ПРИМЕНЕНИЕ АКТИВНОСТИ ЭНДОГЕННОЙ ДНКАЗЫ ДЛЯ ПОНИЖЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ДНК
APPLICATION OF ENDOGENIC DNAASE ACTIVITY TO REDUCE DNA CONTENT

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННУЮ ЗАЯВКУ
Настоящая заявка заявляет приоритет по предварительной заявке на патент США № 61/537837, поданной 22 сентября 2011 г., которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Нитчатые грибы (например, Trichoderma, Aspergillus, Geosmithia, Myceliophthora, Penicillium, Fusarium, Humicola и другие) в последнее время стали популярными штаммами-хозяевами для получения белков. Ферментные препараты, вырабатываемые видами грибов, такими как Trichoderma reesei, Aspergillus niger, Aspergillus tubingensis, Aspergillus oryzae, Geosmithia emersonii, Mycellophthora thermophila, Penicillium funiculosum, Fusarium venenatum и Humicola insolens, разрабатывали как коммерческие продукты. Нитчатые грибы, такие как Trichoderma, Aspergillus, Myceliophthora, Penicillium, Fusarium и другие, также конструировали для экспрессии гетерологичных белков, например, ферментов и терапевтических белков, как правило, управляемой индуцибельными промоторами (см., например, England и соавт., патентную публикацию по PCT WO2004/035070). Многие из белков, полученных таким образом из грибов (например, T. reesei, A. niger, A. tubingensis, A. oryzae, G. emersonii, M. thermophila, P. funiculosum, F. venenatum и H. insolens), применимы в качестве пищевых или кормовых добавок (см., например, Dunn-Coleman и соавт., патентную публикацию по PCT WO2003/038035) или в других путях промышленного применения. В связи с тем, что получение белков с помощью грибов обычно осуществляется в больших масштабах, улучшение эффективности получения и переработки может иметь большое экономическое значение.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
Фигура 1. Эффект повышенных pH или температуры в отношении распада ДНК, наблюдаемого в концентрате ферментативного бульона, полученном путем ультрафильтрации, в котором содержится T. reesei, экспрессирующий фитазу Buttiauxella sp.
Фигура 2. Эффект времени инкубирования в отношении распада ДНК, наблюдаемого в том же, что и описанный выше, концентрате ферментативного бульона, полученном путем ультрафильтрации, в котором содержится T. reesei, экспрессирующий фитазу Buttiauxella sp.
Фигура 3. Эффект повышенных температур и времени инкубирования в отношении распада ДНК, наблюдаемого в том же, что и описанный выше, концентрате ферментативного бульона, полученном путем ультрафильтрации, в котором содержится T. reesei, экспрессирующий фитазу Buttiauxella sp.
Фигуры 4A-4B. Эффекты повышенного pH в отношении распада ДНК, наблюдаемого при уровнях pH 5,2, 6,3 и 7,6, наблюдаемого в концентрате ферментативного бульона, полученном путем ультрафильтрации, в котором содержится T. reesei, экспрессирующий липазу Aspergillus tubingensis.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ
Настоящее изобретение обеспечивает способы понижения содержания ДНК в бульоне, в котором культивировали клетки-хозяева, являющиеся клетками нитчатых грибов. Такие способы включают корректировку pH и/или температуры бульона, в котором культивировали клетки-хозяева, являющиеся клетками нитчатых грибов, в течение по меньшей мере 24 часов, до значений pH и/или температуры, превышающих применяемые в культивировании, и инкубирование бульона при повышенных pH и/или температуре в течение периода, достаточного для поддающегося выявлению понижения уровня ДНК нитчатых грибов-хозяев в препарате. Понижение содержания ДНК в таких способах преимущественно не обусловлено наличием экзогенной ДНКазы в бульоне. Некоторые способы дополнительно включают осуществление стадии разделения жидкой и твердой фазы для отделения бульона от клеток-хозяев, являющихся клетками нитчатых грибов, перед стадией корректировки. Некоторые способы дополнительно включают осуществление стадии ультрафильтрации, на котором макромолекулы в бульоне концентрируют перед стадией корректировки. В некоторых способах бульон имеет комнатную температуру после стадии ультрафильтрации. В некоторых способах температура бульона перед стадией корректировки составляет от 25°C до 34°C. В некоторых способах pH бульона перед стадией корректировки составляет от 4 до 5. Некоторые способы дополнительно включают культивирование клеток-хозяев, являющихся клетками нитчатых грибов, в бульоне до достижения желаемой концентрации секретируемых белков, представляющих интерес, в бульоне перед стадией корректировки. Предпочтительно стадию корректировки pH и/или температуры осуществляют перед тем, как фермент (ферменты), вырабатываемый (вырабатываемые) клеткой-хозяином, применяют для обработки намеченного субстрата или воздействия на него.
В некоторых способах pH повышают до pH 6-8 во время стадии корректировки. В некоторых способах температуру повышают до 35°C-47°C во время стадии корректировки. Некоторые способы дополнительно включают оценивание содержания ДНК в бульоне. В некоторых способах содержание ДНК можно оценить перед и после стадии инкубирования. В некоторых способах содержание ДНК снижается до невыявляемого уровня, что оценивается с помощью ПЦР и/или гель-электрофореза с окрашиванием бромистым этидием. Некоторые способы дополнительно включают предоставление возможности бульону охладиться до комнатной температуры после стадии инкубирования. Некоторые способы дополнительно включают очищение одного или нескольких белков из бульона. В некоторых способах один или несколько белков в бульоне экспрессируются рекомбинантным путем клеткой-хозяином, являющейся клеткой нитчатого гриба. В некоторых способах в клетках-хозяевах, являющихся клетками нитчатых грибов, отсутствует экзогенная ДНКаза. В некоторых способах в бульон не добавляют ДНКазу. В некоторых способах клетки-хозяева, являющиеся клетками нитчатых грибов, экспрессируют фермент целлюлазу рекомбинантным путем. В некоторых способах клетки-хозяева, являющиеся клетками нитчатых грибов, экспрессируют фитазу рекомбинантным путем. В некоторых способах клетки-хозяева, являющиеся клетками нитчатых грибов, экспрессируют липазу рекомбинантным путем.
Настоящее изобретение дополнительно обеспечивает способы понижения содержания ДНК в белковом препарате (в том числе, например, в культуральном бульоне), полученном из клеток-хозяев, являющихся клетками нитчатых грибов. Эти способы включают стадии измерения уровня ДНК грибной клетки-хозяина в белковом препарате, полученном из клеток-хозяев, являющихся клетками нитчатых грибов; корректировки pH и/или температуры белкового препарата до скорректированных pH и/или температуры; инкубирования белкового препарата при скорректированных pH и/или температуре в течение периода, достаточного для поддающегося выявлению понижения уровня ДНК клеток-хозяев, являющихся клетками нитчатых грибов, в белковом препарате и определения понижения количества ДНК клеток-хозяев, являющихся клетками нитчатых грибов, в белковом препарате. Понижение в таких способах преимущественно не обусловлено наличием экзогенной ДНКазы в белковом препарате. В некоторых способах количество ДНК снижается до невыявляемого уровня.
Настоящее изобретение дополнительно обеспечивает способы понижения содержания ДНК в бульоне, в котором культивировали клетки-хозяева, являющиеся клетками нитчатых грибов. Эти способы включают стадии повышения pH и/или температуры бульона, в котором культивировали клетки-хозяева, являющиеся клетками нитчатых грибов, в течение по меньшей мере 24 часов и в котором осуществляли стадию разделения жидкой и твердой фазы для отделения бульона от клеток-хозяев, являющихся клетками нитчатых грибов; и инкубирования бульона при повышенных pH и/или температуре в течение периода, достаточного для поддающегося выявлению понижения уровня ДНК нитчатых грибов-хозяев в бульоне. Понижение в таких способах преимущественно не обусловлено наличием экзогенной ДНКазы в бульоне.
Настоящее изобретение также обеспечивает применение активности эндогенной ДНКазы клеток-хозяев, являющихся клетками нитчатых грибов, для понижения уровня ДНК нитчатых грибов-хозяев в белковом препарате, полученном из грибной клетки-хозяина.
Настоящее изобретение дополнительно обеспечивает применение активности эндогенной ДНКазы клеток-хозяев, являющихся клетками нитчатых грибов, для понижения уровня ДНК грибов-хозяев в культуральном бульоне, в котором культивировали грибные клетки-хозяева.
В любом из вышеописанных способов или путей применения грибная клетка-хозяин может представлять собой клетку T. reesei, A. niger, A. tubingensis, A. oryzae, G. emersonii, M. thermophila, P. funiculosum, F. venenatum или H. insolens.
