ПРИМЕНЕНИЕ ПРОИЗВОДНЫХ N-ПИПЕРИДИНА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНЫХ ПАТОЛОГИЙ
APPLICATION OF N-PIPERIDINE DERIVATIVES FOR TREATING NEURODEGENERATIVE PATHOLOGIES

Известно, что свободные радикалы кислорода (ROS) и свободные радикалы азота (RNS), постоянно образующиеся в ходе клеточного дыхания и нормального метаболизма, выполняют важные физиологические функции, такие как, например, функции вторичных мессенджеров в индуцировании клеточных процессов (Suzuki H.J. Free Rad. Biol. Med. 22, 269-285, 1977; Clement M.V. & Pervaiz S. Free Rad. Res. 30, 247-2525, 1999).
2
2
2
2
2
2
•-)
•-
•
1Δ
•
-
•
•
•
•
Также известно, что значительное и все возрастающее число патологических процессов связано с увеличением образования различных реактивных радикалов, таких как анион супероксида (О , пергидроксильный радикал (HO ), гидроксильный радикал (HO), атомарный кислород (О), перекись водорода (HО), окись азота (NO), двуокись азота (NO ), пероксинитрит и другие (R) радикалы (радикалы алкил-L, алкокси-LO, перокси-LOO и т.д.).
•
al.
al. J.
al.
al.
al.
et al.
Радикалы, которые образуются в избытке, насыщают антиоксидантную систему, которая образована ферментативными системами (супероксид дисмутаза, глютатион пероксидаза, каталаза, глютатион редуктаза) и гидрофильными, и липофильными неферментативными системами (убихинон, убихинол, витамин E, витамин C, витамин A, восстановленный глютатион, мочевая кислота, каротиноиды и т.д.), вызывая широко известное «состояние окислительного стресса» (OSS), которое ответственно за гибель клеток и повреждение тканей: воздействие радикалов приводит к дальнейшему повышению уровня ROS, RNS и R, которые возникают при OSS, с последующим обострением первичного окислительного поражения (Diaz M.D. et al., New Engl. J. Med. 331, 408-416, 1997; Cerutti P.A., The Lancet 344, 862-863, 1994; Giacosa A. & Filiberti R. Eur. J. Cancer Prev. 5, 307-312, 1996; Bruce N.A. et  Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 90, 1915-1922, 1993; Albens L. et Neural Transm. (Suppl.) 59, 133-154, 2000; Foley M. et J. Neurol; (Suppl. 2) 247, II82-94, 2000; Huang Z. et Can J. Neurol. Sci. (Suppl. 1) 30, S10-18, 2003; He Y. et al. J. Neurochem. 86, 1338-1345, 2003; Gao H.M. et Trends Pharmacol. Sci. 24, 395-401, 2003; Sekhon B. Brain Res. 971, 1-8, 2003; Nedelykovic Z.S. et al. Postgrad. Med. J. 79, 195-198, 2003; Arbiser J.L. Nat. Med. 9, 1103-1104, 2003; см. также Medline и Toxline).
Кроме того, известны попытки ослабить каскад событий, которые ведут к OSS, различными терапевтическими подходами, каждый из которых встречается с неизбежными проблемами, которые препятствуют их применению на человеке или животных или ограничивают его. Хелирующие агенты, которые, например, могут катализировать нежелательные окислительно-восстановительные реакции в клетках, легко диссоциируют или теряют активность в результате связывания с многочисленными компонентами клеток (Ikeda Y. et al. Neurosurgery 24, 820-824, 1989; White B.C. & Krause G.S. Ann. Emerg. Med. 22, 970-979, 1993).
2
•-

Помимо лимитирующего фактора, связанного с насыщением фермента (≤уровня обновления белка) и с отдельными дисмутазно-реактивными веществами (О ) в более сложном и динамичном мире OSS, использование фермента супероксид-дисмутазы сталкивается с проблемами стабильности (даже если он включен в состав липосом) вследствие того, что его время полураспада варьирует между несколькими минутами и несколькими часами, в зависимости от типа; он не проникает через клеточные мембраны, а в еще меньшей степени - через гематоэнцефалический барьер, и является иммуногенным (хотя использование в последнее время форм рекомбинантного r-h-MnSOD человека кажется многообещающим) (Mikawa S. et al. J. Neurosurg. 85, 885-891, 1996; Kontos H.A. & Wei E.P. J. Neurosurg. 64, 803-807, 1986; Chan P.H. et al. Ann. Neur. 21, 540-547, 1987); немаловажно, что недавние рандомизированные и межклинические испытания, которые проводились в отношении использования гликоль-конъюгированной супероксид-дисмутазы (Pegorgotein) при закрытых черепных травмах, неизбежным образом не привели к результатам, которые давали бы надежду на успех (Young B. et al. JAMA 276, 538-543, 1996).

