ОДНОДОМЕННЫЕ АНТИТЕЛА, НАПРАВЛЕННЫЕ ПРОТИВ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ АНТИГЕНОВ
SINGLE-DOMAIN ANTIBODIES DIRECTED AGAINST INTRACELLULAR ANTIGENS

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[0001] Данная заявка заявляет приоритет по предварительной заявке на патент США №62/249868, поданной 2 ноября 2015, содержание которой включено в данное описание посредством ссылки в полном объеме.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
[0002] Данная заявка подана вместе с перечнем последовательности в текстовом формате вместо бумажной копии. Перечень последовательностей предоставляется в виде файла под названием "sequence listing.txt," созданного 27 октября 2016, и имеющего размер 58 килобайт. Информация в электронном формате перечня последовательностей включена в данный документ посредством ссылки в полном объеме.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0003] Использование однодоменных антител (sdAb) в качестве отдельных антигенсвязывающих белков или в качестве антигенсвязывающего домена в более крупном белке или полипептиде дает ряд существенных преимуществ перед использованием обычных антител или фрагментов антител. Преимущества sdAb включают: для связывания антигена с высоким сродством и высокой селективностью требуется только один домен; sdAb могут быть экспрессированы из одного гена и не требуют посттрансляционной модификации; sdAb являются высокостабильными при действии денатурирующих агентов или условий, включая тепло, рН и протеазы; sdAb являются недорогими при создании; и sdAb могут получить доступ к мишеням и эпитопам, недоступным обычным антителам.
[0004] Существует ряд заболеваний или патологических состояний, таких как вирусные инфекции или рак, которые вызваны аберрантными внутриклеточными или трансмембранными компонентами, такими как нуклеотиды и белки. Устранение аберрантных компонентов может быть использовано для предотвращения или лечения заболеваний, или патологических состояний. Существует ряд фармакологических соединений, доступных для лечения таких заболеваний, но эти соединения могут быть неэффективными, не доставляемыми или токсичными для незатронутых клеток.
[0005] Другие способы лечения включают использование терапевтических белков или агентов, которые содержат экзогенную нацеливающую последовательность, так что терапевтический агент может быть распознан рецепторами на клеточной мембране, позволяя терапевтическому агенту преодолевать клеточную мембрану и проникать в клетку. Когда терапевтический агент находится внутри клетки, терапевтический агент может взаимодействовать с компонентом-мишенью для лечения заболевания. Однако использование экзогенной последовательности нацеливания может ограничивать тип клеток, на которые нацелен терапевтический агент, и увеличивать стоимость изготовления терапевтического агента.
[0006] По вышеизложенным причинам существует потребность в композициях и способах лечения или профилактики заболевания, которые не полагаются на экзогенные целевые последовательности или химические составы для проникновения в клетку и которые эффективны при нацеливании только на пораженные клетки в организме.
[0007] Данное изобретение относится к однодоменным антителам (sdAb), белкам и полипептидам, содержащим sdAb. SdAb направлены против мишеней, которые вызывают патологическое состояние или болезнь. Изобретение также включает нуклеиновые кислоты, кодирующие sdAb, белки и полипептиды, и композиции, содержащие sdAb. Изобретение включает применение композиций, sdAb, белков или полипептидов для профилактических, терапевтических или диагностических целей. Изобретение также включает применение моноклональных антител, направленных против sdAb по изобретению.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0008] Данное изобретение направлено на sdAb, применяемые для лечения или профилактики патологического состояния, или заболевания. Один из вариантов осуществления относится к однодоменному антителу (sdAb) к обратной транскриптазы вируса иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1). В одном аспекте sdAb обратной транскриптазы ВИЧ-1 содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 27. Изобретение также включает способ лечения заболевания, предотвращения развития заболевания или предотвращения рецидива заболевания у субъекта с применением sdAb к обратной транскриптазы ВИЧ-1 путем введения эффективного количества sdAb к обратной транскриптазы ВИЧ-1 субъекту, нуждающемуся в этом. Субъект может представлять собой млекопитающее, такое как человек. sdAbk обратной транскриптазе ВИЧ-1 можно вводить в комбинации с одним или более соединениями, такими как, например, ингибитор протеазы. Введение эффективного количества sdAbк обратной транскриптазе ВИЧ-1 субъекту, нуждающемуся в этом, может осуществляться путем внутривенного введения, внутримышечного введения, перорального приема, ректального введения, энтерального введения, парентерального введения, внутриглазного введения, подкожного введения, трансдермального введения, введения в виде глазных капель, введения в виде назального спрея, введения путем ингаляции или распыления, местного применения и введения в качестве имплантируемого лекарственного средства.
[0009] В другом варианте осуществления изобретение относится к выделенному полипептиду, имеющему аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 27. В другом варианте осуществления изобретение включает антитело, направленное против полипептида SEQ ID NO: 27.
[0010] Также предполагается, что изобретение включает способ измерения уровней sdAbк обратной транскриптазе ВИЧ-1 в образце от субъекта, причем способ включает этапы: а) создания мышиного моноклонального антитела, направленного против одного или более доменов полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 27; b) получения образца от субъекта; с) проведения количественного иммуноанализа с мышиным моноклональным антителом и образцом для определения количества sdAb у субъекта; таким образом измеряя количество sdAb у субъекта. В одном аспекте количественный иммунологический анализ включает иммуноферментный анализ (ИФА), анализ специфического мечения аналита и повторного захвата (SALRA), жидкостную хроматографию, масс-спектрометрию, сортировку клеток на проточном цитометре, или их комбинацию.
[0011] Другой вариант осуществления изобретения относится к sdAbк VP24 вирусуЭбола. В одном аспекте sdAbк VP24 вирусуЭбола содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 55. Изобретение также включает способ лечения заболевания, предотвращения развития заболевания или предотвращения рецидива заболевания у субъекта с применением sdAbк VP24 вирусуЭбола путем введения эффективного количества sdAbк VP24 вирусуЭбола субъекту, нуждающемуся в этом. Субъектом может представлять собой млекопитающее, такое как человек. sdAbк VP24 вирусуЭбола можно вводить в комбинации с одним или более соединениями, такими как, например, ингибитор протеазы. Введение эффективного количества sdAbк VP24 вирусуЭбола субъекту, нуждающемуся в этом, может осуществляться путем внутривенного введения, внутримышечного введения, перорального приема, ректального введения, энтерального введения, парентерального введения, внутриглазного введения, подкожного введения, трансдермального введения, введения в виде глазных капель, введения в виде назального спрея, введения путем ингаляции или распыления, местного применения и введения в качестве имплантируемого лекарственного средства.
[0012] В другом варианте осуществления изобретение относится к выделенному полипептиду, имеющему аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 55. В другом варианте осуществления изобретение включает антитело, направленное против полипептида SEQ ID NO: 55.
