Некоторые закономерности окисления кверцетина кислородом воздуха в водных растворах

ВЕСТНИК САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКОГО УНИВЕРСИТЕТА

Сер. 4. 2009. Вып. 1

УДК 543.637.4

С. В. Гущина, В. М. Косман, И. Г. Зенкевич

НЕКОТОРЫЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ ОКИСЛЕНИЯ КВЕРЦЕТИНА КИСЛОРОДОМ ВОЗДУХА В ВОДНЫХ РАСТВОРАХ *)

Кверцетин (3,5,7,3/,4/-пентагидроксифлавон, 5,7,3/,4/-тетрагидроксифлавонол, I) является одним из самых распространённых природных флавоноидов. Он обнаружен практически во всех растительных объектах. В соответствии с современными представлениями, это соединение обладает разнообразными фармакологическими эффектами [3]. В большинстве публикаций рассматривают свойства кверцетина in vitro, однако обнаружить кверцетин в живых организмах практически невозможно [4]. Что же касается превращений этого соединения в растворах, то механизмы этих процессов ещё относительно мало изучены. Во многих работах, посвящённых химическим свойствам кверцетина, отмечают, что он нестабилен в водных растворах [5]. Вероятно, что в различных условиях осуществляются разные пути его превращения. Основываясь на литературных данных, можно предположить существование не менее трёх различных механизмов окислительной деструкции I.

Первый механизм включает образование хинонов. Так, в работах [6, 7] описан механизм внутриклеточного ферментативного метаболизма I с образованием хиноидных структур, схема (1). На данной схеме II - первичный продукт окисления (о-хинон), IIa, IIb и IIc - его изомеры (хинон-метиды).

По материалам сообщений на международной конференции «Химия соединений с кратными углерод-углеродными связями» [1] и The 12th International congress Phytopharm [2].

© С. В. Гущина, В. М. Косман, И. Г. Зенкевич, 2009

+ н2о

но

он

он

он он

соон

соон

Второй механизм окислительной деструкции включает стадию гидропероксидного окисления с образованием в качестве главного продукта депсида III - сложного эфира 2,4,6-тригидрокси- IV и 3,4-дигидроксибензойных кислот V, схема (2) [8, 9]. Отмечено также образование альдегидов, таких как 2,4,6-тригидроксибензальдегид [5].

Третий механизм деградации, предложенный в работе [10], включает щелочное расщепление а-дикетонов и также приводит к образованию депсида III.

В качестве конечных продуктов окисления указывают 3,4-дигидроксифенилуксус-ную VI, 3-гидроксифенилуксусную VII, 3-(3-гидроксифенил)пропионовую VIII и про-токатеховую кислоты V [11], схема (3). Последующий метаболизм этих кислот в живых организмах может приводить к образованию их метилированных производных [12].

Кроме того, помимо депсида III выделен и охарактеризован другой промежуточный продукт окислительной деструкции I - 2-(3,4-дигидроксибензоил)-2,4,6-тригидрокси-бензофуран-3-(2Я)он - алфитонин (IX) [8, 13, 14], схема (4).

Условия окисления I весьма разнообразны. Этот процесс наблюдается при действии такого реагента как перекись водорода [15]. Он может протекать за счёт взаимодействия с кислородом воздуха в присутствии ферментов микроорганизмов, грибов, растений

+

HO.

HO

HO

COOH

VIII

COOH

VI

и млекопитающих [3, 7, 16, 17]. Известно электрохимическое окисление кверцетина [8, 18, 19]. В качестве катализаторов процессов окисления могут быть использованы ионы металлов (медь, железо) [14-16, 20].

