ЭКСПРЕССИЯ ПОЛИПЕПТИДОВ НИТРОГЕНАЗЫ В РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТКАХ

1. Растительная клетка, содержащая экзогенный полинуклеотид, который кодирует полипептид NifD, который: (а) устойчив к расщеплению протеазой на сайте в аминокислотной последовательности, соответствующей аминокислотам 97-100 из SEQ ID NO:18; и/или (b) содержит аминокислотную последовательность, отличную от RRNY (SEQ ID NO:101) в позициях, соответствующих аминокислотам 97-100 из SEQ ID NO:18, где экзогенный полинуклеотид содержит промотор, который функционально связан с нуклеотидной последовательностью, которая кодирует полипептид NifD и которая экспрессирует указанную нуклеотидную последовательность в растительной клетке.
2. Растительная клетка по п. 1, отличающаяся тем, что полипептид NifD представляет собой слитой полипептид, который содержит митохондриальный нацеливающий пептид (MTP), при этом MTP, предпочтительно, трансляционно слит с N-концом полипептида NifD.
3. Растительная клетка по п. 2, отличающаяся тем, что слитой полипептид NifD расщепляется внутри MTP митохондриальной процессинговой протеазой (MPP) с продуцированием MPP-расщепленного продукта, причем MPP-расщепленный продукт, содержит: (i) в своей N-концевой области либо C-концевой пептид из MTP (пептид scar) либо (ii) не содержит C-концевой пептид из MTP.
4. Растительная клетка по п. 3, отличающаяся тем, что MPP-расщепленный продукт, по меньшей мере, частично растворим в митохондриях растительной клетки.
5. Растительная клетка по любому из пп. 1-4, содержащая экзогенный полинуклеотид, кодирующий полипептид NifK (NK), отличающаяся тем, что экзогенный полинуклеотид, кодирующий NK, содержит промотор, который функционально связан с нуклеотидной последовательностью, кодирующей NK, и который экспрессирует указанную нуклеотидную последовательность в растительной клетке, где полипептид NifD (ND) имеет С-конец, а NK имеет N-конец, и где (i) NK представляет собой слитой полипептид NifK, который включает MTP, или (ii) ND и NK трансляционно слитые в виде слитого полипептида NifD-линкер-NifK, который содержит олигопептидный линкер, где олигопептидный линкер трансляционно слит с C-концом ND и N-концом NK.
6. Растительная клетка по п. 5, содержащая экзогенный полинуклеотид, который кодирует слитой полипептид NifD-линкер-NifK, отличающаяся тем, что олигопептидный линкер имеет длину в 8-50 остатков, предпочтительно в 16-50 остатков, более предпочтительно примерно в 26 или примерно в 30 остатков или наиболее предпочтительно в 30 остатков.
7. Растительная клетка по п. 5 или 6, отличающаяся тем, что слитой полипептид NifK или слитой полипептид NifD-линкер-NifK имеет С-концевую аминокислотную последовательность, которая аналогична С-концевой аминокислотной последовательности полипептида NifK дикого типа.
8. Растительная клетка по п. 7, отличающаяся тем, что слитой полипептид NifK или слитой полипептид NifD-линкер-NifK имеет аминокислотную последовательность, в которой последние четыре аминокислоты из последовательности аналогичны последним четырем аминокислотам полипептида NifK дикого типа.
9. Растительная клетка по любому из пп. 5-8, отличающаяся тем, что слитой полипептид NifD-линкер-NifK расщепляется внутри MTP с продуцированием MPP-расщепленного продукта, где MPP-расщепленный продукт слитого полипептида NifD-линкер-NifK, по меньшей мере, частично растворим в митохондриях растительной клетки.
10. Растительная клетка по любому из пп. 1-9, отличающаяся тем, что слитой полипептид NifD или слитой полипептид NifD-линкер-NifK содержит отличную от тирозина (Y) аминокислоту в позиции, соответствующей аминокислоте 100 в SEQ ID NO:18, и предпочтительно содержит глутамин (Q) или лизин (K) в позиции, соответствующей аминокислоте 100 в SEQ ID NO:18.
11. Растительная клетка по любому из пп. 1-10, содержащая экзогенный полинуклеотид, который кодирует слитой полипептид NifH, отличающаяся тем, что экзогенный полинуклеотид, который кодирует слитой полипептид NifH, содержит промотор, который функционально связан с нуклеотидной последовательностью, кодирующей слитой полипептид NifH, и который экспрессирует указанную нуклеотидную последовательность в растительной клетке, где слитой полипептид NifH содержит MTP, предпочтительно, где MTP находится на N-конце слитого полипептида NifH.
