СРЕДСТВО ДЛЯ ПОДДЕРЖИВАЮЩЕЙ ТЕРАПИИ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ ИЗ ЗАМОРОЖЕННОЙ ИКРЫ МОРСКИХ ЕЖЕЙ
SUPPORTING THERAPY REMEDY AND METHOD FOR ITS PRODUCTION FROM FROZEN SEA URCHIN SPAWN

Группа изобретений относится к медицине и фармакологии, в частности к технологии получения биологически активного вещества, и касается способа выделения из замороженной икры морских ежей средства для поддерживающей терапии, представляющего собой пептидный комплекс с молекулярной массой входящих в него пептидных компонентов в пределах от 300 до 3000 Да, которое может быть использовано в медицинской практике для профилактики и коррекции возрастных нарушений функций иммунной системы, головного мозга, сердца, репродуктивной системы.
В изобретении используется термин «поддерживающая терапия», принятый в той области, к которой относится использование целевого продукта, полученного по предлагаемой технологии. Термин «поддерживающая терапия» подразумевает использование полученного по предлагаемой технологии средства в комплексном лечении различных заболеваний с целью поддержания функции различных органов и тканей [см. Тутельян В.А., Суханов Б.П., Австриевских А.Н., Позняковский В.М. Биологически активные добавки в питании человека (оценка качества и безопасности, эффективность, характеристика, применение в профилактической и клинической медицине). Томск, 1999, 295 с.].
Известно, что старение человека является результатом целого комплекса изменений в биохимическом статусе организма человека. В связи с тем, что настоящее время в соответствии с демографическими тенденциями сохраняется неуклонный рост людей пожилого и старческого возраста, в мире ведется активная работа по поиску и внедрению в практику новых фармакологических препаратов, биологически активных веществ, действие которых направлено на компенсацию возникающего с возрастом дефицита эндогенных протекторных факторов. Как указывалось выше, основной причиной возникновения многих заболеваний является переизбыток свободных окислительных радикалов. Кроме того, известно, что такой же процесс происходит и при старении организма. Свободные радикалы в первую очередь повреждают мембраны клеток, их липидные структуры, обусловливая нарушение гомеостаза.
Неконтролируемому образованию свободных радикалов (помимо системы защитных сил организма) противостоят биологически ценные белки, полиненасыщенные жирные кислоты, витамины А, Е, С и др., а также минеральные вещества - Са, К, Mg, Fe, Se, Zn, I и др., которые содержатся в продуктах моря.
В последние годы большое значение и спрос приобретают геропротекторные препараты на основе природных компонентов, обладающие, по сравнению с синтетическими препаратами, более мягким действием на организм. Необходимо отметить, что к указанным природным компонентам относят также гидробионты, которые используются в качестве сырья при разработке технологии выделения биологически активных веществ.
Известно, что морской еж, как пищевой продукт, не представляет интереса из-за своего специфического вкуса, но икра морских ежей является лечебно-профилактическим продуктом, в котором в зависимости от сезона добычи содержится 12-20% белка, 10-35% жира и до 3,5% минеральных веществ, оказывающих тонизирующее действие на организм.
При разработке технологии выделения целевого продукта, получаемого из морских ежей, следует учитывать тот факт, что предприятия по производству лекарственных средств и предприятия, добывающие морских ежей, обычно территориально находятся на значительном отдалении друг от друга. Поэтому заготовка сырья и его обработка являются наиболее важными стадиями процесса получения биологически активного вещества для сохранения его биологической активности.
