СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ПАЦИЕНТОВ С ПОВЫШЕННЫМ РИСКОМ РАЗВИТИЯ РАКА ПРОСТАТЫ
METHOD FOR DETECTING PATIENTS WITH HIGH RISK OF DEVELOPING PROSTATE CANCER

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к области медицинской биохимии и может быть использовано для выявления пациентов с повышенным риском развития рака простаты.
Уровень техники
Рак предстательной железы (РПЖ) - вторая по частоте причина смертности от злокачественных новообразований у мужчин в мире - каждый год РПЖ выявляется более чем у одного миллиона мужчин, примерно треть из которых ожидает летальный исход в результате этого заболевания [Ferlay J, Soerjomataram I, Ervik M, et al. GLOBOSCAN 2013 v.1.0. Cancer Incidence and mortality worldwide. IARCCancerBase no. 11.]. Определение повышенного уровня простат-специфического антигена (ПСА) в сыворотке крови является наиболее употребимым маркером для выявления больных с РПЖ. Однако анализ на ПСА (включая его модификации - свободный ПСА, отношение свободного ПСА к общему ПСА) имеет низкую специфичность (значительный процент ложно-положительных результатов), так как увеличение этого параметря в крови может происходить при гиперплазии простаты и при остром простатите [Chatterjee SK and Zetter BR (2005) Cancer biomarkers: knowing the present and predicting the future. Future Oncology 1: 37-50; Ahmed HU (2014) Melbourne consensus - noble but misguided. Nature Reviews (Urology) 11: 250-251) и даже при манипуляциях с простатой (массаж простаты); Park SC, Shin YS, Zhang LT et al. (2015) Prospective investigation of change in the prostate-specific antigens after various urological procedures. Clin Intervent Aging 10: 1213-1218.].
В результате низкой специфичности теста на уровень ПСА в сыворотке крови только у одной трети больных, направленных на биопсию простаты с уровнем ПСА от 2 до 10 нг/мл (так называемая «серая» зона) гистологически подтверждается наличие РПЖ [Catalona WJ, Partin AW, Slawin KM, et al.(1998) Use of the percentage of free prostate-specific antigen to enhance differentiation of prostate cancer from benign prostatic disease: a prospective multicenter clinical trial. JAMA 279: 1542-1547.].
Диагностика РПЖ с помощью маркеров типа про-ПСА или ПСА3 основана на других идентификационных принципах и имеет большую диагностическую точность, чем ПСА, однако в силу большей стоимости (и низкой распространенности) данные методики применяются только в ограниченном числе лабораторий [Fillela X and Foj L (2015) Emerging biomarkers in the detection and prognosis of prostate cancer. Clin Chem Lab Med 53: 963-973.].
Гистохимическое исследование биопсий простаты является в настоящее время «золотым стандартом» подтверждения диагноза, показывая морфологические изменения ткани простаты. Диагностику при подозрении на рак предстательной железы проводят с помощью мультифокальной пункционной биопсии под контролем трансректального ультразвукового исследования (ТРУЗИ). Существенным недостатком этого метода является достаточно высокий процент ложноотрицательных заключений (до 20-30%). В частности, были выявлены пациенты, у которых при первоначальной биопсии не были выявлены морфологические признаки РПЖ (с первоначальными заключениями: ASAP или атипическая мелкоацинарная пролиферация, HPIN или простатическая интраэпителиальная неоплазия высокой степени), однако при повторных биопсиях подтверждалось наличие злокачественной опухоли.
Таким образом, крайне необходимым представляется выявление новых маркеров РПЖ с более высокими показателями чувствительности и специфичности. Технической проблемой является выявление пациентов с повышенным риском развития рака простаты на ранних этапах развития болезни, характеризующихся отсутствием клинических проявлений симптомов болезни.
Раскрытие изобретения
Техническим результатом заявляемого изобретения является разработка способа выявления пациентов, представляющих группу риска развития рака простаты, на ранних этапах развития болезни, который, сохраняя высокую степень чувствительности (сравнимую с уровнем чувствительности ПСА), обладает более высокой степенью специфичности. Данный способ позволяет диагностировать биохимические изменения в ткани простаты до появления изменений морфологических, что делает возможным постановку диагноза на более раннем этапе и повышает точность постановки диагноза.
