Подавление рекомбинантным альфа-2-интерфероном репродукции вируса карельской лихорадки в клетках крови человека

щую активность. ТИ-комплексы, являясь носителем и адъювантом для этих АГ, обеспечивают усиление специфического иммунного ответа гуморального типа. Встраивание ЭХА в тИ-комплексы приводит к повышению их иммуноадъювантного потенциала путем активации гуморального звена иммунного ответа. При этом ЭХА не проявляет собственную иммуноадъювантную активность в отношении АГ вируса гриппа.

Результаты работы подтверждают возможность использования тИ-комплексов как носителя и адъюванта для комплекса АГ вакцинного препарата Инфлю-вак, содержащего субъединичные АГ вируса гриппа. Логическим развитием полученных в данной работе результатов будет проведение дальнейших экспериментов, посвященных возможности построения на основе тИ-комплексов вакцинных препаратов, содержащих индивидуальный гриппоспецифический ГА и его отдельные эпитопы.

Работа поддержана грантом Правительства РФ (ГК № 11.G34.31.001) и грантом аналитической ведомственной целевой программы “Развитие научного потенциала высшей школы” (2009-2010 гг.) по проекту № 2.2.2/603.

ЛИТЕРАТУРА

1. Авилов С. А., Стоник В. А., Калиновский А. И. Строение четырех новых тритерпеновых гликозидов из голотурии Cucumaria japoni-ca // Химия природных соединений. - 1990. - № 6. - С. 787-792.

2. Кривошапко О. Н., Попов А. М., Артюков А. А. Применение биоантиоксидантов при нарушениях липидного и углеводного обмена // Здоровье. Медицинская экология. Наука. - 2009. - № 4-5. - С. 85-88.

3. Ли И. А., Попов А. М., Цибульский А. В. и др. Иммуностимулирующие свойства липид-гликозидного носителя антигена на основе кукумариозида А2-2 и моногалактозилдиацилглицерола из морских водорослей // Прикладная биохимия и микробиол. -2008. - Т. 44. - С. 694-700.

4. Цибульский А. В., Санина Н. М., Ли И. А. и др. Разработка нового адьювантного липид-сапонинового комплекса и его применение при экспериментальной иммунизации бактериальным антигеном // Биомед. химия. - 2007. - Т. 53. - С. 297-306.

5. IosefC., Van Nguyen T., Jeong K. et al. Systemic and intestinal antibody secreting cell responses and protection in gnotobiotic pigs immunized orally with attenuated Wa human rotavirus and Wa 2/6-ro-tavirus-like-particles associated with immunostimulating complexes // Vaccine. - 2002. - Vol. 20. - P. 1741-1753.

6. Kersten G. F. A., Crommelin D. J. A. Liposomes and ISCOMS as vaccine formulations // Biochim. Biophys. Acta. - 1995. - Vol. 1241. - P. 117-138.

7. Lebedev A. V, IvanovaM. V, LevitskyD. O. Echinochrome, a naturally occurring iron chelator and free radical scavenger in artificial and natural membrane systems // Life Sci. - 2005. - Vol. 76. - P. 863-875.

Поступила 21.06.11

© Т. М. СОКОЛОВА, А. Н. ШУВАЛОВ, 2012 УДК 615.373:578.245].03:616.98:578.833.1].036.8

Т. М. Соколова12, А. Н. Шувалов2

Подавление рекомбинантным альфа-2-интерфероном репродукции вируса карельской лихорадки в клетках

крови человека

'ФГБУ НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского Минздравсоцразвития России, 2ФГБУ НИИ эпидемиологии и микробиологии

им. Н. Ф. Гамалеи Минздравсоцразвития России, Москва

Впервые показана активная репликация вируса карельской лихорадки (ВКЛ) в клетках крови человека и профилактическое защитное действие отечественного препарата реаферон. ВКЛ обладал высокой чувствительностью к альфа-иФн. В контрольных (незараженных клетках) реаферон вызывал низкие уровни экспрессии генов иФн-зависимых ферментов дсРнК-зависимой протеинкиназы (дсПК) и 2’5’-олигоаденилатсинтетазы (ОАС), мало влияя на активность генов своего семейства. ВКЛ подавлял индуцированную реафероном экспрессию генов иФн-зависимых ферментов, но в обработанных реафероном зараженных клетках транскрипция генов альфа-иФн возрастала.

