ГУМАНИЗИРОВАННОЕ АНТИТЕЛО ПРОТИВ РЕЦЕПТОРА IGF-1
HUMANIZED ANTIBODY AGAINST IGF-1 RECEPTOR

Область техники
Настоящее изобретение относится к гуманизированному антителу против рецептора IGF-I и, конкретнее, к гуманизированному антителу против рецептора IGF-I, которое специфически связывается с рецептором IGF-I позвоночного.
Уровень техники
1. IGF-I
IGF-I представляет собой инсулиноподобный фактор роста, секретируемый главным образом из печени через активацию рецептора гормона роста (GH) гормоном роста, секретированным из гипофиза, и воздействует на рецептор IGF-I, выражая таким образом различные физиологические функции в различных органах. В силу этого ожидается, что IGF-I будет использоваться для лечения различных заболеваний. Так как аминокислотная последовательность IGF-I имеет высокое подобие - примерно на 40% с последовательностью проинсулина, IGF-I может связываться с рецептором инсулина и посредством этого проявлять инсулиноподобные эффекты (источник непатентной литературы 1). Кроме того, так как аминокислотная последовательность рецептора IGF-I имеет высокое подобие - примерно на 60% с последовательностью рецептора инсулина, эти рецепторы могут образовывать гетеродимер (источник непатентной литературы 1). Инсулин может действовать на рецептор инсулина, проявляя в результате сильный эффект снижения уровня глюкозы в крови и поэтому используется в качестве гипогликемического лекарственного средства.
2. Рецептор IGF-I
Рецептор IGF-I представляет собой трансмембранный белок, состоящий из альфа-цепи и бета-цепи, и имеет шесть внеклеточных доменов (L1, CR, L2, Fn1, Fn2 и Fn3), трансмембранный домен и внутриклеточный домен (источник непатентной литературы 2). Внутриклеточный домен рецептора IGF-I включает тирозинкиназу. Внеклеточный домен представляет собой CR (богатый цистеином домен) и участвует в активации внутриклеточной тирозинкиназы, связанной с конформационным изменением рецептора IGF-I, которое происходит, когда IGF-I связывается с рецептором IGF-I. Рецептор IGF-I образует гомодимерный комплекс (гомотип). Связывание IGF-I с рецептором IGF-I (гомотип) запускает передачу сигнала через активацию рецепторной киназы. Рецептор IGF-I также образует гетеродимерный комплекс (гетеротип) с рецептором инсулина. Связывание инсулина или IGF-I с рецептором IGF-I (гетеротип) запускает передачу сигнала через активацию рецепторной киназы (источник непатентной литературы 3 и 4).
3. Физиологические действия IGF-I
Показано, что IGF-I проявляет действия, способствующие росту, такие как увеличение длины тела и массы тела, и инсулиноподобные метаболические действия, такие как ускорение метаболизма глюкозы и гипогликемические эффекты. Обнаружено, что мекасермин, человеческий рекомбинантный IGF-I, улучшает симптомы, связанные с аномалией рецептора инсулина, такие как гипергликемия, гиперинсулинемия, черный акантоз и гирсутизм. Также показано, что IGF-I дает улучшения при расстройстве роста и карликовости, устойчивой к гормону роста (источник непатентной литературы 5).
4. Эффекты IGF-I, способствующие росту
Известно, что IGF-1 усиливает способность человеческих хондроцитов к синтезу ДНК. Кроме того, введение IGF-I увеличивает массу и удлиняет длину бедренной кости у гипофизэктомированной крысы (источник непатентной литературы 5).
5. Действие IGF-I на увеличение мышечной массы
Повышение активности пролиферации клеток с помощью IGF-I требует непрерывной активации рецептора IGF-I (источник непатентной литературы 6). Животное, созданное для сверхэкспрессии рецептора IGF-I, показывает увеличенную мышечную массу (источник непатентной литературы 7). Длительное введение IGF-I/GFBP3 пациенту с переломом проксимального отдела бедренной кости усиливает силу ее/его захвата и улучшает ее/его способность вставать из положения сидя без посторонней помощи (источник непатентной литературы 8). Известно, что уровни IGF-I в мышцах пожилых людей и мышей более низкие, чем в юности (источник непатентной литературы 9 и 10). Сверхэксперссия IGF-I конкретно в мышечных тканях пожилых мышей улучшает их мышечную массу по сравнению с мышами дикого типа (источник непатентной литературы 11).
6. Прецедентные продукты для повышения мышечной массы
Анаморелин, агонист рецептора грелина, увеличивает сухую массу тела в клиническом испытании на кахексию, которая является атрофией неиспользуемых мышц. Однако имеют место побочные эффекты, такие как вызывание рвоты и гипергликемия (источник непатентной литературы 12).
Миостатин, отрицательный регулятор дифференцировки скелетной мышечной ткани, влияет на рецептор актвина II (ActRII), тем самым ингибируя Akt/mTOR (источники непатентной литературы 13-15). LY2495655, антитело против миостатина, увеличивает мышечную массу пациентов, получивших тотальное эндопротезирование тазобедренного сустава, и пациентов пожилого возраста (источники непатентной литературы 16 и 17).
Бимагрумаб, анти-ActRII антитело, повышает мышечную массу пациентов с нервно-мышечными заболеваниями (источник непатентной литературы 18). Однако до настоящего времени нет лекарственного средства, которое способствует образованию скелетных мышц и в силу этого может быть использовано для лечения субъекта, нуждающегося в этом.
7. Гипогликемическое действие IGF-I
Известно, что IGF-I оказывает гипогликемическое действие, подобное действию инсулина. IGF-I усиливает эффект поглощения глюкозы в мышечных клетках крыс (источник непатентной литературы 5). Введение IGF-I также снижает общий уровень глюкозы в крови у крыс (источник непатентной литературы 5).
Сообщается, что эффект снижения глюкозы IGF-I вызывает гипогликемию как клиническое побочное действие (источник непатентной литературы 19). Кроме того, введение IGF-I человеку вызывает гипогликемию. Поэтому в начале лечения IGF-I необходимо продолжать контролирование дозировки, начиная с низкой дозы, наблюдая за различными клиническими результатами, включая уровень глюкозы в крови после введения (источник непатентной литературы 5).
IGF-I проявляет гипогликемический эффект через промотрирования фосфорилирования Akt, который является сигналом рецептора IGF-I в нисходящем направлении. Активный вариант Akt усиливает поглощение глюкозы клетками 3T3-L1 (источник непатентной литературы 20). С другой стороны, Akt2-дефицитные мыши показывают повышенный уровень глюкозы в крови (источник непатентной литературы 21). Ингибитор Akt подавляет вызванное инсулином поглощение глюкозы мышечными клетками крысы (источник непатентной литературы 22). Кроме того, также известно, что IGF-I активирует рецептор инсулина, который играет некую роль в гипогликемическом эффекте. Эти наблюдения предполагают, что гипогликемическое действие IGF-I включает сверхактивацию Akt и активацию рецептора инсулина.
8. Короткое время полужизни IGF-I в крови
IGF-I имеет короткое время полужизни в крови, и поэтому, когда используется при лечении, требует частого введения. Действительно, мекасермин, человеческий рекомбинантный IGF-I, имеет время полужизни в крови от примерно 11 часов до примерно 16 часов, и поэтому при лечении карликовости его необходимо вводить один-два раза в день (источник непатентной литературы 5).
Примерно 70-80% IGF-I связывается в крови с IGFBP3, в то время как физиологическое действие проявляет свободная форма IGF-I. Связывание IGF-I с IGFBP3 поддерживает его время полужизни в крови в течение периода от примерно 10 часов до примерно 16 часов (источник непатентной литературы 1).
Комбинация лекарственного средства IGF-I с IGFBP3 IPLEX показывает увеличенное по сравнению IGF-I время полужизни в крови до периода от примерно 21 до примерно 26 часов и тем самым допускает снижение частоты введения до одного раза в день (источник непатентной литературы 23). Однако IPLEX уже выведен с рынка.
Также сделана попытка разработать пегилированный IGF-I с улучшенной кинетикой IGF-I, но пока до сих пор не было успехов в разработке лекарственного средства, и оно не доступно в настоящее время (патентная литература 1).
9. Терапевтические эффекты, которые, как ожидается, будут достигнуты через эффекты IGF-I
Известно, что IGF-I действует на различные органы и проявляет широкий спектр физиологических функций (источник непатентной литературы 19).
Сообщается, что IGF-I проявляет нейропротекторное действие на центральную нервную систему, защищая митохондрии, и антиоксидантное действие через активацию рецептора IGF-I (источники непатентной литературы 24 и 25). IGF-I способствует регенерации поврежденных нейритов (источник непатентной литературы 26).
IGF-I является основным фактором способствования росту (источники непатентной литературы 27 и 28). Действительно, мекасермин, человеческий рекомбинатный IGF-I, используется в клинике для лечения карликовости.
IGF-I считается эффективным при лечении цирроза печени, который развивается из повреждения печени и включает фиброз печени. Введение IGF-I дает улучшения при фиброзе печени на животной модели цирроза печени (источник непатентной литературы 29).
Также известно, что IGF-I играет роль в развитии и функционировании почек. IGF-I обладает защитным действием против окислительного стресса и апоптоза из-за глюкотоксичности в мезангиальных клетках почек (источник непатентной литературы 30). Ожидается, что IGF-I может быть лекарственным средством для лечения нефропатии.
Примеры состояний, при которых ожидаются улучшения через введение IGF-I, включают карликовость, синдром Ларона, цирроз печени, фиброз печени, старение, задержку внутриутробного развития (IUGR), неврологическое заболевание, мозговой удар, травму спинного мозга, защиту сердечно-сосудистой системы, диабет, инсулинорезистентность, метаболический синдром, нефропатию, остеопороз, муковисцидоз, лечение ран, миотоническую дистрофию, СПИД-ассоциированную саркопению, ВИЧ-ассоциированный синдром перераспределения жира, ожог, болезнь Крона, синдром Вернера, Х-сцепленное комбинированное иммунодефицитное заболевание, тугоухость, нервно-психическую анорексию и ретинопатию недоношенных (источник непатентной литературы 19).
Таким образом, ожидается, что IGF-1 может быть лекарственным средством для лечения различных заболеваний вследствие его широкого спектра физиологических эффектов. Однако проблемы, такие как его побочное гипогликемическое действие и его короткое время полужизни, требующее многих введений, препятствуют его клиническому применению.
10. Антитела-агонисты рецептора IGF-1
Как правило, препараты на основе антител имеют продолжительное время полужизни и эффективны, как доказано, если вводятся один-два раза в месяц. Хотя сообщается, что некоторые антитела-агонисты рецептора IGF-1 эффективны при активации рецептора in vitro, не сообщается об антителах, проявляющих активность агонистов против рецептора IGF-1 in vivo (источники непатентной литературы 31-35).
Конкретно, антитела 3В7 и 2D1 усиливают клеточный синтез ДНК in vitro (источник непатентной литературы 32).
Антитела 11A1, 11A4, 11A11 и 24-57 усиливают тирозинфосфорилирование рецептора IGF-I in vitro (источник непатентной литературы 33).
Показано, что антитела 16-13, 17-69, 24-57, 24-60, 24-31 и 26-3 являются эффективными в способствовании клеточному синтезу ДНК и поглощению глюкозы in vitro, и имеют потенциал для проявления гипогликемического эффекта (источники непатентной литературы 34 и 35).
Однако не сообщается ни об одном антителе-агонисте рецептора IGF-I, проявляющем действие на пролиферацию клеток в эксперименте in vitro с использованием первичных культивируемых клеток, среди прочего, миобластов человека, не говоря уже об эффекте увеличения мышечной массы in vivo.
11. Антитела-антагонисты рецептора IGF-I
Предпринимаются попытки использовать антитела, которые связываются с рецептором IGF-I, для лечения злокачественных образований на основании их антагонистического эффекта ингибирования связывания IGF-I с рецептором IGF-I. Однако существующие антитела-антагонисты, когда используются в режиме монотерапии, имеют различные побочные эффекты, такие как гипергликемия (источник непатентной литературы 36), и демонстрируют увеличенную частоту гипергликемии, когда используются в комбинации с другими противораковыми средствами (источник непатентной литературы 37). Соответственно, ожидается, что их терапевтическое применение будет ограничено.
Список цитированной литературы
Патентная литература
[Патентная литература 1] JP2011-518778A
Непатентная литература
[Источник непатентной литературы 1] Ohlsson, C., et al., The role of liver-derived insulin-like growth factor-I. Endocr Rev, 2009. 30(5): p. 494-535.
[Источник непатентной литературы 2] Kavran, J.M., et al., How IGF-I activates its receptor. Elife, 2014. 3.
[Источник непатентной литературы 3] Bailyes, E.M., et al., Insulin receptor/IGF-I receptor hybrids are widely distributed in mammalian tissues: quantification of individual receptor species by selective immunoprecipitation and immunoblotting. Biochem J, 1997. 327 (Pt 1): p. 209-15.
[Источник непатентной литературы 4] Pandini, G., et al., Insulin/insulin-like growth factor I hybrid receptors have different biological characteristics depending on the insulin receptor isoform involved. J Biol Chem, 2002. 277(42): p. 39684-95.
[Источник непатентной литературы 5] OrphanPacific, IF. 2015.
[Источник непатентной литературы 6] Fukushima, T., et al., Phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) activity bound to insulin-like growth factor-I (IGF-I) receptor, which is continuously sustained by IGF-I stimulation, is required for IGF-I-induced cell proliferation. J Biol Chem, 2012. 287(35): p. 29713-21.
[Источник непатентной литературы 7] Schiaffino, S. and C. Mammucari, Regulation of skeletal muscle growth by the IGF-I-Akt/PKB pathway: insights from genetic models. Skelet Muscle, 2011. 1(1): p. 4.
[Источник непатентной литературы 8] Boonen, S., et al., Musculoskeletal effects of the recombinant human IGF-I/IGF binding protein-3 complex in osteoporotic patients with proximal femoral fracture: a double-blind, placebo-controlled pilot study. J Clin Endocrinol Metab, 2002. 87(4): p. 1593-9.
[Источник непатентной литературы 9] Barton-Davis, E.R., et al., Viral mediated expression of insulin-like growth factor I blocks the aging-related loss of skeletal muscle function. Proc Natl Acad Sci USA, 1998. 95(26): p. 15603-7.
[Источник непатентной литературы 10] Lamberts, S.W., A.W. van den Beld, and A.J. van der Lely, The endocrinology of aging. Science, 1997. 278(5337): p. 419-24.
[Источник непатентной литературы 11] Musaro, A., et al., Localized IGF-I transgene expression sustains hypertrophy and regeneration in senescent skeletal muscle. Nat Genet, 2001. 27(2): p. 195-200.
[Источник непатентной литературы 12] Temel, J.S., et al., Anamorelin in patients with non-small-cell lung cancer and cachexia (ROMANA 1 and ROMANA 2): results from two randomized, double-blind, phase 3 trials. Lancet Oncol, 2016. 17(4): p. 519-31.
[Источник непатентной литературы 13] Glass, D.J., Signaling pathways perturbing muscle mass. Curr Opin Clin Nutr Metab Care, 2010. 13(3): p. 225-9.
[Источник непатентной литературы 14] Lee, S.J. and A.C. McPherron, Regulation of myostatin activity and muscle growth. Proc Natl Acad Sci USA, 2001. 98(16): p. 9306-11.
[Источник непатентной литературы 15] Amirouche, A., et al., Down-regulation of Akt/mammalian target of rapamycin signaling pathway in response to myostatin overexpression in skeletal muscle. Endocrinology, 2009. 150(1): p. 286-94.
[Источник непатентной литературы 16] Woodhouse, L., et al., A Phase 2 Randomized Study Investigating the Efficacy and Safety of Myostatin Antibody LY2495655 versus Placebo in Patients Undergoing Elective Total Hip Arthroplasty. J Frailty Aging, 2016. 5(1): p. 62-70.
[Источник непатентной литературы 17] Becker, C., et al., Myostatin antibody (LY2495655) in older weak fallers: a proof-of-concept, randomized, phase 2 trial. Lancet Diabetes Endocrinol, 2015. 3(12): p. 948-57.
[Источник непатентной литературы 18] Amato, A.A., et al., Trea™ent of sporadic inclusion body myositis with bimagrumab. Neurology, 2014. 83(24): p. 2239-46.
[Источник непатентной литературы 19] Puche, J.E. and I. Castilla-Cortazar, Human conditions of insulin-like growth factor-I (IGF-I) deficiency. J Transl Med, 2012. 10: p. 224.
[Источник непатентной литературы 20] Kohn, A.D., et al., Expression of a constitutively active Akt Ser/Thr kinase in 3T3-L1 adipocytes stimulates glucose uptake and glucose transporter 4 translocation. J Biol Chem, 1996. 271(49): p. 31372-8.
[Источник непатентной литературы 21] Cho, H., et al., Insulin resistance and a diabetes mellitus-like syndrome in mice lacking the protein kinase Akt2 (PKB beta). Science, 2001. 292(5522): p. 1728-31.
[Источник непатентной литературы 22] Green, C.J., et al., Use of Akt inhibitor and a drug-resistant mutant validates a critical role for protein kinase B/Akt in the insulin-dependent regulation of glucose and system A amino acid uptake. J Biol Chem, 2008. 283(41): p. 27653-67.
[Источник непатентной литературы 23] Submission for marketing application to FDA, APPLICATION NUMBER, 21-884
[Источник непатентной литературы 24] Garcia-Fernandez, M., et al., Low doses of insulin-like growth factor I improve insulin resistance, lipid metabolism, and oxidative damage in aging rats. Endocrinology, 2008. 149(5): p. 2433-42.
[Источник непатентной литературы 25] Puche, J.E., et al., Low doses of insulin-like growth factor-I induce mitochondrial protection in aging rats. Endocrinology, 2008. 149(5): p. 2620-7.
[Источник непатентной литературы 26] Joseph D'Ercole, A. and P. Ye, Expanding the mind: insulin-like growth factor I and brain development. Endocrinology, 2008. 149(12): p. 5958-62.
[Источник непатентной литературы 27] Abuzzahab, M.J., et al., IGF-I receptor mutations resulting in intrauterine and postnatal growth retardation. N Engl J Med, 2003. 349(23): p. 2211-22.
[Источник непатентной литературы 28] Woods, K.A., et al., Intrauterine growth retardation and postnatal growth failure associated with deletion of the insulin-like growth factor I gene. N Engl J Med, 1996. 335(18): p. 1363-7.
[Источник непатентной литературы 29] Perez, R., et al., Mitochondrial protection by low doses of insulin-like growth factor- I in experimental cirrhosis. World J Gastroenterol, 2008. 14(17): p. 2731-9.
[Источник непатентной литературы 30] Kang, B.P., et al., IGF-I inhibits the mitochondrial apoptosis program in mesangial cells exposed to high glucose. Am J Physiol Renal Physiol, 2003. 285(5): p. F1013-24.
[Источник непатентной литературы 31] Bhaskar, V., et al., A fully human, allosteric monoclonal antibody that activates the insulin receptor and improves glycemic control. Diabetes, 2012. 61(5): p. 1263-71.
[Источник непатентной литературы 32] Xiong, L., et al., Growth-stimulatory monoclonal antibodies against human insulin-like growth factor I receptor. Proc Natl Acad Sci U S A, 1992. 89(12): p. 5356-60.
[Источник непатентной литературы 33] Runnels, H.A., et al., Human monoclonal antibodies to the insulin-like growth factor 1 receptor inhibit receptor activation and tumor growth in preclinical studies. Adv Ther, 2010. 27(7): p. 458-75.
[Источник непатентной литературы 34] Soos, M.A., et al., A panel of monoclonal antibodies for the type I insulin-like growth factor receptor. Epitope mapping, effects on ligand binding, and biological activity. J Biol Chem, 1992. 267(18): p. 12955-63.
[Источник непатентной литературы 35] Kato, H., et al., Role of tyrosine kinase activity in signal transduction by the insulin-like growth factor-I (IGF-I) receptor. Characterization of kinase-deficient IGF-I receptors and the action of an IGF-I-mimetic antibody (alpha IR-3). J Biol Chem, 1993. 268(4): p. 2655-61.
[Источник непатентной литературы 36] Atzori, F., et al., A Phase I Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Study of Dalotuzumab (MK-0646), an Anti-Insulin-like Growth Factor-1 Receptor Monoclonal Antibody, in Patients with Advanced Solid Tumors. Clin Cancer Res., 2011.17(19): p.6304-12.
[Источник непатентной литературы 37] de Bono J.S., et al., Phase II randomized study of figitumumab plus docetaxel and docetaxel alone with crossover for metastatic castration-resistant prostate cancer. Clin Cancer Res., 2014.20(7): p.1925-34.
Сущность изобретения
Проблема, решаемая изобретением
Целью настоящего изобретения является гуманизированное антитело против рецептора IGF-1 или его фрагмент или его производное, которые специфически связываются с рецептором IGF-1 позвоночного. Другой целью настоящего изобретения является антитело, которое повышает мышечную массу через рецептор IGF-1, не снижая в то же время уровень глюкозы в крови.
Способы решения проблемы
Настоящее изобретение относится к следующим аспектам.
Аспект [1]
Гуманизированное антитело против рецептора IGF-1 или его фрагмент или его производное, включающие
в качестве последовательности CDR-1 вариабельного участка тяжелой цепи (CDR-H1), аминокислотную последовательность, определенную в SEQ ID NO: 1, или аминокислотную последовательность, полученную из аминокислотной последовательности, определенной в SEQ ID NO: 1, путем замены одного аминокислотного остатка;
в качестве последовательности CDR-2 вариабельного участка тяжелой цепи (CDR-H2), аминокислотную последовательность, определенную в SEQ ID NO: 2, или аминокислотную последовательность, полученную из аминокислотной последовательности, определенной в SEQ ID NO: 2, путем замены одного или двух аминокислотных остатков;
в качестве последовательности CDR-3 вариабельного участка тяжелой цепи (CDR-H3), аминокислотную последовательность, определенную в SEQ ID NO: 3, или аминокислотную последовательность, полученную из аминокислотной последовательности, определенной в SEQ ID NO: 3, путем замены одного или двух аминокислотных остатков;
в качестве последовательности CDR-1 вариабельного участка легкой цепи (CDR-L1), аминокислотную последовательность, определенную в SEQ ID NO: 4, или аминокислотную последовательность, полученную из аминокислотной последовательности, определенной в SEQ ID NO: 4, путем замены одного или двух аминокислотных остатков;
в качестве последовательности CDR-2 вариабельного участка легкой цепи (CDR-L2), аминокислотную последовательность, определенную в SEQ ID NO: 5, или аминокислотную последовательность, полученную из аминокислотной последовательности, определенной в SEQ ID NO: 5, путем замены одного аминокислотного остатка; и
в качестве последовательности CDR-3 вариабельного участка легкой цепи (CDR-L3), аминокислотную последовательность, определенную в SEQ ID NO: 6, или аминокислотную последовательность, полученную из аминокислотной последовательности, определенной в SEQ ID NO: 6, путем замены одного или двух аминокислотных остатков;
причем антитело, его фрагмент или производное специфически связывается с внеклеточным доменом SEQ ID NO: 14 (рецептор IGF-1 человека).
Аспект [2]
Гуманизированное антитело против рецептора IGF-1 или его фрагмент или его производное согласно [1], включающие
в качестве последовательности вариабельного участка тяжелой цепи, аминокислотную последовательность, определенную в SEQ ID NO: 7, или аминокислотную последовательность, полученную из аминокислотной последовательности, определенной в SEQ ID NO: 7, путем замены, делеции или добавления одного или нескольких аминокислотных остатков; и
в качестве последовательности вариабельного участка легкой цепи, аминокислотную последовательность, определенную в SEQ ID NO: 8, или аминокислотную последовательность, полученную из аминокислотной последовательности, определенной в SEQ ID NO: 8, путем замены, делеции или добавления одного или нескольких аминокислотных остатков.
Аспект [3]
Гуманизированное антитело против рецептора IGF-1 или его фрагмент или его производное согласно [1] или [2], включающие
в качестве последовательности вариабельного участка тяжелой цепи, аминокислотную последовательность, определенную в SEQ ID NO: 7; и
в качестве последовательности вариабельного участка легкой цепи, аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 8, 9, 10, 11 и 12.
Аспект [4]
Гуманизированное антитело против рецептора IGF-1 или его фрагмент или его производное согласно любому из [1] - [3], включающие
в качестве константных участков тяжелой и легкой цепи, константные участки любого из классов из человеческого иммуноглобулина.
Аспект [5]
Гуманизированное антитело против рецептора IGF-1 или его фрагмент или его производное согласно [4], причем константный участок тяжелой цепи представляет собой константный участок тяжелой цепи человеческого IgG класса 4.
Аспект [6]
Гуманизированное антитело против рецептора IGF-1 или его фрагмент или его производное согласно любому из [1]-[5], которые связываются с эпитопом, включающим пептид, имеющий аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотным остаткам №№ 308-319 (ProSerGlyPheIleArgAsnGlySerGlnSerMet) SEQ ID NO:14 (рецептор IGF-I человека) или участку в непосредственной близости от них.
Аспект [7]
Гуманизированное антитело против рецептора IGF-1 или его фрагмент или его производное согласно любому из [1]-[6], которые при введении в дозе, достаточной для индуцирования пролиферации культивируемых миобластов человека или морской свинки, не вызывают поглощения глюкозы культивируемыми клетками.
Аспект [8]
Гуманизированное антитело против рецептора IGF-1 или его фрагмент или его производное согласно любому из [1]-[7], которые при введении позвоночному в дозе, достаточной для индуцирования увеличения мышечной массы и/или длины тела позвоночного, не снижают уровень глюкозы в крови позвоночного.
Аспект [9]
Гуманизированное антитело против рецептора IGF-1 или его фрагмент или его производное согласно [8], которые при введении позвоночному на уровне воздействия на кровь, который в 10 раз больше или больше эффективной дозы для индуцирования увеличения мышечной массы и/или длины тела позвоночного, не снижают уровень глюкозы в крови позвоночного.
Аспект [10]
Молекула нуклеиновой кислоты, состоящая из полинуклеотидной последовательности, кодирующей гуманизированное антитело против рецептора IGF-1 или его фрагмент или его производное согласно любому из [1]-[9].
Аспект [11]
Клонирующий вектор или экспрессирующий вектор, включающий по меньшей мере одну молекулу нуклеиновой кислоты согласно [10].
Аспект [12]
Рекомбинантная клетка, полученная путем введения в клетку-хозяина вектора согласно [11].
Аспект [13]
Способ получения гуманизированного антитела против рецептора IGF-1 или его фрагмента или его производного согласно любому из [1]-[9], включающий
культивирование рекомбинантной клетки согласно [12] и
очистку гуманизированного антитела против рецептора IGF-1 или его фрагмента или его производного, продуцированного рекомбинантной клеткой.
Аспект [14]
Фармацевтическая композиция, включающая в качестве активного ингредиента гуманизированное антитело против рецептора IGF-1 или его фрагмент или его производное согласно любому из [1]-[9], молекулу нуклеиновой кислоты согласно [10], вектор согласно [11] или рекомбинантную клетку согласно [12].
Аспект [15]
Фармацевтическая композиция согласно [14] для применения при лечении мышечной атрофии или карликовости.
Аспект [16]
Фармацевтическая композиция согласно [15], причем мышечная атрофия представляет собой атрофию неиспользуемых мышц, саркопению или кахексию.
Аспект [17]
Фармацевтическая композиция согласно [15], причем карликовость является карликовостью типа Ларона или карликовостью, резистентной к гормону роста.
Результат изобретения
Антитело или его фрагмент или его производное согласно настоящему изобретению имеют действие специфического связывания с рецептором IGF-1 позвоночного.
Краткое пояснение чертежей
Фигура 1 показывает выровненные аминокислотные последовательности CR-доменов рецепторов IGF-1 мыши, крысы, человека, морской свинки и кролика, причем аминокислотные последовательности показаны с использованием однобуквенного кода.
Фигура 2 представляет собой диаграмму, показывающую массу длинного разгибателя пальцев стопы у морских свинок, которые получали длительное введение IGF-I с помощью осмотического насоса, или однократное внутривенное введение гуманизированного антитела против рецептора IGF-I R11-16B, через две недели после введения.
Фигура 3 представляет собой график, показывающий кинетику гуманизированного антитела против рецептора IGF-I R11-16B в крови у морских свинок натощак по времени после однократного подкожного введения.
