ЛЕЧЕНИЕ PRDC У МОЛОДЫХ СВИНЕЙ
TREATING PRDC IN GILTS

Перечень последовательностей
В настоящую заявку входит перечень последовательностей в бумажной и электронной версии, сущность и содержание которых включены в настоящее описание в качестве ссылки. Перечень последовательностей идентичен перечню, включенному в WO 06/072065.
Предпосылки создания изобретения
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к применению иммуногенной композиции, которая содержит антиген, представляющий собой цирковирус свиней типа 2 (PCV2), для предупреждения и лечения комплекса респираторных болезней свиней (PRDC) у животных, предпочтительно у молодых (не достигших половой зрелости) свиней.
Описание известного уровня техники
Цирковирус свиней типа 2 (PCV2) представляет собой небольшой (диаметром 17-22 нм) ДНКовый не имеющий оболочки вирус с икосаэдральной структурой, который несет одноцепочечный кольцевой геном. Последовательность PCV2 примерно на 80% идентична последовательности цирковируса свиней типа 1 (PCV1). Однако в настоящее время установлено, что в отличие от PCV1, который, как правило, является невирулентным, заражение свиней PCV2 ассоциировано с рядом болезненных синдромов, которые в целом обозначают как болезни свиней, связанные с цирковирусом (PCVD) (известные также как ассоциированные с цирковирусом болезни свиней (PCVAD)) (Allan и др., IPVS Congress, 2006). Как правило, основным клиническим проявлением PCVD считается синдром послеотъемного мультисистемного истощения (PMWS) (Harding и др., Swine Health Prod; 5, 1997, сс.201-203; Kennedy и др., J Comp Pathol; 122, 2000, сс.9-24). PMWS поражает свиней возрастом 5-18 недель. С клинической точки зрения PMWS характеризуется истощением, бледностью кожи, худосочностью, респираторным дистресс-синдромом, диареей, желтухой новорожденных и желтухой. У некоторых пораженных заболеванием свиней проявляется комбинация всех симптомов, в то время как у других свиней проявляются только один или два из указанных симптомов (Muirhead, Vet. Rec, 150, 2002, с.456). При вскрытии трупа выявляют также микроскопические и макроскопические повреждения многих тканей и органов, причем наиболее часто повреждения встречаются в лимфоидных органах (Allan и Ellis, J Vet. Diagn. Invest., 12, 2001, сс.3-14). Обнаружена выраженная корреляция между уровнем нуклеиновой кислоты или антигена PCV2 и серьезностью микроскопических лимфоидных повреждений. Коэффициенты смертности у свиней, пораженных PCV2, могут достигать 80%.
Доля участия PCV2 в болезнях свиней, отличных от PMWS, в настоящее время изучена недостаточно (Chae, Veterinary J., 169, 2005, сс.326-336). Из литературы известно несколько потенциально родственных состояний, включая комплекс респираторных болезней свиней (PRDC), синдром свиного дерматита и нефропатии (PDNS), снижение репродуктивной функции, грануломатозные энтериты и, возможно, врожденный тремор (СТ-AII) и перинатальный миокардит (Chae, Veterinary J., 169, 2005, сс.326-336). Считается, что из них PRDC имеет наибольшее экономическое значение в Европе, в целом из-за широкого распространения болезни, высокого коэффициента заболеваемости (30-70% на пораженных фермах) и коэффициента смертности (4-6% на пораженных фермах) (Kim и др., Veterinary J., 166, 2003, сс.251-256).
Пневмония у молодых свиней, страдающих PRDC, вызывается комбинацией вирусных и бактериальных агентов, таких как вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRSV), вирус свиного гриппа (SIV), Mycoplasma hyopneumoniae, Actinobacillus pleeuropneumoniae и Pasteurella multocida. Хотя этиология включает несколько патогенов и варьируется от фермы к ферме PRRSV и Mycoplasma hyopneumoniae представляют собой два основных патогена, выделенных из PCV2-позитивных молодых свиней, у которых обнаружен PRDC (Kim и др., Veterinary J., 166, 2003, сс.251-256). К настоящему времени отсутствуют данные о том, является ли PCV2 причинным фактором PRDC или принимает участие в проявлении, серьезности или продолжительности клинических симптомов PRDC.
По сравнению с другими вирусными патогенами PCV2 постоянно диагностируется в легочных повреждениях молодых свиней, страдающих PRDC. В перспективных исследованиях установлено, что пневмония и часто системное заболевание, которое является результатом совместного заражения PCV2 и PRRSV, бывает более серьезным, чем заболевание, ассоциированное с заражением любым из агентом индивидуально, Таким образом, можно предположить, что присутствует выраженный синергизм между PCV2 и другими патогенами в случаях респираторного заболевания в полевых условиях (Ellis и др., Veterinary Microbiol., 98, 2004, сс.159-163). Однако пока не известно, может ли PCV2, если он присутствует у молодых свиней, страдающих PRDC, оказывать влияние на клинические симптомы PRDC у молодых свиней. Из-за повсеместного распространения PCV2, о чем свидетельствует тот факт, что в конце периода откорма количество серопозитивных животных достигает 100%, может также существовать возможность того, что PCV2 вообще не оказывает воздействия на проявление заболевания PRDC, но он точно представляет собой неродственный коинфицирующий агент.
В то время как PMWS главным образом поражает молодых свиней возрастом от 5 до 12 недель, PRDC в основном выявлен у выращенных до стадии завершающего откорма свиней, как правило, возрастом примерно 16-22 недели. Коэффициент заражения составляет 30-70%, а средний коэффициент смертности 4-6% (Kim и др., Veterinary J., 166, 2003, сс.251-256). Клиническими симптомами PRDC являются пролонгированный и необычно серьезный кашель и одышка, не поддающиеся терапии с применением антибиотиков, медленный рост, пониженная эффективность откорма, вялость, анорексия и заметное повышение смертности в период от средней до завершающей фазы откорма.
Отличительным признаком микроскопических повреждений при PRDC является бронхоинтерстициальная пневмония с перибронхиальным и перибронхиолярным фиброзом. Альвеолярные перегородки заметно утолщены в результате инфильтратов макрофагов (Chae, Veterinary J., 169, 2005, сс.326-336).
Подходы к лечению вызываемых PCV2 инфекций, основанные на применении ДНК-вакцины, описаны в US 6703023. В WO 03/049703 описано получение живой химерной вакцины, содержащей каркас PCV-1, в котором ген каркаса PCV-1 заменен на иммуногенный ген патогенных штаммов PCV2. В WO 99/18214 описано несколько штаммов PCV2 и процедуры получения убитой вакцины против PVC2. Однако отсутствуют данные об их эффективности. Эффективная субъединичная вакцина на основе ОРС-2 (открытая рамка считывания 2) описана в WO 06/072065. Любая из указанных вакцин предназначена для применения с целью вакцинации/лечения свиней или молодых свиней старше 3 недель. Ни для одной из указанных вакцин не описано применение для профилактики или лечения молодых свиней, страдающих PRDC, в частности PCV2-позитивных молодых свиней, страдающих PRDC.
Кроме того, не описано, что такие вакцины обусловливают защитный иммунитет от заражения PCV2 или снижение, уменьшение серьезности или исцеление любых клинических симптомов, ассоциированных с ними у молодых свиней, которые уже имеют антитела к PCV2, предпочтительно которые имеют материнские антитела к PCV2.
Краткое описание чертежей
На чертежах показано:
на фиг.1 - различие в приросте массы в группах, отличающихся друг от друга по возрасту на неделю;
на фиг.2 - динамика различия между массой тела (IVP-CP (обработка исследуемым ветеринарным продуктом/контрольным продуктом)) и средним уровнем вирусной нагрузки (log10) в процессе опыта.
Подробное описание изобретения
PRDC характеризуется несколькими клиническими симптомами, включая пролонгированный и необычно серьезный кашель и одышку, не поддающиеся терапии с применением антибиотиков, медленный рост, пониженную эффективность откорма, вялость, анорексию и заметное повышение смертности в период от средней до завершающей фазы откорма. Указанные клинические признаки ассоциированы с широким спектром различных патогенов. Участие в них, и, если это имеет место, то степень участия PCV2 в PRDC к настоящему времени не выяснено. При создании изобретения неожиданно было установлено, что среди различных патогенов PCV2 играет также важную роль в проявлении, серьезности или продолжительности клинических симптомов PRDC. Таким образом, среди прочего PCV2 является одним из причинных факторов PRDC у молодых свиней.
В целом, участие одного из причинных факторов в вызываемом несколькими возбудителями заболевании (многофакторное заболевание) типа PRDC, является не предсказуемым. Причинный фактор может не оказывать воздействия, но также изменять, подавлять, вытеснять, перекрывать или усиливать действие других факторов на проявление, серьезность и продолжительность клинических симптомов многофакторного заболевания типа PRDC. Например, снижение уровня или элиминация одного из причинных факторов многофакторного заболевания типа PRDC, может не оказывать никакого воздействия на клиническое проявление этого заболевания, если присутствует по меньшей мере один из других причинных факторов, но может также существенно снижать клинические симптомы болезни, даже в присутствии любого из других причинных факторов. Чем большее количество причинных факторов принимают участие, тем меньше вероятность того, что снижение уровня или элиминация только одного из причинных факторов окажет положительное воздействие на продолжительность проявления, серьезность или продолжительность болезни. При создании изобретения неожиданно было установлено, что проявление, серьезность или продолжительность клинических симптомов PRDC у молодых свиней можно уменьшать или снижать путем профилактики или лечения имеющих риск возникновения или пораженных животных с помощью антигена PCV2. В частности, серьезность и продолжительность клинических симптомов, ассоциированных PRDC, можно значительно уменьшать или снижать у молодых свиней, зараженных PCV2 в сочетании с патогенами, в отношении которых известно, что они вызывают или могут быть ассоциированы с PRDC у молодых свиней, такими как PRRSV, Mycoplasma hyopneumoniae, Bordetella bronchiseptica, вирус свиного гриппа, Mycoplasma hyorhinis и/или Pasteurella multocida. Другими словами, профилактика или лечение молодых свиней, страдающих PRDC, с помощью антигена PCV2 оказывает положительное воздействие на общее состояние здоровья молодых свиней, прирост массы в процессе откорма и смертность молодых свиней в период от средней до завершающей фазы откорма, в частности, известно, что на такие из указанных факторов, как общее состояние здоровья, прирост массы, смертность, оказывают отрицательное воздействие PRRSV, Mycoplasma hyopneumoniae, Bordetella bronchiseptica, вирус свиного гриппа, Mycoplasma hyorhinis и/или Pasteurella multocida.
Таким образом, одним из объектов настоящего изобретения является способ профилактики и лечения комплекса респираторных болезней свиней (PRDC) и/или любых клинических симптомов, ассоциированных с PRDC, у животных, заключающийся в том, что вводят в терапевтически эффективном количестве антиген PCV2 или иммуногенную композицию, содержащую антиген PCV2, животному, которое нуждается в таком лечении.
Клинические симптомы, ассоциированные с PRDC, выбирают из группы, включающей кашель и одышку, медленный рост, пониженную эффективность откорма, вялость, анорексию и/или заметное повышение смертности в период от средней до завершающей фазы откорма. Таким образом, другим объектом настоящего изобретения является способ профилактики и лечения кашля и одышки, медленного роста, пониженной эффективности откорма, вялости, анорексии и/или заметного повышения смертности, заключающийся в том, что вводят в терапевтически эффективном количестве антиген PCV2 или иммуногенную композицию, содержащую антиген PCV2, животному, которое нуждается в таком лечении. Предпочтительно кашель и одышка не поддаются терапии с применением антибиотиков.
