Хроматографическое изучение фенольного состава сухого экстракта из листьев мушмулы

БИОХИМИЯ И БИОТЕХНОЛОГИЯ

УДК 615.322:582.734.4:581.45.07

В. А. Сысоев, Д. А. Халитова ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ФЕНОЛЬНОГО СОСТАВА СУХОГО ЭКСТРАКТА

ИЗ ЛИСТЬЕВ МУШМУЛЫ

Ключевые слова: экстракт мушмулы, хроматография, крашение, додубливание.

Проведено изучение фенольного состава сухого экстракта листьев мушмулы методами тонкослойной и высокоэффективной жидкостной хроматографии. Установлен качественный и количественный состав индивидуальных соединений, относящихся к основным группам биологически активных веществ фенольного происхождения. На основании полученных экспериментальных данных разработаны унифицированные методики качественного анализа сухого экстракта листьев мушмулы.

Keywords: medlar extracts, chromatography, dyeing, retanning.

The research of phenolic profile of medlar’s leaves dry extracts using thin layer chromatography (TLC) and high-performance liquid chromatography (HPLC) was done. Qualitative and quantitative composition of certain components, classified as main groups of phenol-derived bioactive substances was proved. Relying on findings unified qualitative determination methods applied to medlar’s leaves dry extracts were developed.

Введение

В настоящее время кожевенная и меховая промышленность испытывает дефицит экологически полноценных отечественных химических материалов и технологий на их основе. Производство кожи и меха отличается повышенным техногенным воздействием на окружающую среду, что, прежде всего, связано с большим объемом токсичных сточных вод и образованием плохо утилизируемых хромсодержащих отходов. Вместе с тем, ужесточение экологических требований, как к выпускаемой продукции, так и к охране окружающей среды, объективно способствуют расширению спектра исследований по разработке более экономичных и экологически чистых материалов из кожи и меха [1,2].

В последние годы заметен интерес исследователей к использованию различных растений, компоненты которых обладают дубящими, красящими и наполняющими свойствами, что необходимо для создания хромсберегающих технологий в производстве кожи и меха. Как альтернатива хромовым соединениям предлагаются дубильный экстракт из корней ревеня, волонеи, природные танниды из коры мимозы.

В Дагестане при вспашке полей уничтожается много кустарниковых растений-сорняков, экстракты которых местные жители использовали при выделке овчины, окрашивании мехового полуфабриката и ниток, из которых ткали знаменитые Дагестанские ковры. Так, в экстракте кермека содержатся

флавоноиды, дубильные вещества, кумарины,

фенолкарбоновые и органические кислоты, а также соединения кремниевой кислоты. В экстракте марены красильной содержатся флавоноиды, жирные и органические кислоты, мезоинозит, дубильные

вещества, а также тритерпеновые сапонины. В экстракте крушины ольховидной фенологликозиды, флавоноиды, фенолкарбоновые кислоты и дубильные

вещества [3,4]. Аналогичными качествами обладают экстракты мушмулы, которая растает в большом количестве в виде плодоносных кустарниковых деревьев. Используя свойства веществ, входящих в состав указанных растений, можно разрабатывать экологически чистые технологии додубливания, которые помогут получить полуфабрикат с наполненной кожевой тканью и в тоже время окрасят его в различные цвета. Для этого представляется необходимым детальное изучение фенольной фракции экстрактов указанных растений, как основной группы биологически активных веществ, влияющей на проявление цвета. А также изучение состава фенольных соединений спиртового экстракта (СЭ) листьев мушмулы современными физико-химическими методами.

Экспериментальная часть

Экстракт листьев мушмулы получали с использованием 40% этилового спирта, экстрагент удаляли в вакуум-сушильном шкафу. Данный способ получения экстракта обладает рядом преимуществ перед получением отвара, главное из которых состоит, прежде всего в том, что сводит к минимуму потери ценнейших биологически активных веществ. 0,5010 г сухого экстракта листьев мушмулы экстрагировали 70 мл 70%-го этилового спирта, на кипящей бане с обратным холодильником в течение 1 ч с момента закипания спирто-водной смеси в колбе. После охлаждения смесь фильтровали через бумажный фильтр в мерную колбу и объем доводили растворителем до метки. На водяной бане упаривали 20 мл извлечения и растворяли остаток в 3 мл смеси этилацетат: метанол в соотношении (95:5).