При химическом окислении кверцетина кислородом воздуха основными факторами, влияющими на реализацию того или иного механизма процесса, являются состав растворителя и его рН. Есть сведения об окислении кверцетина в разных средах: ди-метилсульфоксиде, ацетонитриле, водно-спиртовых и различных буферных растворах [5, 8, 14]. Отмечено, что в водной среде обнаружение хинонов, как промежуточных продуктов окисления невозможно, так как они быстро присоединяют воду [5, 14]. Важным фактором, влияющим на реакционную способность кверцетина, является рН среды. Биохимические исследования кверцетина подтверждают, что при низких значениях рН (4,5-6,5) кверцетин не проявляет антиоксидантных свойств [7, 15]. Это может свидетельствовать о том, что в кислой среде окисление I возможно либо в электрохимических процессах, либо под воздействием окислителей более сильных, чем кислород [15, 18].

Таким образом, несмотря на большое количество публикаций, посвящённых изучению окисления кверцетина, чёткой и единообразной картины его химических свойств ещё нет. Поэтому установление механизмов окисления кверцетина в различных условиях и идентификация продуктов его метаболизма, несомненно, актуальны. Настоящее сообщение посвящено установлению некоторых закономерностей окисления кверцети-на, реализуемых при различных условиях.

Экспериментальная часть. В работе использовали образец кверцетина дигидрата (не менее 95 %, Sigma, CAS N 6151-25-3). Готовили его раствор в 95 %

этиловом спирте с концентрацией 5 мг/мл. Для изучения кинетики окисления кверцетина использовали фосфатный буферный раствор с исходным значением рН= 7 [21]. Добавлением 0,2 н. раствора едкого натрия доводили рН до необходимого значения (7,0, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0). К 10 мл буферного раствора с заданным значением рН, помещённого в градуированную пробирку, прибавляли 130 мкл раствора кверцетина. Пробирку с раствором помещали в водяную баню, нагретую до температуры 37 °С, 20 °С и 0 °С. С помощью микрокомпрессора через раствор пропускали воздух со скоростью около 50 мл/мин. Каждые 0,5 ч отбирали для высокоэффективного жидкостно-хроматографического (ВЭЖХ) анализа пробы раствора, которые немедленно дозировали в хроматограф, а испытуемый раствор доводили до исходного объёма соответствующим буферным раствором.

Анализ растворов проб выполнен методом обращённо-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии. На хроматографе Beckman (США) с УФ-детектором и колонкой Luna Ci8 150 х 4, 6 мм (размер частиц сорбента 5 мкм) с предколонкой 2,0 мм, заполненной тем же сорбентом. В качестве элюента использовали смесь ацетонитрила (4-й сорт, НПК Криохром, СПб) и 0,03 % водный раствор трифторуксусной кислоты (Riedel-de Haen, Германия) в бидистиллированой воде. Использован режим градиентного элюирования: изократическая ступень - 10 % ацетонитрила в течение 5 мин, далее линейное увеличение концентрации ацетонитрила до 70 % за 20 мин. Расход элюента 1,0 мл/мин. Длина волны детектирования 280 нм. Регистрация и обработка хроматограмм осуществлялась с помощью программного обеспечения Мультихром (ЗАО Ам-персенц, Россия).

Для идентификации продуктов окисления I использованы стандарты флороглюци-на (95 %) и 3,4-дигидроксибензойной кислоты (95 %). Третий продукт - 2,4,6-тригид-роксибензойную кислоту - идентифицировали на основании литературных данных о её хроматографических параметрах [22]. За изменением концентрации I и продуктов окисления следили по абсолютным значениям площади пиков. При каждом значении рН эксперименты повторяли до получения воспроизводимых значений площадей хроматографических пиков (не менее 3-5 раз).

Ранее было установлено, что основными продуктами окисления кверцетина, по крайней мере, при рН в области 8-10, являются флороглюцин, 2,4,6-тригидрокси-бензойная кислота и 3,4-дигидроксибензойная кислота, а также промежуточный продукт (предположительно депсид), структура которого не была однозначно установлена [10, 22, 23].

Результаты и их обсуждение. В ходе работы была определена скорость окислительной деструкции кверцетина кислородом воздуха в зависимости от различных факторов реакционной среды. В качестве основных действующих факторов были рассмотрены состав растворителя, температура и рН среды.

