МАСШТАБНЫЙ ПРОИЗВОДСТВЕННЫЙ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ ЛЕНТИВИРУСНЫХ ВЕКТОРОВ В СИСТЕМЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК В БЕССЫВОРОТОЧНОЙ СУСПЕНЗИИ

1. Способ крупномасштабной очистки вирусного вектора, включающий:
a) получение рекомбинантных вирусных векторов, включая трансген, из бессывороточной суспензии культуры;
b) очистка сбора стадии a) посредством фильтрации;
c) получение фильтрата на стадии b) и необязательно подвергание указанного фильтрата нуклеазному расщеплению для устранения примесей ДНК/РНК;
d) подвергание фильтрата стадии c) PEG-модулированной аффинной или ионнообменной колоночной хроматографии, выделяя посредством этого указанные вирусные векторы;
e) дополнительную очистку вирусных векторов, полученных на стадии d), посредством тангенциальной поточной фильтрации для уменьшения объема и буферного обмена;
f) подвергание фильтрата стадии e) эксклюзионной колоночной хроматографии для дополнительной очистки указанных вирусных векторов;
g) подвергание векторов стадии f) тангенциальной поточной фильтрации и получение посредством этого итогового титра вектора; и
h) фильтрование раствора вектора, полученного на стадии g) с помощью фильтра; и
i) сбор указанных очищенных вирусных векторов.
2. Способ крупномасштабной очистки вирусного вектора, включающий:
a) получение рекомбинантных вирусных векторов, включая трансген, из бессывороточной суспензии культуры;
b) очистка сбора стадии a) посредством фильтрации;
c) подвергание очищенной суспензии стадии b) тангенциальной поточной фильтрации для уменьшения объема и буферного обмена;
d) получение фильтрата на стадии c) и необязательно подвергание указанного фильтрата нуклеазному расщеплению для устранения примесей ДНК/РНК;
e) подвергание фильтрата стадии d) PEG-модулированной аффинной или ионнообменной колоночной хроматографии, выделяя посредством этого указанные вирусные векторы;
f) подвергание вирусных векторов, полученных на стадии e) эксклюзионной колоночной хроматографии для дополнительной очистки указанных вирусных векторов;
g) подвергание векторов стадии f) тангенциальной поточной фильтрации и получение посредством этого итогового титра вектора; и
h) фильтрование раствора вектора, полученного на стадии g) с помощью фильтра; и
i) сбор указанных очищенных вирусных векторов.
3. Способ крупномасштабной очистки вирусного вектора, включающий:
a) получение рекомбинантных вирусных векторов, включая трансген, из бессывороточной суспензии культуры;
b) очистка сбора стадии a) посредством фильтрации;
с) подвергание очищенной суспензии стадии b) тангенциальной поточной фильтрации для уменьшения объема и буферного обмена;
d) получение фильтрата на стадии c) и необязательно подвергание указанного фильтрата нуклеазному расщеплению для устранения примесей ДНК/РНК;
e) подвергание фильтрата стадии d) PEG-модулированной аффинной или ионнообменной колоночной хроматографии, выделяя посредством этого указанные вирусные векторы;
f) дополнительную очистку вирусных векторов, полученных на стадии e), посредством тангенциальной поточной фильтрации для уменьшения объема и буферного обмена;
g) подвергание фильтрата стадии f) эксклюзионной колоночной хроматографии для дополнительной очистки указанных вирусных векторов;
h) подвергание векторов стадии g) тангенциальной поточной фильтрации, и получение посредством этого итогового титра вектора; и
i) фильтрование раствора вектора, полученного на стадии h), с помощью фильтра; и
j) сбор указанных очищенных вирусных векторов.
4. Способ по любому из пп.1-3, в котором указанный вирусный вектор представляет собой рекомбинантный лентивирусный вектор (rLV).
