СОЕДИНЕНИЯ, КОМПОЗИЦИИ, СПОСОБЫ И НАБОРЫ, СВЯЗАННЫЕ С УДЛИНЕНИЕМ ТЕЛОМЕР
COMPOUNDS, COMPOSITIONS, METHODS AND SETS RELATED TO TELOMERE ELONGATION

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННУЮ ЗАЯВКУ
[0001] Настоящая заявка заявляет приоритет предварительной заявки на патент США №61/768047, поданной 22 февраля 2013 г., содержание которой в полном объеме включено в данный документ посредством ссылки.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0002] Теломеры содержат повторяющиеся последовательности ДНК на концах линейных хромосом, которые в случае, если они имеют достаточную длину, делают возможным образование каждым концом хромосомы петли, защищающей концы от выполнения функции разрывов двухцепочечной или одноцепочечной ДНК. Artandi & DePinho (2010) Carcinogenesis 31:9-18. Со временем теломеры укорачиваются частично вследствие окислительного повреждения и неполной репликации ДНК, что в итоге приводит к критическому укорочению теломер и неспособности образовывать защитные петли, обнажению концов хромосом, слиянию между хромосомами, ответам на повреждение ДНК и клеточному старению, апоптозу или злокачественным образованиям. O'Sullivan and Karlseder (2010) Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11:171-181; Calado el al. (2012) Leukemia 26:700-707; Artandi and DePinho (2010) Carcinogenesis 31:9-18.
[0003] Ферментативный комплекс теломераза удлиняет теломеры и содержит два основных компонента: обратную транскриптазу теломеразы (TERT) и РНК-компонент, известный как РНК-компонент теломеразы (TERC). Другие компоненты комплекса теломеразы включают белки ТСАВ1, Dyskerin, Garl, Nhp2, NoplO, и RHAU. Brouilette el al. (2003) Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology 23:842-846. TERT представляет собой ограничивающий компонент комплекса теломеразы и, следовательно, лечение, включающее повышение уровня TERT, может повышать активность теломеразы. Активность теломеразы, как правило, определяют, используя протокол амплификации теломерных повторов (TRAP), в котором количественно оценивают способность клеточного лизата или другого образца удлинять синтетическую теломероподобную последовательность ДНК.
[0004] Как и ожидается в связи с важностью сохранения длины теломер для предотвращения клеточного старения и апоптоза и возникающей в результате клеточной дисфункции, генетические мутации TERT и TERC связаны с фатальными наследственными заболеваниями, связанными с нарушением сохранения теломер, включая формы идиопатического легочного фиброза, врожденного дискератоза и апластической анемии. Эффект преждевременного клеточного старения и апоптоза вследствие укорочения теломер при этих заболеваниях сам по себе является пагубным и может усугубляться повышенным риском появления рака. Artandi and DePinho (2010) Carcinogenesis 31:9-18; Alter el al. (2009) Blood 113:6549-6557. Кроме многочисленных коррелирующих между собой данных, связывающих наличие коротких теломер с раком (Wentzensen et al. (2011) Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 20:1238-1250), исследования апластической анемии предоставляют первые прямые свидетельства того, что критическое укорочение теломер и обусловленная этим хромосомная нестабильность приводят к предрасположенности клеток к злокачественному перерождению у людей (Calado et al. (2012) Leukemia 26:700-707). Существуют свидетельства, что короткие теломеры определяют развитие фатальной или нефатальной мышечной дистрофии (Sacco et al. (2010) Cell 143:1059-1071), а удлинение теломер предотвращает старение эндотелиальных клеток (Matsushita et al. (2001) Cire. Res. 89:793-798), которое связано с атеросклерозом, повышенным кровяным давлением и заболеванием сердца (Perez-Rivero et al. (2006) Circulation 114:309-317). Кроме роли в этих и других заболеваниях, короткие теломеры также ограничивают амплификацию клеток для клеточной терапии и применений в биоинженерии. Mohsin et al. (2012) Journal of the American College of Cardiology doi: 10.1016/j.jacc.2012.04.0474.
[0005] Полученный из натурального продукта активатор теломераз, ТА-65, продавался на коммерческой основе в качестве нутрицевтика компанией Т.А. Sciences, Inc. Harley et al. (2011) Rejuvenation Research 14:45-56. Это соединение предположительно содержит эндогенный ген hTERT, тем самым активируя экспрессию нативной теломеразы. При этом непонятно, как этот вид лечения преодолевает проблему нормальной регуляции активности нативной теломеразы.
[0006] Человеческие клетки со слабой или отсутствующей теломеразной активностью трансфицировали векторами, кодирующими человеческую TERT (hTERT). Смотрите, например, Bodnar el al. (1998) Science 279:349-352. Было обнаружено, что трансфицированные клетки экспрессируют теломеразу, демонстрируют удлинение теломер, активно делятся и демонстрируют сниженное старение по сравнению с клетками с отсутствием теломеразы, но геномная модификация, являющаяся следствием этого лечения, повышает риск и ограничивает применение данного подхода.
[0007] Ограниченная способность к репликации является одной из основополагающих характеристик большинства нормальных клеток. Конечной точкой этого ограниченного репликативного процесса является старение - законсервированное состояние, в котором клетка остается жизнеспособной, но более не делится. Старые клетки часто характеризуются измененным профилем генной экспрессии, измененной морфологией и сниженной способностью или неспособностью выполнять свои нормальные функции.
[0008] Укорочение теломер играет непосредственную роль в клеточном старении в тканях животных во время старения. Кроме того, накапливаются свидетельства взаимосвязи коротких теломер и различных заболеваний, включая те, которые были описаны выше. Возможность предотвращения заболевания посредством удлинения теломер обуславливает необходимость в безопасных и эффективных видах лечения, направленных на удлинение теломер в клетках животных in vivo и/или in vitro. Кроме того, существует потребность в безопасном и быстром удлинении теломер в клетках для применения в клеточной терапии, клеточной и тканевой инженерии и регенеративной медицине.
[0009] В то же время, однако, существует опасность конститутивной активации теломеразной активности. Действительно, для применений в клеточной терапии первостепенное значение имеет предотвращение риска иммортализации клеток. В связи с этим в целях безопасности преимущественной может являться скорее временная, чем конститутивная теломеразная активность, в особенности, если повышенная теломеразная активность является не только краткосрочной, но также удлиняет теломеры достаточно быстро для того, чтобы отсутствовала необходимость постоянно повторять лечение. Существующие в настоящее время способы удлинения теломер включают вирусную доставку TERT под управлением индуцибельного промотора, доставку TERT с применением векторов на основе аденовируса и аденоассоциированного вируса и применение низкомолекулярных активаторов теломеразы. Эти способы связаны с риском инсерционного мутагенеза, непрерывного повышения теломеразной активности или с ними обоими.
[0010] Таким образом, существует сильная мотивация для разработки терапии, которая безопасно удлиняет теломеры, для потенциального предотвращения, замедления, облегчения или лечения этих и других патологических состояний и заболеваний, для осуществления того же в отношении постепенного ухудшения физической формы и функции, а также умственной функции, которое сопутствует возрастному старению, и для возможности осуществления терапии и регенеративной медицины. Такая терапия была бы очень востребована для омоложения всех животных, включая людей, домашних животных, сельскохозяйственных животных, животных из зоопарков и животных, которые относятся к исчезающим видам.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0011] Настоящее изобретение направлено на эти и другие проблемы и предлагает альтернативный вариант, преимуществом которого является кратковременное повышение теломеразной активности в комбинации с быстрым удлинением теломер, вследствие чего снимается необходимость в непрерывном или даже часто повторяемом лечении и отсутствует риск, связанный с геномным инсерционным мутагенезом. В частности, в данном изобретении предложены композиции, способы и наборы для удлинения теломер путем временной трансляции экзогенной теломеразной активности в клетке.
[0012] В одном аспекте в данном изобретении предложены соединения для удлинения теломер, содержащие: синтетическую рибонуклеиновую кислоту, содержащую по меньшей мере один модифицированный нуклеозид и кодирующую обратную транскриптазу теломеразы; при этом в клетке, обрабатываемой указанным соединением, происходит удлинение теломер.
[0013] В некоторых вариантах реализации изобретения обратная транскриптаза теломеразы представляет собой обратную транскриптазу теломеразы млекопитающего, птицы, рептилии или рыбы или вариант, который сохраняет теломеразную каталитическую активность, а в конкретном варианте реализации изобретения она представляет собой обратную транскриптазу теломеразы человека.
[0014] В некоторых вариантах реализации изобретения рибонуклеиновая кислота содержит 5'-кэп, 5'-нетранслируемую область, З'-нетранслируемую область и поли(А)-хвост. 5'-кэп может быть неиммуногенным и 5'-кэп может быть обработан фосфатазой.
[0015] В предпочтительных вариантах реализации изобретения поли(А)-хвост повышает стабильность рибонуклеиновой кислоты.
[0016] В других предпочтительных вариантах реализации изобретения 5'-нетранслируемая область или 3'-нетранслируемая область содержит последовательность из стабильной мРНК или эффективно транслируемой мРНК, или они обе содержат последовательность из стабильной мРНК или эффективно транслируемой мРНК.
[0017] В других предпочтительных вариантах реализации изобретения 5'-кэп, 3'-нетранслируемая область или 3'-нетранслируемая область стабилизирует рибонуклеиновую кислоту, повышает скорость трансляции рибонуклеиновой кислоты или модулирует иммуногенность рибонуклеиновой кислоты.
[0018] В наиболее предпочтительных вариантах реализации изобретения по меньшей мере один нуклеозид модулирует иммуногенность рибонуклеиновой кислоты.
[0019] В некоторых вариантах реализации изобретения рибонуклеиновая кислота представляет собой очищенную синтетическую рибонуклеиновую кислоту.
[0020] В предпочтительных вариантах реализации изобретения синтетическая рибонуклеиновая кислота очищена с целью удаления иммуногенных компонентов.
[0021] В конкретных вариантах реализации изобретения рибонуклеиновая кислота кодирует обратную транскриптазу теломеразы человека, кошки, собаки, мыши, лошади, коровы, овцы, свиньи, африканского слона, курицы, крысы, данио, японской медаки или шимпанзе или полипептид, обладающий по меньшей мере 95% идентичности последовательности с обратной транскриптазой теломеразы.
[0022] В другом аспекте в данном изобретении предложены композиции, содержащие соединение согласно изобретению и РНК-компонент теломеразы, который, в некоторых вариантах реализации изобретения представляет собой РНК-компонент теломеразы млекопитающего, птицы, рептилии или рыбы. В более конкретных вариантах реализации изобретения РНК-компонент теломеразы представляет собой РНК-компонент теломеразы человека. В некоторых вариантах реализации изобретения соединения и композиции согласно изобретению дополнительно содержат носитель для доставки.
[0023] В некоторых вариантах реализации изобретения носитель для доставки представляет собой экзосому, липидную наночастицу, полимерную наночастицу, природную или искусственную липопротеиновую частицу, катионный липид, белок, комплекс белок-нуклеиновая кислота, липосому, виросому или полимер. В конкретных вариантах реализации изобретения носитель для доставки представляет собой катионный липид.
[0024] В предпочтительных вариантах реализации изобретения носитель для доставки является неиммуногенным. В других предпочтительных вариантах реализации изобретения носитель для доставки является частично иммуногенным. В частности в некоторых обстоятельствах желательно, чтобы носитель сохранял некоторую степень иммуногенности.
[0025] В соответствии с другим аспектом данного изобретения предложены способы удлинения теломер, включающие этап введения любого из раскрытых соединений или композиций в клетку животного, при этом происходит удлинение по меньшей мере одной теломеры в клетке.
[0026] В некоторых вариантах реализации способов изобретения клетка содержит по меньшей мере одну укороченную теломеру перед этапом введения.
[0027] В некоторых вариантах реализации изобретения клетка получена от или принадлежит субъекту, страдающему от или подверженному риску развития возрастного заболевания, возрастного патологического состояния или возрастного ухудшения функциональности или внешнего вида.
[0028] В некоторых вариантах реализации изобретения клетка получена от или принадлежит субъекту, страдающему от или подверженному риску развития рака, заболевания сердца, инсульта, диабета, диабетических язв, болезни Альцгеймера, остеопороза, ухудшения физических данных или внешнего вида, физической травмы или хронического физического стресса, физиологической травмы или хронического физиологического стресса, снижения иммунной функции, старения иммунной системы или макулярной дегенерации.
[0029] В некоторых вариантах реализации изобретения клетка представляет собой соматическую клетку эндодермальной, мезодермальной или эктодермальной линии дифференцировки, или зародышевой линии, или эмбриональную клетку.
[0030] В некоторых вариантах реализации изобретения клетка представляет собой индуцированную плюрипотентную стволовую клетку или клетку, применяемую для получения индуцированной плюрипотентной стволовой клетки.
[0031] В некоторых вариантах реализации изобретения клетка представляет собой трансдифференцированную клетку или клетку, применяемую для получения трансдифференцированной клетки.
[0032] В некоторых вариантах реализации изобретения клетка представляет собой выделенную клетку, а этап введения длится не более 48 часов. В других вариантах реализации изобретения клетка представляет собой выделенную клетку, а этап введения длится по меньшей мере 2 часа.
[0033] В некоторых вариантах реализации изобретения клетка представляет собой выделенную клетку, а этап введения осуществляют не более четырех раз. В других вариантах реализации изобретения клетка представляет собой выделенную клетку, а этап введения осуществляют по меньшей мере два раза.
[0034] В некоторых вариантах реализации изобретения клетка представляет собой выделенную клетку, а способ дополнительно включает этап измерения теломеразной активности в клетке. В конкретных вариантах реализации изобретения этап введения приводит к повышению теломеразной активности в клетке, а в более конкретных вариантах реализации изобретения теломеразная активность временно повышается по меньшей мере на 5%. В других конкретных вариантах реализации изобретения время полужизни повышенной теломеразной активности составляет не более 48 часов.
[0035] В некоторых вариантах реализации изобретения способ дополнительно включает этап измерения длины теломер в клетке. В конкретных вариантах реализации изобретения средняя длина теломер увеличивается по меньшей мере на 0,1 т.п.н.
[0036] В некоторых вариантах реализации изобретения клетка представляет собой выделенную клетку, а способ дополнительно включает этап измерения потенциала удвоения популяции в клетке. В конкретных вариантах реализации изобретения потенциал удвоения популяции увеличивается в некоторых случаях по меньшей мере на одно удвоение популяции.
[0037] В предпочтительных вариантах реализации изобретения клетка получена от млекопитающего субъекта, а в более предпочтительных вариантах реализации изобретения клетка получена от субъекта-человека.
[0038] В некоторых вариантах реализации изобретения клетка представляет собой выделенную клетку, а в других вариантах реализации изобретения клетка не является выделенной клеткой. В некоторых вариантах реализации изобретения этап введения включает электропорацию. В некоторых вариантах реализации изобретения происходит временное удлинение по меньшей мере одной теломеры в клетке.
[0039] В соответствии с другим аспектом изобретения предложены наборы для удлинения теломер в клетке животного, при этом наборы содержат любое из вышеуказанных соединений или композиций и инструкции по применению соединения или композиции для удлинения теломер.
[0040] В некоторых вариантах реализации изобретения наборы дополнительно содержат упаковочные материалы. В некоторых конкретных вариантах реализации изобретения упаковочные материалы являются воздухонепроницаемыми. В некоторых конкретных вариантах реализации изобретения упаковочные материалы включают контейнер из металлической фольги.
[0041] В некоторых вариантах реализации изобретения наборы дополнительно содержат осушитель, культуральную среду или ингибитор РНКазы.
[0042] В некоторых вариантах реализации изобретения композиция является стерильной. В некоторых вариантах реализации изобретения набор содержит соединение согласно изобретению, инструкции по применению композиции для удлинения теломер и РНК-компонент теломеразы, носитель для доставки или как РНК-компонент теломеразы, так и носитель для доставки.
[0043] В другом аспекте в изобретении предложены способы лечения, включающие введение соединения или композиции согласно изобретению субъекту-животному, который нуждается или для которого может оказаться полезным удлинение теломер. В некоторых вариантах реализации изобретения субъект-животное страдает от или подвержено риску развития заболевания или патологического состояния, обусловленного укорочением теломер.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
[0044] Фигура 1. Трансфекция клеток MRC-5 модифицированной рибонуклеиновой кислотой (модРНК), кодирующей TERT, но не каталитически неактивную TERT (CI TERT), временно повышает теломеразную активность, (а) Схематическое изображение конструкта модРНК и подхода, применяемого в этих исследованиях. Конструкт модРНК кодирует человеческую TERT и содержит 5' и 3' НТО, которые придают стабильность, например, из мРНК β-глобина. CI TERT содержит мутацию одной п.н. (b) Трансфекция модРНК TERT или CI TERT приводит к повышению уровней экзогенной мРНК TERT в обрабатываемых клетках в отличие от необрабатываемых контрольных клеток, которые превышают уровни эндогенной РНК TERT. (с) Уровни белка, распознаваемого анти-TERT антителом, значительно выше в клетках MRC-5 через 24 часа после трансфекции модРНК, кодирующей TERT или CI TERT (Ρ<0,03 или 0,01, соответственно), чем в случае необработанных или обработанных только носителем клетках, (d) Обработка модРНК, кодирующей TERT, но не CI TERT, приводит к временному повышению теломеразной активности в клетках MRC-5.
[0045] Фигура 2. Применение экзосом в качестве носителя для доставки для терапевтических средств на основе рибонуклеиновой кислоты.
[0046] Фигура 3. Графическая иллюстрация применения множественной быстрой и временной теломеразной обработки для удлинения теломер в клетке.
[0047] Фигура 4. Обработка модРНК TERT приводит к быстрому удлинению теломер в клетках MRC-5. (а) Обработка и схема анализа, применяемая в этих исследованиях. Обработка длилась 5 часов. (b) Иллюстрация саузерн-блоттинга TRF (вставка) и его количественная оценка, в которой хемолюминесцентный сигнал нормировали, чтобы учесть количество зондов на единицу длины теломеры, после чего строили график зависимости средней интенсивности каждого элементного ряда в каждой гелевой дорожке от длины теломеры (n=3 биологических реплики для каждой обработки), (с) Распределение по средней длине теломер на Фигуре 4b, указывающее на то, что теломеры в клетках, обработанных модРНК TERT, значительно (Р<0,014) длиннее, чем в необработанных или обработанных одним носителем клетках, (d) Содержание теломер, имеющих длину, превышающую произвольный порог (4,2 т.п.н.), выше в клетках, обработанных модРНК TERT, чем в необработанных или обработанных одним носителем клетках, (е) Типовая флуоресцентная микрофотография метафазной пластинки фибробластов MRC-5, применяемой в количественной in situ гибридизации (Q-FISH) для сравнения длин теломер, иллюстрирующая теломерный зонд (светлые пятнистые участки) и ДНК (однородные затененные области), (f) Количественный анализ Q-FISH измерений длины теломер в обработанных и контрольных клетках (n=15 клеток для каждой из двух биологических реплик для каждой), иллюстрирующий быстрое удлинение теломер в обработанных клетках. (Следует отметить, что TRF позволяет определять длину как теломерной, так и субтеломерной ДНК, в то время как Q-FISH позволяет оценить только теломерную ДНК, что объясняет разницу в результатах Q-FISH и TRF). (g) (i) Стандартная кривая, отображающая взаимосвязь между кумулятивным удвоением популяции клеток MRC-5 после поступления от поставщика и длиной теломер, измеренной при помощи Q-FISH путем количественной оценки средней общей флуоресценции теломерных зондов на клетку, которая прямо пропорциональна длине теломер. (g) (ii) Количественная оценка средней длины теломер на клетку в клетках MRC-5, три раза обработанных модРНК TERT через 48-часовые интервалы, согласно данным Q-FISH.
[0048] Фигура 5. Кратковременная обработка модРНК TERT дозозависимым образом повышает способность к репликации, но не приводит к иммортализации клеток MRC-5. (а) Кривые роста клеток, обработанных модРНК TERT один раз, дважды или трижды или трижды с последующей дополнительной обработкой через 8 недель после первой обработки. Контрольные образцы или не обрабатывали или обрабатывали только носителем или CI TERT четырежды, (n=3 для каждой обработки). (b) Кривые роста клеток, обработанных модРНК TERT и РНК TERC в молярном соотношении 1:5 (n=3). (с) Обработка один раз, дважды или трижды модРНК TERT дозозависимым образом обеспечивает дополнительную способность к репликации клеток MRC-5 по сравнению с необработанными клетками. Постепенное повышение пролиферативного потенциала, обеспечиваемого второй и третьей обработками, проводимыми через 48 часов после первой обработки, не настолько велико, как повышение пролиферативного потенциала, обеспечиваемого первой обработкой; при этом дополнительная четвертая обработка, проводимая через несколько недель после первых трех обработок, обеспечивает такой же дополнительный пролиферативный потенциал, как и первая обработка, что свидетельствует о том, что время обработки важно для оптимизации величины пролиферативного потенциала, обеспечиваемого обработкой. Обработка трижды совместно модРНК TERT и модРНК TERC в молярном соотношении 1:5 обеспечивает более высокий пролиферативный потенциал, чем обработка одной модРНК TERT. Обработка одним носителем или модРНК CI TERT не обеспечивает дополнительный пролиферативный потенциал, (n=3).