Влияние состава растворителя. При увеличении количества этилового спирта в реакционной смеси для увеличения растворимости I скорость процесса замедляется. При окислении I в диэтиловом эфире окислительной деструкции кверцетина не обнаружено. Таким образом, максимальная скорость окисления I наблюдается в водных растворах с минимальным добавлением спирта.

Влияние температуры. Влияние температуры оценивали по уменьшению площади пиков кверцетина в растворах. Исходные данные представлены в табл. 1 в виде средних значений по данным трёх экспериментов на каждую временную точку. Было обнаружено, что окисление I в водных растворах при различных температурах может быть описано кинетическими закономерностями реакций псевдопервого порядка:

С « 5 = В + Лс-Ы,

где С - концентрация кверцетина в растворе, 5 - площадь его хроматографического пика (ВЭЖХ анализ), £ - время (ч), к - константа скорости, Л - предэкспоненциальный множитель, В - свободный член.

Таблица 1

Исходные значения площадей пиков кверцетина (мвХмс) для определения значения констант скоростей его окисления при различных температурах

Время окисления, ч Температура

0 °С 20 °С 37 °С

0 2097,5 2051,4 1740,4

0,5 1398,6 1205,1 257,6

1 1138,8 841,4 130,4

1,5 978,5 649,5 0,0

2 986,1 494,9 0,0

2,5 1016,8 401,3 0,0

3 990,4 303,8 0,0

3,5 927,1 195,3 0,0

4 1023,3 126,1 0,0

4,5 929,5 110,3 0,0

5 927,0 40,6 0,0

5,5 900,9 24,9 0,0

6 811,5 68,7 0,0

6,5 817,8 45,3 0,0

7 833,8 62,4 0,0

7,5 834,8 20,6 0,0

Константы скорости определены при трёх различных температурах (табл. 2).

Таблица 2

Константы скорости

Т, °С 0 °С 20 °С 37 °С

Растворимость

кислорода 14,6 9,1 7,0

в воде, мг/л

к 1,15 ±0,17 0,72 ±0,04 3,60 ±0,16

Даже трёх значений к достаточно для выявления интересного факта - при 0 С скорость окисления оказалась аномально выше, чем при 20 С. Возможной причиной такого эффекта является большая растворимость кислорода в воде при 0 С. Более того, при 0 С можно предполагать изменение механизма окислительной деструкции кверцетина, поскольку зарегистрировано образование неизвестных компонентов, более гидрофобных по сравнению с исходным кверцетином (имеют большие параметры удерживания).

Влияние рН. Наиболее значительное влияние на скорость окисления I оказывает рН растворителя. При рН^ 10,5 измерение скорости окисления невозможно из-за очень высокой скорости процесса (табл. 3). При рН^ 7 окисление происходит существенно

медленнее и занимает десятки часов. Исходные данные представлены в табл. 3 в виде средних значений по данным трёх экспериментов на каждую временную точку.

Таблица 3

Исходные значения площадей пиков кверцетина (мвХмс) для определения констант скоростей его окисления при различных рН

Время pH

окисления, ч 8 8,5 9 9,5 10 10,5

0 3197,1 1778,1 1740,4 1823,3 2222,8 1344,5

0,5 1329,3 777,2 257,6 190,3 74,3 58,1

1 1064,1 276,0 130,4 0,0 0,0 0,0

1,5 634,0 173,5 0,0 0,0 0,0 0,0

2 532,4 124,4 0,0 0,0 0,0 0,0

2,5 371,5 31,5 0,0 0,0 0,0 0,0

3 274,4 19,8 0,0 0,0 0,0 0,0

3,5 214,5 9,8 0,0 0,0 0,0 0,0

4 141,6 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

4,5 87,2 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

5 59,8 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

5,5 38,6 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

6 42,9 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

6,5 20,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

7 22,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

7,5 22,4 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

В интервале рН 10,5-8,5 скорость окисления I заметно уменьшается. В этом же интервале рН реакция окисления протекает единообразно с образованием одного и того же промежуточного продукта, предположительно депсида III.