Ключевые слова: вирус карельской лихорадки, реаферон, клетки крови человека

Recombinant interferon-a suppression of Karelian fever virus replication in human

blood cells

T. M. Sokolova12, A. N. Shuvalov2

1D. I. Ivanovsky Research Institute of Virology, Ministry of Health and Social Development of Russia; 2N. F. Gamaleya Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Ministry of Health and Social Development of Russia, Moscow

The active replication of Karelian fever virus (KFV) in human blood vessels and the protective activity of the Russian agent reaferon were first shown. KFL was highly susceptible to interferon (iFN)-a. in control (uninfected) cells, reaferon caused low gene expressions of the iFN-dependent enzymes dsRNA-dependent protein kinase and 2’5’-oligoadenylate synthetase, by exerting a little effect on the activity of its family genes. KFV suppressed the reaferon-induced gene expression of iFN-dependent enzymes, but iFN-a gene transcription was increased in the reaferon-treated infected cells.

Key words: Karelian fever virus, reaferon, human blood cells

Контактная информация:

Соколова Татьяна Михайловна, д-р биол. наук, вед. науч. сотр.; e-mail:tmsokolovavir@mail.ru

27

Отечественный рекомбинантный альфа-2-интер-ферон (реаферон) является доступным антивирусным препаратом [1]. В настоящее время на его основе российские фирмы производят различные фармацевтические средства (виферона свечи и мазь, альфарон для в/м-инъекций, реаферон ЕС-липинт для перорального применения, герпферон и гиаферон). Препараты реаферона имеют широкое применение в лечении герпесвирусных инфекций, гепатитов В и С, гриппа и ряда респираторных заболеваний.

Направленные исследования действия реаферона на альфа-вирусную инфекцию в клетках крови человека не проводили. Механизмы регуляции системы ИФН альфа-вирусами остаются во многом неизвестными [13]. В организме экспериментальных животных препараты ИФН снижают тяжесть альфа-вирусной инфекции, вызванной вирулентными штаммами вируса Синдбис и западного энцефаломиелита лошадей (ЗЭЛ) [7]. Получены положительные результаты лечения больных гепатитом C и раком усовершенствованными препаратами альфа-ИФН пегасис (оказывает длительное действие) и альфакон (консенсус нескольких видов альфа-ИФН) [14].

На территории России имеются сезонные очаги альфа-вирусной инфекции Синдбис [3]. Вирусы выделяются в Карелии, Прибалтике, Астраханской области, на Алтае, в татарии и др. Эпидемические вспышки заболеваемости наблюдаются в Скандинавских странах (Швеция, Норвегия, Финляндия) и Китае [16, 17]. Миграция птиц с Африканского на Европейский континент, а также внутри Азиатского континента приводит к широкому распространению геовариантов вирусов Синдбис. Подъем заболеваемости во многом связан с ростом численности комаров в местах гнездования птиц. Лихорадка Синдбис протекает как гриппоподобное заболевание с сыпью и поражением суставов (частое осложнение - полиартриты). Диагноз ставят по клинической картине и появлению антител к вирусу Синдбис. Отечественные тест-системы ОТ-ПЦР на вирусы серокомплекса Синдбис-ЗЭЛ в нашей стране не производятся.

Вирус карельской лихорадки (ВКЛ) выделен из пула комаров Aedes communis [2]. Вирус изучен нами по генному и антигенному составу [4, 8, 10]. Предпринимались единичные попытки зарубежных исследователей обнаружить генетический материал ВКЛ в пробах крови больных методом От-ПЦР. РНК вируса лучше выявлялась в материале везикулярной сыпи больных, чем в пробах крови [15].

Перед нами стояли задачи: 1) показать репродукцию ВКЛ в клетках крови человека и определить уровни накопления в них инфекционного и генетического материала вируса; 2) оценить профилактический защитный эффект препарата реаферон при Синдбис-вирусной инфекции; 3) связать антивирусное действие препарата с транскрипционной активностью ИФН-зависимых генов.

