ПРОИЗВОДНОЕ 1',2',3'-ТРИМЕТОКСИБЕНЗО[4',5':4,5]-6,7-ДИГИДРОЦИКЛОГЕПТА-[2,3-e]-1H-1-МЕТИЛИНДОЛА И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ
1',2',3'-TRIMETHOXYBENZO[4',5':4,5]-6,7-DIHYDROCYCLOHEPTA-[2,3-e]-1H-1-METHYL INDOLE DERIVATIVE AND USE THEREOF

Настоящее изобретение относится к области органической химии, к гетероциклическим соединениям, содержащим пятичленные кольца, конденсированные с другими ядрами, с одним атомом азота в качестве гетероатома, а именно к индолам, только с атомами водорода или радикалами, содержащими только атомы водорода и углерода, непосредственно связанные с атомами углерода гетероциклического кольца, с замещенными углеводородными радикалами, связанными с атомами углерода гетероциклического кольца, касается производного 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-6,7-дигидроциклогепта-[2,3-e]-1H-1-метилиндола и его применения в качестве активного компонента противоопухолевых лекарственных средств для лечения онкологических заболеваний.
В настоящее время онкологические заболевания являются одной из основных причин смерти во всем мире. В 2007 году зарегистрировано 7,9 миллиона случаев смерти от этой болезни. По прогнозам, число случаев смерти от онкологических заболеваний в мире будет продолжать расти и в 2030 году достигнет 12 миллионов. В связи с этим, синтез новых соединений и создание на их основе противоопухолевых препаратов, обладающих улучшенными фармакокинетическими свойствами, является актуальной задачей здравоохранения.
Известны химические соединения, противоопухолевое действие которых заключается в ингибировании митоза активно пролиферирующих опухолевых клеток.
Цитотоксическая и противоопухолевая активность известных антимитотических соединений обусловлена нарушением обратимости процесса полимеризации и деполимеризации белковых молекул α- и β-тубулина, что приводит к нарушению формирования митотического веретена, образование которого предшествует делению клетки (Biochem. Pharmacol., 1976, 25, 138).
Известно достаточно большое количество химических соединений, обладающих цитотоксической активностью по отношению ко многим видам опухолевых клеток. К таким соединениям относятся алкалоиды ряда колхицина, комбретастатин A-4 и его производные, а также 4-арилкумарины. Однако каждый из них имеет недостатки.
Недостатком комбретастатина A-4 (US 4996237 (A), опубл. 1991.02.26, кл. С07С 43/23, C07D 317/64, А61К 31/075) и его производных (US 2009186857 (A1), опубл. 2009.07.23, кл. A61K 31/66) является низкая эффективность за счет нежелательных побочных эффектов при применении in vivo вследствие их самопроизвольного превращения из активной цис-формы в неактивную транс-форму (Curr. Opin. Pharmacol., 2001, 1,370).
4-арилкумарины проявляют низкую антипролиферацинную и апоптозиндуцирующую активность по сравнению с производными комбретастатина и колхицина [J. Med. Chem. 2003, 46, 5437; J. Med. Chem. 2011, 54, 3153].
Недостатком колхицина и его производных (например: WO 2011022805 (A1), опубл. 2011.03.03, кл. А61К 31/165, A61P 35/00, C07C 233/32; WO 2010105172 (A1), опубл. 2010.09.16, кл. A01N 37/18, A61K 31/16; EP 2056812 А1, опубл. 2009.05.13, кл. A61K 31/165, A61P 35/04; US 2004204370 (A1), опубл. 2004.10.14, кл. С07С 323/41, С07С 323/42, С07С 323/60) является возникновение побочных эффектов при их применении, в частности, значительная неспецифическая токсичность (Med. Res. Rev. 2008, 28, 155-183; Chem. Nat. Prod. 1998, 34, 343), что делает невозможным их использование в качестве противоопухолевых препаратов.
Колхицин, известный по A. Brossi Ed. The Alkaloids, Academic Press, New York, 1984, 23, по заявке WO 2011022805 (A1), опубл. 2011.03.03, кл. A61K 31/165, A61P 35/00, C07C 233/32 представлен формулой:
В задачу изобретения положено создание нового производного 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-6,7-дигидроциклогепта-[2,3-е]-1Н-1-метилиндола и его применение в качестве активного компонента противоопухолевых лекарственных средств для лечения онкологических заболеваний.
Технический результат от использования изобретения заключается в повышении апоптозиндуцирующей активности и активности при ингибировании пролиферации опухолевых клеток, снижении неспецифической токсичности.
