Актуальные вопросы иммунологических исследований в лабораторной диагностике

Одним из возможных подходов к проведению оценки эффективности внутреннего контроля качества и безопасности деятельности медицинских лаборатории может быть использование квалиметрического анализа. Использование квалиметрических методов позволяет не только получить количественные оценки качества исследуемых объектов и процессов с последующей разработкой алгоритмов комплексной оценки, но и, в конечном счете, управлять их качеством. В отличие от общепринятого обследования объекта, включая лечебную организацию или человека, при квалиметрическом оценивании обеспечивается максимальная объективизация

процесса поиска решений по оцениваемому объекту. Исследование состоит из 5 этапов: выбор экспертов; написание пояснительной записки; составление сводного перечня факторов; ранжирование этих факторов по значимости влияющего действия; анализ, графическое изображение и принятие конкретных мер по улучшению качества работы отделения.

Методика непрерывного повышения качества работы медицинской лаборатории и оценки эффективности качества и безопасности ее деятельности может быть воплощена в практику лечебной организации в течение 1-2 недель и отличается тем, что не требует финансовых затрат на свою реализацию.

актуальные вопросы иммунологических исследований в лабораторной диагностике

Е.Н. Александрова, Ж.Г. Верижникова, Н.В. Середавки-на, Т.М. Решетняк, А.А. Новиков, Д. Роггенбук, Е.Л. Насонов. Мультипараметрическое определение профиля аутоан-тител методом точечного иммуноферментного анализа (дот-ИФА) - новый подход к диагностике антифосфоли-пидного синдрома. ФГБУ Научно-исследовательский институт ревматологии РАМН, Москва

Антифосфолипидные антитела (АФЛ) являются серологическим маркером АФС, фактором риска тромботических осложнений и акушерской патологии при данном заболевании. В число диагностических критериев АФС входят положительные результаты обнаружения IgG/IgM антител к кар-диолипину (АКЛ) и ß2-гликопротеину I ^2-ГП I) с помощью стандартного ИФА, а также волчаночного антикоагулянта (ВА) в фосфолипидзависимых коагуляционных тестах.

Цель - изучить клиническую значимость нового мульти-параметрического метода определения АФЛ на основе дот-ИФА у больных АФС.

Обследовано 36 больных АФС (5 мужчин и 31 женщин, возраст Ме [25-75 перцентиль]: 34 [29-44] лет). Среди них 15 (42%) больных имели признаки системной красной волчанки (СКВ), 28 (78%) - артериальные и/или венозные тромбозы, 21 (58%) - патологию беременности в анамнезе. Группа сравнения включала 14 больных СКВ без АФС (3 мужчин и 11 женщин, возраст: 35 [27-45] лет). Одновременное определение АКЛ, аß2-ГП I, антител к фосфатидилсерину (аФС) и фосфатидилинозитолу (аФИ) классов IgG и IgM в сыворотке крови осуществлялось методом дот-ИФА с использованием коммерческого набора реагентов фирмы «Medipan GmbH» (Германия).

При АФС частота обнаружения АФЛ классов IgG и IgM составляла для АКЛ - 81 и 42%, аß2-ГП I - 61 и 47%, аФС -75 и 28%, аФИ - 36 и 25%, и, в большинстве случаев, была выше таковой при СКВ - 50 (р < 0,05) и 43%, 50 и 50%, 50 и 14%, 43 и 7%, соответственно. Среди больных СКВ отмечена тенденция к более частой идентификации положительных результатов суммарного определения профиля АФЛ, чем у пациентов с СКВ (14 и 7% соответственно, р > 0,05). Комбинация высокопозитивных уровней всех четырех субтипов АФЛ (IgG/IgM АКЛ, аß2-ГП I, аФС и аФИ) ассоциировалась с увеличением риска развития ишемических нарушений мозгового кровообращения (ОР 95% ДИ: 2,45, 1,09-5,55, р = 0,049) при АФС.

Мультипараметрическое определение IgG/IgM АКЛ, аß2-ГП I, аФС и аФИ методом дот-ИФА позволяет прогнозировать риск развития ишемических нарушений мозгового кровообращения у больных АФС.

