Анализ процесса гидролиза хитозана с использованием ферментного препарата грибного происхождения, продуцируемого myceliophthorafergussi

УДК 577.114

Ю. В. Лисюкова, А. С. Сироткин, Л. М. Хантимирова АНАЛИЗ ПРОЦЕССА ГИДРОЛИЗА ХИТОЗАНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА ГРИБНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ, ПРОДУЦИРУЕМОГО Myceliophthora fergussi

Ключевые слова: хитозан, ферментативный гидролиз, молекулярная масса.

Проведены исследования процесса гидролиза высокомолекулярного хитозана с использованием ферментного препарата, содержащего карбогидразы. Динамика ферментативной деполимеризации хитозана оценивалась по снижению динамической вязкости. Для лиофильно высушенных гидролизатов были определены молекулярные массы (ММ). В результате эксперимента была получена серия низкомолекулярных образцов хитозана с ММ 4-20 кДа.

Key words: chitosan, enzymatic hydrolysis, the molecular weight.

Investigation of chitosan hydrolysis with using carbohydrase enzyme preparation was carried out. The dynamics of the chitosan enzymatic depolymerization was estimated to reduce the dynamic viscosity. Molecular weight (MM) were determined for freeze dried hydrolysates. In the experiment series low molecular weight chitosan samples was obtained with MM 4-20 kDa.

Введение

Хитозан — линейный полисахарид, состоящий из остатков 2-амино-2-дезокси-Э-глюкопиранозы и ^ацетамидо-2-дезокси-Э-глюкопиранозы, связанных между собой р~( 1 —>4) гликозидной связью. Обычно хитозан получают методом термохимического дезацетилирования хитина, входящего в состав панцирей ракообразных, клеточных стенок некоторых грибов, подмора пчел. Хитозаном принято считать хитин со степенью дезацетилирования (СД) выше 60% [1].

Хитозан является перспективным биополимером для косметической химии, пищевой, фармацевтической, медицинской промышленности и сельского хозяйства [2]. Это объясняется свойствами биополимера — низкой токсичностью, биоразлагаемостью, биосовместимостью, а также мукозоадгезивностью.

Основной недостаток при работе с хитозаном связан с ограниченной растворимостью и высокой вязкостью растворов полисахарида при нейтральных значениях рН. Деполимеризация хитозана методом химического или ферментативного гидролиза позволяет частично преодолеть эту проблему. Ферментативный гидролиз более предпочтителен с точки зрения сохранения структуры биополимера и мягких условий проведения самого процесса (без использования агрессивных, токсичных реагентов).

Экспериментальная часть

В работе обсуждаются влияние продолжительности процесса гидролиза хитозана ферментным препаратом (ФП), продуцируемым мицелиальным грибом Myceliophthora fergussi на динамику деполимеризации биополимера.

Содержание белка в ФП определяли по связыванию с красителем кумасси G-250, по методу Брэдфорд: 1 мг ФП содержал 66 мкг белка (6,6%).

Хитин/хитозанолитическую активности

ферментного препарата оценивали спектральным

методом с использованием реагента динитросалициловой кислоты, ориентируясь на образование восстанавливающих сахаров (ВС) в результате процесса расщепления гликозидных связей в полимерной цепи [3].

Для определения хитиназной активности ФП в качестве субстрата использовали коллоидный хитин в концентрации 5 мг/мл. Реакцию проводили в следующих условиях: 0,5 мл 0,1М №-фосфатного буфера (pH 6,2), 0.5 мл субстрата, 0.5 мл раствора ФП (концентрация по белку 0,066 мг/мл). Реакционную смесь инкубировали при 37°С, в течение 15 мин. Для определения хитозаназной активности ФП в качестве субстрата использовали хитозан (ММ 700 кДа, СД 85%) в концентрации 5 мг/мл. Реакцию проводили в следующих условиях: 0,5 мл 0,1М №-ацетатного буфера (pH 5,7), 0.5 мл субстрата, 0.5 мл раствора ФП (концентрация по белку 0,066 мг/мл). Реакционную смесь инкубировали при 37°С, в течение 15 мин. Ферментативную реакцию, как и в случае определения хитиназной активности, останавливали кипячением в течение 10 мин. Далее реакционную смесь центрифугировали и в супернатанте определяли концентрацию ВС.

Хитиназная активность ФП составила 0,09 ед/мл. 1 мл ФП содержал 0,066 мг белка. Удельная хитиназная активность составляла 1363 ед/г белка.

Хитозаназная активность ФП составила 0,43 ед/мл, а удельная хитозаназная активность -6515 ед/г белка.

За единицу хитиназной и хитозаназной активности принималось количество фермента, которое катализирует выход 1 мкмоля ^ацетил-Э-глюкозамина и Э-глюкозамина, соответственно, образовавшихся за 1 мин, при использовании в реакции 1 г белка.

