Влияние индометацина на рост экспериментальных опухолей мышей

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ EXPERIMENTAL ИССЛЕДОВАНИЯ INVESTIGATIONS

© И. А. Кудрявцев. И. П. Тараненко, 1994 УДК 616-006-577.115.3

И. А. Кудрявцев, И. П. Тараненко

ВЛИЯНИЕ ИНДОМЕТАЦИНА НА РОСТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ОПУХОЛЕЙ МЫШЕЙ

НИИ канцерогенеза

Многочисленные клинико-экспериментальные исследования последних лет свидетельствуют о повышенном образовании циклооксигеназных метаболитов поли-ненасыщенных жирных кислот — простагландинов (ПГ) в различных опухолях человека и животных [5, 7, 8]. Наряду с этим установлена важная роль ПГ в инициации и промоции опухолей [6, 10, 17], иммуносупрессии [4, 9, 12], процессах роста и метастазирования опухолевых клеток [12, 14—16], что является предпосылкой для всестороннего изучения влияния ингибиторов циклооксигена-зы на опухолевый рост in vitro и in vivo. Имеющиеся данные литературы об эффективности применения ингибиторов синтеза ПГ в экспериментах на животных с перевиваемыми и индуцированными опухолями носят противоречивый характер и указывают на необходимость дальнейших исследований [1, 2, 9, 11]. В данной работе изучено влияние одного из наиболее активных ингибиторов циклооксигеназы — индометацина (ИМ) на рост различных экспериментальных опухолей мышей с оценкой профиля синтезируемых ПГ в опухолевых тканях.

Материал и методы. Исследования проведены на 358 мышах-сам-ках линий С57В1/6, DBA/2 массой 20—22 г и 200 мышах-самках линии AKR одного возраста, полученных из питомника «Столбовая» РАМН. Все животные в течение эксперимента получали стандартный брикетированный корм, содержащий 5% линолевой кислоты. В работе использованы известные перевиваемые штаммы: Са-755 (аденокарцинома молочной железы), LLC (карцинома легких Льюис), La (недифференцированный лейкоз), L-1210 (лимфолейкоз), В-16 (меланома), а также штаммы 3—5-й генерации, полученные нами из спонтанно возникших опухолей у мышей DBA/2; КТ-1 (аденокарцинома молочной железы), КТ-2 (аденокарцинома молочной железы), МИС-1 (плоскоклеточный рак кожи). Все указанные штаммы, за исключением лейкоза La и внут-рибрюшинного варианта меланомы В-16, перевивали подкожно по общепринятой методике [3]. Ингибитор биосинтеза ПГ ИМ («Sigma», США) животные получали с питьевой водой [11] в дозе 10 мкг/мл, в отдельных случаях суточную дозу препарата вводили парентерально. Контролем служили мыши, получавшие 1% этанол, а также интактные животные. Модифицирующее действие ИМ оценивали по данным кинетики роста опухолей и средней продолжительности жизни (СПЖ) животных. В качестве кинетических параметров использовали массу или объем опухолей, а при лейкозах L-1210 и La также содержание лейкемических клеток в селезенке и печени. При оценке влияния ИМ на развитие спонтанного лейкоза у мышей AKR принимали во внимание сроки гибели животных, массу тимуса и селезенки, а также проводили цитогистологический анализ указанных органов. Синтез ПГ из [1-14С]-арахидоновой кислоты («Amersham», Англия) в гомогенатах опухолевых тканей оценивали методами тонкослойной хроматографии с привлечением автородиографии и денситометрии [13]. Статистическую достоверность результатов определяли с помощью (-критерия Стьюдента.

