Способ создания полинеоплазии со стимуляцией опухолевого роста в условиях первичного иммунодефицита в эксперименте
METHOD FOR CREATING POLYNEOPLASIA WITH STIMULATION OF TUMOR GROWTH IN CONDITIONS OF PRIMARY IMMUNODEFICIENCY IN EXPERIMENT

Изобретение относится к онкологии, а именно к экспериментальной онкологии, и может быть использовано для изучения первично-множественного процесса в эксперименте.
Несмотря на то, что злокачественные опухоли, как заболевание, известны давно, их экспериментальное воспроизведение долго не удавалось. Вот почему создание в эксперименте этого патологического процесса стало в начале прошлого века крупным научным достижением. Экспериментальные модели опухолей дают возможность выяснить причины, изучить патогенез опухолевого процесса, разработать методы его профилактики и лечения.
Первично множественные злокачественные опухоли (ПМЗО) были впервые описаны Billroth T. и Reimer G. в 1889 году и детально исследованы Warren S., Gates O. в 1932 г. Исходя из критериев, предложенных этими авторами, диагноз ПМЗО можно поставить, если каждая опухоль при гистологическом исследовании имеет четкое свидетельство злокачественности, располагается отдельно от другой опухоли и не является метастатическим отсевом. Современные международные правила для ПМЗО более подробны и опухоли, возникающие в органе, паре органов или ткани, обычно считаются одной опухолью. Однако есть два исключения из этого правила: системные раки, потенциально затрагивающие множество различных органов, должны учитываться только один раз для любого человека, а раки с различной гистологией должны рассматриваться как множественные раковые заболевания, даже если они диагностированы одновременно в одном и том же месте (см. Multiple Primary and Histology Coding Rules., 2015).
В 21 веке рак стал серьезной угрозой для здоровья человека. Сообщается, что частота ПМЗО в разных странах варьирует от 0,52% до 11,7%, а характеристики и выживаемость, связанные с ПМЗО, различны (см. Demandante C.G. et al., 2007; см. Lv M.В. et al., 2017). В 2015 году в Китае насчитывалось около 4 292 000 вновь диагностированных случаев рака, что соответствует почти 12 000 новых диагнозов рака в среднем каждый день (см. Chen W. et al., 2016). В Соединенных Штатах в 2015 году было выявлено в общей сложности 1 658 370 новых случаев заболевания раком (см. Siegel R.L. et al., 2015). Однако исследование пациентов с помощью ПЭТ / КТ показало наличие другой первичной злокачественной опухоли как минимум в 1,2% случаев (см. Ishimori T. et al., 2005). Вероятность развития синхронных злокачественных новообразований варьирует от 34,9 до 41%, а для метахронных новообразований от 59 до 66% в разных исследованиях (см. Sapalidis, K. et al., 2016). Метанализ, основанный на литературных источниках, показывает, что частота развития второй опухоли составляет от 3 до 5%, третьей – около 0,5% и четвертой  – 0,3% (см. Sisti A. et al., 2016).
С развитием современных диагностических процедур, химиотерапии, лучевой и таргетной терапии выживаемость пациентов с онкопатологией увеличивается, что позволяет большему количеству больных раком доживать до ПМЗО (см. Kilciksiz S. et al., 2007; см. Luciani A. et al., 2009; см. Chen W. et al., 2015). Установлено, что риск развития метахронного рака на 3,8% выше у выживших больных раком по сравнению с общей популяцией в течение среднего периода наблюдения 2,5 года. Более того, предполагаемый 10-летний совокупный риск развития второго рака для пациентов, у которых впервые был диагностирован рак в возрасте от 60 до 69 лет, достигает 13% (см. Wang H. et al., 2019).