Известен способ безотходной переработки икры морских ежей [патент РФ №2283006]. Сущность известного способа заключается в том, что замороженную икру морских ежей заливают 95%-ным этиловым спиртом, настаивают в течение 6-10 суток при комнатной температуре, полученный экстракт декантируют. Икру вновь заливают 10%-ным водным раствором этилового спирта, настаивают в течение 2-4 суток при температуре 4-10°С, полученный экстракт декантируют. Оба экстракта объединяют, отстаивают при температуре не выше 10°С до получения прозрачного раствора, который затем фильтруют. Твердый остаток икры, оставшийся после обработки экстрагентами, сушат и измельчают. Полученная настойка из икры морских ежей представляет собой прозрачную жидкость желтовато-оранжевого цвета с характерным запахом морских гидробионтов. В результате чего происходит полная экстракция из сырья хиноидных соединений, обладающих антиоксидантной активностью, которые выделяются из сырья только при обработке этиловым спиртом с концентрацией не менее 95%. Твердый остаток икры морских ежей, полученный после обработки ее экстрагентами, высушенный и измельченный, представляет собой порошок от светло-серого до оранжево-коричневого цвета, со слабо выраженным запахом морских гидробионтов.
К недостаткам описанного способа, описанного в патенте РФ №2283006 и включающего заготовку сырья путем замораживания икры морских ежей, экстракцию и фильтрование с целью получения целевого продукта, и принятого в качестве прототипа предлагаемой группы изобретений, следует отнести то, что целевой продукт, полученный в результате использования способа-прототипа, содержит хиноидные соединения и липидные фракции, обладающие только антиоксидантной активностью, при полном отсутствии пептидных компонентов, которые оказывают выраженное пролиферативное действие в отношении определенных тканей организма, вследствие чего могут быть использованы в качестве средств для поддерживающей терапии.
Задача, на решение которой направлено настоящее изобретение, состоит в разработке технологии выделения из икры морских ежей пептидного комплекса с молекулярной массой входящих в него пептидных компонентов не более 3000 Да, очищенного от белковых, нуклеиновых и липидных примесей.
Технический результат заключается в том, что согласно предлагаемому способу, включающему использование в качестве сырья замороженной икры морских ежей и определенную последовательность технологических операций, а также условий их осуществления, получают средство, представляющее собой пептидный комплекс с молекулярной массой входящих в него пептидных компонентов от 300 до 3000 Да, очищенный от белковых, нуклеиновых и липидных примесей и обладающий выраженным протекторным действием на основные системы организма, основанным на иммуностимулирующей, кардиопротекторной, церебропротекторной активности целевого продукта и его влиянии на репродуктивную систему.
Для решения поставленной задачи и достижения указанного технического результата предложена группа изобретений, объединенных общим изобретательским замыслом.
2
2
Одним из аспектов предлагаемой группы изобретений является способ получения средства для поддерживающей терапии, включающий обработку сырья путем замораживания икры морских ежей, последовательную обработку его экстрагентами, с последующим фильтрованием, характеризующийся тем, что икру морских ежей замораживают не позднее чем через 2 часа после ее сбора при температуре не менее минус 40°С, выдерживают при температуре минус 20÷22°С в течение не менее двух месяцев, после чего к измельченному сырью добавляют 5% раствор уксусной кислоты в объемном соотношении 10 объемов раствора уксусной кислоты к 1 объему измельченного сырья, повышают температуру суспензии до 60÷70°С и проводят экстракцию пептидов в раствор при постоянном перемешивании в течение не менее 2 часов, затем надосадочную жидкость сифонируют и фильтруют через ткань, имеющую плотность не менее 125 г/м, для удаления макрочастиц размером более 5 мкм, после чего очищенный экстракт направляют на тангенциальную микрофильтрацию, которую проводят с использованием микрофильтрационных модулей на основе трековых мембран с номинальным размером пор 0,3÷0,4 мкм при скорости рециркуляции суспензии в камере концентрата 30÷38 л/ч и скорости фильтрации 1,8÷2,5 л/ч; полученный фильтрат направляют на твердофазную экстракцию, которую проводят с использованием ионообменного сорбента, сульфированного сополимера стирола и дивинилбензола с содержанием дивинилбензола 8÷10 моль %; при этом для проведения твердофазной экстракции сорбент помещают в массообменники колоночного типа, а фильтрат подают на массообменник насосом снизу в режиме рециркуляции со скоростью 3÷4 л/ч при температуре 25÷30°С таким образом, что сорбент находится в форме взвешенного слоя; твердофазную экстракцию проводят в течение 3 часов, после чего осуществляют вытеснение фильтрата из экстрактора и отмывку сорбента в условиях взвешенного слоя сорбента 5% водным раствором уксусной кислоты, которую подают в колонку снизу тем же насосом до выхода из колонки прозрачного бесцветного раствора; после получения прозрачного промывочного раствора 5% водный раствор уксусной кислоты подают в массообменник через верхний штуцер и таким образом укладывают сорбент на нижний дренаж ровным слоем; затем последовательно замещают раствор кислоты деминерализованной водой, проводят десорбцию пептидов с катионита в режиме вытеснительной ионообменной хроматографии, при этом в качестве вытеснителя используют катион аммония, а вытеснение осуществляют вначале нейтральным аммиачным буферным раствором при рН 5,5 и затем щелочным буферным раствором при рН 12,5, а хроматографию осуществляют со скоростями, не превышающими 4 мл/ч·см сечения колонки, на выходе из колонок собирают фракции растворов, при этом фракции, содержащие пептидные компоненты, объединяют и направляют на вакуум-выпарную установку при температуре в системе не выше 42±3°С, после чего полученный целевой продукт, характеризующийся рН 5,5÷7,0, содержанием пептидных компонентов с молекулярной массой в пределах от 300 до 3000 Да, лиофилизируют.
