СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПНЕВМОКОККОВЫХ ГИПЕРИММУННЫХ СЫВОРОТОК
METHOD OF OBTAINING PNEUMOCOCCAL HYPERIMMUNE SERA

Изобретение относится к медицинской иммунологии и может найти применение для производства высокоактивных, специфичных гипериммунных сывороток [A61K 39/40, C07K 16/12].
Известен патент RU 2203090 на Способ получения диагностической сыворотки с агглютининами к вирулентным иерсиниям (СВИ) путем гипериммунизации кроликов плазмидосодержащим (pYV+) штаммом Yersinia enterocolitica серовара ОЗ и последующей адсорбции бесплазмидными (pYV-) вариантами иерсинии, отличающийся тем, что для иммунизации кроликов антиген вводят внутривенно по схеме: 0,09-0,11 мл трехкратно с интервалом 2-3 дня и через 7-8 дней - еще 2 введения с интервалом 2-3 дня, а в качестве адсорбентов используют микробные массы референтных штаммов ГИСК 189 и ГИСК 207.
Недостатком решения является толерантность к КПС; кроме того, требуется этап адсорбции сывороток. Использование фенола может разрушать внутреннюю оболочку вен кролика и вызывать их тромбоз, что ограничивает время и количество полученной сыворотки.
В отличие от этого решения в заявленном изобретении сыворотку можно получать длительно, повторяя схему иммунизации. В нашем случае цель достигается иммунизацией целыми микробными клетками, отмытыми от излишков полисахарида, чтобы избежать возникновения толерантности к КПС; кроме того, отсутствует этап адсорбции сывороток, что упрощает схему.
Известен патент RU 2135210 на Способ получения диагностической сыворотки, включающий многократную иммунизацию животных-продуцентов авирулентным антигенным материалом в совокупности с иммуномодуляторами, забор крови и отделение сыворотки, отличающийся тем, что в качестве иммуномодуляторов используют тималин и циклофосфан, иммунизацию осуществляют пятикратно, антигенный материал вводят внутривенно, иммуномодулятор тималин - внутримышечно одновременно с инъекцией антигена, при этом циклофосфан вводят однократно с третьей инъекцией.
Недостатком решения является использование иммуномодуляторов и иммуносупрессоров, что усложняет и удорожает получение сывороток. Кроме того, использование иммуномодулятора и иммуносупрессора "истощает" иммунную систему, что ведет к отбраковке кроликов-продуцентов.
В заявленном изобретении предложена иммунизация целыми микробными клетками. Вводимая вакцина позволяет получать специфичные, высокоактивные сыворотки, без использования иммуномодуляторов и иммуносупрессоров.
Наиболее близким по существу и назначению к заявленному способу является способ получения диагностической агглютинирующей сыворотки к патогенным штаммам иерсиний (патент RU 2358764, A61K 39/40 от 20.06.2009 г.). Способ включает гипериммунизацию кроликов антигеном, представляющим собой инактивированный 0,4-0,6% формалином антиген плазмидосодержащего (pYV+) штамма Yersinia enterocolitica My 03R, в ушную краниальную вену. Иммунизацию кроликов указанным антигеном проводят четырехкратно в дозах: 290-310 млн кл./мл, 490-510 млн кл./мл, 0,99-1,1 млрд. кл./мл и 1,9-2,1 млрд. кл./мл, соответственно, с интервалом между каждой инъекцией 6-7 суток. Далее у продуцента определяют иммуногенные свойства, затем забирают кровь с последующим отделением и консервированием полученной сыворотки. Способ обеспечивает получение высококачественной агглютинирующей сыворотки, используемой для диагностики иерсиниоза у животных.
Недостатком прототипа является недостаточно высокая специфическая активность сывороток.
Задачей изобретения является повышение специфической активности диагностических сывороток, упрощение и снижение трудоемкости процесса их получения при высоком выходе целевого продукта.
Техническим результатом заявленного изобретения является повышение качества сывороток.
9
8
8
9
9
Указанный технический результат достигается за счет того, что заявлен способ получения пневмококковых гипериммунных сывороток, характеризующийся гипериммунизацией кроликов антигеном, представляющим собой инактивированный формалином антиген плазмидосодержащего штамма пневмококка, иммунизацию вакциной проводят в ушную вену, причем иммунизацию кроликов указанным антигеном проводят с интервалом между каждой инъекцией, затем у продуцента определяют иммуногенные свойства, забирают кровь с последующим отделением и консервированием полученной сыворотки, отличающийся тем, что для получения вакцины одной серии используют 16-часовую культуру, выращенную на полусинтетической питательной среде, клетки которой отделяют центрифугированием, осадок ресуспендируют в физиологическом растворе и инактивируют прогреванием, затем клетки отмывают физиологическим раствором, содержащим 0,25% формалина, и готовят микробную взвесь, соответствующую 4×10 мкр.кл./мл, причем микробные клетки пневмококков перед иммунизацией еще раз отмывают, иммунизацию вакциной проводят 3 раза в неделю в течение 4-х недель: первая неделя в дозах 1×10 мкр.кл./мл, вторая - 5×10 мкр.кл./мл, третья - 1×10 мкр.кл./мл и четвертая - 2×10 мкр.кл./мл, на пятой неделе берут кровь, получают сыворотку и проверяют ее активность в реакции агглютинации (РА), титр которой должен быть в пределах 1:3200-1:6400.