ОПРЕДЕЛЕНИЯ
"ДНКаза" представляет собой фермент, способный осуществлять распад ДНК, обычно путем расщепления фосфодиэфирной связи. ДНКазы включают эндонуклеазы, расщепляющие внутренние сайты, и экзонуклеазы, отщепляющие мононуклеотиды от конца молекулы ДНК. ДНКазы обычно представляют собой белки, но также могут быть небелковыми ДНКазами. ДНКазы могут обладать активностью РНКаз, а также активностью ДНКаз, или не обладать таковыми.
"Экзогенный" белок (например, экзогенная ДНКаза) относится к белку, вводимому в штамм-хозяин с помощью экспрессии рекомбинантных генов или добавляемому в экстракты штамма-хозяина из внешнего источника белка. Экзогенный белок может быть гетерологичным по отношению к штамму-хозяину (т.е. вырабатываемым естественным образом другим штаммом-хозяином) или гомологичным (т.е. вырабатываемым естественным образом данным штаммом-хозяином).
Выражение "рекомбинантный" относится к полинуклеотиду или полипептиду, который не встречается в природе в клетке-хозяине. Рекомбинантная молекула может содержать две или более встречающихся в природе последовательности, соединенные не встречающимся в природе образом.
Выражение "гетерологичный" относится к элементам, обычно не связанным друг с другом. Например, если клетка-хозяин вырабатывает гетерологичный белок, то такой белок обычно не вырабатывается в этой клетке-хозяине. Подобным образом, промотор, функционально связанный с гетерологичной кодирующей последовательностью, является промотором, функционально связанным с кодирующей последовательностью, с которой он обычно не связан функционально в клетке-хозяине дикого типа. Выражение "гомологичный" в отношении полинуклеотида (например, ДНК) или белка относится к нуклеиновой кислоте (например, ДНК) или белку, встречающимся в природе в клетке-хозяине.
"Ген" относится к сегменту ДНК, участвующему в выработке полипептида, и включает области, расположенные перед и после кодирующего сегмента (сегментов) (экзонов), а также, в некоторых генах, встроенные сегменты (интроны) между отдельными кодирующими сегментами.
Нуклеиновые кислоты включают однонитевые или двунитевые ДНК и РНК и их химически модифицированные варианты.
"Вектор" представляет собой последовательность полинуклеотида, предназначенную для введения нуклеиновых кислот в клетки одного или нескольких типов. Векторы включают клонирующие векторы, векторы экспрессии, челночные векторы, плазмиды, фаговые частицы, кассеты и т.п.
"Фитаза" представляет собой фермент, катализирующий гидролиз фитата до (1) миоинозитола и/или (2) его моно-, ди-, три-, тетра- и/или пентафосфатов и (3) неорганического фосфата. Например, фитазы включают ферменты, определяемые шифром КФ 3.1.3.8 или шифром КФ 3.1.3.26.
"Ферменты целлюлазы" или "целлюлазы" включают ферменты, оказывающие прямое воздействие на целлюлозу, и вспомогательные ферменты, способствующие прямому воздействию других ферментов на целлюлозу. Целлюлазы включают экзоглюканазы или экзоцеллобиогидролазы, и/или эндоглюканазы, и/или β-глюкозидазы бактерий или грибов. Эти три различных типа ферментов целлюлаз действуют синергически, превращая целлюлозу и ее производные в глюкозу. Ферменты целлюлазы также включают вспомогательные ферменты, в том числе представителей GH61, таких как EG4, сволленин, лузенин, CIP1 и т.п.
"Липаза" представляет собой фермент, катализирующий гидролиз или образование липидов. Например, липазы катализируют гидролиз триацилглицерина с получением диацилглицерина и карбоксилата. Липазы включают ферменты, определяемые шифром КФ 3.1.1.3.
"Выделенный" означает, что целевой образец удален из по меньшей мере одного компонента, с которым он обычно связан.
"Очищенный" означает, что целевой образец по меньшей мере на 50% (вес/вес) и в некоторых случаях по меньшей мере на 75, 90, 95 или 99% (вес/вес) свободен от макромолекулярных примесей, применяемых в его получении или очищении, но не исключает наличия наполнителей, добавляемых для облегчения применения целевого образца.
Белковый препарат содержит один или несколько желаемых белков, секретируемых нитчатым грибом-хозяином (например, T. reesei, A. niger, A. tubingensis, A. oryzae, G. emersonii, M. thermophila, P. funiculosum, F. venenatum, H. insolens и другими), в любом состоянии чистоты и может также содержать примеси, применяемые для получения или очищения желаемого белка (белков), или добавленные наполнители. Таким образом, белковый препарат может представлять собой бульон или белок (белки), очищенный (очищенные) из бульона.
Бульон или "ферментативный бульон" относится к культуральной среде, применяемой для культивирования клеток-хозяев, являющихся клетками нитчатых грибов (например, T. reesei, A. niger, A. tubingensis, A. oryzae, G. emersonii, M. thermophila, P. funiculosum, F. venenatum и H. insolens) с удалением клеток и клеточного дебриса после ферментации или без такового и с концентрированием белков и других макромолекул в бульоне с помощью ультрафильтрации или подобной методики или без такового, но не включает препарат очищенных белков, в котором желаемый белок (белки) отделен (отделены) от бульона с помощью методик, таких как осаждение и ресуспендирование белков в свежеприготовленной среде или колоночная хроматография и элюирование в свежеприготовленной среде.
Выражение "нитчатые грибы" относится ко всем нитчатым формам подотдела Eumycotina (см. Alexopoulos, C. J. (1962), INTRODUCTORY MYCOLOGY, Wiley, New York и AINSWORTH AND BISBY DICTIONARY OF THE FUNGI, 9.sup.th Ed. (2001) Kirk et al., Eds., CAB International University Press, Cambridge UK). Эти грибы характеризуются вегетативным мицелием с клеточной стенкой, состоящей из хитина, целлюлозы и других сложных полисахаридов. Нитчатые грибы по настоящему изобретению морфологически, физиологически и генетически отличаются от дрожжей. Вегетативный рост нитчатых грибов осуществляется за счет удлинения гиф, а катаболизм углерода является облигатно-аэробным.
Выражение "Trichoderma" или "Trichoderma sp." относится к любому роду грибов, ранее или в настоящее время классифицируемому как "T.", и к гибридам таких штаммов, а также к их генетически модифицированным формам (например, модифицированным с помощью мутации, или трансгена, или нокаута гена).
"Корм" означает любые естественные или искусственные продукты питания, еду или подобное или компоненты такой еды, предназначенные или подходящие для поедания, употребления, поглощения животным, отличным от человека.
"Пища" означает любые естественные или искусственные продукты питания, еду или подобное или компоненты такой еды, предназначенные или подходящие для поедания, употребления, поглощения человеком.
"Пищевая или кормовая добавка" представляет собой очищенное соединение или композицию из нескольких компонентов, предназначенные или подходящие для добавления в пищу или корм. Она может включать одно или несколько соединений, таких как витамины, минеральные вещества, ферменты и подходящие носители и/или наполнитель.
Такие выражения, как "оценивать", "измерять" или "определять", охватывают качественное или количественное выявление анализируемого вещества, в частности, эндогенной ДНК. Такое оценивание или определение может, таким образом, указывать на наличие или отсутствие анализируемого вещества или количества анализируемого вещества.
Выражение "содержащий" и однокоренные слова к нему применяют в их исчерпывающем смысле, т.е. оно эквивалентно выражению "включающий" и соответствующим однокоренным словам к нему.
Если из контекста явно не следует иное, ссылка на конкретную численную величину охватывает указанную величину и отклонение, присущее в связи с ее измерением (т.е. +/- SEM).
Если из контекста явно не следует иное, “около” указывает на допустимое отклонение, составляющее +/- 10%.
Числовые диапазоны включают числа, определяющие диапазон. Также перечислены некоторые предпочтительные поддиапазоны, но в любом случае ссылка на диапазон включает все поддиапазоны, определенные целыми числами, включенными в диапазон.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
I. Общая информация
Настоящая заявка обеспечивает способ понижения содержания ДНК в белковом препарате, полученном из нитчатых грибов, без необходимости применения экзогенной ДНКазы. Настоящая заявка частично основана на наблюдении активности эндогенной ДНКазы нитчатых грибов в культуральных бульонах вместе с коммерчески ценными белками. Например, активность ДНКазы обнаруживают в культуральном бульоне, в котором содержится T. reesei, A. niger, A. tubingensis, A. oryzae, G. emersonii, M. thermophila, P. funiculosum, F. venenatum, H. insolens или другой штамм, экспрессирующий и/или вырабатывающий определенный промышленный фермент (ферменты), представляющий интерес. Хотя для практического осуществления настоящего изобретения не требуется понимание механизма, считается, что активность эндогенных ДНКаз может быть обусловлена высвобождением одной или нескольких секретируемых ДНКаз, эндогенных по отношению к нитчатому грибу (например, T. reesei, A. niger, A. tubingensis, A. oryzae, G. emersonii, M. thermophila, P. funiculosum, F. venenatum, H. insolens и т.д.), либо одной или нескольких внутриклеточных ДНКаз таких нитчатых грибов в связи с лизисом клеток.
