Аффинные сорбенты на основе хитозана для выделения протеолитических ферментов

УДК 577.156.07

АФФИННЫЕ СОРБЕНТЫ НА ОСНОВЕ ХИТОЗАНА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ

Л. А. Иголкина1, Ю. А. Руденская2, Г. Н. Руденская3*

Исследована возможность применения хитозана в качестве гидрофильного носителя для выделения и очистки протеиназ. Пять полимерных образцов было получено из панцирей морских ракообразных. В качестве лигандов были использованы антибиотики-полипептиды грамицидин С и бацитрацин. В качестве конденсирующих агентов применяли глутаровый альдегид и и-бензохинон. Аффинная хроматография экстракта из ткани минтая на бацитрацин-хитозане показала, что при элюции 1 M NaCl - 25%-й изопропанол в концентрационном градиенте 1 M NaCl обнаруживаются две изоформы катепсина Д. Выход по активности этих ферментов 23 и 45,5%, а степень очистки 6 и 9 раз соответственно. С помощью грамицидин-хитозана удалось выделить трипсин из гепатопанкреаса камчатского краба с выходом 100% и степенью очистки в 8 раз по сравнению с исходным материалом.

Мировой прогресс индустрии хитозана стимулируется необходимостью утилизации отходов промысла крабов для предотвращения загрязнения окружающей среды. Одной из проблем, связанных с применением биоспецифической хроматографии для выделения протеиназ из отходов рыбопереработки является выбор недорогого и доступного для эксплуатации сорбента. Мы осуществили синтез новых аффинных сорбентов на основе хитозана. Потенциальные источники хитина и хитозана многообраз-

ны и широко распространены в природе. Наиболее доступны панцири ракообразных. Выбор нами хитозана для использования в качестве носителя в случае аффинных сорбентов обусловлен рядом причин. Во-первых, хито-зан имеет региональное происхождение, что исключает расходы на его транспортировку. Во-вторых, он является продуктом переработки вторичных отходов рыбоперерабатывающих производств. Использование этих отходов ведет к улучшению экологической обстановки морских

*Адресат для переписки.

побережий в районах переработки панцирьсодержащих гидробионтов. Наконец, хитозан имеет на поверхности по-лисахаридной матрицы реакционноспособные аминогруппы и может быть использован в синтезе без предварительной активации.

В настоящей статье приведены результаты исследований возможностей применения хитозана в качестве нерастворимого носителя в синтезе аффинных сорбентов для выделения и очистки протеиназ.

Материалы и методы

Синтез сорбентов. Для синтеза использовали хитозан промышленных видов дальневосточных крабов, бацитра-цин («Serva», США), грамицидин С («Красноярскмедпре-параты», Россия), 50%-й глутаровый альдегид («Serva», США).

Метод А. К одному грамму хитозана прибавляли 25 мл 25%-го глутарового альдегида (10103 мкМ) в 0,1 М фосфатном буфере (рН б,9). После перемешивания в течение 4 ч при комнатной температуре помещали в термостат (37°). Готовый сорбент отфильтровывали, промывали буфером и водой. Содержание бацитрацина в образце составляло 8,5 мкМ/г, выход - 94%. Для определения включения антибиотика в сорбент навеску в 20 мг гидролизовали 5,7 М HCl в течение 48 ч при 105° и измеряли количественное содержание аминокислот Asp, Glu, Val, Lys на аминокислотном анализаторе («Hitachi»). Выход реакции рассчитывали по отношению количества антибиотика (мкМ), вводимого в реакцию, принимая за 1 00% исходное содержание антибиотика в реакционной смеси на 1 г хитозана (хитина) [1].

Метод В. Навеску хитозана (1 г) помещали в кругло-донную колбу с фосфатным буфером (рН 8,5) для набухания в течение 30 мин. Количество буфера было минимальным. Затем 0,15 г грамицидина С в спиртовом растворе помещали в стакан и добавляли к нему 0,383 г п-бензохинона при непрерывном перемешивании в течение 20 мин. Раствор приобрел темно-вишневую окраску. Этот раствор прилили к набухшему в колбе гелю. Колбу присоединили к роторному испарителю без вакуума для мягкого перемешивания в течение 20 мин. Полученный аффинный сорбент промывали фосфатным буфером и водой и использовали во влажном состоянии для набивки хроматографической колонки. Включение антибиотика в сорбент определяли по аналогии с методом А.

