ЛЕЧЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
TREATMENT OF BACTERIAL INFECTIOUS DISEASES

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к новому фармакологическому лечению бактериальных инфекционных заболеваний у человека. Конкретно, изобретение относится к применению апрамицина и производных апрамицина для лечения бактериальных инфекционных заболеваний у человека.
Предпосылки создания изобретения
Апрамицин представляет собой аминогликозидный антибиотик, который первоначально был обозначен как фактор II небрамицинового комплекса (US 3691279). Его применение в ветеринарии было описано в US 3876767. Кроме того, апрамицин и некоторые его ацилированные или алкилированные производные описаны в качестве антибиотиков широкого спектра действия в US 4360665. Однако апрамицин никогда не применяли для лечения человека, поскольку считалось, что это сопряжено с высоким риском токсичности (Kondo и др., Angew. Chem. Int. Ed., 45, 2006, сс.3310-3314). Апрамицин не разрешен даже для применения на крупном рогатом скоте или овцах, производящих молоко, предназначенное для потребления человеком.
Краткое изложение сущности изобретения
В настоящем изобретении предложен способ лечения бактериальных инфекционных заболеваний у человека, заключающийся в том, что вводят пациенту, нуждающемуся в этом, в терапевтически эффективном количестве апрамицин формулы (I) или производное апрамицина.
,
Кроме того, изобретение относится к апрамицину или производному апрамицина, предназначенному для применения при таком лечении, к применению апрамицина или производного апрамицина для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения бактериальных инфекционных заболеваний у человека, и к некоторым конкретным новым производным апрамицина.
Краткое описание чертежей
На чертежах показано:
На фиг.1: Результаты оценки кохлеатоксичности in vitro
А - контроль;
Б - апрамицин, 0,5 мМ: уничтожено небольшое количество (<5%) внутренних и наружных волосковых клеток;
В - гентамицин, 0,5 мМ: утрачены все (>80%) внутренние и наружные волосковые клетки;
Г - неомицин, 0,5 мМ: утрачены все (>80%) внутренние и наружные волосковые клетки.
На фиг.2: данные об утрате волосковых клеток в кохлеарных эксплантатах и результаты оценки ототоксичности in vivo
(а) Дозовая зависимость индуцируемой лекарственным средством утраты волосковых клеток в кохлеарных эксплантатах. Утрату волосковых клеток оценивали количественно по всей длине эксплантата и строили график зависимости от концентрации лекарственного средства. % представляет собой % уничтоженных волосковых клеток.
Кружки • и сплошная линия -: гентамицин; квадраты  и штриховая линия : апрамицин.
Данные представляют собой средние значения ± С.К.О., n=3-12 на экспериментальную точку.
(б) Влияние продолжительного лечения аминогликозидом in vivo на слуховой ответ ствола головного мозга. дБ = сдвиг порога восприятия при 12 кГц. «Сдвиг порога восприятия» представляет собой разницу порога слухового восприятия до лечения и через три недели после лечения.
Кружки • и сплошная линия -: гентамицин; квадраты  и штриховая линия : апрамицин.
10
Данные представляют собой средние значения ± С.К.О., n=3-11 на экспериментальную точку (за исключением варианта с использованием гентамицина в дозе 160 мг, когда в опыте выжило только 1 животное). Следует отметить, что сдвиг порога восприятия дан в лБ, что соответствует логарифмическому масштабу, а именно, сдвиг на каждые 10 дБ означает разницу, равную 1 log энергии.
Кохлеатоксичность in vitro апрамицина значительно меньше кохлеатоксичности гентамицина и слуховой ответ in vivo ухудшается после лечения апрамицином существенно в меньшей степени, чем после лечения гентамицином.
Подробное описание изобретения
В настоящем изобретении предложен способ лечения бактериальных инфекционных заболеваний у человека. Предлагаемое в изобретении лечение заключается в том, что вводят пациенту, нуждающемуся в этом, в терапевтически эффективном количестве апрамицин или производное апрамицина, или его кислотно-аддитивную соль, прежде всего, в терапевтически эффективном количестве апрамицин или его кислотно-аддитивную соль. Кроме того, изобретение относится к апрамицину или производному апрамицина, или его кислотно-аддитивной соли, предназначенному/предназначенной для применения при лечении бактериальных инфекционных заболеваний у человека, и к применению апрамицина или производного апрамицина, или его кислотно-аддитивной соли для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения бактериальных инфекционных заболеваний у человека. Предпочтительно применяют апрамицин или его кислотно-аддитивную соль.
Неожиданно было установлено, что апрамицин не обладает ожидаемым высоким уровнем токсичности, который характерен для родственных аминогликозидных антибиотиков, и в действительности является значительно менее токсичным, чем соединения, которые уже применяются в медицине для лечения человека, такие как гентамицин.
Апрамицин представляет собой аминогликозид формулы (I) (кольцо III)
Производное апрамицина, предлагаемое в изобретении, представляет собой, например, производное апрамицина формулы (I), в которой
- одна или большее количество аминогрупп алкилированы, циклоалкилированы, алкенилированы и/или ацилированы, или заменены гидроксигруппой, и/или
- одна или большее количество гидроксигрупп алкилированы, алкенилированы, ацилированы и/или заменены аминогруппой, и/или
- две соседние гидроксигруппы циклизованы с образованием ацеталя или карбоната, и/или
- соседние гидроксигруппа и аминггруппа или N-ацилированная аминогруппа циклизованы с образованием аминоацеталя или карбамата, и/или
3
2
- 7'-NHCH-группа заменена аминогруппой NH, алкилированной, циклоалкилированной, алкенилированной или ацетилированной аминогруппой, гидроксигруппой, алкилированной, циклоалкилированной, алкенилированной или ацетилированной гидроксигруппой, и/или
2
- 3'-атом углерода замещен аминогруппой NH или алкилированной, циклоалкилированной, алкенилированной или ацетилированной аминогруппой, или гидроксигруппой ОН или алкилированной, алкенилированной или ацилированной гидроксигруппой, и/или
- 5- и/или 6-гидроксигруппа гликозилирована моносахаридом, и/или
- кольцо I или кольцо III заменено другим моносахаридом.
