Функциональная экспрессия актинопорина rtx-s3, нового цитолитического токсина актинии Heteractis crispa (=Radianthus macrodactylus)

Научная смена

Вестник ДВО РАН. 2010. № 4

Екатерина Сергеевна Ткачева

Аспирант лаборатории химии пептидов Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН. В 2007 г. окончила Академию экологии, морской биологии и биотехнологии ДВГУ, где за отличные успехи в учебе получала стипендию мэра Владивостока. Научно-исследовательскую деятельность начинала в ТИНРО-Центре. Курсовая работа, выполненная ею в лаборатории пищевых и технических продуктов под руководством к.х.н. Н.Б.Стародубцевой, удостоена премии научно-образовательного центра «Морская биота» ДВГУ.

В лабораторию химии пептидов ТИБОХ ДВО РАН Е.С.Ткачева пришла будучи студенткой 5 курса. Её дипломная работа, выполненная под руководством к.х.н. Е.В.Лейченко., защищена на «отлично», награждена грамотой и стипендией НОЦ «Морская биота». После окончания университета Екатерина Сергеевна поступила в аспирантуру в лабораторию химии пептидов ТИБОХ ДВО РАН. Результаты исследовательской работы молодого ученого неоднократно представлялись на международных и региональных научных конференциях — Первом международном симпозиуме по биологическим наукам (1st Far-Eastern International Symposium on Life Sciences, Vladivostok, Russia, September 2008); III Международной конференции «Химия, структура и функции биомолекул», г. Минск, 1—3 октября 2008; Международном семинаре по морским живым ресурсам (International workshop on marine living resources of Vietnam, Hanoi, Vietnam, May 29th-31st, 2010).

Екатерина Сергеевна успешно работает со студентами, под ее руководством защищена курсовая работа на кафедре химии ДВГУ. Научные интересы молодого ученого сосредоточены на получении рекомбинантных белков актинопоринов и изучении их действия на клетки-мишени и модельные мембраны. Работа в этом направлении поддержана грантами РФФИ и ДВО РАН, по ее результатам имеются публикации: Tkacheva E.S., Eskov A.A., Leychenko E.V. et al. Cloning, sequencing, and expression of actinoporin from the sea anemone, Radianthus macrodactilus // 1st Far-Eastern International Symposium on Life Sciences: proceed. Vladivostok, 2008; P. 76; Ткачева Е.С., Лейченко Е.В., Исаева М.П. и др. Получение рекомбинантного актинопорина, пороформирующего токсина из актинии Radianthus macrodactilus // VIII регион. конф. студентов, аспирантов вузов и научных организаций Дальнего Востока России: тез. докл. Владивосток, 2008. С. 144; Лейченко Е.В., Монастырная М.М., Исаева М.П., Еськов А.А., Ткачева Е.С., Козловская Э.П. Структурно-функциональные исследования актинопоринов // III Междунар. конф. «Химия, структура и функции биомолекул»: тез. докл. Минск, 2008. С. 145.

УДК 577.2 Е.С.ТКАЧЕВА

Функциональная экспрессия актинопорина RTX-S3, нового цитолитического токсина актинии Heteractis crispa

Рассматривается получение рекомбинантного актинопорина RTX-S3 актинии Heteractis crispa. Клонирован новый актинопорин, установлена его аминокислотная последовательность. На основе плазмидного вектора pET-41a(+) создана экспрессионная конструкция гена актинопорина и оптимизированы условия экспрессии.

ТКАЧЕВА Екатерина Сергеевна - аспирант (Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН, Владивосток). E-mail: estkacheva@gmail.com

Работа поддержана грантами РФФИ № 10-08-00316-а, 08-04-01052-а и ДВО РАН № 09-ІІІ-А-05-141.

Рекомбинантный актинопорин выделен из клеточного лизата методом аффинной хроматографии. Установлено, что он проявляет гемолитическую активность, идентичную нативному.

Ключевые слова: актинии, актинопорин, экспрессия, рекомбинантный белок

Functional expression of actinoporin RTX-S3, a new cytolytic toxin of the sea anemone Heteractis crispa (=Radianthus macrodactylus). E.S.TKACHEVA (Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, FEB RAS, Vladivostok).

