СПОСОБ КРУПНОМАСШТАБНОГО ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТЕОГЛИКАНА
METHOD FOR LARGE-SCALE PRODUCTION OF PROTEOGLYCAN

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[0001] Настоящее изобретение относится к способу получения протеогликана. Более конкретно, настоящее изобретение относится, в частности, к способу экстракции протеогликана, позволяющему крупномасштабное получение высокомолекулярного протеогликана с высокой эффективностью.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0002] Протеогликан является одной из основных биологических макромолекул для формирования субстрата внеклеточного матрикса соединительной ткани, какими являются коллаген и другие. Протеогликан до настоящего времени получали экстракцией и выделением из хряща млекопитающих (в частности, бычьего хряща). Однако, с тех пор, как опубликовано возникновение губчатой энцефалопатии крупного рогатого скота (BSE), использования бычьего хряща избегают. Таким образом, существует необходимость в альтернативном источнике протеогликана и в способе получения для альтернативного источника. Кроме того, поскольку себестоимость протеогликана является очень высокой из-за сложности существующей стадии экстракции протеогликана и низкого выхода, промышленное применение протеогликана не было окончательно усовершенствовано. Таким образом, существует необходимость в более простом способе, обеспечивающем более высокий выход.
[0003] В качестве альтернативного источника протеогликана привлекает внимание ткань водных животных. Таким образом, существовали попытки экстракции протеогликана из хряща водных животных, таких как киты и акулы. Однако из-за ограничений, установленных на охоту на этих водных животных, трудно получать большие количества протеогликана. Более того, экстракция и выделение протеогликана являются сложными, и некоторые растворители и т.д., используемые для экстракции, обладают относительно высокой токсичностью.
[0004] В этих условиях существовали попытки экстракции протеогликана из больших количеств выбрасываемых тканей водных животных (например, носового хряща лосося). В Патентном документе 1 описан способ получения композиции (порошка носового хряща), содержащей протеогликан из носового хряща лосося. В частности, поскольку считают, что протеогликан, полученный из носового хряща лосося, оказывает эффект для лечения или предотвращения воспалительных заболеваний кишечника, необходимость в протеогликане увеличивается. Однако способ из Патентного документа 1 не может обеспечивать достаточно высокую эффективность продукции; таким образом, способ еще нуждается в улучшении в отношении эффективности.
Список процитированной литературы
ПАТЕНТНЫЕ ДОКУМЕНТЫ
[0005] Патентный документ 1: JP2009-173702A
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
ТЕХНИЧЕСКАЯ ПРОБЛЕМА
[0006] Целью настоящего изобретения является эффективная экстракция протеогликана из тканей водных животных.
РЕШЕНИЕ ПРОБЛЕМЫ
[0007] Неожиданно, авторы настоящего изобретения обнаружили, что способ замораживания хряща рыбы, измельчения хряща на небольшие части и нагрева частей в воде позволяет экстракцию протеогликана с высокой эффективностью. После нескольких попыток дальнейшего улучшения способа авторы изобретения завершили настоящее изобретение.
[0008] Конкретно, настоящее изобретение относится к способам экстракции протеогликана (т.е. способам получения протеогликана) и к способам улучшения эффективности экстракции протеогликана, указанным в следующих пунктах 1-11.
Пункт 1
Способ экстракции протеогликана из хряща рыбы, включающий в себя стадию (A) нагревания небольших частей замороженного хряща рыбы в воде.
Пункт 2
Способ по пункту 1, где каждая из небольших частей замороженного хряща рыбы составляет 0,001-0,5 г.
Пункт 3
Способ по пункту 1 или 2, где небольшие части замороженного хряща рыбы получают замораживанием хряща рыбы и затем измельчением замороженного хряща рыбы.
Пункт 4
Способ по пункту 3, где хрящ рыбы представляет собой обезжиренный носовой хрящ рыбы.
Пункт 5
4
Способ по любому из пунктов 1-4, где экстрагированный протеогликан содержит протеогликан, обладающий молекулярной массой не менее 900000 (90×10).
Пункт 6
Способ по любому из пунктов 1-5, где нагревание на стадии (A) проводят в течение более 3 часов.
Пункт 7
Способ по любому из пунктов 1-6, где температура воды, используемой для нагревания на стадии (A), составляет не менее 80°C.
Пункт 8
Способ по любому из пунктов 1-7, где соотношение массы всех небольших частей замороженного хряща рыбы к воде составляет 1:1-1:10.
Пункт 9
Способ по любому из пунктов 1-8, где нагревание на стадии (A) продолжают пока масса осадка, собранного после нагревания, не станет равной или меньшей, чем масса нагретых небольших частей замороженного хряща рыбы.
Пункт 10
Способ по пункту 9, где осадок, собранный после нагревания, представляет собой преципитат, полученный центрифугированием при 5000 об/мин, 4°C, в течение 20 минут.
Пункт 11
Способ увеличения эффективности экстракции протеогликана из хряща рыбы, включающий в себя стадию нагревания небольших частей замороженного хряща рыбы в воде.
ПРЕИМУЩЕСТВЕННЫЕ ЭФФЕКТЫ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0009] Способ экстракции протеогликана по настоящему изобретению позволяет простую экстракцию протеогликана из хряща рыбы с очень высокой эффективностью. В частности, способ экстракции протеогликана по настоящему изобретению позволяет экстракцию высокомолекулярного протеогликана. Кроме того, поскольку в способе экстракции по настоящему изобретению экстракцию проводят с использованием только воды, способ обеспечивает безопасность экстракции и безопасность полученного продукта протеогликана по сравнению с известными до настоящего времени способами экстракции с использованием органических растворителей или кислот/щелочей. Более того, стадия удаления органических растворителей обычно является трудоемкой, но эта стадия не является необходимой в способе экстракции по настоящему изобретению.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0010] Фиг.1a представляет собой фотографию блока замороженного носового хряща лосося, помещенного в поднос.
