ЦИТОТОКСИЧНОСТЬ И ИНДУКЦИЯ АПОПТОЗА В КЛЕТОЧНЫХ ЛИНИЯХ МЕЛАНОМ ПРИ КОМБИНИРОВАНИИ ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛИ α (АЛЬНОРИН) С ПРОТИВООПУХОЛЕВЫМИ ХИМИОПРЕПАРАТАМИ

ИММУНОЛОГИЯ № 2, 2012

7. Callard R. Immunoregulation by IL-4 in man // Br. J. Haematol. - 1991. - Vol. 78. - P. 293-299.

8. Doench J. G., Petersen C. P., SharpP. A. siRNAs can function as miRNAs // Genes Dev. - 2003. - Vol. 17. - P 438-442.

9. Elbashir S., Martinez J., Patkaniowska A. et al. Functional anatomy of siRNA for mediating efficient RNAi in Drosophila melanogaster embryo lysate // EMBO J. - 2001. - Vol. 20. - P. 6877-6888.

10. Fire A., Xu S., Montgomery M. K. et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans // Nature. - 1998. - Vol. 391. - P. 806-810.

11. Foley S., Hamid Q. Inflammatory patterns in allergic rinitis // Clin. Exp. Allergy Rev. - 2006. - Vol. 11. - P. 91-99.

12. Mattes J., Yang M., Siqueira A. et al. IL-13 induces airways hyperreactivity independently of IL-4Ra chain in the allergic lung // J. Immunol. - 2001. - Vol. 167. - P. 1683-1692.

13. Meister G., Tuschl T. Mechanisms of gene silencing by doublestranded RNA // Nature. - 2004. - Vol. 431. - P. 343-349.

14. Townsend J., Fallon G., Matthews J. et al. IL-9 deficient mice establish fundamental roles for IL-9 in pulmonary mastocytosis and goblet cell hyperplasia but not T-cell development // Immunity. - 2000. - Vol. 13. - P. 573-583.

15. Wills-Karp M.Immunologic basis of antigen-induced airway hyperresponsiveness // Annu. Rev. Immunol. - 1999. - Vol. 17. -P. 255-281.

Поступила 15.09.11

ИММУНООНКОЛОГИЯ

©КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012

УДК 615.277.3.03:616.5-006.81.04-031.13].015.44

X. А. Бигвава, Т. Н. Заботина, А. А. Борунова, Л. Ф. Морозова, З. Г. Кадагидзе, Е. Г. Славина

ЦИТОТОКСИЧНОСТЬ И ИНДУКЦИЯ АПОПТОЗА В КЛЕТОЧНЫХ ЛИНИЯХ МЕЛАНОМ ПРИ комбинировании фактора некроза опухоли а (АЛьНОРИН) с противоопухолевыми химиопрепаратами

Российский онкологический научный центр им. Н. Н. Блохина,

Фактор некроза опухоли а (ФНОа) в течение многих лет привлекает внимание исследователей, что связано с его избирательной способностью тормозить рост и вызывать лизис злокачественных клеток, активировать иммунный противоопухолевый ответ, оказывать повреждающее действие на сосуды. Однако наличие многочисленных, часто тяжелых, побочных эффектов препятствует широкому применению препаратов ФНОа в онкологии. Поэтому ряд исследователей работают над созданием новых форм и способов применения рекомбинантного ФНОа с целью снижения выраженности побочных действий и усиления его положительных свойств с одновременным максимальным уменьшением используемых доз. В настоящей работе показана способность очень низких доз отечественного рекомбинантного препарата ФНОа усиливать цитотоксическое и апопто-индуцирующее действие противоопухолевых лекарств - дакарбазина (DTIC), BCNU, ACNU и аранозы в отношении клеток 8 культуральных линий меланомы человека in vitro.

Ключевые слова: меланома, апоптоз, факторы некроза опухоли, альнорин

Bigvava Kh.A., Zabotina T.N., Borunova A.A., Morozova L.F., Kadagidze Z.G., Slavina E.G.