Фигура 4 представляет собой график, показывающий кинетику гуманизированного антитела против рецептора IGF-I R11-16B в крови у морских свинок натощак по времени после однократного внутривенного введения.
Воплощения изобретения
В последующем описании настоящее изобретение будет поясняться с обращением к конкретным воплощениям, хотя настоящее изобретение не должно ограничиваться этими воплощениями никоим образом. Все литературные ссылки, цитированные в настоящем описании, включая патентные публикации, публикации непрошедших экспертизу заявок и источники непатентной литературы, включены полностью в настоящее описание путем отсылки.
[IGF]
Согласно заявленному изобретению аббревиатура IGF относится к инсулиноподобному фактору роста, который может представлять собой или IGF-I или IGF-II. Как IGF-I, так и IGF-II являются биологическими лигандами, имеющими агонистическую активность, которые связываются с рецептором IGF-I (рецептор инсулиноподобного фактора роста I) и передают в клетку сигналы, такие как сигналы на деление клеток и сигналы метаболизма. Также известно, что IGF-I и IGF-II имеют перекрестную авидность к рецептору инсулина (INSR), который структурно похож на рецептор IGF-I. В настоящем описании будет обсуждаться главным образом IGF-I, так как его свойства, такие как физиологические функции, известны лучше, чем IGF-II. Однако в контексте обсуждения различных действий и заболеваний, опосредуемых связыванием лиганда с рецептором IGF-I, могут упоминаться вместе как IGF-I, так и IGF-II.
IGF-I, также называемый соматомедином С, представляет собой одноцепочечный полипептид, гормон, состоящий из 70 аминокислот. Последовательность человеческого IGF-I доступна, например, на EMBL-EBI, инвентарный номер UniProtKB P50919. Аминокислотная последовательность зрелого IGF-I показана в SEQ ID NO: 13 в прилагаемом списке последовательностей. Эта последовательность, состоящая из 70 аминокислот, сохраняется у многих видов. В настоящем изобретении термин «IGF-I» без каких-либо ограничений обозначает белок IGF-I, имеющий такую гормональную активность, если не указано иное.

IGF-I продуцируется различными клетками в живом организме, включая клетки печени, и присутствует в крови и других жидкостях организма. Следовательно, IGF-I дикого типа можно получить путем очистки из жидкости организма животного или из клеток первичной культуры или культивированной клеточной линии, происходящих от животного. Такой гормон роста индуцирует продуцирование IGF-I клетками, IGF-I также можно выделить в чистом виде из жидкости организма животного, которому введен гормон роста, или из первичных культивируемых клеток животного или клеточной линии животного, инкубированной в присутствии гормона роста. Как другой способ, IGF-1 также можно получить из рекомбинантных клеток, полученных трансфекцией экспрессирующего вектора, несущего молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность IGF-1, в клетки-хозяев, такие как прокариотический организм (например, E. coli), или эукариотические клетки, включая дрожжи, клетки насекомых или культивируемые клетки млекопитающего, или от трансгенного животного или трансгенного растения, в которые трансфицирован ген IGF-I. Человеческий IGF-I также доступен как исследовательский реагент (Enzo Life Sciences, catalog: ADI-908-059-0100, Abnova, catalog: P3452, и т.д.) или как фармацевтический продукт (Somazon мекасермин, INCRELEX, и т.д.). Активность IGF-I in vivo и in vitro для применения можно оценить как специфическую активность относительно стандартного вещества IGF-I под кодом NIBSC 91/554, активность которого соответствует одной международной единице на микрограмм. Стандартное вещество можно получить у Национального института биологических стандартов и контроля (NIBSC) Всемирной организации здравоохранения. В контексте настоящего изобретения IGF-I рассматривается как имеющий специфическую активность, эквивалентную IGF-I по коду NIBSC 91/554.
[Рецептор IGF-I]
го
ый
го
го
ый
го
ой
го
ый
го
ой
го
ый
Согласно заявленному изобретению термин «рецептор IGF-I» относится к рецептору инсулиноподобного фактора роста I. Термин «рецептор IGF-I», используемый в настоящем описании, обозначает белок рецептора IGF-I, если не указано иное. Рецептор IGF-I представляет собой белок, образовавшийся из двух субъединиц, причем каждая состоит из альфа-цепи и бета-цепи. Аминокислотная последовательность рецептора IGF-I человека показана в SEQ ID NO:14, в которой последовательность с 31 по 735 аминокислотные остатки представляет альфа-цепь, в то время последовательность, начинающаяся с 740 аминокислотного остатка, представляет бета-цепь. Альфа-цепь рецептора IGF-I имеет часть, с которой связывается IGF-I, в то время как бета-цепь имеет трансмембранную структуру и проявляет функцию передачи сигналов в клетку. Альфа-цепь рецептора IGF-I можно разделить на домены L1, CR, L2, FnIII-1 и FnIII-2a/ID/FnIII-2b. В соответствии с аминокислотной последовательностью рецептора IGF-I человека, определенной в SEQ ID NO:14, остатки с 31 по 179 соответствуют домену L1, остатки со 180 по 328 соответствуют домену CR, остатки с 329 по 491 соответствуют домену L2, остатки с 492 по 607 соответствуют домену FnIII-1, и остатки с 608 по 735 соответствуют домену FnIII-2a/ID/FnIII-2b. Из них домен CR (обогащенный цистеином) вовлечен в активацию внутриклеточной тирозинкиназы в бета-цепи, что ассоциируется с конформационным изменением рецептора IGF-I, происходящим, когда с рецептором связывается IGF-I. Аминокислотная последовательность рецептора IGF-I человека доступна, например, на EMBL-EBI, инвентарный номер UniProtKB P08069, и также указана в последовательности, описанной как SEQ ID NO:14.
Известно, что рецептор IGF-I экспрессируется в широком интервале тканей и клеток в живом организме, и получает различные стимулы через IGF-I, такие как индукция клеточной пролиферации и активация внутриклеточных сигналов. В частности, действие IGF-I на миобласты через рецептор IGF-I можно оценить, используя активность клеточной пролиферации в качестве индикатора. По этой причине миобласты применимы в анализе действий антител, связывающихся с рецептором IGF-I. Клетки, экспрессирующие рецептор IGF-I, происходящий от человека или другого позвоночного, можно получить искусственно путем трансфекции экспрессирующего вектора, несущего молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую аминокислотную последовательность рецептора IGF-I, происходящего от человека или другого позвоночного, в эукариотическую клетку-хозяина, такую как культивируемая клетка насекомого или клетка млекопитающего, и получить рекомбинантную клетку, экспрессирующую на ее клеточной мембране рецептор IGF-I, кодируемый трансфицированной нуклеиновой кислотой. Полученную клетку, экспрессирующую рецептор IGF-I, можно использовать для анализа связывающей способности и трансмиссивности внутриклеточных сигналов антител.
[Гуманизированное антитело против рецептора IGF-I]
Один аспект настоящего изобретения относится к новому гуманизированному антителу против рецептора IGF-I (далее упоминаемому в настоящем описании соответственно как «антитело по настоящему изобретению»).
Согласно заявленному изобретению термин «антитело» указывает на гликопротеин, содержащий по меньшей мере две тяжелые (Н) цепи и две легкие (L) цепи, соединенные через дисульфидные связи. Каждая тяжелая цепь имеет вариабельный участок тяжелой цепи (сокращенно VH) и константный участок тяжелой цепи. Константный участок тяжелой цепи содержит три домена, т.е. СН1, СН2 и СН3. Каждая легкая цепь содержит вариабельный участок легкой цепи (сокращенно VL) и константный участок легкой цепи. Константный участок легкой цепи имеет один домен, т.е., CL. Существуют два типа константных участков легкой цепи. т.е. λ(лямбда)-цепь и κ(каппа)-цепь. Константные участки тяжелой цепи делятся на γ(гамма)-цепь, μ(мю)-цепь, α(альфа)-цепь, δ(дельта)-цепь и ε(эпсилон)-цепь, и различные типы константных участков тяжелой цепи приводят к различным изотипам антител, т.е. IgG, IgM, IgA, IgD и IgE, соответственно. Каждый из VH и VL также делится на четыре типа относительно консервативных участка (FR-1, FR-2, FR-3 и FR-4), все называемые каркасными участками (FR), и три высоко вариабельных участка (CDR-1, CDR-2 CDR-3), все называемые определяющими комплементарность участками (CDR). VH-участок включает три CDR и четыре FR, расположенных в порядке FR-1, CDR-1 (CDR-H1), FR-2, CDR-2 (CDR-H2), FR-3, CDR-3 (CDR-H3) и FR-4 от аминоконца к карбоксильному концу. VL включает три CDR и четыре FR, расположенных в порядке FR-1, CDR-1 (CDR-L1), FR-2, CDR-2 (CDR-L2), FR-3, CDR-3 (CDR-L3) и FR-4 от аминоконца к карбоксильному концу. Вариабельный участок каждой тяжелой цепи и легкой цепи включает связывающий домен, который взаимодействует с антигеном.
Антитело по настоящему изобретению может представлять собой фрагмент и/или производное антитела. Примеры фрагментов антитела включают F(ab')2, Fab и Fv. Примеры производных антитела включают антитела, в которые введена аминокислотная мутация в его константном участке; антитела, в которых изменено расположение доменов в константных участках; антитела, имеющие два или больше Fc на молекулу; антитела, состоящие только из тяжелой цепи или только из легкой цепи; антитела с модифицированным гликозилированием; биспецифические антитела; конъюгаты антител или фрагментов антител с соединениями или белками иными, нежели антитела; ферменты антител; нанотела; тандем scFv; биспецифический тандем scFv; диатела и VHH. Термин «антитело», используемый в настоящем описании, охватывает такие фрагменты и/или производные антител, если не указано иное.
-7
-5
-6
-7
Согласно заявленному изобретению термин «реакция антиген-антитело», используемый в настоящем описании, означает, что антитело связывается с рецептором IGF-I с аффинностью, представленной константой равновесия диссоциации (KD) 1×10M или меньше. Антитело по настоящему изобретению предпочтительно должно связываться с рецептором IGF-I с KD, как правило, 1×10M или меньше, в частности 1×10M или меньше, предпочтительнее 1×10M или меньше.
Согласно заявленному изобретению термин «специфичность» антитела к антигену означает, что между антителом и антигеном происходит сильная реакция. В контексте настоящего раскрытия термин «антитело, специфическое к рецептору IGF-I» обозначает антитело, которое, когда используется в концентрации, достаточной для того, чтобы в значительной степени вызвать реакцию антиген-антитело с клетками, экспрессирующими рецептор IGF-I, вызывает реакцию антиген-антитело с INSR с реактивностью в 1,5 или меньше раз меньше реактивности с клеткой Mock. INSR имеет высокую схожесть с рецептором IGF-I в первичной структуре (аминокислотная последовательность) и структуре более высокого порядка.
Специалист в данной области техники сможет осуществить измерение реакции антиген-антитело, выбрав подходящий анализ на связывание в твердофазной или жидкофазной системе. Примеры таких анализов включают, но без ограничения, твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), ферментный иммуноанализ (EIA), поверхностный плазмонный резонанс (SPR), флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET) и резонансный перенос энергии люминесценции (LRET). Измерение аффинности связывания антиген-антитело можно осуществить, например, путем мечения антитела и/или антигена, например, ферментом, флуоресцентным материалом или радиоизотопом, и детекцией реакции антиген-антитело с использованием метода, подходящего для определения физических и/или химических свойств, характерных для использованной метки.
Полагают, что связываясь с доменом CR рецептора IGF-I, антитело по настоящему изобретению активирует гомотипный рецептор, когда рецептор IGF-I образует димер, или гетеротипный рецептор, когда рецептор IGF-I и INSR образуют димер.
Антитело по изобретению должно предпочтительно иметь специфические аминокислотные последовательности такие, как последовательности CDR, как будет поясняться подробнее ниже. В контексте настоящего изобретения термин «идентичность» аминокислотных последовательностей, используемый в настоящем описании, обозначает отношение идентичных аминокислотных остатков в последовательностях, в то время как термин «подобие» аминокислотных последовательностей, используемый в настоящем описании, обозначает отношение идентичных или подобных аминокислотных остатков в последовательностях. Подобие и идентичность аминокислотных последовательностей можно определить, например, с использованием метода BLAST (с условиями по умолчанию PBLAST, предлагаемыми NCBI).
Термин «подобные аминокислотные остатки», используемый в настоящем описании, обозначает группу аминокислотных остатков, имеющих боковые цепи с подобными химическими свойствами (например, электрическим зарядом или гидрофобностью). Группы подобных аминокислотных остатков включают
1) аминокислотные остатки, имеющие алифатические боковые цепи: глициновый, аланиновый, валиновый, лейциновый и изолейциновый остатки;
2) аминокислотные остатки, имеющие алифатические гидроксильные боковые цепи: сериновый и треониновый остатки;
3) аминокислотные остатки, имеющие амидсодержащие боковые цепи: аспарагиновый и глутаминовый остатки;
4) аминокислотные остатки, имеющие ароматические боковые цепи: фенилаланиновый, тирозиновый и триптофановый остатки;
5) аминокислотные остатки, имеющие основные боковые цепи: лизиновый, аргининовый и гистидиновый остатки;
6) аминокислотные остатки, имеющие кислотные боковые цепи: остатки аспарагиновой килоты и глутаминовой кислоты; и
7) аминокислотные остатки, имеющие серосодержащие боковые цепи: цистеиновый и метиониновый остатки.
Согласно настоящему изобретению, последовательность вариабельного участка тяжелой цепи CDR-1 (CDR-H1) предпочтительно представляет собой аминокислотную последовательность, определенную в SEQ ID NO: 1 (SerTyrTrpMetHis), или аминокислотную последовательность, полученную из SEQ ID NO: 1 путем замены аминокислотного остатка в любой одной позиции. Кроме того, последовательность CDR-H1 в вариабельном участке тяжелой цепи предпочтительно имеет 80%-ную или большую гомологию (предпочтительно идентична) с SEQ ID NO: 1.
Последовательность вариабельного участка тяжелой цепи CDR-2 (CDR-H2) предпочтительно представляет собой аминокислотную последовательность, определенную в SEQ ID NO: 2 (GluThrAsnProSerAsnSerValThrAsnTyrAsnGluLysPheLysSer), или аминокислотную последовательность, полученную из SEQ ID NO: 2 путем замены одного или больше аминокислотных остатков в любой одной или двух позициях. Кроме того, последовательность CDR-H2 в вариабельном участке тяжелой цепи предпочтительно имеет 88%-ную или большую, предпочтительнее 94%-ную гомологию (предпочтительно идентична) с SEQ ID NO: 2.
Последовательность вариабельного участка тяжелой цепи CDR-3 (CDR-H3) предпочтительно представляет собой аминокислотную последовательность, определенную в SEQ ID NO: 3 (GlyArgGlyArgGlyPheAlaTyr), или аминокислотную последовательность, полученную из SEQ ID NO: 3 путем замены одного или больше аминокислотных остатков в любой одной или двух позициях. Кроме того, последовательность CDR-H3 в вариабельном участке тяжелой цепи предпочтительно имеет 75%-ную или большую, предпочтительнее 87%-ную или большую гомологию (предпочтительно идентична) с SEQ ID NO: 3.
Последовательность вариабельного участка легкой цепи CDR-1 (CDR-L1) предпочтительно представляет собой аминокислотную последовательность, определенную в SEQ ID NO: 4 (ArgAlaSerGlnAsnIleAsnPheTrpLeuSer), или аминокислотную последовательность, полученную из SEQ ID NO: 4 путем замены одного или больше аминокислотных остатков в любой одной или двух позициях. Кроме того, последовательность CDR-L1 в вариабельном участке легкой цепи предпочтительно имеет 81%-ную или большую, предпочтительнее 90%-ную или большую гомологию (предпочтительно идентична) с SEQ ID NO: 4.
Последовательность вариабельного участка легкой цепи CDR-2 (CDR-L2) предпочтительно представляет собой аминокислотную последовательность, определенную в SEQ ID NO: 5 (LysAlaSerAsnLeuHisThr), или аминокислотную последовательность, полученную из SEQ ID NO: 5 путем замены аминокислотного остатка в любой одной позиции. Кроме того, последовательность CDR-L2 в вариабельном участке легкой цепи предпочтительно имеет 85%-ную или большую гомологию (предпочтительно идентична) с SEQ ID NO: 5.
Последовательность вариабельного участка легкой цепи CDR-3 (CDR-L3) предпочтительно представляет собой аминокислотную последовательность, определенную в SEQ ID NO: 6 (LeuGlnGlyGlnSerTyrProTyrThr), или аминокислотную последовательность, полученную из SEQ ID NO: 6 путем замены одного или больше аминокислотных остатков в любой одной или двух позициях. Кроме того, последовательность CDR-L3 в вариабельном участке легкой цепи предпочтительно имеет 77%-ную или большую, предпочтительнее 88%-ную или большую гомологию (предпочтительно идентична) с SEQ ID NO: 6.
В частности, антитело по настоящему изобретению предпочтительно имеет любую комбинацию следующих последовательностей CDR: аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 1 в качестве последовательности CDR-H1; аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 2 в качестве последовательности CDR-H2; аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 3 в качестве последовательности CDR-H3; аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 4 в качестве последовательности CDR-L1; аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 5 в качестве последовательности CDR-L2; и аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 6 в качестве последовательности CDR-L3.
Примеры способов идентификации каждой последовательности CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 или CDR-L3 в антителе включает метод Кабат (Kabat et al., The Journal of Immunology, 1991, Vol.147, No.5, pp.1709-1719) и метод Хотиа (Al-Lazikani et al., Journal of Molecular Biology, 1997, Vol.273, No.4, pp.927-948). Эти методы технологически обычны для специалистов в данной области техники, и их обзор может быть доступен, например, в Интернете, веб-страница Dr. Andrew C. R. Martin's Group (http://www.bioinf.org.uk/abs/).
Каркасная последовательность иммуноглобулина, который является антителом по настоящему изобретению, предпочтительно представляет собой каркасную последовательность любого из классов человеческого иммуноглобулина.
Вариабельный участок тяжелой цепи и вариабельный участок легкой цепи в антителе по настоящему изобретению предпочтительно имеют специфические аминокислотные последовательности, описанные подробнее ниже. Согласно заявленному изобретению выражение «одна или несколько позиций» показывает одну позицию, две позиции, три позиции, четыре позиции, пять позиций, шесть позиций, семь позиций, восемь позиций, девять позиций или десять позиций, если не указано иное.
Вариабельный участок тяжелой цепи в антителе по настоящему изобретению предпочтительно имеет аминокислотную последовательность, определенную в SEQ ID NO: 7, аминокислотную последовательность, полученную из SEQ ID NO: 7 путем замены одного или больше аминокислотных остатков в любой одной или нескольких позициях, или аминокислотную последовательность, имеющую 90%-ную или большую гомологию (предпочтительно идентичную) с SEQ ID NO: 7. Вариабельный участок легкой цепи в антителе по настоящему изобретению предпочтительно имеет аминокислотную последовательность, определенную в SEQ ID NO: 8, аминокислотную последовательность, полученную из SEQ ID NO: 8 путем замены одного или больше аминокислотных остатков в любой одной или нескольких позициях, или аминокислотную последовательность, имеющую 90%-ную или большую гомологию (предпочтительно идентичную) с SEQ ID NO: 8.
В частности, антитело по настоящему изобретению предпочтительно имеет SEQ ID NO: 7 как вариабельный участок тяжелой цепи и SEQ ID NO: 8 как вариабельный участок легкой цепи, или последовательности, включающие аминокислотную последовательность, в которой Tyr заменен на Ala, Ser, Phe или Cys в позиции 36 (номер по Кабат L36) SEQ ID NO: 8 (SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12, соответственно).
Аминокислотная последовательность каждого каркасного участка и/или каждого константного участка тяжелой цепи и легкой цепи в антителе по настоящему изобретению может быть выбрана из, например, каркасных последовательностей человеческих иммуноглобулинов класса IgG, IgA, IgM, IgE и IgD и их вариантов. Одним из примеров константного участка тяжелой цепи в антителе по настоящему изобретению является константным участком человеческого IgG4.
[Эпитоп гуманизированного антитела против рецептора IGF-I]
Антитело по настоящему изобретению использует домен CR рецептора IGF-I в качестве эпитопа. Антитело по настоящему изобретению предпочтительно связывается с или рядом с эпитопом, включающим пептид, имеющий аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотам с номерами 308-319 (ProSerGlyPheIleArgAsnGlySerGlnSerMet) SEQ ID NO: 14 (рецептор IGF-I человека). Антитело по настоящему изобретению вероятно связывается с доменом CR рецептора IGF-I и тем самым активирует гомотипный рецептор, когда рецептор IGF-I образует димер, или гетеротипный рецептор, когда рецептор IGF-I и INSR образуют димер. Отмечается, что антитело-агонист по настоящему изобретению, описанное далее (т.е., антитело по настоящему изобретению, которое является антителом-агонистом), не имеет авидности к INSR, имеющему высокое подобие с первичной структурой (аминокислотная последовательность) и структурой более высокого порядка рецептора IGF-I.
[Антитело-агонист и антитело-антагонист к рецептору IGF-I]
Антитело по настоящему изобретению включает как антитело-агонист, так и антитело-антагонист (далее в настоящем описании антитело-агонист и антитело-антагонист по настоящему изобретению, соответственно, будут соответственно называться «антитело-агонист по изобретению» и «антитело-антагонист по изобретению»). Антитело-агонист по изобретению оказывает действие усиления активности пролиферации на миобласты с помощью IGF-I при независимом применении. Напротив, антитело-антагонист по изобретению при совместном применении с IGF-I оказывает с помощью IGF-I действие, блокирующее активность пролиферации миобластов.
Антитело-агонист по изобретению предпочтительно представляет собой класс IgG человека или его вариант, предпочтительнее подкласс IgG4 человека или его вариант, или подкласс IgG1 человека или его вариант. В одном примере стабилизированный константный участок IgG4 включает пролин в позиции 241 в шарнирной области в соответствии со схемой нумерации по Кабат. Эта позиция соответствует позиции 228 в шарнирной области в соответствии со схемой EU (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, DIANE Publishing, 1992, Edelman et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 63, 78-85, 1969). Остатком в этой позиции в человеческом IgG4 обычно является серин, и замена серина пролином может привести к стабилизации. В другом примере включение мутации N297A в константный участок IgG1 служит для минимизации способности связываться с рецепторами Fc и/или фиксировать комплемент.
Антитело-агонист по изобретению сильно связывается со специфическим доменом рецептора IGF-I и оказывает действие усиления активности пролиферации in vitro у миобластов.
Кроме того, антитело-агонист по изобретению характеризуется отсутствием эффекта усиления поглощения глюкозы in vitro в дифференцированных мышечных клетках. Подробнее, антитело-агонист по изобретению не оказывает эффекта усиления поглощения глюкозы in vitro в культивированных дифференцированных мышечных клетках в эффективной концентрации для усиления активности пролиферации у миобластов (например, миобластов, полученных от людей или морских свинок), предпочтительнее в концентрации в 10 раз более высокой, или предпочтительнее даже в концентрации в 100 раз выше, чем эффективная концентрация.
Антитело-агонист по изобретению не оказывает гипогликемического эффекта в дозе, при которой проявляется увеличение мышечной массы. IGF-I оказывает значительное гипогликемическое действие в случае введения в дозе, которая проявляет действие увеличения мышечной массы. Однако антитело-агонист по изобретению не оказывает эффекта снижения уровня глюкозы в крови у позвоночного в дозе, которая вызывает увеличение мышечной массы и/или длины тела позвоночного. Антитело-агонист по изобретению предпочтительно не оказывает эффекта снижения уровня глюкозы в крови у позвоночного даже в случае, когда антитело вводят так, что уровень воздействия на кровь достигается при 10-кратной или более высокой эффективной дозы, которая вызывает увеличение мышечной массы и/или длины тела позвоночного.
Кроме того, антитело-агонист по изобретению имеет in vivo активность увеличения мышечной массы при однократном введении, сравнимую с активность при пролонгированном высвобождении IGF-I. Кроме того, антитело-агонист по изобретению имеет длительный период полужизни и проявляет эффект увеличения мышечной массы при однократном введении позвоночному.
Эти результаты показывают, что антитело-агонист по изобретению имеет высокий потенциал как терапевтический агент или профилактический агент при различных заболеваниях, связанных с рецепторами IGF-I, таких как атрофия неиспользуемых мышц и карликовость, который имеет преимущество перед IGF-I и может преодолеть гипергликемический эффект и короткое время полужизни в крови, которые являются недостатками IGF-I.
Напротив, антитело-антагонист по изобретению оказывает блокирующее действие на связывание IGF-I с рецептором IGF-I.
В одном воплощении антитело-антагонист по изобретению активирует рецептор IGF-I, но блокирует действие IGF-I на рецептор IGF-I. В этом случае антитело имеет эффект противодействия аддитивной агонистической активности IGF-I, например, активности IGF-I вызывать пролиферацию миобластов.
В другом воплощении антитело-антагонист по изобретению связывается с рецептором IGF-I, но не активирует рецептор IGF-I. Примеры таких антител-антагонистов, которые не вызывают активацию из-за перекрестной связи рецептора IGF-I, включают, но без ограничения, антитела, которые являются моновалентыми при связывании с антигеном, такие как Fab и scFv, антитела, которые имеют двухвалентные позиции связывания, такие как биспецифические антитела, но связываются со специфическим доменом рецептора IGF-I только на одной стороне позиций связывания, и антитела, в которых расстояние между двухвалентными позициями связывания изменяется, например, с помощью линкера.
В случае антитела-антагониста, которое среди антител-антагонистов по изобретению связывается с рецептором IGF-I, но не имеет агонистической активности, методом оценки реакции антиген-антитело между антителом и рецептором IGF-I можно подтвердить, что такое антитело обладает авидностью к рецептору IGF-I, в то время, как анализом пролиферации клеток, например, миобластов, можно подтвердить, что такое антитело не обладает активностью вызывать пролиферацию клеток.
Кроме того, антитело-антагонист по изобретению in vitro не оказывает влияния на поглощение глюкозы в дифференцированных мышечных клетках или на уровень глюкозы в крови in vivo. Соответственно, антитело-антагонист по изобретению служит в качестве гуманизированного антитела против рецептора IGF-I, которое не вызывает побочного эффекта, такого как гипергликемия, и имеет высокий потенциал как терапевтический агент или профилактический агент в случае злокачественных опухолей, таких как рак молочной железы, рак толстой кишки, саркома, рак легких, рак предстательной железы, рак щитовидной железы и миелома.
[Перекрестное взаимодействие]
Антитело по настоящему изобретению должно предпочтительно перекрестно взаимодействовать с рецептором IGF-I другого позвоночного. Термин «перекрестная реакция» означает, что в то время, как антитело вызывает реакцию антиген-антитело с рецептором IGF-I от животного-мишени (такого как человек), антитело также имеет способность связываться с антигеном другого животного, отличающегося от животного-мишени. Антитело должно предпочтительно иметь способность перекрестно взаимодействовать с рецептором IGF-I другого животного, отличающегося от животного-мишени, рецептор IGF-I которого является мишенью для реакции антиген-антитело с помощью антитела, такого как человек или животное, отличающееся от человека, включая морскую свинку, обезьяну, кролика, корову, свинью, лошадь, овцу, собаку или домашнюю птицу. В примере 4, описанном далее, показано, что гуманизированное антитело против рецептора IGF-I R11-16B связывается с последовательностью ProSerGlyPheIleArgAsnGlySerGlnSerMet в домене CR рецептора IGF-I человека. Так как эта последовательность ProSerGlyPheIleArgAsnGlySerGlnSerMet является консервативной в гомологичных частях рецепторов IGF-I обезьяны (яванский макак), кролика, морской свинки, коровы, овцы, лошади и собаки, это антитело имеет способность перекрестно связываться с рецепторами IGF-I этих видов. Кроме того, так как аминокислотные последовательности гомологичных частей мыши и крысы обе представляют собой ProSerGlyPheIleArgAsnSerThrGlnSerMet, скрининг на антитело против рецептора IGF-I, которое связывается с этой частью, делает возможным получение антитела, которое связывается с рецепторами IGF-I, например, мыши и крысы, и также имеет характеристики и функции, подобные характеристикам и функциям R11-16B.
С другой стороны, клетку или животное вида, которые не реагируют перекрестно с антителом по настоящему изобретению, можно превратить методами генной инженерии в клетку или животное, экспрессирующее рецептор IGF-I, с которым антитело по настоящему изобретению перекрестно взаимодействует.
