Конъюгат люминесцентных наночастиц диоксида кремния с рекомбинантными однодоменными нано - моноантителами C7b ламы, способными специфически взаимодействовать с рекомбинантным белком HER2/neu - аналогом природного рецептора эпидермального фактора роста EGFR/ERBB клеток человека
CONJUGATE OF LUMINESCENT SILICON DIOXIDE NANOPARTICLES WITH RECOMBINANT SINGLE-DOMAIN C7B LAMA NANO-MONOANTIBODIES, CAPABLE OF SPECIFICALLY INTERACTING WITH RECOMBINANT HER2/NEU PROTEIN - ANALOGUE OF EPIDERMAL GROWTH FACTOR NATURAL RECEPTOR EGFR/ERBB OF HUMAN CELLS

Изобретение относится к конъюгатам люминесцентных наночастиц диоксида кремния с рекомбинантными однодоменными нано - моноантителами С7b ламы, способными специфически взаимодействовать с рекомбинантным белком HER2/neu - аналогом природного рецептора эпидермального  фактора роста EGFR/ERBB клеток человека и может быть использовано в медицине, биотехнологии и молекулярной иммунологии, в частности, в диагностике рака, а так же для терапии опухолевых заболеваний, характеризующихся гиперэкспрессией опухолевыми клетками человека белка HER2/neu, в качестве молекулы - курьера к таким клеткам, диагностических и/или лекарственных препаратов, узнающих и/или блокирующих рецептор HER2/neu.
Давыдов М.И., Аксель Е М. Статистика злокачественных новообразований 2014 г. / Евразийский онкологический журнал. 2016. №. 4. С. 692-79.
Шаповал А.И. Легутки Д.Б., Стаффорд Ф. и др. Иммуносигнатура (immunosignature) - пептидные микроэррей для диагностики рака и других заболеваний. / Российский онкологический журнал. 2014. Т. 19. №. 4
По данным ВОЗ, более 14 миллионов человек в мире ежегодно подвергаются онкологическим заболеваниям. В России ежегодно регистрируется более 0,5 млн. новых случаев заболеваний, связанных с онкологией и 0,3 млн. летальных исходов. Например, абсолютное число новых случаев онкологических заболеваний в России в 2012 г. было 525931, что на 8.25% больше, чем в 2007 г. (). В настоящее время в России зарегистрировано около 3 млн. онкологических больных, которые требуют постоянного наблюдения и мониторинга (. С. 6-11). Одной из причин высокой смертности при онкологических заболеваниях считается их позднее диагностирование и отсутствие эффективных противоопухолевых препаратов и стратегий лечения. В этой связи, ранняя диагностика злокачественных новообразований является актуальным и наиболее перспективным подходом для снижения инвалидности и смертности, вызванной раком.
Барышникова М.А., Барышников А.Ю., Афанасьева Д.А. Молекулярные механизмы преодоления множественной лекарственной устойчивости липосомальными противоопухолевыми препаратами. / Российский биотерапевтический журнал. 2015. Т. 14. №. 1
Проблема лечения онкологических заболеваний основана на способности опухолевых клеток вырабатывать устойчивость к лекарственным препаратам (. С. 3-10), поэтому разработка новых подходов для диагностики онкологических заболеваний и их терапии является актуальной научной задачей. Для решения этой задачи необходимо конструировать и исследовать новые белковые молекулы, способные специфически и эффективно узнавать и нейтрализовать опухолевые клетки.
Куликов А.Ю., Нгуен Т. Фармакоэкономический анализ одногодичной адъювантной терапии трастузумабом при неr2 - положительном раке молочной железы ранней стадии. / Фармакоэкономика. Современная фармакоэкономика и фармакоэпидемиология. 2010. №4. С. 28-34; Ягудина Р.И., Куликов А Ю., Нгуен Т. Обзор зарубежных фармакоэкономических исследований применения Герцептина при лечении рака молочной железы. / Фармакоэкономика. Современная фармакоэкономика и фармакоэпидемиология. 2009. №2. С. 28-35
Среди огромного количества типов онкологических заболеваний, в настоящее время рак молочной железы (РМЖ) является основной причиной женской смертности. В мире ежегодно регистрируется более миллиона новых случаев, и более полумиллиона женщин погибает. В России ежегодно выявляется более 50 тыс. новых случаев и около 23 тыс. летальных. На 100 тыс. женщин в возрасте 15 лет и старше смертность составляет 34,06 % ().
Гришина К.А. Музаффарова Т.А., Хайленко
В.А. и др. Молекулярно-генетические маркеры рака молочной железы. / Опухоли женской репродуктивной системы. 2016. Т. 12. №. 3. С. 36-42.; Косоруков В.С., Кособокова Е.Н., Пинюгина М.В. и др. Биологическая активность рекомбинантных антител против рецептора Her2, полученных из растительного источника. / Российский биотерапевтический журнал. 2015. №2. С. 105-112
Сакаева Д.Д. Ранний рак молочной железы. Различные аспекты комбинированного лечения. Новые подходы к неоадъювантной терапии раннего her2 позитивного рака молочной железы. / Злокачественные опухоли. 2013. №1 (5). С. 35-40
Рецептор HER2 на перерожденных клетках - один из наиболее значимых молекулярных маркёров при раке молочной железы в 20-30% случаях (). При HER2 - положительном РМЖ на поверхности раковых клеток происходит гиперэкспрессия белка HER2, который способствует размножению и росту опухолевых клеток, тем самым ускоряет процесс формирования опухоли. Для снижения и полной остановки скорости формирования опухоли, необходимо блокировать белок - рецептор HER2, находящийся на поверхности перерожденных клеток. Более того, в случае HER2 - положительном РМЖ, имеется принципиальная возможность ранней диагностики заболевания и проведения терапии при использовании технологии рекомбинантных антител, способных специфически связываться с этим рецептором ().