Протеолитическая активность. Активность аспартат-ных протеиназ определяли по гемоглобину [2]. За единицу активности принимали количество фермента, при котором оптическая плотность (280 нм) фильтрата после осаждения гемоглобина трихлоруксусной кислотой увеличивалась на единицу за 1 мин. Протеолитическую активность по Bz-Arg-pNA определяли по методу [3]. За единицу активности принимали количество фермента, которое в условиях определения отщепляет от субстрата 1 мкМ п-нитроанилина.

Для аффинной хроматографии использовали свиной пепсин Московского мясокомбината, препарат Морикраза из гепатопанкреаса камчатского краба фирмы «Трини-та», Россия [4].

Выделение трипсина камчатского краба. На колонку (1x5 см) с грамицидин-хитозаном, предварительно промытую 0,1 М раствором ацетата аммония рН 6,4 с 5 мМ CaQ2, наносили раствор 16 мг Морикразы в 8 мл того же буфера и промывали вышеуказанным буфером. Элюцию активного белка проводили 1 М №0 с 20% изопропило-вого спирта на 0,05 М трисовом буфере (рН 8,0).

Приготовление промывных вод фарша минтая. Для этого использовали тушки минтая, хранившиеся при -25°. Рыбу размораживали на воздухе при температуре 18-20° до температуры 0-2°, промывали в пресной воде и белую мышечную ткань измельчали на мясорубке с й = 2,5 мм (ОСТ 15-19-76). Полученный фарш промывали на двойном капроновом фильтре охлажденной питьевой водой с рН 6,8-7,0 при перемешивании в течение 10 мин. Промывку повторяли дважды. Все операции проводили при температуре 0-4°. Катепсины мышечной ткани экстрагировали 0,05%-м КО [5].

Аффинную хроматографию катепсина Д проводили на биоспецифическом сорбенте бацитрацин-хитозане. Неочищенный экстракт мышечной ткани минтая диализо-вали против 0,1 М ацетатного буфера с 0,2 М КС1, рН 6,5 и наносили на хроматографическую колонку (1x8 см), уравновешенную тем же буфером. Элюцию проводили 0,1 М ацетатным буфером с добавлением 25% изоп-ропанола и 75% 1 М раствора КС1.

Обсуждение результатов

Известны способы получения аффинных сорбентов, содержащих в качестве лигандов антибиотики-полипептиды грамицидин и бацитрацин [6, 7].

Эти антибиотики-полипептиды содержат аминокислотные остатки, отвечающие специфичности многих протеи-наз. Характерные изгибы циклопептидов облегчают комплементарное взаимодействие с зоной связывания субстратов, а наличие D-аминокислот обеспечивает устойчивость циклопептидов к протеолизу и, значит, стабильность сорбентов [8]. Основным недостатком вышеуказанных методов является необходимость активировать инертную матрицу бромцианом в случае сефарозы или у-аминопро-пилтриэтоксисиланом в случае силохромов. Хитозан представляет собой природный биополимер, содержащий реакционноспособные аминогруппы, не требующие активации. Исходное количество аминогрупп на хитине мож-

2,00

1,50

1,00

0,50

0,00

Чч

0 2 4 б 8 10 12 14 1б 18 20 Номер фракции

Выделение трипсина гепатопанкреаса камчатского краба на грамицидин-хитозане

Т а б л и ц а 1

Сравнение способов синтеза аффинных сорбентов для очистки протеиназ

Носитель Количество аминогрупп на 1 г сорбента, мкМ Аминопропил этоксисилан, мкМ Лиганд Количество лиганда, мкМ Конденсирующий реагент, мкМ Включение лиганда, мкМ на 1 г сорбента Выход, %

Хитозан 30 0 Бацитрацин 9 глутаровый альдегид 103 8,5 94

Хитозан 30 0 Грамицидин С 120 103 26 21.6

Хитин 30 0 Бацитрацин 14 103 13 93

Силохром 0 50 Бацитрацин 50 и-бензохинон 50 2 4

Силохром 0 340 Бацитрацин 340 340 46 15

Силохром 0 120 Грамицидин С 120 120 6 5

Т а б л и ц а 2

Результаты аффинной хроматографии катепсина Д мышечной ткани минтая на бацитрацин-хитозане

