Экспрессия тканеспецифических генов в гепатокарциномах мыши различного уровня дифференцировки

Д. И. Флейшман, О. В. Морозова, Н. Л. Лазаревич ЭКСПРЕССИЯ ТКАНЕСПЕЦИФИЧЕСКИХ ГЕНОВ В ГЕПАТОКАРЦИНОМАХ МЫШИ РАЗЛИЧНОГО УРОВНЯ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ

НИИ канцерогенеза ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва

Цель работы состояла в выявлении наиболее общих закономерностей нарушения экспрессии генов при прогрессии гепатоцеллюлярных карцином. В статье представлены результаты исследования 11 химически индуцированных гепатокарцином мыши независимого происхождения и разного уровня дифференцировки. Опухоли были охарактеризованы гистологически, а затем методом полуколиче-ственной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией был проведен анализ экспрессии 22 генов, продукты которых в норме вовлечены в процесс дифференцировки гепатоцитов. Показана прямая зависимость между уровнем дифференцировки опухолей и спектром экспрессируемых в них тканеспецифических регуляторов транскрипции. В частности, выявлена четкая корреляция между уровнем дифференцировки и экспрессией генов гепатоцитарных ядерных факторов HNF4a, HNF1a, HNF1P, HNF3y, С/ЕВРа и FTF. Предполагается, что снижение дифференцировочного статуса гепатоцитов вследствие нарушения функции гена HNF4аи его транскрипционных мишеней является важным этапом прогрессии гепатокарцином мышей.

Ключевые слова: гепатокарцинома, гепатоцитарный ядерный фактор, дифференцировка, опухолевая прогрессия.

Гепатокарциномы (ГК) — опухоли, возникающие из зрелых гепатоцитов, составляют 80% случаев первичного рака печени. Возникновение ГК чаще всего ассоциировано с хроническими инфекциями вирусами гепатита В или С, алкоголизмом, циррозом печени, а также с действием на организм микотоксинов, в частности афло-токсина В1 [15]. Смерть от заболевания обусловлена дисфункциями печени. Существуют способы диагностики ГК, основанные на том, что у пациентов с ГК значительно повышен уровень в крови белка альфа-фетопротеина (АФП), впервые описанного в 1962 г. Г. И. Абелевым и соавт. [3]. Этот белок семейства альбуминов является основным компонентом эмбриональной сыворотки крови, и в норме после рождения его уровень в крови резко снижается.

Гепатоканцерогенез представляет собой многостадийный процесс, ассоциированный с изменением спектра экспрессируемых клеткой генов [4]. Схема молекулярных механизмов, ведущих к озлокачествлению гепатоцита, до сих пор полностью не охарактеризована. Можно предположить, что наибольший риск связан с изменениями в генах, продукты которых способны влиять на всю транскрипционную программу клетки. Такими продуктами генов являются транскрипционные факторы, нарушение функции которых приводит к изменению экспрессии других генов [2].

Транскрипционными регуляторами, формирующими фенотип печени, являются так называемые гепатоци-

© Флейшман Д. И., Морозова О. В., Лазаревич Н. Л., 2008 УДК 616.36-006.6-092.9:575.117.2

тарные ядерные факторы (ГЯФ, HNF) [2; 12]. Спектры экспрессии ГЯФ тканеспецифичны, их сайты связывания обнаружены в регуляторных районах большинства известных функциональных генов печени. Выделяют 5 семейств ГЯФ: Н№1, Н№3, НОТ4, НОТ6 и С/ЕВР; каждое из них включает несколько представителей. Кооперативная работа факторов всех пяти семейств необходима для правильного функционирования и поддержания уровня дифференцировки гепатоцитов [2; 12]. Образование гепатобластов из энтодермы на начальных этапах развития печени происходит за счет согласованной деятельности HNF3a и HNF3P [7; 11; 16]. Контроль над дифференцировкой гепатобластов в холангиоци-ты — эпителиальные клетки желчных протоков — осуществляют HNF6 и HNF1P [5], необходимым условием дифференцировки гепатоцитов является экспрессия НОТ4а, НОТ1а и С/ЕВРа [5]. Ключевая роль ГЯФ в процессах дифференцировки позволяет предположить, что они могут оказаться важными мишенями трансформирующих агентов при гепатоканцерогенезе. В то же время системный анализ профилей экспрессии ГЯФ при гепа-токанцерогенезе не проводился.