Были взяты образцы венозной крови 8 здоровых доноров. В культивируемых клетках крови каждого донора в динамике инфекции тестировали продукцию внеклеточного инфекционного вируса и содержание внутриклеточной вирусной РНК. Использовали методы биологического титрования и количественной От-ПЦР в реальном времени. Анализировали действие реаферона на экспрессию трех ключевых генов систе-

мы ИФН-альфа-ИФН, двуспиральной РНК-зависимой (дсРНК-зависимой) протеинкиназы (дсПК) и 2’,5’-олигоаденилатсинтетазы (ОАС) на фоне вирусной инфекции и в незараженных клетках.

Материалы и методы

Пробы венозной крови получены на станции переливания крови. В группе доноров были 3 женщины и 5 мужчин разного возраста (от 18 до 49 лет). Кровь доноров в количестве 1 мл разводили в питательной среде RPMI 1640 с глутамином, антибиотиками и 10% сыворотки телят в соотношении 1:5. Суспензионные культуры инкубировали в объеме 5 мл в микропробирках. Через 24 и 48 ч отбирали аликвоты (0,4 мл) для исследования инфекционного вируса и через 5, 24 и 48 ч - вирусных и клеточных РНК. Препарат реаферон (аптечный, ампула 1 000 000 МЕ) разводили в 10 мл среды и добавляли в дозе 1000 ед/мл к суспензии клеток крови. Для заражения использовали вирус, полученный в клеточной культуре куриных фибробластов, с инфекционным титром 8 lg/мл. Количество вносимого вируса составило 0,1 мл на 5 мл суспензии клеток крови в питательной среде. Через 5 ч клетки крови отмывали от внесенного вируса и продолжали культивирование 24 и 48 ч. Инфекционный титр вируса, секретируемый клетками крови, определяли микрометодом по цитопатогенному действию (ЦПД) на клетки. Вируссодержащую надосадочную жидкость, полученную после осаждения клеток крови при 1500 об/мин, 10 мин, разводили (готовили 10-кратные разведения образцов в среде 199 с 2% сыворотки коров и антибиотиками) и добавляли на монослой клеток Vero (ФГУ НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского). Результат ЦПД вируса учитывали в световом микроскопе через 72 ч. Поставлено 3 варианта опытов: 1) динамика накопления ВКЛ; 2) профилактическое действие реаферона на вирусную инфекцию; 3) влияние реаферона и вируса на экспрессию ИФН-зависимых генов в зараженных и контрольных (незараженных) клетках крови.

Вирусные и клеточные РНК-транскрипты определяли количественным методом От-ПЦР на приборе CFX-96 фирмы “Bio-Rad” (США). Пороговые циклы (Cq) логарифмической фазы синтеза регистрировали в реальном времени по накоплению сигнала флюоресцентного, интеркалирующего в ДНК красителя EvaGreen. Специфичность полученных ДНК-продуктов оценивали по температурам пиков плавления (программа Date analysis CFX-96) и размерам ДНК-амплификатов (электрофорез в агарозном геле). Уровни мРНК в исследуемых пробах сравнивали по Cq. Рассчитывали изменения (ACq) в контроле и опыте по формуле 2 в степени ACq. Калибратором являлась одна из проб суммарной кДНК в разведениях. По калибровочной кривой оценивали эффективность (Е) амплификации кДНК с парами праймеров. Е колебалась от 90 до 100%, что считается допустимым в сравнительном анализе.

РНК выделяли из клеток крови реагентом Trizol (“Invitrogen”) по прилагаемой инструкции. Суммарную кДНК получали в реакции От на поли(А)РНК с праймером олиго(дТ)15. Для количественной ПЦР в реальном времени использовали аликвоты кДНК и ее разведения 1/2 и 1/10. Смешивали пары праймеров, кДНК и готовую смесь EvaGreen Supermix (“Bio-

28

а

71 Г77"

е - -

а

Доноры

ВКЛ 24ч ЕЭ ВКЛ 48ч

б

Амплификация

Рис. 1. Репродукция ВКЛ в клетках крови человека.

