Модифицированная питательная среда для культивирования растений картофеля на основе агаризованной питательной среды Мурасиге-Скуга и способ выращивания растений картофеля в асептических условиях с использованием данной питательной среды
MODIFIED NUTRIENT MEDIUM FOR CULTIVATION OF POTATO PLANTS BASED ON MURASHIGE-SKOOG AGAR NUTRIENT MEDIUM AND METHOD FOR GROWING POTATO PLANTS UNDER ASEPTIC CONDITIONS USING THIS NUTRIENT MEDIUM

I
II
III
Изобретение относится к области био- и нанотехнологий высокомолекулярной химии и микробиологии в растениеводстве, конкретно к новым нанокомпозитам (НК) на основе природных полисахаридов арабиногалактана (), сульфата арабиногалактана () и κ-каррагинана () с марганецсодержащими наночастицами, а так же к способу выращивания растений с использованием НК при выращивании в асептических условиях на модифицированной агаризованной питательной среде, содержащей НК. Предлагаемое изобретение может быть компонентом многоцелевых трофических низкодозных органоминеральных удобрений, обладающих пролонгированным действием, а так же применено в качестве питательной среды, стимулирующей развитие и защиту растений и предназначенной для получения высококачественного посадочного материала сельскохозяйственных и садовых культур, используемых в аэропонных и гидропонных технологиях, при проведении биотехнологических исследований, а также для создания замкнутых систем жизнеобеспечения.
На сегодняшний день сельское хозяйство сталкивается с серьезными проблемами, связанными с необходимостью оптимального питания растений в течение вегетационного периода. Учитывая растущий спрос мирового рынка, большие усилия направлены на разработку нового поколения комплексных минеральных удобрений. Такие удобрения должны улучшать усвоение растениями микроэлементов в безопасных дозах, обеспечивать их отсроченное действие, быть устойчивыми к вымыванию микроэлементов из различных типов почв. Кроме того, каждый год поиск более эффективных и безопасных удобрений становится все более актуальной задачей, особенно в контексте изменения климата и актуальности проблем здорового питания. Применение наноматериалов в качестве микроудобрений и средств защиты растений способствует повышению устойчивости растений к неблагоприятным погодным условиям, снижению заболеваемости и усилению стрессоустойчивости, подобные органоминеральные наносистемы позволяют получать больший урожай с тех же площадей, а лучшее усвоение питательных веществ минимизирует их потери в окружающую среду.
Достижения в области разработки новых материалов и способов использования нанотехнологий для повышения эффективности сельскохозяйственного производства широко освещены в научных публикациях [J.S. Duhan, et al. "Nanotechnology: The new perspective in precision agriculture" // Biotechnology Reports, 2017, V. 15, 11-23; A. Husen, K.S. Siddiqi "Phytosynthesis of nanoparticles: Concept, controversy and application" // Nanoscale Research Letters, 2014, 9(1), 229; G.S. Nechitailo, O.A. Bogoslovskaya, I.P. Ol'khovskaya, N.N. Glushchenko "Influence of iron, zinc, and copper nanoparticles on some growth indices of pepper plants" // Nanotechnologies in Russia, 2018, V. 13, 161-167; L.R. Khot L.R., et al. "Applications of nanomaterials in agricultural production and crop protection: A review" Crop Protection, 2012, V. 35, 64-70]. Современные композиционные биоматериалы, включающие в себя металлсодержащие наночастицы, приобретают повышенную устойчивость к внешним воздействиям, изменяют растворимость, приобретают более высокую биологическую активность и др. [A.D. Pomogailo, G.I. Dzhardimalieva "Nanostructured materials preparation via condensation ways" // Science+Business Media, Dordrecht, 2014; C.N.R. Rao, A. Müller, A.K. Cheetham "The Chemistry of Nanomaterials" // Wiley-VCH, Weinheim, 2004; G.F. Prozorova, et al. "Green synthesis of water-soluble nontoxic polymeric nanocomposites containing silver nanoparticles" // Int. J. Nanomedicine. 2014, 9, 1883-1889; M.V. Lesnichaya, B.G. Sukhov, et al. "Chiroplasmonic magnetic gold nanocomposites produced by one-step aqueous method using κ-carrageenan" // Carbohydr. Polym. 2017, 175, 18-26]. Биополимерные материалы входят в число наиболее перспективных в качестве эффективных стабилизирующих матриц наноразмерных частиц металлов [Rozenberg B.A., Tenne R. "Polymer-Assisted fabrication of nanoparticles and nanocomposites" // Progress in Polymer Science. 2008, 33, 40-112; Ochsner A., Shokuhfar A. "New Frontiers of Nanoparticles and Nanocomposite Materials. Novel Principles and Techniques" // Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Heidelberg, 2013], способных формировать новейшие функциональные материалы, в том числе, для производства удобрений на основе металлсодержащих НК. В то же время, перед нанохимией стоят и такие задачи, как создание биосовместимых, безопасных и биологически легко разрушаемых наносубстанций, поэтому использование в качестве матриц природных полисахаридов более чем актуально [A.I., Nozhkina O.A., Ganenko T.V., Graskova I.A., Sukhov B.G., Artem’ev A.V., Trofimov B.A., Krutovsky K.V. Selenium nanocomposites in natural matrices as potato recovery agent. International Journal of Molecular Sciences. 2021, 22, 4576; Lesnichaya M.V., Sukhov B.G., Aleksandrova G.P., Gasilova E.R., Vakul’skaya T.I., Khutsishvili S.S., Sapozhnikov A.N., Klimenkov I.V., Trofimov B.A. Chiroplasmonic magnetic gold nanocomposites produced by one-step aqueous method using κ-carrageenan. Carbohydrate Polymers. 2017, 175, 18-26; Ganenko T.V., Tantsyrev A.P., Sapozhnikov A.N., Khutsishvili S.S., Vakul’skaya T.I., Fadeeva T.V., Sukhov B.G., Trofimov B.A. Nanocomposites of silver with arabinogalactan sulfate: Preparation, structure, and antimicrobial activity. Russian Journal of General Chemistry. 2015, 85, 477-484].