Ранее в нашей лаборатории на модели одноступенчатой прогрессии, при которой из медленнорастущей высокодифференцированной ГК мыши (мГК) одномоментно выщепился быстро растущий дедифференцированный клон (бГК) [1], было показано, что в ходе опухолевой прогрессии изменилась экспрессия большинства ГЯФ и других важных печеночных регуляторов. В бГК полностью утрачена экспрессия генов Н^4а, HNF1а, Н^6, Н№10, GATA4, FTF, частично подавлена транскрипция факторов

С/EBPa, GATA6, повышен уровень экспрессии фактора COUP-TF1. В то же время в обеих опухолях, как и в нормальной печени, в сравнимых количествах транскрибируются гены HNF3a, HNF3/3 и С/EBPfi. Восстановление экспрессии гена HNF4a привело к частичной реверсии злокачественного фенотипа бГК [10]. Чтобы выяснить, являются ли закономерности, полученные на модели одноступенчатой прогрессии, общими для гепатоканцеро-генеза, мы выбрали 11 химически индуцированных перевиваемых опухолей мыши независимого происхождения и разного уровня дифференцировки и провели анализ спектра экспрессии генов в этих опухолях.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Коллекция мышиных ГК

Первичные ГК мышей, использованные в работе, индуцировали однократной инъекцией диэтилнитрозамина (ДЭНА) (90 мг на 1 кг массы тела внутрибрюшинно) с последующей промоцией фенобарбиталом (0,5% в питьевой воде в течение 14 мес). Опухоли перевивали подкожно суспензией опухолевой ткани в ростовой среде.

Образцы мышиных опухолей размером приблизительно 30 мг вырезали у мышей и замораживали в жидком азоте. До выделения РНК образцы хранили при температуре — 70 °С.

Гистологические препараты

Образцы опухолей фиксировали в 10% нейтральном формалине, затем отмывали в проточной воде и обезвоживали в батарее спиртов с повышающейся концентрацией. Полученные образцы помещали в парафин и затем делали микротомные срезы на стеклах, предварительно обработанных белком. Срезы окрашивали гематоксилином в течение 10 мин, отмывали проточной водой, докрашивали в течение минуты эозином и после проводки по спиртам заключали в канадский бальзам. Окрашенные препараты изучали и фотографировали на микроскопе «Axioplan 2» фирмы «Zeiss» с помощью фотокамеры «AxioCam MRc» и программы «Axiovision 4» («Zeiss»).

Выделение РНК

Тотальную РНК выделяли с помощью набора для выделения РНК фирмы «Promega» («SV Total RNA Isolation System»). Концентрацию РНК определяли по оптической плотности раствора, измеренной на спектрофотометре («Eppendorf BioPhotometr») при длине волны 260 нм.

Полимеразная цепная реакция

С полученных РНК ставили реакцию ОТ: 3 мкг РНК смешивали с 0,1 мкг случайных гексамерных олигонуклеотидов (Синтол), денатурировали при температуре 65 °С и охлаждали на льду, затем добавляли ОТ-смесь (2 ед обратной транскриптазы MMLV («Promega»), буфер, 2 мМ дитиотритола, 0,5 ед ингибитора рибонуклеаз

и смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (ДНФ), по 0,5 мМ каждого и проводили реакцию ОТ (42 °С, 30 мин), затем останавливали ОТ инактивацией ревертазы (94 °С, 5 мин) и доводили объем смеси до 100 мкл.

В состав ПЦР-смеси входили 1 мкл рабочего раствора праймеров 2,5 ед Тад-полимеразы («Биомастер», 10 000 ед/мкл), 2,5 мкл 10Х Тад-буфер без МдС12 («Биомастер»), 2,5 мМ МдС12, 250 мкг/мкл каждого из ДНФ, 5 мкл смеси, полученной после ОТ, Н2О до конечного объема 25 мкл. Для проведения ОТ-ПЦР использовали прибор фирмы «ДНК-технология» и амплификатор Т3 «^егтосус1ег» («Вюте^а»). Проводили первичную полную денатурацию (94 °С, 3 мин), каждый из циклов ПЦР включал этапы денатурации (94 °С, 50 с), отжига праймеров (1 мин) и элонгации (72 °С, 1 мин); по окончании реакции проводили полное достраивание продукта (72 °С, 10 мин). Затем продукты ПЦР подвергали электрофоретическому разделению в 1,5% агарозном геле, результаты документировали с помощью фотодокументирующей системы гелей <ШЮ1 DOC-IT» («UVP», США).