12. Растительная клетка по п. 11, отличающаяся тем, что слитой полипептид NifH расщепляется внутри MTP с продуцированием MPP-расщепленного продукта, причем MPP-расщепленный продукт содержит: (i) в своей N-концевой области либо C-концевой пептид из MTP (пептид scar), либо (ii) не содержит C-концевой пептид из MTP.
13. Растительная клетка по п. 12, отличающаяся тем, что MPP-расщепленный продукт слитого полипептида NifH, по меньшей мере, частично растворим в митохондриях растительной клетки.
14. Растительная клетка по любому из пп. 1-13, дополнительно содержащая один или несколько, или все:
(i) экзогенный полинуклеотид, который кодирует полипептид NifV (NV), где экзогенный полинуклеотид содержит промотор, который функционально связан с нуклеотидной последовательностью, кодирующей NV и экспрессирующей указанную нуклеотидную последовательность в растительной клетке, где NV продуцирует гомоцитрат в растительной клетке и где, необязательно, NV содержит MTP.
(ii) экзогенный полинуклеотид, который кодирует полипептид NifM (NM), где экзогенный полинуклеотид, кодирующий NM, содержит промотор, который функционально связан с нуклеотидной последовательностью, кодирующей NM и экспрессирующей указанную нуклеотидную последовательность в растительной клетке, и где, необязательно, NM содержит MTP, и
(iii) экзогенные полинуклеотиды, которые кодируют слитой полипептид NifS (NS) и слитой полипептид NifU (NU), где каждый экзогенный полинуклеотид содержит промотор, который функционально связан с нуклеотидной последовательностью, которая кодирует один из слитых полипептидов Nif и которая экспрессирует нуклеотидную последовательность в растительной клетке, и где каждый из NS и NU содержит MTP.
15. Растительная клетка по п. 14, отличающаяся тем, что один или несколько или все NV, NM, NS и NU расщепляются внутри MTP с независимым продуцированием MPP-расщепленного продукта, причем MPP-расщепленный продукт в каждом случае, содержит: (i) в своей N-концевой области либо C-концевой пептид из MTP (пептид scar), либо (ii) не содержит C-концевой пептид из MTP.
16. Растительная клетка по любому из пп. 1-15, содержащая экзогенные полинуклеотиды, которые кодируют, по меньшей мере, 8 или, по меньшей мере, 9 слитых полипептидов Nif, отличающаяся тем, что каждый экзогенный полинуклеотид содержит промотор, который функционально связан с нуклеотидной последовательностью, которая кодирует один из слитых полипептидов Nif, и которая экспрессируют нуклеотидную последовательность в растительной клетке, в которой каждый слитой полипептид Nif независимо содержит MTP, при этом слитые полипептиды Nif содержат: (i) слитые полипептиды NifH, NifB, NifF, NifJ, NifS, NifU и NifV; и (ii) либо слитой полипептид NifD и слитой полипептид NifK; или (iii) слитой полипептид NifD-линкер-NifK, который содержит: последовательность NifD, имеющую С-конец; олигопептидный линкер; и последовательность NifK, имеющую N-конец; при этом олигопептидный линкер трансляционно слит с С-концом последовательности NifD и N-концом последовательности NifK; при этом MPP-расщепленные продукты, по меньшей мере, слитых полипептидов NifH, NifF, NifS и NifU каждый, по меньшей мере, частично растворим в митохондриях растительной клетки; при этом MPP-расщепленные продукты слитых полипептидов NifD и NifK из (ii), если они присутствуют в растительной клетке, по меньшей мере частично растворимы в митохондриях растительной клетки, или MPP-расщепленный продукт слитого полипептида NifD-линкер-NifK из (iii), если он присутствует в растительной клетке, по меньшей мере частично растворим в митохондриях растительной клетки, и при этом слитой полипептид NifV и/или его MPP-расщепленный продукт продуцирует гомоцитрат в растительной клетке и, по меньшей мере, частично растворим в митохондриях растительной клетки.
17. Растительная клетка по любому из пп. 2-16, отличающаяся тем, что каждый MTP независимо расщепляется в растительной клетке с эффективностью, составляющей, по меньшей мере, 50%, и/или где каждый MPP-расщепленный продукт независимо присутствует в растительной клетке на более высоком уровне, чем соответствующий нерасщепленный слитой полипептид Nif, предпочтительно в соотношении, составляющем более чем 1:1, более чем 2:1 или более чем 3:1.
18. Растительная клетка по любому из пп. 2-17, отличающаяся тем, что каждый слитой полипептид Nif, по меньшей мере, частично расщеплен в своей последовательности MTP в растительной клетке с независимым продуцированием MPP-расщепленного продукта, причем каждый MPP-расщепленный продукт, содержит пептид (пептид scar) длиной от 1 до 45 аминокислот, предпочтительно от 1 до 20 аминокислот, более предпочтительно от 1 до 11 аминокислот или от 11 до 20 аминокислот, полученных из последовательности MTP, где пептид scar трансляционно слит в N-концевой области MPP-расщепленного продукта.