Ивонин А.Г., Пименов Е.В., Оборин В.А. и др. Направленный транспорт лекарственных препаратов: современное состояние вопроса и перспективы. / Известия Коми НЦ УрО РАН. 2012. №1 (9). С. 46-55; Антипов С.А., Дамбаев Г.Ц., Ермаков А.Е. и др. Направленная доставка противоопухолевых препаратов. / Российский биотерапевтический журнал. 2009. №1. С. 4-12
Бражник К.И., Барышникова М.А., Соколова З.А. и др. Новые направления в исследовании и ранней диагностике рака с применением детекционных систем на основе флуоресцентных нанокристаллов. / Российский биотерапевтический журнал. 2013. №3. С. 12-24
Куликов А.Ю., Нгуен Т. Фармакоэкономический анализ одногодичной адъювантной терапии трастузумабом при неr2 - положительном раке молочной железы ранней стадии. / Фармакоэкономика. Современная фармакоэкономика и фармакоэпидемиология. 2010. №4. С. 28-34; Ягудина Р.И., Куликов А.Ю., Нгуен Т. Обзор зарубежных фармакоэкономических исследований применения Герцептина при лечении рака молочной железы. / Фармакоэкономика. Современная фармакоэкономика и фармакоэпидемиология. 2009. №2. С. 28-35).
Жукова Л.Г. Современные возможности и перспективы таргетной терапии при раке молочной железы. / Практическая онкология. 2010. Т. 11. №. 3. С. 184.
Деев СМ., Лебеденко Е.Н. Инженерия антител: молекулярный конструктор на основе модуля барназа - барстар. Биоорганическая химия. 2009. 35(6). С. 761-78
Hopper-Borge E., Nasto R.N., Ratushny V. et al. Mechanisms of tumor resistance to EGFR-targeted therapies / Exp Opin Ther Targets. 2009. V.13. №3. Р. 339-62; Wilken J.A., Maihie N. Primary trastuzumab resistance: new tricks for an old drug / Annals of the New York Academy of Sciences. 2010. Т. 1210. №. 1. С. 53-65.
Деев С.М., Лебеденко Е.Н. Современные технологии создания неприродных антител для клинического применения. / Acta Nature (русскоязычная версия). 2009. Т. 1. №. 1
Беланова А.А.
Золотухин П.В., Лебедева Ю.А.
и др. История разработки и применение наноантител как инструмента современной медицины и энзимологии. / Scientific and Practical Journal of Health and Life Sciences 2015. № 2. 2015. С. 42; Тиллиб С.В. “Верблюжьи наноантитела” - эффективный инструмент для исследований, диагностики и терапии. / Молекулярная биология. 2011. Т. 45. №. 1. С. 77-85.
Существенные усилия в разработке противоопухолевых препаратов отводятся адресной доставке биологических активных агентов к опухоли. Это позволяет обеспечить подавление роста опухоли с наименьшим количеством побочных эффектов за счет снижения концентрации, как правило, высоко токсичных лекарственных препаратов в организме больного (). В области разработки противоопухолевых препаратов увеличивается количество исследований с применением технологии рекомбинантных антител. В настоящее время рынок спроса на препараты специфических моноклональных антител (МКА) превысил спрос на вакцинные препараты. По прогнозам, к 2020 г. рынок антител превысит 100 млрд. долл. За рубежом уже существует большое количество кандидатных терапевтических препаратов противоопухолевых МКА, которые проходят доклинические и клинические испытания. В тоже время следует отметить, что до сих пор не разработано ни одного альтернативного отечественного противоопухолевого препарата. Производимые в России противоопухолевые препараты являются либо дженериками либо производными зарубежных препаратов таргетных МКА, которые способны специфически связывать определенные аминокислотные участки (эпитопы) антигенов/белков/рецепторов, например HER2, на поверхности опухолевых клеток. Молекулы МКА могут находится как в свободном состоянии, так в комплексе (в конъюгации) с другими молекулами. При таком специфическом иммунном взаимодействии МКА с антигеном/белком/рецептором, в клетках блокируется синтез целевого антигена (белка - рецептора), вызывающего их опухолевый рост, а также стимулируется иммунная система пациента на «уничтожение» этих перерожденных клеток. Кроме этого, молекулы МКА в комплексе (в конъюгации) с другими молекулами открывают возможность создания молекулярно - таргетных флуоресцентных биомаркеров (в случае конъюгации с люминофорами), а также таргетных терапевтических препаратов (в случае конъюгации с веществами, проявляющими противораковую активность) (). Например, широко известный препарат под названием Трастузумаб (Герцептин) (Roche, США) - это гуманизированные МКА, полученные на основе мышиных МКА, направленных против белка HER2. Трастузумаб (Герцептин) показал свою эффективность при сравнении со стандартными методами лечения. Относительный риск рецидива был снижен на 36%, а риск смертности уменьшился на 34% ( Такие препараты как Гертикад и Новотакс (Биокад, Россия), являются отечественными биоаналогами Трастузумаба (Герцептина) и при их применении для лечения РМЖ не было обнаружено существенной разницы от результатов использования трастузумаба (). Наряду со значительными успехами применения терапевтических полноразмерных антител в лечении опухолевых заболеваний, данный подход имеет ряд недостатков: низкую эффективность антител, тяжелые побочные эффекты, такие как кардиомиопатия, аллергические реакции, включая анафилаксию, гепатотоксичность, кожные реакции и др. (), а также невосприимчивость опухолевых клеток к антителам, как первичную, так и приобретенную в процессе длительного применения таких препаратов (). В последние годы интенсивно разрабатываются препараты на основе малых однодоменных нано - моноантител, имеющих ряд преимуществ по сравнению с полноразмерными двухцепочечными (бивалентными) МКА. Одним из важных характеристик нано - моноантител является их сравнительно малый размер (10-15 кДа) по сравнению с размерами классических полноразмерных двухцепочечных антител (150 кДа) и одноцепочечных антител (30 кДа) (). В работах () обобщаются преимущества этих препаратов перед классическими антителами:
→ сродство с антигеном выше, чем у классических антител;
→ возможность получения комплекса молекул наноантител с флуоресцентными молекулами для получения специфических красителей опухолевых клеток;
→ возможность хранения наноантител при 4°С в течение нескольких месяцев или при минус 20°С на протяжении нескольких лет, при сохранении специфичности взаимодействия с антигеном - мишенью;
0
→ термостабильность, позволяющая сохранить до 80% специфической активности наноантител после их недельной инкубации при 37С;
→ устойчивость к агрегации;
→ стабильность при экстремальных рН и в присутствии хаотропных агентов;
→ температура плавления 67-68°С с возможностью полной обратимой денатурации;
E.coli
→ возможность наработки нано - моноантител в прокариотических клетках бактерий  или в эукариотических клетках дрожжей, растений и животных;
→ низкая иммуногенность и др.