Ж. Г. Верижникова, Е. Н. Александрова, А. А. Новиков, Д. Роггенбук, Е.Л. Насонов. Сравнительный анализ автоматизированной и визуальной оценки результатов определения антинуклеарных антител (АНА) методом непрямой реакции иммунофлюоресценции (НРИФ) с

использованием HEp-2 клеток человека. ФГБУ Научно-исследовательский институт ревматологии РАМН, Москва

Определение АНА в сыворотке крови методом НРИФ с использованием в качестве субстрата HEp-2 клеток - «золотой стандарт» и основной скрининговый метод лабораторной диагностики аутоиммунных ревматических заболеваний (РЗ). Интерпретация результатов НРИФ проводится с указанием максимального титра, интенсивности и типа свечения АНА. Автоматизированная система оценки НРИФ создает предпосылки для стандартизации данного метода определения АНА.

Цель - изучить сопоставимость автоматизированной и визуальной оценки результатов определения АНА методом НРИФ у больных РЗ.

Обследовано 1178 пациентов с различными РЗ. Определение АНА в сыворотке крови проводилось методом НРИФ на клетках линии HEp-2 с помощью коммерческого набора реагентов фирмы «Medipan GmbH» (Германия). Анализ результатов НРИФ осуществлялся с использованием автоматизированной платформы «Aklides» (Medipan GmbH, Германия) и традиционным визуальным методом при помощи флюоресцентного микроскопа (AXIOSKOP 40, Zeiss, Германия). Нормальный титр АНА составлял < 1:160. Оценивались следующие типы свечений: гомогенное, крапчатое, нуклеолярное, центромерное, смешанное. Группа пациентов (n = 617) со смешанным типом свечения, который не идентифицируется анализатором «Aklides», рассматривалась отдельно.

Степень согласованности (коэффициент каппа Коэна, ж) позитивных/негативных результатов обнаружения (n=1178), титров (n=1178) и типов свечения (n=561) АНА, полученных при автоматизированной и традиционной интерпретации НРИФ, является «заметной/хорошей» (0,497, 0,458, 0,470 соответственно). Общее количество несовпадений по позитивным/негативным результатам определения АНА в НРИФ составило 97 (8,2%). В образцах сывороток со смешанным типом свечения, который был выявлен при визуальной оценке результатов НРИФ, автоматизированная система определила наличие крапчатого типа свечения в 186 (30,1%), гомогенного в 232 (37,6%), нуклеолярного в 14 (2,3%), центромерно-го в 5 (0,8%) случаев. В 180 образцах (29,2%) тип свечения определен не был.

Использование автоматизированной платформы «Aklides» позволяет идентифицировать негативные/позитивные образцы и выявляет основные типы свечения ядра клетки сопоставимо с «классическим» визуальным методом определения АНА.

Е.С. Федоров', С.О. Салугина1, Е.Ю. Захарова2, Н.Н. Кузьмина1. Молекулярно-генетическая и иммуногенетическая диагностика аутовоспалительных синдромов. 'ФГБУ Научно-исследовательский институт ревматологии РАМН, 2ФГБУ Медико-генетический научный центр РАМН, Москва

Цель - изучить типичные мутации у пациентов с раз-

актуальные вопросы иммунологических исследований в лабораторной диагностике

личными аутовоспалительными синдромами (АВС) - семейной средиземноморской лихорадкой (FMF), синдромом дефицита мевалонаткиназы (MKD/HIDS), с криопирин-ассоциироваными периодическими синдромами (CAPS) у детей, проживающих в России. Определить встречаемость HLA В51-антигена у детей с болезнью Бехчета (ББ).

В исследование включены пациенты с FMF - 5, MKD/ HIDS - 2, CAPS-5, ББ-10. Методом прямого автоматического секвенирования проведено исследование последовательности нуклеотидов в экзоне 10 гена MEFV, кодирующей последовательности и прилегающих интронных областей экзонов 8, 9 и 11 гена MVK, мутаций гена CIAS1(NLRP3) кодоны 134716. Типирование HLA-антигенов I класса выполнялось по методике Терасаки.