Фиг.1b представляет собой фотографию небольших частей замороженного носового хряща лосося, помещенных в пластиковый пакет.
Фиг.1c представляет собой фотографию обезжиренного порошка носового хряща лосося, помещенного в пластиковый пакет.
Фиг.2 представляет собой график, показывающий изменение выхода протеогликана с течением времени, когда воду добавляли к небольшим частям замороженного носового хряща лосося и экстракцию проводили при 100°C.
Фиг.3 представляет собой график, показывающий сравнение выходов уроновой кислоты (обозначенной как «GlcA», сокращение для глюкуроновой кислоты) и выходов белка (обозначенного как «Белок»), когда протеогликан экстрагируют из обезжиренного порошка носового хряща лосося («Порошок»), блоков замороженного носового хряща лосося («Блоки»), небольших частей замороженного носового хряща лосося («Небольшие части»). Выходы GlcA и белка представлены в отношении количеств, экстрагированных на 100 г блоков замороженного носового хряща лосося. Количество уроновой кислоты отражает количество протеогликана.
Фиг.4 представляет собой хроматограмму, вычерченную на основании значений измерений, полученных посредством разделения собранного содержащего протеогликан супернатанта, экстрагированного из небольших частей замороженного носового хряща лосося посредством гель-фильтрационной хроматографии, и измерения количества уроновой кислоты (GlcA) в каждой фракции и оптической плотности при 280 нм каждой фракции.
Фиг.5 представляет собой хроматограмму, вычерченную на основании значений измерений, полученных посредством разделения собранного содержащего протеогликан супернатанта, экстрагированного из небольших частей замороженного носового хряща лосося посредством анионообменной хроматографии, и измерения количества уроновой кислоты (GlcA) в каждой фракции и оптической плотности при 280 нм каждой фракции.
ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
[0011] Настоящее изобретение более подробно описано ниже. Термин «масса» в этом описании является эквивалентным «весу».
[0012] Способ экстракции протеогликана по настоящему изобретению представляет собой способ экстракции протеогликана из хряща рыбы. Способ включает в себя стадию (A) нагревания небольших частей замороженного хряща рыбы в воде.
[0013] Хрящ рыбы представляет собой хрящ, полученный из рыбы, предпочтительно из Oncorhynchus (Salmonidae). Примеры рыбы включают в себя форель (горбушу, симу, амаго и т.д.), лосося (кету, нерку, кижуча, чавычу, стальноголового лосося и т.д.), акулу и треску. Лосось и форель являются особенно предпочтительными. Хрящ, подлежащий использованию, не является конкретно ограниченным; однако, головной хрящ, в частности носовой хрящ, является предпочтительным. Более того, поскольку головы рыбы обычно выбрасывают при переработке рыбы в пищевые продукты, стоимость голов рыбы является низкой, и большое количество голов рыбы можно поставлять стабильно.
[0014] Небольшие замороженные части хряща рыбы можно получать либо (i) замораживанием хряща рыбы и затем измельчением его на небольшие части либо (ii) измельчением хряща рыбы на небольшие части и затем их замораживанием. Возможно также использование (iii) собственно замороженного хряща рыбы. Небольшие замороженные части хряща рыбы, полученные способом (i), являются особенно предпочтительными по настоящему изобретению. Настоящее изобретение относится также к способу экстракции протеогликана, дополнительно включающему в себя, до стадии (A), стадии (α) замораживания хряща рыбы и/или (β) измельчения хряща рыбы на небольшие части.
[0015] Способ замораживания не является конкретно ограниченным, и можно использовать любой известный способ замораживания. Например, можно использовать способ хранения хряща рыбы в морозильнике при приблизительно -20 - -80°C в течение приблизительно 24-72 часов.
[0016] Измельчение можно проводить с использованием известного способа. Например, измельчение хряща рыбы (предпочтительно замороженного хряща рыбы) в порошок можно проводить с использованием известных устройств, таких как блендер или мельница. Измельчение предпочтительно проводят при низкой температуре (например, не более 4°C).
[0017] Каждая небольшая часть замороженного хряща рыбы предпочтительно составляет приблизительно 0,001-0,5 г, более предпочтительно приблизительно 0,005-0,3 г, более предпочтительно приблизительно 0,001-0,1 г. Измельчение хряща рыбы на небольшие части предпочтительно проводят способом, позволяющим получение таких небольших частей замороженного хряща рыбы. Кроме того, если небольшие части замороженного хряща рыбы, обладающие массой в вышеуказанном диапазоне, получают после замораживания хряща рыбы, не является необходимым для проведения измельчения. Хотя это не является конкретно ограниченным, небольшие части замороженного хряща рыбы, обладающие массой в вышеуказанном диапазоне, предпочтительно составляют не менее 50% масс., более предпочтительно не менее 70% масс., более предпочтительно не менее 90% масс. среди всех небольших частей замороженного хряща рыбы, подвергаемых нагреванию. Это соотношение находят, случайно выбирая 20 частей из всех небольших частей замороженного хряща рыбы, подвергаемых нагреванию, измеряя массу каждой из 20 небольших частей и вычисляя долю (%) частей, обладающих массой в вышеуказанном диапазоне, в 20 небольших частях. «Все небольшие части» в настоящем документе относится к группе небольших частей, т.е. к выборке, состоящей из множества небольших частей.
