Композиция для получения высококачественных кормов из козлятника восточного и бобово-злаковых травосмесей на его основе
COMPOSITION FOR PRODUCTION OF HIGH-QUALITY FODDER FROM EASTERN GALEGA AND LEGUMINOUS-CEREAL MIXTURES ON ITS BASIS

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к разработке биотехнологической продукции - композиции, которая обеспечивает получение высококачественных объемистых кормов из козлятника восточного и травосмесей на его основе за счет повышения степени использования трудногидролизуемых полимеров консервируемого сырья.
Проблема получения качественных объемистых кормов по энергетической и протеиновой питательности при высокой концентрации в них биологически активных веществ, стоит наиболее остро при уборке многолетних бобовых и бобово-злаковых трав, а также однолетних вико - овсяных травосмесей. Эти травы в настоящее время преобладают в общей системе возделывания кормовых культур, и на ближайшую перспективу ожидается повышение их доли до 79-85%.
В качестве высокобелковой культуры, наряду с традиционными бобовыми травами (люцерна, клевер и др.), в кормопроизводстве начинают использовать козлятник восточный, который широко распространен на всей территории РФ. По мнению специалистов, введение козлятника восточного в систему кормопроизводства может снизить на 45-50% расход концентратов, так как в сухом веществе этой культуры до 40% составляет протеин. Однако, это растение является наиболее сложным для приготовления объемистых кормов по сравнению с другими бобовыми травами, и применение его сдерживается недостатком эффективных технологий консервирования. Козлятник восточный является многолетней высокоурожайной, относительно раннеспелой бобовой культурой, формирующей полноценный растительный белок, в основном, за счет симбиотической фиксации азота воздуха без затрат дорогостоящих азотных удобрений, и тем самым поставляющей экологически чистый растительный белок, или за счет применения удобрений в первые годы выращивания с целью повышения плодородия почвы. Кроме того, козлятник является хорошим предшественником при выращивании сельскохозяйственных культур, что обусловлено высвобождением легкодоступных соединений фосфора, азота, калия и др. при разложении корневых и стеблевых остатков. Эта культура отличается высокой продуктивностью, экологической пластичностью, длительным периодом использования в травостоях - от 8 до 20 лет [1, 2]. При использовании козлятника следует учитывать, что в растениях содержатся антипитательные вещества, в том числе алкалоиды - галегин, гидроксигаленин и др., которые могут влиять на процессы использования этой культуры в кормопроизводстве. Существует противоречивое мнение о пригодности козлятника восточного в целях заготовки объемистых кормов высокого качества для молочного и мясного скота. Одна группа специалистов считает козлятник перспективной бобовой культурой для этих целей, по мнению других, ее следует применять лишь в качестве зеленого корма.
По данным отечественных исследователей, зеленая масса козлятника восточного первого укоса по содержанию основных питательных веществ, переваримости органического вещества и энергетической питательности обладает лучшим качеством в ранние фазы вегетации - стеблевание - начало бутонизации. В эти фазы козлятник представляет собой ценное растительное сырье для производства объемистых кормов не только для высокопродуктивного крупного рогатого скота, но и свиней и птицы, поскольку имеет высокую концентрацию сырого протеина и биологически полноценного белка, содержащего 18 аминокислот, в том числе лизин, метионин, цистин, триптофан и др. Например, по количеству лизина и метионина сырой протеин козлятника лишь незначительно уступает белку куриного яйца, а по содержанию триптофана и цистина превосходит его. Содержание сырого протеина в нем составляет 25-28%, сырой клетчатки 18-22%, концентрация обменной энергии находится на уровне 10,8-11,1 МдЖ ОЭ. Важной технологической особенностью козлятника в указанные фазы вегетации является более высокое содержание в сухом веществе питательных веществ: сахаров - 6,90% и крахмала - 9,70%, что отличает его от люцерны и клевера, а также гемицеллюлоз - 8,60% и самое низкое содержание лигнина - 4,95% - этих соединений в козлятнике восточном обнаружено, соответственно, в 1,5-2,0 раза меньше, чем в люцерне в фазу начало или полной бутонизации, что свидетельствует о его высокой потенциальной энергетической питательности. Кроме того, козлятник содержит от 3% до 5% пектиновых веществ при высоком содержании в них протопектина - 70-75%, а при уровне пектиновых веществ в люцерне и клевере от 7 до 12% в 1 кг сухого вещества, содержание протопектина колеблется в пределах 25,0-37,5%. Поэтому большинство исследователей рекомендует приступать к заготовке высокопротеиновых и энергонасыщенных кормов из козлятника именно в фазу стеблевание - начало бутонизации, поскольку в растениях содержится высокий уровень сырого протеина, а сырой клетчатки - ниже 20%, сбор сухого вещества в этот период обеспечивается на уровне 40% от максимально возможного его сбора в фазу цветения, а для люцерны и клевера лугового этот показатель в аналогичную фазу составляет только 15-18%, в фазу начала бутонизации сбор сухого вещества козлятника восточного может составить до 60%.
