции. Два или более фармакологически активных экстрагируемых компонентов могут действовать аддитивно или синергически, обеспечивая наблюдаемую эффективность. Другими словами, экстракт из видов Nerium или видов Thevetia по изобретению содержит один или несколько фармакологически активных компонентов, которые не являются сердечными гликозидами, при этом один или несколько сердечных гликозидов могут быть дополнительно включены в экстракт. Экстракт может быть разделен на различные фракции, при этом некоторые из них содержат сердечные гликозиды, один или несколько фармакологически активных компонентов, которые не являются сердечными гликозидами, или они содержат их комбинацию. Кроме того, каждая фракция экстракта может быть дополнительно разделена на две или несколько различных субфракций.
Доказательные результаты о наличии в SCF экстракте одного или нескольких фармакологически активных компонентов, иных, чем олеандрин, был получены путем сравнения кривых "концентрация-ответ" для раствора, содержащего чистый олеандрин по сравнению с раствором, содержащим SCF экстракт. Фиг. 1А показывает результаты анализа "концентрация-ответ" для раствора, содержащего чистый олеандрин по нейропротекции инсульта на основе анализа срезов мозга, как описано в Примере 8. Концентрация олеандрина в растворе изменялась от 0,0069 до 230 мкг/мл. Фиг. 1B показывает результаты анализа "концентрация-ответ" для SCF экстракта из видов Nerium, содержащего олеандрин, по нейропротекции инсульта на основе анализа срезов мозга, как описано выше (Пример 8). Полученные данные показывают, что экстракт является более эффективным, чем чистый олеандрин, и это означает, что экстракт содержит один или несколько фармакологически активных агентов, которые обеспечивают нейропротекцию.
Пример 8 дает подробное описание анализа in vitro, используемого для оценки эффективности экстракта, или его композиции, при лечении ишемического повреждения нейронов, опосредованного инсультом. Такой анализ представляет собой анализ срезов мозга при недостатке кислорода и глюкозы (OGD) который используется для того, чтобы вызвать потерю >50% здоровых нейронов в коре мозга за 24 часа. Исходный нефракционированный SCF экстракт из видов Nerium, например Nerium oleander, используется в качестве положительного контроля. Затем исходный экстракт фракционируют в соответствии с Примером 13 для того, чтобы получить фракцию экстракта из видов Nerium. Фракции анализировали в соответствии с Примерами 6, 14 и 17.
Спектр Н-ЯМР тритерпенов характеризуется наличием 7 метильных сигналов в сильном поле, сигналом, равным приблизительно 5,3 ч./млн от олефинового протона и сигналом, равным приблизительно 3,4 ч./млн от окисленного метина, наряду со многими сигналами протонов метилена и метина в сильное поле (приблизительно равными 1,0-2,5 ч./млн). Н-ЯМР спектр (Фиг. 9B-9I) показывает в качестве главных компонентов стероиды и тритерпены. Не наблюдалось никаких сигналов, характерных для значительного количества гликозидов. Не наблюдалось никаких сигналов от α,β-ненасыщенных γ- или δ-лактонов, которые характерны для сердечных гликозидов, что свидетельствует о том, что во фракции Fr-O-4 нет сердечных гликозидов или их агликонов. Н-ЯМР спектр, представленный на Фиг. 9C, соответствуют субфракции, содержащей по меньшей мере один стероид и по меньшей мере один или по меньшей мере два различных тритерпена. Н-ЯМР спектр, представленный на Фиг. 9B, соответствует субфракции, содержащей по меньшей мере два различных трипена, таких как смесь двух урсанов, и не содержащей стероидов.
Соответственно, фракция О-4 содержит по меньшей мере один тритерпен и по меньшей мере один стероид. В некоторых вариантах осуществления изобретения, фракция О-4 содержит по меньшей мере два различных тритерпена и по меньшей мере два различных стероида, или фракция содержит множество различных тритерпенов и множество различных стероидов. Фракция О-4, проанализированная в данном примере, включает терапевтически эффективное количество сердечных гликозидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения, фракция О-4 не включает сердечных гликозидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения, первая субфракция из фракции О-4 содержит по меньшей мере один стероид и по меньшей мере один тритерпен, или, по меньшей мере, два различных тритерпена, вторая субфракция содержит по меньшей мере два различных трипена и не включает стероидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения, каждая, первая субфракция и вторая субфракция не содержат сердечных гликозидов.
Фракцию О-4 тестировали на срезах мозга, подвергшихся процедуре OGD (модель инсульта) и на срезах мозга не подвергшихся процедуре OGD (т.е. контроль, не моделирующий инсульт). Эти данные показали, что фракция О-4 экстракта обеспечивает существенную нейропротекцию при использовании растворов фракции О-4 экстракта в интервале концентраций от 100 нг/мл до 1 мкг/мл, и обеспечивает еще большую нейропротекцию при использовании растворов фракции О-4 экстракта в диапазоне концентраций от 1 мкг/мл до 1 мг/мл. Соответственно, жидкая дозированная форма, содержащая от 100 нг/мл до 1 мг/мл фракции экстракта из расчета на один миллилитр жидкой лекарственной формы, должна обеспечить нейропротекцию у субъекта, которому ее вводят.
Несмотря на то, что не было сделано никаких прямых измерений в случае мозга человека после системной дозы экстракта, предполагается, что при введении субъекту один или несколько фармакологически активных компонентов фракции экстракта будут пересекать гематоэнцефалический барьер. В модели на грызунах (мыши) было показано, что олеандрин, известный как PBI-05204, в виде чистого соединения или как содержащийся в SCF экстракте, эффективно проходит через гематоэнцефалический барьер и проникает в мозг. Разумно ожидать, что олеандрин будет также проходить гематоэнцефалический барьер и проникать в мозг человека.
Соответственно, настоящее изобретение относится к способу защиты нейронов от потери их активности, вызванной кислородным или глюкозным истощением, путем воздействия на нейроны, истощенные по кислороду и/или глюкозе, эффективного количества экстракта из видов Nerium или видов Thevetia для минимизирования потери активности, снижения скорости потери активности, остановки потери активности, замедления начала потери активности и/или для защиты функции нейронов, при потере активности, вызванной за счет условий кислородного и/или глюкозного истощения. В некоторых вариантах осуществления изобретения, в способе используют эффективное количество фракции или субфракции экстракта из видов Nerium или экстракта из видов Thevetia. В некоторых вариантах осуществления изобретения, фракцию или субфракцию получают путем фракционирования экстракта с помощью жидкостной хроматографии. В некоторых вариантах осуществления изобретения, фракция не включает сердечных гликозидов, а в других вариантах осуществления изобретения, фракция или субфракция содержит один или несколько сердечных гликозидов, в частности тех, которые здесь описаны.
Пример 9 представляет подробное описание анализа in vitro, используемого для оценки эффективности экстракта при лечении болезни Альцгеймера. Такой анализ представляет собой анализ срезов мозга при ΑΡΡ/Αβ-индуцированной (APP: белок-предшественник амилоида) дегенерации пирамидальных нейронов коры мозга. После расщепления ферментом секретазой, APP редуцируется в Αβ пептиды, которые, как считается, являются причинным фактором появления бета-амилоидных бляшек. Αβ белки ассоциированы с образованием бета-амилоидных бляшек и, как полагают, являются характерной чертой, если не этиологическим фактором, при болезни Альцгеймера. Биолистическая трансфекция используется для введения жизненно важных маркеров, таких как YFP (маркер желтого флуоресцентного белка) и для введения генного конструкта заболевания в ту же самую группу нейронов в срезах мозга. Совместная трансфекция YFP с изоформами АРР приводит к прогрессирующей дегенерацией пирамидальных нейронов коры мозга в течение трех-четырех дней после подготовки срезов мозга и трансфекции. Данные (Фиг. 2А-2С) показывают, что SCF экстракт из видов Nerium предоставляет зависимую от концентрации нейропротекцию APP-трансфицированных срезов мозга, обеспечивая сохранение на почти таком же уровне, как и в случае использования препаратов ингибиторов ВАСЕ, т.е. препаратов ингибиторов бета-секретазы. Фермент бета-секретаза расщепляет белок APP предшественника в токсичные Αβ-белки. SCF экстракт, содержащий олеандрин, обеспечивает большую нейропротекцию, чем один олеандрин. Данные, представленные на Фиг. 2А-2С, являются значимыми, поскольку в этом in vitro анализе, отражающем болезнь Альцгеймера, несколько соединений или терапевтических стратегий, описанных в литературе, показали существенную защиту нейронов.
Анализ среза мозга на основе APP-WT для болезни Альцгеймера был выполнен повторно (Пример 11) с использованием фракций SCF экстракта из Nerium oleander. Количество здоровых нейронов коры было определено после дегенерации, индуцированной с помощью ΑΡΡ/Αβ, в присутствии различных количеств (от 0,01 до 100 мкг/мл) фракции О-4А SCF экстракта. Истощение по кислороду и глюкозе служило внутренним положительным контролем, продуцирующим опосредованное, подобное инсульту, повреждение нейронов. Отрицательным контролем были относительно здоровые нейроны среза мозга без воздействия или при воздействии OGD. Данные показаны на Фиг. 6, где светлые столбики показывают в отношении условий АРР-WT значительное различие, определенное анализом ANOVA с последующей оценкой данных с помощью критерия Даннетта на уровне достоверности 0,05. Полученные данные свидетельствуют о том, что фракция О-4A обеспечивает нейропротекцию в этом анализе, несмотря на то, что она не включает сердечных гликозидов.
Фракцию О-4 (О-4A) SCF экстракта из Thevetia oleander оценивали с помощью анализа срезов мозга с tau4R для болезни Альцгеймера (Пример 12). Определялось количество здоровых нейронов коры мозга. Эффективность в данном анализе определяется как или на основе относительного общего количества здоровых нейронов по отношению к числу поврежденных, и доли деградированных нейронов в присутствии различных количеств фракции О-4A SCF экстракта (от 0,3 до 100 мкг/мл, концентрация определена по массе экстракта). Отрицательный контроль в этих экспериментах состоял из срезов головного мозга, которые не были подвергнуты процедуре OGD, в то время как срезы мозга, которые подверглись OGD, но не были обработаны фракций, полученной из нефракционированного экстракта Nerium oleander, служили в качестве внутреннего положительного контроля. Данные показаны на Фиг. 7, где светлые столбики показывают на значительное различие в отношении поврежденных нейронов, определенное анализом ANOVA с последующей оценкой данных с помощью критерия Даннетта на уровне достоверности 0,05. Полученные данные свидетельствуют о том, что фракция О-4A обеспечивает нейропротекцию в этом анализе, несмотря на то, что она не включает сердечных гликозидов.
