Влияние стрессогенных факторов на каллусную ткань Digitalis purpurea L

Выводы

Целесообразность и ценность малораспространенных многолетних трав в лесостепи определяется не только их высокой и стабильной продуктивностью и питательностью, но и холодостойкостью и быстрым формированием укосной массы ранней весной и осенью. Это козлятник и свербига, что позволяет продлить период функционирования зеленых конвейеров. Сравнительно высокая продуктивность хорошо сочетается с полноценностью зеленой массы. Зеленая масса многолетних кормовых трав может использоваться на зеленые подкормки, для заготовки силоса и сенажа, а также других видов кормов для животноводства. На основании наших исследований, а также производственных испытаний в учхозе «Миндерлинское» Сухобузим-ского района, козлятник восточный, свербига восточная, а также эспарцет песчаный и были включены в примерную схему зеленого конвейера (Аветисян, 2011). Данная схема зеленого конвейера позволяет продлить кормление животных зелеными кормами в среднем до 145-150 дней в условиях лесостепи Красноярского края. За два укоса они обеспечивают до 315,0-515,0 зеленой и 78,0-118,3 ц/га сухой массы с высокой питательностью.

Литература

1. Кутузова А.А., Тебердиев Д.М. Ускоренные технологии создания культурных пастбищ на при-фермерских землях // Кормопроизводство. - 1999. - № 4. - С. 8-11.

2. Шпаков А.С., Гришина Н.В. Устойчивая продуктивность кормовых культур в Центральном районе // Кормопроизводство. - 2002. - № 7. - С. 20-22.

3. Косолапое В.М. Новый этап развития кормопроизводства в России // Кормопроизводство. - 2007. - № 5. - С. 3-7.

4. Косолапое В.М. Кормопроизводство в экономике сельского хозяйства России: состояние, проблемы, перспективы // Экономика с.-х. и перерабатывающих предприятий. - 2009. - № 9. - С. 6-10.

5. Романенко Г.А., Тютюнникое А.И., Гончарое П.Л. Кормовые растения России / РАСХН, ЦИНАО. -М., 1999. - 370 с.

6. Интенсификация кормопроизводства на основе адаптивности кормовых культур в Красноярском крае: рекомендации / А. Т. Аветисян [и др.]. - Красноярск: ООО «Енисей-Знак», 2010. - 152 с.

7. Хуснитдинов Ш.К. Новые, малораспространенные сельскохозяйственные культуры в Иркутской области. - Иркутск: Изд-во ИрГСХА, 1999. - 232 с.

8. Аветисян А.Т. Адаптивность нетрадиционных, малораспространенных кормовых культур земледельческой части Красноярского края // Вестн. КрасГАУ. - Красноярск, 2011. - № 5. - С. 38-41.

---------♦'----------

УДК 581.1.575.2 Н.А. Величко, Я.В. Смольникова

ВЛИЯНИЕ СТРЕССОГЕННЫХ ФАКТОРОВ НА КАЛЛУСНУЮ ТКАНЬ DIGITALIS PURPUREA L.

В статье представлены результаты оценки морфофизиологических характеристик и накопления гликозидов в каллусной ткани Digitalis purpurea L. после воздействия стрессогенных факторов.

В ходе эксперимента установлено, что облучение каллусной ткани на стадии ранней экспоненты УФ-светом дает положительный эффект прироста биомассы. Культивирование ткани на среде с нитрозаметилмочевины приводит к высокому проценту гибели штаммов, а у выжившей ткани ингибирует рост.

Ключевые слова: биотехнология, культура ткани, Digitalis purpurea L., сердечные гликозиды, стрессогенные факторы.

N.A. Velichko, Ya.V. Smolnikova STRESS FACTOR INFLUENCE ON TYLOSIS TISSUE DIGITALIS PURPUREA L.

The results of estimation of the morphological and physiological characteristics and glycoside accumulation in tylosis tissue Digitalis purpurea L. after stress factor influence are given in the article.