Это достигается тем, что производное 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-6,7-дигидроциклогепта-[2,3-е]-1H-1-метилиндола представлено общей формулой:
3
где Х - заместитель, Х= =O, -ОН, N, NHAc;
при Х= =O, производное представляет собой 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-1Н-6,7-дигидро-1-оксоциклогепта[2,3-е]1Н-1-метилиндол;
при Х=ОН, производное представляет собой 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-1Н-6,7-дигидро-1-гидроксициклогепта[2,3-е]-1Н-1-метилиндол;
3
при X=N, производное представляет собой 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-1Н-6,7-дигидро-1-азидоциклогепта[2,3-е]-1Н-1-метилиндол;
при X=NHAc, производное представляет собой 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-1Н-6,7-дигидро-1-ацетамидоциклогепта[2,3-е]-1Н-1-метилиндол.
Это достигается также тем, что производное 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-6,7-дигидроциклогепта-[2,3-е]-1H-1-метилиндола применяют в качестве активного компонента противоопухолевого лекарственного средства для лечения онкологических заболеваний.
На фиг.1 представлена общая схема получения производного 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-6,7-дигидроциклогепта-[2,3-е]-1H-1-метилиндола, в котором группа Х соответствует карбонильной группе.
На фиг.2 представлена общая схема получения производного 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-6,7-дигидроциклогепта-[2,3-е]-1Н-1-метилиндола, в котором группа Х соответствует гидроксильной группе, или азидной группе, или ацетамидной группе.
На фиг.3 представлена Таблица 1 «Результаты биологических испытаний, отражающие активность при ингибировании пролиферации опухолевых клеток и апоптозиндуцирующую активность производных 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-6,7-дигидроциклогепта-[2,3-е]-1Н-1-метилиндола по отношению к клеткам BJAB».
На фиг.1-3:
1a - 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-1H-6,7-дигидро-1-оксоциклогепта[2,3-е]-1H-1-метилиндол, в котором группа Х соответствует карбонильной группе,
1b - 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-1H-6,7-дигидро-1-гидроксициклогепта[2,3-е]-1Н-1-метилиндол, в котором группа Х соответствует гидроксильной группе,
1с - 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-1H-6,7-дигидро-1-азидоциклогепта[2,3-е]-1H-1-метилиндол, в котором группа Х соответствует азидной группе,
1d - 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-1H-6,7-дигидро-1-ацетамидоциклогепта[2,3-е]-1H-1-метилиндол, в котором группа Х соответствует ацетамидной группе,
Производное 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-6,7-дигидроциклогепта-1H-1-метилиндола по 1 варианту представлено общей формулой:
где Х - заместитель.
При синтезе 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-6,7-дигидроциклогепта-[2,3-е]-1H-1-метилиндола путем введения в него карбонильной группы Х= =O, производное представляет собой 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-1H-6,7-дигидро-1-оксоциклогепта-[2,3-е]-1Н-1-метилиндол.
При синтезе 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-6,7-дигидроциклогепта-[2,3-е]-1H-1-метилиндола путем введения в него гидроксильной группы Х= ОН, производное представляет собой 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-1H-6,7-дигидро-1-гидроксициклогепта-[2,3-е]-1Н-1-метилиндол.
3
При синтезе 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-6,7-дигидроциклогепта-[2,3-е]-1H-1-метилиндола путем введения в него азидной группы Х=N, производное представляет собой 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-1H-6,7-дигидро-1-азидоциклогепта-[2,3-е]-1H-1-метилиндол.
При синтезе 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-6,7-дигидроциклогепта-[2,3-е]-1H-1-метилиндола путем введения в него ацетамидной группы Х=NHAc, производное представляет собой 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-1H-6,7-дигидро-1-ацетамидоциклогепта-[2,3-е]-1Н-1-метилиндол.
Применяют производное 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-6,7-дигидроциклогепта-[2,3-е]-1H-1-метилиндола в качестве активного компонента противоопухолевого лекарственного средства для лечения онкологических заболеваний.
Получение производного 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-6,7-дигидроциклогепта-[2,3-е]-1Н-1-метилиндола осуществляют следующим образом.
