МОЛОЧНАЯ СМЕСЬ СО СПЕЦИФИЧЕСКИМИ ПЕПТИДАМИ БЕТА-ЛАКТОГЛОБУЛИНА
MILK MIXTURE WITH SPECIFIC PEPTIDES OF BETA-LACTOGLOBULIN

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Изобретение относится к области молочных смесей, содержащих гидролизованный белок коровьего молока, для грудных детей, которые страдают или подвержены риску развития аллергии на белок коровьего молока.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Пищевые белки подвергаются воздействию иммунной системы в желудочно-кишечном тракте. В качестве иммунного ответа по умолчанию развивается оральная толерантность к этим безвредным пищевым белкам. Развитие оральной иммунной толерантности в значительной степени проявляется у грудных детей, которые подвергаются воздействию многочисленных безвредных белков в раннем возрасте под воздействием пищевых белков. При нарушении этого естественного ответа на безвредные белки, возникнет пищевая аллергия. Общепризнано, что распространенность пищевой аллергии растет в последние десятилетия, особенно в западных странах. В раннем возрасте аллергия на коровье молоко является наиболее распространенной пищевой аллергией: в настоящее время 2-5% грудных детей страдают аллергией на коровье молоко, и более высокий процент подвержен риску развития аллергии.
Для грудных детей, страдающих аллергией на белок коровьего молока, на рынке имеются молочные смеси для грудных детей, содержащие высокогидролизованные белки (глубокий гидролизат белка) или даже только свободные аминокислоты в качестве источника азота. В этих молочных смесях практически или вообще отсутствуют вызывающие аллергию белки или пептиды.
Грудные дети, рожденные от родителей, один или оба из которых страдают атопическим заболеванием, или у которых имеются один или более братьев и сестер, страдающих атопическим заболеванием, имеют более высокий риск развития аллергии на пищевые белки. Для этой группы, помимо предпочтительного грудного вскармливания, на рынке имеются гипоаллергенные молочные смеси, содержащие частичный гидролизат белка (частично гидролизованные белки). Эти частично гидролизованные белки обладают пониженной аллергенностью. Было подтверждено, что этот подход эффективен для предотвращения сенсибилизации к нативным белкам, присутствующим в адаптированных молочных смесях. Обычно степень гидролиза белков меньше, чем у высокогидролизованных белков для грудных детей, уже страдающих аллергией. Такие молочные смеси обладают преимуществом не только снижать риск развития аллергической реакции за счет предотвращения сенсибилизации к белку, но также поддерживать естественное развитие оральной иммунной толерантности к интактному белку. Это дает то преимущество, что в дальнейшем нативный белок можно вводить в рацион с пониженным риском возникновения аллергических реакций.
Строгое избегание аллергенов для профилактики и лечения чувствительности к аллергенам было рекомендовано на протяжении многих десятилетий. Акцент на полном избегании пищевых аллергенов может непреднамеренно способствовать росту пищевой аллергии в последние десятилетия. Лучшим способом профилактики или лечения аллергии является разработка стратегий, способствующих индукции оральной толерантности к аллергенам, таких как оральная иммунотерапия или презентация пищевых аллергенов в форме, способствующей индукции естественных механизмов толерантности (Allen et al, 2009, Pediatr Allerg Immunol 20:415-422).
В EP 2044851 раскрыта питательная композиция с частично гидролизованным молочным белком, имеющим степень гидролиза от 15% до 25% и от 50 до 1000 нг TGF-бета на 100 мл, для первичной профилактики аллергических реакций на пищевой белок и предотвращения развитие атопических заболеваний у молодых млекопитающих.
В ЕР 0629350 раскрыто применение не вызывающих аллергию гидролизатов сывороточного белка, которые, как указывается, способны индуцировать толерантность к белку коровьего молока.
В ЕР 0827697 раскрыто применение сыворотки, которая была ферментативно гидролизована для получения композиций, которые индуцируют оральную толерантность к коровьему молоку у восприимчивых млекопитающих. Сыворотка имеет уровень иммунологического обнаружения вызывающих аллергию белков ≥ в 100 раз менее, чем у негидролизованной сыворотки.
В WO 00/42863 раскрыта гипоаллергенная композиция для индукции толерантности к белку у грудных детей из группы риска возникновения аллергии на белок, содержащая не вызывающую аллергию основу высокогидролизованного белка и/или основу свободных аминокислот, указанная композиция содержит в качестве действующего вещества по меньшей мере один толерогенный пептид вызывающего аллергию белка.
В WO 2011/151059 раскрыто детское питание с частично гидролизованными белками и неперевариваемыми олигосахаридами с целью применения для индукции оральной толерантности к нативным пищевым белкам.
WO 2015/090347 относится к идентифицированным пептидам, которые способны индуцировать толерантность к коровьему молоку, особенно к β-лактоглобулину.
В WO 2017/144730 раскрыта стратегия достижения десенсибилизации или индукции толерантности к аллергенам молочного белка, например β-лактоглобулину, у людей или животных, включающая приготовление и применение композиции, содержащей очищенный интактный экспрессированный молочный белок вместе с одним или более очищенными пептидами из указанного интактного молочного белка.
В WO 2016/0148572 раскрыта оральная иммунная толерантность к специфической смеси синтетических пептидов бета-лактоглобулина и пробиотиков.
Однако гипоаллергенные композиции из предшествующего уровня техники часто обеспечивают свое действие просто недопущением присутствия потенциальных аллергенов - как следствие, не решая основную проблему - и/или посредством требования присутствия специальных компонентов, таких как стимуляторы роста или синтетические или очищенные пептиды. Кроме того, пептиды, идентифицированные в предшествующем уровне техники, могут быть непригодны для индукции оральной иммунной толерантности у значительной части человеческой популяции. Таким образом, все еще существует потребность в питании, содержащем специфический гидролизат бета-лактоглобулина крупного рогатого скота со специфическими пептидами и компонентами, которые дополнительно повышают оральную иммунную толерантность у субъектов подверженных риску развития или страдающих пищевой аллергией, с улучшенным эффектами на индукцию оральной иммунной толерантности к пищевым белкам, в частности белку коровьего молока.
Таким образом, техническая задача, лежащая в основе настоящего изобретения, заключается в получении композиций, способов, применений и средств для преодоления вышеупомянутых недостатков, в частности для обеспечения улучшенной индукции оральной иммунной толерантности к пищевым белкам у людей, в частности у людей, подверженных риску развитие пищевой аллергии, в частности у младенцев, и в частности у младенцев с риском развития аллергии на белок коровьего молока.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Авторы изобретения способствуют предположению в данной области техники, что лучший способ профилактики или лечения аллергию аллергии заключается в разработке стратегий, способствующих индукции оральной толерантности к аллергенам, таких как оральная иммунотерапия или презентация пищевых аллергенов в форме, способствующей индукции естественных механизмов толерантности (Allen et al, 2009, Pediatr Allerg Immunol 20:415-422)
Основа всех Т-клеточных ответов, включая индукцию регуляторных Т-клеток (Treg), состоит из трех взаимосвязанных процессов: активации Т-клеточного рецептора, костимуляции и передачи сигналов цитокинами. Активации Т-клеточного рецептора на CD4+ Т-клетках способствует распознавание специфических пептидов, называемых Т-клеточными эпитопами, презентируемые молекулами МНС II класса на антигенпрезентирующих клетках. Присутствие Т-клеточных эпитопов в гидролизате белка имеет важное значение для индукции специфичных для коровьего молока Treg. Аминокислота (AA) № 13-48 зрелого бета-лактоглобулина (BLG) представляет особый интерес, потому что синтетические пептиды, охватывающие эту область, способны в профилактических целях значительно снизить острую аллергическую кожную реакцию на мышиной модели в отношении аллергии на коровье молоко. В целом эта область BLG, по-видимому, важна для развития толерантности к сывороточному белку.
С использованием нового способа исследователи установили, что специфическая молочная смесь для грудных детей на основе частично гидролизованной сыворотки содержала специфические идентичные пептиды бета-лактоглобулина (BLG), которые выполняют функцию Т-клеточных эпитопов, для обеспечения развитие оральной толерантности к белку коровьего молока среди значительной части человеческой популяция, например, имеющей разные аллели HLA-DRB1. Эти специфические аллели являются наиболее релевантными, поскольку аллели HLA-DR являются преобладающим изотипом MHC II класса и играют центральную роль в отборе и активации CD4+ Т-клеток. HLA-DR представляет собой гетеродимерную молекулу, состоящую из цепей HLA-DRA и HLA-DRB. В то время как ген HLA-DRA высоко консервативен у людей, существует множество генов HLA-DRB. Среди них HLA-DRB1 является наиболее полиморфным геном, и он экспрессируется в пять раз выше, чем его функциональные паралоги.
Во-первых, был разработан новый метод жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (ЖХ-МС) для определения ограниченного перечня специфических идентичных пептидов, полученных из BLG, которые естественным образом присутствовали с наибольшей частотой в смеси с гидролизатом сывороточного белка, с акцентом на область AA № 13-48 зрелого BLG крупного рогатого скота. Авторы изобретения смогли идентифицировать в общей сложности тринадцать BLG-пептидов из минимум девяти аминокислот в этой интересующей области, шесть из которых были идентифицированы последовательно в разных производственных партиях.
Во-вторых, смесь подвергали анализу презентации антигена ProImmune ProPresent и алгоритму связывания MHC II класса для идентификации релевантных HLA-DRB1-рестриктированных пептидов. Было подтверждено, что эти пептиды процессируются и презентируются дендритными клетками человека. Вышеуказанные пептиды были сгруппированы в две группы уникальных последовательностей, то есть DIQ…DIS (AA № 11-30) и AMA…APL (AA № 23-39). Было установлено, что фрагменты идентифицированных двух групп уникальных последовательностей BLG обладают высокой аффинностью связывания с выбранными аллелями HLA-DRB1. Было обнаружено, что смесь пептидов BLG является наиболее предпочтительной для обеспечения охвата взаимодействия с несколькими аллелями HLA-DRB1, обычно присутствующими в человеческой популяции. В частности, смесь пептидов, содержащая по меньшей мере пептид BLG SEQ ID NO:5 вместе с одним из пептидов BLG SEQ ID NO:2, 3 или 4, охватывает большинство исследованных аллелей HLA-DRB1. Ссылка приводится на примеры 2 и 3.
В-третьих, были исследованы последовательности идентифицированных пептидов BLG, и было обнаружено, что они распознаются специфичными к коровьему молоку Т-клеточными линиями человека, полученными от различных страдающих аллергическим заболеванием доноров, и индуцируют пролиферацию/активацию Т-клеток. Ссылка приводится на пример 4 и связанную с ним фиг.2. При исследовании на этих различных Т-клеточных линиях наблюдались различные паттерны реактивности Т-клеток, и хотя не каждый пептид взаимодействовал с каждой клеточной линией, при взятии вместе (в частности, пептид BLG SEQ ID NO:4 отдельно или комбинация пептида BLG SEQ ID NO:1 с одним из SEQ ID NO:2, 3 или 5) охватывалась реактивность каждой клеточной линии. Эти результаты указывают на улучшенное влияние гидролизатов с этими идентичными пептидами, полученными из BLG, на развитие оральной иммунной толерантности к сывороточному белку или снижение риска развития оральной иммунной толерантности.
Как показано в примере 6, пептиды имеют большее количество MHC II класса связывающих доменов и, следовательно, повышенную вероятность их презентация Т-клеткам.
Пептиды BLG в области AA № 13-48 обеспечивают дальнейшее улучшение влияния на индукцию оральной иммунной толерантности или дальнейшее снижение риска развития оральной иммунной толерантности при использовании совместно со штаммом молочнокислых бактерий, вместе или отдельно с неперевариваемыми олигосахаридами, и следовательно, эти результаты также указывают на дальнейшее улучшение влияния композиций с гидролизованным белком, содержащих смесь таких полученных из BLG пептидов, состоящих из аминокислотной последовательности, соответствующей последовательным аминокислотам белка бета-лактоглобулина, представленного SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:5, предпочтительно совместно со штаммом молочнокислых бактерий, вместе или отдельно с неперевариваемыми олигосахаридами (пробиотики или синбиотики).
Кроме того, в прилагаемой экспериментальной части показано, что присутствие молочнокислых бактерий, увеличивает экспрессию молекул HLA-DR на поверхности дендритных клеток (пример 6). Повышенная экспрессия HLA-DR также указывает на улучшение презентации пептидов Т-клеткам, и следовательно, индукции оральной иммунной толерантности.
СПИСОК ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
Bos
Bison
Bubalus
Capra
Bos
1. Питательная композиция, содержащая гидролизат белка из молока млекопитающих, предпочтительно молока от видов рода , ,  или , более предпочтительно рода , предпочтительно из коровьего молока, для применения в
индукции оральной иммунной толерантности к молочному белку; и/или
профилактике или лечении оральной иммунной непереносимости молочного белка; и/или
снижении риска развития оральной иммунной непереносимости молочного белка,
у человека, где гидролизат белка содержит по меньшей мере два пептида, имеющих последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:5,
причем указанная композиция предпочтительно дополнительно содержит по меньшей мере один штамм молочнокислых бактерий.
2. Применение по п.1, где гидролизат белка включает:
(i) по меньшей мере пептид, имеющий последовательность в соответствии с SEQ ID NO:5, и по меньшей мере один пептид, имеющий последовательность в соответствии с SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:4; или
(ii) по меньшей мере один пептид, имеющий последовательность в соответствии с SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:4, и по меньшей мере один пептид, имеющий последовательность в соответствии с SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:5.
3. Питательная композиция для применения по п.1 или 2, где композиция содержит менее 6 мкг вызывающего аллергию бета-лактоглобулина, предпочтительно менее 3,5 мкг вызывающего аллергию бета-лактоглобулина на 1 г общего белка.
4. Питательная композиция для применения по одному из предшествующих пунктов, где композиция содержит по меньшей мере 50 вес.%, предпочтительно, по меньшей мере 95 вес.% гидролизованного сывороточного белка в пересчете на общий белок.
5. Питательная композиция для применения по одному из предшествующих пунктов, содержащая менее 10 вес.%, предпочтительно менее 6 вес.% пептидов или белков, имеющих размер 5 кДа или более, в пересчете на общий белок.
6. Питательная композиция для применения по одному из предшествующих пунктов, где по меньшей мере 1 вес.% пептидов или белков, присутствующих в композиции, имеют размер 1 кДа или более, в пересчете на общий белок, предпочтительно, по меньшей мере 5 вес.%, более предпочтительно, по меньшей мере 10 вес.% в пересчете на общий белок.
7. Питательная композиция для применения по одному из предшествующих пунктов, где композиция содержит количество вызывающего аллергию бета-лактоглобулина более 0,8 мкг на 1 г общего белка.
