Ферментативные изменения углеводного и белкового комплекса табачного сырья при изготовлении трубочного табака Кавендиш

ТЕХНОЛОГИЯ

УдК 663.973.4

Ферментативные изменения углеводного и белкового комплексов табачного сырья

при изготовлении трубочного табака Кавендиш

Н. В. Моисеев,

д-р техн. наук, профессор; Д. А. Еделев,

д-р экон. наук, д-р мед. наук,

профессор;

М. Б. Мойсеяк,

канд. техн. наук, доцент;

В. В. Лёзный,

аспирант;

Р. П. Приходько,

аспирант;

Т. П. Симдянова,

аспирант

Московский государственный университет пищевых производств

В большинстве случаев в трубке курится смесь из нескольких видов табака. Основой смеси традиционно являются два сорта: Вирджиния и Бёрли, по отдельности либо в сочетании. На эту основу в различных пропорциях накладываются дополнительные компоненты, или приправы: Кавендиш, Латакия, Пэрик, а также группа сортов, объединенных в группу ориентальных табаков. Каждый табак обладает своими уникальными свойствами, поэтому после того, как смесь готова, ее необходимо выдержать, для того чтобы ароматы и вкусы табаков перемешались между собой и оформились в единую картину. Нередко для этих же целей табачные смеси прессуют и подвергают дополнительной температурной обработке. Кавендиш — это всего-навсего особым образом обработанный табак сортов Бёрли или Вирджиния. Если быть совсем точным — целое семейство табаков. При приготовлении Кавен-диша высушенные табачные листья проходят длительную ферментацию, после чего смешиваются с патокой. В результате получается очень мягкий табак с густым насыщенным ароматом. Еще больше эти свойства проявляются у табака, который называется Black Cavendish. Темный Кавендиш производят только из Вирджинии, листья ферментируют особенно долго, несколько раз, после чего прессуют и выдерживают. Это придает темному Кавендишу характерную пряность. Кавендиш используется в качестве добавки — он очень распространен в смесях Англии, Шотландии и Дании.

В ранее опубликованных исследованиях [1, 2] достаточно подробно изложены теоретические аспекты основных химических реакций, протекающих при производстве трубочного табака Кавендиш, а также приведены результаты изменений химического состава различных ботанических со-ртотипов исходного табачного сырья в течение непрерывного 20-дневного технологического цикла тепловой обработки табака в глюкозо-фруктозном сиропе. На рис. 1 приведена обобщенная схема комплекса необходимых исследований для описания количественных и качественных изменений химической структуры табачного сырья при изготовлении Кавендиша.

Согласно рис. 1 для уточнения механизма сахаро-аминных реакций и процесса меланоидинообразования в Кавендише объектом исследования является изучение изменений содержания полисахаридов (крахмала) и белковых веществ как для исходного табачного сырья, так и для Кавендиша, изготовленного открытым способом суперферментации.

Изменение углеводного комплекса табака

Исследования количественных изменений в составе крахмала важны, поскольку именно полисахариды и продукты их распада скорее всего образуют сахаро-аминный комплекс с белками, что в итоге придает уникальные орга-нолептические свойства дыму при пиролизе Кавендиша. Содержание крахмала определялось ферментативным методом c помощью автоматического

ПИВО и НАПИТКИ

6 • 2014

Белковые вещества

Пептиды, аминокислоты

Продукты распада аминокислот

Полисахариды

Моносахариды

Г

Реакция Майяра

Аминосахара

+ Ароматические вещества

Органические кислоты: яблочная, лимонная, щавелевая и т.д.