2
2
3
2
2
2
2
3
4
2
2
3
4
f
3
2
2
3
3
3
3
3
13
16
5
1
13
-1
+
+
Сначала синтезируют метиловый эфир 3-(2'-бромо-3',4',5'-триметокси-6'-йодофенил)пропановой кислоты. Для этого раствор брома (2 мл, 0.039 моль) в ледяной уксусной кислоте (10 мл) прикалывают к раствору 3-(3',4',5'триметоксифенил)пропановой кислоты (10 г, 0.039 моль) в уксусной кислоте (10 мл). Реакционную смесь перемешивают до исчезновения окраски брома (~2 ч), разбавляют водой (100 мл) и оставляют в холодильнике на 12 часов. Образовавшиеся белые кристаллы отделяют на фильтре Шотта, промывают водным раствором NaSO, водой и сушат при пониженном давлении при температуре 70°С. Полученный продукт (10.1 г, 0.03 моль, 78%) растворяют в CHCl (50 мл), прибавляют трифторацетат серебра (7.1 г, 0.032 моль), после чего прикалывают раствор йода (7.6 г, 0.03 ммоль) в СН2С12 (200 мл) в течение 6 ч при комнатной температуре. Перемешивание продолжают в течение часа. Реакционную смесь фильтруют через Celite, фильтрат промывают насыщенным водным раствором NaSO (100 мл), водой (100 мл), насыщенным водным раствором МаНСОз (100 мл), сушат над MgSO, растворитель удаляют при пониженном давлении. Полученный продукт (13.4 г, 97%, желтое твердое соединение) растворяют EtO (150 мл), раствор охлаждали до 0°С, после чего действуют ~0.3 М раствором диазометана в EtO до достижения полной конверсии субстрата (ТСХ-контроль). Избыток диазометана удаляют действием уксусной кислоты (1 мл). Полученный раствор промывают насыщенным водным NaHCO (3×100 мл), сушат над MgSO, растворитель удаляют при пониженном давлении. После проведения колоночной хроматографии на силикагеле (элюент EtOAc/СуН, 1:5) метиловый эфир 3-(2'-бромо-3',4',5'-триметокси-6'-йодофенил)пропановой кислоты (12.9 г, 72% после 3-х стадий) получают в виде желтого масла, медленно кристаллизующегося при комнатной температуре. Т.пл.=63°С. R=0.43 (EtOAc/Cy, 1:4). H ЯМР (300 МГц, CDCl, 25°С): δ = 2.47-2.59 (м, 2Н, CHC(O)), 3.32-3.45 (м, 2Н, ArCH, 3.71 (с, 3Н, С(О)OCH), 3.84 (с, 3Н, ArOCH), 3.87 (с, 3Н, ArOCH), 3.88 (с, 3Н, ArOCH). С ЯМР (75 МГц, CDCl, 25°С): (δ = 32.0, 37.5, 51.8, 60.7, 60.9, 61.1, 92.9, 113.9, 137.4, 144.8, 151.5, 152.9, 172.6. ИК:  = 957, 1006, 1052, 1084, 1170, 1195, 1263, 1288, 1322, 1375, 1403, 1456, 1733, 2840, 2943 см. Масс-спектр (EI): m/z (%) = 243 (15), 259 (20), 274 (15), 291 (50), 302 (14), 318 (6), 331 (100), 379 (57), 385 (8), 458 (13) [М]. Масс-спектр высокого разрешения (EI): рассчитано для CHBrIO [М] 457.9225; найдено 457.923.
2
3
2
3
3
2
2
3
3
3
3
3
3
22
24
5
1
4
3
3
3
4
13
-1
+
Затем синтезируют метиловый эфир 3-(2'-бромо-3',4',5'-триметокси-6'-(1''-метил-1H-индол-5''-ил)фенил)пропановой кислоты. Для этого пинаколовый эфир 1-метил-1H-индол-5-илборной кислоты (3 г, 12 ммоль), метиловый эфир 3-(2'-бромо-3',4',5'-триметокси-6'-йодофенил)пропановой кислоты (6 г, 13.2 ммоль), CsCO (5.9 г, 18 ммоль), Pd(ОАс) (81 мг, 0.36 ммоль) и PPh (0.283 г, 1.08 ммоль) растворяют в безводном толуоле (20 мл) в атмосфере аргона и полученную смесь перемешивают при кипячении в течение 24 часов. Реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры, фильтруют через Celite этилацетатом (100 мл) и удаляют растворители при пониженном давлении. После проведения колоночной хроматографии на силикагеле (элюент EtOAc/CyH, 1:5) получают метиловый эфир 3-(2'-бромо-3',4',5'-триметокси-6'-(1''-метил-1H-индол-5''-ил)фенил)пропановой кислоты (5.3 г, 96%) в виде твердого желтого соединения. Т.пл.=92°С. Ry=0.25 (EtOAc/CyH, 1:5). H ЯМР (300 МГц, CDCl, 25°С): δ = 2.39-2.44 (м, 2Н, CH), 2.85-2.91 (м, 2Н, CH), 3.52 (с, 3Н, OCH), 3.54 (с, 3Н, OCH), 3.83 (с, 3Н, NCH), 3.94 (с, 3Н, OCH), 3.95 (с, 3Н, OCH), 6.48 (д, J=3.1 Гц, 1Н, 3''-Н), 7.01 (дд, J=1.5 Гц, J=8.4 Гц, 1Н, 6''-Н), 7.09 (д, J=3.1 Гц, 1Н, 2''-Н), 7.36 (д, J=8.4 Гц, 1Н, 7''-Н), 7.40 (д, J=1.5 Гц, 1Н, 4''-Н). С ЯМР (75 МГц, CDCl, 25°С): δ = 28.9, 32.9, 33.5, 51.4, 60.9, 60.9, 61.0, 101.1, 109.0, 114.7, 121.5, 123.2, 127.3, 128.3, 129.2, 134.7 (2С), 136.0, 145.5, 150.2, 151.4, 172.9. ИК:  = 966, 1013, 1050, 1082, 1170, 1194, 1257, 1323, 1396, 1411, 1445, 1460, 1734, 2931 см. Масс-спектр (EI): m/z (%) = 205 (26), 221 (26), 234 (25), 250 (34), 264 (21), 278 (26), 294 (41), 308 (100), 351 (18), 382 (61), 388 (9), 461 (56) [M]. Масс-спектр высокого разрешения (EI): рассчитано для CHBrNO [M]+ 461.0838; найдено 461.084.