It is determined in the experiment that tylosis tissue irradiation on the U-light early exponential stage gives positive effect of biomass gain. Tissue cultivation on the medium with nitrous vitriol methyl urea leads to high percent of strain destruction and inhibits growth in the survived tissue.

Key words: biotechnology, tissue culture, Digitalis purpurea L., cardiac glycosides, stress factors.

Введение

В настоящее время перед биотехнологией как наукой и отраслью промышленности стоит актуальная задача поиска альтернативных источников и разработки методов получения биологически активных веществ растительного происхождения, применяемых для разных целей в сельском хозяйстве, пищевой промышленности, в медицине.

Потери сырьевых источников, расположенных на территории бывших союзных республик, освоение минеральных ресурсов, интенсивные технологии в сельском хозяйстве, негативное влияние промышленных предприятий - все эти факторы обострили проблему обеспечения медицины и других отраслей лекарственным растительным сырьем в полном объеме и ассортименте. Особенно это коснулось регионов с повышенной антропогенной нагрузкой [1].

На сегодняшний день из растений получают более трети всех лекарственных субстанций, используемых в медицинской практике. Структура многих из них настолько сложна, что растения еще долго будут являться их единственным источником [2].

В связи с этим идет активный поиск новых альтернативных источников получения биологически активных веществ растительного происхождения. Одним из таких источников являются культуры клеток растений, преимущества использования которых для получения биологически активных веществ (БАВ) широко признаны в настоящее время [3-5].

Среди лекарственных средств, применяемых в современной фармакотерапии сердечно-сосудистых заболеваний, препараты наперстянки занимают особое место. Это единственная группа лекарственных веществ, не имеющая заменителей химического происхождения, и все лекарства этой группы вырабатываются только из растений.

В то же время выход сердечных гликозидов из растения является непостоянной величиной и зависит от климатических условий, срока вегетации, времени суток, в которое производится сбор. Календарные сроки уборки ограничены. Исходя из этих фактов, альтернативным представляется создание технологии, при которой осуществлялось бы круглодичное, независимое от внешних факторов культивирование растения и получение гликозидов на его основе.

Известны работы, описывающих производство сердечных гликозидов в культуре ткани наперстянки пурпурной (Digitalis purpurea L.), но при этом выход продукта остается довольно низкий [б].

Одним из способов повышения биосинтетических способностей клеток in vitro является воздействие на клеточные культуры различных стрессогенных факторов: элиситоров, светового и радиоактивного облучения, химических мутагенов [7].

Целью настоящего исследования явилось изучение воздействия на каллусную ткань наперстянки пурпурной двух стрессогенных факторов: УФ-излучения и N-нитрозо-И-метилмочевины (НММ).

Объекты и методы исследования

Объектом исследования служила каллусная ткань наперстянки пурпурной (Digitalis purpurea L.), полученная из листовых пластин интактных растений. Культивирование каллусной ткани проводили на агари-зованной среде с минеральной основой по Мурасиге и Скугу с добавлением гормонов: ИУК (индолилуксус-ной кислоты) в концентрации 0,1 мг/л и 2,4-Д (2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты) в концентрации 0,1 мг/л, на свету (3500 люкс) с фотопериодом 16 ч в день, 8 ч ночь, при температуре 22-25 °С и относительной влажности 70 %.

Облучение ультрафиолетом осуществляли с использованием облучателя двухлампового бактерицидного ОБН-150, время экспозиции составляло 1, 2 и 3 ч ежедневно. Контрольные ткани выращивались на рассеянном белом свету.

На основании литературных данных [8] для нашего исследования были выбраны концентрации 1\1-нитрозо-1\1-метилмочевины (НММ): 0,01; 0,02 и 0,03 %.

При приготовлении питательных сред, пассировании и анализе ростовых процессов применяли традиционные для работ по культуре тканей методики. Начальная масса транспланта составляла 40 мг. Ростовой индекс рассчитывали как отношение массы каллусной ткани в конце цикла выращивания к массе транс-планта.

