СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОВОМУКОИДА
METHOD OF PRODUCING OVOMUCOID

Изобретение относится к области биохимии и медицины, а именно к способу получения из белка утиных яиц овомукоида, который является эффективным ингибитором протеолитических ферментов и может быть использован для создания антипротеиназных лекарственных препаратов, биоспецифических сорбентов для удаления протеолитических ферментов из биологических жидкостей, включая кровь, для получения стабилизированных белковых препаратов и высокоочищенных протеолитических ферментов, а также для получения носителей полипептидных лекарственных препаратов с повышенной устойчивостью к действию пищеварительных ферментов.
Известен способ получения овомукоида (Авторское свидетельство СССР №1404513, Бюл. №23, 1988), который состоит в добавлении к белку утиных яиц равного объема смеси 0,5 М водного раствора трихлоруксусной кислоты и органического растворителя в объемном отношении 1:1,8-2,3, отделении образующегося осадка фильтрованием при 0-5°С, добавлении к фильтрату органического растворителя в объемном отношении органического растворителя и фильтрата 3-3,5:1, удалении надосадочной жидкости декантированием при 0-5°С, удалении низкомолекулярных примесей из овомукоида и лиофильном высушивании овомукоида. В качестве органического растворителя используют этанол, а удаление низкомолекулярных примесей из овомукоида проводят путем диализа против дистиллированной воды.
Известный способ позволяет получать овомукоид с выходом 0,89-1,06 г на 100 мл белка утиных яиц и степенью чистоты овомукоида 85-91%.
Цель изобретения - повышение выхода и степени чистоты овомукоида.
Поставленная цель достигается тем, что в способе получения овомукоида, который состоит в добавлении к белку утиных яиц равного объема смеси 0,5 М водного раствора трихлоруксусной кислоты и органического растворителя в объемном отношении 1:1,8-2,3, отделении образующегося осадка фильтрованием при 0-5°С, добавлении к фильтрату органического растворителя в объемном отношении органического растворителя и фильтрата 3-3,5:1, удалении надосадочной жидкости декантированием при 0-5°С, удалении низкомолекулярных примесей из овомукоида и лиофильном высушивании овомукоида, в качестве органического растворителя используют смесь этанола и ацетона в объемном отношении 40-65:60-35, а удаление низкомолекулярных примесей из овомукоида проводят путем ультрафильтрации.
Пример 1
Яйца утки разбивают и отделяют белок от желтка. К 300 мл яичного белка при комнатной температуре (18-22°С) и перемешивании добавляют 300 мл смеси 107,15 мл 0.5 М водного раствора трихлоруксусной кислоты и 193 мл смеси этанола (125,5 мл) и ацетона (67,5 мл) (объемное отношение равно 65:35). Объемное отношение водного раствора трихлоруксусной кислоты и указанного растворителя - 1:1,8.
После добавления всего количества смеси реакционную массу дополнительно перемешивают в течение 1 часа при 0°С. Выпавший осадок отфильтровывают и отбрасывают. К фильтрату добавляют 1960 мл смеси этанола и ацетона указанного выше состава при объемном отношении фильтрата к смеси этанола и ацетона, равном 3,5:1, и смесь оставляют стоять на сутки при 0°С для более полного осаждения овомукоида. Затем надосадочную жидкость удаляют декантированием при 0°С, осадок растворяют в 150 мл дистиллированной воды и раствор помещают в ячейку объемом 250 мл аппарата для ультрафильтрации Amicon (США). Ультрафильтрацию проводят при давлении 3 атм в течение 1 часа, используя мембрану UM-10 (Amicon). Затем в ячейку добавляют 100 мл дистиллированной воды и операцию повторяют 3 раза до полного удаления низкомолекулярных примесей. Контроль за полнотой удаления проводят спектрофотометрически, измеряя оптическую плотность промывных вод при 280 нм. Раствор овомукоида переносят в аппарат для лиофильной сушки и высушивают. Получают 4,31 г овомукоида (1,44 г на 100 мл яичного белка).
