Использование g-излучения для получения тест-культуры Bacillus subtilis при определении b-литической активности крови

Использование у-излучения для получения тест-культуры Bacillus subtilis при определении ß-литической активности крови

Саруханов В.Я., Колганов И.М.1, Царин П.Г.1

ФГБНУ ВНИИ радиологии и агроэкологии, Обнинск;

1 ООО «НПП Эко-фильтр», Обнинск

Известно, что ß-литическая активность крови является одним из информативных показателей состояния организма животных и человека при физиологических и патологических и состояниях различной этиологии, поэтому её определение имеет важное клиническое значение в ветеринарии и медицине. Однако его использование, особенно при массовых исследованиях, бывает ограничено из-за трудоёмкости постановки реакции. Целью настоящей работы было изучение возможности использования у-излучения для получения тест-культуры Bacillus subtilis, обладающей оптимальными размерами для определения ß-литической активности крови сельскохозяйственных животных и человека. Значения ß-литической активности крови овец, лошадей и человека достоверно не отличались как при использовании нативной, так и облучённой суспензий. Сравнительная оценка сезонной динамики ß-литической активности крови коров как при использовании нативной, так и облучённой тест-культуры Bacillus subtilis подтвердило общебиологическую закономерность - максимальные значения ß-литической активности наблюдаются в осенне-зимний, а минимальные - в весенне-летний период времени. Таким образом, результаты работы показали, что использование у-излучения для получения тест-культуры Bacillus subtilis с оптимальным размером частиц без предварительной фильтрации позволяет упростить методику постановки реакции определения ß-литической активности крови сельскохозяйственных животных и человека, а также существенно сократить расход реактивов.

Ключевые слова: сельскохозяйственные животные, лабораторные животные, естественная резистентность, у-излучение, тест-культура, Bacillus subtilis, микробные агрегаты, ß-литическая активность, сыворотка крови, плазма крови.

В обеспечении естественной резистентности организма млекопитающих важную роль играют бактериолизины лизоцим, ß-лизины, а также система комплемента, которая в комплексе с антителами в значительной степени определяет бактерицидные свойства крови [1]. Защитное действие комплемента, лизоцима и антител изучено достаточно подробно, в то время как число публикаций, посвящённых ß-литической активности крови, ограничено. Считают, что ß-лизины представляют собой термостабильную субстанцию, особенно активную к аэробным спорообра-зующим бактериям, особенно Bacillus subtilis и Bacillus anthracis [2]. Активность ß-лизинов определяется по степени лизиса тест-культуры Bacillus subtilis испытуемой сывороткой, выраженной в процентах. Известно, что сыворотка крови лошадей обладает максимальной ß-литической активностью (до 80%), а минимальной - крупного рогатого скота и овец (до 35%) [3]. Высокие показатели ß-литической активности характерны для осенне-зимнего, а более низкие - для весенне-летнего сезона года [4].

Повышение ß-литической активности крови отмечается при острой пневмонии у детей и неспецифическом воспалении половых органов у женщин, понижение - при стафилококковой пневмонии, хроническом остеомиелите, черепно-мозговой и ожоговой травмах. Перед смертью ß-литическая активность крови имеет минимальные значения, тогда как выздоровление сопровождается нормализацией этого показателя [2; 5-8]. Аналогичные результаты были получены при внешнем облучении сельскохозяйственных животных. Так, было установлено, что внешнее

Саруханов В.Я.* - ст. науч. сотр., к.б.н. ФГБНУ ВНИИРАЭ. Колганов И.М. - зав. лаб., к.т.н.; Царин П.Г. - ген. директор. ООО «НПП Эко-фильтр».

•Контакты: 249032, Калужская обл., Обнинск, Киевское шоссе, 109-й км. Тел. 89056402821; e-mail: sarukhanov.vladimir@yandex.ru.

Y-облучение овец и лошадей в сублетальных дозах повышает ß-литическую активность крови, тогда как гибель облучённых животных сопровождается угнетением этого показателя в латентный период [9-11].

Оценка физиологического состояния овец по двум показателям: ß-литической активности и концентрации лейкоцитов в крови, повышает точность прогноза исхода острой лучевой болезни овец (до 5-х суток) [12].