Bos
Bison
Bubalus
Capra
Bos
8. Питательная композиция для применения по одному из предшествующих пунктов, где молочный белок происходит от видов рода , ,  или , более предпочтительно рода , предпочтительно белок коровьего молока.
9. Питательная композиция для применения по одному из предшествующих пунктов, где человек является грудным ребенком.
Bos
Bison
Bubalus
Capra
Bos
10. Питательная композиция для применения по одному из предшествующих пунктов, где человек подвергается риску развития или страдает аллергией на молочный белок из молока от видов рода , ,  или , более предпочтительно от рода .
Bifidobacterium
Bifidobacterium breve
11. Питательная композиция для применения по одному из предшествующих пунктов, где композиция содержит штамм молочнокислых бактерий, принадлежащих к роду , предпочтительно к виду .
12. Питательная композиция для применения по одному из предшествующих пунктов, содержащая один или более неперевариваемых олигосахаридов, выбранных из группы, состоящей из фруктоолигосахарида, неперевариваемого декстрина, галактоолигосахарида, ксилоолигосахарида, арабиноолигосахарида, арабиногалактоолигосахарида, глюкоолигосахарида, глюкоманноолигосахарида, галактоманноолигосахарида, маннанолигосахарида, хитоолигосахарида, олигосахарида уроновой кислоты, сиалилолигосахарида и фукоолигосахарида, и их смеси, предпочтительно фруктоолигосахаридов.
13. Питательная композиция для применения по п.12, где неперевариваемые олигосахариды содержат по меньшей мере два неперевариваемых олигосахарида, выбранных из группы, состоящей из фруктоолигосахаридов и галактоолигосахаридов, предпочтительно смеси длинноцепочечных фруктоолигосахаридов с короткоцепочечными фруктоолигосахаридами или с короткоцепочечными галактоолигосахаридами.
5
11
14. Питательная композиция для применения по одному из предшествующих пунктов, содержащая от 10 до 10 КОЕ штамма молочнокислых бактерий на грамм сухого веса и, необязательно, по меньшей мере 2 вес.% неперевариваемых олигосахаридов в пересчете на сухой вес.
15. Питательная композиция для применения по одному из предшествующих пунктов, содержащая длинноцепочечные полиненасыщенные жирные кислоты, предпочтительно докозагексаеновую кислоту (DHA), более предпочтительно, по меньшей мере 0,35 вес.% DHA в пересчете на общее количество жирных кислот.
16. Питательная композиция для применения по одному из предшествующих пунктов, которая представляет собой молочную смесь для грудных детей, молочную смесь второго уровня или молочную смесь для детей раннего возраста.
17. Питательная композиция, содержащая:
Bifidobacterium
а. штамм молочнокислых бактерий, принадлежащий к роду ;
Bos
Bison
Bubalus
Capra
Bos
b. гидролизат молочного белка от видов рода , ,  или , более предпочтительно рода , где гидролизат молочного белка включает по меньшей мере два пептида, имеющих последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:5
c. менее 6 мкг вызывающего аллергию бета-лактоглобулина, предпочтительно менее 3,5 мкг бета-лактоглобулина, на 1 г общего белка,
d. менее 10 вес.% пептидов или белков, имеющих размер 5 кДа или более, в пересчете на общий белок, и
е. по меньшей мере 50 вес.%, предпочтительно, по меньшей мере 95 вес.% гидролизованного сывороточного белка в пересчете на общий белок,
f. необязательно, один или более неперевариваемых олигосахаридов, выбранных из группы, состоящей из фруктоолигосахарида, неперевариваемого декстрина, галактоолигосахарида, ксилоолигосахарида, арабиноолигосахарида, арабиногалактоолигосахарида, глюкоолигосахарида, глюкоманноолигосахарида, галактоманноолигосахарида, маннанолигосахарида, хитоолигосахарида, олигосахарида уроновой кислоты, сиалилолигосахарида и фукоолигосахарида, и их смеси, предпочтительно фруктоолигосахаридов, и
g. необязательно длинноцепочечные полиненасыщенные жирные кислоты, предпочтительно докозагексаеновую кислоту (DHA), более предпочтительно, по меньшей мере 0,35 вес.% DHA в пересчете на общее количество жирных кислот.
18. Питательная композиция по п.17, в которой гидролизат белка включает:
(i) по меньшей мере пептид, имеющий последовательность в соответствии с SEQ ID NO:5, и по меньшей мере один пептид, имеющий последовательность в соответствии с SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:4; или
(ii) по меньшей мере один пептид, имеющий последовательность в соответствии с SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:4, и по меньшей мере один пептид, имеющий последовательность в соответствии с SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:5.
19. Питательная композиция по п.п.17 или 18, где количество вызывающего аллергию бета-лактоглобулина составляет более 0,8 мкг на 1 г белка, и/или где композиция содержит более 1 вес.% пептидов или белков размером 1 кДа или более в пересчете на общий белок, более предпочтительно, по меньшей мере 5 вес.%, более предпочтительно, по меньшей мере, 10 вес.%.
Bifidobacterium breve
20. Питательная композиция по одному из п.п.17-19, где штамм молочнокислых бактерий принадлежит к виду .
21. Питательная композиция по одному из п.п.17-20, где неперевариваемые олигосахариды содержат по меньшей мере два неперевариваемых олигосахарида, выбранных из группы, состоящей из фруктоолигосахаридов и галактоолигосахаридов, предпочтительно смеси длинноцепочечных фруктоолигосахаридов с короткоцепочечными фруктоолигосахаридами или с короткоцепочечными галактоолигосахаридами.
5
11
22. Питательная композиция по одному из п.п.17-21, содержащая от 10 до 10 КОЕ молочнокислых бактерий на г сухого веса.
23. Питательная композиция по одному из п.п.17-22, содержащая по меньшей мере 2 вес.% неперевариваемых олигосахаридов в пересчете на сухой вес.
24. Питательная композиция по одному из п.п.17-23, которая представляет собой молочную смесь для грудных детей, молочную смесь второго уровня или молочную смесь для детей раннего возраста.
25. Способ обеспечения питанием человека, подверженного риску развития или страдающего аллергией, более предпочтительно, аллергией на молочный белок, включающий введение испытуемому человеку питательной композиции по одному из п.п. 17-24.
26. Способ по п.25, где человек является грудным ребенком или ребенком раннего возраста, предпочтительно грудным ребенком.
Bos
Bison
Bubalus
Capra
Bos
27. Способ по п.п.25 или 26, где молочный белок происходит от видов рода ,, или , более предпочтительно рода , предпочтительно белок коровьего молока.
28. Способ:
индукции оральной иммунной толерантности к молочному белку; и/или
профилактики или лечения оральной иммунной непереносимости молочного белка; и/или
снижения риска развития оральной иммунной непереносимости молочного белка,
Bos
Bison
Bubalus
Capra
Bos
у человека, включающий введение субъекту питательной композиции, содержащей гидролизат белка из молока млекопитающих, предпочтительно молока от видов рода ,, или , более предпочтительно рода , предпочтительно коровьего молока, причем гидролизат белка содержит по меньшей мере два пептида, имеющих последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:5, причем указанная композиция предпочтительно дополнительно содержит по меньшей мере один штамм молочнокислых бактерий.
29. Применения гидролизата белка для получения питательной композиции для:
индукции оральной иммунной толерантности к молочному белку; и/или
профилактики или лечения оральной иммунной непереносимости молочного белка; и/или
снижения риска развития оральной иммунной непереносимости молочного белка,
Bos
Bison
Bubalus
Capra
Bos
где питательная композиция содержит гидролизат белка из молока млекопитающих, предпочтительно молока от видов рода ,, или , более предпочтительно рода , предпочтительно коровьего молока, где гидролизат белка содержит по меньшей мере два пептида, имеющих последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:5, причем указанная композиция предпочтительно дополнительно содержит по меньшей мере один штамм молочнокислых бактерий.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Таким образом, настоящее изобретение относится к питательной композиции, содержащей гидролизат белка из молока млекопитающих,
для применения в индукции оральной иммунной толерантности к молочному белку и/или
для применения в профилактике или лечении оральной иммунной непереносимости молочного белка и/или
для снижения риска развития оральной иммунной непереносимости молочного белка и/или
для улучшения или усиления оральной иммунной толерантности к молочному белку,
у человека, где гидролизат белка содержит по меньшей мере два пептида, имеющих аминокислотную последовательность, соответствующую последовательным аминокислотам, представленным SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:5. В предпочтительном варианте осуществления композиция содержит по меньшей мере пептид, имеющий аминокислотную последовательность, соответствующую последовательным аминокислотам, представленным SEQ ID NO:2 и/или SEQ ID NO:4. В предпочтительном варианте осуществления композиция содержит по меньшей мере пептид, имеющий аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO:4. В предпочтительном варианте осуществления композиция содержит по меньшей мере пептид, имеющий аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO:5. В предпочтительном варианте осуществления композиция содержит по меньшей мере три пептида, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:5, более предпочтительно по меньшей мере четыре пептида или даже все пять пептидов, выбранных из этой группы.
В предпочтительном варианте осуществления гидролизат белка содержит:
(i) по меньшей мере пептид, состоящий из аминокислотной последовательности, соответствующей последовательным аминокислотам, представленным последовательностью SEQ ID NO:5, и по меньшей мере один пептид, состоящий из аминокислотной последовательности, соответствующей последовательным аминокислотам, представленным SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 и SEQ ID NO:4; или
(ii) по меньшей мере пептид, состоящий из аминокислотной последовательности, соответствующей последовательным аминокислотам, представленным SEQ ID NO:4; илипо меньшей мере один пептид, состоящий из аминокислотной последовательности, соответствующей последовательным аминокислотам, представленным SEQ ID NO:1, ипо меньшей мере один пептид, состоящий из аминокислотной последовательности, соответствующей последовательным аминокислотам, представленным SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 и SEQ ID NO:5.
Bos
Bison
Bubalus
Capra
Bos
Bos
Bison
Bubalus
Capra
Bos
Bos
Bison
Bubalus
Capra
Bos
Эти пептиды здесь также называются «полученные из BLG пептиды». Композиция предпочтительно дополнительно содержит штамм молочнокислых бактерий, более предпочтительно дополнительно содержит один или более неперевариваемых олигосахаридов (NDO(s)), как определено далее ниже. Молоко млекопитающих предпочтительно представляет собой молоко от видов рода ,, или , более предпочтительно рода , предпочтительно коровье молоко. Иными словами, изобретение относится к применению гидролизата белка или полученные из BLG пептиды при производстве вышеуказанной питательной композиции для индукции оральной иммунной толерантности к молочному белку и/или для профилактики или лечения оральной иммунной непереносимости молочного белка и/или для снижения риска развития оральной иммунной непереносимости молочного белка у человека, предпочтительно молочного белка от видов рода ,, или , более предпочтительно рода , предпочтительно коровьего молока, при этом питательная композиция включает гидролизат белка, как определено выше, предпочтительно в соответствии с (i) или (ii), как определено здесь выше, указанная композиция предпочтительно дополнительно содержит молочнокислые бактерии, более предпочтительно содержит один или более NDO(s), как определено далее ниже. Изобретение также относится к способу индукции оральной иммунной толерантности к молочному белку и/или применения для профилактики или лечения оральной иммунной непереносимости молочного белка и/или снижения риска развития оральной иммунной непереносимости молочного белка у человека, предпочтительно молочного белка от видов рода ,, или , более предпочтительно рода , предпочтительно коровьего молока, способ включает введение человеку вышеуказанной питательной композиции, содержащей гидролизат белка, как определено выше, предпочтительно в соответствии с (i) или (ii), как определено здесь выше, указанная композиция предпочтительно дополнительно содержит штамм молочнокислых бактерий, более предпочтительно содержит один или более NDO(s), как определено далее ниже.
Настоящее изобретение также относится к одному или более полученным из BLG пептидам
для применения в индукции оральной иммунной толерантности к молочному белку и/или
для применения в профилактике или лечении оральной иммунной непереносимости молочного белка и/или
для снижения риска развития оральной иммунной непереносимости молочного белка и/или
для улучшения или усиления оральной иммунной толерантности к молочному белку,
Bos
Bison
Bubalus
Capra
Bos
Bos
Bison
Bubalus
Capra
Bos
у человека, предпочтительно к молочному белку от видов рода ,, или , более предпочтительно рода , предпочтительно коровьего молока, где указанный один или более полученных из BLG пептидов характеризуются включениемпо меньшей мере двух пептидов, имеющих последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:5, предпочтительно в соответствии с (i) или (ii), как определено здесь выше. Иными словами, изобретение относится к применению одного или более полученных из BLG пептидов при производстве питательной композиции для индукции оральной иммунной толерантности к молочному белку и/или для применения в профилактике или лечении оральной иммунной непереносимости молочного белка и/или для снижения риска развития оральной иммунной непереносимости молочного белка у человека, предпочтительно молочного белка от видов рода ,, или , более предпочтительно рода , предпочтительно коровьего молока, где указанный один или более полученных из BLG пептидов характеризуются включениемпо меньшей мере двух пептидов, имеющих последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:5, предпочтительно в соответствии с (i) (ii), как определено здесь выше.
Изобретение также относится к (нетерапевтическому) способу
для применения в индукции оральной иммунной толерантности к молочному белку и/или
для применения в профилактике или лечении оральной иммунной непереносимости молочного белка и/или
для снижения риска развития оральной иммунной непереносимости молочного белка и/или
для улучшения или усиления оральной иммунной толерантности к молочному белку,
Bos
Bison
Bubalus
Capra
Bos
у человека, предпочтительно к молочному белку от видов рода ,, или , более предпочтительно рода , предпочтительно из коровьего молока, включающему введение человеку одного или более полученных из BLG пептидов, при этом пептиды характеризуются включениемпо меньшей мере двух пептидов, имеющих последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:5, предпочтительно в соответствии с (i) или (ii), как определено здесь выше. В предпочтительном варианте осуществления вышеуказанного применения или способа один или более полученных из BLG пептидов предпочтительно вводят в комбинации со штаммом молочнокислых бактерий, более предпочтительно дополнительно в комбинации с одним или более неперевариваемыми олигосахаридами (NDO(s)), как определено далее ниже.
В одном варианте осуществления
индукция оральной иммунной толерантности к молочному белку и/или
профилактика или лечение пероральной иммунной непереносимости молочного белка и/или
снижение риска развития оральной иммунной непереносимости молочного белка и/или
улучшение или усиление оральной иммунной толерантности к молочному белку
Bos
относится к молочному белку от конкретных видов млекопитающих, а гидролизованный молочный белок, входящий в состав композиции, вырабатывается теми же видами млекопитающих, предпочтительно оба относятся к роду .