Среди детей с FMF (все армянской национальности) 2 были гомозиготны по мутации M694V, 1 ребенок - компаунд-гетерозигота M680I/V726A и 2 - гетерозиготы по M694V. Пациентка с MKD/HIDS (русская) была компаунд-гетерозиготой V377I/R388X. Выявлены мутации гена ClAS1 у всех больных CAPS - замена с.1313 С>Т; с.1217 T>C; с.1049 С>Т; a1705G>C; с.1321 T>C. Все мутации гетерозиготные. Среди пациентов с ББ 7 детей были позитивны по HLA В51-антигену и 3 -негативны. Среди HLAB51-негативных пациентов были 1 русская, 1 - этническая немка и 1 казанский татарин.

Среди пациентов с FMF преобладали носители наиболее частой мутации M694V, 2 пациентки с атипичным течением оказались гетерозиготами. Одна из мутаций у пациентки с MKD/HIDS была V377I, которая присутствует у большинства зарегистрированных в мире пациентов. Все мутации у больных CAPS были гетерозиготными. 70% пациентов с ББ были носителями HLA В51-антигена. Большинство из негативных по HLA В51-АГ пациентов не принадлежали к народам, среди которых наиболее распространено это заболевание.

С.Х. Седышев, В.И. Васильев, Е.Н. Александрова. Определение уровня общего иммуноглобулина G и его 4 субкласса в сыворот ке для дифференциальной диагностики ^С4-связанных заболеваний с вовлечением слюнных желез и ткани орбит. ФГБУ Научно-исследовательский институт ревматологии РАМН, Москва

Цель исследования - установить значимость определения уровня общего иммуноглобулина G и его 4 субкласса (IgG4) в сыворотке для дифференциальной диагностики IgG4-связанных заболеваний (IgG4-C3) с вовлечением слюнных желёз и орбит.

В период выполнения работы впервые в отечественной популяции проведен набор группы из 30 пациентов с достоверным диагнозом IgG4-C3 с вовлечением слюнных желез и орбит, подтвержденным клинически, рентгенологически и морфологически. Среди них мужчин - 16, женщин - 14, средний возраст пациентов 44 ± 6,75 года. Определение уровня общего IgG и IgG4 выполнялись нефелометрическим методом на аппарате BNProSpec. Результаты измерений сравнивали с группой других системных заболеваний с вовлечением слюнных желез и орбит (болезнь Шегрена, лимфомы, саркоидоз).

При сравнении уровня IgG4 сыворотки 30 пациентов с IgG4-C3 (медиана 2,6 г/л (ИКР 1,22-4,65), 22 больных с болезнью Шегрена, лимфомами слюнных и слезных желез (медиана 0,32 г/л (ИКР 0,11-0,44) и 15 здоровых доноров (медиана 0,58 г/л (ИКР 0,29-0,81) (в норме уровень IgG4 сыворотки составляет < 1,35г/л), выявлено статистически значимое повышение концентрации IgG4 в группе IgG4-C3 по сравнению с двумя другими группами (р < 0,001).

Уровень общего IgG также был повышен у 46,7% больных. При сравнении уровня общего IgG сыворотки в группах больных с IgG4-C3 (n = 30) (медиана 16,3 г/л (ИКР 14-22 г/л) и БШ/СШ, лимфомами слюнных и слезных желез и саркоидо-зом (n = 66) (медиана 13,5 г/л (ИКР 11-18 г/л) также выявлено, что уровень IgG достоверно выше в 1-й группе (p = 0,004).

Уровень IgG4 и IgG в сыворотке крови достоверно выше при IgG4-C3, чем при болезни Шегрена, лимфомах, саркои-дозе. Данный показатель может быть использован в диффе-

ренциальной диагностике системных заболеваний, вызывающих поражение слюнных желез и тканей орбит.

