Выбор способа иммобилизации бактерий нефтедеструкторов для разработки биосенсоров на основе кислородного электрода

Известия Тульского государственного университета Естественные науки. 2011. Вып. 1. С. 237-246 Химия

УДК 579.017.7:543.9

Выбор способа иммобилизации бактерий — нефтедеструкторов для разработки биосенсоров на основе кислородного электрода *

О.Н. Понаморева, Н.Л. Лагунова, В.А. Евтеева, И.Ф. Пунтус

Аннотация. Проведено сравнительное изучение окислительной активности представителей грамотрицательных бактерий —

Pseudomonas sp.142NF(pNF142) и грамположительных бактерий — Rhodococcus sp.X5, адсорбированных на пористых и

активированных мембранных материалах и включенных в

синтетические и природные полимерные гели, как основы

для получения стабильно работающего рецепторного элемента биосенсора. Рецепторные элементы на основе микроорганизмов, включенных в агаровый гель, обладают наилучшей стабильностью, что обеспечивает воспроизводимость биосенсорного анализа и длительную работу биосенсорной установки.

Ключевые слова: целоклеточные биосенсоры, микроорганизмы-нефтедеструкторы, иммобилизация микроорганизмов.

Введение

Ведущая роль в разложении углеводородов нефти (УВН) принадлежит бактериям родов Pseudomonas и Rhodococcus, повсеместно распространенным в биогеоценозах и способным к биодеградации нефтекомпонентов различного строения в связи с наличием у них широкого набора ферментных систем. Микроорганизмы-нефтедеструкторы используются не только для биоремедиации почв и вод, загрязненных нефтепродуктами [1, 2], но и для создания на их основе биосенсорных систем для экологического мониторинга загрязнения окружающей среды УВН [3, 4] и изучения закономерностей процессов биоокисления нефтекомпонентов [5, 6].

При разработке биосенсоров необходимо, чтобы биологический материал был надежным образом закреплен (иммобилизован) на физико-химическом преобразователе. Иммобилизованные клетки микроорганизмов, по

* Работа выполнена при финансовой поддержке ФЦП «Научные и научнопедагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы (госконтракт № П976).

сравнению со свободными, обладают длительной функциональной активностью, что определяется не только экранирующим от вредных воздействий эффектом носителя, но и, согласно последним исследованиям, глобальной системой регуляции экспрессии генов у бактерий (Quorun Sensing — QS) [7]. Функционирование QS-регуляции предопределяется концентрацией клеток в системе. Установлено, что эта система играет важную роль в формировании биопленок, то есть важна для самоиммобилизующихся клеток и различается у грамположительных и грамотрицательных бактерий. Следует отметить, что бактерии

— нефтедеструкторы родов Pseudomonas и Rhodococcus значительно различаются по строению клеточной оболочки: грамположительные

родоккоки обладаю лучшей адгезией на различных поверхностях, в то время как грамотрицательные псевдоманады легко десорбируются.

Способ иммобилизации определяет основные аналитические и метрологические характеристики микробных сенсоров, такие как долговременную и оперативную стабильность, время развития отклика биосенсора, предел обнаружения, линейный интервал градуировочной зависимости, а также влияет селективность биосенсорного анализа. Таким образом, исследование влияния способа иммобилизации грамположительных и грамотрицательных бактерий — нефтедесрукторов является важной фундаментальной и практической задачей. Функционирование дыхательной цепи микроорганизмов является важным показателем их физиологической активности. Биосенсорные системы на основе кислородного электрода и иммобилизованных на его поверхности целых клеток микроорганизмов являются чувствительным инструментом, позволяющим регистрировать изменения дыхательной активности в биоматериале.

В работе проводили сравнительное изучение окислительной активности иммобилизованных бактерий — нефтедеструкторов родов Pseudomonas и Rhodococcus в зависимости от типа носителя для иммобилизации.