Технический результат достигается при реализации способа выявления пациентов с повышенным риском развития рака простаты, включающего получение образца ткани (биоптата) простаты, приготовление гомогената из биоптата с последующим определением следующих параметров, характеризующих фенотип АПФ простаты:
- активность АПФ при взаимодействии с двумя искусственными субстратами АПФ - ZPHL и HHL с вычислением каталитической характеристики АПФ, характеризующейся отношением скоростей гидролиза этих двух субстратов ZPHL и HHL;
- коэффициент иммунореактивности АПФ, характеризующийся отношением количества АПФ, присоединившего антитело 9В9, к активности данного АПФ при взаимодействии с субстратом ZPHL;
и при увеличении значений каждого из полученных параметров в 1,5 раза и более, по сравнению с контрольными значениями, характерными для нормальной ткани простаты (т.е. увеличении отношения скоростей гидролиза двух субстратов на 50% и более (Фиг. 1В), и увеличении коэффициента иммунореактивности АПФ на 50% и более (Фиг. 2В)), пациента относят к группе с повышенным риском развития рака простаты.
Таким образом, технический результат достигается посредством реализации способа, позволяющего выявить пациентов с биохимическими характеристиками ангиотензинпревращающего фермента (АПФ), характерными для рака простаты, по результатам тестирования АПФ в гомогенатах биопсий ткани простаты. Способ основан на одновременном определении двух параметров: 1) активности АПФ при взаимодействии с двумя искусственными субстратами АПФ - ZPHL и HHL с вычислением каталитической характеристики АПФ, а именно, отношения скоростей гидролиза этих двух субстратов ZPHL и HHL; 2) коэффициента иммунореактивности АПФ, который определяется по отношению количества АПФ, присоединившего антитело 9В9, к активности данного АПФ при взаимодействии с субстратом ZPHL. Данные параметры могут свидетельствовать о высоком риске развития рака простаты. При этом точность определения высокого риска развития рака простаты повышается, если активность АПФ уменьшена более чем в 2 раза (Фиг. 1А) в сочетании с 50% и более увеличением каждого из параметров - отношения скоростей гидролиза двух субстратов (Фиг. 1В); 2) и коэффициента иммунореактивности АПФ (Фиг. 2В).
Известно, что железистые эпителиальные клетки простаты экспрессируют значительные количества ангиотензин-превращающего фермента (АПФ) поэтому, концентрация АПФ в семенной жидкости в 50 раз больше, чем в плазме крови [Krassnigg F, Niederhauser Н, Fink Е, Frick J, Schill WB (1989) Angiotensin converting enzyme inhuman seminal plasma is synthesized by the testis, epididymis and prostate. Int J Androl 12: 22-28; Nikolaeva MA, Balyasnikova IV, Alexinskaya MA, et al. (2006) Testicular isoform of angiotensin I-converting enzyme (ACE, CD143) on the surface of human spermatozoa: Testicular isoform of angiotensin I-converting enzyme (ACE, CD 143) on the surface of human spermatozoa: revelation and quantification using monoclonal antibodies. Am J Reprod Immunol 55: 54-68.]. Замена высоко-специализированных клеток эпителия простаты опухолевыми клетками приводит к значительному уменьшению активности АПФ в ткани простаты [Yokoyama М, Hiwada K, Kokubu Т, Takaha М, Takeuchi М (1980) Angiotensin-converting enzyme in human prostate. Clin Chim Acta 100: 253-258.]. Следовательно, фенотипирование АПФ в образцах ткани простаты, полученных с помощью биопсии, может иметь важное клиническое значение для выявления пациентов с повышенным риском развития РПЖ.