Clavibacter michiganensis
Cms
Наноматериалы, используемые в различных приемах оздоровления и культивирования посадочного материала, являются перспективным направлением и предназначены для стимулирования роста растений при выращивании в условиях открытого или защищенного грунта. В то же время, современное развитие биотехнологий неразрывно связано с выращиванием растений на искусственных питательных средах, имеющих сбалансированный состав питательных компонентов, необходимых для полноценного роста и развития растений в большом количестве, особенно, трудно размножаемых в обычных условиях форм растений. Большое значение имеет применение искусственных питательных сред при разработке автономных систем жизнеобеспечения, например, в условиях длительных космических полетов. Все это предполагает использование высокотехнологичных приемов, совершенствование техники культивирования растений на основе безопасных и биоразлагаемых материалов с целью получения посадочного материала свободного от различных фитопатогенов. А значит, важной характеристикой является получение многоцелевых нанокомпозитов, ингибирующих образование биопленок и проявляющих антимикробное действие в отношении фитопатогенов, но в то же время безопасных для представителей почвенной микрофлоры. Так, бактерия  () в большинстве стран мира является карантинным объектом и вызывает серьезные потери урожая (около половины) [Eichenlaub R., Gartemann K.-H. "The Clavibacter michiganensis subspecies: Molecular investigation of gramm-positive bacterial plant pathogens" // Annual Review, Phytopathology, 2011, V. 49, 445-464; Li X., Tambong J., Yuan K.X., Chen W., Xu H., Lévesque C.A., De Boer S.H. "Re-classification of Clavibacter michiganensis subspecies on the basis of whole-genome and multi-locus sequence analyses" // International Journal of Systematic Evolutinary Microbiology, 2018, V. 68, 234-240]. Инфекция носит латентный характер и проявляется в виде вилта и пожелтения стеблей в период вегетации. Обнаружить ее можно только при продольном разрезе клубня в виде кольца, при этом внешне клубень, используемый в виде семенного материала, может выглядеть абсолютно здоровым. Проблема обостряется отсутствием эффективных методов борьбы с этой бактерией, все меры являются только превентивными и связаны с обработкой инвентаря и ручном удалении с полей больных растений. Поэтому поиск агента для регуляции численности этого патогена чрезвычайно важен. Не менее актуальным является поиск экологически безопасных веществ, используемых для оздоровления культурных растений. Поэтому существенной характеристикой новых нанокомпозитов становится их воздействие на окружающую среду, в частности, на жизнеспособность представителей почвенной микрофлоры.
Известно изобретение [RU 2601757 C1, дата опубликования 10.11.2016], которое может быть использовано в сельском хозяйстве в качестве композиции, обладающей антимикробным и антитоксическим действием и содержащее бинарную смесь коллоидного раствора наноструктурных частиц серебра с размером частиц 2-100 нм, стабилизатор и растворитель. Для получения композиции в качестве растворителя используют неполярный растворитель из группы предельных углеводородов или воду. В качестве стабилизатора композиция содержит водный раствор гидросодержащего полимера. Композиция дополнительно содержит раствор гидрофобизатора на основе кремнийорганических соединений в виде силоксанов или силиконатов в водной дисперсии или в неполярном растворителе. Изобретение позволяет получить экологически безопасные стабильные бинарные коллоидные смеси, обладающие высокой биологической активностью. Недостатком изобретения является использование в предложенном способе недешевого компонента в виде наночастиц серебра, кроме того наночастицы будут проявлять цитотоксическое действие и в отношении естественного микробиома.
Описаны наноудобрения в форме металлических наночастиц [WO 2013121244 A1, дата опубликования 22.08.2013], на которые нанесено покрытие веществами, представляющими собой питательные микродобавки или их предшественники. Согласно изобретению, в качестве питательной микродобавки, служащей покрытием для наночастиц, может быть использован, по крайней мере, один компонент из широкого круга веществ, включающего соединения углерода, фосфора, азота, бора и других элементов, необходимых для питания и развития растений, а также соли, хелаты и оксиды металлов, и другие соединения. Так же, как и в предыдущем аналоге, в данном техническом решении используются наночастицы дорогих благородных металлов, таких, как серебро, золото, платина и др., которые использованы в качестве «средства доставки» микроудобрения в ткани и клетки растений, в свою очередь их самостоятельную роль в качестве питательного агента оценить затруднительно.
В изобретении, описанном в [ЕР 2499107 А1, дата опубликования 19.09.2012], предлагается способ выращивания растений с использованием наночастиц, сущность которого состоит в применении мультислойных углеродных нанотрубок в эффективной концентрации 10-200 пг/мл для увеличения всхожести семян томата и увеличения зеленой массы растений. Растения томата, выращенные на питательной среде в присутствии углеродных нанотрубок, имеют больший объем биомассы в сравнении с контролем, при этом отличаются от контроля по более развитой корневой системой. Улучшение показателей авторы связывают с увеличением интенсивности процессов водопоглощения семян в присутствии углеродных нанотрубок. Однако известно, что углеродные нанотрубки, подобно асбесту, способны проникать в организм человека через кожу и носоглотку и разрушать клетки, оказывать канцерогенное действие. Поэтому для внедрения углеродных трубок в сельское хозяйство и садоводство необходимы тщательные токсикологические исследования по накоплению и выведению их из растений, а также дополнительное изучение воздействия подобных наносубстанций на организм человека, что делает маловероятным их применение в растениеводстве в ближайшем будущем.
Наиболее близким аналогом является изобретение с использованием НК со стабилизированными наночастицами [US 20110123589 A1, дата опубликования 26.05.2011]. В этом изобретении описаны нанокомпозитные материалы в виде трехмерной структуры, образованной полимерной матрицей, состоящей из полисахаридной композиции нейтральных или анионных полисахаридов и разветвленных катионных полисахаридов, в которой равномерно диспергированы и стабилизированы металлические наночастицы. Получение наноразмерных композитных материалов на основе гидратированных полисахаридных композиций в виде гидрогелей или в негидратированной форме, образованных моно- или олигосахаридными разветвленными производными хитозана с лактозой. В качестве наполнителя выбраны наночастицы металлов серебра, золота, платины, палладия, меди, цинка, никеля и их смесей. Показано, что полученные композиции обладают широким спектром сильной бактерицидной активности, связанные с наноразмерностью металлических частиц и наличием биологической активности оригинальной матрицы, но не проявляют цитотоксичности. Гели на основе полученных нанокомпозитов протестированы как на грамотрицательных штаммах (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa), так и на грамположительных штаммах (Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis). Тесты на цитотоксичность на различных эукариотических клеточных линиях (остеобласты (MG63), гепатоциты (HEPG2) и фибробласты (3T3)) показывают, что эти трехмерные нанокомпозитные гели не являются цитотоксичными, даже сохраняя эффективное бактерицидное действие. Предлагаемые композиции могут быть использованы при разработке биоматериалов нового поколения, обладающих противомикробными свойствами, и для многих других применений в биомедицинской, фармацевтической и пищевой продукции. Однако, как и в описанных выше аналогах, в предложенном изобретении используются дорогие металлы - серебро, золото, платина и др., а используемый в качестве матрицы хитозан плохо растворим в воде. Кроме того, использование в пищевой промышлености таких бактерицидных наноматериалов по отношению к бактериальным фитопатогенам может навредить и естественному микробиому. Указанный размер наночастиц в используемых композициях находится в диапазоне от 5 до 150 нм с контролируемым средним размером в пределах от 30 до 50 нм, что с отсутствием узкой дисперсии не позволяет получить композит в качестве действительно эффективного антибактериального средства, так как известно, что наночастицы наименьшего размера, около 10 нм, показывают наибольшую антибактериальную активность [Raza M.A., Kanwal Z., Rauf A., Sabri A.N., Riaz S., Naseem S. "Size- and shape-dependent antibacterial studies of silver nanoparticles synthesized by wet chemical routes" // Nanomaterials (Basel, Switzerland), 2016, V. 6 (4), 74].
