СПОСОБ КОМПЛЕКСНОГО ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ ИЗ СПИРТОВЫХ ОТХОДОВ
METHOD FOR COMPLEX SYNTHESIS OF BIOLOGICALLY ACTIVE SUBSTANCES FROM ALCOHOL WASTES

Изобретение относится к фармацевтической и спиртовой промышленности и касается способа получения комплекса биологически активных веществ (БАВ) (аминокислот, углеводов, витаминов, биогенных элементов), а также пектинов из спиртовых отходов (барды).
3
Источниками промышленного получения спирта этилового (далее «спирт») являются зерна злаков с высоким содержанием крахмала: пшеницы, кукурузы, проса, ржи, ячменя, овса. Технология получения спирта предполагает измельчение, разваривание зерна, гидролиз крахмала, получение бражки и перегонку спирта (Лихтенберг Л.А. Производство спирта из зерна. М.: Пищевая промышленность, 2006, 324 с.). Образующиеся после отгонки спирта отходы представляют собой взвесь, содержащую 4-8% твердой и 92-96% жидкой фракций. Данные отходы являются многотоннажными: около 10 млн тонн в год. Так, спиртовой завод средней производительности (3000 декалитров спирта в сутки) образует 300-350 м барды в сутки (Мандреа А.Г. Спиртовая барда. Технология утилизации / Пищевая промышленность, 2004, №3, с.54-55).
Ряд спиртовых заводов направляет спиртовые отходы в натуральном виде на животноводческие предприятия. Подобное использование барды малоэффективно, поскольку транспортировка жидкой фракции экономически не выгодна, а малый срок ее хранения (2 суток) и неравномерность потребления в течение года вызывают необходимость либо ее направления на очистные сооружения (очень редко), либо слива в водоемы и на поля, что вызывает загрязнение водного и воздушного бассейнов (Мандреа А.Г., 2004).
Известные в настоящее время технологии переработки спиртовых отходов в подавляющем большинстве направлены на получение продуктов для животноводства: сухих кормовых добавок, кормовых дрожжей, витаминизированных и белковых кормовых продуктов, сухой барды (Усов Е.Н. и др. Комплексная переработка послеспиртовой барды / Резонанс, 2006, №8, с.8-11). Данные технологии являются бесперспективными по ряду причин: гепатотоксичности обеих фракций; отсутствия утилизации жидкой фракции, составляющей более 90%; загрязнения окружающей среды, по-видимому, в результате гниения аминокислот; потери ценных БАВ, перспективных для фармацевтических целей (Усов Е.Н и др., 2006).
Описан способ комплексной переработки послеспиртовой барды для получения пектина (Кайшева Н.Ш., Кайшев А.Ш., Парфейников С.А. Способ комплексной переработки послеспиртовой барды / Патент РФ № 2312520, МПК A23L 1/0524 / Бюл. №35 от 20.12.2007), включающий следующие стадии:
- разделение барды на жидкую и твердую фракции путем декантации, процеживания и фильтрования;
- концентрирование жидкой фракции до получения концентрата плотностью 1,480 г/мл и выделение из него пектинов путем обработки концентрата спиртом в объемном соотношении 1:3;
- извлечение пектинов из твердой фракции горячей водой (температура 70°С) методом вихревой экстракции при скорости вращения массы 8000 об/мин в течение 8 мин с последующим выделением пектинов, аналогичным их выделению из жидкой фракции;
- смешивание образцов пектинов, полученных из обеих фракций.
Данный способ утилизации послеспиртовой барды наиболее близок к заявляемому способу и выбран за прототип. В качестве недостатков указанного способа можно отметить следующие:
- выделение из обеих фракций только пектинов;
- относительно низкий технологический выход целевого продукта (2,7% к барде);
- потеря аминокислот, витаминов, биогенных элементов, выбрасываемых с отходами.
Цель изобретения - практически полное выделение из жидкой и твердой фракций послеспиртовой барды комплекса БАВ, способствующее значительному сокращению объема отходов, повышению степени их чистоты и охране водного и воздушного бассейнов.
