Биотехнологический способ оптимизации производства привитых саженцев винограда на основе применения гриба Glomus intraradices Shenck & Smith, штамм RCAM02146
BIOTECHNOLOGICAL WAY OF OPTIMIZING PRODUCTION OF GRAFTED GRAPES BASED ON USAGE OF FUNGUS GLOMUS INTRARADICES SHENCK & SMITH, STRAIN RCAM02146

Изобретение относится к сельскохозяйственным биотехнологиям и может быть использовано при выращивании высококачественных привитых саженцев винограда. Усовершенствование технологий выращивания и внедрение новых эффективных приемов для получения посадочного материала винограда высокого качества имеет большое значение в современном виноградарстве. В настоящее время используются различные способы оптимизации биологической продуктивности привитых виноградных саженцев для повышения выхода стандартных саженцев с помощью удобрений и регуляторов роста.
Широко известны способы оптимизации роста привитых виноградных саженцев на основе припосадочного внесения минеральных удобрений - азота, фосфора, калия в почву [Подражанский А.Л. Выращивание привитого посадочного материала. - Кишинев, 1955. - С. 38-40, Роганов В.М. Удобрение и глубина посадки прививок винограда в школке. - Кишинев, 1961.- С. 16-22.]. Недостатком этих способов является низкая усваиваемость вносимых элементов питания растениями и негативное влияние этих агрохимикатов на почвообразовательные процессы.
Имеются сведения о внекорневом применении микроудобрений для повышения выхода качественных привитых саженцев [Малых Г.П., Трошин Л.А. Влияние микроудобрений на выход и качество привитых саженцев / Достижения, проблемы и перспективы развития отечественной винограда-винодельческой отрасли на современном этапе: мат. междунар. науч.-практ.конф. - Новочеркасск, 2013. - С. 156-161]. Недостатком этого способа является то, что способ не оказывает никакого влияния на ризосферный микробиоценоз и таким образом на плодородие почвы.
Известны способы оптимизации ризогенеза привитых виноградных саженцев на основе применения химических регуляторов роста - аналогов фитогормонов - это препараты ауксинового действия; препараты на основе индолилуксусной кислоты и др. [Радчевский П.П., Печкуров К.О., Дух А.Е. Влияние физиологически активных веществ на выход и качество виноградных саженцев. - http://lib.convdocs.org/docs/index-115263.html]. Недостатком химических регуляторов роста является то, что передозировка очень опасна: можно не только не получить ожидаемого эффекта, но столкнуться с прямо противоположным результатом. В высоких концентрациях эти препараты оказывают воздействие, угнетающее физиологические процессы в растении. Кроме того, эти препараты не несут питания растениям, и при их использовании все равно необходимо вносить удобрения.
В производстве привитых виноградных саженцев известен способ оптимизации их роста на основе применения и более «мягких» средств, таких как гуминовые препараты, например, гумата калия жидкого торфяного органо-минеральной природы [Радчевский П.П., Мороз Н.Б., Трошин Л.П. Новации виноградарства России 26. Применение биологически активных веществ гумата при выращивании виноградного посадочного материала / Научный журнал КубГАУ, №60(06), 2010. - http://ej.kubagro.ru/2010/06/pdf/28.pdf], которые могут выступать как регуляторы роста растения, так и как удобрения. Недостатком этого способа является то, что состав органических и неорганических соединений микро- и макроэлементов в препаратах очень сильно варьирует, так как зависит от места и сроков добычи и часто не соответствует первоначально заявленному составу. Кроме того, в реальных условиях школок (питомников) очень трудно подобрать действительно оптимальную дозу, требующуюся конкретному насаждению, обычным явлением при использовании гуматов являются повышенные концентрации растворов при обработке, что отрицательно влияет на состояние растений. Излишний рост клеток тканей растений, вызываемый ими, снижает адаптивный потенциал к стрессовым условиям среды, иммунный статус, повышает заболеваемость.
Кроме химических способов оптимизации роста растений также известны и биологические. Особенно большой интерес в этом плане вызывают биотехнологии на основе использования эндомикоризных грибов.