[0049] Фигура 6. Высокая эффективность трансфекции клеток MRC-5, обработанных модРНК, кодирующей ядерный ЗФБ (яЗФБ). (а) Процентная доля клеток с флуоресценцией, превышающей на более чем два СО среднюю величину для необработанных клеток (n=10000). (b) Средняя флуоресценция (n=10000). (с) Флуоресцентная микрофотография яЗФБ в трансфицированных клетках MRC-5 с контрокрашиванием DAPI.
[0050] Фигура 7. График доза-ответ теломеразной активности.
[0051] Фигура 8. Обработка модРНК TERT замедляет клеточный отек в клетках MRC-5. (а) Клетки MRC-5 из ранних пассажей (слева) имеют в несколько раз меньшую площадь, чем клетки в более поздних пассажах (справа), как проиллюстрировано на типовых микрофотографиях необработанных клеток PD 2 и PD 53, как видно на гемоцитометре. (b) Клетки MRC-5 из раннего (PD 2) и среднего (PD 35) пассажа демонстрировали слабый клеточный отек с диаметром, превышающим 25 мкм согласно визуальному наблюдению на гемоцитометре (где одна небольшая клетка имеет длину 50 мкм), в то время как существенно большая фракция клеток из позднего пассажа (PD 53) характеризовалась клеточным отеком. Клетки PD 53, которые были обработаны модРНК TERT, в отличие от тех, которые были обработаны модРНК CI TERT, в PD 40 демонстрировали слабый клеточный отек.
[0052] Фигура 9. Кривая роста клеток микрососудистого эндотелия человека (HMDEC).
[0053] Фигура 10. Влияние обработки модРНК TERT на количество клеток HMDEC. СО: контрольная обработка; hTERT-CI: каталитически неактивная hTERT; hTERT-WT: hTERT дикого типа.
[0054] Фигура 11. Влияние обработки модРНК TERT на рост HMDEC. UT: необработанные; СО: контрольная обработка; CI: каталитически неактивная hTERT; WT: hTERT дикого типа.
[0055] Фигура 12. Влияние обработки модРНК TERT на старение HMDEC. NT: необработанные; hTERT-CI: каталитически неактивная hTERT; hTERT-WT: hTERT дикого типа.
[0056] Фигура 13. Повышение уровня белка TERT и теломеразной активности после доставки модифицированной мРНК TERT. (А) Схематическое изображение модифицированной мРНК, содержащей кодирующую последовательность полноразмерной функциональной формы TERT или каталитически неактивной (CI) формы TERT, фланкируемой нетранслируемыми областями (НТО) НВВ и 151-нуклеотидным поли(А)-хвостом, синтезированной с применением модифицированных нуклеотидов псевдоуридина и 5-метилцитидина. (В) Эффективность трансфекции миобластов (n=2000), обработанных 0,8 мкг/мл модифицированной мРНК, кодирующей ЗФБ, определенная методом проточной цитометрии, через 24 ч после трансфекции превышала 95% (дополнительные графики на Фигуре 16А). (С) Общие уровни белка TERT определяли методом количественного вестерн-блоттинга (панель С, слева; Фигура 17). Количественная оценка уровней белка TERT через 24 часа после трансфекции 1 мкг/мл мРНК TERT или CI TERT (n=3). Количественную оценку белка TERT в ответ на разные дозы мРНК проводили на одноклеточном уровне методом проточной цитометрии (n=10000) (панель С, справа). *Р<0,05, **Р<0,01 по сравнению с необработанными клетками. «Усы» представляют s.e.m. (D) Выявление теломеразной активности в фибробластах и миобластах, трансфицированных 1 мкг/мл модифицированной мРНК TERT, осуществляемое с применением протокола амплификации теломерных повторов (TRAP). Стрелкой указаны внутренние контрольные образцы для определения эффективности ПЦР.
[0057] Фигура 14. Увеличение длины теломер и пролиферативного потенциала после доставки модифицированной мРНК TERT (модРНК). (А) Средняя длина теломер в необработанных фибробластах со временем уменьшалась согласно данным ММкПЦР и SpectraCell (коэффициент корреляции 0,97, Ρ<0,001). Эксперимент повторяли дважды с четырьмя техническими репликами в каждом. (В) Средняя длина теломер в фибробластах, трансфицированных 1 мкг/мл модРНК TERT, мРНК CI TERT или одним носителем один, два или три раза подряд с 48-часовым интервалом. Эксперимент повторяли дважды с четырьмя техническими репликами в каждом. **Р<0,01, ***Р<0,001 по сравнению с клетками, обработанными одним носителем. (С) Средняя длина теломер в миобластах, обработанных аналогично (В). Эксперимент повторяли дважды с четырьмя техническими репликами в каждом. ***Р<0,001 по сравнению с клетками, обработанными одним носителем. (D) Кривые роста фибробластов, обработанных аналогично (В), где зеленые стрелки указывают на время обработки. Кривые роста получали дважды, при этом каждую популяцию культивировали в трех параллелях. Способность к репликации возрастала дозозависимым образом (правая панель). *Р<0,05, **Р<0,01 по сравнению с клетками, обработанными одним носителем. (Е) Потенциал пролиферации миобластов, обработанных аналогично (В) (зеленые стрелки). Кривые роста получали дважды, при этом каждую популяцию культивировали в трех параллелях. Все данные представлены в виде среднего ± s.e.m.
[0058] Фигура 15. Временное снижение уровней ассоциированных со старением маркеров после доставки модифицированной мРНК TERT. (А) Количественная оценка β-gal-экспрессирующих фибробластов после трансфекции модифицированной мРНК TERT три раза подряд с 48-часовым интервалом (зеленые стрелки). Контрольные клетки, содержащие необработанные, обработанные только носителем и мРНК CI TERT популяции, прекращали размножаться в PD 53, а обработанные модРНК TER Τ популяции прекращали размножаться в PD 80. Каждый эксперимент проводили дважды с>50 клеток на образец, подсчитываемых вручную. Типовые изображения иллюстрируют β-гал-окрашенные обработанные модРНК TERT фибробласты в PD 53 (вверху) и PD 80 (внизу). Длина масштабной метки составляет 200 мкм. (В) Количественная оценка экспрессии β-гал в миобластах, обработанных аналогично (А). Контрольные образцы такие же, как в (А). Контрольные и обработанные модРНК TERT популяции прекращали размножаться в PD 8 и PD 11, соответственно. Каждый эксперимент проводили дважды с>50 клеток на образец, подсчитываемых вручную. Типовые изображения иллюстрируют миобласты в PD 2 (вверху) и обработанные модРНК TERT миобласты в PD 11 (внизу). (С) Количественная оценка увеличенных клеток, ассоциируемых с репликативным старением, в фибробластах, трижды трансфицированных модифицированной мРНК TERT. Популяционные плато такие же, как в (А). Контрольные образцы представляют собой образцы, обработанные только носителем и мРНК CI TERT. Каждый эксперимент проводили дважды с>50 клеток на образец, подсчитываемых вручную. Типовые изображения иллюстрируют необработанные фибробласты в PD 2 (вверху) и PD 53 (внизу). Все данные представлены в виде среднего ± s.e.m. Длина масштабной метки составляет 200 мкм.
[0059] Фигура 16. Высокоэффективная трансфекция модифицированной мРНК человеческих миобластов. (А,В) Количественная оценка ЗФБ флуоресцентных миобластов (n=2000), трансфицированных 0,1-0,8 мкг/мл модифицированной мРНК, кодирующей ЗФБ, согласно данным проточной цитометрии через 24 ч после начала обработки. (С) Средняя флуоресценция трансфицированных модифицированной мРНК ЗФБ миобластов в ответ на увеличение дозы. (D) Количественная оценка экзогенной модРНК TERT в фибробластах через 24 ч после трансфекции 1 мкг/мл модРНК TERT или CI TERT согласно данным РВ-кПЦР. Соотношение между TERT и CI TERT рассчитывали при помощи метода Pfaffl, используя RPL37A и GAPDH в качестве эталонных генов (n=3). (Е) Количественная оценка эндогенной модРНК TERT в фибробластах через 24 ч после трансфекции 1 мкг/мл модРНК TERT или CI TERT согласно данным кПЦР, рассчитанная как в (D). Все данные представлены в виде среднего ± s.e.m.
[0060] Фигура 17. Экспрессия TERT после доставки модифицированной мРНК. Экспрессию белка TERT в фибробластах, собранных через 24 ч после начала обработки 1 мкг/мл модРНК TERT, определяли при помощи мультиплексного инфракрасного вестерн-блоттинга. Для получения стандартной кривой использовали серийное разведение общего белка, чтобы сравнивать относительные количества белка TERT с контрольными образцами. Специфичность применяемого антитела к TERT была всестороннее исследована (Wu, 2006).
[0061] Фигура 18. TRAP-гель, иллюстрирующий повышенную теломеразную активность в мононуклеарных клетках, электропорированных модРНК TERT, при этом использовали следующие параметры: 200 В, 25 мкФ, 1000 Ом, в 1 мм кювете с 10 мкл клеточной суспензии и модРНК TERT. Термообработанная линия образцов содержит праймерный димерный артефакт метода, на что указывает интенсивная полоса на четвертой ступеньке лестницы.
[0062] Фигура 19. Микроскопические изображения мононуклеарных клеток, флуоресцирующих после электропорации модРНК, кодирующей ЗФБ.
[0063] Фигура 20. Электропорация модРНК ЗФБ в человеческие лейкоциты (мононуклеарные клетки) приводит к высокой эффективности трансфекции.
[0064] Фигура 21. Изображение геля из анализа TRAP, иллюстрирующее повышение теломеразной активности в фибробластах, электропорированных возрастающими дозами модРНК TERT.
[0065] Фигура 22. Флуоресцентные микрофотографии, иллюстрирующие, что CD8+ Т-клетки, активированные CD3/CD28 и электропорированные модРНК ЗФБ экспрессируют активность ЗФБ. Темные точки представляют собой CD3/CD28-покрытые гранулы.
[0066] Фигура 23. Электропорация человеческих кератиноцитов модРНК TERT приводит к экспрессии теломеразной активности.
[0067] Фигура 24. Экспрессия модРНК люциферазы после in vivo доставки грызунам.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0068] Теломеры представляют собой последовательности ДНК на концах хромосом, которые защищают концы, но которые со временем укорачиваются. Критическое укорочение теломер может привести к прекращению функционирования клеток должным образом или к их гибели. Критическое укорочение теломер также может привести к слиянию хромосом, что в свою очередь может привести к раку. Даже в отсутствие точно диагностированного заболевания короткие теломеры связаны с постепенным ухудшением умственных и физических функций и с возрастными проявлениями старения.
[0069] В то же время укорочение теломер может играть защитную роль в случае рака, например, в ситуации, когда в клетке появляется мутация, которая заставляет ее пролиферировать быстрее, чем нормальные клетки. В такой ситуации укорочение теломер предотвращает неограниченную пролиферацию клетки и развитие рака. Следовательно, постоянное удлинением теломер не обязательно является преимущественным.
[0070] У млекопитающих теломеры содержат тандемные повторы последовательности TTAGGG, а у других животных, таких как птицы, рептилии и рыбы повторяемая последовательность варьируется. У всех этих видов животных теломеры являются двухцепочечными и и содержат большое количество тысяч пар оснований (т.п.н.). Средняя длина теломер отличается для разных видов, как показано в Таблице 1.
[0071] У людей исходная длина теломер до рождения составляет 15-20 т.п.н., а уже при рождении их длина составляет 12-15 т.п.н. Теломеры быстро укорачиваются в детском возрасте, а затем, во взрослом возрасте, - в среднем на около 0-100 п. н. в год, при этом скорость зависит от типа клеток, подверженности физиологическому и окислительному стрессу и других факторов.
[0072] Теломеры являются частью теломерного комплекса, который защищает концы хромосом. Теломерный комплекс также содержит группу белков с общим названием «шелтерины». Белки теломерного комплекса включают РОТ1, ТРР1, ATM, DAT, TRFT, TRF2, Rapl, Rifl, TIN2, NBS, MRE17 и RAD50, а также их гомологи, относящиеся к разным видам млекопитающих. Podlevsky and Chen (2012) Mutat. Res. 730:3-11. У многих видов окончание теломеры находится в одноцепочечном «липком» 3'-конце, который встраивается в двухцепочечную область в ассоциации с белками теломерного комплекса, образуя петлю в пределах теломерного комплекса.
[0073] Теломеры со временем укорачиваются вследствие окислительного повреждения и сестринского хроматидного обмена, а также вследствие проблем репликации концов, когда во время митоза концы хромосом дублируются не полностью. При критическом укорочении теломер теломерный комплекс больше не способен защищать концы и хромосома становится «некэпированной». Некэпированные концы хромосом могут стать причиной слияния между хромосомами, которое может привести к раку. O'Sullivan and Karlseder (2010) Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11:171-181; Calado et al. (2012) Leukemia 26:700-707; Artandi and DePinho Carcinogenesis 31:9-18. Также отсутствие кэпирования может привести к распознаванию концов хромосом как поврежденной ДНК, что приводит к активации ответов на повреждение ДНК и стимуляции клеточного апоптоза или старения. Старение представляет собой законсервированное состояние, в котором клетка сохраняет жизнеспособность, но больше не делится, при этом старые клетки, как правило, прекращают выполнять свои полезные функции должным образом или полностью. Таким образом, укорочение теломер приводит к тканевой дисфункции, утрате физических способностей и внешнего молодого вида, утрате умственных способностей и заболеваниям частично вследствие накопления старых клеток, а частично вследствие потери клеток в результате апоптоза. Действительно, у старых людей с короткими теломерами приблизительно на 200-750% больше вероятность развития инфаркта миокарда (200%) (von Zglinicki et al. (2000) Laboratory Investigation; a Journal of Technical Methods and Pathology 80:1739-1747), сосудистой деменции (200%) (Testa et al. (2011) Diabetic Medicine 28:1388-1394), диабета с осложнениями (400%) (Blackburn et al. (2010) Cancer Prevention Research 3:394-402, рака (Stem and Bryan (2008) Cytogenetic and Genome Research 122:243-254), инсульта, болезни Альцгеймера, инфекции (750%), идиопатического легочного фиброза и других заболеваний. У людей с наличием коротких теломер в одной ткани существует большая вероятность того, что короткие теломеры присутствуют и в большинстве других тканей, и, следовательно, короткие теломеры связаны с риском развития у индивида многих заболеваний. Takubo et al. (2010) Geriatr Gerontol Int. 10 Suppl 1:S197-206; doi:10.1111/j. 1447-0594.2010.00605.X. Короткие теломеры также ограничивают способность клеток к репликации, что в свою очередь ограничивает возможности клеточной терапии и регенеративной терапии. И наоборот, увеличение длины теломер у мышей с короткими теломерами при помощи методов генетической инженерии на основе вирусов приводит к омоложению мышей по нескольким параметрам, включая толщину и эластичность кожи, функцию печени и нюх. Jaskelioff (2011) Nature 469:102-107.
[0074] Так как теломераза удлиняет теломеры, целесообразным подходом к удлинению теломер является повышение уровня теломеразной активности в клетках. Сообщалось о большом количестве агентов и условий, которые повышают теломеразную активность в клетках, включая агенты и условия, перечисленные в Таблице 2.
[0075] Примеры видов лечения, приведенные в Таблице 2, однако, не исключают появления нежелательных явлений. Например, лечение факторами роста, гормонами и цитокинами может привести к появлению побочных явлений, может активировать множественные сигнальные пути, может привести к нежелательной репликации клеток, может вызвать иммунный ответ и в общем случае не является специфическим. Генетические виды лечения с применением плазмид или вирусов несут риск геномной модификации путем инсерционного мутагенеза и риск развития рака. Трансфекция немодифицированной РНК приводит к сильному иммунному ответу и согласно имеющимся данным не приводит к удлинению теломер. Лечение физическими методами может повредить геномную ДНК. Было обнаружено, что лечение небольшими молекулами, полученными из растений приводит к удлинению теломер только в некоторых субъектах и клетках, приводит только к очень медленному удлинению теломер и требует постоянной доставки и, следовательно, связано с риском развития рака.
[0076] Экспрессия в клетках нуклеотидных последовательностей, кодирующих hTERT и TERC, и применение самих этих компонентов было предложено для применения в диагностике, прогнозировании и лечении человеческих заболеваний (см., например, патенты США №№5583016 и 6166178), но при этом не было продемонстрировано удлинение теломер, которое было бы одновременно быстрым и временным и, следовательно, потенциально безопасным в связи с причинами, описанными выше. В Saebe-Larssen et al. (2002) J. Immunol. Methods 259:191-203 сообщается о трансфекции дендритных клеток мРНК, кодирующей hTERT, и о том, что такие клетки приобретали теломеразную активность, но в трансфекции применяли стандартную мРНК, что приводило к сильному ответу цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL) на hTERT, а не к удлинению теломер.
0
0
0
[0077] Кроме того, все существующие виды лечения при помощи небольших молекул являются очень неэффективными и медленными (Harley et al. (2011) Rejuvenation Research 14:45-56) главным образом потому, что они действуют посредством каталитического компонента теломеразы, TERT, который тяжело подвергается посттрансляционной регуляции, ограничивая действие существующих видов лечения небольшой подгруппой клеток, и исключая клетки, находящиеся в интерфазе или G, такие как многие стволовые клетки и клетки-предшественники. Cifuentes-Rojas and Shippen (2012) Mutat. Res. 730:20-27; doi:10.1016/j.mrfmmm.2011.10.003; Cong et al. (2002) Microbiology and Molecular Biology Reviews 66:407-425. Эта регуляция частично опосредуется взаимодействиями между компонентами теломеразного комплекса, теломерного комплекса и другими молекулами. Например, TERT фосфорилируется или дефосфорилируется в разных участках разными киназами и фосфатазами, и в некоторых участках фосфорилирование приводит к повышению теломеразной активности (например, фосфорилирование Akt), в то время как в других участках фосфорилирование снижает теломеразную активность (например, фосфорилирование Srcl или сАЫ). Также TERT убиквитинируется и деубиквитинируется в определенных участках. Также TERT взаимодействует с другими белками в определенных участках TERT и эти взаимодействия могут инактивировать TERT (например, взаимодействия с Pinxl или cAb1) или переносить TERT в сторону от хромосом (например, взаимодействия с CRM1 и Pinx1), предотвращая или замедляя удлинение теломер. Более того, некоторые белки связываются с теломерами или теломерным комплексом, блокируя TERT (например, РОТ1), предотвращая удлинение теломер. Более того, некоторые белки косвенно способствуют удлинению теломер, например, геликазы и UPF1. В связи с регуляторными механизмами пик теломеразной активности приходится на S-фазу клеточного цикла и, следовательно, виды лечения, которые повышают теломеразную активность, могут оказывать благоприятное действие именно на быстро делящиеся клетки. Однако часто необходимо, чтобы клетки находились в состоянии медленного деления или не делились; например, стволовые клетки или клетки-предшественники часто характеризуются медленным делением и, следовательно, большую часть времени могут находиться в интерфазе или G. Таким образом, в общем случае существующие виды лечения являются медленными и неэффективными для большинства типов клеток и для всех типов клеток во время интерфазы и G. Медленные виды лечения являются менее безопасными, так как они требуют лечения на протяжении более длительного времени. Так как укорочение теломер может обеспечивать защитный механизм от неконтролируемой клеточной пролиферации, например, в случае рака, лечение, при котором происходит быстрое удлинение теломер, в общем случае является более безопасным, так как его можно осуществлять на протяжении коротких периодов времени и не часто, что позволяет нормальному механизму безопасности, связанному с укорочением теломер, оставаться действенным большую часть времени. Следовательно, существует необходимость в способе, обеспечивающем временное преодоление теломеразной регуляции для быстрого удлинения теломер во время кратковременного лечения.
[0078] TERT регулирует сотни генов, включая те, которые перечислены в Таблице 3.
[0079] Во многих случаях модуляция генов или путей, приведенных в Таблице 3, является нежелательной, потому что может привести к нежелательным изменениям в клетках. Например, TERT активирует эпигенетические регуляторы, которые могут менять фенотип клетки или препятствовать попыткам перепрограммировать или трансдифференцировать клетки в терапевтических целях. TERT активирует стимуляторы роста, но пролиферация часто является нежелательной, например, часто те стволовые клетки, которые обладают наибольшим регенеративным потенциалом, делятся медленно. TERT модулирует регуляторы предопределения и дифференцировки клеток, что может помешать попыткам дифференцировать клетки в определенные типы клеток. Также TERT активирует протоонкогены, что может привести к раку. Таким образом, необходимо минимизировать количество времени, на протяжении которого происходит искусственное повышение уровней TERT, включая любое лечение, которое приводит к удлинению теломер при помощи TERT. Следовательно, необходимо лечение, которое приводит к удлинению теломер путем только лишь временного повышения уровней теломеразной активности.
[0080] Было показано, что в некоторых типах клеток TERT влияет на экспрессию других генов (Young et al. (2003) J. Biol. Chem. 278:19904-19908; Perrault et al. (2005) Biochem. Biophys. Res. Commun. 335:925-936), что в некоторых случаях может быть нежелательным. Следовательно, необходимо лечение, которое минимизирует количество времени, на протяжении которого происходит повышение уровней TERT.
Соединения
[0081] Настоящее изобретение направлено на эти и другие проблемы и предлагает в одном аспекте новые соединения для временной экспрессии экзогенной теломеразы в клетке. Соединения содержат синтетическую рибонуклеиновую кислоту, содержащую по меньшей мере один модифицированный нуклеозид и кодирующую обратную транскриптазу теломеразы (TERT), при этом в клетке, обработанной соединением происходит удлинение теломер.