Технология

Продукты реакции Майяра

Рис. 1. Обобщенная схема комплекса исследований для описания количественных

и качественных изменений химического состава табачного сырья при изготовлении Кавендиша

биохимического анализатора Konelab arena 20xt, в результате чего было выявлено, что до технологического процесса с табачным блендом в табачном сырье содержание крахмала составляло 1,82 г/100 г, а в готовом Кавендише после окончания 20-дневного цикла — 1,19 г/100 г. Таким образом, во время изготовления Кавендиша содержание крахмала снижается на 35%, что может свидетельствовать об участии крахмала как в структуре обмена органических кислот [4], так и в синтезе

сложных веществ, являющихся продуктами реакции Майяра (химическое взаимодействие продуктов деструкции крахмала и аминных соединений) и положительно влияющих на вкус дыма.

В ранее опубликованном исследовании [3] был проведен дифференцированный анализ изменений в составе низкомолекулярных углеводов и кислотного комплекса табачного сырья при изготовлении трубочного табака Кавендиш открытым способом суперферментации. При этом в ходе

Рис. 2. Электрофореграмма органических кислот

исходного сырья при изготовлении Кавендиша

Дата: 27.08.2014 13:13:03 Оператор: Матп^ег

Файл ЭФГ: С: \Program И^\Ьлех\ЕНогип\оргкислоты\табак 2_140827_1313.т^ Файл метода: С: \Program Files\Lumex\Elfoшn\оргкислоты\оргкислоты. т^к Температура: 20.0 °С Длина волны: 254 нм Проба:

Разбавление:1.00

Буферный раствор: рабочий буфер

Этап 1. Время 299 с, напр. -20 кВ, давл. 0 мбар, длина волны 254 нм. Метод расчета Абсолютная градуировка;

Внутренняя нормализация.

Программа:

1. Промывка. Из 9 в 9, t = 123 с, и = 0 кВ, Р = 1000 мбар.

2. Ввод пробы. Из 1 в 10, t = 5 с, и = 0 кВ, Р = 30 мбар.

3. Анализ. Из 10 в 10.

3.1. t = 299 с, и= -20 кВ, Р = 0 мбар, 254 нм.

экспериментальных исследований было дополнительно подтверждено, что процесс изменения соотношения органических кислот во время изготовления Кавендиша является следствием окислительной диссимиляции растворимых углеводов (глюкозы и фруктозы) за счет ферментативных превращений, входящих в цикл три-карбоновых кислот. При этом, однако, в отличие от процессов томления и сушки табака во время послеуборочной обработки [4] при изготовлении Кавендиша происходит обратная реакция — резкое увеличение содержания яблочной кислоты при уменьшении в первую очередь количества лимонной кислоты. Причем на образование органических кислот, согласно [5], сильно влияет концентрация ионов аммония и нитрат-ионов, являющимися продуктами диссимиляции белков.

Исследование изменений массовых долей органических кислот

На рис. 2 и 3 представлены электро-фореграммы органических кислот, содержащихся в исходном сырье и Кавендише. Исследование состава органических кислот осуществлялось по методике [6].

В табл. 1 представлено содержание органических кислот в исходном табачном сырье и готовом Кавендише.

Как видно из представленных в табл. 1 результатов исследования, после технологической обработки в Кавендише по сравнению с исходным табачным сырьем на 36,7% увеличивается содержание органических кислот за счет увеличения массовых долей в первую очередь яблочной, лимонной и щавелевой кислот, что приводит к смещению от рН 5,6 для ис-

6 • 2014 ПИВО и НАПИТКИ 49

ПДата: 27.08.2014 13:13:03 Оператор: Матп^ег

Файл ЭФГ: С: \Program Files\Lumex\Elfoшn\оргкислоты\табак 2_140827_1313.1Г^ Файл метода: С: \Program Files\LulT]ex\Elfoшn\оргкислоты\оргкислоты.lT]tk Температура: 20.0 °С Длина волны: 254 нм Проба:

Разбавление:1.00

Буферный раствор: рабочий буфер

Этап 1. Время 299 с, напр. -20 кВ, давл. 0 мбар, длина волны 254 нм. Метод расчета Абсолютная градуировка;

Внутренняя нормализация.

Программа:

1. Промывка. Из 9 в 9, t=123 с, и = 0 кВ, Р = 1000 мбар.