5. Способ по любому из пп.1-3, в котором указанный вирусного вектор включает рекомбинантный лентивирусный вектор (rLV), выбранный из ВИЧ-1, ВИЧ-2, ВИЧ-1/ВИЧ-2 псевдотипа, ВИЧ-1/SIV, FIV, лентивируса артроэнцефалита козлов (CAEV), вируса инфекционной анемии лошадей, вируса иммунодефицита крупного рогатого скота, ВИЧ и их псевдотипов или вируса везикулярного стоматита G-псевдотипированного лентивируса (VSVG-псевдотипированного) вектора.
6. Состав rLV вектора, включающий rLV частицы, очищенные с применением способа по любому из пп.1-3 в фармацевтически приемлемом носителе.
7. Способ по любому из пп.1-3, в котором указанный трансген кодирует нуклеиновую кислоту, выбранную из группы, состоящей из миРНК, нечувствительной молекулы и микроРНК рибозима и коротких РНК, образующих шпильки.
8. Способ по любому из пп.1-3, в котором указанный трансген кодирует генный продукт, выбранный из группы, состоящей из инсулина, глюкагона, гормона роста (GH), паратиреоидного гормона (PTH), соматотропин-рилизинг-фактора (GRF), фолликулстимулирующего гормона (FSH), лютеинизирующего гормона (LH), человеческого хорионического гонадотропина (hCG), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), ангиопоэтинов, ангиостатина, колониестимулирующего фактора гранулоцитов (GCSF), эритропоэтина (EPO), фактора роста соединительной ткани (CTGF), основного фактора роста фибробластов (bFGF), кислотного фактора роста фибробластов (aFGF), эпидермального фактора роста (EGF), трансформирующего ростового фактора-α (TGFα), фактора роста тромбоцитов (PDGF), инсулиноподобных факторов роста I и II (IGF-I и IGF-II), TGFβ, активинов, ингибинов, костного морфогенетического белка (BMP), фактора роста нервной ткани (NGF), нейротрофического фактора головного мозга (BDNF), нейротрофинов NT-3 и NT4/5, цилиарного нейротрофического фактора (CNTF), нейротрофического фактора глиальной клеточной линии (GDNF), нейротурина, агрина, нетрина-1 и нетрина-2, фактора роста гепатоцитов (HGF), эфринов, ноггина, «звукового ежика» и тирозингидроксилазы.
9. Способ по любому из пп.1-3, в котором указанный трансген кодирует генный продукт, выбранный из группы, состоящей из тромбопоэтина (TPO), интерлейкинов (с IL-1 по IL-17), моноцитарного хемоаттрактантного белка, фактора, ингибирующего лейкоз, гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора, лиганда Fas, факторов некроза опухоли α и β, интерферонов α, β и γ, фактора стволовой клетки, flk-2/flt3 лиганда, IgG, IgM, IgA, IgD и IgE, химерных иммуноглобулинов, гуманизированных антител, одноцепочечных антител, рецепторов Т-клеток, рецепторов химерных Т-клеток, одноцепочечных рецепторов Т-клеток, рецепторов, связанных с G-белком (GPCRs), CCR5 и молекул MHC класса I и класса II.
10. Способ по любому из пп.1-3, в котором указанный трансген включает нуклеиновую кислоту, кодирующую белок, пригодный для коррекции врожденного нарушения обмена веществ, выбранный из группы, состоящей из карбамоилсинтетазы I, орнитинтранскарбамилазы, аргининосукцинатсинтетазы, аргининосукцинат-лиазы, аргиназы, фумарилацетоацетатгидролазы, фениаланингидролазы, альфа-1 антитрипсина, глюкоза-6-фосфатазы, порфобилиногендезаминазы, Фактора V, Фактора VIII, Фактора IX, цистатионин-бета-синтетазы, разветвленнойо цепи кетоацидодекарбоксилазы, альбумина, изовалерил-КоА-дегидрогеназы, пропионил-КоА-карбоксилазы, метилмалонил-КоА-мутазы, глутарил-КоА-дегидрогеназы, инсулина, бета-глюкозидазы, пируваткарбоксилазы, печеночной фосфорилазы, фосфорилазы-киназы, глициндекарбоксилазы, белка, специфичного для пигментного эпителия сетчатки, с молекулярной массой 65 кДа (RPE65), H-белка, T-белка, последовательности трансмембранного регулятора муковисцидоза (CFTR) и последовательности дистрофина кДНК.
