ФЕРМЕНТ ДЛЯ ПРОДУКЦИИ ДЛИННОЦЕПОЧЕЧНОЙ ПЕРКИСЛОТЫ
FERMENT FOR PRODUCTS OF LONG-CHAIN PEROXY ACID

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА
Настоящая заявка заявляет на приоритет заявки на патент США № 11/595537, поданной 9 ноября 2006, которая является частичным продолжением находящейся на рассмотрении заявки на патент США № 10/581014, поданной 30 мая 2006, которая является регистрацией на национальной (США) фазе рассмотрения согласно § 371 раздела 35 свода законов США международной заявки на патент № US04/040438, которая заявляет на приоритет предварительной заявки на патент США № 60/526764, поданной 3 декабря 2003, которая в настоящее время отозвана.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящим изобретением обеспечиваются способы и композиции, включающие по крайней мере один пергидролазный фермент для мойки или очистки и других применений. В некоторых вариантах осуществления настоящим изобретением обеспечиваются способы и композиции для образования длинноцепочечных перкислот. Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения находят конкретное приложение в применениях, включающих мойку или очистку, отбеливание и дезинфекцию.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Моющее или чистящее средство и другие композиции для мойки или очистки обычно включают сложную комбинацию активных ингредиентов. Например, большинство продуктов для мойки или очистки включают систему поверхностно-активных веществ, ферменты для мойки или очистки, отбеливающие агенты, моющие компоненты, гасители стойкой пены, суспендирующие грязь агенты, грязеотталкивающие агенты, флуоресцентные осветлители, смягчающие агенты, диспергаторы, ингибирующие перенос красителя соединения, абразивы, бактерициды и отдушки. Несмотря на сложность находящихся в обращении моющих или чистящих средств, существует много пятен, которые трудно полностью удалить. Кроме того, часто существует накопление остатков, которое приводит к изменению цвета (например, пожелтению) и уменьшенной эстетичности из-за неполной мойки или очистки. Эти проблемы соединяются при увеличенном использовании низких температур стирки (например, в холодной воде) и укороченных циклов стирки. Сверх того, многие пятна состоят из сложных смесей волокнистых материалов, включающих, главным образом, углеводы и производные углеводов, волокно и компоненты клеточных стенок (например, растительный материал, древесину, основанную на грязи/глине почву и фрукты). Эти пятна представляют трудные испытания для композиции и применения композиций для мойки или очистки.
Кроме того, цветные предметы одежды имеют тенденцию изнашиваться и демонстрируют утрату внешнего вида. Часть этой утраты цвета обусловлена абразивной обработкой в процессе стирки, в частности, в автоматизированных машинах для стирки и сушки. Кроме того, утрата прочности на растяжение ткани, по-видимому, является неизбежным результатом механического и химического действия вследствие использования, носки и/или стирки и сушки. Следовательно, необходимо средство для эффективной и действенной стирки цветных предметов одежды, так чтобы эти утраты внешнего вида были минимизированы.
В данной области техники хорошо известны композиции для мойки или очистки, которые включают эстеразы, липазы и кутиназы. Однако эти ферменты характеризуются очень низким отношением пергидролиза к гидролизу. Это приводит к превращению большей части субстрата со сложноэфирной составляющей в кислоту, вместо более желательной перкислоты. Это является серьезным недостатком, поскольку принятия во внимание занимаемого композицией объема и стоимости делают допустимым включение только ограниченного количества субстрата.
В итоге, несмотря на увеличение возможностей композиций для мойки или очистки, в данной области техники остается потребность в моющих или чистящих средствах, которые удаляют пятна, сохраняют цвет ткани и внешний вид и предотвращают перенос красителя. Кроме того, остается потребность в моющем средстве и/или композициях для ухода за тканями, которые обеспечивают и/или восстанавливают прочность на растяжение, а также обеспечивают тканям устойчивость к образованию складок, катушек и/или усадке, а также обеспечивают статический контроль, мягкость ткани, сохраняют желаемое цветовое проявление и обеспечивают устойчивость к изнашиванию тканей и экономический эффект. В частности, остается потребность во включении композиций, которые способны удалять окрашенные компоненты пятен, которые часто остаются связанными с подвергаемой стирке тканью. Кроме того, остается потребность в улучшенных способах и композициях, подходящих для отбеливания текстиля.
Помимо области мойки тканей и предметов одежды отбеливание часто используется в целлюлозно-бумажной промышленности. До получения бумаги целлюлозную массу обычно подвергают обработке для удаления нежелательных окрашенных примесей. Это обеспечивает целлюлозную массу, которая подходит для получения бумаги более высокого качества, чем целлюлозная масса, не подвергнутая обработке для удаления окрашенных примесей и других нежелательных компонентов, присутствующих в целлюлозной массе. Например, в промышленности переработки макулатуры необходимо удаление краски. Хотя для очистки от краски бумаги с масляными или водосодержащими красками подходят стандартные способы, увеличенное использование электростатических красок сделало очистку от краски проблематичной, поскольку эти краски намного более трудно удалить. Имеются различные способы очистки от краски бумаги, включающие использование ферментов (смотри, например, патент США № 5370770). Однако в данной области техники остается потребность в эффективных, экономически эффективных способах обработки целлюлозной массы для производства бумажных (вторичных и новых) продуктов.
Отбеливание также широко используется на рынке продуктов для личной гигиены (например, отбеливателей для зубов, осветлителей волос и т.п). Хотя отбеливающие продукты для личной гигиены улучшились с годами, остается потребность в мягких, легких в использовании, экономически эффективных способах отбеливания для этой установки.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящим изобретением обеспечиваются способы и композиции, включающие по крайней мере один пергидролазный фермент для мойки или очистки и других применений. В некоторых вариантах осуществления настоящим изобретением обеспечиваются способы и композиции для образования длинноцепочечных перкислот. Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения находят конкретное приложение в применениях, включающих мойку или очистку, отбеливание и дезинфекцию.
Настоящий изобретением обеспечивается выделенный пергидролазный фермент, который пергидролизует длинноцепочечные ацильные эфирные субстраты. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения фермент вызывает продукцию длинноцепочечной перкислоты в присутствии длинноцепочечного ацильного эфирного субстрата и перекиси. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения длинноцепочечный ацильный эфирный субстрат содержит цепь из по крайней мере шести атомов углерода. В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения длинноцепочечный ацильный эфирный субстрат содержит цепь из по крайней мере девяти атомов углерода.
M. smegmatis
M. smegmatis
M. smegmatis
M. smegmatis
В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения указанный пергидролазный фермент имеет аминокислотную последовательность, которая идентична на по крайней мере 80% аминокислотной последовательности встречающейся в природе пергидролазы (т.е. пергидролазы дикого типа, кодируемой геномом клетки). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения фермент имеет аминокислотную последовательность, которая идентична на по крайней мере 80% встречающейся в природе пергидролазе (SEQ ID NO: 2). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения пергидролазный фермент включает по крайней мере одну замену в положении аминокислоты, эквивалентном положению в пергидролазе , включающей аминокислотную последовательность, определенную в SEQ ID NO: 2, причем по крайней мере одну замену выбирают из положений 12, 22, 59, 153, 154, 194, 196 и 204. В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения фермент имеет какую-либо одну или комбинацию следующих аминокислот: Gly, Pro или Gln в положении 12, Trp в положении 22, Pro в положении 59, Pro в положении 153, Thr, Ser, Val или Gln в положении 154, Gly в положении 194, Ser, Gln, Val, Gly, Pro, Ile или His в положении 196 или Tyr или Trp в положении 204, причем положения аминокислот позиционно эквивалентны положениям 12, 22, 59, 153, 154, 194, 196 и 204 в пергидролазе  SEQ ID NO: 2. В некоторых других вариантах осуществления настоящего изобретения фермент содержит следующие аминокислоты: Ala в положении 154 и Met в положении 194, Gly в положении 154 и Val в положении 194, или Gly в положении 12 и Met в положении 194, Thr в положении 154 и Ile в положении 196, Gln в положении 12 и Val в положении 154, Met в положении 12 и Glu в положении 154, Gly в положении 12 и Gly в положении 154, Glu в положении 154 и Ser в положении 194, или Gly в положении 12 и Trp в положении 22, или любую их комбинацию, причем положения аминокислот позиционно эквивалентны положениям 12, 22, 59, 153, 154, 194, 196 и 204 в пергидролазе  SEQ ID NO: 2. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения пергидролазный фермент настоящего изобретения характеризуется отношением пергидролиза к гидролизу, составляющим по крайней мере 1, и/или низкую степень гидролиза по сравнению с SEQ ID NO: 2.
Настоящим изобретением также обеспечивается выделенные пергидролазные ферменты, которые гидролизуют длинноцепочечные ацильные эфирные субстраты. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения фермент вызывает продукцию длинноцепочечной перкислоты в присутствии длинноцепочечного ацильного эфирного субстрата и перекиси. В некоторых дополнительных вариантах осуществления настоящего изобретения длинноцепочечный ацильный эфирный субстрат содержит цепь из по крайней мере шести атомов углерода. В еще одних из дополнительных вариантов осуществления настоящего изобретения длинноцепочечный ацильный эфирный субстрат содержит цепь из по крайней мере девяти атомов углерода.
Настоящим изобретением также обеспечивается выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая выделенные пергидролазные ферменты настоящего изобретения. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения рекомбинантная нуклеиновая кислота содержит промотор и выделенную нуклеиновую кислоту, причем промотор и выделенная нуклеиновая кислота функционально связаны для обеспечения транскрипции выделенной нуклеиновой кислоты.
Настоящим изобретением также обеспечиваю векторы, включающие рекомбинантную нуклеиновую кислоту настоящего изобретения. Также обеспечиваются клетки-хозяева, содержащие векторы. Рекомбинантная нуклеиновая кислота, если она присутствует в клетке-хозяине, может присутствовать в геноме клетки или в векторе, который автономно реплицируется в клетке. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения обеспечивается рекомбинантная нуклеиновая кислота для секреции выделенного пергидролазного белка из клетки-хозяина. Клетка-хозяин может бактериальной или грибковой клеткой-хозяином. Обеспечивается культура, содержащая рассматриваемую клетку-хозяина и среду для культивирования клеток. Среда для культивирования клеток может содержать пергидролазный белок, секретируемый из клетки.
Настоящим изобретением также обеспечиваются способы получения пергидролазных ферментов настоящего изобретения. В общих чертах способы включают культивирование указанной клетки-хозяина в условиях, подходящих для продукции пергидролазы. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения пергидролазу извлекают из среды для роста. В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения извлеченную пергидролазу объединяют с другими реагентами для получения композиции для мойки или очистки.
Настоящим изобретением, кроме того, обеспечиваются композиции для мойки или очистки, включающие по крайней мере одну пергидролазу настоящего изобретения. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения композиция для мойки или очистки, кроме того, включает длинноцепочечный ацильный эфирный субстрат и источник перекиси, которые вместе с пергидролазным ферментом приводят к продукции длинноцепочечной перкислоты. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения композиция для мойки или очистки дополнительно включает по крайней мере одно поверхностно-активное вещество. В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения композицией для мойки или очистки является моющее средство для стирки.
Композиции для мойки или очистки настоящего изобретения находят применение в мойке или очистке субстратов (например, ткани) путем приведения в контакт композиции с субстратом.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящим изобретением обеспечиваются способы и композиции, включающие по крайней мере один пергидролазный фермент для мойки или очистки и других применений. В некоторых вариантах осуществления настоящим изобретением обеспечиваются способы и композиции для образования длинноцепочечных перкислот. Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения находят конкретное приложение в применениях, включающих мойку или очистку, отбеливание и дезинфекцию.
nd
Если не указано иное, осуществление на практике настоящего изобретения включает общепринятые методы, широко применяемые в областях молекулярной биологии, микробиологии, очистки белков, конструирования белков, секвенирования белков и ДНК, рекомбинанной ДНК, химии, биохимии и энзимологии, которые находятся в пределах знаний квалифицированных в данной области техники специалистов. Действительно, такие методы известны квалифицированным в данной области техники специалистам и описываются в многочисленных публикациях и ссылочных работах (Смотри, например, Sambrook et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2 Ed. (Cold Spring Harbor), [1989] и Ausubel et al., “Current Protocols in Molecular Biology” [1987]). Все упоминаемые здесь, как выше, так и ниже, патенты, заявки на патенты, статьи и публикации таким образом специально включены сюда посредством ссылки.
Кроме того, предоставляемые здесь заголовки не являются ограничениями различных аспектов или вариантов осуществления настоящего изобретения, о котором можно говорить при ссылке на описание изобретение в целом. Соответственно, термины, определение которых приводится непосредственно ниже, более полно определяются со ссылкой на описание изобретения в целом. Тем не менее, для облегчения понимания настоящего изобретения ниже приводятся определения ряда терминов.
Определения
Если здесь не определено иное, все технические и научные термины, используемые здесь, имеют такое же значение, в котором они обычно понимаются специалистом со средним уровнем компетентности в области техники, к которой относится это изобретение. Например, Singleton и Sainsbury, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2n Ed., John Wiley and Sons, NY (1994), и Hale и Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology, Harper Perennial, NY (1991) обеспечивают квалифицированных в данной области специалистов словарями общего характера многих из терминов, используемых в настоящем изобретении. Хотя любые способы и материалы, схожие со способами и материалами, описанными здесь, или эквивалентные им, находят применение при осуществлении на практике настоящего изобретения, здесь описываются предпочтительные способы и материалы. Соответственно, термины, определенные непосредственно ниже, более полно характеризуются при ссылке на описание изобретения в целом. Также используемые здесь термины единственного числа включают ссылку на множественное число, если из контекста ясно не следует иное. Если не указано иное, нуклеиновые кислоты записаны слева направо в направлении от 5' к 3', аминокислотные последовательности записаны слева направо в направлении от аминоконца к карбоксильному концу. Следует понимать, что это изобретение не ограничивается конкретной методологией, протоколами и реагентами, которые описаны, поскольку они могут варьировать в зависимости от контекста, в котором они используются квалифицированными в данной области техники специалистами.
Подразумевается, что каждое максимальное числовое ограничение, приведенное на протяжении этого описания изобретения, включает каждое нижнее числовое ограничение, как если бы такие нижние числовые ограничения были прямо написаны здесь. Каждое минимальное числовое ограничение, приведенное на протяжении этого описания изобретения, будет включать каждое верхнее числовое ограничение, как если бы такие верхние числовые ограничения были прямо написаны здесь. Каждый числовой диапазон, приведенный на протяжении этого описания изобретения, будет включать каждый суженный числовой диапазон, который находится в пределах такого расширенного числового диапазона, как если бы такие суженные числовые диапазоны были прямо написаны здесь.
Как здесь используется, «перкислота» представляет собой кислоту формулы RC(=O)OOH, где R является любой органической составляющей.
6
10
11+
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
Как здесь используется, «длинноцепочечная перкислота» представляет собой кислоту формулы RC(=O)OOH, где R является любой органической составляющей, которая содержит цепь из 6 и более атомов углерода. Длинноцепочечные перкислоты могут содержать углеродную цепь из 6-10 атомов углерода (т.е. С-С углеродную цепь) или углеродную цепь из по крайней мере 11 атомов углерода (т.е. Суглеродную цепь). Приводимые в качестве примеров длинноцепочечные перкислоты содержат С, С, С, С, С, С, С, С, С, С, С, С, С, С, С, Сили Суглеродную цепь. Приводимые в качестве примеров длинноцепочечные перкислоты включают, но без ограничения, перкапроновую кислоту, перкаприловую кислоту, пернонановую кислоту, пердекановую кислоту, пердодекановую кислоту, пермиристиновую кислоту, перпальмитиновую кислоту, перстеариновую кислоту и перолеиновую кислоту.
1
2
1
2
2
2
Как здесь используется, термин «пергидролизуют» относится к ферментативной реакции, которая приводит к продукции перкислоты. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения перкислота продуцируется при пергидролизе субстрата со сложноэфирной составляющей формулы RC(=O)OR, где R и R независимо представляют собой органическую составляющую, в присутствии перекиси водорода (НО).
1
2
1
2
6
10
11+
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
Как здесь используется, «длинноцепочечный ацильный эфир» представляет собой сложный эфир формулы RC(=O)OR, где R является любой органической составляющей, которая содержит цепь из по крайней мере 6 атомов углерода, и R является любой органической составляющей. Длинноцепочечные ацильные эфиры могут содержать углеродную цепь из 6-10 атомов углерода (т.е. С-С углеродную цепь) или углеродную цепь из по крайней мере 11 атомов углерода (т.е. Суглеродную цепь). Приводимые в качестве примеров длинноцепочечные ацильные эфиры содержат С, С, С, С, С, С, С, С, С, С, С, С, С, С, С, Сили Суглеродную цепь. Приводимые в качестве примеров длинноцепочечные ацильные эфиры включают, но без ограничения, эфир капроновой кислоты, эфир каприловой кислоты, эфир нонановой кислоты, эфир декановой кислоты, эфир додекановой кислоты, эфир миристиновой кислоты, эфир пальмитиновой кислоты, эфир стеариновой кислоты и эфир олеиновой кислоты.
Как здесь используется, термин «источник перекиси водорода» включает перекись водорода, а также компоненты системы, которые могут самопроизвольно или ферментативно продуцировать перекись водорода в качестве продукта реакции.
2
2
2
2
Как здесь используется, термин «отбеливание» относится к обработке материала (например, ткани, подвергаемой стирке одежды, целлюлозы и т.п.) или любой поверхности в течение достаточной продолжительности и при соответствующих условиях рН и температуры для достижения осветления (т.е. отбеливания) и/или мойки или очистки материала. Примеры химреагентов, подходящих для отбеливания, включают, но без ограничения, ClO, HO, перкислоты, NO и т.п.
Как здесь используется, термин «дезинфекция» относится к удалению с поверхностей загрязняющих веществ, а также к ингибированию или уничтожению микробов на поверхностях отдельных предметов. Не подразумевается, что настоящее изобретение ограничивается какой-либо конкретной поверхностью, предметом или загрязняющим веществом(ами) или микробами, подвергаемыми удалению.
M. smegmatis
Как здесь используется, термин «пергидролаза» относится к ферменту, который способен катализировать реакцию, которая приводит к образованию достаточно больших количеств перкислоты, подходящей для таких применений, как мойка или очистка, отбеливание и дезинфекция. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения пергидролазные ферменты настоящего изобретения пергидролизуют длинноцепочечные ацильные эфиры с продукцией длинноцепочечных перкислот, которые подходят для приложения в широком выборе связанных с мойкой или очисткой применений. В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления пергидролазы настоящего изобретения характеризуются наличием отличной третичной структуры и первичной последовательности. В некоторых дополнительных особенно предпочтительных вариантах осуществления пергидролазы настоящего изобретения являются вариантами пергидролазы . Однако не подразумевается, что настоящее изобретение ограничивается этими специфическими пергидролазами.
Как здесь используется, термин «мультимер» относится к двум или более белкам или пептидам, которые ковалентно или нековалентно связаны и существуют в виде комплекса в растворе. «Димер» является мультимером, который содержит два белка или пептида, «триммер» содержит три белка или пептида и т.п. Как здесь используется, «октамер» относится к мультимеру из восьми белков или пептидов.
Как здесь используется, выражение «отношение пергидролиза к гидролизу» относится к отношению количества ферментативно продуцированной перкислоты к количеству ферментативно продуцированной кислоты с помощью пергидролазы, при определенных условиях и в пределах определенного времени. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предоставленные здесь анализы используются для определения количеств перкислоты и кислоты, продуцированных ферментом.
Как здесь используются, «продукты для личной гигиены» относятся к продуктам, используемым для мойки или очистки, отбеливания и/или дезинфекции волос, кожи, волосистой части кожи головы и/или зубов, включающим, но без ограничения, шампуни, лосьоны для тела, гели для душа, увлажняющие средства для местного применении, зубную пасту и/или другие очищающие средства для местного применения. В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения эти продукты применяются для людей, в то время как в других вариантах осуществления эти продукты находят применение для не являющихся людьми животных (например, для ветеринарных применениях).
Как здесь используется, «фармацевтически приемлемый» относится к лекарственным средствам и/или инертным ингредиентам, которые подходят для применения в приведении в контакт с тканями людей и других животных без чрезмерной токсичности, несовместимости, нестабильности, раздражения, аллергической реакции и т.п., соразмерной с приемлемым отношением польза/риск.
Как здесь используются, «композиции для мойки или очистки» относятся к композициям, которые находят применение в удалении нежелательных соединений с отдельных предметов, подвергаемых мойке или чистке, таких как ткани, посуда, контактные линзы, другие твердые субстраты, волосы (шампуни), кожа (мыло и кремы), зубы (жидкости для полоскания рта, зубные пасты) и т.п. Термин включает любые материалы/соединения, выбираемые для конкретного типа желаемой композиции для мойки или очистки и формы продукта (например, жидкой композиции, композиции в виде геля, гранул или аэрозоля), при условии, что композиция совместима с пергидролазой и другим ферментом(ами), используемыми в композиции. Конкретный выбор материалов композиции для мойки или очистки легко сделать с учетом поверхности, отдельного предмета или ткани, которые подвергаются мойке или чистке, и желаемой формы композиции для условий мойки и очистки во время применения.