2. Ввод пробы. Из 1 в 10, t = 5 с, и = 0 кВ, Р=30 мбар.

3. Анализ. Из 10 в 10.

3.1. t = 299 с, и = -20 кВ, Р = 0 мбар, № = 254 нм.

Рис. 3. Электрофореграмма органических кислот готового Кавендиша

Таблица 1

Исходное табачное сырье Кавендиш Изменение

Органическая кислота Показания прибора Массовая доля, % Показания прибора Массовая доля, % массовой доли,%

Щавелевая 23,35 1,17 36,90 1,84 t 57,27

Винная 6,40 0,32 3,05 0,15 4 53,12

Яблочная 58,06 2,90 81,44 4,07 t 40,35

Лимонная 23,48 1,17 35,34 1,77 t 51,29

Янтарная 2,04 0,10 2,83 0,14 t 40,00

Молочная 3,57 0,18 4,65 0,23 t 27,80

Уксусная 6,35 0,32 4,41 0,22 4 31,25

Массовая доля суммы органических кислот 6,16 8,42 t 36,70

Таблица 2

Образец Масса табака, г Объем буфера, мл

Табачное сырье до ферментации (С) 6,4 16

Табак Кавендиш после 8 6 15 ферментации (К) ,

ходного сырья к pH 4,12 для готового Кавендиша [3].

Изменение белкового комплекса табака

Ферментативные изменения в составе белков и аминокислот при изготовлении Кавендиша интересны прежде всего с точки зрения продуктов их диссимиляции, в первую очередь процесса

окислительного дезаминирования с образованием свободного аммиака и соответствующих кетокислот. Процесс дезаминирования аминокислот приводит к трансформации азотистых соединений в безазотистые, что позитивно сказывается на изменении вкуса дыма ферментированного табака. Свободный аммиак в процессе дезаминирования может связываться органическими кислотами в виде аммонийных солей.

В ходе проделанной исследовательской работы были проанализированы образцы табака на наличие белков и пептидов. Концентрации белка были определены двумя методами — Лоури и Бредфорда [7]. Для спектрофотоме-трического определения концентраций

белка методами Бредфорда и Лоури применялся спектрофотометр Cary 50 Bio (Agilent), для гель-электрофореза использовалась ванна BIO-RAD Mini-Protean Tetra Cell, источник тока — Electrophoresis Power Supply-EPS 3501. Пробоподготовка (табл. 2) осуществлялась на центрифуге Еppendorf 5804 R. Для экстракции белков использовался фосфатный буфер с рН 8. Экстракт центрифугировался при комнатной температуре со скоростью 7000 об./мин (угловой ротор) в течение 5 мин. Супернатант использовался для дальнейших исследований.

В полученных растворах исследовалась концентрация белков методами Бредфорда и Лоури. Результаты приведены в табл. 3.

Анализируя данные, представленные в табл. 3, можно сделать следующие выводы.

1. Сильное различие в значениях концентраций, измеренных методами Лоури и Бредфорда, объясняется тем, что метод Лоури специфичен как для высокомолекулярных (крупных) белков, так и для низкомолекулярных пептидов (реакция основана на образовании комплекса с пептидной связью), тогда как метод Бред-форда рассчитан на определение высокомолекулярных белков. Таким образом, в экстракте табака, особенно в Кавендише, преобладают в основном низкомолекулярные пептиды.

2. В результате технологической обработки при изготовлении Кавендиша концентрация белковых веществ снижается примерно в два раза. Именно с этим фактом, действующим на фоне увеличения кислотности табака во время суперферментации, в первую очередь необходимо связывать улучшение вкуса и облагораживание аромата дыма Кавендиша по сравнению с исходным табачным сырьем. Для определения фракционного состава белков в ходе работы был проведен гель-электрофорез в полиакри-ламидном геле [7]. На рис. 4 представлена ПААГ-ДСН электрофореграмма исследованных растворов белков.