По совокупности признаков, в качестве прототипа принято изобретение [WO 2017101691 A1, дата опубликования 22.06.2017], в котором описан способ выращивания растений с использованием наночастиц, путем проращивания семян и последующего выращивания растений в асептических условиях на агаризованной питательной среде, содержащей наночастицы. Для осуществления способа используется агаризованная питательная среда Мурасиге-Скуга, которая в качестве наночастиц содержит наночастицы железа, цинка или меди, или комбинацию наночастиц железа, цинка и меди. Однако, используемые в изобретении наночастицы, не имеют покрытия, которое предотвращало бы агрегацию наночастиц в более крупные агломераты, замедляло вымывание микроэлементов из почвы, не создавая тем самым дополнительную экологическую нагрузку.
Задачей настоящего изобретения является создание многофункциональных нанотехнологичных материалов, пригодных для применения в качестве микроудобрений и средств защиты растений, обеспечивающих улучшение биометрических и/или физиологических показателей растений, способствующих лучшему усвоению растениями микроудобрений в безопасных дозах, которые обладали бы замедленным действием (устойчивостью к вымыванию микроэлементов для различных типов почв), стимулирующих стрессоустойчивость растений и проявляющих выраженное антибактериальное действие в отношении фитопатогеных бактерий. Разработка способа применения таких НК с целью получения оздоровленного высококачественного посадочного материала.
Поставленная задача решается использованием соединений, представляющих собой марганецсодержащие НК на основе полисахаридов, и способом выращивания растений в асептических условиях на модернизированной питательной среде, в которой в качестве питательного агента используются НК с марганецсодержащими наночастицами.
2
2
Cms
Для реализации настоящего изобретения предлагаются органоминеральные комплексы, представляющие собой водорастворимые соединения на основе природного полисахарида арабиногалактана, сульфатированного арабиногалактана или κ-каррагинана, которые стабилизируют марганецсодержащие наночастицы Mn(OH)×nHO со средним распределением 3-9 нм и представляют собой многофункциональное средство с антимикробной активностью в отношении фитопатогена , но безопасной для представителей почвенной микрофлоры, стимулируют развитие и стрессоустойчивость растений картофеля Solanum tuberosum L., а так же способ выращивания растений с использованием НК в асептических условиях на модифицированной агаризованной питательной среде. При этом марганец входит в состав питательной среды в форме НК, состоящего из наночастиц в композиционном материале (матрице), в свою очередь используемые матрицы - нетоксичные, биоразлагаемые и водорастворимые природные полисахариды. В качестве исходной основы питательной среды, для осуществления заявляемого способа, выбрана широко применяемая питательная среда по прописи Мурасиге-Скуга, которая содержит все необходимые компоненты для развития растений, а именно витамины, углеводы и аминокислоты, белковые гидролизаты, неорганические соли, а так же макро- и микроэлементы.
Достоинствами предлагаемого изобретения является использование простых и экологичных соединений: марганецсодержащие наночастицы стимулируют стрессоустойчивость растений за счет антиоксидантного действия, ингибируют образование биопленки и проявляют антимикробную активность; доступные природные полисахариды (содержание арабиногалактана в лиственнице Larixsibirica Ledeb. до 15%, κ-каррагинан содержится в широко распространенных красных морских водорослях), нетоксичны и хорошо растворимы в воде. Полисахаридная матрица выполняет роль гелеобразующего связывающего агента, препятствует вымыванию микроэлемента из почвы и постепенно высвобождает марганец для усвоения его растениями. Включение НК в состав агаризованной питательной среды позволяет культивировать посадочный материал свободный от фитопатогенов. Изобретение обеспечивает улучшение прорастания семян, а так же получение посадочного материала с улучшенными морфометрическими и/или физиологическими показателями. Способ может быть реализован в автономных системах жизнеобеспечения, например, в условиях длительных космических полетов.
4
Для синтеза нанокомпозитов использовался арабиногалактан, полученный из лиственницы сибирской Larixsibirica Ledeb. компании Wood Chemistry Ltd. (Иркутск, Россия). В свою очередь сульфатированный арабиногалактан получен функционализацией исходного арабиногалактана по описанной методике в патенте [RU 2319707 C1, дата опубликования 20.03.2008]. Полисахарид κ-каррагинан получен из красных морских водорослей компанией CP Celco Comp. (Лилль Скенсвед, Дания). НК могут быть синтезированы в соответствии со следующей процедурой: водные растворы сульфата марганца от 0.30 до 0.69 г (в 2 или 3 мл воды) добавляют к водному раствору полисахарида при интенсивном перемешивании на магнитной мешалке, добавляют 0.1-0.3 мл NHOH (и 0.2 мл гидразина в случае арабиногалактана) и оставляют при комнатной температуре в течение 3-24 часов. Раствор фильтруют и целевые продукты выделяют высаживанием фильтрата в этанол, осадок отфильтровывают и сушат в вакууме. Содержание марганца в полученных образцах, определенное методом элементного анализа и атомно-абсорбционного анализа, в зависимости от условий реакции и используемой матрицы варьируется в пределах 4.8-20.3%. По данным просвечивающей электронной микроскопии размер наночастиц варьируется в диапазоне 2-20 нм со средним распределением 3-9 нм (Фиг. 1).
I
II
III
I
III
III
III
I
III
II
II
III
I
III
I
III
I
III
Cms
Cms
A. guillouiae
R. erythropolis
P. oryzihabitans
Результаты проведенных исследований демонстрируют отсутствие отрицательного влияния НК на развитие растений, биометрические показатели сравнимы или превосходят контрольные образцы. У растений, выращенных на средах с внесением нанокомпозитов  или , корневая система развита обширно, желтые листья отмечены лишь у 10% растений. Наиболее жизнеспособны растения в варианте с . Все НК (-) стимулируют стрессоустойчивость растений картофеля. Выраженным антирадикальным действием из ряда исследуемых веществ обладает . Обработка  инфицированных растений снижает содержание в тканях диеновых коньюгатов (ДК) и малонового диальдегида (МДА), свидетельствующих об интенсивности разрушающих процессов под воздействием активных форм кислорода (АФК). Антибактериальный эффект по отношению к фитопатогенной бактерии  проявляется у всех НК (-). Выраженное негативное влияние на прирост бактерий выявляется при внесении  с концентрацией марганца 0.00625%. Максимальное количество мертвых клеток отмечено в образцах  и  в концентрациях 0.00625%. Проведенные исследования показали, что НК изменяют морфологию бактериальных клеток . После инкубации бактерий с - разрушается их клеточная стенка, наблюдается выход содержимого клетки наружу, что приводит к гибели патогенной бактерии. У всех НК - наблюдается отсутствие бактерицидного эффекта на рост ризосферных бактериальных культур ,  и , и, таким образом, НК - безопасны для представителей естественного почвенного микробиома.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Физико-химические исследования выполнены в Химическом исследовательском центре коллективного пользования СО РАН (Новосибирский институт органической химии им. Н.Н. Ворожцова СО РАН) и Байкальском аналитическом центре коллективного пользования (Иркутский институт химии им. А.Е. Фаворского СО РАН). Биологические исследования выполнены с использованием коллекций Биоресурсного центра коллективного пользования (Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН).
