КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ И ЛЕЧЕНИЯ ПОВРЕЖДЕНИЯ СПИННОГО МОЗГА
COMPOSITION FOR PREVENTION AND TREATMENT OF SPINAL CORD INJURY

Область техники
[1] Настоящее изобретение относится к композиции для предотвращения или лечения повреждения спинного мозга и к пищевой композиции для предотвращения или облегчения последствий повреждения спинного мозга, каждая из которых содержит (S)-2-(((4'-трифторметилбифенил-4-ил)метил)амино)пропанамид метансульфонат, и способ предотвращения или лечения повреждения спинного мозга.
[2]
Уровень техники
[3] Повреждение спинномозгового нерва в результате травмы или тому подобного вызывает паралич функций человека. Ткань спинномозгового нерва имеет более простую структуру, чем головной мозг, но проблема состоит в том, что регенерация нервов значительно затруднена. Патологические явления, возникающие после травмы спинного мозга, классифицируются с течением времени на две фазы: первичное повреждение и вторичное повреждение. Первичное повреждение представляет собой явление, возникающее в течение нескольких минут сразу после повреждения, приводящее к некрозу клеток в месте раны. На этом этапе фармакологическое лечение практически невозможно из-за быстрого разрушения клеток. Вторичное повреждение, которое следует за первичным повреждением, медленно прогрессирует в течение периода времени от нескольких часов до нескольких дней, что приводит к дегенерации клеток вокруг места раны, а также к медленной гибели клеток из-за апоптоза в окружающих нервных клетках и олигодендроцитах. Гибель клеток вокруг раны непрерывно прогрессирует, и в конечном итоге поврежденный участок внутри спинного мозга постепенно увеличивается в размерах. Кроме того, дегенерация аксонов, которые действуют как пути движения нервных сигналов, и миелиновых оболочек, которые помогают функциям аксонов, вызывает образование пустых пространств, таких как полости, что делает невозможным передачу нервных сигналов и, как следствие, к постоянной потере функций.
[4] За последнее десятилетие были проведены исследования по подавлению или облегчению стойкого функционального паралича, вызванного травмой спинного мозга, на основе исследований по изучению причин патологического воздействия после травмы спинномозговых нервов и регенерации спинномозговых нервов. В частности, с помощью фармакологического лечения трудно воздействовать на начальный механизм повреждения спинного мозга, потому что повреждение спинного мозга быстро прогрессирует на начальном этапе. Таким образом, фармакологическая стратегия воздействия на вторичные механизмы является важной частью при разработке терапии. В этом отношении к настоящему времени были опробованы различные потенциальные фармакологические способы лечения, включая стероиды, антиоксиданты, ингибиторы рецептора глутамата, ингибиторы ионных каналов, ганглиозиды, антитела к ингибиторам регенерации аксонов, противовоспалительные агенты и нейротрофические факторы. Среди них только метилпреднизолон в настоящее время используется в качестве терапевтического средства, назначаемого после повреждения спинного мозга. Однако метилпреднизолон имеет много проблем, таких как недостаточно доказанные терапевтические эффекты и побочные эффекты при введении его чрезмерных доз. Таким образом, существует острая необходимость в создании нового терапевтического агента.
[5]
Раскрытие
Техническая проблема
[6] В результате продолжительных усилий, направленных на решение проблем, связанных с предшествующим уровнем техники, авторы настоящего изобретения обнаружили, что соединение (S)-2-(((4'-трифторметилбифенил-4-ил)метил)амино)пропанамид метансульфонат настоящего изобретения обладает действием восстановления утраченной функции нерва, вызванной повреждением спинного мозга, облегчения боли и облегчения восстановления поврежденной ткани спинного мозга, и, таким образом, полезно для профилактики и лечения повреждения спинного мозга. На основании этого открытия было выполнено настоящее изобретение.
[7]
Техническое решение
[8] В соответствии с одним аспектом настоящего изобретения вышеуказанные и другие цели могут быть достигнуты путем получения фармацевтической композиции для предотвращения или лечения повреждения спинного мозга, содержащей в качестве активного ингредиента соединение, представленное следующей Формулой 1, или его фармацевтически приемлемую соль.
[9] Формула 1
[10]
[11] В другом аспекте настоящее изобретение относится к пищевой композиции для предотвращения или облегчения последствий повреждения спинного мозга, содержащей в качестве активного ингредиента данное соединение.