Из-за дефицита легкосбраживаемых сахаров, уровень которых, по данным разных исследователей, варьирует от 0,5 до 7,0% и даже может достигать 11%, а также низкого сахаро-буферного отношения (менее 1,0), козлятник восточный во все фазы вегетации представляет собой практически несилосующееся сырье, причем более трудное для консервирования, чем другие бобовые культуры, высокое содержание протеина в которых при значительном дефиците водорастворимых сахаров также затрудняет приготовление доброкачественного силоса. Из-за низкого содержания сахаров (в среднем, 3-4%), ряд исследователей рекомендует: силосовать козлятник восточный с применением химических консервантов при увеличении их дозы внесения в сравнении с рекомендуемой с 5,0 до 6,0 л, или консервировать совместно со злаковыми культурами, или выращивать в смешанных посевах кормовых культур, что в последние десятилетия приобретает все большее значение в кормопроизводстве.
В последние десятилетия для консервирования растительного сырья используют, наряду с уже известными бактериальными заквасками, препараты ферментов и композиционные системы на основе комплекса ферментов и консорциума бактериальных культур [3]. В РФ выпускают более 10 отечественных бактериальных препаратов для консервирования растительного сырья, которые эффективны при силосовании трав с достаточным содержанием водорастворимых сахаров и практически не пригодны при заготовке силоса из несилосующихся культур (люцерна, клевер луговой второго укоса, эспарцет в фазу бутонизации, ежа сборная, козлятник восточный, смесь злаковых трав, содержащих свыше 18% сырого протеина) ввиду дефицита легко сбраживаемых сахаров, необходимых для полноценного заквашивания силосуемой массы.
Принимая во внимание, что высокая энергетическая питательность бобовых культур обусловлена наличием в них глюкозы (свыше 40% по массе), преобладающая часть которой представлена в виде труднопереваримых углеводов - целлюлозы, гемицеллюлоз, пектиновых веществ и др., гидролиз этих соединений до моносахаров возможен под действием соответствующих ферментов. Последующими исследованиями было показано, что более перспективным направлением в консервировании трудно- и несилосующегося сырья является создание полиферменнтных систем целевого назначения, основанных на конструировании препаратов строго сбалансированного состава с учетом биохимических особенностей разных видов трав.
Существует мнение, что ферментные препараты, предназначенные для разрушения некрахмалистых углеводов силосуемого сырья, не затрагивают целлюлозу и лигнин, так как скорость целлюлазных "реакций" мала и целлюлазы требуют для эффективного гидролиза повышенной температуры и большего времени гидролиза. На наш взгляд, это может иметь место лишь при условии обработки кристаллической целлюлозы высокоочищенной целлюлазой. Разрушение целлюлозосодержащего сырья, как известно, осуществляется под действием ферментной мультисистемы карбогидраз с участием эндо - β-глюканазы, целлобиогидролазы и β-глюкозидазы широкого спектра действия, причем количественное соотношение компонентов комплекса в значительной степени влияет на реализацию синергических эффектов и результативность гидролиза, которые должны быть в строго сбалансированном состоянии по уровню и соотношению активностей ферментов. В этом случае скорость реакции будет достаточной для максимально возможного гидролиза целлюлозосодержащих соединений растений с образованием водорастворимых сахаров, участвующих в процессах молочнокислого брожения. Только при таких условиях комплексная ферментная система может осуществлять эффективные биокаталитические процессы обработки сырья, причем рабочая температурная зона действия для ферментов целлюлолитического комплекса промышленных препаратов составляет 30-55°С.
Некоторые исследователи придерживаются мнения, что при силосовании растительного сырья необходимо использовать, в основном, гемицеллюлазы (ксиланазы, арабиназы, ксилоглюканазы и др.), особенно при поздней уборке трав на сенаж, а также амилоглюкозидазы (глюкоамилазы). На наш взгляд, подобные суждения безосновательны, так как без использования комплекса целлюлаз и пектиназ широкого спектра действия процессы разрушения многокомпонентного растительного сырья по определению не могут быть эффективными. Даже частичный гидролиз всех гемицеллюлоз, особенно в ранние фазы вегетации, не восполнит потребность молочнокислых бактерий в источниках питания, а использование глюкоамилазы при разрушении некрахмалистых полисахаридов целлюлозосодержащего сырья считаем не обоснованным, так как этот фермент совместно с амилазой участвует только в процессах гидролиза крахмала и крахмалосодержащих продуктов.