В настоящее время ПМЗО определяются наличием двух или более гистологически различных злокачественных опухолей, которые не обусловлены рецидивом, метастазированием или локальным распространением у одного и того же человека. Различают синхронные ПМЗО, когда второй первичный рак выявляется в течение 6 месяцев после обнаружения первого первичного рака, и метахронные – второй первичный рак выявляется более чем через 6 месяцев после обнаружения первого первичного рака. В настоящее время увеличение ПМЗО становится важной медицинской проблемой, поскольку часто диагностируются лишь после смерти пациента (см. Whitworth J. et al., 2015).
Из-за вариабельности клинических симптомов и низкой заболеваемости ПМЗО большинство клиницистов не имеют опыта в диагностике и лечении этого типа злокачественной патологии. Например, ПМЗО часто ошибочно диагностируют как рецидив или метастазирование исходной злокачественной опухоли, что может привести к неправильному лечению. Это неизбежно оказывает неблагоприятное влияние на прогноз пациента. Кроме того, не разработаны стандарты лечения ПМЗО (см. Zhai C. et al., 2018). Связано это, в том числе, и с тем, что до сих пор не известен онкогенетический механизм ПМЗО. Исследования в этой области продолжаются.
Уже сейчас установлено, что нонсенс-мутация в факторе, связанном с BRCA1-ассоциированным белком 1 (BAP1), способствовала высокой частоте множественных раковых заболеваний (см. Mitchell C. et al., 2015). Белок, связывающий BRCA2 (PALB2), играет критическую роль в восстановлении гомологичной рекомбинации благодаря его способности привлекать BRCA2 и RAD51 к разрывам ДНК. Сообщалось, что структурные варианты, удаляющие или дублирующие множественные экзоны PALB2, участвуют в возникновении рака молочной железы и яичников (см. Lily O. et al., 2016). Конституционные мутации TP53 тесно связаны с синдромом Ли-Фраумени – аутосомно-доминантно наследуемым прототипическим заболеванием, которое характеризуется высокой частотой предрасположенности к саркомам мягких тканей, остеосаркомам, раку молочной железы, опухолям головного мозга, адренокортикальной карциноме, лейкемии и другим злокачественным новообразованиям (см. Anita V. et al., 2011). Дополнительные механизмы, включая старение (см. Luciani A., Balducci L., 2004), нездоровый образ жизни (см. Morris L.G. et al., 2011; см. Alexandrov L.B. et al., 2016), лечение рака или взаимодействие между любыми из этих факторов также вносят вклад в развитие ПМЗО (см. Oeffinger K.C. et al., 2013). Стоит отметить, что более половины пациентов ПМЗО когда-либо получали химиотерапию. Хорошо известно кумулятивное действие цитотоксических алкилирующих агентов, которые играют важную роль в инициации второй опухоли (см. Zhai C. et al., 2018).
Вторые первичные опухоли являются достаточно частым явлением в повседневной практике онкологов и основной причиной смертности больных (см. Ko H.H. et al., 2016). У пациентов с плоскоклеточным раком головы и шеи выявляют вторые опухоли в легких или пищеводе спустя годы после лечения (см. Morris L.G. et al., 2011). Поэтому долгосрочное наблюдение имеет решающее значение для выявления ПМЗО (см. Brands M.T. et al., 2018; см. Mehra R. et al., 2018). Тем не менее, не существует общепринятых руководящих принципов непрерывного наблюдения (см. National Comprehensive Cancer Network., 2018; см. MaruyamaN. et al., 2019).