Понятие «антиген» в контексте настоящего описания относится к аминокислотной последовательности, которая вызывает иммунный ответ у хозяина. Антиген в контексте настоящего описания включает полноразмерную последовательность любых белков PCV2, их аналогов или их иммуногенных фрагментов. Понятие «иммуногенный фрагмент» обозначает фрагмент белка, который содержит один или несколько эпитопов и в результате этого вызывает иммунный ответ у хозяина. Такие фрагменты можно идентифицировать с помощью любого из многочисленных методов картирования эпитопов, хорошо известных в данной области (см., например, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, том 66, под ред. Glenn E. Morris, изд-во Humana Press, Totowa, New Jersey, 1996). Например, линейные эпитопы можно выявлять, например, осуществляя конкурентный синтез большого количества пептидов на твердых подложках, где пептиды соответствуют фрагментам молекулы белка, и, подвергая пептиды взаимодействию с антителами, при этом пептиды остаются прикрепленными к подложкам. Такие методы известны в данной области и описаны, например в US 4708871; у Geysen и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1984, сс.3998-4002; Geysen и др., Molec. Immunol. 23, 1986, сс.709-715. Аналогично этому, конформационные эпитопы легко можно идентифицировать путем определения пространственной конформации аминокислот, например, с помощью рентгеновской кристаллографии и 2-мерного ядерного магнитного резонанса (см., например, Epitope Mapping Protocols, выше).
Понятие включает также синтетические антигены, например, полиэпитопы, фланкирующие эпитопы и другие полученные методами рекомбинации или синтеза антигены (см., например, Bergmann и др., Eur. J. Immunol. 23, 1993, сс.2777-2781; Bergmann и др., J. Immunol. 157, 1996, сс.3242-3249; Suhrbier А., Immunol, и Cell Biol. 75, 1997, сс.402-408; Gardner и др., 12th World AIDS Conference, Geneva, Switzerland, 28 июня - 3 июля 1998 г.).
Понятие «иммунный ответ» относится, но, не ограничиваясь только этим, к формированию в хозяине клеточно- и/или антитело-опосредованного иммунного ответа на представляющий интерес антиген, композицию или вакцину. Как правило, «иммунный ответ» включает, но, не ограничиваясь только ими, одну или несколько из следующих реакций: производство или активацию антител, B-клеток, T-клеток-хелперов, T-клеток-супрессоров и/или цитотоксических T-клеток, специфически направленных на антиген или антигены, включенный(е) в представляющую интерес композицию или вакцину. Предпочтительно организм-хозяин должен вырабатывать либо терапевтический, либо защитный иммунологический (вторичный иммунный) ответ так, чтобы повышалась устойчивость к новой инфекции и/или снижалась клиническая серьезность заболевания. Такое защитное действие можно выявлять либо по снижению уровня или серьезности, либо по отсутствию одного или нескольких симптомов, ассоциированных с заражением хозяина PCV2, замедлению появления вируса в крови (виремия), снижению персистентности вируса, снижению общей вирусной нагрузки и/или снижению вирусной экскреции.
Понятия «иммуногенная композиция» или «вакцина» (оба понятия являются синонимами) в контексте настоящего описания относятся к любой фармацевтической композиции, которая содержит антиген PCV2, при этом, композицию можно применять для предупреждения или лечения ассоциированного с заражением PCV2 заболевания или состояния у животного. Предпочтительная иммуногенная композиция может индуцировать, стимулировать или повышать иммунный ответ на PCV2. Под это понятие подпадают как субъединичные иммуногенные композиции, описанные ниже, так и композиции, которые содержат убитые (полностью обезвреженные) или ослабленные и/или инактивированные PCV2.
Таким образом, следующим объектом настоящего изобретения является способ профилактики и лечения комплекса респираторных болезней свиней (PRDC) и/или любых клинических симптомов, ассоциированных с PRDC, у животного, заключающийся в том, что животному, которое нуждается в таком лечении, вводят в эффективном количестве антиген PCV2 или иммуногенную композицию, которая содержит антиген PCV2, где иммуногенная композиция представляет собой субъединичную иммуногенную композицию, композицию, содержащую полностью обезвреженные или ослабленные и/или инактивированные PCV2.
В контексте настоящего описания понятие «субъединичная иммуногенная композиция» относится к композиции, которая содержит по меньшей мере один иммуногенный полипептид или антиген, но не все антигены, выведенные или являющиеся гомологами антигена PCV2. Такая композиция практически свободна от интактного PCV2. Таким образом, «субъединичную иммуногенную композицию» получают по меньшей мере из частично очищенных или фракционированных (предпочтительно практически очищенных) иммуногенных полипептидов из PCV2, или их рекомбиантных аналогов. Субъединичная иммуногенная композиция может содержать субъединицу антигена или антигенов, представляющих интерес, которые практически свободны от других антигенов или полипептидов из PCV2 или являются фракционированными. Предпочтительная иммуногенная субъединичная композиция содержит белок ОРС-2 PCV2, описанный ниже. Наиболее предпочтительными являются иммуногенные субъединичные композиции, которые содержат любой из антигенов PCV2, представленных в WO 06/072065, которая полностью включена в настоящее описание в качестве ссылки.
Таким образом, следующим объектом изобретения является иммуногенная композиция, как она определена в контексте настоящего описания, которая наиболее предпочтительно содержит полипептид или его фрагмент, экспрессируемый ОРС-2 PCV2. ДНК ОРС-2 PCV2 и белок, которые применяют согласно изобретению для приготовления композиций и с помощью способов, предлагаемых в изобретении, представляет собой высоко консервативный домен в изолятах PCV2 и поэтому согласно изобретению любая ОРС-2 PCV2 должна быть эффективной в качестве источника ДНК ОРС-2 PCV и/или полипептида. Предпочтительным белком ОРС-2 PCV2 является белок, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:11 в WO 06/072065. Другим предпочтительным полипептидом ОРС-2 PCV является полипептид, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:5 в WO 06/072065. Однако специалистам в данной области должно быть очевидно, что последовательность может варьироваться в пределах 6-10% в соответствии с понятием гомологии последовательностей и все еще сохранять антигенные характеристики, которые делают ее приемлемой для включения в иммуногенные композиции. Антигенные характеристики иммунологической композиции можно оценивать, например, путем экспериментов по контрольному заражению, описанных в примере 4 WO 06/072065. Кроме того, антигенные характеристики модифицированного антигена все еще сохраняются, когда модифицированный антиген обеспечивает по меньшей мере 70%, предпочтительно 80%, более предпочтительно 90% защитного иммунитета по сравнению с белком ОРС-2 PCV2, который кодируется полинуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:4 в WO 06/072065.
Таким образом, еще одним объектом настоящего изобретения является способ профилактики и лечения комплекса респираторных болезней свиней (PRDC) и/или любых клинических симптомов, ассоциированных с PRDC, у животного, заключающийся в том, что животному, которое нуждается в таком лечении, вводят в эффективном количестве антиген PCV2 или иммуногенную композицию, которая содержит антиген PCV2, где антиген PCV2 представляет собой антигенный белок ОРС-2 PCV2, который обеспечивает по меньшей мере 70%, предпочтительно 80%, более предпочтительно 90% защитного иммунитета по сравнению с белком ОРС-2 PCV2, который кодируется полинуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:4 в WO 06/072065. Предпочтительно белок ОРС-2 PCV2 имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO:11 или SEQ ID NO:5 в WO 06/072065.
В некоторых вариантах иммуногенные участки белка ОРС-2 PCV2 применяют а качестве антигенного компонента в иммуногенной композиции, содержащей антиген PCV2. Понятие «иммуногенный участок» в контексте настоящего описания относится к укороченным и/или имеющим замены формам или фрагментам белка и/или полинуклеотида ОРС-2 PCV2 соответственно. Предпочтительно такие укороченные и/или имеющие замены формы или фрагменты должны содержать по меньшей мере 6 смежных аминокислот из полноразмерного полипептида ОРС-2. Более предпочтительно укороченные или имеющие замены формы или фрагменты должны содержать по меньшей мере 10, более предпочтительно по меньшей мере 15 и еще более предпочтительно по меньшей мере 19 смежных аминокислот из полноразмерного полипептида ОРС-2. PCV. Две предпочтительные в этом плане последовательности представлены в виде SEQ ID NO:9 и SEQ ID NO:10 в WO 06/072065. Следует понимать также, что указанные последовательности могут представлять собой часть более крупных фрагментов или укороченных форм.
Как указано выше, предпочтительным является также любой полипептид ОРС-2 PCV2, который кодируется нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:4. Кроме того, как должно быть очевидно специалистам в данной области, эта последовательность может варьироваться в пределах 6-20% в соответствии с понятием гомологии последовательностей и все еще сохранять антигенные характеристики, которые делают ее приемлемой для включения в иммуногенные композиции. В некоторых вариантах укороченные или имеющие замены формы или фрагменты полипептида ОРС-2 PVC2 применяют в качестве антигенного компонента в композиции. Предпочтительно такие укороченные или имеющие замены формы или фрагменты должны содержать по меньшей мере 18 смежных нуклеотидов из полноразмерной нуклеотидной последовательности ОРС-2 PVC2, например, SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:4. Более предпочтительно укороченные или имеющие замены формы или фрагменты должны содержать по меньшей мере 30, более предпочтительно по меньшей мере 45 и еще более предпочтительно по меньшей мере 57 смежных нуклеотидов из полноразмерной нуклеотидной последовательности ОРС-2 PVC2, например, представленной в SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:4.
