СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО КОМПОНЕНТА ДЛЯ СРЕДСТВА, ПРЕДНАЗНАЧЕННОГО ДЛЯ УХОДА ЗА КОЖЕЙ, И КОМПОНЕНТ, ПОЛУЧЕННЫЙ ЭТИМ СПОСОБОМ
METHOD FOR PREPARING BIOLOGICALLY ACTIVE COMPONENT FOR MAKING SKIN CARE PRODUCT, AND COMPONENT PREPARED BY SUCH METHOD

Изобретение относится к получению средств для улучшения состояния наружных покровов человека и может быть использовано в косметической, фармацевтической, космецевтической и парафармацевтической продукции.
Молочнокислые организмы (далее МКО) являются представителями нормальной микрофлоры (нормофлоры) человека, т.е. микроорганизмами, нормальными обитателями его кожных покровов, кишечника и слизистых оболочек (в том числе мочеполовой системы). МКО, обитатели кожи и наружных покровов, выполняют ряд важных для человека функций - препятствуют развитию патогенных микроорганизмов (за счет выделения бактериоцинов), поддерживают низкий pH (выделяя молочную, уксусную и другие органические кислоты), выделяют компоненты (метаболиты разной природы и ферменты), укрепляющие кожные покровы человека (влияя на биосинтетическую и пролиферативную активность фибробластов кожи), укрепляют иммунитет, участвуют в создании специфических естественных запахов тела.
В настоящее время при чрезмерном и необоснованном распространении средств гигиены и антисептики, а также неконтролируемом использовании антимикробных препаратов количество МКО на коже человека может быть и часто бывает сниженным, что приводит к развитию кожных заболеваний (илидисфункций), таких как гнойничковые заболевания, прыщи, раздражение, сухость и другие.
Применение лечебных и косметических препаратов, содержащих компоненты, происходящие из молочнокислых организмов, существенно улучшает и восстанавливает функциональную активность и структурную целостность кожи.
Известен крем для кожи, обладающий антибактериальным и противовоспалительным действием. Крем содержит молочную сыворотку, полученную путем сквашивания молока и последующего отделения (фильтрованием) молочнокислых бактерий (RU 2001121077, 10.07.2003). Недостатком данного способа является использование только продуктов жизнедеятельности молочнокислых бактерий и липофильной основы для крема, что ограничивает удобство применения.
10
Известно средство, которое содержит в качестве активного начала, влияющего на биосинтетическую и пролиферативную активность фибробластов кожи, комбинацию продуктов гидролиза клеточной стенки молочнокислых бактерий лизоцимом и внеклеточных водорастворимых пептидогликанов, выделяемых растущими молочнокислыми бактериями в культуральную среду. Средство является эффективным для ухода за нормальной и сухой кожей, в особенности при признаках старения и увядания кожи, однако способ получения средства сложен, т.к. состоит из комбинации методов выращивания бактерий Lactobacillus bulgaricus до титра 7.5×10 кл/мл, сепарирования культуральной жидкости, упаривания, лиофильного высушивания, «замораживания-оттаивания», центрифугирования, обработки ацетоном и лизоцимом (RU 2197953, 10.02.2003).
Известен способ приготовления основы для лекарственных или косметических средств, в котором использован активный компонент, представляющий собой продукт культивирования лакто- и бифидобактерий. Способ осуществляют следующим образом. Нативную смесь лакто- или бифидобактерий получают путем культивирования производственных штаммов на регламентированных питательных средах. Инактивирование взвеси бактерий производят нагреванием, культуральную жидкость получают путем отделения клеточной взвеси сепарированием или ультрафильтрацией. Полученный жидкий биологически активный компонент смешивают с другими составляющими основы до получения однородной массы с использованием общепринятых технологических приемов приготовления мазевых основ (RU 2187994, 27.08.2002).
Известен способ получения косметического сырья на основе молочной сыворотки, который включает заквашивание обезжиренного стерильного молока животных закваской из молочнокислых бактерий, культивирование бактерий, отделение бактерий от сыворотки центрифугированием или фильтрацией, прогревание и мембранную стерилизацию. (RU 2236144, 20.09.2004).
