1-Этил-6-фтор-4-оксо-7-(8-этокси-2-оксо-2Н-хромен-3-ил)-1,4-дигидрохинолин-3-карбоновая кислота, обладающая противотуберкулезной активностью
1-ETHYL-6-FLUORO-4-OXO-7-(8-ETHOXY-2-OXO-2H-CHROMEN-3-YL)-1,4-DIHYDROQUINOLINE-3-CARBOXYLIC ACID WITH ANTI-TUBERCULAR ACTIVITY

H
Изобретение касается области медицинской химии и относится к новому производному фторхинолонкарбоновой кислоты, 1-этил-6-фтор-4-оксо-7-(8-этокси-2-оксо-2-хромен-3-ил)-1,4-дигидрохинолин-3-карбоновой кислоте, которая обладает противотуберкулезной активностью и может найти применение в медицине и ветеринарии.
Бактериальные инфекции занимают важное место в структуре социально значимых заболеваний, а туберкулез является одной из 10 ведущих причин смертности. В 2015 г. в мире зафиксировано 10,4 млн новых случаев заражения туберкулезом, а смертность составила 1,8 млн. человек. В России в 2015 г. зарегистрировано 130904 случая заболевания туберкулезом. Российская Федерация включена в список стран с высоким бременем туберкулеза, поскольку уровень заболеваемости и смертности населения от туберкулеза превышает аналогичные показатели в странах Европы в 5-8 раз (http://www.who.int/tb/en) (2009); Global Tuberculosis Control: Surveillance, Planning, Financing; WHO Report 2009; World Health Organization: Geneva, 2009).
http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs104/ru/. Эти данные свидетельствуют, насколько велико социально-экономическое значение туберкулеза. К сожалению, борьба с туберкулезом методами современной химиотерапии должного эффекта не имеет.
К основным проблемам лечения туберкулеза относятся ограниченность арсенала противотуберкулезных средств и развитие множественной лекарственной устойчивости возбудителя (МЛУ), когда микобактерии туберкулеза устойчивы как минимум к двум основным противотуберкулезным препаратам - изониазиду и рифампицину. Микобактерия туберкулеза (МБТ) гипермутабельна - при попадании внутрь клетки начинаются ее многочисленные мутации, ведущие к ее резистентности, повышению скорости роста и другим неприятным качествам этого патогена. В 2015 году в мире насчитывалось около 480000 новых случаев туберкулеза (ТБ) с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ-ТБ), в том числе 42000 случаев - в России. Кроме того, диагностировано более 100000 больных с устойчивыми к лечению рифампицином формами туберкулеза (РР-ТБ). Индия, Китай и Российская Федерация составили 45% от общего числа новых случаев МЛУ-ТБ и РР-ТБ - 261000 случаев.
Препараты фторхинолонового ряда проявляют высокую активность в отношении микобактерий туберкулеза (МБТ) и представляют значительный интерес как препараты для комбинированной химиотерапии лекарственно-устойчивого туберкулеза [Caminero J., Sotgiu G., Zumla A. et al. Best drug treatment for multidrug-resistant and extensively drugresistant tuberculosis // Lancet Infect Dis. 2010. №10. P. 621-629]. В руководстве ВОЗ (2011 г.) в лечении МЛУ-ТБ предпочтение отдается левофлоксацину, моксифлоксацин рекомендуется применять лишь при доказанной широкой лекарственной устойчивости.
Eur. J. Med. Chem
2012
Механизм действия фторхинолонов на микобактериальную клетку принципиально отличается от механизма действия известных противотуберкулезных препаратов, что обеспечивает бактерицидный эффект и активность фторхинолонов в отношении штаммов, чувствительных и устойчивых к химиотерапии. Поиск новых препаратов, механизм действия которых на микобактериальную клетку принципиально отличается от механизма действия известных противотуберкулезных препаратов, является актуальной задачей [В. Villemagne, С. Crauste, М. Flipo et al. . , 51, 1-16].
Фторхинолоны оказывают ингибирующее действие на микробную клетку, как в период покоя, так и в период роста. Механизм действия заключается в ингибировании ДНК гиразы, что ведет к нарушению процессов транскрипции и репликации. В результате нарушается синтез ДНК, что в конечном итоге, нарушает деление клетки.
