СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ И ПРОГНОЗА МИОМЫ И РАКА ЭНДОМЕТРИЯ
METHOD OF DIFFERENTIAL DIAGNOSTICS AND PROGNOSIS OF ENDOMETRIUM MYOMA AND CANCER

Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии. Способ обеспечивает повышение степени объективности дифференциальной диагностики миомы матки и рака эндометрия. Проводят взятие материала опухолей матки, полученных после хирургического вмешательства.
Описание пробоподготовки и измерения
В результате проведенной отработки методики подготовки проб образцы ткани, предварительно замороженные, измельчались в жидком азоте и затем высушивались при температуре 45-60°С. Азот позволяет ткани оставаться замороженной в течение всего процесса растирания, что способствует более тонкому измельчению ткани. Этот способ оказался весьма эффективным для подготовки сухого мелкодисперсного материала для формирования таблеток равной толщины с гладкой поверхностью, которая бы исключала шероховатости и выступы при прохождении синхротронного излучения через образец. Результаты для образцов, приготовленных таким способом, дали наилучшую воспроизводимость и позволили использовать метод внешнего стандарта для количественной оценки концентрации элементов. Эксперименты проводились на станции рентгенофлуоресцентного анализа с использованием синхротронного излучения (РФА СИ) Института Ядерной Физики СО РАН, г. Новосибирск. Набор элементов, который был идентифицирован в спектрах снятых образцов, свелся к следующему: K, Са, Cr, Fe, Ni, Сu, Zn, As, Br, Rb, Cd, Sn, Sb. Исследовались здоровые и опухолевые (злокачественные и доброкачественные) ткани одного пациента. Для биологических тканей энергия возбуждения была выбрана 30 кэВ, а время экспозиции - порядка 600 с. Выбор времени экспозиции определялся набором определяемых элементов и воспроизводимостью результатов, которая зависит от времени набора статистики. Ошибки измерения таких элементов, как Fe, Сu, Zn, Br, при энергии возбуждения Е=43 кэВ меньше или порядка 1-2%.
В этих же образцах определяется уровень экспрессии генов матричных металлопротеиназ ММР 2, 3, 9 методом мультиплексной ОТ-ПЦР. Из анализа распределения злокачественных опухолей матки по экспрессии ММР и содержанию ионов Zn можно заключить, что в большинстве случаев повышение экспрессии ММР 3 и 9 совпадает с повышенным содержанием Zn в сравнении с нетрансформированной тканью. Это может быть связано с неблагоприятным прогнозом рака эндометрия. Особенностью опухолей миомы матки является повышенное содержание Zn в нормальной ткани по сравнению с опухолевой, что коррелирует с увеличенной экспрессией ММР-2, тогда как для ММР-3 и ММР-9 таких закономерностей не выявлено. Тогда определение концентрации Zn в тканях эндометрия является одной из стратегий в определении степени злокачественности опухоли и ее способности к метастазированию. Этот параметр может служить основой для диагностики и прогноза заболевания.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Изобретение относится к медицине, в частности к онкологии, и может быть использовано для дифференциальной диагностики доброкачественных и злокачественных опухолей матки.
Известен способ дифференциальной диагностики доброкачественных и злокачественных опухолей матки, включающий взятие материала опухоли с последующим гистологическим анализом
(1. Hecht J.L. and Mutter G.L. (2006) Molecular and Pathologic Aspects of Endometrial Carcinogenesis. // J Clin Oncol 24:4783-4791).
Данный способ позволяет различать доброкачественные и злокачественные опухоли лишь в первом приближении без привлечения молекулярных маркеров для тонкой диагностики и прогноза. Поэтому необходимы объективные критерии для диагностики и оценки факторов прогноза заболеваний. Важно оценить стадию рака, степень инвазии в миометрий, тип опухоли. Ни один из этих факторов не определяется точно с применением гистологического анализа и все зависит от субъективной оценки. Молекулярно-биологический и элементный анализ тканей позволяют глубже проникнуть в суть процесса перерождения тканей в опухолевые, а также понять, какие молекулярные процессы лежат в основе перераспределения цинка и активности ММР, которые являются цинк-зависимыми (2. Oehler М.К., Brand A., Wain G.V. (2003) Molecular genetics and endometrial cancer. // J. Br. Menopause Soc, 9: 27-31.