I. A. Kudryavtsev, I. P. Taranenko

INDOMETHACIN EFFECT ON GROWTH OF MURINE EXPERIMENTAL TUMORS

Research Institute of Carcinogenesis

There are numerous clinical and experimental reports published recently that prove increased production of cyclooxygenase metabolites of polyunsaturated fatty acids, i.e. prostaglandins (PG) in various human and animal tumors [5,7,8]. Besides, PG are found to play a significant part in tumor initiation and promotion [6,10,17], immunosuppression [4,9,12], tumor cell growth and metastasis [12,14-16], which provides a good reason for comprehensive study of cyclooxygenase inhibitor effect on tumor growth in vitro and in vivo. The available data on efficacy of PG synthesis inhibitors in animal experiments with transplantable and induced tumors are equivocal and require further investigation [1,2,9,11]. This paper describes a study of the effect of a most active cyclooxygenase inhibitor indomethacin (IM) on growth of a variety of experimental murine tumors including evaluation of PG profile in tumor tissues.

Material and Method. The study was performed on 358 C57B1/6 and DBA/2 female mice of 20-22 g body weight and on 200 AKR female mice of the same age supplied by the Stolbovaya vivarium. During the experiment all the animals received standard briquetted feed containing 5% of linoleic acid. We used well known transplantable strains Ca-755 (mammary adenocarcinoma), LLC (Lewis lung carcinoma), La (undifferentiated leukemia), L-1210 (lymphatic leukemia), B-16 (melanoma), as well as 3-5 generation strains obtained from spontaneous tumors of DBA/2 mice: KT-1 (mammary adenocarcinoma), KT-2 (mammary adenocarcinoma), MIC-1 (squamous cell skin carcinoma). All the above-mentioned strains except leukemia La and intraperitoneal variant of melanoma B-16 were implanted subcutaneously according to the standard techniques [3]. The PG biosynthesis inhibitor IM (Sigma, USA) was given to the animals with drinking water [11] at 10 mcg/ml, in some cases the daily dose of the drug was administered parenterally. Mice receiving 1% ethanol and intact mice were used as control. The IM modifying activity was evaluated by tumor growth kinetics and average life span (ALS) of the animals. The kinetic parameters studied were tumor weight and volume, in leukemias L-1210 and La the parameters also included the number of leukemic cells in the spleen and liver. Evaluation of IM effect on spontaneous leukemia in AKR mice was performed with respect to animal death onset, weight of the thymus and spleen, and involved cytohistology of these organs. The PG synthesis from [1 -,4C]-arachidonic acid (Amersham, England) in tumor tissue homogenates was evaluated by thin layer chromatography with involvement of autoradiography and densitometry [13]. Statistical significance of the results was verified by Student’s /-test.

Results and Discussion. The study showed that the PG biosynthesis inhibitor IM exerted marked inhibiting action on growth of murine transplantable tumors (fig.l). For instance, IM inhibited considerably the growth of Lewis lung carcinoma (day 12, test 282+98 mnr, control

Рис. 1. Влияние ИМ на рост различных перевиваемых опухолей мышей.

1 — L-1210 (6-е сутки); 2 — Са-755 (14-е сутки); 3 — LLC (12-е сутки); 4 — В-16 подкожно (14-е сутки); 5 — В-16 внутрибрюшинно (14-е сутки; ИМ per os)] 6 — В-16 внутрибрюшинно (14-е сутки; ИМ внутрибрюшинно); 7— КТ-1 (19-е сутки); 8 — КТ-2 (14-е сутки); 9 — МИС-1 (24-е сутки). ИМ животные получали с питьевой водой в дозе 10 мкг/мл ad libitum или внутрибрюшинно (6) в дозе 30 мкг/мышь/сут. В каждой группе — 10 животных. По вертикали — процент торможения или стимуляции роста опухолей по сравнению с контролем. * р < 0,05; ** р < 0,001.

Fig.1. IM effect on growth of various murine transplantable tumors

1, L-1210 (day 6); 2, Ca-755 (day 14); 3, LLC (day 12); 4, B-16 sub-cutaneously (day 14); 5, B-16 intraperitoneally (day 14) (IM per os); 6, B-16 intraperitoneally day 14) (IM intraperitoneally); 7, CT-1 (day 19); 8, CT-2 (day 14); 9, MIC-1 (day 24). IM was given with water at 10 mcg/ml ad libitum or intraperitoneally (6) at 30 mcg/mouse/day. There were 10 animals in each group. Numbers on the vartical show tumor growth inhibition or stimulation as percentage in relation to the control.