[0013] Также предполагается, что изобретение включает способ измерения уровней sdAbк VP24 вирусуЭбола в образце от субъекта, причем способ включает этапы: а) создания мышиного моноклонального антитела, направленного против одного или более доменов полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 55; b) получения образца от субъекта; с) проведения количественного иммуноанализа с мышиным моноклональным антителом и образцом для определения количества sdAb у субъекта; таким образом измеряя количество sdAb у субъекта. В одном аспекте количественный иммунологический анализ включает ИФА, SALRA, жидкостную хроматографию, масс-спектрометрию, сортировку клеток на проточном цитометре, или их комбинацию.
[0014] Еще один вариант осуществления изобретения относится к sdAbк арахидонат-12-липоксигеназе (ALOX12). В одном аспекте sdAbк ALOX12 содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 или SEQ ID NO: 52. Изобретение также включает способ лечения заболевания, предотвращения развития заболевания или предотвращения рецидива заболевания у субъекта с применением sdAb к ALOX12 путем введения эффективного количества sdAbк ALOX12 субъекту, нуждающемуся в этом. Субъектом может представлять собой млекопитающее, такое как человек. sdAb к ALOX12 можно вводить в комбинации с одним или более соединениями. Введение эффективного количества sdAbк ALOX12 субъекту, нуждающемуся в этом, может осуществляться путем внутривенного введения, внутримышечного введения, перорального приема, ректального введения, энтерального введения, парентерального введения, внутриглазного введения, подкожного введения, трансдермального введения, введения в виде глазных капель, введения в виде назального спрея, введения путем ингаляции или распыления, местного применения и введения в качестве имплантируемого лекарственного средства.
[0015] В другом варианте осуществления изобретение относится к выделенному полипептиду, имеющему аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 или SEQ ID NO: 52. В другом варианте осуществления изобретение включает антитело, направленное против полипептида SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 или SEQ ID NO: 52.
[0016] Также предполагается, что изобретение включает способ измерения уровней sdAbк обратной транскриптазе ВИЧ-1 в образце от субъекта, причем способ включает этапы: а) создания мышиного моноклонального антитела, направленного против одного или более доменов полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 27; b) получения образца от субъекта; с) проведения количественного иммуноанализа с мышиныммоноклональным антителом и образцом для определения количества sdAb у субъекта; таким образом измеряя количество sdAb у субъекта. В одном аспекте количественный иммунологический анализ включает ИФА, SALRA, жидкостную хроматографию, масс-спектрометрию, сортировку клетокна проточном цитометре, или их комбинацию.
ГРАФИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ
[0017] Эти и другие признаки, аспекты и преимущества данного изобретения станут более понятными в отношении нижеследующего описания, прилагаемой формулы изобретения и сопроводительных графических материалов, на которых:
На фиг. 1 и 2 представлены результаты ИФА с использованием ВИЧ 1-9 sdAbк OT (обратной транскиптазе) ВИЧ-1 (SEQ ID NO: 27);
На фиг. 3 и 4 представлены результаты ИФА с использованием серийных разведений ВИЧ1-9 sdAbк OT ВИЧ-1 (SEQ ID NO: 27);
На фиг. 5-8 представлены результаты ИФА с использованием VP24-5 sdAbк VP24 вирусуЭбола (SEQ ID NO: 55); и
На фиг. 9 и 10 представлены результаты ИФА с использованием серийных разведений VP24-5 sdAbк VP24 вирусуЭбола (SEQ ID NO: 55);
ОПИСАНИЕ
[0018] Используемые в данном документе следующие термины и их варианты имеют значения, приведенные ниже, если иное значение явно не предусмотрено контекстом, в котором используется этот термин.
[0019] Используемые в данном документе формы единственного числа включают ссылки на множественное число, если из контекста явно не следует иное.
[0020] Термин «антигенная детерминанта» относится к эпитопу на антигене, распознаваемому антигенсвязывающей молекулой (такой как sdAb или полипептид по изобретению), и, в частности, антигенсвязывающим сайтом антигенсвязывающей молекулы. Термины «антигенная детерминанта» и «эпитоп» также могут использоваться взаимозаменяемо. Аминокислотная последовательность, которая может связываться с, которая имеет аффинность по отношению к и/или которая обладает специфичностью по отношению к специфической антигенной детерминанте, эпитопу, антигену или белку, называется, как «против» или «направлена против» антигенной детерминанты, эпитопа, антигена или белка.
[0021] Используемый в данном документе термин «содержать» и варианты термина, такие как «содержащий» и «содержит», не предназначены для исключения других добавок, компонентов, целых или стадий.
[0022] Предполагается, что описанные в данном документе sdAb, полипептиды и белки могут содержать так называемые «консервативные» аминокислотные замены, которые обычно могут быть описаны как аминокислотные замены, в которых аминокислотный остаток заменен другим аминокислотным остатком аналогичной химической структуры и которые мало или практически не влияют на функцию, активность или другие биологические свойства полипептида. Консервативные аминокислотные замены хорошо известны в данной области техники. Консервативные замены представляют собой замены, в которых одна аминокислота в следующих группах (а)-(е) замещена другой аминокислотой в пределах одной и той же группы: (а) малые алифатические, неполярные или слабополярные остатки: Ala, Ser, Thr, Pro и Gly; (b) полярные, отрицательно заряженные остатки и их (незаряженные) амиды: Asp, Asn, Glu и Gln; (с) полярные, положительно заряженные остатки: His, Arg и Lys; (d) большие алифатические, неполярные остатки: Met, Leu, Ile, Val и Cys; и (е) ароматические остатки: Phe, Tyr и Trp. Другие консервативные замены включают: Ala на Gly или на Ser; Arg на Lys; Asn на Gln или на His; Asp на Glu; Cys на Ser; Gln на Asn; Glu на Asp; Gly на Ala или на Pro; His на Asn или на Gln; Ile на Leu или на Val; Leu на Ilr или на Val; Lys на Arg, на Gln или на Glu; Met на Leu, на Tyr или на Ile; Phe на Met, на Leu или на Tyr; Ser на Thr; Thr на Ser; Trp на Tyr; Tyr на Trp; и/или Phe на Val, на Ile или на Leu.
[0023] Используемый в данном документе термин «домен» обычно относится к глобулярной области цепи антитела и, в частности, к глобулярной области антитела с тяжелой цепью или к полипептиду, который по существу состоит из такой глобулярной области.
[0024] Аминокислотная последовательность и структура sdAb обычно состоят из четырех каркасных областей или «FR», которые называются «каркасная область 1» или «FR1»; «каркасная область 2» или «FR2»; «каркасная область 3» или «FR3» и «каркасная область 4» или «FR4», соответственно. Каркасные области прерываются тремя определяющими комплементарность областями или «CDR», которые называются «область определения комплементарности 1» или «CDR1»; «область определения комплементарности 2» или «CDR2» и «область определения комплементарности 3» или «CDR3», соответственно.