Другим аспектом изобретения является средство для поддерживающей терапии, полученное вышеописанным способом из замороженной икры морских ежей и представляющее собой пептидный комплекс с молекулярной массой входящих в него пептидных компонентов в пределах от 300 до 3000 Да, поддерживающее функцию иммунной системы, сердца, головного мозга, мужской репродуктивной системы.
Необходимо отметить, что средство, полученное непосредственно предлагаемым способом, в отличие от известных, позволяет получить пептидный комплекс с молекулярной массой входящих в него пептидных компонентов от 300 до 3000 Да, обладающий выраженным протекторным действием, направленным на поддержание функций определенных систем организма, что достигается предлагаемой последовательностью технологических операций с использованием микрофильтрационного оборудования и условиями их осуществления, включая температурные, временные и иные характеристики, а также использование веществ, включая исходное сырье, определенный экстрагент и сорбент.
Сущность изобретения поясняется таблицей и примерами.
В таблице показано влияние пептидного комплекса, выделенного из замороженной икры морских ежей, на развитие эксплантатов в органотипических культурах различных тканей.
Ниже приведены примеры конкретного выполнения изобретения: пример осуществления способа - пример 1 - способ получения пептидных комплексов из замороженной икры морских ежей, а также пример 2, подтверждающий биологическую активность полученных пептидных комплексов, выделенных из замороженной икры морских ежей.
Пример 1. Способ получения пептидного комплекса, выделенного из замороженной икры морских ежей
В качестве сырья используют икру морских ежей, которую не позднее чем через 2 часа после ее сбора замораживают при температуре не менее минус 40°С, выдерживают при температуре минус 20-22°С в течение не менее двух месяцев.
Замороженное сырье в количестве 350 г измельчают, помещают в стеклянную термостатируемую емкость с мешалкой объемом 4 л и заливают 5% водным раствором уксусной кислоты до суммарного объема 3 л. Затем повышают температуру суспензии до 60-70°С и при постоянном перемешивании проводят экстракцию в течение не менее 2 часов.
2
Надосадочную жидкость сифонируют и фильтруют через ткань, имеющую плотность не менее 125 г/м, для удаления макрочастиц (размером более 5 мкм) из экстракта. Полученный очищенный экстракт из икры морских ежей направляют на тангенциальную микрофильтрацию с использованием микрофильтрационных модулей на основе трековых мембран с номинальным размером пор 0,3-0,4 мкм, при этом скорость рециркуляции суспензии в камере концентрата составляет 30-38 л/ч, а скорость фильтрации - 1,8-2,5 л/ч.