CYTOTOXICITY AND THE INDUCTION OF APOPTOSIS IN MELANOMA CELL LINES BY THE COMBINATION OF TUMOUR NECROSIS FACTOR-ALPHA (ALNORIN) WITH THE CHEMICAL ANTICANCER AGENTS

Tumour necrosis factor-alpha (TNF-a) has had been in the focus of attention of researchers during many years by virtue of its ability to selectively inhibit and induce lysis of malignant cells, activate the immune anti-tumour response, and cause vascular lesions. Numerous (and frequently severe) side effects of TNF-a preparations hamper their wide application in oncological practice. Many research teams are engaged in the development of new dosage forms and routs of administration of recombinant TNF-a producing fewer and less severe adverse events and enhancement of its beneficial action at minimal possible doses. The present study has demonstrated that low doses of the recombinant TNF-a preparation manufactured in this country stimulate the cytotoxic and apoptose-inducing action of many anticancer agents, such as dacarbazine (DTIC), BCNU, ACNU, and aranose, on the cultured human melanoma cells of 8 different lines in vitro.

Key words: melanoma, apoptosis, tumor necrosis factor, alnorin

Применение и совершенствование цитокинотерапии - одно из перспективных направлений лечения диссеминированной меланомы кожи. Фактор некроза опухоли а (ФНОа) в течение многих лет привлекает внимание исследователей, что связано с его избира-

Кадагидзе Заира Григорьевна - д-р мед. наук, проф., тел. 8 (903) 149-29-74.

тельной способностью тормозить рост и вызывать лизис злокачественных клеток, активировать иммунный противоопухолевый ответ, оказывать повреждающее действие на сосуды. Однако наличие побочных эффектов препятствует широкому применению препаратов ФНОа в онкологии. Поэтому в настоящее время ученые работают над созданием новых форм и способов использования рекомбинантного ФНОа

- 70 -

ИММУНООНКОЛОГИЯ

с целью увеличения цитотоксического, цитостатического и иммуномодулирующего действия, а также снижения выраженности побочных эффектов [4, 5, 8, 9].

Ранее в нашей лаборатории были получены данные об эффективности совместного применения in vitro отечественного рекомбинантного препарата ФНОа альнорина с противоопухолевыми препаратами, используемыми при лечении диссеминированной меланомы кожи, в отношении четырех клеточных линий меланом человека [1].

В настоящей работе мы изучали цитотоксическое действие и лекарственноиндуцированный апоптоз противоопухолевыми препаратами в сочетании с альнорином при различных сроках экспозиции на четырех других клеточных линиях меланом.

Материалы и методы. Клеточные линии. Культуры клеток меланом человека получены из образцов хирургически удаленной опухолевой ткани пациентов с диссеминированной меланомой. Клетки культивировали в питательной среде RPMI-1640 (“ПанЭко”, Москва), содержащей 10% телячьей эмбриональной сыворотки (“Perbio HyClone”, США), 2 мМ/мл глутамина, 0,1 мг/мл гентамицина, аминокислоты, витамины и пиру-ват натрия, в термостате при 370С в атмосфере с 5% СО2. Клетки поддерживали постоянным пассированием в культуральных флаконах с поверхностью 25 см2 («Costar”, США) каждые 2-3 сут.

В работе использовали следующие противоопухолевые препараты: дакарбазин (DTIC,

“Lachema”, Чешская Республика) и кармустин (BCNU, “BristolMyers Squibb”, США). В качестве ФНОа применяли отечественный рекомбинантный препарат альнорин (ГНЦ “Вектор”).