Впервые в отечественной практике был разработан полиферментный препарат Феркон [4], и испытан, в основном, на люцерне, частично на клевере и других культурах, в том числе на козлятнике восточном. Установлено, что в условиях производства силоса из люцерны в фазу бутонизации возможно получить корм, равноценный исходной растительной массе по энергетической питательности (10,4-10,7 МДж ОЭ в 1 кг сухого вещества) и содержанию сырого протеина не менее 20%, и не уступающий по продуктивному действию на животных силосу, полученному при химическом консервировании (АИВ-3 Плюс). Установлено, что при силосовании свежескошенных (78-82%) и слабопровяленных бобовых трав (72-75% влажности), убираемых в неблагоприятную погоду, эффективность препарата снижалась, несмотря на высокую дозу (300 г/т) его внесения. Снижение эффективности может быть связано как с недостатком эпифитных молочнокислых бактерий, так и с избыточно образовавшимися сахарами, наличие которых способствует снижению скорости ферментативной реакции, и при этом сахара используются, наряду с молочнокислыми бактериями, и другими видами эпифитной микрофлоры. В связи с этим, в настоящее время препарат Феркон имеет ограниченное применение, так как разработан в расчете на достаточное содержание в эпифитной микрофлоре силосуемой массы молочнокислых бактерий, определяющих направленность молочнокислого брожения. Дальнейшими исследованиями специалистов ВНИИкормов [5] было показано, что каталитическое действие препарата Феркон возможно повысить при совместном использовании его с консорциумом бактериальных культур, даже при снижении в 2-3 раза дозы его внесения в силосуемую массу.
При разработке способов эффективного использования целевых ферментных систем следует учитывать тот факт, что при высоком содержании некрахмалистых полисахаридов в сырье накопление моносахаров, очевидно, будет происходить лишь до тех пор, пока их концентрация не достигнет величины, при которой начинается инактивирование гидролизующей активности соответствующих ферментов (катаболитная репрессия). В связи с этим, необходима и разработка приемов, утилизирующих избыток образующихся простых сахаров, наиболее правильно эта задача может быть решена именно за счет комбинированного использования ферментов с препаратами бактериальных культур. Известно, что наличие сахаров в растениях является одним из основных условий регулирования микробиологических процессов в силосуемой массе, значительный эффект при этом может достигаться повышением концентрации сухих веществ до 30-40%, а также степенью измельчения растений. Поэтому для таких ценнейших трав, как козлятник восточный, но имеющих недостаток сахаров и высокую буферную емкость сырья, надежный результат получают при сочетании процесса оптимизации влажности сырья с использованием препаратов, улучшающих качество брожения, причем для получения объемистых кормов из козлятника необходимо иметь в силосуемой массе, помимо достаточного уровня сахаров, адекватное количество молочнокислых бактерий в составе силосной микрофлоры.
8
3
Не менее важным фактором для успешного консервирования трав, является содержание молочной кислоты, так как ее доля в сумме органических кислот характеризует интенсивность развития молочнокислого брожения в сравнении с другими видами брожения. Для начала заметного снижения рН численность молочнокислых бактерий в 1 г силосуемой массы должна приблизиться к 1×10 КОЕ/см. Это существенно выше численности природных молочнокислых бактерий, а также больше того количества бактерий, которое попадает в зеленую массу с композицией.
Следует отметить [6], что на растениях козлятника восточного содержится гораздо меньше молочнокислой микрофлоры, чем на клевере, притом общая обсемененность эпифитными микроорганизмами на этих культурах практически одинакова. Кроме того, при провяливании массы клевера наблюдается значительное увеличение обсемененности, как смешанным консорциумом эпифитных микроорганизмов, так и молочнокислой микрофлорой. На козлятнике же, в процессе провяливания происходит увеличение обсемененности микрофлорой, но в очень незначительных количествах по сравнению с клевером. Поэтому, силосование козлятника восточного без специальных добавок, позволяющих регулировать микробиологические и биохимические процессы консервирования, нецелесообразно и ведет к приготовлению кормов, как правило, низкого качества. В связи с этим, создание бинарных композиций (ферменты + бактериальные культуры), на наш взгляд, является правильным подходом к решению проблемы обеспечения надежного получения качественных объемистых кормов. Поэтому комплексные биологические препараты, созданные на основе ферментов и консорциума бактериальных культур, наиболее широко распространены в западноевропейских странах, и, по данным ряда зарубежных и отечественных исследователей, более надежны, чем бактериальные. Все применяемые в нашей стране композиционные биологические препараты - иностранного производства и рекомендуются зарубежными фирмами для консервирования разных видов растительного сырья. Ввиду того, что козлятник восточный практически не культивируется в западноевропейских странах, специальные комплексные препараты для его консервирования до настоящего времени не разработаны, хотя в рекламных материалах, например, фирмы «Биотал» [7], известные ранее препараты для злаковых и бобово-злаковых смесей в последнее время рекомендуются и для многолетних бобовых культур, в том числе козлятника восточного, без коррекции комплекса ферментов.