[Активность индуцирования пролиферации клеток, полученных от позвоночных, и активность индуцирования увеличения мышечной массы и/или длины тела]
50
Гуманизироавнное антитело против рецептора IGF-I согласно одному воплощению настоящего изобретения обладает активностью индуцирования пролиферации клеток, полученных от позвоночных. Хотя антитела-агонисты к рецептору IGF-I уже были известны, нет сообщений об антителах, показывающих активность индуцирования пролиферации первичных культивируемых клеток, в частности, миобластов. Также до сих пор не сообщается ни об одном известном антителе, вызывающем пролиферацию клеток в дозе, ниже величины ЕС IGF-I in vitro.
Термин «клетки, полученные от позвоночных» в контексте настоящего раскрытия должен предпочтительно обозначать клетки, полученные от млекопитающих, птиц, рептилий, амфибий или рыб, предпочтительнее, клетки, полученные от млекопитающих или птиц, еще предпочтительнее, клетки, полученные от человека, обезьяны, кролика, морской свинки, коровы, свиньи, овцы, лошади или собаки. Клетки, полученные от этих видов, которые экспрессируют рецептор IGF-I, с которым перекрестно взаимодействует антитело по настоящему изобретению, могут быть индуцированы для пролиферации антителом по настоящему изобретению. «Клетки, полученные от позвоночных» согласно настоящему раскрытию также охватывают клетки и животных, сконструированных для экспрессии рецептора IGF-I видов, с которыми перекрестно взаимодействует антитело по настоящему изобретению; и модифицированные клетки животных, полученные из таких сконструированных клеток и животных.
Активность антитела, вызывающая пролиферацию клеток, полученных от позвоночных, можно проанализировать in vitro с использованием первичных культивируемых клеток, устойчивых клеточных линий или трансформантов, полученных из таких клеток.

Согласно заявленному изобретению термин «первичные культивируемые клетки» обозначает клетки, которые выделены из органа или ткани живого организма, и могут быть обычным образом субкультивированы в течение нескольких пассажей. Первичные культивируемые клетки, полученные от позвоночного, можно получить из органа или ткани позвоночного путем обработки ферментом, дисперсии физическими средствами или методом эксплантирования. Орган или ткань или их фрагменты, полученные от позвоночного, также можно использовать для анализа активности антитела, описанной выше. Предпочтительные примеры органов и тканей, из которых получают первичные клетки, включают эндокринные ткани, такие как щитовидная, паращитовидная железа и надпочечники; ткани иммунной системы, такие как аппендикс, миндалина, лимфоузел и селезенка; органы дыхания, такие как трахеи и легкие; органы пищеварения, такие как желудок, двенадцатиперстная кишка, тонкая кишка и толстая кишка; органы мочевыделения, такие как почки и мочевой пузырь; мужские половые органы, такие как семявыносящие протоки, яичко и предстательная железа; женские половые органы, такие как молочная железа и фаллопиева труба; и мышечные ткани, такие как сердечная мышца и скелетные мышцы. Более предпочтительные примеры включают печень, почки или органы пищеварения или мышечные ткани, среди которых еще более предпочтительными являются мышечные ткани. Первичные культивируемые клетки, которые можно использовать для анализа антитела по настоящему изобретению на активность, вызывающую пролиферацию, представляют собой клетки, которые экспрессируют рецептор IGF-I и могут быть стимулированы к пролиферации IGF-I, связывающимся с рецептором IGF-I. Их типичными примерами являются миобласты скелетных мышц, которые являются первичными культивируемыми клетками, выделенными из мышечной ткани. Первичные культивируемые клетки, полученные от человека или животного, доступные на рынке по заказу или на коммерческих условиях, также можно получить и использовать. Первичные культивируемые клетки человека доступны от различных институтов и компаний, например, ATCC, ECACC, Lonza, Gibco, Cell Applications, ScienCell research laboratories и PromoCell.
Согласно заявленному изобретению термин «клеточная линия» обозначает линию культивированных клеток, которые получены от живого организма и затем иммортализованы таким образом, что может происходить их полунепрерывная пролиферация с сохранением их специфических свойств. Клеточные линии делятся на линии клеток неопухолевого происхождения и линии клеток опухолевого происхождения. Линии клеток, полученных от позвоночных, можно использовать для анализа вызывающей пролиферацию активности антитела по настоящему изобретению, и клеток, которые экспрессируют рецептор IGF-I и могут быть стимулированы для пролиферации связыванием IGF-I с рецептором IGF-I. Примеры клеточных линий, которые экспрессируют рецептор IGF-I и могут быть стимулированы для пролиферации IGF-I, включают, хотя без ограничения, клетки нейробластомы человека SH-SY5Y, линию эпидермальных кератиноцитов человека HaCaT, линию клеток альвеолярной базальной эпителиальной аденокарциномы человека A549, линию клеток аденокарциномы толстой кишки человека Caco-2, линию клеток гепатоцеллюлярного рака человека HepG2, линию клеток рака шейки матки человека Hela, линию клеток рака шейки матки человека SiHa, линию клеток рака молочной железы человека MCF7, линию плюрипотенциальных клеток эмбриональной карциномы человека NTERA-2 и линию клеток рака костей человека U-2-OS.
Согласно заявленному изобретению трансформанты, которые можно использовать для анализа вызывающей пролиферацию активности антитела по настоящему изобретению, представляют собой трансформанты, полученные из первичных культивируемых клеток и клеточных линий, описанных выше. Примеры таких трансформантов включают клетки iPS, полученные из первичных культивируемых клеток; и клетки и ткани, дифференцированные из таких клеток iPS. Примеры других трансформантов включают первичные культивируемые клетки и клеточные линии, сконструированные для включения гена с тем, чтобы временно или постоянно экспрессировать ген. Примеры генов, которые подлежат включению в такие клетки и экспрессируемые такими клетками, включают гены рецептора IGF-I человека и других видов.
Способы определения вызывающей пролиферацию активности с помощью антитела по настоящему изобретения в клетках позвоночных включают подсчет клеток, измерение синтеза ДНК и измерение изменения в активности метаболических ферментов. Методы подсчета клеток включают методы с использованием счетных пластин для клеток крови или счетных устройств, таких как счетчики Культера. Способы измерения синтеза ДНК включают методы на основе поглощения [3Н]-тимидина или 5-бром-2'-дезоксиуридина (BrdU). Метод измерения изменения активности метаболических ферментов включает метод МТТ, метод ХТТ и метод WST. Специалисты в данной области техники могут использовать также другие подходящие методы.
50
50
50
50
50
Активность, вызывающую пролиферацию клеток, можно определить тем, что пролиферация культивируемых клеток, реагирующих с антителом по настоящему изобретению, увеличивается по сравнению с пролиферацией культивируемых клеток, не реагирующих с антителом. В этом случае индуцирующая активность может быть благоприятно нормализована через измерение с использованием IGF-I, исконного лиганда рецептора IGF-I, который взаимодействует в тех же условиях, что и контроль. Величина ЕС показывает концентрацию, при которой получают 50%-ную от максимума вызывающей пролиферацию активности в случае, когда антитело по настоящему изобретению и IGF-I взаимодействуют с культивируемыми клетками в различных концентрациях. В случае, когда вызывающую пролиферацию активность оценивают с помощью миобластов скелетных мышц человека, антитело по настоящему изобретению предпочтительно имеет величину ЕС при вызывающей пролиферацию клеток активности, эквивалентной величине ЕС IGF-I, предпочтительнее 1/10 величины ЕС или меньше, еще предпочтительнее 1/20 или меньше, наиболее предпочтительно 1/50 или меньше величины для IGF-I. Кроме того, в случае, когда вызывающую пролиферацию активность оценивают с помощью миобластов скелетных мышц человека, антитело по настоящему изобретению предпочтительно имеет величину ЕС 0,5 нмоль/л или меньше, предпочтительнее 0,3 нмоль/л или меньше, наиболее предпочтительно 0,1 нмоль/л или меньше.
Способы измерения активности, вызывающей рост происходящих от позвоночных клеток in vivo, включают способ, включающий введение позвоночному антител по настоящему изобретению и измерение изменений массы, размера, числа клеток и т.д. во всем организме индивидуума, который получил введение, или в органе или ткани, взятых у индивидуума; и способ, включающий использование животного с трансплантатом клеток позвоночного и измерение изменений массы, размера, числа клеток и т.д. трансплантата, включающего клетки позвоночного. Измерения по всему организму индивидуума включают измерения массы тела, длины тела и окружностей четырех конечностей; измерение структуры тела с использованием импедансного метода, и измерение коэффициента роста креатинина. Измерения в органе, ткани или трансплантате от индивидуума включают, в случает животного, не являющегося человеком, способ, включающий прямое извлечение мишени органа, ткани или трансплантата и измерение его массы, размера или числа клеток, заключенных в нем. Неинвазивные измерения в органе, ткани или трансплантате от индивидуума включают анализ изображения с использованием рентгеновского снимка, КТ и МРТ, и контрастные методы с использованием индикаторов с изотопами или флуоресцентными веществами. Если тканью-мишенью является скелетная мышца, тогда в качестве индикатора также можно использовать силу мышцы. Специалисты в данной области техники также могут использовать любые другие способы как подходящие для анализа активности антител по настоящему изобретению, вызывающей рост клеток позвоночного in vivo. Способы измерения активности антител по настоящему изобретению, вызывающей рост клеток позвоночного in vivo, включают выполнение измерений с использованием, например, способов, упомянутых выше в отношении индивидуумов, которые получали введение антител по настоящему изобретению, и индивидуумов, которые получали введение иных антител, чем антитела по настоящему изобретению, или любого другого контрольного вещества, и сравнение полученных результатов измерений у этих индивидуумов.
Антитело по настоящему изобретению характеризуется наличием более длительного эффекта, вызывающего пролиферацию клеток, относительно времени контакта с клетками по сравнению с длительностью эффекта IGF-I дикого типа, и тем самым показывает улучшенную устойчивость. Активность, вызывающая пролиферацию клеток in vitro, когда клетки вводят в контакт с IGF-I дикого типа и затем промывают культуральной средой без IGF-I, исчезает после промывки. С другой стороны, когда клетки вводят в контакт с антителом IGF11-16 (JP 2017-106529), которое стало основой для создания антитела по настоящему изобретению, и затем промывают культуральной средой без IGF11-16, активность, вызывающая пролиферацию клеток, сохраняется даже после промывки. В примере 8, описанном далее, в котором сравнивается кинетика IGF-I и антитела R11-16B (антитела по настоящему изобретению) в крови, примерно 50% или больше IGF-I дикого типа, введенного животному, исчезают из крови в пределах 24 часов после введения, в то время как 60% или больше антител R11-16B, введенных животному, остается в крови даже через 48 часов после введения. Таким образом, показано, что антитела R11-16B остаются в крови длительное время. Эти результаты показывают, что антитело по настоящему изобретению проявляет длительное действие, вызывающее пролиферацию клеток как in vitro, так и in vivo.
Также ожидается, что антитело по настоящему изобретению будет проявлять in vivo действие увеличения мышечной массы и/или длины тела. Конкретно, IGF-I оказывает действие, вызывающее рост и дифференцировку миобластов в скелетных мышцах, как упоминалось выше, а также эффект расширения мышечных волокон. Ожидается, что эти эффекты вместе приведут к эффекту увеличения мышечной массы. Подобно IGF-I, когда животному вводят антитела по настоящему изобретению, они также проявляют эффект увеличения мышечной массы. Антитело по настоящему изобретению является первым антителом, которое, как показано, проявляет in vivo действие увеличения мышечной массы.
Способы измерения активности антитела по настоящему изобретению для увеличения мышечной массы включают измерения по всему организму индивидуума, который получил введение: измерение массы тела, длины тела и окружностей четырех конечностей; измерение состава тела с использованием импедансного метода; и измерение креатинина и коэффициента роста. Другие способы включают анализ изображения с использованием рентгеновского снимка, КТ и МРТ; контрастные методы с использованием индикаторов с изотопами или флуоресцентными веществами и измерение изменения силы мышц. В случае животного, не являющегося человеком, также можно использовать способ, включающий прямое извлечение мишени органа, ткани или трансплантата и измерение его массы и/или размера. Эффект увеличения мышечной массы можно оценить, сравнивая увеличение мышечной массы у индивидуума, которому вводили антитела по настоящему изобретению, и у индивидуума, которому антитела не вводили; или сравнивая мышечную массу у индивидуума до и после введения антител по настоящему изобретению. Эффект увеличения мышечной массы можно определить, если у индивидуума имеется любое увеличение мышечной массы после введения антител по настоящему изобретению. Предпочтительно эффект, достигаемый путем введения антител по настоящему изобретению, можно определить, когда имеется различие предпочтительно 103% или больше, предпочтительнее 104% или больше в мышечной массе между индивидуумом, которому вводили антитела по настоящему изобретению, и индивидуумом, которому антитела не вводили, или у самого индивидуума до и после введения антител по настоящему изобретению. IGF-I также играет роль в росте костей, и оказывает влияние на длину тела (высота тела в случае человека). Следовательно, антитела по настоящему изобретению также проявляют эффект увеличения длины тела, когда вводятся животному. Действие антител по настоящему изобретению для увеличения длины тела индивидуума можно определить, измеряя массу тела, длину тела и окружности четырех конечностей индивидуума.
[Эффект на поглощение глюкозы клетками позвоночных и/или уровень глюкозы в крови у животного]
50
Антитело согласно одному воплощению настоящего изобретения характеризуется отсутствием влияния на поглощение глюкозы дифференцированными мышечными клетками, полученными от позвоночного, и/или уровень глюкозы в крови у позвоночного. Известно, что IGF-I вызывает усиление поглощения глюкозы клетками и снижение уровня глюкозы в крови как часть агонистического эффекта на рецептор IGF-I. Однако антитело-агонист по изобретению, которое функционирует как агонист рецептора IGF-I, оказывает такое неожиданное действие, как отсутствие индукции поглощения глюкозы дифференцированными мышечными клетками даже в дозе, в 100 раз или большей величины ЕС in vitro при активности, вызывающей пролиферацию у клеток, полученных от позвоночного, и не изменяет уровень глюкозы в крови даже при уровне воздействия на кровь в 10 или больше раз больше эффективной дозы, которая вызывает увеличение мышечной массы при парентеральном введении животному. Кроме того, антитело-антагонист по изобретению, функционирующее как антагонист рецептора IGF-I, также не влияет на поглощение глюкозы дифференцированными мышечными клетками, полученными от позвоночного, и/или уровень глюкозы в крови у позвоночного, что приводит к выгодному эффекту предотвращения, например, гипергликемии, которая является трудной проблемой применения обычных антител-антагонистов к рецептору IGF-I при лечении людей. Клетки, полученные от позвоночного, согласно заявленному изобретению являются такими, какие описаны выше.
Для того, чтобы проанализировать действие антитела по настоящему изобретению, заключающееся в отсутствии влияния на внутриклеточное поглощение глюкозы клетками позвоночного in vitro, возможно использование первичных культивируемых клеток, клеточных линий и трансформантов, полученных из таких клеток. Первичные культивируемые клетки, утойчивые клетки и клетки-трансформанты согласно заявленному изобретению являются такими, какие описаны выше.
Примеры методов определения эффекта антитела по настоящему изобретению на поглощение глюкозы клетками, полученными от позвоночного, включают измерение внутриклеточной концентрации глюкозы; измерение внутриклеточного поглощения глюкозы с использованием аналогичного отслеживаемого вещества и измерение изменения количества транспортера глюкозы. Методы измерения концентрации глюкозы включают способы измерения поглощения, такие как ферментативный способ. Способы измерения внутриклеточного поглощения глюкозы с использованием аналогичного отслеживаемого вещества включают измерение поглощения [3H]-2'-дезоксиглюкозы. Способы измерения изменения количества транспортера глюкозы включают иммуногистохимическое окрашивание и вестерн-блоттинг. Специалисты в данной области техники также могут использовать другие подходящие способы. Тот факт, что эффект на внутриклеточное поглощение глюкозы отсутствует, можно подтвердить, если внутриклеточное поглощение глюкозы культивируемыми клетками, взаимодействующими с антителом по настоящему изобретению, почти такое же, как внутриклеточное поглощение глюкозы культивируемыми клетками в отсутствие антитела. В этом случае также удобно проводить измерение в тех же условиях, используя в качестве контроля IGF-I, который является исконным лигандом для рецептора IGF-I.
Испытываемые культивируемые клетки обрабатывают либо антителом по настоящему изобретению, либо IGF-I, изменяя их концентрацию, и поглощение глюкозы обработанной группой показывают как процент, причем внутриклеточное поглощение глюкозы необработанной группой принимают за 100%. Когда для оценки поглощения глюкозы используют дифференцированные мышечные клетки человека, поглощение глюкозы, достигаемое с помощью антитела по настоящему изобретению, должно предпочтительно быть равным или меньшим, чем поглощение глюкозы, достигаемое с помощью IGF-I в той же концентрации. Предпочтительное поглощение глюкозы, достигаемое с помощью антитела по настоящему изобретению, должно составлять 110% или меньше, предпочтительнее 100% от поглощения глюкозы необработанной группой. Когда для оценки поглощения глюкозы используют дифференцированные мышечные клетки человека, поглощение глюкозы, достигаемое с помощью антитела по настоящему изобретению, добавленного в количестве 100 нмоль/л, должно предпочтительно составлять 110% или меньше, предпочтительно 105% или меньше, еще более предпочтительно от 95% до 100%.
Способы определения поглощения глюкозы in vivo клетками, полученными от позвоночного, включают способы, включающие парентеральное введение позвоночному антител по настоящему изобретению и определение изменения содержания глюкозы в органе или ткани индивидуума. Способы измерения во всем организме индивидуума, который получил введение, включают измерение уровня глюкозы в крови и гемоглобина А1С с использованием гликозилированных белков в качестве индикаторов. Способы измерения поглощения глюкозы в органе или ткани индивидуума включают, в случае животного, не являющегося человеком, прямое извлечение мишени органа или ткани и вычисление концентрации глюкозы или индикатора. Неинвазивные способы измерения поглощения глюкозы в органе или ткани индивидуума включают анализ изображения с использованием рентгеновского снимка, КТ и МРТ; и контрастные способы с использованием индикаторов с изотопами или флуоресцентными веществами. Если тканью-мишенью является скелетная мышца, тогда в качестве индикатора можно использовать также глюкозный клэип-тест. Специалисты в данной области техники также могут использовать любые другие подходящие способы для анализа воздействия антитела по настоящему изобретению на поглощение глюкозы in vivo клетками, полученными от позвоночного.
Антитело по настоящему изобретению также отличается тем, что, когда вводится позвоночному даже в эффективной дозе, достаточной для увеличения мышечной массы позвоночного, предпочтительно в дозе больше эффективной дозы в 10 раз или больше, это не изменяет уровень глюкозы в крови позвоночного. Когда оценивают действие антитела по настоящему изобретению на изменение уровня глюкозы в крови позвоночного, предпочтительно использовать животное, принадлежащее к млекопитающим, птицам, рептилиям, амфибиям или рыбам, предпочтительнее, животное, принадлежащее к млекопитающим или птицам, еще предпочтительнее, человеку, обезьяне, кролику, морской свинке, корове, свинье, овце, лошади или собаке. Животное, сконструированное для экспрессии рецептора IGF-I вида, который имеет перекрестную реактивность с антителом по настоящему изобретению, также можно использовать в качестве животного для оценки эффекты антитела по настоящему изобретению на изменение уровня глюкозы в крови. Инвазивные способы измерения уровня глюкозы в крови включают колориметрический способ и электродный способ. Примеры ферментативных способов, используемых для детекции, включают глюкозооксидазный способ (GOD способ) и глюкозодегидрогеназный способ (GDH способ). Неинвазивные способы включают оптические способы измерения. Специалисты в данной области техники также могут выбрать любой другой подходящий способ. В случае человека нормальный интервал уровня глюкозы натощак составляет от 100 мг/дл до 109 мг/дл. Что касается нежелательных явлений для уровня глюкозы в крови в результате введения лекарств (Common Terminology Criteria for Adverse Events v4.0), то уровень глюкозы в крови ниже интервала от 77 мг/дл до 55 мг/дл определяют как показатель низкого уровня глюкозы в крови, в то время как уровень глюкозы в крови выше интервала от 109 мг/дл до 160 мг/дл определяют как показатель высокого уровня глюкозы в крови. Введение лекарственного средства рассматривается как не влияющее на уровень глюкозы в крови, когда уровень глюкозы в крови после введения лекарственного средства выше 55 мг/дл и ниже 160 мг/дл, предпочтительнее выше 77 мг/дл и ниже 109 мг/дл. Однако нормальная величина уровня глюкозы в крови и интервал ее колебания изменяются в зависимости от животного, которому вводят лекарство, и даже у человека уровень глюкозы в крови может не всегда находиться в нормальном интервале во время приема лекарства. Соответственно, в контексте настоящего изобретения антитело по настоящему изобретению следует предпочтительно рассматривать как не изменяющее уровень глюкозы в крови позвоночного, которому вводят антитело, когда изменение уровня глюкозы в крови позвоночного составляет предпочтительно 30% или меньше, предпочтительнее 20% или меньше, еще предпочтительнее 10% или меньше.
[Cпособ получения гуманизированного антитела против реацептора IGF-I]
Антитело по настоящему изобретению можно получить путем гуманизации мышиного моноконального антитела IGF11-16 (мышиное антитело IGF11-16, JP 2017-106529) к рецептору IGF-I. Пример способа получения гуманизированного антитела поясняется в примере 1, описанном далее, и гуманизированные антитела, полученные таким способом, включают, но без ограничения, гуманизированные антитела (R11-16B, R11-16C, R11-16D, R11-16E или R11-16F), причем каждое имеет аминокислотную последовательность VH SEQ ID NO: 7 и аминокислотную последовательность VL SEQ ID NO: 8, 9, 10, 11 или 12.
Можно получить молекулу нуклеиновой кислоты, имеющую последовательность оснований, кодирующую аминокислоты белка в полученном гуманизированном антителе против рецептора IGF-I, и такую молекулу нуклеиновой кислоты для получения антитела можно также создать с помощью генной инженерии. Цепь Н, цепь L или их вариабельные участки в генетической информации антитела можно модифицировать для улучшения авидности и специфичности антитела с обращением к информации, например, о последовательностях CDR.
В способе получения антитела по настоящему изобретению, например, клетки млекопитающего, клетки насекомого и Escherichia coli, в которые вводят гены, кодирующие аминокислоты белков целевых антител, культивируют, и тем самым можно получить антитело путем очистки полученного культурального супернатанта обычным способом. Один из конкретных способов поясняется ниже.
Для получения антитела по настоящему изобретению молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельный участок цепи Н, связывают с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей сигнальный пептид цепи Н, и молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей константный участок цепи Н. Для получения антитела по настоящему изобретению молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельный участок цепи L, связывают с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей сигнальный пептид цепи L, и молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей константный участок цепи L.
Эти ген цепи Н и ген цепи L внедряют в вектор, например, клонирующий вектор или экспрессирующий вектор, подходящий для экспрессии в выбранной клетке-хозяине. В этом случае ген цепи Н и ген цепи L можно внедрить в один вектор или раздельные векторы, с тем, чтобы можно было экспрессировать оба гена.
Затем вектор, в который внедрены ген цепи Н и ген цепи L, вводят в клетку-хозяина. Примеры клетки-хозяина включают эукариотические клетки, такие как клетки млекопитающих, клетки насекомых, клетки дрожжей или клетки растений, и бактериальные клетки. Способ введения генов в клетку-хозяина можно соответственно выбрать из химического способа, такого как кальций-фосфатный способ или способ липофекции, физического способа, такого как способ электропорации или способ обстрела частицами, и способ, основанный на заражении вирусом или фагом. Клетку-хозяина, в которую введены ген цепи Н и ген цепи L, можно использовать в культивировании без какого-либо отбора, избирательно конденсируя рекомбинантные клетки, в которые внедрены гены, с использованием свойств, например, лекарственной устойчивости и ауксотрофии, или культивируя рекомбинантные клонированные клетки, сконструированные из одной клетки-хозяина, в которую введены гены.
Клетку-хозяина, в которую введены ген цепи Н и ген цепи L, культивируют в оптимальной среде и условиях культивирования. В этом способе продукты гена цепи Н и гена цепи L, экспрессированные в клетке-хозяине, обычно секретируются в среду в виде белков антител, и полученные белки антитела можно извлечь, собирая среду. Однако через комбинирование генов и клетки-хозяина белки антитела, накопившиеся в клетке, при необходимости можно извлечь путем разрушения клетки-хозяина, или белки антитела можно извлечь из периплазматической фракции в случае прокариотической клетки. Примеры способов, обычно используемых для очистки антитела из образца, такого как среда, содержащая извлеченные белки антитела, включают высаливание; обогащение или замену растворителя путем диализа и ультрафильтрации и аффинной хроматографии с использованием носителя, который содержит, например, иммобилизованный белок А, белок G или антиген. Также доступными являются ионообменная хроматография, гидрофобная хроматография, хроматография смешанного типа и эксклюзионная хроматография. Различные способы, используемые в этих способах, хорошо известны специалистам в данной области техники.
В связи с этим специалист в данной области техники может получить различные антитела, такие как антительные химерные белки, низкомолекулярные антитела и антитела на основе антительных каркасов, используя известные способы, например, осуществляя генетическую модификацию гена, кодирующего тяжелую цепь и/или легкую цепь иммуноглобулина, для введения желательного свойства, и/или используя структурную информацию о вариабельных участках или CDR участках тяжелой цепи и/или легкой цепи иммуноглобулина. Кроме того, для того, чтобы улучшить производительность антитела или избежать побочного эффекта, возможно введение модификации в структуру константного участка антитела или введение сайтов гликозилирования антитела с использованием соответствующих способов, хорошо известных специалистам в данной области техники.
[Лекарственное средство, содержащее гуманизированное антитело против рецептора IGF-I]
Антитело по настоящему изобретению можно использовать как терапевтический или профилактический агент в случае состояния, ассоциированного с IGF-I, или заболевания, вызванного любым действием на рецептор IGF-I. Конкретно, состояния или заболевания, ассоциированные с IGF-I, которые могут быть мишенью для терапии или профилактики с использованием антитела-агониста к рецептору IGF-I, включают мышечную аторфию (например, атрофию неиспользуемых мышц, саркопению и кахексию), карликовость (например, карликовость типа Ларона и карликовость, резистентную к гормону роста), цирроз печени, фиброз печени, диабетическую нефропатию, хроническую почечную недостаточность, старение, задержку внутриутробного развития (IUGR), защиту сердечнососудистой системы, диабет, инсулинорезистентность, метаболический синдром, остеопороз, муковисцидоз, миотоническую дистрофию, СПИД-ассоциированную саркопению, ВИЧ-ассоциированный синдром перераспределения жира, болезнь Крона, синдром Вернера, Х-сцепленное комбинированное иммунодефицитное заболевание, тугоухость, нервную анорексию и ретинопатию недоношенных, синдром Тернера, синдром Прадера-Вилли, синдром Сильвера-Рассела, идиопатическую карликовость, ожирение, рассеянный склероз, неспецифический язвенный колит, низкую мышечную массу, ишемию миокарда и пониженную плотность костей. Заболевания, которые могут быть мишенью для терапии или профилактики с использованием антитела-антагониста к рецептору IGF-I, включают нейробластому, саркому поперечно-полосатых мышц, рак костей, рак у детей, акромегалию, рак яичников, панкреатический рак, доброкачественную гипертрофию предстательной железы, рак молочной железы, рак предстательной железы, рак легких, колоректальный рак, рак шейки матки, синовиальную саркому, рак мочевого пузыря, рак желкдка, опухоль Вильмса, диарею, ассоциированную с метастатическим карциноидом и опухолью, секретирующей вазоактивный интестинальный пептид, випому, синдром Вернера-Моррисона, синдром Беквета-Виндемана, рак почек, почечно-клеточный рак, переходно-клеточный рак, саркому Юнига, лейкоз, острый лимфобластный лейкоз, опухоль головного мозга, глиобластому, неглиобластоматическую опухоль головного мозга, менингиому, аденому гипофиза, вестибулярную шванному, примитивную нейроэктодермальную опухоль, медуллобластому, астроцитому, олигодендроглиому, эпендимому, папиллому сосудистого сплетения, гигантизм, псориаз, атеросклероз, гладкомышечный рестеноз сосудов, неуместный рост микрососудов, диабетическую ретинопатию, болезнь Грейвса, системную красную волчанку, тиреоидит Хашимото, тяжелую псевдопаралитическую миастению, аутоиммунный тиреоидит и болезнь Бехчета. Особенно предпочтительные применения антитела по настоящему изобретению включают применение в качестве терапевтического или профилактического агента при мышечной аторофии (например, атрофии неиспользуемых мышц, саркопении и кахексии) и/или карликовости (например, карликовости типа Ларона и карликовости, резистентной к гормону роста). Антитело по настоящему изобретению имеет то преимущество, что оно не изменяет уровень глюкозы в крови после введения.
