Оценка стимулирующего влияния обогащенной тромбоцитами плазмы в экспериментальной модели культур фибробластов пациентов с трофическими язвами венозной этиологии

Оценка стимулирующего влияния обогащенной тромбоцитами плазмы в экспериментальной модели культур фибробластов пациентов

с трофическими язвами венозной этиологии

Богдан В.Г.1, Толстов Д.А.1, Зафранская М.М.2

1Белорусский государственный медицинский университет, Минск 2Белорусская медицинская академия последипломного образования, Минск

Bogdan V.G.1, Tolstov D.A.1, Zafranskaya M.M. 2

Belarusian State Medical University, Minsk 2Belarusian Medical Academy of Post-Graduate Education, Minsk

Evaluation stimulating influence platelet rich plasma in experimental models fibroblast cultures of patients with trophic ulcers of venous etiology

Резюме. Представлена оценка результатов стимулирующего влияния обогащенной тромбоцитами плазмы на синтез коллагена I и III типа в культурахфибробластов пациентов с трофическими язвами венозной этиологии. Установлено, что аутологичная обогащенная тромбоцитами плазма стимулирует синтез коллагенов культурой фибробластов кожи пациентов с трофическими язвами венозной этиологии, что является экспериментальным обоснованием применения тромбоцитарных концентратов в клинической практике с активацией синтеза соединительной ткани in vivo без изменения ее структуры и состава. Фибробласты кожи пациентов с трофическими язвами венозной этиологии не являются рефрактерными к действию биологических ростовых факторов. Ключевые слова: обогащенная тромбоцитами плазма, фибробласты, коллаген.

Медицинские новости. - 2014. - №8. - С. 87-89. Summary. The article presents the evaluation of the stimulating effect of platelet-rich plasma synthesis of collagen I and III in fibroblast cultures of patients with trophic ulcers of venous etiology. It has been established that autologous platelet-rich plasma stimulates synthesis of collagens in culture of skin fibroblasts from patients with trophic ulcers of venous etiology, that is experimental substantiation for platelet concentrates clinical application with the activation of connective tissue synthesis in vivo without changing its structure and composition. Skin fibroblasts of patients wtth trophic ulcers of venous etiology are not refractory to the biological action of growth factors. Keywords: platelet-rich plasma, fibroblasts, collagen. Meditsinskie novosti. - 2014. - N8. - P. 87-89.

В исследованиях, посвященных изучению патогенеза трофических язв венозной этиологии, важная роль отводится особенностям длительно существующих ран на фоне гипертензии венозной системы с формированием специфических нарушений функционального состояния клеток фибропластического дифферона. Многочисленные методы в определенной степени позволили решить проблему лечения трофических язв, однако длительные сроки заживления язвенных дефектов сохранились. Основной причиной этого является отсутствие прямого позитивного влияния на сниженные репаративные процессы в области язвы. Естественная регенерация ран - сложный биологический механизм с многоступенчатой регуляцией факторов роста.

Установлено, что фибробласты в длительно незаживающих ранах характеризуются общим снижением митотической активности по сравнению с аналогичными культурами, полученными из острых ран [2]. Кроме того, доказано снижение спо-

собности фибробластов хронических ран к синтезу коллагена I типа с нарушением состава внеклеточного матрикса, что может быть одной из предпосылок развития отсроченной реэпителизации [3, 6].

В эксперименте in vitro фибробласты, выделенные из биологического материала, забранного в области трофической язвы на фоне хронической венозной недостаточности, демонстрировали сниженную способность к росту и проявляли свойства «старения» с низкой подвижностью и миграционной активностью по сравнению с фибробластами здоровой ткани [2, 4, 7].

В качестве возможных причин, инициирующих патологию на клеточном уровне, указываются различные факторы и механизмы. Отмечается, что венозная гипертен-зия непосредственно предопределяет низкий темп роста количества фибробластов в области трофической язвы, инициирует отложения фибрина и других макромолекул, что приводит к изоляции факторов роста и делает их недоступными для воздействия на эффекторные точки приложения [4, 10].

Описывается развитие у фибробластов хронических ран признаков устойчивости к воздействию биологических факторов роста, таких как тромбоцитарный фактор роста, трансформирующий фактор роста и другие [2, 9]. В других исследованиях показано, что нарушенные функциональные характеристики фибробластов в культуре могут быть восстановлены посредством воздействия ростовых факторов и медиаторов различного происхождения, в частности основного фактора роста фибробластов, эпидермального фактора роста, интер-лейкина 1 р, фактора некроза опухоли-а и т.д. [1, 5, 8].