Поставленная цель достигается тем, что способ получения БАВ из спиртовых отходов осуществляют разделением барды на жидкую и твердую фракции. Жидкую фракцию фильтруют через крупнопористый бумажный фильтр, упаривают на кипящей водяной бане до получения концентрата плотностью 1,480 г/мл (уменьшение объема примерно в 15 раз), обрабатывают ацетоном в объемном соотношении концентрат:ацетон 1:3, выпавший осадок А отфильтровывают, трижды промывают ацетоном, высушивают. Выход осадка А составляет 3,6% к жидкой фракции барды. Экстракцию твердой фракции проводят методом мацерации 1% раствором оксалата аммония в массо-объемном соотношении сырье:экстрагент 1:10 при температуре 70°С в течение 3 часов. Затем экстракт фильтруют через крупнопористый бумажный фильтр, упаривают до получения концентрата плотностью 1,480 г/мл (уменьшение объема примерно в 11 раз), обрабатывают концентрат спиртом 95% в объемном соотношении концентрат:спирт 1:2. Выпавший осадок Б отфильтровывают, трижды промывают спиртом 95%, высушивают и измельчают. Выход осадка Б составляет 7,1-13,0% (в зависимости от растительного источника) к твердой фракции.
Целевой продукт - осадок А - представляет собой густой экстракт темно-коричневого цвета, легкорастворимый в воде с образованием пены, нерастворимый в ацетоне. Целевой продукт - осадок Б - представляет собой аморфный порошок светло-бежевого цвета, легкорастворимый в воде, нерастворимый в спирте 95%.
Анализ осадков А и Б проведен путем установления подлинности компонентов, физико-химических характеристик и количественного содержания (в пересчете на абсолютно сухое вещество) (табл.1).
1
2
6
Представленные данные свидетельствуют о том, что осадок А представляет собой комплекс веществ: α-аминокислот, восстанавливающих сахаров, витаминов (B, В, В, С, Е, А), биогенных элементов; осадок Б представляет собой пектин с высоким содержанием галактуроновой кислоты и выраженной связывающей способностью.
Дополнительно проведена качественная реакция на аминокислоты с нингидрином в фильтратах, полученных после выделения осадков А и Б. В обоих случаях реакции оказались отрицательными, что свидетельствовало об отсутствии аминокислот в оставшихся растворах.
В результате исследования подобраны следующие оптимальные условия комплексного получения БАВ из спиртовых отходов (табл.2-5).
Из табл.2 следует, что оптимальным осадителем является ацетон, оптимальным соотношением концентрат:ацетон, обеспечивающим максимальный выход осадка А, является соотношение 1:3.
Из табл.3 следует, что максимальный выход осадка Б достигается при применении мацерации с использованием в качестве экстрагента - раствора оксалата аммония в концентрации 1%.
Из табл.4 следует, что оптимальной продолжительностью мацерации, обеспечивающей максимальный выход осадка Б, является продолжительность 3 часа.
Из табл.5 следует, что при соотношении концентрат:спирт 95% 1:2 достигается максимальный выход осадка Б.
Оптимальные значения показателей, установленных для пшеничной барды, аналогичны оптимальным значениям для кукурузной барды.
Предлагаемый способ комплексного получения БАВ из спиртовых отходов поясняется следующими примерами конкретного выполнения.
Пример 1. Послеспиртовую пшеничную барду (объем 1000 мл) разделяют на жидкую и твердую фракции путем декантации и процеживания через мешковину. Жидкую фракцию барды фильтруют через крупнопористый бумажный фильтр, остаток на фильтре объединяют с твердой фракцией. Жидкую фракцию (объем 825 мл, плотность 1,005 г/мл) упаривают на кипящей водяной бане до получения концентрата плотностью 1,480 г/мл (примерно до объема 55 мл, уменьшение объема в 15 раз). Охлажденный до комнатной температуры концентрат обрабатывают ацетоном в объемном соотношении концентрат:ацетон 1:3. Выпавший осадок А отфильтровывают через крупнопористый бумажный фильтр, трижды промывают ацетоном (по 50 мл), высушивают сначала в вытяжном шкафу (до удаления остатков ацетона), а затем - в сушильном шкафу при температуре 60±5°С. Выход осадка А составляет 29,7013 г или 3,6% к жидкой фракции барды.
Целевой продукт - осадок А - представляет собой густой экстракт темно-коричневого цвета, легкорастворимый в воде с образованием пены, нерастворимый в ацетоне.