Термин «улучшение или усиление оральной иммунной толерантности к молочному белку» означает, что оральная иммунная толерантность к молочному белку улучшается по сравнению с оральной иммунной толерантностью к молочному белку до начала введения композиции по изобретению.
Связанное с этим изобретение также относится к питательной композиции, содержащей:
Bifidobacterium
а. штамм молочнокислых бактерий, принадлежащий к роду ;
Bos
Bison
Bubalus
Capra
Bos
b. гидролизат молочного белка от видов рода , ,  или , более предпочтительно рода , где гидролизат молочного белка включаетпо меньшей мере два пептида, имеющих последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:5
c. менее 6 мкг вызывающего аллергию бета-лактоглобулина, предпочтительно менее 3,5 мкг бета-лактоглобулина, на 1 г общего белка,
d. менее 3 вес.% пептидов или белков, имеющих размер 5 кДа или более, в пересчете на общий белок,
е. по меньшей мере 50 вес.%, предпочтительнопо меньшей мере 95 вес.% гидролизованного сывороточного белка в пересчете на общий белок,
f. необязательно, один или более неперевариваемых олигосахаридов, выбранных из группы, состоящей из фруктоолигосахарида, неперевариваемого декстрина, галактоолигосахарида, ксилоолигосахарида, арабиноолигосахарида, арабиногалактоолигосахарида, глюкоолигосахарида, глюкоманноолигосахарида, галактоманноолигосахарида, маннанолигосахарида, хитоолигосахарида, олигосахарида уроновой кислоты, сиалилолигосахарида и фукоолигосахарида, и их смеси, предпочтительно фруктоолигосахаридов, и
g. необязательно длинноцепочечные полиненасыщенные жирные кислоты, предпочтительно докозагексаеновую кислоту (DHA), более предпочтительнопо меньшей мере 0,35 вес.% DHA в пересчете на общее количество жирных кислот.
В связи с этим изобретение также относится к способу обеспечения питанием испытуемого человека, подверженного риску развития или страдающего аллергией, более предпочтительно аллергией на молочный белок, включающему введение человеку питательной композиции, как определено выше.
Питательная композиция в контексте настоящего изобретения определена здесь ниже, и все варианты осуществления применимы ко всем аспектам изобретения, включая композицию, композицию для применения, способы и применение согласно изобретению.
Пептиды/гидролизат
Композиция по изобретению содержитпо меньшей мере два пептида, состоящих из аминокислотной последовательности, соответствующей последовательным аминокислотам, представленным SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:5. Эти пептиды являются производными или получаемыми из бета-лактоглобулина и, таким образом, рассматриваются как пептиды, полученные из бета-лактоглобулина. В описании и формуле изобретения аминокислотные последовательности BLG-пептидов с SEQ ID NO:1-5 идентифицированы здесь ниже:
SEQ ID NO:1: XIVTQTMKGLDIQKVAGTWYSLAMAAS
SEQ ID NO:2: XIVTQTMKGLDIQKVAGTWYSLAMAASDISLL
SEQ ID NO:3: TMKGLDIQKVAGTWYSLAMAASDISLL
SEQ ID NO:4: TMKGLDIQKVAGTWYSLAMAASDISLLDAQ
SEQ ID NO:5: DIQKVAGTWYSLAMAASDISLLDAQSAPLRVY.
Bos
Здесь X означает аминокислоту, выбранную из лейцина (L) или изолейцина (I), предпочтительно X представляет собой лейцин. SEQ ID NO:1, где X=L здесь также обозначается как SEQ ID NO:9. SEQ ID NO:1, где X=I здесь также обозначается как SEQ ID NO:37. SEQ ID NO:2, где X=L здесь также обозначается как SEQ ID NO:11. SEQ ID NO:2, где X=I здесь также обозначается как SEQ ID NO:38. Выбор в качестве X или лейцина, или изолейцина является прямым следствием источника молока млекопитающих. Лейцин является предпочтительным, поскольку молоко млекопитающих от рода , предпочтительно коровье молоко, является наиболее предпочтительным.
Предпочтительный вариант (i) основан на анализе презентации антигена ProImmune ProPresent, в котором было обнаружено, что эта смесь пептидов охватывает больше протестированных аллелей HLA-DRB1; предпочтительный вариант (ii) основан на экспериментах, направленных на Т-клеточное распознавание Т-клеток у грудных детей с аллергией на коровье молоко, где было обнаружено, что эти пептиды охватывают реактивность каждой клеточной линии.
Bos
Bison
Bubalus
Capra
Bos
Bos taurus
Bos
Bison
Capra
Bubalus
Пептиды предпочтительно предоставляются гидролизатом белка (то есть гидролизованными белками), полученным из молока млекопитающих, предпочтительно молока от видов рода , ,  или , более предпочтительно рода , наиболее предпочтительно коровьего молока (). Аминокислотная последовательность BLG у родов  и  является одинаковой, а SEQ ID NO:9, 11, 3, 4 и 5 можно получить в гидролизатах из молочного белка этих родов. У родов  и  аминокислота 1 отличается (изолейцин вместо лейцина в SEQ ID NO:37 и 38), а SEQ ID NO:37, 38, 3, 4 и 5 можно получить в гидролизатах из молочного белка этих родов. В предпочтительном варианте осуществления пептиды получают из сывороточного белка. Питательная композиция предпочтительно содержитпо меньшей мере 50 вес.%, более предпочтительнопо меньшей мере 70 вес.%, еще более предпочтительнопо меньшей мере 95 вес.% гидролизованного сывороточного белка в пересчете на общий белок. Подходящим источником является смесь кислого сывороточного белка и деминерализованного сладкого сывороточного белка. Кислая сыворотка и сладкая сыворотка имеются на рынке. Сладкая сыворотка является побочным продуктом коагулированного сычужным ферментом сыра и содержит казеиногликомакропептид (CGMP), а кислая сыворотка (также называемая заквашенной сывороткой) является побочным продуктом коагулированного кислотой сыра и не содержит CGMP. Подходящими источниками сывороточного белка являются деминерализованная сыворотка (Deminal, Friesland Campina, Нидерланды) и/или концентрат сывороточного белка (WPC80, Friesland Campina, Нидерланды). Сывороточный белок предпочтительно содержит кислую сыворотку, более предпочтительнопо меньшей мере 50 вес.%, более предпочтительнопо меньшей мере 70 вес.% кислой сыворотки, в пересчете на общий сывороточный белок. Кислая сыворотка имеет улучшенный аминокислотный профиль по сравнению со сладким сывороточным белком.
Гидролиз можно осуществлять с использованием смеси микробных эндопептидаз и экзопептидаз с использованием метода, описанного в примере 1 международной заявки WO 2011/151059, включенной здесь посредством ссылки. Гидролизаты с BLG-пептидами в соответствии с SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:5 можно предпочтительно получить с использованием рецептуры согласно примеру 1. Предпочтительно используется смесь эндопротеазы и экзопротеазы. Для определения содержит ли какая-либо данная композиция один или более полученных из BLG пептидов в экспериментальных частях описаны средства идентификации.
Композиция предпочтительно содержит менее 10 вес.%, предпочтительно менее 6 вес.% пептидов или белков размером 5 кДа или более в пересчете на общий белок. В одном варианте осуществления композиция содержит более 0,3 вес.%, предпочтительно более 0,5 вес.%, более предпочтительно более 1 вес.%, даже более предпочтительно более 1,5 вес.% этих пептидов размером 5 кДа или более в пересчете на общий белок. Предпочтительно более 1 вес.% пептидов или белков, присутствующих в композиции, имеют размер 1 кДа или более в пересчете на общий белок, более предпочтительнопо меньшей мере 5 вес.%, более предпочтительнопо меньшей мере 10 вес.%, в пересчете на общий белок. Более предпочтительно более 1 вес.% пептидов или белков, присутствующих в композиции, имеют размер 3 кДа или более в пересчете на общий белок, более предпочтительнопо меньшей мере 5 вес.%, более предпочтительнопо меньшей мере 10 вес.%, в пересчете на общий белок.
Распределение по размерам пептидов в гидролизате белка можно определить посредством эксклюзионной жидкостной хроматографии высокого давления, известной в данной области техники. В статье Saint-Sauveur et al. “Immunomodulating properties of a whey protein isolate, its enzymatic digest and peptide fractions” Int. Dairy Journal (2008) vol. 18(3) pages 260-270 описывается пример этого. Вкратце общая площадь поверхности хроматограмм интегрируется и разделяется на диапазоны масс, выраженные в процентах от общей площади поверхности. Диапазоны масс калибруются с использованием пептидов/белков с известной молекулярной массой. Гидролизат белка, содержащий указанные пептиды, предпочтительно отличается тем, что он содержит от 64 до 89 вес.% пептидов с молекулярной массой ниже 1000 Да, от 10 до 30 вес.% пептидов с молекулярной массой от 1000 до 5000 Да и от 1 до 6 вес.% пептидов или белков с молекулярной массой выше 5 кДа, все в пересчете на общий белок.
Несмотря на то, что распределение пептидов по массе является информативным, оно не дает никакой информации о последовательности и активности пептидов, присутствующих в молочной смеси. Структурная информация имеет решающее значение для понимания общей биологической активности, которой может обладать гидролизованная молочная смесь для грудных детей.
Последовательно несколько специфических пептидов, происходящих из области BLG, которая, как известно, содержит Т-клеточные эпитопы, были идентифицированы в разных производственных партиях. Только в двух исследованиях ранее изучался пептидный профиль pHP (Wada et al. Peptides 2015 73:101-105; Catala-Clariana et al, Electrophoresis 2013 Jul; 34 (13):1886-1894). Несмотря на то, что эти исследования были ориентированы на биоактивные пептиды в целом, а не конкретно на Т-клеточных эпитопах, ни один из пептидов с SEQ ID NO:1-5, идентифицированных в настоящей заявке, не был обнаружен в этих ранее протестированных продуктах. В дополнение к профилям этих гидролизованных белковых продуктов был определен пептидный профиль не имеющего в продаже гидролизата на основе BLG (Pecquet et al. J Allergy Clin Immunol 2000 Mar; 105 (3):514-521). Также в этом гидролизате были идентифицированы два пептида (AA № 21-40 и AA № 25-40), которые перекрываются с интересующей областью, но опять же не пептиды с SEQ ID NO:1-5. По меньшей мере в двух из трех исследований, описанных выше, был исследован гидролизат от разных производителей (Wada и Pecquets), и, как указано выше, основной причиной этих различий могут быть различия в производственных процессах. Это дополнительно подтверждается недавним исследованием, в котором высокогидролизованные молочные смеси для грудных детей от различных производителей характеризовались с использованием пептидомики. Авторы показали, что молочные смеси для грудных детей от разных производителей имеют отличающуюся сигнатуру, основанную на их пептидном профиле, и следовательно могут иметь различный эффект в клинических испытаниях (Lambers et al. Food Sci Nutr 2015 Jan; 3(1):81-90. Hochwallner et al. al, 2017, Allergy 72:416-425).
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения настоящая композиция содержит на грамм общего белкапо меньшей мере 10 мкг (микрограмм), более предпочтительно от 10 до 5000 мкг, более предпочтительно от 20 до 2000 мкг, более приемлемо от 30 до 500 мкг и особенно предпочтительно от 50 до 250 мкг суммы полученных из бета-лактоглобулина пептидов, состоящих из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:5, более предпочтительно состоящих из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:5. Полученные из BLG пептиды предпочтительно присутствуют в терапевтически эффективных количествах.
Предпочтительно питательная композиция содержит менее 6 мкг вызывающего аллергию бета-лактоглобулина BLG на 1 г белка, предпочтительно менее 5 мкг на 1 г белка, более предпочтительно менее 3,5 мкг на 1 г белка. В контексте изобретения выражение «вызывающий аллергию бета-лактоглобулин» относится к интактному или иммуногенному BLG и не учитывает гидролизованный BLG. Предпочтительно питательная композиция содержит количество вызывающего аллергию бета-лактоглобулина выше 0,8 мкг на г белка. Вызывающий аллергию BLG определяется методом ИФА, известным в данной области техники, и количество, превышающее 0,8 мкг на г белка, указывает на частичный гидролизат белка. Для сравнения: высокогидролизованный сывороточный белок демонстрирует менее 0,2 мкг вызывающего аллергию BLG на г белка. Небольшие, но значимые количества вызывающего аллергию BLG вместе с гидролизованным BLG или полученными из BLG пептидами, более предпочтительно также в комбинации со штаммом молочнокислых бактерий, еще более предпочтительно также в комбинации с молочнокислыми бактериями и одним или более NDO(s) усиливают толерогенную активность композиции, однако количество BLG остается все еще достаточно низким для уменьшения аллергенности питательной композиции и для того, чтобы питательная композиция была гипоаллергенной. С этой точки зрения предпочтительно использовать гидролизат белка, содержащий незначительное количество вызывающего аллергию бета-лактоглобулина и содержащий полученные из BLG пептиды по изобретению по сравнению с синтетическими пептидами, состоящими из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:5, более предпочтительно состоящий из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:5 (без вызывающего аллергию BLG).
Молочнокислый бактерии
Композиция по настоящему изобретению предпочтительно содержит штамм видов молочнокислых бактерий, которые усиливают оральную иммунную толерогенную активность BLG пептидов по настоящему изобретению. Штамм бактерии предпочтительно является пробиотиком. Доказательства представлены в примерах 5 и 7. Было обнаружено, что присутствие молочнокислых бактерий увеличивает экспрессию молекул HLA-DR на поверхности дендритных клеток. Повышенная экспрессия HLA-DR также указывает на улучшенную презентацию пептидов Т-клеткам и, следовательно, индукцию оральной иммунной толерантности.
Bifidobacteria
B. breve, B. longum, B. infantis, B. bifidum
Lactobacillus
L. acidophilus, L. paracasei, L. johnsonii, L. plantarum
L. reuteri, L. rhamnosus, L. casei, L. lactis
Streptococcus
S. thermophilus
Bifidobacterium breve
Bifidobacterium longum
Подходящие молочнокислые бактерии включают штаммы рода  (например, ), (например, , ) и  (например, ).  и  являются особенно подходящими молочнокислыми бактериями.