Последовательное улучшение скрининговых тестов и внедрение минимально инвазивных хирургических методов уже создают возможности, которые едва ли были поддержаны несколько лет назад (см. Peng J. et al., 2016). Эти возможности позволяют продвинуться в понимании сложной этиологии рака человека, а также в создании и проверке гипотез о механизмах канцерогенеза (см. Hemminki K., Boffetta P., 2004). Для изучения механизмов канцерогенеза важно подобрать соответствующую модель. Для исследования онкогенеза на сегодняшний день наиболее часто используют мышиные и крысиные модели, хотя иногда упоминаются и другие. Мышь как модель имеет ряд преимуществ по сравнению с другими млекопитающими: финансово выгодное содержание, короткий репродуктивный цикл, возможность использования методов генной инженерии. Высоко раковыми линиями мышей являются A/Sn, C3H/Sn, DBA/1, CBA/1 (рак молочных желез); СВА/Lac, СЗНА (опухоли печени). У низкораковых животных опухоли возникают с малой частотой или не возникают совсем. К таким представителям можно отнести линию BALB/c (Bagg albino C), C57BL/6J – инбредную линию черной масти, которая используется практически во всех медицинских и биологических исследованиях. Обе вышеперечисленные линии являются стандартными для онкологии. Для работ иммунологов и онкологов требуются мыши с подавленным иммунитетом (ксенографты). У этих мышей отсутствует тимус и волосяной покров. Они известны под названием «голые мыши» (Nude mouse).
На данный момент экспериментальная онкология предлагает к воспроизведению многообразие моделей злокачественного роста: спонтанные и индуцированные опухоли, перевиваемые с помощью гомотрансплантации (аутотрансплантация, сингенная трансплантация) или гетеротрансплантации (аллотрансплантация, ксенотратрансплантация) различными способами (см. Побяржин В.В. и соавт., 2018).
Один из способов воспроизведения злокачественного процесса в эксперименте предложен Ю.С. Сидоренко и соавт. в 2008 году на примере перевивки саркомы 45 самцам белых беспородных крыс. Авторы предлагают этот способ для получения злокачественной опухоли, растущей в ткани легкого. Взвесь опухолевых клеток перед введением разводят стерильным физиологическим раствором 1:5 по объему и набирают в стерильный шприц. Самцам белых беспородных крыс, после фиксации их на спине, вводят опухолевую взвесь в подключичную вену в дозе 0,5 мл. На 14-21 сутки от момента перевивки саркомы 45 у самцов развивается опухоль, которую можно извлечь и перевить. По мнению авторов, этот способ должен обеспечивать 100% воспроизводимость, приводя к перевивке опухолевых трансплантатов во всех случаях, что, в свою очередь, даст возможность постановки массовых экспериментов за относительно короткий срок и в большом количестве при простоте исполнения (Пат. 2388064).
Среди перевиваемых меланом наиболее часто применяют меланомы мышей Хардинга-Пасси, В-16 и S-91 Клаудмана. Известно, что меланома В16 возникла спонтанно у основания уха в коже мыши линии C57BL/6 в 1954году. Полученный штамм до сих пор поддерживается на мышах линии C57BL/6 путем перевивки опухолевой взвеси. При перевивке под кожу развитие опухоли составляет 100%, меланома метастазирует преимущественно в легкие (60-90%), реже – в печень и селезенку (Фадеева, Е. В., 2010).
Техническим результатом настоящего изобретения является создание экспериментальной модели роста В16/F10 и саркомы 45 у мышей Nude.
Иммунодефицитные мыши BALB/c Nude – безволосые альбиносы, область применения – онкология.
Технический результат достигается тем, что самцам мышей линии BALB/c Nude перевивают под кожу спины два опухолевых штамма: 0,5 мл взвеси опухолевых клеток мышиной меланомы В16/F10 в физиологическом растворе в разведении 1:20 ниже угла левой лопатки и 0,5 мл опухолевой взвеси саркомы 45, содержащей 0,5 млн. опухолевых клеток, ниже угла правой лопатки.
Изобретение «Способ создания полинеоплазии со стимуляцией опухолевого роста в условиях первичного иммунодефицита в эксперименте» является новым, так как оно неизвестно в области экспериментальных исследований в онкологии о модификации роста меланомы В16/F10 и саркомы 45 у мышей линии BALB/c Nude.
Новизна изобретения заключается в использовании мышей линии BALB/c Nude, развитие злокачественного процесса меланомы В16/F10 и саркомы 45 в организме которых при стандартной подкожной перевивке идёт по нестандартному «сценарию». Воспроизведение модели полинеоплазии, заключающееся в подкожной перевивке меланомы В16/F10 и саркомы 45 мышам линии BALB/c Nude, усиливает злокачественный потенциал обоих опухолей.
