СОСТАВЫ И СПОСОБЫ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАКА
COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATMENT OF CANCER

Перекрестная ссылка на родственные заявки
Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании предварительных заявок на патент США №62/471,994, поданной 16 марта 2017 года, и 62/586,220, поданной 15 ноября 2017 года; обе указанные заявки полностью включены в настоящий документ посредством ссылок, включая любые фигуры.
Ссылка на перечень последовательностей
Настоящая заявка подана вместе с перечнем последовательностей в электронном формате. Перечень последовательностей представлен в виде файла с именем «CD39-6_ST25», созданного 15 марта 2018 года, размер которого составляет 53 КБ. Информация, содержащаяся в электронном формате в перечне последовательностей, полностью включена в настоящий документ посредством ссылки.
Область изобретения
В настоящем изобретении предложены антиген-связывающие соединения (например, антитела), которые ингибируют ферментативную активность растворимого CD39 человека. Настоящее изобретение также относится к клеткам, продуцирующим такие соединения; способам получения таких соединений и антителам, их фрагментам, вариантам и производным; фармацевтическим композициям, содержащим вышеуказанные соединения; способам применения указанных соединений для диагностики, лечения или профилактики заболеваний, например, рака.
Уровень техники
Восемь различных генов ENTPD кодируют белки-члены семейства НТФДаз (NTPDase). Отдельные подтипы НТФДаз отличаются локализацией в клетке и функциональными свойствами. Связанные с плазматической мембраной нуклеозидтрифосфатдифосфогидролазы контролируют уровни нуклеотидов на поверхности клетки путем гидролиза с- и b-фосфатов нуклеотидов.
НТФДаза 1 (эктонукпеозидтрифосфатдифосфогидролаза-1), также известный как CD39/ENTPD1 или сосудистый CD39, функционирует совместно с другим ферментом, CD73 (экто-5'-нуклеотидазой), гидролизуя внеклеточный аденозинтрифосфат (АТФ) и аденозиндифосфат (АДФ) с образованием аденозина, который связывается с рецепторами аденозина и ингибирует ответы Т-клеток и естественных киллеров (NK), тем самым подавляя иммунную систему. Образование аденозина по пути CD73/CD39 считается основным механизмом иммуносупрессивной функции регуляторных Т-клеток (Treg). Количество CD39+-Treg увеличивается при некоторых раковых заболеваниях человека; важная роль CD39+-Treg в стимуляции опухолевого роста и метастазирования продемонстрирована с использованием нескольких моделей in vivo. В то же время, CD39 также экспрессируется опухолевыми клетками, и CD39+-опухолевые клетки могут опосредовать иммуносупрессию через аденозиновый путь. CD39 в раковых клетках обладает активностью АТФазы и вместе с CD73 образует аденозин. CD73+CD39+-раковые клетки ингибируют пролиферацию CD4 и CD8 Т-клеток и образование цитотоксических эффекторных CD8 Т-клеток (CTL) зависимым от CD39 и аденозина образом. Сообщалось, что содержание CD39 увеличивается в некоторых солидных опухолях (раке ободочной и прямой кишки, раке головы и шеи, раке поджелудочной железы), а также при хроническом лимфолейкозе. Антитела, которые связывают и ингибируют CD39 в клетках, экспрессирующих CD39, раскрыты в заявке WO 2009/095478. Антитело «А1» (eBiosciences, Inc.) используется для окрашивания и не обладает способностью нейтрализовать активность CD39 в клетках. В статье Hayes et al. (2015) Am. J. Transl. Res. 7(6):1181-1188 использовали антитело против CD39, которое связывает FcγR и обладает эффекторной функцией, и, согласно утверждениям, также является блокирующим. Экспрессия CD39 на клетках различных типов, включая лейкоциты и опухолевые клетки, в сочетании с использованием антител, которые либо фактически не блокируют CD39, либо не являются чистыми блокаторами, создает сложные условия для оценки основной активности антител. На сегодняшний день единственным описанным ингибитором активного центра CD39 остаются низкомолекулярные негидролизуемые аналоги АТФ, примером которых является ARL67156, что указывает на необходимость разработки соединений, способных напрямую ингибировать активный центр. В то же время ARL67156 не является специфичным по отношению к CD39 и также ингибирует другие НТФДазы, например, НТФДазу-1, НТФДазу-3, NPP1 или НТФДазу-8 мыши, но при этом является слабым конкурентным ингибитором (Levesque et al. (2007) Br. J. Pharmacol. 152:141-150).
CD39 содержит два трансмембранных домена вблизи N- и С-концов, короткие цитоплазматические N- и С-концевые сегменты и крупный внеклеточный домен, содержащий активный центр. Тем не менее, в то время как CD39, как правило, прикрепляется к мембране с помощью двух трансмембранных доменов на обоих концах молекулы, недавно также сообщалось, что в кровотоке человека и мыши обнаружена растворимая каталитически активная форма CD39 (Yegutkin et al., (2012) FASEB J. 26(9): 3875-3883). Несмотря на то, что описаны различные антитела против CD39, не показано, что какое-либо антитело способно ингибировать АТФазную активность растворимого внеклеточного белка CD39.
Сущность изобретения Авторы настоящего изобретения получили антитела, которые ингибируют ферментативную (АТФазную) активность растворимого (внеклеточного домена) белка CD39 человека. Эти антитела дополнительно связывают эпитоп, присутствующий на белке CD39 человека, экспрессируемом на поверхности клеток, в том числе опухолевых клеток, и эффективно ингибируют ферментативную (АТФазную) активность фермента CD39, связанного с клеточной мембраной (CD39, экспрессируемого на поверхности клеток). Эти антитела можно успешно использовать для достижения большей нейтрализации активности CD39 у индивида путем нейтрализации как мембраносвязанного, так и растворимого белка CD39 (внеклеточного домена белка в растворе), тем самым снижая иммуносупрессию, например, для лечения рака и/или инфекционного заболевания. Хотя ранее были описаны другие антитела против CD39, ингибирующие ферментативную (АТФазную) активность мембраносвязанного фермента CD39, эти антитела не ингибируют растворимый белок CD39, не связанный с клеточной мембраной.
Соответственно, в одном варианте реализации предложен антиген-связывающий домен или белок, содержащий такой домен, необязательно, антитело или фрагмент антитела, которые связываются с растворимым белком CD39 (sCD39) и ингибируют или нейтрализуют его АТФазную активность. В одном варианте реализации белок sCD39 не содержит двух трансмембранных доменов (т.е. трансмембранных доменов вблизи N- и С-концов), обнаруженных в мембраносвязанном CD39. В одном варианте реализации sCD39 представляет собой белок sCD39, не связанный с мембраной, обнаруживаемый в кровотоке, например, у человека. В одном варианте реализации sCD39 содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 44 (необязательно дополнительно содержащей С-концевой маркер или другую аминокислотную последовательность, не происходящую от CD39). В одном варианте реализации белок, антитело или фрагмент антитела ингибирует АТФазную активность sCD39 при инкубировании с sCD39 в растворе, например, в соответствии со способами или анализами, проводимыми в отсутствие клеток, как описано в настоящем документе (см., например, разделы "Примеры", "Способы"). В одном варианте реализации белок, антитело или фрагмент антитела специфично связывает белок CD39 человека как в растворимой (белок внеклеточного домена), так и в мембраносвязанной форме.
Безотносительно к теоретическим представлениям, некоторые антитела могут нейтрализовать мембраносвязанный CD39 путем ингибирования перемещения доменов мембраносвязанного CD39 (memCD39), однако не оказывают аналогичного влияния на активность растворимого белка CD39 (sCD39). Сообщалось, что memCD39 встречается в форме гомомультимера, в то время как sCD39 является мономером, и, кроме того, трансмембранные домены в memCD39 подвергаются динамическим перемещениям, которые лежат в основе функциональной связи с активным центром. Следовательно, в отличие от sCD39, memCD39 может находиться в условиях, когда возможна нейтрализация, опосредованная антителами. Одна из возможностей заключается в том, что для функциональной нейтрализации требуется использование двухвалентного антитела, которое одновременно связывается с двумя молекулами memCD39 (например, в составе гомомультимера memCD39).
Антитела согласно настоящему изобретению, нейтрализующие активность sCD39 (и memCD39), могут, помимо использования в качестве двухвалентных связывающих агентов, также быть эффективными в качестве одновалентных связывающих агентов, независимо от того, является ли их мишенью memCD39 в дополнение к sCD39. Следовательно, в одном варианте реализации предоставлен антиген-связывающий белок, одновалентно связывающийся с белком CD39 (sCD39 и/или memCD39) человека и нейтрализующий его ферментативную (АТФазную) активность. Антиген-связывающий белок необязательно может быть указан как связывающийся с единственным белком CD39 и/или несущий единственный антиген-связывающий домен, способный связываться с белком CD39. В одном варианте реализации предложен фрагмент антитела, необязательно F(ab)-фрагмент, одноцепочечное антитело, scFv, мультиспецифичное антитело, одновалентно связывающиеся с белком CD39 (sCD39 и/или memCD39) человека и нейтрализующее его ферментативную (АТФазную) активность. В одном варианте реализации CD39-нейтрализующий антиген-связывающий белок, одновалентно связывающийся с белком CD39 человека, представляет собой мультиспецифичный антиген-связывающий белок, например, мультиспецифичное антитело, биспецифичное антитело, триспецифичное антитело и т.д. В одном варианте реализации CD39-нейтрализующий антиген-связывающий белок, одновалентно связывающийся с белком CD39 человека, содержит первый (или единственный) антиген-связывающий домен, который связывает CD39 (sCD39 и/или memCD39), и второй антиген-связывающий домен, который связывает белок, не являющийся CD39.
Предпочтительно, в одном варианте реализации антитело содержит Fc-домен человека, модифицированный с целью снижения или, по существу, устранения связывания с Fcγ-рецептором человека, например, одним или более (или всеми) из CD16, CD32a, CD32b и CD64 человека. В одном аспекте CD39-ингибирующая активность антител не зависит от опосредованного ADCC, CDC или токсинами истощения CD39-экспрессирующих клеток. Эти антитела можно использовать в качестве «чистых» блокаторов CD39, обеспечивающих иммуномодулирующую активность.
В альтернативном варианте реализации можно получить связывающую молекулу, сохраняющую и/или опосредующую эффекторную функцию через свой Fc-домен. В одном варианте реализации антитело содержит Fc-домен человека, связывающийся с Fcγ-рецептором человека, например, одним или более (или всеми) из CD16, CD32a, CD32b и CD64 человека.
В еще одном варианте реализации Fc-область можно модифицировать с целью снижения связывания с Fcγ-рецептором, необязательно при сохранении связывания с одним или более из Fcγ-рецепторов человека, но снижении связывания с одним или более из других Fcγ-рецепторов человека.
В одном аспекте антитела специфично связывают CD39 в сосудах, например, антитело связывает полипептид, содержащий последовательность SEQ ID NO: 1, но не связывает полипептид секретируемой изоформы CD39, например, полипептид CD39-L2 и/или -L4. Антитело против CD39 необязательно специфично связывает CD39 в сосудах, например, антитело связывает полипептид, содержащий последовательность SEQ ID NO: 1, но не связывает мембраносвязанную изоформу CD39, например, полипептид CD39-L1 и/или -L3.
Антитела согласно настоящему изобретению могут ингибировать ферментативную активность мембраносвязанного белка CD39, экспрессируемого на поверхности клеток.
В одном аспекте CD39-ингибирующая активность антител не зависят от подавления CD39.
Антитела согласно настоящему изобретению могут, в дополнение к ингибированию растворимого CD39, ингибировать ферментативную активность мембраносвязанного белка CD39, экспрессируемого на поверхности клеток, с индукцией интернализации CD39 или без нее, а также со связыванием CD16 (FcγIII-рецептора) или без него и/или с направлением ADCC и/или CDC по отношению к клетке, экспрессирующей CD39, или без него. Антитела необязательно сохраняют Fc-домен и способность связывать FcRn человека.
Хотя антитела, функционирующие путем индукции ADCC и/или CDC, могут быть эффективными даже без полной нейтрализации/ингибирования АТФазной активности CD39, при условии, что с клеткой, экспрессирующей CD39, связывается достаточное количество антитела для индукции ADCC, нейтрализующие неистощающие антитела могут требовать более сильного ингибирования ферментативной активности АТФазы. В одном варианте реализации неистощающее антитело может обеспечить по меньшей мере 50%, 60%, 70%, 80% или 90% снижение АТФазной активности растворимого белка CD39 (например, согласно оценке способами, описанными в настоящем документе), необязательно в концентрации, совместимой с введением антитела человеку. В одном варианте реализации неистощающее антитело может обеспечить по меньшей мере 70%, 80%, 90% снижение АТФазной активности CD39-экспрессирующей клетки (например, оцениваемое по снижению образования АМФ CD39+-клеткой, например, В-клеткой, клеткой линии Ramos, измеренному способами, описанными в настоящем документе, необязательно в концентрации, совместимой с введением антитела человеку.
Эпитоп на CD39, с которым связываются антитела, присутствует на полипептидах CD39, экспрессируемых рядом клеток, например, раковыми клетками, CD4 Т-клетками, CD8 Т-клетками, В-клетками, трансфицированными клетками, и характеризуется связыванием с высоким сродством, согласно проточной цитометрии.
50
Антитело необязательно может характеризоваться значением ЕС, составляющим, согласно проточной цитометрии, не более 2 мкг/мл, не более 1 мкг/мл, не более 0,5 мкг/мл, не более 0,1 мкг/мл или не более 0,05 мкг/мл для связывания с клетками, экспрессирующими полипептид CD39 на своей поверхности. В одном варианте реализации клетки представляют собой клетки, модифицированные с целью экспрессии CD39 на их поверхности. В одном варианте реализации клетки представляют собой клетки, эндогенно экспрессирующие CD39 на своей поверхности, например, регуляторные Т-клетки (TReg), В-клетки, раковые клетки, клетки лимфомы (например, клетки Ramos), клетки лейкоза, клетки рака мочевого пузыря, клетки глиомы, клетки глиобластомы, клетки рака яичников, клетки меланомы, клетки рака предстательной железы, клетки рака щитовидной железы, клетки рака пищевода или клетки рака молочной железы.
В одном аспекте предложено антитело против CD39, способное: (а) ингибировать ферментативную активность мембраносвязанного белка CD39 (например, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1), экспрессируемого на поверхности клеток, и (b) ингибировать ферментативную активность растворимого белка CD39 (например, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 44). В одном варианте реализации антитела по существу не связываются (например, через свой Fc-домен) с Fcγ-рецепторами человека (например, CD16, CD32a, CD32b, CD64) и/или C1q и/или по существу не направляют ADCC и/или CDC по отношению клетке, экспрессирующей CD39. Антитела необязательно сохраняют Fc-домен и способность связывать FcRn человека.
В одном варианте реализации антитела вводят в количестве, эффективном для нейтрализации ферментативной активности sCD39 и/или memCD39 в течение желательного времени, например, 1 недели, 2 недель, месяца, до следующего введения антитела против CD39.
50
70
100
В одном варианте реализации антитела вводят с дозировкой и/или частотой, обеспечивающей концентрацию антитела в крови, равную по меньшей мере ЕС, ЕС или ЕС для ингибирования АТФазной активности белка sCD39, причем указанная концентрация необязательно поддерживается в течение по меньшей мере 1 недели, 2 недель, месяца или до следующего введения антитела против CD39.
В одном аспекте антитело связывает эпитоп на CD39, содержащий аминокислотный остаток (например, один, два или три из остатков), выбранный из группы, состоящей из R138, М139 и Е142 (по отношению к SEQ ID NO: 1).
В одном аспекте антитело против CD39 характеризуется пониженным связыванием (например, по существу, полной потерей способности к связыванию) с полипептидом CD39, содержащим мутацию по одному, двум или трем из остатков, выбранных из группы, состоящей из: R138, М139 и Е142 (по отношению к SEQ ID NO: 1) по сравнению с полипептидом CD39 дикого типа (полипептидом CD39 согласно SEQ ID NO: 1); мутантный полипептид CD39 необязательно содержит мутации R138A, М139А и E142K. В одном необязательном аспекте антитело не характеризуется потерей способности к связыванию ни с одним из мутантных полипептидов CD39 из Таблицы 1, кроме мутанта 19. В другом необязательном аспекте антитело против CD39 характеризуется пониженным связыванием (необязательно пониженным, но не по существу полной потерей способности к связыванию; или необязательно по существу полной потерей способности к связыванию) с полипептидом CD39, содержащим мутацию по одному, двум, трем или четырем из остатков, выбранных из группы, состоящей из: Q96, N99, Е143 и R147 (по отношению к SEQ ID NO: 1), по сравнению с полипептидом CD39 дикого типа (полипептидом CD39 согласно SEQ ID NO: 1); мутантный полипептид CD39 необязательно содержит мутации: Q96A, N99A, Е143А и R147E.
В одном аспекте антитело связывает эпитоп на CD39, содержащий аминокислотный остаток (например, один, два, три или четыре из остатков), выбранный из группы, состоящей из Q96, N99, Е143 и R147 (по отношению к SEQ ID NO: 1). В одном аспекте антитело характеризуется пониженным связыванием (например, по существу, полной потерей способности к связыванию) с мутантным полипептидом CD39, содержащим мутацию в 1, 2, 3 или 4 остатках, выбранных из группы, состоящей из Q96, N99, Е143 и R147 (по отношению к SEQ ID NO: 1), в каждом случае по сравнению со связыванием между антителом и CD39 полипептидом дикого типа, содержащим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1
В одном аспекте антитело связывает эпитоп на CD39, содержащий (а) аминокислотный остаток (например, один, два или три из остатков), выбранный из группы, состоящей из R138, М139 и Е142 (по отношению к SEQ ID NO: 1) и (b) аминокислотный остаток (например, один, два, три или четыре остатка), выбранный из группы, состоящей из Q96, N99, Е143 и R147.
В одном аспекте антитело против CD39 обладает пониженным (например, по существу, полной потерей способности) связыванию с (а) полипептидом CD39, содержащим мутацию в одном, двух, трех или четырех остатках, выбранных из группы, состоящей из: Q96, N99, Е143 и R147 (по отношению к SEQ ID NO: 1) и (b) полипептидом CD39, содержащим мутацию в одном, двух или трех остатках, выбранных из группы, состоящей из: R138, М139 и Е142 (по отношению к SEQ ID NO: 1), в каждом случае по сравнению с полипептидом CD39 дикого типа (полипептидом CD39 согласно SEQ ID NO: 1). Мутантный полипептид CD39 согласно пункту (а) необязательно содержит мутации: Q96A, N99A, Е143А и R147E. Мутантный полипептид CD39 согласно пункту (b) необязательно содержит мутации: R138A, М139А и E142K. Антитело необязательно не характеризуется потерей способности к связыванию с каким-либо из мутантных полипептидов CD39 из Таблицы 1, кроме мутантов 5 и 19.
В одном аспекте антитело связывает эпитоп на CD39, содержащий аминокислотный остаток (например, один, два, три или четыре из остатков), выбранный из группы, состоящей из K87, Е100 и D107 (по отношению к SEQ ID NO: 1)
В одном аспекте антитело против CD39 характеризуется пониженным связыванием (например, по существу, полной потерей способности к связыванию) с полипептидом CD39, содержащим мутацию в одном, двух, трех или четырех остатках, выбранных из группы, состоящей из: K87, Е100 и D107 (по отношению к SEQ ID NO: 1) по сравнению с полипептидом CD39 дикого типа (полипептидом CD39 согласно SEQ ID NO: 1); мутантный полипептид CD39 необязательно содержит мутации: K87A, Е100А и D107A. Антитело необязательно не характеризуется потерей способности к связыванию с каким-либо из мутантных полипептидов CD39 из Таблицы 1, кроме мутанта 15.
В одном аспекте антитело связывает эпитоп на CD39, содержащий аминокислотный остаток (например, один, два, три или четыре из остатков), выбранный из группы, состоящей из N371, L372, Е375, K376 и V377 (по отношению к SEQ ID NO: 1).
В одном аспекте антитело против CD39 характеризуется пониженным связыванием (например, по существу, полной потерей способности к связыванию) с полипептидом CD39, содержащим мутацию в одном, двух, трех, четырех или пяти остатках, выбранных из группы, состоящей из: N371, L372, Е375, K376 и V377 (по отношению к SEQ ID NO: 1) по сравнению с полипептидом CD39 дикого типа (полипептидом CD39 согласно SEQ ID NO: 1); мутантный полипептид CD39 необязательно содержит мутации: N371K, L372K, Е375А, K376G и V377S и вставку валина между остатками 376 и 377. Антитело необязательно не характеризуется потерей способности к связыванию с каким-либо из мутантных полипептидов CD39 из Таблицы 1, кроме мутанта 11.
50
В одном варианте реализации антитела, нейтрализующие CD39, в очищенной форме могут характеризоваться способностью вызывать снижение АТФазной активности белка sCD39 при бесклеточном анализе, необязательно ослабляя образование АМФ за счет sCD39 по меньшей мере на 70%, 80% или 90%; необязательно увеличивая уровень присутствующего АТФ (по сравнению с отрицательным контролем), например, согласно оценке с помощью анализов, описанных в настоящем документе. Например, ингибирование sCD39 можно оценивать путем определения количества единиц люминесценции, пропорционального количеству АТФ, присутствующего после инкубирования с антителом против CD39. В одном варианте реализации CD39-нейтрализующие антитела могут характеризоваться значением ЕС при ингибировании АТФазной активности белка sCD39, составляющим не более 1 мкг/мл, необязательно не более 0,5 мкг/мл, необязательно не более 0,1 мкг/мл.
Ингибирование АТФазной активности белка sCD39 необязательно определяют путем количественной оценки с использованием Cell Titer Glo™ (Promega), в бесклеточной версии анализа, при котором ряд доз тестируемого антитела инкубировали с растворимым рекомбинантным белком CD39 человека, описанным в разделах "Примеры", "Методы", в течение 1 часа при 37°С, где 20 мкМ АТФ добавляли в планшеты еще на 30 минут при 37°С перед добавлением реагента Cell Titer Glo™ (CTG), и количество испускаемого света количественно определяли с использованием люминометра Enspire™ после инкубирования в течение 5 минут в темноте (см., например, "Примеры", "Методы").
50
50
CD39-нейтрализующие антитела в очищенной форме необязательно могут дополнительно характеризоваться способностью вызывать снижение АТФазной активности CD39 в клетках, необязательно ослабляя образование АМФ клеткой, экспрессирующей CD39, по меньшей мере на 70%, 80% или 90%. В одном варианте реализации CD39-нейтрализующие антитела могут характеризоваться значением ЕС при ингибировании АТФазной активности (например, ЕС при ингибировании образования АМФ клеткой, экспрессирующей CD39) CD39, экспрессируемого клеткой, составляющим не более 1 мкг/мл, необязательно не более 0,5 мкг/мл, необязательно не более 0,1 мкг/мл.
Ингибирование АТФазной активности CD39, экспрессируемого в клетке, необязательно определяют путем оценки нейтрализации АТФазной активности в клетках линии Ramos посредством количественного определения АМФ, образованного в результате гидролиза АТФ (см., например, "Примеры", "Методы").
В одном аспекте нейтрализацию АТФазной активности клетки, экспрессирующей CD39, определяют путем приведения клеток, экспрессирующих CD39 (например, клеток лимфомы Ramos, используемых в настоящем документе, доступных для приобретения, например, в АТСС, учетный номер CRL-1596), в контакт с антителом и оценки продукции АМФ, например, с помощью масс-спектрометрии, где снижение уровня образующегося АМФ указывает на нейтрализацию АТФазной активности. В этом анализе антитело необязательно вызывает снижение уровня образующегося АМФ по меньшей мере на 70%, 80% или 90%. Антитело необязательно вызывает снижение внеклеточной АТФазной активности В-клеток по меньшей мере на 70, 80 или 90%.
В одном аспекте предложено нейтрализующее антитело против CD39, связывающее антигенную детерминанту, присутствующую как на sCD39, так и на CD39, экспрессируемом на поверхности клетки (memCD39).
В одном аспекте предложено нейтрализующее антитело против CD39, конкурирующее за связывание с эпитопом на CD39, связываемым антителом I-394, (например, конкурирующее за связывание с эпитопом на полипептиде CD39 с антителом, содержащим CDR или вариабельные области тяжелой и легкой цепи I-394).
В одном аспекте любого из вариантов реализации настоящего изобретения предложено антиген-связывающее соединение, связывающее один и тот же эпитоп и/или конкурирующее за связывание с полипептидом CD39 с монокпональным антителом I-394 (например, связывающее тот же самый эпитоп, и/или конкурирующее за связывание с полипептидом CD39 с антителом, содержащим CDR или вариабельные области тяжелой и легкой цепи I-394). В одном варианте реализации предложено антиген-связывающее соединение, связывающее тот же эпитоп, и/или конкурирующее за связывание с полипептидом CD39 с антителом, содержащим VH- и VL-области SEQ ID NO: 6 и 7, соответственно.
В одном варианте реализации антитело против CD39 связывается с эпитопом, содержащим один, два или три аминокислотных остатка, выбранных из группы, состоящей из аминокислотных остатков CD39, связываемых I-394.
В одном аспекте любого из вариантов реализации настоящего изобретения предложено антиген-связывающее соединение (например, антитело или фрагмент антитела), связывающее один и тот же эпитоп и/или конкурирующее за связывание с полипептидом CD39 с монокпональным антителом I-395 (например, связывающее тот же самый эпитоп, и/или конкурирующее за связывание с полипептидом CD39 с антителом, содержащим CDR или вариабельные области тяжелой и легкой цепи I-395). В одном аспекте любого из вариантов реализации настоящего изобретения предложено антиген-связывающее соединение, связывающее один и тот же эпитоп и/или конкурирующее за связывание с полипептидом CD39 с монокпональным антителом I-396 (например, связывающее тот же самый эпитоп, и/или конкурирующее за связывание с полипептидом CD39 с антителом, содержащим CDR или вариабельные области тяжелой и легкой цепи I-396). В одном аспекте любого из вариантов реализации настоящего изобретения предложено антиген-связывающее соединение, связывающее один и тот же эпитоп и/или конкурирующее за связывание с полипептидом CD39 с монокпональным антителом I-397 (например, связывающее тот же самый эпитоп, и/или конкурирующее за связывание с полипептидом CD39 с антителом, содержащим CDR или вариабельные области тяжелой и легкой цепи I-397). В одном аспекте любого из вариантов реализации настоящего изобретения предложено антиген-связывающее соединение, связывающее один и тот же эпитоп и/или конкурирующее за связывание с полипептидом CD39 с монокпональным антителом I-398 (например, связывающее тот же самый эпитоп, и/или конкурирующее за связывание с полипептидом CD39 с антителом, содержащим CDR или вариабельные области тяжелой и легкой цепи I-398). В одном аспекте любого из вариантов реализации настоящего изобретения предложено антиген-связывающее соединение, связывающее один и тот же эпитоп и/или конкурирующее за связывание с полипептидом CD39 с монокпональным антителом I-399 (например, связывающее тот же самый эпитоп, и/или конкурирующее за связывание с полипептидом CD39 с антителом, содержащим CDR или вариабельные области тяжелой и легкой цепи I-399).
H
L
В одном варианте реализации связывающая молекула (например, антитело или фрагмент антитела) содержит вариабельный домен тяжелой цепи (V), содержащий CDR1, 2 и 3 тяжелой цепи (например, описанные в настоящем документе) антитела I-394, I-395, I-396, I-397, I-398 или I-399, и домен вариабельной легкой цепи (V), содержащий CDR1, 2 и 3 легкой цепи (например, описанные в настоящем документе) соответствующего антитела I-394, I-395, I-396, I-397, I-398 или I-399 или аминокислотную последовательность, в которой CDR (или набор CDR тяжелой и/или легкой цепи) характеризуется по меньшей мере 70%, 80%, 90% или 95% идентичностью аминокислотной последовательности по отношению к указанному CDR (или указанному набору CDR тяжелой и/или легкой цепи). В одном аспекте любого из вариантов реализации в настоящем документе антитело может содержать тяжелую цепь, содержащую три CDR вариабельной области тяжелой цепи (VH) антитела I-394, I-395, I-396, I-397, I-398 или I-399 и легкую цепь, содержащую три CDR вариабельной области легкой цепи (VL) соответствующего антитела I-394, I-395, I-396, I-397, I-398 или I-399, причем CDR необязательно определяют в соответствии со схемами нумерации Kabat, Chothia или IMGT.
В одном аспекте предложено антитело, содержащее Fc-домен, модифицированный (по сравнению с Fc-доменом дикого типа того же изотипа) с целью снижения связывания между Fc-доменом и полипептидами CD16A, CD16B, CD32A, CD32B и/или CD64 человека, причем указанное антитело содержит: (i) тяжелую цепь, содержащую CDR 1, 2 и 3 вариабельной области тяжелой цепи согласно SEQ ID NO: 6, и (ii) легкую цепь, содержащую CDR 1, 2 и 3 вариабельной области легкой цепи согласно SEQ ID NO: 7. В одном аспекте Fc-домен модифицирован (по сравнению с Fc-доменом дикого типа того же изотипа) с целью снижения связывания между Fc-доменом и полипептидом C1q человека. В одном варианте реализации антитело содержит аминокислотную замену в константной области тяжелой цепи в любом одном, двух, трех, четырех, пяти или более остатках, выбранных из группы, состоящей из: 220, 226, 229, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 243, 264, 268, 297, 298, 299, 309, 310, 318, 320, 322, 327, 330 и 331 (нумерация ЕС по Kabat). В одном варианте реализации антитело содержит аминокислотную замену в константной области тяжелой цепи в любых трех, четырех, пяти или более остатках, выбранных из группы, состоящей из: 234, 235, 237, 322, 330 и 331.
В одном варианте реализации антитела вводят индивиду, страдающему раком, в количестве и с частотой, достаточной для нейтрализации активности sCD39 в микроокружении опухоли и/или в кровотоке. В одном варианте реализации антитела вводят в количестве и с частотой, достаточной для ослабления образования и/или концентрации аденозина в микроокружении опухоли. В одном варианте реализации антитела вводят в количестве и с частотой, достаточной для ослабления образования и/или концентрации АМФ и/или аденозина в микроокружении опухоли. В одном варианте реализации антитела вводят в количестве и с частотой, достаточной для нейтрализации активности CD39, экспрессируемого опухолевыми клетками. В одном варианте реализации антитела вводят в количестве и с частотой, достаточной для нейтрализации активности CD39, экспрессируемого лейкоцитами или лимфоцитами, например, CD4 Т-клетками, CD8 Т-клетками, TReg-кпетками и/или В-клетками.
