СПОСОБ ПОДАВЛЕНИЯ РОСТА ОПУХОЛЕЙ
METHOD OF TUMOUR GROWTH SUPPRESSION

Настоящее изобретение относится к медицине, а именно к лечению опухолей методом фотодинамической терапии (ФДТ).
При проведении ФДТ пациенту, как правило, системно вводится фотосенсибилизатор (ФС), после чего опухоль подвергается облучению светом в спектральном диапазоне, соответствующем полосе поглощения молекул ФС. В результате облучения происходит возбуждение молекул ФС, сопровождающееся образованием активных форм кислорода (в первую очередь синглетного кислорода), которые являются цитотоксическими агентами и вызывают гибель клеток опухоли.
Известны способы подавления роста опухолей методом ФДТ путем внутривенного введения ФС в виде истинного раствора [Dougherty Т.J. et al., Photoradiation Therapy for the Treatment of Malignant Tumors, Cancer Res., 1978, 38, 2628-2635], в липосомах [A.S.L.Derycke and P.A.M. de Witte, Liposomes for photodynamic therapy. Advanced Drug Delivery Reviews, 2004, 56, 17-30], в мицеллах [С.F. van Nostrum, Polymeric micelles to deliver photosensitizers for photodynamic therapy, Advanced Drug Delivery Reviews, 2004, 56, 9-16], в коньюгатах с наночастицами [M.E.Wieder, et al., Intracellular photodynamic therapy with photosensitizer-nanoparticle conjugates: cancer therapy using a 'Trojan horse', Photochem. Photobiol. Sci., 2006, 5, 727-734] и др. с последующим облучением опухоли в спектральной области поглощения молекулярной формы ФС.
Недостатком этих способов является то, что здесь ФС проявляет фотодинамическую активность не только в опухоли, но и в здоровых тканях, в частности в коже. Так называемая «кожная фототоксичность» является одним из нежелательных побочных эффектов ФДТ. Пациентам приходится соблюдать определенный световой режим после введения ФС, избегая обычного освещения открытых участков кожи в течение нескольких дней, а иногда и недель.
th
Наиболее близким к заявляемому способу является способ подавления роста опухоли методом ФДТ путем внутривенного введения большой дозы (до 30 мг/кг) дисперсии наночастиц (НЧ) ФС и последующего облучения опухоли в спектральной области поглощения молекулярной формы ФС [B.Ya.Kogan, A.V.Butenin, A.A.Pankratov, R.I.Yakubovskaya, N.V.Bluhterova, R.A.Feysulova, V.A.Puchnova, V.M.Negrimovsky, E.A.Luk'yanets, G.N.Vorozhtsov, Unsubstituted aluminium phthalocyanine nanoparticles as photosensitizer for PDT, Abstract Book, 6 Annual Congress of the European Society for Photodynamic Therapy, Bern, 2006, p.64]. Сами по себе НЧ ФС не обладают фотодинамической активностью, но в биоткани они частично, хотя и очень слабо растворяются, и при этом образуется небольшое количество молекулярной формы ФС, обладающей фотодинамической активностью. Недостатком способа является вышеупомянутая «кожная фототоксичность».
Задачей настоящего изобретения является элиминация «кожной фототоксичности» после внутривенного введения ФС.
2
Поставленная задача решается тем, что после внутривенного введения дисперсии НЧ ФС производится облучение опухоли, а следовательно, и содержащихся в ней НЧ ФС лазерными импульсами в спектральной области поглощения НЧ ФС при плотности энергии в импульсе не ниже 0,1 Дж/см. Такое облучение приводит к импульсному нагреву НЧ с выделением молекулярной фотоактивной формы ФС, обладающей в отличие от НЧ флуоресцентной и фотодинамической активностью. Это позволяет существенно снизить необходимую дозу вводимого ФС по сравнению с прототипом и, следовательно, уменьшить концентрацию спонтанно образующейся в здоровых органах и тканях молекулярной формы ФС. Следует отметить, что фотоактивная форма ФС детектировалась только в облученной импульсным лазером области. В здоровой коже и внутренних органах животного специфическая флуоресценция фотоактивной формы ФС отсутствовала (табл.1). После импульсного облучения проводится сеанс ФДТ путем облучения опухоли в спектральной области поглощения молекулярной формы ФС (спектры поглощения ФС в виде НЧ и в молекулярной форме различны). При таком способе ФС находится во всех органах и тканях (в том числе и в коже) в основном в неактивной форме (в виде НЧ) и только в опухоли активируется импульсным лазерным облучением, приводящим к образованию активной молекулярной формы ФС (табл.1).
