Протеолитическая активность в высших грибах

БИОЛОГИЯ

УДК 577.15

ПРОТЕОЛИТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ В ВЫСШИХ ГРИБАХ © 2005 г. Л.А. Гзогян, М. Т. Проскуряков

The 18 species of basidiomycetes belonging to the Boletales, Agaricales, Russulales, Aphyllophorales order have been studied. The proteoclastic activity of natural and synthetical substrates in all species, and the natural state of the activity distribution over the taxonomic groups have been established. The greatest activity of natural and synthetical substrates has been found in the species of the Boletales order followed by the Agaricales, Russulales, Aphyl-lophorales order. Boletus edulis is considered to be especially perspective for further studies.

Дефицит животного сырья и несовершенство микробных препаратов стимулировали интерес к базидиальным грибам как возможным продуцентам протеолитических ферментов [1]. Два обстоятельства оправдывают поиск ферментов пищевого и медицинского назначения среди высших базидиомицетов: наличие среди них большого числа съедобных грибов и отсутствие спороношения в культуре, что уменьшает опасность профессиональных заболеваний в условиях производства [2]. Протеолитические ферменты применяются в пищевой, кожевенной, легкой, молочной промышленности. С увеличением выработки сыров возрос интерес к замене животного сычуга ферментами другого происхождения. Kawai [3] исследованы 44 штамма базидиомицетов, способных синтезировать молокос-твораживающие ферменты. Установлено, что два вида базидиомицетов -Irpex lacteus и Fomitopsis pinicola образуют протеазы, являющиеся хорошими заменителями химозина.

Л.Н. Шифриной и А.Н. Федоровой [4] изучены 51 вид грибов порядка Aphyllophorales и Agaricales; из них 46 проявляли высокую протеолитиче-скую активность по желатину, казеину и молоку. Особенно перспективными для дальнейшего изучения авторы считают виды Antrodia molis и Flammulina velutipes. У грибов Phellinum chrisoloma, Ganoderma applana-tum и Kuehneromyces mutabilis обнаружена способность образовывать внеклеточные ферменты свертывания молока.

Из P.chrysoloma получен ферментный препарат, сходный в свойствах с химозином [5].

Протеолитическая активность по казеину обнаружена в порядке Aphyl-lopharales, в семействах Corioloideae, Fomitoideae, Hymenohaetaceae, а также в порядке Agaricales семейств Pleurotaceae, Tricholomataceae, Copri-naceae, Cortinariceae [6].

Н.П. Денисовой [7] был проведен скрининг 400 естественных видов высших грибов с целью установления у них протеолитической активно-

сти. Около 1/3 исследованных видов агариковых и болетовых грибов содержали протеиназы, разжижающие фибрин и казеин. Наиболее часто проявлялась протеолитическая активность у дереворазрушающих, сапро-трофных грибов, тогда как у симбиотрофов она встречалась более редко.

Цель нашей работы - детальное исследование протеолитической активности по природным и синтетическим субстратам в 18 видах базидио-мицетов, наиболее распространенных в Краснодарском крае.

Материалы и методы

Нами исследовано 18 видов базидиомицетов порядков Boletales, Agari-cales, Aphyllophorales, Russulales, относящихся к различным эколого-трофическим группам ксилотрофов, сапротрофов и симбиотрофов.

Из порядка Boletales исследовано 5 видов семейства Boletaceae, 1 -Paxillaceae; в порядке Agaricales - 2 вида из семейства Tricholomataceae, 3 - из семейства Agaricaceae, 2 - из семейства Pleurotaceae; в порядке Rus-sulales - 3 вида из семейства Russulaceae; в порядке Aphyllophorales -1 вид из семейства Polyporaceae и 1 вид из семейства Hericiaceae (таблица).

Для исследования использовали сок плодовых тел базидиомицетов, хранившийся при температуре 18 °С, полученный после измельчения, замораживания и размораживания.

Химазную (молокосвертывающую) активность химотрипсина определяли методом Пятницкого [8], протеолитическую активность щелочных протеаз - по казеину методом М. Кунитца [9], кислых - с использованием денатурированного гемоглобина методом М. Anson [10]. Активность ферментов по белковым субстратам определяли в единицах оптической плотности Е280, трипсиноподобную и химотрипсиноподобную амидазную активности - соответственно по синтетическим субстратам N-бензоил-Б,Ь-п-нитроанилида (БАПНА) и N-сукцинил-Ь-фенилаланин-п-нигро-анилиду (СФПНА). Активность выражали в мкМ расщепленного субстрата в минуту [11].

Содержание растворимого белка определяли методом Бредфорд [12]. Содержание белка выражали в мг/мл сока.

При определении оптимумов pH активности и стабильности ферментов использовали растворы субстрата и образца, приготовленные на универсальной буферной смеси с различными значениями pH [13].