Таким образом, ß-литическая активность крови является одним из информативных показателей состояния организма животных и человека при физиологических и патологических и состояниях различной этиологии, поэтому её определение имеет важное клиническое значение в ветеринарии и медицине. Однако применение этого показателя, особенно при массовых исследованиях, бывает ограничено из-за трудоёмкости постановки реакции. Для постановки реакции используется суточная культура Bacillus subtilis, которую смывают со скошенного мясопеп-тонного агара (МПА) 0,75 М раствором сахарозы с pH 6,2-6,4, с последующим доведением оптической плотности до 0,500 (зелёный светофильтр, длина волны 540 нм). Оптимальный размер частиц тест-культуры для определения ß-литической активности крови составляет 100-400 мкм [9]. Это достигается многократным пропусканием суспензии через пипетки с различным диаметром отверстия и последующей фильтрацией через неплотный ватно-марлевый фильтр, на котором остаются крупные микробные конгломераты. Подготовка к постановке реакции обычно занимает не менее 120 минут. Таким образом, продолжительность подготовки вместе с постановкой реакции для лошадей и жвачных животных составляет не менее 240 и 300 минут соответственно. Использование инактивированной тест-культуры позволит сократить время на подготовку к реакции и снизить её трудоёмкость.

Целью настоящей работы было изучение возможности использования Y-излучения для получения тест-культуры Bacillus subtilis, пригодной для определения ß-литической активности крови сельскохозяйственных животных и человека.

Материалы и методы исследования

Объектом исследования служили плазма крови животных: коров чёрно-пёстрой породы (n=30); беспородных лошадей (n=10) и сборная сыворотка крови клинически здоровых людей (n=20). Кровь у животных отбирали из яремной вены утром натощак. Плазму крови получали, центрифугируя цельную кровь при 3000 об/мин в течение 15-ти минут. Активность ß-лизинов определяли по О.В. Бухарину с соавторами [2]. В реакции использовали суточную культуру эталонного штамма Bacillus subtilis (штамм 2216), выращенную на плотной питательной среде (МПБ). Для качественной оценки действия ß-лизинов смесь сыворотки крови крупного рогатого скота с тест-культурой фотографировали через 60,120 и 180 мин; лошадей - через 60 и 120 мин после начала реакции под микроскопом «Биолам-2» с помощью микрофотонасадки «МФН-11», используя фотоаппарат «Nikon E 8400». На полученных фотографиях определяли размер микробных конгломератов с помощью программы Image expert pro. Культуру Bacillus subtilis облучали Y-лучами на установке «Исследователь» (источник излучения 60Co, интенсивность 430 Гр/ч) в дозах от 10 до 70 кГр с шагом 10 кГр. Микробную суспензию перед облучением готовили на 0,75 М растворе сахарозы, с последующим удалением излишков раствора центрифугированием. Инактивацию тест-культуры Bacillus subtilis оценивали по отсутствию роста на жидкой и плотной питательных средах (МПБ, МПА) через 120 часов инкубации. Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью программы Excel.

Результаты и обсуждение

При облучении тест-культуры Bacillus subtilis в диапазоне доз от 10 до 60 кГр через 120 часов инкубации на плотной питательной среде (МПА) наблюдался рост колоний Bacillus subtilis и образование пленки на мясопептонном бульоне. Отсутствие роста культуры на мясопептон-ном бульоне и мясопептонном агаре (МПБ и МПА) имело место только при дозе 70 кГр. Стандартизация облучённой культуры 0,75 М раствором сахарозы перед постановкой реакции привело к образованию в рабочей суспензии частиц размером 100-300 мкм2, без фильтрации, оптимальной для постановки реакции ß-литической активности крови [9]. При использовании облучённой и нативной тест-культуры Bacillus subtilis ß-литическая активность крови коров в параллельных пробах составила через 60 минут 9,2±0,8 и 6,0±0,6% (р<0,05); через 120 минут 23,2±2,1 и 23,5±2,1% (р>0,05); через 180 минут 32,5±3,2 и 35,6±4,2% (р>0,05) соответственно. Следовательно, значения ß-литической активности крови достоверно не отличались через 120 и 180 минут инкубации как при использовании нативной, так и облучённой суспензии тест-культуры (рис. 1). В реакции с плазмой крови лошадей значения ß-литической активности крови составили 50,4±2,5 и 52,6±3,5% (р>0,05) при использовании нативной и облучённой тест-культуры соответственно, а при исследовании сыворотки крови человека значения этого показателя достигали 36,8±3,5 с нативной и 41,2±3,5% (р>0,05) с облучённой тест-культурой.

