МУТАЦИИ В ГЕНАХ OAS1
MUTATIONS IN OAS1 GENES

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к способу обнаружения мутации в гене олигоаденилатсинтетазы человека или приматов, не являющихся человеком, и белкам OAS1, имеющим по меньшей мере одну аминокислотную модификацию.
Уровень техники
К настоящему времени был выявлен ряд болезней, при которых в человеческой популяции существует природная устойчивость к инфекционным заболеваниям. Alter и Moyer, J. Acquir. Immune Defic. Syndr. Hum Retrovirol. 18 Suppl. 1:S6-10 (1998) указывают, что вирусный гепатит C (HCV) может составлять до 90% в группах повышенного риска, например, у людей, получающих инъекции. Тем не менее, механизм за счет которого оставшиеся 10%, по-видимому, устойчивы к инфекции не был описан в литературе. Белки, которые принимают участие в заражении HCV, включают в себя 2'-, 5'-олигоаденилатсинтетазы. OAS представляют собой белки, индуцируемые интерфероном, отличающиеся своей способностью катализировать синтез 2'-, 5'-олигомеров аденозина (2-5As). Hovanessian et al., EMBO 6: 1273-1280 (1987) обнаружили, что клетки человека, обработанные интерфероном, содержат в себе некоторое количество OAS, соответствующих белкам 40 (OAS1), 46 (OAS1), 69 и 100 кДа. Marie et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 160:580-587 (1989) создали высокоспецифичные поликлональные антитела против p69, OAS размером 69 кДа. Посредством скринирования экспрессионной библиотеки клеток человека, обработанных интерфероном, с антителами против p69, Marie и Hovanessian, J. Biol. Chem. 267: 9933-9939 (1992) была выделена неполная кДНК OAS2. Также указанными авторами были проскринированы дополнительные библиотеки c неполной кДНК и выделены кДНК, кодирующие две изоформы OAS2. Меньшую изоформу кодируют две мРНК, которые различаются длиной 3'-нетранслируемой области.
Исследование посредством нозерн-блота выявило, что OAS2 экспрессируется в клетках человека в виде четырех индуцируемых интерфероном мРНК. Выведенные последовательности для белков OAS2 были общими и состояли из 683 аминокислот с различными 3'-концами. Согласно данным SDS-PAGE продуктов транскрипции/трансляции in vitro две изоформы имеют молекулярные массы 69 и 71 кДа. Обе изоформы проявляют активность OAS in vitro. Анализ последовательности показал, что OAS2 включает в себя домены, гомологичные OAS1, разделенные посредством предполагаемого богатого пролином линкерного участка. N- и C-терминальные домены схожи с OAS1 на 41% и 53% соответственно.
Посредством флуоресцентной гибридизации in situ и путем включения в картированные клоны, Hovanian et al., Genomics 52:267-277 (1998) установили, что гены OAS1, OAS2 и OAS3 кластеризуются на участке в 130 п.о. на 12q24.2. 2-5As связываются с РНКазой I, которая разрушает вирусные и клеточные РНК, и активируют ее, приводя к ингибированию синтеза клеточного белка и снижению вирусной репликации.
Четвертый ген OAS, названный OASL, отличается от OAS1, OAS2 и OAS3 тем, что у него отсутствует ферментативная активность. Ген OASL кодирует двухдоменный белок, состоящий из субъединицы OAS, слитой с C-терминальным доменом из 164 аминокислот, который гомологичен тандемному повтору убиквитина (Eskildsen and al., Nuc. Acids Res. 31:3166-3173, 2003; Kakuta et al., J. Interferon & Cytokine Res. 22:981-993, 2002).
Вследствие роли OAS1 в ингибировании вирусной репликации и вирусной инфекции, в данной области существует потребность в способах и композициях, которые подавляют вирусную репликацию вследствие активности OAS1, включая чрезвычайную потребность в основанной на ингибировании терапии, которая подавляет репликацию HCV.
КРАТКАЯ СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к обнаружению мутаций, связанных с устойчивостью к гепатиту С, которые можно охарактеризовать как мутации в гене олигоаденилатсинтетазы 1.
В одном их вариантов осуществления изобретение относится к способу генетического скринирования. Способ включает анализ образца нуклеиновой кислоты, выделенной у человека и приматов, не являющихся человеком, на наличие мутации в гене олигоаденилатсинтетазы 1, вызывающей аминокислотную модификацию в одном или нескольких положениях: 1, 24, 25, 28, 31, 36, 47, 53, 54, 64, 69, 74, 104, 108, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 127, 130, 139, 142, 160, 161, 162, 166, 175, 179, 226, 242, 246, 248, 250, 254, 274, 279, 282, 284, 288, 289, 292, 295, 314, 315 и 335 во всех формах олигоаденилатсинтетазы 1 (OAS1) (включая без ограничения SEQ ID NO:1).
В другом варианте осуществления изобретение относится к способу генетического скрининга. Способ включает анализ образца нуклеиновой кислоты, выделенной у человека и примата, не являющегося человеком, на наличие мутации в гене олигоаденилатсинтетазы 1, вызывающей аминокислотную модификацию в положении 363 во всех формах олигоаденилатсинтетазы 1, которые на карбоксильном конце гомологичны последовательности с регистрационным номером в Genebank NP_002525.1 (включая без ограничения SEQ ID NO:3).
В еще одном из вариантов осуществления изобретение относится к способу гентического скрининга. Способ включает анализ образца нуклеиновой кислоты, выделенной у человека или примата, не являющегося человеком, на наличие мутации в гене олигоаденилатсинтетазы 1, вызывающей аминокислотную модификацию в одном или нескольких аминокислотных положениях: 347, 350, 352, 353, 354, 356, 357, 361, 363, 364, 365, 369, 371, 373, 374, 375, 378, 379, 382, 388, 389 или 394 во всех формах олигоаденилатсинтетазы 1, которые на карбоксильном конце гомологичны последовательности с регистрационным номером в Genebank NP_058132.1 (включая без ограничения SEQ ID NO:2).
В еще одном варианте осуществления изобретение относится к способу генетического скрининга. Способ включает анализ образца нуклеиновой кислоты, выделенной у человека или примата, не являющегося человеком, на наличие мутации в гене олигоаденилатсинтетазы 1, вызывающей аминокислотную модификацию в одном или нескольких аминокислотных положениях: 347, 361, 364, 372, 384, 385 или 399 во всех формах олигоаденилатсинтетазы 1, которые на карбоксильном конце гомологичны последовательности с регистрационным номером в Genebank NP_001027581.1 (включая без ограничения SEQ ID NO:4).
В следующем варианте осуществления настоящее изобретение относится к белку, имеющему по меньшей мере одну аминокислотную модификацию в положениях 1, 24, 25, 28, 31, 36, 47, 53, 54, 64, 69, 74, 104, 108, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 127, 130, 139, 142, 160, 161, 162, 166, 175, 179, 226, 242, 246, 248, 10 250, 254, 274, 279, 282, 284, 288, 289, 292, 295, 314, 315 и 335 во всех формах олигоаденилатсинтетазы 1 (OAS1) (включая без ограничения SEQ ID NO:1), и к применению указанного белка для создания средства для диагностики устойчивости к вирусной инфекции, предпочтительно, к флавивирусной инфекции, наиболее предпочтительно, к гепатиту С. В определенных вариантах осуществления диагностическое средство представляет собой антитело.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к белку OAS1, имеющему аминокислотную модификацию в положении 363 во всех формах олигоаденилатсинтетазы 1, которые на карбоксильном конце гомологичны последовательности с регистрационным номером в Genebank NP_002525.1 (включая без ограничения SEQ ID NO:3), и к применению указанного белка для создания средства для диагностики устойчивости к вирусной инфекции, предпочтительно, к флавивирусной инфекции, наиболее предпочтительно, к гепатиту С. В определенных вариантах осуществления диагностическое средство представляет собой антитело.
В дополнительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к белку OAS1, имеющему по меньшей мере одну аминокислотную модификацию в положениях 347, 350, 352, 353, 354, 356, 357, 361, 363, 364, 365, 369, 371, 373, 374, 375, 378, 379, 382, 388, 389 и 394 во всех формах олигоаденилатсинтетазы 1, которые на карбоксильном конце гомологичны последовательности с регистрационным номером NP_058132.1 в Genebank (включая без ограничения SEQ ID NO:2), и к применению указанного белка для создания средства для диагностики устойчивости к вирусной инфекции, предпочтительно, к флавивирусной инфекции, наиболее предпочтительно, к гепатиту С. В определенных вариантах осуществления диагностическое средство представляет собой антитело.
В еще одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к белку OAS1, имеющему по меньшей мере одну аминокислотную модификацию в положениях 347, 361, 364, 372, 384, 385 или 399 во всех формах олигоаденилатсинтетазы 1, которые на карбоксильном конце гомологичны последовательности с регистрационным номером в Genebank NP_001027581.1 в Genebank (включая без ограничения SEQ ID NO:4), и к применению указанного белка для создания средства для диагностики устойчивости к вирусной инфекции, предпочтительно, к флавивирусной инфекции, наиболее предпочтительно, к гепатиту С. В определенных вариантах осуществления диагностическое средство представляет собой антитело.
В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к терапевтическому средству для профилактики или ингибирования вирусной инфекции, предпочтительно, флавивирусной, наиболее предпочтительно, вирусного гепатита С, где терапевтическое средство представляет собой белок, имеющий по меньшей мере одну аминокислотную модификацию по изобретению. В других вариантах осуществления терапевтическое средство является полинуклеотидом, таким как ДНК или РНК, кодирующим белок.
В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к терапевтическому средству для профилактики или ингибирования вирусной инфекции, предпочтительно, флавивирусной, наиболее предпочтительно, вирусного гепатита С, где терапевтическое средство представляет собой белок, кодируемый OAS1 по изобретению, имеющий одну или несколько описанных аминокислотных модификаций.
В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к терапевтическому средству для профилактики или ингибирования вирусной инфекции, предпочтительно, флавивирусной, наиболее предпочтительно, вирусом гепатита С, где терапевтическое средство воспроизводит благоприятное воздействие по меньшей мере одной мутации по изобретению. Терапевтическое средство может быть малой молекулой, белком, пептидом, молекулой ДНК или РНК, или антителом.
В еще одном варианте осуществления изобретение относится к терапевтическому средству для профилактики или лечения рака, предпочтительно, рака простаты, где терапевтическое средство представляет собой белок, кодируемый геном OAS1, имеющим по меньшей мере одну мутацию по изобретению. В других вариантах осуществления терапевтическое средство представляет собой кодирующий данный белок полинуклеотид, а именно ДНК или РНК.
В еще одном варианте осуществления изобретение относится к терапевтическому средству для профилактики или лечения рака, предпочтительно, рака простаты, где терапевтическое средство представляет собой белок OAS1, имеющий по меньшей мере одну аминокислотную модификацию по изобретению.
В еще одном варианте осуществления изобретение относится к терапевтическому средству для профилактики или лечения рака, предпочтительно, рака простаты, где терапевтическое средство воспроизводит благоприятное воздействие по меньшей мере одной мутации по изобретению. Терапевтическое средство может быть малой молекулой, белком, пептидом, молекулой ДНК или РНК, или антителом.
В еще одном варианте осуществления терапевтическое средство способно ингибировать активность OAS1 или по меньшей мере одного участка, или одну функцию полноразмерного белка, и такие средства представлены антисмысловыми молекулами, рибозимами и молекулами РНКi, способными специфически связываться с полинуклеотидами OAS1 и способными посредством антител и их фрагментов специфически связываться с белками и полипептидами OAS1.
В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к ингибиторам OAS1. Ингибиторы по изобретению включают, но не ограничиваются ими, антисмысловые молекулы, рибозимы, РНКi, антитела или фрагменты антитела, белки или полипептиды, а также малые молекулы. Примеры антисмысловых молекул включают по меньшей мере 10, 15 или 20 последовательных нуклеотидов, или нуклеотидов, которые гибридизуются в жестких условиях с полинуклеотидом, кодирующим OAS1, имеющую по меньшей мере одну аминокислотную модификацию по изобретению.
В еще одном варианте осуществления ингибиторы OAS1 специфически связываются с областью белка, определенной как полипептид OAS1, имеющий аминокислотную модификацию по изобретению. Ингибиторы по изобретению включают, но не ограничиваются ими, антитела, фрагменты антитела, малые молекулы, белки или полипептиды.
В еще одном дополнительном варианте осуществления ингибиторы OAS1 состоят из антисмысловых молекул или молекул РНКi, которые специфически связываются или гибридизуются с полинуклеотидом, кодирующим белок OAS1, имеющий по меньшей мере одну аминокислотную модификацию по изобретению.
В дополнительных вариантах осуществления изобретение относится к композициям, содержащим один или несколько ингибиторов OAS1 в фармацевтически приемлемом носителе.
К дополнительным вариантам осуществления относятся к способам снижения экспрессии гена OAS1 или биологической активности.
К дополнительным вариантам осуществления относятся способы специфического увеличения или уменьшения экспрессии некоторых форм гена OAS1, имеющего по меньшей мере одну мутацию, которая раскрыта в настоящем изобретении.
Изобретение относится к антисмысловому олигонуклеотиду, содержащему по меньшей мере одну модифицированную межнуклеозидную связь.
Изобретение также относится к антисмысловому олигонуклеотиду, имеющему фосфоротиоатную связь.
Более того, изобретение относится к антисмысловому олигонуклеотиду, содержащему по меньшей мере одну модифицированную сахарную группу.
Также изобретение относится к антисмысловому олигонуклеотиду, содержащему по меньшей мере одну модифицированную сахарную группу, которая представляет собой 2'-О-метилированную сахарную группу.
Кроме того, изобретение относится к антисмысловому олигонуклеотиду, содержащему по меньшей мере одно модифицированное нуклеиновое основание.
Более того, изобретение относится к антисмысловому олигонуклеотиду, имеющему модифицированное нуклеиновое основание, где модифицированное нуклеиновое основание представляет собой 5-метилцитозин.
Также изобретение относится к антисмысловому соединению, где антисмысловое соединение представляет собой химерный олигонуклеотид.
Изобретение относится к способу ингибирования экспрессии OAS1 человека в клетках или тканях человека, включающему приведение в контакт in vivo клеток или тканей и антисмыслового соединения или рибозима длиной от 8 до 35 нуклеотидов, направленного на молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую OAS1 человека, в результате чего происходит ингибирование экспрессии OAS1 человека.
Кроме того, изобретение относится к способу снижения или увеличения экспрессии in vivo определенных форм OAS 1 посредством применения антисмысловых соединений или соединений РНКi, или рибозимов, такие формы характеризуются тем, что имеют по меньшей мере одну мутацию в положении по настоящему изобретению.
Настоящее изобретение относится к способу модулирования роста раковых клеток, включающему приведение в контакт in vivo раковых клеток и антисмыслового соединения или рибозима длиной от 8 до 35 нуклеотидов, направленного на молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующей OAS1 человека, в результате чего происходит ингибирование экспрессии OAS1 человека.
Более того, изобретение относится к идентификации участков-мишеней полинуклеотидов OAS1. Также изобретение относится к меченым зондам для распознавания полинуклеотидов OAS1 посредством гибридизации in situ.
Изобретение относится к применению ингибитора OAS1 по настоящему изобретению для получения лекарственного средства для профилактики или ингибирования инфекции HCV.
Изобретение также относится к ориентированию ингибитора OAS1 на конкретные участки белка OAS1 или на конкретные функции указанного белка.
Также изобретение относится к фармацевтической композиции для ингибирования экспрессии OAS1, содержащей антисмысловой олигонуклеотид по изобретению в смеси с физиологически приемлемым носителем или разбавителем.
Изобретение относится к рибозиму, способному специфически расщеплять РНК OAS1, и к фармацевтической композиции, содержащей рибозим.
Также изобретение относится к низкомолекулярным ингибиторам OAS1, где указанные ингибиторы способны снижать активность OAS1, или снижать, или предотвращать экспрессию мРНК OAS1.
Изобретение также относится к ингибиторам OAS1, которые изменяют специфические функции белка за исключением синтеза 2'-5'-олигоаденилатов, такие функции включают взаимодействие с другими белками, такими как белок NS5A вируса гепатита С.
Изобретение относится к соединениям, которые вносят изменения в посттрансляционные преобразования OAS1, включая, но этим не ограничиваясь, гликозилирование и фосфорилирование.
Кроме того, изобретение относится к способу генетического скринирования человека для идентификации мутации в гене олигоаденилатсинтетазы, включающему (a) проведение (в условиях амплификации) на образце геномной ДНК человека полимеразной цепной реакции (ПЦР) с парой праймеров для амплификации участка геномной ДНК человека, содержащей по меньшей мере одну мутацию гена OAS1 по изобретению, указанное воздействие дает продукт амплификации, содержащий в себе упомянутый участок; и (b) обнаружение в продукте амплификации из пункта (a) наличия нуклеотидной мутации в нуклеотидном положении по изобретению, таким образом идентифицируя упомянутую мутацию.
Также изобретение относится к способу обнаружения у человека аллеля устойчивости к заражению гепатитом С, содержащего мутацию, включающую в себя замену нуклеотида, не являющегося нуклеотидом дикого типа, на нуклеотид дикого типа в нуклеотидном положении, соответствующем аминокислотной модификации по изобретению в белке OAS1, кодируемом геном олигоаденилатсинтетазы (OAS1), где способ включает (a) получение смеси для полимеразной цепной реакции (ПЦР) посредством объединения в буфере для ПЦР-образца геномной ДНК вышеупомянутого человека и специфической пары ПЦР-праймеров на ген олигоаденилатсинтетазы; (b) проведение множества циклов ПЦР ПЦР-смеси для получения продукта амплификации гена олигоаденилатсинтетазы; и (c) обработку в гибридизационных условиях продукта, полученного в пункте (b) зондом, способным обнаруживать упомянутую мутацию.
Также изобретение относится к выделенному ингибитору OAS1, выбранному из группы, состоящей из антисмыслового олигонуклеотида, рибозима, малой ингибирующей РНК (RNAi), белка, полипептида, антитела и малой молекулы. Выделенный ингибитор может быть антисмысловой молекулой или ее комплементом, содержащим по меньшей мере 15 последовательных нуклеиновых кислот полинуклеотидной последовательности, соответствующей мутации гена OAS1, связанной с аминокислотной заменой по изобретению.
Выделенный ингибитор OAS1 может быть выбран из группы, состоящей из антитела и фрагмента антитела. Также изобретение относится к композиции, состоящей из терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного ингибитора OAS1 в фармацевтически приемлемом носителе.
Также изобретение относится к способу ингибирования экспрессии OAS1 в клетке млекопитающего, включающему введение в клетку ингибитора OAS1, выбранного из группы, состоящей из антисмыслового олигонуклеотида, рибозима, белка, РНКi, полипептида, антитела и малой молекулы.
Кроме того, изобретение относится к способу ингибирования у индивида экспрессии гена OAS1, включающему введение индивиду вместе с фармацевтически эффективным носителем антисмыслового олигонуклеотида в количестве, которое является эффективным для специфической гибридизации со всей выбранной последовательностью-мишенью нуклеиновой кислоты, полученной из вышеупомянутого гена OAS1, или с ее частью.
Более того, изобретение относится к способу профилактики заражения флавивирусом обследуемого человека, предрасположенного к заражению, включающему введение обследуемому человеку ингибитора OAS1, выбранного из группы, состоящей из антисмыслового олигонуклеотида, рибозима, РНКi, белка, полипептида, антитела и малой молекулы, где указанный ингибитор OAS1 предотвращает заражение вышеупомянутым флавивирусом.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На фиг.1 представлена аминокислотная последовательность терапевтической формы белка OAS1 (SEQ ID NO:1).
На фиг.2 представлена таблица аминокислотных замен, которые могут использоваться во всех терапевтических формах OAS1.
На фиг.3 представлена таблица аминокислотных модификаций OAS1 примата, которые могут использоваться в терапевтических формах OAS1. Положения, отмеченные *, относятся к формам OAS1, которые на карбоксильном конце гомологичны последовательности с регистрационным номером в Genebank NP_002525.1. Положения, отмеченные +, относятся к формам OAS1, которые на карбоксильном конце гомологичны последовательности с регистрационным номером в Genebank NP_0581321. Положения, отмеченные ^, относятся к формам OAS1, которые на карбоксильном конце гомологичны последовательности с регистрационным номером в Genebank NP_001027581.1.
На фиг.4 представлена таблица, в которой указаны положения мутаций в генах OAS1 приматов и соответствующие аминокислотные модификации.
На фиг.5 представлен список дополнительных изоформ OAS1 по настоящему изобретению, включая формы OAS1 человека и приматов, не являющихся человеком. Также предоставлены мутации изоформ OAS1 приматов. Эти изоформы, либо по отдельности, либо вместе с любыми мутациями, идентифицированными в настоящем изобретении, могут быть использованы для диагностических, терапевтических и других указанных в описании целей.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к новым мутациям в гене олигоаденилатсинтетазы 1, к применению этих мутаций для диагностики предрасположенности или устойчивости к вирусной инфекции, к белкам, кодируемым геном, имеющим мутацию по изобретению, и к профилактике или игибированию вирусной инфекции, используя белки, антитела и относящиеся к ним нуклеиновые кислоты. Эти мутации связаны с устойчивостью носителя к заражению флавивирусом, в частности, вирусом гепатита С.
В настоящее время значительная часть исследований в области медицины сфокусирована на идентификации мутаций и дефектов, которые вызывают заболевание или вносят вклад в его развитие. Также исследования предназначены для разработки соединений и способов лечения, направленных на эти болезненные состояния. Меньшее внимание направлено на изучение генетических факторов, которые позволяют людям оставаться здоровыми, несмотря на воздействие возбудителей инфекции и других факторов риска. Настоящее изобретение относится к успешному применению способа, разработанного авторами изобретения, посредством которого определяется и исследуется заданное количество испытуемых людей для того, чтобы обнаружить генетические изменения или мутации, которые обеспечивают устойчивость к заболеванию. Более того, идентификация субпопуляционной части, которая обладает природной устойчивостью к конкретному заболеванию или биологическому состоянию, дает возможность идентифицировать гены и белки, которые представляют собой подходящие мишени для фармацевтического воздействия, диагностической оценки или профилактических мер, таких как профилактическая вакцинация.
Ранее субпопуляционная часть была выявлена и описана в одновременно рассматриваемой заявке с порядковым номером 10/972135 и включала индивидуумов, которые несмотря на повторное воздействие вируса гепатита С (HCV) тем не менее оставались серологически негативными, в то время как другая группа людей инфецировалась (серологически позитивные). Исследованные популяции включали пациентов с гемофилией, которым проводят неоднократное переливание крови, и получающих внутривенные лекарственные препараты людей, которые подвергаются опасности из-за использования общих игл и других факторов риска.
Настоящее заявление относится к мутациям, выявленным в генах OAS1 приматов, не являющихся человеком, как описано в примере 1.
В заявке с номером 10/972135 раскрыты данные, относящиеся к HCV-инфекции; определению; способам применения изобретения; анализу полинуклеотидов; получению полинуклеотидных праймеров; полимеразной цепной реакции; анализу последовательности нуклеиновой кислоты; выявлению иммобилизованных на мембране последовательностей-мишеней; сканирующим методикам для выявления замен оснований; терапевтическим агентам для восстановления и/или усиления работы OAS1; терапевтическим веществам для ингибирования функции OAS1; рибозимам; РНКi; белкам и полипептидам; малым молекулам; способам оценки эффективности ингибиторов OAS1 и фармацевтическим композициям. Описание заявки с порядковым номером 10/972135 включено в настоящее изобретение в виде ссылки в полном объеме.
Природная функция полипептидов по настоящему изобретению позволяет им проходить через клеточную мембрану и опосредовать противовирусные эффекты в отсутствии вектора доставки или экспрессионного носителя. Ранее были описаны свойства клеточной трансдукции основных, положительно заряженных белков, и они хорошо известны специалистам в данной области (Ryser and Hancock, Science. 1965 Oct22; 150(695):501-3).
