Способ моделирования механической формы острого пяточного энтезита у крысы в эксперименте
METHOD FOR SIMULATING THE MECHANICAL FORM OF ACUTE HEEL ENTERITIS IN A RAT IN AN EXPERIMENT

Изобретение относится к экспериментальной хирургии, патофизиологии и может быть применено для моделирования механической формы острого пяточного энтезита (энтезопатии) у крысы в экспериментальных исследованиях.
Энтезис (ЭТ) - переходная структура тканей - фасциальной, сухожильной, фиброзной, костной - образующих сухожильно-фиброзно-костно-хрящевой (СФКХ) комплекс.
Пяточный энтезис крысы представляет собой сложное анатомо-физиологическое образование тазовой конечности, представленное поверхностной фасцией, сухожильной частью волокон общего пяточного сухожилия или ахиллова сухожилия (tendo calcaneus), пяточной костью, а так же окружающими структурами жировой и фиброзной ткани. Ахиллово сухожилие сформировано трехглавой мышцей голени, состоящей из двух самостоятельных мышц - икроножной (m. gastrocnemius cap. lat. et med.) и камбаловидной (m. soleus) [Международная классификация болезней десятого пересмотра МКБ 10 (принята 43-ей Всемирной Ассамблеей Здравоохранения)] (фиг. 1). На фиг. 1 показана тазовая конечность крысы. 1 - os. calcaneus; 2 - regio enthesis; 3 - tendo calcaneus. Ряд авторов соотносит тип его прикрепления к кости, как фиброзно-хрящевой, и выделяет четыре последовательно переходящие друг в друга зоны: собственной ткани сухожилия; неминерализованного фиброзного хряща; минерализованного (кальцифицированного) хряща; пластинчатой кости, переходящей в трабекулярную часть эпифиза. Несмотря на неоднородность энетезиса, функционально это анатомическое образование позволяет выдерживать значительные многократные механические нагрузки, превышающие прочность отдельно взятых составляющих его тканей, даже при частичном нарушении целостности его структур.
Энтезопатия или энтезит (М76, М77) [Международная классификация болезней десятого пересмотра МКБ 10 (принята 43-ей Всемирной Ассамблеей Здравоохранения)] является одной из малоизученных на сегодняшний день форм поражения параартикулярных тканей, ее можно характеризовать как дегенеративно-дистрофический воспалительный процесс, имеющий многофакторную этиологию, возникающий в энтезисе - месте соединения фасциальной, сухожильной, фиброзной, костной и других прилегающих тканей, образующих переходное образование - СФКХ-комплекс, при наличии общих клинических, рентгенологических, ультразвуковых, магниторезонансных и других характерных признаков, и отсутствии в плазме крови ревматоидных и схожих с ними факторов [Кокорин В.В., Крайнюков П.Е., Матвеев С.А., Кузьмин Д.Б., Химченко Ю.В. Патоморфологические особенности энтезита костно-сухожильно-капсульного комплекса латерального отдела голеностопного сустава. // Вестник национального медико-хирургического Центра им. Н.И. Пирогова. - М. - 2020. - т. 15( 2). - С. 170-176; Кокорин В.В., Крайнюков П.Е., Епифанов С.А., Чеснаков А.Н. Применение современных клеточных технологий в лечении энтезопатий. Госпитальная медицина: наука и практика, - 2020, - Т. 1, - №4, - М. - С. 23-28].
В литературе известен способ индуцированного повреждения пяточного (ахиллова) сухожилия у крысы с целью представить особенности репаративной регенерации пяточного (ахиллова) сухожилия в условиях аутотрансплантации клеточного продукта - стромально-васкулярной фракции (СВФ) (Жариков A.M. Особенности репаративной регенерации ахиллова сухожилия в условиях аутотрансплантации клеточного продукта. // дисс. кандидата биологических наук. // - М. - 2021. - 91 с.).
Манипуляции с лабораторными животными проводили согласно «Европейской конвенции о защите позвоночных животных используемых для экспериментов или иных научных целях» (Страсбург, 18 марта 1986 г. ETS №123). Экспериментальные группы были сформированы из клинически здоровых животных с учетом происхождения, пола (самцы), возраста (3 месяца), живой массы (200 г. ). Животных карантинировали в течение 14 суток.
Животным группы «контроль» и «подопытная» перед наркозом проводили премедикацию. Операцию по созданию модели травмы на ахилловом сухожилии выполняли под газовым наркозом. Доступ к сухожилию осуществляли с медиальной стороны тазовой конечности в области голени. Перед оперативным вмешательством в этой области удаляли волосяной покров и создавали стерильное оперативное поле. Для лучшей визуализации осуществляли продольные разрезы и выделяли сухожилие
Травму моделировали посредством поперечного разреза дистальной трети ахилла, ближе к месту прикрепления к пяточной кости заплюсны. В условиях полного расслабления мышц, область повреждения сухожилия сшивали специальным сухожильным швом.