Термины, кроме того, относятся к любой композиции, которая подходит для мойки или очистки, отбеливания, дезинфекции и/или стерилизации любого объекта и/или поверхности. Подразумевается, что термины включают, но без ограничения, моющие или чистящие составы (например, жидкие и/или твердые моющие средства для стирки, мелкозернистые моющие или чистящие средства для тканей, композиции для мойки или очистки твердых поверхностей, таких как стеклянные, деревянные, керамические и металлические горизонтальные верхние части и окна, моющие средства для ковров, моющие средства для духовых шкафов, освежители для тканей, смягчители тканей и предварительный пятновыводитель для текстиля и стирки, а также моющие средства для посуды).
Действительно, используемый здесь термин «композиция для мойки или очистки» включает, если не указано иное, моющие средства для всех целей или для тяжелых условий эксплуатации в гранулированной и порошкообразной форме, особенно моющие или чистящие средства для мойки или очистки, моющие средства для всех целей в жидкой форме, форме геля или пасты, особенно типы так называемых жидкостей для тяжелых условий эксплуатации, жидкие моющие средства для тонких тканей; средства для ручной мойки посуды или средства для мойки посуды для легких условий эксплуатации, особенно средства сильно пенящегося типа, средства для мойки посуды в машине, включающие различные типы таблеток, гранул, жидкостей и средств для промывки для применения в домашнем хозяйстве и учреждениях, жидкие чистящие и дезинфицирующие агенты, включающие антибактериальные типы для ручной мойки, куски мыла для мойки или чистки, жидкости для полоскания рта, моющие средства для зубных протезов, шампуни для машин и ковров, моющие средства для ванной комнаты, шампуни для волос и средства для ополаскивания волос; гели для душа и пены для ванн и моющие средства для металлов, а также вспомогательные средства для мойки или чистки, такие как добавки для отбеливания и типы «нанесения на пятна» или предварительной обработки.
Используемые здесь термины «моющий или чистящий состав» используется при упоминании смесей, которые предназначены для применения в моющей среде для мойки или очистки грязных объектов. В конкретных вариантах осуществления термин используется при упоминании стирки тканей и/или предметов одежды (например, «моющие средства для стирки»). В альтернативных вариантах осуществления настоящего изобретения термин относится к другим моющим или чистящим средствам, таким как средства, используемые для мойки или чистки посуды, столовых принадлежностей и т.п. (например, «моющие средства для мойки посуды»). Не подразумевается, что настоящее изобретение ограничивается каким-либо конкретным моющим или чистящим составом. В действительности подразумевается, что термин охватывает моющие или чистящие средства, которые содержат, помимо пергидролазы, поверхностно-активные вещества, трансферазу(ы), гидролитические ферменты, оксидоредуктазы, моющие компоненты, отбеливающие агенты, активаторы отбеливания, подсинивающие агенты и флуоресцентные красители, ингибиторы образования комочков, маскирующие агенты, активаторы ферментов, антиоксиданты и солюбилизаторы.
Как здесь используется, «увеличенная эффективность» моющего или чистящего средства определяется как увеличение мойки или очистки чувствительных к отбеливанию пятен (например, травы, чая, вина, крови, грязи и т.п.), что определяется с помощью обычной оценки после цикла стандартной стирки. В конкретных вариантах осуществления пергидролаза настоящего изобретения обеспечивает увеличенную эффективность окисления и удаления окрашенных пятен и грязи. В дополнительных вариантах осуществления пергидролаза настоящего изобретения обеспечивает увеличенную эффективность удаления и/или обесцвечивания пятен. В еще одних из дополнительных вариантов осуществления пергидролаза настоящего изобретения обеспечивает увеличенную эффективность удаления пятен и грязи на основе липидов. Во все еще дополнительных вариантах осуществления пергидролаза настоящего изобретения обеспечивает увеличенную эффективность удаления грязи и пятен с посуды и других предметов.
Используемый здесь термин «композиция для мойки или очистки твердых поверхностей» относится к моющим или чистящим составам для мойки или чистки твердых поверхностей, таких как полы, стены, облицовочная плитка, ванны и кухонные неподвижно закрепленные детали и т.п. Такие композиции предоставляются в любой форме, в том числе, без ограничения, в виде твердых веществ, жидкостей, эмульсий и т.п.
Как здесь используется, «композиция для мойки посуды» относится ко всем формам композиций для мойки или чистки посуды, включающим, но без ограничения, гранулированные и жидкие формы.
Как здесь используется, «композиция для мойки или чистки тканей» относится ко всем формам моющих или чистящих составов для мойки или чистки тканей, включающим, но без ограничения, гранулированные, жидкие формы и формы в виде кусков мыла.
Как здесь используется, «текстиль» относится к текстильным тканям, а также штапельным волокнам и нитям, подходящим для использования в качестве пряжи, текстильных, трикотажных и не являющихся текстильными тканей или превращения в них. Термином охватываются пряжи, изготовленные из природных, а также синтетических (например, промышленного производства) волокон.
Как здесь используется, «текстильный материал» является общим термином для волокон, промежуточных продуктов при изготовлении пряжи, тканей и продуктов, изготовленных их тканей (например, предметов одежды и других предметов).
Используемым здесь термином «ткань» охватывается любой текстильный материал. Таким образом, подразумевается, что этим термином охватываются предметы одежды, а также ткани, пряжи, волокна, не являющиеся текстильными материалы, природные материалы, синтетические материалы и любой другой текстильный материал.
Используемый здесь термин «совместимый» означает, что материалы композиции для мойки или очистки не уменьшают ферментативную активность пергидролазы в такой степени, что пергидролаза не является эффективной, как это желательно, во время ситуаций нормального применения. Конкретные материалы композиций для мойки или очистки приводятся в качестве примеров подробно ниже.
Как здесь используется, «эффективное количество пергидролазного фермента» относится к количеству пергидролазного фермента, необходимому для достижения ферментативной активности, требуемой для конкретного применения (например, продукта для личной гигиены, композиции для мойки или очистки и т.п.). Такие эффективные количества без труда определяются специалистом со средним уровнем компетентности в данной области техники и основаны на многих факторах, таких как конкретный используемый вариант фермента, применение для мойки или чистки, конкретный состав композиции для мойки или чистки или от того, требуется ли жидкая или сухая (например, гранулированная, в виде куска мыла) композиция, и т.п.
Как здесь используется, «композиции для мойки или очистки не тканей, включают композиции для мойки или чистки твердых поверхностей, композиции для мойки посуды, композиции для личной гигиены (например, композиции для очистки полости рта, композиции для чистки зубных протезов, композиции для личной дезинфекции и т.п.) и композиции, подходящие для использования в целлюлозно-бумажной промышленности.
Как здесь используются, «композиции для очистки полости рта» относятся к средствам для ухода за зубами, зубным пастам, зубным гелям, зубным порошкам, жидкостям для полоскания рта, аэрозолям для полости рта, гелям для полости рта, жевательным резинкам, лепешкам, саше, таблеткам, биогелям, профилактическим пастам, растворам для обработки зубов и т.п. Композиции для гигиены полости рта, которые находят применение в соединении с пергидролазами настоящего изобретения, хорошо известны в данной области техники (смотри, например, патенты США № 5601750, 6379653 и 5989526, все из которых включены сюда посредством ссылки).
Как здесь используются, «композиции для обработки целлюлозы» относятся к использованию пергидролазных ферментов настоящего изобретения в композициях, подходящих для применения в получении бумаги. Подразумевается, что эти термином охватываются композиции, подходящие для обработки любого целлюлозного материала, включающего древесину, а также не являющихся древесными материалов, таких как «сельскохозяйственные остатки» и «волокнистые культуры», включающие, но без ограничения, солому пшеницы, солому риса, стебли кукурузы, сухие измельченные волокна сахарного тростника (сахарный тростник), солому ржи, солому семенного льна, солому льна, кенаф, промышленную коноплю, сизаль, солому льна, используемого для получения текстиля, геспералоэ и т.п. Таким образом, настоящее изобретение также включает применение пергидролаз настоящего изобретения в способах обработки целлюлозы.
Как здесь используется, «окисляющее химическое вещество» относится к химическому веществу, которое обладает способностью отбеливать целлюлозу или любой другой материал. Окисляющее химическое вещество присутствует в количестве, при рН и температуре, необходимых для отбеливания. Термин включает, но без ограничения, перекись водорода и перкислоты.
3
3
Как здесь используется, «ацил» является общим названием для органических кислотных групп, которые являются остатками карбоновых кислот после удаления группы -ОН (например, ацетилхлорид, CHCO-Cl, является ацилхлоридом, образованным из уксусной кислоты, CHCOO-H). Названия индивидуальных ацильных групп образуется путем замены окончания названия кислоты на «ил».
Как здесь используется, термин «ацилирование» относится к химическому преобразованию, при котором в молекуле обычно активный водород группы -ОН замещается ацильной группой (RCO-).
Как здесь используется, термин «трансфераза» относится к ферменту, который катализирует перенос функциональных соединений на ряд субстратов.
Как здесь используется, термин «отщепляемая группа» относится к нуклеофилу, который отщепляется от ацильного донора при замене другим нуклеофилом.
Как здесь используется, термин «ферментативная реакция» относится к модификации субстрата в промежуточный продукт или модификации промежуточного продукта в конечный продукт при приведении субстрата или промежуточного продукта в контакт с ферментом. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения приведение в контакт осуществляют путем подвергания субстрата или промежуточного продукта прямому воздействию соответствующего фермента. В других вариантах осуществления настоящего изобретения приведение в контакт включает подвергание субстрата или промежуточного продукта воздействию организма, который экспрессирует и/или выделяет фермента, и/или метаболизирует желаемый субстрат и/или промежуточный продукт в желаемый промежуточный продукт и/или конечный продукт, соответственно.
Используемое здесь выражение «стабильность моющего или чистящего средства» относится к стабильности моющего или чистящего состава. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения стабильность определяют во время применения моющего или чистящего средства, в то время как в других вариантах осуществления термин относится к стабильности моющего или чистящего состава во время хранения.
Используемое здесь выражение «устойчивость к протеолизу» относится к способности белка (например, фермента) противостоять протеолизу. Не подразумевается, что этот термин ограничен использованием какой-либо конкретной протеазы для оценки устойчивости белка.
2
2
Используемое здесь выражение «устойчивость к окислению» относится к способности белка функционировать в окислительных условиях. В частности, термин относится к способности белка функционировать в присутствии различных концентраций НО и/или перкислоты. Устойчивость при различных окислительных условиях можно определить либо с помощью стандартных процедур, известных специалистам в данной области техники, и/или с помощью описанных здесь способов. О существенном изменении устойчивости к окислению свидетельствует увеличение или уменьшение (в большинстве вариантов осуществления предпочтительно увеличение) на по крайней мере приблизительно 5% или больше полупериода существования ферментативной активности по сравнению с ферментативной активностью, имеющей место в отсутствие окисляющих соединений.
Как здесь используется, «устойчивость к рН» относится к способности белка функционировать при конкретном рН. В общем, большинство ферментов имеют ограниченный диапазон рН, при котором они будут функционировать. Помимо ферментов, которые функционируют при средних рН (т.е. вокруг рН 7), существуют ферменты, которые могут работать в условиях с очень высокими или очень низкими рН. Устойчивость при различных рН можно определить либо с помощью стандартных процедур, известных специалистам в данной области техники, и/или с помощью описанных здесь способов. О существенном изменении устойчивости к рН свидетельствует увеличение или уменьшение (в большинстве вариантов осуществления предпочтительно увеличение) на по крайней мере приблизительно 5% или больше полупериода существования ферментативной активности по сравнению с ферментативной активностью при оптимальном рН для фермента. Однако не подразумевается, что настоящее изобретение ограничивается каким-либо уровнем устойчивости к рН, а также диапазоном рН.
Как здесь используется, «термостабильность» относится к способности белка функционировать при конкретной температуре. В общем, большинство ферментов имеют ограниченный температурный интервал, при котором они будут функционировать. Помимо ферментов, которые функционируют при средних температурах (например, комнатной температуре), существуют ферменты, которые могут работать при очень высоких или очень низких температурах. Термостабильность можно определить либо с помощью известных процедур или с помощью описанных здесь способов. О существенном изменении термостабильности свидетельствует увеличение или уменьшение (в большинстве вариантов осуществления предпочтительно увеличение) на по крайней мере приблизительно 5% или больше полупериода существования каталитической активности мутанта, подвергаемого воздействию температуры, которая отличается (т.е. выше или ниже) от оптимальной температуры для ферментативной активности. Однако не подразумевается, что настоящее изобретение ограничивается каким-либо уровнем термостальности, а также температурным интервалом.
Используемый здесь термин «химическая стойкость» относится к стойкости белка (например, фермента) к химическим веществам, которые оказывают неблагоприятное воздействие на его активность. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения такие химические вещества включают, но без ограничения, перекись водорода, перкислоты, анионные детергенты, катионные детергенты, неионные детергенты, комплексоны и т.п. Однако не подразумевается, что настоящее изобретение ограничивается каким-либо конкретным уровнем химической стойкости, а также диапазоном химической стойкости.
Используемое здесь выражение «улучшение пергидролазной активности» относится к относительному улучшению пергидролазной активности в сравнении со стандартным ферментом. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения термин относится к увеличенной степени образования продукта пергидролиза, в то время как в других вариантах осуществления термин охватывает композиции пергидролазы, которые продуцируют меньше продукта пергидролиза. В дополнительных вариантах осуществления настоящего изобретения термин относится к композициям пергидролазы с измененной субстратной специфичностью.
cat
m
Используемое здесь выражение «изменение субстратной специфичности» относится к изменениям субстратной специфичности фермента. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения изменение субстратной специфичности определяют в виде разницы в отношении K/K, наблюдаемой между ферментом и вариантами ферментами или другими композициями фермента. Субстратные специфичности фермента варьируют в зависимости от проверяемого субстрата. Субстратную специфичность фермента определяют сравнением каталитических эффективностей, которые он проявляет с различными субстратами. Эти определения находят конкретное применение при оценке эффективности мутантных ферментов, поскольку, как правило, желательно продуцировать варианты ферментов, которые проявляют большие отношения для конкретных, представляющих интерес субстратов. Например, пергидролазные ферменты настоящего изобретения более эффективны в продуцировании перкислоты из субстрата со сложноэфирной составляющей, чем ферменты, которые в настоящее время используются для мойки или очистки, отбеливания и дезинфекции. Другим примером настоящего изобретения является пергидролаза с более низкой активностью в отношении разложения перкислоты по сравнению с диким типом. Другим примером настоящего изобретения является пергидролаза с большей активностью в отношении более гидрофобных ацильных групп, чем уксусная кислота. Однако не подразумевается, что настоящее изобретение ограничивается какой-либо конкретной субстратной композицией, а также конкретной субстратной специфичностью.
Как здесь используется, «поверхностное свойство» используется при упоминании электростатического заряда, а также таких свойств, как гидрофобность и/или гидрофильность, проявляемые поверхностью белка.
Используемое здесь выражение «независимо выбирают из группы, состоящей из…» означает, что составляющие или элементы, которые выбирают из упоминаемой группы Маркуша, могут быть одинаковыми, могут быть разными или любой смесью элементов, как указано в следующем примере:
Молекула, имеющая 3 группы R, где каждую группу R независимо выбирают из группы, состоящей из А, В и С. Здесь группы R могут быть ААА, ВВВ, ССС, ААВ, ААС, ВВА, ВВС, ССА, ССВ или АВС.
При ссылке на химические композиции используемый здесь термин «замещенный» означает, что органическую композицию или радикал, к которым применим термин,
(а) делают ненасыщенными исключением по крайней мере одного элемента или радикала; или
(b) по крайней мере один водород в соединении или радикале замещают составляющей, содержащей один или несколько атомов (i) углерода, (ii) кислорода, (iii) серы, (iv) азота или (v) галогена; или
(с) как (а), так и (b).
Составляющие, которые могут заместить водород, как описывается в (b) непосредственно выше, которые содержат только атомы углерода и водорода, являются углеводородными составляющими, включающими, но без ограничения, алкильные, алкенильные, алкинильные, алкилдиенильные, циклоалкильные, фенильные, алкилфенильные, нафтильные, антрильные, фенантрильные, флуорильные, стероидные группы и комбинации этих групп друг с другом и с поливалентными углеводородными группами, такими как алкиленовые, алкилиденовые и алкилидиновые группы. Составляющие, содержащие атомы кислорода, которые могут заместить водород, как описывается в (b) непосредственно выше, включают, но без ограничения, группы, содержащие гидрокси, ацил или кето, простоэфирный радикал, эпокси, карбокси и сложноэфирный радикал. Составляющие, содержащие атомы серы, которые могут заместить водород, как описывается в (b) непосредственно выше, включают, но без ограничения, группы серосодержащих кислот и их эфиров, тиоэфирные группы, меркаптогруппы и тиокетогруппы. Составляющие, содержащие атомы азота, которые могут заместить водород, как описывается в (b) непосредственно выше, включают, но без ограничения, аминогруппы, нитрогруппу, азогруппы, аммонийные группы, амидные группы, азидогруппы, изоцианатные группы, цианогруппы и нитрильные группы. Составляющие, содержащие атомы галогенов, которые могут заместить водород, как описывается в (b) непосредственно выше, включают, но без ограничения, группы хлора, брома, фтора, йода и любые из ранее описанных составляющих, в которых водород или боковая алкильная группа замещена группой галогена с образованием стабильной замещенной составляющей.
Понятно, что любую из указанных выше в (b)(i)-(b)(v) составляющих можно заместить на любую другую или при одновалентном замещении, или с помощью исключения водорода при поливалентном замещении с образованием другой одновалентной составляющей, которая может заместить водород в органическом соединение или радикале.
Используемые здесь термины «очищенный» или «выделенный» относятся к удалению примесей из образца. Например, пергидролазы очищают путем удаления являющихся примесью белков или других соединений в растворе или препарате, которые не являются пергидролазами. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения рекомбинантные пергидролазы экспрессируют в бактериальных или грибковых клетках-хозяевах, и эти рекомбинантные пергидролазы очищают путем удаления других составных частей клеток-хозяев; тем самым в образце увеличивается процент являющихся рекомбинантными пергидролазами полипептидов.
Как здесь используется, «представляющий интерес белок» относится к белку (например, ферменту или «представляющему интерес ферменту»), который анализируют, идентифицируют и/или модифицируют. Встречающиеся в природе, а также рекомбинантные белки находят применение в настоящем изобретении.
Как здесь используется, «белок» относится к любой структуре, которая состоит из аминокислот и признается как белок квалифицированными в данной области техники специалистами. Термины «белок», «пептид» и полипептид используются здесь взаимозаменяемо. Когда пептид является частью белка, квалифицированным в данной области техники специалистах понятно использование термина в контексте.
Как здесь используется, функционально и/или структурно схожие белки считаются «родственными белками». В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения эти белки происходят из различного рода и/или вида, включающего различия между классами организмов (например, бактериальный белок и грибковый белок). В дополнительных вариантах осуществления настоящего изобретения родственные белки предоставляются из одного и того же вида. Действительно не подразумевается, что настоящее изобретение ограничивается родственными белками из какого-либо конкретного источника(ов). Кроме того, термином «родственные белки» охватываются гомологи по третичной структуре и гомологи по первичной последовательности (например, пергидролаза настоящего изобретения). В дополнительных вариантах осуществления настоящего изобретения термином охватываются белки, которые дают иммунологическую перекрестную реакцию. В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления родственные белки настоящего изобретения характеризуются высокими отношениями пергидролиза к гидролизу.
Используемый здесь термин «производное» относится к белку, который получается при добавлении одной или нескольких аминокислот к одному из двух или обоим из С- и N-конов, замене одной или нескольких аминокислот в одном или ряде различных сайтов в аминокислотной последовательности и/или делеции одной или нескольких аминокислот с одного из двух или обоих концов белка или в одном или нескольких сайтах в аминокислотной последовательности, и/или вставке одной или нескольких аминокислот в один или несколько сайтов в аминокислотной последовательности. Приготовление производного белка предпочтительно достигается путем модификации последовательности ДНК, которая кодирует встречающийся в природе белок, трансформации этой последовательности ДНК в подходящего хозяина и экспрессии модифицированной последовательности ДНК с образованием производного белка.