Ферментативный гидролиз хитозана проводили согласно работе [4]. Для деполимеризации использовали хитозан краба с ММ 1000 кДа и СД 85% (ООО «Биопрогресс», Щелково, Россия). 1,0 г хитозана растворяли в течение 30 мин в 40 мл раствора 1,0М уксусной кислоты при

перемешивании, затем добавляли 116 мл воды. Величину рН полученного раствора доводили раствором 1М №ОН до значения 5,5.

Условия деполимеризации хитозана были следующими: фермент/субстратное соотношение 1/250 по белку (60 мг ФП на 1 г хитозана), температура 55°С, время гидролиза - 10, 60, 180 минут. В качестве контроля использовали исходный хитозан, а также хитозан, который термостатировали 180 мин при 55°С без добавления ФП.

По истечении 10, 60, 180 мин реакцию останавливали кипячением в течение 10 мин. Динамику ферментативной деполимеризации хитозана оценивали по снижению динамической вязкости при помощи ротационного визкозиметра Брукфильда с цилиндрическим ротором (измерения проводили при 25°С); скорости истечения в капиллярном вискозиметре Уббелоде и по образованию ВС. ВС, образующиеся в ходе ферментативного гидролиза, представлены в виде эквивалента глюкозамина (ГА) на 1 г хитозана.

Продукты реакции выделяли из реакционной среды переосаждением 12%-ным раствором МН4ОН. Полученные суспензии гидролизатов

центрифугировали при 6000 об/мин, 10 мин. Осадок ресуспендировали в воде, диализовали против воды с трехкратной сменой и лиофильно высушивали. Выход образцов низкомолекулярного хитозана в зависимости от продолжительности гидролиза составлял 25-50%.

Лиофильно высушенные гидролизаты были охарактеризованы по средневязкостной ММ, которую определяли согласно уравнению Марка-Куна-Хаувинка:

[П] = к х Ма,

где [п] - характеристическая вязкость, М-средневязкостная ММ, к и а коэффициенты: к = 1,38 х 10-4; а = 0,85 (для образцов хитозана с СД 85%).

Результаты исследований представлены в табл. 1.

Таблица 1 - Влияние продолжительности деполимеризации хитозана на ММ, вязкость полученных образцов

Продолжительность гидролиза, мин Динамическая вязкость, сПз Эквивалент мкмоль ГА / 1 г хитозана Скорость истечения гидролизатов, с ММ, кДа Выход, %

10 21 2380 34 20 50

60 20 3050 31 8 40

180 20 5500 29 4 25

Контроль 420 370 550 470 80

:ходный итозан 600 - 710 1000 -

В *

Заключение

1. Получена серия низкомолекулярных образцов хитозана с молекулярными массами 4, 8 и 20 кДа.

2. Выявлено, что использование ФП, продуцируемого Myceliophthora fergussi, позволяет снизить динамическую вязкость исходного хитозана в 30 раз, а молекулярную массу - в 174 раза за 60 минут проведения гидролиза.

3. Результаты изменения времени истечения гидролизатов, полученных через 10, 60 и 180 мин проведения гидролиза свидетельствуют о том, что низкомолекулярные образцы хитозана можно получить за более короткое время (10 мин) с выходом 50%.

Работа поддержана РФФИ (грант № 14-04-00687-а). Литература

1. К.Г. Скрябин, С.Н. Михайлов, В.П. Варламов, Хитозан. Центр «Биоинженерия» РАН, Москва, 2013. 593 с.

2. К.Г. Скрябин, Г.А. Вихорева, В.П. Варламов, Хитин и хитозан: Получение, свойства и применение. Наука, Москва, 2002. 360 с.

3. G.L. Miller, Anal. Chem, 31, 3, 426-428

4. Л.М. Хасанова, А.В. Ильина, В.П. Варламов, О.А. Синицына, А.П. Синицын, Прикл. биохимия и микробиология, 50, 4, 422-428

© Ю. В. Лисюкова, магистрант кафедры промышленной биотехнологии КНИТУ, yulya.lisyukova@mail.ru; А. С. Сироткин, д.т.н., профессор, заведующий кафедрой промышленной биотехнологии КНИТУ, asirotkin66@gmail.com; Л. М. Хантимирова, аспирант, мл. научный сотрудник лаборатории инженерии биополимеров Института биоинженерии, ФИЦ Биотехнологии РАН, leysan.khasanova@gmail.com.

© Y. V. Lisiukova, Master-Student of Department of Industrial Biotechnology, KNRTU, yulya.lisyukova@mail.ru; A. S. Sirotkin, Doctor of Engineering Sciences, Professor, Head of the Department of Industrial Biotechnology, KNRTU, asirotkin66@gmail.com; L. M. Khantimirova, Ph. D. student, researcher on the laboratory of engineering biopolymers, Institute of Bioengineering, Research Center of Biotechnology of the RAS, leysan.khasanova@gmail.com.