Роль системы активации плазминогена в опухолях больных раком желудка

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

РОЛЬ СИСТЕМЫ АКТИВАЦИИ ПЛАЗМИНОГЕНА В ОПУХОЛЯХ БОЛЬНЫХ РАКОМ ЖЕЛУДКА

Е.С. Герштейн1, А.И. Казьмин2, А.М. Щербаков1,Н.А. Огнерубов2,

С.Ш. Жанилсынов1, Н.Е. Кушлинский1

Российский онкологический научный центр им. H.H. Блохина РАМН1, г. Москва;

Воронежская государственная медицинская академия им. H.H. Бурденко2

Иммуноферментными методами показано, что при раке желудка происходит усиление активации плазминогена по урокиназному типу (уровня uPA) с параллельным увеличением концентрации ингибитора PAI-1 в опухолях по сравнению с окружающей слизистой желудка. Эти изменения наиболее выражены на поздних стадиях заболевания. Значимой взаимосвязи содержания компонентов системы активации плазминогена с гистопатологической градацией опухоли не обнаружено, однако высокие показатели концентрации uPA (выше 0,37 нг/мг белка) и PAI-1 (выше 1,61 нг/мг белка) в опухолевой ткани больных раком желудка можно расценивать как прогностически неблагоприятные факторы, снижающие общую выживаемость больных. Активатор тканевого типа существенного прогностического значения при раке желудка не имеет.

ROLE OF PLASMINOGEN ACTIVATION SYSTEM IN TUMORS OF PATIENTS WITH GASTRIC

CANCER

E.S. Gershtein1, A.I. Kazmin2, A.M. Scherbakov1, N.A. Ognerubov2, S.Sh. Zhanilsynov1, N.E. Kushlinsky1

N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center RAMS', Moscow N.N. Burdenko State Medical Academy2, Voronezh

Plasminogen activity enhancement according to urokinase type (uPA) with a parallel increase in concentration of PAT-1 inhibitor was shown to occur in tumors of gastric cancer as compared to surrounding gastric mucosa. These changes were more pronounced at late stages of the disease. No significant relationship between the content of components of plasminogen activation system and histopathologic tumor grade was found. High levels of uPA (above 0,37 ng/mg of protein) and PAI-1 (above 1,61 ng/mg of protein) in tumor tissue of gastric cancer patients, however, can be considered as unfavorable prognostic factors reducing the overall survival of patients. Activator of tissue type has no significant prognostic value in gastric cancer.

Рак желудка занимает одно из ведущих мест по уровню заболеваемости и смертности среди злокачественных новообразований человека. В последние годы многие исследователи указывают на целесообразность разработки новых методов лечения этого заболевания, основанных на современных достижениях в области молекулярной биологии и биохимии опухолей, что позволит повысить эффективность лечения и уменьшить уровень смертности от этого заболевания, недостаточно чувствительного к традиционным видам химиотерапии.

Одним из фундаментальных свойств злокачественных опухолей является способность к инвазии, мета-стазированию и индукции неоангиогенеза. Ключевую роль во всех этих процессах играет протеолитичес-кий каскад активации плазминогена, важнейшими компонентами которого являются активатор плазми-ногена урокиназного типа (иРА) и его ингибитор I типа (РА1-1) [1, 8, 11]. Активная форма иРА катализирует превращение плазминогена в плазмин, который сам разрушает компоненты опухолевой стромы и

активирует металлопротеазы, участвующие в этом процессе. Роль PAI-1, по-видимому, сводится преимущественно к защите опухолевой ткани от саморазрушения под действием продуцируемых ею протеаз [11]. Известно, что активация плазминогена возможна и по тканевому типу, но роль активатора плазминогена тканевого типа (tPA) в развитии опухоли, скорее всего, противоположна роли uPA [1, 14].

Результаты исследований, проведенных in vitro на различных клеточных линиях рака желудка, свидетельствуют о важной роли активации плазминогена по урокиназному типу в процессах инвазии и метаста-зирования этой опухоли [5, 10, 12, 13, 15, 16]. Показано также, что uPA, его рецептор uPAR и PAI-1 представляют интерес в качестве независимых прогностических факторов [3, 4, 6, 9]. Прогностическая роль tPA при раке желудка неоднозначна [14].

