СОЛИ ВОЛЬФРАМА (VI) ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В ЛЕЧЕНИИ ИНФЕРТИЛЬНОСТИ, ДЛЯ ПОДДЕРЖАНИЯ НОРМАЛЬНОЙ РЕПРОДУКТИВНОЙ ФУНКЦИИ И ФЕРТИЛЬНОСТИ У НЕДИАБЕТИЧЕСКОЙ САМКИ МЛЕКОПИТАЮЩЕГО, А ТАКЖЕ ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ВСПОМОГАТЕЛЬНЫХ РЕПРОДУКТИВНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ
TUNGSTEN (VI) SALTS USED TO TREAT INFERTILITY, FOR STIMULATING FERTILITY AND NORMAL REPRODUCTION IN A NON-DIABETIC FEMALE MAMMAL, AND FOR IMPROVING THE EFFECTIVENESS OF ASSISTED REPRODUCTION TECHNIQUES

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к солям вольфрама (VI) и композициям, их содержащим, для их применения в лечении инфертильности, для поддержания нормальной репродуктивной функции и фертильности у недиабетической самки млекопитающего, а также для повышения эффективности вспомогательной репродуктивной технологии, применяемой к млекопитающему.
Сведения о предшествующем уровне техники
Фертильность у млекопитающих представляет собой многоступенчатый процесс, который не является полностью эффективным естественным путем. Факторы, такие как возраст, привычки питания или образ жизни, помимо прочих, модулируют успех этого процесса. В этой связи известно, например, что уровень беременности у женщин в возрасте от 20 до 24 лет составляет около 86%, однако он снижается до 50% у женщин в возрасте от 35 до 32 лет [Management of the Infertile Woman by Helen A. Carcio; The Fertility Sourcebook by M. Sara Rosenthal, ASAS Summary of FAIR 2012]. Другие факторы, такие как избыточный вес или недостаточный вес, также являются причиной задержек в достижении беременности естественным путем или даже невозможности ее достижения [Fertil Steril 2013;100:631–7]. По имеющимся оценкам, около 66% пар не могут зачать ребенка естественным путем в течение первых 3 месяцев незащищенного полового контакта. Этот показатель снижается до 15% пар в течение первого года незащищенного полового контакта. Инфертильность определяется (WHO, ASRM, NICE) как неспособность зачать ребенка через 12 месяцев регулярного незащищенного полового контакта. Термин «недостаточность репродуктивной функции» также был введен в обращение, в частности, в Европе, для выявления тех пар, которые имеют любую форму или степень пониженной фертильности, приводящей к задержке зачатия [Gnoth C et al Definition and prevalence of subfertility and infertility, Human reproduction 2005;20(5):1144-1147].
Основные причины инфертильности среди женщин включают нарушения овуляции, патологии репродуктивного тракта, пониженное качество ооцитов и истощение фолликулярного аппарата, свойственное старению. Однако существует также значительный процент женщин с не поддающейся объяснению инфертильностью, также называемой идиопатической инфертильностью, одна из возможных причин которой относится к дефицитам процесса имплантации.
Развитие фолликулов, овуляция, миграция незрелого яйца (ооцита), а также последующее зачатие и имплантация зиготы на стенку матки регулируется выделениями гормонов определенных эндокринных органов, таких как, например, гипофиз, гипоталамус и щитовидная железа. Среди различных биологических причин инфертильности у женщин могут быть также отмечены причины, связанные с нарушениями гормонального стимула, регулирующего весь этот процесс.
Известны различные способы лечения женской инфертильности, включающие, среди прочих, введение лекарственных средств (таких как, например, кломифен цитрат или гонадотропины) для лечения гормональных проблем, в том числе нарушения овуляции. Аналогично этому, некоторые благоприятные эффекты отмечались при использовании различных терапий, основанных на приеме витаминных добавок, в частности витамина В, витамина С, витамина Е и фолиевой кислоты, минеральных добавок, таких как комплексы, содержащие селен, цинк или железо, или солей, незаменимых жирных кислот (омега-3), а также экстрактов растений, таких как витекс священный (Vitex agnus-castus), дамиана, солодка, цветы красного клевера, Авраамово дерево, клопогон кистневидный, дягиль лекарственный (Angelica sinensis), дикий ямс или сладкий картофель (Dioscorea villosa), корень хамелириума лютеума, зеленый чай, крапива (Urtica dioica), овес пустой (Avena sativa), одуванчик лекарственный (Taraxacum officinale), и т.д., хотя эффективность любой из этих терапий не была четко доказана.
Процент беременностей, достигнутых с помощью вышеуказанных терапий, имеет ограничения. В этой связи, например, наблюдалось, что лечение женщин с нерегулярной овуляцией или ее отсутствием путем введения кломифена цитрата, лекарственного средства, принадлежащего семейству стилбенов, позволяет восстановить овуляцию с высоким процентом, но уровень беременности остается низким, равным примерно 50% или ниже.
Способы лечения, основанные на оплодотворении in vitro, являются высокоэффективными на стадии оплодотворения ооцита. Однако уровень имплантации эмбриона на стенку матки является низким. Это способствует многократным переносам эмбрионов за каждый цикл оплодотворения in vitro, что может привести к более высокому проценту рискованных многоплодных беременностей.
В заключение, известно, что метаболические нарушения, такие как диабет или ожирение, вызывают ограничение фертильности. Известно, что частичное или полное восстановление гликемии, инсулинемии и/или массы тела у диабетических или имеющих ожирение мышиных самок с поврежденной репродуктивной функцией приводит к улучшению фертильности.
Различные фармакологические способы лечения, например, метформином или солями вольфрама (VI), или даже изменения в образе жизни вызывают улучшение диабета или нарушений в работе инсулина, таких как инсулиновая недостаточность или резистентность к инсулину, например, полное или частичное восстановление репродуктивной функции, когда инфертильность вызвана диабетом или нарушениями в работе инсулина.
В конкретном случае вольфрамата натрия известно, что крысы с диабетом и инсулинопенией, индуцированной инъекцией стрептозотоцина, частично восстанавливают уровни циркулирующего инсулина после длительного лечения (10 недель) вольфраматом натрия в результате частично регрессирующего диабета. В последующем, когда крысиные самки, частично восстановившиеся от диабета, спариваются со здоровыми крысиными самцами, наблюдается, что одновременно с частичным восстановлением от диабета они частично восстанавливают свою репродуктивную способность. В частности, наблюдалось, что процент рождений, соответствующий количеству положительных тестов после выскабливаний у мышиных самок, которые частично восстановились от диабета после лечения вольфраматом натрия, увеличился до 66%, более низкого процента, чем у недиабетических мышиных самок, у которых процент рождений составляет 100%. (cf. J. Ballester et. al., “Tungstate administration improves the sexual and reproductive function in female rats with streptozotocin-induced diabetes”, Human Reproduction, 2007, том 22, стр. 2128-2135). Однако не наблюдалось и не предполагалось, что соли вольфрама (VI) оказывают воздействие на недиабетических самок животных.