4
3
2
2
3
3
3
3
3
21
22
5
1
4
4
3
3
4
13
-1
+
+
Затем синтезируют 3-(2'-Бромо-3',4',5'-триметокси-6'-(1''-метил-1H-индол-5''-ил)фенил)пропановая кислоту. Для этого к раствору метилового эфира 3-(2'-бромо-3',4',5'-триметокси-6'-(1''-метил-1H-индол-5''-ил)фенил)пропановой кислоты (5 г, 11.2 ммоль) в ТГФ/МеОН (2:1, 75 мл) медленно прибавляют 1н водный раствор LiOH (25 мл). Реакционную смесь перемешивают 1 ч при 50°С, после чего охлаждают до комнатной температуры, доводят до рН=6 действием 1 н водного раствора HCl, органические растворители удаляют при пониженном давлении. Остаток экстрагируют метал-трет-бутиловым эфиром (4×50 мл), объединенный органический слой промывают насыщенным водным раствором NaCl (3×50 мл) и сушат над MgSO. После удаления растворителя при пониженном давлении и проведения колоночной хроматографии на силикагеле (элюент EtOAc/СуН, 1:2) получают 3-(2'-бромо-3',4',5'-триметокси-6'-(1''-метил-1Н-индол-5''-ил)фенил)пропановая кислота (4.32 g, 89%) в виде бело-розового поликристаллического порошка. Т.пл. = 159°С. Ry=0.25 (EtOH/EtOAc/CyH, 1:1:7). H ЯМР (300 МГц, CDCl, 25°С): δ = 2.38-2.43 (м, 2Н, CH), 2.78-2.89 (м, 2Н, CH), 3.50 (с, 3Н, OCH), 3.80 (с, 3Н, NCH), 3.92 (с, 3Н, OCH), 3.93 (с, 3Н, OCH), 6.44 (д, J=3.0 Гц, 1Н, 3''-Н), 6.97 (дд, J=1.4 Гц, J=8.4 Гц, 1Н, 6''-Н), 7.04 (д, J=3.0 Гц, 1Н, 2''-Н), 7.32 (д, J=8.4 Гц, 1Н, 7''-Н), 7.36 (д, J=1.4 Гц, 1Н, 4''-Н). С ЯМР (75 МГц, CDCl, 25°С): δ = 28.7, 32.9, 33.3, 60.9, 61.0, 61.1, 101.2, 109.1, 114.7, 121.5, 123.1, 127.2, 128.4, 129.2, 134.4, 134.8, 136.0, 145.6, 150.2, 151.5, 177.7. ИК:  = 967, 1013, 1052, 1082, 1257, 1322, 1397, 1411, 1446, 1461, 1706, 2928 см. Масс-спектр (EI): m/z (%) = 194 (60), 205 (28), 221 (26), 236 (31), 250 (37), 264 (19), 278 (28), 294 (70), 309 (55), 338 (12), 353 (22), 373 (14), 388 (14), 447 (100) [М]. Масс-спектр высокого разрешения (EI): рассчитано для CHBrNO [M] 461.0681; найдено 447.068.
Синтез 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-1Н-6,7-дигидро-1-оксоциклогепта-[2,3-е]-1Н-1-метилиндола (1а) осуществляют следующим образом.
