Способ прогнозирования неблагоприятного течения увеальной меланомы
METHOD FOR PREDICTION OF UNFAVOURABLE COURSE OF UVEAL MELANOMA

Изобретение относится к медицине, а именно, к офтальмологии и предназначено для прогнозирования неблагоприятного течения увеальной меланомы.
Увеальная меланома (УМ) - злокачественная опухоль нейроэктодермального происхождения, заболеваемость которой в Российской Федерации достигает 13 случаев на 1 млн. взрослого населения [Бровкина А.Ф. Офтальмоонкология. М.: Медицина; 2002; Бровкина А.Ф., Панова И.Е., Саакян С.В. Офтальмоонкология: новое за последние два десятилетия. Вестник офтальмологии. 2014; 130(6): 13-19].
На долю УМ приходится порядка 3% всех меланом [Singh A.D., Turell М.Е., Topham А.К. Uveal melanoma: trends in incidence, treatment, and survival. Ophthalmology. 2011; 118 (9): 1881-1885; Virgili G., Gatta G., Ciccolallo L. et al. Incidence of uveal melanoma in Europe. Ophthalmology. 2007; 114(12): 2309-2315]. Около 90% опухолей локализуется в хориоидее, 6% - в цилиарном теле, 4% - в радужке [Shields C.L., Kaliki S., Furuta M. et al. Clinical spectrum and prognosis of uveal melanoma based on age at presentation in 8,033 cases. Retina. 2012; 32 (7): 1363-1372]. У половины пациентов с УМ развивается метастатическая болезнь [Rietschel P., Panageas K.S., Hanlon С. et al. Variates of survival in metastatic uveal melanoma. J. Clin. Oncol. 2005; 23 (31): 8076-8080; Pons F., Plana M., Caminal J.M. et al. Metastatic uveal melanoma: is there a role for conventional chemotherapy? A single center study based on 58 patients. Melanoma Res. 2011; 21 (3): 217-222].
Одним из проявлений УМ является экссудат, который диагностируют клинически, ультразвуковыми исследованиями, методами флюоресцентной ангиографии и оптической когерентной томографии [Мякошина Е.Б. Флюоресцентная ангиография и оптическая когерентная томография в дифференциальной диагностике начальной меланомы и невусов хориоидеи: дис. … канд. мед. наук. М., 2007:167]. Выявление экссудата указывает на активность опухоли, склонность к малигнизации и раннему метастазированию. Важнейшее значение в его возникновении имеет нарушение активного физиологического процесса обмена веществ в ретинальном пигментном эпителии, мембране Бруха и слое хориокапилляров. Опухоли хориоидеи создают множественные окклюзии капилляров сетчатки с вторичной гипертрофией эндотелиальных клеток сосудов. Вслед за этими явлениями наступает отек или формирование кист из-за расширения внеклеточных пространств серозным экссудатом, ограничивающимся пределами внутреннего плексиформного и внутреннего ядерного слоев сетчатки [Wolter J.R. Fluid state of malignant choroidal melanoma growth presenting as exudative retinal detachment. Ophthalmologica. 1989; 199(1):34-40].
Органосохранное лечение УМ включает методы разрушающей лазеркоагуляции, транспупиллярной термотерапии, брахитерапии, применяемые с целью сохранения глазного яблока не только как косметического, но и функционального органа [Бровкина, А.Ф. Органосохранное лечение внутриглазных опухолей (тенденции развития) / А.Ф. Бровкина // Вестник офтальмологии. - 2003. - №1. - С. 22-25].
Эффективность различных методов лечения злокачественных новообразований, прогноз заболевания в значительной степени зависят от состояния иммунной системы пациента [Quezada S.A., Peggs K.S., Simpson T.R., Allison J.P. Shifting the equilibrium in cancer immunoediting: from tumor tolerance to eradication. Immunol. Rev. 2011; 241 (104-18)].
Развивающаяся опухоль активно защищается от иммунной атаки, используя разнообразные механизмы системной иммуносупрессии, приводящие к истощению пула и понижению активности основных эффекторных клеток - компонентов адаптивного иммунитета и врожденной системы противоопухолевого надзора [Ярилин А.А. Иммунология. М.: ГОЭТАР: Медиа; 2010].
