СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ИЛИ МОНИТОРИНГА ПОЧЕЧНОЙ ФУНКЦИИ ИЛИ ДИАГНОСТИКИ ПОЧЕЧНОЙ ДИСФУНКЦИИ
DIAGNOSTIC OR MONITORING METHOD OF RENAL FUNCTION OR DIAGNOSIS OF RENAL DYSFUNCTION

Объектом настоящего изобретения является способ (а) диагностики или мониторинга почечной функции у индивидуума или (б) диагностики почечной дисфункции у индивидуума, или (в) прогнозирования или мониторинга риска возникновения нежелательных явлений у больного индивидуума, где указанное нежелательное явление выбирают из группы, включающей ухудшение почечной дисфункции, включая почечную недостаточность, потерю почечной функции и терминальную стадию почечной недостаточности, или смерть вследствие почечной дисфункции, включая почечную недостаточность, потерю почечной функции и терминальную стадию почечной недостаточности, или (г) прогнозирования или мониторинга успеха терапии или вмешательства, заключающийся в том, что
- определяют уровень проэнкефалина (PENK) или его фрагментов, состоящих по меньшей мере из 5 аминокислот, в общей воде организма, взятой у индивидуума, и
(а) устанавливают корреляцию между указанным уровнем проэнкефалина или его фрагментов и почечной функцией у указанного индивидуума, или
(б) устанавливают корреляцию между указанным уровнем проэнкефалина или его фрагментов и почечной дисфункцией, при этом повышенный уровень, превышающий определенное пороговое значение, является прогностическим или диагностическим критерием почечной дисфункции у указанного индивидуума, или
(в) устанавливают корреляцию между указанным уровнем проэнкефалина или его фрагментов и указанным риском возникновения нежелательного явления у больного индивидуума, при этом повышенный уровень, превышающий определенное пороговое значение, является прогностическим критерием повышенного риска возникновения указанных нежелательных явлений, или
(г) устанавливают корреляцию между указанным уровнем проэнкефалина или его фрагментов и успехом терапии или вмешательства для больного индивидуума, при этом уровень, находящийся ниже определенного порогового значения, является прогностическим критерием успеха терапии или вмешательства.
Met-энкефалин, который представляет собой состоящий из 5 аминокислот пептид, выведенный из предшественника энкефалина (пре-проэнкефалина), который обозначают также как «опиоидный фактор роста» (OGF), высвобождается вместе с фрагментами проэнкефалина. Зрелый пептид связывается с различными опиоидными рецепторами (Koneru и др., 2009). Установлено, что энкефалин (OGF) обладает целым рядом физиологических функций. В ЦНС он осуществляет понижающую регуляцию пути передачи болевого сигнала, ассоциированного с субстанцией Р, он выполняет функцию цитокина (Plotnikoff и др., 1997). Родственные проэнкефалину пептиды обладают антибиотическими действиями (Goumon и др., 1998). Проэнкефалин и энкефалин обладают противоопухолевой активностью и действуют в качестве проапоптозных агентов (Tavish и др., 2007, Donahue и др., 2011, Zagon и др., 2009). Опубликованы данные о том, что при почечной дисфункции имеет место повышенный уровень энкефалина (Smith и др., 1985, Zoccali и др., 1987, Smith и др., 1981). Энкефалин продуцируется в виде более крупного проэнкефалина и в результате протеолиза превращается в зрелые пентапептиды. В процессе созревания образуется целый ряд фрагментов проэнкефалина, которые высвобождаются наряду с энкефалином (Ernst и др., 2006).
Объектом настоящего изобретения является применение проэнкефалина (PENK) или его фрагментов в качестве маркера почечной функции и дисфункции, и его клиническое применение для здоровых и больных индивидуумов. Объектом настоящего изобретения является способ диагностики или мониторинга почечной функции у индивидуума или диагностики почечной дисфункции у индивидуума, или прогнозирования риска смерти или возникновения нежелательных явлений у больного индивидуума.
В настоящем изобретении предложено также использование прогностического и диагностического потенциала PENK или его фрагментов для диагностики почечной функции, дисфункции и в качестве прогностического критерия для больных индивидуумов.
При создании изобретения неожиданно было установлено, что PENK или его фрагменты представляют собой эффективный и высоко значимый маркер для почки, ее функции, дисфункции, риска смерти или возникновения нежелательных явлений и для прогнозирования или мониторинга успеха терапии или вмешательства.
Объектом настоящего изобретения является способ (а) диагностики или мониторинга почечной функции у индивидуума или (б) диагностики почечной дисфункции у индивидуума, или (в) прогнозирования или мониторинга риска возникновения нежелательных явлений у больного индивидуума, где указанное нежелательное явление выбирают из группы, включающей ухудшение почечной дисфункции, включая почечную недостаточность, потерю почечной функции и терминальную стадию почечной недостаточности, или смерть вследствие почечной дисфункции, включая почечную недостаточность, потерю почечной функции и терминальную стадию почечной недостаточности, или (г) прогнозирования или мониторинга успеха терапии или вмешательства, заключающийся в том, что
- определяют уровень проэнкефалина (PEN) или его фрагментов, состоящих по меньшей мере из 5 аминокислот, в общей воде организма, взятой у указанного индивидуума, и
(а) устанавливают корреляцию между указанным уровнем проэнкефалина или его фрагментов и почечной функцией у индивидуума, или
(б) устанавливают корреляцию между указанным уровнем проэнкефалина или его фрагментов и почечной дисфункцией, при этом повышенный уровень, превышающий определенное пороговое значение, является прогностическим или диагностическим критерием почечной дисфункции у указанного индивидуума, или
(в) устанавливают корреляцию между указанным уровнем проэнкефалина или его фрагментов и указанным риском возникновения нежелательного явления у больного индивидуума, при этом повышенный уровень, превышающий определенное пороговое значение, является прогностическим критерием повышенного риска возникновения указанных нежелательных явлений, или
(г) устанавливают корреляцию между указанным уровнем проэнкефалина или его фрагментов и успехом терапии или вмешательства для больного индивидуума, при этом уровень, находящийся ниже определенного порогового значения, является прогностическим критерием успеха терапии или вмешательства.
В одном из конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения указанный проэнкефалин или его фрагменты не представляют собой Leu-энкефалин и Met-энкефалин. В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанный фрагмент проэнкефалина представляет собой MR-проэнкефалин (MRPENK) или его фрагмент, состоящий по меньшей мере из 5 аминокислот.
Иными словами, объектом настоящего изобретения является способ (а) диагностики или мониторинга почечной функции у индивидуума или (б) диагностики почечной дисфункции у индивидуума, или (в) прогнозирования или мониторинга риска возникновения нежелательных явлений у больного индивидуума, где указанное нежелательное явление выбирают из группы, включающей ухудшение почечной дисфункции, включая почечную недостаточность, потерю почечной функции и терминальную стадию почечной недостаточности, или смерть вследствие почечной дисфункции, включая почечную недостаточность, потерю почечной функции и терминальную стадию почечной недостаточности, или (г) прогнозирования или мониторинга успеха терапии или вмешательства, заключающийся в том, что
- определяют уровень иммунореактивного аналита путем применения по меньшей мере одной связывающей молекулы, которая связывается с областью внутри аминокислотной последовательности проэнкефалина (PENK), присутствующего в общей воде организма, взятой у указанного индивидуума; и
(а) устанавливают корреляцию указанного уровня иммунореактивного аналита с почечной функцией у индивидуума или
(б) устанавливают корреляцию указанного уровня иммунореактивного аналита с почечной дисфункцией, при этом повышенный уровень, превышающий определенное пороговое значение, является прогностическим или диагностическим критерием почечной дисфункции у указанного индивидуума, или
(в) устанавливают корреляцию указанного уровня иммунореактивного аналита с указанным риском возникновения нежелательного явления у больного индивидуума, при этом повышенный уровень, превышающий определенное пороговое значение, является прогностическим критерием повышенного риска возникновения указанных нежелательных явлений, или
(г) устанавливают корреляцию указанного уровня иммунореактивного аналита с успехом терапии или вмешательства для больного индивидуума, при этом уровень, находящийся ниже определенного порогового значения, является прогностическим критерием успеха терапии или вмешательства.
В одном из конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения указанный иммунореактивный аналит не представляет собой Leu-энкефалин и Met-энкефалин. В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанный иммунореактивный аналит представляет собой MR-проэнкефалин (MRPENK) или его фрагмент, состоящий по меньшей мере из 5 аминокислот.
В том случае, когда в способах, предлагаемых в настоящем изобретении, применяют связывающую молекулу, которая связывается с областью, находящейся в аминокислотной последовательности проэнкефалина (PENK), который присутствует в общей воде организма, понятие «определяют уровень проэнкефалина (PENK) или его фрагментов, состоящих по меньшей мере из 5 аминокислот, в общей воде организма, взятой у указанного индивидуума», эквивалентно понятию «определяют уровень иммунореактивного аналита путем применения по меньшей мере одной связывающей молекулы, которая связывается с областью, находящейся в аминокислотной последовательности проэнкефалина (PENK), который присутствует в общей воде организма, взятой у указанного индивидуума». В конкретном варианте осуществления изобретения в способах, предлагаемых в настоящем изобретении, применяют связывающую молекулу, которая связывается с областью, находящейся в аминокислотной последовательности проэнкефалина (PENK), который присутствует в общей воде организма. В конкретном варианте осуществления изобретения в способах, предлагаемых в настоящем изобретении, применяют связывающую молекулу, которая не связывается с областью, находящейся в аминокислотной последовательности Leu-энкефалина или Met-энкефалина, который присутствует в общей воде организма. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанная по меньшей мере одна связывающая молекула связывается с MR-проэнкефалином (MRPENK) или его фрагментом, состоящим по меньшей мере из 5 аминокислот.
В контексте настоящего описания понятие «индивидуум» относится к живому человеку или организму кроме человека. Предпочтительно в контексте настоящего описания индивидуум представляет собой человека. Индивидуум может быть здоровым или больным, если не указано иное. В одном из вариантов осуществления изобретения указанный индивидуум не страдает сердечным приступом. В другом варианте осуществления изобретения указанный индивидуум не представляет собой страдающего острым сердечным приступом пациента.