[12] В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу предотвращения или лечения повреждения спинного мозга, включающему в себя введение данного соединения субъекту, не являющемуся человеком.
[13]
Полезный эффект изобретения
[14] Композиция, содержащая соединение Формулы 1 настоящего изобретения, обладает превосходным действием по предотвращению, облегчению последствий и лечению повреждения спинного мозга за счет восстановления ухудшения нервных функций, вызванного повреждением спинного мозга, облегчения боли и облегчения восстановления поврежденной ткани спинного мозга.
[15]
Описание чертежей
[16] Фиг. 1 представляет собой диаграмму, показывающую общий период эксперимента и период введения лекарственного средства (KDS2010);
[17] Фиг. 2А представляет собой график, демонстрирующий эффект облегчения восстановления нервных функций при проведении поведенческого теста с использованием системы оценки движений Бассо-Битти-Бреснахана (БББ) после введения KDS2010 крысам с травмой спинного мозга и нормальным крысам;
[18] Фиг. 2В представляет собой график, демонстрирующий эффект снятия болевой реакции при проведении оценки болевой реакции с использованием динамического подошвенного теста после введения KDS2010 крысам с травмой спинного мозга и нормальным крысам;
[19] Фиг. 3 включает изображения, показывающие степень миелинизации тканей в результате окрашивания эриохромцианином поврежденного участка ткани, полученные после введения KDS2010 крысам с повреждением спинного мозга и нормальным крысам, и диаграммы, сравнивающие общую площадь ткани, общую площадь миелинизации и долю (%) общей площади миелинизации от общей площади ткани;
[20] Фиг. 4A-4D показывают количество миелинизированных аксонов, количество полостей и значение g-отношения, измеренные с помощью окрашивания толуидиновым синим (ТС) и ПЭМ-визуализации, где Sham представляет собой животную модель, которой не вводили вещество, индуцирующее повреждение спинного мозга субстанция, а V представляет собой контрольную группу для KDS;
[21] На фиг. 5A-5B показано количество вновь образованных нервных клеток, измеренное в результате иммунофлуоресцентного окрашивания; и
[22] На фиг. 6 показано количество воспалительных клеток, измеренное с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания.
[23]
Лучший вариант осуществления изобретения
[24] Далее настоящее изобретение будет описано подробно. При этом, каждое описание и вариант осуществления, раскрытые в настоящем изобретении, могут применяться к другим описаниям и вариантам осуществления. То есть все комбинации различных элементов, раскрытых в настоящем изобретении, входят в объем настоящего изобретения. Кроме того, объем настоящего изобретения не ограничивается конкретным описанием, приведенным ниже.
[25] Кроме того, специалисты в данной области техники, к которой относится настоящее изобретение, могут получить или распознать ряд эквивалентов определенных вариантов осуществления, раскрытых в настоящем изобретении, просто посредством обычных экспериментов. Кроме того, эти эквиваленты следует рассматривать как включенные объем настоящего изобретения.
[26] Таким образом, в одном аспекте настоящее изобретение направлено на фармацевтическую композицию для предотвращения или лечения повреждения спинного мозга, содержащую в качестве активного ингредиента соединение, представленное следующей Формулой 1, или его фармацевтически приемлемую соль.
[27] Формула 1
[28]
[29] В настоящем изобретении соединение, представленное Формулой 1, представляет собой (S)-2-(((4'-трифторметилбифенил-4-ил)метил)амино)пропанамид метансульфонат. В настоящем изобретении данное соединение может называться «KDS2010».
[30] Хотя изучение специфической фармакологической активности данного соединения все еще продолжается, не было выявлено, оказывает ли это соединение прямое действие на предотвращение и лечение повреждений спинного мозга.
[31] В настоящем изобретении нет особых ограничений в отношении способа получения (S)-2-(((4'-трифторметилбифенил-4-ил)метил)амино)пропанамид метансульфоната, и это соединение может быть химически синтезировано известным в данной области техники способом или может быть выбрано из коммерчески доступных веществ.
[32] (S)-2-(((4'-трифторметилбифенил-4-ил)метил)амино)пропанамид метансульфонат настоящего изобретения может присутствовать в сольватированной или несольватированной форме. (S)-2-(((4'-трифторметилбифенил-4-ил)метил)амино)пропанамид метансульфонат настоящего изобретения может присутствовать в кристаллической или аморфной форме, и все эти физические формы включены в объем настоящего изобретения.
