БИОЛОГИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ ЖЕСТКОКРЫЛЫХ ВРЕДИТЕЛЕЙ

1. Молекула двухнитевой РНК (днРНК), содержащая смысловую нить и антисмысловую нить, где нуклеотидная последовательность антисмысловой нити является комплементарной части мРНК-полинуклеотида, транскрибируемого с гена IAP насекомого рода Diabrotica, содержащего кодирующую последовательность IAP, которая на по меньшей мере от 90 по меньшей мере до 99% идентична по отношению к SEQ ID NO: 2, и где молекула днРНК является токсичной для насекомого рода Diabrotica.
2. Молекула днРНК по п. 1, где кодирующая последовательность IAP содержит SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 17.
3. Молекула днРНК по п. 1 или 2, где часть мРНК-полинуклеотида содержит по меньшей мере 18 последовательных нуклеотидов из SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 15 или SEQ ID NO: 18.
4. Молекула днРНК по п. 3, где часть мРНК-полинуклеотида содержит от 19, 20 или 21 последовательного нуклеотида по меньшей мере до 400 последовательных нуклеотидов из SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 15 или SEQ ID NO: 18.
5. ДнРНК по п. 4, где часть мРНК-полинуклеотида состоит главным образом из (а) какой-либо 19-мерной подпоследовательности из SEQ ID NO: 3 (wcrIAP1), состоящей из нуклеотидов N - N+18, где N представляет собой нуклеотид от 1 до 1603 в SEQ ID NO: 3; или (b) какой-либо 19-мерной подпоследовательности из SEQ ID NO: 12 (wcrIAP2), состоящей из нуклеотидов N - N+18, где N представляет собой от нуклеотида 1 до нуклеотида 1444 в SEQ ID NO: 12; или (с) какой-либо 19-мерной подпоследовательности из SEQ ID NO: 15 (scrIAP1), состоящей из нуклеотидов N - N+18, где N представляет собой от нуклеотида 1 до нуклеотида 1018 в SEQ ID NO: 15; или (d) какой-либо 19-мерной подпоследовательности из SEQ ID NO: 18 (ncrIAP1), состоящей из нуклеотидов N - N+18, где N представляет собой от нуклеотида 1 до нуклеотида 1020 в SEQ ID NO: 18.
6. Молекула днРНК по п. 4, где часть мРНК-полинуклеотида состоит главным образом из нуклеотидной последовательности из SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 15 или SEQ ID NO: 18.
7. Молекула днРНК по любому из пп. 1, 2, 4-6, где нуклеотидная последовательность антисмысловой нити состоит главным образом из (а) какой-либо 19-мерной подпоследовательности из SEQ ID NO: 4 (wcrIAP1*), состоящей главным образом из нуклеотидов N - N+18, где N представляет собой нуклеотид от 1 до 1603 в SEQ ID NO: 4; или (b) какой-либо 19-мерной подпоследовательности из SEQ ID NO: 13 (wcrIAP2*), состоящей из нуклеотидов N - N+18, где N представляет собой от нуклеотида 1 до нуклеотида 1444 в SEQ ID NO: 13; или (с) какой-либо 19-мерной подпоследовательности из SEQ ID NO: 16 (scrIA.P1*), состоящей из нуклеотидов N - N+18, где N представляет собой от нуклеотида 1 до нуклеотида 1018 в SEQ ID NO: 16; или (d) какой-либо 19-мерной подпоследовательности из SEQ ID NO: 19 (ncrIAP1*), состоящей из нуклеотидов N - N+18, где N представляет собой от нуклеотида 1 до нуклеотида 1020 в SEQ ID NO: 19.
8. Молекула днРНК по п. 6, где нуклеотидная последовательность антисмысловой нити состоит главным образом из нуклеотидной последовательности из SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 16 или SEQ ID NO: 19.
9. Молекула днРНК по п. 1, где нуклеотидная последовательность смысловой нити является в значительной степени комплементарной нуклеотидной последовательности антисмысловой нити.
10. Молекула днРНК по п. 1, где нуклеотидная последовательность смысловой нити является полностью комплементарной нуклеотидной последовательности антисмысловой нити.
11. Молекула днРНК по п. 1, где двухнитевая молекула РНК представляет собой короткую молекулу РНК, образующей шпильки (shRNA).