Bifidobacterium
Bifidobacterium breve
B. breve
B. breve
B. breve
B. breve
B. breve
B. breve
B. breve
B. breve
B. breve
B. breve
B. breve
B. breve
B. breve
B. breve
B. breve
Композиция предпочтительно содержит штамм молочнокислых бактерий, принадлежащих к роду , предпочтительно к виду .  предпочтительно имеетпо меньшей мере 95% идентичность последовательности 16S рРНК по сравнению с типовым штаммом  ATCC 15700, более предпочтительно идентичностьпо меньшей мере 97% (Stackebrandt & Goebel, 1994, Int. J. Syst. Bacteriol. 44:846-849). Подходящие штаммы  могут быть выделены из фекалий здоровых грудных детей, вскармливаемых грудным молоком. Обычно они имеются на рынке от производителей молочнокислых бактерий, но их также можно напрямую выделить из фекалий, идентифицировать, охарактеризовать и получить. Согласно одному варианту осуществления настоящая композиция содержит , выбранный из группы, состоящей из  Bb-03 (Rhodia/Danisco),  M-16V (Morinaga),  R0070 (Institute Rosell, Lallemand),  BR03 (Probiotical),  BR92 (Cell Biotech), DSM 20091, LMG 11613, YIT4065, FERM BP-6223 и CNCM I-2219.  может быть  M-16V и  CNCM I-2219, наиболее предпочтительно  M-16V.  I-2219 был опубликован в международной заявке WO 2004/093899 и депонирован в Национальной коллекции культур микроорганизмов Института Пастера, Париж, Франция, 31 мая 1999 г. компанией Compagnie Gervais Danone.  M-16V был депонирован как BCCM/LMG23729 и имеется на рынке от Morinaga Milk Industry Co., Ltd.
4
13
5
11
6
10
Молочнокислые бактерии могут присутствовать в композиции в любой подходящей концентрации, предпочтительно в терапевтически эффективном количестве или «количестве, эффективном для лечения» в контексте изобретения. Предпочтительно штамм молочнокислых бактерий включен в настоящую композицию в количестве 10-10 КОЕ на г сухого веса композиции, предпочтительно 10-10 КОЕ/г, наиболее предпочтительно 10-10 КОЕ/г.
Неперевариваемые олигосахариды
В предпочтительном варианте осуществления настоящая композиция дополнительно содержит один или более неперевариваемых олигосахаридов (NDO). Как и молочнокислые бактерии они дополнительно повышают оральную иммунную толерантность, индуцируя свойства пептидов белка BLG. Доказательства усиленного эффекта приведены в примере 5.
Преимущественно и наиболее предпочтительно неперевариваемый олигосахарид является водорастворимым (согласно способу, раскрытому в L. Prosky et al, J. Assoc. Anal. Chem 71:1017-1023, 1988) и предпочтительно представляет собой олигосахарид со степенью полимеризации (СП) от 2 до 200. Средняя СП неперевариваемого олигосахарида предпочтительно составляет ниже 200, более предпочтительно ниже 100, еще более предпочтительно ниже 60, наиболее предпочтительно ниже 40.
Неперевариваемый олигосахарид предпочтительно является пребиотиком. Он не переваривается в кишечнике под действием пищеварительных ферментов, присутствующих в верхних отделах пищеварительного тракта человека (тонком кишечнике и желудке). Неперевариваемый олигосахарид ферментируется микробиотой кишечника человека. Например, глюкоза, фруктоза, галактоза, сахароза, лактоза, мальтоза и мальтодекстрины считаются перевариваемыми. Исходные материалы олигосахаридов могут включать моносахариды, такие как глюкоза, фруктоза, фукоза, галактоза, рамноза, ксилоза, глюкуроновая кислота, GalNac и тому подобное, но они не являются частью олигосахаридов. Неперевариваемый олигосахарид предпочтительно выбирают из группы, состоящей из фруктоолигосахарида, неперевариваемого декстрина, галактоолигосахарида, ксилоолигосахарида, арабиноолигосахарида, арабиногалактоолигосахарида, глюкоолигосахарида, глюкоманноолигосахарида, галактоманноолигосахарида, маннанолигосахарида, хитоолигосахарида, олигосахарида уроновой кислоты, сиалилолигосахарида и фукоолигосахарида, и их смеси, предпочтительно фруктоолигосахаридов. Примерами сиалилолигосахарида являются 3-сиалиллактоза, 6''-сиалиллактоза, сиалиллакто-N-тетраозы, дисиалиллакто-N-тетраозы. Примерами фукоолигосахаридов являются (не)сульфатированные фукоидановые олигосахариды, 2'-фукозиллактоза, 3'-фукозиллактоза, лакто-N-фукопентаоза I, II, III, LNDH, лактодифукотетраоза, лакто-N-дифукогексаоза I и II.
Один подходящий тип олигосахарида представляет собой короткоцепочечный олигосахарид, который имеет среднюю степень полимеризации ниже 10, предпочтительно не выше 8, предпочтительно в диапазоне 2-7. Короткоцепочечный олигосахарид предпочтительно включает галактоолигосахариды и/или фруктоолигосахариды (то есть scGOS и/или scFOS). В одном варианте осуществления композиция содержит галактоолигосахариды, предпочтительно бета-галактоолигосахариды, предпочтительно трансгалактоолигосахариды. Галактоолигосахариды предпочтительно имеют среднюю степень полимеризации в диапазоне от 2 до 8, предпочтительно от 3 до 7, то есть являются короткоцепочечными олигосахаридами в контексте изобретения. (Транс)галактоолигосахариды имеются в продаже, например, под торговым названием VivinalGOS (Friesland Campina Domo Ingredients, Нидерланды), Bimuno (Clasado), Cup-oligo (Nissin Sugar) и Oligomate55 (Yakult). Композиция предпочтительно содержит короткоцепочечные фруктоолигосахариды и/или короткоцепочечные галактоолигосахариды, предпочтительнопо меньшей мере короткоцепочечные фруктоолигосахариды. Фруктоолигосахариды могут быть продуктами гидролизата инулина, имеющими среднюю СП в вышеуказанных (под)диапазонах; такие продукты FOS, например, имеющиеся на рынке в виде Raftilose P95 (Orafti) или от Cosucra.
Другим подходящим типом олигосахаридов являются длинноцепочечные фруктоолигосахариды (lcFOS), которые имеют среднюю степень полимеризации выше 10, обычно в диапазоне 10-100, предпочтительно 15-50, наиболее предпочтительно выше 20. Конкретный тип длинноцепочечных фруктоолигосахаридов представляет собой инулин, например Raftilin HP.
Настоящая композиция может содержать смесь двух или более типов неперевариваемых олигосахаридов, наиболее предпочтительно смесь двух неперевариваемых олигосахаридов. В случае, если NDO включает или состоит из смеси двух различных олигосахаридов, один олигосахарид может быть короткоцепочечным, как определено выше, и один олигосахарид может быть длинноцепочечным, как определено выше. Наиболее предпочтительно, короткоцепочечные олигосахариды и длинноцепочечные олигосахариды присутствуют в весовом соотношении короткоцепочечных к длинноцепочечным в диапазоне от 1:99 до 99:1, более предпочтительно от 1:1 до 99:1, более предпочтительно от 4:1 до 97:3, еще более предпочтительно от 5:1 до 95:5, еще более предпочтительно от 7:1 до 95:5, еще более предпочтительно от 8:1 до 10:1, наиболее предпочтительно около 9:1.
В одном варианте осуществления композиция содержитпо меньшей мере два фруктоолигосахарида и/или галактоолигосахарида. Подходящие смеси включают смеси длинноцепочечных фруктоолигосахаридов с короткоцепочечными фруктоолигосахаридами или с короткоцепочечными галактоолигосахаридами, наиболее предпочтительно длинноцепочечные фруктоолигосахариды с короткоцепочечными фруктоолигосахаридами.
Настоящая композиция предпочтительно содержит от 0,05 до 20 вес.% указанных неперевариваемых олигосахаридов, более предпочтительно от 0,5 до 15 вес.%, еще более предпочтительно от 1 до 10 вес.%, наиболее предпочтительно от 2 до 10 вес.% в пересчете на сухой вес настоящей композиции. В жидком виде настоящая композиция предпочтительно содержит от 0,01 до 2,5 вес.% неперевариваемого олигосахарида, более предпочтительно от 0,05 до 1,5 вес.%, еще более предпочтительно от 0,25 до 1,5 вес.%, наиболее предпочтительно от 0,5 до 1,25 вес.% на 100 мл.
В одном варианте осуществления смесь NDO не содержит определяемых количеств кислых олигосахаридов.
Если неперевариваемый олигосахарид представляет собой смесь, то для определения настоящего изобретения используются средние значения соответствующих параметров.
Bifidobacterium
B. breve
Комбинация NDO и молочнокислых бактерий, как определено здесь выше, также называется «синбиотиком». Считается, что присутствие терапевтически эффективных количеств NDO вместе с молочнокислыми бактериями, дополнительно улучшает оральную иммунную толерантность, индуцируя свойства штамма , предпочтительно , вместе с фруктоолигосахаридами. Ссылка приводится на пример 5.
Другие компоненты
Композиция может дополнительно содержать длинноцепочечные полиненасыщенные жирные кислоты (LC-PUFA). LC-PUFA представляют собой жирные кислоты, в которых ацильная цепь имеет длину от 20 до 24 атомов углерода (предпочтительно 20 или 22 атома углерода), и в которых ацильная цепь содержитпо меньшей мере две ненасыщенные связи между указанными атомами углерода в ацильной цепи. Более предпочтительно настоящая композиция содержитпо меньшей мере одну LC-PUFA, выбранную из группы, состоящей из эйкозапентаеновой кислоты (EPA, 20:5 n3), докозагексаеновой кислоты (DHA, 22:6 n3), арахидоновой кислоты (ARA, 20:4 n6) и докозапентаеновая кислота (DPA, 22:5 n3), предпочтительно DHA, EPA и/или ARA. Такие LC-PUFA оказывают дополнительное благоприятное воздействие на снижение риска аллергии.
Предпочтительное содержание LC-PUFA в настоящей композиции не превышает 15 вес.% от общего количества жирных кислот, предпочтительно не превышает 10 вес.%, еще более предпочтительно не превышает 5 вес.%. Предпочтительно настоящая композиция содержитпо меньшей мере 0,2 вес.%, предпочтительнопо меньшей мере 0,25 вес.%, более предпочтительнопо меньшей мере 0,35 вес.%, еще более предпочтительнопо меньшей мере 0,5 вес.% LC-PUFA от общего количества жирных кислот, более предпочтительно DHA. Настоящая композиция предпочтительно содержит ARA и DHA, причем весовое соотношение ARA/DHA предпочтительно составляет более 0,25, предпочтительно более 0,5, более предпочтительно 0,75-2, еще более предпочтительно 0,75-1,25. Весовое соотношение предпочтительно составляет менее 20, более предпочтительно от 0,5 до 5. Количество DHA предпочтительно составляет более 0,2 вес.%, более предпочтительно более 0,3 вес.%, более предпочтительнопо меньшей мере 0,35 вес.%, еще более предпочтительно 0,35-0,6 вес.% от общего количества жирных кислот.
Питательная композиция
Композици. по изобретению можно использовать в качестве питательной композиции, нутритивной терапии, нутритивной поддержки, в качестве лечебного питания, в качестве пищевых продуктов для специальных медицинских целей или в качестве пищевой добавки. Настоящая композиция предпочтительно является энтеральной (оральной) композицией. Композиция вводится перорально или предназначена для перорального введения субъекту, нуждающемуся в этом, в частности детям и младенцам, включая детей ясельного возраста, предпочтительно детям до 6 лет, предпочтительно грудным детям или детям раннего возраста, обычно в возрасте 0-36 месяцев, более предпочтительно грудным детям 0-12 месяцев, наиболее предпочтительно 0-6 месяцев. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления настоящая композиция представляет собой молочную смесь первого уровня, молочную смесь второго уровня или молочную смесь для детей раннего возраста (также называемую молочную смесь третьего уровня), предпочтительно она представляет собой молочную смесь первого уровня или молочную смесь второго уровня, наиболее предпочтительно молочную смесь первого уровня. Термин «молочная смесь первого уровня» имеет четкое определение и постоянно контролируется регулирующими органами на международном уровне. В частности, общепризнанным является CODEX STAN 73-1981 «Стандарт на детские смеси и специальные медицинские препараты, предназначенные для младенцев». Он рекомендует по пищевой ценности и составу смеси, которые требуют в приготовленном молоке содержание на 100 мл не менее 60 ккал (250 кДж) и не более 70 ккал (295 кДж) энергии. FDA и другие регулирующие органы установили требования к питательным веществам в соответствии с ними.
Bos, Bison, Bubalus
Capra
Bos
Bos
Предпочтительно настоящая энтеральная предпочтительно питательная композиция предназначена для обеспечения ежедневных потребностей человека в питании, в частности для введения, в частности для кормления, людей, в частности грудных детей, включая детей ясельного возраста, предпочтительно подверженных риску развития аллергии на молочный белок, предпочтительно на молочный белок от видов рода  или , более предпочтительно рода , наиболее предпочтительно аллергии на белок коровьего молока. В одном варианте осуществления аллергия на молочный белок касается молока от конкретных видов млекопитающих, и гидролизованный молочный белок, содержащийся в композиции, принадлежит тем же видам млекопитающих, предпочтительно оба относятся к роду .
С целью удовлетворения потребностей грудного ребенка в калориях, настоящая энтеральная композиция предпочтительно содержит от 50 до 200 ккал/100 мл жидкости, более предпочтительно от 60 до 90 ккал/100 мл жидкости, еще более предпочтительно от 60 до 75 ккал/100 мл жидкости. Эта калорийность обеспечивает оптимальное соотношение между потреблением воды и калорий. Осмолярность данной композиции предпочтительно составляет от 150 до 420 мОсмоль/л, более предпочтительно от 260 до 320 мОсмоль/л. Низкая осмолярность направлена на снижение желудочно-кишечного стресса.
-1
Предпочтительно настоящая энтеральная композиция находится в жидкой форме, предпочтительно с вязкостью ниже 35 мПа⋅с, более предпочтительно ниже 6 мПа⋅с, измеренной на вискозиметре Брукфилда при 20°C и скорости сдвига 100 с. Соответственно, настоящая энтеральная композиция находится в виде порошка, который предпочтительно может быть восстановлен водой с образованием жидкости, или в виде жидкого концентрата, который следует разбавлять водой. Если настоящая энтеральная композиция находится в жидком виде, то предпочтительный объем, вводимый ежедневно, находится в диапазоне от около 80 до 2500 мл, более предпочтительно от около 450 до 1000 мл в день.
Композиция по изобретению предпочтительно содержит липидный компонент, предпочтительно липидный компонент, подходящий для детского питания, как известно в данной области. Липидный компонент настоящей композиции предпочтительно обеспечивает от 2,9 до 6,0 г, более предпочтительно от 4 до 6 г на 100 ккал композиции. В жидкой виде композиция предпочтительно содержит от 2,1 до 6,5 г липидов на 100 мл, более предпочтительно от 3,0 до 4,0 г на 100 мл. В пересчете на сухой вес настоящая молочная смесь первого уровня или второго уровня предпочтительно содержит от 12,5 до 40 вес.% липидов, более предпочтительно от 19 до 30 вес.%.