Понятие «повышенный уровень» означает уровень, превышающий определенный пороговый уровень. Понятие «повышенный» уровень может означать уровень, превышающий значение, которое рассматривается как референс-уровень.
Прогнозирование или мониторинг успеха терапии или вмешательства может представлять собой, например, прогнозирование или мониторинг успеха заместительной почечной терапии с использованием измерений уровня проэнкефалина (PENK) или его фрагментов, состоящих по меньшей мере из 5 аминокислот.
Прогнозирование или мониторинг успеха терапии или вмешательства может представлять собой, например, прогнозирование или мониторинг успеха лечения гиалуроновой кислотой пациентов, подвергающихся заместительной почечной терапии, с использованием измерений уровня проэнкефалина (PENK) или его фрагментов, состоящих по меньшей мере из 5 аминокислот.
Прогнозирование или мониторинг успеха терапии или вмешательства может представлять собой, например, прогнозирование или мониторинг восстановления почечной функции у пациента с нарушенной почечной функцией до и после заместительной почечной терапии и/или фармацевтических вмешательств, с использованием измерений уровня проэнкефалина (PENK) или его фрагментов, состоящих по меньшей мере из 5 аминокислот.
Общую воду организма можно выбирать из группы, включающей кровь, сыворотку, плазму, мочу, спинномозговую жидкость (СМЖ) и слюну.
Определение уровней проэнкефалина или его фрагментов позволяет характеризовать почечную функцию у индивидуума. Повышенная концентрация проэнкефалина или его фрагментов свидетельствует о сниженной почечной функции. Выявляемое при измерениях в период последующего (врачебного) наблюдения относительное изменение уровня проэнкефалина или его фрагментов коррелирует либо с улучшением (снижение уровня проэнкефалина или его фрагментов) либо и с ухудшением (повышение уровня проэнкефалина или его фрагментов) почечной функции у индивидуумов.
Проэнкефалин или его фрагменты являются диагностическими (маркерами) почечной дисфункции, при этом повышенный уровень, превышающий определенное пороговое значение, является прогностическим или диагностическим критерием наличия почечной дисфункции у указанного индивидуума. Выявляемое при измерениях в период последующего (врачебного) наблюдения относительное изменение уровня проэнкефалина или его фрагментов коррелирует либо с улучшением (снижение уровня проэнкефалин или его фрагментов), либо и с ухудшением (повышение уровня проэнкефалина или его фрагментов) почечной дисфункции у индивидуумов.
Проэнкефалин или его фрагменты обладают преимуществом по сравнению с другими маркерами (NGAL, уровень креатинина в крови, клиренс креатинина, цистатин С, мочевина) при диагностировании почечной функции/дисфункции и в течение периода последующего наблюдения. Преимущество заключается в более высокой специфичности, более высокой чувствительности и лучшей корреляции с клиническими «конечными точками».
Устанавливают корреляцию между указанным уровнем проэнкефалина или его фрагментов и риском смерти или возникновением нежелательного явления у больного индивидуума, при этом повышенный уровень, превышающий определенное пороговое значение, является прогностическим критерием повышенного риска смерти или возникновения нежелательных явлений. И с этой точки зрения также проэнкефалин или его фрагменты обладают преимуществом по сравнению с указанными выше клиническими маркерами.
R
I
F
L
E
Согласно настоящему изобретению риск соответствует определению риска согласно критериям RIFLE (isk, njury, ailure, oss, nd-stage renal failure - Риск, Повреждение, Недостаточность, Потеря, Терминальная стадия почечной недостаточности) (Venkatamaran и Kellum, 2006).
Больной индивидуум может страдать заболеванием, выбранным из таких заболеваний, как хроническая почечная недостаточность, вызываемая иммунными ответами на воспаление, острая почечная недостаточность, вызываемая сниженным кровотоком, что может быть обусловлено очень низким кровяным давлением вследствие травмы, его можно выбирать из травмированных пациентов, пациентов, подвергнутых хирургическому вмешательству, перенесших сердечный приступ, страдающих острой и хронической почечной недостаточностью, пациентов, страдающих SIRS (синдром системного воспалительного ответа), сепсисом, септическим шоком, сердечным приступом, острым инфарктом миокарда и постинфарктным состоянием, острой и хронической сердечной недостаточностью, местными и системными бактериальными и вирусными инфекциями, аутоиммунными заболеваниями, пациентов с ожогами, раком, заболеваниями печени, заболеваниями легкого, пациентов, получающих нефротоксины, такие как циклоспорин, антибиотики, включая аминогликозиды, и противораковые лекарственные средства, такие как цисплатин.
Терапия или вмешательство, поддерживающая(ее) или замещающая(ее) почечную функцию, может включать различные методы заместительной почечной терапии, включающие (но, не ограничиваясь только ими) гемодиализ, перитонеальный диализ, гемофильтрацию и почечную трансплантацию.
Нежелательное явление можно выбирать из группы, включающей ухудшение почечной дисфункции, включая почечную недостаточность, потерю почечной функции и терминальную стадию почечной недостаточности (согласно критериям RIFLE, Venkatamaran и Kellum, 2006).
В одном из вариантов осуществления изобретения подразумевается, что понятие фрагменты проэнкефалина включает также Leu-энкефалин и Met-энкефалин.
Объектом настоящего изобретения является способ, в котором уровень проэнкефалина или его фрагментов, состоящих по меньшей мере из 5 аминокислот, определяют с применением связывающей молекулы, по меньшей мере одной связывающей молекулы, которая связывается с проэнкефалином или его фрагментами, состоящими по меньшей мере из 5 аминокислот. В одном из вариантов осуществления изобретения указанную связывающую молекулу выбирают из группы, включающей антитело, фрагмент антитела или не-Ig-каркас, которое/который связывается с проэнкефалином или его фрагментами, состоящими по меньшей мере из 5 аминокислот. В конкретном варианте осуществления изобретения указанная по меньшей мере одна связывающая молекула связывается с областью в последовательностях, выбранных из группы, включающей SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 и 10. В конкретном варианте осуществления изобретения указанная связывающая молекула не связывается с пептидами энкефалина [Met]энкефалином, SEQ ID NO: 3, и [Leu]энкефалином, SEQ ID NO: 4. В конкретном варианте осуществления изобретения указанная по меньшей мере одна связывающая молекула связывается с областью в последовательностях, выбранных из группы, включающей SEQ ID NO: 1, 2, 5, 6, 7, 8, 9 и 10. В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанная по меньшей мере одна связывающая молекула связывается с областью в последовательностях, выбранных из группы, включающей SEQ ID NO: 2, 5, 6 и 10. В другом наиболее конкретном варианте осуществления изобретения указанная по меньшей мере одна связывающая молекула связывается с проэнкефалином 119-159, т.е. со срединной областью (Mid regional) проэнкефалина, MRPENK.
Проэнкефалин имеет следующую последовательность:
SEQ ID NO. 1 (проэнкефалин (1-243)
ECSQDCATCSYRLVRPADINFLACVMECEGKLPSLKIWETCKELLQLSKPELPQDGTSTLRENSKPEESHLLAKRYGGFMKRYGGFMKKMDELYPMEPEEEANGSEILAKRYGGFMKKDAEEDDSLANSSDLLKELLETGDNRERSHHQDGSDNEEEVSKRYGGFMRGLKRSPQLEDEAKELQKRYGGFMRRVGRPEWWMDYQKRYGGFLKRFAEALPSDEEGESYSKEVPEMEKRYGGFMRF.
Фрагменты проэнкефалина, которые можно выявлять в общей воде организма, можно выбирать, например, из группы следующих фрагментов:
SEQ ID NO: 2 (синэнкефалин, проэнкефалин 1-73)
ECSQDCATCSYRLVRPADINFLACVMECEGKLPSLKIWETCKELLQLSKPELPQDGTSTLRENSKPEESHLLA
SEQ ID NO: 3 (Met-энкефалин)
YGGFM
SEQ ID NO: 4 (Leu-энкефалин)
YGGFL
SEQ ID NO: 5 (проэнкефалин 90-109)
MDELYPMEPEEEANGSEILA
SEQ ID NO 6: (проэнкефалин 119-159, фрагмент срединной области проэнкефалина, MR PENK)
DAEEDDSLANSSDLLKELLETGDNRERSHHQDGSDNEEEVS
SEQ ID NO: 7 (Met-энкефалин-Arg-Gly-Leu)
YGGFMRGL
SEQ ID NO: 8 (проэнкефалин 172-183)
SPQLEDEAKELQ
SEQ ID NO: 9 (проэнкефалин 193-203)
VGRPEWWMDYQ
SEQ ID NO. 10 (проэнкефалин 213-234)
FAEALPSDEEGESYSEVPEME
SEQ ID NO: 11 (проэнкефалин 213-241)
FAEALPSDEEGESYSKEVPEMEKRYGGFM
SEQ ID NO: 12 (Met-энкефалин-Arg-Phe)
YGGFMRF
Определение уровня проэнкефалина или его фрагментов, включая Leu-энкефалин и Met-энкефалин, можно осуществлять посредством определения иммунореактивности в отношении проэнкефалина или его фрагментов, включая Leu-энкефалин и Met-энкефалин. В зависимости от области связывания связывающая молекула, которую применяют для определения проэнкефалина или его фрагментов, включая Leu-энкефалин и Met-энкефалин, может связываться с более чем одной из указанных выше молекул. Это должно быть очевидно специалисту в данной области.
Таким образом, согласно настоящему изобретению определяют уровень иммунореактивного аналита с использованием по меньшей мере одной связывающей молекулы, которая связывается с областью в аминокислотной последовательности любого из вышеуказанных пептидов и пептидных фрагментов (т.е. проэнкефалина (PENK) и его фрагментов, имеющих любую из последовательностей 1-12), в общей воде организма, взятой у указанного индивидуума, и устанавливают имеющую клиническое значение корреляцию согласно конкретным вариантам осуществления изобретения.