В случае, когда полипептиды получены в виде жидкой композиции и вводятся путем инъекции, предпочтительно, чтобы раствор был изотоническим солевым раствором, содержащим 140-миллимолярный хлорид натрия и 10-миллимолярный кальций при pH 7,4. Инъекцию можно вводить, например, в терапевтически эффективном количестве, предпочтительно, в дозировке приблизительно от 1 мкг/кг веса тела до приблизительно 5 мг/кг веса тела ежедневно, принимая во внимание пути введения, общее состояние пациента и т.д.
Полипептид(ы) по настоящему изобретению могут применяться в сочетании с подходящим фармацевтическим носителем. Также композиции включают в себя терапевтически эффективное количество белка и фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент. Такой носитель включает, но ими не ограничивается, физиологический раствор, забуференный физиологический раствор, декстрозу, воду, глицерин, этанол и их комбинации. Композиция должна соответствовать способу введения.
Полипептид(ы) по настоящему изобретению также можно модифицировать посредством химического сшивания полипептида с одним или несколькими фрагментами или конъюгатами для усиления активности, клеточного распределения или клеточного усвоения полипептида(ов). Такие фрагменты или конъюгаты включают липиды, как например, холестерин, холевая кислота, тиоэфир, алифатические цепочки, фосфолипиды и их производные, полиамины, полиэтиленгликоль (ПЭГ), пальмитиловые фрагменты и другие, как раскрывается, например, в патентах США 5514758, 5565552, 5567810, 5574142, 5585481, 5587371, 5597696 и 5958773.
Также полипептиды по настоящему изобретению можно модифицировать для осуществления нацеленной доставки к специфическим клеточным типам в случае признаков конкретного заболевания, включая, но ими не ограничиваясь, клетки печени в случае заражения гепатитом С. Специалисты в данной области оценят удобные способы, описанные в настоящем изобретении, благодаря которым достигаются поставленные задачи и они включают, но ими не ограничиваются, липосомное нацеливание, опосредованный рецепторами эндоцитоз и связывание антитела с антигеном. В одном из вариантов осуществления может использоваться асиагликопротеиновый рецептор для нацеливания на клетки печени путем добавления галактозного фрагмента к полипептиду(ам). В другом варианте осуществления маннозный фрагмент может быть конъюгирован с полипептидом(ами) для осуществления нацеленной доставки к рецептору маннозы, обнаруженному на макрофагах и клетках печени. Специалисту в данной области будет понятно, что способы одновременной доставки и нацеливания можно комбинировать. Например, полипептид(ы) по настоящему изобретению могут быть доставлены к клеткам печени посредством упаковки в липосомы, такие липосомы конъюгированы с галактозой для нацеленной доставки к асиалогликопротеиновому рецептору.
Изобретение также относится к фармацевтической упаковке или набору, содержащему один или несколько контейнеров, заполненных одним или несколькими ингредиентами фармацевтических композиций по изобретению. К таким контейнерам могут быть приложена инструкция в форме, предписанной государственным органом, регулирующим производство, применение или продажу фармацевтических препаратов или биологических продуктов, эта инструкция отражает аттестацию органом производства, применения или продажи для приема человеком. Кроме того, полипептид по настоящему изобретению может использоваться в сочетании с другими терапевтическими средствами.
Если полипептид(ы) по настоящему изобретению используются в качестве фармацевтического препарата, их можно вводить млекопитающим вместе с подходящим средством доставки. Если полипептиды по настоящему изобретению применяют в качестве фармацевтического препарата, как описано выше, то их назначают, например, в терапевтически эффективных дозах приблизительно от 10 мкг/кг веса тела до приблизительно 10 мг/кг веса тела ежедневно, учитывая путь введения, общее состояние пациента и т.д. Предпочтительно, чтобы установленное количество было достаточным для достижения профилактики или ингибирования заражения вирусом, предпочтительно, флавивирусом, наиболее предпочтительно, RSV и HCV, профилактики или лечения рака, воспаления, диабета или других заболеваний.
Белки, их фрагменты или другие производные, или их аналоги, или экспрессирующие их клетки могут использоваться в качестве иммуногена для получения к ним антител. Эти антитела могут быть, например, поликлональными, моноклональными, химерными, одноцепочечными, Fab-фрагментами или продуктом экспрессионной библиотеки, основанной на Fab. Для производства поликлональных антител могут применяться различные известные в данной области методики.
Антитела, вырабатываемые против полипептида(ов) по настоящему изобретению, могут быть получены посредством прямой инъекции полипептида животному или посредством введения полипептида животному, предпочтительно, не являющемуся человеком. Полученные таким образом антитела затем связывают полипептид. Таким образом, для получения антител, связывающих весь нативный полипептид, достаточно последовательности, кодирующей только фрагмент полипептида. Более того, может использоваться набор подобных антител, специфичных к большому количеству полипептидов.
Для получения моноклональных антител может применяться любой способ, который обеспечивает выработку антитела, непрерывными культурами клеточной линии. Примеры включают гибридомную технологию (Kohler and Milstein, 1975, Nature, 256:495-597), триомную технологию, гибридомную технологию с B-клетками человека (Kozbor, et al., 1983, Immunology Today 4:72) и основанную на EBV гибридомную технологию получения моноклональных антител человека (Сое, et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. pp. 77-96).
Описанные способы получения одноцепочечных антител (патент США No. 4946778) могут быть адаптированы для получения одноцепочечных антител к иммуногенным полипептидным продуктам по изобретению.
Антитела могут применяться в способах, относящихся к локализации и активности белковых последовательностей по данному изобретению, например, для визуализации белков, измерения их уровней в соответствующих физиологических образцах и т.п.
Настоящее изобретение относится к полипептидам, которые отличаются от полипептидов, представленных на фиг. 1-5 аминокислотами с 1 по 34, такие различия могут включать замены, инсерции, делеции, объединение модифицированных аминокислот или производных аминокислот и добавление или удаление аминокислот на C-терминальном конце или N-терминальном конце полипептидов. Изобретение относится к терапевтическому и профилактическому применению этих полипептидов, включая, но ими не ограничиваясь, лечение вирусной инфекции, новообразования рака, диабета и ускорение клеточного роста и дифференциации и регенерации ткани. Изобретение относится к полинуклеотидам, кодирующим полипептиды по изобретению и к их применению, включая, но не ограничиваясь, применение в производстве полипептидов, при генной терапии, в качестве диагностических средств и т.д.
Фармацевтические композиции
Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции полипептидов в качестве активных ингредиентов для терапевтического применения. Композиции также можно использовать в способе по настоящему изобретению. В большинстве случаев фармацевтическая композиция для ингибирования вирусной инфекции, рака, новообразования, воспаления или других заболеваний у млекопитающего или индивидуума включает в себя эффективное количество по меньшей мере одного полипептида, необходимого в практике изобретения, как описано выше, или его фрагмента, для которого показано, что он имеет такой же эффект, и фармацевтически физиологически приемлемый носитель или разбавитель. По настоящему изобретению фармацевтическая композиция может быть составлена как сочетание двух или нескольких полипептидов из представленных фиг. 1-5. Более того, фармацевтическая композиция может состоять только из полипептида, который содержит одну или несколько модификаций, как показано на фиг. 1-5 в непрерывной молекуле.
Композиции могут вводиться перорально, подкожно или парентерально, включая внутривенное, внутриартериальное, внутримышечное, внутрибрюшинное и интраназальное введение, а также интратекальные и инфузионные методы, если требуется. Фармацевтически приемлемые носители, разбавители, вспомогательные вещества и средства доставки, а также носители имплантатов обычно относятся к инертным, нетоксичным твердым или жидким заполнителям, разбавителям или инкапсулирующему материалу, которые не взаимодействуют с активными ингредиентами по изобретению. Также в композицию могут быть включены катионные липиды для облегчения поглощения полипептида. Также применяются имплантаты соединений. В большинстве случаев фармацевтические композиции являются стерильными.
Настоящее изобретение относится к композициям полипептидов, к которым присоединена детектируемая метка, такая как флуоресцентная, хемилюминесцентная или радиоактивная молекула.
Еще один пример представляет собой фармацевтическую композицию, которая может быть составлена посредством известных методов с применением известных материалов, см. Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, Pa. 18042) pp. 1435-1712, которые включены в настоящее изобретение в качестве ссылок. Как правило, композиция будет зависеть от различных факторов, таких как введение, стабильность, производственные задачи и другие факторы. Полипептиды, указанные на фиг. 1-5, могут вводиться путем инъекции или посредством легочного введения с помощью ингаляции. Также могут быть доступны энтеральные лекарственные формы, и, следовательно, может быть эффективным пероральное введение. Полипептиды по изобретению могут встраиваться в липосомы или другие микроносители для доставки и могут быть разработаны в виде гелей или других композиций для длительного высвобождения. Хотя предпочтительные композиции изменяются в зависимости от применения, для которого данная композиция составляется, как правило, в отношении полипептидов по настоящему изобретению, предпочтительные фармацевтические композиции, это композиции, приготовленные для подкожного введения или для легочного введения с помощью ингаляции, хотя конкретные композиции для каждого типа введения зависят от особенностей конкретного полипептида.
Терапевтические композиции полипептидов или полипептидных конъюгатов по изобретению как правило вводят в композицию, которая включает в себя один или несколько фармацевтически приемлемых носителей или эксципиентов. Такие фармацевтические композиции могут быть получены известным в данной области способом, что дает полипептидный фармацевтический препарат, который является достаточно стабильным при хранении и подходит для введения людям или животным.
Полипептиды или полипептидные конъюгаты по изобретению могут применяться «как есть» и/или в виде их соли. Подходящие соли включают, но ими не ограничиваются, соли щелочных металлов или щелочноземельных металлов, таких как натрий, калий, кальций и магний, а также, например, соли цинка. Эти соли или комплексы могут присутствовать в виде кристаллической и/или аморфной структуры.
«Фармацевтически приемлемый» подразумевает носитель или эксципиент, которые при используемых дозировках и концентрациях не вызывают каких-либо неблагоприятных эффектов у пациентов, которым он вводится. Такие фармацевтически приемлемые носители и эксципиенты хорошо известны в данной области (см. Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A.R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Company (1990); Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer and L. Hovgaard, Eds., Taylor & Francis (2000); and Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press (2000)).
Композиция по изобретению может вводиться самостоятельно или в сочетании с другими терапевтическими веществами. Например, было показано, что рибавирин и интерферон альфа являются эффективными при лечении HCV-инфекции, если применяются совместно. Их совместная эффективность превышает эффективность каждого лекарственного препарата, применяемого раздельно. Композиции по изобретению могут вводиться отдельно или в сочетании с интерфероном, рибавирином и/или с рядом малых молекул, которые разрабатываются и против вирусных мишеней (вирусных протеаз, вирусных полимераз, сборки вирусных репликационных комплексов), и против мишеней хозяина (протеаз хозяина, необходимых для вирусного процессинга, киназ хозяина, необходимых для фосфорилирования вирусных мишеней, например NS5A, и ингибиторов хозяйских факторов, необходимых для эффективного использования вирусной IRES). Совместно могут вводиться цитокины, такие как, например IL-2, IL-12, IL-23, IL-27, или IFN-гамма. Эти агенты могут быть объединены как часть одной и той же фармацевтической композиции, либо могут вводиться отдельно от полипептидов или конъюгатов по изобретению, либо параллельно, либо в соответствии с еще одной схемой лечения. К тому же полипептиды, полипептидные конъюгаты или композиции по изобретению могут применяться как вспомогательное вещество при других методах лечения.
Термин «пациент» для целей настоящего изобретения включает как людей, так и других млекопитающих. Таким образом, способы могут использоваться для лечения человека, а также для применения в ветеринарии.
Фармацевтическая композиция, содержащая в себе полипептид или конъюгат по изобретению, может быть разработана в различных формах, например, в виде жидкости, геля, лиофилизированного или спрессованного твердого вещества. Предпочтительная форма будет зависеть от конкретного подвергающегося лечению симптома и будет очевидна для специалиста в данной области.
Введение композиций по настоящему изобретению может осуществляться различными путями, включая, но не ограничиваясь ими, пероральный, подкожный, внутривенный, интрацеребральный, интраназальный, трансдермальный, внутрибрюшинный, внутримышечный, внутрилегочный, интратекальный, вагинальный, ректальный, интраокулярный или любой другой приемлемый способ. Композиции могут вводиться непрерывно посредством инфузии, хотя приемлема и инъекция ударной дозы вещества, при применении технических приемов, хорошо известных в данной области, таких как насосы (например, подкожные осмотические насосы) или имплантация. В некоторых случаях композиции могут быть применены непосредственно в виде раствора или спрея.
Примером фармацевтической композиции является раствор, разработанный для парентерального введения. Хотя во многих случаях композиции фармацевтического раствора находятся в жидкой форме, предназначенной для немедленного использования, такие парентеральные композиции также могут находиться в замороженном или лиофилизированном виде. В первом случае композицию следует оттаять перед использованием. Вторая форма часто используется для повышения стабильности при различных условиях хранения содержащегося в композиции активного соединения, что и понятно специалистам в данной области, так как лиофилизированные препараты обычно более стабильны, чем их жидкие аналоги. Лиофилизированные препараты перед применением растворяют путем добавления одного или несколько подходящих фармацевтически приемлемых разбавителей, таких как стерильная вода для инъекций или стерильный физиологический раствор.
Парентеральные композиции могут быть получены для хранения в виде лиофилизированных композиций или водных растворов путем смешивания соответствующим образом полипептида, имеющего желаемую степень чистоты, с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями, эксципиентами или стабилизаторами, обычно используемыми в данной области (все из которых называются «эксципиенты»), например с буферирующими агентами, стабилизирующими агентами, консервантами, изотониками, неионными детергентами, антиоксидантами и/или другими разнообразными вспомогательными веществами.
Буферирующие агенты помогают поддерживать pH в области, которая приближается к физиологическим условиям. Обычно они присутствуют в диапазоне концентрации примерно от 2 мМ до 50 мМ. Подходящие буферирующие вещества для применения по настоящему изобретению включают и органические, и неорганические кислоты и их соли, как например, цитратные буферы (например, смесь мононатриевого цитрата и динатриевого цитрата, смесь лимонной кислоты и тринатриевого цитрата, смесь лимонной кислоты и мононатриевого цитрата и т.д.), сукцинатные буферы (например, смесь янтарной кислоты и мононатриевого сукцината, смесь янтарной кислоты и гидроксида натрия, смесь янтарной кислоты и динатриевого сукцината и т.д.), тартратные буферы (например, смесь винной кислоты и виннокислого натрия, смесь винной кислоты и виннокислого калия, смесь винной кислоты и гидроксида натрия и т.д.), фумаратные буферы (например, смесь фумаровой кислоты и мононатриевого фумарата, смесь фумаровой кислоты и динатриевого фумарата, смесь мононатриевого фумарата и динатриевого фумарата и т.д.), глюконатные буферы (например, смесь глюконовой кислоты и глюконата натрия, смесь глюконовой кислоты и гидроксида натрия, смесь глюконовой кислоты и глюконата калия и т.д.), оксалатные буферы (например, смесь щавелевой кислоты и оксалата натрия, смесь щавелевой кислоты и гидроксида натрия, смесь щавелевой кислоты и оксалата калия и т.д.), лактатные буферы (например, смесь молочной кислоты и лактата натрия, смесь молочной кислоты и гидроксида натрия, смесь молочной кислоты и лактата калия и т.д.) и ацетатные буферы (например, смесь уксусной кислоты и ацетата натрия, смесь уксусной кислоты и гидроксида натрия и т.д.). Дополнительные возможности дают фосфатные буферы, гистидиновые буферы и соли триметиламина, такие как Tris.
Для замедления роста микроорганизмов добавляют консерванты и обычно их добавляют в количестве около 0,2%-1% (вес./об.). Подходящие консерванты для применения по настоящему изобретению включают фенол, бензиловый спирт, метакрезол, метилпарабен, пропилпарабен, хлорид октадецилдиметилбензиламмония, галоиды бензалкония (например, бензалкония хлорид, бромид или иодид), хлорид гексония, алкилпарабены, такие как метилпарабен или пропилпарабен, катехин, резорцин, циклогексанол и 3-пентанол.
Изотонические средства добавляют для придания жидким композициям изотоничности, и они включают многоатомные спирты сахара, предпочтительно, трехатомные спирты сахара или выше, такие как глицерин, эритритол, арабитол, ксилит, сорбит и маннит. Многоатомные спирты могут присутствовать в количестве от 0,1% до 25% по весу, обычно от 1% до 5%, принимая во внимание относительные количества других ингредиентов.
Стабилизаторы относятся к обширной категории наполнителей, которые могут варьировать по функции от наполнителя до вспомогательного вещества, которое растворяет терапевтическое вещество или помогает предотвратить денатурацию или прилипание к стенке контейнера. Характерными стабилизаторами могут быть сахар в спиртовой форме (перечислены выше); аминокислоты, такие как аргинин, лизин, глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аланин, орнитин, L-лейцин, 2-фенилаланин, глутаминовая кислота, треонин и т.д., органические сахара или спирты сахара, такие как лактоза, трегалоза, стахиоза, маннит, сорбит, ксилит, рибит, миоинозит, галактит, глицерин и т.п., включая циклитолы, такие как инозитол; полиэтиленгликоль; полимеры аминокислот; серосодержащие восстановители, такие как мочевина, глутатион, липоевая кислота, тиогликолят натрия, тиоглицерин, альфа-монотиоглицерин и тиосульфат натрия; низкомолекулярные полипептиды (то есть <10 остатков); белки, такие как сывороточный альбумин человека, бычий сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; моносахариды, такие как ксилоза, манноза, фруктоза и глюкоза; дисахариды, такие как лактоза, мальтоза и сахароза; трисахариды, такие как раффиноза, и полисахариды, такие как декстран. Обычно стабилизаторы присутствуют в диапазоне от 0,1 до 10000 частей по весу исходя из веса активного белка.
Неионные поверхностно-активные вещества или детергенты (так же известные как «смачивающие вещества») могут присутствовать для улучшения растворимости терапевтического вещества, а также для защиты терапевтического полипептида от слипания, вызванного перемешиванием, что также позволяет композиции подвергаться напряжению сдвига без денатурации полипептида. Подходящие неионные поверхностно-активные вещества включают полисорбаты (20, 80 и т.д.), полоксамеры (184, 188 и т.д.), многоатомные спирты Pluronic, полиоксиэтиленовые моноэфиры сорбитана (Tween-20, Tween-80 и т.д.).
Дополнительные разнообразные эксципиенты включают наполнители или заполнители (например, крахмал), хелатирующие агенты (например, EDTA), антиоксиданты (например, аскорбиновую кислоту, метионин, витамин E) и совместные растворители.
Также активный ингредиент может захватываться в микрокапсулы, приготовленные, например, посредством коацервационных способов или посредством поверхностной полимеризации, например, в микрокапсулы из гидроксиметилцеллюлозы, желатина или полиметилметакрилата, в коллоидные системы доставки лекарственного вещества (например, в липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в макроэмульсии. Такого рода способы раскрыты в Remington's Pharmaceutical Sciences, supra.
В одном из аспектов изобретения композиция представляет собой жидкую композицию, такую как водная композиция, и включает в себя производное сульфоалкилового эфира циклодекстрина.
Парентеральные композиции, используемые для введения in vivo, должны быть стерильными. Это легко достигается, например, посредством фильтрации через стерильные мембраны для фильтрации.
Подходящие примеры препаратов с длительным высвобождением включают полупроницаемые матрицы твердых гидрофобных полимеров, содержащие в себе полипептид или конъюгат, матрицы, имеющие подходящую форму, как например, пленка или микрокапсулы. Примеры длительно высвобождаемых матриц, включают в себя полиэфиры, гидрогели (например, поли-2-гидроксиэтилметакрилат или поливиниловый спирт), полилактиды, сополимеры L-глутаминовой кислоты и этил-L-глутамата, неразлагающийся этиленвинилацетат, разлагающиеся сополимеры молочной кислоты и гликолевой кислоты, такие как ProLease technology или Lupron Depot (инъецируемые микросферы, состоящие из сополимера молочной кислоты и гликолевой кислоты и ацетата лейпролида), и поли-D-(-)-3-гидроксибутановую кислоту. Тогда как полимеры, такие как этиленвинилацетат и сополимер молочной кислоты и гликолевой кислоты, способны высвобождать молекулы в течение длительного времени, например до 100 дней или более, некоторые гидрогели высвобождают белки в течение более короткого времени. Если инкапсулированные полипептиды остаются в организме в течение длительного времени, они могут денатурировать или агрегировать в результате воздействия влаги при 37ºC, что приводит к утрате биологической активности и возможным изменениям в иммуногенности. Могут быть разработаны целесообразные стратегии для стабилизации в зависимости от затронутого механизма. Например, если обнаружено, что механизм агрегации представляет собой образование межмолекулярной S-S связи посредством тиодисульфидного обмена, стабилизация может быть достигнута посредством видоизменения сульфгидрильных остатков, лиофилизации из кислых растворов, контроля абсолютной влажности при использовании соответствующих вспомогательные вещества и посредством разработки специальных композиций с полимерной матрицей.
Изобретение относится к пероральному приему пептидов и пептидных конъюгатов. Для перорального приема фармацевтическая композиция может находиться в твердом или жидком виде, например в виде капсулы, таблетки, суспензии, эмульсии или раствора. Предпочтительно, фармацевтическую композицию составляют в виде единичных доз, содержащих установленное количество активного ингредиента. Подходящая суточная доза для человека или другого млекопитающего может колебаться в широких пределах в зависимости от состояния пациента и других факторов, и она может быть определена специалистами в данной области стандартными способами.
Твердые лекарственные формы для перорального приема включают капсулы, таблетки, суппозитории, порошки и гранулы. В таких твердых лекарственных формах активное соединение может быть с примесью по меньшей мере одного инертного разбавителя, такого как сахароза, лактоза или крахмал. Также, в обычной практике, подобные лекарственные формы могут содержать в себе дополнительные субстанции, например смазывающие вещества, такие как стеарат магния. Что касается капсул, таблеток и пилюль, лекарственные формы также могут содержать в себе буферирующие агенты. Дополнительно таблетки и пилюли могут быть приготовлены с энтеросолюбильным покрытием.
Полипептиды или конъюгаты могут быть смешаны со вспомогательными веществами, такими как лактоза, сахароза, крахмальный порошок, эфиры целлюлозы и алкановых кислот, стеариновая кислота, тальк, стеарат магния, оксид магния, натриевые и кальциевые соли фосфорной и серной кислот, гуммиарабик, желатин, альгинат натрия, поливинилпирролидин и/или поливиниловый спирт, и могут быть таблетированы или инкапсулированы для обычного приема. В другом случае они могут быть растворены в физиологическом растворе, воде, полиэтиленгликоле, пропиленгликоле, этаноле, маслах (таких как кукурузное масло, арахисовое масло, хлопковое масло или кунжутное масло), трагакантовой камеди и/или в различных буферах. В фармацевтической области хорошо известны другие вспомогательные вещества и способы введения. Носитель или разбавитель могут содержать в себе инерционный материал, такой как глицерилмоностеарат или глицерилдистеарат в чистом виде или с твердыми углеводородами, или другие материалы, общеизвестные в данной области.
Фармацевтические композиции могут подвергаться традиционным фармацевтическим манипуляциям, таким как стерилизация, и/или могут содержать обычные вспомогательные вещества, такие как консерванты, стабилизаторы, смачивающие вещества, эмульгаторы, буферы, заполнители и т.д., например, как отмечалось где-либо еще в настоящем изобретении.
Жидкие лекарственные формы для перорального приема могут иметь в своем составе фармацевтически приемлемые эмульсии, растворы, суспензии, сиропы и эликсиры, содержащие инертные разбавители, распространенные в данной области, например воду. Подобные композиции также могут содержать вспомогательные вещества, например смачивающие вещества, подсластители, ароматизирующие вещества и отдушки.