Материалы и методы

Бактериальные штаммы. В работе использовали два природных нефтедеструктора — Pseudomonas sp.142NF(pNF142) и Rhodococcus sp.X5 из коллекции микроорганизмов лаборатории биологии плазмид ИБФМ РАН г.Пущино.

Питательные среды и условия культивирования. Микроорганизмы культивировали на агаризованной (1.7% по весу) синтетической минимальной среде Эванса [8] на чашках Петри при 28°С в парах нафталина (для псевдомонад) или в парах дизельного топлива (для родококков) в качестве источника углерода и энергии.

Реактивы. Все реактивы, используемые в работе, имели степень чистоты х.ч. или ч.д.а. (Sigma (США), ХимМед (Россия), Диа-М (Россия)).

В качестве буферного раствора использовали 1/30 мМ натрий-калиевый фосфатный буфер, pH = 7.6 (соли Na2HPO4 и KH2PO4, Диа-М, Россия).

Иммобилизация микроорганизмов

Формирование рецепторного элемента. Бактериальные клетки смывали с чашек Петри буферным раствором, центрифугировали (Фуга/Вортекс Комбиспин FVL-2400) 10 мин (2000 об/мин). Биомассу, полученную в виде осадка, промывали буфером и снова центрифугировали до прозрачности супернатанта (3-4 раза). Проводили иммобилизацию бактерий на разных носителях. После иммобилизации полученный биорецепторный элемент помещали на кислородный электрод типа Кларка с полиэтиленовой газопроницаемой мембраной (толщина мембраны 50 у м) и фиксировали с помощью нейлоновой сетки. Измерения проводили при величине базового тока 25±3 нА. Исходная величина тока в системе количественно отражает эндогенное дыхание клеток, связанное с их концентрацией.

Иммобилизация бактерий на стекловолоконном фильтре. 25

мг сырой биомассы микроорганизмов ресуспендировали в 1 мл буфера, полученную смесь в объеме 5 мкл наносили на пористый стекловолоконный фильтр (GF/A, Whatman) размером 4x4 мм. Биомассу бактерий на фильтре подсушивали в течение 15 минут при 20°C.

Иммобилизация бактерий на активированной нитроцеллюлоз-ной мембране. Поверхность нитроцеллюлозного мембранного фильтра (размер пор 2-5 ц м, Synpor) активировали бензохиноном согласно методике

[9]. На поверхность активированной мембраны наносили 25 мг сырой массы клеток и инкубирования в течение суток в 1 мл буферного раствора.

Иммобилизация бактерий на нитроцеллюлозной мембране, активированной бензохиноном и диэтиламиноэтилдекстраном (ДЭАЭ-декстран). Активированную мембрану модифицировали ДЭАЭ-декстраном согласно методике [9]. Рецепторный элемент получали путем нанесения 25 мг сырой массы клеток и инкубирования в течение двух суток в 1 мл буферного раствора.

Иммобилизация бактерий в полиакриламидном геле (ПААГ). Приготовление смеси буферного раствора, акриламида, метилен-бис-акриламида, персульфата аммония и тетраметилэтилендиамина проводили согласно [10], в 1 мл этого раствора вносили 25 мг охлажденных клеток. Смесь выливали в чашку Петри и закрывали. Время полимеризации составляло 12-15 мин. Из полученного геля вырезали рецепторные элементы размером 4x4 мм, которые хранили в буферном растворе при +4°С.

Иммобилизация бактерий в криогеле поливинилового спирта (ПВС). Для получения криогеля в 1 мл 20% водного раствора ПВС добавляли 25 мг сырой биомассы микробных клеток. Полученную смесь переносили на предметное стекло в морозильную камеру (—25°С, 14 часов). Из размороженного при комнатной температуре криогеля вырезали

рецепторные элементы размером 4x 4 мм, которые хранили в буферном растворе при +4°С.