1
7
1
4
Алкильные группы, которые можно применять для алкилирования гидроксигруппы и/или аминогруппы, представляют собой линейный или разветвленный C-Cалкил, предпочтительно C-Cалкил, например, метил, этил, н-пропил, изопропил или изобутил, прежде всего, метил или этил;
1
4
циклопропилметил, необязательно замещенный бензил, например, бензил или ияро-метоксибензил; и амино-, ацетиламино- и/или гидрокси-C-Cалкил, например, 2-аминоэтил, 2-ацетиламиноэтил, 2-гидроксиэтил, 4-амино-2-гидроксибутил, или 3-амино-2-гидроксипропил.
3
7
Циклоалкильные группы, которые можно применять для циклоалкилирования аминогруппы, представляют собой C-Cциклоалкил, прежде всего циклопропил.
1
7
1
4
Алкенильные группы, которые можно применять для алкенилирования гидроксигруппы и/или аминогруппы, представляют собой линейный или разветвленный C-Cалкенил, предпочтительно C-Cалкенил, например, аллил или изобутенил, прежде всего аллил.
1
7
1
4
1
7
Ацильные группы, которые можно применять для ацилирования гидроксигруппы и/или аминогруппы, представляют собой C-Cацил, предпочтительно C-Cацил, например, этоксикарбонил, пропионил или ацетил, прежде всего ацетил; амино-, ацетиламипо- и/или гидрокси-C-Cацил, например, гидроксиацетил, аминоацетил, ацетиламиноацетил, γ-амино-α-гидроксибутирил, γ-ацетиламино-α-гидроксибутирил, β-амино-α-гидроксипропионил или β-ацетиламино-α-гидроксипропионил; аминоацетильные группы, полученные из 20 встречающихся в естественных условиях незаменимых α-аминокислот, предпочтительно полученные из нейтральных или основных α-аминокислот, например, полученные из аланина, валина, лейцина, изолейцина, серина, треонина, фенилаланина или лизина; ароил, например, необязательно замещенный бензоил, такой как бензоил, пара-метоксибензоил или 3,4,5-триметоксибензоил; и гетероароил, например, пиридилкарбонил, такой как 2-, 3- или 4-пиридилкарбонил, тиофенкарбонил, такой как 2- или 3-тиофенкарбонил, или фуранилкарбонил, такой как 2- или 3-фуранилкарбонил. Другими ацильными группами, которые можно применять для ацилирования гидроксигруппы, являются сульфатные и фосфатные сложные эфиры.
1
7
1
4
1
7
1
4
1
7
1
7
1
4
Циклический ацеталь, образованный из двух соседних гидроксильных групп, представляет собой ацеталь, полученный из C-Cалкилкарбальдегида, предпочтительно C-Cалкилкарбальдегида, например, формальдегида, ацетальдегида, бензальдегида, ди(C-Cалкил)кетона, предпочтительно ди(C-Cалкил)кетона, например, ацетона, из циклопентанона или из циклогексанона. Циклический аминоацеталь, образованный из двух соседних гидроксильной группы и аминогруппы, также получают из C-Cалкилкарбальдегида, бензальдегида, ди(C-C)кетона, циклопентанона или циклогексанона; он может быть N-ацилирован C-Cацильными группами.
1
4
1
4
В замещенном бензиле и замещенном бензоиле заместитель может представлять собой C-Cалкил, например, метил, C-Cалкоксигруппу, например, метоксигруппу или этоксигруппу, хлор, бром, фтор, цианогруппу или нитрогруппу. Такой замещенный бензил или бензоил может нести один, два или три указанных заместителя.
Моносахарид, который можно применять для замещения кольца I или кольца III, или в качестве заместителя 5- или 6-гидроксигруппы, представляет собой, например, глюкозу, глюкозамин, 3-амино-3-дезоксиглюкозу, 3,4-диамино-3,4-дидезоксиглюкозу, 4-амино-3,4-дидезоксиглюкозу, 4-амино-3,6-дидезоксиглюкозу, 6-амино-6-дезоксиглюкозу, 4-амино-4-дезоксиаллозу, 4-амино-4-дезоксиидозу, рибозу, 5-амино-5-дезоксирибозу, 3,5-диамино-3,5-дидезоксирибозу, ксилозу, 5-амино-5-дезоксиксилозу, 3,5-диамино-3,5-дидезоксиксилозу, арабинозу, 4-амино-4-дезоксиарабинозу (D- и L-), 5-амино-5-дезоксиарабинозу, 3,5-диамино-3,5-дидезоксиарабинозу, 6-амино-3,4,6-тридезокси-D-эритрогекс-3-енопиранозу или 6-амино-4,5,6-тридезокси-L-треогекс-4-енопиранозу.