Известны пробиотическая композиция с высокой антагонистической активностью в отношении условно-патогенной и патогенной микрофлоры, применяемая для создания лечебно-профилактических средств, и способ ее получения. В качестве микробной массы полезной микрофлоры используют живую нелиофилизированную микробную массу бактерий Enterococcus faecium, Lactobacillus acidophilus или другие молочнокислые бактерии. Основа препарата содержит сыпучий компонент, нейтральный для полезной микрофлоры и для кожи и слизистых человека, который использован в качестве сорбента для нелиофилизированной массы бактерий, в соотношении 1:1-1:10 с жировым компонентом, нейтральным для полезной микрофлоры и для кожи и слизистых человека (RU 2227039, 20.04.2004).
Недостатками средства является использование ограниченного спектра молочнокислых организмов - только молочнокислых бактерий, а также сыпучего сорбента, что являются неудобным для применения в кремах для каждодневного ухода. Применение жира в качестве основы крема может значительно увеличивать скорость отмирания живых молочнокислых бактерий, т.е. приводить к снижению срока хранения препаратов. Применение высушенной биомассы бактерий также приводит к снижению количества живых клеток.
4
11
Известно средство, представляющее собой гигиеническую ткань, импрегнированную суспензией бактерий, продуцирующих молочную кислоту, в липиде. Количество липидной суспензии продуцирующих молочную кислоту бактерий на ткани составляет 0.5-95% мас. Препарат бактерий предпочтительно представлен в высушенном виде, количество пробиотических бактерий на ткани составляет предпочтительно 10-10колониеобразующих единиц. Бактериальный штамм выбирают из родов Pediococcus, Lactobacillus или Lactococcus, включая их комбинации. (RU 2306132, 20.09.2007).
Недостатком полученного средства является применение суспензии бактерий на тканях, использование липида, что значительно ограничивает сферу и удобство их применения.
Известен способ лечебно-профилактического ухода за кожей лица и шеи пациента, который предусматривает очищение кожи и нанесение на нее средства, в качестве которого используют суточную культуру бифидумбактерий, или лактобактерий, или термофильных стрептококков, или смесь культуры лактобактерий и термофильных стрептококков в соотношении 1:4, или смесь культуры бифидумбактерий и лактобактерий в соотношении 1:1. Могут быть использованы следующие штаммы молочнокислых бактерий: В.longum B379 м, B.bifidum 1, B.bifidum 791, L.acidophilus ЦМПМ - В3324, L.acidophilus ЦМПМ - В4425, L.plantarum 8 РАЗ, Str.thermophilus T-50. Приведенные штаммы бактерий выращивают в стерильных молочных средах: гидролизатно-молочной, молочно-дрожжевой, цельном молоке, обрате (RU 2026665, 10.01.1995).
Основным недостатком известного технического решения является использование свежевыращенных культур бактерий, что ограничивает его применение специализированными лечебными учреждениями, а при массовом производстве продукта срок хранения продукта снижен до нескольких дней, что коммерчески невыгодно.
Таким образом, известные способы получения средств для ухода за кожей, содержащие МКО или продукты их жизнедеятельности, подразделяются на две группы: использующие продукты жизнедеятельности молочнокислых бактерий (RU 2001121077, RU 2227039, RU 2197953, RU 2187994, RU 2236144) и использующие живые молочнокислые бактерии (RU 2306132, RU 2026665, RU 2227039). У способов обеих групп имеются недостатки. Общим недостатком первой группы является неиспользование (вследствие исключения из состава живых организмов) всего спектра полезных для человека свойств молочнокислых бактерий (выработка бактериоцинов, экзоферментов и других веществ). В случае применения живых бактерий (вторая группа), их применение ограничено или неудобством применения средства (использование жира и плотных носителей), или крайне коротким сроком действия средства. Кроме того, спектр применяемых организмов ограничен только бактериями, в то время как пробиотические организмы дрожжевой природы также обладают полезными свойствами.
За прототип предложенного технического решения выбран RU 2187994, 27.08.2002.
