КОМПОЗИЦИЯ НА ОСНОВЕ СИНТЕТИЧЕСКИХ ПЕПТИДОВ И ЛИПИДОВ ДЛЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ГЕПАТИТА С
COMPOSITION BASED ON SYNTHETIC PEPTIDES AND LIPIDS FOR C HEPATITIS VACCINE

Описание изобретения
Изобретение относится к области иммунологии, биотехнологии и медицины и касается состава композиции, которая может быть использована для разработки вакцины против гепатита С, направленной на выработку специфичного гуморального иммунного ответа с образованием антител, связывающих вирус гепатита С.
Более конкретно, изобретение представляет собой композицию, содержащую пять синтетических пептидных антигенов следующих структур: 1) ацетил-тирозил-пролил-тирозил-аргинил-лейцил-триптофил-гистидил-тирозил-пролил-глицил-глицил-серил-треонил-глицил-лейцил-изолейцил-гистидил-лейцил-гистидил-глутаминил-аспарагинил-изолейцил-валил-аспартил-валил-глутаминил-тирозил-лейцил-тирозил-глицин, 2) ацетил-аргинил-пролил-тирозил-цистеинил-триптофил-гистидил-тирозил-аланил-пролил-аргинил-серил-цистеинил-глицил-глицил-валил-цистеинил-глицил-пролил-валил-тирозил-цистеинил-фенилаланил-треонил-пролил-серил-пролил-валил-валил-валил-глицил-треонил-треонил-аспарагиновая кислота, 3) ацетил-глицил-серил-триптофил-гистидил-изолейцил-аспарагинил-серил-треонил-аланил-лейцил-аспарагинил-глицил-глицил-серил-треонил-глицил-лейцил-изолейцил-гистидил-лейцил-гистидил-глумаминил-аспарагинил-изолейцил-валил-аспартил-валил-глутаминил-тирозил-лейцил-тирозил-глицин, 4) ацетил-глицил-серил-триптофил-гистидил-изолейцил-аспарагинил-аргинил-треонил-аланил-лейцил-аспарагинил-глицил-глицил-валил-цистеинил-глицил-пролил-валил-тирозил-цистеинил-фенилаланил-треонил-пролил-серил-пролил-валил-валил-валил-глицил-треонил-треонил-аспарагиновая кислота, 5) серил-треонил-глицил-лейцил-изолейцил-гистидил-лейцил-гистидил-глутаминил-аспарагинил-изолейцил-валил-аспартил-валил-глутаминил-тирозил-лейцил-тирозил-глицил-цистеинил-пролил-тирозил-аспартил-цистеинил-фенилаланил-аргинил-лизил-гистидил-пролил-глутамил-аланил-треонил-тирозин, не обладающих антигенностью при введении в виде индивидуальных препаратов или смеси вне состава композиции, а также сквален, фосфолипид Липоид С100, твин 80, мальтозу, полученная после лиофилизации водного раствора, содержащего синтетические пептидные антигены 0,002-0,01 мас. %, сквален 0,2 мас. %, фосфолипид Липоид С100 0,02 мас. %, твин 80 0,4 мас. %, мальтозу 10 мас. %, воду для инъекций до 100%.
Отличительной характеристикой данной композиции является способность при введении в виде водного раствора вызывать образование в организме млекопитающих (мышей и кроликов) антител, принадлежащих к классу иммуноглобулинов G, которые связывают оболочечные белки вируса гепатита С и сам вирус гепатита С из плазмы крови больных.
Предпосылки создания изобретения.
По оценке ВОЗ доля инфицированных вирусом гепатита С (ВГС) в человеческой популяции составляет около 3% (1). Эта инфекция представляет серьезную угрозу здоровью людей из-за высокой вероятности (до 85%) возникновения хронического гепатита С, неизбежно приводящего в дальнейшем к развитию печеночной недостаточности, цирроза, в некоторых случаях - первичного рака печени, а также к системному поражению организма (1). Хотя ВГС был впервые обнаружен и выделен в 1988 г., вакцина против вызываемого им заболевания на рынке пока не появилась. Тому есть объективные причины: а) высокая степень генетического разнообразия и изменчивости ВГС, особенно белков его оболочки, ответственных за проникновение вируса в клетку-мишень (2), б) недостаточна информация о рецепторах ВГС и взаимодействии вируса с иммунной системой организма-хозяина (3), в) чрезвычайная сложность культивирования вируса в лабораторных условиях и г) отсутствие лабораторных моделей ВГС-инфекции на мелких животных (4).