Тиллиб С.В., Иванова Т.И., Васильев Л.А. Фингерпринтный анализ селекции наноантител методом фагового дисплея с использованием двух вариантов фагов-помощников. / Acta Naturae (русскоязычная версия). 2010. №3. С. 100-108; Тиллиб С.В. “Верблюжьи наноантитела” - эффективный инструмент для исследований, диагностики и терапии. / Молекулярная биология. 2011. Т. 45. №. 1. С. 77-85.
В качестве преимуществ так же можно выделить простоту всевозможных генно-инженерных манипуляций при конструировании нано - моноантител и их высокую адаптивность для различных задач, возможность создания их многофункциональных производных и др. ().
Тиллиб С.В. Верблюжьи наноантитела эффективный инструмент для исследований, диагностики и терапии. / Молекулярная биология. 2011. Т. 45. № 1. С. 77-85
В 1993 г. группой бельгийских ученых, в сыворотке крови представителей семейства Camelidae (верблюды, ламы, викуньи), были обнаружены однодоменные наноантитела. Как выяснилось, однодоменные антитела состоят только из димера одной укороченной тяжелой цепи (без СН1), а легкая цепь отсутствует. Вариабельный участок таких антител формируется только одним вариабельным доменом, который связан через шарнирный регион с константным доменом. Для специфического узнавания и связывания эпитопа молекулы антигена молекуле такого наноантитела достаточно наличия лишь тяжелой цепи. Организация вариабельных доменов наноантител подобна той, что существует у классических антител, т.е. состоят из константных и гипервариабельных доменов. ().
Тиллиб С.В., Наноантитело, специфически связывающее белок сеа, способ его использования для детекции этого белка. / международная заявка WO 2013154460, опубл. 20.09.2013; Тиллиб С.В.. Наноантитело, специфически связывающее белок muc1, способ детекции белка muc1 с помощью наноантител. / международная заявка WO 2013129978, опубл. 28.11.2013; Ларин C.C., Захарова Е.С., Вихрева П.Н. и др.  Наноантитело v9, связывающее vegf, и способ его получения, кодирующая v9 нуклеотидная последовательность и содержащий ее вектор, способ ингибирования пролиферации эндотелиальных клеток. / Патент РФ № 2395521, опубл. 27.07.2010
Tillib S. V. “Camel nanoantibody” is an efficient tool for research, diagnostics and therapy. / Molecular biology. 2011. Т. 45. №. 1. С. 66-73
Зигангирова Н.А., Тиллиб С.В. Наноантитела, связывающие антиген Chlamydia rachomatis, способ подавления инфекции, вызванной Chlamydia trachomatis. / Патент РФ № 2487724, опубл. 20.07.2013
Известны следующие изобретения : (), в которых показано, что рекомбинантные наноантитела способны эффективно связывать белки СЕА (Carcinoembryonic antigen), MUC1(Mucin 1) и VEGF (Vascular endothelial growth factor). В этих работах так же продемонстрировано, что способ получения рекомбинантных нано - моноантител довольно простой. Полученные нано - моноантитела имеют высокую растворимость, аффинность и специфичность, позволяющую узнавать некоторые «скрытые» эпитопы белков - мишеней (). Наноантитела, специфичные к антигену Chlamydia trachomatis, способны эффективно связываться с антигеном внутриклеточного паразита Chlamydia trachomatis и ингибировать развитие хламидийной инфекции ().
Tian B.
Wong W.Y., Hegmann E. et al. Production and Characterization of a Camelid Single Domain Antibody - Urease Enzyme Conjugate for the Treatment of Cancer. / Bioconjugate chemistry. 2015. Т. 26. №. 6. С. 1144-55
Maussang D., Mujic-Delic A., Descamps F.J. et al. Llama-derived single variable domains (nanobodies) directed against chemokine receptor CXCR7 reduce head and neck cancer cell growth in vivo. / J. Biol. Chem. 2013. V. 288. № 41. Р. 29562-72
Enterobacter cloacea
Cortez-Retamozo V., Backmann N., Senter P.D. et al. Efficient cancer therapy with a nanobody-based conjugate. / Cancer Res. 2004. V. 64. № 8. 2853-57)
Vosjan M.J., Vercammen J., Kolkman J.A. et al. Nanobodies targeting the hepatocyte growth factor: potential new drugs for molecular cancer therapy. Mol. Cancer Ther. 2012. V. 11. № 4. 1017 -25).
Здобнова Т. А., Лебеденко Е. Н., Деев С. М. Квантовые точки для молекулярной диагностики опухолей. / Acta Naturae (русскоязычная версия). 2011. №1. С. 30-50
Известно исследование, в результате которого было показано, что конъюгированные наноантитела L-DOS47 обладали большей связывающей активностью со специфическим антигеном немелкоклеточного рака легкого, чем нативные наноантитела AFAIKL2. В настоящее время данный конъюгат исследуется в качестве потенциального терапевтического препарата и проходит первую фазу клинических исследований (). Природные наноантитела, полученные при иммунизации ламы цельными человеческими клетками (из биопсийного материала), содержащими белок CXCL12, были способны связывать нативный белок и блокировать β-арестин 2, находящиеся в хемокиновом рецепторе CXCR7 и гиперэкспрессирующиеся в при гепатоцеллюлярной карциноме, раке мочевого пузыря, раке шейки матки, глиобластоме и др. Эти же наноантитела уменьшали секрецию ангиогенных (замедляющих рост клеток) факторов (). В исследованиях in vivo было показано, что наноантитела, конъюгированные с бета - лактомазой , обладают высокой противоопухолевой активностью, взаимодействуя с антигеном LS174T, который экспрессируется на карциноэмбриональных раковых клетках (. Конъюгат наноантител с облученным цирконием, ингибировал рост опухоли у мышей с ксенотрансплантантами глиобластомы, по сравнению с контрольной группой животных, не обработанных таким конъюгатом. У некоторых мышей после лечения наблюдалось полное отсутствие раковых клеток ( Таким образом, получение флуоресцентных конъюгатов на основе рекомбинантных нано - моноантител является приоритетным направлением в современной биотехнологии, биомедицине и биофармакологии. А флуоресцентные конъюгаты, проявляющие яркую, долгоживущую люминесценцию в красной области спектра, являются наиболее перспективными в качестве молекул - маркеров для диагностики многих онкологических заболеваний. ().
