УСТРОЙСТВО ДЛЯ ТЕСТИРОВАНИЯ УРОВНЯ ТРЕВОЖНОСТИ У ГРЫЗУНОВ

Предлагаемая полезная модель относится к области научных исследований и предназначена для изучения поведенческих реакций в условиях эмоционального стресса. Устройство позволяет оценить уровень тревожности экспериментального животного (крысы, мыши) по соотношению двух поведенческих тактик: избегание пугающей (анксиогенной) обстановки (открытое, освещенное и поднятое пространство) и исследование всей незнакомой обстановки с целью бегства. Устройство делает более эффективным и удобным разработку и тестирование анксиолотических и антидепрессивных препаратов, планируемых к применению на человеке.
Первые устройства, предназначенные для изучения взаимоотношения исследовательского и избегающего поведения животных на моделях крыс и мышей, были предложены в 50-ых годах прошлого столетия (Montgomery K.C. The Relationship Between Fear induced by Novel Stimulation and Exploratory Behavior. J. Сотр. and Physiol. Psychol. 1954. 48: 254-260) и представляли собой Y-образный лабиринт с одним открытым и одним закрытым рукавом. В 80-ых годах для изучения мотивированного страхом поведения мелких грызунов были использованы установки, описанные в статьях: Handley S.L., Mithani S. “Effects of alpha-adrenoceptor agonists and antagonists in a maze-exploration model of 'fear'-motivated behaviour” Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 1984. 327(1): 1-5 и Pellow S, Chopin P, File SE, Briley M. “Validation of open/closed arm entries in an elevated plus-maze as a measure of anxiety in the rat”. J Neurosci Methods. 1985. 14 (3): 149-156 и представляющие собой приподнятый крестообразный лабиринт (ПКЛ). В настоящее время модель ПКЛ активно используется для оценки уровня тревожности в моделях выученной беспомощности, пост-травматического стрессового расстройства животных, в задачах тестирования эффекта анксиолитеческих или анксиогенных средств. Установки ПКЛ выпускаются фирмами: «Открытая Наука», «Ugo Basile», «SD Instruments)) и др. и имеют схожую геометрию и пропорциональные габариты для удобства тестирования крыс и мышей.
Описанные в литературе и предлагаемые на рынке аналоги ПКЛ установки успешно решают задачу тестирования грызунов на уровень тревожности, но имеют ряд ограничений, связанных с системой внешнего освещения и возможностей его регулировки.
Устройство для тестирования уровня тревожности у крыс (Установка TS0502 «Приподнятый крестообразный лабиринт»), принятое за прототип заявленной полезной модели, выпускается отечественным производителем - ООО «НПК Открытая Наука» (см. www.openscience.ru/pdf/ts/002.pdf) и входит в перечень установок для выполнения психофармакологических тестов согласно приказу Минздрава России N 281 от 30.04.2013. Устройство состоит из равных по протяженности (50 см) и ширине (10-12 см) двух закрытых руковов, имеющих вертикальные стенки высотой 30 см, и двух открытых рукавов, не имеющих стенок, сходящихся в открытом центре под прямым углом. Конструкция может быть закреплена на одной центральной опоре, на крестообразной подставке или точечных опорах на высоте от пола 50-100 см. Устройство снабжено двумя светильниками, закрепленными на отдельных штативах и расположенными над дальними концами открытых рукавов. Тестирование проводится в слабоосвещенном помещении, поэтому в закрытых рукавах формируется комфортное для испытуемого животного затемнение, в то же время открытые рукава ПКЛ дополнительно освещаются наружными источниками света. Использование ПКЛ рассчитано на выявление и количественный анализ баланса двух противоположных тактик поведения у животных, помещенных в анксиогенную среду. Одна тактика рассчитана на пребывание в наименее ангсиогенном участке ПКЛ (затемненные тупики закрытых рукавов); другая на исследование предлагаемой обстановки, в том числе в открытых рукавах ПКЛ, характеризующиеся тремя анксиогенными факторами - открытостью, освещенностью и высотой над полом). Стандартный протокол тестирования включает помещение крысы в центр между становки, в том числе в открытых рукавах ПКЛ, характеризующиеся тремя анксиогенными факторами - открытостью, освещенностью и высотой над полом). Стандартный протокол тестирования включает помещение крысы в центр между рукавами носом в сторону открытого рукава и пятиминутное наблюдение за ее поведением, с регистрирацией ряда поведенческих параметров (время пребывания в открытом и закрытом рукавах, число переходов, стоек, свешиваний, факты груминга и дефекации).