3
2
2
2
2
3
2
2
4
4
f
3
2
2
3
3
3
3
21
21
4
1
3
5
3
3
3
5
13
+
3-(2'-Бромо-3',4',5'-триметокси-6'-(1''-метил-1Н-индол-6''-ил)фенил)пропановую кислоту (3 г, 6.70 ммоль) растворяют в безводном CHCl (25 мл) в атмосфере аргона. Раствор охлаждают до -10°С и прибавляют 1-хлоро-N,N,2-триметилпропениламин (0.93 мл, 7.04 ммоль). Реакционную смесь перемешивают 12 ч при 0°С. Полученный раствор разбавляют CHCl (335 мл) и добавляют ZnCl (1.82 г, 13.4 ммоль) при 0°С. Температуру реакционной смеси медленно повышают до комнатной и смесь интенсивно перемешивают 2 ч. В реакционную смесь добавляют 100 мл насыщенного раствора NaHCO, органический слой отделяют, а водный слой экстрагируют CHCl (3×50 мл). Органический экстракт сушат над безводным MgSO, растворитель удаляют при пониженном давлении. Применяют колоночную хроматографию на силикагеле (элюент EtOAc/Су, 1:2) для выделения 1.15 г продуктов реакции в виде белого поликристаллического порошка. К 0.6 г полученного продукта, растворенного в безводном толуоле (5 мл) в атмосфере аргона, добавляют 2,2'-азоизобутиронитрил (0.17 г, 0.7 ммоль) и трибутилоловогидрид (0.38 мл, 1.4 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при кипячении в течение 4 ч и каждый час к смеси добавляют трибутилоловогидрид (3×(0.38 мл, 1.4 ммоль)). По завершении реакции реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры и в колбу добавляют 50 мл насыщенного водного раствора KF и полученную суспензию интенсивно перемешивают в течение 1 ч. Водный слой отделяют, экстрагируют EtOAc (3×50 мл), органический слой сушат над MgSO, растворитель удаляют при пониженном давлении. При помощи колоночной хроматографии на смеси силикагель-KF (9:1 массовое отношение) (элюент EtOAc/Cy, 2:3) выделяют соединение 1а (0.09 г) в виде бесцветного поликристаллического порошка. Т.пл.=142°С. R=0.38 (EtOAc/Cy, 2:3). H ЯМР (400 MHz, CDCl, 25°C): δ = 2.56-2.67 (м, 1Н, СН), 2.82-3.16 (м, 3Н, CH), 3.40 (с, 3Н, OCH), 3.83 (с, 3Н, NCH), 3.89 (с, 6Н, OCH), 6.61 (с, 1Н, 4-Н), 6.63 (дд, J=3.1 Hz, J=0.7 Hz, 1Н, 3'-Н), 7.12 (д, J=3.1 Hz, 1Н, 2'-Н), 7.41 (д, J=8.6 Hz, 1Н, 6'-Н), 7.45 (дд, J=8.6 Hz, J=0.7 Hz, 1Н, 7'Н). С ЯМР (101 MHz, CDCl, 25°С): δ = 30.20, 33.0, 49.3, 56.0, 60.8, 61.2, 101.2, 107.0, 111.4, 124.9, 125.5, 125.9, 126.2, 130.5, 130.6, 135.7, 136.2, 141.5, 152.4, 152.4, 207.0. Масс-спектр (EI): m/z (%) = 194 (35), 206 (23), 220 (24), 234 (15), 251 (33), 266 (12), 276 (16), 293 (30), 307 (19), 322 (21), 336 (11), 351 (100) [М]. Масс-спектр высокого разрешения (EI): вычислено для CHNO [М]+ 351.1471; найдено 351.147.
Затем синтезируют 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-1Н-6,7-дигидро-1-гидроксициклогепта-[2,3-е]-1Н-1-метилиндол (1b).
2
4
f
3
3
2
3
3
3
3
3
2
3
3
3
3
3
3
2
3
3
3
3
3
21
23
4
1
3
3
3
3
1
3
3
3
3
1
3
3
3
3
13
+
+
Для этого соединение 1а (0.34 г, 0.967 ммоль) растворяют в смеси ТГФ/МеОН (4:1, 12.5 мл). К полученному раствору медленно приливают НО (2.5 мл) и прибавляют NaBH (0.037 г, 0.967 ммоль). Реакционную смесь перемешивают в течение 3 ч при комнатной температуре, разбавляют водой (5 мл), органические растворители удаляют при пониженном давлении. После удаления растворителя при пониженном давлении получают 0.31 г (92%) соединения 1b в виде бесцветного поликристаллического порошка Т.пл.