Образцы 6-9 были предварительно осаждены ацетоном сразу после стадии получения экстракта. Значения маркера соответствуют молекулярной массе белков в килодальтонах (кДа).

Из рис. 4 видно, что образцы ферментированного табака практически не содержат белков массой более 10 кДа. Кроме того, сплошные полосы неферментированного табака (треки 2,

50 ПИВО и НАПИТКИ 6 • 2014

3, 6, 7) свидетельствуют о большом количестве полимера. Сравнивая результаты, полученные в ходе анализов концентраций белков методами Бред-форда, Лоури, и данных электрофореза, можно сделать вывод, что белки, вероятнее всего, обладают сложным составом (гликопротеиды). В результате технологической обработки углеводный фрагмент разрушается, после чего остается только белковый. Таким образом, интенсивные полосы (треки 2, 3, 6, 7) обусловлены, вероятнее всего, наличием высокомолекулярных углеводных фрагментов.

При изготовлении экстрактов и последующем осаждении белков ацетоном было отмечено, что в начале эксперимента вся окраска раствора была сосредоточена в осажденных белках, но через некоторое время начинала переходить в ацетон. Это может свидетельствовать о том, что в экстракте могут содержаться как высокомолекулярные красители, так и низкомолекулярные. Это подтверждается результатами, приведенными в табл. 4 [2]. На основе определения общего содержания углеводов и белков (методика ЦИНАО) показано [2], что для табачного сырья Вирджиния характерно снижение количества углеводов в 2 раза (метод Бертрана) во время технологического цикла при полном исчезновении редуцирующих сахаров, причем на этом фоне более чем на 25% растет количество азотистых веществ за счет низко- и высокомолекулярных соединений.

Как видно из табл. 4, структура белкового комплекса табаков сорто-типа Вирджиния (рН 5,34) в отличие от табаков сортотипа Бёрли (рН 7,58) показывает увеличение азотистых веществ на 25,4% на фоне снижения уровня никотина (11%) и редуцирующих сахаров (100%), что характерно для процессов образования новых сахаро-аминных веществ за счет как собственных сахаров Вирджинии, так и углеводов соусов; уровень белков для табака Бёрли (при использовании методики ЦИНАО), напротив, уменьшается, что на фоне появления незначительного количества углеводов (0,4-1,4%) и интенсивных окислительных процессов говорит о менее эффективном, чем для Вирджинии, процессе образования меланоидино-вых белковоподобных комплексов.

Выводы

При изготовлении Кавендиша содержание крахмала снижается на

Технология

Таблица 3

Тип табака Масса табака, г Метод Лоури Метод Бредфорда

Концентрация в экстракте, мг/мл Концентрация в табаке, мг/г Концентрация в экстракте, мг/мл Концентрация в табаке, мг/г

Сырье (С) 6,4 70 175 3,82 9,6

Кавендиш (К) 8,6 62 108 2,2 4,1

Рис. 4. ПААГ-ДСН электрофореграмма белков.

Треки: 1 — Маркер; 2 — С 5 мкл; 3 — С 10 мкл; 4 — К 5 мкл; 5 — К 10 мкл; 6 — С осаждено ацетоном 5 мкл; 7 — С осаждено ацетоном 10 мкл; 8 — К осажден ацетоном 5 мкл; 9 — К осажден ацетоном 10 мкл

35% — с 1,82 г/100 г в исходном сырье до 1,19 г/100 г после истечения 20-дневного технологического цикла. Таким образом, крахмал активно участвует как в структуре обмена органических кислот, так и синтезе сложных веществ, являющихся продуктами реакции Майера и положительно влияющих на вкус дыма. В целях производственной идентификации эффективности процесса суперферментации есть смысл введения крахмального коэффициента суперферментации, равного отношению разницы содержания крахмала в исходном сырье и Кавендише к количеству крахмала в исходном сырье (в %%). Для используемых в данной работе образцов данный коэффициент деградации крахмала равен 34,62%.