Такую активность эндогенных ДНКаз можно применять для понижения содержания или устранения молекул ДНК из культурального бульона, в котором содержатся нитчатые грибы, например, из культурального бульона, в котором содержатся T. reesei, A. niger, A. tubingensis, A. oryzae, G. emersonii, M. thermophila, P. funiculosum, F. venenatum или H. insolens. Удаление таких молекул ДНК применимо во многих путях применения, например, в получении ферментного препарата в виде пищевой или кормовой добавки или биологически активной добавки. Регуляторные органы требуют, чтобы некоторые коммерческие ферментные препараты, в частности, применяемые в получении пищи или кормов, не содержали выявляемой ДНК хозяина или по крайней мере содержали ДНК хозяина на уровне ниже определенного предела. Хотя ДНК грибов (например, ДНК T. reesei, A. niger, A. tubingensis, A. oryzae, G. emersonii, M. thermophila, P. funiculosum, F. venenatum, H. insolens и т.д.) в культуральном бульоне можно удалить с помощью экзогенной ДНКазы, экспрессия такой ДНКазы рекомбинантным путем или ее подача в культуральный бульон подразумевает дополнительные стадии, возрастание затрат и, возможно, понижение эффективности. Способ по настоящему изобретению обеспечивает простой метод удаления генетического материала хозяина из белкового препарата без необходимости манипуляций с генами клетки-хозяина либо добавления ДНКазы (ДНКаз) в препарат.
II. Штаммы-хозяева, являющиеся штаммами нитчатых грибов
Для практического осуществления настоящего изобретения можно применять любые подходящие штаммы-хозяева, являющиеся штаммами грибов, способные к экспрессии белков гетерологичных либо эндогенных видов. Например, штаммы-хозяева, являющиеся штаммами грибов, могут представлять собой штаммы-хозяева, являющиеся штаммами видов нитчатых грибов, как, например, таковых из типа Ascomycota и подтипа Pezizomycotina. Такие организмы включают клетки нитчатых грибов, применяемые для получения коммерчески важных промышленных и фармацевтических белков, в том числе, но без ограничений, Trichoderma spp., Aspergillus spp., Fusarium spp., Penicillium spp., Chrysosporium spp., Talaromyces spp., Geosmithia spp., Myceliophthora spp. и Neurospora spp. Конкретные организмы, из которых могут быть получены подходящие штаммы-хозяева, могут включать, но без ограничений, Trichoderma reesei (ранее классифицируемый как Trichoderma longibrachiatum и Hypocrea jecorina), Aspergillus niger, Aspergillus fumigatus, Aspergillus itaconicus, Aspergillus oryzae, Aspergillus nidulans, Aspergillus terreus, Aspergillus sojae, Aspergillus japonicus, Aspergillus tubingensis, Humicola insolens, Humicola grisea, Thermomyces lanuginosus, Neurospora crassa, Penicillium funiculosum, Penicillium chrysogenum, Talaromyces (Geosmithia) emersonii, Fusarium venenatum, Fusarium graminearum, Myceliophthora thermophila и Chrysosporium lucknowense. Штаммы-хозяева, являющиеся штаммами грибов, также могут быть штаммами-хозяевами, являющимися штаммами видов нитчатых грибов, как, например, таковых из типа Basidiomycota или подтипа Mucormycotina. Такие организмы включают клетки нитчатых грибов, применяемые для получения коммерчески важных промышленных и фармацевтических белков, в том числе, но без ограничений, Agaricus spp., Phanerochaete spp., Schizophyllum spp., Rhizomucor spp. и Mucor spp. Конкретные организмы, из которых могут быть получены подходящие штаммы-хозяева, могут включать, но без ограничений, Agaricus bisporus, Phanerochaete chrysosporium, Schizophyllum commune, Rhizomucor miehei и Mucor circinelloides.
Можно ожидать, что в продуктах ферментации (например, в белковом препарате, в том числе, например, в культуральном бульоне), полученных из вышеперечисленных и других видов нитчатых грибов, будет существовать активность эндогенной ДНКазы на некотором уровне. Уровень активности ДНКазы и pH или температура, оптимальные для ДНКазы, могут варьировать между отдельными видами и среди всех видов. Тем не менее, корректировки, производимые в отношении pH, температуры и времени инкубирования, описываемые в данном документе, можно тестировать в целях определения необходимых условий для удаления ДНК в соответствии с настоящим раскрытием.
В конкретном варианте осуществления любого из способов по настоящему изобретению клетка-хозяин является клеткой T. reesei, хорошо известного нитчатого гриба. Примеры штаммов T. reesei включают № 13631 в ATCC, № 26921 в ATCC, № 56764 в ATCC, № 56765 в ATCC, № 56767 в ATCC и № 15709 в NRRL. Один пример клетки-хозяина получен из штамма RL-P37 T. reesei (описанного в Sheir-Neiss et al. (1984) Appl. Microbiol. Biotechnology 20:46-53). Другая клетка-хозяин представляет собой штамм Morph 1.1 (pyr+) T. reesei, спонтанный ревертант по pyr4 штамма RL-P37 T. reesei с делецией в четырех генах (описанного в патентной публикации по PCT WO 05/001036). Другие штаммы-хозяева, сходные с RL-P37, включают штамм RUT-C30 (№ 56765 в ATCC) и штамм QM9414 (№ 26921 в ATCC) T. reesei (longibrachiatum).
В определенных вариантах осуществления штамм-хозяин может подвергаться манипуляции с генами при помощи генной инженерии, классического мутагенеза или путем образования гибридов существующих штаммов. Генную инженерию можно применять для введения экзогенных генов или нокаута или нокдауна эндогенных генов. Мутагенез можно применять для подавления или нокаута эндогенных генов или, в некоторых клетках-хозяевах, изменения или усиления функции эндогенных генов. Примеры включают мутантов, характеризующихся сверхсинтезом, описанных, например, Bower и соавт. в патентной публикации по PCT WO2008/153903. Примеры также включают штаммы-хозяева, в которых различные нативные гены грибных клеток-хозяев были инактивированы. Инактивацию генов можно осуществлять при помощи полной или частичной делеции, при помощи инактивации вставкой или при помощи любых других способов, которые делают ген нефункциональным в отношении его предназначения (так что экспрессия функционального белка с помощью данного гена предотвращается). Примеры способов инактивации генов можно найти, например, в патентах США №№ 5246853 и 5475101 и в патентной публикации по PCT WO 92/06209. У некоторых хозяев можно инактивировать один или несколько генов, кодирующих целлюлолитические ферменты, такие как эндоглюканазы (EG) и экзоцеллобиогидролазы (CBH) (например, cbh1, cbh2, egl1 или egl2). Например, в патенте США № 5650322 раскрыты штаммы, являющиеся производными RL-P37, с делециями как в гене cbh1, так и в гене cbh2. В конкретном примере “делеция в четырех генах” cbh1, cbh2, egl1 и egl2 описана в патенте США № 5847276 и в патентной публикации по PCT WO 05/001036. В еще одном дополнительном примере определенные клетки-хозяева можно подвергать манипуляциям таким образом, что они становятся штаммами с дефицитом или отсутствием протеаз, так что риск распада белков, представляющих интерес, экспрессируемых такими штаммами, снижается или уменьшается.