ДНК-гираза бактерий является белковым тетрамером массой 400 kDa, состоящим из двух субъединиц A (GyrA) и двух субъединиц В (GyrB). Связывание и расщепление ДНК связано с GyrA, в то время как АТФ связывается и гидролизуется белком GyrB. GyrB состоит из аминоконцевого домена, который обладает АТФ-азной активностью, и карбоксиконцевого домена, который взаимодействует с GyrA и ДНК. В идеале, антибиотики, механизм действия которых основан на ингибировании ДНК-гиразы бактерий, будут избирательными для данного фермента и относительно неактивны в отношении топоизомераз типа II у эукариот.
Фторхинолоновые антибиотики ингибируют ДНК-гиразу бактерий: связываются с GyrA и стабилизируют расщепленный комплекс, ингибируя, таким образом, функцию гиразы в целом, приводя к гибели клеток.
Менее известны ингибиторы, которые связываются с GyrB. Примеры включают кумарины, новобиоцин и кумермицин А, циклотиалидин, цинодин и клероцидин. Установлено, что кумарины очень прочно связываются с GyrB [Maxwell, Trends in Microbiology, 1997, 5, 102].
Синтез новых соединений, сочетающих в одной молекуле фрагменты, ингибирующие обе субъединицы ДНК-гиразы, может представлять интерес с точки зрения расширения спектра их действия на патоген.
Задача предлагаемого изобретения - поиск нового соединения с высокой антимикобактериальной активностью, в том числе по отношению к мультирезистентным штаммам микобактерий, расширяющего арсенал известных противотуберкулезных средств.
H
4
Техническим результатом данного изобретения является создание нового химического соединения - 1-этил-6-фтор-4-оксо-7-(8-этокси-2-оксо-2-хромен-3-ил)-1,4-дигидрохинолин-3-карбоновой кислоты формулы ()
4
Соединение , его физико-химические характеристики, а также способ его получения в литературе не описаны.
4
1
Соединение формулы () может быть получено в три стадии из доступного этилового эфира 6,7-дифтор-1-этил-4-оксо-1,4-дигидрохинолин-3-карбоновой кислоты ().
1
2
3
3
4
Соединение  нагревают с этиловым эфиром циануксусной кислоты в диметилсульфоксиде (ДМСО) в присутствии предварительно прокаленного карбоната калия. В результате выделяют этиловый эфир 7-(1-циано-2-этокси-2-оксоэтил)-1-этил-6-фтор-4-оксо-1,4-дигидрохинолин-3-карбоновой кислоты (), кислотным гидролизом которого получают соединение  - 7-цианометил-1-этил-6-фтор-4-оксо-1,4-дигидрохинолин-3-карбоновую кислоту. Соединение  вводят в реакцию с 3-этоксисалициловым альдегидом в N,N-диметилформамиде при комнатной температуре, далее полученный продукт отфильтровывают и в смеси серной и уксусной кислот при нагревании получают целевое соединение .
Характеристики соединений приведены в примерах конкретного выполнения.
1
19
13
Структуры соединений подтверждают методами элементного анализа, ЯМР Н, F и С спектрами и масс-спектрами. Температуры плавления соединений определяют на приборе Stuart SMP3 (Barloworld Scientific). Элементный анализ выполнен на автоматическом CHNS-O анализаторе РЕ 2400 серия II (Perkin Elmer).
1
6
4
J
Спектры ЯМР Н зарегистрированы на приборах Bruker DRX-400 (400 МГц) или Bruker Avance 500 (500 МГц) в ДМСО-d с SiMe в качестве внутреннего стандарта при 25°С. Химические сдвиги (δ) приведены в миллионных долях (м.д.), а константы спин-спинового взаимодействия () в герцах.
19
6
J
Спектры ЯМР F зарегистрированы на приборах Bruker Avance 500 (500 МГц) в ДМСО-d. Химические сдвиги (δ) приведены в миллионных долях (м.д.), а константы спин-спинового взаимодействия () в герцах.