РЕЗУЛЬТАТЫ Гистологическая характеристика ГК мышей

На первом этапе работы мы провели гистологический анализ химически индуцированных ДЭНА перевиваемых ГК мыши независимого происхождения и разной степени дифференцировки. Для этого из полученной ранее в НИИ канцерогенеза РОНЦ РАМН коллекции перевиваемых мышиных ГК выбрали 11 независимо индуцированных опухолей, обладающих разной скоростью роста (скорость роста опухоли определяли по требуемой частоте перевивки от одной особи к другой). Первичные опухоли коллекции, существующей в НИИ канцерогенеза, были индуцированы у гибридов F1 (С57В1 х DBA) ДЭНА с последующей промоцией фенобарбиталом; полученные опухоли перевивали подкожно. Были получены гистологические препараты каждой опухоли (рис. 1). В качестве параметров, по которым определяли степень дифференцировки опухоли, использовали следующие факторы.

1. Балочность структуры опухоли. Клетки высокодифференцированных опухолей выстраивают балки вокруг сосудов, образуя подобие печеночных долек. Балки в основном толстые, шириной 2—5 клеток (иногда 5—10 клеток) с расширенными синусами. Деструктурированные опухоли, клетки которых не образовывали четких балочных структур, были описаны как низкодифференцированные.

2. Полиморфность клеток. В недифференцированных ГК наблюдали ярко выраженный клеточный полиморфизм: опухолевые клетки были разной формы и размера, встречались многоядерные клетки. Кроме того, различались и внутриклеточные параметры: присутствовали клетки с ядрами и цитоплазмой различной величины и консистенции.

1

Рисунок 1. Гистологическое строение ГК мыши. Окраска гематоксилином и эозином. 1 — просвет сосуда, вокруг которого формируется балочная структура, характерная для печени; 2 — расширенный синус; 3 — тяж соединительной ткани; 4 — полиплоидная клетка; 5 — митоз.

А. Высокодифференцированная ГК (образец №3, х 200). •. Высокодифференцированная ГК (образец №4, х 200). В. Высокодифференцированная ГК (образец №2, х 400). Г. Низкодифференцированная ГК (образец №12, х 200). Д. Низкодифференцированная ГК (образец №12, х 400). Е. Низкодифференцированная ГК (образец №7, х 1000).

3. Инвазия соединительной ткани. Часто ткань опухолей была иссечена соединительнотканными тяжами. Их количество, архитектура и общее соотношение количества эпителиальных клеток к мезенхимным также позволяли судить об уровне дифференцировки.

4. Оценивали уровень сохранения клетками эпителиальной морфологии, отмечали участки некрозов в опухолях и количество клеток, проходящих митоз. Необходимо отметить, что часть высокодифференцированных опухолей содержала участки умеренно дифференцированной ткани.

По результатам проведенного анализа 5 опухолей были охарактеризованы как высокодифференцированные и 6 образцов получили статус низкодифференцированных ГК. Морфология типичных высоко- и низкодифференцированных опухолей представлена на рис. 1.

Примечательно, что ГК, гистологически квалифицированные как высокодифференцированные, росли гораздо медленнее, чем низкодифференцированные опухоли: средняя скорость роста дифференцированной опухоли составляла 3—7 мес, а скорость роста дедиффе-ренцированных ГК — от 2 нед до 3 мес.

Анализ уровней экспрессии генов в ГК мыши

Мы задались целью на охарактеризованной таким образом коллекции из 11 опухолей, различающихся по скорости роста, уровню дифференцировки и соответственно степени опухолевой прогрессии, выявить наиболее общие генетические изменения, произошедшие в процессе гепатоканцерогенеза, а также определить, экспрессия каких специфических для печени генов отличает дифференцированные ГК от низкодифференцированных быстрорастущих опухолей.

Для этого был проведен анализ экспрессии специфических для печени генов, экспрессируемых в ГК мыши. Из образцов опухолей была выделена тотальная РНК, панель соответствующих РНК была подвергнута анализу с помощью ОТ-ПЦР.