Как указано, способы по настоящему изобретению, такие как методы, описанные в EP658621 или патентной публикации по PCT WO2008065200, не требуют дополнения культуры клеток-хозяев экзогенной ДНКазой. Однако, хотя этого и не требуется, но можно применять клетки-хозяева, в которых одна или несколько экзогенных ДНКаз экспрессируется рекомбинантным путем, при условии, что активность ДНКаз, используемая в способе, не является преимущественно активностью экзогенной ДНКазы (ДНКаз). В некоторых таких клетках-хозяевах экзогенная ДНКаза не экспрессируется в активной форме (например, она экспрессируется в тельцах-включениях) или экспрессируется лишь незначительно. В некоторых таких клетках-хозяевах экзогенная ДНКаза не характеризуется внеклеточной секрецией (например, не имеет сигнального пептида). Если в культуральном бульоне или другом белковом препарате находится какая-либо экзогенная ДНКаза, то вклад такой экзогенной ДНКазы в распад ДНК хозяина составляет не более 49% (например, не более 49%, не более 45%, не более 40%, не более 35%, не более 30%, не более 25%, не более 20%, не более 15%, не более 10% или не более 5%) общей активности ДНКазы. Это можно продемонстрировать, показывая, что в условиях температуры и pH, применяемых в анализе (например, pH 7,0 при температуре 40°C), время, затрачиваемое на понижение содержания эндогенной ДНК до невыявляемого уровня, повышается не более чем на 49% (например, не более чем на 49%, не более чем на 45%, не более чем на 40%, не более чем на 35%, не более чем на 30%, не более чем на 25%, не более чем на 20%, не более чем на 15%, не более чем на 10% или не более чем на 5%) и предпочтительно повышается менее чем на 25% или 10% при отсутствии экзогенной ДНКазы (ДНКаз) по сравнению с таковым в случае ее (их) присутствия. Другими словами, за распад ДНК клетки-хозяина (например, T. reesei, A. niger, A. tubingensis, A. oryzae, G. emersonii, M. thermophila, P. funiculosum, F. venenatum, H. insolens и т.д.) в культуральном бульоне или другом белковом препарате преимущественно отвечает активность эндогенной ДНКазы.
Штамм-хозяин можно применять для экспрессии и предпочтительно секреции одного или нескольких эндогенных или экзогенных ферментов или комбинации эндогенных и экзогенных ферментов. Некоторые примеры типов ферментов, которые могут характеризоваться эндогенной или экзогенной экспрессией, включают амилолитические ферменты, протеолитические ферменты, ферменты целлюлазы, ферменты оксидоредуктазы и ферменты, разрушающие клеточную стенку растений. Более конкретно, такие ферменты включают амилазы, протеазы, ксиланазы, липазы, лакказы, фенолоксидазы, оксидазы, кутиназы, целлюлазы, гемицеллюлазы, эстеразы, пероксидазы, каталазы, глюкозооксидазы, фитазы, пектиназы, глюкозидазы, изомеразы, трансферазы, галактозидазы и хитиназы.
Альтернативно или дополнительно, штамм-хозяин можно сконструировать для экспрессии и предпочтительно секреции гормонов, ферментов, факторов роста, цитокинов, антител и т.п. Некоторые примеры гормонов, которые могут экспрессироваться, включают фолликулостимулирующий гормон, лютеинизирующий гормон, кортикотропин-высвобождающий фактор, соматостатин, гонадотропный гормон, вазопрессин, окситоцин, эритропоэтин, инсулин и т.п.
Факторы роста представляют собой белки, связывающиеся с рецепторами на поверхности клетки, преимущественно обусловливающие активацию пролиферации и/или дифференцировки клеток. Некоторые примеры экспрессируемых факторов роста включают тромбоцитарный фактор роста, эпидермальный фактор роста, фактор роста нервов, факторы роста фибробластов, инсулиноподобные факторы роста, трансформирующие факторы роста и т.п.
Цитокины представляют собой особое семейство факторов роста. Секретируемые преимущественно лейкоцитами, цитокины стимулируют как гуморальный, так и клеточный иммунные ответы, а также активацию фагоцитарных клеток. Некоторые примеры экспрессируемых цитокинов включают колониестимулирующие факторы, интерлейкины (IL-1 α и β, IL-2 - IL-13) и интерфероны (α, β и γ).
Клетки-хозяева также можно сконструировать для экспрессии антител. Человеческие, гуманизированные, химерные или венированные антитела являются предпочтительными. Антитела могут быть любого класса и изотипа, т.е. G1, 2, 3 и 4 и A, M, E или D.
В определенных вариантах осуществления сегмент нуклеиновой кислоты, кодирующий экзогенный белок, клонируют в вектор экспрессии. Сегмент нуклеиновой кислоты, кодирующий экзогенный белок, можно разместить в функциональной связи с сигнальным пептидом, придающим способность к секреции, или его можно разместить в функциональной связи с промотором и в некоторых случаях с другими регуляторными последовательностями для надлежащей экспрессии. Вектор экспрессии, кодирующий полипептид, можно вводить в клетку-хозяина путем трансфекции или трансформации при помощи стандартных методик, описанных, например, в Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Нуклеиновую кислоту также можно переносить в клетки посредством вектора на основе ретровируса (см., например, Ferry et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88: 8377-8381; и Kay et al. (1992) Human Gene Therapy 3: 641-647), вектора на основе аденовируса (см., например, Rosenfeld (1992) Cell 68: 143-155; и Herz and Gerard (1993) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90:2812-2816), рецепторно-опосредованного внедрения ДНК (см., например, Wu, and Wu (1988) J. Biol. Chem. 263:14621; Wilson et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 963-967; и патент США № 5166320), прямой инъекции ДНК (см., например, Acsadi et al. (1991) Nature 332: 815-818 и Wolff et al. (1990) Science 247:1465-1468) или бомбардировки частицами (биобаллистического способа) (см., например, Cheng et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90:4455-4459; Zelenin et al. (1993) FEBS Letts. 315: 29-32).
Можно применять как эписомные, так и интегрирующие векторы экспрессии. Для идентификации интегрантов, полученных с помощью интегрирующего вектора, ген, содержащий селектируемый маркер (например, устойчивости к лекарственным средствам), вводят в клетки-хозяева вместе с нуклеиновой кислотой, представляющей интерес. Примеры селектируемых маркеров включают маркеры, придающие устойчивость к определенным лекарственным средствам, таким как G418 и гигромицин. Селектируемые маркеры и нуклеиновую кислоту, представляющую интерес, можно вводить в отдельных векторах или в одном и том же векторе. Трансфицированные клетки-хозяева можно затем идентифицировать путем селекции клеток при помощи селектируемого маркера. Например, если селектируемый маркер кодирует ген, придающий устойчивость к неомицину, клетки-хозяева, в которые поместили нуклеиновую кислоту, можно идентифицировать по их росту в присутствии G418. Клетки, в которые внедрили селектируемый маркерный ген, выживут, тогда как остальные клетки погибнут.
После экспрессии полипептид можно очистить в соответствии с традиционными методами, включая аффинную очистку, осаждение при помощи сульфата аммония, ионообменную хроматографию или гель-электрофорез (см. в общем R. Scopes (1982) Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y.; Deutscher (1990) Methods in Enzymology Vol. 182:Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc. N.Y.). Альтернативно, полипептид после экспрессии можно подвергать минимальным манипуляциям или не подвергать таковым, так что его применяют в композиции, по существу аналогичной культуральному бульону, в котором содержатся клетки-хозяева, экспрессирующие его.
III. Культивирование клетки-хозяина, являющейся клеткой нитчатого гриба
Желаемые белки, такие как ферменты целлюлазы, кормовые ферменты или другие ферменты, могут вырабатываться клетками нитчатых грибов-хозяев (например, T. reesei, A. niger, A. tubingensis, A. oryzae, G. emersonii, M. thermophila, P. funiculosum, F. venenatum, H. insolens и т.д.) в условиях твердофазного или глубинного культивирования, в том числе с помощью способов периодического культивирования, культивирования с подпиткой и культивирования в непрерывном потоке. Культивирование с подпиткой широко применяют в связи с легкостью его контроля, получением постоянного количества продуктов и наиболее экономически выгодным применением всего оборудования.
Культивирование (иногда называемое ферментацией) можно производить в жидкой (например, в водной) среде или в твердой среде, и способ по настоящему изобретению применим к обеим. Культивирование в определенных типичных вариантах осуществления осуществляют в бульоне, содержащем водную среду с минеральными солями, органические факторы роста, материал, являющийся источником углерода или энергии, усваиваемый азот, молекулярный кислород и стартовый инокулят используемых видов грибов-хозяев. Минеральные среды в подходящем случае содержат определенное количество фосфора, магния, кальция, калия, серы и/или натрия в растворимых усваиваемых ионных и комбинированных формах, а также предпочтительно содержат следовые элементы, такие как медь, марганец, молибден, цинк, железо, бор и/или йод и другие, также в подходящей растворимой усвояемой форме. Минеральные питательные вещества могут способствовать должному росту микроорганизмов, максимизируя усвоение источника углерода и энергии клетками в ходе процесса микробной конверсии и обеспечивая достижение максимальных показателей урожая клеток.
