СПОСОБ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ СТИМУЛЯЦИИ НЕОАНГИОГЕНЕЗА В ЛЕЧЕНИИ ОСТРОЙ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ИШЕМИИ КОНЕЧНОСТИ
METHOD FOR PHARMACOLOGICAL STIMULATION OF NEOANGIOGENESIS IN TREATING ACUTE EXPERIMENTAL LIMB ISCHEMIA

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной фармакологии и сосудистой хирургии, и может быть использовано при лечении критической ишемии конечности.
Наиболее близким к заявленному решению является способ фармакологической коррекции ишемии скелетной мышцы ресвератролом (патент RU 2518965 С1 от 10.06.2014). В данном экспериментальном исследовании ишемию мышц голени моделировали оперативным удалением участка магистральных сосудов, включающего бедренную, подколенную, переднюю и заднюю большеберцовые артерии на вторые сутки эксперимента; лабораторному животному внутрижелудочно вводили ресвератрол в суточной дозе 2,0 мг/кг каждые 46 часов первые 7 суток эксперимента; уровень микроциркуляции в мышцах оценивали на 28 сутки ишемии посредством лазерной допплеровской флоуметрии. Однако в данном исследовании ишемию мышц голени моделируют на вторые сутки эксперимента оперативным путем после применения эффекта ишемического прекондиционирования, который состоит, как известно, из двух периодов: раннего (длится до 2 часов и защищает клетки от повреждения) и позднего («второе защитное окно» развивается через 24 часа после начала действия причинного фактора и длится около 48 часов). Кроме этого, недостатком способа является то, что авторами препарат ресвератрол, обладающий доказанным цитопротекторным эффектом, применяется как раз в фазу позднего периода ишемического прекондиционирования, а именно каждые 46 часов, что способствует тому, что уровень микроциркуляции становится выше, чем даже у интактных животных. Это свидетельствует о том, чтя фармакологическая коррекция ишемии скелетной мышцы достигается не только за счет неоангиогенеза, но и за счет феномена прерывистой ишемии или метаболической адаптации.
Основным преимуществом предлагаемого способа является то, что на фоне применения препарата «Актовегин» восстановление микроциркуляции достигается лишь за счет стимуляции неоангиогенеза и активации развития коллатерального кровотока в ишемизированной конечности и улучшение, таким образом, артериального притока крови из проксимальных отделов конечности в дистальные. Препарат вводится интраперитонеально в дозе 50 мкг/кг ежедневно 1 раз в сутки на протяжении 5 дней непосредственно после операции в условиях отсутствия эффекта ишемического прекондиционирования, который в реальных жизненных условиях у пациентов, страдающих острой тромбоэмболией артерий нижних конечностей, не срабатывает.
Техническим результатом изобретения является разработка способа лечения острой экспериментальной ишемии конечности с использованием препарата «Актовегин».
Технический результат достигается тем, что на фоне моделирования острой экспериментальной ишемии конечности у крыс-самцов линии Вистар путем иссечения магистрального сосуда, включающего бедренную артерию, подколенную артерию и начальные отделы артерий голени под наркозом хлоралгидратом в дозе 250-300 мг/кг проводится коррекция патологии интраперитонеальным введением препарата "Актовегин", полученного из крови здоровых молочных телят, в дозе 50 мкг/кг ежедневно 1 раз в сутки на протяжении 5 дней непосредственно после операции. Это приводит к выраженной коррекции нарушений микроциркуляции в ишемизированной конечности, что подтверждается методом лазерной допплеровской флоуметрии.
Способ осуществляется следующим образом.
Опыты проводят на 160 крысах-самцах линии Вистар массой тела 300-350 г. Крысы-самцы были разделены на четыре серии: интактную, контрольную, опытную и сравнения. В каждую из серий было включено по 40 крыс-самцов, которые были разделены на четыре группы в зависимости от срока выведения, в каждую из групп вошло по 10 крыс-самцов.
У крыс-самцов всех серий изучали динамику уровня микроциркуляции в ишемизированной конечности без и на фоне лечения острой экспериментальной ишемии препаратом "Актовегин" на сроках 5, 10, 21 и 28 сутки. Острую ишемию задней конечности моделировали по методике M. Sugano et al. (2004), S. Takeshita et al. (1998) путем иссечения магистрального сосуда, включающего бедренную артерию, подколенную артерию и начальные отделы артерий голени.
Оценка уровня микроциркуляции в мышцах голени крыс-самцов выполнялась методом лазерной допплеровской флоуметрии (ЛДФ). Исследование осуществляли при помощи аппарата - лазер-допплеровского флоуметра «Biopac-systems MP-100» и датчика «TSD-144». Запись и обработка данных производилась при помощи программы AcqKnowledge 38. Исследование выполняли под наркозом хлоралгидратом в дозе 250-300 мг/кг, который вводили внутрибрюшинно в виде водного раствора. После наступления наркотического сна иссекали участок кожи на переднелатеральной поверхности правой голени задней конечности. Крысу-самца укладывали на противоположную сторону. Датчик вплотную приставляли к мышце и проводили флоуметрию. Уровень микроциркуляции регистрировали в пяти точках: 1) середина длины мышцы; точки на 3-4 мм 2) выше, 3) ниже, 4) латеральнее и 5) медиальнее от первой (патент №2353977 от 27.04.2009). Запись кривой уровня микроциркуляции проводили в течение 30 сек в каждой точке. Из полученных пяти значений выводили среднее, которое вносили в протокол и принимали за уровень микроциркуляции в мышцах голени у данной крысы-самца. Из 10 полученных значений выводили среднее, которое принимали за уровень микроциркуляции в данной группе крыс-самцов на данном сроке исследования.
