КОМБИНИРОВАННАЯ СЕМИВАЛЕНТНАЯ ВАКЦИНА
COMBINED HEPTAVALENT VACCINE

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Изобретение относится к стабильной иммуногенной комбинированной вакцине для профилактики и лечения любых генотипов или антигенных вариантов инфекций ротавируса, полиомиелита, коклюша, гепатита B, Haemophilus influenzae, дифтерии и столбняка. Более конкретно, изобретение относится к стабильной иммуногенной комбинированной вакцине для профилактики и лечения любых генотипов или антигенных вариантов инфекций ротавируса, полиомиелита, коклюша, гепатита B, Haemophilus influenzae, дифтерии и столбняка, в которых любой из отдельных антигенов каждого компонента не ухудшается за счет наличия антигенов других компонентов, предоставляя посредством этого титр антител, эквивалентный или превосходящий критерий для серопротекции для каждого антигенного компонента. Изобретение также относится к бивалентной вакцинной композиции для иммунизации младенцев против инфекций ротавируса и полиомиелита.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Вакцинация представляет собой важный инструмент для проведения программ здравоохранения как в развитых, так и в развивающихся странах. За последние годы количество рекомендуемых вакцин против отдельных инфекций значительно увеличилось. На текущий момент программа младенцев и детей может требовать более чем 24-25 отдельных инъекций вакцин для эффективной иммунизации против угрожающих жизни заболеваний.
Комбинированная вакцина, которая может обеспечить иммуногенность против большого количества заболеваний, всегда является предпочтительной над моновалентными вакцинами. Мы не можем уменьшить количество иммунизаций, необходимых для младенцев и детей для защиты их от различных смертельных заболеваний, но за счет уменьшения количества отдельных вакцинаций может быть улучшено соблюдение режима. Комбинированная вакцина является предпочтительной перед моновалентной вакциной, так как она не только повышает соблюдение режима, но также является экономически эффективной и удобной, уменьшая посредством этого шансы отсутствия какой-либо вакцинной инъекции. Однако, вследствие осложнений, связанных с получением таких комбинированных вакцин, одинаковая стабильность таких комбинированных вакцин вследствие возможного взаимодействия между антигенами всегда была проблемой для научного сообщества.
Rumke, 1994
Следовательно, нынешний глобальный сценарий требует более эффективного, доступного, экономически эффективного и надежного способа иммунизации против многих смертельных заболеваний. Доступность комбинированных вакцин, содержащих в своем составе протективные антигены против большинства заболеваний, против которых в детском возрасте рекомендуется универсальная иммунизация, способствует упрощению осуществления, повышению признания, снижению общей стоимости иммунизационных программ и повышению эффективности борьбы с заболеваниями. Вследствие этого, стоимость, удобство и факторы соблюдения режима вносят вклад в усиленное применение комбинированных вакцин по сравнению с моновалентными вакцинами. Также это может увеличить количество пациентов или населения, находящегося в доступности или часто отсутствующего ().
Разработка мультивалентной вакцины, способной защищать против дифтерии (D), столбняка (T), коклюша (P), полиомиелита, гепатита B и Haemophilus influenzae типа b (Hib) представляла собой эволюционный процесс, который начался в 1950-х годах, когда дифтерийный и столбнячный анатоксины стали впервые мультивалентными с инактивированной цельноклеточной коклюшной (wP) вакциной (Mallet et al.; 2004). Применение обезвреженного и инактивированного токсина коклюша и филаментного гемагглютинина (PT+FHA) в качестве бесклеточных коклюшных вакцинных компонентов было описано у Robinson, A., Gorrige, A.R., Funnell, S.G.P. и Fernandez, M. (1989). Serospecific protection of mice against in infection with Bordetella pertussis. Vaccine 7: 321-324. Вакцины, объединяющие антигены дифтерии-столбняка-коклюша, являются доступными и широко использовались на протяжении 60-х годов. Также были разработаны расширенные четырехвалентные и пятивалентные комбинированные вакцины, которые содержат вакцину Haemophilus influenzae типа b. В некоторых развитых и развивающихся странах используют пятивалентные комбинации, которые содержат DPT-Hib-гепатит B (HB).
Некоторые из многокомпонентных вакцин, предлагаемых на рынке до настоящего времени, упоминаются, как указано ниже.
Tripedia от Sanofi Pasteur представляет собой дифтерийную, столбнячную и бесклеточную коклюшную вакцину (против судорожного кашля) (DaPT). Она одобрена FDС целью применения для младенцев и детей в возрасте до семи лет. Также она одобрена для смешивания вместе с ActHIB, вакциной Haemophilus influenzae типа b (Hib вакциной), для детей 15-18-месячного возраста (Trihibit).
Daptacel также от Sanofi Pasteur представляет собой дифтерийный и столбнячный анатоксины и адсорбированную бесклеточную коклюшную вакцину (DaPT), одобренную для регулярной иммунизации младенцев и детей в возрасте от шести недель до шести лет. Ее вводят посредством внутримышечной инъекции в четырех следующих друг за другом дозах пятидозовой иммунизационной серии. Четыре дозы дают приблизительно в два месяца, четыре месяца, шесть месяцев и шесть месяцев после третьей дозы.
С 1996 года за пределами Соединенных Штатов продается вакцина Kinrix для DaPT-инактивированного полиовируса (IPV), которая эквивалентна получению вакцин DTaP и IPV в виде отдельных бустер-инъекций MMR при возрасте ребенка 4-6 лет.
Стоит упомянуть пятивалентные вакцины Pediarix [комбинированная вакцина из дифтерийного и столбнячного анатоксинов и бесклеточного коклюша адсорбированного, гепатита B (рекомбинантного) и инактивированного полиовируса] и DTaP-IPV/Hib вакцина Pentacel, которая используется с 1997 года в виде инъекций комбинированной вакцины, подлежащей введению детям в виде четырехдозовой серии, с прайминг-дозами в два, четыре и шесть месяцев и бустер-дозой в 15-18 месяцев.
Infanrix hexa от GlaxoSmithkilne, вводимая внутримышечно, представляет собой конъюгированную вакцину против дифтерии, столбняка, бесклеточного коклюша, гепатита B (HB), инактивированного полиомиелита и Haemophilus influenzae типа b (Hib), показанную для прайминг- и бустер-вакцинации младенцев. Infanrix hexa должна вводиться в виде двух- или трехдозового курса прайминг-вакцинации младенцам возраста, менее или равного 6 месяцам, с последующей бустер-вакцинацией в возрасте от 11 до 18 месяцев, с интервалом, составляющим по меньшей мере 6 месяцев между последней дозой прайминг-вакцинации и бустер-дозой. Подробное исследование на иммуногенность и безопасность новой жидкой шестивалентной комбинированной вакцины по сравнению с отдельным введением контрольных лицензированных вакцин младенцам было опубликовано Mallet E, Fabre P, Pines E, et al. Pediatr Infect Dis J 2000; 19:1119-27. Таким образом, в нескольких европейских странах, а также в США используются шестивалентные вакцины, которые могут обеспечивать иммунизацию единственной инъекцией только против шести важных детских заболеваний. Необходимо, чтобы комбинированная вакцина содержала дополнительные антигены, нежели шестивалентные антигены, так чтобы единственная вакцинация могла включать иммунизацию против других серьезных заболеваний, например ротавируса.
Ротавирус является основной причиной заболевания тяжелой диареей у младенцев и маленьких детей во всем мире. Каждый год от ротавирусной инфекции умирают приблизительно 600000 детей, при этом более чем 80% всех связанных с ротавирусом смертей происходят в бедных ресурсами странах в Южной Азии и в Африке к югу от Сахары. Настоящее изобретение излагает новую комбинацию антигенов D-aP-T-Hib-HepB-IPV и инактивированного ротавируса (IRV) в стабильной семивалентной комбинированной вакцинной композиции.
Все ротавирусные вакцины, которые проходили клинические испытания у детей, представляли собой живые штаммы для перорального приема, и эффективность некоторых из них была подтверждена, и они стали лицензированными. Однако ни одна из данных вакцин не была протестирована на вакцинируемом населении в бедных странах Африки и Азии, в которых ротавирус остается основной причиной смерти детей. Однако существенная задержка с живыми пероральными вакцинами является причиной неблагоприятных явлений типа внедрения, и ротавирусы демонстрируют огромное разнообразие (Human vaccines 4:3, 143-147:2008). В настоящем изобретении авторы также занимались альтернативной стратегией развития инактивированной ротавирусной вакцины (IRV) и этим ротавирусным антигеном в виде части комбинированной детской вакцины с комбинированным антигеном сэбина типа I, II и III в качестве новой двухвалентной комбинированной вакцины. Клеточной линией, используемой для размножения ротавируса, являются клетки vero, потому что эти клетки обладают широкой чувствительностью к различным типам вирусов и широко используются в противовирусной вакцинной продукции для человека. Ротавирусные вакцины в предшествующем уровне техники все еще не предлагаются в виде инъецируемой вакцины. Все предлагаемые ротавирусные вакцины вводятся перорально. Вследствие этого, необходимо включить ротавирусный антиген, который придавал бы иммунитет против любых штаммов ротавируса в инъекционной форме в комбинации с другими антигенами.
