Определение параметров гидрофобности олигомицинов

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

Определение параметров гидрофобности олигомицинов

А. Н. ДАНИЛЕНКО', М. В. БИБИКОВА2, И. А. СПИРИДОНОВА2

1 Институт биохимической физики им. Н. М. Эммануэля РАН, Москва

2 ООО «ВИОРИН», Москва

Determination of Oligomycins Hydrophobicity Parameters

A. N. DANILENKO, M. V. BIBIKOVA, I. A. SPIRIDONOVA

N. M. Emmanuel Institute of Biochemical Physics, Russian Academy of Sciences, Moscow VIORIN, Moscow

Методом ВЭЖХ определены параметры гидрофобности пяти олигомицинов: A, B, C, F и SC-II, установлено расположение олигомицинов по возрастанию параметра гидрофобности: олигомицин В < олигомицин SC-II < олигомицин А < оли-гомицин F < олигомицин C.

Ключевые слова: антибиотики, олигомицины A, B, C, F, SC-II, гидрофобность.

The parameters of hydrophobicity of five oligomycins, i. e. A, B, C, F and SC-II were determined by HPLC. The location of the ascending hydrophobicity parameter was set: oligomycin B <oligomycin SC-II <oligomycin A <oligomycin F <oligomycin C.

Key words: antibiotics, oligomycins A, B, C, F, SC-II, hydrophobicity.

Группа макролидных антибиотиков, механизм действия которых в первую очередь связан с подавлением активности Р^-АТФазы митохондрий, вызывают большой интерес в связи широким спектром их биологической активности: проявляют высокую антигрибную и антипаразитарную активность, являются высокоспецифичными иммуносупрессорами, проявляют противовирусную, противоопухолевую активности, при этом особый интерес определяется способностью олигомицинов ингибировать МЛУ опухолевых клеток [1, 2]. К этим антибиотикам, общим элементом структуры которых являются 26-членные макролидные агликоны, относятся олигомицины с известной химической структурой, а также близкие по структуре и механизму действия апоптолидин, оссамицин и др. [3]. Ведутся исследования по получению полусинтетических производных этих антибиотиков [4].

Рассматриваемые антибиотики продуцируются актиномицетами и, будучи гидрофобными соединениями, извлекаются органическим растворителями из мицелия продуцента после биосинтеза.

Гидрофобность молекул лекарственных препаратов играет важную роль в их адсорбции и прохождении через мембраны [5]. Для количест-

© Коллектив авторов, 2014

Адрес для корреспонденции: 117105 Москва, Нагатинская ул., д. 3а. ООО «Виорин»

венной оценки гидрофобности молекул традиционным прямым методом является измерение распределения веществ в системе октанол—во-да[6], однако он является весьма трудоёмким, поэтому в настоящее время для оценки гидрофобности веществ разработан метод ВЭЖХ в об-ращённых фазах [7].

В литературе отсутствуют данные по сравнительному исследованию гидрофобности оли-гомицинов. В данной работе оптимизированы условия разделения пяти олигомицинов (A, B, С, F и SC-II) и определены индексы их гидро-фобности.

Материал и методы

Олигомицины A, B и C были выделены из мицелия культуры Streptomyces griseolus 182, олигомицин F получен из культуры Streptomyces sp. 31, а олигомицин SC-II — из культуры Streptomyces sp. 17. [8, 9].

Антибиотики из мицелия экстрагировали ацетоном и реэк-страгировали этиловым эфиром, проводили очистку колоночной хроматографией, а окончательную очистку проводили методом ВЭЖХ на колонке Zorbax С18 (250x22 мм, 5 мкм); в качестве подвижной фазы использовали смесь метанол — вода в соотношении 85:15 (v/v) при скорости протока 8 мл/мин. Детектирование осуществляли рефрактометрическим детектором, объём вводимой пробы — 1 мл при концентрации 50 мг/мл.

Химическая структура антибиотиков была установлена на основании данных двухмерного ЯМР.