[0025] Используемый в данном документе термин «гуманизированноe sdAb» означает sdAb, которое имеет один или более аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности встречающейся в природе последовательности VHH, замененных одним или более аминокислотными остатками, которые встречаются в соответствующем положении в VH-домене обычного 4-цепного антитела человека. Это может быть выполнено способами, хорошо известными в данной области техники. Например, FR sdAbs могут быть заменены вариабельными FR человека.
[0026] Используемый в данном документе термин «выделенная» нуклеиновая кислота или аминокислота, означает что они были отделены от, по меньшей мере, одного другого компонента, с которым они обычно связаны, такого как их источник или среда, другая нуклеиновая кислота, другой белок/полипептид, другой биологический компонент или макромолекула, или загрязнитель, примесь или второстепенный компонент.
[0027] Термин «млекопитающее» определяется как индивидуум, принадлежащее к классу «Mammalia» (Млекопитающие), и включает, без ограничения, людей, домашних и сельскохозяйственных животных, а также вальерных, спортивных и домашних животных, таких как коровы, лошади, овцы, собаки и кошки.
[0028] Используемый в данном документе термин «фармацевтически приемлемый носитель» предназначен для включения любых и всех растворителей, дисперсионных сред, покрытий, антибактериальных и противогрибковых агентов, изотонических агентов и агентов, замедляющих абсорбцию, и т.п., совместимых с фармацевтическим введением. Подходящие носители описаны в последнем издании Remington'sPharmaceuticalSciences, стандартного справочного текста в данной области техники. Предпочтительные примеры таких носителей или разбавителей включают, но не ограничиваются ими, воду, физиологический раствор, растворы Рингера, раствор декстрозы, PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор) и 5% человеческий сывороточный альбумин. Также могут быть использованы липосомы, катионные липиды и неводные носители, такие как нелетучие масла. Использование таких сред и агентов для фармацевтически активных веществ хорошо известно в данной области техники. За исключением того, что любые обычные среды или агент несовместимы с терапевтическим агентом, как определено выше, предполагается использование его в композиции по данному изобретению.
[0029] «Количественный иммунологический анализ» относится к любым средствам измерения количества антигена, присутствующего в образце, с использованием антитела. Методы для проведения количественного иммунологического анализа включает, без ограничения, фермент-связанный иммуносорбентный анализ (ИФА), анализ специфического мечения аналита и повторного захвата (SALRA), жидкостную хроматографию, масс-спектрометрию, сортировку клетокна проточномцитометре и тому подобное.
[0030] Термин «раствор» относится к композиции, содержащей растворитель и растворимое вещество, и включает настоящие растворы и суспензии. Примеры растворов включают твердые, жидкие или газообразные вещества, растворенные в жидкости, а также частицы или мицеллы, суспендированные в жидкости.
[0031] Термин «специфичность» относится к числу различных типов антигенов или антигенных детерминант, с которыми может связываться конкретная антигенсвязывающая молекула или антигенсвязывающая белковая молекула. Специфичность антигенсвязывающего белка может быть определена на основе аффинности и/или авидности. Аффинность, представленная константой равновесия для диссоциации антигена с антигенсвязывающего белка (KD), является мерой для силы связывания между антигенной детерминантой и антигенсвязывающим сайтом на антигенсвязывающем белке: чем меньше значение KD, тем сильнее сила связи между антигенной детерминантой и антигенсвязывающей молекулой (альтернативно, аффинность также может быть выражена как константа аффинности (KA), которая равна 1/KD). Как будет понятно специалисту в данной области техники, аффинность может быть определена в зависимости от конкретного представляющего интерес антигена. Авидность является мерой силы связывания между антигенсвязывающей молекулой и антигеном. Авидностьсвязана как с аффинностью между антигенной детерминантой и ее сайтом связывания антигена с антигенсвязывающей молекулой, так и с числом сайтов связывания, присутствующих на антигенсвязывающей молекуле. Специфическое связывание антигенсвязывающего белка с антигеном или антигенной детерминантой может быть определено любым известным способом, таким как, например, анализ Скатчарда и/или анализы конкурентного связывания, такие как радиоиммунологический анализ (RIA), иммуноферментный анализ (EIA) и сэндвич-конкурентный анализ.
[0032] Используемый в данном документе термин «рекомбинантный» относится к использованию методов генной инженерии (например, клонирования и амплификации), используемых для получения sdAb по изобретению.
[0033] «Однодоменное антитело», «sdAb» или «VHH» можно в целом определить, как полипептид или белок, содержащий аминокислотную последовательность, которая состоит из четырех каркасных областей, разделенных тремя определяющими комплементарность областями. Это представлено как FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4.SdAb по изобретению также включает полипептид или белок, который содержит аминокислотную последовательность sdAb. Как правило, sdAb продуцируются представителями семейства верблюдовые, такими как ламы, но также могут синтетически создаваться с использованием методик, которые хорошо известны в данной области техники. Используемые в данном документе, вариабельные домены, присутствующие во встречающейся в природе тяжелой цепи антител, также будут называться «доменами VHH», чтобы отличать их от вариабельных доменов тяжелой цепи, которые присутствуют в обычных 4-цепочечных антителах, называемых «VH» и от вариабельных доменов легкой цепи, которые присутствуют в обычных 4-цепочечных антителах, называемых «доменами VL». «VHH » и « sdAb» используются в данном документе взаимозаменяемо. Нумерация аминокислотных остатков sdAb или полипептида соответствует общей нумерации для доменов VH, Kabatetal. ("Sequence of proteins of immunological interest," US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No. 91).Согласно этой нумерации, FR1 sdAb содержит аминокислотные остатки в положениях 1-30, CDR1 sdAb содержит аминокислотные остатки в положениях 31-36, FR2 sdAb содержит аминокислоты в положениях 36-49, CDR2 sdAb содержит аминокислотные остатки в положениях 50-65, FR3 sdAb содержит аминокислотные остатки в положениях 66-94, CDR3 sdAb содержит аминокислотные остатки в положениях 95-102, a FR4 sdAb содержит аминокислотные остатки в положениях 103-113.
[0034] Термин «синтетический» относится к получению путем химического или ферментативного синтеза in vitro.
[0035] Используемый в данном документе термин «мишень» относится к любому компоненту, антигену или фрагменту, который распознается sdAb. Термин «внутриклеточная мишень» относится к любому компоненту, антигену или фрагменту, присутствующему внутри клетки.«Трансмембранная мишень» представляет собой компонент, антиген или фрагмент, который находится внутри клеточной мембраны. «Внеклеточная мишень» относится к компоненту, антигену или фрагменту, который расположен снаружи клетки.
[0036] Используемая в данном документе «терапевтическая композиция» означает вещество, которое предназначено для терапевтического эффекта, такое как фармацевтические композиции, генетические материалы, биологические вещества и другие вещества. Генетические материалы включают вещества, предназначенные для прямого или косвенного генетического терапевтического эффекта, такие как генетические векторы, генетические регуляторные элементы, генетические структурные элементы, ДНК, РНК и тому подобное. Биологические вещества включают вещества, которые являются живым веществом или получены из живого вещества, предназначенные для терапевтического эффекта.