Изобретение «Способ создания полинеоплазии со стимуляцией опухолевого роста в эксперименте» является промышленно применимым, так как может быть использовано в научно-исследовательских учреждениях онкологического профиля для воспроизведения экспериментальной модели роста двух морфологически разнородных злокачественных опухолей на мышах с первичным иммунодефицитом, изучение их роста, особенностей метастазирования, поиска способов воздействия на них.
Представленные фигуры поясняют суть изобретения.
На фиг. 1 представлен вид подкожных опухолей: мышиной меланомы В16/F10 (слева) и крысиной саркомы 45 (справа) у самца BALB/c Nude в модели полинеоплазии.
На фиг. 2 представлен метастаз мышиной меланомы B16/F10 в крысиную саркому 45 у самца BALB/c Nude в модели полинеоплазии.
«Способ создания полинеоплазии в условиях первичного иммунодефицита в эксперименте» выполняется следующим образом. Самцам мышей линии BALB/c Nude под кожу спины ниже угла левой лопатки вводят 0,5 мл взвеси опухолевых клеток мышиной меланомы В16/F10 в физиологическом растворе в разведении 1:20, с другой стороны – ниже угла правой лопатки подкожно вводят 0,5 мл опухолевой взвеси саркомы 45, содержащей 0,5 млн. опухолевых клеток. Для этого, соблюдая все условия асептики, ассистент фиксирует мышь спиной кверху, предварительно обработав кожу 5% спиртовым раствором йода. Экспериментатор рукой в стерильной перчатке захватывает кожную складку, в центре которой прокалывает кожу и вводит опухолевую взвесь сначала с одной стороны, затем с другой. После извлечения иглы место введения плотно прижимает ватным тампоном, смоченным в 70% спирте с небольшим добавлением йода, на 1 минуту, чтобы исключить вытекание опухолевого материала. Контролем служат мыши-самцы линии BALB/c Nude с перевивкой либо меланомы В16/F10, либо саркомы 45 в той же дозе и объёме.
Особенности роста опухолей при стандартной и синхронной перевивке представлены в таблице 1.
Таблица 1
Особенности роста опухолей: мышиной меланомы В16/F10 и крысиной саркомы 45 в самостоятельном варианте и в модели полинеоплазии
у самцов мышей линии BALB/c Nude
объект исследования
В16/F10, n=7
С45, n=7
полинеоплазия, n=7
B16/F10
С45
дата выхода опухоли, сут
12,28±0,61
10,85±0,77
4,29±0,42<sup><b>*</b></sup>
5,43±0,61<sup><b>+</b></sup>
объем опухоли через 3 недели после перевивки (см<sup>3</sup>)
1,30±0,12
1,08±0,12
2,87±0,27<sup><b>*</b></sup>
3,49±0,30<sup><b>+</b></sup>
продолжительность жизни, сут
33,40±2,41
43,00±2,89
22,00±0,58<sup><b>*,+</b></sup>
* –
–
+
Примечание: статистически значимая разница по сравнению с изолированным ростом меланомы;  с изолированным ростом саркомы 45 (р<0,05).
Как видно из таблицы опухоли, перевитые в самостоятельном варианте: и мышиная меланома, и крысиная саркома выходили примерно в одни и те же сроки. При этом меланома начинала прощупываться с 11 суток (3 мыши), саркома с 7 суток (1 мышь) и 10 суток (2 мыши) после перевивки. Срок окончания выхода опухолей у мышей с меланомой – 14 сутки (1 мышь) и 15 сутки (1 мышь), у мышей с саркомой – 13 сутки (1 мышь). У мышей с синхронной перевивкой (модель полинеоплазии) опухоли появлялись значительно раньше – на 1 неделе после перевивки. При этом меланома начинала определяться в виде черного просяного зёрнышка с 3 суток (2 мыши), а саркома – в виде белого тяжика длиной 4-5 мм с 4 суток (3 мыши). Срок окончания выхода обеих опухолей – 7 сутки (по 1 мыши). Таким образом, в модели полинеоплазии меланома В16/F10 выходила в 3 раза быстрее, а саркома 45 в 2 раза быстрее, чем при стандартной перевивке (Таблица 1). Статистически значимой разницы по срокам выхода опухолей между меланомой и саркомой, как в самостоятельном, так и сочетанном варианте, не было.
