Новый экспресс-метод оценки физиологического влияния слабоалкогольных и безалкогольных напитков

УДК 66.663.47

Новый экспресс-метод оценки физиологического влияния

слабоалкогольных и безалкогольных напитков

С. Г. Давыденко,

канд. биол. наук; А. Т. Дедегкаев,

канд. техн. наук

Пивоваренная компания «Балтика», Санкт-Петербург

Т. В. Меледина,

д-р техн. наук, профессор Санкт-Петербургский национальный исследовательский университет информационных технологий, механики и оптики

В рецептуру слабоалкогольных (СА) и безалкогольных (БА) напитков могут входить красители, ароматизаторы и стимулирующие нервную систему вещества (например, кофеин, таурин и т. д.). Несмотря на название, слабоалкогольные напитки содержат до 7-8% У/У этилового спирта, т. е. содержание этанола в них может быть гораздо выше, чем в пиве. Провести объективную научную оценку влияния того или иного СА и БА на здоровье тех или иных групп населения очень сложно. Такие исследования особенно актуальны в связи с тем, что основные потребители СА и БА — молодежь.

В то же время пиво — натуральный напиток, имеющий тысячелетнюю репутацию положительного влияния на человеческий организм при условии не чрезмерного его употребления. Проблема «умеренного» употребления актуальна для любых пищевых продуктов. Например, злоупотребление сахаром может привести к серьезным заболеваниям. Таким образом, натуральность пива — его главное преимущество по сравнению с появившимися на рынке безалкогольными тонизирующими и слабоалкогольными напитками.

Существует несколько технологий производства СА и БА: купажирование, удаление этилового спирта (диализ, обратный осмос, ультрафильтрация), экстракция и последующее включение в состав ароматических веществ, добавление ароматизаторов, красителей, биологически активных веществ и консервантов, например кофеина.

Механизм действия кофеина направлен на стимулирование физических и умственных способностей человека. Это вещество кратковременно

улучшает физическую выносливость и увеличивает умственную активность при утомлении. Позволяет на определенный период сохранять бодрость и работоспособность. Однако потребление кофеина в дозе выше 400мг/сут нежелательно, так как в ряде случаев может негативно воздействовать на организм человека, его сердечно-сосудистую, мочеполовую, нервную системы, желудочно-кишечный тракт. Считается, что подавляющее большинство неблагоприятных эффектов кофеина не проявляется при его постоянном потреблении в дозе порядка 150400 мг/сут [1]. Все содержащие кофеин пищевые продукты и пищевые ингредиенты по показателям безопасности должны соответствовать требованиям ТР ТС 021/2011 «О безопасности пищевой продукции» и ТР ТС 029/2012 «Требования безопасности пищевых добавок, ароматизаторов и технологических вспомогательных средств» [1].

1234 5 6789

Рис. 1. Сравнение токсичного действия этанола и напитков: 1 — вода; 2 — 96%-ный этанол;

3 — 40%-ный этанол;

4 — светлое пиво;

5 — безалкогольное пиво;

6 — СА напиток М;

7 — СА напиток Р;

8 — квас; 9 — безалкогольный напиток. Инкубирование проводили в течение 18 ч

58 ПИВО и НАПИТКИ 5 • 2014

К «

- ЗА

100 -

IS 60 -

N

а>

40 -

20 -

140-,

80-

60----------------------------------------_ -----------------------

40----------------------------------------1 -----------------------------

20-..........."..............J.....Л........щ

Пиво светлое СА напиток Р

Сумма Сахаров а

Пиво БА Квас

Этанол

БА напиток Б

Триоза Мальтоза Сахароза Глюкоза Фруктоза Сумма Этанол

Сахаров

Пиво светлое Пиво БА Ц Квас Ц СА напиток Р БА напиток Б б

Рис. 2. Содержание Сахаров в напитках, определенное методом жидкостной хроматографии:

а — содержание определенного сахара в напитке; б — суммарное содержание Сахаров и этанола в напитках

Ученым-физиологам и специалистам по продуктам питания хорошо известна проблема «синергидного эффекта» — значительного превышения влияния одновременного действия нескольких веществ по сравнению с суммированным эффектом действия каждого из них по отдельности. Так, совместный прием алкоголя и кофеина может иметь особенно неблагоприятные последствия для здоровья. Кофеин повышает давление, а в сочетании с алкоголем гипер-тензивный эффект может усилиться. Вначале возможен протрезвляющий эффект, но затем опьянение усиливается. Поскольку кофеин и алкоголь оказывают противоположные эффекты (возбуждающий и тормозящий), в результате их совместного употребления сердце может быстро «изнашиваться» даже у молодых и здоровых людей. Несмотря на некоторые имеющиеся позитивные эффекты одновременного приема умеренных доз кофеина (до 150 мг/кг) и алкоголя (до 0,5 г/кг) (например, снижение сонливости), показано, что ежедневное употребление этой смеси в течение двух недель приводит к повышению толерантности к алкоголю и исчезновению защитного рефлекса [2].