Even-desrumeaux K. Fourquet P., Secq V.,
et al. Single-domain antibodies: a versatile and rich source of binders for breast canser diagnostic approaches. / Molecular BioSystems. 2012. V. 8. №. 9. P. 2385-94)
Even-desrumeaux K.
et al. Single-domain antibodies: a versatile and rich source of binders for breast canser diagnostic approaches. / Molecular BioSystems. 2012. V. 8. №. 9. P. 2385-94)
Наиболее близким аналогом (прототипом) к заявляемому изобретению, по совокупности существенных признаков и техническому результату, являются рекомбинантные нано - моноантитела, специфичные к белку - рецептору HER2/neu. Эти моноантитела были получены методом фагового дисплея отбором из пула природных поликлональных наноантител, полученных при иммунизации ламы биопсийным материалом от пациентки с диагнозом РМЖ (рак молочной железы), как описано в источнике (. Далее указанные авторы использовали плазмиду pET14a для переклонирования нуклеотидной последовательности одного из наноантител в фагмиду pHEN1 и получения препарата рекомбинантных нано - моноантител (специфических молекул-курьеров к мишени - белку HER2/neu), конъюгированных с биотин - стрептовидиновым комплексом (молекулами - маркерами). Полученные таким образом, иммуно - химические конъюгаты нано - моноантител с биотин - стрептовидиновым комплексом, сорбированные на магнитных эпоксидных частицах, были использованы в цитохимическом анализе опухолевых тканей для разработки быстрой диагностики РМЖ (Fourquet P., Secq V., .
Однако, полученные таким образом иммуно-химические конъюгаты нано-моноантител с биотин - стрептовидиновым комплексом, сорбированные на магнитных эпоксидных частицах обладают недостаточной опухоль-связывающей активностью со специфическим антигеном.
Техническим результатом заявляемого технического решения является увеличение эффективности использования конъюгатов молекул - маркеров с рекомбинантными нано-моноантителами, специфичными к белку HER2/neu вследствие повышения опухоль-связывающей активности конъюгата со специфическим антигеном за счет использования в качестве молекул - маркеров сферических наночастиц диоксида кремния.
Указанный технический результат достигается тем, что создан конъюгат люминесцентных наночастиц диоксида кремния с рекомбинантными  однодоменными нано - моноантителами С7b ламы, характеризующийся тем, что люминесцентные наночастицы диоксида кремния имеют модифицированную эпоксидными группами гидрофильную поверхность, химически связанную с аминогруппами рекомбинантных однодоменных нано - моноантител С7b ламы, имеющих аминокислотную последовательность SEQ ID №1 (приложение):
MQVQLVQSGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSSYAMAWFRQAPGKEREFVA
10                       20                      30                        40                       50
AISWSGANIYVADSVKGRFTISRDNAKDTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAVK
60                       70                       80                       90                     100
LGFAPVEERQYDYWGQGTQVTVSS (124 а.о.),
110                      120
молекулярную массу 17 кДа и способных специфически взаимодействовать  с рекомбинантным белком HER2/neu - аналогом природного рецептора эпидермального фактора роста EGFR/ERBB  клеток  человека.
Люминесцентные наночастицы диоксида кремния имеют размер от 45 до 55 нм.
Основным отличием заявляемого  конъюгата рекомбинантных нано - моноантител (специфических молекул - курьеров к мишени - белку HER2/neu) от выше указанного аналога  (прототипа), является то, что в качестве молекул - маркеров используются сферические (наночастицы) диоксида кремния, допированные люминесцентными октаэдрическими кластерными комплексами молибдена, со средним размером 50±5 нм. Как известно, данные комплексы обладают высоким квантовым выходом, что обеспечивает исключительную яркость в широком спектре излучения, а также обладают высоким коэффициентом молярной экстинкции (в 10-100 раз выше, чем у других флуорофоров). Помимо этого, у кластерных комплексов имеется высокая устойчивость к фото деградации, устойчивость к фотовыцветанию в 100-1000 раз выше, чем у органических флуорофоров. Образование комплекса (конъюгата) между частицами диоксида кремния и молекулами наноантител проходит за счет химического взаимодействия гидрофильного покрытия наночастиц (эпоксидные или карбоксильные группы) и аминогруппы наноантител, а не через биотин - стрептовидиновый мостик, что снижает эффективность за счет присутствия в организме  эндогенного биотина, конкурирующего с вводимыми в организм синтетическими биотинилированными компонентами (Vorotnikov Y. A. et al. On the synthesis and characterisation of luminescent hybrid particles: Mo 6 metal cluster complex/SiO 2. / RSC Advances. 2016. Т. 6. №. 49. С. 43367-43375).
Заявляемый конъюгат люминесцентных наночастиц диоксида кремния с однодоменными очищенными рекомбинантными нано - моноантителами, обеспечивает узнавание как рекомбинантного так и природного гиперэкспрессирующегося на поверхности опухолевых клеток, белок HER2/neu - рецептор эпидермального фактора роста клеток молочной железы человека. Полученный конъюгат  обладает всеми преимуществами природного однодоменного наноантитела, в частности высокой специфичностью к белку HER2/neu, а так же простотой получения и ярко-красной люминесценцией на поверхности опухолевых клеток, которую можно легко детектировать с использованием конфокального или флуоресцентного микроскопа.
Изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами. На фиг.1 представлена нуклеотидная последовательность кодирующее рекомбинантное нано-моноантитело C7b. На фиг.2 приведена аминокислотная последовательность рекомбинантного - моноантитела. На фиг.3 представлена схема получения экспессионной гибридной (рекомбинантной) ДНК - конструкции кодирующей рекомбинантное нано - моно антитело C7b. На фиг.4 приведена схема конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК конструкции pET21a-C7b, находящейся под контролем промотора Т7. На фиг. 5 изображена электрофореграмма продукта экспресс последовательности рекомбинантного нано-моноантитела C7b в клетках E.coli штамма BL21(DE3) и очищенного препарата нано-моноантител C7b C7b в 12% SDS-ПААГ. На фиг. 6 представлен дот-блот анализ взаимодействия очищенного препарата рекомбинантных нано - моноантител C7b с антигеном - рекомбинантным белком - рецептором HER2/neu. На фиг. 7 приведена диаграмма исследования специфичности взаимодействия в ТФ-ИФА рекомбинантных нано - моноантител C7b с рекомбинантным белком - рецептором HER2/neu человека в концентрации 0,05 мкг/50 мкл.
Пример 1. Конструирование рекомбинантной плазмиды pET21а-C7b.
1.1. Получение нуклеотидной последовательности нано - моноантитела C7b ламы.
Нуклеотидная последовательность нано - моноантитела C7b ламы (GenBank: AFN61318.1) была синтезирована и клонирована в состав коммерческой плазмиды pGH, по нашему заказу, в коммерческой научно - производственной фирме (ДНК-Синтез, Россия).
Последовательность размером 468 пар нуклеотидов (п.н.), кодирующая 156 аминокислотных остатков (а.о.) нано - моноантитела C7b, соответственно, представлена на фиг. 1ифиг. 2.
За основу была взята молекула ДНК (GenBank: AFN61318.1), которая состоит из 468 пар нуклеотидов (п.н.), в том числе (фиг. 1):
- последовательности, кодирующей природное нано - моноантитело ламы 372 п.н.;
- последовательности, кодирующей гексaгистидиновый блок His-tag 18 п.н., необходимый для аффинной очистки препарата рекомбинантного нано - моноантитела С7b;
- фрагмента 45 п.н., кодирующего пептид Avi tag для биотинилирования рекомбинантных нано-моноантител in vivo;
- 2-х  глицин-сериновых мостика размером 21 и 12 п.н. соответственно.
Аминокислотная последовательность молекулы ДНК природного нано - моноантитела С7b состоит из 156 а.о. (фиг. 2), в том числе:
- последовательности, кодирующей природное нано - моноантитело ламы 124 а.о.;
- последовательности, кодирующей гексaгистидиновый блок His-tag 6 а.о., необходимый для аффинной очистки препарата рекомбинантного нано - моноантитела С7b;
- фрагмента 15 а.о., кодирующего пептид Avi tag для биотинилирования рекомбинантных нано - моноантител in vivo;
- 2-х глицин-сериновых мостика размером 7 и 4 а.о. соответственно.
1.2. Гидролиз плазмид pET21a(+) и pGH-C7b.
Получение экспрессирующей рекомбинантной плазмиды pET21а-C7b, кодирующей последовательность природногонано - моноантитела C7b, проводили по схеме, представленной на фиг. 3.
Векторную плазмиду pET21a(+) (Novagen, США) и плазмиду pGH-C7b, включающую синтезированную последовательность, кодирующую нано - моноантитело C7b, обрабатывали рестриктазами NdeI-XhoI (New England Biolabs, Англия). Полученный гидролизат разделяли с помощью электрофореза в 1% агарозном геле с последующим выделением аликвоты фрагмента и векторной части плазмиды с помощью набора “Cleanup Standard” (Евроген, Россия) согласно рекомендациям производителя.
1.3. Лигирование ДНК.
E.coli
5842
17,0
Для проведения лигазной реакции использовали 0,5 мкг препарата линеаризованной векторной плазмиды рЕТ21а(+), 0,7 мкг аликвоты фрагмента C7b и 200 е.а. (единиц активности) Т4 ДНК лигазы (СибЭнзим, Россия) в реакционном буфере “Quick ligation” (Евроген, Россия). Полученный таким образом препарат гибридной (рекомбинантной) плазмидной ДНК pET21a+C7b, которая представлена на фиг. 4, которую далее использовали для трансформирования культуры клеток  BL21(DE3). Представленная на фиг. 4 ДНК - конструкция имеет размер п.н., кодирует целевой белок с молекулярной массой  кДа и состоит из следующих фрагментов:
- Nde
Xho
Escherichia coli;
I-I - векторный фрагмент ДНК плазмиды рET21a(-) размером 5365 п.н. содержит промотор T7, обеспечивающий экспрессию последовательности нано - моноантитела C7b в прокариотических клетках; Ampicilin - ген устойчивости к ампициллину и pBR322 ori, обеспечивающие селекцию и размножение целевой плазмиды в клетках бактерий лактозный репрессор - ДНК - связывающий белок, который ингибирует экспрессию генов и обеспечивает экспрессию целевого белка после добавления индуктора изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид (ИПТГ); f1 origin - точка начала репликации f1, обеспечивающая клонирование вектора в комбинации с нитевидным бактериофагом М13;
- Nde
Xho
E.coli
468
I-I - фрагмент ДНК размером  п.н., содержащий последовательность нано - антитела C7b; гескагистидиновый пептид Avi-tag, служащий в качестве сайта узнавания для биотин - холанзим - синтетазы  для возможной сшивки с биотином in vivo.
Пример 2. Получение штамма
Escherichia Coli
BL21(DE3) - продуцента рекомбинантных нано - моноантител C7b.
E.coli BL21(DE3) (Novagen, США)
Коммерчески доступный штамм  использовали для экспрессии гена рекомбинантного нано - моноантитела C7b.
2.1. Трансформация компетентных клеток
E. coli
гибридными плазмидами.