[0037] Используемые в данном документе фразы «терапевтически эффективное количество» и «профилактически эффективное количество» относятся к количеству, которое обеспечивает терапевтическое преимущество при лечении, профилактике или лечении заболевания или явного симптома заболевания. Терапевтически эффективное количество может лечить заболевание или патологическое состояние, симптом заболевания или предрасположенность к заболеванию с целью исцеления, лечения, смягчения, облегчения, изменения, исправления, улучшения или воздействия на болезнь, симптомы болезни или предрасположенности к болезни. Конкретное количество, которое является терапевтически эффективным, может быть легко определено практикующим врачом и может варьировать в зависимости от факторов, известных в данной области техники, таких как, например, тип заболевания, история и возраст пациента, стадия заболевания и введение других терапевтических агентов.
[0038] Данное изобретение относится к однодоменным антителам (sdAb), которые направлены против вирусных и внутриклеточных компонентов, а также белкам и полипептидам, содержащим sdAb и нуклеотидам, кодирующим белки и полипептиды. Изобретение также может относиться к sdAb, которые направлены против межклеточных, трансцеллюлярных и внеклеточных мишеней или антигенов. Изобретение также включает нуклеиновые кислоты, кодирующие sdAb, белки и полипептиды, и композиции, содержащие sdAb. Изобретение включает применение композиций, sdAb, белков или полипептидов для профилактических, терапевтических или диагностических целей.
[0039] SdAb имеют ряд уникальных структурных характеристик и функциональных свойств, которые делают sdAb очень выгодными для применения в качестве функциональных антигенсвязывающих доменов или белков. SdAb функционально связываются с антигеном в отсутствие вариабельного домена легкой цепи и могут функционировать как единая относительно небольшая функциональная антигенсвязывающая структурная единица, домен или белок. Это отличает sdAb от доменов обычных антител, которые сами по себе не функционируют как антигенсвязывающий белок или домен, и их необходимо объединить с обычными фрагментами антител, такими как антигенсвязывающие фрагменты (Fab) или одноцепочечные вариабельные фрагменты (ScFv) для связывания антигена.
[0040] SdAb можно получить с использованием способов, хорошо известных в данной области техники. Например, один способ получения sdAb включает (а) иммунизацию представителя семейства Верблюдовые одним или более антигенами, (b) выделение периферических лимфоцитов из иммунизированного представителя семейства Верблюдовые, получение тотальной РНК и синтез соответствующих комплементарных ДНК (кДНК), (с) конструирование библиотеки фрагментов кДНК, кодирующих домены VHH, (d) транскрибирование кДНК домена, кодирующего домен VHH, полученного на стадии (с) в матричную РНК (мРНК) с использованием ПНР, преобразованиемРНК в формат рибосомального дисплея, и выбор домена VHH с помощью рибосомального дисплея, и (е) экспрессию домена VHH в подходящем векторе и, необязательно, очистку экспрессированного домена VHH.
[0041] Другим способом получения sdAb по изобретению является получение нуклеиновой кислоты, кодирующей sdAb, с использованием методик синтеза нуклеиновых кислот с последующей экспрессией нуклеиновой кислоты in vivo или in vitro. Кроме того, sdAb, полипептиды и белки по изобретению могут быть получены с использованием синтетических или полусинтетических методик получения белков, полипептидов или других аминокислотных последовательностей.
[0042] SdAb по изобретению обычно связываются со всеми природными или синтетическими аналогами, вариантами, мутантами, аллелями, частями и фрагментами мишени или, по меньшей мере, с такими аналогами, вариантами, мутантами, аллелями, частями и фрагментами мишени, которые содержат одну или более антигенных детерминант или эпитопов, которые по существу являются такими же, как антигенная детерминанта или эпитоп, с которыми sdAb по изобретению связываются в мишени дикого типа. SdAb по изобретению могут связываться с такими аналогами, вариантами, мутантами, аллелями, частями и фрагментами с аффинностью и/или специфичностью, которые являются такими же или выше, или ниже, чем аффинность и специфичность, с которыми sdAb по изобретению связываются с мишенью дикого типа. В объем данного изобретения также предполагается, что sdAb по изобретению связываются с некоторыми аналогами, вариантами, мутантами, аллелями, частями и фрагментами мишени, но не с другими. Кроме того, sdAb по изобретению может быть гуманизированным и может быть моновалентным или многовалентным и/или мультиспецифичным. Кроме того, sdAb по изобретению могут связываться с фосфорилированной формой белка-мишени, а также с нефосфорилированной формой белка-мишени. sdAb могут быть связаны с другими молекулами, такими как альбумин или другие макромолекулы.
[0043] Кроме того, в объем изобретения входит то, что sdAb являются многовалентными, то есть sdAb может иметь два или более белка или полипептида, которые направлены против двух или более различных эпитопов мишени. В таком многовалентном sdAb белок или полипептид могут быть направлены, например, на те же эпитопы, по существу эквивалентные эпитопы или различные эпитопы. Различные эпитопы могут быть расположены на одной и той же цели или могут быть на двух или более разных мишенях.
[0044] Также предполагается, что последовательность одного или более sdAb по изобретению может быть соединена или объединена с одной или более линкерными последовательностями. Линкером может быть, например, белковая последовательность, содержащая комбинацию серинов, глицинов и аланинов.
[0045] В объем изобретения также входит применение частей, фрагментов, аналогов, мутантов, вариантов, аллелей и/или производных sdAb по изобретению, если они пригодны для описанных применений.
[0046] Поскольку sdAb по изобретению в основном предназначены для терапевтического и/или диагностического применения, они направлены против мишеней млекопитающих, предпочтительно человека. Однако возможно, что описанные в данном документе sdAb будут перекрестно-реактивными с мишенями других видов, например, мишенями из одного или более других видов приматов или других животных (например, мыши, крысы, кролика, свиньи или собаки), и, в частности, на животных моделях заболеваний и расстройств, ассоциированных с заболеванием, ассоциированным с мишенями.
[0047] В другом аспекте изобретение относится к нуклеиновой кислоте, которая кодирует sdAb по изобретению. Такая нуклеиновая кислота может быть, например, в виде генетической конструкции.
[0048] В другом аспекте изобретение относится к хозяину или клетке хозяину, которые экспрессируют или способны экспрессировать sdAb по изобретению и/или которые содержат нуклеиновую кислоту, кодирующую sdAb по изобретению. Последовательности sdAb могут быть использованы для вставки в геном любого организма для создания генетически модифицированного организма (ГМО). Примеры включают, но не ограничиваются ими, растения, бактерии, вирусы и животные.
[0049] Изобретение также относится к способам получения или создания sdAb, нуклеиновых кислот, кодирующих sdAb, клеток-хозяев, экспрессирующих или способных экспрессировать такие sdAb, продуктам и композициям, содержащим sdAb по изобретению.