12. Молекула днРНК по любому из пп. 2, 4-6, 8-11, где насекомое рода Diabrotica выбрано из группы, состоящей из D. barberi (северный кукурузный корневой жук), D. virgifera virgifera (западный кукурузный корневой жук), D. undecimpunctata howardi (южный кукурузный корневой жук), D. balteata (жук-блошка окаймленная), D. undecimpunctata undecimpunctata (жук-блошка одиннадцатиточечная), D. signiflcata (3-точечный листоед), D. speciosa (диабротика особая) и D. virgifera zeae (мексиканский кукурузный корневой жук).
13. Конструкция нуклеиновой кислоты, содержащая по меньшей мере одну нить молекулы днРНК по любому из пп. 1-12.
14. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая по меньшей мере одну нить молекулы днРНК по любому из пп. 1-12.
15. Конструкция нуклеиновой кислоты, содержащая полинуклеотид по п. 14.
16. Молекула химерной нуклеиновой кислоты, содержащая антисмысловую нить, имеющую нуклеотидную последовательность любой из 19-мерных подпоследовательностей по п. 7, функционально связанную с молекулой-предшественником растительной микроРНК.
17. Молекула химерной нуклеиновой кислоты по п. 16, где молекула-предшественник растительной микроРНК является предшественником микроРНК маиса.
18. Конструкция нуклеиновой кислоты, содержащая молекулу химерной нуклеиновой кислоты по п. 16 или 17
19. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая молекулу химерной нуклеиновой кислоты по п. 16 или 17.
20. Конструкция нуклеиновой кислоты, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по п. 19.
21. Молекула-предшественник искусственной растительной микроРНК, содержащая антисмысловую нить, имеющую нуклеотидную последовательность любой из 19-мерных подпоследовательностей по п. 7.
22. Молекула-предшественник искусственной растительной микроРНК по п. 21, где молекула-предшественник микроРНК является молекулой-предшественником микроРНК маиса.
23. Конструкция нуклеиновой кислоты, содержащая молекулу-предшественника искусственной растительной микроРНК по п. 21 или 22.
24. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая искусственную растительную микроРНК по п. 21 или 22.
25. Конструкция нуклеиновой кислоты, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по п. 24.
26. Конструкция нуклеиновой кислоты по любому из пп. 13, 15, 18, 20, 23 или 25, где конструкция нуклеиновой кислоты является вектором экспрессии.
27. Рекомбинантный вектор, содержащий регуляторную последовательность, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, которая кодирует по меньшей мере одну нить днРНК по любому из пп. 1-12.
28. Композиция, содержащая две или более молекулы днРНК по любому из пп. 1-12, отличающаяся тем, что каждая из двух или более молекул РНК содержит различную антисмысловую нить.
29. Композиция по п. 28, отличающаяся тем, что две или более молекулы днРНК присутствуют в одной и той же конструкции нуклеиновой кислоты, в различных конструкциях нуклеиновой кислоты или в любой их комбинации.
30. Композиция по любому из п. 28 или 29, содержащая молекулу РНК, которая содержит антисмысловую нить, состоящую главным образом из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 6, и молекулу РНК, которая содержит антисмысловую нить, состоящую главным образом из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 8, и/или молекулу РНК, которая содержит антисмысловую нить, состоящую главным образом из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 10.
31. Композиция, содержащая две или более конструкции нуклеиновой кислоты по любому из пп. 13, 18 или 23, отличающаяся тем, что каждая из двух или более конструкций нуклеиновой кислоты содержит различную антисмысловую нить.
32. Композиция, содержащая две или более молекулы нуклеиновых кислот по любому из пп. 14, 19 или 24, где каждая из двух или более молекул нуклеиновых кислот кодирует различную антисмысловую нить.
33. Композиция, содержащая две или более конструкции нуклеиновой кислоты по пп. 13, 18 или 23, отличающаяся тем, что каждая из двух или более конструкций нуклеиновой кислоты содержит молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую различную антисмысловую нить.
34. Композиция, содержащая две или более молекулы химерной нуклеиновой кислоты по п. 16 или 17, отличающаяся тем, что каждая из двух или более молекул химерной нуклеиновой кислоты содержит различную антисмысловую нить.
35. Композиция, содержащая две или более молекулы-предшественника искусственной растительной микроРНК по п. 21 или 22, отличающаяся тем, что каждая из двух или более молекул-предшественников искусственной растительной микроРНК содержит различную антисмысловую нить.
36. Инсектицидная композиция для подавления экспрессии гена IAP у насекомого рода Diabrotica, содержащая днРНК по любому из пп. 1-12 и приемлемый с точки зрения сельского хозяйства носитель.