Понятие «идентичность последовательностей», как известно в данной области, относится к родству между двумя или большим количеством полипептидных последовательностей или двумя или большим количеством полинуклеотидных последовательностей, а именно между референс-последовательностью и рассматриваемой последовательностью, подлежащей сравнению с референс-последовательностью. Идентичность последовательностей определяют путем сравнения данной последовательности с референс-последовательностью после оптимального выравнивания последовательностей для получения наиболее высокой степени сходства последовательностей, что определяют по совместимости отрезков указанных последовательностей. После выравнивания идентичность последовательностей оценивают по находящимся в одинаковых положениях основаниям (по типу «положение с положением»), например, последовательности являются «идентичными» в определенном положении, если в этом положении нуклеотиды или аминокислотные остатки идентичны. Общее количество таких идентичных положений затем делят на общее количество нуклеотидов или остатков в референс-последовательности, получая % идентичности последовательностей. Идентичность последовательностей легко можно рассчитывать с помощью известных методов, включая, но, не ограничиваясь только ими, описанные в: Computational Molecular Biology, под ред. Lesk A.N., изд-во Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, под ред. Smith D.W., изд-во, Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, часть I, под ред. Griffin A.M. и Griffin H.G., изд-во Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge G., изд-во Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, под ред. Gribskov M. и Devereux J., изд-во M. Stockton Press, New York, 1991; и Carillo H. и Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48, 1988, c.1073, содержание которых включено в настоящее описание в качестве ссылки. Предпочтительные методы определения идентичности последовательностей созданы так, чтобы получать наибольшее соответствие между изучаемыми последовательностями. Методы определения идентичности последовательностей приведены в систему в доступных общественности компьютерных программах, которые позволяют определять идентичность последовательностей для рассматриваемых последовательностей. Примерами таких программ являются, но, не ограничиваясь только ими, пакет программ GCG (Devereux J. и др., Nucleic Acids Research, 12(1), 1984, с.387), BLASTP, BLASTN и FASTA (Altschul S.F. и др., J. Molec. Biol., 215, 1990, cc.403-410). Программа BLASTX является доступной общественности от фирмы NCBI и других источников (BLAST Manual, Altschul S. и др., NCVINLM NIH Bethesda, MD 20894, Altschul S.F. и др., J. Molec. Biol., 215, 1990, cc.403-410), содержание которых включено в настоящее описание в качестве ссылки). Эти программы позволяют осуществлять оптимальное выравнивание последовательностей с помощью принимаемых по умолчанию значений, таких как вес бреши, для того, что получать наиболее высокий уровень идентичности последовательностей для рассматриваемой последовательности и референс-последовательности. В качестве иллюстрации: когда упоминается полинуклеотид, нуклеотидная последовательность которого по меньшей мере на 85%, предпочтительно на 90%, еще более предпочтительно на 95% «идентична последовательности» нуклеотидной референс-последовательности, то подразумевается, что нуклеотидная последовательность данного полинуклеотида идентична референс-последовательности за исключением того, что данная полинуклеотидная последовательность может включать вплоть до 15, предпочтительно вплоть до 10, еще боле предпочтительно вплоть до 5 точечных мутаций на каждые 100 нуклеотидов нуклеотидной референс-последовательности. Другими словами, для того, чтобы полинуклеотид имел нуклеотидную последовательность, идентичную по меньшей мере на 85%, предпочтительно на 90%, еще боле предпочтительно на 95% с нуклеотидной референс-последовательностью, вплоть до 15%, предпочтительно 10%, еще более предпочтительно 5% нуклеотидов в референс-последовательности можно изымать путем делеции или заменять на другой нуклеотид, или вплоть до 15% нуклеотидов, предпочтительно 10%, еще более предпочтительно 5% от общего количества нуклеотидов в референс-последовательности можно встраивать в референс-последовательность. Эти мутации референс-последовательности могут иметь место на 5′- или 3′-конце нуклеотидной референс-последовательности или в любом положении между этими концами, либо находясь индивидуально среди нуклеотидов в референс-последовательности, либо в виде одной или нескольких смежных групп в референс-последовательности. Аналогично этому, когда упоминают полипептид, аминокислотная последовательность которого идентична по меньшей мере, например на 85%, предпочтительно на 90%, еще более предпочтительно на 95% аминокислотной референс-последовательности, то подразумевают, что рассматриваемая аминокислотная последовательность полипептида идентична референс-последовательности за исключением того, что рассматриваемая полипептидная последовательность может включать вплоть до 15, предпочтительно вплоть до 10, еще более предпочтительно вплоть до 5 аминокислотных замен на каждые 100 аминокислот аминокислотной референс-последовательности. Другими словами, для получения данной полипептидной последовательности, которая по меньшей мере на 85%, предпочтительно на 90%, еще более предпочтительно на 95% идентична последовательности аминокислотной референс-последовательности, вплоть до 15%, предпочтительно вплоть до 10%, еще более предпочтительно вплоть до 5% аминокислотных остатков в референс-последовательности можно изымать путем делеции или заменять на другую аминокислоту, или вплоть до 15% аминокислот, предпочтительно вплоть до 10%, еще более предпочтительно вплоть до 5% от общего количества аминокислотных остатков в референс-последовательности можно встраивать в референс-последовательность. Эти изменения референс-последовательности могут иметь место на амино- или карбоксиконце аминокислотной референс-последовательности или в любом положении между этими концевыми положениями, либо находясь индивидуально среди остатков в референс-последовательности, либо в виде одной или нескольких смежных групп в референс-последовательности. Предпочтительно положения остатков, которые являются неидентичными, отличаются консервативными аминокислотными заменами. Однако консервативные замены не относят к совместимым при определении идентичности последовательностей.
Определение «гомологии последовательностей» в контексте настоящего описания относится к методу определения сходства двух последовательностей. Для определения гомологии последовательностей две или большее количество последовательностей подвергают оптимальному выравниванию и при необходимости интродуцируют бреши. В отличие от оценки идентичности последовательностей при определении гомологии последовательностей консервативные аминокислотные замены считают удовлетворяющими условиям гомологии. Другими словами, для того, чтобы полипептид или полинуклеотид имел 95% гомологию последовательности с референс-последовательностью, 85%), предпочтительно 90%, еще более предпочтительно 95% аминокислотных остатков или нуклеотидов в референс-последовательности должны соответствовать или содержать консервативную замену на другую аминокислоту или нуклеотид, или количество аминокислот или нуклеотидов, составляющее вплоть до 15%), предпочтительно вплоть до 10%, еще более предпочтительно вплоть до 5% от общего количества аминокислотных остатков или нуклеотидов, не включая консервативные замены, в референс-последовательности можно встраивать в референс-последовательность. Предпочтительно гомологичная последовательность содержит по меньшей мере участок, состоящий из 50, еще более предпочтительно из 100, еще более предпочтительно из 250, еще более предпочтительно из 500 нуклеотидов.
Понятие «консервативная замена» относится к замене аминокислотного остатка или нуклеотида на другой аминокислотный остаток или нуклеотид, имеющий сходные характеристики или свойства, включая размер, гидрофобность и т.д., в результате чего общая функциональность не изменяется существенно.
Понятие «выделенный» означает «измененный человеком» относительно его встречающегося в естественных условиях состояния, т.е., если он встречается в природе, то его изменяют или удаляют из естественного окружения, или осуществляют и то, и другое. Например, полинуклеотид или полипептид, встречающийся в естественных условиях в живом организме, не является «выделенным», но этот же полинуклеотид или полипептид, отделенный от материала, вместе с которым он присутствует в своем естественном состоянии, является «выделенным» согласно применяемому в описании понятию.
Таким образом, еще одним объектом настоящего изобретения является способ профилактики и лечения комплекса респираторных болезней свиней (PRDC) и/или любых клинических симптомов, ассоциированных с PRDC, у животного, заключающийся в том, что животному, которое нуждается в таком лечении, вводят в эффективном количестве антиген PCV2 или иммуногенную композицию, которая содержит антиген PCV2, где белок ОРС-2 PCV2 представляет собой любой из указанных выше белков. Предпочтительно белок ОРС-2 PCV2 представляет собой:
I) полипептид, содержащий последовательность, представленную в SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 или SEQ ID NO:11 в WO 06/07065;
II) любой полипептид, который по меньшей мере на 80% гомологичен полипептиду, указанному в I);
III) любой иммуногенный фрагмент полипептидов, указанных в I) и/или II);
IV) иммуногенный фрагмент, указанный в III), который содержит по меньшей мере 10 смежных аминокислот, входящих в последовательности, представленные в SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 или SEQ ID NO:11 в WO 06/072065,;
V) полипептид, который кодируется ДНК, содержащей последовательность, представленную в SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:4 в WO 06/072065;
VI) любой полипептид, кодируемый полинуклеотидом, который по меньшей мере на 80% гомологичен полинуклеотиду, указанному в V);
VII) любой иммуногенный фрагмент полипептидов, которые кодируются полинуклеотидом, указанным в V) и/или VI);
VIII) иммуногенный фрагмент, указанный в VII), где полинуклеотид, кодирующий иммуногенный фрагмент, содержит по меньшей мере 30 смежных нуклеотидов, входящих в последовательности, которые представлены в SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:4 в WO 06/072065.
Предпочтительно любой из указанных иммуногенных фрагментов имеет иммуногенный характеристики белка ОРС-2 PCV2, кодируемого последовательностями, которые представлены в SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:4 в WO 06/07065.
Таким образом, согласно следующему объекту изобретения белок ОРС-2 PCV2 содержится в иммуногенной композиции с таким уровнем включения антигена, который является эффективным для индукции требуемого иммунного ответа, а именно для снижения количества случаев, уменьшения серьезности или предупреждения или снижения PRDC и/или одного или нескольких клинических симптомов, ассоциированных с PRDC. Предпочтительно уровень включения белка ОРС-2 PCV2 соответствует по меньшей мере 0,2 мкг антигена/мл конечной иммуногенной композиции (мкг/мл), более предпочтительно от примерно 0,2 до примерно 400 мкг/мл, еще более предпочтительно от примерно 0,3 до примерно 200 мкг/мл, еще более предпочтительно от примерно 0,35 до примерно 100 мкг/мл, еще более предпочтительно от примерно 0,4 до примерно 50 мкг/мл, еще более предпочтительно от примерно 0,45 до примерно 30 мкг/мл, еще более предпочтительно от примерно 0,5 до примерно 18 мкг/мл, еще более предпочтительно от примерно 0,6 до примерно 15 мкг/мл, еще более предпочтительно от примерно 0,75 до примерно 8 мкг/мл, еще более предпочтительно от примерно 1,0 до примерно 6 мкг/мл, еще более предпочтительно от примерно 1,3 до примерно 3,0 мкг/мл, еще более предпочтительно от примерно 1,4 до примерно 2,5 мкг/мл, еще более предпочтительно от примерно 1,5 до примерно 2,0 мкг/мл и наиболее предпочтительно примерно 1,6 мкг/мл.
Согласно еще одному объекту изобретения уровень включения антигена ОРС-2 PCV составляет по меньшей мере 0,2 мкг белка ОРС-2 PCV2, описанного выше, на дозу конечной антигенной композиции (мкг/дозу), более предпочтительно от примерно 0,2 до примерно 400 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 0,3 до примерно 200 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 0,35 до примерно 100 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 0,4 до примерно 50 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 0,45 до примерно 30 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 0,6 до примерно 15 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 0,75 до примерно 8 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 1,0 до примерно 6 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 1,3 до примерно 3,0 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 1,4 до примерно 2,5 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 1,5 до примерно 2,0 мкг/дозу и наиболее предпочтительно примерно 1,6 мкг/дозу.
Полипептид ОРС-2 PCV2, применяемый в иммуногенной композиции, предлагаемой в настоящем изобретении, можно получать любым методом, включая выделение и очистку ОРС-2 PCV2, стандартный метод синтеза белков и метод рекомбинантной ДНК. Предпочтительные методы получения полипептида ОРС-2 PCV2 представлены в WO 06/072065, сущность и содержание которой полностью включены в настоящее описание в качестве ссылки. В целом, метод состоит в следующем: заражают чувствительные клетки рекомбинантным вирусным вектором, который содержит кодирующие последовательности ДНК ОРС-2 PCV2, экспрессируют полипептид ОРС-2 PCV2 с помощью рекомбинантного вируса и выделяют экспрессируемый полипептид ОРС-2 PCV2 из супернатанта путем фильтрации, и инактивируют общепринятым методом, предпочтительно используя бинарный этиленимин (БЭИ), который затем нейтрализуют для прекращения процесса инактивации.
Понятие «иммуногенная композиция» в контексте настоящего описания относится также к композиции, которая содержит I) любой белок ОРС-2 PCV2, описанный выше, предпочтительно в указанных выше концентрациях, и II) по меньшей мере часть вирусного вектора, экспрессирующего указанный белок ОРС-2 PCV2, предпочтительно рекомбинантного бакуловируса. Кроме того, иммуногенная композиция может содержать I) любой из белков ОРС-2 PCV2, описанных выше, предпочтительно в указанных выше концентрациях, II) по меньшей часть вирусного вектора, экспрессирующего белок ОРС-2 PCV2, предпочтительно рекомбинантного бакуловируса, и III) часть супернатанта клеточной культуры.
Таким образом, еще одним объектом настоящего изобретения является способ профилактики и лечения комплекса респираторных болезней свиней (PRDC) и/или любых клинических симптомов, ассоциированных с PRDC, у животного, заключающийся в том, что животному, которое нуждается в таком лечении, вводят в эффективном количестве антиген PCV2 или иммуногенную композицию, которая содержит антиген PCV2, где антиген PCV2 представляет собой рекомбинантный ОРС-2 PCV2, предпочтительно экспрессируемый в бакуловирусе ОРС-2 PCV2. Предпочтительно рекомбинантные или экспрессируемые в бакуловирусе ОРС-2 PCV2 имеют указанную выше последовательность.