Любая аминогруппа апрамицина или аминогруппа заместителя, представляющего собой аминоалкил или аминоацил, может находиться в защищенной форме. В качестве защитных групп можно применять, например, группы, которые описаны в книгах, посвященных защитным группам, таких как T.W. Greene и P.G.M. Wuts, «Protective Groups in Organic Synthesis», изд-во Wiley, 3-е изд., 1999. Конкретными примерами защитных групп для аминогрупп являются фталоил, сукциноил, глутароил, трет-бутоксикарбонил, бензоксикарбонил и т.п.
Конкретными производными апрамицина являются производные формулы (I), в которой:
- одна или большее количество аминогрупп алкилированы, циклоалкилированы, алкенилированы и/или ацилированы и/или
- одна или большее количество гидроксигрупп алкилированы, алкенилированы или ацилированы, и/или
- две соседние гидроксигруппы циклизованы с образованием ацеталя или карбоната, и/или
- соседние гидроксигруппа и аминогруппа циклизованы с образованием аминоацеталя или карбамата, и/или
3
2
- 7'-NHCH-группа заменена аминогруппой NH или алкилированной, циклоалкилированной, алкенилированной и/или ацилированной аминогруппой, и/или
2
- 3'-атом углерода замещен аминогруппой NH или алкилированной, циклоалкилированной, алкенилированной и/или ацилированной аминогруппой, или гидроксигруппой OH или алкилированной, алкенилированной или ацилированной гидроксигруппой.
Более конкретно производное апрамицина представляет собой соединение формулы (II),
,
в которой
1
1
7
1
7
1
7
1
7
1
7
1
7
3
7
1
4
1
7
1
7
1
7
1
7
1
7
1
7
2
2
R обозначает водород, C-Cалкил, циклопропилметил, необязательно замещенный бензил, амино-C-Cалкил, ацетиламино-C-Cалкил, гидрокси-C-Cалкил, аминогидрокси-C-Cалкил, ацетиламиногидрокси-C-Cалкил, C-C-циклоалкил, C-Cалкенил, C-Cацил, амино-C-Cацил, ацетиламино-C-Cацил, гидрокси-C-Cацил, аминогидрокси-C-Cацил, ацетиламиногидрокси-C-Cацил, аминоацетил, полученный из 20 встречающихся в естественных условиях незаменимых α-аминокислот, ароил, гетероароил, SOOH или PO(OH);
2
1
4
1
4
R обозначает водород, C-Cалкил или C-Cалкенил;
3
1
7
1
7
1
7
1
7
1
7
1
7
3
7
1
4
1
7
1
7
1
7
1
7
1
7
1
7
2
2
R обозначает водород, C-Cалкил, циклопропилметил, необязательно замещенный бензил, амино-C-Cалкил, ацетиламино-C-Cалкил, гидрокси-C-Cалкил, аминогидрокси-C-Cалкил, ацетиламиногидрокси-C-Cалкил, C-Cциклоалкил, C-Cалкенил, C-Cацил, амино-C-Cацил, ацетиламино-C-Cацил, гидрокси-C-Cацил, аминогидрокси-C-Cацил, ацетиламиногидрокси-C-Cацил, аминоацетил, полученный из 20 встречающихся в естественных условиях незаменимых α-аминокислот, ароил, гетероароил, SOOH или PO(ОH);
4
1
4
1
4
R обозначает водород, C-Cалкил или C-Cалкенил;
5
1
7
1
7
1
7
1
7
1
7
1
7
1
4
1
7
1
7
1
7
1
7
1
7
1
7
2
2
R обозначает водород, C-Cалкил, циклопропилметил, необязательно замещенный бензил, амино-C-Cалкил, ацетиламино-C-Cалкил, гидрокси-C-Cалкил, аминогидрокси-C-Cалкил, ацетиламиногидрокси-C-Cалкил, C-Cалкенил, C-Cацил, амино-C-Cацил, ацетиламино-C-Cацил, гидрокси-C-Cацил, аминогидрокси-C-Cацил, ацетиламиногидрокси-C-Cацил, аминоацетил, полученный из 20 встречающихся в естественных условиях незаменимых α-аминокислот, моносахарид, полученный из встречающихся в естественных условиях пентоз и гексоз и соответствующих моноаминодезокси-или диаминодидезокси-производных, ароил, гетероароил, SOOH или PO(OH);
6
1
7
1
7
1
7
1
7
1
7
1
7
1
4
1
7
1
7
1
7
1
7
1
7
1
7
2
2
R обозначает водород, C-Cалкил, циклопропилметил, необязательно замещенный бензил, амино-C-Cалкил, ацетиламино-C-Cалкил, гидрокси-C-Cалкил, аминогидрокси-C-Cалкил, ацетиламиногидрокси-C-Cалкил, C-Cалкенил, C-Cацил, амино-C-Cацил, ацетиламино-C-Cацил, гидрокси-C-Cацил, аминогидрокси-C-Cацил, ацетиламиногидрокси-C-Cацил, аминоацетил, полученный из 20 встречающихся в естественных условиях незаменимых α-аминокислот, моносахарид, полученный из встречающихся в естественных условиях пентоз и гексоз и соответствующих моноаминодезокси-или диаминодидезокси-производных, ароил, гетероароил, SOOH или PO(OH);
