Новые технологии создания средств диагностики и терапии на основе аптамеров

НАУЧНЫЕ ОБЗОРЫ

© ЗАМАЙ Т.Н., ЗАМАЙ А.С., КОЛОВСКАЯ О.С., САВИЦКАЯ А.Г., ЗАМАЙ Г.С., КРАТ А.В., РЕШЕТНЕВА И.Т., МАЛЫШЕВА Е.А., ЗУБКОВА

О.А., СПИВАК Е.А.

УДК 577.29

НОВЫЕ ТЕХНОЛОГИИ СОЗДАНИЯ СРЕДСТВ ДИАГНОСТИКИ И ТЕРАПИИ НА ОСНОВЕ АПТАМЕРОВ

Т.Н. Замай, А.С. Замай, О.С. Коловская, А.Г. Савицкая, Г.С. Замай, А.В.

Крат, И.Т. Решетнева, Е.А. Малышева, О.А. Зубкова, Е.А. Спивак

ГБОУ ВПО Красноярский государственный медицинский университет им.

проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздравсоцразвития РФ, ректор - д.м.н., проф. И.П. Артюхов; кафедра биологической химии с курсом медицинской,

фармацевтической и токсикологической химии, зав. - д.м.н., проф. А.Б.

Салмина, кафедра микробиологии, зав. - к.б.н., доц. О.В. Перьянова;

КГБУЗ Красноярский краевой клинический онкологический диспансер имени А.И. Крыжановского, гл. врач - к.м.н. А.А. Модестов.

Резюме. В статье представлен опыт получения аптамеров к опухолевым клеткам человека и животных и возбудителям кишечных инфекций (Salmonella Enteritidis и Salmonella Typhimurium). Показаны примеры их практического применения для создания средств диагностики и терапии. Сделан вывод о том, что аптамеры являются перспективными биофармацевтическими препаратами и на их основе возможно создание высокоэффективных, недорогих и простых в применении средств адресной доставки диагностических и терапевтических средств.

Ключевые слова: диагностика, терапия, аптамеры, сальмонеллез, рак легкого, асцитная карцинома Эрлиха.

Замай Татьяна Николаевна - д.б.н., проф. каф. биологической химии КрасГМУ; е-шаП: tzamay@yandex.ru.

Замай Анна Сергеевна - к.б.н., доц. каф. биологической химии КрасГМУ; е-таП: annazamay@yandex.ru.

Коловская Ольга Сергеевна - научный сотрудник НИИ молекулярной медицины и патобиохимии КрасГМУ; е-mail: zamaykin@gmail.com.

Разработка технологии создания новых средств диагностики и терапии -одно из наиболее актуальных и востребованных направлений развития современной персонализированной медицины. В последнее время все большую популярность приобретают аптамеры как новые средства адресной терапии различных заболеваний [10]. Аптамеры представляют собой фрагменты однонитевой РНК или ДНК (30-100 нуклеотидов), образующие трехмерные структуры при взаимодействии комплементарных участков цепи. Каждый такой олигонуклеотид имеет константные области, необходимые для посадки праймеров при амплификации и область случайных нуклеотидных последовательностей. Пространственное расположение заряженных фосфатов и неспаренных оснований в олигонуклеотиде образует уникальное распределение функциональных групп, способных к электростатическим и ван-дер-ваальсовым взаимодействиям и образованию водородных связей с функциональными группами молекулярной мишени, что определяет способность аптамеров к специфическому связыванию [3,11].

Спектр применения аптамеров, обладающих высоким сродством к мишеням, достаточно широк - от визуализации и количественной детекции мишеней до использования их в качестве терапевтических препаратов или для адресной доставки лекарственных средств. Аналогами аптамеров (искусственных антител) являются моноклональные антитела, также

обладающие высокой специфичностью. Однако аптамеры обладают рядом существенных преимуществ, прежде всего, это возможность их химического синтеза, благодаря которому удается получить высокочистую фракцию олигонуклеотидов, в том числе с различными химическими модификациями (красителями, метками, различными химическими группами, малыми молекулами). Стоимость синтеза невысока (по сравнению с моноклональными антителами их производство примерно в lOO раз дешевле), кроме того, они термостабильны, а при потере аффинности их свойства могут быть легко восстановлены, все это обеспечивает им конкурентные преимущества. На сегодняшний день разработаны технологии селекции аптамеров к различным множественным и единичным мишеням и сложным структурам (живым клеткам [5,7], бактериям, вирусам, белкам [11], «маленьким» молекулам [7].

