КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАКА С ИСТОЩАЮЩИМИ АРГИНИН И ИММУНООНКОЛОГИЧЕСКИМИ АГЕНТАМИ
COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATMENT OF CANCER WITH ARGININE-DEPLETING AND IMMUNE-ONCOLOGICAL AGENTS

Уровень техники изобретения
0
in vitro
[0001] В течение более 50 лет считалось, что некоторые опухолевые клетки имеют высокую потребность в аминокислотах, таких как L-аргинин, и погибают в условиях истощения L-аргинина (Wheatley and Campbell, 2002). В клетках человека L-аргинин синтезируется в три этапа; сначала L-цитруллин синтезируется из L-орнитина и карбамоилфосфата с помощью фермента орнитинтранскарбамилазы (ОТК), аргининосукцинатсинтетаза (АСС) превращает L-цитруллин и аспартат в аргининосукцинат, с последующим превращением аргининсукцината в L-аргинин и фумарат при помощи аргининосукцинатлиазы (АСЛ). Большое количество гепатоцеллюлярных карцином (ГЦК), меланом и почечно-клеточного рака (Ensor et al., 2002; Feun et al., 2007; Yoon et al., 2007) не экспрессируют АСС и, таким образом, являются чувствительными к истощению L-аргинина. Молекулярная основа отсутствия экспрессии АСС, по-видимому, разнообразна и включает в себя нарушение регуляции генов. В то время как незлокачественные клетки при истощении L-аргинина переходят в состояние покоя (G) и, таким образом, остаются жизнеспособными в течение нескольких недель, опухолевые клетки имеют дефекты клеточного цикла, которые приводят к повторной инициации синтеза ДНК, даже если синтез белка, в свою очередь, ингибируется, что приводит к серьезному дисбалансу и быстрой гибели клеток (Shen et al., 2006; Scott et al., 2000). Селективная токсичность истощения L-аргинина для ГЦК, меланомы и других раковых клеток с дефицитом АСС широко показана , на моделях ксенотрансплантатов на животных и в клинических испытаниях (Ensor et al., 2002; Feun et al., 2007; Shen et al., 2006; Izzo et al., 2004). Недавно Cheng et al. (2007) продемонстрировали, что многие клетки ГЦК также имеют дефицит экспрессии орнитинтранскарбамилазы и, следовательно, они также чувствительны к ферментативному истощению L-аргинина.
[0002] Существует интерес к применению гидролитических ферментов L-аргинина для лечения рака, особенно для лечения таких видов рака, как, например, гепатокарциномы, меланомы и почечно-клеточная карцинома, которые являются распространенными формами рака, связанными с высокой заболеваемостью. Для лечения рака применялись два фермента, разрушающих L-аргинин: бактериальная аргининдезиминаза и человеческие аргиназы. К сожалению, оба этих фермента обладают значительными недостатками, которые создают серьезные препятствия для их клинического применения (иммуногенность и низкая каталитическая активность при очень низкой стабильности в сыворотке крови, соответственно). Таким образом, терапевтический успех лечения, связанного с истощением L-аргинина, будет зависеть от устранения этих недостатков.
[0003] Другой проблемой при лечении многих видов рака является способность некоторых видов рака избегать распознавания иммунной системой. Например, некоторые опухоли, делают это через пути иммунных контрольных точек, которые являются ингибирующими путями в иммунной системе, которые поддерживают аутотолерантность путем модулирования иммунного ответа. Регулирование этих путей может нарушаться опухолями, что приводит к иммунной резистентности. Некоторые из этих путей, как агонисты простимулирующих рецепторов, так и антагонисты ингибирующих сигналов, оба из которых приводят к усилению антигенспецифичных Т-клеточных ответов, стали мишенями для иммунотерапии рака. Некоторые типичные рецепторы и лиганды включают в себя среди прочего антиген, ассоциированный с цитотоксическими T-лимфоцитами 4, (CTLA4), белок программируемой клеточной смерти 1 (PD1), лиганд белка программируемой клеточной смерти 1 (PDL1), ген активации лимфоцитов 3 (LAG3), B7-H3, B-7-H4 и белок клеточной мембраны Т-лимфоцитов 3 (TIM3) (Pardoll, 2012).
Сущность изобретения
[0004] В одном аспекте настоящее изобретение в целом относится к композициям и способам лечения рака ферментами, которые истощают L-аргинин в сыворотке крови. В некоторых вариантах осуществления изобретения рак представляет собой рак, который не экспрессирует или иным образом является дефицитным в отношении аргининосукцинатсинтетазы (АСС), орнитинтранскарбамилазы (ОТК) или аргининосукцинатлиазы (АСЛ).
2+
2+
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
cat
M
cat
M
cat
M
[0005] В некоторых аспектах настоящее изобретение также относится к применению белков аргиназы, в которых природный кофактор металла (Mn) заменен другим металлом. В конкретных вариантах осуществления изобретения белок аргиназы содержит аминокислотную последовательность аргиназы I человека или аминокислотную последовательность аргиназы II человека и неприродный кофактор металла. В некоторых вариантах осуществления изобретения металл представляет собой кобальт (Co). Белки аргиназы I и II человека в соответствии с настоящим изобретением имеют два сайта Mn (II); один или оба этих сайта могут быть замещены так, чтобы получить модифицированный белок аргиназы I или II с неприродным кофактором металла. В некоторых вариантах осуществления изобретения белок обладает k/K более 400 мМс при значении pH 7,4. В конкретном варианте осуществления изобретения 400 мМс до 4000 мМс при значении рН 7,4. В другом варианте осуществления изобретения белок обладает k/K от 400 мМс до 2500 мМс при значении рН 7,4 при температуре 37°C. В конкретном варианте осуществления настоящее изобретение относится к белку, содержащему аминокислотную последовательность аргиназы I или II человека и неприродный кофактор металла, где указанный белок обладает k/K более 400 мМс при температуре 37°C и значении pH 7,4.
[0006] В еще одном аспекте настоящее изобретение относится способам лечения рака или опухолей путем истощения аргинина в сочетании с иммунотерапевтическим лечением, направленным, например, на путь иммунной контрольной точки, например, истощение аргинина может быть достигнуто путем введения фермента аргиназа I или аргиназа II человека, включая сконструированные или дериватизированные ферменты аргиназы, а также аргиназы или других ферментов, истощающих аргинин, из других видов, которые обладают, по меньшей мере, аддитивным или синергетическим действием при введении с иммунной терапией, направленной на иммунную контрольную точку.
[0007] Таким образом, настоящее изобретение может быть описано в некоторых вариантах осуществления как способ ингибирования роста опухоли у субъекта, включающий в себя введение фармацевтической композиции, содержащей терапевтическое количество фермента аргиназа I человека, в качестве кофактора содержащего кобальт, и иммуноонкологический агент. Опухоль может быть различных типов, которые отвечают на терапию, направленную на истощение аргинина, и в некоторых вариантах осуществления изобретения она представляет собой ауксотрофную в отношении аргинина опухоль или включает в себя аргининзависимые или ауксотрофные клетки. В некоторых вариантах осуществления изобретения ауксотрофные клетки обладают пониженной или ингибированной экспрессией одного или нескольких ферментов из АСС, ОТК, АСЛ или их комбинации, что делает необходимым, чтобы опухолевая клетка использовала аргинин из сыворотки крови.
[0008] В некоторых вариантах осуществления изобретения аргиназа I человека или другой фермент стабилизируется путем ассоциации со стабилизирующим агентом для увеличения времени полужизни фермента в сыворотке крови пациента. Используемый здесь термин «ассоциация» может включать в себя любой из нескольких типов ассоциации, включая без ограничений ковалентные или нековалентные связи, и также может включать в себя получение слитого белка путем экспрессии из генно-инженерной конструкции нуклеиновой кислоты, путем образования водородной связи или гидрофобного взаимодействия, а также других типов связей, известных специалистам в данной области техники. Стабилизирующие агенты для применения в раскрытых способах могут включать в себя без ограничений, полиэтиленгликоль, что часто именуется как пегилирование, конъюгирование с одним или несколькими однородными синтетическими белковыми полимерами, что именуется как экстенилирование, и эти полимеры являются коммерчески доступными под торговым наименованием Xten, конъюгирование с одним или несколькими Fc-фрагментами или сывороточным белком, таким как, например, альбумин. Все такие стабилизированные ферменты и другие химические соединения, которые могут появиться у специалистов в данной области техники, предусматриваются настоящим изобретением.
[0009] Раскрытые способы применимы как к людям, так и к не являющимся людьми животным, включая, без ограничений ветеринарных, сельскохозяйственных, домашних или лабораторных животных. В одном аспекте настоящего изобретения иммуноонкологический агент усиливает иммунный ответ у субъекта. В некоторых вариантах осуществления изобретения усиление иммунной системы включает в себя увеличение активности Т-клеточного ответа пациента на присутствие опухоли. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретения иммуноонкологический агент ингибирует иммуносупрессор, который иногда является рецептором клеточной поверхности, называемым ингибитором контрольной точки, или лигандом такого рецептора. Примеры включают в себя без ограничений ингибиторы пути PD-1, такие как анти-PD-1 антитело или анти-PD-L1 антитело, ингибиторы пути OX40 (CD134), такие как анти-OX40 или анти-OX40L (CD252), анти-4-1BB или другие лиганды семейства анти-В7, такие как, например, анти-В7-Н1 и анти-В7.1. Типичные антитела включают в себя без ограничений пембролизумаб, ипилимумаб, атезолизумаб или ниволумаб.
[00010] Предполагается, что способы настоящего изобретения будут применяться для лечения любого чувствительного рака или опухоли, включая без ограничений гепатоцеллюлярную карциному, почечно-клеточную карциному, рак молочной железы, меланому, рак предстательной железы, рак поджелудочной железы, рак мочевого пузыря, рак толстой кишки, колоректальный рак, трижды негативный рак молочной железы, лимфому Ходжкина, рак желудка, глиобластому, карциному из клеток Меркеля, карциному легкого, мелкоклеточный рак легкого или немелкоклеточный рак легкого. Введение комбинации фермента аргиназа I человека и анти-PD-1-антитела или анти-PDL-1-антитела или других ингибиторов иммунных контрольных точек или рецептора ФНО может оказывать аддитивное влияние на ингибирование роста опухоли по сравнению с ингибированием роста опухоли, имеющим место при введении терапевтической дозы только анти-PD-1-антитела или только анти-PD-Li-антитела или только фермента аргиназа I человека, или в некоторых вариантах осуществления изобретения имеет место большее, чем аддитивное или синергетическое действие на рост опухоли или рак. Две схемы лечения могут вводиться одновременно или при необходимости они могут вводиться последовательно.
[00011] Настоящее изобретение также может быть описано в некоторых вариантах осуществления как способ лечения рака у пациента, страдающего раком, включающий в себя введение указанному пациенту терапевтического количества фармацевтической композиции, содержащей пегилированный фермент аргиназа I человека, в качестве кофактора содержащий кобальт, и модулирующей иммунную систему терапии, включающей введение фармацевтической композиции, содержащей иммуноонкологический агент.
[00012] В некоторых вариантах осуществления изобретения терапевтическое количество пегилированного фермента аргиназа I человека, в качестве кофактора содержащего кобальт, составляет от примерно 0,01 до примерно 7,5 мг/кг, от примерно 0,05 до примерно 5 мг/кг или от примерно 0,1 мг/кг до примерно 5 мг/кг или любое количество, полученное из или содержащееся в вышеуказанных диапазонах.
[00013] Фармацевтическая композиция, содержащая пегилированный фермент аргиназа I человека, в качестве кофактора содержащий кобальт, может вводиться парентерально или может доставляться различными способами, известными в данной области техники, включая, без ограничений местное, подкожное, внутривенное, внутрикожное, внутриартериальное, внутрибрюшинное, внутриочаговое, внутричерепное, внутрисуставное, внутрипростатическое, внутриплевральное, интратрахеальное, интраокулярное, интраназальное, интравитреальное, интравагинальное, интраректальное, внутримышечное, подкожное, субконъюнктивальное, интравезикулярное, мукозальное, интраперикардиальное, внутрипуповинное, оральное введение, введение путем ингаляции, инъекции, инфузии, непрерывной инфузии, местного перфузионного промывания клеток-мишеней непосредственно через катетер или через лаваж. В некоторых вариантах осуществления изобретения фармацевтическую композицию вводят внутривенно или подкожно.