Показано, что в нейтрализации ВГС участвуют как клеточный, так и гуморальный механизмы адаптивного иммунитета (5). Первый реализуется посредством участия хелперных и цитотоксических Т-лимфоцитов, второй -посредством секреции специфичных антител образованными из В-лимфоцитов плазматическими клетками с участием Т-хелперных лимфоцитов. Разрабатываемые в мире вакцины против гепатита С направлены на стимуляцию либо одного, либо другого, либо обоих вместе механизмов иммунного ответа. По составу иммуногенов разрабатываемые вакцины против гепатита С можно разделить на: 1) рекомбинантные вакцины, содержащие рекомбинантные белки вируса либо их слитые фрагменты, а также системы их доставки, которыми могут быть липопротеидные вирусоподобные частицы, например, виросомы, липосомы, мицеллы (3, 6); 2) ДНК-вакцины - плазмиды, несущие один или несколько генов белков ВГС, вместе с системой доставки этих генов, которой может быть другой аттенуированный вирус, например, вирус осповакцины (3, 7); 3) пептидные вакцины - полученные химическим синтезом В- и/или Т-эпитопы консервативной структуры из белков ВГС, снабженные системой доставки и стимуляции иммунного ответа (8). Первый тип направлен на формирование гуморального протективного ответа против ВГС, второй - на формирование и гуморального, и цитотоксического ответа. Ответ на третий тип вакцин зависит от типа использованных эпитопов.
Существенным недостатком рекомбинантных вакцин, ДНК-вакцин, несущих гены целых белков, является специфичность в отношении узкого круга генетических вариантов ВГС (3). При использовании ДНК-вакцин существует риск проникновения в организм чужеродного генетического материала и посторонних патогенов и реактогенов. Все большее внимание привлекают технические решения разработки вакцин против гепатита С на основе фрагментов белков ВГС, в частности, полученных химическим синтезом пептидов.
Вакцины на основе синтетических пептидов обладают целым рядом преимуществ: а) безопасность технологий их производства; б) высокая степень стандартизации препаратов; в) формирование иммунного ответа на те фрагменты белка-антигена, которые в составе целой молекулы обладают слабой иммуногенностью; г) отсутствие высокореактогенных компонентов; д) исключение фрагментов антигенов, вызывающих аллергические и аутоиммунные реакции; е) возможность совмещения в одной молекуле эпитопов разных белков-антигенов (9).
Сущность изобретения.
Задачей настоящего изобретения является разработка композиции на основе синтетических пептидов, составленных из фрагментов оболочечного белка Е2 ВГС, липидов и вспомогательных соединений, способной при парентеральном введении вызывать образование специфичных антител класса иммуноглобулинов G, связывающих ВГС.