Пример №1. Синтез нанокомпозита на основе арабиногалактана (I).
2
4
2
2
I
g
H
A
B
N
20
-1
2.0 г арабиногалактана (18 кДа) растворяли в 5 мл НO, к полученному раствору добавляли 0.40 г сульфата марганца MnSO×5НO в 3 мл НO и при перемешивании на магнитной мешалке добавляли 0.1 мл NH4OH и 0.2 мл гидразина. Через 3 ч перемешивания реакционную смесь высаживали в спирте. Выделение и очистку продукта проводили высаживанием фильтрата в этанол с дальнейшим отделением осадка и высушиванием. Выход продукта  составил 1.68 г, содержание в нем марганца 5.2%. ЭПР-спектр:  = 2.090, Δ = 550 Гс, / = 0.7,  = 10 спин/г. ИК-спектр (ν, см): 3425, 2924, 2151, 2071, 1713, 1634, 1423, 1367, 1225, 1152, 1079, 1044, 885, 776, 711, 606, 570, 534, 424.
Пример №2. Синтез нанокомпозита на основе сульфатированного арабиногалактана (II).
2
4
2
2
4
II
g
H
A
B
N
20
-1
2.0 г сульфатированого арабиногалактана (22 кДа) растворяли в 6 мл НO, к полученному раствору добавляли 0.30 г сульфата марганца MnSO×5НO в 2 мл НO и при перемешивании на магнитной мешалке добавляли 0.2 мл NHOH. Через 4 ч перемешивания реакционную смесь высаживали в спирте. Выделение и очистку продукта проводили высаживанием фильтрата в этанол с дальнейшим отделением осадка и высушиванием. Выход продукта  составил 1.80 г, содержание в нем марганца 4.8%. ЭПР-спектр:  = 2.060, Δ = 220 Гс, / = 0.8,  = 10 спин/г. ИК-спектр (ν, см): 3427, 3264, 3072, 2927, 2897, 2484, 2052, 1705, 1633, 1470, 1433, 1375, 1357, 1214, 1134, 1081, 894, 772, 711, 616, 579, 427.
Пример №3. Синтез нанокомпозита на основе κ-каррагинана (III).
2
4
2
2
4
III
g
H
A
B
N
20
-1
3.0 г κ-каррагинана (1100 кДа) выдерживали при перемешивании в 150 мл НO при нагревании 50°С до гомогенной среды, к полученному раствору добавляли 0.69 г сульфата марганца MnSO×5НO в 3 мл НO и 0.3 мл NHOH. Через 24 ч реакционную смесь высаживали в спирте. Выделение и очистку продукта проводили высаживанием фильтрата в этанол с дальнейшим отделением осадка и высушиванием. Выход продукта  составил 2.40 г, содержание в нем марганца 20.3%. ЭПР-спектр:  = 2.060, Δ = 240 Гс, / = 1.0,  = 10 спин/г. ИК-спектр (ν, см): 3438, 2958, 2921, 2084, 1698, 1635, 1423, 1375, 1261, 1233, 1194, 1149, 1119, 1082, 975, 931, 845, 770, 733, 702, 611, 553, 446.
I
II
III
Фиг. 1. Микрофотографии просвечивающей электронной микроскопии нанокомпозитов (A) , (B)  и (C)  и гистограммы с распределением марганецсодержащих наночастиц по размерам.
Пример №4. Модификация питательной среды Мурасиге-Скуга с использованием НК I-III
4
2
2
2
I, II
III
κ
Питательная среда, готовится на основе широко применяемой стандартизованной агаризованной питательной среды по прописи Мурасиге-Скуга, которая содержит все необходимые компоненты для развития растений, а именно витамины, углеводы и аминокислоты, белковые гидролизаты, неорганические соли, а так же макро- и микроэлементы. Все компоненты готовятся и вносятся в соответствии с необходимыми концентрациями, согласно процедуре для приготовления питательной среды по прописи [Murashing Т., Skoog F. "А received medium for rapid growth and bio-assays with tobacco tissue culture" // Physiologia Plantarum, 1962, V. 15, 473-497]. При этом марганец вносится в питательную среду не в ионной форме (в виде раствора соли кристаллогидрата сульфата марганца MnSO×5HO (24.1 г/л)), а в виде НК ( или ) на основе природных полисахаридов арабиногалактана, сульфатированного арабиногалактана или -каррагинана с марганецсодержащими наночастицами Mn(OH)×nHO со средним распределением 3-9 нм. Синтезированный НК растворяется в воде при перемешивании магнитной мешалкой до полного растворения, фильтруется и далее добавляется в питательную среду. Количество НК берется из расчета необходимого содержания марганца в среде в соответствии с прописью (в пересчете на массовое количество элементного марганца необходимого для внесения в среду - 5.49 г/л) и исходя из массовой доли металла в НК.
Пример №5. Исследование стимулирования развития растений в присутствии нанокомпозитов.
in vitro
Для исследования развития растений в присутствии нанокомпозитов использовались  растения картофеля сорта "Лукьяновский", восприимчивого к биотическим стрессам [Romanenko A.S., Riffel A.A., Graskova I.A., Rachenko M.A. "The role of extracellular pH-homeostasis in potato resistance to ring rot pathogen" // Journal of Phytopathology, 1999, V. 147, 679-686]. Для изучения влияния на вегетацию и продуктивность растений, осуществляли культивирование растений картофеля в факторостатных условиях на питательной среде Мурасиге-Скуга модифицированной марганецсодержащими НК на основе природных полисахаридов.
4
2
Для контрольных образцов марганец в агаризованную питательную среду вносился в виде кристаллогидрата сульфата марганца MnSO×5HO в количестве, согласно прописи питательной среды Мурасиге-Скуга. Результаты подвергали статистическому анализу с использованием пакета статистических надстроек MS Excel, сравнение с контролем оценивали по критерию Манна-Уитни.