Антитела можно применять для ингибирования CD39-опосредованного гидролиза АТФ, например, тем самым снижая концентрацию аденозина в микроокружении опухоли и/или в кровотоке. Таким образом, эти антитела можно применять для купирования иммуносупрессивного действия CD39 и/или аденозина на Т-клетки, В-клетки и другие клетки, которые экспрессируют рецепторы аденозина (рецепторы А2А), например, при лечении рака. В одном варианте реализации антитело против CD39 нейтрализует аденозин-опосредованное ингибирование пролиферации, продукции цитокинов, цитотоксичности и/или активности NFκB-b Т-кпетках.
Антитела можно применять для ингибирования продукции, количества и/или концентрации аденозина в микроокружении опухоли и/или в кровотоке.
В другом аспекте предложен способ лечения индивида, включающий введение индивиду (например, индивиду с заболеванием, опухолью и т.д.) терапевтически активного количества любого из антиген-связывающих соединений против CD39, описанных в настоящем документе. В одном аспекте предложен способ лечения индивида, причем указанный способ включает, по существу состоит из или состоит из введения индивиду (например, индивиду с заболеванием, опухолью и т.д.) терапевтически активного количества антиген-связывающего соединения согласно настоящему изобретению, ингибирующего полипептид CD39. В одном варианте реализации антиген-связывающее соединение против CD39 (например, антитело) вводят индивиду в комбинации со вторым терапевтическим агентом, необязательно терапевтическим агентом (например, антителом), который нейтрализует ингибирующую активность PD-1 человека, необязательно антителом против PD-1, необязательно антителом против PD-L1. В одном варианте реализации антиген-связывающее соединение против CD39 (например, антитело) вводят индивиду с раком и плохой реакцией или прогнозируемым наличием реакции на лечение агентом, нейтрализующим ингибирующую активность PD-1 человека. В одном варианте реализации антитело ингибирует полипептид CD39 при клеточном анализе. В одном варианте реализации соединение представляет собой неистощающее антитело (антитело, которое не истощает клетки, с которыми оно связывается, например антитело с молчащим Fc-фрагментом). Соединение необязательно связывается с полипептидами CD39 двухвалентным способом. Антитело необязательно представляет собой химерное, гуманизированное антитело или антитело человека. Антитело необязательно содержит константную область тяжелой цепи изотипа IgG (например, lgG1), модифицированную с целью устранения связывания с Fcγ-рецепторами человека (например, CD16A, CD16B, CD32A, CD32B и/или CD64).
В еще одном аспекте антитела, обладающие повышенной стабильностью и/или растворимостью в обычных фармацевтических композициях, можно с успехом объединять в фармацевтических композициях с другими антителами. В одном варианте реализации предложена фармацевтическая композиция, содержащая (i) антитело, ингибирующее полипептид CD39 и обладающее повышенной стабильностью, например, антитело, ингибирующее полипептид CD39, содержащее множество ароматических остатков в CDR, и модифицированный Fc-домен lgG1 человека, содержащий аминокислотную замену в любых трех, четырех, пяти или более остатках в положениях 234, 235, 237, 322, 330 и 331 по Kabat, и (ii) второе антитело изотипа IgG человека, причем указанное второе антитело необязательно обладает противораковой активностью. В одном варианте реализации указанное второе антитело способно индуцировать ADCC по отношению к клетке, к которой оно связывается, причем второе антитело необязательно связывается с антигеном, присутствующим на опухолевой клетке (опухолевым антигеном). В одном варианте реализации второе антитело способно нейтрализовать активность белка, с которым связывается его гипервариабельная область. В одном варианте реализации предложена фармацевтическая композиция, содержащая (i) антитело, ингибирующее полипептид CD39 и обладающее повышенной стабильностью, например, антитело, ингибирующее полипептид CD39, содержащее множество ароматических остатков в CDR, и модифицированный Fc-домен lgG1 человека, содержащий аминокислотную замену в любых трех, четырех, пяти или более остатках в положениях 234, 235, 237, 322, 330 и 331 по Kabat, и (ii) второе антитело изотипа IgG человека, причем указанное второе антитело нейтрализует ингибиторную активность PD-1 человека и необязательно является антителом против PD-1, необязательно является антителом против PD-1 человека. В одном варианте реализации и антитело против CD39, и второе антитело содержат модифицированный Fc-домен lgG1 человека, содержащий аминокислотную замену в любых трех, четырех, пяти или более остатках в положениях 234, 235, 237, 322, 330 и 331 по Kabat.
В одном аспекте предложен способ подавления гидролиза АТФ клеткой, экспрессирующей CD39 (например, лейкоцитом и/или опухолевой клеткой индивида), или способ нейтрализации ферментативной активности клеточного CD39, причем указанный способ включает: приведение CD39-экспрессирующей клетки в контакт с антителом согласно настоящему изобретению, ингибирующим CD39. В одном варианте реализации стадия приведения CD39-экспрессирующей клетки в контакт с антиген-связывающим соединением согласно настоящему изобретению включает введение индивиду терапевтически активного количества антитела, ингибирующего CD39. В одном варианте реализации индивид страдает онкологическим заболеванием.
В одном аспекте предоставлен способ снижения уровня аденозина, присутствующего в окружении опухоли (например, у индивида), причем указанный способ включает, по существу состоит из или состоит из: введения индивиду терапевтически активного количества антитела согласно настоящему изобретению, ингибирующего полипептид CD39. В одном варианте реализации индивид страдает онкологическим заболеванием.
50
70
100
50
70
100
50
70
100
В одном варианте реализации активное количество антитела, ингибирующего полипептид CD39, представляет собой количество, позволяющее достичь и/или поддерживать (например, до следующего введения антиген-связывающего соединения) концентрации в крови, составляющей по меньшей мере ЕС, необязательно ЕС, необязательно по существу ЕС для ингибирования CD39-опосредованного катаболизма АТФ до АМФ у индивида. В одном варианте реализации активное количество антиген-связывающего соединения, ингибирующего полипептид CD39, представляет собой количество, позволяющее достичь ЕС, необязательно ЕС, необязательно по существу ЕС для ингибирования CD39-опосредованного катаболизма АТФ в АМФ во внесосудистой ткани человека. В одном варианте реализации активное количество антиген-связывающего соединения, ингибирующего полипептид CD39, представляет собой количество, позволяющее достичь ЕС, необязательно ЕС, необязательно по существу ЕС для ингибирования CD39-опосредованного катаболизма АТФ в АМФ у человека. В одном варианте реализации активное количество антиген-связывающего соединения, ингибирующего полипептид CD39, составляет от 1 до 20 мг/кг массы тела. В одном варианте реализации активное количество вводят индивиду еженедельно, каждые две недели, ежемесячно или каждые два месяца.
Индивидом необязательно является человек, страдающий раком или имеющий склонность к раку. Индивидом необязательно является человек, страдающий раком или имеющий склонность к раку, характеризующемуся злокачественными клетками, экспрессирующими CD39, и/или присутствием (секрецией или выделением) растворимого белка CD39. Индивидом необязательно является человек, страдающий раком или имеющий склонность к раку, у которого имеются обнаруживаемые уровни циркулирующего растворимого внеклеточного белка CD39 или опухоль-инфильтрирующих лейкоцитов, экспрессирующих CD39.
D
50
50
-9
-10
-11
Антитела необязательно характеризуются сродством связывания (K) полипептида CD39 человека, составляющим менее (лучше чем) 10 М, предпочтительно менее 10 М или предпочтительно менее 10 М, и/или связыванием с CD39 человека со значением ЕС ниже (лучшим связыванием, чем) 1 мкг/мл, причем указанное антитело предпочтительно обладает ЕС не более 0,5 мкг/мл, необязательно не более 0,2 мкг/мл, необязательно не более 0,1 мкг/мл для связывания с клетками (например, опухолевыми клетками), экспрессирующими CD39 человека на поверхности клетки.
Антитела необязательно являются химерными, гуманизированными антителами или антителами человека.
50
Антитела необязательно характеризуются ЕС для нейтрализации ферментативной активности CD39 в CD39-экспрессирующих клетках (например, опухолевых клетках Ramos), составляющим менее (лучше чем) 1 мкг/мл, необязательно менее 0,5 мкг/мл.
В одном варианте реализации антитело представляет собой моноклональное антитело или его фрагмент, который сохраняет специфичность связывания и способность к нейтрализации ферментативной активности CD39. В одном варианте реализации антитело представляет собой антитело lgG1. Например, антитело может представлять собой антитело, содержащее Fc-домен изотипа lgG1 человека, модифицированный с целью ослабления связывания между Fc-доменом и Fcγ-рецептором (например, CD16). B одном варианте реализации антиген-связывающее соединение не содержит Fc-домена или содержит Fc-домен, не индуцирующий антитело-опосредованную клеточную цитотоксичность (ADCC) и/или CDC; антиген-связывающее соединение необязательно содержит Fc-домен, который не связывается с полипептидом FcγRIIIA (CD16). В одном варианте реализации Fc-домен (например, изотипа lgG1, lgG2, lgG3 или lgG4 человека) содержит аминокислотную модификацию (например, замену) по сравнению с Fc-доменом дикого типа, причем указанная замена снижает способность Fc-домена (или антител, содержащих его) связываться с Fcγ-рецептором (например, CD16) и/или связывать комплемент. В одном варианте реализации антиген-связывающее соединение не связано с токсичной группой.
Также в настоящем изобретении предложены нуклеиновые кислоты, кодирующие антитело человека или гуманизированное антитело или фрагмент антитела, обладающие любым из вышеуказанных свойств, вектор, содержащий такую нуклеиновую кислоту, клетка, содержащая такой вектор, и способ получения антитела человека против CD39, включающий культивирование такой клетки в условиях, подходящих для экспрессии антитела против CD39. Настоящее изобретение также относится к композициям, например, фармацевтически приемлемым композициям и наборам, содержащим такие белки, нуклеиновые кислоты, векторы и/или клетки и обычно один или более из дополнительных ингредиентов, которые могут являться активными ингредиентами или неактивными ингредиентами, способствующими составлению, доставке, стабильности или другим характеристикам композиции (например, различные носители). Настоящее изобретение также относится к различным новым и полезным способам получения и применения таких антител, нуклеиновых кислот, векторов, клеток, организмов и/или композиций, например, при модуляции CD39-опосредованных биологических активностей, например, при лечении заболеваний, связанных с ними, особенно рака.
В настоящем изобретении также предложен способ усиления активности лимфоцитов (например, Т-клеток) у нуждающегося в этом субъекта или восстановления активности лимфоцитов (например, Т-клеток), или способ ослабления аденозин-опосредованного ингибирования лимфоцитов (например, Т-клеток), причем указанный способ включает введение субъекту эффективного количества любой из вышеуказанных композиций. В одном варианте реализации субъект является пациентом, страдающим от рака. Например, пациент может страдать от солидной опухоли, например, рака ободочной и прямой кишки, рака почки, рака яичника, рака легкого, рака молочной железы или злокачественной меланомы. В качестве альтернативы, пациент может страдать от гемобластоза, например, острого миелоидного лейкоза, хронического миелоидного лейкоза, множественной миеломы или неходжкинской лимфомы.
50
50
70
100
100
В настоящем изобретении также предложен способ лечения заболевания у индивида, причем лечение включает введение индивиду антитела против CD39, нейтрализующего ферментативную активность CD39 по меньшей мере на один цикл введения, в котором антитело против CD39 вводят по меньшей мере однократно, необязательно по меньшей мере дважды, в количестве, позволяющем достичь и/или поддерживать между двумя последовательными введениями концентрацию антитела против CD39 в крови (сыворотке) или внесосудистой ткани (например, в окружении опухоли), которая соответствует по меньшей мере ЕС (например, значения ЕС, составляющего от 0,01 до 0,5 мкг/мл), необязательно ЕС или необязательно ЕС для нейтрализации ферментативной активности CD39 (например, значения ЕС, составляющего от 0,05 до 1 мкг/мл, от 0,1 до 1 мкг/мл). Антитело можно, например, вводить в количестве, обеспечивающем и/или поддерживающем концентрацию в кровотоке или во внесосудистой ткани (например, в окружении опухоли), равную по меньшей мере приблизительно 0,1 мкг/мл, 0,5 мкг/мл, 1 мкг/мл или 2 мкг/мл). Например, для достижения концентрации в внесосудистой ткани между 0,05 и 1 мкг/мл, или от 0,1 до 1 мкг/мл, антитело против CD39 вводят в количествах, позволяющих достичь концентрации антитела против CD39 в кровотоке между 0,5 и 10 мкг/мл, или между 1 и 10 мкг/мл. Антитело против CD39 необязательно вводят по меньшей мере дважды и в количествах, позволяющих поддерживать по меньшей мере вышеупомянутую концентрацию антитела против CD39 в течение по меньшей мере 1 недели, 2 недель, 3 недель, 4 недель, между двумя последовательными введениями антитела против CD39 и/или в течение всего цикла введения.
В настоящем изобретении также предложен способ лечения заболевания у индивида, причем лечение включает введение индивиду антитела против CD39, нейтрализующего ферментативную активность CD39 по меньшей мере на один цикл введения, в котором антитело против CD39 вводят по меньшей мере однократно, необязательно по меньшей мере дважды, в количестве, позволяющем достичь и/или поддерживать между двумя последовательными введениями антитела против CD39 концентрацию антитела против CD39 в крови или ткани, равную по меньшей мере 1 мкг/мл, необязательно по меньшей мере 10 мкг/мл, необязательно от 1 до 100 мкг/мл. Антитело против CD39 необязательно вводят по меньшей мере дважды и в количествах, позволяющих поддерживать постоянную концентрацию антитела против CD39 в крови или ткани, равную по меньшей мере 1 мкг/мл, необязательно по меньшей мере 10 мкг/мл, необязательно от 1 до 100 мкг/мл, в течение по меньшей мере 1 недели, 2 недель, 3 недель, 4 недель, между двумя последовательными введениями антитела против CD39 и/или в течение всего цикла введения.
Эти аспекты описаны более полно в настоящем документе; дополнительные аспекты, особенности и преимущества понятны из описания, представленного в настоящем документе.
Краткое описание чертежей
На Фигуре 1 показан типичный результат скрининга, на котором приведены антитела I-397, I-398 и I-399 по сравнению с положительным контролем - антителом I-394.
На Фигуре 2А показано, что антитела BY40, I-394, I-395 и I-396 ингибируют связанный с клеточной мембраной CD39, причем как I-394, так и I-395 демонстрируют более высокую активность при всех концентрациях, а также повышенную степень максимального ингибирования клеточного CD39 по сравнению с BY40. На Фигуре 2В показано, что антитела I-395 и I-396 ингибируют растворимый CD39 по сравнению с антителами отрицательного контроля (BY40) и положительного контроля (I-394).
На Фигуре 3А показано положение остатков, мутированных у мутантов 5 (М5), 15 (М15) и 19 (М19) на поверхности белка CD39. На Фигуре 3В показаны результаты связывания различных антител с мутантами 5, 15 и 19.
На Фигуре 4 показано связывание антитела I-394 с клетками, экспрессирующими CD39 человека, по данным проточной цитометрии. I-394 связывает клетки, экспрессирующие CD39 человека (CHO-huCD39), клетки, экспрессирующие CD39 яванского макака (CHO-cyCD39), и клетки лимфомы Ramos, но не клетки, экспрессирующие CD39 мыши (CHO-moCD39).
На Фигуре 5 показано, что антитело I-394 обладает высокой активностью при блокировании ферментативной активности CD39 в опухолевых (Ramos) клетках, в клетках, экспрессирующих CD39 человека (CHO-huCD39), и в клетках, экспрессирующих CD39 яванского макака (CHO-cyCD39), согласно количественной оценке единиц люминесценции, пропорциональной количеству присутствующего АТФ.
На Фигуре 6 показано, что антитело I-394 обладает высокой активностью при блокировании ферментативной активности растворимого рекомбинантного белка CD39 человека, согласно количественной оценке единиц люминесценции, пропорциональной количеству присутствующего АТФ.
На Фигуре 7 показано, что антитело I-394 связывается с CD39 человека, но не связывается с любыми изоформами CD39-L1, -L2, -L3 или -L4 человека, согласно твердофазному ИФА.
На Фигуре 8 показана экспериментальная процедура оценки влияния АТФ-опосредованной активации DC на активацию CD4 Т-клеток; АТФ-активированные DC промывали и затем инкубировали с аллогенными CD4 Т-клетками (соотношение 1 MoDC / 4 Т-клетки) с отслеживанием реакции смешанных лимфоцитов (MLR) в течение 5 дней. Активацию и пролиферацию Т-клеток анализировали посредством экспрессии CD25 и разбавления Cell Trace Violet с помощью проточной цитометрии.
На Фигуре 9 показана экспрессия HLA-DR на moDC, а на Фигуре 10 - экспрессия CD83 на moDC. На этих фигурах показано, что блокирующее антитело I-394 против CD39 и химические ингибиторы CD39 приводят к активации moDC в концентрациях 0,125 мМ, 0,25 мМ или 0,5 мМ. Однако антитело BY40 против CD39 или антитело против CD73 не могли способствовать АТФ-индуцированной активации дендритных клеток (DC), что указывает, что антитела не могли блокировать ферментативную активность в достаточной степени для избегания катаболизма АТФ. Обозначения (сверху вниз) соответствуют столбцам на графике слева направо.
На Фигуре 11, где показана экспрессия CD25, продемонстрировано, что MoDC, активированный в присутствии АТФ, способен индуцировать активацию и пролиферацию Т-клеток в анализе MLR; усиление АТФ-опосредованной активации MoDC с помощью блокирующего антитела I-394 против CD39 приводило к более выраженной пролиферации и активации Т-клеток. Обозначения (сверху вниз) соответствуют столбцам на графике слева направо.
Подробное описание изобретения
Определения
Термин «содержащий» в настоящем документе необязательно можно заменять на выражения «по существу состоящий из» или «состоящий из».
CD39 человека, также известный как «сосудистый» CD39, НТФДаза1, ENTPD1, АТФДаза и сосудистая АТФ-дифосфогидролаза, обладает АТФазной активностью. CD39 гидролизует внеклеточный АТФ и АДФ до АМФ, который затем преобразуется в аденозин другим ферментом, 5-штрих-нуклеотидазой. Аминокислотная последовательность зрелой полипептидной цепи «сосудистого» CD39 человека показана в Genbank под инвентарным номером Р49961, полное описание которой включено в настоящий документ посредством ссылки, и представляет собой:
CD39-L1 человека, также известный как НТФДаза-2 или ENTPD2, показан в Genbank под регистрационным номером NP_001237, полное описание которого включено в настоящий документ посредством ссылки, и представляет собой:
CD39-L2 человека также известен как НТФДаза-6 или ENTPD6; изоформа 1 ENTPD6 показана в Genbank под регистрационным номером NP_001238, полное описание которого включено в настоящий документ посредством ссылки, и представляет собой:
CD39-L3 человека также известен как НТФДаза-3 или ENTPD3; изоформа ENTPD3 показана в Genbank под инвентарным номером NP_001239, полное описание которого включено в настоящий документ посредством ссылки, и представляет собой:
CD39-L1 человека, также известный как НТФДаза-5 или ENTPD5, показан в Genbank под регистрационным номером NP_001240 (предшественник), полное описание которого включено в настоящий документ посредством ссылки, и представляет собой:
В данном контексте «нейтрализовать» или «нейтрализующий» при упоминании полипептида CD39 (например, «нейтрализовать CD39», «нейтрализовать активность CD39» или «нейтрализовать ферментативную активность CD39») относится к процессу, в котором происходит ингибирование АТФ-гидролизной (АТФазной) активности. Сюда входит, в частности, ингибирование CD39-опосредованного образования АМФ и/или АДФ, т.е. ингибирование CD39-опосредованного катаболизма АТФ до АМФ и/или АДФ. Для мембраносвязанного CD39 его можно измерить, например, в клеточном анализе, который измеряет способность тестируемого соединения непосредственно или косвенно ингибировать преобразование АТФ в АМФ и/или АДФ. Для растворимого CD39 его можно измерить путем инкубирования рекомбинантного растворимого CD39, описанного в настоящем документе, с тестируемым соединением и непосредственного или косвенного измерения преобразования АТФ в АМФ и/или АДФ. Например, можно оценивать исчезновение АТФ и/или образование АМФ, описанное в настоящем документе. Например, исчезновение АТФ и/или образование АМФ можно оценивать путем количественного определения единиц люминесценции, пропорционального количеству присутствующего АТФ. В одном варианте реализации препарат антитела вызывает по меньшей мере 60% снижение преобразования АТФ в АМФ, по меньшей мере 70% снижение преобразования АТФ в АМФ или по меньшей мере 80% или 90% снижение преобразования АТФ в АМФ согласно, например, анализам, описанным в настоящем документе (например, исчезновения АТР и/или образования АМФ).
Выражения «лечение рака» и т.п. с упоминанием агента, связывающего CD39 (например, антитела), могут включать: (а) способ лечения рака, причем указанный способ включает стадию введения (по меньшей мере, во время одного сеанса лечения) агента, связывающего CD39 (предпочтительно в материале фармацевтически приемлемого носителя) индивиду, млекопитающему, особенно человеку, нуждающемуся в таком лечении, в дозе, позволяющей лечить рак (терапевтически эффективном количестве), предпочтительно в дозе (количестве), указанном в настоящем документе; (b) применение агента, связывающего CD39, для лечения рака, или агента, связывающего CD39, для применения при указанном лечении (особенно у человека); (с) применение агента, связывающего CD39, для изготовления фармацевтического препарата для лечения рака, способ применения агента, связывающего CD39, для изготовления фармацевтического препарата для лечения рака, необязательно включающий смешивание агента, связывающего CD39, с фармацевтически приемлемым носителем или фармацевтическим препаратом, содержащим эффективную дозу агента, связывающего CD39, подходящую для лечения рака; или (d) любую комбинацию а), b) и с) в соответствии с сущностью изобретения, пригодного для патентования в стране, где подана эта заявка.
В настоящем документе термин «антиген-связывающий домен» относится к домену, содержащему трехмерную структуру, способную иммуноспецифично связываться с эпитопом. Таким образом, в одном варианте реализации указанный домен может содержать гипервариабельную область, необязательно VH- и/или VL-домен цепи антитела, необязательно по меньшей мере VH-домен. В еще одном варианте реализации связывающий домен может содержать по меньшей мере одну область, определяющую комплементарность (CDR) цепи антитела. В еще одном варианте реализации связывающий домен может содержать полипептидный домен из неиммуноглобулинового каркаса.
L
H
В настоящем документе термин «антитело» относится к поликлональным и монокпональным антителам. В зависимости от типа константного домена в тяжелых цепях антитела относятся к одному из пяти основных классов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM. Некоторые из них дополнительно подразделяются на подклассы или изотипы, например, lgG1, lgG2, lgG3, lgG4 и т.п. Типичная структурная единица иммуноглобулина (антитела) содержит тетрамер. Каждый тетрамер состоит из двух идентичных пар полипептидных цепей, каждая пара содержит одну «легкую» (приблизительно 25 кДа) и одну «тяжелую» цепь (приблизительно 50-70 кДа). N-конец каждой цепи определяет вариабельную область размером приблизительно от 100 до 110 или более аминокислот, которая в первую очередь ответственна за распознавание антигена. Термины "вариабельная область легкой цепи" (V) и "вариабельная область тяжелой цепи" (V) относятся к этим легким и тяжелым цепям, соответственно. Константные домены тяжелой цепи, соответствующие различным классам иммуноглобулинов, называются «альфа», «дельта», «эпсилон», «гамма» и «мю», соответственно. Субъединичная структура и трехмерные конфигурации различных классов иммуноглобулинов хорошо известны. IgG является типичным классом антител, используемых в настоящем документе, поскольку они являются наиболее распространенными антителами в физиологической ситуации, и их легче всего получить в лабораторных условиях. Антитело необязательно представляет собой моноклональное антитело. Конкретными примерами антител являются гуманизированные, химерные антитела, антитела человека или иные подходящие для человека антитела. «Антитела» также включают любые фрагменты или производные любого из описанных в настоящем документе антител.
Термин «специфично связывается с» означает, что антитело может предпочтительно связываться в конкурентном анализе связывания с партнером по связыванию, например, CD39, что оценивают с использованием рекомбинантных форм белков, их эпитопов, либо нативных белков, присутствующих на поверхности выделенной клетки-мишени. Анализы конкурентного связывания и другие способы определения специфичного связывания дополнительно описаны ниже и хорошо известны в данной области техники.
Когда говорят, что антитело «конкурирует с» конкретным монокпональным антителом (например, антителом I-394, I-395, I-396, I-397, I-398 или I-399), это означает, что антитело конкурирует с монокпональным антителом в анализе связывания с использованием рекомбинантных молекул CD39 либо поверхностно экспрессируемых молекул CD39. Например, если тестируемое антитело ослабляет связывание референсного антитела с полипептидом CD39 или экспрессирующей CD39 клеткой в анализе связывания, говорят, что антитело «конкурирует», соответственно, с референсным антителом.
a
Термин «сродство» в настоящем документе означает силу связывания антитела с эпитопом. Сродство антитела определяется константой диссоциации Kd, определяемой как [Ab] × [Ag] / [Ab-Ag], где [Ab-Ag] - молярная концентрация комплекса антитело-антиген, [Ab] - молярная концентрация несвязанного антитела, а [Ag] - молярная концентрация несвязанного антигена. Константа сродства K определяется как 1/Kd. Методы определения сродства мАт можно найти в источниках Harlow, et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988), Coligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993), и Muller, Meth. Enzymol. 92:589-601 (1983), которые полностью включены в настоящий документ посредством ссылок. Одним стандартным методом определения сродства мАт, хорошо известным в данной области техники, является использование скрининга на основе поверхностного плазмонного резонанса (ППР) (например, путем анализа с помощью аналитического устройства ППР BIAcore™).
В контексте настоящего документа «детерминанта» обозначает сайт взаимодействия или связывания с полипептидом.
Термин «эпитоп» относится к антигенной детерминанте и представляет собой область на антигене, с которой связывается антитело. Белковый эпитоп может содержать аминокислотные остатки, непосредственно участвующие в связывании, а также аминокислотные остатки, которые эффективно блокируются специфичным антиген-связывающим антителом или пептидом, т.е. аминокислотные остатки в «отпечатке» антитела. Это самая простая форма или наименьшая структурная область на сложной молекуле антигена, которую можно объединить, например, с антителом или рецептором. Эпитопы могут быть линейными или конформационными/структурными. Термин «линейный эпитоп» определяется как эпитоп, состоящий из аминокислотных остатков, идущих друг за другом в линейной последовательности аминокислот (первичная структура). Термин «конформационный или структурный эпитоп» определяется как эпитоп, состоящий из аминокислотных остатков, не все из которых расположены друг рядом с другом, и, таким образом, представляет собой отдельные фрагменты линейной последовательности аминокислот, которые сближаются друг с другом при фолдинге молекулы (вторичные, третичные и/или четвертичные структуры). Конформационный эпитоп зависит от трехмерной структуры. Поэтому термин «конформационный» часто используют взаимозаменяемо с термином «структурный».
Термин «интернализация», используемый взаимозаменяемо с термином «внутриклеточная интернализация», относится к молекулярным, биохимическим и клеточным явлениям, связанным с процессом транслокации молекулы с внеклеточной поверхности клетки на внутриклеточную поверхность клетки. Процессы, ответственные за внутриклеточную интернализацию молекул, хорошо известны и могут включать, в числе прочего, интернализацию внеклеточных молекул (например, гормонов, антител и низкомолекулярных органических соединений); мембраноассоциированных молекул (например, рецепторов клеточной поверхности); и комплексов мембраноассоциированных молекул, связанных с внеклеточными молекулами (например, лиганда, связанного с трансмембранным рецептором, или антитела, связанного с мембраноассоциированной молекулой). Таким образом, «индукция и/или усиление интернализации» включает явления, при которых инициируется внутриклеточная интернализация и/или увеличивается скорость и/или степень внутриклеточной интернализации.
Термин «агент» в настоящем документе используется для обозначения химического соединения, смеси химических соединений, биологической макромолекулы или экстракта, изготовленного из биологических материалов. Термин «терапевтический агент» относится к агенту, который обладает биологической активностью.
Для целей настоящего изобретения «гуманизированное» антитело или антитело «человека» относится к антителу, в котором константная и вариабельная каркасная область одного или более иммуноглобулинов человека объединены со связывающей областью, например, CDR, иммуноглобулина животного происхождения. Такие антитела предназначены для поддержания специфичности связывания антитела животного, не являющегося человеком, из которого получены связывающие области, и предотвращения иммунного ответа против антитела животного, не являющегося человеком. Такие антитела можно получить от трансгенных мышей или других животных, «сконструированных» для производства специфичных антител человека в ответ на стимуляцию антигеном (см., например, Green et al. (1994) Nature Genet 7:13; Lonberg et al. (1994) Nature 368:856; Taylor et al. (1994) Int Immun 6:579, содержание которых полностью включено в настоящий документ посредством ссылки). Полностью человеческое антитело также можно сконструировать с использованием способов генетической или хромосомной трансфекции, а также с помощью технологии фагового дисплея, которые известны в данной области техники (см., например, McCafferty et al. (1990) Nature 348:552-553). Антитела человека также могут образовывать В-клетки, активированные in vitro (см., например, патенты США №5567610 и 5229275, полностью включенные в настоящий документ посредством ссылок).
«Химерное антитело» представляет собой молекулу антитела, в которой (а) константная область или ее фрагмент изменена, замещена или заменена таким образом, что сайт связывания антигена (вариабельная область) связан с константной областью другого или измененного класса антитела и/или вида животного, или константной областью антитела, обладающей другой эффекторной функцией, или совершенно другой молекулой, которая придает химерному антителу новые свойства, например, ферментом, токсином, гормоном, фактором роста, лекарственным средством и т.д.; или (b) вариабельная область или ее фрагмент изменена, замещена или заменена вариабельной областью, обладающей другой или модифицированной антигенной специфичностью.