Недостатком данной конструкции является невысокая достоверность результатов тестирования из-за чрезмерной стрессирования испытуемых животных, вызванного, помимо указанных трех анксиогенных факторов, наличием точечных источников верхнего освещения, расположенных в визуальной близости. Кроме того, указанное расположение источников света и их закрепление на отдельных штативах затрудняют регулировку дозы анксиогенной стимуляции, усложняют конструкцию устройства, не обеспечивает симметричности освещения открытых рукавов, необходимой для формирования равных градиентов их освещенности и равной геометрии затенения центрального квадрата, не обеспечивает управление паттерном освещенности закрытых рукавов независимо от освещения открытых и т.д.
Заявляемое техническое решение повышает достоверность результатов тестирования за счет нейтрализации избыточной сенсорной стрессогенности животных и одновременно позволяет упростить конструкцию устройства, повысить удобство и настроечные возможности теста, а также расширить исследовательские возможности устройства.
Для достижения указанного результата устройство для тестирования уровня тревожности у грызунов, включающее, как и прототип, равные по протяженности и ширине закрытые и открытые прямоугольные рукава, перекрещивающиеся в открытом центре под прямым углом и приподнятые над полом на опорной системе, длина и ширина рукавов, а также высота стенок закрытых рукавов и высота над полом варьируются, поверхности закрытых и открытых рукавов (полы) выполнены в виде крышек коробов с высотой стенок 10 см, в отличие от прототипа поверхности закрытых и открытых рукавов (полы) выполнены из полупрозрачного светорассеивающего материала, на дне крышек коробов закрытых и открытых рукавов расположены светодиодные ленты для создания равномерно рассеивающей светопередачи через полупрозрачный материал, внутренняя поверхность крышки короба снабжена прозрачной пленочной полосой с напечатанным градиентом затемнения, симметрично изменяющим светопропускание от центра полосы к концам в открытых рукавах создают большее затемнение в центре, а в закрытых - в тупиках, при этом устройство выполнено из инертного, не впитывающего запах материала, а также снабжено блоком управления для регулировки освещенности.
Сущность предложенной полезной модели состоит в оптимизации устройства тестирования за счет замены внешнего на внутреннее освещение с целью повышения достоверности получаемых результатов, что достигается снижением избыточного стрессирования животных, реагирующих на присутствие внешних точечных источников освещения.
Заявляемое устройство с внутренним освещением, как и прототип, основано на создании и количественной оценке соотношения исследовательского и избегающего (тревожного) поведения у крыс или мышей в условиях выбора пребывания в открытом и освещенном или закрытом и затемненном рукавах установки, но в отличие от прототипа обладает большим удобством в эксплуатации, и имеет больше возможностей для регулировки условий освещенности и, в том числе, возможность создания произвольной функции затемнения от края открытого рукава к центру установки.
При этом использование внутреннего освещения позволяет варьировать экспериментальную задачу путем создания разных условий в открытых рукавах в сочетании с параметрами открытости/закрытости и освещенности/затемненности.
Сопоставление предлагаемой полезной модели и прототипа показало, что поставленная задача - повышение достоверности получаемых результатов - решается в результате новой совокупности признаков, что доказывает соответствие предлагаемого технического решения критерию патентоспособности «новизна».