[33]
[34] Фармацевтическая композиция настоящего изобретения может включать в себя не только соединение, представленное Формулой 1, но также его фармацевтически приемлемую соль. Используемый здесь термин «фармацевтически приемлемая соль» означает соль соединения в комбинации с другим веществом и относится к веществу, способному проявлять фармакологически подобную активность.
[35] Типы фармацевтически приемлемых солей включают в себя без ограничений соли неорганических кислот, такие как гидрохлорид, гидробромид, фосфат или сульфат, и соли органических кислот, такие как карбоксилат или сульфонат. Кроме того, тип карбоксилата включает в себя без ограничений ацетат, малеат, фумарат, малат, цитрат, тартрат, лактат или бензоат. Кроме того, тип сульфоната включает в себя без ограничений метансульфонат, этансульфонат, бензолсульфонат, толуолсульфонат или нафталиндисульфонат.
[36]
[37] Используемый здесь термин «повреждение спинного мозга» означает патологию, связанную с повреждением спинного мозга, вызванную травмой, такой как дорожно-транспортное происшествие или падение, которая вызывает потерю движения и, следовательно, потерю чувствительности из-за паралича двигательных нервов ниже поврежденного участка, а также нарушения в регуляции перистальтики мочевого пузыря и кишечника, регулируемой вегетативной нервной системой. Как правило, повреждение спинного мозга подразделяется на полное повреждение спинного мозга и неполное повреждение спинного мозга в зависимости от степени повреждения. Термин «полное повреждение спинного мозга» относится к повреждению спинного мозга, которое представляет собой состояние полностью поперечно разрезанного спинного мозга и приводит к потере двигательных и сенсорных способностей из-за потери всех функций спинного мозга ниже поврежденного участка спинного мозга. Термин «неполное повреждение спинного мозга» относится к повреждению спинного мозга, которое сохраняет некоторые ощущения или двигательную функцию ниже места повреждения и возникает в результате смещения костей, гематом из-за отека мягких тканей или позвоночного канала или частичного разрыва спинного мозга. Как правило, симптомы различаются в зависимости от расположения поврежденной области, и повреждение в шейном отделе имеет такие симптомы, как снижение артериального давления, пульса, температуры тела и частоты дыхания, а также может вызывать респираторный дистресс. Повреждение в грудном и поясничном отделе приводит к потере моторных и сенсорных функций тела и конечностей, а также к потере функций мочевого пузыря, толстой кишки и половой функции.
[38] Фармацевтическая композиция настоящего изобретения может способствовать восстановлению нервной функции, уменьшать боль, вызываемую повреждением спинного мозга, или способствовать восстановлению ткани спинного мозга.
[39] В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения результат лечения модели повреждения спинного мозга у животных соединением Формулы 1 настоящего изобретения показывает, что восстановление функции нервов облегчалось, боль уменьшалась, и восстановление ткани спинного мозга облегчалось по сравнению с группой животных с повреждением спинного мозга, которым не вводили лекарственное средство (Фиг. 2A, 2B и 3).
[40] Результат продемонстрировал, что композиция, содержащая соединение Формулы 1 настоящего изобретения, обладает превосходным эффектом предотвращения или лечения повреждения спинного мозга.
[41] Используемый здесь термин «предотвращать» или «предотвращение» относится к любому действию, которое ингибирует или задерживает начало повреждения спинного мозга путем введения композиции, содержащей соединение Формулы 1 настоящего изобретения. Используемый здесь термин «лечение» относится к любому действию, которое облегчает или благоприятно изменяет симптомы заболевания путем введения композиции, содержащей соединение Формулы 1 настоящего изобретения.
[42]
[43] Фармацевтическая лекарственная форма композиции для предотвращения или лечения повреждения спинного мозга настоящего изобретения может быть ее фармацевтически приемлемой солью, и композиция может применяться отдельно или совместно с другим фармацевтически активным соединением или в комбинации с ним.
[44] Композиция для предотвращения или лечения повреждения спинного мозга настоящего изобретения может дополнительно включать в себя фармацевтически приемлемый носитель.
[45] Композиция для предотвращения или лечения повреждения спинного мозга настоящего изобретения может быть получена в виде фармацевтического препарата с использованием способа, хорошо известного в данной области техники, для обеспечения быстрого, замедленного или отсроченного высвобождения активного ингредиента после введения млекопитающему. При получении композиции активный ингредиент предпочтительно смешивают с или разбавляют носителем или инкапсулируют в носитель в форме контейнера.
