ПЛЮРИПОТЕНТНЫЕ КЛЕТКИ

1. Способ получения популяции клеток, состоящей из клеток, экспрессирующих маркеры плюрипотентности, включающий следующие этапы:
а. получение клеток; и
b. культивирование клеток в условиях гипоксии на субстрате тканевой культуры, не подвергавшемся перед культивированием предварительной обработке белком или экстраклеточным матриксом.
2. Способ по п.1, в котором клетки представляют собой человеческие эмбриональные стволовые клетки.
3. Способ по п.2, в котором человеческие эмбриональные стволовые клетки обрабатываются ингибитором Rho-киназы.
4. Способ по п.1, в котором клетки представляют собой клетки с экспрессией маркеров, характерных для дифференцировки по линии сформированной эндодермы.
5. Способ по п.1, в котором человеческие эмбриональные стволовые клетки культивируются в среде с нормальным содержанием кислорода перед культивированием клеток в условиях гипоксии на субстрате тканевой культуры, не подвергавшемся предварительной обработке белком или экстраклеточным матриксом.
6. Способ по п.1, в котором человеческие эмбриональные стволовые клетки культивируются в условиях гипоксии перед культивированием клеток в условиях гипоксии на субстрате тканевой культуры, не подвергавшемся предварительной обработке белком или экстраклеточным матриксом.
7. Способ по п.1, в котором клетки с экспрессией маркеров, характерных для дифференцировки по линии сформированной эндодермы, культивируются в среде с нормальным содержанием кислорода перед культивированием клеток в условиях гипоксии на субстрате тканевой культуры, не подвергавшемся предварительной обработке белком или экстраклеточным матриксом.
8. Способ по п.1, в котором клетки с экспрессией маркеров, характерных для дифференцировки по линии сформированной эндодермы, культивируются в условиях гипоксии перед культивированием клеток в условиях гипоксии на субстрате тканевой культуры, не подвергавшемся предварительной обработке белком или экстраклеточным матриксом.
2
9. Способ по п.1, в котором условия гипоксии представляют собой содержание O от приблизительно 1% до приблизительно 20%.
2
10. Способ по п.1, в котором условия гипоксии представляют собой содержание O от приблизительно 2% до приблизительно 10%.
2
11. Способ по п.1, в котором условия гипоксии представляют собой содержание O приблизительно 3%.
12. Способ по п.1, в котором клетки культивируются в условиях гипоксии на субстрате тканевой культуры, не подвергавшемся предварительной обработке белком или экстраклеточным матриксом, в среде, содержащей сыворотку в концентрации от приблизительно 2% до приблизительно 5%.
13. Способ по п.1, в котором клетки культивируются в условиях гипоксии на субстрате тканевой культуры, не подвергавшемся предварительной обработке белком или экстраклеточным матриксом, в среде, содержащей сыворотку в концентрации приблизительно 2%.
14. Способ по п.1, в котором клетки культивируются в условиях гипоксии на субстрате тканевой культуры, не подвергавшемся предварительной обработке белком или экстраклеточным матриксом, в среде, содержащей активин-А в концентрации от приблизительно 50 нг/мл до приблизительно 100 нг/мл.
15. Способ по п.1, в котором клетки культивируются в условиях гипоксии на субстрате тканевой культуры, не подвергавшемся предварительной обработке белком или экстраклеточным матриксом, в среде, содержащей активин-А в концентрации приблизительно 100 нг/мл.
16. Способ по п.1, в котором клетки культивируются в условиях гипоксии на субстрате тканевой культуры, не подвергавшемся предварительной обработке белком или экстраклеточным матриксом, в среде, содержащей Wnt-лиганд в концентрации от приблизительно 10 нг/мл до приблизительно 20 нг/мл.
17. Способ по п.1, в котором клетки культивируются в условиях гипоксии на субстрате тканевой культуры, не подвергавшемся предварительной обработке белком или экстраклеточным матриксом, в среде, содержащей Wnt-лиганд в концентрации приблизительно 200 нг/мл.
18. Способ по п.16, в котором Wnt-лиганд представляет собой Wnt-3a.
19. Способ по п.1, в котором клетки культивируются в условиях гипоксии на субстрате тканевой культуры, не подвергавшемся предварительной обработке белком или экстраклеточным матриксом, в среде, содержащей IGF-1 в концентрации от приблизительно 25 нг/мл до приблизительно 50 нг/мл.
