Способ проведения туберкулостатической пробы у больных туберкулёзом легких для лабораторного обоснования персонифицированного лечения
METHOD FOR CARRYING OUT TUBERCULOSTATIC TESTS IN PATIENTS WITH PULMONARY TUBERCULOSIS FOR LABORATORY SUBSTANTIATION OF PERSONIFIED TREATMENT

Изобретение относится к медицине, а именно к области фтизиатрии и бактериологии, и может быть использовано для лабораторной оценки адекватности химиотерапии легочного туберкулеза и коррекции химиотерапии, а также оценки ex vivo противотуберкулезной активности новых препаратов.
Лекарственная устойчивость Mycobacterium tuberculosis (МБТ), в особенности множественная и широкая (МЛУ и ШЛУ), еще в 2006 г. признана ВОЗ глобальной угрозой [9]. По данным ВОЗ в 2014 г. МЛУ-туберкулезом заболели 480000 человек, умерло от него 190000 [10]. Низкая эффективность лечения туберкулеза, отягощенного МЛУ и ШЛУ, соответственно 39,1% и 26,2% по данным Стерликова С.А. и соавторов [7], до 51,1 по данным Тестова В.В. и соавторов [8], высокая его стоимость [1, 5] требуют особенно тщательного и точного подбора химиотерапии, перехода от стандартного и эмпирического к лабораторно обоснованному персонализированному режиму.
Суть проведения туберкулостатической пробы (ТСП) заключается в оценке способности сыворотки крови, собранной на пике концентраций назначаемых пациенту нескольких противотуберкулезных препаратов (ПТП), задерживать in vitro рост штамма М. tuberculosis, выделенного от данного больного (аутоштамма). В сравнении с определением минимальной ингибирующей концентрации (МИК) какого-либо одного противотуберкулезного препарата, либо ряда препаратов по отдельности [6], ценность ТСП (ранее: тест БАК - бактериостатической активности крови) определяется тем, что величина ТСП/БАК является результирующей действия многих факторов: пути введения препаратов, их фармакокинетики и фармакодинамики в организме данного больного, синергизма или антагонизма комплекса вводимых веществ, уровня чувствительности возбудителя к каждому из назначаемых препаратов. Все перечисленное позволяет отнести данный тест к важным методам, которые обеспечивают лабораторное обоснование персонализированной химиотерапии.
Ранее было показано, что величина ТСП (БАК) коррелирует с клиническими показателями эффективности лечения (101 пациент) [2, 4]. Так, низкие и нулевые значения БАК соотносятся с наибольшей длительностью бактериовыделения (3,8+1,2 и 5,5+1,0 месяцев) и сохранением его через 3 и 6 месяцев лечения (у 44,8% и 27,6% больных при низких значениях БАК и у 100,0% и 54,5% - при нулевых), а также с наименьшей частотой значительных улучшений у пациентов в ходе лечения - 62,1% и 18,2% против 80,0% при высоких значениях БАК в случаях устойчивости возбудителя к изониазиду.
Прототипом предлагаемого способа является пробирочный метод определения БАК (ТСП) [2, 3, 4] с помощью полужидкой среды, недостатком которого является субъективность теста, так как результат регистрируется визуально.
Предлагаемый способ переводит пробирочный метод определения ТСП/БАК в формат приборного определения с помощью метода микроразведений в планшете с индикацией роста М. tuberculosis посредством резазурина и регистрацией роста с помощью планшетного флуоресцентного спектрофотометра.
Преимущество предлагаемого способа: 1) объективная оценка интенсивности роста М. tuberculosis посредством приборного измерения (планшетный флуориметр) интенсивности флуоресценции резоруфина, который образуется при воздействии комплекса ферментов окислительно-восстановительной системы микобактерий на индикатор роста резазурин; 2) определение точки задержки роста исследуемого штамма после инкубации с разведениями сыворотки крови пациента, содержащей комплекс противотуберкулезных препаратов на пике их концентрации, путем построения графика интенсивности флуоресценции резоруфина с помощью программы, составленной на платформе пакета программ Microsoft Excel; 3) в отличие от пробирочного метода разведение пробы сыворотки параллельно в восьми лунках планшета позволяет избежать ошибки разведения, учесть влияние разведений на флуоресценцию индикатора, обработать статистически полученные данные.