[0050] Изобретение также относится к использованию и применению sdAb, нуклеиновых кислот, кодирующих sdAb, клеткам-хозяевам, продуктам и композициям, описанным в данном документе. Такой продукт или композиция может представлять собой, например, фармацевтическую композицию для лечения или профилактики заболевания, или продукт, или композицию для диагностического применения. SdAb можно применять в различных анализах, например, анализах ИФА и масс-спектрометрических анализах для измерения уровней sdAb в сыворотке и ткани.
[0051] В другом аспекте нуклеиновая кислота, кодирующая один или более sdAb по изобретению, может быть введена в геном организма для лечения или профилактики заболеваний.
[0052] Данное изобретение в целом относится к sdAb, а также к белкам или полипептидам, содержащим или по существу состоящим из одного или более таких sdAb, которые могут быть применены для профилактических, терапевтических и/или диагностических целей.
[0053] Способы и композиции, подробно описанные в данном изобретении, могут быть использованы для лечения заболеваний, описанных в данном документе, и могут быть использованы с любой дозировкой и/или рецептурой, описанными в данном документе или другими известными, а также с любым способом введения, описанным в данном документе или другим способом, известным специалисту в данной области техники.
[0054] SdAb по изобретению могут применяться для лечения и профилактики заболеваний, вызванных вирусами или аберрантными клеточными белками. SdAb по данному изобретению также можно применять для лечения и профилактики заболеваний. SdAb по изобретению можно применять для лечения заболеваний, при которых происходит сверхэкспрессия внутриклеточной молекулы. Они также могут быть применены для лечения вирусных инфекций путем нацеливания на внутриклеточные вирусные белки в инфицированных клетках. Блокирование продуцирования вирусных белков, таких как, например, обратная транскриптаза ВИЧ-1, может блокировать жизненный цикл вируса.
[0055] SdAb по изобретению могут также нацеливаться на внутриклеточные вирусные белки, такие как VP24 вируса Эбола и, таким образом, блокировать способность Эбола прекращать антивирусную иммунную реакцию хозяина.
[0056] SdAb по изобретению можно применять с одним или более соединениями. Например, sdAb по изобретению можно применять с ингибиторами JAK/STAT такими как, например, куркумин, ресвератрол, кукурбитацин А, В, Е, I, Q, флавопиридол, деокситетрангомицин, производные циклопентенона, N-ацилгомосерин лактон, производные индирубина, мейзоиндиго, тирфостины, платиносодержащими соединениями (например, IS3-295), пептидомиметиками, антисмысловымиолигонуклеотидами, S3I-201, производными фосфотирозиновыхтрипептидов, ингибиторами протеазы ВИЧ (например, нелфинавир, индинавир, саквинавир и риторнавир), JSI-124, XpYL, Ac-pYLPQTV-NH2, ISS 610, CJ-1383, пириметамином, метформином, атипримодом, S3I-M2001, STX-0119; производным N-[2-(1,3,4-оксадиазолил)]-4 хинолинкарбоксамида, S3I-1757, LY5; 5,8-диоксо-6(пиридин-3-иламино)-5,8,-дигидро-нафтален-1-сульфонамидом, витацинстином, статиком, STA-21, LLL-3, LLL12, XZH-5, SF-1066, SF-1087, 17о, криптотанзиноном, FLL32, FLL62, С188-9, BP-1108 и BP-1075, галиеллактоном, JQ1, 5, 15 DPP, WP1066, никлозамидом, SD1008, нифуроксазидом, криптотанзиноном, BBI хиноном и руксолитиниб фосфатом. Одно или более соединений могут увеличивать терапевтический ответ и повысить эффективность sdAb по изобретению. Кроме того, эффективность sdAb может быть увеличена путем объединения их с пептидами, пептидомиметиками и другими лекарственными средствами, такими как, например, циметидин, аторвастатин, целекоксиб, метформин и циметидин, но не ограничиваясь ими.
[0057] Также предполагается, что один или более sdAb по изобретению могут быть объединены или sdAb по изобретению могут быть объединены с другими sdAb.
[0058] Предполагается, что некоторые sdAb по изобретению могут проникать через клеточную мембрану и проникать в клетку без помощи дополнительных нацеливающих белковых последовательностей на sdAb и без помощи экзогенных соединений, которые направляют sdAb на связывание с рецепторами клеточной поверхности и пересечение клеточной мембраны.
[0059] После проникновения через клеточную мембрану эти sdAb могут быть нацелены на трансмембранные или внутриклеточные молекулы, или антигены. Этими мишенями могут быть, например, белки, углеводы, липиды, нуклеиновые кислоты, мутированные белки, вирусные белки и прионы. Мишени sdAb могут функционировать как ферменты, структурные белки клетки, внутриклеточные части молекул клеточной мембраны, молекулы в мембранах органелл, любые типы молекул РНК, любые области ДНК или хромосомы, метилированные или неметилированные нуклеиновые кислоты, частично собранные молекулы в рамках механизма синтеза клетки, вторичные молекулы-мессенджеры и молекулы в механизмах сигналинга клеток. Мишени могут включать все молекулы в цитоплазме, ядре, органеллах и клеточной мембране. Молекулы, предназначенные для секреции или размещения в клеточной мембране, могут быть подвержены нацеливанию в цитоплазме перед выходом из клетки.
[0060] Мишени sdAb могут быть у людей, животных, растений, грибов, паразитов, протестов, бактерий, вирусов, прионов, прокариотических клеток и эукариотических клеток. Некоторые примеры межклеточных и внутриклеточных сигнальных молекул и белковых групп, на которые могут быть нацелены sdAb по изобретению, представляют собой: онкогенные продукты, гормоны, цитокины, факторы роста, нейромедиаторы, киназы (включая тирозинкиназу, серинкиназу и треонинкиназу), фосфатазы, убиквитин, циклические нуклеотиды, циклазы (аденилил и гуанилил), G белки, фосфодиэстеразы, суперсемействоГТФаз, иммуноглобулины (антитела, фрагменты Fab, связывающие домены, sdAb), суперсемейство иммуноглобулинов, инозитолфосфатные липиды, стероидные рецепторы, кальмодулин, группа CD (например, CD4, CD8, CD28, и т.д.), транскрипционные факторы, TGF-бета, ФНО-альфа и бета, суперсемействолигандов TNF, сигнальные молекулы рецептора notch, сигнальные молекулы рецептора hedgehog, сигнальные молекулы рецептора Wnt, сигнальные молекулы toll-подобного рецептора, каспазы, актин, миозин, миостатин, 12-липоксигеназа, 15-липоксигеназа, суперсемействолипоксигеназ, обратная транскриптаза, вирусы и их белки, амилоидные белки, коллаген, G-белковые рецепторы, мутированные нормальные белки, прионы, Ras, Raf, Мус, Src, BCR/ABL, MEK, Erk, Mos, Tpl2, MLK3, TAK, DLK, MKK, р38, MAPK, MEKK, ASK, SAPK, JNK, BMK, MAP, JAK, PI3K, циклооксигеназы, STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b, STAT6, Мус, р53, BRAF, NRAS, KRAS, HRAS и хемокины.