[46] Соответственно, композиция для предотвращения или лечения повреждения спинного мозга настоящего изобретения применяется в виде перорального препарата, такого как порошок, гранула, таблетка, капсула, суспензия, эмульсия, сироп или аэрозоль, или препарата, такого как препарат для наружного применения, суппозиторий или стерильный раствор для инъекций общепринятым способом. Композиция может дополнительно включать в себя подходящий носитель, вспомогательное вещество и разбавитель, обычно используемые при приготовлении композиций.
[47] Например, носитель, который может быть включен в композицию настоящего изобретения, включает в себя без ограничений лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбит, маннит, ксилит, эритрит, мальтит, крахмал, гуммиарабик, альгинат, желатин, фосфат кальция, силикат кальция, целлюлозу, метилцеллюлозу, микрокристаллическую целлюлозу, поливинилпирролидон, воду, метилгидроксибензоат, пропилгидроксибензоат, тальк, стеарат магния, минеральное масло и тому подобное. Приготовление осуществляется с использованием обычного разбавителя или вспомогательного вещества, такого как наполнитель, разбавитель, связующее вещество, смачивающий агент, разрыхлитель или поверхностно-активное вещество.
[48] Твердые препараты для перорального введения включают в себя таблетки, пилюли, порошки, гранулы, капсулы и тому подобное, и твердый препарат готовят путем смешивания, по меньшей мере, одного вспомогательного вещества, такого как крахмал, карбонат кальция, сахароза, лактоза или желатин. Кроме того, в дополнение к простым вспомогательным веществам также могут использоваться смазывающие вещества, такие как стеарат магния и тальк.
[49] Жидкие препараты для перорального введения включают в себя суспензии, жидкости/растворы, эмульсии, сиропы и тому подобное. В дополнение к обычно используемым простым разбавителям, воде и жидкому парафину, в состав препарата также могут быть включены различные вспомогательные вещества, такие как смачивающие вещества, подсластители, ароматизаторы и консерванты.
[50] Препараты для парентерального введения включают в себя стерильные водные растворы, неводные растворители, суспензии, эмульсии, лиофилизированные препараты и суппозитории. Неводные растворители и суспензии могут включать в себя пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло, и сложные эфиры для инъекций, такие как этилолеат. В качестве основы для суппозиториев можно использовать витепсол, макрогол, твин 61, масло какао, масло с лаурином и глицерожелатин.
[51] Фармацевтическая композиция настоящего изобретения может вводиться в виде единственного терапевтического агента или в комбинации с другим терапевтическим агентом и может вводиться последовательно или одновременно с обычным терапевтическим агентом. Фармацевтическая композиция может вводиться один или несколько раз. Принимая во внимание все факторы, описанные выше, важно вводить композицию в количестве, позволяющем получить максимальный эффект в минимальном количестве, не вызывая побочных эффектов, и такое количество может быть легко определено специалистами в данной области техники.
[52] Используемый здесь термин «введение» относится к введению фармацевтической композиции настоящего изобретения пациенту любым подходящим способом, и путь введения композиции настоящего изобретения может быть любым из множества пероральных или парентеральных путей, позволяющих композиции достичь ткани-мишени.
[53] Способ введения фармацевтической композиции настоящего изобретения специально не ограничивается и может представлять собой любой способ, обычно используемый в данной области техники. В качестве неограничивающего примера способа введения композиция может вводиться пероральным или парентеральным способом. Фармацевтическая композиция настоящего изобретения может быть получена в виде различных препаратов в соответствии с желаемым способом введения.
[54] Частота введения композиции настоящего изобретения специально не ограничивается, но может составлять один или несколько раз в день порциями.
[55] Типичная суточная доза композиции, содержащей в качестве активного ингредиента соединение Формулы 1 настоящего изобретения, может составлять от 1 до 1000 мг/кг, в частности от 11 до 100 мг/кг, и композиция может вводиться один или несколько раз порционно.
[56]
[57] В другом аспекте настоящее изобретение относится к пищевой композиции для предотвращения или облегчения последствий повреждения спинного мозга, содержащей в качестве активного ингредиента соединение, представленное Формулой 1.