Продукция инфекционного вируса через 24 и 48 ч в lg ЦПД (а) и амплификация вирусной РНК с праймерами гена Е1 (б) в количественной ПЦР. По оси абсцисс (а) - номера доноров крови.

Rad”). Структура использованных в работе праймеров на РНК ВКЛ (участки генов С, Е2 и Е1 (структурные белки), консервативные праймеры на мРНК альфа-ИФН (подвиды 4, 7, 8 и 21) и мРНК ферментов ОАС1 и дсПК приведены в опубликованных ранее работах [6-9].

Результаты

Инфекционные титры накопления ВКЛ через 24 и 48 ч культивирования клеток крови 8 доноров представлены на рис. 1, а. Индивидуальные показатели широко варьировали от 1 до 7 lg. У 5 доноров прирост вируса продолжался до 48 ч, но у 2 человек после 24 ч, наоборот, происходило снижение. По данным количественной ОТ-ПЦР (см. рис. 1, б), в клетках крови 8 доноров происходило быстрое накопление вирусных РНК. Синтез вирусных РНК оценивали по 3 участкам генов С, Е2 и Е1. Выявляемость с праймерами Е1 была наилучшей. На рисунке приведены кривые амплификации с праймерами к участку гена Е1 через 24 ч. Наблюдалась положительная корреляция между количеством внеклеточного вируса и внутриклеточным синтезом вирусных РНК. Исключением оказалась донор 2 (молодая женщина), у которой был высокий инфекционный титр ВКЛ 6 lg, но низкий пороговый

Доноры

И ВКЛ Ц ИФН+ВКЛ

Температура плавления 85° С

Рис. 2. Подавление реафероном репродукции ВКЛ. Продукция инфекционного вируса (а) через 24 ч в клетках крови, не обработанных реафероном (светлые столбики) и предобработанных реафероном (темные столбики). По оси абсцисс - номера доноров крови. Пики плавления (б) ДНК-амплификатов гена Е1 в конечной точке количественной ПЦР. Клетки крови, обработанные реафероном за 24 ч до заражения ВКЛ (1), и необработанные (2). Высота пиков характеризует уровень накопления вирусных РНК через 48 ч.

цикл амплификации РНК (кривая обозначена * на рис. 1, б).

Реаферон в дозе 1000 ед/мл эффективно подавлял репродукцию вируса и синтез вирусных РНК во всех пробах (рис. 2, а, б). Время инкубации клеток крови с ИФН до заражения составляло 24 ч. За это время в клетках крови развивалось антивирусное состояние. Защитный эффект ИФН в отношении инфекционного вируса варьировал от 2 до 5 lg ТЦД50/мл. Уровни снижения вирусных РНК составляли от 0,92 до 6,87 ACq. Ингибирующее действие реаферона на инфекционный вирус и вирусные РНК у большей части доноров хорошо коррелировало. ДНК-амплификаты гена Е1 ВКЛ были гомогенными по температуре плавления (см. рис. 2, б) и имели расчетный размер 506 п. н. по данным электрофореза (не приводятся). Количество специфического продукта в конечной точке (40-й цикл амплификации) прямо зависело от значения Cq. ПЦР-анализ вирусных РНК по другим участкам генома ВКЛ (С-Е2) подтвердил описанную выше динамику размножения ВКЛ в клетках крови человека.

29

Таблица 1

а

Влияние реаферона на конститутивные уровни экспрессии генов альфа-ИФН и ИФН-зависимых ферментов в пробах крови человека