[0018] Хотя это не является конкретно ограниченным им, предпочтительно используют обезжиренный хрящ рыбы. С использованием обезжиренного хряща рыбы можно получать высокоочищенный содержащий протеогликан экстракт хряща рыбы, содержащий меньше липида. Обезжиривание можно проводить с использованием известного способа. Например, можно осуществлять способ обработки хряща рыбы под водой (например, водопроводной водой) в течение приблизительно 1-24 часов. Получение хряща рыбы можно проводить с использованием известного способа, включая способ погружения тканей рыбы (предпочтительно, голов рыбы) в воду приблизительно на 1-24 часа, чтобы заставить ткани набухнуть, и удаления тканей, отличных от хряща (предпочтительно, назального хряща), и способ оттаивания замороженной головы лосося, затем немедленного отделения носового хряща и обработки носового хряща под водой в течение приблизительно 1-24 часов, таким образом промывая и обезжиривая хрящ. Если хрящ имеет остатки мяса, является предпочтительным удалять мясо с помощью пинцета или т.п.
4
4
4
4
4
4
4
4
[0019] Протеогликан, экстрагированный способом экстракции протеогликана по настоящему изобретению, содержит высокомолекулярный протеогликан. Авторы настоящего изобретения предполагают, что эффект лечения и предотвращения воспалительных заболеваний кишечника протеогликаном увеличивается с увеличением молекулярной массы протеогликана. Таким образом, настоящее изобретение, позволяющее получение высокомолекулярного протеогликана, является преимущественным также и в этом отношении. Термин «высокомолекулярный протеогликан», применяемый в настоящем документе, конкретно относится к протеогликану, обладающему молекулярной массой не менее 900000 (90×10), предпочтительно не менее 1000000 (100×10), более предпочтительно не менее 1200000 (120×10). Считают, что по настоящему изобретению можно получать протеогликан, обладающий молекулярной массой не менее 2500000 (250×10) или даже 5000000 (500×10). Предпочтительный высокомолекулярный протеогликан определяют, подвергая содержащий протеогликан экстракт, полученный способом экстракции протеогликана по настоящему изобретению, гель-фильтрационной хроматографии в следующих условиях, определяя количество уроновой кислоты (отражающее количество протеогликана) в каждой фракции с использованием способа с карбазолом-серной кислотой, получая хроматограмму на основании определенных количеств уроновой кислоты и подтверждая, что пик на хроматограмме является равным или большим, чем вышеуказанный диапазон молекулярной массы (не менее 900000 (90×10), предпочтительно не менее 1000000 (100×10), более предпочтительно не менее 1200000 (120×10)). Такую хроматограмму на основании количества уроновой кислоты можно далее в настоящем документе обозначать как «хроматограмма количества уроновой кислоты в протеогликане». Кроме того, является возможным также получать хроматограмму (отражающую количество белка) на основании поглощения, посредством измерения оптической плотности фракций при 280 нм и нахождения затем относительных значений количества белка на основании результатов измерения (т.е. под значениями измерения принимают значения, отражающие количества белка). Далее в настоящем документе такую хроматограмму можно обозначать как «хроматограмма количества белка в протеогликане».
[0020] Гель-фильтрационная хроматография
Колонка: Набитая сефарозой CL-4B колонка (колонка диаметром 1 см × 38,5 см, набитая сефарозой CL-4B в качестве носителя. Сефароза CL-4B является доступной, например, из GE Healthcare и других компаний. Сефароза CL-4B, регистрационный № CAS 61970-08-9, представляет собой 4% перекрестно сшитую агарозу с размером частиц 40-165 мкм (измеренным способом лазерной дифракции рассеяния)).
Буфер: 0,1 M фосфатный буфер (pH 7,0, содержащий 0,2 M NaCl)
Количество фракции: 1 мл/пробирку
[0021] Аналитическая кривая молекулярной массы: Аналитическую кривую для использования получают подверганием различных маркеров молекулярной массы декстрана, описанных ниже, гель-фильтрационной хроматографии в тех же самых условиях, как описано выше, и измерением оптической плотности (отражающей количество декстрана) каждой фракции посредством способа с фенолом-серной кислотой, который является хорошо известным способом детекции цепей сахаров.
[0022] Маркеры молекулярной массы декстрана
Стандарт декстрана 1400000 (Sigma)... 1400 кДа
Стандарт декстрана 670000 (Sigma)... 670 кДа
Стандарт декстрана 410000 (Sigma)... 410 кДа
Стандарт декстрана 270000 (Sigma)... 270 кДа
Количественное определение декстрана (измерение оптической плотности) проводят следующим образом, согласно способу, описанному в Hodge, J. E., and Hofreiter, B. T., Method in Carbohydrate Chemistry, 1, 338 (1962).
[1] 500 мкл водного раствора образца или водного раствора стандартного моносахарида (маннозы) помещают в пробирку 105×15 мм.
[2] К этому добавляют 500 мкл фенольного реагента (5 об./об.% водного раствора фенола) и смесь перемешивают.
[3] К этому добавляют 2,5 мл концентрированной серной кислоты и смесь немедленно интенсивно перемешивают в течение 10 секунд.
[4] Смесь оставляют стоять в течение 20 минут или более при комнатной температуре.
[5] Оптическую плотность при 490 нм измеряют с помощью спектрофотометра.