13
6
4
Спектры ЯМР С зарегистрированы на приборе Bruker Avance 500 (125 МГц) в ДМСО-d с SiMe в качестве внутреннего стандарта при 25°С. Химические сдвиги (6) приведены в миллионных долях (м.д.).
Масс-спектры зарегистрированы на спектрометре Shimadzu GCMS-QP 2010 «Ultra». Условия съемки: энергия ионизирующих электронов 70 эВ, прямой ввод образца в источник.
Примеры конкретного выполнения.
H
Пример 1. Синтез 1-этил-6-фтор-4-оксо-7-(8-этокси-2-оксо-2-хромен-3-ил)-1,4-дигидрохинолин-3-карбоновой кислоты (4).
2
Стадия 1. Синтез 7-(1-циано-2-этокси-2-оксоэтил)-1-этил-6-фтор-4-оксо-1,4-дигидрохинолин-3-карбоновой кислоты ().
2
К раствору, содержащему 10,00 г (35,55 ммолей) этилового эфира 6,7-дифтор-1-этил-4-оксо-1,4-дигидрохинолин-3-карбоновой кислоты (1) в 65 мл диметилсульфоксида, прибавляют 4,80 г (42,66 ммоля) этилового эфира циануксусной кислоты и присыпают 11,79 г предварительно прокаленного карбоната калия. Полученную реакционную смесь нагревают с обратным холодильником с хлоркальциевой трубкой при 80°С в течение 4 ч. Реакционную массу выливают в ледяную воду (~ 250 мл) и к полученному раствору при перемешивании добавляют раствор HCl (18%) до рН 2-3. Полученный продукт экстрагируют хлористым метиленом (~ 600 мл). Водный слой отделяют, а органический слой промывают 2 раза по 200 мл дистиллированной водой и 1 раз насыщенным раствором хлорида натрия (200 мл), затем высушивают над безводным сульфатом натрия. Хлористый метилен удаляют на ротационном вакуум-испарителе, к остатку добавляют диэтиловый эфир (~ 75 мл), полученный осадок соединения  отфильтровывают и сушат на воздухе, при перекристаллизации из этилового спирта получают бесцветное вещество с т. пл. > 250°С (разложение без плавления). Выход 11,6 г (87,1%).
2
В следующей стадии соединение  используют без дополнительной очистки.
19
19
2
5
Найдено, %: С 60.92; Н 5.12; N 7.43. Вычислено для CHFNO (М 374.377), %: С 60.96; Н 5,12; N7.48.
1
B
A
6
2
3
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
J =
H
Спектр ЯМР Н (500.1 МГц, ДМСО-d): 1.22 (т, 3Н, 7.1 Гц, Н-4'); 1.30 (т, 3Н, 7.1 Гц, Н-3''); 1.41 (т, 3Н, 7.1 Гц, NCHC); 4.24 (кв, 2Н, 7.1 Гц, Н-2''); 4.27 (кв, 2Н, 7.1 Гц, Н-3'); 4.41 (д кв, 1H, 14.1, 7.1 Гц, NCH); 4.45 (д кв, 1Н, 14.1, 7.1 Гц, NCH); 6.13 (с, 1Н, Н-1'); 8.00 (д, 1Н, 10.2 Гц, Н-5); 8.09 (д, 1Н, 5.9 Гц, Н-8); 8.77 (с, 1Н, Н-2).
19
6
J =
Спектр ЯМР F (470.5 МГц, DMSO-d): 42.97 (дд, 10.2, 5.9 Гц, F-6).
13
2
3
2
3
4
1
4
6
3
2
CF
CF
CF
CF
CF
CF
CF
J
J
J
J
J
J
J
Спектр ЯМР С (125.7 МГц, DMSO-d): 13.75 (С-4'); 14.25 и 14.28 (2*СН); 37.94 (С-1'); 48.46 (NCH); 59.88 (С-2''); 63.21 (С-3'): 109.90 (С-3); 111.93 (д,  = 22.3 Гц, С-5); 115.19 (CN); 121.41 (д, =2.7 Гц, С-8); 124.21 (д,  = 17.7 Гц, С-7); 130.53 (д,  = 6.6 Гц, С-4а); 135.28 (дкв,  = 1.5 Гц, С-8а); 149.50 (С-2); 156.88 (д,  = 248.5 Гц, С-6); 163.88 (С-2'); 164.36 (С-1''); 171.47 (д,  = 2.1 Гц, С-4).
m/z
I
отн.