19. Растительная клетка по любому из пп. 11-18, отличающаяся тем, что экзогенные полинуклеотиды кодируют: (i) слитой полипептид NifH, который представляет собой слитой полипептид AnfH; и либо (ii) слитой полипептид NifD, который представляет собой слитой полипептид AnfD и слитой полипептид NifK, который представляет собой слитой полипептид AnfK; или (iii) слитой полипептид NifD-линкер-NifK, который представляет собой слитой полипептид AnfD-линкер-AnfK; причем растительная клетка дополнительно содержит (iv) экзогенный полинуклеотид, который кодирует слитой полипептид AnfG, который содержит MTP, где экзогенный полинуклеотид, который кодирует слитой полипептид AnfG, содержит промотор, который функционально связан с нуклеотидной последовательностью, кодирующей слитой полипептид AnfG и которая экспрессирует указанную нуклеотидную последовательность в растительной клетке, и где MPP-расщепленный продукт слитого полипептида AnfG, по меньшей мере, частично растворим в митохондриях растительной клетки.
20. Растительная клетка по любому из пп. 1-19, отличающаяся тем, что один или несколько или предпочтительно все экзогенные полинуклеотиды интегрированы в ядерный геном растительной клетки и/или экспрессируются в ядре растительной клетки.
21. Растение или его часть, содержащие растительную клетку по любому из пп. 1-20, или которые являются трансгенными в отношении экзогенных полинуклеотидов, кодирующих слитые полипептиды Nif, определенные в любом из пп. 1-20.
22. Растение или его часть по п. 21, которая представляет собой злаковое растение, предпочтительно, пшеницу, рис, кукурузу, тритикале, овес, ячмень или их часть.
23. Слитой полипептид NifD, содержащий митохондриальный нацеливающий пептид (MTP), трансляционно слитой с полипептидом NifD (ND), или его расщепленный продукт, который содержит ND, где слитой полипептид NifD или его расщепленный продукт: (а) устойчив к расщеплению протеазой на сайте в аминокислотной последовательности, соответствующей аминокислотам 97-100 из SEQ ID NO:18; и/или (b) содержит аминокислотную последовательность, отличную от RRNY (SEQ ID NO:101) в позициях, соответствующих аминокислотам 97-100 из SEQ ID NO:18.
24. Слитой полипептид NifD или расщепленный продукт по п. 23, содержащий отличную от тирозина (Y) аминокислоту в позиции, соответствующей аминокислоте 100 из SEQ ID NO:18, предпочтительно содержащий глутамин (Q) или лизин (K) в позиции, соответствующей аминокислоте 100 в SEQ ID NO:18.
25. Слитой полипептид NifD или расщепленный продукт по п. 23 или 24, который содержит олигопептидный линкер и полипептид NifK (NK), которые трансляционно слиты с ND в качестве слитого полипептида NifD-линкер-NifK, отличающийся тем, что ND содержит С-конец, а NK содержит N-конец, где олигопептидный линкер трансляционно слит с C-концом ND и N-концом NK.
26. Расщепленный продукт слитого полипептида NifD по п. 25, отличающийся тем, что расщепленный продукт содержит ND, олигопептидный линкер и NK, где олигопептидный линкер трансляционно слит с C-концом ND и N-концом NK.
27. Слитой полипептид NifD или его расщепленный продукт по любому из пп. 23-25, или расщепленный продукт по п. 26, который, по меньшей мере, частично растворим в митохондриях растительной клетки, когда слитой полипептид NifD продуцируется в растительной клетке.
28. Слитой полипептид NifD или его расщепленный продукт по любому из пп. 23-25 или 27, или расщепленный продукт по п. 26, который находится в растительной клетке, предпочтительно в митохондриях растительной клетки.
29. Слитой полипептид NifD или его расщепленный продукт по п. 24 или 25, или расщепленный продукт по любому из пп. 26-28, отличающийся тем, что слитой полипептид NifD представляет собой слитой полипептид AnfD, NK представляет собой полипептид AnfK, а слитой полипептид NifD- линкер-NifK представляет собой слитой полипептид AnfD-линкер-AnfK.
30. Комбинация по п. 23 или 24 (i) слитого полипептида NifD или его расщепленного продукта и (ii) слитого полипептида NifK, которая содержит MTP, трансляционно слитую с полипептидом NifK (NK), или его MPP-расщепленный продукт, отличающаяся тем, что слитой полипептид NifK или его MPP-расщепленный продукт, по меньшей мере, частично растворимы в митохондриях растительной клетки, когда слитой полипептид NifK или его MPP-расщепленный продукт продуцируется в растительной клетке.