E. coli
Маниатис Т, Фрич Э, Сэмбрук Дж. / Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. Москва. Мир. 1984. с. 240-241
E.coli
600
Трансформацию клеток  BL21(DE3) проводили с применением раствора хлористого кальция по методу, описанному в руководстве (). Клетки культивировали в 5 мл жидкой питательной среды LB до оптической плотности OD=0.6, охлаждали во льду и аликвоту бактериальной культуры (1,5 мл) центрифугировали при 6000 rpm в течение 2 мин при 4°С. Супернатант удаляли, а осадок клеток ресуспендировали в 700 мкл охлажденного хлорида кальция и инкубировали на льду в течение 15 мин. Далее клетки осаждали при 6000 rpm в течение 2 мин при 4°С. Осадок клеток ресуспендировали в 100 мкл охлажденного раствора хлорида кальция, и к суспензии клеток добавляли 10 мкл реакционной лигазной смеси, с последующей инкубацией на льду в течение 30 мин. После инкубации  проводили для клеток тепловой шок - выдерживали 5 мин при 37°С, затем к суспензии клеток добавляли 1 мл жидкой питательной среды LB и инкубировали при 37°С в течение 1часа. Трансформанты рассевали на LB - агар, содержащий 50-100 мкг/мл ампициллина.
2.2. Культивирование трансформированной культуры клеток штамма
E.coli
BL21(DE3)[pET21a-C7b]
и индукция синтеза рекомбинантных нано - моноантител C7b
.
E.coli
BL21(DE3),
E.coli
E.coli
BL21(DE3),
см. пример 4
см. пример 5
Штамм  трансформированный рекомбинантной плазмидой pET21a-C7b, культивировали в объеме 150 мл жидкой питательной среды LB с добавлением ампициллина в рабочей концентрации. Синтез рекомбинантного полипептида в клетках  индуцировали 0,1 мM IPTG (изопропил-β-D-тиогалактозид). Отбор клонов клеток - продуцентов проводили по наличию синтезируемого ими белка в 15% полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-ПААГ) () и посредством анализа лизатов бактериальной культуры клеток со специфическим рекомбинантным антигеном HER2/neu (R&D systems, INC., США) в дот - блот анализе (). В качестве контроля использовали, полученный аналогичным способом, лизат культуры клеток штамма  содержащих векторную плазмиду pET21.
Пример 3. Очистка рекомбинантных нано - моноантител C7b в денатурирующих условиях.
E.coli
BL21(DE3)
Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. / Nature. 1970. V. 227. No. 5259. P. 680-685
см. пример 4
фиг. 5
Очистку рекомбинантного белка (препарата нано - моноантител C7b), содержащего в своем составе полигистидиновый блок, проводили аффинной хроматографией на Ni-хеллатной смоле, согласно протоколу фирмы-производителя (GE Healthcare Life Sciences, Великобритания). Полученные клеточные лизаты штамма - продуцента  и очищенный препарат рекомбинантных нано - моноантител C7b, анализировали методом белкового электрофореза по методу Лэммли в SDS-ПААГ () (). Электрофоретическая подвижность синтезируемых рекомбинантных нано - моноантител C7b в 12% SDS-ПААГ составила 10-15 кДа (), где:
E.coli,
E.coli,
1 - лизат клеток несущий рекомбинантные плазмиды pET21a+C7b до индукции IPTG (3 часа); 2 - лизат клеток несущий плазмиды pET21a+C7b, после индукции IPTG (16 часов); 3 - белки,  не связавшиеся на Ni-хеллатной смоле; 4 - слабоспецифические белки, снятые с колонки с помощью раствора, содержащего 40мМ имидозола; 5, 7 - 11 - фракции очищенных белков 1-5 белков после очистки на Ni-хеллатной смоле; 6 - маркеры молекулярной массы белков (Thermo Fisher Scientific, США).
Even-desrumeaux K. et al. Single-domain antibodies: a versatile and rich source of binders for breast canser diagnostic approaches. / Molecular BioSystems. 2012. V. 8. №. 9. Р. 2385-94
Выше указанные результаты соответствуют литературным данным (). Концентрацию препарата рекомбинантных нано - моноантител C7b измеряли в соответствии с рекомендациями производителя в микрообъемах при помощи спектрофотометра «Implen NanoPhotometer NP80».
Пример 4. Белковый электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-ПААГ).
Электрофорез проводили в разрешающем геле (состав: 30% акриламида; 1,5 M Tris (pH 8,8); 10% SDS; 10% аммония персульфата; TEMED (tetramethylethylenediamine) 1 мкл/мл) и концентрирующем геле (состав: 30% акриламида; 1M Tris (pH 6,8); 10% SDS; 10% аммония персульфата; TEMED 1 мкл/мл) в различных буферных растворах (верхний - 5Х трис-глициновый буферный раствор pH 8,3 (состав:1,25 мM Tris; 1,25 M глицина; 0,5 % SDS), нижний - 1Х трис-ацетатный буферный раствор pH 8,0 (состав: 40 мМ  Tris-HCl; 40 мМ уксусной кислоты; 2 мМ EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота). Биологический материал смешивали с буферным раствором для нанесения и наносили в верхний концентрирующий гель. SDS-ПААГ вели при напряжении ~150В. Окраску гелей проводили при помощи раствора Кумасси G-250.
Пример 5. Дот - блот анализ.