Иммобилизация бактерий в агаровом геле. Агаровый гель получали нагреванием на водяной бане 200 мг Bacto Agar (Sigma) и 90 мг хлорида натрия в 10 мл дистиллированной воды до полного растворения. Затем 25 мг сырой массы клеток перемешивали встряхиванием (Фуга/Вортекс Комбиспин FVL-2400) с 1 мл агарового геля в микропробирке «Eppendorf» при температуре 50-55°С с последующим охлаждением при комнатной температуре в течение часа до полного застывания геля, после чего из полученного агарового блока формировали рецепторные элементы в виде тонких срезов диаметром 4мм и толщиной 0,5мм.

Биосенсорные измерения. В качестве преобразователя использовали гальваностат-потенциостат IPC (Вольта, Россия), рабочий потенциал —700 мВ. Измерения выполняли в открытой кювете с рабочим объемом 4 мл при постоянном перемешивании магнитной мешалкой 200 об/мин и 20-23°С в диапазоне полного насыщения по кислороду, в качестве фонового использовали буферный раствор. Ввод пробы осуществляли на 100-ой секунде от начала записи ответа автоматическими микропипетками переменного объема (20-200 мкл, 200-1000 мкл) (Ленпипет, Россия). После каждого измерения осуществляли промывание электрода буферным раствором в течение 5-10 минут до восстановления концентрации кислорода в примембранном слое до первоначального уровня. Ток регистрировали в интервале 0.1-50 нА, в качестве измеряемого параметра (способа обработки сигнала сенсора) использовали максимальную скорость изменения выходного сигнала (отклика) биосенсора при добавлении субстратов.

Статистическую обработку результатов проводили с помощью специализированной компьютерной программы «IPC2000» (Вольта, Россия) и статистического пакета «Microsoft Excel».

Результаты и обсуждение

Принцип работы микробного сенсора основан на том, что при окислении субстрата иммобилизованными на поверхности кислородного электрода микроорганизмами в приэлектродном пространстве измерительной кюветы снижается концентрация кислорода, что регистрируется с помощью электрода и преобразуется в аналитический сигнал. Способы иммобилизации целых клеток микроорганизмов при создании биосенсоров каталитического типа ограничены, что обусловлено необходимостью сохранения жизнеспособности микроорганизмов в иммобилизованном состоянии и использования мягких методов иммобилизации, диффузионной доступностью субстратов (анализируемых веществ) в слое иммобилизованного биокатализатора, технологической возможностью создания тонких слоев и пленок на поверхности преобразователя. В работе исследовали возможность получения рецепторных элементов для биосенсоров, используя адгезию

целых клеток бактерий на поверхности носителей и включение в гели. Выбор способов иммобилизации проводили, оценивая такие параметры функционирования биосенсора, как повторяемость отклика, длительность стабильной работы рецепторного элемента и время подготовки рецепторного элемента к работе.

Адгезия микроорганизмов на пористых материалах — наиболее простой способ иммобилизации биокатализатора. Адсорбция биомассы микроорганизмов на стекловолоконном фильтре часто используют для получения рецепторных элементов биосенсоров на основе кислородного электрода. Этот способ не требует длительной подготовки рецепторного элемента (время иммобилизации биоматериала занимает 15-20 минут, что значительно сокращает время подготовки биосенсорной установки к работе). Иммобилизация целых клеток бактерий на нитроцеллюлозной мембране, предварительно активированной бензохиноном, или последовательно

— бензохиноном и ДЭАЭ-декстраном, характеризуется гораздо более длительным временем подготовки — 2 и 6 суток соответственно.

Обработка мембранных фильтров бензохиноном приводит к появлению на их поверхности дополнительных функциональных групп, способных взаимодействовать с гидроксильными группами биомолекул клеточной поверхности. Модификация мембраны ДЕАЕ-декстраном позволяет получить положительно заряженную поверхность носителя, что способствует более прочному взаимодействию отрицательно заряженных поверхностных структур клеток с носителем.