*, p<0.05; ”, p<0.001.

Результаты и обсуждение. Результаты проведенных исследований показали, что в большинстве случаев ингибитор биосинтеза ПГ ИМ оказывает выраженное ингибирующее действие на рост перевиваемых опухолей мышей (рис. 1). Так, ИМ значительно тормозил рост карциномы легких Льюис (12-е сутки, опыт — 282 ± 98 мм , контроль — 2274 ± 230 мм3; - 88%; р < 0,001), аденокарциномы молочной железы Са-755 (14-е сутки, опыт — 1870 ±318 мм3; контроль — 2980 ±310 мм3; - 37%; р < 0,05), а также всех 3 полученных нами штаммов: аденокарциномы молочной железы КТ-1 (19-е сутки, опыт — 5137 ± 463 мм3, контроль — 9791 ± 657 мм3; - 47%;р < 0,001) и КТ-2 (14-е сутки, опыт— 1490 ± 157 мм3; контроль — 4520 ± 524 мм3; - 67%;р < 0,001), плоскоклеточного рака кожи МИС-1 (24-е сутки, опыт — 350 ± 128 мм3; контроль — 2020 ± 186 мм3; - 83%; р < 0,001). Вместе с тем ингибитор циклооксигеназы существенно стимулировал развитие подкожной опухоли (6-е сутки, опыт — 848 ± 120 мг; контроль — 582 ± 12 мг; + 46%; р < 0,05) и разрастание лей-кемических клеток в селезенке и печени у мышей с лейкозом Ь-1210. Подобные, но менее выраженные изменения в селезенке и печени, а также крови животных при воздействии ИМ наблюдались и при лейкозе Ьа. Следует отметить, что ИМ значительно стимулировал рост внутрибрюшинно перевитой меланомы В-16 при пероральном (14-е сутки, опыт — 3276 ± 673 мг, контроль — 1587 ± 282 мг;

2274+230 mm3; -88%; /><0.001), mammary adenocarcinoma Ca-75 (day 14, test 1870±318 mm3; control 2980±310 mm3; -37%; /><0.05), and all the three strains obtained by the authors, i.e. mammary adenocarcinoma KT-1 (day 19, test 5137±463 mm3, control 9791+657 mm3; -47%; /><0.001) and KT-2 (day 14, test 1490±157 mm3, control 4520±524mm3; -67%;/><0.001),squamous cell skin carcinoma MIC-1 (day 24, test 350±128 mm3, control 2020±186 mm3; -83%; /?<0.001). However, the cyclooxygenase inhibitor stimulated significantly the growth of the subcutaneous tumor (day 6, test 848±120 mg, control 582+12 mg; +46%; /?<0.05) and proliferation of leukemia L-1210 cells in the spleen and liver of the mice. Similar, though less pronounced, changes in the spleen, liver and blood of the animals under the effect of IM were also observed in leukemia La. Of note, that IM stimulated considerably the growth of the intraperitoneally implanted melanoma B-16 when administered orally (day 14, test 3276±673 mg, control 1587±282 mg, + 106%, /><0.05) or parenterally (test 3085±633 mg; +94%;/?<0.05), but showed no activity if the tumor was implanted subcutaneously. The dependance of the cyclooxygenase inhibitor modifying activity both on histogenesis and on way of tumor transplantation was also observed in cases with the strain KT-1. IM suppressed considerably the growth of subcutaneous tumors of the strain, while ALS of the treated and control mice was similar. At the same time intraperitoneal tumors was growing much faster in the test mice, and their ALS was 16% shorter (p<0.1) than that of the control. There was a marked increase in the ALS of the IM treated mice with mammary adenocarcinoma KT-2 (test-day 21.8±1.5, control —day 18.1 + 1.5, +20%, /?<0.1) and of those with Lewis lung carcinoma LLC (test — day 29.4+1.3, control — day 24.3+1.5, +21%, /?<0.05).