3
Проведены исследования эффективности полиферментного препарата Феркон и бактериальных заквасок - Биосиб и Лактофид по силосованию свежескошенной массы козлятника [6]. В опытах с использованием препарата Феркон в дозе 100 г/т, но совместно с бактериальной закваской Биосиб (80 см/т), показано, что по сравнению с рекомендуемой (300 г/т) дозой и без использования Биосиба, интенсивность гидролиза сложных углеводов до легкосбраживаемых сахаров оказалась достаточной, чтобы из несилосующегося сырья получить высококлассный силос по всем показателям, еще более выраженный консервирующий эффект отмечен на провяленной массе. Использование же Лактофида оказалось малоэффективным, хотя масса и подкислялась, но из-за дефицита сахаров молочнокислые бактерии не получили достаточного питания, что привело к угнетению их роста, развития и получению некачественного силоса.
В лабораторных, полевых и научно-производственных условиях было изучено влияние композиции (Феркон - 100 г/т + консорциум молочнокислых и пропионовокислых бактерий Биосиб - 80 мл/т) на качество силоса и сенажа козлятника по органолептическим и биохимическим показателям, содержанию основных питательных веществ и их переваримости [3]. Установлено, что композиция обладает высоким консервирующим действием при силосовании козлятника восточного первого и второго укосов, незначительно уступая действию муравьиной кислоты на свежескошенной и провяленной массе, равноценна - на массе с влажностью 60-70%, но превосходит ее по повышению переваримости питательных веществ и энергетической питательности полученного корма, причем наилучший эффект установлен при консервировании козлятника в фазу стеблевание - начало бутонизации, когда в растениях содержится до 27% сырого протеина и 11,2-10,3 Мдж ОЭ в 1 кг СВ, что превышает показатели для люцерны и клевера лугового. Низкое содержание лигнина и сырой клетчатки (4,9 и 21,2%, соответственно) обеспечивает высокую переваримость органического вещества зеленой массы, а энергетическая питательность приближается к зерну злаковых культур. В поздние фазы вегетации (начало и полное цветение) содержание ОЭ в растениях козлятника восточного заметно снижается - 9,2-8,7 МДж, что обусловлено существенным увеличением сырой клетчатки в 1,6-1,7 раза, а также уменьшением ее переваримости, однако, и в эти фазы вегетации применение композиции позволяет повысить энергетическую питательность полученного корма в среднем на 0,4 МДж ОЭ в пересчете на СВ при содержании сырого протеина в пределах 17-19%. Кроме того, установлено относительное уменьшение содержания лигнина, по сравнению с исходной массой, при обработке растений козлятника: в фазу стеблевание - начало бутонизации с 4,9 до 3,8%, а в фазу бутонизации - с 6,3 до 4,9%, на 1 кг СВ - это выявлено при силосовании свежескошенной и слабопровяленной массы, причем, в большей мере, в силосе из свежескошенной массы, на слабопровяленной массе других фаз вегетации интенсивность разложения лигнина заметно снижается, а на глубокопровяленной - процесс прекращается. На основании проведенных исследований рекомендовано для получения качественного корма из козлятника начинать уборку этой культуры на силос в фазе стеблевание - начало бутонизации и заканчивать в фазу бутонизации, причем провяливание массы на силос необходимо вести до влажности 70%, а сенаж допускается готовить при влажности сырья до 72% и благоприятных погодных условиях.
Однако, эффективность композиции значительно снижается при сенажировании пересушенной (влажность 45% и менее) и при силосовании свежескошенной избыточно влажной массы козлятника, содержащей свыше 70% влаги. Кроме того, за период использования композиции при силосовании козлятника с повышенной влажностью сырья (75,99-77,51%) отмечено получение ненадежных результатов, о чем свидетельствуют работы ряда авторов. Из представленных материалов следует, что нестабильность полученных результатов, на наш взгляд, может быть связана также с несовершенством мультисистемы препарата Феркон, вероятно, не в полной мере учитывающей биохимические особенности этой нетрадиционной культуры (пониженное содержание пектиновых веществ при высоком уровне протопектинов в них, высокий уровень сырого протеина, низкое содержание сахаров при высокой буферности, а также недостаточный уровень численности эпифитной молочнокислой микрофлоры по сравнению с традиционными бобовыми культурами). Поэтому, создание новой ферментной мультисистемы в составе композиции для использования в технологии консервирования козлятника с целью производства качественных кормов, является актуальным.
Проведены исследования по изучению влияния различных препаратов на процессы силосования провяленного (до 70% влажности) козлятника восточного: полиферментный препарат Феркон, бактериальный препарат Лактофид, содержащий консорциум молочнокислых бактерий (МКБ) и универсальный биопрепарат - ЖиБиСил, содержащий сообщество молочнокислых бактерий, ферменты и сахара [6]. Установлено, что добавление в силосуемую массу препаратов Феркон или Лактофид способствовало подкислению опытных вариантов силоса до рН 4,3 и 4,6, соответственно, содержание молочной кислоты в варианте с Ферконом (1,01%) оказалось практически в 3 раза больше, чем при применении Лактофида (0,36%). При силосовании козлятника с применением препарата ЖиБиСил в готовом корме образовывалось более 90% молочной кислоты, но при уровне рН 5,5 ед., что значительно превышает величину этого показателя и не соответствует по показателю рН требованиям НТД, даже для силоса 3-го класса величина рН допустима в пределах 3,7 - 4,3. Анализируя эти материалы, следует отметить, что аргументация авторов по поводу эффективного разрушения трудногидролизуемых углеводов козлятника ферментами, содержащимися в препарате ЖиБиСил (инвертаза и катализа), не убедительна, поскольку под действием этих ферментов не могут образовываться сахара, аналогично действию ферментов препарата Феркон.