В качестве части указанного изобретения предполагаются композиции, подходящие для легочного введения. Композиции, подходящие для применения с распылителем, либо струйным, либо ультразвуковым, в большинстве случаев содержат в себе полипептид или конъюгат, растворенный в воде с концентрацией, например, приблизительно от 0,01 до 25 мг конъюгата на 1 мл раствора, предпочтительно примерно от 0,1 до 10 мг/мл. Также композиция может включать в свой состав буфер и моносахарид (например, для стабилизации белка и регуляции осмотического давления), и/или сывороточный альбумин человека, концентрация которого находится в пределах от 0,1 до 10 мг/мл. Примерами буферов, которые могут применяться, служат ацетат натрия, цитрат натрия и глицин. Предпочтительно, чтобы буфер имел состав и молярность, подходящую для приведения указанного раствора к pH в диапазоне от 3 до 9. Как правило, молярность буфера от 1 мМ до 50 мМ подходит для этой цели. Примерами сахаров, которые могут использоваться, служат лактоза, мальтоза, маннит, сорбит, трегалоза и ксилоза, обычно в количестве, колеблющемся в пределах от 1% до 10% от веса композиции.
Аэрозольные композиции также могут содержать в себе поверхностно-активное вещество для уменьшения или предотвращения возникновения в формирующемся аэрозоле индуцированной поверхностью агрегации белка, вызванной пульверизацией раствора. Могут использоваться различные стандартные поверхностно-активные вещества, такие как полиоксиэтиленовые эфиры жирных кислот и спиртов, и полиоксиэтиленовые эфиры сорбитана и жирных кислот. Количество, как правило, колеблется в пределах между 0,001% и 4% от веса композиции. Особенно предпочтительным поверхностно-активным веществом для целей изобретения является полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат.
Конкретные композиции и способы создания подходящих дисперсий из жидких частиц по изобретению описаны в WO 94/20069, в патенте США No. 5915378, в патенте США No. 5960792, в патенте США No. 5957124, в патенте США No. 5934272, в патенте США No. 5915378, в патент США No. 5855564, в патенте США No. 5826570 и в патенте США No. 5522385, которые включены в настоящее изобретение в качестве ссылок.
Композиции для использования с ингалятором, отмеряющим дозу, как правило, включают в себя мелкодисперсионный порошок. Этот порошок может быть получен посредством лиофилизации и последующего измельчения сложной жидкой композиции, и также может содержать в себе стабилизатор, такой как сывороточный альбумин человека (HSA). Обычно добавляют более чем 0,5% (вес./вес.) HSA. Кроме того, если необходимо, к препарату могут быть добавлены один или несколько сахаров или сахаров в форме спиртов. Примеры включают лактозу, мальтозу, маннит, сорбит, сорбозу, трегалозу, ксилит и ксилозу. Добавляемое к композиции количество колеблется в пределах примерно от 0,01 до 200% (вес./вес.), предпочтительно, приблизительно от 1 до 50% от присутствующего конъюгата. Затем такие композиции лиофилизируют и измельчают до желаемого размера частицы.
Затем частицы подходящего размера суспендируют в пропелленте при помощи поверхностно-активного вещества. Пропеллент может представлять собой любой стандартный материал, используемый для этой цели, например хлорфторуглерод, гидрохлорфторуглерод, гидрофторуглерод или углеводород, включая трихлорфторметан, дихлордифторметан, дихлортетрафторэтанол и 1,1,1,2-тетрафторэтан или их комбинации. Подходящие поверхностно-активные вещества включают сорбитантриолеат и соевый лецитин. Также в качестве поверхностно-активного вещества может применяться олеиновая кислота. Затем смесью наполняют подающее устройство. Примером коммерчески доступного отмеряющего дозу ингалятора, подходящего для применения в настоящем изобретении, является Ventolin metered dose inhaler, изготовленный Glaxo Inc., Research Triangle Park, N.C., USA.
2
Композиции для порошковых ингаляторов содержат мелкодисперсионный сухой порошок, содержащий полипептиды или полипептидные конъюгаты, и также могут включать в свой состав наполнитель, такой как лактоза, сорбит, сахароза или маннит, в количестве, которое способствует распылению порошка из устройства, например, от 50% до 90% от веса композиции. В легком частицы порошка должны иметь аэродинамические свойства, соответствующие частицам с плотностью примерно 1 г/см, имеющим средний диаметр менее чем 10 микрометров, предпочтительно, между 0,5 и 5 микрометров, наиболее предпочтительно, между 1,5 и 3,5 микрометров. Примером порошкового ингалятора, подходящего для применения в соответствии с идеей изобретения, является Spinhaler powder inhaler, выпущенный Fisons Corp., Bedford, Mass., USA. Порошки для этих устройств могут создаваться и/или доставляться посредством способов, раскрытых в патенте США No. 5997848, в патенте США No. 5993783, в патенте США No. 5985248, в патенте No. 5976574, в патенте США No. 5922354, в патенте США No. 5785049 и в патенте США No. 5654007.
Механические устройства, разработанные для доставки терапевтических препаратов в легкие, включают, но ими не ограничиваются, распылители, отмеряющие дозу ингаляторы и порошковые ингаляторы, все из которых известны специалистам в данной области. Конкретными примерами коммерчески доступных устройств, подходящих для использования в этом изобретении, являются Ultravent nebulizer, выпущенный Mallinckrodt, Inc., St Louis, Mo., USA; Acorn II nebulizer, выпущенный Marquest Medical Products, Englewood, Colo., USA; Ventolin metered dose inhaler, выпущенный Glaxo Inc., Research Triangle Parle, N.C., USA; Spinhaler powder inhaler, выпущенный Fisons Corp., Bedford, Mass., USA, остающееся «аэрозольным» устройство от Nektar Pharmaceuticals, Inc., San Carlos, Calif., USA; AIR inhaler, выпущенный Alkermes, Cambridge, Mass., USA; и AERx pulmonary drug delivery system, выпущенная Aradigm Corporation, Hayward, Calif., USA.
Также настоящее изобретение относится к наборам, содержащим в своем составе полипептиды, конъюгаты, полинуклеотиды, экспрессионные векторы, клетки, способы, композиции и системы, и приборы по изобретению. Наборы по изобретению произвольно содержат в себе по меньшей мере одно из нижеследующего по изобретению: (1) прибор, систему, компонент системы, или компонент прибора, которые описаны в настоящем изобретении; (2) по меньшей мере один компонент набора, включающий в себя полипептид или конъюгат или полинуклеотид по данному изобретению; плазмидный экспрессионный вектор, кодирующий полипептид по изобретению; клетку, экспрессирующую полипептид по изобретению; или композицию, включающую в себя по меньшей мере любой из таких компонентов; (3) инструкции для применения любого способа, описанного здесь, включая терапевтический или профилактический способ, инструкции по применению любого компонента, описанного в пункте (2), или любой композиции любого из таких компонентов; и/или инструкции по управлению любым прибором, системой или компонентом, описанным здесь; (4) контейнер для хранения по меньшей мере одного такого упомянутого компонента или композиции и (5) упаковочные материалы.
В следующем аспекте настоящее изобретение относится к применению любого прибора, компонента, композиции или набора, описанного выше в настоящем изобретении, применение любого способа или исследования, описанного в описании, и/или применение любого прибора, компонента, композиции или набора для применения на практике любого исследования или метода, описанного здесь.
Химические модификации, конъюгаты и слияния
Любой полипептид по изобретению может представлять собой часть большей полипептидной последовательности, например, слитого белка, возникающего при добавлении одного или нескольких доменов или подпоследовательностей для стабилизации, или детекции, или очистки полипептида. Подпоследовательность для очистки полипептида может включать в себя, например, эпитопную метку, FLAG-метку, полигистидиновую последовательность, GST или любую другую подпоследовательность для детекции/очистки или «метку», известную в данной области. Эти дополнительные домены или подпоследовательности либо имеют незначительное воздействие на активность полипептид по изобретению, либо не имеют никакого воздействия, или могут быть удалены посредством этапов постсинтетического процессинга, таких как обработка протеазой, введение интеина или т.п.
SC
Настоящее изобретение включает слитые белки, включающие в полипептид по изобретению, слитый, например, как описано здесь, с молекулой Ig, например, с Fc-петлей IgG человека («кристаллизующимся фрагментом» или фрагментом связывания комплемента), с CH2-доменом и CH3-доменом, и нуклеотидные последовательности, кодирующие такой слитый белок. Fc представляет собой часть антитела, отвечающую за связывание с рецепторами антитела на клетках и с C1q-элементом комплемента. Эти слитые белки и кодирующие их нуклеиновые кислоты пригодны в качестве профилактических и/или терапевтических лекарственных препаратов или в качестве средств диагностики (также см., например, Challita-Eid, P. et al. (1998) J. Immunol 160:3419-3426; Sturmhoefel, K. et al. (1999) Cancer Res 59:4964-4972). Также изобретение включает слитые белки, содержащие в себе полипептид по изобретению, слитый с молекулой альбумина, такого как сывороточный альбумин человека (HSA), как описано, например, в патенте США No. 5876969, и нуклеотидные последовательности, кодирующие данный слитый белок. Белки, слитые с Ig и альбумином, могут демонстрировать повышенное время полужизни пептида в сыворотке и/или функциональное время полужизни in vivo, сниженную антигенность полипептида, увеличенную стабильность полипептида при хранении или возрастающую биодоступность, например увеличенную AUC, и таким образом могут применяться в качестве профилактических и/или терапевтических лекарственных препаратов.
Все полипептиды по изобретению имеют специфическую способность проходить через клеточные мембраны и воздействовать на терапевтические функции внутри клеток. Следовательно, настоящее изобретение относится к применению полипептидов по изобретению для улучшения клеточной проницаемости или передачи сигнала любой другой молекулой. Более того, изобретение относится к применению любого фрагмента или подфрагмента полипептидов по изобретению для усиления клеточной проницаемости для любой другой молекулы, длина таких фрагментов или подфрагментов составляет около 5 аминокислот, около 10 аминокислот, например 15 аминокислот, например около 20 аминокислот, приблизительно 25 аминокислот, примерно 30 аминокислот, например 35 аминокислот, около 35-50 аминокислот, примерно 50-100 аминокислот, например 75 аминокислот, например 100-125 аминокислот.
sc
Также любой полипептид по изобретению может включать в свой состав одну или несколько модифицированных аминокислот. Модифицированная аминокислота может быть, например, гликозилированной аминокислотой, ПЭГилированной аминокислотой, фарнезилированной аминокислотой, ацетилированной аминокислотой, биотинилированной аминокислотой, аминокислотой, конъюгированной с липидным фрагментом, или аминокислотой, конъюгированной с органическим веществом, создающим производные. Наличие модифицированных аминокислот может быть благоприятно, например, (a) при увеличении времени полужизни полипептида в сыворотке и/или функционального времени полужизни in vivo, (b) при снижении антигенности полипептида, (c) при увеличении стабильности полипептида при хранении или (d) при увеличении биодоступности, например при увеличении AUC. Аминокислота(-ы) модифицируется, например, во время трансляции или после трансляции во время рекомбинантной продукции (например, гликозилирование на N-конце в мотивах N-X-S/T во время экспрессии в клетках млекопитающих) или модифицируется при помощи синтетических способов.
Термин «конъюгат» (или равнозначные термины «полипептидный конъюгат» или «конъюгированный полипептид») обозначает гетерогенные (по составу) молекулы, образуемые посредством ковалентного присоединения одного или несколько полипептидов по изобретению к одному или нескольким неполипептидному фрагменту. Термин «ковалентное присоединение» подразумевает, что полипептид и неполипептидный фрагмент либо непосредственно ковалентно соединены друг с другом, либо же опосредованно ковалентно соединены друг с другом через находящийся между ними фрагмент или фрагменты, такие как мостик, спейсер или связывающий фрагмент или фрагменты. Предпочтительно, конъюгированный полипептид является растворимым при соответствующих концентрациях и условиях, то есть растворим в физиологических жидкостях, например в крови. Примеры конъюгированных полипептидов по изобретению включают гликозилированные и/или ПЭГилированные полипептиды. Термин «неконъюгированный полипептид» может применяться в отношении полипептидной части конъюгированного полипептида.
Термин «неполипептидный фрагмент» обозначает молекулу, которая способна конъюгировать с присоединяющей группой полипептида. Предпочтительные примеры неполипептидных фрагментов включают полимерные молекулы, фрагменты сахаров, липофильные соединения или органические вещества, создающие производные, в частности полимерные молекулы или фрагменты сахаров. Очевидно, что неполипептидный фрагмент связан с полипептидом через присоединяющую группу полипептида. Исключая случаи, когда явно указано количество неполипептидных фрагментов, таких как полимерная молекула(ы), соединенная с полипептидом, каждую ссылку на «неполипептидный фрагмент», присоединенный к полипептиду или иным образом применяемый в настоящем изобретении, следует относить к одному или нескольким неполипептидным фрагментам, присоединенным к полипептиду.
Термин «полимерная молекула» определяется как молекула, образованная посредством ковалентного соединения двух или несколько мономеров, где ни один из мономеров не является аминокислотным остатком. Термин «полимер» может равнозначно использоваться с термином «полимерная молекула».
Термин «фрагмент сахара» обозначает молекулу углевода, прикрепленную посредством гликозилирования in vivo или in vitro, такого как N- или O-гликозилирование. «Сайт N-гликозилирования» имеет последовательность N-X-S/T/C, где X представляет собой любой аминокислотный остаток, кроме пролина, N представляет собой аспарагин и S/T/C представляет собой либо серин, либо треонин, либо цистеин, предпочтительно, серин или треонин, и наиболее предпочтительно, треонин. «Сайт O-гликозилирования» включает OH-группу остатка серина или треонина.
Термин «присоединяющая группа» обозначает группу аминокислотного остатка, способную соединяться с соответствующим неполипептидным фрагментом, таким как полимерная молекула или фрагмент сахара.
В отношении N-гликозилирования in vivo термин «присоединяющая группа» применяется нетрадиционным образом для указания аминокислотных остатков, составляющих сайт N-гликозилирования (с последовательностью N-X-S/T/C, где X представляет собой любой аминокислотный остаток, кроме пролина, N представляет собой аспарагин и S/T/C представляет собой либо серин, либо треонин, либо цистеин, предпочтительно, серин или треонин, и наиболее предпочтительно, треонин). Несмотря на то, что остаток аспарагина N-гликозилированного сайта является тем остатком, к которому крепится фрагмент сахара во время гликозилирования, такое прикрепление не может быть достигнуто, если не присутствуют остальные аминокислотные остатки сайта N-гликозилирования. Следовательно, если неполипептидный фрагмент является фрагментом сахара и слияние достигается посредством N-гликозилирования, термин «аминокислотный остаток, содержащий в себе присоединяющую группу для неполипептидного фрагмента», применяемый в связи с изменениями в аминокислотной последовательности полипептида по изобретению, подразумевает один, два или все аминокислотные остатки, образующие сайт N-гликозилирования, которые изменяются таким образом, что либо функциональный сайт N-гликозилирования вводится в данную аминокислотную последовательность, удаляется из упомянутой последовательности, либо функциональный сайт N-гликозилирования сохраняется в аминокислотной последовательности (например, посредством замещения серинового остатка, который уже составляет часть сайта N-гликозилирования, остатком треонина, и наоборот).
Термин «вводить» (то есть «введенный» аминокислотный остаток, «введение» аминокислотного остатка) прежде всего предназначен для обозначения замены существующего аминокислотного остатка на другой аминокислотный остаток, но также может означать инсерцию дополнительного аминокислотного остатка.
Термин «удалять» (то есть «удаленный» аминокислотный остаток, «удаление» аминокислотного остатка) прежде всего предназначен для обозначения замены аминокислотного остатка, который следует заменить другим аминокислотным остатком, но также может означать делецию (без замены) аминокислотного остатка, который следует удалить.
Термин «аминокислотный остаток, содержащий в себе присоединяющую группу для неполипептидного фрагмента» обозначает, что данный аминокислотный остаток является тем остатком, с которым связывается неполипептидный фрагмент (в случае введенного аминокислотного остатка) или с которым связался бы (в случае удаленного аминокислотного остатка).
Термин «функциональное время полужизни in vivo » применяется в его обычном смысле, то есть представляет собой время, в течение которого в организме/органе мишени все еще обнаруживается 50% биологической активности полипептида, или время, в течение которого активность полипептида составляет 50% от исходного значения. Функциональное время полужизни in vivo может быть определено на экспериментальном животном, таком как крыса, мышь, кролик, собака или обезьяна. Предпочтительно, функциональное время полужизни in vivo определяется на приматах, не являющихся человеком, таких как обезьяна. Кроме того, функциональное время полужизни in vivo может определено для образца, который был введен внутривенно или подкожно.
В качестве альтернативы при определении функционального времени полужизни in vivo может быть определено «время полужизни в сыворотке», то есть время, в течение которого 50% полипептида циркулирует в плазме или в кровяном русле до выведения. Определение времени полужизни в сыворотке часто является более простым, чем определение функционального времени полужизни in vivo, и значение времени полужизни в сыворотке обычно является хорошим показателем значения функционального времени полужизни in vivo. Альтернативно термины, обозначающие время полужизни в сыворотке, включают «время полужизни в плазме», «полупериод циркулирования», «очищение сыворотки», «очищение плазмы» и «полупериод очищения».
Полинуклеотиды и способы мутагенеза
Настоящее изобретение включает нуклеиновые кислоты и полинуклеотиды, которые кодируют полипептиды по изобретению. Изобретение включает композиции, полученные посредством разрезания любого одного или нескольких полинуклеотидов по изобретению эндонуклеазой рестрикции, РНКазой или ДНКазой (например, как выполнено в некоторых рекомбинантных схемах где-либо в спецификации); и композиции, полученные посредством дезинтегрирования или отрезания одного или нескольких полинуклеотидов по изобретению посредством механических способов (например, посредством разрушения ультразвуком, интенсивного перемешивания и т.п.), которые также могут применяться для обеспечения субстратов для рекомбинации в описанных здесь способах. Также изобретение относится к композициям, образованным при отщеплением по меньшей мере одного из полинуклеотидов по изобретению. Расщепление может включать в себя механическое, химическое или ферментативное расщепление, и ферментативное расщепление может включать в себя расщепление эндонуклеазой рестрикции, РНКазой или ДНКазой.
Также в изобретение включены композиции, полученные способом, включающим инкубацию одного или нескольких дезинтегрированных полинуклеотидов по изобретению в присутствии трифосфатов рибонуклеотида или дезоксирибонуклеотида и полимеразы нуклеиновой кислоты. Эти итоговые композиции образуют рекомбинационную смесь для многих рекомбинантных схем, описанных выше. Полимераза нуклеиновой кислоты может быть РНК-полимеразой, ДНК-полимеразой или РНК-зависимой ДНК-полимеразой (например, «обратной транскриптазой»); полимераза может быть, например, термостабильной ДНК-полимеразой (например, VENT, TAQ или т.п.).
Аналогичным образом композиции, содержащие в себе серии олигонуклеотидов, соответствующих нескольким нуклеиновым кислотам по изобретению, могут быть использованы в качестве рекомбинационных субстратов и являются особенностью указанного изобретения. Для удобства эти дезинтегрированные, расщепленные или синтезированные олигонуклеотидные смеси именуются как серии дезинтегрированных нуклеиновых кислот.
Также изобретение относится к выделенной или рекомбинантной нуклеиновой кислоте, кодирующему полипептиду, полученному посредством мутирования, или рекомбинации по меньшей мере одного полинуклеотида по изобретению.
Полинуклеотиды, олигонуклеотиды и фрагменты нуклеиновой кислоты по изобретению могут быть получены посредством стандартных твердофазных способов в соответствии с известными синтетическими способами. В большинстве случаев фрагменты примерно до 100 оснований синтезируются отдельно, затем соединяются (например, посредством ферментативных или химических способов лигирования или посредством рекомбинационных способов, опосредованных полимеразой) для образования фактически любой желаемой непрерывной последовательности. Например, полинуклеотиды и олигонуклеотиды по изобретению могут быть получены посредством химического синтеза при использовании, например, классического фосфорамидитного способа, описанного, например, Beaucage et al. (1981) Tetrahedron Letters 22:1859-69, или способа, описанного Matthes et al. (1984) EMBO J 3:801-05, что, например, обычно используется в автоматизированных синтетических способах. В соответствии с фосфорамидитным способом, олигонуклеотиды синтезируют, например, в автоматическом устройстве, синтезирующем ДНК, очищают, отжигают, сшивают и клонируют в соответствующие векторы.
Помимо этого, фактически любой полинуклеотид может быть заказан в любом из множества коммерческих источников, таких как Operon Technologies Inc. (Alameda, Calif.) и многих других. Аналогичным образом пептиды и антитела могут быть заказаны в любом из множества источников, например, в Celtek Peptides (Nashville, Tenn.); Washington Biotechnology, Inc. (Baltimore Md.); Global Peptide Services (Ft. Collin Colo.) и во многих других.
Некоторые полинуклеотиды по изобретению также могут быть получены посредством скринирования библиотек кДНК (например, библиотек, созданных посредством рекомбинирования гомологичных нуклеиновых кислот, как при обычной рекомбинации рекурсивной последовательности) с применением олигонуклеотидных зондов, которые могут гибридизоваться с полинуклеотидами, амплифицированными в результате ПЦР, которые кодируют полипептиды OAS и фрагменты этих полипептидов. Способы скринирования и выделения клонов кДНК хорошо известны специалистам в данной области. Такие технические приемы описаны, например, Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymol. Vol. 152, Acad. Press, Inc., San Diego, Calif. ("Berger"); J. Sambrook and D.W. Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, ("Sambrook"); and EM. Ausubel et al. (1987-2005) Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Interscience, New York, NY ("Ausubel"). Некоторые полинуклеотиды по изобретению могут быть получены посредством изменения природной последовательности, например посредством мутагенеза, рекомбинации рекурсивной последовательности (например, перемешивания) или посредством олигонуклеотидной рекомбинации. В иных случаях такие полинуклеотиды могут изготовляться in silico либо посредством олигонуклеотидных рекомбинационных способов, описанных в цитированных здесь ссылках.
Как описано более подробно в настоящем изобретении, полинуклеотиды по изобретению включают полинуклеотиды, которые кодируют полипептиды по изобретению, полинуклеотидные последовательности, комплементарные этим полинуклеотидным последовательностям, и полинуклеотиды, которые гибридизуются по меньшей мере в жестких условиях с охарактеризованной здесь последовательностью. Кодирующая последовательность соотносится с полинуклеотидной последовательностью, кодирующей конкретный полипептид или домен, область или фрагмент упомянутого полипептида. Полинуклеотиды по изобретению могут существовать в виде РНК или в виде ДНК и включают мРНК, кРНК, синтетические РНК и ДНК и кДНК. Полинуклеотиды могут быть двухцепочечными или одноцепочечными, и во втором случае могут представлять собой кодирующую цепь или некодирующую (антисмысловую, комплементарную) цепь. Полинуклеотиды по данному изобретению включают кодирующую последовательность полипептида по изобретению (i) отдельно, (ii) совместно с одной или несколькими дополнительными кодирующими последовательностями так, что кодируют, например, слитый белок, пребелок, препробелок или т.п., (iii) совместно с некодирующими последовательностями, такими как интроны, управляющими элементами, например, с промотором (например, природным или рекомбинантым, или перемещенным промотором), с терминирующим элементом или с 5' и/или 3' нетранслируемыми областями, эффективными при экспрессии кодирующей последовательности у подходящего хозяина, и/или (iv) в векторе, в клетке или в среде хозяина, в которой кодирующая последовательность представляет собой гетерологичный ген.
