СПОСОБ ВИДОВОЙ ДНК-ДИАГНОСТИКИ НА РАЗНЫХ СТАДИЯХ ЖИЗНЕННОГО ЦИКЛА ГЕЛЬМИНТОВ-ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ЦЕРКАРИАЛЬНОГО ДЕРМАТИТА ЧЕЛОВЕКА

Способ видовой ДНК-диагностики на разных стадиях жизненного цикла гельминтов-возбудителей церкариального дерматита человека, включающий выделение ДНК возбудителя, амплификацию мишени с использованием специфических праймеров, ПЦР и электрофоретическое разделение, отличающийся тем, что генотипирование и видовую дифференциацию возбудителей церкариального дерматита - четырех видов птичьих шистосом из рода Trichobilharzia - кровяных сосальщиков, T.szidati, T.regenti, T.franki и T.sp.var.narochanica проводят путем амплификации участков последовательности ядерной рибосомальной ДНК в образцах половозрелых гельминтов или их личиночных стадий, принадлежащих к четырем видам, и/или на рДНК инфицированных шистосомами пресноводных моллюсков из семейства Lymnaeidae с помощью полимеразной цепной реакции и использованием четырех олигонуклеотидных праймеров, затем разделяют указанные амплифицированные последовательности рДНК с помощью электрофореза с получением образцов видоспецифичного электрофоретического паттерна гельминта, при этом на каждой из выделенных ДНК осуществляют в двух реакциях ПЦР с набором из четырех предлагаемых праймеров, а именно F, R1, R2, R3, где в первой реакции используют праймеры F, R1, R2, во второй реакции - праймеры F, R3, при этом используют биологический маркер, содержащий полиморфную ДНК и характеризующий видовую принадлежность четырех европейских видов птичьих шистосом рода Trichobilharzia, и представляющий собой нуклеотидную последовательность из группы 4 праймеров следующего состава
F: 5'-CTTTCCATCTATCACGATGCACT-3'
R1: 5'-ATGATAATGTGCATAACACACC-3'
R2: 5'-GCCGTTTATTTATATGTATGTG-3'
R3: 5'-CAAGCCGTTTATTWATATATAACGG-3',
2
причем используют набор для диагностики и видовой идентификации возбудителей церкариального дерматита, содержащий биологический маркер, реакционную смесь, состоящую из 60 мМ трис-HCl, 10 мМ сульфата аммония, 0,1% TWEEN 20, по 100 мкМ каждого dNTP, 0,5 мкМ MgCl, 0,9 единиц Taq-полимеразы и эталонные ДНК для каждого вида трихобильгарций - положительный контроль, а полученные амплификационные продукты визуализируют и дифференцируют путем электрофореза в агарозном геле, и после окрашивания гелей бромистым этидием идентифицируют по размеру (длине) выявляемые полиморфные маркеры, где в первой реакции амплификации один фрагмент размером 255 п.н. характерен для вида Т.regenti, один фрагмент длиной 316 п.н. характерен для вида Т.szidati, два фрагмента размером 255 и 316 п.н. характерны для вида Т. Т.narochanica, а во второй реакции аамлификационный фрагмент размером 258 п.н. детектируется только у вида T.franki.