Черенки высаживали на глубину междоузлия в агаризованную питательную среду и культивировали 28 суток в факторостатных условиях при температуре 24-25°С, освещенности 5-6 кЛк и продолжительности фотопериода 16 ч, периодически замеряя длину и подсчитывая количество листьев. По окончании эксперимента определяли биомассу надземной части и биомассу корней, проводили физико-химические анализы растительного материала. Независимые эксперименты были выполнены в трех повторностях, в каждом варианте выращивали по десять растений. Для физико-химических экспериментов использовали по три растения из каждого варианта.
I
II
III
II
III
2+
g
Результаты эксперимента показали отсутствие отрицательного влияния НК на развитие картофеля, биометрические показатели сравнимы или превосходили контрольные образцы (Фиг. 2 и 3). На 28 сутки инкубации у контроля корневая система зачастую была хорошо развита, отмечены единичные растения с каллусом, появлялись завядшие и желтоватые листья. У растений, выращенных на средах с внесением нанокомпозитов  или , корневая система была развита обширно, желтые листья отмечены лишь у 10% растений. Наиболее жизнеспособными оказались растения в варианте с . Они имели хорошо развитую корневую систему, количество завядших и желтых листьев у картофеля этого варианта было меньше в сравнении с контролем, каллус не отмечен. Исследования методом ЭПР показали, что во всех тканях растений (корни, стебли, листья), выращенных в среде с марганецсодержащими нанокомпозитами, также как и в контроле наблюдается характерный мультиплет от ионов марганца Mn. Спектральные характеристики сигналов (-фактор в области 2.0031(2), константа (A) 94(2) Гс) практически идентичны сигналам, наблюдаемым в спектрах биоматериалов растений контроля. Сравнение с контролем показывает близкие значения по содержанию марганца в органах растения (Таблица 1). При этом НК стимулировали развитие растений, максимальным эффектом обладали нанокомпозиты и . Внесение их в среду культивирования картофеля стимулировало развитие мощной корневой системы.
I
II
III
Фиг. 2. Динамика биометрических показателей длины растений (A) и количества листьев (B) в контроле и растениях, выращенных на питательной среде с нанокомпозитами; 1 - контроль, 2 - без сульфата марганца в среде, 3 - , 4 - , 5 - ; * p ≤ 0.05 и ** p ≤ 0.01 по сравнению с контролем по критерию Манна-Уитни.
I
II
III
Фиг. 3. Масса вегетативной части растений (A) и биомасса корней (B) в контроле и растениях, выращенных на питательной среде с нанокомпозитами; 1 - контроль, 2 - без сульфата марганца в среде, 3 - , 4 - , 5 - ; * p ≤ 0.05 и ** p ≤ 0.01 по сравнению с контролем по критерию Манна-Уитни.
Таблица 1. Аккумуляция марганца (wt.% ±SD) в растениях, выросших на среде с нанокомпозитами (<b>I-III</b>) в сравнении с контролем.
Корни
Стебли
Листья
Контроль
0.17 ± 0.03
0.19 ± 0.04
0.20 ± 0.13
I
0.28 ± 0.10*
0.27 ± 0.01*
0.24 ± 0.20
II
0.05 ± 0.04*
0.16 ± 0.11
0.17 ± 0.13
III
0.29 ± 0.11*
0.38 ± 0.13*
0.24 ± 0.11
p
*  ≤ 0.01 по сравнению с контролем по критерию Манна-Уитни.
Пример №6. Исследование стрессоустойчивости растений.
I
III
Cms
in vitro
2+
Для оценки наличия стрессового состояния растений под влиянием нанокомпозитов - были исследованы следующие биохимические показатели: активность пероксидазы в тканях листьев картофеля, содержание АФК и количество продуктов перексиного окисления липидов (ПОЛ) - ДК и МДА в тканях корней и листьев. Для выявления участков продукции АФК растения заражали , выдерживали 4 суток, затем обрабатывали нанокомпозитом и через 1 ч совместной инкубации готовили образцы для анализа. Образцы корневой ткани растений инкубировали в течение 30 минут с 5 мкМ реагента CellROX Deep Red (абс./эм.м. 644/665 нм) (Thermo Fisher Scientific Inc., Уолтем, Массачусетс, США), растворенного в фосфатном буфере. Затем ткань фиксировали 2% параформальдегидом в течение 15 мин. Полученные препараты заливали антифейдерным реагентом ProLong Gold (Thermo Fisher Scientific Inc., Уолтем, Массачусетс, США) и исследовали с помощью лазерного конфокального сканирующего микроскопа (ЛКСМ) CLSM 710 (Carl Zeiss, Йена, Германия). В исследовании использовались лазеры 405, 561 нм и фильтры Ch1 410-522. Содержание АФК в корнях картофеля определяли спектрофотометрически с использованием красителя ксиленолового оранжевого [Bindschedler L.V., Minibayeva F., Gardner S.L., Gerrish C., Davies D.R., Bolwell G.P. "Early signaling events in apoplastic oxidative burst in suspension cultured french bean cells involve camp and Ca" // New Phytologist, 2001, 151, 185-194]. Определение первичных продуктов ПОЛ и ДК в тканях растений картофеля проводили по стандартной методике с использованием гексана и изопропанола через 30 и 60 мин после добавления раствора нанокомпозита в питательную среду картофеля  [Revin V.V., Gromova N.V., Revina E.S., Samonova A.Yu., Tychkov A.Yu., Bochkareva S.S., Moskovkin A.A., Kuzmenko T.P. "The influence of oxidative stress and natural antioxidants on morphometric parameters of red blood cells, the hemoglobin oxygen binding capacity, and the activity of antioxidant enzyme" // BioMed Research International, 2019, 2019, 2109269]. Концентрацию МДА определяли по методике с использованием 20% трихлоруксусной кислоты и 0.5% раствора тиобарбитуровой кислоты [Heath R.L., Packer L. "Photoperoxidation in isolated chloroplasts. Kinetics and stoichiometry of fatty acid peroxidation" // Archives of Biochemistry and Biophysics, 1968, 125, 189-198]. Активность пероксидазы в тканях картофеля определяли по методу Бояркина [Sharlaeva E.A., Chirkova V.Yu. "The impact of short-wave UV radiation on peroxidase activity in soft wheat seeds" IOP Conference Series: Earth and Environmental Science, 2021, 670, 012008]. Результаты подвергали статистическому анализу с использованием пакета статистических надстроек MS Excel, сравнение с контролем оценивали по критерию Манна-Уитни.
III
I
II
Активность гвоякол зависимой пероксидазы определяли по методу Бояркина в конце периода коинкубации растений с нанокомпозитами (Фиг. 4). Было обнаружено достоверное увеличение активности пероксидазы по сравнению с контролем при выращивании растений на среде, содержащей . Влияние нанокомпозитов  и  на активность фермента не выявлено.
Для оценки наличия стрессового состояния у растений под влиянием заражения, после обработки нанокомпозитами и заражения в комплексе с нанокомпозитами, на первом этапе биохимических исследований было изучено содержание АФК в тканях корня растений картофеля (Фиг. 5), которые запускают каскад защитных программ в клетке, а также способны вызывать перекисное окисление липидов (ПОЛ).