Аналогичные оперативные вмешательства выполняли на всех сроках эксперимента (7-ые сутки, 14-ые сутки, 30-ые сутки, и 60-ые сутки).
Для получения тестируемой фракции осуществляли липосакцию в области холки. После разреза фрагмент жировой ткани помещали в транспортную среду и доставляли в лабораторию Центра ветеринарной клеточной медицины, где производили приготовление суспензии стромальной васкулярной фракции. На третье сутки после операции, каждому животному подопытной группы проводили введение аутологичного клеточного продукта (СВФ). Животным контрольной группы стромально-васкулярную фракцию не вводили, преследуя задачу - получить полную картину естественной регенерации ахиллова сухожилия.
Анатомическое макро- и микропрепарирование проводили путем выделения мышц тазовой конечности, формирующих ахиллово сухожилие. Микроскопическое исследование проводили с использованием световой микроскопии по общепринятым методикам. Изучение общей морфологической картины осуществляли при помощи светового микроскопа «Jenamed 2» (Carl Zeiss, Jena, Germany) после окрашивания гистологических срезов гематоксилином и эозином, по классическим методикам.
Известно устройство для нанесения стандартизированных повреждений на сухожилиях, которое, может быть использовано для моделирования стандартизированных повреждений на сухожилиях, в экспериментальных исследованиях (патент RU 128982 U1, Дубровин Г.М., Ковалев П.В., Зохиров А.Н. 2012 г.)
Для нанесения стандартизированных повреждений на сухожилиях авторы использовали сложное техническое устройство. Исследование проводили на 5 здоровых половозрелых собаках, массой 8-10 кг. Исследования выполняли с соблюдением принципов, изложенных в Конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других целей (Страсбург, Франция, 1986).
Эксперимент производили под общей анестезией, осуществляли послойный доступ к ахиллову сухожилию, выделяли и фиксировали его в устройстве для нанесения стандартизированных повреждений; на планшете с градуировкой из миллиметровой бумаги помечали силу приложения (то насколько была сжата пружина); производили разрезы сухожилия установленного характера и силы при помощи пружинной установки. На всех собаках получены абсолютно идентичные по характеру и приложенной силе повреждения ахиллова сухожилия. После нанесения стандартизированных повреждений и сравнения результатов производили сшивание ахиллова сухожилия при помощи авторского шва, послойно ушивали рану. Таким образом, данная полезная модель для нанесения стандартизированных повреждений на сухожилиях позволила наносить и моделировать стандартизованные повреждения сухожилий в условиях эксперимента путем использования пружинного прибора со сменными стандартными хирургическими лезвиями, путем приложения разной действующей силы, в зависимости от степени сжатия пружины.
В основу изобретения положена задача создания способа моделирования механической формы острого пяточного энтезита у крысы в эксперименте, который позволяет моделировать патофизиологический процесс - механическую энтезопатию (энтезит), подтвержденную морфологическим исследованием, с целью последующего исследования и разработки методов и способов лечения данной патологии.
Решение поставленной задачи обеспечивается тем, что в способе моделирования механической формы острого пяточного энтезита у крысы в эксперименте, включающем нанесение индуцированного повреждения, при помощи лезвия микрохирургического скальпеля особой формы с толщиной кромки лезвия 0,08 мм, производят нанесение продольных насечек длиной 5 мм параллельно сухожильным волокнам, в проекции пяточного энтезиса, на всю его толщину 6 мм, в количестве 10 манипуляций, не приводящее к нарушению анатомо-физиологических свойств пяточного энтеза.
Существенными отличительными признаками заявленного метода в том, что:
1. С целью нанесения стандартизованных повреждений был использован инструмент со сменными одноразовыми стерильными лезвиями микрохирургического скальпеля: толщина режущей кромки лезвия 0,08 мм, ширина и высота полотна 5 и 6 мм соответственно.
2. Продольные насечки длиной 5 мм наносились параллельно сухожильным волокнам, в проекции пяточного бугра, в количестве 10 манипуляций, с глубиной проникновения 6 мм (данная величина соответствует высоте лезвия и толщине пяточного энтезиса и реализуется за счет ограничителя, расположенного на рукоятке держателя, площадь повреждения сухожилия при этом не превышала 20%, что позволило обеспечить сохранение его функциональной прочности в рассматриваемой модели.
3. Способ позволяет моделировать патофизиологический процесс - механическую энтезопатию (энтезит), подтвержденную морфологическим исследованием, с целью последующего исследования и разработки методов и способов лечения данной патологии.
4. Описанное в литературе сложное техническое устройство - стационарный пружинный прибор на основании с прикрепленными крючком, платформой, цилиндром, пружиной и планшетом с градуировкой на миллиметровой бумаге - не может быть использовано для изучения пяточного энтезиса ввиду его конструктивных особенностей (не предназначен для фиксации СФКХ - органокомплекса, не позволяет определить глубину и площадь проникновения лезвия, полноту повреждений структур энтезиса);
5. Пяточное сухожилие не пересекается поперечным разрезом, не нарушается его макроанатомическая целостность.