[58] Пищевая композиция для предотвращения или облегчения последствий повреждения спинного мозга настоящего изобретения включает в себя препараты, такие как пилюли, порошки, гранулы, агенты для акупунктуры, таблетки, капсулы или жидкости, и пищевые продукты, к которым может быть добавлена композиция настоящего изобретения, включают в себя, например, различные пищевые продукты, такие как напитки, жевательная резинка, чаи, витаминные комплексы и пищевые добавки для здоровья.
[59] Пищевая композиция для предотвращения или облегчения последствий повреждения спинного мозга настоящего изобретения может включать в качестве основного ингредиента композицию или ее активный компонент или его физиологически приемлемую соль, и нет особых ограничений в отношении других ингредиентов. Подобно обычным продуктам питания, пищевая композиция может дополнительно включать дополнительные ингредиенты, такие как различные экстракты трав, пищевые добавки или натуральные углеводы.
[60] Как упоминалось выше, пищевые добавки также могут быть добавлены, и эти пищевые добавки включают в себя пищевые добавки, обычно используемые в данной области техники, например вкусовые добавки, ароматизаторы, красители, наполнители, стабилизаторы и тому подобное.
[61] Примеры натуральных углеводов включают в себя обычные сахара, включая моносахариды, такие как глюкоза и фруктоза, дисахариды, такие как мальтоза и сахароза, и полисахариды, такие как декстрин и циклодекстрин, и сахарные спирты, такие как ксилит, сорбит и эритрит. В дополнение к ингредиентам, описанным выше, в качестве ароматизаторов с успехом можно использовать натуральные ароматизаторы (например, ребаудиозид А, глицирризин или тому подобное) и синтетические ароматизаторы (сахарин, аспартам или тому подобное).
[62] В дополнение к ингредиентам, описанным выше, пищевая композиция для предотвращения или облегчения последствий повреждения спинного мозга настоящего изобретения может включать в себя ряд питательных веществ, витаминов, минералов (электролитов), ароматизаторов, таких как синтетические ароматизаторы и натуральные ароматизаторы, красителей и наполнителей (таких как сыр или шоколад), пектиновую кислоту и ее соли, альгиновую кислоту и ее соли, органические кислоты, защитные коллоидные загустители, агенты, регулирующие pH, стабилизаторы, консерванты, глицерин, спирт, карбонизирующие агенты, используемые в газированных напитках, и тому подобное. Кроме того, пищевая композиция может включать в себя натуральный фруктовый сок и фруктовую мякоть для производства напитков из фруктовых соков и овощных напитков. Эти ингредиенты можно использовать по отдельности или в комбинации.
[63] В настоящем изобретении биологически активная пищевая добавка включает в себя здоровое функциональное питание, здоровое питание и тому подобное.
[64] Термин «здоровое функциональное питание» имеет то же значение, что и пищевые продукты, предназначенные для оздоровления (FoSHU), и означает продукты питания, обладающие прекрасным фармацевтическим и лечебным действием, которые проходят специальную обработку для эффективного обеспечения функций биорегуляции и обеспечения питанием. Используемый здесь термин «функция» (или «функциональный») означает получение эффектов, полезных для здоровья, таких как контроль питательных веществ или физиологические воздействия на структуры и функции человеческого тела. Пищевой продукт настоящего изобретения можно производить способом, обычно используемым в данной области техники, и его можно производить путем добавления сырья и ингредиентов, обычно добавляемых в данной области техники. Кроме того, любую рецептуру пищевого продукта можно использовать без ограничений, если она приемлема в качестве пищи. Пищевая композиция настоящего изобретения может быть приготовлена в виде рецептур различных типов, и ее преимущества заключаются в отсутствии побочных эффектов, которые могут возникнуть при длительном введении лекарственного средства, поскольку в отличие от обычных лекарственных средств она в качестве сырья содержит пищевой продукт. Кроме того, благодаря прекрасной совместимости пищевой продукт настоящего изобретения можно принимать в качестве добавки для улучшения действия по предотвращению или облегчению последствий повреждения спинного мозга.
[65]
[66] В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу предотвращения или лечения повреждения спинного мозга, включающему в себя введение соединения, представленного Формулой 1, субъекту, не являющемуся человеком.
[67] Используемый здесь термин «субъект» может означать любое животное, включая человека, у которого есть или у которого может развиться повреждение спинного мозга. Животное может быть человеком или млекопитающим, таким как корова, лошадь, овца, свинья, коза, верблюд, антилопа, собака или кошка, которые нуждаются в лечении подобных симптомов, но не ограничивается этим.