Пики плавления

Доноры, № и возраст, годы

Пороговые циклы экспрессии генов Cq

альфа-ИФН

дсПК

ОАС

1 - Женщина, 43 22,50

2 - Женщина, 27 23,63 (21,65)Т 34,06 (32,32)Т 34,73 (32,75)Т

3 - Женщина, 31 22,74

4 - Мужчина, 49 20,14

5 - Мужчина, 18 22,09 (23,04) 35,72 (31,03)Т 35,69 (33,77)Т

6 - Мужчина, 26 21,21

7 - Мужчина, 23 20,98 (21,66) 35,07 (27,31)Т 35,41 (30,68)Т

8 - Мужчина, 20 20,73 (22,32) 34,06 (33,62)Т 36,40 (34,50)Т

Среднее 21,75 (21,98)* 33,82 (31,80)Т* 35,05 (34,30)Т*

SD 1,18

Примечание. * - достоверные различия между альфа-ИФН и ферментами дсПК и ОАС по уровням экспрессии генов. Без скобок - значения Cq в контрольных клетках, в скобках - в клетках через 24 ч после добавления реаферона. Альфа-ИФН кДНК 1/10; дсПК и ОАС кДНК без разведения.

Т аблица 2

Действие реаферона на экспрессию генов ИФН-зависимых ферментов в зараженных вирусом клетках

Доноры, № и возраст, годы Пороговые циклы экспрессии генов Cq

альфа-ИФН дсПК ОАС

1 - Женщина, 43 26,25

2 - Женщина, 27 27,59

3 - Женщина, 31 28,13

4 - Мужчина, 49 28,33

5 - Мужчина, 18 28,12

6 - Мужчина, 26 27,54

7 - Мужчина, 23 28,52

8 - Мужчина, 20 28,62

Среднее 27,89

SD 0,77

Примечание. Без скобок - значения Cq в зараженных ВКЛ клетках без реаферона, в скобках - с реафероном через 24 ч после заражения.

Уровни генной активности ИФН-зависимых генов в клетках крови доноров суммированы в табл. 1. Конститутивная экспрессия альфа-ИФН в клетках крови здоровых людей была высокой (среднее значение Cq 21,75). Ранее мы об этом уже сообщали [6]. На этом основании гены семейства альфа-ИФН подобны ак-тиновым, и их можно отнести к “генам домашнего хозяйства”. Вариации уровней экспрессии альфа-ИФН-гена у разных доноров были незначительными и составляли в среднем 1-2 Cq. Уровни экспрессии генов ферментов ОАС и дсПК в клетках крови человека по сравнению с генами альфа-ИФН очень низкие (средние значения пороговых циклов амплификации генов CqOAC = 35,05 и CqдсПК = 33,82). Добавление реа-ферона мало изменяло конститутивную активность ИФН-генов своего семейства в контрольных клетках (см. табл. 1; рис. 3, а). У 4 доноров-мужчин наблюдалось двукратное снижение и у 2 доноров-женщин - двукратное увеличение. Вместе с тем у большей части доноров реаферон оказывал стимулирующее дей-

Пики плавления

Рис. 3. Действие реаферона на экспрессию генов альфа-ИФН и дсПК в незараженных ВКЛ-клетках.

Пики плавления ДНК-амплификатов альфа-ИФН (а) и дсПК (б). Клетки крови, обработанные через 24 ч реафероном (1) и необработанные (2).

ствие на гены ИФН-зависимых ферментов (см. табл. 1). Влияние реаферона на транскрипцию гена дсПК в клетках крови было сильнее, чем на ген ОАС (см. рис. 3, б).

В зараженных клетках влияние реаферона на гены альфа-ИФН и ИФН-зависимых ферментов было различным (табл. 2). Обнаружено, что стимулирующее действие реаферона на ген дсПК, наблюдаемое в контрольных клетках, не проявляется в зараженных клетках. Ингибирующий эффект ВКЛ на ген дсПК обнаружен в ранний срок 5 ч и сохранялся в процессе вирусной репликации до 48 ч (табл. 3). Вирусом также устраняется стимуляция реаферо-ном гена ОАС. Ингибирующий эффект вируса преобладает над стимулирующим действием реаферо-на. Однако в зараженных клетках у большинства

30

Таблица 3

Регуляция экспрессии гена дсРНК-зависимой протеинкиназы реафероном и ВКЛ в клетках крови человека

Пороговые циклы экспрессии генов Cq

возраст, годы контроль, 5 ч реаферон, 5 ч ВКЛ, 5 ч

1 - Женщина, 43 30,03 25,38ф 34,41|

2 - Женщина, 27 32,44 29,52| 30,85| (31,72)!