Понятие «иммуногенная композиция» в контексте настоящего описания относится также к композиции, которая содержит I) любой из белков ОРС-2 PCV2, описанных выше, предпочтительно в указанных выше концентрациях, II) по меньшей мере часть вирусного вектора, экспрессирующего указанный белок ОРС-2 PCV2, предпочтительно рекомбинантного бакуловируса, и III) часть клеточной культуры; где примерно 90% компонентов имеют размер менее 1 мкм.
Понятие «иммуногенная композиция» в контексте настоящего описания относится также к композиции, которая содержит I) любой из белков ОРС-2 PCV2, описанных выше, предпочтительно в указанных выше концентрациях, II) по меньшей мере часть вирусного вектора, экспрессирующего указанный белок ОРС-2 PCV2, III) часть клеточной культуры, IV) инактивирующий агент, предназначенный для инактивации рекомбинантного вирусного вектора, предпочтительно БЭИ, где примерно 90% компонентов I)-III) имеют размер менее 1 мкм. Предпочтительно БЭИ присутствует в концентрациях, эффективных для инактивации бакуловируса, предпочтительно от 2 до примерно 8 мМ БЭИ, предпочтительно примерно 5 мМ БЭИ.
Понятие «иммуногенная композиция» в контексте настоящего описания относится также к композиции, которая содержит I) любой из белков ОРС-2 PCV2, описанных выше, предпочтительно в указанных выше концентрациях, II) по меньшей мере часть вирусного вектора, экспрессирующего указанный белок ОРС-2 PCV2, III) часть клеточной культуры, IV) инактивирующий агент, предназначенный для инактивации рекомбинантного вирусного вектора, предпочтительно БЭИ, и V) нейтрализующий агент, предназначенный для прекращения инактивации, опосредуемой инактивирующим агентом, где примерно 90% компонентов I)-III) имеют размер менее 1 мкм. Предпочтительно, если инактивирующий агент представляет собой БЭИ, то указанная композиция содержит тиосульфат натрия в количествах, эквивалентных количеству БЭИ.
Полипептид включают в композицию, которую можно вводить животному, чувствительному к заражению PCV2. В предпочтительных вариантах в композицию можно включать дополнительные компоненты, известные специалистам в данной области (см. также Remington's Pharmaceutical Sciences, 18-е изд., изд-во Mack Publ., Easton, 1990). Кроме того, в состав композиции могут входить один или несколько приемлемых для применения в ветеринарии носителей. В контексте настоящего описания понятие «приемлемый для применения в ветеринарии носитель» включает, но, не ограничиваясь только ими, любые из перечисленных или все растворители, дисперсионные среды, материалы для нанесения покрытия, адъюванты, стабилизаторы, разбавители, консерванты, антибактериальные и противогрибковые агенты, агенты для придания изотоничности, замедляющие адсорбцию агенты и т.п. В предпочтительном варианте осуществления изобретения иммуногенная композиция содержит белок ОРС-2 PCV2, описанный выше, предпочтительно в указанных выше концентрациях, который смешивают с адъювантом, предпочтительно карбополом, и физиологическим раствором.
Специалистам в данной области должно быть очевидно, что композиция, которую применяют согласно изобретению, может включать известные пригодные для инъекции физиологически приемлемые стерильные растворы. Для приготовления готового к применению раствора для парентеральной инъекции или инфузии широко используют водные изотонические растворы, такие, например, как физиологический раствор или соответствующие растворы белков плазмы. Кроме того, иммуногенные композиции и вакцины, предлагаемые в настоящем изобретении, могут включать разбавители, агенты для придания изотоничности, стабилизаторы или адъюванты. Разбавители могут представлять собой воду, физиологический раствор, декстрозу, этанол, глицерин и т.п. Агенты для придания изотоничности могут представлять собой среди прочего хлорид натрия, декстрозу, маннит, сорбит и лактозу. Стабилизаторы представляют собой среди прочего альбумин и соли щелочных металлов и этилендиаминтетрауксусной кислоты.
Понятие «адъюванты» в контексте настоящего описания может относиться к гидроксиду алюминия и фосфату алюминия, сапонинам, таким, например, как Quil A, QS-21 (фирма Cambridge Biotech Inc., Кэмбридж, шт.Массачусетс), GPI-0100 (фирма Galenica Pharmaceuticals, Inc., Бирмингем, шт.Алабама), эмульсии вода-в-масле, эмульсии масло-в-воде, эмульсии вода-в-масле-в-воде. Основой эмульсии может являться, в частности, легкое жидкое парафиновое масло (соответствующее Европейской фармакопеи); изопреноидное масло, такое как сквалан или сквален; масло, образовавшееся в результате олигомеризации алкенов, прежде всего изобутена или децена; эфиры кислот или спиртов, содержащие линейную алкильную группу, более конкретно растительные масла, этилолеат, ди(каприлат/капрат) пропиленгликоля, три(каприлат/капрат) глицерина или диолеат пропиленгликоля; эфиры разветвленных жирных кислот или спиртов, в частности, эфиры изостеариновой кислоты. Масла применяют в сочетании с эмульгаторами для получения эмульсии. Эмульгаторы предпочтительно представляют собой неионогенные поверхностно-активные вещества, прежде всего сложные эфиры сорбитана, маннида (например, безводный маннитолеат), гликоля, полиглицерина, пропиленгликоля и олеиновой, изостеариновой, рицинолеиновой или гидроксистеариновой кислоты, которые необязательно являются этоксилированными, и блок-сополимеры полиоксипропилена-полиоксиэтилена, в частности продукты типа Pluronic, прежде всего L121 (см. Hunter и др., The Theory and Practical Application of Adjuvants, под ред. Stewart-Tull D.E.S., изд-во John Wiley and Sons, NY, cc.51-94, 1995 и Todd и др., Vaccine 15, 1997, cc.564-570).
Например, можно применять SPT-эмульсию, описанную на с.147 в: «Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach)), под ред. M. Powell и M. Newman, изд-во Plenum Press, 1995, и эмульсию MF59, описанную на с.183 в этой же публикации.
Другим примером адъюванта является соединение, выбранное из полимеров акриловой или метакриловой кислоты и сополимеров малеинового ангидрида и алкенильного производного. Предпочтительными адъювантами являются полимеры акриловой или метакриловой кислоты, прежде всего, сшитые с простыми полиалкениловыми эфирами сахаров или многоатомными спиртами. Эти соединения известны под названием карбомеры (Phameuropa, т.8, №.2 июня 1996 г.). Специалистам в данной области в качестве ссылки можно предложить US 2909462, в котором описаны указанные акриловые полимеры, сшитые с полигидроксилированным соединением, которое имеет по меньшей мере 3 гидроксильные группы, предпочтительно не более 8, при этом атомы водорода по меньшей мере трех гидроксильных групп замещены ненасыщенными алифатическими радикалами, которые имеют по меньшей мере 2 атома углерода. Предпочтительными являются радикалы, которые содержат от 2 до 4 атомов углерода, например, винильные, аллильные и другие ненасыщенные группы ряда этилена. Ненасыщенные радикалы могут сами содержать другие заместители, такие как метил. Наиболее предпочтительными являются продукты, поступающие в продажу под названием карбопол (фирма BF Goodrich, шт.Огайо). Их сшивают с аллилсахарозой или аллилпентаэритритолом. Среди них прежде всего следует упомянуть карбопол 974P, 934P и 971P. Наиболее предпочтительным для применения является карбопол 971P. Наиболее предпочтительно применяют карбопол, в частности можно применять карбопол 971P, предпочтительно в количествах от примерно 500 мкг до примерно 5 мг на дозу, еще более предпочтительно в количестве от примерно 750 мкг до примерно 2,5 мг на дозу и наиболее предпочтительно в количестве примерно 1 мг на дозу.
Другими пригодными адъювантами являются, но, не ограничиваясь только ими, система RIBI-адъювантов (фирма Ribi Inc.), блок-сополимеры (фирма CytRx, Атланта, шт.Джорджия), SAF-M (фирма Chiron, Emeryville, шт.Калифорния), монофосфорил-липид А, адъювант на основе амина липида авридина, термолабильный энтеротоксин Е.coli (рекомбинантный или нерекомбинантный), токсин холеры, IMS 1314 или мурамил-дипептид.
Предпочтительно адъювант добавляют в количестве от примерно 100 мкг до примерно 10 мг на дозу. Еще более предпочтительно адъювант добавляют в количестве от примерно 100 мкг до примерно 10 мг на дозу. Еще более предпочтительно адъювант добавляют в количестве от примерно 500 мкг до примерно 5 мг на дозу. Еще более предпочтительно адъювант добавляют в количестве от примерно 750 мкг до примерно 2,5 мг на дозу. Наиболее предпочтительно адъювант добавляют в количестве примерно 1 мг на дозу.
Кроме того, композиция может включать один или несколько фармацевтически приемлемых носителей. В контексте настоящего описания понятие «фармацевтически приемлемый носитель» включает любой из перечисленных или все растворители, дисперсионные среды, материалы для нанесения покрытия, стабилизаторы, разбавители, консерванты, антибактериальные и противогрибковые агенты, агенты для придания изотоничности, замедляющие адсорбцию агенты и т.п. Наиболее предпочтительно композиция, предлагаемая в изобретении, содержит белок ОРС-2 PCV2, выделенный из супернатанта культивируемых in vitro клеток, где указанные клетки инфицируют рекомбинантным вирусным вектором, который содержит ДНК ОРС-2 PCV2 и экспрессирует белок ОРС-2 PCV2, и где указанную клеточную культуру обрабатывают от примерно 2 до примерно 8 мМ БЭИ, предпочтительно примерно 5 мМ БЭИ, для инактивации вирусного вектора и нейтрализующего агента, взятого в эквивалентной концентрации, предпочтительно раствором тиосульфата натрия в конечной концентрации от примерно 2 до примерно 8 мМ, предпочтительно примерно 5 мМ.
Настоящее изобретение относится также к применению иммуногенной композиции для профилактики или лечения PRDC или снижения клинических симптомов, ассоциированных с PRDC, которая содержит I) любой из белков ОРС-2 PCV2, описанных выше, предпочтительно в указанных выше концентрациях, II) по меньшей мере часть вирусного вектора, экспрессирующего указанный белок ОРС-2 PCV2, III) часть клеточной культуры, IV) инактивирующий агент, предназначенный для инактивации рекомбинантного вирусного вектора, предпочтительно БЭИ, и V) нейтрализующий агент, предназначенный для прекращения инактивации, опосредуемой инактивирующим агентом, предпочтительно тиосульфат натрия в количествах, эквивалентных количеству БЭИ; и VI) приемлемый адъювант, предпочтительно карбопол 971 в указанных выше количествах; где примерно 90% компонентов I)-III) имеют размер менее 1 мкм. Согласно еще одному объекту изобретения указанная иммуногенная композиция содержит также фармацевтически приемлемую соль, предпочтительно фосфат, в физиологически приемлемых концентрациях. Предпочтительно значение pH указанной иммуногенной композиции доводят до физиологического значения pH, т.е. примерно от 6,5 до 7,5.
В контексте настоящего описания иммуногенная композиция представляет собой также композицию, которая содержит в одном мл: I) по меньшей мере 1,6 мкг белка ОРС-2 PCV2, описанного выше, II) по меньшей мере часть бакуловируса, экспрессирующего указанный белок ОРС-2 PCV2, III) часть клеточной культуры, IV) примерно от 2 до 8 мМ БЭИ, V) тиосульфат натрия в количествах, эквивалентных количеству БЭИ, и VI) примерно 1 мг карбопола 971, и VII) фосфат в физиологически приемлемой концентрации; где примерно 90% компонентов I)-III) имеют размер менее 1 мкм, и значение pH указанной иммуногенной композиции доведено примерно до 6,5-7,5.