Нарушения в иммунной системе, в частности, субпопуляционном составе лимфоцитов периферической крови, были выявлены у больных с различными новообразованиями, в том числе при меланоме кожи. Так, при прогрессировании этой опухоли отмечаются увеличение количества регуляторных Т-клеток (Трег), снижение показателей пролиферативной и цитотоксической активности CD3+CD8+Т-цитотоксических лимфоцитов, также уменьшение количества и подавление функций натуральных киллеров (NK) - клеток [Houghton A.N., Gold J.S., Blachere N.E. Immunity against cancer: lessons learned from melanoma. Curr Opin Immunol. 2001; 13 (134-40); Черткова А.И., Славина Е.Г., Жукова Л.Г., Ганьшина И.П., Окружнова М.А., Шоуа Э.К., Нуртдинова В.А., Борунова А.А., Кадагидзе З.Г. Субпопуляционный состав лимфоцитов при Her2-положительном и трижды - негативном раке молочной железы. Российский биотерапевтический журнал. 2015; 14 (2):47-52].
Выбор лечебной тактики при УМ определяется прогнозом течения заболевания. В настоящее время официально признаны 16 клинико-морфологических критериев прогноза меланомы сосудистой оболочки. Основными являются: размеры, локализация, тип гистологического строения опухоли, степень склеральной инвазии, наличие или отсутствие очагов эпибульбарного роста, факт соприкосновения края опухоли с ДЗН или факт распространения переднего края опухоли кпереди за экватор, присутствие субретинальной жидкости, характер или тип ангиогенеза, показатели клеточной пролиферации (например, митотический индекс), возраст пациента, количество и состав тумор-инфильтрирующих лимфоцитов в строме опухоли, присутствие генетических аберраций; характер и спектр экспрессии меланома-ассоциированных антигенов, уровень экспрессии активаторов и ингибиторов плазминогена и уровень их рецепции [Мооу С.М. De Yong PTVM. Prognostic parameters in uveal melanoma: a review. Surv. Opthalmol, 1996, 41:215-228]. Чувствительность и специфичность каждого из прогностических критериев и их различных комбинаций колеблется от 40% до 76%. Это означает, что при отборе пациентов с меланомой в группу высокого риска развития метастазов по указанным критериям последние разовьются практически только у каждого второго.
Известны способы прогнозирования течения увеальной меланомы хориоидеи по уровню показателей сыворотки крови и слезной жидкости: интерферона-гамма (RU 2157998, 20.10.2000); фактора некроза опухоли альфа (RU 2193200, 20.11.2002); по иммуногистохимическому анализу клеток удаленной опухоли с определением процента иммунопозитивных клеток, экспрессирующих рецептор Flt в ядре (RU 2193200, 20.11.2002). Однако эти способы являются довольно трудоемкими и дорогостоящими.
Известен способ прогнозирования течения увеальной меланомы на основе данных ультразвукового исследования в В-режиме с биометрическим определением элевации опухоли, в режиме цветового картирования или энергетической допплерографии - степени васкуляризации меланомы, в режиме спектральной допплерографии - средней величины периферического сосудистого сопротивления в новообразованном русле с вычислением суммарной кодовой величины по определенной формуле (RU 2280410, 27.07.2006). Данный способ принят за ближайший аналог.
В основе предлагаемого нами изобретения лежала идея выявления связи наличия экссудата в зоне опухоли, сопредельной области и макуле при УМ и уровня абсолютного и относительного числа Т-цитотоксических лимфоцитов с фенотипом CD3+ CD8+ в периферической крови.
Наличие экссудата диагностировали клинически, ультразвуковыми исследованиями и методом оптической когерентной томографии (ОКТ).
Задачей настоящего изобретения является разработка прогнозирования неблагоприятного течения УМ на основе морфометрических исследований и и оценки иммунного статуса пациента.
Техническим результатом предлагаемого способа является выбор своевременного, адекватного лечения УМ.
Технический результат достигается за счет выявления наличия экссудата и определения количества абсолютного и относительного числа Т-цитотоксических лимфоцитов с фенотипом CD3+ CD8+ в периферической крови.
Нами проведены клинические и инструментальные исследования (ультразвуковые методы и ОКТ) по выявлению наличия или отсутствия экссудата при УМ у 56 пациентов в возрасте 53,7±12,2 года с разными стадиями опухоли (малые - 17 больных, средние - 13 пациентов, большие - 26 пациента). Стадию УМ определяли по проминенции и диаметру основания с помощью ультразвукового исследования.