[0023] Способ с карбазолом-серной кислотой обозначает хорошо известный способ, осуществляемый посредством добавления раствора карбазола, который является окрашенным компонентом уроновой кислоты (глюкуроновой кислоты (Glc A), идуроновой кислоты и т.д.), к измеряемому образцу и измерения оптической плотности с использованием спектрофотометра. Аналитическую кривую вычерчивают с использованием стандартного раствора глюкуроновой кислоты, обладающего конкретной концентрацией, таким образом, находя содержание глюкуроновой кислоты в образце. Более конкретно, способ с карбазолом-серной кислотой осуществляли следующим образом. 2,5 мл реагента, полученного растворением 0,95 г декагидрата бората натрия в 100 мл концентрированной серной кислоты, помещают в пробирку и охлаждают во льду. 0,5 мл тестируемого объекта (предпочтительно, содержащего 2-20 мкг уроновой кислоты) осторожно наслаивают на него. Смесь хорошо перемешивают при охлаждении во льду, таким образом, поддерживая ее при комнатной температуре или ниже. Затем пробирку накрывают стеклянным шариком, пробирку нагревают в кипящей водяной бане в течение 10 минут с последующим охлаждением водой для снижения температуры до комнатной температуры. Затем к этому добавляют 0,1 мл реагента, полученного растворением 125 мг карбазола в 100 мл безводного метилового спирта, и перемешивают, и смесь нагревают в кипящей водяной бане в течение 15 минут. Затем смесь охлаждают водой до комнатной температуры и измеряют оптическую плотность при 530 нм. В нулевом тесте используют 0,5 мл дистиллированной воды. Одновременно вычерчивают аналитическую кривую с использованием глюкуроновой кислоты.
[0024] Нагревание на стадии (A) проводят до такой степени, при которой обеспечивают эффект по настоящему изобретению. Хотя условия нагревания не являются ограниченными в такой степени, в какой получают эффект по настоящему изобретению, пример условий нагревания является следующим. Хотя это зависит от температуры нагревания, время нагревания предпочтительно составляет более 3 часов, более предпочтительно не менее 3,5 часов, более предпочтительно не менее 4 часов. Хотя это зависит от времени нагревания, температура воды, используемой для нагревания, предпочтительно составляет не менее 80°C, более предпочтительно не менее 90°C, более предпочтительно температуру кипения (100°C или более под давлением 1 атмосфера).
[0025] Кроме того, хотя количество небольших частей замороженного хряща рыбы, подлежащих подверганию нагреванию, и количество воды можно определять подходящим образом, является предпочтительным погружать все небольшие части в воду. Конкретно, соотношение всех небольших частей к воде (все небольшие части:вода) предпочтительно составляет приблизительно 1:1-1:10.
[0026] Когда небольшие части замороженного хряща рыбы погружают в воду, небольшие части хряща рыбы набухают, поскольку вода проникает в части. Кроме того, в ходе нагревания небольшие набухшие части хряща рыбы постепенно размягчаются и деформируются, и, наконец, становятся густой жидкостью, частично растворенной в воде. Таким образом, подходящий уровень нагревания можно определять в соответствии с массой небольших набухших частей хряща рыбы после нагревания (т.е. осадка, оставшегося после нагревания). Более конкретно, по настоящему изобретению, является предпочтительным проводить нагревание пока масса всех небольших набухших частей хряща рыбы (т.е. осадка), полученная в результате нагревания, не упадет ниже общей массы небольших частей замороженного хряща рыбы, подвергаемого нагреванию; более предпочтительно нагревание проводят пока масса всех небольших набухших частей хряща рыбы (т.е. осадка), полученная в результате нагревания, не упадет до 70% или менее, более предпочтительно 50% масс. или менее, от общей массы небольших частей замороженного хряща рыбы, использованных для нагревания.
[0027] Выражение «все небольшие набухшие части хряща рыбы» (т.е. осадок) в настоящем документе относится к преципитату, полученному 20-минутным центрифугированием при 5000 об/мин и 4°C (преципитат, полученный удалением раствора после центрифугирования).
[0028] Жидкая часть (вода) продукта, полученного после стадии (A), содержит большое количество протеогликана. Таким образом, посредством сбора жидкой части является возможным получение содержащего протеогликан экстракта. Сбор жидкой части проводят удалением супернатанта посредством, например, обработки центрифугированием (предпочтительно, центрифугированием в вышеуказанных условиях). Жидкость (супернатант) можно использовать как есть или ее можно очищать известным способом. Возможно также концентрировать жидкость дистилляцией, лиофилизацией или т.п. Возможно также получать порошок из жидкости способом лиофилизации или способом сушки распылением. Можно также осуществлять другие способы, в той степени, в какой эффекты настоящего изобретения не нарушаются. Полученный таким образом протеогликан можно использовать, например, как материалы для пищевых продуктов, косметики, медицинских продуктов и т.п.
[0029] Использование протеогликана, полученного способом по настоящему изобретению, не является ограниченным; однако, поскольку протеогликан обеспечивает вышеупомянутые эффекты, протеогликан по настоящему изобретению является пригодным для композиций для наружного применения или для пероральных композиций. Более конкретно, предпочтительным использованием является композиция для наружного применения или пероральная композиция, содержащая протеогликан, полученный способом по настоящему изобретению. Содержащий протеогликан экстракт можно использовать непосредственно в качестве композиции для наружного применения или в качестве пероральной композиции. Композицию наружного применения или пероральную композицию можно использовать, например, в качестве медицинской композиции, лечебно-профилактической композиции, косметической композиции или пищевой композиции. Их можно получать общепринятым способом с использованием протеогликана, полученного способом по настоящему изобретению. Они являются особенно пригодными для продуктов в промышленности для гигиены полости рта, в косметической промышленности, в пищевой промышленности и в производстве напитков.