Источником усвояемого азота может быть любое азотсодержащее соединение или соединения, способные высвобождать азот в форме, подходящей для утилизации микроорганизмом в ходе метаболизма. Хотя можно использовать разнообразные органические соединения, являющиеся источниками азота, такие как гидролизаты белков, обычно можно использовать недорогие азотсодержащие соединения, такие как аммиак, гидроксид аммония, мочевина или различные соли аммония, такие как фосфат аммония, сульфат аммония, пирофосфат аммония, хлорид аммония или различные другие соединения аммония. Газообразный аммиак сам по себе удобен для крупномасштабных операций, и его пузырьки можно пропускать через водный ферментационный раствор (ферментационную среду) в подходящем количестве. Аммиак также может содействовать регуляции pH.
Культивирование представляет собой аэробный способ, как правило, сопряженный с участием молекулярного кислорода, подаваемого в газе, содержащем молекулярный кислород, таком как воздух, воздух, обогащенный кислородом, или даже практически чистый молекулярный кислород, предоставляемого для поддержания содержимого ферментационного чана в условиях подходящего парциального давления кислорода, эффективного в содействии бурному росту видов микроорганизмов. По существу, при применении кислородсодержащего углеводородного субстрата потребность в кислороде для роста микроорганизмов снижается. Тем не менее, молекулярный кислород подают для роста, поскольку усвоение субстрата и соответствующий рост микроорганизмов отчасти представляют собой процесс окисления.
Хотя скорость аэрации может варьировать в пределах значительного диапазона, аэрацию, как правило, проводят при скорости, находящейся в диапазоне от около 0,5 до 10, предпочтительно от около 0,5 до 7 объемов (при используемом давлении и при 25°C) кислородсодержащего газа на объем жидкости в ферментере в минуту. Это количество основано на количестве воздуха с обычным содержанием кислорода, подаваемом в реактор, и в перерасчете на чистый кислород соответствующие диапазоны будут составлять от около 0,1 до 1,7 или предпочтительно от около 0,1 до 1,3 объема (при используемом давлении и при 25°C) кислорода на объем жидкости в ферментере в минуту.
Давление для ферментации также может варьировать в широком диапазоне. Значения давления обычно находятся в пределах диапазона от около 0 до 50 фунт/кв.дюйм изб., предпочтительно от около 0 до 30 фунт/кв.дюйм изб., более предпочтительно на уровне, по меньшей мере незначительно превышающем атмосферное давление, поскольку в этом случае можно достичь баланса между затратами на оборудование и эксплуатацию и растворимостью кислорода. Давление, превышающее атмосферное, является предпочтительным для повышения концентрации растворенного кислорода, что, в свою очередь, может оказать помощь в повышения темпа роста клеток. При более высоком давлении, однако, повышаются затраты на оборудование и эксплуатацию.
Температура ферментации может в некоторой степени варьировать. Например, для T. reesei температура, как правило, находится в пределах диапазона от около 20°C до около 40°C, как правило, предпочтительно в диапазоне от около 25°C до около 34°C. Предпочтительная температура ферментации для T. reesei находится в пределах диапазона от около 27°C до около 30°C.
Диапазон pH в водном растворе для микробиологической ферментации (ферментационной смеси) может, например, представлять собой диапазон от около 2,0 до около 8,0. Для нитчатых грибов pH обычно находится в диапазоне от около 2,5 до около 8,0; например, для T. reesei pH обычно находится в диапазоне от около 3,0 до около 7,0. Предпочтительный диапазон pH для T. reesei представляет собой диапазон от около 3,5 до около 5,0.
Хотя среднее время удержания ферментационной смеси в ферментере может в значительной степени варьировать, частично в зависимости от используемых температуры ферментации и культуры, оно обычно находится в диапазоне от около 24 до около 500 часов, предпочтительно от 24 до 400 часов. В определенных вариантах осуществления грибные клетки-хозяева культивируют в течение по меньшей мере 24 часов, например, в течение по меньшей мере 48 часов, по меньшей мере 72 часов или по меньшей мере 96 часов. Например, T. reesei предпочтительно культивируют в течение по меньшей мере 24 часов, как, например, в течение по меньшей мере 48 часов, по меньшей мере 72 часов или по меньшей мере 96 часов. Ферментацию предпочтительно продолжают до тех пор, пока плотность клеток и/или концентрация одного или нескольких секретируемых белков, представляющих интерес, не приблизится к предварительно определенному желаемому уровню. То, был ли достигнут этот желаемый уровень, можно определить при помощи периодического отбора образцов из ферментационного бака. Конкретный желаемый уровень плотности клеток и/или концентрации одного или нескольких секретируемых белков, представляющих интерес, может варьировать, и его можно установить с учетом ряда факторов. В определенных вариантах осуществления конкретный желаемый уровень можно установить на момент, когда продуктивность клетки-хозяина начинает падать. В определенных других вариантах осуществления конкретный желаемый уровень можно установить на момент, когда ферментационный бак становится слишком полным, чтобы предоставлять возможность продолжения эффективной ферментации. В еще нескольких дополнительных вариантах осуществления конкретный желаемый уровень можно гибко установить на момент, когда ферментационный бак попросту нужен для осуществления другого прогона ферментации. Конкретный желаемый уровень плотности клеток можно установить с учетом любого одного, двух или всех вышеописанных факторов.
В некоторых способах распада под действием ДНКазы любое повышение pH и/или температуры после ферментации оценивают относительно pH и температуры во время ферментации. Если pH или температура в течение периода ферментации изменяются значительно (т.е. более чем на 2°C или 0,5 единицы pH), то в качестве исходного уровня для сравнения применяют среднее значение pH или температуры в течение периода ферментации. Альтернативно, в частности, если pH или температура изменяются незначительно, то можно применять однократное измерение, например, в начале или конце периода ферментации.
Предпочтительно ферментацию проводят таким образом, чтобы количество углеродсодержащего субстрата регулировалось в качестве лимитирующего фактора, обеспечивая, таким образом, хорошую конверсию углеродсодержащего субстрата в клетках и избегая загрязнения клеток значительным количеством неконвертированного субстрата. Неконвертированные субстраты, однако, не представляют проблему, если такие субстраты являются водорастворимыми, поскольку любые остающиеся следовые количества таких субстратов без труда вымываются. Тем не менее, для субстратов, не являющихся водорастворимыми, может быть необходимым добавление стадий обработки продукта, таких как стадии подходящей промывки.
Часть материала, являющегося источником углерода и энергии, или весь материал и/или часть источника усвояемого азота, такого как аммиак, можно добавлять в водную минеральную среду перед подачей такой среды в ферментер.
Каждый из потоков, вводимых в реактор, предпочтительно регулируют при заданной скорости или в ответ на необходимость, определяемую путем отслеживания, например, концентрации углеродного и энергетического субстрата, pH, концентрации растворенного кислорода, кислорода или диоксида углерода в отходящих газах, отводимых из ферментера, плотности клеток, измеряемой при помощи светопропускания, или подобным образом. Интенсивность подачи различных материалов можно варьировать для того, чтобы добиться как можно более быстрого темпа роста клеток, что согласуется с эффективной утилизацией источника углерода и энергии, с получением как можно более высокого урожая клеток микроорганизмов по отношению к загрузке субстрата.
В процессе осуществления периодического культивирования или предпочтительного культивирования с подпиткой все оборудование, реактор или приспособление для ферментации, чан или контейнер, систему трубок, сопутствующие циркуляционные или охлаждающие устройства и т.п. первоначально стерилизуют, что можно выполнить, например, используя пар, как, например, при температуре около 121°C, в течение длительного периода, такого как, например, по меньшей мере 15 минут. В стерилизованный реактор затем инокулируют культуру выбранного микроорганизма в присутствии всех требуемых питательных веществ, включая кислород и углеродсодержащий субстрат.
Ферментативный бульон обычно содержит клеточный дебрис, в том числе клетки, различные суспендированные твердые вещества и другие примеси биомассы, включая ДНК грибов-хозяев, а также желаемые белки или белки, представляющие интерес. Предпочтительно, по меньшей мере около 40%, например, по меньшей мере около 50%, по меньшей мере около 75% или по меньшей мере около 90% общего экспрессируемого количества каждого желаемого белка секретируется в бульон к концу ферментации.
IV. Понижение содержания ДНК в белковом препарате, полученном из грибов
После того, как во время ферментации получили желаемую плотность клеток или концентрацию белка, бульон, применяемый в культивировании, или белковый препарат, полученный из него, можно затем подвергать обработке для понижения содержания ДНК в нем. Полагают, что типичный грибной организм-хозяин или клетка-хозяин (например, T. reesei, A. niger, A. tubingensis, A. oryzae, G. emersonii, M. thermophila, P. funiculosum, F. venenatum или H. insolens) может вырабатывать одну или несколько ДНКаз, которые могут присутствовать в бульоне с культурой клеток после секреции или в результате лизиса клеток, что обусловливает активность, направленную на распад ДНК. Содержание ДНК в белковом препарате, полученном таким образом из грибов, можно снизить исключительно или по меньшей мере преимущественно за счет активности эндогенной ДНКазы без экзогенной ДНКазы или при ее незначительном количестве в белковом препарате.