A.A. Новиков, Е.Н. Александрова, А.Н. Герасимов, М.В. Черкасова, Д.Е. Каратеев, Е.Л. Лучихина, Е.Л. Насонов. Многопараметрический анализ биомаркеров в лабораторной диагностике раннего ревматоидного артрита. ФГБУ Научно-исследовательский институт ревматологии РАМН, Москва

Цель - разработать многопараметричесий диагностический индекс (МДИ) для лабораторной диагностики раннего ревматоидного артрита (РА).

Обследовано 102 пациента с ранним РА: 79 женщин и 23 мужчины; возраст (МЕ [25-75 перцентиль]): 51 [41-62] лет, длительность 4 [2,5-6,0] мес, DAS28 5,4 [4,1-5,9]. Группу сравнения составили (n = 616): 27 пациентов с системной красной волчанкой (СКВ), 15 - с синдромом Шегрена (СШ), 25 - с анкилозирующим спондилоартритом (АС), 33 - с остеоартритом (ОА), 20 - с OVERLAP синдромом, 9 - с подагрическим (ПА), 22 - с псориатическим (ПСА) и 168 - с недифференцированным (НА) артритами, а также 297 здоровых доноров, сопоставимых по полу и возрасту с обследованными больными. Концентрации 36 биомаркеров измеряли с использованием иммунонефелометрического метода, имму-ноферментного анализа и технологии «xMAP». Прогноз значений одной переменной по другим проводили при помощи метода многомерной линейной регрессии (многофакторного анализа).

Выделены наиболее «сильные» факторы прогнозирования наличия раннего РА, а именно концентрации: интерлейкина-6, С-реактивного белка, гранулоцитарно-макрофогальный колониестимулирующий фактор, ин-терферон-у, ИФН-у-инду-цибельный белок, антитела к циклическому цитруллинированному пептиду и создан кан-дидатный МДИ для раннего РА (МИРРА). МИРРА обладает высокими значениями диагностической чувствительности (ДЧ) - 97%; диагностической специфичности - 94%; отношения правдоподобия положительных (ОППР) - 16,1 и отрицательных результатов (ОПОР) - 0,03; площади под кривой (ППК, ROC-анализ) превосходя IgM РФ (67%, 79%, 3,2, 0,4, 0,8 соответственно) по всем перечисленным параметрам, а АЦЦП (64%, 94%, 11, 0,4, 0,87 соответственно) по ДЧ, ОППР, ОПОР и ППК. После тщательной валидации МИРРА может рассматриваться как высокоточный серологический тест для ранней диагностики РА.

Создание МДИ с более высокой диагностической точностью, по сравнению с рутинно используемыми биомаркерми, крайне важно для ранней диагностики РА позволяющей начать активную противоревматическую терапию, способную эффективно затормозить прогрессирующие поражение суставов.

А. С. Авдеева, Е. Н. Александрова, А. А. Новиков, М.В. Черкасова, Е.Л. Насонов. Взаимосвязь уровня антител к цитруллинированным белкам (АЦБ), активности заболевания и маркеров деструкции костной и хрящевой ткани при ревматоидном артрите (РА). ФГБУ Научно-исследовательский институт ревматологии РАМН, Москва

АЦБ являются не только диагностическими маркерами РА, но и принимают непосредственное участие в патогенезе заболевания.

Цель - оценить взаимосвязь уровней антител к циклическому цитруллинированному пептиду (АЦЦП) и модифицированному цитруллинированному виментину (АМЦВ) с активностью заболевания и лабораторными маркерами деструкции костной и хрящевой ткани при РА.

В исследование было включено 105 больных РА (85 женщин, средний возраст - 53,0; 42,0-60,0, длительность заболевания - 60; 28-108 мес, DAS 28-5,9; 5,2-6,7, SDAI 34,4; 23,545,5, CDAI 30,5; 20,9-41). Определение СОЭ осуществляли методом Вестергрена, сывороточную концентрацию АМЦВ (ЕД/мл), матриксной металлопротеиназы 3 (ММП-3, нг/мл) и олигомерного матриксного белка хряща (COMP, нг/мл) -

методом ИФА, уровень АЦЦП (ЕД/мл) - электрохемилюми-несцентным методом.

