Ферментативная интенсификация протеолиза с целью регулирования структуры пастообразных продуктов

2003

Известия ТИНРО

Том 134

УДК 664.953

Т.П.Калиниченко

ФЕРМЕНТАТИВНАЯ ИНТЕНСИФИКАЦИЯ ПРОТЕОЛИЗА С ЦЕЛЬЮ РЕГУЛИРОВАНИЯ СТРУКТУРЫ ПАСТООБРАЗНЫХ ПРОДУКТОВ

Исследована зависимость степени протеолиза в малосоленой пастообразной продукции из мышечной ткани нерестовой кеты от использованной дозы ферментов комплексного препарата протеаз "Протин". Установлено, что реологические характеристики паст (предельное напряжение сдвига, липкость, динамическая вязкость) находятся в логарифмической зависимости от степени протео-лиза. Показана возможность регулирования структуры малосоленых паст из мышечной ткани нерестовой кеты путем интенсификации протеолиза.

Kalinichenko T.P. Enzyme intensification of proteolysis to regulate paste products structure // Izv. TINRO. — 2003. — Vol. 134. — P. 334-339.

Muscle tissue of spawning chum salmon (Oncorhynchus keta) has undergone the certain changes: its water content is increasing, the content of proteins and li pids is decreasing , proteolytic activity of endogenous enzymes is heightening. The high activity of spawning chum salmon endogenous protease responsible for tissue tenderization allows a using this raw material for paste-like production. However, the enzymes of muscle are insufficient for receiving a product with paste-like consistence. Therefore, the opportunity was investigated of structure regulation of light-salted paste-like product from muscle tissue of spawning chum salmon by intensification of proteolysis. Protein hydrolysis was stimulated by complex protease preparation "Protin".

Dependence of proteolysis degree of spawning chum salmon muscle tissue on the doze of the enzymes has been established. Dependence of rheological characteristics of the production on proteolysis degree was estimated: the dynamic viscosity, shearing stress and stickiness depended logarithmically on the proteolysis degree.

The found dependencies allow calculating a quantity of protease preparation for maintenance of the certain structural-mechanical characteristics of paste-like production from muscle tissue of spawning chum salmon. The opportunity of regulation of the paste structure is established by enzyme intensification of proteolysis.

The developed technology of pastes from spawning chum salmon muscle tissue allows introducing this kind of raw material in manufacture of light-salted pastes.

Одним из направлений рационального использования сырьевых ресурсов является получение продуктов питания из сырья, недоиспользуемого с этой целью в настоящее время. Лососевые с нерестовыми изменениями — пример такого сырья. В частности, мышечная ткань кеты (Oncorhynchus keta) перед нерестом претерпевает определенные изменения: увеличивается содержание воды, уменьшается количество белка и липидов (Орлова и др., 2003), возрастает эндогенная протеолитическая активность (Nomata et al., 1985; Yamashita, Konagaya, 1990; Слуцкая и др., 1999). Особенности мышечной ткани не позволяют получать качественную малосоленую продукцию из этого сырья по известным технологиям.

Ранее установлено, что тендеризация тканей рыбы обусловлена главным образом работой таких эндогенных мышечных ферментов, как катепсин Д и тиоловые катепсины (Yamashita, Konagaya, 1991; Виняр и др., 1995). H ерестовые изменения в мышечной ткани кеты сопровождаются увеличением активности катепсина Д в 3-4 раза, тиоловых катепсинов — в 7-12 раз по сравнению с активностью соответствующих ферментов питающейся кеты (Yamashita, 1993; Слуцкая и др., 1999). Высокая активность эндогенных протеаз нерестовой кеты, ответственных за тендеризацию тканей, позволила предположить возможность использования этого сырья для получения малосоленой пастообразной продукции. Однако предварительные исследования показали, что активности собственных ферментов недостаточно для придания продукту консистенции, соответствующей пастообразной. Поэтому целью настоящей работы явилось изучение возможности регулирования структуры малосоленой пастообразной продукции из мышечной ткани нерестовой кеты путем интенсификации протеолиза. Стимулирование гидролиза белков проводили препаратом протеолитических ферментов "Протин", получаемым из пилорических придатков лососевых рыб, что попутно дает возможность решать проблему комплексного использования сырья.

Объектами исследований служили образцы пастообразной продукции, приготовленные на основе мышечной ткани кеты с нерестовыми изменениями, выловленной в эстуарной зоне р. Аввакумовка, хранившейся мороженой в течение 3 мес при температуре минус 20 оС.

Протеолитическую активность "Протина" определяли по методу Е.Д.Каверзневой (1971) на субстрате казеинат натрия, используя фосфатный буфер, и выражали в протеолитических единицах (ПЕ) на 1 г препарата. Экспериментальные образцы паст готовили используя концентрации "Протина" от 5 до 20 ПЕ на 100 г измельченной мышечной ткани, ферментный препарат вносили при измельчении после добавления вкусовых добавок (соль, сахар) и консерванта (бензойнокислый натрий).