[68] Способ предотвращения или лечения повреждения спинного мозга в соответствии с настоящим изобретением может, в частности, включать в себя введение фармацевтически эффективного количества композиции субъекту, который имеет повреждение спинного мозга или у которого оно может развиться.
[69]
Лучший вариант осуществления изобретения
[70] Далее настоящее изобретение будет описано более подробно со ссылкой на примеры и экспериментальные примеры. Однако для специалистов в данной области техники будет очевидно, что эти примеры и экспериментальные примеры предоставлены только для иллюстрации настоящего изобретения и не должны рассматриваться как ограничивающие объем настоящего изобретения.
[71]
Пример 1: Метод испытания
[72]
[73]
1-1. Получение лекарственного средства для введения
[74]
[75]
[76] Целевое лекарственное средство получали для определения его терапевтического эффекта при повреждении спинного мозга. Вводимое лекарственное средство получали, как описано в корейской патентной заявке с регистрационным № 10-1746060. В частности, (S)-2-(((4'-трифторметилбифенил-4-ил)метил)амино)пропанамид метансульфонат, описанный в Примере 9 настоящей заявки, (далее именуемый «KDS2010») синтезировали способом синтеза, описанным в Патентном бюллетене.
[77]
1-2. Получение животной модели повреждения спинного мозга
[78]
[79]
[80] В качестве животных моделей повреждения спинного мозга в настоящем изобретении использовали взрослых самцов крыс линии Спрег-Доули массой от 180 до 200 г, крыс анестезировали путем внутрибрюшинной инъекции кетамина. Ламинэктомию проводили на участке Т9, чтобы обнажить спинной мозг, спинной мозг сдавливали в течение 10 секунд с помощью специальных зажимов (самозакрывающиеся зажимы, Германия), чтобы вызвать повреждение спинного мозга, а затем зашивали мышцы и кожу.
[81]
1-3. Введение напитка KDS2010 в модели повреждения спинного мозга и тесты поведения и реакции на боль
[82]
[83]
[84] Манипуляции по обращению с лабораторными животными и исследования были проведены с разрешения отдела лабораторных животных, Департамента медицины Университета Йонсей, в соответствии с руководящими принципами Ассоциации по аттестации и аккредитации содержания лабораторных животных (AAALAC).
[85] Из 50 животных моделей с повреждением спинного мозга в общей сложности 5 были контрольной группой, не получавшей лекарственные препараты (нормальная), 5 - контрольной группой, получавшей лекарственное средство (нормальная/KDS2010), 20 - группой, не получавшей лекарственное средство, подвергшейся повреждению спинного мозга (ПСМ), и 20 были группой, получавшей лекарственное средство, подвергшейся повреждению спинного мозга (ПСМ/KDS2010). Через 2 недели после индукции повреждения спинного мозга вводили смесь препарата и питьевой воды в дозе 10 мг/кг.
[86] Проверку двигательной функции выполняли в общей сложности 10 раз в неделю в течение 10 недель после повреждения спинного мозга, а восстановление функции задних конечностей у животных оценивали с использованием шкалы оценки движения Бассо-Битти-Бреснахана (БББ). Оценка БББ делится на 21 балл и в целом делится на 3 этапа. На первом этапе восстановления проверялась степень движения сустава и контакт подошвы с полом, на втором этапе восстановления отслеживалась степень восстановления устойчивой походки, а на заключительном этапе в основном оценивали баланс походки и восстановление движений хвоста. Тест на невропатическую болевую реакцию при повреждении спинного мозга проводили путем измерения изменения механического отдергивания лапы с использованием динамического подошвенного эстезиометра, и этот тест проводили еженедельно в течение 3 недель после повреждения, вызвавшего реакцию подошв. Этот тест проводился путем приложения силы от 0 до 50 г к подошве лапы задней конечности с использованием иглы диаметром 0,5 мм в течение 20 секунд. В это время измеряли приложенную силу, при которой происходило отдергивание подошвы из-за болевого ощущения.
[87]
1-4. Гистологический анализ
[88]
[89]
[90] Для окраски ЭЦ (окраска эриохромцианином (солохромом)) ткань спинного мозга получали через 10 недель после повреждения спинного мозга, фиксировали 4% параформальдегидом и обезвоживали для выполнения замораживания и заливки. Окрашивание ЭЦ проводили на поврежденной области (грудной позвонок №9, Т9) у 5 крыс из контрольной группы, 10 крыс из группы с повреждением спинного мозга, не получавшей лекарственное средство, и 10 крыс из группы с повреждением спинного мозга, получавшей лекарственное средство.