8
9
Известен способ силосования провяленной массы козлятника восточного [8] с использованием жидкофазного биосредства, получаемого в результате ферментации торфонавозной смеси (50/50) с добавлением древесной золы (3%) в течение 5 суток с последующим экстрагированием полученного продукта. Биосредство содержит сообщество микроорганизмов, в т.ч. молочнокислых бактерий 7×10…2×10 КОЕ/мл, общие сахара, а также биологически активные вещества, в том числе ферменты - каталазу и инвертазу. Показано, что опытные силоса (фаза бутонизации) с использованием биосредства (0,3%) по ряду биохимических показателей и органолептической оценке не уступают силосам, полученным с применением препаратов Феркон + Биосиб, хотя авторы не проводили практических испытаний биосредства и выбранного аналога при консервировании сырья, а сослались на опубликованные в печати данные. Кроме того, при анализе материалов патента вызывает сомнение правомерность сопоставления специфичности действия ферментов, которые в дальнейшем играют ключевую роль в реализации сравниваемых объектов. Такое сравнение, на наш взгляд, является некорректным приемом при оценке существующего изобретения ввиду разных подходов к выбору субстратов биокаталитических процессов. Если ферментная система препарата Феркон гидролизует труднопереваримые углеводы силосуемого сырья не только с целью получения глюкозы и других моносахаров для улучшения процессов силосования, но и для снижения уровня этих углеводов в сырье, повышая тем самым энергетическую питательность кормов, то указанные ферменты в торфонавозной смеси действуют иначе: инвертаза гидролизует только легко ферментируемые углеводы, а каталаза осуществляет распад перекиси водорода на воду и молекулярный кислород, присутствие которого в процессе силосования нежелательно. Поэтому, наличие упомянутых ферментов в торфонавозной смеси не может существенно влиять на процессы силосования. На наш взгляд, биосредство действует на растительное сырье за счет сообщества микроорганизмов, потребляющих присутствующие в торфонавозной смеси сахара для развития молочнокислого брожения, т.е. по типу традиционного использования консорциума бактериальных культур совместно с сахаросодержащими добавками (меласса, патока), а роль инвертазы и каталазы при этом не является существенной и не подтверждена экспериментальными данными. В доступной научно-технической литературе и патентных материалах не обнаружено подтверждения данных использования инвертазы и каталазы для улучшения силосуемости многолетних высокобелковых трав, в том числе козлятника восточного.
Техническая задача состоит в разработке композиции на основе комплекса целевых ферментов и консорциума бактериальных культур, предназначенной для силосования козлятника восточного и бобово-злаковых смесей, обеспечивающей высокий консервирующий и ресурсосберегающий эффект при влажности сырья 50-70% и не более 72%, с целью получения объемистых кормов, не уступающих исходной зеленой массе по энергетической и протеиновой питательности и способствующих повышению продуктивного потенциала с/х животных. Кроме того, бобово-злаковые травосмеси на основе козлятника восточного и определенных злаковых культур имеют большую перспективу использования при консервировании сырья с целью получения объемистых кормов для сельскохозяйственных животных.
При разработке композиции для консервирования козлятника восточного, необходимо учитывать механизм ферментативной деструкции растительных углеводов, с учетом особенности структуры и состава сырья. Как известно, клеточная стенка растений состоит, главным образом, из полисахаридов, структура которых включает в себя целлюлозу, гемицеллюлозы, пекгины, и эти соединения могут быть расщеплены лишь в определенной последовательности, согласно которой пектолитические ферменты разрушают сначала протопектины межклеточных структур и низкометоксилированных соединений для последующего воздействия на гемицеллюлозно - целлюлозные компоненты растительного сырья.