При проведении тонкослойной

хроматографии (ТСХ) в качестве неподвижной фазы использовали пластины “KIЕSELGEL 60 F254” фирмы “Merk” размером 20х20 см.

Хроматографирование проводили в системе растворителей: этилацетат-метилэтилкетон-

муравьиная кислота-вода в соотношении 50:30:10:10. Смесь растворителей помещали в стеклянную камеру для хроматографии, которую насыщали в течение 2 ч. В качестве объекта изучения использовали 70%-е спиртовое извлечение из сухого экстракта листьев мушмулы. В качестве растворов сравнения использовали 0,05%-е растворы рабочих стандартных образцов рутина, кверцетина, галловой кислоты, хлорогеновой кислоты, апигенина, гиперозида, гисперидина, лютеолина, лютеолин-7-гликозида в смеси растворителей: этилацетат: метанол в

соотношении (95:5).

На линию старта хроматографической пластины наносили по 30 мкл исследуемого раствора и по 20 мкл рабочих стандартных образцов, затем высушивали пластину на воздухе до полного улетучивания растворителей. Длина пробега растворителей составляла 18 см. В качестве проявителя использовали 5% раствор

фосфорномолибденовой кислоты в 95%-м этаноле, затем нагревали в сушильном шкафу при температуре 100-105°С в течение 5 мин.

Для проведения высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) образцы готовили следующим образом колбу объемом 200 мл помещали 0,5010 г листьев мушмулы, прибавляли по 70 мл 70%-го этилового спирта, затем присоединяли ее к обратному холодильнику и нагревали на кипящей водяной бане в течение 1 ч с момента закипания спирто-водной смеси. После охлаждения смесь фильтровали через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 50 мл, и объем доводили растворителем до метки (исследуемый раствор). Параллельно готовили серию 0,05%-х растворов флавоноидных веществ в метаноле (рутин, кверцетин, лютеолин, лютеолин-7-гликозид, галловая, кофейная и хлорогеновая кислоты, апигенин, геспередин, гиперозид, арбутин).

Таблица 1 - Результаты исследования фенольных соединений листьев мушмулы и сухих экстрактов, входящих в его состав, методом ТСХ

Проба К/ пятен а н т р Р? а н 8 т е а 2 0? о в о X - ет Ь ° £ 5 ° § Р? а о р о п 5 - 2? а н 8 т Ю р а Р? о в л от 4 о 5 § _ § р? К/ лютеолин К/ апигенина 1 5 О ^ (Я і- М 1 £ Я Неидентифи- цировано

Извлечение 0,29 0,29 Рутин

70%-мэтанолом 0,36 0,36 хлорогеновая

0,42 0,42 кислота

0,55 0,55 гиперозид

0,64 арбутин 1 зона с

0,72 0.72 галловая Я/ 0,64

0,76 0,76 кислота

0,82 0,82 лютеолин

0,86 0,86 кверцетин апигенин

Извлечении из 0,53 галловая о ° ^ зо / 0 <4 Р4

сухого экстракта 0,62

кермека 70%-м 0,71 кислота лютеолин

этанолом 0,76

Извлечение 0,11

из сухого 0,23

марены 0,29 лютеолин 4 зоны с Я/ 0,11;0,23; 0,40; 0,63

красильной 70%-м 0,42 галловая

этанолом 0,40 арбутин гиперозид рутин

0,55

0,63

0,71

0,76

Извлечение 0,11 рутин гиперозид арбутин галловая кислота

из сухого 0,23

крушины 0,29 3 зоны с Я/ 0,11;0,23; 0,63

ольховидной 0,42

70%-м 0,40

этанолом 0,55

0,63 лютеолин

0,71

0,76 кверцетин

Исследование проводили на

высокоэффективном жидкостном хроматографе (“Gilston“, Франция) с последующей компьютерной обработкой результатов исследования с помощью программы “Мультихром“ для “Windows“. В качестве неподвижной фазы была использована металлическая колонка Platinum EPS C-18 100 А (4,6x250 мм); в качестве подвижной фазы использовали смесь метанол-вода-концентрированная фосфорная кислота в соотношении 40:60:0,5; анализ проводили при комнатной температуре; скорость подачи элюента составляла 0,6 мл/мин. Продолжительность анализа -63,85 мин. Детектирование проводили с помощью УФ-детектора при длине волны 254 нм. В хроматограф вводили по 1 мкл исследуемого раствора и растворов стандартных образцов.