До лечения у всех 56 исследуемых пациентов с УМ выявили экссудат в зоне опухоли, сопредельной области и макуле и подсчитали количество абсолютного и относительного числа Т-цитотоксических лимфоцитов с фенотипом CD3+ CD8+ в периферической крови.
9
Несмотря на наличие экссудата в зоне опухоли, сопредельной области и макуле при УМ у 27 из 84 пациентов выявлен низкий уровень в крови абсолютного числа - менее 0,4×10/л и относительного содержания менее 22% от общего количества лимфоцитов периферической крови Т-цитотоксических лимфоцитов с фенотипом CD3+ CD8+. У таких пациентов в последующем отмечалось благоприятное течение заболевания после проведенного лечения.
9
У остальных пациентов (29 из 56) отмечено повышение в крови абсолютного числа более 0,4×10/л и относительного содержания более 22% от общего количества лимфоцитов периферической крови Т-цитотоксических лимфоцитов с фенотипом CD3+ CD8+. Пациентов наблюдали и при наличии до лечения экссудата и повышения в крови абсолютного числа более 0,4x109/л и относительного содержания более 22% от общего количества лимфоцитов периферической крови Т-цитотоксических лимфоцитов с фенотипом CD3+ CD8+до операции через 4 месяца после лечения отмечали неблагоприятное течение заболевания в виде гемофтальма, усиления вторичной отслойки сетчатки, продолженного роста. Это потребовало проведения курса рассасывающей терапии и/или проведения дополнительных сеансов лечения.
В зависимости от стадии опухоли больным проводили транспупиллярную термотерапию (при малых опухолях) и брахитерапию (при средних и больших УМ).
Таким образом, у пациентов при наличии экссудата и выявлении в крови повышения абсолютного числа и относительного количества в периферической крови Т-цитотоксических лимфоцитов с фенотипом CD3+ CD8+ отмечали неблагоприятное течение УМ.
Таким образом, была установлена связь между наличием экссудата и уровнем абсолютного числа и относительного содержания от общего количества лимфоцитов периферической крови Т-цитотоксических лимфоцитов с фенотипом CD3+ CD8+. Данные ультразвукового исследования не позволили выявить такие зависимости с тяжестью течения заболевания.
9
Способ осуществляют следующим образом. У пациента с диагнозом УМ определяют наличие экссудата и абсолютного относительного количества Т-цитотоксических лимфоцитов с фенотипом CD3+ CD8+ в периферической крови. При наличии экссудата в зоне опухоли, сопредельной области и макуле, при содержании Т-цитотоксических лимфоцитов с фенотипом CD3+ CD8+ более 0,4×10/л и относительном содержании более 22% прогнозируют неблагоприятное течение.
Материалом исследования иммунологических показателей служили пробы цельной крови, взятой из локтевой вены натощак в утренние часы (с 9.00-10.00 ч) при помощи вакуумных систем в пробирки Vacuette с антикоагулянтом K3EDTA. Иммунофенотипирование проводили методом проточной лазерной цитофлуориметрии на цитометре BD FACSCanto II (Becton Dickinson, США) с использованием системы моноклональных антител Multitest 6-Color TBNK Reagent в пробирках BD TruCount (Becton Dickinson, США). Лизис эритроцитов и фиксацию лейкоцитов производили с помощью лизирующего раствора BD FACSTM Lysing Solution (Becton Dickinson, США). Относительное и абсолютное содержание популяций и субпопуляций лимфоцитов определяли в программе Canto (Becton Dickinson, США). Использовали меченые флуорохромами антитела к CD3+(FITC), CD8+ (APC-CY7*), позволяющие дифференцировать Т-цитотоксические (CD3+, CD8+) лимфоциты.
В зависимости от абсолютного и относительного содержания периферической крови Т-цитотоксических лимфоцитов с фенотипом CD3+ CD8+ и наличия экссудата прогнозируют течение УМ. После этого решают вопрос о методе лечения УМ и необходимости сопроводительной терапии.
Пример 1. Пациент Б., 56 лет обратился с жалобами на появление искажения формы предметов перед правым глазом.
Проведенные офтальмологические исследования:
Визометрия: Visus OD - 0,6 н.к.,
Visus OS - 1,0.
Тонометрия: ВГД OD - 17 мм. рт.ст., OS - 17 мм. рт.ст.