В более конкретном варианте способа, предлагаемого в настоящем изобретении, определяют уровень MRPENK (SEQ ID NO: 6: проэнкефалин 119-159, т.е. фрагмент срединной области проэнкефалина, MRPENK). В более конкретном варианте осуществления изобретения определяют уровень иммунореактивного аналита с использованием по меньшей мере одной связывающей молекулы, которая связывается с MR-PENK, и устанавливают имеющую клиническое значение корреляцию согласно конкретным вариантам осуществления изобретения, например,
- устанавливают корреляцию указанного уровня иммунореактивного аналита с почечной функцией у индивидуума или
(б) устанавливают корреляцию указанного уровня иммунореактивного аналита с почечной дисфункцией, при этом повышенный уровень, превышающий определенное пороговое значение, является прогностическим или диагностическим критерием почечной дисфункции у указанного индивидуума, или
(в) устанавливают корреляцию указанного уровня иммунореактивного аналита с указанным риском возникновения нежелательного явления у больного индивидуума, при этом повышенный уровень, превышающий определенное пороговое значение, является прогностическим критерием повышенного риска возникновения указанных нежелательных явлений, или
(г) устанавливают корреляцию указанного уровня иммунореактивного аналита с успехом терапии или вмешательства для больного индивидуума, при этом уровень, находящийся ниже определенного порогового значения, является прогностическим критерием успеха терапии или вмешательства.
Альтернативно этому уровень любого из указанных выше аналитов можно определять с помощью других аналитических методов, таких, например, как масс-спектроскопия.
Таким образом, объектом настоящего изобретения является способ (а) диагностики или мониторинга почечной функции у индивидуума или (б) диагностики почечной дисфункции у индивидуума, или (в) прогнозирования или мониторинга риска возникновения нежелательных явлений у больного индивидуума, где указанное нежелательное явление выбирают из группы, включающей ухудшение почечной дисфункции, включая почечную недостаточность, потерю почечной функции и терминальную стадию почечной недостаточности, или смерть вследствие почечной дисфункции, включая почечную недостаточность, потерю почечной функции и терминальную стадию почечной недостаточности, или (г) прогнозирование или мониторинг успеха терапии или вмешательства, заключающийся в том, что
- определяют уровень иммунореактивного аналита путем применения по меньшей мере одной связывающей молекулы, которая связывается с областью в аминокислотной последовательности пептида, выбранного из группы, включающей пептиды и фрагменты, имеющие SEQ ID NO: 1-12, которые присутствуют в общей воде организма, взятой у указанного индивидуума; и
(а) устанавливают корреляцию указанного уровня проэнкефалина или его фрагментов с почечной функцией у индивидуума или
(б) устанавливают корреляцию указанного уровня проэнкефалина или его фрагментов с почечной дисфункцией, при этом повышенный уровень, превышающий определенное пороговое значение, является прогностическим или диагностическим критерием почечной дисфункции у указанного индивидуума, или
(в) устанавливают корреляцию указанного уровня проэнкефалина или его фрагментов с указанным риском возникновения нежелательного явления у больного индивидуума, при этом повышенный уровень, превышающий определенное пороговое значение, является прогностическим критерием повышенного риска возникновения указанных нежелательных явлений, или
(г) устанавливают корреляцию указанного уровня проэнкефалина или его фрагментов с успехом терапии или вмешательства для больного индивидуума, при этом уровень, находящийся ниже определенного порогового значения, является прогностическим критерием успеха терапии или вмешательства.
В конкретном варианте осуществления изобретения уровень иммунореактивного аналита определяют с применением по меньшей мере одной связывающей молекулы, которая связывается с областью в аминокислотной последовательности пептида, выбранного из группы, включающей проэнкефалин или его фрагменты, состоящие по меньшей мере из 5 аминокислот. В одном из конкретных вариантов осуществления изобретения указанная по меньшей мере одна связывающая молекула связывается с областью в последовательностях, выбранных из группы, включающей SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 и 10. В конкретном варианте осуществления изобретения указанная связывающая молекула не связывается с пептидами энкефалина [Met]энкефалином, SEQ ID NO: 3, и [Leu]энкефалином, SEQ ID NO: 4. В конкретном варианте осуществления изобретения указанная по меньшей мере одна связывающая молекула связывается с областью в последовательностях, выбранных из группы, включающей SEQ ID NO: 1, 2, 5, 6, 7, 8, 9 и 10. В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанная по меньшей мере одна связывающая молекула связывается с областью в последовательностях, выбранных из группы, включающей SEQ ID NO: 2, 5, 6 и 10. В другом наиболее конкретном варианте осуществления изобретения указанная по меньшей мере одна связывающая молекула связывается с проэнкефалином 119-159, т.е. фрагментом срединной области проэнкефалина, MRPENK. Указанная выше связывающая молекула связывается с указанными пептидами в общей воде организма, взятой у указанного индивидуума.
В одном из вариантов осуществления изобретения указанную по меньшей мере одну связывающую молекулу выбирают из группы, включающей антитело, фрагмент антитела или не-Ig-каркас, которое/который связывается с проэнкефалином или его фрагментами, состоящими по меньшей мере из 5 аминокислот.
В более конкретном варианте осуществления изобретения уровень иммунореактивного аналита определяют с применением по меньшей мере одной связывающей молекулы, которая связывается с областью в аминокислотной последовательности проэнкефалина 119-159, т.е. фрагментом срединной области проэнкефалина, MRPENK (SEQ ID NO: 6), в общей воде организма, взятой у указанного индивидуума.
В конкретном варианте осуществления изобретения уровень проэнкефалина или его фрагментов измеряют с помощью иммуноанализа с использованием антител или фрагментов антител, которые связываются с проэнкефалином или его фрагментами. Иммуноанализ, который можно применять для определения уровня проэнкефалина или его фрагментов, состоящих по меньшей мере из 5 аминокислот, может включать стадии, описанные в примере 1. Все пороговые значения и величины должны рассматриваться в контексте теста и калибровки, которые применяли в примере 1. Специалисту в данной области должно быть известно, что абсолютная величина порогового значения может зависеть от применяемой калибровки. Это означает, что все величины и пороговые значения, представленные в настоящем описании, следует рассматривать в контексте использованной в настоящем описании калибровки (пример 1).
Согласно изобретению диагностическую связывающую молекулу, которая связывается с проэнкефалином, выбирают из группы, включающей антитела, например, IgG, как правило, полноразмерный иммуноглобулин, или фрагменты антител, содержащие по меньшей мере вариабельный (Fv) домен тяжелой и/или легкой цепи, такие, например, как химически сшитые антитела (антигенсвязывающие фрагменты), включая (но, не ограничиваясь только ими) Fab-фрагменты, включая миниантитела в виде Fab, антитело в виде одноцепочечного Fab, одновалентное антитело в виде Fab с эпитопными метками, например, Fab-V5S×2; двухвалентный Fab (мини-антитело), димеризованный с помощью СН3-домена; двухвалентный Fab или многовалентный Fab, например, образованный посредством мультимеризации с помощью гетерологичного домена, например, посредством димеризации dHLX-доменов, например, Fab-dHLX-FS×2; F(ab')2-фрагменты, scFv-фрагменты, мультимеризованные многовалентные и/или мультиспецифические scFv-фрагменты, двухвалентные и/или биспецифические диабоди, BITE (биспецифический активатор Т-клеток), трифункциональные антитела, многовалентные антитела, например, класса, отличного от G-класса; однодоменные антитела, например, наноантитела, выведенные из верблюжьих или рыбьих иммуноглобулинов.
В конкретном варианте осуществления изобретения уровень проэнкефалина или его фрагментов измеряют с помощью анализа с использованием связывающих молекул, выбранных из группы, включающей аптамеры, не-Ig-каркасы, которые связываются с проэнкефалином или его фрагментами, что будет более подробно описано ниже.
7
-1
8
-1
9
-1
10
-1
Связывающая молекула, которую можно применять для определения уровня проэнкефалина или его фрагментов, характеризуется константой аффиности к проэнкефалину, составляющей по меньшей мере 10 М, предпочтительно 10 М, предпочтительно константа аффинности превышает 10 М, наиболее предпочтительно превышает 10 М. Специалисту в данной области известно, что для компенсации пониженной аффинности можно рассматривать применение соединений в более высокой дозе, и этот подход не выходит за рамки объема изобретения. Аффинность связывания можно определять с помощью метода Biacore, доступного в виде сервисного анализа, например, на сайте фирмы Biaffin, Кассель, Германия (http://www.biaffin.com/de/).
Контрольный образец человеческого проэнкефалина можно получать от фирмы ICI-Diagnostics, Берлин, Германия (http://www.ici-diagnostics.com/). При проведении анализа калибровку можно осуществлять с использованием синтетического (для экспериментов, проведенных при создании настоящего изобретения, применяли синтетический MRPENK, SEQ ID NO: 6) или рекомбинантного проэнкефалина или его фрагментов.
Помимо антител в данной области хорошо известны другие биополимерные каркасы, образующие комплекс с молекулой-мишенью, и их применяют для создания высокоспецифичных в отношении мишени биополимеров. Примерами являются аптамеры, шпигельмеры, антикалины и конотоксины. Не-Ig-каркасы могут представлять собой белковые каркасы и их можно применять в качестве имитаторов антитела, поскольку они обладают способностью связываться с лигандами или антигенами. Не-Ig-каркасы можно выбирать из группы, включающей не-Ig-каркасы на основе тетранектина (например, описанные в US 2010/0028995), фибронектиновые каркасы (например, описанные в ЕР 1266025; каркасы на основе липокалина (например, описанные в WO 2011/154420); убиквитиновые каркасы (например, описанные в WO 2011/073214), трансферриновые каркасы (например, описанные в US 2004/0023334), каркасы на основе белка А (например, описанные в ЕР 2231860), каркасы на основе анкиринового повтора (например, описанные в WO 2010/060748), каркасы на основе микропротеинов, предпочтительно микропротеинов, образующих цистеиновый узел (например, описанные в ЕР 2314308), каркасы на основе SH3-домена киназы Fyn (например, описанные в WO 2011/023685), каркасы на основе А-домена EGFR (например, описанные в WO 2005/040229) и каркасы на основе домена Кунитца (например, описанные в ЕР 194867).
Пороговое значение для диагностики почечного заболевания/дисфункции или для определения риска смерти или возникновения нежелательного явления, может представлять собой верхний предел нормального диапазона (99-й процентиль, 80 пмолей MRPENK/л, более предпочтительно 100 пмолей/л, еще более предпочтительно 120 пмолей/л). За диапазон пороговых значений можно принимать диапазон от 75 до 130 пмолей MRPENK/л.