Указанная задача решается включением в состав композиции следующих соединений:
- эквимолярной смеси пяти синтетических пептидов, составленных из фрагментов оболочечного белка Е2 ВГС и имеющих следующие структуры: 1) ацетил-тирозил-пролил-тирозил-аргинил-лейцил-триптофил-гистидил-тирозил-пролил-глицил-глицил-серил-треонил-глицил-лейцил-изолейцил-гистидил-лейцил-гистидил-глутаминил-аспарагинил-изолейцил-валил-аспартил-валил-глутаминил-тирозил-лейцил-тирозил-глицин, 2) ацетил-аргинил-пролил-тирозил-цистеинил-триптофил-гистидил-тирозил-аланил-пролил-аргинил-серил-цистеинил-глицил-глицил-валил-цистеинил-глицил-пролил-валил-тирозил-цистеинил-фенилаланил-треонил-пролил-серил-пролил-валил-валил-валил-глицил-треонил-треонил-аспарагиновая кислота, 3) ацетил-глицил-серил-триптофил-гистидил-изолейцил-аспарагинил-серил-треонил-аланил-лейцил-аспарагинил-глицил-глицил-серил-треонил-глицил-лейцил-изолейцил-гистидил-лейцил-гистидил-глумаминил-аспарагинил-изолейцил-валил-аспартил-валил-глутаминил-тирозил-лейцил-тирозил-глицин, 4) ацетил-глицил-серил-триптофил-гистидил-изолейцил-аспарагинил-аргинил-треонил-аланил-лейцил-аспарагинил-глицил-глицил-валил-цистеинил-глицил-пролил-валил-тирозил-цистеинил-фенилаланил-треонил-пролил-серил-пролил-валил-валил-валил-глицил-треонил-треонил-аспарагиновая кислота, 5) серил-треонил-глицил-лейцил-изолейцил-гистидил-лейцил-гистидил-глутаминил-аспарагинил-изолейцил-валил-аспартил-валил-глутаминил-тирозил-лейцил-тирозил-глицил-цистеинил-пролил-тирозил-аспартил-цистеинил-фенилаланил-аргинил-лизил-гистидил-пролил-глутамил-аланил-треонил-тирозин в суммарном содержании пептидов в составе водного раствора композиции 0,002-0,01 мас. %,
- липида сквалена в содержании в составе водного раствора композиции 0,2 мас. %,
- фосфолипида Липоид С100 в содержании в составе водного раствора композиции 0,02 мас. %,
- вспомогательного соединения твина 80 в содержании в составе водного раствора композиции 0,4 мас. %,
- вспомогательного соединения мальтозы в содержании в составе водного раствора композиции 10 мас. %,
- воды для инъекций до 100 мас. %,
- последующей обработки водного раствора композиции микрофлюидизацией до достижения полного смешивания компонентов с образованием раствора со светопропусканием не ниже 90% при 660 нм по данным фотометрии,
- лиофилизации полученного раствора с получением лиофилизата, который легко восстанавливается до раствора при добавлении воды для инъекций до объема, равного объему водного раствора композиции до лиофилизации.
Существенным свойством вышеупомянутой композиции является способность при парентеральном введении ее водного раствора в организм вызывать специфический иммунный ответ, заключающийся в образовании антител класса иммуноглобулинов G, связывающих оболочечные белки ВГС. Для оценки продукции антител против оболочечного белка Е2 и гетеродимера обол очечных белков Е1Е2 ВГС при введении животным вышеупомянутых синтетических пептидных иммуногенных конструкций можно использовать стандартные методы иммуноанализа (предпочтительно ELISA, иммунодот или иммуноблоттинг) с оболочечным белком Е2 или гетеродимером обол очечных белков Е1Е2 в качестве антигена (предпочтительно фиксированных на твердой фазе). Еще одним существенным свойством вышеупомянутой композиции является способность при таком же введении в организм вызывать образование антител, связывающих ВГС из плазмы крови больных. Для оценки продукции антител, связывающих частицы ВГС из плазмы крови больных гепатитом С, может быть использована детекция связавшихся с антителами вирусных частиц методом ПЦР, включая ПНР в реальном времени.
Синтетические пептиды 1-5, входящие в состав композиции, составлены из ранее выявленных высококонсервативных фрагментов оболочечного белка Е2 (2) и получены с помощью стандартного метода твердофазного пептидного синтеза, как это указано в (9). Предпочтительность использования в составе композиции вышеуказанных пептидов состоит в том, что они включают фрагменты оболочечного белка ВГС, на который в организме формируется протективный антителоопосредованный иммунный ответ. Предпочтительность использования вышеуказанных пептидов определяется также консервацией первичных структур выбранных фрагментов оболочечного белка Е2, входящих в состав пептидов, поскольку это определяет возможность связывания образующимися в ответ на них антителами широкого набора генетических вариантов ВГС. Структуры пептидов разработаны в соответствии с принципом объединения в одной молекуле В- и Т-эпитопа, как указано в (10), однако структуры пептидов, входящих в вышеуказанную композицию, существенно отличаются от приведенных в публикации (10).