[0061] ВИЧ представляет собой ретровирус, который вызывает синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД) у людей. СПИД приводит к прогрессивному отказу иммунной системы инфицированного человека, что приводит к развитию угрожающих жизни оппортунистических инфекций и рака. Среднее время выживания после заражения ВИЧ оценивается в 9-11 лет без лечения
[0062] ВИЧ передается как одноцепочечный, положительно направленный, РНК-вирус с липидной мембраной. При входе в клетку-мишень вирусный РНК-геном подвергается обратной транскрипции в двухцепочечную ДНК с помощью кодированной вирусом обратной транскриптазы (ОТ), которая переносится вместе с вирусным геномом в вирусной частице. ОТ представляет собой РНК-зависимую ДНК-полимеразу, а также имеет активность рибонуклеазы Н. Полученная вирусная ДНК затем импортируется в ядро клетки-хозяина и интегрируется в клеточную ДНК с помощью кодированных вирусом интеграз и ко-факторов хозяина. После интегрирования вирус может стать скрытым в течение нескольких месяцев или лет. Альтернативно, вирус можно транскрибироваться, продуцируя новые РНК-геномы и вирусные белки, которые упаковываются и высвобождаются из клетки в виде новых вирусных частиц.
[0063] Описаны два типа ВИЧ: ВИЧ-1 и ВИЧ-2. ВИЧ-1 более вирулентен, более патогенный и является причиной большинства ВИЧ-инфекций во всем мире. ВИЧ-2 в основном ограничивается Западной Африкой.
[0064] sdAbк ОТ ВИЧ были разработаны для нацеливания на обратную транскриптазу ВИЧ-1. sdAbк ОТ ВИЧ-1 может успешно лечить людей, инфицированных ВИЧ, самостоятельно или в сочетании с другими ретровирусными агентами. Используя известные в данной области техники способы рекомбинантный белок обратной транскриптазы ВИЧ-1 (CreativeBiomart, Ширли, штат Нью-Йорк) (SEQ ID NO: 1) использовали для получения sdAb, которые нацелены против или могут связываться с эпитопом ОТ ВИЧ -1.
[0065] Белковая последовательность, используемая для иммунизации верблюда рекомбинантным белком обратной транскриптазы ВИЧ-1 (SEQ ID NO: 1), представляла собой
[0066] В результате иммунизации было получено и скринировано несколько sdAb. Последовательности ДНК sdAbк OT ВИЧ-1 приведены ниже:
[0067] ВИЧ1-1 (SEQ ID NO: 2):
[0068] ВИЧ1-2 (SEQ ID NO: 3):
[0069] ВИЧ1-7 (SEQ ID NO: 4):
[0070] ВИЧ1-8 (SEQ ID NO: 5):
[0071] ВИЧ1-6 (SEQ ED NO: 6):
[0072] ВИЧ1_28 (SEQ ID NO: 7):
[0073] ВИЧ1-21 (SEQ ID NO: 8):
[0074] ВИЧ1-37 (SEQ ID NO: 9):
[0075] ВИЧ1-3 (SEQ ID NO: 10):
[0076] ВИЧ1-5 (SEQ ID NO: 11):
[0077] ВИЧ1-10 (SEQ ID NO: 12):
[0078] ВИЧ1_29 (SEQ ID NO: 13):
[0079] ВИЧ1_32 (SEQ ID NO: 14):
[0080] ВИЧ 1-9 (SEQ ID NO: 15):
[0081] ВИЧ1-16 (SEQ ID NO: 16):
[0082] ВИЧ1-13 (SEQ ID NO: 17):
[0083] ВИЧ1_35 (SEQ ID NO: 18):
[0084] ВИЧ1-11 (SEQ ID NO: 19):
[0085] ВИЧ1_22 (SEQ ID NO: 20):
[0086] ВИЧ1-4 (SEQ ID NO: 21):
[0087] ВИЧ1_38 (SEQ ID NO: 22):
[0088] ВИЧ1_23 (SEQ ID NO: 23):
[0089] ВИЧ1_25 (SEQ ID NO: 24):
[0090] Аминокислотные последовательности sdAbк OT ВИЧ-1 представлены ниже:
[0091] ВИЧ1-1 (SEQ ID NO: 25):
[0092] ВИЧ 1-2 (SEQ ID NO: 26):
[0093] ВИЧ1-9 (SEQ ID NO: 27):
[0094] ВИЧ1-16 (SEQ ID NO: 28):
[0095] ВИЧ 1 -27 (SEQ ID NO: 29):
[0096] ВИЧ1-30 (SEQ ID NO: 30):
[0097] ВИЧ1-21 (SEQ ID NO: 31):
[0098] ВИЧ1-4 (SEQ ID NO: 32):
[0099] ВИЧ1-6 (SEQ ID NO: 33):
[0100] ВИЧ1-7 (SEQ ID NO: 34):
[0101] ВИЧ1-8 (SEQ ID NO: 35):
[0102] ВИЧ1-11 (SEQ ID NO: 36):
[0103] ВИЧ1-13 (SEQ ID NO: 37):
[0104] ВИЧ1-23 (SEQ ID NO: 38):
[0105] ВИЧ1-24 (SEQ ID NO: 39):
[0106] ВИЧ1-25 (SEQ ID NO: 40):
[0107] ВИЧ1-31 (SEQ ID NO: 41):
[0108] ВИЧ1-38 (SEQ ID NO: 42):
[0109] ВИЧ1-39 (SEQ ID NO: 43):
[0110] Одно или более мышиных моноклональных антител могут быть получены против одного или более доменов sdAbк ОТ ВИЧ-1 по изобретению. Мышиное моноклональное антитело может быть получено способами, которые известны специалисту в данной области техники, например, мышиное моноклональное антитело может быть получено при помощи мышиной гибридомы. Мышиное моноклональное антитело можно использовать в диагностических анализах, например, антитело можно использовать в иммунологическом анализе, таком как анализ ИФА или масс-спектрометрии, чтобы измерить количество sdAbк OT ВИЧ-1, присутствующего в образце от пациента.
[0111] SdAb также создавали против рекомбинантной арахидонат-12-липоксигеназы (ALOX12). ALOX12 также известен как 12-липоксигеназа тромбоцитарного типа, арахидонатжислород-12-оксидоредуктаза, дельта 12-липоксигеназа, 12-дельта-липоксигеназа, С-12-липоксигеназа, синтазалейкотриена А4 и синтаза LTA4. ALOX12 представляет собой фермент липоксигеназы, который участвует в метаболизме арахидоновой кислоты. ALOX12 участвует в развитии и осложнениях индуцированного диетой и/или генетически индуцированного диабета, дисфункции жировых клеток/ткани и ожирения. Считалось, что ALOX12 регулирует сокращение сосудов, расширение, давление, ремоделирование и ангиогенез. Ингибирование ALOX12 предотвращает развитие образования кровеносных сосудов и, таким образом, ALOX12 является мишенью для снижения неоваскуляризации, которая способствует атеросклерозу, стеатогепатиту и другим артритам и раковым заболеваниям. Повышенные количества ALOX12 могут способствовать развитию болезни Альцгеймера.
