Кинетика восстановления 2,6-дихлорфенолиндофенола в присутствии этанола в биотопливном элементе на основе клеток Gluconobacter oxydans и их мембранной фракции

Известия Тульского государственного университета Естественные науки. 2012. Вып. 1. С. 254-264 Химия

УДК 543.55:579.222.2

Кинетика восстановления 2,6-дихлорфенолиндофенола в присутствии этанола в биотопливном элементе на основе клеток ОЫсопоЬасЬет охуйапв и их мембранной фракции *

В. Т. Нгуен, В. А. Алферов, С. В. Алферов, А. В. Скорынина

Аннотация. Спектрофотометрическим методом получены эффективные константы скорости и начальные скорости восстановления медиатора 2,6-дихлорфенолиндофенола в присутствии этанола в биотопливном элементе на основе бактериальных клеток Gluconobacter oxydans и их мембранной фракции при различных условиях работы. Реакции восстановления окисленной формы и окисления восстановленной формы медиатора на аноде имеют первый порядок. Растворенный кислород не конкурирует с медиатором при восстановлении.

Ключевые слова: кинетика, биотопливные элементы, Gluconobac-ter oxydans, мембранная фракция, 2,6-дихлорфенолиндофенол.

Введение

Применение микроорганизмов является одним из перспективных направлений при создании экологически безопасных альтернативных источников электроэнергии — биотопливных элементов (БТЭ). Эти устройства преобразовывают химическую энергию в электричество за счет процессов биокаталитического окисления органических веществ. Основой БТЭ является биокатализатор, в качестве которого могут выступать как целые клетки микроорганизмов, так и индивидуальные ферменты. Использование бактериальных клеток в качестве биокатализатора БТЭ устраняет необходимость выделения индивидуальных ферментов, и позволяет активному биоматериалу работать в условиях, близких к их естественной среде, а, следовательно, с более высокой производительностью.

Штаммы СЫсопоЪаЫет охуйапв в качестве биокатализатора применяются в биосенсорных и биотопливных устройствах благодаря своей уникальной

* Работа выполнена в рамках проекта по Государственному заданию 4412ГЗ.

системе мембранно-локализованных ферментов [1,2]. Однако для эффективного переноса электронов из клеток СЫсопоЪасЬет охуйапв к электроду требуется использование медиаторов электронного транспорта, что усложняет механизм передачи зарядов в БТЭ и затрудняет понимание его.

Растворенный в растворе кислород, как правило, служит конечным акцептором электронов в дыхательной цепи бактериальных клеток, потому может влиять на процесс восстановления медиатора. В литературе известны случаи, когда медиаторы не могут конкурировать с кислородом за электроны. В таких случаях процесс восстановления медиатора протекает либо очень медленно, либо начинается только после полного израсходования кислорода в растворе. Если медиатор успешно конкурирует с кислородом, то процесс восстановления медиатора протекает независимо от присутствия растворимого кислорода в растворе [3].

Целью данной работы являлось определение кинетических параметров процесса восстановления медиатора 2,6-дихлорфенолиндофенол (ДХФИФ) в БТЭ, работающего на основе бактериальных клеток С1псопоЪас1вт охуйапв и их мембранной фракции с использованием этанола в качестве субстрата, при различных режимах работы (разомкнутая и замкнутая цепи, в деоксигенированной среде и в среде, содержащей кислород).

Материалы и методы

Культивирование бактериальных клеток Gluconobacter oxy-

ёапБ. В работе использовали бактерии С1псопоЪас1вт охуйапв виЪвр. тйпвЬппв (ВКМ В-1280) (Всероссийская коллекция микроорганизмов, ИБФМ РАН). Культивирование бактерий проводили на питательной среде следующего состава: Б-сорбит — 200 г/л; дрожжевой экстракт — 20 г/л; дистиллированная вода — 100 мл, pH среды — 5,5, при температуре 28°С, в течение 18-20 часов. После культивирования клетки собирали центрифугированием при 12000 об/мин 10 мин. и отмывали двукратно 20 мМ натрий-фосфатным буфером с рН 6,6. Осевшие клетки ресуспендировали в новой порции буфера и центрифугировали 5 мин при 12000 об/мин. Полученные осадки в пробирках «Эпендорф» подсушивали на воздухе в течение часа, и замораживали для длительного хранения при температуре

— 15°С. Массу всех порций биомассы регистрировали. Для каждой серии опытов использовали новые клетки, размороженные в течение 1 часа при комнатной температуре, а затем разбавленные 30 мМ натрий-фосфатным буфером рН 6,0 в соотношении 1:3 (мг сырого веса/мкл).