Таблица 1
Интенсивность флуоресценции мономерной фотоактивной формы ФС в опухолевом узле, здоровой коже и внутренних органах животных после внутривенного введения наночастиц ФС с последующим облучением опухолевого узла импульсным лазером
Орган/ткань
Опухолевый узел
Кожа в области уха
Кожа в области стопы
Мышечная ткань
Печень
Почки
Сердце
Интенсивность флуоресценции, у.е.
Наночастицы фталоцианина алюминия, 15 мг/кг
52000±11000
21±9
15±6
16±5
20±8
19±8
22±3
Наночастицы фталоцианина алюминия, 3 мг/кг
32000±13000
25±8
20±10
22±9
27±8
21±8
16±9
Наночастицы фталоцианина цинка, 3 мг/кг
24000±1300
18±5
23±5
16±8
20±9
14±8
19±7
Наночастицы фталоцианина цинка, 1 мг/кг
7000±1700
15±5
18±3
22±7
12±7
19±7
23±9
Контроль (животные, которым не вводили наночастицы ФС)
24±9
19±7
21±10
13±10
17±6
24±6
10±10
-1
-2
-1
5
-1
-3
2
-1
Необходимые параметры импульса облучения могут быть определены расчетным путем. Введем следующие обозначения: r - радиус НЧ; k - коэффициент поглощения НЧ на длине волны облучения; с - объемная удельная теплоемкость НЧ; α - температуропроводность среды; Δt - длительность импульса облучения; Е - плотность энергии импульса; ΔТ - увеличение температуры НЧ, необходимое для образования молекулярной формы ФС. Наиболее благоприятным для максимального нагрева является адиабатический случай, когда за время импульса тепло не успевает перейти из НЧ в окружающую среду. Этот случай может быть реализован при r>k, Δt<kα. Приняв характерные значения k=10 см, α=10 смс, получим, что адиабатический случай может быть реализован при радиусе НЧ больше 100 нм и длительности светового импульса короче 100 нс. При этом нагрев ΔТ определяется соотношением
сΔТ=kE.
-3
-1
2
2
2
Приняв характерные значения с=2 Дж см К, ΔТ=500 К, получим величину, необходимой для нагрева НЧ плотности энергии импульса Е=0,01 Дж/см. С учетом того, что излучение сильно ослабляется при прохождении в глубину опухоли, за минимальную плотность энергии импульса следует принять на порядок большую величину Е=0,1 Дж/см. При более длинном импульсе или меньшем радиусе НЧ для нужного нагрева потребуется более высокая плотность энергии импульса Е. В общем случае, чем больше величина Е, тем более толстый слой опухоли может быть обработан. Допустимая верхняя граница величины Е определяется допустимой величиной нагрева прилегающей к опухоли здоровой ткани и составляет несколько десятков Дж/см (такие плотности мощности применяются в косметологических кабинетах при лазерном удалении пигментных пятен, татуировок и пр.).
2
2
Исследования проводили на мышах с привитой опухолью (саркома S-37). НЧ фталоцианинов (средний радиус 100-150 нм, максимальный радиус 500 нм) вводили внутривенно в дозах от 0,5 до 15 мг/кг веса. Были испытаны НЧ фталоцианина цинка (ZnPc), алюминия (AlPc) и безметального (HPc). Затем опухоль облучали импульсами лазера на рубине с модуляцией добротности. Плотность энергии в импульсе была не ниже 0,1 Дж/см. Доказательством появления молекулярной формы ФС в опухоли служило появление в облученной зоне, в отличие от необлученной, флуоресценции молекулярной формы ФС. После этого проводился сеанс ФДТ с последующей оценкой ее терапевтической эффективности. Для этого опухолевый узел облучали непрерывным излучением лазера с длиной волны 670 нм, попадающей в полосу поглощения молекулярной формы ФС. Оценку противоопухолевого эффекта производили по торможению роста опухоли (ТРО, %), которое рассчитывали по формуле:
контроль
опыт
контроль
ТРО(%)=[(РО-РО)/РО]×100,
контроль
опыт
где РО - размер опухоли в контрольной, а РО - в опытной группе.