В одном из конкретных вариантов осуществления изобретения уровень проэнкефалина измеряют с помощью иммуноанализа и указанная связывающая молекула представляет собой антитело или фрагмент антитело, которое/который связывается с проэнкефалином или его фрагментами, состоящими по меньшей мере из 5 аминокислот.
В одном из конкретных вариантов осуществления изобретения применяют две связывающие молекулы, которые связываются с двумя различными областями в области проэнкефалина, которая включает аминокислоты 133-140 (LKELLETG, SEQ ID NO: 13) и аминокислоты 152-159 (SDNEEEVS, SEQ ID NO: 14), где каждая из указанных областей содержит по меньшей мере 4 или 5 аминокислот.
В одном из вариантов анализа для определения проэнкефалина или фрагментов проэнкефалина в образце согласно настоящему изобретению чувствительность указанного анализа позволяет осуществлять количественную оценку проэнкефалина или фрагментов проэнкефалина у здоровых индивидуумов, и она составляет < 15 пмолей/л, предпочтительно < 10 пмолей/л и более предпочтительно < 6 пмолей/л.
Объектом настоящего изобретения является применение по меньшей мере одной связывающей молекулы, которая связывается с областью в аминокислотной последовательности пептида, выбранного из группы, которая включает пептиды и фрагменты, имеющие SEQ ID NO: 1-12, которые присутствуют в общей воде организма, взятой у указанного индивидуума, в способе (а) диагностики или мониторинга почечной функции у индивидуума или (б) диагностики почечной дисфункции у индивидуума, или (в) прогнозирования или мониторинга риска возникновения нежелательных явлений в больного индивидуума, где указанное нежелательное явление выбирают из группы, включающей ухудшение почечной дисфункции, включая почечную недостаточность, потерю почечной функции и терминальную стадию почечной недостаточности, или смерть вследствие почечной дисфункции, включая почечную недостаточность, потерю почечной функции и терминальную стадию почечной недостаточности, или (г) прогнозирования или мониторинга успеха терапии или вмешательства. В одном из вариантов осуществления изобретения указанную связывающую молекулу выбирают из группы, включающей антитело, фрагмент антитела или не-Ig-каркас, которое/который связывается с проэнкефалином или его фрагментами, состоящими по меньшей мере из 5 аминокислот. В конкретном варианте осуществления изобретения указанная по меньшей мере одна связывающая молекула связывается с областью в последовательностях, выбранных из группы, включающей SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 и 10. В конкретном варианте осуществления изобретения указанная связывающая молекула не связывается с пептидами энкефалина [Met]энкефалином, SEQ ID NO: 3, и [Leu]энкефалином, SEQ ID NO: 4. В конкретном варианте осуществления изобретения указанная по меньшей мере одна связывающая молекула связывается с областью в последовательностях, выбранных из группы, включающей SEQ ID NO: 1, 2, 5, 6, 7, 8, 9 и 10. В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанная по меньшей мере одна связывающая молекула связывается с областью в последовательностях, выбранных из группы, включающей SEQ ID NO: 2, 5, 6 и 10. В другом более конкретном варианте осуществления изобретения указанная связывающая молекула связывается с проэнкефалином 119-159, т.е. фрагментом срединной области проэнкефалина, MRPENK.
В более конкретном варианте осуществления изобретения указанная по меньшей мере одна связывающая молекула связывается с областью в аминокислотной последовательности проэнкефалина 119-159, т.е. фрагмента срединной области проэнкефалина, MRPEN (SEQ ID NO: 6), в общей воде организма, взятой у указанного индивидуума, более конкретно с аминокислотами 133-140 (LKELLETG, SEQ ID NO: 13) и/или аминокислотами 152-159 (SDNEEEVS, SEQ ID NO: 14), где каждая из указанных областей содержит по меньшей мере 4 или 5 аминокислот.
8
-1
Таким образом, согласно способам, предлагаемым в настоящем изобретении, определяют уровень иммунореактивности указанной выше связывающей молекулы в общей воде организма, взятой у указанного индивидуума. Уровень иммунореактивности означает концентрацию аналита, определенную количественно, полуколичественно или качественно на основе реакции связывания связывающей молекулы с указанным аналитом, где предпочтительно связывающая молекула характеризуется константой аффинности связывания с аналитом, составляющей по меньшей мере 10 М, и связывающая молекула может представлять собой антитело или фрагмент антитела, или не-IgG-каркас, и где реакция связывания представляет собой иммуноанализ.
Способы, предлагаемые в настоящем изобретении, в которых применяют PENK и его фрагменты, прежде всего MRPENK, обладают очень большими преимуществами по сравнению с методами и биомаркерами, известными из существующего уровня техники, в отношении (а) диагностики или мониторинга почечной функции у индивидуума или (б) диагностики почечной дисфункции у индивидуума, или (в) прогнозирования или мониторинга риска возникновения нежелательных явлений у больного индивидуума, где указанное нежелательное явления выбирают из группы, включающей ухудшение почечной дисфункции, включая почечную недостаточность, потерю почечной функции и терминальную стадию почечной недостаточности или смерть вследствие почечной дисфункции, включая почечную недостаточность, потерю почечной функции и терминальную стадию почечной недостаточности, или (г) прогнозирования или мониторинга успеха терапии или вмешательства. Прежде всего, PENK и его фрагменты, применяемые в качестве биомаркера для указанных выше целей, представляют собой независимый от воспаления маркер. Это является важной особенностью, поскольку большинство из известных почечных биомаркеров типа NGAL и KIM зависят от воспаления, это означает, что, если у индивидуума имеется воспаление, например, сепсис, то повышение уровня NGAL или KIM может быть обусловлено либо воспалением, либо почечной функцией/дисфункцией. Таким образом, не представляется возможным осуществлять дифференциальную диагностику, по меньшей мере ее нельзя осуществлять с использованием простого отсекающего значения (т.е. единственного (1) отсекающего значения), которое не зависит от конкретной исследуемой популяции пациентов. При использовании NGAL и KIM все пациенты до единого характеризуются «индивидуальным» пороговым значением для почечной функции/дисфункции, зависящим от воспалительного статуса указанного пациента, что при некоторых заболеваниях затрудняет клиническое применение указанных почечных маркеров, а при других делает его невозможным. В отличие от этого, согласно способам, предлагаемым в настоящем изобретении, для всех индивидуумов можно применять одно единственное пороговое значение, которое не зависит от воспалительного статуса индивидуума. Это позволяет применять способы, предлагаемые в настоящем изобретении, в стандартной клинической практике в отличие от применения указанного выше маркера.
PENK и его фрагменты, применяемые в качестве биомаркера в способах, предлагаемых в настоящем изобретении, прежде всего MRPENK, характеризуют «реальную» почечную функцию в отличие от NGAL и KIM, которые характеризуют и почечное нарушение и воспаление.
Таким образом, объектом настоящего изобретения является способ (а) диагностики или мониторинга почечной функции у индивидуума или (б) диагностики почечной дисфункции у индивидуума, или (в) прогнозирования или мониторинга риска возникновения нежелательных явлений у больного индивидуума, где указанное нежелательное явление выбирают из группы, включающей ухудшение почечной дисфункции, включая почечную недостаточность, потерю почечной функции и терминальную стадию почечной недостаточности, или смерть вследствие почечной дисфункции, включая почечную недостаточность, потерю почечной функции и терминальную стадию почечной недостаточности, или (г) прогнозирования или мониторинга успеха терапии или вмешательства, отличающийся тем, что включает указанные выше стадии и отличительные признаки, в котором применяют независимое от воспалительного статуса пороговое значение.
Другим преимуществом описанных выше способов и применения PENK и его фрагментов в качестве биомаркера в способах а) диагностики или мониторинга почечной функции у индивидуума или (б) диагностики почечной дисфункции у индивидуума, или (в) прогнозирования или мониторинга риска возникновения нежелательных явлений у больного индивидуума, где указанное нежелательное явление выбирают из группы, включающей ухудшение почечной дисфункции, включая почечную недостаточность, потерю почечной функции и терминальную стадию почечной недостаточности, или смерть вследствие почечной дисфункции, включая почечную недостаточность, потерю почечной функции и терминальную стадию почечной недостаточности, или (г) прогнозирования или мониторинга успеха терапии или вмешательства является то, что PENK и его фрагменты, применяемые в качестве биомаркера, представляют собой очень ранний биомаркер почечной функции, почечной дисфункции, риска возникновения нежелательного явления, успеха терапии или вмешательства. Очень ранний означает, например, что маркер является более ранним, чем креатинин, более ранним, чем NGAL (липокалин, ассоциированный с нейтрофильной желатиноазой).
Одно из доказательств очевидного преимущества PENK по сравнению с креатинином может быть получено при анализе ассоциации соответствующих концентраций, обнаруженных у критически больных пациентов в день госпитализации, с их коэффициентом смертности в течение 7 дней: концентрации PENK у выживших и у невыживших значимо отличаются друг от друга, в то время как это не имеет место в случае клиренса креатинина. Смертность в такой популяции пациентов в основном определяется потерей почечной функции. Таким образом, значимая и намного более выраженная ассоциация PENK со смертностью по сравнению с креатинином является еще одним свидетельством преимущества PENK по сравнению с клиренсом креатинина в качестве маркера почечной дисфункции.
Объектом настоящего изобретения является также способ (а) диагностики или мониторинга почечной функции у индивидуума или (б) диагностики почечной дисфункции у индивидуума, или (в) прогнозирования или мониторинга риска возникновения нежелательных явлений у больного индивидуума, где указанное нежелательное явление выбирают из группы, включающей ухудшение почечной дисфункции, включая почечную недостаточность, потерю почечной функции и терминальную стадию почечной недостаточности, или смерть вследствие почечной дисфункции, включая почечную недостаточность, потерю почечной функции и терминальную стадию почечной недостаточности, или (г) прогнозирования или мониторинга успеха терапии или вмешательства с целью поддержания или замещения почечной функции, включая различные методы заместительной почечной терапии, в том числе (но, не ограничиваясь только ими) гемодиализ, перитонеальный диализ, гемофильтрацию и почечную трансплантацию, согласно любому из предыдущих вариантов осуществления изобретения, в котором применяют уровень проэнкефалина или его фрагментов, состоящих по меньшей мере из 5 аминокислот, в общей воде организма, взятой у указанного индивидуума, либо индивидуально, либо в сочетании с другими пригодными для прогнозирования лабораторными или клиническими параметрами, где применение можно выбирать из следующих альтернатив:
- сравнение медианы уровня проэнкефалина или его фрагментов, состоящих по меньшей мере из 5 аминокислот, в общей воде организма, взятой у указанного индивидуума, и предварительно определенного уровня в совокупности образцов, взятых из популяции «здоровых» или «по-видимому, здоровых» индивидуумов,
- сравнение квантиля уровня проэнкефалина или его фрагментов, состоящих по меньшей мере из 5 аминокислот, в общей воде организма, взятой у указанного индивидуума, и предварительно определенного уровня в совокупности образцов, взятых из популяции «здоровых» или «по-видимому, здоровых» индивидуумов,
N
R
I
I
D
I
- расчет на основе анализа пропорциональных рисков Кокса или расчетов коэффициентов риска, таких как NRI (чистый коэффициент переклассификации, et eclassification ndex) или IDI (интегральный индекс дискриминации, ntegrated iscrimination ndex).