Цитотоксичность препаратов. Для оценки цитотоксического действия препаратов использовали высокочувствительный микроколориметрический полуавтоматический МТТ-тест [6]. Клетки в концентрации 2 • 104 клеток/мл засевали по 200 мкл/лунка в 96-луночные пластиковые планшеты с плоским дном («Costar”) и инкубировали 1 сут в термостате при 37oC в атмосфере с 5% CO2. Затем заменяли ростовую среду такой же средой, содержащей различные концентрации препарата, ФНОа (альнорин) или смеси препарата с ально-рином, или чистой средой (контроль), и инкубировали 24, 48 или 72 ч при тех же условиях. По окончании инкубации во все лунки вносили по 10 мкл раствора МТТ («Sigma”, “Chemical Co”, США) при исходной концентрации 5 мг/мл. После 4 ч инкубации клетки осаждали центрифугированием при 1000 об/мин в течение 5 мин. Супернатант осторожно отбирали, вносили в каждую лунку по 100 мкл ДМСО, клетки ресуспендировали встряхиванием планшета в течение 15 мин, после чего определяли оптическую плотность (ОП) на спектрофотометре Labsystems Multiscan MS при длине волны 540 нм. Интенсивность цитотоксичности вычисляли по формуле:

% ЦТ = 100 - (ОП /ОП 100).

Методы выявления апоптоза. Определение апоптотических клеток по окрашиванию ДНК пропидия йодидом (PI). Для определения интенсивности апоптоза клетки выращивали в лунках 6-луночных планшетов (“Costar”), засевая их по 2

сгС

о

сгС

-н

°\

00

о

Г";

о"

(N

-Н

СП

о"

о

сп

-н

СП

40

о

и

2

°°с

04

-Н

СП

o'

«о

СП

-н

«о

40

°°с

<N

-н

«о

«о

-н

-н

-Н

2 2

сЗ

Я

S

Ч

ю

сЗ

н

VI

S

Си

С

о

§

а

со

т

о

и

со

и

Н

О

п

!=Г

я

я

я

-н

-н

г-

сн

-н

-Н „ 00^ 1/~) 04 04"

-н

м о О U

2 2 2

71 -

ИММУНОЛОГИЯ № 2, 2012

Рис. 1. Эффективность комбинирования альнорина (А) с BCNU и DTIC в цитотоксическом действии в отношении клеток меланом. а - цитотоксичность одного BCNU или в сочетании с различными концентрациями А в отношении клеток четырех линий меланом; б - влияние продолжительности экспозиции на цитотоксичность BCNU в отношении клеток mel-Is; в - влияние продолжительности экспозиции на цитотоксичность BCNU в отношении клеток mel-Cher; г - цитотоксичность одного DTIC или в сочетании с различными концентрациями А в отношении клеток четырех линий меланом; д - влияние продолжительности экспозиции на цитотоксичность DTIC в отношении клеток mel-Is; е - влияние продолжительности экспозиции на цитотоксичность DTIC в отношении клеток mel-Cher. По оси ординат - ЦД50 (в мкг/мл). * - p < 0,05. 1 - только препарат: BCNU на а-в или DTIC на г—в; 2 - препарат + А (500 МЕ/мл); 3 - препарат + А (50 МЕ/мл); 4 - препарат + А (5 МЕ/мл); 5 - препарат + А (2,5 МЕ/мл).

мл клеточной суспензии, содержащей 5 • 104 клеток/мл. После 1 сут культивирования в них так же, как и в опытах по цитотоксичности, вносили ростовую среду, содержащую различные концентрации препарата, цитокина или смесь препарата с цитокином, инкубировали 24, 48 или 72 ч при 37oC в атмосфере с 5% CO2. Клетки снимали с поверхности пластика обработкой раствором Версена, фиксировали ледяным 70° этанолом и хранили при 4oC. Перед окрашиванием клетки осаждали центрифугированием 5 мин при 1000 об/мин, осадок осторожно ресуспендировали в 0,5 мл гипотонического раствора, содержащего 5 мкг/мл PI, 0,1% цитрата натрия, 0,1% Тритона Х-100, и инкубировали в течение 30 мин при 4°C. Суспензию клеток, окрашенных PI, без дальнейшей отмывки анализировали на проточном цитофлюориметре [7].