Объем опухолевых узлов у всех животных замеряли перед гибелью первых мышей с полинеоплазией – на 20 сутки после перевивки. На фиг. 1 представлена фотография мыши с одновременным ростом мышиной меланомы и крысиной саркомы.
Установлено, что объём каждой опухоли, перевитых синхронно на одну мышь, превысил объём соответствующих опухолей, перевитых в стандартном изолированном варианте: меланомы B16/F10 – в 2,2 раза, саркомы – в 3,2 раза (см. Табл. 1).
Было обнаружено, что меланома в модели полинеоплазии кроме типичных мест (лёгкие, селезёнка, печень) метастазировала в саркому 45 со стороны, прилегающей к грудной клетке – под опухолевый узел (см. Фиг. 2).
Продолжительность жизни мышей зависела от гистологии опухоли и варианта перевивки: изолированного или сочетанного. Максимально долго жили мыши с изолированным ростом крысиной саркомы 45: минимальная продолжительность их жизни составила 35 дней (2 мыши), максимальная – 56 дней (1 мышь), средняя – 43 дня (см. Табл. 1). Мыши с изолированным ростом меланомы B16/F10 жили в среднем на 10 дней меньше, чем мыши с саркомой, при этом минимальная продолжительность их жизни составила 27 дней (3 мыши), максимальная – 42 дня (1 мышь). Меньше всех жили мыши с полинеоплазией: средняя продолжительность их жизни была в 1,5 раза меньше, чем у мышей с изолированным ростом меланомы, и в 2,0 раза меньше, чем у мышей с изолированным ростом саркомы (см. Табл. 1); минимальная продолжительность их жизни составила 21 день (3 мыши), максимальная – 25 дней (1 мышь).
Таким образом, синхронная подкожная перевивка мышиной меланомы B16/F10 и крысиной саркомы 45 мышам BALB/c Nude увеличивала злокачественный потенциал каждой из одномоментно перевитых опухолей: ускорялся срок их выхода и увеличивалась скорость роста опухолей, что способствовало уменьшению продолжительности жизни животных.
Технико-экономическая эффективность «Способа создания полинеоплазии со стимуляцией опухолевого роста в условиях первичного иммунодефицита в эксперименте» заключается в том, что воспроизведение модели полинеоплазии путем подкожной перевивки меланомы В16/F10 и саркомы 45 мышам линии BALB/c Nude усиливает злокачественный потенциал обоих опухолей – активизирует их рост и способствует метастазированию меланомы в опухолевый узел саркомы. Это дает возможность изучать патогенез синхронного злокачественного роста, что важно для клиники, а также проводить поиск мишеней для таргетной терапии полинеоплазий. Способ экономичен, доступен.
Список литературы
1. Побяржин В.В., Пашинская Е.С., Семенов В.М., Гончаров А.Е.Методологические аспекты постановки онкологических моделей в условиях эксперимента// Вестник ВГМУ. – 2018. – Том 17, №6. – С. 32-45.
2. Структурные изменения в экспериментальной перевивной опухоли крыс лимфосаркома плисса после леченияциклофосфаном / Е. С. Джадранов [и др.] // Вестн. КазНМУ. – 2015. – № 3. – С. 213–215.