3. Shamamian, P., Schwartz, J.D., Pocock, B.J., Monea, S., Whiting, D., Marcus, S. G., and Mignatti, P. (2001) Activation of progelatinase A (MMP-2) by neutrophil elastase, cathepsin G, and proteinase-3: a role for inflammatory cells in tumor invasion and angiogenesis. J. Cell Physiol. 189, 197-206).
Это служит практическим целям и основой для разработки метода диагностики и прогноза заболевания органов репродуктивной сферы женщин. Предложенный метод позволяет с большой степенью точности количественно оценить в опухолях матки содержание цинка и активность металлопротеиназ
(4. Braundmeier A.G., Fazleabas AT., Lessey B.A., Guo H., Toole B.P., Nowak R.A. (2006) Extracellular Matrix Metalloproteinase Inducer Regulates Metalloproteinases in Human Uterine Endometrium. // The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 91:2358-2365.
5. Visse R., Nagase H. (2003) Matrix Metalloproteinases and Tissue Inhibitors of Metalloproteinases: Structure, Function, and Biochemistry. // Circ. Res., 92: 827-839. Malemud C.J. (2006) Matrix metalloproteinases (MMPs) in health and disease: an overview. // Front Biosci., 11: 696-1701.
6. Curry Т.Е., Jr., Osteen K.G. (2003) The Matrix Metalloproteinase System: Changes, Regulation, and Impact throughout the Ovarian and Uterine Reproductive Cycle. // Endocr. Rev.24: P.428-465)
и соотнести их со степенью злокачественности опухоли матки. Особенностью метода является его высокая чувствительность и хорошая воспроизводимость. Наиболее близким к заявленному является способ определения уровня матриксных металлопротеиназ 2, 9 в смывах матки
(7. Lopata A., (AU), Salamonsen L.A. (AU), Quinn M A (AU) Matrix metalloproteinase levels as indicators of endometrial cancer, US 6607894),
который может быть как качественным, так и количественным и адаптирован к скринингу в клиниках. Авторы использовали накопленные научные знания об усилении активности некоторых ММР при трансформации тканей. На этом основании авторы разработали неинвазивный скрининговый метод для оценки риска развития рака эндометрия.
Недостатком данного метода является зависимость активности ММР от фазы менструального цикла, что может затруднять диагностику. Кроме того, данный метод требует дополнительного контроля присутствия в смывах клеток эндометрия, что затрудняет скрининговую диагностику. В нашем случае активность определяется непосредственно в ткани, когда процессы трансформации уже имеются. Такая информация существенна для развития стратегии контроля биологического поведения эндометрия и других тканей.
Задачей, на решение которой направлено изобретение, является повышение степени объективности диагностики опухолей матки и дифференциального распознавания миомы и рака эндометрия. Решение поставленной задачи достигается тем, что оценивается содержание цинка и уровень экспрессии ММР2.3,9 в опухолевой и прилежащей к ней нетрансформированной ткани матки.
Описание изобретения
Способ дифференциальной диагностики и прогноза миомы и рака эндометрия по содержанию цинка и активности матричных металлопротеиназ согласно заявляемому изобретению включает:
1) взятие операционного материала матки с пораженного опухолью участка и прилежащего к нему без опухоли. А именно были взяты 41 пара образцов тканей доброкачественных опухолей и нетрансформированных, прилежащих к ним, и 37 пар образцов тканей злокачественных опухолей и окружающих их нетрансформированных;
2) приготовление из взятой ткани 2-х образцов - одного для проведения рентгенофлуоресцентного элементного анализа и определения содержания элементов в тканях; второго - для определения экспрессии металлопротеиназ ММР, который помещается в жидкий азот;
3) проведение рентгенофлуоресцентного элементного анализа с использованием синхротронного излучения для определения содержания цинка в исследуемых тканях из сравнения спектрограмм данных тканей со спектрограммами внешнего стандарта, в качестве которого берется стандарт «Бычья печень» NIES 1577, матрица элементов которого наиболее близка матрице исследованных тканей;
4) выделение из кусочка ткани, замороженной в жидком азоте, суммарной РНК с последующим измерением экспрессии генов ММР методом мультиплексной ОТ-ПЦР;
5) оценка количественных признаков: изменение содержания цинка, повышение активности ММР2, 3, 9;
6) определение по каждому количественному признаку корреляции между содержанием цинка, активности ММР и степенью злокачественности опухоли, определенной в клинике;
7) анализ полученных количественных признаков пациентов, а именно содержания цинка в опухолевых и нетрансформированных тканях, на уровень значимости отличий концентраций с помощью программы типа SPSS 13;
8) проведение корреляционного анализа полученных величин концентраций цинка и уровня экспрессии металлопротеиназ в тканях.