Предлагаемое изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1
2
2
2
Трем группам мышей с опухолью (саркома S-37) наночастицы (НЧ) фталоцианина цинка (ZnPc) вводили внутривенно в дозе 7 мг/кг. Четвертая группа мышей была контрольной. Затем у животных было произведено облучение опухолевого узла импульсами рубинового лазера (λ=694 нм). Плотность энергии в импульсе в центре светового пятна достигала 1 Дж/см и спадала к периферии пятна до 0,1 Дж/см. В первой группе опухоль была облучена 1 импульсом, во второй - 5 и в третьей - 10 импульсами. НЧ ZnPc хорошо поглощают излучение с длиной волны 694 нм. После импульсного облучения была измерена интенсивность флуоресценции в каждом опухолевом узле. Затем опухоли были облучены непрерывным лазером на длине волны 670 нм (ФДТ, 100 мВт/см, 15 мин). Молекулярная форма ZnPc хорошо поглощает излучение с длиной волны 670 нм. Результаты представлены в табл.2.
Таблица 2
Интенсивность флуоресценции в опухоли и противоопухолевая эффективность ФДТ после импульсного облучения опухолевого узла с НЧ ZnPc (7 мг/кг) у мышей с S-37
№ п.п.
Доза ZnPc, мг/кг
Количество импульсов
Интенсивность флуоресценции (у.е.)
ФДТ
ТРО на сутки после лечения, %
8
12
15
18
20
1
7
1
1900±600
100 мВт/см<sup>2</sup>15 мин
88
79
69
47
38
2
5
4160±1200
96
92
90
74
67
3
10
6800±3100
96
94
91
87
78
Из данных табл.2 видно, что интенсивность флуоресценции в опухоли растет с увеличением числа импульсов облучения. Это говорит о накоплении в ней молекулярной фотоактивной формы ФС. Об этом же свидетельствует терапевтическая эффективность последующей ФДТ, степень выраженности которой коррелирует с интенсивностью флуоресценции и, значит, с количеством накопившегося ФС.
Пример 2
2
Трем группам мышей с опухолью (саркома S-37) НЧ ZnPc вводили внутривенно в дозе 15 мг/кг. Четвертая группа мышей была контрольной. Затем у животных в первой и третьей группах было произведено облучение опухолевого узла импульсами рубинового лазера (10 импульсов; λ=694 нм) с плотностью энергии в импульсе такой же, как в примере 1. После этого у всех животных была измерена интенсивность флуоресценции в опухоли. Затем у мышей во второй и третьей группах опухолевые узлы были облучены непрерывным лазером (ФДТ - λ=670 нм; 100 мВт/см, 15 мин). Результаты представлены в таблице 3.
Таблица 3
Интенсивность флуоресценции в опухоли и противоопухолевая эффективность ФДТ после импульсного облучения опухолевого узла с НЧ ZnPc (15 мг/кг) у мышей с S-37
№ п.п.
Доза ZnPc, мг/кг
Количество импульсов
Интенсивность флуоресценции (у.е.)
ФДТ
ТРО на сутки после лечения, %
опухолевый узел
кожа в области лапы
9
13
16
18
20
1
15
10
31000±15000
33±21
-
39
27
19
20
6
2
0
24±11
26±18
100 мВт/см<sup>2</sup>, 15 мин
47
29
25
25
27
3
10
24000±9600
31±12
100 мВт/см<sup>2</sup>, 15 мин
100
100
100
100
100
4
0
-
27±16
23±12
-
-
-
-
-
-
Из данных табл.3 видно, что флуоресценция молекулярной формы ФС в опухолевом узле регистрируется только после его импульсного облучения. В коже, которая не была подвержена воздействию импульсного лазерного излучения, специфическая флуоресценция молекулярной фотоактивной формы ФС отсутствовала.
В отдельности импульсное облучение и ФДТ, проведенные после введения НЧ ZnPc, не оказывали терапевтического действия (опытные группы 1 и 2), а их последовательное применение (опытная группа 3) приводило к полной регрессии опухолевого узла (в течение последующих 20 суток рецидива опухоли отмечено не было). Полученные данные подтверждают высокую терапевтическую эффективность предложенного способа. Низкая противоопухолевая эффективность, отмеченная у животных, которым проводили только ФДТ (опытная группа 2), подтверждает отсутствие в зоне воздействия (опухолевый узел) фотоактивной формы ФС.
