Исследование энергетического метаболизма и кальций-связывающей способности митохондрий миокарда у крыс, адаптированных к хронической нормобарической гипоксии

УДК 615.471:617.7

С. Ю. Цибульников, старший лаборант-исследователь, А. С. Горбунов, мл. науч. сотрудник,

Е. С. Прокудина, студент, ГОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет» Н. В. Нарыжная, канд. мед. наук, ст. науч. сотрудник, Л. Н. Маслов, д-р мед. наук, профессор, ФГБУ «НИИ кардиологии» СО РАМН

Исследование энергетического метаболизма и кальиий-связываюшей способности митохондрий миокарда у крыс, адаптированных к хронической нормобарической гипоксии1

Ключевые слова: пора ППМ, адаптация, ишемия. Key words: МРТ-pore, adaptation, ischemia.

Исследовали параметры дыхания, величину трансмембранного потенциала и кальций-связывающую способность митохондрий после ишемии-реперфузии в миокарде крыс, адаптированных к хронической нормобарической гипоксии. Обнаружено, что воздействие ишемии и репер-фузии приводит к снижению Са2+-связывающей способности митохондрий, указывающей на увеличение чувствительности пор переменной проницаемости митохондрий (ППМ) к кальцию, которая сопровождается ухудшением состояния энергетического метаболизма митохондрий — снижением трансмембранного потенциала и замедлением дыхания. В условиях хронической нормобарической гипоксии воздействие ишемии и реперфузии не приводит к указанным нарушениям.

Введение

Защитный эффект, наблюдаемый при адаптации особей к высокогорью или нормобарической гипоксии, является объектом внимания ученых на протяжении последних 50 лет. Вместе с тем механизмы формирования кардиопротекции при адаптации к хронической гипоксии остаются недостаточно исследованными. Согласно общепринятому мнению, ключевым звеном гипоксической

1 Исследование выполнено при поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации, соглашение

14.B37.21.0175 «Метод и инструментальные средства оценки функционального состояния систем организма».

защиты является перестройка энергетического метаболизма митохондрий [1]. Однако взаимосвязь этих процессов с запуском механизмов клеточной гибели или выживания остается неясной. Известно, что инициирование апоптоза и некроза кардиомиоцитов обусловлено состоянием пор переменной проницаемости митохондрий (ППМ), регулирующих кальциевый гомеостаз этих орга-нелл [2]. В настоящей работе мы сопоставили влияние хронической нормобарической гипоксии на энергетический метаболизм и состояние пор ППМ при острой ишемии и реперфузии у крыс.

Материал и методы исследования

Эксперименты выполнены на крысах-самцах массой 250—300 г линии «Вистар». Животные были произвольно разделены на три группы. Первую группу составляли контрольные животные. Миокард крыс двух экспериментальных групп подвергали ишемии и реперфузии. Животных третьей группы дополнительно адаптировали к хронической нормобарической гипоксии в специальной камере с заданными параметрами воздуха: 12 % O2, 0,03 % CO2 и нормальном атмосферном давлении на протяжении 21 дня [3]. Давление O2 и CO2 внутри гипоксической камеры постоянно поддерживали системой «Био-нова-20404К1» (НТО «Био-нова», Москва) и контролировали датчиками TCOD-IR и OLC 20 (Oldham, Франция) через блок управления MX32 (Oldham, Франция).

Ишемию и реперфузию миокарда моделировали на изолированном перфузируемом сердце. Крыс,

биотехносфера

| № 3-4 (21-22)/2012

114

Конференции, школы и стажировки молодых ученых

наркотизированных диэтиловым эфиром, умерщвляли с помощью цервикальной дислокации. После стернотомии сердца быстро иссекали и помещали в ледяной бикарбонатный буфер Кребса—Хензелай-та. Аорту канюлировали, после чего осуществляли ретроградную перфузию буфером Кребса—Хен-зелайта, содержащим 120 мМ МаС1, 4,8 мМ КС1, 2,0 мМ СаС12, 1,2 мМ МяБ04, 1,2 мМ КН2Р04, 20,0 мМ МаНСОз, 10,0 мМ глюкозы, насыщенным смесью газов: 95 % О2 5 % СО2, при наличии рН 7,4, при постоянном давлении 52 мм рт. ст. и температуре +37 °С. Стабилизационный период оставлял 20 мин, после его окончания нормотерми-ческую глобальную ишемию вызывали с помощью полного прекращения перфузии на 45 мин и последующей 30-минутной реперфузии. Миокард крыс, составлявших группу контрольных животных, подвергался нормотермической перфузии на протяжении 2 ч без моделирования глобальной ишемии.