11. Способ по любому из пп.1-3, в котором указанный трансген кодирует генный продукт, выбранный из Фактора VIII и Фактора IX.
12. Способ по любому из пп.1-3, в котором указанный трансген кодирует опухолеспецифический антиген (TAA).
13. Способ по любому из пп.1-3, в котором указанный трансген кодирует генный продукт, выбранный из группы, состоящей из CAIX, CD19, CD20, CD20, CD22, CD30, CD33, CD44v7/8, CEA, EGF-RIII (варианта 3 рецептора эпидермального фактора роста) EGP-2, erb-B2, erb-B2, 3, 4, FBP, ацетилхолинового рецептора фетального типа, GD2, Her2/neu, IL-13R-a2, KDR, k-легкой цепи, LeY, L1 молекулы клеточной адгезии, MAGE-A1, мезотелина, MUC1, NKG2D, раково-эмбрионального антигена (h5T4), PSCA, PSMA, mAb IgE, меченного TAA, TAG-72 или VEGF-R2.
14. Способ по любому из пп.1-3, в котором указанные рекомбинантные вирусные векторы продуцируются клетками млекопитающих.
15. Способ по любому из пп.1-3, в котором указанные рекомбинантные вирусные векторы продуцируются клетками HEK293T (ATCC); HEK293F (Life Technologies); HEK293(ATCC); 293S (ATCC), BHK (ATCC), BHK-21 (ATCC), CHO (ATCC), CHO/dhFr- (ATCC)l или CHO K1 (ATCC).
16. Способ по любому из пп.1-3, в котором указанная бессывороточная суспензия культуры включает бессывороточную среду для выращивания клеток.
TM
R
R
TM
TM
R
R
R
R
17. Способ по п.16, в котором указанная бессывороточная среда для выращивания выбрана из: FreeStyle293 (Gibco, Life Technologies), DMEM/F12 (Gibco, Life Technologies), SFM4Transfx-293 (HyClone, ThermoScientific), CDM4HEK293 (HyClone, ThermoScientific), StemPro-34SFM (Gibco, Life Technologies), FreeStyle F17 (Gibco, Life Technologies), 293SFM II (Gibco, Life Technologies) и CD293 (Gibco, Life Technologies).
18. Способ по любому из пп.1-3, в котором указанная нуклеаза включает эндонуклеазу, экзонуклеазу или их комбинации.
19. Способ по любому из пп.1-3, в котором указанная нуклеаза включает дезоксирибонуклеазу, рибонуклеазу или их комбинации.
20. Способ по любому из пп.1-3, в котором указанная нуклеаза включает бензоназу или ДНКазу.
21. Способ по любому из пп.1-3, в котором указанная ионнообменная колоночная хроматография включает анионнообменную колоночную хроматографию.
22. Способ по любому из пп.1-3, в котором указанная ионнообменная колоночная хроматография включает сильную или слабую анионнообменную колоночную хроматографию.
23. Способ по любому из пп.1-3, в котором указанная ионнообменная колоночная хроматография включает катионнообменную колоночную хроматографию.
24. Способ по любому из пп.1-3, в котором указанная ионнообменная колоночная хроматография включает сильную или слабую катионнообменную колоночную хроматографию.
25. Способ по любому из пп.1-3, в котором указанная ионнообменная колонка включает кватернизированную смолу на основе полиэтиленимина; или четвертичную аминовую смолу.
26. Способ по любому из пп.1-3, в котором указанная ионнообменная колонка включает в себя смолу на основе полиэтиленимина; смолу на основе диэтиламиноэтила (DEAE); или смолу на основе диэтиламинопропила.
27. Способ по любому из пп.1-3, в котором указанная аффинная колонка включает смолу на основе сульфопропила.