Соответственно, настоящее изобретение относится к способу защиты нейронов от потери активности, которая вызвана болезнью Альцгеймера, где способ включает: воздействие на нейроны, которые имеют признаки болезни Альцгеймера, эффективным количеством экстракта из видов Nerium или видов Thevetia для минимизирования потери активности, снижения скорости потери активности, остановки потери активности, замедления начала потери активности и/или критического функционирования нейронов, вызванной болезнью Альцгеймера. В некоторых вариантах осуществления изобретения, способ предусматривает использование эффективного количества фракции экстракта из видов Nerium или из видов Thevetia. В некоторых вариантах осуществления изобретения, фракцию получают путем фракционирования экстракта с помощью жидкостной хроматографии. В некоторых вариантах осуществления изобретения, фракция не включает сердечных гликозидов, а в других вариантах осуществления изобретения, фракция включает один или несколько сердечных гликозидов, в частности тех, которые описаны здесь.
Пример 10 содержит подробное описание анализа, который используется для оценки эффективности экстракта при лечения болезни Хантингтона. Мутантный белок htt вводят при помощи электропорации в смешанные совместные культуры высокой плотности нейронов коры мозга, стриарных нейронов и глии. Стриарные нейроны и нейроны коры мозга трансфицируют флуоресцентными белками с различным цветом, облегчая тем самым отдельную идентификацию различных типов нейронов в совместной культуре. Цветные флуоресцентные белки флуоресцируют и "излучают" цвет после активации от источника света с соответствующей длиной волны. Данные (Фиг. 3А-3D) показывают, что олеандрин и SCF экстракт из Nerium oleander более эффективны, чем KW6002 (антагонист аденозинового рецептора 2а), с точки зрения обеспечения большего числа выживших нейронов. Эти данные также показывают, что SCF экстракт является более эффективным, чем один олеандрин, предполагая, что экстракт, кроме олеандрина, дополнительно содержит один или несколько терапевтически эффективных агентов, которые могут быть использованы для лечения болезни Хантингтона. Такие другие агенты могут быть использованы вместе с олеандрином или с другими сердечными гликозидами или без них. Соответственно, настоящее изобретение относится к способу защиты нейронов от потери активности, вызванной болезнью Хантингтона, где способ включает: воздействие на нейроны, которые имеют признаки болезни Хантингтона, эффективным количеством олеандрина или экстракта, содержащего олеандрин для минимизирования потери активности, снижения скорости потери активности, остановки потери активности, замедления начала потери активности и/или нормального функционирования нейронов, вызванной болезнью Хантингтона.
Пример 16 детализирует иллюстративный анализ срезов мозга, который может быть использован для оценки эффективности экстракта при лечении инсульта у субъекта, по завершении периода задержки после инсульта. Анализ срезов мозга при недостатке кислорода и глюкозы проводился как описано здесь, однако, вместо профилактической обработки срезов мозга экстрактом, их обрабатывали экстрактом после периодов задержки, равных 0, 1, 2, 4 и 6 часам. Данные должны продемонстрировать, что экстракт является эффективным для обеспечения значительной нейропротекции при периоде задержки вплоть до 1, 2, 3, 4, 5 и вплоть до приблизительно 6 часов после инсульта.
Соответственно, настоящее изобретение относится способу лечения инсульта с временной задержкой у субъекта, путем введения субъекту дозы экстракта из видов Nerium или видов Thevetia, после того, как у субъекта имел место инсульт. В течение приемлемого времени задержки от момента времени, когда у субъекта имел место инсульт, вводят начальную дозу экстракта в соответствии с начальным режимом дозирования. Затем определяют адекватность клинического и/или терапевтического ответа у субъекта на лечение экстрактом. Если клинический и/или терапевтический ответ у субъекта является адекватным, то введение экстракта продолжают по мере необходимости, пока не будет достигнут желаемый клинический результат. Кроме того, если клинический и/или терапевтический ответ на начальную дозу и начальный режим дозирования у субъекта является неадекватным, то дозу увеличивают или уменьшают до тех пор, пока желаемый клинический и/или терапевтический ответ у субъекта не будет достигнут. Увеличение или уменьшение дозы может быть выполнено в сочетании с изменением режима дозирования, таким как изменение частоты введения или полного периода введения дозы.
Некоторые из этих анализов срезов мозга, описанных здесь, проводят в условиях, при которых ткань мозга обрабатывают экстрактом до OGD. В этих условиях данные показывают полезность экстракта для профилактики нейропротекции против повреждений, вызванных инсультом.
Если клиницист предполагает лечение субъекта, имеющего неврологическое патологическое состояние, при помощи комбинации экстракта или композиции, содержащей его, с одним или несколькими другими терапевтическими агентами, и при этом известно, что конкретное неврологическое патологическое состояние, которое имеется у субъекта, по меньшей мере частично терапевтически реагируют на лечение указанным одним или несколькими другими терапевтическими агентами, то способ по настоящему изобретению включает: введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически релевантной дозы экстракта (или фракции, или субфракции) и терапевтически релевантной дозы указанного одного или нескольких других терапевтических агентов, где экстракт (или фракцию, или субфракцию) вводят в соответствии с первым режимом дозирования, и один или несколько других терапевтических агентов вводят в соответствии со вторым режимом дозирования. В некоторых вариантах осуществления изобретения, первый и второй режимы дозирования являются одинаковыми. В некоторых вариантах осуществления изобретения, первый и второй режимы дозирования являются различными.
Если неврологическое патологическое состояние, подлежащее лечению, представляет собой болезнь Альцгеймера, то один или несколько других терапевтических агентов, могут быть выбраны из группы, состоящей из ингибиторов ВАСЕ или ингибиторор ацетилхолинэстеразы. В некоторых вариантах осуществления изобретения, один или несколько других терапевтических агентов могут быть выбраны из группы, состоящей из Namenda™ (мемантин HCl), Aricept™ (донепезил), Razadyne™ (галантамин), Exelon™ (ривастигмин) и Cognex™ (такрин).
Если неврологическое патологическое состояние, подлежащее лечению, представляет собой болезнь Хантингтона, то один или несколько других терапевтических агентов могут быть выбраны из группы, состоящей из природных продуктов, противосудорожных средств, антагонистов рецепторов NMDA (N-метил-D-аспартат) и блокаторов натриевых каналов. Примеры агентов включают витамин Е, баклофен (производное CoQ10), ламотригин (противосудорожное средство), ремацемид (анестетик, антагонист NMDA с низкой аффинностью) и рилузол (блокатор натриевого канала). Эффективность каждого из этих агентов по отдельности считается низкой (Mestre T. et al, Chochrane Database Systematic Reviews July 8, 2009; 8(3): CD006455), однако, ожидается, что введение дозированной формы, содержащей экстракт, субъектам, которые получают один или несколько из этих других агентов, обеспечит у субъекта, имеющего неврологическое патологическое расстройство, улучшенный клинический результат, по сравнению со случаем, когда эти агенты вводятся при отсутствии экстракта.
Когда неврологическое патологическое состояние, подлежащее лечению, представляет собой ишемическое повреждение головного мозга, опосредованное инсультом (ишемический инсульт), терапевтические процедуры описанные в литературе (Gutierrez M. et al. “Cerebral protection, brain repair, plasticity and cell therapy in ischemic stroke” Cerebrovasc. Dis. 2009; 27 Suppl 1:177-186), например внутривенный тромболизис, могут быть использованы в дополнение к экстракту. В некоторых вариантах осуществления изобретения, один или несколько других терапевтических агентов могут быть выбраны из группы, состоящей из препаратов, таких как альтеплаз (тромболитический агент).
Один или несколько других терапевтических агентов можно вводить в дозах и по схемам дозирования, которые известны клиницистам как терапевтически эффективные, или в дозах, которые известны клиницистам как субтерапевтически эффективные. Клинический положительный результат и/или терапевтическое действие, которое обеспечивает введение комбинации экстракта и одного или нескольких других терапевтических агентов, может быть аддитивном или синергетическим, при этом уровень положительного результата или действия определяют путем сравнения при введении комбинации и введении экстракта и одного или нескольких других терапевтических агентов по отдельности. Один или несколько других терапевтических агентов можно вводить в дозах и по режимам дозирования, как это предлагается или как описано в документах управления по контролю продуктов питания и лекарственных средств США (U.S.F.D.A.), Всемирной организации здравоохранения (W.H.O.), Европейского агентства по лекарственным средствам (E.M.E.A.), управления по контролю товаров лекарственных средств Австралии (TGA), Панамериканской организация здравоохранения (PAHO), управления по контролю за безопасностью лекарственных средств и медицинского оборудования (Medsafe, Новая Зеландия), или в документах министерств здравоохранения различных государств мира.
Если в соответствии с изобретением используется сердечный гликозид, он может представлять собой любой известный сердечный гликозид, который обладает активностью по связыванию Na/K-АТФазы. Сердечный гликозид должны быть способен пересекать гематоэнцефалический барьер и удерживаться в ткани головного мозга в течение длительного периода времени после введения. В этой связи сердечный гликозид должен сохраняться в головном мозге по меньшей мере в течение 8 часов после введения сердечных гликозидов, за счет связывания тканью, как следствие этого, он должен иметь низкий клиренс.
Если используются сердечные гликозиды, то они могут находиться в чистом виде или в виде смеси с одним или несколькими другими соединениями. Сердечные гликозиды могут быть представлены в виде экстракта.
2
2
Экстракт может быть получен с использованием экстракции со сверхкритической жидкостью (SCF), с углекислым газом (CO) или с химически модифицированными формами таких экстрагентов (например, экстракт, который содержит этанол, получают с использованием CO, в качестве SCF, и этанола; см. Пример 1). Экстракт может быть получен путем экстракции растительного материала органическим растворителем, например, этанолом, метанолом, пропанолом или другим подобным растворителем. Экстракт может быть получен из растительного материала. Растительный материал может быть растительной массой, такой как полученной из видов Nerium, таких как Nerium oleander, или видов Thevetia, таких как Thevetia neriifolia или Thevetia peruviana (иначе известный как желтый олеандр). Процесс экстракции может быть выполнен с использованием высушенный порошка листьев Nerium oleander, который получают в соответствии со способом, описанным в рассматриваемой предварительной заявке на патент США No. 60/653210, поданной 15 февраля 2005 года на имя Addington, или в заявке на патент США No. 11/340016, поданной 26 января 2006 года на имя Addington, в заявке на патент США No. 11/191650, поданной 28 июля 2006 года (в настоящее время - патент США No. 7402325, выданный 22 июля 2008 года) на имя Addington, или в международной патентной заявке РСТ No. PCT/US06/29061, поданной 26 июля 2006 года, или в работе Newman et al. (Mol. Interven. (2008), 8, 36-49), полное содержание которых включено в настоящее описание в виде ссылки, или который получают способом, описанным в настоящем документе. Эти способы также могут быть использованы для получения нефракционированного экстракта из видов Nerium или видов Thevetia. Если не указано иначе, термин "экстракт", как используется здесь, служит для обозначения "нефракционированного экстракта", или фракции экстракта, или субфракции из фракции экстракта. Термин "нефракционированный экстракт" обычно обозначает экстракт, полученный путем экстракции растительного материала, где экстракт не был подвергнут фракционированию, например, фракционированию и разделение на отдельные компоненты или группы компонентов с помощью хроматографии или путем экстракции растворителем, после получения исходного экстракта.