Проведенные нами ранее исследования связывания панели моноклональных антител (мАт) к различным конформационным эпитопам на поверхности АПФ человека с АПФ из разных тканей человека (конформационный фингерпринт АПФ), показали, что связывание ткане-специфично, главным образом, вследствие ткане-специфичного гликозилирования АПФ [Danilov SM, Balyasnikova IB, Danilova AS, et al. (2010) Conformational fingerprinting of the angiotensin-converting enzyme (ACE): Application in sarcoidosis. J Proteome Res 9: 5782-5793; Danilov SM, Tikhomirova VE, Metzger R, et al. (2018a) ACE phenotyping in Gaucher disease. Mol Genet Metab 123: 501-510.].
Более того, были получены результаты, показывающие существенные отличия конформационного фингерпринта АПФ простаты от АПФ легкого [Kryukova OV, Tikhomirova VE, Golukhova EZ, et al. (2015) Tissue Specificity of human angiotensin I-converting enzyme. PLoS One 10: e0143455], что открывает теоретическую возможность использования появления АПФ простаты в крови, как раннего маркера РПЖ. В связи с тем, что концентрация АПФ в семенной жидкости превышает концентрацию АПФ в плазме всего в 50 раз, по сравнению с превышением ПСА в семенной жидкости над плазмой в 1000000 раз [Lovgren J, Valtonen-Andre С, Marsal K, Lilja H, Lundwall A (1999) Measurement of prostate-specific antigen and human glandular kallikrein 2 in different body fluids. J Androl 20: 348-355], можно предположить, что частота ложно-позитивных тестов при детектировании АПФ простаты в крови будет значительно меньше, чем при определении ПСА в крови.
На первом этапе проведенных нами исследований (фенотипирования АПФ при ранней диагностике РПЖ), был осуществлен анализ АПФ в образцах ткани простаты, полученных с помощью биопсии у пациентов с гиперплазией простаты, у пациентов с раком простаты, а также в аутопсийном материале тканей простаты, как образец тканей из нормальной предстательной железы.
Результаты проведенных исследований показали, что: во-первых, каталитическая характеристика АПФ (отношение относительной скорости гидролиза одного искусственного субстрата АПФ (ZPHL) к таковой для другого искусственного субстрата (HHL) - ZPHL/HHL ratio была значительно увеличена у пациентов с РПЖ. Во-вторых, конформационный фингерпринт АПФ из ткани пациента с РПЖ существенно отличался от такового для пациентов с гиперплазией простаты или АПФ ткани простаты у условно здоровых индивидуумов.
При проведении исследований была выявлена группа пациентов, у которых при первоначальной биопсии не выявлялось морфологических признаков РПЖ, однако при повторных биопсиях подтверждалось наличие злокачественной опухоли. В первоначальных заключениях гистологических исследований присутствовали: ASAP или атипическая мелкоацинарная пролиферация (31-40% риск РПЖ при повторной биопсии), HPIN или простатическая интраэпителиальная неоплазия высокой степени, выявленная более чем в трех биоптатах (30% риск РПЖ при повторной биопсии). Данные заключения являются показаниями к повторной биопсии.
С учетом выявленных особенностей АПФ в ткани простаты при наличии РПЖ, было предложено проведение анализа ткани простаты на АПФ для снижения количества ложноотрицательных первичных системных и прицельных биопсий. Таким образом, даже при морфологическом заключении об отсутствии РПЖ у пациента, но при значимых признаках РПЖ по данным иммунохимического анализа ткани простаты на АПФ, назначение повторной прицельной биопсии из участка с патологическим фенотипом АПФ может улучшить первичную диагностику РПЖ на более ранних стадиях. Данная возможность является важной для улучшения клинического прогноза и выживаемости данной группы пациентов.
Таким образом, фенотипирование АПФ в образцах ткани простаты, полученных с помощью биопсии, обещает стать эффективным подходом для выявления пациентов с повышенным риском развития РПЖ.
Краткое описание чертежей
Изобретение поясняется чертежами, где представлены результаты проведенных исследований: на фиг. 1 представлена схема определения активности АПФ в гомогенатах тканей простаты, полученных в результате трансректальной биопсии простаты. А) Активность АПФ с субстратом ZPHL; Б) Активность АПФ с субстратом HHL: В) Отношение скоростей гидролиза субстрата ZPHL к таковому для субстрата HHL (ZPHL/HHL ratio); Г) Определение концентрации ПСА (Простат-Специфический Антиген) в плазме крови тестируемых пациентов.