Известны зарубежные препараты на основе грибов арбускулярной микоризы (AM), такие как «VAM Везикулярная Арбускулярная Эндо-Микориза», производитель Dr. Rajan laboratories (Индия) (http://www.drrajanlaboratories.com) - состав: штаммы эндомикоризных грибов Glomus intraradices; Glomus mosseae; Glomus aggregatum; Glomus clarum; «Микоплант», производитель фирма GEE Biotech GmbH Co KG (Германия) - состав: штаммы эндомикоризных грибов Glomus sp. (http://www.agrochim.biz/katalog-firm/rekultivacija-i-ozelenenie/am-mykoplantgermany.html). Но данные исследований по их использованию в производстве привитых виноградных саженцев отсутствуют, и эффективность их применения не подтверждена ни лабораторными, ни полевыми испытаниями. А между тем, в природных условиях не выявлено растительно-микробных симбиозов между растениями рода Vitis и грибами Glomeromycota. Кроме того, для эффективного использования микроорганизмов необходимо учитывать средовые условия региона выращивания культуры - эдафические, гидротермические.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является оптимизация почвенно-биотического комплекса виноградных школок, которая выражается в формировании сбалансированного ризосферного микробиоценоза, что положительно влияет на восстановление почвенного плодородия; повышении биологической продуктивности виноградных саженцев, их приживаемости в школке, в том числе в стрессовых средовых условиях на 9,5-19,0%; стандартности на 15,4-15,9% и в целом увеличении выхода высококачественных стандартных саженцев на 20-25%. Разработанный биотехнологический способ обладает характеристиками, требующимися для агроприемов в адаптивном земледелии - экологичный, экономичный, ресурсосберегающий (используются возобновляемые биологические ресурсы) и т.д.
Сущность изобретения заключается в том, что впервые для оптимизации производства привитых виноградных саженцев используется биотехнологический способ на основе применения штамма гриба арбускулярной микоризы Glomus intraradices Shenck & Smith, депонированного в Ведомственную коллекцию полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения Россельхозакадемии ГНУ ВНИИСХМ Россельхозакадемии (ФГБНУ ВНИИСХМ) 19 сентября 2013 года под регистрационным номером RCAM02146 (Glomus intraradices Shenck & Smith штамм RCAM02146) (приложение к заявке "Справка №399/09 от 20.09.2013"), который был выделен как наиболее перспективный в результате скрининга большого набора штаммов симбиотических микроорганизмов, в том числе микоризных грибов и показал высокую биологическую и хозяйственную эффективность в отношении растений винограда (p. Vitis), как в оптимальных условиях среды, так и в стрессовых.
Разработанная биотехнология включает в себя обработку растений различными способами: а) непосредственно перед посадкой привитые саженцы винограда инокулируются грибом арбускулярной микоризы Glomus intraradices Shenck & Smith, штамм RCAM02146 путем замачивания в раствор биопрепарата на 50-60 минут; б) непосредственно перед посадкой привитые саженцы винограда инокулируются грибом арбускулярной микоризы Glomus intraradices Shenck & Smith, штамм RCAM02146 путем замачивания в раствор биопрепарата на 20-30 минут, а сразу после посадки производится полив почвы раствором биопрепарата в районе корней. Биопрепарат представляет собой почвенно-корневой субстрат растений люцерны хмелевидной, выращенной в стерильной почве с низким содержанием фосфора, корни которой инфицированы (микоризованы) микроскопическим грибом арбускулярной микоризы Glomus intraradices штамм RCAM02146 с эффективностью микоризации 75% и более. Соотношение почвы и корней в препарате 1:1. Расход препарата 200 мг на 10 л воды. Затем растения высаживаются в школку и выращиваются в течение 6-6,5 месяцев по принятой в хозяйстве технологии.