Как используется здесь, термин "олеандрин" означает все известные формы олеандрина, если не указано иное. Олеандрин могут присутствовать в рацемической, оптически чистой или оптически обогащенной форме. Растительный материал из Nerium oleander может быть получен, например, от коммерческих поставщиков растений, например, от Aldridge Nursery, Atascosa, штат Техас.
Нефракционированный экстракт может быть получен экстракцией с помощью модифицированной (например, этанолом) или немодифицированной сверхкритической жидкостью из растительной массы, содержащей сердечный гликозид, например, растительной массы, содержащей виды Nerium или виды Thevetia. Экстракт, полученный с использованием сверхкритической жидкости, может содержать одно или несколько фармакологически активных агентов, экстрагированных из растительной массы, что вносит свой вклад в терапевтическую эффективность экстракта при введении его субъекту. Когда два или более таких агентов присутствуют в экстракте, они могут способствовать терапевтической эффективности экстракта аддитивно или синергически.
Нефракционированный экстракт может быть получен различными способами. Экстракт может быть получен как описано выше, или в соответствии со способом, разработанным доктором Huseyin Ziya Ozel, см. патент США No. 5135745, где описана процедура экстракции горячей водой для получения экстракта растения в воде. Как сообщается, водный экстракт содержит несколько полисахаридов с молекулярной массой в диапазоне от 2 до 30 кДа, олеандрин, олеандригенин, одорозид и нериталозид. Как сообщается, полисахариды включают кислотные гомополигалактуронаны или арабиногалактуронаны. Патент США No. 5869060 на имя Selvaraj et al. раскрывает экстракты, полученные экстракцией с помощью горячей воды, из видов Nerium и способы их получения, см., например, Пример 2. Полученный экстракт затем может быть лиофилизирован с получением порошка. В патенте США No. 6565897 (предпатентная публикация No. 20020114852 и публикация международной заявки РСТ WO 2000/016793 на имя Selvaraj et al.) раскрыт способ экстракции с помощью горячей воды для получения по существу стерильного экстракта. В работе Erdemoglu et al., J. Ethnopharmacol. (2003) Nov. 89(1), 123-129 описаны результаты сравнения водных и спиртовых экстрактов растений, в том числе Nerium oleander, в части их противоноцицептивной и противовоспалительной активностей. Экстракты из Nerium oleander, полученные с помощью органических растворителей, раскрыты в работах Adome et al. (Afr. Health Sci. (2003) Aug. 3(2), 77-86; этанольный экстракт), el-Shazly et al. (J. Egypt Soc. Parasitol. (1996), Aug. 26(2), 461-473; этанольный экстракт), Begum et al. (Phytochemistry (1999) Feb. 50(3), 435-438; метанольный экстракт), Zia et al. (J. Ethnolpharmacol. (1995) Nov. 49(1), 33-39; метанольный экстракт) и Vlasenko et al. (Farmatsiia. (1972) Sept.-Oct. 21(5), 46-47; спиртовой экстракт). Предпатентная публикация заявки на патент США No. 20040247660 на имя Singh et al. раскрывает получение стабилизированный белком липосомальной композиции олеандрина для применения при лечении рака. США Предпатентная публикация заявки на патент США No. 20050026849 на имя Singh et al. описывает водорастворимые композиции олеандрина, содержащих циклодекстрин. Предпатентная публикация заявки на патент США No. 20040082521 на имя Singh et al. раскрывает получение препаратов наночастиц олеандрина, стабилизированных белком, из экстракта, полученного с помощью горячей воды.
Экстракция с помощью SCF может быть проведена в присутствии в сверхкритической жидкости модификатора, такого как спирт, например этанол, в целях повышения экстракции целевого соединения(ий) из растительной массы (см. заявку PCT/US06/29061, поданную 26 июля 2005 г., патент США No. 7402325 и заявка на выдачу патента США No. 12/019435, поданная 24 января 2008 г., или работу Newman et al. (Mol. Interven. (2008), 8, 36-49), полное содержание которых включено в настоящее описание посредством ссылки). Модификаторы обычно обладают летучестью, которая находится между летучестью сверхкритической жидкости и извлекаемого соединения, и они должны смешиваться со сверхкритической жидкостью. В некоторых вариантах осуществления изобретения, модификатор, в условиях окружающей среды, представляет собой жидкость. В качестве примера, но без ограничения, модификатор может быть выбран из группы, включающей этанол, метанол, пропанол, ацетон, этилацетат, хлористый метилен и т.п.
Возможно, что экстракты также отличаются по их относительной эффективности, как определено в настоящем документе в анализах по эффективности. Тем не менее, если один или несколько фармакологически активных агентов присутствуют в достаточно большом количестве или в большой концентрации в экстракте, так чтобы иметь возможность получить терапевтически релевантные дозы, то такой экстракт считается частью изобретения.
Пример 13 описывает хроматографический способ разделения SCF экстракта на пять различных фракций: O-H, О-2, О-3, О-4 и О-5. Фракции получали путем загрузки нефракционированного экстракта на колонку с ODS-силикагелем уравновешенную водой, с последующим элюированием различных фракций из экстракта путем последовательного пропускания через колонку различных порций водной подвижной фазы, отличающихся содержанием метанола (30%, 55%, 80% и 100%), сбором соответствующих выходящих порций жидкости (фракций) и концентрации выходящих порций жидкости путем выпаривания растворителя при пониженном давлении для того, чтобы удалить растворитель, получая, тем самым, фракции О-1 (или О-Н), О-2, О-3, О-4 и О-5. Фракции анализировали в соответствии с Примером 14, и их состав, в пересчете на сердечный гликозид и другие компоненты, был определен с помощью тонкослойной хроматографии, с использованием чувствительного окрашивающего индикатора, который обладает адгезией (и, следовательно, полезен для обнаружения) к сердечным гликозидам. Кроме того, наличие или отсутствие сердечных гликозидов в этих фракциях определяли с помощью жидкостной хроматографии стандемной масс-спектрометрией или с помощью DAD-УФ-детектирования.
Фракция или субфракция экстракта может быть проанализирована способом жидкостной хроматографии с использованием неподвижной фазы, иной, чем ODS-силикагель, и/или с использованием в качестве подвижной фазы жидкости, иной, чем вода. Примеры подходящих неподвижных фаз описаны далее.
Фиг. 8A-8D изображают хроматограммы, которые получены после ВЭЖХ фракций Fr-O-1, Fr-O-2, Fr-О-3 и Fr-O-4 Примера 13. На основании сравнения полученных времен удерживания, с использованием соответствующих внешних референсных проб, было установлено, что фракции (Fr-O-2 и Fr-О-3) содержат производные олеандрина (сердечные гликозиды), олеандрин (Rt=8,3 мин) и другие неизвестные компоненты. Основная часть олеандрина, находившегося в исходном нефракционированным SCF экстракте, присутствовала, в основном, во фракции Fr-О-3. Фракция Fr-O-4 не содержала измеримых количеств каких-либо сердечных гликозидов. Соответственно, состав фракций отличался по содержанию олеандрина, сердечных гликозидов и других неизвестных компонентов.
Фракция
Олеандрин(Да/Нет)
Другие сердечные гликозиды(Да/Нет)
Нейропротекция(Да/Нет)
О-Н
Нет
Нет
Да
О-2
Нет
Да
Нет
О-3
Да
Да
Да
О-4 (О-4А)
Нет
Нет
Да
О-5
Нет
Нет
Нет
Эти фракции затем подвергали анализу по нейропротекции на срезах мозга, как подробно описано в Примере 15, для того, чтобы определить уровень нейропротекции, обеспечиваемый каждой фркцией. Эти данные представлены на Фиг. 4A-4E, где нейропротективная активность водного раствора, содержащего SCF экстракт (23 г/мл) сравнивалась с другими растворами, содержащими 0,03, 0,3 или 3 г/мл другого компонента(ов). Все фракции были взвешены и их сравнивали на основе равных масс. Было установлено, что фракции (описанные здесь), содержащие олеандрин или сердечный гликозид, а также некоторые фракции, которые не содержали олеандрин или сердечных гликозидов, могут обеспечить нейропротекцию.
Эффективность фракции О-4 SCF экстракта сравнивалась с нефракционированным SCF экстрактом (PBI-05204) в анализе срезов мозга в отношение инсульта (Пример 15). Эффективность различных количеств (от 0,03 до 300 г/мл) фракции О-4 сравнивалась с фиксированным количеством экстракта (23 мкг олеандрина на миллилитр). Данные (Фиг. 5) ясно показывают, что фракция О-4 SCF экстракта из Nerium oleander сохраняет свою эффективность, хотя она не содержит олеандрина или выявляемого количества каких-либо других сердечных гликозидов. Более светлые столбики на Фиг. 5 указывают на значимое различие в отношении условий инсульта (установлено как 0), определенное анализом ANOVA с последующей оценкой данных с помощью критерия Даннетта на уровне достоверности 0,05.
Соответственно настоящее изобретение относится к множеству терапевтические фракций экстракта из видов Nerium или видов Thevetia, где фракции выбраны из группы, состоящей из: а) фракции, содержащей один или несколько фармакологически активных агентов, без учета олеандрина и других сердечных гликозидов, где фракция обеспечивает нейропротекцию; b) фракции, содержащей один или несколько фармакологически активных агентов, олеандрин и один или нескольких других сердечных гликозидов, где фракция обеспечивает нейропротекцию; и с) фракции, содержащей один или несколько других фармакологически активных агентов (иных, чем указанные в а) выше), без учета олеандрина и других сердечных гликозидов, где фракция обеспечивает нейропротекцию.
Настоящее изобретение также относится к способу фракционирование экстракта из видов Nerium или видов Thevetia для того, чтобы получить одну или несколько терапевтически эффективных фракций. Способ включает: а) получение экстракта из видов Nerium или видов Thevetia; b) фракционирование экстракта для получения двух или более различных фракций экстракта, где первый экстракт содержит один или несколько фармакологически активных агентов, которые не являются сердечными гликозидами, без учета присутствующих сердечных гликозидов, и второй экстракт содержит один или несколько фармакологически активных агентов, которое не являются сердечными гликозидами, и один или несколько сердечных гликозидов. В некоторых вариантах осуществления изобретения, фракционирование осуществляют при помощи жидкостной хроматографии с использованием неподвижной фазы и подвижной фазы. В некоторых вариантах осуществления изобретения неподвижная фаза содержит среду, выбранную из группы, состоящей из "обращенно-фазной" смолы, инертного неполярного вещества, которое имеет достаточную упаковку для использования в хроматографии, например, которое состоит из коротких углеродных цепей (С8-С18), соединенных с диоксидом кремния, диоксида кремния, связанного с цианом, или диоксида кремния, связанного с фенилом, ионообменных смол (катионных или анионных), "нормально-фазной" смолы, например, где группы окиси кремния или органические группы связаны с циано- и амино-функциональными группами. В некоторых вариантах осуществления изобретения, подвижная фаза включает растворитель, выбранный из группы, состоящей из воды, метанола, этанола, ацетонитрила, тетрагидрофурана, буферных растворов на водной основе или их смеси. В некоторых вариантах осуществления изобретения, подвижная фаза включает водный метанол, в которой содержание метанола последовательно увеличивается приблизительно от 30% до 100%, и неподвижная фаза представляет собой ODS-силикагель. Хроматографию можно проводить с использованием градиентного элюирования подвижной фазой, ступенчатым элюированием подвижной фазой или с помощью подвижной фазы постоянного состава.