или
1
6
1
7
1
7
2
4
2
5
R и R вместе обозначают C-Cалкил-CH, фенил-CH, (C-Cалкил)C, цикло-(CH2)C, цикло-(CH)C или C=O; или
5
6
1
7
1
7
2
2
4
2
5
R и R вместе обозначают C-Cалкил-CH, фенил-CH, (C-Cалкил)C, цикло-(CH)C, цикло-(CH)C или C=O;
1
7
1
7
1
7
1
7
1
7
1
7
3
7
1
4
1
7
1
7
1
7
1
7
1
7
1
7
2
2
R7 обозначает водород, C-Cалкил, циклопропилметил, необязательно замещенный бензил, амино-C-Cалкил, ацетиламино-C-Cалкил, гидрокси-C-Cалкил, аминогидрокси-C-Cалкил, ацетиламиногидрокси-C-Cалкил, C-Cциклоалкил, C-Cалкенил, C-Cацил, амино-C-Cацил, ацетиламино-C-Cацил, гидрокси-C-Cацил, аминогидрокси-C-Cацил, ацетиламиногидрокси-C-Cацил, аминоацетил, полученный из 20 встречающихся в естественных условиях незаменимых α-аминокислот, ароил, гетероароил, SOOH или PO(OH);
8
1
4
1
4
R обозначает водород, C-Cалкил или C-Cалкенил;
9
1
7
1
7
1
7
1
7
1
7
1
7
1
7
1
7
1
7
1
7
1
7
1
7
1
7
2
2
R обозначает водород, C-Cалкил, циклопропилметил, необязательно замещенный бензил, амино-C-Cалкил, ацетиламино-C-Cалкил, гидрокси-C-Cалкил, аминогидрокси-C-Cалкил, ацетиламиногидрокси-C-Cалкил, C-Cалкенил, C-Cацил, амино-C-Cацил, ацетиламино-C-Cацил, гидрокси-C-Cацил, аминогидрокси-C-Cацил, ацетиламиногидрокси-C-Cацил, аминоацетил, в полученный из 20 встречающихся в естественных условиях незаменимых α-аминокислот, ароил, гетероароил, SOOH или PO(OH);
10
1
7
1
7
1
7
1
7
1
7
1
7
3
7
1
4
1
7
1
7
1
7
1
7
1
7
1
7
2
2
R обозначает водород, C-Cалкил, циклопропилметил, необязательно замещенный бензил, амино-C-Cалкил, ацетиламино-C-Cалкил, гидрокси-C-Cалкил, аминогидрокси-C-Cалкил, ацетиламиногидрокси-C-Cалкил, C-Cциклоалкил, C-Cалкенил, C-Cацил, амино-C-Cацил, ацетиламино-C-Cацил, гидрокси-C-Cацил, аминогидрокси-C-Cацил, ацетиламиногидрокси-C-Cацил, аминоацетил, полученный из 20 встречающихся в естественных условиях незаменимых α-аминокислот, ароил, гетероароил, SOOH или PO(OH); или
9
10
1
7
1
7
2
3
4
3
5
R и R вместе обозначают C-Cалкил-СН, фенил-CH, (C-Cалкил)C, цикло-(CH)C, цикло-(CH)C или C=O;
11
1
7
1
7
1
7
1
7
1
7
1
7
1
4
1
7
1
7
1
7
1
7
1
7
1
7
2
2
R обозначает водород, C-Cалкил, циклопропилметил, необязательно замещенный бензил, амино-C-Cалкил, ацетиламино-C-Cалкил, гидрокси-C-Cалкил, аминогидрокси-C-Cалкил, ацетиламиногидрокси-C-Cалкил, C-Cалкенил, C-Cацил, амино-C-Cацил, ацетиламино-C-Cацил, гидрокси-C-Cацил, аминогидрокси-C-Cацил, ацетиламиногидрокси-C-Cацил, аминоацетил, полученный из 20 встречающихся в естественных условиях незаменимых α-аминокислот, ароил, гетероароил, SOOH или PO(OH);
12
1
7
1
7
1
7
1
7
1
7
1
7
1
4
1
7
1
7
1
7
1
7
1
7
1
7
2
2
R обозначает водород, C-Cалкил, циклопропилметил, необязательно замещенный бензил, амино-C-Cалкил, ацетиламино-C-Cалкил, гидрокси-C-Cалкил, аминогидрокси-C-Cалкил, ацетиламиногидрокси-C-Cалкил, C-Cалкенил, C-Cацил, амино-C-Cацил, ацетиламино-C-Cацил, гидрокси-C-Cацил, аминогидрокси-C-Cацил, ацетиламиногидрокси-C-Cацил, аминоацетил, полученный из 20 встречающихся в естественных условиях незаменимых α-аминокислот, ароил, гетероароил, SOOH или PO(OH); или
11
12
1
7
1
7
2
2
4
2
5
R и R вместе обозначают C-Cалкил-CH, фенил-CH, (C-Cалкил)C, цикло-(CH)C, цикло-(CH)C или C=O;
13
1
7
1
7
1
7
1
7
1
7
1
7
3
7
1
4
1
7
1
7
1
7
1
7
1
7
1
7
2
2
R обозначает водород, C-Cалкил, циклопропилметил, необязательно замещенный бензил, амино-C-Cалкил, ацетиламино-C-Cалкил, гидрокси-C-Cалкил, аминогидрокси-C-Cалкил, ацетиламиногидрокси-C-Cалкил, C-Cциклоалкил, C-Cалкенил, C-Cацил, амино-C-Cацил, ацетиламино-C-Cацил, гидрокси-C-Cацил, аминогидрокси-C-Cацил, ацетиламиногидрокси-C-Cацил, аминоацетил, полученный из 20 встречающихся в естественных условиях незаменимых α-аминокислот, ароил, гетероароил, SOOH или PO(OH); или
12
13
1
7
1
7
2
2
4
2
5
R и R вместе обозначают C-Cалкил-СН, фенил-CH, (C-Cалкил)C, цикло-(CH)C, цикло-(CH)C или C=O;