This work is devoted to isolation of actinoporin RTX-S3 from the sea anemone Heteractis crispa. A new actinoporin is cloned, and its amino acid sequence is determined. Expression construction of the actinoporin gene is created on the basis of plasmid vector pET41a(+), and the expression conditions are optimized. The recombinant actinoporin is isolated from cell lysate by the method of affine chromatography, and it is established to display hemolytic activity similar to the native actinoporin.

Key words: sea anemones, actinoporin, expression, recombinant protein.

Цитолизины актиний (актинопорины) - уникальные по своей структуре и механизму действия природные полипептиды, способные увеличивать проницаемость клеточных мембран в результате образования пор в липидном бислое. Благодаря мемб-ранотропным и цитостатическим свойствам они проявляют противоопухолевую, кардиостимулирующую, дерматонекротическую, антимикробную, антипаразитарную и другие виды биологической активности [2]. Актинопорины также могут выступать в качестве цитоплазматических маркеров и поэтому являются незаменимым инструментом исследования структурной организации и механизмов функционирования биологических мембран.

В настоящее время детально исследованы эквинатоксин II (EqtlI) из Actinia equina и стихолизин II (StnII) из Stichodactyla helianthus [1, 2], для которых методом рентгеноструктурного анализа установлены пространственные структуры. Водорастворимые формы молекул EqtII и StnII представляют собой глобулярные однодоменные ß-сэндвич-структу-ры, состоящие из двенадцати для EqtII и десяти для StnII антипараллельных ß-стрендов, фланкированных двумя а-спиралями [3, 6].

Большинство аминокислотных последовательностей актинопоринов устанавливают методами молекулярной биологии, т.е. аминокислотные последовательности выводят на основании нуклеотидных последовательностей их генов. Этот подход позволяет, с одной стороны, получить информацию об актинопоринах, совместно присутствующих в одном виде-продуценте, а с другой - установить нуклеотидные последовательности генов, чтобы создать генно-инженерные конструкции для их экспрессии в бактериальных системах. В лаборатории химии пептидов ТИБОХ ДВО РАН из актинии Heteractis crispa (=Radianthus macrodactylus) выделены четыре актинопорина с высокой гемолитической активностью [5, 7]. Для двух из них - RTX-A и RTX-SII - методами структурной белковой химии и молекулярной биологии установлены аминокислотные последовательности [4, 5].

Цель настоящей работы - получение рекомбинантной формы актинопорина актинии H. crispa. На основании нуклеотидной последовательности гена, кодирующего RTX-SII, с помощью программы Gene Runner сконструированы прямой SF: 5’-GTCGGCGGCTT-TAGCTGGCACAATTACTCTC-3’ и обратный SR: 5 ’-CCCCAAGCTTAGCGTGAGATCT-TAATTTGCAGTAT-3’ праймеры, которые фланкировали последовательность гена актинопорина; кДНК актинии H. crispa использована в качестве матрицы для получения гена актинопорина с помощью ПЦР-амплификации. В результате получен фрагмент ДНК длиной 550 пар оснований, кодирующий зрелый актинопорин, нуклеотидная последовательность которого определена с помощью ДНК анализатора ABI PRISM 310 (Applied Biosystems). Выведенная аминокислотная последовательность отличалась от полученной ранее последовательности RTX-SII пятью аминокислотными остатками в следующих положениях: I9T, E10L, F112L, G167V, Q173E. Эта последовательность, соответствующая новому актинопорину актинии H. crispa RTX-S3, имеет высокую степень идентичности (62-99%) с установленными ранее последовательностями актинопоринов из различных видов актиний (рис. 1).

Рис. 1. Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей актинопоринов. RTX-S3, RTX-SII и RTX-A (swiss-prot, P58691) - актинопорины из актинии H. crispa; EqtlI, EqtIV, EqtV - эквинатоксины из Actinia equina (swiss-prot, P61914, Q9Y1U9, Q93109); StnI , StnII стихолизины из Stichodactyla helianthus (swiss-prot, P81662, P07845); HMgIII - магнификализин из Heteractis magnifica (swiss-prot, Q9U6X1); Or-A и Or-G - акти-нопорины из Oulactis orientalis (swiss-prot Q5I4B8, Q5I2B1). Идентичные аминокислотные остатки показаны на сером фоне, консервативные аминокислотные замены - на светло-сером фоне, не консервативные аминокислотные замены - на белом фоне

Для создания экспрессионной конструкции выбрали вектор на основе плазмиды рЕТ-41а(+). Фрагмент ДНК rtx-s3, полученный после ПЦР, обработали рестриктазой HindIII и клонировали в плазмидный вектор рЕТ-41а (+) по сайтам рестрикции PShAI и HindIII (рис. 2). Для проверки корректности вставки провели секвенирование рекомбинантной плазмиды.

