Промышленный мономер акриламид: взаимосвязь окислительного метаболизма, гепатотоксических эффектов и механизмов их развития

ОБРАЗ ЖИЗНИ, ЭКОЛОГИЯ

© 1 АРСКИХ ММ,-

ПРОМЫШЛЕННЫЙ МОНОМЕР АКРИЛАМНД: ВЗАИМОСВЯЗЬ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО МЕТАБОЛИЗМА, ГЕПАТОТОКСИЧЕСКИХ ЭФФЕКТОВ И МЕХАНИЗМОВ ИХ РАЗВИТИЯ

М. М. Тарских

(Красноярская государственная медицинская академия, ректор - д.м.н., проф. В.И. Прохоренков,

кафедра гигиены ГОУ В ПО)

Резюме. В работе доказана взаимосвязь между метаболизмом промышленного мономера акриламида и развитием его гепатотоксинеских эффектов: показана роль окислительного стресса в патогенезе гепатотоксинности яда, а также влияние окислительных превращений мономера в системе микросомальных оксидаз на процесс пере-кисного окисления липидов биомембран печени крыс. Витамин Е, ионол и низкомолекулярные тиолы (цисте-ин, глутатион и унитиол) предотвращали развитие повреждающих эффектов яда и предлагаются в качестве средств химиопрофилактики токсичности акриламида.

Ключевые слова. Акриламид, гепатотоксичность, перекисное окисление липидов.

Изучения механизмов токсического действия чужеродных химических веществ — ксенобиотиков связан с исследованием патологических реакций на уровне клеток и их мембран [1,6]. При этом рассмотрение состояния биомембран является особенно актуальным в связи с тем, что поступление в организм, распределение в тканях, метаболизм и выделение ксенобиотиков непосредственно связаны с их проникновением через мембраны |1, 15]. Именно на этом уровне ксенобиотики могут осуществлять свои токсические эффекты [4, 5]. Акриламид (АА) широко используется в самых различных отраслях промышленности, лабораторных и медицинских исследованиях. В литературе указывается на его высокую нейротоксичность [13]. Есть данные о его гепатотоксичности [11]. Однако нет сведений о конкретных патогенетических механизмах яда, неизвестна роль метаболизма АА в системе микросомальных оксидаз на развитие его токсических эффектов и их патогенетические механизмы.

Целью настоящей работы явилась оценка гепатотоксичности АА, изучение влияния его метаболизма в системе микросомальных оксидаз на развитие токсических эффектов и их механизмов, а также поиск средств химиопрофилактики повреждающего действия этого промышленного яда.

Методы и материалы

Работа выполнена на белых беспородных крысах-самцах массой 150-200 г. Вводился АА однократно, внугрибрюшинно в дозе 1,06 и 1,4 ммоль/кг. Для оценки гепатотоксичности АА в сыворотке крови определяли активности печеночно-специфических ферментов: фруктозомоно-фосфатальдолазы (ФМФА), бутирилхолинэстеразы (БХЭ) и щелочной фосфатазы (ЩФ) по методам, описанным ранее [2, 7, 8]. Активность ферментов выражали в микромолях гидролизованного субстрата на 1 мл сыворотки крови при инкубации в течение часа при температуре 37°С.

С целью индукции цитохрома Р-450 использовали отечественный препарат фенобарбитал, который вводился по классической схеме: внугрибрюшинно в дозе

0,31 ммоль/кг (80 мг/кг) трехкратно за 72,48 и 24 часа до АА. Для ингибирования синтеза цитохрома Р-450 применяли СоСЬ, вводимый подкожно в дозе 0,46 ммоль/кг (60 мг/кг) по схеме: двухкратно — за 48 и 24 часа до введения АА. Для изучения активности печеночно-специфических ферментов кровь забиралась из хвостовой вены у всех животных до начала опыта для определения фоновой активности ферментов и через 1,6, 12 и 24 часа после инъекции АА. Активность перекисного окисления липидов (ПОЛ) биомембран определялась по скорости образования малонового диалвдегида (МДА) [12] и выражалась в нмоль на мг белка за 30 минут.

