СПОСОБ ОЦЕНКИ ПРИСУТСТВИЯ ФОСФАТИДИЛСЕРИНА НА ПОВЕРХНОСТИ МЕМБРАН ЭРИТРОЦИТОВ
METHOD FOR DETECTING PHOSPHATIDYLSERINE ON THE ERYTHROCYTE MEMBRANE SURFACE

Предлагаемое изобретение относится к биологии и медицине, а именно к лабораторным методам исследования, и может использоваться для оценки присутствия фосфатидилсерина на поверхности мембран эритроцитов.
Известно, что в эритроцитах фосфолипиды расположены асимметрично. Фосфатидилхолин и сфингомиелин локализованы на внешней половине липидного бислоя, фосфатидилэтаноламин на внешней и внутренней половине мембраны. Отрицательно заряженный фосфолипид фосфатидилсерин локализован исключительно на внутренней стороне липидного бислоя (Zwaal R.F.A., Schroit A.J. Blood. 1997. Vol. 89. P. 1121-1132). Выход фосфатидилсерина на поверхность мембран клеток крови при многих патологических состояниях ускоряет свертывание крови, приводит к тромботическим состояниям (Zwaal R.F.A, Comfurius P., Bevers E.V. Cell. Mol. Life Sci. 2005. Vol. 62. P. 971-988.).
Известен способ оценки присутствия фосфатидилсерина на поверхности мембран эритроцитов, который включает добавление к эритроцитам флюоресцентного белка аннексина V и последующее измерение флюоресценции с помощью проточного цитофлюориметра (Kuypers F.A., Lewis R.A., Hua М. et al. Blood. 1996. Vol. 87. P. 1179-1183).
Однако для этого требуется дорогостоящее дефицитное оборудование (проточный цитофлюориметр) и дорогие дефицитные реактивы.
В качестве прототипа выбран способ оценки присутствия фосфатидилсерина на поверхности мембран эритроцитов (Шереметьев Ю.А., Успенский А.Н., Шевченко Е.А., Еремин С.П. Способ оценки присутствия фосфатидилсерина на поверхности мембран эритроцитов. Патент RU 2547573. 2015), который включает фиксацию эритроцитов глутаровым альдегидом, помещение их на предметное стекло, обработанное хлористым лантаном. После перемешивания по появлению агрегатов судят о присутствии фосфатидилсерина на поверхности мембран эритроцитов.
Однако этот способ требует длительного времени. Это заключается в предварительном приготовлении стекол, обработанных хлористым лантаном и трехкратном отмывании эритроцитов дистиллированной водой. Кроме того, фиксация эритроцитов происходит в растворе глутарового альдегида в течение 60 минут.
Задача предлагаемого изобретения - совершенствование способа.
Технический результат - сокращение времени оценки присутствия фосфатидилсерина на поверхности мембран эритроцитов.
Технический результат достигается за счет того, что в способе, включающем фиксацию эритроцитов с помощью раствора глутарового альдегида в течение 30 минут, их однократное отмывание забуференным физиологическим раствором, к клеткам добавляют хлористый лантан в финальной концентрации 20 мкМ и наблюдают за появлением агрегатов. По появлению агрегатов эритроцитов судят о присутствии фосфатидилсерина на поверхности мембран эритроцитов.
Способ осуществляется следующим образом. Эритроциты фиксируют в 0.25% растворе глутарового альдегида, приготовленного на фосфатном буфере, в течение 30 минут при комнатной температуре. После фиксации эритроциты один раз отмывают забуференным физиологическим раствором (10 мМ трис-HCI, 150 мМ NaCI, рН 74) с последующим центрифугированием при 3000 об/мин в течение 5 минут. К 0.9 мл 0.5% суспензии фиксированных эритроцитов в забуференном физиологическом растворе добавляют 0.1 мл хлористого лантана в финальной концентрации 20 мкМ, перемешивают и наблюдают с помощью светового микроскопа за образованием агрегатов клеток. Появление агрегатов свидетельствует о присутствии фосфатидилсерина на поверхности мембран эритроцитов.
Известно, что инкубация отмытых эритроцитов при 37°C в течение 48 ч в присутствии кальция приводит к развитию эриптоза, на поверхности мембран появляется большое количество фосфатидилсерина (Klarl В.A. et al. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2006. Vol. 290. C. 244-253).
Пример 1. К 0.9 мл 0.5% суспензии фиксированных нормальных эритроцитов добавляли 0.1 мл хлористого лантана до финальной концентрации 20 мкМ, перемешивали и наблюдали с помощью светового микроскопа. Наблюдается отсутствие агрегатов эритроцитов (рис. 1). На поверхности мембран эритроцитов фосфатидилсерин отсутствует (рис. 1).
Пример 2. К 0.9 мл 0.5% суспензии фиксированных эритроцитов, которые предварительно инкубировали в присутствии 1 мМ кальция при 37°C в течение 48 ч, добавляли 0.1 мл хлористого лантана до финальной концентрации 20 мкМ, перемешивают и наблюдают с помощью светового микроскопа. Наблюдаются агрегаты эритроцитов (рис. 2). На поверхности мембран эритроцитов присутствует фосфатидилсерин.
Проведенные эксперименты показывают возможности применения способа оценки присутствия фосфатидилсерина на поверхности мембран эритроцитов и его преимущества перед прототипом (сокращается время определения с 120 до 40 мин).