Грамотрицательные бактерии рода Pseudomonas не удерживаются прочно на поверхности исследуемых носителей из-за слабого взаимодействия обогащенной липидами клеточной стенки этих микроорганизмов с функциональными группами матрицы. На третий день после иммобилизации такие рецепторные полностью теряли активность (рис. 1).

В то же время адсорбция бактерий — нефтедеструкторов на стекловолоконном фильтре позволяет в течение одного дня исследовать их способность окислять различные субстраты, что можно использовать для быстрой характеристики окислительной активности этих микроорганизмов (рис. 2).

Адсорбционные способы иммобилизации хорошо себя зарекомендовали при работе с грамположительными бактериями Rhodococcus, что обусловлено высокой способностью пептидогликановой клеточной стенки этих бактерий к адгезии (рис. 1). Следует отметить, что рецепторные элементы на основе стекловолоконного мембранного фильтра не уступали по стабильности и чувствительности рецепторным элементам на основе модифицированных нитроцеллюлозных мембран.

Включение биомассы микроорганизмов в матрицу синтетических полимерных гелей обеспечивает более прочное удерживание целых клеток бактерий в полостях сетчатых структур носителя. При формировании синтетических полимерных гелей (например, на основе ПААГ), необходимо

Сутки

Рис. 1. Стабильность биосенсоров на основе бактерий Pseudomonas 8р.142МР

Рис. 2. Спектр окисляемых субстратов бактериями Pseudomonas sp.142NF(pNF142), адсорбированными на стекловолоконном мембранном

фильтре

использовать токсичные для многих бактерий низкомолекулярные соединения, что является препятствием для работы с живыми клетками

[10]. Приготовленные в работе рецепторные элементы на основе бактерий

— нефтедеструкторов в матрице ПААГ имели низкую окислительную активность.

Широкое распространение в качестве матрицы при разработке гетерогенных биокатализаторов на основе иммобилизованных клеток микроорганизмов получили криогели поливинилового спирта

[11]. Однако такой способ иммобилизации не позволяет получать тонкие структурные элементы с равномерным распределением клеток микроорганизмов по всему объему, что затрудняет проведение сравнительных исследований.

Иммобилизация целых клеток бактерий в природных полимерных гелях (агаре, коллагене, альгинате кальция) является одним из самых мягких методов, позволяющих получать биокатализаторы с высокой активностью ферментных систем бактерий. Иммобилизация бактериальных клеток в агаре позволила получить рецепторные элементы, которые сохраняли окислительную активность в отношении углеводородов и их производных в течение нескольких дней и недель. Полученные результаты подтверждают выдвинутое ранее предположение о сохранении пролиферативной функции у иммобилизованных в геле бактерий даже после длительного их использования в биотехнологических процессах [11]. По мере того, как популяция клеток увеличивается (первый день после иммобилизации, рис. 1) и достигает критического значения, аутоиндукторы QS-системы также накапливаются до порогового значения. После этого аутоиндукторы взаимодействуют с соответствующими регуляторными белками, которые превращаются в активаторы экспрессии определенных генов, что и приводит к изменению их биохимического статуса и к стабилизации системы. Биосенсор на основе псевдоманад характеризовался непрерывной стабильной работой более 12 недель, причем контрольный высев микроорганизмов из рецепторного элемента показал отсутствие приживления чужеродной нефтеокисляющей микрофлоры.

Следует отметить, что спектр субстратов, окисляемых микроорганизмами, адсорбированными на пористом мембранном фильтре, наиболее достоверно отражает способность этих бактерий участвовать в окислительных превращениях этих веществ. Диффузионные ограничения, присущие биокаталитическим системам на основе полимерного геля, приводят к снижению чувствительности биосенсорной системы. При одинаковом содержании анализируемого вещества в измерительной кювете отклики биосенсоров с рецепторными элементами на основе полимерной матрицы в 2 раза меньше, чем у биосенсоров с рецепторными элементами на основе стекловолоконного фильтра (рис. 1). Окислительная активность грамположительных бактерий рода ЯЬойососсиз, адсорбированных на стекловолоконном фильтре, сохраняется в течение нескольких дней, а биосенсор характеризуется высокой операционной стабильностью (табл.1).