Выявление апоптотических клеток методом двойного прижизненного окрашивания с использованием аннексина V-FITC (ApoScreen Annexin V Apoptosis Kit - FITC, “Beckman Coulter”, Cat. # 731718) в комбинации с PI. После инкубации клеток с препаратом, альнорином и их сочетанием, а также интактные клетки собирали раствором Версена без фиксации, осаждали центрифугированием 5 мин при 1000 об/мин. Клетки дважды отмывали в солевом фосфатном буфере (PBS) и добавляли 100 мкл связывающего буфера, 5 мкл аннексина V-FITC и 5 мкл PI. Образцы интенсивно встряхивали и инкубировали в темноте 15 мин при комнатной температуре. К пробам добавляли 400 мкл связывающего буфера и произ-

водили анализ на цитофлюориметре. Прямое и боковое светорассеяние регистрировали по каналам FSC и SSC. Оценку результатов проводили по следующим параметрам: интактные (живые) клетки, не связывающие ни аннексин V/FITC, ни PI (AnV- PI-), ранние апоптотические клетки, окрашенные только аннексином V/FITC (AnV+ PI-), и поздние апоптотиче-ские или некротические клетки, окрашенные и аннексином V/FITC, и PI (AnV+ PI+).

Анализ клеточных суспензий (фиксированных и живых клеток) выполняли методом проточной цитофлюориметрии на проточном цитофлюориметре FACScan (“Becton Dickinson”, США) с использованием программного обеспечения LYSIS II software. В каждой пробе изучали от 5000 (при фиксации клеток) до 10 000 событий.

Результаты статистически обрабатывали по определению 50% цитотоксической (ТТЛ) и 50% апоптозиндуцирующей (АД50) дозы препаратов и /-критерию Стьюдента с использованием компьютерной программы Sigma Plot for Windows (“Jandel Scientific”, США) и пакета программ Statistica 5.0.

Результаты. Клеточные линии меланом проявляют различную чувствительность к цитотоксическому действию противоопухолевых препаратов. В табл. 1 представлены данные о цитотоксичности BCNU при различных сроках экспозиции и в сочетании с четырьмя дозами альнорина - 500, 50, 5, 2,5 МЕ/мл на

- 72 -

ИММУНООНКОЛОГИЯ

125

250

500

1000

125 250 500 1000

100

80

60

40

20

0

125 250 500 1000

mel-Kor 72 ч

125

250

500

1000

Рис. 2. Влияние альнорина (А) на индукцию апоптоза DTIC в клетках меланом в зависимости от продолжительности экспозиции. По оси абсцисс - концентрация DTIC (в мкг/мл); по оси ординат - % апоптотических клеток.

Кривая с квадратами - DTIC; с треугольниками - DTIC + А (5 МЕ/мл); с кругами - DTIC + А (2,5 МЕ/мл).

четырех линиях. Как видно из табл. 1, клетки линий mel-Cher и mel-Kor оказались существенно более чувствительными к BCNU, чем mel-Is и mel-Ibr: при 24часовой экспозиции ЦД для этих линий составила 198,7, 164,3, 464,0 и 375,6 мкг/мл соответственно. Альнорин существенно усиливает цитотоксический эффект BCNU в отношении наиболее чувствительных клеток линий mel-Cher и mel-Kor и лишь в слабой степени на клетках mel-Is и mel-Ibr (рис. 1, а). По мере увеличения продолжительности экспозиции усиливалось цитотоксическое действие BCNU. Так, на клетках линии mel-Is (рис. 1, б) при 24-часовой экспозиции ЦД50 препарата составляет 464 мкг/мл, а через 48 или 72 ч - 268,1 и 181 мкг/мл соответственно. Клетки линии mel-Cher при 24-часовой экспозиции были чувствительны к цитотоксическому действию BCNU, и добавление альнорина в концентрации 5 и 2,5 МЕ/мл достоверно снижало ЦД50 BCNU (рис. 1, в), а после 48- и 72-часовой экспозиции это повышение прояв-

лялось в значительно большей степени. Индекс стимуляции цитотоксичности (ИСТ - соотношение ЦД50 препарата в присутствии альнорина и без него) для линии mel-Cher при различных сроках экспозиции возрастает от 1,44 при 24-часовой до 1,8 и 3,6 при 48-и 72-часовой экспозиции соответственно.