50

Нативная тест-культура

Облученная тест-культура

40

£

£ т

£ зо

1 20

10

35,5 32,5

23,5 23,2

9,2

6,0

120

Время инкубации, мин

Рис. 1. ß-литическая активность крови коров.

0

60

В плазме крови коров через 60 минут инкубации наблюдалось объединение частиц суспензии нативной и облучённой тест-культуры в агрегаты площадью 9000±900 и 7500±850 мкм2 с гомогенной структурой. Увеличение времени инкубации до 120 минут привело к уменьшению площади агрегатов до 6000±850 и 4000±350 мкм соответственно, с участками просветления по краям. Увеличение времени инкубации до 180-ти минут смеси плазмы крови и частиц нативной и облучённой тест-культуры привело к уменьшению площади агрегатов тест-культуры до 650±100 и 480±80 мкм2 соответственно (рис. 2). В обоих случаях наблюдалось увеличение участков просветления.

12000

8000

4000

9000 Нативная тест-культура

Облученная тест-культура

500 300 " rnftn

7500

6000

4000

X

650 480

0

60

120

180

Время инкубации, мин

Рис. 2. Площадь микробных агрегатов в реакции.

0

Изучение сезонной динамики ß-литической активности крови коров при использовании как нативной, так и облучённой тест-культуры Bacillus subtilis подтвердило общебиологическую закономерность, что максимальные значения ß-литической активности наблюдаются в осенне-зимний, а минимальные - в весенне-летний период времени [4, 5, 11]. Значения ß-литической активности в параллельных пробах составили в апреле 30,3±2,5 и 35,3±1,5%; июле 29,8±1,9 и 30,2±2,5%; ноябре 33,7±3,4 и 35,6±3,4% и феврале 41,9±4,2 и 43,1±2,7% соответственно (табл. 1).

Таблица 1

ß-литическая активность крови коров в разные сезоны года

Сезон года Тест-культура

Нативная Облучённая

ß-литическая активность, %

Весна (апрель) 30,3±2,5 35,3±1,5

Лето (июль) 29,8±1,9 30,2±2,5

Осень (ноябрь) 33,7±3,4 35,6±3,4

Зима (февраль) 41,9±4,2 43,1±2,7

Таким образом, реакция ß-литической активности крови сельскохозяйственных животных и человека протекает однотипно как с нативной, так и с облучённой культурой Bacillus subtilis. Доза у-излучения 70 кГр является летальной для культуры Bacillus subtilis (штамм 2216). Использование 0,75 М раствора сахарозы в качестве жидкой фазы микробной суспензии предотвращает распад колоний на отдельные клетки после у-облучения, что, вероятно, связано, с тем, что микробная частица обволакивается сахарозой и существует в суспензии в виде отдельной частицы или мицеллы, что способствует её стабильности как во время облучения, так и при последующем разведении суспензии тест-культуры перед постановкой реакции. Это способствует получению частиц тест-культуры оптимального размера, без предварительной фильтрации, что упрощает постановку реакции и позволяет уменьшить расход реактивов.

Литература

1. Петров Р.В. Иммунология. М.: Медицина, 1983. 368 с.

2. Бухарин О.В., Васильев Н.В. Система р-лизина и её роль в клинической и экспериментальной медицине. Томск, 1977. 187 с.

3. Бритвина Г.И. Распространение р-лизинов у животных //Факторы естественного иммунитета /Под ред. О.В. Бухарина. Оренбург, 1979. С. 13-16.