Фракция экстракта может быть субфракционирована для получения двух или более различных субфракций из фракции экстракта. Субфракционирование фракции может быть осуществлено с помощью жидкостной хроматографии. Подходящая неподвижная фаза для жидкостной хроматографии может включать силикагель или другие смолы, такие как ионообменные среды, оксид алюминия или несвязанный C18-материал, а подходящая подвижная фаза для жидкостной хроматографии, может включать комбинацию двух или более органических растворителей различной полярности: менее полярный органический растворитель и более полярный органический растворитель. Подходящий полярный органический растворитель может представлять собой тетрагидрофуран, дихлорметан, этилацетат, ацетон, диметилформамид, ацетонитрил, н-бутанол, изопропанол, н-пропанол, этанол, метанол, уксусную кислоту и воду. Подходящий неполярный органический растворитель может представлять собой этилацетат, пентан, циклопентан, гексан, циклогексан, бензол, толуол, 1,4-диоксан, хлороформ или диэтиловый эфир.
Буферные агенты для использования в буферных растворах включают любые из числа тех, которые известны в области жидкостной хроматографии. Типичные буферные агенты включают те, которые содержат фосфат, ацетат, цитрат, формиат, фосфат, трифторуксусную кислоту, хлоруксусную кислоту, сульфонат, алкиламин, TAE, TBE, аммоний, BuffAR, карбонат, HEPES, MES, тиоцианат, CAPS, CHES, гуанидин, MOPS, PIPES, TRIS, сульфат, гидроксид, галогенид щелочного металла, трицин, ионы аминокислот или их комбинации. В подвижную фазу могут быть включены один или несколько агентов, содержащих ионы, образующие пары, и/или один или несколько органических модификаторов.
Другие типы хроматографии, которые могут быть использованы для фракционирования экстракта, включают гель-хроматографию, хроматографии с нормальной фазой, ионообменную хроматографию, гидрофобную хроматографию или их комбинации. Кроме того, можно использовать комбинированные формы различных типов хроматографии. Неподвижная фаза может включать среду, которая представляет собой комбинацию двух или более различных сред, используемых для хроматографии с обращенной фазой, гель-хроматографии, ионообменной хроматографии или гидрофобной хроматографии, например, комбинация неподвижной фазы для хроматографии с обращенной фазой и неподвижной фазы для гель-хроматографии, комбинация неподвижной фазы для хроматографии с обращенной фазой и неподвижной фазы для хроматографии ионного обмена или другие такие комбинации, или две, три или четыре различных сред для неподвижной фазы. Среда неподвижной фазы может быть пористой, не иметь пор, иметь поверхностную пористость, диффузионную пористость или быть полностью пористой.
Настоящее изобретение относится к способу фракционирование экстракта, включающего: а) получение экстракта из видов Nerium или видов Thevetia; b) фракционирование экстракта с помощью хроматографии на колонке с ODS-силикагелем в качестве неподвижной фазы и с использованием водного метанола в качестве подвижной фазы, для получения по меньшей мере двух различных фракций: первой фракции, содержащей по меньшей мере один сердечный гликозид и по меньшей мере один фармакологически активный агент, который не является сердечным гликозидом, и другая фракция, без учета сердечных гликозидов, содержит по меньшей мере один фармакологически активный агент, который не является сердечным гликозидом; с1) субфракционирование другой фракции, полученной в b) с помощью колоночной хроматографии с силикагелем, в качестве неподвижной фазы, и со смесью по меньшей мере двух органических растворителей различной полярности, в качестве подвижной фазы, для получения по меньшей мере двух различных субфракций: субфракции, содержащей один или несколько стероидов, и один или несколько тритепенов, и другой субфракции, содержащей два или более различных трипена, без учета стероидов, где субфракция не включает сердечный гликозид.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, способ дополнительно включает: c2) субфракционирование первой фракции, полученной в b), с помощью колоночной хроматографии с силикагелем, в качестве неподвижной фазы, и смеси по меньшей мере двух органических растворителей различной полярности, в качестве подвижной фазы, для получения по меньшей мере двух различных субфракций: субфракции, содержащей один или несколько стероидов, и один или более тритепенов, и другой субфракции, содержащей два или более различных трипена, без учета стероидов, где одна или обе субфракций дополнительно содержат сердечные гликозиды.
Экстракт, фракция или субфракция, могут быть представлены в любой пригодной фармацевтически приемлемой дозированной форме. Особенно полезны парентеральная, ушная, офтальмологическая, назальная, ингаляционная, буккальная, сублингвальная, энтеральная, местная, оральная, пероральная и инъецируемая дозированные формы. Конкретные дозированные формы включают твердые или жидкие дозированные формы. Примеры подходящих дозированных форм включают таблетки, капсулы, пилюли, каплеты, пастилки, саше, растворы, суспензии, дисперсии, флаконы, пакеты, пузырьки, жидкости для инъекций, в/в (внутривенно), в/м (внутримышечно) или в/б (внутрибрюшинно) вводимые жидкости и другие дозированные формы, известных специалистам в области фармацевтических наук.
Количество экстракта, фракции или субфракции, включенное в дозу по изобретению, соответствует по меньшей мере одной или нескольким дозированным формам, и может быть выбрано в соответствии с известными принципами фармации. В рамках изобретения рассматривается эффективное количество или терапевтически релевантное количество терапевтического соединения. Под термином "эффективное количество", в отношении, например, фармацевтических препаратов, понимается, что имеется в виду фармацевтически эффективное количество. Фармацевтически эффективное количество представляет собой количественный показатель или количество активного ингредиента, которое достаточно для достижения требуемой или желаемой терапевтической реакции, или, другими словами, количество, которое достаточно для того, чтобы вызвать заметной биологический ответ, когда активный ингредиент вводят пациенту. Заметный биологический ответ может быть достигнут в результате введения одной или нескольких доз активного вещества. Доза может содержать одну или несколько дозированных форм. Следует понимать, что конкретный уровень дозы для любого пациента будет зависеть от множества факторов, включающих заболевание, которое лечат, тяжесть заболевания, состояние здоровья пациента, возраст, пол, вес пациента, диету, фармакологический ответ, конкретные используемые дозированные формы и другие подобные факторы.
Желаемая доза для орального введения, составляет до пяти дозированных форм, хотя в виде разовой дозы могут быть введены как одна, так и десять дозированных форм. Типичные дозированные формы содержат от 0,1 до 5 мг SCF экстракта в одной дозированной форме, в общей сложности из расчета от 0,1 до 500 мг (от 1 до 10 доз) на дозу. Дозы вводятся по режиму дозирования, который может быть заранее определен и/или адаптирован для достижения конкретного терапевтического ответа или положительного клинического результата у субъекта.
Для использования при лечении млекопитающих, экстракт, фракция или субфракция, могут быть включены в дозированную форме. В некоторых вариантах выполнения изобретения, дозированная форма не имеет энтеросолюбильного покрытия и высвобождает экстракт, содержащийся в ней, в течение периода времени от 0,5 до 1 часа или менее. В некоторых вариантах выполнения изобретения, дозированная форма имеет энтеросолюбильное покрытие, и высвобождает экстракт, содержащийся в ней в кровоток, ведущий к сердцу, на выходе из желудка, например в тонкой кишке, подвздошной кишке, тонкой кишке и/или толстой кишке (прямой кишке). Дозированные формы с энтеросолюбильным покрытием высвобождают экстракт в системный кровоток в пределах 1-10 часов после перорального приема.
Следует отметить, что соединение, раскрытое здесь, может обладать одной или несколькими функциями в композиции по изобретению. Например, соединение может служить как поверхностно-активное вещество и смешивающимся с водой растворителем, или как поверхностно-активное вещество и не смешивающимся с водой растворителем.
Жидкая композиция может включать один или несколько фармацевтически приемлемых жидких носителей. Жидкий носитель может быть водным, неводным, полярным, неполярным и/или органическим носителем. Жидкие носители включают, в качестве примера и без ограничения, смешивающийся с водой растворитель, несмешивающийся с водой растворитель, воду, буфер и их смеси.
Как используется здесь, термины "растворимый в воде растворитель" или "смешивающийся с водой растворитель" используются взаимозаменяемо, и они относятся к органической жидкости, которая не образует двухфазную смесь с водой или которая достаточно растворима в воде, с получением растворимой в воде смеси, содержащей по меньшей мере пять процентов растворителя без разделения жидких фаз. Растворитель является пригодным для введения человеку или животным. Типичные растворимые в воде растворители включают, в качестве примера и без ограничения, ПЭГ (поли(этиленгликоль)), ПЭГ 400 (поли(этиленгликоль, имеющий среднюю молекулярную массу приблизительно равную 400), этанол, ацетон, алканол, спирт, простой эфир, пропиленгликоль, глицерин, триацетин, поли(пропиленгликоль), PVP (поли(винилпирролидон)), диметилсульфоксид, N,N-диметилформамид, формамид, Ν,Ν-диметилацетамид, пиридин, пропанол, N-метилацетамид, бутанол, сулофор (2-пирролидон), фармасолв (N-метил-2-пирролидон).
Как используется здесь, термины «нерастворимый в воде растворитель" или "несмешивающийся с водой растворитель", используются взаимозаменяемо, и они относятся к органической жидкости, которая образует двухфазную смесь с водой или имеет место разделение фаз, когда концентрация растворителя в воде превышает пять процентов. Растворитель является пригодным для введения человеку или животным. Примерами нерастворимых в воде растворителей включают, в качестве примера и без ограничения, триглицериды со средней/большой длиной цепи, масло, касторовое масло, кукурузное масло, витамин Е, производное витамина Е, олеиновую кислоту, жирную кислоту, оливковое масло, Softisan 645 (диглицерилкаприлат/капрат/стеарат/адипатгидроксистеарат), миглиол, каптекс (Captex 350: глицерилтрикаприлат/капрат/триглицеридлаурат; Captex 355: глицерилтрикаприлат/триглицеридкапрат; Captex 355 EP/NF: глицерилтрикаприлат/капраттриглицерид со средней длиной цепи).
Подходящие растворители перечислены в документе "International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH) guidance for industry Q3C Impurities: Residual Solvents" (1997), где даны рекомендации относительно того, какие количества остаточных растворителей считаются безопасными в фармацевтике. Примеры растворителей перечислены как растворители класса 2 или класса 3. Растворители класса 3 включают, например, уксусную кислоту, ацетон, анизол, 1-бутанол, 2-бутанол, бутилацетат, трет-бутилметиловый эфир, кумол, этанол, этиловый эфир, этилацетат, этилформиат, муравьиную кислоту, гептан, изобутил, изопропилацетат, метилацетат, метил-1-бутанол, метилэтилкетон, метилизобутилкетон, 2-метил-1-пропанол, пентан, 1-пентанол, 1-пропанол, 2-пропанол или пропилацетат.