У интактных крыс-самцов оценивали уровень микроциркуляции и мышцах голени правой задней конечности методом ЛДФ. Полученное среднее значение уровня микроциркуляции в этой группе было принято за «норму» и составило 535,22±37,1 перфузионных единиц (п.е.). Ошибка этого среднего значения (37,1) не превышает 10% от абсолютного значения (53,52), что свидетельствует о достаточном количестве единиц наблюдения в группе.
Крысы-самцы контрольной серии лечения не получали. У крыс-самцов опытной серии лечение начинали непосредственно после операции интраперитонеальным введением препарата "Актовегин", полученного из крови здоровых молочных телят, в дозе 50 мкг/кг ежедневно 1 раз в сутки на протяжении 5 дней. В группе сравнения крысы-самцы были пролечены пентоксифиллином в дозе 60 мг/кг интраперитонеально ежедневно 1 раз в сутки на протяжении 5 дней.
Крысы-самцы выводились из эксперимента путем передозировки наркоза на 5, 10, 21 и 28 сутки. Перед выведением из эксперимента у крыс-самцов оценивали динамику клинических и флоуметрических показателей при моделировании ишемии конечности на разных сроках. Полученные данные обработаны статистически: рассчитаны средние значения сдвигов (М), средняя ошибка средней арифметической (±m) и вероятность возможной ошибки (p). Различия оценивали как достоверные при p<0,05.
При клиническом обследовании у большинства крыс-самцов зарегистрировано бледность и похолодание кожи голени и стопы, ограниченное участие конечности в передвижении.
Влияние препарата "Актовегин" на уровень микроциркуляции у крыс-самцов с острой экспериментальной ишемией конечности представлено в таблице 1.
Как видно из таблицы 1, в контрольной серии крыс-самцов после операции моделирования ишемии отмечается резкое и быстрое снижение уровня микроциркуляции по сравнению с интактной: на 5 сутки - на 71,5%; на 10 сутки - на 61,3%; на 21 сутки - на 42,9%; на 28 сутки - на 33,4%. Прослеживается медленное восстановление уровня микроциркуляции, что свидетельствует о включении имеющихся компенсаторных механизмов коллатерального кровообращения. Однако до 28 суток включительно показатели микроциркуляции остаются достоверно ниже нормального значения, зарегистрированного в группе интактных крыс-самцов.
В серии крыс-самцов, получавших пентоксифиллин, выявляется увеличение уровня микроциркуляции по сравнению с контрольной на 5 сутки - на 30%; на 10 сутки - на 11%; на 21 сутки - на 11%; на 28 сутки - на 5%. Отсюда следует, что пентоксифиллин оказывает положительное влияние на микроциркуляцию, но к 28 суткам статистически достоверно последняя не достигает нормального значения.
По сравнению с контрольной серией уровень микроциркуляции в опытной серии, пролеченных по заявленному способу, был достоверно выше на 5 сутки - на 38%; на 10 сутки - на 19%; на 21 сутки - на 28%; на 28 сутки -на 45%; а по сравнению с серией крыс-самцов, получавших пентоксифиллин, на 5 сутки - возрастает на 5,6%; на 10 сутки - на 7,4%; на 21 сутки - на 14,5%; на 28 сутки - на 38%.
Итак, уровень микроциркуляции в опытной серии крыс-самцов, получавших препарат "Актовегин", в отличие от серии, получавших стандартный препарат "Пентоксифиллин", к 28 суткам статистически достоверно достиг нормального значения, зарегистрированного в серии интактных крыс-самцов, что свидетельствует о достаточной эффективности предложенного способа.
ПРИМЕР КОНКРЕТНОГО ВЫПОЛНЕНИЯ
Крысам-самцам серии сравнения в эксперименте вводили стандартный препарат "Пентоксифиллин" в дозе 60 мг/кг интраперитонеально ежедневно 1 раз в сутки на протяжении 5 дней непосредственно после моделирования острой ишемии конечности, что приводило к увеличению микроциркуляции в ишемизированной конечности на 5 сутки до 198,33±11,48 п.е., на 10 сутки - до 232,20±13,57 п.е., на 21 сутки до 347,96±17,36 п.е. и на 28 сутки 388,98±13,34 п.е., однако уровень микроциркуляции статистически достоверно не достигал нормального значения, зарегистрированного в серии интактных крыс-самцов.
Крысам-самцам опытной серии непосредственно после моделирования острой ишемии конечности интраперитонеально вводили препарат "Актовегин", полученный из крови здоровых молочных телят, в дозе 50 мкг/кг ежедневно 1 раз в сутки на протяжении 5 дней. Это приводило к достоверному повышению уровня микроциркуляции в ишемизированной конечности на 5 сутки до 209,44±19,32 п.е., на 10 сутки - до 249,46±9,49 п.е., на 21 сутки - до 398,42±26,37 п.е. и на 28 сутки - до 535,34±18,26 п.е., что выше по сравнению с серией крыс-самцов, получавших пентоксифиллин, и достигает нормального значения к 28 суткам.
Таким образом, результаты экспериментального исследования убедительно свидетельствуют о том, что предложенный метод более эффективный и патогенетически обоснован при лечении острой ишемии конечности по сравнению с известным за счет стимуляции неоангиогенеза и развития коллатерального кровотока в ишемизированной конечности и улучшения, таким образом, артериального притока крови из проксимальных отделов конечности в дистальные.