[91] Окрашивание ЭЦ - это метод окрашивания, с помощью которого можно сравнивать участки ткани и миелинизированную часть между группами, поскольку миелинизированная часть окрашивается в синий цвет, тогда как другие ядра, нервы и немиелинизированные части выглядят белыми.
[92]
Пример 2: Результаты тестирования
[93]
[94]
2-1. Определение эффекта неврологического восстановления с помощью системы оценки движений Бассо-Битти-Бреснахана (БББ)
[95]
[96]
[97] Поведенческий тест проводили с использованием системы оценки движений Бассо-Битти-Бреснахана (БББ) после введения KDS2010 крысам с повреждением спинного мозга и нормальным крысам таким же образом, как в Примере 1-3 выше. Результат поведенческого теста выражали в баллах шкалы БББ.
[98]
[99] В результате, как видно на Фиг. 2А, контрольная группа без введения лекарственного средства (нормальная) и контрольная группа с введением лекарственного средства (нормальная/KDS2010) показали нормальное значение 21 балл, а группа с повреждением спинного мозга без введения лекарственного средства (ПСМ) имела 10 баллов шкалы БББ или меньше из-за неустойчивой походки. Между тем, группа с повреждением спинного мозга с введением лекарственного средства (ПСМ/KDS2010), имела 10 баллов или выше благодаря устойчивой походке, начиная с 5 недель. На последней неделе группа ПСМ/KDS2010 продемонстрировала сбалансированную походку и восстановление поведенческой функции. Кроме того, было обнаружено, что группа ПСМ/KDS2010 имела значимо больше баллов шкалы БББ по сравнению с группой, которой не вводили лекарственное средство, и которая подверглась повреждению спинного мозга.
[100]
[101] Таким образом, описанные выше результаты показали, что введение препарата KDS2010 в модели повреждения спинного мозга может способствовать восстановлению нервной функции у животной модели.
[102]
2-2. Определение обезболивающего эффекта с использованием оценки болевой реакции на основе динамического подошвенного теста
[103]
[104]
[105] Степень облегчения боли измеряли с использованием оценки болевой реакции на основе динамического подошвенного теста после введения KDS2010 крысам с повреждением спинного мозга и нормальным крысам таким же образом, как в Примере 1-3 выше.
[106]
[107] В результате, как видно на Фиг. 2B, контрольная группа без введения лекарственного средства (нормальная) и контрольная группа с введением лекарственного средства (нормальная/KDS2010) имели высокое пороговое значение (g) для боли, тогда как группа с повреждением спинного мозга без введения лекарственного средства (ПСМ) имела низкое пороговое значение. С другой стороны, в группе с повреждением спинного мозга, получавшей лекарственное средство (ПСМ/KDS2010), было обнаружено значимо повышенное пороговое значение для боли по сравнению с группой с повреждением спинного мозга, не получавшей лекарственное средство.
[108]
[109] Таким образом, описанные выше результаты показали, что введение препарата KDS2010 в модели повреждения спинного мозга может облегчить боль у животной модели.
[110]
2-3. Определение эффекта облегчения восстановления ткани спинного мозга
[111]
[112]
[113] Окрашивание ЭЦ проводили на поврежденной области (грудной позвонок №9, Т9) у животных контрольной группы без введения лекарственного средства, контрольной группы с введением лекарственного средства, группы с повреждением спинного мозга без введения лекарственного средства и группы с повреждением спинного мозга с введением лекарственного средства, таким же образом, как в Примере 1-4, и проводили количественную оценку результатов для миелинизированных частей.
[114]
[115] В результате, как видно на Фиг. 3, контрольная группа без введения лекарственного средства (контроль) и контрольная группа с введением лекарственного средства (контроль/KDS2010) имели высокими все показатели: общая площадь ткани, общая площадь миелинизированной части и доля (%) общей площади миелинизированной части от общей площади ткани, а группа с повреждением спинного мозга, не получавшая лекарственное средство (ПСМ), имела высокими все показатели: общая площадь ткани, общая площадь миелинизированной части и доля (%) общей площади миелинизированной части от общей площади ткани. Эти результаты показали, что при повреждении спинного мозга уменьшается общая площадь тканей и общая площадь миелинизированной части.