В WO 1993/024148 раскрыто изобретение мультивалентной вакцины, содержащей в своем составе антигены IPV-DPT-Hib-гепатит B, в которой DTP адсорбирован в гидроксиде алюминия или фосфате алюминия, а Hib адсорбирован только в фосфате алюминия, в котором Hib антиген используется без предварительной подготовки посредством смешивания с другими антигенами непосредственно перед введением. В WO 1997/00697 раскрыта мультивалентная вакцина против DPT-Hib и коклюша, адсорбированная в фосфате алюминия, в которой один контейнер имеет лиофилизированную вакцину, а другой контейнер содержит второй антиген.
В WO 1998/000167 раскрыта антигенная вакцина D-T-aP-IPV-Hib, а в WO 1999/13906 описана многокомпонентная вакцина, в которой некоторые компоненты могут быть восстановлены из лиофилизированного состояния с помощью других компонентов вакцины или могут существовать в одном растворе, при этом вакцину вводят в специально разработанном контейнере в то время, когда проводится вакцинация.
,
В WO 2000/07623 описана многокомпонентная вакцинная композиция, имеющая бесклеточные коклюшные вакцинные компоненты (PT и FHA), дифтерийный анатоксин (DT), столбнячный анатоксин (TT), конъюгат капсульного полисахарида (Haemophilus influenze) типа b и столбнячный анатоксин или дифтерийный анатоксин (Hib), поверхностный Ag гепатита B (HBsAg) и инактивированный полиовирус (IPV), которые могут находиться в одном растворе, или некоторые компоненты могут быть восстановлены из лиофилизированного состояния с помощью других компонентов вакцины. В WO 2002/000249 раскрыт капсульный полисахарид H. influenzae bне адсорбированный на адъювантной соли алюминия, и два или более дополнительных бактериальных полисахарида, которые могут содержать цельноклеточный коклюш, столбнячный анатоксин, дифтерийный анатоксин, поверхностный антиген гепатита B (HbsAg) и/или конъюгированные полисахариды N. meningitides типа A, или B, или C в качестве антигенов в единственной четырехвалентной и/или трехвалентной вакцине. В WO 2006/097851 раскрыта мультивалентная вакцина, которая может быть получена без предварительной подготовки во время применения посредством смешивания вместе двух компонентов, при этом первый компонент содержит антигены D, T, wP и HbsAg, а второй компонент содержит конъюгат Hib и один или более менингококковых конъюгатов. WO 2007/054820 относится к вакцинной композиции, в которой антигены D, T и aP специфично адсорбированы на гидроксиде алюминия, а антигены Hib и Hep B адсорбированы на фосфате алюминия, который не существует в полностью жидкой стабильной композиции.
В патенте США 6333036 говорится о мультивалентной вакцине, в которой используется Hib конъюгированный полисахарид полирибосилрибитол фосфат (PRP), адсорбированный на фосфате алюминия, содержащем антигены D, T и aP. Антиген Hep B адсорбирован на гидроксиде алюминия, причем он не является полностью жидкой композицией, образующей мультивалентную вакцину.
В европейском патенте 1028750 сообщается о мультивалентной вакцине, которая имеет D, T, aP, адсорбированные на фосфате алюминия, при этом антиген Hep B не адсорбирован на гидроксиде алюминия, а также не существует в единой стабильной жидкой композиции, образующей комбинированную вакцину.
Хотя эрадикация полиомиелита в западном мире и его глобальное снижение является результатом успешного применения пероральной полиовакцины (OPV) в большинстве частей мира (Plotkin, 1995), потенциальный риск вакцины, связанной с паралитическим полиомиелитом (VAPP) с OPV, привел многие страны к переходу на использование IPV для регулярной иммунизации. Некоторыми другими публикациями предшествующего уровня техники в данной области являются Plotkin SA. Inactivated poliomyelitis vaccine for the United States: a missed vaccination opportunity. Pediatr Infect Dis J 1995; 14: 835-9 and Rümke HC. Are different combined vaccines needed in different parts of Europe? A point of view from a Northern European country. Biologicals 1994; 22: 425-7. Все заявки на патенты, подробно изложенные выше, рассматривают различные адъюванты для различных антигенов, не существующих в виде единой жидкой композиции в едином флаконе.
В WO 2008/044611 раскрыт способ получения смешанной вакцины IPV-DPT, содержащей штаммы сэбина типа I, II и III инактивированного полиовируса, выращенного в клетках Vero, протективный антиген против Bordetella pertussis, дифтерийный анатоксин и столбнячный анатоксин, который включает стадию получения полиовируса штамма сэбина, имеющего высокий титр.
Все заявки на патенты, упомянутые выше, требуют восстановления отдельных компонентов перед введением вакцины. Они не могут называться комбинированными в буквальном смысле термина, а также могут называться мультивалентными вакцинами для придания иммунитета против, самое большее, шести антигенов. Смешивание перед введением антигенных компонентов из различных флаконов приводит к убыванию титра антител против любого конкретного антигена, благодаря вмешательству антигенных взаимодействий. В публикации США 2011/0206726A1 сообщается о полностью жидкой шестивалентной комбинированной вакцине, содержащей антигены D-T-aP-IPV,-Hep B и Hib, в которой Hib по существу не адсорбирован на каком-либо адъюванте, а D-T-aP адсорбирован на гидроксиде алюминия, а Hep B адсорбирован на фосфате алюминия в одном флаконе. В ней также указано, что антигенная конкуренция в подобных мультивалентных вакцинах часто приводит к пониженному реагированию на некоторые отдельные антигены. В этой заявке признается наличие проблемы смешивания лиофилизированных вакцин с жидкими вакцинами, что представляет дополнительное ограничение для практикующего врача и включает возможность плохого ее осуществления. В ней признается также, что осуществление применения многокомпонентных шприцов, имеющих отдельные камеры для жидких и лиофилизированных вакцин, является слишком трудным и невозможно уменьшение производственных расходов на вакцину, за счет чего также невозможно уменьшение стоимости иммунизации. Хотя в этой заявке описывается жидкая комбинированная вакцина в одном флаконе, в ней не описывается комбинированная вакцинная композиция, содержащая в своем составе до 7 различных антигенов. В ней не говорится о предоставлении защиты или иммунитета к инфекциям, вызываемым ротавирусом в комбинированной вакцинной композиции.
Следовательно, в этом изобретении была сделана возможной разработка такой комбинированной семивалентной вакцины, которая была бы способна обеспечивать защиту против полиовируса, ротавируса, Haemophilus influenzae, гепатита B, дифтерии, столбняка и бесклеточного коклюша за счет введения с использованием единой комбинированной вакцины. Настоящее изобретение преодолевает ограничения предшествующего уровня техники, предоставляя стабильную комбинированную семивалентную вакцину (инактивированного полиовируса (сэбина)-инактивированного ротавируса- Haemophilus influenzae типа b- поверхностного антигена гепатита B - дифтерии - столбняка - коклюша (aP)), которая обеспечивает возможность вакцинации против полиомиелита, ротавируса, Hib, гепатита B, дифтерии, столбняка и коклюша посредством единственной инъекции, которая является стабильной и удовлетворяет критериям эффективной серопротекции против каждого из антигенов с минимальными или наименьшими антигенными помехами в комбинированной вакцине.
ЦЕЛЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Основной целью изобретения является получение комбинированной семивалентной вакцины, которая индуцирует иммуногенность у человека против по меньшей мере семи заболеваний.
Еще одной целью изобретения является получение полностью стабильной комбинированной семивалентной вакцины, которая обеспечивает возможность вакцинации против полиомиелита, ротавируса, Hib, гепатита B, дифтерии, столбняка и коклюша посредством единственной инъекции.
Еще одной целью изобретения является получение стабильной комбинированной семивалентной (IPV-IRV-Hib-HBsAg-DPT) вакцины, содержащей инактивированный полиовирус (сэбина тип I, II, III), инактивированный ротавирус, штамм 116E, Haemophilus influenzae типа b, поверхностный антиген гепатита B, антигены дифтерии, столбняка и коклюша (aP)) в одной единственной комбинированной вакцине.
Дополнительной целью изобретения является разработка способа получения комбинированной семивалентной вакцины против инактивированного полиовируса (сэбина тип I, II, III) - инактивированного ротавируса - Haemophilus influenzae типа b - поверхностного антигена гепатита B (HBsAg) - дифтерии-столбняка-коклюша(aP).
Еще одной дополнительной целью изобретения является получение бивалентной новой комбинированной вакцины против инактивированного полиовируса - инактивированного ротавируса для предотвращения и лечения инфекций ротавируса и полиомиелита у детей в одной единственной комбинированной вакцине.
Дополнительной целью изобретения является разработка способа получения комбинированной бивалентной вакцины.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Соответственно, настоящее изобретение относится к стабильной иммуногенной комбинированной вакцине для профилактики и лечения любых генотипов или антигенных вариантов инфекций ротавируса, полиомиелита, коклюша, гепатита B, Haemophilus influenzae, дифтерии и столбняка, в которой любой из отдельных антигенов каждого компонента не ухудшается за счет наличия антигенов других компонентов, предоставляя посредством этого титр антител, эквивалентный или превосходящий критерий для серопротекции для каждого антигенного компонента.
