СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭРИТРОЦИТАРНОГО ДИАГНОСТИКУМА ДЛЯ РЕАКЦИИ НЕПРЯМОЙ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ ПРИ КОКСИЕЛЛЕЗЕ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
METHOD OF OBTAINING ERYTHROCYTE DIAGNOSTICUM FOR REACTION OF INDIRECT HEMAGGLUTINATION IN CATTLE COCCIELLOSIS

Способ получения эритроцитарного диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации относится к методам лабораторной диагностики коксиеллеза и может быть использован в ветеринарной медицине.
Известны способы получения эритроцитарных диагностикумов, ранее используемые для реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) при сальмонеллезе, пастереллёзе животных, описанные в рефератах российских патентных документов за 1994-2008 гг. (M№ 2257581, 2005.07.27, 95117746, 1997.10.10).
Однако у известных способов присутствует ряд недостатков:
1. трудоемкие методы фиксации эритроцитов,
2. неэкономичные и сложные методы сенсибилизации эритроцитов сенситином,
3. проводится танизация.
Наиболее близким в техническом плане к заявляемому способу является бруцеллезный эритроцитарный диагностикум (Красиков А.П. Новые механизмы исскуственной регуляции паразито-хозяинных отношений: дис. доктора вет. наук.: 16.00.03. / А.П.Красиков. - Новосибирск - 1996. - С.97-101), который готовится по следующей схеме:
1. В качестве клеточной основы для приготовления диагностикума применяются эритроциты барана. При формалинизации эритроцитов используется свежая дефибринированная кровь барана - донора, которую разводят 1:1 буферным физиологическим раствором pH - 7,2 (0,137 M хлористый натрий и 0,001 M двузамещенный фосфорнокислый калий на 1 литр дистиллированной воды).
Фиксацию эритроцитов проводят по методу Фили в модификации Красикова А.П., которая заключается в более щадящем способе воздействия раствора формальдегида на эритроциты и одновременно обеспечивающая хорошую их фиксацию. Для чего к 100 мл разведенной крови раствор формальдегида добавлялся не сразу, а порциями, в возрастающих объемах, через определенный промежуток времени.
Так, к 100 мл 50% взвеси эритроцитов барана добавляют 20%-ный раствор формальдегида порциями в возрастающих объемах, через каждые 15 минут: 6, 7, 8, 9 и 10 мл. После каждого внесения смесь перемешивают на водяной бане при 70°C до получения темно-коричневого цвета. Взвесь эритроцитов 4-кратно отмывают фосфатно-буферным раствором pH 7,2, путем центрифугирования при 3000 об/мин 2-5 мин и ресуспендируют в 400 мл того же буфера. Из осадка готовят 10% рабочую взвесь на буферном физиологическом растворе, содержащем 0,3% 20%-ного раствора формальдегида. При данном способе фиксации эритроциты сохраняют свои сорбционные свойства в течение 5 лет.
2. Второй этап приготовления эритроцитарного диагностикума - получение антигена, который обладает способностью адсорбироваться на эритроцитах. С этой целью используется глубокодиссоциированный вакцинный штамм B.abortus 16/4. Антиген готовят по методике ВНИИБТЖ-ИЭВСиДВ. Для этого девитализированную бактериальную массу центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20-30 минут, надосадочную жидкость сливают, а на сырую бактериальную массу воздействуют расплавленным концентрированным фенолом (ХЧ) в соотношении 1:1.
Бактериальную массу с фенолом выдерживают 30-40 мин при 80-85°C на водяной бане. Затем добавляют дистиллированную воду, нагретую до 70°C, в таком количестве, чтобы остаточная концентрация фенола в растворе составила 5%. После фильтрации смеси проводят ее диализ при комнатной температуре в целлофановых мешочках против десяти объемов дистиллированной воды в течение 48 часов. Диализат используют в качестве антигена.
3. Танизацию эритроцитов исключают из цикла приготовления эритроцитарного диагностикума в связи с низким содержанием белка в полученном антигене.