Другие материалы, которые можно использовать в изобретении в качестве несмешивающихся с водой растворителей, включают: Captex 100: пропиленгликольдикапрат; Captex 200: пропиленгликольдикаприлат/дикапрат; Captex 200 P: пропиленгликоль/дикапрат; пропиленгликольдикаприлокапрат; Captex 300: глицерилтрикаприлат/капрат; Captex 300 EP/NF: глицерилтрикаприлат/капраттриглицерид с цепью средней длины; Captex 350: глицерилтрикаприлат/капрат/лаурат; Captex 355: глицерилтрикаприлат/капрат; Captex 355 EP/NF: глицерилтрикаприлат/капраттриглицерид с цепью средней длины; Captex 500: триацетин; Captex 500 P: триацетин фармацевтического качества; Captex 800: пропиленгликоль-ди(2-этилгексаноат); Captex 810 D: глицерилтрикаприлат/капрат/линолеат; Captex 1000: глицерилтрикапрат; Captex CA: триглицериды с цепью средней длины; Captex MCT-170: триглицериды с цепью средней длины; Capmul GMOO: глицерилмоноолеат; Capmul GMO-50 EP/NF: глицерилмоноолеат; Capmul MCM: моно- и ди-глицериды с цепью средней длины; Capmul MCM C8: глицерилмонокаприлат; Capmul MCM C1O: глицерилмонокапрат; Capmul PG-8: пропиленгликольмонокаприлат; Capmul PG-12: пропиленгликольмонолаурат; CAPROL 10G10O: декаглицеролдекаолеат; CAPROL 3GO: триглицеринмоноолеат; CAPROL ET: полиглицериновый эфир смешанных жирных кислот; CAPROL MPGO: гексаглицериндиолеат; CAPROL PGE 860: декаглицерол моно- и ди-олеат.
Как используется здесь, "поверхностно-активное вещество" означает соединение, которое содержит как полярные или заряженные гидрофильные части, так и неполярные гидрофобные (липофильные) части, т.е. поверхностно-активное вещество является амфифильным. Термин поверхностно-активное вещество может относиться к одному соединению или к смеси соединений. Поверхностно-активное вещество может представлять собой солюбилизатор, эмульгатор или диспергирующий агент. Поверхностно-активное вещество может быть гидрофильным или гидрофобным.
Гидрофильное поверхностно-активное вещество может представлять собой любое гидрофильные поверхностно-активное вещество, которое подходят для использования в фармацевтических композициях. Такие поверхностно-активные вещества могут быть анионными, катионными, цвиттерионными или неионногенными, при этом в настоящее время неионогенные гидрофильные поверхностно-активные вещества являются предпочтительными. Как обсуждалось выше, эти неионогенные гидрофильные поверхностно-активные вещества обычно имеют значение ГЛБ (гидрофильно-липофильный баланс) приблизительно более 10. Смеси гидрофильных поверхностно-активных веществ также входят в объем притязаний настоящего изобретения.
Кроме того, гидрофобное поверхностно-активное вещество может представлять собой любое гидрофобное поверхностно-активное вещество, пригодные для использования в фармацевтических композициях. В целом, подходящее гидрофобное поверхностно-активное вещество имеет значение ГЛБ приблизительно менее 10. Смеси гидрофобных поверхностно-активных веществ также входят в объем притязаний настоящего изобретения.
Примеры дополнительных подходящих солюбилизаторов включают: спирты и многоатомные спирты, такие как этанол, изопропанол, бутанол, бензиловый спирт, этиленгликоль, пропиленгликоль, бутандиолы и их изомеры, глицерин, пентаэритрит, сорбит, маннит, транскутол, диметилизосорбид, полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль, поливиниловый спирт, гидроксипропилметилцеллюлоза и другие производные целлюлозы, циклодекстрины и производные циклодекстринов; эфиры полиэтиленгликолей, имеющих среднюю молекулярную массу от приблизительно 200 до приблизительно 6000, например, эфир тетрагидрофурфурилового спирта и ПЭГ (гликофурол, коммерчески доступный от BASF под торговым названием Тетрагликоль) или метокси-ПЭГ (Union Carbide), амиды, такие как 2-пирролидон, 2-пиперидон, капролактам, N-алкилпирролидон, N-гидроксиадкилпирролидон, N-алкилпиперидон, N-алкилкапролактам, диметилацетамид и поливинилпирролидон, сложные эфиры, такие как этиловый эфир пропионовой кислоты, трибутилцитрат, ацетилтриэтилцитрат, ацетилтрибутилцитрат, триэтилцитрат, этилолеат, этилкаприлат, этилбутират, триацетин, моноацетатпропиленгликоля, диацетатпропиленгликоля, капролактон и его изомеры, валеролактон и его изомеры, бутиролактон и его изомеры, а также другие растворители, известные в данной области, такие как диметилацетамид, диметилформамидизосорбида (Arlasolve DMI (ICI)), N-метилпирролидоны (Pharmasolve (ISP)), монооктаноин, ноноэтиловый эфир диэтиленгликоля (доступный от Gattefosse под торговой маркой Транскутол) и вода. Смеси солюбилизаторов также входят в объем притязаний настоящего изобретения.
Соединения, указанные здесь, являются легкодоступными из стандартных коммерческих источников, если не указано иное.
Композиция в форме прозрачной жидкости, оценивается как прозрачная при наблюдении невооруженным глазом, когда она содержит менее 5%, менее 3% или менее 1% по массе взвешенных твердых частиц, по отношению к общей массе композиции.
Хотя это и не является обязательным, композиция или набор по настоящему изобретению могут включать хелатирующий агент, консервант, антиоксидант, адсорбенты, подкислитель, подщелачивающий агент, пеногаситель, буферный агент, краситель, электролит, соль, стабилизатор, модификатор тоничности, разбавитель, других фармацевтический эксципиент или их комбинацию.
Как используется здесь, термин "антиоксидант" означает агент, который ингибирует окисление и, таким образом, используется для предотвращения ухудшения свойств препаратов за счет окислительного процесса. Такие соединения включают, в качестве примера и без ограничения, натрий, аскорбиновую кислоту, аскорбатпальмитат, витамин Е, производное витамина Е, бутилированный гидроксианизол, бутилированный гидрокситолуол, гипофосфористую кислоту, монотиоглицерин, пропилгаллат, аскорбат натрия, бисульфит натрия, натрий формальдегид, метабисульфит и другие подобные материалы, известные специалистам в данной области.
2
Как используется здесь, термин "хелатирующий агент" означает соединение, которое хелатирует ионы металлов в растворе. Типичные хелатирующие агенты включают ЭДТА (тетранатриевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты), DTPA (пентанатриевая соль диэтилентриаминпентауксусной кислоты), HEDTA (тринатриевую соль N-(гидроксиэтил)-этилен-диаминтриуксусной кислоты), NTA (тринатриевая соль нитрилотриуксусной кислоты), динатриевую соль этанолдиглицина (NaEDG), натриевую соль диэтанолглицина (DEGNa), лимонную кислоту и другие соединения, известных специалистам в данной области.
Как используется здесь, термин "адсорбент" означает агент, способный удерживать другие молекулы на своей поверхности путем физического или химического (хемосорбции) связывания. Такие соединения включают, в качестве примера и без ограничения, порошкообразный и активированный уголь, а также другие материалы, известные специалисту в данной области.
Как используется здесь, термин "подщелачивающий агент" означает соединение, которое используется для создания щелочной среды. Такие соединения включают, в качестве примера и без ограничения, раствор аммиака, карбонат аммония, диэтаноламин, моноэтаноламин, гидроксид калия, борат натрия, карбонат натрия, бикарбонат натрия, гидроксид натрия, триэтаноламин, троламин и другие соединения, известные специалистам в данной области.
Как используется здесь, термин "подкислитель" означает соединение, которое используется для создания кислой среды. Такие соединения включают, в качестве примера и без ограничения, уксусную кислоту, аминокислоту, лимонную кислоту, фумаровую кислоту и другие альфа-гидрокси кислоты, соляную кислоту, аскорбиновую кислоту, азотную кислоту и другие соединения, известные специалистам в данной области техники.
Как используется здесь, термин "пеногаситель" означает соединение или соединения, предотвращающее или уменьшающее количество пены, которая образуется на поверхности жидкой композиции. Подходящие пеногасители включают, в качестве примера и без ограничения, диметикон, симетикон, октоксинол и другие соединения, известные специалистам в данной области.
Как используется здесь, термин «буферный агент" означает соединение, которое используется для противодействия изменению величины рН при разбавлении или добавлении кислоты или щелочи. Такие соединения включают, в качестве примера и без ограничения, метафосфат калия, фосфат калия, одноосновной ацетат натрия и цитрат натрия в безводной или дегидратированной формах, а также другие подобные материалы, известные специалистам в данной области.
Как используется здесь, термин "разбавитель" или "наполнитель" означает инертные вещества, используемые в качестве наполнителей для создания нужного объема, реологических свойств и показателей для прессования при изготовлении таблеток и капсул. Такие соединения включают, в качестве примера и без ограничения, двухосновный фосфат кальция, каолин, лактозу, сахарозу, маннит, микрокристаллическую целлюлозу, порошкообразную целлюлозу, осажденный карбонат кальция, сорбит, крахмал и другие материалы, известные специалистам в данной области техники.
Как используется здесь, термин "консервант" означает соединение, используемое для предотвращения роста микроорганизмов. Такие соединения включают, в качестве примера и без ограничения, бензалконий хлорид, бензетоний хлорид, бензойную кислоту, бензиловый спирт, цетилпиридиний хлорид, хлорбутанол, фенол, фенилэтиловый спирт, нитрат, фенилацетат, тимеросал, крезол, миристилгаммапиколиний, хлорид калия, бензоат калия, сорбат калия, бензоат натрия, пропионат натрия, сорбиновую кислоту, тимол, и метил-, этил-, пропил- или бутил-парабены, а также другие соединения, известные специалистам в данной области.
Как используется здесь, термин "краситель" означает соединение, используемое для придания цвета фармацевтическим препаратам. Такие соединения включают, в качестве примера и без ограничения, краситель FD & C красный No. 3, краситель FD & C красный No. 20, краситель FD & C желтый No. 6, краситель FD & C синий No. 2, краситель FD & C зеленый No. 5, краситель FD & C оранжевый No.5, краситель FD & C красный No. 8, краситель карамель, оксид железа (черный, красный, желтый), другие красители FD & C, природные красители, такие как экстракт кожуры винограда, красный порошок свеклы, бета-каротин, аннато, кармин, куркума, паприка, и их комбинации, а также другие материалы, известные специалистам в данной области.