Вольфрам обнаруживается в следовых количествах у животных и растений. Например, было описано, что содержание вольфрама в растениях составляет до максимум 100 мг/кг [Gbaruko B.C. & Igwe J.C. Global Tungsten: Occurrence, Chemistry, Environmental and Health Exposure Issues. Journal of Environmental Research 2007;1(1):27-32].
В виду вышеуказанного, несмотря на широкие исследования и прогресс в понимании и управлении репродуктивным процессом у млекопитающих и, в частности, у человека, до сих пор существует множество пар, которые не получают положительного эффекта от применения различных доступных на сегодняшний день подходов для повышения фертильности, поскольку они являются неэффективными. Таким образом, все еще существует потребность в нахождении новых альтернатив для повышения естественной репродуктивной эффективности и/или лечения женской инфертильности, которые обеспечивают более высокую эффективность.
Описание изобретения
Было обнаружено, что введение соли вольфрама (VI) или сольвата указанной соли является эффективным для лечения инфертильности у недиабетической самки млекопитающего, для поддержания нормальной репродуктивной функции и фертильности у недиабетической самки млекопитающего, и для повышения эффективности вспомогательных репродуктивных технологий, применяемых к млекопитающему. Несмотря на то, что известно, что вольфрамат натрия частично устраняет нарушения репродуктивной функции у диабетических мышиных самок за счет нормализации уровней глюкозы в крови, не было описано или предложено применение вольфрамата натрия, воздействующего на функцию женской репродуктивной системы у недиабетических самок млекопитающих, для лечения инфертильности и/или поддержания нормальной репродуктивной функции и фертильности у недиабетических самок млекопитающих. Эффективность введения соли вольфрама для лечения инфертильности или для улучшения или нормализации фертильности была продемонстрирована с помощью животной модели, в частности, мышиных самок IRS2-/-, как показано в примерах по настоящему изобретению. Влияние солей вольфрама на имплантацию эмбриона также было продемонстрировано на тех же самых моделях животных, которые указаны выше, а также положительное влияние на прилипание эмбриона к эндометрию по данным анализа in vitro, результаты которого также представлены в примерах.
Таким образом, первый аспект настоящего изобретения относится к соли вольфрама (VI) или ее сольвату для их применения в лечении инфертильности у недиабетической самки млекопитающего или для поддержания нормальной репродуктивной функции и фертильности у недиабетической самки млекопитающего.
Второй аспект настоящего изобретения относится к композиции, содержащей соль вольфрама (VI) или ее сольват при концентрации более 100 мг/кг, а также по меньшей мере одно фармацевтически или диетически приемлемое вспомогательное вещество или носитель, для лечения инфертильности у недиабетической самки млекопитающего или для поддержания нормальной репродуктивной функции и фертильности у недиабетической самки млекопитающего.
Третий аспект изобретения относится к применению соли вольфрама (VI) или ее сольвата, как определено выше, для изготовления лекарственного средства для лечения инфертильности у недиабетической самки млекопитающего или для поддержания фертильности у недиабетической самки млекопитающего.
В четвертом аспекте изобретение относится к способу лечения инфертильности или для поддержания нормальной репродуктивной функции и фертильности у недиабетической самки млекопитающего, который включает введение терапевтически эффективного количества соли вольфрама (VI) или ее сольвата, как определено выше.
Подробное описание изобретения
Как указано выше, в соответствии с первым аспектом настоящее изобретение относится к соли вольфрама (VI) или ее сольвату для лечения инфертильности у недиабетической самки млекопитающего или для поддержания и/или содействия нормальной репродуктивной функции и фертильности у недиабетической самки млекопитающего.
Термин «поддержание нормальной репродуктивной функции и фертильности» или «содействие нормальной репродуктивной функции и фертильности» относится к содействию нормальной репродуктивной функции и фертильности или улучшению нормальной репродуктивной функции и фертильности (сокращению сроков достижения беременности), при этом «нормальная репродуктивная функция и фертильность» означает состояние фертильности, при котором беременность достигается согласно приведенным выше определениям:
*в ситуации недостаточности репродуктивной функции: беременность достигается за период, составляющий 12 месяцев регулярного незащищенного полового контакта; и
*в ситуации инфертильности: беременность достигается после периода, составляющего 12 месяцев регулярного незащищенного полового контакта. Необходимость восстановления и/или стимулирования овуляции; улучшение качества ооцита и эмбриона; увеличение имплантации зигота в стенку матки; регулирование нарушения оси гипоталамус-гипофиз-яичник, включая синдром поликистозных яичников; метаболический синдром, гиперпролактинемия; эндометриоз; гипотиреоз; множественный склероз; ревматоидный артрит; красная волчанка; цирроз; ревматоидный артрит; глютеновая болезнь; хроническая почечная недостаточность; идиопатические причины; и расстройство пищевого поведения, такое как нервная анорексия и булимия, включены в настоящий документ.
В контексте настоящего изобретения термин «вспомогательные репродуктивные технологии» охватывает любую вспомогательную репродуктивную технологию или искусственное оплодотворение, которое понимается как группа биомедицинских технологий или способов, содействующих или заменяющих по меньшей мере один из естественных процессов, протекающих во время воспроизводства. Они включают, но без ограничения, индукцию овуляции, искусственное оплодотворение (включая оплодотворение донорской спермой) и оплодотворение in vitro (включая оплодотворение донорской яйцеклетки или оплодотворение донорской спермой). Таким образом, вспомогательные репродуктивные технологии могут применяться по причинам инфертильности или пониженной фертильности, как у самки млекопитающего (как определено выше), так и у самца млекопитающего (например, изменения сперматозоидов, отраженные в семинограмме, такие как изменения подвижности сперматозоидов, изменения жизнеспособности сперматозоидов, а также изменения морфологии сперматозоидов). Также, вспомогательную репродуктивную технологию можно применять у женщин, которые несмотря на отсутствие проблем per se, связанных с фертильностью, вынуждены прибегать к указанной технологии по разным причинами, например (но без ограничения), женщин, у которых нет партнера, которым требуется донация спермы; пар, которые вынуждены прибегать к донации яйцеклетки и/или спермы вследствие генетической несовместимости или несовместимости другого типа; или сельскохозяйственных животных, которым требуется перенос эмбриона для улучшенной продуктивности. Эти вспомогательные репродуктивные технологии обычно имеют пониженный показатель успеха, составляющий менее 50% или даже 40%. Это обусловлено тем, что использованию вспомогательных репродуктивных технологий свойственно снижение эффективности репродуктивного процесса. Одна из основных причин этой низкой эффективности репродуктивности при использовании вспомогательных репродуктивных технологий связана с трудностями процесса прилипания эмбриона и имплантации.