3 - Женщина, 31 30,22 25,40| 31,21!

4 - Мужчина, 49 28,31 25,04| 29,04! (29,20)!

5 - Мужчина, 18 30,30 28,26| 28,25! (32,48)!

6 - Мужчина, 26 29,03 29,07 33,37! (30,42)!

7 - Мужчина, 23 29,08 25,90ф 31,64! (30,21)!

8 - Мужчина, 20 29,62 27,83| 28,35! (31,83)!

Среднее 29,88 27,05ф 30,89! (30,61)!

SD 1,24 1,7 2,27

Примечание. Значения Cq через 5 ч после добавления реа-ферона и заражения вирусом; в скобках - ВКЛ Cq через 48 ч после заражения; кДНК без разведения.

доноров наблюдается активация реафероном генов альфа-ИФН.

Обсуждение

Впервые показана активная репликация ВКЛ в клетках крови человека и профилактическое защитное действие отечественного препарата реаферон. Исследования проведены на модели клеток крови человека, максимально приближенной к естественному пути передачи вируса кровососущими комарами в природе. Быстрое накопление внеклеточного инфекционного вируса сопровождалось активным синтезом вирусных РНК, которые хорошо выявлялись в клетках крови при количественной ОТ-ПЦР. Эти данные имеют важное значение для разработки современных методов генодиагностики лихорадки Синдбис. Чувствительность клеток крови разных людей к ВКЛ имеет индивидуальный характер. В клетках крови разных доноров титры инфекционного вируса значительно варьировали от 4 до 7 lg по ЦПД. Реаферон не оказывал выраженное влияние на транскрипцию генов своего семейства, но стимулировал низкие уровни экспрессии генов ИФН-зависимых ферментов дсПК и ОАС, которые являются ключевыми в реализации антивирусного действия [19].

По данным литературы [11, 18], препараты ИФН и его индукторов оказывают профилактическое и лечебное действие на ряд арбовирусных инфекций, передаваемых комарами (Крымская геморрагическая лихорадка, лихорадка Западного Нила и лихорадка денге). Вирус ВКЛ обладает высокой чувствительностью к альфа-ИФН. Об этом свидетельствуют данные о снижении реафероном продукции инфекционного вируса ВКЛ и синтеза вирусных РНК. В сезонных очагах в период подъема заболеваемости лихорадкой Синдбис целесообразно применение лекарственных форм альфа-ИФН как профилактического средства.

ВКЛ подавляет активность генов ферментов дсПК и ОАС в клетках крови и фибробластах человека [5],

обеспечивая приоритет для собственных синтезов. Такой вирусный механизм в первую очередь направлен на устранение клеточных регуляторов трансляции и транскрипции. Полимеразный белок Nsp2 вируса Синдбис, обладающий сигналами ядерной транслокации и протеазной активностью, рассматривается как наиболее вероятный ингибитор транскрипции клеточных генов [12].

ЛИТЕРАТУРА

1. Ершов Ф. И., Киселев О. И. Интерфероны и их индукторы (от молекул до лекарств). - М., 2005.

2. Львов Д. К., Скворцова Т. М., Громашевский В. Л. и др. Изоляция возбудителя карельской лихорадки от комаров Aedes sp. // Вопр. вирусол. - 1985. - № 3. - С. 311-315.

3. Медицинская вирусология: Руководство / Под ред. Д. К. Львова.

- М., 2008.

4. Соколова Т. М., Урываев Л. В., Громашевский В. Л. и др. Вирусы Синдбис разного географического происхождения и дифференцирование их от вирусов западного энцефаломиелита лошадей методом полимеразной цепной реакции // Вопр. вирусол. - 1996.

- № 3. - С. 117-122.

5. Соколова Т. М., Боброва О. В., Лебедев А. Ю. и др. Сравнительный анализ экспрессии генов 2,5-олигоаденилатсинтетазы и дсРНК-протеинкиназы в фибробластах человека, инфицированных альфавирусом Синдбис и индуцированных альфа-интерфероном // Вопр. вирусол. - 1997. - № 3. - С. 98-102.