Наиболее доступными носителями биологических факторов роста являются тромбоциты. Среди веществ, высвобождаемых при дегрануляции а-гранул тромбоцитов, важное значение имеют факторы роста, которые влияют на тканевую регенерацию посредством ауто-кринного и паракринного механизмов. В клинической практике используются различные варианты получения тромбо-

цитарных концентратов с содержанием тромбоцитов не ниже 1х106 /мкл, которые разделяют на две основные категории: обогащенная тромбоцитами плазма (platelet-rich plasma - PRP) и обогащенный тромбоцитами фибрин (platelet-rich fibrin - PRF). Некоторые исследователи дополнительно выделяют еще два вида: плазма, обогащенная тромбоцитами и лейкоцитами (leucocyte-rich PRP LPRP) и фибрин, обогащенный тромбоцитами и лейкоцитами (leucocyte-rich PRF LPRF) [1].

Учитывая отсутствие единого понимания патогенетических механизмов нарушения функции фибробластов трофических язв венозной этиологии, а также необходимость обоснования возможности применения аутологичных биологических медиаторов, содержащихся в обогащенной тромбоцитами плазме, для стимуляции синтеза коллагена основных типов, проведение экспериментальных исследований на культуральной модели актуально и принципиально в развитии регенеративной медицины.

Цель исследования - провести оценку стимулирующего влияния обогащенной тромбоцитами плазмы на синтез коллагена I и III типа в культурах фибробластов пациентов с трофическими язвами венозной этиологии.

Материалы и методы

Использовались культуры фибробластов кожи пациентов с трофическими язвами венозной этиологии (n=8) с хронической венозной недостаточностью

III степени по классификации L.R. Widmer (1987) в модификации Е.Г. Яблокова и со-авт. (1999) или VI клинического класса (С6) по классификации СЕАР Объединенного совета сосудистых хирургов (1994-2006), возникшими на фоне варикозной или посттромбофлебитической болезни. Все пациенты (8 женщин, средний возраст 52,8±12,1 года) проходили плановое лечение в отделении осложненной сосудистой патологии и гнойной хирургии УЗ «4-я городская клиническая больница им. Н.Е. Савченко» города Минска.

Выделение фибробластов кожи человека. Забор биологического материала (фрагмент кожи размером 1 см2) выполняли под местной анестезией у пациентов во время операции по закрытию хронической язвы кожным лоскутом после оформления информированного согласия. Для выделения фибробластов полученный материал инкубировали в 0,25% диспазе в течение 24 часов при 4°С для расслоения по базальной мембране и отделения дермы от эпидермиса. Дерму нарезали на участки размером 0,5 см2 и инкубировали в течение 2 часов с 0,2% раствором коллагеназы I типа (Sigma, США) в фосфатном буфере при 37°С.

Получение обогащенной тромбоцитами плазмыI (ОТП). В стерильные пластиковые пробирки, содержащие 1 мл 3,8% раствора цитрата натрия в качестве антикоагулянта, набирали по 6 мл крови пациента. Затем проводили центрифугирование пробирок в течение 20 минут с числом оборотов 2000 в минуту. После центрифугирования

в пробирках происходило разделение крови на три слоя. Два верхних слоя (за исключением нижнего, эритроцитарного) собирали шприцем и разводили в необходимом количестве плазмы (рис. 1).

Варианты культивирования фибробластов кожи человека. Культуры фибробластов высевали в концентрации 2х104 клеток на 1 см2 в различные культуральные среды. В качестве среды-контроля использовали среду DMEM-LG (Sigma, США), содержащую 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 2 мМ 1глутамина, антибиотика (50 ед/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина и 100 мкг/мл неомицина) в культуральные чашки диаметром 60 мм. Для оценки влияния тромбоцитарных концентратов на культуры фибробластов в пролиферативной среде проводили замену 10% ЭТС на 10% ОТП человека.

Микроскопия и мониторинг клеточных культур. Культуры исследовали на универсальном инвертированном микроскопе Carl Zeiss Axiovert 200 (Германия) с применением методов светлого поля, бокового освещения, фазового и Varel-контрастов (рис. 2).

Определение концентрации коллагенов. Количественное определение концентрации коллагена I и III типов методом твердофазного иммунофер-ментного анализа с использованием тест-систем производства Uscn Life Science Inc. (Китай) проводили в шестидневных супернатантах (n=16) второго пассажа культур фибробластов кожи пациентов с трофическими язвами венозной этиологии в различных условиях культивирования с расчетом содержания пг/мл на 105 клеток и оценкой отношения коллагена I/III типа. Результаты регистрировали на спектрофотометре BRIO-SIRIO (SEAC, Италия), измеряя оптическую плотность при 450 нм.

Статистическую обработку полученных результатов исследований проводили с применением пакета прикладных программ «Statistica» (Version 10, StatSoft Inc., 2011). Результаты представляли в виде медианы и интерквартильного размаха (Ме [25-й; 75-й процентили]). Для сравнения значений применяли критерий Вилкоксона (Wilcoxon) с поправкой Бонферрони. Различия считали достоверными при p<0,05.

Результаты и обсуждение

Анализ изменений показателей концентрации коллагена I и III типа в супер-натантах первичных культур фибробластов кожи пациентов с трофическими язвами венозной этиологии в различных условиях культивирования позволил установить ряд характерных особенностей.

