ИММУНОФЕРМЕНТНАЯ ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВЕРОЯТНЫХ СРОКОВ ЗАРАЖЕНИЯ ВИРУСОМ ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА 1 ТИПА (ВИЧ-1), В ТОМ ЧИСЛЕ ВИЧ-1 ГРУППЫ О, В СЫВОРОТКЕ (ПЛАЗМЕ) КРОВИ ЧЕЛОВЕКА "ДС-ИФА-ВИЧ-АТ-СРОК"
DS-IFA-VICH-AT-SROK ENZYME IMMUNOASSAY SYSTEM FOR DETERMINING PROBABLE TIME OF INTRODUCTION OF TYPE 1 HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS (HIV-1) INFECTION, INCLUDING GROUP O HIV-1 IN HUMAN SERUM (PLASMA)

ИЗОБРЕТЕНИЕ относится к области биотехнологии и медицины. И может быть использовано для определения вероятных сроков заражения вирусом иммунодефицита человека 1 типа (ВИЧ-1), в том числе ВИЧ-1 группы О, в сыворотке (плазме) крови человека.
Распространение ВИЧ-инфекции остается реальной проблемой современного мира. Поскольку своевременная и качественная диагностика является реальным средством для сокращения ареала распространения ВИЧ-инфекции, то разработка эффективной тест-системы, способной определить вероятный срок инфицирования, является важной задачей современного общества.
2
Анализ уровня техники показал существование ряда способов и тестов, предложенных разными авторами, для определения стадий ВИЧ-инфекции с использованием различных методов. Известен, например, молекулярно-генетический тест, основанный на определении вирусной нагрузки периферической крови методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) (Кравченко А.В., Серебровская Л.В., Голохвостова Е.Л. и др. Тимазид в сочетании с хивидом и инвиразой в комплесной терапии больных с ВИЧ-инфекцией. - Эпидемиология и инфекционные болезни. - 1998. - №5 - с.51-52). Известен способ оценки стадий ВИЧ-инфекции (Клиническая иммунология и аллергология под ред. Г.Лолора-младшего. - М.: Практика, 2000. - С.585-587), заключающийся в определении уровня сывороточного β-микроглобулина. Описан способ диагностики стадий ВИЧ-инфекции (В.В.Покровский с соавт. "Клиническая диагностика и лечение ВИЧ-инфекции". - М.: ГОУ ВУНМЦ РФ, 2001. - С.11), заключающийся в определении абсолютного количества CD4+лимфоцитов периферической крови. Также известен способ диагностики стадий ВИЧ-инфекции, основанный на том, что при исследовании сыворотки крови пациента методом иммуноферментного анализа (ИФА) определяют оптическую плотность (ОП) исходного образца сыворотки крови, отражающую уровень ВИЧ-специфических антител, и ОП исходного образца сыворотки, инкубированного в течение 10 минут со 100 мкл 3.5 М раствора изотиоционата натрия. При снижении ОП на 40% и менее диагностируют стадию А - генерализованной лимфаденопатии, при снижении ОП в интервале 40-60% - стадию В - бациллярного ангиоматоза, орофарингеального кандидоза и т.д., а при снижении ОП на 60% и более - стадию С - СПИД (RU 2251701).
Таким образом, проведенный анализ уровня техники показал, что ни один из существующих источников не может служить ближайшим аналогом к заявляемому изобретению, так как все указанные документы относятся к способам и тестам, определяющим стадию ВИЧ-инфекции, и ни один из описанных источников не содержит технических решений, направленных на определение вероятного временного интервала заражения. Заявляемое изобретение относится к тест-системе, определяющей вероятный срок заражения ВИЧ-инфекцией. Анализ уровня техники не выявил аналогичных решений, направленных на решение поставленной задачи.
В настоящем изобретении заявляется набор реагентов «ДС-ИФА-ВИЧ-АТ-СРОК» для определения вероятных сроков заражения вирусом иммунодефицита человека 1 типа (ВИЧ-1), в том числе ВИЧ-1 группы О, в сыворотке (плазме) крови человека. Тест предназначен для дополнительного исследования ВИЧ-позитивных образцов с подтвержденным положительным результатом в иммунном блоте. Возможно исследование образцов с неопределенным или негативным результатом исследования в иммунном блоте, в которых подтверждено наличие ВИЧ РНК и/или антигена р24 ВИЧ-1.
В настоящем изобретении заявляется также способ использования данным набором реагентов «ДС-ИФА-ВИЧ-АТ-СРОК» для определения вероятных сроков заражения вирусом иммунодефицита человека 1 типа (ВИЧ-1), в том числе ВИЧ-1 группы О, в сыворотке (плазме) крови человека.
Техническим результатом заявленного изобретения является определение вероятных сроков заражения вирусом иммунодефицита человека 1 типа (ВИЧ-1), в том числе ВИЧ-1 группы О, простота выполнения теста, что позволяет использовать заявленное изобретение для эпидемиологического надзора за динамикой распространения ВИЧ-инфекции, за динамикой выявления сероконверторов в определенной популяции (поло-возрастные, социальные группы населения), а также при эпидемиологическом расследовании случаев и очагов ВИЧ-инфекции.
