СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ УПРУГОСТИ КЛЕТОК КРОВИ
METHOD FOR BLOOD CELL ELASTICITY TEST

Изобретение - способ определения упругости клеток крови относится к области физиологии крови и может быть использован для изучения свойств поверхности нативных клеток методом силовой спектроскопии.
-2
-1
В области сканирующей зондовой микроскопии известны способы определения упругости биологических объектов методом силовой спектроскопии. В основе этого метода лежит измерение степени деформации поверхности образца при взаимодействии его с вершиной зонда АСМ [1]. Для АСМ спектроскопии рекомендованы способы измерения упругости зондами с «мягкой балкой», константа жесткости которой находится в пределах 10-10 Н/м, позволяющей исследовать мягкие биологические образцы [2]. Однако главным недостатком этих способов является малый радиус АСМ-зонда, который легко нарушает целостность биологической мембраны, протыкая ее своим острием.
Известны способы изучения свойств поверхности биологических объектов с использованием сенсоров, в качестве которых выступают биологические молекулы, одиночные клетки и слои, иммобилизованные на титановых tipless кантилеверах [3]. Основным недостатком таких способов является использование в качестве сенсоров биологических объектов, не откалиброванных размеров, т.е. точная форма вершины каждого конкретного зонда неизвестна. В результате довольно сложно получить количественные значения упругости. Помимо этого биологические сенсоры не пригодны для измерения упругости клеток крови, т.к. вступают с ними во взаимодействие за счет сил адгезии.
Наиболее близким по своей сущности к заявляемому является способ измерения модуля Юнга биологических объектов в жидкой среде с помощью специального зонда АСМ [4], включающий измерение упругости поверхности кровеносного сосуда. Для осуществления способа изготавливают зонд следующим образом:
1) высаживают кварцевые шарики диаметром 5 мкм на стеклянную подложку и высушивают их;
2) наносят небольшое количество эпоксидного клея на другую часть стеклянной подложки;
3) устанавливают tipless контилеверы, марки CSC12 фирмы MicroMash (жесткость 0,6 Н/м), в держатель АСМ, пьезосканер которого используется в качестве прецизионного манипулятора;
4) свободный конец tipless контилевера приводят в соприкосновение с каплей жидкости клея, а затем опускают на отдельно лежащий кварцевый шарик (под контролем оптического микроскопа);
5) tipless контилевер извлекают из микроскопа и оставляют до полного затвердевания эпоксидного клея.
С помощью созданного зонда проводят измерения упругих свойств поверхности брюшной аорты лабораторной крысы. Для этого фрагмент кровеносного сосуда разрезают вдоль, закрепляют на твердом основании в жидкостной ячейке АСМ. Сканирование производят в жидкостной ячейке с помощью микроскопа «Solver-Bio» (производитель НТ-МДТ). Получают серию силовых кривых, на основании которых рассчитывают модуль Юнга в соответствии с моделью Герца.
Недостатком изложенного способа является использование в качестве зонда кварцевых шариков, которые являются жесткими, несмотря на большой радиус закругления, в результате они изменяют свойства клеточной поверхности, оставляя на ней вдавливания. Использование в процессе прикрепления шарика к tipless контилеверу эпоксидного клея создает риск получения хрупкого tipless контилевера при несоблюдении пропорций при разведении эпоксидной смолы с отвердителем. Длительная сушка (до 1 суток) зондов до полного затвердевания клея ограничивает время исследования живых клеток. Сканирование стенки сосуда, закрепленного на твердом основании, изменяет силы поверхностного натяжения клеточной поверхности, что приводит к завышенным значениям модуля Юнга. Кроме того, использование в процессе выполнения силовой спектроскопии жидкостной ячейки, заполненной физиологическим раствором, создает дополнительные силы при отводе зонда от поверхности образца, что негативно влияет на достоверность полученных результатов.
Задачей предлагаемого изобретения является создание способа исследования упругих свойств клеток крови, который не вызывает механического повреждения клеток, не нарушает целостность их мембран и сводит к минимуму адгезию зонда к поверхности клетки, позволяющего получать наиболее достоверные результаты.