Содержание общего и небелкового азота в мышечной ткани нерестовой кеты и в пастообразной продукции определяли на автоматическом анализаторе азота Kjeltec Auto 10 SO Analyser (Швеция), пробы готовили по методу Кьельда-ля (ГОСТ 7636-85). Степень протеолиза рассчитывали как отношение азота небелкового, образовавшегося в результате гидролиза белков, к азоту белковому и выражали в процентах. Определение азота концевых аминогрупп проводили после взаимодействия последних с тринитробензолсульфокислотой и последующей регистрацией оптической плотности продуктов реакции на спектрофотометре Hitachi 330 (Япония) при длине волны 340 нм (Satake et al., 1960).

Определение массовой доли хлорида натрия осуществляли аргентометри-ческим методом, воды — методом высушивания (ГОСТ 7636-85).

Липкость паст из мышечной ткани нерестовой кеты измеряли на приборе Reotech Fudon Rheo Meter (Япония), динамическую вязкость — на приборе Rheolograph Sol-535 (Япония), предельное напряжение сдвига — на полуавтоматическом пенетрометре конструкции В.Д.Косого (Россия).

Мышечная ткань кеты, взятая для исследований, содержала 76,7 % воды, 20,9 % белка, количество низкомолекулярных азотсодержащих веществ в ней составляло 432 мг/100 г. Химические характеристики рыбы соответствовали таковым, присущим кете с выраженными признаками брачного наряда (Слуцкая и др., 1999; Орлова и др., 2003).

Определение рН мышечной ткани кеты показало, что оно составляет 6,33, поэтому провели исследование протеолитической активности "Протина", использованного для стимулирования протеолиза нерестовой кеты, не только в щелочной среде, где подобные препараты проявляют максимальную активность (Пив-ненко, 1997), но и в слабокислой. Установлено, что протеолитическая активность использованного препарата "Протин" достаточно высока в слабокислой среде, при рН мышечной ткани нерестовой кеты она составляет 4,62 ПЕ/ г препарата.

В экспериментальные образцы вносили "Протин" из расчета его активности при естественном значении рН мышечной ткани кеты. По химическому составу образцы пастообразной продукции, полученные при различных фермент-субстратных соотношениях, близки между собой: содержание N^ изменялось в них от 3,020 до 3,125; количество хлорида натрия составляло 3,4-3,9 %; воды — 7 2,272,9 %.

Поскольку химический состав паст примерно одинаков, интенсивность гидролиза белков, происходящего в них, зависела от активности протеаз. Влияние ферментов препарата "Протин" на белки мышечной ткани нерестовой кеты подтверждается накоплением неосаждаемых трихлоруксусной кислотой продуктов гидролиза белков, причем их значительную часть составляют низкомолекулярные фрагменты, о чем можно судить по количеству азота концевых аминогрупп (см. таблицу). Установлено, что степень протеолиза увеличивалась в пастах как при увеличении количества использованных протеолитических единиц ферментного препарата, так и в процессе хранения (рис. 1).

Накопление продуктов протеолиза в пастах с различным количеством "Протина", мг/100 г Accumulation of proteolysis products in pastes with different quantity of "Protin", mg/100 g

Кол-во фермента, ПЕ/100 г фарша 1,0 мес Мб 2,0 мес 3,5 мес 1,0 мес N ам 2,0 мес 3,5 мес

- 590 678 808 297 342 400

5 730 1033 1108 538 640 781

10 872 1375 1585 675 902 1111

15 1085 1558 1840 993 1051 1196

20 1214 1722 1950 1043 1127 1260

Срок хранения, мес

Рис. 1. Степень протеолиза в пастах из мышечной ткани нерестовой кеты в зависимости от количества "Протина": 1 — контроль без "Протина"; 2 — 5 ПЕ/100 г;

3 — 10; 4 — 15; 5 — 20 ПЕ/100 г фарша

Fig. 1. Degree of proteolysis in pastes from muscle tissue of spawning chum salmon depending on quantity "Protin": 1 — control without "Protin"; 2 — 5 PU/100 g; 3 — 10;

4 — 15; 5 — 20 PU/100 g of forcemeat

Исследование структурно-механических характеристик паст показало, что реологические свойства продукции изменяются в зависимости от степени ферментативного воздействия: чем большее количество протеолитических единиц использовано и глубже протекает протеолиз (рис. 1), тем ниже показатели предельного напряжения сдвига (рис. 2), липкости (рис. 3) и динамической вязкости

(рис. 4). Следовательно, реологические характеристики паст из нерестовой кеты зависят от степени протеолиза.