Предпочтительность добавления в состав композиции к пептидам сквалена, фосфолипидов и твина 80 определяется тем, что вышеуказанные пептиды не обладали иммуногенностью вне состава композиции, а именно в виде раствора каждого из пептидов в отдельности, а также смеси всех 5 пептидов в 0,9%-ном растворе натрия хлорида при парентеральном введении млекопитающим (мышам и кроликам). Включение в состав вакцинных композиций сквалена и твина 80 является обычной практикой, поскольку известно, что эти компоненты в сочетании способны повышать интенсивность иммунного ответа на вводимые в составе композиции антигены. Однако отличительной характеристикой заявляемой композиции является соотношение антигена, сквалена, фосфолипидов и твина 80 в ее составе, а именно (1-5):20:2:40 по массе, и низкая концентрация сквалена (2 г/л) в водном растворе композиции, тогда как обычно содержание сквалена и твина 80 в композициях в несколько десятков и даже сотен раз выше содержания антигенов, как это указано в (8), а фосфолипиды не всегда присутствуют в описанных ранее композициях.
Данное изобретение и его промышленная применимость иллюстрируются следующими примерами, которые никоим образом не должны рассматриваться как ограничивающие область настоящего изобретения.
Пример 1. Синтез пептидов 1-5, входящих в состав композиции. Пептиды 1-5 синтезировали методом стандартного твердофазного пептидного синтеза с использованием в качестве активатора HBTU в присутствии 1-гидрокси-бензотриазола и N-диизопропил-N-этиламина. Для очистки целевых пептидов от примесей реагентов, использовавшихся в ходе синтеза, а также побочных продуктов синтеза применяли стандартные процедуры осаждения и кристаллизации из растворов, гель-фильтрации и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). После очистки препараты подвергали лиофилизации. Очищенные препараты синтетических пептидных иммуногенных конструкций характеризовали стандартными методами аналитической ВЭЖХ и масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением для подтверждения степени чистоты и правильности синтеза. В таблице 1 приведены результаты анализов препаратов синтетических пептидов 1-5. Все препараты получены в кристаллической форме в виде натриевых и трифторацетатных солей.
2
2
Пример 2. Синтетические пептиды 1-5 по отдельности растворяли в 0,9%-ном растворе натрия хлорида для инъекций до концентрации пептида 0,01 мг/мл и вводили этот раствор белым беспородным мышам массой 20 г внутримышечно в дозе 5 мкг пептида/животное. Раствор каждого из пептидов вводили двум группам мышей: пяти самкам и пяти самцам. Инъекции повторяли трижды с интервалом в две недели. Кровь собирали после декапитации через 7 дней после последней иммунизации. Для получения сыворотки кровь инкубировали 1 час при комнатной температуре, после чего центрифугировали при 3000 об/мин (диаметр ротора центрифуги 15-20 см) 10 минут, сыворотку отбирали аликвотами по 100 мкл в пробирки типа «эппендорф» и хранили при -30°С. В качестве контроля использовали сыворотку крови, полученную от контрольных групп животных (5 самцов и 5 самок), которым вводили 0,9%-ный раствор натрия хлорида для инъекций в том же объеме и с той же периодичностью, что и растворы пептидов. Титры антител против соответствующих пептидов в сыворотках крови определяли методом ELISA. Для этого синтезированные пептиды 1-5 сорбировали по отдельности из 0,05 М натрий-бикарбонатного буфера, рН 8,5 в лунки предварительно УФ-облученного полистирольного планшета высокой сорбционной емкости ("Costar", США, кат. №9018) в количестве 0,2 мкг пептида/лунку. В лунки с сорбированными пептидами вносили раствор обезжиренного молока (50% молока по объему) в фосфатно-солевом буфере с 0,1% Твина 20 (ФСБТ-молоко) и инкубировали 1 ч при комнатной температуре при перемешивании. После удаления этого раствора в