Исходя из того, что природный антиоксидант альфа-токоферол и синтетический антиоксидант ионол находят широкое применение в качестве средств неспецифической терапии при различных патологических состояниях, в том числе и как мембранопротекто-ры [3, 14], изучалась возможность профилактического их применения при отравлении АА. Масляный раствор альфа-токоферола ацетата вводился трехкратно, внугрибрюшинно в эквимолярной с АА дозе -1,4 ммоль/кг (593,4 мг/кг) за 48,24 и 2 часа до введения акрилата. Масляный раствор ионола вводился также в дозе 1,4 ммоль/кг (280 мг/кг) однократно, внугрибрюшинно за б часов до введения АА. Цистеин гидрохлорид вводился однократно, внугрибрюшинно, в дозе

1,05 или 10,5 ммоль/кг за 30 минут до введения АА. (pH раствора цистеина доводился до 7,4). Унитиол вводился трехкратно, внутримышечно, в эквимолярной с ААдозе одновременно и через 3 и 5 часов после введения мономера.

Опыты проводились на группах, включающих 6-8 животных. Полученные результаты обрабатывались статистически с помощью вычисления средней арифметической (М) и стандартной ошибки средней арифметической (ш). Достоверность различий сравниваемых параметров рассчитывали с использованием t — критерия Стыодента. Различия считались значительными при Р<0,05. Математический расчет выполнялся с помощью статистической программы «Microsoft Excel».

Результаты и обсуждение

Полученные результаты свидетельствуют, что ЛЛ, вводимый животным -однократно, внутрибрюшинно, в дозе 4/5 от ЛД50 (1,04 ммоль/кг) вызывал повышение ФМФЛ в сыворотке кровь крыс уже через три часа с максимумом через б часов после введения яда (рис. 1). Активность фермента оставалась повышенной и через 24 часа с момента затравки, что свидетельствует о цитолизе гепатоцитов при остром отравлении. Иная динамика активности отмечалась для БХЭ: активность фермента в крови тех же животных снижалась на 80—90 % к б часам с момента введения ЛЛ, оставаясь на этом уровне до 12 часов и незначительно повышаясь через 24 часа после начала опыта (рис. 1). Это свидетельствует о нарушении белково-синтетической функции эндоплазматического ретикулума гепатоцитов. Падение активности БХЭ, вероятно, могло быть обусловлено как нарушением ее белкового синтеза в эндоплазматическом ретикулуме гепатоцитов, так и прямым ингибированием каталитической активности ферментов ЛЛ, как это имеет место при отравлении фосфорорганическими соединениями, оказываюши-

ФМФА

Примечание: но оси абсцисс — время забора крови после иньек-ции ЛЛ; по оси ординат - активность ферментов, в мкмоль/мл,в мин.

Здесь и далее: ° - Р < 0,05; 00 - Р < 0,01;

°"-Р< 0,001.

Рис. 1. Влияние акриламида

ми прямое ингибирующее действие на ацетилхолинэ-стеразу. С целью изучения прямого токсического действия мономера на бутирилхолинэстеразу была проведена инкубация сыворотки крови КрЬгс^'а]'!! тяжении часа в приеутетвшл-выеокойТеонцентрации ЛЛ - 40 мМ. Активность фермента при этом уменьшалась лишь на 30 %, учитывая, что скорость гидролиза бутирилхолина в контроле и опыте равны 19,8 и 13,6 мкмоль/мин. х мл1, соответственно. Изменение активности ЩФ в течение всего времени после отравления животных ЛЛ не отмечалось (рис. 1).

Таким образом, исследуемый нами промышленный мономер ЛЛ вызывал повреждение плазматической мембраны гепатоцитов, судя по повышению ФМФЛ, а также повреждение мембран эндоплазматического ретикулума гепатоцитов, диагностируемого по падению активности БХЭ в сыворотке крови опытных крыс. Это позволяет судить о типе поражения печени под воздействием акриламида, характеризуемого как некротически-дистрофический.