Cms
III
III
II
I
I
II
III
II
III
Продуктами повреждающего действия АФК на живые клетки растений на первом этапе являются ДК. Поэтому были проведены серии исследований по оценке количества ДК в тканях корней и листьев картофеля при исследуемых стрессовых факторах (Фиг. 6). Было обнаружено, что заражение картофеля  приводит к повышению содержания ДК, промежуточных продуктов ПОЛ, как в тканях корня, так и в листьях по сравнению с контролем. В случае  увеличивалось количество ДК в тканях корня, при этом в листьях этот показатель оставался на уровне контроля. Внесение  к уже инфицированным растениям снижало содержание ДК как в тканях корня, так и в листьях картофеля, что свидетельствует о снижении интенсивности процессов ПОЛ. Обработка здоровых растений нанокомпозитом  не влияла на уровень ДК. Внесение этого композита к инфицированным растениям снижало количество ДК в тканях корня и листьев по сравнению с инфицированными растениями без обработки нанокомпозитом. В наибольшей степени этот эффект был выражен при исследовании образцов, полученных из корней растений. Обнаружено, что  в 2 раза по сравнению с контролем повышал содержание ДК в тканях корней картофеля, при этом в тканях листьев наблюдался обратный эффект, отмечено снижение ДК. Внесение композита  к инфицированным растениям приводило к значительному повышению количества ДК в тканях корня и снижению в листьях по сравнению с зараженными растениями без обработки НК. Таким образом, все исследуемые НК снижали количество ДК в тканях листьев зараженных растений,  и  также снижали количество ДК в тканях корней. Полученный результат свидетельствует о снижении стрессовой нагрузки на растение под влиянием  и .
Cms
Cms
III
III
II
I
I
III
Если стрессовая нагрузка на растительный организм не прекращается, или даже усиливается, в клетках начинает образовываться конечный продукт перекисного окисления МДА, поэтому на следующем этапе было изучено его содержание в тканях картофеля (Фиг. 7). Было обнаружено, что при инфицировании растений патогеном  содержание МДА возрастало как в корнях, так и в листьях. Обработка композитом  свободных от инфекции растений значительно снижала количество МДА как в тканях корня, так и в тканях листьев. Обработка  инфицированных растений приводило к понижению уровня МДА в исследуемых тканях до контрольного значения. Композит  не оказывал эффекта на количество МДА как в корнях, так и в листьях. Однако у зараженных растений значительно увеличивал количество МДА в листьях. Композит  выраженно уменьшал количество МДА в тканях корней, как здоровых, так и инфицированных растений картофеля. В тканях листьев  повышал содержание МДА при заражении . Полученный результат показывает, что выраженным антирадикальным действием из ряда исследуемых веществ обладает , обработка им инфицированных растений снижала содержание в их тканях ДК и МДА, свидетельствующих об интенсивности разрушающих процессов под воздействием АФК.
in vitro
I
II
III
Фиг. 4. Влияние нанокомпозитов на пероксидазную активность растений картофеля по сравнению с контрольной группой ; 1 - контроль, 2 - без сульфата марганца в среде, 3 - , 4 - , 5 - . Обработка нанокомпозитом не отличались от контроля по критерию Манна-Уитни.
Cms
Cms
I
I
Фиг. 5. Микрофотографии ЛКСМ влияния нанокомпозитов на продукцию АФК и соответствующие данные о количестве АФК в тканях корня в контроле (A), инфицированных  (B), обработанных нанокомпозитом  (C), обработанных нанокомпозитом  и инфицированных  (D); * p ≤ 0.01 по сравнению с контролем по критерию Манна-Уитни.
in vitro
Cms
Cms
Cms
Cms
Cms
I
I
II
II
III
III
Фиг. 6. Влияние нанокомпозитов на содержание ДК в листьях (A) и корнях (B) картофеля по сравнению с контрольной группой , а также в растениях, инфицированных возбудителем ; 1 - контроль, 2 - растения, зараженные , 3 -  без , 4 - зараженные растения в присутствии , 5 -  без , 6 - зараженные растения в присутствии , 7 -  без , 8 - инфицированные растения в присутствии ; * p ≤ 0.01 по сравнению с контролем по критерию Манна-Уитни.
in vitro
Cms
Cms
Cms
Cms
Cms
I
I
II
II
III
III
Фиг. 7. Влияние нанокомпозитов на содержание МДА в листьях (A) и корнях (B) картофеля по сравнению с контрольной группой , а также в растениях, инфицированных возбудителем ; 1 - контроль, 2 - растения, зараженные  без нанокомпозитов, 3 -  без , 4 - зараженные растения в присутствии , 5 -  без , 6 - зараженные растения в присутствии , 7 -  без , 8 - инфицированные растения в присутствии ; * p ≤ 0.01 по сравнению с контролем по критерию Манна-Уитни.
Пример №7. Определение антибактериального эффекта марганецсодержащих нанокомпозитов I-III.
I-III
Cms
Cms
Для этого проводилась серия экспериментов по изучению влияния  на жизнеспособность бактерии - возбудителя кольцевой гнили картофеля . Использовалась грамположительная бактерия , вызывающая заболевание кольцевой гнили картофеля (штамм Ас-14 05, полученный из Всероссийской коллекции микроорганизмов). Бактерии культивировали на среде GPY [Roozen N.J.M., Van Vuurde J.W.L. "Development of a semi-selective medium and an immunofluorescence colony-staining procedure for the detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in cattle manure slurry" // Netherlands Journal of Plant Pathology, 1991, V. 97, 321-334], содержащей дрожжевой экстракт 5 г/л ("Sigma", США), глюкозу 5 г/л ("Диаэм", Россия), пептон 10 г/л ("Sigma", США), NaCl 5 г/л ("НеваРеактив", Россия) и агар 7 г/л ("Диаэм", Россия). Для поддерживания культуры пробирки со скошенной агаризованной средой помещали в термостат (при температуре 25°С). Для эксперимента колонию бактерий перемещали с твердой питательной среды в жидкую, выращивали в течение 2 суток.