Обсуждение результатов После проявления детектором на хроматограмме в исследуемом растворе, было обнаружено 9 окрашенных в зон: R/ ~ 0,29 (рутин), R/ ~ 0,36 (хлорогеновая кислота), R/ ~ 0,42 (гиперозид)Д/ ~

0,55 (арбутин), Я/ - 0,72 (галловая кислота)Д/ -

0,76 (лютеолин), Я/ - 0,82 (кверцетин), Я/ -0,86 (апигенин). Параллельно в тех же условиях проведено исследование на наличие вышеназванной группы веществ в сухих экстрактах кермека, марены красильной и крушины ольховидной. Результаты приведены в табл. 1.

Проведенные исследования 70%-го водно -спиртового извлечения экстракта из листьев

мушмуллы методом ТСХ показали, что в составе исследуемого образца находятся соединения

фенольной природы, идентичные рутину, кверцетину, апигенину, лютеолину, гиперозиду,

галловой и хлорогеновой кислотам, подтверждено также наличие арбутина; одна зона хроматограммы с Я/ -0,64 не идентифицирована. Фенольные соединения по составу идентичны таковым в

индивидуальных сухих экстрактах, что

подтверждает подлинность экстракта по компонентному составу.

Таблица 2 - Результаты исследования фенольных соединений сухого экстракта из листьев мушмулы методом ВЭЖХ

Наименование РСО Время удерживания РСО, мин Компоненты исследуемого образца Идентифицировано

Апигенин 32,9S + апигенин

Арбутин 4,7S4 + арбутин

Гиперозид 19,02 + гиперозид

Геспередин 16,61 + геспередин

Галловая кислота 5,224 + галловая кислота

Кверцетин 5S,25 + кверцетин

Кофейная кислота 5,905 + кофейная кислота

Лютеолин 6,S03 + лютеолин

Лютеолин-7- 13,15 + лютеолин-7-гликозид

гликозид

Рутин 24,S3 + рутин

Хлорогеновая 11,26 + хлорогеновая

кислота кислота

Апигенин 32,9S + апигенин

Арбутин 4,7S4 + арбутин

Результаты исследования фенольных

соединений сухого экстракта из листьев мушмулы методом ВЭЖХ представлены в таблице 2.

Полученные в результате анализа данные позволяют сделать вывод о присутствии в изучаемом объекте следующих фенольных соединений: рутина, хлорогеновой, галловой и кофейной кислот, гиперозида, арбутина, лютеолина, кверцетина,

апигенина, лютеолина-7-гликозида и геспередина (11 веществ, выделенных в описанных выше условиях, не идентифицировано). Методом внутренней

стандартизации определено, что в исследуемом веществе среди флавоноидов содержится больше всего

лютеолина (15,12%), среди фенолкарбоновых кислот содержится больше всего галловой (12,90%) и кофейной (10,00%) кислот; 16,40% среди

выделенных веществ занимает арбутин. С помощью ВЭЖХ удалось не только подтвердить качественный фенольный состав,

идентифицированный методом ТСХ, но и значительно его расширить. Удалось также получить представление о том, какие фенольные соединения доминируют в изучаемом сухом экстракте, что представляется крайне необходимым, так как из данных о количественном содержании полифенолов можно судить не только о

возможности использования изучаемых экстрактов качестве компонентов дубящих композиций, но и о степени проявления красящей способности в отношении кожевой ткани.

Литература

1. Сысоев В.А. Матричная изоляция наноструктуры коллагена мономерными уретанами // Вестник Казанского гос. технол. ун-та, №11, Казань: КГТУ. - 2010. - С. 588590.

2. Сысоев В.А. Влияние плазменной активации наноструктуры коллагена на процесс бесхромового дубления меховой овчины / В.А.Сысоев, А.Р.Гарифуллина // Вестник Казан. гос. технол. ун-та. -2010. №11- С. 590-595.

3. Лоншакова К.С., Убашеев И.О., Шантанова Л.Н. и др. // Актуальные проблемы фармакологии и поиска новых лекарственных препаратов. Томск, 1997. Т. 9. С. 66.

4. Запрометнов М.Н. Фенольные соединения. М., 1993.

© В. А. Сысоев - д-р техн. наук, проф. каф. плазмохимических и нанотехнологий высокомолекулярных материалов КНИТУ, tkim1@kstu.ru; Д. А. Халитова - асп. той же кафедры.