Полученный фильтрат направляют на твердофазную экстракцию, которую проводят с использованием ионообменного сорбента - сульфированного сополимера стирола и дивинилбензола с содержанием дивинилбензола 8-10 моль %; при этом для проведения твердофазной экстракции сорбент помещают в массообменники колоночного типа, а фильтрат подают на массообменник перистальтическим насосом снизу в режиме рециркуляции со скоростью 3-4 л/ч при температуре 25-30°С так, что сорбент находится в форме взвешенного слоя для однородного обтекания гранул сорбента. Твердофазную экстракцию проводят в течение 3 часов, затем отбирают пробу из циркулирующего раствора и сохраняют ее при температуре 2-4°С для последующего анализа. Вытеснение фильтрата из экстрактора и отмывку сорбента проводят в условиях взвешенного слоя сорбента 5% водным раствором уксусной кислоты, подавая его в колонку снизу тем же насосом, до выхода из колонки прозрачного бесцветного раствора. После получения прозрачного промывочного раствора 5% водный раствор уксусной кислоты подают в массообменник через верхний штуцер, укладывая сорбент на нижний дренаж ровным слоем; затем последовательно замещают раствор кислоты деминерализованной водой.
2
Десорбцию пептидов икры морских ежей с катионита проводят в режиме вытеснительной ионообменной хроматографии, используя катион аммония в качестве вытеснителя, причем вытеснение осуществляют аммиачными буферными растворами в две стадии - вначале нейтральным (рН 5,5) и затем щелочным (рН 12,5), а хроматографию осуществляют со скоростями, не превышающими 4 мл/ч·см сечения колонки, что позволяет значительно сконцентрировать целевые пептиды. На выходе из колонок собирают фракции растворов, при этом фракции, содержащие пептидные компоненты, объединяют и направляют на вакуум-выпарную установку для удаления летучих компонентов и воды при температуре в системе не выше 42±3°С, после чего полученный целевой продукт лиофилизируют.
Выход целевого продукта (пептидного комплекса, выделенного из замороженной икры морских ежей) составляет 20,0 г на 1 кг исходного сырья.
Целевой продукт (пептидный комплекс, выделенный из замороженной икры морских ежей) представляет собой порошок от светло-кремового до желтовато-кремового цвета и содержит биологически активные пептидные компоненты. Целевой продукт умеренно растворим в воде, рН раствора 5,8-6,3.
Для более подробной характеристики пептидного комплекса, полученного предлагаемым способом, проведено изучение его состава, основных физико-химических свойств, специфической биологической активности.
18
Молекулярную массу пептидных компонентов, входящих в пептидный комплекс, определяют методом гель-хроматографии на сефадексах G-25 и G-50 («Pharmacia», Швеция). Для калибровки колонки 1,6×60 см используют набор маркеров Peptide Molecuar Weight Kit MS III («Serva», Германия). Установлено, что в состав пептидного комплекса, выделенного из замороженной икры морских ежей, входят вещества с молекулярной массой не более 3000 Да. С помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии в градиенте ацетонитрила (сорбент «Lichrosorb C», колонка 2×62 мм) установлено, что в состав пептидного комплекса входят преимущественно низкомолекулярные пептидные фракции (от 70 до 90%), а высокомолекулярные компоненты в пептидном комплексе отсутствуют. По данным электрофореза в 15%-ном полиакриламидном геле, молекулярная масса пептидных компонентов пептидного комплекса, выделенного из замороженной икры морских ежей, составляет от 300 до 3000 Да.
Для определения подлинности пептидного комплекса навеску целевого продукта 10 мг помещают в пробирку, растворяют при тщательном перемешивании в 5 мл воды. Раствор фильтруют через бумажный фильтр. Для приготовления биуретового реактива растворяют 90 г калия-натрия тартрата в 400 мл 0,2 н. раствора едкого натрия, прибавляют 10 г меди сернокислой 5-водной, после растворения добавляют 10 г йодида калия, и доводят объем раствора 0,2 н. раствором едкого натра до 2 л. К исследуемому раствору добавляют 5 мл биуретового реактива. В качестве вещества сравнения используют воду. Окрашивание раствора в фиолетовый цвет свидетельствует об имеющихся в комплексе пептидных связях.