Полинуклеотиды по изобретению также могут встречаться совместно с характерными композиционными формулами из нуклеиновых кислот, включая присутствующие носители, буферы, вспомогательные вещества, эксципиенты и т.п., что известно обычным специалистам в данной области. Полинуклеотидные фрагменты обычно состоят по меньшей мере примерно из 200 нуклеотидных оснований, например, по меньшей мере приблизительно из 250, 300, 350, 400, 450, 460, 470 или более оснований. Нуклеотидные фрагменты полинуклеотидов по изобретению могут гибридизоваться в очень жестких условиях с описанной здесь полинуклеотидной последовательностью и/или кодировать аминокислотные последовательности, имеющие по меньшей мере одно из свойств полипептидов согласно описанному здесь изобретению.
Полинуклеотиды по изобретению имеют разнообразное применение, например, в рекомбинантной продукции (то есть в экспрессии) полипептидов по изобретению, обычно посредством экспрессии плазмидного экспрессионного вектора, содержащего в себе последовательность, кодирующую полипептид или его фрагмент; в качестве терапевтического средства; в качестве профилактического средства; в качестве диагностических средств; в качестве иммуногенов; в качестве вспомогательных веществ; в качестве диагностических зондов для определения наличия комплементарных или частично комплементарных нуклеиновых кислот (включая детекцию нуклеиновой кислоты олигоаденилатсинтетазы дикого типа), в качестве субстратов для последующих реакций, например реакций рекомбинации рекурсивной последовательности или реакций мутации для получения новых и/или улучшенных вариантов и т.п.
Экспрессионные векторы, способы получения, генная терапия
В описании раскрыты рекомбинантные способы получения и выделения полипептидов по изобретению. Кроме рекомбинантной продукции, полипептиды могут быть получены посредством прямого синтеза пептида с применением твердофазной технологии (см., например, Stewart et al. (1969) Solid-Phase Peptide Synthesis, WH Freeman Co, San Francisco; Merrifield J. (1963) J Am Chem Soc 85:2149-2154). Пептидный синтез может осуществляться вручную или посредством автоматики. Автоматизированный синтез может осуществляться, например, при использовании Applied Biosystems 431A Peptide Synthesizer (Perkin Elmer, Foster City, Calif.) в соответствии с инструкциями, предусмотренными производителем. Например, подпоследовательности можно химически синтезировать раздельно и совместно с применением химических способов для получения полноразмерных полипептидов или их фрагментов. В другом случае такие последовательности можно заказать в любой из множества компаний, которые специализируются на выпуске полипептидов. Чаще всего полипептиды по изобретению могут быть получены посредством экспрессии кодирующих нуклеиновых кислот и выделения полипептидов, например, как описано ниже.
Также представлены способы получения полипептидов по изобретению. Один такой способ включает в себя введение в популяцию клеток любой нуклеиновой кислоты по изобретению, которая функционально связана с регуляторной последовательностью, эффективной для получения кодируемого полипептида, культивирование клеток в культуральной среде для экспрессии указанного полипептида и выделение полипептида из клеток или из культуральной среды. Используется количество нуклеиновой кислоты, достаточное для облегчения поглощения клеткой (трансфекции) и/или экспрессии полипептида. Нуклеиновая кислота вводится в такие клетки посредством любого известного в данной области способа доставки, включая, например, инъекцию, генную пушку, пассивное поглощение и т.д. Как будет ясно любому специалисту в данной области, нуклеиновая кислота может быть частью вектора, такого как рекомбинантный экспрессионный вектор, включая плазмидный вектор ДНК, или любым вектором, известным в данной области. Нуклеиновая кислота или вектор, содержащий в себе нуклеиновую кислоту по изобретению, могут быть подготовлены и разработаны посредством стандартных технологий на основе рекомбинантной ДНК и способов выделения, известных в данной области. Такая нуклеиновая кислота или экспрессионный вектор могут вводиться в популяцию клеток млекопитающего in vivo, или выбранные клетки млекопитающего (например, опухолевые клетки) могут выделяться из млекопитающего, и экспрессионный вектор нуклеиновой кислоты может вводиться ex vivo в популяцию таких клеток в количестве, достаточном настолько, что происходит поглощение и экспрессия кодируемого полипептида. В противном случае воспроизводится нуклеиновая кислота, или вектор, содержащий в себе нуклеиновую кислоту по изобретению, при применении культуры клеток in vitro. В одном аспекте способ получения полипептида по изобретению включает в себя введение в популяцию клеток рекомбинантного экспрессионного вектора, содержащего любую описанную здесь нуклеиновую кислоту по изобретению в количестве и в композиции такой, что это приведет к поглощению вектора и экспрессии кодируемого полипептида; введение экспрессионного вектора млекопитающему посредством любой описанной здесь схемы введения/доставки; и выделение полипептида у млекопитающего или из побочного продукта от млекопитающего.
Изобретение относится к выделенным или рекомбинантным нуклеиновым кислотам (также называемым полинуклеотидами), совместно называемым «нуклеиновые кислоты (или полинуклеотиды) по изобретению», которые кодируют полипептиды по изобретению. Полинуклеотиды по изобретению пригодны для различного применения. Как рассмотрено выше, полинуклеотиды могут использоваться для получения полипептидов по изобретению. Кроме того, полинуклеотиды по изобретению могут быть включены в экспрессионные векторы, используемые для генной терапии, ДНК-вакцинации и иммунотерапии, как описано в других местах в этой заявке.
Любой из полинуклеотидов по изобретению (которые включают описанные выше полинуклеотиды) может кодировать слитый белок, включающий в себя по меньшей мере одну дополнительную аминокислотную последовательность, такую как, например, последовательность для секреции/локализации, последовательность, удобную для растворения или иммобилизации (например, при исследовании поверхности клетки) полипептида, последовательность, применимую для детекции и/или очистки указанного полипептида (например, подпоследовательность для очистки полипептида, как например, эпитопная мишень, полигистидиновая последовательность и т.п.). В еще одном аспекте изобретение относится к клеткам, содержащим один или несколько полинуклеотидов по изобретению. Такие клетки могут экспрессировать один или несколько полипептидов, кодируемых полинуклеотидами по изобретению.
Также изобретение относится к векторам, содержащим в себе любой из полинуклеотидов по изобретению. Такие векторы могут включать в себя плазмиду, космиду, фаг, вирус или фрагмент вируса. Такие векторы могут вмещать в себя экспрессионный вектор и, при желании, нуклеиновую кислоту, функционально связанную с промотором, включая те, что описаны здесь и ниже. Кроме всего прочего, в еще одном аспекте настоящее изобретение относится к композициям, содержащим эксципиент или носитель и по меньшей мере любой из полинуклеотидов по изобретению, или векторы, клетки, или хозяина, содержащего в себе такие нуклеиновые кислоты. Такие композиции могут быть фармацевтическими композициями, и эксципиент или носитель могут быть фармацевтически приемлемыми эксципиентом или носителем.
Также изобретение включает композиции, содержащие в себе две или несколько нуклеиновых кислот по изобретению или их фрагменты (например, субстраты для рекомбинации). Композиция может включать в себя библиотеку рекомбинантных нуклеиновых кислот, где данная библиотека вмещает в себя по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 5, по меньшей мере 10, по меньшей мере 20, по меньшей мере 50 или по меньшей мере 100 или более нуклеиновых кислот, описанных выше. При желании, нуклеиновые кислоты клонируют в экспрессионные векторы, обеспечивая экспрессионные библиотеки.
Полинуклеотиды по изобретению и их фрагменты, а также векторы, содержащие такие полинуклеотиды, могут применяться для терапевтических или профилактических целей в сочетании с подходящим носителем, таким как фармацевтический носитель. Такие композиции вмещают терапевтически и/или профилактически эффективное количество соединения и фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент. Такой носитель или эксципиент включает, но ими не ограничивается, физиологический раствор, забуференный физиологический раствор, декстрозу, воду, глицерин, этанол и их сочетания. Композиция должна соответствовать способу введения. Способы введения нуклеиновых кислот, полипептидов и белков хорошо известны в данной области.
Полные тексты, которые описывают применимые здесь молекулярно-биологические технические приемы, включая применение векторов, промоторов и многие другие актуальные темы, включают Berger supra; Sambrook (1989) supra и Ausubel supra. Примеры технических приемов, достаточных для того, чтобы указать специалистам путь по способам амплификации in vitro, включая полимеразную цепную реакцию (ПЦР), лигазную цепную реакцию (LCR), Q-бета-репликазной амплификацию и другие опосредованные РНК-полимеразой технические приемы (например, NASBA), например, при продукции гомологичных нуклеиновых кислот по изобретению, находятся в Berger, Sambrook, и Ausubel, все supra, а также Mullis et al. (1987) патент США No. 4683202; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis et al, eds.) Academic Press Inc. San Diego, Calif. (1990) ("Innis"); Arnheim & Levinson (Oct. 1,1990) C&EN 36-47; The Journal Of NIH Research (1991) 3:81-94; (Kwoh et al. (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86:1173-1177; Guatelli et al. (1990) Proc Natl Acad Sci USA 87:1874-1878; Lomeli et al. (1989) J Clin Chem 35:1826-1831; Landegren et al. (1988) Science 241:1077-1080; Van Brunt (1990) Biotechnology 8:291-294; Wu and Wallace (1989) Gene 4:560-569; Barringer et al. (1990) Gene 89:117-122, and Sooknanan and Malek (1995) Biotechnology 13:563-564. Улучшенные способы клонирования амплифицированных нуклеиновых кислот in vitro описаны у Wallace et al., патент США No. 5426039. Усовершенствованные способы амплификации больших нуклеиновых кислот посредством ПЦР резюмированы у Cheng et al. (1994) Nature 369:684-685 и во внутренних ссылках, в которых получены ПЦР-ампликоны размером до 40 тысяч оснований (kb). Специалист оценит то, что фактически любая РНК может быть преобразована в двухцепочечную ДНК, подходящую для рестрикции, увеличения посредством ПЦР и секвенирования при использовании обратной транскриптазы и полимеразы. См. Ausubel, Sambrook и Berger, все supra.
В клетках-хозяевах млекопитающего может использоваться множество экспрессионных систем, таких как системы, основанные на вирусах. В случаях, когда в качестве экспрессионного вектора применяется аденовирус, кодирующая последовательность, при желании, вшивается в транскрипционно-трансляционный комплекс аденовируса, состоящий из позднего промотора и из трех частей лидерной последовательности. Введение в незначимую область E1 или E3 вирусного генома приводит к получению жизнеспособного вируса, способного экспрессировать полипептид по изобретению в инфицированных клетках-хозяевах (Logan and Shenk (1984) Proc Natl Acad Sci USA 81:3655-3659). Помимо этого, для усиления экспрессии в клетках-хозяевах млекопитающего используются энхансеры транскрипции, такие как энхансер вируса саркомы Рауса (RSV). Клетки-хозяева, среда, экспрессионные системы и способы продукции включают таковые для клонирования и экспрессии разнообразных белков млекопитающих, известные в данной области. Эффективность экспрессии может быть увеличены посредством введения энхансеров, соответствующих используемой клеточной системе (см., например, Scharf D. et al. (1994) Results Probl cell Differ 20:125-62; и Bittner et al. (1987) Methods in Enzymol 153:516-544).
Специфические сигналы инициации могут содействовать эффективной трансляции полинуклеотида, кодирующего последовательность по изобретению и/или их фрагменты. Эти сигналы могут включать в себя, например, инициирующий кодон ATG и смежные последовательности. В случае, когда кодирующая последовательность, ее инициирующий кодон и последовательности, расположенные в 3'-5' направлении, встроены в соответствующий экспрессионный вектор, нет необходимости в дополнительных регулирующих трансляцию сигналах. Тем не менее, в случаях, когда встроена единственная кодирующая последовательность (например, последовательность, кодирующая зрелый белок) или ее часть, должны обеспечиваться внешние транскрипционные регулирующие сигналы нуклеиновой кислоты, включая инициирующий кодон ATG. Кроме того, инициирующий кодон должен находиться в верной рамке считывания для обеспечения транскрипции всей вставки. Внешние транскрипционные элементы и инициирующие кодоны могут происходить из различных источников, и природных, и синтетических.
Введение конструкции в клетку-хозяина может осуществляться посредством трансфекции с фосфатом кальция, трансфекции, опосредованной DEAE-Декстраном, посредством электропорации, генной или вакцинной пушки, инъекции или других обычных технических приемов (см., например, Davis, L., Dibner, M., and Battey, I. (1986) Basic Methods in Molecular Biology) для способов in vivo, ex vivo или in vitro.
Как отмечалось, многие рекомендации пригодны для культивирования и продукции множества клеток, включая бактериальные клетки, растительные, животные (особенно клетки млекопитающих) и клетки архебактериального происхождения. См., например, Sambrook, Ausubel, и Berger (все supra), а также Sambrook, Ausubel, and Berger (all supra), as well as Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, third edition, Wiley-Liss, New York and the references cited therein; Doyle and Griffiths (1997) Mammalian Cell Culture: Essential Techniques John Wiley and Sons, New York; Humason (1979) Animal Tissue Techniques, fourth edition W.H. Freeman and Company; and Ricciardelli et al. (1989) In vitro Cell Dev Biol 25:1016-1024. О культивировании и восстановлении растительной клетки смотрите, например, Payne et al. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, N.Y.; Gamborg and Phillips (eds.) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York) and Plant Molecular Biology (1993) R.R.D. Croy (ed.) Bios Scientific Publishers, Oxford, U.K. ISBN 0 12 198370 6. Среда для культуры клеток обычно печатается в Atlas and Parks (eds.) Handbook of Microbiological Medium (1993) CRC Press, Boca Raton, Fla. Дополнительная информация по культивированию клеток находится в доступной коммерческой литературе, такой как Life Science Research Cell Culture Catalogue от Sigma-Aldrich, Inc (St Louis, Mo.) («Sigma-LSRCCC») и, например, Plant Culture Catalogue и приложении, также от Sigma-Aldrich, Inc (St Louis, Mo.) («Sigma-PCCS»).
Полипептиды по изобретению могут быть выделены и очищены из культур рекомбинантных клеток посредством любого количества способов, хорошо известных в данной области, включая осаждение сульфатом аммония или этанолом, экстрагирование кислотой, анионную или катионную обменную хроматографию, фосфоцеллюлозную хроматографию, хроматографию, основанную на гидрофобных взаимодействиях, аффинную хроматографию (например, применяя любую из упомянутых здесь меченых систем), хроматографию с гидроксилапатитом и хроматографию с лецитином. По желанию, могут использоваться этапы рефолдинга белка при завершении конформации зрелого белка или его фрагментов. И, наконец, может применяться высокоэффективная жидкостная хроматография (HPLC) на финальных этапах очистки. В дополнение к рекомендациям, упомянутым выше, в данной области хорошо известен целый ряд способов очистки, включая, например, способы, изложенные в Sandana (1997) Bioseparation of Proteins, Academic Press, Inc.; Bollag et al. (1996) Protein Methods, 2.sup.nd Edition Wiley-Liss, New York; Walker (1996) The Protein Protocols Handbook Humana Press, New Jersey; Harris and Angal (1990) Protein Purification Applications: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, England; Harris and Angal Protein Purification Methods: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, England; Scopes (1993) Protein Purification: Principles and Practice 3.sup.rd Edition Springer Verlag, New York; Janson and Ryden (1998) Protein Purification: Principles, High Resolution Methods and Applications, Second Edition Wiley-VCH, New York; and Walker (1998) Protein Protocols on CD-ROM Humana Press, New Jersey.
Известно некоторое количество вирусных векторов, подходящих для трансдукции в организме in vivo и для экспрессии. Такие векторы включают ретровирусные векторы (см., например, Miller, Curr Top Microbiol Immunol (1992) 158:1-24; Salmons and Gunzburg (1993) Human Gene Therapy 4:129-141; Miller et al. (1994) Methods in Enzymology 217:581-599) и аденоассоцированные векторы (рассмотренные в Carter (1992) Curr Opinion Biotech 3:533-539; Muzcyzka (1992) Curr Top Microbiol Immunol. 158:97-129). Другие применяющиеся вирусные векторы включают аденовирусные векторы, векторы на основе вируса герпеса и векторы на основе вируса Sindbis, которые в основном описаны, например, у Jolly (1994) Cancer Gene Therapy 1:51-64; Latchman (1994) Molec Biotechnol 2:179-195; и у Johanning et al. (1995) Nucl acids Res 23:1495-1501.
В одном из аспектов может использоваться вектор на основе вируса оспы. Вектор на основе вируса оспы трансфицируется полинуклеотидной последовательностью, кодирующей полипептид по изобретению и может использоваться для профилактического, терапевтического и диагностического применения, где желательно усиление иммунного ответа, такого как, например, увеличенная или улучшенная пролиферация T-клеток. Смотрите вирусные векторы, описанные, например, у Berencsi et al, J Infect Dis (2001)183(8): 1171-9; Rosenwirth et al, Vaccine 2001 February 8;19(13-14):1661-70; Kittlesen et al, J Immunol (2000) 164(8):4204-ll; Brown et al. Gene Ther 2000 7(19): 1680-9; Kanesa-thasan et al., Vaccine (2000) 19(4-5):483-91; Sten (2000) Drug 60(2):249-71. Композиции, содержащие в своем составе такие векторы и приемлемый эксципиент, также являются особенностью указанного изобретения.
Генная терапия и генетические вакцины обеспечивают способы борьбы с хроническими инфекционными заболеваниями (например, с ВИЧ-инфекцией, вирусным гепатитом), а также с неифекционными заболеваниям, включая рак и некоторые формы врожденных дефектов, таких как ферментативная недостаточность, и подобные способы могут применяться с полинуклеотидами по изобретению, включая, например, векторы и клетки, содержащие такие полинуклеотиды. Использовалось несколько подходов к введению нуклеиновых кислот и векторов в клетки in vivo, ex vivo и in vitro, и они могут применяться с полинуклеотидами по изобретению и векторами, содержащими такие полинуклеотиды. Эти подходы включают доставку гена с применением липосомы (Debs and Zhu (1993) WO 93/24640 и патент США No. 5641662; Mannino and Gould-Fogerite (1988) BioTechniques 6(7):682-691; Rose, патент США No. 5279833; Brigham (1991) WO 91/06309; and Feigner et al. (1987) Proc Natl Acad Sci USA 84:7413-7414; Brigham et al. (1989) Am J Med Sci 298:278-281; Nabel et al. (1990) Science 249:1285-1288; Hazinski et al. (1991) Am J Resp Cell Molec Biol 4:206-209; and Wang and Huang (1987) Proc Natl Acad Sci USA 84:7851-7855); доставку гена, опосредованную аденовирусными векторами, например, для лечения злокачественной опухоли (см., например, Chen et al. (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91:3054-3057; Tong et al. (1996) Gynecol Oncol 61:175-179; Clayman et al. (1995) Cancer Res. 5:1-6; O'Malley et al. (1995) Cancer Res 55:1080-1085; Hwang et al. (1995) Am J Respir Cell Mol Biol 13:7-16; Haddada et al. (1995) Curr Top Microbiol Immunol. 1995 (Pt. 3):297-306; Addison et al. (1995) Proc Natl Acad Sci USA 92:8522-8526; Colak et al. (1995) Brain Res 691:76-82; Crystal (1995) Science 270:404-410; Elshami et al. (1996) Human Gene Ther 7:141-148; Vincent et al. (1996) J Neurosurg 85:648-654), и многие другие. Также использовались ретровирусные векторы с нарушенной репликацией, удерживающие терапевтическую полинуклеотидную последовательность как часть ретровирусного генома, в частности простые векторы на основе MuLV. Смотрите, например, Miller et al. (1990) Mol cell Biol 10:4239 (1990); Kolberg (1992) J NIH Res 4:43 и Cornetta et al. (1991) Hum Gene Ther 5 2:215). Также применялся перенос нуклеиновой кислоты, связанный с лиганд-специфическими, основанными на катионах транспортными системами (Wu and Wu (1988) J Biol Chem, 263:14621-14624). Также описаны экспрессионные векторы с депротеинизированной ДНК (Nabel et al. (1990), supra); Wolff et al. (1990) Science, 247:1465-1468). Как правило, эти подходы могут быть адаптированы к данному изобретению благодаря включению нуклеиновых кислот, кодирующих полипептиды по изобретению, в соответствующие вектора.
Основные тексты, которые описывают протоколы генной терапии, которые могут быть адаптированы к настоящему изобретению посредством введения нуклеиновых кислот по изобретению пациентам, включают, например, Robbins (1996) Gene Therapy Protocols, Humana Press, New Jersey и Joyner (1993) Gene Targeting: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, England.
Противовирусное лечение
Полинуклеотиды и полипептиды по изобретению могут использоваться терапевтически или профилактически для лечения или профилактики вирусной инфекции. Примеры вирусов включают, но ими не ограничиваются, вирусы семейства Flaviviridae, такие как, например, вирус гепатита С, вирус желтой лихорадки, вирус Западного Нила, вирус японского энцефалита, вирус тропической лихорадки и вирус вирусной диареи крупного рогатого скота; вирусы семейства Hepadnaviridae, такие как, например, вирус гепатита B; вирусы семейства Picornaviridae, такие как, например, вирус энцефаломиокардита, риновирус человека и вирус гепатита A; вирусы семейства Retroviridae, такие как, например, вирус иммунодефицита человека, вирус иммунодефицита обезьян, T-лимфотропный вирус человека и вирус саркомы Рауса; вирусы семейства Coronaviridae, такие как, например, коронавирус SARS; вирусы семейства Rhabdoviridae, такие как, например, вирус бешенства и вирус везикулярного стоматита, вирусы семейства Paramyxoviridae, такие как, например, респираторно-синцитиальный вирус и вирус парагриппа, вирусы семейства Papillomaviridae, такие как, например, вирус папилломы человека и вирусы семейства Herpesviridae, такие как, например, вирус простого герпеса.
Еще одной целью изобретения являются конъюгаты, такие конъюгаты включают в свой состав один или несколько неполипептидных фрагментов, связанных с полипептидом по изобретению, такой конъюгат проявляет противовирусное свойство и факультативно проявляет другие желательные свойства, такие как увеличение времени полужизни в сыворотке и/или функционального времени полужизни in vivo и/или уменьшает антигенность по сравнению с неконъюгированным полипептидом. Некоторые подобные конъюгаты могут проявлять повышенную эффективность при очистке вируса от клеток, зараженных данным вирусом, при сравнении с контрольной олигоаденилатсинтетазой. Сверх того, некоторые такие конъюгаты могут иметь пониженную токсичность в сравнении с контрольной олигоаденилатсинтетазой.
Другой целью изобретения является способ ингибирования вирусной репликации в клетках, зараженных вирусом, данный способ включает в себя введение в зараженные вирусом клетки полипептида или конъюгата по изобретению в количестве, эффективном для ингидирования вирусной репликации в упомянутых клетках. Также изобретение относится к способу уменьшения количества копий вируса в клетках, зараженных вирусом, включающий в себя введение в зараженные вирусом клетки полипептида или конъюгата по изобретению в количестве, эффективном для уменьшения количества копий вируса в упомянутых клетках. Данные клетки могут существовать в культуре или в ином случае могут быть выделены у млекопитающего (то есть, in vitro или ex vivo), или могут существовать in vivo, например, у индивудуума, у млекопитающего, у примата или у человека.
Лечение рака и воспаления
Было показано, что полипептиды по изобретению могут вызывать апоптоз у некоторых типов клеток и клеточных линий или могут вызывать замедление роста упомянутых клеточных линий или типов клеток. Такие клеточные линии или типы клеток включены в иллюстративный вариант осуществления, где они происходят из простаты и груди.
Изобретение относится к способу замедления пролиферации популяции клеток, включающему в себя соприкосновение популяции клеток с полипептидом по данному изобретению в количестве, эффективном для уменьшения пролиферации популяции клеток. Популяция клеток может существовать в культуре или в ином случае может быть выделена у млекопитающего (то есть in vitro или ex vivo), или может существовать in vivo, например, у индивидуума, у млекопитающего, у примата или у человека.