Биомикроскопия: OD - спокоен, среды прозрачны,
Прямая офтальмоскопия:
OD - На глазном дне - ДЗН бледно-розовый, границы четкие. В парамакулярной зоне по меридианам с 10 до 12 часов определяется проминирующее образование аспидного цвета, с нечеткими, неровными границами, гладкой поверхностью. На поверхности опухоли экссудат.
OS - ДЗН бледно-розовый, границы четкие. В макулярной зоне - рефлекс четкий. На периферии очаговой патологии не выявлено.
Эхография:
OD - «+» - ткань с проминенцией 2,5 мм, диаметром основания 10 мм,
OS - «+» - ткань не определяется.
Проведены УЗИ и ОКТ. Подтверждено наличие экссудата в зоне опухоли, сопредельной области и макуле.
Взята цельная кровь из локтевой вены натощак в утренние часы (с 9.00-10.00 ч) при помощи вакуумных систем в пробирки Vacuette с антикоагулянтом K3EDTA. Иммунофенотипирование проводили методом проточной лазерной цитофлуориметрии на цитометре BD FACSCanto II (Becton Dickinson, США) с использованием системы моноклональных антител Multitest 6-Color TBNK Reagent в пробирках BD TruCount (Becton Dickinson, США). Лизис эритроцитов и фиксацию лейкоцитов производили с помощью лизирующего раствора BD FACSTM Lysing Solution (Becton Dickinson, США). Относительное и абсолютное содержание популяций и субпопуляций лимфоцитов определяли в программе Canto (Becton Dickinson, США). Использовали меченые флуорохромами антитела к CD3+(FITC), CD8+ (APC-CY7*), позволяющие дифференцировать Т-цитотоксические (CD3+, CD8+) лимфоциты.
9
В крови обнаружено пониженное абсолютное, менее 0,4×10/л и относительное количество, менее 22%, Т-цитотоксических лимфоцитов с фенотипом CD3+ CD8+. Таким образом, выявленный экссудат в зоне опухоли, сопредельной области и макуле и сниженное абсолютное и относительное содержание в крови Т-цитотоксических лимфоцитов с фенотипом CD3+ CD8+, свидетельствуют о благоприятном течении УМ. Проведена транспупиллярная термотерапия.
Через 4 месяца наблюдения отмечали хориоретинальный рубец, что подтверждает правильность прогноза при проведения морфометрических исследований и анализа абсолютного и относительного числа Т-цитотоксических лимфоцитов с фенотипом CD3+ CD8+ в цельной крови.
Пример 2. Пациентка Ж., 39 лет обратилась с жалобами на появление искажения формы предметов перед правым глазом.
Проведенные офтальмологические исследования:
Визометрия: Visus OD - 0,5 н.к.,
Visus OS - 1,0.
Тонометрия: ВГД OD - 16 мм. рт.ст., OS - 16 мм. рт.ст.
Биомикроскопия: OD - спокоен, среды прозрачны, Прямая офтальмоскопия:
OD - ДЗН бледно-розовый, границы четкие. В макулярной зоне - рефлекс четкий. На периферии очаговой патологии не выявлено.
OS - На глазном дне - ДЗН бледно-розовый, границы четкие. В парамакулярной зоне кверху от макулы по меридианам с 12 до 3 часов определяется проминирующее образование серого цвета, с нечеткими, неровными границами, гладкой поверхностью. На поверхности опухоли экссудат, вторичная отслойка сетчатки.
Эхография:
OD - «+» - ткань не определяется,
OS - «+» - ткань с проминенцией 3,7 мм, диаметром основания 12 мм.
Проведены УЗИ и ОКТ. Подтверждено наличие экссудата в зоне опухоли, сопредельной области и макуле.
Взята цельная кровь из локтевой вены натощак в утренние часы (с 9.00-10.00 ч) при помощи вакуумных систем в пробирки Vacuette с антикоагулянтом K3EDTA. Иммунофенотипирование проводили методом проточной лазерной цитофлуориметрии на цитометре BD FACSCanto II (Becton Dickinson, США) с использованием системы моноклональных антител Multitest 6-Color TBNK Reagent в пробирках BD TruCount (Becton Dickinson, США). Лизис эритроцитов и фиксацию лейкоцитов производили с помощью лизирующего раствора BD FACSTM Lysing Solution (Becton Dickinson, США). Относительное и абсолютное содержание популяций и субпопуляций лимфоцитов определяли в программе Canto (Becton Dickinson, США). Использовали меченые флуорохромами антитела к CD3+(FITC), CD8+ (APC-CY7*), позволяющие дифференцировать Т-цитотоксические (CD3+,CD8+) лимфоциты.