37. Трансгенное растение или его часть, содержащие молекулу днРНК, конструкцию нуклеиновой кислоты, молекулу химерной нуклеиновой кислоты, молекулу-предшественника искусственной растительной микроРНК и/или композицию по любому из соответствующих предыдущих пунктов, отличающиеся тем, что трансгенное растение имеет повышенную устойчивость к насекомому рода Diabrotica по сравнению с контрольным растением.
38. Трансгенное растение или его часть по п. 37, отличающиеся тем, что трансгенным растением или его частью является растение маис или его часть.
39. Трансгенное семя трансгенного растения по п. 37 или 38, отличающееся тем, что семя содержит молекулу днРНК, конструкцию нуклеиновой кислоты, молекулу химерной нуклеиновой кислоты, молекулу-предшественника искусственной растительной микроРНК и/или композицию.
40. Биологический образец из трансгенного растения или его части по п. 37 или 38.
41. Товарный продукт, полученный из трансгенного растения или его части по п. 37 или 38.
42. Товарный продукт по п. 41, отличающийся тем, что товарный продукт выбран из группы, состоящей из цельных или переработанных семян, бобов, зерен, косточек, оболочек, муки грубого помола, круп, муки, сахаров, сахаров, крахмалов, белковых концентратов, белковых изолятов, восков, масел, экстрактов, соков, концентратов, жидкостей, сиропов, корма, силоса, волокна, бумаги или других пищевых продуктов или продуктов, получаемых из растений.
43. Способ контроля насекомого рода Diabrotica, предусматривающий приведение насекомого рода Diabrotica в контакт с молекулой нуклеиновой кислоты, которая представляет собой или может дать интерферирующую РНК для подавления экспрессии гена LAP у насекомого рода Diabrotica, контролируя таким образом насекомое рода Diabrotica.
44. Способ по п. 43, отличающийся тем, что ген IAP содержит кодирующую последовательность IAP
a. которая на по меньшей мере от 90 по меньшей мере до 99% идентична по отношению к SEQ ID NO: 2; или
b. содержащую SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 17.
45. Способ по п. 43, отличающийся тем, что интерферирующая РНК является комплементарной части мРНК-полинуклеотида, транскрибируемого с гена IAP.
46. Способ по п. 45, отличающийся тем, что часть мРНК-полинуклеотида содержит от 18, 19, 20 или 21 последовательного нуклеотида по меньшей мере приблизительно до 400 последовательных нуклеотидов из SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 15 или SEQ ID NO: 18.
47. Способ по п. 46, отличающийся тем, что часть мРНК-полинуклеотида состоит главным образом из (а) какой-либо 19-мерной подпоследовательности из SEQ ID NO: 3 (wcrIAP1), состоящей из нуклеотидов N - N+18, где N представляет собой нуклеотид от 1 до 1603 в SEQ ID NO: 3; или (b) какой-либо 19-мерной подпоследовательности из SEQ ID NO: 12 (wcrIAP2), состоящей из нуклеотидов N - N+18, где N представляет собой от нуклеотида 1 до нуклеотида 1444 в SEQ ID NO: 12; или (с) какой-либо 19-мерной подпоследовательности из SEQ ID NO: 15 (scrIAP1), состоящей из нуклеотидов N - N+18, где N представляет собой от нуклеотида 1 до нуклеотида 1018 в SEQ ID NO: 15; или (d) какой-либо 19-мерной подпоследовательности из SEQ ID NO: 18 (ncrIAP1), состоящей из нуклеотидов N - N+18, где N представляет собой от нуклеотида 1 до нуклеотида 1020 в SEQ ID NO: 18.
48. Способ по п. 46, отличающийся тем, что часть мРНК-полинуклеотида состоит главным образом из нуклеотидной последовательности из SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 15 или SEQ ID NO: 18.