В качестве контроля нормального уровня экспрессии генов в панели использовали РНК из нормальной печени взрослой мыши линии BDF. На электрофорез продукты ПЦР наносили в следующем порядке: нормальная печень (образец №1), дифференцированные ГК (образцы №2—6), низкодифференцированные ГК (образцы №7—11). Достоверность того, что продукт ПЦР действительно является фрагментом исследуемого гена, подтверждали, основываясь на размере продукта.

В реакцию ОТ брали равное количество РНК из каждого образца, однако для полного подтверждения точности выравнивания проводили ПЦР с праймерами к гену гипоксантинфосфорибозилтрансферазы (HPRT), который равномерно экспрессируется во всех клетках. Данные ОТ-ПЦР представлены на рис. 2.

По итогам проведенной работы все изученные гены можно разделить на 2 группы: гены, экспрессия которых

полностью коррелирует с уровнем дифференцировки опухоли, и гены, активные как в высоко-, так и в низкодифференцированных ГК мышей.

В первую группу попали следующие гены.

Ген альбумина. Кодирует основной маркер зрелых гепатоцитов, что подтверждает соответствие между гистологическим и молекулярным методами оценки уровня дифференцировки образцов.

HNF4a. Кодирует транскрипционный фактор, который связывается с респонсивными элементами ге-патоцитарных генов, продукты которых вовлечены в разнообразные процессы клеточного метаболизма, дифференцировки и роста (HNF4a активирует основные ферменты глюконеогенеза и синтеза желчных кислот; необходим для регуляции обмена липидов, играет значительную роль в формировании плотных контактов, является морфогеном и способен индуцировать мезенхимально-эпителиальный переход; предполагается, что способен подавлять клеточную пролиферацию как индуктор р21). Кроме того, HNF4a признан ключевым регулятором дифференцировки гепатоцитов [10; 6; 9; 15]. Оказалось, что ген HNF4a экспрессирован во всех высокодифференцированных опухолях на том же уровне, что и в нормальной печени мыши (см. рис. 2А), экспрессия в низкодифференцированных опухолях не наблюдалась. Это подтверждает ранее выдвинутое предположение [10] о взаимосвязи активности HNF4aи уровня дифференцировки клеток, а также о важной роли репрессии этого фактора при прогрессии ГК.

Существуют 9 вариантов альтернативного сплайсинга гена HNF4a. Все они обладают различными трансактивационными свойствами. Для взрослых гепатоцитов характерна экспрессия изоформ a1—a6 с промотора Р1 (далее HNF4a1), в то время как в эмбриональной печени транскрипция осуществляется преимущественно с Р2 (изоформы a7— a9, далее — HNF4a7). Мы обнаружили, что, в отличие от нормальной печени мыши, в которой выявляются только варианты a1, в опухолях вклад в суммарное количество мРНК HNF4a вносят формы сплайсинга как a1, так и a7. Это указывает на активацию альтернативного промотора гена HNF4a на ранних стадиях прогрессии опухоли. Одновременная репрессия обеих форм в низкодифференцированных опухолях свидетельствует о возможной взаимосвязи в их регуляции.

COUP-TFI. Этот ген кодирует ядерный рецептор, который признан антагонистом HNF4a [13], и транскрибируется в 5 из 6 гепатокарцином, не экспрессирующих HNF4a(см. рис. 2А).

В эту же группу попали гены HNF1a, HNF1/3, HNF3y C/EBPaи FTF (см. рис. 2). Ранее на модели одноступенчатой прогрессии [10] мы установили, что в клетках бГК экспрессия генов HNF3y HNF1aи FTF индуцируется экзогенным функционально-активным HNF4a1. Сейчас мы подтвердили эту закономерность, выявленную для модели одноступенчатой прогрессии, для других ГК мыши.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

HPRT

HNF4

HNF4- a1

HNF4- a7

HNF1

HNF1

HNF3y

C/ESPa

FTF

Альбумин

COUP-TF1

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

HPRT

HNF6

АФП

HNF3a

HNF3P

С/ЕВРР

A

Б

Рисунок 2. Экспрессия генов, участвующих в дифференцировке печени. Электрофорез продуктов ОТ-ПЦР со специфическими праймерами к указанным генам. 1 — печень; 2—6 — дифференцированная ГК; 7—12 — недифференцированная ГК.