В табл. 2 приведены результаты изучения цитотоксичности DTIC на клетках этих же линий меланом. Они слабо различались по чувствительности к цитотоксическому действию DTIC - ЦД50 от 460,2 мкг/мл для клеток mel-Cher до 661 мкг/мл для клеток mel-Is. Альнорин усиливал это действие DTIC на всех линиях (рис. 1, г). Однако оптимальная доза альнорина, усиливающая цитотоксичность DTIC, на разных клеточных линиях различна: при 24-часовой экспозиции для клеток линии mel-Kor это 500 МЕ/мл, для клеток линии mel-Ibr - 5 МЕ/мл, для mel-Cher и mel-Is - 2,5 МЕ/мл. При увеличении продолжительности экспозиции клеточных линий меланом повышалась как ци-

- 73 -

ИММУНОЛОГИЯ № 2, 2012

Таблица 3

Количественный анализ аннексин V-FITC и PI-детектируемых клеток линий меланом при различных сроках экспозиции с

противоопухолевым препаратом и в сочетании с альнорином

Линия Живые интактные клетки, % Ранние апоптотические клетки, % Поздние апоптотические или некроти-

Препарат, мкг/мл

24 ч 48 ч 72 ч 24 ч 48 ч 72 ч 24 ч 48 ч 72 ч

Mel-Cher Интактный контроль 78,8 ± 2,8 81,7 ± 1,8 75,7 ± 1,7 1,8 ± 0,4 4,9 ± 0,4 2,8 ± 0,8 6,3 ± 1,2 9,4 ± 1,6 10,1 ± 1,3

DTIC (0,5 мкг/мл) 72,7 ± 1,9 62,8 ± 8,3 54,9 ± 2,5 2,3 ± 0,8 5,5 ± 2,4 4,2 ± 1,2 14,7 ± 2,4 21,9 ± 3,2 28,1 ± 2,1

DTIC (0,5 мкг/мл) + А (2,5 МЕ/мл) 56,0 ± 2,4 38,8 ± 2,1 21,8 ± 1,4 1,2 ± 0,7 5,2 ± 3,6 2,0 ± 0,4 24,6 ± 1,3 47,6 ± 3,3 62,3 ± 3,0*

Mel-Kor Интактный контроль 76,8 ± 2,5 75,7 ± 1,5 62,3 ± 5,8 8,0 ± 1,2 5,8 ± 0,6 10,2 ± 2,9 14,1 ± 1,4 6,5 ± 0,4 26,4 ± 2,2

DTIC (0,5 мкг/мл) 40,0 ± 2,2 26,1 ± 2,4 26,5 ± 0,8 5,2 ± 0,9 20,1 ± 8,2 7,2 ± 0,4 34,3 ± 1,3 36,4 ± 2,1 58,7 ± 1,7

DTIC (0,5 мкг/мл) + А (2,5 мкг/мл) 37,5 ± 1,4 18,2 ± 4,7 10,5 ± 0,9 12,0 ± 0,4 20,5 ± 2,1 5,5 ± 0,8 38,5 ± 0,5 49,2 ± 1,2 77,0 ± 2,8*

Mel-Is Интактный контроль 93,5 ± 2,1 86,2 ± 1,5 4,0 ± 0,8 4,2 ± 1,7 1,9 ± 1,1 2,3 ± 0,6

DTIC (0,5 мкг/мл) 77,1 ± 3,4 62,7 ± 2,4 10,4 ± 2,4 10,7 ± 1,5 8,5 ± 2,9 16,3 ± 2,8

DTIC (0,5 мкг/мл) + А (5 МЕ/мл) 75,2 ± 2,8 44,5 ± 1,2 11,5± 0,7 13,5 ± 1,4 12,6 ± 2,6 30,4 ± 3,6