[116]
[117] С другой стороны, в группе с повреждением спинного мозга, получавшей лекарственное средство (ПСМ/KDS2010), было обнаружено увеличение общей площади ткани и общей площади миелинизированной части по сравнению с группой с повреждением спинного мозга, не получавшей лекарственное средство.
[118]
[119] Таким образом, описанные выше результаты показали, что введение препарата KDS2010 в модели повреждения спинного мозга может способствовать восстановлению ткани спинного мозга.
[120]
2-4. Определение эффекта повторной миелинизации места повреждения спинного мозга
[121]
[122]
[123] Дополнительный анализ проводили для более подробного изучения результатов, полученных в Примере 2-3.
[124] В частности, количество миелинизированных аксонов, количество полостей и g-отношение измеряли с помощью окрашивания толуидиновым синим (ТС) и ПЭМ-визуализации.
[125]
[126] В результате, как видно на Фиг. 4, количество миелинизированных аксонов, которое уменьшилось из-за повреждения спинного мозга, было восстановлено до почти нормального значения при применении KDS2010 (Фиг. 4A), тогда как количество полостей, которое значительно увеличились из-за повреждения спинного мозга, быстро уменьшилось при применении KDS2010 (Фиг. 4B). Кроме того, измеряли g-отношение, в качестве показателя нормальной проводимости и скорости у восстановленных миелинизированных аксонов. Результат показал, что модель повреждения спинного мозга имела g-отношение, сильно отличающееся от нормального диапазона 0,79 ± 0,0005, тогда как при применении KDS2010 g-отношение находилось в пределах нормального диапазона.
[127]
[128] Таким образом, описанные выше результаты показали, что введение препарата KDS2010 в модели повреждения спинного мозга может способствовать эффекту повторной миелинизации и, таким образом, восстанавливать ткань спинного мозга.
[129]
2-5. Определение эффекта регенерации спинного мозга
[130]
[131]
[132] Проводили испытание, чтобы определить, оказывает ли лечение KDS2010 индуцирующее действие на дифференцировку новых нервных клеток, чтобы изучить эффект регенерации спинного мозга.
[133] В частности, подопытным животным путем внутрибрюшинной инъекции вводили БДУ в дозе 50 мг/кг/ в сутки в течение недели до умерщвления, и спинномозговые нервы подвергали иммунофлуоресцентному окрашиванию, а затем наблюдали результат.
[134] В результате, как видно на Фиг. 5, модель повреждения спинного мозга ингибировала образование новых нервных клеток и приводила к потере нервных клеток, тогда как животная модель, получавшая KDS2010, демонстрировала наличие вновь сформированных нервных клеток.
[135] Таким образом, описанные выше результаты показали, что препарат KDS2010 может способствовать образованию нервных клеток спинного мозга и, таким образом, способствовать образованию нервов при повреждении спинного мозга.
[136]
2-6. Определение эффекта подавления воспалительной реакции в месте повреждения спинного мозга
[137]
[138]
[139] Когда происходит повреждение спинного мозга, разрушенные клетки и кластеры клеток находятся внутри от места повреждения. Эти клетки могут вызывать воспалительную реакцию и препятствовать регенерации в результате повреждения спинного мозга. Проводили испытание, чтобы изучить влияние препарата KDS2010 на воспалительную реакцию.
[140] В частности, модель повреждения спинного мозга, которой вводили KDS2010, подвергали иммунофлуоресцентному окрашиванию, чтобы определить, были ли клетки положительными по маркеру макрофагов CD68 и маркеру микроглии Iba1.
[141] В результате, как видно на Фиг. 6, количество клеток, положительных по CD68 и Iba1, значительно снизилось в группе модели повреждения спинного мозга, получавшей KDS2010.
[142] Таким образом, описанные выше результаты показали, что введение KDS2010 может уменьшить количество воспалительных клеток, которые подавляют регенерацию спинного мозга.
[143]
[144] Из приведенного выше описания специалистам в данной области техники будет понятно, что настоящее изобретение может быть реализовано в других конкретных вариантах осуществления без изменения его технической идеи или обязательных признаков. В этом отношении описанные выше варианты осуществления изобретения предоставлены только для иллюстративных целей и не должны рассматриваться как ограничивающие объем настоящего изобретения во всех отношениях. Таким образом, следует понимать, что значения и объем прилагаемой формулы изобретения и всех изменений или модификаций, производных от ее эквивалентов, а не от лучшего варианта осуществления изобретения, включены в объем настоящего изобретения.