20. Способ по п.1, в котором клетки культивируются в условиях гипоксии на субстрате тканевой культуры, не подвергавшемся обработке белком или экстраклеточным матриксом, в среде, содержащей IGF-1 в концентрации приблизительно 50 нг/мл.
21. Способ по п.1, в котором клетки, экспрессирующие маркеры плюрипотентности, экспрессируют по меньшей мере один маркер плюрипотентности, выбираемый из группы, состоящей из ABCG2, cripto, FoxD3, Connexin43, Connexin45, Oct4, SOX-2, Nanog, hTERT, UTF-1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra1-60 и Tra1-81.
22. Способ по п.1, в котором клетки, экспрессирующие маркеры плюрипотентности, экспрессируют маркеры, характерные для клеток зародышевого диска.
23. Способ по п.1, в котором клетки, экспрессирующие маркеры плюрипотентности, экспрессируют маркеры, характерные для клеток первичной полоски.
24. Способ по п.1, в котором клетки, экспрессирующие маркеры плюрипотентности, экспрессируют маркеры, характерные для клеток мезоэндодермы.
25. Способ по п.1, в котором клетки, экспрессирующие маркеры плюрипотентности, экспрессируют маркеры, характерные для клеток сформированной эндодермы.
26. Способ получения популяции, состоящей из клеток, экспрессирующих маркеры плюрипотентности, включающий следующие этапы:
а. культивирование человеческих эмбриональных стволовых клеток;
b. дифференцировку человеческих эмбриональных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы; и
c. извлечение клеток с последующим их культивированием в условиях гипоксии на субстрате тканевой культуры, не подвергавшемся перед культивированием предварительной обработке белком или экстраклеточным мактриксом.
27. Способ по п.26, в котором человеческие эмбриональные стволовые клетки обрабатываются ингибитором Rho-киназы.
28. Способ по п.26, в котором человеческие эмбриональные стволовые клетки культивируются на экстраклеточном матриксе перед дифференцировкой клеток.
29. Способ по п.26, в котором человеческие эмбриональные стволовые клетки культивируются на слое питающих клеток перед дифференцировкой клеток.
30. Способ по п.26, в котором человеческие эмбриональные стволовые клетки дифференцируются на экстраклеточном матриксе перед извлечением клеток.
31. Способ по п.26, в котором человеческие эмбриональные стволовые клетки дифференцируются на слое питающих клеток перед извлечением клеток.
32. Способ по п.26, в котором человеческие эмбриональные стволовые клетки культивируются и дифференцируются в среде с нормальным содержанием кислорода перед извлечением клеток.
33. Способ по п.26, в котором человеческие эмбриональные стволовые клетки культивируются и дифференцируются в условиях гипоксии перед извлечением клеток.
2
34. Способ по п.26, в котором условия гипоксии представляют собой содержание O от приблизительно 1% до приблизительно 20%.
2
35. Способ по п.26, в котором условия гипоксии представляют собой содержание O от приблизительно 2% до приблизительно 10%.
2
36. Способ по п.26, в котором условия гипоксии представляют собой содержание O приблизительно 3%.
37. Способ по п.26, в котором клетки культивируются в условиях гипоксии на субстрате тканевой культуры, не подвергавшемся предварительной обработке белком или экстраклеточным матриксом, в среде, содержащей сыворотку в концентрации от приблизительно 2% до приблизительно 5%.
38. Способ по п.26, в котором клетки культивируются в условиях гипоксии на субстрате тканевой культуры, не подвергавшемся предварительной обработке белком или экстраклеточным матриксом, в среде, содержащей сыворотку в концентрации приблизительно 2%.
39. Способ по п.26, в котором клетки культивируются в условиях гипоксии на субстрате тканевой культуры, не подвергавшемся предварительной обработке белком или экстраклеточным матриксом, в среде, содержащей активин-А в концентрации от приблизительно 50 нг/мл до приблизительно 100 нг/мл.
40. Способ по п.26, в котором клетки культивируются в условиях гипоксии на субстрате тканевой культуры, не подвергавшемся предварительной обработке белком или экстраклеточным матриксом, в среде, содержащей активин-А в концентрации приблизительно 100 нг/мл.
41. Способ по п.26, в котором клетки культивируются в условиях гипоксии на субстрате тканевой культуры, не подвергавшемся предварительной обработке белком или экстраклеточным матриксом, в среде, содержащей Wnt-лиганд в концентрации от приблизительно 10 нг/мл до приблизительно 20 нг/мл.