A significant part of our investigation involved study of synthesis of cyclooxygenase metabolites of [1-14C]-arachidonic acid in transplantable tumors of various genesis. We found that each transplantable murine tumor has a specific profile of synthesized PG of its own. There was a positive correlation between IM growth inhibiting activity and the murine transplantable tumor ability to produce PGE2. PGE2 peak level and high relative content as compared to other oxygenase metabolites of [1-14C]-arachidonic acid were detected in Lewis lung carcinoma (fig.2, a), whose growth was inhibited most effectively by IM. The conversion of the labeled acid into PGE2 was less intensive in mammary carcinoma Ca-755 and KT-1. The synthesis of PGE2 and other PG was the lowest in subcutaneous murine leukemia L-1210, and melanoma B-16 (fig.2, b).

Since IM suppressed growth of epithelial tumors only, while non-epithelial transplantable tumors showed no response to or were stimulated by the drug, it was interesting to evaluate the drug’s effect on spontaneous development of leukemia in AKR mice. It appeared that long-term inhibition of PG synthesis under the effect of IM led to a considerable decrease in time till onset of leukemia and animal death. The control mice died at the age of

+ 106%; р < 0,05) и парентеральном (опыт — 3085 ± 633 мг; + 94%;/? < 0,05) введение, однако не проявлял какой-либо активности при подкожной перевивке опухоли. Зависимость модифицирующего действия ингибитора циклоок-сигеназы не только от гистогенеза, но и от способа перевивки опухолей была обнаружена также на штамме КТ-1. Рост подкожных опухолей этого штамма существенно подавлялся ИМ, а СПЖ животных, получавших препарат и контрольных, была одинаковой. В то же время внутрибрюшинно перевитая опухоль значительно быстрее росла у опытных мышей, а СПЖ их была на 16% меньше (р < 0,1), чем в контроле. Выраженное увеличение СПЖ у мышей, получавших ИМ, наблюдалось в 2 случаях: при аденокарциноме молочной железы КТ-2 (опыт — 21,8 ± 1,5 сут, контроль — 18,1 ± 1,5 сут; + 20%; р < 0,1) и карциноме легких Льюис 1ХС (опыт — 29,4 ± 1,3 сут, контроль— 24,3 ± 1,5 сут; + 21%; р < 0,05).

Важный элемент в нашей работе составляло изучение синтеза циклооксигеназных метаболитов [1-14С]-арахи-доновой кислоты в перевиваемых опухолях разного гистогенеза. В результате этих исследований было установлено, что каждая из перевиваемых опухолей мышей имеет строго определенный профиль синтезируемых ПГ. При сопоставлении данных о спектре синтезируемых ПГ и характере модифицирующего действия ИМ отмечалась положительная корреляция между ростоингибирующей активностью ИМ и способностью перевиваемых опухолей мышей продуцировать ПГЕ2. Максимальный уровень ПГЕг и его высокое относительное содержание среди других циклооксигеназных метаболитов [1-14С]-арахидоновой кислоты были выявлены в карциноме легких Льюис (рис. 2, а), рост которой наиболее эффективно подавлялся ИМ. В меньшей степени конверсия меченой кислоты в ПГЕг имела место в опухолях молочной железы Са-755 и Кт-1. Самый низкий уровень синтеза ПГЕг, равно как и других ПГ, наблюдался в подкожных опухолях у мышей с лейкозом Ь-1210 и меланоме В-16 (рис. 2, Ь).

В связи с тем, что ИМ угнетал рост только эпителиальных опухолей, а перевиваемые опухоли неэпителиальной природы были нечувствительны к препарату или стимулировались им, представляла интерес оценка его влияния на развитие спонтанного лейкоза у мышей линии АКЯ. Проведенные исследования показали, что в условиях длительного торможения синтеза ПГ при воздействии ИМ значительно сокращаются сроки развития лейкоза и последующей гибели животных. Так, контрольные мыши в I серии опытов погибли от лейкоза в возрасте 10,83 ± 0,39 мес, во II— 11,21 ± 0,48 мес, в то время как у животных, получавших ИМ, эти сроки были равны соответственно 9,45 ±0,18 мес (- 13%; р < 0,002; рис. 3) и 9,71 ± 0,24 мес (- 13%; р < 0,01). При этом другие показатели у опытных и контрольных мышей практически не различались. Частота развития лейкоза в опытной и контрольной групаах была равной 80%, масса опухоли тимуса составила соответственно 556 ± 58 и 558 ± 62 мг, масса селезенки 455 ± 49 и 421 ± 44 мг, не было обнаружено отличий и в микроскопической картине лейкоза. Таким образом, стимулирующий эффект ИМ, наблюдаемый при перевиваемых лейкозах Ь-1210 и Ьа, в значительной