Комбинированная вакцина по изобретению содержит смесь антигенов для защиты против таких заболеваний, как дифтерия, столбняк, коклюш, и инфекций, вызванных Haemophilus influenzae, гепатита B, полиовирусов и ротавирусов. В частности, изобретение относится к новой полностью жидкой стабильной семивалентной вакцинной композиции, адсорбированной на фосфате алюминия, содержащей
i) три типа инактивированного полиовируса (тип-1,2,3),
ii) единственный штамм инактивированного ротавируса (116E), адсорбированного
iii) конъюгат Haemophilus influenzae типа b PRP, конъюгированный с TT
iv) рекомбинантную вакцину против гепатита B, адсорбированную
v) дифтерийный анатоксин (DT), адсорбированный
vi) столбнячный анатоксин (TT), адсорбированный
vii) Bordetella pertussis, бесклеточная (aP) адсорбированный
Комбинированная семивалентная вакцина по изобретению уменьшает количество инъекций, требующихся для иммунизации, повышает удовлетворенность родителей и детей, уменьшает боль, является более удобной, улучшает соблюдение режима с однократной иммунизацией, улучшает ведение записей и является более экономически эффективной.
Также изобретение относится к новой комбинированной вакцине инактивированного сэбина I, II и III и инактивированного ротавирусного антигенов и способ ее получения. Способ по изобретению включает добавление подходящего стабилизатора во время процесса инактивации полио- и ротавируса.
Кроме того, также изобретение относится к способу иммунизации детей против упомянутых выше заболеваний посредством инъецирования всех семи и/или IPV-IRV антигенов в единственной жидкой композиции за одну инъекцию вакцины. Настоящее изобретение дополнительно направлено на комбинированную вакцину, которая содержит множество компонентов вакцины, которые подходят для предотвращения, ослабления и лечения множества состояний заболевания, которые соответствуют критерию серопротекции для каждого из указанных компонентов вакцины с наименьшими антигенными помехами.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В заявке обсуждаются подробные варианты осуществления настоящего изобретения. Однако следует понимать, что раскрытые варианты осуществления являются всего лишь иллюстрацией изобретения, которое может быть воплощено в различных формах. Вследствие этого, конкретные структурные и функциональные детали, раскрытые в заявке, не следует интерпретировать в качестве ограничения, но всего лишь как основу для формулы изобретения и как типичную основу для обучения специалиста в данной области различным использованиям настоящего изобретения фактически в любой соответствующим образом детализированной структуре. Кроме того, термины и фразы, используемые в заявке, не предназначены для ограничения, но предоставляют понятное описание изобретения.
Различные антигены, используемые в семивалентной вакцине по изобретению, наряду с кратким описанием способа их получения будут описаны далее в следующих параграфах наряду с их вариантами применения и преимуществами над предшествующим уровнем техники.
i) Инактивированная полиовакцина
Полиовирусы (семейство picrnaviridae, род enterovirus) являются безоболочечными вирусами, содержащими положительную цепь РНК и являются возбудителями паралитического полиомиелита. Enterovirus являются временными обитателями желудочно-кишечного тракта и являются устойчивыми к кислому pH. Полиовирусы имеют икосаэдрические капсиды, состоящие из одной копии генома РНК и 60 копий каждого из вирусных капсидных белков VP1, VP2, VP3 и VP4.
Вирус попадает через рот, а первичное размножение вируса происходит в месте имплантации в глотке и в желудочно-кишечном тракте. Инкубационный период длится от 3 до 35 дней. Затем инфекция поступает в лимфатические органы посредством инфильтрации моноцитных клеток в пейеровых бляшках. Миндалины, шейные лимфатические узлы и кишечные лимфатические узлы являются обычными местами вторичной репликации. Вирус переносится кровотоком к различным внутренним органам и региональным лимфатическим узлам. Кроме того, когда полиовирус поражает медуллярный дыхательный центр, может произойти смерть от паралича дыхания.
Используют два типа полиовакцин: пероральную живую полиовакцину и инактивированную полиовакцину. Живая атенуированная пероральная полиовакцина является высоко эффективной против всех трех серотипов полиовируса и используется для прерывания передачи полиовируса дикого типа для глобальной инициативы по ликвидации полиомиелита. Штаммы полиовируса для перорального приема могут эффективно индуцировать как гуморальный и мукозальный иммунитет против полиовируса, однако вследствие их генетической нестабильности и быстрого образования ревертантов во время репликации вируса в реципиенте вакцины, они обладают некоторыми присущими недостатками для минимизации потенциального риска вспышек полиомиелита, связанных как со штаммами циркулирующего полиовируса вакцинного происхождения (cVDPV), так и с вакциной, связанной с паралитическим полиомиелитом (VAPP) и для уменьшения тяжести заболевания, связанного с применением OPV.
Инактивированную полиовакцину (IPV) в основном получают, используя вирулентные штаммы полиовируса дикого типа. Вероятность утечки дикого полиовируса с места производства IPV в среду обитания людей приводит к возможному риску вспышки у неиммунизированного населения. В связи с этим предпочтительно применение штаммов живого атенуированного полиовируса для производства IPV вместо штаммов дикого типа для минимизации риска вспышек полиомиелита вследствие высвобождения вируса в среду обитания людей в постэрадикационный период.
Инактивированная полиовакцина представляет собой вакцину, которая потеряла свою инфекционность за счет инактивации полиовируса, инактивированного 0,020-0,025% формалином в течение 2 недель при 37°C (Vaccine 17, 2059-206: 1999). Исследования стабильности и иммуногенности IPV солка и сэбина при 37°C были аналогичными (Biologicals 34, 155-158: 2006).
Полиовирусы имеют два различных вида антигенов, а именно антигены D-(N) и C-(H). Антиген D экспрессируется в нативных вирусных частицах и может индуцировать антитела специфичного протективного нейтрализующего типа у индивидуумов после полиовирусной инфекции или вакцинации OPV или IPV. Антиген D может конвертироватся в непротективный антиген C посредством мягкого нагревания, вследствие этого измерение содержания антигена D используется в тесте для оценки эффективности вакцины. (Vaccine 25, 7041-7046: 2007). Что касается иммуногенности у крыс, в тесте для оценки эффективности вакцины она значительно отличается. Для типа-1 иммуногенность была значительно выше для IPV сэбина по сравнению с IPV солка. Для типа-2, основное уменьшение иммуногенности наблюдалось для IPV сэбина по сравнению с IPV солка. Для типа 3 для IPV сэбина и солка наблюдалась аналогичная иммуногенность (Biologicals 34, 155-158: 2006). Имеющиеся в настоящее время штаммы пероральной живой атенуированной вакцины, разработанные посредством репликации штамма сэбина в пищеварительном тракте человека и порождающие вирусные штаммы повышенной нейровирулентности, которые в очень редких случаях, приблизительно 1 случай на 2,5 миллиона доз, вызванной вакциной, связанной с паралитическим полиомиелитом.
Два вирусных антигена, известных как антигены D и антигены C, обычно присутствуют в смеси с инактивированным штаммом сэбина полиовируса. Антигены D представляют собой полностью вирусные белки. Антитела к антигенам D обладают способностью нейтрализовывать инфекционный живой вирус. Вследствие этого, когда в качестве вакцины должен быть использован инактивированный штамм сэбина полиовируса, требуются антигены D.
Имеется три типа полиовирусов: тип I, тип II и тип III, каждый из которых вызывает заболевание полиомиелита. Вследствие этого, когда в качестве вакцины используют инактивированный штамм сэбина полиовируса (инактивированная полиовакцина), он должен обладать иммуногенностью, способной к продуцированию количества антител, достаточного для нейтрализации каждого дикого штамма полиовируса из типа I, типа II и типа III.
В слоях населения с низким охватом прививками и плохим наблюдением в течение долгих периодов времени могут скрыто циркулировать штаммы вакцинного происхождения, приводя к вспышкам полиомиелита.
ВОЗ следит за экспортом технологии производства IPV солка в крупных масштабах, используя полиовирус дикого типа для производства в странах с ограниченными ресурсами и/или слабой нормативно-правовой базой биологической безопасности, где значительная часть населения становится полностью восприимчивой к полиовирусной инфекции вслед за прекращением использования OPV. Вследствие этого, инактивированная полиовакцина IPV в изобретении была разработана из живого атенуированного штамма сэбина. В представленном описании штамм сэбина полиовируса относится к полиовирусному штамму, происходящему из атенуированного штамма полиовируса. Полиовирус штамма сэбина включает штамм сэбина полиовируса типа I, штамм сэбина полиовируса типа II и штамм сэбина полиовируса типа III.