Поставленная задача решается с помощью предлагаемого способа определения упругости клеток крови, включающего изготовление tipless контилевера, закрепление биологической ткани, сканирование клеток ткани, получение силовых кривых, расчет модуля Юнга, причем tipless контилевер изготавливают на основе полых полимерных микросфер диаметром 10 мкм, которые прикрепляют в режиме силовой спектроскопии на tipless контилевер, предварительно обработанный густым раствором желатина и охлажденный на воздухе в течение 2-3 минут. Полые полимерные микросферы расположены на противоположном участке той же стеклянной подложки, что и суспензия с живыми клетками. Для сохранения нативных свойств клеток стеклянную подложку помещают в камеру, насыщенную парами воды, и сначала проводят силовую спектроскопию на участке стеклянной подложки, где расположены полые полимерные микросферы, осуществляя подвод tipless контилевера на отдельно лежащую полую полимерную микросферу, а после прикрепления ее к tipless контилеверу область сканирования переводят на суспензию клеток и, не отрываясь от образца, производят регистрацию силовых кривых не менее 20 клеток.
Предлагаемый способ позволит получить объективные данные об упругих свойствах клеток крови за счет использования модифицированных АСМ-зондов, которые не будут изменять свойства поверхности, т.к. полые полимерные микросферы являются инертными и достаточно мягкими, не будут оставлять повреждений после контакта с клеточной поверхностью, кроме того, применение желатина для их приклеивания позволит сохранить оптимальный баланс сил при выдвижении пьезосканера и надавливании на клетку с определенной силой, исключения механического воздействия на клетку в процессе приготовления препарата, использования влажной камеры, создающей оптимальные условия для сохранения нативной формы клеток. Модификация tipless контилеверов полыми полимерными микросферами на одной стеклянной подложке с клетками крови позволяет сократить время исследования и увеличивает скорость манипулирования объектами, за счет быстрой смены областей сканирования.
Отличительными признаками заявленного способа являются:
- использование модифицированных АСМ-зондов на основе полых полимерных микросфер диаметром 10 мкм, которые являются инертными и мягкими, таким образом, исключается повреждение клеток в процессе их контакта;
- использование густого раствора желатина для обработки tipless контилеверов поддерживает оптимальный баланс сил при выдвижении пьезосканера и надавливании на клетку с определенной силой, что позволяет избежать воздействия на поверхность чрезмерных нагрузок при силовом надавливании;
- изготовление АСМ-зондов в процессе проведения силовой спектроскопии, что позволяет экономить время исследования и увеличивает скорость манипулирования объектами за счет быстрой смены областей сканирования на одной подложке;
- использование в процессе сканирования влажной камеры для создания условий, обеспечивающих сохранение нативного функционально активного и морфологически неизменного состояния клеток в течение времени, достаточного для сканирования образцов.
Предлагаемый способ осуществляют следующим образом. Готовят густой раствор желатина, в котором ополаскивают tipless контилевер, дают ему немного остыть и подсохнуть на воздухе в течение 2-3 минут, не доводя до превращения желатина в гель. Готовят суспензию клеток крови путем нанесения ее на один край предметного стекла, на другой край стекла наносят водную суспензию полых полимерных микросфер (PS, производитель Micropartieles GmbH, Германия). Помещают во влажную камеру, насыщенную парами воды, предметное стекло с исследуемым препаратом на одном его участке, а на противоположном участке нанесены полые полимерные микросферы. Сначала проводят процедуру силовой микроскопии на участке предметного стекла, где расположены микросферы, осуществляя подвод tipless контилевера к отдельно лежащей полой микросфере. Изменяют область сканирования, перемещаясь на противоположный край препарата, где расположена суспензия клеток, и осуществляют процедуру силовой микроскопии клетки. Регистрируют силовые кривые отвода и подвода tipless контилевер с поверхности 20 клеток. Рассчитывают упругость клеток с помощью программного обеспечения Nova.
Пример.
Способ определения упругости лимфоцитов крови больных лейкозом и здоровых доноров во влажной камере с помощью модифицированного АСМ-зонда.