Следующая серия экспериментов проводилась с целью установления того, связан ли обнаруженный эффект ЛЛ с повреждающим действием его исходной молекулы или образующимися в системе микросо-мальных оксидаз его метаболитами. При этом изучалась активность ФМФЛ в сыворотке крови крыс на фоне предварительного введения фенобарбитала, классического индуктора микросомальных ферментов, а также с ос 12 — ингибитора цитохрома Р-450. В наших опытах предварительное введение фенобарбитала значительно усиливало гепатотоксическое действие ЛЛ, о чем свидетельствует более значительное повышение активности ФМФЛ в сыворотке крови отравленных животных уже через 3 часа после однократного внутрибрюшинного введения мономера в дозе 0,42 ммоль/кг (1/4 ЛДж) (рис. 2Л, кривая 2) по сравнению с теми опытами, где крысам вводился только один ЛЛ (рис. 2Л, кривая 1). Предварительное введение хлористого кобальта снижало цитолитичес-кое действие яда (рис. 2Б, кривая 4), что выражалось в меньшем приросте активности ФМФЛ по сравнению с группой животных, получавших только ЛЛ (рис. 2Б, кривая 3), вводившийся в этой серии опытов в гораздо более высокой дозе — 1,06 ммоль/кг (3/5 ЛДю). Как в опытах с фенобарбиталом, вводимым на фоне ЛЛ, так и в опытах с предварительным введением хлористого кобальта отличие эффекта от результатов на фоне одного ЛЛ сохранялось и через 12 часов с момента введения яда (рис. 2). Следовательно, окислительный метаболизм в системе микросомальных оксидаз играет важную роль в развитии гепатотоксичности ЛЛ, а его повреждающие эффекты связаны, по-видимому, с действием образующихся реактивных метаболитов, что подтверждается другими данными [9].

Далее нами проводились эксперименты с целью установления возможного прооксидантного действия в механизме токсических эффектов акриламида. Результаты опытов продемонстрировали значение ПОЛ по скорости образования МДЛ (нмоль/мг белка за 30 мин) в печени опытных животных за 1,3, 12 и 24 часа. Стимуляция ПОЛ наступала через 3 часа после введения крысам ЛЛ 0,34±0,03. Максимальный эффект

А

Т ооо*

1 2

Г-

13 6 12

1.5 1,4 1.3 1.2 1.1 1

0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2

0.1

Примечание: по оси абсцисс — время забора крови после инъекции АА; по оси ординат - активность фруктозомо-нофосфатапьдолазы (ФМФА) (мкмоль/мл в мин.) после внутрибрюшинного однократного введения АА в дозе 0,42 ммоль/кг (кривая I) или 1,06 ммоль/кг (кривая 3), или тех же доз фенобарбитала (кривая 2), или хлористого кобальта (кривая 4). Здесь и далее — достоверность отличий по сравнению с опытами, где животным вводился один АА:

! - Р < 0,05 ;5' - Р < 0,01 ; - Р < 0,001,

Рис. 2. Влияние фенобарбитала и хлористого кобальта на гепатотокеичноеть акриламида

приходился на 12 часов после начала затравки, о чем свидетельствует наибольшая скорость образования МДА 0,42±0,04, при контроле 0,23±0,13. Полученные результаты свидетельствуют о возможной роли пере-кисного окисления липидов в патогенезе гепатоток-сического действия АА.

С целью изучения влияния метаболитов акриламида на ПОЛ в следующей серии экспериментов оценивалась скорость образования МДА в печени на фоне тех же индукторов и ингибиторов системы микросо-мальных оксидаз. Результаты продемонстрировали увеличение скорости образования МДА в печени отравленных акриламидом крыс через 3 часа после затравки на фоне предварительного введения им фенобарбитала по сравнению с опытами, где им вводился один АА (табл. 1). Предварительное введение животным хлористого кобальта по вышеописанной схеме, хотя и не предотвращало развитие прооксидантного эффекта яда, но и достоверно не увеличивало скорости образования МДА в печени крыс данной группы по сравнению с теми, которым вводился один АА (табл. 1). Характерно, что введение одного хлористого

кобальта также оказывало прооксидантное действие, что согласуется с литературными данными |10|.