Инактивация есть не что иное, как устранение инфекционной способности вируса с использованием химических препаратов. Химическими препаратами, используемыми для инактивации вируса, являются формальдегид или бета-пропиолактон. Инактивацию полиовируса можно осуществить с помощью химического метода. Например, инактивацию можно осуществить посредством обработки полиовируса формалином.
ii) Инактивированная ротавирусная вакцина
Ротавирус остается основной причиной смерти детей вследствие диареи, обезвоживания и недостаточного питания в странах Африканского и Азиатского континента. В этих бедных странах коммерческие вакцины не были протестированы на целевой группе населения. Существующая живая вакцина является недостаточной для индуцирования иммунитета и не защищает население полностью. Иногда она также вызывает неблагоприятные явления наподобие инвагинации кишечника.
Когда происходит смешивание инфекций более чем с одним ротавирусным штаммом, генные сегменты из родительских вирусов могут независимо пересортировываться вследствие генетического сдвига, продуцируя реассортанты смешанного происхождения, источник вирусного многообразия.
Настоящее изобретение относится к новому способу разработки антигена инактивированной инъецируемой ротавирусной вакцины (IRV) в комбинации с другими антигенами, который преодолевает поствакцинальные проблемы, связанные с пероральными ротавирусными вакцинами, известными в данной области.
Штамм ротавируса 116E представляет собой встречающийся в природе человеческий и бычий реассортант. 116E представляет собой человеческий ротавирус, полученный у бессимптомно инфицированных новорожденных, имеющий p[10]G9 и p[11]G10 антигенные основы. Данная живая пероральная вакцина в клиническом испытании была безопасной и хорошо переносимой. Penelope H. Denneht: «Rotavirus vaccines: overview, «Clinical microbiology Reviews, 198-208 (2008) или патент ротавируса BBIL в качестве примера или ссылки. В представленном изобретении инактивация вируса связана с устранением инфекционной способности вируса. В двух способах инактивации (химическом и физическом) наиболее широко используемыми химическими веществами являются формальдегид и бета-пропиолактон. Инактивацию ротавируса можно осуществлять с помощью способа (Human vaccines: «Immunogenicity of a thermally inactivated rotavirus vaccine in mice», 143-147: 2008. Например, инактивацию можно осуществлять посредством обработки ротавируса нагреванием.
iii) Получение протективного антигена Bordetella pertussis
Штамм, используемый для разработки и получения бесклеточной коклюшной вакцины против Bordetella pertussis Tohama-1 и Bordetella Bronchiseptica TY-178.
Bordetella pertussis Tohama-I:
Представляет собой грамотрицательную, аэробную, подвижную коккобациллу. Она проявляет бета-гемолиз на кровяном агаре. Это один из штаммов, который авторы используют для выделения и очистки FHA и PRN, который имеет доступ к большинству компонентов бесклеточных коклюшных вакцин.
Bordetella Bronchiseptica TY-178:
Представляет собой грамотрицательную, аэробную, подвижную коккобациллу. Она проявляет бета-гемолиз на кровяном агаре. Данный штамм является генетически модифицированным. Его используют специально для выделения и очистки детоксифицированной PT.
Получение коклюшного анатоксина и филаментного гемагглютинина
Штамм B. pertussis tohama-I/B. bronchiseptica TY 178 инокулировали на 2 B.G. скошенные агары, инкубированные при 37+0,5°C в течение 48 часов в инкубаторе. Наблюдается сплошной рост. Затем культуру брали в 5 мл нормальный солевой раствор и инокулировали в 2×10 мл SS среду при 37+0,50°C в течение 24 часов в шейкерный инкубатор при 120 об./мин. (Стадия-I) наблюдали 5% рост. Культуру стадии I переносили в 2×50 мл SS среды, инкубировали при 37+0,5°C в течение 24 часов в шейкерном инкубаторе при 150 об./мин (стадия II). Затем культуру стадии II переносили в 2×250 мл SS среду, инкубировали при 37+0,5°C в течение 24 часов в шейкерном инкубаторе при 200 об./мин (стадия III). Наблюдался хороший рост. Проверяли чистоту и объединяли в колбу 5% инокулята для 10 л среды биореактора согласно протоколу.
B.P. Tohama-I
: Сбор клеток из биореактора собирали в стерильную 10 л бутыль и центрифугировали при 4200 об./мин в течение 45 мин. Собранный супернатант, который содержит антиген FHA, который фильтруют посредством 0,45 мкм фильтрации, и сгусток клеток обрабатывают для экстракции Пертактина.
B. bronchiseptica TY 178
: Сбор клеток из биореактора собирали в стерильную 10 л бутыль и центрифугировали при 4200 об./мин в течение 45 мин. Собранный супернатант содержит антиген PT, фильтруемый посредством 0,45 мкм фильтрации. После инактивации сгусток клеток выкидывают.
Бульон, отфильтрованный посредством 0,45 мкм фильтрации, указанной выше, который имеет FHA и PT, концентрируют в 5-6 раз до своего первоначального объема с помощью системы TFF с его последующей диафильтрацией фосфатным буфером при pH 8,0.
Хроматография-1 (первичная очистка): первичную очистку проводят с помощью афинной хроматографии и элюирование проверяют посредством функции HA на наличие антигена.
Хроматография-2 (вторичная очистка): вторичную очистку проводят с помощью ионообменной хроматографии и элюирование проверяют посредством функции HA на наличие антигена. Чистоту проверяли посредством SDS PAGE (серебряное окрашивание).
iv) Антиген дифтерийного анатоксина
Антиген дифтерийного анатоксина приобрели у производителя, прошедшего предварительный отбор ВОЗ. Данный объем использовали для получения комбинированной вакцины. Комбинированную вакцину составляли таким образом, чтобы каждые 0,5 мл обязательно имели в своем составе 25 LF анатоксина.
v) Антиген столбнячного анатоксина
Антиген столбнячного анатоксина приобрели у производителя, прошедшего предварительный отбор ВОЗ. Данный объем использовали для получения комбинированной вакцины. Комбинированную вакцину составляли таким образом, чтобы каждые 0,5 мл обязательно имели в своем составе 7,5 LF анатоксина.
vi) Конъюгированная вакцина Haemophilus influenzae типа b
Получение конъюгированной вакцины Haemophilus influenzae типа b включает следующие стадии:
1. Ферментация культуры Нaemophilus influenzae типа b.
2. Выделение и очистка PRP.
3. Активация PRP бромистым цианогеном и связывание дигидразидом адипиновой кислоты.
4. Соединение с очищенным столбнячным анатоксином.
5. Очистка конъюгата посредством гель-хроматографии.
vii) Поверхностный антиген гепатита B
Поверхностный антиген HBV получают посредством культивирования созданных методами генетической инженерии дрожжевых клеток, которые несут ген, кодирующий большинство поверхностных антигенов HBV. HBS Ag экспрессируют в дрожжевых клетках и очищают посредством технологии Himax.
viii) Комбинированные вакцины
Одна комбинированная вакцина согласно настоящему изобретению имеет в своем составе инактивированный рота штамм 116E и инактивированный сэбин штамм полиовируса. Еще одна комбинированная вакцина согласно настоящему изобретению содержит в своем составе инактивированный рота штамм 116E, инактивированный штамм сэбина полиовируса тип I, II и III, протективный антиген Bordetella pertussis (пертактин, коклюшный анатоксин, филаментный гемагглютинин), поверхностный антиген гепатита B, конъюгированный антиген Haemphilus influenzae типа b PRP, дифтерийный анатоксин и столбнячный анатоксин. Вследствие этого, комбинированная вакцина согласно настоящему изобретению также может быть получена посредством смешивания инактивированного ротавируса и штамма сэбина полиовируса вместе с дифтерийным анатоксином, столбнячным анатоксином, коклюшем, конъюгированным антигеном Hаеmophilus influenzae типа b PRP-TT и поверхностным антигеном гепатита B.
ПРИМЕРЫ
Следующие примеры используют для дополнительного иллюстрирования настоящего изобретения и его преимуществ. Следующие конкретные примеры приведены с пониманием, что они предназначены для иллюстрации и не служат в качестве ограничения объема правовых притязаний представленного изобретения.
Пример 1:
Инактивация ротавируса
В настоящем изобретении живой ротавирус подвергали термической инактивации при трех различных температурах с и/или без стабилизатора сорбитола во время процесса инактивации.
Исследование кинетики инактивации вируса
: Во время процесса инактивации брали образец сбора вирусных клеток и остаточные живые вирусные частицы тестировали посредством иммунопероксидазного теста.
Таблица 1
Темпера-тура
10% сорбитол
Время взятия образцов вирусов во время исследования кинетики инактивации
1-й час
2-й час
3-й час
4-й час
5-й час
6-й час
56°C
С сахаром
++
++
++
++
--
--
Без сахара
++
++
++
++
--
--
60°C
С сахаром
++
--
--
--
--
--
Без сахара
++
--
--
--
--
--
70°C
С сахаром
--
--
--
--
--
--
Без сахара
--
--
--
--
--
--
++: обозначает наличие остаточной вирусной частицы в конкретный момент взятия образца посредством иммунопероксидазного теста--: обозначает отсутствие остаточной вирусной частицы в конкретный момент взятия образца посредством иммунопероксидазного теста.