лунки вносили сыворотку крови мыши, полученную против соответствующей синтетической пептидной конструкции, разведенную в 20, 200, 1000 раз ФСБТ-молоком, и инкубировали 1,5 ч при 37°С. После удаления раствора сыворотки крови лунки планшета промывали трижды по 300 мкл ФСБТ и вносили в них раствор конъюгата пероксидазы хрена с антителами козы против IgG мыши в разведении 1:10000 в ФСБТ-молоке. Инкубировали 1 час при перемешивании при температуре 37°С, после чего трижды промывали планшет ФСБТ, как указано выше. После этого в лунки планшета вносили по 100 мкл раствора субстрата пероксидазы: ABTS в концентрации 0,5 мг/мл и HO в концентрации 0,01% в 0,08М цитратном буфере, рН 4,0; раствор готовили непосредственно перед употреблением в склянке темного стекла). Инкубировали 40 мин в темноте при 37°С (при перемешивании), после чего измеряли оптическую плотность растворов в лунках при 405 нм. За величину титра антител принимали такое разведение сыворотки крови иммунизированного животного, для которого соответствующее значение оптической плотности в ELISA превышает двукратное значение оптической плотности контрольного образца сыворотки крови, взятого в таком же разведении. Ни у одного животного не было зарегистрировано появления в сыворотке крови пептид-специфичных антител в титре ниже 1:20 при иммунизации одними пептидами, растворенными в 0,9%-ном растворе натрия хлорида.
Пример 3. Синтетические пептиды 1-5, взятые в виде эквимолярной смеси в растворе 0,9%-ного натрия хлорида для инъекций в суммарной концентрации 0,05 мг/мл, вводили белым беспородным мышам массой 20 г внутримышечно в дозе 10 мкг пептида/животное. Раствор каждого из пептидов вводили двум группам мышей: пяти самкам и пяти самцам. Инъекции повторяли трижды с интервалом в две недели. Кровь собирали после декапитации через 7 дней после последней иммунизации. Получали сыворотку крови и определяли титр антипептидных антител, как это описано в примере 2. Ни у одного из иммунизированных животных не было зарегистрировано появления в сыворотке крови пептид-специфичных антител ни к одному из пептидов в титре ниже 1:20 при иммунизации раствором смеси пептидов.
Пример 4. Синтетические пептиды 1-5, взятые в виде эквимолярной смеси в растворе 0,9%-ного натрия хлорида для инъекций в суммарной концентрации 0,1 мг/мл, вводили двум кроликам-самцам породы «Советская шиншилла» массой 2.5 кг внутримышечно в дозе 0,2 мг пептида/животное. Инъекции повторяли трижды с интервалом в две недели. Кровь отбирали из ушной вены. Получали сыворотку крови и определяли титр антипептидных антител, как это описано в примере 2, но вместо раствора конъюгата пероксидазы хрена с антителами козы против IgG мыши использовали раствор конъюгата пероксидазы хрена с антителами козы против IgG кролика. У обоих иммунизированных животных не было зарегистрировано появления в сыворотке крови пептид-специфичных антител ни к одному из пептидов в титре ниже 1:20 при иммунизации раствором смеси пептидов.
Пример 5. Для получения водного раствора композиции синтетических пептидов 1-5 со скваленом, Липоидом С100 С и твином 80 20, 50 или 100 мг эквимолярной смеси пептидов 1-5, 2,0 г сквалена, 0,2 г Липоида С100, 4,0 г твина 80 вносили в 900 мл воды для инъекций, проводили первичную гомогенизацию механическим диспергированием, затем добавляли воду до общего объема 1000 мл и проводили микрофлюидизацию до достижения светопропускания полученной композиции не ниже 90% при 660 нм, измеренного с помощью спектрофотометра Multiscan Spectrum (Thermo Fisher Scientific). По окончании микрофлюидизации композицию подвергали микрофильтрации через фильтр с порами 0,22 мкм в стерильные флаконы. Полученная композиция представляла собой стабильный коллоидный раствор, не изменявший величину светопропускания при хранении при +4оС в течение по крайней мере 1 месяца.