Хроматографические исследования олигомицинов проводили на хроматографе Gilson в изократическом режиме на колонке Reprosil PUR C8 (150x4,6; 5 мкм). В качестве подвижной фазы использовали смесь метанол—вода в диапазоне объёмных соотношений: 74/26—86/14. На колонку наносили 25 мкл растворов индивидуальных олигомицинов или их смесей

о

Олигомнцнн & Ка Я? И4 Яб 1*7 Я*

А Н СН5 Н н он СНз о СНз

В Н СН3 Н он он СНз о СНз

С н СН3 Н н н СНз 0 СНз

р сн3 Н н н он н 0 СНз

БС-П н СН3 н н он СНз он н

Рис. 1. Структура олигомицинов А, В, С, А, БС-П.

с концентрациями 40 мкг/мл. Скорость протока подвижной фазы варьировали от 0,7 до 1,5 мл/мин. Основные эксперименты были проведены при оптимальной (наилучший фактор разделения олигомицинов) скорости протока подвижной фазы, равной 1 мл/мин. Детектирование пиков проводили УФ-детектором при длине волны 225 нм, соответствующей их максимальной экстинции.

Результаты и обсуждение

На рис. 1 приведены химические формулы пяти исследованных олигомицинов, видно что они отличаются друг от друга только боковыми группами. На рис. 2 приведена хроматограмма смеси пяти идентифицированных олигомици-нов. Идентификация хроматографических пиков была проведена с использованием внутренних стандартов следующим образом: в растворы пяти проб смесей олигомицинов объёмами 1 мл ( кон-

центрация каждого олигомицина 40 мкг/мл) было добавлено по 200 мкг каждого из олигомици-нов и проведен хроматографический анализ каждой пробы. Хроматографический пик, площадь которого возрастала в несколько раз по сравнению с площадями других пиков, был отнесён к олигомицину, который добавлялся в пробу (хро-матораммы не приводятся).

В табл. 1 приведены данные о временах (1;г) и факторах удерживания (^ к) для олигомицинов в зависимости от объёмной доли метанола (<) в подвижной фазе. Фактор удерживания определяли по формуле:

к = (1Г- 1о) / 1о

где: ^ — времена удерживания олигомицинов; 10 — время, соответствующее мёртвому объёму колонки и равное 2,16 мин.

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

Использованы данные, приведённые в табл. 1, а также уравнение из [7]:

log k = log kw — S^p,

где: log kw — параметр гид-рофобности, получаемый экстраполяцией log k от объёмной доли метанола в подвижной фазе к нулевому значению.

Были определены параметры гидрофобности исследуемых олигомицинов (табл. 2).

Из данных табл. 2 следует, что олигомицины по возрастанию параметра гидрофобности могут быть рассмотрены следующим образом: олигомицин В < олигомицин SC-II < олигомицин А < олигомицин F < олигомицин C.

Заключение

В результате сравнительного анализа методом ВЭЖХ определены численные значения параметров гидрофобности 5 известных

Таблица 1. Зависимость факторов удерживания (log k) олигомицинов от объёмной доли метанола (р) в подвижной фазе.

Объёмная доля метанола

0,74 Олигомицин В 21,11 0,943

Олигомицин SC-II 29,26 1,099

Олигомицин A 34,05 1,169

Олигомицин F 46,43 1,312

Олигомицин С 52,12 1,364

0,76 Олигомицин В 16,25 0,814

Олигомицин SC-II 22,28 0,969

Олигомицин A 25,36 1,031

Олигомицин F 34,12 1,170

Олигомицин С 37,53 1,214

0,78 Олигомицин В 10,41 0,582

Олигомицин SC-II 14,20 0,746

Олигомицин A 16,04 0,808

Олигомицин F 20,52 0,929

Олигомицин С 23,14 1,045

0,80 Олигомицин В 8,57 0,472

Олигомицин SC-II 11,40 0,631

Олигомицин A 12,52 0,681

Олигомицин F 16,01 0,807

Олигомицин С 17,41 0,849

0,82 Олигомицин В 6,43 0,296

Олигомицин SC-II 8,27 0,452

Олигомицин A 9,07 0,505

Олигомицин F 10,58 0,591

Олигомицин С 11,58 0,640

0,86 Олигомицин В 4,23 -0,019

Олигомицин SC-II 5,12 0,137

Олигомицин A 5,27 0,157

Олигомицин F 6,14 0,266

Олигомицин С 6,45 0,298

Рис. 2. Хроматограмма смеси олигомицинов — В; БС-11; А; F и С.