После окончания реперфузии из ткани желудочков проводили выделение митохондрий методом дифференциального центрифугирования [4, 5]. Для этого фрагменты миокарда массой 0,5—1,0 г гомогенизировали в растворе, содержащем 70 мМ сахарозы, 210 мМ манитола, 1 мМ этиленгликоля те-трауксусной кислоты (ЕСТА), 5 мг/мл бычьего сывороточного альбумина в 10 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфатной кислоты (НЕРЕБ), рН 7,4, центрифугировали при центробежной силе 900 g (ускорение свободного падения g = 9,81 м/с2) 10 мин. Супернатант собирали и митохондрии, содержащиеся в нем, осаждали центрифугированием при 9000g 10 мин. Осадок, содержащий митохондрии, промывали буфером (70 мМ сахарозы, 210 мМ манитола, 0,1 мМ ЕСТА в 10 мМ НЕРЕБ, рН 7,4) и осаждали повторным центрифугированием при 9000g 10 мин. Все процедуры проводили при +2...+4 °С. Содержание белка в суспензии митохондрий определяли методом Бредфорда [6].

Измерение трансмембранного потенциала митохондрий Д^ проводили с использованием ка-тионного флуоресцентного зонда этиловый эфир тетраметилродамина (ТМКЕ, молекулярные зонды) на спектрофлуориметре Shimadzu КЕ-5301-РС (Shimadzu, Япония) при длинах волн возбуждения/ излучения АЕх = 550 нм; АЕт = 575 нм [7] в буфере, содержащем 200 мМ сахарозы, 10 мМ Тпв-НС1, 1 мМ КН2Р04, 10 мкМ ЕСТА, 0,3 мМ пирувата, 0,3 мМ малата, имеющем рН 7,4, при температуре 25 °С. Конечная концентрация ТМКЕ составляла 150 нмоль/л, содержание митохондрий — 1 мг/мл [8]. Выход на нулевые значения Д^ осуществляли добавлением 0,1 мМ карбонилцианид 4-(трифтор-метокси) фенилгидразона (ЕССР). За величину трансмембранного потенциала принимали удельное падение флуоресценции при добавлении ЕССР.

Состояние поры ППМ оценивали по Са2+-свя-зывающей способности митохондрий, которую

определяли с использованием флуоресцентного Са2+-чувствительного зонда Calcium Green-5N (молекулярного зонда) при длинах волн возбуждения/ излучения AEx = 506 нм; AEm = 535 нм [4, 8, 9] на спектрофлюориметре Shimadzu RF-5301-PC. Среда инкубации содержала 200 мМ сахарозы, 10 мМ Tris-HCl, 1 мМ KH2PO4, 10 мкМ EGTA, 0,3 мМ пирувата, 0,3 мМ малата, имела pH 7,4 и температуру 25 °C, объем — 3 мл, концентрация Calcium Gre-en-5N — 100 нМ, митохондрий — 1 мг/мл. К суспензии митохондрий дробно добавляли по 100 нМ СаС12 и регистрировали возрастание свечения Calcium Green-5N, соответствующее добавлению Са2+, и последующее снижение свечения, соответствующее его поглощению Са2+ митохондриями, до тех пор пока не происходили открытие поры ППМ и массированный выход Са2+, детектируемый по значительному возрастанию флюоресценции Calcium Green-5N. Са2+-связывающую способность митохондрий вычисляли по максимальному количеству удерживаемого митохондриями Са2+ в пересчете на 1 мг митохондриального белка [9].

Проводилась оценка параметров дыхания митохондрий по поглощению ими кислорода в закрытой камере с помощью кислородчувствительного клар-ковского электрода и оксиметра «Эконикс-эксперт» (Россия) в среде, содержащей 180 мМ сахарозы, 70 мМ манитола, 5 мМ KH2PO4, 5 мМ MgC12, 10 мМ и имеющей pH 7,37. Измеряли скорость поглощения кислорода в присутствии субстратов (ни-котинамидадениндинуклеотид-зависимых (NADH) малата (3 мМ) и пирувата (3 мМ) ифлавинаденин-динуклеотид-зависимого (FAD) сукцината (5 мМ) без аденозиндифосфата (ADP) (состояние 2), после добавления 200 нМ ADP (состояние 3) и после завершения ресинтеза ATP (состояние 4) [8]. Эффективность дыхания вычислялась по соотношению количества добавленного АДФ к поглощенному в течение состояния 3 кислороду (индекс АДФ/O).