=133°С. R=0.4 (EtOAc/Cy, 1:1 В спектрах ЯМР зарегистрированных в CDCl присутствуют два конформера с соотношением 5:3. Химические сдвиги для основного конформера: H ЯМР (300 MHz, CDCl, 25°C): δ = 2.22-2.54 (м 4Н, CH), 3.58 (с, 3Н, OCH), 3.80 (с, 3Н, NCH), 3.90 (с, 3Н, OCH), 3.92 (с, 3 Н, OCH), 4.92-4.97 (м, 1Н, 7-Н), 6.59 (с, 1Н, 4-Н), 7.05 (д, J=3.1 Hz, 1Н, 3'-Н), 7.10 (д, J=3.1 Hz, 1Н, 2'-Н), 7.27 (д, J=8.7 Hz, 1Н, 6'-Н), 7.34 (д, J=8.7 Hz, 1Н, 7'-Н). Химические сдвиги для не основного конформера: H ЯМР (300 MHz, CDCl, 25°С): δ = 2.22-2.54 (м, 4Н, CH), 3.55 (с, 3Н, OCH), 3.81 (с, 3Н, NCH), 3.90 (с, 3Н, OCH), 3.92 (с, 3Н, OCH), 5.35-5.40 (м, 1Н, 7-Н), 6.53 (д, J=3.1 Hz, 1Н, 3'-Н), 6.67 (с, 1Н, 4-Н), 7.06 (д, J=3.1 Hz, 1Н, 2'-Н), 7.31 (д, J=8.7 Hz, 1Н, 6'-Н), 7.43 (д, J=8.7 Hz, 1Н, 7'-Н). В ЯМР-спектрах, зарегистрированных в CDOD присутствует набор сигналов для одного конформера: H ЯМР (300 MHz, CDOD, 25°С): δ = 2.18-2.49 (м, 4Н, CH), 3.51 (с, 3Н, OCH), 3.84 (с, 3Н, NCH), 3.90 (с, 3Н, OCH), 3.91 (с, 3Н, OCH), 4.80-4.86 (м, 1Н, 7-Н), 6.75 (с, 1Н, 4-Н), 7.10 (д, J=3.1 Hz, 1Н, 3'-Н), 7.14 (д, J=3.1 Hz, 1Н, 2'-Н), 7.25 (д, J=8.5 Hz, 1Н, 6'-Н), 7.31 (д, J=8.5 Hz, 1Н, 7'-Н). С ЯМР (75 MHz, CDOD, 25°С): δ = 31.6, 32.9, 42.2, 56.6, 61.0, 61.6, 73.3, 103.0, 108.0, 108.9, 124.6 (d), 124.7, 126.0, 127.8, 129.2, 134.7, 137.5, 138.6, 142.1, 151.7, 153.4. Масс-спектр (EI): m/z (%) = 191 (16), 206 (15), 218 (13), 234 (14), 250 (13), 264 (9), 278 (13), 293 (19), 309 (9), 324 (11), 335 (11), 353 (100) [М]. Масс-спектр высокого разрешения (EI): вычислено для CHNO [M]353.1627; найдено 353.162.
Затем синтезируют 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-1H-6,7-дигидро-1-азидоциклогепта-[2,3-е]-1Н-1-метилиндол (1с).
3
2
f
f
3
3
2
3
3
3
3
3
2
3
3
3
3
3
21
22
4
3
1
1
3
3
3
3
13
13
+
+
Для этого к суспензии соединения 1b (0.250 г, 0.708 ммоль), Zn(N)·2Py (0.164 г, 0.531 ммоль) и трифенилфосфина (0.371 г, 1.416 ммоль) в безводном толуоле (3 мл) по каплям добавляют диизопропилазодикарбоксилат (0.28 мл, 0.202 ммоль). После перемешивания в течение 0.5 ч при комнатной температуре реакционную смесь разбавляют EtOAc, фильтруют через Селит и растворитель удаляют при пониженном давлении. При помощи колоночной хроматографии на силикагеле (элюент EtOAc/Cy, 1:5) выделяют 0.24 г (89%) продукта 1с в виде бесцветного масла R=0.43, R=0.48 (EtOAc/Cy, 1:5). В спектрах ЯМР зарегистрированных в CDCl присутствуют два конформера с соотношением 5:3. Химические сдвиги для основного конформера: Н ЯМР (300 MHz, CDCl 25°С): δ = 2.15-2.55 (м, 4Н, CH), 3.61 (с, 3Н, OCH), 3.82 (с, 3Н, NCH), 3.90 (с, 3Н, OCH), 3.93 (с, 3Н, OCH), 4.75-4.84 (м, 1Н, 7-Н), 6.60 (с, 1Н, 4-Н), 7.06-7.11 (м, 2Н, 3'-Н, 6'-Н), 7.31-7.39 (м, 2Н, 2'-Н, 7'-Н). Химические сдвиги для не основного конформера: H ЯМР (300 MHz, CDCl, 25°С): δ = 2.15-2.55 (м, 4Н, CH), 3.58 (с, 3Н, OCH), 3.83 (с, 3Н, NCH), 3.90 (с, 3Н, OCH), 3.93 (с, 3Н, OCH), 5.36-5.42 (м, 1Н, 7-Н), 6.53 (д, J=3.1 Hz, 1Н, 3'-Н), 6.60 (с, 1Н, 4-Н), 7.08 (д, J=3.1 Hz, 1H, 2'-Н), 7.31 (д, J=8.4 Hz, 1H, 6'-Н), 7.49 (д, J=8.4 Hz, 1H, 7'-Н). Химические сдвиги в С ЯМР спектре приведены для смеси конформеров: С ЯМР (75 MHz, CDCl, 25°С): δ = 30.8, 31.0, 32.9, 33.0, 38.7, 38.8, 55.9, 56.0, 60.1, 60.7, 60.8, 61.1, 62.7, 98.2, 101.0, 107.4, 107.5, 108.0, 108.6, 124.0, 124.2, 125.0, 125.9, 126.7, 127.0, 127.6, 128.2, 128.7, 128.9, 129.1, 135.0, 135.6, 136.8, 141.2, 150.9, 151.0, 152.1, 152.4. Масс-спектр (EI): m/z (%) = 193 (26), 206 (23), 221 (18), 234 (13), 249 (15), 264 (16), 277 (17), 291 (23), 307 (66), 320 (9), 335 (100), 350 (9), 378 (22) [М]. Масс-спектр высокого разрешения (EI): вычислено для CHNO [M] 378.1692; найдено 378.169.