[00014] Настоящее изобретение также может быть описано как способ лечения рака у пациента, страдающего раком, включающий в себя введение указанному пациенту истощающего аргинин агента и ингибитора пути контрольной точки или другого модулятора иммунной системы, который ингибирует или уменьшает рост или пролиферацию рака. Эти способы также включают в себя лечение раковых заболеваний, при которых терапевтический эффект от лечения истощающим аргинин агентом и ингибитором пути контрольной точки, является аддитивным по сравнению с лечением только истощающим аргинин агентом или только указанным ингибитором пути контрольной точки, или при котором терапевтический эффект от лечения указанным истощающим аргинин агентом и ингибитором пути контрольной точки является синергетическим по сравнению с лечением истощающим аргинин агентом или только указанным ингибитором пути контрольной точки. В некоторых вариантах осуществления изобретения лечение может приводить к снижению уровня аргинина в сыворотке крови у пациента от 50% до 99% или от 90% до 99%, или снижению уровня аргинина в сыворотке крови у пациента до неопределяемого уровня.
[00015] Ферменты, пригодные для осуществления этих способов, могут включать в себя ферменты аргиназы, ферменты аргининдезиминазы или их комбинации. Эти ферменты могут быть ферментами человека, рекомбинантными ферментами человека, сконструированными ферментами человека или ферментами других видов, например, млекопитающих или бактерий, включая без ограничений микоплазму.
[00016] В некоторых вариантах осуществления изобретения нативная аргиназа модифицируется только заменой металла-кофактора. В других вариантах осуществления изобретения аргиназа модифицируется заменой металла-кофактора в дополнение к другим модификациям, таким как замены, делеции, усечения или стабилизация, путем конъюгирования со стабилизирующим белком или полимером, таким как пегилирование. В конкретном варианте осуществления настоящее изобретение относится к белку, содержащему нативную аминокислотную последовательность аргиназы I или II человека и ненативный металл-кофактор, где в аминокислотной последовательности отсутствует часть нативной последовательности. В конкретных вариантах осуществления изобретения ненативным металлом-кофактором является кобальт. В некоторых вариантах осуществления изобретения у аргиназы отсутствует часть последовательности дикого типа. В других вариантах осуществления изобретения аминокислотная последовательность включает в себя укороченную последовательность аргиназы I или аргиназы II. В конкретном варианте осуществления изобретения аргиназа представляет собой аргиназу II, в которой отсутствуют первые 21 аминокислота последовательности дикого типа. В другом варианте осуществления изобретения нативные аргиназы не содержат N-концевого метионина.
+2
+2
+2
M
[00017] В другом аспекте настоящее изобретение относится к белку аргиназы, содержащему, по меньшей мере, одну аминокислотную замену, где этот белок обладает повышенной каталитической активностью в физиологических условиях и особенно при значении pH сыворотки крови человека (pH 7,4) по сравнению с нативным белком аргиназа I или II человека. В некоторых вариантах осуществления изобретения белок аргиназы представляет собой белок аргиназы I человека или белок аргиназы II человека. В некоторых вариантах осуществления изобретения белок дополнительно содержит ненативный металл-кофактор. В конкретных вариантах осуществления изобретения ненативный металл-кофактор представляет собой Co. Замена кофактора Mn на Co приводит к значительному увеличению каталитической активности и резкому уменьшению K при физиологическом значении pH. В некоторых аспектах настоящее изобретение также относится к слитым белкам, содержащим аргиназу, связанную с неаргиназной аминокислотной последовательностью. В одном варианте осуществления изобретения неаргиназная последовательность содержать, по меньшей мере, часть Fc-области иммуноглобулина, например, для увеличения времени полужизни аргиназы в сыворотке крови при введении пациенту. Fc-область или ее часть может быть любой подходящей Fc-областью. В одном варианте осуществления изобретения Fc-область или ее часть представляет собой Fc-область IgG. В некоторых вариантах осуществления изобретения аминокислотная последовательность, обладающая активностью аргиназы, выбрана из группы, состоящей из нативной или мутированной аминокислотной последовательности аргиназы I человека и нативной или мутированной аминокислотной последовательности аргиназы II человека или других истощающих аргинин ферментов, известных в данной области техники. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к конъюгату димерного слитого белка Fc-аргиназа, альбумина или синтетического белка.
[00018] Аргиназа в слитом белке может быть нативной, мутированной и/или иным образом модифицированной, например, модифицированной металлом-кофактором. В некоторых вариантах осуществления изобретения аргиназа может содержать делеции, замены, усечения или их комбинации. В конкретном варианте осуществления настоящее изобретение относится к слитому белку, содержащему Fc-аргиназу, где аргиназа представляет собой аргиназу I. В одном варианте осуществления изобретения аргиназа не имеет части последовательности дикого типа. В другом варианте осуществления изобретения аргиназа представляет собой аргиназу I, у которой отсутствует N-концевой метионин. В еще одном варианте осуществления изобретения аргиназа представляет собой аргиназу II, где у аргиназы II отсутствуют первые 21 аминокислота последовательности аргиназы II дикого типа. В некоторых вариантах осуществления изобретения аргиназа дополнительно содержит ненативный металл-кофактор. В этих вариантах осуществления изобретения один или оба сайта могут быть замещены для получения слитого белка, содержащего аминокислотную последовательность аргиназы I или II человека и ненативный металл-кофактор. В некоторых вариантах осуществления изобретения ненативный металл-кофактор представляет собой кобальт. В некоторых вариантах осуществления изобретения аргиназа содержит замену. Типичные ферменты аргиназы для применения в настоящем изобретении более полно описаны в патенте США No. 8440184, полностью включенном в настоящее описание путем ссылки.
[00019] Настоящее изобретение также относится к способам лечения путем введения белков аргиназы настоящего изобретения и, в частности, способам лечения субъектов, страдающих раком. В некоторых вариантах осуществления изобретения рак представляет собой рак, который не экспрессирует или иным образом является дефицитным в отношении АСС, ОТК или АСЛ. В конкретных вариантах осуществления рак человека представляет собой ауксотрофный в отношении аргинина рак. Как обсуждалось выше, белок аргиназы может быть нативным, мутированным и/или иным образом модифицированным, например, модифицированным металлом-кофактором. В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения больного раком человека, включающему в себя введение пациенту композиции, содержащей слитый белок, где этот слитый белок содержит аминокислотную последовательность, обладающую активностью аргиназы, и, по меньшей мере, часть Fc-области иммуноглобулина человека. В некоторых вариантах осуществления изобретения введение происходит в таких условиях, что, по меньшей мере, часть раковых клеток рака погибает. В другом варианте осуществления изобретения композиция содержит аминокислотную последовательность, обладающую активностью аргиназы человека, более высокой, чем активность, проявляемая аутентичными аргиназами человека в физиологических условиях, и дополнительно содержащую одну или несколько связанных с ней полиэтиленгликолевых цепей. В некоторых вариантах осуществления изобретения композиция представляет собой фармацевтическую композицию, содержащую любой из вышеуказанных белков аргиназы и фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества. Такие фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества хорошо известны специалистам в данной области техники. Все вышеперечисленные варианты аргиназы рассматриваются как применимые для лечения человека.
[00020] Рак может представлять собой любой тип рака или тип опухоли. В некоторых вариантах осуществления изобретения рак представляет собой гепатоцеллюлярную карциному, почечно-клеточную карциному, меланому, рак предстательной железы или рак поджелудочной железы. В некоторых вариантах осуществления композицию вводят путем местного, подкожного, внутривенного, внутрикожного, внутриартериального, внутрибрюшинного, внутриочагового, внутричерепного, внутрисуставного, внутрипростатического внутриплевральное, интратрахеального, интраокулярного, интраназального, интравитреального, интравагинального, интраректального, внутримышечного, подкожного, субконъюнктивального, интравезикулярного, мукозального, интраперикардиального, внутрипуповинного, орального введения, введения путем ингаляции, инъекции, инфузии, непрерывной инфузии, местного перфузионного промывания клеток-мишеней непосредственно через катетер или через лаваж.
[00021] Все вышеуказанные аргиназы, варианты и тому подобное рассматриваются в предпочтительном варианте осуществления изобретения в качестве очищенных или выделенных белков и предпочтительно мономерных белков.
[00022] Варианты осуществления изобретения, описанные в разделе Пример, предложены в качестве вариантов осуществления изобретения, которые применимы ко всем аспектам настоящего изобретения.
[00023] Термин «или» в формуле изобретения используется для обозначения «и/или», если явно не указано, что он относится только к альтернативам или альтернативы являются взаимоисключающими, хотя раскрытие поддерживает определение, которое относится только к альтернативам и «и/или».
[00024] По всему тексту данной заявке термин «примерно» используется для указания того, что значение включает в себя стандартное отклонение ошибки для композиции, устройства или способа, используемое для определения значения.
[00025] Согласно давно сложившемуся патентному законодательству, существительные в единственном числе, когда они используются вместе со словом «содержащий» в формуле изобретения или описании, обозначают существительное, как в единственном, так и во множественном числе, если не указано иное.
[00026] Используемый здесь термин «терапевтически эффективный» относится к количеству активного агента и/или терапевтической композиции (такой как терапевтический полинуклеотид и/или терапевтический полипептид), которое используется в способах настоящего изобретения для достижения терапевтического эффект, например, когда, по меньшей мере, один симптом состояния, подвергаемого лечению, по меньшей мере, улучшается, и/или для анализа процессов или материалов, используемых вместе с этими клетками.
[00027] Другие цели, признаки и преимущества настоящего изобретения станут очевидными из следующего подробного описания. Однако следует понимать, что подробное описание и конкретные примеры, хотя и указывают на конкретные варианты осуществления изобретения, приведены только в качестве иллюстрации, поскольку различные изменения и модификации в пределах сущности и объема изобретения будут очевидными для специалистов в данной области техники из этого подробного описания.
Краткое описание чертежей
[00028] Следующие чертежи составляют часть настоящего описания и включены в него для дополнительной демонстрации определенных аспектов настоящего изобретения. Настоящее изобретение может быть лучше понято при обращении к одному или нескольким из этих чертежей в сочетании с подробным описанием конкретных вариантов осуществления, представленных здесь.
[00029] Фигура 1 представляет собой график, показывающий истощение L-аргинина в сыворотке крови в мышиной модели. Концентрации L-Arg в сыворотке крови мышей линии Balb/c, получавших однократную внутрибрюшинную дозу Co-hArgI, сохраняются на уровне≤3-4 мкМ в течение периода времени более 3 суток.
[00030] Фигура 2 представляет собой график, показывающий уменьшение ксенотрансплантата опухоли ГЦК при лечении Co-hArgI по сравнению с контролем. Голым мышам, несущим ксенотрансплантаты опухоли Hep3b, дважды на 9-й день и на 12-й день вводили путем внутрибрюшинной инъекции или ФСБ (°) или Co-hArgI (•). У мышей, получавших Co-hArgI, наблюдалось уменьшение опухоли, тогда как рост опухоли у мышей, получавших ФСБ, продолжался беспрепятственно.
[00031] Фигура 3 представляет собой график, показывающий влияние введения кобальта на каталитическую активность аргиназы I человека.
[00032] Фигура 4 представляет собой график, показывающий ингибирование роста опухоли толстой кишки у мышиной модели CT26 под действием Co-hArgI, анти-PD-L1 и комбинации Co-hArgI и анти-PD-L1. Как видно из этих данных, комбинация из 2 агентов оказывает более сильное, чем аддитивное влияние на ингибирование роста опухоли.
[00033] Фигура 5 представляет собой график, показывающий ингибирование роста опухоли толстой кишки у мышиной модели MC38 под действием Co-hArgI, анти-OX40-антител и комбинации Co-hArgI и анти-OX40-антител. Как видно из этих данных, комбинация из 2 агентов оказывает более сильное, чем аддитивное влияние на ингибирование роста опухоли.
[00034] Фигура 6 представляет собой график, показывающий присутствие CD45+ T-клеток, в мышиной модели CT26 при введении Co-hArgI, анти-PD-L1 и комбинации Co-hArgI и анти-PD-L1.
[00035] Фигура 7 представляет собой график, показывающий процент CD8+ клеток, присутствующих в CD45+ T-клетках, как показано на Фигуре 6.
Описание иллюстративных вариантов осуществления изобретения
[00036] Настоящее изобретение в целом относится к композициям и способам лечения рака ферментами, которые истощают L-аргинин в сыворотке крови. В некоторых вариантах осуществления изобретения рак представляет собой рак, который не экспрессирует или иным образом является дефицитным в отношении аргининосукцинатсинтетазы (АСС), орнитинтранскарбамилазы (ОТК) или аргининосукцинатлиазы (АСЛ) или других ферментов, необходимых для биосинтеза аргинина. Рассматриваются как нативные, так и мутированные ферменты, а также ферменты с модифицированными металлами-кофакторами, ферменты, слитые с другими полипептидами, а также ферменты, конъюгированные с полимерами, которые увеличивают персистенцию в сыворотке крови, например высокомолекулярный полиэтиленгликоль.