Гидролиз полимеров силоса ферментным комплексом заявляемой композиции на первом этапе приводит к выделению фрагментов полигалактуроновой кислоты из состава протопектина, не затрагивающий при этом структуры целлюлозы и гемицеллюлоз, и в результате действия пектиназ, происходит распад тканей до отдельных клеток, то есть расщепление клеточной стенки. Далее пектиназы, а также ферменты гемицеллазного действия, вызывающие деградацию арабиногалактанов, расщепляют поперечные мостики, соединяющие Д-галактуронаны с гемицеллюлозами (ксилоглюканы), покрывающими микрофибриллы целлюлозы, а гемицеллюлазы делают их доступными действию целлюлолитических ферментов. В растительной клеточной стенке гемицеллюлозы выполняют роль полимера, осуществляющего связь целлюлозы с пектином, на размягчение клеточных стенок также оказывают влияние глюканазы, обуславливающие распад ксилоглюкана. По мнению Бутовой [9], без модификации клеточной стенки пектолитическими ферментами, другие полисахаридрасщепляющие ферменты не способны атаковать соответствующие субстраты, что было подтверждено результатами проведенных исследований. Установлено, что использование мультиэнзимного комплекса на основе ферментов полигалактуроназно-гемицеллюлазно-целлюлазного действия позволяет увеличить выход пектинов из растительного сырья на 25-30%, в сравнении с применением только пектиназы. Это свидетельствует о том, что для результативного гидролиза сложной структуры козлятника восточного, необходим соответствующий полиферментный комплекс.
Как известно, ферментативный гидролиз целлюлозы осуществляется комплексом, в основном, трех типов ферментов: эндо - 1,4 - β - глюканазы, экзо 1,4 - β - глюканазы (экзоцеллобиогидролазы) и целлобиазы, причем, для гидролиза целлюлозы ферментные комплексы должны обязательно содержать достаточный уровень эндо-1,4-β-глюканазы, сорбирующейся на субстрате. Известно, что в волокнах целлюлозы козлятника содержится большее количество аморфных участков, чем у других бобовых культур, которые в первую очередь разрушаются под действием именно эндо-β-глюканазы, вследствие чего становится доступным и большее число молекул целлюлозы, а также образуются новые концы полимерных участков для последующего действия прочно сорбирующихся экзо-1,4-β-глюканаз (экзоцеллобиогидролаз), поэтому повышенное содержание эндоглюканазы обеспечивает увеличение осахаривающей способности ферментного комплекса в целом. Однако, при деструкции целлюлозы участвуют как эндо -, так и экзоглюканазы, где, как правило, присутствует эндофермент с высокой сорбционной способностью, а экзофермент может и не обладать этими свойствами, при этом наблюдается синергизм действия эндо - и экзо - глюканаз. По мнению О. Кислухиной и И. Кюдуласа [10], гидролиз целлюлозы могут осуществлять не только комплексы ферментов, но и индивидуальные высокоактивные эндо-1,4-β-глюканазы, хорошо сорбирующиеся на субстрате и имеющие достаточно высокую осахаривающую способность, которые при расщеплении целлюлозы могут образовывать, наряду с целлодекстринами, значительное количество глюкозы уже на первом этапе гидролиза (больше на 7-9%), что также является основанием для повышения уровня эндо-1,4-β-глюканазы в разрабатываемой новой мультисистеме для козлятника восточного. Кроме того, при гидролизе целлюлозы комплексом ферментов, включающим целлобиазу, ингибирование фермента целлобиозой снимается за счет ее расщепления и образования глюкозы, также являющейся ингибитором процесса, но в меньшей степени. Устранить процесс ингибирования ферментов при силосовании возможно осуществить за счет своевременного потребления образующейся глюкозы бактериальными культурами, то есть за счет комбинированного использования ферментов совместно с препаратами молочнокислых бактерий.
Технический результат заявляемого изобретения заключается в реализации новой композиции, обеспечивающей максимально возможное повышение питательной ценности получаемых консервируемых кормов из козлятника восточного и бобово-злаковых травосмесей на его основе для животноводства в результате создания специфичной для этого вида сырья ферментной мультисистемы в сочетании с консорциумом молочнокислых или молочнокислых и пропионовокислых бактерий в ее составе. Заявленная композиция соответствует биохимическим особенностям растительной массы козлятника за счет оптимизации и сбалансированности уровня контролируемых ферментов до необходимых значений при разрушении, в основном, протопектина и других пектиновых соединений,
8
3
обеспечивающих, и частичное разложение лигнина в козлятнике восточном. Увеличение уровня активности эндо - β - глюканазы позволит повысить эффективность деструкции компонентов целлюлозы и, вследствие этого, обоснованно снизить уровень целлюлазы без снижения качества получаемых кормов. Кроме того, будет обеспечено снижение как стоимости композиции за счет ее усовершенствования, так и затрат, в том числе нормы ввода на ферментативную обработку сырья. Многокомпонентная система ферментов широкой субстратной специфичности и консорциума бактериальных культур, заявляемая в композиции, позволит интенсифицировать процессы комплексного воздействия на различные природные трудногидролизуемые полимеры козлятника восточного, а также бобово-злаковых травосмесей на его основе, и максимально быстро обеспечить их разрушение с образованием не только легкосбраживаемьгх сахаров для нормального протекания молочнокислого брожения, но и для снижения уровня некрахмалистых полисахаридов, препятствующих проникновению ферментов бактерий рубца к целлюлозе. В результате положительного влияния композиции на процессы ферментации массы будет достигнуто также и повышение энергетического потенциала получаемых кормов за счет увеличения переваримости питательных веществ и лучшей их сохранности. При этом, ожидается повышение качества силоса и сенажа по энергетической питательности, не менее чем на 0,4-0,7 ОЭ МДж в 1 кг сухого вещества, по сравнению с их консервированием без использования композиции, при сохранении биологической полноценности сырого протеина. Установлено, что в качестве консорциума бактериальных культур возможно использование препаратов молочнокислых бактерий - Биосиб, Биотроф, Силзак с титром жизнеспособных клеток, не менее, чем 1×10×КОЕ/см.