Затем синтезируют 1',2',3'-гриметоксибеизо[4',5':4,5]-1Н-6,7-дигидро-1-ацетамидоциклогепта-[2,3-е]-1H-1-метилиндол (1d).
4
2
4
2
2
2
2
4
2
2
f
f
2
2
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
23
26
2
4
1
3
3
13
1
3
3
+
+
Для этого 1 М раствора LiAlH в EtO (0.28 мл, 0.28 ммоль) прибавляют по каплям к соединению 1с (0.07 г, 0.185 ммоль) в ТГФ (1 мл). После перемешивания в течение 24 ч к реакционной смеси последовательно прибавляют воду (5 мл) и 2 М водного раствора NaOH (5 мл). Водную фазу экстрагируют метилтрет-бутиловым эфиром (3×15 мл), органический экстракт сушат над MgSO и растворитель удаляют при пониженном давлении. Полученный продукт растворяют в CHCl (1 мл) и прибавляют к раствору пиридин (0.06 мл, 0.74 ммоль) и уксусный ангидрид (0.06 мл, 0.64 ммоль). Реакцию проводят в атмосфере аргона. Через 0.5 ч к реакционной смеси добавляют воду (10 мл), органический слой отделяют, а водный слой экстрагируют CHCl (3×15 мл). Органический экстракт промывают 10% раствором HCl (10 мл) и насыщенным раствором NaCl (10 мл), сушат над MgSO легколетучие продукты удаляют при пониженном давлении. При помощи колоночной хроматографии на силикагеле (элюент CHCl/МеОН, 20:1) выделяют 0.063 г (87%) получают соединение 1d в виде бесцветных кристаллов. Т.пл.=175°С. R=0.30, R=0.33 (CHCl/MeOH, 30:1). В ЯМР спектрах, зарегистрированных в CDCl присутствуют два набора сигналов с соотношением 5:1. Химические сдвиги для основного конформера: H ЯМР (600 MHz, CDCl, 25°С): δ = 1.56 (с, 3Н, С(О)CH), 2.64-2.25 (м, 4Н), 3.56 (с, 3Н, OCH), 3.80 (с, 3Н, NCH), 3.92 (с, 6Н, OCH), 5.75 (м, 1Н, 7-Н), 6.67 (с, 1Н, 4-Н), 6.71 (д, J=2.9 Hz, 1Н, 3'-Н), 7.07 (д, J=2.9 Hz, 1Н, 2'-Н), 7.30 (д, J=8.5 Hz, 1Н), 7.37 (д, J=8.5 Hz, 1Н, 7'-Н). С ЯМР (150 MHz, CDCl, 25°С): δ = 23.3, 31.2, 33.0, 40.9, 47.7, 56.1, 60.4, 61.2, 99.3, 108.0, 108.1, 124.9, 125.2, 126.9, 127.3, 129.0, 131.0, 136.0, 136.4, 141.4, 151.1, 152.5, 168.2. Химические сдвиги для не основного конформера: H ЯМР (600 MHz, CDCl, 25°С): δ = 1.24 (с, 3Н, С(О)CH), 2.64-2.25 (м, 4Н), 3.49 (с, 3Н, OCH), 3.78 (с, 3Н, OCH), 3.88 (с, 3Н, NCH), 3.93 (с, 3Н, OCH), 5.00 (м, 1Н, 7-Н), 6.56 (с, 1Н, 4-Н), 6.63 (д, J=2.5 Hz, 1Н, 3'-Н), 7.04 (д, J=2.5 Hz, 1Н, 2'-Н), 7.25 (д, J=8.4 Hz, 1Н), 7.35 (д, J=8.4 Hz, 1Н, 7'-Н. Масс-спектр (EI): m/z (%) = 193 (28), 206 (31), 219 (20), 234 (26), 248 (14), 262 (21), 277 (32), 290 (19), 305 (60), 320 (52), 335 (63), 394 (100) [М]. Масс-спектр высокого разрешения (EI): вычислено для CHHO [М] 394.1892; найдено 394.189.
Биологические испытания.
Заявляемые производные 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-6,7-дигидроциклогепта-[2,3-е]-1H-1-метилиндола были испытаны с целью определения их активности при ингибировании пролиферации опухолевых клеток, апоптозиндуцирующей активности, а также неспецифической токсичности по отношению к клеточной линии лимфомы Беркитта BJAB.