Пример 2: Концентрация и очистка инактивированной ротавирусной частицы
Сбор инактивированных ротавирусных клеток подвергали ультрафильтрации, используя фильтрацию в тангенциальном потоке. Молекулярными отделяющими кассетами, используемыми для удаления включений с более низкой молекулярной массой, являются кассеты 100 кДа или 300 кДа. Вируссодержащую жидкость несколько раз пропускали через кассету, используя систему TFF, до тех пор, пока не получали требуемую концентрацию. Во время процесса ультрафильтрования объем сбора будет достигнут с помощью фосфатного буфера (10-20 мМ) или фосфатного буфера (10 мМ) с 100-136 мМ хлорида натрия. pH буфера будет нейтральным, предпочтительно pH будет 7,2±0,2.
2
2
2
Концентрированный сбор вирусных клеток дополнительно очищали посредством ионообменной хроматографии с последующей гельпроникающей хроматографией. Концентрированный ретентат вирусного материала пропускали через слабую анионообменную хроматографию. Хроматографическую среду уравновешивали 25, или 50, или 100 мМ раствором хлорида натрия, содержащим в своем составе 10 мМ фосфатный буфер. pH уравновешенного буферного раствора колеблется от 7,0 до 7,4. После уравновешивания концентрированный ротавирусный материал пропускали через слабую анионную среду с линейной скоростью потока, составляющей 45-60 см/час. Предпочтительно 60 см/час. Буфер промывали содержащим l0 мМ хлоридом натрия. Содержащий в своем составе 10 мМ фосфатный буфер с pH 7,0-7,2 пропускали с линейной скоростью потока, равной 50 см/час, для элюирования включений с более низкой молекулярной массой.
Посредством солевого градиента связанный ротавирус элюировали и фракцию объединяли с более высоким значением оптической плотности при 280 нм. Объединенные фракции диализировали, используя кассеты 100 кДа или 10 кДа против 140 мМ хлорида натрия с 10 мМ фосфатным буфером с pH 7,0-7,4.
Чистоту и белковый состав инактивированной ротавирусной частицы определяли посредством анализа методом электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия и вестерн-блоттинга. Концентрацию белка очищенного основного объема количественно определяли методом Лоури.
Пример 3:
Инактивация полиовируса
Инактивацию полиовируса можно осуществлять посредством широко используемого способа. Конкретно, полиовирус может быть инактивирован за счет добавления в жидкость, содержащую живой полиовирус, химического инактивирующего агента и посредством этого фиксации поверхностного белка вируса. Инактивирующим агентом предпочтительно является формалин. Формалин используют в качестве инактивирующего агента, количество добавления предпочтительно составляет от приблизительно 0,001 до приблизительно 0,1% масс./об., более предпочтительно от приблизительно 0,05% масс./об., а наиболее предпочтительно приблизительно 0,04% масс./об. Содержание антигенной D единицы рассчитывали после процесса инактивации в очищенном объемном образце, обработанном с или без глицина во время процесса инактивации. Температура инактивации наиболее предпочтительно составляет приблизительно 37°C. Период инактивации составляет предпочтительно от приблизительно 7 дней до 14 дней.
Таблица 2
Содержание антигена D в очищенном объеме, полученном из сбора вирусных клеток, обработанного с глицином или без него во время процесса инактивации
Полио-вирус
Инактивирующий агент и концентрация
Температура
Стабилизатор, используемый во время процесса инактивации
Содержание антигена D в очищенном объеме
Тип I
Формалин (0,025%)
37°C
С 0,5% глицином
118
Без стабилизатора
82
Тип II
Формалин (0,025%)
37°C
С 0,5% глицином
52
Без стабилизатора
31
Тип III
Формалин (0,025%)
37°C
С 0,5% глицином
128
Без стабилизатора
84
Таблица 3
Кинетическое исследование инактивации полиовируса
Тип вируса
Темпе-ратура
Остаточная живая вирусная частица
0 день
1<sup></sup>день
2 день
3<sup></sup>день
4<sup></sup>день
5<sup></sup>день
6<sup></sup>день
7 день
8<sup></sup>день
9 день
Тип I
25
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
---
----
37
+++
+++
+++
+++
+++
-----
----
----
----
----
Тип II
25
+++
+++
+++
+++
+++
+++
++++
+++
+++
----
37
+++
+++
+++
+++
+++
+++
----
----
----
----
Тип III
25
+++
+++
+++
+++
+++
+++
++++
+++
----
----
37
+++
+++
+++
+++
+++
+++
----
----
----
----
++: обозначает наличие остаточной вирусной частицы в конкретный момент взятия образца посредством CCID<sub>50</sub>--: обозначает отсутствие остаточной вирусной частицы в конкретный момент взятия образца посредством CCID<sub>50</sub>
Пример 4:
Концентрирование и очистка полиовируса сэбина
2
2
Отдельный штамм сэбина полиовируса типа I, типа II и типа III очищали отдельно без всякого контаминирования антигена вируса в результате многократных манипуляций с образцом. Сбор жидкости, содержащей инактивированный вирус, концентрировали до требуемого объема с помощью ультрафильтрационной мембраны (sartorius, PESU(полиэфирсульфон) 100 КДа, 0,7 м. Концентрированный сбор диафильтровали на фоне фосфатного буферного солевого раствора для удаления включений более низкой молекулярной массы и для понижения концентрации хлорида натрия со 117 мM до 25 мМ. После стадии концентрирования в кассете 100 КДа кассету необходимо было промыть для удаления вирусной частицы, которая связана с мембранной кассетой. Концентрированную вируссодержащую жидкость дополнительно очищали слабо aнионообменной хроматографической средой. В данном случае слабую анионообменную среду использовали в качестве DEAE. Среду заполняли и уравновешивали с помощью 0,1 моль/л фосфатного буфера, содержащего в своем составе 25 мМ хлорида натрия. Во время заполнения линейная скорость потока должна быть в два раза больше скорости загрузки образца. Вслед за стадией уравновешивания концентрированную вируссодержащую жидкость загружали с линейной скоростью потока, равной 50 см/час.
Вирусную частицу элюировали с другой концентрацией ионов хлорида натрия согласно принципу солевого градиента. Пиковые фракции объединяли и диализировали на фоне фосфатного буфера. Очищенный объем фильтровали через 0,2 мкм PES фильтр и хранили при 2-8°C. Очистку вируссодержащей жидкости штамма сэбина типа II и типа III проводили таким же образом, что и тип I.
Количественный анализ антигена D в очищенном полиовирусном объеме:
Количество антигена D измеряют посредством непрямого метода ELISА, используя антитела, имеющие высокую специфичность к типу и антигену D. Непрямой метод ELISА начинается покрытием микропланшета, в качестве первичного антитела, моноклональным антителом (мышиного происхождения), специфическим для антигенов D того же самого типа, что и антиген, подлежащий испытанию. Планшет инкубировали в течение ночи и блокировали 1% BSA. Затем антиген, подлежащий испытанию, разбавляли и инкубировали в течение 1 часа при 37°C. Впоследствии типоспецифическое кроличье поликлональное антитело того же самого типа, что и антиген, подлежащий испытанию, помещали на него в качестве вторичного антитела, в добавление к которому туда помещали HRPO-меченное антикроличье-IgG антитело, вызывая реакцию. Вслед за реакцией проводят формирование цвета, используя O-фенилендиаминовый раствор, а поглощением при 492 нм является измеренное поглощение исследуемого антитела и измеренное поглощение для контрольного антигена посредством параллельного количественного анализа.
Пример 5
Данный пример предоставляет композицию и способ изготовления комбинированной инактивированной противовирусной вакцины согласно одному варианту осуществления изобретения.
A.
Композиция комбинированной противовирусной вакцины согласно изобретению, приведенная в нижеупомянутой таблице.
Каждые 0,5 мл вакцины содержат следующее:
Таблица 4
Компоненты
Количество
Очищенный инактивированный ротавирусный антиген
5 микрограммов
<u>Инактивированный полиовирус сэбина (sIPV)</u>
Полиотип 1
40 D единиц
Полиотип 2
08 D единиц
Полиотип 3
32 D единицы
<u>Другие эксципиенты</u>
Содержание алюминия
0,25-0,30 мг Al<sup>+3</sup> (в виде фосфата алюминия)
2-феноксиэтанол
2,5 мг
Забуференный фосфатом солевой раствор
По необходимости
B
. Ниже описан способ изготовления комбинированной противовирусной вакцины согласно изобретению.
1. Методика составления компонента 1:
1,5% гель фосфата алюминия добавляли в сосуд с последующим забуференным фосфатом солевым раствором, и содержимое перемешивали. Смесь проверяли и регулировали с понижением в диапазоне, равном pH 6,5-7,00. Компонент 1 добавляли в смесь, встряхивая содержимое для адсорбции вирусного антигена на ионах алюминия. Дополнительно требуемый объем забуференного фосфатом солевого раствора и 2-феноксиэтанола перемешивали с указанной выше смесью.
2. Добавление объема sIPV:
Содержимое компонента 1 перемешивали с антигенным препаратом IPV при встряхивании для получения комбинированной бивалентной противовирусной вакцины. В заключение проверяли pH и регулировали pH до понижения в диапазоне, равном 6,5-7,2.