А. Гены, уровень экспрессии которых коррелирует с дифференцировочным статусом ГК мыши. Б. Гены, уровень транскрипции которых не полностью коррелирует с дифференцировочным статусом ГК мыши.

В другую группу попали гены, экспрессия которых нечетко коррелирует с уровнем дифференцировки ГК.

Несмотря на то что эмбриональный сывороточный белок АФП является признанным маркером гепатокарцином [З], экспрессия гена, кодирующего этот белок, не наблюдалась в 4 из 11 опухолей панели (см. рис. 2Б); все они были низкодифференцированными. Возможно, активация экспрессии АФП является достаточно ранним событием гепатоканцерогенеза, а дальнейшая прогрессия опухоли сопровождается подавлением экспрессии его гена. Это явление может быть обусловлено нарушением функции ключевых трансактиваторов гена АФП (например, HNFla и FTF [8; 14]), транскрипция которых подавлена в низкодифференцированных опухолях.

HNF6. Помимо дифференцированных опухолей экспрессируется в 2 ГК с подавленной транскрипцией HNF4a.

HNF3a. Транскрибируется во всех медленно- и 4 быстрорастущих образцах.

HNF3/3. Помимо HNF4a-положительных ГК экспрессия регистрируется в 4 низкодифференцированных опухолях.

C/EBPp. Гиперэкспрессирован в высокодифференцированных ГК, а также в З низкодифференцированных образцах.

Тот факт, что активность генов HNF6, HNF3|Зи Н^За наблюдается в большинстве исследованных опухолей, подтверждает гепатоцитарное происхождение последних. По всей вероятности, факторы HNF3P и HNF3a, являясь одними из самых ранних регуляторов эмбриогенеза печени, во взрослом организме не оказывают определяющего влияния на дифференцировку. Это предположение согласуется с данными литературы о том, что кондиционный нокаут HNF3P не летален для взрослой мыши. Таким образом, несмотря на сохранение экспрессии таких важных факторов, как HNF3P и HNF3а, ряд опухолей претерпевает дедифференцировку.

Итак, по результатам анализа с помощью ОТ-ПЦР уровней экспрессии основных ГЯФ и других транскрипционных факторов, определяющих дифференцировочный статус печени, мы впервые наглядно продемонстрировали, что среди исследованных факторов именно экспрессия Н^4а и HNF4a-респонсивных генов четко коррелирует с уровнем дифференцировки и со скоростью роста ГК. Значимость этих результатов определяется тем, что Н^4а является центральным регулятором процессов метаболизма, пролиферации и поддержания эпителиальной морфологии в гепатоцитах [10; 11; 16]. Вероятно, нарушение функции HNF4а и его транскрипционных мишеней, наблюдаемое в ГК мыши с наиболее ярко выраженными

признаками злокачественности, является важным событием в дедифференцировке ГК и, таким образом, приводит к прогрессии опухолей этого типа.

Гиперэкспрессия эмбриональной формы HNF4a7 во всех образцах дифференцированных ГК мыши свидетельствует о том, что активация альтернативного промотора HNF4a маркирует ранние этапы злокачественного перерождения печени и может служить маркером гепа-токанцерогенеза. В то же время последующее исчезновение активности гена HNF4a7 маркирует поздние этапы опухолевой прогрессии.

Мы рассчитываем, что проводимый нами в настоящее время анализ изменения уровней экспрессии тканеспецифических генов в клинических образцах позволит ответить на вопрос о справедливости выявленных закономерностей для ГК человека.

Работа поддержана грантом. Американского фонда гражданских исследований и развития (АФГИР) № RUB1-2662-MO-05, грантами Президента РФ для поддержки молодых российских ученых (МД-8329.2006.4) и ведущих научных школ (НШ-6607.2006.4), грантом. РФФИ 07-04-01422.

ЛИТЕРАТУРА

1. Энгельгардт Н. В., Кудрявцева Е. И., Морозова О. В. и др. Скачкообразная прогрессия перевиваемой гепатокарциномы мышей, сопряженная с утратой полярности клеток // Арх. пат. —

2000. — № 3. — С. 24—29.

2. Abelev G. I., Lazarevich N. L. Control of differentiation in progression of epithelial tumors // Adv. Cancer Res. — 2006. — Vol. 95. — P. 61—113.