В контексте настоящего изобретения термин «повышение» в выражении «повышение эффективности вспомогательной репродуктивной технологии» относится к повышению доли успеха таких вспомогательных репродуктивных технологий. Таким образом, если доля успеха в возрастном диапазоне пары млекопитающих, в отношении которой применяется вспомогательная репродуктивная технология, согласно предыдущим статистическим данным составляет, например 43%, то доля выше 44% будет означать повышение эффективности такой технологии. Это улучшение обусловлено, главным образом, содействием прилипанию эмбриона и имплантации в результате введения солей вольфрама (VI).
Даже если вспомогательная репродуктивная технология применяется из-за изменения фертильности самца пары млекопитающих путем улучшения прилипания эмбриона и имплантации, соли вольфрама (VI) вводят по меньшей мере самке млекопитающего. Альтернативно, соли вольфрама (VI) можно вводить обоим, как самке, так и самцу млекопитающего.
Млекопитающее в контексте настоящего изобретения может представлять собой любое млекопитающее, включая, но без ограничения, человека, мышей, крыс, собак, кошек, морских свинок, хомячков, коров, лошадей, свиней, овец, коз и т.д. В соответствии с конкретным вариантом осуществления млекопитающее представляет собой человека.
В соответствии с другим конкретным вариантом осуществления указанную соль вводят в суточной дозе от 0,001 мг до 1000 мг соли вольфрама (VI) на кг массы тела самки млекопитающего.
В другом конкретном варианте осуществления соль вольфрама (VI) включает анион вольфрама (VI) и фармацевтически или ветеринарно-приемлемый катион. «Фармацевтически или ветеринарно-приемлемый катион» относится к любому приемлемому, нетоксичному, органическому или неорганическому катиону, который способен образовывать терапевтически эффективную соль вольфрама (VI) и является подходящим для применения в лекарственной или ветеринарной терапии. Катион предпочтительно представляет собой щелочной или щелочноземельный катион. Более предпочтительно катион выбран из группы, состоящей из натрия, калия, магния, кальция и цинка. В соответствии с конкретным вариантом осуществления катион представляет собой натрий. В соответствии с другим конкретным вариантом осуществления катион представляет собой цинк.
4
4
2
7
2
7
4
2−
−
2−
−
2−
Анион вольфрама (VI) в соли вольфрама (VI) предпочтительно выбран из ионов WO, HWO, WOи HWO. Предпочтительно анион представляет собой WO.
В соответствии с дополнительным конкретным вариантом осуществления сольват соли вольфрама (VI) представляет собой гидрат, более предпочтительно дигидрат.
Все признаки, перечисленные индивидуально для различных элементов изобретения могут быть комбинированы друг с другом, при этом все возможные комбинации включены в объем настоящего изобретения. Например, в соответствии с предпочтительным вариантом осуществления сольват соли вольфрама (VI) представляет собой дигидрат, и катион представляет собой катион натрия. Аналогичным образом предполагается, что остальные возможные комбинации также включены в объем настоящего изобретения.
Дополнительный аспект изобретения представляет собой композицию, содержащую соль вольфрама (VI) или ее сольват, как определено выше, при концентрации, равной или больше 100 мг/кг, и по меньшей мере одно фармацевтически, ветеринарно или диетически приемлемое вспомогательное вещество или носитель, для лечения инфертильности у недиабетической самки млекопитающего, для поддержания нормальной репродуктивной функции и фертильности у недиабетической самки млекопитающего, или для повышения эффективности вспомогательной репродуктивной технологии, применяемой к млекопитающему.
Термин «фармацевтически, ветеринарно или диетически приемлемое вспомогательное вещество или носитель» относится к вспомогательным веществам или носителям, подходящим для их применения в фармацевтических, ветеринарных или пищевых технологиях для приготовления композиций. Эти компоненты, вспомогательные вещества или носители должны быть совместимы с другими ингредиентами композиции. Также, они должны быть подходящими для их применения при контакте с тканью или органом человека и животных без избыточной токсичности, раздражения, аллергической реакции или других иммуногенетических проблем или осложнений при разумном соотношении польза/риск. Они представляют собой вещества, лишенные фармакологической активности при концентрациях, в которых они присутствуют в фармацевтической форме. Вспомогательные вещества или носители применяют для обеспечения характеристик фармацевтической или ветеринарной формы, которые гарантируют стабильность, биодоступность, приемлемость и легкость введения одного или нескольких активных ингредиентов. Что касается степени влияния вспомогательных веществ на высвобождение активного ингредиента, то они смогут модифицировать величину и временной профиль фармакологической активности лекарственного средства посредством изменений его биодоступности. Вспомогательные вещества также используют для получения препарата, имеющего подходящую форму или консистенцию. Примеры типов вспомогательных веществ: солюбилизирующие агенты, разрыхлители или дезинтегрирующие агенты, эмульгаторы (эмульгирующие агенты), красители, вкусовые добавки, связывающие вещества, антиоксиданты, смазывающие вещества, консерванты, загустители и т.п.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления вспомогательное вещество или носитель является фармацевтически или ветеринарно-приемлемым, и композиция представляет собой фармацевтическую композицию для лечения инфертильности у недиабетической самки млекопитающего или для повышения эффективности вспомогательной репродуктивной терапии, применяемой к млекопитающему.
Фармацевтическая композиция предпочтительно представлена в форме драже, таблетки, пастилки, капсулы, порошка, облатки, шипучего порошка или таблеток, раствора, суспензии, сиропа или гранул.
В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления композиция представляет собой пищевую композицию для содействия нормальной репродуктивной функции и фертильности у недиабетической самки млекопитающего.
Пищевая композиция может представлять собой жидкую композицию или напиток, твердую композицию или пищевую добавку или дополнительную добавку (также называемую диетической или пищевой добавкой или дополнительной добавкой). В контексте настоящего изобретения термин «пищевая композиция» охватывает любой твердый или жидкий пищевой продукт, обогащенный солью вольфрама (VI), а также любую пищевую добавку или дополнительную добавку, содержащую по меньшей мере одну соль вольфрама (VI).