Метод Брэдфорда (по сравнению с методом Лоури, методикой ЦИНАО) является предпочтительным методом при исследовании концентрации белков и их производных в табачном сырье, а также готовом Кавендише; в ходе эксперимента установлено снижение концентрации белков более чем в 2 раза (с 9,6 до 4,1 мг/г) по сравнению с исходным сырьем. Таким образом, метод Брэдфорда позволяет ввести для описания эффективности технологического процесса еще термин белкового коэф-

фициента суперферментации, равного отношению концентрации белка в готовом Кавендише к исходному сырью (в %%). Для используемых в данной работе образцов данный коэффициент равен 42,7% и характеризует эффективность технологического процесса суперферментации по снижению уровня белков. Косвенно данный коэффициент также, в первом приближении, будет характеризовать количество белков, которые вступили во время технологического процесса в аминосахарные реакции.

ЛИТЕРАТУРА

1. Моисеев, И. В. Теоретические аспекты формирования вкусо-ароматических свойств дыма Кавендиша / И. В. Моисеев, Х. Беренс, М. Б. Мойсеяк [и др.] // Профессиональный индустриальный журнал «ТоЬассо-Ревю» (рег. свид. ПИ N 77-1936 от 15.03.2000). — 2014. — № 2 (71). — С. 44-50.

2. Моисеев, И. В. Комплексное использование инструментальных и органолептических методов контроля качественных характеристик Кавендиша из различных сортотипов табачного сырья — Вирджинии и Бёрли / В. Моисеев, Х. Беренс, М. Б. Мойсеяк [и др.] // Профессиональный индустриальный журнал «ТоЬассо-Ревю» (рег. свид. ПИ N 77-1936 от 15.03.2000). — 2014. — № 3 (72). — С. 46-56.

6 • 2014 ПИВО и НАПИТКИ 51

технология'

Таблица 4

Параметр Тип сырья Исходый Временной период, дни

образец 2 4 6 9 11 13 16 18 20 А, %

Углеводы, % Вирджиния FCV 7,39 5,66 5,36 5,05 5,28 4,58 4,73 4,73 3,83 4,13 i 44,1

Бёрли 0 0 0 0 0,41 0,27 0,27 0,27 0,41 1,40 —

Сахара, % Вирджиния FCV 5,97 4,43 3,68 3,35 3,05 0 0,27 0,27 0 0 —

Бёрли 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 —

Никотин, % Вирджиния FCV 1,99 1,77 1,95 1,80 1,86 1,63 1,73 1,80 1,34 1,77 i 11

Бёрли 1,85 1,60 1,35 1,08 1,32 1,10 1,30 1,13 1,17 1,15 i 37,8

Белки, % Вирджиния FCV 6,88 7,94 8,50 9,19 9,88 11,25 10,44 8,63 10,06 8,63 t 25,4

Бёрли 12,94 10,81 11,56 12,38 12,88 13,88 13,94 13,06 11,69 11,50 i 12,5

Сумма азотосодержащих Вирджиния FCV 8,87 9,71 10,45 10,99 11,74 12,88 12,17 10,43 11,40 10,40 t 17,5

веществ Бёрли 14,79 12,41 12,91 13,46 14,20 14,98 15,24 14,19 12,86 12,65 i 14,5

3. Моисеев, И. В. Дифференцированный анализ изменений в структурах углеводного и кислотного комплексов табачного сырья при изготовлении трубочного табака Кавендиш открытым способом суперферментации / И. В. Моисеев, М. Б. Мойсеяк, В. В. Лёзный [и др.] // Профессиональный индустриальный журнал «ТоЬассо-Ревю» (рег. свид. ПИ N 77-1936 от 15.03.2000). — 2014. — № 4 (73).

4. Кретович, В. Л. Биохимия растений. Учебник. 2-е изд., перераб. и доп. / В. Л. Кре-тович. — М.: Высшая школа, 1986. — 503 с.