Недавно было показано, что аптамеры не иммунногенны, не токсичны, могут сами по себе обладать терапевтическими свойствами за счет специфичного воздействия на определенные рецепторы [11]. Например РНК-аптамер (Macugen) уже является зарегистрированным терапевтическим средством [12] и используется как за рубежом, так и на территории Российской Федерации. Еще несколько лекарств находятся на разных стадиях клинических испытаний [б].

В статье представлен опыт получения аптамеров к опухолевым клеткам человека и животных и возбудителям кишечных инфекций (Salmonella Enteritidis и Salmonella Typhimurium), показаны примеры их практического применения для создания средств диагностики и терапии.

Технология SELEX. Аптамеры получают методом SELEX (системная эволюция лигандов экспоненциальным обогащением), представляющим собой процесс скрининга очень большой библиотеки олигонуклеотидов со случайными последовательностями повторяющихся циклов селекции и амплификации. Селекция аптамеров обычно проходит на протяжении 1O-15 раундов, в которых отбирают последовательности, связывающиеся с

молекулой-мишенью. В результате отбора происходит постепенное обогащение библиотеки последовательностями, обладающими повышенным сродством к мишени. Обычно аффинность библиотеки к мишени повышается на несколько порядков. Когда аффинность перестает увеличиваться, обогащенную библиотеку клонируют и проводят определение последовательностей индивидуальных аптамеров.

Получение одноцепочечных ДНК-аптамеров из ДНК-библиотек к различным клеточным мишеням основано на технологии cell SELEX [1,2,8,9, 15]. Базовый раунд селекции включает б основных стадий: 1) инкубация библиотеки олигонуклеотидов с клеточными мишенями; 2) отделение несвязавшихся с клетками олигонуклеотидов; З) экстракция аптамеров связавшихся со своими мишенями; 4) инкубация аптамеров кандидатов с негативными мишенями; 5) удаление из пула аптамеров

последовательностей, связавшихся с негативными мишенями; б) амплификация пулов аптамеров. Обычно проводят 1O-15 раундов иногда с различными модификациями. Наличие аптамеров в каждом раунде селекции контролируют с помощью гель-электрофореза. Аффинность и специфичность пулов аптамеров полученных на разных раундах селекции проверяют различными методами, чаще всего используют проточную цитометрию. На основании полученных данных выбирают пул аптамеров с наибольшей аффинностью и специфичностью к мишеням. Таким образом, в результате селекции получают пул из нескольких десятков аптамеров.

Стандартная процедура выделения отдельных клонов аптамеров из пула включает в себя бактериальное клонирование и секвенирование, в результате чего получают несколько уникальных последовательностей с определенными вторичными структурами (рис.1). На следующем этапе исследуют аффинность каждого клона аптамеров и выбирают те из них, которые обладают наибольшей аффинностью по отношению к своей мишени. После получения искусственных аптамеров их используют для создания средств диагностики и/или терапии.

Диагностические средства на основе аптамеров. Использование аптамеров в качестве диагностических средств позволяет идентифицировать разные виды и стадии заболеваний. При этом для определения маркеров заболевания требуются очень малые количества крови или других биологических жидкостей, поскольку чувствительность сенсоров на основе аптамеров очень высока. В частности, аптамеры к небольшим молекулам имеют чувствительность на микромолярном уровне (2,8 мкМ для дофамина, 6 мкМ - для АТР) [7], а к белкам проявляют чувствительность на наномолярном и даже на субнаномолярном уровнях (чувствительность к VEGF - 100 пМ, к фактору роста кератиноцитов - 1 пМ) [14]. Для детекции биомаркеров могут быть использованы разные виды сенсоров -электрохимические [8], оптические, пьезоэлектрические [16] и др. Таким образом, по сравнению с традиционными, методы диагностики на основе аптамеров имеют ряд преимуществ, в первую очередь, хорошую чувствительность и высокую скорость определения, и, кроме того, возможность детекции с помощью устройств различного рода.

