Вовлечение аутофагии в васкулогенную мимикрию при меланоме

вовлечение аутофагии в васкулогенную мимикрию при меланоме

A.A. Бартанян, о.С. Бурова, и.Б. Уласов, м.А. Барышникова

ФГБУ«РОНЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава России; Россия, 115478 Москва, Каширское шоссе, 24

Контакты: Амалия Арташевна Вартанян zhivotov57@mail.ru

Введение. Аутофагия — катаболический процесс удаления отработанных органелл, долгоживущих белков, патогенов и продуктов распада с помощью двумембранных фагосом — сопровождает жизнедеятельность нормальной клетки на протяжении всего времени ее существования. Аутофагия обеспечивает выживание клетки в условиях стресса, играет существенную роль в защите от инфекций, в развитии аутоиммунных процессов. В последние годы получены доказательства существования альтернативной системы кровоснабжения опухоли — васкулогенной мимикрии (ВМ), которая может частично компенсировать недостаток питания и кислорода в условиях гипоксии. Цель исследования — выявление взаимосвязи между аутофагией и ВМ.

Материалы и методы. В работе были использованы 2D- и 3D-культивирование клеток меланомы, выведенных в клеточную линию из операционного материала больных диссеминированной меланомой, электрофорез и вестерн-блот, нокдаун генов с помощью малых интерферирующих РНК (small interfering RNA, siRNA), проточная цитофлуориметрия, флуоресцентная микроскопия.

Результаты. О базовом уровне аутофагии в клетках меланомы судили по экспрессии LC-3B и флуоресценции монодансилка-даверина. Оба теста являются маркерами поздней стадии аутофагии. Нами показано, что в клетках меланомы, формирующих сосудистоподобные структуры (СПС) на матригеле, базовый уровень аутофагии был значительно выше, чем в клетках меланомы, не способных участвовать в ВМ. Блокирование аутофагии 3-метиладенином (3-methyladenine, 3-МА) или хлоро-кином — ингибиторами инициации и терминальной фазы аутофагии — приводило к заметному снижению способности клеток меланомы участвовать в ВМ. Полученные результаты были подтверждены siRNA-опосредованным подавлением экспрессии гена BECN1, участвующего в инициации аутофагии, и гена ATG5, который считается маркером поздней необратимой стадии аутофагии. Нокдаун генов BECN1 или ATG5 в клетках меланомы mel P снижал уровень белка ВесШ-1 и Atg5 на 70—75 % и блокировал формирование СПС на матригеле. Клетки меланомы с нокдауном гена ATG5меняли форму с веретеноподобной на шаровидную, но сохраняли способность мигрировать и узнавать друг друга, формирование СПС не наблюдалось. Низкомолекулярный ингибитор ВМ, ЛХС-1269, заметно снижал базовый уровень аутофагии.

Заключение. Полученные данные свидетельствуют о том, что активация аутофагии является необходимым условием формирования СПС. Мы предполагаем, что аутофагия обеспечивает прогрессию опухоли 2 путями: способствуя выживанию опухолевых клеток при химио- и радиотерапии и стимулируя процесс формирования васкулярных каналов, доставляющих питание и кислород в области опухоли с гипоксией.

Ключевые слова: меланома, аутофагия, васкулогенная мимикрия

A.A. Vartanian, O.S. Burova, I.V. Ulasov, M.A. Baryshnikova

N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center, Ministry of Health of Russia; 24 Kashyrskoe shosse, Moscow 115478, Russia

Introduction. Autophagy, a catabolic process of protein and organelle recycling by transferring defective cytoplasm and organelles into double-membraned vesicles to degrade and regenerate materials, plays a critical role in maintaining energy homeostasis. Autophagy also protects against stress and infection, participates at the development of autoimmune disease. In recent years, the existence of alternative blood circulation system in tumors, vasculogenic mimicry (VM), which can partially compensate the lack of nutrients and oxygen under the hypoxic conditions, has been described. Objective. To elucidate the relationship between autophagy and VM.

Materials and methods. In this study we used 2D- and 3D-culturing of melanoma cells derived from surgical species of patients with disseminated melanoma, electrophoresis and western blot, knockdown of the genes by using small interfering RNA (siRNA), flow cytom-etry, fluorescence microscopy.