2
4
2
4
Идентификацию полученных рекомбинантных нано - моноантител C7b проводили методом дот - блот анализа на нитроцеллюлозной мембране (Hybond-C Extra). На мембрану капельно наносили рекомбинантный белок HER2/neu, концентрация которого составляет 50 нг в точку диаметром 2 мм и высушивали при комнатной температуре в течение 15 минут. Далее мембрану переносили в смоченный водой держатель. Поверхность мембраны для неспецифического связывания блокировали 1% раствором бычьего сывороточного альбумина (БСА) в ФСБ (Фосфатный солевой буфер, 137 mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM NaHPO,1.74 mM KHPO pH 7.4) с 0,1% Tween 20 (ФСБ-Т). После трехкратной промывки мембраны с ФСБ с 0,1% Tween 20, на местоположение сорбированного антигена HER2/neu капельно добавляли раствор препарата конъюгата нано - моноантител C7b с диоксидом кремния в концентрации 100 мкг/мл в 1% растворе БСА в ФСБ-Т и инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре, затем трехкратно промывали с ФСБ-Т. Далее на отмытую мембрану наносили раствор мышиных антител, специфичных против His-tag (Sigma-Aldrich, США) в рабочем разведении в 1%-ном растворе БСА  на ФСБ -Т и инкубировали  при комнатной температуре в течение 10 мин. После трехкратной промывки мембраны с ФСБ-Т, добавляли козьи анти - мышиные антитела, меченные щелочной фосфатазой. В качестве субстрата для щелочной фосфатазы использовали раствор 5-бром-4-хлор-3-индолил фосфат (BCIP) и нитро синий тетразол (NTB) в водном растворе. Ферментативную реакцию останавливали промывкой дистиллированной водой. Результат дот - блот анализа представлен на фиг. 6 (взаимодействие очищенного препарата рекомбинантных нано - моноантител C7b с антигеном - рекомбинантным белком - рецептором HER2/neu), где:
(К-) -  (отрицательный контроль) - сорбированный на мембране бычий сывороточный альбумин, не содержащий His-tag блок, последовательно инкубированный с препаратом рекомбинантных нано - моноантител C7b, содержащих His-tag блок; c препаратом мышиных антител, специфичных против His-tag блока и козьими анти - мышиными антителами, меченными щелочной фосфатазой; К и Кх2 - иммунное взаимодействие сорбированного на мембране рекомбинантного белка - рецептора HER2/neu с препаратом нано - моноантител C7b, конъюгированных с люминесцентными наночистицами диоксида кремния (в однократной и двухкратной концентрации, соответственно) и последовательно c препаратом мышиных антител, специфичных против His-tag блока и козьими анти - мышиными антителами, мечеными щелочной фосфатазой; А - препарат сорбированных на мембране нано - моноантител C7b (без антигена HER2/neu), последовательно инкубированный c препаратом мышиных антител, специфичных против His-tag блока  и козьими анти - мышиными антителами, мечеными щелочной фосфатазой; КаН - (без антигена HER2/neu) контроль взаимодействия препарата мышиных антител с рекомбинантным белком TBI ВИЧ содержащий гексагистидиновую метку, специфичных против His-tag блока с козьими анти - мышиными антителами, меченые щелочной фосфатазой; КмА - (без антигена HER2/neu) контроль взаимодействия мышиного антитела 29F2 против белка p24  ВИЧ  с козьими анти - мышиными антителами, меченые щелочной фосфатазой.
Пример 6. Синтез наночастиц.
4
2
6
8
3
6
Vorotnikov Y. A. et al. On the synthesis and characterisation of luminescent hybrid particles: Mo 6 metal cluster complex/SiO 2.  /RSC Advances. 2016. Т. 6. №. 49. С. 43367-43375
В круглодонной колбе смешивали 27,5 мл гептана и 14,5 мл ПАВа (поверхностно активное вещество) Brij L4. 17 мг комплекса (BuN)[{MoI}(NO)] растворяли в 2,5 мл 96 %-го этанола, затем добавляли 2,5 мл воды. К смеси ПАВ/гептан добавляли 0,8 мл раствора комплекса и 0,65 мл раствора аммиака (30%). Смесь оставляли при постоянном перемешивании на 1 час при комнатной температуре, после чего добавляли 1 мл тетраэтилортосиликата. Полученную смесь выдерживали при постоянном перемешивании при комнатной температуре в течение 3 дней, после чего вливали в 50 мл этанола. Осадок, образовавшийся при центрифугировании,  промывали трехкратно 96 %-ным этанолом, с последующей трехкратной промывкой дистиллированной водой и однократной промывкой ацетоном. Осадок наночастиц, образовавшийся при центрифугировании, далее высушивали на воздухе ().
Пример 7. Конъюгирование нано - моноантител C7b с молекулами SiO
.
2
7.1. Вариант конъюгирования № 1.
Перед началом проведения конъюгации было приготовлено 4 раствора:
а) буфер для промывания (0.1 M NaCl): 2,9 г NaCl растворяли в 30 мл дистиллированной воды, перемешивали до полного растворения и затем доводили объем раствора до 50 мл.
2
3
3
б) буфер для проведения конъюгации (карбонатный/бикарбонатный буфер): 0,29 г NaCO и 0,19 г NaHCO растворяли в 30 мл дистиллированной воды и доводили объем раствора до 50 мл и pH до 10.
в) раствор для связывания свободных антител: 50 мг глицина растворяли в 10 мл воды, затем доводили объем раствора до 20 мл. К полученному раствору добавляли 0,014 мл ПАВа Triton X-100.
г) буфер для хранения: 2,9 г NaCl растворяли в 30 мл дистиллированной воды, перемешивали до полного растворения и затем доводили объем раствора до 50 мл. К полученному раствору добавляли 30 мг трис(гидроксиметил)аминометана (pH = 8).
Порядок проведения конъюгации.
2
2
2
2
2
10 мг наночастиц SiO с поверхностью, модифицированной эпоксидными группами, промывали двумя циклами центрифугирования/ресуспендирования 3 мл буфера для промывания. Затем осадок наночастиц SiOресуспендировали в 1,5 мл буфера для проведения конъюгации. К полученной суспензии наночастиц SiOдобавляли препарат очищенных наноантител с концентрацией 6,7 мг/мл в 0,5 мл забуференном растворе NaCl. Полученную смесь наночастиц SiO с наноантителами инкубировали при мягком перемешивании на магнитной мешалке (20 об./мин) на 24 часа при комнатной температуре. Далее конъюгат наночастиц SiO с наноантителами отмывали в 3 мл буфера для промывания и ресуспендировали в 3 мл раствора для связывания свободных антител. Суспензию конъюгата перемешивали на магнитной мешалке (250 об./мин) в течение 30 минут, после чего так же промывали двумя циклами центрифугирования/ресуспендирования 3 мл буфера для промывания и ресуспендировали в 1 мл буфера для хранения при 4°C.
7.2. Вариант конъюгирования № 2.
Перед началом проведения конъюгации было приготовлено 4 раствора.
2
4
2
4,
а) буфер для промывания/проведения конъюгации: натрий-фосфатный буфер ФСБ (Фосфатный солевой буфер, 137 mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM NaHPO,1.74 mM KHPO pH 7.4).
б) раствор для связывания свободных антител: 50 мг глицина растворяли в 10 мл воды, затем доводили объем раствора до 20 мл. К полученному раствору добавляли 0,014 мл ПАВа Triton X-100.
в) буфер для хранения: 2,9 г NaCl растворяли в 30 мл дистиллированной воды, перемешивали до полного растворения и, затем, доводили объем раствора до 50 мл. К полученному раствору добавляли 30 мг трис(гидроксиметил)аминометана (pH = 8).