8
3
Указанный технический результат достигается заявляемой композицией для консервирования козлятника восточного и бобово-злаковых травосмесей на его основе, характеризующейся тем, что она включает консорциум бактериальных культур штаммов молочнокислых или молочнокислых и пропионовокислых бактерий с титром жизнеспособных клеток, не менее 1×10 КОЕ/см и комплекс ферментов гидролитического и лиазного действия, в котором соотношение единиц активности контролируемых ферментов целлюлазы, эндобетаглюканазы, экзоцеллобиогидролазы, эндополигалактуроназы и пектинлиазы составляет 1,0:(2,2-3,3):(5,5-6,6), (0,8-1,3):(4,4-5,5), соответственно.
Рабочая зона действия композиции находится в пределах рН 3,5-6,5 и диапазоне температур - (30-55)°С.
Использование композиции для получения сенажа и силоса из козлятника восточного и травосмесей на его основе позволяет консервировать растительное сырье с массовой долей влаги 50-70%. При заготовке силоса допускается использование сырья с влажностью до 72%. Норма ввода композиции для консервирования козлятника восточного составляет не менее 0,016% по массе, а для травосмесей на его основе эта величина может быть снижена на 10-15% при условии содержания сырого протеина в сухом веществе менее 18%.
Для получения заявляемой композиции используют очищенные базовые концентраты гидролитических и лиазных ферментов, продуцируемых грибными и бактериальными микроорганизмами, и консорциумы бактериальных культур. Источником ферментов являются базовые концентраты, то есть полупродукты культивирования определенных штаммов-продуцентов ферментов в промышленных условиях. Они, наряду с ведущим ферментом, по которому проводят биосинтез, содержат и сопутствующие ферменты, показатели которых при этом не контролируют, а их значения могут колебаться в существенных пределах. Получаемые базовые концентраты исследуют на наличие всех ферментов с целью отбора концентратов с необходимым спектром и уровнем активностей ферментов, проявляющих высокую субстратную специфичность по отношению к трудногидролизуемым компонентам обрабатываемого растительного сырья, что было установлено экспериментально с учетом теории ферментативного катализа. Эти показатели определяют в каждом из базовых концентратов, по действующей НТД, и учитывают полученную характеристику при создании композиции. Минимальный уровень активности каждого из ферментов в базовых концентратах, необходимый для создания композиции с заявляемыми соотношениями ферментов, установлен расчетным путем для достижения сбалансированности состава композиции по активностям и массовым долям каждого из компонентов, причем минимальный уровень единиц активностей ферментов в концентратах составляет, не менее: целлюлазы - 1800 ед/г, эндо-бетаглюканазы - 5000 ед/г, экзоцеллобиогидролазы - 12000 ед/г, пектинлиазы - 90000 ед/г, эндополигалак-туроназы - 10000 ед/г. При этом, активность ферментов в отобранных базовых концентратах может быть в разы выше, но не должна быть ниже заявляемого минимума, а соотношение ферментов в композиции должно быть постоянным.
На основании полученных результатов исследований по разрушению полисахаридов растительного сырья, были установлены: необходимый уровень ведущего фермента целлюлазы - 900 ед/г и обязательные при этом минимальные и максимальные значения активностей и других заявляемых в композиции контролируемых ферментов: эндобетаглюканазы, экзоцеллобиогидролазы, эндополигалактуроназы и пектинлиазы. В формулу изобретения внесены наименьшее и наибольшее значения соотношений активностей соответствующих ферментов, в итоге реализации которых получают практически идентичные результаты. Соотношения активностей целлюлазы и допустимых значений активностей ферментов выражены формулами, введенными в п. 1 ФИ. Например, соотношение активности целлюлазы и эндобетаглюканазы составляет 1,0:(2,2-3,3), то есть минимальное значение активности эндобетаглюканазы = 900 ед/г × 2,2=1980 ед/г, максимальное - 900 ед/г × 3,3=3000 ед/г; минимальное значение активности экзоцеллобиогидролазы = 900 ед/г × 5,5=4950 ед/г, максимальное - 900 ед/г × 6,6=5940 ед/г и т.д. Подобным образом рассчитывают величины и остальных ферментов, которые будут введены в соответствующую нормативно-техническую документацию на заявляемую композицию.