275
260
275
260
275
260
Идентификацию активного пептидного комплекса проводят с помощью ультрафиолетовой спектрофотометрии. Для этого 10 мг пептидного комплекса растворяют в воде в мерной колбе вместимостью 100 мл, и доводят объем раствора водой до метки. На спектрофотометре измеряют ультрафиолетовый спектр пептидного комплекса в кварцевых кюветах с толщиной слоя 10 мм в области длин волн от 250 до 300 нм. В качестве раствора сравнения используют воду. Спектр должен иметь выраженный максимум при длине волны (270±5) нм. Соотношение оптических плотностей при длинах волн 275 нм (Д) и 260 нм (Д) - Д/Д - должно быть не менее 1,0. В полученном целевом продукте - пептидном комплексе, выделенном из замороженной икры морских ежей, - соотношение оптических плотностей Д/Д составило 1,16.
Пример 2. Биологическая активность пептидного комплекса, выделенного из замороженной икры морских ежей
Для изучения биологической активности пептидного комплекса, выделенного предлагаемым способом из замороженной икры морских ежей, исследовали влияние целевого продукта на рост органотипических культур различных тканей молодых (3-месячных) половозрелых крыс линии «Wistar» с массой тела 150-200 г и старых крыс (24-месячных) с массой тела 420-450 г.
3
Отпрепарированные в стерильных условиях фрагменты различных тканей (хрящей, сердца, тимуса, коры головного мозга, шишковидной железы, поджелудочной железы, щитовидной железы, предстательной железы, семенников, почек, мочевого пузыря, сосудов, яичников, слизистой оболочки бронхов, слизистой оболочки желудка, надпочечников) крыс разделяли на более мелкие части величиной около 1 мм, которые помещали в чашки Петри с коллагеновым покрытием дна. Питательная среда состояла из 35% среды Игла, 35% раствора Хенкса, 25% фетальной телячьей сыворотки, 5% куриного эмбрионального экстракта, 0,6% глюкозы, 100 ед/мл гентамицина.
Исследуемый пептидный комплекс, выделенный из замороженной икры морских ежей, вводили в культуральную среду в концентрациях от 0,01 до 20 нг/мл для выявления его эффективных концентраций. В чашки Петри с экспериментальными эксплантатами добавляли по 3 мл питательной среды, содержащей пептидный комплекс, выделенный из замороженной икры морских ежей, в исследуемой концентрации, а в чашки Петри с контрольными эксплантатами - по 3 мл питательной среды без пептидного комплекса; таким образом, экспериментальные и контрольные эксплантаты развивались в одинаковых объемах питательной среды. Чашки Петри помещали в термостат при температуре (37±0,5)°С и через 3 сут просматривали под фазово-контрастным микроскопом. Определяли индекс площади (ИП), который рассчитывали в условных единицах как отношение площади всего эксплантата вместе с зоной выселяющихся клеток к площади центральной зоны эксплантата. Для визуализации эксплантатов применяли микротеленасадку для микроскопа (серия 10, МТН-13 "Альфа-Телеком", Россия). Для расчета индекса площади эксплантатов использовали программу Photo M 1,2. Достоверность различий в индексах площади контрольных и экспериментальных эксплантатов оценивали с помощью t-критерия Стьюдента. Значения индекса площади выражали в процентах, контрольное значение ИП принимали за 100%.
При использовании пептидного комплекса, выделенного из замороженной икры морских ежей, в концентрациях 0,01 и 10 нг/мл наблюдалось достоверное повышение ИП эксплантатов сердца на 26-28% у молодых животных и на 21-23% - у старых крыс; эксплантатов тимуса - на 34-35% у молодых животных и на 30-31% - у старых крыс; эксплантатов коры головного мозга - на 22-23% у молодых животных и на 21-23% - у старых крыс; эксплантатов семенников - на 25-27% у молодых животных и на 22-23% - у старых крыс по сравнению с соответствующими контрольными значениями ИП. Полученные данные представлены в таблице.