Results. We detected the basal level autophagy by examining the expression of autophagy-specific protein (LC-3B) by flow cytometry and cellular immunofluorescence staining by monodancylcadaverine. Both assays are the markers of autophagy late stage. Here we

DOI: 10.17650/1726-9784-2017-16-2-66-73

THE INVOLVEMENT OF AUTOPHAGY IN MELANOMA VASCULOGENIC MIMICRY

show that the level of autophagy in melanoma cells mel P, participated in capillary-like structures (CLS) formation in matrigel, was considerably higher than in mel Me cells which do not involve in VM. To explore the function of autophagy in the ability of melanoma cells to form CLS 3-methyladenine (3-MA) or chloroquine — inhibitors of initiation and terminal stage of autophagy — were used. Both inhibitors reduced the ability of melanoma cells to engage in VM. The data obtained were confirmed by siRNA-mediated gene silencing of BECN1 involved in the initiation of autophagy and ATG5 gene which is considered to be a marker of late stage of autophagy. Knockdown of BECN1 or ATG5 in mel P melanoma cells reduced the level of protein Beclin-1 and Atg5 about 70—75 %, and suppressed CLS formation in matrigel. Melanoma cells with the ATG5 gene knockdown changed the shape but maintained the ability to migrate and recognize each other, the formation of CLS was not observed. Low molecular weight VM inhibitor LCS-1269, significantly reduced the basic level of autophagy.

Conclusion. Our data indicate that autophagy participates in CLS formation, and inhibition of autophagy suppresses CLS formation. We suggest that autophagy plays a dual role in the survival and development of tumors: autophagy helps cancer cells against environment stress and provides a temporary survival pathway by promoting energy regeneration, autophagy also promotes VM formation which supplies nutrients and oxygen to less vascularized area of tumor.

Key words: autophagy, melanoma, vasculogenic mimicry

Введение

Аутофагия — процесс, при котором внутренние компоненты клетки доставляются внутрь ее лизосом и подвергаются в них деградации, — находится в центре научных интересов более 20 лет. Сформировавшись в ходе эволюции как реакция на дефицит питательных веществ, система аутофагии сегодня рассматривается как способ поддержания гомеоста-за клетки [1, 2]. Аутофагия играет существенную роль в выживании клетки в условиях стресса, развитии аутоиммунных и воспалительных процессов. С другой стороны, аутофагия может быть древнейшей системой защиты клеток от вторжения извне, так как вместе с частью цитоплазмы могут захватываться вирусы или другие внутриклеточные паразиты.

При аутофагии de novo формируются специализированные структуры — фагофоры — двумембран-ные липидные образования, которые изолируют подлежащий уничтожению материал и расщепляют его в аутофагосоме. Аутофагосома образуется слиянием фагофор с лизосомами [3]. Благодаря аутофа-гии становится возможным расщепление собственных макромолекул и повторное их использование для поддержания нормальной жизнедеятельности клетки. Непрерывно работающая система аутофагии поддерживает также концентрацию токсичных метаболитов клетки на безопасном уровне [4]. В опухолевых клетках аутофагия имеет патологически повышенную активность, и неэффективность химио- и радиотерапии во многом связывают с ауто-фагией [5, 6]. Опухолевые клетки используют ауто-фагию также для того, чтобы выжить в условиях гипоксии [7]. Подобные условия могут возникнуть, например, при недостаточном кровоснабжении опухоли.

По данным ряда клинических испытаний, анти-ангиогенные препараты достоверно увеличивают общую выживаемость онкологических больных [8].

В то же время аккумулируются данные, свидетельствующие о том, что большинство опухолей практически не отвечают на анти-VEGF терапию (antivascular endothelial growth factor therapy, anti-VEGF therapy — терапия, направленная на блокировку фактора роста эндотелия сосудов) [9]. Одной из причин выживаемости опухолевых клеток в условиях блокирования ангиогенеза может быть гетерогенность кровеносных сосудов. Формирование сосудов в опухоли происходит на фоне неконтролируемой митогенной стимуляции и измененного внеклеточного матрикса. Это приводит к замещению эндотелия в сосудах опухолевыми клетками, иногда эндо-телиальные клетки могут и вовсе отсутствовать. Образование опухолевыми клетками васкулярных каналов, ограниченных базальной мембраной, в отсутствие эндотелиальных клеток и фибробластов получило название «васкулогенная мимикрия» (ВМ) [10]. Формируют васкулярные каналы опухолевые клетки с высокозлокачественным фенотипом, слабоагрессивные опухолевые клетки таких структур не формируют.