Некоторые ограничения, связанные с использованием природного фермента, такие как, например, проницаемость клетки, в особенности гематоэнцефалического барьера, и введение его в организм, были преодолены путем использования органических соединений (например, M40401 или M40403) с низким молекулярным весом и с каталитической дисмутазной активностью, например, в отношении супероксида (SOD-миметики) (см. патенты США 5874421, 5637578 и 5696109; международная заявка WO02/28390 и WO02/058686, Samilowski W.E. et al. Nat. Med. 9, 750-755, 2003), или даже с использованием изолированной активной части фермента (патент США 6117454).
2
•-
•
Однако даже такая стратегия может иметь лишь ограниченную эффективность, так как она воспроизводит активность естественного фермента на молекулярном уровне, действуя только на один вид радикалов (О ), и, следовательно, полностью неактивна в отношении остальных - ROS, RNS и R, что приводит в целом к OSS. В настоящее время вещества, которым необходимо проникнуть через мембраны гематоэнцефалического барьера и которые проникают через него с затруднениями или не способны проникнуть через него, должны вводиться путем прямой инфузии в ЦНС или полимерным имплантантом с контролируемым выделением активного вещества, что сопряжено с проблемами, которые легко себе представить (см., например, патент США 4883666).
•
•
Другим видом молекул, которые были предложены для той же цели, являются так называемые "очищающие средства со спиновым улавливанием", такие как, например, азуленил нитроны, NXY-059 и в особенности альфа-фенил-трет-бутил нитрон (PBN), которые дали удовлетворительные результаты при различных патологиях (Rachnilewitz D. et al. Gut 35, 1181-1188, 1994; Krishna M.C. et al. J. Biol. Chem. 271, 26018-26025, 1996; Gilgun-Sherki Y. et al. Pharmacol. Rev. 54, 271-284, 2002). Однако действие ограничено немногими видами радикалов, так как, хотя действие на свободные радикалы углерода (C) приводит к сравнительно стабильному соединению, связывание со свободными радикалами кислорода совершенно неудовлетворительно; достаточно принять во внимание, например, что время полураспада соединения между нежелательным гидроксильным радикалом (HO) и PBN составляет всего 40 секунд (Jansen F.G. et al. Free Rad. Biol. Med. 12, 169-173, 1992).
in vitro
in vivo
2
•-
•
После распада эти короткоживущие нитроксиды также образуют новые виды радикалов, которые могут распространяться или инициировать реакцию самоокисления. Далее, PBN не связывается со свободными радикалами азота (RNS) (Hensley K. et al. Int. Rev. Neurobiol. 40, 299-317, 1997). Были получены спиновые ловушки, которые имеют большую стабильность  (Tempo. Tempol) и могут связывать радикалы супероксида (О ) и гидроксильные радикалы (HO), которые способны к саморегенерации (т.е. которые не обладают саморазлагающим действием, как обычные антиоксиданты) и которые могут одновременно блокировать реакцию Фентона, т.е. которые могут останавливать реакции радикалов (Samuni et al. Biochemistry 30, 555-561, 1991; Samuni et al. J. Clin. Invest. 87, 1562-1530, 1991; Li H. et al. Free Rad. Biol. Med. 32.712-719, 2002; Krishna M.C. et al. J. Biol. Chem. 271, 26026-26031, 1996). Однако защитное действие этих молекул ограничено и их токсичностью, и их временем полураспада, которое составляет менее 3 минут (Laight D. et al. Br. J. Pharmacol. 124, 238-244, 1988).
in vivo
Для преодоления этих трудностей спиновые ловушки используются совместно с полинитроксилированными макромолекулами (полинитроксил альбумин сыворотки человека, PNA), которые уменьшают их токсичность, позволяют повторное связывание и, если используемая доза поддерживается на низком уровне, предупреждают сосудорасширяющие эффекты (Kupposomi P. et al. Biochemistry 35 7051-7057, 1996; Kupposomi P. et al., Magn. Res. Med. 40, 806-811, 1998); естественно, учитывая их значительные размеры, такие макромолекулы действуют только во внеклеточных пространствах.
Фармацевтические композиции, включающие в себя циклические гидроксиламины, полученные из N-пиперидина, для лечения заболеваний, связанных с избыточной продукцией свободных радикалов, недавно были описаны в патенте США 5981548.
Первый аспект данного изобретения основывается на признании того факта, что циклические гидроксиламины, полученные из N-пиперидина, которые описаны в вышеупомянутом патенте США 5981548, могут проникать через гематоэнцефалический барьер и могут, следовательно, использоваться в терапии и профилактике нейродегенеративных заболеваний.
В рамках данного изобретения были идентифицированы другие соединения, полученные из N-пиперидина, имеющие фармацевтическую активность в лечении различных патологий, указанных ниже, и для которых никакого применения в области фармации не было предложено до настоящего времени.