Изобретение относится к лечению рака и новообразований при применении полипептидов и полинуклеотидов по изобретению. Примеры злокачественных опухолей и новообразований включают, но ими не ограничиваются: адренокортикальную карциному, СПИД-ассоциированную злокачественную опухоль, такую как, например, саркома Капоши, СПИД-ассоциированную лимфому, злокачественную опухоль заднего прохода, астроцитому, базалиому, рак желчных путей, как например, рак внепеченочной природы, рак диафрагмы, рак костей, как например, остеосаркомы и злокачественные фиброзные гистиоцитомы, глиому стволовой части мозга, опухоли мозга, такие как, например, глиомы, астроцитомы, злокачественные глиомы, эпендимомы, медуллобластомы и нейробластомы, надмозжечковую опухоль первичной нейроэктодермы, глиому зрительного пути и гипоталамуса, рак груди, аденому бронха, лимфому Беркитта, карциноидные опухоли, лимфому центральной нервной системы, рак шейки матки, лейкемии, такие как, например, лейкоз ворсистых клеток, острая лимфобластная лейкемия, острая миелоидная лейкемия, хронический лимфолейкоз и хронический миелолейкоз, хронические миелопролиферативные нарушения, колотеральный рак, T-клеточную лимфому кожи, рак эндометрия, рак пищевода, семейство опухолей Юинга, экстракраниальную гоноцитому, внегонадную гоноцитому, злокачественные опухоли глаза, такие как, например, внутриглазная меланома и ретинобластома, злокачественную опухоль желчного пузыря, рак желудка, трофобластную опухоль матки, злокачественную опухоль головы и шеи, гепатоклеточную карциному, лимфому Ходжкина, неходжкинскую лимфому, первичную лимфому ЦНС, носоглоточную злокачественную опухоль, карциному островковой клетки, рак почки (клетки почечного эпителия), рак гортани, злокачественную опухоль губы и ротовой полости, рак печени, рак легкого, как например, немелкоклеточный и мелкоклеточный рак легкого, макроглобулинемию Вальденстрема, карциному клеток Меркеля, мезотелиому, метастатический плоскоклеточный рак шеи, множественные эндокринные новообразования, множественную миелому, плазмоклеточное новообразование, фунгоидную гранулему, миелодиспластические синдромы, миелопролиферативные синдромы, злокачественную опухоль носовой полости и околоносовой пазухи, рак яичников, например половых клеток и эпителия, низкозлокачественную потенциальную опухоль яичников, злокачественную опухоль поджелудочной железы, злокачественную опухоль паращитовидной железы, рак полового члена, феохромоцитому, опухоль гипофиза, плевролегочную бластому, рак простаты, рабдомиосаркому, злокачественную опухоль слюнных желез, саркомы, синдром Сезари, рак кожи, такой как, например, меланома и плоскоклеточная карцинома, рак яичек, тимому, карциному тимуса, рак щитовидной железы, переходно-клеточный рак, трофобластическую опухоль, злокачественную опухоль уретры, рак матки, рак влагалища, злокачественную опухоль вульвы и опухоль Вильмса.
Кроме того, изобретение относится к лечению аутоиммунных заболеваний и воспаления с применением полипептидов и полинуклеотидов по изобретению, упомянутые аутоиммунные и воспалительные заболевания включают, но ими не ограничиваются: астму, болезнь Крона, синдром Гийена-Барре, рассеянный склероз, злокачественную миастению, неврит зрительного нервы, псориаз, ревматоидный артрит, базедову болезнь, болезнь Хашимото (тиреоидит), тиреоидит Орда, диабет, сахарный диабет, синдром Рейтера, аутоиммунный гепатит, биллиарный первичный цирроз печени, цирроз печени, фиброз печени, антифосфолипидный синдром, синдром пляшущих глаз, височный артерит, острый рассеянный энцефаломиелит, синдром Гудпасчера, гранулематоз Вегенера, целиакию, пузырчатку, полиартрит, тепловую аутоиммунную гемолитическую анемию, синдром Такаясу, болезнь коронарных артерий, эндометриоз, интерстициальный цистит, нейромиотонию, склеродерму, витилиго, вульводинию, болезнь Шагаса, саркоидоз, синдром хронической усталости, синдром острой дыхательной недостаточности, тендинит, бурсит, ревматическую полимиалгию, воспалительное заболевание кишечника, хроническое обструктивное заболевание легких, аллергический ринит, сердечно-сосудистое заболевание, хронический холецистит, бронхоэктаз, пневмокониоз, как например, силикоз, остеоартрит, атеросклероз, вегетативную дистонию, анкилозирующий спондилоартрит, острый передний увеит, красную волчанку, инсулинозависимый сахарный диабет, обыкновенную пузырчатку, экспериментальный аллергический энцефаломиелит, экспериментальный аутоиммунный увеит, смешанное заболевание соединительной ткани, синдром Шоргена, аутоиммунную гемолитическую анемию, аутоиммунную тромбоцитопеническую пурпуру, острую ревматическую атаку, смешанную основную криоглобулинемию, ювенильный ревматоидный артрит, дегенеративное поражение сустава, анкилозирующий спондилоартрит, псориатический артрит, невралгию, синовит, гломерулонефрит, васкулит, воспаление, которое встречается в виде остаточного явления после гриппа, простуду и другие вирусные инфекции, подагру, контактный дерматит, боль в нижней части спины и в шее, дисменорею, головную боль, зубную боль, растяжения связок, растяжения сухожилия, миозит, ожоги, травмы и боль, и воспаление после хирургических и стоматологических процедур у индивида.
Терапия клеточного роста и регенерации ткани
Было показано, что полипептиды по изобретению индуцируют митогенную, усиливающую рост клетки программу в определенных типах клеток и клеточных линиях, таких как, например, клетки гепатомы Huh7 и фетальные фибробласты легкого MRC5. Эта митогенная программа выявлена при применении исследования экспрессионной микроматрицы и исследования жизнеспособности клеток и клеточных линий, обработанных полипептидами по изобретению. Настоящее изобретение относится к применению полипептидов по изобретению для стимуляции клеточного роста и регенерации ткани in vitro, in vivo и ex vivo при использовании тканей и клеток, полученных от индивидуумов или млекопитающих.
Производные полипептидов по изобретению
Изобретение относится к полипептидам, которые отличаются от любого полипептида, указанного на фиг. 1-5, аминокислотами с 1 по 34, такие различия могут включать замены, инсерции, делеции, объединение модифицированных аминокислот или производных аминокислот, и добавление или удаление аминокислот с C-терминального или N-терминального конца полипептидов. Одна или несколько аминокислотных замен могут быть получены в полипептидах по изобретению в соответствии, например, с заменяемой группой (такой как группа консервативной замены), такой как изложенные ниже. В качестве альтернативы или дополнительно в полипептидах могут быть получены одна или несколько аминокислотных замен, которые вводят или удаляют аминокислотный остаток, содержащий присоединяющую группу для неполипептидного фрагмента. Примеры включают введение одного или нескольких сайтов N-гликозилирования, введение одного или нескольких остатков цистеина или остатков лизина, удаление одного или нескольких сайтов N-гликозилирования и/или удаление одного или нескольких остатков лизина или гистидина. Некоторые подобные полипептиды проявляют олигоаденилатсинтетазную активность. Группы консервативных замен включают: Группу 1, Аланин (A) Глицин (G) Серин (S) Треонин (T), Группу 2, Аспарагиновая кислота (D) Глутаминовая кислота (E), Группу 3, Аспарагин (N) Глутамин (Q), Группу 4, Аргинин (R) Лизин (K) Гистидин (H), Группу 5, Изолейцин (I) Лейцин (L) Метионин (M) Валин (V), и Группу 6, Фенилаланин (F) Тирозин (Y) Триптофан (W). Могут быть просчитаны другие группы замен аминокислот. Например, аминокислоты могут быть сгруппированы по схожей функции или химической структуре, или по композиции (например, кислотная, основная, алифатическая, ароматическая, серосодержащая). Например, Алифатическая группировка может включать в себя Глицин (G), Аланин (A), Валин (V), Лейцин (L), Изолейцин (I). Другие группы, содержащие аминокислоты, которые считаются консервативными заменами друг для друга, включают: Ароматическую группу: Фенилаланин (F), Тирозин (Y), Триптофан (W); Серосодержащую группу: Метионин (M), Цистеин (C); Основную группу: Аргинин (R), Лизин (K), Гистидин (H); Кислотную группу: Аспарагиновая кислота (D), Глутаминовая кислота (E), Аспарагин (N), Глутамин (Q). Дополнительные группировки аминокислот, смотрите также у Creighton (1984) Proteins, WH. Freeman and Company. В данном изобретении в списке полипептидной последовательности дается специальный список всех консервативно замещенных полипептидных последовательностей в сочетании с упомянутыми выше группами замен.
В одном аспекте изобретение относится к выделенным или рекомбинантным полипептидам, каждый из которых содержит последовательность, имеющую по меньшей мере 90% сходства последовательности (например, по меньшей мере приблизительно 91%, по меньшей мере приблизительно 92%, по меньшей мере приблизительно 93%, по меньшей мере приблизительно 94%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98% или по меньшей мере приблизительно 99% сходства аминокислотной последовательности) с любым полипептидом из фиг.5. В отдельных случаях полипептид проявляет олигоаденилатсинтетазную активность.
Степень сходства одной последовательности (полипептида или нуклеиновой кислоты) с другой дает отображение сходных структурных и функциональных свойств двух последовательностей. В соответствии с этим, в контексте настоящего изобретения, последовательности, которые имеют схожую последовательность с любой заданной иллюстративной последовательностью, являются характерной чертой настоящего изобретения. В частности, последовательности, которые имеют процент схожести последовательности согласно приведенным ниже данным, являются характерной чертой изобретения. Может применяться множество способов определения родства последовательностей, включая выравнивание вручную и выравнивание и анализ последовательности, осуществляемые с помощью компьютера. Доступен ряд компьютерных программ для осуществления выравнивания последовательностей, либо выравнивание может проводиться специалистом вручную.
Как отмечено выше, последовательности полипептидов и нуклеиновых кислот, использованные в тематике изобретения, не должны быть идентичными, но могут быть в достаточной степени схожими с соответствующей последовательностью полипептида по изобретению или нуклеиновой кислоты по изобретению. Например, полипептиды по изобретению могут подвергаться различным изменениям, таким как одна или несколько аминокислотных инсерций, делеций и/или замен, либо консервативных, либо неконсервативных, включая случаи, когда, например, такие изменения могли бы обеспечить некоторые преимущества в их применении, таком как их терапевтическое или профилактическое применение или назначение, или диагностическое применение. Также нуклеиновые кислоты по изобретению могут подвергаться различным изменениям, таким как одна или несколько замен одной или нескольких нуклеиновых кислот в одном или нескольких кодонах, таких, что определенный кодон кодирует ту же самую аминокислоту либо другую, что приводит либо к молчащему варианту (как определено в настоящем изобретении), либо к немолчащему варианту, либо одной или нескольких делеций одной или нескольких нуклеиновых кислот (или кодонов) в последовательности. Также нуклеиновые кислоты могут быть модифицированы для внесения одного или более кодонов, что обеспечит оптимум экспрессии в экспрессионной системе (например, в системе бактерий или млекопитающих), тогда как, если требуется, один или несколько упомянутых кодонов по-прежнему кодируют ту же аминокислоту(-ы). Такие изменения нуклеиновой кислоты могут предусматривать некоторые преимущества при их терапевтическом или профилактическом применении или назначении, или при диагностическом применении. Нуклеиновые кислоты и полипептиды могут быть модифицированы целым рядом способов, поскольку они содержат в себе последовательность в значительной степени, схожую (как описано ниже) с последовательностью соответствующей нуклеиновой кислоты или полипептида по изобретению.
Термин «схожий» или «сходство» в отношении двух или нескольких последовательностей нуклеиновой кислоты или полипептида относится к двум или нескольким последовательностям, которые являются одинаковыми или имеют установленный процент одинаковых аминокислотных остатков или нуклеотидов при сравнении и выравнивании на максимальную схожесть, что установлено при использовании алгоритма сравнения последовательности или при визуальном исследовании.
«Процент сходства последовательности» («% сходства») анализируемой последовательности с исходной (то есть с запрашиваемой) последовательностью подразумевает, что анализируемая последовательность идентична (то есть по принципу аминокислота за аминокислотой для полипептидной последовательности или по принципу нуклеотид за нуклеотидом для полинуклеотидной последовательности) запрашиваемой последовательности по всей сравниваемой длине в соответствии с установленным процентом.
Сайт-направленный мутагенез для создания полипептидов по изобретению
Полипептиды по настоящему изобретению могут быть сконструированы при применении любой стандартной технологии сайт-направленного мутагенеза. Последовательности нуклеиновой кислоты, соответствующие полипептидам по изобретению, синтезируются при помощи специфических олигонуклеотидных праймеров и высокоточной ДНК-полимеразы. Последовательность-мишень ограничена двухцепочечной плазмидой, выделенной из восприимчивого к метилированию штамма E. coli. Комплементарные олигонуклеотиды, несущие желаемую мутацию, синтезируют и очищают, применяя электрофорез в полиакриламидном геле. Термоциклер служит для регулирования температуры изменяющихся циклов денатурации образца двухцепочечной плазмиды (94ºC в течение 30 секунд), отжига олигонуклеотидных праймеров (55ºC в течение 1 минут) и удлинения праймеров высокоточной полимеразой (68ºC в течение 1 минуты на тысячу оснований длины плазмиды). Приблизительно после 15 циклов смесь только что синтезированной и исходной ДНК обрабатывают рестрикционным ферментом, специфичным к метилированным остаткам (Dpn I) для расщепления исходной плазмиды. Получившуюся ДНК вводят в химически или электрически компетентные бактериальные штаммы для отбора и выделения плазмид, содержащих желаемые мутации. Плазмидную ДНК выделяют из трансформантов и проверяют при помощи секвенирования с флуоресцентным обрывающим цепь красителем для подтверждения мутантной последовательности.
Экспрессия действующего вещества препарата в большом объеме, ферментация и очистка
2
4
Штамм E. Coli, содержащий лизогенный λDE3 и, следовательно, несущий хромосомную копию гена РНК-полимеразы T7 под контролем промотора lacUV5, трансформируют бактериальным экспрессионным вектором, содержащим IPTG-индуцибельный промотор, кодирующий последовательность нуклеиновой кислоты, соответствующую одному или нескольким полипептидам по настоящему изобретению. Культуры растят при 37ºC на среде Luria, дополненной 34 мкг/мл хлорамфеникола и 15 мкг/мл канамицина. Когда OD600 достигает >0,4, температуру уменьшают до 18ºC, и на клетки воздействуют 0,5 мМ IPTG в течение 17 часов. Затем бактериальные клетки ресуспендируют в буфере, содержащем 50 мМ NaHPO, pH 8, 300 мМ NaCl, 20 мМ имидазол, 10% глицерин, 0,1% NP40, 2 мМ DTT и ингибиторы протеаз (VWR), лизируют в гомогенизаторе Gaulin и центрифугируют для удаления клеточного дебриса перед очисткой белка.
2
4
2
4
2
4
2
4
2
В одном из вариантов осуществления очистка полипептидов по настоящему изобретению может достигаться при применении полигистидиновой метки на амино-конце. При аффинной очистке полигистидиновых меток применяют никелевую колонку, например колонку объемом 5 мл используют для лизата, полученного из 4 л E. coli. Лизат загружают в колонку и затем промывают Буфером A (50 мМ NaHPO, 300 мМ NaCl, 30% глицерин, 20 мМ имидазол, 2 мМ DTT при pH 7,5). Затем проводят этап элюции 7% Буфером B (50 мМ NaHPO, 300 мМ NaCl, 30% глицерин, 2M имидазол, 2 мМ DTT при pH 6,8) в объеме, равном 3,2 объема колонки. Затем достигается 100% градиент Буфера B более чем 3 объемами колонки. Затем полипептид по настоящему изобретению может пройти гель-фильтрацию в Буфере C (50 мМ NaHPO, 150 мМ NaCl, 40% глицерин, 1 мМ EDTA, 2 мМ DTT при pH 6,8) и может быть загружен в катионобменную колонку для последующей очистки. После загрузки белка колонку промывают Буфером C, затем следует этап элюции до 75% Буфера D (50 мМ NaHPO, 1M NaCl, 40% глицерин, 1 мМ EDTA, 2 мМ DTT при pH 6.8), затем достигается 100% градиент Буфера D при использовании 5 объемов колонки. Затем белок проходит гель-фильтрацию в Буфере E (50 мМ NaHP04, 300 мМ NaCl, 40% глицерин, 1 мМ EDTA, 2 мМ DTT при pH 6,8) и хранится при -20ºC.
2
4
4
2
4
Различные варианты осуществления полипептидов по изобретению, включая, но ими не ограничиваясь: полипептиды без полигистидиновой метки, полипептиды, имеющие полиаргининовую метку, полипептиды с уменьшенным содержанием цистеина, полипептиды с модификациями аминокислотной последовательности, задуманными для получения более термостабильного возможного действующего вещества лекарственного средства, полипептиды с модификациями для увеличения или снижения специфической активности возможного действующего вещества лекарственного средства могут нуждаться в альтернативных подходах к очистке. Например, варианты осуществления возможного полипептидного действующего вещества препарата без полигистидиновой метки могут непосредственно наноситься на катионобменную колонку. Могут проводиться дополнительные этапы, например хроматография, основанная на гидрофобном взаимодействии, при размещении белка в Буфере F (50 мМ NaHPO, 300 мМ NaCl, 1M (NH)SO, 30% глицерин, 1 мМ EDTA, 2 мМ DTT при pH 6,8) и пропускании 10 объемов колонки до 100% градиента Буфера E. Могут использоваться другие аффинные колонки или сортирующие по величине колонки для очистки различных вариантов осуществлений возможных полипептидных действующих веществ препарата.
4
2
4
Также могут применяться альтернативные способы при изменении буферов, концентрации возможных действующих веществ лекарственного средства и при очистке действующих веществ лекарственных средств. Эти способы могут включать, но ими не ограничиваются, ультрафильтрацию, контактную фильтрацию вдоль потока и диафильтрацию при концентрировании возможного действующего вещества препарата и при замене буферов. Также могут применяться технические приемы, такие как преципитация возможных действующих веществ лекарственного средства посредством (NH)SO или какого-либо иного химического вещества. Также может применяться денатурирование возможного действующего вещества препарата в мочевине или в каком-либо другом денатурирующем веществе и рефолдинг.
Полипептиды по настоящему изобретению стабилизированы посредством эксципиентов, содержащих соли; растворы, стабильные при 300 мМ NaCl, могут начать выпадать в осадок при 150 мМ NaCl. По этой причине смеси эксципиентов тяготеют к этим стабилизирующим концентрациям соли, которые могут включать, но не ограничиваются этим, фосфат натрия, хлорид натрия, хлорид кальция и хлорид магния.
Доказано, что добавление эксципиентов, основанных на аминокислотах, таких как аргинин, стабилизирует полипептиды по настоящему изобретению. 10% раствор сахарозы дает возможность полипептидам по изобретению быть стабильными при 1 мг/мл, добавление 2% (вес./об.) аргинина дает возможность некоторым вариантам осуществления полипептидов быть стабильными при 3 мг/мл. По этой причине другие соединения, основанные на аминокислотах, включая, но не ограничиваясь этим, гистидин, глутамин, глицин и альбумин человека, могут применяться в качестве эксципиентов.
Внесение эксципиентов, таких как глицерин, стабилизирует полипептиды по настоящему изобретению. Например, в одном извариантов осуществления полипептид имеет максимальную концентрацию, равную 1 мг/мл, при 10% глицерина (об./об.); тогда как при 40% глицерина возможные действующие вещества лекарственного средства стабильны при концентрации до 12 мг/мл. Смеси эксципиентов, содержащие соединения со схожими химическими свойствами, предусматривают включение, но не ограничиваются этим, многоатомных спиртов, таких как маннит, ксилит и сорбит. Обнаружено, что дисахариды, такие как сахароза, стабилизируют при концентрации 10% вес./об.; также могут применяться другие дисахариды, включая, но ими не ограничиваясь, мальтозу и трегалозу. Также в настоящем изобретении могут использоваться моносахариды. Также при применении настоящего изобретения могут использоваться полисорбаты, полиэтиленгликоли и подобные соединения.
Специалисту в данной области очевидно, что для обеспечения стабильности полипептидов во время хранения также могут использоваться антиоксиданты и консерванты. Антиоксиданты, включая, но не ограничиваясь этим, цитрат натрия, могут быть стабилизаторами при длительном хранении полипептидов по изобретению. Консерванты, включая, но не ограничиваясь этим, бензиловый спирт, также могут стабилизировать полипептиды во время хранения и могут применяться в итоговых смесях эксципиентов.
Измерение олигоаденилатсинтетазной активности полипептидов
2
2
2
4
32
Олигоаденилатсинтетазная активность полипептидов по изобретению измеряется в соответствии с ранее опубликованными способами (Justesen, J., et el. Nuc Acids Res. 8:3073-3085, 1980). Вкратце: белок активируют полиинозиновой:полицитидиловой кислотой (200 мкг/мл) в буфере, содержащем 20 мМ Tris-HCl, pH 7,8, 50 мМ Mg(OAc), 1 мМ DTT, 0,2 мМ EDTA, 2,5 мМ ATP, α[P]ATP, 0,5 мг/мл BSA и 10% глицерин. Реакция протекает при 37ºC в течение от 30 минут до 24 часов и останавливается посредством нагревания до 90ºC в течение 3 минут. 2-4 мкл реакционной смеси наносится на пластинку для тонкослойной хроматографии из PEI-целлюлозы. После высыхания пластинку обрабатывают 0,4M Tris-HCl, 30 мМ MgCl, pH 8,7. Пластинку подсушивают и визуализируют посредством люминесцентного исследования. Или же, кроме того, можно инкубировать реакционную смесь с 0,05 U/мкл желудочной фосфатазы теленка для удаления терминального фосфата. Тонкослойное хроматографическое разделение достигается при использовании буферной системы с 0,76M KHPO, pH 3,6. Затем пластинку высушивают и визуализируют посредством люминесцентного исследования.
Измерение противовирусной активности полипептидов
Способность полипептидов по настоящему изобретению защищать культивируемые клетки от цитотоксических вирусов доказывают, применяя инфекционную модель с вирусом мышиного энцефаломиокардита (EMCV, штамм VR-129B в ATCC). Другие модели вирусной инфекции in vitro включают, но ими не ограничиваются, флавивирусы, такие как вирус диареи крупного рогатого скота, вирус Западного Нила и вирус GBV-C, другие РНК-вирусы, такие как респираторно-синцитиальный вирус, и репликонные системы HCV (например, Blight, K.J., at al. 2002. J. Virology, 76:13001-13014). В противовирусных исследованиях может использоваться любая подходящая для вирусной репликации культивируемая клетка.
4
Клетки гепатомы человека Huh7 засевают в 96-луночную культуральную плашку при плотности 1×10 клеток/лунку и инкубируют всю ночь в полной среде (в DMEM, содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки). На следующее утро среду заменяют полной средой, имеющей в своем составе 0-10 мкМ белка или эквивалентные количества белкового буфера для разведения. Если требуется, добавляют интерферон-альфа в концентрации 100 IU/мл. Проводят предварительную обработку клеток в течение 2-8 часов перед заражением вирусом. После предварительной обработки в лунки вносят одинаковый объем среды, содержащей разведения вируса EMC в полной среде. В описанных здесь экспериментах на лунку добавляют 50-500 бляшкообразующих единиц (БОЕ).
Вирусная инфекция развивается в течение ночи (приблизительно 18 часов), и подсчитывается процентная доля жизнеспособных клеток при использовании любых доступных реагентов для оценки клеточной жизнеспособности или цитотоксичности. Описанные здесь результаты получают, применяя анализ жизнеспособности клеток, в котором оценивается превращение соединения тетразолия [3-(4,5-димэтил-2-ил)-5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2H-тетразолий, внутренняя соль; MTS] в окрашенное соединение формазана в жизнеспособных клетках. Превращение MTS в формазан детектируют в спектрофотометре для чтения 96-луночных плашек при оптической плотности 492 нм. Получаемые оптические плотности либо немедленно наносят на схему для оценки клеточной жизнеспособности, либо нормализуют с контрольными образцами для подсчета процента жизнеспособных клеток после обработки.