Целью настоящего исследования было получение экспериментального подтверждения существования взаимосвязи между аутофагией и ВМ. Мы предполагаем, что аутофагия выполняет двойную функцию в опухоли: способствует выживанию опухолевых клеток при химио- и радиотерапии, а также стимулирует процесс формирования васкулярных каналов, что может частично компенсировать недостаточно быстрое развитие в опухоли кровеносной микроцир-куляторной сети.

Материалы и методы

Материалы

BECN1 siRNA (small interfering RNA — малая интерферирующая РНК) (sc-29 797), ATG5 siRNA (sc-41 446), контрольная siRNA (sc-37 007), siRNA Dilu-

68 Оригинальные статьи

tion Buffer (sc-29527) и антитела к Beclin-1 иммунокомплекса, сорбированного на бусах протеин (sc-48341) и Atg5 (sc-133158) были получены от Santa А-сефарозы, промывали 5 раз буфером Б, содержа-Cruz Biotechnology (США). Липофектамин-2000 щим трис-буфер солевой, 20 мкмоль/мл ортованада-(#11668027) был приобретен у Thermo Fisher Seien- та и коктейль ингибиторов протеаз. Образцы лизи-tific (США). Хлорокин (C6628), 3-метиладенин ровали в буфере Laemmli кипячением в течение (3-methyladenine, 3-МА) (M9281) и монодансилкада- 4 мин на водяной бане. Белки разделяли электрофо-верин (monodansylcadaverine, MDC) (#D4008) были ретически при 120 В на полиакриламидном геле приобретены у Sigma-Aldrich Corporation (США). с 10 % додецилсульфатом натрия. Состав использо-Антитела к LC-3B были получены от Abcam ванных буферных растворов: концентрирующий (ab51 520) (Великобритания). Вторичные антитела, буфер — 0,5 моль Трис-HCl pH 6,8, 0,4 % додецил-конъюгированные с флуоресцеина изотиоцианатом сульфата натрия; разделяющий буфер — 120 ммоль (goat anti-rabbit IgG — козьи антикроличьи иммуно- Трис, 1,25 моль глицина и 0,5 % додецилсульфата глобулины класса G), были получены от AbD Serotec натрия; электродный (трис-глициновый) буфер — (Великобритания) (№ STAT121F). В работе также 120 ммоль Трис, 1,25 моль глицина и 0,5 % додецил-был использован ингибитор ВМ — ЛХС-1269 (ФГБУ сульфата натрия; буфер для нанесения образцов — «Российский онкологический научный центр 0,01 % бромфеноловый синий, 200 ммоль Трис-HCl им. Н.Н. Блохина» (РОНЦ им. Н.Н. Блохина) Мин- pH 6,8, 4 % додецилсульфата натрия, 40 % глицери-здрава России). на, 400 ммоль ß-меркаптоэтанола. Культура клеток Вестерн-блот В работе использованы клеточные линии мела- После окончания электрофореза гель, не окра-номы mel P, mel Il и mel Ме [11]. Клетки культивиро- шивая, переносили электрофоретически в течение вали в полной среде RPMI-1640, содержащей 10 % 1 ч при 80 В на мембрану (EMD Millipore, США). телячьей эмбриональной сыворотки, 2 ммоль/мл По окончании переноса мембрану промывали глутамина и 0,1 мг/мл гентамицина. В эксперимен- в трис-буфере солевом с 5 % альбумина сывороточ-тах использовали клетки 70—75 % конфлюентности. ного