В отношении этих новых соединений данное изобретение вносит вклад в новые подходы к терапии и профилактике, что является результатом установления их неожиданных свойств, таких как, в частности, высокая способность реагировать с различными типами свободных радикалов, прекращать реакции радикалов, способность легко проникать через двойные липопротеиновые мембраны (в особенности гематоэнцефалический барьер), высокая способность распространяться в тканях, обеспечивая таким образом высокую концентрацию активного вещества в той части организма, в которой требуется антиоксидантная защита, а также способность к саморегенерации (самовосполнению антиоксидантов) и предупреждению реакции Фентона путем окисления ионов металлов.
Еще одним предметом данного изобретения предпочтительно является возможность терапевтического использования класса соединений, который, помимо указанных выше преимуществ, является нетоксичным, неиммуногенным, стабильным и может быть изготовлен в больших количествах при низких затратах.
Новые терапевтические применения и фармацевтические композиции по данному изобретению определены в формуле изобретения.
В частности, новые применения в области фармацевтики, которые более детально описаны ниже, относятся к классу соединений формулы (I):
6
1
2
3
4
где R представляет собой оксил, водород или гидроксил, R, R, R и R выбраны независимо друг от друга из:
- водорода
- алкила с количеством атомов углерода от 1 до 12, предпочтительно от 1 до 6 атомов углерода, а более предпочтительно от 1 до 3 атомов углерода,
- алкенила с количеством атомов углерода от 2 до 12, предпочтительно от 2 до 6 атомов углерода и более предпочтительно от 2 до 3 атомов углерода,
- алкинила с количеством атомов углерода от 2 до 12, предпочтительно от 2 до 6 атомов углерода и более предпочтительно от 2 до 3 атомов углерода, или
1
2
- R и R вместе образуют тетраметиленовую или пентаметиленовую группу;
5
- R представляет собой водород,
- алкил с количеством атомов углерода от 1 до 12, предпочтительно от 1 до 6 атомов углерода, а более предпочтительно от 1 до 3 атомов углерода,
- циклоалкил с количеством атомов углерода от 3 до 8,
- алкенил с количеством атомов углерода от 2 до 12, предпочтительно от 2 до 6 атомов углерода и более предпочтительно от 2 до 3 атомов углерода,
- алкинил с количеством атомов углерода от 2 до 12, предпочтительно от 2 до 6 атомов углерода и более предпочтительно от 2 до 3 атомов углерода, или
где
1
2
3
4
R, R, R и R определены выше, n - представляет собой целое число от 1 до 30*, более предпочтительно от 2 до 14 и даже более предпочтительно от 6 до 10,
7
R является водородом, окислом или гидроксилом.
Группой соединений, которые предпочтительны и иллюстративны для данного изобретения, являются соединения с формулой:
где
1
2
3
4
R, R, R и R являются алкилами, имеющими от 1 до 3 атомов углерода,
5
R представляет собой
где
1
2
3
4
R, R, R и R являются алкилом с количеством атомов углерода от 1 до 3,
6
7
6
7
n - это целое число от 1 до 10, и по меньшей мере один из радикалов R и R является оксилом, а второй из радикалов R и R является оксилом или гидроксилом; в частности, использование соединения с формулой:
известного как бис(1-оксил-2,2,6,6-тетраметил-4-пиперидинил) декандиоат особенно предпочтительно.
Термин «алкил с количеством атомов углерода от 1 до 12» обозначает группу-заместитель, образующуюся из насыщенного углеводорода при удалении одного атома водорода. Термин включает в себя метил, этил, н-пропил, н-бутил, втор-бутил, изо-бутил, трет-бутил и различные изомерные формы пентила, гексила, гептила, октила, нонила, децила, ундецила и додецила.
Термины «алкенил, имеющий от 2 до 12 атомов углерода» и «алкенил с 2-12 атомами углерода»** указывают на группы-заместители, полученные соответственно из алкенового и алкинового углеводородов путем удаления одного атома водорода. Эти термины включают в себя этенил, этинил, пропенил, пропинил и сходные разветвленные и неразветвленные ненасыщенные углеводородные группы, имеющие до 12 атомов углерода.
Термин «циклоалкил, имеющий от 3 до 8 атомов углерода» указывает на насыщенные карбоциклические кольца, такие как циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, так же как карбоциклические кольца с замещенные алкилом, который содержит до 8 атомов углерода, такими как, например, метил-, диметил- и этилциклогексил.
N-оксил и N-гидроксил производные соединения могут быть приготовлены с использованием процессов, описанных в патентах США 4691015 и 5981548, начиная с N-H-производных.
2
В частности, N-оксил производные получали из соответствующего N-H производного путем реакции с м-хлорпербензойной кислотой. N-оксил производное может быть преобразовано в соответствующее N-гидрокси производное путем каталитической гидрогенизации, например, с использованием PtО в качестве катализатора.