Задачей предлагаемого изобретения является разработка приборного способа определения туберкулостатической (бактериостатической) активности крови с целью лабораторного обоснования персонализированного лечения больных туберкулезом легких, отягощенного множественной и широкой лекарственной устойчивостью возбудителя, а также оценки активности ex vivo новых противотуберкулезных препаратов.
Задача решается за счет того, что сыворотку крови пациента, взятой на пике концентраций вводимых препаратов, разводят последовательно двукратно в 96-луночном планшете жидкой средой Миддлбрука 7Н9 (с 10% ростовой добавки OADC) и засевают суспензией штамма М. tuberculosis, выделенного от данного больного, интенсивность роста бактерий визуализируют с помощью резазурина и регистрируют в планшетном флуориметре, точку задержки роста возбудителя определяют графически с помощью составленной на платформе Microsoft Excel программы. Оценка активности противотуберкулезных препаратов приводится на примере исследования потенцирующего эффекта перхлозона.
Способ поясняется графическим изображениями, где:
2
Фиг. 1. Пациент А., штамм 2801. Сыворотка задерживает рост M. tuberculosis в разведении 1:64 (log=6).
А - графический вариант. По оси абсцисс - разведения сыворотки; по оси ординат - интенсивность флуоресценции в условных единицах. ТСП - линия изменения интенсивности флуоресценции в лунках с разведениями сыворотки. Контроль - рост рабочей суспензии без сыворотки, 10% Контроль - 10% от интенсивности свечения контроля роста рабочей суспензии, 1% Контроль - интенсивность флуоресценции разведенной в 100 раз рабочей суспензии; во всех случаях сплошные линии - средние значения, пунктирные - верхние и нижние значения доверительного интервала (при р=0,05). Б - визуальный вариант.
2
Фиг. 2. Пациент А., штамм 2801, терапия усилена перхлозоном. Сыворотка задерживает рост М. tuberculosis в разведении 1:64 (log=6).
См. примечания к рис. 1.
Фиг. 3. Пациентка Ф., штамм 147, ТСП до и после введения перхлозона.
2иcx
2Пх
2Пх
2исх
А. Сыворотка задерживает рост М. tuberculosis в разведении 1:8 (log=3). Б. Сыворотка задерживает рост М. tuberculosis в разведении 1:16 (log=4). Потенцирование в 2 раза, log-log=1.
Фиг. 4. Пациент П., штамм 1127, ТСП до и после введения перхлозона.
2исх
2Пх
2Пх
2исх
А. Сыворотка задерживает рост M. tuberculosis в разведении 1:32 (log=5). Б. Сыворотка задерживает рост M. tuberculosis в разведении 1:512 (log=9). Потенцирование в 16 раз, log-log=4.
Способ осуществляется следующим образом.
За 2 дня до ТСП отменяют все препараты.
1. Кровь на ТСП забирают на пике концентраций препаратов. При пероральном введении - за 2 часа до взятия крови (этионамид, протионамид - за 5 часов, внутримышечном - за 1 час, внутривенном - непосредственно перед взятием крови, из локтевой вены другой руки (в вену одной руки вводится препарат, из вены другой руки берут кровь). Кровь забирают в объеме 10-12 мл в стерильные иммунологические пробирки с коагулирующим агентом, способствующим образованию сгустка и отделению сыворотки, или в сухие стерильные пластиковые пробирки.
2. Подготовка питательной среды.
Готовят 15 мл коммерческой жидкой среды Миддлбрука7Н9 с коммерческой ростовой добавкой OADC (10%) согласно прописи производителя среды.
3. Подготовка суспензии аутоштамма пациента.
Используют штамм М. tuberculosis, свежевыделенный (не более месяца с момента выделения) на плотной яичной среде, или 3-недельную субкультуру (на среде Левенштейна-Йенсена).