A
P
C
H
E
Указанный дополнительный по меньшей мере один клинический параметр, который можно определять, выбирают из группы, включающей: возраст, NGAL, цистатин С, клиренс креатинина, креатинин, мочевину и балл по шкале Apache (cute hysiology and hronic ealth valuation, шкала оценки острых физиологических расстройств и хронических нарушений).
В одном из вариантов осуществления изобретения указанный способ осуществляют более одного раза для того, чтобы осуществлять мониторинг функции или дисфункции, или риска у указанного индивидуума, или для того, чтобы осуществлять мониторинг в процессе лечения почек и/или заболевания. В одном из конкретных вариантов осуществления изобретения указанный мониторинг осуществляют для того, чтобы оценивать ответ указанного индивидуума на предпринятые профилактические и/или терапевтические меры.
В одном из вариантов осуществления изобретения способ применяют для стратификации указанных индивидуумов на группы риска.
Кроме того, объектом изобретения является анализ, предназначенный для определения проэнкефалина и фрагментов проэнкефалина в образце, в котором применяют две связывающие молекулы, которые связываются с двумя различными областями в области проэнкефалина, содержащими аминокислоты 133-140 (LKELLETG, SEQ ID NO: 13) и аминокислоты 152-159 (SDNEEEVS, SEQ ID NO: 14), где каждая из указанных областей содержит по меньшей мере 4 или 5 аминокислоты.
В одном из вариантов предлагаемого в настоящем изобретении анализа, предназначенного для определения проэнкефалина или фрагментов проэнкефалина в образце, чувствительность указанного анализа позволяет проводить количественную оценку проэнкефалина или фрагментов проэнкефалина у здоровых индивидуумов, и она составляет < 15 пмолей/л, предпочтительно <10 пмолей/л и более предпочтительно < 6 пмолей/л.
7
-1
8
-1
9
-1
10
-1
В одном из вариантов предлагаемого в настоящем изобретении анализа, предназначенного для определения проэнкефалина или фрагментов проэнкефалина в образце, указанная связывающая молекула характеризуется константой аффинности к проэнкефалину, составляющей по меньшей мере 10 М, предпочтительно 10 М, предпочтительно константа аффинности составляет менее чем 10 М, наиболее предпочтительно менее чем 10 M. Специалисту в данной области известно, что для компенсации пониженной аффинности можно рассматривать применение соединений в более высокой дозе, и этот подход не выходит за рамки объема изобретения.
p
o
c
В одном из вариантов осуществления изобретения анализ может представлять собой, так называемый РОС-тест (анализ по месту лечения, oint-f-are), представляющий собой технологию тестирования, позволяющую осуществлять тест в течение менее чем 1 ч в непосредственной близости от пациента без необходимости использования полностью автоматической системы анализа. Одним из примеров такой технологии является технология иммунохроматографического теста.
В одном из вариантов осуществления изобретения такой анализ представляет собой сэндвич-иммуноанализ, который осуществляют с применением любой технологии обнаружения, включая (но, не ограничиваясь только ими) использование ферментной метки, хемилюминисцентной метки, электрохемилюминисцентной метки, предпочтительно полностью автоматический анализ. В одном из вариантов осуществления изобретения такой анализ представляет собой сэндвич-анализ с использованием ферментной метки. Примерами автоматических или полностью автоматических анализов являются анализы, которые можно применять с использованием одной из следующих систем: Roche Elecsys, Abbott Architect, Siemens Centauer, Brahms Kryptor, Biomerieux Vidas, Alere Triage.
Известен целый ряд иммуноанализов, и их можно применять при осуществлении анализов и способов, предлагаемых в настоящем изобретении, они включают: радиоиммуноанализы («РИА»), гомогенные ферментативно усиленные иммуноанализы («EMIT»), твердофазный иммуноферментный анализ («ELISA»), иммуноанализ на основе реактивации апофермента («ARIS»), иммуноанализы с использованием тест-полосок (dipstick) и иммунохроматографические анализы.
В одном из вариантов осуществления изобретения осуществляют мечение по меньшей мере одной из указанных двух связующих молекул с целью обнаружения. Предпочтительные методы обнаружения включают иммуноанализы в различных форматах, такие, например, как радиоиммуноанализ («РИА»), хемилюминисцентный и флуоресцентный иммуноанализы, твердофазные иммуноферментные анализы («ELISA»), анализы с использованием массивов гранул на основе люминекса, анализы с использованием белковых микромассивов и быстрые форматы тестирования, такие, например, как тесты с использованием иммунохроматографических полосок.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанную метку выбирают из группы, включающей хемилюминисцентную метку, ферментную метку, флуоресцентную метку, метку, представляющую собой радиоактивный йод.
Анализы могут представлять собой гомогенные или гетерогенные анализы, конкурентные и неконкурентные анализы. В одном из вариантов осуществления изобретения анализ проводят в формате сэндвич-анализа, который представляет собой неконкурентный иммуноанализ, в котором подлежащая обнаружению и/или количественной оценке молекула связывается с первым антителом и вторым антителом. Первое антитело может быть связано с твердой фазой, например, гранулой, поверхностью лунки или другого контейнера, чипа или полоски, а второе антитело представляет собой антитело, которое метят, например, красителем, радиоизотопом или реакционноспособным или обладающим каталитической активностью фрагментом. Затем с помощью пригодного метода измеряют количество меченого антитела, связанного с аналитом. Обычные композиции и процедуры, применяемые в таких «сэндвич-анализах», хорошо разработаны и известны специалисту в данной области (23).
В другом варианте осуществления изобретения в анализе используют две захватывающие молекулы, предпочтительно антитела, которые обе присутствуют в виде дисперсий в жидкой реакционной смеси, где первый служащий для мечения компонент присоединен к первой захватывающей молекуле, при этом указанный первый служащий для мечения компонент представляет собой часть системы мечения на основе гашения или амплификации флуоресценции или люминисценции, а второй служащий для мечения компонент указанной маркерной системы присоединен ко второй захватывающей молекуле, благодаря чему при связывании обеих захватывающих молекул с аналитом генерируется измеряемый сигнал, который позволяет обнаруживать образовавшиеся сэндвич-комлексы в растворе, содержащем образец.
В другом варианте осуществления изобретения указанная система мечения содержит криптаты редкоземельного металла или хелаты редкоземельного металла в комбинации с флуоресцентным красителем или хемилюминисцентным красителем, прежде всего красителем цианинового типа.
В контексте настоящего изобретения анализ на основе флуоресценции включает применение красителей, которые можно выбирать, например, из группы, включающей FAM (5- или 6-карбоксифлуоресцеин), VIC, NED, флуоресцеин, флуоресцеинизотиоцианат (ФИТЦ), IRD-700/800, цианиновые красители, такие как CY3, CY5, CY3.5, CY5.5, Су7, ксантен 6-карбокси-2',4',7',4',7'-гексахлорфлуоресцеин (HEX), ТЕТ, 6-карбокси-4',5'-дихлор-2',7'-диметодифлуоресцеин (JOE), N,N,N',N'-тетраметил-6-карбоксиродамин (TAMRA), 6-карбокси-Х-родамин (ROX), 5-карбоксиродамин-6G (R6G5), 6-карбоксиродамин-6G (RG6), родамин, родамин зеленый, родамин красный, родамин 110, красители BODIPY, такие как BODIPY TMR, Oregon Green, кумарины, такие как умбеллиферон, бензимиды, такие как Hoechst 33258; фенантридины, такие как Texas Red, Yakima Yellow, Alexa Fluor, PET, этидийбромид, акридиниевые красители, карбазольные красители, феноксазиновые красители, порфириновые красители, полиметиновые красители и т.п.
В контексте настоящего изобретения анализ на основе хемилюминисценции включают применение красителей на основе физических принципов, описанных для хемилюминисцентных материалов, которые изложены в (24). Предпочтительными хемилюминисцентными красителями являются сложные эфиры акридиния.
8
-1
Как указано в настоящем описании, «анализ» или «диагностический анализ» может представлять собой анализ любого типа, который можно применять в области диагностики. Такой анализ может быть основан на связывании подлежащего обнаружению аналита с одним или несколькими захватывающими зондами, обладающими определенной аффинностью. С точки зрения взаимодействия между захватывающими молекулами и молекулами-мишенями или представляющими интерес молекулами константа аффинности предпочтительно должна превышать 10 М.
В контексте настоящего изобретения «связывающие молекулы» представляют собой молекулы, которые можно применять для связывания с молекулами-мишенями или представляющими интерес молекулами, т.е. аналитами (т.е. в контексте настоящего изобретения с PENK и его фрагментами), присутствующими в образце. Таким образом, связывающие молекулы должны иметь адекватную форму, как с пространственной точки зрения, так и с позиций характеристик поверхности, таких как поверхностный заряд, гидрофобность, гидрофильность, наличие или отсутствие доноров и/или акцепторов Льюиса, для того, чтобы специфически связываться с молекулами-мишенями или представляющими интерес молекулами. При этом связывание может опосредоваться, например, ионными, ван-дер-Ваальсовыми, pi-pi, sigma-pi, гидрофобными взаимодействиями или водородными связями, или комбинацией двух или большего количества указанных выше взаимодействий между захватывающими молекулами и молекулами-мишенями или представляющими интерес молекулами. В контексте настоящего изобретения связывающие молекулы можно выбирать, например, из группы, включающей молекулу нуклеиновой кислоты, молекулу углевода, молекулу ПНК, белок, антитело, пептид или гликопротеин. Предпочтительно связывающие молекулы представляют собой антитела, включая их фрагменты, обладающие достаточной аффинностью в отношении мишени или представляющей интерес молекулы, и включая рекомбинантные антитела или фрагменты рекомбинантных антител, а также химически и/или биохимически модифицированные производные указанных антител или фрагментов, выведенных из вариабельной цепи, которые имеют длину по меньшей мере 12 аминокислот.