Количественно данные представлены как % от значений для гомогенатов из тканей контрольных простат (от 2 до 6 контролей для каждого определения).
На фиг. 2. А) продемонстрирована активность АПФ в тканях простаты с субстратом ZPHL; Б) Преципитация АПФ антителом 9В9; В) Отношение иммунореактивного белка АПФ (с антителом 9В9) к активности АПФ в этом же гомогенате (то есть отношение Б\А); Г) Определение концентрации ПСА. Количественно данные представлены как % от значений для гомогенатов из контрольных простат. Окраска столбцов- как на Фиг. 1. Столбцы, значения которых меньше 50% от значений нормальной ткани простаты, обозначены черным цветом.
Осуществление изобретения
Заявляемый способ, основанный на исследовании фенотипа АПФ в гомогенатах ткани простаты, включает следующие этапы: а) получение образцов ткани простаты при помощи трансректальной биопсии под контролем ультразвукового исследования; б) приготовление гомогената из биоптата; в) определение следующих параметров характеризующих фенотип АПФ простаты данного больного: 1) определение активности АПФ при взаимодействии с двумя искусственными субстратами АПФ - ZPHL и HHL с вычислением каталитической характеристики АПФ (отношение скоростей гидролиза этих двух субстратов ZPHL и HHL) и 2) вычисление коэффициента иммунореактивности АПФ (отношение количества АПФ, присоединившего антитело 9В9, к активности данного АПФ при взаимодействии с субстратом ZPHL).
Из уровня техники известно уменьшение активности АПФ в ткани простаты у больных РПЖ. Однако проведенные исследования показали возможность использования маркера, характеризующего нативность каталитической характеристики АПФ с помощью искусственных субстратов ZPHL и HHL (ZPHL/HHL ratio), для ранней диагностики РПЖ.
Было обнаружено, что отношение количества иммунореактивного белка АПФ в гомогенате ткани простаты (определяемое с помощью моноклонального антитела 9В9) к активности АПФ резко уменьшается именно в гомогенатах биоптатов из раковой ткани простаты, но не из ткани простаты с признаками доброкачественной гиперплазии.
Проведенное фенотипирование АПФ на 35 образцах ткани простаты, полученных от 18 пациентов с гиперплазией простаты, от 6 пациентов с раком простаты и на 11 контрольных тканях простаты (аутопсийный материал от условно здоровых индивидуумов) показало, что:
а) Резкое падение активности АПФ (более чем в 3 раза) наблюдалось во всех 6 случаях рака простаты (Фиг. 1А и Б). При этом значительное (больше чем на 50%) увеличение отношения скоростей гидролиза двух субстратов (ZPHL/HHL ratio) -наблюдалось у 4-х из 6-ти пациентов (Фиг. 1 В). В то же время положительный результат исследования на ПСА крови был отмечен только у двух пациентов данной группы (из 6 пациентов с верифицированным гистологически раком простаты) (Фиг. 1Г).
б) Значительное (больше чем на 50%) увеличение отношения иммунореактивного белка АПФ (определенное с помощью мАт 9В9) к активности АПФ в этом же гомогенате (Фиг. 2В) наблюдалось во всех 6 случаях рака простаты (Фиг. 2В). При этом позитивный тест на ПСА крови был отмечен только у двух пациентов данной группы из 6 (Фиг. 2Г).
в) Следует отметить, что некоторые пациенты с гиперплазией простаты (верифицированной гистологически), имели такие же количественные характеристики фенотипа АПФ, как и у больных РПЖ (увеличение отношение скоростей гидролиза двух субстратов (ZPHL/HHL ratio) - Фиг. 1В, и отношения иммунореактивного белка АПФ к активности АПФ в этом же гомогенате (Фиг. 2В).
Проведенные исследования показали, что фенотипирование АПФ позволяет выявлять пациентов, у которых наряду с гиперплазией начинается перерождение ткани простаты (скорее всего, как клональный рост опухолевых клеток), которое еще не изменяет ткань простаты гистологически, но биохимические изменения АПФ (привнесенные опухолевыми клетками) уже начинают проявляться.