3. Пат. 2388064 Российская Федерация. Способ воспроизведения злокачественного процесса в эксперименте, МПК G 09 B 23/28 / Ю. С. Сидоренко, Е. М. Франциянц, Л. Д. Ткаля ; заявитель и патентообладатель Ростов. науч.-исслед. онкол. ин-т Росмедтехнологий. – заявка № 2008133088/14; заявл. 11.08.08 ; опубл. 27.04.10, Бюл. № 12. – 7 с.
4. Фадеева Е.В. Экспериментальная модель меланомы В16 и методы иммунотерапии// Междунар. журн. эксперим. образования. – 2010. – № 8. – С. 49–50.
5. Alexandrov LB, Ju YS, Haase K. et al. Mutational signatures associated with tobacco smoking in human cancer. Science. 2016; 354(6312):618–22.
6. Anita V, Uri T, Joshua S. et al. Biochemical and imaging surveillance in germline TP53 mutation carriers with Li-Fraumeni syndrome: a prospective observational study. Lancet Oncol. 2011; 12(6): 559–67.
7. Billroth T. Reimer G. Die allgemeine chirurgische pathologie und therapie. Vorlesungen-Ein Handbuch fur Studierende und Artze, Berlin: Auflage; 1889. 908.
8. Brands MT, Brennan PA, Verbeek ALM, Merkx MAW, Geurts SME. Follow-up after curative treatment for oral squamous cell carcinoma. A critical appraisal of the guidelines and a review of the literature. Eur J Surg Oncol. 2018; 44:559–565. doi: 10.1016/j.ejso.2018.01.004.
9. Chen W, Zheng R, Baade PD, et al. Cancer statistics in China, 2015. CA Cancer J Clin. 2016; 66:115–32.
10. Chen W, Zheng R, Baade PD. et al. Cancer statistics in China, 2015. CA Cancer J Clin. 2016; 66(2):115–132.
11. Demandante CG, Troyer DA, Miles TP. Multiple primary malignant neoplasms: case report and a comprehensive review of the literature. Am J Clin Oncol. 2003; 26:79–83.
12. Hemminki K., Boffetta P. Multiple primary cancers as clues to environmental and heritable causes of cancer and mechanisms of carcinogenesis. IARC Sci. Publ. 2004; 157: 289–297.
13. Ishimori T., Patel P.V., Wahl R.L. Detection of unexpected additional primary malignancies with PET/CT. J. Nucl. Med. Offic. Publ. Soc. Nucl. Med. 2005; 46(5): 752–757.
14. Kilciksiz S, Gokce T, Baloglu A, et al. Characteristics of synchronous- and metachronous-type multiple primary neoplasms: a study of hospital-based cancer registry in Turkey. Clin Genitourin Cancer. 2007; 5:438–445.
15. Ko HH, Cheng SL, Lee JJ, Chen HM, Wang CW, Cheng SJ, Kok SH. Factors influencing the incidence and prognosis of second primary tumors in patients with oral squamous cell carcinoma. Head Neck. 2016; 38:1459–1466. doi: 10.1002/hed.24457.
16. Lily O, Yong HW, Tinu T. et al. Genome Sequencing of Multiple Primary Tumors Reveals a Novel PALB2 Variant. J Clin Oncol. 2016; 34(8): e61–7.
17. Luciani A, Ascione G, Marussi D. et al. Clinical analysis of multiple primary malignancies in the elderly. Med Oncol. 2009; 26(1): 27–31.
18. Luciani A, Balducci L. Multiple primary malignancies. Semin Oncol. 2004; 31(2): 264–273.
19. Lv M., Zhang X., Shen Y., Wang F., Yang J., Wang B., Yang J. (). Clinical analysis and prognosis of synchronous and metachronous multiple primary malignant tumors. Medicine. 2017, 96(17), e6799. doi:10.1097/MD.0000000000006799.
20. Maruyama N., Sasaki T., Arasaki A., Matsuzaki A., Nakasone T., Teruya T., Nishihara K. Thymoma appearing 9 years after the resection of squamous cell carcinoma of the lip: A case report of triple primary tumors and literature review. Oncology letters. 2019. 18(3), 2777–2788. doi:10.3892/ol.2019.10675.