Задачей (и техническим результатом) настоящего изобретения является расширение ассортимента пробиотических активных агентов, входящих в состав средств по уходу за кожей и покровами, которые могут быть использованы в лечебно-косметических целях, которые характеризуются повышенным сроком хранения и пролонгированным действием.
Поставленная задача решается описываемым способом получения биологически активного компонента средства, предназначенного для ухода за кожей, включающим выращивание смешанной культуры молочнокислых организмов на регламентированных питательных средах, введение в полученную суспензию стабилизирующих добавок и расфасовку, согласно которому после выращивания до стационарной фазы роста смешанной культуры молочнокислых бактерий и дрожжей относительное содержание бактерий составляет 2-50% и содержание дрожжей 98-50% (по количеству живых клеток, КОЕ), в качестве стабилизирующих добавок в суспензию вводят вещества, выбранные из ряда: орпин, гексилрезорцин, крахмал, крахмал, желатин, расфасовку осуществляют в герметичную упаковку в отсутствие свободного доступа кислорода к средству.
Предпочтительно, суспензия содержит молочнокислые бактерии Lb. plantarum и дрожжи С.parapsilosis.
8
Предпочтительно, общее содержание молочнокислых организмов составляет не менее 2×10 живых клеток (КОЕ)/мл.
Предпочтительно, стабилизирующие добавки вводят в суспензию в следующих количествах (мас.%): орцин - 0.0025-0.01, гексилрезорцин - 0.0005-0.0015, крахмал - 3, желатин - 5.
Поставленная задача решается также описываемым биологически активным компонентом средства, предназначенного для ухода за кожей, содержащим в качестве активного компонента композицию из молочнокислых организмов разных таксономических групп, полученную способом, охарактеризованным выше.
Ниже приведены примеры и результаты экспериментов.
Предлагаемый способ основан на сравнительном исследовании использования чистых музейных культур молочнокислых организмов, ассоциации из музейных культур молочнокислых организмов, отселектированной в течение 6 месяцев по признаку длительного выживания при комнатной температуре, и штаммов, входящих в эту ассоциацию (табл.1). В таблице 1 указаны молочнокислые организмы, использованные в настоящем изобретении.
Таблица 1.
Организм, номер штамма
Источник (коллекция)
Lactobacillus acidophilus В-1660
Всероссийская коллекция микроорганизмов (ВКМ)
Lв.casei B-1144
ВКМ
Lв.plantarum B-578
ВКМ
Lв.pentosus B-1941
ВКМ
Lactococcus lactis ТБ2
Коллекция ГосНИИ генетики и селекции промышленных штаммов микроорганизмов
Candida parapsilosis Y-2645
BKM
Torulaspora delbrueckii Y-879
BKM
Lb.plantarum B-578
(после селекции на выживаемость)
C.parapsilosis Y-2645
(после селекции на выживаемость)
Ассоциация из Lb.plantarum B-578 и С.parapsilosis Y-2645
(после селекции на выживаемость)
Пример получения заявленного средства
8
Смешанные (состоящие из молочнокислых бактерий и дрожжей) или чистые культуры МКО (т.е. состоящие только из бактерий или только из дрожжей) выращивали с соблюдением норм асептики и основных микробиологических приемов на стерильных средах - обезжиренном молоке или среде MRS, на качалке в течение 3-5 суток при температуре 25-30°С в колбах объемом 250 мл в 50 мл среды до стационарной фазы роста (концентрация живых клеток составляла 2-11×10 КОЕ/мл). При выращивании смешанных культур инокулят состоял из бактерий и дрожжей в разной пропорции. В работе использовали МКО, перечисленные в табл.1. Концентрацию живых клеток определяли как концентрацию колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 мл среды методом высева аликвот десятичных разведений на плотную среду MRS. В культурах стационарной фазы относительное содержание бактериальных и дрожжевых культур варьировало от 0 до 100% (использовали их чистые культуры, а также с содержанием 2% или 50% бактерий). После получения культур стационарной фазы роста их разделяли на порции и добавляли одну из добавок: полисахаридной природы - крахмал или карбоксиметилцеллюлоза (3%), белковой природы - желатин (5%), антиоксидантной природы - орцин (0.0025-0.05%) или гексилрезорцин (0.0005-0.0025%), сорбент на основе пшеничных отрубей (10%), молочный жир сливок (5%), после чего оставляли на длительное хранение при комнатных условиях (температура 17-25°С). Для расфасовки и хранения препаратов с МКО использовали микробиологические пробирки с ватно-марлевыми пробками или пластиковые шприцы с герметично закупоренными иглами (для поддержания бескислородных условий). Через определенные интервалы времени из пробирок и шприцев отбирали порцию препарата для определения концентрации жизнеспособных микроорганизмов, а также для определения чистоты препаратов и их качественного состава, определяемых микроскопически и методом высева на плотную среду МРС. По результатам исследований выбирали наиболее эффективные композиции.