49. Способ по п. 45, отличающийся тем, что нуклеотидная последовательность интерферирующей РНК состоит главным образом из (а) какой-либо 19-мерной подпоследовательности из SEQ ID NO: 4 (wcrIAP1*), состоящей из нуклеотидов N - N+18, где N представляет собой нуклеотид от 1 до 1603 в SEQ ID NO: 4; или (b) какой-либо 19-мерной подпоследовательности из SEQ ID NO: 13 (wcrIAP2*), состоящей из нуклеотидов N - N+18, где N представляет собой от нуклеотида 1 до нуклеотида 1444 в SEQ ID NO: 13; или (с) какой-либо 19-мерной подпоследовательности из SEQ ID NO: 16 (scrIAP1*), состоящей из нуклеотидов N - N+18, где N представляет собой от нуклеотида 1 до нуклеотида 1018 в SEQ ID NO: 16; или (d) какой-либо 19-мерной подпоследовательности из SEQ ID NO: 19 (ncrIAP1*), состоящей из нуклеотидов N - N+18, где N представляет собой от нуклеотида 1 до нуклеотида 1020 в SEQ ID NO: 19.
50. Способ по п. 45, отличающийся тем, что нуклеотидная последовательность интерферирующей РНК состоит главным образом из нуклеотидной последовательности из SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 16 или SEQ ID NO: 19.
51. Способ по любому из пп. 43-50, отличающийся тем, что насекомое рода Diabrotica выбрано из группы, состоящей из D. barberi (северный кукурузный корневой жук), D. virgifera virgifera (западный кукурузный корневой жук), D. undecimpunctata howardi (южный кукурузный корневой жук), D. balteata (жук-блошка окаймленная), D. undecimpunctata undecimpunctata (жук-блошка одиннадцатиточечная), D. significata (3-точечный листоед), D. speciosa (диабротика особая) и D. virgifera zeae (мексиканский кукурузный корневой жук).
52. Способ по п. 51, отличающийся тем, что приведение в контакт предусматривает
a. посев трансгенного семени, из которого может быть получено трансгенное растение, экспрессирующее молекулу нуклеиновой кислоты, при этом насекомое рода Diabrotica питается трансгенным растением или его частью; или
b. нанесение композиции, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты, на семя, или растение, или его часть, при этом насекомое рода Diabrotica питается семенем, растением или его частью.
53. Способ по п. 52, отличающийся тем, что трансгенным семенем и трансгенным растением является семя кукурузы и растение кукуруза.
54. Способ по п. 52, отличающийся тем, что семенем или растением является семя кукурузы или растение кукуруза.
55. Способ уменьшения популяции взрослых насекомых рода Diabrotica на трансгенном растении, экспрессирующем белок Cry, гибридный белок Cry или модифицированный белок Cry, который предусматривает экспрессию в трансгенном растении молекулы нуклеиновой кислоты, которая представляет собой или может дать интерферирующую РНК, способную подавлять экспрессию гена IAP у взрослого насекомого рода Diabrotica с уменьшениемтаким образом популяции взрослых насекомых рода Diabrotica.
56. Способ уменьшения развития устойчивости у популяции насекомых рода Diabrotica в отношении интерферирующей РНК, способной подавлять экспрессию гена LAP у насекомого рода Diabrotica, при этом способ предусматривает экспрессию в трансгенном растении, которым питается популяция насекомых рода Diabrotica, интерферирующей РНК, способной подавлять экспрессию гена LAP у насекомого в стадии личинки и у взрослого насекомого рода Diabrotica, с уменьшениемтаким образом развития устойчивости у популяции насекомых рода Diabrotica по сравнению с популяцией насекомых рода Diabrotica, подвергнутой воздействию интерферирующей РНК, способной подавлять экспрессию гена LAP у насекомого в стадии личинки или у взрослого насекомого рода Diabrotica.
57. Способ снижения уровня целевой РНК, которая транскрибируется с гена LAP у насекомого рода Diabrotica, предусматривающий приведение насекомого рода Diabrotica в контакт с композицией, содержащей молекулу днРНК по любому из пп. 1-12, отличающийся тем, что молекула днРНК снижает уровень целевой РНК в клетке насекомого рода Diabrotica.
58. Способ по п. 57, отличающийся тем, что продуцирование белка IAP, кодируемого целевой РНК, снижается.
59. Способ по п. 58, отличающийся тем, что белок содержит аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 20-23.
60. Способ по п. 57, отличающийся тем, что днРНК получена из трансгенного организма, экспрессирующего днРНК.
61. Способ по п. 60, отличающийся тем, что трансгенный организм является трансгенным растением, трансгенной бактерией или трансгенным эндофитом.
62. Способ по п. 57, отличающийся тем, что днРНК обладает летальным действием в отношении насекомого рода Diabrotica.