4. Бодягин Е.В., Лушников М.В. К вопросу о возрастных и сезонных колебаниях показателей естественной резистентности организма //Факторы естественного иммунитета /Под ред. О.В. Бухарина. Оренбург, 1979. С. 20-23.

5. Малеева Н.П. Состояние естественной резистентности при острой пневмонии у детей в зависимости от проводимой терапии //Факторы естественного иммунитета /Под ред. О.В. Бухарина. Оренбург, 1979. С. 84-86.

6. Рыжанова О.М. О динамике показателей естественной резистентности организма у женщин с неспецифическим воспалением внутренних половых органов //Факторы естественного иммунитета /Под ред. О.В. Бухарина. Оренбург, 1979. С. 111-114.

7. Павловичев С.А. Состояние естественной резистентности при сочетанной черепно-мозговой травме //Факторы естественного иммунитета /Под ред. О.В. Бухарина. Оренбург, 1979. С. 69-71.

8. Никитенко Н.К., Сафронов А.А., Андриянов В.Н. Клинико-иммунологическая характеристика хронического остеомиелита //Факторы естественного иммунитета /Под ред. О.В. Бухарина. Оренбург, 1979. С. 99-101.

9. Саруханов В.Я., Исамов Н.Н., Грудина Н.В., Царин П.Г. Метод определения бета-литической активности крови крупного рогатого скота //Сельскохозяйственная биология. Сер. Биология животных. 2005. № 6. С. 115-116.

10. Саруханов В.Я., Исамов Н.Н. Бета-литические свойства крови, при действии ионизирующих излучений //Сельскохозяйственная биология. Сер. Биология животных. 2005. № 3. С. 116-118.

11. Саруханов В.Я., Исамов Н.Н., Царин П.Г. Антимикробное действие р-лизинов сельскохозяйственных животных и человека //Сельскохозяйственная биология. Сер. Биология животных. 2009. № 6. С. 103-105.

12. Саруханов В.Я., Исамов Н.Н., Епимахов В.Г. Оценка последствий внешнего Y-излучения и ранний прогноз острой лучевой болезни у овец //Ветеринарный врач. 2015. № 1. С. 40-43.

Applicability of y-radiation for obtaining test-culture Bacillus Subtilis in measurement of p-lysine activity in the blood

Sarukhanov W.J., Kolganov I.M.1, Tsarin P.G.1

All-Russian Scientific Research Institute of Radiology and Agroecology, Obninsk; 1 Research and Production Enterprise «Eco-filter», Obninsk

p-lysine activity in the blood is one of informative indicators of physiological status of a human and animals, that is why measuring its level is very important for application a test in medicine and veterinary. However, the use of the test is limited because the reaction is a labor-consuming process. The purpose of the study is examining the applicability of y-radiation for obtaining test-culture Bacillus subtilis of optimal size for quantitative measurement of p-lysine activity in the blood of farm animals and a human. The level of p-lysine activity in the blood of sheeps, horses and a human measured with native and y-irradiated suspension was reliably similar. Comparative analysis of seasonal changes of p-lysine activity in the blood of cows measured with native and irradiated test-cultures Bacillus subtilis confirmed general common biological regularity that the highest level of p-lysine activity is in autumn winter season, and the lowest level is in the spring-summer season. The results of the study show that the use of y-radiation for obtaining test-culture Bacillus subtilis with optimal size of particles without preliminary filtration allows to simplify the measuring p-lysine activity in the blood of farm animals and a human, as well as to reduce significantly consumption of reagents.

Key words: farm animals, laboratory animals, natural resistance, y-radiation, test-culture, Bacillus subtilis, microbial aggregates, p-lysine activity, blood serum, blood plasma.

References

1. Petrov R.V. Immunology. Moscow, Medicine, 1983. 368 p. (In Russian).

2. Buharin O.V., Vasil'ev N.V. Sistema fi-lizina i ee rol' v klinicheskoj i jeksperimental'noj medicine [p-lisin system and it's role in clinical and experimental medicine]. Tomsk, 1977. 187 p.