Количественные результаты обработаны методами вариационной статистики [14].

Обсуждение результатов

Содержание белка в исследованных грибах (таблица) не имело закономерного характера распределения по таксономическим группам и составляло от 1,3 до 7,2 мг/мл. Максимальное количество обнаружено в Suillus flavidus из порядка Boletales, минимальное - в Pleurotus ostreatus из

порядка Agaricales. Более близкие по содержанию белка виды порядка Russulales: 1,5-2,2 мг/мл. По имеющимся справочным данным [15] содержание общего белка в г на 100 г продукта составляет в шампиньоне 4,3; подосиновике - 3,3; лисичке - 1,6; масленке - 2,0; березовике - 5,0; белом грибе - 5,5; опенке - 3,3. Исходя из этого, нами было рассчитано процентное содержание растворимого белка от общего, которое составляло 2,8-10 %.

Содержание белка и активность ферментов в базидиомицетах

Порядок, вид Белок, мг/мл Активность по субстратам

БАПНА, мкМ СФПНА, мкМ СИАПНА Молоко Казеин Оптимум pH Гемоглобин, pH Оптимум pH

Порядок Boletales

Boletus edulis 2,4 2,2 4,8 0,24 4,9 0,78 8,5 0,26 3,5

Leccinum auranticum 5,2 1,8 3,8 0,11 2,8 0,64 8,5 0,41 2,5

Leccinum melanum 5,6 1,5 2,4 0,14 1,7 0,57 8,5 0,38 2,5

Boletus castanus 3,5 2,1 1,9 0,12 3,4 0,67 9,5 0,33 3,0

Suillus flavidus 7,2 1,9 2,3 0,8 2,2 0,73 8,5 0,22 2,0

Cantarellus aurantiaca 1,9 1,4 2,4 0,09 2,2 0,33 8,0 0,35 3,5

Порядок Agaricales

Flammulina velutipes 4,1 1,3 2,4 0 1,7 0,76 8,5 0,22 3,5

Armmilaria mellea 1,9 1,1 2,3 0 1,2 0,38 8,5 0,11 5,0

Macrolepiota procera 4,5 1,2 1,9 0 0,6 0,45 8,0 0,24 3,5

Agaricus silvaficus 1,8 0,8 2,2 0 0,8 0,53 9,5 0,25 3,0

Amanita phaloides 3,6 0,4 1,9 0 0,4 0,28 8,5 0,12 3,5

Pleurotus ostreatus 1,3 0,2 2,2 0 0,2 0,14 9,0 0,41 3,0

Pleurotus cornucopiae 1,5 0,3 1,4 0 0,3 0,28 9,5 0,12 3,0

Порядок Russulales

Lactarius pubescens 2,2 1,6 2,7 0 1,4 0,23 8,0 0,13 2,5

Russula veska 1,9 1,2 2,5 0 1,2 0,26 8,0 0,17 2,5

Lactarius piperatus 1,54 0,9 2,9 0 2,4 0,33 8,5 0,19 2,5

Порядок Aphyllophorales

Coriolus versicolor 3,2 1,3 1,3 0 0,8 0,18 8,5 0,12 3,0

Hericium erinaceus 4,2 2,1 2,1 0 1,2 0,26 9,0 0,16 2,5

Во всех видах обнаружена протеолитическая активность по использованным синтетическим и природным субстратам (таблица). Применение синтетических субстратов позволило отнести определяемую активность к группе трипсиноподобных и химотрипсиноподобных ферментов.

Активность трипсиноподобных ферментов колебалось в диапозоне от 0,3 до 2,2 мкМ. Среди видов четырех порядков наиболее высокая активность обнаружена в порядке Boletales; максимальная - у видов Boletus edulis (2,2 мкМ), минимальная - в Cantarellus aurantiaca (1,4 мкМ). В порядке Agaricales наибольшая трипсиноподобная активность у вида Flam-mulina velutipes - 1,3 мкМ семейства Tricholomataceae, наименьшая - у вида Pleurotus cornucopiae - 0,3 мкМ семейства Pleurotaceae. В порядке Russulales наибольшее количество трипсиноподобных ферментов наблюдалось у вида Lactarius pubescens - 1,6 мкМ, в порядке Aphyllophorales - у вида Herricium erinaceus - 0,9 мкМ.

Активность химотрипсиноподобных ферментов колебалась от 1,3 до 4,8 мкМ. Наиболее высокой обладали грибы порядка Boletales, вид Boletus edulis. В порядке Agaricales высокой активностью отличался вид Flammu-lina velutipes - 2,4 мкМ; в порядке Russulales - Lacatarius piperatus -2,7 мкМ. Наименьшей химотрипсиноподобной активностью обладали грибы порядка Aphyllophorales, вид Hericium erinaceus - 2,1 мкМ.