Родственные (и производные) белки включают «варианты белка». В некоторых предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения варианты белка отличаются от исходного белка и друг от друга по небольшому числу остатков аминокислот. Число различающихся остатков аминокислот может быть один или более, предпочтительно приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 или более остатков аминокислот. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения число различающихся в вариантах аминокислот находится между 1 и 10. В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения родственные белки и, в частности, варианты белков идентичны на по крайней мере приблизительно 35%, приблизительно 40%, приблизительно 45%, приблизительно 50%, приблизительно 55%, приблизительно 60%, приблизительно 65%, приблизительно 70%, приблизительно 75%, приблизительно 80%, приблизительно 85%, приблизительно 90%, приблизительно 95%, приблизительно 97%, приблизительно 98% или приблизительно 99% по аминокислотным последовательностям. Кроме того, родственный белок или вариант белка, как здесь используется, относится к белку, который отличается от другого родственного белка или исходного белка по числу выступающих районов. Например, в некоторых вариантах осуществления варианты белка имеют приблизительно 1, 2, 3, 4, 5 или 10 соответствующих выступающих районов, что отличается от исходного белка.
В данной области техники известно несколько способов, которые подходят для создания вариантов пергидролазных ферментов настоящего изобретения, включающих, но без ограничения, мутагенез методом насыщения сайтов, сканирующий мутагенез, мутагенез методом микроинъекций, неспецифический мутагенез, сайт-направленный мутагенез и направленную эволюцию, а также различные другие рекомбинационные подходы.
В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения конструируют гомологичные белки для получения ферментов с желаемой активностью(ями). В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения сконструированные белки входят в семейство белков SGNH-гидролаз. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения сконструированные белки включают по крайней мере один или комбинацию из следующих консервативных остатков: L6, W14, W34, L38, R56, D62, L74, L78, H81, P83, M90, K97, G110, L114, L135, F180, G205. В альтернативных вариантах осуществления настоящего изобретения сконструированные белки включают мотивы GDSL (SEQ ID NO: 28) и GRTT (SEQ ID NO: 29) и/или ARTT (SEQ ID NO: 30). В некоторых дополнительных вариантах осуществления настоящего изобретения ферменты являются мультимерами, в том числе, без ограничения, димерами, октамерами и тетрамерами. В дополнительных вариантах осуществления настоящего изобретения сконструированные белки сконструированные белки характеризуются отношением пергидролиза к гидролизу, которое превышает 1.
M. smegmatis
M. smegmatis
Аминокислотный остаток пергидролазы является эквивалентным остатку пергидролазы , если он или гомологичен (т.е. имеет соответствующее положение или в первичной, и/или третичной структуре), или аналогичен конкретному остатку или части этого остатка в пергидролазе  (т.е. имеет одинаковую или схожую функциональную способность к объединению, реагированию и/или химическому взаимодействию).
M. smegmatis
M. smegmatis
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения для установления гомологии по первичной структуре аминокислотную последовательность пергидролазы непосредственно сравнивают с первичной последовательностью пергидролазы  и, в частности, с совокупностью остатков, известных как инвариантные остатки во всех пергидролазах, для которых известна последовательность. После выравнивания консервативных остатков, при котором разрешены необходимые для поддержания выравнивания вставки и делеции (т.е. при котором избегают исключения консервативных остатков во время произвольной делеции и вставки), определяют остатки, эквивалентные конкретным аминокислотам в первичной последовательности пергидролазы . В некоторых вариантах осуществления выравнивание консервативных остатков определяет 100% эквивалентных остатков. Однако для определения эквивалентных остатков также является пригодным выравнивание более приблизительно 75% или не больше приблизительно 50% консервативных остатков. В предпочтительных вариантах осуществления сохраняется консервация каталитических остатков серинов и гистидинов.
M. smegmatis
Консервативные остатки используют для определения соответствующих эквивалентных аминокислотных остатков пергидролазы в других пергидролазах (например, пергидролазах из других видов Mycobacterium, а также любых других организмов).
M. smegmatis
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения модифицируют последовательность ДНК, кодирующую пергидролазу . В некоторых вариантах осуществления модифицируют следующие остатки: Cys7, Asp10, Ser11, Leu12, Thr13, Trp14, Trp16, Pro24, Thr25, Leu53, Ser54, Ala55, Thr64, Asp65, Arg67, Cys77, Thr91, Asn94, Asp95, Tyr99, Val125, Pro138, Leu140, Pro146, Pro148, Trp149, Phe150, Ile153, Phe154, Thr159, Thr186, Ile192 и Phe196. Однако не подразумевается, что настоящее изобретение ограничивается модифицируемой в этих положениях последовательностью. В действительности подразумевается, что настоящее изобретение включает различные модификации и комбинации модификаций.
M. smegmatis
M. smegmatis
M. smegmatis
M. smegmatis
M. smegmatis
M. smegmatis
В дополнительных вариантах осуществления настоящего изобретения эквивалентные остатки определяют путем определения гомологии на уровне третичной и четвертичной структуры пергидролазы, третичная и четвертичная структура которой была определена с помощью рентгеновской кристаллографии. В этом контексте «эквивалентные остатки» определяются как остатки, для которых координаты двух или более атомов основной цепи конкретного аминокислотного остатка карбонилгидролазы и пергидролазы (N относительно N, СА относительно СА, С относительно С и О относительно О) находятся в пределах 0,13 нм и предпочтительно 0,1 нм после совмещения. Совмещения достигают после ориентирования и установления лучшей модели для предоставления максимального совмещения координат не являющихся водородом атомов белка указанной пергидролазы с пергидролазой. Как известно в данной области техники, лучшей моделью является кристаллографическая модель, предоставляющая наименьший фактор R для экспериментальных дифракционных данных при наибольшем из имеющихся разрешений. Эквивалентные остатки, которые функционально и/или структурно аналогичны конкретному остатку пергидролазы, определяют как такие аминокислоты пергидролаз, которые предпочтительно принимают конформацию из условия, чтобы они или изменяли, модифицировали, или модулировали структуру белка, для совершения изменений в связывании субстрата и/или катализе образом, определяемым и объясняемым конкретным остатком пергидролазы. Кроме того, они являются такими остатками пергидролазы (в тех случаях, когда третичная структура была получена с помощью рентгеновской кристаллографии), которые занимают аналогичное положение в таких пределах, что хотя атомы основной цепи рассматриваемого остатка могут не удовлетворять критериям эквивалентности на основе занятия гомологичного положения, координаты по крайней мере двух из атомов боковой цепи остатка находятся в пределах 0,13 нм от соответствующих атомов боковой цепи пергидролазы. Координаты трехмерной структуры пергидролазы определены и изложены в примере 14 WO 05/056782 и находят применение, как очерчено выше, для определения эквивалентных остатков на уровне третичной структуры.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения некоторые остатки, определенные для замены, вставки или делеции, являются консервативными остатками, тогда как другие ими не являются. Мутанты пергидролазы настоящего изобретения включают различные мутанты, в том числе мутанты, кодируемые нуклеиновой кислотой, которая включает сигнальную последовательность. В некоторых вариантах осуществления мутанты пергидролазы, которые кодируются такой последовательностью, секретируются экспрессирующим хозяином. В некоторых дополнительных вариантах осуществления мутанты пергидролазы, которые кодируются такой последовательностью, продуцируются цитоплазматически экспрессирующим хозяином. В некоторых дополнительных вариантах осуществления настоящего изобретения последовательность нуклеиновой кислоты включает гомолог, имеющий секреторный сигнал.
Характеристику белка дикого типа и мутантных белков проводят с помощью любых пригодных способов, и предпочтительно она основа на оценке представляющих интерес свойств. Например, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения определяют устойчивость к рН и/или термостабильность, а также устойчивость к детергентам и/или стойкость к окислению. В действительности подразумевается, что найдут применение ферменты, имеющие различные показатели в одной или нескольких из этих характеристик (например, устойчивости к рН, термостабильности, стойкости к протеолизу, устойчивости к детергентам и/или стойкости к окислению). В еще одних вариантах осуществления отбирают пергидролазы с низкой активностью разложения перкислот. В еще одних из дополнительных вариантов осуществления отбирают пергидролазы с высокой продукцией перкислот.
Как здесь используется, «экспрессионный вектор» относится к ДНК-конструкции, содержащей последовательность ДНК, которая функционально связана с подходящей контролирующей последовательностью, способной оказывать влияние на экспрессию ДНК в подходящем хозяине. Такие контролирующие последовательности включают промотор, оказывающий влияние на транскрипцию, последовательность необязательного оператора, контролирующую такую транскрипцию, последовательность, кодирующую подходящие сайты связывания рибосом с мРНК, и последовательности, которые контролируют терминацию транскрипции и трансляцию. Вектор может быть плазмидой, фаговой частицей или просто потенциальной вставкой в геном. После трансформации в подходящего хозяина вектор может реплицироваться и функционировать независимо от генома хозяина или может, в некоторых случаях, интегрироваться в сам геном. Используемые здесь термины «плазмида», «экспрессионная плазмида» или «вектор» часто используются взаимозаменяемо, поскольку плазмида является наиболее широко используемой формой вектора в настоящее время. Однако, настоящее изобретение, как подразумевается, включает такие другие формы экспрессионных векторов, которые выполняют эквивалентные функции и которые известны, или станут известными, в данной области техники.
В некоторых предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения ген пергидролазы лигируют в подходящую экспрессионную плазмиду. Клонированный ген пергидролазы затем используют для трансформации или трансфекции клетки-хозяина для того, чтобы экспрессировать ген пергидролазы. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения эта плазмида, содержащая хорошо известные элементы, необходимые для репликации плазмид, реплицируется в хозяевах в смысловой ориентации, в то время как в других вариантах осуществления настоящего изобретения плазмида сконструирована для интеграции в хромосому хозяина. Для эффективной экспрессии гена предоставляются необходимые элементы (например, промотор, функционально связанный с представляющим интерес геном). В некоторых вариантах осуществления эти необходимые элементы обеспечиваются в виде собственного гомологичного промотора гена, если он узнается (т.е. транскрибируется хозяином), терминатора транскрипции (например, район полиаденилирования для эукариотических клеток-хозяев), который является экзогенным или обеспечивается эндогенным районом терминации гена пергидролазы. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения также обеспечивается селективный ген, такой как ген устойчивости к противомикробному средству, который делает возможным поддержание непрерывной культуры инфицированных плазмидой клеток-хозяев при выращивании в содержащей противомикробное средство среде.
В некоторых вариантах осуществления следующий способ мутагенеза с использованием кассет находит применение для содействия в конструировании вариантов пергидролаз настоящего изобретения, хотя в настоящем изобретении находят применение также и другие способы.
Сначала, как здесь описывается, встречающийся в природе ген, кодирующий пергидролазу, получают и секвенируют полностью или частично. Затем последовательность сканируют ради места, в котором желательно осуществление мутации (например, одной или нескольких делеций, вставок и/или замен) одной или нескольких аминокислот в кодируемой пергидролазе. Последовательности, фланкирующие это место, оценивают на присутствие сайтов рестрикции для замены короткого сегмента гена пулом нуклеотидов, которые при экспрессии будут кодировать различные мутанты. Такие сайты рестрикции предпочтительно являются уникальными сайтами в пределах гена белка, чтобы облегчить замену сегмента гена. Однако, любой подходящий сайт рестрикции, который не является слишком избыточным в гене пергидролазы, находит применение в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения при условии, что фрагменты гена, образованные при рестрикционном расщеплении, могут быть снова соединены в правильную последовательность. Если сайты рестрикции не присутствуют в положениях внутри подходящего расстояния от отобранного места (например, от 10 до 15 нуклеотидов), такие сайты создают с помощью замены нуклеотидов в гене таким образом, чтобы ни рамка считывания, ни кодируемые аминокислоты не были изменены в конечной конструкции. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения осуществляют мутацию гена, чтобы изменить его последовательность для соответствия желаемой последовательности, с помощью удлинения праймера М13 в соответствии с общеизвестными способами. Задача установления подходящих фланкирующих районов и оценки изменений, необходимых для прихода к последовательностям двух подходящих сайтов рестрикции, является установившейся практикой согласно избыточности генетического кода, рестрикционной карте гена и большому числу различных ферментов рестрикции. Заметьте, что если подходящий фланкирующий сайт рестрикции имеется, указанный выше способ необходимо использовать только в связи с фланкирующим районом, который не содержит сайт.
После клонирования встречающейся в природе и/или синтетической ДНК сайты рестрикции, фланкирующие положения, подвергаемые мутированию, расщепляют узнающими их ферментами рестрикции и множество кассет олигогуклеотидов, комплементарных по концам, лигируют внутрь гена. Мутагенез упрощается с помощью этого способа, поскольку все олигонуклеотиды можно синтезировать так, чтобы они имели одинаковые сайты рестрикции, и для создания сайтов рестрикции нет необходимости в каких-либо синтетических линкерах.
Как здесь используется, «соответствующий» относится к остатку в пронумерованном положении в белке или пептиде или остатку, который аналогичен, гомологичен или эквивалентен пронумерованному остатку в белке или пептиде.
Как здесь используется, «соответствующий район», как правило, относится к аналогичному положению на протяжении длины родственных белков или исходного белка.
Термины «кодирующая молекула нуклеиновой кислоты», «кодирующая последовательность нуклеиновой кислоты», «кодирующая последовательность ДНК» и «кодирующая ДНК» относятся к порядку или последовательности дезоксирибонуклеотидов на протяжении цепи дезоксирибонуклеиновой кислоты. Порядок этих дезоксирибонуклеотидов определяет порядок аминокислот на протяжении цепи полипептида (белка). Таким образом, последовательность ДНК кодирует аминокислотную последовательность.
Используемый здесь термин «аналогичная последовательность» относится к последовательности внутри белка, которая обеспечивает функцию, третичную структуру и/или консервативные остатки, схожие с таковыми представляющего интерес белка (т.е. обычно представляющего интерес исходного белка). Например, в областях эпитопов, которые содержат альфа-спиральную или бета-складчатую структуру, замененные аминокислоты в аналогичной последовательности предпочтительно поддерживают такую же специфическую структуру. Термин также относится к нуклеотидным последовательностям, а также к аминокислотным последовательностям. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения аналогичные последовательности разработаны так, что замененные аминокислоты приводят к варианту фермента, демонстрирующему схожую или улучшенную функцию. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения третичная структура и/или консервативные остатки аминокислот в представляющем интерес белке размещены в представляющем интерес сегменте или фрагменте или вблизи него. Таким образом, когда представляющий интерес сегмент или фрагмент содержит, например, альфа-спиральную или бета-складчатую структуру, замененные аминокислоты предпочтительно поддерживают такую специфическую структуру.
Как здесь используется, «гомологичный белок» относится к белку (например, пергидролазе), который имеет действие и/или структуру, схожую с такой структурой представляющего интерес белка (например, пергидролазы из другого источника). Не подразумевается, что гомологи обязательно являются родственными эволюционно. Таким образом, подразумевается, что термином охватываются одинаковые или схожие ферменты (т.е. относительно структуры и функции), полученные из различных видов. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения желательно идентифицировать гомолог, имеющий четвертичную, третичную и/или первичную структуру, схожую с такой структурой представляющего интерес белка, поскольку замена сегмента или фрагмента в представляющем интерес белке аналогичным сегментам из такого гомолога будет снижать деструктивность замены. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения гомологичные белки индуцируют иммунологический ответ(ы), схожий с таковым на представляющий интерес белок.
Как здесь используются, «гомологичные гены» относятся к по крайней мере паре генов, соответствующих друг другу и идентичных или очень схожих друг другу, из различных видов. Термином охватываются гены, которые отделимы по видообразованию (т.е. образованию новых видов) (например, ортологичные гены), а также гены, которые отделимы по генетической дупликации (например, паралогичные гены). Эти гены кодируют «гомологичные белки».
Как здесь используются, белки «дикого типа», «природные» и «встречающиеся в природе» белки являются белками, обнаруживаемыми в природе. Термины «последовательность дикого типа» и «ген дикого типа», используемые здесь взаимозаменяемо, относятся к последовательности, являющейся природной или природно-встречающейся в клетке-хозяине. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения последовательность дикого типа относится к представляющей интерес последовательности, являющейся исходной точкой проекта конструирования белков. Гены, кодирующие встречающийся в природе белок, можно получить в соответствии с общими способами, известными квалифицированным в данной области техники специалистам. Способы обычно включают синтез меченых зондов, имеющие предполагаемые последовательности, кодирующие районы представляющего интерес белка, приготовление геномных библиотек из организмов, экспрессирующих белок, и скринирование библиотек на представляющий интерес ген с помощью гибридизации с зондами. Позитивно гибридизующиеся клоны затем картируют и секвенируют.
Используемый здесь термин «рекомбинантная молекула ДНК» относится к молекуле ДНК, которая включает сегменты ДНК, соединенные вместе посредством методов молекулярной биологии.
Термин «рекомбинантный олигонуклеотид» относится к олигонуклеотиду, созданному с использованием манипуляций молекулярной биологии, включающих, но без ограничения, лигирование двух или более олигонуклеотидных последовательностей, образованных расщеплением ферментами рестрикции полинуклеотидной последовательности, синтез олигонуклеотидов (например, синтез праймеров или олигонуклеотидов) и т.п.
Степень гомологии последовательностей можно определить, используя любой подходящий способ, известный в данной области техники (смотри, например, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math., 2: 482 [1981]; Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol., 48: 443 [1970]; Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444 [1988]; такие программы, как GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA, в пакете программ Wisconsin Genetics (Genetics Computer Group, Madison, WI) и Devereux et al., Nucl. Acid Res., 12: 387-395 [1984]).
Например, PILEUP является программой, применимой для определения уровней гомологии последовательностей. PILEUP выравнивает множество последовательностей из группы родственных последовательностей с использованием прогрессирующих попарных выравниваний. Она также может вычертить дерево, демонстрирующее кластерные связи, используемые для создания выравнивания. В PILEUP используется упрощенный способ прогрессирующего выравнивания Feng и Doolittle (Feng and Doolittle, J. Mol. Evol., 35: 351-360 [1987]). Этот способ схож со способом, описанным Higgins и Sharp (Higgins and Sharp, CABIOS 5: 151-153 [1989]). Используемые в PILEUP параметры включают вес пробела по умолчанию, составляющий 3,00, вес длины пробела по умолчанию, составляющий 0,10, и снабженные весом концевые пробелы. Другим примером применимого алгоритма является алгоритм BLAST, описанный Altschul и др. (Altschul et al., J. Mol. Biol., 215: 403-410 [1990] и Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787 [1993]). Одной из особенно полезных программ BLAST является программа WU-BLAST-2 (смотри Altschul et al., Method Enzymol., 266: 460-480 [1996]). Параметры «W», «T» и «X» определяют чувствительность и скорость выравнивания. В программе BLAST используются в качестве параметров по умолчанию длина слова (W), составляющая 11, выравнивания (В) с использованием матрицы оценки BLOSUM62 (смотри Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 [1989]), составляющие 50, ожидание (Е) - 10, M' - 5, N'- 4 и сравнение обеих цепей.
Как здесь используется, «идентичность последовательностей нуклеиновых кислот в процентах (%)» определяется как процент нуклеотидных остатков исследуемой последовательности, которые идентичны нуклеотидным остаткам последовательности.
Используемый здесь термин «гибридизация» относится к процессу, с помощью которого цепь нуклеиновой кислоты соединяется с комплементарной цепью благодаря спариванию оснований, как известно в данной области техники.
Используемое здесь выражение «условия гибридизации» относится к условиям, при которых проводят реакции гибридизации. Эти условия обычно классифицируют по степени «жесткости» условий, при которых определяют гибридизацию. Степень жесткости может быть основана, например, на температуре плавления (Tm) связывающегося с нуклеиновой кислотой комплекса или зонда. Например, «максимальная жесткость» обычно имеет место при приблизительно Tm - 5°С (5ºС ниже Tm зонда); «высокая жесткость» - при приблизительно 5-10°С ниже Tm; «средняя жесткость» - при приблизительно 10-20°С ниже Tm зонда, и «низкая жесткость» - при приблизительно 20-25°С ниже Tm. Альтернативно или дополнительно, условия гибридизации могут основываться на солевых условиях или условиях ионной силы гибридизации и/или промывках одной или нескольких жесткостей. Например, 6×SSC = очень низкой жесткости; 3×SSC = от низкой до средней жесткости; 1×SSC = средней жесткости; и 0,5×SSC = высокой жесткости. Функционально условия максимальной жесткости можно использовать для идентификации последовательностей нуклеиновых кислот, имеющих строгую идентичность или близкую к строгой идентичность с зондом для гибридизации, в то время как условия высокой жесткости используются для идентификации последовательностей нуклеиновых кислот, идентичных на приблизительности 80% или больше последовательности зонда.
Для применений, для которых требуется высокая избирательность, может быть желательным использование относительно жестких условий для образования гибридов (например, используются условия относительно низкой концентрации соли и/или условия высокой температуры).