14
1
4
1
4
R обозначает водород, C-Салкил или C-Салкенил;
15
1
7
1
7
1
7
1
7
1
7
1
7
1
4
1
7
1
7
1
7
1
7
1
7
1
7
2
2
R обозначает водород, C-Cалкил, циклопропилметил, необязательно замещенный бензил, амино-C-Cалкил, ацетиламино-C-Cалкил, гидрокси-C-Cалкил, аминогидрокси-C-Cалкил, ацетиламиногидрокси-C-Cалкил, C-Cалкенил, C-Cацил, амино-C-Cацил, ацетиламино-C-Cацил, гидрокси-C-Cацил, аминогидрокси-C-Cацил, ацетиламиногидрокси-C-Cацил, аминоацетил, полученный из 20 встречающихся в естественных условиях незаменимых α-аминокислот, ароил, гетероароил, SOOH или PO(OH); или
13
15
1
7
1
7
2
2
4
2
5
R и R вместе обозначают C-Cалкил-CH, фенил-CH, (C-Cалкил)C, цикло-(CH)C, цикло-(CH)C или C=O;
16
10
16
1
4
1
4
R обозначает водород, C-Cалкил, циклопропилметил, циклопропил или C-Cалкенил; или необязательно N-R и R вместе обозначают насыщенный или частично ненасыщенный гетероцикл, такой как азиридин, азетидин, пиролидин, пиперидин, пиперазин или морфолин; и
17
1
7
1
7
1
7
1
7
1
7
1
7
3
7
1
7
1
7
1
7
1
7
1
7
1
7
1
7
2
2
1
7
1
7
1
7
1
7
1
7
1
7
1
4
1
7
1
7
1
7
1
7
1
7
1
7
2
2
R обозначает водород; аминогруппу, C-Cалкилалкиламиногруппу, циклопропилметиламиногруппу, необязательно замещенную бензиламиногруппу, амино-C-Cалкиламиногруппу, ацетиламино-C-Cалкиламиногруппу, гидрокси-C-Cалкиламиногруппу, аминогидрокси-C-Cалкил аминогруппу, ацетиламиногидрокси-C-Cалкиламиногруппу, C-Cциклоалкиламиногруппу, C-Cалкениламиногруппу, C-Cациламиногруппу, амино-C-Cациламиногруппу, ацетиламино-C-Cациламиногруппу, гидрокси-C-Cациламиногруппу, аминогидрокси-C-Cациламиногруппу, ацетиламиногидрокси-C-Cациламиногруппу, аминоацетиламиногруппу, где аминоацетил получен из 20 встречающихся в естественных условиях незаменимых α-аминокислот, ароиламиногруппу, гетероароиламиногруппу, NHSOOH, NHPO(OH); гидроксигруппу, C-Cалкоксигруппу, циклопропилметоксигруппу, необязательно замещенную бензилоксигруппу, амино-C-Cалкоксигруппу, ацетиламино-C-Cалкоксигруппу, гидрокси-C-Cалкоксигруппу, аминогидрокси-C-Cалкоксигруппу, ацетиламиногидрокси-C-Cалкоксигруппу, C-Cалкенилоксигруппу, C-Cацилоксигруппу, амино-C-Cацилоксигруппу, ацетиламино-C-Cацилоксигруппу, гидрокси-C-Cацилоксигруппу, аминогидрокси-C-Cацилоксигруппу, ацетиламиногидрокси-C-Cацилоксигруппу, аминоацетоксигруппу, где аминоацетил получен из 20 встречающихся в естественных условиях незаменимых α-аминокислот, ароилоксигруппу, гетероароилоксигруппу, OSOOH или OPO(OH);
16
17
1
15
при условии, что когда R обозначает метил и R обозначает водород, то по меньшей мере один из заместителей R-R отличен от водорода;
и его производные, в которых одна или несколько аминогрупп находятся в защищенной форме.
17
15
Предпочтительными являются соединения формулы (II), в которой R обозначает водород. В таких соединениях любая из 5 вторичных гидроксигрупп и одна первичная гидроксигруппа (OR), или также 2, 3, 4, 5 или все 6 гидроксигрупп могут быть алкилированы, алкенилированы или ацилированы, или заменены атомом водорода.
5
6
9
11
12
15
15
16
5
6
9
11
12
15
16
1
4
1
4
1
4
1
4
Предпочтительными являются соединения формулы (II), в которой один из R, R, R, R, R и R, прежде всего R, обозначает C-Cалкил, например, метил, или C-Cацил, например, ацетил, R обозначает метил, а все другие заместители обозначают водород. Предпочтительным является также соединение, в котором все R, R, R, R, R и R обозначают C-Cалкил, например метил, или C-Cацил, например ацетил, R обозначает метил, а все другие заместители обозначают водород.
15
16
5
6
12
16
1
4
1
4
1
4
1
4
1
4
1
4
Предпочтительным является производное, в котором R обозначает C-Cалкил, C-Cалкенил или C-Cацил, R обозначает метил, а все другие заместители обозначают водород. Предпочтительным является также производное, в котором один, два или три из R, R и R обозначают C-Cалкил, C-Cалкенил или C-Cацил, R обозначает метил, а все другие заместители обозначают водород.