Пищевая композиция может представлять собой жидкую композицию, то есть напиток, в соответствии с условиями, обычно используемыми в обществе. В контексте настоящего изобретения такая жидкая композиция включает, но без ограничения, любой напиток, выбранный из группы, состоящей из молока животного или растительного происхождения, а также любого продукта на его основе, такого как, например, молочные коктейли, йогурт, кефир и т.д.; фруктовых и/или овощных соков; чистой воды или газированной воды, или ароматизированной или подслащенной (с помощью калорийных сахаристых веществ (сахарозы, фруктозы и т.п.) или искусственных подсластителей) воды или напитков; приправ, таких как, например, любой острый соус, заправка, кетчуп, масло, уксус или уксусные составы; алкогольных напитков любого типа; чая, кофе; а также всех типов освежающих напитков или безалкогольных напитков, или энергетических напитков.
Пищевая композиция может также представлять собой твердую композицию. Такая твердая композиция может быть выбрана, например, но без ограничения, из группы, состоящей из молочных продуктов животного или растительного происхождения, таких как сыр, масло, маргарин и тофу; любого типа хлеба, включая свежий, упакованный или замороженный хлеб, нарезанный хлеб, цельнозерновой хлеб, хлеб с пряностями, сладкий хлеб, соленый хлеб и т.д.; пасты, изготовленной из любой зерновой муки, такой как пшеничная муки или мука грубого помола (макароны, спагетти, лапша и т.д.); выпечки, включая кексы, выпечку, маффины, донаты и т.д.; настоев, чая или кофе, россыпью или в пакетиках для приготовления напитков; желе, конфет, в том числе жевательных конфет, больше известных как «мягкие фруктовые конфеты», а также любого типа твердой приправы, например, орегано, соль, кориандр, чеснок, базилик и т.д., или их смесей.
И наконец, пищевая композиция может также представлять собой питательную, диетическую или пищевую добавку или дополнительную добавку, при этом любой из этих терминов используется в контексте настоящего изобретения эквивалентным образом. Эти термины обычно используют для композиций, употребляемых перорально, которые содержат ингредиент, предназначенный для дополнения диеты, в случае настоящего изобретения, солью/солями вольфрама (VI). Они никогда не заменят традиционную пищу или никогда не будут единственным компонентом пищи или диеты. Они могут содержаться в различных формах, таких как пастилки, драже, таблетки, капсулы, мягкие желатиновые капсулы, желатиновые капсулы, облатки, шипучие таблетки, жидкости (раствор, суспензия, сироп), гранулы и порошки, все из которых включены в виде конкретных вариантов осуществления в объем настоящего изобретения. Диетически или фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества являются очевидными для специалиста в отношении получения любой из указанных форм и включены в объем настоящего изобретения.
В соответствии с конкретным вариантом осуществления любая из указанных композиций (фармацевтическая композиция, твердая композиция, жидкая композиция или питательная добавка/дополнительная добавка) содержит в своем составе по меньшей мере одно калорийное сахаристое вещество, такое как сахароза или фруктоза. Прием внутрь этих калорийных сахаристых веществ должен находиться под контролем и быть ограничен у диабетических пациентов, таким образом, пищевая композиция, включающая такое калорийное сахаристое вещество, будет противопоказана для диабетических млекопитающих или по меньшей мере учтена при контроле их диеты.
В соответствии с конкретным вариантом осуществления недиабетическая самка млекопитающего выбрана из группы, состоящей из самок млекопитающих, которым требуется восстановление и/или стимулирование овуляции, улучшение качества ооцита и эмбриона, увеличение имплантации зигота на стенке матки, регулирование нарушения по оси гипоталамус-гипофиз-яичник, включая синдром поликистозных яичников, метаболический синдром, гиперпролактинемию, эндометриоз, гипотиреоз, множественный склероз, ревматоидный артрит, красную волчанку, цирроз, ревматоидный артрит, глютеновую болезнь, хроническую почечную недостаточность, идиопатические причины и расстройства пищевого поведения, такие как нервная анорексия и булимия.
В соответствии с другим конкретным вариантом осуществления недиабетическая самка млекопитающего выбрана из группы, состоящей из самок млекопитающих, обладающих резистентностью к инсулину (также известной как резистентность к инсулину или инсулиновая резистентность); в случае, когда резистентность к инсулину возникает вместе с гипергликемией, она может привести к развитию диабета, хотя сама по себе резистентность к инсулину диабет не вызывает. Самки млекопитающих, имеющие резистентность к инсулину, предпочтительно выбраны из группы, состоящей из самок млекопитающих, имеющих одно или несколько из следующих состояний: ожирение или лишний вес, метаболический синдром, предрасположенность к диабету, синдром поликистозных яичников, гипертензию, сердечно-сосудистое заболевание, гиперлипидемию или дислипидемию, гипертиреоз, гиперпаратиреоз, гиперлептинемию или резистентность к лептину, малоподвижный образ жизни, нарушения пищевого поведения, синдром обструктивного апноэ сна, недостаточность питания плода, синдром Прадера-Вилли, синдром Рабсона-Менденхолла, жировую дистрофию печени, лепречаунизм, патологии, связанные с избыточной секрецией глюкокортикоидов (например, акромегалия), резистентность к инсулину, вызванную фармакологическими терапиями (например, глюкокортикоиды, диуретическое средство тиазидной структуры, бета-блокаторы), стресс или раннее менархе [Egas Béjar, Daniela et. al Insulinorresistencia/Insulin resistance. Medicina (Guayaquil);10(2):159-166, April 2005; Graves, Thomas K. WHY ISN’T THIS INSULIN WORKING? Western Veterinary Conference 2013 (SA113); Ximena Gaete V. Adelanto de la pubertad en Chile y el mundo. Rev Chil Pediatr 77 (5); 456-465, 2006; Leszek Szablewski Glucose Homeostasis and Insulin Resistance (eISBN: 978-1-60805-) Bentham e-books]. Многие из этих признаков были описаны как не связанные с инфертильностью, включая предрасположенность к диабету [Acta Diab. Latina 4, 507, 1967].
В композициях согласно изобретению соль или соли вольфрама (VI), или их сольваты присутствуют при концентрации по меньшей мере 100 мг/кг. В соответствии с конкретными вариантами осуществления соль или соли вольфрама (VI) включены в композицию при концентрациях по меньшей мере 150 мг/кг, по меньшей мере 200 мг/кг, по меньшей мере 250 мг/кг, по меньшей мере 300 мг/кг, по меньшей мере 350 мг/кг, по меньшей мере 400 мг/кг, по меньшей мере 450 мг/кг, по меньшей мере 500 мг/кг, по меньшей мере 550 мг/кг, по меньшей мере 600 мг/кг, по меньшей мере 650 мг/кг, по меньшей мере 700 мг/кг, по меньшей мере 750 мг/кг, по меньшей мере 800 мг/кг, по меньшей мере 850 мг/кг, по меньшей мере 900 мг/кг или по меньшей мере 850 мг/кг.