Иммуногенные композиции могут содержать также один или несколько других иммуномодулирующих агентов, таких, например, как интерлейкины, интерфероны или другие цитокины. Иммуногенные композиции могут содержать также гентамицин и мертиолат. Хотя специалист в данной области легко может определить количества и концентрации адъювантов и добавок, которые можно применять в контексте настоящего изобретения, в настоящем изобретении предложены композиции, содержащие от примерно 50 до примерно 2000 мкг адъюванта и предпочтительно примерно 250 мкг/мл дозы композиции вакцины. Так, иммуногенная композиция, предлагаемая в изобретении, представляет собой также композицию, которая содержит от примерно 1 до примерно 60 мкг/мл антибиотиков и более предпочтительно менее примерно 30 мкг/мл антибиотиков.
В контексте настоящего описания иммуногенная композиция представляет собой также композицию, которая содержит I) любой из белков ОРС-2 PCV2, описанных выше, предпочтительно в указанных выше концентрациях, II) по меньшей мере часть вирусного вектора, экспрессирующего указанный белок ОРС-2 PCV2, III) часть клеточной культуры, IV) инактивирующий агент, предназначенный для инактивации рекомбинантного вирусного вектора, предпочтительно БЭИ, и V) нейтрализующий агент, предназначенный для прекращения инактивации, опосредуемой инактивирующим агентом, предпочтительно тиосульфат натрия в количествах, эквивалентных количеству БЭИ; VI) приемлемый адъювант, предпочтительно карбопол 971 в указанных выше количествах; VII) соляной буфер в фармацевтически приемлемой концентрации, предпочтительно фосфат, и VIII) противомикробное действующее вещество; где примерно 90% компонентов I)-III) имеют размер менее 1 мкм.
Понятие «иммуногенная композиция, которую можно применять согласно изобретению», относится также к Ingelvac CircoFLEX™ (фирма Boehringer Ingelheim Vetmedica Inc, St Joseph, шт.Миссури, США), CircoVac (фирма Merial SAS, Лион, Франция), CircoVent (фирма Intervet Inc., Millsboro, шт.Делавэр, США) или Suvaxyn PCV-2 One Dose (фирма Fort Dodge Animal Health, Канзас-Сити, шт.Канзас, США). Таким образом, настоящее изобретение относится также к способу профилактики или лечения комплекса респираторных болезней свиней (PRDC) или снижения клинических симптомов, ассоциированных с PRDC, у животного, заключающийся в том, что животному, которое нуждается в таком лечении, вводят в эффективном количестве антиген PCV2 или иммуногенную композицию, которая содержит антиген PCV2, где иммуногенная композиция, содержащая антиген PCV2, представляет собой Ingelvac CircoFLEX™, CircoVac, CircoVent и/или Suvaxyn PCV-2 One Dose, предпочтительно Ingelvac CircoFLEX™.
Как описано выше, PCV2 идентифицирован в качестве одного из соответствующих причинных факторов PRDC. Большинство молодых свиней, страдающих PRDC, являются позитивными по PCV2 (см., например, Kim и др., Veterinary Journal, 166, 2003, сс.251-256). Лечение молодых свиней антигеном PCV2 приводит к снижению респираторных симптомов PRDC (см. пример 3). Таким образом, еще одним объектом настоящего изобретения является способ профилактики и лечения комплекса респираторных болезней свиней (PRDC) и/или любых клинических симптомов, ассоциированных с PRDC, у животного, заключающийся в том, что животному, которое нуждается в таком лечении, вводят в терапевтически эффективном количестве антиген PCV2 или иммуногенную композицию, содержащую антиген PCV2, где PRDC или клинические симптомы, ассоциированные с PRDC, связаны или вызываются PCV2. Кроме того, настоящее изобретение относится также к способу профилактики и лечения комплекса респираторных болезней свиней (PRDC) и/или любых клинических симптомов, ассоциированных с PRDC, у животного, заключающемуся в том, что животному, которое нуждается в таком лечении, вводят в терапевтически эффективном количестве антиген PCV2 или иммуногенную композицию, содержащую антиген PCV2, где PRDC или клинические симптомы, ассоциированные с PRDC, связаны или вызываются PCV2 и PRRSV, Actinobacillus pleuropneumoniae, Mycoplasma hyopneumoniae, Bordetella bronchiseptica, вирусом свиного гриппа, Mycoplasma hyorhinis и/или Pasteurella multocida.
Поскольку PCV2 является одним из причинных факторов PRDC, стада, в которых животные являются позитивными по PCV2, имеют более высокий риск развития PRDC или развития более серьезной продолжительности PRDC с серьезными клиническими симптомами по сравнению со свободными от PCV2 стадами. Понятие «стадо, позитивное по PCV2» в контексте настоящего описания означает, что по меньшей мере 1%, предпочтительно 10%, более предпочтительно 30%, еще более предпочтительно 50%, наиболее предпочтительно 70% животных в стаде заражены или могут в любой момент стать зараженными PCV2. Этот не обязательно означает, что у любого животного в стаде разовьются клинические симптомы, для которых известно, что они вызываются PCV2, такие как PMWS или PRDC. Таким образом, еще одним объектом настоящего изобретения является способ профилактики и лечения комплекса респираторных болезней свиней (PRDC) и/или любых клинических симптомов, ассоциированных с PRDC, у животного, заключающийся в том, что животному, которое нуждается в таком лечении, вводят в терапевтически эффективном количестве антиген PCV2 или иммуногенную композицию, содержащую антиген PCV2, где животное принадлежит к стаду, позитивному по PCV2. Предпочтительно PRDC и/или любые клинические симптомы, ассоциированные с PRDC, вызываются PCV2.
PRDC и клинические симптомы PRDC можно также снижать или уменьшать у животных, коинфицированных другими представляющими собой причинные факторы патогенами PRDC, настоящее изобретение относится также к способу профилактики и лечения комплекса респираторных болезней свиней (PRDC) и/или любых клинических симптомов, ассоциированных с PRDC, у животного, заключающемуся в том, что животному, которое нуждается в таком лечении, вводят в терапевтически эффективном количестве антиген PCV2 или иммуногенную композицию, содержащую антиген PCV2, где животное принадлежит к стаду, позитивному по PCV2 и одному или нескольким дополнительному(ым) патогену(ам), выбранным их группы, включающей PRRSV, Mycoplasma hyopneumoniae, Actinobacillus pleuropneumoniae, Bordetella bronchiseptica, вирус свиного гриппа, Mycoplasma hyorhinis и/или Pasteurella multocida. Предпочтительно PRDC и/или любые клинические признаки, ассоциированные с PRDC, вызываются PCV2 и по меньше мере одним другим патогеном, который является причинным фактором PRDC. Понятие «стадо, позитивное по PCV2 и одному или нескольким дополнительному(ым) патогену(ам), выбранному(ым) из группы, включающей PRRSV, Mycoplasma hyopneumoniae, Actinobacillus pleuropneumoniae, Bordetella bronchiseptica, вирус свиного гриппа, Mycoplasma hyorhinis и/или Pasteurella multocida», в контексте настоящего описания означает, что по меньшей мере 10%, предпочтительно 30%, более предпочтительно 50%, еще более предпочтительно 70% животных в стаде заражены или могут в любой момент стать зараженными PCV2 и по меньшей мере одним дополнительным патогеном, указанным ниже. Этот не обязательно означает, что у любого животного в стаде разовьются клинические симптомы, для которых известно, что они вызываются PCV2 и по меньшей мере одним дополнительным патогеном, указанным выше, например, PRDC. Предпочтительно PRDC и/или любые клинические симптомы, ассоциированные с PRDC, вызываются по меньшей мере PCV2.
PRDC не только поражает определенное количество животных, он, как правило, поражает всех животных в стаде (все стадо). Другими словами, если по меньшей мере у одного животного на ферме развивается PRDC, то причинные факторы PRDC постоянно присутствуют в поголовье этой фермы. Таким образом, еще одним объектом настоящего изобретения является способ профилактики и лечения комплекса респираторных болезней свиней (PRDC) и/или любых клинических симптомов, ассоциированных с PRDC, у животного, заключающийся в том, что животному, которое нуждается в таком лечении, вводят в эффективном количестве антиген PCV2 или иммуногенную композицию, содержащую антиген PCV2, где животное принадлежит к стаду, позитивному по PCV2. Предпочтительно PRDC и/или любые клинические симптомы, ассоциированные с PRDC, вызываются PCV2. Понятие «стадо, позитивное по PCV2» в контексте настоящего описания означает, что по меньшей мере 1% предпочтительно 10%, более предпочтительно 30%, еще более предпочтительно 50%, наиболее предпочтительно 70% животных в стаде заражены или могут в любой момент стать зараженными PCV2. Этот не обязательно означает, что у любого животного в стаде разовьются клинические симптомы, для которых известно, что они вызываются PCV2, такие как PMWS или PRDC. Предпочтительно PRDC и/или любые клинические симптомы, ассоциированные с PRDC, вызываются PCV2.
Поскольку PRDC и клинические симптомы PRDC можно также снижать или уменьшать у животных, коинфицированных другими представляющими собой причинные факторы патогенами PRDC, настоящее изобретение относится также к способу профилактики и лечения комплекса респираторных болезней свиней (PRDC) и/или любых клинических симптомов, ассоциированных с PRDC, у животного, заключающемуся в том, что животному, которое нуждается в таком лечении, вводят в терапевтически эффективном количестве антиген PCV2 или иммуногенную композицию, содержащую антиген PCV2, где животное принадлежит к стаду (находится на ферме), позитивному по PCV2 и одному или нескольким дополнительному(ым) патогену(ам), выбранным их группы, включающей PRRSV, Mycoplasma hyopneumoniae, Actinobacillus pleuropneumoniae, Bordetella bronchiseptica, вирус свиного гриппа, Mycoplasma hyorhinis и/или Pasteurella multocida. Предпочтительно PRDC и/или любые клинические признаки, ассоциированные с PRDC, вызываются PCV2 и по меньше мере одним патогеном, который является причинным фактором PRDC. Понятие «стадо, позитивное по PCV2 и одному или нескольким дополнительному(ым) патогену(ам), выбранным их группы, включающей PRRSV, Mycoplasma hyopneumoniae, Actinobacillus pleuropneumoniae, Bordetella bronchiseptica, вирус свиного гриппа, Mycoplasma hyorhinis и/или Pasteurella multocida» в контексте настоящего описания означает, что по меньшей мере 10%, предпочтительно 30%, более предпочтительно 50%, еще более предпочтительно 70% животных в стаде заражены или могут в любой момент стать зараженными PCV2 и по меньшей мере одним дополнительным патогеном, указанным ниже. Этот не обязательно означает, что у любого животного в стаде разовьются клинические симптомы, для которых известно, что они вызываются PCV2 и по меньшей мере одним дополнительным патогеном, указанным выше, например, PRDC.