Композиция по изобретению может содержать дополнительный белковый материал в дополнение к полученному из бета-лактоглобулина пептиду(ам) по изобретению. В контексте настоящего изобретения дополнительный «белок» или «белковый материал» или «белковые эквиваленты» охватывает белки, пептиды, свободные аминокислоты и частично или высокогидролизованные белки.
Предпочтительно дополнительный белковый материал - добавляемый к полученному из бета-лактоглобулина пептиду(ам) - не вызывает аллергической реакции или является гипоаллергенным, таким как свободные аминокислоты и гидролизованный белок. В качестве дополнительного белкового компонента, то есть помимо полученного из бета-лактоглобулина пептида(ов) композиция по настоящему изобретению предпочтительно содержит свободные аминокислоты, гидролизованный сывороточный белок, предпочтительно частично гидролизованные сывороточные белки.
Композиция по настоящему изобретению предпочтительно содержит менее 1 вес.% интактного белка молока млекопитающих (коров). Композиция может содержать дополнительный белковый компонент, выбранный из группы, состоящей из свободных аминокислот, гидролизованного сывороточного белка и белков из других источников, таких как соя, горох, рис, коллаген или тому подобное, в интактной форме, в частично гидролизованной форме и/или в высокогидролизованной форме.
Настоящая композиция предпочтительно содержитпо меньшей мере 50 вес.% белкового компонента, полученного из молока нечеловеческого происхождения, более предпочтительнопо меньшей мере 90 вес.% в пересчете на сухой вес всего белка.
Настоящая композиция предпочтительно содержит от 4 до 25%, более предпочтительно от 5 до 20%, более предпочтительно от 7 до 16%, наиболее предпочтительно от 7 до 12% белка в пересчете на общую калорийность. Настоящая композиция, если она находится в жидком виде, предпочтительно содержит от 0,5 до 6,0 г, более предпочтительно от 0,8 до 3,0 г, еще более предпочтительно от 1,0 до 2,5 г белка на 100 мл. Настоящая композиция предпочтительно содержитпо меньшей мере 7,0 вес.%, более предпочтительнопо меньшей мере 8,0 вес.%, наиболее предпочтительнопо меньшей мере 9 вес.% илипо меньшей мере 10 вес.% белка в пересчете на сухой вес всей композиции. Предпочтительно настоящая композиция содержит не более 40 вес.%, более предпочтительно не более 15 вес.%, предпочтительно не более 20 вес.% белка в пересчете на сухой вес всей композиции.
Композиция может содержать перевариваемый углевод(ы). Обычно используются перевариваемые углеводы, которые, как известно в данной области техники, подходят для использования в питательных композициях для грудных детей, например, выбранные из перевариваемых полисахаридов (например, крахмала, мальтодекстрина), перевариваемых моносахаридов (например, глюкозы, фруктозы) и перевариваемых дисахаридов (например, лактозы, сахарозы). Особенно подходящими являются лактоза и/или мальтодекстрин. В одном варианте осуществления композиция не содержит лактозу.
Перевариваемый углеводный компонент предпочтительно содержитпо меньшей мере 60 вес.% лактозы в пересчете на общее количество перевариваемых углеводов, более предпочтительнопо меньшей мере 75 вес.%, еще более предпочтительнопо меньшей мере 90 вес.% лактозы в пересчете на общее количество перевариваемых углеводов.
Испытуемые люди
Bos
Bison
Bubalus
Capra
Bos
Bos
Bison
Bubalus
Capra
Bos
Целевые испытуемые люди или популяция предпочтительно представляют собой грудных детей (0-12 месяцев), предпочтительно грудных детей с риском развития аллергии, предпочтительно аллергии на молочный белок, предпочтительно молочный белок от видов рода ,, или , более предпочтительно рода , наиболее предпочтительно аллергии на белок коровьего молока, предпочтительно грудных детей, страдающих аллергией на молочный белок, предпочтительно на молочный белок от видов рода ,, или , более предпочтительно рода , наиболее предпочтительно аллергией на белок коровьего молока. Грудные дети, находящиеся в группе риска, предпочтительно определяются семейным анамнезом, предпочтительнопо меньшей мере одним родителем или наличие аллергии в анамнезе.
Человек предпочтительно имеет определенный аллель HLA-DRB1, выбранный из групп, состоящих из HLA-DRB1*01:01, HLA-DRB1*04:01, HLA-DRB1*04:04, HLA-DRB1*04:05, HLA-DRB1*7:01 и HLA-DRB1*09:01. HLA-DRB1 является наиболее преобладающим изотипом MHC II класса человека (>90%), локус гена HLA-DRB1 является полиморфным, в то время как локус гена HLA-DRA1 является мономорфным (то есть генотип HLA-DRB1 определяет всю молекулу HLA-DR), а аллель HLA-DRB1 экспрессируется в пять раз выше, чем его паралоги (HLA-DRB3, -DRB4 или -DRB5), и присутствует у всех людей.
Индукция оральной иммунной толерантности
Изобретение относится к
Bos
Bison
Bubalus
Capra
Bos
индукции оральной иммунной толерантности к молочному белку, предпочтительно к молочному белку от видов рода ,, или , более предпочтительно рода , наиболее предпочтительно к белку коровьего молока у человека или популяции, или
Bos
Bison
Bubalus
Capra
Bos
профилактике или лечению оральной иммунной непереносимости молочного белка, предпочтительно молочного белка от видов рода ,, или , более предпочтительно рода , наиболее предпочтительно белка коровьего молока у человека или популяции, или
Bos
Bison
Bubalus
Capra
Bos
снижению риска возникновения или развития оральной иммунной непереносимости молочного белка, предпочтительно молочного белка от видов рода ,, или , более предпочтительно рода , наиболее предпочтительно белка коровьего молока у человека или популяции, или
Bos
Bison
Bubalus
Capra
Bos
улучшению или усилению оральной иммунной толерантности к молочному белку, предпочтительно к молочному белку от видов рода ,, или , более предпочтительно рода , наиболее предпочтительно белку коровьего молока у человека или популяции.
Как описано здесь выше, испытуемый человек или популяция предпочтительно является испытуемым грудным ребенком или популяцией.
В контексте настоящего изобретения термин «оральная толерантность» означает оральную иммунную толерантность.
Bos
Bison
Bubalus
Capra
Bos
Bos
Bison
Bubalus
Capra
Bos
Bos
Bison
Bubalus
Capra
Bos
В предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к питательной композиции, как определено здесь выше, для применения в профилактике оральной иммунной непереносимости белка коровьего молока у испытуемого грудного ребенка или детской популяции грудного возраста с риском развития аллергии на молочный белок, предпочтительно на молочный белок от видов рода ,, или , более предпочтительно рода , наиболее предпочтительно аллергии на белок коровьего молока. В предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к питательной композиции, как определено здесь выше, для применения с целью снижения риска возникновения или развития оральной иммунной непереносимости молочного белка, предпочтительно молочного белка от видов рода ,, или , более предпочтительно рода , наиболее предпочтительно белка коровьего молока у испытуемого грудного ребенка или детской популяции грудного возраста с риском развития аллергии на молочный белок, предпочтительно на молочный белок от видов рода ,, или , более предпочтительно рода , наиболее предпочтительно аллергии на белок коровьего молока, где частичный гидролизат белка млекопитающих содержитпо меньшей мере 1 вес.%, более предпочтительнопо меньшей мере 5 вес.%, еще более предпочтительнопо меньшей мере 10 вес.% пептидов с молекулярной массой выше 1 кДа и/или более 0,8 мкг вызывающего аллергию BLG на 1 г общего белка.
УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ К ФИГУРАМ
Фиг.1: Сравнение спектров фрагментации репрезентативного пептида (SEQ ID NO:3; показан вверху), экспериментально зарегистрированного (B) и его синтетического эквивалента (A). Разница масс между аннотированными фрагмент-ионами экспериментального и синтетического пептида соответствует присутствию стабильного изотопа, меченного лизином в синтетическом пептиде, выделенном курсивом в последовательности (+8 Да). Символ * указывает на потерю воды фрагментами соответствующих b-ионов.
Фиг.2: Т-клеточные ответы после стимуляции идентифицированными пептидами. Специфичные к коровьему молоку Т-клеточные линии (TCLs) трех разных доноров стимулировали синтетическими эквивалентами идентифицированных пептидов (LIV…AAS=SEQ ID NO:9; LIV…SLL=SEQ ID NO:11; TMK…SLL=SEQ ID NO:3; TMK…DAQ=SEQ ID NO:4; DIQ…RVY=SEQ ID NO:5). Белок коровьего молока (CMP) брали в качестве контроля. Индекс стимуляции ≥2 считался значимым.
ПРИМЕР 1. ГИДРОЛИЗОВАННЫЙ СЫВОРОТОЧНЫЙ БЕЛОК И НОВЫЙ СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ ПЕПТИДОВ БЕТА-ЛАКТОГЛОБУЛИНА
Смесь кислого сывороточного белка и деминерализованного сладкого сывороточного белка (весовое соотношение белков 77:23) растворяли в воде (очищенной обратным осмосом) и затем гидролизовали в определенных условиях. Кислая сыворотка и сладкая сыворотка имеются на рынке. Сладкая сыворотка является побочным продуктом коагулированного сычужным ферментом сыра и содержит казеиногликомакропептид (CGMP), а кислая сыворотка (также называемая заквашенной сывороткой) является побочным продуктом коагулированного кислотой сыра и не содержит CGMP. Подходящими источниками кислого сывороточного белка являются деминерализованная сыворотка (Deminal, Friesland Campina, Нидерланды) и концентрат сывороточного белка (WPC80, Friesland Campina, Нидерланды). Смесь микробных эндопептидаз и экзопептидаз использовали для гидролиза этих двух источников белка с использованием метода, описанного в примере 1 международной заявки WO 2011/151059. Затем раствор гидролизованного белка подвергали распылительной сушке. Распределение пептидов по размеру в этом гидролизате белка определяли посредством эксклюзионной жидкостной хроматографии высокого давления, известной в данной области. Вкратце общая площадь поверхности хроматограмм интегрируется и разделяется на диапазоны масс, выраженные в процентах от общей площади поверхности. Диапазоны масс калибруются с использованием пептидов/белков с известной молекулярной массой. Гидролизат сывороточного белка можно классифицировать как частичный или умеренный гидролизат белка.
Полученный порошок гидролизата использовали в качестве единственного источника белка в молочных смесях для грудных детей. Аналогичным образом получали 10 разных партий молочной смеси для грудных детей. Количество бета-лактоглобулина, определенное методом ИФА, известным в данной области техники, составляло примерно от 0,8 до 3,5 мкг/г общего белка.
Для определения присутствия конкретных последовательностей в биологических образцах предпочтительным методом является масс-спектрометрия (МС) в отличие от более традиционных методов, которые в настоящее время используются для характеристики гидролизатов белков. Недавняя разработка в области МС, названная пептидомикой, позволяет характеризовать пептидные последовательности с большой чувствительностью и специфичностью (Dallas et al. J Nutr 2015; 145:425-433). Этот метод способен сократить разрыв между пониманием влияния специфичности последовательности на биологическую активность, которую может иметь гидролизат белка.
Образцы, по существу, готовили, как описано Butre et al, с добавлением стадии восстановления и алкилирования (Butre et al. Anal Bioanal Chem 2014; 406:5827-5841). Все химические вещества были получены от Sigma Aldrich. Вкратце, партии частичного гидролизата белка (pHP) разбавляли до 0,5% (об./об.) с использованием 50 мМ бикарбоната аммония с последующим восстановлением пептидов 4 мМ DTT и алкилированием 8 мМ йодацетамида. Смесь очищали центрифугированием при 20000×g в течение 10 мин и разбавляли до 0,1% (об./об.) с использованием 0,1 М уксусной кислоты.
Все образцы проанализировали методом нанопоточной жидкостной хроматографии с использованием ВЭЖХ системы Agilent 1200 (Agilent Technologies), подключенной в режиме онлайн к масс-спектрометру LTQ Velos (Thermo Fisher Scientific). Часть системы для жидкостной хроматографии работала при настройке, по существу, как описано ранее (14). Пептиды улавливали со скоростью 5 мкл/мин в 100% растворителе A (0,1 М уксусной кислоты в воде) на 2-см колонке-ловушке (внутренний диаметр 100 мкм, заполненной внутри компании с использованием смолы Aqua C18, 5 мкм (Phenomenex)) и элюировали с 20-см колонки IntegraFrit (внутренний диаметр 50 мкм, ReproSil-Pur C18-AQ 3 мкм, New Objective) при ~100 нл/мин в 90-минутном градиенте от 10% до 40% растворителя B (0,1 М уксусной кислоты в 8:2 (об./об.) ацетонитрил/вода). Элюент распыляли через стандартные наконечники эмиттера с покрытием (New Objective), соединенные встык с аналитической колонкой. Масс-спектрометр работал в режиме зависимости от данных, автоматически переключаясь между МС и МС/МС. Масс-спектры полного сканирования (от 300 до 1200 m/z) были получены при увеличении скорости сканирования после накопления до целевого значения 3000. Пять наиболее интенсивных ионов при пороге выше 500 были выбраны для индуцированных столкновением при нормированной энергии столкновения 35% после накопления до целевого значения 10000.
Все данные МС обрабатывались с помощью Proteome Discoverer (версия 2.1, Thermo Scientific). Списки пиков были созданы с использованием стандартного рабочего процесса. Идентификацию пептидов проводили путем поиска индивидуальных списков пиков спектров CID-фрагментации по базе данных, содержащей выбранные белки бычьей сыворотки и казеина, с использованием Mascot (версия 2.4.1, Matrix Science). Фермент не был определен, и пропущенные расщепления не допускались. Допуск по массе иона-предшественника был установлен на 0,2 Да, а допуск по массе иона продукта - на 0,5 Да. Карбамидометилирование (C) было установлено в качестве фиксированной модификации.
Из 314 пептидов, идентифицированных этим способом, 101 можно отнести к бета-лактоглобулину (BLG), что приводит к охвату последовательностей BLG на 90%. Большинство оставшихся пептидов происходило из других распространенных сывороточных белков, таких как α-лактальбумин и сывороточный альбумин. Всего в интересующей области (AA № 13-48) было идентифицировано 13 пептидов беталактоглобулина из минимальных 9 AAs (смотри таблицу 1 и фиг.1). Шесть из них были идентифицированы последовательно во всех 10 партиях. Однозначная идентификация пептидов была получена сравнением характеристик (время удерживания, массы пептида и спектра фрагментации) экспериментального пептида с его синтетическим эквивалентом, меченным стабильным изотопом. Пример приведен на фиг.1, где спектры фрагментации экспериментального и синтетического пептидов показывают отличную корреляцию. Таким образом, была подтверждена идентичность шести пептидов, обнаруженных во всех 10 партиях.
Таблица 1.