Термин «гипервариабельная область» в настоящем документе относится к аминокислотным остаткам антитела, которые отвечают за связывание антигена. Гипервариабельная область обычно содержит аминокислотные остатки из «области, определяющей комплементарность» или «CDR» (например, остатки 24-34 (L1), 50-56 (L2) и 89-97 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 31-35 (Н1), 50-65 (Н2) и 95-102 (Н3) в вариабельном домене тяжелой цепи; Kabat et al. 1991) и/или остатки из "гипервариабельной петли" (например, остатки 26-32 (L1), 50-52 (L2) и 91-96 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 26-32 (Н1), 53-55 (Н2) и 96-101 (Н3) в вариабельном домене тяжелой цепи; Chothia and Lesk, J. Mol. Biol 1987; 196: 901-917), или аналогичной системы для определения важнейших аминокислот, ответственных за связывание антигена. Как правило, нумерация аминокислотных остатков в этой области выполняется способом, описанным в Kabat et al., выше. Такие фразы, как «положение по Kabat», «нумерация остатков вариабельного домена согласно Kabat» и «в соответствии с Kabat» в настоящем документе относятся к этой системе нумерации для вариабельных доменов тяжелой цепи или вариабельных доменов легкой цепи. При использовании системы нумерации по Kabat фактическая линейная аминокислотная последовательность пептида может содержать меньшее количество аминокислот или дополнительные аминокислоты, соответствующие укорочению или вставки в FR или CDR вариабельного домена. Например, вариабельный домен тяжелой цепи может включать вставку единственной аминокислоты (остатка 52а по Kabat) после остатка 52 CDR Н2 и вставки остатков (например, остатков 82а, 82b, 82с и т.д. по Kabat) после остатка FR 82 тяжелой цепи. Нумерацию остатков по Kabat можно определить для данного антитела путем выравнивания в областях гомологии последовательности антитела со «стандартной» последовательностью, пронумерованной по Kabat.
Под «каркасными» или «FR» остатками в настоящем документе, подразумевается область вариабельного домена антитела, за исключением областей, определенных как CDR. Каркас вариабельного домена каждого антитела можно дополнительно разделить на смежные области, разделенные CDR (FR1, FR2, FR3 и FR4).
Термины «Fc-домен», «Fc-фрагмент» и «Fc-область» относятся к С-концевому фрагменту тяжелой цепи антитела, например, от приблизительно аминокислоты (АК) 230 до приблизительно АК 450 γ (гамма) тяжелой цепи человека или аналогичной ей последовательности в тяжелых цепях антител других типов (например, α, δ, ε и μ для антител человека) или их природного аллотипа. Если не указано иное, в настоящем описании используется общепринятая нумерация аминокислот по Kabat для иммуноглобулинов (см. Kabat et al. (1991) Sequences of Protein of Immunological Interest, 5th ed., United States Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD).
Термины «выделенный», «очищенный» или «биологически чистый» относятся к материалу, который по существу или в основном не содержит компонентов, которые обычно сопровождают его в естественном состоянии. Чистоту и однородность обычно определяют с использованием методик аналитической химии, например, электрофореза в полиакриламидном геле или высокоэффективной жидкостной хроматографии. Белок, который является преобладающим видом, присутствующим в препарате, является по существу очищенным.
Термины «полипептид», «пептид» и «белок» используются в настоящем документе взаимозаменяемо для обозначения полимера из аминокислотных остатков. Эти термины применяют к аминокислотным полимерам, в которых один или несколько аминокислотных остатков представляют собой искусственное химическое соединение, имитирующее соответствующую природную аминокислоту, а также к природным аминокислотным полимерам и не аминокислотным полимерам, не встречающимся в природе.
Термин «рекомбинантный» при упоминании, например, клетки или нуклеиновой кислоты, белка или вектора, указывает на то, что клетка, нуклеиновая кислота, белок или вектор модифицированы посредством введения гетерологичной нуклеиновой кислоты или белка или изменения нативной нуклеиновой кислоты или белка, или то, что клетка получена из клетки, модифицированной таким образом. Таким образом, например, рекомбинантные клетки экспрессируют гены, не встречающиеся в нативной (нерекомбинантной) форме клетки, или экспрессируют нативные гены, которые в ином случае экспрессируются аномальным образом, в недостаточном количестве или вообще не экспрессируются.
В данном контексте термин антитело, «связывающее» полипептид или эпитоп, обозначает антитело, связывающее указанную детерминанту с определенной специфичностью и/или сродством.
Термин «идентичность» или «идентичный» в отношении сравнения последовательностей двух или более полипептидов относится к степени родства последовательностей между полипептидами, определяемой по количеству совпадений между цепями из двух или более аминокислотных остатков. «Идентичность» измеряет процент идентичных совпадений между меньшей из двух или более последовательностей с выравниванием пропусков (при их наличии), выполняемым с помощью конкретной математической модели или компьютерной программы (то есть «алгоритмов»). Идентичность родственных полипептидов легко рассчитать известными способами. Такие способы включают способы, описанные в Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991; и Carillo et al., SIAM J. Applied Math. 48, 1073 (1988), но не ограничиваются ими.
Способы определения идентичности предназначены для получения наибольшего соответствия между протестированными последовательностями. Способы определения идентичности описаны в общедоступных компьютерных программах. Способы на основе компьютерных программ для определения идентичности между двумя последовательностями включают пакет программ GCG, в том числе GAP (Devereux et al., Nucl. Acid. Res. 12, 387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.), В LASTP, BLASTN и FASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-410 (1990)). Общедоступную программу BLASTX можно получить в Национальном центре биотехнологической информации (NCBI) и других источниках (BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul et al., выше). Кроме того, для определения идентичности также можно использовать общеизвестный алгоритм Смита-Уотермана.
Продукция антител
Домен, связывающий антиген CD39, или белок (например, антитело или фрагмент антитела), содержащий такой домен, который можно использовать для лечения рака и/или других заболеваний (например, инфекционного заболевания), связывает растворимый полипептид CD39 человека, например, полипептид CD39 человека, лишенный двух трансмембранных доменов присутствующих в мембраносвязанном CD39 вблизи N- и С-концов, например, белок с внеклеточным доменом, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 44. В одном варианте реализации агент ингибирует АТФазную активность CD39. В одном варианте реализации антитело ингибирует CD39-опосредованное образование аденозина. В одном варианте реализации изобретения антитело ингибирует CD39-опосредованный катаболизм АТФ до АМФ. В одном варианте реализации антитело ингибирует аденозин-опосредованное ингибирование активности лимфоцитов (например, Т-клеток). В одном аспекте антитело выбрано из полноразмерного антитела, фрагмента антитела и молекулы, полученной из синтетического или полусинтетического антитела.
Антитела, эффективно ингибирующие ферментативную (АТФазную) активность растворимого (и необязательно мембраносвязанного) белка CD39, могут в одном варианте реализации иммобилизовать или ограничивать движение домена растворимого (и необязательно мембраносвязанного) белка CD39 в одной из его конформаций, тем самым предотвращая гидролиз его субстрата. Антитела могут выполнять это путем одновременного связывания с С- и N-концевыми доменами растворимого (и необязательно связанного с мембраной) CD39.
В одном варианте реализации домен, связывающий антиген CD39, или антиген-связывающий белок, который содержит антиген-связывающий домен (например, антитело или фрагмент антитела, мультиспецифичный связывающий белок, биспецифичное антитело и т.д.), содержит области, определяющие комплементарность (CDR), и каркасные области (FR). Антиген-связывающие домены можно сконструировать или модифицировать, придавая им желательные и/или улучшенные свойства.
В одном варианте реализации белок, связывающий антиген CD39, способен связывать и ингибировать активность полипептида CD39 человека, причем антиген-связывающий белок содержит VH и VL, каждый из которых содержит каркас (например, каркас, содержащий аминокислотную последовательность человеческого происхождения) и CDR1, CDR2 и CDR3. В одном варианте реализации антиген-связывающий белок ограничивает перемещение домена CD39 при связывании с CD39. Каркас VH и/или VL (например, FR1, FR2, FR3 и/или FR4) необязательно имеет человеческое происхождение.
L
H
H
L
H
В определенном варианте реализации связывающие молекулы и домены можно получать из вариабельных доменов иммуноглобулина, например, в форме ассоциированных V- и V-доменов, находящихся на двух полипептидных цепях, или одноцепочечного антиген-связывающего домена, например, scFv, V-домен, V-домен, dAb, домен V-NAR или VH-домен.
В одном аспекте агент, связывающий CD39, представляет собой антитело, выбранное из полностью человеческого антитела, гуманизированного антитела и химерного антитела.
В одном аспекте агент представляет собой фрагмент антитела, включающего константный или Fc-домен, полученный из константного или Fc-домена lgG1 человека, например, модифицированный, как дополнительно описано в настоящем документе.
HH
В одном аспекте агент содержит фрагмент антитела, выбранный из Fab-фрагмента, Fab'-фрагмента, Fab'-SH-фрагмента, F(ab)2-фрагмента, F(ab’)2-фрагмента, Fv-фрагмента, lg тяжелой цепи (lg ламы или верблюда), V-фрагмента, однодоменного FV и фрагмента одноцепочечного антитела. В одном аспекте агент содержит молекулу, полученную из синтетического или полусинтетического антитела, выбранную из scFV, dsFV, миниантитела, диатела, триатела, каппа-тела, IgNAR; и мультиспецифичного (например, биспецифичного) антитела. Агент необязательно может дополнительно содержать Fc-домен.
В одном аспекте антитело находится в по меньшей мере частично очищенной форме.
В одном аспекте антитело находится в по существу выделенной форме.
Антитела можно получить различными способами, известными в данной области техники. В одном варианте реализации антитела согласно настоящему изобретению получают путем отбора из библиотеки антител (например, из библиотеки фагового дисплея). В еще одном варианте реализации антитела получают иммунизацией животного, не являющегося человеком, предпочтительно мыши, иммуногеном, содержащим полипептид CD39, предпочтительно растворимым полипептидом внеклеточного домена CD39 человека. Полипептид CD39 необязательно может представлять собой или содержать фрагмент или производное полноразмерного полипептида CD39, обычно иммуногенного фрагмента, т.е. фрагмента полипептида, содержащего эпитоп, экспонированный на поверхности клеток, экспрессирующих полипептид CD39. Такие фрагменты обычно содержат по меньшей мере приблизительно 7 последовательных аминокислот последовательности зрелого полипептида, еще более предпочтительно - по меньшей мере приблизительно 10 последовательных аминокислот этого полипептида. Фрагменты, как правило, в основном происходят от внеклеточного домена рецептора. В одном варианте реализации иммуноген содержит полипептид CD39 дикого типа человека в липидной мембране, обычно на поверхности клетки. В конкретном варианте реализации иммуноген включает интактные клетки, в частности, интактные клетки человека, необязательно обработанные или лизированные. Веще одном варианте реализации полипептид представляет собой рекомбинантный полипептид CD39.
Стадию иммунизации млекопитающего, не являющегося человеком, антигеном можно осуществить любым способом стимуляции продукции антител у мыши, хорошо известным в данной области техники (см., например, источник Е. Harlow and D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1988), полное описание которого включено в настоящий документ посредством ссылки). Выделение гибридом, продуцирующих антитела, хорошо известно и может быть выполнено любым способом, хорошо известным в данной области техники.
Антитела также можно получать путем отбора из комбинаторных библиотек иммуноглобулинов, как описано, например, в источнике (Ward et al. Nature, 341 (1989) p. 544, полное описание которого включено в настоящий документ посредством ссылки).
Идентификацию одного или более антител, которые связываются с CD39, особенно с в значительной степени или по существу той же самой областью на CD39, что и моноклональное антитело I-394, можно легко выполнить с помощью любого из множества иммунологических скрининговых анализов, в которых можно оценивать конкуренцию антител. Многие такие анализы широко используются и хорошо известны в данной области техники (см., например, патент США №5660827, выданный 26 августа 1997 г., специально включенный в настоящий документ посредством ссылки).
Например, если исследуемые антитела получены от разных животных или даже относятся к другому изотипу lg, можно использовать простой конкурентный анализ, в котором контрольные (например, I-394) и тестируемые антитела смешивают (или предварительно адсорбируют) и наносят на образец, содержащий полипептиды CD39. Протоколы, основанные на вестерн-блоттинге и использовании анализа BIACORE, подходят для применения в таких конкурентных исследованиях.
В некоторых вариантах реализации предварительно смешивают контрольные антитела (например, I-394) с различными количествами тестируемых антител (например, в соотношении приблизительно 1:10 или приблизительно 1:100) в течение некоторого времени перед нанесением на образец антигена CD39. В других вариантах реализации контрольные антитела и различные количества тестируемых антител можно просто смешивать во время воздействия на образец антигена CD39. При условии возможности различать связанные и свободные антитела (например, используя методики разделения или отмывки для удаления несвязанных антител) и I-394 и тестируемые антитела (например, используя видоспецифичные или изотип-специфичные вторичные антитела или путем специфичного мечения I-394 обнаружимой меткой) можно определить, ослабляют ли тестируемые антитела связывание I-394 с антигенами. Связывание (меченых) контрольных антител в отсутствие полностью несоответствующего антитела может использоваться как высокое контрольное значение. Низкое контрольное значение можно получить путем инкубирования меченых (I-394) антител с немечеными антителами точно такого же типа (I-394), при котором будет происходить конкуренция, ослабляющая связывание меченых антител. В тестовом анализе значительное снижение реакционной способности меченого антитела в присутствии тестируемого антитела указывает на тестируемое антитело, которое может распознавать ту же область или эпитоп на CD39. Можно выбрать тестируемое антитело, которое ослабляет связывание I-394 с антигенами CD39 по меньшей мере приблизительно на 50%, например, по меньшей мере приблизительно на 60% или, более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно на 80% или 90% (например, приблизительно на 65-100%), при любом соотношении "I-394:тестируемое антитело" от приблизительно 1:10 до приблизительно 1:100. Такое тестируемое антитело предпочтительно ослабляет связывание I-394 с антигеном CD39 по меньшей мере приблизительно на 90% (например, приблизительно на 95%).
Конкуренцию также можно оценивать, например, с помощью проточной цитометрии. В таком тесте клетки, несущие данный полипептид CD39, можно сначала инкубировать, например, с I-394, а затем с тестируемым антителом, меченным флуорохромом или биотином. Считается, что антитело конкурирует с I-394, если связывание, полученное при предварительном инкубировании с насыщающим количеством соответствующего I-394, составляет приблизительно 80%, предпочтительно приблизительно 50%, приблизительно 40% или менее (например, приблизительно 30%, 20% или 10%) от связывания (измеренного по флуоресценции), полученного для данного антитела без предварительного инкубирования с соответствующим I-394. В качестве альтернативы, считается, что антитело конкурирует с I-394, если связывание, полученное с использованием меченого (флуорохромом или биотином) антитела I-394 на клетках, предварительно инкубированных с насыщающим количеством тестируемого антитела, составляет приблизительно 80%, предпочтительно приблизительно 50%, приблизительно 40% или менее (например, приблизительно 30%, 20% или 10%) от связывания, полученного без предварительного инкубирования с тестируемым антителом.
Можно также использовать простой конкурентный анализ, в котором тестируемое антитело предварительно адсорбируют и наносят в насыщающей концентрации на поверхность, на которой иммобилизован антиген CD39. Поверхность в простом конкурентном анализе предпочтительно представляет собой чип BIACORE (или другой носитель, подходящий для анализа посредством поверхностного плазмонного резонанса). Затем контрольное антитело (например, I-394) приводят в контакт с поверхностью в концентрации, насыщающей CD39, и измеряют связывание контрольного антитела с CD39 и поверхностью. Это связывание контрольного антитела сравнивают со связыванием контрольного антитела с CD39-содержащей поверхностью в отсутствие тестируемого антитела. В тестовом анализе значительное снижение связывания CD39-содержащей поверхности контрольным антителом в присутствии тестируемого антитела указывает на то, что тестируемое антитело «перекрестно реагирует» с контрольным антителом. Любое тестируемое антитело, которое ослабляет связывание контрольного антитела (например, I-394) с антигеном CD39 по меньшей мере приблизительно на 30% или более, предпочтительно приблизительно на 40%, можно считать антителом, которое конкурирует с контрольным антителом (например, I-394). Такое тестируемое антитело предпочтительно ослабляет связывание контрольного антитела (например, I-394) с антигеном CD39 по меньшей мере приблизительно на 50% (например, по меньшей мере приблизительно на 60%, по меньшей мере приблизительно на 70% или более). Следует принимать во внимание, что порядок контрольных и тестируемых антител может быть обратным: т.е. в конкурентном анализе можно сначала связать контрольное антитело с поверхностью, а затем привести тестируемое антитело в контакт с поверхностью. Предпочтительно, антитело, обладающее более высоким сродством к антигену CD39, связывается с поверхностью первым, так как ожидается, что величина ослабления связывания, наблюдаемого для второго антитела (при условии, что антитела перекрестно реагируют), будет большей. Дополнительные примеры таких анализов приведены, например, в статье Saunal (1995) J. Immunol. Methods 183: 33-41, описание которой включено в настоящий документ посредством ссылки.
В одном варианте реализации антитела проходят валидацию посредством иммуноанализа для проверки их способности связываться с растворимым CD39 и/или CD39-экспрессирующими клетками, например, злокачественными клетками. Например, выполняют анализ крови или биопсию опухоли и выделяют растворимый CD39 и/или собирают опухолевые клетки. Затем выполняют оценку способности данного антитела связываться с sCD39 и/или клетками с использованием стандартных способов, хорошо известных специалистам в данной области техники. Антитела могут связываться, например, со значительной долей (например, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или более) клеток, заведомо экспрессирующих CD39, например, опухолевых клеток, полученных у значительной доли индивидов или пациентов (например, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% или более). Антитела можно применять в диагностических целях для определения наличия или уровня sCD39 и/или злокачественных клеток у пациента, например, в качестве биомаркера для оценки того, подходит ли пациент для лечения с применением агента против CD39, или для применения в терапевтических способах, описанных в настоящем документе. Для оценки связывания антител с sCD39 и/или клетками антитела можно непосредственно или косвенно метить. При косвенном мечении обычно добавляют вторичное меченое антитело.
Определение способности связывания антитела в области эпитопа можно выполнить способами, известными специалисту в данной области техники. В качестве одного из примеров таких способов картирования/исследования характеристик, можно определить область эпитопа антитела против CD39 посредством футпринтинга с использованием химической модификации экспонированных аминогрупп/карбоксильных групп в белке CD39. Одним конкретным примером такой методики футпринтинга является использование HXMS (водород-дейтериевого обмена, обнаруживаемого с помощью масс-спектрометрии), при котором происходит водород/дейтериевый обмен протонов амидных групп белков рецептора и лиганда, связывание и обратный обмен, причем амидные группы каркаса молекулы, участвующие в связывании белков, оказываются защищены от обратного обмена и, следовательно, остаются дейтерированными. В данный момент можно выявить соответствующие области с помощью пептического протеолиза, быстрого высокопроизводительного жидкостного хроматографического разделения на микроколонке и/или масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением. См., например, Ehring Н, Analytical Biochemistry, Vol. 267 (2) pp. 252-259 (1999) Engen, J.R. and Smith, D.L. (2001) Anal. Chem. 73, 256A-265A. Другим примером подходящей методики выявления эпитопов является ядерно-магнитно-резонансное (ЯМР) картирование эпитопов, при котором обычно сравнивают положение сигналов в двумерных ЯМР-спектрах свободного антигена и антигена в комплексе с антиген-связывающим пептидом, например, антителом. Антиген обычно селективно метят изотопной меткой 15N, так что в ЯМР-спектре видны только сигналы, соответствующие антигену, и отсутствуют сигналы от антиген-связывающего пептида. Сигналы антигена, происходящие от аминокислот, участвующих во взаимодействии с антиген-связывающим пептидом, обычно характеризуются сдвигом положения в спектре комплекса по сравнению со спектром свободного антигена, и таким образом можно выявить аминокислоты, участвующие в связывании. См., например, Ernst Schering Res Found Workshop. 2004; (44): 149-67; Huang et al., Journal of Molecular Biology, Vol. 281 (1) pp. 61-67 (1998); и Saito and Patterson, Methods. 1996 Jun; 9 (3): 516-24.
Картирование/исследование характеристик эпитопа также можно выполнить с использованием масс-спектрометрии. См., например, Downard, J. Mass Spectrom. 2000 Apr; 35 (4): 493-503 и Kiselar and Downard, Anal Chem. 1999 May 1; 71 (9): 1792-1801. В контексте картирования и выявления эпитопов также можно применять методики протеазного гидролиза. Соответствующие антигенной детерминанте области/последовательности можно определить путем расщепления протеазой, например, с использованием трипсина в соотношении приблизительно 1:50 к CD39 или о/n гидролиза при рН 7-8 с последующим масс-спектрометрическим (МС) анализом с целью идентификации пептидов. Пептиды, защищенные от трипсинового гидролиза агентом, связывающим CD39, можно впоследствии выявить путем сравнения образцов, подвергнутых трипсиновому гидролизу, и образцов, инкубированных с антителом, а затем подвергнутых гидролизу, например, трипсиновому (таким образом, обнаруживая отпечаток связывающего агента). Кроме того, в качестве альтернативы в аналогичных способах исследования характеристик эпитопов можно использовать другие ферменты, например, химотрипсин, пепсин и т.д. Кроме того, ферментативное расщепление может обеспечить быстрый способ анализа того, находится ли потенциальная последовательность антигенной детерминанты в пределах области полипептида CD39, которая не подвергается поверхностному воздействию и, соответственно, скорее всего, не имеет отношения к иммуногенности/антигенности.
Сайт-специфичный мутагенез является еще одной методикой, полезной для выявления связывающего эпитопа. Например, при «сканировании аланином» каждый остаток в сегменте белка заменяют остатком аланина и измеряют последствия для сродства связывания. Если мутация приводит к значительному снижению сродства связывания, данный остаток, скорее всего, участвует в связывании. Моноклональные антитела, специфичные по отношению к структурным эпитопам (т.е. антитела, не связывающие белок не в состоянии фолдинга), можно применять для проверки того, что замена аланином не влияет на фолдинг белка в целом. См., например, Clackson and Wells, Science 1995; 267:383-386; и Wells, Proc Natl Acad Sci USA 1996; 93:1-6.
Для футпринтинга эпитопов также можно применять электронную микроскопию. Например, Wang et al., Nature 1992; 355: 275-278 использовали скоординированное применение крио электрон ной микроскопии, трехмерной реконструкции изображений и рентгеновской кристаллографии для определения физического отпечатка Fab-фрагмента на поверхности капсида нативного вируса мозаики вигны.
Другие формы "безметочного" анализа для оценки эпитопов включают поверхностный плазмонный резонанс (ППР, BIACORE) и рефлектометрическую интерференционную спектроскопию (RifS). См., например, Fagerstam et al., Journal Of Molecular Recognition 1990; 3:208-14; Nice et al., J. Chroma-togr. 1993; 646:159-168; Leipert et al., Angew. Chem. Int. Ed. 1998; 37:3308-3311; Kroger et al., Biosensors and Bioelectronics 2002; 17:937-944.
Также следует отметить, что антитело, которое связывает тот же или по существу тот же эпитоп, что и антитело, можно выявить в одном или нескольких типичных конкурентных анализах, описанных в настоящем документе.
После иммунизации и продуцирования антител у позвоночного или в клетке можно выполнить конкретные стадии отбора для выделения антител согласно требованиям. В связи с этим, в конкретном варианте реализации настоящее изобретение также относится к способам получения таких антител, включающим: (а) иммунизацию млекопитающего, не являющегося человеком, иммуногеном, содержащим полипептид CD39; (b) получение антител от указанного иммунизированного животного; и (с) отбор антител, полученных на стадии (b), которые способны связывать CD39. Выбранные антитела, способные связывать CD39, затем необязательно очищают и тестируют на способность ингибировать АТФазную активность CD39 (например, в соответствии с любым из описанных в настоящем документе способов).
4
11
-1
8
10
-1
-9
-8
-10
-9
-11
D
Как правило, антитело против CD39, предложенное в настоящем документе, обладает сродством к полипептиду CD39 (например, мономерному полипептиду CD39, полученному в приведенных в настоящем документе примерах) в диапазоне от приблизительно 10 до приблизительно 10 М (например, от приблизительно 10 до приблизительно 10 м). Например, антитела против CD39 могут обладать средней константой диссоциации (K) по отношению к CD39 менее 1×10 М, что определяют, например, посредством скрининга с использованием поверхностного плазмонного резонанса (ППР) (например, с помощью аналитического устройства ППР BIAcore™). В более конкретном типичном аспекте настоящее изобретение относится к антителам против CD39, обладающим KD для CD39 от приблизительно 1×10 М до приблизительно 1×10 М или от приблизительно 1×10 М до приблизительно 1×10 М.
D
D
Антитела могут характеризоваться, например, средним значением K, равным не более (то есть более высоким сродством) 100, 60, 10, 5 или 1 наномоль, предпочтительно в диапазоне ниже наномолярного или, необязательно, не более приблизительно 500, 200, 100 или 10 пикомоль. K можно определить, например, путем иммобилизации рекомбинантно продуцируемых белков CD39 человека на поверхности чипа с последующим нанесением тестируемого антитела в растворе. В одном варианте реализации способ дополнительно включает стадию (d), отбор антител, полученных на стадии (b), которые способны конкурировать за связывание с CD39 с антителом I-394, I-395, I-396, I-397, I-398 или I-399.
В одном аспекте любого из вариантов реализации антитела, полученные в соответствии с настоящими способами, представляют собой моноклональные антитела. В другом аспекте животное, не являющееся человеком, используемое для получения антител в соответствии с описанными в настоящем документе способами, представляет собой млекопитающее, например, грызуна, крупный рогатый скот, свинью, домашнюю птицу, лошадь, кролика, козу или овцу.
ДНК, кодирующую антитело, связывающее эпитоп, присутствующий в полипептидах CD39, выделяют из гибридомы и помещают в соответствующий экспрессирующий вектор для трансфекции в соответствующего хозяина. Хозяина затем используют для рекомбинантной продукции антитела или его вариантов, например, гуманизированной версии этого моноклонального антитела, активных фрагментов антитела, химерных антител, содержащих антиген-связывающий фрагмент антитела, или вариантов, содержащих обнаружимую группу.
ДНК, кодирующую моноклональные антитела согласно настоящему изобретению, например, антитело I-394, легко выделить и секвенировать с использованием общепринятых процедур (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, способных специфично связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи антител мыши). В одном аспекте настоящего изобретения предложена нуклеиновая кислота, кодирующая тяжелую цепь или легкую цепь антитела против CD39 согласно любому варианту реализации из настоящего документа. После выделения ДНК можно поместить в экспрессирующие векторы, которые затем трансфицируют в клетки-хозяева, например, клетки Е. coli, клетки обезьяны COS, клетки яичника китайского хомяка (СНО) или клетки миеломы, которые в иных случаях не продуцируют белок иммуноглобулина, с целью синтеза моноклональных антител в рекомбинантных клетках-хозяевах. Как описано в другом месте настоящего документа, такие последовательности ДНК можно модифицировать для любой из ряда целей, например, для гуманизации антител, получения фрагментов или производных или для модификации последовательности антитела, например, в сайте связывания с антигеном с целью оптимизации специфичности связывания антитела. В одном варианте реализации предложена выделенная нуклеотидная последовательность, кодирующая легкую цепь и/или тяжелую цепь антитела (например, I-394), а также рекомбинантная клетка-хозяин, содержащая (например, в своем геноме) такую нуклеиновую кислоту, Рекомбинантная экспрессия ДНК, кодирующей антитело, в бактериях хорошо известна в данной области техники (см., например, Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5, pp. 256 (1993); и Pluckthun, Immunol. 130, p. 151 (1992).
После выявления антител, способных связывать sCD39 и/или memCD39 и/или имеющих другие желательные свойства, их также, как правило, оценивают с использованием способов, например, описанных в настоящем документе, на предмет способности связываться с другими полипептидами, включая неродственные полипептиды. В идеале, антитела связываются с существенным сродством только с CD39, и не связываются со значительным уровнем с неродственными полипептидами или других полипептидами семейства НТФДаз, в частности CD39-L1, L2, L3 и L4 или НТФДазы-8. Однако следует принимать во внимание, что при условии сродства к CD39, значительно большего (например, в 10, 100, 500, 1000, 10000 или более раз), чем к другим, неродственным полипептидам), антитела подходят для применения в способах согласно настоящему изобретению.
В одном варианте реализации можно получить антитела против CD39, не обладающие существенным специфичным связыванием с Fcγ-рецептора ми человека, например, любым или любыми из CD16A, CD16B, CD32A, CD32B и/или CD64). Такие антитела могут содержать константные области различных тяжелых цепей, которые заведомо не могут связываться или характеризуются слабым связыванием с Fcγ-рецепторами. В качестве альтернативы, во избежание связывания с Fc-рецептором можно применять фрагменты антител, которые не содержат (или содержат фрагменты) константных областей, например, Р(ab’)2-фрагменты. Связывание с Fc-рецептором можно оценивать в соответствии со способами, известными в данной области техники, включая, например, тестирование связывания антитела с белком Fc-рецептора в анализе BIACORE. Кроме того, в целом можно применять любой изотип lgG-антитела, в котором Fc-фрагмент модифицирован (например, путем введения 1, 2, 3, 4, 5 или более аминокислотных замен) с целью минимизации или устранения связывания с Fc-рецепторами (см., например, WO 03/101485, описание которой включено в настоящий документ посредством ссылки). Анализы, например, анализы на основе клеток для оценки связывания с Fc-рецепторами, хорошо известны в данной области техники, и описаны, например, в WO 03/101485.