Условия хроматографирования: колонка КергоБИ С8 (150x4,6 мм; 5 мкм); подвижная фаза - 78% метанол с водой; скорость протока - 1 мл/мин; объём пробы, наносимой на колонку - 25 мкл (с=40 мкг/мл каждого олигомицина в смеси); детектирование УФ при 225 нм.

Таблица 2. Параметры гидрофобности олигомицинов

Олигомицины

log kw

po

Уравнения зависимости log k от объёмной доли метанола в подвижной фазе

Олигомицин-B 6,9248 86 7 log k = -8,0800p + 6,9248 R2 = 0,9956

Олигомицин-SC-II 7,0870 87 6 log k = -8,0857p + 7,0870 R2 = 0,9965

Олигомицин-A 7,4414 87 9 log k = -8,4657p + 7,4414 R2 = 0,9974

Олигомицин-F 7,8572 88 9 log k = -8,8379p + 7,8572 R2 = 0,9960

Олигомицин-C 8,0887 89 3 log k = -9,0593p + 8,0887 R2 = 0,9980

Примечание. log kw - параметр гидрофобности, полученный экстраполяцией log k от концентрации метанола в подвижной фазе к нулевому значению; <0 - индекс гидрофобности, соответствует процентному содержанию органической фазы в подвижной фазе, при котором время удерживания вещества превышает в два раза мертвое время (log k=0).

олигомицинов. Это позволяет связать химическую структуру олигомицинов с уровнем их гидрофобности. Полученные данные важны для

прогнозирования уровня гидрофобности новых природных и полусинтетических олигомицинов.

ЛИТЕРАТУРА

1. Бибикова М. В., Грамматикова Н. Э. и др. Механизм биологической активности макролидных антибиотиков-ингибиторов F0F1-АТФазы. Антибиотики и химиотер 2003; 12: 25—32.

2. Laatsch H, Kellner M, Gerhard Wolfä G. et al. Oligomycin F, a new immunosuppressive homolog of oligomycin A. J Antibiot 1993; 46; 9; 1334—1341.

3. Salomon A. R, Voehringer D. W, Herzenberg L. A., Khosla C. Understanding and exploiting the mechanistic basis for selectivity of polyketide inhibitors of F0FrATPase PNAS 2000; 97: 26: 14766— 14771.

4. Лысенкова Л. H, Королев А. М, Штиль А. А. И др. Цитотоксичес-кие полусинтетические производные макролидного антибиотика олигомицина А и способ их получения. Патент на изобретение №2454420, РФ, 2012.

Wender P. A., Janhowski O. D, Tabet E. A., Sato H. Toward a structure-activity relationship for appoptolidin: selective functionalization of the hydroxyl group array. Org Lett 2003; 5: 4: 487—490. Fujita T, Iwasa J., Hansch C. A new substituent constant, pi, derived from partition coefficients. J Am Chem Soc 1964; 86: 5175—5180. Valko K, Siegel P. New chromatographic hydrophobicity index(<0) based on the slope and the intercept of the log K' versus organic phase concentration plot. J Chromatography 1993; 631: 49—61. Кабанов A. E, Даниленко A. H, Спиридонова И. А. и др. Определение структуры основного копонента антибиотического комплекса, образуемого Streptomyces griseolus 182. Антибиотики и химиотер 2003; 48: 10: 16—20.

Бибикова М. В., Грамматикова Н. Э, Спиридонова И. А. и др. Штамм Streptomyces sp. 17 — продуцент олигомицина SC-II (характеристика продуцента, биологические свойства антибиотика). Антибиотики и химиотер 2012; 57: 7—8: 3—6.