Как используется здесь, термин «стабилизатор» означает соединение, используемое для стабилизации активного агента от воздействия физических, химических или биохимических процессов, которые могут уменьшить терапевтическую активность агента. Подходящие стабилизаторы включают, в качестве примера и без ограничения, альбумин, сиаловую кислоту, креатинин, глицин и другие аминокислоты, ниацинамид, ацетилтриптофонат натрия, оксид цинка, сахарозу, глюкозу, лактозу, сорбит, маннит, глицерин, полиэтиленгликоли, каприлат натрия, сахарин натрия и другие соединения, известные специалистам в данной области.
Как используется здесь, термин "модификатор тоничности" предназначен для обозначения соединения или соединений, которые могут быть использованы для регулировки тоничности жидкой композиции. Подходящие модификаторы тоничности включают глицерин, лактозу, маннит, глюкозу, хлорид натрия, сульфат натрия, сорбит, трегалозу и другие соединения, известные квалифицированным или обычным специалистам в данной области техники.
Композиция по изобретению может также содержать масла, такие как жирные масла, арахисовое масло, кунжутное масло, хлопковое масло, кукурузное масло, оливковое масло, жирные кислоты, например олеиновую кислоту, стеариновую кислоту и изостеариновую кислоту и эфиры жирных кислот, такие как этилолеат, изопропилмиристат, глицериды жирных кислот и ацетилированные глицериды жирных кислот. Композиция может также включать спирты, такие как этанол, изопропанол, гексадециловый спирт, глицерин и пропиленгликоль; глицериновые кетали, такой как 2,2-диметил-3-диоксолан-4-метанол; простые эфиры, такой как поли(этиленгликоль) 450; нефтяные углеводороды, такие как минеральное масло и вазелин; воду; фармацевтически приемлемое поверхностно-активное вещество, суспендирующий агент или эмульгиратор; или их смеси.
Следует понимать, что соединения, используемые в области фармацевтических композиций, обычно служат для различных функций или целей. Таким образом, если указанное соединение упоминается здесь только один раз или используется при указании нескольких назначений, его цели и функции не должны рассматриваться как ограниченное только указанной целью(целями) или функцией(функциями).
th
Один или несколько компонентов композиции могут присутствовать в форме свободного основания или в форме фармацевтически или аналитически приемлемой соли. Используемый здесь термин "фармацевтически или аналитически приемлемая соль" относится к соединению, которое было модифицировано путем взаимодействия с кислотой, которая необходима для образования ионно-связанной пары. Примеры приемлемых солей включают обычные нетоксичные соли, образованные, например, с помощью нетоксичных неорганических или органических кислот. Подходящие нетоксичные соли включают соли, полученные из неорганических кислот, таких как соляная, бромистоводородная, серная, сульфоновая, сульфаминовая, фосфорная и азотная кислоты, а также из других кислот, известных специалистам в данной области. Специалистам в данной области известные соли, полученные из органических кислот, таких как аминокислоты, уксусная, пропионовая, янтарная, гликолевая, стеариновая, молочная, яблочная, винная, лимонная, аскорбиновая, памовая, малеиновая, гидроксималеиновая, фенилуксусная, глутаминовая, бензойная, салициловая, сульфаниловая, 2-ацетоксибензойная, фумаровая, толуолсульфоновая, метансульфоновая, этандисульфоновая, щавелевая, изетионовая кислоты и другие. Перечни других подходящих солей можно найти в справочнике Remington's Pharmaceutical Sciences, 17. ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1985, p. 1418, раскрытие релевантной части которого включено сюда посредством ссылки.
Фраза "фармацевтически приемлемый", используемая здесь, относится к таким соединениям, материалам, композициям и/или дозированным формам, которые, в соответствии со знаниями в области медицины, подходят для использования при контакте с тканями человека и животных и не имеют чрезмерной токсичности, не вызывают раздражения, аллергической реакции или других проблем или осложнений, соразмерно с разумным соотношением риск/эффект.
Дозированная форма может быть изготовлена любым традиционным способом, известным в области фармацевтической промышленности. Жидкая дозированная форма может быть получена путем включения по меньшей мере одного жидкого носителя и олеандрина или экстракта олеандрина в контейнер. Один или несколько других эксципиентов могут быть включены в жидкую дозированную форму. Твердая дозированная форма может быть получена объединением по меньшей мере одного твердого носителя и олеандрина или экстракта, содержащего олеандрин. В твердую дозированную форму может быть включен один или несколько других эксципиентов.
Дозированные формы могут быть упакованы с использованием обычного оборудования и материалов для упаковки. Она может быть включена в пакет, пузырек, флакон, мягкую упаковку, шприц, конверт, жесткую упаковку, блистер, коробку, ампулу или в другого подобный контейнер.
Настоящее изобретение относится к способу улучшения клинического состояния статистически значимого числа субъектов в группе субъектов, имеющих неврологическое патологическое состояние, где способ включает: введение субъектам в группе экстракта из видов Nerium или видов Thevetia, или его композиции; и определение клинического статуса субъектов для установления улучшения клинического состояния. В некоторых вариантах осуществления изобретения, статистически значимое количество составляет по меньшей мере 5%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере, 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80% или по меньшей мере 90% субъектов в группе. В некоторых вариантах осуществления изобретения, экстракт содержит одно или несколько других фармакологически активных соединений. В других вариантах осуществления изобретения, экстракт, содержащий одно или несколько других фармакологически активных соединений, включает такие соединения, которые, взаимодействуя вместе с олеандрином или другим сердечным гликозидом, улучшают клиническое состояние субъектов.
В связи с вышеизложенным описанием и примерами, которые представлены ниже, любой специалист в данной области техники сможет реализовать на практике заявленное изобретение без излишнего экспериментирования. Вышеизложенное будет лучше понято с использованием следующих примеров, в которых подробно описаны некоторые процедуры выполнения вариантов осуществления настоящего изобретения. Все указания, представленные в этих примерах, приведены с иллюстративными целями. Следующие примеры нельзя рассматривать как ограничивающие, поскольку они только иллюстрируют некоторые из многих вариантах выполнений, раскрытых в настоящем изобретении.
Олеандрин может быть приобретен от фирмы Sigma Chemical Co (Сент-Луис, штат Миссури).
Пример 1
Экстракт из порошка листьев олеандра, полученный с помощью сверхкритической жидкости
Способ А. Способ с применением двуокиси углерода.
Измельченные в порошок листья олеандра были получены путем сбора, промывки и сушки материала листьев олеандра, с последующим пропусканием материала листьев олеандра через аппарат для измельчения и сушки, такой как описано в патентах США No. 5236132, No. 5598979, No. 6517015 и No. 6715705. Масса исходного материала составила 3,94 кг.
2
2
2
Исходный материал был объединен в экстракторе с чистым CO при давлении 300 бар (30 МПа, 4351 фунтов на квадратный дюйм) и температуре 50°C (122°F). В общей сложности было использовано 197 кг CO для того, чтобы достичь соотношения растворитель/исходный материал, равного 50:1. Затем смесь COи сырья пропускали через сепаратор, в котором изменялись давление и температура смеси, и экстракт отделялся от двуокиси углерода.
Экстракт (65 г) был получен в виде коричневатого, липкого и вязкого материала, который обладал приятным запахом. Цвет экстракта, скорее всего, вызван хлорофиллом. Для точного определения выхода, трубы и сепаратор были промыты ацетоном и, после выпаривания ацетона, было дополнительно получено 9 г экстракта. Общее количество экстракта составило 74 г. Выход экстракта, определенный на основании массы исходного материала, составил 1,88%. Содержание олеандрина в экстракте было определено с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии, и оно составило 560,1 мг, что соответствует выходу 0,76%.
Способ В. Способ с применением смеси двуокиси углерода и этанола
Измельченные в порошок листья олеандра были получены путем сбора, промывки и сушки материала листьев олеандра, с последующим пропусканием материала листьев олеандра через аппарат для измельчения и сушки, такой как описано в патентах США No. 5236132, No. 5598979, No. 6517015 и No. 6715705. Масса исходного материала составила 3,85 кг.
2
2
2
Исходный материал был объединен в экстракторе с чистым CO и 5% этанола, используемого в качестве модификатора, при давлении 280 бар (28 МПа, 4061 фунтов на квадратный дюйм) и температуре 50°C (122°F). В общей сложности было использовано 160 кг CO и 8 кг этанола для того, чтобы достичь соотношения растворитель/исходный материал, равного 43,6 к 1. Затем смесь CO, этанола и сырья пропускали через сепаратор, в котором изменялись давление и температура смеси, и экстракт отделялся от двуокиси углерода.
Экстракт (207 г), полученный после удаления этанола, представлял собой темно-зеленую, липкую, вязкую массу, вероятно содержащую некоторое количество хлорофилла. Выход экстракта, определенный на основании массы исходного материала, составил 5,38%. Содержание олеандрина в экстракте было определено с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии, и оно составило 1,89 г, что соответствует выходу 2,1%.
Пример 2
Экстракции измельченных листьев олеандра при помощи горячей воды
Экстракция при помощи горячей воды, как правило, используется для извлечения олеандрина и других активных компонентов из листьев олеандра. Примеры способов экстракции при помощи горячей воды можно найти в патентах США No. 5135745 и No. 5869060.
Экстракцию при помощи горячей воды проводили с использованием 5 г измельченных листьев олеандра. К измельченным листьям олеандра добавляли десять объемов кипящей воды (по массе исходного материала олеандра) и смесь непрерывно перемешивали в течение 6 часов. Затем смесь фильтровали, собирали остаток листьев и снова экстрагировали в тех же условиях. Фильтраты объединяли и лиофилизировали. Полученный экстракт имел коричневый цвет. Высушенный экстрагированный материал имел массу, равную приблизительно 1,44 г. Экстрагированный материал массой 34,21 мг растворяли в воде и подвергали анализу на содержание олеандрина при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии. Количество олеандрина в экстракте было определено равным 3,68 мг. Выход олеандрина, из расчета на количество экстракта, составил 0,26%. Приведенная ниже таблица показывает сравнение между выходами олеандрина в двух экстракциях с использованием диоксида углерода в сверхкритическом состоянии по Примеру 1 и при экстракции горячей водой.
Сравнение выходов
Экстрагент
Выход олеандрина из расчета на общую массу экстракта
Двуокись углерода в сверхкритическом состоянии: Пример 1, Способ A
0,76%
Двуокись углерода в сверхкритическом состоянии: Пример 1, Способ B
2,1%
Горячая вода: Пример 2
0,26%
Пример 3
Лечение неврологического состояния, включая, но не ограничиваясь, болезнь Альцгеймера
Способ А. Терапия экстрактом
Субъекту с болезнью Альцгеймера назначают сердечные гликозиды, и терапевтически релевантные дозы вводят субъекту в соответствии с заданным режимом дозирования в течение определенного периода времени. Периодически определяют уровни терапевтического ответа у субъекта. Если уровень терапевтической реакции на одну дозу слишком низкий, то дозу увеличивают согласно заранее определенной схеме увеличения доз, до тех пор, пока у субъекта не будет достигнут желаемый уровень терапевтического ответа. Лечение субъекта экстрактом, фракцией или субфракцией продолжают по мере необходимости, и доза или режим дозирования может быть скорректирован по мере необходимости, пока пациент не достигнет желаемого конечного клинического состояния.