В одном варианте реализации антитело может содержать одну или несколько специфичных мутаций в Fc-области, которые приводят к получению антител с «молчащим Fc», характеризующимся минимальным взаимодействием с эффекторными клетками. Молчащие эффекторные функции можно получить путем мутации в Fc-области антител; они описаны в данной области как мутация N297A, мутации LALA (Strohl, W., 2009, Curr. Opin. Biotechnol. Vol. 20(6):685-691); и D265A (Baudino et al., 2008, J. Immunol. 181: 6664-69) см. также Heusser et al., WO 2012/065950, описания которых включены в настоящий документ посредством ссылок. В одном варианте реализации антитело содержит одну, две, три или более аминокислотных замен в шарнирной области. В одном варианте реализации антитело представляет собой lgG1 или lgG2 и содержит одну, две или три замены по остаткам 233-236, необязательно 233-238 (нумерация согласно ЕС). В одном варианте реализации антитело представляет собой lgG4 и содержит одну, две или три замены по остаткам 327, 330 и/или 331 (нумерация согласно ЕС). Примерами lgG1-антител с молчащим Fc являются мутанты LALA, содержащие мутации L234A и L235A в аминокислотной последовательности Fc lgG1. Другим примером молчащей мутации Fc является мутация по остатку D265 или по D265 и Р329, например, при использовании в антителе lgG1 в качестве мутации DAPA (D265A, Р329А) (US 6737056). Другое молчащее lgG1-антитело содержит мутацию по остатку N297 (например, мутацию N297A, N297S), которая приводит к получению агликозилированных/негликозилированных антител. Другие молчащие мутации включают: замены по остаткам L234 и G237 (L234A/G237A); замены по остаткам S228, L235 и R409 (S228P/L235E/R409K,T,M,L); замены по остаткам Н268, V309, А330 и А331 (H268Q/V309L/A330S/A331S); замены в остатках С220, С226, С229 и Р238 (C220S/C226S/C229S/P238S); замены по остаткам С226, С229, Е233, L234 и L235 (C226S/C229S/E233P/L234V/L235A; замены по остаткам K322, L235 и L235 (K322A/L234A/L235A); замены по остаткам L234/L235 и L235 L235E/P331S); замены по остаткам 234, 235 и 297; замены по остаткам Е318, K320 и K322 (L235E/E318A/K320A/K322A); замены по остаткам (V234A, G237A, P238S); замены по остаткам 243 и 264; замены по остаткам 297 и 299; такие замены, что остатки 233, 234, 235, 237 и 238 согласно системе нумерации ЕС содержат последовательность, выбранную из РАААР, PAAAS и SAAAS (см. WO 2011/066501).
1
3
3
1
2
4
4
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
4
4
5
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
В одном варианте реализации антитело может содержать одну или несколько специфичных мутаций в Fc-области. Например, такое антитело может содержать Fc-домен lgG1 человека, содержащий мутацию по остаткам 234, 235, 237, 330 и/или 331 по Kabat. Один пример такого Fc-домена включает замены по остаткам L234, L235 и Р331 по Kabat (например, L234A/L235E/P331S или (L234F/L235E/P331S). Еще один пример такого Fc-домена включает замены по остаткам L234, L235, G237 и Р331 по Kabat (например, L234A/L235E/G237A/P331S). Еще один пример такого Fc-домена включает замены по остаткам L234, L235, G237, А330 и Р331 по Kabat (например, L234A/L235E/G237A/A330S/P331S). В одном варианте реализации изобретения антитело содержит Fc-домен, необязательно изотипа lgG1 человека, содержащий: замену L234X, замену L235X2 и замену Р331Х3, где X1 представляет собой любой аминокислотный остаток, кроме лейцина, Х2 представляет собой любой аминокислотный остаток, кроме лейцина, и Х представляет собой любой аминокислотный остаток, кроме пролина; где X1 необязательно представляет собой аланин или фенилаланин или их консервативную замену; где Х2 необязательно представляет собой глутаминовую кислоту или ее консервативную замену; где Х необязательно представляет собой серии или его консервативную замену. В еще одном варианте реализации изобретения антитело содержит Fc-домен, необязательно изотипа lgG1 человека, содержащий: замену L234X, замену L235X, замену G237X и замену Р331Х, где X представляет собой любой аминокислотный остаток, кроме лейцина, Х представляет собой любой аминокислотный остаток, кроме лейцина, Х представляет собой любой аминокислотный остаток, кроме глицина, а Х представляет собой любой аминокислотный остаток, кроме пролина; где X необязательно представляет собой аланин или фенилаланин или их консервативную замену; где Х необязательно представляет собой глутаминовую кислоту или ее консервативную замену; Х необязательно представляет собой аланин или его консервативную замену; Х необязательно представляет собой серии или его консервативную замену. В еще одном варианте реализации изобретения антитело содержит Fc-домен, необязательно изотипа lgG1 человека, содержащий: замену L234X, замену L235X, замену G237X, замену G330X и замену P331X, где X представляет собой любой аминокислотный остаток, кроме лейцина, Х представляет собой любой аминокислотный остаток, кроме лейцина, Х представляет собой любой аминокислотный остаток, кроме глицина, X представляет собой любой аминокислотный остаток, кроме аланина, а Х представляет собой любой аминокислотный остаток, кроме пролина; где X необязательно представляет собой аланин или фенилаланин или их консервативную замену; где Х необязательно представляет собой глутаминовую кислоту или ее консервативную замену; Х необязательно представляет собой аланин или его консервативную замену; X необязательно представляет собой серии или его консервативную замену; Х необязательно представляет собой серии или его консервативную замену. В сокращенной записи, используемой в настоящем документе, формат выглядит следующим образом: Остаток дикого типа: Положение в полипептиде: Мутантный остаток, где положения остатков указаны в соответствии с нумерацией ЕС по Kabat.
В одном варианте реализации антитело содержит константную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, приведенную ниже, или аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90, 95 или 99% идентичную ей, но сохраняющую аминокислотные остатки в положениях 234, 235 и 331 по Kabat (подчеркнуто):
В одном варианте реализации антитело содержит константную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, приведенную ниже, или аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90, 95 или 99% идентичную ей, но сохраняющую аминокислотные остатки в положениях 234, 235 и 331 по Kabat (подчеркнуто):
В одном варианте реализации антитело содержит константную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, приведенную ниже, или аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90, 95 или 99% идентичную ей, но сохраняющую аминокислотные остатки в положениях 234, 235, 237, 330 и 331 по Kabat (подчеркнуто):
В одном варианте реализации антитело содержит константную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, приведенную ниже, или последовательность, по меньшей мере на 90, 95 или 99% идентичную ей, но сохраняющую аминокислотные остатки в положениях 234, 235, 237 и 331 по Kabat (подчеркнуто):
Антитела с молчащим Fc приводят к отсутствию ADCC или ее низкой активности, что означает, что антитела с молчащим Fc проявляют ADCC-активность, которая составляет менее 50% специфичного лизиса клеток. Предпочтительно антитело по существу не обладает ADCC-активностью, например, антитело с молчащим Fc проявляет ADCC-активность (специфичный лизис клеток), которая составляет менее 5% или менее 1%. Антитела с молчащим Fc также могут приводить к отсутствию FcγR-опосредованного перекрестного связывания CD39 на поверхности CD39-экспрессирующей клетки.
В одном варианте реализации антитело содержит замену в константной области тяжелой цепи в любом одном, двух, трех, четырех, пяти или более остатках, выбранных из группы, состоящей из: 220, 226, 229, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 243, 264, 268, 297, 298, 299, 309, 310, 318, 320, 322, 327, 330, 331 и 409 (нумерация остатков в константной области тяжелой цепи соответствует нумерации ЕС по Kabat). В одном варианте реализации антитело содержит замену по остаткам 234, 235 и 322. В одном варианте реализации антитело содержит замену по остаткам 234, 235 и 331. В одном варианте реализации антитело содержит замену по остаткам 234, 235, 237 и 331. В одном варианте реализации антитело содержит замену по остаткам 234, 235, 237, 330 и 331. В одном варианте реализации Fc-домен относится к подтипу lgG1 человека. Аминокислотные остатки указаны в соответствии с нумерацией ЕС по Kabat. В одном варианте реализации антитело содержит Fc-домен, содержащий аминокислотную замену, которая увеличивает связывание с полипептидами FcRn человека для увеличения периода полужизни антитела in vivo. Типичные мутации описаны в статье Strohl, W., 2009, Curr. Opin. Biotechnol. vol. 20(6):685-691, описание которой включено в настоящий документ посредством ссылки. Примерами замен, используемых в антителах изотипа lgG1 человека, являются замены по остаткам М252, S254 и Т256; замены по остаткам Т250 и М428; замены по остатку N434; замены по остаткам Н433 и N434; замены по остаткам Т307, Е380 и N434; замены по остаткам Т307, Е380 и N434; замены по остаткам М252, S254, Т256, Н433, N434 и 436; замены по остатку I253; замены по остаткам Р257, N434, D376 и N434.
В одном варианте реализации изобретения антитело содержит Fc-домен, содержащий аминокислотную замену, который придает пониженную чувствительность к расщеплению протеазами. Металлопротеиназы матрикса (ММР) представляют собой наиболее значимое семейство протеиназ, связанных с онкогенезом. Хотя раковые клетки могут экспрессировать ММР, основная доля внеклеточных ММР синтезируется различными типами стромальных клеток, которые инфильтрируют опухоль, и каждая из них продуцирует специфичный набор протеиназ и ингибиторов протеиназ, которые высвобождаются во внеклеточное пространство и специфично изменяют среду вокруг опухоли. ММР, присутствующие в микроокружении опухоли, могут расщеплять антитела в шарнирной области и, таким образом, могут приводить к инактивации терапевтических антител, которые предназначены для функционирования в области опухоли. В одном варианте реализации Fc-домен, содержащий аминокислотную замену, обладает пониженной чувствительностью к расщеплению любой одной, двумя, тремя или более (или всеми) протеазами, выбранными из группы, состоящей из: GluV8, IdeS, желатиназы А (ММР2), желатиназы В (ММР-9), металлопротеиназы-7 матрикса (ММР-7), стромелизина (ММР-3) и эластазы макрофагов (ММР-12). Водном варианте реализации изобретения антитело с пониженной чувствительностью к расщеплению содержит Fc-домен, содержащий аминокислотную замену по остаткам E233-L234 и/или L235. В одном варианте реализации изобретения антитело содержит Fc-домен, содержащий аминокислотную замену по остаткам Е233, L234, L235 и G236. В одном варианте реализации изобретения антитело содержит Fc-домен, содержащий аминокислотную замену по одному или более остаткам 233-238, например, таким образом, что последовательность E233-L234-L235-G236 замещается на P233-V234-A235 (G236 удален). См., например, WO 99/58572 и WO 2012087746, описание которых включено в настоящий документ посредством ссылки.
На любой желательной стадии можно выполнить оценку способности антиген-связывающего соединения ингибировать ферментативную активность CD39, в частности, блокировать АТФазную активность sCD39 и снижать продукцию АДФ и АМФ (и, вместе с CD73, аденозина) за счет растворимого белка CD39 и, необязательно, также клетки, экспрессирующей CD39, и, в свою очередь, восстанавливать активность лимфоцитов и/или ослаблять аденозин-опосредованное ингибирование лимфоцитов.
Ингибирующую активность (например, иммуностимулирующий потенциал) антитела можно оценивать, например, в анализе для выявления исчезновения (гидролиза) АТФ и/или образования АМФ.
Способности антитела ингибировать растворимый рекомбинантный белок CD39 человека можно проверить путем обнаружения АТФ после инкубирования тестируемого антитела с растворимым белком CD39 (например, белком, содержащим аминокислотную последовательность SEQ ID NO 44 или 45, продуцированным в разделах "Примеры", "Способы", необязательно дополнительно содержащим метку для очистки или другую функциональную или нефункциональную аминокислотную последовательность, не происходящую от CD39). См., например, "Примеры. Способы". Вкратце, АТФ можно количественно определять с использованием Cell Titer Glo™ (Promega) в анализе, в котором набор доз тестируемого антитела инкубировали с растворимым рекомбинантным белком CD39 человека, описанным в Примере 1, в течение 1 часа при 37°С. 20 мкМ АТФ добавляли в планшеты на еще 30 минут при 37°С перед добавлением реагента CTG. Испускаемый свет количественно определяли с помощью люминометра Enspire™ после короткого периода инкубирования в течение 5 минут в темноте.
Способность антитела ингибировать клетки, экспрессирующие белок CD39, можно проверить путем обнаружения АТФ после инкубирования тестируемого антитела с клетками (например, клетками Ramos, клетками, трансфицированными CD39, и т.д.). См., например, "Примеры, Способы". Клетки можно инкубировать в течение 1 часа при 37°С с тестируемым антителом. Затем клетки инкубируют с 20 мкМ АТФ в течение еще 1 часа при 37°С. Планшеты центрифугируют в течение 2 минут при 400 g и переносят клеточный супернатант в люминесцентный микропланшет (белые лунки). К супернатанту добавляют CTG и количественно измеряют испускаемый свет после 5-минутного инкубирования в темноте с использованием люминометра Enspire™. Эффективность антитела против CD39 определяют путем сравнения испускаемого света в присутствии антитела с АТФ самим по себе (максимальное излучение света) и АТФ вместе с клетками (минимальное излучение света).
Ослабление гидролиза АТФ до АМФ и/или увеличение уровня АТФ и/или уменьшение образования АМФ в присутствии антитела указывают, что антитело ингибирует CD39. В одном аспекте препарат антитела способен вызывать по меньшей мере 60% снижение ферментативной активности полипептида CD39, экспрессируемого в клетке, причем антитело предпочтительно вызывает по меньшей мере 70%, 80% или 90% снижение ферментативной активности полипептида CD39 в клетке, согласно обнаружению АТФ с использованием Cell Titer Glo™ (Promega) после инкубирования клеток, экспрессирующих полипептид CD39 (например, клеток Ramos), с тестируемым антителом, например, как описано в разделе "Примеры, Способы".
В одном аспекте препарат антитела способен вызывать по меньшей мере 60% снижение ферментативной активности растворимого рекомбинантного полипептида CD39 (например, в отсутствие клеток), предпочтительно по меньшей мере 70%, 80% или 90% снижение ферментативной активности растворимого рекомбинантного полипептида CD39, согласно обнаружению АТФ с использованием Cell Titer Glo™ (Promega) после инкубирования растворимого рекомбинантного полипептида CD39 с тестируемым антителом, например, как описано в разделе "Примеры, Способы".
Активность антитела также можно измерить при непрямом анализе его способности модулировать активность иммунных клеток (например, иммунных клеток, экспрессирующих рецепторы аденозина; клеток, экспрессирующих рецептор А2А), например, ослаблять аденозин-опосредованное ингибирование активности лимфоцитов, или вызывать активацию активности лимфоцитов. Это можно выполнить, например, с использованием анализа высвобождения цитокинов. В другом примере антитело можно оценивать при непрямом анализе его способности модулировать пролиферацию лимфоцитов.
В одном из примеров предоставлен способ получения или выявления антитела против CD39 или антиген-связывающего домена, включающий следующие стадии:
(a) получение множества образцов, содержащих антитело, связывающее полипептид CD39 человека (например, супернатантов клеточных культур, супернатантов гибридом),
(b) очистка образцов с целью получения множества образцов, каждый из которых содержит очищенное моноклональное антитело, путем приведения каждого из образцов антител в контакт с растворимым внеклеточным доменом белка CD39 (например, в отсутствие клеток) и оценки нейтрализации его АТФазной активности и
(c) выбор антитела со стадии (b), которое приводит к нейтрализации АТФазной активности, необязательно, выбор антитела, которое приводит к по меньшей мере 70%, необязательно 80% или необязательно 90% нейтрализации. В одном варианте реализации стадия (а) включает иммунизацию одного или нескольких млекопитающих, не являющихся человеком, полипептидом CD39 и получение от такого млекопитающего множества образцов, содержащих антитело, которое связывает полипептид CD39 человека.
В одном из примеров предоставлен способ получения или выявления антитела против CD39 или антиген-связывающего домена, включающий следующие стадии:
(a) получение множества очищенных антител, связывающих полипептид CD39 человека,
(b) приведение каждого антитела в контакт с растворимым внеклеточным доменом белка CD39 и оценку нейтрализации его АТФазной активности, и
(c) выбор антитела со стадии (b), которое приводит к по меньшей мере 70%, необязательно 80% или необязательно 90% нейтрализации АТФазной активности.
Кроме того, способы необязательно могут включать стадии:
(d) приведения каждого из антител в контакт с С039-экспрессирующими клетками, необязательно В-клетками человека, необязательно клетками лимфомы человека Ramos, и оценки нейтрализации АТФазной активности; а также
(е) выбор антитела со стадии (d), которое приводит к по меньшей мере 70%, необязательно 80% или необязательно 90% снижению АТФазной активности. Стадии (b) и (с) можно выполнять до или после стадий (d) и (е).
Эпитопы на CD39
В одном аспекте антитела связываются с антигенной детерминантой, присутствующей на CD39, экспрессируемом на поверхности клетки.
В одном аспекте антитела связываются по существу с тем же эпитопом, что и антитела I-394, I-395, I-396, I-397 или I-398. В одном варианте реализации антитела связываются с эпитопом CD39, который по меньшей мере частично перекрывается с или содержит по меньшей мере один остаток эпитопа, связываемого антителом I-394, I-395, I-396, I-397 или I-398. Остатки, связываемые антителом, можно обозначить как присутствующие на поверхности полипептида CD39, например, полипептида CD39, экспрессируемого на поверхности клетки.
Связывание антитела против CD39 с клетками, трансфицированными мутантами CD39, можно измерить и сравнить со способностью антитела против CD39 связывать полипептид CD39 дикого типа (например, SEQ ID NO: 1). Ослабление связывания между антителом против CD39 и мутантным полипептидом CD39 (например, мутантом из Таблицы 1) означает, что имеет место снижение сродства связывания (например, измеренного известными способами, например, посредством FACS-анализа клеток, экспрессирующих конкретный мутант, или анализа связывания с мутантными полипептидами с помощью Biacore) и/или снижение общей связывающей способности антитела против CD39 (например, согласно уменьшению Вплах на графике зависимости концентрации антитела против CD39 от концентрации полипептида). Значительное ослабление связывания указывает на то, что мутированный остаток непосредственно участвует в связывании с антителом против CD39 или находится в непосредственной близости от связывающего белка при связывании антитела против CD39 с CD39.
В некоторых вариантах реализации значительное ослабление связывания означает, что снижение сродства связывания и/или способности к связыванию антитела против CD39 с мутантным полипептидом CD39 составляет более 40%, более 50%, более 55%, более 60%, более 65%, более 70%, более 75%, более 80%, более 85%, более 90% или более 95% по сравнению со связыванием между антителом и полипептидом CD39 дикого типа. В определенных вариантах реализации связывание ослабляется ниже определяемых пределов. В некоторых вариантах реализации значительное ослабление связывания подтверждают, если связывание антитела против CD39 с мутантным полипептидом CD39 составляет менее 50% (например, менее 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15% или 10%) от связывания, наблюдаемого между антителом против CD39 и полипептидом CD39 дикого типа.
В некоторых вариантах реализации предоставлены антитела против CD39, демонстрирующие значительно ослабленное связывание с мутантным полипептидом CD39, при котором остаток в сегменте, включающем аминокислотный остаток, связываемый антителом I-394, I-395, I-396, I-397, I-398 или I-399, замещен другой аминокислотой по сравнению со связыванием с полипептидом CD39 дикого типа, не содержащим такой замены/замен (например, полипептидом с последовательностью SEQ ID NO: 1).
В некоторых вариантах реализации предложены антитела против CD39 (например, отличающиеся от I-394), которые связывают эпитоп на CD39, связываемый антителом I-394.
В любом варианте реализации настоящего изобретения антитело можно охарактеризовать как антитело, отличающееся от BY40, BY12 или BA54g (или антитело, содержащее их CDR), упоминаемое в публикации РСТ № WO 2009/095478, описание которой включено в настоящий документ посредством ссылки.
В одном аспекте антитела против CD39 характеризуются ослабленным связыванием с полипептидом CD39, содержащим мутацию по остатку, выбранному из группы, состоящей из: Q96, N99, Е143 и R147 (по отношению к SEQ ID NO: 1); мутантный полипептид CD39 необязательно содержит мутации: Q96A, N99A, Е143А и R147E. В одном аспекте антитела против CD39 связывают эпитоп на CD39, содержащий аминокислотный остаток (например, один, два, три или четыре остатка), выбранный из группы, состоящей из Q96, N99, Е143 и R147 (по отношению к SEQ ID NO: 1).
В одном варианте реализации антитело характеризуется ослабленным связыванием с мутантным полипептидом CD39, содержащим мутацию по одному или нескольким (или всем) остаткам, выбранным из группы, состоящей из R138, М139 и Е142 (по отношению к SEQ ID NO: 1), по сравнению со связыванием антитела с полипептидом CD39 дикого типа, содержащим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1.
В одном варианте реализации антитело характеризуется ослабленным связыванием с мутантным полипептидом CD39, содержащим мутацию по одному или нескольким (или всем) остаткам, выбранным из группы, состоящей из K87, Е100 и D107 (по отношению к SEQ ID NO: 1), по сравнению со связыванием антитела с полипептидом CD39 дикого типа, содержащим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1.
В одном варианте реализации антитело характеризуется ослабленным связыванием с мутантным полипептидом CD39, содержащим мутацию по одному или нескольким (или всем) остаткам, выбранным из группы, состоящей из N371, L372, Е375, K376 и V377 (по отношению к SEQ ID NO: 1), по сравнению со связыванием антитела с полипептидом CD39 дикого типа, содержащим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1.
Типичные последовательности вариабельной области антитела
Типичная пара VH и VL антитела против CD39 в соответствии с настоящим изобретением представляет собой пару, содержащуюся в антителе I-394, аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи которого указана ниже (SEQ ID NO: 6), и аминокислотная последовательность вариабельная область легкой цепи которого указана ниже (SEQ ID NO: 7). CDR согласно нумерации по Kabat подчеркнуты в SEQ ID NO: 6 и 7. VH и VL необязательно содержат (например, модифицированы с целью включения) акцепторные каркасные структуры человека. В одном варианте реализации антитело против CD39 согласно настоящему изобретению содержит CDR1, CDR2 и/или CDR3 VH (например, согласно нумерации по Kabat) вариабельной области тяжелой цепи, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6. В одном варианте реализации антитело против CD39 согласно настоящему изобретению содержит CDR1, CDR2 и/или CDR3 VL (например, согласно нумерации по Kabat) вариабельной области легкой цепи, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7. В одном варианте реализации антитело против CD39 по настоящему изобретению содержит VH, содержащую CDR1, CDR2 и/или CDR3 вариабельной области тяжелой цепи по Kabat, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, и VL, содержащую CDR1, CDR2 и/или CDR3 вариабельной области легкой цепи по Kabat, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7.
Антитело против CD39 может, например, содержать: HCDR1, содержащий аминокислотную последовательность: DYNMH (SEQ ID NO: 8), или последовательность из по меньшей мере 4 ее смежных аминокислот, причем одна или более из этих аминокислот необязательно могут быть замещены другой аминокислотой; HCDR2, содержащий аминокислотную последовательность: YIVPLNGGSTFNQKFKG (SEQ ID NO: 9), или последовательность из по меньшей мере 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 ее смежных аминокислот, причем одна или более из этих аминокислот необязательно может быть замещена другой аминокислотой; HCDR3, содержащий аминокислотную последовательность: GGTRFAY (SEQ ID NO: 10) или последовательность из по меньшей мере 4, 5 или 6 ее смежных аминокислот, причем одна или более из этих аминокислот необязательно может быть замещена другой аминокислотой; LCDR1, содержащий аминокислотную последовательность: RASESVDNFGVSFMY (SEQ ID NO: 11) или последовательность из по меньшей мере 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 ее смежных аминокислот, причем одна или более из этих аминокислот необязательно может быть замещена другой аминокислотой; область LCDR2, содержащий аминокислотную последовательность: GASNQGS (SEQ ID NO: 12) или последовательность из по меньшей мере 4, 5 или 6 ее смежных аминокислот, причем одна или более из этих аминокислот необязательно может быть замещена другой аминокислотой; и/или область LCDR3 I-394, содержащий аминокислотную последовательность: QQTKEVPYT (SEQ ID NO: 13) или последовательность из по меньшей мере 4, 5, 6, 7 или 8 ее смежных аминокислот, причем одна или более из этих аминокислот необязательно может быть удалена или замещена другой аминокислотой. Положения CDR могут соответствовать нумерации по Kabat.
Еще одна типичная пара VH и VL антитела против CD39 в соответствии с настоящим изобретением представляет собой пару, содержащуюся в антителе I-395, аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи которого указана ниже (SEQ ID NO: 14), и аминокислотная последовательность вариабельная область легкой цепи которого указана ниже (SEQ ID NO: 15). CDR согласно нумерации по Kabat подчеркнуты в SEQ ID NO: 14 и 15. VH и VL необязательно содержат (например, модифицированы с целью включения) акцепторные каркасные структуры человека. В одном варианте реализации антитело против CD39 согласно настоящему изобретению содержит CDR1, CDR2 и/или CDR3 VH (например, согласно нумерации по Kabat) вариабельной области тяжелой цепи, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14. В одном варианте реализации антитело против CD39 согласно настоящему изобретению содержит CDR1, CDR2 и/или CDR3 VL (например, согласно нумерации по Kabat) вариабельной области легкой цепи, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15. В одном варианте реализации антитело против CD39 по настоящему изобретению содержит VH, содержащую CDR1, CDR2 и/или CDR3 вариабельной области тяжелой цепи по Kabat, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и VL, содержащую CDR1, CDR2 и/или CDR3 вариабельной области легкой цепи по Kabat, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15.
Антитело против CD39 может, например, содержать: HCDR1, содержащий аминокислотную последовательность: DYNMH (SEQ ID NO: 16), или последовательность из по меньшей мере 4 ее смежных аминокислот, причем одна или более из этих аминокислот необязательно могут быть замещены другой аминокислотой; HCDR2, содержащий аминокислотную последовательность: YINPNNGGTTYNQKFKG (SEQ ID NO: 17), или последовательность из по меньшей мере 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 ее смежных аминокислот, причем одна или более из этих аминокислот необязательно может быть замещена другой аминокислотой; HCDR3, содержащий аминокислотную последовательность: GGTRFAS (SEQ ID NO: 18) или последовательность из по меньшей мере 4, 5, 6 ее смежных аминокислот, причем одна или более из этих аминокислот необязательно может быть замещена другой аминокислотой; LCDR1, содержащий аминокислотную последовательность: RASESVDNYGISFMY (SEQ ID NO: 19) или последовательность из по меньшей мере 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 ее смежных аминокислот, причем одна или более из этих аминокислот необязательно может быть замещена другой аминокислотой; область LCDR2, содержащий аминокислотную последовательность: AASTQGS (SEQ ID NO: 20) или последовательность из по меньшей мере 4, 5 или 6 ее смежных аминокислот, причем одна или более из этих аминокислот необязательно может быть замещена другой аминокислотой; и/или область LCDR3 I-396, содержащий аминокислотную последовательность: QQSKEVPFT (SEQ ID NO: 21) или последовательность из по меньшей мере 4, 5, 6, 7 или 8 ее смежных аминокислот, причем одна или более из этих аминокислот необязательно может быть удалена или замещена другой аминокислотой. Положения CDR могут соответствовать нумерации по Kabat.
Еще одна типичная пара VH и VL антитела против CD39 в соответствии с настоящим изобретением представляет собой пару, содержащуюся в антителе I-396, аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи которого указана ниже (SEQ ID NO: 22), и аминокислотная последовательность вариабельная область легкой цепи которого указана ниже (SEQ ID NO: 23). CDR согласно нумерации по Kabat подчеркнуты в SEQ ID NO: 22 и 23. VH и VL необязательно содержат (например, модифицированы с целью включения) акцепторные каркасные структуры человека. В одном варианте реализации антитело против CD39 согласно настоящему изобретению содержит CDR1, CDR2 и/или CDR3 VH (например, согласно нумерации по Kabat) вариабельной области тяжелой цепи, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22. В одном варианте реализации антитело против CD39 согласно настоящему изобретению содержит CDR1, CDR2 и/или CDR3 VL (например, согласно нумерации по Kabat) вариабельной области легкой цепи, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23. В одном варианте реализации антитело против CD39 по настоящему изобретению содержит VH, содержащую CDR1, CDR2 и/или CDR3 вариабельной области тяжелой цепи по Kabat, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, и VL, содержащую CDR1, CDR2 и/или CDR3 вариабельной области легкой цепи по Kabat, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23.
Антитело против CD39 может, например, содержать: HCDR1, содержащий аминокислотную последовательность: DTYIN (SEQ ID NO: 24), или последовательность из по меньшей мере 4 ее смежных аминокислот, причем одна или более из этих аминокислот необязательно могут быть замещены другой аминокислотой; HCDR2, содержащий аминокислотную последовательность: RIDPANGNTKYDPKFQG (SEQ ID NO: 25), или последовательность из по меньшей мере 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 ее смежных аминокислот, причем одна или более из этих аминокислот необязательно может быть замещена другой аминокислотой; HCDR3, содержащий аминокислотную последовательность: WGYDDEEADYFDS (SEQ ID NO: 26) или последовательность из по меньшей мере 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 ее смежных аминокислот, причем одна или более из этих аминокислот необязательно может быть замещена другой аминокислотой; LCDR1, содержащий аминокислотную последовательность: RASESVDNYGISFMN (SEQ ID NO: 27) или последовательность из по меньшей мере 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 ее смежных аминокислот, причем одна или более из этих аминокислот необязательно может быть замещена другой аминокислотой; область LCDR2, содержащий аминокислотную последовательность: AASNQGS (SEQ ID NO: 28) или последовательность из по меньшей мере 4, 5 или 6 ее смежных аминокислот, причем одна или более из этих аминокислот необязательно может быть замещена другой аминокислотой; и/или область LCDR3 I-396, содержащий аминокислотную последовательность: HQSKEVPWT (SEQ ID NO: 29) или последовательность из по меньшей мере 4, 5, 6, 7 или 8 ее смежных аминокислот, причем одна или более из этих аминокислот необязательно может быть удалена или замещена другой аминокислотой. Положения CDR могут соответствовать нумерации по Kabat.
Еще одна типичная пара VH и VL антитела против CD39 в соответствии с настоящим изобретением представляет собой пару, содержащуюся в антителе I-399, аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи которого указана ниже (SEQ ID NO: 30), и аминокислотная последовательность вариабельная область легкой цепи которого указана ниже (SEQ ID NO: 31). CDR согласно нумерации по Kabat подчеркнуты в SEQ ID NO: 30 и 31. VH и VL необязательно содержат (например, модифицированы с целью включения) акцепторные каркасные структуры человека. В одном варианте реализации антитело против CD39 согласно настоящему изобретению содержит CDR1, CDR2 и/или CDR3 VH (например, согласно нумерации по Kabat) вариабельной области тяжелой цепи, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30. В одном варианте реализации антитело против CD39 согласно настоящему изобретению содержит CDR1, CDR2 и/или CDR3 VL (например, согласно нумерации по Kabat) вариабельной области легкой цепи, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31. В одном варианте реализации антитело против CD39 по настоящему изобретению содержит VH, содержащую CDR1, CDR2 и/или CDR3 вариабельной области тяжелой цепи по Kabat, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30, и VL, содержащую CDR1, CDR2 и/или CDR3 вариабельной области легкой цепи по Kabat, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31.