ПЭГилирование полипептида; сульфгидрил
Присоединение полиэтиленгликоля (ПЭГ) к полипептидам по изобретению достигали посредством смешивания свободного от дитиотреитола (DTT) очищенного полипептида с активированным mPEG-MAL (Nektar Therapeutics) в молярном отношении 0,5-10:1. Реакция развивалась при комнатной температуре в течение 5 минут-2 часов и ее подавляли посредством добавления 2 мМ DTT. Наблюдали слияние с многочисленными сайтами цистеина при применении линейного ПЭГ (20 кДа) и разветвленного ПЭГ (40 кДа), (фиг.6A и 6B). НеПЭГилированные формы и формы, содержащие один или более ПЭГ, могут быть отделены друг от друга при применении ряда хроматографических методов, известных специалистам в данной области. В иллюстративных вариантах осуществления настоящего изобретения для выделения разных форм ПЭГ могут использоваться ионообменные колонки, колонки, основанные на гидрофобных взаимодействиях, гель-фильтрация и эксклюзионная хроматография размеров, каждая отдельно или в сочетании друг с другом.
ПЭГилирование полипептида на N-конце
2
4
N-терминальный амин полипептидов по изобретению может быть ПЭГилирован. К полипептидам в 50 мМ NaHPO, 300 мМ NaCl, 30% глицерине, 1 мМ EDTA, 2 мМ DTT при pH 5, содержащим 20 мМ натрия цианоборогидрид и перемешанным на ледяной бане, добавляют пятикратно превышающее количество mPEG butyrALD-40K. Реакция развивается до десяти часов и затем подавляется при добавлении пятидесятикратно превышающего количества глицина. Продукты реакции исследуются при помощи SDS-PAGE.
Нижеследующие примеры предоставляются в качестве иллюстрации, но не в качестве ограничения.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
Аминокислотные модификации в белках OAS1 примата, не являющегося человеком
Гены OAS1 приматов, не являющихся человеком, секвенировали и сравнили с мутациями, обнаруженными в гене человека OAS1. Такие мутации создают дополнительное правильное представление об эволюции гена и белка OAS1. Эволюционно консервативные аминокислоты наводят на мысль о сайтах, важных или критических для функционирования OAS1 или для ферментативной активности. С другой стороны, аминокислотные сайты OAS1, которые мутировали недавно, например, только у людей, и демонстрируют совокупность аминокислотных замен среди приматов, указывают на сайты менее критичные для функционирования или ферментативной активности. Относительное содержание мутировавших сайтов в пределах отдельного мотива белка OAS1 коррелирует с толерантностью этого функционального домена к изменению. Такие сайты и мотивы обеспечивают наибольшее улучшение функции белка или специфической активности. Аналогичным образом, мутации в генах и белках с иммунными или противовирусными функциями, как OAS1, гипотетически являются результатом исторического изменения вследствие вирусной инфекции. Исходя из этого, мутации в белках OAS1 приматов гипотетически улучшают противовирусную эффективность и представляют собой возможности для достижения наилучшего качества терапевтического белка человека OAS1.
В иллюстративном варианте осуществления унаследованная от приматов аминокислота определенного сайта OAS1 может быть восстановлена в терапевтической форме белка человека OAS1 для оптимизации специфической белковой активности или противовирусной эффективности. В других вариантах осуществления альтернативные аминокислоты, идентифицированные в OAS1 приматов, не являющихся человеком, но необязательно наследственно консервативные, заменены в терапевтической форме человека OAS1 для улучшения специфической белковой активности или противовирусной эффективности. Последовательности ДНК и мРНК, которые кодируют природные белки примата, а также гибридные формы белков примата и человека, являются оригинальными и имеют применение. Некоторые примеры их применения: в качестве агентов для обнаружения соответствующих им вариантов ДНК или мРНК; в экспрессионных векторах, применяемых в производстве терапевтических белков; и при обнаружении новых соединений, которые связывают соответствующую мРНК.
Фиг.1 предоставляет терапевтическую форму OAS1 (SEQ ID NO:
1). Модификации этой формы для предоставления дополнительных терапевтических форм осуществляются при применении по меньшей мере одной аминокислотной модификации, как предложено на фиг.2. Как изображено на фиг.2, полезные модификации представляют собой отщепление инициирующего метионина из SEQ ID NO:1 и других форм OAS1. Как показано на фиг.3, созданы дополнительные модификации. Предшествующие модификации, описанные на фиг.2 и 3, также применяются для других терапевтических изоформ OAS1, предложенных на фиг.5. Фиг.3 также предоставляет специфические модификации белков OAS1, которые на карбоксильном конце гомологичны последовательности с регистрационным номером в Genebank NP_002525.1 (например, SEQ ID NO:3), специфические модификации белков OAS1, которые на карбоксильном конце гомологичны последовательности с регистрационным номером в Genebank NP_0058132.1 (например, SEQ ID NO:2) и специфические модификации белков OAS1, которые на карбоксильном конце гомологичны последовательности с регистрационным номером в Genebank NP_001027581.1 (например, SEQ ID NO:4). На фиг.4 перечислены иллюстративные мутации, идентифицированные у приматов, не являющихся человеком, включая гориллу, шимпанзе, орангутана и макаку. На фиг.5 приведен список дополнительных изоформ OAS1 человека и приматов, не являющихся человеком, которые пригодны для диагностических и терапевтических целей по настоящему изобретению, а также конкретные мутации у приматов, описанные в настоящем изобретении.
Пример 2
Получение и секвенирование кДНК
Из культивируемых лимфобластов или фибробластов пациентов, имеющих устойчивый к гепатиту С фенотип, очищают тотальную клеточную РНК. Процедуру очистки проводят, как описано Chomczynski, et al., Anal. Biochem., 162:156-159 (1987). Для формирования клеточного лизата клетки гомогенизируют в 10 миллилитрах (мл) денатурирующего раствора, содержащего 4,0 М гуанидинтиоцианат, 0,1 M Tris-HCl при pH 7,5, и 0,1 М бета-меркаптоэтанол. Затем к клеточному лизату добавляют лаурилсаркозинат натрия до конечной концентрации 0,5%, после чего смесь центрифугируют при 5000×g в течение 10 минут при комнатной температуре. Получившийся супернатант, содержащий тотальную РНК, наслаивают на буфер с 5,7M хлорида цезия и 0,01M EDTA при pH 7,5 и осаждают посредством центрифугирования. Получившийся осадок РНК растворяют в растворе 10 мМ Tris-HCl при pH 7,6 и 1 мМ EDTA (TE), содержащем 0,1% додецилсульфата натрия (SDS). После экстракции фенолом и хлороформом и осаждения этанолом, оценивают концентрацию очищенной тотальной клеточной РНК посредством измерения оптической плотности при 260 нм.
Тотальную РНК, полученную выше, применяют в качестве матрицы для синтеза кДНК, используя обратную транскриптазу для синтеза первой цепи и ПЦР с олигонуклеотидными праймерами, разработанными таким образом, чтобы амплифицировать кДНК в виде двух перекрывающихся фрагментов, обозначенных как 5' и 3' фрагменты. Олигонуклеотиды, используемые при применении этого изобретения, синтезируют на Applied Biosystems 381A DNA Synthesizer, следуя инструкциям производителя. Проводят ПЦР, применяя методы, известные в данной области. Методы ПЦР-амплификации подробно описываются в патентах США No. 4683192, 4683202, 4800159 и 4965188 и по меньшей мере в нескольких текстах, включая PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H. Erlich, ed., Stockton Press, New York (1989); и PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis, et al., eds., Academic Press, San Diego, Calif. (1990), а праймеры на основании нуклеотидных последовательностей, кодирующих модифицированные участки аминокислот, раскрываются в настоящем изобретении.
Анализируются последовательности, определенные непосредственно по ПЦР-амплифицированным ДНК пациентов с инфекцией HCV и без нее. Наличие мутации, находящейся в 31-51 направлении, относительно кодирующей области гена OAS, может быть обнаружено у пациентов, которые являются серологически негативными к HCV, несмотря на повторные воздействия вируса.
Пример 3
Активность IB657 в качестве ингибитора вируса гепатита С (HCV) и других вирусов
Данные, приведенные ниже и сопровождаемые фигурами, были получены на полипептиде OAS1, созданном авторами настоящей заявки и названном IB657. Этот полипептид основан на последовательности SEQ ID NO:1, указанной в настоящей заявке, имеющей две следующие модификации, также раскрытые в заявке: первоначальный метионин (М) был удален, а аминокислота в положении 162 представляет собой глицин (G). На фиг.2 первоначального описания перечислены эти модификации.
Данные, которые приведены ниже, указывают на то, что IB657 влияет на трансляцию белков HCV.
A. IB657 влияет на HCV в культивированных клетках
1. На фиг.6 показано, что IB657 подавляет вирус генотипа 1a HCV, резистентный к IFN, в клетках гепатомы человека (Huh7.5). Клетки Huh7.5 трансфицировали РНК HCV 1а в течение 48 часов, пересевали, а затем культивировали в среде, содержащей буфер или повышающиеся концентрации IB657. Через 72 часов после обработки IB657 подсчитывали число клеток, инфицированных HCV la, с помощью анализа FFA (анализ с образованием фокусов флуоресценции). График показывает среднее число инфекционных фокусов (n=3)±s.d. с рассчитанным значением IC50, равным 2,6 мкМ.
2. На фиг.7 показано, что IB657 усиливает противовирусные эффекты интерферона (IFN). Клетки гепатомы, инфицированные HCV 2а (слева), и клетки гепатомы, ифицированные РНК (справа), обрабатывали 2 мкМ IB657, 25 Ед/мл IFNα-2a или и тем и другим в течение 72 часов. Клетки фиксировали, окрашивали и определяли число клеток, инфицированных HCV. Результаты представлены в процентах от контрольных клеток, обработанных буфером, которые были обозначены как 100%. Результаты являются репрезентативными для трех независимых экспериментов. Величина ошибки соответствует стандартному отклонению.
3. На фиг.8 показано, что IB657 ингибирует синтез белка HCV. Подвергнутые импульсному мечению [35S]метионином неинфицированные (-HCV) и инфицированные клетки Huh7.5 HCV 2а культивировали в течение 24 или 48 часов в буфере, 2 мкМ IB657 или 50 Ед/мл IFN-α2a.
(а) Показан радиоавтограф анализа SDS-PAGE суммарного клеточного белка (на входе) и белки HCV (осадок, α-HCV), полученных из клеточных экстрактов при иммунопреципитации.
(b) Встраивание радиоактивной метки в белок HCV (стрелка) было количественно измерено анализом на визуализацию фосфора и пересчитано как процент необработанного образца, соответствующего 100%. Величина ошибки соответствует стандартному отклонению усредненной интенсивности белковой полосы двух независимых экспериментов. Количественная оценка других белков HCV, таких как NS3, NS5B, NS5A, NS4B и коровых белков, была аналогична (а).
(с) Уровни РНК HCV в каждом образце определяли с помощью qRT-ПЦР, а оставшееся количество выражали как кратное необработанному образцу. Величина ошибки соответствует стандартному отклонению среднего уровня РНК HCV в трех повторах. Значимых различий в уровнях РНК HCV замечено не было (p<0,01, двухвыборочный непарный t-тест) по сравнению с образцами, обработанными буфером. Результаты представлены как по крайней мере два независимых эксперимента.
В. Эффект IВ657 на трансляцию белка HCV. Проникновение HCV в мишеневую клетку-хозяин представляет собой процесс, в который вовлечен участок внутренней посадки рибосомы (IRES). IRES направляет кэп-независимую инициацию трансляции РНК HCV за счет непосредственного связывания рибосомальной субъединицы 40S, опуская необходимость рибосомального поиска на кодон инициации и факторы преинициации. Домен I вируса модулирует IRES-регулируемую трансляцию. IRES в свою очередь направляет инициацию трансляции РНК HCV за счет непосредственного связывания рибосомальной субъединицы 40S. Клеточные белки, факторы инициации эукариот (elF) 2 и 3 затем рекрутируются на поверхность рибосомальной субъединицы 40S и соединяются с рибосомальной субъединицей 60S с образованием рибосомы 80S, осуществляющей трансляцию. Два набора данных показывают, что полипептид, обозначенный как IB657, влияет на IRES-регулируемую трансляцию.
1. На фиг.4 показано, что IB657 главным образом ингибирует IRES-регулируемую трансляцию HCV. In vitro трансляцию РНК pRL-HL оценивали по одновременной 5′ кэп-зависимой люциферазной (люцифераза Renilla) (ren-luc) и HCV IRES-регулируемой люциферазной (люцифераза светлячка) (ff-luc) трансляции в присутствии IB657. Вверху на фигуре показан радиоавтограф SDS-PAGE продуктов трансляции. Продукты трансляции люциферазы Renilla (закрашенные столбики) и люциферазы светлячка (белые столбики) также анализировали с помощью двойного люциферазного анализа. Результаты выражены как средняя (n=6) люциферазная активность нормированная с необработанными образцами (полосы 1 and 3) ± стандартное отклонение. Представленное значение p обозначает значимость при сравнении уровней люциферазы светлячка и люциферазы Renilla в пятой полосе, других значимых отличий не было обнаружено (двухвыборочный непарный t-тест Стьюдента).
2. На фиг.10 показано, что IB657 специфически супрессирует IRES-регулируемую трансляцию HCV. Клетки Huh7 и Huh7-K2040 с репликоном вируса культивировали в течение 72 часов в среде, содержащей буфер, IB657 или IFNα с (черные столбики) или без (белые столбики) 5 мкг/мл G418. Вверху указано количество клеток/мл ± стандартное отклонение (n=4), оставшееся в каждом образце. Представленное значение p обозначает значимое различие между IB657+G418 и K2040+G418. Других значимых различий клеточной жизнеспособности не было обнаружено (p<0,01, двухвыборочный непарный t-тест Стьюдента). Параллельный иммуноблотинг проводили на образцах для оценки уровня белков NPT II, HCV и GAPDH в эквивалентных количествах клеток. Номер под каждым блотом обозначает относительные уровни экспрессии белка (интенсивность полосы NPT II или HCV/интенсивность полосы GAPDH), выраженные как кратность количеству, присутствующему в необработанных контрольных клетках K2040, соответствующему 1. Интенсивность полос определяли с помощью денситометрии. Показанные результаты являются репрезентативными по меньшей мере для трех независимых экспериментов.
С. Фигуры, представленные выше, относятся к вирусу гепатита С. Дополнительные фигуры, описанные ниже, относятся к противовирусной активности IB657 в отношении вируса энцефаломиокардита (EMCV), респираторного синцитиального вируса (RSV) и вируса Западного Нила.
1. EMCV
Как показано на фиг.11, обработка his-меченым IB657 привела к значительному снижению количества инфекционного вируса, освобожденного из клеток Huh7. Необработанные клетки давали 4,9×106 б.о.е./мл EMCV, тогда как клетки, обработанные 6 мкМ IB657, давали 7,5×104 б.о.е./мл EMCV. Значение IC50 и IC90 his-меченого IB657 в указанных исследованиях составило 0,78 мкМ и 2,08 мкМ соответственно. IB657 эффективно снизил продукцию инфекционных EMCV в клетках гепатомы человека. Кроме того, обработка IB657 или his-меченым производным IB657 давала зависимое от дозы ингибирование EMCV-индуцированного цитопатического эффекта в инфицированных клетках Huh7 и NIH/3T3 (фиг.12-14). IB657 и his-меченый IB657 оказывали одинаковое защитное действие, несмотря на то, что his-меченый вариант проявлял чуть больший защитный эффект из-за повышенного захвата his-меченого белка по сравнению с природным белком.
Для оценки того, имеют ли низкие дозы IB657 и интерферон-альфа аддитивные противовирусные активности при объединении, клетки Huh7 обрабатывали 5 Ед/мл интрон A (Intron A) (Schering) и различными концентрациями his-меченого IB657. Заранее было определено, что 5 Ед/мл интрона А является полумаксимальной дозой для защиты от EMCV в анализах цитопатической активности (данные не показаны). Как показано на фиг.15, низкие дозы his-меченого IB657 усиливают защитный эффект низких доз интрона А, и наоборот. Эти данные указывают на то, что IB657 и интрон А обладают аддитивной противовирусной активностью.
2. RSV
Как показано на фиг.16, обработка IB657 привела к снижению распространения RSV в клетках Hep2, что было измерено с помощью фокус-образующих единиц. Клетки, обработанные 4 мкМ IB657, образовывали приблизительно в 7,5 раз меньше фокусов, чем необработанные клетки в течение 24 часов после инфицирования. Значения IC50 и IC90 IB657 в этих исследованиях составили 1,01 мкМ и 1,8 мкМ соответственно. Кроме того, обработка his-меченым вариантом IB657 дала зависимое от дозы ингибирование экспрессии F-белка RSV (фиг.17) и RSV-индуцированный цитопатический эффект в инфицированных клетках MRC5 (данные не приведены). Исследование «время-добавление» с his-меченым IB657 показало, что обработка указанным вариантом через 1 и 4 часа после инфицирования вирусом дала незначительно снижение ингибирования продукции F-белка (фиг.17), что указывает на противовирусную активность IB657 даже после того, как произошло инфицирование вирусом.
3. вирус Западного Нила
Как показано на фиг.18, обработка his-меченым IB657 дала двух-log снижение продукции инфекционного вируса Западного Нила клетками Huh7. Значения IC50 и IC90 his-меченого IB657 IB657 в этих исследованиях составили 1,66 мкМ и 3,11 мкМ соответственно. При тех же условиях, обработка IB657 снижала количество вирусного белка в инифицированных клетках, даже если клетки были инфицированы со множественностью инфекции (MOI), равной пяти (данные не показаны). Кроме того, репликация репликона вируса Западного Нила ингибировалась в зависимости от дозы (данные не показаны). Эти данные указывают, что IB657 обладает широким спектром активности в отношении представителей семейства флавивирусов.
Предшествующая спецификация, включая конкретные варианты осуществления и примеры, является иллюстративной по отношению к настоящему изобретению и не рассматриваться как ограничивающая. Могут производиться другие многочисленные изменения и модификации без отступления от истинной сущности изобретения и его рамок. Все упомянутые патенты, патентные публикации и непатентные публикации включены в настоящее изобретение в качестве ссылок.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> ИЛЛЮМИДЖЕН БАЙОСАЙЕНСИЗ, ИНК.