42. Способ по п.26, в котором клетки культивируются в условиях гипоксии на субстрате тканевой культуры, не подвергавшемся предварительной обработке белком или экстраклеточным матриксом, в среде, содержащей Wnt-лиганд в концентрации приблизительно 200 нг/мл.
43. Способ по п.42, в котором Wnt-лиганд представляет собой Wnt-3a.
44. Способ по п.26, в котором клетки культивируются в условиях гипоксии на субстрате тканевой культуры, не подвергавшемся предварительной обработке белком или экстраклеточным матриксом, в среде, содержащей IGF-1 в концентрации от приблизительно 25 нг/мл до приблизительно 50 нг/мл.
45. Способ по п.26, в котором клетки культивируются в условиях гипоксии на субстрате тканевой культуры, не подвергавшемся обработке белком или экстраклеточным матриксом, в среде, содержащей IGF-1 в концентрации приблизительно 50 нг/мл.
46. Способ по п.26, в котором клетки, экспрессирующие маркеры плюрипотентности, экспрессируют по меньшей мере один маркер плюрипотентности, выбираемый из группы, состоящей из ABCG2, cripto, FoxD3, Connexin43, Connexin45, Oct4, SOX-2, Nanog, hTERT, UTF-1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra1-60 и Tra1-81.
47. Способ по п.26, в котором клетки, экспрессирующие маркеры плюрипотентности, экспрессируют маркеры, характерные для клеток зародышевого диска.
48. Способ по п.26, в котором клетки, экспрессирующие маркеры плюрипотентности, экспрессируют маркеры, характерные для клеток первичной полоски.
49. Способ по п.26, в котором клетки, экспрессирующие маркеры плюрипотентности, экспрессируют маркеры, характерные для клеток мезоэндодермы.
50. Способ по п.26, в котором клетки, экспрессирующие маркеры плюрипотентности, экспрессируют маркеры, характерные для клеток сформированной эндодермы.
51. Способ получения популяции клеток, состоящей из клеток, экспрессирующих маркеры плюрипотентности, включающий следующие этапы:
а. культивирование человеческих эмбриональных стволовых клеток; и
b. извлечение клеток с последующим их культивированием в условиях гипоксии на субстрате тканевой культуры, не подвергавшемся перед культивированием предварительной обработке белком или экстраклеточным мактриксом.
52. Способ по п.51, в котором человеческие эмбриональные стволовые клетки обрабатываются ингибитором Rho-киназы.
53. Способ по п.51, в котором человеческие эмбриональные стволовые клетки культивируются на экстраклеточном матриксе перед извлечением клеток.
54. Способ по п.51, в котором человеческие эмбриональные стволовые клетки культивируются на слое питающих клеток перед извлечением клеток.
55. Способ по п.51, в котором человеческие эмбриональные стволовые клетки культивируются в среде с нормальным содержанием кислорода перед извлечением клеток.
56. Способ по п.51, в котором человеческие эмбриональные стволовые клетки культивируются в условиях гипоксии перед извлечением клеток.
2
57. Способ по п.51, в котором условия гипоксии представляют собой содержание O от приблизительно 1% до приблизительно 20%.
2
58. Способ по п.51, в котором условия гипоксии представляют собой содержание O от приблизительно 2% до приблизительно 10%.
2
59. Способ по п.51, в котором условия гипоксии представляют собой содержание O приблизительно 3%.
60. Способ по п.51, в котором клетки культивируются в условиях гипоксии на субстрате тканевой культуры, не подвергавшемся предварительной обработке белком или экстраклеточным матриксом, в среде, содержащей сыворотку в концентрации от приблизительно 2% до приблизительно 5%.
61. Способ по п.51, в котором клетки культивируются в условиях гипоксии на субстрате тканевой культуры, не подвергавшемся предварительной обработке белком или экстраклеточным матриксом, в среде, содержащей сыворотку в концентрации приблизительно 2%.
62. Способ по п.51, в котором клетки культивируются в условиях гипоксии на субстрате тканевой культуры, не подвергавшемся предварительной обработке белком или экстраклеточным матриксом, в среде, содержащей активин-А в концентрации от приблизительно 50 нг/мл до приблизительно 100 нг/мл.
63. Способ по п.51, в котором клетки культивируются в условиях гипоксии на субстрате тканевой культуры, не подвергавшемся предварительной обработке белком или экстраклеточным матриксом, в среде, содержащей активин-А в концентрации приблизительно 100 нг/мл.