3. Britvina G.I. Rasprostranenie fi-lizinov u zhivotnyh. Faktory estestvennogo immuniteta [Distribution of P-lysine in animals. The factors of natural immunity]. Ed.: Buharin O.V. Orenburg, 1979, pp. 13-16.

4. Bodjagin E.V., Lushnikov M.V. K voprosu o vozrastnyh i sezonnyh kolebanijah pokazatelej estestvennoj rezistentnosti organizma. Faktory estestvennogo immuniteta [On the question of age and seasonal fluctuations in the natural resistance of the organism. The factors of natural immunity]. Ed.: Buharin O.V. Orenburg, 1979, pp. 20-23.

5. Maleeva N.P. Sostojanie estestvennoj rezistentnosti pri ostroj pnevmonii u detej v zavisimosti ot provodimoj terapii. Faktory estestvennogo immuniteta [Status of natural resistance in acute pneumonia in children, depending on the therapy. The factors of natural immunity]. Ed.: Buharin O.V. Orenburg, 1979, pp. 84-86.

6. Ryzhanova O.M. O dinamike pokazatelej estestvennoj rezistentnosti organizma u zhenshhin s nespecificheskim vospaleniem vnutrennih polovyh organov. Faktory estestvennogo immuniteta [On the dynamics of indicators of natural resistance in women with non-specific inflammation of internal genitals. The factors of natural immunity]. Ed.: Buharin O.V. Orenburg, 1979, pp. 111-114.

7. Pavlovichev S.A. Sostojanie estestvennoj rezistentnosti pri sochetannoj cherepno-mozgovoj travme. Faktory estestvennogo immuniteta. [Status of natural resistance in combined traumatic brain injury. The factors of natural immunity]. Ed.: Buharin O.V. Orenburg, 1979, pp. 69-71.

Saruhanov V.Ya.* - Senior Researcher, C. Sc., Biol. RSRIRA. Kolganov I.M. - Head of Lab., C. Sc., Tech.; Tsarin P.G. - General Director. RPE «Eco-filter».

•Contacts: Kievskoe Sh., 109 km, Obninsk, Kaluga region, Russia, 249032. Tel.: 89056402821; e-mail: sarukhanov.vladimir@yandex.ru.

8. Nikitenko N.K., Safronov A.A., Andrijanov V.N. Kliniko-immunologicheskaja harakteristika hronicheskogo osteomielita. Faktory estestvennogo immuniteta [Clinical and immunological characteristics of chronic osteomyelitis. The factors of natural immunity]. Ed.: Buharin O.V. Orenburg, 1979, pp. 99-101.

9. Saruhanov V.Ya., Isamov N.N., Grudina N.V., Carin P.G. Metod opredelenija beta-liticheskoj aktivnosti krovi krupnogo rogatogo skota [Method for determination of beta-lytic activity of the blood of cattle]. Sel'skohozjajstvennaja biologija. Ser. Biologija zhivotnyh - Agricultural Biology. Ser. Animal Biology, 2005, no. 6, pp. 115-116.

10. Saruhanov V.Ya., Isamov N.N. Beta-liticheskie svojstva krovi, pri dejstvii ionizirujushhih izluchenij [Beta-lytic properties of blood, under the influence of ionizing radiation] Sel'skohozjajstvennaja biologija. Ser. Biologija zhivotnyh - Agricultural Biology. Ser. Animal Biology, 2005, no. 3, pp. 116-118.

11. Saruhanov V.Ya., Isamov N.N., Carin P.G. Antimikrobnoe dejstvie p-lizinov sel'skohozjajstvennyh zhivotnyh i cheloveka [The antimicrobial action of p-lysine farm animals and man]. Sel'skohozjajstvennaja biologija. Ser. Biologija zhivotnyh - Agricultural Biology. Ser. Animal Biology, 2009, no. 6, pp. 103-105.

12. Saruhanov V.Ya., Isamov N.N., Epimahov V.G. Ocenka posledstvij vneshnego y-izlucheniya i rannij prognoz ostroj luchevoj bolezni u ovec [Assessment of the effects of external y-rays and early prognosis of acute radiation sickness in sheep]. Veterinarnyj vrach - Veterinarian, 2015, no. 1, pp. 40-43.