В соответствии с другим конкретным вариантом осуществления общая концентрация солей вольфрама (VI) составляет 1000 мг/кг или менее.
В соответствии с другим конкретным вариантом осуществления пищевая композиция будет подходящей для введения солей вольфрама в суточной дозе от 0,001 мг на кг массы самки млекопитающего (в настоящем документе мг/кг/день) и максимальной переносимой дозе для самок млекопитающих соответствующих видов.
В соответствии с более конкретным вариантом осуществления максимальная суточная доза составляет 1000 мг/кг/сутки; в соответствии с дополнительными конкретными вариантами осуществления введение проводят в дозах, составляющих по меньшей мере 0,001 мг/кг/сутки, по меньшей мере 0,01 мг/кг/сутки, по меньшей мере 0,1 мг/кг/сутки, по меньшей мере 0,5 мг/кг/сутки, по меньшей мере 10 мг/кг/сутки, по меньшей мере 25 мг/кг/сутки, по меньшей мере 50 мг/кг/сутки, по меньшей мере 100 мг/кг/сутки, по меньшей мере 200 мг/кг/сутки, по меньшей мере 300 мг/кг/сутки, по меньшей мере 400 мг/кг/сутки, по меньшей мере 500 мг/кг/сутки, по меньшей мере 600 мг/кг/сутки, по меньшей мере 700 мг/кг/сутки, по меньшей мере 800 мг/кг/сутки или по меньшей мере 900 мг/кг/сутки.
Третий аспект изобретения относится к применению соли вольфрама (VI) или ее сольвата, как определено выше, для изготовления лекарственного средства для лечения инфертильности у недиабетической самки млекопитающего или для поддержания фертильности у недиабетической самки млекопитающего.
Четвертый аспект изобретения относится к способу лечения инфертильности или поддержки нормальной репродуктивной функции и фертильности у недиабетической самки млекопитающего, который включает введение терапевтически эффективного количества соли вольфрама (VI) или ее сольвата, как определено выше.
4
4
2
7
2
7
4
2−
−
2−
−
2−
Все определения и предпочтительные значения, представленные выше, в отношении первого аспекта изобретения применимы к другим аспектам изобретения. Таким образом, например, соль вольфрама (VI) будет содержать анион вольфрама (VI) и диетически или фармацевтически приемлемый катион, который предпочтительно будет представлять собой щелочной или щелочноземельный катион, предпочтительнее катион натрия, калия, магния и кальция, и цинка. В частности, соль будет представлять собой натриевую соль вольфрама (VI). Анион вольфрама (VI) представляет собой анион, выбранный из ионов WO, HWO, WO и HWO, предпочтительно WO, и в случае, если представлен в форме сольвата, указанный сольват предпочтительно представляет собой гидрат, в частности, дигидрат. Остальные конкретные варианты осуществления, представленные выше в отношении первого аспекта, также относятся к другим аспектам.
Серии неограничивающих иллюстративных примеров настоящего изобретения представлены ниже.
Примеры
Пример 1. Описание животной модели (мышиные самки IRS2 -/-)
-/-
Мышиную модель использовали для определения активности солей вольфрама (VI) в отношении поддержания нормальной репродуктивной функции и фертильности у мышей с нокаутом гена Irs2, IRS2 [Burks et. al., “IRS-2 pathways integrate female reproduction and energy homeostasis”, Nature, 2000, vol. 407, pp. 377-382]. Делеция гена Irs2 обуславливает четкий половой диморфизм в отношении фертильности и углеводного обмена.
-/-
-/-
wt
+/+
Мышиные самцы этой модели имеют резистентность к инсулину и тяжелую гипергликемию, которая начинается в раннем возрасте. Напротив, мышиные самки остаются относительно эугликемичными в раннем возрасте и развивают легкую резистентность к инсулину, которая сохраняется до более позднего возраста (4-5 месяцев). Мышиные самки IRS2 в раннем возрасте примерно 10 недель демонстрируют низкое развитие фолликулов и устойчивое отсутствие овуляции, сопровождающееся отсутствием эстрального цикла у большинства мышей. Уровень беременности у мышиных самок IRS2 составляет 9% по сравнению с уровнем, составляющим 100%, у мышиных самок IRS (дикого типа IRS-2). При условии, что мышиные самки в этом возрасте остаются эугликемичными и развивают лишь легкую резистентность к инсулину, значительное нарушение фертильности не является прямым следствием отклонений в метаболизме глюкозы.
Мышиных самок IRS2-/- использовали в возрасте от 6 до 8 недель. В публикации Burks et al, “IRS-2 pathways integrate female reproduction and energy homeostasis”, Nature, 2000, том. 407, стр. 377-382 описано, что мышиные самцы IRS2-/- уже в возрасте 6 недель имели высокую непереносимость глюкозы, тогда как у мышиных самок IRS2-/- исходные уровни глюкозы сохранялись на уровне 120-160 мг/дл вплоть до 4-5-месячного возраста (страница 378, колонка 1, конец второго параграфа). Кроме того, в этой же публикации описывается, что мышиные самки в возрасте менее 10 недель являются относительно эугликемичными и имеют легкую резистентость к инсулину. Таким образом, значительное нарушение фертильности в этой животной модели не является прямым следствием отклонений в метаболизме глюкозы у мышиных самок IRS-2-/-. Исходные уровни глюкозы в крови, составляющие 120-160 мг/дл, считаются нормальными уровнями [“Ciencia y Tecnologia en protección y experimentación animal”, Ed McGraw-Hill/interamericana de España (2001). ISBN:84-486-0310-9 (стр. 27): нормальные уровни у мышей находятся в диапазоне между 63 и 176 мг/дл)].
В других более поздних исследованиях, проводимых с использованием мышей IRS2-/-, изучали указанные различия, существующие между мышиными самцами и самками; например, в Biochemical Pharmacology 2011, 81, 279-288 описано, что циркулирующие уровни инсулина значительно не различались между мышами дикого типа и мышиными самками IRS2-/- и в ответ на несколько концентраций глюкозы, при этом ответ мышиных самок IRS2-/- в условиях секреции инсулина был идентичным ответу контрольных животных, мышей дикого типа (страница 281, колонка 2, параграф 1; и страница 284, колонка 2, параграф 1 раздела, озаглавленного «Обсуждение»), тогда как секреция инсулина у мышиных самцов IRS2-/- увеличилась по сравнению с контролями дикого типа.
Другие исследования, проведенные с использованием этой животной модели, показали, что IRS2 выполняет важные и прямые функции в отношении яичников, в частности, влияет на развитие фолликулов и овуляцию путем регулирования ключевых компонентов механизма клеточного цикла, вовлеченных в клеточную пролиферацию и координацию дифференциации, четко и непосредственно связывая отсутствие экспрессии IRS2 с инфертильностью [Biology of Reproduction 2007, 76, 1045-1053].