ДНК можно удалить из бульона после завершения ферментации без дополнительной обработки бульона. Альтернативно, для удаления клеток и клеточного дебриса из бульона (т.е. по меньшей мере понижения их количества в нем) перед удалением ДНК можно осуществлять по меньшей мере одну стадию разделения жидкой и твердой фазы. В некоторых способах после удаления клеток и твердых веществ белки в бульоне концентрируют и в некоторых случаях дополнительно очищают перед удалением ДНК. Однако во время любых стадий очистки, осуществляемых перед инкубированием для удаления ДНК, желаемый белок (белки) предпочтительно не следует отделять от ферментов с активностью ДНКазы, и в любом случае не следует устранять активность ДНКазы более чем на 10% (например, более чем на 20%, более чем на 30%, более чем на 40% или более чем на 50%). Аналогично, во время любых стадий, осуществляемых перед инкубированием для удаления ДНК, активность ДНКазы предпочтительно не должна инактивироваться, и в любом случае активность ДНКазы не должна инактивироваться более чем на 10% (например, более чем на 20%, более чем на 30%, более чем на 40% или более чем на 50%).
Клетки и клеточный дебрис можно удалять с помощью традиционных методик разделения жидкой и твердой фазы, таких как, например, центрифугирование, фильтрация, диализ, микрофильтрация, вакуум-фильтрация во вращающемся барабане или другие известные способы, с получением бесклеточного фильтрата. Ферментативный бульон или бесклеточный фильтрат можно дополнительно концентрировать при помощи методик, таких как, например, ультрафильтрация, выпаривание или осаждение. Белковые компоненты надосадочной жидкости или фильтрата можно осаждать с помощью соли, например, сульфата аммония, с последующей очисткой при помощи различных традиционных методов очистки, таких как ионообменная хроматография, аффинная хроматография или подобные традиционные методы.
Для понижения содержания ДНК в белковом препарате, полученном из грибов (например, в белковом препарате из T. reesei, A. niger, A. tubingensis, A. oryzae, G. emersonii, M. thermophila, P. funiculosum, F. venenatum или H. insolens), pH и/или температуру белкового препарата корректируют, как правило, повышают, для того, чтобы повысить активность ДНКазы гриба в препарате. pH перед стадией корректировки, как правило, является неизменным по сравнению с таковым во время ферментации. Температура перед стадией корректировки, как правило, варьирует в диапазоне от температуры культивирования до комнатной температуры в зависимости от того, как долго охлаждался бульон перед корректировкой температуры, если это вообще происходило. Белковый препарат затем инкубируют при скорректированных pH и/или температуре в течение периода, достаточного для поддающегося выявлению понижения содержания ДНК, и предпочтительно понижения содержания ДНК до невыявляемого уровня. В некоторых способах корректировка pH или температуры состоит в повышении pH и/или температуры с повышением относительно значений, применяемых в ферментации (как правило, pH 4,0-5,0 и температура 27-30°C). Сочетание повышенных значений pH и температуры является эффективным, но не всегда необходимым. Например, полного распада ДНК можно достичь с применением только повышенного pH, сохраняя в то же время температуру белкового препарата низкой (например, 10°C или 4°C) или поддерживая ее неизмененной или соответствующей комнатной температуре (например, температура в пределах диапазона 4°C-27°C). Также можно обеспечить распад ДНК с применением только повышенной температуры, сохраняя в то же время pH белкового препарата низким (например, pH 4-5) или поддерживая его неизменным по сравнению с применяемым в ферментации. Активность эндогенной ДНКазы в белковом препарате, полученном из грибов, можно выявить при помощи анализа, раскрытого, например, в Sinicropi, D., et al., (1994) Anal. Biochem. 222:351-358, или в Tolun, G. and Myers, R.S. (2003) Nucleic Acids Research 31: e111. Такой анализ можно применять для определения pH и/или температуры, оптимальных для активности эндогенной ДНКазы.
Повышенный pH для удаления ДНК может находиться в диапазоне от 5,0 до 9,0 и предпочтительно находится в диапазоне от 6,0 до 8,0. Некоторые примеры диапазонов pH для удаления ДНК включают от 5,0 до 6,0, от 5,2 до 7,8, от 5,5 до 7,5, от 6,0 до 7,0, от 6,5 до 7,5, от 7,0 до 8,0 и от 8,0 до 9,0.
Повышенная температура для удаления ДНК может находиться в диапазоне от 30°C до 70°C и предпочтительно находится в диапазоне от 35°C до 47°C. Некоторые примеры диапазонов температуры для удаления ДНК включают от 30°C до 40°C, от 40°C до 50°C, от 50°C до 60°C и от 60°C до 70°C. Для термофильных или термостабильных белков, экспрессируемых рекомбинантным путем нитчатыми грибами-хозяевами (например, T. reesei, A. niger, A. tubingensis, A. oryzae, G. emersonii, M. thermophila, P. funiculosum, F. venenatum или H. insolens), можно применять более высокую температуру. Термостабильность ДНКазы конкретного гриба-хозяина также является определяющим фактором применения такой более высокой температуры. Например, такая более высокая температура может быть не выше чем около 66°C, такой как не выше чем около 60°C, 58°C, 55°C или 52°C.
Белковый препарат можно инкубировать при повышенном pH в сочетании с различными диапазонами температуры. Например, pH можно повышать до диапазона от 5,2 до 7,8, от 5,5 до 7,5, от 5,5 до 6,5, от 6,5 до 7,5 или от 7,5 до 8,5 при температуре, поддерживаемой в диапазоне от 0°C до 5°C, от 5°C до 15°C, от 15°C до 25°C, от 25°C до 35°C, от 35°C до 45°C или от 45°C до 55°C. Аналогично, белковый препарат можно инкубировать при повышенной температуре в сочетании с различными диапазонами pH. Например, температуру можно повышать до диапазона от 25°C до 35°C, от 35°C до 45°C или от 45°C до 55°C при pH, поддерживаемом в диапазоне от 3,5 до 4,5, от 4,5 до 5,5, от 5,5 до 6,5, от 6,5 до 7,5 или от 7,5 до 8,5.
Если удаление ДНК при помощи ДНКазы осуществляется в концентрате белка, полученном путем ультрафильтрации, концентрат после ультрафильтрации, как правило, имеет комнатную температуру. В этом случае температуру можно повысить выше комнатной температуры и/или pH можно повысить выше pH, применяемых в ферментации с участием грибов-хозяев.
Время инкубирования для удаления ДНК во время стадии корректировки может в значительной степени варьировать, частично в зависимости от желаемой степени понижения содержания ДНК и чувствительности желаемых белков к температуре и pH, применяемым для удаления ДНК. Удаление ДНК до невыявляемого уровня является предпочтительным. Также предпочтительной является небольшая потеря активности желаемого белка (белков) или отсутствие таковой. Предпочтительно, оптимизированные условия инкубирования обусловливают отсутствие потери или незначительную потерю стабильности или активности белка, например, потерю активности желаемого белка (белков), составляющую менее чем 1%, 2%, 5%, 10%, 15% или 20%. Стабильность или активность белка можно необязательно оценивать перед и/или после инкубирования. Период времени, необходимый для удаления ДНК при инкубировании, также зависит от pH и/или температуры во время удаления ДНК, при этом, по мере того как pH опускается ниже 7, а температура опускается ниже 40°C, требуется больше времени. Период времени обычно составляет по меньшей мере 10, 20, 30, 60, 120, 180, 240 минут и вплоть до 4, 6, 12, 24 или 48 часов, включая все перестановки нижнего и верхнего пределов. Время инкубирования также может быть больше 48 часов. Предпочтительное время инкубирования составляет 2-8 часов. Предпочтительно, стадию корректировки pH и/или температуры осуществляют перед тем, как фермент (ферменты), вырабатываемый (вырабатываемые) клеткой-хозяином, применяют для обработки намеченного субстрата или воздействия на него.
Содержание ДНК в белковом препарате (например, в культуральном бульоне) можно также оценивать перед или после стадий инкубирования или корректировки. Любой сегмент ДНК гриба-хозяина можно применять в качестве маркера общего содержания ДНК в препарате. Предпочтительно, применяют сегмент генома. Можно необязательно выявлять более одного сегмента.