Между содержанием трипсиноподобных и химотрипсиноподобных ферментов существует положительная корреляционная зависимость r = 0,64.

Анализ активности протеолитических ферментов по природным субстратам - молоку, казеину и гемоглобину показал, что самая высокая активность молокосвертывающих ферментов наблюдалась у видов порядка Boletales. Активность по молоку была в диапазоне от 0,2 до 4,9 ед. Внутри порядка Boletales высокая активность отмечена у Boletus edulis - 4,9 ед.; минимальная - у Leccinum melanum - 1,7 ед. В порядке Agaricales наиболее выраженная активность по молоку у вида Flammulina velutipes -1,7 ед., в Pleurotus ostreatus - 0,2 ед.; в порядках Aphyllophorales и Russulales - у вида Lactarius pubecens - 1,4 ед., Hericium erinaceus - 1,2 ед.

Молокосвертывающие ферменты вида Cantarellus aurantiaca отличались от всех исследованных высокой термостабильностью при pH 8,5.

Высокая активность щелочных протеаз по казеину отмечена у видов порядка Boletales, далее следуют Agaricales, Russulales, наименее выражена в видах порядка Aphyllophorales. Внутри порядка Boletales высокая активность обнаружена в виде Boletus edulis - 0,78 ед., минимальная - в Cantarellus aurantiaca - 0,33 ед. В порядке Agaricales активность по казеину более выражена у Flammulina velutipes - 0,76 ед., наименьшая - в Pleurotus ostreatus - 0,14 ед. В порядках Russulales и Aphyllophorales высокой активностью по казеину обладали виды Lactarius pubescens (1,4 ед.) и Hericium erinaceus (0,26 ед.). Оптимум активности щелочных протеаз находится в интервале pH от 7,5 до 9,5.

Максимальная активность кислых протеаз по гемоглобину обнаружена у видов порядка Boletales и Agaricales в диапазоне от 0,12 до 0,41 ед. Порядки Aphyllophorales и Russulales схожи по активности расщепления гемоглобина (0,12-0,19 ед.). Из 18 исследованных видов минимальной активностью по этому субстрату обладали Armillaria mellea - 0,11 ед. и максимальной Leccinum auranticum - 0,41 ед. Оптимум кислых протеаз находился при pH от 2,5 до 3,5.

Между полученными нами показателями активности ферментов существует положительная корреляционная зависимость. Между молокосвер-тывающей и активностью щелочных протеаз r = 0,68; кислых протеаз r = 0,36; щелочных и кислых r = 0,37.

Таким образом, во всех исследованных видах обнаружена протеолити-ческая активность по природным и синтетическим субстратам. Анализ характера распределения протеолитической активности по таксономическим группам показал, что наиболее активные по природным и синтетическим субстратам - виды порядка Boletales, далее следуют Agaricales, Russulales и Aphyllophorales. Можно предположить, что наиболее перспективными видами для поисков заменителей химозина являются Boletus edulis, B. Castanus, Leccinum auranticum, Cantarellius aurantiaca порядка Boletales и Lactarius piperatus порядка Russulales.

Литература

1. Белова Н.В. // Растительные ресурсы. 1991. № 2. С. 18-21.

2. ДенисоваН.П. // Микология и фитопатология. 1982. № 16. С. 458-465.

3. KawaiM. // J. Agr. Chem. Soc. Japan. 1973. Vol. 47. № 8. P. 467-472.

4. Федорова Л.Н., Шифрина А.Н. // Микология и фитопатология. 1975. № 4. С. 307-310.

5. Низковская О.П., ФедороваЛ.Н. // Микология и фитопатология. 1979. № 3. С. 217-220.

6. Маттисон Н.А., Фалина Н.Н. // Микология и фитопатология. 1973. № 5. С. 394-399.

7. Денисова Н.П. // Микология и фитопатология. 1984. № 2. С. 112-116.

8. Пятницкий Н.П., Проскуряков М.Т. // Материалы 17 науч. конф. физиологов юга РСФСР. Ставрополь, 1969. С. 80-82.

9. Нортроп Д., Кунитц М., Херриотт Р. Кристаллические ферменты. М., 1950.

10. Anson M.L. // J. Gen. Physiol. 1938. Vol. 22. № 1. P. 79-89.

11. Tuppy et al. // Hoppe Seyler. Physiol. Chem. 1961. Vol. 329. № 3-6. Р. 278-288.

12. BradfordM.M. // Anal. Biochem. 1976. Vol. 72. P. 115-119.

13. Джоржеску П., Пунэнеску Е. Биохимические методы диагноза и исследования. Бухарест, 1963.

14. Лакин Г.Ф. Биометрия. М., 1990.

15. СкурихинН.П. Справочник химического состава пищевых продуктов. М., 1987. Кубанский государственный университет 11 марта 2005 г.