Выражения «по существу схожие» или «по существу идентичные» в контексте по крайней мере двух нуклеиновых кислот или полипептидов обычно означают, что полинуклеотид или полипептид включает последовательность, которая идентична на по крайней мере приблизительно 40%, более предпочтительно на по крайней мере приблизительно 50%, еще более предпочтительно на по крайней мере приблизительно 60%, предпочтительно на по крайней мере приблизительно 75%, более предпочтительно на по крайней мере приблизительно 80%, еще более предпочтительно на по крайней мере приблизительно 90%, все еще более предпочтительно на приблизительно 95%, наиболее предпочтительно на приблизительно 97%, иногда на не менее приблизительно 98% или приблизительно 99% эталонной (например, дикого типа) последовательности. Идентичность последовательностей можно определить с использованием известных программ, таких как BLAST, ALIGN и CLUSTAL, используя стандартные параметры (смотри, например, Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 [1990]; Henikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 [1989]; Karin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873 [1993] и Higgins et al., Gene 73: 237-244 [1988]). Программное обеспечение для выполнения анализов BLAST общедоступно через National Center for Biotechnology Information. Также базы данных можно перебирать, используя FASTA (Pearson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444-24448 [1988]). Одним из показателей того, что два полипептида по существу идентичны, является то, что первый и второй полипептиды дают перекрестную иммунологическую реакцию. Как правило, полипептиды, которые отличаются заменами консервативных аминокислот, дают перекрестную иммунологическую реакцию. Таким образом, полипептид по существу идентичен второму полипептиду, например, когда два пептида отличаются только консервативной заменой. Другим показателем того, что две последовательности нуклеиновых кислот по существу идентичны, является то, две молекулы гибридизуются друг с другом в жестких условиях (например, внутри диапазона средняя жесткость - высокая жесткость).
Используемые здесь термины «гибридные пергидролазы» и «слитые пергидролазы» относятся к белкам, которые сконструированы из по крайней мере двух различных или «исходных» белков. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения эти исходные белки являются гомологами друг друга. Например, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предпочтительная гибридная пергидролаза или слитый белок содержит N-конец белка и С-конец гомолога белка. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения два конца объединены так, что они соответствуют полноразмерному активному белку.
Используемый здесь термин «регуляторный элемент» относится к генетическому элементу, который контролирует некоторые аспекты экспрессии последовательностей нуклеиновых кислот. Например, промотор является регуляторным элементом, способствующим инициации транскрипции функционально связанной с ним кодирующей области. Дополнительные регуляторные элементы включают сигналы сплайсинга, сигналы полиаденилирования и сигналы терминации.
Как здесь используются, «клетки-хозяева» являются обычно прокариотическими или эукариотическими хозяевами, которые трансформированы или трансфецированы векторами, сконструированными с использованием методов рекомбинантных ДНК, известных в данной области техники. Трансформированные клетки-хозяева способны или реплицировать векторы, кодирующие варианты белка, или экспрессировать желаемый вариант белка. В случае векторов, которые кодируют пре- или препроформу варианта белка, такие варианты при экспрессии, как правило, секретируются из клетки-хозяина в питательную среду для клеток-хозяев.
Термин «введенный» в контексте включения последовательности нуклеиновой кислоты в клетку относится к таким способам, как трансформация, трансдукция и трансфекция. Способы трансформации включают трансформацию с использованием протопластов, трансформацию с использованием хлорида кальция, электропорацию, «голую» ДНК и т.п., известные в данной области техники (смотри Chang and Cohen, Mol. Gen. Genet., 168: 111-115 [1979]; Smith et al., Appl. Env. Microbiol., 51: 634 [1986] и обзорную статью Ferrari и др. в Harwood, Bacillus, Plenum Publishing Corp., pp. 57-72 [1989]).
Используемый здесь термин «промотор/энхансер» обозначает сегмент ДНК, который содержит последовательности, способные обеспечивать как функцию промотора, так и функцию энхансера (например, длинные концевые повторы ретровирусов обладают функциями и промотора, и энхансера). Энхансер/промотор может быть «эндогенным» или «экзогенным» или «гетерологичным». Эндогенным энхансером/промотором является энхансер/промотор, который природно связан с данным геном в геноме. Экзогенным (гетерологичным) энхансером/промотором является энхансер/промотор, который помещен в смежное положение с геном посредством генетической манипуляции (т.е. методов молекулярной биологии).
nd
Наличие «сигналов сплайсинга» в экспрессионном векторе часто приводит к более высоким уровням экспрессии рекомбинантного транскрипта. Сигналы сплайсинга опосредуют удаление интронов из первичного РНК-транскрипта и состоят из донорного и акцепторного сайта сплайсинга (смотри, например, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York [1989], pp. 16.7-16.8). Широко применяемым донорным и акцепторным сайтом сплайсинга является сплайсинговый стык из РНК 16S SV40.
Термин «стабильная трансфекция» или «стабильно трансфицированный» относится к введению и интеграции чужеродной ДНК в геном трансфицированной клетки. Термин «стабильный трансфектант» относится к клетке, в геномную ДНК которой стабильно интегрирована чужеродная или экзогенная ДНК.
Термины «селективный маркер» или «селективный генный продукт», как здесь используются, относятся к использованию гена, который кодирует ферментативную активность, которая придает устойчивость к антибиотику или лекарственному средству клетке, в которой экспрессируется селективный маркер.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящим изобретением обеспечиваются способы и композиции, включающие по крайней мере один пергидролазный фермент для мойки или очистки и других применений. В некоторых вариантах осуществления настоящим изобретением обеспечиваются способы и композиции для образования длинноцепочечных перкислот. Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения находят конкретное приложение в применениях, включающих мойку или очистку, отбеливание и дезинфекцию.
В некоторых вариантах осуществления настоящим изобретением обеспечивается пергидролазный фермент, который находит применении в ферментативной продукции длинноцепочечной перкислоты из субстрата со сложноэфирной составляющей и перекиси водорода. Перкислота, продуцируемая указанной пергидролазой, зависит от субстрата со сложноэфирной составляющей, пергидролизуемого указанной пергидролазой. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения перкислота, продуцируемая указанной пергидролазой, включает, но без ограничения, перкапроновую кислоту, перкаприловую кислоту, пернонановую кислоту, пердекановую кислоту, пердодекановую кислоту, пермиристиновую кислоту, перпальмитиновую кислоту, перстеариновую кислоту или перолеиновую кислоту. В дополнительных вариантах осуществления множество субстратов находит применение в настоящем изобретении.
6
10
11+
11
22
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, как описывается более подробно ниже, сложноэфирным субстратом с длинной цепью является С-Ссубстрат или С-субстрат (например, С-Ссубстрат) в зависимости от желаемой перкислоты. Как описывается более подробно ниже, в настоящем изобретении находит применение множество различных сложноэфирных субстратов с длинными цепями. В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения субстрат со сложноэфирной составляющей выбирают из одного или нескольких следующих субстратов: эфира капроновой кислоты, эфира каприловой кислоты, эфира нонановой кислоты, эфира декановой кислоты, эфира додекановой кислоты, эфира миристиновой кислоты, эфира пальмитиновой кислоты, эфира стеариновой кислоты и эфира олеиновой кислоты или любой их насыщенной или ненасыщенной формы. В дополнительных вариантах осуществления множество сложных эфиров находит применение в настоящем изобретении.
Пергидролазные ферменты и перкислоты настоящего изобретения находят применение в мойке или очистке, отбеливании и/или дезинфекции в широком диапазоне рН и интервале температур. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения диапазон рН, используемый при этом образовании, составляет от приблизительно 4 до приблизительно 12. В некоторых альтернативных вариантах осуществления настоящего изобретения используемый интервал температур находится между приблизительно 5°С и приблизительно 90°С. Действительно, некоторые варианты осуществления настоящего изобретения предоставляют преимущества над используемыми в настоящее время системами (смотри, например, ЕР-заявку 87-304933.9) в том, что настоящее изобретение делает возможным отбеливание при оптимальном для окисления перкислот рН, также обеспечивая отбеливание при нейтральном рН, кислых рН и при низких температурах. Длинноцепочечные перкислоты имеют слабый запах или лишены запаха. Как таковое, применение пергидролазы настоящего изобретения обеспечивает определенные преимущества над другими системами (например, другими пергидролазами, которые продуцируют только короткоцепочечные перкислоты, имеющие сильный запах).
Несмотря на то, что настоящее изобретение описывается здесь наиболее полно в отношении стирки и ухода за тканью, не подразумевается, что настоящее ограничивается этими применениями. Действительно, настоящее изобретение находит применение в различных установках, в частности тех, в которых желательно отбеливание перкислотами и/или перекисью водорода, включающих, но без ограничения, стирку, мойку посуды, обработку тканей, переработку целлюлозы и бумаги, применения для личной гигиены, дезинфекцию и мойку или чистку твердых поверхностей. Например, предусматривается, что композиции настоящего изобретения найдут применение для отбеливания целлюлозы, в том числе применение в таких способах, как способы, изложенные в патентах США № 6569286, 5785812, 6165318 и 4400237, все из которых включены сюда посредством ссылки.
2
2
Исторически в качестве отбеливающих соединений использовались натрия перборат и более недавно натрия перкарбонат, в частности в моющих средствах в Европейских прачечных. Эти соединения имеют тенденцию к быстрому разложению в водных растворах с выходом перекиси водорода (НО), которая является активным отбеливающим агентом. Поскольку натрия перборат является более активным при температурах, превышающих 80°С, и менее активным в интервале температур 40-60°С (т.е. при температурах стирки, которые стали наиболее широко предпочтительными с 1950 годов), активаторы отбеливания включали в моющие средства для стирки, содержащие натрия перборат. Действительно, большинство моющих средств для стирки содержат активаторы отбеливания. Этими активаторами являются соединения с О- или N-связанными ацетильными группами, которые способны вступать в реакцию в значительной степени нуклеофильным гидроперокси-анионом с выходом пероксиуксусной кислоты. Поскольку вступающим в реакцию видом является гидроперокси-анион, для эффективного превращения этих активаторов в перкислоты весьма важны щелочные значения рН. Пероксиуксусная кислота разлагается в слабо основной среде с продукцией синглетного кислорода (смотри, например, Hofmann et al., J. Prakt. Chem., 334: 293-297 [1992]).
2
2
2
2
2
2
Перекись водорода является особенно эффективным отбеливающим веществом при высоких температурах (например, >40°С) и рН (>10), в условиях, которые обычно используются при стирке тканей в некоторых установках. Однако, как указано выше, стирка в холодной воде становится более широко используемой и приводит к менее эффективному отбеливанию перекисью водорода, чем при использовании горячей воды. Для преодоления этого ущерба от низкой температуры моющие составы обычно включают усилители отбеливания, такие как TAED (N,N,N',N'-тетраацетилэтилендиамин), NOBS (нонаноилоксибензолсульфонат) и т.п. В то время как при комбинации NOBS с НО образуется пернонановая кислота, при комбинации TAED с НО образуется перуксусная кислота, вид перкислоты, который эффективнее самой НО. Хотя это увеличивает отбеливающую способность моющего средства, реакция с использованием TAED эффективна только на приблизительно 50%, поскольку только две из четырех ацетильных групп в TAED превращаются в перкислоты. Кроме того, превращение TAED в перуксусную кислоту под действием перекиси водорода эффективно только при щелочных рН и высоких температурах. Таким образом, реакция с использованием TAED не оптимизирована для приложения во всех применениях для отбеливания (например, тех, в которые вовлечены нейтральные или кислые рН и холодная вода). Настоящим изобретением обеспечивается средство преодоления недостатков использования TAED. Например, некоторые особенно предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения находят приложение с применениями холодной воды, а также для тех случаев, в которые вовлечены нейтральные или кислые величины рН. Кроме того, дополнительные особенно предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения обеспечивают способ образования перкислоты из перекиси водорода с высоким отношением пергидролиза к гидролизу. Такой способ обеспечивает преимущества над композициями, содержащими такие ферменты, как эстеразы и липазы), которые характеризуются очень низкими отношениями пергидролиза к гидролизу.
Помимо его применения в моющих средствах, некоторые предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения обеспечивают способы и композиции для применения перкислот в отбеливании текстиля и в различных других применениях. В некоторых вариантах осуществления настоящим изобретением обеспечиваются одностадийные способы применений для обработки текстиля, включающие, но без ограничения, одностадийные процессы расшлихтовки, промывки и отбеливания (смотри, например, WO 03/002810, EP 1255888, WO 01/64993 и US 2002/0007516, все из которых таким образом включены посредством ссылки). Как здесь описывается более подробно, в некоторых вариантах осуществления отбеливание включает обработку текстильного материала до его сушки и/или после его включения в текстильные товары. Однако не подразумевается, что настоящее изобретение ограничивается какой-либо конкретной схемой применения, а также каким-либо конкретным текстильным материалом.
Кроме того, многие перкислоты находят применение в качестве эффективного бактерицида (смотри Baldry, J. Appl. Bacteriol., 54: 417-423 [1983]). Таким образом, некоторые варианты осуществления настоящего изобретения обеспечивают композиции и способы для стерилизации/дезинфекции различных объектов, включающих, но без ограничения, медицинские устройства, медицинское оборудование, промышленное оборудование и биореакторы, а также любой объект, для которого требуется стерилизация и/или дезинфекция. В дополнительных вариантах осуществления настоящим изобретением обеспечиваются композиции и способы, подходящие для применения в контролировании биопленок, таких как в градирне.
Также, как описывается более подробно в примерах ниже, настоящее изобретение обеспечивает много преимуществ для мойки или очистки и/или стерилизации широкого ряда объектов. В дополнительных вариантах осуществления настоящим изобретением обеспечиваются композиции, которые эффективны в мойке, отбеливании и дезинфекции при ряде температур и рН стирки. В еще одних дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение находит применение в разложении перкислот благодаря присущей пергидролазам активности разложения перкислот. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления эту активность используют в применениях для удаления отработанных перкислот.
Кроме того, некоторые пергидролазные ферменты настоящего изобретения активны на различных субстратах, являющихся донорами ацильных групп, а также активны при низких концентрациях субстрата и обеспечивают средство для эффективного пергидролиза вследствие высокого отношения перкислота: кислота. Действительно признано, что более высокие отношения пергидролиза к гидролизу являются предпочтительными для применений для отбеливания (смотри, например, патент США № 5352594, 5108457, 5030240, 3974082 и 5296616, все из которых включены сюда посредством ссылки). Некоторые пергидролазные ферменты настоящего изобретения обеспечивают отношения пергидролиза к гидролизу, превышающие 1. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения пергидролазные ферменты обеспечивают отношение пергидролиза к гидролизу, превышающие 1, и находят применение в отбеливании.
Кроме того, показано, что пергидролазы настоящего изобретения активны в широко используемых моющих или чистящих составах (например, Ariel Futur, WOB и т.п.). Таким образом, указанная пергидролаза обеспечивает много преимуществ в различных установках для мойки или очистки.
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Как указано выше, конкретными компонентами для продукции перкислот при ферментативном пергидролизе являются фермент, субстрат со сложноэфирной составляющей и перекись водорода. В некоторых вариантах осуществления перекись водорода непосредственно добавляют в замес, в то время как в других вариантах осуществления она непрерывно образуется in situ. В используемых в настоящее время стиральных порошках используются добавления в замес НО в форме солей перкарбоната или пербората, которые самопроизвольно разлагаются с образованием НО. Пергидролазные ферменты настоящего изобретения находят применение в том же способе групповой обработки стиральным порошком, что и источник НО. Однако эти ферменты также находят применение с любым другим подходящим источником НО, в том числе НО, образованной химическим, электрохимическим и/или ферментативным способом. Примеры химических источников включают, но без ограничения, перкарбонаты и пербораты, упоминаемые выше. Не ограничивающим примером электрохимического источника является подаваемый в топливный элемент кислород и водород в виде газа, в то время как не ограничивающий пример ферментативного примера включает образование НО в реакции глюкозы и кислорода с участием глюкозооксидазы. Следующее уравнение предоставляет пример связанной системы, которая находит применение с настоящим изобретением.
2
2
2
2
Не подразумевается, что какие-либо варианты осуществления настоящего изобретения ограничены каким-либо конкретным ферментом, поскольку любой фермент, который приводит к образованию НОпри использовании подходящего субстрата, находит применение в настоящем изобретении. Например, лактатоксидазы из видов Lactobacillus, которые, как известно, продуцируют НО из молочной кислоты и кислорода, находят применение в настоящем изобретении. Действительно, одним из преимуществ некоторых способов настоящего изобретения является то, что образование кислоты (например, глюконовой кислоты в приведенном выше примере) снижает рН основного раствора до диапазона рН, в котором перкислота наиболее эффективна для отбеливания (т.е. около рКа). Другие ферменты (например, для алкогольоксидаза, этиленгликольоксидаза, глицеролоксидаза, оксидазы аминокислот и т.п.), которые могут приводить к образованию перекиси водорода, также находят применение с субстратами со сложноэфирными составляющими в комбинации с пергидролазными ферментами настоящего изобретения для образования перкислот.
Как здесь описывается более подробно, настоящим изобретением обеспечиваются способы и композиции, включающие по крайней мере один пергидролазный фермент для мойки или очистки и других применений. В некоторых вариантах осуществления настоящим изобретением обеспечиваются способы и композиции для образования длинноцепочечных перкислот. Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения находят конкретное приложение в применениях, включающих мойку или очистку, отбеливание и дезинфекцию.
Обеспечиваются композиции, включающие пергидролазный фермент, который пергидролизует длинноцепочечные ацильные эфирные субстраты с образованием длинноцепочечных перкислот, а также способы их применения. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение находит конкретное приложение в применениях, включающих мойку или очистку, отбеливание и/или дезинфекцию.
Как отмечено выше, настоящая заявка испрашивает приоритет заявки на патент WO 05/056782. Полное описание WO 05/056782, в том числе, без ограничения, все описания пергидролазных ферментов, изменений аминокислот, кристаллических структур, способов анализ, способов применения, последовательностей, гомологов, ортологов, сопоставлений последовательностей, фигур, таблиц, композиций для мойки или очистки и т.п., включено таким образом сюда посредством ссылки для всех целей. Также отмечено, что в некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления предоставляемые здесь ферменты гидролизуют, а также пергидролизуют длинноцепочечные ацильные эфирные субстраты.
Пергидролазные ферменты
M. smegmatis
Как указано выше, настоящим изобретением обеспечиваются выделенные пергидролазные ферменты, которые пергидролизуют длинноцепочечные ацильные эфирные субстраты. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления в присутствии длинноцепочечного ацильного эфирного субстрата и перекиси водорода ферменты продуцируют перкислоты с длинными и средними цепями. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения пергидролазы имеют измененную субстратную специфичность относительно встречающейся в природе пергидролазы (например, встречающейся в природе пергидролазы  (SEQ ID NO: 2)), поскольку указанные пергидролазы способны пергидролизовать длинноцепочечные ацильные эфирные субстраты в степени, превышающей степень гидролиза короткоцепочечных эфирных субстратов. В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения пергидролаза способна пергидролизовать длинноцепочечные эфирные субстраты в степени, превышающей на по крайней мере приблизительно 10%, на по крайней мере приблизительно 50%, на по крайней мере приблизительно 100%, на по крайней мере приблизительно 200%, на по крайней мере приблизительно 500% или на по крайней мере приблизительно 10000% степень пергидролиза короткоцепочечных эфирных субстратов. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения отношение степени пергидролиза длинноцепочечных эфиров: степени гидролиза короткоцепочечных эфиров для указанной пергидролазы составляет по крайней мере приблизительно 1, по крайней мере приблизительно 2, по крайней мере приблизительно 3, по крайней мере приблизительно 10, по крайней мере приблизительно 100 или по крайней мере приблизительно 1000, причем короткоцепочечные эфирные субстраты включают эфир перуксусной кислоты и эфир пербутаноной кислоты, а длинноцепочечный эфирный субстрат включает эфир пероктановой кислоты.
M. smegmatis
Различные аминокислоты в указанном пергидролазном ферменте упоминаются здесь со ссылкой на их положение в первичной аминокислотной последовательности фермента (например, «указанная пергидролаза может содержать Gly в положении 12»). Как описано выше и без труда очевидно для квалифицированного в данной области техники специалиста, положения аминокислот в указанном пергидролазном ферменте определяют относительно соответствующего положения пергидролазы SEQ ID NO: 2 (т.е. пергидролазы дикого типа ). В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения соответствующие положения аминокислот идентифицируют с помощью структурного анализа и или выравнивания первичной аминокислотной последовательности указанного пергидролазного фермента и SEQ ID NO: 2. Способы выравнивания первичных аминокислотных последовательностей родственных ферментов хорошо известны (смотри, например, Upton and Buckley, Trends Biochem. Sci., 20: 178 [1995]). Кроме того, не ограничивающие выравнивания предоставляются в WO 05/056782.