Примером использования аптамеров для диагностики кишечных инфекций может стать разработанный нами метод идентификации разных серотипов сальмонелл на основе аптамеров. Преимуществом метода является малое время детекции, что важно для своевременной терапии, поскольку позднее выявление возбудителя сальмонеллеза нередко заканчивается эндартериитом, циррозом печени, септическим артритом, менингитом, остеомиелитом, пневмонией и др. [12]. В настоящее время основным способом диагностики сальмонеллеза служит бактериологический метод, который, несмотря на высокую степень достоверности и точности, имеет один существенный недостаток - слишком длительное время идентификации возбудителя, что негативно отражается на эффективности проводимой терапии. Для осуществления быстрой детекции сальмонеллеза нами была разработана тест-система на основе аптамеров к двум сероварам сальмонелл

S. Enteritidis и S. Typhimurium, обладающим разной лекарственной устойчивостью.

Для разработки тест-системы были выбраны клоны аптамеров с наилучшей аффинностью к S. Typhimurium и S. Enteritidis. Аптамеры этих клонов хорошо связывались с сальмонеллами, но практически не взаимодействовали c бактериями E. Coli, S. Aureus, C. Freundi, P. Aeruginosa и сальмонеллами, подвергшимися обработке высокой температурой. Для испытания тест-системы проводили исследования на наличие возбудителей сальмонеллеза в пробах, полученных путем смыва с кожи бедра курицы и искусственно зараженной курицы. Для этого делали смыв 2 мл фосфатного буфера, собирали в пробирку, на анализ брали 100 мкл образца, объем которого на последнем этапе пробоподготовки перед измерением доводили до 200 мкл. Измерение проводили на проточном цитометре FC-500 (Beckman Coulter Inc., США). Результаты исследований представлены на рис. 2. Для обработки данных использовали программное обеспечение Kaluza 1.1.

Другим примером использования полученных нами аптамеров стала тест-система для выявления рака легкого человека. Известно, что в России основная масса больных раком легкого выявляется только на IV стадии, когда исход лечения уже неблагоприятен. Высокая смертность связана в основном с отсутствием эффективных методов выявления опухоли на ранних стадиях ее развития. Для обеспечения эффективного лечения и увеличения выживаемости пациентов необходима ранняя диагностика рака легкого. Для создания тест-системы мы применяли аптамеры, подобранные к тканям рака легкого трех гистологических типов (плоскоклеточного ороговевающего, плоскоклеточного железистого и мелкоклеточного), полученных во время операции от пациентов в возрасте 50-70 лет (послеоперационный материал был любезно предоставлен Красноярским краевым клинческим онкологическим диспансером им. А.И.Крыжановского).

Результаты испытаний диагностической тест-системы, проведенные с использованием интактной крови условно здоровых людей, больных

пневмонией и больных раком легкого, в которых применялись аптамеры и антитела к цитокератину показали наличие в крови больных раком легкого циркулирующих опухолевых клеток (рис.З). Таким образом, результаты исследований подтвердили возможность использования аптамеров для выявления в крови онкобольных циркулирующие опухолевые клетки.

Терапия на основе аптамеров. Важным преимуществом аптамеров является то, что они представляют собой препараты двойного назначения. Связываясь с молекулой-мишенью, аптамеры могут выявлять место локализации мишени в организме, и, одновременно изменять ее биологическую активность. Таким образом, одни и те же аптамеры могут выступать в качестве диагностических и терапевтических средств. Приняв во внимание эту двойственность аптамеров, мы исследовали антибактериальные свойства тех аптамеров, которые были использованы нами для выявления возбудителей сальмонеллеза, тем более что создание новых антибактериальных препаратов является актуальным из-за усиливающейся в последнее время циркуляции полирезистентных штаммов сальмонелл, отличающихся повышенной термоустойчивостью и резистентностью ко многим современным антибиотикам и дезинфицирующим средствам [4,5] и распространения серотипов сальмонелл, способных вызывать

внутрибольничные эпидемии с высоким уровнем смертности детей младенческого возраста [1З].

Антибактериальный эффект аптамеров оценивали по разнице в количестве колоний S. Enteritidis и S. Typhimurium, выросших при культивировании на чашках Петри контрольных проб (бактерии в питательном бульоне или 1 мкМ исходной ДНК-библиотеки) и опытных проб (бактерии в питательном бульоне с добавлением 1 мкМ аптамеров). Результаты исследований показали, что после инкубации бактерий S. Typhimurium с аптамерами происходило снижение количества выросших колоний приблизительно на 75±15,4%. Подавление роста бактериальных колоний при действии аптамеров на S. Enteritidis составило около 7З±15,1%. ДНК-библиотека также

снижала количество колоний S. Enteritidis и S. Typhimurium, но в меньшей степени - в среднем на 10±4,2%, 9±2,4%. Таким образом, исследования показали, что аптамеры могут стать новым классом антибиотиков, безопасных для человека.