Сущность полезной модели поясняется чертежом, где
на фиг. 1 - дано схематическое изображение устройства в сборе
на фиг. 2 - вид сверху на устройство с установленными градиентными вкладками
на фиг. 3 - вид сверху на устройство с незакрытыми световыми коробами
Заявляемое устройство состоит из открытого 1 и закрытого 2 прямоугольных тоннелей, образующих четыре рукава, соединенных под прямым углом и приподнятых над полом на опорной системе 3. В зависимости от задач тестирования крыс или мышей длина и ширина рукавов, высота стенок закрытых рукавов и высота над полом может варьировать. Поверхности (полы) закрытых 4 и открытых 5 рукавов выполнены из полупрозрачного светорассеивающего материала (коэффициент пропускания 30-50%) и представляют собой крышки световых коробов, имеющих стенки высотой ≈10 см. На дне световых коробов открытого и закрытого рукавов расположены независимо запитанные светодиодные ленты 6 (мощность каждой 10-15 Вт, что эквивалентно 1000-2000 лм, ленты длиной по 5 м уложены в несколько рядов), создающие равномерно рассеянную светопередачу через полупрозрачную крышку. Отдельно создается набор прозрачных пленочных полос равных по длине и ширине габаритам туннелей с напечатанными на них градиентными затемнениями, симметрично изменяющими светопропускание от центра полосы к концам. К внутренней поверхности крышки крепится пленочная полоса, выбранная из указанного набора с определенным паттерном градиента 7: при использовании протокольной схемы в открытом туннеле создается большее затемнение в центре, а в закрытом, наоборот, в тупиках. Регулировка освещенности осуществляется при помощи вынесенного к операторскому сектору блока управления 8. Освещение закрытого рукава может быть снижено до нуля (выключено). Установка выполнена из инертного, не впитывающего запах материала (пластика).
Тестирование проходит по стандартному протоколу, после подбора условий освещенности при валидации эксперимента (например, по протоколу компании ООО «Открытая наука» на тестовой группе животных с использованием бензодиазепиновых транквилизаторов в неседативных дозах) или после получения нормального распределения поведенческих тактик в контрольной группе животных. Тестовое исследование с помощью предлагаемого устройства проводилось на крысах линии Вистар (200-250 г). Закрытые рукава были традиционно затемнены; в открытые и закрытые рукава были вставлены градиентные вкладки. Было исследовано два режима освещенности (замер проводился по краевой точке открытого рукава в люменах и по ограничителю питающего напряжения в вольтах).
В первом режиме, при U=8.25 V, распределение наблюдаемых тактик животных было смещено в сторону избегания открытых рукавов, во втором, при U=8.05 V по выбору тактик животных можно было разделить на три равные группы с активным (исследовательским), средне-активным и пассивным (избегающим) поведением.
Как показали проведенные лабораторные исследования, использование предлагаемого устройства, по сравнению с ранее применявшимся устройством-прототипом, позволяет получить более точные (достоверно различающиеся) результаты при сравнении уровней тревожности крыс, перенесших только тяжелую гипоксию и крыс, перед тяжелой гипоксией, испытавших серию сеансов протективной умеренной гипобарии. Кроме того устройство более удобно в эксплуатации, позволяет более тонко изменять паттерны свечения, что оптимизирует процедуру тестирования, а также предоставляет возможность совершенствовать исходную методику тестирования путем введения управляемой вариабельности паттернов свечения тоннелей.
Устройство было разработано сотрудниками Института физиологии им. И.П. Павлова РАН при проведении исследований гипобарического воздействия на лабораторных животных. Для валидации устройства было протестировано 12 крыс линии Вистар. В эксперименте с применением тяжелой гипобарии протестировано более 30 животных.
Заявленная полезная модель продемонстрировала хорошие результаты в эксперименте на лабораторных животных - крысах, что позволяет рекомендовать ее к использованию в поведенческих лабораторных тестах.
Изложенное позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «промышленная применимость».