Животная модель IRS2-/- в первую очередь представляет собой модель с дисфункцией бета-клеток [Am J Physiol Endocrinol Metab 2014, 306, E36-E47)]. Описывается, что прогрессирующая потеря бета-клеток вследствие повышенного числа апоптотических бета-клеток определяет прогрессирование в диабет в этой животной модели (смотри страницу Е36, колонку 2, параграф 2), только в пожилом возрасте. Постепенное сокращение бета-клеток вначале компенсируется повышенной активностью сохранившихся клеток, и только в пожилом возрасте уменьшение количества клеток не может компенсироваться сохранившимися клетками, вызывая развитие гипергликемии и последующее развитие диабета.
Фертильность представляет собой сложный механизм, в который вовлечены различные факторы. Не существует «идеальной» животной модели, а скорее множество животных моделей, например тех, которые предлагаются Jackson Laboratories (http://jaxmice.jax.org/list/ra861.html).
Важным фактором, влияющим на фертильность, является гормон лептин, который необходим для фертильности у мужчин и женщин. Лептин влияет на циклы овуляции у женщин, и уровни лептина, выходящие за рамки нормального диапазона, могут негативно влиять на качество яйцеклетки. Мыши IRS2-/- имеют высокие уровни циркулирующего лептина, что возможно является еще одним фактором, влияющим на фертильность.
Таким образом, эта животная модель охватывает серии важных связанных с инфертильностью факторов и является подходящей моделью для изучения эффективности соединений на инфертильность у самок млекопитающих.
Пример 2. Исследованием овуляции, имплантации и беременности
А. Животные
-/-
Десять мышиных самок IRS2 в возрасте 6-8 недель.
wt
Шесть мышиных самцов «дикого типа» (IRS2) в возрасте 6-8 недель.
Мышиных самок и самцов размещали отдельно в нормальных условиях, то есть в условиях 12-часового цикла свет/темнота и при контролируемой температуре и влажности. Животные имели неограниченный доступ (также называемый как ad libitum) к стандартной диете.
В. Способ
Стадия предварительной обработки
-/-
После периода акклиматизации мышиных самок IRS2 размещали группами по 4-6 мышей в клетки. Во время стадии предварительной обработки (2 недели) животным давали питьевую воду, не содержащую вольфрамат.
Стадия обработки
Вольфрамат натрия вводили в питьевую воду (ad libitum) посредством раствора дигидрата вольфрамата натрия при концентрации 2 мг/мл (предлагаемый Carlo Erba) в дистиллированной воде после стадии предварительной обработки (день 0 лечения) и вплоть до 4 недель до умерщвления животных. Суточная доза вольфрама натрия, потребляемая мышами, составила около 180 мг/кг массы тела.
Скрещивание
-/-
wt
После первых трех недель обработки мышиных самок IRS2 помещали в клетки в парах с мышиными самцами IRS2.
Мышей наблюдали ежедневно на наличие признаков беременности или рождения.
Через 4 недели мышиных самцов меняли между клетками и содержали в них еще в течение 4 недель.
Введение вольфрамата проводили в течение 8 недель, в течение которых мышиные самцы и самки содержались вместе. После 8 недель обработку прекращали и мышиных самцов и самок помещали вместе еще на 4 дополнительных недели.
Умерщвление
После этого периода мышиных самок умерщвляли и проводили биопсию на признаки беременности.
С. Результаты
Результаты исследования овуляции
Во время периода предварительной обработки и во время первых 3 недель обработки брали мазок из влагалища у 6 случайным образом выбранных мышиных самок на дни -8; -5; -2; -1; 7; 8; 14; 15 и 22 для определения фазы эстрального цикла, в которой они находились.
Во влагалище мышей вводили 1-2 мл солевого раствора с помощью пипетки Пастера. Вагинальный экссудат собирали этой же пипеткой и наносили на предметное стекло. После сушки на воздухе его фиксировали и окрашивали по Папаниколау.
Окрашивание по Папаниколау включает окрашивание вагинального экссудата, фиксированного на предметном стекле, следующим образом:
- 10 погружений в 50% об./об. спирт;
- Погружение в раствор гематоксилина Харриса на 3 минуты;
- Споласкивание проточной водой;
- 10 погружений в кислый спирт (1% соляная кислота);
- Споласкивание проточной водой;
- 10 погружений в 95% об./об. спирт;
- Погружение в раствор OG-6 на 30 секунд;
- 10 погружений в 95% об./об. спирт;
- Погружение в раствор эозина на 1 минуту;
- 10 Погружений в 96% об./об. спирт;
- 10 Погружений в 86% об./об. спирт; и
- 10 Погружений в ксилол.
Препараты анализировали опытные специалисты с использованием кодирования односторонним слепым образом для устранения необъективности наблюдателя.
Образцы идентифицировали в следующих фазах: диэструс, проэструс, эструс, метэструс, анэструс или не поддающиеся оценке. Циклическая природа четырех фаз в периодах, составляющих 4-6 дней, являются признаком нормального цикла эструса, тогда как отсутствие этой циклической природы и персистентность в фазах анеструса, диэструса или проэструса является признаком отсутствия цикла эструса.
-/-
В таблице 1 приведены фазы цикла эструса 10 мышиных самок, подвергнутых исследованию, в мазках из влагалища, выполненных у 6 из этих мышиных самок IRS2.
Таблица 1
<u>Мышь No.</u>
<u>Время (дни)</u>
<u>-8</u>
<u>-5</u>
<u>-2</u>
<u>-1</u>
<u>7</u>
<u>8</u>
<u>14</u>
<u>15</u>
<u>22</u>
<u>72</u>
<u>A</u>
<u>A</u>
<u>P</u>
<u>D</u>
<b></b><b><u>E</u></b><b></b>
<u>E-M</u>
<u>E</u>
<u>E</u>
<u>A</u>
<u>898</u>
<u>D</u>
<u>D</u>
<u>P</u>
<u>P</u>
<b></b><b><u>E</u></b><b></b>
<u>E</u>
<u>E-M</u>
<u>M</u>
<u>M</u>
<u>926</u>
<u>D</u>
<u>D</u>
<u>P</u>
<u>P</u>
<b></b><b><u>E-M</u></b><b></b>
<u>E-M</u>
<u>D</u>
<u>E</u>
<u>P</u>
<u>928</u>
<u>D-P</u>
<u>D</u>
<u>P</u>
<u>P</u>
<b></b><b><u>E</u></b><b></b>
<u>E</u>
<u>E-M</u>
<u>M</u>
<u>A</u>
<u>942</u>
<u>A</u>
<u>D</u>
<u>P</u>
<u>P</u>
<b></b><b><u>E</u></b><b></b>
<u>E-M</u>
<u>E-M</u>
<u>A</u>
<u>D</u>
<u>972</u>
<u>D</u>
<u>D</u>
<u>-</u>
<u>P</u>
<b></b><b><u>M</u></b><b></b>
<u>M</u>
<u>-</u>
<u>D</u>
<u>D</u>
Фазы эстрального цикла представляют собой следующие: А: Анеструс; D: Диэструс; Р: Проэструс; Е: Эструс; и М: Метэструс.