бычьего для блокирования неспецифического 3D -культура связывания белков. Гибридизацию проводили с пер- 100 мкл матригеля (8,7 мг/мл) быстро наносили вичными антителами к Вeclin-1 или Atg5 в течение на дно 24-луночного планшета на льду, планшет 2 ч при комнатной температуре при качании на шей-оставляли при комнатной температуре в течение 1 ч кере. Затем промывали 3 раза по 15 мин в трис-соле-и затем помещали в С02-инкубатор на 30 мин. Клет- вом буфере с Твин-20, далее инкубировали 2 ч ки добавляли в количестве 2 х 105 в полной среде при комнатной температуре то вторичными антите-RPMI-1640 на гелевую матрицу и продолжали инку- лами, конъюгированными с щелочной фосфатазой, бировать при +37 °C в СО2-инкубаторе. Формирова- и проявляли 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфа-ние сосудистоподобной структуры (СПС), которое том/нитросиним тетразолием. Состав использован-является in vitro тестом ВМ [12, 13], наблюдалось ных буферных растворов: трис-солевой буфер — через 14—16 ч роста клеток на матригеле. 390 ммоль глицина, 480 ммоль Трис-HCl pH 7,5, 1 % Электрофоретическое разделение белков додецилсульфата натрия, 20 % метанола; трис-соле- Электрофоретическое разделение белков прово- вой буфер с Твин-20—0,1 моль Трис-HCl pH 7,5, дили в полиакриламидном геле по методу Laemmli 0,2 моль хлорида натрия, 0,1 % Твин-20; альбумин в денатурирующих условиях. Клетки после трансфек- сывороточный бычий — 5 % альбумина сывороточ-ции BECN1 siRNA или ATG5 siRNA снимали с куль- ного бычьего в трис-солевом буфере. Для количе-туральных флаконов раствором Версена, промывали ственного анализа вестерн-блота была использована натрий-фосфатным буфером и гомогенизировали программа Gel Analysis Software (Syngene, Велико-в буфере А (200 ммоль/мл маннитола, 70 ммоль/мл британия). сахарозы, 5 ммоль/мл пиперазин^-№>-бис-2-этан- Трансфекция клеток меланомы siRNA in vitro сульфоновой кислоты (PIPES) с рН 7,5, 1 ммоль/мл В 24-луночный планшет засевали 50 тыс. клеток этилен-бис-оксиэтиленнитрилотетрауксусной кис- меланомы в полной среде RPMI-1640 без антибио-лоты (EGTA) и коктейль ингибиторов протеаз). тика. Клетки культивировали в СО2-инкубаторе при Экстракт белков центрифугировали при 1000 об/мин +37 °С в течение 18—24 ч. Предварительно готовили в течение 5 мин для удаления ядер. Супернатант смесь (на каждую лунку), состоящую из 80 пмоль (цитоплазматическая фракция) иммунопреципити- siRNA (1 мкг) и 1 мкл липофектамина-2000 ровали с использованием протеин А-сефарозы, в RPMI-1640 без антибиотика и сыворотки, и инку-конъюгированной с антителами к Вeclin-1 и АTG5, бировали при комнатной температуре 20 мин. Клет-в течение 2 ч при +4 °С. Далее центрифугировали при ки меланомы 60—70 % конфлюентности промывали 2500 об/мин в течение 5 мин для выделения средой без сыворотки и антибиотика и инкубирова-

РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ | RUSSiAN JOURNAL OF BiOTHERAPY 2'2017 том 16 | vol. 16

Оригинальные статьи 69

ли с siRNA и липофектамином-2000 в полной среде взаимосвязи между аутофагией и ВМ при меланоме. RPMI-1640 без антибиотика в СО2-инкубаторе В работе были использованы клеточные линии ме-при +37 °С в течение 6—8 ч. Далее среду для транс- тастатической меланомы кожи, выведенные из опу-фекции заменяли свежей полной средой RPMI-1640 холевого материала пациентов, находившихся на леи клетки меланомы инкубировали еще 24—36 ч. чении в НИИ клинической онкологии ФГБУ «РОНЦ Трансфецированные клетки использовали для иссле- им. Н.Н. Блохина» Минздрава России, — mel P дования их способности формировать СПС. и mel Il, формирующие СПС на матригеле, и mel Me, определение экспрессии LC-3B не способная участвовать в ВМ. Об уровне аутофагии Клетки меланомы (1 х 106 клеток) ресуспендиро- в клетках меланомы судили по изменениям, проис-вали в 3 мл охлажденного 70 % спирта и хранили ходящих в поздней стадии аутофагии, — экспрессии при +4 °С. Перед реакцией окрашивания клетки LC-ЗВ [16]. Известно, что в поздней стадии аутофа-осаждали центрифугированием (7 мин, 500 об/ мин). гии — слиянии фагофор с лизосомами — важную роль Осевшие клетки осторожно пипетировали в 1 мл играют белки семейства Atg [17]. Активация аутофа-натрий-фосфатного буфера, осаждали центрифуги- гии сопровождается протеолитическим расщеплени-рованием и ресуспендировали в 50 мкл натрий-фос- ем белка LC-3 (Atg8) в изоформу LC-3A. Его конью-фатного буфера, содержащего поликлональные ан- гация с фосфатидилэтаноламином приводит титела к LC-3B, и инкубировали 30 мин при +4 °С к образованию LC-3B формы, которая и встраивает-в темноте. Клетки отмывали 1 мл натрий-фосфатно- ся в мембрану аутофагосомы. В процессе формиро-го буфера от не связавшихся антител, ресуспендиро- вания аутофагосомы участвует только LC-3В изофор-вали в натрий-фосфатном буфере, содержащем вто- ма белка. Недавно был предложен новый метод ричные антитела, конъюгированные с флуоресцеина для мониторинга аутофагии — окрашивание аутофа-изотиоцианатом. Экспрессию LC-3В оценивали госом флуоресцентным красителем MDC [18]. Изби-на проточном цитофлуориметре BD FACSCanto II рательное аккумулирование MDC в аутофагосомах (Becton Dickinson, США). В каждой пробе анализи- посредством специфического взаимодействия с ли-ровали до 10 тыс. событий. пидами мембран аутофагосом свидетельствует о пе-окрашивание клеток MDC реходе аутофагии в позднюю, необратимую фазу. Клетки меланомы в течение ночи инкубировали На рис. 1 представлены результаты определения с ингибитором аутофагии — хлорокином или инги- базового уровня аутофагии в клетках меланомы mel битором ВМ — ЛХС-1269. Утром среду замещали P и mel Ме. Видно, что в клетках mel Р, формирую-на свежую и добавляли 0,05 ммоль MDC в RP- щих СПС, базовый уровень аутофагии, определен-MI-1640 без сыворотки, инкубировали 20—30 мин ный как экспрессией LC-3В (рис. 1а, б), так и флуо-при +37 °С в СО2-инкубаторе. Далее клетки 3 раза ресценцией MDC (рис. 1в, г), значительно выше, промывали ледяным натрий-фосфатным буфером чем в клетках mel Me. и немедленно определяли флуоресценцию на флуо- Более детальное исследование участия аутофагии ресцентном микроскопе IN Cell Analyzer (GE Health- в формировании СПС показало, что селективный care, США). ингибитор инициации аутофагии — 3-МA или ингибитор поздней стадии аутофагии — хлорокин блоки-Результаты и обсуждение руют формирование СПС клетками меланомы mel Опухоль для выживания и прогрессии может P. В предварительных исследованиях были определе-индуцировать частичную трансдифференцировку ны концентрации обоих ингибиторов, в присутствии опухолевых клеток в эндотелийподобный фенотип, которых более 95 % клеток меланомы оставались позволяющий формировать васкулярные каналы, живыми. Это условие является необходимым необходимые для доставки питания и, возможно, для формирования СПС на матригеле: клетки долж-метастазирования [10]. Исследования последних лет ны быть живыми, чтобы мигрировать, узнавать друг указывают на то, что кратковременное блокирование друга, вытягиваться и формировать СПС. Клетки аутофагии существенно снижает продолжительность mel P в присутствии ингибиторов аутофагии не теря-жизни опухолевых клеток [14]. Недавно группой ли способность мигрировать, но рисунок структур, китайских ученых было показано, что уровень экс- сформированных на матригеле, заметно отличался прессии Beclin-1 в клетках карциномы желудка от геометрии классических СПС (рис. 2а—в). Пред-SGC7901, растущих в 3D-культуре, на матригеле, ставленные результаты были воспроизведены на дру-значительно выше, чем в тех же клетках, растущих гой клеточной линии меланомы, участвующей в 2D-культуре, на пластике [15]. Этими же авторами в ВМ, — mel Il (данные не приводятся) и подтвердили впервые высказано предположение об участии ауто- выявленную закономерность: ингибиторы аутофагии фагии в ВМ при раке клеток эпителиальной ткани блокируют формирование СПС. Для верификации желудка. Целью нашей работы было выявление этого феномена нами был осуществлен нокдаун ге-

2'2017 том 16 | vol. 16 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ | RUSSIAN JOURNAL OF BiOTHERAPY

250 200

§ 150

о

100 50 0

II Ш[ \ |Т

0 102

"ffHif Т I I ИП||—.........