Синтетические рибонуклеиновые кислоты
[0082] Рибонуклеиновые кислоты, применяемые для временной экспрессии TERT в соответствии с разными аспектами настоящего изобретения, содержат рибонуклеиновую кислоту, кодирующую белок TERT. Как правило, рибонуклеиновые кислоты дополнительно содержат последовательности, которые оказывают влияние на экспрессию и/или стабильность рибонуклеиновой кислоты в клетке. Например, как показано на Фигуре 1а, рибонуклеиновые кислоты могут содержать 5'-кэп и нетранслируемую область (НТО) с 5' и/или 3' стороны кодирующей последовательности. Рибонуклеиновые кислоты могут дополнительно содержать 3' хвост, например, (поли)А-хвост.(Поли)А-хвост может, например, повышать стабильность рибонуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах реализации изобретения (поли)А-хвост содержит по меньшей мере 75 нуклеотидов, 100 нуклеотидов, 125 нуклеотидов, 150 нуклеотидов или даже более.
[0083] В некоторых вариантах реализации изобретения 5'-кэп рибонуклеиновой кислоты представляет собой неиммуногенный кэп. В некоторых вариантах реализации изобретения 5'-кэп может усиливать трансляцию рибонуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах реализации изобретения 5'-кэп можно обрабатывать фосфатазой, чтобы модулировать естественную иммуногенность рибонуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах реализации изобретения 5'-кэп представляет собой анти-инвертированный аналог кэп («ARCA»), такой как 3'-0-Me-m7G(5')ppp(5')G РНК аналог кэп-структуры.
[0084] Как хорошо известно в данной области техники, вышеуказанные или другие признаки могут усиливать трансляцию белка TERT, кодируемого рибонуклеиновой кислотой, могут улучшать стабильность самой рибонуклеиновой кислоты или могу делать и то и другое. В некоторых вариантах реализации изобретения 5'-НТО и/или 3'-НТО получены из гена очень стабильной мРНК и/или мРНК, которая быстро транслируется, например, α-глобина, β-глобина, c-fos или вируса гравировки табака. В некоторых вариантах реализации изобретения 5'-НТО и 3'-НТО получены из разных генов или от видов, отличных от вида, которому осуществляют доставку композиций. Также НТО могут быть собраны из частей НТО из мРНК разных генов, при этом части подбирают так, чтобы достичь определенной комбинации стабильности и эффективности трансляции.
[0085] Рибонуклеиновые кислоты согласно изобретению предпочтительно представляют собой нуклеозид-модифицированные РНК («модРНК»). Большинство зрелых молекул РНК в эукариотических клетках содержат нуклеозиды, которые являются модифицированными версиями канонических немодифицированных нуклеозидов РНК аденина, цитидина, гуанозина и уридина. Эти модификации могут предотвращать распознавание РНК как чужеродной РНК. Kariko et al. (2005) Immunity 23:165-175. Синтетические молекулы РНК, полученные с использованием определенных нуклеозидов, являются намного менее иммуногенными, чем немодифицированная РНК. Иммуногенность можно снизить даже больше путем очистки синтетической модРНК, например, при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Модифицированные нуклеозиды, например, могут быть выбраны из нуклеозидов, приведенных в Таблице 4. В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеозиды представляют собой псевдоуридин, 2-тиоуридин или 5-метилцитидин. В некоторых обстоятельствах может быть желательно, чтобы модифицированная РНК сохраняла некоторую степень иммуногенности.
[0086] Не привязываясь к теории, можно сказать, что наличие модифицированных нуклеозидов позволяет модРНК избежать активации иммунного ответа, опосредованной различными рецепторами, включая толл-подобные рецепторы и PJG-1. Неиммуногенную модРНК применяли на мышах в качестве терапевтического агента путем местной доставки. Kormann et al. (2011) Nature Biotechnology 29:154-157. Открытие нуклеотид-модифицированной мРНК облегчает доставку РНК-кодируемых терапевтических белков или их мутантов в клетки, а также экспрессию этих белков в клетках.
[0087] Соответственно, в некоторых вариантах реализации изобретения рибонуклеиновые кислоты настоящих композиций содержат псевдоуридин, 2-тиоуридин, 5-метилцитидин или нуклеозид из Таблицы 4. В некоторых вариантах реализации изобретения рибонуклеиновые кислоты содержат более одного из вышеуказанных нуклеозидов или комбинацию вышеуказанных нуклеозидов. В особенно предпочтительных вариантах реализации изобретения рибонуклеиновые кислоты содержат псевдоуридин и 5-метилцитидин.
[0088] В некоторых вариантах реализации изобретения иммунный ответ на модРНК может быть желательным, а РНК может быть модифицирована так, чтобы индуцировать оптимальный уровень природного иммунитета. В некоторых вариантах реализации изобретения иммунный ответ на модРНК может быть нежелательным, а РНК может быть модифицирована так, чтобы минимизировать такую реакцию. РНК может быть модифицирована для любой ситуации.
[0089] Рибонуклеиновые кислоты согласно настоящему изобретению предпочтительно представляют собой синтетические рибонуклеиновые кислоты. Употребляемый в данном документе термин «синтетический» означает, что в некоторых вариантах реализации изобретения рибонуклеиновые кислоты получены методами молекулярной биологии под управлением человека, например, как описано ниже. Синтетические рибонуклеиновые кислоты могут, например, быть получены при помощи in vitro синтеза с использованием клеточных экстрактов или очищенных ферментов и нуклеотидных матриц. Синтетические рибонуклеиновые кислоты могут в некоторых вариантах реализации изобретения быть получены при помощи химического синтеза, как частично, так и полностью. В альтернативном или дополнительном варианте синтетические рибонуклеиновые кислоты могут в некоторых вариантах реализации изобретения быть получены путем искусственной экспрессии в клетке с последующим разрушением клетки и по меньшей мере частичной очисткой рибонуклеиновой кислоты. Синтетическая рибонуклеиновая кислота, однако, не является рибонуклеиновой кислотой природного происхождения, так как она экспрессируется в немодифицированной клетке в отсутствие экстракции и очистки.
[0090] Рибонуклеиновые кислоты согласно настоящему изобретению могут быть получены при помощи большого количества стандартных методов, как понятно специалисту в данной области техники. В некоторых вариантах реализации изобретения рибонуклеиновые кислоты могут быть получены при помощи in vitro синтеза, как описано, например, в заявках на патенты США №№2009/0286852 и 2011/0143397. В некоторых вариантах реализации изобретения рибонуклеиновые кислоты могут быть получены при помощи химического синтеза. В некоторых вариантах реализации изобретения рибонуклеиновые кислоты могут быть получены при помощи комбинации in vitro синтеза и химического синтеза. Как описано выше, термин «синтетический» следует понимать как такой, который включает рибонуклеиновые кислоты, полученные при помощи химического синтеза, in vitro синтеза, in vivo экспрессии и по меньшей мере частичной очистки или при помощи комбинации этих или других методов химии или молекулярной биологии.
[0091] Рибонуклеиновые кислоты согласно настоящему изобретению могут в некоторых вариантах реализации изобретения быть очищены. Как отмечалось выше, очистка может снижать иммуногенность рибонуклеиновых кислот, что в некоторых обстоятельствах может давать преимущество. Смотрите также заявку на патент США №2011/0143397. В предпочтительных вариантах реализации изобретения рибонуклеиновые кислоты очищены при помощи ВЭЖХ или аффинного захвата и элюирования.
[0092] Белковая структура TERT содержит по меньшей мере три уникальных домена: длинный удлиняющий сегмент в амино-конце (N-концевой удлиняющий сегмент, ΝΤΕ), который содержит консервативные домены и неструктурированную линкерную область; домен каталитической обратной транскриптазы в середине первичной последовательности, которая содержит семь консервативных RT-мотивов; и короткий удлиняющий сегмент в карбоксил-конце (С-концевой удлиняющий сегмент, СТЕ). Autexier and Lue (2006) Annu Rev Biochem. 75:493- 517. В некоторых вариантах реализации изобретения рибонуклеиновая кислота согласно настоящему изобретению кодирует полноразмерную TERT. В некоторых вариантах реализации изобретения рибонуклеиновая кислота кодирует домен каталитической обратной транскриптазы TERT. В некоторых вариантах реализации изобретения рибонуклеиновая кислота кодирует полипептид, обладающий активностью TERT.
[0093] TERT, кодируемая рибонуклеиновыми кислотами согласно настоящему изобретению, предпочтительно представляет собой TERT млекопитающего, птицы, рептилии или рыбы. Более предпочтительно TERT представляет собой TERT млекопитающего, например, TERT человека. Meyerson et al. (1997) Cell 90:785-795; Nakamura et al. (1997) Science 277:955-959; Wick et al. (1999) Gene 232:97-106. Аминокислотные последовательности двух изоформ человеческой TERT доступны в виде стандартных последовательностей NCBI: NP_937983.2 и NP 001180305.1. Другие неограничивающие типовые аминокислотные последовательности, кодируемые рибонуклеиновыми кислотами предложенных композиций, включают TERT кошки (Стандартная последовательность NCBI: ХР_003981636.1), собаки (Стандартная последовательность NCBI: NP_001026800.1), мыши (Стандартная последовательность NCBI: NP_033380.1), коровы (Стандартная последовательность NCBI: NP_001039707.1), овцы (Стандартная последовательность NCBI: ХР_004017220.1), свиньи (Стандартная последовательность NCBI: NP_001231229.1), африканского слона (Стандартная последовательность NCBI: ХР 003408191.1), курицы (Стандартная последовательность NCBI: NP_001026178.1), крысы (Стандартная последовательность NCBI: NP_445875.1), данио (Стандартная последовательность NCBI: NP_001077335.1); японской медаки (Стандартная последовательность NCBI: NP_001098286.1); и шимпанзе (Стандартная последовательность NCBIs: ХР 003950543.1 и ХР_003950544.1).
[0094] Следует понимать, что рибонуклеиновые кислоты согласно настоящему изобретению могут кодировать варианты любой из вышеперечисленных аминокислотных последовательностей, в частности, варианты, которые сохраняют теломеразную каталитическую активность, включая усеченные варианты. В некоторых вариантах реализации изобретения рибонуклеиновые кислоты предложенных композиций кодируют одну из вышеперечисленных аминокислотных последовательностей или последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную этой последовательности. В некоторых вариантах реализации изобретения нуклеиновые кислоты предложенных композиций кодируют одну из вышеперечисленных аминокислотных последовательностей или последовательность, по меньшей мере на 98%, 99%, 99,9% или даже более идентичную этой последовательности.
[0095] Следует также понимать, что предложенные рибонуклеиновые кислоты могут соответствовать нативным генным последовательностям, кодирующим вышеуказанные белки TERT, или могут соответствовать вариантам, возможным вследствие избыточности генетического кода, как понятно специалисту в данной области техники. В некоторых вариантах реализации изобретения селекция кодонов может быть оптимизирована в целях оптимизации экспрессии белка при помощи алгоритмов и способов, известных специалистам в данной области техники. Fath et al. (2011) PLoS ONE 6:3.
Композиции
[0096] В другом аспекте в настоящем изобретении предложены композиции для удлинения теломер в клетке, содержащие соединение согласно изобретению, как описано выше, и дополнительный компонент. В некоторых вариантах реализации изобретения композиции дополнительно содержат РНК-компонент теломеразы (TERC). (Смотрите также Таблицу 6, ниже). В некоторых вариантах реализации изобретения композиции дополнительно содержат носитель для доставки.
Носители для доставки
[0097] Как было отмечено непосредственно выше, композиции согласно настоящему изобретению могут дополнительно содержать носитель для доставки рибонуклеиновой кислоты. Носитель для доставки может в некоторых случаях облегчать нацеливание и поглощение рибонуклеиновой кислоты из композиции клеткой-мишенью. В частности, композиции согласно настоящему изобретению могут содержать любой известный в данной области техники носитель для генной доставки, например, наночастицы, липосомы, баллистические частицы для генной пушки, вирусы, катионные липиды, коммерческие продукты, такие как Lipofectamine RNAiMax, или другие носители. В некоторых вариантах реализации изобретения носитель для доставки представляет собой экзосому, липидную наночастицу, полимерную наночастицу, природную или искусственную липопротеиновую частицу, катионный липид, белок, комплекс белок-нуклеиновая кислота, липосому, виросому или полимер. В некоторых предпочтительных вариантах реализации изобретения носитель для доставки представляет собой форму, содержащую катионный липид. Как правило, вирусная доставка не является предпочтительной, так как она может привести к инсерционному мутагенезу.
[0098] В некоторых предпочтительных вариантах реализации изобретения носитель для доставки представляет собой экзосому, липидную наночастицу или полимерную наночастицу. В наиболее предпочтительных вариантах реализации изобретения носитель для доставки представляет собой экзосому. Экзосомы представляют собой бислоевые липидные везикулы природного происхождения диаметром 40-100 нм. Экзосомы содержат группу специфических белков, включая мембранные белки Lamp-1 и Lamp-2, которые являются исключительно многочисленными. Lakhal and Wood (2011) BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology 33:737-741. В 2007 г. было обнаружено, что экзосомы являются природными носителями РНК и белка, включая более 1300 типов мРНК и 121 тип некодирующих микроРНК. Экзосомы также могут переносить мРНК между видами: обработка человеческих клеток мышиными экзосомами, несущими мышиную РНК, приводит к трансляции мышиной мРНК в человеческих клетках.
[0099] В качестве средств доставки РНК, белка или ДНК экзосомы обладают большим количеством преимуществ по сравнению с альтернативными носителями. В частности, экзосомы можно получить из собственных клеток пациента, что делает их неиммуногенными и, следовательно, они не подвергаются атаке со стороны антител, комплемента, факторов свертывания крови или опсонинов. Кроме того экзосомы можно нагружать нуклеиновыми кислотами методом электропорации и они являются носителями природного происхождения, которые переносят мРНК и белок между клетками человека. Экзосомы защищают нагруженные на них РНК и белки во время транспорта, а груз доставляется непосредственно в цитозоль. Они могут проникать из кровотока во внесосудистые ткани и даже пересекать гематоэнцефалический барьер, и также их можно нацеливать. Кроме того, экзосомы не накапливаются в нецелевых органах, таких как, например, печень. Следовательно, экзосомы можно использовать как «липосомы» клеточного происхождения для доставки терапевтической мРНК или другого груза при лечении заболевания. Mizrak et al. (2013) Molecular Therapy 21:101-108; doi:10.1038/mt.2012.161. Графическая иллюстрация доставки экзосомой мРНК в клетку приведена на Фигуре 2. Смотрите также van den Boom et al. (2011) Nature Biotechnology 29:325-326.
[00100] Полагают, что генерировать экзосомы способно большинство типов клеток, а экзосомы можно обнаружить в большинстве биологических жидкостей, включая кровь, слюну, мочу, цереброспинальную жидкость, грудное молоко и околоплодную жидкость. Экзосомы вырабатываются большинством типов клеток в разном количестве. Большое количество экзосом, на которые не реагируют активаторы Т-клеток, можно получить из незрелых дендритных клеток, которые присутствуют в человеческой крови. O'Doherty et al. (1994) Immunology 82:487-493. Также экзосомы можно получить искусственным способом, например, комбинируя рекомбинантные экзосомальные белки с липидами и фосфолипидами, такими как те, которые можно обнаружить в экзосомальных мембранах. В альтернативном варианте экзосомы можно сконструировать путем in vitro самосборки липосом с подгруппой экзосомальных поверхностных белков.
[00101] Потенциал экзосом в отношении доставки лекарственных веществ был впервые продемонстрирован в 2011 г. Alvarez-Erviti et al. (2011) Nature Biotechnology 29:341 -345. В частности, экзосомы получали из дендритных клеток, сконструированных для экспрессии белка слияния Lamp2B, слитого с 28 а.к. нацеливающим лигандом гликопротеина вируса бешенства (RVG), затем электропорировали миРНК в экзосомы и инъецировали экзосомы мышам, иммуносовместимым с мышами, от которых были получены дендритные клетки. Таким образом, экзосомы были аутологичными и не вызывали иммунный ответ согласно измеренным уровням IL-6, IP-10, TNF-α и IFN-α. Кроме того, повторные дозы через один месяц приводили к таким же ответам, демонстрируя, что адаптивный иммунный ответ также отсутствовал.
[00102] Как описано выше, экзосомы могут быть аутологичными и, таким образом, обладать низкой иммуногенностью. Так как модРНК также обладает низкой иммуногенностью, комбинация из модРНК в качестве рибонуклеиновой кислоты и экзосомы в качестве носителя для доставки в композициях согласно настоящему изобретению является в особенности предпочтительной. Таким образом, в этих вариантах реализации в изобретения предложен новый путь доставки мРНК или модРНК в клетки или ткани с применением экзосом. Такая доставка обеспечивает удобный способ для временного повышения уровня любого белка в клетки in vivo с применением РНК, доставляемой в экзосомах путем внутривенной или местной инъекции, и, в частности, для доставки РНК, кодирующей TERT. Соответственно, в предпочтительных вариантах реализации изобретения носители для доставки предложенных в данном изобретении композиций являются неиммуногенными. В некоторых обстоятельствах, однако, может быть желательно, чтобы носитель сохранял некоторую степень иммуногенности.
Дополнительные компоненты
[00103] Раскрытые в данном документе композиции могут дополнительно содержать дополнительные компоненты, которые повышают доставку композиции в клетку-мишень, повышают удлинение теломер внутри клетки или и то, и другое. Например, композиции могут дополнительно содержать одно или более соединений и условий из Таблицы 2. Как понятно специалисту в данной области техники, комбинации активных ингредиентов часто демонстрируют синергетическое действие на необходимую активность, как, например, временная экспрессия экзогенной теломеразной активности в клетке, и такие комбинации входят в объем изобретения. Дополнительные примеры белков, которые могут быть включены в состав композиций согласно настоящему изобретению, приведены в Таблице 5. Следует понимать, что композиции могут содержать как сами белки, так и нуклеотидные последовательности, предпочтительно РНК или модРНК, которые кодируют эти белки, или белки, обладающие идентичностью последовательностей, которая позволяет сохранить активность указанного белка.
[00104] Другие примеры агентов, которые можно включать в состав композиций согласно настоящему изобретению, приведены в Таблице 6.
[00105] Так как TERT является наиболее активной во время определенных фаз клеточного цикла, композиции согласно настоящему изобретению также могут необязательно содержать один или более временных активаторов клеточной пролиферации, чтобы увеличить эффективность лечения TERT. Такие агенты могут включать, например, агент РНКи, который временно снижает количество ингибиторов клеточного цикла, таких как Rb или P19/Arf, в клетке. Специалисту в данной области техники понятно, что в состав представленных композиций можно включать другие временные активаторы клеточной пролиферации.
Способы удлинения теломер и способы лечения
[00106] В другом аспекте в настоящем изобретении предложены способы удлинения теломер, включающие этап введения любого из вышеописанных соединений или композиций в клетку с укороченными теломерами, при этом происходит удлинение теломер в клетке. Также в настоящем изобретении предложены способы лечения, включающие этап введения любого из вышеописанных соединений или композиций субъекту-животному, которое нуждается или для которого может оказаться полезным удлинение теломер.
[00107] В предпочтительных вариантах реализации изобретения соединения и композиции вводят в клетку, при этом клетка является выделенной клеткой или является частью клеточной культуры, выделенной тканевой культуры, выделенного органа и тому подобного (т.е. введения осуществляют in vitro).
[00108] В других предпочтительных вариантах реализации изобретения соединения и композиции вводят без выделения клетки или клеток, ткани или органа из субъекта (т.е. введения осуществляют in vivo). В некоторых из этих вариантов реализации изобретения соединение или композицию доставляют во все или практически все клетки организма субъекта. В некоторых вариантах реализации изобретения соединение или композицию доставляют в определенную клетку или ткань организма субъекта.
[00109] В некоторых вариантах реализации изобретения субъект представляет собой млекопитающее, птицу, рыбу или рептилию. В предпочтительных вариантах реализации изобретения субъект представляет собой млекопитающее и более предпочтительно -человека. В других предпочтительных вариантах реализации изобретения субъект представляет собой домашнее животное, животное из зоопарка, сельскохозяйственное животное или животное, принадлежащее находящемуся под угрозой виду. Примеры предпочтительных видов субъектов перечислены в Таблице 7.
[00110] В случае in vitro применений соединения и композиции можно вводить любым удобным способом, как понятно специалистам в области клеточной биологии, клеточного культивирования, тканевого культивирования, культивирования органов и тому подобного. В случае in vivo применений соединения и композиции удобно вводить путем инъекции, местного применения, ингаляции или любого другого подходящего способа введения, как понятно специалистам в области медицины и тому подобного.