Таблица 1

Влияние фенобарбитала

Серия опытов Скорость образования МДА, нмоль/мг белка за 30 мин

Контроль 0,23±0,03

АА 0,34±0,03°

ФБ +А А 0,91±0,25о§

ФБ 0,42±0,18

СоСЬ + АА 0,59±0,15°

СоСН 0,52±0,02оо°

Примечание: инкубационная смесь, термостатируемая при 37°С, в 2,1 мл объема содержала: 100 мМ трис-НС1 буфер, pH 7,4; 4 мг/мл белка гомогенага печени. Скорость образования МДА определялась через 3 часа после введения АА.

Из полученных данных вытекает предположение, что ПОЛ биомембран, как составной компонент окислительного стресса, играет важную роль в патогенезе интоксикации АА. В связи с этим, учитывая результаты вышеприведенных исследований с целью поисков протекторов токсического действия АА использовались антиоксиданты различных классов: жирорастворимый полифенол альфа-токоферол, синтетический антиоксидант ионол, а также тиоловые соединения. Активность ферментов сыворотки крови измерялась через 6 часов после введения АА.

Таблица 2

Влияние предварительного введения антиоксидантов и тиоловых соединений на активность фруктозомоно-фосфатальдолазы (ФМФА), бутирихолинэстеразы (БХЭ) в сыворотке крови крыс при остром отравлении акриламидом

Серия ФМФА БХЭ

фон опыт фон опыт

АА 0 2,0±0,5°° 11,2±2,4 2,6 + 1,0"

Цистеин (1,05 мМ/кг) + АА 0,10-0,01 0,26+0,0 Г"» 10,0+0,6 5,2±0,4оо°8

Цистеин (10,5 мМ/кг) + АА 0 (*<§ 17,0+4,0 17,2+1,0

Унитиол + АА 0,20-0,1 0,10+0,098* 14,4+0,4 5,8±1,0оо°8

Альфа-токоферол + АА 0 0,1 0±0,05к 9,8±1,0 9,0±1,0855

Ионол + АА 0,07+0,04 0,12+0,06“ 9,0±1,0 11,8+2,0

Примечание: инкубационная смесь, термостатируемая

при 37°С в 2,1 мл объема содержала: 100 мМ трис — НС1 буфер, pH 7,4; 4 мг/мл белка гомогената печени.

Как видно из таблицы 2, геиатотоксическое действие акрилата предотвращалось предварительным введением как витамина Е, ионола, гак и тиоловых соединений отравленный АА крысам, что выражалось в снижении уровня активности ФМФА в сыворотке крови этих животных до фоновых значений, Введение витамина Е, ионола и тиоловых соединений отравленных АА крысам предотвращало также и нарушение белковосинтетической функции органа, о чем свидетельствует значительно меньшее снижение активности БХЭ в сыворотке крови этих крыс.

Таким образом, исходя из вышеприведенных данных АА при остром отравлении оказывает гена-

тотоксическое действие, характеризующееся некро-I ически-дистрофическим I ином поражения печени, обусловленною стимуляцией ПОЛ биомембран в этом органе в результате превращения яда в системе микросомальных оксидаз. Генат от оксические эффекты усиливаются после предварительного введения отравленным животным фенобарбитала — индуктора системы микросомального окисления в результате усиления стимуляции ПОЛ в печени опытных крыс. В качестве химионротекторов генатоток-сичности АА могут быть использованы природные и синтетические антиоксиданты и тиоловые соединения.