В колбы с бактериальной суспензией (оптическая плотность D = 0.9) вносили 0.05%-ный водный раствор нанокомпозитов и их предшественников. Предварительно растворы исследуемых агентов подвергали холодной стерилизации (насадка шприцевая "Minisart NML", размер пор 0.22 мкм). Концентрация действующего вещества была равной для всех агентов и составляла 0.000625% и 0.00625% (в расчете на массовое количество марганца вещества-предшественника). При выборе действующих концентраций ориентировались на используемые концентрации для селеносодержащих нанокомпозитов на основе полисахаридов [Perfileva A.I., Nozhkina O.A., Graskova I.A., Sidorov A.V., Lesnichaya M.V., Aleksandrova G.P., Dolmaa G., Klimenkov I.V., Sukhov B.G. "Synthesis of selenium and silver nanobiocomposites and their influence on phytopathogenic bacterium Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus" // Russian Chemical Bulletin, 2018, V. 67, 157-163], концентрация увеличенная в 10-кратной дозе 0.00625% использовалась для изучения случаев локальной законцентрированности вещества в питательном субстрате. Для исследования бактериостатической активности нанокомпозитов в отношении бактерий жидкую культуру микроорганизмов выращивали в темноте при 26°С в аэрируемых условиях (80 об/мин) в колбах, содержащих питательную среду. После внесения композитов проводили измерение оптической плотности суспензии при 595 нм на планшетном спектрофотометре Bio-Rad spectrophotometer model 680 (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA) сразу и через 2, 4, 24, 28, 48, 48, 52 и 72 ч коинкубации. Выявление бактерицидного эффекта нанокомпозитов осуществлялась с применением метода кругов (метода диффузии в агар) [Sagdic O., Aksoy A., Ozkan G. "Evaluation of the antibacterial and antioxidant potentials of gilaburu (Viburnum opulus L.) fruit extract" // Acta Alimentaria, 2006, V. 35, 487-492].
Влияние нанокомпозитов на биопленкообразование бактерий исследовалось с применением планшетного метода. Микроскопия выполнялась с применением окрашивания мертвых клеток красителем пропидий йодид в конечной концентрации 7.5 мкМ ("Biotium", США) [Yamori W., Kogami H., Masuzawa T. "Freezing tolerance in alpine plants as assessed by the FDA-staining method" // Polar Bioscience, 2005, V. 18, 73-81], процессе эксперимента бактериальные клетки подвергаются инкубации с нанокомпозитами в течение 24 ч. Исследование бактерий осуществлялось на инвертированном флуоресцентном микроскопе AxioObserver Z1 ("Carl Zeiss", Германия). Микрофотографии получали камерой AxioCam MRm3 и обрабатывались с помощью программного обеспечения AxioVision Rel.4.8.2.
Cms
Бактерии  после инкубации с нанокомпозитами в течение 1 суток фиксировали в 2.5%-ном растворе глутарового альдегида на 0.1 М фосфатном буфере (pH 7.4) 1 ч, промывали тем же буфером, дофиксировали 2%-ным раствором четырехокиси осмия (1-3 ч) и заливали в эпоксидную смолу. Срезы изготавливали на ультрамикротоме Ultracut R (Leica), которые после контрастирования в цитрате свинца и исследовались с помощью просвечивающего электронного микроскопа Leo 906 E.
II
II
I
III
Cms
Cms
Результаты показали (Фиг. 8), что на начальном этапе наблюдения и до 28 ч все вносимые нанокомпозиты снижали прирост бактерий. Однако далее бактериостатический эффект отмечался при внесении композитов с концентрацией 0.00625% марганца в объеме. Наиболее выраженное негативное влияние на прирост бактерий выявлялось при внесении  с концентрацией марганца 0.00625%. Исследование наличия бактерицидного эффекта по отношению к  у композитов с применением метода кругов (метод колодцев, метод диффузии в агар) показало, что  обладал бактерицидным эффектом по отношению к . Зона ингибирования роста бактерий вокруг лунки достигала 9.0±0.3 мм. Во всех остальных вариантах эксперимента для  и  выраженного ингибирования роста бактерий не выявлено.
in vitro
Cms
Cms
I
II
II
III
II
Для кольцевой гнили биопленкообразование также характерно, эти бактерии способны скапливаться в проводящих каналах растения, вызывая их закупорку, в результате чего наблюдается вилт стеблей [Secor G.A., DeBuhr L., Gudmestad N.C. Susceptibility of Corynebacterium sepedonicum to disinfectants  // Plant Dis. 1988, 72, 585-588]. Результаты показали, что нанокомпозиты  и  с концентрацией 0.00625% в объеме снижают биопленкообразование бактерий, а количество мертвых клеток достигает 30% (Фиг. 8). Результаты показали, что в контрольном образце количество мертвых клеток было незначительным (Фиг. 9A), при обработке бактерий нанокомпозитами в концентрации 0.000625% уже приводило к появлению мертвых клеток (Фиг. 9 B, D и F). Увеличение концентрации композитов в 10 раз приводило к значительному повышению мертвых клеток бактерий (Фиг. 9 C, E и G). Максимальное количество мертвых клеток отмечено в образцах  и  в концентрациях 0.00625%. Таким образом, результаты показали наличие антибактериального эффекта у всех НК по отношению к фитопатогенной бактерии . Наибольшим воздействием обладал  с концентрацией марганца 0.00625%. Кроме того, было обнаружено, что нанокомпозиты изменяют морфологию бактериальных клеток . После инкубации клетки утолщались и укорачивались по сравнению с контролем (Таблица 2).
Cms
Cms
I
II
III
С помощью просвечивающей электронной микроскопии было показано, что бактерии  в контрольном варианте, как в поперечном (Фиг 10), так и в продольном (Фиг. 11) оптических срезах имели толстую, целостную, без выраженных повреждений клеточную стенку. После инкубации бактерий с нанокомпозитами в течение 1 ч, они теряли нативную форму, поверхность клеток становилась неровной. Выявлено, что после инкубации бактерий с нанокомпозитами разрушалась их клеточная стенка, наблюдался выход содержимого клетки наружу, что приводило к гибели патогенной бактерии. Ярко выраженный лизис клеточной стенки отмечен при обработке бактерий нанокомпозитами - в поле зрения микроскопа в вариантах с  и  часто наблюдались вместо бактерий лишь обломки их клеточной стенки (Фиг. 11). Обработка  нанокомпозитом  приводила к инвагинациям клеточной стенки внутрь бактериальной клетки (Фиг. 11 G, H), при этом не наблюдалось слипания нескольких бактериальных клеток. Полученные микрофотографии свидетельствуют о потере бактериальными клетками тургора и выхода содержимого клеток наружу.
†
†
†
†
Cms
I
I
II
II
III
III
Фиг. 8. Влияние обработки нанокомпозитами с концентрацией Mn 0.000625% и 0.00625% в объеме на рост (A) и образование биопленок (B) возбудителя ; 1 - контроль, 2 - , 3 - , 4 - , 5 - , 6 - , 7 - ; * р ≤ 0.01 по сравнению с контролем по критерию Манна-Уитни.
Cms
†
†
†
†
I
I
II
II
III
III
Фиг. 9. Микрофотографии биопленок  для контроля (A) и в присутствии нанокомпозитов с концентрацией Mn 0.000625% и 0.00625% по объему для  (B),  (В),  (D),  (E),  (F),  (G).