Уровень АМЦВ (Me; 25-75%) составил 470,2; 106,9-1000, АЦЦП - 366,8; 76,9-500 (n = 43), ММП-3 - 35,0; 12,5-66,5 (n = 52), COMP - 472,5; 375,0-600,0 (n = 34). Была выявлена положительная корреляция концентрации АМЦВ с индексами активности: SDAI (r = 0,25, p = 0,02), CDAI (r = 0,3, p = 0,02). Достоверных корреляционных взаимосвязей уровня АЦЦП с клинико-лабораторными показателями активности выявлено не было. В зависимости от уровня позитивности по АМЦВ и АЦЦП все больные были разделены на группы. Среди высоко позитивных по АМЦВ больных (> 60 ЕД/мл, n = 80) чаще регистрировался повышенный уровень ММП-3 (56%), а также регистрировалась более высокая концентрация COMP (485,0; 405,0-655,0) и СОЭ (40,0; 30-61), по сравнению с негативными/низко позитивными (< 60 ЕД/мл) пациентами (31%; 340 (270-535); 30 (21-48,5) соответственно, n = 25, p < 0,05). Достоверных различий в активности заболевания, уровне маркеров деструкции костной и хрящевой ткани в группах больных, в зависимости от уровня позитивности по АЦЦП выявлено не было, p > 0,05.

Уровень АМЦВ в большей степени чем АЦЦП коррелирует с активностью заболевания и ассоциируется с более высокой концентрацией маркеров деструкции костной и хрящевой ткани при РА.

Ю.Н. Горбунова, Т.В. Попкова, Е.Н.Александрова, Л.В. Кондратьева, М.В. Черкасова, А.А.Новиков, Е.Л.Насонов. Клиническое значение адипоцитокинов при ревматоидном артрите. ФГБУ Научно-исследовательский институт ревматологии РАМН, Москва

Жировая ткань представляет собой активный эндокринный орган, вырабатывающий адипоцитокины (адипонектин, лептин, резистин, висфатин и др.). Обсуждается взаимосвязь адипокинов с маркерами активности и воспаления у больных ревматоидным артритом (РА), их возможная роль в иммуно-патогенезе этого заболевания.

Цель - изучить уровни адипоцитокинов у больных РА на ранней и поздней стадиях патологического процесса в сопоставлении с клинической активностью заболевания, лабораторными показателями воспаления и концентрацией аутоантител.

Обследовано 69 пациентов с достоверным диагнозом РА по критериям ACR (51 женщина и 18 мужчин, возраст - МЕ [25-75 перцентиль]: 57 [46-64] лет; длительность заболевания: 24 [6-72] мес), серопозитивных по IgM ревматоидному фактору (IgM РФ) и антителам к циклическому цитруллини-рованному пептиду (АЦЦП). Степень активности РА определяли по индексам активности DAS28 и SDAI. Сывороточную концентрацию С-реактивного белка (СРБ) и IgM РФ измеряли иммунонефелометрическим методом; АЦЦП, адипонек-тина, лептина, резистина и висфатина с помощью ИФА.

В зависимости от длительности РА пациенты были разделены на 2 группы: первая (n = 39) - пациенты с ранней стадией РА (длительность болезни от 6 мес до 1 года), вторая (n = 30) - с поздними (> 2х лет) клиническими стадиями РА. Группы достоверно различались по уровню DAS28: 5,5[5,1;6,3] vs 4,9[3,9;5,2], СРБ: 38,6[14;47,9] vs 20,1[4,2;31,8], АЦЦП:222,6[54,2;500] vs 124,8[40,3;200] (р < 0,05 во всех случаях). У больных первой группы отмечена положительная корреляция сывороточных уровней лептина и висфатина с DAS28 (r = 0,5; r = 0,64, соответственно); висфатина - с SDAI (r = 0,56) и концентрацией IgM РФ (r = 0,44) (р<0,05 во всех случаях). Во второй группе выявлена прямая корреляционная связь между уровнем адипонектина и SDAI (r = 0,41; р = 0,04); резистина и числом припухших суставов (r = 0,44; р = 0,03).