В качестве хемилюминисцентной метки можно применять метку, представляющую собой сложный эфир акридиния, стероидные метки включают изолюминольные метки и т.п.
Ферментные метки могут представлять собой лактатдегидрогеназу (LDH), креатинкиназу (CP), щелочную фосфатазу, аспартатаминотрансферазу (AST), аланинаминотрансферазу (ALT), кислую фосфатазу, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу и т.п.
В одном из вариантов осуществления изобретения по меньшей мере одна из указанных двух связывающих молекул связывается с твердой фазой, такой как магнитные частицы и полистироловые поверхности.
В одном из вариантов анализов для определения согласно настоящему изобретению проэнкефалина или фрагментов проэнкефалина в образце такой анализ представляет собой сэндвич-анализ, предпочтительно полностью автоматический анализ. Он может представлять собой полностью автоматический или выполняемый вручную ELISA. Он может представлять собой так называемый РОС-тест (анализ по месту). Примерами автоматических или полностью автоматических анализов являются анализы, которые можно применять с использованием одной из следующих систем: Roche Elecsys, Abbott Architect, Siemens Centauer, Brahms Kryptor, Biomerieux Vidas, Alere Triage. Примеры форматов тестов представлены выше.
В одном из вариантов анализов для определения согласно настоящему изобретению проэнкефалина или фрагментов проэнкефалина в образце по меньшей мере одну из указанных двух связывающих молекул метят для целей обнаружения. Примеры меток представлены выше.
В одном из вариантов анализов для определения согласно настоящему изобретению проэнкефалина или фрагментов проэнкефалина в образце по меньшей мере одну из указанных двух связывающих молекул связывают с твердой фазой. Примеры твердых фаз представлены выше.
В одном из вариантов анализов для определения согласно настоящему изобретению проэнкефалина или фрагментов проэнкефалина в образце указанную метку выбирают из группы, включающей хемилюминисцентную метку, ферментную метку, флуоресцентную метку, метку, представляющую собой радиоактивный йод. Другим объектом настоящего изобретение является набор, содержащий систему анализа, предлагаемого в настоящем изобретении, где компоненты указанной системы анализа могут содержаться в одном или нескольких контейнерах.
В одном из вариантов осуществления изобретения объект изобретения представляет собой устройство для проведения анализа по месту нахождения индивидуума согласно способу, предлагаемому в изобретении, где указанное устройство для проведения анализа по месту нахождения индивидуума содержит по меньшей мере одно антитело или фрагмент антитела, мишенью которого являются либо аминокислоты 133-140 (LKELLETG, SEQ ID NO: 13), либо аминокислоты 152-159 (SDNEEEVS, SEQ ID NO: 14), где каждая из указанных областей содержит по меньшей мере 4 или 5 аминокислот.
В одном из вариантов осуществления изобретения объект изобретения представляет собой устройство для проведения анализа по месту нахождения индивидуума согласно способу, предлагаемому в изобретении, где указанное устройство для проведения анализа по месту нахождения индивидуума содержит по меньшей мере два антитела или фрагмента антитела, мишенью которых являются аминокислоты 133-140 (LKELLETG, SEQ ID NO: 13) и аминокислоты 152-159 (SDNEEEVS, SEQ ID NO: 14), где каждая из указанных областей содержит по меньшей мере 4 или 5 аминокислот.
В одном из вариантов осуществления изобретения объект изобретения представляет собой набор для осуществления способа, предлагаемого в изобретении, где указанное устройство для проведения анализа по месту нахождения индивидуума содержит по меньшей мере одно антитело или фрагмент антитела, мишенью которого являются либо аминокислоты 133-140 (LKELLETG, SEQ ID NO: 13), либо аминокислоты 152-159 (SDNEEEVS, SEQ ID NO: 14), где каждая из указанных областей содержит по меньшей мере 4 или 5 аминокислот.
В одном из вариантов осуществления изобретения объект изобретения представляет собой набор для осуществления способа, предлагаемого в изобретении, где указанное устройство для проведения анализа по месту нахождения индивидуума содержит по меньшей мере два антитела или фрагмента антитела, мишенью которых являются аминокислоты 133-140 (LKELLETG, SEQ ID NO: 13) и аминокислоты 152-159 (SDNEEEVS, SEQ ID NO: 14), где каждая из указанных областей содержит по меньшей мере 4 или 5 аминокислот.
Примеры
Пример 1
Создание антител
Пептиды
Пептиды синтезировали на фирме JPT Technologies, Берлин, Германия.
Пептиды/конъюгаты для иммунизации:
Пептиды, предназначенные для иммунизации, синтезировали (фирма JPT Technologies, Берлин, Германия) с включением дополнительного N-концевого остатка цистеина для конъюгации пептидов с бычьим сывороточным альбумином (БСА). Пептиды ковалентно сшивали с БСА с использованием сульфо-SMCC (фирма Perbio-science, Бонн, Германия). Процедуру сочетания осуществляли согласно руководству фирмы Perbio.
Антитела создавали согласно следующему методу:
Мышь линии BALB/c иммунизировали путем введения 100 мкг конъюгата пептид-БСА в дни 0 и 14 (эмульгированного в 100 мкл полного адъюванта 20 Фрейнда) и 50 мкг в дни 21 и 28 (в 100 мкл неполного адъюванта Фрейнда). За три дня до осуществления эксперимента по слиянию животному вводили 50 мкг конъюгата, растворенного в 100 мкг физиологического раствора, путем одной внутрибрюшинной и одной внутривенной инъекции.
Осуществляли слияние спленоцитов иммунизированной мыши с клетками
25 миеломы линии SP2/0 с использованием 1 мкл 50% полиэтиленгликоля в течение 30 с при 37°С. После отмывки клетки высевали в 96-луночные планшеты для клеточных культур. Гибридные клоны отбирали путем выращивания в среде ГАТ (питательная среда RPMI 1640, дополненная 20% сыворотки плода коровы и ГАТ-добавкой (гипоксантин, аминоптерин, тимидин)). Через две недели среду ГАТ заменяли средой ГТ и после осуществления трех пересевов возвращались к стандартной среде для клеточных культур.
Через три недели после осуществления слияния проводили первичный скрининг супернатантов клеточной культуры в отношении антигенспецифических антител IgG-типа. Позитивные по данным теста микрокультуры переносили в 24-луночные планшеты для размножения. После повторного тестирования осуществляли клонирование и повторное клонирование отобранных культур с применением метода серийных разведений и определяли изотипы (Lane R.D. «А short-duration polyethylene glycol fusiontechnique for increasing production of monoclonal antibody-secreting hybridomas», J. Immunol. Meth. 81, 1985, cc. 223-228; Ziegler В. и др., «Glutamate decarboxylase (GAD) is not detectable on the surface of rat islet cells examined by cytofluorometry and complement-dependent antibody-mediated cytotoxicity of monoclonal GAD antibodies», Horm. Metab. Res. 28, 1996, cc. 11-15).
Получение моноклональных антител
Антитела получали согласно стандартным методам получения антител (Marx и др., Monoclonal Antibody Production, ATLA 25, 1997, с. 121) и очищали с помощью хроматографии на белке А. Чистота антител составляла > 95% по данным электрофоретического анализа на геле в присутствии ДСН.
Мечение антител и их применение для сенсибилизации
Все антитела метили с использованием сложного эфира акридиния согласно следующей процедуре.
Меченое соединение (метка): 100 мкг (100 мкл) антитела (1 мг/мл в ЗФР, рН 7,4), смешивали с 10 мкл сложного NHS-эфира акридиния (1 мг/мл в ацетонитриле, фирма InVent GmbH, Германия) (ЕР 0353971) и инкубировали в течение 20 мин при комнатной температуре. Меченое антитело очищали методом ЖХВР с помощью гель-фильтрации на Bio-Sil SEC 400-5 (фирма Bio-Rad Laboratories, Inc., США). Очищенное меченое антитело разводили в 300 ммолей/л фосфата калия, 100 ммолей/л NaCl, 10 ммолей/л Na-ЭДТК, 5 г/л бычьего сывороточного альбумина, рН 7,0. Конечная концентрация меченого соединения соответствовала примерно 800000 относительным световым единицам (RLU) (примерно 20 нг меченого антитела) на 200 мкл. Хемилюминисценцию сложного эфира акридиния измеряли с помощью устройства AutoLumat LB 953 (фирма Berthold Technologies GmbH & Co. KG).
Антитело на твердой фазе (применяемое для сенсибилизации антитело):
Твердая фаза: Полистироловые пробирки (фирма Greiner Bio-One International AG, Австрия) сенсибилизировали (в течение 18 ч при комнатной температуре) антителом (1,5 мкг антитела на 0,3 мл буфера, содержащего 100 ммолей/л NaCl, 50 ммолей/л Трис/HCl, рН 7,8). После блокирования с помощью 5% бычьего сывороточного альбумина, пробирки промывали ЗФР, рН 7,4 и сушили в вакууме.
Специфичность антитела
Перекрестные реактивности антител определяли следующим образом: вносили с помощью пипетки по 1 мкг пептида в 300 мкл ЗФР, рН 7,4 в полистироловые пробирки и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. После инкубации пробирки 5-кратно промывали (используя каждый раз по 1 мл) 5% БСА в ЗФР, рН 7,4. Добавляли каждое из меченых антител (300 мкл в ЗФР, рН 7,4, 800000 RLU/300 мкл) и инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре. После 5-кратной промывки (используя каждый раз по 1 мл промывочного раствора (20 ммолей/л ЗФР, рН 7,4, 0,1% Тритон X 100)), количественно оценивали оставшуюся люминисценцию (от меченого антитела) с помощью люминометра AutoLumat Luminumeter 953. MRPENK-пептид применяли в качестве референс-молекулы (100%).