Получение мембранной фракции бактерий Gluconobacter охуёапБ. Разрушение бактерий С. охуйапв производили с использованием ультразвукового диспергатора УЗД11-0,1/22 в натрий-фосфатном буфере (рН 6,0). Время обработки ультразвуком составляло 2 минуты при подаваемой мощности 100 Вт, рабочей частоте 22 кГц. Полученный

лизат центрифугировали при 4000 об/мин в течение 25 мин. Мембранные дегидрогеназы содержались в надосадочной жидкости. Затем производили центрифугирование при 14000 об/мин в течение 30 мин, что вызывало осаждение мембранной фракции бактерий. Надосадочная жидкость представляла собой цитоплазматическую фракцию. Полученные осадки в пробирках «Эпендорф» подсушивали на воздухе, для каждой серии опытов в качестве биокатилизатора в биотопливном элементе использовали новую мембранную фракцию разбавленной 30 мМ натрий-фосфатным буфером рН 6,0 в соотношении 1:3 (мг сырого веса/мкл).

Подготовка ячейки биотопливного элемента. Основой модели БТЭ является двухкамерная ячейка. Объём анодного отделения был равен объему катодного и составлял 5 мл. Электродами служили спектрографитовые стержни диаметром 8 мм. Высота погружения электродов в раствор — 10 мм. Связь кювет осуществлялась через отверстие в стенке диаметром 6 мм, площадь окна, соединяющего анодное и катодное отделения, составляла 50 мм. Камеры разделяли протонселективной мембраной МФ-4СК («Пластполимер», Санкт-Петербург, Россия), являющейся аналогом мембраны «Нафион-117» в протонированной форме [4].

Спектрофотометрическое измерение скорости восстановления медиатора при различных условиях. Определение скорости восстановления медиатора ДХФИФ проводилось с использованием спектрофотометра СФ 103 («Аквилон», Россия) при длине волны 600 нм. Измерения проводились как в деоксигенированной среде, так и среде, содержащей кислород, в условиях разомкнутой внешней цепи и в режиме короткого замыкания. Для получения деоксигенированной среды через раствор анодного отделения пропускали поток азота.

Для определения скорости восстановления медиатора в режиме разомкнутой цепи в измерительную кювету и кювету сравнения последовательно вводились 3мл фосфатной буферной смеси (рН 6,0), 30 мкл 3 мМ раствора ДХФИФ, и 30 мкл смеси биокатализатора (1:3 мг сырого веса/мкл), после чего растворы тщательно перемешивались. Далее в кювету сравнения вносили 100 мкл 1 М раствора этанола для полного восстановления медиатора. Затем в измерительную кювету вносили 30 мкл 1 М раствора этанола и начинали снимать зависимость оптической плотности от времени.

Для определения скорости восстановления медиатора в режиме замкнутой цепи в катодное отделение ячейки биотопливного элемента вводилось 3мл 60мкМ гексацианоферрата (III) калия. В анодное отделение вводились 3мл фосфатной буферной смеси (рН 6,0), 30 мкл 3 мМ раствора ДХФИФ, и биокатализатора. Растворы в обоих отделениях непрерывно перемешивались магнитной мешалкой. Анод и катод биотопливного элемента соединялись медным проводником. Через каждые 2 минуты раствор в анодном отделении отбирали и измеряли его оптическую плотность.

Измерение концентрации кислорода в анолите БТЭ. В

анолит БТЭ добавляли 30 мкл суспензии клеток СЫсопоЪааЬвг оху-йапв (1:3 мг сырого веса/мкл), 30 мкл 1М этанола. Для оценки изменения концентрации кислорода при использовании ДХФИФ в анолит также добавляли 30 мкл раствора 2,6-ДХФИФ (концентрация 1мг/мл). Концентрацию кислорода в растворе измеряли кислородомером «Эксперт 001» (Эконикс-Эксперт, Россия) в натрий-фосфатном буфере (рН 6.0) при постоянном перемешивании раствора магнитной мешалкой (400 об/мин).