График зависимости константы скорости окисления I кислородом воздуха в зависимости от рН представлен на рис. 2 (см. также табл. 4).

Таблица 4 Данные для графика на рис. 1

pH к pH к

8 1,06 ± 0,09 9,5 4,55 ±0,05

8,5 1,67 ±0,05 10 6,70 ±0,02

9 3,60 ±0,16 10,5 6,25 ±0,02

Рис. 1. Зависимость константы скорости окисления соединения I от рН реакционной среды

pH

Наблюдаемую зависимость &(рН) можно аппроксимировать уравнением Больцмана:

Аг - А2

У

+ А2

где Аг = 0, 61, А2 = 6, 78, х0 =9,1 и ё,х = 0,42.

Установлено, что при рН ^ 7 окислительная деструкция I происходит медленнее и механизм её другой. Такое заключение можно сделать, исходя из отсутствия на хроматограммах пика промежуточного продукта, характерного для окисления при более высоких значениях рН, и появления пиков других веществ, характеризующихся большей гидрофобностью по сравнению с I.

Для определения структуры промежуточного продукта, образовавшегося в результате окисления кверцетина при температуре 37 С и рН от 8 до 10, фракция элюента, содержащая данный компонент, была выделена хроматографически. Но проанализировать данную фракцию не удалось, так как содержащееся в ней вещество оказалось нестабильным. При хранении в течение суток в растворе это соединение трансформировалось в несколько неизвестных более гидрофобных веществ. Такая же картина наблюдалась и при выпаривании фракции элюента, собранного на выходе хроматографической колонки. Следовательно, установить структуру данного вещества можно только без выделения из раствора с использованием метода ЖХ-МС.

Заключение. Рассмотрены важнейшие закономерности окисления кверцетина кислородом воздуха в водных растворах. Впервые выявлено, что существуют несколько различных механизмов этого процесса, один из которых реализуется при рН 8-10. При этом в ряду значений рН 10-9-8 скорость окисления кверцетина существенно уменьшается. Помимо основного механизма при рН = 8-10,5, обнаружены аномалии окисления при рН ^ 7 и при температурах около 0 С. Существование различных механизмов окисления означают, что дальнейшее их изучение должно быть продолжено с целью идентификации неизвестных продуктов окисления кверцетина и уточнения возможных механизмов реакций.

Литература

1. Гущина С. В., Косман В. М., Зенкевич И. Г. Кинетические закономерности окисления кверцетина кислородом воздуха в водных растворах // Тез. докл. Междунар. конф. «Химия соединений с кратными углерод-углеродными связями». СПб., 2008. С. 149-150.

2. Gushchina S. V., Kosman V. M., Zenkevich I. G. Kinetics of quercetin oxidation by air oxygen at different pH values and temperatures // Abstr. The 12th International congress Phytopharm. Saint-Petersburg, 2008. P. 48.

3. Andersen O. M., Markham K. R. Eds. Flavonoids: Chemistry, Biochemistry and Applications // Taylor & Francis Group, LLC, 2006. 1237 p.

4. Gugler R., Leschik M., Dengler H. J. Disposition of quercetin in man after single oral and intravenous doses // Eur. J. Clin. Pharmacol. 1975. Vol. 9. P. 223-234.

5. Dangles O., Fargeix G., Dufour C. One-electron oxidation of quercetin and quercetin derivatives in protic and non protic media // J. Chem. Soc. Perkin Trans. Vol. 2. 1999. P. 1387-1395.

6. Spencer J., Kuhnle G., Williams R., Rice-Evans C. Intracellular metabolism and bioactivity of quercetin and its in vivometabolites // Biochem. J. 2003. Vol. 372. P. 173-181.

7. Woude H. Mechanisms of toxic action of the flavonoid quercetin and its phase II metabolites // Thesis Wageningen University. Wageningen (Netherlands), 2006. 229 p.