M. smegmatis
В некоторых предпочтительных вариантах осуществления пергидролазы настоящего изобретения имеют аминокислотную последовательность, которая идентична на по крайней мере приблизительно 35% аминокислотной последовательности исходного фермента (например, фермента дикого типа, кодируемого микроорганизмом, хотя не подразумевается, что настоящее изобретение ограничивается вариантами ферментов дикого типа, поскольку сконструированные ферменты находят применение в качестве исходных ферментов). В некоторых вариантах осуществления пергидролазы настоящего изобретения родственны ферменту дикого типа, кодируемому геном микроорганизма, но не являются одинаковыми с таким ферментом. В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления пергидролазы настоящего изобретения имеют аминокислотную последовательность, которая идентична аминокислотной последовательности исходного фермента (например, пергидролазы дикого типа  или варианта такой пергидролаза, указанного в WO 05/05678, или встречающего в природе, родственного ацилтрасферазе фермента, кодируемого геномом бактерии, указанного в WO 05/05678) на по крайней мере приблизительно 35%, на по крайней мере приблизительно 40%, на по крайней мере приблизительно 45%, на по крайней мере приблизительно 50%, на по крайней мере приблизительно 55%, на по крайней мере приблизительно 60%, на по крайней мере приблизительно 65%, на по крайней мере приблизительно 70%, на по крайней мере приблизительно 75%, на по крайней мере приблизительно 80%, на по крайней мере приблизительно 85%, на по крайней мере приблизительно 90%, на по крайней мере приблизительно 95%, на по крайней мере приблизительно 97%, на по крайней мере приблизительно 98% или на по крайней мере приблизительно 99%.
В некоторых предпочтительных вариантах осуществления аминокислотная последовательность пергидролазы настоящего изобретения отличается от исходного фермента по небольшому числу остатков аминокислот. Число различающихся остатков аминокислот может составлять приблизительно 1, приблизительно 2, приблизительно 3, приблизительно 4, приблизительно 5, по крайней мере приблизительно 10, по крайней мере приблизительно 15, по крайней мере приблизительно 20, по крайней мере приблизительно 30, по крайней мере приблизительно 40, по крайней мере приблизительно 50 или более остатков аминокислот. В некоторых вариантах осуществления число различающихся между вариантами аминокислот находится между приблизительно 1 и приблизительно 10.
В некоторых вариантах осуществления пергидролазные ферменты настоящего изобретения включают какую-либо одну или комбинацию следующих аминокислот: Gly, Pro или Gln в положении 12, Trp в положении 22, Pro в положении 59, Pro в положении 153, Thr, Ser, Val или Gln в положении 154, Gly в положении 194, Ser, Gln, Val, Gly, Pro, Ile или His в положении 196 и/или Tyr или Trp в положении 204. В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления пергидролазные ферменты настоящего изобретения включают: а) Ala в положении 154 и Met в положении 194, b) Gly в положении 154 и Val в положении 194, или c) Gly в положении 12 и Met в положении 194, d) Thr в положении 154 и Ile в положении 196, e) Gln в положении 12 и Val в положении 154, f) Met в положении 12 и Glu в положении 154, g) Gly в положении 12 и Gly в положении 154, h) Glu в положении 154 и Ser в положении 194, или i) Gly в положении 12 и Trp в положении 22, или любую их комбинацию.
Хотя не подразумевается, что настоящее изобретение ограничено каким-либо конкретным механизмом, присутствие этих аминокислот обеспечивает пергидролазу, которая способна гидролизовать длинноцепочечные ацильные эфиры с образованием длинноцепочечных перкислот. В некоторых вариантах осуществления замена аминокислоты пергидролазы дикого типа одной из указанных выше аминокислот приводит к получению пергидролазы с измененной субстратной специфичность по сравнению с ферментом пергидролазы дикого типа.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения пергидролазные ферменты пергидролизуют длинноцепочечные ацильные эфирные субстраты, причем эквивалентный пергидролазный фермент, не содержащий одну или несколько из указанных выше замен аминокислот, не пергидролизуют выявляемо тот же самый субстрат(ы). В некоторых других вариантах осуществления пергидролазы настоящего изобретения имеют большую специфичность в отношении длинноцепочечных ацильных эфирных субстратов, чем в отношении короткоцепочечных ацильных эфирных субстратов.
M. smegmatis
Структурно-функциональную связь нескольких пергидролазных ферментов, включающих встречающуюся в природе пергидролазуи несколько сотен их активных вариантов, и гомологичные ферменты из других видов, детально исследовали, как описано в WO 05/056782. Действительно предусматривается, что широкий выбор замен аминокислот вводится в пергидролазный фермент без отмены его активности. Кроме того, конкретные аминокислоты, описанные выше, можно заменить в любой пергидролазе с получением пергидролазы, которая может продуцировать длинноцепочечные перкислоты.
M. smegmatis
M. smegmatis
M. smegmatis
M. smegmatis
Координаты аминокислот встречающейся в природе пергидролазы  фермента и обсуждение ее кристаллической структуры предоставляется в WO 05/056782. Кроме того, как сообщается в WO 05/056782, пергидролаза была подвергнута мутагенезу методом насыщения сайтов для систематичной проверки эффектов аминокислотных замен на каждое положение аминокислоты в ферменте. В этих экспериментах каждую аминокислоту пергидролазы заменяли каждой из остающихся 19 аминокислот, и каждый вариант систематично проверяли на различные активности, включающие их гидролитическую активность, их пергидролитическую («PAF») активность, активность разложение перкислот («PAD»), устойчивость к рН, термостабильность, химическую стабильность и т.п. Списки сотен аминокислотных замен, которые допускаются некоторыми вариантами осуществления и в некоторых вариантах осуществления и могут использоваться для изменения гидролитической активности, пергидролитической активности, активности разложение перкислот или стабильности пергидролазы , изложены в WO 05/056782.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения любые изменения аминокислот, которые придают способность пергидролизовать длинноцепочечный эфирный субстрат, объединяют с любым из изменений аминокислот, описанных в WO 05/056782, для получения вариантов белков, описанных здесь. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения изменения аминокислот объединяют для получения вариантов, которые характеризуются увеличением или уменьшением степени гидролиза перкислоты и/или увеличением или уменьшением отношения пергидролиз/гидролиз.
В некоторых предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения одно или несколько изменений аминокислот, обеспечивающих длинноцепочечные перкислоты, объединяют с изменениями, обеспечивающими пергидролазу, которая характеризуется более высоким отношением пергидролиза к гидролизу (например, отношением, превышающим 1) и более низкую степень гидролиза перкислот (например, степень гидролиза перкислот меньше 0,8, по сравнению с SEQ ID NO: 2), для обеспечения пергидролазного фермента, который эффективно продуцирует длинноцепочечную кислоту(ы).
M. smegmatis
В некоторых вариантах осуществления, и без какого-либо намерения ограничить какой-либо аспект настоящего изобретения какой-либо конкретной последовательностью, пергидролазные ферменты настоящего изобретения включают: а) одно или несколько описанных выше изменений, обеспечивающих длинноцепочечные перкислоты, и b) одно или несколько изменений, которые обеспечивают степень гидролиза перкислот, составляющую приблизительно 0,8 или меньше, по сравнению с пергидролазой  дикого типа. В некоторых из этих вариантов осуществления одно или несколько изменений, которые обеспечивают степень гидролиза перкислот, составляющую приблизительно 0,8 или меньше, включают по крайней мере одну замену, выбираемую из A122, A23, A29, A55, D45, D62, D65, E26, E50, F150, F46, G110, G124, G43, L109, L119, L42, L68, L78, L82, L84, N59, P66, R101, R27, R4, R67, S112, S54, S76, T116, T120, T25, V125, V48, W149, Y73, A44, A79, D85, E51, G124, G126, G15, G52, I194, K97, L119, L12, L38, L53, L68, L86, N94, P18, R101, R27, R4, R67, S54, S72, T58, T80, V118, V87, W34, R4, I5, D10, L12, W14, V19, T25, W34, I49, E50, E51, L53, S54, A55, R56, N59, D62, T64, D65, R67, L68, N69, S76, C77, T80, L82, P83, L86, V87, N94, T96, F100, R101, L109, M111, L114, L119, W149, Y129, A122, G126, T127, A23, A55, A79, D65, D85, E26, F154, G110, G124, G126, G22, G36, G43, G52, G70, I49, K97, L109, L114, L119, L12, L38, L42, L53, L68, L86, P104, P83, Q41, R102, R56, R67, S54, T57, V118, V125, W14, W149, Y129, Y73, A122, A23, A79, D45, D65, D85, E26, E47, E51, F150, F196, F28, G110, G124, G36, G43, G52, G70, I107, I5, I60, L109, L119, L53, L6, L68, L82, M111, P104, P66, R102, R67, S11, S112, S121, S54, S72, T25, T35, T57, T58, V118, V125, V19, W149, W16, A108, A122, A23, A29, A79, C7, D106, D21, D45, D62, D65, D85, E50, F150, F28, G124, G126, G22, G36, G52, I107, I194, K97, L105, L109, L114, L119, L38, L68, L78, L82, L84, M111, N69, N94, P104, P63, P66, R102, R27, S11, S112, S54, S72, T116, T120, T127, T13, T25, T57, T80, T96, V113, A122, A29, A71, A79, C7, D106, D21, D61, D65, D85, E47, E50, F150, F196, F28, F46, G124, G126, G15, G36, G70, I49, I5, I69, L105, L109, L12, L38, L42, L53, L84, L86, M111, N59, P146, P24, P66, Q41, R102, R27, R56, S112, S121, S54, S72, T116, T120, T127, T128, T13, T57, T64, V125, V17, V19, W14, W149, W16, Y129, Y99, A108, A122, A23, A29, A44, A55, A71, A79, C77, D45, D61, D65, D85, D95, E47, E51, F150, F196, F46, G110, G126, G36, G43, G52, I107, I194, I49, I5, I60, I89, L114, L42, L53, L68, L78, L84, M111, N59, N94, P146, P24, P30, P63, P66, P83, Q117, R101, R4, S112, S121, S72, T116, T120, T127, T13, T57, T96, V113, V125, V17, V19, V32, V87, W149, Y129, Y73, G190, V191, G193, T197, N201, D203, L208, A209, V212, L215 и L216. В некоторых вариантах осуществления одно или несколько изменений, которое(ые) является по крайней мере одной заменой, выбираемой из R4, L12, G15, P18, R27, W34, L38, A44, E51, G52, L53, S54, T58, R67, L68, S72, A79, T80, D85, L86, V87, N94, K97, R101, V118, L119, G124, G126 и I194, обеспечивают степень гидролиза перкислот, составляющую приблизительно 0,1 или меньше.
В дополнительных вариантах осуществления, и снова без какого-либо намерения ограничить какой-либо аспект настоящего изобретения какой-либо конкретной последовательностью, пергидролазные ферменты настоящего изобретения включают: а) одно или несколько описанных выше изменений, обеспечивающих длинноцепочечные перкислоты, и b) одно или несколько изменений, которые обеспечивают изменение пергидролиза, так что отношение пергидролиза с участием варианта пергидролазы к пергидролизу с участием пергидролазы дикого типа составляет по крайней мере 1,2. В некоторых из этих вариантов осуществления одно или несколько изменений, которые обеспечивают изменение пергидролиза, так что отношение пергидролиза с участием варианта пергидролазы к пергидролизу с участием пергидролазы дикого типа составляет по крайней мере приблизительно 1,2, выбирают из C7, D10, L12, G15, P18, V19, G22, T25, E26, R27, F28, A29, P30, D31, G36, Q40, Q41, L42, G43, A44, D45, F46, E47, I49, E51, L53, S54, A55, T57, D61, P63, T64, D65, P66, R67, L68, N69, A71, S72, Y73, S76, L78, A79, T80, L82, P83, D85, L86, D95, K97, R101, T103, P104, L105, D106, I107, L109, M111, V113, Q117, V118, S121, G124, V125, G126, T127, P148, F150, I153, F154 и F196. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления одно или несколько изменений, которые выбирают из A44, C7, D10, D85, D95, E26, E47, I107, L12, L42, P104, P148, S54, Q40, Q117, D203, V206, E210, K97, L12, P104, V125, D85, L53 и L78, обеспечивают изменение пергидролиза, так что отношение пергидролиза с участием варианта пергидролазы к пергидролизу с участием пергидролазы дикого типа составляет по крайней мере приблизительно 2.
В некоторых альтернативных предпочтительных вариантах осуществления, и снова без какого-либо намерения ограничить какой-либо аспект настоящего изобретения какой-либо конкретной последовательностью, пергидролазные ферменты настоящего изобретения включают одно или несколько описанных выше изменений, обеспечивающих длинноцепочечные перкислоты, а также аминокислотные замены, которые обеспечивают пергидролазу, которая проявляет отношение пергидролазных активностей, составляющее по крайней мере приблизительно 1,2, и степень гидролитической в отношении перкислот активности, составляющую приблизительно 0,8 или меньше, по сравнению с пергидролазой дикого типа. В некоторых из этих вариантов осуществления замены выбирают из A29, A44, A55, A71, A79, C7, D10, D106, D31, D85, E26, E47, F150, F154, F196, F28, G124, G126, G36, G43, I153, L109, L42, L53, L109, L42, L53, L109, L42, L53, L68, L82, L86, M111, N69, P104, P148, P18, P63, P66, P83, Q117, Q40, R101, R67, S54, S121, S72, S76, T25, T64, V115 и V19. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления используют следующие аминокислотные замены: L12I и S54V, L12M и S54T, L12T и S54V, L12Q, T25S и S54V, L53H и S54V, S54P и V125R, S54V и V125G, S54V и F196G, S54V, K97R и V125G, и A55G, R67T, K97R и V125G, как описано в WO 05/056782.
M. smegmatis
Agrobacterium rhizogenes
A. rhizogenes
A. tumefaciens
A. tumefaciens
A. tumefaciens
A. tumefaciens
Prosthecobacter dejongeii
Rhizobium loti
R. meliloti
R. meliloti
R. rhizogenes
R. rhizogenes
R. solanacerarum
Sinorhizobium meliloti
S. meliloti
Mesorhizobium loti
A. rhizogenes
A. rhizogenes
Agrobacterium tumefaciens
Mesorhizobium loti
Mesorhizobium loti
Ralstonia solanacearum
Ralstonia eutropha
Moraxella bovis
Burkholderia cepacia
Chromobacterium violaceum
Vibrio vulnificus
Salmonella typhimurium
Sinorhizobium meliloti
Sinorhizobium meliloti
Sinorhizobium meliloti
Аминокислоты, которые являются критическими для активности указанной пергидролазы, описываются в WO 05/056782 как аминокислоты, которые подходят для изменения пергидролазы без отмены ее активности. Также в WO 05/056782 описывается несколько пергидролазных ферментов из видов, отличных от , а также домены, которые являются консервативными в этом семействе пергидролаз, включающих, но без ограничения,  (Q9KWA6),  (Q9KWB1),(Q8UFG4), (Q8UAC0),(Q9ZI09), (ACA),(RVM04532), (Q98MY5), (Q92XZ1), (Q9EV56), (NF006), (NF00602875), (Q8XQI0), (RSM02162), (RSM05666),  (RMLO00301), (Q9KWA6), (Q9KWB1), (AAD02335), (Q98MY5), (ZP00197751), (Q8XQI0), (ZP00166901), (AAK53448),(ZP00216984), (Q7NRP5), виды Pirellula (NP_865746), (AA007232), (AAC38796), (SMal993), (Q92XZ1) и (Q9EV56). Аминокислотные последовательности этих белков, выравнивания последовательностей и вся другая информация, относящаяся к указанному выше, включены сюда посредством ссылки для всех целей из WO 05/056782.
В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения пергидролазный фермент является гидролазой GDSL-GRTT/ARTT или SGNH, описываемой в WO 05/056782. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения фермент включает по крайней мере один или комбинацию следующих консервативных остатков: L6, W14, W34, L38, R56, D62, L74, L78, H81, P83, M90, K97, G110, L114, L135, F180 и G205.
Как описывается в WO 05/056782, различные способы находят применение для определения активности(ей) пергидролазного фермента. Однако не подразумевается, что настоящее изобретение ограничивается каким-либо конкретным способом анализа.
6
Репортерные субстраты, подходящие для определения того, может ли пергидролаза использовать длинноцепочечные эфирные субстраты, включают, но без ограничения, п-нитрофениловые эфиры, содержащие цепь из по крайней мере С углеродов (например, п-нитрофенилкапроат, п-нитрофенилкаприлат, п-нитрофенилнонаноат, п-нитрофенилдеканоат, п-нитрофенилдодеканоат, п-нитрофенилмиристат, п-нитрофенилпальмитат, п-нитрофенилстеарат и п-нитрофенилолеат). Дополнительные длинноцепочечные эфирные субстраты, которые находят применение, включают, но без ограничения, эфиры гексановой кислоты, эфиры гептановой кислоты, эфиры октановой кислоты, эфиры нонановой кислоты и эфиры высших карбоновых кислот, такие как С10-С18 или выше.
Продукция пергидролазы
M. smegmatis
E. coli
Пергидролаза  дикого типа является внутриклеточным белком в ее природном хозяине. В некоторых вариантах осуществления пергидролазные ферменты настоящего изобретения продуцируются внутриклеточно в не являющихся природными хозяевах. В некоторых вариантах осуществления к пергидролазе добавляют сигнальную последовательность, которая способствует экспрессии пергидролазы путем секреции в периплазму (т.е. в грамотрицательных организмах, таких как ) или во внеклеточное пространство (т.е. в грамположительных организмах, таких как Bacillus и Actinomyces) или грибковых хозяевах (например, Trichoderma, Aspergillus, Saccharomyces и Pichia). Не подразумевается, что настоящее изобретение ограничивается этими конкретными хозяевами, так как различные другие организмы, включающие другие прокариоты и эукариоты, находят применение в качестве экспрессирующих хозяев в настоящем изобретении.
E. coli
Pantoea citrea
Множество имеющихся в продаже экспрессионных систем, включающих, но без ограничения, pBAD, plac, T7, находят применение для экспрессии пергидролазы в грамотрицательных хозяевах (например, ). В некоторых вариантах осуществления эти же типы промоторов находят применение в другом грамотрицательном хозяине, .
B. subtilis
Виды Bacillus широко известны в качестве подходящих хозяев для экспрессии экстраклеточных белков (например, протеаз). Внутриклеточная экспрессия белков менее известна. В некоторых вариантах осуществления экспрессию белка пергидролазы внутриклеточно в  осуществляют, используя любое разнообразие промоторов, включающих, но без ограничения, pVeg, pSPAC, pAprE или pAmyE, в отсутствие сигнальной последовательности на 5'-конце гена. В некоторых вариантах осуществления экспрессия достигается из реплицирующейся плазмиды (с высоким или низким числом копий), в то время как в альтернативных вариантах осуществления экспрессия достигается с помощью интегрирования желаемой конструкции в хромосому. Интеграцию можно осуществить в любой локус, включающий, но без ограничения, локусы aprE, amyE или pps. В некоторых вариантах осуществления пергидролаза экспрессируется из одной или нескольких копий интегрированной конструкции. В альтернативных вариантах осуществления множество интегрированных копий получают с помощью интеграции конструкции, способной амплифицироваться (например, связанной с противомикробной кассетой и фланкированной последовательностями прямых повторов) или с помощью лигирования множества копий и последующей интеграции в хромосому. В некоторых вариантах осуществления экспрессию пергидролазы или с реплицирующейся плазмиды, или с интегрированной конструкции контролируют, используя анализ активности pNB (описанный здесь) в соответствующей культуре.
Как и в случае видов Bacillus, в некоторых вариантах осуществления экспрессию пергидролазы в Streptomyces осуществляют, используя реплицирующуюся плазмиду, в то время как в других вариантах осуществления экспрессию пергидролазы осуществляют через интеграцию вектора в геном Streptomyces. Любой промотор, который может быть узнан в Streptomyces, находит применение в запуске транскрипции гена пергидролазы (например, промотор глюкозоизомеразы или промотор А4). Реплицирующиеся плазмиды, или «челночные» векторы или только Streptomyces, также находят применение в настоящем изобретении для экспрессии (например, pSECGT).
В некоторых предпочтительных вариантах осуществления пергидролазы настоящего изобретения секретируются из клетки-хозяина, так что пергидролазу можно извлечь из среды для культивирования клеток, в которой культивируют клетку-хозяина.
Композиции для мойки или очистки
1
2
1
2
Как указано выше, настоящим изобретением обеспечиваются композиции для мойки или очистки, включающие пергидролазные ферменты настоящего изобретения. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения композиции для мойки или очистки включают по крайней мере одну пергидролазу настоящего изобретения, по крайней мере один длинноцепочечный эфирный субстрат и по крайней мере один источник перекиси водорода. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения длинноцепочечный эфирный субстрат имеет формулу RC(=O)OR, где R включает насыщенную или ненасыщенную углеводную цепь из по крайней мере 5 атомов углерода, и R является любой органической составляющей. Субстрат со сложноэфирной составляющей и источник перекиси водорода описываются здесь подробнее. Также во многих вариантах осуществления настоящего изобретения ряд других соединений присутствует в композициях для мойки или очистки настоящего изобретения.