103 1 04 1 05 FITC-A

150

100

о и

50

-142

0 102

I 1 I F I Ill| I 1 I I   ВВ| I

103 1 04 1 05 FITC-A

6000 р < 0,05

I

4000

Œ

О ^

с;

§ 2000

I

ш

Mel P

Mel Me

0

0

Рис. 1. Базовый уровень аутофагии в клетках меланомы mel P и mel Me. Уровень экспрессии LC-3B определяли проточной цитофлуориме-трией с использованием антител к LC-3B

Рис. 2. Влияние ингибиторов аутофагии на формирование сосудистоподобных структур на матригеле клетками меланомы mel P: а — контроль; б — ингибитор инициации аутофагии 3-МА, 1 ммоль; в — ингибитор поздней стадии аутофагии хлорокин, 20мкмоль, блокирует формирование сосудистоподобных структур. х 20

нов, участвующих в инициации (BECN1) или терминальной стадии аутофагии (ATG5), с помощью siRNA. Белок Atg5 является ключевым компонентом аутофа-госом [17]. Известно, что комплекс Atg5 + Atg12, присоединяя Atg16, приобретает свойство лигазы, которая пришивает Atg8 (LC-3B) к фосфатидилэта-ноламину мембраны аутофагосом. Клетки меланомы mel P трансфецировали BECN1 siRNA с липофекта-мином-2000. Клетки меланомы, трансфецированные контрольной siRNA (sc-37 007) (рис. 3а), на матриге-

ле практически не отличались от контрольных клеток те1 Р (рис. 3в). SiRNA-опосредованное подавление экспрессии BECN1 (в наших экспериментах — на 72 ± 3 %) практически не отражалось на способности клеток те1 Р участвовать в ВМ (рис. 3б, в), наблюдалось лишь вытягивание единичных клеток, которое не приводило к формированию СПС. SiRNA-опосре-дованное подавление экспрессии гена ATG5 приводило к снижению уровня Atg5 на 70 ± 3 % и полностью нивелировало способность клеток меланомы

рис. 3. Эффект нокдауна гена BECN1 и гена ATG5 на формирование сосудистоподобных структур клетками меланомы те1 Р: а — клетки были трансфецированы контрольной малой интерферирующей РНК (siRNA); б — вестерн-блот демонстрирует снижение уровня ВесНп-1 и ATG5 после трансфекции BECN1 siRNA или ATG5 siRNA. Количественные характеристики представлены графически справа: нокдаун гена BECN1 (в) или нокдаун ATG5 (г) блокирует формирование сосудистоподобных структур. х 20

формировать СПС (рис. 3б, г). Клетки меланомы, трансфецированные ЛТ05 siRNA, на матригеле принимали шаровидную форму, но сохраняли способность мигрировать и узнавать друг друга, формирование СПС не наблюдалось. Изменение формы клетки из веретеноподобной в шаровидную в ответ как на фармакологический ингибитор поздней стадии аутофагии — хлорокин, так и на нокдаун гена ЛTG5, указывает на существование связи (возможно, опосредованной) между слиянием фагосомы с лизо-сомой и реорганизацией актина клетки.

Чрезвычайно интересным нам представлялось проследить изменения уровня аутофагии в условиях блокирования ВМ. Ранее нами был идентифицирован высокоэффективный ингибитор ВМ ЛХС-1269 [19]. Клетки те1 Р росли на пластике в течение 16—18 ч в присутствии 10-7 моль ЛХС-1269 или 20 мкмоль хлорокина (не цитотоксические концентрации). Об уровне аутофагии судили по экспрессии LC-3B (рис. 4а—в). Можно видеть, что экспрессия LC-3B в клетках меланомы, которые росли в присутствии

ингибитора ВМ ЛХС-1269, снижена по сравнению с контролем (на 44 ± 2 %). Аналогичная корреляция наблюдалась, когда уровень аутофагии определяли по окрашиванию клеток флуоресцентным красителем МDС (рис. 4г—е). Хлорокин снижал базовый уровень аутофагии на 56 ± 4 %. Заметное снижение аутофагии в ответ на блокаду ВМ (сравнимую с хло-рокином) предполагает, что конститутивно активная аутофагия может являться одним из доминирующих свойств опухолевой клетки, способной участвовать в ВМ. Таким образом, экспериментально подтверждено, что высокий базовый уровень аутофагии является обязательным и необходимым условием организации клеток меланомы в СПС. У нас нет ответа на вопрос, как аутофагия может активироваться при переходе клетки в агрессивную фазу роста и какой вклад она вносит в ВМ. Ответ, по-видимому, нужно искать в существовании неидентифицирован-ных еще эндогенных/экзогенных активаторов аутофагии или несогласованности событий в ядре и цитоплазме клетки.