17
Кроме того, в соединениях формулы (II), в которых R обозначает водород, любая из 4 первичных аминогрупп или также 2, 3 или все 4 первичные аминогруппы, может(ут) быть алкилирована(ы), диалкилирована(ы), алкенилирована(ы), диалкенилирована(ы) или ацилирована(ы), с образованием, например, тетраацетата.
1
3
7
13
13
16
1
3
7
13
16
1
4
3
7
1
4
1
4
1
4
Предпочтительными являются соединения формулы (II), в которой один из R, R, R и R, прежде всего R, обозначает C-Cалкил, например метил, C-Cциклоалкил, например циклопропил, C-Cацил, например ацетил, амино-, ацетиламино- и/или гидрокси-C-Cацил, например гидроксиацетил, аминоацетил, ацетиламиноацетил, γ-амино-α-гидроксибутирил, γ-ацетиламино-α-гидроксибутирил, β-амино-α-гидроксипропионил или β-ацетиламино-α-гидроксипропионил, R обозначает метил, а все другие заместители обозначают водород. Предпочтительным также является соединение, в котором все R, R, R и R обозначают C-Cацил, например ацетил, R обозначает метил, а все другие заместители обозначают водород. Предпочтительными являются также соединения, в которых аминогруппа в таком предпочтительном заместителе, как аминоацетил, γ-амино-α-гидроксибутирил или β-амино-α-гидроксипропионил, находится в защищенной форме, например, защищена бензоксикарбонилом или фталоилом.
10
16
16
10
10
10
10
10
3
3
3
5
2
3
5
2
2
3
Вторичная аминогруппа NRR, в которой R обозначает CH, может быть алкилирована второй метильной группой (R обозначает CH), циклопропилметилом (R обозначает цикло-CH-CH-) или циклопропильной группой (R обозначает цикло-CH-), алкенилирована аллильной группой (R обозначает CH=CHCH-) или ацетилирована (R обозначает CHCO-). Необязательно NR R может представлять собой насыщенный или частично ненасыщенный гетероцикл, такой как азиридин, азетидин, пирролидин, пиперидин, пиперазин или морфолин.
1
7
13
13
16
1
7
Предпочтительными являются соединения формулы (II), в которой R или R, или R, прежде всего R, обозначает амино-, ацетиламино- и/или гидрокси-C-Cацил, например гидроксиацетил, аминоацетил, ацетиламиноацетил, γ-амино-α-гидроксибутирил, γ-ацетиламино-α-гидроксибутирил, β-амино-α-гидроксипропионил или β-ацетиламино-α-гидроксипропионил, R обозначает метил, а все другие заместители обозначают водород.
9
10
13
1
7
Кроме того, предпочтительными являются соединения формулы (II), в которой RR обозначает C=O, R обозначает амино-, ацетиламино- и/или гидрокси-C-Cацил, например гидроксиацетил, аминоацетил, ацетиламиноацетил, γ-амино-α-гидроксибутирил, γ-ацетиламино-α-гидроксибутирил, β-амино-α-гидроксипропионил или β-ацетиламино-α-гидроксипропионил, R обозначает метил, а все другие заместители обозначают водород.
10
16
16
Кроме того, предпочтительными являются соединения формулы (II), в которой R обозначает метил или аллил, R обозначает метил, а все другие заместители обозначают водород; или в которой R обозначает этил, циклопропилметил, циклопропил или аллил, а все другие заместители обозначают водород.
Кислотцо-адитивные соли апрамицина представляют собой соли с органическими или неорганическими кислотами, прежде всего фармацевтически приемлемые соли. Пригодными неорганическими кислотами являются, например, галогеновые кислоты, такие как соляная кислота, серная кислота или фосфорная кислота. Пригодными органическими кислотами являются, например, карбоновые, фосфоновые, сульфоновые или сульфамовые кислоты, например, уксусная кислота, пропионовая кислота, каприловая кислота, декановая кислота, додекановая кислота, гликолевая кислота, молочная кислота, фумаровая кислота, янтарная кислота, адипиновая кислота, пимелиновая кислота, пробковая кислота, азелаиновая кислота, яблочная кислота, винная кислота, лимонная кислота, аминокислоты, такие как глутаминовая кислота или аспартамовая кислота, малеиновая кислота, гидроксималеиновая кислота, метилмалеиновая кислота, циклогексанкарбоновая кислота, адамантанкарбоновая кислота, бензойная кислота, салициловая кислота, 4-аминосалициловая кислота, фталевая кислота, фенилуксусная кислота, миндальная кислота, коричная кислота, метан- или этансульфоновая кислота, 2-гидроксиэтансульфоновая кислота, этан-1,2-дисульфоновая кислота, бензолсульфоновая кислота, 2-нафталинсульфоновая кислота, 1,5-нафталиндисульфоновая кислота, 2-, 3- или 4-метилбензолсульфоновая кислота, метилсерная кислота, этилсерная кислота, додецилсерная кислота, N-циклогексилсульфамовая кислота, N-метил-, N-этил-или N-пропилсульфамовая кислота, или другие органические протонные кислоты, такие как аскорбиновая кислота.
Как определено выше, производные апрамицина не включают производные, в которых отсутствуют амино- или гидроксигруппы в положениях 5 и 6 в кольце I апрамициновой структуры, указанной в формуле (I), или другие производные, полученные путем других добавлений к структуре апрамицина за исключением указанных выше, или путем элиминаций или делеций частей структуры апрамицина.