6. Сохраняется функционально-анатомическое расположение окружающих тканей.
В результате применения способа формируются микродефекты фасциальной, сухожильной, фиброзной, костной и других структур, составляющие не более 20% всей площади органокомплекса, при этом сохраняется функциональная прочность анатомического образования (плотность и направленность не поврежденно части коллагеновых и эластических волокон), иннервация и микроциркуляция, анатомо-физиологическая последовательность и положение тканей (фасциальной, сухожильной, хрящевой, костной), не происходит их полного пересечения, иссечения, удаления, изменения места прикрепления. Формируемая модель морфологически аналогична механической пяточной энтезопатии и необходима для проведения исследований патологии, с целью разработки методов ее комплексного лечения.
Технический результат полезной модели заключается в создании однотипной схемы нанесения индуцированных повреждений пяточного энтезиса в условиях эксперимента путем использования однотипного лезвия с одной действующей силой в точке ее приложения, имитирующего механический микродефект структур энтезиса (СФКХ комплекса).
Изобретение поясняется фиг. 1, на которой показана тазовая конечность крысы (1 - os. calcaneus; 2 - regio enthesis; 3 - tendo calcaneus; 4 - стандартизованные повреждения), фиг. 2, на которой показана схема нанесения повреждений СФКХ комплекса пяточного энтезиса, фронтальная (А), сагитальная плоскость (Б): 1. - os. calcaneus; 2. - regio enthesis; 3. - tendo calcaneus; 4. - стандартизованные повреждения, выполненные лезвием микрохирургической заточки - 5. На фиг. 3 показаны результаты морфологического исследования СФКХ комплекса пяточного энтезиса с помощью трансмиссионной электронной микроскопии. Увеличение дано на снимке. А. неповрежденный энтезис - упорядоченная структура коллагеновых волокон. Б. после нанесения стандартизированных насечек (Б).
Одним из этиологических факторов возникновения энтезопатии является механическое повреждение структур энтезиса. С целью моделирования данной формы патологии у крыс, были сформированы группы исследования из клинически здоровых животных с учетом происхождения, пола (самцы), возраста (3 месяца), живой массы (180-200 г) и проведенного в течение 14 суток карантина.
Все манипуляции с лабораторными животными проводили согласно «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» (Страсбург, 18 марта 1986 г. ETS №123).
Гистологические препараты исследовали при помощи светового микроскопа «Leica 1000DM» (Германия), окрашивание производили гематоксилином и эозином, а также по Маллори. Микроморфометрию осуществляли с помощью программы «ImagScope-М» (Россия).
Оценку статистической значимости различий исследуемых показателей осуществляли с использованием критериев, применимых для ненормального распределения.
Эксперимент моделировали в условиях лабораторной операционной, с соблюдением правил асептики и антисептики. Премедикация и анестезия проводилась сочетанием препаратов тилетамина гидрохлорида, золазепама гидрохлорида из расчета 10-15 мг/кг массы крысы и эфирного наркоза. Перед оперативным вмешательством удаляли волосяной покров и выполняли обработку операционного поля растворами антисептика. Доступ осуществляли латеральным дугообразным разрезом в проекции пяточного энтеза, длиной до 1,5 см, послойно рассекали ткани, визуально контролируя целостность сосудисто-нервного пучка, выделяли место прикрепления ахиллова сухожилия к пяточному бугру пяточной кости (пяточный энтезис) на всем его протяжении.
С целью нанесения индуцированных повреждений был использован микрохирургический скальпель со сменными одноразовыми стерильными лезвиями: толщина режущей кромки лезвия 0,08 мм, ширина и высота полотна 5 и 6 мм соответственно. Продольные насечки длиной 5 мм наносились параллельно сухожильным волокнам, в проекции пяточного бугра, в количестве 10 манипуляций, с глубиной проникновения 6 мм (соответствует высоте лезвия и толщине пяточного энтезиса), на всю толщину пяточного энтезиса. Контроль глубины проникновения осуществляется за счет ограничителя, расположенного на рукоятке держателя. Средняя ширина энтезиса в проекции пяточного бугра составляет порядка 5 мм, при нанесении лезвием 10-ти индуцированных насечек, площадь повреждений его структур не превышает 20%, что обеспечивает сохранение его функциональной прочности в рассматриваемой модели (фиг. 2).
Индуцированное повреждение подтверждалось морфологическим исследованием (фиг. 3).
Таким образом удалось создать однотипную модель нанесения стандартизованных повреждений пяточного энтезиса в условиях эксперимента путем использования лезвия микрохирургической заточки с одной действующей силой в точке ее приложения, имитирующего механический микродефект структур энтезиса (СФКХ комплекса), при сохранении его прочности. Получены хорошие результаты, подтвержденные объективными исследованиями.