В связи с вышеизложенным целью настоящего исследования явились сравнительное изучение содержания uPA, tPA и PAI-1 в ткани рака и неизмененной слизистой желудка и оценка взаимосвязи экспрессии этих белков с клинико-морфологическими характеристиками и прогнозом заболевания.

Материалы и методы

В исследование вошли 97 больных раком желудка (58 мужчин и 39 женщин) в возрасте от 15 до 82 лет, лечившихся в ВГМА им. H.H. Бурденко. У всех больных исследовали ткань опухоли, а у 21 больного -еще и гистологически не измененную ткань желудка. Клинический диагноз во всех случаях подтвержден данными гистологического исследования.

Во время операции брали образцы ткани весом 200-500 мг и хранили их при -70°С до начала обработки. Концентрации uPA, PAI-1 и tPA определяли в цитозолях, полученных по стандартной процедуре, используемой при определении рецепторов стероидных гормонов, и разведенных в 10 раз К,№-фосфат-ным буфером (14 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 1,5 мМ KH2PO4, 8,1 мМ Na2HPO4, рН 7,4), содержащим 0,1 % Твин-20 и 1 % БСА, с помощью стандартных наборов реактивов для иммуноферментного анализа, разработанных в Католическом университете г. Наймеген (Нидерланды) [6], как описано ранее [1, 2]. Измерения проводили на автоматическом универсальном ридере для микропланшет ELX800 фирмы Bio-Tek Instruments, Inc. (США) при 490/630 нм. Концентра-

ции анализируемых белков выражали в нг/мг цитозольного белка. Белок определяли по методу Лоури.

При сравнении показателей в различных группах использовали t-критерий Стьюдента и непараметрические критерии: медианный, Манна - Уитни, парный тест Вилкоксона. Корреляционные зависимости исследовали с помощью критериев Пирсона (r) и Спирмена (R). Общую выживаемость больных оценивали методом Каплана - Мейера (при сравнении кривых использовали F -тест Кокса), а также регрессионную многофакторную модель Кокса. Статистическая обработка данных осуществлялась с помощью программного пакета Statistica для Windows (версия 6.0, StatSoft, Inc., США, 2001).

Результаты и обсуждение

Средние и медианные показатели концентрации uPA и PAI-1 в опухолевой ткани были достоверно выше, чем в неизмененной слизистой желудка (табл. 1; p<0,05). Концентрация tPA, напротив, в неизмененной ткани желудка была выше, чем в ткани рака (табл. 1; p<0,05).

У 76 % больных уровень uPA в опухолевой ткани был в 1,1-9,3 раза (медиана - 2,7) выше, чем в окружающей слизистой желудка (рис. 1). Для PAI-1 такое соотношение наблюдалось у 71 % больных (в 1,1-15,2 раза, медиана - 2,8; рис. 2), а обратное соотношение для tPA выявлено у 76 % больных (снижение в опухолевой ткани в 1,5-131,4 раза, медиана - 5,0; рис. 3). Отмечена достоверная прямая корреляция между уровнями PAI-1 в опухолевой и неизмененной ткани (r=0,51; p<0,05), а также положительная взаимосвязь уровней PAI-1 и uPA в опухолевой ткани (R=0,74; p<0,05) и уровней PAI-1 и tPA в гистологически не измененной слизистой желудка (R=0,46; p<0,05).

Таким образом, в ткани рака желудка происходит не зависимое от нормальной слизистой увеличение экспрессии uPA, сопровождающееся увеличением концентрации ингибитора PAI-1. В то же время повышенный уровень PAI-1 в опухоли взаимосвязан с его содержанием в нормальной слизистой желудка, что указывает на различный механизм активации этих белков при малигнизации. Подавление экспрессии tPA, так же как и активация uPA, происходит независимо от окружающей гомологичной слизистой. По-видимому, для рака желудка характерна значительная несбалансированность протеолитических процессов, что и определяет инвазивную активность опухоли, связанную с исследованными ферментами.