8. Bin Y., Kensuke A., Fumiyo K. Electrochemical behaviors of quercetin and кaempferol in neutral buffer solution // Analit. Sci. 2001. Vol. 17. P. 987-989.

9. Krishnamachari V., Levine L. H., Pare P. W. Flavonoid oxidation by the radical generator AIBN: a unified mechanism for quercetin radical scavenging // J. Agric. Food Chem. 2002. Vol. 50. N 15. P. 4357-4363.

10. Zenkevich I. G., Eschenko A. Y., Makarova S. V., Vitenberg A. G., Dobryakov Y. G., Utsal V. A. Identification of the Products of Oxidation of Quercetin by Air Oxygen at Ambient Temperature // Molecules. 2007. Vol. 12. P. 654-672.

11. Rice-Evans C. Why do we expect flavonoids to function as antioxidants in vivo? http://www.healthcare.uiowa.edu/research/sfrbm/Papers/Sunrise%20Papers/2002/Rice-Evans %202002.ppt.

12. Prior R. Fruits and vegetables in the prevention of cellular oxidative damage // Am. J. Clinical Nutrition. Vol. 78. N 3. P. 570-578.

13. Jorgensen L. V., Cornett C., Justesen U., Skibsted L. H., Dragsted L. O. Two-electron electrochemical oxidation of quercetin and kaempferol changes only the flavonoid C-ring // Free Radical Res. 1998. Vol. 29. N 4. P. 339-350.

14. Jungbluth G., Ruhling I., Ternes W. Oxidation of flavonols with Cu(II), Fe(II) and Fe(III) in aqueous media // J. Chem. Soc. Perkin Trans. 2000. Vol. 2. P. 1946-1952.

15. Kopacz M., Kopacz S., Skuba E. Redox Reactions of Quercetin and Quercetin-5'-sulfonic Acid with Fe3+ and Cu2+ Ions and with H2O2 // Russ. J. General Chem. Vol. 74. N 6. P. 957-959.

16. Brown S. B., Rajananda V., Holroyd J. A., Evans E. G. V. A study of the mechanism of quercetin oxygenation by 18O labelling // Biochem. J. 1982. Vol. 205. P. 239-244.

17. Lu J., Papp L., Fang J., Rodriguez-Nieto S., Zhivotovsky B., Holmgren A. Inhibition of mammalian thioredoxin reductase by some flavonoids: implications for myricetin and quercetin anticancer activity // Cancer Res. 2006. Vol. 66. N 8. P. 4410-4418.

18. He J., Xu H., Kang G., Zhu Y. Carbon nanotube-nujol paste electrode for the determination of quercetin // Science paper http://www.paper.edu.cn/downloadpaper.php?serial_number=200410-13&type=l.

19. Timbola A. K., de Souza C. D., Giacomelli C., Spinelli A. Electrochemical oxidation of quercetin in hydro-alcoholic solution // J. Braz. Chem. Soc. 2006. Vol. 17. P. 139-148.

20. Makris D. P., Rossiter J. T. Heat-induced, metal-catalyzed oxidative degradation of quercetin and rutin (Quercetin 3-O-rhamnosylglucoside) in aqueous model systems // J. Agric. Food Chem. 2000. Vol. 48. N 9. P. 3830-3838.

21. Лурье Ю. Ю. Справочник по аналитической химии //М., 1989. С. 267-275.

22. Зенкевич И. Г., Ещенко А. Ю., Макарова С. В., Утсаль В. А. Продукты окисления кверцетина кислородом воздуха при комнатной температуре и их идентификация // Растит. ресурсы. 2007. Т. 43. Вып. 2. С. 111-124.

23. Zenkevich I. G., Eshchenko A. Yu., Makarova S. V., Makarov V. G. Unusual Chemical Transformations of Natural Flavonoids // Abstr. 54th Annual Congr. on Medicinal Plant Research. Helsinki (Finland), 2006. Vol. 72. P. 1070.

Принято к публикации 22 сентября 2008 г.