Cms
I
II
III
Фиг. 10. Микрофотографии ПЭМ бактерий  в контроле (A) и обработанных  (B),  (C) и  (D). Поперечный оптический срез клеток.
Cms
I
II
III
Фиг. 11. Микрофотографии ПЭМ бактерий  в контроле (A, B) и обработанных (C, D),  (E, F) и  (G, H). Продольный оптический срез клеток.
Таблица 2. Влияние нанокомпозитов на морфологические параметры бактерии <i>Cms</i> (длина, ширина и количество мертвых клеток) с концентрацией марганца 0.000625% и 0.00625%† в объеме.
Длина, мкм
Ширина, мкм
Количество мертвых клеток, %
Контроль
3.13 ± 0.08
0.56 ± 0.02
0.34 ± 0.01
I
2.12 ± 0.07*
0.49 ± 0.01*
2.35 ± 0.46*
I<sup>†</sup>
2.07 ± 0.08*
0.65 ± 0.19
5.55 ± 0.40*
II
2.31 ± 0.09*
0.53 ± 0.01
3.69 ± 0.54*
II<sup>†</sup>
2.53 ± 0.34*
0.77 ± 0.01*
24.77 ± 1.70*
III
2.41 ± 0.63*
0.62 ± 0.04*
3.07 ± 0.66
III<sup>†</sup>
2.62 ± 0.17*
0.71 ± 0.24*
13.68 ± 4.82*
* <i>p</i> ≤ 0.01 по сравнению с контролем по критерию Манна-Уитни.
Пример №8. Бактерицидный эффект нанокомпозитов I-III в отношении почвенных бактерий почвенного микробиома.
В качестве почвенных микроорганизмов использовали бактерии, выделенные из ризосферы растений, произрастающих на нефтезагрязненной территории поселка Тыреть (Заларинский район, Иркутская область, Россия). После выделения бактерий были изучены их морфологические, культуральные, физиологические и биохимические свойства, также провели секвенирование гена 16S рРНК с целью определения видовой принадлежности [Третьякова М.С., Беловежец М.А., Маркова Ю.А., Макарова Л.Е. "Способность бактерий-нефтедеструкторов снижать токсическое действие нефти на растение" // Агрохимия, 2017, № 12, 56-61].
Acinetobacter guillouiae
Elytrigia repens
Штамм  был выделен из ризосферы пырея . Клетки представляют собой короткие палочки, по Граму окрашиваются отрицательно. Бактерии (аэробы, оксидазо- и каталазоположительные) образуют колонии размером до 1.2 мм, бежевого цвета, округлые, блестящие, слегка выпуклые, однородные, мягкой консистенции, с ровным краем.
Rhodococcus erythropolis
E. re-pensquack
Штамм  также был выделен из ризосферы травы . На ранней стадии развития культура представляет собой рудиментарный мицелий, который в дальнейшем распадается на фрагменты. Фрагменты затем превращаются в палочки, а затем в кокки. Бактерии грамположительны. Их колонии средние, размером около 1.5-2.5 мм. Они кремового цвета, матовые, пастообразные, выпуклые, с ризоидным краем, грубой структуры. Они аэробы, оксидазоотрицательны, обладают каталазной активностью.
Pseudomonas oryzihabitans
Carex hancockiana
Штамм  был выделен из ризосферы осоки  Maxim. Клетки представляют собой одиночные или парные прямые палочки, по Граму окрашиваются отрицательно. Бактерии (аэробы, каталазо- и оксидазоположительные, способны к пигментации) при культивировании на твердых средах образуют желтые, гладкие, блестящие, круглые с ровными краями, выпуклые, однородные, мягкой консистенции, слизистые колонии [Silva F. "Pseudomonas (Flavimonas) oryzihabitans" // Revista Chilena de Infectologia, 2015, 32, 445-446].
Для уточнения видового состава чистых культур была проанализирована нуклеотидная последовательность гена 16S рРНК, которая показала следующие нуклеотидные последовательности размером: 1136 п.н. (98%), 1429 п.н. (99%) и 1098 п.н. (98%), которые выявили родовую принадлежность к Rhodococcus spp., Pseudomonas spp. и Acinetobacter spp. соответственно.
Бактерии культивировали в темноте в течение суток на твердой среде, состоящей из агара, ферментативного гидролизата говяжьего мяса и на жидкой питательной среде аналогичного состава. Выявление возможного бактерицидного действия нанокомпозитов осуществляли с применением метода кругов (метода диффузии в агар) [Sagdic O., Aksoy A., Ozkan G. "Evaluation of the antibacterial and antioxidant potentials of gilaburu (Viburnum opulus L.) fruit extract" // Acta Alimentaria, 2006, V. 35, 487-492]. Наличие эффекта нанокомпозитов определяли по ширине зоны ингибирования вокруг лунок на чашке со средой.
Для оценки бактериостатической активности НК в отношении бактерий жидкую культуру микроорганизмов выращивали в темноте при 26°С в аэрируемых условиях (80 об/мин) в колбах с питательной средой. После добавления нанокомпозитов измеряли оптическую плотность суспензии при 595 нм на планшетном спектрофотометре Bio-Rad сразу и через 2, 4, 24, 28, 48, 52 и 72 ч совместной инкубации.
Опыты проводили в трех независимых биологических повторностях. Полученные данные подвергали статистической обработке с использованием пакета программ статистической обработки MS Excel и оценивали по критерию Манна-Уитни.
I
III
A. guillouiae
R. erythropolis
P. oryzihabitans
Результаты показали отсутствие бактерицидного эффекта нанокомпозитов - на рост ризосферных бактериальных культур ,  и  (Фиг. 12). Было показано, что марганецсодержащие НК не оказывали бактерицидного действия на эти бактерии и вокруг лунок с композитами не выявлены зоны выпадения осадков. Обнаружено, что в первые сутки конинкубации бактерий нанокомпозитами отмечалось снижение прироста клеток по сравнению с контролем, однако далее, в динамике наблюдения этот эффект нивелировался. Таким образом, можно заключить, что исследуемые нанокомпозиты безопасны для представителей почвенной микрофлоры.
†
†
†
†
A. guillouiae
P. erythropolis
P. oryzihabitans
I
I
II
II
III
III
Фиг. 12. Влияние обработки нанокомпозитами с концентрацией марганца 0.000625% и 0.00625% в объеме на рост (левый график) и образование биопленки (правый график)  (A),  (B) и  (C); 1 - контроль, 2 - , 3 - , 4 - , 5 - , 6 - , 7 - ; * p ≤ 0.05 и ** p ≤ 0.01 по сравнению с контролем по критерию Манна-Уитни.
Результаты показали, что марганецсодержащие НК не приводят к какому-либо нарушению развития растений - растения остаются прямостоячими, имеют развитую листовую пластину, сохраняют чередование листьев и другие характерные признаки. При этом не происходит заражения растений бактериальным фитопатогеном и стимулируется стрессоустойчивость.