[0112] В данном изобретении представлены sdAb, белки и полипептиды, которые направлены против белка ALOX12.
[0113] Предполагается, что sdAbк ALOX12 и полипептиды по изобретению могут быть применены для профилактики и/или лечения заболеваний и расстройств, связанных с ALOX12 и/или опосредованных ими, таких как диабет, дисфункция жировых клеток, ожирение, атеросклероз, стеатогепатит, артрит и рак.
[0114] Рекомбинантный белок ALOX12 человека использовали для получения sdAb, которые направлены против или могут связываться с эпитопом АLОХ12. Для получения sdAbк ALOX12 рекомбинантный ALOX12 человека экспрессировали в Escherichiacoli и использовали в качестве целевого антигена.
[0115] Последовательность рекомбинантного белка ALOX12 (SEQ ID NO: 44), используемая для иммунизации верблюдов, представляла собой:
[0116] В результате иммунизации было получено и скринировано несколько sdAb. Последовательности ДНК sdAb приведены ниже:
[0117] ALOX_21 (SEQ ID NO: 45):
[0118] ALOX_41 (SEQ ID NO: 46):
[0119] ALOX_43 (SEQ ID NO: 47):
[0120] ALOX_46 (SEQ ID NO: 48):
[0121] Белковые последовательности созданных sdAbk ALOX являются следующими:
[0122] ALOX_21 (SEQ ID NO: 49):
[0123] ALOX_41 (SEQ ID NO: 50):
[0124] ALOX_43 (SEQ ID NO: 51):
[0125] ALOX_46 (SEQ ID NO: 52):
[0126] Одно или более мышиных моноклональных антител могут быть получены против одного или более доменов sdAbк ALOX12 по изобретению. Мышиное моноклональное антитело может быть получено способами, которые известны специалисту в данной области техники, например, мышиное моноклональное антитело может быть получено при помощи мышиной гибридомы. Мышиное моноклональное антитело можно использовать в диагностических анализах, например, антитело можно использовать в иммунологическом анализе, таком как анализ ИФА или масс-спектрометрии, чтобы измерить количество sdAbк ALOX12, присутствующего в образце от пациента.
[0127] Эбола, также известная как вирусная болезнь Эбола (EVD) и геморрагическая лихорадка Эбола (EHF), представляет собой вирусную геморрагическую лихорадку людей и других приматов, вызванную эболавирусом. Болезнь имеет высокий риск смерти, убивая от 25 до 90 процентов инфицированных, обычно через шесть-шестнадцать дней после появления симптомов.
[0128] Эбола препятствует правильному функционированию врожденной иммунной системы инфицированного человека. Белки Эбола ослабляют реакцию иммунной системы на вирусные инфекции, препятствуя способности клеток продуцировать и реагировать на белки-интерфероны, такие как интерферон-альфа, интерферон-бета и интерферон-гамма. Структурные белки Эбола, VP24 и VP35, играют ключевую роль в этом вмешательстве.
Белок V24 блокирует продуцирование антивирусных белков клеткой-хозяином. Ингибируя иммунные реакции хозяина, Эбола быстро распространяется по всему телу.
[0129] Как описано в данном документе, sdAbк VP24 были разработаны для нацеливания на белок VP24 Эбола. sdAbк VP24 может успешно лечить людей, инфицированных болезнью Эбола, самостоятельно или в сочетании с другими ретровирусными агентами. Способы, хорошо известные в данной области техники, использовали рекомбинантный белок VP24 (SEQ ID NO: 53) для получения sdAb, которые направлены против эпитопа VP24 или могут связываться с ним.
[0130] Последовательность рекомбинантного белка VP24 (SEQ ID NO: 53), используемая для иммунизации верблюда, представляла собой:
[0131] В результате иммунизации был получен один sdAbк VP24-VP24_5, и подвергся скринингу для связывания с VP24. Последовательность ДНК VP24_5 (SEQ ID NO: 54) представляет собой:
[0132] Ниже продемонстрирована аминокислотная последовательность sdAb VP24_5 (SEQ ID NO: 55), в которой подчеркнуты CDR:
[0133] Одно или более мышиных моноклональных антител могут быть получены против одного или более доменов sdAbк VP24 по изобретению. Мышиное моноклональное антитело может быть получено способами, которые известны специалисту в данной области техники, например, мышиное моноклональное антитело может быть получено при помощи мышиной гибридомы. Мышиное моноклональное антитело можно использовать в диагностических анализах, например, антитело можно использовать в иммунологическом анализе, таком как анализ ИФА или масс-спектрометрии, чтобы измерить количество sdAbк VP24, присутствующего в образце от пациента.
ПРИМЕРЫ
ПРИМЕР 1: СОЗДАНИЕ SDAB
[0134] SdAb получали от верблюда, который был иммунизирован несколькими белками, включая ALOX12 (SEQ ID NO: 44), VP24 (SEQ ID NO: 53) и обратную транскриптазу ВИЧ-1 (SEQ ID NO: 1).
[0135] Используя стандартные методики, библиотека фагового дисплея была построена с использованием вектора pCDisplay-3M (CreativeBiogene, Ширли, штат Нью-Йорк) и вспомогательный фаг M13K07 (NewEnglandBiolabs, Ипсвич, штат Массачусетс). Одиночные клоны sdAb подтверждали с помощью ИФА, а последовательности ДНК и белка определяли с использованием стандартных методов.
ПРИМЕР 2: ВИЧ1-9 (SEQ ID NO: 27) SDAB СВЯЗЫВАЕТ ОБРАТНУЮ ТРАНСКРИПТАЗУ ВИЧ-1 И VP-24 ЭБОЛЫ
[0136] Эксперименты по связыванию с белками проводили на Biacore 3000 (GeneralElectricCompany, Фейрфилд, штат Коннектикут) при 25°C. Буфер для анализа содержал 10 мМ буфера HEPES (рН 7,4), 150 MMNaCl, 3 мМ ЭДТА, 0,05% Р20. Буфер регенерации содержал 10 мМ глицина HCl, рН 1,75, а иммобилизационный буфер содержал 10 мМ ацетата натрия, рН 5,0. Скорость потока, используемая для захвата лиганда, составляла 5 мкл/мин. Скорость потока, используемая для анализа кинетики, составляла 30 мкл/мин.
[0137] Лиганды, используемые для эксперимента по связыванию белка, представляли собой ВИЧ1-9 (SEQ ID NO: 27) и STAT3-VHH 14 (SEQ ID NO: 56). Лиганды были непосредственно иммобилизованы аминным связыванием (EDC/NHS) в единицах ответа (RU) 1200 и 550 на проточной ячейке 2 и 4, соответственно, сенсорного чипа СМ5. Проточная ячейка 1 оставалась пустой и использовалась для вычитания фона. Незанятые сайты на чипе СМ5 были блокированы 1 М этаноламином. Для анализа связывания аналит rВИЧ-1 (SEQ ID NO: 1) пропускали через сенсорный чип. Связывание аналита с лигандом контролировалось в реальном времени. Константу аффинности (Kd=kd/ka) рассчитывали по наблюдаемой скорости «on» (ka) скорости «off» (kd), как представлено в таблице 1.
