СПОСОБЫ ОБНАРУЖЕНИЯ МОДИФИКАЦИИ НУКЛЕОТИДОВ

1. Способ идентификации модифицированного остатка цитозина в образце нуклеотидной последовательности, включающий:
(i) обеспечение популяции полинуклеотидов, содержащих исследуемую нуклеотидную последовательность,
(ii) окисление или восстановление первой части указанной популяции,
(iii) обработку окисленной или восстановленной первой части указанной популяции и второй части указанной популяции бисульфитом,
(iv) секвенирование полинуклеотидов в первой и второй частях популяции после этапов ii) и iii) с получением первой и второй нуклеотидных последовательностей, соответственно, и
(v) идентификацию остатка в первой и второй нуклеотидных последовательностях, соответствующего остатку цитозина в исследуемой нуклеотидной последовательности.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что остатки, идентифицированные в первой и второй нуклеотидных последовательностях, указывают на модифицированный цитозин в соответствующем положении исследуемой нуклеотидной последовательности.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что модифицированный цитозин представляет собой 5-метилцитозин (5mС), 5-гидроксиметилцитозин (5hmC) или 5-формилцитозин (5fC).
4. Способ по пункту 1, отличающийся тем, что первую часть указанной популяции окисляют на этапе ii).
5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что указанное окисление обеспечивает селективное окисление остатков 5-гидроксиметилцитозина.
6. Способ по п. 4, отличающийся тем, что этап ii) включает множественные этапы окисления и очистки первой части полинуклеотидов.
7. Способ по п. 4, отличающийся тем, что указанную первую часть окисляют с использованием химического окислителя.
8. Способ по п. 4, отличающийся тем, что указанную первую часть окисляют с использованием перрутенатного окислителя.
4
9. Способ по п. 4, отличающийся тем, что указанную первую часть окисляют с использованием KRuO.
10. Способ по п. 4, отличающийся тем, что идентификация урацила в положении в первой нуклеотидной последовательности, соответствующем остатку цитозина в исследуемой нуклеотидной последовательности, и цитозина в том же положении во второй нуклеотидной последовательности указывает на то, что остаток цитозина в исследуемой нуклеотидной последовательности представляет собой 5-гидроксиметилцитозин (5hmC).
11. Способ по п. 4, отличающийся тем, что идентификация цитозина в положении в первой и во второй нуклеотидных последовательностях, соответствующем остатку цитозина в исследуемой нуклеотидной последовательности, указывает на то, что остаток цитозина в исследуемой нуклеотидной последовательности представляет собой 5-метилцитозин (5mС).
12. Способ по п. 4, отличающийся тем, что идентификация цитозина в положении в первой нуклеотидной последовательности, соответствующем остатку цитозина в исследуемой нуклеотидной последовательности, указывает на то, что остаток цитозина в исследуемой нуклеотидной последовательности представляет собой 5-метилцитозин (5mС).
13. Способ по п. 4, включающий:
vi) восстановление третьей части популяции полинуклеотидов, включающей исследуемую нуклеотидную последовательность,
vii) обработку восстановленной третьей части указанной популяции бисульфитом,
viii) секвенирование полинуклеотидов в третьей части после этапов vi) и vii) с получением третьей нуклеотидной последовательности, и
ix) идентификацию остатка в третьей нуклеотидной последовательности, соответствующего остатку цитозина в исследуемой нуклеотидной последовательности.
14. Способ по п. 13, отличающийся тем, что остатки, идентифицированные в первой, второй и третьей нуклеотидных последовательностях, указывают на модифицированный цитозин в соответствующем положении исследуемой нуклеотидной последовательности.
15. Способ по п. 13, отличающийся тем, что идентификация урацила в положении в первой и второй нуклеотидных последовательностях, соответствующем остатку цитозина в исследуемой нуклеотидной последовательности, и цитозина в указанном положении в третьей нуклеотидной последовательности указывает на то, что остаток цитозина в исследуемой нуклеотидной последовательности представляет собой 5-формилцитозин.
16. Способ по п. 1, отличающийся тем, что первую часть указанной популяции восстанавливают на этапе ii).
4
17. Способ по п. 16, отличающийся тем, что первую часть указанной популяции восстанавливают с использованием NaBH.
18. Способ по п. 16, отличающийся тем, что идентификация цитозина в положении в первой нуклеотидной последовательности, соответствующем цитозину в исследуемой нуклеотидной последовательности, и урацила в том же положении во второй нуклеотидной последовательности указывает на то, что остаток цитозина в исследуемой нуклеотидной последовательности представляет собой 5-формилцитозин.
19. Способ по п. 16, отличающийся тем, что идентификация урацила в положении в первой и второй нуклеотидных последовательностях, соответствующем цитозину в исследуемой нуклеотидной последовательности, указывает на то, что остаток цитозина в исследуемой нуклеотидной последовательности представляет собой немодифицированный цитозин.
20. Способ по п. 1, включающий:
обеспечение четвертой части популяции полинуклеотидов, включающей исследуемую нуклеотидную последовательность; и
секвенирование полинуклеотидов в четвертой части популяции с получением исследуемой нуклеотидной последовательности.
21. Способ идентификации 5-метилцитозина в исследуемой нуклеотидной последовательности, включающий:
(i) обеспечение популяции полинуклеотидов, содержащих исследуемую нуклеотидную последовательность,
(ii) окисление указанной популяции,
(iii) обработку окисленной популяции бисульфитом,
(iv) секвенирование полинуклеотидов в популяции после этапов ii) и iii) с получением обработанной нуклеотидной последовательности, и;
(v) идентификацию остатка в обработанной нуклеотидной последовательности, соответствующего остатку цитозина в исследуемой нуклеотидной последовательности,
причем присутствие цитозина в обработанной нуклеотидной последовательности указывает на то, что остаток цитозина в исследуемой нуклеотидной последовательности представляет собой 5-метилцитозин (5mС).
22. Способ по любому из пп. 1-21, отличающийся тем, что полинуклеотиды представляют собой геномную ДНК.
23. Способ по п. 22, отличающийся тем, что геномная ДНК является геномной ДНК млекопитающего.
24. Способ по любому из пп. 1-21, отличающийся тем, что полинуклеотиды представляют собой РНК.
25. Способ по п. 24, отличающийся тем, что РНК является геномной РНК, мРНК, тРНК, рРНК или некодирующей РНК.
26. Способ по п. 25, отличающийся тем, что геномная РНК является геномной РНК млекопитающего, растения или вируса.
27. Способ по любому из пп. 1-21, отличающийся тем, что популяцию полинуклеотидов или одну или более из первой, второй, третьей и четвертой частей популяции иммобилизуют.
28. Способ по любому из пп. 1-21, отличающийся тем, что одну или более из первой, второй, третьей и четвертой частей популяции амплифицируют перед секвенированием.
29. Способ по п. 28, отличающийся тем, что одну или более из первой, второй, третьей частей популяции амплифицируют после обработки бисульфитом.
30. Набор для применения в способе идентификации модифицированного остатка цитозина по любому из пп. 1-21, включающий:
(i) окислитель и/или восстановитель и
(ii) бисульфитный реагент.
31. Набор по п. 30, отличающийся тем, что окислитель является перрутенатным окислителем.
4
32. Набор по п. 31, отличающийся тем, что окислитель является перрутенатом калия (KRuO).