Молекулярная фотоактивная формы ФС в здоровой коже практически отсутствовала (табл.3), поэтому развития такого тяжелого побочного эффекта ФДТ, как «кожная фототоксичность», не происходило.
Пример 3
2
2
Трем группам мышей с опухолью S-37 НЧ AlPc вводили внутривенно в дозе 0,5 мг/кг. Четвертая группа мышей была контрольной. Затем у животных первой группы было произведено облучение опухолевого узла импульсами рубинового лазера (694 нм) с плотностью энергии в импульсе такой же, как в примере 2 (10 импульсов). НЧ AlPc хорошо поглощают излучение с длиной волны 694 нм. У животных второй группы опухолевый узел был облучен непрерывным лазером на длине волны 670 нм (ФДТ, 50 мВт/см, 15 мин), а третьей группы - сначала импульсным (10 импульсов), а затем непрерывным излучением (ФДТ, 50 мВт/см, 15 мин). Молекулярная форма AlPc хорошо поглощает излучение с длиной волны 670 нм. Результаты представлены в табл.4.
Таблица 4
Влияние импульсного и непрерывного облучения (ФДТ) и также их комбинации после предварительного введения НЧ AlPc (0,5 мг/кг) на ТРО у мышей с S-37
№ группы (облучение)
ТРО на сутки после лечения, %
7
9
12
14
16
19
1 (импульсное облучение)
19
16
-1
29
15
22
2 (непрерывное облучение; ФДТ)
-13
-17
-37
-40
-11
-34
3 (имп. + ФДТ)
93
93
90
87
77
73
Из данных табл.4 видно, что импульсное облучение и ФДТ в отдельности не приводили к биологически значимому торможению роста опухоли (группы 1 и 2), в то время как их последовательное применение оказывало выраженное терапевтическое действие - ТРО на уровне 93-70% наблюдали в течение 19 суток после лечения (группа 3). Эти данные также подтверждает высокую терапевтическую эффективность предложенного способа. У животных всех групп «кожная фототоксичность» отсутствовала.
Пример 4
2
2
2
2
2
Трем группам мышей с опухолью S-37 НЧ НРс вводили внутривенно в дозе 3 мг/кг. Четвертая группа мышей была контрольной. Затем у животных первой группы было проведено облучение опухолевого узла импульсами рубинового лазера (694 нм) с плотностью энергии в импульсе такой же, как в примере 2 (100 импульсов). НЧ НРс хорошо поглощают излучение с длиной волны 694 нм. У мышей второй группы опухоль была облучена непрерывным лазером на длине волны 670 нм (ФДТ, 50 мВт/см,15 мин), а третьей группы - сначала импульсным (10 импульсов), а затем непрерывным лазерным излучением (ФДТ, 50 мВт/см, 15 мин). Молекулярная форма НРс хорошо поглощает излучение с длиной волны 670 нм. Результаты представлены в табл.5.
Таблица 5
Влияние импульсного и непрерывного облучения (ФДТ) и также их комбинации после предварительного введения НЧ Н<sub>2</sub>Рс (3 мг/кг) на ТРО у мышей с S-37
№ группы (облучение)
ТРО на сутки после лечения, %
6
11
13
16
18
20
1 (имп. облучение)
55
46
46
44
26
39
2 (непр. обл.; ФДТ)
44
38
21
20
16
-5
3 (имп. + ФДТ)
92
86
87
78
74
73
2
Как видно из данных, представленных в табл.5, только импульсное облучение после предварительно введенных НЧ НРс приводило к непродолжительному (только в течение 6 дней после лечения) биологически значимому ТРО на 55% (опытная группа 1). Непрерывное облучение опухолевого узла в исследованном режиме не оказывало биологически значимого противоопухолевого действия (опытная группа 2). Наилучший терапевтический эффект отмечен у животных третьей группы, у которых проводили ФДТ после предварительного облучения опухолевого узла импульсным лазером: ТРО на уровне 92%-73% сохранялось более 20 дней после лечения (табл.5, опытная группа 3). Полученные результаты подтверждают высокую терапевтическую эффективность предложенного способа. Следует отметить, что у животных всех групп «кожная» фототоксичность отсутствовала.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет исключить кожную фототоксичность при эффективном подавлении опухолевого роста.