Таким образом, поставленная задача разработки простого в исполнении и сравнительно недорогого способа выявления пациентов с повышенным риском развития РПЖ была решена за счет использования новой технологии - фенотипирования АПФ на гомогенатах ткани простаты, полученной в результате трансректальной биопсии под контролем ультразвукового исследования.
Ниже представлено более подробное описание проведенных исследований и осуществления изобретения, демонстрирующее достижение технического результата.
1. Критерии отбора больных с патологией простаты для проведения анализа.
Обследовано 24 пациента, наблюдавшихся в отделении урологии МНОЦ МГУ им. Ломоносова в период с января 2017 года по октябрь 2018 года. Критериями включения были подозрение на наличие РПЖ, а также подписанное информированное согласие на участие в исследовании. Отбор проводился согласно рекомендациям Европейского Общества Урологов, по которым при подозрении на РПЖ показанием для биопсии простаты являются: повышенный уровень ПСА (больше 4 нг/мл) и/или подозрительные результаты пальцевого ректального исследования и/или подозрительные результаты трансректального ультразвукового исследования [Mottet N, Bellmunt J, Bolla M. et al. (2017) EAU-ESTRO-SIOG Guidelines on prostate cancer. Part 1: Screening, diagnosis, and local treatment with curative intent. European Urology 71 (2017) 618-629.].
Диагноз гиперплазии или рака простаты устанавливался гистологически - согласно общепринятым критериям.
По результатам гистологического исследования биоптатов были сформированы 2 группы пациентов: с выявленной доброкачественной гиперплазией простаты (N=18) и с раком простаты (N=6). Кроме того, отдельную группу составили контрольные образцы ткани простат (N=11), полученные путем аутопсии пациентов со смертельными исходами в результате аварий, без признаков морфологического изменения простаты.
2. Проведение биопсии простаты.
24 пациента были отобраны для проведения биопсии простаты под контролем трансректального ультразвукового исследования и ультразвуковой эластографии сдвиговой волной.
Всем пациентам выполнялось трансректальное ультразвуковое исследование (ТРУЗИ) предстательной железы и семенных пузырьков на аппарате Aixplorer (Supersonic Imagine, Франция) с помощью внутриполостного датчика, работающего в диапазоне частот 3-12 МГц. Проводилось ТРУЗИ предстательной железы с использованием серошкального режима, режима энергетического допплеровского картирования и режима эластографии сдвиговой волной, позволяющего оценивать жесткость периферической зоны простаты. Предстательная железа была разделена на 12 секторов для ультразвуковой оценки и последующей системной биопсии предстательной железы (каждый из секстантов основания, средней части и верхушки железы справа и слева подразделялся на латеральный и медиальный субрегионы - итого 12 секторов).
После проведения ТРУЗИ и ультразвуковой эластографии всем пациентам выполнялась трансректальная мультифокальная системная пункционная биопсия предстательной железы из 12 точек под контролем ультразвукового исследования с использованием биопсийного пистолета Bard Magnum и одноразовых игл диаметром 18G. В дополнение к системной биопсии проводили прицельную биопсию из очагов, подозрительных на злокачественность по данным ультразвука и эластографии сдвиговой волной. Ультразвуковыми критериями, на основании которых проводилась прицельная биопсия, считались: гипоэхогенные очаги периферической зоны (серошкальный режим); зоны локального усиления кровотока с возможной деформацией сосудистого рисунка (энергетическое допплеровское картирование); жесткие очаги при эластографии сдвиговой волной. Жесткими считали очаги, модуль Юнга которых был более 35 кПа [Barr R.G., Cosgrove D., Brock М., Cantisani V., Correas J.M., Postema A.W., Salomon G., Tsutsumi M., Xu H.X., Dietrich C.F. WFUMB Guidelines and Recommendations on the Clinical Use of Ultrasound Elastography: Part 5. Prostate // Ultrasound Med. Biol. 2017. V. 43. No. 1. P. 27-48. Doi: 10.1016/j.ultrasmedbio.2016.06.020.]. В протоколе биопсии на схеме простаты, разделенной на секторы по вышеописанной методике, отмечалась точная локализация подозрительного очага. Затем проводился забор трех дополнительных столбиков ткани из каждого подозрительного очага для последующих измерений ферментативной активности и иммунохимической характеристики ткани предстательной железы на этом участке.