Величины перекрестной реактивности представлены в таблице 3.
Связывание всех антител с пептидом MRPENK было сопоставимо со связыванием пептидов, которые применяли для иммунизации. За исключением антитела NT-MRPENK (10%-ная перекрестная реактивность с EEDDSLANSSDLLK), ни одно из антител не обладало перекрестной реактивностью с MR-PENK-фрагментами, которые не применяли для иммунизации индивидуальным антителом.
Иммуноанализ проэнкефалина:
С помощью пипетки вносили по 50 мкл образца (или калибратора) в сенсибилизированные пробирки, после добавления меченого антитела (200 мкл) пробирки инкубировали в течение 2 ч при 18-25°С. Несвязанную метку удаляли путем 5-кратной промывки (используя каждый раз по 1 мл) промывочным раствором (20 ммолей/л ЗФР, рН 7,4, 0,1% Тритон Х-100). Связанное с пробиркой меченое антитело оценивали с использованием люминометра 953. Применяли MRPENK в фиксированной концентрации 1000 пмолей/л. Величины отношения сигнала (RLU при 1000 пмолей MRPENK/1) к шуму (RLU без MRPENK) для различных комбинаций антител представлены в таблице 4. Все антитела были способны образовывать сэндвич-комплекс с любым другим антителом. Неожиданно было установлено, что наиболее высокое отношение сигнала к шуму (наиболее высокая чувствительность) достигалось при объединении антитела MR-MRPENK и антитела CT-MRPENK. Поэтому при создании изобретения в дальнейших исследованиях применяли указанную комбинацию антител для осуществления MRPENK-иммуноанализа. Антител MR-MRPENK применяли в качестве сенсибилизирующего пробирку антитела, а антитело CT-MRPENK применяли в качестве меченого антитела.
Калибровка:
2
4
При проведении анализа калибровку осуществляли с использованием разведений синтетического MRPENK, разведенного в растворе, содержащем 20 мМ KPO, 6 мМ ЭДТК, 0,5% БСА, 50 мкМ амастин, 100 мкМ леупептин, рН 8,0. Содержащую проэнкефалин контрольную плазму получали от фирмы ICI-diagnostics, Берлин, Германия.
На фиг. 1 представлена типичная кривая зависимости сигнала от дозы проэнкефалина.
Чувствительность анализа составляла 5,5 пмолей/л для 20 определений 0-калибратора (без добавления MRPENK) + 2SD).
Клиренс креатинина
Клиренс креатинина определяли с использованием формулы MDRD (Modification of Diet in Renal Disease), модификация диеты при заболеваниях почек) (см. Levey и др., 2009).
Пример 2: Уровень PENK у здоровых индивидуумов
С помощью MRPENK-анализа проводили измерения уровня MRPENK у здоровых индивидуумов (n=4211, средний возраст 56 лет). Средняя величина составляла 44,7 пмолей MRPENK/л, наименьшая величина составляла 9 пмолей/л, а величина 99-ого процентиля составляла 80 пмолей/л. Поскольку чувствительность анализа составляла 5,5 пмолей/л, то с помощью описанного MRPENK-анализа удалось выявить MRPENK у 100% всех здоровых индивидуумов (см. фиг. 2).
Уровень проэнкефалина коррелировал с клиренсом креатинина у здоровых индивидуумов с нормальной почечной функцией.
Неожиданно было установлено, что проэнкефалин находился в отрицательной корреляции с клиренсом креатинина у здоровых индивидуумов (r=-0,33, р<0,0001), см. фиг. 3. Величина коэффициента корреляции была немного большей у мужчин, чем у женщин (r=-0,34 по сравнению с -0,29, для обеих величин р<0,0001). Эти данные свидетельствуют о наличии выраженной ассоциации между PENK и почечной функцией.
На фиг. 3 продемонстрирована корреляция клиренса креатинина с PENK у здоровых индивидуумов. По оси Y: квартили клиренса креатинина, по оси х: квартили PENK.
Пример 3: Корреляция между PENK и почечной функцией (клиренс креатинина) у пациентов с хроническими и острыми заболеваниями
Во всех случаях была выявлена значимая корреляция PENK с клиренсом креатинина, при острых заболеваниях корреляция была более сильной, чем при хронических заболеваниях или у здоровых индивидуумов.
Пример 4: PENK у критически больных индивидуумов
Для исследования характеристик PENK в качестве диагностического средства при диагностировании почечной недостаточности в случаях острой клинической ситуации при создании изобретения было проведено следующее клиническое исследование:
Клиническое исследование
Поступивших в отделение неотложной помощи (ED, emergency department) пациентов (101 пациент), состояние которых удовлетворяло определению сепсиса (Crit Care Med.; 36(1), январь 2008, cc. 296-327), были затем госпитализированы (средний срок госпитализации 5 дней) и их подвергали стандартному уходу и лечению. Брали образец ЭДТК-плазмы в день 1 (при поступлении в ED) и по одному образцу каждый день в период нахождения в госпитале. Промежуток времени до замораживания образцов для дальнейших измерений аналита составлял менее 4 ч.
Характеристики пациентов обобщены в таблице 6:
26,7% всех пациентов умерли в период нахождения в госпитале и их рассматривали как не давших ответа на лечение (не респондеры), 73,3% всех пациентов выжили после сепсиса и их рассматривали как давших ответ на лечение (респондеры).
У 53% всех пациентов с сепсисом был выявлен аномальный уровень PENK > 80 пмолей/л (99 процентиль), это свидетельствовало о том, что PENK не являлся маркером инфекции.
Результаты клинического исследования
Обнаружена выраженная корреляция PENK с клиренсом креатинина (r=-0,74, р<0,0001, фиг. 4).
PENK позволяет диагностировать почечную дисфункцию:
r
i
f
l
e
Наличие почечной дисфункции определяли на основе критериев RIFLE (Venkatamaran и Kellum, 2007). Считалось, что у пациентов имеется почечная дисфункция, если выполняется любой из критериев по классификации RIFLE. В исследуемой группе оценка соответствия критериям RIFLE была проведена для 90 индивидуумов в день 1 (день поступления в ED), установлено, что 39 пациентов удовлетворяли классификации RIFLE (т.е. имели риск почечного заболевания, почечного повреждения, почечной недостаточности, потери почечной функции или терминальной стадии почечной недостаточности (isk of kidney disease, kidney njury, kidney ailure, oss of kidney function or nd-stage kidney disease)) и 51 пациент не имел почечной дисфункции. Повышенный уровень PENK значимо (р=<0,0001) коррелировал с почечной дисфункцией (AUC: 0,868) (фиг. 5 и фиг. 6).
Для сравнения диагностического потенциала в отношении почечной дисфункции при создании изобретения в качестве референс-маркера применяли NGAL (Soni и др., 2010). Уровень NGAL измеряли с помощью поступающего в продажу набора для ELISA (набор NGAL Elisa, фирма Bioporto, Гентофте, Дания). Уровень NGAL, подобно уровню PENK, значимо возрастал у пациентов с почечной дисфункцией (р<0,0001), величина AUC, применяемая для диагностики почечной дисфункции, составляла 0,809 (фиг. 7 и фиг. 8).
2
Сравнение PENK и NGAL продемонстрировало выраженное преимущество PENK над NGAL в отношении диагностики почечной дисфункции: величина χ для PENK составляла 45,32 по сравнению с 32,21 для NGAL, что свидетельствует о 40%-ном улучшении качества диагностики (специфичности и чувствительности) при применении PENK (таблица 7).
Исходный уровень PENK обладает высоким прогностическим потенциалом
При создании изобретения проводили оценку корреляции исходного уровня PENK со смертностью в период нахождения в госпитале и сравнивали PENK с APACHE 2-баллами, применяемыми для оценки сепсиса (см. Knaus и др., 1985, 2001), и клиренсом кретинина. PENK обладал высоким прогностическим потенциалом в отношении исхода сепсиса (см. фиг. 9) и был сопоставим по эффективности с балльной оценкой по шкале APACHE 2 (индексы AUC/C составляли 0,744 (PENK) и 0,783 (Apache). Информативность значимо повышалась при объединении PENK и APACHE 2 (объединенная величина AUC: 0,794, фиг. 10). PENK обладал существенно более высоким прогностическим потенциалом по сравнению с клиренсом креатинина (AUC 0,638). При создании изобретения неожиданно было установлено, что прогностический потенциал PENK повышался после первого дня лечения в отделении интенсивной терапии (ICU) (AUC 0,79).
Анализ на основе отсекающего значения (cut Off-анализ) для прогнозирования наступления смерти в период нахождения в госпитале при использовании полученного на исходном уровне образца и 1 образца, полученного через 1 день после начала лечения в ICU.
Поскольку прогностический потенциал PENK еще более повышался через один день после начала лечения в ICU, при создании изобретения проводили анализ PENK с использованием серий измерений за день до лечения в ICU и через 1 день после начала лечения в ICU. Для демонстрации клинического потенциала применяли cut off-анализ с использованием отсекающего значения 100 пмолей/л.
Если у пациентов уровень PENK был ниже отсекающего значения в момент поступления на госпитализацию и оставался ниже отсекающего значения после начала лечения в ICU, то смертность составляла 11% (успешное лечение до и в течение периода госпитализации). Если уровень PENK был выше отсекающего значения в оба момента времени, то смертность была примерно в 5 раз выше (52,5%) (пациенты не давали ответа на лечение), а если пациенты поступали с уровнями PENK выше 100 пмолей/л и их уровни PENK снижались до менее чем 100 пмолей/л в процессе лечения в ICU, то смертность была равна 0 (пациенты давали ответ на лечение). Эти данные свидетельствуют о наличии выраженной ассоциации между уровнем PENK и успехом лечения и подтверждают целесообразность его применения для терапии в течение последующего периода времени (серийное тестирование).
На фиг. 11а-г представлены в качестве примеров результаты измерений, полученные на пациентах в течение последующего периода лечения.
а) Пациент (выживший), у которого начальный уровень PENK составлял < 100 пмолей/л и оставался < 100 пмолей/л в течение пребывания в госпитале.
б) Пациент (умер в период пребывания в госпитале), у которого начальный уровень PENK составлял > 100 пмолей/л и не снижался до уровня < 100 пмолей/л.