Анализ цитофизиологических параметров проводили на 3, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 30 и 33 сутки культивирования каллуса. Массу сырого каллуса оценивали на основании взвешивания не менее 10 трансплантов. Данные обрабатывали статистически с вычислением средних арифметических и доверительных интервалов при 95% уровне значимости.

Для определения сердечных гликозидов использовали реакцию активного водородного атома пятичленного кольца с пикратом натрия (реакция Балье).

Общее содержание стероидных гликозидов определяли по методу А.И. Ермакова с изменениями П.М. Лошкарева (ВИЛАР) [9]. Метод основан на получении спиртохлороформного экстракта, его дальнейшей очистке и колориметрировании. Для расчета концентрации гликозидов использовали калибровочный график, построенный путем колориметрирования стандартного раствора гликозида.

Для определения содержания дигитоксина проводили разделение суммы гликозидов методом тонкослойной хроматографии. Разделение суммы гликозидов осуществлялось на пластинках силуфол в системе растворителей хлороформ : этанол (3 : 1). Величина фронта растворителя 20 см, количество вещества в пробе составляло 20 мкг. Проявитель - насыщенный раствор треххлористой сурьмы в хлороформе.

Результаты исследований и их обсуждение

Оценка воздействия стрессогенных факторов проводилась по нескольким параметрам: морфофизиологическим характеристикам ткани (динамика роста, структура ткани) и накоплению гликозидов.

В ходе эксперимента было установлено, что облучение каллусной ткани на стадии ранней экспоненты УФ-светом дает положительный эффект прироста биомассы. Облучение тканей УФ-светом стимулировало каллусогенез, сокращая время лаг-фазы до 3 суток, тогда как фаза логарифмического роста удлинялась. Ростовой индекс в конце цикла выращивания составил 12,82; 18,78; 15,55 и 10,87 при экспозиции 1, 2, 3 ч и на контроле соответственно. Максимальный прирост биомассы - 715,11 мг сырой массы наблюдался при облучении ткани в течение 2 ч.

Результаты по динамике роста представлены на рисунке 1.

Каллусные ткани эксплантов (первоначально бледные, оводненные) на 12-15-й день после начала каллусообразования образовывали зеленый глобулярный каллус. Пассируемые каллусные ткани не обнаруживали признаков как стеблевого органогенеза, так и ризогенеза.

— 1 час “* 2 часа —• ' 3 часа -О-контроль

900

100

О

О 3 9 12 15 18 21 24 27 30 33

Продолжительность культивирования, сутки

Рис. 1. Зависимость динамики роста каллусной ткани Digitalis purpurea L. от времени воздействия

УФ-облучения

Морфофизиологическая оценка клеточных культур показала, что они состояли из клеток паренхимного типа, имеющих крупную вакуоль, занимающую большую часть клетки. Помимо паренхимных клеток в структуре каллусов наблюдалось формирование меристематических очагов и трахеидальных элементов.

При добавлении в среду НММ установлен высокий процент гибели эксплантов в течение первой недели культивирования. Процент выживших эксплантов составил 42,5; 37,5 и 27,5 %, на среде с концентрацией НММ 0,01; 0,02 и 0,03 % соответственно. Дальнейшие исследования по динамике роста и накоплению гликозидов проводили среди выживших эксплантов.

Динамика роста каллусной ткани на средах с добавлением НММ представлена на рисунке 2.

-•0,01% НММ -Й 0,02% НММ -• -0,03% IIMM -О-контроль

700 600 500

¡40»

в О &

Ö 300

св о «

S 200 100 о

О 3 9 12 15 18 21 24 27 30 33

Продолжительность культивировании, сутки

Рис. 2. Динамика роста каллусной ткани Digitalis purpurea 1.на средах с добавлением

Ы-нитрозо-Ы-метилмочевины

Согласно полученным результатам (см. рис. 2), добавление нитрозометилмочевины в среду значительно ингибировало рост культуры. Наибольший ингибирующий эффект наблюдали на среде с добавлением НММ в концентрации 0,03 %, наименьший - в концентрации 0,01 %, ростовые характеристики на среде с добавлением НММ в концентрации 0,02 % занимали промежуточное значение.