Способ В. Комбинированная терапия: экстракт и другой терапевтический агент
Для лечения болезни Альцгеймера или ее симптомов применяют способ A, описанный выше, за исключением того, что субъекту вводят один или несколько других терапевтических агентов. При этом один или несколько других терапевтических агентов можно вводить до, после или одновременно с экстрактом. Также может быть выполнено повышение дозы (или снижение дозы) одного или нескольких других терапевтических агентов. Подходящий один или несколько других терапевтических агентов включают Namenda™ (мемантин HCl), Aricept™ (донепезил), Razadyne™ (галантамин), Exelon™ (ривастигмин), Cognex™ (такрин) и амантадин.
Пример 4
Лечение неврологических состояний, включая, но не ограничиваясь, болезнь Хантингтона.
Способ А. Терапия экстрактом
Субъекту с болезнью Хантингтона назначают экстракт, и терапевтически релевантные дозы вводят субъекту в соответствии с заданным режимом дозирования в течение определенного периода времени. Периодически определяют уровни терапевтического ответа у субъекта. Если уровень терапевтической реакции на одну дозу слишком низкий, то дозу увеличивают согласно заранее определенной схеме увеличения доз до тех пор, пока у субъекта не будет достигнут желаемый уровень терапевтического ответа. Лечение субъекта экстрактом продолжают по мере необходимости, и доза или режим дозирования может быть скорректирован по мере необходимости, пока пациент не достигнет желаемого конечного клинического состояния. Вводимые дозы могут быть аналогичны Примеру 3 или иными, как описано здесь.
Способ В. Комбинированная терапия: экстракт и другой терапевтический агент
Для лечения болезни Хантингтона или ее симптомов применяют способ A, описанный выше, за исключением того, что субъекту вводят один или несколько других терапевтических агентов. При этом один или несколько других терапевтических агентов можно вводить до, после или одновременно с экстрактом. Также может быть выполнено повышение дозы (или снижение дозы) одного или нескольких других терапевтических агентов. Подходящий один или несколько других терапевтических агентов включают витамин Е, баклофен (производное CoQ10), ламотригин (противосудорожное средство), ремацемид (анестетик, антагонист NMDA с низкой аффинностью) и рилузол (блокатор натриевого канала).
Пример 5
Лечение неврологических состояний, включая, но не ограничиваясь, ишемический инсульт.
Способ А. Терапия экстрактом
Субъекту с ишемическим инсультом назначают экстракт, и терапевтически релевантные дозы вводят субъекту в соответствии с заданным режимом дозирования в течение определенного периода времени. Периодически определяют уровни терапевтического ответа у субъекта. Если уровень терапевтической реакции на одну дозу слишком низкий, то дозу увеличивают согласно заранее определенной схеме увеличения доз до тех пор, пока у субъекта не будет достигнут желаемый уровень терапевтического ответа. Лечение субъекта экстрактом продолжают по мере необходимости, и доза или режим дозирования может быть скорректирован по мере необходимости, пока пациент не достигнет желаемого конечного клинического состояния. Вводимые дозы могут быть аналогичны Примеру 3 или иными, как описано здесь.
Способ В. Комбинированная терапия: экстракт и другой терапевтический агент
Для лечения ишемического инсульта или его симптомов применяют способ A, описанный выше, за исключением того, что субъекту вводят один или несколько других терапевтических агентов. При этом один или несколько других терапевтических агентов можно вводить до, после или одновременно с экстрактом. Также может быть выполнено повышение дозы (или снижение дозы) одного или нескольких других терапевтических агентов.
Пример 6
Аанализ растворов, содержащих олеандрин, при помощи ВЭЖХ
Образцы (олеандрин стандарт, SCF экстракт и экстракт, полученный с помощью горячей воды) анализировали с помощью ВЭЖХ (Waters) используя следующие условия: колонка Symmetry C18 (5,0 мкм, 150×4,6 мм внутр. диам.; Waters); подвижная фаза МеОН:вода=54:46 (объем/объем); расход 1,0 мл/мин. Длина волны детектирования составляла 217 нм. Образцы готовили путем растворения соединения или экстракта в фиксированном количестве растворителя для ВЭЖХ до достижения приблизительно целевой концентрации олеандрина.
Пример 7
Определение экспрессии α3 и α1 в нормальной нервной ткани
Выполняли процедуры, изложенные в международной заявке РСТ PCT/US08/82641, поданной 6 ноября 2008 г., на имя Phoenix Biotechnology, Inc., полное раскрытие которой включено в настоящее описание в виде ссылки.
Пример 8
Оценка сердечного гликозида и экстракта по изобретению в анализе in vitro для состояний, относящихся и не относящихся к инсульту
Способ А. Инсульт: получение срезов коры мозга и выполнение процедуры OGD.
2
Срезы неокортекса мозга были получены от новорожденных семидневных крыс Sprague-Dawley в возрасте 7 дней. Кору головного мозга рассекали, нарезали пластины толщиной 400 мкм и перед культивированием переносили в контейнер, содержащий холодную искусственную спинномозговую жидкостью с 1 мкМ МК-801; МК-801 в каких-либо последующих процедурах не использовался. Для имитации ишемического повреждения с использованием транзиетного недостатка кислорода и глюкозы (OGD), срезы из одного полушария каждого мозга подвергали, при барботировании азотом, воздействию искусственной спинномозговой жидкости, не содержащей глюкозы, в течение 7,5 мин при пониженном содержании кислорода (0,5%) в окружающей среде. Затем срезы, подвергшиеся процедуре OGD, помещали на нитроцеллюлозные мембраны или на мембраны Millicell (Millipore) параллельно с контрольными срезами из контралатерального полушария, которые были подготовлены аналогично, за исключением того, что процедура OGD для них не выполнялась. Через 30 минут после помещения на мембраны, пары срезов мозга были трансфицированы, их переносили в 24-луночные планшеты и инкубировали в увлажненных камерах при 37°С в атмосфере с 5% CO. В каждом эксперименте применяли режим 5-6 минутного недостатка кислорода и глюкозы (OGD) для индуцирования потери более 50% здоровых нейронов коры за 24 часа. В качестве внутреннего положительного контроля использовали установленную концентрация (3 мкМ) нериифолина (сердечного гликозида). Для нейропротекции, обеспечиваемой олеандрином (сердечным гликозидом), в первых двух экспериментах использовали три концентрации в диапазоне от 0,3 до 3 мкМ, при этом в третьем испытании концентрации олеандрина были снижена до порогового значения для нейропротекции, которое находилось между 0,1 и 0,3 мкМ. Нефракционированный экстракт, например из видов Nerium, или его фракция может использоваться также, как это описано для олеандрина.
Способ B. Состояние, не относящееся к инсульту: анализ срезов мозга
Олеандрин и PBI-05204, нефракционированный SCF экстракт из Nerium oleander, были исследованы в тесте с использованием "неинсультных" срезов мозга, т.е. таких, которые после получения и трансфицирования YFP не подвергались дополнительному повреждению за счет процедуры OGD (см. экспериментальную процедуру, описанную выше). Авторы установили, что ряд нейропротекторных соединений, включая нериифолин, могут обеспечить незначительные уровни нейропротекции таких срезов мозга, вероятно в объеме защиты от травмы, вызванной процессом получения срезов и их культивирования. Полученные данные показывают, что олеандрин и экстракт в состоянии обеспечить нейропротекцию таких срезов мозга, не подвергавшихся процедуре OGD, на том же уровне, что и нериифолин, показывая тем самым, что сердечные гликозиды обеспечивают нейропротекцию даже при отсутствии условий недостатка кислорода или глюкозы.
Пример 9
Оценка сердечных гликозидов и экстракта в in vitro анализе по лечению болезни Альцгеймера
В модели со срезами головного мозга крыс с APP/A-бета-индуцированной дегенерацией пирамидальных нейронов оболочки, полученной при помощи баллистической трансфекции, применяют не только введение жизненно важных маркеров, таких как YFP; в эту же группу нейронов срезов мозга также вводят конструкты генов, ответственных за заболевание. Таким образом, модель среза мозга с ΑΡΡ/Αβ совместно транфицируют YFP с изоформами APP, что приводит к прогрессирующей дегенерации пирамидальных нейронов оболочки в течение 3-4 дней после получения срезов мозга и их трансфекции. Полученные данные показывают, что олеандрин, также как и PBI-05204, нефракционированный SCF экстракт из Nerium oleander, способны обеспечить зависимую от концентрации нейропротекцию в APP-трансфицированных срезах мозга, сохраняя нейроны до уровней, приблизительно соответствующих уровням, которые обеспечивают препараты ингибиторов ВАСЕ.
Пример 10
Оценка сердечного гликозида и экстракта в in vitro анализе с совместным кортикостриарном культивированием для болезни Хантингтона
В этом анализе, вместо интактных срезов мозга, использовали 96-луночные планшеты с совместной культурой высокой плотности нейронов коры мозга, стриарных нейронов и глии, в которую введены с помощью электропорации мутантные htt. Цель этого анализа состоит в объединении результатов, получаемых в биологической/клинической комплексной системе на основе первичной культуры, которая повторяет ключевые аспекты взаимосвязи популяции нейронов с заболеванием в условиях in vivo, с возможностью проведения крупномасштабных, полностью автоматизированных скрининговых исследований. В этом анализе in vitro, трансфицированные мутантные htt вызывают в течение 1-2 недель прогрессирующую дегенерацию стриарных нейронов и нейронов коры мозга, которую затем количественно определяют с использованием системы автоматизированного захвата изображений и алгоритмов обнаружения объектов на платформе Cellomics ArrayScan VTI. Каждая точка данных была получена на основе анализа 6 лунок, при этом от каждой лунки получали по 16 изображений, которые были автоматически захвачены, обработаны и проанализированы на приборе Cellomics ArrayScan, используя протоколы, разработанные в ходе крупномасштабных скрининговых исследований, проведенных в ассоциации с фондом Cure Huntington's Disease Initiative. В целом, в каждом из циклов, выполнявшихся 4 раза в неделю, было собрано и проанализировано около 25000 изображений.
Кортикостриарный анализ с совместным культивированием
В 96-луночных планшетах для культивирования, перед помещением в них нейронов, были получены чистые глиальные культуры со слиянием глиальных гранул. Кортикальную и стриарную ткань по отдельности диссоциировали и затем "нуклеофицировали" соответствующими конструктами ДНК для дальнейшей возможности отличать их друг от друга по экспрессии различных флуоресцентных белков, таких как YFP, CFP и mCherry. Затем эти отдельно трансфицированные нейроны коры мозга и стриарные нейроны тщательно смешивали и помещали в 96-луночные планшеты, содержащие предварительно выполненное покрытие из глиального монослоя.