В некоторых вариантах осуществления композиции для мойки или очистки настоящего изобретения находят приложение в применениях для стирки, мойки или очистки твердых поверхностей и/или применениях для автоматизированной мойки посуды, а также применениях для личной гигиены/косметических применениях (например, для мойки или чистки зубных протезов, зубов, волос и кожи). Однако из-за их уникальных свойств: увеличенной эффективности в растворах низкой температуры и превосходного профиля сохранения цвета, пергидролазные ферменты настоящего изобретения идеально подходят для применений для стирки (например, отбеливания тканей). Кроме того, ферменты настоящего изобретения находят применение в гранулированных и/или жидких композициях, в том числе гелях и эмульсиях.
Пергидролазные ферменты настоящего изобретения также находят применение в продуктах-добавках для мойки или очистки. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления продукты-добавки для мойки или очистки идеально подходят для включения в процессы стирки, в которых желательна дополнительная эффективность отбеливания. Такие случаи включают, но без ограничения, применения для мойки или очистки раствором низкой температуры. В некоторых вариантах осуществления продукты-добавки являются, в их самой простой форме, одним или несколькими ферментами настоящего изобретения. В некоторых вариантах осуществления добавку упаковывают в форму разовой дозы для добавления в процесс мойки или очистки, в котором используется источник перкислорода и желательно увеличение эффективности отбеливания. Такие формы разовой дозы включают, но без ограничения, пилюли, таблетки, дозы, включенные в растворимые оболочки из желатины, или другие единицы однократной дозы (например, заранее отмеренные порошки или жидкости). В некоторых вариантах осуществления для увеличения объема композиции для мойки или очистки включают по крайней мере один материал наполнителя и/или носителя. Подходящие материалы наполнителей или носителей включают, но без ограничения, различные соли, выбираемые из сульфата, карбоната и силиката, а также тальк, глину и т.п. В некоторых вариантах осуществления материалы наполнителей и/или носителей для жидких композиций включают воду или низкомолекулярные первичные и вторичные спирты, включающие полиолы и диолы. Примеры таких спиртов включают, но без ограничения, метанол, этанол, пропанол и изопропанол. В некоторых вариантах осуществления композиции содержат от приблизительно 5% до приблизительно 90% таких материалов. В еще одних дополнительных вариантах осуществления для снижения рН используются кислотные наполнители. В некоторых альтернативных вариантах осуществления добавка(и) для мойки или очистки включает источник активированного перкислорода, такой как эфиры спиртов, эфиры диолов или эфиры полиолов. В еще одних дополнительных вариантах осуществления добавки для мойки или очистки включают один или несколько вспомогательных ингредиентов.
Для композиций для мойки или очистки и добавок для мойки или очистки настоящего изобретения требуется эффективное количество фермента, обеспечиваемого настоящим изобретением. В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления композиции для мойки или очистки настоящего изобретения включают по крайней мере 0,0001 весовых процентов, от приблизительно 0,0001 до приблизительно 1, от приблизительно 0,001 до приблизительно 0,5 или даже от приблизительно 0,01 до приблизительно 0,1 весового процента по крайней мере одного пергидролазного фермента настоящего изобретения.
Без труда понятно, что помимо типичных композиций для мойки или очистки варианты пергидролазы настоящего изобретения находят применение для любого назначения, для которого используется природный фермент или фермент дикого типа. Таким образом, такие варианты находят приложение, например, в применениях в кусковом и жидком мыле, композициях для ухода за посудой, применениях для мойки или очистки поверхностей, растворах и/или продуктах для очистки контактных линз, обработке отходов, применениях для текстиля, отбеливании целлюлозы, средствах для дезинфекции, уходе за кожей, уходе за полостью рта, уходе за волосами и т.п. Действительно не подразумевается, что какие-либо варианты пергидролазы настоящего изобретения ограничены каким-либо конкретным применением. Например, в некоторых вариантах осуществления варианты пергидролазы настоящего изобретения характеризуются, помимо увеличенной аллергенности, увеличенной эффективностью в моющих или чистящих составах (по сравнению с пергидролазой дикого типа или не модифицированной пергидролазой).
Источник перекиси водорода
В некоторых вариантах осуществления композиции для мойки или очистки настоящего изобретения включают источник перекиси водорода, который может быть самой перекисью водорода или композицией, которая продуцирует перекись водорода в качестве продукта реакции. Подходящие источники перекиси водорода, которые продуцируют перекись водорода в качестве продукта реакции, включают, но без ограничения, источник перкислорода, выбираемый из:
(i) от приблизительно 0,01 до приблизительно 50, от приблизительно 0,1 до приблизительно 20 или от приблизительно 1 до 10 весовых процентов соли перкислоты, органической пероксикислоты, гидроперита и их смеси;
(ii) от приблизительно 0,01 до приблизительно 50, от приблизительно 0,1 до приблизительно 20 или от приблизительно 1 до 10 весовых процентов углевода и от приблизительно 0,0001 до приблизительно 1, от приблизительно 0,001 до приблизительно 0,5, от приблизительно 0,01 до 0,1 весовых процентов карбогидратоксидазы; и
(iii) их смеси.
Подходящие соли перкислот включают, но без ограничения, те, которые выбирают из пербората щелочного металла, перкарбоната щелочного металла, перфосфатов щелочных металлов, персульфатов щелочных металлов и их смесей.
В некоторых предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения углевод выбирают из моноуглеводов, диуглеводов, триуглеводов, олигоуглеводов и их смесей. Подходящие углеводы включают углеводы, выбираемые из группы, состоящей из D-арабинозы, L-арабинозы, D-целлобиозы, 2-дезокси-D-галактозы, 2-дезокси-D-рибозы, D-фруктозы, L-фукозы, D-галактозы, D-глюкозы, D-глицеро-D-гулогептозы, D-лактозы, D-ликсозы, L-ликсозы, D-мальтозы, D-маннозы, мелезитозы, L-мелибиозы, палатинозы, D-раффинозы, L-рамнозы, D-рибозы, L-сорбозы, стахиозы, сахарозы, D-трегалозы, D-ксилозы, L-ксилозы и их смесей. Действительно не подразумевается, что настоящее изобретение ограничивается каким-либо конкретным углеводом, поскольку различные углеводы находят применение в настоящем изобретении.
Подходящие карбогидратоксидазы включают, но без ограничения, карбогидратоксидазы, выбираемые из альдозооксидазы (ЕС1.1.3.9 по классификации IUPAC), галактозооксидазы (ЕС1.1.3.9 по классификации IUPAC), целлобиозооксидазы (ЕС1.1.3.25 по классификации IUPAC), пиранозооксидазы (ЕС1.1.3.10 по классификации IUPAC), сорбозооксидазы (ЕС1.1.3.11 по классификации IUPAC) и/или гексозооксидазы (ЕС1.1.3.5 по классификации IUPAC), глюкозооксидазы (ЕС1.1.3.4 по классификации IUPAC) и их смесей.
Субстраты со сложноэфирными составляющими
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения по крайней мере один субстрат со сложноэфирной составляющей, включающий алифатические и/или ароматические карбоновые кислоты и спирты, используется с по крайней мере одним пергидролазным ферментом настоящего изобретения. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения субстрат выбирают из одного или нескольких следующих субстратов: эфира капроновой кислоты, эфира каприловой кислоты, эфира нонановой кислоты, эфира декановой кислоты, эфира додекановой кислоты, эфира миристиновой кислоты, эфира пальмитиновой кислоты, эфира стеариновой кислоты и эфира олеиновой кислоты, а также являющихся длинноцепочечными сложными эфирами субстратов.
В некоторых предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения субстрат со сложноэфирной составляющей присутствует в количестве, которое составляет от приблизительно 0,01 до приблизительно 99,9, от приблизительно 0,01 до приблизительно 50, от приблизительно 0,1 до 20 или от приблизительно 1 до приблизительно 15 весовых процентов композиции для мойки или очистки.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения подходящая молекула, включающая сложноэфирную составляющую, имеет формулу:
1
2
3
x
m
n
p
RO[(R)(R)]
1
1
где R является составляющей, выбираемой из группы, состоящей из Н или замещенного или незамещенного алкила, гетероалкила, алкенила, алкинила, арила, алкиларила, алкилгетероарила и гетероарила; в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения R включает от 1 до 50000 атомов углерода, от 1 до 10000 атомов углерода или от 2 до 100 атомов углерода;
2
2
каждая R является необязательно замещенной алкоксилатной составляющей, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения R независимо представляет собой этоксилатную, пропоксилатную или бутоксилатную составляющую;
3
R представляет собой образующую сложный эфир составляющую, имеющую формулу:
4
4
4
4
4
5
10
11
22
RСО-, где R выбирают из Н, замещенного или незамещенного алкила, алкенила, алкинила, арила, алкиларила, алкилгетероарила и гетероарила в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, в то время как в других вариантах осуществления R является замещенной или незамещенной алкильной, алкенильной или алкинильной составляющей с неразветвленной или разветвленной цепью, включающей от 5 до 22 или более атомов углерода, арильной, алкиларильной, алкилгетероарильной или гетероарильной составляющей, включающей от 5 до 12 или более атомов углерода, или Rявляется замещенной или незамещенной алкильной составляющей с С-С или более, или Rявляется замещенной или незамещенной алкильной составляющей с С-С или более;
1
1
1
х равняется 1, когда R представляет собой Н; когда Rне является Н, х является целым числом, которое равно или меньше числа атомов углерода в R;
р является целым числом, которое равно или меньше х;
m является целым числом от 0 до 50, целым числом от 0 до 18 или целым числом от 0 до 12, и
n равняется по крайней мере 1.
1
2
3
x
m
n
p
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения молекула, включающая сложноэфирную составляющую, является алкилэтоксилатом или алкилпропоксилатом, имеющим формулу RO[(R)(R)], где
1
2
32
R является С-Сзамещенной или незамещенной алкильной или гетероалкильной составляющей;
2
каждая R независимо представляет собой этоксилатную или пропоксилатную составляющую;
3
R представляет собой образующую сложный эфир составляющую, имеющую формулу:
4
4
4
4
4
5
10
11
22
RСО-, где R выбирают из Н, замещенного или незамещенного алкила, алкенила, алкинила, арила, алкиларила, алкилгетероарила и гетероарила в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, в то время как в других вариантах осуществления R выбирают из замещенной или незамещенной алкильной, алкенильной или алкинильной составляющей с неразветвленной или разветвленной цепью, включающей от 5 до 22 или более атомов углерода, замещенной или незамещенной арильной, алкиларильной, алкилгетероарильной или гетероарильной составляющей, включающей от 5 до 12 или более атомов углерода, или Rявляется замещенной или незамещенной алкильной составляющей с С-С или более, или Rявляется замещенной или незамещенной алкильной составляющей с С-С или более;
1
х является целым числом, которое равно или меньше числа атомов углерода в R;
р является целым числом, которое равно или меньше х;
m является целым числом от 1 до 12, и
n равняется по крайней мере 1.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения молекула, включающая сложноэфирную составляющую, имеет формулу:
1
2
3
x
m
n
p
RO[(R)(R)]
1
1
1
где R является Н или составляющей, которая включает первичную, вторичную, третичную или четвертичную аминогруппу, при этом указанную составляющую R, которая включает аминогруппу, выбирают из замещенного или незамещенного алкила, гетероалкила, алкенила, алкинила, арила, алкиларила, алкилгетероарила и гетероарила; в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения R включает от 1 до 50000 атомов углерода, от 1 до 10000 атомов углерода или от 2 до 100 атомов углерода;
2
2
каждая R представляет собой алкоксилатную составляющую, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения R независимо представляет собой этоксилатную, пропоксилатную или бутоксилатную составляющую;
3
R представляет собой образующую сложный эфир составляющую, имеющую формулу:
4
4
4
4
4
5
10
11
22
RСО-, где R выбирают из Н, замещенного или незамещенного алкила, алкенила, алкинила, арила, алкиларила, алкилгетероарила и гетероарила в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения; в других вариантах осуществления R выбирают из замещенной или незамещенной алкильной, алкенильной или алкинильной составляющей с неразветвленной или разветвленной цепью, включающей от 5 до 22 атомов углерода, замещенной или незамещенной арильной, алкиларильной, алкилгетероарильной или гетероарильной составляющей, включающей от 9 до 12 или более атомов углерода, или Rявляется замещенной или незамещенной алкильной составляющей с С-С или более, или Rявляется замещенной или незамещенной алкильной составляющей с С-С или более;
1
1
1
х равняется 1, когда R представляет собой Н; когда Rне является Н, х является целым числом, которое равно или меньше числа атомов углерода в R;
р является целым числом, которое равно или меньше х;
m является целым числом от 0 до 12 или даже от 1 до 12, и
n равняется по крайней мере 1.
В любом из вышеупомянутых вариантов осуществления настоящего изобретения молекула, включающая сложноэфирную составляющую, может иметь среднюю молекулярную массу менее 600000 Дальтон, менее 300000 Дальтон, менее 100000 Дальтон или даже менее 60000 Дальтон.
Подходящие молекулы, которые включают сложноэфирную составляющую, включают, но без ограничения, полиуглеводы, включающие сложноэфирную составляющую.
Вспомогательные материалы
Хотя не являясь существенным для применения настоящего изобретения, не ограничивающий перечень вспомогательных средств, проиллюстрированных здесь, подходит для применения в композициях для мойки или очистки настоящего изобретения. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения эти материалы включают для способствования или увеличения эффективности мойки или очистки, для обработки субстрата, подвергаемого мойке или чистке, или для изменения эстетичности композиции для мойки или чистки, как в случае с парфюмерными изделиями, красящими веществами, красителями и т.п. Понятно, что такие вспомогательные средства находятся помимо ферментов настоящего изобретения, источника перекиси водорода и субстрата со сложноэфирной составляющей. Точная природа этих дополнительных компонентов и уровни их включения будут зависеть от физической формы композиции и сущности операции мойки или очистки, для которой она используется. Подходящие вспомогательные материалы включают, но без ограничения, поверхностно-активные вещества, моющие компоненты, хелатообразующие агенты, ингибирующие перенос красителя соединения, вспомогательные вещества для осаждения, диспергаторы, дополнительные ферменты и стабилизаторы ферментов, каталитические материалы, активаторы отбеливания, усилители отбеливания, предварительно образованные перкислоты, полимерные диспергирующие агенты, агенты для удаления глинистого грунта/агенты против повторного отложения, осветлители, гасители стойкой пены, красители, отдушки, агенты, делающие структуру эластичной, смягчители тканей, носители, гидротропы, вспомогательные средства для обработки и/или пигменты. Помимо описания ниже, подходящие примеры таких других вспомогательных средств и уровни их применения находятся в патентах США № 5576282, 6306812 и 6326348, включенных сюда посредством ссылки. В некоторых вариантах осуществления вышеупомянутые вспомогательные ингредиенты составляют остаток композиций для мойки или очистки настоящего изобретения.
Поверхностно-активные вещества
- В некоторых вариантах осуществления композиции для мойки или очистки, обеспечиваемые настоящим изобретением, включают по крайней мере одно поверхностно-активное вещество или систему поверхностно-активных веществ, причем поверхностно-активное вещество выбирают из неионных поверхностно-активных веществ, анионных поверхностно-активных веществ, катионных поверхностно-активных веществ, амфолитных поверхностно-активных веществ, цвиттер-ионных поверхностно-активных веществ, семиполярных неионных поверхностно-активных веществ и их смесей.
В некоторых предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения поверхностно-активное вещество обычно присутствует на уровне от приблизительно 0,1% до приблизительно 60%, от приблизительно 1% до приблизительно 50% или даже от приблизительно 5% до приблизительно 40% в весовом отношении рассматриваемой композиции для мойки или очистки.
Ряд известных соединений являются подходящими поверхностно-активными вещества, применимыми в композициях, включающих пергидролазные ферменты настоящего изобретения. Эти соединения включают неионные, анионные, катионные, анионные или цвиттер-ионные детергенты (смотри, например, патенты США № 4404128 и 4261868). Подходящим моющим или чистящим составом является моющий или чистящий состав, описанный в патенте США № 5204015 (включенном посредством ссылки). Специалистам в данной области техники хорошо известны различные композиции, которые найдут применение в качестве композиций для мойки или очистки.
Как указано выше, в некоторых предпочтительных вариантах осуществления в моющих или чистящих составах настоящего изобретения используется поверхностно-активное вещество, включающее анионные, неионные и амфолитные поверхностно-активные вещества, широко известные из-за их применения в моющих или чистящих составах. Некоторые поверхностно-активные вещества, подходящие для применения в настоящем изобретении, описываются в заявке на Британский патент № 2094826 А, включенной сюда посредством ссылки. В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении используются смеси поверхностно-активных веществ.
Подходящие для использования в моющем или чистящем составе настоящего изобретения анионные поверхностно-активные вещества включают, но без ограничения, неразветвленные или разветвленные алкилбензолсульфонаты, алкильные или алкенильные эфирсульфаты, имеющие неразветвленные или разветвленные алкильные группы или алкенильные группы, алкил- или алкенилсульфаты, олефинсульфонаты, алкансульфонаты и т.п. Подходящие противойоны для анионных поверхностно-активных веществ включают, но без ограничения, ионы щелочных металлов, такие как натрий или калий, ионы щелочноземельных металлов, такие как кальций и магний, аммонийные йоны и алканоламины, имеющие 1-3 алканольные группы с числом углеродов 2 или 3.
Амфолитные поверхностно-активные вещества, которые находят применение в настоящем изобретении, включают, но без ограничения, четвертичные аммониевые соли алифатических сульфокислот, амфолитные поверхностно-активные вещества типа бетаина и т.п. Такие амфолитные поверхностно-активные вещества имеют как положительно, так и отрицательно заряженные группы в одной и той же молекуле.
Неионные поверхностно-активные вещества, которые находят применение в настоящем изобретении, обычно включают полиоксиалкиленовые эфиры, а также алканоламиды высших жирных кислот или их аддукт, полученный при взаимодействии с алкиленоксидом, моноэфиры жирных кислот и глицерина и т.п.
В некоторых предпочтительных вариантах осуществления поверхностно-активное вещество или смесь поверхностно-активных веществ, включенные в моющие или чистящие составы настоящего изобретения, предоставляются в количестве от приблизительно 1 весового процента до приблизительно 95 весовых процентов общего моющего или чистящего состава и предпочтительно от приблизительно 5 весовых процентов до приблизительно 45 весовых процентов общего моющего или чистящего состава. Как здесь указывается, в различных вариантах осуществления настоящего изобретения многочисленные другие компоненты включаются в композиции настоящего изобретения. Однако не подразумевается, что настоящее изобретение ограничивается этими конкретными примерами. Действительно предусматривается, что дополнительные соединения найдут применение в настоящем изобретении. Приведенные ниже описания только иллюстрируют некоторые необязательные компоненты.
Белки, в частности пергидролазу настоящего изобретения, можно включить в известные порошкообразные и жидкие моющие или чистящие средства, имеющие рН между 3 и 12,0, на уровнях от приблизительно 0,001 до приблизительно 5% (предпочтительно от 0,1% до 0,5%) в весовом отношении. В некоторых вариантах осуществления эти моющие или чистящие составы, кроме того, включают другие ферменты, такие как протеазы, амилазы, маннаназы, пероксидазы, оксидоредуктазы, целлюлазы, липазы, кутиназы, пектиназы, пектинлиазы, ксиланазы и/или эндогликозидазы, а также моющий компонент и стабилизатор.
Добавление белков к общепринятым композициям для мойки или очистки не создает каких-либо ограничений для конкретных применений. Другими словами, любая температура и рН, подходящие для моющего или чистящего средства, также подходят для композиций настоящего изобретения при условии, что рН находится в пределах диапазона, в котором фермент(ы) является активным, а температура ниже вызывающей денатурацию температуры для описываемого белка. Кроме того, белки настоящего изобретения находят применение в композициях для мойки или очистки, отбеливания и дезинфекции без детергентов, снова или отдельно, или в комбинации с источником перекиси водорода, субстратом со сложноэфирной составляющей (например, или добавляемым к системе или присущим этой системе, используемой, например, с пятнами, содержащими сложные эфиры, целлюлозой, содержащей сложные эфиры, и т.п.), другими ферментами, поверхностно-активными веществами, моющими компонентами, стабилизаторами и т.п. Действительно не подразумевается, что настоящее изобретение ограничивается какой-либо конкретной композицией или применением.
Моющие компоненты
- Композиции для мойки или очистки настоящего изобретения могут включать один или несколько моющих компонентов детергента или систем моющих компонентов детергента. При использовании моющего компонента композиция для мойки или очистки обычно включает по крайней мере приблизительно 1%, от приблизительно 3% до приблизительно 60% или от приблизительно 5% до приблизительного 40% моющего компонента в весовой отношении композиции для мойки или чистки.