[0030] Пероральные композиции, содержащие экстракт, содержащий протеогликан, полученный способом по настоящему изобретению (которые можно далее в настоящем документе обозначать как пероральные композиции по настоящему изобретению), используемые в промышленности для гигиены полости рта, могут представлять собой собственно содержащий протеогликан экстракт или композицию, полученную соответствующей комбинацией содержащего протеогликан экстракта с другими компонентами (например, абразивами, пенообразователями, очистителями, поверхностно-активными веществами, увлажняющими средствами, средствами для доведения pH, загустителями, ароматизаторами и т.п.), обычно используемыми для пероральных композиций. Примеры продуктов - пероральных композиций включают в себя средства для пасты, мази, гели, растирания, спреи, добавки, жидкости, ополаскиватели рта, пасту, жевательную резинку, лепешки и таблетки, которые можно изготавливать общепринятыми способами.
[0031] Такие пероральные композиции по настоящему изобретению можно предпочтительно использовать для облегчения воспаления в тканях ротовой полости или для предотвращения старения тканей ротовой полости. Более конкретно, пероральные композиции по настоящему изобретению включают в себя облегчающую воспаление пероральную композицию и антивозрастную пероральную композицию.
[0032] Косметическая композиция (которую можно далее в настоящем документе обозначать как «косметическая композиция по настоящему изобретению»), содержащая экстракт, содержащий протеогликан, полученный способом по настоящему изобретению, может представлять собой собственно содержащий протеогликан экстракт по настоящему изобретению или композицию, полученную соответствующей комбинацией содержащего протеогликан экстракта с косметически приемлемыми средой, основами, носителями, добавками или другими косметически приемлемыми компонентами или материалами с использованием общепринятого способа. Более конкретно, косметические композиции, полученные посредством включения содержащего протеогликан экстракта по настоящему изобретению, включают в себя эмульсии, лосьоны, кремы, сыворотки, основы под макияж, маски для лица и солнцезащитные средства. Такую косметическую композицию по настоящему изобретению можно предпочтительно использовать для облегчения воспаления или для предотвращения старения. Примеры предпочтительных применений включают в себя композиции для защиты от солнца, лечения солнечных ожогов, увлажнения и предотвращения старения кожи (например, предотвращения или облегчения сухости кожи, огрубения кожи, морщин на лице или обвисания кожи).
[0033] Композиции пищевых продуктов и напитков (пищевые продукты и напитки), содержащие экстракт, содержащий протеогликан, полученный способом по настоящему изобретению (которые можно далее в настоящем документе обозначать как композиции пищевых продуктов и напитков по настоящему изобретению), используемые в пищевой промышленности, могут представлять собой собственно содержащий протеогликан экстракт или композицию, полученную соответствующей комбинацией содержащего протеогликан экстракта с основами, носителями или добавками, которые являются приемлемыми в отношении гигиены питания, или другими компонентами или материалами, используемыми для пищевых продуктов и напитков. Их примеры включают в себя приготовленные пищевые продукты и напитки, содержащие экстракт, содержащий протеогликан, с заявленными эффектами увлажнения и предотвращения старения (например, предотвращения или облегчения сухости кожи, огрубения кожи, морщин на лице или обвисания кожи), продукты здорового питания (пищевые продукты с заявленными функциями пищевых добавок, пищевые продукты для конкретных применений в здравоохранении и т.д.), диетические добавки, пищевые продукты для улучшения внешности и пищевые продукты для пациентов. Более того, настоящее изобретение относится также к увлажнителям и средствам, предотвращающим старение кожи, сформированным из вышеупомянутых композиций пищевых продуктов и напитков по настоящему изобретению. Увлажнители и средства, предотвращающие старение кожи, можно поставлять в форме напитков, пилюль, таблеток, капсул, гранул, желе, лепешек или т.п. для косметических или предотвращающих старение кожи целей (например, предотвращения или облегчения сухости кожи, огрубения кожи, морщин на лице или обвисания кожи).
[0034] Количество содержащего протеогликан экстракта, содержащееся в пероральных композициях, косметических композициях или композициях пищевых продуктов или напитков по настоящему изобретению, составляет, например, но без ограничения, как правило, 0,001-100% масс., предпочтительно 0,01-95% масс., на основании всей композиции.
4
4
4
[0035] Содержащий протеогликан экстракт, полученный способом экстракции протеогликана по настоящему изобретению, содержит протеогликан, экстрагированный с высокой эффективностью. Более конкретно, на основании количества уроновой кислоты (т.е. на основании количества уроновой кислоты, найденного способом с карбазолом-серной кислотой), не менее 60% масс., предпочтительно не менее 70% масс., более предпочтительно не менее 80% масс., более предпочтительно не менее 90% масс. протеогликана, содержащегося в небольших частях замороженного хряща рыбы, используемых для экстракции, можно экстрагировать способом по настоящему изобретению. Кроме того, как описано выше, протеогликан, полученный способом экстракции протеогликана по настоящему изобретению, представляет собой высокомолекулярный протеогликан. Более конкретно, содержащий протеогликан экстракт, полученный способом экстракции протеогликана по настоящему изобретению, предпочтительно содержит протеогликан, обладающий молекулярной массой не менее 900000 (90×10) (более предпочтительно молекулярной массой не менее 1000000 (100×10), более предпочтительно молекулярной массой не менее 1200000 (120×10)). Протеогликан, обладающий молекулярной массой не менее вышеуказанного диапазона, составляет предпочтительно не менее 60% масс., более предпочтительно не менее 70% масс., более предпочтительно не менее 80% масс., еще более предпочтительно не менее 90% масс. всего экстрагированного протеогликана. Долю можно найти из площади пика на вышеупомянутой хроматограмме количества уроновой кислоты в протеогликане посредством вычисления площади для протеогликана, обладающего молекулярной массой не менее вышеуказанного диапазона. Более конкретно, долю можно найти посредством вычисления доли площади для протеогликана, обладающего молекулярной массой не менее вышеуказанного диапазона, на основании площади всего пика на хроматограмме количества уроновой кислоты в протеогликане.