Лекарственное средство, содержащее антитело по настоящему изобретению, может быть составлено в форме фармацевтической композиции, которая содержит, кроме антитела по настоящему изобретению, фармацевтически приемлемый носитель и/или другой эксципиент. Лекарственный препарат с использованием фармацевтически приемлемого носителя и/или другого эксципиента, можно получить в соответствии, например, со способом, описанным в работе Университета наук в Филадельфии «Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th EDITION”, Lippincott Williams & Wilkins, 2000».
Такой терапевтический или профилактический агент может быть предоставлен в виде жидкого препарата, полученного путем растворения, суспендирования или эмульгирования ингредиентов в стерильной водной среде или масляной среде или в виде их лиофилизованных препаратов. Средой или растворителем для получения такого препарата может быть водная среда, примеры которой включают дистиллированную воду для инъекции и физиологический солевой раствор, которую можно, необязательно, использовать с добавлением осмотического агента (например, D-глюкозы, D-сорбита, D-маннита и хлорида натрия), и/или в комбинации с подходящим содействующим растворению веществом, таким как спирт (например, этанол), полиспирт (например, пропиленгликоль или полиэтиленгликоль) или неионное поверхностно-активное вещество (например, полисорбат 80 или полилксиэтилированное гидрогенизированное касторовое масло 50). Такой препарат также можно получить в масляной среде или растворителе, примеры которых включают сезамовое масло и соевое масло, которые можно использовать, необязательно, в комбинации с содействующим растворению веществом, таким как бензилбензоат и бензиловый спирт. Такие жидкие лекарственные средства часто можно получить с использованием подходящих добавок, таких как буферирующие агенты (например, фосфатные буферирующие агенты и ацетатные буферирующие агенты), успокаивающие агенты (например, хлорид бензалкония и гидрохлорид прокаина), стабилизаторы (например, человеческий сывороточный альбумин и полиэтиленгликоль), консерванты (например, аскорбиновая кислота, эриторбовая кислота и их соли), красители (например, медный комплекс хлорофилла и β-каротин, красный №2 и синий №1), антисептические агенты (например, эфиры параоксибензойной кислоты, фенол, хлорид бензетония и хлорид бензалкония), загустители (например, гидроксипропилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза и их соли), стабилизаторы (например, человеческий сывороточный альбумин, маннит и сорбит) и корригенты запаха (например, ментол и цитрусовые ароматы).
Другие альтернативные формы включают терапевтические агенты или профилактические агенты для нанесения на слизистые оболочки, причем такие препараты обычно содержат добавки, такие как чувствительные к давлению адгезивы, чувствительные к давлению усилители, регуляторы вязкости, загустители и т.п. (например, муцин, агар, желатин, пектин, каррагенан, альгинат натрия, смола плодов робинии, ксантановая камедь, трагакантовая камедь, аравийская камедь, хитозан, пуллулан, восковидный крахмал, сукральфат, целлюлоза и ее производные (такие как гидроксипропилметилцеллюлоза), эфиры полиглицерина и жирных кислот, сополимеры акриловой кислоты и алкил(мет)акрилатов или их соли и эфиров полиглицерина и жирных кислот), преимущественно с целью придания свойств адсорбции или удержания в слизистой оболочке. Однако форма, растворитель и добавки для терапевтического агента или профилактического агента для введения в организм не ограничиваются перечисленным, и, соответственно, специалистом в данной области техники может быть сделан выбор.
Лекарственное средство, содержащее антитело по настоящему изобретению, также может содержать, кроме антитела по настоящему изобретению, другой известный агент (активный ингредиент). Лекарственное средство, содержащее антитело против рецептора IGF-I по настоящему изобретению, может находиться в комбинации в другим известным агентом в форме набора. Примеры активных ингредиентов для комбинации с антителом-агонистом к рецептору IGF-I включают гормон роста или его аналог, инсулин или его аналог, IGF-II или его аналог, антитело против миостатина, антагонист миостатина, антитело против рецептора активина типа IIB, антагонист рецептора активина типа IIB, растворимый рецептор активина типа IIB или его аналог, грелин или его аналог, фоллистатин или его аналог, бета-2 агонист и селективный модулятор андрогенного рецептора. Примеры активных ингредиентов для комбинации с антителом-антагонистом к рецептору IGF-I включают кортикостероид, антиэметик, гидрохлорид ондансетрона, гидрохлорид гранисетрона, метоклопрамид, домперидон, галоперидол, циклизин, лоразепам, прохлорперазин, дексаметазон, левомепромазин, трописетрон, вакцину против рака, ингибитор GM-CSF, ДНК-вакцину с GM-CSF, вакцину на основе клеток, вакцину на основе дендритных клеток, рекомбинантную вирусную вакцину, вакцину на основе белков теплового шока (HSP), гомологичную противоопухолевую вакцину, аутологичную противоопухолевую вакцину, аналгетик, ибупрофен, напроксен, холин-магний трисалицилат, гидрохлорид оксикодона, антиангиогеник, антитромбоцитарное средство, антитело против PD-1, ниволумаб, пембролизумаб, антитело против PD-L1, атезолизумаб, антитело против CTLA4, ипилимумаб, антитело против CD20, ритуксимаб, антитело против HER2, трастузумаб, антитело против CCR4, могамулизумаб, антитело против VEGF, бервацизумаб, антитело против рецептора VEGF, растворимый фрагмент рецептора VEGF, антитело против TWEAK, антитело против рецептора TWEAK, растворимый фрагмент рецептора TWEAK, AMG 706, AMG 386, антипролиферативное средство, ингибитор фарнезилпротеинтрансферазы, ингибитор альфа-v-бета 3, ингибитор альфа-v-бета 5, ингибитор p53, ингибитор рецептора Kit, ингибитор рецептора ret, ингибитор PDGFR, ингибитор секреции гормона роста, ингибитор ангиопоэтина, ингибитор опухоль-инфильтрирующего макрофага, ингибитор c-fms, антитело против c-fms, ингибитор CSF-1, антитело против CSF-1, растворимый фрагмент c-fms, пегвисомант, гемцитабин, панитумумаб, иринотекан и SN-38. Дозировка другого агента, используемого в комбинации с антителом, может находиться в пределах дозировки, используемой для обычной терапии, но может быть увеличена или снижена, в зависимости от ситуации.
Терапевтический или профилактический агент согласно настоящему изобретению может быть введен с целью улучшения симптоматики. Для парентерального введения можно получить трансназальное средство, и можно выбрать жидкое лекарство, суспензию или твердый препарат. Можно получить инъекцию как другую форму для парентерального введения, причем инъекцию выбирают как подкожную инъекцию, внутривенную инъекцию, инфузию, внтуримышечную инъекцию, интрацеребровентрикулярную инъекцию или интраперитонеальную инъекцию. Другие препараты, используемые для парентерального введения, включают суппозитории, сублингвальные средства, чрезкожные средства и средства для трансмукозального введения, иные, чем трансназальные средства. Кроме того, возможно внутрисосудистое местное введение путем добавления или нанесения покрытия на стент или внутрисосудистый обтуратор.
Доза средства для лечения или профилактики согласно изобретению будет различной в зависимости от возраста пациента, пола, массы тела и симптомов, терапевтического эффекта и способа введения, времени лечения или типов активных ингредиентов в лекарственной композиции, но обычно можно вводить дозу в интервале 0,1 мг - 1 г, и предпочтительно в интервале 0,5 мг - 300 мг активного соединения на введение для взрослых один раз в одну-четыре недели или один раз в один-два месяца. Однако, так как частота введения и доза будут изменяться в зависимости от различных состояний, достаточными могут быть меньшая доза для введения и меньшая частота, чем указанные выше, или могут быть необходимыми доза для введения и частота, превышающие эти интервалы.
[Способ культивирования клеток с использованием гуманизированного антитела против рецептора IGF-I]
IGF-I и его производные широко используются в способах культивирования клеток для поддержания, роста и/или дифференцировки полученных от позвоночных клеток in vitro, и имеются на рынке как реагенты для культивирования клеток. Однако, так как IGF-I может утратить свое действие в течение длительного культивирования из-за, например, отсутствия у него достаточной стабильности, необходимо поддерживать его концентрацию для того, чтобы стабильно проводить культивирование клеток. Кроме того, так как IGF-I вызывает поглощение глюкозы клетками, возможно, что метаболизм и характеристики клеток могут изменяться из-за повышения концентрации внутриклеточной глюкозы, и что условия культивирования могут изменяться из-за снижения концентрации глюкозы в культуральной среде. По сравнению с IGF-I, антитело по настоящему изобретению отличается тем, что оно более стабильно, может сохранять свое действие на пролиферацию клеток даже после контакта с клетками, может проявлять активность индуцировать пролиферацию клеток даже в более низкой концентрации, и дозы не вызывают внутриклеточного поглощения глюкозы. Антитело против рецептора IGF-I по настоящему изобретению можно использовать для культивирования клеток, добавляя соответствующее количество антител в культуральную среду или адсорбируя или иммобилизуя соответствующее количество антител на твердой фазе сосуда для культивирования. Таким образом, антитело по настоящему изобретению делает возможным уменьшить используемое количество и эффективно индуцировать пролиферацию клеток, прилипающих к твердой фазе. Полученные от позвоночного клетки согласно заявленному изобретению являются такими, как описано выше. Конкретнее, примеры объектов, которые можно культивировать с использованием антитела по настоящему изобретению, также включают орган или ткань позвоночного или трансгенного животного, полученного из такого позвоночного. Антитело по настоящему изобретению можно использовать для культивирования клеток с целью продуцирования клетками вещества или для клеточной терапии и регенеративной медицины с использованием таких клеток.
ПРИМЕРЫ
Теперь настоящее изобретение будет описываться подробнее через следующие далее примеры. Настоящее изобретение не ограничивается этими примерами и может быть реализовано в любой форме без отступления от сущности настоящего изобретения.
Пример 1. Получение гена гуманизированного антитела мышиного антитела IGF11-16
Матричное человеческое антитело выбирают из зародышевых линий человеческих антител, имеющих аминокислотные последовательности, высокогомологичные последовательностям каркасных участков (FR) в вариабельном участке тяжелой цепи (VH) и вариабельном участке легкой цепи (VL) мышиного антитела IGF11-16, где в матричное человеческое антитело должны быть трансплантированы аминокислоты определяющего комплементарность участка (CDR) из VH и VL мышиного моноклонального антитела IGF11-16 (мышиное антитело IGF11-16 раскрыто в JP 2017-106529) к рецепторам IGF-I, полученного гибридомным способом Kohler et al. (Nature, 256: 495-497, 1975).
Требуемые аминокислотные последовательности из VH и VL мышиного антитела IGF11-16 трансплантируют в FR в VH и VL матричных человеческих антител для получения гуманизированных антител. Подробно, аминокислотную последовательность CDR и некоторые позиции в аминокислотной последовательности FR из VH матричного человеческого антитела заменяют соответствующими аминокислотными последовательностями из VH мышиного антитела IGF11-16 для создания аминокислотной последовательности R11-16VH (SEQ ID NO: 7), которая является гуманизированной VH мышиного антитела IGF11-16, и для дальнейшего создания последовательности оснований ДНК, кодирующей эти аминокислоты.
Аминокислотную последовательность CDR и некоторые позиции в аминокислотной последовательности FR из VL матричного человеческого антитела заменяют аминокислотными последовательностями из VL мышиного антитела IGF11-16 для создания аминокислотной последовательности R11-16VL которая является гуманизированной VL мышиного антитела IGF11-16.
Аминокислотная последовательность 36 в R11-16VL представляет собой цистеин в мышином антителе IGF11-16. Однако цистеин редко присутствует в этой позиции в нормальном человеческом антителе. Так как генерация дисульфидной связи, которая изначально не генерируется, вероятно приводит к агрегации, создают дополнительно пять аминокислотных последовательностей R11-16VL, т.e., R11-16VL-C36, R11-16VL-C36Y, R11-16VL-C36A, R11-16VL-C36S и R11-16VL-C36F (SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11), которые в позиции 36 включают цистеин, тирозин, аланин, серин или фенилаланин, и также создают последовательности оснований ДНК, кодирующих эти аминокислоты. Структура гуманизированных антител и их аминокислотные последовательности приводятся в таблице 1.
Таблица 1. Структуры и аминокислотные последовательности гуманизированных антител
Название антитела
Вариабельный участок тяжелой цепи
Вариабельный участок легкой цепи
R11-16B
R11-16VH
R11-16VL-C36Y
SEQ ID NO: 7
SEQ ID NO: 8
R11-16C
R11-16VH
R11-16VL-C36A
SEQ ID NO: 7
SEQ ID NO: 9
R11-16D
R11-16VH
R11-16VL-C36S
SEQ ID NO: 7
SEQ ID NO: 10
R11-16E
R11-16VH
R11-16VL-C36F
SEQ ID NO: 7
SEQ ID NO: 11
R11-16F
R11-16VH
R11-16VL-C36
SEQ ID NO: 7
SEQ ID NO: 12
Пример 2. Получение гуманизированного антитела
Синтезируют ДНК, кодирующие вариабельный участок тяжелой цепи R11-16VH созданного гуманизированного антитела, и ДНК, кодирующие человеческий вариант IgG4S228P, который является стабилизированым вариантом подкласса IgG4 человека, и внедряют и лигируют в экспрессионный вектор pCAGGS1 с образованием плазмиды, экспрессирующей тяжелую цепь гуманизированного антитела.
Что касается вариабельного участка легкой цепи R11-16VL, созданного гуманизированного антитела, то синтезируют ДНК, кодирующие участок легкой цепи гуманизированного антитела, лигированный в константный участок каппа-цепи, и внедряют в экспрессионный вектор pCAGGS1 с образованием плазмиды, экспрессирующей легкую цепь гуманизированного антитела.
Смешивают плазмиду, экспрессирующую тяжелую цепь гуманизированного антитела, и плазмиду, экспрессирующую легкую цепь гуманизированного антитела, и вводят в клетки с использованием экспрессирующей системы Expi293 ™ Expression System (Thermo Fisher Scientific), и посредством этого экспрессируют различные антитела, полученные гуманизацией мышиного антитела IGF11-16. Эти антитела называют антитело R11-16B, антитело R11-16C, антитело R1-16D, антитело R11-16E и антитело R11-16F, соответственно: антитело R11-16B является гуманизированным антителом, экспрессированным комбинацией плазмиды для экспрессии тяжелой цепи, включающей R11-16VH, и плазмиды для экспрессии легкой цепи, включающей R11-16VL-C36Y; антитело R11-16C является гуманизированным антителом, экспрессированным комбинацией плазмиды для экспрессии тяжелой цепи, включающей R11-16VH, и плазмиды для экспрессии легкой цепи, включающей R11-16VL-C36A; антитело R11-16D является гуманизированным антителом, экспрессированным комбинацией плазмиды для экспрессии тяжелой цепи, включающей R11-16VH, и плазмиды для экспрессии легкой цепи, включающей R11-16VL-C36S; антитело R11-16E является гуманизированным антителом, экспрессированным комбинацией плазмиды для экспрессии тяжелой цепи, включающей R11-16VH, и плазмиды для экспрессии легкой цепи, включающей R11-16VL-C36F; и антитело R11-16F является гуманизированным антителом, экспрессированным комбинацией плазмиды для экспрессии тяжелой цепи, включающей R11-16VH, и плазмиды для экспрессии легкой цепи, включающей R11-16VL-C36. Гуманизированные антитела получают аффинной очисткой культурального супернатанта клеток, в которые внедрены плазмиды, экспрессирующие тяжелую цепь и легкую цепь гуманизированного антитела, с помощью колонки с белком А.
Пример 3. Авидность к рецептору IGF-I (ELISA)
Авидность к рецептору IGF-I антител-агонистов к рецепторам IGF-I человека (SEQ ID NO: 14, NP_000866), морской свинки (SEQ ID NO: 16, XP_003475316), яванского макака (SEQ ID NO: 18, XP_005560575) и крысы (SEQ ID NO: 20, NP_434694) проверяют ELISA на основе клеток с использованием клеток, в которых экспрессированы рецепторы IGF-I.
4
Экспрессирующие векторы pEF1 (Thermo fisher), в которые внедрены гены рецептора IGF-I человека (SEQ ID NO: 15), морской свинки (SEQ ID NO: 17), яванского макака (SEQ ID NO: 19) и крысы (SEQ ID NO: 21), вводят в клетки HEK293T липофекцией. Клетки HEK293T, культивированные в течение по меньшей мере ночи после липофекции, добавляют в 96-луночный планшет (сенсибилизированный поли-D-лицином) в количестве 4×10 клетки/лунка, и после дополнительного культивирования в течение по меньшей мере одной ночи планшет используют для ELISA.
Для ELISA 2 нМ растворы гуманизированных антител в смеси 1% БСА/1% ФБС/ФСБ (100 мкл) добавляют в соответствующие лунки, и проводят реакции в течение примерно одного часа при 37°C. Лунки промывают три раза раствором для очистки. В соответствующие лунки добавляют растворы конъюгатов с HRP (100 мкл) антител против IgG человека, полученные в различных концентрациях в смеси 1% БСА/1% ФБС/ФСБ, и проводят реакции в течение примерно одного часа при 37°C. Каждую лунку промывают три раза раствором для очистки. В каждую лунку добавляют субстрат ™B (100 мкл) для инициации реакции. Приблизительно через 30 минут в каждую лунку добавляют 1 M серную кислоту (100 мкл), измеряют поглощение при 450 нм и 650 нм и вычисляют различие между величинами при 450 нм и 650 нм. Авидность вычисляют на основании различия поглощения при 450 нм и 650 нм для клеток, не содержащих ген рецептора IGF-I, которыми являются клетки HEK293T (т.e., контрольные клетки), как стандартную величину 1. Результаты приводятся в таблице 2.
Таблица 2. Авидность* гуманизированных антител к различным рецепторам IGF-I
Гуманизированное антитело
Человек
Яванский макак
Морская свинка
Крыса
R11-16B
3,4
3,3
3,3
0,8
R11-16C
3,4
3,3
3,3
0,9
R11-16D
3,4
3,4
3,3
0,9
R11-16E
3,7
3,7
3,4
0,8
R11-16F
3,4
3,3
3,3
0,9
* Авидность приводится как относительная величина к стандартной величине 1 контрольных клеток (HEK293T).
В клетках, экспрессирующих рецепторы IGF-I человека, японского макака и морской свинки, каждое гуманизированное антитело проявляет авидность, которая больше авидности к контрольным клеткам (HEK293T) в три или больше раз. Напротив, авидность к клеткам, экспрессирующим рецептор IGF-I крысы, эквивалентна авидности к контрольным клеткам. Эти результаты показывают, что каждое гуманизированное антитело связано с рецепторами IGF-I человека, японского макака и морской свинки, но не с рецептором IGF-I крысы.
Пример 4. Определение эпитопа в гуманизированном антителе R11-16В
Гуманизированное антитело R11-16В связывается с рецепторами IGF-I человека, японского макака и морской свинки, но не с рецептором IGF-I крысы. Кроме того, мышиное антитело IGF11-16, которое является мышиным антителом (JP 2017-106529), которое служит основой для создания R11-16B, связывается с доменом CR в рецепторе IGF-I человека, но не с таким доменом в рецепторе IGF-I крысы. Из этих результатов предполагается, что из аминокислотных последовательностей доменов CR в рецепторах IGF-I эпитоп R11-16B имеет аминокислотную последовательность, обычную для человека, японского макака и морской свинки, и аминокислотную последовательность, отличную от крысы.
Авидность домена CR к различным аминокислотным заменам измеряют ELISA для определения позиции аминокислоты в домене CR рецептора IGF-I человека, связывающейся с R11-16B. ELISA на основе клеток выполняют с использованием клеток, экспрессирующих рецепторы IGF-I, в которых аминокислотная последовательность в домене CR, предполагаемая для связывания с R11-16B, мутирована.
Используют две аминокислотные замены в домене CR, как описано ниже. Используемым положительным контролем является экспрессионный вектор pEF1 (Thermo fisher), который внедряют в ДНК, кодирующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 22), в которой метка FLAG (AspTyrLysAspAspAspAspLys) связана с C-концом рецептора IGF-I человека дикого типа (SEQ ID NO: 14, NP_000866). Клетки, включающие только экспрессионный вектор pEF1, обозначены как Mock.
(Замена 1 в домене CR)
В аминокислотной последовательности рецептора IGF-I человека (SEQ ID NO: 14, NP_000866) аспарагиновая кислота, аланин и глутаминовая кислота соответственно в позициях 245, 247 и 294 заменяются аспарагином, треонином и аспарагиновой кислотой. ДНК (SEQ ID NO: 23), кодирующую аминокислотную последовательность, в которой метка FLAG связывается с C-концом аминокислотной последовательности рецептора с заменой 1, внедряют в экспрессионный вектор pEF1.
(Замена 2 в домене CR)
В аминокислотной последовательности рецептора IGF-I человека (SEQ ID NO: 14, NP_000866) глицин и серин соответственно в позициях 315 и 316 заменяются серином и треонином. ДНК (SEQ ID NO: 24), кодирующую аминокислотную последовательность, в которой метка FLAG связывается с C-концом аминокислотной последовательности рецептора с заменой 2, внедряют в экспрессионный вектор pEF1.
6
4

2
Клетки 293Т высевают в 10-см чашки, сенсибилизированные поли-D-лизином, в количестве 6×10 клеток. На следующий день в клетки вводят каждую плазмидную ДНК путем липофекции. Спустя два дня клетки 293Т высвобождают смесью 0,05% трипсина/ЭДТК и суспендируют в культуральной среде. Клетки 293Т добавляют в 96-луночный планшет (сенсибилизированный поли-D-лизином) в количестве 2×10 клетки/лунка и инкубируют в течение ночи при 37°С с 5%-ную СО. Из 96-луночного планшета удаляют среду. Планшет фиксируют 10%-ным забуференным формалином (Mildform 10NM, Wako), заменяют блокирующим буфером (3%-ный БСА/ФСБ/0,02% азида натрия), и используют для ELISA.
Для ELISA 5 нМ раствор R11-16B в блокирующем буфере (50 мкл) добавляют в каждую лунку и проводят реакцию в течение примерно одного часа при комнатной температуре. Каждую лунку промывают два раза раствором для очистки. В каждую лунку добавляют 2500-кратно разведенный раствор конъюгата антитела к IgG человека и ALP (2087-04, Southern Biotech) в блокирующем буфере (50 мкл), и проводят реакцию в течение примерно одного часа при комнатной температуре. Каждую лунку промывают три раза раствором для очистки. В каждую лунку добавляют субстрат pNPP (100 мкл) для инициации реакции. Примерно через один час измеряют поглощение при 405 нм и 550 нм. Величину, полученную вычитанием величины для группы без добавления R11-16B из величины для группы с добавлением R11-16B, определяют как авидность. Результаты приводятся в таблице 3.
Таблица 3. Авидность R11-16B к рецептору IGF-I человека и его аминокислотным заменам
Mock
Рецептор IGF-Iчеловека
Замена 1
Замена 2
Авидность
0,328
0,835
0,885
0,308
Авидность R11-16B к рецептору IGF-I человека выше в два или больше раз авидности к Mock. Авидность к замене 1 эквивалентна авидности к рецептору IGF-I человека. Напротив, авидность к замене 2 эквивалентна авидности к Mock, что показывает отсутствие усиления авидности. Эти результаты показывают, что аминокислоты в позициях 315 и 316 рецептора IGF-I существенны для авидности R11-16B к рецептору IGF-I человека.
Эти результаты предполагают, что позиция связывания R11-16B с рецептором IGF-I человека лежит в непосредственной близости от Gly (глицин) и Ser (серин) в позициях 315 и 316, соответственно. Вообще, на основе распознавания антителом последовательности из ряда из восьми аминокислотных остатков (средняя величина от шести до десяти остатков) и перекрестной реактивности R11-16B (не имеющего авидности к рецептору IGF-I крысы и имеющему авидность к рецепторам IGF-I человека и морской свинки), полагают, что последовательность рецептора IGF-I человека в позициях связывания с R11-16B представляет собой ProSerGlyPheIleArgAsnGly*Ser*GlnSerMet (Gly*Ser* показывают аминокислотную последовательность в позициях 315 и 316).
Пример 5. Эффекты на клеточную пролиферацию миобластов человека
К миобластам человека добавляют различные агенты, и через четыре дня измеряют содержание АТФ в клетках для проверки воздействия на пролиферацию антитела-агониста к рецептору IGF-I на миобластах человека.
3

2
2
Миобласты скелетных мышц здорового человека (HSMM, Lonza) высевают в 96-луночный планшет (сенсибилизированный коллагеном типа I) в количестве 0,1 мл/лунка (2×10 клетки/лунка) с использованием среды SkBM-2 (CC-3246, Lonza), содержащей 1%-ный БСА, и планшет инкубируют при 37°C в 5%-ном CO. На следующий день после посева добавляют различные агенты в количестве 25 мкл/лунка, и планшет инкубируют в течение четырех дней при 37°C в 5%-ном CO. Измеряют содержание АТФ в лунках как индикатор клеточной пролиферации с помощью люминесцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo (Promega). Из 96-луночного планшета, инкубированного в течение четырех дней, удаляют супернатант так, что культуральный раствор достигает объема 50 мкл/лунка, и планшет оставляют стоять в течение 30 минут или дольше при комнатной температуре. В планшет добавляют реагент CellTiter-Glo в количестве 50 мкл/лунка, и проводят реакцию в течение десяти минут или дольше, и затем измеряют сигнал люминесценции с помощью люминометра (Berthold). Вычисляют активность пролиферации миобластов человека, где активность в группе, которой добавляли только носитель, принимают за 100%. Результаты приводятся в таблицах 4 - 6.
Таблица 4. Активность пролиферации миобластов человека в случае добавления 0,5 нМ различных агентов
Агент
Активность пролиферации миобластов человека (%)
R11-16B
135
Мышиное антитело IGF11-16
137
IGF-I
123
50
Добавление R11-16B в количестве 0,0000005, 0,000005, 0,00005, 0,0005, 0,005, 0,05, 0,5, 5 или 50 нМ усиливает активность пролиферации миобластов человека в зависимости от концентрации. Величины EC активности пролиферации R11-16B, мышиного антитела IGF11-16 и IGF-I для миобластов человека составляют 0,002, 0,002 и 0,95 нМ, соответственно. Действие R11-16B эквивалентно действию мышиного антитела IGF11-16 и в 100 раз или больше выше, чем активность IGF-I.
Таблица 5. Активность пролиферации миобластов человека в случае добавления различных агентов в концентрации 0,5 нМ и 0,005 нМ
Агент
Концентрация(нМ)
Активность пролиферации миобластов человека (%)
Эксперимент 1
Эксперимент 2
IGF-I
0,005
108
110
R11-16B
147
148
R11-16C
150
143
R11-16D
144
149
R11-16E
150
143
R11-16F
146
148
IGF-I
0,5
133
125
R11-16B
164
164
R11-16C
178
172
R11-16D
160
169
R11-16E
166
164
R11-16F
161
156
50
Добавление R11-16B, R11-16C, R11-16D, R11-16E, R11-16F в количестве 0,00005, 0,0005, 0,005, 0,05, 0,5, 5 или 50 нМ усиливает активность пролиферации миобластов человека в зависимости от концентрации. Все величины EC активности пролиферации миобластов человека для R11-16B, R11-16C, R11-16D, R11-16E и R11-16F составляют 0,002 нM. Каждое гуманизированное антитело имеет высокую активность, которая в 100 раз или больше выше активности IGF-I.