рис. 4. Влияние специфического ингибитора васкулогенной мимикрии — ЛХС-1269 (10-7моль) и хлорокина (20 мкмоль) на уровень аутофагии в клетках меланомы те1 Р: а, б — базальный уровень аутофагии определяли проточной флуориметрией; в, г — базальный уровень аутофагии определяли окрашиванием клеток флуоресцентным красителем монодансилкадаверином

Сегодня не известно ни одного физиологического процесса, аналогичного ВМ, у взрослых или детей. Единственным примером ВМ, встречающимся у человека, является формирование цитотрофобластами васкулярных каналов в плаценте в ходе эмбриогенеза. Полученные нами данные о блокировании аутофагии ЛХС-1269 открывают новые возможности ингибирования роста опухоли с минимальным влиянием на нормальные физиологические процессы.

Заключение

По-видимому, на ранних стадиях трансформации клетки активация аутофагии способствует развитию защитного механизма, проявляя противоопухолевый эффект. На поздних стадиях заболевания при гипоксии или лучевой терапии, или действии противоопухолевых препаратов аутофагия используется опухолевой клеткой как механизм выживания и может стать причиной лекарственной устойчивости и быстрой прогрессии опухоли.

В настоящей работе мы показали, что аутофагия участвует в формировании СПС на матригеле, которое является in vitro тестом ВМ. Эксперименты с использованием фармакологических ингибиторов аутофагии и siRNA-опосредованным снижением экспрессии генов, участвующих в инициации аутофагии или в терминальной ее стадии, подтвердили участие аутофагии в ВМ. Другим подтверждением участия аутофагии в ВМ явилось снижение базового уровня аутофагии в клетках меланомы блокатором ВМ — ЛХС-1269. Полученные нами результаты указывают на то, что ау-тофагия в опухолевых клетках не только поддерживает жизнеспособность клеток в условиях метаболического стресса, действия химио- и радиотерапии,

но и способна стимулировать процесс формирования альтернативной системы кровоснабжения опухоли — ВМ, которая может частично компенсировать недостаточно быстрое развитие в опухоли кровеносной микроциркуляторной сети. Становится очевидным, что аутофагия — это тот чувствительный индикатор, который сигнализирует о высокозлокачественном фенотипе опухолевой клетки. Все это подводит нас к идее, что для повышения эффективности лечения злокачественных новообразований необходимо инги-бировать аутофагию в опухолевых клетках. И поиск блокаторов аутофагии представляется как многообещающий подход к лечению рака.

В настоящее время проходят I и II фазы клинических испытаний около 20 низкомолекулярных ингибиторов аутофагии [20]. Предварительные результаты указывают на положительную динамику в лечении опухолей. Но нельзя игнорировать тот факт, что аутофагия — регулярное избавление от отработанного материала и получивших повреждение органелл клетки — имеет особенно большое значение для клеток нервной системы (нейронов). Когда система аутофагии работает в этих клетках слишком медленно или не безошибочно, это приводит к развитию таких нейродегенеративных расстройств, как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, хорея Гентингтона [21]. Для всех этих патологий характерны медленные, но неотвратимые изменения в функционировании головного мозга.

В ближайшие 5—10 лет, скорее всего, мы придем к более детальному пониманию процесса аутофагии в онкологии, что откроет нам либо новые эффективные методы терапии, либо позволит улучшить качество жизни онкологических больных.

Авторы благодарят А. Белявского и Е. Егорова за ценные советы в обсуждении работы. Авторы также выражают искреннюю благодарность Д. Хоченкову за помощь в интерпретации результатов по флуоресцентному изображению.

ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES

1. Mizushima N., Komatsu M. Autophagy: renovation of cells and tissues. Cell 2011;147(4):728-41.

DOI: 10.1016/j.cell.2011.10.026. PMID: 22078875.

2. Singh R., Cuervo A.M. Autophagy in the cellular energetic balance. Cell Metab 2011;13(5):495-504. DOI: 10.1016/j.cmet.

PMID: 21531332.