Примеры конкретного выполнения
Содержание цинка было оценено в 41 образце миомы и 37 образцах рака эндометрия. Пациенты разделились на 2 группы по признаку изменения концентрации Zn в нормальных и опухолевых тканях. Одна часть пациентов (большая) имела концентрацию цинка в нормальных тканях ниже (75-105 ppm), чем в злокачественных (130-160 ppm), а другая часть - наоборот. То же самое относится и к образцам тканей пациентов с миомой эндометрия. Повышенное содержание цинка в нетрансформированной ткани, прилежащей к доброкачественной опухоли, наблюдалось у большей части пациентов. Проведенный по программе SPSS13 статистический анализ полученных данных подтвердил необходимость деления образцов тканей различных пациентов по типу изменения цинка в исследуемых тканях. Так, в нетрансформированных тканях, прилегающих к ткани миомы эндометрия, у большей части пациентов (>60%) увеличение цинка было порядка 1,5 с уровнем значимости р<0,0003 и составляло 153±12 ppm. В злокачественных тканях рака матки у большей части пациентов (>65%) увеличение цинка было порядка 1,4 с уровнем значимости р<0,008 и составляло 120±12 ppm.
2
Прежде чем приступить к измерению относительного уровня мРНК генов ММР2, 3 и 9, а также ERα и ERβ в опухолевых и нормальных тканях эндометрия и миометрия были подобраны оптимальные условия для проведения мультиплексной ПЦР. Мультиплексную ПЦР проводили в реакционном объеме 20 мкл. В качестве эндогенного внутреннего контроля, относительно которого проводилось выравнивание продуктов амплификации исследуемых генов, были выбраны гены «домашнего хозяйства» - β-актин для нормирования ММР2, 3 и 9; глицеральдегид-3-фосфот дегидрогеназа (GAPDH) для нормирования ERα и ERβ. Каждая проба ПЦР содержала 2 мкл кДНК, 1-кратный буфер для ПЦР, 0,2 мМ дезоксирибонуклеотидтрифосфаты (каждого), 20 пкМ каждого праймера и 2 ед. ак. Taq ДНК-полимеразы. Для каждой пары праймеров были подобраны оптимальные концентрации MgCl: ММР2, ММР3, ММР9 и ERβ - 2,0 мМ, ERα - 1,8 мМ. Праймеры для определения экспрессии генов ММР-2: прямой: TCG ССС АТС АТС AAG ТТС и обратный: GTG АТС TGG ТТС TTG ТСС, ММР-3: прямой: TGC ТТТ GTC СТТ TGA TGC TG и обратный: GGG AAA ССТ AGG GTG TGG AT, ММР-9: прямой: ССС ТТС СТТ АТС GCC GAC AAG и обратный: ААС АТС CGG ТСС АСС TCG С. Для всех пар праймеров были подобраны температуры отжига, равные 59°С для генов ММР2, ММР3, ММР9; 63°С для гена ERα и 65°С для гена ERβ. Оптимальными считали такие условия проведения ПЦР, при которых наблюдалось отсутствие неспецифических продуктов амплификации, а интенсивность (яркость) полосы ПЦР-продукта была достаточной для проведения денситометрии.
Далее было определено оптимальное количество циклов амплификации. Оптимальным считали такое количество циклов, при котором сохранялась линейная зависимость между количеством ПЦР-продукта и числом циклов. В наших условиях наиболее подходящее число циклов для ММР2 - 32, для ММР3 - 38, для ММР9 - 38, для ERα - 38, для ERβ - 38, для GAPDH - 32 и β-актина - 32.