К твердой фракции (масса 68,2322 г в пересчете на абсолютно сухое вещество) приливают 682 мл 1% раствора оксалата аммония (массо-объемное соотношение 1:10), нагревают смесь в течение 3 часов на кипящей водяной бане. Затем экстракт фильтруют через крупнопористый бумажный фильтр, упаривают до получения концентрата плотностью 1,480 г/мл (примерно до объема 55 мл, уменьшение объема в 11 раз), обрабатывают спиртом 95% в объемном соотношении концентрат:спирт 1:2. Выпавший осадок Б отфильтровывают через крупнопористый бумажный фильтр, трижды промывают спиртом 95% (по 50 мл), высушивают при температуре 60±5°С и измельчают в ступке до образования однородного порошка. Выход осадка Б составляет 4,8445 г или 7,1% к твердой фракции.
Целевой продукт - осадок Б - представляет собой аморфный порошок светло-бежевого цвета, легкорастворимый в воде, нерастворимый в спирте 95%.
Пример 2. Послеспиртовую кукурузную барду перерабатывают, как описано в примере 1. Выход осадка А составляет 3,6% к жидкой фракции, осадка Б - 13,0% к твердой фракции.
50
Выделенные осадки А и Б подвергнуты испытаниям на тест «острая токсичность». Изучение проведено известным методом (Сидоров К.К. Методы определения острой токсичности и опасности химических веществ (токсикометрия) / М.: Медицина, 1970, 117 с.) путем перорального однократного введения целевых продуктов крысам линии Вистар массой 180-220 г в дозах 10, 100, 1000, 5000 мг/кг (6 животных в каждой серии опытов). Установлено, что исследуемые продукты имеют LD>5000 мг/кг, что свидетельствует об их практической нетоксичности.
Изучение гепатотоксичности целевых продуктов по продолжительности сна крыс проведено по известной методике (Архипова О.Г. и др. Методы исследований в профессиональной патологии. М., 1988, 137 с.) путем перорального однократного введения осадков А и Б в дозе по 500 мг/кг с последующим однократным внутрибрюшинным введением животным пентабарбитала натрия в дозе 30 мг/кг. Контролем служили крысы, получавшие пентабарбитал натрия в той же дозе. В каждой группе животных было по 6 крыс. Установлено, что продолжительность сна крыс уменьшилась на 27,3% (вероятность результатов различий сравниваемых групп животных <0,05), что свидетельствует о безвредности целевых продуктов.
Выделенные осадки А и Б подвергнуты испытаниям на тест «антиоксидантная активность», поскольку компоненты осадков чаще всего ответственны за указанную активность (Яшин А.Я., Черноусова Н.И. Определение содержания природных антиоксидантов в пищевых продуктах и БАД / Пищевая промышленность, 2007, №5, с.28-29). Влияние целевых продуктов на скорость пероксидного окисления липидов (ПОЛ) изучено в системе, содержащей суспензию яичного желтка, по изменению параметров хемилюминесценции, сопровождающей этот процесс в присутствии ионов железа (II) (Сыров В.Н., Хушбактова З.А., Гукасов В.М. и др. Антиоксидантная активность некоторых растительных фенольных соединений / Химико-фармацевтический журнал, 1987, № 1, с. 59-62.). Веществом сравнения служил свекловичный пектин. Данные изучения антиоксидантных свойств, обработанные методом вариационной статистики (n=6, t=3,97), приведены в табл.6. Результаты опытов свидетельствуют о существенном ингибирующем влиянии обоих целевых продуктов на кинетику ПОЛ в тестируемой системе: снижение скорости реакции ПОЛ мембран по сравнению с контролем составляет 57,9% для осадка А и 66,4% для осадка Б; подобная активность свекловичного пектина составляет 51,9%. Таким образом, способность выделенных осадков А и Б тормозить процессы ПОЛ в 1,14 и 1,43 раза соответственно выше аналогичной способности известного антиоксиданта - свекловичного пектина.
Антиоксидантная активность целевых продуктов подтверждена также методом аскорбатзависимого пероксидного окисления, основанного на способности к окислению кислородом воздуха в разбавленных водных растворах остатков олеиновой кислоты в составе твина-80 в присутствии кофакторов окисления - ионов железа (II) и аскорбиновой кислоты. Антиоксидантную активность оценивали по степени уменьшения концентрации комплекса малонового диальдегида (продукта окисления) с тиобарбитуровой кислотой (Благородов С.Г., Шепелев А.П., Дмитриева Н.А. и др. Определение антиокислительной активности химических соединений / Химико-фармацевтический журнал, 1987, №3, с.292-294.). Контролем служили пробы без добавления исследуемого вещества. Данные опытов, обработанные методом вариационной статистики (n=12), приведены в табл.7. Полученные результаты свидетельствуют о том, что под влиянием осадка А показатель экстинкции, отражающий максимальное накопление малонового диальдегида, снизился на 52% по сравнению с контролем, а под влиянием осадка Б - на 64%, что подтверждает выраженный антиоксидантный эффект целевых продуктов.