7
Готовят суспензию M. tuberculosis в бульоне 7Н9 (без ростовой добавки OADC). В сухую стеклянную пробирку с 6-8 стеклянными бусами диаметром 3 мм, помещают полную петлю культуры M. tuberculosis, которую растирают в течение 15-20 сек с помощью шейкера Vortex, добавляют 3 капли бульона Миддлбрука и вновь растирают. Затем добавляют 5 мл той же среды, размешивают получившуюся суспензию и оставляют для осаждения конгломератов на 40 мин. Собирают верхнюю часть (≈2 см) супернатанта в сухую пробирку и доводят бульоном Миддлбрука до плотности 1,5 ед. по McFarland, измерение на DENSILAMETR. Для приготовления рабочей суспензии концентрацией 5×10 м.к./мл (микробных клеток/мл) разводят суспензию жидкой средой 7Н9 с 10% OADC в 10 раз, объем 12 мл (1,2 мл суспензии плотностью 1,5 ед. по McFarland + 10,8 мл 7Н9 с OADC) в пробирке объемом 50 мл.
5
-2
-1
-1
Для приготовления контроля роста 1% популяции (концентрация 5×10 м.к/мл, 10) разводят рабочую суспензию в 100 раз. Для этого: 1) разводят рабочую суспензию в 10 раз (10) - 0,1 мл рабочей суспензии + 0,9 мл 7Н9 с OADC; 2) предыдущую суспензию разводят еще в 10 раз: 0,2 мл разведения 10 + 1,8 мл 7Н9 с OADC, объем конечного разведения 2 мл.
4. Приготовление сыворотки
Переносят сыворотку из пробирки с коагулирующим агентом в сухую стерильную пробирку. При использовании пробирок без коагулирующего агента ставят пробирку с кровью на 30 мин в термостат, затем на 30 мин в холодильник (+4°С). Осторожно обводят стерильной пипеткой или палочкой образовавшийся сгусток в верхней его части. Центрифугируют 10 мин 1000 об/мин. Переносят сыворотку из пробирки со сгустком в сухую стерильную пробирку.
5. Подготовка планшета со средой для приготовления разведений сыворотки.
Надписывают 96-луночный стерильный плоскодонный планшет в соответствии со схемой исследования. Вносят в планшет жидкую среду Миддлбрука с 10% ростовой добавки OADC по 150 мкл в ряды А-Н1-11, в ряд A-D12 - по 180 мкл (бланк), в ряд Е-Н12 - по 105 мкл, затем в ряд Е-Н12 добавляют по 75 мкл неразведенной сыворотки пациента (контроль сыворотки).
6. Разведение сыворотки.
В ряд А-Н1 планшета со средой Миддлбрука вносят по 150 мкл исследуемой сыворотки, разводят последовательно двукратно 8-канальным дозатором, из ряда А-Н10 отбирают по 150 мкл и выливают в дезраствор. Затем в ряды А1-10, В1-10 вносят по 30 мкл среды 7Н9 с OADC.
7. Инокуляция суспензии М. tuberculosis.
-2
В ряды CH1-10, A-D11 планшетов с разведениями сыворотки в среде Миддлбрука вносят по 30 мкл рабочей суспензии, в ряд Е-Н11 - по 30 мкл суспензии МБТ 10 (контроль роста 1% популяции).
8. Инкубация.
Засеянные планшеты помещают в герметичные пластиковые пакеты с увлажненной ватой, инкубируют при температуре 35°С в течение 7 дней. Затем во все лунки вносят по 30 мкл 0,02% стерильного водного раствора резазурина (Sigma, кат. номер R7017), инкубируют вторично 18 ч. В случае слабого изменения окраски индикатора инкубацию продлевают еще на 1-2 суток.
9. Регистрация результата
С помощью планшетного флуориметра FLUOstarOptima (длина волны возбуждения - 520 нм, излучения - 590 нм) измеряют интенсивность флуоресценции в лунках планшета.