Пример 6. Водный раствор композиции, полученный как в примере 5, с содержанием 0,02 мас. % эквимолярной смеси пептидов 1-5, растворяли в воде для инъекций и вводили белым беспородным мышам массой 20 г внутримышечно в дозе, соответствующей 5 мкг смеси пептидов/животное. Композицию вводили двум группам мышей: пяти самкам и пяти самцам. Инъекции повторяли трижды с интервалом в две недели. Кровь собирали после декапитации через 7 дней после последней иммунизации. Получали сыворотку крови и определяли титр антител против оболочечного белка Е2 и гетеродимера обол очечных белков Е1Е2 ВГС методом ELISA, как это описано в примере 2, но вместо пептидов в лунках планшета сорбировали препарат рекомбинантного оболочечного белка Е2 либо препарат гетеродимера рекомбинантных оболочечных белков Е1Е2. У 3 мышей-самок из 5 и у 3 мышей-самцов из 5 в сыворотке крови были выявлены антитела против рекомбинантного оболочечного белка Е2 и гетеродимера оболочечных белков Е1Е2 ВГС в титре 1:20.
Пример 7. Водный раствор композиции, полученный как в примере 5, с содержанием 0,05 мас. % эквимолярной смеси пептидов 1-5, растворяли в воде для инъекций и вводили 4 кроликам-самцам породы «Советская шиншилла» массой 2,5 кг внутримышечно в дозе, соответствующей 0,1 мг смеси пептидов/животное. Инъекцию повторяли трижды с интервалом в две недели. Кровь отбирали из ушной вены через 7 дней после последней иммунизации. Получали сыворотку крови и определяли титр антител против оболочечного белка Е2 и гетеродимера оболочечных белков Е1Е2 ВГС методом ELISA, как это описано в примере 6, но вместо раствора конъюгата пероксидазы хрена с антителами козы против IgG мыши использовали раствор конъюгата пероксидазы хрена с антителами козы против IgG кролика. У 3 кроликов из 4 в сыворотке крови были выявлены антитела против оболочечного белка Е2 и гетеродимера оболочечных белков Е1Е2 ВГС в титре 1:20.
Пример 8. Водный раствор композиции, полученный как в примере 5, с содержанием 100 мг эквимолярной смеси пептидов 1-5 в 1 л водного раствора, вводили 4 кроликам-самцам породы «Советская шиншилла» массой 2,5 кг внутримышечно в дозе 0,2 мг смеси пептидов/животное. Инъекцию повторяли трижды с интервалом в две недели. Кровь отбирали из ушной вены через 7 дней после последней иммунизации. Получали сыворотку крови и определяли титр антител против оболочечного белка Е2 и гетеродимера оболочечных белков Е1Е2 ВГС методом ELISA, как это описано в примере 6, но вместо раствора конъюгата пероксидазы хрена с антителами козы против IgG мыши использовали раствор конъюгата пероксидазы хрена с антителами козы против IgG кролика. У всех 4 кроликов в сыворотке крови были выявлены антитела против оболочечного белка Е2 и гетеродимера оболочечных белков Е1Е2 ВГС в титре 1:20, у двух кроликов из 4 титр анти-Е2 антител достигал 1:40.
Пример 9. Из сыворотки крови одного из кроликов, имевших титр анти-Е2 антител 1:40, получили фракцию иммуноглобулинов G осаждением раствором сульфата аммония 50%-ного насыщения и хроматографией на белок А-агарозе в соответствии с инструкцией к препарату белок А-агарозы.
В микропробирки объемом 1,5 мл для ПЦР вносили по 300 мкл препарата IgG, разведенного стерильным фосфатно-солевым буфером (0,01М фосфат натрия, рН 7,4, 0,14 М NaCl) до концентрации 1 мг/мл. Инкубировали 1 час при 37°С, затем ночь при 4°С. Раствор из микропробирок удаляли при помощи вакуумного аспиратора. Добавили по 400 мкл блокирующего буфера, содержащего 0,01М ФСБ и 10% (об.) 0,5% молока. Инкубировали 1 час при комнатной температуре при перемешивании на орбитальном мини-шейкере ELMI S-3. Промыли микропробирки 3 раза ФСБТ по 400 мкл в лунку.