2+
Наряду с антиоксидантным эффектом осадок Б имеет огромные перспективы для использования его в качестве антидота тяжелых металлов, о чем свидетельствует связывающая способность: 282,23 мг Рb/1 г, что в 2,8 раза превышает подобную способность пектина, выделенного по способу, принятому за прототип.
Итак, в результате изучения биологической активности целевых продуктов из барды методами in vitro и in vivo выявлена их практическая нетоксичность, отсутствие гепатотоксичности, высокая антиоксидантная активность осадков А и Б и выраженный детоксикационный эффект осадка Б в отношении ионов тяжелых металлов.
Таким образом, предлагаемый способ комплексного получения БАВ из спиртовых отходов обеспечивает следующий положительный эффект:
1. Полное извлечение комплекса БАВ из обеих фракций барды. В отличие от способа, принятого за прототип, в предлагаемом способе после осаждения БАВ из жидкой фракции ацетоном в фильтрате не обнаруживаются аминокислоты, способные в результате гниения в водоемах быть источниками загрязнения. Наряду с аминокислотами применение ацетона в качестве осадителя способствует выделению всех других ценных веществ: углеводов, витаминов, биогенных элементов. Выделенные с помощью оксалата аммония пектины максимально освобождены от сопутствующих их металлов, что способствует усилению детоксикационных свойств в 2,8 раза. В известном способе не предполагается выделения, кроме пектинов, других БАВ.
2. Увеличение технологического выхода целевых продуктов. В предлагаемом способе выход целевых продуктов из жидкой и твердой фракций соответственно составляет 3,6% и 7,1-13,0%, в то время как в известном способе - 3,1% и 2,7%, т.е. наблюдается увеличение выхода на 0,5% и в 2,6-4,8 раз соответственно.
3. Расширение спектра биологической активности. Применение ацетона для извлечения осадка А в предлагаемом способе позволяет, наряду с углеводами, выделить витамины групп В, С, А, Е, биогенные элементы и аминокислоты, в совокупности обусловливающие антиоксидантный эффект целевого продукта. В более выраженной степени данный эффект характерен для осадка Б.
4. Выделенные целевые продукты нетоксичны и перспективны в качестве лекарственных средств антиоксидантного и детоксикационного действия.
5. Предлагаемый способ отличается упрощенностью: не требует применения сложного оборудования типа «Мельэкстрактор» (как предусмотрено в способе-прототипе), а для проведения мацерации в производственных условиях пригодны любые аппараты, чаны. Кроме того, применение ацетона, имеющего относительно низкую температуру кипения (56°С), позволяет достаточно легко его удалить из экстракта и многократно использовать в технологическом цикле.
3
3
3
6. Решение экологической проблемы: значительное сокращение объема отходов и повышение степени их чистоты. Предлагаемый способ позволяет от 40 до 100 раз уменьшить объем выбрасываемой барды. Так, для спиртового завода средней мощности (3000 декалитров спирта в сутки) объем выбрасываемых отходов сокращается с 300-350 м в сутки до 3-8 м в сутки (по способу-прототипу до 16-18 м). При этом очень важно, что выбрасываемые отходы экологически безвредны.