[00111] Как описано выше, клетки, которые можно эффективно лечить в соответствии со способами согласно данному изобретению, включают клетки как в организме субъекта (для in vivo введения), так и полученные от субъекта (для in vitro введения), для которого может оказаться полезным удлинение теломер. Так как короткие теломеры присущи практически всем типам клеток у большинства животных, удлинение теломер может оказаться целесообразным для большинства животных. Лечение, включающее удлинение теломер, являющееся временным и короткодействующим, потенциально является безопасным, как описано выше. Следовательно, удлинение теломер посредством раскрытого в данном документе временного лечения может быть эффективным для всех или большинства индивидов в качестве превентивной меры, например, для того, чтобы предотвратить или отложить начало многих заболеваний и патологических состояний, связанных с укорочением теломер, или в качестве лечения этих заболеваний и патологических состояний. Лечение может быть целесообразным в случае субъектов, подверженных риску развития возрастных заболеваний или патологических состояний, или тех, кто уже страдает от этих заболеваний, а также может быть целесообразным в случае субъектов, которые перенесли, имеют или подвержены риску физической травмы или хронического физического стресса, такого как тяжелые физические тренировки или ручной труд, или психологической травмы, или хронического психологического стресса, так как все эти патологические состояния приводят к укорочению теломер; физический стресс или травма требуют клеточного деления с целью исправления полученного повреждения, что приводит к укорочению теломер, также эти патологические состояния могут вызывать окислительный стресс, который также приводит к укорочению теломер. Такие заболевания и патологические состояния включают, например, метаболический синдром, диабет, диабетические язвы, заболевание сердца, многие формы рака, сосудистую деменцию, болезнь Альцгеймера, инсульт, возрастную макулярную дегенерацию, старение иммунной системы, недостаточность костного мозга, желудочно-кишечные язвы, цирроз, грыжу, инфекцию, такую как вторичная пневмония вследствие нарушения иммунной функции, хроническую инфекцию, легкое или тяжелое когнитивное нарушение, нарушение подвижности, остеопороз, остеоартрит, ревматоидный артрит, возрастное тревожное расстройство, нарушение равновесия, тиннитус, паралич Белла, катаракты, ХОЗЛ, истирание роговицы, ишемическую болезнь сердца, заболевание периферических артерий, конъюнктивит, халазион, обезвоживание, депрессию, эмфизему, различные заболевания глаз, отсутствия прибавки в весе, гриппа, общее тревожное расстройство, глаукому, потерю слуха, потерю чувства вкуса, потерю аппетита, вывих бедра, потерю памяти, болезнь Паркинсона, спинальный стеноз, недержание мочи, перелом позвоночника и другие.
[00112] Клетки, которые можно эффективно лечить в соответствии с предложенными способами, также включают клетки в организме субъекта или полученные от субъекта, который страдает от возрастного заболевания или патологического состояния или подвержен риску развития такого заболевания или патологического состояния. Такие возрастные заболевания или патологические состояния могут включать генетические заболевания, в которых гены, кодирующие компоненты теломеразного комплекса или теломерного комплекса, мутированы, что приводит к укорочению теломер. Такие заболевания включают, например, формы идиопатического легочного фиброза, врожденного дискератоза и апластической анемии.
[00113] В случае генетических заболеваний композиции могут дополнительно содержать дополнительные нуклеиновые кислоты, такие как нормальные функциональные версии кодирующих последовательностей генов, которые поражаются при таких заболеваниях, например, DKC1, TINF2, NOPIO, NHP2, TERC или других генов. Примеры таких генов приведены в Таблице 8. Смотрите также Armarnos (2009) Ann. Rev. Genomics Hum. Genet. 10: 45-61.
[00114] Дополнительно, лечение может быть целесообразным для субъектов, страдающих от или подверженных риску развития других типов генетических заболеваний, в которых играет роль укорочение теломер, таких как, например, мышечная дистрофия. В случае таких заболеваний необходимость в репликации клеток для решения проблемы, причиняемой генетической мутацией, быстрее чем обычно укорачивает теломеры, результатом чего является более быстрое чем обычно укорочение теломер, что в свою очередь снижает способность клеток к репликации, приводя к тканевой дисфункции, усугублению или появлению дополнительных симптомов, недееспособности и часто к смерти. Кроме того лечение соединениями согласно данному изобретению может лечить или замедлять развитие разных типов рака, так как считается, что слияние между хромосомами вследствие критического укорочения теломер является причиной рака. Также теломеры можно избирательно удлинять в здоровых клетках индивида, не удлиняя при этом теломеры в раковых клетках, что позволяет применять предложенные соединения, композиции и способы, например, для удлинения теломер иммунной системы для повышения ее способности бороться с раком. Кроме того, клетки иммунной системы можно также получать от индивида для лечения согласно данному изобретению ex vivo с последующим повторным внесением индивиду.
[00115] В некоторых вариантах реализации изобретения клетки, обрабатываемые в соответствии с предложенными способами, получены от субъектов, у которых еще не проявлялись признаки болезненного состояния, но которые подвержены риску развития патологического состояния или заболевания, связанного с укорочением теломер, или клетки содержат укороченные теломеры. В некоторых вариантах реализации изобретения возрастным заболеванием является просто преклонный возраст. Предложенные виды лечения также можно применять в качестве косметической помощи для предотвращения, замедления или смягчения возрастных ухудшений состояния кожи, волос, костной структуры, осанки, остроты зрения или других признаков, которые ухудшаются с возрастом. Например, лечение можно применять для сохранения эластичности, толщины, гладкости и внешнего вида кожи, так как удлинение теломер улучшает эти параметры. В случае физической травмы, такой как перелом костей или разрыв тканей, или резанная рана, или ожог, изобретение можно применять для увеличения длины теломер в клетках, которые участвуют в заживлении раны для повышения их способности к репликации. В случаях хронического физического стресса, который является причиной укорочения теломер, лечение согласно изобретению сожжет удлинять теломеры в пораженных клетках, повышая их способность к репликации и способность восстанавливать поврежденные ткани. Так как теломерное укорочение накапливается из поколения в поколение, например, у людей с гаплонедостаточностью теломеразных компонентов, таких как hTR или hTERT, Armanios (2009) Аппи. Rev. Genomics Hum. Genet. 10:45-61, лечение согласно настоящему изобретению можно осуществлять в отношении зародышевых линий, таких как яйцеклетки, сперма или их предшественники, или в отношении оплодотворенных яйцеклеток или эмбрионов, например, во время in vitro процедур оплодотворения. Также лечение может быть полезным как вспомогательное при других видах лечения разных заболеваний или патологических состояний, например, при трансдифференцировке клеток in vivo. Способы лечения также могут быть полезными перед или во время хирургической операции или химиотерапии, или лучевой терапии для повышения способности клеток к репликации для восстановления повреждений вследствие этих процедур.
[00116] Указанные способы также могут быть полезными для обработки клеток in vitro для различных применений, включая аутологичную и гетерологичную клеточную терапию, биоинженерию, тканевую инженерию, выращивание искусственных органов, генерацию индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) и клеточную дифференцировку, дедифференцировку или трансдифференцировка. В этих применениях может требоваться многократное деление клеток, что может привести к уменьшению длины теломер, что можно компенсировать согласно данному изобретению до, во время или после указанного применения.
[00117] Кроме того, возрастными заболеваниями могут считаться различные типы рака, в частности, в случае, если раковые клетки содержат укороченные теломеры. В некоторых случаях клетки, обрабатываемые в соответствии с предложенными способами, получены от субъектов, у которых еще не проявлялись признаки болезненного состояния, но клетки которых содержат укороченные теломеры. В некоторых вариантах реализации изобретения возрастным заболеванием является просто изменение формы или функции, которая обычно ассоциируется у людей с преклонным возрастом.
[00118] Клетки, в которые целесообразно вводить соединения или композиции согласно настоящему изобретению в соответствии с предложенными способами, включают клетки любой ткани или клеточного типа, которые могут пострадать вследствие укорочения теломер или для которых может быть целесообразным удлинение теломер в клетках. Клетки могут включать соматические клетки или зародышевые клетки, а также стволовые клетки и другие клетки-предшественники и/или недефференцированные клетки. Клетки могут включать опухолевые клетки и неопухолевые клетки.
[00119] Примеры клеток, в которые целесообразно вводить соединения или композиции в соответствии с предложенными способами, включают клетки, которые получены главным образом из эндодермы, клетки, которые получены главным образом из эктодермы, и клетки, которые получены главным образом из мезодермы. Клетки, полученные главным образом из эндодермы, включают, например, экзокринные секреторные эпителиальные клетки и клетки, секретирующие гормоны. Клетки, полученные главным образом из эктодермы, включают, например, клетки покровной системы (например, ороговевшие эпителиальные клетки и клетки влажного многослойного барьерного эпителия) и нервной системы (например, сенсорные клетки-трансдукторы, автономные нейроны, поддерживающие клетки органов чувств и периферических нейронов, нейроны центральной нервной системы и глиальные клетки, а также клетки хрусталика). Клетки, полученные главным образом из мезодермы, включают, например, клетки метаболизма и памяти, клетки барьерной функции (например, клетки легких, кишечника, экзокринной железы и урогенитального тракта), клетки внеклеточного матрикса, сократительные клетки, клетки кровеносной и иммунной системы, зародышевые клетки, питающие клетки и интерстициоциты. Соответственно, в некоторых вариантах реализации предложенных способов клетка, в которую вводят композицию, представляет собой соматическую клетку эндодермальной, мезодермальной или эктодермальной линии дифференцировки. В некоторых вариантах реализации изобретения клетка представляет собой зародышевую клетку или эмбриональную клетку.
[00120] Конкретные примеры клеток, в которые можно вводить соединение или композицию в соответствии с предложенными способами, включают, например, клетки слизистой оболочки слюнной железы, серозные клетки слюнной железы, клетки железы Эбнера на языке, клетки молочной железы, клетки слезной железы, клетки церуминозной железы в ухе, темные клетки эккриновой потовой железы, прозрачные клетки эккриновой потовой железы, клетки апокринной потовой железы, клетки потовой железы Моля глазного века, клетки сальной железы, клетки боуменовой железы носа, клетки бруннеровой железы двенадцатиперстной кишки, клетки семенной железы, клетки предстательной железы, клетки бульбоуретральной железы, клетки бартолиновой железы, клетки железы Литтре, клетки эндометрия матки, изолированные бокаловидные клетки дыхательного и пищеварительного трактов, клетки слизистой оболочки желудка, зимогенные клетки желудочной железы, обкладочные клетки желудочной железы, ацинарные клетки поджелудочной железы, панетовские клетки тонкого кишечника, пневмоциты легких типа И, клетки Клары легких, клетки передней доли гипофиза (например, соматотрофы, лактотрофы, тиротрофы, гонадотрофы и кортикотрофы), клетки средней доли гипофиза (например, секретирующие меланоцит-стимулирующий гормон), крупноклеточные нейросекреторные клетки (например, секретирующие окситоцин или вазопрессин), клетки кишечного и дыхательного тракта, (например, секретирующие серотонин, эндорфин, соматостатин, гастрин, секретин, холецистокинин, инсулин, глюкагон или бомбезин), клетки щитовидной железы (например, эпителиальные клетки щитовидной железы и парафолликулярные клетки), клетки паращитовидной железы (например, главные клетки паращитовидной железы и оксифильные клетки), клетки надпочечной железы (например, хромаффинные клетки и клетки, секретирующие стероидные гормоны, такие как минералокортикоиды и глюкокортикоиды), клетки Лейдига семенников, клетки внутренней оболочки овариального фолликула, клетки желтого тела раскрытого овариального фолликула, гранулезные лютеиновые клетки, клетки теки желтого тела, юкстагломерулярные клетки, клетки плотного пятна почек периполярные клетки почек, мезангиальные клетки почек, эпидермальные кератиноциты, эпидермальные базальные клетки, кератиноциты ногтей рук и ног, базальные клетки ногтевого ложа, медуллярные клетки волосяного стержня, кортикальные клетки волосяного стержня, кутикулярные клетки волосяного стержня, кутикулярные клетки капсул корней волос, клетки капсул корней волос слоя Хаксли, клетки капсул корней волос слоя Хенле, внешние клетки капсул корней волос, клетки матрицы волоса, поверхностные эпителиальные клетки многослойного плоского эпителия роговой оболочки, языка, полости рта, пищевода, анального канала, дистальной части уретры и вагины, базальные клетки эпителия роговой оболочки, языка, полости рта, пищевода, анального канала, дистальной части уретры и вагины, эпителиальные клетки мочевого канала (например, выстилающие мочевой пузырь и мочевыводящие протоки), ушные внутренние волосковые клетки в кортиевом органе, ушные внешние волосковые клетки в кортиевом органе, базальные клетки обонятельного эпителия, холодочувствительные первичные сенсорные нейроны, теплочувствительные первичные сенсорные нейроны, клетки Меркеля эпидермиса, обонятельные рецепторные нейроны, чувствительные к боли первичные сенсорные нейроны, фоторецепторные клетки сетчатки глаза (например, фоторецепторные палочки, фоторецепторные колбочки, чувствительные к синему цвету, фоторецепторные колбочки, чувствительные к зеленому цвету, фоторецепторные колбочки, чувствительные к красному цвету), проприоцептивные первичные сенсорные нейроны, чувствительные к прикосновению первичные сенсорные нейроны, клетки каротидного тельца типа I и II, ушные клетки вестибулярного аппарата уха типа I и II, клетки вкусовых рецепторов типа I, холинергические нервные клетки, адренергические нервные клетки, пептидергические нервные клетки, внутренние и внешние столбовые клетки кортиева органа, внутренние и внешние фалангеальные клетки кортиева органа, пограничные клетки кортиева органа, клетки Гензена кортиева органа, поддерживающие клетки вестибулярного аппарата, поддерживающие клетки вкусовых рецепторов, поддерживающие клетки обонятельного эпителия, шванновские клетки, глиальные клетки-спутники, кишечные глиальные клетки, астроциты, нервные клетки, олигодендроциты, веретеновидные нейроны, эпителиальные клетки передней поверхности хрусталика, кристаллин-содержащие волокнистые клетки хрусталика, гепатоциты, адипоциты (например, клетки белой жировой ткани и клетки бурой жировой ткани), печеночные липоциты, обкладочные клетки почек, подоциты почечных клубочков, клетки щеточной каймы проксимального почечного канальца, клетки тонкого сегмента петли Генле, клетки дистального почечного канальца, клетки собирающего протока почки, пневмоциты типа I, клетки протока поджелудочной железы, гладкие дуктальные клетки (например, главные клетки и дополнительные клетки), дуктальные клетки (семенной железы, предстательной железы и т.д.), клетки щеточной каймы кишечника (с микроворсинками), полосатые дуктальные клетки экзокринной железы, эпителиальные клетки желчного пузыря, клетки безреснитчатых эфферентных канальцев, эпидидимальные главные клетки, эпидидимальные базальные клетки, эпителиальные клетки энамелобластов, эпителиальные клетки planum semilunatum вестибулярного аппарата уха, интердентальные эпителиальные клетки кортиева органа, фибробласты рыхлой соединительной ткани, фибробласты роговицы (кератиноциты роговицы), фибробласты сухожилий, фибробласты ретикулярной ткани костного мозга, другие неэпителиальные фибробласты, перициты, клетки пульпозного ядра межпозвоночного диска, цементобласты/цементоциты, одонтобласты/одонтоциты, хондроциты гиалинового хряща, хондроциты волокнистого хряща, хондроциты эластического хряща, остеобласты/остеоциты, остеопрогениторные клетки, гиалоциты стекловидного тела глаза, звездчатые клетки перилимфатического пространства уха, звездчатые клетки печени (клетки Ито), звездчатые клетки поджелудочной железы, клетки скелетных мышц (например, клетки красных скелетных мышц (медленные) и клетки белых скелетных мышц (быстрые)), клетки промежуточных скелетных мышц, сумчато-ядерные клетки мышечного веретена, цепочно-ядерные клетки мышечного веретена, сателлитные клетки, клетки сердечной мышцы (например, обыкновенные клетки сердечной мышцы, узловые клетки сердечной мышцы и волокнистые клетки Пуркинье), клетки гладкой мускулатуры (различные типы), миоэпителиальные клетки радужной оболочки, миоэпителиальные клетки экзокринной железы, эритроциты, мегакариоциты, моноциты, макрофаги соединительной ткани (различные типы), эпидермальные клетки Лангерганса, остеокласты, дендритные клетки, микроглиальные клетки, нейтрофильные гранулоциты, эозинофильные гранулоциты, базофильные гранулоциты, клетки гибридомы, тучные клетки, хелперные Т-клетки, Т-клетки-супрессоры, цитотоксичные Т-клетки, естественные киллерные Т-клетки, В-клетки, естественные киллерные клетки, ретикулоциты, стволовые клетки и потомство коммитированных клеток кровеносной и иммунной системы (различные типы), оогонии/ооциты, сперматиды, сперматоциты, сперматогонии, сперматозоиды, питающие клетки, клетки овариального фолликула, клетки Сертоли, эпителиальные клетки вилочковой железы и интерстициальные клетки почек.
[00121] В предпочтительном варианте реализации изобретения клетки, в которые вводят соединение или композицию в соответствии с предложенными способами, представляют собой стволовые клетки или клетки-предшественники, так как из этих клеток развиваются другие клетки организма. В другом предпочтительном варианте реализации изобретения обрабатываемые клетки представляют собой клетки, в которых укорочение теломер происходит быстрее, чем в других типах клеток, например, эндотелиальные клетки, фибробласты, кератиноциты, клетки иммунной системы, включая клетки щитовидной и паращитовидной железы, а также лейкоциты и их предшественники, клетки кишечника, печени, клетки слизистой оболочки, например, пищевода и толстой кишки, и клетки десен и зубной пульпы.
[00122] Соответственно, в некоторых вариантах реализации изобретения клетки представляют собой клетки фибробластов, кератиноцитов, эндотелиальные клетки, эпителиальные клетки или кровяные клетки.
[00123] Этап введения можно проводить один или более раз в зависимости от необходимой степени удлинения теломер. В некоторых вариантах реализации предложенных способов клетка представляет собой выделенную клетку, а этап введения длится не более 96 часов, не более 72 часов, не более 48 часов, не более 36 часов, не более 24 часов, не более 18 часов, не более 12 часов, не более 8 часов, не более 4 часов или даже меньшее количество времени. В некоторых вариантах реализации изобретения этап введения длится по меньшей мере 2 часа, по меньшей мере 4 часа, по меньшей мере 8 часов, по меньшей мере 12 часов, по меньшей мере 18 часов, по меньшей мере 24 часа, по меньшей мере 36 часов, по меньшей мере 48 часов или даже большее количество времени. В предпочтительных вариантах реализации изобретения этап введения длится не более 48 часов, не более 96 часов или не более 1 недели. В других предпочтительных вариантах реализации изобретения этап введения длится по меньшей мере 2 часа. Следует понимать, что в случае, когда введение осуществляется путем трансфекции, время введения включает время, необходимое для восстановления клетки после трансфекции.
[00124] В некоторых вариантах реализации предложенных способов клетка представляет собой выделенную клетку, а этап введения проводят не более 6 раз, не более 5 раз, не более 4 раз, не более 3 раз, не более 2 раз или даже не более 1 раза. В некоторых вариантах реализации изобретения этап введения проводят не менее 2 раз, не менее 3 раз, не менее 4 раз, не менее 5 раз, не менее 6 раз или даже чаще.
[00125] В некоторых вариантах реализации изобретения этап введения проводят один раз или несколько раз на протяжении относительно короткого периода времени для повторного удлинения теломер, и после этого его не проводят на протяжении длительного периода времени до тех пор, пока снова не появится необходимость в удлинении теломер. Этот цикл можно повторять неограниченное количество раз. Такая схема лечения обеспечивает периодическое повторное удлинение теломер с интервалами между этапами введения, во время которых происходит укорочение теломер. Периодические способы лечения можно осуществлять как путем in vivo введения, так и путем in vitro введения, по желанию. В некоторых вариантах реализации изобретения этап введения в такой серии проводят не более 6 раз, не более 5 раз, не более 4 раз, не более 3 раз, не более 2 раз или даже не более 1 раза. В некоторых вариантах реализации изобретения этап введения проводят не менее 2 раз, не менее 3 раз, не менее 4 раз, не менее 5 раз, не менее 6 раз или даже чаще. Варьируя количество проведений этапа введения и применяемую дозу соединений или композиций согласно изобретению, можно контролировать достигаемую степень удлинения теломер.
[00126] В некоторых вариантах реализации изобретения способы согласно настоящему изобретению дополнительно включают этап культивирования клетки на специальном субстрате, предпочтительно эластичном субстрате. Известно, что такие субстраты предотвращают появление нежелательных изменений в клетке, которые обычно возникают на субстратах как следствие нефизиологической эластичности этих субстратов. Смотрите международную публикацию согласно РСТ № W02012/009682, которая в полном объеме включена в данный документ посредством ссылки. Эластичные субстраты могут дополнительно стимулировать выживаемость клеток.
[00127] Введение соединений или композиций согласно настоящему изобретению приводит к временной экспрессии теломеразной активности в клетке. Повышение активности легко определяется при помощи разных методов анализа, таких как, например, набор для детекции теломеразы Trapeze RT (Millipore), который обеспечивает чувствительный, in vitro анализ в режиме реального времени, в котором используется флуориметрическая детекция и количественная оценка теломеразной активности, при этом возможно применение других способов измерения. В некоторых вариантах реализации изобретения теломеразная активность повышается по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 50% или даже более. В предпочтительных вариантах реализации изобретения теломеразная активность повышается по меньшей мере на 5%.
[00128] Как отмечалось ранее, одно из преимуществ предложенных способов состоит в том, что экспрессия теломеразной активности в обрабатываемых клетках является временной. В частности, такая временная экспрессия представляет собой противоположность более ранним способам, в которых ген обратной транскриптазы теломеразы вставляли в геномную последовательность клетки или каким-либо другим образом перманентно модифицировали генетическую основу клеток-мишеней, что приводило к конститутивной активности нуклеотидной последовательности.