Как было указано выше, предметом данного изобретения является использование вышеупомянутых соединений для приготовления лекарственных средств, фармацевтических или ветеринарных композиций для лечения (ингибирования, предупреждения, профилактики и терапии) нейродегенеративных синдромов и патологий, таких как болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, поражения мозга, связанные с эпилептическими припадками, травматические поражения мозга, невропатия вследствие ВИЧ, синдром Дауна, диабетическая полиневропатия, мышечная дистрофия, множественный склероз, хорея Гентингтона, заболевания, вызванные прионами, поздняя дискинезия, тауопатия, патологии, связанные с димиелинизацией, и болезнь Лу Герига.
Данное изобретение также относится к использованию указанных соединений для приготовления фармацевтических и ветеринарных композиций, а также лекарственных средств для терапевтического лечения, предупреждения и/или профилактики смертельных заболеваний, таких как сердечная/почечная/легочная/печеночная/кишечная ишемия-реперфузия, гипертензия, диабеты, рак, а также шоковые состояния, фиброзно-кистозная дегенерация (муковисцидоз), вирусные инфекции, токсикозы вследствие воспаления, вызванного приемом лекарств или облучением (например, вследствие радиотерапии, или в более общем смысле - радиопротекции воспаления), атеросклероз, старение, ревматоидный артрит, эпилепсия, гиперхолестеринемия, гиперлипидемия, а также лечения боли и сепсиса, а также патологий, связанных с избыточной продукцией свободных радикалов.
Для использования в области фармацевтики и ветеринарии соединения по данному изобретению вводятся пациенту в дозах в диапазоне от 0,01 до 1 г/кг веса тела, предпочтительно от 0,1 до 200 мг/кг, а более предпочтительно в диапазоне между 0,5 и 20 мг/кг веса тела при введении один или более раз в день.
Специфические дозировки, однако, могут варьировать в зависимости от потребностей конкретного пациента или животного, от глубины патологии, которую необходимо излечить (от возраста, пола, диеты, способа введения и от фармакологических соображений, таких как активность используемого вещества, эффективности и фармакокинетического и токсикологического профиля предварительно избранного соединения, а также от комбинации с другими лекарственными препаратами и т.д.). Определение оптимальной дозы входит в сферу выбора специалистов в данной области техники.
Для приготовления фармацевтических или ветеринарных композиций могут быть использованы фармацевтически приемлемые носители, как в твердой, так и жидкой форме, содержащие, по меньшей мере, одно из соединений по данному изобретению.
Способы введения включают в себя, помимо орального и парентерального введения, введение путем ингаляции и дерматологическим (местным) путем.
Твердые препараты включают в себя, например, порошки, таблетки, гранулы, капсулы, облатки и суппозитории.
Твердый носитель может состоять из одного или более веществ, которые могут также действовать как разбавители, вкусовые вещества, растворители, смазывающие вещества, суспендирующие агенты, связующие или дезагрегирующие вещества для таблеток; может также быть использован материал для капсул.
В порошках носитель состоит из тонко измельченного твердого вещества, которое смешано с по меньшей мере одним активным веществом. В таблетках активный ингредиент смешан с носителем, имеющим необходимые связывающие свойства, в подходящей пропорции, которому приданы желаемые форма и размер. Порошки и таблетки предпочтительно содержат активный ингредиент в количестве между 7 и 70% веса.
Подходящие носители представлены в основном карбонатом магния, стеаратом магния, тальком, лактозой, сахаром, пектином, декстрином, кукурузным крахмалом, метилцеллюлозой, карбоксиметилцеллюлозой натрия, восками с низкой температурой плавления, кокосовым маслом и им подобными.
Таблетки, порошки, облатки и капсулы могут быть использованы как подходящие формы дозировок для орального введения.
Препараты в жидкой форме включают в себя растворы, пригодные для парентерального введения (подкожных, внутривенных, внутримышечных, внутригрудинных инъекций или способов вливания) или орального введения, то есть суспензий и эмульсий, пригодных для орального введения. И стерильные водные растворы активного ингредиента, и стерильные растворы активного ингредиента в растворителях, включающих в себя воду, этанол или пропиленгликоль, могут быть упомянуты как примеры жидких препаратов, пригодных для парентерального введения.
Стерильные растворы могут быть приготовлены путем растворения активного ингредиента в желаемой системе растворителей, а затем пропускания образовавшегося раствора через мембранный фильтр с целью стерилизации или, альтернативный вариант, путем растворения стерильного вещества в предварительно стерилизованном растворителе в стерильных условиях.
Водные растворы для орального введения могут быть приготовлены путем растворения активного ингредиента в воде и добавления подходящих цветовых, вкусовых, стабилизирующих и агломерирующих агентов в желаемых количествах.
Водные суспензии для орального применения могут быть приготовлены путем диспергирования тонко измельченного активного ингредиента в воде вместе со связующими материалами, такими как естественные или синтетические клеи, смолы, метилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза натрия и другими суспендирующими агентами, известными в области фармацевтических и ветеринарных форм.
Предпочтительно, фармацевтические и ветеринарные препараты существуют в форме разовых доз, предпочтительно содержащих от 1 до 300 мг.В такой форме препарат делят на отдельные дозы, содержащие подходящее количество активного ингредиента. Упаковка разовых доз может содержать таблетки, капсулы или порошки в пузырьках или ампулах.