63. Способ по п. 62, отличающийся тем, что насекомое рода Diabrotica выбрано из группы, состоящей из D. barberi (северный кукурузный корневой жук), D. virgifera virgifera (западный кукурузный корневой жук), D. undecimpunctata howardi (южный кукурузный корневой жук), D. balteata (жук-блошка окаймленная), D. undecimpunctata undecimpunctata (жук-блошка одиннадцатиточечная), D. significata (3-точечный листоед), D. speciosa (диабротика особая) и D. virgifera zeae (мексиканский кукурузный корневой жук).
64. Способ придания растению или его части выносливости в отношении насекомого рода Diabrotica, предусматривающий введение в растение или его часть молекулы днРНК, конструкции нуклеиновой кислоты, молекулы химерной нуклеиновой кислоты, молекулы-предшественника искусственной растительной микроРНК и/или композиции по любому из соответствующих предыдущих пунктов, придаваятаким образом растению или его части выносливость в отношении насекомого рода Diabrotica.
65. Способ уменьшения повреждения корней у растения, которым питается насекомое рода Diabrotica, предусматривающий введение в клетки растения молекулы нуклеиновой кислоты, конструкции нуклеиновой кислоты, молекулы химерной нуклеиновой кислоты, молекулы-предшественника искусственной растительной микроРНК и/или композиции по любому из соответствующих предыдущих пунктов, уменьшаятаким образом повреждение корней у растения.
66. Способ получения трансгенной растительной клетки, характеризующейся токсичностью для насекомого рода Diabrotica, предусматривающий введение в растительную клетку молекулы нуклеиновой кислоты, конструкции нуклеиновой кислоты, молекулы химерной нуклеиновой кислоты, молекулы-предшественника искусственной растительной микроРНК и/или композиции по любому из соответствующих предыдущих пунктов с получениемтаким образом трансгенной растительной клетки, характеризующейся токсичностью для насекомого рода Diabrotica по сравнению с контрольной растительной клеткой.
67. Совокупность трансгенных растительных клеток, полученных с помощью способа по п. 66.
68. Совокупность трансгенных растительных клеток по п. 67, где растительные клетки выращены в условиях, которые включают естественный солнечный свет.
69. Способ получения трансгенного растения, характеризующегося повышенной выносливостью к повреждению, возникающему при поедании насекомым рода Diabrotica, предусматривающий введение в растение молекулы нуклеиновой кислоты, конструкции нуклеиновой кислоты, молекулы химерной нуклеиновой кислоты, молекулы-предшественника искусственной растительной микроРНК и/или композиции по любому из соответствующих предыдущих пунктов с получениемтаким образом трансгенного растения, характеризующегося повышенной выносливостью к повреждению, возникающему при поедании насекомым рода Diabrotica, по сравнению с контрольным растением.
70. Способ по п. 69, отличающийся тем, что этап введения осуществляют путем трансформации растительной клетки и получения трансгенного растения из трансформированной растительной клетки.
71. Способ по п. 69, отличающийся тем, что этап введения осуществляют путем скрещивания между собой двух растений.
72. Способ повышения контроля популяции насекомых рода Diabrotica, предусматривающий получение трансгенного растения по п. 37 или трансгенного семени по п. 39 и нанесение на растение или семя химического пестицида.
73. Способ по п. 72, отличающийся тем, что химический пестицид представляет собой карбамат, пиретроид, фосфорорганическое соединение, фрипрол, неоникотиноид, хлорорганическое соединение, нереистоксин или их комбинацию.
74. Способ по п. 73, отличающийся тем, что химический пестицид содержит активный ингредиент, выбранный из группы, состоящей из карбофурана, карбарила, метомила, бифентрина, тефлутрина, перметрина, цифлутрина, лямбда-цигалотрина, циперметрина, дельтаметрина, хлорпирифоса, хлорэтоксифоса, диметоата, этопрофоса, малатиона, метил-паратиона, фората, тербуфоса, тебупиримифоса, фипронила, ацетамиприда, имидаклоприда, тиаклоприда, тиаметоксама, эндосульфана, бенсультапа и их комбинации.
75. Способ по п. 74, отличающийся тем, что активный ингредиент доставляют в продукте, выбранном из группы, состоящей из Furadan, Lanate, Sevin, Talstar, Force, Ammo, Cymbush, Delta Gold, Karate, Ambush, Pounce, Brigade, Capture, ProShield, Warrior, Dursban, Fortress, Mocap, Thimet, AAstar, Rampart, Counter, Cygon, Dicap, Regent, Cruiser, Gaucho, Prescribe,Poncho, Aztec и их комбинации.