I. Аргиназа
[00037] Аргиназа представляет собой марганецсодержащий фермент. Это последний фермент цикла мочевины. Аргиназа является пятым и последним этапом в цикле мочевины, серии биофизических реакций у млекопитающих, во время которых организм избавляется от вредного аммиака. В частности, аргиназы превращают L-аргинин в L-орнитин и мочевину.
М
М
[00038] L-аргинин является субстратом донором азота для синтазы оксида азота (СОА), продуцирующей L-цитруллин и NO. Хотя сообщалось, что для L-аргинина К аргиназы (2-5 мМ) намного выше, чем К СОА (2-20 мкМ), аргиназа также может играть роль в регуляции активности СОА. При определенных условиях аргиназа I является Cys-S-нитрозилированной, что приводит к более высокому сродству к L-аргинину и пониженной доступности субстрата для СОА.
2+
2+
[00039] Аргиназа представляет собой гомотримерный фермент с α/β-укладкой параллельного восьмицепочечного β-слоя, окруженного несколькими спиралями. Этот фермент содержит двуядерных кластер металлов, который является неотъемлемой частью образования гидроксида для нуклеофильной атаки на гуанидиновый углерод L-аргинина. Нативным металлом для аргиназы является Mn. Эти ионы Mn координируют воду, ориентируя и стабилизируя молекулу и позволяя воде действовать как нуклеофил и атаковать L-аргинин, гидролизуя его в орнитин и мочевину.
[00040] Млекопитающие имеют два изофермента аргиназы (КФ 3.5.3.1), которые катализируют гидролиз L-аргинина до мочевины и L-орнитина. Ген аргиназы I находится на хромосоме 6 (6q.23), высоко экспрессируется в цитозоле гепатоцитов и выполняет функцию удаления азота в качестве заключительного этапа цикла мочевины. Ген аргиназы II обнаружен в хромосоме 14 (14q.24.1). Аргиназа II находится в митохондриях в тканях, таких как ткани почек, головного мозга и скелетных мышц, где, как считается, она обеспечивает запас L-орнитина для биосинтеза пролина и полиамина (Lopez et al., 2005).
М
[00041] Аргиназы изучали в течение почти 50 лет как способ деградации внеклеточного L-аргинина (Dillon et al., 2002). Некоторые многообещающие клинические результаты были достигнуты при введении аргиназы путем чрескожной артериальной эмболизации; после чего у нескольких пациентов наблюдалась частичная ремиссия ГЦК (Cheng et al., 2005). Однако, поскольку аргиназа имеет высокую К (~2-5 мМ) и проявляет очень низкую активность при физиологических значениях рН, для химиотерапевтических целей требуется высокая доза этого фермента (Dillon et al., 2002). Хотя нативная аргиназа выводится из кровообращения в течение нескольких минут (Savoca et al., 1984), одной инъекции ПЭГ-аргиназы MW5000 крысам было достаточно для достижения почти полного истощения аргинина в течение ~3 суток (Cheng et al., 2007).
[00042] Авторы статьи Cheng et al. сделали неожиданное наблюдение, что многие линии клеток ГЦК человека не экспрессируют ОТК (в дополнение к АСС) и, таким образом, они чувствительны к ПЭГ-аргиназе (Cheng et al., 2007). У мышей, которым имплантировали клетки гепатокарциномы Hep3b, еженедельное введение ПЭГ-аргиназы приводило к замедлению роста опухоли, которое усиливалось совместным введением 5-фторурацила (5-ФУ). Однако ПЭГ-аргиназу применяли в очень высоких дозах, которые нецелесообразны для терапии человека, что отражает ее более низкую физиологическую активность.
in vitro
[00043] Для решения этих проблем бактериальный гидролизующий аргинин фермент, аргининдезиминаза или АДИ, который обладает хорошей кинетикой и стабильностью, был испытан  и клинически. К сожалению, АДИ является бактериальным ферментом, и поэтому он вызывает сильный иммунный ответ и побочные эффекты у большинства пациентов. Однако для тех пациентов, у которых не развивается значительных побочных реакций, внушительный процент демонстрирует стабилизацию состояния при заболевании или ремиссию.
[00044] Для клинического применения важно, чтобы аргиназа была сконструирована таким образом, чтобы она сохранялась в кровотоке в течение длительного времени (например, дней). В отсутствие какой-либо модификации аргиназа человека имеет время полужизни в кровотоке всего несколько минут, главным образом потому, что ее размер недостаточно велик, чтобы избежать фильтрации через почки. Немодифицированная аргиназа человека очень чувствительна к дезактивации в сыворотке крови, и ее время полужизни составляет всего четыре часа. Поэтому в настоящем изобретении разработаны новые и улучшенные формы аргиназы для клинических исследований и потенциального терапевтического применения с улучшенной персистенцией в кровотоке.
II. Варианты аргиназы
М
М
cat
M
2+
2+
2+
[00045] Млекопитающие имеют два изофермента аргиназы (КФ 3.5.3.1), которые катализируют гидролиз L-аргинина до мочевины и L-орнитина. Ген аргиназы I находится на хромосоме 6 (6q.23), высоко экспрессируется в цитозоле гепатоцитов и выполняет функцию удаления азота в качестве заключительного этапа цикла мочевины. Ген аргиназы II обнаружен на хромосоме 14 (14q.24.1). Аргиназа II находится в митохондриях в тканях, таких как ткани почек, головного мозга и скелетных мышц, где, как считается, она обеспечивает запас L-орнитина для биосинтеза пролина и полиамина (Lopez et al., 2005). L-аргинин является единственным субстратом для синтазы оксида азота (СОА), продуцируя L-цитруллин и NO. Хотя сообщалось, что для L-аргинина К аргиназы (2-5 мМ) намного выше, чем К СОА (2-20 мкМ), аргиназа также может играть роль в регуляции активности СОА (Durante et al., 2007). При определенных условиях аргиназа I является Cys-S-нитрозилированной, что приводит к более высокому сродству к L-аргинину и пониженной доступности субстрата для СОА (Santhanam et al., 2007). Аргиназа представляет собой гомотримерный фермент с α/β-укладкой параллельного восьмицепочечного β-слоя, окруженного несколькими спиралями. Этот фермент содержит двуядерных кластер металлов, который является неотъемлемой частью образования гидроксида для нуклеофильной атаки на гуанидиновый углерод L-аргинина (Cama et al., 2003; Dowling et al., 2008). Нативным металлом для аргиназы является Mn. Аргиназа с нативным металлом (то есть Mn) имеет оптимальное значение pH, равное 9. При физиологическом значении pH фермент демонстрирует более чем 10-кратное снижение k/K в гидролизе L-аргинина. Низкая каталитическая активность, проявляемая нативной аргиназой человека с нативным кофактором Mn, представляет проблему для терапии человека, поскольку это означает, что неприемлемые дозы фермента, возможно, придется применять для достижения терапевтически значимого снижения уровня L-аргинина в плазме крови.
2+
2+
[00046] В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к мутантным аргиназам, в которых нативный металл-кофактор (Mn) заменен другим металлом. Было обнаружено, что замена металла-кофактора в аргиназе человека оказывает благоприятное влияние на скорость гидролиза L-аргинина и стабильность в физиологических условиях по сравнению с нативной аргиназой человека с нативным металлом-кофактором. Замена нативного металла-кофактора (Mn) другими двухвалентными катионами может быть использована для смещения оптимального значения pH фермента до более низких значений и, таким образом, достижения высоких скоростей гидролиза L-аргинина в физиологических условиях. Белки аргиназы I и II человека настоящего изобретения имеют два сайта Mn(II); следовательно, один или оба сайта могут быть замещены так, чтобы получить мутированный белок аргиназы I или II с ненативным металлом-кофактором.
2+
2+
2+
2+
2+
cat
M
[00047] В некоторых вариантах осуществления изобретения металл представляет собой кобальт (Co). Включение Co вместо Mn в аргиназу I человека или аргиназу II человека приводит к значительно более высокой активности при физиологическом значении pH. Было обнаружено, что фермент аргиназа I человека, содержащий Co («Co-hArgI»), демонстрирует 10-кратное увеличение k/K in vitro при значении pH 7,4, что, в свою очередь, приводит к 15-кратному увеличению цитотоксичности для ГЦК и 13-кратному увеличение цитотоксичности для меланомы по сравнению с аргиназой I человека, которая содержит Mn («Mn-hArgI»). Было также обнаружено, что фармакологический препарат Co-hArgI может очищать сыворотку крови от L-Arg в течение более 3 суток у мышей в результате одной инъекции. Кроме того, было обнаружено, что фармакологический препарат Co-hArgI может уменьшать опухолевые ксенотрансплантаты ГЦК у голых мышей, тогда как Mn-hArgI только замедляет рост опухоли (Ensor et al., 2002).
[00048] В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к способам и композициям, связанным с пегилированной аргиназой. В частности, пегилирование аргиназы по сконструированному остатку цистеина (например, замена третьего остатка N-конца) может быть использовано для получения однородной композиции пегилированной аргиназы. Также раскрыты способы выделения пегилированной аргиназы, основанные на временном нарушении полимеризации.
[00049] Пегилирование представляет собой процесс ковалентного присоединения полимерных цепей поли(этиленгликоля) к другой молекуле, обычно лекарственному средству или терапевтическому белку. Пегилирование обычно достигается путем инкубации реакционноспособного производного ПЭГ с макромолекулой-мишенью. Ковалентное присоединение ПЭГ к лекарственному средству или терапевтическому белку может «маскировать» агент от распознавания иммунной системой хозяина (снижение иммуногенности и антигенности), увеличивать гидродинамический размер (размер в растворе) агента, что продлевает время его нахождения в кровотоке за счет уменьшения почечного клиренса. Пегилирование также может обеспечить растворимость в воде для гидрофобных лекарственных средств и белков.
[00050] Первым этапом пегилирования является подходящая функционализация полимера ПЭГ на одном или обоих концах. ПЭГ, которые активированы на каждом конце одной и той же реакционноспособной группой, известны как «гомобифункциональные», в то время как если присутствующие функциональные группы являются различными, то производное ПЭГ называется «гетеробифункциональным» или «гетерофункциональным». Химически активные или активированные производные полимера ПЭГ готовы для присоединения ПЭГ к желаемой молекуле.
[00051] Выбор подходящей функциональной группы для производного ПЭГ основан на типе доступной реакционноспособной группы в молекуле, которая будет связана с ПЭГ. Для белков типичные реактивные аминокислоты включают в себя лизин, цистеин, гистидин, аргинин, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, серин, треонин, тирозин. N-концевая аминогруппа и С-концевая карбоксильная группа также могут быть использованы.
[00052] Методы, используемые для получения производных ПЭГ первого поколения, обычно включают в себя взаимодействие полимера ПЭГ с группой, которая реагирует с гидроксильными группами, как правило, ангидридами, хлорангидридами, хлорформиатами и карбонатами. В химии пегилирования второго поколения для конъюгации становятся доступными более эффективные функциональные группы, такие как альдегид, сложные эфиры, амиды и т.д.
[00053] По мере того, как применения пегилирования становятся все более и более совершенными и сложными, растет потребность в гетеробифункциональных ПЭГ для конъюгации. Эти гетеробифункциональные ПЭГ очень эффективны при соединении двух молекул, где требуется гидрофильный, гибкий и биосовместимый спейсер. Предпочтительными концевыми группами для гетеробифункциональных ПЭГ являются малеимид, винилсульфоны, пиридилдисульфид, амин, карбоновые кислоты и сложные эфиры N-гидроксисукцинимида.
[00054] Наиболее распространенные модифицирующие агенты или линкеры основаны на молекулах метокси-ПЭГ (мПЭГ). Их активность зависит от добавления белковой группы к спиртовому концу. В некоторых случаях полиэтиленгликоль (ПЭГ диол) используется в качестве молекулы-предшественника. Затем диол модифицируют с обоих концов, чтобы получить гетеро- или гомодимерную ПЭГ-связанную молекулу (как показано в примере с ПЭГ-бис-винилсульфоном).