В то же время иммобилизацию микроорганизмов в агаровом геле можно использовать для получения стабильных рецепторных элементов биосенсора, что позволяет сравнивать биокаталитические свойства грамположительных и грамотрицательных бактерий в условиях длительного эксперимента.

Для сравнительного изучения окислительной активности разных штаммов бактерий необходимо убедиться в применимости биосенсорного подхода для решения таких задач на основе статистического анализа

Таблица 1

Операционная и долговременная стабильность микробных сенсоров

Штамм, способ иммобилизации Операционная стабильность *, % Долговременная стабильность, дни

Як. эр.Х5, адсорбция 4 14

ЯН. вр.Х5, включение в гель 3 21

Р. вр.142ХЕ, адсорбция 15 2

Р. вр.142ХЕ, включение в гель 10 9

* За операционную стабильность принимали относительное стандартное отклонение для 15 последовательных измерений.

полученных данных. Для этого использовали рецепторные элементы, приготовленные в разное время из микроорганизмов, которые культивировали в одинаковых условиях. Было приготовлено 10 рецепторных элементов путем иммобилизации бактерий P. sp. 142NF^NF142) в агаровом геле. Бактерии выращивали на твердой агаризованной синтетической среде Эванса в парах нафталина с разницей времени в 1 день. В каждой серии измерений было получено 5-7 результатов (вариант), образующих выборку. Оценка правильности производилась с использованием данных по воспроизводимости и заключалась в нахождении доверительных границ (доверительного интервала 5), учитывая тот факт, что систематическая погрешность биосенсорного анализа заведомо меньше случайной погрешности вследствие использования в эксперименте биологического объекта.

Исключение данных по Q-критерию позволило сделать вывод о необходимом количестве биомассы в агаровом блоке для достоверности получаемых результатов, которое составило 25±2 мг по сырому весу на 1 мл агарового геля. Для решения вопроса о принадлежности отдельных выборок одной совокупности по воспроизводимости использовали статистический критерий F-распределения (критерий Фишера), для чего производили сравнение дисперсий двух выборочных совокупностей. Для всех дисперсий Fэксп. оказалось меньше Fкрит., следовательно, различия в дисперсиях имеют случайный характер и выборки принадлежат одной генеральной совокупности по воспроизводимости. Основываясь на массиве значений, полученном путем объединения пар выборок, была определена случайная ошибка эксперимента, которая составила 4,5%.

Заключение

Для получения стабильно работающего рецепторного элемента биосенсора провели сравнительное изучение окислительной активности представителей грамотрицательных бактерий — Pseudomonas sp.142NF(pNF-142) и грамположительных бактерий — Rhodococcus sp.X5, адсорбированных

на пористых и активированных мембранных материалах и включенных в синтетические и природные полимерные гели, как основы как основы для получения стабильно работающего рецепторного элемента биосенсора. Показали, что адсорбционные методы иммобилизации применимы для грамположительных бактерий Rhodococcus. Рецепторные элементы на основе микроорганизмов, включенных в агаровый гель, обладают наилучшей стабильностью, что обеспечивает воспроизводимость биосенсорного анализа и длительную работу биосенсорной установки.

Список литературы

1. Van Hamme J.D., Ajay S., Owen P.W. Recent advances in petroleum microbiology // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2003. V.67, №4. P.503-549.

2. Выбор и характеристика активных психротрофных микроорганизмов-деструкторов нефти / И.А. Пырченкова [и др.]. // Прикл. биохим. и микробиол. 2006. Т.42, №3. С.298-305.

3. Понаморева О.Н. Бактериальные биосенсоры для экологического мониторинга углеводородов нефти: мини-обзор // Изв. ТулГУ. Естественные науки. 2010. Вып.2. C.273-281.