Производят забор крови больных лейкозом и здоровых доноров в гепаринизированные вакуумные пробирки. Производят выделение лимфоцитов крови путем центрифугирования при 1500 об/мин в течение 10 мин. Отбирают плазму и лимфоцитарное кольцо, примесь эритроцитов разрушают 0,83% раствором хлорида аммония. Полученные лимфоциты трижды отмывают физиологическим раствором. Лимфоциты суспендируют в физиологическом растворе. Готовят густой раствор желатина, в котором ополаскивают tipless контилевер CSG 11 /tipless. Подсушивают его на воздухе при комнатной температуре. На стеклянную подложку с одного края наносят суспензию лимфоцитов здоровых доноров, а с противоположного - суспензию лимфоцитов больных острым лимфобластным лейкозом.
Посередине стекла оставляют область, куда высаживают полимерные полые микросферы, находящиеся в виде водной суспензии. Помещают препарат во влажную камеру и производят силовую микроскопию в области расположения полимерных микросфер. После приклеивания одной микросферы к tipless контилеверу (фиг.1) меняют область сканирования, передвигают препарат к одному из краев, где расположена суспензия лимфоцитов здоровых доноров. В этой области регистрируют силовые кривые 20 клеток, затем передвигают препарат на противоположный край стекла и осуществляют снятие силовых кривых 20 клеток в области расположения лимфоцитов, больных лейкозом. Полученные силовые кривые обрабатывают с помощью программы Nova и рассчитывают упругость лимфоцитов.
Результаты измерений представлены в таблице.
Параметры
Лимфоциты здоровых доноров
Лимфоциты больных лейкозом
Е, модуль Юнга, µРа
3,45±0,18
1,83±0,07*
Погружение зонда, нм
345,16±3,76
1035,18±7,02*
Примечание: * Статистически достоверные различия при р<0,05 в сравнении с лимфоцитами здоровых доноров.
Как видно из представленных данных упругость лимфоцитов больных лимфобластным лейкозом снижена в два раза. При этом глубина погружения зонда возрастает на 67%. Наблюдаемые различия в упругости поверхности связаны с морфологическими трансформациями цитоскелета в опухолевых клетках, проявляющимися в усилении распластывания и изменении локомоторного поведения неопластических клеток, нарушении прикрепления клеток к подложке. Эти процессы контролируются актиновым цитоскелетом, системой микротрубочек, фокальными контактами и являются ключевыми в приобретении клетками способности к метастазированию [5, 6]. Оценка упругих свойств трансформированных клеток позволит расширить арсенал средств диагностики лейкозов.
Предлагаемый способ определения упругости клеток крови во влажной камере с использованием модифицированного АСМ-зонда технически прост, позволяет исключить повреждение клеток в процессе проведения силовой спектроскопии, не изменяет свойств поверхности исследуемых образцов, обеспечивает сохранение нативности и формы клеток крови, обеспечивает получение наиболее достоверных результатов. Способ может быть использован в общей и клинической физиологии для исследования упругости клеток крови.
Используемая литература
1. A-Hassan E., Heinz W.F., Antonik M.D et al. Microelastic mapping of living cells by atomic force microscopy // Biophys. J. - 1998. V.74 (3). - P.1564-1578.
2. Наносклерометрия и наноидентирование // www.ntmdt.ru/page/nanoindent.
3. Benoit M., Gaub H.E. Measuring cell adhesion force with the atomic force microscope at the molecular level // Cell tissues organs. - 2002. - V.172. - P.174-189.
4. Лебедев Д.В., Чукланов А.П., Бухараев А.А., О.С.Дружинина. Измерение модуля Юнга биологических объектов в жидкой среде с помощью специального зонда атомно-силового микроскопа // Письма в ЖТФ. - 2009. - Т. 35. Вып.8. - С.54-61.
5. Ровенский Ю.А. Клеточные и молекулярные механизмы опухолевой инвазии // Биохимия. - 1998. - Т.63. Вып.9. - С.1204-1221.
6. Ровенский Ю.А., Васильев Ю.М. Морфогенетические реакции клеток и их нарушения при опухолевой трансформации // Канцерогенез/ Под ред. Д.Г.Заридзе. - M.: Медицина, 2004. - С.376-414.