Mel-Ibr Интактный контроль 86,8 ± 1,6 78,2 ± 2,1 79,5 ± 2,8 4,3 ± 0,5 4,5 ± 1,2 11,2 ± 3,1 2,7 ± 1,2 10,5 ± 1,4 5,0 ± 2,1

DTIC (0,5 мкг/мл) 71,0 ± 2,2 56,8 ± 2,6 29,7 ± 1,5 8,2 ± 0,8 8,6 ± 1,1 3,0 ± 0,8 9,7 ± 2,4 25,4 ± 2,2 34,9 ± 1,8

DTIC (0,5 мкг/мл) + А (5 МЕ/мл) 66,1 ± 3,5 39,0 ± 1,8 11,5 ± 3,2 12,4 ± 1,6 7,7 ± 1,7 4,4 ± 1,2 13,9 ± 1,9 42,9 ± 2,8* 56,9 ± 2,9*

тотоксичность DTIC, так и ее усиливающее действие альнорина (рис. 1, д, е). Так, индекс стимуляции токсичности DTIC для линии mel-Cher при 24-часовой экспозиции при концентрации альнорина 50 и 2,5 МЕ/мл равнялся 1,18 и 1,23 соответственно; при 48часовой экспозиции при тех же концентрациях альнорина - 1,52 и 1,55, при 72-часовой экспозиции - 12,9 и 4,8. Таким образом, на клеточной линии mel-Cher при 72-часовой экспозиции альнорин максимально усиливал цитотоксическое действие DTIC.

Для количественного популяционного анализа лекарственно-индуцированного апоптоза применяли два различных метода идентификации апоптоти-ческих клеток с использованием проточной цито-флюориметрии. С помощью метода фиксированного окрашивания ДНК PI апоптотические клетки регистрировали по выявлению клеток с гиподиплоидным содержанием ДНК. На рис. 2 представлены результаты индукции апоптоза DTIC, полученные на четырех клеточных линиях при экспозиции различной продолжительности. При 24-часовой экспозиции DTIC не индуцировал апоптоз. Только при максимальной концентрации DTIC 1000 мкг/мл процент апоптотиче-ских клеток составил для линии mel-Ibr 14,9 ± 2,4%; для mel-Is 11,4 ± 1%; для mel-Kor 9,1 ± 1,8%; для mel-Cher 8,1 ± 0,4% (см. рис. 2, а-г). Индукция апоптоза DTIC незначительно усиливалась альнорином на линии mel-Ibr, процент апоптотической гибели клеток при дозе DTIC 1000 мкг/мл + 5 МЕ/мл альнорина составил 25,7 ± 3. Процент апоптотических клеток после 48- и 72-часовой экспозиции клеток возрастал на линии mel-Ibr до 26 ± 2 и 50,6 ± 1,4 соответственно, на линии mel-Is до 31,9 ± 2,2 и 53 ± 2, на mel-Kor до 49,1 ± 1,4 и 75,2 ± 2,6, на mel-Cher до 21,1 ± 2,5 и

34,7. Альнорин лишь в небольшой степени усиливал индукцию апоптоза DTIC в клетках линии mel-Ibr и mel-Is - 38,2 ± 1,8 и 46 ± 1% соответственно при сочетании высокой дозы химиопрепарата 1000 мкг/мл и 5 МЕ/мл альнорина при 48-часовой экспозиции. Таким образом, по мере увеличения срока экспозиции повышается индукция апоптоза DTIC, но ее усиление альнорином незначительно.