Стадии хроматографии Белок общий, о.е. Активность общая, ед. акт. Активность удельная, ед./ед.А280 Степень очистки Выход, %

Экстракт 35,9 1900 50 - 100

Фракция 1 12,3 430 30 - 22,5

Промывка

Фракция 2 8,95 875 430 8,6 45,5

Элюат

Фракция 3 1,1 440 310 6,2 23

но заранее определить и подобрать соответствующее ко -личество антибиотика. Использование предлагаемого способа позволяет сократить расход антибиотика в 4-23 раза (табл. 1).

Для определения сорбционных свойств полученных аффинных сорбентов проводили хроматографию коммерческого препарата пепсина в режиме полного насыщения.

Сорбент (1 г) Включение лиганда, мкМ/г Пепсин, мг/г

Бацитрацин-хитозан 8,5 2,6

Грамицидин С-хитозан 5,0 6,2

Бацитрацин-силохром 6,0 3,8

Приведенные результаты показывают, что сорбенты на основе хитозана обладают сорбционными свойствами, сравнимыми с таковыми для сорбентов на основе сило-хрома. Это означает возможность их применения для очистки аспартатных протеиназ. В табл. 2 приведен пример выделения катепсина Д из экстракта мышечной ткани минтая. Применение синтезированных сорбентов для получения мышечных катепсинов является практически важным. В настоящее время на Дальнем Востоке ведется лов и переработка минтая для изготовления фарша по

японской технологии Сурими непосредственно на плавбазах. Промывные воды, содержащие значительное количество белка, и в частности протеолитических ферментов, загрязняют океан. В модельном эксперименте мы продемонстрировали возможность выделения катепсинов Д минтая из промывных вод.

Анализ результатов аффинной хроматографии на ба-цитрацин-хитозане (табл. 2) показывает, что 35% общего белка, нанесенного на колонку, не связялось с сорбентом (фракция 1), 30,6% белка вышло в результате промывки сорбента 0,1 М ацетатным буфером (фракция 2), 23% вещества элюировалось 1 М NaCl с добавлением 25% изоп-ропанола (фракция 3). Активный белок присутствовал во всех фракциях. При этом наблюдалось повышение общей активности фермента во второй фракции по сравнению с исходной в 8,6 раза. Этот эффект можно объяснить присутствием в исходном препарате ингибирующей примеси, отделяющейся в процессе промывки. Степень очистки фермента фракции 3 составила 6,2%. Полученные результаты подтверждают возможность применения грамици-дин-хитозана для получения катепсина Д мышечной ткани минтая, который в дальнейшем можно использовать при посоле морских рыб. Другим примером использования сорбентов на основе хитозана является выделение трипсина гепатопанкреаса камчатского краба. На рисунке приведена аффинная хроматография коммерческого препарата

протеиназ Морикраза на колонке с грамицидин-хитоза- Таким образом, новые аффинные сорбенты на основе ном. В приведенных условиях удельная активность трип- хитозана могут быть использованы в безотходных техно-сина камчатского краба повышается в 8 раз. логиях переработки морепродуктов.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:

1. Иголкина Л.А., Руденская Г.Н. Патент РФ № 2065877. 20.07.

1996.

2. Anson M.L. // J. Gen.Physiol. 1938. 22. P. 79

3. Erlanger B.F., Kokovsky N., Cohen W. // Arch. Biochem. Biophys.

1961. 95. P. 271.

4. Исаев В.А , Руденская Г.Н., Купенко О.Г., Степанов В.М., По-

пова И.М., Диденко Ю.Г. Патент РФ. № 2008353. 27.08.1994.

5. Иголкина Л.А. Патент РФ № 2065876. 20.07. 1996.

6. Степанов В.М., Руденская Г.Н. Авт. св. № 644796. 30.01.1979.

7. Степанов В.М., Руденская Г.Н., Акпаров ВХ., Гайда А.В. Авт.

св. № 942427. 09.03.1982.

8. Руденская Г.Н. // Биоорганическая химия. 1994. 20. С. 213.

Поступила в редакцию 20.06.00