[00129] Фигура 3 иллюстрирует некоторые из преимуществ раскрытых в данном документе соединений, композиций и способов. В частности, скорость удлинения теломер, которую обеспечивают эти соединения, композиции и способы, делает возможным поддержания состояния теломер путем очень нечастой доставки модРНК TERT. Экспрессируемая теломеразная активность приводит к быстрому удлинению теломер за короткий период до своего прекращения, позволяя, таким образом, защитному противораковому механизму, связанному с укорочением теломер, действовать большую часть времени. В период между этапами лечения сохраняется нормальная теломеразная активность и укорочение теломер и, следовательно, противораковый механизм, связанный с укорочением теломер и направленный на предотвращение неконтролируемой пролиферации, остается интактным, в то же время риск развития заболеваний, связанных с укорочением теломер, остается низким. В противоположность этому, наиболее эффективное лечение с применением небольших молекул для удлинения теломер требует постоянной доставки и, таким образом, сохраняется постоянный риск развития рака, и при всем этом оказывает слабое, неустойчивое влияние на длину теломер с полным отсутствием обнаруживаемого влияния на длину теломер приблизительно у половины пациентов.
[00130] Соответственно, в некоторых вариантах реализации предложенных способов экспрессия активности обратной транскриптазы теломеразы, т.е. время полужизни теломеразной активности, сохраняется не более 48 часов, не более 36 часов, не более 24 часов, не более 18 часов, не более 12 часов, не более 8 часов, не более 4 часов или даже меньшее количество времени. В некоторых вариантах реализации изобретения экспрессия активности обратной транскриптазы теломеразы сохраняется по меньшей мере 2 часа, по меньшей мере 4 часа, по меньшей мере 8 часов, по меньшей мере 12 часов, по меньшей мере 18 часов, по меньшей мере 24 часа, по меньшей мере 36 часов, по меньшей мере 48 часов или даже большее количество времени. В предпочтительных вариантах реализации изобретения экспрессия активности обратной транскриптазы теломеразы сохраняется не более 48 часов. В других предпочтительных вариантах реализации изобретения экспрессия активности обратной транскриптазы теломеразы сохраняется по меньшей мере 2 часа.
[00131] В некоторых вариантах реализации предложенных способов временная экспрессия не зависит от клеточного цикла.
[00132] Как отмечалось выше, временная экспрессия активности обратной транскриптазы теломеразы приводит к удлинению укороченных теломер в обрабатываемых клетках. Длину теломер легко можно определить такими методами как анализ длины терминального рестрикционного фрагмента (ТРФ), кПЦР, ММкПЦР и Q-FISH, как понятно специалисту в данной области техники. Сотрите, например, Kimura et al. (2010) Nat Protoc. 5:1596-607; doi:10.1038/nprot.2010.124. В некоторых вариантах реализации предложенных способов происходит увеличение длины теломер в обрабатываемых клетках по меньшей мере на 0,1 т.п.н., по меньшей мере на 0,2 т.п.н., по меньшей мере на 0,3 т.п.н., по меньшей мере на 0,4 т.п.н., по меньшей мере на 0,5 т.п.н., по меньшей мере на 1 т.п.н., по меньшей мере на 2 т.п.н., по меньшей мере на 3 т.п.н., по меньшей мере на 4 т.п.н., по меньшей мере на 5 т.п.н. или даже более.
[00133] Одним из преимуществ предложенных соединений, композиций и способов является скорость удлинения теломер, достигаемая при помощи этих способов. Указанные способы обеспечивают возможность кратковременного и, следовательно, безопасного лечения, так как нормальный защитный механизм, связанный с укорочением теломер, остается интактным большее количество времени. Лечение раскрытыми в данном документе соединениями и композициями приводит к доставке десятков или сотен копий модРНК TERT на клетку согласно измерениям при помощи абсолютно РВ-кПЦР, что существенно превышает количество копий эндогенной мРНК TERT, обнаруживаемое в клетках с высокой теломеразной активностью. Как правило, такие клетки содержат менее одной копии мРНК TERT на клетку. (Yi et al. (2001) Nucl. Acids Res. 29:4818-4825). Таким образом, лечение приводит к временному внесению большого количества копий модРНК, кодирующей TERT, в клетку, что приводит к быстрому удлинению теломер. Не привязываясь к теории, можно сказать, что большое количество копий модРНК, кодирующей TERT, может временно подавлять ингибиторный регуляторный механизм, который обычно препятствует настолько быстрому удлинению теломер при помощи TERT и других способов удлинения теломер, которое обеспечивают раскрытые в данном документе соединения, композиции и способы.
[00134] Временная экспрессия обратной транскриптазы теломеразы также приводит к повышению способности к репликации в обрабатываемых клетках. Повышение способности к репликации легко отслеживать в клетках, которые приближаются к репликативному старению, путем определения дополнительных удвоений популяции в таких клетках. Деление старых клеток невозможно стимулировать путем пассажа в культуре или обработки сывороткой. Кроме того, старые клетки часто характеризуются экспрессией активности рН-зависимой β-галактозидазы, экспрессией ингибиторов клеточного цикла р53 и р19 и другими измененными профилями генной экспрессии, а также увеличенным размером клеток. В отсутствие лечения соединениями и композициями согласно настоящему изобретению человеческие клетки легочных фибробластов, как правило, удваиваются 50-60 раз. При этом после применения серии из от одного до трех этапов обработки на протяжении всего нескольких дней для этих клеток наблюдали дополнительные 16-28 удвоений популяции. Повторная обработка через несколько недель снова обеспечивала дополнительный пролиферативный потенциал. Этот способ периодической обработки для периодического повторного удлинения теломер можно применять дополнительное количество раз с интервалами между обработками, которые будут зависеть от таких факторов, как скорость укорочения теломер, скорость деления клеток и степень удлинения теломер, которую обеспечивает обработка. Аналогично для человеческих микрососудистых дермальных эндотелиальных клеток, полученных от индивида преклонного возраста, в отсутствие предложенными композициями можно достичь только 1-2 удвоений популяции, в то время как для обрабатываемых клеток можно достичь 3, 4 и даже более удвоений популяции.
[00135] Соответственно, в некоторых вариантах реализации изобретения предложенные способы лечения увеличивают число удвоений популяции по меньшей мере на одно, два, четыре или даже более удвоений популяции. В некоторых вариантах реализации изобретения способы лечения увеличивают число удвоений популяции по меньшей мере на 5, 10, 15, 20 или даже более удвоений популяции.
[00136] В некоторых из вариантов реализации предложенных способов соединения или композиции согласно изобретению вводят в клетку животного путем электропорации. В конкретных вариантах реализации изобретения соединение согласно изобретению вводят в клетку животного путем электропорации в отсутствие носителя для доставки. В другом конкретном варианте реализации изобретения соединение согласно изобретению и РНК-компонент теломеразы вводят в клетку животного путем электропорации.
Наборы
[00137] В другом аспекте в настоящем изобретении предложены готовые к применению наборы для применения для удлинения теломер в клетках млекопитающих. Наборы содержат любые из вышеописанных соединений или композиций с прилагающимися инструкциями по их применению. В некоторых вариантах реализации изобретения наборы дополнительно содержат упаковочные материалы. В предпочтительных вариантах реализации изобретения упаковочные материалы являются воздухонепроницаемыми. В этих вариантах реализации изобретения упаковочные материалы, необязательно, могут быть наполнены инертным газом, таким как, например, азот, аргон и тому подобные. В некоторых вариантах реализации изобретения упаковочные материалы включают контейнер из металлической фольги, такой как, например, запечатанный алюминиевый пакет и тому подобное. Такие упаковочные материалы хорошо известны специалистам в данной области техники.
[00138] В некоторых вариантах реализации изобретения набор может дополнительно содержать осушитель, культуральную среду, ингибитор РНКазы или другие компоненты. В некоторых вариантах реализации изобретения набор может дополнительно содержать комбинацию из более чем одного из этих дополнительных компонентов. В некоторых вариантах реализации наборов композиция набора является стерильной.
Дополнительные аспекты
[00139] В еще одном аспекте в данном изобретении предложены новые соединения, композиции, наборы и способы в соответствии с нижеприведенными пронумерованными пунктами:
1. Композиция для удлинения теломер, содержащая:
рибонуклеиновую кислоту, содержащую по меньшей мере один модифицированный нуклеозид и кодирующую обратную транскриптазу теломеразы; и
носитель для доставки для рибонуклеиновой кислоты; при этом в клетке, обработанной композицией, происходит удлинение теломер.
2. Композиция по пункту 1, отличающаяся тем, что обратная транскриптаза теломеразы представляет собой обратную транскриптазу теломеразы млекопитающего, птицы, рептилии или рыбы или вариант, который сохраняет теломеразную каталитическую активность.
3. Композиция по пункту 2, отличающаяся тем, что обратная транскриптаза теломеразы представляет собой обратную транскриптазу теломеразы человека.
4. Композиция по пункту 1, отличающаяся тем, что рибонуклеиновая кислота содержит 5'-кэп, 5'-нетранслируемую область, 3'-нетранслируемую область и поли(А)-хвост.
5. Композиция по пункту 4, отличающаяся тем, что поли(А)-хвост повышает стабильность рибонуклеиновой кислоты.
6. Композиция по пункту 4, отличающаяся тем, что 5'-нетранслируемая область или 3'-нетранслируемая область содержит последовательность из стабильной мРНК или эффективно транслируемой мРНК.
7. Композиция по пункту 4, отличающаяся тем, что 5'-нетранслируемая область и 3'-нетранслируемая область обе содержат последовательность из стабильной мРНК или эффективно транслируемой мРНК.
8. Композиция по пункту 4, отличающаяся тем, что 5'-кэп, 5'-нетранслируемая область или 3'-нетранслируемая область стабилизирует рибонуклеиновую кислоту, повышает скорость трансляции рибонуклеиновой кислоты или модулирует иммуногенность рибонуклеиновой кислоты.
9. Композиция по пункту 1, отличающаяся тем, что по меньшей мере один модифицированный нуклеозид снижает иммуногенность рибонуклеиновой кислоты.
10. Композиция по пункту 1, отличающаяся тем, что рибонуклеиновая кислота представляет собой синтетическую рибонуклеиновую кислоту.
11. Композиция по пункту 10, отличающаяся тем, что синтетическая рибонуклеиновая кислота представляет собой очищенную синтетическую рибонуклеиновую кислоту.
12. Композиция по пункту 11, отличающаяся тем, что синтетическая рибонуклеиновая кислота очищена с целью удаления иммуногенных компонентов.
13. Композиция по пункту 1, отличающаяся тем, что рибонуклеиновая кислота кодирует обратную транскриптазу теломеразы человека, кошки, собаки, мыши, коровы, овцы, свиньи, африканского слона, курицы, крысы, данио, японской медаки или шимпанзе или полипептид, обладающий по меньшей мере 95% идентичности последовательности с обратной транскриптазой теломеразы.
14. Композиция по пункту 1, отличающаяся тем, что композиция дополнительно содержит РНК-компонент теломеразы.
15. Композиция по пункту 14, отличающаяся тем, что РНК-компонент теломеразы представляет собой РНК-компонент теломеразы млекопитающего, птицы, рептилии или рыбы.
16. Композиция по пункту 15, отличающаяся тем, что РНК-компонент теломеразы представляет собой РНК-компонент теломеразы человека.
17. Композиция по пункту 1, отличающаяся тем, что носитель для доставки представляет собой экзосому, липидную наночастицу, полимерную наночастицу, природную или искусственную липопротеиновую частицу, катионный липид, белок, комплекс белок-нуклеиновая кислота, липосому, виросому или полимер.
18. Композиция по пункту 17, отличающаяся тем, что носитель для доставки представляет собой катионный липид.
19. Композиция по пункту 1, отличающаяся тем, что носитель для доставки является неиммуногенным.
20. Способ удлинения теломер, включающий этап: введения композиции по любому из пунктов 1-19 в клетку животного, при этом происходит удлинение по меньшей мере одной теломеры в клетке.
21. Способ по пункту 20, отличающийся тем, что клетка содержит по меньшей мере одну укороченную теломеру перед этапом введения.
22. Способ по пункту 20, отличающийся тем, что клетка получена от субъекта, страдающего от или подверженного риску развития возрастного заболевания, возрастного патологического состояния или возрастного ухудшения функциональности или внешнего вида.
23. Способ по пункту 20, отличающийся тем, что клетка получена от субъекта, страдающего от или подверженного риску развития рака, заболевания сердца, инсульта, диабета, болезни Альцгеймера, остеопороза, ухудшения физических данных или внешнего вида, физической травмы или хронического физического стресса, или физиологической травмы или хронического физиологического стресса.
24. Способ по пункту 20, отличающийся тем, что клетка представляет собой соматическую клетку эндодермальной, мезодермальной или эктодермальной линии дифференцировки, или зародышевой линии, или эмбриональную клетку.
25. Способ по пункту 20, отличающийся тем, что клетка представляет собой индуцированную плюрипотентную стволовую клетку или клетку, применяемую для получения индуцированной плюрипотентной стволовой клетки.
26. Способ по пункту 20, отличающийся тем, что клетка представляет собой трансдифференцированную клетку или клетку, применяемую для получения трансдифференцированной клетки.
27. Способ по пункту 20, отличающийся тем, что клетка представляет собой выделенную клетку, а этап введения длится не более 48 часов.
28. Способ по пункту 20, отличающийся тем, что клетка представляет собой выделенную клетку, а этап введения осуществляют не более четырех раз.
29. Способ по пункту 20, отличающийся тем, что клетка представляет собой выделенную клетку, а способ дополнительно включает этап измерения теломеразной активности в клетке.
30. Способ по пункту 29, отличающийся тем, что этап введения приводит к повышению теломеразной активности в клетке.
31. Способ по пункту 30, отличающийся тем, что теломеразная активность временно повышается по меньшей мере на 5%.
32. Способ по пункту 30, отличающийся тем, что время полужизни повышенной теломеразной активности составляет не более 48 часов.
33. Способ по пункту 20, отличающийся тем, что клетка представляет собой выделенную клетку, а способ дополнительно включает этап измерения средней длины теломер в клетке.
34. Способ по пункту 33, отличающийся тем, что средняя длина теломер увеличивается по меньшей мере на 0,1 т.п.н.
35. Способ по пункту 20, отличающийся тем, что клетка представляет собой выделенную клетку, а способ дополнительно включает этап измерения потенциала удвоения популяции в клетке.
36. Способ по пункту 35, отличающийся тем, что потенциал удвоения популяции увеличивается по меньшей мере на 25%.
37. Способ по пункту 20, отличающийся тем, что клетка получена от млекопитающего субъекта.
38. Способ по пункту 37, отличающийся тем, что клетка получена от субъекта-человека.
39. Способ по пункту 20, отличающийся тем, что клетка представляет собой выделенную клетку.
40. Способ по пункту 20, отличающийся тем, что клетка не является выделенной клеткой.
41. Набор для удлинения теломер в клетке животного, содержащий: композицию по любому из пунктов 1-19; и инструкции по применению композиции для удлинения теломер.
42. Набор по пункту 41, дополнительно содержащий упаковочные материалы.
43. Набор по пункту 42, отличающийся тем, что упаковочные материалы являются воздухонепроницаемыми.
44. Набор по пункту 42, отличающийся тем, что упаковочные материалы включают контейнер из металлической фольги.
45. Набор по пункту 41, дополнительно содержащий осушитель.
46. Набор по пункту 41, дополнительно содержащий культуральную среду.
47. Набор по пункту 41, дополнительно содержащий ингибитор РНКазы.
48. Набор по пункту 41, отличающийся тем, что композиция является стерильной.
[00140] Для специалиста в данной области техники совершенно очевидно, что в отношении описанных в данном документе соединений, композиций, способов и наборов можно реализовывать другие подходящие модификации, не отступая при этом от объема изобретения или любого варианта его реализации. После подробного описания настоящего изобретения более четкое его понимание обеспечат нижеприведенные Примеры, которые включены в данный документ исключительно в иллюстративных целях и не ограничивают данное изобретение.
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Высокоэффективное удлинение теломер в человеческих клетках с применением модифицированной мРНК, кодирующей теломеразу
[00141] Заболевания, связанные с недостаточным сохранением длины теломер, и необходимость в повышенной репликативной способности клеток для клеточной терапии и применений в биоинженерии мотивируют разработку безопасных способов удлинения теломер. Blackburn et al. (2010) Cancer Prev Res (Phila) 3:394-402; Calado et al. (2012) Leukemia 26:700-707; Alter et al. (2009) Blood 113:6549-6557; Mohsin et al. (2012) Journal of the American College of Cardiology doi:10.1016/j.jacc.2012.04.047. Доставка мРНК для временного повышения количества кодируемого мРНК белка для терапевтических применений облегчается путем внесения модифицированных нуклеозидов для снижения иммуногенности и повышения стабильности. Kariko et al. (2005) Immunity 23:165-175; Kariko et al. (2011) Nucleic Acids Res. 39:el42; doi:10.1093/nar/gkr695.
[00142] Чтобы быть терапевтически эффективным, лечение, направленное на удлинение теломер, в идеале должно быть неимуногенным; специфическим; его можно инициировать до того, как произойдет укорочение теломер до критически короткой длины, что приводит к нестабильности хромосом и повышенному риску развития рака (Wentzensen et al. (2011) Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 20:1238-1250; Calado et al. (2012) Leukemia 26:700-707; Artandi and DePinho (2010) Carcinogenesis 31:9-18); временным и периодическим, чтобы нормальный противораковый механизм, связанный с укорочением теломер, мог действовать практически непрерывно; эффективным даже в случае медленно делящихся клеток, таких как некоторые популяции клеток-предшественников и стволовых клеток; доставляемым in vitro и in vivo при помощи неиммуногенных носителей; и наконец, обеспечивающим количество дополнительных клеточных делений достаточное только для потенциального облегчения или предотвращения заболеваний, связанных с недостаточным сохранением теломер, или обеспечивающим достаточную амплификацию клеток для клеточной терапии или применений в биоинженерии. Существующие виды лечения, включая лечение при помощи небольших молекул, не отвечают всем этим критериям. Harley et al. (2011) Rejuvenation Res. 14:45-56. Вирусная доставка TERT, хотя и осуществима, но несет риск, связанный с инсерционным мутагенезом, и, таким образом, ее безопасность вызывает серьезные сомнения. Виды лечения, включающие постоянную сверхэкспрессию теломеразы, являются потенциально небезопасными, так как в клетке, содержащей онкогенную мутацию, связанную как с критическим укорочением теломер и обусловленной им нестабильностью хромосом (O'Sullivan and Karlseder (2010) Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11:171-181), так и с другой причиной, постоянная экспрессия теломеразы, как вследствие второй мутации, так и действия лекарственного препарата, может способствовать злокачественному развитию, стимулируя неограниченную пролиферацию. Artandi and DePinho (2010) Carcinogenesis 31:9-18; Ding et al. (2012) Cell 148:896-907.
[00143] Критериям безопасного удлинения теломер отвечает подход на основе РНК, чему способствует недавнее открытие, что некоторые нуклеозиды природного происхождения, которые можно обнаружить в РНК, повышают стабильность и снижают иммуногенность экзогенной РНК при доставке в клетки. Kariko et al. (2005) Immunity 23:165-175. Примеры таких нуклеозидов перечислены в Таблице 4. Не привязываясь к теории, можно сказать, что эти модифицированные версии канонических нуклеозидов могут приводить к тому, что толл-подобные рецепторы врожденной иммунной системы будут отличать эндогенную модРНК от чужеродной РНК, не содержащей эти нуклеозиды. Доставка в достаточной степени очищенной синтетической модРНК, содержащей эти неканонические нуклеозиды, в клетки приводит к повышению стабильности модРНК и временному повышению уровня белка, кодируемого мод РНК, при сниженном или отсутствующем иммунном ответе. Kariko et al. (2011) Nucleic Acids Res. 39:el42; doi:10.1093/nar/gkr695. Таким образом, доставка экзогенной модРНК представляет беспрецедентные возможности для применений, в которых требуется временная выработка белка. Например, биомиметики модРНК трансфицировали в фибробласты, перепрограммируя их таким образом в плюрипотентные стволовые клетки. Yakubov et al. (2010) Biochem. Biophys. Res. Commun. 394:189-193. Биомиметики модРНК также инъецировали мышам для эффективного лечения в модели дефицита белка легочного сурфактанта и для повышения уровней эритропоэтина и гематокрита. Kormann el al. (2011) Nat. Biotechnol. 29:154-157. Как описано выше, нуклеозиды, применяемые в модРНК, применяемой в данном документе, выбирали не только для повышения стабильности, но также для снижения или устранения иммуногенности, а также для повышения трансляционной эффективности РНК. Трансфекция дендритных клеток немодифицированной мРНК, кодирующей hTERT, хоть и приводит к повышению теломеразной активности в клетках, но также вызывает сильный hTERT-специфический цитотоксичный ответ Т-лимфоцитов. Saeboe-Larssen et al. (2002) Journal of Immunological Methods 259:191-203. Следовательно, подходы, в которых применяется немодифицированная РНК, скорее всего, являются неэффективными в отношении удлинения теломер в клетках.
[00144] Таким образом, доставку в клетки модРНК, кодирующей TERT, можно применять для временного повышения уровней белка TERT и теломеразной активности, которых достаточно для удлинения теломер и повышения способности к репликации до конечного количества. Повышение уровней теломеразной активности происходит достаточно быстро, чтобы сделать возможным лечение, направленное на удлинение теломер, краткосрочным и нечастым (смотрите Фигуру 1а и Фигуру 3).