[0036] Кроме того, настоящее изобретение относится также к способу увеличения эффективности экстракции протеогликана из хряща рыбы, включающему в себя стадию нагревания небольших частей замороженного хряща рыбы в воде. По этому способу получение небольших частей замороженного хряща рыбы, нагревание, измерение эффективности экстракции протеогликана и т.п. можно проводить с использованием вышеупомянутых способов и условий.
[0037] В соответствии со способами, описанными выше, настоящее изобретение позволяет простую экстракцию протеогликана из хряща рыбы с очень высокой эффективностью, так же как увеличение эффективности экстракции протеогликана из хряща рыбы. В частности, способ по настоящему изобретению позволяет экстракцию высокомолекулярного протеогликана. Хотя ограничительное толкование нежелательно, настоящее изобретение является успешным для такой высокоэффективной экстракции протеогликана (в частности, высокомолекулярного протеогликана) не только посредством использования небольших частей хряща рыбы, но также посредством измельчения замороженного хряща рыбы на небольшие части. Более конкретно, считают, что по этому способу функция ферментов (в частности, ферментов для разрушения протеогликана), содержащихся в ткани кости, является супрессированной, и считают, что процесс нагревания дополнительно инактивирует фермент. С этой точки зрения, дополнительно заключают, что с хрящом рыбы предпочтительно проводят манипуляции при низкой температуре, и что воду, используемую для экстракции, предпочтительно нагревать до высокой температуры на время добавления небольших частей замороженного хряща рыбы.
ПРИМЕРЫ
[0038] Настоящее изобретение ниже описано более подробно. Однако объем изобретения не является ограниченным этими примерами.
Анализ экстракции протеогликана из носового хряща лосося
Образцы, используемые для экстракции
Следующие три типа ((1)-(3)) образцов, полученных из носового хряща лосося, использовали для анализа экстракции протеогликана. Носовой хрящ лосося, используемый для анализа, получали отделением носового хряща непосредственно после оттаивания замороженной головы лосося, промывкой и обезжириванием носового хряща посредством обработки его под водой в течение 6 часов, удаления частей мяса и т.п. с помощью пинцета и промывки носового хряща водой вручную.
(1) Замороженные блоки носового хряща лосося
Носовой хрящ лосося хранили и замораживали в морозильнике, и замороженный носовой хрящ использовали в виде блоков замороженного носового хряща лосося. Блок замороженного носового хряща лосося обладал размером от приблизительно 2,5×1,5 см до приблизительно 4,5×2 см и массой от приблизительно 1,71 г до приблизительно 6,91 г (средняя масса 7 блоков составляла 3,701 г.), хотя размер и масса зависели от размера использованной головы лосося. На Фиг.1a показана фотография блока замороженного носового хряща лосося.
(2) Небольшие части замороженного носового хряща лосося
Замороженные блоки носового хряща лосося из пункта (1) выше помещали в блендер и разрушали в течение 10 секунд для получения небольших частей замороженного носового хряща лосося. На Фиг.1b показана фотография небольших частей замороженного носового хряща лосося. Случайно собирали двадцать частей и анализировали размер и массу каждой части. Каждая часть обладала размером от приблизительно 0,2 см до приблизительно 0,7 см и массой от приблизительно 0,0116 г до приблизительно 0,0890 г (средняя масса 20 частей составляла 0,033 г.) Из 100 г блоков замороженного носового хряща лосося получали 95,6 г небольших частей замороженного носового хряща лосося.
(3) Обезжиренный порошок носового хряща лосося
Порошок композиции протеогликана получали с использованием замороженного носового хряща лосося из пункта (1) выше способом, описанным в примере 1 из Патентного документа 1 (JP2009-173702A). Этот порошок использовали в качестве обезжиренного порошка носового хряща лосося. Из 100 г блоков замороженного носового хряща лосося получали 5,83 г обезжиренного порошка носового хряща лосося. На Фиг.1c показана фотография обезжиренного порошка носового хряща лосося.
[0039] Следующее представляет собой цитату из описания примера 1 из Патентного документа 1.
«Замороженный носовой хрящ лосося (100 г) разрушали и равный объем водопроводной воды при 15°C добавляли к разрушенному носовому хряща лосося. Смесь осторожно перемешивали для полного смешивания и смесь, которую поддерживали при приблизительно 5°C, немедленно центрифугировали с помощью центробежного сепаратора при 9000 об/мин при 4°C в течение 30 минут для разделения липидов и других компонентов, включающих протеогликан. После центрифугирования получали три слоя. Липидный слой в верхнем слое и водный слой в среднем слое удаляли и преципитат собирали. Преципитат лиофилизировали и затем измельчали с помощью центробежной мельницы для получения обезжиренного водой тонкого порошка. На этой стадии часть тонкого порошка подвергали эфирной экстракции для измерения количества липида и обнаружили, что 8,8% осталось, что процент удаления составлял 75,0%, когда липид перед обезжириванием определяли как 100%, и что липид обладал слабым гнилостным запахом. Затем 10-кратный объем этанола добавляли к обезжиренному водой тонкому порошку для растворения и экстракции липида с гнилостным запахом. Эту операцию повторяли дважды. Раствор в этаноле отфильтровывали и растворитель выпаривали до получения бледного желто-коричневого порошка композиции протеогликана без запаха. Выход относительно носового хряща лосося составлял 58,7% (на основании сухого вещества), и содержание протеогликана составляло 77,7%. Гнилостный запах порошка композиции протеогликана полностью исчез».
«Замороженный носовой хрящ лосося» из примера 1 из Патентного документа 1 соответствует «блокам замороженного носового хряща лосося», описанным выше. Термин «на основании сухого вещества» обозначает на основе массы сухого вещества.