Пример использования средства
При исследовании действия композиции из молочнокислых организмов на кожу человека использовали испытание на добровольцах.
8
Суспензии МКО, состоящей из бактерий и дрожжей, а именно (Lb.plantarum+С.parapsilosis) и (Lв.pentosus+Т.delbrueckii) в двух разных пропорциях (1 - по 50% дрожжей и бактерий; 2 - 2% бактерий + 98% дрожжей), выращенных на обезжиренном молоке или среде MRS до титра 2-11×10 КОЕ/мл, использовали для протирания кожи рук, лица или бедренной области добровольных испытателей. Такая обработка привела к умягчению кожи рук и лица (сухой до применения средства), к существенному (до 90%) сокращению угрей на лице и к практически полному исчезновению гнойничковых высыпаний на бедренной области.
Данный пример показывает, что применение суспензий различных МКО обладает выраженным положительным (оздоравливающим) действием на кожу человека.
Результаты исследования сроков хранения средства
Известно, что МКО в условиях хранения их при комнатной температуре быстро отмирают, их количество снижается ниже концентраций, когда они проявляют свои пробиотические, положительные свойства.
На фиг.1 представлены результаты исследования по хранению некоторых культур МКО при температуре 17-25°С без применения каких-либо специальных мер по поддержанию их жизнеспособности, в пробирках, заткнутых ватно-марлевыми пробками.
Представленные результаты показывают, что 1) музейные штаммы отмирают гораздо быстрее, чем штаммы, специально отобранные нами по признаку долгого выживания в течение 6 месяцев (кривые 1+2 и 3+4), и 2) ассоциация МКО выживает гораздо успешнее (в течение большего времени поддерживает высокий титр живых клеток), чем чистые культуры, ее составляющие по отдельности (кривые 5+6 и 3+4), при разном изначальном составе популяции организмов - 2% и 50% дрожжей. Полученные данные иллюстрируют существенность применения именно композиций разных МКО - дрожжей и бактерий, а не их чистых культур, для длительного поддержания жизнеспособности организмов. Для чистых культур Lв.casei, Lв.pentosus и Т.delbrueckii результаты аналогичны таковым для Lb.acidophilus (быстрое отмирание). В другой бинарной культуре (Lв.pentosus+Т.delbrueckii) - отмирание культур бактерий и дрожжей было замедленно по сравнению с чистыми культурами.
МКО чувствительны к содержанию кислорода в среде обитания и довольно быстро гибнут при хранении. Было исследовано влияние способа расфасовки и хранения культур на выживаемость МКО при хранении в течение длительного времени. Количество кислорода регулировали путем выбора способа расфасовки и хранения культур МКО - в пробирках под ватно-морлевыми пробками (свободный доступ кислорода воздуха), или в герметично закрытых пластиковых шприцах без доступа воздуха. Ассоциации МКО содержали изначально от 2 до 50% бактерий Lв.plantarum (или Lв.pentosus), а также дрожжи С.parapsilosis (или Т.delbrueckii) соответственно. Результаты, представленные на фиг.2 (для ассоциации Lв.planfarum+C.parapsilosis с содержанием бактерий 50%), свидетельствуют, что хранение в условиях ограниченного доступа воздуха в течение нескольких месяцев позволяет поддержать концентрацию МКО на несколько порядков выше, чем в условиях свободного доступа кислорода. Для ассоциации Lв.plantarum+C.parapsilosis с начальным содержанием бактерий 2% результаты аналогичны. Для ассоциации Lв.pentosus+Т.delbrueckii результаты аналогичны.