Последовательности пептидов бета-лактоглобулина, идентифицированных в 10 разных партиях частично гидролизованной молочной смеси для грудных детей на основе сыворотки
Номер аминокислоты в последовательности BLG
Последовательность
Количество партий, в которых был идентифицирован пептид
SEQ ID NO
AA 1-22
LIVTQTMKGLDIQKVAGTWYSL
7
6
AA 1-25
LIVTQTMKGLDIQKVAGTWYSLAMA
9
7
AA 1-26
LIVTQTMKGLDIQKVAGTWYSLAMAA
10
8
AA 1-27
LIVTQTMKGLDIQKVAGTWYSLAMAAS
10
9
AA 1-30
LIVTQTMKGLDIQKVAGTWYSLAMAASDIS
2
10
AA 1-32
LIVTQTMKGLDIQKVAGTWYSLAMAASDISLL
10
11
AA 1-35
LIVTQTMKGLDIQKVAGTWYSLAMAASDISLLDAQ
5
12
AA 1-39
LIVTQTMKGLDIQKVAGTWYSLAMAASDISLLDAQSAPL
2
13
AA 1-42
LIVTQTMKGLDIQKVAGTWYSLAMAASDISLLDAQSAPLRVY
2
14
AA 5-35
QTMKGLDIQKVAGTWYSLAMAASDISLLDAQ
2
15
AA 6-32
TMKGLDIQKVAGTWYSLAMAASDISLL
10
3
AA 6-35
TMKGLDIQKVAGTWYSLAMAASDISLLDAQ
10
4
AA 11-42
DIQKVAGTWYSLAMAASDISLLDAQSAPLRVY
10
5
Аналогичный анализ был проведен с партиями Nutrilon pepti, молочной смеси для грудных детей, содержащей высокогидролизованный сывороточный белок, продаваемой для диетотерапии аллергии на коровье молоко. Пептиды BLG из таблицы 1 не присутствовали в Nutrilon pepti.
ПРИМЕР 2. ИДЕНТИФИКАЦИЯ IN VITRO HLA-DR-РЕСТРИКТИРОВАННЫХ ПЕПТИДОВ
Идентификацию полученных из BLG пептидов, презентируемых человеческими DCs, проводили посредством ProImmune, как описано (Lamberth et al, Sci Transl Med 2017 11; 9(372):10.1126/scitranslmed.aag1286.). Вкратце, получали образцы мононуклеарных клеток периферической крови от 12 здоровых взрослых доноров с HLA-DR-типом. Доноров отбирали на основе общих 11 аллелей HLA-DRB1 (таблица 2). В данном исследовании HLA-DRB1 являлся приоритетным вследствие того, что молекула HLA-DR является наиболее преобладающим изотипом MHC II класса человека (>90%) (Sturniolo et al. Nat Biotechnol 1999; 17:555-561) и что локус гена HLA-DRB1 является полиморфным, в то время как локус гена HLA-DRA1 является мономорфным (то есть генотип HLA-DRB1 определяет всю молекулу HLA-DR) (Marsh et al, 2010. Tissue Antigens 75:291-455). Кроме того, аллель HLA-DRB1 экспрессируется в пять раз выше, чем ее паралоги (HLA-DRB3, -DRB4 или -DRB5), и присутствует у всех людей (O'Leary et al. Nucleic Acids Res 2016 4; 44(D1):D733 -45).
Таблица 2.
Доноры с учетом информации о типировании HLA-DRB1
Идентификатор донора
DRB1_1
DRB1_2
P1
*03:01
*03:01
P2
*01:01
*04:01
P3
*01:01
*07:01
P4
*01:01
*04:05
P5
*04:01
*07:01
P6
*13:02
*14:01
P7
*03:01
*09:01
P8
*11:01
*15:01
P9
*03:01
*11:01
P10
*07:01
*15:01
P11
*03:01
*15:01
P12
*01:01
*04:04
Незрелые моноцитарные DCs были сгенерированы in vitro и созревали в присутствии испытуемого гидролизованного белка (HP). DCs собирали и лизировали с целью получения комплексов HLA-DR с использованием специфического иммуноаффинного метода. Пептиды элюировали из комплексов HLA-DR и затем анализировали секвенированием с высоким разрешением ЖХ-МС/МС. Присутствие шести эндогенных релевантных белков (то есть ITGAM, ApoB, CLIP, TFRC, FcER2/FcGR2 и LAMP-1/3) оценивали в качестве контроля для этого анализа. Каждый донорский образец должен был экспрессировать минимум 3 релевантных белка, чтобы быть квалифицированным для последующего анализа. Полученные данные по HLA-DR-рестриктированным пептидам были скомпилированы и оценены с использованием программного обеспечения для анализа последовательностей со ссылкой на базу данных Swiss-Prot Human Proteome Database с включенными последовательностями испытуемых элементов. Вероятность реального обнаружения пептидов описывается их ожидаемым значением ≤0,05. Частота ложных обнаружений была определена как <1%.
С использованием анализа презентации антигена ProPresent, фокусируясь на полученных из BLG последовательностях, 15 релевантных пептидов с ожидаемым значением ≤0,05 были идентифицированы в 5 образцах доноров (таблица 3). Эти пептиды могут быть дополнительно сгруппированы в 2 группы уникальных последовательностей, то есть DIQ…DIS (AA № 11-30) и AMA…APL (AA № 23-39) (таблица 4). Важно отметить, что обе группы последовательностей перекрываются интересующей областью (то есть AA № 13-48 зрелой BLG). Это открытие продемонстрировало, что исследуемые полученные из BLG пептиды могут быть презентированы молекулами HLA-DR на человеческих DCs при инкубации со специфическим HP.
Таблица 3.
Значимые фрагменты, идентифицированные из HLA-DR-пептидных комплексов с ожидаемым значением <0,05
Идентификатор донора
DRB1_1
DRB1_2
Последовательность фрагмента(зрелый BLG)[SEQ ID NO]
Аминокислота начало/конец
Ожидаемое значение
P2
*01:01
*04:01
AMAASDISLLDAQSAPL - [16]- MAASDISLLDAQSAPLR [17]
23-3924-40
0,0430,0013
P3
*01:01
*07:01
- MAASDISLLDAQSAPL - [18]
24-39
0,009
P4
*01:01
*04:05
DIQKVAGTWYSLAMAASDI - [19]- - - - VAGTWYSLAMAASDIS [20]- - - - - - GTWYSLAMAASDIS [21]
11-2915-3017-30
0,0000520,000210,00037
P7
*03:01
*09:01
DIQKVAGTWYSLAMAASDI - - [19]DIQKVAGTWYSLAMAASDIS - [22]- - - - VAGTWYSLAMAASDI - - [23]- - - - VAGTWYSLAMAASDIS - [20]- - - - - AGTWYSLAMAASDIS - [24]- - - - - - GTWYSLAMAASDI - - [25]- - - - - - GTWYSLAMAASDIS - [21]
11-2911-3015-2915-3016-3017-2917-30
0,000190,000530,0020,0000190,00140,000230,000015
P12
*01:01
*04:04
AMAASDISLLDAQSAPL - [16]- MAASDISLLDAQSAPL - [18]
23-3924-39
0,0280,042
Таблица 4.
Ассоциацию аллелей HLA-DR в уникальной области зрелого BLG со значимыми фрагментами определяли по ожидаемому значению <0,05
Идентификатор донора
DRB1_1
DRB1_2
Уникальная область(зрелый BLG)[SEQ ID NO]
Аминокислота начало-конец
Количество значимых фрагментов и индивидуальный фрагмент
P2
*01:01
*04:01
AMAASDISLLDAQSAPLR [39]
23-40
2(23-39 и 24-40)
P3
*01:01
*07:01
MAASDISLLDAQSAPL [18]
24-39
1(24-39)
P4
*01:01
*04:05
DIQKVAGTWYSLAMAASDIS [22]VAGTWYSLAMAASDIS [20]GTWYSLAMAASDIS [21]
11-30
3(11-29, 15-30 и 17-30)
P7
*03:01
*09:01
DIQKVAGTWYSLAMAASDIS [22]
11-30
7(11-29, 11-30, 15-29, 15-30, 16-30, 17-29, 17-30)
P12
*01:01
*04:04
AMAASDISLLDAQSAPL [16]
23-39
2(23-39, 24-39)
Не все донорские антигенпрезентирующие клетки связываются с пептидами. Это касалось HLA-DRB1*03:01 у гомозиготного донора P1. Аналогичные аргументы могут быть применены в отношении доноров P6 и P11.
ПРИМЕР 3. СВЯЗЫВАНИЕ MHC II КЛАССА ПРИ ОЦЕНКЕ IN SILICO

Ограничением анализа презентации антигена ProPresent является использование общего анти-HLA антитела, а не специфического антитела к определенному аллелю HLA-DRB1 (например, анти-DRB1*01:01 антитела) для выделения исследуемого HLA-DR-пептидного комплекса. Следовательно, для донора с гетерозиготными генотипами HLA-DRB1, например, *01:01 и *04:01, неясно, какой аллель будет презентировать идентифицированный пептид.
Таким образом, идентифицированные HLA-DR-рестриктированные пептиды вычисляли в программном обеспечении для предсказания связывания с МНС II класса IEDB (http://tools.iedb.org/mhcii/) для оценки связывания обнаруженных пептидов с выбранными аллелями HLA-DRB1, как описано (Wang P, et al. PLoS Comput Biol 2008 4; 4(4):e1000048; Wang et al, BMC Bioinformatics 2010, 11:568-2105-11-568). По умолчанию был выбран рекомендованный метод предсказания IEDB. Для каждой пептидной последовательности (15-мерной длиной) получали процентильный ранг сравнением баллов пептида с баллами пяти миллионов случайных 15-мерных пептидов, выбранных из базы данных Swiss-Prot. Более низкий процентильный ранг указывает на более высокую аффинность связывания пептида с конкретным аллелем MHC II класса, при котором IEDB рекомендует сделать выбор, основанный на консенсусном процентильном ранге верхних 10%. Для большей строгости при использовании оценки in silico был сделан выбор, основанный на консенсусном процентильном ранге верхних 3%.
Программное обеспечение для предсказания MHC II класса использовали для оценки того, будут ли фрагменты идентифицированных двух групп уникальных последовательностей BLG иметь высокую аффинность связывания с выбранными аллелями HLA-DRB1 охарактеризованных доноров из анализа ProPresent, то есть HLA-DRB1 *01:01, *03:01, *04:01, *04:04, *04:05, *07:01 и *09:01. Как показано в таблице 5, при произвольном пороге процентильного ранга, установленном на уровне <3% (то есть 3% верхних связывающих веществ), фрагменты DIQ…DIS (AA № 11-30) были предсказаны как имеющие высокую аффинность связывания с 5 аллелями HLA-DRB1, то есть DRB1 *01:01, *04:01, *04:04, *04:05 и *09:01. Напротив, было подсчитано, что только один фрагмент AMA…APL (AA № 23-39) связывается с HLA-DRB1 *07:01 с высокой аффинностью. Взятые вместе, эти полученные результаты свидетельствуют о том, что фрагменты AA № 11-30 имели более высокую вероятность быть презентированными в виде Т-клеточных эпитопов, чем фрагменты AA № 23-39. Кроме того, эти данные свидетельствуют о том, что несколько общих аллелей HLA-DRB1 могут презентировать фрагменты, полученные из идентифицированных двух групп полученных из BLG уникальных последовательностей.
Эти группы уникальных последовательностей BLG (AA № 11-30 и № 23-39) перекрываются и могут быть объединены в одну последовательность (то есть AA № 11-39). Эта объединенная последовательность сильно коррелировала с одним постоянно идентифицированным пептидом в исследуемой HP (AA № 11-42; DIQ…RVY). Следовательно, последовательность AA № 11-42 была испытана на программном обеспечении предсказания MHC II класса. Важно отметить, что предсказанные комплексы AA № 11-42 подтвердили предсказанные результаты двух идентифицированных in vitro уникальных последовательностей (таблица 6), предполагая, что обе уникальные последовательности BLG можно получить из пептида AA № 11-42, который присутствует в исследуемой молочной смеси. Кроме того, было предсказано, что части AA № 11-42 имеют высокую аффинность к теми же группами идентифицированных аллелей HLA-DRB1, то есть DRB1 *01:01, *04:01, *04:04, *04:05, *07:01 и *09:01. В заключение, оценка in silico подтверждает результаты in vitro, что полученные из BLG пептиды могут связываться с общими аллелями HLA-DRB1.
Таблица 5.
Оценка in silico потенциальных HLA-DRB1-пептидных комплексов двух идентифицированных полученных из BLG пептидов с процентильным рангом <3%
Аллель HLA-DRB1
Прогнозируемый 15-мерный фрагмент DIQKVAGTWYSLAMAASDIS (SEQ ID NO:25) или AMAASDISLLDAQSAPL (SEQ ID NO:19) [SEQ ID NO]
Процентильный ранг
HLA-DRB1*09:01
AGTWYSLAMAASDIS [24]
0,86
HLA-DRB1*04:05
AGTWYSLAMAASDIS [24]
1,38
HLA-DRB1*04:05
VAGTWYSLAMAASDI [23]
1,40
HLA-DRB1*09:01
VAGTWYSLAMAASDI [23]
1,56
HLA-DRB1*04:05
KVAGTWYSLAMAASD [26]
2,26
HLA-DRB1*01:01
AGTWYSLAMAASDIS [24]
2,37
HLA-DRB1*04:04
AGTWYSLAMAASDIS [24]
2,44
HLA-DRB1*09:01
KVAGTWYSLAMAASD [26]
2,53
HLA-DRB1*04:01
AGTWYSLAMAASDIS [24]
2,84
HLA-DRB1*07:01
AASDISLLDAQSAPL [27]
2,39
Таблица 6.