Т а б л и ц а

Содержание активаторов плазминогена урокиназного и тканевого типов и ингибитора РА1-1 в цитозолях гистологически не измененной слизистой и опухолей больных раком желудка

Исследованная ткань Кол-во образцов Концентрация (нг/мг белка) М m (медиана) квартили

иРА tPA PAI-1

Гистологически не измененная слизистая желудка 21 0,09±0,01 (0,09) 0,07-0,11 0,61±0,08 (0,53) 0,29 - 0,97 0,17±0,04 (0,10) 0,04 - 0,30

I стадия 9 0,27 0,15 (0,11) 0,03-1,41 1,56 1,10(0,32) 0,00-10,00 0,34 0,14(0,12) 0,00-1,24

сЗ £ 5 *• II стадия 28 0,82 0,17(0,35)* 0,01-4,10 0,58 0,13 (0,38) 0,00-2,40 1,39 0,36(0,79)* 0,00-8,31

III стадия 40 0,78 0,13 (0,47)* 0,05-3,35 0,33 0,08(0,14)** 0,00-2,25 1,77 0,43 (0,62)* 0,00-11,46

сЗ IV стадия 12 0,86 0,18(0,81)* 0,17-2,15 0,58 0,15 (0,48) 0,04-1,73 3,21 0,89(1,62)* 0,50-9,76

Вся группа 97 0,27 0,15 (0,11) 0,03-1,41 1,56 1,10(0,32) 0,00-10,00 0,34 0,14(0,12) 0,00-1,24

Примечание: * - р<0,05 по сравнению с неизмененной слизистой желудка; * сравнению с неизмененной слизистой желудка.

В соответствии с клинической классификацией рака желудка, I стадия заболевания была выявлена у 9 обследованных больных, II стадия - у 28 больных, III стадия -у 40 больных, IV стадия -у 12 больных (табл. 1). При II, III и IV стадиях заболевания содержание uPA и PAI-1 в опухоли оказалось достоверно выше, чем в неизмененной слизистой желудка (p<0,01). У больных I стадии содержание uPA в опухоли достоверно не отличалось

от нормальной слизистой желудка. Содержание tPA в опухоли было достоверно снижено по сравнению с неизмененной тканью только при III стадии заболевания. Достоверных различий концентраций компонентов системы активации плазминогена между опухолями больных I и II, II и III, III и IV стадий заболевания не обнаружено. Выраженные и достоверные различия концентраций uPA и PAI-1 выявлены между опухолями больных I и IV стадий. Таким образом, активация плазминогена по уроки-назному типу с параллельным увеличением уровня PAI-1 происходит преимущественно на поздних стадиях заболевания.

Прослеживалась также взаимосвязь экспрессии активаторов плазминогена с возрастом больных: содержание uPA в опухоли слабо положительно коррелировало с возрастом (r=0,21, p<0,05), а для концентрации tPA обнаружена противоположная тенденция (r=-0,32, p<0,001). В то же время уровень PAI-1 не зависел от возраста больных.

p<0,01 по

1І1І

ДгІгігіпгкгіпГІГІгІгиіЬі

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

Рис. 1. Концентрации иРА (нг/мг цитозольного белка; по оси абсцисс) в цитозолях опухолей и гистологически не измененных тканей больных раком желудка (сравнение показателей для каждого больного): ^ - опухоль; ^ -норма. По оси ординат - номер больного

ЕЙ

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

Рис. 2. Концентрации 1РА (нг/мг цитозольного белка; по оси абсцисс) в цитозолях опухолей и гистологически не измененных тканей больных раком желудка (сравнение показателей для каждого больного): ^ - опухоль; ^ -норма. По оси ординат - номер больного раком желудка

Таблица 2

Концентрации иРА, 1РА и РА1-1 в цитозолях опухолей больных раком желудка в зависимости

от гистопатологической градации опухоли

Степень дифференцировки (О) Кол-во Концентрация (нг/мг белка) М ± т (медиана)квартили