INDUSTRIAL MONOMER ACRILAMIDE: CORRELATION OF OXIDATIVE METABOLISM, TOXICITY EFFECTS AND MECHANISMS OF THEIR DEVELOPMENT

M.M. Tarskikh

The article showed correlation between oxidative metabolism industrial monomer acrilamide and its toxicity effects in rats. The author examined the role of lipid peroxidation biomembranes and possibility of using antioxidants and low-molecular thiols (cystein, glutatione and unithiol) in the chemoprophilaxis of poisonings with acrilamide.

ЛИТЕРАТУРА

1. Блтгер А.Ф., Майоре А.Я. Биологическая мембрана — основная структура организации жизнедеятельности клетки // Биологические мембраны и патология клетки. - Рига, 1986. - С. 5-10.

2. Брагинский Д.М., Пакторис Е.А., Подгорная Е.В. и др. Opi аноснецифические ферменты (фрукт озе-1-фос-фатальдолаза, сорбит ол дегидрогеназа, i лутаматде! и-дрогеназа) при вирусном гепатите и некоторых других заболеваниях// Ферменты в лабораторной диагностике. - М., 1973.-Т. 1.-С. 29-31.

3. Владимиров Ю.А. Свободные радикалы, антиоксиданты // Вестник РАМН. - 1998. - № 7. - С. 43-45.

4. Всемирная организация здравоохранения. Гигиенические критерии состояния окружающей среды 72. Принципы изучения болезней предположительно химической этиологии и их профилактика. —Женева, 1990.-С. 48.

5. Голиков С.И., Саиоцкий И.В.. Тиунов Л.А. Общие механизмы токсическою действия. — М.: Медицина, 1986. - С. 276.

6. Иванов В.В.. Климацкая Л.Г. Биомониторинг в предупреждении экологических болезней. — Красноярск.: КГУ, 1996,- 217 с.

7. Клинические лабораторные методы исследования в педиатрии/Под ред. И. Тодорова. — София, 1968. — С. 551-553.

8. Колб В. Г., Камышников B.C. Клиническая биохимия. -Минск: Беларусь, 1976, — С. 311.

9. Котловский И.В., Гришанова А.Ю., Иванов В.В. Взаимодействие метилмегакрилата и акриламида с системой микросомального окисления печени крыс // Вопросы мед. химии. — 1984. — Т. 30, Выи. 5. — С. 44-46.

10. Нефедов В.П., Кулис Ю.Ю., Лауринавичус А.В. и др. Влияние кобальта на динамику гематологических и метаболических показателей // Анализ регуляции гомеостатических процессов в изолированных системах и организме. — Красноярск, 1986. — С. 3—16.

11. Новикова Е.Е. О токсическом действии акриламида при поступлении через кожные покровы // Гигиена и санитарии, 1979. - № 10. - С. 73-74.

12. Стальная И.Д., Гаришвили Т. Г. Метод определения малоновою диальдегида с номощыо т иобарбитуровой кислот«//Современные методы в биохимии. — М., 1977. - С. 63-64.

13. Acrilamide. Environmental Health Criteria 49. — Geneva: WHO, 1985.-P. 42-61.

14. Lippman R.D., Agren A., Uhlen M. Application ofchemi-luminescent probes in investigating lysosomal sensitivity to superoxide versus suspected radical scavengers // Mech. Ageing. Dev. - 1981. - Vol. 17. - P. 2 83287.

15. Parke D. V. Activation mechanisms to chemical toxicity II Arch. Toxicol. - 1987. - Vol. 60. - P. 5-15.

ОСИПЕНКО Б.Г., ПОЛЯКОВА Л.О. -

ПРОСПЕКТИВНОЕ КОНТРОЛИРУЕМОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ В ЭПИДЕМИОЛОГО-ГИГИЕНИЧЕСКИХ НАБЛЮДЕНИЯХ

Б. Г. Осипенко, Л.О. Полякова

(Иркутский государственный медицинский университет, ректор — A.A. Майборода, кафедра общей химии, зав.- доц. Г.А. Заварзина; Иркутский государственный педагогический университет, ректор — проф. A.B. Гаврилюк, кафедра возрастной анатомии и физиологии спорта),

зав.— проф. Е.В. Бахарева