в) Пациент (умер в период пребывания в госпитале), у которого начальный уровень PENK составлял > 100 пмолей/л и не снижался до уровня < 100 пмолей/л.
г) Пациент (выживший), у которого начальный уровень PENK составлял > 100 пмолей/л и снижался до уровня < 100 пмолей/л через 1 день после начала лечения в ICU.
Пример 5: Применение серийных измерений PENK
У пациентов из популяции, описанной в примере 4 (пациенты с сепсисом, серьезным сепсисом или септическим шоком) проводили измерение уровней PENK в плазме в день госпитализации и на следующий день (день 1). С использованием одного порогового значения, равного 100 пмолей/л, которое было близко к 99-му процентилю нормального диапазона, популяцию разделяли на две группы (с уровнями выше и ниже 100 пмолей/л), соответствующие коэффициенты выживаемости в течение 7 дневного периода представлены на графиках Каплана-Мейера (фиг. 16а) и 16б)). У пациентов с концентрацией PENK ниже 100 пмолей/л в день поступления, у которых концентрация PENK оставалась ниже 100 пмолей/л в день 1, коэффициент выживаемости был высоким и составлял 87%, в то время как у пациентов, у которых концентрация PENK возрастала в день 1 до уровня выше 100 пмолей/л, коэффициент выживаемости снижался до 67%. В отличие от этого, у пациентов с концентрацией PENK выше 100 пмолей/л в день поступления, у которых концентрация PENK оставалась выше 100 пмолей/л в день 1, коэффициент выживаемости был низким и составлял лишь 50%, в то время как у пациентов, у которых концентрация PENK в день 1 снижалась до уровня ниже 100 пмолей/л, коэффициент выживаемости составлял 100%.
Пример 6
С использованием концентраций PENK в плазме, которые были определены в день поступления у пациентов из популяции, описанной в примере 4 (пациенты с сепсисом, серьезным сепсисом или септическим шоком), был проведен многовариантный линейный регрессионный анализ для определения параметров/переменных, от которых зависят концентрации PENK. На фиг. 17 представлены частичные коэффициенты R2. Результаты анализа продемонстрировали, что параметры почечной функции (в данном случае в виде клиренса креатинина) безусловно являются наиболее сильными детерминантами концентраций PENK.
Уровни PENK у мужчин
При использовании PENK в качестве прогностического маркера уровень PENK, определенный в первый день (при поступлении в ED) оказался еще более эффективным в отношении прогнозирования смерти в период нахождения в госпитале для мужской популяции (AUC 0,849, фиг. 12), комбинация PENK и Apache давала величину AUC, составлявшую 0,89, по сравнению с 0,837 при использовании только Apache (фиг. 13). Комбинация PENK и клиренса креатинина обладала наиболее высоким прогностическим потенциалом, в этом случае величина AUC составляла 0,91 по сравнению с 0,721 при использовании только клиренса креатинина (фиг. 14). Как и для всей популяции пациентов, и в этом случае прогностический потенциал PENK был выше после первого дня лечения в ICU (день 2, AUC 0,872).
Описание чертежей
На чертежах показано:
на фиг. 1 - типичная кривая зависимости сигнала от дозы проэнкефалина. Стандартная кривая для проэнкефалина;
на фиг. 2 - распределение частоты встречаемости (концентрации) проэнкефалина в популяции здоровых людей (n=4211). Среднее значение концентрации PENK составляло 44,7 пмолей/л, стандартное отклонение 1,27, 99-й процентиль (верхний предел нормального диапазона) составлял 80 пмолей PENK/л; на фиг. 2 представлены величины ln PENK;
на фиг. 3 - корреляция клиренса креатинина с PENK в здоровых индивидуумов. Ось Y: квартили клиренса креатинина, ось X: квартили PENK;
на фиг. 4 - результаты, демонстрирующие высокую корреляцию уровня PENK с клиренсом креатинина (r=-0,74, р < 0,0001);
на фиг. 5 - результаты, демонстрирующие значимую корреляцию повышенного уровня PENK с почечной дисфункцией;
r
o
c
на фиг. 6 - кривая операционной характеристики приемника (eceiver/perator urve, ROC) для проэнкефалина и диагноза почечной дисфункции согласно критериям RIFLE (см. выше). Площадь под кривой (AUC) составляла 0,868, что свидетельствует о большом диагностическом потенциале проэнкефалина в отношении почечной дисфункции;
∧
на фиг. 7 - результаты, демонстрирующие, что повышенный уровень NGAL является значимо более высоким у пациентов с почечной дисфункцией. Нормальные диапазоны NGAL (диапазон 0,037-0,106 мкг/мл; http://www.bioporto.com/products/bioporto_di agnostics/ngal_elisa kits/ngal_rapid_eIisa kit се ivd) показан на графике затененной областью;
на фиг. 8 - кривая операционной характеристики приемника (ROC) для NGAL и диагноза почечной дисфункции согласно критериям RIFLE (см. выше). При создании изобретения NGAL применяли в качестве референс-маркера почечной дисфункции. Величина AUC составляла 0,809, т.е. существенно меньше, чем для проэнкефалина (AUC 0,868, фиг. 6), это свидетельствует о более высоком потенциале проэнкефалина;
на фиг. 9 - результаты, демонстрирующие высокий прогностический потенциал PENK в отношении исхода сепсиса;
на фиг. 10 - данные, свидетельствующие о повышении информативности при объединении PENK и APACHE 2;
на фиг. 11а) - результаты, полученные для пациента (выжившего), у которого исходный уровень PENK < 100 пмолей/л и сохранялся на уровне < 100 пмолей/л в течение периода пребывания в госпитале;
на фиг. 11б) - результаты, полученные для пациента (умершего в течение периода пребывания в госпитале), у которого исходный уровень PENK > 100 пмолей/л и не снижался до уровня < 100 пмолей/л;
на фиг. 11в) - результаты, полученные для пациента (умершего в течение периода пребывания в госпитале), у которого исходный уровень PENK > 100 пмолей/л и не снижался до уровня < 100 пмолей/л;
на фиг. 11г) - результаты, полученные для пациента (выжившего), у которого исходный уровень PENK > 100 пмолей/л и уровень PENK снижался до < 100 пмолей/л в течение одного дня после начала лечения в ICU;
на фиг. 12 - данные, свидетельствующие о том, что прогностический потенциал уровней PENK, определенных в первый день (при поступлении в ED), в отношении прогнозирования наступления смерти в период пребывания в госпитале являлся еще более сильным для мужской популяции;
на фиг. 13 - данные, свидетельствующие о том, что путем объединения PENK и Apache достигалась величина AUC, составлявшая 0,89, по сравнению с 0,837 при использовании только Apache;
на фиг. 14 - данные, свидетельствующие о том, что комбинация PENK и клиренса креатинина обладает более высоким прогностическим потенциалом (AUC 0,91) по сравнению с клиренсом креатинина (0,721) при индивидуальном применении этого маркера;
на фиг. 15 - на фиг. 15А и фиг. 15Б представлены концентрации в плазме PENK (А) и NGAL (Б) соответственно, измеренные у пациентов с сепсисом, разделенных на категории по степени острой почечной дисфункции. 0 обозначает отсутствие почечной дисфункции; R обозначает риск; I обозначает повреждение; F обозначает недостаточность; L обозначает потерю. Категории определяли следующим образом
∧
(http://en.wikipedia.org/wiki/Acute_kidney_injury): риск: снижение GFR > 25%, повышение уровня сывороточного креатинина в 1,5 раза или производство мочи < 0,5 мл/кг/ч в течение 6 ч; повреждение: снижение GFR > 50%, удвоение уровня креатинина или производство мочи < 0,5 мл/кг/ч в течение 12 ч; недостаточность: снижение GFR (скорость клубочковой фильтрации) > 75%, утроение уровня креатинина или уровень креатинина > 355 мкмолей/л (с повышением на > 44) (> 4 мг/дл), или выход мочи менее 0,3 мл/кг/ч в течение 24 ч; потеря: персистентное AKI (острое почечное нарушение) или полная потеря почечной функции в течение 4 недель. Нормальные диапазоны концентрации PENK (см. фиг. 2) и NGAL (диапазон 0,037-0,106 мкг/мл; http://www.bioporto.com/products/bioporto_di agnostics/ngal_elisa kits/ngal_rapid_eIisa kit се ivd) показаны на графиках затененной областью. На чертежах продемонстрировано, что концентрации NGAL значительно повышены у пациентов с сепсисом даже в том случае, когда у них нет почечной дисфункции, что не имеет место в случае PENK;
на фиг. 16 - зависимости коэффициентов выживаемости критически больных пациентов от концентраций PENK в их плазме, измеренных в день поступления и на следующий день (день 1). Панель А: слева представлен график Каплана-Мейера для субпопуляций пациентов, у которых концентрации PENK в день поступления были выше и ниже 100 пмолей/л соответственно. Справа представлен график Каплана-Мейера для субпопуляций пациентов с концентрациями PENK в день 1 выше и ниже 100 пмолей/л соответственно, у которых концентрация PENK была ниже 100 пмолей/л в день поступления. Панель Б: слева представлен график Каплана-Мейера для субпопуляций пациентов, у которых концентрации PENK в день поступления были выше и ниже 100 пмолей/л соответственно. Справа представлен график Каплана-Мейера для субпопуляций пациентов с концентрациями PENK в день 1 выше и ниже 100 пмолей/л соответственно, у которых концентрация PENK была выше пмолей/л в день поступления;
на фиг. 17 - Результаты многовариантного линейного регрессионного анализа прогнозирования с использованием PENK. Примечание: BP, креатинин и мочу не включали в анализ вследствие высокой степени корреляции с MAP или клиренсом креатинина. Линейную регрессию рассчитывали с использованием указанных переменных следующим образом: Log(PENK)=a×CreaClearance + b×Cardiovasc + с×МАР + и т.д. Частичный R2 характеризует степень, в которой каждая переменная вносит вклад в PENK, а именно, вклад клиренса креатинина (Crea Clearance) является наибольшим и характеризуется частичным коэффициентом R2, немного превышающим 0,15, т.е. клиренс креатинина обусловливает примерно 15% вариабельности, обнаруженной для PENK. Важно отметить, что возраст, пол и т.д. не оказывают значимого влияния на концентрации PENK.