<120> МУТАЦИИ В ГЕНАХ OAS1
<130> 55382-52
<140> PCT/US06/016983
<141> 2006-05-03
<150> 60/677680
<151> 2005-05-04
<160> 16
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 346
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Met Asp Leu Arg Asn Thr Pro Ala Lys Ser Leu Asp Lys Phe Ile
1               5                  10                  15
Glu Asp Tyr Leu Leu Pro Asp Thr Cys Phe Arg Met Gln Ile Asn His
20                  25                  30
Ala Ile Asp Ile Ile Cys Gly Phe Leu Lys Glu Arg Cys Phe Arg Gly
35                  40                  45
Ser Ser Tyr Pro Val Cys Val Ser Lys Val Val Lys Gly Gly Ser Ser
50                  55                  60
Gly Lys Gly Thr Thr Leu Arg Gly Arg Ser Asp Ala Asp Leu Val Val
65                  70                  75                  80
Phe Leu Ser Pro Leu Thr Thr Phe Gln Asp Gln Leu Asn Arg Arg Gly
85                  90                  95
Glu Phe Ile Gln Glu Ile Arg Arg Gln Leu Glu Ala Cys Gln Arg Glu
100                 105                 110
Arg Ala Phe Ser Val Lys Phe Glu Val Gln Ala Pro Arg Trp Gly Asn
115                 120                 125
Pro Arg Ala Leu Ser Phe Val Leu Ser Ser Leu Gln Leu Gly Glu Gly
130                 135                 140
Val Glu Phe Asp Val Leu Pro Ala Phe Asp Ala Leu Gly Gln Leu Thr
145                 150                 155                 160
Gly Ser Tyr Lys Pro Asn Pro Gln Ile Tyr Val Lys Leu Ile Glu Glu
165                 170                 175
Cys Thr Asp Leu Gln Lys Glu Gly Glu Phe Ser Thr Cys Phe Thr Glu
180                 185                 190
Leu Gln Arg Asp Phe Leu Lys Gln Arg Pro Thr Lys Leu Lys Ser Leu
195                 200                 205
Ile Arg Leu Val Lys His Trp Tyr Gln Asn Cys Lys Lys Lys Leu Gly
210                 215                 220
Lys Leu Pro Pro Gln Tyr Ala Leu Glu Leu Leu Thr Val Tyr Ala Trp
225                 230                 235                 240
Glu Arg Gly Ser Met Lys Thr His Phe Asn Thr Ala Gln Gly Phe Arg
245                 250                 255
Thr Val Leu Glu Leu Val Ile Asn Tyr Gln Gln Leu Cys Ile Tyr Trp
260                 265                 270
Thr Lys Tyr Tyr Asp Phe Lys Asn Pro Ile Ile Glu Lys Tyr Leu Arg
275                 280                 285
Arg Gln Leu Thr Lys Pro Arg Pro Val Ile Leu Asp Pro Ala Asp Pro
290                 295                 300
Thr Gly Asn Leu Gly Gly Gly Asp Pro Lys Gly Trp Arg Gln Leu Ala
305                 310                 315                 320
Gln Glu Ala Glu Ala Trp Leu Asn Tyr Pro Cys Phe Lys Asn Trp Asp
325                 330                 335
Gly Ser Pro Val Ser Ser Trp Ile Leu Leu
340                 345
<210> 2
<211> 400
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Met Asp Leu Arg Asn Thr Pro Ala Lys Ser Leu Asp Lys Phe Ile
1               5                  10                  15
Glu Asp Tyr Leu Leu Pro Asp Thr Cys Phe Arg Met Gln Ile Asn His
20                  25                  30
Ala Ile Asp Ile Ile Cys Gly Phe Leu Lys Glu Arg Cys Phe Arg Gly
35                  40                  45
Ser Ser Tyr Pro Val Cys Val Ser Lys Val Val Lys Gly Gly Ser Ser
50                  55                  60
Gly Lys Gly Thr Thr Leu Arg Gly Arg Ser Asp Ala Asp Leu Val Val
65                  70                  75                  80
Phe Leu Ser Pro Leu Thr Thr Phe Gln Asp Gln Leu Asn Arg Arg Gly
85                  90                  95
Glu Phe Ile Gln Glu Ile Arg Arg Gln Leu Glu Ala Cys Gln Arg Glu
100                 105                 110
Arg Ala Phe Ser Val Lys Phe Glu Val Gln Ala Pro Arg Trp Gly Asn
115                 120                 125
Pro Arg Ala Leu Ser Phe Val Leu Ser Ser Leu Gln Leu Gly Glu Gly
130                 135                 140
Val Glu Phe Asp Val Leu Pro Ala Phe Asp Ala Leu Gly Gln Leu Thr
145                 150                 155                 160
Gly Gly Tyr Lys Pro Asn Pro Gln Ile Tyr Val Lys Leu Ile Glu Glu
165                 170                 175
Cys Thr Asp Leu Gln Lys Glu Gly Glu Phe Ser Thr Cys Phe Thr Glu
180                 185                 190
Leu Gln Arg Asp Phe Leu Lys Gln Arg Pro Thr Lys Leu Lys Ser Leu
195                 200                 205
Ile Arg Leu Val Lys His Trp Tyr Gln Asn Cys Lys Lys Lys Leu Gly
210                 215                 220
Lys Leu Pro Pro Gln Tyr Ala Leu Glu Leu Leu Thr Val Tyr Ala Trp
225                 230                 235                 240
Glu Arg Gly Ser Met Lys Thr His Phe Asn Thr Ala Gln Gly Phe Arg
245                 250                 255
Thr Val Leu Glu Leu Val Ile Asn Tyr Gln Gln Leu Cys Ile Tyr Trp
260                 265                 270
Thr Lys Tyr Tyr Asp Phe Lys Asn Pro Ile Ile Glu Lys Tyr Leu Arg
275                 280                 285
Arg Gln Leu Thr Lys Pro Arg Pro Val Ile Leu Asp Pro Ala Asp Pro
290                 295                 300
Thr Gly Asn Leu Gly Gly Gly Asp Pro Lys Gly Trp Arg Gln Leu Ala
305                 310                 315                 320
Gln Glu Ala Glu Ala Trp Leu Asn Tyr Pro Cys Phe Lys Asn Trp Asp
325                 330                 335
Gly Ser Pro Val Ser Ser Trp Ile Leu Leu Ala Glu Ser Asn Ser Ala
340                 345                 350
Asp Asp Glu Thr Asp Asp Pro Arg Arg Tyr Gln Lys Tyr Gly Tyr Ile
355                 360                 365
Gly Thr His Glu Tyr Pro His Phe Ser His Arg Pro Ser Thr Leu Gln
370                 375                 380
Ala Ala Ser Thr Pro Gln Ala Glu Glu Asp Trp Thr Cys Thr Ile Leu
385                 390                 395                 400
<210> 3
<211> 364
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 3
Met Met Asp Leu Arg Asn Thr Pro Ala Lys Ser Leu Asp Lys Phe Ile
1               5                  10                  15
Glu Asp Tyr Leu Leu Pro Asp Thr Cys Phe Arg Met Gln Ile Asn His
20                  25                  30
Ala Ile Asp Ile Ile Cys Gly Phe Leu Lys Glu Arg Cys Phe Arg Gly
35                  40                  45
Ser Ser Tyr Pro Val Cys Val Ser Lys Val Val Lys Gly Gly Ser Ser
50                  55                  60
Gly Lys Gly Thr Thr Leu Arg Gly Arg Ser Asp Ala Asp Leu Val Val
65                  70                  75                  80
Phe Leu Ser Pro Leu Thr Thr Phe Gln Asp Gln Leu Asn Arg Arg Gly
85                  90                  95
Glu Phe Ile Gln Glu Ile Arg Arg Gln Leu Glu Ala Cys Gln Arg Glu
100                 105                 110
Arg Ala Phe Ser Val Lys Phe Glu Val Gln Ala Pro Arg Trp Gly Asn
115                 120                 125
Pro Arg Ala Leu Ser Phe Val Leu Ser Ser Leu Gln Leu Gly Glu Gly
130                 135                 140
Val Glu Phe Asp Val Leu Pro Ala Phe Asp Ala Leu Gly Gln Leu Thr
145                 150                 155                 160
Gly Gly Tyr Lys Pro Asn Pro Gln Ile Tyr Val Lys Leu Ile Glu Glu
165                 170                 175
Cys Thr Asp Leu Gln Lys Glu Gly Glu Phe Ser Thr Cys Phe Thr Glu
180                 185                 190
Leu Gln Arg Asp Phe Leu Lys Gln Arg Pro Thr Lys Leu Lys Ser Leu
195                 200                 205
Ile Arg Leu Val Lys His Trp Tyr Gln Asn Cys Lys Lys Lys Leu Gly
210                 215                 220
Lys Leu Pro Pro Gln Tyr Ala Leu Glu Leu Leu Thr Val Tyr Ala Trp
225                 230                 235                 240
Glu Arg Gly Ser Met Lys Thr His Phe Asn Thr Ala Gln Gly Phe Arg
245                 250                 255
Thr Val Leu Glu Leu Val Ile Asn Tyr Gln Gln Leu Cys Ile Tyr Trp
260                 265                 270
Thr Lys Tyr Tyr Asp Phe Lys Asn Pro Ile Ile Glu Lys Tyr Leu Arg
275                 280                 285
Arg Gln Leu Thr Lys Pro Arg Pro Val Ile Leu Asp Pro Ala Asp Pro
290                 295                 300
Thr Gly Asn Leu Gly Gly Gly Asp Pro Lys Gly Trp Arg Gln Leu Ala
305                 310                 315                 320
Gln Glu Ala Glu Ala Trp Leu Asn Tyr Pro Cys Phe Lys Asn Trp Asp
325                 330                 335
Gly Ser Pro Val Ser Ser Trp Ile Leu Leu Val Arg Pro Pro Ala Ser
340                 345                 350
Ser Leu Pro Phe Ile Pro Ala Pro Leu His Glu Ala
355                 360
<210> 4
<211> 414
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 4
Met Met Asp Leu Arg Asn Thr Pro Ala Lys Ser Leu Asp Lys Phe Ile
1               5                  10                  15
Glu Asp Tyr Leu Leu Pro Asp Thr Cys Phe Arg Met Gln Ile Asn His
20                  25                  30
Ala Ile Asp Ile Ile Cys Gly Phe Leu Lys Glu Arg Cys Phe Arg Gly
35                  40                  45
Ser Ser Tyr Pro Val Cys Val Ser Lys Val Val Lys Gly Gly Ser Ser
50                  55                  60
Gly Lys Gly Thr Thr Leu Arg Gly Arg Ser Asp Ala Asp Leu Val Val
65                  70                  75                  80
Phe Leu Ser Pro Leu Thr Thr Phe Gln Asp Gln Leu Asn Arg Arg Gly
85                  90                  95
Glu Phe Ile Gln Glu Ile Arg Arg Gln Leu Glu Ala Cys Gln Arg Glu
100                 105                 110
Arg Ala Phe Ser Val Lys Phe Glu Val Gln Ala Pro Arg Trp Gly Asn
115                 120                 125
Pro Arg Ala Leu Ser Phe Val Leu Ser Ser Leu Gln Leu Gly Glu Gly
130                 135                 140
Val Glu Phe Asp Val Leu Pro Ala Phe Asp Ala Leu Gly Gln Leu Thr
145                 150                 155                 160
Gly Gly Tyr Lys Pro Asn Pro Gln Ile Tyr Val Lys Leu Ile Glu Glu
165                 170                 175
Cys Thr Asp Leu Gln Lys Glu Gly Glu Phe Ser Thr Cys Phe Thr Glu
180                 185                 190
Leu Gln Arg Asp Phe Leu Lys Gln Arg Pro Thr Lys Leu Lys Ser Leu
195                 200                 205
Ile Arg Leu Val Lys His Trp Tyr Gln Asn Cys Lys Lys Lys Leu Gly
210                 215                 220
Lys Leu Pro Pro Gln Tyr Ala Leu Glu Leu Leu Thr Val Tyr Ala Trp
225                 230                 235                 240
Glu Arg Gly Ser Met Lys Thr His Phe Asn Thr Ala Gln Gly Phe Arg
245                 250                 255
Thr Val Leu Glu Leu Val Ile Asn Tyr Gln Gln Leu Cys Ile Tyr Trp
260                 265                 270
Thr Lys Tyr Tyr Asp Phe Lys Asn Pro Ile Ile Glu Lys Tyr Leu Arg
275                 280                 285
Arg Gln Leu Thr Lys Pro Arg Pro Val Ile Leu Asp Pro Ala Asp Pro
290                 295                 300
Thr Gly Asn Leu Gly Gly Gly Asp Pro Lys Gly Trp Arg Gln Leu Ala
305                 310                 315                 320
Gln Glu Ala Glu Ala Trp Leu Asn Tyr Pro Cys Phe Lys Asn Trp Asp
325                 330                 335
Gly Ser Pro Val Ser Ser Trp Ile Leu Leu Thr Gln His Thr Pro Gly
340                 345                 350
Ser Ile His Pro Thr Gly Arg Arg Gly Leu Asp Leu His His Pro Leu
355                 360                 365
Asn Ala Ser Ala Ser Trp Gly Lys Gly Leu Gln Cys Tyr Leu Asp Gln
370                 375                 380
Phe Leu His Phe Gln Val Gly Leu Leu Ile Gln Arg Gly Gln Ser Ser
385                 390                 395                 400
Ser Val Ser Trp Cys Ile Ile Gln Asp Arg Thr Gln Val Ser
405                 410
<210> 5
<211> 353
<212> БЕЛОК
<213> Gorilla gorilla
<400> 5
Met Met Asp Leu Arg Asn Thr Pro Ala Lys Ser Leu Asp Lys Phe Ile
1               5                  10                  15
Glu Asp Tyr Leu Leu Pro Asp Thr Cys Phe Arg Met Gln Ile Asn His
20                  25                  30
Ala Ile Asp Ile Ile Cys Gly Phe Leu Lys Glu Arg Cys Phe Arg Gly
35                  40                  45
Ser Ser Tyr Pro Val Cys Val Ser Lys Val Val Lys Gly Gly Ser Ser
50                  55                  60
Gly Lys Gly Thr Ala Leu Arg Gly Arg Ser Asp Ala Asp Leu Val Val
65                  70                  75                  80
Phe Leu Ser Pro Leu Thr Thr Phe Gln Asp Gln Leu Asn Arg Arg Gly
85                  90                  95
Glu Phe Ile Gln Glu Ile Arg Arg Gln Leu Glu Ala Cys Gln Arg Glu
100                 105                 110
Arg Ala Phe Ser Val Lys Phe Glu Val Gln Ala Pro Arg Trp Gly Asn
115                 120                 125
Pro Cys Ala Leu Ser Phe Val Leu Ser Ser Leu Gln Leu Gly Glu Gly
130                 135                 140
Val Glu Phe Asp Val Leu Pro Ala Phe Asp Ala Leu Gly Gln Leu Thr
145                 150                 155                 160
Gly Gly Tyr Lys Pro Asn Pro Gln Ile Tyr Val Lys Leu Ile Lys Glu
165                 170                 175
Cys Thr Tyr Leu Gln Lys Glu Gly Glu Phe Ser Thr Cys Phe Thr Glu
180                 185                 190
Leu Gln Arg Asp Phe Leu Lys Gln Arg Pro Thr Lys Leu Lys Ser Leu
195                 200                 205
Ile Arg Leu Val Lys His Trp Tyr Gln Asn Cys Lys Lys Lys Leu Gly
210                 215                 220
Lys Leu Pro Pro Gln Tyr Ala Leu Glu Leu Leu Thr Val Tyr Ala Trp
225                 230                 235                 240
Glu Gln Gly Ser Met Lys Thr His Phe Asn Thr Ala Gln Gly Phe Arg
245                 250                 255
Thr Val Leu Glu Leu Val Ile Asn Tyr Gln Gln Leu Cys Ile Tyr Trp
260                 265                 270
Thr Lys Tyr Tyr Asp Phe Lys Asn Pro Ile Ile Glu Lys Tyr Leu Arg
275                 280                 285
Arg Gln Leu Arg Lys Pro Arg Pro Val Ile Leu Asp Pro Ala Asp Pro
290                 295                 300
Thr Gly Asn Leu Gly Gly Gly Asp Pro Lys Gly Trp Arg Gln Leu Ala
305                 310                 315                 320
Gln Glu Ala Glu Ala Trp Leu Asn Tyr Pro Cys Phe Lys Asn Trp Asp
325                 330                 335
Gly Ser Pro Val Ser Ser Trp Ile Leu Leu Ala Glu Ser Asp Ser Gly
340                 345                 350
Arg
<210> 6
<211> 364
<212> БЕЛОК
<213> Gorilla gorilla
<400> 6
Met Met Asp Leu Arg Asn Thr Pro Ala Lys Ser Leu Asp Lys Phe Ile
1               5                  10                  15
Glu Asp Tyr Leu Leu Pro Asp Thr Cys Phe Arg Met Gln Ile Asn His
20                  25                  30
Ala Ile Asp Ile Ile Cys Gly Phe Leu Lys Glu Arg Cys Phe Arg Gly
35                  40                  45
Ser Ser Tyr Pro Val Cys Val Ser Lys Val Val Lys Gly Gly Ser Ser
50                  55                  60
Gly Lys Gly Thr Ala Leu Arg Gly Arg Ser Asp Ala Asp Leu Val Val
65                  70                  75                  80
Phe Leu Ser Pro Leu Thr Thr Phe Gln Asp Gln Leu Asn Arg Arg Gly
85                  90                  95
Glu Phe Ile Gln Glu Ile Arg Arg Gln Leu Glu Ala Cys Gln Arg Glu
100                 105                 110
Arg Ala Phe Ser Val Lys Phe Glu Val Gln Ala Pro Arg Trp Gly Asn
115                 120                 125
Pro Cys Ala Leu Ser Phe Val Leu Ser Ser Leu Gln Leu Gly Glu Gly
130                 135                 140
Val Glu Phe Asp Val Leu Pro Ala Phe Asp Ala Leu Gly Gln Leu Thr
145                 150                 155                 160
Gly Gly Tyr Lys Pro Asn Pro Gln Ile Tyr Val Lys Leu Ile Lys Glu
165                 170                 175
Cys Thr Tyr Leu Gln Lys Glu Gly Glu Phe Ser Thr Cys Phe Thr Glu
180                 185                 190
Leu Gln Arg Asp Phe Leu Lys Gln Arg Pro Thr Lys Leu Lys Ser Leu
195                 200                 205
Ile Arg Leu Val Lys His Trp Tyr Gln Asn Cys Lys Lys Lys Leu Gly
210                 215                 220
Lys Leu Pro Pro Gln Tyr Ala Leu Glu Leu Leu Thr Val Tyr Ala Trp
225                 230                 235                 240
Glu Gln Gly Ser Met Lys Thr His Phe Asn Thr Ala Gln Gly Phe Arg
245                 250                 255
Thr Val Leu Glu Leu Val Ile Asn Tyr Gln Gln Leu Cys Ile Tyr Trp
260                 265                 270
Thr Lys Tyr Tyr Asp Phe Lys Asn Pro Ile Ile Glu Lys Tyr Leu Arg
275                 280                 285
Arg Gln Leu Arg Lys Pro Arg Pro Val Ile Leu Asp Pro Ala Asp Pro
290                 295                 300
Thr Gly Asn Leu Gly Gly Gly Asp Pro Lys Gly Trp Arg Gln Leu Ala
305                 310                 315                 320
Gln Glu Ala Glu Ala Trp Leu Asn Tyr Pro Cys Phe Lys Asn Trp Asp
325                 330                 335
Gly Ser Pro Val Ser Ser Trp Ile Leu Leu Val Arg Pro Pro Ala Ser
340                 345                 350
Ser Leu Pro Phe Ile Pro Ala Pro Leu His Lys Ala
355                 360
<210> 7
<211> 414
<212> БЕЛОК
<213> Gorilla gorilla
<400> 7
Met Met Asp Leu Arg Asn Thr Pro Ala Lys Ser Leu Asp Lys Phe Ile
1               5                  10                  15
Glu Asp Tyr Leu Leu Pro Asp Thr Cys Phe Arg Met Gln Ile Asn His
20                  25                  30
Ala Ile Asp Ile Ile Cys Gly Phe Leu Lys Glu Arg Cys Phe Arg Gly
35                  40                  45
Ser Ser Tyr Pro Val Cys Val Ser Lys Val Val Lys Gly Gly Ser Ser
50                  55                  60
Gly Lys Gly Thr Ala Leu Arg Gly Arg Ser Asp Ala Asp Leu Val Val
65                  70                  75                  80
Phe Leu Ser Pro Leu Thr Thr Phe Gln Asp Gln Leu Asn Arg Arg Gly
85                  90                  95
Glu Phe Ile Gln Glu Ile Arg Arg Gln Leu Glu Ala Cys Gln Arg Glu
100                 105                 110
Arg Ala Phe Ser Val Lys Phe Glu Val Gln Ala Pro Arg Trp Gly Asn
115                 120                 125
Pro Cys Ala Leu Ser Phe Val Leu Ser Ser Leu Gln Leu Gly Glu Gly
130                 135                 140
Val Glu Phe Asp Val Leu Pro Ala Phe Asp Ala Leu Gly Gln Leu Thr
145                 150                 155                 160
Gly Gly Tyr Lys Pro Asn Pro Gln Ile Tyr Val Lys Leu Ile Lys Glu
165                 170                 175
Cys Thr Tyr Leu Gln Lys Glu Gly Glu Phe Ser Thr Cys Phe Thr Glu
180                 185                 190
Leu Gln Arg Asp Phe Leu Lys Gln Arg Pro Thr Lys Leu Lys Ser Leu
195                 200                 205
Ile Arg Leu Val Lys His Trp Tyr Gln Asn Cys Lys Lys Lys Leu Gly
210                 215                 220
Lys Leu Pro Pro Gln Tyr Ala Leu Glu Leu Leu Thr Val Tyr Ala Trp
225                 230                 235                 240
Glu Gln Gly Ser Met Lys Thr His Phe Asn Thr Ala Gln Gly Phe Arg
245                 250                 255
Thr Val Leu Glu Leu Val Ile Asn Tyr Gln Gln Leu Cys Ile Tyr Trp
260                 265                 270
Thr Lys Tyr Tyr Asp Phe Lys Asn Pro Ile Ile Glu Lys Tyr Leu Arg
275                 280                 285
Arg Gln Leu Lys Lys Pro Arg Pro Val Ile Leu Asp Pro Ala Asp Pro
290                 295                 300
Thr Gly Asn Leu Gly Gly Gly Asp Pro Lys Gly Trp Arg Gln Leu Ala
305                 310                 315                 320
Gln Glu Ala Glu Ala Trp Leu Asn Tyr Pro Cys Phe Lys Asn Trp Asp
325                 330                 335
Gly Ser Pro Val Ser Ser Trp Ile Leu Leu Thr Gln His Thr Pro Gly
340                 345                 350
Ser Ile His Pro Thr Gly Arg Arg Gly Leu Asp Leu His His Pro Leu
355                 360                 365
Asn Ala Ser Ala Ser Trp Gly Lys Gly Leu Gln Cys Tyr Leu Asp Gln
370                 375                 380
Phe Leu His Phe Gln Val Gly Leu Leu Ile Gln Arg Gly Gln Ser Ser
385                 390                 395                 400
Ser Val Ser Trp Cys Ile Ile Gln Asp Arg Thr Gln Val Ser
405                 410
<210> 8
<211> 401
<212> БЕЛОК
<213> Pan paniscus
<220>
<221> Вариант
<222> 336
<223> Xaa представляет собой Trp или Cys
<400> 8
Met Met Asp Leu Arg Asn Thr Pro Ala Lys Ser Leu Asp Lys Phe Ile
1               5                  10                  15
Glu Asp Tyr Leu Leu Pro Asp Thr Cys Phe Arg Thr Gln Ile Asn His
20                  25                  30
Ala Ile Asp Ile Ile Cys Gly Phe Leu Lys Glu Arg Cys Phe Arg Gly
35                  40                  45
Ser Ser Tyr Pro Val Cys Val Ser Lys Val Val Lys Gly Gly Ser Ser
50                  55                  60
Gly Lys Gly Thr Thr Leu Arg Gly Arg Ser Asp Ala Asp Leu Val Val
65                  70                  75                  80
Phe Leu Ser Pro Leu Thr Thr Phe Gln Asp Gln Leu Asn Arg Arg Gly
85                  90                  95
Glu Phe Ile Gln Glu Ile Arg Arg Gln Leu Glu Val Cys Gln Arg Glu
100                 105                 110
Glu Arg Ala Phe Ser Val Lys Phe Glu Val Gln Ala Pro Arg Trp Asp
115                 120                 125
Asn Pro Arg Ala Leu Ser Phe Val Leu Ser Ser Leu Gln Leu Gly Glu
130                 135                 140
Gly Val Glu Phe Asp Val Leu Pro Ala Phe Asp Ala Leu Gly Gln Leu
145                 150                 155                 160
Ile Gly Gly Tyr Lys Pro Asp Pro Gln Ile Tyr Val Lys Leu Ile Glu
165                 170                 175
Glu Cys Thr Tyr Leu Gln Lys Glu Gly Glu Phe Ser Thr Cys Phe Thr
180                 185                 190
Glu Leu Gln Arg Asp Phe Leu Lys Glu Arg Pro Thr Lys Leu Lys Ser
195                 200                 205
Leu Ile Arg Leu Val Lys His Trp Tyr Gln Asn Cys Lys Lys Lys Leu
210                 215                 220
Gly Lys Leu Pro Pro Gln Tyr Ala Leu Glu Leu Leu Thr Val Tyr Ala
225                 230                 235                 240
Trp Glu Arg Gly Ser Met Lys Thr His Phe Asn Thr Ala Gln Gly Phe
245                 250                 255
Arg Thr Val Leu Glu Leu Val Ile Asn Tyr Gln Gln Leu Cys Ile Tyr
260                 265                 270
Trp Thr Lys Tyr Tyr Asp Phe Lys Asn Pro Ile Ile Glu Lys Tyr Leu
275                 280                 285
Ser Arg Gln Leu Glu Lys Pro Arg Pro Val Ile Leu Asp Pro Ala Asp
290                 295                 300
Pro Thr Gly Asn Leu Gly Gly Gly Asp Pro Lys Gly Trp Arg Gln Leu
305                 310                 315                 320
Ala Gln Glu Ala Glu Ala Trp Leu Asn Tyr Pro Cys Phe Lys Asn Xaa
325                 330                 335
Asp Gly Ser Pro Val Ser Ser Trp Ile Leu Leu Ala Glu Ser Asp Ser
340                 345                 350
Ala Asp Asp Glu Thr Asp Asp Pro Arg Arg Tyr Gln Lys Tyr Gly Tyr
355                 360                 365
Ile Gly Thr His Glu Tyr Pro His Phe Ser His Arg Pro Ser Thr Leu
370                 375                 380
Gln Ala Ala Ser Ala Pro Gln Ala Glu Glu Asp Trp Thr Cys Thr Ile
385                 390                 395                 400
Leu
<210> 9