Грибы AM являются облигатными симбионтами, т.е. не способны к самостоятельному росту и развитию без растения-хозяина. AM способствует улучшению минерального питания растений. Особое значение AM имеет в адаптации растений к условиям низкого уровня доступного для питания растений фосфора (Рд) в почве. В силу низкой подвижности фосфорных соединений в почве, влияние AM на фосфорное питание растений актуально на почвах любой степени окультуренности. Грибы AM оказывают общестимулирующее влияние на растения, в результате которого значительно возрастает урожайность сельскохозяйственных культур (Маршунова Г.Н., Якоби Л.М., 1988; Кирпичников Н.А. и др.,. 2012; Юрков А.П. и др., 2012). Растение снабжает микосимбионта глюкозой, и без этого механизма грибы AM не имели бы возможности выжить, поскольку являются облигатными симбионтами растений (Bago et al. 1999, 2000). В свою очередь грибы AM оказывают оздоравливающий эффект, защищая растение от корневых патогенов путем синтеза антибиотиков или конкуренции за субстрат, либо за счет индукции иммунных реакций у растения-хозяина (Dehne H.W., 1982; Caron М., 1989; Marsh J.F., Schultze M., 2001). Грибы AM могут изменять гормональный статус растений, влияя на содержание ауксинов, гиббереллинов, абсцизовой кислоты и цитокининов (Allen O.N., Allen Е.К., 1980; Danneberg et al., 1992; Allen M.F. et al., 1982). В процессе взаимодействия фитобионта с грибами AM и патогенными микроорганизмами возможен целый каскад гормональных перестроек у растения-хозяина, который влечет адаптацию растения к стресс-факторам биотической и абиотической природы. Это свидетельствует о перспективности применения грибов AM для разработки биотехнологий биопрепаратов для растений защитного и стимулирующего действия.
Примеры конкретного выполнения.
Пример 1. Посадку саженцев в школку начинают, когда почва на глубине 25-30 см прогреется выше 10°С. Подготовленную партию привитых саженцев перед посадкой сортируют, отбраковывая нежизнеспособные растения, удаляют все корни, развившиеся от привоя и на верхних узлах подвоя, укорачивают корни на нижнем узле подвоя до 2-3 см. Все пригодные для посадки саженцы помещают корнями в емкости с приготовленным 2%-ным раствором биопрепарата AM на 50-60 минут. Затем вынимают и высаживают в грунт, почву у основания посаженных растений хорошо уплотняют и поливают водой. Норма полива 150-200 л/га.
Раствор биопрепарата AM готовят следующим образом: 200 г почвенно-корневого субстрата люцерны хмелевидной, 75% и более корней которой микоризовано грибом арбускулярной микоризы Glomus intraradices, штамм RCAM02146, заливают водой в объеме 1 л (1:5) на 12-24 часа, затем непосредственно перед посадкой приготовленный маточный раствор разбавляют в 10 раз, заливают в емкости для замачивания (инокулирования) саженцев. Таким образом, расход биопрепарата AM составляет 200 г на 10 литров воды.
Пример 2. Пригодные для посадки саженцы помещают корнями в емкости с 2%-ным раствором биопрепарата AM (приготовление которого описано в Примере 1) на 20-30 минут, затем вынимают и высаживают в грунт. Сразу после посадки поливают почву возле саженцев в районе корней раствором биопрепарата AM в 2%-ной концентрации. Норм а вылпьа рабочего раствора биопрепарата AM 150-200 л/га.
Существует несколько способов высадки саженцев: вручную в открытые или закрытые борозды под гидробур, в канавки с помощью машин ПРВИ-2.5 или в подготовленную выровненную почву, накрытую перфорированной полиэтиленовой мульчирующей пленкой. В последнее время в хозяйствах получили распространение школкопосадочные машины МВС, МПТ-2, навешанные на трактор с резервуарами для воды.
Исследования по изучению влияния гриба AM на рост и развитие виноградных саженцев в школке проводились в течение 2011-2014 гг. В течение этого срока был период (2012-2014 гг.), который по гидротермическим условиям отличался от среднемноголетних. Особенно большие отклонения от среднемноголетних показателей наблюдались в течение 2012, 2013 годов - отмечалась необычайно жаркая погода в течение мая - июня месяцев, отклонение среднесуточных температур от среднемноголетних достигало в мае 4,0…4,5°С, в июне 4,0…4,1°С (по данным метеостанции г. Темрюка). Максимальная температура воздуха на опытном участке в июле - августе достигала 42…44°С на фоне пониженной влажности воздуха (38…55%). В таких абиотических условиях наблюдалось торможение начального роста и дальнейшего развития саженцев в школке (см. контроль, фиг. 1), часть растений погибала от температурного шока.
Обработка растений биопрепаратом на основе гриба AM положительно повлияла на адаптацию растений к стрессовым условиям среды, что выразилось в повышенной по сравнению с контролем динамике распускания и динамике начального нарастания листовой массы. На протяжении всех учетов (в период с 8-ого по 16-й день после посадки) в опыте увеличение площади листовой поверхности в варианте обработки AM опережало контрольный вариант примерно в 2 раза. В дальнейших наблюдениях за развитием саженцев в школке было отмечено оптимизирующее влияние обработки биопрепаратом на основе грибов AM на биологическую продуктивность надземной части виноградных растений (табл. 1).