-/-
Фазы эстрального цикла, обнаруженные в мазках из влагалища мышиных самок IRS2, представленных в таблице 1, показывают, что во время периода предварительной обработки все мыши находились в фазе проэструса (Р) или диэструса (D), то есть с отсутствием цикла эструса.
-/-
Однако после начала введения вольфрамата наблюдалось, что мышиные самки IRS2 находятся в поздних фазах эстрального цикла, то есть фазах эструса (Е) и метэструса (М), что является показателем восстановления нормального эстрального цикла.
-/-
Эти результаты указывают на то, что введение соли вольфрама (VI) обеспечивает быстрое восстановление (на седьмой день лечения) эстрального цикла у инфертильных недиабетических мышиных самок IRS2 у 100% подвергнутых анализу мышей.
Результаты исследования имплантации и беременности
После периода скрещивания согласно способу раздела В, мышиных самок умерщвляли и собирали биопсии для выявления признаков беременности.
В таблице 2 приводится возраст на момент обработки, независимо от наличия или отсутствия беременности, и количество эмбрионов на мышиную самку.
Таблица 2
Мышь No.
Возраст (месяцы)на начало
Беременность
Количество имплантированных эмбрионов или рождений потомства
обработки
скрещивания
72
10
12
да
1 детеныш
942
10
12
да
8 детенышей
928
10
12
да
7 эмбрионов
931
10
12
да
3 детенышей
898
10
12
да
7 эмбрионов
900
10
12
нет
-
921
10
12
да
6 эмбрионов
926
10
12
да
8 детенышей
972
8
10
нет
-
973
8
10
да
7 эмбрионов
-/-
-/-
Результаты в таблице 2 показывают, что, несмотря на то, что уровень беременности у необработанных мышиных самок IRS2 составляет 9%, уровень беременности у мышиных самок IRS2, обработанных вольфраматом, повысился до 80%.
Кроме того, эти результаты также показывают, что средний показатель детенышей/имплантированных эмбрионов на беременную мышиную самку равен 5, показатель, который может считаться сравнимым с количеством детенышей мышиной самки.
Таким образом, результаты, представленные в таблицах 1 и 2, показывают, что соль вольфрама (VI) является эффективным лечением для восстановления овуляции и/или увеличения имплантации ооцита. Следовательно, введение соли вольфрама (VI), как определено в настоящем изобретении, является эффективным для лечения инфертильности у недиабетических самок млекопитающих.
Пример 3. Исследование гликемии и массы тела
А. Животные
-/-
Шесть мышиных самок IRS2 в возрасте 6-8 недель.
Мышиных самок размещали в нормальных условиях, то есть в условиях 12-часового цикла свет/темнота, и контролируемой температуре и влажности. Животные имели неограниченный доступ (также называемый как ad libitum) к стандартной диете.
В. Способ
Стадии обработки
После периода акклиматизации вольфрамат натрия вводили в питьевую воду (ad libitum) в виде раствора дигидрата вольфрамата натрия при концентрации 2 мг/мл (предлагаемого Carlo Erba) в дистиллированной воде после фазы предварительной обработки (день 0 лечения) и в течение 12 дней.
С. Результаты
Массу тела контролировали на дни 0, 2, 5, 7, 9 и 12 лечебного периода и содержание глюкозы в крови определяли через 6 часов после кормления в каждый из вышеуказанных дней путем взятия крови из хвостовой вены и с помощью сенсора глюкозы (AccuTrend glucose sensor, Roche, Mannheim, Germany).
В таблице 3 приведены уровни глюкозы, выраженные в мг/дл, и в таблице 4 приведена масса тела мышей, подвергнутых исследованию, выраженная в граммах.
Таблица 3
Гликемия (мг/дл)
R1327
R1345
R1347
R1354
R1376
R1381
Среднее
<b>День 0</b>
<b>146</b>
<b>129</b>
<b>115</b>
<b>126</b>
<b>141</b>
<b>112</b>
<b>128,17</b>
День 2
136
128
118
110
105
107
117,33
День 5
125
142
114
111
137
105
122,33
<b>День 7</b>
<b>140</b>
<b>110</b>
<b>106</b>
<b>89</b>
<b>133</b>
<b>135</b>
<b>118,83</b>
День 9
125
153
109
108
131
125
125,17
День 12
136
116
111
86
123
141
118,83
Таблица 4
Масса тела (г)
1327
1345
1347
1354
1376
1381
Среднее
<b>День 0</b>
<b>22,7</b>
<b>15,33</b>
<b>18,21</b>
<b>16,5</b>
<b>13,99</b>
<b>15,45</b>
<b>17,03</b>
День 2
22,9
14,84
18,98
17,01
14,18
16,04
17,33
День 5
22,61
14,89
18,2
16,61
13,79
15,72
16,97
<b>День 7</b>
<b>22,42</b>
<b>15,07</b>
<b>17,81</b>
<b>16,35</b>
<b>13,74</b>
<b>15,66</b>
<b>16,84</b>
День 9
22,85
15,56
17,9
16,89
14,5
16,39
17,35
День 12
23,15
15,91
18,24
17,19
14,92
16,89
17,72
Результаты в таблицах 3 и 4 показывают, что во время введения вольфрамата натрия не наблюдалось отклонений в массе тела или в гликемии в первые 12 дней лечения, такой же период, в течение которого успешно восстанавливалась овуляция у тестируемых мышиных самок с 7 дня лечения (см. таблицу 1).
Таким образом, результаты, представленные таблицах 1-4, показывают, что соль вольфрама (VI) является эффективным лечением для восстановления овуляции и/или увеличения имплантации ооцита, несмотря на изменения массы тела и углеводный обмен. Таким образом, показано, что введение соли вольфрама (VI), как определено в настоящем изобретении, или композиции, содержащей соль вольфрама (VI), имеет прямое воздействие на женскую репродуктивную систему и, следовательно, является эффективным для поддержания нормальной репродуктивной функции и фертильности у недиабетических самок млекопитающих.