Рис. 2. Изменение предельного напряжения сдвига паст из нерестовой кеты в зависимости от степени про-теолиза мышечной ткани

Fig. 2. Changes of shearing stress of pastes from spawning chum salmon depending on a degree of proteoly-sis of muscle tissue

<а С 3500

О

к 3000

с

2500

2000

1500

1000

500

0

6 10 14 18 22 26 30 34 38 42 46 50 54

ГГБ, %

C3

К

л" н о о и с к Ч

7000

6000

5000

4000

3000

2000

1000

Рис. 3. Изменение липкости паст из нерестовой кеты в зависимости от степени про-теолиза мышечной ткани

Fig. 3. Changes of stickiness of pastes from spawning chum salmon depending on a degree of proteolysis of muscle tissue

Математическая обработка результатов исследования, проведенная с помощью программы "Master Statistics", позволила установить, что реологические характеристики паст из нерестовой кеты находятся в логарифмической зависимости от глубины гидролиза белков в них. Зависимости выражаются следующими уравнениями:

ПНС = 3877,99 - 921,41 Ln (ГГБ); В = 276,08 - 71,61 Ln (ГГБ); Л = 7044,01 - 1724,70 Ln (ГГБ); где ПНС — предельное напряжение сдвига; В липкость; ГГБ — глубина гидролиза белков; R ции соответствующих зависимостей.

Отрицательный коэффициент корреляции указывает на то, что зависимость является обратной, т.е. с увеличением аргумента значение функции уменьшается, что соответствует полученным данным: при увеличении степени протеолиза уменьшаются ПНС, вязкость и липкость паст.

Достоверность полученных зависимостей подтверждена коэффициентами корреляции, абсолютные величины которых выше критического значения,

R = |- 0, 9131

R2 = R3 =

R

- 0,8934

- 0,9324 динамическая вязкость; Л — R3 — коэффициенты корреля-

ГГБ, %

Рис. 4. Изменение динамической вязкости паст из нерестовой кеты в зависимости от степени протеолиза мышечной ткани

Fig. 4. Changes of dynamic viscosity of pastes from spawning chum salmon depending on a degree of proteolysis of muscle tissue

составляющего r = 0,64 при 1 %-ном уровне значимости и степени свободы n - 2 = 13 (Лакин, 1980). Следовательно, с вероятностью P = 0,99 можно заключить, что реологические характеристики паст из мышечной ткани нерестовой кеты зависят от глубины гидролиза белков.

Таким образом, установлены зависимость между концентрацией протеоли-тических ферментов, использованных при производстве паст, и степенью протео-лиза, а также зависимости структурно-механических характеристик паст от степени протеолиза. Найденные закономерности дают возможность рассчитать количество препарата протеаз, необходимое для обеспечения заданных структурных характеристик пастообразной продукции из нерестовой кеты, т.е. установлена возможность регулирования структуры паст путем ферментативной интенсификации протеолиза.

Изготовление пастообразной продукции из нерестовой кеты позволит вовлечь в производство малосоленой продукции ранее неиспользуемое сырье и получить относительно недорогую продукцию, поскольку разрабатываемая технология предусматривает использование сырья низкой стоимости.

Литература

Виняр Т.Н., Калиниченко Т.П., Слуцкая Т.Н. Активность мышечных протеаз как показатель способности рыб к тендеризации в соленом виде // Изв. ТИНРО. — 1995. — Т. 118. — С. 105-110.

ГОСТ 7636-85. Рыба, морские млекопитающие, морские беспозвоночные и продукты их переработки. Методы анализа.

Каверзнева Е.Д. Стандартный метод определения протеолитической активности для комплексных препаратов протеиназ // Прикл. биохим. и микробиол. — 1971. — Т. 7, вып. 2. — С. 225-228.

Лакин Г.Ф. Биометрия. — М.: Высш. шк., 1980. — 293 с

Орлова М.В., Чибиряк Л.М., Леваньков С.В., Якуш Е.В. Технохимическая характеристика нерестовой кеты // Хранение и переработка сельхозсырья. — 2003. — № 1 — С. 24-27.

Пивненко Т.Н. Субстратная специфичность панкреатических сериновых протеиназ различного происхождения // Изв. ТИНРО. — 1997. — Т. 120. — С. 14-22.

Слуцкая Т.Н., Виняр Т.Н., Калиниченко Т.П. и др. Особенности мышечной ткани нерестовой кеты // Изв. ТИНРО. — 1999. — Т. 125. — С. 60-67.

Nomata H., Toyohara H., Makinodan Y., Ikeda S. The existence of proteinases in chum salmon muscle and their activities in the spawning stage // Nipp. Suis. Gakk. — 1985. — Vol. 51, № 11. — P. 1799-1804.

Satake K., Okuyama T., Ohashi M. and Shinoda T. The spectrophotometry determination of amine, amino acid and peptide with 2,4,6-trinitrobenzene-1-sulfonic acid // J. of Biochem. — 1960. — Vol. 47, № 5. — P. 654-660.

Yamashita M., Konagaya S. Hydrolytic Action of Salmon Cathepsins B and L to Muscle Structural Proteins in Respect of Muscle Softening // Nipp. Suis. Gakk. — 1991. — Vol. 57, № 10. — P. 1917-1922.

Yamashita M., Konagaya S. Participation of Cathepsin L into Extensive Softening of the Muscle of Chum Salmon Caught during Spawning Migration // Nipp. Suis. Gakk. — 1990. — Vol. 56, № 8. — P. 1271-1277.

Yamashita M. Studies on Cathepsins in the Muscle of Chum Salmon // Bull. Natl. Res. Inst. Fish. Sci. — 1993. — № 5. — P. 9-116.

Поступила в редакцию 5.06.03 г.