Результаты и обсуждение

Кинетика восстановления медиатора ДХФИФ бактериальными клетками ОЫсопоЪасЬвг охуд,апв в присутствии этанола. На рис. 1 и 2

представлены зависимости оптической плотности измеряемой смеси (буфер, суспензия клеток, ДХФИФ, этанол) от времени в различных условиях. Из анализа литературы известно, что в большинстве случаев кинетика восстановления медиатора соответствует реакции первого порядка, т.е. С = = Со • в~ы (где Со и С — начальная и текущая концентрация медиатора в измерительной кювете соответственно, к — константа скорости реакции) [3]. С другой стороны оптическая плотность раствора прямо пропорциональна концентрации медиатора, поэтому данные по оптической плотности были обработаны в виде зависимости 1п( у) от времени, где Оо и О — начальная и текущая оптические плотности реакционной смеси. Тангенс угла наклона линейной зависимости является эффективной константой скорости реакции (рис. 3).

0.35

О 200 400 600 800 1000 1200

время,с

Рис. 1. Кинетика восстановления ДХФИФ клетками аисопоЬасЬвт охуд,апя в среде, содержащей кислород

Надо отметить, что полученная константа скорости является эффективной, поскольку включает в себя:

Рис. 2. Кинетика восстановления ДХФИФ клетками ЄІисопоЬасієг охуд,апя в бескислородной среде

Рис. 3. Зависимость 1п от времени в среде, содержащей кислород

— концентрацию клеток, которая влияет на скорость восстановления медиатора;

— константу адсорбционного равновесия и константу скорости переноса электрона на электрод в режиме короткого замыкания.

Полученные константы скорости реакции приводили на единицу массы клеток. Начальные скорости восстановления медиатора, приведенные на единицу массы клеток, были рассчитаны по формуле

V — к • Сдхфиф • Ук

где к — эффективная константа скорости восстановления медиатора, с-1; СдХФИФ — начальная концентрация медиатора в кювете, моль/л; Укюветы — объем кюветы, л.

Результаты расчетов представлены в табл. 1.

Таблица 1

Приведенные эффективные константы скорости и начальные скорости реакции восстановления ДХФИФ бактериальными клетками в различных

условиях

Показатели Атмосфера О2 Атмосфера N2

Разомкнутая цепь Замкнутая цепь Разомкнутая цепь Замкнутая цепь

к, с-1 • г-1 16±1 6,7±0,4 18±1 7,3±0,3

V, мкмоль • с-1 г -1 1,0±0,1 0,40±0,02 1,1±0,1 0,44±0,02

В режиме короткого замыкания кроме процесса восстановления медиатора бактериальными клетками происходит также реакция окисления восстановленной формы медиатора на аноде. Обработка кривых показывает, что кинетика восстановления медиатора как в режиме разомкнутой цепи, так и в режиме короткого замыкания соответствует реакциям первого порядка. Ранее было показано, что при замкнутой цепи реакция окисления молекул восстановленного медиатора на электроде также имеет первый порядок [5]. В результате реакции на электроде образуется окрашенная окисленная форма медиатора, что снижает общую скорость восстановления медиатора в 2-3 раза.

В табл. 2 показаны аналогичные данные по скорости восстановления ДХФИФ клетками СІисопоЬасієт охуйапв в присутствии глюкозы [5].

Таблица 2

Эффективные константы скорости и начальные скорости реакции восстановления ДХФИФ бактериальными клетками в присутствии

глюкозы

Показатели Атмосфера О2 Атмосфера N2

Разомкнутая цепь Замкнутая цепь Разомкнутая цепь Замкнутая цепь

к, с-1 • г-1 1,0±0,1 0,48±0,03 1,9±0,1 0,46±0,03

— 1 —1 V, мкмоль • с 1 г 1 0,062±0,002 0,029±0,002 0,116±0,007 0,028±0,002

Сравнение полученных результатов с литературными данными показывает, что при использовании этанола в качестве субстрата эффективные константы скорости реакции восстановления ДХФИФ клетками аисопоЪасЬвт охуйапв на порядок большие, чем при использовании глюкозы.