5
5
Клетки BJAB культивировали на питательной среде RPMI 1640 (GIBCO, Invitrogen, Karlsruhe, Germany) с добавлением 10% (по объему) инактивированной нагреванием эмбриональной телячьей сыворотки (FCS), 0.56 г/л L-глутамина, 100,000 I.U. пенициллина и 0.1 г/л стрептомицина. Клетки пассировали 2 раза в неделю. За 24 ч до анализа количество клеток доводили до концентрации 3×10 клеток/мл для стандартизации условий роста. Для оценки пролиферации и апоптоза клетки разводили до количества 1×10 клеток/мл непосредственно перед воздействием соответствующими соединениями.
Оценка выхода лактатдегидрогеназы (ЛДГ): измерение неспецифичесой цитотоксичности:
Цитотоксичность различных соединений измеряли по выходу ЛДГ с использованием стандартного набора реактивов фирмы Boehringer Mannheim {Mannheim, Germany). За 100% клеточной гибели принимали максимальную активность фермента ЛДГ, вышедшего в среду инкубации при лизисе клеток 0.1% Тритоном Х-100. Оценка пролиферации: определение количества клеток и клеточной выживаемости:
5
5
50
Выживаемость клеток определяли с использованием системы для подсчета и анализа клеток CASYR (Reutlingen, Germany). Система была настроена под используемые клетки. Система позволяет определять одновременно 3 группы клеток: клеточные остатки, мертвые клетки и живые клетки. Клетки рассеивали в концентрации 1×10 на 1 мл и добавляли различные концентрации аналогов колхицина; клетки, не подвергавшиеся воздействию, служили контролем. После инкубации в течение 24 ч клетки ресуспендировали в полной среде, и 100 мкл каждого образца тщательно разводили в 10 мл CASYRтонa (готового к использованию изотонического раствора) для последующего подсчета клеток. Ингибирование пролиферации представляли как показатель IC, который означает концентрацию соединения, вызывающую снижение числа живых клеток на 50%. Концентрацию клеток 2×10 клеток/мл принимали за 100%.
Оценка апоптоза: измерение уровня фрагментации ДНК:
5
50
Апоптотическую гибель клеток определяли методом анализа клеточного цикла, который детектирует фрагменты ДНК на уровне единичной клетки. Клетки рассеивали в количестве 1×10 клеток/мл и добавляли различные концентрации аналогов колхицина. После инкубации в течение 72 ч при температуре 37°С клетки центрифугировали на 150 об/мин в течение 5 мин, отмывали фосфатным буфером (PBS) при 4°С и фиксировали смесью PBS и 2% формальдегида (1:1 по объему) на льду в течение 30 мин. Затем клетки осаждали, инкубировали с раствором этанола и PBS (2:1 по объему) 15 мин, снова осаждали и ресуспендировали в PBS, содержащем 40 мкг/мл рибонуклеазы (RNase). РНК расщепляли в течение 30 мин при температуре 37°С, после чего клетки опять осаждали и ресуспендировали в PBS, содержащем 50 мкг/мл пропидий йодида. Фрагментация ядерной ДНК количественно оценивалась с помощью проточной цитометрии по гиподиплоидной ДНК. Сбор и анализ данных производился на приборе FACScalibur (Becton Dickinson, Heidelberg, Germany) с программным обеспечением CellQuest. Данные представляли в виде процента гипоплоидии (subG1), который отражает число апоптотических клеток. Уровень апоптоза оценивали по показателю АС, который означает апоптоз 50% клеток.
Результаты биологических испытаний представлены в Таблице 1. Из таблицы 1 видно, что соединения 1а-с не вызывают некроз опухолевых клеток BJAB в концентрации 100 мкМ (по данным оценки выхода лактатдегидрогеназы). Соединение 1d вызывает некроз не более 4% опухолевых клеток BJAB в концентрации 100 мкМ. Это означает, что соединения 1a-d не проявляют неспецифической токсичности по отношению к BJAB клеткам в концентрациях, значительно превышающих терапевтические.
Приведенные данные демонстрируют, что заявляемые производные 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-6,7-дигидроциклогепта-[2,3-е]-1H-1-метилиндола обладают более высокими значениями активности при ингибировании пролиферации опухолевых клеток, большими значениями апоптозиндуцирующей активности и меньшей неспецифической токсичностью по сравнению с колхицином.
Заявляемые производные 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-6,7-дигидроциклогепта-[2,3-е]-1H-1-метилиндола могут быть использованы для лечения онкологических заболеваний, связанных с неоваскуляризацией новообразований. Это относится, в частности, к лимфомам, к солидным (твердым) опухолям типа карцином и аденокарцином молочной железы, раку легких и т.д. Кроме того, они могут применяться в терапии в сочетании с другими химиотерапевтическими препаратами, а также после хирургических операций и при облучении.
Применение предложенных производных 1',2',3'-триметоксибензо[4',5':4,5]-6,7-дигидроциклогепта-[2,3-е]-1H-1-метилиндолов в качестве активного компонента лекарственного средства для лечения онкологических заболеваний обеспечивает повышение апоптозиндуцирующей активности и активности при ингибировании пролиферации опухолевых клеток, снижение неспецифической токсичности.