Пример 4. Исследование внутриматочного прилипания эмбриона
А. Модель
Модель «in vitro» прилипания эмбрионов человек-человек, состоящую из клеточной линии рака эндометрия HEC1-A и клеточной линии трофобласта JEG-3, использовали для определения эффекта вольфрамата натрия на состояние имплантационной готовности.
Использование моделей in vitro и особенно модели на основе указанных клеточных линий (HEC-1A и JEG-3) считается стандартной моделью для исследования состояния имплантационной готовности и, в частности, прилипания трофобласта к эндометрию (Fertility and Sterility 2011; 96,522-529; Methods in Enzymology 2006;420:3-18 or FASEB J.201;26:3715–3727).
Клеточная линия JEG-3, которая имитирует трофэктодермальные клетки эмбриона человека, представляет собой клетки, которые растут в монослоях в лаборатории с использованием планшетов с низкой адгезией и способны формировать сфероиды, имитирующие эмбрион человека; она является одной из самых широко используемых клеточных линий для проведения анализа in vitro прилипания эмбрионов.
В. Способ
Клеточные линии приобретали коммерческим путем (American Type Culture Collection (ATCC); Rockville, MD, USA) для проведения экспериментов по прилипанию эмбрионов к эндометрию. Клетки оттаивали и размножали за 4 пассажа для получения достаточного количества клеток для выполнения всех анализов.
Клетки HEC1-A засевали на 24-луночные планшеты и культивировали с культуральной средой McCoy 5A, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки и 0,1% антибиотиков (фунгизон и пенициллин), до достижения 90% конфлюэнтности. После достижения конфлюэнтности в культуральную среду добавляли вольфрамат натрия при конечной концентрации 10 мкМ, а также витаферин А (в качестве контроля, соединение, которое предотвращает прилипание эмбриона), или в культуральную среду (исходные данные по прилипанию), не содержащую какого-либо дополнительного компонента, в течение 24 часов.
5
Клетки JEG-3 засевали в планшеты с низкой адгезией, содержащие минимальную эссенциальную среду Игла (EMEM), дополненную 10% фетальной бычьей сыворотки и 0,1% антибиотиков (фунгизон и пенициллин). За двадцать четыре часа до анализа прилипания происходило формирование из этой культуры сфероидов трофобластов JEG-3. Для этого клетки JEG-3, содержащиеся в описанной выше среде, суспендировали в колбе Эрленмейера при перемешивании при концентрации 6х10 клеток/6 мл. Полученные сфероиды собирали для анализа прилипания.
Для анализа прилипания через 24 часа после культивирования клеток HEC-1A с культуральной средой, с добавлением вольфрамата натрия, витаферина А или без добавления какого-либо агента, культуральную среду заменяли свежей культуральной средой, не содержащей агентов, подвергаемых исследованию. Трофектодермальные сфероиды добавляли на монослой клеток HEC-1A, нанося от 6 до 10 сфероидов на лунку. Прилипание сфероидов измеряли через 60 минут, подсчитывая сфероиды, которые свободно перемещались в культуральной среде в виде неприлипшего сфероида, и сфероиды, которые свободно не перемещались в виде прилипшего сфероида. Анализ проводили с помощью инвертированного микроскопа (Nikon Diaphot 300; Nikon Corp., Tokyo, Japan). Анализ проводили в трех повторах.
С. Результаты
Полученные результаты представлены в таблице 5. Более высокий процент прилипания эмбрионов наблюдался в условиях, когда линии HEC-1A обрабатывали вольфрамом натрия, по сравнению с теми, в которых они не были обработаны. Прилипания не наблюдалось в клетках, обработанных витаферином А в качестве отрицательного контроля (C-).
Таблица 5
Показатели абсолютного прилипания
Эксп. 1
Эксп. 2
Эксп. 3
Среднее
Исходное прилипание
12%
48%
31%
30%
10 мкМ вольфрамата натрия
31%
65%
35%
44%
Витаферин A (C-)
0%
0%
0%
0%
Конкретные композиции согласно изобретению
Пищевые композиции согласно изобретению приготовлены ниже в качестве примера. Они не должны рассматриваться ни в коей мере как ограничивающие объем изобретения.
Пример 5
2
4
Готовили заправку для салата, обогащенную солью вольфрама. NaWO (100 мг/кг) в количестве 25 мг добавляли в 250 грамм коммерчески доступной заправки и механически перемешивали в течение 30 минут.
Пример 6
4
Готовили соус типа кетчупа. Для этого 170 мг CaWO добавляли в 200 грамм коммерчески доступного кетчупа и механически перемешивали в течение 1 часа.
Пример 7
4
Готовили молоко, обогащенное солью вольфрама. Для этого в 1 кг цельного коровьего молока добавляли 150 мг ZnWO и механически перемешивали в течение 20 минут. Рекомендуется встряхивание упаковки непосредственно перед употреблением.
Пример 8
4
Готовили фруктовый сок, обогащенный солью вольфрама. 500 мг MgWO добавляли в 1 кг коммерческого сока и механически перемешивали в течение 10 минут. Рекомендуется встряхивание упаковки непосредственно перед употреблением.
Пример 9
Готовили таблетки, содержащие оболочку, имеющие следующий состав:
Микрокристаллическая целлюлоза РН200 (разбавитель/скользящий агент) 250,00 мг
Диоксид кремния коллоидный безводный (скользящий агент/адсорбент) 3,00 мг
Стеарат магния (смазывающее вещество) 5,00 мг
Тальк (смазывающее вещество) 7,00 мг
Opadry white (Opadry и-1-7000 White)(*) (пленочное покрытие) 8,00 мг
Вольфрамат натрия дигидрат 200,00 мг
(*) смесь гидроксипропилметилцеллюлозы, полиэтиленгликоля 6000 и диоксида титана (Е-171)
Пример 10
Готовили шипучие таблетки, имеющие следующий состав:
Сорбитол, аспартам, сукралоза и ксилитол (подсластители) 0,025 мг на 10 мг
Карбонат кальция 0,350 мг на 10 мг
Лимонная кислота (подкислитель) 0,650 мг на 10 мг
Бикарбонат натрия (регулятор кислотности) 0,350 мг на 10 мг
Вкусовая добавка апельсин 0,25 мг на 10 мг
Соль вольфрама
Пример 11
Готовили желатиновые капсулы, имеющие следующий состав:
Нифедипин 6 мг
Ксантановая камедь 6 мг
Вкусовая добавка апельсин 0,3 мг
Лимонная кислота 0,4 мг
Гелуцир 44/14 90 мг
Микрокристаллическая целлюлоза РН10 (разбавитель) 92,00 мг/капсула
Вольфрамат натрия дигидрат 100,00 мг/капсула