[0138] Отрицательным контролем экспериментов по связыванию белка представлял собой sdAbK STAT3 - VHH 14 (SEQ ID NO: 56):
2
2
[0139] Анализ хи-квадрат (χ) был проведена между фактической сенсограммой и сенсограммой, генерируемой программным обеспечением BIAnalysis, для определения точности анализа. Значение χ в пределах 1-2 считается точным, а ниже 1 считается очень точным.
[0140] Полный кинетический анализ проводили при концентрациях аналита, как указано в таблице 2, с 2-х кратным серийным разведением максимальной концентрации аналита. sdAbк ОТ ВИЧ1-9 связывали как аналиты ВИЧ-1, так и VP24 вируса Эбола.
ПРИМЕР 3: ВИЧ1-9 (SEQ ID NO: 27) SDAB СВЯЗЫВАЕТ ОБРАТНУЮ ТРАНСКРИПТАЗУ ВИЧ-1 ВИФА
[0141] Два различных образца ВИЧ1-9 sdAbк ОТ ВИЧ-1 (SEQ ID NO: 27) оценивали в концентрации 1 мкг/мл по схеме шахматной доски кконцентраций покрывающего антигена, антитела 2° и HRP (пероксидаза хрена) в ИФА. Покрывающий антиген представлял собой рекомбинантную ОТ ВИЧ-1 (CreativeBioMart) (SEQ ID NO: 1) в концентрации 0,5, 0,025 и 0,125 мкг/мл на лунку. Вторичные антитела представляли собой биотинилированные кроличьи анти-ламовые антитела, разведенные 1:5000 и 1:10000, HRP, разведенная в соотношении 1:25000 и 1:50000. Отношение сигнал-шум > 20 были замечены с несколькими концентрациями. Результаты ИФА представлены на фиг. 1 и 2.
[0142] Три комбинации были выбраны для оценки серии разведений ВИЧ 1-9 sdAbк ОТ ВИЧ-1 (SEQ ID NO: 27) (1 мкг/мл к 0,0001 мкг/мл).
[0143] Результаты представлены на фиг. 3 и 4. Используемые два препарата ВИЧ 1-9 sdAbк OT ВИЧ-1 (SEQ ID NO: 27) имели очень сходные результаты. Результаты с 0,5 мкг/мл покрывающего буфера, антитела 2° в разведении 1:5000 и HRP в разведении 1:50000 продемонстрировали связывание ВИЧ1-9 sdAbк OT ВИЧ-1 (SEQ ID NO: 27) с ОТ ВИЧ-1 (SEQ ID NO: 1) с наибольшим отношением сигнал-шум и немного меньшим значением для холостой пробы.
ПРИМЕР 4: SDAB VP24-5 (SEQ ID NO: 55) СВЯЗЫВАЕТ VP24
[0144] Эксперименты по связыванию с белками выполняли, как описано в примере 2. Лиганды, используемые для связывания белка, представляли собой VP24-5 (SEQ ID NO: 55) и STAT3-VHH 14 (SEQ ID NO: 56).Лиганды были непосредственно иммобилизованы аминным связыванием (EDC/NHS) в единицах ответа (RU) 427 и 550 на проточной ячейке 2 и 4, соответственно, сенсорного чипа СМ5. Проточная ячейка 1 оставалась пустой и использовалась для вычитания фона. Незанятые сайты на чипе СМ5 были блокированы 1 М этаноламином. Для анализа связывания аналиты VP24 (SEQ ID NO: 53) пропускали через сенсорный чип и наблюдали в реальном времени. Константу аффинности (Ko=kd/ka) рассчитывали по наблюдаемой скорости «on» (ka) скорости «off» (kd), как представлено в таблице 3.
[0145] Полный кинетический анализ проводили при различных концентрациях аналита, с 2-х кратным серийным разведением максимальной концентрации аналита, как представлено в таблице 4.
ПРИМЕР 5: SDAB VP24-5 (SEQ ID NO: 55) СВЯЗЫВАЕТ VP24 МИШЕНЬВИРУСАЭБОЛАВИФА
[0146] Два различных образца VP24-5 sdAbк VP24 вируса Эбола (SEQ ID NO: 55) оценивали в концентрации 1 мкг/мл по схеме шахматной доски концентраций покрывающего антигена, антитела 2° и HRP (пероксидаза хрена) в ИФА. Покрывающий антиген представлял собой рекомбинантный VP24 вируса Эбола (CreativeBioMart) (SEQ ID NO: 53) в концентрации 0,5, 0,025 и 0,125 мкг/мл на лунку. Вторичные антитела представляли собой биотинилированные кроличьи анти-ламовые антитела, разведенные 1:5000 и 1:10000. HRP использовали в разбавлении 1:10000 и 1:25000. Результаты ИФА представлены на фиг. 5 и 6. Отношение сигнал-шум было низким, и анализ повторяли с более высокими концентрациями.
[0147] АнализИФАповторялис 1 и 0,5 мкг/мл VP24-5 sdAbк VP24 вирусаЭбола (SEQ ID NO: 55). Рекомбинантный VP24 (SEQ ID NO: 53) использовали в концентрации 0,5 или 1 мкг/мл на лунку. Вторичные антитела представляли собой биотинилированные кроличьи анти-ламовые антитела, разведенные 1:1000, 1:4000, 1:10000 и 1:10000. HRP использовали в разбавлении 1:25000 и 1:50000. Результаты ИФА представлены на фиг. 7 и 8.
[0148] Три комбинации были выбраны для оценки серии разведений VP24-5 sdAbк VP24 вируса Эбола (SEQ ID NO: 55) (1 мкг/мл к 0,0001 мкг/мл).
[0149] Результаты представлены на фиг. 9 и 10. Два использованных препарата VP24-5 sdAb против VP24 вируса Эбола (SEQ ID NO: 55) имели очень похожие результаты и продемонстрировали связывание VP24-5 sdAbк VP24 вируса Эбола (SEQ ID NO: 55) с рекомбинантный VP24 (SEQ ID NO: 53).
[0150] Хотя данное изобретение было подробно описано со ссылкой на некоторые предпочтительные варианты осуществления, возможны другие варианты осуществления. Стадии, раскрытые для данных способов, например, не предназначены для ограничения, и они не предназначены для указания того, что каждый шаг является необходимым для данного способа, но вместо этого являются только примерными шагами. Следовательно, объем прилагаемой формулы изобретения не должен ограничиваться описанием предпочтительных вариантов осуществления, содержащихся в данном раскрытии. Все цитируемые в данном документе ссылки включены в качестве ссылок в полном объеме.