Установлено, что полученный от матери иммунитет обеспечивает определенную степень защиты от вызываемой PCV2 инфекции и клинических заболеваний, связанных с PCV2-инфекцией. Установлено, что указанная защита зависит от титра антител: как правило, более высокие титры обеспечивают защитное действие, а при более низких титрах оно отсутствует (McKeown и др., Clin. Diagn. Lab. Immunol., 12, 2005, cc.1347-1351). Установлено, что среднее время полужизни антител у животных-отъемышей составляет 19,0 дней, и окно распада связанных с пассивной иммунизацией антител к PCV2 в популяции является относительно широким (Opriessnig и др., J. Swine Health Prod. 12, 2004, сс.186-191). Присутствие полученных от матери антител не только может обеспечивать определенную степень защиты от вирусной инфекции, что однако является непрогнозируемым, но так же, как известно, влияет на эффективность иммунизации. При создании изобретения неожиданно было установлено, что присутствие антител к PCV, в частности титров антител к PCV2 вплоть до 1:20480, не оказывает влияние на эффективность лечения PCV2. Таким образом, еще одним объектом настоящего изобретения является способ профилактики и лечения комплекса респираторных болезней свиней (PRDC) и/или любых клинических симптомов, ассоциированных с PRDC, у животного, заключающийся в том, что животному, которое нуждается в таком лечении, вводят в терапевтически эффективном количестве антиген PCV2 или иммуногенную композицию, содержащую антиген PCV2, где животное имеет антитела к PCV2, предпочтительно где животное имеет выявляемый титр антитела к PCV2, составляющий вплоть до 1:100, предпочтительно превышающий 1:100, еще более предпочтительно превышающий 1:250, еще более предпочтительно превышающий 1:500, еще более предпочтительно превышающий 1:640; еще болеее предпочтительно превышающий 1:750, наиболее предпочтительно превышающий 1:1000. Предпочтительно указанный титр антител к PCV2 определяют и оценивают количественно с помощью специфического иммунного анализа антител к PCV2, предпочтительно анализа, описанного в примере 2.
Методы выявления и количественной оценки антител к PCV2 хорошо известны в данной области. Например, выявление и количественную оценку антител к PCV2 можно осуществлять с помощью метода непрямой иммунофлуоресценции, описанного у Magar и др., Can. J. Vet Res.; 64, 2000, сс.184-186 или у Magar и др., J. Сотр. Pathol.; 123, 2000, сс.258-269. Другие методы количественной оценки антител к PCV2 описаны у Opriessnig и др., 37-th Annual Meeting of the American Association of Swine Veterinarians (37-ой Ежегодный съезд американской ассоциации по ветеринарии свиней), 2006 г.). Кроме того, в примере 2 описан также непрямой иммунофлуоресцентный анализ, который может применять специалист в данной области. В случае спорных результатов и при любых сомнениях следует иметь в виду, что указанные в настоящем описании титры антител к PCV2 относятся к титрам, которые установлены/могут быть установлены с помощью анализа, описанного в примере 2.
Таким образом, следующим более общим объектом настоящего изобретения является способ профилактики PRDC, предпочтительно ассоциированного или вызываемого PCV2, или снижения клинических симптомов, вызываемых или ассоциированных с заражением PCV2, у молодых животных, заключающийся в том, что молодому животному, которое нуждается в таком лечении, вводят в эффективном количестве антиген PCV2.
Понятие «молодое животное» в контексте настоящего описания относится к животному возрастом от 1 до 22 дней. Предпочтительно под понятием молодое животное подразумевают животное возрастом от 1 до 20 дней. Более предпочтительно под понятием молодое животное подразумевают животное возрастом от 1 до 15 дней, еще более предпочтительно возрастом от 1 дня до 14 дней, еще более предпочтительно возрастом от 1 до 12 дней, еще более предпочтительно возрастом от 1 до 10 дней, еще более предпочтительно возрастом от 1 до 8 дней, еще более предпочтительно возрастом от 1 до 7 дней, еще более предпочтительно возрастом от 1 до 6 дней, еще более предпочтительно возрастом от 1 до 5 дней, еще более предпочтительно возрастом от 1 до 4 дней, еще более предпочтительно возрастом от 1 до 3 дней, еще более предпочтительно возрастом от 1 до 2 дней, наиболее предпочтительно животное возрастом 1 день. Таким образом, еще одним объектом настоящего изобретения является способ профилактики PRDC, предпочтительно ассоциированного или вызываемого PCV2, или снижения клинических симптомов, вызываемых или ассоциированных с заражением PCV2, у молодых животных, заключающийся в том, что вводят в эффективном количестве антиген PCV2 животному, которое нуждается в таком лечении, возрастом 1-22 дня, предпочтительно возрастом 1-20 дней, более предпочтительно возрастом 1-15 дней, еще более предпочтительно возрастом 1-14 дней, еще более предпочтительно возрастом 1-12 дней, еще более предпочтительно возрастом 1-10 дней, еще более предпочтительно возрастом 1-8 дней, еще более предпочтительно возрастом 1-7 дней, еще более предпочтительно возрастом 1-6 дней, еще более предпочтительно возрастом 1-15 дней, еще более предпочтительно возрастом 1-4 дня, еще более предпочтительно возрастом 1-3 дня, еще более предпочтительно возрастом 1 или 2 дня, наиболее предпочтительно возрастом 1 день. Например, установлено, что вакцинация/обработка, которую проводят в возрасте от 19 до 22 дней, является высокоэффективной вакцинацией. Кроме того, установлено, что вакцинация/обработка, которую проводят в возрасте от 12 до 18 дней также является очень эффективной в отношении снижения клинических симптомов, ассоциированных или вызываемых PRDC, снижения общей вирусной нагрузки, снижения продолжительности виремии, замедления начала виремии, прироста массы.
Из-за повсеместного распространения PCV2 в полевых условиях большая часть молодых поросят являются серопозитивными в отношении PCV2. Таким образом, еще одним объектом настоящего изобретения является способ профилактики PRDC, предпочтительно ассоциированного с заражением PCV2, или снижения клинических симптомов, вызываемых или ассоциированных с заражением PCV2, у молодых животных, которые имеют антитела к PCV2, предпочтительно в день вакцинации, заключающийся в том, что животному возрастом 1-22 дня, предпочтительно возрастом 1-20 дней, более предпочтительно возрастом 1-15 дней, еще более предпочтительно возрастом 1-14 дней, еще более предпочтительно возрастом 1-12 дней, еще более предпочтительно возрастом 1-10 дней, еще более предпочтительно возрастом 1-8 дней, еще более предпочтительно возрастом 1-7 дней, еще более предпочтительно возрастом 1-6 дней, еще более предпочтительно возрастом 1-5 дней, еще более предпочтительно возрастом 1-4 дня, еще более предпочтительно возрастом 1-3 дня, еще более предпочтительно возрастом 1 или 2 дня, наиболее предпочтительно возрастом 1 день, которое нуждается в таком лечении, вводят в эффективном количестве антиген PCV2. Предпочтительно указанное молодое животное в день вакцинации/обработки имеет выявляемый титр антител к PCV2 вплоть до 1:100, предпочтительно превышающий 1:100, еще более предпочтительно превышающий 1:250, еще более предпочтительно превышающий 1:500, еще более предпочтительно 1:640, еще более предпочтительно превышающий 1:750, наиболее предпочтительно превышающий 1:1000.
Как описано выше, вакцинация/лечение животных, страдающих PRDC, антигеном PCV2 приводит к укорочению фазы виремии по сравнению с невакцинированными контрольными животными. Среднее укорочение времени составляет 15,4 дня по сравнению с невакцинированными контрольными животными этого же вида. Таким образом, еще одним объектом настоящего изобретения является также способ лечения или профилактики PRDC, предпочтительно ассоциированного или вызываемого PCV2, или снижения клинических симптомов, вызываемых или ассоциированных с PRDC у животных, заключающийся в том, что вводят в эффективном количестве антиген PCV2 животному, которое нуждается в таком лечении, при этом лечение или профилактика приводит к укорочению фазы виремии на 5 или более дней, предпочтительно на 6 или более дней, еще более предпочтительно на 7 или более дней, еще более предпочтительно на 8 или более дней, еще более предпочтительно на 9 дней, еще более предпочтительно на 10 дней, еще более предпочтительно на 12 дней, еще более предпочтительно на 14 дней, наиболее предпочтительно более чем на 15 дней, по сравнению с животными этого же вида из необработанной контрольной группы.
В целом, вакцинация молодых свиней, страдающих PRDC, приводит к снижению потери прироста массы, снижению клинических респираторных симптомов, таких как кашель и одышка, укорочению продолжительности виремии, более раннему окончанию виремии и пониженной вирусной нагрузке. Таким образом, следующим объектом настоящего изобретения является способ лечения или профилактики PRDC, предпочтительно ассоциированного или вызываемого PCV2, или снижения клинических симптомов, ассоциированных или вызываемых PRDC, у животных, заключающийся в том, что животному, которое нуждается в таком лечении, вводят в эффективном количестве антиген PCV2, при этом лечение или профилактика приводит к улучшению по сравнению с животными этого же вида из необработанной контрольной группы параметра эффективности вакцины, выбранного из группы, включающей снижение потери прироста массы, снижение клинических респираторных симптомов, таких как кашель и одышка, укорочение продолжительности виремии, более раннее окончание виремии, понижение вирусной нагрузки или их комбинации.
Понятие «эффективное количество» в контексте настоящего описания означает, но, не ограничиваясь только указанным, количество антигена, которое вызывает или может вызывать иммунный ответ у животного, которому вводят антиген PCV2 в эффективной дозе.
2,0
9,0
3,0
8,0
4,0
8,0
3,0
6,0
4,0
5,0
2,0
9,0
3,0
6,0
4,0
5,0
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
Эффективное количество зависит от ингредиентов вакцины и схемы введения. Как правило, когда в комбинированной вакцине применяют препарат инактивированного вируса или модифицированного живого вируса, то вакцину применяют в количестве, составляющем от примерно 10 до примерно 10 TCID на дозу, предпочтительно от примерно 10 до примерно 10 TCID на дозу, более предпочтительно от примерно 10 до примерно 10 TCID на дозу. В частности, когда в вакцинах применяют модифицированный живой PCV2, то рекомендованная доза, предназначенная для введения чувствительному животному, составляет предпочтительно от примерно 10 TCID (средняя цитопатогенная доза, инфицирующая 50% клеток)/дозу до примерно 10 TCID/дозу и более предпочтительно от примерно 10 TCID/дозу до примерно 10 TCID/дозу. В целом, количество антигена должно составлять от примерно 0,2 до 5000 мкг и от 10 до 10 TCID, предпочтительно от 10 до 10 TCID, более предпочтительно от 10 до 10 TCID, при применении очищенного антигена.
Субъединичные вакцины, как правило, вводят с уровнем включения антигена, составляющим по меньшей мере 0,2 мкг антигена на дозу, предпочтительно от примерно 0,2 до примерно 400 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 0,3 до примерно 200 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 0,35 до примерно 100 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 0,4 до примерно 50 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 0,45 до примерно 30 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 0,6 до примерно 16 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 0,75 до примерно 8 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 1,0 до примерно 6 мкг/дозу, еще более предпочтительно от примерно 1,3 до примерно 3,0 мкг/дозу.
При создании изобретения неожиданно было установлено, что профилактическое применение описанных выше иммуногенных композиций является эффективным в отношении снижения клинических симптомов, вызываемых или ассоциированных с PRDC, предпочтительно вызываемых по меньшей мере PCV2, у животных. Кроме того, антигенная композиция, описанная выше, снижает общую цирковирусную нагрузку, включая более позднее начало, снижение продолжительности, более раннее окончание виремии, снижение вирусной нагрузки и ее иммуносупрессорного действия на животных, страдающих PRDC, и в результате приводит к повышению уровня общей устойчивости к заболеваниям и снижает коэффициент заболеваемости PRDC.