Для получения композиции базовые концентраты ферментов и консорциумы бактериальных культур, а также инертные наполнители вводят в специальный аппарат с учетом их активностей, титров жизнеспособных клеток культур, массовых долей каждого из компонентов и насыпных масс. Технологический процесс получения композиции проводят в течение 1,0-1,5 часов при постоянном перемешивании и комнатной температуре. Изготовленную композицию характеризуют по активностям ферментов, титру жизнеспособных клеток и другим показателям качества в соответствии с нормативно-технической документацией на разработанную продукцию.
Предлагаемая композиция обеспечивает максимально быстрое разрушение трудногидролизуемых углеводов до образования Сахаров, прежде всего, за счет повышения уровня глюкозы, и для успешного заквашивания в силосуемой массе создает необходимую концентрацию легкосбраживаемых Сахаров, ускоряя процессы молочнокислого брожения и способствуя тем самым быстрому подкислению массы в первые 3 суток до рН 3,9-4,3. В результате исследований установлено повышение уровня глюкозы на 8-15%, переваримости компонентов клетчатки на 7-12%, при потерях питательных веществ на уровне 8-10%, и, кроме того, отмечена тенденция уменьшения содержания лигнина в консервированных кормах, а также снижение затрат на получение кормовой продукции. Использование заявляемой композиции обеспечит повышение качества объемистых кормов по энергетической питательности не менее, чем на 0,2 МДж ОЭ в 1 кг сухого вещества, в том числе за счет большей доступности целлюлозно-гемицеллюлозных структур бактериальным ферментам рубца жвачных животных. Установлено, что опытные консервированные корма, полученные с заявляемой биоактивной композицией, не уступают исходной зеленой массе по содержанию сырого протеина и полноценности белка по аминокислотному составу.
Ссылки
1. Ламан, Н.А. Галета восточная - многолетняя высокобелковая кормовая культура [Текст] / Н.А. Ламан, И.М. Прохорова, В.Н. Прохоров, Е.И. Чекель, И.А. Довнар, П.Т. Пикун, Н.В. Фролов, А.Г. Скидан, А.И. Скоринко // Белорусское сельское хозяйство. - 2005. - №12 (44). - С 35-38.
2. Бушуева, В.И. Использование галеги восточной в кормопроизводстве [Текст] / В.И. Бушуева // Аграрная экономика. - 2007. - №2. - С. 36-39.
3. Клименко, В.П. Научное обоснование и разработка эффективных способов повышения энергетической и протеиновой питательности силоса и сенажа из трав [Текст]: дис. … докт. с.-х. наук: 06.02.08: защищена 20.11.2012 / Клименко Владимир Павлович. - Дубровицы, 2012. - 35 с.
4. Пат. №2277345 Российская Федерация, МПК A23K 3/00, A23K 3/03. Полиферментная композиция для консервирования многолетних высокобелковых трав [Текст] / Э.В. Удалова Э.В., Т.М. Рышкова, Г.Б. Бравова, В.А Бондарев, А.А. Панов, М.Б. Никитина, Г.А. Громова, А.А. Анисимов (РФ); заявитель Научно-технический центр «Лекарства и биотехнология», патентообладатель ООО «Восток» №2005109319/13; заявл. 01.04.2005; опубл. 10.06.2006. Бюл. №6. - 16 с.
5. Бондарев, В.А. Перспективные направления исследований по разработке эффективных технологий приготовления высококачественных объемистых кормов [Текст] / В.А. Бондарев, В. П. Клименко //Адаптивное кормопроизводство. - 2010. - №1. - С. 36-42.
6. Васильева, Б.А. Регуляция бродильных процессов при силосовании высокобелковых кормовых трав [Текст] / Е.А. Васильева, Г.Ю. Рабинович, Н.А. Лукичева // Инновационные технологии возделывания сельскохозяйственных культур в Нечерноземье: сб. докл. Всерос. науч. - практ. конференции Владимирского НИИСХ РСХА (2-4 июля 2013 г.). - Суздаль, 2013. - С. 198-203.
7. Рекламные материалы фирмы «Биотал» (Великобритания) URL - (www/ perspective agro. ru/ preparary  torgovoy  marki  biotal. html.).
8. Пат. 2437567 Российская Федерация, МПК A23K 3/00. Способ силосования козлятника восточного [Текст] / Е.А. Васильева, А.Г. Кобзин, Г.Ю. Рабинович, Н.В. Фомичева, Н.Г. Ковалев (РФ); заявитель и патентообладатель ГНУ ВНИИ сельскохозяйственного использования мелиорированных земель РАСХН. - №2010126256/13; заявл. 25.02.2010; опубл. 27.12.2011.
9. Бутова, С.Н. Разработка биотехнологических основ деградации отходов сырья ферментами пектолитического комплекса [Текст]: автор, дисс. … докт. биол. наук: 03.00.16; 03.00.23 / Бутова Светлана Николаевна. - М., 2005. - 45 с.
10. Кислухина, О. Биотехнологические основы переработки растительного сырья [Текст] / О. Кислухина, И. Кюдулас // Каунас: Технология, 1997. - 183 с.