3. Abelev G. I., Perova S., Khramkova N. I. et al. Production of embryonic alpha-globulin by the transplantable mouse hepatomas // Trans-

plant. Bull. — 1963. — Vol. 1. — P. 174—180.

4. Buendia M. A. Genetics of hepatocellular carcinoma // Cancer Biol. — 2000. — Vol. 10. — Р 185—200.

5. Clotman F., Lannoy V. J., Reber M. The onecut transcription factor HNF6 is required for normal development of the biliary tract // Development. — 2002. — Vol. 129, N 8. — Р. 1819—1828.

6. Duncan S. A., Nagy A., Chan W. Murine gastrulation requires HNF-4 regulated gene expression in the visceral endoderm: tetraploid rescue of Hnf-4(-/-) embryos // Development. — 1997. — Vol. 124, N 2. — Р. 279—287.

7. Duncan S. A., Navas M. A., Dufort D. Regulation of a transcription factor network required for differentiation and metabolism // Science. — 1998. — Vol. 281, N 5377. — Р. 692—695.

8. Galarneau L., Pare J. F., Allard D. The alpha1-fetoprotein locus is activated by a nuclear receptor of the Drosophila FTZ-F1 family // Mol. Cell. Biol. — 1996. — Vol. 16, N 7. — P. 3853—3865.

9. Hatzis P., Talianidis I. Regulatory mechanisms controlling human hepatocyte nuclear factor 4a gene expression // Mol. Cell. Biol. —

2001. — Vol. 21, N 21. — P. 7320—7330.

10. Lazarevich N. L., Cheremnova O. A., Varga E. V. Progression of HCC in mice is associated with a downregulation in the expression of Hepatocyte Nuclear factors // Hepatology. — 2004. — Vol. 39. — Р. 1038—1047.

11. Lemaigre F., Zaret K. Liver development update: new embryo models, cell lineage control, and morphogenesis // Curr. Opin. Genet. Dev. — 2004. — Vol. 14, N 5. — P. 582—590.

12. Locker J. Tissue-specific regulation by transcription factors / Locker J. (ed.). Transcription factors. — 1st ed. — Oxford: BIOS Scientific Publishers Ltd., 2001. — P. 237—262.

13. Power S. C., Cereghini S. Positive regulation of the vHNF1 promoter by the orphan receptors COUP-TF1/Ear3 and COUP-TFII/Arp1 // Mol. Cell. Biol. —1996. — Vol. 16, N 3. — P. 778—791.

14. R^ken C., McGrath S. C. Pathology and pathogenesis of hepatocellular carcinoma // Dig. Dis. — 2001. — Vol. 19. — P. 269—278.

15. Thorgeirsson S. S., Grisham J. W. Molecular pathogenesis of human hepatocellular carcinoma // Nat. Gen. — 2002. — Vol. 31. — P. 339—345.

16. Zaret K. Regulatory phases of early liver development: paradigms of organogenesis // Nat. Rev. Genet. — 2002. — Vol. 3, N 7. — Р. 499—512.

Поступила 08.11.2007

D. I. Fleishman, O. V. Morozova, N. L. Lazarevich

TISSUE-SPECIFIC GENE EXPRESSION IN MOUSE HEPATOCARCINOMAS WITH DIFFERENT STATES OF DIFFERENTIATION

Carcinogenesis Research Institute, N. N. Blokhin RCRC RAMS, Moscow

The purpose of this study was to find most general regularities in gene expression changes associated with progression of hepatocellular carcinoma. The paper describes results of study in 11 chemically induced mouse hepatocarcinomas of independent origin and different states of differentiation. After histological characterization of the tumors we analyzed expression of 22 genes whose products were normally involved in hepatocyte differentiation using semi-quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction technique. Tumor differentiation state was shown to be directly related to spectrum of tissue-specific transcription regulators expressed on tumor cells. In particular, there was a clear correlation between the differentiation state and expression of genes of hepatocyte nuclear factors HNF4a, HNFla, HNFip, HNF3y, C/EBPa and FTF. We believe that decrease in hepatocyte differentiation state due to impairment of functions of HNF4a and its transcription targets may be an important stage in progression of mouse hepatocarcinoma.

Key words: hepatocarcinoma, hepatocyte nuclear factor, differentiation, tumor progression.