Композицию, предлагаемую в изобретении, можно вводить внутрикожно, внутритрахеально или внутривлагалищно. Предпочтительно композицию следует вводить внутримышечно или интраназально, наиболее предпочтительно внутримышечно. Может оказаться предпочтительным вводить описанные выше фармацевтические композиции в организм животного внутривенно или путем инъекции непосредственно в ткани-мишени. Для системного введения предпочтительными являются внутривенный, внутрисосудистый, внутримышечный, интраназальный, внутриартериальный, внутрибрюшинный, оральный или внутриоболочечный пути введения. Более локальное введение можно осуществлять подкожно, интрадермально, внутрикожно, внутрисердечно, внутридольково, интрамедуллярно, внутрилегочно или непосредственно в ткань, подлежащую обработке, или в близлежащую область (соединительная, костная, мышечная, нервная, эпителиальная ткань). В зависимости от требуемой продолжительности и эффективности лечения композиции, предлагаемые в изобретении, можно вводить один или несколько раз, а также периодически, например, с интервалом в один день в течение нескольких дней, недель или месяцев и с использованием различных доз.
Предпочтительно по меньшей мере одну дозу описанной выше иммуногенной композиции вводят внутримышечно индивидууму, нуждающемуся в этом. Еще одним объектом изобретения является антиген PCV2 или иммуногенная композиция, содержащая любой описанный выше антиген PCV2, которую фасуют в пузырьки и вводят из расчета один (1) мл на дозу. Таким образом, еще одним объектом настоящего изобретения является иммуногенная композиция объемом 1 мл, которая содержит описанный выше антиген PCV-2, предназначенная для лечения или профилактики комплекса респираторных болезней свиней (PRDC) и/или любых клинических симптомов, ассоциированных с PRDC, предпочтительно вызываемых PCV2, у животного, путем введения в эффективном количестве антигена PCV2 животному, которое нуждается в таком лечении.
Таким образом, еще одним объектом изобретения является по меньшей мере одно дополнительное введение одной дозы иммуногенной композиции, описанной выше, животному, которое нуждается в этом, где второе или любое дополнительное введение осуществляют по меньшей мере через 14 дней после первого или любого другого предыдущего введения. Предпочтительно иммуногенную композицию вводят в сочетании с агентом, стимулирующим иммунитет. Предпочтительно указанный агент, стимулирующий иммунитет, вводят по меньшей мере дважды. Предпочтительно между первым и вторым или любым следующим введением агента, стимулирующего иммунитет, должно пройти по меньшей мере 3 дня, более предпочтительно по меньшей мере 5 дней, еще более предпочтительно по меньшей мере 7 дней. Предпочтительно агент, стимулирующий иммунитет, вводят по меньшей мере через 10 дней, предпочтительно 15 дней, еще болеее предпочтительно 20 дней, еще более предпочтительно по меньшей мере 22 дня, после первоначального введения иммуногенной композиции, предлагаемой в изобретении. Предпочтительным агентом, стимулирующим иммунитет, является, например, гемоцианин лимфы улитки (KLH), предпочтительно эмульгированный с помощью неполного адъюванта Фрейнда (KLH/ICFA). Однако, как должно быть очевидно, можно применять любой другой агент, стимулирующий иммунитет, известный специалисту в данной области. Понятие «агент, стимулирующий иммунитет» в контексте настоящего описания относится к любому агенту или композиции, который/которая может «запускать» иммунный ответ, предпочтительно без инициации или повышения специфического иммунного ответа, например, иммунного ответа на специфический патоген. Кроме того, принято вводить агент, стимулирующий иммунитет, в приемлемой дозе.
Настоящее изобретение относится также к применению антигена PCV2 или иммуногенной композиции, содержащей антиген PCV2, для приготовления лекарственного средства, предназначенного для профилактики или лечения комплекса респираторных болезней свиней (PRDC) и/или любых клинических симптомов, ассоциированных с PRDC, у животного. Предпочтительно PRDC или клинические симптомы, ассоциированные с PRDC, вызываются по меньшей мере PCV2, более предпочтительно комбинацией одного или нескольких дополнительных патогенов, выбранных из группы, включающей PRRSV, Mycoplasma hyopneumoniae, Actinobacillus pleuropneumoniae, Bordetella bronchiseptica, вирус свиного гриппа, Mycoplasma hyorhinis и/или Pasteurella multocida. Более предпочтительно антиген PCV2 представляет собой рекомбинантный антиген, предпочтительно ОРС-2 PCV2, еще более предпочтительно Ingelvac CircoFLEX™.
Понятие «животное» в контексте настоящего описания включает свинью, молодую (не достигшую половой зрелости) свинью или поросенка.
Таким образом, еще одним объектом настоящего изобретения является способ профилактики и лечения комплекса респираторных болезней свиней (PRDC) и/или любых клинических симптомов, ассоциированных с PRDC, у молодых свиней, заключающийся в том, что вводят в терапевтически эффективном количестве антиген PCV2 или иммуногенную композицию, содержащую антиген PCV2, молодой свинье, нуждающейся в таком лечении. Предпочтительно PRDC вызывается по меньшей мере PCV2, предпочтительно комбинацией одного или нескольких дополнительных патогенов, для которых известно, что они вызывают PRDC, таких, например, как PRRSV, Mycoplasma hyopneumoniae, Actinobacillus pleuropneumoniae, Bordetella bronchiseptica, вирус свиного гриппа, Mycoplasma hyorhinis и/или Pasteurella multocida. Предпочтительно антиген PCV2 или иммуногенная композиция, содержащая антиген PCV2, представляет собой любой/любую из описанных выше, наиболее предпочтительно антиген PCV2 представляет собой Ingelvac CircoFLEX™.
Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления изобретения
Ниже в примерах представлены предпочтительные материалы и процедуры, применяемые в настоящем изобретении. Хотя при воплощении на практике и проверке настоящего изобретения можно применять любые методы и материалы, аналогичные или эквивалентные представленным в настоящем описании, ниже описаны предпочтительные методы, устройства и материалы. Однако следует понимать, что эти примеры даны только с целью иллюстрации и не направлены на ограничение общего объема изобретения.
Пример 1
Получение антигена ОРС-2 PCV2
6
6
Начальные культуры клеток линии SF+, взятые из хранящейся в жидком азоте культуры, выращивали в среде Excell 420 (фирма JRH Biosciences, Inc., Ленекса, шт.Канзас) в суспензии в стерильных вращающихся колбах при постоянном перемешивании. Культуры выращивали во вращающихся колбах объемом от 100 до 250 мл, содержащих от 25 до 150 мл бессывороточной среды Excell 420. Когда клетки размножились до клеточной плотности 1,0-8,0×10 клеток/мл, их разделяли, перенося в новые сосуды, используя плотность посева 0,5-1,5×10 клеток/мл. Следующие размножающие культуры выращивали во вращающихся колбах объемом вплоть до 36 л или биореакторах из нержавеющей стали объемом вплоть до 300 л в течение 2-7 дней при 25-29°C.
После посева колбы инкубировали при 27°C в течение 4 ч. Затем в каждую колбу вносили рекомбинантный бакуловирус, содержащий ген ОРС-2 PCV2 (SEQ ID NO:4). Рекомбинантный бакуловирус, содержащий ген ОРС-2 PCV2, создавали согласно методу, описанному в WO 06/072065. После внесения бакуловируса колбы инкубировали при 27±2°C в течение 7 дней и при перемешивали при 100 об/мин в течение этого времени. Колбы закрывали вентилируемыми крышками, пропускающими воздушных поток.
После инкубации полученный супернатант собирали, фильтровали для удаления клеточного дебриса и инактивировали. Для инактивации супернатанта его температуру доводили до 37±2°C и к супернатанту добавляли бинарный этиленимин (БЭИ) до конечной концентрации 5 мМ. Последующее перемешивание образца продолжали в течение 72-96 ч. Добавляли 1,0 М раствор тиосульфата натрия до конечной минимальной концентрации 5 мМ для нейтрализации любых остаточных количеств БЭИ. После инактивации ОРС-2 PCV2 забуферивали фосфатным буфером и добавляли карбопол до достижения концентрации примерно 0,5-2,5 мг/дозу. Конечная доза содержала примерно 16 мкг антигена ОРС-2 PCV2.
Пример 2
Иммуноанализ антител к PCV-2
50
Клетки линии PK15 (например, АТСС CCL-33) или VIDO R1, описанные в WO 02/07721, высевали в 96-луночный планшет (примерно 20000-60000 клеток на лунку). Клетки заражали изолятом PCV2, когда конфлюэнтность монослоев достигала примерно 65-85%. Зараженные клетки инкубировали в течение 48 ч. Среду удаляли и лунки отмывали дважды ЗФР. Буфер для отмывки отбрасывали и клетки обрабатывали холодным фиксатором, представляющем собой смесь 50/50 метано л/ацетон (~100 мкл/лунку) в течение примерно 15 мин при температуре примерно -20°C. Фиксатор отбрасывали и планшеты сушили на воздухе. Готовили серийные разведения свиной сыворотки в ЗФР, добавляли в планшеты и инкубировали, давая антителам, если они присутствовали в образцах сыворотки, связываться, в течение примерно 1 ч при 36,5±1°C. Кроме того, параллельно оценивали серийные разведения, положительные в отношении антител к PCV2, и отрицательные контрольные образцы (образцы, представляющие собой положительный контроль и отрицательный контроль). Затем планшеты отмывали трижды ЗФР. ЗФР отбрасывали. Затем планшеты окрашивали поступающим в продажу козьим антисвиным антителом, конъюгированным с ФИТЦ, разведенным в соотношении 1:100 в ЗФР, и инкубировали в течение примерно 1 ч при 36,5±1°C, что давало возможность выявлять антитела, связанные с зараженными клетками. После завершения инкубации микропланшеты изымали из инкубатора, конъюгат отбрасывали и планшеты отмывали дважды ЗФР. Планшеты оценивали с помощью УФ-микроскопа и индивидуальные лунки обозначали как позитивные или негативные. Для оценки тест-системы использовали образцы, представляющие собой положительный контроль и отрицательный контроль. Если результаты, полученные для контролей, находились в ожидаемых пределах, то результаты опыта принимались как приемлемые с позиций метода оценки параметров. Титры сывороточных антител рассчитывали на основе наибольшего разведения, при котором наблюдалась специфическая IFA (метод непрямой иммунофлуоресценции)-реактивность, и определяли количество позитивных лунок для каждого разведения, или рассчитывали конечное значение TCID с помощью соответствующей формулы Рида-Менча.
Пример 3
Эффективность ОРС-2 PCV2 (Ingelvac CircoFLEX™) в отношении лечения PRDC
Задача исследования
Целью настоящего исследования была демонстрация эффективности Ingelvac CircoFLEX в отношении контроля ассоциированного с PCV2 PRDC.
План эксперимента
В этом опыте использовали 1542 обычные молодые свиньи, принадлежащие к трем последовательным возрастным группам, отличающимся друг от друга по возрасту на одну неделю, каждая из которых включала примерно 500 животных. Подопытных животных объединяли с учетом массы тела и принадлежности к определенному приплоду и произвольно разделяли на группы, одну из которых подвергали вакцинации (n=769) и одну применяли в качестве контрольной группы (n=773).
Группа 1: В день 0 опыта молодых свиней вакцинировали внутримышечно в возрасте примерно 20 дней с помощью одной дозы вакцины Ingelvac CircoFLEX, содержащей белок ОРС-2 PCV2 в качестве действующего вещества, с RP 1 (на дозу 1 мл) и Carbopol в качестве адъюванта.
Группа 2: Контрольной группе вводили 1 мл контрольного продукта, представляющего собой не содержащий белок ОРС-2 PCV2 супернатант клеточной культуры и Carbopol в качестве адъюванта.
Группа 3: Необработанные молодые свиньи.
Эксперимент прекращали в конце периода откорма (неделя опыта 22).