Продукты мультиплексной ПЦР разделяли методом горизонтального электрофореза в 2% агарозном геле. Электрофорез вели в 1×ТВЕ (0,018 М трис-борат, 0,018 М борная кислота, 0,4 мМ ЭДТА) при напряжении 8 В/см. Гель-сканирование проводили в ультрафиолетовом свете с помощью видеосистемы "DNA Analyzer". Денситометрию проводили с помощью компьютерной программы "Total Lab". Относительное содержание мРНК исследуемых генов оценивали в относительных единицах как отношение интенсивности окрашивания специфической полосы генов к интенсивности полосы гена «домашнего хозяйства». При анализе уровня экспрессии металлопротеиназ выявлено, что профиль экспрессии зависит как от типа опухоли, так и от класса ММР. Так, ММР-2 одинаково эффективно экспрессируется и в злокачественных тканях эндометрия, и в тканях миомы. И лишь у 2-х пациентов ее экспрессия не регистрируется. Другой фермент, ММР-3, напротив, экспрессируется, главным образом, в раковых тканях эндометрия, тогда как в миоме ее экспрессия выражена слабее, а у некоторых больных она вообще отсутствует. В злокачественных тканях многих больных наблюдается достаточно высокая экспрессия ММР-3, тогда как ММП-9 также выраженно экспрессируется в тканях рака эндометрия, но не в миоме. Таким образом, ММР-3 и ММР-9 экспрессируются главным образом в злокачественных тканях эндометрия, но не в доброкачественных. Исходя из этого, данные металлопротеиназы могут быть подходящими кандидатами для характеристики злокачественности этих опухолей.
Проведенный далее анализ распределения опухолей матки по гормональному статусу, экспрессии ММР и содержанию ионов цинка дал основание сделать следующее заключить: в большинстве случаев (от 60 до 90%) в злокачественных тканях эндометрия наблюдается повышенная экспрессия ММР-3 (с 0.4 до 1.5 о.е.) и ММР-9 (с 0.01 до 0.8 о.е.), что совпадает с повышенным содержанием Zn (130-160 ppm) по сравнению с прилегающей к опухоли нетрансформированной тканью. Особенностью опухолей миомы матки является повышенное содержание Zn в нормальной ткани (153±12 ppm) по сравнению с опухолевой, что коррелирует с увеличенной экспрессией ММР-2 (с 1 до 3 о.е.), тогда как для ММР-3 и ММР-9 таких закономерностей не выявлено. Таким образом, определение концентрации Zn в тканях эндометрия может быть одной из стратегий в определении степени злокачественности опухоли и ее способности к метастазированию. Именно этот показатель может быть использован в дифференциальной диагностике миомы и рака эндометрия. Проведенный далее анализ распределения опухолей матки по гормональному статусу, экспрессии ММР и содержанию ионов цинка дал основание сделать следующее заключение: в большинстве случаев (от 60 до 90%) в злокачественных тканях эндометрия наблюдается повышенная экспрессия ММР-3 (с 0.4 до 1.5 о.е.) и ММР-9 (с 0.01 до 0.8 о.е.), что совпадает с повышенным содержанием Zn (130-160 ppm) по сравнению с прилегающей к опухоли нетрансформированной тканью. Особенностью опухолей миомы матки является повышенное содержание Zn в нормальной ткани (153±12 ppm) по сравнению с опухолевой, что коррелирует с увеличенной экспрессией ММР-2 (с 1 до 3 о.е.), тогда как для ММР-3 и ММР-9 таких закономерностей не выявлено. Таким образом, определение концентрации Zn в тканях эндометрия может быть одной из стратегий в определении степени злокачественности опухоли и ее способности к метастазированию. Именно этот показатель может быть использован в дифференциальной диагностике миомы и рака эндометрия.
Примеры дифференциальной диагностики гинекологических опухолей у пациентов 1 и 2 согласно заявленному изобретению
Пациент 1
Пациент 2
Концентрация Zn
[N]>[T]
[N]<[T]
Уровень экспрессии ERα
0
+
Уровень экспрессии ERβ
0
-
Уровень экспрессии ММР 2
++
+++
Уровень экспрессии ММР 3
+
++
Уровень экспрессии ММР 9
0
+++
Заключение
Миома тела матки
Рак эндометрия
Примечание: N - нормальная нетрансформированная ткань,
Т - опухолевая ткань,
0 - экспрессия гена не изменяется,
+ - экспрессия гена увеличивается в 1,5-2 раза (в опухолевой ткани по сравнению с нетрансформированной),
++ - экспрессия гена увеличивается в 2,2-5 раз (в опухолевой ткани по сравнению с нетрансформированной),
++ - экспрессия гена увеличивается в 2,2-5 раз (в опухолевой ткани по сравнению с нетрансформированной),
+++ - экспрессия гена увеличивается в 5,1 и более раз (в опухолевой ткани по сравнению с нетрансформированной),
- - экспрессия гена уменьшается (в опухолевой ткани по сравнению с нетрансформированной).