Гистологическое исследование биоптатов проводилась по стандартной методике. Образцы фиксировались в 4%-м нейтральном забуференном формалине в течение 48 ч, с дальнейшим погружением в парафин. Затем проводились окрашивание гематоксилином и эозином и изучение срезов под микроскопом.
Дополнительные столбики ткани простаты, полученные для анализа иммунохимических характеристик АПФ, охлаждались до 4°С без погружения в формалин.
По результатам гистологического исследования, морфологические характеристики всех подозрительных очагов были проанализированы и сопоставлены с активностью и иммунохимическими характеристиками АПФ в ткани простаты, полученной из этих очагов.
3. Приготовление гомогенатов из образцов ткани простаты.
2
Все операции по приготовлению гомогенатов ткани простаты проводили при 4°С. Для этого 2-3 биоптата (весом примерно 3-5 мг каждый) или ткань контрольной простаты, полученной при вскрытии (не более 10 мг) гомогенизировали в 1 мл 0,05 М фосфатного буфера, рН 7,5 содержащего 0,15 М NaCl, 1 мкМ ZnCl, (буфер А) используя тканевой гомогенизатор Speed Mill (Analytik Jena, Jena, Germany) со стальыым шариком (3 = минутный цикл). Затем в гомогенат добавляли тритон Х-100 до 0,025%, перемешивали переворачиванием в течение 1 часа и центрифугировали на микрофуге в течение 5 мин при 13000 оборотах в минуту. Осадок отбрасывали, а супернатант использовали для дальнейшей работы. Концентрацию белка в гомогенатах с помощью реактива Брэдфорда.
4. Определение активности АПФ
2
Активность АПФ в супернатантах гомогенатов биопсий ткани простаты определяли по начальным скоростям гидролиза субстратов Z-Phe-His-Leu (ZPHL) и Hip-His-Leu (HHL), измеряя на многофункциональном микропланшетном ридере «Hitachi» (Japan) накопление продукта реакции His-Leu с помощью орто-фталевого альдегида. Для этого в ячейки 96-луночных планшетов помещали по 100 мкл 2,4 мМ ZPHL и 6 мМ HHL в 0,1 М фосфатном буфере рН 8,3, содержащем 0,3 М NaCl и 1 мкМ ZnCl, добавляли по 20 мкл супернатанта гомогената в Буфере А и инкубировали смесь в течение 60 минут при 37°С в термостате. Конечная концентрация субстратов в реакционной смеси - 5 мМ и 2 мМ, соответственно. Время реакции подбирали таким образом, чтобы степень превращения субстрата не превышала 5%. Реакцию останавливали добавлением 25 мкл 1.4 н. NaOH, затем вносили 25 мкл раствора орто-фталевого альдегида (3.3 мг/мл) в метаноле, инкубировали смесь 10 минут, затем добавляли 25 мкл 2.1 н. HCl. Флуоресценцию образованного аддукта измеряли при длине волны возбуждения 370 нм и эмиссии 500 нм. Фоновую флуоресценцию измеряли в тех же условиях, но фермент (супернатат гомогената простаты) вносили после добавления щелочи. Стандартную флуоресценцию измеряли так же, как и фоновую, но вместо субстрата использовали раствор His-Leu. Отношение скоростей гидролиза двух субстратов вычисляли разделив среднюю флюоресценцию в трех ячейках планшета с субстратом ZPHL на среднюю флюоресценцию в трех ячейках с субстратом HHL.