+
+
Масс-спектр,  (, > 5%): 375 [М+1] (1,35); 374 [М] (5,91); 329 (6,76); 303 (18,07); 302 (100); 230 (7.07); 229 (7.09); 228 (6.67); 145 (5,12).
3
Стадия 2. Синтез 7-цианометил-1-этил-6-фтор-4-оксо-1,4-дигидрохинолин-3-карбоновой кислоты ().
К 10,00 г (26,71 ммолей) этилового эфира 7-(1-циано-2-этокси-2-оксоэтил)-1-этил-6-фтор-4-оксо-1,4-дигидрохинолин-3-карбоновой кислоты (2) приливают 75 мл смеси кислот (серная кислота, конц.: уксусная кислота: вода дист. - 1: 20: 20). Реакционную массу нагревают при температуре 125°С в течение 6 ч. Затем реакционный раствор охлаждают до комнатной температуры, выпавший осадок отфильтровывают, промывают на фильтре дистиллированной водой и сушат на воздухе. Осадок перекристаллизовывают из смеси этанол:N,N-диметилформамид, получают бесцветное кристаллическое вещество с т. пл. > 250°С (разложение без плавления). Выход: 6,7 г (91,8%).
14
11
2
3
Найдено, %: С 60.92; Н 5.12; N 7.43. Вычислено для CHFNO (М 274.258), %: С 61.31; Н 4.04; N 10.22.
1
6
3
2
2
J =
J =
J =
J =
Спектр ЯМР Н (500.1 МГц, ДМСО-d): 1.46 (т, 3Н, 7.1 Гц, СН); 4.34 (с, 2Н, CHCN); 4.60 (кв, 2Н, 7.1 Гц, NCH); 8.10 (д, 1Н, 9.5 Гц, Н-5); 8.22 (д, 1H, 6.0 Н-8); 9.10 (с, 1H, Н-2); 14.89 (с, 1Н, ОН).
19
6
J =
Спектр ЯМР F (470.5 МГц, ДМСО-d): 44.84 (дд, 9.5, 6.0 Гц, F-6).
13
2
3
2
3
4
1
4
6
3
2
2
CF
CF
CF
CF
CF
CF
CF
J
J
J
J
J
J
J
Спектр ЯМР С (125.7 МГц, ДМСО-d): 14.47 (СН); 17.81 (CHCN); 49.44 (NCH); 107.68 (С-3); 110.87 (д,  = 22.8 Гц, С-5); 117.26 (CN); 121.23 (д,  = 3.6 Гц, С-8); 126.67 (д,  = 18.8 Гц, С-7); 126.94 (д,  = 7.7 Гц, С-4а); 135.81 (д,  = 1.4 Гц, С-8а); 149.42 (С-2); 157.68 (д,  = 249.9 Гц, С-6); 165.66 (СОО); 176.63 (д,  = 2.6 Гц, С-4).
m/z
I
отн.
+
+
Масс-спектр,  (, > 9%): 275 [М+1] (1,26); 274 [М] (7,24); 231 (14,36); 230 (100); 215 (53,38); 147 (9,89).
H
4
Стадия 3. Синтез 1-этил-6-фтор-4-оксо-7-(8-этокси-2-оксо-2-хромен-3-ил)-1,4-дигидрохинолин-3-карбоновой кислоты ().
К суспензии, содержащей 0,500 г (1,82 ммолей) 7-цианометил-1-этил-6-фтор-4-оксо-1,4-дигидрохинолин-3-карбоновой кислоты (3) и 0,303 г (1,82 ммолей) 3-этоксисалицилового альдегида, добавляют 5 капель пиперидина и перемешивают при комнатной температуре в течение 1 ч. К реакционной массе добавляют 15 мл этанола, осадок отфильтровывают, промывают на фильтре небольшим количеством этанола и гептана. Осадок с фильтра переносят в круглодонную колбу, добавляют 20 мл 5% раствора серной кислоты и нагревают при температуре 110°С в течение 6 ч. Реакционную массу охлаждают до комнатной температуры, осадок отфильтровывают и промывают на фильтре водой дистиллированной, затем гексаном или гептаном. Перекристаллизовывают из водного N,N-диметилформамида, получают 375 мг (48,6%) целевого соединения (4). Т. пл. 230°С (разложение без плавления).