Смешали 100 мкл плазмы крови, содержащей ВГС, с 300 мкл 0,01М стерильного ФСБ и внесли полученный раствор в микропробирки с сорбированными антителами. Микропробирки инкубировали 2 ч при 4°С при перемешивании на мини-шейкере ELMI S-3, затем раствор удалили с помощью аспиратора и промыли микропробирки 4 раза 25 мМ Tris-HCl буфером, рН 8.0, содержащим 300 мМ NaCl.
Выделение тотальной РНК проводили с помощью комплекта для выделения РНК/ДНК «РИБО-сорб-12» ФГУН ЦНИИЭ в соответствии с инструкцией к комплекту. Параллельно проводили выделение РНК из плазмы крови пациентов. При выделении РНК из плазмы крови пациентов в микропробирки к «Лизирующему раствору» и ВКО добавляли образец плазмы объемом 100 мкл. Для постановки отрицательного контроля выделения в пробирку с «Лизирующим раствором» и ВКО добавляли 100 мкл отрицательного контрольного образца (ОКО). В пробирку положительного контроля (ПК) выделения вносили 90 мкл ОКО и 10 мкл «ПКО HCV-rec».
Были поставлены отрицательный контроль выделения РНК и два положительных контрольных образца выделения («ПКО-1-HCV» и «ПКО-2-HCV»). Для отрицательного контроля в пробирку с лизирующим раствором добавили 100 мкл отрицательного контрольного образца (ОКО) и 10 мкл «ВКО HCV-M-FRT». Для положительных контролен в каждую пробирку добавили по 90 мкл ОКО, по 10 мкл «ВКО HCV-M-FRT» и 10 мкл соответствующего «ПКО-1-HCV» или «ПКО-2-HCV»
Полученный препарат РНК-пробы в надосадочной жидкости использовали для проведения совмещенной реакции обратной транскрипции РНК и ПЦР-амплификации кДНК вируса гепатита С с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени» с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени» на приборе Rotor-Gene Q (QIAGEN, Германия) «ПЦР-комплектом» набора реагентов для количественного определения РНК вируса гепатита С в клиническом материале методом полимеразной цепной реакции «АмплиСенс HCV-Mohhtop-FRT» согласно прилагаемой к набору инструкции ФГУН Центрального Научно-исследовательского института эпидемиологии.
Полученные данные - кривые накопления флуоресцентного сигнала по двум каналам - анализировали с помощью программного обеспечения прибора Rotor-Gene Q для проведения ПНР в режиме «реального времени». По одному из каналов регистрировали накопление продукта амплификации участка кДНК ВГС (ПКО), а по другому - ВКО. На основании значений порогового цикла «Ct» (пересечение кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией) и исходя из заданных значений калибраторов ПКО и ВКО происходило автоматическое построение калибровочной прямой и расчет количества копий кДНК ПКО и ВКО в ПЦР-пробе. Полученные значения использовали для расчета концентрации РНК HCV в исследуемых и контрольных образцах по формуле: (число копий кДНК ВГС в ПЦР пробе / число копий кДНК ВКО в ПНР пробе) × коэффициент = ME ВГС/мл образца, где ME - международные единицы (1МЕ = 1/4 РНК HCV копий/мл для данной тест-системы). Коэффициент для данных приборной и аналитической систем составлял 14390.
Количество вирусных частиц, связавшихся с IgG, равнялось количеству копий обнаруженной РНК ВГС в микропробирках с сорбированными на их внутренней поверхности IgG. Это количество копий РНК рассчитывали по калибровочным графикам, построенным при использовании ДНК-калибраторов, амплификация которых проходила в тех же условиях. Накопление продуктов амплификации ДНК-калибраторов регистрировали по двум каналам FAM/Green и JOE/Yellow, поскольку концентрация РНК ВГС рассчитывалась из соотношения количества копий кДНК ВГС и ВКО. Накопление продукта амплификации участка кДНК ВГС детектировалось по каналу JOE/Yellow, а накопление продукта амплификации ВКО - по каналу для детекции флуорофора FAM/Green. По результатам амплификации, представленным на рис. 1, видно, что кривые накопления флуоресцентного сигнала по каналу JOE/Yellow (кДНК ВГС) пересекают пороговую линию на различных циклах и имеют характерную S-образную форму. Это означает, что IgG связали нативные вирусные частицы из образцов плазмы крови больных, поскольку после отмывки микропробирок из них были выделены молекулы РНК ВГС. Так как в случае с препаратами IgG из преиммунных сывороток тех же животных, которые использовались в качестве контроля, кривые накопления флуоресцентного сигнала не пересекают пороговую линию, это означает, что препараты IgG, выделенные из антисывороток, способны специфически связывать вирусные частицы. В таблице 3 приведены результаты определения концентраций РНК ВГС в плазме крови больных и в препаратах вирусных частиц, полученных после сорбции на антипептидных антителах. Всего были проведены эксперименты с 8 образцами плазмы крови больных гепатитом С, в которых в ходе лабораторно-клинического анализа было выявлено присутствие ВГС различных субтипов.