Кинетика восстановления кислорода бактериальными клетками ОЫсопоЪасЬвт охуд,апв в присутствии этанола. В режимах замкнутой и разомкнутой цепей присутствие кислорода в растворе не оказывает существенного влияния на скорость восстановления медиатора. Отсюда следует, что для клеток ОЫсопоЪасЬвт охуйапв кислород не составляет конкуренцию медиатору. Для освещения этого явления проводили сравнение скорости восстановления медиатора и скорости восстановления кислорода.

На рис. 5 представлена кинетика расходования кислорода в анолите БТЭ в случаях присутствия и отсутствия медиатора при разомкнутой цепи.

Рис. 5. Кинетика расходования кислорода в случаях присутствия и отсутствия медиатора при разомкнутой цепи

В течение первых 10 минут коннцентрация кислорода в анолите практически линейно снижается, что соответствует реакции нулевого порядка для кислорода. Аппроксимация экспериментальных кривых в данном интервале времени уравнением линейной зависимости позволяет определить константу скорости и скорости восстановления кислорода в двух случаях.

v(безДХФИФ) = 0, 40 ± 0, 03 мкмоль • с-1 • г-1;

v(сДХФИФ) = 0, 38 ± 0, 03 мкмоль • с-1 • г-1;

Можно видеть, что присутствие ДХФИФ в растворе практически не влияет на скорость восстановления кислорода. Если учесть, что при своем восстановлении молекула кислорода принимает 4 электрона, а молекула ДХФИФ - 2, то скорость восстановления кислорода и ДХФИФ составляет примерно 4,0 и 1,6 мкмоль электронов • с-1 • г-1 соответственно. Таким образом можно говорить, что скорость восстановления кислорода и ДХФИФ в данном случае сопоставимы.

В литературе известны подобные случаи для других видов бактерий и медиаторов, как видно из табл. 2.

Таблица 3

Скорости восстановления (V) кислорода и медиаторов (мкмоль • с-1 • г-1) с учетом числа перенесенных электронов для каждого вида окислителя [3]

Микроорганизм V

Escherichia coli 7,04 7,30 8,32

Bacillus subtilis 2,20 18,0 3,82

Proteus vulgaris 2,96 14,2 3,40

Pseudomonas aeruginosa 4,12 3,08 -

В литературе показано, что гомогенат Gluconobacter oxydans, полученный после ультразвуковой обработки бактериальных клеток, обладает удельной активностью 2,78 Е/мг, что соответствует скорости восстановления этанола 46,3 мкмоль • г-1 • с-1 [6]. Даже если предположить, что целые клетки обладают удельной активностью в 10 раз меньшей, чем гомогенат клеток, т.е. 4,63 мкмоль • г-1 • с-1, то такое значение еще в 4 раза выше, чем суммарная скорость восстановления ДХФИФ и кислорода. Таким образом, отсутствие конкуренции между ДХФИФ и кислородом можно объяснить присутствием избытка бактериальных клеток в условиях эксперимента.

Кинетика восстановления медиатора ДХФИФ мембранной фракцией, выделенной из клеток ОЫсопоЪасЬвт ОхуСапв.

Аналогичным образом проводили исследование кинетики восстановления медиатора ДХФИФ в присутствии этанола мембранной фракцией, выделенной из Gluconobactвr oxydans. Обработку кривых проводили аналогично случаю с бактериальными клетками.

Рис. 6. Зависимость 1п в

^0 от времени в среде, содержащей кислород

Рис. 7. Зависимость 1п ^0 от времени в бескислородной среде

Результаты расчетов эффективной константы скорости и начальной скорости восстановления медиатора представлены в табл. 4.

Таблица 4

Эффективные константы скорости и начальные скорости реакции восстановления ДХФИФ мембранной фракцией в различных условиях

Показатели Атмосфера О2 Атмосфера N

Разомкнутая Замкнутая Разомкнутая Замкнутая

цепь цепь цепь цепь

к, с-1 • г-1 100±5 35±2 110±10 38±2

— і —1 V, мкмоль • с 1 г 1 6,3±0,3 2,2±0,1 6,9±0,6 2,4±0,1

Результаты обработки кривых показывает, что кинетика восстановления медиатора мембранной фракцией в присутствии этанола в режимах разомкнутой цепи и короткого замыкания соответствует реакциям первого порядка. При коротком замыкании скорость реакции уменьшается на 3-4 раза. Присутствие кислорода в реакционной среде не влияет на скорость восстановления медиатора.