[00145] Чтобы продемонстрировать возможности указанного подхода, синтезировали модРНК TERT, используя соотношения между каноническими и неканоническими нуклеозидами, которые обеспечивают стабильность, эффективную трансляцию и сниженную или отсутствующую иммуногенность. Yakubov et al. (2010) Biochem. Biophys. Res. Commun. 394:189-193; Kariko et al. (2011) Nucleic Acids Res. 39:el42; doi: 10.1093/nar/gkr695. Синтетическая модРНК содержит 5' и 3' НТО мРНК бета-глобина, которая характеризуется относительно большим временем полужизни. Для дополнительного повышения стабильности модРНК содержит длинный, 151-нуклеотидный поли(А)-хвост. Чтобы максимизировать соответствие длинной ДНК-матрицы TERT, применяемой для реакции in vitro транскрипции для получения РНК, ДНК-матрица получали при помощи подхода на основе плазмид, а не на основе ПЦР.
[00146] Чтобы отличить действительное удлинение теломер от выборки клеток с длинными теломерами из гетерологичной исходной популяции, синтезировали контрольную модРНК, которая кодирует каталитически неактивную форму TERT (CI TERT) с мутацией в одном остатке D712A, где один из триады металл-координирующих аспартатов в каталитическом сайте домена обратной транскриптазы замещен аланином, что приводит к утрате каталитической активности CI TERT, но сохранению ее структурной невредимости в той степени, которая позволяет связываться с матричной ДНК, и сохранению стабильности TERT в лизате ретикулоцитов. Wyatt (2009) "Structure-Function Analysis of the Human Telomerase Reverse Transcriptase" University of Calgary, Ph.D. Thesis (http://dspace.ucalgary.ca/bitstream/1880/47511/1/2009_Wyatt_PhD.pdf).
[00147] Человеческие фетальные легочные фибробласты MRC-5 были выбраны в качестве тестируемых клеток в этом примере, так как эти и другие штаммы человеческих фибробластов на протяжении десятилетий служили рабочим материалом в области изучения теломер и, следовательно, обеспечивают многочисленные данные для разработки экспериментального дизайна и анализа. Клетки MRC-5 также характеризуются относительно низкой эндогенной теломеразной активностью и демонстрируют укорочение теломер и в конечном итоге старение. Так как окислительный стресс повышает скорость укорочения теломер в клетках MRC-5 (von Zglinicki et al. (2000) Free Radie. Biol. Med. 28:64-74) и приводит к локализации TERT в цитоплазме, где она не может удлинять теломеры (Ahmed et al. (2008) J. Cell. Sci. 121:1046-1053), клетки культивировали в среде с 5% превышающим содержанием кислорода. Чтобы дополнительно увеличить вероятность успеха, клетки культивировали в среде, оптимизированной для выработки белка в клетках MRC-5 (Wu et al. (2005) Cytotechnology 49:95-107).
[00148] Эффективность удлинения теломер при помощи модРНК зависит от нескольких факторов, включая эффективность трансфекции, трансляции и сборки в функциональную теломеразу, а также способность по меньшей мере временно обходить экстенсивные механизмы посттрансляционной регуляции, которые ингибируют TERT и теломеразу во многих типах клеток, включая клетки MRC-5. Хотя эффективность трансляции при применении более мелких видов модРНК, таких как яЗФБ (0,8 т.п.н.), в клетках MRC-5, как правило превышает 90% даже при низких концентрациях модРНК (Фигура 6), открытая рамка считывания TERT является относительно крупной (3399 п. н.), вследствие чего конструкция модРНК TERT содержит НТО и поли(А)-хвост, что делает конструкцию даже более крупной (3751 п. н.). Однако, как показано на Фигуре 1b, как TERT, так и CI TERT были эффективно трансфицированы в клетки MRC-5 при помощи катионного липида (согласно данным РТ-ПЦР для мРНК, полученной в конце обработки из клеток MRC-5, обрабатываемых 1 мкг/мл модРНК TERT на протяжении 5 часов). Кроме того, доставка модРНК TERT или CI TERT модРНК приводила к эквивалентному и существенному (Р<0,03 и <0,01, соответственно) повышению количества белка, распознаваемого анти-TERT антителом, с размером приблизительно 122 кДа, что близко к оценочному размеру TERT, составляющему 127 кДа (Фигура 1e). Wick et al. (1999) Gene 232:97-106. Уровни белка измеряли методом количественного инфракрасного флуоресцентного вестерн-блоттинга. Уровни белка TERT существенно не отличаются для клеток, обработанных TERT, и клеток, обработанных CI TERT (n=3).
[00149] Для образования функциональной теломеразы TERT должна надлежащим образом свернуться и образовать комплекс по меньшей мере с TERC. Также теломераза подвергается сильной посттрансляционной регуляции, включая цитоплазматическую локализацию и ингибиторное фосфорилирование. Cifuentes-Rojas and Shippen (2012) Mutât. Res. 730:20-27; doi:10.1016/j.mrfmmm.2011.10.003. Действительно, не все клетки, экспрессирующие TERT, способны сохранять теломеры. Counter et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:14723-14728. Доставка модРНК TERT повышает теломеразную активность дозозависимым образом вплоть до максимума при концентрации, составляющей приблизительно 0,6 мкг/мл (смотрите Фигуру 7), а в последующих экспериментах использовали концентрацию 1 мкг/мл. Уровни теломеразной активности быстро повышались, но возвращались к базовым уровням в пределах приблизительно 48 часов, а модРНК CI TERT не приводила к изменению теломеразной активности (Фигура 1d). Теломеразную активность определяли при помощи анализа TRAPeze RT на основе кПЦР (n=3).
[00150] Так как посттрансляционная регуляция TERT частично опосредуется цитоплазматической секвестрацией в клетке цикл-зависимым образом, также исследовали субклеточную локализацию TERT в обработанных и необработанных клетках. Cifuentes-Rojas et al. (2011) Mutat. Res. doi:10.1016/j.mrfmmm.2011.10.003. В полном соответствии с результатами вестерн-блоттинга, иммуноцитохимия показала наличие многочисленного, хотя, возможно, ингибированного, белка, распознаваемого антителом к TERT, в необработанных клетках MRC-5, что приводит к трудностям в отличии эндогенной TERT от экзогенной (данные не показаны).
[00151] Клетки в пределах приблизительно 10 удвоений популяции (УП) в начале репликативного старения использовали для определения действия лечения при помощи модРНК TERT на длину теломер и способность к репликации. Решение использовать именно эти клетки основывалось по меньшей мере на двух факторах. Во-первых, клетки на этой стадии содержат относительно короткие теломеры, а так как теломераза удлиняет преимущественно короткие теломеры, в том числе в клетках MRC-5, обработка клеток на этой стадии должна приводить к более заметному и легко выявляемому эффекту. Britt-Compton et al. (2009) FEBS Lett. 583:3076-3080. Во-вторых, при обработке клеток на этой стадии снижается количество времени, необходимое для определения того, привела ли обработка к повышению способности к репликации. В существующих условиях репликативное старение начинается приблизительно через 50 У Π после получения клеток MRC-5 от поставщика (более подробно смотрите в разделе, описывающем Способы), поэтому было решено обрабатывать клетки приблизительно через 40 УП. Средняя длина теломер в клетках MRC-5 на этой стадии составляет приблизительно 5-7 т.п.н. в зависимости от истории культивирования и УП на момент получения от поставщика. Sitte et al. (1998) Free Radie. Biol. Med. 24:885-893; MacKenzie et al. (2000) Exp. Cell Res. 259:336-350.
[00152] При разработке дизайна схемы обработки принимали во внимания несколько факторов (Фигура 4а). Скорость удлинения теломер при вирусной транедукции TERT в клетки MRC-5 варьируется, но остается порядка около 0,2 т.п.н. на одно деление. MacKenzie et al. (2000) Exp. Cell Res. 259:336-350. Скорость укорочения теломер в клетках MRC-5 варьируется в зависимости от условий и практической реализации культивирования (Sitte et al. (1998) Free Radie. Biol. Med. 24:885-893; von Zglinicki et al. (2000) Free Radie. Biol. Med. 28:64-74), но соответствует приблизительно 0,1 т.п.н. на УП в атмосфере кислорода окружающей среды (Sitte et al. (1998) Free Radie. Biol. Med. 24:885-893). Клетки культивировали в 5% кислороде, так как теломеры клеток MRC-5 в окислительных условиях укорачиваются медленнее, von Zglinicki et al. (2000) Free Radie. Biol. Med. 28:64-74. Наблюдаемое время УП для клеток MRC-5 на этапе УП 40 составляло приблизительно 33 часа. Учитывая эти данные, можно ожидать, что понадобится многоразовая обработка, чтобы зарегистрировать удлинение теломер в пределах разрешения выбранных методов измерения длины теломер, а именно, анализа рестрикционного фрагмента теломер (РФТ) и количественной флуоресцентной in situ гибридизации (Q-FISH). Выбранный интервал между обработками составил 48 часов, так как было обнаружено, что за это время уровни теломеразной активности возвращаются к базовому уровню после единичной обработки.
[00153] Как показано на Фигурах 3(b)-(d), обработка клеток MRC-5 модРНК hTERT приводит к существенному увеличению длины теломер в этих клетках по сравнению как с необработанными клетками, так и обработанными одним средством доставки. На флуоресцентных микрофотографиях метафазных клеток MRC-5 после обработки показано расположение теломерного зонда в хромосомах этих клеток (Фигура 4(e)).
[00154] Влияние обработки на длину теломер определяли также методом количественной флуоресцентной in situ гибридизации (Q-FISH) (Фигура 4(f)), так как этот метод обеспечивает относительно высокое разрешение (0,3 т.п.н.) и так как флуоресценция теломерных зондов Q-FISH прямо пропорциональна длине теломер. Lansdorp et al. (1996) Hum. Mol. Genet. 5:685-691; Martens et al. (1998) Nat. Genet. 18:76-80. Так как способность к репликации является функциональным параметром, повышение которого в результате удлинения теломер представляет наибольший интерес, строили стандартную кривую зависимости количества удвоения популяции клеток MRC-5 от длины теломер, определенной методом Q-FISH (Фигура 4(g)(i)). После трех обработок УП 40 MRC-5 при помощи мРНК TERT с 48-часовыми интервалами средняя общая длина теломер на клетку увеличивалась на 56+/-5% (n=15 клеток для каждой из двух биологических реплик на каждом этапе обработки; «усы» представляют s.e.m.). Длина теломер в обработанных клетках УП 40 была сходна с длиной в необработанных клетках УП 3 (Фигура 4(g)(ii)) (верхняя пунктирная линия), и таким образом, обработка приводит к удлинению теломер на величину их укорочения в этих клетках за 37 УП. При таком количестве УΠ в стандартных культуральных условиях теломеры MRC-5 укорачиваются на >1 т.п.н. Sitte et al. (1998) Free Radie. Biol. Med. 24:885-893. В соответствии с этим, наблюдаемое увеличение длины теломер на 56% соответствует увеличению средней длины теломер, составляющему приблизительно 0,6-2,5 т.п.н. на основании факта, что клетки MRC-5 на этапе УП 40 характеризуются средней длиной теломер 5-7 т.п.н. согласно данным РФТ (Sitte et al. (1998) Free Radie. Biol. Med. 24:885-893; MacKenzie et al. (2000) Exp. Cell Res. 259:336-350), что превышает длину теломер приблизительно на 2,5-4 т.п.н., и, следовательно, фактическая средняя длина теломер в клетках MRC-5 на этапе УП 40 соответствует диапазону 1-4,5 т.п.н. Aubert et al. Mutat. Res. 730:59-67. Так как общее время обработки составляет 144 часа, а время удвоения популяции клеток составляло приблизительно 33 ч, за это время произошло приблизительно 4-5 УП клеток. Таким образом, скорость удлинения теломер составила приблизительно 0,1-0,6 т.п.н. на УП, при этом верхний диапазон соответствует максимальной скорости, которую когда-либо регистрировали после вирусной транедукции ДНК, кодирующей TERT, а нижний диапазон сопоставим с типичной скоростью, наблюдаемой при вирусной доставке. Как и ожидалось, длина теломер в необработанных клетках такая же, как и в УП 40 клетках во время получения стандартной кривой (нижняя пунктирная линия на Фигуре 4(g)).
[00155] После этого исследовали влияние обработки мРНК TERT на способность клеток к репликации. Как и ожидалось, необработанные клетки и клетки, обработанные только носителем, старели в пределах стандартного диапазона в 50-60 УП (Фигура 5а). В отличие от них, клетки, обработанные мРНК TERT, продолжали дозозависимым образом пролиферировать после УП, при котором контрольные популяции достигали репликативного старения, при этом каждая дополнительная обработка обеспечивала существенное количество дополнительных УП.
[00156] Три обработки мРНК TERT приводили к повышению способности к репликации, составляющему 28+/-1,5 УП. Этот результат согласуется с оценкой, согласно которой удлинение теломер составило >1 т.п.н., так как теломеры MRC-5 укорачиваются приблизительно на 0,1 т.п.н. за УП (Sitte et al. (1998) Free Radie. Biol. Med. 24:885-893) в атмосфере кислорода окружающей среды (20%), а обрабатываемые клетки культивировали в 5% кислорода, при этом теломеры укорачиваются медленнее. Наблюдаемое увеличение реплйкативной способности обрабатываемых клеток, составляющее 28 УП, соответствует утрате реплйкативной способности, которая наступает для человеческих фибробластов за более чем десять лет нормального человеческого старения. Takubo et al. (2010) Geriatr Gerontol Int. 10 Suppl 1:S197-206; doi:10.1111/j.1447- 0594.2010.00605.x.; Allsopp, R. C. et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:10114-10118.
[00157] Для терапевтических применений важно то, что все обрабатываемые клетки, изучаемые к настоящему времени, в конечном итоге старели, и в действительности старели за меньшее количество УП, чем необработанные клетки с такой же длиной теломер, что можно было ожидать, так как обработанные клетки прошли десятки дополнительных УП по сравнению с необработанными клетками с теломерами аналогичной длины, во время которых происходило накопление повреждений ДНК, не связанных с теломерами, или других повреждений, которые могут влиять на скорость укорочения теломер или каким-либо другим образом способствовать индукции репликативного старения.
[00158] После того, как клетки MRC-5 достигают и входят в период репликативного старения, они увеличиваются в несколько раз по сравнению с диаметром, характерным для ранних пассажей (Фигура 8а). Как и в случае репликативного старения, это преобразование было замедлено в клетках, обработанных модРНК TERT, но не в клетках, обработанных модРНК CI TERT или одним носителем (Фигура 8b).
[00159] В соответствии с тем, что модРНК CI TERT не приводит к повышению теломеразной активности (Фигура 1d), обработка при помощи модРНК CI TERT не изменяет распределение длины теломер по сравнению с необработанными клетками, и также модРНК CI TERT не повышает способность к репликации, несмотря на то, что она приводит к повышению уровня белка TERT, эквивалентному тому, которое обеспечивает модРНК TERT (Фигура 1с). Так как единственной разницей между TERT и CI TERT является замещение в одном остатке, которое лишает CI TERT способности переносить нуклеотиды в теломеры, эти результаты подтверждают гипотезу, что увеличение длины теломер и способности к репликации, наблюдаемое в клетках, обработанных модРНК TERT, происходит действительно вследствие удлинения теломер по меньшей мере в некоторых из обработанных клеток, а не выборки клеток с более длинными теломерами из предсуществующей подпопуляции.
[00160] Результаты этого примера демонстрируют, что доставка модРНК TERT в человеческие клетки временно повышает теломеразную активность, приводит к быстрому удлинению теломер и повышает способность к репликации до конечного и, следовательно, безопасного предела. Очищенные биомиметики модРНК также являются гипоиммуногенными. Kariko et al. (2011) Nucleic Acids Res. 39:el42; doi:10.1093/nar/gkr695. Таким образом, доставка модРНК соответствует нескольким важным критериям для терапевтического лечения, включающего удлинение теломер, и также является перспективной в отношении других критериев, включая специфичность, нацеленную доставку и способность преодолевать посттрансляционную регуляцию. В контексте специфичности сверхэкспрессия TERT также может оказывать влияние на другие гены, такие как Wnt (Park et al. (2009) Nature 460:66-72), но такого влияния можно избежать путем доставки модРНК, кодирующей TERT с мутациями в участках связывания факторов, которые опосредуют любые такие неспецифические эффекты. В контексте доставки недавнее открытие того, что в организме человека модРНК транспортируется в экзосомах между клетками посредством крови и других жидкостей организма, делает возможной доставку модРНК с применением экзосом для удлинения теломер и других применений. Lakhal and Wood (2011) Bioessays 33:737-741. Экзосомы успешно использовали для доставки миметиков модРНК в клетки in vitro (данные не показаны). В контексте посттрансляционной регуляции зависимой и независимой от клеточного цикла ингибиторной посттрансляционной регуляции TERT можно избежать путем доставки мод РНК, кодирующей TERT с мутациями в одном или более известных участков, которые опосредуют такую активность, таких как последовательность ядерного экспорта, или путем совместной доставки модРНК, кодирующей другие компоненты теломеразных или теломерных комплексов. Эти подходы делают возможным удлинение теломер даже в медленно делящихся или неделящихся клетках, что делает лечение при помощи модРНК TERT подходящим для покоящихся или медленно делящихся популяций стволовых клеток и клеток-предшественников. Таким образом, удлинение теломер на основе модРНК находит непосредственное применение в повышении способности к репликации клеток для исследований и дополнительно для клеточной терапии, применений в биоинженерии и, in vivo лечении, которое направлено на заболевания и патологические состояния, связанные с нарушением сохранения теломер.
[00161] Подводя итог, следует отметить, что модРНК, кодирующую обратную транскриптазу теломеразы (TERT) человека, доставляли в человеческие легочные фибробласты MRC-5 три раза на протяжении 96 часов. Для теломер в обработанных клетках наблюдали удлинение на>1 т.п.н., которое соответствует величине укорочения теломер фибробластов в среднем за более чем десять лет старения человека. Takubo et al. (2010) Geriatr Gerontol Int. 10 Suppl 1:S197-206; doi:10.1111/j.1447-0594.2010.00605.x. Теломеразная активность возвращается к уровням, наблюдаемым до обработки, а начало репликативного старения в обработанных клетках было отложено приблизительно на 30 удвоений популяции и зависело от дозы. Таким образом, доставка РНК теломеразы, содержащей модифицированные нуклеозиды, в клетки обеспечивает быстрый и гипоиммуногенный или неиммуногенный способ, а применение РНК является целесообразным подходом для удлинения теломер для разнообразных применений.
СПОСОБЫ
[00162] Генерация и синтез матрицы модРНК. Открытую рамку считывания (ОРС) человеческой TERT дикого типа (ДТ), используемую для генерации ДНК-матриц для синтеза модРНК и идентичную стандартной последовательности NCBI-варианта 1 транскрипта человеческой TERT NM 198253.2, генерировали путем внесения модификации G516D в ОРС плазмиды pBABE-neo-hTERT (плазмида Addgene 1774). Остаток 516 находится в мотиве QFP N-концевого удлинения TERT, мотиве, который связывают с мультимеризацией и РНК-связыванием TERT. Каталитически неактивный мутант TERT (CI TERT) генерировали из последовательности ДТ TERT путем введения мутации D712A. ОРС TERT, ДТ и CI, вставляли в MCS (участок множественного клонирования) исходной плазмиды, содержащей промотор Т7, 5' НТО человеческого бета-глобина (hBB), MCS, 3' НТО hBB, 151 п.н. поли(А)-последовательность и рестрикционный сайт для линеаризации с ферментом класса IIs за поли(А)-последовательностью. Полученную в результате промежуточную плазмиду секвенировали по меньшей мере в четырех повторах, чтобы гарантировать соответствие, линеаризовали и транскрибировали в кэпированную РНК при помощи РНК-полимеразы из набора MEGAscript Т7 (Ambion, Austin, Texas) и специальной нуклеотидной смеси из канонических и неканонических нуклеотидов (TriLink BioTechnologies), в которой конечные концентрации нуклеотидов на 40 мкл IVT реакции составляли 7,5 мМ для каждого из аденозин-5'-трифосфата (АТР), 5-метилцитидин-5'-трифосфата (т5С) и псевдоуридин-5'-трифосфата (ψ), 1,5 мМ для гуанозин-5'-трифосфата (GTP) и 6 мМ для кэп-аналога (ARCA, NEB), что соответствовало молярному соотношению ATP:m5C:ψ:GTP:ARCA of 1:1:1:0.2:0,8. Для дополнительного снижения потенциальной иммуногенности мРНК, связанной с 5'-3Р-несущей фракцией (-20% от общего количества), продукты IVT обрабатывали фосфатазой (антарктическая фосфатаза, NEB). Размер и структурную целостность продуктов модРНК подтверждали при помощи денатурирующего арагозного гель-электрофореза.