31. Слитой полипептид или его расщепленный продукт по любому из пп. 23-29, или комбинация по п. 30, отличающиеся тем, что полипептид NifK имеет С-концевую аминокислотную последовательность, которая аналогична С-концевой аминокислотной последовательности полипептида NifK дикого типа.
32. Комбинация по п. 30 или 31, дополнительно содержащая слитой полипептид NifH, содержащий MTP, трансляционно слитой с полипептидом NifH (NH), или его расщепленный продукт, содержащий NH, отличающаяся тем, что слитой полипептид NifH и/или его расщепленный продукт, по меньшей мере, частично растворимы в митохондриях растительной клетки.
33. Комбинация по любому из пп. 30-32, отличающаяся тем, что ND представляет собой полипептид AnfD, NK представляет собой полипептид AnfK, а NH представляет собой полипептид AnfH.
34. Полинуклеотид, кодирующий полипептид, по любому из пп. 23-25, 27 или 28, или комбинация по любому из пп. 30-33.
35. Полинуклеотид по п. 34, отличающийся тем, что одна или несколько или все полипептид-кодирующие области полинуклеотида, были кодон-модифицированы для экспрессии в растительной клетке, по сравнению с соответствующей полипептид-кодирующей областью кодирования природного полинуклеотида в бактерии.
36. Полинуклеотид по п. 34 или 35, дополнительно содержащий промотор, функционально связанный с полинуклеотидом, кодирующим каждый полипептид.
37. Полинуклеотид по любому из пп. 34-36, который присутствует в растительной клетке, дрожжевой клетке или бактериальной клетке.
38. Полинуклеотид по п. 37, который интегрирован в ядерный геном растительной клетки и/или экспрессирован в ядро растительной клетки.
39. Вектор, содержащий полинуклеотид по любому из пп. 34-38.
40. Вектор по п. 39, содержащий: полинуклеотиды, которые кодируют, по меньшей мере, 3, по меньшей мере, 4 или, по меньшей мере, 5 слитых полипептидов Nif, предпочтительно слитых полипептидов Nif, как определено в любом из предыдущих пунктов.
41. Вектор по п. 40, который содержит полинуклеотиды, кодирующие:
а) слитой полипептид NifD и слитой полипептид NifK или слитой полипептид NifD-линкер-NifK; и
b) слитой полипептид NifH и слитой полипептид NifV; и,
c) необязательно, слитой полипептид AnfG.
42. Вектор по п. 40 или 41, который содержит полинуклеотиды, кодирующие:
а) слитые полипептиды NifF, NifJ, NifU и NifB и, необязательно, слитой полипептид NifS; и/или
b) один или несколько или все слитые полипептиды NifW, NifX, NifY и NifZ.
43. Применение полинуклеотида по любому из пп. 34-38 и/или вектора по любому из пп. 39-42 для продуцирования трансгенной растительной клетки.
44. Способ продуцирования трансгенного растения, способ, включающий стадии:
i) введения одного или нескольких полинуклеотидов по любому из пп. 34-38 и/или одного или нескольких векторов по любому из пп. 39-42 в растительную клетку;
ii) регенерацию трансгенного растения по п. 21 или 22 из клетки стадии i); и
iii) продуцирование, необязательно, трансгенных семян и/или растений-потомков из трансгенного растения, регенерированного на стадии ii).
45. Способ получения трансгенного семени, включающий:
i) сбор семян трансгенного растения по п. 21 или 22, и/или
ii) сбор семян от одного или нескольких трансгенных растений-потомков, полученных способом по п. 44.
46. Часть растения по п. 21 или 22, которое представляет собой семя.
47. Способ производства муки, муки крупного помола, крахмала, масла, кормовой муки из семян или другого продукта, полученного из семян, при этом способ включает: экстрагирование муки, муки крупного помола, крахмала, масла или другого продукта или получение кормовой муки из семян по п. 46.
48. Продукт, полученный из трансгенного растения или его части по п. 21 или 22 и/или семян по п. 46, отличающийся тем, что продукт содержит полипептид или MPP-расщепленный продукт, по любому из пп. 23-29 и/или полинуклеотид по любому из пп. 34-38.
49. Способ приготовления пищевого продукта, способ, включающий: смешивание семян по п. 46 или муки, муки грубого помола, крахмала, масла или другого продукта из семян с другим пищевым ингредиентом.
50. Способ кормления животного, включающий предоставление животному растения или его части по п. 21 или 22, семян по п. 46 или продукта по п. 48.