64. Способ по п.51, в котором клетки культивируются в условиях гипоксии на субстрате тканевой культуры, не подвергавшемся предварительной обработке белком или экстраклеточным матриксом, в среде, содержащей Wnt-лиганд в концентрации от приблизительно 10 нг/мл до приблизительно 20 нг/мл.
65. Способ по п.51, в котором клетки культивируются в условиях гипоксии на субстрате тканевой культуры, не подвергавшемся предварительной обработке белком или экстраклеточным матриксом, в среде, содержащей Wnt-лиганд в концентрации приблизительно 200 нг/мл.
66. Способ по п.65, в котором Wnt-лиганд представляет собой Wnt-3a.
67. Способ по п.51, в котором клетки культивируются в условиях гипоксии на субстрате тканевой культуры, не подвергавшемся предварительной обработке белком или экстраклеточным матриксом, в среде, содержащей IGF-1 в концентрации от приблизительно 25 нг/мл до приблизительно 50 нг/мл.
68. Способ по п.51, в котором клетки культивируются в условиях гипоксии на субстрате тканевой культуры, не подвергавшемся обработке белком или экстраклеточным матриксом, в среде, содержащей IGF-1 в концентрации приблизительно 50 нг/мл.
69. Способ по п.51, в котором клетки, экспрессирующие маркеры плюрипотентности, экспрессируют по меньшей мере один маркер плюрипотентности, выбираемый из группы, состоящей из ABCG2, cripto, FoxD3, Connexin43, Connexin45, Oct4, SOX-2, Nanog, hTERT, UTF-1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra1-60 и Tra1-81.
70. Способ по п.51, в котором клетки, экспрессирующие маркеры плюрипотентности, экспрессируют маркеры, характерные для клеток зародышевого диска.
71. Способ по п.51, в котором клетки, экспрессирующие маркеры плюрипотентности, экспрессируют маркеры, характерные для клеток первичной полоски.
72. Способ по п.51, в котором клетки, экспрессирующие маркеры плюрипотентности, экспрессируют маркеры, характерные для клеток мезоэндодермы.
73. Способ по п.51, в котором клетки, экспрессирующие маркеры плюрипотентности, экспрессируют маркеры, характерные для клеток сформированной эндодермы.
74. Способ выращивания клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, включающий этапы культивирования клеток в условиях гипоксии на субстрате тканевой культуры, не подвергавшемся обработке белком или экстраклеточным матриксом.
75. Способ по п.74, в котором клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, получают из плюрипотентных клеток, формируемых способами, составляющими предмет настоящего изобретения.
76. Способ по п.74, в котором клетки культивируются в условиях гипоксии на субстрате тканевой культуры, не подвергавшемся предварительной обработке белком или экстраклеточным матриксом, в среде, содержащей сыворотку в концентрации от приблизительно 0,2% до приблизительно 5%.
77. Способ по п.74, в котором клетки культивируются в условиях гипоксии на субстрате тканевой культуры, не подвергавшемся предварительной обработке белком или экстраклеточным матриксом, в среде, содержащей сыворотку в концентрации приблизительно 0,5%.
78. Способ по п.74, в котором клетки культивируются в условиях гипоксии на субстрате тканевой культуры, не подвергавшемся предварительной обработке белком или экстраклеточным матриксом, в среде, содержащей активин-А в концентрации от приблизительно 50 нг/мл до приблизительно 100 нг/мл.
79. Способ по п.74, в котором клетки культивируются в условиях гипоксии на субстрате тканевой культуры, не подвергавшемся предварительной обработке белком или экстраклеточным матриксом, в среде, содержащей активин-А в концентрации приблизительно 100 нг/мл.
80. Способ по п.74, в котором клетки культивируются в условиях гипоксии на субстрате тканевой культуры, не подвергавшемся предварительной обработке белком или экстраклеточным матриксом, в среде, содержащей Wnt-лиганд в концентрации от приблизительно 10 нг/мл до приблизительно 20 нг/мл.
81. Способ по п.74, в котором клетки культивируются в условиях гипоксии на субстрате тканевой культуры, не подвергавшемся предварительной обработке белком или экстраклеточным матриксом, в среде, содержащей Wnt-лиганд в концентрации приблизительно 200 нг/мл.
82. Способ по п.80, в котором Wnt-лиганд представляет собой Wnt-3a.
83. Способ по п.74, в котором клетки культивируются в условиях гипоксии на субстрате тканевой культуры, не подвергавшемся предварительной обработке белком или экстраклеточным матриксом, в среде, содержащей ингибитор GSK-3B.