5. Определение иммунореактивного белка АПФ (с помощью антиетла 9В9)
Количество иммунорективного белка АПФ - то есть относительную эффективность связывания мАт с АПФ (в данном случае мАт 9В9), определяли методом иммуносорбции [Kryukova OV, Tikhomirova VE, Golukhova EZ, et al. (2015) Tissue Specificity of human angiotensin I-converting enzyme. PLoS One 10: e0143455.]. Для этого на плашку «Corning» с высокой сорбционной способностью наносили поликлональные антитела козы против иммуноглобулинов мыши (50 мкл, 10 мкг/мл) в 0,05 М фосфатном буфере с рН 7,5 и 0.15 М NaCl. Далее плашку оставляли в термостате при 37°С на 1 час. Затем раствор удаляли и промывали лунки буфером А, содержащим 0,05% Tween-20. В лунки добавляли по 50 мкл раствора моноклональных антител (мАт) 9В9 к АПФ человека с концентрацией 3 мкг/мл в буфере А, содержащем 100 мкг/мл БСА (в трипликатах). После инкубации в течение часа при 37°С лунки снова промывали буфером А, содержащим, 0,05% Tween-20, и добавляли по 50 мкл раствора АПФ (в супернатанте гомогената тканей простаты) и оставляли на ночь при 4°С. Отмывали плашку сначала 5 раз 0,05 М фосфатном буфере с рН 7,5 и 0.15 М NaCl, содержащим 0,05% Tween-20. Активность преципитированног АПФ простаты антителом 9В9 определяли по ферментативной активности АПФ связанного с поверхностью плашки. На плашку наносили по 100 мкл раствора субстрата ZPHL (2 мМ) в буфере А. Реакцию вели в течение одного часа при 37°С и останавливали добавлением 25 мкл 1.4 н. NaOH, затем вносили 25 мкл раствора орто-фталевого альдегида (3.3 мг/мл) в метаноле, инкубировали смесь 10 минут, затем добавляли 25 мкл 2.1 н. HCl. Флуоресценцию образованного аддукта измеряли при длине волны возбуждения 370 нм и длине волны эмиссии 500 нм. Фоновую флуоресценцию измеряли в тех же условиях, но в ячейках где вместо мАт 9В9 был добавлен 0,05 М фосфатном буфер с рН 7,5 и 0.15 М NaCl.
6. Статистическая обработка результатов
Статистическую обработку данных проводили с помощью пакетов «Microsoft Office Excel 2007» и «Statistica 10.0» с использованием двустороннего точного критерия Фишера и критерия %2 Пирсона (для качественных признаков), критерия Манни-Уитни и Краскела-Уолиса (для количественных признаков с распределением, отличающимся от нормального). Достоверными считались различия при р<0,05 и 95% доверительном интервале (ДИ) для ОШ, не включающем «1».
Прогностически значимым принимали 50-ти процентное (то есть полуторакратное) увеличение отношения скоростей гидролиза субстрата ZPHL к таковому для субстрата HHL (ZPHL/HHL ratio, так как данный параметр отличается среди индивидуумов со стандартным отклонением не более 5%). Для отношения иммунореактивного белка АПФ (по 9В9) к активности прогностически значимым мы принимали 50-ти процентное (то есть полуторакратное) увеличение этого параметра.
7. Оценка полученных результатов.
Каталитическая характеристика АПФ ткани простаты - специфичная для АПФ из раковой ткани простаты
Из 24 биоптатов ткани простаты резкое падение активности АПФ (более чем в 3 раза) наблюдалось во всех 6 случаях рака простаты (Фиг. 1А и Б). При этом значительное увеличение (больше 50%) отношения скоростей гидролиза двух субстратов (ZPHL/HHL ratio) наблюдалось у 4-х из 6-ти пациентов (Фиг. 1В). В то же время позитивный тест на ПСА крови был отмечен только у двух пациентов (из 6 пациентов) с верифицированным гистологически раком простаты (Фиг. 1Г). Из чего следует, что новая каталитичская характеристика АПФ ткани простаты - более чувствительный маркер РПЖ, чем тест на ПСА крови. Особенно интересно, что среди 18 пациентов с гиперплазией простаты (верифицированной гистологически) у двух пациентов (3-6 и 3-8 Фиг. 1) была резко уменьшена (меньше 50% от контроля - черные столбцы) активность АПФ в ткани простаты по обоим субстратам, но при этом ZPHL/HHL ratio было резко увеличено (больше 200% от контроля) только у пациента 3-8. Только резкое уменьшение активности АПФ в отдельном биоптате не является прогностическим признаком (так как биопсия может пройти не через ткань простаты, а через, например, соеднителькую ткань), а вот сочетание уменьшения активности и увеличения отношения ZPHL/HHL (Фиг. 1 В, пациент 3-8, выделено прямоугольником), сигнализирует о резком изменении микроокружения АПФ в ткани простаты. Например, повышенная экспрессия какого-то опухолевого белка, который, к тому же, обладает способностью связываться с АПФ и изменять его каталитические свойства.