иРА гРА РАІ-1

01 - высокая 4 0,71±0,18 (074) 0,45-0,97 0,24±0,18 (0,10) 0,02-0,46 0,61±0,17 (057) 0,38-0,85

02 - умеренная 30 0,98±0,17 (0,70)* 023-1,71 0,53±0,15 (0,13) 0,04-0,55 1,96±0,44(1,27) 0,38-1,72

О 3 - низкая 39 054±010 (031) 0,12-0,84 0,43±0,08 (0,33) 0,00-0,57 1,78±0,47(0,48) 0,13-2,05

04 - недифференцированный рак 9 0,81±0,24(0,35) 028-1,24 0,50±0,18 (0,37) 011-049 0,87±0,24 (0,85) 0,28-1,24

Примечание: * - р=0,01 по сравнению с 03.

Таким образом, тенденция к усилению в опухоли активации плазминогена по урокиназному типу и параллельному уменьшению концентрации активатора плазминогена тканевого типа проявляется в большей степени в старших возрастных группах. Выявленные закономерности указывают на усиление способствующей инвазии протеазной активности опухоли у больных старших возрастных групп.

Степень дифференцировки опухоли также является важным фактором прогноза. По гистопатологической градации опухоли (0) больные были разделены на следующие группы: 4 больных с высокодифференцированными опухолями (в1), 30 больных - с уме-

реннодифференцированными (в2), 39 больных - с низкодифференцированными (в3) и 9 больных с недифференцированным раком (в4). Не обнаружено достоверной взаимосвязи уровней №А и РА1-1 в опухолевой ткани со степенью дифференцировки опухоли. Концентрации иРА значительно и достоверно различались только между двумя наиболее репрезентативными группами больных с умеренно- и низкодифференцированными опухолями (в2 и в3): уровень иРА в первой группе был более чем вдвое выше, чем во второй (табл. 2; р = 0,01). В настоящее время трудно объяснить эту парадоксальную зависимость, в соответствии с которой низкодифференцированные и недифференцированные опухоли должны быть менее инвазивными, чем умеренно- и высокодифференцированные .

Таким образом, значимой взаимосвязи содержания компонентов системы активации плазминогена со степенью дифференцировки рака желудка не наблюдается, что не исключает возможности использования этих показателей в качестве факторов прогноза выживаемости больных.

Для проверки этого предположения больные были прослежены в течение двух лет после операции и разделены на группы в зависимости от концентрации изучаемых белков в опухолевой ткани. В качестве пороговых критериев рассматривали по два уровня для каждого маркера: показатель медианы и показатель верхнего квартиля концентрации в опухолевой ткани (табл. 1). Для иРА эти величины составили, соответственно, 0,37 и 1,03 нг/мг белка, для РА1-1 - 0,67 и 1,61 нг/мг белка, для 1РА - 0,28 и 0,55 нг/мг белка. Медианы общей

Рис. 3. Концентрации РАІ-1 (нг/мг цитозольного белка; по оси абсцисс) в цитозолях опухолей и гистологически не измененных тканей больных раком желудка (сравнение показателей для каждого больного): ^ - опухоль; ^ - норма. По оси ординат - номер больного раком желудка

Таблица 3

Показатели общей продолжительности жизни больных раком желудка в зависимости от содержания

компонентов системы активации плазминогена в опухоли

Группа Число больных Число умерших Максимальный срок наблюдения (мес) Медиана выыкиваемости (мес) Р