Взаимосвязь уровня адипокинов с клинико-лабораторными показателями воспалительной активности заболевания и концентрацией аутоантител (IgM РФ) свидетельствует о потенциальном участии данных цитокинов в развитии иммунологических нарушений и хронического воспаления при РА.

Д.Г. Гилязова. Иммунохемилюминесценция - альтернатива радиоиммунному методу лабораторной диагностики почечной гипертензии. ООО «Текан», Москва

Один миллиард людей по всему миру страдают от повышенного артериального давления. Продолжительное неконтролируемое или неадекватное лечение гипертензии - основной фактор риска инфаркта миокарда, инсульта, почечной недостаточности и других заболеваний сердечно-сосудистой системы. Почечная гипертензия в отличие от гипертензий другого происхождения часто склонна к особенно быстрому и злокачественному течению. Именно поэтому, при постановке диагноза артериальной гипертензии важно исключить ее вторичные формы, в том числе обусловленные нарушением функций ренин-ангиотензин-альдостероновой системы (РААС), первичный альдостеронизм и вазоренальную гипер-тензию, вклад которых в общее число случаев артериальной гипертензии в настоящее время оценивается, как 15-20%.

Совместное определение альдостерона и ренина обычно показано, если у пациента повышено кровяное давление и понижена концентрация калия. Также тестирование можно выполнять, если уровень калия у пациента в норме, но стандартные схемы лечения не приводят к нормализации давления или же гипертония развивается в молодом возрасте.

Первичный альдостеронизм - это поддающаяся лечению форма гипертонии, его ранняя диагностика и лечение позволяют избежать осложнений. Наиболее достоверным скри-нинговым маркером первичного альдостеронизма считается отношение альдостерон/ренина.

В настоящее время наиболее распространен метод оценки содержания ренина путем определения активности ренина плазмы (АРП). Достоинство этой методики, основанной на ферментативной реакции между ренином и ангиотензиноге-ном, заключается в образовании больших количеств ангиотен-зина I, достаточных для измерения с помощью радиоиммунного метода (РИА), то есть делает возможным оценку активности РААС в случае низких концентраций ренина. Кинетическое измерение содержания ренина, тем не менее, технически сложно, требует нескольких продолжительных процедур, зависит от уровня эндогенного ангиотензиногена, при этом воспроизводимость данного метода крайне низка, особенно между лабораториями. С появлением неизотопной методики хемилюминесцентного определения концентрации иммуноре-активного ренина появилась возможность стандартизовать и автоматизировать процесс измерения, при этом концентрация прямого ренина хорошо коррелирует с АРП и концентрацией ангиотензина II в широком диапазоне значений.

Для определения концентрации альдостерона традиционно используют РИА или иммуноферментный анализ (ИФА). Измерение концентрации альдостерона методом РИА, безусловно, является более чувствительным и достоверным способом, чем ИФА. Но, несмотря на аналитические достоинства РИА, существенным его недостатком является необходимость в специализированной лаборатории, квалифицированном персонале, а также дорогостоящем оборудовании. Кроме того, распад радиоактивной метки в составе наборов затрудняет стандартизацию измерений и обусловливает сравнительно короткий срок годности реагентов.

Иммунохемилюминесцентный метод анализа (ИХЛА) не уступает по чувствительности РИА, но при этом лишен его недостатков, связанных с процедурой измерения. Прямое определение ренина и альдостерона методом ИХЛА доступно только на анализаторах Liaison и Liaison XL (DiaSorin S.p.a.). Аналитические характеристики автоматизированной платформы и тест-систем обеспечивают высокую чувствительность и межсерийную воспроизводимость исследований. При этом количество необходимых манипуляций с пробой минимально, нужно лишь поместить пробу в анализатор, заказать необходимые тесты и запустить их выполнение, результат измерения будет доступен менее чем через 1 час, что позволяет принципиально ускорить выдачу результатов для определения окончательного клинического диагноза.