Рисунок 1

Этапы получения обогащенной тромбоцитами плазмы

Рисунок 2

I Морфология фибробластов кожи пациентов с трофическими язвами венозной этиологии (2-й пассаж) при культивировании на 5 сутки в среде DMEM с 10% эмбриональной телячьей сывороткой (а) и с 10% аутологичной обогащенной тромбоцитами плазмой (б), ув. 100

МЕДИЦИНСКИЕ НОВОСТИ

№9* 2014

88

Рисунок 3

180 160 140 120 100

Концентрация коллагена I в супернатантах первичных культур фибробластов кожи пациентов с трофическими язвами венозной этиологии при культивировании в ЭТС и ОТП

Median  25%-75% Щ Мп-Мах

п

Рисунок 4

Концентрация коллагена III типа в супернатантах первичных культур фибробластов кожи пациентов с трофическими язвами венозной этиологии при культивировании в ЭТС и ОТП

п Median О 25%-75% Щ Min-Max

Обогащенная тромбоцитами плазма аутологичного происхождения оказывала стимулирующее влияние на культуру фибробластов с активацией продукции изучаемых типов коллагена. Установленный характер коррекции функционального состояния фибробластов обосновывает сохраняющуюся восприимчивость клеток к действию биологических медиаторов.

В ходе исследования выявлено увеличение в 3 раза содержания коллагена I типа при нахождении клеточных культур в среде, содержащей аутологичные ростовые факторы (ОТП), по сравнению с использованием ЭТС (3,38 (2,33; 5,65) пг/мл (n=8) и 10,3 (8,1; 50,94) пг/мл (n=8) соответственно, p<0,05) (рис. 3).

Кроме того, отмечен выраженный рост (в 7,7 раза) уровня коллагена III типа с 3,76 (1,45; 11,95) пг/мл (n=8) при культивировании в стандартной среде с ЭТС до 29,3 (14,45; 57,6) пг/мл (n=8) в среде с ОТП (p<0,05), превосходящий динамику накопления коллагена I типа (рис. 4).

Синергичное увеличение продукции коллагенов с преимущественным нако-

плением коллагена III типа может являться отражением активации синтетической функции фибробластов с формированием in vivo временной матрицы в процессе ремоделирования тканей в сочетании с преобразованием коллагена III типа в истинный коллаген I типа.

Вместе с тем, сохраняющееся без статистически значимых изменений (p>0,05) отношение коллагена I/III типа 0,74 (0,36; 1,95) - среда с ЭТС (n=8) и 0,49 (0,29; 1,1) - среда с ОТП (n=8) подтверждает отсутствие влияния комплекса аутологичных ростовых факторов на структуру и состав вновь образованной соединительной ткани.

Выводы

1. Аутологичная обогащенная тромбоцитами плазма стимулирует синтез коллагенов культурой фибробластов кожи пациентов с трофическими язвами венозной этиологии, что может являться экспериментальным обоснованием применения тромбоцитарных концентратов в клинической практике.

2. Использование обогащенной тромбоцитами плазмы позволяет активировать

синтез соединительной ткани без изменения ее структуры и состава.

3. У пациентов с трофическими язвами венозной этиологии фибробласты кожи сохраняют способность к колла-генообразованию при стимулирующем действии биологических ростовых факторов.

Л И Т Е Р А Т У Р А

1. Богдан В.Г. [и др.] // Мед. журн. - 2012. - №2. -С.22-25.

2. ВинникЮ.С. [и др.] // Новости хирургии. - 2011. -Т.19, №3. - С.101-110.

3. Cook H.J. [et al.] // Invest. Dermatol. - 2000. -Vol.115, N2. - Р.225-233.

4. Mendez M.V [et al.] // J. Vasc. Surg. - 1998. - Vol.28, N5. - Р.876-883.

5. Mendez MM [et al.] // J. Vasc. Surg. - 1998. - Vol.28, N6. - Р.1040-1050.

6. Raffetto J.D. // Thromb. Res. - 2009. - N123. -Р.66-71.

7. Raffetto J.D. [et al.] // J. Vasc. Surg. - 2001. - Vol.33, N6. - Р.1233-1241.

8. Stanley А.С. [et al.] // J. Vasc. Surg. - 1997. - Vol. 26, N6. - Р.994-999.

9. Telgenhoffl D, Shroot B. // Cell Death and Differentiation. - 2005. - N12. - Р. 695-698.

10. Trent JT. [et al.] // Ostom. Wound. Manage. - 2005 - Vol.51, N5. - Р.38-54.

Поступила 30.05.2014 г.

Уважаемые читатели!

Начинается подписка на журнал «Медицинские новости» на I полугодие 2015 года. Оставайтесь вместе с нами во имя здоровья людей!

Напоминаем, что сейчас Вы можете подписаться как на печатную (по каталогу РУП «Белпочта», индексы:

инд. - 74954, вед. - 74 9542), так и на электронную в формате pdf (по заявке в редакцию) версии нашего журнала.

Вся необходимая информация - на сайте www.mednovosti.by в разделах «Подписка» и «Электронная подписка».