4. Monitoring aromatic hydrocarbons by whole cell electrochemical biosensors / Y. Paitan [et al.]. // Anal. Biochem. 2004. V.335. P.175-183.

5. Лагунова Н.Л., Понаморева О.Н., Филонов А.Е., Пунтус И.Ф. Оценка влияния плазмид биодеградации нафталина на биохимическое поведение бактерий-нефтедеструкторов рода Pseudomonas с помощью биосенсорных технологий // Изв. ТулГУ. Естественные науки. 2007. Вып.1. С.243-252.

6. Screening of xenobiotic compounds degrading microorganisms using biosensor techniques / B. Beyersdorf-Radeck [et al.]. // Microbiol Res. 1998. V.153, №3. P.239-245.

7. Atkinson S., Williams P. Quorum sensing and social networking in the microbial world. Review // J.R. Soc. Interface. 2009. V.6. P.959-978.

8. Evans C, Herbert D., Tempest D. The continiuous cultivation of microorganisms // Methods in Microbiology. 1970. V.2, №4. P.277-327.

9. Зайцев М.Г., Алферов В.А., Кузнецова Т.А., Решетилов А.Н. Характеристика биокатализаторов на основе иммобилизованных дрожжевых алкогольоксидаз как основы рецепторных элементов биосенсоров для определения содержания спиртов // Изв. ТулГУ. Естественные науки. 2008. Вып.2. С.200-207.

10. Иммобилизация клеток Gluconobacter oxydans для создания стабильных рецепторных элементов биосенсоров / В.А. Арляпов [и др.]. // Изв. ТулГУ. Сер. Химия. 2006. Вып.6. С.137-144.

11. Ефременко Е.Н., Татаринова Н.Ю. Влияние длительного хранения клеток микроорганизмов, иммобилизованных в криогель поливинилового спирта, на их выживаемость и биосинтез целевых метаболитов // Микробиология. 2007. Т 48, №6. С.383-389.

Понаморева Ольга Николаевна (olga@rtsu.tullla.ru), к.х.н., доцент, кафедра химии, Тульский государственный университет.

Лагунова Наталия Леонидовна (dragon.natashka@rambler.ru), к.б.н., кафедра химии, Тульский государственный университет.

Евтеева Вера Алексеевна, к.х.н., ученый секретарь, Медицинский институт, Тульский государственный университет.

Пунтус Ирина Филипповна (puntus@ibpm.pushchino.ru), к.б.н., старший научный сотрудник, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино, Московская область.

Selecting the method of immobilization of oil-degrading microorganisms for the development of biosensors based on

oxygen electrode

O.N. Ponamoreva, N.L. Lagunova, V.A. Evteeva, I.F. Puntus

Abstract. We conducted a comparative study of oxidative activity of representatives of Gram-negative bacteria — Pseudomonas sp.142NF (pNF142) and Gram-positive Bacteria — Rhodococcus sp.X5, adsorbed on a porous membrane and activated materials, and included in the synthetic and natural polymer gels as a basis for successfully working receptor element of the biosensor. Receptor cells, based on the microorganisms in the agar gel, has the best stability, which ensures the reproducibility of the biosensor analysis and long-term work of the biosensor setup.

Keywords: microbial biosensors, oil-degrading microorganisms, immobilization of microorganisms.

Ponamoreva Olga (olga@rtsu.tullla.ru), candidate of chemical sciences, associate professor, department of chemistry, Tula State University.

Lagunova Nataliya (dragon.natashka@rambler.ru), candidate of biological sciences, department of chemistry, Tula State University.

Evteeva Vera, candidate of chemical sciences, scientific secretary, Medical Institute, Tula State University.

Puntus Irina (puntus@ibpm.pushchino.ru), candidate of biological sciences, senior researcher, Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms of RAS, Pushchino, Moscow region.

Поступила 10.01.2011