Оценка in silico потенциальных HLA-DRB1-пептидных комплексов длинного полученного из BLG пептида с процентильным рангом <3% (верхние 3% связывающих веществ)
Аллель HLA-DRB1
Прогнозируемый 15-мерный фрагмент DIQKVAGTWYSLAMAASDIS (SEQ ID NO:25) или AMAASDISLLDAQSAPL (SEQ ID NO:19) [SEQ ID NO]
Процентильный ранг
HLA-DRB1*09:01
GTWYSLAMAASDISL [28]
0,65
HLA-DRB1*09:01
AGTWYSLAMAASDIS [24]
0,86
HLA-DRB1*04:05
GTWYSLAMAASDISL [28]
1,30
HLA-DRB1*09:01
TWYSLAMAASDISLL [29]
1,32
HLA-DRB1*04:05
AGTWYSLAMAASDIS [24]
1,38
HLA-DRB1*04:05
VAGTWYSLAMAASDI [23]
1,40
HLA-DRB1*04:05
TWYSLAMAASDISLL [29]
1,40
HLA-DRB1*09:01
VAGTWYSLAMAASDI [23]
1,56
HLA-DRB1*09:01
WYSLAMAASDISLLD [30]
2,12
HLA-DRB1*09:01
YSLAMAASDISLLDA [31]
2,14
HLA-DRB1*01:01
GTWYSLAMAASDISL [28]
2,18
HLA-DRB1*04:05
KVAGTWYSLAMAASD [26]
2,26
HLA-DRB1*01:01
AGTWYSLAMAASDIS [24]
2,37
HLA-DRB1*07:01
AASDISLLDAQSAPL [27]
2,39
HLA-DRB1*07:01
SDISLLDAQSAPLRV [32]
2,44
HLA-DRB1*04:04
AGTWYSLAMAASDIS [24]
2,44
HLA-DRB1*04:04
GTWYSLAMAASDISL [28]
2,44
HLA-DRB1*04:04
TWYSLAMAASDISLL [29]
2,44
HLA-DRB1*01:01
TWYSLAMAASDISLL [29]
2,46
HLA-DRB1*09:01
KVAGTWYSLAMAASD [26]
2,53
HLA-DRB1*04:04
YSLAMAASDISLLDA [31]
2,57
HLA-DRB1*04:01
GTWYSLAMAASDISL [28]
2,83
HLA-DRB1*04:01
AGTWYSLAMAASDIS [24]
2,84
HLA-DRB1*04:04
WYSLAMAASDISLLD [30]
2,91

Некоторые оценки in silico подтвердили результаты in vitro ProPresent в отношении HLA-DR-пептидных комплексов. Однако мы заметили, что некоторые предсказанные in silico комплексы не коррелируют с обнаруженными в анализе ProPresent, например, DRB1 *04:04 с AGT…DIS. Это расхождение можно объяснить или небольшим размером исследуемой когорты в анализе ProPresent (n=12), или тем фактом, что каждый донор имел различную комбинацию типов аллелей HLA-DRB1 (то есть межиндивидуальную вариабельность) и/или тенденцией оценки in silico быть чрезмерно предсказуемой (что требует строгого ограничения). Следовательно, целесообразно комбинировать подходы как in vitro, так и in silico для идентификации комплексов пептид-MHC II класса.
ПРИМЕР 4. АНАЛИЗ ПРОЛИФЕРАЦИИ Т-КЛЕТОК
Синтетические пептиды получали JPT технологиями. Учитывались только пептиды, содержащиепо меньшей мере 9 AAs, поскольку это минимальный размер для связывания с молекулами MHC II класса и последующего распознавания Т-клетками (Holland et al, Front Immunol 2013 Jul 1; 4:172). Синтетические пептиды (JPT технологий), идентичные пептидам, идентифицированным во всех партиях HP из примера 1, растворяли в диметилсульфоксиде (Sigma Aldrich) в концентрации 5,3 мМ. Пептиды тестировали на специфичных для коровьего молока Т-клеточных линиях (TCLs) от трех разных доноров. Пептиды тестировали на специфичных к белку коровьего молока Т-клеточных линиях (TCLs) от трех доноров- доноров-детей грудного возраста с диагнозом аллергия на белок коровьего молока в возрасте <1 года, 7,5 месяцев и 6 лет. Эти TCLs были сгенерированы ранее, и, как было показано, распознают эпитопы в интересующей области (AA № 13-48 зрелой BLG). Пролиферацию определяли, как описано ранее (Ruiter et al, Clin Exp Allergy 2006, 36(3):303-310). Рассчитывали индексы стимуляции (SIs, соотношение между пролиферацией аллерген/стимулированных и нестимулированных пептидом Т-клеток), и SI≥2 считали положительным.
С целью подтверждения того, что пептиды, идентифицированные в HP, были распознаны Т-клетками, синтетические пептиды, идентичные этим идентифицированным пептидам, тестировали на специфичных для коровьего молока человеческих TCLs. Поскольку между идентифицированными пептидами наблюдалось перекрытие, протестировали пять пептидов (таблица 7), которые были идентифицированы во всех партиях и отличались друг от друга более чем на 9А. Все протестированные пептиды были способны индуцировать пролиферацию (фиг. 2). Однако каждый донор демонстрировал свое распознавание паттерна. Это также наблюдалось с данными предсказания in silico (данные не представлены). Все пять пептидов индуцировали пролиферацию TCL B, предполагая, что эта TCL распознает или перекрывающуюся часть пептидов (AA № 11-27), или множественные Т-клеточные эпитопы в этой области. Также TCL A показала пролиферативный ответ после стимуляции несколькими пептидами. Поскольку пептид LIV…AAS (AA № 1-27) не был способен индуцировать пролиферацию в TCL A, в то время как пептид LIV…SLL (AA № 1-32) мог, то область, содержащая AA № 28-32 (DISLL), имеет существенное значение для ответа TCL A. Неожиданно TCL C распознала пептид LIV…AAS (AA № 1-27), в то время как более длинный пептид, содержащий ту же последовательность с 5 дополнительными AA, LIV…SLL (AA № 1-32) не был способен индуцировать пролиферативный ответ, указывающий на то, что более длинные пептиды не всегда презентированы лучше.
Таблица 7.
Последовательности пептидов бета-лактоглобулина, идентифицированных в 10 разных партиях частично гидролизованной молочной смеси для грудных детей на основе сыворотки и протестированных на активность пролиферации Т-клеток
Номер аминокислоты в последовательности
Последовательность
SEQ ID NO
AA 1-27
LIVTQTMKGLDIQKVAGTWYSLAMAAS
9
AA 1-32
LIVTQTMKGLDIQKVAGTWYSLAMAASDISLL
11
AA 6-32
TMKGLDIQKVAGTWYSLAMAASDISLL
3
AA 6-35
TMKGLDIQKVAGTWYSLAMAASDISLLDAQ
4
AA 11-42
DIQKVAGTWYSLAMAASDISLLDAQSAPLRVY
5
Не все пептиды распознавались каждым донором, что указывает на различия между донорами. Каждый донор экспрессировал различную панель молекул MHC II класса. Для определения того, был ли и какой аллель HLA-DRB1 экспрессирован донорами презентируемых пептидов, использовался тот же алгоритм, что и описанный выше. Предсказание in silico подтвердило, что аллели HLA-DRB1 (*11:01 и *04:04), экспрессируемые донором B, способны презентировать все пептиды. На основе данных алгоритма TCL A должна распознавать только пептид DIQ...RVY (AA № 11-42), однако эта TCL показала пролиферативный ответ после стимуляции четырьмя из пяти пептидов. Возможное объяснение может заключаться в том, что три других пептида были презентированы не HLA-DRB1, а другими молекулами MHC II класса.
В заключение, примеры 1-4 демонстрируют, что специфический гидролизат сывороточного белка содержит функциональные Т-клеточные эпитопы. Было идентифицировано присутствие специфических пептидов бета-лактоглобулина, которые являются HLA-DRB1-рестриктированными пептидами. Они презентируются и распознаются Т-клетками разных доноров, включая здоровых доноров и грудных детей с аллергией на белок коровьего молока. Это взаимодействие было подтверждено анализом in silico. Следовательно, HP может стимулировать развитие оральной иммунотолерантности к белку.
ПРИМЕР 5. СМЕСЬ СИНБИОТИКОВ ДЕМОНСТРИРУЕТ ЕЩЕ БОЛЕЕ УЛУЧШЕННЫЙ ЭФФЕКТ ИНДУКЦИИ ТОЛЕРАНТНОСТИ ПО СРАВНЕНИЮ С ВЗЯТЫМИ ОТДЕЛЬНО ПРОБИОТИКАМИ ИЛИ ПРЕБИОТИКАМИ
Несколько опубликованных исследований подтверждают идею о том, что пищевые антигены (включая пептиды) в просвете кишечника могут абсорбироваться, а затем захватываться и презентироваться антигенпрезентирующими клетками кишечника, то есть механизмами отбора антигена, без необходимости нарушения кишечного барьера. Существуетпо меньшей мере два различных механизма, которые непрерывно работают для отбора пищевых антигенов в здоровом состоянии, то есть микроскладчатами/М-клетками опосредованный трансцитоз и антигенный пассаж, связанный с бокаловыми клетками. Оба пути обеспечивают пищевые антигены в CD103+ DCs собственной пластинки кишечника, которые, в свою очередь, могут импринировать молекулы кишечного самонаведения на Т и В-клетках, могут способствовать дифференцировке IgA-продуцирующих плазматических клеток кишечника, а также могут генерировать кишечные Tregs, ключевой элемент в состоянии гипореактивности к абсорбированному антигену, известном как оральная толерантность. Это говорит о том, что пептиды в испытуемых HP могут быть абсорбированы перорально с последующим захватом и презентацией кишечными CD103+DCs, что затем приводит к образованию функциональных Tregs.
Для развития оральной толерантности Т-клеточные эпитопы в испытуемых HP должны быть презентированы при соответствующих условиях. В дополнение к активации TCR, костимуляция и передача сигналов цитокинами играют важную роль в генерации Tregs. Про- или пребиотики играют важную роль в создании соответствующей среды для этой предрасположенности к Tregs. Профилактический эффект синтетических пептидов BLG усиливался в сочетании с пробиотической или пребиотической диетой.
Для демонстрации эффекта про-, пре- и синбиотиков проводили эксперимент, аналогичный описанному в примере 4 международной заявки WO 2016/148572, с использованием того же протокола, той же концентрации и смеси синтетических пептидов («Pepmix»), Pepmix идентифицирован в таблице 8.
Таблица 8.
Pepmix согласно международной заявке WO 2016/148572
Пептид
Последовательность
1 (18AA)
SEQ ID NO: 33
QKVAGTWYSLAMAASDIS
2 (18AA)
SEQ ID NO: 34
WYSLAMAASDISLLDAQS
3 (18AA)
SEQ ID NO: 35
AASDISLLDAQSAPLRVY
4 (18AA)
SEQ ID NO: 36
LLDAQSAPLRVYVEELKP
Сравнивали ряд диет:
9
Bifidobacterium breve
(а) синбиотическая диета из примера 1 международной заявки WO 2016/14472 (1 вес.% scFOS/lcFOS в весовом соотношении 9:1+2 вес.% 2×10 КОЕ/г  M-16V,
9
Bifidobacterium breve
(b) пробиотическая диета из примера 4 международной заявки WO 2016/148572 с использованием 2 вес.% 2×10 КОЕ/г  M-16V, и
(c) пребиотическая диета, содержащая 1 вес.% scFOS/lcFOS с весовым соотношением 9/1.
Короткоцепочечные (sc-) и длинноцепочечные (lc-) фруктоолигосахариды (FOS) имелись на рынке в виде Raftilose P95 (Orafti) и Raftiline HP соответственно.
Все группы предварительно обрабатывали с использованием Pepmix и одной из вышеуказанных диет, сенсибилизировали сывороткой+холерным токсином и заражали сывороткой.
После заражения сывороткой дельта отека уха у мышей, потреблявших (c) диету scFOS/lcFOS, составляла около 174 мкм, у мышей, потреблявших (b) пробиотическую диету, составляла около 158 мкм, а у мышей, потреблявших (а) синбиотическую диету, составляла около 112 мкм. Отек уха в группе синбиотиков (a) был статистически значимо ниже, чем в соответствующей группе scFOS/lcFOS (c), и наблюдалась тенденция к более низкому ответу по сравнению с группой пробиотиков (b) (p=0,08). Эти результаты свидетельствуют о дальнейшем улучшении эффекта на индукцию оральной иммунотолерантности:
Bifidobacterium
B. breve
при использовании молочнокислых бактерий, в частности штамма  вида , и
особенно при использовании молочнокислых бактерий в сочетании с NDOs.
ПРИМЕР 6. MHC-СВЯЗЫВАЮЩИЕ ДОМЕНЫ В ПРИРОДНЫХ, ИДЕНТИФИЦИРОВАННЫХ ПЕПТИДАХ ГИДРОЛИЗАТА ПО СРАВНЕНИЮ С СИНТЕТИЧЕСКИМИ ПЕПТИДАМИ БЕТА-ЛАКТОГЛОБУЛИНА
Метод: последовательности пептидов бета-лактоглобулина, которые были идентифицированы в гидролизованной молочной смеси для грудных детей (ID_PEP), и последовательности синтетических пептидов бета-лактоглобулина, которые были опубликованы в международной заявки WO2016/148572 (SYN_PEP, таблица 9), тестировали in silico с использованием программного обеспечения для предсказания связывания с МНС II класса IEDB (http://tools.iedb.org/mhcii/) с целью определения количества MHC II класса связывающих доменов в каждом пептиде. В программном обеспечении были выбраны рекомендованный IEDB метод предсказания и полный набор эталонов HLA. Этот набор эталонов HLA обеспечивает охват населения >99%. Программное обеспечение вычисляет процентильный ранг сравнением аффинность связывания предсказанного связывающего домена с большой группой пептидов. Чем выше аффинность, тем ниже процентильный ранг. В этом эксперименте были выбраны верхних 2% связывающих веществ.
Результаты
Количество MHC II класса связывающих доменов в идентифицированных пептидах выше, чем в синтетических пептидах (смотри таблицу 9). Программное обеспечение предсказалопо меньшей мере один связывающий домен для всех идентифицированных пептидов и в общей сложности шесть разных доменов. Для синтетических пептидов было предсказано четыре разных домена. Однако все эти домены были получены из одной последовательности, а именно SYN_PEP_1. Для других двух синтетических пептидов не было предсказано MHC II класса связывающих доменов.
Таблица 9.
Количество MHC II класса связывающих доменов на один пептид бета-лактоглобулина, предсказанный IEBD
Пептид
Последовательность
Количество MHC II класса связывающих доменов
ID_PEP_1
LIVTQTMKGLDIQKVAGTWYSLAMAAS
1
ID_PEP_2
LIVTQTMKGLDIQKVAGTWYSLAMAASDISLL
6
ID_PEP_3
TMKGLDIQKVAGTWYSLAMAASDISLL
6
ID_PEP_4
TMKGLDIQKVAGTWYSLAMAASDISLLDAQ
6
ID_PEP_5
DIQKVAGTWYSLAMAASDISLLDAQSAPLRVY
6
SYN_PEP_1
QKVAGTWYSLAMAASDIS
4
SYN_PEP_2
WYSLAMAASDISLLDAQS
0
SYN_PEP_3
AASDISLLDAQSAPLRVY
0
Количество MHC II класса связывающих доменов выше в идентифицированных пептидах, чем в синтетических пептидах. Другими словами, из идентифицированных пептидов можно получить больше Т-клеточных эпитопов, чем из синтетических пептидов. Следовательно, вероятность того, что идентифицированные пептиды будут презентированы Т-клеткам выше. Такая презентация Т-клеткам является необходимым условием для индукции оральной иммунной толерантности.