Фармацевтические композиции по данному изобретению предпочтительно используются на человеке. Однако, поскольку они применимы на человеке, они могут также быть применимы в области ветеринарии для домашних животных, экзотических животных и сельскохозяйственных животных, включая млекопитающих, птиц, грызунов и т.д., более предпочтительно таких животных, как собаки и кошки, также как коровы, овцы и свиньи.
Следующие примеры могут помочь специалистам в данной области техники осуществить данное изобретение. Примеры служат для иллюстрации данного изобретения и включены исключительно как примеры, а не ограничения. Поэтому описано использование данного изобретения на модели болезни Паркинсона как примера нейродегенеративного заболевания и на модели ишемии-реперфузии миокарда как примера заболевания, угрожающего жизни.
Пример 1
Хотя болезнь Паркинсона (PS) была описана впервые в 1817 г. как "дрожательный паралич" неизвестного происхождения (существуют, однако, свидетельства синдрома болезни Паркинсона, датированные еще тысячей лет до наших дней), ее этиология все еще остается достаточно неясной.
Помимо возраста, в оживленной научной дискуссии на международном уровне обсуждается роль генетических факторов и факторов окружающей среды в происхождении PS (Huang Z et al. Can. J. Neur. Sci. 30 Suppl. 1, 510-518, 2.003; Daner W. et al. Proc. Natl. Acad. Scie. (USA) 99, 14524-14529, 2002; Vaughan J.R. et al Am. Hum. Gen. 65, 111-126, 2001; Thiruchelvam M. et al. Neurotoxicology 23, 621-633, 2002; Scott W.K. et al. JAMA 286, 2239-2244, 2001; Warner T.T. & Schapira A.H. Am. Neurol. 53 Suppl. 3, 516-523, 2003). Значительный импульс исследованиям был дан в области влияния окружающей среды в середине 1990-х годов после открытия, что специфические нейротоксины, такие как н-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин (MTPT), могут вызывать паркинсонизм у человека и животных; с тех пор было обнаружено, что многие пестициды воспроизводят PS на животных моделях (Betarbert R. et al. Nat. Neurosci. 3, 1301-1306, 2000; Kirbi M.L. et al, Toxicol. Sci. 61, 100-106, 2001; Yumino K. et al. J. Biochem. (Tokyo) 131, 565-570, 2002; Gao et al. J. Neurosci. 23, 6181-6187, 2003). Немаловажно, что метаанализ  доступных данных предполагает наличие связи между воздействием и PS (Priyadarshi A. et al. Neurotoxicology 21, 435-440, 2000; Priyadarshi A. et al. Environ. Res. 86, 123-127, 2001).
Многочисленные экспериментальные исследования показывают, что гербицид Paraquat (который имеет химическую структуру, сходную с MPTP) вовлечен в патогенез PS; и микроинфузия Paraquat в черную субстанцию (substantia nigra) животного, и системное или интраперитонеальное воздействие ведет к селективной дегенерации дофаминергических нейронов, сопровождающейся поведенческими и невропатологическими признаками жестокой неселективной нейротоксичности (Brooks A.I. et al. Brain Res. 823, 1-10, 1999; Thiruchelvam M. et al. Neurotoxicology 23, 621-633, 2002; McCornack A.L. et al. Neurobiol Dis. 10, 119-127, 2002), приписываемой избытку OSS-реактивных свободных радикалов (Jannone N. et al. Neuropharmacology 30, 893-898, 1991; Klivenyi G. et al Neurobiol. Dis. 5, 253-258, 1998; Foley M. et al. J. Neurol. 247 Suppl. 2, 1182-94, 2000).
Поэтому экспериментальная модель Paraquat/крыса/PS была избрана как наиболее показательная для проверки эффективности химических соединений по данному изобретению, два антиоксиданта, обозначенные MP1002 и MP1001, были использованы в тестах:
MP1002
MP1001
Самцов крыс Sprague Dawley (вес 210-220 г) кормили в соответствии со стандартной лабораторной диетой, дополненной гранулами "Nossan Pellets" (и животные, и гранулы доступны от фирмы Nossan Company, Milan, Италия), содержались перед тестами в течение трех недель (относительная влажность 50%±10%, температура 22°С±1°С при свето-темновом цикле 12 часов/12 часов с включением освещения в 7 ч 30 мин утра) при неограниченной подаче корма и воды.
Перед воздействием крыс анестезировали интраперитонеальной инъекцией хлорал гидрата 380 мг/кг веса; проводниковую канюлю из нержавеющей стали (размер 25) имплантировали унилатерально в черную субстанцию в стереотаксических условиях и прикрепляли к черепу стоматологическим акриловым материалом.