6. Соколова Т. М., Бибикова О. В., БыстровН. С., Урываев Л. В. Экспрессия генов системы интерферона и клеточного апоптоза в пробах крови человека // Вопр. вирусол. - 2005. - № 1. - С. 19-23.

7. Соколова Т. М. Регуляция генов системы интерферона при вирусных инфекциях (альфа-, флави- и найровирусы) // Арбовиру-сы и арбовирусные инфекции. - М., 2007. - С. 46-51.

8. Соколова Т. М., Уласов А. В., Галкина И. В. и др. Генотипиро-вание штаммов вируса Синдбис, выделенных на территории Астраханской области // Арбовирусы и арбовирусные инфекции. - М., 2007. - С. 87-96.

9. Соколова Т. М., Федорова Н. Е., МеджидоваМ. Г. и др. Механизмы клеточной резистентности к цитомегаловирусу связаны с пролиферативным состоянием и транскрипционной активностью генов лейкоцитарного и иммунного интерферонов // Мед. иммунол. - 2007. - № 4-5. - С. 457-466.

10. Урываев Л. В., Петров Н. А., Соколова Т. М. и др. Анализ первичной структуры участков генома вируса карельской лихорадки // Вопр. вирусол. - 1995. - № 5. - С. 198-202.

11. Anderson I., Lundquist A., Haller O., Mirazimi A. Type 1 interferon inhibits Crimean-Congo fever virus in human target cells // Med. J. Virol. - 2006. - Vol. 78. - P. 216-22.

12. Frolova E. I., Fayzulin R. Z., Cook S. H. et al. Roles of nonstructural protein nsP2 and alpha/beta interferons in determining the outcome of Sindbis virus infection // J. Virol. - 2002. - Vol. 76. - P. 11254-11264.

13. GorchakovR., FrolovaE., WilliamsR. G. et al. PKR-dependent and -independent mechanisms are involved in translation shutoff during SV infection // J. Virol. - 2004. - Vol. 78. - P. 8455-8467.

14. Julander J. G., Siddharthan V, BlattL. M. et al. Effect of exogenous interferon and an interferon inducer on west equine encephalitis virus disease in a hamster model // Virology. - 2007. - Vol. 360. - P. 454-460.

15. Kurkela S., Manni T., Vaheri A., Vapalahti O. Causative agent of Pogosta disease isolated from blood and skin lesions // Emerg. Infect. Dis. - 2004. - Vol. 10. - P. 889-894.

16. Liang G.-D., Li L., Zhou J. L. et al. Isolation and complete nucleotide sequence of a Chinese Sindbis-like virus // J. Gen. Virol. - 2000. -Vol. 81. - P. 1347-1351.

17. Norder H., Lundstrom J. O., Kozuch O., Magnius L. O. Genetic relatedness of Sindbis virus strains from Europe, Middle East and Africa // Virology. - 1996. - Vol. 222. - P. 440-445.

18. SamuelM. A., DiamondM. S. Alpha-beta interferon protects against lethal WNV infection by restriction cellular tropism and enhancing neuronal survival // J. Virol. - 2005. - Vol. 79. - P. 13350-13361.

19. Sandler A. J., Williams B. R. G. Interferon-inducible antiviral effectors // Nat. Rev. Immunol. - 2008. - Vol. 8. - P. 559-568.

Поступила 23.09.11

31

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 615.281.8.03:578.891].012.6.076.7

А. С. Бавыкин1, Д. В. Мишин2, А. В. Карпухин1, П. Г. Дерябин2

Способность малых интерферирующих РНК-олигонуклеотидов снижать инфекционную активность вируса гепатита C

в культурах клеток

Учреждение Российской академии медицинских наук Медико-генетический научный центр РАМН, Москва; 2ФГБУ НИИ вирусологии

им. Д. И. Ивановского Минздравсоцразвития России, Москва

С помощью метода РНК-интерференции были получены данные о противовирусной активности малых интерферирующих РнК-олигонуклеотидов (миРнК) в отношении инфекции, вызванной вирусом гепатита ^ВГС) в культурах клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ). Механизм РнК-интерференции основан на специфическом распознавании мРНК-мишени с помощью специально сконструированных малых (19-22 пары оснований) интерферирующих РНК-олигонуклеотидов (миРНК, или siRNA). В частности показано, что обработка монослоя клеток СПЭВ, инфицированных ВгС, миРНК приводила к защите зараженных клеток от цитопатогенного действия вируса. Результаты были подтверждены в опытах, в которых была обнаружена способность РНК-олигонуклеотидов снижать продукцию инфекционного (цитопатогенного) ВГС инфицированными клетками СПЭВ в ранних стадиях инфекции.