ПРИМЕР 7: ЭКСПРЕССИЯ HLA-DR НА ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТКАХ ПОСЛЕ СОЗРЕВАНИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ
Bifidobacterium breve
Метод: моноциты (клетки CD14+) культивировали в течение 7 дней с GM-CSF и IL-4 для получения незрелых дендритных клеток (DCs). Через 7 дней незрелые DCs промывали и инкубировали или с использованием среды, LPS (100 нг/мл) или  M-16V (Morinaga) в соотношении бактерии:DC 10:1. Через 48 часов зрелые DCs собирали и окрашивали меченным APC-Cyanine7 в отношении антител HLA-DR человека для определения экспрессии HLA-DR на поверхности клеток. Образцы анализировали на проточном цитометре BD FACS Canto с программным обеспечением FACS DIVA. Экспрессия HLA-DR приводится в виде средней интенсивности флуоресценции (MFI).
Bifidobacterium breve
Результаты: Созревание с использованием  M-16V (M16v-DC) увеличивает экспрессию HLA-DR до уровня, аналогичного LPS (LPS-DC, смотри таблицу 10).
Таблица 10.
Количество MHC II класса связывающих доменов на один пептид бета-лактоглобулина, предсказанный IEBD
DCs
MFI HLA-DR экспрессии (SD)
Незрелые DCs
11338 (1919,1)
LPS-DCs
24676 (9694,4)
M16v-DCs
21714 (1516)
DC=дендритные клетки, MFI=средняя интенсивность флуоресценции, SD=стандартное отклонение
Bifidobacterium breve
M-16V увеличивает экспрессию молекул HLA-DR на поверхности дендритных клеток. Повышенная экспрессия HLA-DR указывает на повышенную презентацию пептидов Т-клеткам.
ПРИМЕР 8. МОЛОЧНАЯ СМЕСЬ ДЛЯ ГРУДНЫХ ДЕТЕЙ
Порошкообразная молочная смесь для грудных детей, упакованная с инструкциями о том, что ее следует восстановить водой температурой 40°C с добавлением 3 мерных ложек порошка (13,74 г) в 90 мл воды для получения конечного объема 100 мл. Продукт подходит от рождения до 6 месяцев.
Bifidobacterium breve
7
В 100 мл молочной смеси для грудных детей содержится 66 ккал, 1,5 г белка (гидролизованный сывороточный белок из примера 1), 3,3 г жира (растительные масла, масло одноклеточных и рыбий жир, содержащие 0,4 вес.% DHA и 0,35 вес.% ARA в пересчете на общее количество жирных кислот), 7,2 г перевариваемых углеводов (преимущественно лактоза), 0,8 г неперевариваемых олигосахаридов (смесь scGOS и lcFOS 9/1 вес./вес.),  M-16V в количестве примерно 3×10 КОЕ/г , а также витамины, минеральные вещества, микроэлементы и другие биологически активные вещества в соответствии с международными директивами для молочных смесей для грудных детей.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  N.V. Nutricia
<120>  МОЛОЧНАЯ СМЕСЬ СО СПЕЦИФИЧЕСКИМИ ПЕПТИДАМИ БЕТА-ЛАКТОГЛОБУЛИНА
<130>  P6075124PCT1
<150>  PCT/NL2018/050281
<151>  2018-04-30
<160>  39
<210>  1
<211>  27
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  фрагмент пептида бета-лактоглобулина
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (1)..(1)
<223>  Хаа может быть Ile или Leu
<400>  1
Xaa Ile Val Thr Gln Thr Met Lys Gly Leu Asp Ile Gln Lys Val Ala
1               5                   10                  15
Gly Thr Trp Tyr Ser Leu Ala Met Ala Ala Ser
20                  25
<210>  2
<211>  32
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  фрагмент пептида бета-лактоглобулина
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (1)..(1)
<223>   Хаа может быть Ile или Leu
<400>  2
Xaa Ile Val Thr Gln Thr Met Lys Gly Leu Asp Ile Gln Lys Val Ala
1               5                   10                  15
Gly Thr Trp Tyr Ser Leu Ala Met Ala Ala Ser Asp Ile Ser Leu Leu
20                  25                  30
<210>  3
<211>  27
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  фрагмент пептида бета-лактоглобулина
<400>  3
Thr Met Lys Gly Leu Asp Ile Gln Lys Val Ala Gly Thr Trp Tyr Ser
1               5                   10                  15
Leu Ala Met Ala Ala Ser Asp Ile Ser Leu Leu
20                  25
<210>  4
<211>  30
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  фрагмент пептида бета-лактоглобулина
<400>  4
Thr Met Lys Gly Leu Asp Ile Gln Lys Val Ala Gly Thr Trp Tyr Ser
1               5                   10                  15
Leu Ala Met Ala Ala Ser Asp Ile Ser Leu Leu Asp Ala Gln
20                  25                  30
<210>  5
<211>  32
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  фрагмент пептида бета-лактоглобулина
<400>  5
Asp Ile Gln Lys Val Ala Gly Thr Trp Tyr Ser Leu Ala Met Ala Ala
1               5                   10                  15
Ser Asp Ile Ser Leu Leu Asp Ala Gln Ser Ala Pro Leu Arg Val Tyr
20                  25                  30
<210>  6
<211>  22
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  фрагмент пептида бета-лактоглобулина
<400>  6
Leu Ile Val Thr Gln Thr Met Lys Gly Leu Asp Ile Gln Lys Val Ala
1               5                   10                  15
Gly Thr Trp Tyr Ser Leu
20
<210>  7
<211>  25
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  фрагмент пептида бета-лактоглобулина
<400>  7
Leu Ile Val Thr Gln Thr Met Lys Gly Leu Asp Ile Gln Lys Val Ala
1               5                   10                  15
Gly Thr Trp Tyr Ser Leu Ala Met Ala
20                  25
<210>  8
<211>  26
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  фрагмент пептида бета-лактоглобулина
<400>  8
Leu Ile Val Thr Gln Thr Met Lys Gly Leu Asp Ile Gln Lys Val Ala
1               5                   10                  15
Gly Thr Trp Tyr Ser Leu Ala Met Ala Ala
20                  25
<210>  9
<211>  27
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  фрагмент пептида бета-лактоглобулина
<400>  9
Leu Ile Val Thr Gln Thr Met Lys Gly Leu Asp Ile Gln Lys Val Ala
1               5                   10                  15
Gly Thr Trp Tyr Ser Leu Ala Met Ala Ala Ser
20                  25
<210>  10
<211>  30
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  фрагмент пептида бета-лактоглобулина
<400>  10
Leu Ile Val Thr Gln Thr Met Lys Gly Leu Asp Ile Gln Lys Val Ala
1               5                   10                  15
Gly Thr Trp Tyr Ser Leu Ala Met Ala Ala Ser Asp Ile Ser
20                  25                  30
<210>  11
<211>  32
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  фрагмент пептида бета-лактоглобулина
<400>  11
Leu Ile Val Thr Gln Thr Met Lys Gly Leu Asp Ile Gln Lys Val Ala
1               5                   10                  15
Gly Thr Trp Tyr Ser Leu Ala Met Ala Ala Ser Asp Ile Ser Leu Leu
20                  25                  30
<210>  12
<211>  35
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  фрагмент пептида бета-лактоглобулина
<400>  12
Leu Ile Val Thr Gln Thr Met Lys Gly Leu Asp Ile Gln Lys Val Ala
1               5                   10                  15
Gly Thr Trp Tyr Ser Leu Ala Met Ala Ala Ser Asp Ile Ser Leu Leu
20                  25                  30
Asp Ala Gln
35
<210>  13
<211>  39
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  фрагмент пептида бета-лактоглобулина
<400>  13
Leu Ile Val Thr Gln Thr Met Lys Gly Leu Asp Ile Gln Lys Val Ala
1               5                   10                  15
Gly Thr Trp Tyr Ser Leu Ala Met Ala Ala Ser Asp Ile Ser Leu Leu
20                  25                  30
Asp Ala Gln Ser Ala Pro Leu
35
<210>  14
<211>  42
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  фрагмент пептида бета-лактоглобулина
<400>  14
Leu Ile Val Thr Gln Thr Met Lys Gly Leu Asp Ile Gln Lys Val Ala
1               5                   10                  15
Gly Thr Trp Tyr Ser Leu Ala Met Ala Ala Ser Asp Ile Ser Leu Leu
20                  25                  30
Asp Ala Gln Ser Ala Pro Leu Arg Val Tyr
35                  40
<210>  15
<211>  31
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  фрагмент пептида бета-лактоглобулина
<400>  15
Gln Thr Met Lys Gly Leu Asp Ile Gln Lys Val Ala Gly Thr Trp Tyr
1               5                   10                  15
Ser Leu Ala Met Ala Ala Ser Asp Ile Ser Leu Leu Asp Ala Gln
20                  25                  30
<210>  16
<211>  17
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  фрагмент пептида бета-лактоглобулина
<400>  16
Ala Met Ala Ala Ser Asp Ile Ser Leu Leu Asp Ala Gln Ser Ala Pro
1               5                   10                  15
Leu
<210>  17
<211>  17
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  фрагмент пептида бета-лактоглобулина
<400>  17
Met Ala Ala Ser Asp Ile Ser Leu Leu Asp Ala Gln Ser Ala Pro Leu
1               5                   10                  15
Arg
<210>  18
<211>  16
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  фрагмент пептида бета-лактоглобулина
<400>  18
Met Ala Ala Ser Asp Ile Ser Leu Leu Asp Ala Gln Ser Ala Pro Leu
1               5                   10                  15
<210>  19
<211>  19
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  фрагмент пептида бета-лактоглобулина
<400>  19
Asp Ile Gln Lys Val Ala Gly Thr Trp Tyr Ser Leu Ala Met Ala Ala
1               5                   10                  15
Ser Asp Ile
<210>  20
<211>  16
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  фрагмент пептида бета-лактоглобулина
<400>  20
Val Ala Gly Thr Trp Tyr Ser Leu Ala Met Ala Ala Ser Asp Ile Ser
1               5                   10                  15
<210>  21
<211>  14
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  фрагмент пептида бета-лактоглобулина
<400>  21
Gly Thr Trp Tyr Ser Leu Ala Met Ala Ala Ser Asp Ile Ser
1               5                   10
<210>  22
<211>  20
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  фрагмент пептида бета-лактоглобулина
<400>  22
Asp Ile Gln Lys Val Ala Gly Thr Trp Tyr Ser Leu Ala Met Ala Ala
1               5                   10                  15
Ser Asp Ile Ser
20
<210>  23
<211>  15
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  фрагмент пептида бета-лактоглобулина
<400>  23
Val Ala Gly Thr Trp Tyr Ser Leu Ala Met Ala Ala Ser Asp Ile
1               5                   10                  15
<210>  24
<211>  15
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  фрагмент пептида бета-лактоглобулина
<400>  24
Ala Gly Thr Trp Tyr Ser Leu Ala Met Ala Ala Ser Asp Ile Ser
1               5                   10                  15
<210>  25
<211>  13
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  фрагмент пептида бета-лактоглобулина
<400>  25
Gly Thr Trp Tyr Ser Leu Ala Met Ala Ala Ser Asp Ile
1               5                   10
<210>  26
<211>  15
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  фрагмент пептида бета-лактоглобулина
<400>  26
Lys Val Ala Gly Thr Trp Tyr Ser Leu Ala Met Ala Ala Ser Asp
1               5                   10                  15
<210>  27
<211>  15
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  фрагмент пептида бета-лактоглобулина
<400>  27
Ala Ala Ser Asp Ile Ser Leu Leu Asp Ala Gln Ser Ala Pro Leu
1               5                   10                  15
<210>  28
<211>  15
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  фрагмент пептида бета-лактоглобулина
<400>  28
Gly Thr Trp Tyr Ser Leu Ala Met Ala Ala Ser Asp Ile Ser Leu
1               5                   10                  15
<210>  29
<211>  15
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  фрагмент пептида бета-лактоглобулина
<400>  29
Thr Trp Tyr Ser Leu Ala Met Ala Ala Ser Asp Ile Ser Leu Leu
1               5                   10                  15
<210>  30
<211>  15
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  фрагмент пептида бета-лактоглобулина
<400>  30
Trp Tyr Ser Leu Ala Met Ala Ala Ser Asp Ile Ser Leu Leu Asp
1               5                   10                  15
<210>  31
<211>  15
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  фрагмент пептида бета-лактоглобулина
<400>  31
Tyr Ser Leu Ala Met Ala Ala Ser Asp Ile Ser Leu Leu Asp Ala
1               5                   10                  15
<210>  32
<211>  15
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  фрагмент пептида бета-лактоглобулина
<400>  32
Ser Asp Ile Ser Leu Leu Asp Ala Gln Ser Ala Pro Leu Arg Val
1               5                   10                  15
<210>  33
<211>  18
<212>  белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223>  Pepmix пептид 1
<400>  33
Gln Lys Val Ala Gly Thr Trp Tyr Ser Leu Ala Met Ala Ala Ser Asp
1               5                   10                  15
Ile Ser
<210>  34
<211>  18
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Pepmix пептид 2
<400>  34
Trp Tyr Ser Leu Ala Met Ala Ala Ser Asp Ile Ser Leu Leu Asp Ala
1               5                   10                  15
Gln Ser
<210>  35
<211>  18
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Pepmix пептид 3
<400>  35
Ala Ala Ser Asp Ile Ser Leu Leu Asp Ala Gln Ser Ala Pro Leu Arg
1               5                   10                  15
Val Tyr
<210>  36
<211>  18
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Pepmix пептид 4
<400>  36
Leu Leu Asp Ala Gln Ser Ala Pro Leu Arg Val Tyr Val Glu Glu Leu
1               5                   10                  15
Lys Pro
<210>  37
<211>  27
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  фрагмент пептида бета-лактоглобулина
<400>  37
Ile Ile Val Thr Gln Thr Met Lys Gly Leu Asp Ile Gln Lys Val Ala
1               5                   10                  15
Gly Thr Trp Tyr Ser Leu Ala Met Ala Ala Ser
20                  25
<210>  38
<211>  32
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  фрагмент пептида бета-лактоглобулина
<400>  38
Ile Ile Val Thr Gln Thr Met Lys Gly Leu Asp Ile Gln Lys Val Ala
1               5                   10                  15
Gly Thr Trp Tyr Ser Leu Ala Met Ala Ala Ser Asp Ile Ser Leu Leu
20                  25                  30
<210>  39
<211>  18
<212>  белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  фрагмент пептида бета-лактоглобулина
<400>  39
Ala Met Ala Ala Ser Asp Ile Ser Leu Leu Asp Ala Gln Ser Ala Pro
1               5                   10                  15
Leu Arg
<---