Регистрируемые параметры
Определяли следующие параметры:
- индивидуальная масса тела (для всех животных),
- частота встречаемости малорослых (карликовых» животных (для всех животных),
- клинические симптомы (для всех животных),
- смертность (для всех животных),
- PCV2-виремия в сыворотке: начало, окончание, продолжительность виремии, вирусная нагрузка (17% подопытных животных),
- аутопсия (для каждого умершего или умерщвленного животного, если это было возможно).
Ситуация с заболеванием на ферме
Согласно истории болезни на ферме, на которой осуществляли выращивание и откорм, у животных респираторные симптомы, связанные с комплексом респираторных болезней свиней (PRDC), проявлялись с середины стадии откорма. Эти симптомы сопровождались снижением прироста массы (ADWG 750-780 г) и повышенным коэффициентом смертности (5,5-6,6%) в течение периода откорма. Считается, что в патогенезе PRDC одновременно принимают участие PCV2, PRRSV, Pasteurella multocida, Bordetella bronchiseptica и иногда SIV (вирус свиного гриппа). В процессе этого эксперимента установлено, что Mycoplasma hyopneumoniae и Mycoplasma hyorhinis также участвуют в этом комплексе болезней. Важно отметить, как это было установлено при создании настоящего изобретения, что заражение и PRRSV и Mycoplasma hyopneumoniae происходило примерно за 4-6 недель до начала PCV2-виремии. Однако на основе данных о количестве погибших животных в процессе эксперимента и частоты респираторных симптомов до и после начала PCV2-виремии, оставшиеся животные были скорее не поражены этими двумя инфекционными патогенами.
Результаты
Масса тела, прирост массы, средний суточный прирост массы (ADWG)
Масса тела двух подвергнутых обработке групп сравнивали в момент начала опыта. Через 17 и 22 недели масса животных в вакцинированной группе оказалась существенно выше, чем масса животных в обработанной плацебо группе (p=0,0007 и p<0,0001 соответственно).
С момента начала опыта до недели 22 опыта у вакцинированных животных прирост массы на 2,8 кг превышал прирост массы у животных в обработанной плацебо группе. Это соответствует тому, что ADWG у вакцинированных животных был на 13 г/день выше с момента начала опыта до недели 17 опыта, и ADWG у вакцинированных животных был на 18 г/день выше с момента начала опыта до недели 22 опыта. Таким образом, в течение всего периода откорма (недели 7-22 опыта), ADWG могут повышаться с 777 г/день у животных в обработанной плацебо группе (что сопоставимо с величинами ADWG до проведения опыта, которые составляли 750-780 г/день) до 803 г/день у вакцинированных животных (таблица 1 и фиг.1).
Таблица 1:
Сравнение массы тела, прироста массы и ADWG (объединенные данные для всех трех возрастных групп, отличающихся на неделю)
Неделя опыта
Обработанная плацебо группа (среднеквадратичное значение)
Вакцинированная группа(среднеквадратичное значение)
Разница (IVP-СР)
Значение p<sup>1)</sup>
Живая масса тела
0
6,45 кг
6,59 кг
0,14 кг
0,1289 ns
7
25,79 кг
26,18 кг
0,39 кг
0,3955 ns
12
50,63 кг
51,01 кг
0,38 кг
0,9564 ns
17
78,29 кг
80,22 кг
1,93 кг
0,0007<sup>***</sup>
22
106,55 кг
109,77 кг
3,22 кг
<0,0001<sup>***</sup>
Прирост массы
0-17
71,97 кг
73,51 кг
1,54 кг
0,0007<sup>***</sup>
0-22
100,22 кг
103,02 кг
2,80 кг
0,0001<sup>***</sup>
ADWG
0-17
603 г/день
616 г/день
13 г/день
0,0007<sup>***</sup>
0-22
649 г/день
667 г/день
18 г/день
<0,0001<sup>***</sup>
7-22
777 г/день
803 г/день
26 г/день
<0,0001<sup>***</sup>
1) p-значение согласно t-критерию для сравнения между группам, ns: несущественно, <sup>***</sup>существенно, p≤0.001
Виремия в крови
Для вакцинированных животных обнаружено, что начало виремии у них происходило несколько позднее (на 1,5 дня позднее), существенно раньше происходило окончание виремии (p<0,0001), продолжительность виремии оказалась существенно короче (p<0,0001), существенно снижалось количество дней получения положительных в отношении виремии образцов на животное (p<0,0001) и существенно снижалась общая вирусная нагрузка (p<0,0001). Наибольшее относительное содержание имеющих виремию животных обнаружено на недели 17 опыта, при этом виремия обнаружена у 75% животных в обработанной плацебо группе и 28% животных в вакцинированной группе.
Таблица 2:
Сравнение виремии в крови (объединенные данные для всех трех возрастных групп, отличающихся на неделю)
Неделя опыта
Обработанная плацебо группа (среднее значение)
Вакцинированная группа (среднее значение)
Разница (CP-IVP)
Значение p-<sup>2)</sup>
Начало виремии
104,4 дня
105,9 дня
-1,5 дня
0,3244 ns
Окончание виремии
138,7 дня
123,3 дня
15,4 дня
<0,0001<sup>***</sup>
Продолжительность виремии
34,3 дня
17,4 дня
16,9 дня
<0,0001<sup>***</sup>
Кол-во дней получения положительных образцов
4,3 дня
1,4 дня
2,9 дня
<0,0001<sup>***</sup>
Среднее значение суммы gE (log10)<sup>1</sup>)
22,7
7,1
15,6
<0,0001<sup>***</sup>
<sup>1)</sup> gE: геномные эквиваленты на мл
<sup>2)</sup> p-значение (критерий Уилкоксона-Манна-Уитни для сравнения между группами) ns: не существенно <sup>***</sup>существенно, p≤0,001
Корреляция между виремией и массой тела
На фиг.2 проиллюстрированы данные о вирусной нагрузке в образцах, полученных из животных обеих обрабатываемых групп в процессе опыта, позволяющие провести сравнение разницы живой массы тела (CP-IVP) у всех животных обеих обрабатываемых групп в соответствующие моменты времени, в которые осуществляли взвешивание. При сравнении кривых разницы массы тела с гистограммами, соответствующими вирусной нагрузке, очевидно, что обнаруженная разница массы тела между двумя обрабатываемыми группами (недели 17 и 22 опыта) имеет место после начала виремии (недели 14-16 опыта). В то время как вирусная нагрузка снижается после достижения пика в неделю 17 опыта, разница массы тела между группами дополнительно увеличивается до конца откорма. В сочетании эти данные свидетельствуют о наличии корреляции между обнаруженным более высоким приростом массы в процессе развития в недели опыта 17 и 22 в вакцинированной группе и началом, продолжительностью и уровнем виремии.
Расчет коэффициента ранговой корреляции Спирмана подтвердил наличие статистически значимой корреляции между виремией и разницей в приросте массы в процессе развития у животных в обработанной плацебо группе в недели 17 и 22 опыта. Более низкая масса тела у животных в обработанной плацебо группе коррелировала с более ранним началом, большей продолжительностью виремии и боле высокой вирусной нагрузкой. Для вакцинированных животных не обнаружено никакой указанной корреляции, свидетельствующей о том, что более высокая масса тела вакцинированных животных является результатом более позднего начала и более короткой продолжительности виремии, а также более низкой вирусной нагрузкой в крови.
Частота встречаемости малорослых животных
Никакой существенной разницы не обнаружено в частоте встречаемости «малорослых животных» между вакцинированной и обработанной плацебо группами в любой из соответствующих моментов времени проведения взвешивания. После начала PCV2-виремии (недели 14-16 опыта) частота встречаемости «малорослых животных», как правило, была низкой в обеих группах (2,2-3,9%).
Таблица 3:
Сравнение частоты встречаемости «малорослых животных» (объединенные данные для всех трех возрастных групп, отличающихся на неделю)
До начала виремии
После начала виремии
Неделя
0
7
12
17
22
опыта
CP
17,08%
11,16%
5,02%
3,57%
2,97%
IVP
17,17%
11,03%
5,32%
3,99%
2,23%
Р
1,0000
0,6845
0,8147
0,6830
0,4082
P: p-значение согласно t-критерию для сравнения между группами; p>0,05 несущественно
Клинические симптомы
До начала виремии основными клиническими симптомами были хромота, кашель и диарея (у 8-12% животных). Они встречались с одинаковой частотой у животных в обеих обрабатываемых группах. При аутопсии погибших животных и последующей микробиологической оценке Streptococcus suis идентифицирован в качестве возможного инфекционного патогена хромоты, Haemophilus parasuis и Bordetella bronchiseptica идентифицированы в качестве возможных инфекционных патогенов кашля, а гемолитическая Е. coli идентифицирована в качестве возможного причинного фактора диареи.
После начала виремии основными клиническими симптомами, обнаруженными у животных в обеих обрабатываемых группах, были кашель и хромота. Периодические серологические анализы в отношении других инфекционных патогенов и микробиологических агентов, проведенные при аутопсии, свидетельствовали о том, что PCV2-виремия сопровождалась (предшествующим) заражением PRRSV и Mycoplasma hyopneumoniae. Вместе с PCV2 эти инфекционные патогены формируют часть PRDC, что, как считается, приводит к увеличению частоты кашляющих животных после начала виремии. По сравнению с животными обработанной плацебо группы частота кашля и одышки у вакцинированных животных снижалась на 12,2% и 17,5% соответственно. Однако эти данные не являются статистически значимыми. Повышение частоты случаев хромоты после начала виремии по сравнению с временем до начала виремии наиболее вероятно связано с хроническими формами вызываемого Streptococcus suis артрита или ослаблением суставного аппарата, и в обеих обрабатываемых группах хромота встречалась одинаково часто (p=0,321). Аналогично этому, частота других клинических проявлений (диарея, кожные аномалии, поведение) после начала виремии оказалась практически одинаковой в обеих обрабатываемых группах.
Смертность
До начала виремии коэффициент смертности был сопоставим в обеих обрабатываемых группах (вакцинированные животные: 5,20%, обработанные плацебо животные: 5,17%). После начала виремии у обработанных плацебо животных коэффициент смертности оказался существенно выше, чем у вакцинированных животных (вакцинированные животные: 1,51%, обработанные плацебо животные: 3,68%, р=0,0127). По сравнению с обработанными плацебо животными коэффициент смертности у вакцинированных животных снижался на 59%.
Заключение
Эксперимент проводили на ферме, на которой у животных выявлены типичные симптомы PRDC на поздней фазе откорма. У молодых свиней возрастом 17-19 недель развивались респираторные симптомы, обнаружен повышенный коэффициент смертности и снижение прироста массы. При серологическом и микробиологическом скрининге идентифицированы PCV2, PRRSV, Mycoplasma hyopneumoniae, Mycoplasma hyorhinis и Pasteurella multocida в качестве возможных патогенов, с которыми связан это комплексе болезней.
По сравнению с обработанной плацебо контрольной группой животных у вакцинированных животных обнаружены следующие статистически значимые различия:
- снижение потери прироста массы,
- снижение смертности,
- снижение продолжительности виремии и более раннее прекращение виремии,
- снижение вирусной нагрузка,
- снижение кашля и одышки.
Как и ожидалось, никаких статистически значимых различий не обнаружено в частоте встречаемости «малорослых животных», поскольку малорослость животных не относится к типичными признакам PRDC.
В сочетании эти данные позволяют сделать следующие заключения: Настоящее исследование проведено в стаде, пораженном PRDC в период времени от средней до заключительной фазы откорма. Четко доказано, что PCV2 принимает участие в этом комплексе болезней, поскольку респираторные симптомы, снижение прироста массы и повышение смертности обнаружены только после начала виремии.
Вакцинация животных Ingelvac CircoFLEX™ может снижать или даже предупреждать соответствующие признаки, характерные для ассоциированного с PCV2 PRDC.