Пример 6
Данный пример дает краткое описание тестирования активности, проводимого для инактивированного ротавирусного антигена и инактивированного полиовирусного антигена и данных по стабильности.
A. Тестирование активности, проводимое для инактивированного ротавирусного антигена и инактивированного полиовирусного антигена
1. Тест оценки эффективности вакцины для ротавакцины:
Требующийся вид животных
Мыши
Количество требующихся животных в партии
20
Путь введения вакцины
Подкожный
Объем инъекции
0,5 мл
Количество дней размещения животных
21 день
Подкожная инъекция ротавакцины швейцарским мышам-альбиносам: Их подвергали предварительному кровопусканию и тестировали на ротавирус-специфическое антитело в тестируемой и контрольной группе. Мышей, в каждой группе по десять, дважды иммунизировали подкожно по 5 микрограммов на 0-й день и 14-й день. Для контроля мышей в группе, равной 10, инъецировали плацебо на 0-й день и 14-й день. Животным пускали кровь на 21-й день (послеиммунизационное кровопускание). Перед началом иммунизации животных проверяли, чтобы удостовериться, что масса отдельных мышей не отличается более чем на 20% от среднего по группе. На дозу использовали инокулум, составляющий 0,5 мл ротавакцины, содержащей в своем составе 5 мкг антигена с другими эксципиентами.
У иммунизированной группы и контрольной группы выделяли сыворотку. Титры нейтрализующих антител против ротавирусной вакцины измеряли посредством реакции сывороточной нейтрализации. Чтобы нейтрализовать 2-кратно разбавленную сыворотку использовали 100 флуоресцентных бляшкообразующих единиц ротавирусного штамма 116E и тестировали в клеточной линии Ma104. Последовательно разбавляли сыворотку с 2-кратным разбавлением и перемешивали разбавленное антитело с активированным ротавирусом. Инкубировали смесь антиген-антитело при 37°C в течение 1 часа. После инкубирования смесь Ag-Ab добавляли в монослойный клеточный пласт Ma104 в многолуночном планшете. Для адсорбции вируса планшет инкубировали в течение 1 часа при 37°C. На следующей стадии в каждую лунку добавляли дополнительные 100 мкл EMEM, содержащей в своем составе 10% FBS, и планшет инкубировали при 37°C в течение 24 часов. После фиксации формалином планшет промывали PBS, а затем инфицированные клетки в течение 1 часа при 37°C окрашивали моноклональным антителом, разбавленным 1:1000, направленным против структурного белка ротавируса 116E VP6. В качестве конъюгата использовали перекись водорода, меченную козьим-антимышиным IgG, разбавленную до 1:1000, а в качестве субстрата использовали OPD в 0,05 натрий-ацетатном буфере, содержащем в своем составе 0,01% перекись водорода. Титр нейтрализующих антител определяли как кратность разбавления сыворотки, показывающего 50% уменьшение количества инфицированных клеток.
2. Тест оценки эффективности полиовакцины (тип I, тип II и тип III)
Требующийся вид животных
Крысы
Количество требующихся животных в партии
80
Путь введения вакцины
внутримышечный
Объем инъекции
0,5 мл
Количество дней размещения животных
21 день
2
Исследуемую вакцину и контрольную вакцину инъецировали внутримышечно в задние конечности крысы из четырех разбавлений (2-кратных) вакцины, подлежащей исследованию. Через 21 день вслед за инъекцией отдельно у каждого животного брали кровь и выделяли сыворотку, затем инактивировали комплемент нагреванием при 56°C в течение 30 минут в водяной бане с регулируемой температурой. Сыворотку для каждого животного из группы исследуемой вакцины и группы контрольной вакцины помещали по меньшей мере в три лунки для каждой сыворотки и 2-кратно последовательно разбавляли средой EMEM. В последовательно разбавленную сыворотку добавляли 100 CCID50 полиовируса в каждую лунку и инкубировали в течение 3 часов при 37°C для реакции антиген-антитело в присутствии 5% CО. После инкубирования 10000 клеток добавляли в каждую лунку и инкубировали в течение 5 дней. После завершения культивирования для каждой лунки исследовали CPE (цитопатический эффект), рассчитывали степень разбавления сыворотки во время 50% нейтрализации и рассчитывали обратную величину коэффициента разбавления в качестве титра нейтрализации антител.
B. Исследование стабильности инактивированной полиовирусной вакцины и инактивированной ротавирусной вакцины:
Проводили испытания, как приведено в вышеуказанной таблице. Комбинированную противовирусную вакцину измеряли посредством проведения теста хранения вакцины при 5±3°C. Cтабильность оценивали с помощью тестов оценки эффективности на каждом из вирусов.
Таблица 5
I. Исследование долгосрочной стабильности комбинированной вакцины (5±3°C) полиовакцины штамма сэбина (тип I, II и III) и инактивированной ротавирусной вакцины в течение периода, составляющего 12 месяцев.
Антиген
Концентрация антигена
Описание эффективности
Значение эффективностикомбинированной вакцины IPV-IRV
0 день
1-й мес.
2-й мес.
3-й мес.
6-й мес.
9-й мес.
12-й мес.
Полиотип 1<sup>а</sup>
Единица 40 D
Относительная эффективность равна или выше чем контрольная вакцина
1,5
1,4
1,15
1,3
1,2
1,3
1,4
Полиотип 2<sup>а</sup>
Единица 8 D
Полиотип 3<sup>а</sup>
Единица 32 D
Инактивированная ротавакцина (5 мкг/мл)<sup>b</sup>
5 мкг очищенного антигена
Титр нейтрализующих антител
1144
1120
998
1056
1114
1072
978
а. Для инактивированной полиовакцины значение эффективности исследуемой вакцины сравнивали со стандартной вакциной с помощью относительной единицы. Например, если относительное значение эффективности контрольной вакцины составляло 1, относительное значение эффективности исследуемой вакцины будет меньше, чем 1, или больше, чем 1.b. Для инактивированной ротавирусной вакцины значение эффективности было основано на титре нейтрализующих антител.
Таблица 6
Долгосрочная стабильность (5±3°C) однокомпонентной инактивированной ротавакцины
Антиген
Концентрация антигена
Описание эффективности
Относительное значение эффективности вакцины IPV
0 день
1-й мес.
2-й мес.
3-й мес.
6-й мес.
9-й мес.
12-й мес.
Полиотип 1
Единица 40 D
Относительная эффективность равна или выше, чем контрольная вакцина
1,25
1,12
1,4
1,45
1,3
1,2
1,15
Полиотип 2
Единица 8 D
Полиотип 3
Единица 32 D
Таблица 7
III. Стабильность в реальном времени (5±3°C) однокомпонентной полиовакцины (тип I, II и III)
Антиген
Концентрация антигена
Описание эффективности
Значение эффективности вакцины IRV (титр нейтрализующих антител)
0 день
1-й мес.
2-й мес.
3-й мес.
6-й мес.
9-й мес.
12-й мес.
Инактивированная ротавакцина (5 мкг/мл)
5 мкг очищенного антигена
Титр нейтрализующих антител
1256
1020
1114
986
1230
1096
1218
Пример 7
В этом примере представлена композиция и способ получения семивалентной вакцины согласно одному аспекту изобретения.
A. Композиция семивалентной вакцины согласно изобретению, как указано ниже
- каждые 0,5 мл вакцины содержат следующее
Таблица 8
Компоненты
Количество
Дифтерийный анатоксин<sup>1</sup> (DT)
25 LF адсорбированный
Столбнячный анатоксин<sup>1 </sup>(DT)
7,5 LF адсорбированный
Бесклеточный коклюш<sup>1</sup> (aP)
Коклюшный анатоксин (PT) адсорбированный 25 мкг
Филаментный гемагглютинин (FHA) адсорбированный
25 мкг
Гепатит B поверхностный антиген<sup>1</sup> (HBsAg)
10 мкг адсорбированный
Haemophilus influenzae (Hib)b
10 мкг конъюгат с ТТ
Инактивированный ротавирусный антиген<sup>2</sup> (IRV)
5 мкг адсорбированный
Инактивированный полиовирус(IPV)
Полиотип 1
40 D единиц
Полиотип 2
08 D единиц
Полиотип 3
32 D единицы
<u>Другие эксципиенты</u>
Содержание алюминия
0,50-0,60 мг Al<sup>+3 </sup>(в виде фосфата алюминия)0,25-0,30 мг Al<sup>+3</sup> (в виде гидроксида алюминия)
2-феноксиэтанол
2,5 мг
Забуференный фосфатом солевой раствор
По необходимости
<sup>1</sup>На фосфате алюминия.
<sup>2</sup>На гидроксиде алюминия.q.s. - по необходимости.