ь

Рис. 2. Профиль синтезируемых ПГ из П-^ф-арахидоновой кислоты в опухолевой ткани карциномы легких Льюис (а) и меланомы В-16 (b). Денситометрированные авторадио-ТС-хроматограммы.

1 — старт; 2 — б-кето-PGFti; 3 — PGF2a; 4 — тромбоксан Вг; 5 — PGE2; 6 — PGD2; 7 — арахидоновая кислота.

Fig.2. Profile of PG synthesized from [1=C14]=arachidonic acid in tissue of Lewis lung carcinoma (a) and melanoma B=16 (b). Densitometerized autoradio=TL=chromatograms.

1, start; 2, 6-keto-PGF-ia; 3, PGF2a; 4, thromboxane B2; 5, PGE2; 6, PGD2; 7, arachidonic acid.

10.83 7± 00.39 mo in experimental series I and at

11.21 7+ 00.48 mo in series II, while as concerns the animals receiving IM these terms were 9.45±0.18 mo (-13%; /7<0.002; fig.3) and 9.71±0.24 mo (-13%; /><0.01), respectively. Other parameters were practically similar in the test and control animals. Rate of leukemia incidence in the test and control groups was 556±58 and 558±62 mg, respectively, spleen weight 455±49 and 421±44 mg, respectively, the microscopic leukemia patterns showed no difference either. Thus, the IM stimulating effect observed in transplantable leukemias L-1210 and La was also detected in spontaneous leukemia in AKR mice.

Our findings prove rather strong dependance of character of the growth modifying effect of the cyclooxygenase inhibitor IM upon tumor histogenesis and transplantation mode. There is a correlation of transplantable tumor growth inhibition by IM and intensity of PGE2 synthesis in the tumors. Of note is the fact that IM inhibits growth of epithelial tumors only, but stimulates growth of melanoma, transplantable and spontaneous leukemias. Mechanism of different effects of the inhibitor as well as pro-

7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Рис. 3. Влияние ИМ на развитие спонтанного лейкоза у мышей линии AKR.

а — ИМ; b — контроль. ИМ животные получали с питьевой водой в дозе 10 мкг/мл с 7-го по 12-й месяц. По оси абсцисс — возраст мышей, мес; по оси ординат — количество мышей, погибших от лейкоза.

Fig.3. IM effect on spontaneous leukemia in AKR mice.

1, IM; 2, control. IM was given with water at 10 mcg/ml from month 7 to 12. There were 50 animals in each group. Numbers on the x axis show months of mise’s life; numbers on the у axis show number of mice dying from leukemia.

степени проявлялся и в случае спонтанного лейкоза у мышей АКК.

Полученные результаты свидетельствуют о выраженной зависимости характера ростомодифицирующего действия ингибитора циклооксигеназы ИМ от гистогенеза опухолей и стособа их перевивки. При этом отмечается взаимосвязь эффективности ИМ в подавлении роста перевиваемых опухолей и интенсивности синтеза в них ПГЕг. Заслуживают внимания проявление ростоингибирующей активности ИМ только на опухолях эпителиальной природы и стимулирующий эффект препарата при меланоме, перевиваемых и спонтанном лейкозах. Механизм различного действия игибитора, а также предшественников [2] синтеза ПГ на рост опухолей разного гистогенеза остается неясным и, по-видимому, связан с особенностями метаболизма полиненасыщенных жирных кислот в каждой опухолевой ткани. Большое значение в понимании этого механизма будут иметь детальные исследования профиля циклооксигеназных и липок-сигеназных метаболитов кислот в различных органах и опухолях экспериментальных животных.