[0040] Анализ экстракции протеогликана с использованием небольших частей замороженного носового хряща лосося
Пытались проводить экстракцию протеогликана посредством добавления воды к небольшим частям замороженного носового хряща лосося, полученным, как описано выше в пункте (2), и нагревания смеси при 100°C. Более конкретно, анализ проводили следующим образом. Получали четыре образца. Каждый образец получали добавлением 60 мл дистиллированной воды к приблизительно 12 г небольших частей замороженного носового хряща лосося. Эти четыре образца нагревали при 100°C в течение 1 часа, 2 часов, 3 часов и 4 часов, соответственно, и каждый образец центрифугировали с помощью центробежного сепаратора при 5000 об/мин при 4°C в течение 20 минут для удаления нерастворимого вещества (осадка) и сбора супернатанта. После измерения количества собранного супернатанта количество протеогликана в супернатанте измеряли как эквивалент уроновой кислоты способом с карбазолом-серной кислотой (в таблицах и фигурах уроновая кислота представлена термином «GlcA», аббревиатурой для глюкуроновой кислоты.) Кроме того, количество белка в собранном супернатанте измеряли способом Бредфорд. Результаты показаны в таблице 1. На Фиг.2 присутствует графическое представление таблицы 1.
[0041]
Таблица 1
Время нагревания (количество небольших частей (г))
Количество жидкости (мл)
На грамм небольших частей замороженного носового хряща лосося
GlcA/белок
Количество (г) и состояние осадка
GlcA (мг)
Белок (мг)
1 час(12,261 г)
31,0
4,507
0,441
10,22
33,83Немного мягкий
2 часа(12,322 г)
40,0
8,069
0,883
9,14
28,49Желеобразное состояние; форма легко разрушается при нажатии пальцем
3 часа(12,599 г)
45,5
8,636
1,039
8,31
21,79Почти теряет свою форму
4 часа(12,405 г)
61,5
15,592
3,401
4,58
5,56Бесформенный, кашицеобразный; небольшое количество
[0042] Из таблицы 1 и Фиг.2 обнаружено, что время экстракции протеогликана увеличивается с увеличением времени нагревания. Обнаружено также, что нагревание в течение более 3 часов (например, 4 часов), в частности, значительно увеличивает уровень экстракции протеогликана.
[0043] Сравнение небольших частей замороженного носового хряща лосося, блоков замороженного носового хряща лосося и обезжиренного порошка носового хряща лосося
Протеогликан экстрагировали также из блоков замороженного носового хряща лосося из пункта (1) и из обезжиренного порошка носового хряща лосося из пункта (3) в тех же самых условиях, как для небольших частей замороженного носового хряща лосося из пункта (2) выше, и сравнивали количества, экстрагированные из них. Результаты показаны в таблице 2. В таблице 2 количество экстрагированного протеогликана и количество экстрагированного белка представлены в отношении количеств на 100 г блоков замороженного носового хряща лосося. Фиг.3 представляет собой графическое представление таблицы 2. Описания образцов (1-9), показанных на Фиг.3, соответствуют описаниям в колонке № графика в таблице 2.
[0044] Таблица 2
Количества, экстрагированные на 100 г блоков замороженного носового хряща лосося (обезжиренного порошка носового хряща лосося: 5,83 г, небольших частей замороженного носового хряща лосося: 95,6 г)
Таблица 2
№ графика
Температура нагревания
Время нагревания
GlcA (мг)
Белок (мг)
GlcA/белок
Обезжиренный порошок носового хряща лосося
1
4°C
2 часа
186,68
45,88
4,07
2
100°C
2 часа
581,43
136,25
4,27
3
100°C
4 часа
733,15
215,30
3,41
Блоки замороженного носового хряща лосося
4
4°C
2 часа
96,90
-
-
5
100°C
2 часа
499,90
96,90
5,16
6
100°C
4 часа
832,10
234,85
3,54
Небольшие части замороженного носового хряща лосося
7
4°C
2 часа
150,67
18,55
8,12
8
100°C
2 часа
771,40
84,41
9,14
9
100°C
4 часа
1490,60
325,14
4,58
[0045] Из таблицы 2 и Фиг.3 обнаружено, что количество экстрагированной глюкуроновой кислоты (отражающее количество протеогликана) значительно увеличивалось, когда небольшие части замороженного носового хряща лосося нагревали при 100°C в воде в течение 4 часов. В частности, учитывая тот факт, что количество уроновой кислоты (отражающее количество протеогликана), содержащееся на 100 г носового хряща лосося, составляло приблизительно 1,6 г (значение определяли с использованием способа с карбазолом-серной кислотой посредством разрушения носового хряща после лиофилизации и посредством проведения экстракции с помощью 4 M гидрохлорида гуанидина/50 мМ ацетатного буфера), количество уроновой кислоты, экстрагированной при 100°C в течение 4 часов из блоков замороженного носового хряща лосося, составляло 832 мг (процент экстракции: 52%), где количество уроновой кислоты, экстрагированной при 100°C в течение 4 часов из небольших частей замороженного носового хряща лосося, составляло 1490,6 мг, и процент ее экстракции составлял 93,2%. Способ экстракции протеогликанов с такой высокой эффективностью экстракции не был известен. Можно сказать, что настоящее изобретение сделало возможной такую высокую эффективность экстракции в первый раз. Следует отметить, что поскольку 5,83 г обезжиренного порошка носового хряща лосося получали из 100 г блоков замороженного носового хряща лосося, количество уроновой кислоты, полученное, когда обезжиренный порошок носового хряща лосося подвергали экстракции при 100°C в течение 4 часов, составляло 733 мг в отношении количества на 100 г носового хряща, и процент ее экстракции составлял 45,8%.