Компетентные клетки E. coli Rosetta (DE3) трансформировали плазмидой pET-41a(+)/ rtx-s3. Экспрессию химерного GST-RTX-S3 белка индуцировали изопропил^^-1-тиога-лактопиранозидом (ИПТГ). Были подобраны оптимальные условия экспрессии, при которых продуцируется наибольшее количество растворимой формы GST-RTX-S3 (расчетная Mr 52000): температура наращивания 30 С, концентрация ИПТГ 0,1 мМ, время наращивания 3 ч (рис. 3а).

Рис. 2. Физическая карта рекомбинантной плазмиды pET-41a(+)/rtx-s3

Рис. 3. Анализ клеточных белков в 15%-ном ДСН-ПААГ а - электрофореграмма клеточного лизата после экспрессии: 1 - клеточный лизат без добавления ИПТГ, 2 - клеточный лизат после добавления ИПТГ, 3 - маркеры молекулярной массы; б - элект-рофореграмма рекомбинантного актинопорина гЯТХ-83: 1 - маркеры молекулярной массы, 2 - рекомбинантный актинопорин гЯТХ-83

Рекомбинантный актинопорин (rRTX-S3) выделен с помощью аффинной хроматографии с последующей обработкой белка энтеропептидазой (рис. 3б). Общий выход rRTX-S3 составил в среднем 4 мг с 1 л клеточной культуры. Расчетная молекулярная масса рекомбинантного белка - 19389,02 Да, зоэлектрическая точка - 9,01.

Гемолитическая активность rRTX-S3, определенная на эритроцитах человека, составила 3,3 х 104 ГЕ/мг, что сравнимо с гемолитической активностью нативного актинопорина RTX-SII - 3,6 х 104 ГЕ/мг [5] (за одну гемолитическую единицу принимали количество белка (в мг), которое вызывает 50%-ный гемолиз 0,1%-ной суспензии эритроцитов).

Таким образом, в результате исследований определена экспрессионная конструкция гена актинопорина, оптимизированы условия экспрессии и получен рекомбинантный ак-тинопорин RTX-S3, обладающий гемолитической активностью, идентичной нативному актинопорину. Это важно для дальнейшего исследования механизма функционирования актинопоринов, выяснения причин многообразия продуцируемых форм и возможности применения актинопоринов в качестве биотехнологических объектов для создания лекарственных препаратов нового поколения.

ЛИТЕРАТУРА

1. Alegre-Cebollada J., Oñaderra M., Gavilanes J.G., del Pozo A.M. Sea. Sea anemone actinoporins: the transition from a folded soluble state to a functionally active membrane-bound oligomeric pore // Current protein and peptide science. 2007. Vol. 8. P. 558-552.

2. Anderluh G., Macek P Cytolytic peptide and protein toxins from sea anemones (Anthozoa: Actiniaria) // Toxicon. 2002. Vol. 40. P. 111-124.

3. Athanasiadis A., Anderluh G., Macek P., Turk D. Crystal structure of the soluble form of equinatoxin II, a pore-forming toxin from the sea anemone Actinia equina // Structute. 2001. Vol. 9. P. 341-346.

4. Il’ina A., Lipkin A., Barsova E. et al. Amino acid sequence of RTX-A’s isoform actinoporin from the sea anemone, Radianthus macrodactylus // Toxicon. 2006. Vol. 47. P 517-520.

5. Klyshko E.V., Issaeva M.P, Monastyrnaya M.M. et al. Isolation, properties and partial amino acid sequence of a new actinoporins from the sea anemone Radianthus macrodactylus // Toxicon. 2004. Vol. 44. P. 315-324.

6. Mancheno J.M., Martin-Benito J., Martinez-Ripol M. et al. Crystal and electron microscopy structures of sticholy-sin II actinoporin reveal insights into the mechanism of membrane pore formation // Structure. 2003. Vol. 11. P. 1-20.

7. Monastyrnaya M.M., Zykova T.A., Apalikova O.V et al. Biologically active polypeptides from the tropical sea anemone Radianthus macrodactylus // Toxicon. 2002. Vol. 40. P. 1197-1217.