Примечание: * - здесь и далее статистически достоверно.
Проведенный анализ структурных элементов роста продуктивности зафиксировал достоверное увеличение площади листовой поверхности; значения же среднего количества побегов и диаметра побегов находились в пределах ошибки опыта. Повышение интенсивности ризогенеза (табл. 2) при обработке виноградных растений биопрепаратом (статистически значимое увеличение общего количества корней, корней более 2 мм и суммарной толщины корней) также говорит об эффективном оптимизирующем воздействии грибов AM.
Для определения степени микоризации на протяжении 3-х лет экспериментов проводили микроскопические анализы корней винограда в период выкопки саженцев из школки (октябрь-ноябрь). В варианте инокуляции микоризным грибом установлено, что все опытные растения (100%) были заражены Glomus intraradices (штамм RCAM02146) (фиг. 2(а)). При раздавливании корешков винограда и просматривании их под микроскопом наблюдали межклеточный мицелий и везикулы гриба (фиг. 2(б)). Арбускулы настолько плотно (на 100%) заполняли клетки вокруг центральных цилиндров корней, что отдельные арбускулы не просматривались, а вся центральная зона заражения выглядела сплошной непрозрачной темной полосой (фиг. 2(г)). Фрагмент корня винограда с арбускулами в клетках коры корня, близких к клеткам центрального цилиндра (верхний слой клеток коры корня без арбускул снят, чтобы были видны слои клеток с арбускулами и можно было рассмотреть отдельные арбускулы) (фиг. 2(b)). Фигура 3 представлена фотографиями корневой системы винограда, выполненными в период выкопки растений из школки (ноябрь 2014 года), на которых видно, что внешний вид корневой системы инокулированных растений винограда грибом Glomus intraradices штамм RCAM02146 имеет более разветвленную, мочковатую структуру, большую длину корней и в целом больший общий объем, чем выгодно отличается от контрольных растений.
В результате микробиологического анализа почвы ризосферы саженцев было выявлено довольно значительное количество микроорганизмов различных эколого-трофических групп, отмечалась интенсификация минерализационных процессов (табл.3).
В ходе исследований на это указало то, что на бедных питательных средах численность микроорганизмов была выше, чем на богатых органических. Подтверждением этого факта послужило также и то, что на крахмало-аммиачной среде была зафиксирована большая численность колоний микроорганизмов, чем на МПА. Обработка микоризосодержащим биопрепаратом растений винограда повлияла на увеличение аммонификаторов в ризосфере, по сравнению с контролем (вариант спонтанного заселения) - количество этих видов при инокуляции AM увеличилось в 1,6 раз. Группу аммонификаторов при анализе взаимоотношений между растениями и ризосферными микроорганизмами некоторые исследователи (Малиновская И.М., Сорока А.П., 2010) рассматривают как индикаторную, т.к. субстратом для роста этих микроорганизмов являются белковые вещества корневых выделений и отмершие фрагменты корней и корневых волосков. Возрастание аммонификаторов свидетельствует об увеличении количества корневых выделений, поскольку никакая другая исследованная группа микроорганизмов так тесно не связана с их количеством. Инокуляция AM увеличила также содержание другой группы микроорганизмов иммобилизаторов минерального азота более чем в 2,5 раза. Аналогичные тенденции наблюдались для олигонитрофилов (в 3,1 раза), педотрофов (в 3,5 раза) и микромицетов (в 1,7 раза). Анализ последовательности и интенсивности появления колоний микроорганизмов показал, что микроорганизмы ризосферы виноградных саженцев, инокулированных AM, характеризуются большей физиолого-биохимической активностью, по сравнению, с вариантом спонтанной инокуляции, особенно аммонификаторы, олигонитрофилы, микромицеты. Расходование органического вещества без внесения в ризосферу микоризообразователей замедляется, индекс педотрофности уменьшился на 0,7%.
Интегральным показателем эффективности агропрепаратов является отзывчивость саженцев на их применение, которая выражается в увеличении стандартности саженцев. Обработка грибами AM повысила выход стандартных саженцев на 15,4% по сравнению с контрольным вариантом спонтанной инокуляции (табл. 4).