ПЦР-амплификация является подходящим и предпочтительным способом анализа содержания нуклеиновой кислоты (например, ДНК). Праймеры могут предназначаться для фланкирования подходящего сегмента геномной ДНК (например, полную геномную последовательность T. reesei можно получить на веб-сайте Объединенного института генома Министерства энергетики США, а полную геномную последовательность Aspergillus sp. можно получить в базе данных по геному Aspergillus, организованной школой медицины Мэрилендского университета и кафедрой генетики школы медицины Стэндфордского университета, а также на веб-сайте проекта "Fungal Genome Initiative" Института Брода). Выявление с помощью ПЦР может быть качественным или количественным. Осуществляя амплификацию с последующим выявлением продукта амплификации, при наличии такового, с помощью окрашивания геля бромистым этидием, можно получить свидетельства наличия или отсутствия соответствующего маркера, но при этом не будет обеспечиваться точное измерение количества такого маркера. Наличие ДНК также можно выявлять с помощью гель-электрофореза и окрашивания бромистым этидием без ПЦР-амплификации. ДНК показана с помощью характерного пятна или полос лэддера.
При количественной амплификации количество продукта амплификации пропорционально количеству матрицы в исходном образце, и выявление происходит в режиме реального времени. Сравнение с соответствующими контрольными образцами обеспечивает меру числа копий амплифицированных сегментов ДНК. Подробные протоколы количественной ПЦР приведены в Innis et al. (1990) PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc. N.Y.
Другие способы амплификации, подходящие для применения в выявлении, включают лигазную цепную реакцию (LCR) (см. Wu and Wallace (1989) Genomics 4: 560, Landegren et al. (1988) Science 241: 1077 и Barringer et al. (1990) Gene 89: 117), транскрипционную амплификацию (Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173), самоподдерживающуюся репликацию последовательностей (Guatelli et al. (1990) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 87: 1874), точечную ПЦР и ПЦР с применением линкеров и адаптеров.
TM
Наличие или уровень ДНК в белковом препарате (например, в культуральном бульоне) также можно оценить с помощью, например, гибридизационных анализов. Способы, такие как Саузерн-блоттинг, описаны, например, в Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d Ed., vols 1-3, Cold Spring Harbor Press, New York). Также доступны коммерческие наборы для анализа ДНК, такие как набор для анализа ДНК Quant-iT, поставляемый InVitrogen Corporation (Карлсбад, Калифорния).
Обработка бульона или другого белкового препарата при помощи способов по настоящему изобретению обусловливает выявляемое понижение содержания ДНК, и предпочтительно содержание ДНК снижается до невыявляемого уровня. Уровень считается невыявляемым, если ПЦР-амплификация любого сегмента геномной ДНК, присутствующего в виде одной копии в гаплоидном геноме, с последующим окрашиванием бромистым этидием не дает видимую полосу (при применении условий ПЦР, описанных в настоящих Примерах). В примере типичного нормативного требования в “отсутствии выявляемой ДНК в конечном продукте” можно удостовериться при помощи анализа на основе ПЦР с пределом выявления, составляющим, например, 1-5 нг общей ДНК нитчатых грибов/мл ферментного препарата. В другом примере можно установить пределы выявления общей ДНК нитчатых грибов, составляющие 20 пг/мл, или 2 нг/мл, или 10 нг/мл, в зависимости от формы состава и/или применения конечного продукта. В определенных других примерах при помощи способа по настоящему изобретению, например, путем увеличения времени инкубирования при повышенной температуре и/или при повышенном pH можно достичь еще более низкого предела, составляющего около 500 фемтограммов общей ДНК нитчатых грибов/г лиофилизированного продукта (например, менее чем около 450 фг ДНК на г лиофилизированного продукта, менее чем около 400 фг/г, менее чем около 350 фг/г, менее чем около 300 фг/г, менее чем около 250 фг/г или даже менее чем около 200 фг/г). В дополнение, также предполагается применение настоящего способа в сочетании с традиционными способами удаления ДНК из культуральных бульонов или других белковых препаратов. Например, описанный в данном документе способ можно применять для понижения уровня ДНК в культуральном бульоне с последующим добавлением небольших количеств экзогенной ДНКазы для того, чтобы дополнительно удалить остаточную ДНК из такого бульона при условии, что вклад такой экзогенной ДНКазы в распад составляет не более 49% (например, не более 49%, не более 45%, не более 40%, не более 35%, не более 30%, не более 25%, не более 20%, не более 15%, не более 10% или не более 5%) общей активности ДНКазы.
После удаления ДНК из белкового препарата (в том числе, например, из культурального бульона) может быть предоставлена возможность падения температуры в случае, если она была повышенной во время удаления ДНК, до более низкой температуры, например, до комнатной температуры, или охлаждения до более низкой температуры, составляющей 4°C, или другой температуры, подходящей для хранения препарата. Повторная корректировка pH препарата до другого значения обычно не является необходимой. Однако, если дальнейшее составление или другие процедуры требуют конкретного значения pH, pH препарата можно откорректировать до желаемого значения.
Поскольку можно ожидать, что продукты ферментации или бульон, в котором содержатся другие рекомбинантные клетки-хозяева, являющиеся клетками нитчатых грибов, обладают активностью эндогенной ДНКазы на некотором уровне так же, как и культуральный бульон, в котором содержится T. reesei, способ, описанный в данном документе, можно в равной степени применять для удаления ДНК из таких бульонов или других белковых препаратов. Поскольку можно ожидать, что уровень активности ДНКазы и pH или температура, оптимальные для эндогенных ДНКаз, могут варьировать среди видов, специалист в данной области может установить корректировку pH и/или корректировку температуры, а также период инкубирования, необходимый для удаления молекул ДНК, применяя идеи, изложенные в данном документе, без обширного экспериментирования.
V. Составление
После распада ДНК гриба-хозяина в белковом препарате (в том числе, например, в культуральном бульоне) препарат можно упаковать для продажи или применять по сути как есть с минимальной дополнительной переработкой или без таковой, или белковый препарат можно дополнительно очищать или иным способом перерабатывать и/или составлять для дальнейших путей применения. Белок (белки) или белковые препараты можно составлять, например, в виде жидкости, жидкой массы, порошка, распыляемого раствора, суспензии, лиофилизированной композиции/состава, твердого вещества, гранулы, таблетки с желатиновой оболочкой, пилюли, имплантата, геля или в виде фармацевтического состава, пищи, корма, пищевой биологически активной добавки, кормовой биологически активной добавки, пищевой добавки, кормовой добавки, питательной добавки или диетической добавки к ним.
VI. Пути применения белков
Белок (белки) или белковые препараты (например, бульон), полученные с помощью способов по настоящему изобретению, имеют пути применения в сельском хозяйстве, промышленности, медицине и питании. Например, ферменты целлюлазы можно применять для получения глюкозы из зерна или в качестве биологически активной добавки к корму животных для уменьшения выработки фекальных отходов жизнедеятельности путем увеличения перевариваемости корма. Ферменты целлюлазы также можно применять для повышения эффективности спиртового брожения (например, в пивоварении) путем конверсии лигноцеллюлозной биомассы в ферментируемые сахара. Препарат фитазы можно применять в мокром помоле зерна, кормах для животных и чистящих средствах. Фитазы, фитаты и производные фитатов, являющиеся низшими фосфатами, также находят много других путей применения в средствах личной гигиены, медицинских продуктах и пищевых и питательных продуктах, а также в различных путях применения в промышленности, в частности, в области очистки, текстильной промышленности, литографической печати и химии. Липазы можно применять в различных путях применения, связанных с пищей/кормом, выпеканием, очисткой и/или биологическим топливом. Белки, такие как гормоны, факторы роста, цитокины и антитела, можно применять в лечении и профилактике заболеваний.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
Часть A
Рекомбинантный штамм T. reesei, экспрессирующий фитазу Buttiauxella sp., культивировали в биореакторе. Кассету экспрессии, вырабатывающую фитазу, получали в соответствии с протоколами, описанными в публикации патента США US2009/0098249. Кассету экспрессии затем вводили в штамм-хозяин, полученный из варианта “с делецией в четырех генах” (где в генах четырех основных секретируемых целлюлаз CBHI (cel7a), CBHII (cel6a), EGI (cel7b), EGII (cel5a) произошли делеции) штамма RL-P37 T. reesei (Sheir-Neiss and Montenecourt, 1984, Appl. Microbiol. Biotechnol. 20:46-53). Биореактор эксплуатировали согласно описанному в публикации патента US20040121446 (соответствующее раскрытие которой включено в данный документ посредством ссылки).