Цель работы — применение ранее созданного нами экспресс-метода оценки токсичности веществ, основанного на изменении эффективности процесса брожения у тест-объекта — пивоваренных дрожжей 5. овгвю1в1ав в зависимости от наличия в среде токсичных или, напротив, стимулирующих физиологическую активность веществ [3].

Ранее нами был разработан метод оценки активности пивных дрожжей по определению интенсивности образова-

ния CO2 [3]. В чашке Петри смешивали 0,25 мл 8-кратной среды YPD, 0,5 мл 400 г/л раствора глюкозы, 0,05 мл воды и 1 мл суспензии дрожжей c концентрацией клеток 2,0108 кл/мл. Добавляли 0,2 мл исследуемого дегазированного напитка. Позитивным контролем была вода, а к негативной пробе добавляли 0,2 мл 96%-ного этилового спирта. Получившуюся суспензию набирали в одноразовый медицинский шприц объемом 10 мл. В случае образования воздушных пузырей вытесняли попавший воздух с помощью поршня, оставляя в шприце 2 мл исследуемой суспензии. Нижний конец шприца герметично запаивали. После этого помещали шприцы в термостат в горизонтальном положении, инкубировали при 30 °С и измеряли высоту поднятия поршня.

Определение дыхательной активности с помощью iodonitrotetrazo-liumchloride (INT). Дрожжи центрифугировали 5 мин при 3000 мин-1, сливали надосадочную жидкость и снова ресуспензировали в физиологическом растворе до конечной концентрации 1107 кл/мл. Добавляли к 0,2 мл этой суспензии 0,08 мл 0,4%-ного раствора иодонитротетразолиум хлорида INT (Sigma) в стерильной пробирке и инкубировали 30 мин при 30 °С. В присутствии INT живые клетки образуют красные гранулы, которые детектируются при микроскопировании в светлом поле. Использовали микроскоп Axioskop 40 фирмы Zeiess, хШ0 объектив, масло нефлюоресцирующее (Zeiess). Проводили подсчет клеток с большим количеством гранул формазана, сниженным, а также c их отсутствием.

Определение содержания Сахаров в напитках. Концентрацию сахаров

и глицерина в напитках определяли методом жидкостной хроматографии на хроматографе Shumadzu.

Современные напитки содержат разное количество этанола, сахаров, красителей, консервантов и т.д. Поэтому очень сложно объективно оценить физиологическое воздействие напитков на человеческий организм.

На рис. 1 приведено сравнение различных СА и БА напитков с использованием разработанного нами [3] физиологического теста на интенсивность выделения С02.

Так, например, высокие концентрации этанола по-разному ингибируют бродильную активность используемого нами тест-объекта (см. рис. 1, дорожки 1-4), высокое содержание сахаров, напротив, стимулирует образование С02 (см. рис. 1, дорожки 5-9).

Исследованные нами напитки имеют очень разный состав сахаров (рис. 2).

Предварительно содержание сахаров и этанола в напитках определяли методом жидкостной хроматографии.

Следует отметить, что светлое пиво оказывает позитивный эффект по сравнению с контролем (вода), (см. рис. 1, дорожки 4 и 1 соответственно). Более того, даже крепкое пиво показывает выраженный позитивный эффект по сравнению с некоторыми СА напитками, содержащими примерно такое же количество этанола (рис. 3, дорожки 1 и 3), несмотря на практически полное отсутствие сахаров в пиве и, напротив, наличие очень высоких концентраций сахаров в СА напитках (см. рис. 2). Следовательно, в его составе есть вещества, оказывающие ингибирующее действие на интенсивность жизнедеятельности использованного нами тест-объекта.

120-

100-

0

0

5 • 2014

ПИВО и НАПИТКИ 59

1 2 3 4

Рис. 3. Сравнение напитков с использованием физиологического теста на интенсивность выделения ГО2: 1 — крепкое пиво; 2 — слабоалкогольный напиток Д;

3 — слабоалкогольный напиток М;

4 — слабоалкогольный напиток Р

Рис. 4. Сравнение напитков с использованием физиологического теста на интенсивность выделения ГО2:

1 — соответственно вода;

2 — безалкогольное пиво 1;

3 — безалкогольное пиво 2;

4 — квас; 5 — БА напиток Б

4

5

Рис. 5. Сравнение сахаров с использованием физиологического теста на интенсивность выделения ГО2: 1 — вода; 2 — мальтоза;

3 — сахароза;

4 — глюкоза; 5 — фруктоза

Вызывает интерес и возможность сравнения практически не содержащих этанол БА. Следует упомянуть, что квас и безалкогольное пиво все-таки имеют незначительное количество алкоголя: 0,5 и 1,2% V/V соответственно.