Преимуществом использования аптамеров в качестве противоопухолевых препаратов является то, что аптамеры, по сравнению с традиционными препаратами, связываются только со своими мишенями и поэтому оказывают свое терапевтическое воздействие адресно. Следовательно, лекарственные препараты на основе аптамеров должны отличаться большей безопасностью и эффективностью. Исследование противоопухолевых свойств аптамеров мы проводили на асцитных клетках карциномы Эрлиха. Критериями противоопухолевой активности аптамеров в наших исследованиях служили два показателя - уровень пролиферации и ранний апоптоз опухолевых клеток. Исследования показали, что аптамеры значительно подавляли скорость клеточной пролиферации (рис.4) и при этом стимулировали апоптоз опухолевых клеток (рис.5), что однозначно указывало на противоопухолевый эффект аптамеров.

Таким образом, работы по селекции и исследованию свойств аптамеров к опухолевым клеткам и бактериям показали, что аптамеры являются перспективными биофармацевтическими препаратами персонализированной медицины и на их основе возможно создание высокоэффективных, недорогих и простых в применении средств адресной доставки диагностических и терапевтических средств.

Работа поддержана Министерством образования и науки Российской Федерации в рамках Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научнотехнологического комплекса России на 2007-2012 годы» (госконтракт № 16.512.11.2107), Красноярским краевым фондом поддержки научной и научно-технической деятельности (доп. Соглашение 09/12), Сибирским отделением РАН.

Благодарности. Авторы выражают глубокую благодарность А.Б. Салминой, Д.В. Попову, А. А. Модестову, В.К. Бельтюкову, М.В. Березовскому и О.В. Перьяновой за помощь в выполнении работы.

NEW TECHNOLOGY IN CREATION OF DIAGNOSIS AND TREATMENT MEANS

BASED ON APTAMERS T.N. Zamaj, A.S. Zamaj, O.S. Kolovskaja, A.G. Savickaja, G.S. Zamaj, A.V.

Krat, I.T. Reshetneva, E.A. Malysheva, O.A. Zubkova, E.A. Spivak

Krasnoyarsk State Medical University named after prof. V.F. Voino-Yasenetsky

Abstract. The article presents the experience of obtaining aptamers to tumor cells of human and animal pathogens of intestinal infections (Salmonella Enteritidis and Salmonella Typhimurium). Here are shown the examples of their practical application to create diagnostic and therapies means. It is concluded that the aptamers are promising biopharmaceuticals and on that basis it is possible to create high-effective, low-cost and easy-to-use means of targeted delivery of diagnostic and therapeutic agents.

Key words: diagnosis, treatment, aptamers, salmonella, lung cancer, Ehrlich ascites carcinoma.

Литература

1. Замай О.С., Замай Г.С., Замай А.С. и др. Селекция аптамеров к опухолевой ткани легкого человека // Вестн. СГАУ. - 2011. - Т.40, №7.

- С. 220-225.

2. Замай Т.Н., Салмина А.Б., Замай О.С. Новый перспективный способ идентификации возбудителя сальмонеллеза // Вестн. новых медицинских технологий. - 2011. - №4. С.36-39.

3. Радько С.П., Рахметова С.Ю., Бодоев Н.В. и др. Аптамеры как перспективные аффинные реагенты для клинической протеомики // Биомедицинская химия. - 2007. - Т.53, №1. - С.5-24.

4. Helms M., Ethelberg S., Molbak K. International Salmonella, typhimurium DT104 infections, 1992-2001 // Emerg. Infect. Dis. - 2005. -Vol.ll. - P. 859-671.

5. Jean S.S., Wang J.Y., Hsueh P.R. Bacteremia caused by Salmonella enterica serotype Choleraesuis in Taiwan // J. Microbiol. Immunol. Infect. -2006. - Vol.39. - P. 35865.

6. Keefe A. D., Pai S., Ellington A. Aptamers as therapeutics // Nature Reviews Drug Discovery. - 2012. - Vol. 9. - P. 538-550.

7. Kiga D. nRNA Aptamer to the Xanthine/Guanine Base with a Distinctive Mode of Purine Recognition // Nucleic Acids Research. - 1998.

- Vol. 26. - P. 1755-1760.

8. Labib M., Zamay A.S., Muharemagic D. et al. Aptamer-Based Viability Impedimetric Sensor for Viruses // Analytical Chemistry. - 2012. -Vol.84, №4. - P. 1813-1816.