Таблица 6. Активность пролиферации миобластов в случае добавления различных агентов в концентрации 0,5 нМ и 0,005 нМ
Агент
Концентрация (нМ)
Эксперимент 1
Эксперимент 2
Активность клеточной пролиферации (%)
Активность клеточной пролиферации (%)
Контрольное антитело (антитело FLAG M2)
0,005
99
-
IGF-I
0,005
102
103
R11-16B
0,005
-
127
16-13
0,005
-
102
26-3
0,005
-
108
Контрольный раствор 1*(содержащий азид натрия)
-
-
104
Контрольное антитело(антитело FLAG M2)
0,5
98
-
IGF-I
0,5
133
137
R11-16B
0,5
-
140
16-13
0,5
-
109
26-3
0,5
-
119
Контрольный раствор 2*(содержащий азид натрия)
-
-
112
* Контрольные растворы 1 и 2, соответственно, содержат азид натрия в концентрации 0,005 нМ и 0,5 нМ, которые равны концентрациям антител 16-13 и 26-3.
IGF-I усиливает активность пролиферации по сравнению с контрольным антителом (FLAG M2, Sigma-Aldrich).
Антитела 16-13 и 26-3, описанные в непатентной литературе 35 (т.e., антитела-агонисты, которые in vitro оказывают эффект усиления синтеза клеточной ДНК и поглощения глюкозы), не показывают существенной активности в отношении пролиферации клеток по сравнению с контрольным раствором (содержащим азид натрия), и показывают меньшую активность, чем R11-16B.
Пример 6. Эффективность in vivo (действие увеличения мышечной массы у морских свинок)
Эффективность in vivo антитела-агониста к рецептору IGF-I подтверждают путем сравнения с действием непрерывного введения IGF-I.
Вводят однократную дозу R11-16B морским свинкам, и через две недели измеряют мышечную массу. Эффект увеличения мышечной массы подтверждается тем эффектом, что мышечная масса морских свинок увеличилась на 5% или больше по сравнению с контрольной группой. Однократную дозу R11-16B (0,1 и 0,3 мг/кг) вводят внутривенно здоровым морским свинкам. Положительным контролем являются морские свинки, которым человеческий рекомбинантный IGF-I (мекасермин) подкожно имплантирован с использованием осмотического насоса (Alzet) и вводится непрерывно в количестве 0,3 и 1 мг/кг/день. После двухнедельного введения морским свинкам спускают кровь под наркозом, и измеряют массу длинного разгибателя пальцев стопы. Результаты приводятся на фиг.2.
В группе (R11-16B), которой внутривенно вводили R11-16B в количестве 0,1 и 0,3 мг/кг, мышечная масса увеличивается в зависимости от дозы, и существенно увеличивается по сравнению с контрольной группой (носитель), которой вводили только носитель.
Увеличение мышечной массы в группе однократного введения R11-16B в количестве 0,3 мг/кг в основном эквивалентно увеличению в группе (IGF-I), которой непрерывно вводили человеческий рекомбинантный IGF-I в количестве 1 мг/кг/день. Этот результат показывает, что однократное введение R11-16B имеет эффективность, эквивалентную эффективности непрерывного введения IGF-I. После введения клинической дозы IGF-I (мекасермин) один или два раза в день, и, напротив, однократного введения in vivo R11-16B каждые две недели, имеющего эквивалентное действие непрерывному введению IGF-I, R11-16B показывает превосходную устойчивость к IGF-I.
Пример 7. Гипогликемичекое действие in vivo (гипогликемичекое действие у морских свинок)
Морским свинкам вводят однократную дозу R11-16B, измеряют уровни глюкозы в крови со временем и сравнивают с гипогликемическим действием однократного введения IGF-I для того, чтобы убедиться в существовании гипогликемического эффекта антитела-агониста к рецептору IGF-I. Гипогликемичекое действие подтверждается действием, которое снижает уровень глюкозы в крови до 50 мг/дл или ниже или вызывает симптомы гипогликемии.
Проверяют гипогликемичекое действие IGF-I. Морских свинок не кормят в течение 12 часов и вводят им однократную дозу человеческого рекомбинантного IGF-I в количестве 0,3, 1, 3 и 10 мг/кг. Морских свинок после введения не кормят до 24 часов. Берут образцы крови у бодрствующих морских свинок до введения (час 0) и через 1, 2, 4, 8 и 24 часа после введения, и измеряют уровни глюкозы в крови датчиком Glutest (Sanwa Kagaku Kenkyusho). Результаты приводятся в таблице 7.
Таблица 7. Гипогликемическое действие IGF-I у морских свинок натощак
Время(часы)
Контрольная группа с контрольным раствором
Группа введения IGF-I (мг/кг)
0,3
1
3
10
0
114
93
108
92
94
1
116
77
35
30
20
2
115
31
20
20
20
4
105
48
20
20
20
8
99
94
35
24
-
24
95
85
95
101
-
Величины в таблице показывают средний уровень глюкозы в крови (мг/дл).Уровень глюкозы в крови меньше нижнего предела измерения (меньше 20 мг/дл) показан как 20.-: Данные недоступны, поскольку все особи погибли.
IGF-I существенно снижает уровень глюкозы в крови в количестве 0,3 мг/кг или больше, симптомы гипогликемии появляются при количестве 1 мг/кг или больше, и случаи гибели наблюдают при количестве 3 мг/кг или больше.
Проверяют действие на уровни глюкозы в крови R11-16B, R11-16C, R11-16D, R11-16E и R11-16F. Морских свинок не кормят в течение 12 часов и каждое гуманизированное антитело вводят внутривенно в однократной дозе в количестве 10 мг/кг. Морских свинок после введения не кормят до 24 часов. Берут образцы крови у бодрствующих морских свинок до введения (час 0) и через 1, 2, 4, 8 и 24 часа после введения, и измеряют уровни глюкозы в крови датчиком Glutest (Sanwa Kagaku Kenkyusho). Результаты приводятся в таблицах 8 - 10.
Таблица 8. Действие R11-16B на уровни глюкозы в крови* у морских свинок натощак
Время(часы)
Контрольная группа с контрольным раствором
Группа введения R11-16B (10 мг/кг)
0
90
81
1
81
82
2
79
78
4
81
68
8
87
74
24
79
70
* Величины в таблице показывают средние уровни глюкозы в крови (мг/дл).
Таблица 9. Действие R11-16C и R11-16D на уровни глюкозы в крови* у морских свинок натощак
Время(часы)
Контрольная группа с контрольным раствором
Группа введения R11-16C (10 мг/кг)
Группа введения R11-16D (10 мг/кг)
0
91
88
95
1
90
94
87
2
92
91
91
4
84
80
77
8
80
76
80
24
79
78
72
* Величины в таблице показывают средние уровни глюкозы в крови (мг/дл).
Таблица 10. Действие R11-16E и R11-16F на уровни глюкозы в крови* у морских свинок натощак
Время(часы)
Контрольная группа с контрольным раствором
Группа введения R11-16E (10 мг/кг)
Группа введения R11-16F (10 мг/кг)
0
103
103
101
1
92
102
102
2
91
96
103
4
91
94
95
8
94
100
106
24
92
94
87
* Величины в таблице показывают средние уровни глюкозы в крови (мг/дл).
После введения каждого гуманизированного антитела уровень глюкозы в крови составляет 50 мг/дл, что показывает отсутствие существенного отличия от группы контроля носителя, которой вводят только носитель. Эти результаты показывают, что каждое гуманизированное антитело не имеет ни существенного гипогликемического эффекты, ни эффекты на уровень глюкозы в крови, в отличие от IGF-I, и в силу этого гуманизированное антитело имеет высокий потенциал как агент, с которым можно преодолеть гипогликемию, которая является побочным действием при применении IGF-I.
Пример 8. Кинетика в крови IGF-I и R11-16B (кинетика в крови морских свинок)
Кинетика в крови IGF-I
Морских свинок не кормят в течение 12 часов, и вводят подкожно человеческий рекомбинантный IGF-I в количестве 0,3, 1, 3 и 10 мг/кг. Морских свинок не кормят до 24 часов после введения. Берут образцы крови у бодрствующих морских свинок до введения (час 0) и через 1, 2, 4, 8 и 24 часа после введения, и измеряют концентрацию IGF-I в плазме способом ELISA (DG100, R&D). Результаты приводятся на фиг.3.
Концентрация IGF-I в плазме возрастает в зависимости от дозировки, и концентрация IGF-I в плазме снижается до примерно 50%-ную или меньше максимального пика через 24 часа после введения. Концентрация IGF-I в группе введения в количестве 0,3 мг/кг становится ниже нижнего предела измерения через 24 часа после введения. В группе введения в количестве 10 мг/кг собрать плазму морских свинок невозможно, поскольку морские свинки погибают из-за гипогликемии через четыре часа после введения.
Кинетика в крови гуманизированного антитела
Морских свинок не кормят в течение 12 часов, и внутривенно в однократной дозе вводят гуманизированное антитело R11-16B в количестве 1,5 и 10 мг/кг. Морских свинок не кормят до 24 часов после введения, и затем снова кормят после голодания в течение 24 часов. Берут образцы крови у бодрствующих морских свинок до введения (час 0) и через 2, 4, 8, 24, 48 и 72 часа после введения, и измеряют концентрацию гуманизированного антитела в плазме способом ELISA. Результаты приводятся на фиг.4.
Концентрация гуманизированного антитела в плазме возрастает в зависимости от дозировки, и концентрация гуманизированного антитела в плазме сохраняется до примерно 50%-ную или больше даже через 48 часов или дольше после введения по сравнению с концентрацией через 24 часа после введения. Кинетика в крови гуманизированного антитела показывает превосходную устойчивость по сравнению с IGF-I.
Промышленная применимость
Настоящее изобретение может предоставить антитело, которое специфически связывается с рецептором IGF-I позвоночного и посредством этого увеличивает мышечную массу через рецептор IGF-I, но не снижает уровень глюкозы в крови. Следовательно, настоящее изобретение можно использовать для лечения, профилактики или диагностики заболеваний в связи с гуманизированным антителом против рецептора IGF-I.
--->
SEQUENCE LISTING
<110>  Teijin Pharma Limited
KM Biologics Co., Ltd.
<120>  Humanized anti IGF-1R antibody
<130>  P190562WO
<150>  2018-226669
<151>  2018-12-03
<160>  24
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  5
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  CDR-H1
<400>  1
Ser Tyr Trp Met His
1               5
<210>  2
<211>  17
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  CDR-H2
<400>  2
Glu Thr Asn Pro Ser Asn Ser Val Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1               5                   10                  15
Ser
<210>  3
<211>  8
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  CDR-H3
<400>  3
Gly Arg Gly Arg Gly Phe Ala Tyr
1               5
<210>  4
<211>  11
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  CDR-L1
<400>  4
Arg Ala Ser Gln Asn Ile Asn Phe Trp Leu Ser
1               5                   10
<210>  5
<211>  7
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  CDR-L2
<400>  5
Lys Ala Ser Asn Leu His Thr
1               5
<210>  6
<211>  9
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  CDR-L3
<400>  6
Leu Gln Gly Gln Ser Tyr Pro Tyr Thr
1               5
<210>  7
<211>  117
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  R11-16VH
<400>  7
Gln Val Gln Leu Val Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Pro Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Glu Thr Asn Pro Ser Asn Ser Val Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50                  55                  60
Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Thr Ile Gly Arg Gly Arg Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  8
<211>  107
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  R11-16VL-C36Y
<400>  8
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Asn Phe Trp
20                  25                  30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Gly Gln Ser Tyr Pro Tyr
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105
<210>  9
<211>  107
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  R11-16VL-C36A
<400>  9
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Asn Phe Trp
20                  25                  30
Leu Ser Trp Ala Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Gly Gln Ser Tyr Pro Tyr
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105
<210>  10
<211>  107
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  R11-16VL-C36S
<400>  10
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Asn Phe Trp
20                  25                  30
Leu Ser Trp Ser Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Gly Gln Ser Tyr Pro Tyr
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105
<210>  11
<211>  107
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  R11-16VL-C36F
<400>  11
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Asn Phe Trp
20                  25                  30
Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Gly Gln Ser Tyr Pro Tyr
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105
<210>  12
<211>  107
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  R11-16VL-C36
<400>  12
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Asn Phe Trp
20                  25                  30
Leu Ser Trp Cys Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Gly Gln Ser Tyr Pro Tyr
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105
<210>  13
<211>  70
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<220>
<223>  Human mature IGF-I
<400>  13
Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu Gln Phe
1               5                   10                  15
Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly
20                  25                  30
Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys Cys
35                  40                  45
Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu
50                  55                  60
Lys Pro Ala Lys Ser Ala
65                  70
<210>  14
<211>  1367
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<220>
<223>  Human IGF-I receptor
<400>  14
Met Lys Ser Gly Ser Gly Gly Gly Ser Pro Thr Ser Leu Trp Gly Leu
1               5                   10                  15
Leu Phe Leu Ser Ala Ala Leu Ser Leu Trp Pro Thr Ser Gly Glu Ile
20                  25                  30
Cys Gly Pro Gly Ile Asp Ile Arg Asn Asp Tyr Gln Gln Leu Lys Arg
35                  40                  45
Leu Glu Asn Cys Thr Val Ile Glu Gly Tyr Leu His Ile Leu Leu Ile
50                  55                  60
Ser Lys Ala Glu Asp Tyr Arg Ser Tyr Arg Phe Pro Lys Leu Thr Val
65                  70                  75                  80
Ile Thr Glu Tyr Leu Leu Leu Phe Arg Val Ala Gly Leu Glu Ser Leu
85                  90                  95
Gly Asp Leu Phe Pro Asn Leu Thr Val Ile Arg Gly Trp Lys Leu Phe
100                 105                 110
Tyr Asn Tyr Ala Leu Val Ile Phe Glu Met Thr Asn Leu Lys Asp Ile
115                 120                 125
Gly Leu Tyr Asn Leu Arg Asn Ile Thr Arg Gly Ala Ile Arg Ile Glu
130                 135                 140
Lys Asn Ala Asp Leu Cys Tyr Leu Ser Thr Val Asp Trp Ser Leu Ile
145                 150                 155                 160
Leu Asp Ala Val Ser Asn Asn Tyr Ile Val Gly Asn Lys Pro Pro Lys
165                 170                 175
Glu Cys Gly Asp Leu Cys Pro Gly Thr Met Glu Glu Lys Pro Met Cys
180                 185                 190
Glu Lys Thr Thr Ile Asn Asn Glu Tyr Asn Tyr Arg Cys Trp Thr Thr
195                 200                 205
Asn Arg Cys Gln Lys Met Cys Pro Ser Thr Cys Gly Lys Arg Ala Cys
210                 215                 220
Thr Glu Asn Asn Glu Cys Cys His Pro Glu Cys Leu Gly Ser Cys Ser
225                 230                 235                 240
Ala Pro Asp Asn Asp Thr Ala Cys Val Ala Cys Arg His Tyr Tyr Tyr
245                 250                 255
Ala Gly Val Cys Val Pro Ala Cys Pro Pro Asn Thr Tyr Arg Phe Glu
260                 265                 270
Gly Trp Arg Cys Val Asp Arg Asp Phe Cys Ala Asn Ile Leu Ser Ala
275                 280                 285
Glu Ser Ser Asp Ser Glu Gly Phe Val Ile His Asp Gly Glu Cys Met
290                 295                 300
Gln Glu Cys Pro Ser Gly Phe Ile Arg Asn Gly Ser Gln Ser Met Tyr
305                 310                 315                 320
Cys Ile Pro Cys Glu Gly Pro Cys Pro Lys Val Cys Glu Glu Glu Lys
325                 330                 335
Lys Thr Lys Thr Ile Asp Ser Val Thr Ser Ala Gln Met Leu Gln Gly
340                 345                 350
Cys Thr Ile Phe Lys Gly Asn Leu Leu Ile Asn Ile Arg Arg Gly Asn
355                 360                 365
Asn Ile Ala Ser Glu Leu Glu Asn Phe Met Gly Leu Ile Glu Val Val
370                 375                 380
Thr Gly Tyr Val Lys Ile Arg His Ser His Ala Leu Val Ser Leu Ser
385                 390                 395                 400
Phe Leu Lys Asn Leu Arg Leu Ile Leu Gly Glu Glu Gln Leu Glu Gly
405                 410                 415
Asn Tyr Ser Phe Tyr Val Leu Asp Asn Gln Asn Leu Gln Gln Leu Trp
420                 425                 430
Asp Trp Asp His Arg Asn Leu Thr Ile Lys Ala Gly Lys Met Tyr Phe
435                 440                 445
Ala Phe Asn Pro Lys Leu Cys Val Ser Glu Ile Tyr Arg Met Glu Glu
450                 455                 460
Val Thr Gly Thr Lys Gly Arg Gln Ser Lys Gly Asp Ile Asn Thr Arg
465                 470                 475                 480
Asn Asn Gly Glu Arg Ala Ser Cys Glu Ser Asp Val Leu His Phe Thr
485                 490                 495
Ser Thr Thr Thr Ser Lys Asn Arg Ile Ile Ile Thr Trp His Arg Tyr
500                 505                 510
Arg Pro Pro Asp Tyr Arg Asp Leu Ile Ser Phe Thr Val Tyr Tyr Lys
515                 520                 525
Glu Ala Pro Phe Lys Asn Val Thr Glu Tyr Asp Gly Gln Asp Ala Cys
530                 535                 540
Gly Ser Asn Ser Trp Asn Met Val Asp Val Asp Leu Pro Pro Asn Lys
545                 550                 555                 560
Asp Val Glu Pro Gly Ile Leu Leu His Gly Leu Lys Pro Trp Thr Gln
565                 570                 575
Tyr Ala Val Tyr Val Lys Ala Val Thr Leu Thr Met Val Glu Asn Asp
580                 585                 590
His Ile Arg Gly Ala Lys Ser Glu Ile Leu Tyr Ile Arg Thr Asn Ala
595                 600                 605
Ser Val Pro Ser Ile Pro Leu Asp Val Leu Ser Ala Ser Asn Ser Ser
610                 615                 620
Ser Gln Leu Ile Val Lys Trp Asn Pro Pro Ser Leu Pro Asn Gly Asn
625                 630                 635                 640
Leu Ser Tyr Tyr Ile Val Arg Trp Gln Arg Gln Pro Gln Asp Gly Tyr
645                 650                 655
Leu Tyr Arg His Asn Tyr Cys Ser Lys Asp Lys Ile Pro Ile Arg Lys
660                 665                 670
Tyr Ala Asp Gly Thr Ile Asp Ile Glu Glu Val Thr Glu Asn Pro Lys
675                 680                 685
Thr Glu Val Cys Gly Gly Glu Lys Gly Pro Cys Cys Ala Cys Pro Lys
690                 695                 700
Thr Glu Ala Glu Lys Gln Ala Glu Lys Glu Glu Ala Glu Tyr Arg Lys
705                 710                 715                 720
Val Phe Glu Asn Phe Leu His Asn Ser Ile Phe Val Pro Arg Pro Glu
725                 730                 735
Arg Lys Arg Arg Asp Val Met Gln Val Ala Asn Thr Thr Met Ser Ser
740                 745                 750
Arg Ser Arg Asn Thr Thr Ala Ala Asp Thr Tyr Asn Ile Thr Asp Pro
755                 760                 765
Glu Glu Leu Glu Thr Glu Tyr Pro Phe Phe Glu Ser Arg Val Asp Asn
770                 775                 780
Lys Glu Arg Thr Val Ile Ser Asn Leu Arg Pro Phe Thr Leu Tyr Arg
785                 790                 795                 800
Ile Asp Ile His Ser Cys Asn His Glu Ala Glu Lys Leu Gly Cys Ser
805                 810                 815
Ala Ser Asn Phe Val Phe Ala Arg Thr Met Pro Ala Glu Gly Ala Asp
820                 825                 830
Asp Ile Pro Gly Pro Val Thr Trp Glu Pro Arg Pro Glu Asn Ser Ile
835                 840                 845
Phe Leu Lys Trp Pro Glu Pro Glu Asn Pro Asn Gly Leu Ile Leu Met
850                 855                 860
Tyr Glu Ile Lys Tyr Gly Ser Gln Val Glu Asp Gln Arg Glu Cys Val
865                 870                 875                 880
Ser Arg Gln Glu Tyr Arg Lys Tyr Gly Gly Ala Lys Leu Asn Arg Leu
885                 890                 895
Asn Pro Gly Asn Tyr Thr Ala Arg Ile Gln Ala Thr Ser Leu Ser Gly
900                 905                 910
Asn Gly Ser Trp Thr Asp Pro Val Phe Phe Tyr Val Gln Ala Lys Thr
915                 920                 925
Gly Tyr Glu Asn Phe Ile His Leu Ile Ile Ala Leu Pro Val Ala Val
930                 935                 940
Leu Leu Ile Val Gly Gly Leu Val Ile Met Leu Tyr Val Phe His Arg
945                 950                 955                 960
Lys Arg Asn Asn Ser Arg Leu Gly Asn Gly Val Leu Tyr Ala Ser Val
965                 970                 975
Asn Pro Glu Tyr Phe Ser Ala Ala Asp Val Tyr Val Pro Asp Glu Trp
980                 985                 990
Glu Val Ala Arg Glu Lys Ile Thr  Met Ser Arg Glu Leu  Gly Gln Gly
995                 1000                 1005
Ser Phe  Gly Met Val Tyr Glu  Gly Val Ala Lys Gly  Val Val Lys
1010                 1015                 1020
Asp Glu  Pro Glu Thr Arg Val  Ala Ile Lys Thr Val  Asn Glu Ala
1025                 1030                 1035
Ala Ser  Met Arg Glu Arg Ile  Glu Phe Leu Asn Glu  Ala Ser Val
1040                 1045                 1050
Met Lys  Glu Phe Asn Cys His  His Val Val Arg Leu  Leu Gly Val
1055                 1060                 1065
Val Ser  Gln Gly Gln Pro Thr  Leu Val Ile Met Glu  Leu Met Thr
1070                 1075                 1080
Arg Gly  Asp Leu Lys Ser Tyr  Leu Arg Ser Leu Arg  Pro Glu Met
1085                 1090                 1095
Glu Asn  Asn Pro Val Leu Ala  Pro Pro Ser Leu Ser  Lys Met Ile
1100                 1105                 1110
Gln Met  Ala Gly Glu Ile Ala  Asp Gly Met Ala Tyr  Leu Asn Ala
1115                 1120                 1125
Asn Lys  Phe Val His Arg Asp  Leu Ala Ala Arg Asn  Cys Met Val
1130                 1135                 1140
Ala Glu  Asp Phe Thr Val Lys  Ile Gly Asp Phe Gly  Met Thr Arg
1145                 1150                 1155
Asp Ile  Tyr Glu Thr Asp Tyr  Tyr Arg Lys Gly Gly  Lys Gly Leu
1160                 1165                 1170
Leu Pro  Val Arg Trp Met Ser  Pro Glu Ser Leu Lys  Asp Gly Val
1175                 1180                 1185
Phe Thr  Thr Tyr Ser Asp Val  Trp Ser Phe Gly Val  Val Leu Trp
1190                 1195                 1200
Glu Ile  Ala Thr Leu Ala Glu  Gln Pro Tyr Gln Gly  Leu Ser Asn
1205                 1210                 1215
Glu Gln  Val Leu Arg Phe Val  Met Glu Gly Gly Leu  Leu Asp Lys
1220                 1225                 1230
Pro Asp  Asn Cys Pro Asp Met  Leu Phe Glu Leu Met  Arg Met Cys
1235                 1240                 1245
Trp Gln  Tyr Asn Pro Lys Met  Arg Pro Ser Phe Leu  Glu Ile Ile
1250                 1255                 1260
Ser Ser  Ile Lys Glu Glu Met  Glu Pro Gly Phe Arg  Glu Val Ser
1265                 1270                 1275
Phe Tyr  Tyr Ser Glu Glu Asn  Lys Leu Pro Glu Pro  Glu Glu Leu
1280                 1285                 1290
Asp Leu  Glu Pro Glu Asn Met  Glu Ser Val Pro Leu  Asp Pro Ser