Антитело против CD39 может, например, содержать: HCDR1, содержащий аминокислотную последовательность: SFWMN (SEQ ID NO: 32), или последовательность из по меньшей мере 4 ее смежных аминокислот, причем одна или более из этих аминокислот необязательно могут быть замещены другой аминокислотой; HCDR2, содержащий аминокислотную последовательность: EIDPSDFYTNSNQRFKG (SEQ ID NO: 33), или последовательность из по меньшей мере 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 ее смежных аминокислот, причем одна или более из этих аминокислот необязательно может быть замещена другой аминокислотой; HCDR3, содержащий аминокислотную последовательность: GDFGWYFDV (SEQ ID NO: 34) или последовательность из по меньшей мере 4, 5 или 6 ее смежных аминокислот, причем одна или более из этих аминокислот необязательно может быть замещена другой аминокислотой; LCDR1, содержащий аминокислотную последовательность: SASSSINSNYLH (SEQ ID NO: 35) или последовательность из по меньшей мере 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 ее смежных аминокислот, причем одна или более из этих аминокислот необязательно может быть замещена другой аминокислотой; область LCDR2, содержащий аминокислотную последовательность: RTSNLAS (SEQ ID NO: 36) или последовательность из по меньшей мере 4, 5 или 6 ее смежных аминокислот, причем одна или более из этих аминокислот необязательно может быть замещена другой аминокислотой; и/или область LCDR3 I-399, содержащий аминокислотную последовательность: QQGSSLPRT (SEQ ID NO: 37) или последовательность из по меньшей мере 4, 5, 6, 7 или 8 ее смежных аминокислот, причем одна или более из этих аминокислот необязательно может быть удалена или замещена другой аминокислотой. Положения CDR могут соответствовать нумерации по Kabat.
В любом из антител I-394, I-395, I-396 и I-399 последовательности HCDR1, 2, 3 и LCDR1, 2, 3 (каждая CDR независимо или все CDR) можно обозначить как являющиеся таковыми согласно системе нумерации по Kabat (как указано в последовательностях VH и VL подчеркиванием), системе нумерации по Chotia или системе нумерации по IMGT или любой другой подходящей системе нумерации.
В любом аспекте указанные вариабельные области, последовательности FR и/или CDR могут содержать одну или более модификаций последовательности, например, замену (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или более модификаций последовательности). В одном варианте реализации замена представляет собой консервативную модификацию.
H
L
В еще одном аспекте соединение против CD39 содержит домен V, характеризующийся по меньшей мере приблизительно 60%, 70% или 80% идентичностью последовательности, необязательно по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95%, 97%, 98% или 99% идентичностью по отношению к домену VH согласно SEQ ID NO: 6. В еще одном аспекте антитело против CD39 содержит домен V, характеризующийся по меньшей мере приблизительно 60%, 70% или 80% идентичностью последовательности, необязательно по меньшей мере приблизительно 85%, 90%, 95%, 97%, 98% или 99% идентичностью по отношению к домену VL согласно SEQ ID NO: 7.
Фрагменты и производные антител (охватываемые термином «антитело» или «антитела» в настоящей заявке, если не указано иное или если это явно не противоречит контексту) можно получать способами, известными в данной области техники. «Фрагменты» содержат часть интактного антитела, обычно сайт связывания антигена или вариабельную область. Примеры фрагментов антител включают фрагменты Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2 и Fv; диатела; любой фрагмент антитела, который представляет собой полипептид, обладающий первичной структурой, состоящей из одной непрерывной последовательности смежных аминокислотных остатков (называемый в настоящем документе «одноцепочечным фрагментом антитела» или «одноцепочечным полипептидом»), включая, без ограничения, (1) одноцепочечные молекулы Fv (2) одноцепочечные полипептиды, содержащие только один вариабельный домен легкой цепи или ее фрагмент, содержащий три CDR вариабельного домена легкой цепи, без связанного фрагмента тяжелой цепи, и (3) одноцепочечные полипептиды, содержащие только одну вариабельную область тяжелой цепи или ее фрагмент, содержащий три CDR вариабельной области тяжелой цепи, без связанного фрагмента легкой цепи; и мультиспецифичные (например, биспецифичные) антитела, образованные из фрагментов антител. В числе прочего, данное определение включает нанотело, доменное антитело, однодоменное антитело или «dAb».
В некоторых вариантах реализации ДНК гибридомы, продуцирующей антитело, можно модифицировать перед вставкой в экспрессирующий вектор, например, путем замены кодирующей последовательности константных доменов тяжелой и легкой цепи человека вместо гомологичной последовательности нечеловеческого происхождения (например, Morrison et al., PNAS pp. 6851 (1984)), или путем ковалентного присоединения к кодирующей последовательности иммуноглобулина всей кодирующей последовательности неиммуноглобулинового полипептида или ее фрагмента. Таким образом, получают «химерные» или «гибридные» антитела, которые обладают специфичностью связывания исходного антитела. Обычно такие неиммуноглобулиновые полипептиды заменяют константные домены антитела.
Антитело необязательно является гуманизированным. «Гуманизированные» формы антител представляют собой специфичные химерные иммуноглобулины, цепи иммуноглобулинов или их фрагменты (например, Fv, Fab, Fab', F(ab')2 или другие антиген-связывающие подпоследовательности антител), содержащие минимальную последовательность, полученную из иммуноглобулина мыши. По большей части гуманизированные антитела представляют собой иммуноглобулины человека (антитело-реципиент), в которых остатки из области, определяющей комплементарность (CDR) реципиента, заменены остатками из CDR исходного антитела (донорского антитела) при сохранении желательной специфичности, сродства и способности исходного антитела.
В некоторых случаях Fv-каркасные остатки иммуноглобулина человека можно заменить соответствующими остатками нечеловеческого происхождения. Кроме того, гуманизированные антитела могут содержать остатки, не встречающиеся ни в антителе-реципиенте, ни в импортированных CDR или каркасных последовательностях. Эти модификации вносят для дальнейшего уточнения и оптимизации характеристик антител. В общем случае гуманизированное антитело содержит по существу все, по меньшей мере один, и, как правило, два вариабельных домена, в которых все или по существу все области CDR соответствуют областям CDR исходного антитела, и все или по существу все области FR являются областями FR консенсусной последовательности иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело в оптимальном случае также содержит по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина (Fc), обычно иммуноглобулина человека. Дополнительную информацию см. в источниках Jones et al., Nature, 321, pp. 522 (1986); Reichmann et al, Nature, 332, pp. 323 (1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2, pp. 593 (1992); Verhoeyen et Science, 239, pp. 1534 и патенте США №4816567, полное описание которых включено в настоящий документ посредством ссылок). Способы гуманизации антител хорошо известны в данной области техники.
Выбор вариабельных доменов человека, как легких, так и тяжелых, для применения при создании гуманизированных антител очень важен для снижения антигенности. В соответствии с так называемым методом «наилучшего соответствия» последовательность вариабельного домена антитела подвергают скринингу на основе всей библиотеки известных последовательностей вариабельного домена человека. Затем последовательность человека, наиболее близкую к последовательности мыши, принимают в качестве каркасной области (FR) человека для гуманизированного антитела (Sims et al., J. Immunol. 151, pp. 2296 (1993); Chothia and Lesk, J. Mol. 196, 1987, pp. 901). В другом способе используют конкретную структуру из консенсусной последовательности всех антител человека определенной подгруппы легких или тяжелых цепей. Один и тот же каркас можно использовать для нескольких различных гуманизированных антител (arter et al., PNAS 89, pp. 4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151, p. 2623 (1993)).
Кроме того, важно, чтобы антитела были гуманизированы с сохранением высокого сродства к CD39 и других благоприятных биологических свойств. Для достижения этой цели, согласно одному способу, гуманизированные антитела получают с помощью анализа исходных последовательностей и различных концептуальных гуманизированных продуктов с использованием трехмерных моделей исходных и гуманизированных последовательностей. Трехмерные модели иммуноглобулинов общедоступны и знакомы специалистам в данной области техники. Существуют компьютерные программы, которые иллюстрируют и отображают возможные трехмерные структуры выбранных кандидатных последовательностей иммуноглобулинов. Изучение этих изображений позволяет проанализировать вероятную роль остатков в функционировании кандидатной последовательности иммуноглобулина. Таким образом, можно выбрать и объединить остатки FR из консенсусной и импортируемой последовательностей, обеспечивая желательные характеристики антитела.
Другой способ получения «гуманизированных» моноклональных антител заключается в использовании XenoMouse (Abgenix, Фримонт, штат Калифорния, США) в качестве мыши, используемой для иммунизации. XenoMouse - это хозяин-мышь, у которой гены иммуноглобулинов заменены функциональными генами иммуноглобулинов человека. Таким образом, антитела, продуцируемые этой мышью или гибридомами, изготовленными из В-клеток этой мыши, уже являются гуманизированными. XenoMouse описана в патенте США №6162963, полностью включенном в настоящий документ посредством ссылки.
Антитела человека также можно получать в соответствии с различными другими способами, например, использованием для иммунизации других трансгенных животных, сконструированных для экспрессии репертуара антител человека (Jakobovitz et al., Nature 362 (1993) 255), или путем отбора из репертуаров антител с использованием фагового дисплея. Такие методики известны специалисту в данной области техники и могут быть реализованы, начиная с моноклональных антител, как описано в настоящей заявке.
Антитело против CD39 можно включить в состав фармацевтического состава, содержащего его в концентрации от 1 мг/мл до 500 мг/мл, причем рН указанного состава составляет от 2,0 до 10,0. Состав может дополнительно содержать буферную систему, консервант(ы), агент(ы) для придания тоничности, хелатообразующий(е) агент(ы), стабилизаторы и поверхностно-активные вещества. В одном варианте реализации фармацевтический состав представляет собой водный состав, т.е. состав, содержащий воду. Такой состав обычно представляет собой раствор или суспензию. В дополнительном варианте реализации фармацевтический состав представляет собой водный раствор. Термин «водный состав» определяют как состав, содержащий по меньшей мере 50% (масс/масс) воды. Аналогичным образом, термин «водный раствор» определяют как раствор, содержащий по меньшей мере 50% (масс/масс) воды, а термин «водная суспензия» определяют как суспензию, содержащую по меньшей мере 50% (масс/масс) воды.
В еще одном варианте реализации фармацевтический состав представляет собой лиофилизированный состав, к которому врач или пациент добавляют растворители и/или разбавители перед применением.
В еще одном варианте реализации фармацевтический состав представляет собой высушенный (например, лиофилизированный или высушенный посредством распылительной сушки) состав, готовый для применения без предварительного растворения.
В дополнительном аспекте фармацевтический состав содержит водный раствор такого антитела и буфер, причем антитело присутствует в концентрации от 1 мг/мл или выше, а рН указанного состава составляет от приблизительно 2,0 до приблизительно 10,0.
В еще одном варианте реализации рН состава находится в диапазоне, выбранном из списка, состоящего из от приблизительно 2,0 до приблизительно 10,0, от приблизительно 3,0 до приблизительно 9,0, от приблизительно 4,0 до приблизительно 8,5, от приблизительно 5,0 до приблизительно 8,0 и от приблизительно 5,5 до приблизительно 7,5.
В дополнительном варианте реализации буфер выбран из группы, состоящей из ацетата натрия, карбоната натрия, цитрата, глицилглицина, гистидина, глицина, лизина, аргинина, дигидрофосфата натрия, гидрофосфата натрия, фосфата натрия и трис(гидроксиметил)аминометана, бицина, трицина, яблочной кислоты, сукцината, малеиновой кислоты, фумаровой кислоты, винной кислоты, аспарагиновой кислоты или их смеси. Каждый из этих конкретных буферов составляет альтернативный вариант реализации.
th
В дополнительном варианте реализации состав дополнительно содержит фармацевтически приемлемый консервант. В дополнительном варианте реализации состав дополнительно содержит изотонический агент. В дополнительном варианте реализации состав также содержит хелатообразующий агент.В дополнительном варианте реализации состав дополнительно содержит стабилизатор. В дополнительном варианте реализации состав дополнительно содержит поверхностно-активное вещество. Для удобства приведена ссылка на пособие Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19 edition, 1995.
В пептидном фармацевтическом составе могут присутствовать другие ингредиенты. Такие дополнительные ингредиенты могут включать увлажнители, эмульгаторы, антиоксиданты, наполнители, модификаторы тоничности, хелатообразующие агенты, ионы металлов, маслянистые носители, белки (например, человеческий сывороточный альбумин, желатин или белки) и цвиттер-ион (например, аминокислоту, например, бетаин, таурин, аргинин, глицин, лизин и гистидин). Такие дополнительные ингредиенты, разумеется, не должны оказывать отрицательного влияния на общую стабильность фармацевтического состава.
Фармацевтические композиции, содержащие антитело, можно вводить пациенту, нуждающемуся в таком лечении, в несколько областей, например, в области для местного применения, например, в участки кожи и слизистой оболочки, в области, которые позволяют обходиться без всасывания, например, при введении в артерию, в вену, в сердце и в области, которые подразумевают всасывание, например, при введении в кожу, под кожу, в мышцу или в брюшную полость. Введение фармацевтических композиций пациентам, нуждающихся в таком лечении, можно осуществлять несколькими путями, например, подкожным, внутримышечным, внутрибрюшинным, внутривенным, лингвальным, сублингвальным, буккальным, внутрь, оральным, в желудок и кишечник, назальным, легочным, например, через бронхиолы и альвеолы или их комбинации, эпидермальным, дермальным, трансдермальным, вагинальным, ректальным, глазным, например, через конъюнктиву, уретальным и парентеральным.
Подходящие составы антител также можно определить путем изучения опыта применения других уже разработанных терапевтических моноклональных антител. Показано, что некоторые моноклональные антитела являются эффективными в клинических ситуациях, например, можно применять Rituxan (ритуксимаб), Herceptin (трастузумаб), Xolair (омализумаб), Bexxar (тозитумомаб), Campath (алемтузумаб), Zevalin, Oncolym и аналогичные препараты, содержащие антитела. Например, моноклональное антитело можно вводить в концентрации 10 мг/мл в одноразовых флаконах по 100 мг (10 мл) или 500 мг (50 мл), в составе для в/в введения, содержащем 9,0 мг/мл хлорида натрия, 7,35 мг/мл дигидрата цитрата натрия, 0,7 мг/мл полисорбата 80 и стерильную воду для инъекций. рН доводят до 6,5. В другом варианте реализации антитело поставляют в составе, содержащем приблизительно 20 мМ цитрата Na, приблизительно 150 мМ NaCl, при рН приблизительно 6,0.
Диагностика и лечение заболеваний
Кроме того, предложены способы лечения индивида, в частности, индивида-человека, с применением антитела против CD39, описанного в настоящем документе. В одном варианте реализации настоящего изобретения предложено применение антитела, описанного в настоящем документе, при изготовлении фармацевтической композиции для введения пациенту-человеку. Как правило, индивид страдает от рака или инфекционного заболевания (например, вирусной инфекции, бактериальной инфекции) или подвергается риску развития этого заболевания. В одном варианте реализации у индивида в кровотоке и/или в образце ткани (например, в образце опухоли или прилегающей к опухоли ткани) содержится обнаружимый растворимый (внеклеточный) белок CD39.
Например, в одном аспекте предложен способ восстановления или усиления активности лимфоцитов у индивида, нуждающегося в этом, включающий стадию введения указанному индивиду нейтрализующего антитела против CD39 согласно настоящему изобретению. Антитело может быть, например, человеческим или гуманизированным антителом против CD39, специфично связывающим и нейтрализующим АТФазную активность растворимых и мембранных форм «сосудистого» CD39 без связывания CD39-L1, L2, L3 и/или L4, которое необязательно по существу не связывается с CD16 человека (и, кроме того, необязательно не связывается с другими Fcγ-рецептора ми человека, например, CD32a, CD32b или CD64). Такие антитела характеризуются ослабленными нежелательными побочными эффектами или токсичностью из-за отсутствия связывания с изоформами, отличающимися от сосудистого CD39, и ослабленными нежелательными побочными эффектами или токсичностью, обусловленными истощением или другим Fc-опосредованным влиянием на CD39-экспрессирующие эндотелиальные клетки в сосудистой сети.
В одном варианте реализации указанный способ направлен на повышение активности лимфоцитов (например, Т-клеток) у индивида, страдающего заболеванием, при котором полезна повышенная активность лимфоцитов, или которое вызывается или характеризуется иммуносупрессией, иммуносупрессивными клетками или, например, аденозином, образуемым CD4 Т-клетками, CD8 Т-клетками, В-кпетками). Указанные способы особенно пригодны, например, для лечения индивида с солидной опухолью и подозрением на то, что микроокружение опухоли (и CD39-опосредованная продукция аденозина в нем) может способствовать отсутствию распознавания иммунной системой (избеганию иммунного ответа). Окружение опухоли (опухолевая ткань или ткань, прилегающая к опухоли) может, например, характеризоваться наличием CD39-экспрессирующих иммунных клеток, например, CD4 Т-клеток, CD8 Т-клеток, В-клеток.
Конкретнее, указанные способы и композиции применяют для лечения различных видов рака и других пролиферативных заболеваний и инфекционных заболеваний. Поскольку эти методы работают за счет снижения уровня аденозина, который ингибирует активность лимфоцитов в отношении клеток-мишеней (например, противоопухолевую активность) и, возможно, дополнительно за счет увеличения уровня АТФ, что может усилить противоопухолевую активность лимфоцитов, их можно применять при очень широком диапазоне раковых и инфекционных заболеваний. В одном варианте реализации композиции на основе антитела против CD39 можно применять для лечения рака у индивидов, плохо реагирующих на (или не чувствительных к) лечение с применением агента, нейтрализующего ингибиторную активность PD-1 человека, например, ингибирующего взаимодействие между PD-1 и PD-L1. Типичные примеры раковых заболеваний, которые можно лечить, включают, в частности, солидные опухоли, в которых аденозин в микроокружении опухоли может играть важную роль в подавлении противоопухолевого иммунного ответа. В одном варианте реализации пациент-человек, получающие лечение с применением антитела против CD39, страдает раком печени, раком кости, раком поджелудочной железы, раком кожи, раком головы или шеи, включая плоскоклеточный рак головы и шеи (HNSCC), раком молочной железы, раком легкого, немелкокпеточным раком легкого (NSCLC), раком предстательной железы, устойчивым к кастрации (CRPC), меланомой, раком матки, раком толстой кишки, раком прямой кишки, раком анальной области, раком желудка, раком яичка, раком матки, раком фаллопиевых труб, раком эндометрия, раком шейки матки, раком влагалища, раком вульвы, неходжкинской лимфомой, раком пищевода, раком тонкой кишки, раком эндокринной системы, раком щитовидной железы, раком паращитовидной железы, раком надпочечника, саркомой мягких тканей, раком мочеиспускательного канала, раком полового члена, солидными опухолями детского возраста, лимфоцитарной лимфомой, раком мочевого пузыря, раком почки или мочеточника, карциномой почечной лоханки, новообразованием центральной нервной системы (ЦНС), первичной лимфомой ЦНС, опухолевым ангиогенезом, опухолью спинного мозга, глиомой ствола головного мозга, аденомой гипофиза, саркомой Капоши, эпидермоидным раком, плоско клеточным раком, раком, вызванным факторами окружающей среды, в том числе воздействием асбеста, гематологическими злокачественными заболеваниями, включая, например, множественную миелому, В-клеточную лимфому, лимфому Ходжкина/первичную В-клеточную медиастинальную лимфому, неходжкинские лимфомы, острую миелоидную лимфому, хронический миелогенный лейкоз, хронический лимфоидный лейкоз, фолликулярную лимфому, диффузную круп но клеточную В-клеточную лимфому, лимфому Беркитта, иммунобластную круп но клеточную лимфому, лимфому из предшественников В-лимфобластов, лимфому из клеток мантии, острый лимфобластный лейкоз, фунгоидный микоз, анапластическую крупноклеточную лимфому, Т-клеточную лимфому и лимфому из предшественников Т-лимфобластов, а также любыми комбинациями указанных злокачественных заболеваний. Настоящее изобретение также можно применять при лечении метастатического рака. Пациентов можно тестировать или отбирать по одному или более из вышеописанных клинических признаков до, во время или после лечения.
В одном варианте реализации антитело против CD39 применяют при лечении рака, характеризующегося обнаруживаемыми и/или повышенными уровнями растворимого (внеклеточного) белка CD39, например, в кровотоке и/или в тканях, например, в опухоли или ткани, прилегающей к опухоли.
В одном варианте реализации антитело против CD39 применяют при лечении рака, характеризующегося злокачественными клетками, экспрессирующими CD39.
50
70
100
50
70
100
50
70
100
В одном варианте реализации антитело против CD39 вводят в количестве, позволяющем достичь и/или поддерживать у индивида (например, в течение 1, 2, 3, 4 недель и/или до следующего введения антиген-связывающего соединения) концентрации в крови, составляющей по меньшей мере ЕС, необязательно ЕС, необязательно по существу ЕС для нейтрализации ферментативной активности CD39, необязательно sCD39, необязательно memCD39. В одном варианте реализации активное количество антитела против CD39 представляет собой количество, позволяющее достичь ЕС, необязательно ЕС, необязательно по существу ЕС для нейтрализации ферментативной активности CD39, необязательно sCD39, необязательно memCD39, во внесосудистой ткани индивида. В одном варианте реализации активное количество антитела против CD39 представляет собой количество, позволяющее достичь (или поддерживать) у индивида ЕС, необязательно ЕС, необязательно по существу ЕС для ингибирования нейтрализации ферментативной активности CD39, необязательно sCD39, необязательно memCD39.
В одном варианте реализации, в отличие от некоторых антител, направленных на истощение CD39-экспрессирующих опухолевых клеток посредством ADCC (что, например, может обеспечить полную эффективность при концентрациях, равных или существенно меньших, чем концентрации, которые обеспечивают насыщение рецептора), антитело против CD39 необязательно не проявляет значительной активности, опосредованной Fcγ-рецептором, и его вводят в количестве, позволяющем нейтрализовать ферментативную активность, необязательно, дополнительного количества CD39, без существенного снижения уровня экспрессии CD39, в течение желательного периода времени, например, в течение 1 недели, 2 недель, месяца, или до следующего введения антитела против CD39.
50
70
100
В одном варианте реализации антитело против CD39 вводят в количестве, позволяющем достичь и/или поддерживать (например, в течение 1, 2, 3, 4 недель и/или до следующего введения антитела против CD39) концентрации в крови индивида, составляющей по меньшей мере ЕС, необязательно ЕС, необязательно по существу ЕС для ингибирования CD39-опосредованного катаболизма АТФ до АМФ (например, согласно оценке нейтрализации АТФазной активности sCD39; согласно оценке нейтрализации АТФазной активности растворимого (внеклеточного) белка CD39, см. Пример 5).
В одном варианте реализации предложен способ лечения или профилактики рака у индивида, причем указанный способ включает введение индивиду, страдающему заболеванием, антитела против CD39 в количестве, позволяющем достичь или поддерживать в течение определенного времени концентрацию в кровотоке, необязательно в представляющей интерес внесосудистой ткани (например, опухоли или окружении опухоли), превышающей концентрацию, необходимую для 50%, 70% или полного (например, 90%) насыщения рецептора CD39-экспрессирующих клеток в кровотоке (например, согласно оценке в МПК). Достигаемая концентрация необязательно по меньшей мере на 20, 50 или 100% превышает концентрацию, необходимую для насыщения указанного рецептора.
50
70
100
50
70
100
В одном варианте реализации предложен способ лечения или профилактики рака у индивида, причем указанный способ включает введение индивиду антитела против CD39 в количестве, позволяющем достичь или поддерживать в течение определенного времени концентрацию в кровотоке, необязательно в представляющей интерес внесосудистой ткани (например, опухоли или окружении опухоли), превышающей ЕС, необязательно ЕС или необязательно ЕС для связывания CD39-экспрессирующих клеток (например, согласно оценке посредством проточной цитометрии, титрования антитела против CD39 на CD39-экспрессирующих клетках, например, клетках Ramos, как описано в разделе "Примеры, Способы"). Достигаемая концентрация необязательно по меньшей мере на 20, 50 или 100% превышает ЕС, необязательно ЕС или необязательно ЕС для связывания с клетками, экспрессирующими CD39.
50
70
100
50
70
100
ЕС, ЕС или ЕС можно оценивать, например, при клеточном анализе нейтрализации ферментативной активности CD39, показанном в разделе "Примеры" настоящего документа, например, нейтрализации АТФазной активности в В-клетках путем количественного определения гидролиза АТФ до АМФ (или АТФ до аденозина), см. "Примеры, Методы". «ЕС» по отношению к нейтрализации ферментативной активности CD39 относится к эффективной концентрации антитела против CD39, которая обеспечивает 50% от максимального ответа или действия в отношении нейтрализации ферментативной активности. «ЕС» по отношению к нейтрализации ферментативной активности CD39 относится к эффективной концентрации антитела против CD39, которая обеспечивает 70% от максимального ответа или действия. «ЕС» по отношению к нейтрализации ферментативной активности CD39 относится к эффективной концентрации антитела против CD39, которая обеспечивает по существу максимальный ответ или действие в отношении нейтрализации ферментативной активности.
50
70
100
В некоторых вариантах реализации, в частности, для лечения солидных опухолей, достигаемая концентрация должна приводить к получению концентрации в тканях (вне сосудистой сети, например, в опухоли или окружении опухоли), соответствующей по меньшей мере ЕС или ЕС. для нейтрализации ферментативной активности, необязательно приблизительно или по меньшей мере приблизительно ЕС.
В одном варианте реализации количество антитела против CD39 составляет от 1 до 20 мг/кг массы тела. В одном варианте реализации указанное количество вводят индивиду еженедельно, каждые две недели, ежемесячно или каждые два месяца.
В одном варианте реализации предложен способ лечения индивида-человека, страдающего раком, включающий введение индивиду эффективного количества антитела против CD39 согласно настоящему изобретению в течение по меньшей мере одного цикла введения (необязательно по меньшей мере 2, 3, 4 или более циклов введения), где цикл представляет собой период в восемь недель или менее, причем в течение каждого из по меньшей мере одного цикла вводят одну, две, три или четыре дозы антитела против CD39 в дозе 1-20 мг/кг массы тела. В одном варианте реализации антитело против CD39 вводят посредством внутривенного вливания.
Подходящие протоколы лечения для лечения людей включают, например, введение пациенту антитела против CD39 в количестве, описанном в настоящем документе, причем указанный способ включает по меньшей мере один цикл введения, в течение которого вводят по меньшей мере одну дозу антитела против CD39. Необязательно вводят по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 доз антитела против CD39. В одном варианте реализации цикл введения составляет от 2 недель до 8 недель.
50
70
100
В одном варианте реализации предложен способ лечения или профилактики заболевания (например, рака, солидной опухоли, гемобластоза) у индивида, причем указанный способ включает введение индивиду, страдающему заболеванием (например, раком, солидной опухолью, гемобластозом) антитела против CD39, нейтрализующего ферментативную активность CD39, в течение по меньшей мере одного цикла введения, причем цикл введения включает по меньшей мере первое и второе (и, необязательно, 3, 4, 5, 6, 7 и/или 8 или дальнейшие) введения антитела против CD39, причем антитело против CD39 вводят в количестве, позволяющем достичь или поддерживать между двумя последовательными введениями концентрацию антитела против CD39 в крови (сыворотке), составляющую по меньшей мере 0,1 мкг/мл, необязательно по меньшей мере 0,2 мкг/мл, необязательно по меньшей мере 1 мкг/мл или необязательно по меньшей мере 2 мкг/мл (например, для лечения гемобластоза) или необязательно по меньшей мере приблизительно 1 мкг/мл, 2 мкг/мл, 10 мкг/мл или 20 мкг/мл, например, в диапазоне 1-100 мкг/мл, 1-50 мкг/мл, 1-20 мкг/мл или 1-10 мкг/мл (например, для лечения солидной опухоли, для лечения гемобластоза). В одном варианте реализации поддерживают заданную постоянную концентрацию в крови, причем указанная концентрация в крови не падает существенно ниже указанной концентрации в крови в течение указанного времени (например, между двумя введениями антитела, в течение определенного количества недель, 1 недели, 2 недель, 3 недель, 4 недель), т.е. хотя концентрация в крови может варьироваться в течение указанного времени, указанная поддерживаемая концентрация в крови представляет собой минимальную концентрацию. В одном варианте реализации терапевтически активное количество антитела против CD39 представляет собой количество такого антитела, способное обеспечить (по меньшей мере) концентрацию в крови и/или в ткани, равную ЕС, необязательно концентрацию в крови и/или в ткани, равную ЕС, необязательно концентрацию в крови и/или в ткани, равную ЕС для нейтрализации ферментативной активности CD39 в течение по меньшей мере приблизительно 1 недели, приблизительно 2 недель или приблизительно месяца после введения антитела.
До или во время курса лечения антителом против CD39 согласно настоящему изобретению можно оценивать наличие или уровни растворимого (внеклеточного) белка CD39, клеток, экспрессирующих CD39, уровня аденозина, АТФ, АДФ и/или АМФ в опухоли и/или рядом с опухолью пациента с целью определить, подходит ли пациент для лечения (например, прогнозировать способность пациента реагировать на лечение). Присутствие или повышенные уровни растворимого (внеклеточного) CD39, CD39-экспрессирующих клеток, аденозина, АТФ, АДФ и/или АМФ могут указывать, что индивид подходит для лечения (например, лечение, вероятно, будет полезно для него) с применением антитела против CD39 согласно настоящему изобретению (включая антитело, ингибирующее связанный с субстратом CD39, но не ограничиваясь им).
До или во время курса лечения с применением антитела против CD39 согласно настоящему изобретению можно необязательно оценивать уровни аденозина, АДФ и/или АМФ в опухоли пациента и/или рядом с ней, чтобы определить, полезно ли для пациента лечение с применением антитела против CD39. Снижение уровней аденозина, АТФ, АДФ и/или АМФ после введения (или приема антитела) по сравнению с уровнями до лечения (или приема антитела) может указывать на то, что лечение с применением антитела против CD39 согласно настоящему изобретению (включая антитело, ингибирующее связанный с субстратом CD39, но не ограничиваясь им) полезно для индивида. Если лечение с применением антитела против CD39 полезно для пациента, способы могут дополнительно необязательно включать введение пациенту дополнительной дозы антитела против CD39 (например, при продолжении лечения).