На рис. 4 видно, насколько синтетический БА напиток Б более токсичен, чем квас натурального брожения (рис. 4, дорожки 4 и 5). Содержащее меньшее количество сахаров безалкогольное пиво 1 значительно меньше стимулирует брожение, чем безалкогольное пиво 2 (см. рис. 4, дорожки 2 и 3, рис. 2).

При производстве пива практически все сахара пивного сусла утилизируются дрожжами, поэтому пробы с пивом не привносят дополнительного питания для дрожжей при постановке экспери-

мента, тогда как безалкогольные напитки содержат очень высокие концентрации различных сахаров.

На рис. 5 представлено влияние различных сахаров на активность дрожжей в эксперименте. Поскольку дрожжи находятся в анаэробных условиях, утилизация мальтозы заблокирована, в то же время активно утилизируются сахароза, глюкоза и фруктоза, что согласуется с эффектом Пастера, в основе которого лежит неспособность дрожжей в отсутствие кислорода синтезировать мембранные структуры, в которых локализованы ферменты для утилизации мальтозы [4].

Следовательно, пробы с напитками целесообразно сравнивать только после выравнивания содержания всех сахаров и этанола.

В результате выравнивания содержания сахаров и этанола предлагаемый нами метод позволяет выявить более токсичные напитки и проанализировать токсичность отдельных компонентов рецептур (ароматизаторов, красителей, замутнителей, подсластителей, консервантов, стимуляторов и т. д.).

На рис. 6 представлено сравнение кваса, БА напитка К, БА энергетическо-

1 2 3 4 5

Рис. б. Сравнение напитков с использованием физиологического теста на интенсивность выделения ГО2: 1 — вода; 2 — квас; 2

3 — БА напиток К;

4 — БА энергетический напиток Б; 5 — БА пиво 1

" r.v- Ч .

....   % •

„.-» О* о о

щщ  &

ч Ч'З

* Tf

V

Рис. 7. Сравнение напитков с использованием оксидазного теста на интенсивность выделения ГО2: а — вода; б — квас; в — БА энергетический напиток Б; г — БА пиво 1

в

г

60 ПИВО и НАПИТКИ 5 • 2014

ЧОНТРОЛЬКАЧЕСТВА

го напитка Б, БА пива 1 после выравнивания концентраций этанола и сахара.

Эти результаты подтверждаются и при проведении оксидазного теста [4], также отражающего физиологическую активность используемого тест-объекта — дрожжей S. cerevisiae (рис. 7).

Проникая в дрожжевую клетку, INT образует в результате работы клеточных ферментов нерастворимые гранулы иодонитротетразолиум формазана, которые имеют интенсивную красную окраску, наблюдаемую при микроскопирова-нии в светлом поле. Количество и размер гранул свидетельствуют об активности окислительно-восстановительных процессов в клетке. Большое количество окрашенных гранул придает дрожжевой суспензии красный цвет. По интенсивности окрашивания суспензии можно качественно определять интенсивность

окислительно-восстановительных процессов в клетке [3].

Проводя сравнение результатов обоих тестов, можно убедиться, что наименее токсичным является натуральный квас (см. рис. 6, дорожка 2; рис. 7, б), а наиболее ингибирующий эффект выявлен у БА энергетического напитка Б (см. рис. 6, дорожка 4; рис. 7, в).

Таким образом, благодаря применению разработанного нами экспресс-метода оценки физиологического влияния различных веществ на тест-объект (дрожжи 5. овгвю1в1ав) [3] стало возможно проводить быструю сравнительную оценку не только единичных веществ, но и сложных СА и БА напитков.

ЛИТЕРАТУРА

1. Калинин, А. Я. Анализ рисков потребления

кофеинсодержащих пищевых продуктов /

А. Я. Калинин // Пиво и напитки. — 2014. — № 2. — С. 40-44.

2. Андреева, И. В. Употребление «энергетических» напитков и алкоголя / И. В. Андреева // Актуальные вопросы психиатрии и наркологии. Материалы юбилейной научно-практической конференции, посвященной 85-летию ГУЗ «Краевая психиатрическая больница»; под ред. Н. П. Панюшкиной. — Хабаровск: Изд-во ГУЗ КПБ. — 2008. — С. 10-12.