Органотипическая культура
Возраст крыс
Кол-во эксплантатов
Концентрация пептидного комплекса, выделенного из замороженной икры морских ежей, нг/мл
0,01
0,1
1,0
10,0
Сердце
Молодые
24
26,2±2,5*
15,6±1,2
16,2±1,4
28,5±1,8*
Старые
23
21,5±1,7*
14,1±1,3
12,1±1,1
23,1±1,7*
Тимус
Молодые
25
35,4±2,2*
17,2±1,8
16,1±1,6
34,6±2,3*
Старые
26
31,3±1,9*
16,7±1,6
10,1±1,5
30,5±2,3*
Кора головного мозга
Молодые
23
23,4±1,4*
10,6±1,7
12,2±1,9
22,6±1,8*
Старые
25
21,6±1,5*
9,3±1,2
8,1±1,6
22,7±1,9*
Семенники
Молодые
23
25,7±2,2*
10,4±1,8
12,5±2,2
27,4±2,1*
Старые
25
22,3±1,8*
9,3±1,4
8,5±1,5
23,5±1,7*
Шишковидная железа
Молодые
27
6,2±1,7
10,2±1,2
6,1±1,2
3,2±1,1
Старые
25
3,4±1,3
4,5±1,5
4,7±1,4
5,2±1,5
Поджелудочная железа
Молодые
26
7,4±1,4
9,2±1,6
5,7±1,3
8,2±1,5
Старые
24
2,1±0,9
3,6±1,2
4,1±1,3
3,3±1,5
Щитовидная железа
Молодые
27
8,2±1,7
9,4±1,6
7,3±1,5
4,2±1,6
Старые
25
8,9±1,1
7,7±1,5
9,6±2,2
5,7±1,8
Предстательная железа
Молодые
24
2,1±0,5
3,1±0,7
6,8±1,8
5,4±1,7
Старые
26
3,8±1,7
4,1±1,8
5,4±1,5
7,8±1,5
Почки
Молодые
26
6,8±1,9
5,6±1,7
7,2±0,9
8,5±1,1
Старые
27
4,5±1,3
3,7±0,8
5,7±0,9
7,9±0,9
Мочевой пузырь
Молодые
25
9,8±1,8
10,7±1,7
8,6±1,5
6,4±1,3
Старые
24
8,1±1,5
9,4±1,8
6,8±1,8
7,6±0,9
Сосуды
Молодые
25
7,5±1,8
6,7±1,5
8,5±0,9
6,7±1,6
Старые
26
4,5±0,9
2,7±0,7
4,3±0,8
3,6±0,9
Яичники
Молодые
27
9,7±1,3
10,3±1,4
7,5±1,5
8,5±1,9
Старые
23
6,5±1,5
8,2±1,6
7,8±1,2
5,8±1,9
Слизистая оболочка желудка
Молодые
25
2,2±0,9
3,5±0,7
1,9±0,6
5,2±0,9
Старые
24
1,6±0,7
2,5±0,9
3,4±0,8
2,8±0,9
Надпочечники
Молодые
26
8,1±1,7
9,4±1,9
7,6±1,5
6,2±1,1
Старые
24
7,8±1,8
9,5±1,6
6,2±1,4
5,7±0,9
Слизистая оболочка бронхов
Молодые
25
5,7±1,3
4,7±1,6
6,3±1,8
4,6±1,2
Старые
26
2,1±0,9
3,5±0,8
2,2±0,9
4,4±1,6
* - р<0,05 по сравнению с контролем.
Следует отметить, что добавление пептидного комплекса, выделенного из замороженной икры морских ежей, в эффективной концентрации в питательную среду органотипических культур других тканей крысы (хрящей, шишковидной железы, поджелудочной железы, щитовидной железы, предстательной железы, почек, мочевого пузыря, сосудов, яичников, слизистой оболочки бронхов, слизистой оболочки желудка, надпочечников) не приводило к достоверному увеличению ИП эксплантатов.
Таким образом, проведенные исследования позволяют сделать вывод о том, что в отношении тканей сердца, тимуса, коры головного мозга и семенников пептидный комплекс, выделенный из замороженной икры морских ежей, оказывает стимулирующее действие, проявляющееся в стимуляции роста эксплантатов соответствующих тканей, что подтверждает проявление биологической активности пептидного комплекса по отношению к основным системам организма. Это позволяет считать показанным использование пептидного комплекса в качестве средства для поддерживающей терапии.