Вторым методом прижизненного двойного окрашивания клеток аннексином V-FITC в комбинации с PI выявляли популяцию клеток на разных стадиях апоптоза. В табл. 3 приведен количественный анализ детектируемых аннексином V-FITC и PI-клеток линий меланом при различных сроках экспозиции с 500 мкг/мл DTIC и в сочетании 500 мкг/мл DTIC с 2,5 или 5 МЕ/мл альнорина. При 24-часовой экспозиции клеток четырех исследованных линий меланом с DTIC не происходит индукции ни раннего, ни позднего апоптоза или некротической гибели клеток. При сочетании химиопрепарата с альнорином в концентрации, в которой сам альнорин не вызывает апоптоза, отметили небольшое усиление апоптоза, индукцированного DTIC. При увеличении срока экспозиции до 48 ч клеток с химиопрепаратом процент ранних апоптотических клеток не очень высок на всех линиях, за исключением линии mel-Kor (20,1 ± 8,2), процент поздних апоптотических или некротических клеток увеличился в сравнении с данными, полученными при 24-часовой экспозиции, а сочетанное применение DTIC + альнорин приводит к увеличению в 2 раза количества поздних апоптотических или некротических клеток. Через 72 ч экспозиции химиопрепарата процент поздних апоптотических или некротических клеток увеличивается по сравнению с

- 74 -

ИММУНООНКОЛОГИЯ

4,3%

80,6%

7,1%

68,6%

14%

39,2%

Рис. 3. Dotplot (аннексин V-FITC vs PI) распределения клеток линии mel-Cher при 24-, 48- и 72-часовой экспозиции только с противоопухолевым препаратом и в сочетании с альнорином (А).

Интактный контроль клеток линии mel-Cher при различных сроках инкубации (а, г, ж); те же клетки после инкубации с DTIC (500 мкг/мл) (б, д, з) и после инкубации с DTIC (500 мкг/мл) + А (2,5 МЕ/мл) (в, е, и).

По оси абсцисс - аннексин V-FITC; по оси ординат - PI.

контролем, а при сочетании DTIC + альнорин процент поздних апоптотических или некротических клеток значительно возрастает по сравнению с контролем и с действием только химиопрепарата. Таким образом, показано, что при индукции апоптоза в клетках меланом количество интактных живых клеток (FITCYPI') значительно уменьшается, а процент поздних апоптотических или некротических клеток (FITC+/PI+) существенно возрастает при сочетании DTIC с альнорином и с увеличением срока экспозиции.

На рис. 3 представлен один из экспериментов по индукции апоптоза 500 мкг/мл DTIC после 24-, 48- и 72-часовой экспозиции клеток меланомы mel-Cher с химиопрепаратом и в сочетании с альнорином. Процентная доля живых клеток в сравнении с контролем снижается с 78,2 до 73,3 при 24-часовой экспозиции (см. рис. 3, а и г), с 80,6 до 68,6 при 48-часовой (см. рис. 3, б и д), с 76,9 до 56,6 при 72-часовой (см. рис. 3, в и е). Добавление 2,5 МЕ/мл альнорина приводит к дальнейшему снижению процентной доли живых клеток до 54,3, 39,2 и 20,3 при 24-, 48- и 72-часовой экспозиции соответственно (см. рис. 3, ж, з, и). Процент-

ная доля поздних апоптотических или некротических клеток при 24-часовой экспозиции возрастает с 5,8 до 13,9 при использовании DTIC и до 25,4 при сочетании DTIC с альнорином; при 48-часовой экспозиции - с 10,5 до 19,6% под действием DTIC и до 44,6 при сочетании DTIC с альнорином; при 72-часовой экспозиции - с 11,2 до 26,8 при использовании DTIC и до 60,1 при сочетании DTIC с альнорином. Таким образом, усиление альнорином индукции апоптоза DTIC клеток линии mel-Cher методом прижизненного окрашивания ДНК при различной продолжительности экспозиции соотносятся с данными, полученным по цитотоксичности DTIC на этих клетках.

При сравнительном анализе результатов лекарственно-индуцированного апоптоза, полученных двумя количественными методами, установили, что доля апоптотических клеток, выявленных методом прижизненного окрашивания ДНК аннексином V-FITC (сумма ранних и поздних апоптотических / или некротических / клеток), во всех случаях выше доли апоптотических (гиподиплоидных) клеток (окрашивание PI).