Моющие компоненты включают, но без ограничения, соли щелочных металлов, аммония и алканоламмония, силикаты щелочных металлов, карбонаты щелочноземельных и щелочных металлов, поликарбоксилатные соединения алюмосиликатные моющие компоненты, эфирные гидроксиполикарбоксилаты, сополимеры малеинового ангидрида с этиленом или винилметиловым эфиром, 1,3,5-тригидроксибензол-2,4,6-трисульфокислоту и карбоксиметилоксиянтарную кислоту, различные соли щелочных металлов, аммония и замещенного аммония и полиуксусных кислот, такие как этилендиамин тетрауксусная кислота и нитрилотриуксусная кислота, а также поликарбоксилаты, такие как меллитовая кислота, янтарная кислота, лимонная кислота, оксидиянтарная кислота, полималеиновая кислота, бензол-1,3,5-трикарбоновая кислота, карбоксиметилоксиянтарная кислота и их растворимые соли.
Хелатообразующие агенты
- В некоторых вариантах осуществления композиции для мойки или очистки, обеспечиваемые здесь, содержат по крайней мере один хелатообразующий агент. Подходящие хелатообразующие агенты включают, но без ограничения, агенты, образующие хелаты с медью, железом и/или марганцем и их смеси.
При использовании хелатообразующего агента композиция для мойки или очистки обычно включает от приблизительно 0,1% до приблизительно 15% или от приблизительно 3,0% до приблизительно 10% хелатообразующего агента в весовом отношении рассматриваемой композиции для мойки или очистки.
Вспомогательное средство для осаждения
- В некоторых вариантах осуществления композиции для мойки или очистки, обеспечиваемые здесь, включают, кроме того, по крайней мере одно вспомогательное средство для осаждения. Подходящие вспомогательные средства для осаждения включают, но без ограничения, полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль, поликарбоксилаты, грязеотталкивающие полимеры, такие как политерефталевая кислота, глины, такие как каолинит, монтмориллонит, атапульгит, иллит, бентонит, галлуазит и их смеси.
Ингибирующие перенос красителя соединения
- В еще некоторых дополнительных вариантах осуществления композиции для мойки или очистки настоящего изобретения также включают одно или несколько ингибирующих перенос красителя соединений. Подходящие полимерные соединения, ингибирующие перенос красителя, включают, но без ограничения, полимеры поливинилпирролидоны, полимеры полиамин-N-оксиды, сополимеры N-винилпирролидона и N-винилимидазола, поливинилоксазолидоны и поливинилимидазолы или их смеси.
При использовании в рассматриваемой композиции для мойки или очистки ингибирующие перенос красителя соединения обычно присутствуют на уровнях от приблизительно 0,0001% до приблизительно 10%, от приблизительно 0,01% до приблизительно 5% или от приблизительно 0,1% до приблизительно 3% в весовом отношении композиции для мойки или очистки.
Диспергаторы
- В некоторых дополнительных вариантах осуществления композиции для мойки или очистки настоящего изобретения включают диспергаторы. Подходящие водорастворимые органические материалы включают, но без ограничения, гомо- или сополимерные кислоты или их соли, в которых поликарбоновые кислоты включают по крайней мере два карбоксильных радикала, разделенных друг от друга не более чем двумя атомами углерода.
Ферменты
- В некоторых дополнительных вариантах осуществления композиции для мойки или очистки настоящего изобретения включают один или несколько ферментов, применяемых в моющем или чистящем средстве, которые обеспечивают эффективность мойки или очистки и/или преимущества в уходе за тканью. Примеры подходящих ферментов включают, но без ограничения, гемицеллюлазы, пероксидазы, протеазы, целлюлазы, ксиланазы, липазы, фосфолипазы, эстеразы, кутиназы, пектиназы, кератиназы, редуктазы, оксидазы, фенолоксидазы, липоксигеназы, лигниназы, пуллуланазы, танназы, пентосаназы, маланазы, β-глюканазы, арабинозидазы, гиалуронидазу, хондроитиназу, лакказу и амилазу или их смеси. Типичная комбинация является смесью обычно применимых ферментов, подобных протеазе, липазе, кутиназе и/или целлюлазе в соединении с амилазой.
Стабилизаторы ферментов
- Ферменты для применения в моющих или чистящих средствах можно стабилизировать с помощью различных методов. Используемые здесь ферменты могут быть стабилизированы в присутствие водорастворимых источников ионов кальция и/или магния в готовых композициях, которые предоставляют такие ионы ферментам. Предусматривается, что стабилизаторы ферментов найдут применение в некоторых вариантах осуществления композиций для мойки или очистки, обеспечиваемых здесь.
Каталитические металлы комплексы
- В некоторых вариантах осуществления композиции для мойки или очистки настоящего изобретения включают каталитические металлы комплекса. Одним типом содержащего металл катализатора отбеливания является каталитическая система, включающая катион переходного металла определенной каталитической в отношении отбеливания активности, такой как катионы меди, железа, титана, рутения, вольфрама, молибдена или марганца, вспомогательный катион металла, имеющий незначительную каталитическую в отношении отбеливания активность или не обладающий такой активностью, такой как катионы цинка или алюминия, и секвестрант, имеющий определенные константы устойчивости для каталитических и вспомогательных катионов металлов, в частности этилендиаминтетрауксусная кислота, этилендиаминтетра(метиленфосфорная кислота) и их водорастворимые соли. Примеры этих катализаторов описываются в патенте США № 4430243, включенном сюда посредством ссылки.
В некоторых вариантах осуществления обеспечиваемые здесь композиции катализируются посредством соединения марганца. Такие соединения и уровни их применения хорошо известны в данной области техники и включают, например, катализаторы на основе марганца, описанные в патенте США № 5576282, который включен сюда посредством ссылки.
Кобальтовые катализаторы отбеливания, применимые здесь, известны и описываются, например, в патентах США № 5597936 и 5595967, оба из которых включены сюда посредством ссылки. Такие кобальтовые катализаторы легко приготовить с помощью известных способов, например, способов, приводимых, например, в патентах США № 5597936 и 5595967.
В некоторых вариантах осуществления обеспечиваемые здесь композиции также включают по крайней мере один комплекс макрополициклического жесткого лиганда («MRL») с переходным металлом. На практике, и не в качестве ограничения, в некоторых вариантах осуществления композиции и способы мойки или очистки, обеспечиваемые здесь, устанавливают для обеспечения приблизительно по крайней мере одной части на сто миллионов активного вида MRL в водной промывочной среде и будут предпочтительно обеспечивать от приблизительно 0,005 частей на миллион до приблизительно 25 частей на миллион, более предпочтительно от приблизительно 0,05 частей на миллион до приблизительно 10 частей на миллион и наиболее предпочтительно от приблизительно 0,1 частей на миллион до приблизительно 5 частей на миллион MRL в промывочной жидкости.
Предпочтительные переходные металлы в основанном на переходном металле катализаторе отбеливания настоящего изобретения включают марганец, железо и хром. Предпочтительные здесь MRL являются специальным типом сверхжесткого лиганда, который является перекрестно мостиковым, таким как 5,12-диэтил-1,5,8,12-тетраазабицикло[6.6.2]гексадекан.
Подходящие MRL с переходными металлами легко приготовить с помощью известных способов, таких как способы, приводимые в WO 00/332601 и патенте США № 6225464, оба из которых включены сюда посредством ссылки.
Композиции для мойки и очистки и моющие или чистящие составы
Моющие или чистящие составы настоящего изобретения предоставляются в любой подходящей форме, включающей, но без ограничения, жидкости, гранулы, эмульсии, гели и пасты. При использовании твердого моющего или чистящего состава моющее или чистящее средство предпочтительно готовят в форме гранул. Предпочтительно гранулы готовят так, чтобы они дополнительно содержали защитный агент (смотри, например, заявку на патент США № 07/642669, поданную 17 января 1991, включенную сюда посредством ссылки). Подобным образом в некоторых вариантах осуществления гранулы готовят, чтобы они содержали материалы для уменьшения степени растворения гранулы в промывочной среде (смотри, например, патент США 5254283, включенный сюда посредством ссылки). Кроме того, пергидролазные ферменты настоящего изобретения находят применение в композициях, в которых субстрат и фермент присутствуют в одной и той же грануле. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления эффективность фермента увеличивается при условии высоких локальных концентраций фермента и субстрата (смотри, например, публикацию заявки на патент США US 2003/0191033, включенную сюда посредством ссылки).
Композиции для мойки или очистки настоящего изобретения готовят в любой подходящей форме и с помощью любого способа, выбираемого составляющим композицию человеком, не ограничивающие примеры которых описываются в патентах США № 5879584, 5691297, 5574005, 5569645, 5565422, 5516448, 5489392 и 5486303, все из которых включены сюда посредством ссылки.
Обеспечиваемые здесь композиции для мойки или очистки обычно готовят так, чтобы во время применения в операциях мойки водой промывочная вода имела рН от приблизительно 5,0 до приблизительно 11,5 или от приблизительно 7,5 до приблизительно 10,5. Композиции в виде жидких продуктов обычно готовят так, чтобы они имели рН от приблизительно 3,0 до приблизительно 9,0. Продукты для стирки в гранулах обычно готовят так, чтобы они имели рН от приблизительно 9 до приблизительно 11. Методы контролирования рН на уровнях рекомендуемых коэффициентов использования включают применение буферов, щелочей, кислот и т.п. и хорошо известны квалифицированным в данной области техники специалистам.
При использовании фермента(ов) настоящего изобретения в композиции в гранулах или жидкости иногда желательно, чтобы фермент(ы) был в форме инкапсулированной частицы для защиты такого фермента от других компонентов композиции в гранулах во время хранения. Кроме того, инкапсуляция также является средством контролирования доступности фермента(ов) во время процесса мойки или очистки и может увеличивать эффективность фермента(ов). Вследствие этого, фермент(ы) инкапсулируют с использованием любого подходящего материала для инкапсуляции, известного в данной области техники.
ο
Материал для инкапсуляции обычно инкапсулирует по крайней мере часть фермента(ов). Обычно материал для инкапсуляции является водорастворимым и/или диспергируемым в воде. Материал для инкапсуляции может иметь температуру стеклования (Tg), составляющую 0С или выше (смотри, например, заявку WO 97/11151, включенную сюда посредством ссылки).
В некоторых вариантах осуществления материал для инкапсуляции выбирают из углеводов, природной или синтетической смолы, хитина и хитозана, целлюлозы и производных целлюлозы, силикатов, фосфатов, боратов, поливинилового спирта, полиэтиленгликоля, твердых парафинов и их комбинаций. Когда материалом для инкапсуляции является углевод, его обычно выбирают из моносахаридов, олигосахаридов, полисахаридов и их комбинаций. Как правило, материалом для инкапсуляции является крахмал. Подходящие крахмалы описываются в ЕР 0922499, в патентах США № 4977252, 5354559 и 5935826, все из которых включены сюда посредством ссылки.
В некоторых вариантах осуществления материал для инкапсуляции является микросферой, изготовленной из пластмассы (например, термопластмассы, акрилонитрила, метакрилонитрила, полиакрилонитрила, полиметакрилонитрила и их смесей). Имеющиеся в продаже микросферы, которые находят применение, включают, но без ограничения, микросферы, поставляемые Expancel (Stockviksverken, Швеция) под товарным знаком EXPANCEL, и микросферы, поставляемые PQ Corp. (Valley Forge, PA) под фирменными названиями PM 6545, PM 6550, PM 7220, PM 7228, EXTENDOSPHERES, LUXSIL, Q-CEL и SPHERICEL.
Помимо описанных выше ингредиентов отдушки, буферы, консерванты, красители и т.п. также находят применение с настоящим изобретением. Эти компоненты обеспечиваются в концентрациях и формах, известных специалистам в данной области техники.
В некоторых вариантах осуществления основы порошкообразных моющих или чистящих средств настоящего изобретения готовят с помощью любых способов приготовления, включающих способы сушки распылением и способы грануляции. Предпочтительными являются основы моющего или чистящего средства, полученные, в частности, с помощью способа сушки распылением и/или способа грануляции с использованием сушки распылением. Основа моющего или чистящего средства, полученная с помощью способа сушки распылением, не ограничивается относительно условий приготовления. Основа моющего или чистящего средства, полученная с помощью способа сушки распылением, является формой пустых гранул, которые получают распылением водной суспензии устойчивых к нагреванию ингредиентов, таких как поверхностно-активные вещества и моющие компоненты, в область повышенной температуры. После сушки распылением добавляют, как желательно, отдушки, ферменты, отбеливающие агенты, неорганические щелочные моющие компоненты. В случае высокоплотной основы для моющего или чистящего средства в гранулах, получаемой, например, с помощью способа грануляции с использованием сушки распылением, после приготовления основы можно также добавлять различные ингредиенты.
В некоторых вариантах осуществления, включающих основы для жидких моющих или чистящих средств, основа представляет собой гомогенный раствор, в то время как в других вариантах осуществления она является негомогенной дисперсионной системой.
В некоторых вариантах осуществления моющие или чистящие составы настоящего изобретения инкубируют с тканью (например, грязными тканями) при промышленных и бытовых применениях при температурах, времени реакции и модулях ванных, обычно используемых в этих условиях. Квалифицированные в данной области техники специалисты без труда могут определить условия инкубации (т.е. условия, эффективные для обработки материалов моющими или чистящими составами в соответствии с настоящим изобретением). Соответственно, соответствующие условия, эффективные для обработки материалов моющими или чистящими средствами настоящего изобретения, соответствуют условиям, при которых используются схожие моющие или чистящие составы, которые включают пергидролазу дикого типа.
Как указано выше, в некоторых вариантах осуществления моющие или чистящие средства, обеспечиваемые настоящим изобретением, готовят в виде предварительной жидкой формы в соответствующем растворе при среднем рН, при котором существует активность, достаточная для обеспечения желаемых улучшений в смягчении, уменьшении пиллинга, предотвращении пиллинга, удалении волокон с поверхности или мойки или чистке. Когда моющий или чистящий состав является композиций для предварительной пропитки (например, предварительной стирки или предварительной обработки), композиции или в виде жидкости, аэрозоля, геля, или в виде пасты, пергидролазный фермент, как правило, используют от приблизительно 0,00001% до приблизительно 5% весовых процентов в расчете на общий вес композиции для предварительной пропитки или предварительной обработки. В таких композициях можно необязательно использовать поверхностно-активное вещество(а), и при его(их) использовании оно(они) обычно присутствует в концентрации от приблизительно 0,0005 до приблизительно 1 весового процента в расчете на общий вес композиции для предварительной пропитки. Остаток композиции включает общепринятые компоненты, используемые для предварительной пропитки (например, разбавитель, буферы, другие ферменты (протеазы) и т.п.) в их обычных концентрациях.
В некоторых вариантах осуществления композиции для мойки или очистки, обеспечиваемые настоящим изобретением, находят применение для мойки или очистки места (например, поверхности или ткани). Как правило, по крайней мере часть места приводят в контакт с по крайней мере одной композицией для мойки или очистки, обеспечиваемой здесь, в неразбавленной форме или разбавленной в моющем растворе, и затем место необязательно промывают и/или прополаскивают. Для целей настоящего изобретения мойка включает, но без ограничения, очистку жесткой щеткой или механическое перемешивание. Ткань включает почти любую ткань, которую можно стирать в нормальных условиях эксплуатации потребителем. Композиции для мойки или очистки, обеспечиваемые здесь, обычно применяются в концентрациях от приблизительно 500 частей на миллион до приблизительно 15000 частей на миллион в растворе. Когда моющим раствором является вода, температура воды обычно находится в интервале от приблизительно 5°С до приблизительно 90°С, и, когда место включает ткань, отношение массы воды к массе ткани обычно составляет от приблизительно 1:1 до приблизительно 30:1.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ РАСКРЫТИЕ
Следующие примеры предоставлены для демонстрации и дальнейшей иллюстрации некоторых предпочтительных вариантов осуществления и аспектов настоящего изобретения и не должны толковаться как ограничение его объема.
В РСТ-публикации WO 05/056782 предоставляются способы идентификации и применения пергидролазных ферментов. Каждый из примеров в этой публикации индивидуально включен сюда посредством ссылки для раскрытия всех способов и раскрывает там, в том числе, но без ограничения, сообщение о способах получения пергидролаз, способах идентификации пергидролаз, способах проверки пергидролаз, полинуклеотидных и полипептидных последовательностях для пергидролаз, способах применения пергидролаз и композиций, в которых могут использоваться пергидролазы.
2
2
280
600
M. smegmatis
При экспериментальном раскрытии, которое следует, используются следующие сокращения: °С (градусы по Цельсию), оборотов/мин (оборотов в минуту), НО (вода), HCl (соляная кислота), ак (аминокислота), п.о. (пара оснований), т.п.о. (тысяча пар оснований) кДа (килодальтоны), г (граммы), мкг (микрограммы), мг (миллиграммы), нг (нонограммы), мкл (микролитры), мл (миллилитры), мм (миллиметры), нм (нанометры), мкм (микрометр) М (молярный), мМ (миллимолярный), мкМ (микромолярный), Е (единицы), В (вольты), М.м. (молекулярная масса), сек (секунды), мин (минута/минуты), ч (час/часы), MgCl (магния хлорид), NaCl (натрия хлорид), ОП (оптическая плотность при 280 нм), ОП (оптическая плотность при 600 нм), электрофорез в ПААГ (электрофорез в полиакриламидном геле), EtOH (этанол), PBS (забуференный фосфатом солевой раствор [150 мМ NaCl, 10 мМ натрий-фосфатный буфер, рН 7,2]), SDS (натрия додецилсульфат, Tris (трис(гидроксиметил)аминометан), TAED (N,N,N',N'-тетраацетилэтилендиамин), вес/объем (в отношении веса к объему), вес/вес (в весовом отношении), Per (пергидролаза), per (ген пергидролазы), Ms (), MS (масс-спектроскопия), ААТСС (American Association of Textile and Coloring Chemists), WFK (wfk Testgewebe GmbH, Bruggen-Bracht, Германия), Amersham (Amersham Life Science, Inc. Arlington Heights, IL), Pierce (Pierce Biotechnology, Rockford, IL), Amicon (Amicon, Inc., Beverly, MA), ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA), Amersham (Amersham Biosciences, Inc., Piscataway, NJ), Becton Dickinson (Becton Dickinson Labware, Lincoln Park, NJ), BioRad (BioRad, Richmond, CA), Clontech (CLONTECH Laboratories, Palo Alto, CA), Difco (Difco Laboratories, Detroit, MI), GIBCO BRL или Gibco BRL (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD), Novagen (Novagen, Inc., Madison, WI), Qiagen (Qiagen, Inc., Valencia, CA), Invitrogen (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA), Dionex (Dionex Corp., Sunnyvale, CA), Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO), Sorvall (Sorvall Instruments, дочерняя компания DuPont Co., Biotechnology Systems, Wilmington, DE), Stratagene (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA), Roche (Hoffmann La Roche, Inc., Nutley, NJ), Molecular Devices (Molecular Devices, Corp, Sunnyvale, CA) или Agilent (Agilent Technologies, Palo Alto, CA).
ПРИМЕР 1
Идентификация ферментов пергидролаз, которые гидролизуют п-нитрофенилкапроат (pNC6)
M. smegmatis
M. smegmatis
Как описывается в РСТ-публикации WO 05/056782, был клонирован ген пергидролазы . Нуклеотидной последовательностью гена пергидролазы  является:
M. smegmatis
Аминокислотной последовательностью фермента пергидролазы  является:
M. smegmatis
6
Так же, как описывается в РСТ-публикации WO 05/056782, каждое и всякое положение аминокислоты фермента пергидролазы было мутировано в каждую из 19 остающихся аминокислот с получением библиотеки насыщения сайтов. Используя способы, описанные в примере 2 РСТ-публикации WO 05/056782, пергидролазу дикого типа и каждый из вариантов пергидролазы в библиотеке насыщения сайтов проверяли на их способность гидролизовать п-нитрофенилкапроат, являющийся С ацильным эфиром субстрат.
Пергидролаза дикого типа была не способна гидролизовать pNC6. Следующие варианты пергидролазы были идентифицированы в качестве вариантов, обладающих способностью гидролизовать pNC6.