28. Способ по любому из пп.1-3, в котором указанная аффинная колонка включает на основе карбоксиметила.
29. Способ по любому из пп.1-3, в котором указанная аффинная колонка включает многофункциональную хроматографическую смолу.
5
4
3
2
30. Способ по любому из пп.1-3, в котором указанная аффинная или ионнообменная колонка включает смолу на основе гидроксиапатита ((Ca(PO)OH)); мультимодальную слабую катионнообменную смолу; смолу на основе N-бензил-n-метилэтаноламина; или смолу на основе октиламина.
31. Способ по любому из пп.1-3, в котором указанная аффинная колонка включает металло-хелатную аффинную смолу или среду; смолу или среду на основе гепарина, или группоспецифическую аффинную смолу или среду.
32. Способ по любому из пп.1-3, в котором указанная PEG-модулированная аффинная или ионнообменная колоночная хроматография включает:
i) регулирование фильтрата стадии c) к связывающему раствору, при этом указанный связывающий раствор необязательно включает в себя PEG, и приведение в контакт указанного фильтрата с аффинной или ионнообменной колонкой, связывая таким образом вирусные векторы с аффинной или ионнообменной колонкой,
ii) отмывание связанных вирусны векторов для устранения примеси отмывающим раствором, включающим PEG, или раствором, включающим в себя PEG и соль; и
iii) элюирование вирусных векторов из аффинной или ионнообменной колонки элюирующим раствором.
33. Способ по п.32, в котором указанный связывающий раствор включает PEG в количестве от приблизительно 0% до 10% вес/объем, или от приблизительно 0% до 5% вес/объем, или от приблизительно 0% до 2% вес/объем.
34. Способ по п.32, в котором указанный связывающий раствор включает PEG, имеющий молекулярную массу от приблизительно 2000 кДа до приблизительно 40000 кДа.
35. Способ по п.32, в котором указанный отмывающим раствор включает PEG в количестве от приблизительно 1% до 10% вес/объем, или от приблизительно 1% до 5% вес/объем, или от приблизительно 1% до 2% вес/объем.
36. Способ по п.32, в котором указанный отмывающий раствор включает PEG, имеющий молекулярную массу от приблизительно 2000 кДа до приблизительно 40000 кДа.
37. Способ по п.32, в котором указанный элюирующий раствор включает PEG в количестве от приблизительно 0% до 20% вес/объем.
38. Способ по п.32, в котором указанный элюирующий раствор включает PEG, имеющий молекулярную массу от приблизительно 2000 кДа до приблизительно 40000 кДа.
39. Способ по п.32, в котором указанный связывающий, отмывающий или элюирующим раствор дополнительно включает соль.
40. Способ по п.32, в котором указанный элюирующий раствор включает соль в количестве от приблизительно 500 мМоль до приблизительно 1000 мМоль.
41. Способ пп.39 или 40, в котором указанная соль включает натрия хлорид или калия хлорид.
42. Способ по любому из пп.1-3, в котором указанную стадию фильтрования h) или i) осуществляют с помощью фильтра, имеющего диаметр пор, составляющий приблизительно 0,20-0,5 мкм.
43. Способ по любому из пп.1-3, в котором указанную стадию фильтрования g) осуществляют через фильтр с диаметром пор 0,20 мкм.
44. Способ по любому из пп.1-3, в котором указанную стадию фильтрования g) осуществляют через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм.
45. Способ по любому из пп.1-3, в котором указанную стадию фильтрования g) осуществляют через фильтр с диаметром пор 0,45 мкм.
5
46. Способ по любому из пп.1-3, в котором получают приблизительно 5×10 инфекционных единиц (IU)/мл указанного вирусного вектора.
6
47. Способ по любому из пп.1-3, в котором получают приблизительно 6×10 инфекционных единиц (IU)/мл указанного вирусного вектора.
8
48. Способ по любому из пп.1-3, в котором получают приблизительно 3×10 инфекционных единиц (IU)/мл указанного вирусного вектора.