Сущность предлагаемого технического решения состоит в том, что определение вероятного срока заражения ВИЧ-1 проводят с помощью тест-системы, которая включает иммуносорбент на основе антигенов вируса иммунодефицита человека 1 типа (env ВИЧ-1 и ВИЧ-1 группы О), раствор для разведения образцов (РРС) и детектирующие реагенты (конъюгаты, хромоген/субстрат). Исследуемые образцы тестируются нативными и разведенными в растворе для разведения образцов. По результатам тестирования образцы подразделяются на «ранние» и «поздние». «Ранние» образцы - вероятный срок инфицирования до 9 месяцев от момента заражения, «поздние» образцы - вероятный срок инфицирования 9 и более месяцев от момента заражения. Принадлежность образца к «ранним» или «поздним» оценивается по проценту падения оптической плотности (ОП) разведенного образца по отношению к неразведенному.
Примеры
Данные примеры служат для иллюстрации конкретных воплощений изобретения и не направлены на сужение прав заявителя. Под объем прав заявителя подпадают все возможные варианты изобретения, в том числе и не приведенные в данном разделе.
Пример 1
В качестве иммуносорбента используются рекомбинантные антигены, содержащие иммунодоминантные регионы env ВИЧ-1 и ВИЧ-1 группы О. Конъюгат-1 - это смесь рекомбинантных антигенов gp41 ВИЧ-1 и gp41 ВИЧ-1 группы О, конъюгированных с биотином. На первом этапе исследуемые образцы, контрольные образцы и их разведения 1:101, а также РРС инкубируют с конъюгатом-1. Специфические антитела, присутствующие в исследуемых и контрольных положительных образцах, связываются с антигенами, сорбированными в лунках микропланшета, и антигенами, конъюгированными с биотином, и образуют устойчивые комплексы. Избыток образцов и конъюгата-1 удаляется при промывке. На следующем этапе в лунки добавляется стрептавидин, конъюгированный с пероксидазой хрена (конъюгат-2). Конъюгат-2 связывается с комплексом антиген-антитело-антиген, присутствующим в лунке. Избыток конъюгата-2 удаляется промывкой, и затем в лунки добавляется хромоген/субстрат. В лунках со связавшимся конъюгатом-2 развивается голубое окрашивание, которое сменяется на желтое при добавлении стоп-раствора. Учет результатов проводится при помощи спектрофотометра.
Пример 2
В качестве иммуносорбента используются рекомбинантные антигены, содержащие иммунодоминантные регионы env ВИЧ-1 и ВИЧ-1 группы О. Используется один конъюгат - смесь рекомбинантных антигенов gp41 ВИЧ-1 и gp41 ВИЧ-1 группы О, конъюгированных с пероксидазой хрена. В процессе анализа образцы, контроли и их разведения, а также РРС инкубируют с конъюгатом в покрытых антигенами лунках планшета. Образующийся устойчивый комплекс после удаления избытка образца и конъюгата проявляется добавлением хромогена/субстрата. При этом развивается голубое окрашивание, которое сменяется на желтое при добавлении стоп-раствора. Учет результатов проводится при помощи спектрофотометра.
Принадлежность исследуемых образцов к «ранним» или «поздним» оценивается по % падения ОП при разведении образца, который рассчитывается по формуле:
<mrow><mi>%</mi><mtext> </mtext><mi>п</mi><mi>а</mi><mi>д</mi><mi>е</mi><mi>н</mi><mi>и</mi><mi>е</mi><mtext> </mtext><mi>О</mi><mi>П</mi><mo>=</mo><mn>100</mn><mi>%</mi><mo>−</mo><mfrac><mrow><mi>О</mi><mi>П</mi><mtext> </mtext><mi>р</mi><mi>а</mi><mi>з</mi><mi>в</mi><mi>е</mi><mi>д</mi><mo>.</mo><mi>о</mi><mi>б</mi><mi>р</mi><mi>а</mi><mi>з</mi><mi>ц</mi><mi>а</mi><mo>−</mo><mi>О</mi><mi>П</mi><mi>с</mi><mi>р</mi><mo>.</mo><mtext> </mtext><mi>Р</mi><mi>Р</mi><mi>С</mi></mrow><mrow><mi>О</mi><mi>П</mi><mtext> </mtext><mi>ц</mi><mi>е</mi><mi>л</mi><mi>ь</mi><mi>н</mi><mi>о</mi><mi>г</mi><mi>о</mi><mtext> </mtext><mi>о</mi><mi>б</mi><mi>р</mi><mi>а</mi><mi>з</mi><mi>ц</mi><mi>а</mi></mrow></mfrac><mo>×</mo><mn>100</mn><mi>%</mi></mrow>
,
где ОПср. РРС - среднее значение ОП РРС (рассчитывается по нескольким значениям ОП РРС).