В одном варианте реализации оценка уровней аденозина, АДФ и/или АМФ в опухоли и/или рядом с опухолью пациента включает получение от пациента биологического образца ткани человека, выбранной из группы, состоящей из ткани онкологического пациента, например, раковой ткани, ткани, близкой к опухоли, или ткани с периферии раковой опухоли, ткани, прилегающей к раковой опухоли, прилегающей неопухолевой ткани или здоровой прилегающей ткани, и обнаружение уровней аденозина, АТФ, АДФ и/или АМФ в указанной ткани. Уровни у пациента можно сравнивать с референсным уровнем, например, соответствующим здоровому индивиду.
В одном варианте реализации настоящего изобретения предложен способ лечения или профилактики рака у индивида, нуждающегося в этом, причем указанный способ включает:
a) обнаружение растворимого (внеклеточного) белка CD39 и/или клеток, экспрессирующих CD39, в кровотоке или в окружении опухоли, необязательно внутри опухоли и/или в прилегающей ткани, и
b) после определения того, что уровень растворимого (внеклеточного) белка CD39 и/или CD39-экспрессирующих клеток, содержащихся в кровотоке или окружении опухоли, необязательно соответствует уровню, повышенному по сравнению с референсным уровнем (например, соответствующим здоровому индивиду или индивиду, не получающему существенной пользы от антитела против CD39), введение индивиду антитела против CD39. CD39-экспрессирующие клетки могут включать раковые клетки или лейкоциты, например, циркулирующие или опухоль-инфильтрирующие клетки, например, CD4 Т-клетки, CD8 Т-клетки, Treg-клетки, В-клетки.
В одном варианте реализации настоящего изобретения предложен способ лечения или профилактики рака у индивида, нуждающегося в этом, причем указанный способ включает:
a) оценку наличия обнаружимого растворимого (внеклеточного) CD39 у индивида, необязательно в кровотоке, необязательно в опухоли и/или в прилегающей ткани, и
b) при обнаружении уровня растворимого (внеклеточного) CD39, необязательно соответствующего уровню, повышенному по сравнению с референсным уровнем (например, соответствующим здоровому индивиду или индивиду, не получающему существенной пользы от антитела против CD39 согласно настоящему изобретению), введение индивиду антитела против CD39 согласно настоящему изобретению.
В любом из способов обнаружение растворимого белка CD39 и/или CD39-экспрессирующих клеток (или аденозина, АТФ, АДФ и/или АМФ) в среде опухоли необязательно включает получение от индивида биологического образца, который содержит раковую ткань и/или ткань, близкую к опухоли или ткань с периферии раковой опухоли (например, ткань, прилегающую к раковой опухоли, прилегающую неопухолевую ткань или здоровую прилегающую ткань), и определение уровней белка sCD39, клеток, экспрессирующих CD39 (или аденозина, АТР, АДФ и/или АМФ). CD39-экспрессирующие клетки могут включать, например, опухолевые клетки, CD4 Т-клетки, CD8 Т-клетки, клетки Treg, В-клетки.
Индивида, страдающего раком, можно лечить с применением антитела против CD39 без предварительной стадии обнаружения и оценки наличия sCD39 и/или экспрессии CD39 на циркулирующих клетках или на клетках в микроокружении опухоли (например, на опухолевых клетках, CD4 Т-клетках, CD8 Т-клетках, TReg-кпетках, В-клетках). Способ лечения может необязательно включать стадию обнаружения нуклеиновой кислоты или полипептида CD39 в биологическом образце из крови или опухоли индивида (например, в раковой ткани, ткани, близкой к опухоли, или ткани с периферии раковой опухоли, ткани, прилегающей к раковой опухоли, прилегающей неопухолевой ткани или здоровой прилегающей ткани). Определение наличия в биологическом образце клеток, экспрессирующих CD39 (например, выраженно экспрессирующих; экспрессирующих CD39 на высоком уровне, с высокой интенсивностью окрашивания антителом против CD39 по сравнению с референсом), указывает на наличие у пациента рака, при котором лечение агентом, ингибирующим CD39, может принести значительную пользу. В одном варианте реализации способ включает определение уровня экспрессии нуклеиновой кислоты или полипептида CD39 в биологическом образце и сравнение этого уровня с референсным уровнем, соответствующим здоровому индивиду. Определение наличия в биологическом образце белка sCD39 и/или клеток, экспрессирующих нуклеиновую кислоту или полипептид CD39 на уровне, повышенном по сравнению с референсным уровнем, указывает на наличие у пациента рака, который можно с успехом лечить с применением антитела против CD39 согласно настоящему изобретению. В одном варианте реализации обнаружение полипептида CD39 в биологическом образце включает обнаружение растворимого внеклеточного белка CD39. В одном варианте реализации обнаружение полипептида CD39 в биологическом образце включает обнаружение полипептида CD39, экспрессированного на поверхности злокачественной клетки, CD4 Т-клетки, CD8 Т-клетки, TReg-клетки, В-клетки. В одном варианте реализации определение наличия в биологическом образце клеток, выраженно экспрессирующих нуклеиновую кислоту или полипептид CD39, указывает на наличие у пациента рака, который можно с успехом лечить с применением антитела против CD39 согласно настоящему изобретению. «Выраженно экспрессируемый» применительно к полипептиду CD39 означает, что полипептид CD39 экспрессируется в значительном количестве клеток, взятых у данного пациента. Хотя определение термина «выраженно экспрессируемый» не связано с точным процентным значением, в некоторых примерах рецептор, который считается «выраженно экспрессируемый», присутствует по меньшей мере на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или более опухолевых клеток, взятых у пациента.
Определение наличия у индивида рака, характеризующегося клетками, экспрессирующими полипептид CD39, может, например, включать получение биологического образца (например, путем проведения биопсии) от индивида, содержащего клетки из окружения раковой опухоли (например, опухоли или ткани, прилегающей к опухоли), приведение указанных клеток в контакт с антителом, связывающим полипептид CD39, и определение наличия экспрессии CD39 клетками на своей поверхности. Определение наличия у индивида клеток, экспрессирующих CD39, необязательно включает выполнение иммуногистохимического анализа.
Композиции антител можно применять в качестве монотерапии или комбинированного лечения с одним или более другими терапевтическими агентами, включая агенты, обычно используемые для конкретной терапевтической цели, для которой вводят антитело. Дополнительный терапевтический агент обычно вводят в количествах и согласно схемам лечения, обычно применяемым для этого агента при монотерапии конкретного заболевания или состояния, подвергаемого лечению. Такие терапевтические агенты включают противораковые агенты и химиотерапевтические агенты, например, химиотерапевтический агент, способный вызывать внеклеточное высвобождение АТФ из опухолевых клеток, но не ограничиваются ими.

В одном варианте реализации нейтрализующие антитела против CD39 не способны связываться с CD16 человека, но усиливают активность CD16-экспрессирующих эффекторных клеток (например, NK или эффекторных Т-клеток). Соответственно, в одном варианте реализации, второй или дополнительный второй терапевтический агент представляет собой антитело или другой белок, содержащий Fc-домен, способный индуцировать ADCC по отношению к клетке, к которой он связывается, например, посредством CD16, экспрессируемого NK-клеткой. Как правило, такое антитело или другой белок содержат домен, связывающийся с интересующим антигеном, например, антигеном, присутствующим в опухолевой клетке (опухолевым антигеном), и Fc-домен или его фрагмент, и связываются с антигеном за счет антиген-связывающего домена и с Fcγ-рецепторами (например, CD16) за счет Fc-домена. В одном варианте реализации его ADCC-активность по меньшей мере частично опосредована CD16. В одном варианте реализации дополнительный терапевтический агент представляет собой антитело, содержащее нативный или модифицированный Fc-домен человека, например, Fc-домен антитела lgG1 или lgG3 человека. Термин «антитело-зависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность» или «ADCC» является термином, хорошо известным в данной области техники, и относится к клеточно-опосредованной реакции, при которой неспецифичные цитотоксические клетки, экспрессирующие Fc-рецепторы (FcR), распознают связанное антитело на клетки-мишени и впоследствии вызывают лизис клетки-мишени. Неспецифичные цитотоксические клетки, опосредующие ADCC, включают естественные киллеры (NK-кпетки), макрофаги, моноциты, нейтрофилы и эозинофилы. Термин «антитело, индуцирующее ADCC» относится к антителу, которое демонстрирует ADCC при измерении с помощью анализа(ов), известных специалистам в данной области техники. Такая активность обычно характеризуется связыванием Fc-области с различными FcR. Безотносительно к конкретному механизму, специалисты в данной области должны понимать, что способность антитела демонстрировать ADCC может быть обусловлена, например, его принадлежностью к определенному подклассу (например, lgG1 или lgG3), мутациями, введенными в Fc-область, или модификациями углеводных структур в Fc-области антитела. Примеры антител, которые индуцируют ADCC, включают ритуксимаб (для лечения лимфомы, ХЛЛ, трастузумаб (для лечения рака молочной железы), алемтузумаб (для лечения хронического лимфоцитарного лейкоза) и цетуксимаб (для лечения рака ободочной и прямой кишки, плоскоклеточной карциномы головы и шеи). Примеры ADCC-усиливающих антител включают: GA-101 (гипофукозилированное антитело против CD20), маргетуксимаб (Fc-усиленное антитело против HER2), меполизумаб, MEDI-551 (модифицированное по Fc антитело против CD19), обинутузумаб (модифицированное по гликозилированию/гипофукозилированное антитело против CD20), окаратузумаб (модифицированное по Fc антитело против CD20), XmAb5574/MOR208 (модифицированное по Fc антитело против CD19), но не ограничиваются ими.
В одном варианте реализации нейтрализующие антитела против CD39 усиливают эффективность агентов, нейтрализующих ингибиторную активность PD-1 человека, например, ингибирующих взаимодействие между PD-1 и PD-L1, особенно у индивидов, плохо реагирующих на (или нечувствительных к) лечению агентом, нейтрализующим ингибиторную активность PD-1 человека. Соответственно, в одном варианте реализации, второй или дополнительный второй терапевтический агент представляет собой антитело или другой агент, нейтрализующий ингибиторную активность PD-1 человека.
Белок запрограммированной гибели-1 (PD-1) (также называемый «белком запрограммированной гибели клетки-1») является ингибиторным членом семейства рецепторов CD28. Полная последовательность PD-1 человека находится в GenBank под номером доступа U64863. Ингибирование или нейтрализация ингибиторной активности PD-1 может включать применение полипептидного агента (например, антитела, полипептида, объединенного с Fc-доменом, иммуноадгезина и т.д.), блокирующего PD-L1-индуцируемый сигнальный путь PD-1, В настоящее время существует по меньшей мере шесть агентов, блокирующих путь PD-1/PD-L1, которые присутствуют на рынке или проходят клиническую оценку. Одним из агентов является BMS-936558 (ниволумаб/ONO-4538, Bristol-Myers Squibb; ранее известный как MDX-1106). Ниволумаб (торговое наименование Opdivo) представляет собой утвержденное FDA полностью человеческое lgG4-MAT против PD-L1, ингибирующее связывание лиганда PD-L1 как с PD-1, так и с CD80, и описывается как антитело 5С4 в заявке WO 2006/121168, описание которой включено в настоящий документ посредством ссылки. Для пациентов с меланомой наиболее значительную OR наблюдали при дозе 3 мг/кг, в то время как для других типов рака она составляла 10 мг/кг. Ниволумаб обычно вводят в дозе 10 мг/кг каждые 3 недели до прогрессирования рака. Термины «снижает ингибиторную активность PD-1 человека», «нейтрализует PD-1» или «нейтрализует ингибиторную активность PD-1» относятся к процессу, при котором происходит ингибирование способности PD-1 к передаче сигнала в результате взаимодействия PD-1 с одним или более из его партнеров по связыванию, например, PD-L1 или PD-L2. Агент, нейтрализующий ингибиторную активность PD-1, ослабляет, блокирует, ингибирует, отменяет или мешает передаче сигнала, возникающей в результате взаимодействия PD-1 с одним или более из его партнеров по связыванию, например, PD-L1, PD-L2. Таким образом, такой агент может снижать отрицательный костимуляторный сигнал, опосредованный белками клеточной поверхности, экспрессируемыми на Т-лимфоцитах, усиливая эффекторные функции Т-клеток, например, пролиферацию, продукцию цитокинов и/или цитотоксичность.
MK-3475 (lgG4 мАт человека против PD1 от Merck), также называемый ламбролизумабом или пембролизумабом (торговое наименование Keytruda), утвержден FDA для лечения меланомы и проходит испытания при других видах рака. Пембролизумаб тестировали в дозе 2 мг/кг или 10 мг/кг каждые 2 или 3 недели до прогрессирования заболевания. MK-3475, также известный как Merck 3745 или SCH-900475, также описан в WO 2009/114335.
MPDL3280A/RG7446 (атезолизумаб, торговое наименование Tecentriq™, антитело против PD-L1 от Roche/Genentech) представляет собой mAb человека против PD-L1, содержащее сконструированный Fc-домен, предназначенный для оптимизации эффективности и безопасности за счет минимизации связывания с FcγR и последующей антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (ADCC). Дозы ≤1, 10, 15 и 25 мг/кг MPDL3280A вводили каждые 3 недели в течение срока продолжительностью до 1 года. В исследовании 3 фазы MPDL3280A вводят при NSCLC в дозе 1200 мг путем внутривенного вливания каждые три недели.
АМР-224 (Amplimmune и GSK) представляет собой иммуноадгезин, содержащий внеклеточный домен PD-L2, присоединенный к Fc-домену. Другие примеры агентов, нейтрализующих PD-1, могут включать антитело, связывающее PD-L2 (антитело против PD-L2) и блокирующее взаимодействие между PD-1 и PD-L2.
Пидлизумаб (СТ-011; CureTech) (гуманизированное lgG1 мАт против PD1 от CureTech/Teva), пидлизумаб (СТ-011; CureTech) (см., например, WO 2009/101611) представляет собой еще один пример; этот препарат протестировали у тридцати пациентов с рецидивирующей FL, чувствительной к ритуксимабу, получавших 3 мг/кг СТ-011 внутривенно каждые 4 недели за 4 вливания в комбинации с ритуксимабом в дозе 375 мкг/м2 в неделю в течение 4 недель, начиная со 2 недели после первого вливания СТ-011.
Кроме того, известные антитела против PD-1 и другие ингибиторы PD-1 включают АМР-224 (гибридный белок B7-DC/lgG1, лицензированный в GSK), АМР-514, описанный в WO 2012/145493, антитело MEDI-4736 (дурвалумаб, торговое название Imfinzi™, антитело против PD-L1, разработанное в AstraZeneca/Medlmmune), описанное в WO 2011/066389 и US 2013/034559, антитело YW243.55.S70 (антитело против PD-L1), описанное в WO 2010/077634, MDX-1105, также известный как BMS-936559, представляющий собой антитело против PD-L1, разработанное Bristol-Myers Squibb, описанное в WO 2007/005874, и антитела и ингибиторы, описанные в WO 2006/121168, WO 2009/014708, WO 2009/114335 и WO 2013/019906, описания которых включены в настоящий документ посредством ссылок. Дополнительные примеры антител против PD1 описаны в WO 2015/085847 (Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co., Ltd.), например, антитела с CDR1, 2 и 3 вариабельного домена легкой цепи согласно SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 и/или SEQ ID NO: 8, соответственно, и CDR1, 2 и 3 вариабельного домена тяжелой цепи антитела согласно SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5, соответственно, где ссылки на SEQ ID NO соответствуют нумерации в заявке WO 2015/085847, описание которой включено в настоящий документ посредством ссылки. Кроме того, можно использовать антитела, конкурирующие с любым из этих антител за связывание с PD-1 или PD-L1. Типичное антитело против PD-1 представляет собой пембролизумаб (коммерциализированный Merck & Co., под названием Keytruda™, см, также WO 2009/114335, описание которой включено в настоящий документ посредством ссылки).
В некоторых вариантах реализации агент, нейтрализующий PD-1, представляет собой мАт против PD-L1, ингибирующее связывание PD-L1 с PD-1. В некоторых вариантах реализации агент, нейтрализующий PD-1, представляет собой мАт против PD1, ингибирующее связывание PD-1 с PD-L1. В некоторых вариантах реализации агент, нейтрализующий PD-1, представляет собой иммуноадгезин (например, иммуноадгезин, содержащий внеклеточный или PD-1-связывающий фргамент PD-L1 или PD-L2, присоединенный к константной области (например, Fc-области последовательности иммуноглобулина).
В способах лечения CD39-связывающее соединение и второй терапевтический агент можно вводить отдельно, вместе или последовательно, или в виде смеси. В некоторых вариантах реализации антиген-связывающее соединение вводят до введения второго терапевтического агента. Например, CD39-связывающее соединение можно вводить приблизительно за 0-30 дней до введения второго терапевтического агента. В некоторых вариантах реализации CD39-связывающее соединение вводят от приблизительно 30 минут до приблизительно 2 недель, от приблизительно 30 минут до приблизительно 1 недели, от приблизительно 1 часа до приблизительно 2 часов, от приблизительно 2 часов до приблизительно 4 часов, от приблизительно 4 часов до 6 часов, от приблизительно 6 часов до приблизительно 8 часов, от приблизительно 8 часов до 1 дня или от приблизительно 1 до 5 дней до введения второго терапевтического агента. В некоторых вариантах реализации CD39-связывающее соединение вводят одновременно с введением терапевтических агентов. В некоторых вариантах реализации CD39-связывающее соединение вводят после введения второго терапевтического агента. Например, CD39-связывающее соединение можно вводить приблизительно через 0-30 дней после введения второго терапевтического агента. В некоторых вариантах реализации CD39-связывающее соединение вводят от приблизительно 30 минут до приблизительно 2 недель, от приблизительно 30 минут до приблизительно 1 недели, от приблизительно 1 часа до приблизительно 2 часов, от приблизительно 2 часов до приблизительно 4 часов, от приблизительно 4 часов до 6 часов, от приблизительно 6 часов до приблизительно 8 часов, от приблизительно 8 часов до 1 дня или от приблизительно 1 до 5 дней после введения второго терапевтического агента.
Примеры
Способы
Получение мутантов CD39
Мутантов CD39 получали с помощью ПЦР. Амплифицированные последовательности разделяли в агарозном геле и очищали с использованием набора для выделения из геля и очистки Macherey Nagel PCR Clean-Up Gel Extraction (учетный номер 740609). Затем очищенные продукты ПЦР, полученные для каждого мутанта, лигировали в экспрессирующий вектор с помощью системы ClonTech InFusion. Векторы, содержащие мутированные последовательности, получали в мини-препаративном количестве и секвенировали. После секвенирования векторы, содержащие мутированные последовательности, получали в миди-препаративном количестве с использованием плазмидной системы Promega Pure Yield™ Plasmid Midiprep System. Клетки HEK293T выращивали в среде DMEM (Invitrogen), трансфицировали векторами с использованием липофектамина 2000 (Invitrogen) и инкубировали при 37°С в CO2-инкубаторе в течение 48 часов перед анализом экспрессии трансгена. Мутантов трансфицировали в клетки Hek-293Т, как показано в таблице ниже. Мутации аминокислот-мишеней в приведенной ниже Таблице 1 показаны с использованием нумерации согласно SEQ ID NO: 1.
Клонирование, продукция и очистка растворимого huCD39 Молекулярная биология
Белок huCD39 клонировали из кДНК МПК человека с использованием праймеров TACGACTCACAAGCTTGCCGCCACCATGGAAGATACAAAGGAGTC (SEQ ID NO: 42) (прямой) и CCGCCCCGACTCTAGATCACTTGTCATCGTCATCTTTGTAATCGACATAGGTGGAGTGGGAGAG (SEQ ID NO: 43) (обратный). Очищенный продукт ПЦР затем клонировали в экспрессирующий вектор с использованием системы клонирования InFusion. Маркер М2 (FLAG-маркер, выделенный подчеркиванием в SEQ ID NO: 45) добавляли в С-концевую часть белка для стадии очистки; следует принимать во внимание, что белок внеклеточного домена CD39 (например, SEQ ID NO: 45) в любом варианте реализации необязательно может не содержать маркера М2.
Экспрессия и очистка белка huCD39
После валидации клонированной последовательности клетки СНО подвергали нуклеофекции, а продуцирующий пул субклонировали для получения клона клеток, продуцирующих белок huCD39. Супернатант клона huCD39, выращенного в роллер-флаконе, собирали и очищали с использованием хроматографической колонки М2 и элюировали с использованием пептида М2. Затем очищенные белки загружали в колонку для эксклюзионной хроматографии размера S200. Состав очищенного белка, соответствующего мономеру, готовили в буфере TBS рН 7,5. Аминокислотная последовательность рекомбинантного белка внеклеточного домена CD39-M2 без маркера М2 представляла собой:
Конечная аминокислотная последовательность рекомбинантного белка внеклеточного домена CD39-M2 с маркером М2 представляла собой:
Ингибирование ферментативной активности растворимого CD39
-3
Ингибирование ферментативной активности продуцируемого растворимого белка CD39 антителами оценивали с использованием Cell Titer Glo™ (Promega, учетный номер G7571), который позволял оценивать гидролиз АТФ с помощью реагента, генерирующего люминесцентный сигнал, пропорциональный количеству присутствующего АТФ. Таким образом, можно оценить ингибирование гидролиза АТФ, опосредованного растворимым CD39. Вкратце, дозы антитела против CD39 в диапазоне от 100 мкг/мл до 6×10 мкг/мл инкубировали с 400 нг/мл растворимого рекомбинантного белка CD39 человека, содержавшего аминокислотную последовательность, описанную в разделе «Способы» (SEQ ID NO: 45), в течение 1 часа при 37°С. 20 мкМ АТФ добавляли в планшеты еще на 30 минут при 37°С перед добавлением реагента CTG (Cell Titer Glo). Испускаемый свет количественно определяли с помощью люминометра Enspire™ после короткого периода инкубирования в течение 5 минут в темноте. Эффективность антитела против CD39 определяли путем сравнения испускаемого света в присутствии антитела с АТФ самим по себе (максимальное излучение света) и АТФ вместе с растворимым белком CD39 (минимальное излучение света).
Ингибирование ферментативной активности клеточного CD39
4
3
-4
Ингибирование ферментативной активности CD39 в CD39-экспрессирующих клетках антителами оценивали с использованием Cell Titer Glo™ (Promega, учетный номер G7571), который позволял оценивать гидролиз АТФ с помощью реагента, генерирующего люминесцентный сигнал, пропорциональный количеству присутствующего АТФ. Таким образом, анализ был предназначен для оценки ингибирования гидролиза АТФ за счет CD39 в супернатанте клеточной культуры. Вкратце, 5×10 клеток лимфомы человека Ramos, 5×10 клеток СНО, экспрессирующих CD39 человека, CD39 яванского макака и CD39 мыши, инкубировали в течение 1 часа при 37°С с антителами против CD39 в концентрации от 30 мкг/мл до 5×10 мкг/мл. Затем клетки инкубировали с 20 мкМ АТФ в течение еще 1 часа при 37°С. Планшеты центрифугировали в течение 2 минут при 400 g, и 50 мкл клеточного супернатанта переносили в люминесцентный микропланшет (белые лунки). К супернатанту добавляли 50 мкл реагента CellTiter-Glo (CTG) и количественно определяли испускаемый свет после 5-минутного инкубирования в темноте с использованием люминометра Enspire™. Эффективность антитела против CD39 определяли путем сравнения испускаемого света в присутствии антитела с АТФ самим по себе (максимальное излучение света) и АТФ вместе с клетками (минимальное излучение света).
Получение антител: иммунизация и скрининг у мышей
Для получения антител против CD39 человека мышей Balb/c иммунизировали рекомбинантным белком внеклеточного домена CD39-M2 человека, описанным выше. Мыши получали одну первичную иммунизацию эмульсией из 50 мкг белка CD39 и полного адъюванта Фрейнда внутрибрюшинно, 2-ю иммунизацию эмульсией из 50 мкг белка CD39 и неполного адъюванта Фрейнда внутрибрюшинно, и, наконец, бустер-иммунизацию 10 мкг белка CD39 внутривенно. Иммунные клетки селезенки сливали через 3 дня после бустер-иммунизации с иммортализованными В-клетками X63.Ag8.653 и культивировали в присутствии облученных клеток селезенки. Гибридомы высевали в полужидкую среду, содержащую метилцеллюлозу, растущие клоны отбирали с использованием аппарата clonepix 2 (Molecular Devices).
Пример 1. Эпитопное картирование известных нейтрализующих мАт против CD39.
Чтобы исследовать антитела, способные ингибировать ферментативную (АТФазную) активность клеточного CD39, авторы изобретения исследовали эпитопы, связываемые антителами, согласно сообщениям, ингибирующими АТФазную активность CD39 в клеточных анализах: BY40, описанным в публикации РСТ № WO 2009/095478.
Для определения эпитопов антител против CD39 авторы изобретения разработали мутанты CD39, определяемые по заменам аминокислот, экспонированных на поверхности молекулы CD39. Мутантов трансфицировали в клетки Нек-293Т, как показано в Таблице 1, с использованием нумерации согласно SEQ ID NO: 1.
Ряд доз I-394 (10 - 2,5 - 0,625 - 0,1563 - 0,0391 - 0,0098 - 0,0024 - 0,0006 мкг/мл) протестировали на 20 полученных мутантах с помощью проточной цитометрии. Оба антитела BY40 характеризовались полной потерей способности к связыванию с клетками, экспрессирующими мутант 5 CD39, без потери способности к связыванию с любым другим мутантом. Мутант 5 содержал аминокислотные замены по остаткам Q96, N99, Е143 и R147. Положение мутанта 5 на поверхности CD39 показано на Фигуре 3А.
Пример 2. Известные нейтрализующие мАт против CD39 не способны ингибировать АТФазную активность рекомбинантного растворимого белка CD39.
Два антитела, согласно сообщениям, ингибировавшие АТФазную активность CD39 в клеточных анализах (BY40 и BY12), подвергли оценке с целью определить, способны ли они ингибировать АТФазную активность рекомбинантного растворимого белка CD39. Ингибирование антителами ферментативной активности растворимого белка CD39, полученного, как описано выше, оценивали с использованием Cell Titer Glo™ (Promega, учетный номер G7571). Ингибирование ферментативной активности клеточного белка CD39 антителами оценивали, как указано выше.
Как и ожидалось, BY40 ингибировало АТФазную активность белка CD39 в клетках. Однако BY40 не могло ингибировать ферментативную активность растворимого белка CD39. На Фигуре 2 В показано сравнение BY40 с новыми антителами, указанными в настоящем документе.
Пример 3: Скрининг новых мАт для блокировки активности sCD39
Выполнили серию иммунизации с целью поиска антител, нейтрализующих АТФазную активность sCD39. Для получения антител против CD39 человека животных иммунизировали рекомбинантным белком внеклеточного домена CD39-M2 человека, описанным выше. Всего выполнили 15 серий иммунизации с использованием различных протоколов и на различных животных. Сюда входили различные линии мышей, крыс и кроликов.
В первоначальных протоколах иммунизации первичный скрининг включал тестирование супернатанта (SN) растущих клонов посредством проточной цитометрии с использованием линий клеток СНО дикого типа и СНО, экспрессирующих huCD39. Клетки окрашивали 0,1 мкм и 0,005 мкМ CFSE, соответственно. Для скрининга с помощью проточной цитометрии все клетки смешивали одинаковым образом, и присутствие реагирующих антител в супернатантах выявляли с использованием поликлонального антитела (пАт) козы против антител мыши, меченого АРС. Для получения антител, связывавших huCD39, супернатанты подвергали скринингу на предмет ингибирования ферментативной активности растворимого CD39 с помощью скринингового анализа, разработанного и описанного выше ("Способы").
Результаты показали, что несмотря на возможность получения множества специфичных С039-связывающих антител, ни одно из антител при любой из иммунизаций не демонстрировало ингибирования ферментативной активности растворимого CD39. Одна возможная причина этого состоит в том, что основные эпитопы CD39 не включают эпитоп, расположенный в каталитическом центре CD39 или вблизи него. Ввиду небольшого количества имеющихся антител, ингибирующих клеточный CD39, и известных трудностей с ингибированием каталитических центров ферментов с использованием антител, отсутствие антител, нейтрализующих sCD39, может указывать на невозможность получения антител, ингибирующих растворимый (внеклеточный домен) CD39. Другие возможные причины связаны с нефункциональными скрининговыми анализами и/или неправильным фолдингом или функционированием растворимого белка CD39; в частности, отсутствие антитела, способного ингибировать растворимый CD39, затрудняет валидацию анализа блокады sCD39.
В связи с отсутствием антител, способных ингибировать растворимый CD39, выполнили дополнительную иммунизацию с использованием скринингового протокола, предназначенного для образования антител, связывающих активный центр CD39, выявляемый по эпитопу антитела BY40. Вкратце, первичный скрининг включал тестирование супернатанта (SN) растущих клонов с помощью проточной цитометрии с использованием линий клеток СНО дикого типа и СНО, экспрессирующих huCD39, как при предыдущих иммунизациях, с последующим скринингом на предмет потери способности к связыванию клеток Hek-293Т, экспрессирующих мутант 5 CD39, по сравнению с CD39 дикого типа, как показано в Таблице 1. Мутант 5 содержал аминокислотные замены по остаткам Q96, N99, Е143 и R147. Однако результаты вновь показали, что несмотря на возможность получения множества специфичных CD39-связывающих антител, демонстрировавших потерю способности к связыванию с мутантом 5, ни одно из антител при любой из начальных иммунизаций не демонстрировало ингибирования ферментативной активности растворимого CD39.
Пример 4. Выявление первого антитела, ингибирующего активность sCD39, в рамках эпитоп-специфичного скрининга.
Авторы изобретения стремились выявить антитела против CD39, которые не связываются с областью Q96, N99, Е143 и R147 (определяемые с использованием мутанта 5), с целью получения антител, не конкурирующих с антителами, подобными BY40. Такие антитела, которые не должны обладать способностью блокировать АТФазную активность CD39, можно применять для фармакологических исследований антител, ингибирующих клеточный CD39, связывающихся с сайтом связывания BY40, например, для обнаружения и количественного определения свободного белка CD39 на клетках в присутствии BY40 или BY40-noflo6Hbix антител, ингибирующих клеточный CD39.