иРА > 0,37 нг/мг белка 49 24 22,5 12,8 0,03

иРА < 0,37 нг/мг белка 48 16 24,0 16,6

иРА > 1,03 нг/мг белка 25 12 22,5 15,7 0,20

иРА < 103 нг/мг белка 72 28 24,0 15,0

РА1-1 > 0,67 нг/мг белка 49 26 24,0 9,8 0,01

РА1-1 < 0,67 нг/мг белка 48 14 18,8 15,0

РА1-1 >1,61 нг/мг белка 25 15 20,3 7,8 0,004

РА1-1 <1,61 нг/мг белка 72 25 24,0 16,6

1РА > 0,28 нг/мг белка 47 19 24,0 15,5 0,42

!РА<0,28 нг/мг белка 50 21 20,3 12,8

1РА > 0,55 нг/мг белка 24 10 24,0 15,7 0,45

!РА<0,55 нг/мг белка 73 30 22,5 15,0

выживаемости для всех групп больных представлены в табл. 3. Как следует из данных этой таблицы и кривых кумулятивной выживаемости, представленных на рис. 4 и 5, достоверное ухудшение выживаемости отмечается у больных с показателями иРА выше медианы (р = 0,03) и с показателями РА1-1 выше медианы (р = 0,01) или верхнего квартиля (р = 0,004). При этом различия в выживаемости были наиболее

выражены на ранних сроках наблюдения (до одного года; рис. 4 и 5). Наиболее значимым пороговым критерием оказался уровень верхнего квартиля концентрации РА1-1: медианы выживаемости больных раком желудка при использовании этого критерия различаются более чем вдвое и составляют 7,8 и 16,6 мес для больных с высоким и низким содержанием РА1-1 соответственно (табл. 3). Концентрация 1РА в

Рис. 4. Общая выживаемость больных раком желудка в зависимости от концентрации иРА в опухоли. Сплошная линия - иРА > 0,37 нг/мг белка; пунктирная линия - иРА I 0,37 нг/мг белка. По оси абсцисс - время после операции

Рис. 5. Общая выживаемость больных раком желудка в зависимости от концентрации РАІ-1 в опухоли. Сплошная линия - РАІ-1>1,61 нг/мг белка; пунктирная линия - РАІ-111,61 нг/мг белка. По оси абсцисс - время после операции

опухоли не влияла на выживаемость больных раком желудка (табл. 3).

Следует отметить, что определенное влияние на ухудшение выживаемости при высоких показателях uPA и PAI-l, по-видимому, оказывает тот факт, что в эти подгруппы попадает большинство больных с IV стадией заболевания, а больные с I стадией в основном находятся в подгруппах с низкими уровнями данных маркеров. Однако, учитывая относительно низкую долю больных с I и IV стадиями в общей группе (табл. l), влияние этого фактора не следует преувеличивать. Это предположение подтвердилось и при проведении многофакторного анализа с помощью регрессионной модели Кокса, который свидетельствует о том, что уровень PAI-l выше верхнего квартиля является более значимым фактором прогноза, чем наличие отдаленных метастазов, степень поражения лимфатических узлов и стадия заболевания в целом (р = 0,048).

Таким образом, высокие показатели концентрации uPA и в особенности его ингибитора PAI-l в опухолевой ткани больных раком желудка можно расценивать как прогностически неблагоприятные факторы, что согласуется с закономерностями, выявленными при различных злокачественных новообразованиях [l, 7, 8], и может быть связано с увеличением инвазивной и метастатической активности опухоли, обусловленной усилением активации плазминогена и последующих протеолитических процессов.

Подводя общий итог работы, можно отметить, что на примере рака желудка нам удалось еще раз подтвердить выявленную ранее [l] закономерность, заключающуюся в том, что в большинстве злокачественных опухолей различного гистогенеза происходит значительное увеличение концентрации uPA и PAI-l по сравнению с гомологичными нормальными тканями и доброкачественными опухолями. Это наблюдение может иметь как теоретическое, так и практическое значение. С одной стороны, оно свидетельствует о том, что усиление активации плазминогена по урокиназному типу, сопровождающееся усилением защиты опухолевых клеток от саморазрушения (за счет увеличения уровня PAI-l), является достаточно универсальным признаком малигнизации. С другой стороны, повышенная экспрессия uPA в опухоли по сравнению с окружающей тканью делает этот фермент перспективной избирательной мишенью для антиме-тастатической (с использованием специфических ингибиторов) противоопухолевой терапии рака желудка, характеризующегося достаточно низкой чувствительностью к стандартным видам химиотерапии. Наиболее перспективно использование таких препа-

ратов у больных с высокими уровнями uPA и PAI-1 в опухолевой ткани, общий прогноз заболевания для которых неблагоприятен.