Неоднозначный характер модифицирующего действия ИМ указывает также на необходимость избирательного отношения к применению ингибиторов синтеза ПГ в онкологической клинике. Учитывая наши данные о выраженном торможении ингибитором циклооксигеназы роста карциномы Льюис, можно предположить его высокую эффективность при химиотерапевтическом или комбинированном лечении больных раком легкого. Однако определяющую роль в прогнозировании эффекта ИМ у онкологических больных, по-видимому, должен играть анализ циклооксигеназных матаболитов арахи-доновой кистоты в опухолевой ткани.

genitors [2] of PG synthesis on growth of tumors of different histogenesis is unknown, but seems to be related to peculiarities of metabolism of polyunsaturated fatty acids in each tumor tissue. Of considerable importance for understanding of this mechanism will be study of profiles of cyclooxygenase and lipoxygenase acid metabolites in different organs and experimental animal tumors. The dubious character of the IM modifying effect infers the necessity of selective administration of PG synthesis inhibitors in the clinical oncology. The marked suppressing effect of the cyclooxygenase inhibitor on Lewis carcinoma suggests its high efficacy in chemotherapy orcombined treament of lung cancer. However, the effect of IM in cancer patients may be prognosticated mainly basing on analysis of cyclooxygenase metabolites of arachidonic acid in tumor tissue.

ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES

1. Беспалов В. Г., Лидак М. Ю., Петров А. С. и др. // Экспер. онкол. — 1992. — Т. 14, № 1,—С, 36-40.

2. Кудрявцев И. А., Алексеев С. М., Аширова В. Э. и др. // Бюл. экспер. биол. — 1988. — Т. 105, № 4. — С. 471—474.

3. Экспериментальная оценка противоопухолевых препаратов в СССР и США / Под ред. 3. П. Софьиной и др. — М., 1980.

4. Batch С. М., Dougherty P. A., Cloud G. A., Tilden А. В. II Surgery. — 1984. — Vol. 95, № 1. — P. 71—77.

5. Bennett A., Berstock D. A., Harris M. et al. // Advances in prostaglandin and thromboxane research. — New York, 1980. — Vol. 6. — P. 595—600.

6. Bennett S., Marshall W., O'Brien P. J. II Prostaglandins and cancer: First International Conference. — New York, 1982. — P. 143— 148.

7. Castelli M. G., Chiabrando C., Fanelli R. et al. // Cancer Res. — 1989.— Vol. 49.— P. 1505—1508.

8. Chiabrando C., Broggini М., Castelli M. G. et al. // Ibid. — 1987. — Vol. 47. — P. 988—991.

9. Favalli C., Garaci E., Etheredge E. et al. // J. Immunol. — 1980. — Vol. 125. — P. 897—902.

10. Fischer S. М., Gleason G. L., Bohrman J. S., Slaga T. J. II Advances in prostaglandin and thromboxane research. —New York, 1980. — Vol. 6.— P. 517—522.

11. Fulton А. М. И Cancer Res. — 1984. — Vol. 44. — P. 2416—2420.

12. Fulton A. М., Heppner G. H. II Cancer Res. — 1985. — Vol. 45. — P. 4779—4784.

13. Hawkey C. J., Boughton-Smith N. K., Whittle B. J. R. II Dig. Dis. Sciences. — 1985. — Vol. 30, № 12.— P. 1161—1165.

14. Honn К. V. II Prostaglandins and cancer: First International Conference.— New York, 1982. — P. 733—752.

15. Santoro M. G., Crisari A., Benedetto A., Amici A. II Cancer Res. — 1986. — Vol. 46. — P. 6073—6077.

16. Tock> S., Hashida Т., Shimizu Y. et al. // Prostagland. Leuk. Med. — 1986.—Vol. 23.— P. 55—65.

17. Wise R. W., Zenser Т. V., Kadlubar F. F., Davis В. В. II Cancer Res. — 1984. — Vol. 44. — P. 1893—1897.

Поступила 24.11.92 / Submitted 24.11.92