2
Олеандрин и PBI-05204 (экстракт из Nerium oleander, полученный с помощью сверхкритического СО) были испытаны в этой системе на основе совместной кортикостриарной культуры, и предварительно было установлено, что эти соединения были самыми активными из более чем 400 известных в настоящее время молекул лекарственных веществ, которые были оценены в этой тест-системе. Здесь представлен для сравнения график зависимости "доза-реакция" для KW6002 (антагонист аденозинового рецептора 2а), т.е. соединения, которое обычно используют в качестве положительного контроля для этого анализа с совместным культивированием. Эффективность олеандрина сравнима с KW6002, при этом его активность практически в 100 раз выше (Фиг. 3A-3D).
Пример 11
Оценка фракции SCF экстракта из Nerium oleander в анализе in vitro для болезни Альцгеймера, с использованием APP
Фракция была получена согласно Примеру 13. Это испытание было проведено аналогично Примеру 9. Данные, представленные на Фиг. 6, показывают, что для фракции О-4A имеет место зависимый от концентрации эффект по предотвращению нейродегенерации, ассоциированной с введением конструкта APP. В частности, эти данные показывают, что нейропротекция достигалась при диапазоне концентраций в интервале от 3 до 30 мкг/мл.
Пример 12
Оценка фракции SCF экстракта из Nerium oleander в анализе in vitro для болезни Альцгеймера, с использованием tau4R
Фракция была получена согласно Примеру 13. Данные, представленные на Фиг. 6, показывают, что для фракции О-4A имеет место зависимый от концентрации эффект по предотвращению нейродегенерации, ассоциированной с введением конструкта Tau. В частности, эти данные показывают, что нейропротекция достигалась при диапазоне концентраций в интервале от 3 до 30 мкг/мл. Имеет место существенное различие между клетками, обработанными конструктом Tau, и клетками, которые подверглись воздействию раствора фракции О-4A.
Пример 13
Хроматографическое фракционирование SCF экстракта
2
Сверхкритический экстракт (5 г) из листьев олеандра (полученный, как описано здесь, путем экстракции растительной массы смесью CO в сверхкритических условиях с добавкой EtOH в качестве сорастворителя/модификатора; образец #270111) суспендировали в воде (150 мл) и три раза разделяли на фазы с использованием гексана (каждый раз по 150 мл). Водный слой подвергали фракционированию на открытой колонке с ODS C-18 (силикагель, функционализированный на 20-22% октадецилом, зернистость - 200-400 меш) размером 400 мм (длина) × 38 мм (внутр. диам.) с помощью нанесения слоя воды непосредственно на слой смолы ODS, уравновешенную водой. Колонку последовательно обрабатывали смесью воды и метанола (1000 мл 30% метанола в воде, 1000 мл 55% метанола в воде, 1000 мл 80% метанола в воде, 1000 мл 100% метанола) и смесью ацетон:метанол ( соотношение по объему 2:1, 1000 мл). Собирали выходящий раствор (1000 мл) для каждой смеси. Растворитель из каждой фракции удаляли путем упаривания, и получали пять фракций, а именно Fr-O-1, Fr-O-2, Fr-О-3, Fr-О-4 и Fr-О-5. Фракции анализировали с помощью ВЭЖХ, как описано в Примере 14.
Пример 14
ВЭЖХ анализа фракций SCF экстракта
Целью этого анализа была идентификация фракций экстракта (см. выше), содержащих сердечные гликозиды. Образцы каждой фракции, полученной в соответствии с Примером 13, были проанализированы следующим образом. Фракцию (1-3 мг) растворяли в 1-5 мл водного раствора метанола (80% метанола в воде). Разбавленный образец (10-25 мкл) анализировали на колонке Agilent Zorbax SB-C18 с использованием в качестве подвижной фазы 80%-ного раствора метанола в воде при скорости потока 0,7 мл/мин и с использованием для контроля потока DAD-UV-детектора при длинах волн 203, 210, 217, 230, 254, 280, 310 и 300 нм.
Пример 15
Тест на срезах мозга по определению нейропротекции, обеспечиваемой фракциями экстракта
Этот анализ проводили в соответствии с Примером 8. Данные показывают, что в сравнении с необработанными (OGD) срезами мозга PBI-05204 обеспечивает значительный уровень защиты нейронов от повреждения, опосредованное инсультом. Аналогичный уровень нейропротекции был достигнут при использовании фракции О-4A (Фиг. 4A и 5), а также фракции О-3 (Фиг. 4С) и фракции О-1 (Фиг. 4D). В противоположность этому, в этой OGD модели инсульта, опосредованной ишемическим повреждением мозга, для фракции О-2 (Фиг. 4В) и 0-5 (Фиг. 4E) не было выявлено нейропротекторных эффектов.
Пример 16
Анализ среза мозга для определения нейропротекции с задержкой во времени
Этот анализ был проведен в соответствии с Примером 8, за исключением того, что были внесены следующие изменения. Заданный период времен соответствовал времени между OGD и применением предлагаемого нейропротектора. Была определена способность PBI-05204 обеспечить нейропротекцию в срезах мозга, когда лечение было отсрочено по отношению времени выполнения процедуры OGD. Данные показали, что в случае использования экстрактов Nerium oleander задержки на 2 часа хорошо переносятся, при этом уровни нейропротекции были аналогичными, как и в случае применения PBI-05204 сразу после процедуры OGD. Эффективность нейропротекции была снижена при использовании PBI-05204 с задержкой, равной от 4 до 6 часов, но она находилась на уровне нейропротекции, который еще являлся значительным и физиологически значимым.
Пример 17
Идентификация соединений во фракции SCF экстракта из Nerium oleander, полученной согласно Примеру 13
Воду и метанол, присутствующие во фракции Fr-O-4, удаляли выпариванием при пониженном давлении. Остаток, содержащий фракцию Fr-O-4 по Примеру 13, подвергали хроматографии на силикагеле (см. ниже), чтобы получить субфракции, которые затем анализировали с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ). Фракции, имеющие сходные профили при ТСХ, объединяли, и удаляли из них растворители выпариванием при пониженном давлении. Остальные остатки анализировали с использованием метода Н-ЯМР.
Тонкослойная хроматография
2
4
ТСХ проводили на обычных пластинах аналитической чистоты для ТСХ с использованием смеси гексан:этилацетат (в соотношении 7:3 по объему). Соединения были визуализированы с использованием HSO, в результате чего стероиды приобретали синий цвет, а тритерпены приобретали фиолетовый цвет.
Перед дальнейшим фракционированием с использованием флэш-хроматографии, ТСХ анализ Fr-O-4-фракции показал наличие одного главного пятна и более пяти небольших пятна. Цветная реакция показала, что главное пятно содержит смесь стероидов и тритерпенов, а большинство небольших пятен содержит стероиды.
Хроматография на силикагеле
Силикагель (Biotage; 10-15 г) загружали в колонку и уравновешивали смесью этилацетата (3%) и гексана (97%). Остаток фракции Fr-O-4 был растворен в смеси этилацетата (3%) и гексана (97%) объемом 0,2-0,5 мл, и раствор ввели в колонку. Флэш-хроматографию проводили с использованием градиента растворителя, который представлял собой раствор этилацетата (3%-30%) в гексане (97%-70%, соответственно), а затем с использованием 100% метанола. Субфракции, собранные из колонки, анализировали с помощью ТСХ (см. выше) и фракции, имеющие сходные профили при визуализации ТСХ, объединяли и концентрировали удалением растворителя.
Н-ЯМР спектроскопия
Образец каждой сконцентрированной субфракции, полученной при помощи флэш-хроматографии, анализировали с использованием метода Н-ЯМР, применяя обычные способы для определения структурных классов основных компонентов.
Пример 18
Идентификация соединений в нефракционированной форме SCF экстракта из Nerium oleander, полученного согласно Примеру 1 (способ В)
SCF экстракт анализировали с помощью MS- DART TOF анализа следующим образом.
Был использован масс-спектрометр модели JEOL AccuTOF DART- (Jeol США, Peobody, штат Массачусетс, США). Анализы проводили в режиме положительных ионов (DART+), получая массы соответствующих ионов М+ и Н+, образующихся при DART-MS. Были использованы диапазоны настроек прибора, определенные как оптимальные условия при анализе N. oleander. Основные параметры DART+ включали: напряжение на игле 3500 В, напряжение на диафрагме 1-2-20 В; напряжение на фокусирующих кольцах 2-5 В; напряжение на диафрагме 2-2-5 В, и напряжение на конусе 1000 В. Внутренняя калибровка для каждого образца проводились с использованием 10%-ного раствора ПЭГ 600, который обеспечивает маркеры массы во всем требуемом диапазоне масс, составляющем 100-1000 массовых единиц. Другие анализы в DART-режиме были выполнены при следующих настройках: напряжение на игле 3500 В; температура нагревательного элемента 250°С; напряжение на электроде 1-150 В; напряжение на электроде 2-250 В; скорость подачи гелия 3,79 л/мин. Настройки масс-спектрометра: MCP 2600 В; напряжение на диафрагме 1-15 В; напряжение на фокусирующих кольцах 5 В, напряжение на диафрагме 2-5 В и напряжение на конусе 1000 В. Внутренняя калибровка для каждого образца проводилась с использованием раствора перфторированных карбоновых кислот, который обеспечивает маркеры массы во всем требуемом диапазоне масс, составляющем 100-1000 массовых единиц.
Пробы N. oleander были введены непосредственно в гелиевую плазму в DART с использованием закрытого конца трубки из боросиликатного стекла с высокой температурой плавления. Капиллярная трубка удерживалась в гелиевой плазме в течение приблизительно 3-5 с для каждого анализа. Молекулярные формулы были подтверждены элементным составом и изотопным соответствием по программам, поставляемых вместе с прибором JEOL AccuTOF DART-MS. Была использована поисковая база данных компонентов N. oleander, разработанная HerbalScience (Naples, штат Флорида, США).
Было установлено, что SCF-экстракт содержит по меньшей мере следующие компоненты, представленные с указанным относительным содержанием (%):
Компонент
Относительное содержание (%)
Олеандрин
2,99
Олеандригенин
3,31
Урсоловая кислота/бетулиновая кислота
15,29
Одорозид
0,80
Олеанолевая кислота
0,60
Урс-12-ен-3β,28-диол/бетулин
5,44
3β,3β-гидрокси-12-олеан-ен-28-оевая кислота
14,26
28-норурс-12-ен-3β-ол
4,94
Урс-12-ен-3β-ол
4,76
Термин "приблизительно" или "около", как используется здесь, если не указано иное, подразумевает нормированное значение, равное ±10%, ±5%, 2,5% или ±1%. Как используется здесь, если не указано иное, термин "по существу" в данном случае означает "в значительной степени", "по меньшей мере большая часть", что составляет более 70%, более 85%, более чем 90%, более 95%, более 98% или более 99%.
Выше приведено подробное описание конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения. Следует иметь в виду, что конкретные варианты осуществления настоящего изобретения были описаны здесь в иллюстративных целях, поэтому могут быть осуществлены их различные модификации без отступления от сущности изобретения и объема притязаний. Соответственно, изобретение не ограничено ничем, кроме как прилагаемой формулой изобретения. Все варианты осуществления, описанные и заявленные здесь, могут быть выполнены и осуществлены без излишних экспериментов в свете настоящего описания.