Животным (20 в тестовой группе) перед воздействием давали восстановиться в течение семи дней; в этот период никаких изменений в двигательной активности или поддержании позы не наблюдалось. Микроинфузию выполняли с помощью 10 мкл гамильтоновского шприца, соединенного с инъекционной канюлей тефлоновой трубкой. Соединения или носитель (0,8% NaCl) инъецировали в общем объеме 1 мкл/минута.
Микроинфузия 50 мкг Paraquat в черную субстанцию (n=20 крыс) приводила к повышению двигательной активности, выражающейся в прыжках животных и движению кругами в направлении, контрлатеральном относительно места инъекции, через примерно 24 минуты; все животные погибали через 24±2,5 минуты после инфузии. Следующие двадцать животных подвергались вливанию Paraquat, а еще двадцать - Paraquat и носителя; около десяти животных в каждой группе выживали в течение 20 часов после воздействия и были использованы для определения развития липидного перекисного окисления в черной субстанции.
При микроинфузии Paraquat (50 мг) в черную субстанцию одновременно с 1 мкг MP1002 или MP1001 все животные выживали в течение последующих 24 часов, и никаких признаков нарушений не наблюдалось в течение длительного наблюдения (см. таблицу 1). Сходные результаты были получены при интраперитонеальном введении антиоксидантов, таким образом, продемонстрирована чрезвычайная способность MP1002 или MP1001 проникать через гематоэнцефалический барьер (BBB), который является одним из наиболее лимитирующих факторов для общепринятых антиоксидантов (вместе с их селективностью по отношению к специфическим типам радикалов) для терапевтических целей при нейродегенеративных патологиях.
В частности, ни одна из крыс не погибла, когда: (1) они получали интраперитонеальную премедикацию 120 мг/кг веса MP1002 или MP1001 за 5 минут до микроинфузии 50 мкг Paraquat; (2) их одновременно подвергали интраперитонеальной инъекции MP1002 или MP1001 120 мг/кг веса и инфузии 50 мкг Paraquat; и (3) они подвергались микроинфузии 50 мкг Paraquat, за которой через 5 минут следовала интраперитонеальная инъекция MP1002 и MP1001 120 мг/кг веса (см. таблицу 1).
,
Перекисное окисление липидов в черной субстанции определяли по количеству выделенного малондиальдегида (MDA), который использовался как биомаркер, с помощью реагента тиобарбитуровой кислоты - TCA-HCl, как описано Buege J.A. & Aust S.D. Meth. Enzymol. 52, 302-310, 1978. Таблица 1 ясно показывает усиление перекисного окисления липидов в черной субстанции в дополнительной группе животных (около десяти), которые выжили через 20 часов после инфузии 50 мкг Paraquat или Paraquat и физиологического раствора. Воздействие MP1002 или MP1001 в различных ситуациях (перед, одновременно или после инфузии Paraquat) заметно и достоверно (p<0.01) уменьшало перекисное окисление липидов в черной субстанцииясно демонстрируя высокую антиоксидантную способность этих соединений.
В этих тестах и интрацеребральное введение, и периферическое введение MP1002 или MP1001, двух типов антиоксидантов, описанных в данном документе, полностью защищали от поведенческих и невропатологических эффектов, вызванных Paraquat у крыс. Эти результаты показывают способность соединений по данному изобретению легко проникать через гематоэнцефалический барьер, защищая, таким образом, дофаминергические нейроны черной субстанции против дегенеративных повреждений (например, OSS), вызванных гербицидами, такими как Paraquat. Это представляет собой полезный подход в лечении различных нейродегенеративных патологий, включающих в себя болезнь Паркинсона.
Пример 2
in vivo
Модель поражения миокарда вследствие ишемии и реперфузии  была избрана как наиболее пригодная для проверки эффективности соединений MP1002 и MP1001 по данному изобретению.
Самцов крысы Sprague Dawley (220-230 г) кормили в соответствии со стандартной лабораторной диетой, дополненной "Nossan Pellets" (Nossan Company, Milan, Милан) и выдерживали в течение трех недель до тестов (относительная влажность 50%±10%, температура 22°С±1°С при свето-темновом цикле 12/12 часов с включением освещения в 7 ч.30 мин. утра); пища и вода были доступны без ограничений.
Крысы (двадцать на группу) были анестезированы интраперитонеальной инъекцией хлоралгидрата (380 мг/кг), трахеотомированы, интубированы и вентилировались окружающим воздухом подходящим вентилятором; температуру тела поддерживали на уровне 38°С±1°С, а в правую сонную артерию вводили канюлю, которую соединяли с датчиком кровяного давления, для контроля среднего артериального кровяного давления (MAP).
В правую яремную вену вставляли канюлю для введения соединений, проводили латеральную торакотомию, сердце подвешивали на временном ложе из перикарда и организовывали петлю окклюзии вокруг левой нисходящей коронарной артерии (LAD); животным позволяли стабилизироваться в течение 40 минут перед наложением лигатуры на LAD.