[0046] Анализ молекулярной массы протеогликана
Протеогликан, выделенный, как описано выше, анализировали по молекулярной массе. Более конкретно, анализ проводили следующим образом. Собранный супернатант, полученный в «Анализе экстракции протеогликана с использованием небольших частей замороженного носового хряща лосося», описанном выше, содержащий протеогликан, экстрагированный из небольших частей замороженного носового хряща лосося из пункта (2), разделяли на фракции посредством гель-фильтрационной хроматографии в следующих условиях. Количество уроновой кислоты (отражающее количество протеогликана), содержащееся в каждой фракции, определяли количественно способом с карбазолом-серной кислотой. Кроме того, измеряли оптическую плотность каждой фракции при 280 нм и поглощение определяли как значение, отражающее количество содержащегося в ней белка. На основании этих результатов вычерчивали хроматограмму количества уроновой кислоты в протеогликане и вычерчивали хроматограмму количества белка в протеогликане. Результаты показаны на Фиг.4.
[0047] Гель-фильтрационная хроматография
Колонка: Набитая сефарозой CL-4B колонка (колонка диаметром 1 см × 38,5 см, набитая сефарозой CL-4B в качестве носителя. Сефароза CL-4B является доступной, например, из GE Healthcare и других компаний. Сефароза CL-4B, регистрационный № CAS 61970-08-9, представляет собой 4% перекрестно сшитую агарозу с размером частиц 40-165 мкм (измеренным способом лазерной дифракции рассеяния)).
Буфер: 0,1 M фосфатный буфер (pH 7,0, содержащий 0,2 M NaCl)
Количество нанесенного образца: приблизительно 0,5 мл собранного супернатанта (количество уроновой кислоты: приблизительно 1 мг)
Скорость потока: приблизительно 0,15 мл/мин
Количество фракции: 1 мл/пробирку
Аналитическая кривая молекулярной массы: Аналитическую кривую получали подверганием различных маркеров молекулярной массы декстрана, описанных ниже, гель-фильтрационной хроматографии в тех же самых условиях, как описано выше (за исключением того, что количество нанесенного образца составляло 1 мг) и количественным определением количества сахарида (т.е. количества декстрана), содержащегося в каждой элюированной фракции, посредством способа с фенолом-серной кислотой.
[0048] Маркеры молекулярной массы декстрана
Стандарт декстрана 1400000 (Sigma)... 1400 кДа
Стандарт декстрана 670000 (Sigma)... 670 кДа
Стандарт декстрана 410000 (Sigma)... 410 кДа
Стандарт декстрана 270000 (Sigma)... 270 кДа
Проводили количественное определение декстрана, конкретно, следующим образом, согласно способу, описанному в Hodge, J. E., and Hofreiter, B. T., Method in Carbohydrate Chemistry, 1, 338 (1962).
[0049] [1] 500 мкл водного раствора образца или водного раствора стандартного моносахарида (маннозы) помещали в пробирку 105×15 мм.
[2] К этому добавляли 500 мкл фенольного реагента (5 об./об.% водного раствора фенола) и смесь перемешивали.
[3] К этому добавляли 2,5 мл концентрированной серной кислоты и смесь немедленно интенсивно перемешивали в течение 10 секунд.
[4] Смесь оставляли стоять в течение 20 минут или более при комнатной температуре.
[5] Оптическую плотность при 490 нм измеряли с помощью спектрофотометра.
4
4
4
[0050] Как показано на Фиг.4, пики для уроновой кислоты и белка наблюдали среди фракций № 10-25 (т.е. пики для уроновой кислоты и белка перекрываются). Из этих результатов подтвердили также, что эти фракции содержали протеогликан. Это происходит, поскольку считают, что протеогликан содержится во фракции, в которой детектируют как уроновую кислоту, так и белок, поскольку протеогликан обладает структурой, в которой ряд цепей сахара (содержащих большое количество уроновой кислоты как составляющей сахара) являются связанными с белком (коровым белком), который служит кором. Считали также, что из аналитической кривой молекулярной массы молекулярная масса компонента, содержащегося во фракции № 20, составляла приблизительно 900000 (90×10), и молекулярная масса компонента, содержащегося во фракции № 30, составляла приблизительно 150000 (15×10). Соответственно, обнаружили, что собранный супернатант, полученный из небольших частей замороженного носового хряща лосося, содержал высокомолекулярный протеогликан, обладающий молекулярной массой не менее приблизительно 900000 (90×10). На фигурах № фракции указан как «№ пробирки», и они являются синонимами.
[0051] Кроме того, собранный содержащий протеогликан супернатант, экстрагированный из небольших частей замороженного носового хряща лосося, разделяли на фракции анионообменной хроматографией в следующих условиях и хроматограмму количества уроновой кислоты в протеогликане и хроматограмму количества белка в протеогликане вычерчивали таким же способом, как описано выше. Обнаружено, что пик для уроновой кислоты и пик для белка перекрывались (Фиг.5, стрелка влево-вправо). Это предоставляет также доказательство того, что протеогликан содержался в собранном супернатанте.
[0052] Анионообменная хроматография
Колонка: Набитая DEAE Sephacel колонка (колонка диаметром 2,5 см × 10 см, набитая DEAE (диэтиламиноэтилом) Sephacel в качестве носителя. DEAE Sephacel является доступным, например, из GE Healthcare и других компаний.)
Буфер: 7 M мочевина/50 мМ Трис-HCl буфер (pH of 7,4) (Элюцию линейным градиентом проводили с помощью 0,1 M NaCl.)
Количество фракции: 10 мл/пробирку.