Поскольку иммунизирующая доза, вводимая за неделю, большая и при однократном введении может вызвать гибель животных, необходимо растягивать введение на неделю. В перерыве между иммунизациями происходит частичная элиминация антигена.
Считается, что за неделю после иммунизации происходит формирование антител в необходимом нам количестве.
Технический результат повышения качества сывороток достигается за счет использования изменений в приготовлении вакцин из микробных клеток каждого из серотипов пневмококка и схемы иммунизации кроликов.
Осуществление изобретения
Способ реализуется посредством того, что кроликов-продуцентов иммунизируют инактивированной микробной культурой по приведенной в таблице схеме:
9
Для получения вакцины одной серии используют 16-часовую культуру, выращенную на полусинтетической питательной среде. Клетки отделяют центрифугированием. Осадок ресуспендируют в физиологическом растворе и инактивируют прогреванием. Клетки отмывают физиологическим раствором, содержащим 0,25% формалина, и готовят микробную взвесь, соответствующую 4×10 мкр.кл./мл. Для стабилизации и интенсивного образования антител ограниченной гетерогенности микробные клетки пневмококков перед иммунизацией еще раз отмывают, во избежание развития толерантности под воздействием свободного полисахарида.
9
Если сыворотки при пробном кровопускании содержат большое количество антител, то кровопускания продолжают в течение последующих 2-3 недель, а затем делают 4-недельный перерыв. После этого иммунизацию повторяют, вводя по 2×10 мкр.кл. в мл в первую неделю 3 раза и в следующие 4 недели - 2 раза. Активность сывороток определяют в реакции агглютинации. Титр должен быть 1:3200-1:6400.
В патентной и научно-технической литературе не известны технические решения, содержащие режимы получения гипериммунных сывороток к штаммам пневмококка, принадлежащим к различным серотипам, аналогично заявляемому, т.е. предложение соответствует критерию «новизна». Все режимы способа осуществимы в лабораторных и промышленных условиях, направлены на решение реальной технической задачи, т.е. предложение «промышленно применимо».
Способ иллюстрируется на следующих примерах.
Пример 1.
9
Получают гипериммунную сыворотку к штамму пневмококка серотипа 19А следующим образом. 1500 мл 16-часовой культуры центрифугировали. Осадок микробных клеток ресуспендировали в 30 мл физиологического раствора и инактивировали прогреванием при 56°С. Клетки трижды отмывали физиологическим раствором, содержащим 0,25% формалина, и готовили микробную взвесь, соответствующую 4×10 мкр.кл./мл. Перед иммунизацией микробные клетки еще раз отмывали физраствором.
8
8
9
9
Иммунизацию кроликов вакциной проводили в ушную вену 3 раза в неделю, в течение 4-х недель в дозах 1×10, 5×10, 1×10 и 2×10 мкр.кл./мл. На пятой неделе у кроликов брали кровь, получали сыворотку и проверяли ее активность в РА. Средний титр антител в полученной сыворотке крови к S. pneumoniae серотип 19А в РА составил 1:6400.
Пример 2.
9
Получают гипериммунную сыворотку к штамму пневмококка серотипа 3 следующим образом. 1000 мл 16-часовой культуры центрифугировали. Осадок микробных клеток ресуспендировали в 20 мл физиологического раствора и инактивировали прогреванием при 56°С. Клетки трижды отмывали физиологическим раствором, содержащим 0,25% формалина, и готовили микробную взвесь, соответствующую 4×10 мкр.кл./мл. Перед иммунизацией микробные клетки еще раз отмывали физраствором.
8
8
9
9
Иммунизацию кроликов вакциной проводили в ушную вену 3 раза в неделю, в течение 4-х недель в дозах 1×10, 5×10, 1×10 и 2×10 мкр.кл./мл. На пятой неделе у кроликов брали кровь три раза, получали сыворотку и проверяли ее активность в РА. Средний титр антител в полученной сыворотке крови к S. pneumoniae серотип 3 в РА составил 1:3200.