1295                 1300                 1305
Ala Ser  Ser Ser Ser Leu Pro  Leu Pro Asp Arg His  Ser Gly His
1310                 1315                 1320
Lys Ala  Glu Asn Gly Pro Gly  Pro Gly Val Leu Val  Leu Arg Ala
1325                 1330                 1335
Ser Phe  Asp Glu Arg Gln Pro  Tyr Ala His Met Asn  Gly Gly Arg
1340                 1345                 1350
Lys Asn  Glu Arg Ala Leu Pro  Leu Pro Gln Ser Ser  Thr Cys
1355                 1360                 1365
<210>  15
<211>  4128
<212>  DNA
<213>  Homo sapiens
<220>
<223>  Human IGF-I receptor
<400>  15
atgaagtctg gctccggagg agggtccccg acctcgctgt gggggctcct gtttctctcc       60
gccgcgctct cgctctggcc gacgagtgga gaaatctgcg ggccaggcat cgacatccgc      120
aacgactatc agcagctgaa gcgcctggag aactgcacgg tgatcgaggg ctacctccac      180
atcctgctca tctccaaggc cgaggactac cgcagctacc gcttccccaa gctcacggtc      240
attaccgagt acttgctgct gttccgagtg gctggcctcg agagcctcgg agacctcttc      300
cccaacctca cggtcatccg cggctggaaa ctcttctaca actacgccct ggtcatcttc      360
gagatgacca atctcaagga tattgggctt tacaacctga ggaacattac tcggggggcc      420
atcaggattg agaaaaatgc tgacctctgt tacctctcca ctgtggactg gtccctgatc      480
ctggatgcgg tgtccaataa ctacattgtg gggaataagc ccccaaagga atgtggggac      540
ctgtgtccag ggaccatgga ggagaagccg atgtgtgaga agaccaccat caacaatgag      600
tacaactacc gctgctggac cacaaaccgc tgccagaaaa tgtgcccaag cacgtgtggg      660
aagcgggcgt gcaccgagaa caatgagtgc tgccaccccg agtgcctggg cagctgcagc      720
gcgcctgaca acgacacggc ctgtgtagct tgccgccact actactatgc cggtgtctgt      780
gtgcctgcct gcccgcccaa cacctacagg tttgagggct ggcgctgtgt ggaccgtgac      840
ttctgcgcca acatcctcag cgccgagagc agcgactccg aggggtttgt gatccacgac      900
ggcgagtgca tgcaggagtg cccctcgggc ttcatccgca acggcagcca gagcatgtac      960
tgcatccctt gtgaaggtcc ttgcccgaag gtctgtgagg aagaaaagaa aacaaagacc     1020
attgattctg ttacttctgc tcagatgctc caaggatgca ccatcttcaa gggcaatttg     1080
ctcattaaca tccgacgggg gaataacatt gcttcagagc tggagaactt catggggctc     1140
atcgaggtgg tgacgggcta cgtgaagatc cgccattctc atgccttggt ctccttgtcc     1200
ttcctaaaaa accttcgcct catcctagga gaggagcagc tagaagggaa ttactccttc     1260
tacgtcctcg acaaccagaa cttgcagcaa ctgtgggact gggaccaccg caacctgacc     1320
atcaaagcag ggaaaatgta ctttgctttc aatcccaaat tatgtgtttc cgaaatttac     1380
cgcatggagg aagtgacggg gactaaaggg cgccaaagca aaggggacat aaacaccagg     1440
aacaacgggg agagagcctc ctgtgaaagt gacgtcctgc atttcacctc caccaccacg     1500
tcgaagaatc gcatcatcat aacctggcac cggtaccggc cccctgacta cagggatctc     1560
atcagcttca ccgtttacta caaggaagca ccctttaaga atgtcacaga gtatgatggg     1620
caggatgcct gcggctccaa cagctggaac atggtggacg tggacctccc gcccaacaag     1680
gacgtggagc ccggcatctt actacatggg ctgaagccct ggactcagta cgccgtttac     1740
gtcaaggctg tgaccctcac catggtggag aacgaccata tccgtggggc caagagtgag     1800
atcttgtaca ttcgcaccaa tgcttcagtt ccttccattc ccttggacgt tctttcagca     1860
tcgaactcct cttctcagtt aatcgtgaag tggaaccctc cctctctgcc caacggcaac     1920
ctgagttact acattgtgcg ctggcagcgg cagcctcagg acggctacct ttaccggcac     1980
aattactgct ccaaagacaa aatccccatc aggaagtatg ccgacggcac catcgacatt     2040
gaggaggtca cagagaaccc caagactgag gtgtgtggtg gggagaaagg gccttgctgc     2100
gcctgcccca aaactgaagc cgagaagcag gccgagaagg aggaggctga ataccgcaaa     2160
gtctttgaga atttcctgca caactccatc ttcgtgccca gacctgaaag gaagcggaga     2220
gatgtcatgc aagtggccaa caccaccatg tccagccgaa gcaggaacac cacggccgca     2280
gacacctaca acatcaccga cccggaagag ctggagacag agtacccttt ctttgagagc     2340
agagtggata acaaggagag aactgtcatt tctaaccttc ggcctttcac attgtaccgc     2400
atcgatatcc acagctgcaa ccacgaggct gagaagctgg gctgcagcgc ctccaacttc     2460
gtctttgcaa ggactatgcc cgcagaagga gcagatgaca ttcctgggcc agtgacctgg     2520
gagccaaggc ctgaaaactc catcttttta aagtggccgg aacctgagaa tcccaatgga     2580
ttgattctaa tgtatgaaat aaaatacgga tcacaagttg aggatcagcg agaatgtgtg     2640
tccagacagg aatacaggaa gtatggaggg gccaagctaa accggctaaa cccggggaac     2700
tacacagccc ggattcaggc cacatctctc tctgggaatg ggtcgtggac agatcctgtg     2760
ttcttctatg tccaggccaa aacaggatat gaaaacttca tccatctgat catcgctctg     2820
cccgtcgctg tcctgttgat cgtgggaggg ttggtgatta tgctgtacgt cttccataga     2880
aagagaaata acagcaggct ggggaatgga gtgctgtatg cctctgtgaa cccggagtac     2940
ttcagcgctg ctgatgtgta cgttcctgat gagtgggagg tggctcggga gaagatcacc     3000
atgagccggg aacttgggca ggggtcgttt gggatggtct atgaaggagt tgccaagggt     3060
gtggtgaaag atgaacctga aaccagagtg gccattaaaa cagtgaacga ggccgcaagc     3120
atgcgtgaaa ggattgagtt tctcaacgaa gcttctgtga tgaaggagtt caattgtcac     3180
catgtggtgc gattgctggg tgtggtgtcc caaggccagc caacactggt catcatggaa     3240
ctgatgacac ggggcgatct caaaagttat ctccggtctc tgaggccaga aatggagaat     3300
aatccagtcc tagcacctcc aagcctgagc aagatgattc agatggccgg agagattgca     3360
gacggcatgg catacctcaa cgccaataag ttcgtccaca gagaccttgc tgcccggaat     3420
tgcatggtag ccgaagattt cacagtcaaa atcggagatt ttggtatgac gcgagatatc     3480
tatgagacag actattaccg gaaaggaggg aaagggctgc tgcccgtgcg ctggatgtct     3540
cctgagtccc tcaaggatgg agtcttcacc acttactcgg acgtctggtc cttcggggtc     3600
gtcctctggg agatcgccac actggccgag cagccctacc agggcttgtc caacgagcaa     3660
gtccttcgct tcgtcatgga gggcggcctt ctggacaagc cagacaactg tcctgacatg     3720
ctgtttgaac tgatgcgcat gtgctggcag tataacccca agatgaggcc ttccttcctg     3780
gagatcatca gcagcatcaa agaggagatg gagcctggct tccgggaggt ctccttctac     3840
tacagcgagg agaacaagct gcccgagccg gaggagctgg acctggagcc agagaacatg     3900
gagagcgtcc ccctggaccc ctcggcctcc tcgtcctccc tgccactgcc cgacagacac     3960
tcaggacaca aggccgagaa cggccccggc cctggggtgc tggtcctccg cgccagcttc     4020
gacgagagac agccttacgc ccacatgaac gggggccgca agaacgagcg ggccttgccg     4080
ctgccccagt cttcgacctg cgattataag gatgacgatg acaagtag                  4128
<210>  16
<211>  1367
<212>  PRT
<213>  Cavia porcellus
<220>
<223>  Cavia porcellus IGF-I receptor
<400>  16
Met Lys Ser Gly Ser Gly Gly Gly Ser Pro Thr Ser Leu Trp Gly Leu
1               5                   10                  15
Leu Phe Leu Ser Ala Ala Leu Ser Leu Trp Pro Thr Ser Gly Glu Ile
20                  25                  30
Cys Gly Pro Gly Ile Asp Ile Arg Asn Asp Tyr Gln Gln Leu Lys Arg
35                  40                  45
Leu Glu Asn Cys Thr Val Ile Glu Gly Tyr Leu His Ile Leu Leu Ile
50                  55                  60
Ser Lys Ala Glu Asp Tyr Arg Ser Tyr Arg Phe Pro Lys Leu Thr Val
65                  70                  75                  80
Ile Thr Glu Tyr Leu Leu Leu Phe Arg Val Ala Gly Leu Glu Ser Leu
85                  90                  95
Gly Asp Leu Phe Pro Asn Leu Thr Val Ile Arg Gly Trp Lys Leu Phe
100                 105                 110
Tyr Asn Tyr Ala Leu Val Ile Phe Glu Met Thr Asn Leu Lys Asp Ile
115                 120                 125
Gly Leu Tyr Asn Leu Arg Asn Ile Thr Arg Gly Ala Ile Arg Ile Glu
130                 135                 140
Lys Asn Ala Asp Leu Cys Tyr Leu Ser Thr Val Asp Trp Ser Leu Ile
145                 150                 155                 160
Leu Asp Ala Val Ser Asn Asn Tyr Ile Val Gly Asn Lys Ser Pro Lys
165                 170                 175
Glu Cys Gly Asp Leu Cys Pro Gly Thr Met Glu Glu Lys Pro Leu Cys
180                 185                 190
Glu Lys Thr Thr Ile Asn Asn Glu Tyr Asn Tyr Arg Cys Trp Thr Thr
195                 200                 205
Asn Arg Cys Gln Lys Met Cys Pro Ser Ala Cys Gly Lys Arg Ala Cys
210                 215                 220
Thr Glu Tyr Gln Glu Cys Cys His Pro Glu Cys Leu Gly Ser Cys His
225                 230                 235                 240
Ala Pro Asp Asp Asp Thr Ala Cys Val Ala Cys Arg His Phe Tyr Tyr
245                 250                 255
Ala Gly Ile Cys Val Pro Ala Cys Pro Pro Gly Thr Tyr Arg Phe Glu
260                 265                 270
Gly Trp Arg Cys Val His Arg Asp Phe Cys Ala Asn Ile Pro Asn Ala
275                 280                 285
Glu Ser Ser Asp Ser Glu Gly Phe Val Ile His Asp Gly Glu Cys Met
290                 295                 300
Gln Glu Cys Pro Ser Gly Phe Ile Arg Asn Gly Ser Gln Ser Met Tyr
305                 310                 315                 320
Cys Ile Pro Cys Glu Gly Pro Cys Pro Lys Val Cys Glu Glu Glu Lys
325                 330                 335
Lys Thr Lys Thr Ile Asp Ser Val Thr Ser Ala Gln Met Leu Gln Gly
340                 345                 350
Cys Thr Ile Phe Lys Gly Asn Leu Leu Ile Asn Ile Arg Arg Gly Asn
355                 360                 365
Asn Ile Ala Ser Glu Leu Glu Asn Phe Met Gly Leu Ile Glu Val Val
370                 375                 380
Thr Gly Tyr Val Lys Ile Arg His Ser His Ala Leu Val Ser Leu Ser
385                 390                 395                 400
Phe Leu Lys Asn Leu Arg Leu Ile Leu Gly Glu Glu Gln Leu Glu Gly
405                 410                 415
Asn Tyr Ser Phe Tyr Val Leu Asp Asn Gln Asn Leu Gln Gln Leu Trp
420                 425                 430
Asp Trp Asp His Arg Asn Leu Thr Ile Lys Ser Gly Lys Met Tyr Phe
435                 440                 445
Ala Phe Asn Pro Lys Leu Cys Val Ser Glu Ile Tyr Arg Met Glu Glu
450                 455                 460
Val Thr Gly Thr Lys Gly Arg Gln Ser Lys Gly Asp Ile Asn Thr Arg
465                 470                 475                 480
Asn Asn Gly Glu Arg Ala Ser Cys Glu Ser Asp Val Leu Arg Phe Thr
485                 490                 495
Ser Thr Thr Thr Ser Lys Asn Arg Ile Ile Ile Thr Trp His Arg Tyr
500                 505                 510
Arg Pro Pro Asp Tyr Arg Asp Leu Ile Ser Phe Thr Val Tyr Tyr Lys
515                 520                 525
Glu Ala Pro Phe Lys Asn Val Thr Glu Tyr Asp Gly Gln Asp Ala Cys
530                 535                 540
Gly Ser Asn Ser Trp Asn Met Val Asp Val Asp Leu Pro Pro Asn Lys
545                 550                 555                 560
Asp Ala Glu Pro Gly Ile Leu Leu His Gly Leu Lys Pro Trp Thr Gln
565                 570                 575
Tyr Ala Val Tyr Val Lys Ala Val Thr Leu Thr Met Val Glu Asn Asp
580                 585                 590
His Ile Arg Gly Ala Lys Ser Glu Ile Leu Tyr Ile Arg Thr Asn Ala
595                 600                 605
Ser Val Pro Ser Ile Pro Leu Asp Val Leu Ser Ala Ser Asn Ser Ser
610                 615                 620
Ser Gln Leu Ile Val Lys Trp Asn Pro Pro Ser Leu Pro Asn Gly Asn
625                 630                 635                 640
Leu Ser Tyr Tyr Ile Val Arg Trp Gln Arg Gln Pro Gln Asp Ser Tyr
645                 650                 655
Leu Tyr Arg His Asn Tyr Cys Ser Lys Asp Lys Ile Pro Ile Arg Lys
660                 665                 670
Tyr Ala Asp Gly Thr Ile Asp Val Glu Glu Val Thr Glu Asn Pro Lys
675                 680                 685
Thr Glu Val Cys Gly Gly Glu Lys Gly Pro Cys Cys Ala Cys Pro Lys
690                 695                 700
Thr Glu Ala Glu Lys Gln Ala Glu Lys Glu Glu Ala Glu Tyr Arg Lys
705                 710                 715                 720
Val Phe Glu Asn Phe Leu His Asn Ser Ile Phe Val Pro Arg Pro Glu
725                 730                 735
Arg Arg Arg Arg Asp Val Ala Gln Met Ala Asn Thr Thr Met Ser Ser
740                 745                 750
Arg Ser Arg Asn Thr Thr Val Ala Asp Thr Tyr Asn Ala Thr Asp Pro
755                 760                 765
Glu Glu Leu Glu Thr Glu Tyr Pro Phe Phe Glu Ser Arg Val Asp Asn
770                 775                 780
Lys Glu Arg Thr Val Ile Ser Asn Leu Arg Pro Phe Thr Leu Tyr Arg
785                 790                 795                 800
Ile Asp Ile His Ser Cys Asn His Glu Ala Glu Lys Leu Gly Cys Ser
805                 810                 815
Ala Ser Asn Phe Val Phe Ala Arg Thr Met Pro Ala Glu Gly Ala Asp
820                 825                 830
Asp Ile Pro Gly Pro Val Thr Trp Glu Ala Arg Pro Glu Asn Ser Ile
835                 840                 845
Phe Leu Lys Trp Pro Glu Pro Glu Asn Pro Asn Gly Leu Ile Leu Met
850                 855                 860
Tyr Glu Ile Lys Tyr Gly Ser Gln Val Glu Asp Gln Arg Glu Cys Val
865                 870                 875                 880
Ser Arg Gln Glu Tyr Arg Lys Tyr Gly Gly Ala Lys Leu Ser Arg Leu
885                 890                 895
Asn Pro Gly Asn Tyr Thr Ala Arg Ile Gln Ala Thr Ser Leu Ser Gly
900                 905                 910
Asn Gly Ser Trp Thr Asp Pro Val Phe Phe Tyr Val Pro Ala Lys Thr
915                 920                 925
Thr Tyr Glu Asn Phe Ile His Leu Ile Ile Ala Leu Pro Val Ala Ile
930                 935                 940
Leu Leu Ile Val Ala Gly Leu Ala Ile Met Leu Tyr Val Phe His Arg
945                 950                 955                 960
Lys Arg Asn Ser Ser Arg Leu Gly Asn Gly Val Leu Tyr Ala Ser Val
965                 970                 975
Asn Pro Glu Tyr Phe Ser Ala Ala Asp Val Tyr Val Pro Asp Glu Trp
980                 985                 990
Glu Val Ala Arg Glu Lys Ile Thr  Met Ser Arg Glu Leu  Gly Gln Gly
995                 1000                 1005
Ser Phe  Gly Met Val Tyr Glu  Gly Val Ala Lys Gly  Val Val Lys
1010                 1015                 1020
Asp Glu  Pro Glu Thr Arg Val  Ala Ile Lys Thr Val  Asn Glu Ala
1025                 1030                 1035
Ala Ser  Met Arg Glu Arg Ile  Glu Phe Leu Asn Glu  Ala Ser Val
1040                 1045                 1050
Met Lys  Glu Phe Asn Cys His  His Val Val Arg Leu  Leu Gly Val
1055                 1060                 1065
Val Ser  Gln Gly Gln Pro Thr  Leu Val Ile Met Glu  Leu Met Thr
1070                 1075                 1080
Arg Gly  Asp Leu Lys Ser Tyr  Leu Arg Ser Leu Arg  Pro Glu Val
1085                 1090                 1095
Glu Asn  Ser Pro Ile Leu Ala  Pro Pro Ser Leu Ser  Lys Met Ile
1100                 1105                 1110
Gln Met  Ala Gly Glu Ile Ala  Asp Gly Met Ala Tyr  Leu Asn Ala
1115                 1120                 1125
Asn Lys  Phe Val His Arg Asp  Leu Ala Ala Arg Asn  Cys Met Val
1130                 1135                 1140
Ala Glu  Asp Phe Thr Val Lys  Ile Gly Asp Phe Gly  Met Thr Arg
1145                 1150                 1155
Asp Ile  Tyr Glu Thr Asp Tyr  Tyr Arg Lys Gly Gly  Lys Gly Leu
1160                 1165                 1170
Leu Pro  Val Arg Trp Met Ser  Pro Glu Ser Leu Lys  Asp Gly Val
1175                 1180                 1185
Phe Thr  Thr His Ser Asp Val  Trp Ser Phe Gly Val  Val Leu Trp
1190                 1195                 1200
Glu Ile  Ala Thr Leu Ala Glu  Gln Pro Tyr Gln Gly  Leu Ser Asn
1205                 1210                 1215
Glu Gln  Val Leu Arg Phe Val  Met Glu Gly Gly Leu  Leu Asp Lys
1220                 1225                 1230
Pro Asp  Asn Cys Pro Asp Met  Leu Phe Glu Leu Met  Arg Met Cys
1235                 1240                 1245
Trp Gln  Tyr Asn Pro Lys Met  Arg Pro Ser Phe Leu  Glu Ile Ile
1250                 1255                 1260
Ser Ser  Val Lys Asp Glu Leu  Glu Ala Gly Phe Arg  Glu Val Ser
1265                 1270                 1275
Phe Tyr  Tyr Ser Glu Glu Asn  Lys Pro Pro Glu Pro  Glu Glu Leu
1280                 1285                 1290
Asp Leu  Glu Pro Glu Asn Met  Glu Ser Val Pro Leu  Asp Pro Ser
1295                 1300                 1305
Ala Ser  Ser Ser Ser Leu Pro  Pro Pro Asp Arg His  Ser Gly His
1310                 1315                 1320
Lys Gly  Glu Asn Gly Pro Gly  Pro Gly Val Leu Val  Leu Arg Ala
1325                 1330                 1335
Ser Phe  Asp Glu Arg Gln Pro  Tyr Ala His Met Asn  Gly Gly Arg
1340                 1345                 1350
Thr Asn  Glu Arg Ala Leu Pro  Leu Pro Gln Ser Ser  Thr Cys
1355                 1360                 1365
<210>  17
<211>  4128
<212>  DNA
<213>  Cavia porcellus
<220>
<223>  Cavia porcellus IGF-I receptor
<400>  17
atgaagtctg gctccggagg agggtccccg acctcgctgt gggggctcct gtttctctct       60
gctgcgctct cgctctggcc gacgagtgga gaaatctgtg ggccgggcat cgacatccgc      120
aatgactatc agcagctaaa acgcctggag aactgcacgg tgatcgaggg ctacctccac      180
atcctgctca tctccaaggc cgaggactac cgcagctacc gcttccccaa gctcaccgtc      240
atcaccgagt acttgctgct gttccgggtc gctggcctcg agagcctcgg agacctcttc      300
ccgaacctca ccgtcatccg cggctggaaa ctcttctata actacgccct ggtcatcttc      360
gagatgacca acctgaagga tattgggctt tacaacctga ggaacattac tcggggggcc      420
atcaggattg agaagaatgc tgacctgtgc tacctctcca cagtggactg gtcgctgatc      480
ctggatgcgg tgtccaataa ctacattgtg gggaacaagt ccccaaagga atgtggagac      540
ctgtgtccag ggaccatgga ggagaaacca ttgtgcgaga agaccaccat caacaatgag      600
tacaactacc gctgctggac cacaaatcgc tgccagaaaa tgtgcccaag tgcctgcggg      660
aagcgtgcgt gcaccgagta ccaggagtgc tgccatcctg agtgcctggg cagctgccat      720
gcacccgacg acgacacggc ctgtgtggcc tgcagacact tctactatgc tggcatctgc      780
gtgcccgcct gtccacccgg cacctaccgc ttcgagggct ggcgctgtgt gcaccgagac      840
ttctgcgcca acatccccaa tgctgagagc agtgactccg agggcttcgt catccatgac      900
ggggagtgca tgcaggagtg tccctcgggc ttcatccgca acggcagcca gagcatgtac      960
tgcatccctt gtgaaggtcc ttgccccaag gtctgcgagg aagaaaagaa gacgaaaacc     1020
attgactctg tgacttctgc tcagatgctc caagggtgca ccatcttcaa gggcaacctg     1080
ctcattaata tccgacgggg caataacatt gcgtcggaac tggagaactt catggggctc     1140
attgaggtgg tgactggcta cgtgaagatc cgccattccc atgccttggt ctccttgtcc     1200
ttcctgaaaa accttcgcct gatcctgggg gaggagcagc tggaagggaa ctactccttc     1260
tacgtcctgg acaaccagaa cctgcagcag ctgtgggatt gggaccaccg caacctcacc     1320
atcaaatctg ggaagatgta ctttgctttc aatcccaaac tgtgtgtctc tgaaatttac     1380
cgcatggaag aagtgacggg gacgaaaggg cgccagagca aaggggacat aaacaccagg     1440
aacaacgggg aacgagcctc ctgtgaaagt gacgtattgc gtttcacctc caccaccaca     1500
tcgaagaacc gcattatcat cacctggcac cggtaccggc ccccagacta cagggatctc     1560
atcagcttca ctgtttacta caaggaggca ccgtttaaaa atgtcaccga gtatgatggg     1620
caggatgctt gtggctccaa cagttggaac atggtggacg tggacctgcc tcctaacaag     1680
gacgcggagc ctggcatcct actgcatggg ctgaagccct ggacacagta cgcggtctat     1740
gtcaaggccg tgaccctcac catggtagag aacgaccaca tccgtggggc caagagtgaa     1800
atcttgtaca ttcgcaccaa tgcttcagtt ccttccattc ccctggatgt cctttcggca     1860
tccaactcct cttctcagct catcgtcaag tggaaccccc catctctgcc caacggaaac     1920
ctgagttatt atatcgtgcg gtggcagcgg cagcctcagg acagctacct ataccggcac     1980
aattactgct ccaaagacaa aatccccatc agaaagtatg cggatggcac catcgatgtc     2040
gaagaggtca ccgagaaccc caagactgaa gtatgtggtg gcgagaaagg gccttgctgc     2100
gcttgcccca aaaccgaagc cgagaagcag gccgagaagg aggaggccga gtaccggaaa     2160
gtgtttgaga atttcctgca caactccatc ttcgtgccga ggcctgaaag gaggcggcga     2220
gatgttgcgc agatggccaa caccaccatg tccagccgca gcaggaacac cacggtggct     2280
gatacctaca atgccacaga tccagaggag ctagagaccg aatacccttt ctttgagagc     2340
agagtggata acaaggaaag aactgtaatt tcaaacctcc ggccttttac cttgtaccgc     2400
attgacatcc acagctgtaa ccatgaggct gagaagctgg gctgcagcgc ttctaacttt     2460
gtttttgcaa gaaccatgcc cgcagaagga gcagatgaca ttcctggccc ggtgacgtgg     2520
gaagcaaggc ctgaaaactc catcttttta aagtggccag agcctgagaa tcctaatgga     2580
ttgattctaa tgtacgaaat aaaatacgga tcacaagttg aggatcagcg agaatgtgtg     2640
tccagacagg aatacaggaa atacggaggg gccaagctta gccggctaaa cccagggaac     2700
tatacagccc ggattcaagc tacctcgctc tctgggaatg ggtcgtggac agatcctgtg     2760
tttttctatg tcccagccaa aacaacgtat gaaaacttca tccatctgat catcgctctg     2820
ccagtcgcca tcctgttgat tgtggcaggc ttggcgataa tgctgtacgt cttccatagg     2880
aagagaaaca gcagcaggct ggggaatgga gtgttgtacg cctctgtgaa cccggagtac     2940
ttcagtgctg cggatgtgta cgttcctgat gagtgggagg tagcgcgaga gaagatcacc     3000
atgagccggg agctggggca aggctccttt gggatggtct acgaaggagt ggctaaaggt     3060
gtggtgaaag acgagcctga gacccgggta gccatcaaga cagtgaacga ggccgcaagc     3120
atgcgtgaaa ggatcgagtt tctcaatgag gcctctgtga tgaaggagtt caactgtcat     3180
catgtggtgc gactgctagg cgtggtgtcc cagggccagc ccacactggt catcatggag     3240
ctgatgacgc ggggggatct caagagctat ctcaggtctt tgaggccgga agtagagaat     3300
agccccatcc tggcacctcc aagcctcagc aagatgatcc agatggccgg agagattgca     3360
gatggcatgg catacctcaa cgccaacaag tttgtccaca gagaccttgc tgcccgcaat     3420
tgcatggtag ctgaagattt cacagtcaaa attggagatt ttgggatgac gcgagatatt     3480
tacgagacag actactaccg gaaaggaggg aaagggctgc tgcctgtgcg ctggatgtct     3540
cctgagtccc tcaaggatgg agtcttcacc actcattcgg acgtctggtc cttcggggtc     3600
gtcctctggg agatcgccac gctggctgag cagccatacc agggcttgtc caacgagcaa     3660
gtccttcgct tcgtcatgga gggtggcctc ctggacaaac ccgacaactg cccagacatg     3720
ctgtttgagc tgatgcgcat gtgctggcag tacaacccca agatgaggcc ttccttcctg     3780
gagatcatca gcagcgtcaa agacgagctg gaggccggct tccgggaggt ctccttctac     3840
tacagcgagg agaacaagcc gcccgagccg gaggagctgg acctggagcc cgagaacatg     3900
gagagcgtcc cgctggaccc atcagcctcc tcgtcctccc tgccgccgcc cgacagacac     3960
tcaggacaca agggcgagaa cggcccgggc cccggcgtgc tggtgctccg cgccagcttc     4020
gacgagagac agccttacgc gcacatgaac ggaggccgca cgaacgagag ggccttgccg     4080
ctgccccagt cgtcaacctg cgattataag gatgacgatg acaagtga                  4128
<210>  18
<211>  1367
<212>  PRT
<213>  Macaca fascicularis
<220>
<223>  Macaca fascicularis IGF-I receptor
<400>  18
Met Lys Ser Gly Ser Gly Glu Gly Ser Pro Thr Ser Leu Trp Gly Leu
1               5                   10                  15
Leu Phe Leu Ser Ala Ala Leu Ser Leu Trp Pro Thr Ser Gly Glu Ile
20                  25                  30
Cys Gly Pro Gly Ile Asp Ile Arg Asn Asp Tyr Gln Gln Leu Lys Arg
35                  40                  45
Leu Glu Asn Cys Thr Val Ile Glu Gly Tyr Leu His Ile Leu Leu Ile
50                  55                  60
Ser Lys Ala Glu Asp Tyr Arg Ser Tyr Arg Phe Pro Lys Leu Thr Val
65                  70                  75                  80
Ile Thr Glu Tyr Leu Leu Leu Phe Arg Val Ala Gly Leu Glu Ser Leu
85                  90                  95
Gly Asp Leu Phe Pro Asn Leu Thr Val Ile Arg Gly Trp Lys Leu Phe
100                 105                 110
Tyr Asn Tyr Ala Leu Val Ile Phe Glu Met Thr Asn Leu Lys Asp Ile
115                 120                 125
Gly Leu Tyr Asn Leu Arg Asn Ile Thr Arg Gly Ala Ile Arg Ile Glu
130                 135                 140
Lys Asn Ala Asp Leu Cys Tyr Leu Ser Thr Val Asp Trp Ser Leu Ile
145                 150                 155                 160
Leu Asp Ala Val Ser Asn Asn Tyr Ile Val Gly Asn Lys Pro Pro Lys
165                 170                 175
Glu Cys Gly Asp Leu Cys Pro Gly Thr Met Glu Glu Lys Pro Met Cys
180                 185                 190
Glu Lys Thr Thr Ile Asn Asn Glu Tyr Asn Tyr Arg Cys Trp Thr Thr