Порядок проведения конъюгации.
2
2
2
2
2
2
2
10 мг наночастиц SiO с поверхностью, модифицированной аминогруппами, промывали двумя циклами центрифугирования/ресуспендирования 3 мл буфера для промывания/проведения конъюгации. После второго промывания наночастицы SiO ресуспендировали в 2 мл буфера для промывания/проведения конъюгации, содержащего 10% глутарового альдегида. Полученную суспензию наночастиц SiO перемешивали на магнитной мешалке (250 об./мин) в течение 2 часов при комнатной температуре, после чего промывали двумя циклами центрифугирования/ресуспендирования 3 мл буфера для промывания/проведения конъюгации. Далее наночастицы SiO ресуспендировали в 1,5 мл буфера для промывания/проведения конъюгации и добавляли антитела с концентрацией 6,7 мг/мл в 0,5 мл забуференного раствора NaCl. Полученную смесь наночастиц SiO с наноантителами инкубировали при мягком перемешивании на магнитной мешалке (20 об./мин) на 2 часа при комнатной температуре. Далее смесь наночастиц SiO с наноантителами промывали 3 мл буфера для промывания промывания/проведения конъюгации и ресуспендировали в 3 мл раствора для связывания свободных антител. Суспензию наночастиц SiO с наноантителами перемешивали на магнитной мешалке (250 об./мин) в течение 30 минут, после чего еще промывали двумя циклами центрифугирования/ресуспендирования 3 мл буфера для промывания/проведения конъюгации и ресуспендировали в 1 мл буфера для хранения при 4°C.
Пример 8. Твердофазный иммуноферментный анализ (ТФ-ИФА).
Исследование специфического взаимодействия очищенного препарата рекомбинантных нано - моноантител C7b с коммерческим препаратом рекомбинантного белка - рецептора HER2/neu человека (R&D system Inc. США).
2
2
2
2,
Для проведения ТФ-ИФА использовали высокосорбционные стриповые 96-луночные полистироловые планшеты Nunc (Termoscientific, США). Сенсибилизацию ячеек планшетов очищенным препаратом рекомбинантных нано - моноантител C7b или их конъюгатом с молекулами диоксида кремния выполняли в трис - солевом буфере, содержащем 0,15M NaCl; 0,02M трис - HCl рН 7,4 (ТСБ) в объеме 100 мкл/лунка при 22°C в течение 18 часов. Титрование очищенного препарата рекомбинантных нано - моноантител C7b и их конъюгата с молекулами диоксида кремния проводили с разведения 1/100 (что соответствует 6700 и 3400 нг/лунка, соответственно) 2-х кратным шагом. После трехкратной отмывки с ТСБ с 0,05% твин-20 (ТСБ-Т) в лунки добавляли по 150 мкл блокировочного 1%-го раствора казеина в ТСБ-Т и инкубировали в течение 1 часа при 37°С. Затем раствор казеина удаляли и инкубировали сорбированные нано - моноантитела C7b с рекомбинантным белком HER2/neu человека, в ранее выбранном рабочем разведении 1/100 (что соответствует 50нг/лунка), в объеме 50 мкл/лунка 0,5%-го раствора казеина в ТСБ-Т и инкубировали в течение 1 часа при 37°С. После трехкратной отмывки лунок с ТСБ-Т буфером, в них добавляли по 100 мкл пероксидазного конъюгата антител Goat - anti human (Sigma-Aldrich, США), в ранее выбранном рабочем разведении 1/2000 и инкубировали в течение 1 часа при 37°С. После трехкратной отмывки лунок с ТСБ-Т буфером в них добавляли по 50 мкл жидкого субстрата на основе ТМБ (3,3',5,5'–Tetramethylbenzidine) и буфера, содержащего НОдля окисления субстрата. Проявление иммунной реакции нано - моноантител с рекомбинантным антигеном HER2/neu и ферментативной реакции субстрата с НОпроводили в течение 15 минут при комнатной температуре в защищенном от света месте. Ферментативную реакцию блокировали добавлением 50 мкл 1 N HCl в каждую лунку и измеряли оптическую плотность (ОП) субстратно-индикаторной смеси на спектрофотометре “Uniscan” при длине волны 450 нм.
В результате проведенного исследования в ТФ-ИФА было показано, что очищенный препарат рекомбинантных нано - моноантител C7b проявляет высокую аффинность к антигену - рекомбинантному белку HER2/neu – аналогу природного рецептора эпидермального фактора роста клеток молочной железы человека, взаимодействуя с ним до разведения антител 1/102400 (фиг.7 - исследование специфичности взаимодействия в ТФ-ИФА рекомбинантных нано - моноантител C7b с рекомбинантным белком - рецептором HER2/neu человека в концентрации 0,05 мкг/50 мкл), что количественно выражается в 6,54 нг/100 мкл (таблица 1).  Конъюгат препарата нано - моноантител C7b с люминесцентными наночастицами диоксида кремния в этом анализе наглядно взаимодействует с антигеном в концентрациях – от 3400 до 850 нг.
Таблица 1
Результат титрования в ТФ-ИФА препаратов нано - моноантител C7b с коммерческим препаратом рекомбинантного антигена, белком HER2/neu человека.
Шаги титрования препаратов
Разведения препаратов в объеме 100 мкл/лунка
Концентрация очищенного препарата наноантител C7b(в нг/100 мкл)
Концентрация конъюгата препарата наноантител C7b с диоксидом кремния (в нг/100 мкл)
1
1/100
6700
3400
2
1/200
3350
1700
3
1/400
1675
850
4
1/800
837,5
425
5
1/1600
418,75
212,5
6
1/3200
209,37
106,25
7
1/6400
104,68
53,12
8
1/12800
52,34
26,56
9
1/25600
26,17
13,28
10
1/51200
13,08
6,64
11
1/102400
6,54
3,32
12
1/204800
3,27
1,66
Примечание к табл. 1: рекомбинантный антиген, белок HER2/neu человека (R&D system Inc. США) был использован в концентрации 100 мкг/мл.
Таким образом, примеры 1-8 наглядно подтверждают достижение заявляемого технического результата.