2
[00163] Клетки и клеточные культуры. Человеческие фетальные легочные фибробласты MRC-5 (АТСС CCL-171) получали от АТСС в пассаже 14, что является текущим номером пассажа в их товарной описи. Так как АТСС не указывает номер УП, приведенные в данном документе значения УП относятся к количеству УП после получения клеток от АТСС, которое соответствует УП 0. Для укорочения теломер в препарате для экспериментов по удлинению теломер клетки культивировали, используя руководства АТСС, в DMEM с 10% ФБС в кислородной атмосфере окружающей среды и 5% СО. Обработку, направленную на удлинение теломер, начинали приблизительно на этапе УП 40 после получения клеток от АТСС. По меньшей мере за 48 часов до начала обработки модРНК клетки переносили в среду с 5% кислорода и DMEM, содержащую 20% ФБС и пенициллин-стрептомицин. Клетки обрабатывали по меньшей мере через 24 часа после посева и за 24 часа до обработки трипсином.
[00164] Трансфекция модРНК. Клетки трансфицировали при помощи 0,4 нМ модРНК TERT и 2,0 нМ РНК TERC, если не указано иное, используя катионный липид Lipofectamine RNAiMax (Invitrogen), в восстановленной сывороточной среде Opti-MEM (Invitrogen) на протяжении 4-5 часов, после чего их возвращали в нормальную среду.
[00165] Определение теломеразной активности. Через 24 часа после начала трансфекционного периода клетки промывали ФСБ, обрабатывали трипсином, таблетировали при 500 г на протяжении 5 мин и промывали ФСБ, повторно таблетировали, а затем лизировали, следуя инструкциям из набора TRAPeze RT (Millipore). Этапы обратной транскрипции и кПЦР проводили при помощи Roche LightCycler 480 II и ABI 7900 HT. Теломеразную активность образцов всегда сравнивали с эталонным стандартом, прилагающимся к набору, так как кратность увеличения оказалась очень изменчивой, возможно, вследствие низкой теломеразной активности в клетках MRC-5.
[00166] Иммуноцитохимия. Через 24 часа после начала трансфекционного периода клетки промывали ФСБ, фиксировали в 2% параформальдегиде на протяжении 20 минут, промывали три раза ФСБ, блокировали в ФСБ, содержащем 7,5% БСА и 0,1% Тритон Х-100 на протяжении 1 часа, промывали три раза, инкубировали на протяжении ночи при 4°С в шейкере с анти-TERT антителом (АВСАМ 32020 при 1:50 или Rockland 600-401-252S при 1:500) в ФСБ с 5% БСА, промывали три раза, инкубировали на протяжении одного часа с вторичным антителом, промывали два раза, а затем еще два раза в шейкере по 3 минуты каждый раз, затем инкубировали в 0,1 мкг/мл DAPI на протяжении 3 минут и промывали четыре раза в ФСБ.
[00167] Проточная цитометрия. Клетки обрабатывали 0,5-1,5 мкг/мл модРНК TERT, а контрольные образцы обрабатывали трипсином через 22 часа после начала трансфекции, промывали, фиксировали в 2% параформальдегиде, пермеабилизировали в 7,5% БСА с 0,1% Тритон Х-100 на протяжении 20 мин, промывали три раза ФСБ, блокировали в 7,4% БСА на протяжении 1 ч, инкубировали с анти-TERT антителом (АВСАМ 32020 при 1:50) в ФСБ с 5% БСА, промывали три раза, инкубировали с вторичным антителом (1:200) в ФСБ, затем промывали три раза и перерастворяли в буфере F АС S и анализировали на проточном цитометре Accuri С6 (Becton Dickinson). Среднюю величину флуоресценции рассчитывали как среднюю флуоресценцию по всем клеткам в обработанных и контрольных образцах. Данные анализировали при помощи программного обеспечения CFlow.
[00168] РВ-ГЩР. Всю РНК собирали при помощи набора RNeasy Mini kit (Qiagen) и конвертировали в кДНК, используя набор High-Capacity RNA-to-cDNA Kit (Invitrogen). кДНК амплифицировали при помощи ПЦР, используя нижеприведенные праймеры:
hTERT-F: 5'-GCCCTCAGACTTCAAGACCA (SEQ ID NO: 1)
3'-hBB-R: 5'-AGGCAGAATCCAGATGCTCA (SEQ ID NO: 2)
GAPDH-F: 5'-GTGGACCTGACCTGCCGTCT (SEQ ID NO: 3)
GAPDH-R: 5'-GGAGGAGTGGGTGTCGCTGT (SEQ ID NO: 4)
[00169] Вестерн-блоттинг. Белок собирали путем промывания клеток один раз ФСБ и последующего лизиса клеток в буфере RIPA. Белок проводили через Трис-ацетатные гели NuPAGE No vex, переносили на ПВДФ мембрану на 2 ч при 35 В, затем гибридизировали с анти-альфа тубулином (Sigma при 1:10000) и анти-TERT антителом (АВСАМ 32020 при 1:1000 или Rockland 600-401-252S при 1:500) на протяжении ночи при 4°С. Вторичную детекцию проводили при помощи инфракрасных (680 нм и 800 нм) антител (LI-COR) и устройства для визуализации Odyssey (LI-COR). Изображения анализировали при помощи Image J.
[00170] Q-FISH. Клетки инкубировали в 0,1 мкг/мл колцемида на протяжении 4 часов перед фиксацией и подготовкой метафазных пластинок после процедуры согласно Lansdorp et al.41. Затем препараты окрашивали при помощи Telomere PNA FISH Kit/FITC kit (Dako, Denmark), заменяя AlexaFluor 555-меченым теломерным зондом (Bio-Synthesis, USA) зонд из набора. Каждую клетку визуализировали на микроскопе DeltaVision (Applied Precision, Inc., Washington) при помощи программного обеспечения SoftWoRx, используя 60Х или 100Х масляный объектив с интервалами 0,2 мкм в 3-мкм диапазоне, используя механизированный предметный столик, и специальное программное обеспечение применяли для определения изображения, на котором каждое теломерное пятно находилось в фокусе, и определения его интенсивности на этом сфокусированном изображении. Временные изменения интенсивности освещения компенсировали, используя фотосенсор DeltaVision, который регистрировал интенсивность освещения каждого изображения, а изменение пространственной интенсивности, темновой ток ПЗС и ошибку считывания компенсировали, получая изображения с плоским полем и изображения с темным полем, соответственно. В каждую реплику входил материал по меньшей мере 15 метафазных клеток, а измерения для каждого образца проводили по меньшей мере дважды в по меньшей мере двух отдельных экспериментах.
[00171] Кривые роста. Клетки собирали и пересчитывали на гемоцитометре, так как автоматизированный счетчик не мог точно сосчитать клетки посте того, как популяция становилась гетерогенной в отношении диаметра, когда популяция входила в фазу репликативного старения. Изображения получали для того, чтобы оценить диаметр клеток. УП рассчитывали как log2 соотношения количества клеток в конце и в начале каждого культурального периода между пассажами.
[00172] Статистика. Статистический анализ проводили при помощи Microsoft Excel. «Усы» представляют среднее ± s.e.m. Сравнение длины теломер проводили, используя Т-критерий, при этом Ρ<0,05 (двухсторонний) считали статистически значимым.
Пример 2. Действие обработки модРНК TERT на человеческие эндотелиальные клетки
[00173] Действие обработки модРНК TERT не ограничивается клетками фибробластов. Как показано на Фигуре 9, человеческие микрососудистые дермальные эндотелиальные клетки («HMDEC») характеризуются типичными кривыми удвоения с ранним началом старения, которое приходится приблизительно на пассаж #12, а полное старение клеток приходится на пассаж #17. Как показано на Фигуре 10, обработка этих клеток в пассаже #18 модРНК hTERT дикого типа (правый столбик в каждой группе) приводит к обращению старения, в то время как контрольная обработка (левый столбик в каждой группе) или обработка мутантной модРНК hTERT (средний столбик в каждой группе) не оказывает влияние на клеточное старение.
[00174] Фигура 11 иллюстрирует влияние разных видов обработки на рост HMDEC. В частности, клетки, трижды обработанные модРНК TERT дикого типа (ДТ) между пассажем #10 и пассажем #11, продолжали расти, в то время как необработанные клетки (НК), клетки, обработанные только носителем (ТН), и клетки, обработанные каталитически неактивной TERT (CI), прекращали удваиваться.
[00175] Фигура 12 иллюстрирует результаты окрашивания β-галактозидазой (bГАЛ) HMDEC в пассаже #14 после обработки модРНК ДТ и CI. Это окрашивание позволяет определить активность β-галактозидазы при рН 6, которая присуща старым клеткам и не свойственна предстарым, покоящимся или иммортальным клеткам. Смотрите Dimri et al. (1995) Proc. NaflAcad. Sci. USA 92:9363-7.
СПОСОБЫ
5
[00176] Кумулятивную популяционную кривую удвоения HMDEC строили на основании формата 12-луночного планшета. Для каждой временной точки приблизительно 10 HMDEC пересевали в трех репликах и проводили подсчет клеток на 4 день после предыдущего пересева. Как показано на Фигуре 9, пассаж #12 был определен как ранняя точка начала старения HMDEC.
5
[00177] Как показано на Фигуре 10, приблизительно 105 HMDEC трансфицировали дважды через день при помощи 0,75 мг модРНК, кодирующих hTERT-CI и -ДТ в присутствии только носителя (ТО, RNiMAX) в качестве контроля. Подсчет клеток проводили в пассажах #19, 20 и 21 каждый раз на 5 день после пересева. [00178] В эксперименте, проиллюстрированном на Фигуре 11, в интервале между пассажами #10 и #11 (как отмечалось выше, пассаж #12 соответствует раннему началу старения HMDEC), приблизительно 5x10 HMDEC на 75 см пробирку культивировали на среде ЕВМ-2, обогащенной EGM-2 MV (оба компонента от Lonza, Walkersville, MD USA, номер в каталоге СС-3156 и СС-4176, соответственно). Микрососудистые клетки трансфицировали трижды через день при помощи 5 мкг модРНК, кодирующих hTERT-WT (ДТ) и hTERT-CI (CI) в присутствии необработанных (НО) и обработанных только носителем (ТО, RNAiMAX) контрольных пробирок. Для каждой временной точки высевали 5×10 клеток и, начиная с пассажа #11, проводили подсчет клеток при помощи гемоцитометра на 5 день после пересева. Для каждой временной точки каждые экспериментальные условия повторяли трижды.
5
[00179] В экспериментах, проиллюстрированных на Фигуре 12, приблизительно 10 каждых HMDEC из НО, hTERT-CI и hTERT-WT из пассажа #14 обрабатывали, как описано на Фигуре 10. Затем клетки подвергали анализу старения клеток на основании гистохимического окрашивания в отношении активности β-галактозидазы при рН 6 при помощи набора для гистохимического окрашивания стареющих клеток (Sigma, номер в каталоге CS0030). Слева приведены типовые изображения необработанных (НО) клеток и клеток, обработанных модРНК hTERT-CI (CI) или hTERT-WT (ДТ). Все изображения были получены в одинаковых условиях получения изображений. Каждые экспериментальные условия повторяли трижды, а процентное содержание клеток, положительных в отношении активности β-галактозидазы (как представлено на графике), для каждых условий рассчитывали как среднее по положительным клеткам по трем случайно выбранным участкам.
Пример 3. Дополнительные характеристики действия обработки модРНК TERT на человеческие клетки
[00180] В этом примере мРНК трансфицировали при помощи катионного липида в первичные человеческие фибробласты и миобласты (Фигура 13А) - клетки, которые, как известно, имеют ограниченный пролиферативный потенциал. Webster and Blau (1990) Somat Cell Mol Genet. 16:557-565; Hayflick and Moorhead (1961) Exp Cell Res. 25:585-621; Yakubov et al. (2010) Biochem Biophys Res Commun. 394:189-193. Эффективность трансфекции определяли методом проточной цитометрии при помощи количественной оценки флуоресценции единичной клетки после доставки мРНК ЗФБ, которая показала, что большинство клеток (>90%) были трансфицированы даже при относительно низких концентрациях модифицированной мРНК (0,1 мкг/мл) (Фигура 13В и Фигура 16А-С). Обработка клеток одинаковыми концентрациями экзогенной мРНК TERT или мРНК, кодирующей каталитически неактивную (CI) форму TERT, приводила к интернализаций одинаковых количеств мРНК (Фигура 16D) согласно данным РВ-кПЦР через 24 ч после первой обработки. CI TERT содержит замещающую мутацию в одном из триады металл-координирующих аспартатов в каталитическом сайте домена обратной транскриптазы TERT. В результате CI TERT не может добавлять нуклеотиды к теломерам, оставаясь при этом структурно интактной и способной связываться с матричной ДНК, а также проявляет стабильность по сравнению с TERT дикого типа в лизатах ретикулоцитов. Wyatt (2009) Structure-Function Analysis of the Human Telomerase Reverse Transcriptase. Обработка мРНК как TERT, так и CI TERT не влияла на уровни эндогенной мРНК TER Τ по сравнению с необработанными клетками согласно данным РВ-кПЦР (Фигура 16Е). Трансфекция 1 мкг/мл мРНК TERT или CI TERT приводила к одинаковому 50% повышению (Р<0,05 и <0,01, соответственно) количества белка TERT в фибробластах (Фигура 13С, левая панель). Wick et al. (1999) Gene. 232:97-106; Ahmed et al. (2008) J Cell Sci. 121:1046-1053. Присутствие эндогенного белка TERT в клетках со слабой эндогенной теломеразной активностью согласуется с относительно большим количеством неактивных сплайс-вариантов TERT во многих типах клеток и экстенсивной посттрансляционной ингибиторной регуляцией активности TERT, как сообщалось ранее. Yi et al. (2001) Nucleic Acids Res. 29:4818-4825; Cifuentes-Rojas and Shippen (2011) Mutat Res. [опубликованная он-лайн перед печатью: 18 октября, 2011 г.]; doi:10.1016/j.mrfmmm.2011.10.003. Обработка возрастающими количествами мРНК TER Τ приводила к дозозависимому повышению экспрессии белка TERT согласно данным одноклеточного анализа методом проточной цитометрии (Фигура 13С, правая панель).
[00181] Теломеразная активность повышается временно. Чтобы исследовать, приводит ли доставка модифицированной мРНК TERT к генерации функционального белка TERT, проводили количественную оценку теломеразной активности методом гель-анализа TRAP. Теломеразную активность зарегистрировали в фибробластах и миобластах для всех исследуемых доз мРНК TERT (0,25, 0,5, 1,0 и 2,0 мкг/мл), и не зарегистрировали в необработанных клетках или клетках, обработанных только носителем или модифицированной мРНК, кодирующей CI TERT, даже в случае самой высокой дозы в 2,0 мкг/мл (Фигура 13D). Хотя для образования функционального теломеразного комплекса TERT требует участия TERC, доставки одной TERT было достаточно для повышения теломеразной активности, что согласуется с ранее полученными данными, что TERT часто служит ограничителем, так как количество копий РНК TERC во многих клетках с отсутствующей теломеразной активностью, включая фибробласты, является большим. Yi et al. (2001) Nucleic Acids Res. 29:4818-4825. Исследования в динамике по времени показали, что теломеразная активность достигает пика через 24 часа и возвращается к базовой линии в пределах 48 часов после единичной трансфекции. Эти временные рамки согласуются с более ранее опубликованными данными по временам полужизни человеческой мРНК TERT (2-4 ч), человеческой мРНК β-глобина (17-18 ч: экзогенная мРНК TER Τ фланкируется 5' и 3' НТО β-глобина) и теломеразной активности в клетках в присутствии ингибитора синтеза белка (зависит от типа клеток, но, как правило, >24 ч). Kabnick and Housman (1988) Mol Cell Biol. 8:3244-3250; Holt et al. (1997) Proc Natl Acad Se i USA. 94:10687-10692; Xu et al. (1999) Br J Cancer. 80:1156-1161.
[00182] Удлинение теломер. Длина теломер в необработанных фибробластах уменьшалась со временем (3 месяца), как и ожидалось (62) (Фигура 14А), а ее количественную оценку проводили двумя разными способами. Монохромный мультиплексный метод кПЦР (ММкПЦР) применяли для оценки длины, а результаты измерений проверяли на достоверность методом кПЦР, проводимым SpectraCell Laboratories, Inc. (коэффициент корреляции 0,97, Ρ<0,001). Последовательная трехразовая доставка мРНК TERT с 48-часовыми интервалами в фибробласты и миобласты, начиная с удвоения популяции (УП) 25 и 6, соответственно, приводила к удлинению теломер на 0,9±0,1 т.п.н. (22±3%) и 0,7±0,1 т.п.н. (12±2%), соответственно (Фигура 14В, С). Обработка только носителем или мРНК CI TERT не оказывала существенного влияния на длину теломер по сравнению с необработанными клетками. Средняя скорость удлинения теломер в фибробластах составила 135±15 п. н./УП.
[00183] Повышение пролиферативного потенциала в зависимости от типа клеток. Чтобы исследовать влияние доставки модифицированной мРНК TERT и последующего удлинения теломер на пролиферативный потенциал клеток, человеческие фибробласты последовательно трансфицировали один, два или три раза. Обработку осуществляли в 48-часовыми интервалами. Необработанные, обработанные только носителем и обработанные мРНК CI TERT выходили на одинаковое плато в отношении числа клеток приблизительно через 50-60 УП, в то время как клетки, трижды обработанные мРНК TERT, продолжали пролиферировать до конечных дополнительных 28±1,5 УП с общим увеличением числа клеток, на 2,7×10 превышающим необработанные клетки (Фигура 14D, левая панель). Данный эффект был дозозависимым, а каждая дополнительная обработка обеспечивала дополнительные УП (Фигура 14D, правая панель). Пошаговое повышение пролиферативного потенциала было большим в случае первой обработки, чем в случае второй или третьей обработки. Человеческие миобласты, которые три раза последовательно обрабатывали каждые 48 часов, достигали 3,4±0,4 УП, что соответствует 10-кратному увеличению числа клеток по сравнению с необработанными или обработанными только носителем контрольными образцами (Фигура 14Е). Такая разница в УП между миобластами и фибробластами не является неожиданной, так как в предыдущих исследованиях было обнаружено то же самое ограниченное несколькими УП действие сверхэкспрессии TERT и показано, что это ограничение связано с р16-опосредованной блокировкой роста в человеческих миобластах в отличие от фибробластов. Bodnar et al. (1998) Science. 279:349-352; Zhu et al. (2007) Aging Cell. 6:515-523. Как в фибробластах, так и в миобластах один носитель или мРНК CI TERT не оказывали влияние на пролиферативный потенциал по сравнению с необработанными контрольными образцами. Эти данные демонстрируют, что доставка модифицированной мРНК TER Τ является эффективным способом увеличения числа УП в культуре. Важно отметить, что, все исследуемые обработанные клетки демонстрировали существенное увеличение числа клеток, но в итоге кривые их роста выходили на плато, демонстрируя отсутствие иммортализации.
[00184] Временное снижение количества маркеров старения. Так как рост популяций фибробластов прекращался, они демонстрировали наличие маркеров старения, включая ассоциируемое со старением окрашивание β-галактозидазой (β-гал) и увеличение в размерах (Фигура 15А-С). Cristofalo and Kritchevsky (1969) Med Exp IntJExp Med. 19:313-320; Dimri et al. (1995) Proc Natl Acad Sci USA. 92:9363-9367; Cristofalo et al. (2004) Mech Ageing Dev. 125:827-848; Lawless et al. (2010) Exp Gerontol. 45:772-778. Эти изменения временно снижались в фибробластах, обработанных мРНК TERT по сравнению с необработанными клетками и клетками, обработанными мРНК CI TERT или только носителем. В соответствии с известными по другим работам данными, не все клетки в популяции, которые вышли на плато роста демонстрировали экспрессию β-галактозидазы на определяемых уровнях. Lawless et al. (2010) Exp Gerontol. 45:772-778; Binet et al. (2009) Cancer Res. 69:9183-9191. При этом трансфицированные мРНК TERT фибробласты и миобласты экспрессировали β-галактозидазу в той же мере, что и контрольные клетки каждого типа после выхода на плато роста двух популяций. Эти данные демонстрируют, что клетки, обработанные мРНК TERT в конечном итоге предсказуемо прекращают деление и экспрессируют маркеры старения и, следовательно, не трансформируются.
[00185] Этот пример демонстрирует, что временная доставка мРНК TERT, содержащей модифицированные нуклеотиды, приводит к удлинению человеческих теломер и повышению пролиферативного потенциала клеток без иммортализации клеток. Наблюдаемая скорость удлинения фибробластов, составляющая 135±15 п.н./УП, сопоставима со скоростями при применении вирусных способов, от 94 до >150 п.н./УП (22, 69). Модифицированная мРНК TERT за несколько дней приводит к удлинению теломер в фибробластах на 0,9±0,1 п. н. Сообщалось, что длина теломер фибробластов уменьшается за время жизни человека в среднем приблизительно на 1-2 т.п.н.. Allsopp et al. (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:10114-10118. Следовательно, модифицированная мРНК TER Τ является эффективной, но при этом временной и не включающей интеграцию, а также преодолевающей основные ограничения конститутивно экспрессируемой вирусной мРНК TERT mRNA доставкой.