Можно видеть, что константы скорости восстановления медиатора для мембранной фракции примерно в 6-7 раз выше, чем для целых клеток Gluconobacter oxydans.

Выводы

Спектрофотометрическим методом получены эффективные константы скорости и начальные скорости восстановления медиатора 2,6-дихлорфенелиндофенола в биотопливном элементе, работающем на основе бактериальных клеток Gluconobacter oxydans и их мембранной фракции, при различных режимах работы. Выявлено, что кинетика восстановления медиатора в данных случаях соответствует реакции первого порядка.

Для клеток Gluconobacter oxydans и их мембранной фракции присутствие кислорода в растворе не оказывает существенного влияния на скорость восстановления медиатора, что связано с присутствием избытка биокатализатора в условиях экспериментов.

При использовании этанола в качестве субстрата эффективные константы скорости реакции восстановления ДХФИФ клетками Gluconobacter оxydans на порядок большие, чем при использовании глюкозы.

Константы скорости восстановления медиатора для мембранной фракции в присутствии этанола примерно в 6-7 раз выше, чем для целых клеток Gluconobacter oxydans.

Список литературы

1. Tkac J. Determination of total sugars in lignocellulose hydrolysate by a mediated Gluconobacter oxydans biosensor // Analytica Chimica Acta. 2000. V.420. P.1-7.

2. Алферов С.В. Биотопливный элемент на основе бактериальных клеток Gluconobacter oxydans и 2,6-дихлорфенолиндофенол как медиатор электронного транспорта // Электрохимия. 2004. Т.42. №4. C.403-404.

3. Roller S.D., Bennetto H.P. Electron-transfer Coupling in Microbial Fuel Cells: 1. Comparison of Redox-mediator Reduction Rates and Respiratory Rates of Bacteria // J. Chem. Tech. Biotechnol. 1984. V. 34B. P.3-12.

4. Тимонов А.М. Твердые полимерные электролиты: структура, свойства и применение // Соросовский образовательный журнал. 2000. Т.6. №8. С.69-75.

5. Кинетические аспекты процесса передачи электронов в системе глюкоза-gluconobacter oxydans-2,6-дихлорфенолиндофенол-графитовый электрод / В.Т. Нгуен [и

др.] // Бутлеровские сообщения. 2011. Т.24. №4. С.60-65.

6. Islami M. Purification and Characterization of Alcohol Dehydrogenase from Gluconobacter suboxydans // Pakistan J. of Biological Sciences. 2008. V.11. P.208-213.

Нгуен Винь Тиен (tiencoc@yahoo.com), аспирант, кафедра химии, Тульский государственный университет.

Алферов Валерий Анатольевич (chem.@tsu.tula.ru), к.х.н., профессор, зав. кафедрой, кафедра химии, Тульский государственный университет.

Алферов Сергей Валерьевич (vdr_alf@rambler.ru), ассистент, кафедра биотехнологии, Тульский государственный университет.

Скорынина Анна Валерьевна, студент, кафедра биотехнологии, Тульский государственный университет.

Kinetics of the reduction of 2,6-dichlorophenolindophenol in the presence of ethanol in a biofuel cell based on Gluconobacter oxydans and its membrane fraction

V. T. Nguyen, V. A. Alferov, A. S. Reshetnikov, A. A. Goryacheva,

T. V. Funtikova

Abstract. Effective rate constants and initial rates of reduction of the mediator

2.6-chlorophenolindophenol in the presence of ethanol in the biofuel cell based on Gluconobacter oxydans and its membrane fraction at various operating modes were obtained by using spectrophotometric method. Reduction of the oxidized form of the mediator and oxidation of its reduced form on the anode have the first order. The dissolved oxygen does not compete to the mediator in the reduction process.

Keywords: kinetics, Gluconobacter oxydans, biofuel cell, membrane fraction,

2.6-dichlorophenolindophenol.

Nguyen Vinh Tien (tiencoc@yahoo.com), postgraduate student, department of chemistry, Tula State University.

Alferov Valeriy (chem.@tsu.tula.ru), candidate of chemical sciences, professor, head of department, department of chemistry, Tula State University.

Alferov Sergey (vdr_alf@rambler.ru), assistant, department of biotechnology, Tula State University.

Skorinina Anna, student, department of biotechnology, Tula State University.

Поступила 15.10.2012