ЛИТЕРАТУРА

1. Герштейн Е.С., Кушлинский Н.Е. Активаторы плазминогена урокиназного и тканевого типов и их ингибитор PAI-1 в опухолях человека // Бюл. эксп. биол. мед. 2001. Т. 131, № 1. С. 81-87.

2. Герштейн Е.С., Щербаков А.М., Казьмин А.И. и др. Активаторы плазминогена урокиназного и тканевого типов и их ингибитор PAI-1 в опухолях больных раком желудка // Вопросы онкологии. 2003. Т. 49, № 2. С. 165-169.

3. Allgayer H., Babic R., Grutzner K.U. et al. Tumor-associated proteases and inhibitors in gastric cancer: analysis of prognostic impact and individual risk protease patterns // Clin. Exp. Metastasis. 1998. Vol. 16. Р. 62-73.

4. Cho J. Y, Chung H. C., Noh S.H. et al. High level of urokinasetype plasminogen activator is a new prognostic marker in patients with gastric carcinoma // Cancer. 1997. Vol. 79. Р. 878-883.

5. Choi Y.K., Yoon B.I., Kook Y.H. et al. Overexpression of urokinase-type plasminogen activator in human gastric cancer cell line (AGS) induces tumorigenicity in severe combined immunodeficient mice // Jpn. J. Cancer Res. 2002. Vol. 93. Р. 151-156.

6. Ganesh S., Sier C.F., Heerding M.M. et al. Prognostic value of the plasminogen activation system in patients with gastric carcinoma // Cancer. 1996. Vol. 77. Р. 1035-1043.

7. Grebenschikov N., Geurts-Moespot A., De Witte H. et al. A sensitive and robust assay for urokinase and tissue-type plasminogen activators (uPA and tPA) and their inhibitor type I (PAI-1) in breast tumor cytosols // Int. J. Biol. Markers. 1997. Vol. 12. P. 6-14.

8. Harbeck N., Kruger A., Sinz S. et al. Clinical relevance of the plasminogen activator inhibitor type 1-a multifaceted proteolytic factor // Onkologie. 2001. Vol. 24. P. 238-244.

9. Kaneko T., Konno H., Baba M. et al. Urokinase-type plasminogen activator expression correlates with tumor angiogenesis and poor outcome in gastric cancer // Cancer Sci. 2003. Vol. 94. P. 43-49.

10. Lee D.H., Yang Y, Lee S.J. et al. Macrophage inhibitory cytokine-1 induces the invasiveness of gastric cancer cells by up-regulating the urokinase-type plasminogen activator system // Cancer Res. 2003. Vol. 63. P. 4648-4655.

11. Mignatti P., Rifkin D.B. Biology and biochemistry of proteinases in tumor invasion // Physiol. Rev. 1993. Vol. 73. P. 161-195.

12. Okusa Y, Ichikura T., Mochizuki H., Shinomiya N. Urokinase type plasminogen activator and its receptor regulate the invasive potential of gastric cancer cell lines // Int. J. Oncol. 2000. Vol. 17. P. 1001-1005.

13. Plebani M., Herszenyi L., Cardin R. et al. Cystein and serine proteases in gastric cancer // Cancer. 1995. Vol. 76. P. 367-375.

14. Sanz L., Vizoso F, Verez P. et al. Prognostic significance of tissue-type plasminogen activator (tPA) content in gastric cancer and surrounding mucosa // Int. J. Biol. Markers. 2002. Vol. 17. P. 169-176.

15. Sier C.F., Verspaget H.W., Griffioen G. et al. Plasminogen activators in normal tissue and carcinomas of the human oesophagus and stomach // Gut. 1993. Vol. 34. P. 80-85.

16. Umehara Y, Kimura T., Yoshida M. et al. Relationship between plasminogen activators and stomach carcinoma stage // Acta Oncol. 1991. Vol. 30. P. 815-818.

Поступила 2.02.04