<211> 365
<212> БЕЛОК
<213> Pan paniscus
<220>
<221> Вариант
<222> 336
<223> Xaa представляет собой Trp или Cys
<400> 9
Met Met Asp Leu Arg Asn Thr Pro Ala Lys Ser Leu Asp Lys Phe Ile
1               5                  10                  15
Glu Asp Tyr Leu Leu Pro Asp Thr Cys Phe Arg Thr Gln Ile Asn His
20                  25                  30
Ala Ile Asp Ile Ile Cys Gly Phe Leu Lys Glu Arg Cys Phe Arg Gly
35                  40                  45
Ser Ser Tyr Pro Val Cys Val Ser Lys Val Val Lys Gly Gly Ser Ser
50                  55                  60
Gly Lys Gly Thr Thr Leu Arg Gly Arg Ser Asp Ala Asp Leu Val Val
65                  70                  75                  80
Phe Leu Ser Pro Leu Thr Thr Phe Gln Asp Gln Leu Asn Arg Arg Gly
85                  90                  95
Glu Phe Ile Gln Glu Ile Arg Arg Gln Leu Glu Val Cys Gln Arg Glu
100                 105                 110
Glu Arg Ala Phe Ser Val Lys Phe Glu Val Gln Ala Pro Arg Trp Asp
115                 120                 125
Asn Pro Arg Ala Leu Ser Phe Val Leu Ser Ser Leu Gln Leu Gly Glu
130                 135                 140
Gly Val Glu Phe Asp Val Leu Pro Ala Phe Asp Ala Leu Gly Gln Leu
145                 150                 155                 160
Ile Gly Gly Tyr Lys Pro Asp Pro Gln Ile Tyr Val Lys Leu Ile Glu
165                 170                 175
Glu Cys Thr Tyr Leu Gln Lys Glu Gly Glu Phe Ser Thr Cys Phe Thr
180                 185                 190
Glu Leu Gln Arg Asp Phe Leu Lys Glu Arg Pro Thr Lys Leu Lys Ser
195                 200                 205
Leu Ile Arg Leu Val Lys His Trp Tyr Gln Asn Cys Lys Lys Lys Leu
210                 215                 220
Gly Lys Leu Pro Pro Gln Tyr Ala Leu Glu Leu Leu Thr Val Tyr Ala
225                 230                 235                 240
Trp Glu Arg Gly Ser Met Lys Thr His Phe Asn Thr Ala Gln Gly Phe
245                 250                 255
Arg Thr Val Leu Glu Leu Val Ile Asn Tyr Gln Gln Leu Cys Ile Tyr
260                 265                 270
Trp Thr Lys Tyr Tyr Asp Phe Lys Asn Pro Ile Ile Glu Lys Tyr Leu
275                 280                 285
Ser Arg Gln Leu Glu Lys Pro Arg Pro Val Ile Leu Asp Pro Ala Asp
290                 295                 300
Pro Thr Gly Asn Leu Gly Gly Gly Asp Pro Lys Gly Trp Arg Gln Leu
305                 310                 315                 320
Ala Gln Glu Ala Glu Ala Trp Leu Asn Tyr Pro Cys Phe Lys Asn Xaa
325                 330                 335
Asp Gly Ser Pro Val Ser Ser Trp Ile Leu Leu Val Arg Pro Pro Ala
340                 345                 350
Ser Ser Leu Pro Phe Ile Pro Ala Pro Leu His Glu Ala
355                 360                 365
<210> 10
<211> 415
<212> БЕЛОК
<213> Pan paniscus
<220>
<221> Вариант
<222> 336
<223> Xaa представляет собой Trp или Cys
<400> 10
Met Met Asp Leu Arg Asn Thr Pro Ala Lys Ser Leu Asp Lys Phe Ile
1               5                  10                  15
Glu Asp Tyr Leu Leu Pro Asp Thr Cys Phe Arg Lys Gln Ile Asn His
20                  25                  30
Ala Ile Asp Ile Ile Cys Gly Phe Leu Lys Glu Arg Cys Phe Arg Gly
35                  40                  45
Ser Ser Tyr Pro Val Cys Val Ser Lys Val Val Lys Gly Gly Ser Ser
50                  55                  60
Gly Lys Gly Thr Thr Leu Arg Gly Arg Ser Asp Ala Asp Leu Val Val
65                  70                  75                  80
Phe Leu Ser Pro Leu Thr Thr Phe Gln Asp Gln Leu Asn Arg Arg Gly
85                  90                  95
Glu Phe Ile Gln Glu Ile Arg Arg Gln Leu Glu Val Cys Gln Arg Glu
100                 105                 110
Glu Arg Ala Phe Ser Val Lys Phe Glu Val Gln Ala Pro Arg Trp Asp
115                 120                 125
Asn Pro Arg Ala Leu Ser Phe Val Leu Ser Ser Leu Gln Leu Gly Glu
130                 135                 140
Gly Val Glu Phe Asp Val Leu Pro Ala Phe Asp Ala Leu Gly Gln Leu
145                 150                 155                 160
Ile Gly Gly Tyr Lys Pro Asp Pro Gln Ile Tyr Val Lys Leu Ile Glu
165                 170                 175
Glu Cys Thr Tyr Leu Gln Lys Glu Gly Glu Phe Ser Thr Cys Phe Thr
180                 185                 190
Glu Leu Gln Arg Asp Phe Leu Lys Glu Arg Pro Thr Lys Leu Lys Ser
195                 200                 205
Leu Ile Arg Leu Val Lys His Trp Tyr Gln Asn Cys Lys Lys Lys Leu
210                 215                 220
Gly Lys Leu Pro Pro Gln Tyr Ala Leu Glu Leu Leu Thr Val Tyr Ala
225                 230                 235                 240
Trp Glu Arg Gly Ser Met Lys Thr His Phe Asn Thr Ala Gln Gly Phe
245                 250                 255
Arg Thr Val Leu Glu Leu Val Ile Asn Tyr Gln Gln Leu Cys Ile Tyr
260                 265                 270
Trp Thr Lys Tyr Tyr Asp Phe Lys Asn Pro Ile Ile Glu Lys Tyr Leu
275                 280                 285
Ser Arg Gln Leu Glu Lys Pro Arg Pro Val Ile Leu Asp Pro Ala Asp
290                 295                 300
Pro Thr Gly Asn Leu Gly Gly Gly Asp Pro Lys Gly Trp Arg Gln Leu
305                 310                 315                 320
Ala Gln Glu Ala Glu Ala Trp Leu Asn Tyr Pro Cys Phe Lys Asn Xaa
325                 330                 335
Asp Gly Ser Pro Val Ser Ser Trp Ile Leu Leu Thr Gln His Thr Pro
340                 345                 350
Gly Ser Ile Arg Pro Thr Gly Arg Arg Gly Leu Asp Leu His His Pro
355                 360                 365
Leu Asn Ala Ser Ala Ser Trp Gly Lys Gly Leu Gln Cys Tyr Leu Asp
370                 375                 380
Gln Phe Leu His Phe Gln Val Gly Leu Leu Ile Gln Arg Gly Gln Ser
385                 390                 395                 400
Ser Ser Val Ser Trp Cys Ile Ile Gln Asp Arg Thr Gln Val Ser
405                 410                 415
<210> 11
<211> 335
<212> БЕЛОК
<213> Pan troglodytes verus
<400> 11
Met Met Asp Leu Arg Asn Thr Pro Ala Lys Ser Leu Asp Lys Phe Ile
1               5                  10                  15
Glu Asp Tyr Leu Leu Pro Asp Lys Cys Phe Arg Lys Gln Ile Asn His
20                  25                  30
Ala Ile Asp Ile Ile Cys Gly Phe Leu Lys Glu Arg Cys Phe Gln Gly
35                  40                  45
Ser Ser Tyr Pro Val His Val Ser Lys Val Val Lys Gly Gly Ser Ser
50                  55                  60
Gly Lys Gly Thr Thr Leu Arg Gly Arg Ser Asp Ala Asp Leu Val Val
65                  70                  75                  80
Phe Leu Ser Pro Leu Thr Thr Phe Gln Asp Gln Leu Asn Arg Arg Gly
85                  90                  95
Glu Phe Ile Gln Glu Ile Arg Arg Gln Leu Glu Ala Cys Gln Arg Glu
100                 105                 110
Glu Arg Ala Phe Ser Val Lys Phe Glu Val Gln Ala Pro Arg Trp Asp
115                 120                 125
Asn Pro Arg Ala Leu Ser Phe Val Leu Ser Ser Leu Gln Leu Gly Glu
130                 135                 140
Gly Val Glu Phe Asp Val Leu Pro Ala Phe Asp Ala Leu Gly Gln Leu
145                 150                 155                 160
Thr Asp Gly Tyr Lys Pro Asp Pro Gln Ile Tyr Val Lys Leu Ile Glu
165                 170                 175
Glu Cys Thr Tyr Leu Gln Lys Glu Gly Glu Phe Ser Thr Cys Phe Thr
180                 185                 190
Glu Leu Gln Arg Asp Phe Leu Lys Gln Arg Pro Thr Lys Leu Lys Ser
195                 200                 205
Leu Ile Arg Leu Val Lys His Trp Tyr Gln Asn Cys Lys Lys Lys Leu
210                 215                 220
Gly Lys Leu Pro Pro Gln Tyr Ala Leu Glu Leu Leu Thr Val Tyr Ala
225                 230                 235                 240
Trp Glu Gln Gly Ser Met Glu Thr Asp Phe Asn Thr Ala Gln Glu Phe
245                 250                 255
Arg Thr Val Leu Glu Leu Val Ile Asn Tyr Gln Gln Leu Cys Ile Tyr
260                 265                 270
Trp Thr Lys Tyr Tyr Asp Phe Glu Asn Pro Ile Ile Glu Lys Tyr Leu
275                 280                 285
Arg Arg Gln Leu Thr Lys Pro Arg Pro Val Ile Leu Asp Pro Ala Asp
290                 295                 300
Pro Thr Gly Asn Leu Gly Gly Gly Asp Pro Lys Gly Trp Arg Gln Leu
305                 310                 315                 320
Ala Gln Glu Ala Glu Ala Trp Leu Asn Tyr Pro Cys Phe Lys Asn
325                 330                 335
<210> 12
<211> 335
<212> БЕЛОК
<213> Pan troglodytes
<220>
<221> Вариант
<222> 117
<223> Xaa представляет собой Ser или Ala
<400> 12
Met Met Asp Leu Arg Asn Thr Pro Ala Lys Ser Leu Asp Lys Phe Ile
1               5                  10                  15
Glu Asp Tyr Leu Leu Pro Asp Lys Cys Phe Arg Lys Gln Ile Asn His
20                  25                  30
Ala Ile Asp Ile Ile Cys Gly Phe Leu Lys Glu Arg Cys Phe Gln Gly
35                  40                  45
Ser Ser Tyr Pro Val His Val Ser Lys Val Val Lys Gly Gly Ser Ser
50                  55                  60
Gly Lys Gly Thr Thr Leu Arg Gly Arg Ser Asp Ala Asp Leu Val Val
65                  70                  75                  80
Phe Leu Ser Pro Leu Thr Thr Phe Gln Asp Gln Leu Asn Arg Arg Gly
85                  90                  95
Glu Phe Ile Gln Glu Ile Arg Arg Gln Leu Glu Ala Cys Gln Arg Glu
100                 105                 110
Glu Arg Ala Phe Xaa Val Lys Phe Glu Val Gln Ala Pro Arg Trp Asp
115                 120                 125
Asn Pro Arg Ala Leu Ser Phe Val Leu Ser Ser Leu Gln Leu Gly Glu
130                 135                 140
Gly Val Glu Phe Asp Val Leu Pro Ala Phe Asp Ala Leu Gly Gln Leu
145                 150                 155                 160
Thr Asp Gly Tyr Lys Pro Asp Pro Gln Ile Tyr Val Lys Leu Ile Glu
165                 170                 175
Glu Cys Thr Tyr Leu Gln Lys Glu Gly Glu Phe Ser Thr Cys Phe Thr
180                 185                 190
Glu Leu Gln Arg Asp Phe Leu Lys Gln Arg Pro Thr Lys Leu Lys Ser
195                 200                 205
Leu Ile Arg Leu Val Lys His Trp Tyr Gln Asn Cys Lys Lys Lys Leu
210                 215                 220
Gly Lys Leu Pro Pro Gln Tyr Ala Leu Glu Leu Leu Thr Val Tyr Ala
225                 230                 235                 240
Trp Glu Gln Gly Ser Met Glu Thr Asp Phe Asn Thr Ala Gln Glu Phe
245                 250                 255
Arg Thr Val Leu Glu Leu Val Ile Asn Tyr Gln Gln Leu Cys Ile Tyr
260                 265                 270
Trp Thr Lys Tyr Tyr Asp Phe Glu Asn Pro Ile Ile Glu Lys Tyr Leu
275                 280                 285
Arg Arg Gln Leu Thr Lys Pro Arg Pro Val Ile Leu Asp Pro Ala Asp
290                 295                 300
Pro Thr Gly Asn Leu Gly Gly Gly Asp Pro Lys Gly Trp Arg Gln Leu
305                 310                 315                 320
Ala Gln Glu Ala Glu Ala Trp Leu Asn Tyr Pro Cys Phe Lys Asn
325                 330                 335
<210> 13
<211> 118
<212> БЕЛОК
<213> Pongo pygmaeus abelii
<400> 13
Met Met Asp Leu Arg Asn Thr Pro Ala Lys Ser Leu Asp Lys Phe Ile
1               5                  10                  15
Glu Asp Tyr Leu Leu Pro Asp Thr His Phe Arg Met Gln Ile Asn His
20                  25                  30
Ala Ile Asp Thr Ile Cys Gly Phe Leu Lys Glu Arg Cys Phe Arg Gly
35                  40                  45
Ser Ser Tyr Pro Ala Arg Val Ser Lys Val Val Lys Gly Gly Ser Ser
50                  55                  60
Gly Lys Gly Thr Ala Leu Arg Gly Arg Ser Asp Ala Asp Leu Val Val
65                  70                  75                  80
Phe Leu Ser Pro Leu Thr Thr Phe Gln Asp Gln Leu Asn Arg Arg Gly
85                  90                  95
Glu Phe Ile Gln Glu Ile Arg Lys Gln Leu Glu Ala Cys Gln Arg Glu
100                 105                 110
Ser Ile Phe Arg Glu Val
115
<210> 14
<211> 400
<212> БЕЛОК
<213> Pongo pygmaeus abelii
<220>
<221> Вариант
<222> 113
<223> Xaa представляет собой Ser или Arg
<220>
<221> Вариант
<222> 114
<223> Xaa представляет собой Ile или Ala
<220>
<221> Вариант
<222> 116
<223> Xaa представляет собой Arg или Ser
<220>
<221> Вариант
<222> 117
<223> Xaa представляет собой Glu или Val
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 118
<223> Xaa представляет собой Val или Lys
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 119
<223> Xaa представляет собой Phe или терминатор
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 142
<223> Xaa представляет собой Arg или Gly
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 363
<223> Xaa представляет собой Pro или Gln
<400> 14
Met Met Asp Leu Arg Asn Thr Pro Ala Lys Ser Leu Asp Lys Phe Ile
1               5                  10                  15
Glu Asp Tyr Leu Leu Pro Asp Thr His Phe Arg Met Gln Ile Asn His
20                  25                  30
Ala Ile Asp Thr Ile Cys Gly Phe Leu Lys Glu Arg Cys Phe Arg Gly
35                  40                  45
Ser Ser Tyr Pro Val His Val Ser Lys Val Val Lys Gly Gly Ser Ser
50                  55                  60
Gly Lys Gly Thr Ala Leu Arg Gly Arg Ser Asp Ala Asp Leu Val Val
65                  70                  75                  80
Phe Leu Ser Pro Leu Thr Thr Phe Gln Asp Gln Leu Asn Arg Arg Gly
85                  90                  95
Glu Phe Ile Gln Glu Ile Arg Lys Gln Leu Glu Ala Cys Gln Arg Glu
100                 105                 110
Xaa Xaa Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Val Gln Ala Pro Arg Trp Asp Asn
115                 120                 125
Pro Arg Ala Leu Ser Phe Val Leu Ser Ser Phe Gln Leu Xaa Glu Gly
130                 135                 140
Val Glu Phe Asp Val Leu Pro Ala Phe Asp Ala Leu Gly Gln Leu Thr
145                 150                 155                 160
Gly Gly Tyr Lys Pro Asp Pro Gln Ile Tyr Val Lys Leu Ile Glu Glu
165                 170                 175
Cys Thr Asp Leu Gln Lys Glu Gly Glu Phe Ser Thr Cys Phe Thr Glu
180                 185                 190
Leu Gln Arg Asp Phe Leu Lys Gln Arg Pro Thr Lys Leu Lys Ser Leu
195                 200                 205
Ile Arg Leu Val Lys His Trp Tyr Gln Asn Cys Lys Lys Lys Leu Gly
210                 215                 220
Lys Leu Pro Pro Gln Tyr Ala Leu Glu Leu Leu Thr Val Tyr Ala Trp
225                 230                 235                 240
Glu Arg Gly Ser Met Lys Thr His Phe Asn Thr Ala Gln Gly Phe Arg
245                 250                 255
Thr Val Leu Glu Leu Val Ile Asn Tyr Gln Gln Leu Cys Ile Tyr Trp
260                 265                 270
Thr Lys Tyr Tyr Asp Phe Lys Asn Pro Ile Ile Lys Lys Tyr Leu Ser
275                 280                 285
Arg Gln Leu Arg Lys Pro Arg Pro Val Ile Leu Asp Pro Ala Asp Pro
290                 295                 300
Thr Gly Asn Leu Gly Gly Gly Asp Pro Ile Gly Trp Arg Gln Leu Ala
305                 310                 315                 320
Gln Glu Ala Glu Ala Trp Leu Asn Tyr Pro Cys Phe Lys Asn Trp Asp
325                 330                 335
Gly Ser Pro Val Ser Ser Trp Ile Leu Leu Ala Glu Ser Asp Ser Glu
340                 345                 350
Asp Asp Glu Thr Tyr Asp Pro Arg Met Tyr Xaa Lys Tyr Gly Tyr Ile
355                 360                 365
Arg Thr His Glu Tyr Ser His Phe Ser His Ser Pro Ser Thr Leu Gln
370                 375                 380
Ala Ala Ser Thr Pro Gln Ala Glu Glu Asn Trp Thr Cys Thr Ile Leu
385                 390                 395                 400
<210> 15
<211> 364
<212> БЕЛОК
<213> Pongo pygmaeus abelii
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 113
<223> Xaa представляет собой Ser или Arg
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 114
<223> Xaa представляет собой Ile или Ala
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 116
<223> Xaa представляет собой Arg или Ser
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 117
<223> Xaa представляет собой Glu или Val
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 118
<223> Xaa представляет собой Val или Lys
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 119
<223> Xaa представляет собой Phe или терминатор
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 142
<223> Xaa представляет собой Arg или Gly
<400> 15
Met Met Asp Leu Arg Asn Thr Pro Ala Lys Ser Leu Asp Lys Phe Ile
1               5                  10                  15
Glu Asp Tyr Leu Leu Pro Asp Thr His Phe Arg Met Gln Ile Asn His
20                  25                  30
Ala Ile Asp Thr Ile Cys Gly Phe Leu Lys Glu Arg Cys Phe Arg Gly
35                  40                  45
Ser Ser Tyr Pro Val His Val Ser Lys Val Val Lys Gly Gly Ser Ser
50                  55                  60
Gly Lys Gly Thr Ala Leu Arg Gly Arg Ser Asp Ala Asp Leu Val Val
65                  70                  75                  80
Phe Leu Ser Pro Leu Thr Thr Phe Gln Asp Gln Leu Asn Arg Arg Gly
85                  90                  95
Glu Phe Ile Gln Glu Ile Arg Lys Gln Leu Glu Ala Cys Gln Arg Glu
100                 105                 110
Xaa Xaa Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Val Gln Ala Pro Arg Trp Asp Asn
115                 120                 125
Pro Arg Ala Leu Ser Phe Val Leu Ser Ser Phe Gln Leu Xaa Glu Gly
130                 135                 140
Val Glu Phe Asp Val Leu Pro Ala Phe Asp Ala Leu Gly Gln Leu Thr
145                 150                 155                 160
Gly Gly Tyr Lys Pro Asp Pro Gln Ile Tyr Val Lys Leu Ile Glu Glu
165                 170                 175
Cys Thr Asp Leu Gln Lys Glu Gly Glu Phe Ser Thr Cys Phe Thr Glu
180                 185                 190
Leu Gln Arg Asp Phe Leu Lys Gln Arg Pro Thr Lys Leu Lys Ser Leu
195                 200                 205
Ile Arg Leu Val Lys His Trp Tyr Gln Asn Cys Lys Lys Lys Leu Gly
210                 215                 220
Lys Leu Pro Pro Gln Tyr Ala Leu Glu Leu Leu Thr Val Tyr Ala Trp
225                 230                 235                 240
Glu Arg Gly Ser Met Lys Thr His Phe Asn Thr Ala Gln Gly Phe Arg
245                 250                 255
Thr Val Leu Glu Leu Val Ile Asn Tyr Gln Gln Leu Cys Ile Tyr Trp
260                 265                 270
Thr Lys Tyr Tyr Asp Phe Glu Asn Pro Ile Ile Lys Lys Tyr Leu Ser
275                 280                 285
Arg Gln Leu Arg Lys Pro Arg Pro Val Ile Leu Asp Pro Ala Asp Pro
290                 295                 300
Thr Gly Asn Leu Gly Gly Gly Asp Pro Ile Gly Trp Arg Gln Leu Ala
305                 310                 315                 320
Gln Glu Ala Glu Ala Trp Leu Asn Tyr Pro Cys Phe Lys Asn Trp Asp
325                 330                 335
Gly Ser Pro Val Ser Ser Trp Ile Leu Leu Val Arg Pro Pro Ala Ser
340                 345                 350
Ser Leu Pro Phe Ile Pro Ala Pro Leu His Glu Ala
355                 360
<210> 16
<211> 414
<212> БЕЛОК
<213> Pongo pygmaeus abelii
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 113
<223> Xaa представляет собой Ser или Arg
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 114
<223> Xaa представляет собой Ile или Ala
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 116
<223> Xaa представляет собой Arg или Ser
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 117
<223> Xaa представляет собой Glu или Val
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 118
<223> Xaa представляет собой Val или Lys
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 119
<223> Xaa представляет собой Phe или терминатор
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 142
<223> Xaa представляет собой Arg или Gly
<400> 16
Met Met Asp Leu Arg Asn Thr Pro Ala Lys Ser Leu Asp Lys Phe Ile
1               5                  10                  15
Glu Asp Tyr Leu Leu Pro Asp Thr His Phe Arg Met Gln Ile Asn His
20                  25                  30
Ala Ile Asp Thr Ile Cys Gly Phe Leu Lys Glu Arg Cys Phe Arg Gly
35                  40                  45
Ser Ser Tyr Pro Val His Val Ser Lys Val Val Lys Gly Gly Ser Ser
50                  55                  60
Gly Lys Gly Thr Ala Leu Arg Gly Arg Ser Asp Ala Asp Leu Val Val
65                  70                  75                  80
Phe Leu Ser Pro Leu Thr Thr Phe Gln Asp Gln Leu Asn Arg Arg Gly
85                  90                  95
Glu Phe Ile Gln Glu Ile Arg Lys Gln Leu Glu Ala Cys Gln Arg Glu
100                 105                 110
Xaa Xaa Phe Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Val Gln Ala Pro Arg Trp Asp Asn
115                 120                 125
Pro Arg Ala Leu Ser Phe Val Leu Ser Ser Phe Gln Leu Xaa Glu Gly
130                 135                 140
Val Glu Phe Asp Val Leu Pro Ala Phe Asp Ala Leu Gly Gln Leu Thr
145                 150                 155                 160
Gly Gly Tyr Lys Pro Asp Pro Gln Ile Tyr Val Lys Leu Ile Glu Glu
165                 170                 175
Cys Thr Asp Leu Gln Lys Glu Gly Glu Phe Ser Thr Cys Phe Thr Glu
180                 185                 190
Leu Gln Arg Asp Phe Leu Lys Gln Arg Pro Thr Lys Leu Lys Ser Leu
195                 200                 205
Ile Arg Leu Val Lys His Trp Tyr Gln Asn Cys Lys Lys Lys Leu Gly
210                 215                 220
Lys Leu Pro Pro Gln Tyr Ala Leu Glu Leu Leu Thr Val Tyr Ala Trp
225                 230                 235                 240
Glu Arg Gly Ser Met Lys Thr His Phe Asn Thr Ala Gln Gly Phe Arg
245                 250                 255
Thr Val Leu Glu Leu Val Ile Asn Tyr Gln Gln Leu Cys Ile Tyr Trp
260                 265                 270
Thr Lys Tyr Tyr Asp Phe Glu Asn Pro Ile Ile Lys Lys Tyr Leu Ser
275                 280                 285
Arg Gln Leu Lys Lys Pro Arg Pro Val Ile Leu Asp Pro Ala Asp Pro
290                 295                 300
Thr Gly Asn Leu Gly Gly Gly Asp Pro Ile Gly Trp Arg Gln Leu Ala
305                 310                 315                 320
Gln Glu Ala Glu Ala Trp Leu Asn Tyr Pro Cys Phe Lys Asn Trp Asp
325                 330                 335
Gly Ser Pro Val Ser Ser Trp Ile Leu Leu Pro Gln His Thr Pro Gly
340                 345                 350
Ser Ile His Pro Thr Gly Arg Arg Glu Leu Asp Val His His Pro Leu
355                 360                 365
Asn Ala Ser Ala Ser Trp Gly Lys Gly Leu Gln Cys Tyr Leu Asp His
370                 375                 380
Leu Leu His Phe Gln Val Gly Leu Leu Ile Gln Arg Gly Gln Arg Ser
385                 390                 395                 400
Ser Val Ser Trp Cys Ile Ile Gln Asp Arg Thr Gln Val Ser
405                 410
30