Для нагрузки формалинизированных эритроцитов бруцеллезный антиген разводят 1:10 буферным раствором с pH 6,4. Данной дозой антигена сенсибилизируют эритроциты в соотношении 2:1 (2 объема антигена, 1 объем эритроцитов). Сенсибилизация проводится на водяной бане при температуре 70°C, в течение 30 мин при перемешивании взвеси через каждые 5 мин. За 10 мин до конца сенсибилизации для закрепления сенситина на эритроцитах добавляют 1% 40%-ного раствора формальдегида. Полученный эритроцитарный диагностикум трехкратно отмывают буферным раствором с pH 7,2 с добавлением отрицательной на бруцеллез нормальной кроличьей сыворотки в соотношении 1:250 путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 5 минут и доводят тем же буфером до 3%-ной концентрации эритроцитов с добавлением 1% формальдегида с целью закрепления антигена на эритроцитах.
Цель изобретения - получение коксиеллезного эритроцитарного диагностикума для выявления антител в сыворотке крови крупного рогатого скота.
Данная цель реализуется в несколько этапов:
1. дробная формалинизация эритроцитов барана,
2. получение антигена из вакцинного штамма C.burnetii M-44 путем прогревания его на водяной бане при 70°C в течение 30 мин,
3. сенсибилизация формалинизированных эритроцитов барана, без предварительной танизации коксиеллезным антигеном, при 70°C в течение 30 мин, с последующим трехкратным отмыванием эритроцитарного диагностикума буферным раствором с pH 7,2 без добавления нормальной кроличьей сыворотки.
Описание метода:
1. Для формалинизации (фиксации) эритроцитов берут свежую дефибринированную кровь барана-донора, которую разводят буферным физиологическим раствором в соотношении 1:1, pH 7,2 (0,137 M NaCl и 0,001 M двузамещенный фосфорнокислый калий на 1 литр дистиллированной воды). Фиксацию эритроцитов проводят по методу Фили в модификации Красикова А.П.
Затем к 100 мл 50% взвеси эритроцитов барана добавляют 20%-ный раствор формальдегида, небольшими порциями в возрастающих объемах, каждые 15 минут: 6, 7, 8, 9 и 10 мл. После каждого добавления раствора формальдегида смесь перемешивают на водяной бане при 70°C до получения темно-коричневого цвета. Взвесь эритроцитов 4-кратно отмывают фосфатно-буферным солевым раствором pH 7,2, путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 5 минут, а затем ресуспензируют в 400 мл того же буфера. Из полученного осадка готовят 10% рабочую взвесь на буферном физиологическом растворе, содержащем 0,3% 20%-ного раствора формальдегида. При данном способе фиксации эритроциты в течение 5 лет сохраняют свои сорбционные свойства.
2. Коксиеллезный антиген получают из вакцинного штамма C.burnetii М-44, инактивируют его путем прогревания на водяной бане при 70°C в течение 30 мин. Затем разводят стерильным физиологическим раствором до концентрации 1,7 млрд микробных клеток в 1 мл по бактериальному стандарту мутности (ГИСК им. Л.А.Тарасевича). В качестве рабочего используют разведение 850 млн микробных клеток в 1 мл. Полученный антигенный препарат используют для сенсибилизации формалинизированных эритроцитов.
3. Для нагрузки 3% формалинизированных эритроцитов их сенсибилизируют в соотношении 2:1 (2V антигена: 1V эритроцитов). Сенсибилизацию проводят на водяной бане при температуре 70°C в течение 30 мин, с перемешиванием взвеси каждые 5 минут. За 10 минут до конца сенсибилизации добавляют 1% 40%-ного раствора формальдегида для закрепления сенситина на эритроцитах.
Эритроциты, нагруженные антигеном трехкратно отмывают от несвязавшихся сенситинов фосфатно-буферным солевым раствором с pH 7,2 путем центрифугирования при 3000 об/мин, затем ресуспендируют в этом же растворе, доводя до первоначальной 3% концентрации и используют для постановки РНГА макрометодом в объеме 0,5 мл на полистироловых планшетах.