Кроме пациента 3-8, увеличение отношения ZPHL/HHL было отмечено у пациентов 4-6 и 5-1 (Фиг. 1В). При этом у пациента 5-1 было также отмечено увеличение ПСА в крови (Фиг. 1 В и С- отмечено прямоугольником). Этот факт прибавляет уверенности в том, что пациенты с увеличением отношения ZPHL/HHL для АПФ из простаты представляют собой группу риска (для развития РПЖ) и должны быть под особым наблюдением врачей с вероятностью дополнительных анализов (например, иммуногистохимии на экспрессию специфических опухолевых маркеров).
Отношение иммунореактивного белка АПФ к активности в ткани простаты - специфичное для АПФ из раковой ткани простаты
Из 24 биоптатов ткани простаты значительное увеличение отношения иммунореактивного белка АПФ к активности АПФ наблюдалось во всех 6 случаях рака простаты (Фиг. 2 В). Тогда как позитивный тест на ПСА крови был отмечен только у двух пациентов (из 6 пациентов с верифицированным гистологически раком простаты (Фиг. 2Г). Из чего следует, что новая конформационная характеристика АПФ ткани простаты - более чувствительный маркер РПЖ, чем тест на ПСА крови. Особенно интересно, что среди 18 пациентов с гиперплазией простаты (верифицированной гистологически) у 3-х пациентов (3-3, 3-4 и 3-6 - Фиг. 2) было резко увеличено это отношение. При этом у пациента 3-4 (с увеличенным отношением иммуно-реактивного белка АПФ к активности) также был увеличен ПСА в крови.
Полученные данные свидетельствуют о том, что совместное определение двух новых параметров фенотипа АПФ в тканях простаты 1) отношение скоростей гидролиза двух субстратов (ZPHL/HHL ratio) и 2) отношения иммунореактивного белка АПФ к активности позволяет выявить пациентов (с гистологически верифицированной гиперплазией простаты) которые представляют группу риска развития рака простаты.
Пример 1.
Пациент Р. 76 лет, при амбулаторном обследовании в крови выявлен уровень ПСА общ. 5,6 нг/мл (норма 0-4 нг/мл), объем предстательной железы составлял 65 см3. При проведении ТРУЗИ в обеих долях предстательной железы определялись кальцинаты до 3 мм. По результатам проведенной трансректальной биопсии простаты с ИГХ исследованием у пациента была выявлена ДГПЖ. Заключение патоморфологического исследования: «Кусочки ткани простаты с железами различной величины и формы с сохраненной базальной мембраной, местами - с признаками пролиферации, железы извитой формы, с атрофией эпителия. Строма с участками склероза, кровоизлияниями и признаками хронического воспаления». Однако по данным измерения активности АПФ у пациента был заподозрен РПЖ, так как было выявлено уменьшение активности АПФ более чем в 2 раза по сравнению с нормой и на 50% увеличено отношения скоростей гидролиза двух субстратов, а также увеличен коэффициент иммунореактивности АПФ более чем на 50%. В дальнейшем, в связи с выраженными симптомами нижних половых путей (18 баллов по шкале IPSS), через 3 месяца после трансректальной биопсия простаты пациенту была выполнена трансуретральная биопсия предстательной железы. По данным патоморфологического исследования резецированной ткани простаты у пациента был подтвержден диагноз РПЖ. Пациенту проведено оперативное лечение.