9. Labib M., Zamay A.S., Muharemagic D. Electrochemical Sensing of Aptamer-Facilitated Virus Immunoshielding // Analytical Chemistry. -2012. - Vol.84, № 3. - P.1677-1686.

10. Meyer C., Hahn U., Rentmeister A. Cell-Specific Aptamers as Emerging Therapeutics // Journal of Nucleic Acids. - 2011. - Vol. 904750.

- P. 1-18.

11. Patel D.J., Suri A.K. Structure, recognition and discrimination in RNA aptamer complexes with cofactors, amino acids, drugs and aminoglycoside antibiotics // J. Biotechnol. - 2000. - Vol. 74. - P. 39-60.

12. Pegues D. A., Ohl M. E., Miller S. I. Salmonella species, including Salmonella typhi. In Principles and Practice of Infectious Diseases. - New York: Churchill Livingstone, 2005. - P. 2636-2654.

13. PessoaSilva C.L., Toscano C.M., Moreira B.M. et al. Infection due to extendedspectrum blactamaseproducing Salmonella enterica subsp enterica serotype infants in a neonatal unit // J. Pediatr. - 2002. - Vol.141. - P. 3817.

14. Sassanfar M., Szostak J.W. An RNA Motif That Binds ATP // Nature.

- 1993. - Vol. 364. - P. 550-553.

15. Sefah K., Shangguan D., Xiong X. et al. Development of DNA aptamers using Cell-SELEX // Nature Protocols. - 2010. - Vol.5, №6. - P. 1169-1185.

16. Tombelli S., Bini A., Minnuni M. Biosensors and Biodetection: Methods and Protocols: Electrochemical and Mechanical Detectors, Lateral Flow and Ligands for Biosensors // Methods in Molecular Biology. - 2008.

- Vol. 504. - P. 23-36.

Рис.1. Примеры структуры аптамеров

Бактерии окрашенные SEQ ID NO Бактерии окрашенные SEQ ID NO Бактерии окрашенные SEQ ID NO

13 в смыве с мяса птицы, искусственно зараженного 5Т 13 в смыве с мяса птицы, искусственно зараженного 5Е 13 всмывес интактногомяса гттицы

Неокрашенные бактерии в смыве с интактногомяса птицы

Интенси вность флуоресценци и

ЧИСЛО % от общего числа

3 Д| 69 655 100,00

2 67 981 100,00

1 ... 69 755 100,00

4 ... 73 03S 100,00

3 . 19 953 23,64

2 39 G77 57,-8

1 .. 13 771 19,74

4  1 0,00

PDF created with ' p

Ac- 1*Б

dfFact

Iff Бантерии сжязаннь+е с 5T12

ory Pro trial ve

4 Неокрашенные бактерии в смывес интактногомяса птицы

-Si on-www.pdffactory.com

и гмкшрг мага гггмми игичггтррцип запаи/йиипгп 4F

Рис.2. Выявление Salmonella Enteritidis и Salmonella Typhimurium в смывах

с образцов интактной курицы (кривая 1); курицы, зараженной Salmonella

enteritidis (кривая 2); курицы зараженной Salmonella Typhimurium (кривая 3),

кривая 4 соответствует неокрашенным бактериям. (A) Выявление

Salmonella Enteritidis с помощью клона аптамеров, представленного как SEQ

ID NO: 13. (В) Выявление Salmonella typhimurium с помощью клона

аптамеров, представленного как SEO ID NO: 5.

о

I COO

Аптамеры

"1...............................I

Норма

«МО-

КР 101 102 101

Аптамеры

......і .....і—

1 (Р 101 102 103

Рак легкого

ІСОО

10= 101 102 103

Пневмония

Антитела к цитокератину

103 101

10і 103

Рак легкого

Рис.3. Выявление циркулирующих опухолевых клеток с помощью аптамеров и антгтел к цитокератину у больных раком легкого.

90

Е± 80

Ф

. 70 X н

О 60

к

5

6 40 &

S

с

о

CL С

50

30

20

10

Контроль Л1З

Л9

Л14

Л42 ДНК- библ.

0

Рис.4. Влияний0 различных клонов аптамеров уровень пролиферации асцитных клеток карциномы Эрлиха.

35 -30 -I 25 -20 -15 -

<

10 -5 -0 -

Контроль Л1З Л9 Л14 Л42 ДНК-библ.

J

1— 1

-I—1

1 1—1

Hh

1—1

Рис.5. Транслокация фосфатидилсерина в мембранах асцитных клеток карциномы Эрлиха, показывающая уровень раннего апоптоза