Апрамицин, производное апрамицина или его кислотно-аддитивная соль обладают выраженной активностью в отношении бактерий и бактериоподобных организмов. Их можно применять в медицине для профилактики и химиотерапии местных и системных инфекций, вызываемых указанными патогенами, а также нарушений, связанных с бактериальными инфекциями, включая пневмонию, отит среднего уха, синусит, бронхит, тонзилит и мастоидит, связанных с инфекцией Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Moraxeila catarrhalis, Staphylococcus aureus, S. epidermidis или S. haemolyticus; фарингита, ревматической атаки и гломерулонефрита, связанных с инфекцией Streptococcus pyogenes, стрептококков групп С и G или Corynehacterium diphtheriae; инфекционных заболеваний дыхательных путей, связанных с инфекцией Mycoplasma pneumoniae, Legionella pneumophila, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae или Chlamydia pneumoniae; инфекционных заболеваний крови и тканей, включая эндокардит и остеомиелит, вызываемых S. aureus, S. haemoiyticus, Efaecalis, E. faecium, E. durans, включая штаммы, устойчивые к известным антибактериальным средствам, таким как (но не ограничиваясь только ими) бета-лактамы, ванкомицин, хинолоны, хлорамфеникол, тетрациклины и макролиды; инфекционных заболеваний и абсцессов кожи и мягкой ткани и послеродового сепсиса, связанных с инфекцией Staphylococcus aureus, коагулазонегативным стафилококком (например, S. epidermidis, S. haemoiyticus). Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, стрептококками групп C-F (образующие мелкие колонии стрептококки), зеленящими стрептококками, Corynebacterium minutissimum или Bartonella henselae; инфекционных заболеваний мочевых путей, связанных с инфекцией Enterobacte aceae spp., Staphylococcus aureus, коагулазонегативными видами стафилококков или Enterococcus spp.; уретрита и цервицита; заболеваний, передаваемых половым путем, которые связаны с инфекцией Chlamydia trachomatis, Haemophilus ducreyi, Treponema pallidum, Ureapiasma ureaiyticum или Neiserria gonorrheas; вызываемых токсинами заболеваний, которые связаны с инфекцией S. aureus (пищевое отравление и синдром токсического шока), или стрептококков групп A, B и C; язв, связанных с инфекцией Helicobacter pylori; системных лихорадочных синдромов, связанных с инфекцией Borreiia recurrentis; болезни Лайма, связанной с инфекцией Borreiia burgdorferi; конъюнктивита, кератита и дакроцистита, связанных с инфекцией Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, S. aureus, S. pneumoniae, S. pyogenes, H influenzae или Listeria spp.; диссеминированного заболевания, связанного с инфекцией нетуберкулезными микобактериями (НТБМ), такими как Mycobacterium avium-intraceiluiare, M. abscessus, M. bolletii или М. massilicnse; инфекционных заболеваний, вызываемых Mycobacterium tuberculosis, M. leprae, M. paratubercuiosis, M. kansasii, M. chelonei или M. fortuitum; гастроэнтерита, связанного с инфекцией Campylobacter jejuni; вызываемых простейшими кишечных заболеваний, связанных с инфекцией Cryptosporidium spp.; одонтогенного инфекционного заболевания, связанного с инфекцией зеленящими стрептококками; постоянного кашля, связанного с инфекцией Bordetelia pertussis; атеросклероза или сердечно-сосудистого заболевания, связанного с инфекцией Helicobacter pylori или Chlamydia pneumonia; и диссеминированных инфекционных заболеваний, вызываемых Francisella tularensis, Rickettsia spp., Brucella spp., Enterohacteriaceae и грамнегативными неферментирующими палочками (например, Pseudomonas spp.).
Апрамицин, производное апрамицина или его кислотно-аддитивную соль можно применять прежде всего для лечения пневмонии, обусловленной инфекцией Pseudomonas spp. у страдающих муковисцидозом пациентов или диссеминированного инфекционного заболевания, вызываемого Francisella tularensis, Rickettsia spp., Brucella spp., Enterohacteriaceae spp.и Pseudomonas spp.
Конкретным бактериальным инфекционным заболеванием, которое следует лечить с помощью апрамицина, производного апрамицина или его кислотно-аддитивной соли, является туберкулез. Другим конкретным заболеванием является септицемия, вызываемая бактериальными патогенами. Третьим конкретным заболеванием является пневмония, вызываемая инфекцией Pseudomonas spp. у страдающих муковисцидозом пациентов. Четвертым конкретным заболеванием является инфекционное заболевание, вызываемое нетуберкулезными микобактериями, такими как Mycobacterium avium-intraceiluiare, M. abscessus, M. bolletii или М. massiliense.
Предназначенное для введения действующее вещество предпочтительно находится в форме фарамцевтического препарата, содержащего апрамицин, производное апрамицина или его кислотно-аддитивную соль, в химически чистой форме и необязательно фармацевтически приемлемый носитель и необязательно адъюванты. Апрамицин, производное апрамицина или его кислотно-аддитивную соль применяют в количестве, эффективном в отношении бактериального инфекционного заболевания у человека. Доза действующего вещества зависит от возраста, веса и индивидуального состояния человека, индивидуальных фармакокинетических характеристик и пути введения. В случае конкретного человека, имеющего вес тела примерно 70 кг, вводимая суточная доза апрамицина или его производного составляет от 0,01 до 1000 мг/кг веса тела, предпочтительно от 0,1 до 100 мг/кг веса тела, более предпочтительно от 1 до 25 мг/кг веса тела, и ее вводят в виде однократной дозы или в виде нескольких доз. Апрамицин, производное апрамицина или его кислотно-аддитивную соль можно применять индивидуально или в комбинации с другими лекарственными средствами.