[00055] Белки обычно ПЭГилируют в нуклеофильных сайтах, таких как непротонированные тиолы (цистеинильные остатки) или аминогруппы. Примеры цистеинил-специфичных модификационных реагентов включают в себя ПЭГ-малеимид, ПЭГ-йодацетат, ПЭГ-тиолы и ПЭГ-винилсульфон. Все четыре вещества являются высоко цистеинилспецифичными в мягких условиях и имеют значение рН от нейтрального до слабощелочного, но у каждого есть некоторые недостатки. Амид, образованный с малеимидами, может быть несколько нестабильным в щелочных условиях, поэтому могут существовать некоторые ограничения для вариантов приготовления с этим линкером. Амидная связь, образованная йод-ПЭГ, является более стабильной, но свободный йод в некоторых условиях может модифицировать остатки тирозина. ПЭГ-тиолы образуют дисульфидные связи с белковыми тиолами, но эта связь также может быть нестабильной в щелочных условиях. Реакционная способность ПЭГ-винилсульфона является относительно медленной по сравнению с ПЭГ-малеимидом и йод-ПЭГ; однако сформированная тиоэфирная связь является довольно стабильной. Его более медленная скорость реакции также позволяет легче контролировать реакцию ПЭГ-винилсульфона.
[00056] Сайт-специфичное пегилирование по нативным цистеинильным остаткам проводится редко, поскольку эти остатки обычно находятся в форме дисульфидных связей или необходимы для биологической активности. С другой стороны, сайт-направленный мутагенез может быть использован для включения сайтов цистеинилового пегилирования для тиол-специфичных линкеров. Мутация цистеина должна быть разработана таким образом, чтобы она была доступна реагенту пегилирования и оставалась биологически активной после пегилирования.
[00057] Аминспецифичные модифицирующие агенты включают в себя сложный эфир ПЭГ и N-гидроксисукцинимида, ПЭГ-трезилат, ПЭГ-альдегид, ПЭГ-изотиоцианат и некоторые другие. Все они реагируют в мягких условиях и очень специфичны для аминогрупп. Сложный эфир ПЭГ и N-гидроксисукцинимида, вероятно, является одним из наиболее реакционноспособных агентов; однако его высокая реакционная способность может затруднить контроль реакции пегилирования в больших масштабах. ПЭГ-альдегид образует имин с аминогруппой, который затем восстанавливается до вторичного амина с цианоборогидридом натрия. В отличие от боргидрида натрия, цианоборогидрид натрия не восстанавливает дисульфидные связи. Однако это химическое вещество является высокотоксичным, и с ним следует обращаться осторожно, особенно при более низких значениях рН, когда оно становится летучим.
in vitro
in vivo
[00058] Из-за множества остатков лизина в большинстве белков сайт-специфичное пегилирование может представлять собой определенную проблему. К счастью, поскольку эти реагенты реагируют с непротонированными аминогруппами, можно направить пегилирование на аминогруппы с более низким значением pK, осуществляя реакцию при более низком значении pH. Обычно pK α-аминогруппы на 1-2 единицы рН ниже, чем эпсилон-аминогруппа остатков лизина. За счет пегилирования молекулы при рН 7 или ниже часто можно добиться высокой селективности по N-концу. Однако это возможно только в том случае, если N-концевая часть белка не требуется для биологической активности. Тем не менее, фармакокинетические преимущества пегилирования часто перевешивают значительную потерю биологической активности , что приводит к получению продукта с гораздо большей биологической активностью  независимо от химической природы пегилирования.
[00059] Существует несколько параметров, которые следует учитывать при разработке процедуры пегилирования. К счастью, обычно существует не более четырех или пяти ключевых параметров. Подход «дизайн экспериментов» к оптимизации условий пегилирования может быть очень полезным. Для тиол-специфичных реакций пегилирования необходимо учитывать следующие параметры: концентрация белка, отношение ПЭГ к белку (в молярном выражении), температура, рН, время реакции и, в некоторых случаях, исключение кислорода. Кислород может способствовать образованию белком межмолекулярного дисульфида, что приведет к снижению выхода пегилированного продукта. Те же факторы следует учитывать (за исключением кислорода) для амин-специфичной модификации, за исключением того, что значение рН может быть даже более критическим, особенно при нацеливании на N-концевую аминогруппу.
[00060] Как для амин-, так и для тиол-специфичных модификаций условия реакции могут влиять на стабильность белка. Это может ограничивать температуру, концентрацию белка и значение рН. Кроме того, реакционная способность ПЭГ-линкера должна быть известна до начала реакции пегилирования. Например, если пегилирующий агент активен только на 70%, количество используемого ПЭГ должно гарантировать, что в стехиометрии реакции белок-ПЭГ учитываются только активные молекулы ПЭГ. Как определить реакционную способность и качество ПЭГ, будет описано ниже.
IV. Белки и пептиды
[00061] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к новым композициям, содержащим, по меньшей мере, один белок или пептид, такие как стабилизированные мультимерные аргиназы. Эти пептиды могут содержаться в слитом белке или могут быть конъюгированы с агентом, как описано выше.
А. Белки и пептиды
[00062] Используемый здесь термин «белок или пептид» как правило, относится, но без ограничений, к белку, содержащему более 200 аминокислот, вплоть до полноразмерной последовательности, транслированной с гена; полипептиду, содержащему более 100 аминокислот; и/или пептиду от примерно 3 до примерно 100 аминокислот. Для удобства термины «белок», «полипептид» и «пептид» используются здесь взаимозаменяемо.
[00063] В некоторых вариантах осуществления изобретения размер, по меньшей мере, одного белка или пептида может включать в себя без ограничений 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, примерно 110, примерно 120, примерно 130, примерно 140, примерно 150, примерно 160, примерно 170, примерно 180, примерно 190 примерно 200, примерно 210, примерно 220, примерно 230, примерно 240, примерно 250, примерно 275, примерно 300, примерно 325, примерно 350, примерно 375, примерно 400, примерно 425, примерно 450, примерно 475, примерно 500, примерно 525, примерно 550, примерно 575, примерно 600, примерно 625, примерно 650, примерно 675, примерно 700, примерно 725, примерно 750, примерно 775, примерно 800, примерно 825, примерно 850, примерно 875, примерно 900, примерно 925, примерно 950, примерно 975, примерно 1000, примерно 1100, примерно 1200, примерно 1300, примерно 1400, примерно 1500, примерно 1750, примерно 2000, примерно 2250, примерно 2500 или более аминокислотных остатков.
[00064] Используемый здесь термин «аминокислотный остаток» относится к любой встречающейся в природе аминокислоте, любому производному аминокислоты или любому имитатору аминокислоты, известному в данной области техники. В некоторых вариантах осуществления изобретения остатки белка или пептида являются последовательными, без какой-либо неаминокислотной молекулы, прерывающей последовательность аминокислотных остатков. В других вариантах осуществления изобретения последовательность может содержать одну или несколько неаминокислотных молекул. В конкретных вариантах осуществления изобретения последовательность остатков белка или пептида может быть прервана одной или несколькими неаминокислотными молекулами. Соответственно, термин «белок или пептид» охватывает аминокислотные последовательности, включающие в себя, по меньшей мере, одну из 20 стандартных аминокислот, обнаруженных в природных белках, или, по меньшей мере, одну модифицированную или нестандартную аминокислоту, включая без ограничений аминокислоты, перечисленные ниже в Таблице 1.
Таблица 1
Модифицированные и нестандартные аминокислоты
Сокращение
Аминокислота
Aad
2-аминоадипиновая кислота
Baad
3-аминоадипиновая кислота
Bala
β-аланин, β-аминопропионовая кислота
Abu
2-аминомасляная кислота
4Abu
4-аминомасляная кислота, пиперидиновая кислота
Acp
6-аминокапроновая кислота
Ahe
2-аминогептановая кислота
Aib
2-аминоизомасляная кислота
Baib
3-аминоизомасляная кислота
Apm
2-аминопимелиновая кислота
Dbu
2,4-диаминомасляная кислота
Des
десмозин
Dpm
2,2'-диаминопимелиновая кислота
Dpr
2,3-диаминопропионовая кислота
EtGly
N-этилглицин
EtAsn
N-этиласпарагин
Hyl
гидроксилизин
AHyl
алло-гидроксилизин
3Hyp
3-гидроксипролин
4Hyp
4-гидроксипролин
Ide
изодесмозин
Alle
алло-изолейцин
MeGly
N-метилглицин, саркозин
MeIle
N-метилизолейцин
MeLys
6-N-метиллизин
MeVal
N-метилвалин
Nva
норвалин
Nle
норлейцин
Orn
орнитин
[00065] Белки или пептиды могут быть получены любым способом, известным специалистам в данной области техники, включая экспрессию белков, полипептидов или пептидов с помощью стандартных молекулярно-биологических методов, выделение белков или пептидов из природных источников или химический синтез белков или пептидов. Нуклеотидные и белковые, полипептидные и пептидные последовательности, соответствующие различным генам, были ранее раскрыты и могут быть найдены в компьютеризированных базах данных, известных специалистам в данной области техники. Примерами таких баз данных являются базы данных Genbank и GenPept Национального центра биотехнологической информации (доступны во всемирной сети интернет по адресу ncbi.nlm.nih.gov/). Кодирующие области известных генов могут быть амплифицированы и/или экспрессированы с использованием способов, раскрытых в данном описании, или известных специалистам в данной области техники. Альтернативно, специалистам в данной области техники известны различные коммерческие препараты белков, полипептидов и пептидов.
B. Нуклеиновые кислоты и векторы
E.coli
E.coli
[00066] В некоторых аспектах настоящее изобретение может относиться к последовательностям нуклеиновых кислот, кодирующим слитый белок в качестве стабилизированной мультимерной аргиназы. В зависимости от того, какая система экспрессии будет использована, последовательности нуклеиновых кислот могут быть выбраны при помощи общепринятых методов. Например, аргиназа I и II человечка содержат много кодонов, которые редко используются , что может мешать экспрессии, поэтому соответствующие гены или их варианты могут быть оптимизированы по кодонам для экспрессии в . Различные векторы могут также использоваться для экспрессии представляющего интерес белка, такого как слитая мультимерная аргиназа или цистеинзамещенная аргиназа. Типичные векторы включают в себя без ограничений плазмидные векторы, вирусные векторы, векторы на основе транспозона или на основе липосомы.
C. Клетки-хозяева
Escherichia
Bacillus
Saccharomyces
Kluyveromyces
Hansenula
Pichia
Aspergillus
Trichoderma
Neurospora
Penicillium
Cephalosporium
Achlya
Podospora
Endothia
Mucor
Cochliobolus
Pyricularia
Клетки-хозяева, предпочтительно эукариотические клетки, используемые в настоящем изобретении, представляют собой клетки, которые можно трансформировать для обеспечения экспрессии и секреции аргиназы и ее слитых мультимеров. Клетками-хозяевами могут быть бактерии, клетки млекопитающих, дрожжи или мицелиальные грибы. Различные бактерии включают в себя бактерии, принадлежащие к родам  и . Дрожжи, принадлежащие к родам , ,  или , могут найти применение в качестве подходящей клетки-хозяина. Различные виды мицелиальных грибов могут использоваться в качестве хозяев для экспрессии, включая следующие роды: , , , , , , , , ,  и .
Escherichia coli
Bacillus subtilis
Staphylococcus aureus
Streptococcus lividans
Saccharomyces cerevisiae
Schizosaccharomyces pombe
Aspergillus nidulans
Aspergillus awamori
Trichoderma reesei
[00068] Примеры пригодных для использования организмов-хозяев включают в себя бактерии, например,  MC1061, производные  BRB1 (Sibakov et al., 1984),  SAI123 (Lordanescu, 1975) или  (Hopwood et al., 1985); дрожжи, например  AH 22 (Mellor et al., 1983) и ; мицелиальные грибы, например, ,  (Ward, 1989),  (Penttila et al., 1987; Harkki et al, 1989).
1
[00069] Примеры клеток-хозяев млекопитающих включают в себя клетки яичника китайского хомячка (CHO-K1; ATCC CCL61), клетки гипофиза крысы (GH; ATCC CCL82), клетки HeLa S3 (ATCC CCL2.2), клетки гепатомы крысы (H-4-II-E; ATCCCRL 1548) SV40-трансформированные клетки почки обезьяны (COS-1; ATCC CRL 1650) и мышиные эмбриональные клетки (NIH-3T3; ATCC CRL 1658). Приведенные выше примеры являются иллюстративным и не ограничивают многие возможные организмы-хозяева, известные в данной области техники. В принципе, могут использоваться любые способные к секреции хозяева, как прокариотические, так и эукариотические.
[00070] Клетки-хозяева млекопитающих, экспрессирующие аргиназу и/или ее слитые мультимеры, культивируют в условиях, обычно используемых для культивирования исходной клеточной линии. Как правило, клетки культивируют в стандартной среде, содержащей физиологические соли и питательные вещества, такие как стандартные среды RPMI, MEM, IMEM или DMEM, обычно с добавлением 5-10% сыворотки, такой как фетальная бычья сыворотка. Условия культивирования также являются стандартными, например, культуры инкубируют при температуре 37°C в стационарных или роликовых культурах до тех пор, пока не будут достигнуты желаемые уровни белков.