Результаты

Определение Са2+-связывающей способности митохондрий обнаружило значительное (на 16 %, р < 0,05) снижение этого показателя в группе крыс, миокард которых был подвергнут ишемии-репер-фузии по отношению к интактным сердцам (см. рисунок). При этом интегральный показатель энер-гизации — величина трансмембранного потенциала Д^ митохондрий, выделенных после окончания ишемии-реперфузии, — оказался на 20 % ниже, чем в контрольной группе. Исследуемые показатели митохондрий крыс, подвергнутых предварительной адаптации к хронической нормобарической гипоксии, не претерпевали изменений при моделировании ишемии-реперфузии.

Калъций-связывающая способность, нМ/мг

250

200

150

100

50

Ду, у. е. 25

20 15 10

Контроль

Ишемия-реперфузия Адаптация к гипоксии + ишемия-реперфузия

5

0

0

Рис. 1

Влияние адаптации к хронической нормобарической гипоксии на Са2+-связыва-ющую способность и трансмембранный потенциал митохондрий: р^ — уровень достоверности по отношению к первой группе; р2 — по отношению ко второй группе; (серый маркер)— Са2+-связывающая способность; (заштрихованный маркер) — трансмембранный потенциал

Кальций-связывающая способность

В таблице представлены результаты исследования параметров NADH-зависимого и FAD-зависимого дыхания митохондрий в трех группах исследования. Во второй группе животных, миокард которых был подвергнут 45-минутной ишемии и 30-минутной реперфузии, наблюдается статистически достоверное снижение абсолютной скорости NADH-зависимого дыхания в состоянии 3 (V3) по сравнению с таковой у первой групп. У третьей группы животных данный показатель достоверно выше по сравнению со второй.

У второй группы после ишемии-реперфузии наблюдается достоверное снижение показателя ADP/O в случае NADH-зависимого дыхания по сравнению с таковым показателем у первой группы, что говорит о нарушении сопряжения «окисление/фосфо-рилирование». В третьей группе значение ADP/O в присутствие малата и пирувата достоверно выше

по сравнению со второй группой. По показателям абсолютной скорости сукцинат-зависимого дыхания достоверных различий между всеми тремя группами животных обнаружено не было, так же как и при сравнении показателя ЛБР/О.

Проведенные исследования показали, что воздействие ишемии и реперфузии приводит к снижению Са2+-связывающей способности митохондрий, указывающей на увеличение чувствительности пор ППМ к кальцию, которая сопровождается ухудшением состояния энергетического метаболизма митохондрий — снижением трансмембранного потенциала и замедлением дыхания. В условиях хронической нормобарической гипоксии воздействие ишемии и реперфузии не приводит к указанным нарушениям. Мы можем предполагать, что повышение устойчивости пор ППМ к кальцию и влияние на энергетический метаболизм может быть одним из факторов формирования защитного эффекта адаптации к хронической нормобарической гипоксии.

Таблица Параметры дыхания митохондрий при ишемии-реперфузии и адаптации к хронической нормобарической гипоксии

Параметр дыхания Контроль, n = 16 Ишемия-реперфузия, n = 11 Адаптация к гипоксии + ишемия-реперфузия, n = 10

NADH-зависимое дыхание

V2, нМ[0]/мг белка V3, нМ[0]/мг белка V4, нМ[0]/мг белка ADP/O, нМ[АДФ]/нМ[0]

V2, нМ[0]/мг белка V3, нМ[0]/мг белка V4, нМ[0]/мг белка ADP/O, нМ[АДФ]/нМ[0]

64,68 + 4,35 243,96 + 25,95 82,12+ 5,71 2,40 + 0,52

57,18 + 11,51 187,92 + 26,38* 72,35 + 15,78 1,76 + 0,21*

F^D-зависимое дыхание

157,63 + 17,62 377,39 + 30,72 211,95 + 12,13 1,02 + 0,26

147,72 + 15,40 342,07 + 24,87 225,34 + 19,54 1,15 + 0,36

51,54 + 9,67 243,34 + 55,76** 101,32 + 29,53 2,10 + 0,19**

162,68 + 49,96 393,36 + 84,85 195,06 + 16,87 1,01 + 0,26

Достоверность по отношению к Достоверность по отношению к

группе интактных животных (p < 0,05);

группе животных с ишемией-реперфузией (p < 0,05).