350
280
Оценку качества выделенного овомукоида проводят следующим образом. Сначала готовят раствор красителя. Для этого 60 мг Кумасси бриллиант (Coomassie Brilliant Blue G) растворяют в 50 мл этанола и перемешивают в течение нескольких часов. К раствору добавляют 100 мл 85%-ной фосфорной кислоты, доводят до 1000 мл водой и фильтруют. Краску выдерживают в течение суток, а затем доводят концентрацию красителя до 0.005% (E=0.6 для кюветы с оптическим путем 1 см). Затем к 1000 мл раствора красителя добавляют 1 мл раствора додецилсульфата натрия - SDS (3.003 г SDS/100 мл). Для проведения измерения 0.1 мл раствора овомукоида смешивают с 2 мл раствора красителя, смесь инкубируют 10-60 минут при комнатной температуре и измеряют оптическую плотность раствора при 595 нм. Концентрацию овомукоида рассчитывают по предварительно построенной калибровке с бычьим сывороточным альбумином (БСА). Стандартный раствор БСА получают растворением 5 мг БСА в 5 мл дистиллированной воды. Для расчета концентрации БСА измеряют оптическую плотность раствора при 280 нм и используют формулу [БСА] мг/мл=А×1.49.
Выделенный препарат овомукоида содержит 98,9% белка и 1,1% связанной воды.
Определение степени чистоты овомукоида проводят путем изучения природы N-концевой аминокислоты (гомогенный белок должен содержать только одну N-концевую аминокислоту). 30 мкл раствора овомукоида в 0.1 М бикарбонате натрия (общее количество белка равно 1 нмоль) помещают в ампулу и добавляют 30 мкл раствора дансил хлорида (dansyl chloride) в ацетоне (6 мг/мл). Смесь инкубируют 45 минут при 37°С. Затем смесь упаривают досуха в вакууме при 50°С. К остатку добавляют 50 мкл 5,7 N HCl, содержимое ампулы замораживают жидким азотом, ампулу вакуумируют и выдерживают 16 часов при 105°С для полного кислотного гидролиза дансилированного белка. Затем ампулу вскрывают, кислоту удаляют выпариванием в вакууме при 50°С. К остатку добавляют 20 мкл воды и высушивают в тех же условиях. Затем остаток растворяют в минимальном количестве ацетона и анализируют дансильные производные аминокислот HPLC в обращенной фазе на колонке Superspher RP 6 (125×2 мм, Merk, Германия), используя линейный градиент 60% ацетонитрила, содержащего 0.1% трифторуксусной кислоты.
Содержание дансил-валина составляет более 0,995 нмоль, т.е. степень чистоты овомукоида составляет более 99,5%.
Пример 2
Процесс проводят по примеру 1, используя различные соотношения компонентов. Параметры процесса и свойства полученного продукта приведены в таблице.
Пример 3
Процесс проводят по примеру 1, используя различные соотношения компонентов и на всех стадиях вместо температуры 0°С используют температуру 5°С. Параметры процесса и свойства полученного продукта приведены в таблице.
Примеры 4-5 (контрольные)
Процесс проводят по примеру 1, используя соотношения компонентов, лежащие вне заявленных пределах. Параметры процесса и свойства полученного продукта приведены в таблице.
Таблица
Параметры процесса получения овомукоида и характеристики конечного продукта
№ примера
Объемное отношение этанол:ацетон
Объемное отношение 0.5 М раствор ТХУ*:смесь этанола и ацетона
Объемное отношение фильтрат:смесь этанола и ацетона
Выход овомукоида, г/100 мл яичного белка
Степень чистоты овомукоида, %
1
65:35
1:1,8
3,5:1
1,44
>99,5
2
50:50
1:2,3
3,2:1
1,53
>99,5
3
40:60
1:2,0
3,0:1
1,66
>99,6
4 (к)
70:30
1:2,2
3,4:1
1,13
95,1
5 (к)
30:70
1:2,2
3,4:1
1,22
94,8
6 (прототип)
Этанол=100%
1:1,8-2,3
3,0-3,5:1
0,89-1,06
85-91
* - ТХУ - трихлоруксусная кислота.
Использование предложенного способа позволяет получать овомукоид со степенью чистоты до 99,6% и выходом до 1,66 г на 100 мл белка утиных яиц. Замена диализа на ультрафильтрацию существенно ускоряет процесс выделения овомукоида (часы вместо суток) и способствует повышению выхода овомукоида. Выбор состава органического растворителя обусловлен тем, что при увеличении количества ацетона в смеси выше 60% резко снижается степень чистоты овомукоида (до 95%) при выходе до 1,2 г на 100 мл белка, а при увеличении количества этанола в смеси выше 65% снижается выход овомукоида до 1,1 г на 100 мл белка и степень его чистоты (до 95%).
Таким образом, предложенный способ позволяет более эффективно использовать сырье, то есть снизить стоимость самого овомукоида и продуктов на его основе, интенсифицировать процесс, а главное, существенно повысить степень чистоты овомукоида, то есть повысить ингибиторную активность овомукоида в расчете на единицу массы и избежать нежелательных реакций при использовании овомукоида в качестве лекарственного препарата, обусловленных большим количеством (до 9%) неидентифицированных примесей.