D. Очистка белков
[00071] Способы очистки белков хорошо известны специалистам в данной области техники. Эти способы включают в себя, сразу, гомогенизацию и грубое фракционирование клеток, ткани или органа до полипептидных и не полипептидных фракций. Интересующий белок или полипептид может быть дополнительно очищен с использованием хроматографических и электрофоретических методов для достижения частичной или полной очистки (или очистки до однородности), если не указано иное. Аналитические методы, особенно подходящие для получения чистого пептида, включают в себя ионообменную хроматографию, гель-эксклюзионную хроматографию, электрофорез в полиакриламидном геле, аффинную хроматографию, иммуноаффинную хроматографию и изоэлектрическую фокусировку. Особенно эффективным способом очистки пептидов является жидкостная хроматография быстрого разрешения (ЖХБР) или даже высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ).
[00072] Предполагается, что термин «очищенный белок или пептид» относится к композиции, выделяемой из других компонентов, где белок или пептид очищен в любой степени по сравнению с его естественным состоянием. Следовательно, термин «выделенный или очищенный белок или пептид» также относится к белку или пептиду, свободному от окружения, в котором он может встречаться в природе. Как правило, термин «очищенный» относится к белковой или пептидной композиции, которая была подвергнута фракционированию для удаления различных других компонентов, и которая в значительной степени сохраняет свою выраженную биологическую активность. Когда используется термин «в значительной степени очищенный», этот термин относится к композиции, в которой белок или пептид составляет основной компонент композиции, например, примерно 50%, примерно 60%, примерно 70%, примерно 80%, примерно 90%, примерно 95% или более белков в композиции.
[00073] Различные методики, подходящие для использования при очистке белка, хорошо известны специалистам в данной области техники. Они включают в себя, например, осаждение сульфатом аммония, ПЭГ, антителами и тому подобным или денатурацию при нагревании с последующим центрифугированием; стадии хроматографии, такие как ионообменная хроматография, гель-фильтрация, хроматография с обращенной фазой, хроматография на гидроксилапатите и аффинная хроматография; изоэлектрическую фокусировку; гель-электрофорез; и комбинации этих и других методов. Как общеизвестно в данной области техники, считается, что порядок проведения различных стадий очистки может быть изменен или, что определенные этапы могут быть пропущены, и все равно приводить к подходящему способу получения в значительной степени очищенного белка или пептида.
[00074] Специалистам в данной области известны различные способы количественного определения степени очистки белка или пептида в свете настоящего раскрытия. Они включают в себя, например, определение удельной активности активной фракции или оценку количества полипептидов во фракции с помощью анализа ДСН/ПААГ. Предпочтительный способ оценки чистоты фракции заключается в том, чтобы рассчитать удельную активность фракции, сравнить ее с удельной активностью исходного экстракта и, таким образом, рассчитать ее степень чистоты, выражаемую «значением кратности очистки». Фактические единицы, используемые для представления количества активности, будут, конечно, зависеть от конкретной методики анализа, выбранной для последующей очистки, и от того, проявляет ли экспрессированный белок или пептид обнаруживаемую активность.
[00075] Нет общего требования, чтобы белок или пептид всегда были получены в их наиболее очищенном состоянии. В действительности, предполагается, что в меньшей степени очищенные продукты могут использоваться в определенных вариантах осуществления изобретения. Частичная очистка может быть достигнута путем использования меньшего количества стадий очистки в комбинации или путем использования различных форм одной и той же общей схемы очистки. Например, является общепризнанным, что катионообменная колоночная хроматография, проводимая с использованием аппарата ВЭЖХ, обычно приводит к большей «кратности» очистки, чем та же методика, использующая систему хроматографии низкого давления. Способы, демонстрирующие более низкую степень относительной очистки, могут иметь преимущества в общем извлечении белкового продукта или в поддержании активности экспрессированного белка.
[00076] В некоторых вариантах осуществления изобретения белок или пептид могут быть выделены или очищены, например, стабилизированный слитый белок мультимера аргиназы или аргиназа, до или после пегилирования. Например, гистидиновая метка или аффинный эпитоп могут содержаться в таком варианте аргиназы для облегчения очистки. Аффинная хроматография представляет собой хроматографическую процедуру, основанную на специфичном сродстве между веществом, которое должно быть выделено, и молекулой, с которой оно может специфично связываться. Это рецептор-лигандный тип взаимодействия. Материал колонки синтезируют путем ковалентного связывания одного из партнеров связывания с нерастворимой матрицей. Материал колонки затем способен специфично адсорбировать вещество из раствора. Элюция происходит путем изменения условий на условия, при которых связывание не происходит (например, изменение значения рН, ионной силы, температуры и т.д.). Матрица должна представлять собой вещество, которое само по себе не адсорбирует молекулы в какой-либо значительной степени и обладает широким спектром химической, физической и термической стабильности. Лиганд должен быть связан таким образом, чтобы это не оказывало влияние на его связывающие свойства. Лиганд также должен обеспечивать относительно прочное связывание. Кроме того, необходимо, чтобы была возможность элюировать вещество, не разрушая образец или лиганд.
[00077] Эксклюзионная хроматография (ЭХ) представляет собой хроматографический метод, в котором молекулы в растворе разделяются на основе их размера или, в более технических терминах, их гидродинамического объема. Обычно применяется для больших молекул или макромолекулярных комплексов, таких как белки и промышленные полимеры. Как правило, когда водный раствор используется для транспортировки образца через колонку, этот метод известен под названием гель-фильтрационная хроматография, в отличие от гель-проникающей хроматографии, которая применяется, когда в качестве подвижной фазы используется органический растворитель.
[00078] Основной принцип ЭХ заключается в том, что частицы разных размеров будут элюироваться (фильтроваться) через неподвижную фазу с разными скоростями. Это приводит к разделению раствора частиц в зависимости от их размера. При условии, что все частицы загружаются одновременно или почти одновременно, частицы одного размера должны элюироваться вместе. Каждая колонка для выделения по размеру имеет диапазон молекулярных масс, которые можно разделить. Предел выделения определяет молекулярную массу в верхнем конце этого диапазона и находится там, где молекулы слишком велики для захвата в неподвижной фазе. Предел проницаемости определяет молекулярную массу на нижнем конце диапазона разделения и находится там, где молекулы достаточно малого размера могут полностью проникнуть в поры неподвижной фазы, и все молекулы ниже этой молекулярной массы настолько малы, что они элюируются как одна фракция.
[00079] Высокоэффективная жидкостная хроматография (или жидкостная хроматография высокого давления, ВЭЖХ) является формой колоночной хроматографии, часто используемой в биохимии и аналитической химии для разделения, идентификации и количественного определения химических соединений. В ВЭЖХ используется колонка, которая содержит хроматографический сорбент (неподвижная фаза), насос, который перемещает подвижную фазу(ы) через колонку, и детектор, который показывает время удерживания молекул. Время удерживания варьирует в зависимости от взаимодействия между неподвижной фазой, анализируемыми молекулами и используемым растворителем(ями).
V. Фармацевтические композиции
[00080] Предполагается, что новые аргиназы настоящего изобретения можно вводить системно или местно для ингибирования роста опухолевых клеток и, наиболее предпочтительно, для уничтожения раковых клеток у пациентов, страдающих раком, с местнораспространенным или метастатическим раком. Они могут вводиться внутривенно, интратекально и/или внутрибрюшинно. Они могут вводиться отдельно или в комбинации с антипролиферативными препаратами. В одном варианте осуществления изобретения их вводят для снижения онкологической нагрузки у пациента перед операцией или другими процедурами. Альтернативно, они могут вводиться после операции, чтобы гарантировать уничтожение любого остаточного рака (например, рака, который не удалось устранить хирургическим вмешательством).
[00081] Не предполагается, что настоящее изобретение ограничено конкретной природой терапевтического препарата. Например, такие композиции могут быть получены в составах вместе с физиологически переносимыми жидкими, гелевыми или твердыми носителями, разбавителями и вспомогательными веществами. Эти терапевтические препараты можно вводить млекопитающим для ветеринарного применения, например, домашним животным, и для клинического применения у людей способом, подобным введению других терапевтических агентов. Как правило, доза, необходимая для терапевтической эффективности, будет варьировать в зависимости от типа применения и способа введения, а также от конкретных требований отдельных субъектов.
[00082] Такие композиции, как правило, готовят в виде жидких растворов или суспензий, в форме инъекционных препаратов. Подходящими разбавителями и вспомогательными веществами являются, например, вода, физиологический раствор, декстроза, глицерин или тому подобное и их комбинации. Кроме того, при необходимости композиции могут содержать незначительные количества вспомогательных веществ, таких как смачивающие или эмульгирующие агенты, стабилизаторы или поддерживающие значение рН буферные агенты.
[00083] В тех случаях, когда предполагаются клинические применения, может оказаться необходимым приготовить фармацевтические композиции - экспрессионные векторы, вирусный посевной материал, белки, антитела и лекарственные средства - в форме, подходящей для предполагаемого применения. Как правило, фармацевтические композиции настоящего изобретения содержат эффективное количество одного или нескольких вариантов аргиназы или дополнительный агент, растворенный или диспергированный в фармацевтически приемлемом носителе. Термины «фармацевтический» или «фармакологически приемлемый» относятся к молекулярным веществам и композициям, которые не вызывают неблагоприятную, аллергическую или другую нежелательную реакцию при введении животному, такому как, например, человек, в зависимости от конкретного случая. Получение фармацевтической композиции, которая содержит, по меньшей мере, один вариант аргиназы, такой как стабилизированная мультимерная аргиназа или пегилированная аргиназа, выделенная способом, раскрытым в данном документе, или дополнительный активный ингредиент, станет понятно специалистам в данной области техники в свете настоящего раскрытия, которое проиллюстрировано в книге Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., 1990, включенной в настоящее изобретение путем ссылки. Кроме того, для введения животным (например, человеку) следует понимать, что препараты должны соответствовать стандартам стерильности, пирогенности, общей безопасности и чистоты, как того требует Служба биологических стандартов Управления США по надзору в сфере пищевых продуктов и лекарственных средств.
[00084] Используемый здесь термин «фармацевтически приемлемый носитель» включает в себя любые и все растворители, дисперсионные среды, оболочки, поверхностно-активные вещества, антиоксиданты, консерванты (например, антибактериальные агенты, противогрибковые агенты), изотонические агенты, замедляющие всасывание агенты, соли, консерванты, лекарственные средства, стабилизаторы лекарственных средств, гели, связующие вещества, вспомогательные вещества, дезинтеграторы, смазывающие вещества, подсластители, ароматизаторы, красители, такие как материалы и их комбинации, известные среднему специалисту в данной области техники (см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., 1990, включенную в настоящее изобретение путем ссылки). За исключением случаев, когда какой-либо традиционный носитель несовместим с активным ингредиентом, предполагается его использование в фармацевтических композициях.
[00085] Настоящее изобретение может включать в себя различные типы носителей в зависимости от того, осуществляется ли введение в твердой, жидкой или аэрозольной форме, и необходима ли стерилизация для таких путей введения, как инъекция. Настоящее изобретение можно вводить внутривенно, внутрикожно, трансдермально, интратекально, внутриартериально, внутрибрюшинно, интраназально, интравагинально, интраректально, местно, внутримышечно, подкожно, мукозально, перорально, местно, локально, ингаляционно (например, ингаляция аэрозоля), путем инъекции, инфузии, непрерывной инфузии, местного перфузионного промывания клеток-мишеней непосредственно через катетер или через лаваж, в липидных композициях (например, липосомах), или другим способом или любой комбинацией вышеперечисленного, как известно среднему специалисту в данной области техники (см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., 1990, включенную в настоящее изобретение путем ссылки).
[00086] Варианты аргиназы могут быть включены в композицию в форме свободного основания, нейтральной формы или формы соли. Фармацевтически приемлемые соли включают в себя соли присоединения кислоты, например соли, образованные со свободными аминогруппами белковой композиции, или соли, образованные неорганическими кислотами, такими как, например, соляная или фосфорная кислоты, или такими органическими кислотами, как уксусная, щавелевая, винная или миндальная кислота. Соли, образованные со свободными карбоксильными группами, также могут быть получены из неорганических оснований, таких как, например, гидроксиды натрия, калия, аммония, кальция или железа; или такие органические основания, как изопропиламин, триметиламин, гистидин или прокаин. После приготовления растворы можно вводить способом, совместимым с лекарственной формой, и в таком количестве, которое является терапевтически эффективным. Композиции легко вводятся в виде различных лекарственных форм, таких как композиции для парентерального введения, такие как растворы для инъекций, или аэрозоли для доставки в легкие, или композиции для введения с пищей, такие как капсулы, высвобождающие лекарственное средство, и тому подобное.