[00186] Человеческие клетки, представляющие наибольший интерес для применения в экспериментах или регенеративной медицине, часто ограничены в количестве, включая стволовые клетки. В настоящее время эту проблему решают различными способами, включая соматический ядерный транспорт, вирусные способы генной доставки и применение условий культивирования, которые снижают скорость укорочения теломер. Le et al. (2013) Cell Stem Cell, [опубликованная он-лайн перед печатью: 19 ноября 2013 г. ]; doi:10.1016/j.stem.2013.11.005; Zimmermann and Martens (2008) Cell Tissue Res. 331:79-90; Mohsin et al. Cire Res. 113:1169-1179. Описанная в данном документе обработка модифицированной мРНК TER Τ предлагает дополнение или альтернативу этим способам, преимущество которой состоит в том, что она является кратковременной, приводит к быстрому удлинению теломер и не несет риска, связанного с инсерционным мутагенезом. Кратковременность обработки мРНК TERT является исключительно привлекательной с той точки зрения, что в этом случае удается избежать потери фенотипа стволовых клеток, которая со временем может произойти в культуре (Gilbert et al. (2010) Science. 329:1078-1081), и сократить следующий за перепрограммированием этап iPSC-генерации, во время которого происходит удлинение теломер (Wang et al. (2012) Cell Res. 22:757-768). Такой способ удлинения теломер потенциально может привести к расширению применения разных видов клеток для моделирования заболеваний, разработки мелиоративных лекарственных препаратов и применения в клеточной терапии.
[00187] Для исследуемых типов клеток наблюдали целый ряд эффектов, связанных с пролиферативным потенциалом, в соответствии с предыдущими исследованиями, демонстрирующими разные эффекты сверхэкспрессии TERT на пролиферативный потенциал миобластов и фибробластов. Bodnar et al. (1998) Science. 279:349-352; Zhu et al. (2007) Aging Cell. 6:515-523. Кроме того, степень удлинения теломер не коррелирует с пролиферативным потенциалом. Следовательно, эффективность экспрессии TERT в отношении пролиферативного потенциала определяет клеточный контекст, а понимание факторов, которые опосредуют этот эффект, представляет интерес в свете преодоления этого ограничения. Факторы, связанные с ограничением пролиферативного потенциала миобластов после вирусной сверхэкспрессии TERT, включают р16-опосредованную блокировку роста, тип и штамм клеток и условия культивирования. Zhu et al. (2007) Aging Cell. 6:515-523. В общем случае эффект может опосредоваться не связанными с теломерами повреждениями ДНК, возрастом и митохондриальной целостностью. Sahin et al. (2011) Nature. 470:359-365; Mourkioti et al. (2013) Nat Cell Biol. 15:895-904; Lopez-Otm et al. (2013) Cell. 153:1194-1217. Отсутствие увеличения длины теломер или пролиферативного потенциала в трансфицированных мРНК CI TERT клетках согласуется с тем, что действие обработки происходит через каталитический сайт TERT, посредством которого происходит непосредственное добавление нуклеотидов к теломерам. Для клеточных популяций, обработанных мРНК TERT, наблюдали экспоненциальное увеличение количества клеток на протяжении определенного периода времени, а затем прекращение размножения и появление маркеров старения в той же мере, что и в случае необработанных популяций, что согласуется с отсутствием иммортализации.
[00188] Временная природа модифицированной мРНК с отсутствием интеграции, а также конечное повышение пролиферативного потенциала, которые наблюдали в данной работе, обеспечивают большую безопасность, чем в случае применяемых в настоящее время вирусных или ДНК векторов. Кроме того, указанный способ приводит к быстрому удлинению теломер, так что обработка может быть краткосрочной, после чего защитный связанный с укорочением теломер механизм остается интактным. Этот способ можно применять ex vivo для обработки тех типов клеток, которые опосредуют определенные патологические состояния или заболевания, таких как гематопоэтические стволовые клетки или предшественники в случаях иммуностарения или недостаточности костного мозга. Кроме того, модифицированную мРНК можно доставлять в определенные ткани in vivo. Kormann et al. (2011) Nat Biotechnol. 29:154-157. Подводя итоги, можно сказать, что быстрый и безопасный способ быстрого удлинения теломер, описанный в данном документе, приводит к замедлению старения и повышению пролиферативного потенциала клеток без иммортализации человеческих клеток.
СПОСОБЫ
[00189] Генерация и синтез матрииы модРНК. Чтобы получить модифицированную мРНК, кодирующую ЗФБ, TERT и CI TERT, их соответствующие открытые рамки считывания (ОРС) вставляли в MCS исходной плазмиды, содержащей промотор Т7, 5' НТО человеческого b-глобина (НВВ), MCS, 3' НТО НВВ, 151 п. н. поли(А)-последовательность и рестрикционный сайт для линеаризации с ферментом класса II за поли(А)-последовательностью. Полученную в результате промежуточную плазмиду секвенировали, линеаризовали и транскрибировали при помощи буфера и РНК-полимеразы из набора MEGAscript T7 Kit (Ambion, Austin, Texas, USA) и специальной смеси из канонических и неканонических нуклеотидов (TriLink BioTechnologies, San Diego, CA, USA), в которой конечные концентрации нуклеотидов на 40 мкл IVT реакции составляли 7,5 мМ для каждого из аденозин-5'-трифосфата (АТР), 5-метилцитидин-5'-трифосфата (ш5С) и псевдоуридин-5'-трифосфата (ψ), 1,5 мМ для гуанозин-5'-трифосфата (GTP) и 6 мМ для кэп-аналога (ARCA) (New England Biolabs, Ipswitch, MA, USA), что соответствовало молярному соотношению ATP:m5C:T:GTP:ARCA of 1:1:1:0.2:0,8. Для дополнительного снижения потенциальной иммуногенности мРНК, связанной с 5'-3Р-несущей фракцией, продукты IVT обрабатывали антарктической фосфатазой (New England Biolabs). Размер и структурную целостность продуктов мРНК подтверждали при помощи денатурирующего арагозного гель-электрофореза. ОРС человеческой TERT дикого типа, используемая для генерации ДНК-матриц для синтеза мРНК, идентична NCBI-варианту 1 транскрипта человеческой TERT (стандартная последовательность NM_198253.2). ОРС получали из плазмиды рВАВЕ-пео-hTERT (Counter et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA. 95:14723-14728) (плазмида 1774, Addgene, Cambridge, MA, USA). Плазмида pBABE-neo-hTERT содержит немолчащую мутацию в остатке 516 в мотиве QFP TERT, мотиве, который связывают с мультимеризацией и взаимодействием TERT с РНК TERC, поэтому, чтобы избежать возможности появления артефактов вследствие этой мутации, была получена последовательность, идентичная стандартной последовательности NCBI, путем коррекции мутации при помощи изменения G516D. Мутант CI TER Τ получали из последовательности TERT путем внесения мутации D712A.
[00190] Клеточные культуры и обработка. Человеческие первичные фетальные легочные фибробласты MRC5 получали от АТСС АТСС (Manassas, VA, USA) в пассаже 14. АТСС не указывает номер УП, поэтому приведенные в данном документе значения УП относятся к количеству У Π после получения клеток от АТСС. Клетки MRC5 культивировали в DMEM с 20% ФБС и пенициллином-стрептомицином. Первичные миобласты скелетной мышцы человека в возрасте 30 лет (Lonza, Allendale, N J, USA) культивировали в среде SkGM-2 (Lonza) в соответствии с инструкциями производителя. Удвоение популяции рассчитывали как log с основанием 2 соотношения между собранными клетками и клетками, которые высевали в предыдущем пассаже, и полагали таким, которое равно нулю, если количество собранных клеток было меньше количества высеянных клеток. Клетки трансфицировали модифицированной мРНК TERT, используя Lipofectamine RNAiMax (Life Technologies, Grand Island, NY, USA), приготовленный в восстановленной сывороточной среде OptiMEM (Life Technologies, Grand Island, NY, USA), и добавляли к клеткам в соотношении 1:5 об:об с их нормальной средой для достижений указанной в данном документе конечной концентрации.
[00191] Определение теломеразной активности. Через двадцать четыре часа после начала трансфекционного периода клетки собирали и лизировали в буфере CHAPS. Анализ TRAP проводили, используя модифицированную версию TRAPeze kit (EMD Millipore, Billerica, MA, USA), в которой праймеры и полимеразу добавляют после, а не до этапа, на котором происходит удлинение искусственного теломерного субстрата. Последовательность ПЦР была следующей: 94°С 30 с/59°С 30 с/72°С 45 с, всего 30 циклов, после чего продукты проводили через 15% полиакриламидный гель в 0,5Х ТВЕ, окрашенном SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (Life Technologies, Grand Island, NY, USA). Исследование теломеразной активности в динамике проводили при помощи TRAPeze RT kit (EMD Millipore, Billerica, MA, USA).
[00192] Вестерн-блоттинг. Белок собирали путем промывания клеток один раз ФСБ и последующего лизиса клеток в буфере RIPA (Cell Signaling Technology, Danvers MA, USA). Белок проводили через Трис-ацетатные гели NuPAGE Novex (Life Technologies, Grand Island, NY, USA), переносили на ПВДФ мембрану на 2 ч при 35 В, затем гибридизировали с антиальфа тубулином (Sigma, St. Louis, МО, USA) при 1:10000 и тти-ТЕЛΤ антителом (АВСАМ, Cambridge, MA, USA, 32020 npnt 1:1000; или Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA, USA, 600-401-252S при 1:500) и инкубировали на протяжении ночи при 4°С. Детекцию проводили при помощи инфракрасных (680 нм и 800 нм) антител (LI-COR, Lincoln, NE, USA) и устройства для визуализации Odyssey (LI-COR). Общую интенсивность каждой полосы количественно оценивали при помощи ImageJ (NIH, Bethesda, MD, USA). Интенсивность каждой полосы TERT нормировали относительно соответствующей полосы тубулина.
[00193] Проточная цитометрш. Клетки собирали через 24 ч после трансфекции указанными дозами (Фигура 16А-С) мРНК TERT и окрашивали amn-TERT антителом (Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, РА, USA; 600-401-252S) при 1:500. [00194] Определение длины теломер в SpectraCell Laboratories, Inc. Геномную ДНК экстрагировали, используя фенол-хлороформ и количественно оценивали при помощи Quant-iT™ PicoGreen dsDNA Assay Kit (Life Technologies, Grand Island, NY, USA). Анализ длины теломер проводили в SpectraCell Laboratories Inc. (Houston, TX, USA), используя утвержденный CLIA, анализ кПЦР с высокой пропускной способностью, главным образом так, как описано в Cawthon et al. Cawthon (2002) Nucleic Acids Res. 30(10):e47; Cawthon (2009) Nucleic Acids Res. 37(3):e21. Этот анализ позволяет определить относительную длину теломер путем определения фактора, которым образец отличается от образца стандартной ДНК по соотношению числа копий теломерных повторов и числа копий одного гена (36В4). Считается, что это соотношение (соотношение T/S) пропорционально средней длине теломер. Все образцы исследовали по меньшей мере дважды с по меньшей мере одним негативным контролем и по меньшей мере двумя позитивными контролями для двух разных известных длин теломер (длинной и короткой), при этом наблюдаемая средняя вариация составляла до 8%. Результаты были представлены как оценка теломер, эквивалентная средней длине теломер в т.п.н.
[00195] Определение длины теломер методом ММкПЦР. Длину теломер измеряли, используя модифицированную версию протокола ММкПЦР, разработанного Cawthon (Cawthon (2009) Nucleic Acids Res. 37(3):e21) со следующими изменениями: добавляли дополнительные, предшествующие амплификации ПЦР циклы, чтобы амплификация теломерных продуктов произошла раньше, расширяя гэп между сигналами теломеры и однокопийного гена; экспериментально определили, что смесь двух Taq полимераз приводит к лучшей эффективности ПЦР реакции, чем каждая из них в отдельности; снижение концентрации SYBR Green от 0,75Х до 0,5Х приводило к более раннему сигналу. Геномную ДНК получали из клеток, используя PureGene kit (Qiagen Germantown, MD, USA) с расщеплением РНКазой, количественно оценивали при помощи NanoDrop 2000 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA), и использовали 10-40 нг на 15 мкл кПЦР реакции, проводимой в четырех повторах при помощи ПЦР-системы LightCycler 480 (Roche, Basel, Switzerland). Серийное разведение стандартной ДНК, охватывающее пять точек от 100 нг/мкл до 1,23 нг/мкл, включали в каждый анализ для получения стандартной кривой, необходимой для количественной оценки образцы ДНК. Конечные концентрации реагентов в каждых 15 мкл ПЦР-реакции составили: 20 мМ Трис-HCl, рН 8,4, 50 мМ КС1, 3 мМ MgC12, 0,2 мМ каждого dNTP, 1 мМ ДТТ, 1 M бетаина (Affymetrix, Santa Clara, СА, USA), 0,5Х SYBR Green I (Life Technologies, Grand Island, NY, USA), 0,1875U Platinum Taq (Life Technologies, Grand Island, NY, USA), 0625X Titanium Taq (Clontech) и 900 нМ каждого праймера (последовательности праймеров telg, tele, hbgu и hbgd определены в Cawthon (2009) Nucleic Acids Res. 37(3):e21). Программа циклического изменения температуры была следующей: 2 минуты при 95°С; с последующими 6 циклами по 15 с при 95°С, 15 с при 49°С; с последующими 40 циклами по 15 с при 95°С, 10 с при 62°С, 15 с при 72°С с получением сигнала, 15 с при 84°С и 10 с при 88°С с получением сигнала. Программное обеспечение Roche LightCycler 480 использовали для генерации стандартных кривых и расчета концентраций ДНК и однокопийных генов для каждого образца. Соотношения T/S рассчитывали для каждой копии образца, а результат усредняли, чтобы получить соотношение T/S для образца, которое калибровали, используя контрольные пробы стандартных образцов, отосланные в SpectraCell, как описано выше. Независимо полученные относительные величины соотношений T/S, измеренные методом ММкПЦР и в SpectraCell для одних и тех же образцов, хорошо согласовались (коэффициент корреляции = 0,97, Р<0,001).
[00196] кПЦР с обратной транскрипцией. Праймеры были получены при помощи Primer3 (Untergasser et al. (2012) Nucleic Acids Res. 40:ell5) и перечислены в Таблице 9, если не указано иное. Через двадцать четыре часа после начала обработки клетки трижды промывали ФСБ перед тем, как собрать их в буфер RLT (Qiagen, Germantown, MD, USA). РНК конвертировали в кДНК, используя High Capacity RNA-to-cDNA Master Mix (Life Technologies, Grand Island, NY, USA). Эндогенную мРНК TERT амплифицировали, используя прямой праймер в открытой рамке считывания TERT и обратный праймер в 3' НТО эндогенной мРНК TERT. Экзогенную мРНК TERT амплифицировали, используя прямой праймер в открытой рамке считывания мРНК TERT и обратный праймер в 3' НТО НВВ, который присутствует в мРНК экзогенной TERTh CI TERT, но не в мРНК эндогенной TERT. Относительные уровни рассчитывали по методу Pfaffl. Стандартными генами служили RPL37A (с применением праймеров, определенных в Greber et al. (2011) EMBO J. 30:4874-4884) и GAPDH, ни один из которых не демонстрировал существенного изменения по величине Ct в контрольных или обработанных клетках.
[00197] Ассоциируемое со старением окрашивание β-галактозидазой и оценка размера клеток. Окрашивание β-гал проводили при помощи набора Senescence β-Galactosidase Staining Kit (Cell Signaling Technology, Danvers MA, USA). По меньшей мере 50 клеток на популяцию оценивали в двух репликах. Диаметр клеток оценивали вручную после обработки трипсином на решетке гемоцитометра. Cristofalo and Kritchevsky (1969) Med Exp Int J Exp Med. 19:313-320.
[00198] Статистика. Расчеты t-критериев Стьюдента и корреляционного коэффициента Пирсона проводили, используя Microsoft Excel. «Усы» представляют среднее ± s.e.m.
Пример 4. Доставка модРНК TERT в клетки путем электропорации [00199] Соединения модРНК TERT согласно данному изобретению также можно доставлять в клетки путем электропорации, как проиллюстрировано на Фигурах 18-20, используя параметры электропорации, включая концентрацию модРНК TERT, форму сигнала напряжения и геометрию электродов, подходящие для достижения оптимальной эффективности трансфекции и жизнеспособности заданного типа клеток. На Фигуре 21 приведена зависимость теломеразной активности от дозы модРНК TERT, доставляемой путем электропорации.
Пример 5. Доставка модРНК в человеческие кровяные клетки
[00200] CD8+ Т-клетки трансфицировали модРНК следующим образом. Светлый слой из цельной человеческой крови центрифугировали в среде с градиентом плотности Lymphoprep (Axis-Shield), чтобы получить мононуклеарные клетки, которые дважды промывали, а затем очищали от отличных от CD8+ лейкоцитов при помощи набора Dynabeads Untouched Human CD8 Τ Cells Kit (Life Technologies). Клетки CD8+стимулировали при помощи Dynabeads Human Τ-Activator CD3.CD28 (Life Technologies) и культивировали на протяжении 4 дней в среде OpTimizer T-Cell, обогащенной 30000 Е/мл IL-2. Затем Т-клетки трансфицировали модРНК, кодирующей ядерный ЗФБ и TERT в концентрации 50 мкг/мл в объеме 20 мкл раствора Nucleofector РЗ, содержащего добавку 1. Клетки анализировали в отношении флуоресценции и жизнеспособности через 24 часа после трансфекции. Результаты трансфекции приведены на Фигуре 22. Яркая флуоресценция соответствует большому числу копий с эффективностью трансфекции более 90% с высокой жизнеспособностью.
Пример 6. Экспрессия теломеразы в человеческих кератиноцитах при помощи теломеразной модРНК
[00201] Как показано на Фигуре 23, электропорация человеческих кератиноцитов модРНК TERT приводит к экспрессии теломеразной активности в клетках. Человеческие первичные кератиноциты (Lonza) суспендировали при плотности 3x107 клеток/мл в среде OptiMEM (Life Technologies), содержащей 50 мкг/мл модРНК, кодирующей как каталитически неактивную (CI) TERT, так и TERT дикого типа. 10 мкл клеточной суспензии помещали в 1 мм кювету с отверстиями и проводили электропорацию при помощи Gene Puiser (BioRad) при 200 В, 1000 Ом и 25 микрофарад. Клетки немедленно возвращали в среду KGM-2 (Lonza) и инкубировали на протяжении 24 часов перед сбором для измерения теломеразной активности, используя гель-анализ TRAPeze (Millipore). Каждые 25 мкл реакции TRAP проводили, используя 1 мкг общего белка, с двумя копиями образцов, которые нагревали при 85°С на протяжении 10 минут, чтобы инактивировать теломеразу. Необработанные, прошедшие только электропорацию и CI TERT образцы служили отрицательными контролями, а клетки 293Т и TSR8 служили в качестве положительных контролен.
Пример 7. Экспрессия кодируемого модРНК белка in vivo
[00202] Доставляемая in vivo модРНК может привести к экспрессии функционального белка, кодируемого модРНК. Kormann et al. (2012) Nature Biotechnology 29:154-157; Kariko et al. (2012) Molecular Therapy 20:948-93. Это подтвердили в данной работе путем создания комплекса из 2 мкг модРНК, кодирующей люциферазу, с катионным липидным носителем (TransIT) и проведения внутривенной инъекции в 50 мкл OptiMEM (Life Technologies) в хвост грызуна. Селезенку извлекали и обрабатывали люциферином и оценивали в отношении люциферазной активности, используя биолюминесцентное устройство для визуализации IVIS (Perkin-Elmer). Как показано на Фигуре 24, люциферазную активность обнаружили в месте инъекции и селезенке (стрелки).
[00203] Все патенты, патентные публикации и другие ссылочные материалы, приведенные в данном документе, в полном объеме включены посредством ссылки как в случае, если бы каждый из них был отдельно и специально включен в данный документ посредством ссылки.
[00204] Несмотря на то что были описаны конкретные примеры, вышеприведенное описание является иллюстративным и неограничивающим. Любой один или более признаков описанных вариантов реализации можно комбинировать любым образом с одним или более признаками других вариантов реализации настоящего изобретения. Кроме того, для специалистов в данной области техники после ознакомления с сущностью изобретения будет очевидно существование большого количества вариаций данного изобретения. Следовательно, объем изобретения определяется прилагаемой формулой изобретения вместе с полным объемом ее эквивалентов.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  THE BOARD OF TRUSTEES OF THE LELAND STANFORD JUNIOR
UNIVERSITY
RAMUNAS, John
YAKUBOV, Eduard
BLAU, Helen M.
COOKE, John
<120>  Соединения, композиции, способы и наборы, связанные с удлинением теломер
<130>  S12-001WO1
<150>  US 61/768,047
<151>  2013-02-22
<160>  10
<170>  PatentIn версия 3.5
<210>  1
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  ПЦР праймер
<400>  1
gccctcagac ttcaagacca                                                   20
<210>  2
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  ПЦР праймер
<400>  2
aggcagaatc cagatgctca                                                   20
<210>  3
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  ПЦР праймер
<400>  3
gtggacctga cctgccgtct                                                   20
<210>  4
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  ПЦР праймер
<400>  4
ggaggagtgg gtgtcgctgt                                                   20
<210>  5
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  ПЦР праймер
<400>  5
gtcacctacg tgccactcct                                                   20
<210>  6
<211>  19
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  ПЦР праймер
<400>  6
agcaagaaag cgagccaat                                                    19
<210>  7
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  ПЦР праймер
<400>  7
gccctcagac ttcaagacca                                                   20
<210>  8
<211>  19
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  ПЦР праймер
<400>  8
gctgctggtg tctgctctc                                                    19
<210>  9
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  ПЦР праймер
<400>  9
caatgacccc ttcattgacc                                                   20
<210>  10
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  ПЦР праймер
<400>  10
ttgattttgg agggatctcg