23
18
6
Найдено, %: С 64.89; Н 4.28; N 3.36. Вычислено для CHFNO (М 423.425), %: С 65.25; Н 4.29; N3.31.
1
6
2
3
2
3
2
3
2
3
J =
H
J =
H
J =
H
J =
H
J =
J =
Спектр ЯМР Н (500.1 МГц, ДМСО-d): 1.43 (т, 3Н, 7.0 Гц, OCHC); 1.47 (т, 3Н, 7.1 Гц, NCHC); 4.23 (кв, 2Н, 7.0 Гц, OCCH); 4.64 (кв, 2Н, 7.1 Гц, NCCH); 7.34-7.41 (м, 3Н, Н-5', 6', 7'); 8.14 (д, 1H, 9.7 Гц, Н-5); 8.35 (д, 1H, 5.9 Гц, Н-8); 8.42 (с, 1Н, Н-4'); 9.12 (с, 1H, Н-2); 14.97 (с, 1Н, СООН).
19
6
J =
Спектр ЯМР F (470.5 МГц, DMSO-d): 47.91 (дд, 9.7, 5.9, F-6).
13
2
3
3
2
4
4
1
4
6
3
2
2
CF
CF
CF
CF
CF
CF
CF
CF
J
J
J
J
J
J
J
J
Спектр ЯМР С (125.7 МГц, DMSO-d): 14.59 и 14.65 (2*СН); 49.46 (NCH); 64.52 (ОСН); 107.66 (С-3); 110.76 (д,  = 24.0 Гц, С-5); 115.97 (С-7'); 119.29 (C-4'a); 121.46 (С-3'); 122.24 (д,  = 3.1, С-8); 124.96 (С-6'); 127.15 (д,  = 7.8, С-4а); 129.80 (д,  = 18.1, С-7); 135.58 (д,  = 1.2, С-8а); 142.88 (C-8'a); 145.01 (д,  = 1.5, С-4'); 145.67 (С-8'); 149.50 (С-2); 157.20 (д,  = 250.5, С-6); 158.43 (С-2'); 165.77 (СОО); 176.66 (d,  = 2.7, С-4).
m/z
I
отн.
+
+
Масс-спектр,  (, > 11%): 424 [М+1] (2,00); 423 [М] (6,86); 380 (25,57); 379 (100); 336 (17,50); 176 (11,20).
Биологическая активность
Туберкулостатическую активность изучали в лаборатории экспериментальных и диагностических исследований ФГБУ «Уральского научно-исследовательского института фтизиопульмонологии» Минздрава России, г. Екатеринбург.
Изучение туберкулостатической активности соединений проводят методом вертикальной диффузии с использованием лабораторного штамма H37Rv на плотной питательной среде «Новая».
4
Питательную среду разливают в пробирки по 5 мл, свертывая в наклонном положении таким образом, чтобы 1/2 часть дна пробирки оставалась свободной. Свернутую среду засевают по 0,1 мл взвеси микобактерий туберкулеза (МБТ) штамма H37Rv, разведенного по стандарту мутности 10 ед. ГКИ, и в наклонном положении помещают в термостат на 24 часа для выращивания МБТ. Через сутки пробирки ставят в вертикальное положение и по свободному краю закапывают по 0,3 мл субстанции раствора соединений в исследуемых концентрациях: 12,5; 6,25; 3,1; 1,5; 0,75 мкг/мл. Затем пробирки помещают в термостат при температуре 37°С и инкубируют в течение 10 суток. Оценку роста МБТ проводят по стандартной методике, где появление зон задержки роста МБТ (более 10 мм) свидетельствует о наличии туберкулостатических свойств в исследуемой концентрации соединений. Величина зоны задержки роста МБТ (в мм) пропорциональна степени туберкулостатической активности соединений. Задержка роста 100 мм и более расценивается как полная задержка роста МБТ. Соединение  проявило высокую туберкулостатическую активность в отношении лабораторного штамма H37Rv (таблица 1).