- 75 -

ИММУНОЛОГИЯ № 2, 2012

Таблица 4

Сравнительный анализ лекарственно-индуцированного апоптоза клеток линии меланом человека (на примере линий mel-Cher в различные сроки экспозиции

Время Процент апоптотических клеток

Препарат инку- бации, ч pi

Контроль клеток 24 1,0 8,1

DTIC (500 мкг/мл) 4,1 17,0

DTIC (500 мкг/мл) + альнорин (2,5 МЕ/мл) 4,8 25,7

Контроль клеток 48 0,9 14,3

DTIC (500 мкг/мл) 14,1 27,4

DTIC (500 мкг/мл) + альнорин (2,5 МЕ/мл) 15,7 52,8

Контроль клеток 72 2,5 12,9

DTIC (500 мкг/мл) 16,5 32,3

DTIC (500 мкг/мл)+ альнорин (2,5 ME/мл) 23,8 64,3

Результаты проведенного анализа, представленные в табл. 4, подтверждают мнение о том, что при исследовании апоптоза принципиально важно учитывать особенности различных методов и по возможности комбинировать методы, выявляющие различные события эффекторной стадии апоптоза [2, 3].

Обсуждение. Цитотоксическое действие BCNU в большей степени усиливается альнорином на чувствительной клеточной линии при более продолжительной экспозиции. Альнорин усиливает цитотоксическое действие DTIC на резистентных линиях, а при увеличении продолжительности экспозиции клеточных линий усиливается как цитотоксичность химиопрепарата, так и усиливающее его действие альнорина. При индукции апоптоза клеточных линий меланом сочетанием DTIC с альнори-ном количество интактных живых клеток значитель-

но уменьшается и процент поздних апоптотических или некротических клеток существенно возрастает с увеличением срока экспозиции. Наши результаты показали, что противоопухолевый препарат DTIC при комбинировании с альнорином эффективно индуцирует процесс гибели клеток линии меланом человека по механизму апоптоза в зависимости от времени воздействия.

литература

1. Славина Е. Г., Бигвава Х. А., Заботина Т. Н. и др. Модификация фактором некроза опухоли (ФНОа) цитотоксического и апоптотического действия противоопухолевых лекарств в клетках меланомы человека // Рос. биотерапевт. журн. -2009. - Т. 8, № 4. - С. 37-44.

2. Фильченков А. А., Стойка Р. С. Апоптоз и рак. - Киев, 1999.

3. Darzynkiewicz Z., Bedner E., Traganos F., Murakami T. Critical aspects in the analysis of apoptosis and necrosis // Hum. Cell. -1998. - Vol. 11. - P. 3-12.

4. Kramer G., Steiner G. E., Sokol P. et al. Local intratumoral tumor necrosis factor-alpha and systemic IFN-alpha 2b in patients with locally advanced prostate cancer // J. Interferon Cytokine Res. - 2001. - Vol. 21, N 7. - P. 475-484.

5. Lejeune F. J., Ruegg C. Recombinant human tumor necrosis factor: an efficient agent for cancer treatment // Bull. Cancer. -2006. - Vol. 93, N 8. - P. E90-E100.

6. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxic assays // J. Immunol. Meth. - 1983. - Vol. 65, N 1-2. - P. 55-63.

7. Nicoletti I., Migliorati G., PagliacciM. C. et al. A rapid and simple methods for measuring thymocyte apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry // J. Immunol. Meth. - 1991. - Vol. 139. - P. 271-280.

8. Rezende C. M., Goes T. S., Goes V S. et al. GM-CSF and TNF-alpha synergize to increase in vitro granuloma size of PBMC from humans induced by Schistosoma mansoni recombinant 28-kDa GST // Immunol. Lett. - 2004. - Vol. 95, N 2. - P. 221-228.

9. Yasuoka Y., Naomoto Y., Yamatsuji T. et al. Combination of tumor necrosis factor alpha and interferon alpha induces apoptotic cell death through a c-myc-dependent pathway in p53 mutant H226br non-small-cell lung cancer cell line // Exp. Cell Res. -2001. - Vol. 271, N 2. - P. 214-222.

Поступила 30.09.11

- 76 -