[00087] Кроме того, в соответствии с настоящим изобретением, композиция настоящего изобретению, подходящая для введения, находится в фармацевтически приемлемом носителе с инертным разбавителем или без него. Носитель должен быть усваиваемым и включает в себя жидкие, полутвердые, то есть пасты, или твердые носители. За исключением тех случаев, когда какой-либо традиционно используемый наполнитель, агент, разбавитель или носитель вреден для реципиента или для терапевтической эффективности содержащейся в нем композиции, его применение в вводимой композиции для применения при осуществлении способов настоящего изобретения является подходящим. Примеры носителей или разбавителей включают в себя жиры, масла, воду, солевые растворы, липиды, липосомы, смолы, связующие вещества, наполнители и тому подобное или их комбинации. Композиция также может содержать различные антиоксиданты для замедления окисления одного или нескольких компонентов. Кроме того, предотвращение действия микроорганизмов может быть достигнуто с помощью консервантов, таких как различные антибактериальные и противогрибковые агенты, включая без ограничения, парабены (например, метилпарабены, пропилпарабены), хлорбутанол, фенол, сорбиновую кислоту, тимеросал или их комбинации.
[00087] В соответствии с настоящим изобретением композицию объединяют с носителем любым удобным и практичным способом, то есть растворением, суспендированием, эмульгированием, смешиванием, капсулированием, абсорбцией и тому подобным. Такие процедуры являются обычными для специалистов в данной области техники.
[00089] В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения композицию объединяют или тщательно смешивают с полутвердым или твердым носителем. Смешивание может быть осуществлено любым удобным способом, таким как измельчение. Стабилизирующие агенты также могут быть добавлены в процессе смешивания, чтобы защитить композицию от потери терапевтической активности, то есть денатурации в желудке. Примеры стабилизаторов для использования в композиции включают в себя буферы, аминокислоты, такие как глицин и лизин, углеводы, такие как декстроза, манноза, галактоза, фруктоза, лактоза, сахароза, мальтоза, сорбит, маннит и т.д.
[00090] В других вариантах осуществления настоящее изобретение может относиться к применению фармацевтических композиций с липидным носителем, которые включают в себя варианты аргиназы, один или несколько липидов и водный растворитель. Используемый здесь термин «липид» будет определяться как включающий любое из широкого ряда веществ, которые обычно нерастворимы в воде и экстрагируются органическим растворителем. Этот широкий класс химических соединений хорошо известен специалистам в данной области техники, и используемый здесь термин «липид» не ограничен какой-либо конкретной структурой. Примеры включают в себя химические соединения, которые содержат длинноцепочечные алифатические углеводороды и их производные. Липид может быть встречающимся в природе или синтетическим (то есть разработанным или произведенным человеком). Однако липид обычно является биологическим веществом. Биологические липиды хорошо известны в данной области техники и включают в себя, например, нейтральные жиры, фосфолипиды, фосфоглицериды, стероиды, терпены, лизолипиды, гликосфинголипиды, гликолипиды, сульфатиды, липиды с эфирными и сложноэфирными жирными кислотами и полимеризуемые липиды и их комбинации. Следует понимать, что соединения, отличные от тех, которые конкретно описаны в настоящем изобретении, и которые понимаются специалистом в данной области как липиды, также охватываются композициями и способами настоящего изобретения.
[00091] Специалисту в данной области техники хорошо известен рядом методик, которые можно применять для диспергирования композиции в липидном носителе. Например, стабилизированная мультимерная или пегилированная аргиназа может быть диспергирована в растворе, содержащем липид, растворена в липиде, эмульгирована в липиде, смешана с липидом, объединена с липидом, ковалентно связана с липидом, содержаться в виде суспензии в липиде, содержаться или образовывать комплекс с мицеллой или липосомой, или иначе быть связанной липидом или со структурой липида любым способом, известным специалистам в данной области техники. Диспергирование может приводить к образованию липосом, но может и не приводить к этому.
[00092] Фактическое количество дозы композиции настоящего изобретения, вводимое пациенту-животному, может определяться физическими и физиологическими факторами, такими как масса тела, тяжесть состояния, тип заболевания, подлежащего лечению, предыдущие или одновременные терапевтические вмешательства, идиопатия пациента и путь введения. В зависимости от дозы и пути введения количество введений предпочтительной дозы и/или эффективного количества может варьироваться в зависимости от ответа субъекта. В любом случае, специалист, ответственный за введение, будет определять концентрацию активного ингредиента(ов) в композиции и соответствующую дозу(ы) для конкретного субъекта.
[00093] В некоторых вариантах осуществления изобретения фармацевтические композиции могут включать в себя, например, по меньшей мере, примерно 0,1% активного соединения. В других вариантах осуществления изобретения активное соединение может составлять, например, от примерно 2% до примерно 75% от веса единицы или, например, от примерно 25% до примерно 60%, и любой диапазон, между этими значениями. Естественно, что количество активного соединения(й) в каждой терапевтически композиции может быть подобрано таким образом, что подходящая доза будет получена в любой данной разовой дозе химического соединения. Такие факторы, как растворимость, биодоступность, биологический период полужизни, способ введения, срок годности продукта, а также другие фармакологические соображения будут приниматься во внимание специалистом в области приготовления таких фармацевтических композиций и, в силу этого, приемлемыми могут оказаться различные дозы и схемы лечения.
[00094] В других неограничивающих примерах доза также может составлять от примерно 1 микрограмм/кг/массы тела, примерно 5 микрограмм/кг/массы тела, примерно 10 микрограмм/кг/массы тела, примерно 50 микрограмм/кг/массы тела, примерно 100 микрограмм/кг/массы тела, примерно 200 микрограмм/кг/массы тела, примерно 350 микрограмм/кг/массы тела, примерно 500 микрограмм/кг/массы тела, примерно 1 миллиграмм/кг/массы тела, примерно 5 миллиграмм/кг/массы тела, примерно 10 миллиграмм/кг/массы тела, примерно 50 миллиграмм/кг/массы тела, примерно 100 миллиграмм/кг/массы тела, примерно 200 миллиграмм/кг/массы тела, примерно 350 миллиграмм/кг/массы тела примерно 500 миллиграмм/кг/массы тела до примерно 1000 миллиграмм/кг/массы тела или более на одно введение, и любой диапазон значений, находящихся в этом интервале. В неограничивающих примерах диапазона значений, находящихся в интервале между перечисленными здесь числами, диапазон от примерно 5 мг/кг/массы тела до примерно 100 мг/кг/массы тела, от примерно 5 микрограмм/кг/массы тела до примерно 500 миллиграмм/кг/массы тела и т.д. можно вводить на основании чисел, указанных выше.
VII. Определения
[00095] Термин «ак» относится к аминокислоте(ам). Аминокислотные замены обозначены положением аминокислоты, например, 303, в молекуле с использованием буквенного кода (буква перед числом указывает заменяемую аминокислоту, а буква после числа указывает вводимую аминокислоту).
[00096] Используемый здесь термин «часть», когда он относится к белку (например, «часть данного белка»), относится к фрагментам этого белка. Фрагменты могут иметь размер от четырех аминокислотных остатков до всей аминокислотной последовательности минус одна аминокислота.
[00097] Используемые здесь термины «белок» и «полипептид» относятся к химическим соединениям, содержащим аминокислоты, соединенные посредством пептидных связей, и используются взаимозаменяемо.
[00098] Используемый здесь термин «слитый белок» относится к гибридному белку, содержащему целевой белок (т.е. аргиназу человека или ее вариант), присоединенный (или функционально связанный) к фрагменту экзогенного белка (партнер слияния, который состоит из неаргиназного белка). Партнер слияния может увеличить время полужизни в сыворотке крови, растворимость или и то, и другое. Он также может нести аффинную метку (например, гистидиновую метку), чтобы обеспечить выделение рекомбинантного слитого белка из клетки-хозяина или культурального супернатанта или их обоих.
[00099] Термины «в функциональной комбинации», «в функциональном порядке» и «функционально связаны» относятся к связыванию последовательностей нуклеиновой кислоты таким образом, что молекула нуклеиновой кислоты способна направлять транскрипцию данного гена и/или осуществлять синтез желаемой молекулы белка. Термин также относится к связыванию аминокислотных последовательностей таким образом, что получается функциональный белок.
m
[000100] Используемый здесь термин «K» относится к константе Михаэлиса-Ментен для фермента и определяется как концентрация специфичного субстрата, при которой данный фермент дает половину своей максимальной скорости в реакции, катализируемой ферментом.
cat
[000101] Используемый здесь термин «k» относится к числу оборотов или числу молекул субстрата, которые каждый сайт фермента превращает в продукт в единицу времени, и при которых фермент работает с максимальной эффективностью.
cat
m
[000102] Используемый здесь термин «K/K» представляет собой константу специфичности, которая является мерой того, насколько эффективно фермент превращает субстрат в продукт.
50
[000103] Термин «Mn-hArgI» относится к аргиназе I человека с кофактором Mn(II). Термин «Co-hArgI» относится к аргиназе I человека (мутантной или нативной) с кофактором Co(II). Термин «ИК» представляет собой половину максимальной (50%) ингибирующей концентрации (ИК) и, следовательно, является мерой эффективности.
[000104] Термин «пегилированный» относится к конъюгированию с полиэтиленгликолем (ПЭГ), который широко используется в качестве носителя лекарственного средства, благодаря своей высокой степени биосовместимости и простоте модификации. (Harris et al., 2001). Было показано, что прикрепление к различным лекарственным средствам, белкам и липосомам увеличивает время пребывания в организме и снижает токсичность. (Greenwald et al., 2000; Zalipsky et al., 1997). ПЭГ может быть связан (например, ковалентно связан) с активными агентами через гидроксильные группы на концах цепи и другими химическими методами; однако сам ПЭГ ограничен максимум двумя активными агентами на молекулу. В другом подходе сополимеры ПЭГ и аминокислот были исследованы в качестве новых биоматериалов, которые сохраняли бы свойства биосовместимости ПЭГ, но которые имели бы дополнительное преимущество в виде многочисленных точек присоединения на молекулу (обеспечивая большую нагрузку лекарственного средства), и которые могли бы быть синтетически получены для различных применений (Nathan et al., 1992; Nathan et al., 1993).
[000105] Термин «ген» относится к последовательности ДНК, которая содержит регуляторные и кодирующие последовательности, необходимые для продуцирования полипептида или его предшественника. Полипептид может кодироваться полноразмерной кодирующей последовательностью или любой частью кодирующей последовательности, до тех пор, пока он сохраняет желаемую ферментативную активность.
[000106] Термин «субъект» относится к животным, включая людей.
[000107] Термин «дикий тип» относится к гену или продукту гена, который имеет характеристики этого гена или продукта гена при выделении из встречающегося в природе источника. Ген дикого типа представляет собой ген, который чаще всего наблюдается в популяции и поэтому произвольно обозначен как «нормальная» или «дикая» форма гена. Напротив, термин «модифицированный» или «вариант» или «мутант» относится к гену или продукту гена, который имеет модификации в последовательности и/или функциональных свойствах (то есть измененные характеристики) по сравнению с геном или продуктом гена дикого типа. Отмечено, что могут быть выделены встречающиеся в природе мутанты; их идентифицируют на основании того факта, что они имеют измененные характеристики по сравнению с геном или продуктом гена дикого типа.
VIII. Наборы
[000108] Настоящее изобретение относится к наборам, таким как терапевтические наборы. Например, набор может содержать одну или несколько фармацевтических композиций, как описано здесь, и, при необходимости, инструкции по их применению. Наборы также могут содержать одно или несколько устройств для осуществления введения таких композиций. Например, набор настоящего изобретения может содержать фармацевтическую композицию и катетер для осуществления прямой внутривенной инъекции композиции в раковую опухоль. В других вариантах осуществления набор настоящего изобретения может содержать предварительно заполненные стабилизированной мультимерной аргиназой или выделенной пегилированной аргиназой ампулы, при необходимости, изготовленные в виде фармацевтического средства или лиофилизированные, для использования с устройством доставки.
in vivo
in vitro
[000109] Наборы могут содержать контейнер с этикеткой. Подходящие контейнеры включают в себя, например, бутылки, флаконы и пробирки. Контейнеры могут быть изготовлены из различных материалов, таких как стекло или пластик. Контейнер может содержать композицию, которая включает в себя антитело, которое эффективно для терапевтического или нетерапевтического применения, такого как описано выше. Этикетка на контейнере может указывать, что композиция используется для конкретного терапевтического или нетерапевтического применения, а также может указывать направления для применения или , или , такие как описанные выше. Набор настоящего изобретения, как правило, будет содержать контейнер, описанный выше, и один или несколько других контейнеров, содержащих материалы, желательные с коммерческой и пользовательской точки зрения, включая буферы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы и листки-вкладыши с инструкциями по применению.