Исследуемые образцы расценивать как «ранние»: если падение ОП>40%.
Исследуемые образцы расценивать как «поздние»: если падение ОП≤40%.
Пример расчета % падения ОП при разведении образца приведен в таблице 1.
Таблица 1
Результаты тестирования ВИЧ-позитивных образцов сыворотки/плазмы крови, установленные по % падения ОП при разведении образца
Порядковый номер образца
ДС-ИФА-ВИЧ-АТ-СРОК
ОП цельного образца
ОП разведенного образца
ОПср. РРС
% падения ОП
результат тестирования
10
3,189
3,071
0,054
5,4
поздний
11
3,117
2,999
0,054
5,5
поздний
38
2,964
0,062
0,048
99,5
ранний
39
3,187
0,487
0,048
86,2
ранний
Для учета и обработки результатов удобно использовать программу Excel. Использование данного приложения позволит проводить расчеты автоматически. Программа для обработки результатов тестирования находится на диске, приложенном к набору, или ее можно найти на сайте компании.
При разработке и оценке теста использовались образцы сероконверсионных панелей (BBI, Inc., Zeptometrix, США) и ВИЧ-позитивные образцы сывороток (плазмы) крови с установленными вероятными сроками заражения. Вероятность правильного определения давности заражения вирусом иммунодефицита человека 1 типа (ВИЧ-1), в том числе ВИЧ-1 группы О, установленная по сероконверсионным панелям, составляет 100% (данные представлены в таблице 2), по образцам сывороток лиц с условно установленным сроком заражения (n=129) составляет 94% (таблицы 3, 4; данные приведены частично).
Таблица 2
Результаты тестирования ВИЧ-позитивных образцов сыворотки/плазмы крови, установленные по сероконверсионным панелям
Сероконверсионная панель
Дни с первого забора крови
Результат тестирования в «ДС-ИФА-ВИЧ-АТ-СРОК»
BBI PRB 914
31
«ранние»
BBI PRB 916
35
«ранние»
BBI PRB 925
49
«ранние»
BBI PRB 929
28
«ранние»
BBI PRB 930
10
«ранние»
BBI PRB 931
42
«ранние»
BBI PRB 934
11
«ранние»
BBI PRB 941
25
«ранние»
BBI PRB 942
14
«ранние»
BBI PRB 944
16
«ранние»
BBI PRB 947
20
«ранние»
BBI PRB 951
19
«ранние»
BBI PRB 952
21
«ранние»
BBI PRB 955
14
«ранние»
BBI PRB 965
21
«ранние»
BBI PRB 966
51
«ранние»
BBI PRB 968
35
«ранние»
BBI PRB 969
77
«ранние»
ZMC HIV 6243
33
«ранние»
ZMC HIV 6247
30
«ранние»
ZMC HIV 9014
31
«ранние»
ZMC HIV 9017
35
«ранние»
ZMC HIV 9018
33
«ранние»
ZMC HIV 9021
57
«ранние»
ZMC HIV 9022
29
«ранние»
ZMC HIV 9032
55
«ранние»
ZMC HIV 9077
104
«ранние»
ZMC HIV 9079
95
«ранние»
ZMC HIV 12008
42
«ранние»
В тесте «ДС-ИФА-ВИЧ-АТ-СРОК» оценивалась возможность исследования образцов сывороток (плазмы) крови, содержащих антитела к ВИЧ-1 различных субтипов, в том числе к ВИЧ-1 группы О: референс панель QCS 42-28-327-03Р (ГИСК) (субтипы А, В, С) (за исключением образца №24, содержащего антитела к ВИЧ-2), 1-ая международная референс панель анти ВИЧ (NIBSC Code:02/210) (субтипы А, В, С, Е) (за исключением образца №5, содержащего антитела к ВИЧ-2), образцы сывороток (плазмы) крови, содержащих антитела к ВИЧ-1 группы О (№1342, К00175, К00259; BioMex). Результаты свидетельствуют о возможности исследования образцов сывороток (плазмы) крови, содержащих антитела к ВИЧ-1, принадлежащих различным субтипам, в том числе к ВИЧ-1 группы О, в тесте «ДС-ИФА-ВИЧ-АТ-СРОК».
Специфичность набора реагентов «ДС-ИФА-ВИЧ-АТ-СРОК» определяли при исследовании образцов сывороток донорской крови (n=352), продемонстрировавших в ИФА отрицательный результат. Специфичность составила 100%. Дополнительно были протестированы 255 образцов сывороток крови (отрицательных в ИФА):
 167 образцов сывороток крови от беременных женщин и больных с инфекционными заболеваниями;
 128 образцов сывороток крови от пациентов с различными неинфекционными заболеваниями.
Специфичность составила - 100%.
Полученные данные показывают высокую эффективность разработанной тест-системы «ДС-ИФА-ВИЧ-АТ-СРОК» при определении вероятных сроков заражения вирусом иммунодефицита человека 1 типа (ВИЧ-1), в том числе ВИЧ-1 группы О, в сыворотке (плазме) крови человека.