B. Способ изготовления Семивалентной вакцины согласно изобретению, как указано ниже:
1. Методика приготовления для компонента 1
+3
Требуемое количество 1,5% геля фосфата алюминия добавляли в сосуд в такой концентрации, что каждые 0,5 мл итоговой вакцины обязательно имели в своем составе 0,50-0,60 мг Al в виде фосфата алюминия. В гель фосфата алюминия добавляли требуемое количество забуференного фосфатом солевого раствора pH 7,2±0,4. Содержимое проверяли, а pH регулировали таким образом, чтобы он обязательно падал до диапазона pH 6,0-6,5. Вслед за указанной выше стадией дифтерийный анатоксин добавляли таким образом, чтобы состав итоговой вакцины обязательно имел 25 LF (флокуллирующих единиц токсина) на 0,5 мл. Далее добавляли антиген столбнячного анатоксина с концентрацией в итоговом составе, чтобы каждые 0,5 мл вакцины обязательно имели в своем составе 7,5 LF (флокуллирующих единиц токсина). Компоненты бесклеточного коклюша типа коклюшного анатоксина и филаментного гемагглютинина добавляли в смесь, полученную выше, по 25 мкг каждого компонента в 0,5 мл. В заключение поверхностный антиген гепатита B добавляли в смесь, полученную выше, с подходящей концентрацией. Смесь, полученную выше, перемешивали, pH регулировали с понижением в диапазоне, составляющем 6,0-7,0. Кроме того, добавляли забуференный фосфатом солевой раствор,
проверяли pH и регулировали с понижением в диапазоне pH: 6,5-7,2.
2. Методика приготовления для компонента 11
2,1% геля гидроксида алюминия брали в сосуд и добавляли забуференный фосфатом солевой раствор. Смесь, полученную выше, перемешивали, pH регулировали с понижением в диапазоне, составляющем 7,0-7,4. Инактивированный ротавирусный антиген добавляли таким образом, чтобы каждые 0,5 мл итоговой вакцины обязательно имели в своем составе 5 мкг вирусного антигена. Добавляли дополнительный забуференный фосфатом солевой раствор, проверяли pH и регулировали с понижением в диапазоне, равном pH: 6,5-7,2.
3. Смешивание компонента I и компонента II
Данную стадию проводили посредством переноса содержимого компонента II в компонент I для получения смеси.
4. Добавление Hib типа b и объема IPV:
Смесь, указанную выше, содержащую компоненты I и II, перемешивали с антигеном Hib. Смесь перемешивали при встряхивании для получения семивалентной вакцины. Дополнительно 2-феноксиэтанол переносили в сосуд и добавляли забуференный фосфатом солевой раствор для создания объема в требуемом количестве. pH проверяли и регулировали с понижением в диапазоне, равном 6,5-7,2.
Пример 8
in vivo
Данный пример дает краткое описание тестирования активности , проводимого для дифтерии, столбняка, коклюша, гепатита B, Нaemophilus influenzae типа b, ротавирусного антигена и полиовирусного антигена, и данные стабильности.
A. Тестирование активности, проводимое для дифтерии, столбняка, коклюша, гепатита B, Haemophilus influenzae типа b, ротавирусного антигена и полиовирусного антигена (антиген IPV-IRV-DTaP-rHBsAg-Hib)
a. Тест оценки эффективности IPV
Требующийся вид животных
Крысы
Количество требующихся животных в партии
80
Путь введения вакцины
Внутримышечный
Объем инъекции
0,5 мл
Количество дней размещения животных
21 день
2
Исследуемую вакцину и контрольную вакцину инъецировали внутримышечно в задние конечности крысы из четырех разбавлений (2-кратных) вакцины, подлежащей исследованию. Через 21 день вслед за инъекцией отдельно у каждого животного брали кровь и выделяли сыворотку, затем инактивировали комплемент нагреванием при 56°C в течение 30 минут на водяной бане с регулируемой температурой. Сыворотку для каждого животного из группы исследуемой вакцины и группы контрольной вакцины помещали по меньшей мере в три лунки для каждой сыворотки и 2-кратно последовательно разбавляли средой EMEM. В последовательно разбавленную сыворотку добавляли 100 CCID50 полиовируса в каждую лунку и инкубировали в течение 3 часов при 37°C для реакции антиген-антитело в присутствии 5% CО. После инкубирования в каждую лунку добавляли 10000 клеток и инкубировали в течение 5 дней. После завершения культивирования для каждой лунки исследовали CPE (цитопатический эффект), рассчитывали степень разбавления сыворотки во время 50% нейтрализации и рассчитывали обратную величину коэффициента разбавления в качестве титра нейтрализации антител.
b. Тест оценки эффективности IRV
Требующийся вид животных
Мыши
Количество требующихся животных в партии
20
Путь введения вакцины
Подкожный
Объем инъекции
0,5 мл
Количество дней размещения животных
21 день
Подкожная инъекция ротавакцины швейцарским мышам-альбиносам. Их подвергали предварительному кровопусканию и тестировали на ротавирус-специфическое антитело в тестируемой и контрольной группе. Мышей, в каждой группе по десять, дважды иммунизировали подкожно по 5 микрограммов на 0-й день и 14-й день. Для контроля мышей в группе, равной 10, инъецировали плацебо на 0-й день и 14-й день. Животным пускали кровь на 21-й день (послеиммунизационное кровопускание). Перед началом иммунизации животных проверяли, чтобы удостовериться, что масса отдельных мышей не отличается более чем на 20% от среднего по группе. На дозу использовали инокулум, составляющий 0,5 мл ротавакцины, содержащей в своем составе 5 мкг антигена с другими эксципиентами.
У иммунизированной группы и контрольной группы выделяли сыворотку. Титры нейтрализующих антител против ротавирусной вакцины измеряли посредством реакции сывороточной нейтрализации. Чтобы нейтрализовать 2-кратно разбавленную сыворотку использовали 100 флуоресцентных бляшкообразующих единиц ротавирусного штамма 116E и тестировали в клеточной линии Ma104. Последовательно разбавляли сыворотку с 2-кратным разбавлением и перемешивали разбавленное антитело с активированным ротавирусом. Инкубировали смесь антиген-антитело при 37°C в течение 1 часа. После инкубирования смесь Ag-Ab добавляли в монослойный клеточный пласт Ma104 в многолуночном планшете. Для адсорбции вируса планшет инкубировали в течение 1 часа при 37°C. На следующей стадии в каждую лунку добавляли дополнительные 100 мкл EMEM, содержащей в своем составе 10% FBS, и планшет инкубировали при 37°C в течение 24 часов. После фиксации формалином планшет промывали PBS, а затем инфицированные клетки в течение 1 часа при 37°C окрашивали моноклональным антителом, разбавленным 1:1000, направленным против структурного белка ротавируса 116E VP6. В качестве конъюгата использовали перекись водорода, меченную козьим-антимышиным IgG, разбавленную до 1:1000, а в качестве субстрата использовали OPD в 0,05 натрий-ацетатном буфере, содержащем в своем составе 0,01% перекись водорода. Титр нейтрализующих антител определяли как кратность разбавления сыворотки, показывающего 50% уменьшение количества инфицированных клеток.
c. Тест оценки эффективности коклюш протективного антигена:
Требующийся вид животных
Мыши
Количество требующихся животных в партии
116
Путь введения вакцины
Внутримышечный
Объем инъекции
0,5 мл
Количество дней размещения животных
28 дней
Исследуемую вакцину и контрольную вакцину разбавляли в 2 раза за три различных разбавления вакцины, подлежащей тестированию на мышах, каждое разбавление инжектировали группе мышей. Исследуемую и контрольную вакцину инжектировали внутрибрюшинно каждой мыши по 0,5 мл разбавления. У животных брали кровь спустя 21 день после вакцинации. выделяли сыворотку, инактивировали комплемент и титровали нейтрализующие антитела с помощью ELISA.
Титрационные микропланшеты покрывали очищенным антигеном с концентрацией, равной 100 нг протективного антигена на лунку. После промывания непрореагировавшие участки блокировали BSA, а затем промывали. После инкубирования при 37°C в течение 1 часа планшеты промывали, добавляли в каждую лунку конъюгат антимышиного IgG и инкубировали в течение 1 часа при 37°C. После промывания добавляли субстрат, из которого конъюгат связанного фермента выделяет цвет, его количественно определяли посредством измерения поглощения. На основании значений поглощения рассчитывали титры антител в сыворотке мышей, иммунизированных исследуемой и контрольной вакцинами, а из значений рассчитывали эффективность исследуемой вакцины относительно контрольной вакцины.
d. Тест оценки эффективности дифтерийного анатоксина:
Требующийся вид животных
Морская свинка
Количество требующихся животных в партии
125
Путь введения вакцины
Подкожный
Объем инъекции
0,5 мл
Количество дней размещения животных
33 дня
Для исследования требуются исследуемая вакцина, стандартная вакцина и токсин. Проводят разбавление исследуемой вакцины и стандартной вакцины 0,9% солевым раствором, и проводят разбавление раствора токсина 10 мМ фосфатным буфером, содержащим в своем составе 137 мM хлорида натрия. Исследуемую вакцину и стандартную вакцину серийно разбавляли в 2 раза (три различных разбавления исследуемой и контрольной вакцины). Используя одну группу по меньшей мере из 20 морских свинок для каждого разбавления исследуемой вакцины и контроля, каждому животному делали единственную подкожную инъекцию 0,5 мл. В середине 4-й - 5-й недели проводят контрольное заражение исследуемой, стандартной и контрольной группы дифтерийным токсином, содержащим 100 LD50. Дважды день в течение 5 дней осматривают морских свинок и регистрируют количество морских свинок, защищенных с помощью каждого разбавления исследуемой вакцины и контрольной вакцины. Эффективность оценивали посредством сравнения значений между тестом и контролем посредством пробит-анализа.