10. Математическая обработка полученных данных
-2
-2
2
С помощью программы, составленной в формате МС Excel вычисляют: 1) среднее значение интенсивности свечения контроля разведения сыворотки (КРС) в каждом разведении; 2) в каждой лунке, с инокулятом рабочей суспензии штамма М. tuberculosis, от значения интенсивности свечения данного разведения сыворотки вычитают среднее значение интенсивности свечения КРС; 3) среднее значение интенсивности свечения полученных значений; 4) среднее значение интенсивности свечения контроля роста рабочей суспензии; 5) вычисляют 10% от каждого из значений интенсивности свечения контроля роста рабочей суспензии в каждой лунке планшета и находят среднее значение - 10% контроль; 6) среднее значение интенсивности свечения контроля роста 1% популяции (10). Для каждого из полученных параметров вычисляют доверительный интервал (α=0,05). На основании полученных данных в программе Excel строят графики и определяют точку ТСП. Величина ТСП равна log разведения сыворотки в точке пересечении прямой, соответствующей средним значениям контроля роста 1% популяции (10) в рамках доверительного интервала. Значимость отличий от 1%-ного контроля определяют по t-тесту для парных выборок с помощью программы VassarStats или Microsoft Excel (2 хвоста, двухпарный с неравным отклонением).
11. Оценка активности сыворотки, содержащей комплекс противотуберкулезных препаратов.
Оценку туберкулостатической пробы (ТСП) проводили аналогично пробирочному методу [2, 3, 4]: ТСП считали высокой, если сыворотка задерживала рост МБТ в 5-10 разведении (1:32 - 1:1024), средней - в 3-4 (1:8 - 1:16), низкой - в 1-2 (1:2 - 1:4), нулевой - если сыворотка не задерживала рост МБТ ни в одном из разведений.
Испытание предлагаемого метода проведено при проведении ТСП/БАК у 16 пациентов с МЛУ/ШЛУ туберкулезом легких, находившихся в клиниках ФГБУ СПб НИИ фтизиопульмонологии МЗ РФ и Второй Городской противотуберкулезной больнице в 2015-2016 гг. От каждого пациента получено информированное согласие на участие в проводимом исследовании.
Выделение M. tuberculosis из патологического материала обследуемых пациентов, идентификацию выделенной культуры бактерий, определение лекарственной чувствительности возбудителя проводили стандартными бактериологическими методами (Приказ №951 от 29.12.2014). Через неделю после проведения ТСП/БАК всем пациентам усиливали терапию добавлением препарата перхлозон и повторно тестировали.
ТСП проводили в пробирочном и планшетном вариантах, при этом результат пробы в планшетном варианте регистрировали визуально по изменению цвета индикатора роста и приборно с помощью планшетного флуориметра FLUOstarOptima.
Результаты проведения ТСП/БАК представлены в таблицах 1, 2 и на фиг. 1-4.
На фиг. 1 и 2 приведен пример визуального и графического результата проведения ТСП планшетным методом у пациента А., штамм 2801. Фиг. 1: введение пациенту перорально левофлоксацина, ПАСК, циклосерина, амоксиклава, внутривенно-капреомицина и меронема, фиг. 2 - терапия усилена перхлозоном per os.
В 11 случаях из 16 (68,7%) флуоресцентным планшетным способом выявлена потенцирующая активность перхлозона, значения ТСП колебались от 2 до 64.
В табл. 1 приведены результаты проведения ТСП пробирочным и планшетным способом с визуальной и приборной регистрацией интенсивности роста M. tuberculosis.
В планшетном варианте визуальная регистрация результата ТСП, как правило, выявляет более высокие ее значения в сравнении с приборной вследствие субъективной оценки изменения цвета индикатора роста. При сравнении данных, полученных пробирочным и приборным способами значения ТСП отклоняются как в большую, так и в меньшую сторону. Это объясняется тем, что в варианте пробирочного способа интенсивность роста штамма M. tuberculosis в разведениях сыворотки сравнивается с 1% контролем только визуально, точная ее количественная оценка в большинстве случаев невозможна из-за особенностей роста микобактерий в полужидкой среде.