IX. Примеры
[000110] Следующие примеры служат для иллюстрации некоторых предпочтительных вариантов осуществления и аспектов настоящего изобретения и не должны рассматриваться как ограничивающие его объем. В следующем экспериментальном описании применяются следующие сокращения: экв. (эквиваленты); М (молярный); мкМ (микромолярный); мМ (миллимолярный); Н (нормальный); моль (моль); ммоль (миллимоли); мкмоль (микромоль); нмоль (наномоль); г (грамм); мг (миллиграммы); мкг (микрограммы); л (литры); мл (миллилитры); мкл (микролитры); см (сантиметры); мм (миллиметры); мкм (микрометры); нм (нанометры); EC (градусы Цельсия); ММ (молекулярный масса); ФСБ (фосфатно-солевой буфер); мин (минуты).
Пример 1
Включение и определение содержания металла в аргиназе I
2+
2+
-1
-1
2+
2+
[000111] Включение Mn и Co может быть достигнуто путем очистки аргиназы с последующей стадией инкубации с 10 мМ металла при температуре 50°C в течение 10 минут. Чтобы определить конечное содержание металлов и идентичность препаратов аргиназы, образцы белков Mn-hArgI (145 мкМ), Co-hArgI (182 мкМ) и связанных с ними буферов для диализа (100 мМ Hepes, pH 7,4) разводили в 2% азотной кислоте и анализировали при помощи масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой (ИСП-МС, Департамент геологических наук, университет Техаса в Остине) для количественного определения содержания в белке кобальта, железа, марганца и цинка путем вычитания концентрации металлов, обнаруженных в диализном буфере, из концентрация металла в конечных образцах белка и деления на концентрацию белка. Для определения концентраций белка рассчитывали коэффициент экстинкции для hArgI на основе аминокислотной последовательности (Gill and von Hippel, 1989). Все концентрации белка для аргиназы I были рассчитаны на основе рассчитанного ε280=24,180 М см в конечной концентрации буфера 6М гуанидингидрохлорида, 20 мМ фосфатного буфера, рН 6,5. Для сравнения концентрацию аргиназы также рассчитывали с помощью количественного биуретового анализа содержания белков с использованием разведений БСА в качестве стандарта. Используя этот метод, было обнаружено, что образцы аргиназы, инкубированные с Co, содержали 2,1±0,5 эквивалента Co и 0,4±0,1 эквивалента Fe и не содержали определяемых количеств Zn или Mn. Образцы, инкубированные с Mn, содержали 1,5±0,2 эквивалента Mn и 0,4±0,1 эквивалента Fe и не содержали определяемых количеств Zn или Co. Таким образом, тепловая инкубация является эффективным методом включения кобальта.
[000112] Дополнительные исследования загрузки кобальтом показали, что более высокая доля загрузки кобальта является достижимой, и это приводит к более высокой удельной активности. Результаты этих исследований показаны в следующей таблице и на Фигуре 3.
Таблица 2
Загрузка кобальтом Co-аргиназы I
Идентичность
Co (мМ)
Темп. (°C)
Время (мин)
Всего Co (мкг/мг аргиназы)
Всего Mn (мкг/мг аргиназы)
Удельная активность (Ед./мг)
Апо-аргиназа I*
Н.Д.
Н.Д.
Н.Д.
<0,025
0,008
24
Апо-загрузка 1*
0.1
5
15
0,3
Н.Д.
117
Coh-Arg I*
10
20
60
2
0,06
410
Апо-загрузка 2*
1
5
15
2,4
Н.Д.
395
Апо-загрузка 3*
10
20
15
2,8
Н.Д.
493
Апо-загрузка 4*
10
20
60
2,9
Н.Д.
489
Апо-загрузка 5
10
37
15
2,8
Н.Д.
Н.Д.
Апо-загрузка 6
10
53
15
2,6
Н.Д.
Н.Д.
Co-ArgI-ПЭГ
10
53
15
3
Н.Д.
500
Теоретическая
3,4
*На графике
[000113] Помеченные звездочкой данные показаны на Фигуре 3.
Пример 2
Цитотоксичность Co-Arg и ее вариантов в отношении клеток гепатоцеллюлярной карциномы и метастатических меланом
in vitro
2
50
50
50
50
50
[000114] Для проверки цитотоксичности сконструированной аргиназы  различные концентрации (0-100 нМ) вариантов Mn-ArgI, Co-ArgI или Co-hArgI инкубировали с клетками ГЦК (Hep 3b) или клетками меланомы (A375) (Американская коллекция типовых культур) в 96-луночных планшетах при плотности посева 500 клеток на лунку в среде DMEM, дополненной фетальной бычьей сывороткой. После 24 часов инкубации при температуре 37°C клетки обрабатывали средой, содержащей аргиназу, в трех параллелях в различных концентрациях. Контрольный раствор представлял собой сбалансированный солевой раствор в среде. Обработанные клетки поддерживали при температуре 37°C и атмосфере с 5% СО. Клетки анализировали при помощи стандартного МТТ-теста (Sigma-Aldrich) в дни 1, 3, 5 и 7 путем добавления 100 мкл/лунку МТТ (5 мг/мл) и инкубирования в течение 4 часов с легким перемешиванием от одного до двух раз в час. После этого раствор отбирали с помощью аспиратора и затем в каждую лунку добавляли 200 мкл ДМСО. Поглощение при 570 нм интерпретировали для каждой лунки с использованием автоматического планшет-ридера для определения относительного количества выживших клеток по сравнению с контролями. Полученные данные подставляли в экспоненциальное уравнение, чтобы определить кажущееся значение ИК для цитотоксичности аргиназы. Значения ИК со дня 5 рассчитывали, получая значение ИК для Mn-hArgI 5±0,3 нМ (~0,18 мкг/мл) и значение 0,33±0,02 нМ для Co-hArgI (~0,012 мкг/мл). Таким образом, фермент Co-ArgI, по-видимому, в 15 раз более цитотоксичен для ГЦК, чем Mn-замещенный фермент. В отношении клеточной линии метастатической меланомы (A375) Mn-hArgI имела кажущуюся ИК 4,1±0,1 нМ (~0,15 мкг/мл). Инкубация с Co-hArgI приводила к 13-кратному увеличению цитотоксичности с кажущейся ИК 0,32±0,06 нМ (~0,012 мкг/мл).
Пример 3
Разработка слитого белка Fc-аргиназа для увеличения времени полужизни
in vivo
in vivo
[000115] Слияние с Fc-доменом IgG широко используется для продления времени полужизни  терапевтических полипептидов, таких как ингибитор ФНО-α этанерцепт (Enbril™). Домен Fc связывается с рецептором FcγRn, который экспрессируется в эндотелии сосудов и многих других тканях (Roopenian and Akilesh, 2007). Сродство FcγRn к Fc-домену IgG в большой степени зависит от значения рН. Связывание происходит при кислом значении pH эндосомальных компартментов, что позволяет белку рециркулировать на клеточную поверхность и, таким образом, избегать протеолитической деградации. На клеточной поверхности домен Fc высвобождается из FcγRn, поскольку при физиологическом значении pH аффинность связывания очень низкая. Эндосомная рециркуляция через FcγRn, по оценкам, увеличивает время полужизни иммуноглобулинов в сыворотке крови, по меньшей мере, в 4-7 раз, примерно до 7-14 дней у людей. Слияние с Fc использует это свойство, чтобы придать короткоживущим молекулам длительные периоды времени полужизни. Однако аргиназа человека представляет собой гомотример, и, следовательно, при слиянии с Fc IgG, который сам является димером, полученный полипептид Fc-аргиназа, вероятно, будет образовывать агрегаты с большой молекулярной массой.
cat
M
-1
-1
[000116] Эта проблема была устранена путем использования мутантных форм аргиназы, которые нарушают тримеризацию и являются стабильными в мономерной форме. Тримеризация и поверхность контакта субъединицы аргиназы I были изучены довольно подробно (Lavulo et al., 2001). Было показано, что единичная аминокислотная замена в Glu256Gln нарушает тримеризацию, приводя к образованию мономерного фермента аргиназа I (Sabio et al., 2001). После экспрессии и очистки этого варианта анализ стационарной кинетики выявил почти идентичную активность по сравнению с Co-hArgI со значением k/K 1320 с мМ.
E.coli
E.coli
E.coli
in vivo
[000117] Затем эту конструкцию клонировали в экспрессионные векторы Fc. Экспрессионный вектор Fc представляет собой конструкцию на основе плазмиды pTRC99a (Amersham), которая содержит лидерную последовательность DsbA, за которой следует кодирующая область Fc IgG, сайт рестрикции EcoRI и стоп-кодон. Ген мономерной аргиназы помещали в рамку считывания после кодирующей области Fc путем расщепления вектора и гена рестриктазой EcoRI, после чего проводили лигирование, и этой конструкцией трансформировали клетки  (BL21) для секвенирования и экспрессии. Так как Fc IgG обычно представляет собой гликозилированный белок, экспрессия рекомбинантных IgG или слитых с Fc белков до сих пор осуществлялась в рекомбинантных клетках млекопитающих, которые, в отличие от бактерий, способны к N-сцепленному гликозилированию. Однако, хотя гликозилирование в Asn297 является критическим для связывания с активирующими и ингибирующими рецепторами Fcγ (FcγRI-III у людей), оно не оказывает заметного влияния на сродство или рН-зависимое связывание с FcγRn (Tao and Morrison, 1989; Simmons et al. al., 2002). Таким образом, агликозилированные IgG-антитела, экспрессируемые в бактериях, обладают персистентностью в сыворотке крови приматов, почти неотличимую от таковой у полностью гликозилированных антител, экспрессируемых в клетках млекопитающих (Simmons et al., 2002). В противоположность преобладающим более ранним представлениям, IgG-антитела и белки Fc могут эффективно экспрессироваться в клетках  вплоть до количеств, измеряемых в г/л в ферментерах. Экспрессия в клетках  технически намного проще и быстрее. Кроме того, поскольку полученный белок агликозилирован, он не проявляет гетерогенности гликанов, что является важной проблемой в экспрессии терапевтических гликопротеинов (Jefferis, 2007). Слитый белок очищают с помощью хроматографии на белке А, и выход правильно уложенного димерного слитого белка Fc-аргиназа относительно полипептидов, которые не смогли димеризоваться, количественно определяют с помощью гель-фильтрационной хроматографии ЖХБР. Эта процедура привела к получению высокоактивной и очень стабильной формы аргиназы человека, подходящей для испытаний .
Пример 4
Пегилирование аргиназы
2
[000118] Аргиназу очищали и затем добавляли 10 мМ CoCl и нагревали при температуре 50°C в течение 10 минут. После центрифугирования для удаления любых осадков аргиназу ПЭГ-5000 подвергали интенсивной замене буфера (ФСБ с 10% глицерина) с использованием фильтрационного устройства с 100000 НОММ (Amicon) и стерилизовали с помощью шприцевого фильтра с размером пор 0,2 микрона (VWR). Весь пегилированный фермент анализировали на содержание липополисахаридов (ЛПС), используя набор реагентов с лизатом амебоцитов мечехвоста (LAL) (Cape Cod Incorporated).
cat
M
-1
-1
[000119] Было обнаружено, что пегилированная Co-hArgI обладает почти идентичной с ферментом дикого типа стабильностью в сыворотке крови и имеет значение k/K, равное 1690 ± 290 с мМ.