3. Bursch W. The autophagosomal-lysosomal compartment in programmed cell death. Cell Death Differ

2001;8(6):569-81.

DOI: 10.1038/sj.cdd.4400852.

PMID: 11536007.

4. Rabinowitz J.D., White E. Autophagy and metabolism. Science 2010;330(6009):1344-8.

DOI: 10.1126/science.1193497. PMID: 21127245.

5. Guo J.Y., Xia B., White E. Autophagy-mediated tumor promotion. Cell 2013;155(6):1216-9.

DOI: 10.1016/j.cell.2013.11.019. PMID: 24315093.

6. Degenhardt K., Mathew R., Beaudoin B. et al. Autophagy promotes tumor cell survival and restricts necrosis, inflammation, and tumorigenesis. Cancer Cell 2006;10(1):51-64.

DOI: 10.1016/j.ccr.2006.06.001. PMID: 16843265.

7. Sun K., Deng W, Zhang S. et al. Paradoxical roles of autophagy in different stages of tumorigenesis: protector for normal or cancer cells. Cell Biosci 2013;3(1):35-42. DOI: 10.1186/2045-3701-3-35. PMID: 24016776.

8. Gerger A., LaBonte M., Lenz H.L. Molecular predictors of response

to antiangiogenesis therapies. Cancer J 2011;17(2):134—41.

DOI: 10.1097/pp0.0b013e318212db3c. PMID: 21427557.

9. Cantelmo A.R., Pircher A., Kalucka J. et. al. Vessel pruning or healing: endothelial metabolism as a novel target? Expert Opin Ther Targets 2017;21(3):239-47.

DOI: 10.1080/14728222.2017.1282465. PMID: 28081641.

10. Folberg R., Maniotis A.J. Vasculogenic mimicry. APMIS 2004;112(7-8):508-25. DOI: 10.1111/j.1600-0463.2004. apm11207-0810.x.

PMID: 15563313.

11. Михайлова И.Н., Лукашина М.И., Барышников А.Ю. и др. Клеточные линии меланомы — основа для создания противоопухолевых вакцин. Вестник РАМН 2005;7:37-40.

12. Kimlin L.C., Casagrande G., Virador V.M. In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: an

update. Mol Carcinog 2013;52(3):167-82. DOI: 10.1002/mc.21844. PMID: 22162252.

13. Yamada K.M., Cukierman E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell 2007;130(4):601-10.

DOI: 10.1016/j.cell.2007.08.006. PMID: 17719539.

14. Amaravadi R.K., Lippincott-Schwartz J., Yin X.M. et al. Principles and current strategies for targeting autophagy

for cancer treatment. Clin Cancer Res 2011;17(4):654-66. DOI: 10.1158/1078-0432. PMID: 21325294.

15. Ding Y., Zhao K., Wu Y., Xing C. Expression and significance of Beclin-1 in vasculogenic mimicry formation

of gastric cancer. Oncol Rep 2014;17(7):716-9. PMID: 25070456.

16. Hönscheid P., Datta K., Muders M.H. Autophagy: detection, regulation and its role in cancer and therapy response. Int J Radiat Biol 2014;90(8):628-35. DOI: 10.3109/09553002.

PMID: 24678799.

17. Pyo J.O., Nah J., Jung Y.K. Molecules and their functions in autophagy. Exp Mol Med 2012;44(2):73-80.

DOI: 10.3858/emm.2012.44.2.029. PMID: 22257882.

18. Barth S., Danielle Glick D., Kay F., Macleod K.F. Autophagy: assays and artifacts. J Pathol 2010;221(2):117-24. DOI: 10.1002/path.2694.

PMCID: PMC2989884.

19. Вартанян А.А., Барышникова М.А., Эктова Л.В. и др. Производные ин-долкарбазолов, блoкирующие васку-логенную мимикрию в опухоли. Патент РФ № 2557554. Бюлл. № 21, 2015.

20. Ozpolat В., Benbrook D.M. Targeting autophagy in cancer management -strategies and developments. Cancer Manag Res 2015;7:291-9.

DOI: 10.2147/CMAR.S34859. PMID: 26392787.

21. Menzies F.M., Fleming A., Rubinsztein D.C. Compromised autophagy and neurodegenerative diseases. Nat Rev Neurosci 2015;16(6):345-57.

DOI: 10.1038/nrn3961. PMID: 25991442.