Коронарную артерию сужали, пережимая петлю окклюзии, эта процедура коррелирует с электрокардиографическими и гемодинамическими изменениями (скачок MAP), которые типичны для ишемии миокарда. Через 25 минут ишемии миокарда петлю окклюзии снова открывали, обеспечивая реперфузию в течение 2 часов. Частоту сердечных сокращений (HR) и MAP контролировали постоянно.
После реперфузии в течение 2 часов коронарную артерию снова сжимали и инъецировали краситель синий Эванса (4,5 мл при 2% p/v) в левый желудочек с помощью канюли в правой сонной артерии, чтобы можно было различить перфузируемый и неперфузируемый отделы сердца (AAR); раствор синего Эванса окрашивает перфузируемый миокард, тогда как пережатое сосудистое русло остается неокрашенным.
Крыс затем умерщвляли с помощью передозировки анестетика, сердца удаляли и делали срезы (3-4 мм), стенку правого желудочка и область риска (розовую) отделяли от неишемической области (окрашенной синим). Область риска разрезали на небольшие кусочки и инкубировали с тетразолием p-нитросиним (NBT, 0,48 мг/мл) в течение 20 минут при 37°С; в присутствии интактных дегидрогеназных ферментов (живой миокард) NBT образует темно-синий формазан, тогда как область некроза без дегидрогеназной активности не окрашивается. Кусочки рассортировывали в соответствии с их окрашиванием и взвешивали, чтобы определить размер инфаркта как процент от веса AAR.
Рассмотрены следующие тестовые группы: a) пережатие LAD (25 минут) и реперфузия (2 часа) плюс введение носителя (физиологический раствор, 3 мл/кг-v-плюс болюс 1,8 мл/кг/ч), начинающееся с 5-й минуты реперфузии и продолжающееся в течение периода реперфузии; b) пережатие LAD и реперфузия плюс введение MP1002 или MP1001 (инъекция 10 мг/кг в болюсе) за 5 минут до реперфузии, вслед за чем проводилась инфузия 2 мг/кг/ч в течение периода реперфузии; c) ложная операция (без пережатия LAD) и инфузия носителя; d) ложная операция и инфузия MP1002 или MP1001, как описано выше.
Малондиальдегид (MDA) в ткани сердца как финальный продукт перекисного окисления липидов клеточной мембраны также определяли, как описано выше.
Таблица 2 дает различные значения MPA и HR, измеренные в ходе тестов. Основные гемодинамические результаты в различных рассмотренных группах сходны.
У животных, на которых проводилась ложная операция (без пережатия LAD), инфузия носителя или носителя с MP1002 или MP1001 не имела значительных гемодинамических эффектов.
У животных, которые подверглись коронарной окклюзии и реперфузии, средние значения MAP немного уменьшались в период теста, но изменения HR отсутствовали. Далее, средние значения MAP и HR крыс, которые подверглись воздействию I/R (ишемии/реперфузии) и введению MP1002 или MP1001, достоверно не различались с группой, подвергшейся I/R с введением только носителя.
Инфузия MP1002 или MP1001 вызывала достоверное уменьшение (p<0.01) размера инфаркта (80% и 78% соответственно) по сравнению с контролем (фиг.1). Ложная операция не влияла достоверно на тяжесть инфаркта. Тогда как воздействие I/R приводило к заметному и достоверному усилению перекисного окисления липидов (p<0.01) по сравнению с крысами, которые подверглись ложной операции (плюс вливание носителя или антиоксиданта), воздействие MP1002 или MP1001 достоверно (p<0.01) уменьшало развитие перекисного окисления до уровня, сходного с таковым у животных, подвергшихся ложной операции (фиг.2), предоставляя таким образом доказательство высокой антиоксидантной мощности этих соединений.
Эти тесты показывают, что MP1002 и MP1001 могут резко уменьшать размеры инфарктов миокарда после окклюзии [кровотока] и реперфузии миокарда. Эти результаты показывают способность соединений по данному изобретению давать хороший защитный эффект против поражений миокарда, вызванных ишемией-реперфузией.
Это предполагает, что соединения по данному изобретению дают новый подход к лечению опасных для жизни заболеваний, включая ишемические болезни сердца.