Испытуемые сыворотки, после освобождения от неспецифических гемагглютининов путем инактивации в течение 20 мин при 56°C, разводят в двукратной последовательности, начиная с разведения 1:10, фосфатно-буферным раствором с pH 7,2. К каждому разведению добавляют по одной капле (0,05 мл) эритроцитарного диагностикума, тщательно перемешивают встряхиванием и оставляют при комнатной температуре на 1,5-2 часа. Реакция оценивается по четырехкрестной системе. Конечным титром считают последнее разведение сыворотки, дающее гемагглютинацию на три креста.
Определены специфичность и активность четырех серий (C-1-C-4) коксиеллезного эритроцитарного диагностикума (КЭД) в РНГА (табл.1, 2).
Преимущество данного эритроцитарного диагностикума в специфичности и активности в РНГА при коксиеллезе крупного рогатого скота.
Контроль на чувствительность и активность КЭД в РНГА
Для контроля чувствительности и активности полученного эритроцитарного диагностикума проводят постановку РНГА. Реакцию ставят макрометодом в объеме 0,5 мл в полистироловых планшетах с коксиеллезными сыворотками кроличьей и крупного рогатого скота, начиная с разведений 1:10 и 1:50 соответственно. В качестве разбавителя применяют фосфатный буфер с pH 7,2. В качестве контроля используют этот же буфер и заведомо отрицательные на коксиеллез сыворотки кролика и крупного рогатого скота.
С коксиеллезными антисыворотками полученный диагностикум реагирует на три креста до разведения 1:1280 с кроличьей и 1:800 с сывороткой крупного рогатого скота. С отрицательными сыворотками отмечается положительная реакция до разведений 1:20 и 1:200 соответственно. В контроле с буферным раствором четко выраженная отрицательная реакция наблюдается во всех разведениях (табл.1).
Таблица 1
Активность КЭД в РНГА
Титр сыворотки
Сыворотка кроличья
ФБР
Титр сыворотки
Сыворотка КРС
ФБР
Негативная
Коксиеллезная
Негативная
Коксиеллезная
1:10
++++
++++
-
1:50
++++
++++
-
1:20
+++
++++
-
1:100
+++
++++
-
1:40
-
++++
-
1:200
+++
++++
-
1:80
-
++++
-
1:400
-
++++
-
1:160
-
++++
-
1:800
-
++++
-
1:320
-
++++
-
1:1600
-
++
-
1:640
-
++++
-
1:3200
-
+
-
1:1280
-
+++
-
1:6400
-
-
-
1:2560
-
++
-
1:12800
-
-
-
Контроль на специфичность КЭД в РНГА
Для контроля специфичности полученных серий коксиеллезного эритроцитарного диагностикума ставят РНГА с гетерологичными сыворотками. КЭД в РНГА не вызывает перекрестных реакций с бруцеллезной, пастереллезной, лептоспирозной, листериозной, сальмонеллезной и хламидиозной гетерологичными сыворотками, во всех разведениях РНГА отрицательная при четко выраженных положительных реакциях с гомологичными коксиеллезными сыворотками. Поэтому за диагностический (патологический) титр принимается разведение сыворотки 1:40 и выше для кроличьей сыворотки и 1:400 для крупного рогатого скота (табл.2).
Таблица 2
Специфичность КЭД в РНГА
КЭД
Стандартные диагностические сыворотки
Сыворотка кроличья
Сыворотка КРС
бруц
паст.
лепт.
лист.
сальм.
хлам.
1:40
1:400
C-1
-
-
-
-
-
++++
++++
C-2
-
-
-
-
-
-
++++
++++
C-3
-
-
-
-
-
-
++++
++++
C-4
-
-
-
-
-
++++
++++
Примечание: бруц. - бруцеллезная; паст. - пастерелезная, лепт. - лептоспирозная; лист. - листериозная; сальм. - сальмонеллезная; хлам. - хламидиозная.