I № 3-4 (21-22)/2012

биотехносфера

1. Лукьянова Л. Д. Современные проблемы адаптации к гипоксии. Сигнальные механизмы и их роль в системной регуляции // Пат. физиология и экспериментальная терапия. 2011. № 1. С. 3-19.

2. Halestrap A. P. A pore way to die: the role of mitochondria in reperfusion injury and cardioprotection // Biochem. Soc. Trans. 2010. Vol. 38. P. 841-860.

3. Neckar J., Szarszoi O., Herget J. et al. Cardioprotective effect of chronic hypoxia is blunted by concomitant hypercapnia // Physiol. Res. 2003. Vol. 52. P. 171-175.

4. Argaud L., Gateau-Roesch O., Muntean D. et al. Specific inhibition of the mitochondrial permeability transition prevents lethal reperfusion injury // J. Mol. Cell. Cardiol. 2005. Vol. 38, N 2. P. 367-374.

5. Chen X., Jennings D. B., Medeiros D. M. Impaired cardiac mitochondrial membrane potential and respiration in copper-

deficient rats // J Bioenerg Biomembr. 2002. Vol. 34, N 5. P. 397-406.

6. Bradford M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilized the principle of protein day binding // Anal. Biochem. 1976. Vol. 72. P. 248-254.

7. Scaduto R. C., Grotyohann L. W. Measurement of mito-chondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives // Biophys. J. 1999. Vol. 76. P. 469-477.

8. Singh I. N., Sullivan P. G., Deng Y. et al. Time course of post-traumatic mitochondrial oxidative damage and dysfunction in a mouse model of focal traumatic brain injury: implications for neuroprotective therapy // J. Cereb. Blood. Flow. Metab. 2006. Vol. 26, N 11. P. 1407-1418.

9. Gomez L., Paillard M., Thibault H. et al. Inhibition of GSK3P by postconditioning is required to prevent opening of the mitochondrial permeability transition pore during reperfusion circulation. 2008. Vol. 117. P. 2761-2768.

УДК 615.471:617.7

А. С. Красичков, канд. техн. наук, доцент, Е. Б. Григорьев, студент, А. А. Соколова, аспирант,

ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный электротехнический университет „ЛЭТИ"» А. А. Федоров, инженер,

ФГБОУ ВПО «Петрозаводский государственный университет»

Оценка отношения «сигнал/помеха» при обработке электрокардиосигнала1

Ключевые слова: аппроксимация сигнала, миографическая помеха, электрокардиосигнал. Key words: approximation of a noise-free ECG, myographic noise, electro cardio signal.

Предложен алгоритм оценки отношения «сигнал/помеха», заключающийся в том, что предварительно на выбранном фрагменте мони-торограммы методом наименьших квадратов оценивается кардиосигнал, а затем на основе данной оценки с использованием той же выборки оценивается и отношение «сигнал/помеха» для данного фрагмента.

Неотъемлемым элементом диагностики сердечнососудистой системы человека является метод суточного мониторирования электрокардиосигнала (ЭКС). Если ЭКС снимается в течение продолжительного времени, пациент может как находиться в состоянии покоя, так и выполнять различные физические нагрузки, поэтому длительные мониторограммы чрезвычайно сильно подвержены влиянию часто встречающейся миографической помехи, вызванной

1 Исследование выполнено при поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации, соглашение

14.B37.21.0175 «Метод и инструментальные средства оценки функционального состояния систем организма».

работой скелетных мышц. Современные мониторы являются цифровыми устройствами и имеют полосу пропускания намного больше ширины спектра сигнала, которая должна обеспечить максимальное сохранение формы сигнала. В рамках данной работы будем считать, что отчеты шума являются независимыми случайными величинами с неизменной дисперсией а2 на анализируемом фрагменте. Данное условие справедливо для большинства практических задач анализа непродолжительных фрагментов ЭКС [1].

Наиболее удобным способом анализа длительных записей является сортировка кардиокомплексов каждого вида по соответствующим группам на основе анализа близости форм различных фрагментов кардиосигнала путем вычисления коэффициента взаимной корреляции между опорным (эталонным) сигналом и анализируемым фрагментом [2—4].

В работе [2] было показано, что для корректного использования данного подхода необходимо знать оценку отношения «сигнал/помеха», в качестве которой при цифровой обработке сигнала может быть использован безразмерный параметр