Таблица 1
Результаты анализа осадков А и Б
№
Показатели
Методы анализа
Результаты анализа
Заключение
1
2
3
4
5
Осадок А
1
Подлинность:
1.1
на α-аминокислоты:
Реакции «+», что
с нингидрином
Визуально
Раствор синего цвета
доказывает наличие
с сульфатом меди (II)
Визуально
Раствор сине-
аминокислот
фиолетового цвета
1.2
на восстанавливающие сахара(с кислотой пикриновой)
Визуально, метод спектрофотометрии
Раствор оранжевого цвета с максимумом поглощения при 460 нм
Реакция «+», что доказывает наличие сахаров
1.3
на витамины:
Реакции «+»,
витамин B<sub>1</sub> (с феррицианидом
Визуально в УФ свете
Синяя флюоресценция
что доказывает
калия, бутанолом)
наличие вита
витамин В<sub>2</sub>
Визуально в УФ свете
Зеленая флюоресценция
минов B<sub>1</sub>, B<sub>2</sub>,
водного раствора
В<sub>6</sub>, С, Е, А
витамин В<sub>6</sub> (с 2,6-дихлор-хинонхлоримидом, бутанолом)
Визуально
Голубое окрашивание слоя бутанола
витамин С (с 2,6-дихлор-
Визуально
Обесцвечивание синей
фенолиндофенолом)
окраски реагента
витамин Е (с азотной кисло той в присутствии спирта)
Визуально
Раствор красно-оранжевого цвета
витамин А (с хлоридом
Визуально
Раствор синего цвета
сурьмы (III), хлороформом)
2
Количественное содержание
2.1
Аминокислоты (аминокислотный
Метод жидкостной хроматографии
8,52
анализатор, проявитель-нингидрин), %
2.2
Восстанавливающие сахара
Метод гравиметрии
25,8
(с реактивом Фелинга), %
2.3
Витамины, мг %:
B<sub>1</sub>
Метод гравиметрии по массе осадка с кремне-
0,56
вольфрамовой кислотой
B<sub>2</sub>
Метод спектрофотометрии в УФ свете
1,22
В<sub>6</sub>
Метод неводного титрования хлорной кислотой
0,86
С
Метод йодиметрического титрования
0,46
Е
Метод цериметрического титрования
3,15
А
Метод спектрофотометрии в УФ свете
0,75
2.4
Элементный состав, мг/кг
Метод спектрального полуколичественного анализа
Фосфор
>30000
Марганец
8000
Магний
1800
Цинк
150
Железо
60
Медь
20
Хром
10
Кобальт
3
Молибден
1
Осадок Б
3
Подлинность (на галактуроновую кислоту): с ацетатом свинца (II) (проба Эрлиха)
Визуально
Образующийся белый осадок постепенно окрашивается в оранжевый цвет с красноватым оттенком
Реакции положительные, что доказывает наличие галактуроновой кислоты или пектина
с карбазолом в сернокислой среде
Визуально, метод спектрофотометрии
Раствор вишневого цвета с максимумом поглощения при 530 нм
4
Водородный показатель (0,5% водный раствор)
Метод потенциометрии
4,2
5
Связывающая способность к ионам свинца (II), мг Рb<sup>2+</sup>/1 г
Метод обратного комплексонометрического титрования
282,23
6
Количественное содержание галактуроновой кислоты, %
Метод потенциометрического кислотно-основного титрования
32,5
Таблица 2
Влияние природы осадителя и его соотношения с концентратом на выход осадка А
Осадитель
Спирт 95%
Ацетон
Соотношение
1:1
1:2
1:3
1:4
1:1
1:2
1:3
1:4
концентрат: осадитель
Выход осадка А, % к
0,9
1,6
3,1
2,9
2,1
3,2
3,6
3,4
жидкой фракции
Таблица 3
Влияние способа экстракции, природы и концентрации экстрагента (при продолжительности извлечения 8 мин) на выход осадка Б
Способ экстракции
Выход осадка Б (% к твердой фракции) при использовании экстрагентов:
воды
раствора оксалата аммония
0,5%
1,0%
1,5%
Вихревая экстракция
2,9
3,1
3,4
3,3
Мацерация
3,2
4,0
4,5
4,3
Таблица 4
Влияние продолжительности мацерации на выход осадка Б
Продолжительность мацерации, час
1
2
3
4
Выход осадка Б,% к твердой фракции
6,1
6,4
7,1
6,8
Таблица 5
Влияние соотношения концентрата и спирта 95% на выход осадка Б
Соотношениеконцентрат:спирт 95%
1:1
1:2
1:3
Выход осадка Б,% к твердой фракции
6,2
7,1
6,9
Таблица 6
Влияние осадков А и Б на скорость ПОЛ (хемилюминесцентный метод)
Объекты
Интенсивность свечения, мВ
X±Sx
Достоверность изменения по отношению к контролю
Изменение, %
Контроль
0,532±0,085
100,0
Осадок А
0,224±0,021
0,001
42,1
Осадок Б
0,179±0,014
<0,001
33,6
Свекловичный пектин
0,256±0,019
<0,001
48,1
Таблица 7
Влияние осадков А и Б на скорость ПОЛ (метод аскорбатзависимого пероксидного окисления)
Объекты
Показатель экстинкции X±Sx
Достоверность изменения по от ношению к контролю
% снижения экстинкции по отношению к контролю
Контроль
0,25±0,006
Осадок А
0,12±0,007
<0,001
-52%
Осадок Б
0,09±0,004
<0,001
-64%