e. Тест оценки эффективности столбнячного анатоксина:
Требующийся вид животных
Мыши
Количество требующихся животных в партии
125
Путь введения вакцины
Подкожный
Объем инъекции
0,5 мл
Количество дней размещения животных
29 дней
Требуются исследуемая вакцина, стандартная вакцина и токсин. Проводят разбавление исследуемой вакцины и контрольной вакцины 0,9% солевым раствором, проводят разбавление раствора токсина 10 мМ фосфатным буфером, содержащим 137 мM хлорида натрия. Исследуемую вакцину и контроль разбавляют последовательно в 4 раза. Используя одну группу по меньшей мере из двадцати мышей с массой 17-20 г для каждого разбавления исследуемой вакцины и контрольной вакцины, каждому животному делали единственную подкожную инъекцию 0,5 мл. Спустя 21 день после иммунизации, проводили контрольное заражение каждой мыши приблизительно 100 LD50 токсина и наблюдали в течение 7 дней. Эффективность рассчитывали с помощью статистического метода посредством сравнения исследуемой и контрольной вакцины.
f. Тест оценки эффективности вакцины для поверхностного антигена гепатита B:
Требующийся вид животных
Мыши
Количество требующихся животных в партии
180
Путь введения вакцины
Внутрибрюшинно
Объем инъекции
1 мл
Количество дней размещения животных
28 дней
Эффективность исследуемой вакцины сравнивали со стандартной вакциной посредством определения специфических анти-HBsAg антител у мышей. Мышей, весящих от 15 до 20 г, инъецируют внутрибрюшинно в четырех разбавлениях (4-кратно) исследуемой вакциной и стандартной вакциной. Одну группу контрольных животных оставляют невакцинированной, но инъецируют внутрибрюшинно таким же объемом одного разбавителя. Брали кровь у животного на 28-й день после вакцинации и выделяли сыворотку. Посредством метода ELISА исследовали индивидуальную сыворотку на концентрацию специфических HBsAg антител. Результаты теста анализировали с помощью стандартного статистического метода. Преобразовывали процентную долю животных в каждой группе, демонстрирующих сероконверсию, и строили параллельную модель, используя кривую зависимости от логарифма дозы. Эффективность исследуемой вакцины сравнивали с контрольным препаратом.
g. Тест оценки эффективности конъюгированной вакцины Haemophilus influenzae типа b PRP:
Требующийся вид животных
Мыши
Количество требующихся животных в партии
16
Путь введения вакцины
Внутрибрюшинно
Объем инъекции
0,5 мл
Количество дней размещения животных
21 день
Данный способ предназначен для количественной оценки антител, индуцированных у мышей исследуемой вакциной посредством исследования иммуногенности мышей. Иммунизацию мышей проводят, делая единичные разбавления человеческой дозы, получаемой в стерильном солевом растворе, в 4 раза. Две дозы 4-кратного разбавления вакцины инъецировали внутрибрюшинно по 0,5 мл (8 мышей, каждая весит 15-20 г) на 0-й день и 14-й день. Каждую из 8 мышей одной контрольной группы инокулируют внутрибрюшинно 0,5 мл стерильного солевого раствора на 0-й день и 14-й день.
На 21-й день у тестовой группы и контрольной группы брали кровь и выделяли сыворотку для титра антител. Для определения во сколько раз увеличился титр антител, проводили тест способом ELISА. Титр антител не должен быть меньше, чем 4-кратно увеличенный титр антител в вакцинированной группе по сравнению с контрольной группой.
B. Стабильность IPV-IRV-Hib-HBsAg-DaPT:
Комбинированную вакцину измеряли посредством проведения теста хранения вакцины при 5±3°C. Стабильность оценивали с помощью тестов оценки эффективности для каждого из вирусов, субъединичной бактериальной вакцины и рекомбинантной вакцины.
Таблица 9
I. Долгосрочная стабильность комбинированной вакцины (5±3°C) IPV-IRV-Hib-HBsAg-DaPT
Антиген
Концентрация антигена
Описание эффективности
Значение эффективности вакцины IPV-IRV-Hib-HBsAg-DaPT
0 день
1-й мес.
2-й мес.
3-й мес.
6-й мес.
9-й мес.
12-й мес.
Полиотип 1<sup>а</sup>
Единица 40 D
Относительная эффективность равна или выше, чем контрольная вакцина
1,4
1,12
1,15
1,3
1,25
1,4
1,2
Полиотип 2<sup>а</sup>
Единица 8 D
Полиотип 3<sup>а</sup>
Единица 32 D
Инактивированная ротавакцина<sup>b</sup>
5 мкг очищенного антигена
Титр нейтрализующих антител
1124
1020
956
1114
1056
1006
1078
Дифтерийный анатоксин адсорбированный<sup>с</sup>
25 LF
NLT 30 единиц на дозу по сравнению с контрольной вакциной
52
48
51
47
44
46
43
Столбнячный анатоксин<sup>с</sup>
7,5 LF
NLT 60 единиц на дозу по сравнению с контрольной вакциной
85
87
89
84
79
75
81
Филаментный гемагглютинин коклюшного анатоксина<sup>a</sup>
25 мкг каждый
Относительная эффективность равна или выше, чем у контрольной вакцины
1,5
1,4
1,5
1,2
1,4
1,15
1,6
Конъюгированный антиген<sup>d</sup> Hib типа b PRP-T
10 мкг
Не меньше, чем 4-кратное увеличение титра антител у вакцинированной группы по сравнению с контрольной группой
8,8
9,0
8,5
8,2
7,5
7,7
7,4
Поверхностный антиген гепатита В
10 мкг
Относительная эффективность равна или выше, чем у контрольной вакцины
1,7
1,9
1,45
1,6
1,40
1,6
1,5
а. Для инактивированной полиовакцины, бесклеточной коклюшной вакцины и вакцины против гепатита значение эффективности исследуемой вакцины сравнивали со стандартной вакциной с помощью относительной единицы. Например, если относительное значение эффективности контрольной вакцины составляло 1, относительное значение эффективности исследуемой вакцины будет меньше, чем 1 или больше, чем 1.b. Для инактивированной ротавирусной вакцины значение эффективности было основано на титре нейтрализующих антител.с. Для вакцины дифтерийного и столбнячного анатоксина значение эффективности зависит от сравнения единиц, полученных от контрольной вакцины, на ED<sub>50</sub>.d. Для конъюгированного антигена Hib типа b PRP-T значение эффективности зависит от числа кратного увеличения антител в вакцинированной группе по сравнению с невакцинированной группой.
Таблица 10
II. Долгосрочная стабильность (5±3°C) комбинированной вакцины DapT
Антиген
Концент-рация антигена
Описание эффективности
Значение эффективности вакцины DapT
0 день
1-й мес.
2-й мес.
3-й мес.
6-й мес.
9-й мес.
12-й мес.
Дифтерийный анатоксин адсорбированный
25 LF
NLT 30 единиц на дозу по сравнению с контрольной вакциной
55
52
48
46
52
56
51
Столбнячный анатоксин
7,5 LF
NLT 60 единиц на дозу по сравнению с контрольной вакциной
85
79
90
78
85
84
82
Филаментный гемагглютинин коклюшного анатоксина
25 мкг каждый
Относительная эффективность равна или выше, чем у контрольной вакцины
1,2
1,12
1,3
1,4
1,5
1,3
1,12
Таблица 11
1. Долгосрочная стабильность (5±3°C) однокомпонентной вакцины Hib
Антиген
Концент-рация антигена
Описание эффективности
Значение эффективности вакцины Hib
0 день
1-й мес.
2-й мес.
3-й мес.
6-й мес.
9-й мес.
12-й мес.
Конъюгированный антиген Hib типа b PRP-TТ
10 мкг
Не менее чем 4-кратное увеличение титра антител в вакцинированной группе по сравнению с контрольной группой
8,5
8,8
7,5
7,2
7,9
8,2
7,4
Таблица 12
2. Долгосрочная стабильность (5±3°C) однокомпонентной вакцины rHBsAg
Антиген
Концент-рация антигена
Описание эффективности
Значение эффективности вакцины rHBsAg
0 день
1-й мес.
2-й мес.
3-й мес.
6-й мес.
9-й мес.
12-й мес.
Поверхностный антиген гепатита В
10 мкг
Относительная эффективность равна или выше, чем у контрольной вакцины
1,4
1,12
1,4
1,5
1,15
1,2
1,4
Таким образом, можно видеть, что значение эффективности семивалентной вакцины равно или выше, чем у однокомпонентной вакцины, которая была протестирована, а также вакцина была стабильна в течение более одного года.