Пример 5
Истощение L-Arg в сыворотке крови в мышиной модели
[000120] Мышам линии Balb/c путем внутрибрюшинной инъекции однократно вводи 500 мкг фармакологически приготовленной пегилированной Co-hArgI или равный объем ФСБ. Мышей умерщвляли путем пункции вены сердца для забора крови в моменты времени 0, 48, 72 и 96 часов. Образцы крови немедленно смешивали в соотношении 50:50 (об./об.) с 400 мМ натриево-цитратным буфером, рН 4, оставляли сворачиваться на 30 минут и центрифугировали для отделения сыворотки. Полученную сыворотку затем отфильтровали на устройстве с 100000 НОММ (Amicon) для удаления крупных белков и осадка, и полученную жидкость собирали для анализа. Стандарты L-аргинина, контрольную мышиную сыворотку и экспериментальные образцы дериватизировали о-фталальдегидом (Agilent) и разделяли на колонке ВЭЖХ с обращенной фазой С18 (Agilent) (5 мкм, 4,6×150 мм), по существу так, как описано Agilent Technologies (номер публикации: 5980- 3088) за исключением незначительного изменения протокола разделения путем уменьшения скорости потока на 1/2 и удвоения времени сбора, чтобы получить лучшее разделение пиков. Стандартную кривую L-аргинина получали путем построения графика зависимости площади пика L-Arg от концентрации для количественного определения уровней L-Arg в сыворотке. Однократной дозы фармакологически приготовленной Co-hArgI было достаточно для поддержания L-Arg на уровне или ниже уроня пределов обнаружения в течение более 3 дней (Фигура 1).
Пример 6
Лечение ксенотрансплантата опухоли ГЦК при помощи Co-hArgI
6
3
in vitro
in vivo
[000121] Голым мышам подкожно инъецировали в бок ~ 10 клеток ГЦК, собранных из 75% конфлюентной культуры ткани. После того, как ксенотрансплантированные опухоли ГЦК вырастали до размера ~ 0,5 см в диаметре (день 9), мышей распределяли по двум группам. Экспериментальная группа получала внутрибрюшинную инъекцию 500 мкг фармакологически оптимизированной Co-hArgI на 9-й и 12-й день. Контрольная группа получала внутрибрюшинные инъекции ФСБ на 9-й и 12-й дни. Как видно на Фигуре 2, опухоли у животных, получавших ФСБ, увеличились в 3 раза к 15-му дню. В отличие от этого, опухоли у животных, получавших Co-hArgI, уменьшились в размере к 15-му дню. Было показано, что опухоли у животных, получавших Mn-hArgI, только замедляются в скорости роста (Cheng et al., 2007). По-видимому, Co-hArgI является высокоэффективным химиотерапевтическим средством против ГЦК как , так и .
Пример 7
Нарушение баланса L-аргинина в микроокружении опухоли с помощью Co-hArgI и анти-PD-L1 антител
2+
+
2+
2+
in vivo
[000122] аргиназа I человека (hArgI) представляет собой Mn-зависимый фермент, который проявляет низкую активность и низкую стабильность в сыворотке крови. Супрессорные клетки миелоидного происхождения (СКМП), экспрессируют hArgI и синтазу оксида азота (СОА), которые регулируют доступность L-аргинина в микроокружении опухоли и, в свою очередь, регулируют функцию Т-лимфоцитов. Истощение L-аргинина с помощью СКМП коррелирует с нарушением противоопухолевой функции Т-лимфоцитов и уклонением опухоли от действия иммунитета хозяина. Экспрессия ферментов пути биосинтеза L-аргинина в мононуклеарных клетках периферической крови, мононуклеарных клетках костного мозга и CD34 клетках была проанализирована, и этот анализ показал, что эти клетки экспрессируют низкие уровни ОТК и АСС, что указывает на зависимость этих клеток от экзогенного/внеклеточного L-аргинина для осуществления физиологической функции. На основании этого открытия предполагается, что длительное истощение L-аргинина может отрицательно влиять на популяцию СКМП и, следовательно, усиливать иммунную регуляцию роста опухоли. Эта гипотеза была проверена с использованием сконструированной hArgI (AEB1102), полученной путем замены природного кофактора Mn на Co, что приводит к значительному улучшению каталитической активности и стабильности в сыворотке крови по сравнению с эндогенной hArgI. Сконструированный фермент также был пегилирован, как описано выше. Было оценено действие хронического, обширного, опосредованного пегилированной Co-hArgI истощения L-аргинина  у мышиной модели рака ободочной кишки CT26, при введении этого фермента отдельно и в сочетании с анти-PD-L1 и анти-PD-1 моноклональными антителами (mAb).
[000123] В этих исследованиях использовали самок мышей линии Balb/c Envigo (BALB/cAnNHsd). В первый день исследования их возраст составлял 6-7 недель. Подопытным животным имплантировали подкожно в день 0 клетки 5.0E+05CT26.WT. Все мыши были распределены по группам исследования, и лечение было начато следующим образом:
AEB-001-1037
- Группа 1: Носитель (ФСБ) внутрибрюшинно, Q7Dx4; плюс изотипический контроль, 10 мг/кг внутрибрюшинно, (Q3Dx2; 3off)×4
- Группа 2: AEB1102, (3 мг/кг внутрибрюшинно, Q7Dx4)
- Группа 3: анти-PD-L1 антитела, 10 мг/кг внутрибрюшинно, (Q3Dx2; 3off)×4
- Группа 4: AEB1102, 3 мг/кг внутрибрюшинно, Q7Dx4; плюс анти-PD-L1 антитела, 10 мг/кг IP, (Q3Dx2; 3off)×4;
[000124] AEB1102 вводили 4 раза, один раз в неделю (дни 3, 10, 17, 24)
[000125] Анти-PD-L1 антитела вводили 8 раз, один раз через два дня, один раз через три дня каждую неделю (дни 3, 6, 10, 13, 17, 20, 24, 27).
3
[000126] У всех животных отмечали клинические признаки, по меньшей мере, один раз в день. Индивидуальную массу тела и объем опухоли регистрировали три раза в неделю. Отдельных мышей умерщвляли, когда размер опухоли достигал значения 2000 мм.
in vivo
[000127] Лечение  мышей CT26 с помощью AEB1102 (пеглилированная Co-hArgI) приводило к терапевтическому эффекту, сравнимому с эффектом от стандартных иммуномодулирующих антител, которые нацелены на PD-1 и PD-L1. Важно отметить, что комбинированная терапия AEB1102 с анти-PD-1 и анти-PD-L1 моноклональными антителами приводила к явно синергическому или, по меньшей мере, аддитивному противоопухолевому эффекту по сравнению с действием только AEB1102 и только иммунотерапии.
[000128] Данные этого исследования графически показаны на Фигуре 4. Эти данные отражают эффект лечения пегилированной Co-hArgI в сочетании с антителами, направленными против иммунных контрольных точек: белка рецептора (анти-PD-1) и лиганда (анти-PD-L1). На Фигуре верхняя кривая представляет собой антитело изотипического контроля, вторая кривая представляет собой анти-PD-L1 антитело, третья кривая представляет собой пегилированную Co-hArgI, а нижняя кривая представляет собой комбинированное лечение пегилированной Co-hArgI и анти-PD-L1-антителом. Как видно из приведенных данных, комбинация из 2 агентов оказывает более сильное, чем аддитивное влияние на ингибирование роста опухоли.
45+
45+
8+
[000129] Влияние на активацию T-лимфоцитов также измеряли в образцах, взятых на 3-й день. Процент общего числа живых клеток, которые экспрессировали CD в четырех группах, а также процент клеток CD, которые также были CD, показаны в Таблице 3. Эти данные также показаны в графической форме на Фигурах 6 и 7.
Таблица 3
Группы
День 3 CD45+ клетки
День 3 CD8+ клетки
14,8 ± 3,4
19,4 ± 3,9
Носитель
13,8 ± 2,2
18,7 ± 2,1
Изотип
26,5 ± 3,7
18,7 ± 7,1
AEB1102
13,1 ± 3,5
26,3 ± 3,24
Анти-PD-L1
22,4 ± 2,3
34,2 ± 5,0
AEB1102+Анти-PD-L1
14,8 ± 3,4
19,4 ± 3,9
В таблице приведены значения в виде среднее ± СКО
[000130] В совокупности эти результаты показывают, что нарушение физиологического баланса L-аргинина в микроокружении опухоли ингибирует рост опухоли и дополнительно повышает чувствительность опухоли к иммунотерапии.
Пример 8
Эффект от лечения рака толстой кишки при помощи ArgI и OX40
3
[000131] Суспензии клеток карциномы ободочной кишки MC38 инъецировали в бок самкам мышей линии C57BL/6. Когда объем опухоли достигал 75-100 мм в день 0, мышей случайным образом распределяли по группам. Объем опухоли измеряли два раза в неделю с помощью штангенциркуля. Лечение начинали в день 0.
[000132] Первой группе вводили изотипический контроль по 10 мг/кг каждые две недели в течение 6 недель, второй группе вводили Co-аргиназу I по 3 мг/кг, еженедельно в течение 6 недель, третьей группе вводили анти-OX40 антитела по 10 мг/кг еженедельно в течение 6 недель, и четвертой группе вводили 3 мг/кг co-ArgI и 10 мг/кг анти-OX40 антитела еженедельно в течение 6 недель. Данные этого исследования показаны на Фигуре 5. Несмотря на то, что, по-видимому, co-ArgI вводили в субоптимальной дозе, наблюдалась тенденция, при которой комбинация ArgI и aOX40 оказывала более чем аддитивное действие на уменьшение или ингибирование объема опухоли.
[000133] Все композиции и способы, раскрытые и заявленные в настоящем изобретении, могут быть изготовлены и выполнены без излишних экспериментов в свете настоящего раскрытия. Хотя композиции и способы настоящего изобретения были описаны в терминах предпочтительных вариантов осуществления изобретения, специалистам в данной области техники будет очевидно, что изменения могут вноситься в композиции и способы на любых этапах или в последовательность этапов способов, описанные в данной заявке, без отступления от концепции, сущности и объема изобретения. В частности, будет очевидно, что определенные агенты, которые являются как химически, так и физиологически родственными, могут заменить агенты, описанные здесь, при условии, что будут достигнуты такие же или аналогичные результаты. Все такие аналогичные заменители и модификации, очевидные для специалистов в данной области техники, считаются находящимися в пределах сущности, объема и концепции настоящего изобретения, определенных в прилагаемой формуле изобретения.
Источники информации
Cama et al., Biochemistry, 42:7748-7758, 2003.
Cheng et al., Cancer Lett., 224:67-80, 2005.
Cheng et al., Cancer Res., 67:309, 2007.
Cheng et al., Cancer Res., 67:4869-4877, 2007.
Dillon et al., Med. Sci. Monit., 8:BR248-253, 2002.
Dowling et al., Cell Mol. Life. Sci., 65(13):2039-55, 2008.
Durante et al., Clin. Exp. Pharmacol. Physiol., 34:906-911, 2007.
Ensor et al., Cancer Res., 62:5443-5450, 2002.
Feun et al., J. Neurooncol., 82:177-181, 2007.
Gill and von Hippel, Anal. Biochem., 182:319-326, 1989.
Greenwald et al., Crit. Rev Therap Drug Carrier Syst., 17:101-161, 2000.
Harkki et al., BioTechnology, 7:596-603, 1989.
Harris et al., Clin. Pharmacokinet., 40(7):539-51, 2001.
Hopwood et al., In: Genetic Manipulation of Streptomyces, A Laboratory Manual, The John Innes Foundation, Norwich, Conn., 1985.
Izzo et al., J. Clin. Oncol., 22:1815-1822, 2004.
Jefferis, Expert Opin. Biol. Ther., 7:1401-1413, 2007.
Lavulo et al., J. Biol. Chem., 276:14242-14248, 2001.
Lopez et al., Febs J., 272:4540-4548, 2005.
Lordanescu, J. Bacteriol, 12:597 601, 1975.
Mellor et al., Gene, 24:1-14, 1983.
Nathan et al., Bioconj Chem., 4:54-62, 1993.
Nathan et al., Macromolecules, 25:4476-4484, 1992.
Pardoll, Drew, Nature Reviews Cancer 12, 252-264 (April 2012
Penttila et al., Gene, 61:155-164, 1987.
Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1289-1329, 1990.
Roopenian and Akilesh, Nat. Rev. Immunol., 7:715-725, 2007.
Sabio et al., FEBS Lett., 501:161-165, 2001.
Santhanam et al., Circ. Res., 101:692-702, 2007.
Savoca et al., Cancer Biochem. Biophys., 7:261-268, 1984.
Scott et al., Br. J. Cancer, 83:800-810, 2000.
Shen et al., Cancer Lett., 231:30-35, 2006.
Sibakov et al., Eur. J. Biochem., 145:567 572, 1984.
Simmons et al., J. Immunol. Methods, 263:133-147, 2002.
Tao et al., J. Immunol., 143:2595-2601, 1989.
Ward, Embo-Alko Workshop on Molecular Biology of Filamentous Fungi, Helsinki, 119-128, 1989.
Wheatley and Campbell, Pathol. Oncol. Res., 8:18-25, 2002.
Yoon et al., Int. J. Cancer, 120:897-905, 2007.
Zalipsky et al., Bioconjug Chem., 8:111-118, 1997.