9
В крови пациента выявлено высокое абсолютное, более 0,4×10/л и относительное количество, более 22%, Т-цитотоксических лимфоцитов с фенотипом CD3+ CD8+, что свидетельствовало о неблагоприятном течении УМ. Поэтому необходимым оказалось проведение брахитерапии.
Через 4 месяца наблюдения отмечали сохранение остаточной опухоли, наличие гемофтальма, усиление вторичной отслойки сетчатки. Таким образом, выявление экссудата при УМ в сочетании с высоким уровнем абсолютного числа и относительного содержания от общего количества лимфоцитов периферической крови Т-цитотоксических лимфоцитов с фенотипом CD3+ CD8+ свидетельствовало о неблагоприятном течении УМ. Рекомендован дополнительный курс рассасывающей и дегидратационной терапии.
Таким образом, способ позволяет адекватно оценить прогноз течения УМ с целью планирования адекватного органосохраняющего лечения.
Пример 3. Пациентка В., 43 года обратилась с жалобами на появление искажения формы предметов перед правым глазом.
Проведенные офтальмологические исследования:
Визометрия: Visus OD - 0,3 н.к.,
Visus OS - 1,0.
Тонометрия: ВГД OD - 16 мм. рт.ст., OS - 16 мм. рт.ст.
Биомикроскопия: OD - спокоен, среды прозрачны,
Прямая офтальмоскопия:
OD - ДЗН бледно-розовый, границы четкие. В макулярной зоне - рефлекс четкий. На периферии очаговой патологии не выявлено.
OS - На глазном дне - ДЗН бледно-розовый, границы четкие. В парамакулярной зоне по меридианам с 2 до 5 часов определяется проминирующее образование серого цвета, с нечеткими, неровными границами, гладкой поверхностью. На поверхности опухоли экссудат в зоне опухоли, сопредельной области и макуле, вторичная отслойка сетчатки.
Эхография:
OD - «+» - ткань не определяется,
OS - «+» - ткань с проминенцией 3,8 мм, диаметром основания 14 мм.
Проведены УЗИ и ОКТ. Подтверждено наличие экссудата в зоне опухоли, сопредельной области и макуле.
Взята цельная кровь из локтевой вены натощак в утренние часы (с 9.00-10.00 ч) при помощи вакуумных систем в пробирки Vacuette с антикоагулянтом K3EDTA. Иммунофенотипирование проводили методом проточной лазерной цитофлуориметрии на цитометре BD FACSCanto II (Becton Dickinson, США) с использованием системы моноклональных антител Multitest 6-Color TBNK Reagent в пробирках BD TruCount (Becton Dickinson, США). Лизис эритроцитов и фиксацию лейкоцитов производили с помощью лизирующего раствора BD FACSTM Lysing Solution (Becton Dickinson, США). Относительное и абсолютное содержание популяций и субпопуляций лимфоцитов определяли в программе Canto (Becton Dickinson, США). Использовали меченые флуорохромами антитела к CD3+(FITC), CD8+ (APC-CY7*), позволяющие дифференцировать Т-цитотоксические (CD3+,CD8+) лимфоциты. В периферической крови пациентки выявлено высокое абсолютное, более 0,4×10/л и относительное количество, более 22%, Т-цитотоксических лимфоцитов с фенотипом CD3+ CD8+, что указывало на неблагоприятное течение УМ.
Проведена брахитерапия и в раннем послеоперационном периоде назначен курс местной и общей дегидратационной, рассасывающей и противовоспалительной терапии.
Через 4 месяца наблюдения отмечали сохранение остаточной опухоли без экссудативных и геморрагических проявлений. Таким образом, выявление экссудата при УМ в сочетании с высоким уровнем абсолютного количества и относительного содержания от общего количества лимфоцитов периферической крови Т-цитотоксических лимфоцитов с фенотипом CD3+ CD8+ свидетельствуют о неблагоприятном течении УМ. Это диктует необходимость комбинированной лучевой терапии и интенсивной медикаментозной терапии в раннем послеоперационном периоде.
Таким образом, способ позволяет адекватно оценить прогноз течения УМ с целью планирования адекватного органосохраняющего лечения.