<b>ТАБЛИЦА 1</b><b>ЭФФЕКТЫ БИС(1-ОКСИЛ-2,2,6,6-ТЕТРАМЕТИЛ-4-ПИПЕРИДИНИЛ)ДЕКАНДИОАТА (MP1002) ИЛИ БИС(1-ГИДРОКСИЛ-2,2,6,6-ТЕТРАМЕТИЛ-4-ПИПЕРИДИНИЛ)ДЕКАНДИОАТА (MP1001) НА ЛАТЕНТНЫЙ ПЕРИОД, ДЛИТЕЛЬНОСТЬ ПРИПАДКА, СМЕРТНОСТЬ И РАЗВИТИЕ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ У КРЫС, ПОЛУЧИВШИХ PARAQUAT В <i>SUBSTANTIA NIGRA</i></b>
<b>Воздействие</b>
<b>Латентный период </b>(мин)
<b>Длительность</b> (мин)
<b>Смертность </b>(%)
<b>Перекисное окисление липидов </b>(нмоль MDA x ч<sup>-1</sup>' x мг белка<sup>-1</sup>)
Контроль
0
0
0
3,8±0,76
Paraquat*
25±4
270±15
100 (20/20)
14,6±1,34**
Paraquat+носитель*
25±6
266±17
100 (20/20)
13,5±1,10**
Paraquat+MP1002<sup>a</sup>
Отсутствие припадков и эпилептических разрядов
Отсутствие припадков и эпилептических разрядов
0
4,3±0,63**
Paraquat+MP1001<sup>a</sup>
Отсутствие припадков и эпилептических разрядов
Отсутствие припадков и эпилептических разрядов
0
5,4±0,84**
Paraquat+MP1002<sup>b</sup>
Отсутствие припадков и эпилептических разрядов
Отсутствие припадков и эпилептических разрядов
0
5,2±0,75**
Paraquat+MPI001<sup>b</sup>
Отсутствие припадков и эпилептических разрядов
Отсутствие припадков и эпилептических разрядов
0
4,7±0,49**
Paraquat+MP1.002<sup>c</sup>
Отсутствие припадков и эпилептических разрядов
Отсутствие припадков и эпилептических разрядов
0
4,9±0,86**
Paraquat+MP1001<sup>C</sup>
Отсутствие припадков и эпилептических разрядов
Отсутствие припадков и эпилептических разрядов
0
5,1±0,94**
Paraquat+MP1002<sup>d</sup>
Отсутствие припадков и эпилептических разрядов
Отсутствие припадков и эпилептических разрядов
0
4,1±0,39**'
Paraquat+MP1001<sup>d</sup>
Отсутствие припадков и эпилептических разрядов
Отсутствие припадков и эпилептических разрядов
0
4,8±0,57**
,
В таблице 1 каждое значение представляет собой среднее±стандартное отклонение (SD) из двадцати разных тестов, выполненных на двадцати различных крысах; a) животные, которые получили, при одновременной микроинфузии в черную субстанциюParaquat (50 мкг) и 1 мкг MP 1002 или MP 1001; b) животные, которые предварительно интраперитонеально получили 120 мг/кг веса MP1002 или MP1001 и которые через 5 минут получили Paraquat (50 мкг) путем микроинфузии; c) животные, которые получили одновременно 50 мкг Paraquat путем микроинфузии и 120 мг/кг веса MP1002 или MP1001 путем интраперитонеальной инъекции; d) животные, которые получили 50 мкг Paraquat путем микроинфузии и через 5 минут после этого 100 мг/кг веса MP1002 или MP1001 путем интраперитонеальной инъекции.
Инфузия носителя в то же самое место не вызывала никаких эффектов в поведенческих реакциях или в смертности, коррелирующих с Paraquat. Таблица также дает вариации перекисного окисления в черной субстанции как уровня малондиальдегида (MDA) через 24 или 20 (*) часов после воздействия. Относительно деталей и процедур тестов см. текст.
**p<0.01 Paraquat или Paraquat+носитель относительно контроля и Paraquat+носитель относительно групп, получавших MP 1002 или MP 1001 (способ классификации Вилкоксона).
<b>ТАБЛИЦА 2</b><b>ЭФФЕКТЫ АНТИОКСИДАНТОВ MP1002 И MP1001 НА ИЗМЕНЕНИЯ СРЕДНЕГО АРТЕРИАЛЬНОГО КРОВЯНОГО ДАВЛЕНИЯ (MAP) И СЕРДЕЧНОГО РИТМА (HR) ПРИ ИШЕМИИ И РЕПЕРФУЗИИ МИОКАРДА (I/R) У КРЫС</b>
Группа
Исходный уровень
Пережатие (мин)
Реперфузия (мин)
15
25
15
25
Ложная операция+носитель
MAP
128±12
126±14
118±10
112±9
105±12
HR
425±25
429±26
426±21
431±23
429±22
Ложная операция+MP 1002
MAP
125±15
123±16
120±11
110±12
105±9
HR
421±26
420±33
422±25
428±26
426±32
Ложная операция+MP 1001
MAP
127±16
125±13
121±11
112±8
107±16
HR
422±33
422±26
424±48
427±27
427±23
I/R+носитель
MAP
128±10
121±12
113±10
101±12
96±9
HR
445±34
440±31
436±27
434±28
436±26
I/R+MB 1002
MAP
127±14
121±14
114±10
102±11
97±9
HR
438±30
437±32
431±24
427±29
429±25
I/R+MP1001
MAP
125±9
118±12
111±13
100±10
95±8
HR
435±25
438±31
430±28
425±28
427±26
Каждое значение представляет собой среднее±SD из по меньшей мере пятнадцати разных экспериментов. Животные получали MP1002, MP1001 или равный объем носителя. Относительно деталей и экспериментальных процедур см. текст.