Удлинялось время лаг-фазы до 9 суток, тогда как фаза логарифмического роста сокращалась и составляла 13 суток при концентрации в среде НММ 0,02 и 0,03 %, в то время как в контроле фаза экспоненциального роста длилась до 16 суток. Ростовой индекс в конце цикла выращивания составил 3,92; 6,15; 9,36 и 13,5 на средах с концентрациями НММ 0,01; 0,02; 0,03 % и в контроле соответственно. Минимальный прирост биомассы (156,74 мг сырого веса) наблюдали при выращивании ткани на среде с добавлением НММ в концентрации 0,03 %.

Ткань, выращенная на среде с добавлением НММ, была сильно оводненной, бледной и неструктурированной.

Самыми значимыми биологически активными веществами наперстянки пурпурной являются сердечные гликозиды. От их качественного и количественного содержания зависит перспективность использования полученной каллусной ткани и создания промышленной технологии на ее основе.

Содержание гликозидов в каллусной ткани наперстянки пурпурной после воздействия нитрозоме-тилмочевины приведены в таблице.

Содержание гликозидов в каллусной ткани Digitalis purpurea L. после воздействия стрессогенных

факторов

Стрессорный фактор Воздействие Содержание гликозидов, % а. с. м. Содержание дигитоксина, % а. с. м.

УФ-облучение 1 ч 0,675 0,103

2 ч 0,652 0,095

3 ч 0,637 0,092

Нитрозометимочевина 0,01 % 0,303 0,051

0,02 % 0,285 0,047

0,03 % 0,287 0,043

Контроль - 0,668 0,115

Выводы

В результате изучения влияния стрессогенных факторов на вторичный метаболизм в каллусной ткани Digitalis purpurea L. было установлено:

1. Непродолжительное облучение каллусной ткани (от 1 до 3 ч) положительно влияет на рост культуры и увеличивает выход гликозидов относительно каллусной ткани, культивируемой на агаре.

2. Культивирование ткани на среде с НММ приводит к высокому проценту гибели штаммов, а у выжившей ткани ингибирует рост.

Данные исследования могут стать основой для дальнейшей разработки клеточных технологий, основанных на использовании каллусной культуры Digitalis purpurea L., в частности получения сердечных гликозидов, процессов биотрансформации in vitro и ряда других.

Литература

1. Белоногова В.Д. Ресурсы, экологическая безопасность и фитохимические исследования дикорастущих лекарственных растений Пермского края: автореф. дис. ... д-ра фарм. наук. - Пермь: Изд-во Перм. гос. фарм. акад., 2009. - 39 с.

2. Валиханова Г.Ж. Биотехнология растений. - Алматы: Конжык, 1996. - 272 с.

3. Бабикова А.В. Горпеченко Т.Ю., Журавлев Ю.Н. Растение как объект биотехнологии // Комаровские чтения. - 2007. - Вып. IV. - С. 184-211.

4. Mulabagal V., Tsay H.-S. Plant cell cultures - an alternative and efficient source for the production of biologically important secondary metabolites // International journal of applied science and engineering. - 2004. -Vol. 2. - P. 29-48.

5. Юрин В.М. Основы ксенобиологии: учебное пособие. - Минск: Новое знание, 2002. - 267 с.

6. Bruneton J. Pharmacology, phytochemistry, medicinal plants. - Paris: Lavoisier, 1995. - 915 p.

7. Бунтукова Е.К., Пахомова В.М. Методические указания по биотехнологии сельскохозяйственных растений. - Казань: Изд-во Казан. гос. с.-х. акад., 2003. Ч. I. - С. 49.

8. Гуськов Е.П., Маркин Н.В., Усатов А.В., Машкина Е.В. Модификация действия нитрозометилмо-чевины на проростки подсолнечника тепловым шоком // Генетика. - 2001. - Т. 37. - № 3. - С. 336-343.

9. Ермаков А.И. Методы биохимического исследования растений. - Л.: Агропромиздат, 1987. - 320 с.

---------♦------------