Таблица 1Варианты пергидролазы, способные гидролизовать pNC6
Остаток дикого типа/положение
Вариант(ы) аминокислоты
L12
G,P,Q
G22
W
N59
P
I153
P
F154
Q,S,T,V
I194
G
F196
S,Q,V,G,P,I,H
L204
Y,W
ПРИМЕР 2
Получение и скринирование комбинаторных библиотек
Идентифицированные мутации в таблице 1 объединяли вместе с получением четырех различных библиотек, NSAL1, NSAL2, NSAL3 и NSAL4, используя в качестве исходных молекул пергидролазу дикого типа (SEQ ID NO: 2) и вариант L12G праймерами, используемыми для получения комбинаторных библиотек, были следующие праймеры, где последовательность «NNS» представляет вырожденный кодон NNG/C (N = G, A, T или C), который кодирует все 20 аминокислот и один стоп-кодон:
2
6
Набор QuikChange для сайт-направленного полимутагенеза (QCMS) использовали для создания комбинаторных библиотек NSAL1-NSAL4, используя описанный в WO 05/056782 способ. Реакция QCMS состояла из 16,5 мкл стерильной дистиллированной НО, 2,5 мкл 10× буфера из набора, 1 мкл dNTP из набора, 3 мкл смеси 20 праймеров (10 мкл каждого праймера 100 нг/мкл смешивали вместе до срока выполнения), 1 мкл ДНК pMSAT-NcoI мини-приготовления в качестве матрицы (~50 нг) и 1 мкл смеси ферментов из набора для общего объема 25 мкл. Циклическими условиями были 95°С в течение 1 мин один раз, 95°С в течение 1 мин, 55°С в течение 1 мин, 65°С в течение 10 мин на протяжении 30 циклов. Затем расщепление DpnI проводили дважды последовательно с использованием 1 или 0,5 мкл фермента (из набора QCMS) при 37°С в течение 4 часов. 2 мкл реакции трансформировали в компетентные клетки BL21 (DE3) pLysS (Novagen) в соответствии с инструкциями производителя. Трансформированные клетки размещали по чашкам с LB, содержащим 100 м.д. карбенициллина, 0,1 мМ IPTG и 0,25% трикапроина (субстрата с С ацильной цепью, который вмешивали в среду с помощью обработки ультразвуком).
После инкубации чашек при 37°С в течение 24 часов с последующим инкубированием при комнатной температуре в течение 2 дней большинство образующих ореолы колоний выращивали в течение ночи при 37°С в 96-луночных планшетах, содержащих LB со 100 м.д. карбенициллина. Для повторной оценки образующих ореолы колоний культуры перепечатывали на большую чашку с агаризованной средой LB, содержащей 100 м.д. карбенициллина, 0,1 мМ IPTG и 0,25% трикапроина.
В таблице 3 приводятся дополнительные детали комбинаторных библиотек и их скринирования.
Таблица 3Описание библиотек и колоний, подвергнутых скринингу
Библиотека
Используемый праймер
Исходная молекула
Колонии, подвергнутые скринированию
Колонии с ореолами**
NSAL1
L12NNS, F154NNS, F196NNS, I194NNS, L204NNS
дикого типа
182
21
NSAL2
L12NNS, F154NNS, F196NNS,I194NNS, L204NNS
L12G
169
40
NSAL3
Все праймеры, приведенные в таблице 1, за исключением праймеров с кодоном NNS
дикого типа
-1200*
4
NSAL4
Все праймеры, приведенные в таблице 1, за исключением праймеров с кодоном NNS
L12G
-1000*
-100-200*
* Это число является приблизительным. Точное число колоний не определено.** Некоторые из образующих ореолы колоний не образовывали ореолы при повторной проверке. Число образующих ореолы колоний в NSAL2 и NSAL4 выше, чем в NSAL1 и NSAL3 из-за исходного L12G, который присутствовал в 25% библиотек NSAL2 и NSAL4.
Полинуклеотиды, кодирующие фермент пергидролазу, из образующих ореолы колоний секвенировали для определения того, какие мутации вносят вклад в образование ореола (таблица 4).
Таблица 4Последовательность образующих ореолы клонов
Библиотека
Последовательность
NSAL1
I194G (3 клона)
NSAL3
I194G
NSAL4
L12G G22W
NSAL2
L12G I194M
NSAL1
F154A I194M (2 клона)
NSAL1
F154A
NSAL1
F154G I194V
NSAL1
F154E I194S (3 клона)
NSAL1
F154E
NSAL3
F154T F196I (2 клона)
NSAL3
F154V
NSAL3
L12Q F154V
NSAL3
L12M F154E
NSAL3
L12G F154G I194V
* Образующих ореолы клонов L12G нет в списке таблицы, поскольку было известно, что эта мутация приводит к образованию ореолов на чашках с трикапроином.
ПРИМЕР 3
Биохимическая характеристика образующих ореолы вариантов
Варианты, образующие ореолы на чашках с трикапроином, которые имели аминокислотную последовательность, отличную от исходной последовательности, проверяли на их способность гидролизовать п-нитрофенилкапроат (pNC6) и п-нитрофенилоктаноат (pNC8) в 100 мМ Tris/HCl, рН 8, 0,1% Triton-X100 и 1 мМ pNC6 или pNC8, используя способы, описанные в примере 2 РСТ-публикации WO 05/056782.
Для каждого из образующих ореолы вариантов регистрировали степень появления п-нитрофенола. Фермент дикого типа не демонстрировал гидролиз pNC6 или pNC8. В таблице ниже продемонстрированы отношения гидролиза pNC6 к гидролизу pNC8.
Таблица 5Варианты, обладающие pNC6/pNC8 гидролитической активностью
Последовательности
Отношение гидролиза pNC6 к гидролизу pNC8
F154A I194M
1,13
F154G I194V
0,34
L12G
0,79
L12G I194M
0,65
Варианты F154T F196I, L12Q F154V, L12M F154E, L12G F154G, F154E I194S и L12G G22W обладали способность гидролизовать трикапроин, но не гидролизовали pNC6 или pNC8.
M. smegmatis
Данные показывают, что специфические варианты пергидролазы  способны использовать питательную среду и длинноцепочечные ацильные эфиры в качестве субстратов.
ПРИМЕР 4
Ферментный анализ
В этом примере описываются способы, которые применяют в оценке чистоты и активности ферментов. Однако не подразумевается, что настоящее изобретение ограничивается этими конкретными способами, поскольку другие подходящие способы находят свое применение.
Анализ активности фермента (анализ pNB)
410
410
Эту активность определяют по гидролизу п-нитрофенилбутирата или других длинноцепочечных п-нитрофенильных соединений. Реакционную смесь готовили добавлением 10 мкл 100 мМ п-нитрофенилбутирата в диметилсульфоксиде к 990 мл 100 мМ Tris-HCl буфера, рН 8,0, содержащего 0,1% Triton X-100. Фоновую степень гидролиза определяли до добавления фермента при 410 нм. Реакции инициировали добавлением 10 мкл фермента к 990 мл реакции, и изменение оптической плотности при 410 нм определяли при комнатной температуре (~23°С). Результаты, в которые вносились поправки на фон, приведены как δОП/мин/мл или δОП/мин/мг белка.
Трансэстерификация
4
4
Трансэстерификацию определяют с помощью разделения с использованием GC (газовой хроматографии) продуктов в буферных водных реакциях. Реакции для измерения трансэстерификации этилацетата пропанолом содержали в 1 мл 50 мМ KPO, рН 7,0, 200 мМ этилацетат, 200 мМ 1-пропал и фермент. Реакции для измерения трансэстерификации этилацетата неопентилгликолем (NPG) содержали в 1 мл 50 мМ KPO, рН 7,0, 303 мМ этилацетат, 100 мМ NPG и фермент. Реакции инкубировали при указанных температурах и в течение указанных периодов времени. Разделения проводили с использованием колонки 30М FFAP (Phenomenex). Индекс разведения на входе составлял приблизительно 1:25, температура инжектора составляла 250°С, давление напора - 10 фунтов на квадратный дюйм He, и детекцию проводили с помощью FID при 250°С. Программа хроматографии была установлена на первоначальные 40ºС в течение 4 мин с последующим градиентом на 15ºС/мин до 180ºС. Компоненты элюировали в следующем порядке: этилацетат, этиловый спирт, пропилацетат, пропиловый спирт, уксусная кислота, диацетат NPG, моноацетат NPG и NPG, и их количество не определяли.
Приготовление субстрата
Субстраты готовили, как описано ниже. Этилацетат (EtOAc) или другие водорастворимые сложные эфиры разводили в желаемом буфере до концентрации 10 мМ сложного эфира. Трибутирин и другие не растворимые в воде субстраты готовили получением образцов субстратов на ткани. Полиэфирные образцы вырезали из неокрашенной полиэфирной ткани (Polycotton, PCW 22), используя перфоратор 5/8 дюймов, и помещали в 24-луночный микротитрационный планшет (Costar, Cell Culture Plate). Нерастворимый сложный эфир разводили до 1,03 М в гексане. Затем 10 мкл раствора нерастворимого сложного эфира адсорбировали на полиэфирный образец.
Определение гидролиза (GC-анализ)
Описываемый ниже гидролитический анализ применяют при определении степени гидролиза субстрата. В этом анализе раствор для анализа состоял из 50 мМ калия фосфата, рН 7,5, 10 мМ являющего сложным эфиром субстрата, 29 мМ перекиси водорода и 20 мМ калия хлорида в общем объеме 0,99 мл и количества фермента, которое приводило бы к продукции 20 нмоль уксусной кислоты в минуту при 25°С.
Для измерения гидролиза нерастворимого в воде сложного эфира реакционную смесь добавляли к образцу нерастворимого сложного эфира на ткани. Образец готовили, как описано выше («Приготовление субстрата»). Все другие условия анализа были такими же, кроме исключения других являющихся сложными эфирами субстратов.
Гидролитическую активность измеряли с помощью контролирования увеличения кислот, продуцированных ферментом из являющихся донорами ацильных групп субстратов, используя газовую хроматографию, сопряженную с пламенно-ионизационной детекцией. Анализ проводили путем сначала пипетирования 50 мкл раствора для анализа, содержащего все компоненты, кроме фермента, в 200 мкл метанола (степени чистоты HPLC) для определения количества кислоты в растворе для анализа в момент времени 0. Затем в раствор для анализа добавляли 10 мкл фермента до желаемой конечной концентрации, которая приводила к продукции приблизительно 20 нмоль кислоты в минуту. Включали таймер, и 50 мкл-аликвоты отбирали из раствора для анализа и добавляли к 200 мкл метанола в различные моменты времени, обычно 2, 5, 10, 15, 25, 40 и 60 минут, после добавления фермента.
Эти погашенные метанолом образцы затем инъецировали в газовый хроматограф, сопряженный с пламенно-ионизационным детектором (Agilent 6890N), и анализировали на гидролитические компоненты, уксусную и масляную кислоты и т.п. Газовую хроматографию проводили с использованием колонки с модифицированным нитротерефталевой кислотой полиэтиленгликолем (Zebron FFAP, с размерами: 30 м длина, 250 мкм диаметр, 250 нм толщина пленки). 3 мкл-аликвоту образца вносили в колонку путем бесщелевой инъекции при постоянной потоке гелия 1 мл/минуту. Входное отверстие поддерживали при температуре 250°С и очищали от каких-либо оставшихся компонентов образца через 2 минуты. При анализе уксусной кислоты температуру колонки поддерживали при 75°С в течение 1 минуты после инъекции, увеличивали на 25°С/минуту до 100°С, затем увеличивали на 15°С/минуту до 200°С.
При анализе масляной кислоты температуру колонки контролировали, как описано выше, за исключением того, что температуру дополнительно увеличивали на 25°С/минуту до 225°С и поддерживали при 225°С в течение 1 минуты. Пламенно-ионизационный детектор поддерживали на протяжении хроматографии при 250°С и при постоянном потоке водорода 25 мл/минуту, потоке воздуха 200 мл/минуту и комбинированном колоночном и подпиточном гелиевом потоке 30 мл/минуту. Количество подвергнутой гидролизу кислоты в образце затем определяли интегрированием кислотного пика на хроматограмме для определения общего количества ионов и расчетом кислоты из количества ионов, используя стандартную кривую, построенную при указанных выше условиях для уксусной и масляной кислот при различных концентрациях в растворе для анализа (без фермента).
Определение пергидролиза (анализ OPD)
Анализ пергидролитической активности, описываемый ниже, применяют при определении количества перкислоты, образуемой в реакции. В этих анализах раствор включал 50 мМ калия фосфат, рН 7,5, 10 мМ являющийся сложным эфиром субстрат, 29 мМ перекись водорода, 20 мМ калия хлорид и 10 мМ О-фенилендиамин.
При использовании нерастворимого в воде сложного эфира в качестве донора ацильной группы, в качестве субстрата использовали образец ткани с адсорбированным сложным эфиром, приготовленный как описано выше («Приготовление субстрата»).
Пергидролитическую активность измеряли с помощью контроля за увеличением оптической плотности при 458 нм окисленного перкислотой, образованной ферментом, О-фенилендиамина (OPD). Раствор для анализа пергидролитической активности готовили также, как и раствор для анализа гидролитической активности, за исключением того, что в раствор для анализа добавляли OPD в конечной концентрации 10 мМ. Раствор OPD готовили непосредственно перед проведением анализа растворением 72 мг OPD (Sigma-Aldrich, дигидрохлорид) в 19,94 мл того же буфера, и рН доводили медленным добавлением 60 мкл 13,5 М калия хлорида. рН измеряли, и, если необходимо, добавляли небольшие количества калия хлорида для возвращения рН к исходному рН буфера. Затем 495 мкл этого раствора OPD объединяли с другими компонентами анализа до конечного анализируемого объема 0,990 мл. Раствор для гашения анализа также готовили растворением 36 мг OPD в 20 мл 100 мМ лимонной кислоты и 70% этанола.
Анализ обычно проводили при 25°С. Анализ начинали пипетированием 100 мкл раствора для анализа до добавления фермента в 200 мкл раствора для гашения для определения количества пергидролитических компонентов и фоновой оптической плотности в растворе для анализа в момент времени 0. Затем в раствор для анализа добавляли 10 мкл фермента до желаемой конечной концентрации, которая приводила к продукции приблизительно 10 нмоль перкислоты в минуту. Включали таймер, и 100 мкл-аликвоты отбирали из раствора для анализа и добавляли к 200 мкл раствора для гашения в различные моменты времени, обычно 2, 5, 10, 15, 25, 40 и 60 минут, после добавления фермента. Анализируемые растворы после гашения инкубировали в течение 30 минут для того, чтобы сделать возможным окисление OPD любой остающейся перкислотой. Затем 100 мкл каждого анализируемого раствора после гашения переносили в 96-луночный микротитрационный планшет (Costar), и оптическую плотность раствора измеряли при 458 нм с помощью спектрофотометрического считывающего устройства для планшетов (Molecular Devices, SpectraMAХ 250). Количество перкислоты в каждом образце после гашения рассчитывали, используя стандартную кривую, построенную при указанных выше условиях с использованием перуксусной кислоты при различных концентрациях в растворе для анализа (без фермента).
Отношение пергидролиз/гидролиз
Отношение пергидролиз/гидролиз = пергидролиз, измеренный в анализе пергидролиза/(Суммарная кислота, определенная в анализе гидролиза - пергидролиз, измеренный в анализе пергидролиза)
Анализ образования перкислоты пергидролазой
Для измерений пергидролиза фермент инкубируют в предпочтительном буфере при точно определенной температуре со сложным эфиром в качестве субстрата в присутствии перекиси водорода. Типичные субстраты для измерения пергидролиза средне- или длинноцепочечных сложных эфиров включают метиловые или этиловые эфиры гексановой, гептановой, октановой, нонановой кислоты или эфиры жирных кислот с С10-С20 или больше и другие. Кроме того, обнаружено, что фермент дикого типа способен гидролизовать нитрофениловые эфиры короткоцепочечных кислот. Последние из названных эфиров являются удобными субстратами для определения концентрации фермента. В некоторых вариантах осуществления перуксусную кислоту и уксусную кислоту измеряют с помощью анализов ABTS или HPLC. Гидролиз нитрофелинового эфира также описывается ниже.
Анализ ABTS (одномиллиметровый)
+
Этот анализ обеспечивает определение перуксусной кислоты, продуцированной пергидролазой. Этот протокол является адаптированным вариантом протокола Karst и др. (Karst et al., Analyst, 122: 567-571 [1997]). Вкратце, 100 мкл-аликвоту анализируемого раствора добавляли в 1 мл 125 мМ Кцитрата, рН 5, 1 мМ ABTS, 50 мкМ KI. Оптическую плотность измеряли при 420 нм для наибольшей чувствительности. Однако множество дополнительных длин волн иногда использовалось в отношении широкого спектра поглощения ABTS. Калибровочные кривые строили на основе известного ряда концентраций перкислоты.
Определение продуктов реакции с участием пергидролазы с помощью HPLC (модели - Agilent)
4
2
4
Для определения отношения пергидролиза к гидролизу реакции с участием пергидролазы, образцы реакции с участием пергидролазы гасили подкислением до конечной концентрации 0,24% метансульфокислоты, и продукты разделяли с помощью HPLC с обращенной фазой на колонке Dionex OA (каталожный # 062903, Dionex). Подвижной фазой был 100 мМ NaPO, pH 3,9 (буфер готовили с помощью титрования 100 мМ NaPOметансульфокислотой до рН 3,9), движущийся при изократических условиях при 30°С. Детекция была при 210 нм. Концентрации продуктов рассчитывали путем сравнения проинтегрированных площадей под кривыми относительно калибровочных стандартов.
Кинетический анализ гидролиза нитрофенилового эфира
3
Фермент и субстрат инкубировали в 100 мМ Tris/HCl pH 8,0 (или 50 мМ B(OH) pH 9,5 или другом буфере). Контролировали оптическую плотность при 402 нм. В некоторых экспериментах анализ проводили в стандартных 1 мл-кюветах, в то время как в других экспериментах использовали лунки микротитрационного планшета. Последний из двух названных способов использовали для скрининга библиотек мутантов. Концентрацию фермента определяли сравнением со стандартными кривыми, полученными при тех же условиях реакции.
Анализ гидролиза пара-нитрофенилкапроата
Раствор субстрата pNC6 готовили смешиванием 1 мМ pNC6 (100 мМ маточный раствор), 1 мл DMSO, 19 мл 100 мМ фосфата (рН 8) и глицерина до конечной концентрации 10%. Для анализа образов к 190 мкл раствора субстрата добавляли 10 мкл лизата клеток, и анализировали при 405 нм в течение 15 минут в спектрофотометре. Результаты представлены в виде среднего значения двух экспериментов.
Анализ гидролиза пара-нитрофенилацетата (pNA)
Аликвоты супернатанта лизированных клеток разводили 1-100 в 100 мМ фосфатном буфере (рН 8). Для анализа образов 5 мкл разведенного 1-100 супернатанта клеток помещали в каждую лунку микротитрационого планшета. Затем добавляли 195 мкл смеси буфер/субстрат для реакции (1 мМ pNA, 100 мМ фосфат, рН 8, 10% глицерина), и определяли оптическую плотность при 405 нм в течение 3 минут (программа для кинетики, считывающее устройство для микротитрационных планшетов). Результаты представлены в виде среднего значения двух экспериментов.
Все патенты и публикации, упоминаемые в описании изобретения, служат признаками уровней специалистов, квалифицированных в области техники, к которой относится изобретение. Все патенты и публикации включаются сюда посредством ссылки в той же степени, как если бы специально и отдельно указывалось, что каждая отдельная публикация включена посредством ссылки.
После описания предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения специалисты со средним уровнем компетентности в данной области техники обнаружат, что различные модификации раскрытых вариантов осуществления могут быть осуществлены, и что такие модификации, как подразумевается, находятся в пределах объема настоящего изобретения.
Квалифицированным в данной области техники специалистам без труда понятно, что настоящее изобретение хорошо адаптируется для выполнения целей или получения результатов и преимуществ упоминаемых, а также присущих ему. Описанные здесь композиции и способы представляют предпочтительные варианты осуществления, являются примерами и не предназначаются в качестве ограничений объема настоящего изобретения. Для квалифицированного в данной области техники специалиста без труда очевидно, что различные замены и модификации описанного здесь изобретения могут быть осуществлены без отступления от объема и существа настоящего изобретения.
Настоящее изобретение, иллюстративно описанное здесь подходящим образом, можно осуществить на практике в отсутствие какого-либо элемента или элементов, ограничения или ограничений, которые не раскрыты здесь специально. Термины и выражения, которые применялись, используются в качестве терминов описания, а не ограничения, и нет намерения при использовании таких терминов и выражений исключить какие-либо эквиваленты признаков, продемонстрированных и описанных, или их частей, а признается, что различные модификации возможны в пределах объема заявленного изобретения. Таким образом, следует понимать, что хотя настоящее изобретение специально раскрыто с помощью предпочтительных вариантов осуществления и дополнительных признаков, квалифицированные в данной области техники специалисты могут прибегнуть к модификации или вариации раскрытых здесь принципов, и что такие модификации и вариации, как считается, находятся в пределах объема этого изобретения, определяемого прилагаемой формулой изобретения.
Настоящее изобретение описано здесь широко и в общем. Каждая ограниченная разновидность и субгенерические группирования, находящиеся в пределах общего описания, также образуют часть настоящего изобретения. Это включает общее описание настоящего изобретения с оговоркой или отрицательным ограничением, исключающим какой-либо предмет изобретения из рода, независимо от того, упоминается ли здесь специально исключенный материал или нет.