5. Junjie Zhang, Chunxia Zhao, Yuwei Chang, Yanni Zhao, Qinghua Li, Xin Lu, Guowang Xu. Analysis of free amino acids in flue-cured tobacco leaves using ultra-high performance liquid chromatography with single quadrupole mass spectrometry. Received April 28, 2013,

revised June 10, 2013, accepted June 10, 2013. J. Sep. Sci. 2013, 36, 2868-2877.

6. Определение органолептических кислот в винодельческой, соковой, алкогольной, безалкогольной и пивоваренной продукции. Методика М 04-47-2012.

7. Уилсон, К. Принципы и методы биохимии и молекулярной биологии. Пер. с англ./ К. Уилсон, Дж. Уолкер — М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2013. — 849 с. ¿S

Ферментативные изменения углеводного и белкового комплекса табачного сырья при изготовлении трубочного табака Кавендиш

Ключевые слова

белковый коэффициент суперферментации; крахмальный коэффициент суперферментации; открытый способ суперферментации; полисахарид; трубочный табак Кавендиш; углеводный и белковый комплекс; ферментативные изменения.

Реферат

Статья посвящена изучению изменений содержания полисахаридов (крахмала) и белковых веществ как в исходном табачном сырье, так и в трубочном табаке Кавендиш, изготовленном открытым способом суперферментации.

Выявлено, что крахмал активно участвует в структуре обмена органических кислот и в синтезе сложных веществ, являющихся продуктами реакции Майера и положительно влияющих на вкус дыма. В статье проведены исследования количественных изменений в составе крахмала, которые важны, поскольку именно полисахариды и продукты их распада скорее всего образуют сахаро-аминный комплекс с белками, что в итоге приводит к уникальным органолептическим свойствам дыма при пиролизе табака Кавендиш. Это позволило сделать выводы, рекомендации и пожелания по коррекции факторов, регулирующих в настоящее время оборот ОТП в РФ.

Авторы

Моисеев Игорь Викторович, д-р техн. наук, профессор;

Еделев Дмитрий Аркадьевич,

д-р экон. наук, д-р мед. наук, профессор;

Мойсеяк Марина Борисовна, канд. техн. наук, доцент;

Лёзный Валерий Владимирович, апирант;

Приходько Роман Петрович, аспирант;

Симдянова Татьяна Петровна, аспирант

Московский государственный университет пищевых производств,

125080, Москва, Волоколамское шоссе, д. 11, sahar@mgupp.ru

Enzymatic Changes in Carbohydrate

and Protein Complex Raw Tobacco

in the Manufacture of Pipe Tobacco Cavendish

Key words

a protein factor superfermentation; starch superfermentation factor; open way superfermentation; polysaccharide; pipe tobacco Cavendish; carbohydrate and protein complex; enzymatic changes.

Abstract

The objects of study of this article is to study changes in the content of polysaccharides (starch) and proteins, both for the initial raw tobacco and for Cavendish.

Estimated that starch is an active participant in the changes of organic acid metabolism and synthesis of complex substances which are the reaction products of Mayer and positively affect the taste of the smoke. The quantitative changes in the starch composition, which is important because it polysaccharides and their degradation products are likely to form a sugar-amine complex with proteins, which eventually leads to unique organoleptic properties of the smoke during pyrolysis Cavendish, and allowed to draw conclusions recommendations and suggestions for correction factors currently governing turnover OTP in Russia.

Authors

Moiseev Igor Viktorovich, Doctor of Technical Science, Professor; Yedelev Dmitriy Arkadievich,

Candidate of Economic Science, Candidate of Medical Science, Professor;

Moyseyak Marina Borisovna, Candidate of Technical Science, Associate Professor;

Liozniy Valeriy Vladimirovich, Post-graduate Student;

Prohodko Roman Petrovich, Post-graduate Student;

Simdiakova Tatiana Petrovna, Post-graduate Student

Moscow State University of Food Production,

11 Volokolamskoe shosse, Moscow, 125080, Russia, sahar@mgupp.ru

52 ПИВО и НАПИТКИ 6 • 2014