21. Mehra R, Seiwert TY, Gupta S, Weiss J, Gluck I, Eder JP, Burtness B, Tahara M, Keam B, Kang H et al. Efficacy and safety of pembrolizumab in recurrent/metastatic head and neck squamous cell carcinoma: Pooled analyses after long-term follow-up in KEYNOTE-012. Br J Cancer. 2018; 119: 153–159. doi: 10.1038/s41416-018-0131-9.
22. Mitchell C, Yuwaraj K, Jacqueline T. et al. Germline BAP1 mutation in a family with high incidence of multiple primary cancers and a potential gene-environment interaction. Cancer Lett. 2015; 369(2): 261–265.
23. Morris LG, Sikora AG, Hayes RB, Patel SG, Ganly I. Anatomic sites at elevated risk of second primary cancer after an index head and neck cancer. Cancer Causes Control. 2011; 22:671–679. doi: 10.1007/s10552-011-9739-2.
24. Morris LG, Sikora AG, Patel SG. et al. Second primary cancers after an index head and neck cancer: subsite-specific trends in the era of human papillomavirus-associated oropharyngeal cancer. J Clin Oncol. 2011; 29(6): 739–746.
25. Multiple Primary and Histology Coding Rules. Available at: http://seer.cancer.gov/tools/mphrules/. Accessed April 9, 2015.
26. National Comprehensive Cancer Network. Head and Neck Cancers Version 2, 2018. https://www.nccn.org/professionals/physician_gls/pdf/head-and-neck.pdf.
27. Oeffinger KC, Baxi SS, Novetsky Friedman D. et al. Solid tumor second primary neoplasms: who is at risk, what can we do? Semin Oncol. 2013;40(6):676–689.
28. Peng J., An S., Wang H.P., Chen X.L., Ning X.G., Liu J., Yu X.Y., Mao X., Xu T.R. Video-assisted thoracoscopic surgery lobectomy for lung cancer versus thoracotomy: a less decrease in sVEGFR2 level after surgery. J. Thorac. Dis. 2016; 8(3): 323–328.
29. Sapalidis K., Schizas N., Lazopoulos A., Kamparoudi P., Paliouras D., Sardeli C., Barbetakis N. Multiple metachronous and synchronous malignancies with lung and thorax involvement. Report of two cases. Respiratory medicine case reports. 2018. 24, 5–7. doi:10.1016/j.rmcr.2018.03.006
30. Siegel RL, Miller KD, Jemal A. Cancer statistics, 2015. CA Cancer J Clin. 2015; 65: 5–29.
31. Sisti A., Tassinari J., Nisi G., Grimaldi L., Sisti G., Di.Tommaso M., Fambrini M. Synchronous and metachronous malignancies after malignant struma ovarii in the SEER database. In vivo. 2016; 30(5): 713–716.
Wang H32. ., Hou J., Zhang G., Zhang M., Li P., Yan X., Ma Z. Clinical characteristics and prognostic analysis of multiple primary malignant neoplasms in patients with lung cancer. Cancer Gene Ther. 2019 Jan 31. doi: 10.1038/s41417-019-0084-z.
33. Warren S, Gates O. Multiple primary malignant tumors: a survey of the literature and a statistical study. Am J Cancer. 1932;16: 1358–1414.
34. Whitworth J, Hoffman J, Chapman C. et al. A clinical and genetic analysis of multiple primary cancer referrals to genetics services. Eur J Hum Genet. 2015; 23(5): 581–587.
35. Zhai C., Cai Y., Lou F., Liu Z., Xie J., Zhou X., Han W. Multiple Primary Malignant Tumors - A Clinical Analysis of 15,321 Patients with Malignancies at a Single Center in China. Journal of Cancer. 2018, 9(16), 2795–2801. doi:10.7150/jca.25482.