195                 200                 205
Asn Arg Cys Gln Lys Met Cys Pro Ser Ala Cys Gly Lys Arg Ala Cys
210                 215                 220
Thr Glu Asn Asn Glu Cys Cys His Pro Glu Cys Leu Gly Ser Cys Ser
225                 230                 235                 240
Ala Pro Asp Asn Asp Thr Ala Cys Val Ala Cys Arg His Tyr Tyr Tyr
245                 250                 255
Ala Gly Val Cys Val Pro Ala Cys Pro Pro Asn Thr Tyr Arg Phe Glu
260                 265                 270
Gly Trp Arg Cys Val Asp Arg Asp Phe Cys Ala Asn Ile Leu Ser Ala
275                 280                 285
Glu Ser Ser Asp Ser Glu Gly Phe Val Ile His Asp Gly Glu Cys Met
290                 295                 300
Gln Glu Cys Pro Ser Gly Phe Ile Arg Asn Gly Ser Gln Ser Met Tyr
305                 310                 315                 320
Cys Ile Pro Cys Glu Gly Pro Cys Pro Lys Val Cys Glu Glu Glu Lys
325                 330                 335
Lys Thr Lys Thr Ile Asp Ser Val Thr Ser Ala Gln Met Leu Gln Gly
340                 345                 350
Cys Thr Ile Phe Lys Gly Asn Leu Leu Ile Asn Ile Arg Arg Gly Asn
355                 360                 365
Asn Ile Ala Ser Glu Leu Glu Asn Phe Met Gly Leu Ile Glu Val Val
370                 375                 380
Thr Gly Tyr Val Lys Ile Arg His Ser His Ala Leu Val Ser Leu Ser
385                 390                 395                 400
Phe Leu Lys Asn Leu Arg Leu Ile Leu Gly Glu Glu Gln Leu Glu Gly
405                 410                 415
Asn Tyr Ser Phe Tyr Val Leu Asp Asn Gln Asn Leu Gln Gln Leu Trp
420                 425                 430
Asp Trp Asp His Arg Asn Leu Thr Ile Lys Ala Gly Lys Met Tyr Phe
435                 440                 445
Ala Phe Asn Pro Lys Leu Cys Val Ser Glu Ile Tyr Arg Met Glu Glu
450                 455                 460
Val Thr Gly Thr Lys Gly Arg Gln Ser Lys Gly Asp Ile Asn Thr Arg
465                 470                 475                 480
Asn Asn Gly Glu Arg Ala Ser Cys Glu Ser Asp Val Leu His Phe Thr
485                 490                 495
Ser Thr Thr Thr Trp Lys Asn Arg Ile Ile Ile Thr Trp His Arg Tyr
500                 505                 510
Arg Pro Pro Asp Tyr Arg Asp Leu Ile Ser Phe Thr Val Tyr Tyr Lys
515                 520                 525
Glu Ala Pro Phe Lys Asn Val Thr Glu Tyr Asp Gly Gln Asp Ala Cys
530                 535                 540
Gly Ser Asn Ser Trp Asn Met Val Asp Val Asp Leu Pro Pro Asn Lys
545                 550                 555                 560
Asp Val Glu Pro Gly Ile Leu Leu His Gly Leu Lys Pro Trp Thr Gln
565                 570                 575
Tyr Ala Val Tyr Val Lys Ala Val Thr Leu Thr Met Val Glu Asn Asp
580                 585                 590
His Ile Arg Gly Ala Lys Ser Glu Ile Leu Tyr Ile Arg Thr Asn Ala
595                 600                 605
Ser Val Pro Ser Ile Pro Leu Asp Val Leu Ser Ala Ser Asn Ser Ser
610                 615                 620
Ser Gln Leu Ile Val Lys Trp Asn Pro Pro Ser Leu Pro Asn Gly Asn
625                 630                 635                 640
Leu Ser Tyr Tyr Ile Val Arg Trp Gln Arg Gln Pro Gln Asp Gly Tyr
645                 650                 655
Leu Tyr Arg His Asn Tyr Cys Ser Lys Asp Lys Ile Pro Ile Arg Lys
660                 665                 670
Tyr Ala Asp Gly Thr Ile Asp Ile Glu Glu Val Thr Glu Asn Pro Lys
675                 680                 685
Thr Glu Val Cys Gly Gly Glu Lys Gly Pro Cys Cys Ala Cys Pro Lys
690                 695                 700
Thr Glu Ala Glu Lys Gln Ala Glu Lys Glu Glu Ala Glu Tyr Arg Lys
705                 710                 715                 720
Val Phe Glu Asn Phe Leu His Asn Ser Ile Phe Val Pro Arg Pro Glu
725                 730                 735
Arg Lys Arg Arg Asp Val Met Gln Val Ala Asn Thr Thr Met Ser Ser
740                 745                 750
Arg Ser Arg Asn Thr Thr Val Ala Asp Thr Tyr Asn Ile Thr Asp Leu
755                 760                 765
Glu Glu Leu Glu Thr Glu Tyr Pro Phe Phe Glu Ser Arg Val Asp Asn
770                 775                 780
Lys Glu Arg Thr Val Ile Ser Asn Leu Arg Pro Phe Thr Leu Tyr Arg
785                 790                 795                 800
Ile Asp Ile His Ser Cys Asn His Glu Ala Glu Lys Leu Gly Cys Ser
805                 810                 815
Ala Ser Asn Phe Val Phe Ala Arg Thr Met Pro Ala Glu Gly Ala Asp
820                 825                 830
Asp Ile Pro Gly Pro Val Thr Trp Glu Pro Arg Pro Glu Asn Ser Ile
835                 840                 845
Phe Leu Lys Trp Pro Glu Pro Glu Asn Pro Asn Gly Leu Ile Leu Met
850                 855                 860
Tyr Glu Ile Lys Tyr Gly Ser Gln Val Glu Asp Gln Arg Glu Cys Val
865                 870                 875                 880
Ser Arg Gln Glu Tyr Arg Lys Tyr Gly Gly Ala Lys Leu Asn Arg Leu
885                 890                 895
Asn Pro Gly Asn Tyr Thr Ala Arg Ile Gln Ala Thr Ser Leu Ser Gly
900                 905                 910
Asn Gly Ser Trp Thr Asp Pro Val Phe Phe Tyr Val Gln Ala Lys Thr
915                 920                 925
Gly Tyr Glu Asn Phe Ile His Leu Ile Ile Ala Leu Pro Val Ala Val
930                 935                 940
Leu Leu Ile Val Gly Gly Leu Val Ile Met Leu Tyr Val Phe His Arg
945                 950                 955                 960
Lys Arg Asn Asn Ser Arg Leu Gly Asn Gly Val Leu Tyr Ala Ser Val
965                 970                 975
Asn Pro Glu Tyr Phe Ser Ala Ala Asp Val Tyr Val Pro Asp Glu Trp
980                 985                 990
Glu Val Ala Arg Glu Lys Ile Thr  Met Ser Arg Glu Leu  Gly Gln Gly
995                 1000                 1005
Ser Phe  Gly Met Val Tyr Glu  Gly Val Ala Lys Gly  Val Val Lys
1010                 1015                 1020
Asp Glu  Pro Glu Thr Arg Val  Ala Ile Lys Thr Val  Asn Glu Ala
1025                 1030                 1035
Ala Ser  Met Arg Glu Arg Ile  Glu Phe Leu Asn Glu  Ala Ser Val
1040                 1045                 1050
Met Lys  Glu Phe Asn Cys His  His Val Val Arg Leu  Leu Gly Val
1055                 1060                 1065
Val Ser  Gln Gly Gln Pro Thr  Leu Val Ile Met Glu  Leu Met Thr
1070                 1075                 1080
Arg Gly  Asp Leu Lys Ser Tyr  Leu Arg Ser Leu Arg  Pro Glu Met
1085                 1090                 1095
Glu Asn  Asn Pro Val Leu Ala  Pro Pro Ser Leu Ser  Lys Met Ile
1100                 1105                 1110
Gln Met  Ala Gly Glu Ile Ala  Asp Gly Met Ala Tyr  Leu Asn Ala
1115                 1120                 1125
Asn Lys  Phe Val His Arg Asp  Leu Ala Ala Arg Asn  Cys Met Val
1130                 1135                 1140
Ala Glu  Asp Phe Thr Val Lys  Ile Gly Asp Phe Gly  Met Thr Arg
1145                 1150                 1155
Asp Ile  Tyr Glu Thr Asp Tyr  Tyr Arg Lys Gly Gly  Lys Gly Leu
1160                 1165                 1170
Leu Pro  Val Arg Trp Met Ser  Pro Glu Ser Leu Lys  Asp Gly Val
1175                 1180                 1185
Phe Thr  Thr Tyr Ser Asp Val  Trp Ser Phe Gly Val  Val Leu Trp
1190                 1195                 1200
Glu Ile  Ala Thr Leu Ala Glu  Gln Pro Tyr Gln Gly  Leu Ser Asn
1205                 1210                 1215
Glu Gln  Val Leu Arg Phe Val  Met Glu Gly Gly Leu  Leu Asp Lys
1220                 1225                 1230
Pro Asp  Asn Cys Pro Asp Met  Leu Phe Glu Leu Met  Arg Met Cys
1235                 1240                 1245
Trp Gln  Tyr Asn Pro Lys Met  Arg Pro Ser Phe Leu  Glu Ile Ile
1250                 1255                 1260
Ser Ser  Ile Lys Asp Glu Met  Glu Pro Gly Phe Arg  Glu Val Ser
1265                 1270                 1275
Phe Tyr  Tyr Ser Glu Glu Asn  Lys Leu Pro Glu Pro  Glu Glu Leu
1280                 1285                 1290
Asp Leu  Glu Pro Glu Asn Met  Glu Ser Val Pro Leu  Asp Pro Ser
1295                 1300                 1305
Ala Ser  Ser Ser Ser Leu Pro  Leu Pro Asp Arg His  Ser Gly His
1310                 1315                 1320
Lys Ala  Glu Asn Gly Pro Gly  Pro Gly Val Leu Val  Leu Arg Ala
1325                 1330                 1335
Ser Phe  Asp Glu Arg Gln Pro  Tyr Ala His Met Asn  Gly Gly Arg
1340                 1345                 1350
Lys Asn  Glu Arg Ala Leu Pro  Leu Pro Gln Ser Ser  Thr Cys
1355                 1360                 1365
<210>  19
<211>  4128
<212>  DNA
<213>  Macaca fascicularis
<220>
<223>  Macaca fascicularis IGF-I receptor
<400>  19
atgaagtctg gctctggaga agggtccccg acctcgctgt gggggctcct gtttctctcc       60
gccgcgctct cgctctggcc gacgagtgga gaaatctgtg ggccgggcat cgacatccgc      120
aacgactatc agcagctgaa gcgcctggag aactgcacgg tgatcgaggg ctacctccac      180
atcctgctca tctccaaggc cgaggactac cgcagctacc gcttccccaa gctcacggtc      240
atcaccgagt acttgctgtt gttccgagtg gctggcctag agagcctcgg agacctgttc      300
cccaacctca cggtaatccg cggctggaaa ctcttctaca actacgccct ggtcatcttt      360
gagatgacca atctcaagga tattgggctt tacaacctga ggaacattac tcggggggcc      420
atcaggattg agaaaaatgc tgacctctgt tacctctcca ctgtggactg gtccctgatc      480
ctggatgcag tgtccaataa ctacattgtg gggaataagc ccccaaagga atgcggggac      540
ctgtgtccgg ggaccatgga ggagaagccg atgtgcgaga agaccaccat caacaatgag      600
tacaactacc gctgctggac cacaaaccgc tgccagaaaa tgtgcccgag tgcctgtggg      660
aagagggcat gcaccgagaa caacgagtgc tgccaccccg agtgcctggg cagctgcagc      720
gcgcctgaca acgacacggc ctgtgtagct tgccgccact actactacgc cggtgtctgc      780
gtgcctgcct gcccgcccaa cacctacagg tttgagggct ggcgctgtgt ggaccgtgac      840
ttctgcgcca acatcctcag tgccgagagc agcgactccg agggtttcgt gatccacgac      900
ggcgagtgca tgcaggagtg cccctcaggc ttcatccgca acggcagcca gagcatgtac      960
tgcatccctt gtgaaggtcc ttgccccaag gtctgtgagg aagaaaagaa aacaaagacc     1020
attgattctg ttacttctgc tcagatgctt caaggatgca ccatcttcaa gggcaatttg     1080
ctcattaaca tccgacgggg gaataacatt gcttcagaac tggagaactt catggggctc     1140
atcgaggtgg tgacgggcta cgtgaagatc cgccattccc atgccttggt ctccttgtcc     1200
ttcctaaaaa accttcgcct catcttagga gaggagcagc tagaagggaa ttactccttc     1260
tacgtcctcg acaaccagaa cttgcagcaa ctatgggact gggaccaccg caacctgacc     1320
atcaaagcag ggaaaatgta ctttgctttc aatcccaaat tgtgtgtttc ggaaatttac     1380
cgcatggagg aagtgacggg gactaaaggg cgccaaagca aaggggacat aaacaccagg     1440
aacaacgggg aaagagcctc ctgtgaaagt gacgtcctgc atttcacctc caccaccacg     1500
tggaagaatc gcatcatcat aacctggcac cggtaccggc cccctgacta cagggatctc     1560
atcagcttca ccgtttacta caaggaagca ccttttaaga atgtcacgga gtatgatggg     1620
caggatgcct gcggctccaa cagctggaac atggtggacg tggacctccc gcccaacaag     1680
gacgtggagc ccggcatctt actgcatggg ctgaagccct ggactcagta cgccgtttac     1740
gtcaaggctg tgaccctcac catggtggag aacgaccata tccgtggggc caagagtgag     1800
atcttgtaca ttcgcaccaa tgcttcagtt ccttccattc ccttggacgt tctttcagca     1860
tcgaactcct cttctcagtt aatcgtgaag tggaaccctc cctctctgcc caacggcaac     1920
ctgagttact acattgtgcg ctggcagcgg cagcctcagg acggctacct ttaccggcac     1980
aattactgct ccaaagacaa aatccccatc aggaagtatg ccgacggcac cattgacatt     2040
gaggaggtca cagagaaccc gaagactgag gtgtgtggtg gagagaaagg gccttgctgc     2100
gcctgcccca aaactgaagc tgagaagcag gccgagaagg aggaggctga gtaccgcaaa     2160
gtctttgaga atttcctgca caactccatc tttgtgccca gacctgaaag gaagcggaga     2220
gatgtcatgc aagtggccaa caccaccatg tccagccgaa gcaggaacac cacggtggca     2280
gacacctaca acatcacaga tctggaagag ctagagacag agtacccttt ctttgagagc     2340
agagtggata ataaggagag aactgtcatt tctaaccttc ggcctttcac attgtaccgc     2400
attgatatcc acagctgcaa ccacgaggct gagaaactgg gctgcagcgc ctccaacttt     2460
gtctttgcaa ggactatgcc tgcagaagga gcagatgaca ttcctgggcc agtgacctgg     2520
gagccaaggc ctgaaaactc catcttttta aagtggccag aacctgagaa tcccaatgga     2580
ttgattctaa tgtatgaaat aaaatacgga tcacaagttg aggatcagcg agaatgtgtg     2640
tccagacagg aatacaggaa gtatggaggg gccaagctaa accggctaaa cccggggaac     2700
tacacagccc ggattcaggc tacatctctc tctgggaatg ggtcgtggac agatcctgtg     2760
ttcttctatg tccaggccaa aacaggatac gaaaacttca tccatctgat catcgctctg     2820
cccgtcgctg tcctgttgat cgtgggaggg ttggtgatca tgctgtacgt cttccataga     2880
aagagaaata acagcaggct ggggaatgga gtgctgtacg cgtctgtgaa cccggagtac     2940
ttcagcgctg cggatgtgta cgttcctgat gagtgggagg tggctcggga gaagatcacc     3000
atgagccggg aacttgggca ggggtcgttt gggatggtct atgaaggagt tgccaagggt     3060
gtggtgaaag acgaacctga aaccagagtg gccattaaaa cagtgaacga ggccgcgagc     3120
atgcgtgaaa ggatcgagtt tctcaacgag gcttctgtga tgaaggagtt caattgtcac     3180
catgtggtgc ggttgctggg tgtggtgtcc cagggccagc caacgctggt catcatggaa     3240
ctgatgacgc ggggcgatct caaaagttat ctccggtctc tgaggccaga aatggagaat     3300
aatccagtcc tagcacctcc aagcctaagc aagatgattc agatggctgg agagattgca     3360
gacggcatgg catacctcaa cgccaacaag ttcgtccaca gagaccttgc tgcccggaat     3420
tgcatggtag ccgaggattt cacagtcaaa attggagatt ttgggatgac gcgagatatc     3480
tatgagacag actattaccg gaaaggaggg aaagggctgt tgcccgtgcg ctggatgtct     3540
cccgagtccc tcaaggatgg agtcttcacc acttactcgg acgtctggtc cttcggggtt     3600
gtcctctggg agatcgccac actggccgag cagccctacc agggcttgtc caacgagcaa     3660
gtccttcgct tcgtcatgga gggcggcctt ctggacaagc cagacaactg ccccgacatg     3720
ctgtttgaat tgatgcgcat gtgctggcag tacaacccca agatgaggcc ttccttcctg     3780
gagatcatca gcagcatcaa agacgagatg gagcctggct tccgggaggt ctccttctac     3840
tacagtgagg agaacaagct gcccgagccg gaggagctgg acctggagcc agagaacatg     3900
gagagcgtcc ccctggaccc ctcggcctcc tcgtcctccc tgccactgcc cgacagacac     3960
tcaggacaca aggccgagaa cggccccggc cctggagtgc tggtgctccg cgccagcttc     4020
gatgagagac agccttacgc acacatgaac ggtggccgca agaacgagcg ggccttgccg     4080
ctgccccagt cttcgacctg cgattataag gatgacgatg acaagtga                  4128
<210>  20
<211>  1370
<212>  PRT
<213>  Rattus norvegicus
<220>
<223>  Rattus norvegicus IGF-I receptor
<400>  20
Met Lys Ser Gly Ser Gly Gly Gly Ser Pro Thr Ser Leu Trp Gly Leu
1               5                   10                  15
Val Phe Leu Ser Ala Ala Leu Ser Leu Trp Pro Thr Ser Gly Glu Ile
20                  25                  30
Cys Gly Pro Gly Ile Asp Ile Arg Asn Asp Tyr Gln Gln Leu Lys Arg
35                  40                  45
Leu Glu Asn Cys Thr Val Ile Glu Gly Phe Leu His Ile Leu Leu Ile
50                  55                  60
Ser Lys Ala Glu Asp Tyr Arg Ser Tyr Arg Phe Pro Lys Leu Thr Val
65                  70                  75                  80
Ile Thr Glu Tyr Leu Leu Leu Phe Arg Val Ala Gly Leu Glu Ser Leu
85                  90                  95
Gly Asp Leu Phe Pro Asn Leu Thr Val Ile Arg Gly Trp Lys Leu Phe
100                 105                 110
Tyr Asn Tyr Ala Leu Val Ile Phe Glu Met Thr Asn Leu Lys Asp Ile
115                 120                 125
Gly Leu Tyr Asn Leu Arg Asn Ile Thr Arg Gly Ala Ile Arg Ile Glu
130                 135                 140
Lys Asn Ala Asp Leu Cys Tyr Leu Ser Thr Ile Asp Trp Ser Leu Ile
145                 150                 155                 160
Leu Asp Ala Val Ser Asn Asn Tyr Ile Val Gly Asn Lys Pro Pro Lys
165                 170                 175
Glu Cys Gly Asp Leu Cys Pro Gly Thr Leu Glu Glu Lys Pro Met Cys
180                 185                 190
Glu Lys Thr Thr Ile Asn Asn Glu Tyr Asn Tyr Arg Cys Trp Thr Thr
195                 200                 205
Asn Arg Cys Gln Lys Met Cys Pro Ser Val Cys Gly Lys Arg Ala Cys
210                 215                 220
Thr Glu Asn Asn Glu Cys Cys His Pro Glu Cys Leu Gly Ser Cys His
225                 230                 235                 240
Thr Pro Asp Asp Asn Thr Thr Cys Val Ala Cys Arg His Tyr Tyr Tyr
245                 250                 255
Lys Gly Val Cys Val Pro Ala Cys Pro Pro Gly Thr Tyr Arg Phe Glu
260                 265                 270
Gly Trp Arg Cys Val Asp Arg Asp Phe Cys Ala Asn Ile Pro Asn Ala
275                 280                 285
Glu Ser Ser Asp Ser Asp Gly Phe Val Ile His Asp Gly Glu Cys Met
290                 295                 300
Gln Glu Cys Pro Ser Gly Phe Ile Arg Asn Ser Thr Gln Ser Met Tyr
305                 310                 315                 320
Cys Ile Pro Cys Glu Gly Pro Cys Pro Lys Val Cys Gly Asp Glu Glu
325                 330                 335
Lys Lys Thr Lys Thr Ile Asp Ser Val Thr Ser Ala Gln Met Leu Gln
340                 345                 350
Gly Cys Thr Ile Leu Lys Gly Asn Leu Leu Ile Asn Ile Arg Arg Gly
355                 360                 365
Asn Asn Ile Ala Ser Glu Leu Glu Asn Phe Met Gly Leu Ile Glu Val
370                 375                 380
Val Thr Gly Tyr Val Lys Ile Arg His Ser His Ala Leu Val Ser Leu
385                 390                 395                 400
Ser Phe Leu Lys Asn Leu Arg Leu Ile Leu Gly Glu Glu Gln Leu Glu
405                 410                 415
Gly Asn Tyr Ser Phe Tyr Val Leu Asp Asn Gln Asn Leu Gln Gln Leu
420                 425                 430
Trp Asp Trp Asn His Arg Asn Leu Thr Val Arg Ser Gly Lys Met Tyr
435                 440                 445
Phe Ala Phe Asn Pro Lys Leu Cys Val Ser Glu Ile Tyr Arg Met Glu
450                 455                 460
Glu Val Thr Gly Thr Lys Gly Arg Gln Ser Lys Gly Asp Ile Asn Thr
465                 470                 475                 480
Arg Asn Asn Gly Glu Arg Ala Ser Cys Glu Ser Asp Val Leu Arg Phe
485                 490                 495
Thr Ser Thr Thr Thr Trp Lys Asn Arg Ile Ile Ile Thr Trp His Arg
500                 505                 510
Tyr Arg Pro Pro Asp Tyr Arg Asp Leu Ile Ser Phe Thr Val Tyr Tyr
515                 520                 525
Lys Glu Ala Pro Phe Lys Asn Val Thr Glu Tyr Asp Gly Gln Asp Ala
530                 535                 540
Cys Gly Ser Asn Ser Trp Asn Met Val Asp Val Asp Leu Pro Pro Asn
545                 550                 555                 560
Lys Glu Gly Glu Pro Gly Ile Leu Leu His Gly Leu Lys Pro Trp Thr
565                 570                 575
Gln Tyr Ala Val Tyr Val Lys Ala Val Thr Leu Thr Met Val Glu Asn
580                 585                 590
Asp His Ile Arg Gly Ala Lys Ser Glu Ile Leu Tyr Ile Arg Thr Asn
595                 600                 605
Ala Ser Val Pro Ser Ile Pro Leu Asp Val Leu Ser Ala Ser Asn Ser
610                 615                 620
Ser Ser Gln Leu Ile Val Lys Trp Asn Pro Pro Thr Leu Pro Asn Gly
625                 630                 635                 640
Asn Leu Ser Tyr Tyr Ile Val Arg Trp Gln Arg Gln Pro Gln Asp Gly
645                 650                 655
Tyr Leu Phe Arg His Asn Tyr Cys Ser Lys Asp Lys Ile Pro Ile Arg
660                 665                 670
Lys Tyr Ala Asp Gly Thr Ile Asp Val Glu Glu Val Thr Glu Asn Pro
675                 680                 685
Lys Thr Glu Val Cys Gly Gly Asp Lys Gly Pro Cys Cys Ala Cys Pro
690                 695                 700
Lys Thr Glu Ala Glu Lys Gln Ala Glu Lys Glu Glu Ala Glu Tyr Arg
705                 710                 715                 720
Lys Val Phe Glu Asn Phe Leu His Asn Ser Ile Phe Val Pro Arg Pro
725                 730                 735
Glu Arg Arg Arg Arg Asp Val Leu Gln Val Ala Asn Thr Thr Met Ser
740                 745                 750
Ser Arg Ser Arg Asn Thr Thr Val Ala Asp Thr Tyr Asn Ile Thr Asp
755                 760                 765
Pro Glu Glu Phe Glu Thr Glu Tyr Pro Phe Phe Glu Ser Arg Val Asp
770                 775                 780
Asn Lys Glu Arg Thr Val Ile Ser Asn Leu Arg Pro Phe Thr Leu Tyr
785                 790                 795                 800
Arg Ile Asp Ile His Ser Cys Asn His Glu Ala Glu Lys Leu Gly Cys
805                 810                 815
Ser Ala Ser Asn Phe Val Phe Ala Arg Thr Met Pro Ala Glu Gly Ala
820                 825                 830
Asp Asp Ile Pro Gly Pro Val Thr Trp Glu Pro Arg Pro Glu Asn Ser
835                 840                 845
Ile Phe Leu Lys Trp Pro Glu Pro Glu Asn Pro Asn Gly Leu Ile Leu
850                 855                 860
Met Tyr Glu Ile Lys Tyr Gly Ser Gln Val Glu Asp Gln Arg Glu Cys
865                 870                 875                 880
Val Ser Arg Gln Glu Tyr Arg Lys Tyr Gly Gly Ala Lys Leu Asn Arg
885                 890                 895
Leu Asn Pro Gly Asn Tyr Thr Ala Arg Ile Gln Ala Thr Ser Leu Ser
900                 905                 910
Gly Asn Gly Ser Trp Thr Asp Pro Val Phe Phe Tyr Val Pro Ala Lys
915                 920                 925
Thr Thr Tyr Glu Asn Phe Met His Leu Ile Ile Ala Leu Pro Val Ala
930                 935                 940
Ile Leu Leu Ile Val Gly Gly Leu Val Ile Met Leu Tyr Val Phe His
945                 950                 955                 960
Arg Lys Arg Asn Asn Ser Arg Leu Gly Asn Gly Val Leu Tyr Ala Ser
965                 970                 975
Val Asn Pro Glu Tyr Phe Ser Ala Ala Asp Val Tyr Val Pro Asp Glu
980                 985                 990
Trp Glu Val Ala Arg Glu Lys Ile  Thr Met Asn Arg Glu  Leu Gly Gln
995                 1000                 1005
Gly Ser  Phe Gly Met Val Tyr  Glu Gly Val Ala Lys  Gly Val Val
1010                 1015                 1020
Lys Asp  Glu Pro Glu Thr Arg  Val Ala Ile Lys Thr  Val Asn Glu
1025                 1030                 1035
Ala Ala  Ser Met Arg Glu Arg  Ile Glu Phe Leu Asn  Glu Ala Ser
1040                 1045                 1050
Val Met  Lys Glu Phe Asn Cys  His His Val Val Arg  Leu Leu Gly
1055                 1060                 1065
Val Val  Ser Gln Gly Gln Pro  Thr Leu Val Ile Met  Glu Leu Met
1070                 1075                 1080
Thr Arg  Gly Asp Leu Lys Ser  Tyr Leu Arg Ser Leu  Arg Pro Glu
1085                 1090                 1095
Val Glu  Asn Asn Leu Val Leu  Ile Pro Pro Ser Leu  Ser Lys Met
1100                 1105                 1110
Ile Gln  Met Ala Gly Glu Ile  Ala Asp Gly Met Ala  Tyr Leu Asn
1115                 1120                 1125
Ala Asn  Lys Phe Val His Arg  Asp Leu Ala Ala Arg  Asn Cys Met
1130                 1135                 1140
Val Ala  Glu Asp Phe Thr Val  Lys Ile Gly Asp Phe  Gly Met Thr
1145                 1150                 1155
Arg Asp  Ile Tyr Glu Thr Asp  Tyr Tyr Arg Lys Gly  Gly Lys Gly
1160                 1165                 1170
Leu Leu  Pro Val Arg Trp Met  Ser Pro Glu Ser Leu  Lys Asp Gly
1175                 1180                 1185
Val Phe  Thr Thr His Ser Asp  Val Trp Ser Phe Gly  Val Val Leu
1190                 1195                 1200
Trp Glu  Ile Ala Thr Leu Ala  Glu Gln Pro Tyr Gln  Gly Leu Ser
1205                 1210                 1215
Asn Glu  Gln Val Leu Arg Phe  Val Met Glu Gly Gly  Leu Leu Asp
1220                 1225                 1230