Ключевые слова: малые интерферирующие РНК, вирус гепатита C, культура клеток, противовирусная активность, инфекционные свойства

The ability of small interfering RNA oligonucleotides to decrease the infective activity

of hepatitis C virus in the cell cultures

A. S. Bavykin1, D. V. Mishin2, A.V. Karpukhin1, P. G. Deryabin2

'Molecular Genetics Research Center, Russian Academy of Medical Sciences; 2D. I. Ivanovsky Research Institute of Virology, Ministry of Health and Social Development of Russia, Moscow

The use of the RNA interference technique yielded data on the antiviral activity of small interfering RNA (siRNA) oligonucleotides against hepatitis C virus (HCV) infection in the pig embryo kidney (SPEV) cell cultures. The RNA interference technique is based on the specific recognition of the mRNA target by using the specially designed siRNA (19-22 bp) oligonucleotides. in particular, it was shown that siRNA added to the monolayer of HCv-infected sPEv cells resulted in the protection of the infected cells against the cytopathogenic activity of the virus. The results were confirmed in the experiments that demonstrated the ability of RNA oligonucleotides to reduce the production of infectious (cytopathogenic) HCV by infected SPEV cells in early-stage infection.

Key words: small interfering RNA oligonucleotides, hepatitis C virus, cell culture, antiviral activity, infective properties

Гепатит С является одной из наиболее серьезных проблем здравоохранения в глобальном масштабе. По консервативным оценкам, во всем мире вирусом гепатита С (HCV, Hepatitis C virus) инфицировано около 170 млн человек с ежегодным приростом числа инфицированных от 3 до 4 млн [1, 6]. Возбудителем инфекции является HCV, относящийся к семейству Flavi-viridae [6]. В 85% случаев ВГС вызывает хроническое заболевание, которое в дальнейшем может приводить к циррозу печени, а также к хроническому поражению многих органов и тканей человека, а впоследствии - к развитию гепатоцеллюлярной карциномы [1, 6].

Основными препаратами для лечения гепатита C являются интерфероны в сочетании с рибавирином (виразол). В зависимости от влияния различных факторов, связанных с особенностями вируса или течением инфекции у пациента, эффективность такого комбинированного лечения не превышает 40-60%. Невысокая эффективность лечения усугубляется побочным действием препаратов: интерфероны вызывают длительное и выраженное общее недомогание и депрессию, а применение рибавирина ведет к появлению гемолитической анемии.

Таким образом, в настоящее время остро встает вопрос поиска альтернативных путей терапии ВГС-инфекции, решение которого в течение длительного времени было затруднено из-за недоступности надежных моделей инфекции, вызванной ВГС в клеточных культурах, необходимых для доклинических испытаний противовирусной активности соединений. Впервые созданная нами лабораторная модель инфекции, вызванной ВГС в культурах клеток, открыла перспективу для широкого скрининга соединений с целью поиска альтернативных путей лечения ВГС-инфекции [2-5].

В последние годы в мире наметилось динамично развивающееся направление в лечении вирусных инфекций [8, 9], связанное с применением метода РНК-интерференции [7]. Данный метод основан на специфическом распознавании РНК-мишени с помощью специально сконструированных малых (19-22 пары оснований) интерферирующих РНК-олигонуклеотидов (миРНК, или siRNA). Попадая внутрь клетки, миРНК образуют комплекс с мРНК-мишенью на уровне комплементарного взаимодействия. Это приводит к нарушению синтеза вирусных

Контактная информация:

Бавыкин Андрей Сергеевич, канд. мед. наук, ст. науч. сотр.; e-mail:bavykinas@mail.ru

32