Начиная с результатов иммунизации, описанных в Примере 3, где гибридомы подвергали скринингу на предмет потери способности к связыванию с мутантом 5 CD39, выбрали гибридому, отсутствовавшую среди тех, которые продемонстрировали потерю способности к связыванию с мутантом 5 CD39. Эта гибридома (I-394) находилась среди расширенного пула, возможно, из-за частичного ослабления связывания с мутантом 5, но не потеряла способности к связыванию с мутантом 5 и поэтому изначально не учитывалась.
В контексте продолжающегося скрининга супернатантов после дальнейших вакцинаций на предмет ингибирования ферментативной активности растворимого CD39, клонированное и продуцированное антитело I-394 включили в скрининг в качестве контроля. Неожиданно, несмотря на то, что антитело I-394 не входило в число клонов, сохраненных в ходе эпитоп-специфичного скрининга, это антитело продемонстрировало сильное ингибирование ферментативной активности растворимого CD39 в анализе, описанном выше ("Способы").
I-394 продуцировали с модификацией, включавшей мутации L234A/L235E/G237A/A330S/P331S (нумерация ЕС по Kabat) в константных областях человека с Fc-доменом lgG1, приводившей к отсутствию N-связанного гликозилирования и отсутствию связывания с Fcγ-рецептора ми CD16A, CD16B, CD32A, CD32B и CD64 человека. Вкратце, последовательности VH и Vk антитела I-394 (вариабельных областей VH и Vk, показанных в SEQ ID NO 6 и 7, соответственно) клонировали в экспрессирующие векторы, содержащие константные домены hulgG1, несущие вышеупомянутые мутации и константный домен huCk, соответственно. Два полученных вектора совместно трансфицировали в клетки линии СНО. Созданный пул клеток использовали для продукции антитела в среде СНО. Затем антитело очищали с использованием белка А. Аминокислотные последовательности соответствующих тяжелых и легких цепей I-394 показаны ниже (CDR по Kabat выделены подчеркиванием).
Затем антитело I-394 тестировали на предмет потери способности к связыванию с мутантами CD39, определяемыми по заменам аминокислот, экспонированных на поверхности молекулы CD39. Мутантов трансфицировали в клетки Hek-293Т, как показано в Таблице 1, с использованием нумерации согласно SEQ ID NO: 1. Ряд доз антител I-394 протестировали на 20 мутантах с помощью проточной цитометрии. Как показано на Фигуре 3В, I-394 продемонстрировало полную потерю связывания с клетками, экспрессирующими мутант 19 CD39. Мутант 19 включал замены по остаткам R138, М139 и Е142. Таким образом, основной эпитоп I-394 включал один или более (или все) из остатков R138, М139 и Е142.
В отличие от предшествующего антитела BY40, которое теряло способность к связыванию с мутантом 5 и обладало способностью ингибировать клеточный CD39, но не растворимый CD39, антитело I-394 теряло способность к связыванию с соседним мутантом 19 наряду с сильно ослабленным связыванием с мутантом 5 (однако некоторое остаточное связывание с мутантом 5 сохранялось). Интересно, что остатки мутанта 19 находились в непосредственной близости или примыкали к остаткам мутанта 5, так что I-394 может представлять собой сдвиг эпитопа по сравнению с BY40. Таким образом, антитело I-394 позволило выявить новый ценный эпитоп для антител против CD39, который позволял ингибировать АТФазную активность растворимого белка CD39. Оно также представляло собой специфичный положительный контроль, который позволял выполнять валидацию и тестирование скрининговых анализов для обнаружения дополнительных антител, нейтрализующих АТФазную активность растворимого белка CD39.
Пример 5: Эпитоп-неспецифичный скрининг sCD39-нейтрализующих мАт
На основании результатов, полученных для Примера 4 и показывающих возможность антитело-опосредованного ингибирования растворимого CD39, слитые клетки, полученные при различных иммунизациях с использованием различных протоколов в Примере 3, были пересмотрены с целью поиска антител, нейтрализующих АТФазную активность sCD39.
Затем выполнили оценку различных подходов к скринингу ингибирования АТФазы. В одном эксперименте антитело I-394 использовали для обогащения супернатантов гибридом, полученных при иммунизации в Примере 3, которые были признаны отрицательными в отношении способности ингибировать АТФазную активность растворимого CD39. Это добавление I-394 к супернатанту не восстанавливало способность отрицательных супернатантов ингибировать АТФазную активность CD39. Затем антитело I-394 очищали от отрицательного супернатанта с использованием гранул, покрытых белком А, и наблюдали восстановление способности очищенного I-394 ингибировать АТФазную активность.
С учетом приведенных выше результатов были разработаны новые иммунизации и скрининга протоколов, в которых растущие клоны, полученные при новых и прошлых иммунизациях, подвергали скринингу с помощью проточной цитометрии с использованием линий клеток СНО дикого типа и СНО, экспрессирующих huCD39, без оценки ингибирования АТФазной активности растворимого CD39 или клеточного CD39 и без скрининга смещения эпитопов. Хотя для некоторых гибридом имелись данные о потере способности к связыванию с мутантом 5 или 19, такие данные не использовались для отбора клонов, а сохранялись только в целях сохранения гибридом для клонирования в случае получения отрицательных результатов в анализе блокирования АТФазы. Гибридомы, связывающие CD39, отбирали и клонировали, а затем очищали с использованием белка А в соответствии со следующим протоколом:
- Добавить к 300 мкл супернатанта гибридомы 10 мкл гранул с белком А
- Добавить NaCl до конечной концентрации 1,5 М
- Встряхивать пробирки в течение 3-4 часов при 4°С
- Центрифугировать в течение 1 мин при 1500 об/мин
- Удалить супернатант и трижды промыть 1 мл TBS
- Удалить весь TBS после третьей промывки
- Добавить 50 мкл 0,1 М цитрата, рН3, гомогенизировать и инкубировать при комнатной температуре в течение 5 мин
- Центрифугировать гранулы в течение 1 минуты при 1500 об/мин.
- Собрать 50 мкл элюата, быстро добавить 450 мкл TBS и хранить при 4°С.
Затем полученные антитела затем подвергали скринингу при сравнительном анализе способности ингибировать АТФазную активность CD39 в той же степени, что и I-394. Для ингибирования ферментативной активности растворимого и клеточного CD39 использовали анализы, описанные выше ("Способы"). Как ни странно, некоторые из типичных антител, полученных таким способом, продемонстрировали ингибирование растворимого CD39 (а также ингибирование клеточного CD39). На Фигуре 1 показан типичный результат скрининга, на котором показаны антитела I-397, I-398 и I-399 по сравнению с положительным контролем - антителом I-394. Аналогичным образом, антитела I-395 и I-396, полученные при различных иммунизациях, ингибировали ферментативную активность растворимого белка CD39. На Фигурах 2А и 2В показаны результаты для антител I-395 и I-396, для которых имелось большее количество антитела для дополнительных экспериментов по оценке нейтрализации как растворимого, так и клеточного CD39. На Фигуре 2А показано, что антитела I-395 и I-396 ингибировали CD39, связанный с клеточной мембраной, по сравнению с антителами BY40 и I-394, причем как I-394, так и I-395 демонстрировали повышенную активность и максимальное ингибирование клеточного CD39 по сравнению с BY40. На Фигуре 2 В показано, что антитела I-395 и I-396 ингибировали растворимый CD39 по сравнению с антителами BY40 и I-394. Хотя BY40 не ингибировало растворимый CD39 при любой концентрации, все антитела I-394, I-395 и I-396 ингибировали растворимый CD39, причем I-394 демонстрировало максимальную активность, следующим являлось I-395, и затем I-396, обладавшее меньшей активностью.
Полученные результаты указывают на возможность того, что какие-то факторы в супернатантах гибридом быстро гидролизовали АТФ как в клеточной культуре, так и при анализе растворимого CD39 таким образом, что сигнал АТФ не обнаруживался при скрининге антител с использованием обычных способов. Этим растворимым фактором может являться CD39 или какой-либо другой фермент, например, продуцируемый партнером по слиянию.
50
50
Затем антитела клонировали с модификацией, включавшей мутации L234A/L235E/G237A/A330S/P331S (нумерация ЕС по Kabat) в константных областях человека с Fc-доменом lgG1, приводившей к отсутствию N-связанного гликозилирования и отсутствию связывания с Fcγ-рецептора ми CD16A, CD16B, CD32A, CD32B и CD64 человека, аналогично тому, как показано в настоящем документе для I-394. Полученные антитела затем можно было подвергать титрованию и более подробной оценке активности, как показано в Примерах 7-9 (титрование, ингибирование АТФазной активности), для определения ЕС и IC и ранжирования антител в соответствии с их активностью.
Пример 6. Картирование эпитопов мАт, нейтрализующих sCD39.
Как показано в Примере 4, I-394 демонстрировало полную потерю способности к связыванию с клетками, экспрессирующими мутант 19 CD39, но не потеряло способности к связыванию с мутантом 5. Для определения эпитопов дополнительных антител против CD39 из Примера 5 их тестировали на предмет потери способности к связыванию с панелью мутантов CD39, описанной в Примере 1 и в Таблице 1. Мутанты трансфицировали в клетки Hek-293Т, как показано в Таблице 1, с использованием нумерации согласно SEQ ID NO: 1. Ряд доз тестируемых антител (10 - 2,5 - 0,625 - 0,1563 - 0,0391 - 0,0098 - 0,0024 - 0,0006 мкг/мл) протестировали на 20 полученных мутантах с помощью проточной цитометрии.
Результаты показали, что антитела, отобранные в Примере 5 по способности ингибировать растворимый CD39, представляли несколько различных эпитопов. Среди антител, демонстрировавших ингибирование растворимого внеклеточного CD39 в Примере 5, антитело I-395 являлось Примером антитела, демонстрировавшего потерю способности к связыванию с мутантом 5, содержавшим замены по остаткам Q96, N99, Е143 и R147, а также потерю способности к связыванию с мутантом 19, содержавшим замены по остаткам R138, М139 и Е142. Мутант 19 содержал замены по остаткам Q96, R138, М139 и Е142. Таким образом, основной эпитоп CD39 для I-395 содержал один, два, три или четыре остатка Q96, N99, Е143 и R147, а также один, два или три остатка R138, М139 и Е142.
С другой стороны, антитело I-398 являлось примером антитела, демонстрировавшего потерю способности к связыванию с мутантом 19, содержавшим замены по остаткам R138, М139 и Е142, но не характеризовалось снижением или потерей способности к связыванию с мутантом 5, содержавшим замены по остаткам Q96 N99, Е143 и R147.
Другие антитела, демонстрировавшие ингибирование растворимого внеклеточного CD39 в Примере 5, характеризовались сильно различающимися эпитопами и не демонстрировали потери способности к связыванию ни с одним из мутантов 5 или 19, что указывало на возможность ингибирования растворимого CD39 за счет связывания с другими сайтами на sCD39. Для некоторых антител потеря способности к связыванию с одним из 20 мутантов из Таблицы 1 позволила локализовать сайт связывания на CD39, тогда как для других сайт связывания еще предстоит определить, так как они не потеряли способности к связыванию ни с одним из 20 мутантов. Среди антител, демонстрировавших ингибирование АТФазной активности растворимого CD39 в Примере 5, антитело I-396 продемонстрировало потерю способности к связыванию с мутантом 15, содержавшим замены K87A, Е100А и D107A, без потери способности к связыванию с любым из других 20 мутантов. Таким образом, основной эпитоп этого антитела на CD39 содержал один или более (или все) из остатков K87, Е100 и D107. Антитело I-399 демонстрировало потерю способности к связыванию с мутантом 11, содержавшим замены N371K, L372K, Е375А, K376G, V377A и вставку валина между K376 и V377 (называемую в Таблице 1 «вставкой 377V»), без потери способности к связыванию с любым из 20 других мутантов. Таким образом, основной эпитоп этого антитела на CD39 содержал один или более (или все) из остатков N371, L372, Е375, K376 и V377. На Фигуре 3А показано положение остатков, мутированных у мутантов 5 (М5), 15 (М15) и 19 (М19), на поверхности белка CD39. На Фигуре ЗВ показаны результаты связывания различных антител с мутантами 5, 15 и 19.
Таким образом, результаты показывают возможность получения антител, ингибирующих растворимый CD39, против различных эпитопов. Эти эпитопы включают эпитопы, определяемые по одному или более из остатков мутанта 19, расположенных рядом с сайтом связывания BY40 или BY40-подобных антител, ингибирующих только клеточный CD39, но не растворимый CD39 (которые теряют способность к связыванию с мутантом 5), эпитопы, определяемые по одному или более из остатков мутанта 19, а также частично мутанта 5, что указывает на возможный небольшой сдвиг по сравнению с BY40 или BY40-подобными антителами, эпитопы, определяемые по одному или более из остатков мутанта 19, но не остаткам мутанта 5, а также другие эпитопы, например, определяемые по одному или более из остаткаов мутанта 11 или одному или более из остатков мутанта 15, или эпитопы других дополнительных антител, не характеризующихся снижением связывания с любым из мутантов 5, 15 или 19, локализацию которых еще предстоит определить.
Пример 7. Титрование антител на клетках, экспрессирующих CD39, с помощью проточной цитометрии.
-4
Антитело I-394 тестировали в двух повторных экспериментах на предмет связывания с клетками СНО, экспрессирующими CD39 человека, клетками СНО, экспрессирующими CD39 яванского макака (macaca flavicularis), клетками СНО, экспрессирующими CD39 мыши, и клетками лимфомы человека Ramos (АТСС™, учетный номер CRL-1596). Клетки инкубировали с различными концентрациями немеченого антитела против CD39, составлявшими от 30 мкг/мл до 5×10 мкг/мл, в течение 30 минут при 4°С. После промывки клетки инкубировали с меченым вторичным антителом козы против Н+L мыши в течение 30 минут при 4°С.
50
50
Результаты показаны на Фигуре 4. Антитело I-394 связывалось с клетками, экспрессирующими CD39 человека (CHO-huCD39), клетками, экспрессирующими CD39 яванского макака (CHO-cyCD39), и с клетками лимфомы Ramos, но не с клетками, экспрессирующими CD39 мыши (CHO-moCD39). I-394 связывалось с клетками Ramos со значениями EC, равными 0,16 мкг/мл и 0,19 мкг/мл в первой и второй серии экспериментов. Несколько других антител против CD39 показали сопоставимые значения ЕС для связывания с клетками Ramos.
Пример 8. Определение IC50 для ингибирования клеточной АТФазной активности.
Ингибирование антителом I-394 АТФазной активности CD39 в CD39-экспрессирующих клетках оценивали с использованием анализа, используемого для ингибирования ферментативной активности клеточного CD39, как описано выше ("Способы").
50
Результаты показаны на Фигуре 5. I-394 обладало высокой способностью блокировать ферментативную активность CD39 в опухолевых клетках (Ramos) и обладало повышенной активностью по сравнению со всеми другими протестированными антителами. I-394 также блокировало ферментативную активность CD39 в клетках, экспрессирующих CD39 человека (CHO-huCD39), и в клетках, экспрессирующих CD39 яванского макака (CHO-cyCD39). Клетки, экспрессирующие CD39 мыши (CHO-moCD39), показаны в качестве отрицательного контроля. Расчетная IC (ингибирование 50% ферментативной активности CD39, экспрессируемого 50000 клетками Ramos) составила 0,05 мкг/мл. Максимальное достигаемое ингибирование составляло 81,6%. Изотипический контроль не оказывал никакого действия.
Пример 9. Определение IC50 для ингибирования АТФазной активности рекомбинантного растворимого белка CD39.
50
Ингибирование антителом I-394 АТФазной активности растворимого белка CD39 оценивали с помощью анализов, используемых для ингибирования ферментативной активности растворимого CD39, описанных выше ("Способы"). Результаты показаны на Фигуре 6. I-394 ингибировало ферментативную активность растворимого белка CD39. Антитело BY40, приведенное для сравнения, не ингибировало ферментативную активность растворимого белка CD39. Расчетная IC составила 0,003 мкг/мл. Максимальное достигнутое ингибирование составляло 74,9%.
Пример 10. Титрование твердофазного ИФА на изоформах CD39-L1, L2, L3, L4.
Антитело I-394 тестировали на предмет связывания с рекомбинантными изоформами CD39 человека (изоформами Rec-huCD39); изоформы, содержавшие аминокислотные последовательности, показанные ниже, иммобилизовали в 96-луночном планшете в PBS 1Х при концентрации 500 нг/мл или 1 мкг/мл при 4°С в течение ночи. Лунки промывали TBS твин-20 и дополнительно насыщали в течение 2 ч при комнатной температуре в блокирующем буфере TBS. Концентрацию первичного антитела в диапазоне доз инкубировали в блокирующем буфере TBS в течение 2 ч при комнатной температуре. Лунки промывали TBS твин-20. Вторичное антитело (GAM-HRP или GAH-HRP в блокирующем буфере TBS) инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре и проявляли с помощью ТМВ. Оптическую плотность измеряли на Enspire™ при OD=450.
Аминокислотная последовательность клонированного huCD39 (сосудистая изоформа): CD39-L1 человека, также известный как НТФДаза-2 или ENTPD2:
CD39-L2 человека, также известный как НТФДаза-6 или ENTPD6:
CD39-L3 человека, также известный как НТФДаза-3 или ENTPD3:
CD39-L4 человека, также известный как НТФДаза-5 или ENTPD5:
I-394 связывалось с CD39, но не с какой-либо из изоформ CD39-L1, -L2, -L3 или -L4. Антитела изотипического контроля (IC) не связывались ни с одной из молекул CD39 или CD39-L. Результаты показаны на Фигуре 7.
Пример 11: Активация дендритных клеток
Хотя АТФ обладает провоспалительным действием, считается, что CD39-опосредованный катаболизм АТФ способен нарушать активацию дендритных клеток (DC), что, в свою очередь, влияет на расширенный адаптивный иммунный ответ против опухолевого антигена. Для оценки способности блокады CD39 с использованием антитела против CD39 преодолевать CD39-опосредованное изменение активации дендритных клеток (DC) в присутствии АТФ, авторы изобретения инкубировали DC, происходящие от моноцитов (moDC), с антителами против CD39 в присутствии АТФ.
Вкратце, моноциты человека очищали от здоровой крови человека и дифференцировали в MoDC в присутствии ГМКСФ и ИЛ-4 в течение 6 дней. Затем MoDC активировали в присутствии АТФ (Sigma, 0,25-1 мМ) в течение 24 часов, активацию DC оценивали путем анализа экспрессии CD80, CD83 и HLA-DR с помощью проточной цитометрии. В некоторых случаях MoDC предварительно инкубировали в течение 1 часа в присутствии ингибитора CD39: ARL6716 (Tocris, 250 мкМ), ингибитора CD73: АРСР (Tocris, 50 мкМ), блокирующего антитела I-394 или BY40 против CD39 (для BY40 см. WO 2009/095478), или блокирующего антитела против CD73. LPS (Invivogen, 10 нг/мл) использовали в качестве положительного контроля. Для оценки итогового влияния АТФ-опосредованной активации DC на активацию CD4 Т-клеток, АТФ-активированные DC промывали и затем инкубировали с аллогенными CD4 Т-клетками (в соотношении 1 MoDC/4 Т-клетки) для оценки реакции смешанных лимфоцитов (MLR) в течение 5 дней. Активацию и пролиферацию Т-клеток анализировали с помощью экспрессии CD25 и разведения с Cell Trace Violet с помощью проточной цитометрии (Фигура 8).
Результаты показаны на Фигурах 9, 10 и 11. В присутствии отрицательного контроля (среды) наблюдали активацию moDC в присутствии 1 мМ АТФ, однако АТФ в концентрации 0,125 мМ, 0,25 мМ или 0,5 мМ не позволял активировать moDC. Добавление химических ингибиторов CD39, которые, как считается, полностью блокируют ферментативную активность CD39 путем связывания с активным центром, привело к активации moDC при каждой из концентраций 0,125 мМ, 0,25 мМ или 0,5 мМ. В то же время антитела против CD39, например, BY40, или антитела против CD73 не были способны стимулировать АТФ-индуцированную активацию дендритных клеток (DC), что свидетельствует о неспособности этих антител блокировать ферментативную активность в достаточной степени для устранения катаболизма АТФ. Как ни странно, блокирующее антитело I-394 против CD39 (показанное на фигурах в концентрации 10 мкг/мл), по существу полностью блокирующее АТФазную активность CD39 и, следовательно, способное обеспечить накопление АТФ, допускало активацию moDC согласно оценке по экспрессии HLA-DR или CD83 при каждой из концентраций 0,125 мМ, 0,25 мМ или 0,5 мМ (Фигуры 9 и 10). Интересно, что MoDC, активированные в присутствии АТФ, способны индуцировать улучшенную активацию и пролиферацию Т-клеток в анализе MLR. Кроме того, усиление АТФ-опосредованной активации MoDC с помощью блокирующего антитела I-394 против CD39 приводило к усиленной пролиферации и активации Т-клеток (Фигура 11).
Оценка способности ингибиторов CD39 активировать DC в присутствии АТФ обеспечивает способ выявления и оценки антител против CD39, способных достигать высокой степени ингибирования CD39.
Возможность использования антител против CD39 для ослабления иммуносупрессивного эффекта, оказываемого CD39 на DC, может обеспечить усиление адаптивного иммунного ответа на антигены, особенно на опухолевые клетки. Кроме того, такие антитела против CD39 могут представлять особый интерес при использовании для усиления иммуногенного действия химиотерапевтических агентов. Многочисленные химиотерапевтические агенты, вызывающие некроз опухолевых клеток, способны индуцировать АТФ; их комбинированное применение с антителами против CD39 может быть особенно полезным для усиления противоопухолевого ответа в этих условиях.
Все источники, включая публикации, заявки на патенты и патенты, процитированные в данном документе, полностью включены в настоящий документ посредством ссылок и в той же степени, как если бы включение каждого источника посредством ссылки было оговорено по отдельности отдельно и явным образом и полностью изложено в настоящем документе (в максимальной степени, разрешенной законом), независимо от любого отдельно предусмотренного включения конкретных документов, сделанного где-либо еще в настоящем документе.
Использование форм единственного числа и аналогичных ссылок должно толковаться как охватывающее как единственное, так и множественное число, если иное не указано в настоящем документе или не противоречит контексту явным образом.
Если не указано иное, все точные значения, представленные в настоящем документе, представляют соответствующие приблизительные значения (например, можно считать, что все точные приблизительные значения, представленные в отношении конкретного параметра или измерения, также включают соответствующее приблизительное измерение, в соответствующих случаях модифицированное добавлением слова «приблизительно»).
Описание в данном документе любого аспекта или варианта реализации с использованием таких терминов, как «содержащий», «имеющий» или «включающий» со ссылкой на определенный элемент или элементы, предназначено для обеспечения поддержки для аналогичного аспекта или варианта реализации в настоящем документе, который «состоит из», «по существу состоит из» или «по существу содержит» этот конкретный элемент или элементы, если иное не указано в настоящем документе или не противоречит контексту явным образом (например, следует понимать, что композиция, описанная в настоящем документе как содержащая конкретный элемент, также описывает композицию, состоящую из этого элемента, если иное не указано в настоящем документе или не противоречит контексту явным образом).
Использование всевозможных примеров или формулировок, указывающих на конкретные примеры (например, «такой как»), в настоящем документе предназначено исключительно для лучшего освещения изобретения и не налагает ограничения на сущность изобретения, если иное не указано в формуле изобретения. Ни одну формулировку в описании изобретения не следует истолковывать как указывающую на какой-либо не вошедший в формулу изобретения элемент, существенный для практической реализации изобретения.