Lys Pro  Asp Asn Cys Pro Asp  Met Leu Phe Glu Leu  Met Arg Met
1235                 1240                 1245
Cys Trp  Gln Tyr Asn Pro Lys  Met Arg Pro Ser Phe  Leu Glu Ile
1250                 1255                 1260
Ile Gly  Ser Ile Lys Asp Glu  Met Glu Pro Ser Phe  Gln Glu Val
1265                 1270                 1275
Ser Phe  Tyr Tyr Ser Glu Glu  Asn Lys Pro Pro Glu  Pro Glu Glu
1280                 1285                 1290
Leu Glu  Met Glu Leu Glu Leu  Glu Pro Glu Asn Met  Glu Ser Val
1295                 1300                 1305
Pro Leu  Asp Pro Ser Ala Ser  Ser Ala Ser Leu Pro  Leu Pro Glu
1310                 1315                 1320
Arg His  Ser Gly His Lys Ala  Glu Asn Gly Pro Gly  Val Leu Val
1325                 1330                 1335
Leu Arg  Ala Ser Phe Asp Glu  Arg Gln Pro Tyr Ala  His Met Asn
1340                 1345                 1350
Gly Gly  Arg Ala Asn Glu Arg  Ala Leu Pro Leu Pro  Gln Ser Ser
1355                 1360                 1365
Thr Cys
1370
<210>  21
<211>  4140
<212>  DNA
<213>  Rattus norvegicus
<220>
<223>  Rattus norvegicus IGF-I receptor
<400>  21
atgaagtctg gctccggagg agggtccccg acctcgctgt gggggctcgt gtttctctcc       60
gccgcgctct cgctctggcc gacgagtgga gaaatttgtg ggcccggcat tgacatccgc      120
aacgactatc agcagctgaa gcgcctggaa aactgcacgg tgatcgaggg cttcctccac      180
atcctgctca tctccaaggc cgaggactac cgaagctacc gcttccccaa gctcacagtc      240
atcaccgagt acttgctgct gtttcgagtg gccggcctcg agagcctggg agacctcttc      300
ccgaacctca cagtcatccg tggctggaaa ctcttctaca attacgcact ggtcatcttc      360
gagatgacca atctcaagga tattgggctt tataatctga ggaacattac tcggggggcc      420
atcaggattg agaaaaacgc tgacctctgt tacctctcca ccatagactg gtctctcatc      480
ttggatgcgg tgtccaataa ctacattgtg gggaacaagc ccccaaagga atgtggggac      540
ctgtgtccag ggaccttgga ggagaagccc atgtgtgaga agaccaccat caacaatgag      600
tacaactacc gctgctggac cacaaatcgc tgccagaaaa tgtgcccaag tgtgtgtggg      660
aagcgagcct gcaccgagaa caatgagtgc tgccacccgg agtgcctagg cagctgccac      720
acaccggacg acaacacaac ctgcgtggcc tgccgacact actactacaa aggcgtgtgc      780
gtgcctgcct gcccgcctgg cacctacagg ttcgagggct ggcgctgtgt ggaccgggat      840
ttctgcgcca acatccccaa cgccgagagc agtgactcag atggcttcgt catccacgat      900
ggcgagtgca tgcaggagtg tccatcaggc ttcatccgca acagcaccca gagcatgtac      960
tgtatcccct gtgaaggccc ctgccccaag gtctgcggcg atgaagaaaa gaaaacgaaa     1020
accatcgatt ctgtgacgtc tgcccagatg ctccaagggt gcaccatttt gaagggcaat     1080
ctgcttatta acatccggcg aggcaataac attgcctcgg aattggagaa cttcatgggg     1140
ctcatcgagg tggtgactgg ctacgtgaag atccgccatt cccatgcctt ggtctccttg     1200
tccttcctga agaaccttcg tctcatctta ggagaggagc agctagaagg aaactactcc     1260
ttctatgtcc tggacaacca gaacttgcag cagctgtggg actggaacca ccggaacctg     1320
accgtcaggt cagggaaaat gtacttcgct ttcaatccca agctgtgtgt ctctgaaatt     1380
taccgaatgg aggaggtgac aggaacaaag ggacggcaga gcaaaggaga cataaacacc     1440
aggaacaacg gagagcgagc ttcctgtgaa agtgatgttc tccgtttcac ctccaccacc     1500
acctggaaga accgcatcat cataacgtgg caccggtacc ggccgccgga ctaccgggat     1560
ctcatcagtt tcacagtcta ctacaaggag gcacccttta aaaacgtcac ggaatacgac     1620
gggcaggatg cctgtggctc caacagctgg aacatggtgg acgtggacct gcctccgaac     1680
aaggaggggg agcctggcat tttgctgcat gggctgaagc cctggaccca gtatgcagtc     1740
tatgtcaagg ctgtgaccct caccatggtg gaaaacgacc acatccgtgg ggccaaaagt     1800
gaaatcttgt acattcgcac caacgcttca gttccttcca ttcctctaga tgtcctctcg     1860
gcatcaaact cctcctctca gctgatcgtg aagtggaacc ccccaactct gcccaatggt     1920
aacttgagtt actacattgt gaggtggcag cggcagccgc aggatggcta tctgttccgg     1980
cacaactact gctccaaaga caaaataccc atcagaaagt acgccgatgg taccatcgat     2040
gtggaggagg tgacagaaaa tcccaagaca gaagtgtgcg gtggtgataa agggccgtgc     2100
tgtgcctgtc ctaaaaccga agctgagaag caggctgaga aggaggaggc tgagtaccgt     2160
aaagtctttg agaatttcct tcacaactcc atctttgtgc ccagacctga gaggaggcgg     2220
agagatgtcc tgcaggtggc taacaccacc atgtccagcc gaagcaggaa caccacggta     2280
gctgacacct acaatatcac agacccggaa gagttcgaga cagaataccc tttctttgag     2340
agcagagtgg ataacaagga gaggactgtc atttccaacc tccggccttt cactctgtac     2400
cgtatcgata tccacagctg caaccacgag gctgagaagc tgggctgcag cgcctccaac     2460
tttgtctttg caagaaccat gccagcagaa ggagcagatg acattcctgg cccagtgacc     2520
tgggagccaa gacctgaaaa ctccatcttt ttaaagtggc cagaacccga gaaccccaac     2580
ggattgattc taatgtatga aataaaatac ggatcgcaag tcgaggatca gcgggaatgt     2640
gtgtccagac aggagtacag gaagtatgga ggggccaaac ttaaccgtct aaacccaggg     2700
aactatacgg cccggattca ggctacctcc ctctctggga atgggtcgtg gacagatcct     2760
gtgttcttct atgtcccagc caaaacaacg tatgagaatt tcatgcatct gatcattgct     2820
ctgccggttg ccatcctgct gattgtgggg ggcctggtaa tcatgctgta tgtcttccat     2880
agaaagagga ataacagcag attgggcaac ggggtgctgt acgcctctgt gaaccccgag     2940
tatttcagcg cagctgatgt gtacgtgcct gatgaatggg aggtagctcg ggagaagatc     3000
accatgaacc gggagctcgg acaagggtcc ttcgggatgg tctatgaagg agtggccaag     3060
ggcgtggtca aggacgagcc tgaaaccaga gtggccatca agacagtgaa tgaggctgca     3120
agtatgcgtg agagaattga gtttctcaac gaggcctcag tgatgaagga gttcaactgt     3180
caccatgtgg tccggttgct gggtgtagta tcccaaggcc agcccaccct ggtcatcatg     3240
gaactaatga cacgtggcga tctcaaaagt tatctccggt ctctaaggcc agaggtggag     3300
cagaataatc tagtcctgat tcctccgagc ttaagcaaga tgatccagat ggctggagag     3360
attgcagatg gcatggccta cctcaatgcc aacaagttcg tccacagaga cctggctgct     3420
cggaactgca tggtagctga agatttcaca gtcaaaattg gagattttgg tatgacacga     3480
gacatctacg agacggacta ctaccggaaa ggcgggaagg gcttgctgcc tgtgcgctgg     3540
atgtctcccg agtccctcaa ggatggcgtc ttcaccactc attccgatgt ctggtccttt     3600
ggggtcgtcc tctgggagat cgccactctg gctgagcagc cgtaccaggg cctgtccaac     3660
gagcaagttc ttcgtttcgt catggagggc ggccttctgg acaagccgga taactgcccc     3720
gatatgctgt ttgaacttat gcgcatgtgc tggcagtaca accccaagat gcggccctcc     3780
ttcctggaga tcatcggaag catcaaggat gagatggagc ccagtttcca ggaggtctcc     3840
ttctactaca gcgaggagaa caagcctcca gagccggagg agctggagat ggagctggag     3900
ctggagcccg agaacatgga gagcgtcccg ctggaccctt cggcctcctc agcctccctg     3960
cctctgcctg aaagacactc aggacacaag gctgagaacg gccctggcgt gctggttctc     4020
cgtgccagtt ttgatgagag acagccttac gctcacatga atgggggacg cgccaacgag     4080
agggccttgc ctctgcccca gtcctcaacc tgcgattata aggatgacga tgacaagtga     4140
<210>  22
<211>  4142
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  hIGF-1R_FLAG
<400>  22
gaattcatga agtctggctc cggaggaggg tccccgacct cgctgtgggg gctcctgttt       60
ctctccgccg cgctctcgct ctggccgacg agtggagaaa tctgcgggcc aggcatcgac      120
atccgcaacg actatcagca gctgaagcgc ctggagaact gcacggtgat cgagggctac      180
ctccacatcc tgctcatctc caaggccgag gactaccgca gctaccgctt ccccaagctc      240
acggtcatta ccgagtactt gctgctgttc cgagtggctg gcctcgagag cctcggagac      300
ctcttcccca acctcacggt catccgcggc tggaaactct tctacaacta cgccctggtc      360
atcttcgaga tgaccaatct caaggatatt gggctttaca acctgaggaa cattactcgg      420
ggggccatca ggattgagaa aaatgctgac ctctgttacc tctccactgt ggactggtcc      480
ctgatcctgg atgcggtgtc caataactac attgtgggga ataagccccc aaaggaatgt      540
ggggacctgt gtccagggac catggaggag aagccgatgt gtgagaagac caccatcaac      600
aatgagtaca actaccgctg ctggaccaca aaccgctgcc agaaaatgtg cccaagcacg      660
tgtgggaagc gggcgtgcac cgagaacaat gagtgctgcc accccgagtg cctgggcagc      720
tgcagcgcgc ctgacaacga cacggcctgt gtagcttgcc gccactacta ctatgccggt      780
gtctgtgtgc ctgcctgccc gcccaacacc tacaggtttg agggctggcg ctgtgtggac      840
cgtgacttct gcgccaacat cctcagcgcc gagagcagcg actccgaggg gtttgtgatc      900
cacgacggcg agtgcatgca ggagtgcccc tcgggcttca tccgcaacgg cagccagagc      960
atgtactgca tcccttgtga aggtccttgc ccgaaggtct gtgaggaaga aaagaaaaca     1020
aagaccattg attctgttac ttctgctcag atgctccaag gatgcaccat cttcaagggc     1080
aatttgctca ttaacatccg acgggggaat aacattgctt cagagctgga gaacttcatg     1140
gggctcatcg aggtggtgac gggctacgtg aagatccgcc attctcatgc cttggtctcc     1200
ttgtccttcc taaaaaacct tcgcctcatc ctaggagagg agcagctaga agggaattac     1260
tccttctacg tcctcgacaa ccagaacttg cagcaactgt gggactggga ccaccgcaac     1320
ctgaccatca aagcagggaa aatgtacttt gctttcaatc ccaaattatg tgtttccgaa     1380
atttaccgca tggaggaagt gacggggact aaagggcgcc aaagcaaagg ggacataaac     1440
accaggaaca acggggagag agcctcctgt gaaagtgacg tcctgcattt cacctccacc     1500
accacgtcga agaatcgcat catcataacc tggcaccggt accggccccc tgactacagg     1560
gatctcatca gcttcaccgt ttactacaag gaagcaccct ttaagaatgt cacagagtat     1620
gatgggcagg atgcctgcgg ctccaacagc tggaacatgg tggacgtgga cctcccgccc     1680
aacaaggacg tggagcccgg catcttacta catgggctga agccctggac tcagtacgcc     1740
gtttacgtca aggctgtgac cctcaccatg gtggagaacg accatatccg tggggccaag     1800
agtgagatct tgtacattcg caccaatgct tcagttcctt ccattccctt ggacgttctt     1860
tcagcatcga actcctcttc tcagttaatc gtgaagtgga accctccctc tctgcccaac     1920
ggcaacctga gttactacat tgtgcgctgg cagcggcagc ctcaggacgg ctacctttac     1980
cggcacaatt actgctccaa agacaaaatc cccatcagga agtatgccga cggcaccatc     2040
gacattgagg aggtcacaga gaaccccaag actgaggtgt gtggtgggga gaaagggcct     2100
tgctgcgcct gccccaaaac tgaagccgag aagcaggccg agaaggagga ggctgaatac     2160
cgcaaagtct ttgagaattt cctgcacaac tccatcttcg tgcccagacc tgaaaggaag     2220
cggagagatg tcatgcaagt ggccaacacc accatgtcca gccgaagcag gaacaccacg     2280
gccgcagaca cctacaacat caccgacccg gaagagctgg agacagagta ccctttcttt     2340
gagagcagag tggataacaa ggagagaact gtcatttcta accttcggcc tttcacattg     2400
taccgcatcg atatccacag ctgcaaccac gaggctgaga agctgggctg cagcgcctcc     2460
aacttcgtct ttgcaaggac tatgcccgca gaaggagcag atgacattcc tgggccagtg     2520
acctgggagc caaggcctga aaactccatc tttttaaagt ggccggaacc tgagaatccc     2580
aatggattga ttctaatgta tgaaataaaa tacggatcac aagttgagga tcagcgagaa     2640
tgtgtgtcca gacaggaata caggaagtat ggaggggcca agctaaaccg gctaaacccg     2700
gggaactaca cagcccggat tcaggccaca tctctctctg ggaatgggtc gtggacagat     2760
cctgtgttct tctatgtcca ggccaaaaca ggatatgaaa acttcatcca tctgatcatc     2820
gctctgcccg tcgctgtcct gttgatcgtg ggagggttgg tgattatgct gtacgtcttc     2880
catagaaaga gaaataacag caggctgggg aatggagtgc tgtatgcctc tgtgaacccg     2940
gagtacttca gcgctgctga tgtgtacgtt cctgatgagt gggaggtggc tcgggagaag     3000
atcaccatga gccgggaact tgggcagggg tcgtttggga tggtctatga aggagttgcc     3060
aagggtgtgg tgaaagatga acctgaaacc agagtggcca ttaaaacagt gaacgaggcc     3120
gcaagcatgc gtgagaggat tgagtttctc aacgaagctt ctgtgatgaa ggagttcaat     3180
tgtcaccatg tggtgcgatt gctgggtgtg gtgtcccaag gccagccaac actggtcatc     3240
atggaactga tgacacgggg cgatctcaaa agttatctcc ggtctctgag gccagaaatg     3300
gagaataatc cagtcctagc acctccaagc ctgagcaaga tgattcagat ggccggagag     3360
attgcagacg gcatggcata cctcaacgcc aataagttcg tccacagaga ccttgctgcc     3420
cggaattgca tggtagccga agatttcaca gtcaaaatcg gagattttgg tatgacgcga     3480
gatatctatg agacagacta ttaccggaaa ggagggaaag ggctgctgcc cgtgcgctgg     3540
atgtctcctg agtccctcaa ggatggagtc ttcaccactt actcggacgt ctggtccttc     3600
ggggtcgtcc tctgggagat cgccacactg gccgagcagc cctaccaggg cttgtccaac     3660
gagcaagtcc ttcgcttcgt catggagggc ggccttctgg acaagccaga caactgtcct     3720
gacatgctgt ttgaactgat gcgcatgtgc tggcagtata accccaagat gaggccttcc     3780
ttcctggaga tcatcagcag catcaaagag gagatggagc ctggcttccg ggaggtctcc     3840
ttctactaca gcgaggagaa caagctgccc gagccggagg agctggacct ggagccagag     3900
aacatggaga gcgtccccct ggacccctcg gcctcctcgt cctccctgcc actgcccgac     3960
agacactcag gacacaaggc cgagaacggc cccggccctg gggtgctggt cctccgcgcc     4020
agcttcgacg agagacagcc ttacgcccac atgaacgggg gccgcaagaa cgagcgggcc     4080
ttgccgctgc cccagtcttc gacctgcgac tacaaagacg atgacgacaa gtgagcggcc     4140
gc                                                                    4142
<210>  23
<211>  4142
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  hIGF1R-D245N-A247T-E294D_FLAG
<400>  23
gaattcatga agtctggctc cggaggaggg tccccgacct cgctgtgggg gctcctgttt       60
ctctccgccg cgctctcgct ctggccgacg agtggagaaa tctgcgggcc aggcatcgac      120
atccgcaacg actatcagca gctgaagcgc ctggagaact gcacggtgat cgagggctac      180
ctccacatcc tgctcatctc caaggccgag gactaccgca gctaccgctt ccccaagctc      240
acggtcatta ccgagtactt gctgctgttc cgagtggctg gcctcgagag cctcggagac      300
ctcttcccca acctcacggt catccgcggc tggaaactct tctacaacta cgccctggtc      360
atcttcgaga tgaccaatct caaggatatt gggctttaca acctgaggaa cattactcgg      420
ggggccatca ggattgagaa aaatgctgac ctctgttacc tctccactgt ggactggtcc      480
ctgatcctgg atgcggtgtc caataactac attgtgggga ataagccccc aaaggaatgt      540
ggggacctgt gtccagggac catggaggag aagccgatgt gtgagaagac caccatcaac      600
aatgagtaca actaccgctg ctggaccaca aaccgctgcc agaaaatgtg cccaagcacg      660
tgtgggaagc gggcgtgcac cgagaacaat gagtgctgcc accccgagtg cctgggcagc      720
tgcagcgcgc ctgacaacaa cacgacctgt gtagcttgcc gccactacta ctatgccggt      780
gtctgtgtgc ctgcctgccc gcccaacacc tacaggtttg agggctggcg ctgtgtggac      840
cgtgacttct gcgccaacat cctcagcgcc gagagcagcg actccgacgg gtttgtgatc      900
cacgacggcg agtgcatgca ggagtgcccc tcgggcttca tccgcaacgg cagccagagc      960
atgtactgca tcccttgtga aggtccttgc ccgaaggtct gtgaggaaga aaagaaaaca     1020
aagaccattg attctgttac ttctgctcag atgctccaag gatgcaccat cttcaagggc     1080
aatttgctca ttaacatccg acgggggaat aacattgctt cagagctgga gaacttcatg     1140
gggctcatcg aggtggtgac gggctacgtg aagatccgcc attctcatgc cttggtctcc     1200
ttgtccttcc taaaaaacct tcgcctcatc ctaggagagg agcagctaga agggaattac     1260
tccttctacg tcctcgacaa ccagaacttg cagcaactgt gggactggga ccaccgcaac     1320
ctgaccatca aagcagggaa aatgtacttt gctttcaatc ccaaattatg tgtttccgaa     1380
atttaccgca tggaggaagt gacggggact aaagggcgcc aaagcaaagg ggacataaac     1440
accaggaaca acggggagag agcctcctgt gaaagtgacg tcctgcattt cacctccacc     1500
accacgtcga agaatcgcat catcataacc tggcaccggt accggccccc tgactacagg     1560
gatctcatca gcttcaccgt ttactacaag gaagcaccct ttaagaatgt cacagagtat     1620
gatgggcagg atgcctgcgg ctccaacagc tggaacatgg tggacgtgga cctcccgccc     1680
aacaaggacg tggagcccgg catcttacta catgggctga agccctggac tcagtacgcc     1740
gtttacgtca aggctgtgac cctcaccatg gtggagaacg accatatccg tggggccaag     1800
agtgagatct tgtacattcg caccaatgct tcagttcctt ccattccctt ggacgttctt     1860
tcagcatcga actcctcttc tcagttaatc gtgaagtgga accctccctc tctgcccaac     1920
ggcaacctga gttactacat tgtgcgctgg cagcggcagc ctcaggacgg ctacctttac     1980
cggcacaatt actgctccaa agacaaaatc cccatcagga agtatgccga cggcaccatc     2040
gacattgagg aggtcacaga gaaccccaag actgaggtgt gtggtgggga gaaagggcct     2100
tgctgcgcct gccccaaaac tgaagccgag aagcaggccg agaaggagga ggctgaatac     2160
cgcaaagtct ttgagaattt cctgcacaac tccatcttcg tgcccagacc tgaaaggaag     2220
cggagagatg tcatgcaagt ggccaacacc accatgtcca gccgaagcag gaacaccacg     2280
gccgcagaca cctacaacat caccgacccg gaagagctgg agacagagta ccctttcttt     2340
gagagcagag tggataacaa ggagagaact gtcatttcta accttcggcc tttcacattg     2400
taccgcatcg atatccacag ctgcaaccac gaggctgaga agctgggctg cagcgcctcc     2460
aacttcgtct ttgcaaggac tatgcccgca gaaggagcag atgacattcc tgggccagtg     2520
acctgggagc caaggcctga aaactccatc tttttaaagt ggccggaacc tgagaatccc     2580
aatggattga ttctaatgta tgaaataaaa tacggatcac aagttgagga tcagcgagaa     2640
tgtgtgtcca gacaggaata caggaagtat ggaggggcca agctaaaccg gctaaacccg     2700
gggaactaca cagcccggat tcaggccaca tctctctctg ggaatgggtc gtggacagat     2760
cctgtgttct tctatgtcca ggccaaaaca ggatatgaaa acttcatcca tctgatcatc     2820
gctctgcccg tcgctgtcct gttgatcgtg ggagggttgg tgattatgct gtacgtcttc     2880
catagaaaga gaaataacag caggctgggg aatggagtgc tgtatgcctc tgtgaacccg     2940
gagtacttca gcgctgctga tgtgtacgtt cctgatgagt gggaggtggc tcgggagaag     3000
atcaccatga gccgggaact tgggcagggg tcgtttggga tggtctatga aggagttgcc     3060
aagggtgtgg tgaaagatga acctgaaacc agagtggcca ttaaaacagt gaacgaggcc     3120
gcaagcatgc gtgagaggat tgagtttctc aacgaagctt ctgtgatgaa ggagttcaat     3180
tgtcaccatg tggtgcgatt gctgggtgtg gtgtcccaag gccagccaac actggtcatc     3240
atggaactga tgacacgggg cgatctcaaa agttatctcc ggtctctgag gccagaaatg     3300
gagaataatc cagtcctagc acctccaagc ctgagcaaga tgattcagat ggccggagag     3360
attgcagacg gcatggcata cctcaacgcc aataagttcg tccacagaga ccttgctgcc     3420
cggaattgca tggtagccga agatttcaca gtcaaaatcg gagattttgg tatgacgcga     3480
gatatctatg agacagacta ttaccggaaa ggagggaaag ggctgctgcc cgtgcgctgg     3540
atgtctcctg agtccctcaa ggatggagtc ttcaccactt actcggacgt ctggtccttc     3600
ggggtcgtcc tctgggagat cgccacactg gccgagcagc cctaccaggg cttgtccaac     3660
gagcaagtcc ttcgcttcgt catggagggc ggccttctgg acaagccaga caactgtcct     3720
gacatgctgt ttgaactgat gcgcatgtgc tggcagtata accccaagat gaggccttcc     3780
ttcctggaga tcatcagcag catcaaagag gagatggagc ctggcttccg ggaggtctcc     3840
ttctactaca gcgaggagaa caagctgccc gagccggagg agctggacct ggagccagag     3900
aacatggaga gcgtccccct ggacccctcg gcctcctcgt cctccctgcc actgcccgac     3960
agacactcag gacacaaggc cgagaacggc cccggccctg gggtgctggt cctccgcgcc     4020
agcttcgacg agagacagcc ttacgcccac atgaacgggg gccgcaagaa cgagcgggcc     4080
ttgccgctgc cccagtcttc gacctgcgac tacaaagacg atgacgacaa gtgagcggcc     4140
gc                                                                    4142
<210>  24
<211>  4142
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  hIGF1R-G315S-S316T_FLAG
<400>  24
gaattcatga agtctggctc cggaggaggg tccccgacct cgctgtgggg gctcctgttt       60
ctctccgccg cgctctcgct ctggccgacg agtggagaaa tctgcgggcc aggcatcgac      120
atccgcaacg actatcagca gctgaagcgc ctggagaact gcacggtgat cgagggctac      180
ctccacatcc tgctcatctc caaggccgag gactaccgca gctaccgctt ccccaagctc      240
acggtcatta ccgagtactt gctgctgttc cgagtggctg gcctcgagag cctcggagac      300
ctcttcccca acctcacggt catccgcggc tggaaactct tctacaacta cgccctggtc      360
atcttcgaga tgaccaatct caaggatatt gggctttaca acctgaggaa cattactcgg      420
ggggccatca ggattgagaa aaatgctgac ctctgttacc tctccactgt ggactggtcc      480
ctgatcctgg atgcggtgtc caataactac attgtgggga ataagccccc aaaggaatgt      540
ggggacctgt gtccagggac catggaggag aagccgatgt gtgagaagac caccatcaac      600
aatgagtaca actaccgctg ctggaccaca aaccgctgcc agaaaatgtg cccaagcacg      660
tgtgggaagc gggcgtgcac cgagaacaat gagtgctgcc accccgagtg cctgggcagc      720
tgcagcgcgc ctgacaacga cacggcctgt gtagcttgcc gccactacta ctatgccggt      780
gtctgtgtgc ctgcctgccc gcccaacacc tacaggtttg agggctggcg ctgtgtggac      840
cgtgacttct gcgccaacat cctcagcgcc gagagcagcg actccgaggg gtttgtgatc      900
cacgacggcg agtgcatgca ggagtgcccc tcgggcttca tccgcaacag cacccagagc      960
atgtactgca tcccttgtga aggtccttgc ccgaaggtct gtgaggaaga aaagaaaaca     1020
aagaccattg attctgttac ttctgctcag atgctccaag gatgcaccat cttcaagggc     1080
aatttgctca ttaacatccg acgggggaat aacattgctt cagagctgga gaacttcatg     1140
gggctcatcg aggtggtgac gggctacgtg aagatccgcc attctcatgc cttggtctcc     1200
ttgtccttcc taaaaaacct tcgcctcatc ctaggagagg agcagctaga agggaattac     1260
tccttctacg tcctcgacaa ccagaacttg cagcaactgt gggactggga ccaccgcaac     1320
ctgaccatca aagcagggaa aatgtacttt gctttcaatc ccaaattatg tgtttccgaa     1380
atttaccgca tggaggaagt gacggggact aaagggcgcc aaagcaaagg ggacataaac     1440
accaggaaca acggggagag agcctcctgt gaaagtgacg tcctgcattt cacctccacc     1500
accacgtcga agaatcgcat catcataacc tggcaccggt accggccccc tgactacagg     1560
gatctcatca gcttcaccgt ttactacaag gaagcaccct ttaagaatgt cacagagtat     1620
gatgggcagg atgcctgcgg ctccaacagc tggaacatgg tggacgtgga cctcccgccc     1680
aacaaggacg tggagcccgg catcttacta catgggctga agccctggac tcagtacgcc     1740
gtttacgtca aggctgtgac cctcaccatg gtggagaacg accatatccg tggggccaag     1800
agtgagatct tgtacattcg caccaatgct tcagttcctt ccattccctt ggacgttctt     1860
tcagcatcga actcctcttc tcagttaatc gtgaagtgga accctccctc tctgcccaac     1920
ggcaacctga gttactacat tgtgcgctgg cagcggcagc ctcaggacgg ctacctttac     1980
cggcacaatt actgctccaa agacaaaatc cccatcagga agtatgccga cggcaccatc     2040
gacattgagg aggtcacaga gaaccccaag actgaggtgt gtggtgggga gaaagggcct     2100
tgctgcgcct gccccaaaac tgaagccgag aagcaggccg agaaggagga ggctgaatac     2160
cgcaaagtct ttgagaattt cctgcacaac tccatcttcg tgcccagacc tgaaaggaag     2220
cggagagatg tcatgcaagt ggccaacacc accatgtcca gccgaagcag gaacaccacg     2280
gccgcagaca cctacaacat caccgacccg gaagagctgg agacagagta ccctttcttt     2340
gagagcagag tggataacaa ggagagaact gtcatttcta accttcggcc tttcacattg     2400
taccgcatcg atatccacag ctgcaaccac gaggctgaga agctgggctg cagcgcctcc     2460
aacttcgtct ttgcaaggac tatgcccgca gaaggagcag atgacattcc tgggccagtg     2520
acctgggagc caaggcctga aaactccatc tttttaaagt ggccggaacc tgagaatccc     2580
aatggattga ttctaatgta tgaaataaaa tacggatcac aagttgagga tcagcgagaa     2640
tgtgtgtcca gacaggaata caggaagtat ggaggggcca agctaaaccg gctaaacccg     2700
gggaactaca cagcccggat tcaggccaca tctctctctg ggaatgggtc gtggacagat     2760
cctgtgttct tctatgtcca ggccaaaaca ggatatgaaa acttcatcca tctgatcatc     2820
gctctgcccg tcgctgtcct gttgatcgtg ggagggttgg tgattatgct gtacgtcttc     2880
catagaaaga gaaataacag caggctgggg aatggagtgc tgtatgcctc tgtgaacccg     2940
gagtacttca gcgctgctga tgtgtacgtt cctgatgagt gggaggtggc tcgggagaag     3000
atcaccatga gccgggaact tgggcagggg tcgtttggga tggtctatga aggagttgcc     3060
aagggtgtgg tgaaagatga acctgaaacc agagtggcca ttaaaacagt gaacgaggcc     3120
gcaagcatgc gtgagaggat tgagtttctc aacgaagctt ctgtgatgaa ggagttcaat     3180
tgtcaccatg tggtgcgatt gctgggtgtg gtgtcccaag gccagccaac actggtcatc     3240
atggaactga tgacacgggg cgatctcaaa agttatctcc ggtctctgag gccagaaatg     3300
gagaataatc cagtcctagc acctccaagc ctgagcaaga tgattcagat ggccggagag     3360
attgcagacg gcatggcata cctcaacgcc aataagttcg tccacagaga ccttgctgcc     3420
cggaattgca tggtagccga agatttcaca gtcaaaatcg gagattttgg tatgacgcga     3480
gatatctatg agacagacta ttaccggaaa ggagggaaag ggctgctgcc cgtgcgctgg     3540
atgtctcctg agtccctcaa ggatggagtc ttcaccactt actcggacgt ctggtccttc     3600
ggggtcgtcc tctgggagat cgccacactg gccgagcagc cctaccaggg cttgtccaac     3660
gagcaagtcc ttcgcttcgt catggagggc ggccttctgg acaagccaga caactgtcct     3720
gacatgctgt ttgaactgat gcgcatgtgc tggcagtata accccaagat gaggccttcc     3780
ttcctggaga tcatcagcag catcaaagag gagatggagc ctggcttccg ggaggtctcc     3840
ttctactaca gcgaggagaa caagctgccc gagccggagg agctggacct ggagccagag     3900
aacatggaga gcgtccccct ggacccctcg gcctcctcgt cctccctgcc actgcccgac     3960
agacactcag gacacaaggc cgagaacggc cccggccctg gggtgctggt cctccgcgcc     4020
agcttcgacg agagacagcc ttacgcccac atgaacgggg gccgcaagaa cgagcgggcc     4080
ttgccgctgc cccagtcttc gacctgcgac tacaaagacg atgacgacaa gtgagcggcc     4140
gc                                                                    4142
<---