Значимых различий между средними значениями ТСП, полученными при пробирочном и планшетном приборном способе оценки нет ни в случае до введения перхлозона, ни после его приема (табл. 2). Визуальная оценка результатов ТСП в планшете значимо отличается от приборной в сторону увеличения значений (р=0,0002 и 0,001)
Таким образом, проведенные исследования показали, что предлагаемый приборный планшетный метод проведения туберкулостатической пробы у больных туберкулезом легких, не отличаясь существенно от прототипа по средним значениям величин ТСП, лишен недостатков прототипа - 1) субъективности оценки результата; 2) невозможности точной количественной оценки интенсивности роста микобактерий; 3) невозможности математической (статистической) обработки данных, полученных при проведении каждой конкретной ТСП.
Источники информации
1. Гельманова И.Е., Земляная Н.А., Хон Л.В., Крук Е.А., Мишустин С.П., Янова Г.В. Оценка себестоимости лечения больных туберкулезом с лекарственной чувствительностью и устойчивостью возбудителя в учреждениях фтизиатрической службы Томской области // Туберкулез и болезни легких. - 2016. - №3. - С. 20-27. http://elibrary.ru/item.asp?id=25733852
2. Маничева О.А. Проблемы лекарственной устойчивости Mycobacterium tuberculosis: ускоренное культуральное выявление, контроль адекватности химиотерапии, вирулентность: Автореф. дис. … д.б.н. - СПб., 2009. - 36 с.
3. Маничева О.А. Ускоренное определение бактериостатической активности крови у больных туберкулезом с помощью полужидкой питательной среды // Пробл. туб. - 2003. - №9. - С. 26-29.
4. Маничева О.А., Павлова М.В., Сапожникова Н.В., Арчакова Л.И., Скворцова Л.А., Вишневский Б.И. Контроль химиотерапии больных туберкулезом органов дыхания с помощью БАК-пробы // Пробл. туб. и болезней легких. - 2008. - №5. - С. 14-17.
5. Маркелов Ю.М., Кононенко Ю.С., Войшнис М.Р., Доева Л.В. Сравнительная оценка клинико-экономической эффективности лечения больных туберкулезом в условиях стационара и использования стационарзамещающих технологий. // Туберкулез и болезни легких. - 2015. - №2. - С. 32-38. http://elibrary.ru/item.asp?id=23032865
6. Попов С.А., Сабгайда Т.П., Можокина Г.Н., Кузьмин А.В., Ставицкая Н.В. Гетерогенность лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза в контексте фармакокинетики противотуберкулезных препаратов как основа персонифицированного лечения. // Туберкулез и болезни легких. - 2015. - №4. - С. 18-23. http://elibrary.ru/item.asp?id=23502820\
7. Стерликов С.А., Тестов В.В., Васильева И.А. Результаты лечения пациентов с множественной и широкой лекарственной устойчивостью возбудителя, зарегистрированных в 2012 г. в Российской Федерации и в мире // Туберкулез и болезни легких - 2016. - №1. - С. 22-27 http://elibrary.ru/item.asp?id=25611104
8. Тестов В.В., Стерликов С.А., Пунга В.В., Ерохин В.В. Мониторинг результатов химиотерапии туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью возбудителя в районах курации ФГБУ «ЦНИИТ» РАМН // Туберкулез и социально значимые заболевания. - 2014. - №1-2. - С. 10 http://elibrary.ru/download/87020699.pdf
9. Emergence of Mycobacterium tuberculosis with extensive resistance to second-line drugs--worldwide, 2000-2004 // MMWR Morb. Mortal. Wkly. Rep. - 2006. - Vol. 55, N11. - P. 301-305. http://www.cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/mm5511a2.htm
10. Global tuberculosis report, 2015. WHO http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/191102/1/9789241565059_eng.pdf?ua=1&ua=1
11. Palomino J.-C., Martin A., Camacho M., Guerra H., Swings J., Portaels F. Resazurin microliter assay plate: simple and inexpensive method for detection of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis // Antimicrob. Agents Chemother. - 2002. - Vol. 46, N8. - P. 2720-2722. doi: 10.1128/AAC.46.8.2720-2722.2002