Полученные данные показывают существенность признака, касающегося ограничения контакта ассоциации МКО с кислородом воздуха при расфасовке и хранении для поддержания их жизнеспособности в течение нескольких месяцев.
Результаты, касающиеся введения в средство стабилизирующих добавок
В ходе исследования проверяли влияние стабилизирующих добавок (антиоксидантов орцина и гексилрезорцина, полимеров разной природы - крахмала, карбоксиметилцеллюлозы, желатина, сорбентов - мелкопомолотых пшеничных отрубей) на длительность хранения МКО. На фиг.3 представлены результаты эксперимента по хранению ассоциации молочнокислых бактерий и дрожжей (начальное содержание - по 50%) в бескислородных условиях в течение 12 месяцев при комнатной температуре. Представленные данные показывают, что добавка отрубей и молочного жира существенно снижала титр жизнеспособных клеток; в присутствии орцина, гексилрезорцина, крахмала и желатина титр живых клеток был на 1-1.5 порядка выше, чем в контроле; применение карбоксиметилцеллюлозы давало неоднозначные результаты. Для ассоциации с начальным содержанием бактерий 2% данные аналогичны.
Данный пример иллюстрирует существенность присутствия в средстве стабилизаторов разной природы для повышения количества жизнеспособных клеток при длительном хранении средства при комнатной температуре. Наиболее эффективным оказалось использование в заявленной композиции применение орцина, гексилрезорцина, крахмала и желатина в заявленных концентрациях.
В результате проведенных исследований нами разработан способ, позволяющий получить активный компонент, который можно хранить в герметичной упаковке до 12 месяцев. В течение срока хранения полученный продукт пригоден к смешиванию с носителем для получения однородной массы необходимой консистенции с использованием общепринятых технологических приемов приготовления крема, геля, молочка или иного средства. После получения конкретного средства его снова расфасовывают в отсутствие или с ограничением свободного доступа воздуха в герметичную упаковку, сводящую к минимуму контакт средства с воздухом. В результате получают средство по уходу за кожей, обладающее высокой биологической активностью, а именно смягчающее, увлажняющее и регенерирующее кожу, с антибактериальным против патогенной микрофлоры и одновременно пробиотическим эффектом по отношению к симбиотической микрофлоре и пролонгированным сроком действия (12 мес. и больше).
Краткое описание чертежей
Фиг.1. Изменение количества жизнеспособных клеток (КОЕ/мл) разных МКО в течение 6 мес.1 - Lb.acidophilus, 2 - Lc.lactis, 3 - Lb.plantarum, 4 - С.parapsilosis, 5 - ассоциация Lb.plantarum и С.parapsilosis (изначально содержащая по 50% бактерий и дрожжей), 6 - ассоциация Lb.plantarum и С.parapsilosis (изначально содержащая 2% бактерий и 98% дрожжей).
Фиг.2. Выживание ассоциации молочнокислых бактерий Lb.plantarum и дрожжей С.parapsilosis (начальное содержание - по 50%) в течение 12 месяцев в разных условиях хранения. 1-е доступом воздуха, 2-е ограничением доступа воздуха.
Фиг.3. Хранение ассоциации молочнокислых бактерий Lb.plantarum и дрожжей С.parapsilosis в бескислородных условиях в течение 12 месяцев при комнатной температуре в присутствии разных стабилизирующих добавок: 1 - контроль; 2 - гексилрезорцин (0.0005%, для 0.0015% данные аналогичны); 3 - орцин (0.0025%, для 0.01% данные аналогичны); 4 - крахмал (3%); 5 - карбоксиметилцеллюлоза (3%); 6 - желатин (5%); 7 - отруби пшеничные (10%); 8 - молочный жир (5%).