После роста в биореакторе надосадочную жидкость культуры получали путем фильтрации для удаления клеток T. reesei. Надосадочную жидкость концентрировали приблизительно в четыре раза путем ультрафильтрации. Как бензоат натрия, так и сорбат калия добавляли до конечной концентрации 0,3%, и pH корректировали до 5,5, обеспечивая концентрат, полученный путем ультрафильтрации (UFC), который применяли в нижеописанных экспериментах.
Фрагмент ДНК размером 1526 п.о. (стандартная добавка ДНК) получали с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и очищали при помощи набора для очистки продуктов ПЦР от Qiagen (Валенсия, Калифорния) согласно инструкциям производителя. Эту стандартную добавку ДНК добавляли к образцам UFC при конечной концентрации 1 мкг/мл. Олигонуклеотидные праймеры, применяемые в ПЦР, можно применять для образования такого же фрагмента ДНК, применяя в качестве матрицы либо геномную ДНК штамма T. reesei, выращиваемого в биореакторе, либо очищенную плазмидную ДНК, содержащую такую же последовательность ДНК-матрицы. ДНК-последовательность стандартной добавки ДНК неважна. Любой участок геномной ДНК T. reesei можно применять в качестве матрицы, а праймеры можно разработать с помощью традиционных методов.
Метод тестирования наличия ДНК хозяина в образцах UFC состоит в следующем. ДНК очищали из 50 мкл образцов UFC (к которым при необходимости добавляли стандартную добавку препарата ДНК) при помощи набора Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System от Promega (Мэдисон, Висконсин) согласно инструкциям производителя. Вкратце, 50 мкл образца UFC смешивали с 450 мкл раствора для связывания с мембранами от Promega и эту смесь загружали в миниколонку Wizard SV. После промывки миниколонки с помощью раствора для промывки мембран любую ДНК, связавшуюся с мембраной миниколонки, в конечном счете элюировали водой, не содержащей нуклеаз. Выявление ДНК в элюированном образце осуществляли с помощью ПЦР, применяя те же праймеры, которые применяли для образования стандартной добавки ДНК, с последующей визуализацией фрагментов ДНК с помощью электрофореза в агарозном геле и окрашивания бромистым этидием. В продуктах ПЦР часто наблюдали две полосы ДНК, предположительно в связи с некоторым неспецифическим связыванием праймеров.
Часть B
Образец UFC, содержащий выявляемую ДНК, выбирали с помощью анализа по методу ПЦР без добавления стандартной добавки ДНК (фигура 1, дорожка 1). К этому UFC добавляли стандартную добавку ДНК до конечной концентрации 1 мкг/мл, и было видно, что количество полученного продукта ПЦР увеличивалось (фигура 1, дорожка 2). UFC (без стандартной добавки ДНК) доводили до pH 3,0, pH 4,5 или pH 7,0 и инкубировали при 10°C в течение 1 часа. ДНК оставалась выявляемой с помощью анализа по методу ПЦР после инкубирования при pH 3,0 и pH 4,5, но не после инкубирования при pH 7,0. UFC (без стандартной добавки ДНК) доводили до pH 4,5 или pH 7,0 и инкубировали при 40°C в течение 24 часов, после чего ДНК нельзя было выявить с помощью анализа по методу ПЦР.
Часть C
К образцу UFC при pH 5,5 добавляли стандартную добавку ДНК при конечной концентрации 1 мкг/мл. Образец инкубировали при 40°C в течение 0, 4, 8, 12, 24 или 48 часов. Стандартная добавка ДНК была выявляемой с помощью анализа по методу ПЦР без инкубирования (фигура 2, дорожка 1). Однако через 4 часа инкубирования стандартную добавку ДНК больше нельзя было выявить (фигура 2, дорожка 2). При инкубировании в течение до 24 часов не наблюдали потери активности фитазы. Такой же образец UFC со стандартной добавкой ДНК инкубировали в течение 7 дней при 4°C или комнатной температуре, после чего ДНК нельзя было выявить с помощью анализа по методу ПЦР (фигура 2, дорожки 7 и 8).
Часть D
К образцу UFC при pH 5,5 добавляли стандартную добавку ДНК при конечной концентрации 1,45 мкг/мл. Образец инкубировали при 10°C, или 22°C, или 37°C в течение 0, 4, 8, 12 или 24 часов с последующим анализом по методу ПЦР для выявления стандартной добавки ДНК.
После инкубирования в течение 8 часов при 10°C ДНК была выявляемой с помощью ПЦР (фигура 3, дорожка 4), и даже через 24 часа при 10°C наблюдали следовые количества продукта ПЦР (фигура 3, дорожка 5). После инкубирования в течение 8 часов при 22°C ДНК была выявляемой с помощью ПЦР (фигура 3, дорожка 9), но через 24 часа при 22°C продукт ПЦР не наблюдали (фигура 3, дорожка 10). После инкубирования в течение 2 или 4 часов при 37°C наблюдали следовые количества продукта ПЦР (фигура 3, дорожки 12 и 13), но через 8 часов при 37°C ДНК не выявляли (фигура 3, дорожка 14). В контрольном эксперименте, включающем стандартную добавку ДНК в воде, была четко показана выявляемая ДНК после инкубирования в течение 24 часов при 37°C, что подтвердило, что потеря ДНК была обусловлена компонентами UFC (фигура 3, дорожка 16).
Пример 2
Рекомбинантный штамм T. reesei, экспрессирующий липазу Aspergillus tubingensis, культивировали в биореакторе. Кассету экспрессии, вырабатывающую липазу, получали в соответствии с протоколами, описанными в публикации патента США WO 2010/122531. Кассету экспрессии затем вводили в штамм-хозяин, полученный из варианта “с делецией в четырех генах” (где в генах четырех основных секретируемых целлюлаз CBHI (cel7a), CBHII (cel6a), EGI (cel7b), EGII (cel5a) произошли делеции) штамма RL-P37 T. reesei (Sheir-Neiss and Montenecourt, 1984, Appl. Microbiol. Biotechnol. 20:46-53). Биореактор эксплуатировали согласно описанному в публикации патента US20040121446 (соответствующее раскрытие которой включено в данный документ посредством ссылки).
После роста в биореакторе надосадочную жидкость культуры получали путем фильтрации для удаления клеток T. reesei. Надосадочную жидкость концентрировали приблизительно в четыре раза путем ультрафильтрации с образованием концентрата, полученного путем ультрафильтрации (UFC), который применяли в дальнейших экспериментах.
Для экстракции ДНК из образцов UFC применяли набор Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System от Promega (Мэдисон, Висконсин) согласно указаниям производителя. Вкратце, 100 мкл образца UFC смешивали с 450 мкл раствора для связывания с мембранами от Promega, и эту смесь загружали в миниколонку Wizard SV. После промывки миниколонки с помощью раствора для промывки мембран любую ДНК, связавшуюся с мембраной миниколонки, в конечном счете элюировали водой, не содержащей нуклеаз. Выявление ДНК в элюированном образце осуществляли с помощью электрофореза в агарозном геле и окрашивания бромистым этидием. В образцах UFC часто наблюдали пятно, соответствующее фрагментам ДНК с низким молекулярным весом (приблизительно 300 п.о. и менее), и они предположительно были получены из фрагментированной геномной ДНК T. reesei.
Тестировали различные методы обработки UFC и наблюдали их эффекты в отношении относительного количества ДНК, извлеченной из UFC. Исходное значение pH UFC составляло приблизительно 4,0 (контрольный UFC). Корректировали pH образцов UFC до 5,2, 6,3 или 7,6. Контрольный UFC и UFC со скорректированными значениями замораживали непосредственно после корректировки pH либо инкубировали в течение 24 часов при 4°C или комнатной температуре и замораживали до проведения дальнейшего анализа. Все образцы затем анализировали с помощью электрофореза в агарозном геле. Результаты показаны на фигурах 4A и 4B. Инкубирование контрольного UFC или UFC с pH, скорректированным до 5,2, не оказывало явного эффекта в отношении наличия ДНК. Инкубирование UFC с pH, скорректированным до 6,3, вызывало небольшое понижение содержания ДНК. Инкубирование UFC с pH, скорректированным до 7,6, вызывало явное понижение содержания ДНК, так что через 24 часа при комнатной температуре пятно ДНК нельзя было выявить с помощью электрофореза в агарозном геле.
Все патенты и публикации, в том числе все последовательности, раскрытые в этих патентах и публикациях, о которых идет речь в данном документе, в явной форме включены посредством ссылки во всей своей полноте во всех отношениях. Хотя были описаны предпочтительные способы и материалы, любые способы и материалы, подобные или эквивалентные описанным в данном документе, можно применять при практическом осуществлении или тестировании настоящего изобретения. Если из контекста явно не следует иное, любой вариант осуществления, аспект, стадию, признак, элемент или ограничение можно применять в сочетании с любым другим.