3. Давыденко, С. Г. Создание и применение нового экспресс-метода оценки качества семенных дрожжей / С. Г. Давыденко // Пиво и напитки. — 2012. — № 5. — С. 20-23.

4. Munujos, P. Assay of succinate dehydrogenase activity by a colorimetric-continuous method using iodonitrotetrazolium chloride as electron acceptor / P. Munujos, J. Coll-Canta, F. Gonzбlez-Sastre, F. Gella // J. Anal Biochem. 1993. — V. 212. — № 2. — P. 506-509. <S

Новый экспресс-метод оценки физиологического влияния слабоалкогольных и безалкогольных напитков

Ключевые слова

напитки;токсичность; экспресс-метод. Реферат

В современных условиях динамичного развития рынка все более крупную нишу занимают новые слабоалкогольные и безалкагольные напитки. Все большее количество природных и синтетических ароматизаторов, красителей, замутнителей и стабилизаторов становятся доступными для создателей новых напитков. Современные технологии позволяют производить большое число разнообразных напитков на одном предприятии. Однако существующая тенденция расширения рынка синтетических продуктов приводит к уменьшению потребления напитков натуральных, имеющих давнюю историю потребления. Недостаточность статистических данных о влиянии синтетических продуктов на здоровье потребителей обусловлена не только короткой историей их использования, но и сложностью выявления влияния на организм человека. Практически отсутствуют данные об отдаленных последствиях употребления таких продуктов. Трудности прежде всего связаны с проведением дорогостоящих и сложных в интерпретации испытаний на животных. Кроме того, для получения действительно достоверных данных требуется использование большого числа животных и проведение независимых испытаний. В статье представлены результаты, говорящие об эффективности использования экспресс-метода выявления токсичности напитков, основанного на изменении эффективности процесса брожения у тест-объекта — пивоваренных дрожжей Saccharomyces cerevisiae — в зависимости от наличия в напитке токсичных или, напротив, стимулирующих физиологическую активность веществ. Метод дает возможность проводить быструю оценку потенциального влияния любых продуктов, включая сложные по составу содержащие алкоголь, слабоалкогольные и безалкогольные напитки.

Авторы

Давыденко Светлана Геннадьевна, канд. биол. наук; Дедегкаев Александр Тазаретович, канд. техн. наук Пивоваренная компания «Балтика»,

194292, Санкт-Петербург, 6-й Верхний пер., д. 3, davydenko@spb.baltika.ru Меледина Татьяна Викторовна, д-р техн. наук, профессор Санкт-Петербургский национальный исследовательский университет информационных технологий, механики и оптики, 197101, Санкт-Петербург, Кронверкский пр., д. 49, meledina07@mail.ru

New Express Method of Low Alcohol and Soft Drinks Physiological Influence Assessment

Key words

drinks; toxicity; express method. Abstract

Developing industry of drinks demands creation of new products. In modern conditions of market dynamic development large niche is occupied by new low alcohol and soft drinks. An increasing number of natural and synthetic aromas, dyesand stabilizers become available to create new drinks. Modern technologies allow to make a large number of various drinks at one enterprise. However the existing tendency of market expansion by synthetic products leads to reduction of consumption of natural drinks, having an old story of consumption. Insufficiency of statistical data on influence of synthetic products on consumers health, is caused not only by short history of their use, but also complexity of identification oftheir influence on a human organism. Practically there are no data about remote consequences of using such products. Difficulties, first of all, are connected with carrying out expensive and difficult tests on animals and their interpretation. Besides, obtaining really authentic data in such experiments requires the use of a large number of animals and carrying out independent tests. The paper presents results showing a new express method of toxicity detection, based on fermentation efficiency of test object — brewing yeast Saccharomyces cerevisiae depending on existence of toxic or stimulating of physiological activity substances. This method gives an opportunity of quick assessment of potential influence of any product including beer, complex containing alcohol beverages and soft drinks.

Authors

Davydenko Svetlana Gennadievna, Candidate of Biological Science Dedegkayev Alexander Tazaretovich, Candidate of Technical Science JSC Baltic Brewery, Russia,

3, 6 Verkhny per., St. Petersburg, 194292, Russia, davydenko@spb.baltika.ru Meledina Tatiana Viktorovna, Doctor of Technical Science, Professor St. Petersburg National Research University of information technologies, mechanics and optics (ITMO University),

49 Kronverksky pr., St. Petersburg, 197101, Russia, meledina07@mail.ru

5 • 2014 ПИВО и НАПИТКИ 61