Полученные результаты показывают, что при иммунизации водным раствором заявленной композиции на основе синтетических пептидов и липидов у животных образуются антитела, специфично связывающие разные изоляты вируса гепатита С, относящиеся к различным субтипам и генетическим вариантам.
Все приведенные выше примеры свидетельствуют о том, что разработанная композиция на основе синтетических пептидов и липидов обладает иммуногенностью, способна при введении млекопитающим вызывать у них образование антител, связывающих оболочечные белки вируса гепатита С и сам вирус, и может быть использована в вакцине против гепатита С.
* % от внесенного количества РНК ВГС. **н.о. - не определяли
Использованная литература.
1. Gal-Tanamy, М. Hepatitis С./ М. Gal-Tanamy [et al.] // In: Vaccines for Biodefence and Emerging and Neglected Diseases. Eds. A.T. Barrett and L.R. Stanberry., London [etc]: Academic Press. - 2009. - P. 413-440.
2. Sobolev, B.N. Comparative analysis of amino acid sequences from envelope proteins isolated from different hepatitis С virus variants: possible role of conservative and variable regions / B.N. Sobolev [et al.] // Journal of Viral Hepatitis. - 2000 - Vol. 7(5). - P. 368-374.
3. Waheed, A. Virus-neutralizing antibodies to hepatitis С virus/ D. Steinmann [et al.] // Wahid A., Dubuisson J. //Journal of Viral Hepatitis. - 2013. - Vol. 20. - P. 369-376.
4. Bukh, J. Animal models for the study of hepatitis С virus infection and related liver disease. / J. Bukh // Gastroenterology. - 2012. - Vol. 142. - P. 1279-1287.
5. Neuman-Haefelin, C. Adaptive immune responses in hepatitis С virus infection / C. Neumann-Haefelin, RThimme // Current Topics in Microbiology and Immunology. - 2013. - Vol. 369. - P. 243-262.
6. Law, J.L. A hepatitis С virus (HCV) vaccine comprising envelope glycoproteins gpEl/gpE2 derived from a single isolate elicits broad cross-genotype neutralizing antibodies in humans / J.L. Law [et al.] // PLoS ONE. - 2013. - Vol. 8. - e59776.: doi: 10.1371/journal.pone.0059776.
7. Fournillier, A. An accelerated vaccine schedule with a poly-antigenic hepatitis С virus MVA-based candidate vaccine induces potent, long lasting and in vivo cross-reactive T cell responses / A. Fournillier [et al.] // Vaccine. - 2007. - Vol. 25. - P. 7339-7353.
8. Klade, C.S. Therapeutic Vaccination of Chronic Hepatitis С Nonresponder Patients with the Peptide Vaccine IC41. / C.S. Klade [et al.] //Gastroenterology. - 2009. - Vol. 134. - P. 1385-1395.
9. Мойса, A.A. Синтетические пептидные вакцины. / A.A. Мойса, Е.Ф. Колесанова // Биомедицинская химия. - 2011. - Т.57. - Вып.1. - С. 14-30.
10. Колесанова, Е.Ф. Путь к пептидной вакцине против гепатита С./ Е.Ф. Колесанова [и др.] // Биомедицинская химия. - 2015. - Т.61. - Вып.2. - С. 254-264.