--->
Перечень последовательностей
<110>  ИННЕЙТ ФАРМА
<120>  СОСТАВЫ И СПОСОБЫ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАКА
<130>  CD39-6
<150>  US 62/471,994
<151>  2017-03-16
<150>  US 62/586,220
<151>  2017-11-15
<160>  45
<170>  PatentIn версии 3.5
<210>  1
<211>  510
<212>  БЕЛОК
<213>  HOMO SAPIENS
<400>  1
Met Glu Asp Thr Lys Glu Ser Asn Val Lys Thr Phe Cys Ser Lys Asn
1               5                   10                  15
Ile Leu Ala Ile Leu Gly Phe Ser Ser Ile Ile Ala Val Ile Ala Leu
20                  25                  30
Leu Ala Val Gly Leu Thr Gln Asn Lys Ala Leu Pro Glu Asn Val Lys
35                  40                  45
Tyr Gly Ile Val Leu Asp Ala Gly Ser Ser His Thr Ser Leu Tyr Ile
50                  55                  60
Tyr Lys Trp Pro Ala Glu Lys Glu Asn Asp Thr Gly Val Val His Gln
65                  70                  75                  80
Val Glu Glu Cys Arg Val Lys Gly Pro Gly Ile Ser Lys Phe Val Gln
85                  90                  95
Lys Val Asn Glu Ile Gly Ile Tyr Leu Thr Asp Cys Met Glu Arg Ala
100                 105                 110
Arg Glu Val Ile Pro Arg Ser Gln His Gln Glu Thr Pro Val Tyr Leu
115                 120                 125
Gly Ala Thr Ala Gly Met Arg Leu Leu Arg Met Glu Ser Glu Glu Leu
130                 135                 140
Ala Asp Arg Val Leu Asp Val Val Glu Arg Ser Leu Ser Asn Tyr Pro
145                 150                 155                 160
Phe Asp Phe Gln Gly Ala Arg Ile Ile Thr Gly Gln Glu Glu Gly Ala
165                 170                 175
Tyr Gly Trp Ile Thr Ile Asn Tyr Leu Leu Gly Lys Phe Ser Gln Lys
180                 185                 190
Thr Arg Trp Phe Ser Ile Val Pro Tyr Glu Thr Asn Asn Gln Glu Thr
195                 200                 205
Phe Gly Ala Leu Asp Leu Gly Gly Ala Ser Thr Gln Val Thr Phe Val
210                 215                 220
Pro Gln Asn Gln Thr Ile Glu Ser Pro Asp Asn Ala Leu Gln Phe Arg
225                 230                 235                 240
Leu Tyr Gly Lys Asp Tyr Asn Val Tyr Thr His Ser Phe Leu Cys Tyr
245                 250                 255
Gly Lys Asp Gln Ala Leu Trp Gln Lys Leu Ala Lys Asp Ile Gln Val
260                 265                 270
Ala Ser Asn Glu Ile Leu Arg Asp Pro Cys Phe His Pro Gly Tyr Lys
275                 280                 285
Lys Val Val Asn Val Ser Asp Leu Tyr Lys Thr Pro Cys Thr Lys Arg
290                 295                 300
Phe Glu Met Thr Leu Pro Phe Gln Gln Phe Glu Ile Gln Gly Ile Gly
305                 310                 315                 320
Asn Tyr Gln Gln Cys His Gln Ser Ile Leu Glu Leu Phe Asn Thr Ser
325                 330                 335
Tyr Cys Pro Tyr Ser Gln Cys Ala Phe Asn Gly Ile Phe Leu Pro Pro
340                 345                 350
Leu Gln Gly Asp Phe Gly Ala Phe Ser Ala Phe Tyr Phe Val Met Lys
355                 360                 365
Phe Leu Asn Leu Thr Ser Glu Lys Val Ser Gln Glu Lys Val Thr Glu
370                 375                 380
Met Met Lys Lys Phe Cys Ala Gln Pro Trp Glu Glu Ile Lys Thr Ser
385                 390                 395                 400
Tyr Ala Gly Val Lys Glu Lys Tyr Leu Ser Glu Tyr Cys Phe Ser Gly
405                 410                 415
Thr Tyr Ile Leu Ser Leu Leu Leu Gln Gly Tyr His Phe Thr Ala Asp
420                 425                 430
Ser Trp Glu His Ile His Phe Ile Gly Lys Ile Gln Gly Ser Asp Ala
435                 440                 445
Gly Trp Thr Leu Gly Tyr Met Leu Asn Leu Thr Asn Met Ile Pro Ala
450                 455                 460
Glu Gln Pro Leu Ser Thr Pro Leu Ser His Ser Thr Tyr Val Phe Leu
465                 470                 475                 480
Met Val Leu Phe Ser Leu Val Leu Phe Thr Val Ala Ile Ile Gly Leu
485                 490                 495
Leu Ile Phe His Lys Pro Ser Tyr Phe Trp Lys Asp Met Val
500                 505                 510
<210>  2
<211>  472
<212>  БЕЛОК
<213>  HOMO SAPIENS
<400>  2
Met Ala Gly Lys Val Arg Ser Leu Leu Pro Pro Leu Leu Leu Ala Ala
1               5                   10                  15
Ala Gly Leu Ala Gly Leu Leu Leu Leu Cys Val Pro Thr Arg Asp Val
20                  25                  30
Arg Glu Pro Pro Ala Leu Lys Tyr Gly Ile Val Leu Asp Ala Gly Ser
35                  40                  45
Ser His Thr Ser Met Phe Ile Tyr Lys Trp Pro Ala Asp Lys Glu Asn
50                  55                  60
Asp Thr Gly Ile Val Gly Gln His Ser Ser Cys Asp Val Pro Gly Gly
65                  70                  75                  80
Gly Ile Ser Ser Tyr Ala Asp Asn Pro Ser Gly Ala Ser Gln Ser Leu
85                  90                  95
Val Gly Cys Leu Glu Gln Ala Leu Gln Asp Val Pro Lys Glu Arg His
100                 105                 110
Ala Gly Thr Pro Leu Tyr Leu Gly Ala Thr Ala Gly Met Arg Leu Leu
115                 120                 125
Asn Leu Thr Asn Pro Glu Ala Ser Thr Ser Val Leu Met Ala Val Thr
130                 135                 140
His Thr Leu Thr Gln Tyr Pro Phe Asp Phe Arg Gly Ala Arg Ile Leu
145                 150                 155                 160
Ser Gly Gln Glu Glu Gly Val Phe Gly Trp Val Thr Ala Asn Tyr Leu
165                 170                 175
Leu Glu Asn Phe Ile Lys Tyr Gly Trp Val Gly Arg Trp Phe Arg Pro
180                 185                 190
Arg Lys Gly Thr Leu Gly Ala Met Asp Leu Gly Gly Ala Ser Thr Gln
195                 200                 205
Ile Thr Phe Glu Thr Thr Ser Pro Ala Glu Asp Arg Ala Ser Glu Val
210                 215                 220
Gln Leu His Leu Tyr Gly Gln His Tyr Arg Val Tyr Thr His Ser Phe
225                 230                 235                 240
Leu Cys Tyr Gly Arg Asp Gln Val Leu Gln Arg Leu Leu Ala Ser Ala
245                 250                 255
Leu Gln Thr His Gly Phe His Pro Cys Trp Pro Arg Gly Phe Ser Thr
260                 265                 270
Gln Val Leu Leu Gly Asp Val Tyr Gln Ser Pro Cys Thr Met Ala Gln
275                 280                 285
Arg Pro Gln Asn Phe Asn Ser Ser Ala Arg Val Ser Leu Ser Gly Ser
290                 295                 300
Ser Asp Pro His Leu Cys Arg Asp Leu Val Ser Gly Leu Phe Ser Phe
305                 310                 315                 320
Ser Ser Cys Pro Phe Ser Arg Cys Ser Phe Asn Gly Val Phe Gln Pro
325                 330                 335
Pro Val Ala Gly Asn Phe Val Ala Phe Ser Ala Phe Phe Tyr Thr Val
340                 345                 350
Asp Phe Leu Arg Thr Ser Met Gly Leu Pro Val Ala Thr Leu Gln Gln
355                 360                 365
Leu Glu Ala Ala Ala Val Asn Val Cys Asn Gln Thr Trp Ala Gln Gln
370                 375                 380
Leu Leu Ser Arg Gly Tyr Gly Phe Asp Glu Arg Ala Phe Gly Gly Val
385                 390                 395                 400
Ile Phe Gln Lys Lys Ala Ala Asp Thr Ala Val Gly Trp Ala Leu Gly
405                 410                 415
Tyr Met Leu Asn Leu Thr Asn Leu Ile Pro Ala Asp Pro Pro Gly Leu
420                 425                 430
Arg Lys Gly Thr Asp Phe Ser Ser Trp Val Val Leu Leu Leu Leu Phe
435                 440                 445
Ala Ser Ala Leu Leu Ala Ala Leu Val Leu Leu Leu Arg Gln Val His
450                 455                 460
Ser Ala Lys Leu Pro Ser Thr Ile
465                 470
<210>  3
<211>  484
<212>  БЕЛОК
<213>  HOMO SAPIENS
<400>  3
Met Lys Lys Gly Ile Arg Tyr Glu Thr Ser Arg Lys Thr Ser Tyr Ile
1               5                   10                  15
Phe Gln Gln Pro Gln His Gly Pro Trp Gln Thr Arg Met Arg Lys Ile
20                  25                  30
Ser Asn His Gly Ser Leu Arg Val Ala Lys Val Ala Tyr Pro Leu Gly
35                  40                  45
Leu Cys Val Gly Val Phe Ile Tyr Val Ala Tyr Ile Lys Trp His Arg
50                  55                  60
Ala Thr Ala Thr Gln Ala Phe Phe Ser Ile Thr Arg Ala Ala Pro Gly
65                  70                  75                  80
Ala Arg Trp Gly Gln Gln Ala His Ser Pro Leu Gly Thr Ala Ala Asp
85                  90                  95
Gly His Glu Val Phe Tyr Gly Ile Met Phe Asp Ala Gly Ser Thr Gly
100                 105                 110
Thr Arg Val His Val Phe Gln Phe Thr Arg Pro Pro Arg Glu Thr Pro
115                 120                 125
Thr Leu Thr His Glu Thr Phe Lys Ala Leu Lys Pro Gly Leu Ser Ala
130                 135                 140
Tyr Ala Asp Asp Val Glu Lys Ser Ala Gln Gly Ile Arg Glu Leu Leu
145                 150                 155                 160
Asp Val Ala Lys Gln Asp Ile Pro Phe Asp Phe Trp Lys Ala Thr Pro
165                 170                 175
Leu Val Leu Lys Ala Thr Ala Gly Leu Arg Leu Leu Pro Gly Glu Lys
180                 185                 190
Ala Gln Lys Leu Leu Gln Lys Val Lys Glu Val Phe Lys Ala Ser Pro
195                 200                 205
Phe Leu Val Gly Asp Asp Cys Val Ser Ile Met Asn Gly Thr Asp Glu
210                 215                 220
Gly Val Ser Ala Trp Ile Thr Ile Asn Phe Leu Thr Gly Ser Leu Lys
225                 230                 235                 240
Thr Pro Gly Gly Ser Ser Val Gly Met Leu Asp Leu Gly Gly Gly Ser
245                 250                 255
Thr Gln Ile Ala Phe Leu Pro Arg Val Glu Gly Thr Leu Gln Ala Ser
260                 265                 270
Pro Pro Gly Tyr Leu Thr Ala Leu Arg Met Phe Asn Arg Thr Tyr Lys
275                 280                 285
Leu Tyr Ser Tyr Ser Tyr Leu Gly Leu Gly Leu Met Ser Ala Arg Leu
290                 295                 300
Ala Ile Leu Gly Gly Val Glu Gly Gln Pro Ala Lys Asp Gly Lys Glu
305                 310                 315                 320
Leu Val Ser Pro Cys Leu Ser Pro Ser Phe Lys Gly Glu Trp Glu His
325                 330                 335
Ala Glu Val Thr Tyr Arg Val Ser Gly Gln Lys Ala Ala Ala Ser Leu
340                 345                 350
His Glu Leu Cys Ala Ala Arg Val Ser Glu Val Leu Gln Asn Arg Val
355                 360                 365
His Arg Thr Glu Glu Val Lys His Val Asp Phe Tyr Ala Phe Ser Tyr
370                 375                 380
Tyr Tyr Asp Leu Ala Ala Gly Val Gly Leu Ile Asp Ala Glu Lys Gly
385                 390                 395                 400
Gly Ser Leu Val Val Gly Asp Phe Glu Ile Ala Ala Lys Tyr Val Cys
405                 410                 415
Arg Thr Leu Glu Thr Gln Pro Gln Ser Ser Pro Phe Ser Cys Met Asp
420                 425                 430
Leu Thr Tyr Val Ser Leu Leu Leu Gln Glu Phe Gly Phe Pro Arg Ser
435                 440                 445
Lys Val Leu Lys Leu Thr Arg Lys Ile Asp Asn Val Glu Thr Ser Trp
450                 455                 460
Ala Leu Gly Ala Ile Phe His Tyr Ile Asp Ser Leu Asn Arg Gln Lys
465                 470                 475                 480
Ser Pro Ala Ser
<210>  4
<211>  529
<212>  БЕЛОК
<213>  HOMO SAPIENS
<400>  4
Met Phe Thr Val Leu Thr Arg Gln Pro Cys Glu Gln Ala Gly Leu Lys
1               5                   10                  15
Ala Leu Tyr Arg Thr Pro Thr Ile Ile Ala Leu Val Val Leu Leu Val
20                  25                  30
Ser Ile Val Val Leu Val Ser Ile Thr Val Ile Gln Ile His Lys Gln
35                  40                  45
Glu Val Leu Pro Pro Gly Leu Lys Tyr Gly Ile Val Leu Asp Ala Gly
50                  55                  60
Ser Ser Arg Thr Thr Val Tyr Val Tyr Gln Trp Pro Ala Glu Lys Glu
65                  70                  75                  80
Asn Asn Thr Gly Val Val Ser Gln Thr Phe Lys Cys Ser Val Lys Gly
85                  90                  95
Ser Gly Ile Ser Ser Tyr Gly Asn Asn Pro Gln Asp Val Pro Arg Ala
100                 105                 110
Phe Glu Glu Cys Met Gln Lys Val Lys Gly Gln Val Pro Ser His Leu
115                 120                 125
His Gly Ser Thr Pro Ile His Leu Gly Ala Thr Ala Gly Met Arg Leu
130                 135                 140
Leu Arg Leu Gln Asn Glu Thr Ala Ala Asn Glu Val Leu Glu Ser Ile
145                 150                 155                 160
Gln Ser Tyr Phe Lys Ser Gln Pro Phe Asp Phe Arg Gly Ala Gln Ile
165                 170                 175
Ile Ser Gly Gln Glu Glu Gly Val Tyr Gly Trp Ile Thr Ala Asn Tyr
180                 185                 190
Leu Met Gly Asn Phe Leu Glu Lys Asn Leu Trp His Met Trp Val His
195                 200                 205
Pro His Gly Val Glu Thr Thr Gly Ala Leu Asp Leu Gly Gly Ala Ser
210                 215                 220
Thr Gln Ile Ser Phe Val Ala Gly Glu Lys Met Asp Leu Asn Thr Ser
225                 230                 235                 240
Asp Ile Met Gln Val Ser Leu Tyr Gly Tyr Val Tyr Thr Leu Tyr Thr
245                 250                 255
His Ser Phe Gln Cys Tyr Gly Arg Asn Glu Ala Glu Lys Lys Phe Leu
260                 265                 270
Ala Met Leu Leu Gln Asn Ser Pro Thr Lys Asn His Leu Thr Asn Pro
275                 280                 285
Cys Tyr Pro Arg Asp Tyr Ser Ile Ser Phe Thr Met Gly His Val Phe
290                 295                 300
Asp Ser Leu Cys Thr Val Asp Gln Arg Pro Glu Ser Tyr Asn Pro Asn
305                 310                 315                 320
Asp Val Ile Thr Phe Glu Gly Thr Gly Asp Pro Ser Leu Cys Lys Glu
325                 330                 335
Lys Val Ala Ser Ile Phe Asp Phe Lys Ala Cys His Asp Gln Glu Thr
340                 345                 350
Cys Ser Phe Asp Gly Val Tyr Gln Pro Lys Ile Lys Gly Pro Phe Val
355                 360                 365
Ala Phe Ala Gly Phe Tyr Tyr Thr Ala Ser Ala Leu Asn Leu Ser Gly
370                 375                 380
Ser Phe Ser Leu Asp Thr Phe Asn Ser Ser Thr Trp Asn Phe Cys Ser
385                 390                 395                 400
Gln Asn Trp Ser Gln Leu Pro Leu Leu Leu Pro Lys Phe Asp Glu Val
405                 410                 415
Tyr Ala Arg Ser Tyr Cys Phe Ser Ala Asn Tyr Ile Tyr His Leu Phe
420                 425                 430
Val Asn Gly Tyr Lys Phe Thr Glu Glu Thr Trp Pro Gln Ile His Phe
435                 440                 445
Glu Lys Glu Val Gly Asn Ser Ser Ile Ala Trp Ser Leu Gly Tyr Met
450                 455                 460
Leu Ser Leu Thr Asn Gln Ile Pro Ala Glu Ser Pro Leu Ile Arg Leu
465                 470                 475                 480
Pro Ile Glu Pro Pro Val Phe Val Gly Thr Leu Ala Phe Phe Thr Ala
485                 490                 495
Ala Ala Leu Leu Cys Leu Ala Phe Leu Ala Tyr Leu Cys Ser Ala Thr
500                 505                 510
Arg Arg Lys Arg His Ser Glu His Ala Phe Asp His Ala Val Asp Ser
515                 520                 525
Asp
<210>  5
<211>  428
<212>  БЕЛОК
<213>  HOMO SAPIENS
<400>  5
Met Ala Thr Ser Trp Gly Thr Val Phe Phe Met Leu Val Val Ser Cys
1               5                   10                  15
Val Cys Ser Ala Val Ser His Arg Asn Gln Gln Thr Trp Phe Glu Gly
20                  25                  30
Ile Phe Leu Ser Ser Met Cys Pro Ile Asn Val Ser Ala Ser Thr Leu
35                  40                  45
Tyr Gly Ile Met Phe Asp Ala Gly Ser Thr Gly Thr Arg Ile His Val
50                  55                  60
Tyr Thr Phe Val Gln Lys Met Pro Gly Gln Leu Pro Ile Leu Glu Gly
65                  70                  75                  80
Glu Val Phe Asp Ser Val Lys Pro Gly Leu Ser Ala Phe Val Asp Gln
85                  90                  95
Pro Lys Gln Gly Ala Glu Thr Val Gln Gly Leu Leu Glu Val Ala Lys
100                 105                 110
Asp Ser Ile Pro Arg Ser His Trp Lys Lys Thr Pro Val Val Leu Lys
115                 120                 125
Ala Thr Ala Gly Leu Arg Leu Leu Pro Glu His Lys Ala Lys Ala Leu
130                 135                 140
Leu Phe Glu Val Lys Glu Ile Phe Arg Lys Ser Pro Phe Leu Val Pro
145                 150                 155                 160
Lys Gly Ser Val Ser Ile Met Asp Gly Ser Asp Glu Gly Ile Leu Ala
165                 170                 175
Trp Val Thr Val Asn Phe Leu Thr Gly Gln Leu His Gly His Arg Gln
180                 185                 190
Glu Thr Val Gly Thr Leu Asp Leu Gly Gly Ala Ser Thr Gln Ile Thr
195                 200                 205
Phe Leu Pro Gln Phe Glu Lys Thr Leu Glu Gln Thr Pro Arg Gly Tyr
210                 215                 220
Leu Thr Ser Phe Glu Met Phe Asn Ser Thr Tyr Lys Leu Tyr Thr His
225                 230                 235                 240
Ser Tyr Leu Gly Phe Gly Leu Lys Ala Ala Arg Leu Ala Thr Leu Gly
245                 250                 255
Ala Leu Glu Thr Glu Gly Thr Asp Gly His Thr Phe Arg Ser Ala Cys
260                 265                 270
Leu Pro Arg Trp Leu Glu Ala Glu Trp Ile Phe Gly Gly Val Lys Tyr
275                 280                 285
Gln Tyr Gly Gly Asn Gln Glu Gly Glu Val Gly Phe Glu Pro Cys Tyr
290                 295                 300
Ala Glu Val Leu Arg Val Val Arg Gly Lys Leu His Gln Pro Glu Glu
305                 310                 315                 320
Val Gln Arg Gly Ser Phe Tyr Ala Phe Ser Tyr Tyr Tyr Asp Arg Ala
325                 330                 335
Val Asp Thr Asp Met Ile Asp Tyr Glu Lys Gly Gly Ile Leu Lys Val
340                 345                 350
Glu Asp Phe Glu Arg Lys Ala Arg Glu Val Cys Asp Asn Leu Glu Asn
355                 360                 365
Phe Thr Ser Gly Ser Pro Phe Leu Cys Met Asp Leu Ser Tyr Ile Thr
370                 375                 380
Ala Leu Leu Lys Asp Gly Phe Gly Phe Ala Asp Ser Thr Val Leu Gln
385                 390                 395                 400
Leu Thr Lys Lys Val Asn Asn Ile Glu Thr Gly Trp Ala Leu Gly Ala
405                 410                 415
Thr Phe His Leu Leu Gln Ser Leu Gly Ile Ser His
420                 425
<210>  6
<211>  116
<212>  БЕЛОК
<213>  MUS MUSCULUS
<400>  6
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20                  25                  30
Asn Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Arg Thr Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Tyr Ile Val Pro Leu Asn Gly Gly Ser Thr Phe Asn Gln Lys Phe
50                  55                  60
Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asn Thr Ser Ser Arg Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ala Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Gly Gly Thr Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100                 105                 110
Thr Val Ser Ala
115
<210>  7
<211>  111
<212>  БЕЛОК
<213>  MUS MUSCULUS
<400>  7
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Phe
20                  25                  30
Gly Val Ser Phe Met Tyr Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35                  40                  45
Asn Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ala
50                  55                  60
Arg Phe Arg Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His
65                  70                  75                  80
Pro Met Glu Ala Asp Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Thr Lys
85                  90                  95
Glu Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210>  8
<211>  5
<212>  БЕЛОК
<213>  MUS MUSCULUS
<400>  8
Asp Tyr Asn Met His
1               5
<210>  9
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  9
Tyr Ile Val Pro Leu Asn Gly Gly Ser Thr Phe Asn Gln Lys Phe Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>  10
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  10
Gly Gly Thr Arg Phe Ala Tyr
1               5
<210>  11
<211>  15
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  11
Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Phe Gly Val Ser Phe Met Tyr
1               5                   10                  15
<210>  12
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  12
Gly Ala Ser Asn Gln Gly Ser
1               5
<210>  13
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  13
Gln Gln Thr Lys Glu Val Pro Tyr Thr
1               5
<210>  14
<211>  116
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  14
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Arg Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20                  25                  30
Asn Met His Trp Val Lys Lys Asn His Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Tyr Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe
50                  55                  60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asn Thr Ser Ser Lys Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Thr Arg Gly Gly Thr Arg Phe Ala Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100                 105                 110
Thr Val Ser Ala
115
<210>  15
<211>  111
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  15
Asn Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
20                  25                  30
Gly Ile Ser Phe Met Tyr Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35                  40                  45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Gln Gly Ser Gly Val Pro Ala
50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His
65                  70                  75                  80
Pro Met Glu Glu Asp Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys
85                  90                  95
Glu Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210>  16
<211>  5
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  16
Asp Tyr Asn Met His
1               5
<210>  17
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  17
Tyr Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>  18
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  18
Gly Gly Thr Arg Phe Ala Ser
1               5
<210>  19
<211>  15
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  19
Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr Gly Ile Ser Phe Met Tyr
1               5                   10                  15
<210>  20
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  20
Ala Ala Ser Thr Gln Gly Ser
1               5
<210>  21
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  21
Gln Gln Ser Lys Glu Val Pro Phe Thr
1               5
<210>  22
<211>  122
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  22
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Ile Val Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20                  25                  30
Tyr Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Lys Ala Thr Met Thr Ser Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Trp Gly Tyr Asp Asp Glu Glu Ala Asp Tyr Phe Asp Ser Trp
100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  23
<211>  111
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  23
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
20                  25                  30
Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35                  40                  45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ala
50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile Leu
65                  70                  75                  80
Pro Met Glu Glu Val Asp Ala Ala Met Tyr Phe Cys His Gln Ser Lys
85                  90                  95
Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210>  24
<211>  5
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  24
Asp Thr Tyr Ile Asn
1               5
<210>  25
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  25
Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe Gln
1               5                   10                  15
Gly
<210>  26
<211>  13
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  26
Trp Gly Tyr Asp Asp Glu Glu Ala Asp Tyr Phe Asp Ser
1               5                   10
<210>  27
<211>  15
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  27
Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr Gly Ile Ser Phe Met Asn
1               5                   10                  15
<210>  28
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  28
Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser
1               5
<210>  29
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  29
His Gln Ser Lys Glu Val Pro Trp Thr
1               5
<210>  30
<211>  118
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  30
Pro Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Val Val Met Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Phe
20                  25                  30
Trp Met Asn Trp Met Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Phe Tyr Thr Asn Ser Asn Gln Arg Phe
50                  55                  60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Ala Arg Gly Asp Phe Gly Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Thr Gly Thr
100                 105                 110
Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  31
<211>  108
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  31
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Thr Thr Met Thr Ser Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Lys Ile Thr Phe Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Asn Ser Asn
20                  25                  30
Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Phe Ser Pro Lys Leu Leu
35                  40                  45
Ile Tyr Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Thr Arg Phe Ser
50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Gly Thr Met Glu
65                  70                  75                  80
Ala Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Ser Leu Pro
85                  90                  95
Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105
<210>  32
<211>  5
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  32
Ser Phe Trp Met Asn
1               5
<210>  33
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  33
Glu Ile Asp Pro Ser Asp Phe Tyr Thr Asn Ser Asn Gln Arg Phe Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>  34
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  34
Gly Asp Phe Gly Trp Tyr Phe Asp Val
1               5
<210>  35
<211>  12
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  35
Ser Ala Ser Ser Ser Ile Asn Ser Asn Tyr Leu His
1               5                   10
<210>  36
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  36
Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1               5
<210>  37
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  37
Gln Gln Gly Ser Ser Leu Pro Arg Thr
1               5
<210>  38
<211>  330
<212>  БЕЛОК
<213>  HOMO SAPIENS
<400>  38
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85                  90                  95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100                 105                 110
Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115                 120                 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130                 135                 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145                 150                 155                 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165                 170                 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180                 185                 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195                 200                 205
Lys Ala Leu Pro Ala Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210                 215                 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225                 230                 235                 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245                 250                 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260                 265                 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275                 280                 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290                 295                 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305                 310                 315                 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325                 330
<210>  39
<211>  330
<212>  БЕЛОК
<213>  HOMO SAPIENS
<400>  39
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85                  90                  95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100                 105                 110
Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115                 120                 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130                 135                 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145                 150                 155                 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165                 170                 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180                 185                 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195                 200                 205
Lys Ala Leu Pro Ala Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210                 215                 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225                 230                 235                 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245                 250                 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260                 265                 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275                 280                 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290                 295                 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305                 310                 315                 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325                 330
<210>  40
<211>  330
<212>  БЕЛОК
<213>  HOMO SAPIENS
<400>  40
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85                  90                  95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100                 105                 110
Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115                 120                 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130                 135                 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145                 150                 155                 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165                 170                 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180                 185                 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195                 200                 205
Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210                 215                 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225                 230                 235                 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245                 250                 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260                 265                 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275                 280                 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290                 295                 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305                 310                 315                 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325                 330
<210>  41
<211>  330
<212>  БЕЛОК
<213>  HOMO SAPIENS
<400>  41
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85                  90                  95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100                 105                 110
Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115                 120                 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130                 135                 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145                 150                 155                 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165                 170                 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180                 185                 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195                 200                 205
Lys Ala Leu Pro Ala Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210                 215                 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225                 230                 235                 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245                 250                 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260                 265                 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275                 280                 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290                 295                 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305                 310                 315                 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325                 330
<210>  42
<211>  45
<212>  ДНК
<213>  HOMO SAPIENS
<400>  42
tacgactcac aagcttgccg ccaccatgga agatacaaag gagtc                       45
<210>  43
<211>  64
<212>  ДНК
<213>  HOMO SAPIENS
<400>  43
ccgccccgac tctagatcac ttgtcatcgt catctttgta atcgacatag gtggagtggg       60
agag                                                                    64
<210>  44
<211>  478
<212>  БЕЛОК
<213>  HOMO SAPIENS
<400>  44
Met Glu Asp Thr Lys Glu Ser Asn Val Lys Thr Phe Cys Ser Lys Asn
1               5                   10                  15
Ile Leu Ala Ile Leu Gly Phe Ser Ser Ile Ile Ala Val Ile Ala Leu
20                  25                  30
Leu Ala Val Gly Leu Thr Gln Asn Lys Ala Leu Pro Glu Asn Val Lys
35                  40                  45
Tyr Gly Ile Val Leu Asp Ala Gly Ser Ser His Thr Ser Leu Tyr Ile
50                  55                  60
Tyr Lys Trp Pro Ala Glu Lys Glu Asn Asp Thr Gly Val Val His Gln
65                  70                  75                  80
Val Glu Glu Cys Arg Val Lys Gly Pro Gly Ile Ser Lys Phe Val Gln
85                  90                  95
Lys Val Asn Glu Ile Gly Ile Tyr Leu Thr Asp Cys Met Glu Arg Ala
100                 105                 110
Arg Glu Val Ile Pro Arg Ser Gln His Gln Glu Thr Pro Val Tyr Leu
115                 120                 125
Gly Ala Thr Ala Gly Met Arg Leu Leu Arg Met Glu Ser Glu Glu Leu
130                 135                 140
Ala Asp Arg Val Leu Asp Val Val Glu Arg Ser Leu Ser Asn Tyr Pro
145                 150                 155                 160
Phe Asp Phe Gln Gly Ala Arg Ile Ile Thr Gly Gln Glu Glu Gly Ala
165                 170                 175
Tyr Gly Trp Ile Thr Ile Asn Tyr Leu Leu Gly Lys Phe Ser Gln Lys
180                 185                 190
Thr Arg Trp Phe Ser Ile Val Pro Tyr Glu Thr Asn Asn Gln Glu Thr
195                 200                 205
Phe Gly Ala Leu Asp Leu Gly Gly Ala Ser Thr Gln Val Thr Phe Val
210                 215                 220
Pro Gln Asn Gln Thr Ile Glu Ser Pro Asp Asn Ala Leu Gln Phe Arg
225                 230                 235                 240
Leu Tyr Gly Lys Asp Tyr Asn Val Tyr Thr His Ser Phe Leu Cys Tyr
245                 250                 255
Gly Lys Asp Gln Ala Leu Trp Gln Lys Leu Ala Lys Asp Ile Gln Val
260                 265                 270
Ala Ser Asn Glu Ile Leu Arg Asp Pro Cys Phe His Pro Gly Tyr Lys
275                 280                 285
Lys Val Val Asn Val Ser Asp Leu Tyr Lys Thr Pro Cys Thr Lys Arg
290                 295                 300
Phe Glu Met Thr Leu Pro Phe Gln Gln Phe Glu Ile Gln Gly Ile Gly
305                 310                 315                 320
Asn Tyr Gln Gln Cys His Gln Ser Ile Leu Glu Leu Phe Asn Thr Ser
325                 330                 335
Tyr Cys Pro Tyr Ser Gln Cys Ala Phe Asn Gly Ile Phe Leu Pro Pro
340                 345                 350
Leu Gln Gly Asp Phe Gly Ala Phe Ser Ala Phe Tyr Phe Val Met Lys
355                 360                 365
Phe Leu Asn Leu Thr Ser Glu Lys Val Ser Gln Glu Lys Val Thr Glu
370                 375                 380
Met Met Lys Lys Phe Cys Ala Gln Pro Trp Glu Glu Ile Lys Thr Ser
385                 390                 395                 400
Tyr Ala Gly Val Lys Glu Lys Tyr Leu Ser Glu Tyr Cys Phe Ser Gly
405                 410                 415
Thr Tyr Ile Leu Ser Leu Leu Leu Gln Gly Tyr His Phe Thr Ala Asp
420                 425                 430
Ser Trp Glu His Ile His Phe Ile Gly Lys Ile Gln Gly Ser Asp Ala
435                 440                 445
Gly Trp Thr Leu Gly Tyr Met Leu Asn Leu Thr Asn Met Ile Pro Ala
450                 455                 460
Glu Gln Pro Leu Ser Thr Pro Leu Ser His Ser Thr Tyr Val
465                 470                 475
<210>  45
<211>  486
<212>  БЕЛОК
<213>  HOMO SAPIENS
<400>  45
Met Glu Asp Thr Lys Glu Ser Asn Val Lys Thr Phe Cys Ser Lys Asn
1               5                   10                  15
Ile Leu Ala Ile Leu Gly Phe Ser Ser Ile Ile Ala Val Ile Ala Leu
20                  25                  30
Leu Ala Val Gly Leu Thr Gln Asn Lys Ala Leu Pro Glu Asn Val Lys
35                  40                  45
Tyr Gly Ile Val Leu Asp Ala Gly Ser Ser His Thr Ser Leu Tyr Ile
50                  55                  60
Tyr Lys Trp Pro Ala Glu Lys Glu Asn Asp Thr Gly Val Val His Gln
65                  70                  75                  80
Val Glu Glu Cys Arg Val Lys Gly Pro Gly Ile Ser Lys Phe Val Gln
85                  90                  95
Lys Val Asn Glu Ile Gly Ile Tyr Leu Thr Asp Cys Met Glu Arg Ala
100                 105                 110
Arg Glu Val Ile Pro Arg Ser Gln His Gln Glu Thr Pro Val Tyr Leu
115                 120                 125
Gly Ala Thr Ala Gly Met Arg Leu Leu Arg Met Glu Ser Glu Glu Leu
130                 135                 140
Ala Asp Arg Val Leu Asp Val Val Glu Arg Ser Leu Ser Asn Tyr Pro
145                 150                 155                 160
Phe Asp Phe Gln Gly Ala Arg Ile Ile Thr Gly Gln Glu Glu Gly Ala
165                 170                 175
Tyr Gly Trp Ile Thr Ile Asn Tyr Leu Leu Gly Lys Phe Ser Gln Lys
180                 185                 190
Thr Arg Trp Phe Ser Ile Val Pro Tyr Glu Thr Asn Asn Gln Glu Thr
195                 200                 205
Phe Gly Ala Leu Asp Leu Gly Gly Ala Ser Thr Gln Val Thr Phe Val
210                 215                 220
Pro Gln Asn Gln Thr Ile Glu Ser Pro Asp Asn Ala Leu Gln Phe Arg
225                 230                 235                 240
Leu Tyr Gly Lys Asp Tyr Asn Val Tyr Thr His Ser Phe Leu Cys Tyr
245                 250                 255
Gly Lys Asp Gln Ala Leu Trp Gln Lys Leu Ala Lys Asp Ile Gln Val
260                 265                 270
Ala Ser Asn Glu Ile Leu Arg Asp Pro Cys Phe His Pro Gly Tyr Lys
275                 280                 285
Lys Val Val Asn Val Ser Asp Leu Tyr Lys Thr Pro Cys Thr Lys Arg
290                 295                 300
Phe Glu Met Thr Leu Pro Phe Gln Gln Phe Glu Ile Gln Gly Ile Gly
305                 310                 315                 320
Asn Tyr Gln Gln Cys His Gln Ser Ile Leu Glu Leu Phe Asn Thr Ser
325                 330                 335
Tyr Cys Pro Tyr Ser Gln Cys Ala Phe Asn Gly Ile Phe Leu Pro Pro
340                 345                 350
Leu Gln Gly Asp Phe Gly Ala Phe Ser Ala Phe Tyr Phe Val Met Lys
355                 360                 365
Phe Leu Asn Leu Thr Ser Glu Lys Val Ser Gln Glu Lys Val Thr Glu
370                 375                 380
Met Met Lys Lys Phe Cys Ala Gln Pro Trp Glu Glu Ile Lys Thr Ser
385                 390                 395                 400
Tyr Ala Gly Val Lys Glu Lys Tyr Leu Ser Glu Tyr Cys Phe Ser Gly
405                 410                 415
Thr Tyr Ile Leu Ser Leu Leu Leu Gln Gly Tyr His Phe Thr Ala Asp
420                 425                 430
Ser Trp Glu His Ile His Phe Ile Gly Lys Ile Gln Gly Ser Asp Ala
435                 440                 445
Gly Trp Thr Leu Gly Tyr Met Leu Asn Leu Thr Asn Met Ile Pro Ala
450                 455                 460
Glu Gln Pro Leu Ser Thr Pro Leu Ser His Ser Thr Tyr Val Asp Tyr
465                 470                 475                 480
Lys Asp Asp Asp Asp Lys
485
<---