Изучение туберкулостатической активности в отношении резистентных штаммов проводят методом вертикальной диффузии на плотной питательной среде «Новая» с использованием лабораторных и клинических штаммов микобактерий туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ), выделенных от больных, находящихся на лечении в клинике ФГБУ «УНИИФ».
Питательную среду разливают в пробирки по 5 мл, свертывая в наклонном положении таким образом, чтобы 1/2 часть дна пробирки оставалась свободной. Свернутую среду засевают по 0,1 мл суспензией микобактерий различных штаммов, разведенных по стандарту мутности 10 ед. ГКИ, и в наклонном положении помещают в термостат на 24 часа для выращивания МБТ. Через сутки пробирки ставят в вертикальное положение и по свободному краю закапывают по 0,3 мл раствора соединений в исследуемых концентрациях: 12,5; 6,2; 3,1; 1,5; 0,7 мкг/мл. Затем пробирки помещают в термостат при температуре 37°С и инкубируют в течение 10 суток. Оценку роста МБТ проводят по стандартной методике, где появление зон задержки роста МБТ (более 10 мм) свидетельствует о наличии туберкулостатических свойств в исследуемой концентрации соединений. Величина зоны задержки роста МБТ (в мм) пропорциональна степени туберкулостатической активности соединений. Задержка роста 100 мм и более расценивается как полная задержка роста МБТ. Данные представлены в таблице 1.
4
4
Из данных таблицы 1 следует, что соединение  проявляет высокую туберкулостатическую активность (МИК 0,7-1,5 мкг/мл) как в отношении лабораторного штамма H37Rv, так и в отношении ряда лекарственно устойчивых штаммов МБТ. Следует подчеркнуть, что соединение  проявило активность в отношении штамма МЛУ, в отношении которого известный противотуберкулезный препарат, изониазид, не активен.
4
in vivo
Для заявляемого соединения  изучена острая токсичность и определена летальная доза LD50 в опытах на животных (). Определяют максимально переносимую дозу (МПД), при которой не наблюдалось гибели животных, и дозу, вызывающую гибель 50% животных (ЛД50). В соответствии с методикой (Г.Н. Першин, 1971. М.) расчет ЛД50 проводят по формуле, определяя среднюю смертельную дозу:
х. среднее = [(a+b) (m-n)]:200,
где (а+b) - сумма смежных доз; (m-n) - разность % смертности от 2-х последних доз.
4
Исследование острой токсичности и отработку летальной дозы ЛД50 соединения  проводят на белых мышах весом 17-20 г. Для препарата отбирают индивидуальные дозы: минимальная 150 мг/кг, средняя 300 мг/кг или 600 мг/кг и максимальная 900 мг/кг. Для каждой дозы берут по 5 белых мышек, которым вводят препараты в желудок в объеме 0,5 мл в 1% растворе крахмального клейстера. Контрольной группе вводят только 1% раствор крахмального клейстера.
Наблюдение за животными проводят в течение 14 дней. У всех животных, павших в процессе опыта, проводят макроскопические и гистологические исследования внутренних органов (печени, почек, легких, селезенки). У выживших животных после забоя также проводят гистологические исследования внутренних органов.
4
Данные по острой токсичности соединения  представлены в таблице 2.
4
4
4
4
Из представленных в таблице 2 данных следует, что при введении животным соединения  в дозе 300 мг/кг гибель животных не отмечена через 24 часа после введения. При введении животным соединения  в дозе 600 мг/кг гибель животных наступает через 2 часа после приема (20%). При введении животным соединения  в дозе 900 мг/кг гибель животных наступает через 30-60 мин после приема (60%). При вскрытии погибших животных макроскопических изменений во внутренних органах не выявлено. В результате проведенного исследования для соединения  установлено, что максимально переносимая доза (МПД) - 300 мг/кг (гибели животных не наблюдалось), ЛД50 - 600 мг/кг (гибель животных в 20%).