Наиболее предпочтительными являются фармацевтические композиции, предназначенные для энтерального введения, такого как интраназальное, трансбуккальное, ректальное или, прежде всего, оральное введение, и для парентерального введения, такого как подкожное, внутривенное, внутрипеченочное или внутримышечное введение. Фармацевтические композиции содержат от примерно 1% до примерно 95% действующего вещества, предпочтительно от примерно 20% до примерно 90% действующего вещества.
Для парентерального введения предпочтительно применяют растворы, а также суспензии или дисперсии апрамицина, производных апрамицина или его кислотно-аддитивных солей, прежде всего изотонические водные растворы, дисперсии или суспензии, которые, например, можно приготавливать непосредственно перед применением. Фармацевтические композиции могут быть стерилизованы и/или могут содержать эксципиенты, например консерванты, стабилизаторы, смачивающие агенты и/или эмульгаторы, солюбилизаторы, повышающие вязкость агенты, соли для регулирования осмотического давления и/или буферы, и их можно приготавливать хорошо известным методом, например, с использованием общепринятых процессов растворения и лиофилизации.
Для оральных фармацевтических препаратов пригодными носителями являются, прежде всего, наполнители, такие как сахара, например, лактоза, сахароза, манит или сорбит, целлюлозные препараты и/или фосфаты кальция, а также связующие вещества, такие как крахмалы, производные целлюлозы и/или поливинилпирролидон, и/или при необходимости разрыхлители, вещества, повышающие текучесть, и замасливатели, такие, например, как стеариновая кислота или ее соли, и/или полиэтиленгликоль. На ядра таблеток можно наносить соответствующие, необязательно энтеросолюбильные, покрытия. В таблетки или покрытия для таблеток можно добавлять красители или пигменты, например, для целей идентификации или для обозначения различных доз действующего вещества. Фармацевтические композиции, предназначенные для орального введения, могут находиться также в форме твердых состоящих из желатина капсул, а также мягких запечатанных капсул, состоящих из желатина и пластификатора, такого как глицерин или сорбит. Капсулы могут содержать действующее вещество в форме гранул, или растворенное или суспендированное в пригодных жидких эксципиентах, таких как масла. Можно рассматривать также трансдермальные/внутрибрюшинные и внутривенные пути введения, например, с использованием трансдермального пластыря, которые позволяют осуществлять введение в течение продолжительного периода времени, составляющего, например, от одного до двадцати дней.
Можно рассматривать также введение в форме аэрозолей. В этом случае действующее вещество должно находиться в твердой форме с заранее определенным размером частиц или в форме раствора. Можно применять твердые частицы в смеси с пригодными наполнителями, такими как сахара, например, лактоза. Растворы предпочтительно представляют собой водные растворы, необязательно содержащие консерванты, стабилизаторы, солюбилизаторы, соли для регулирования осмотического давления и/или буферы. Аэрозоли можно вводить с помощью пригодных распылителей или необязательно в сочетании с пропеллентом, находящимся под давлением, таким, например, как HFA 134a (1,1,1,2-тетрафторэтан), HFA 227 (1,1,1,2,3,3,3-гептафторпропан), дихлордифторметан, 1,1- или 1,2-дихлортетрафторэтан, трихлорфторметан или их комбинация.
Наиболее предпочтительными являются внутривенный, внутримышечный и подкожный пути введения. При пневмонии, вызываемой инфекцией Pseudomonas spp. у страдающих муковисцидозом пациентов, наиболее предпочтительным является введение в аэрозольной форме.
Лекарственные средства, предлагаемые в изобретении, приготавливают с помощью методов, известных в данной области, прежде всего с использованием общепринятых процессов смешения, нанесения покрытия, гранулирования, растворения или лиофилизации. Апрамицин, производное апрамицина или его кислотно-аддитивную соль можно вводить индивидуально или в комбинации с одним или несколькими другими терапевтическими средствами, возможной формой комбинированной терапии является применение фиксированных комбинаций апрамицина или производных апрамицина и одного или нескольких других терапевтических средств, для которых известно их применение при лечении бактериальных инфекционных заболеваний у человека, введение компонентов осуществляют в определенном порядке или независимо друг от друга, или в форме фиксированной комбинации.
В качестве возможных компонентов комбинации можно рассматривать бета-лактамы, макролиды, хинолоны, рифамицины или изониазид.
Изобретение относится также к самим новым производным апрамицина и их кислотно-аддитивным солям. Конкретными соединениями являются:
1
16
соединение формулы (II), в которой R обозначает γ-амино-α-гидроксибутирил, R обозначает метил, а все остальные заместители представляют собой водород;
1
16
соединение формулы (II), в которой R обозначает γ-амино-α-гидроксибутирил, R обозначает метил, а все остальные заместители представляют собой водород; и
9
10
13
16
соединение формулы (II), в которой RR обозначает C=O, R обозначает γ-амино-α-гидроксибутирил, R обозначает метил, а все остальные заместители представляют собой водород.
Другие соединения представляют собой:
10
16
соединение формулы (II), в которой R обозначает метил, R обозначает метил, а все остальные заместители представляют собой водород;
10
16
соединение формулы (II), в которой R обозначает аллил, R обозначает метил, а все остальные заместители представляют собой водород;
16
соединение формулы (II), в которой R обозначает этил, а все остальные заместители представляют собой водород;
16
соединение формулы (II), в которой R обозначает циклопропилметил, а все остальные заместители представляют собой водород;
16
соединение формулы (II), в которой R обозначает циклопропил, а все остальные заместители представляют собой водород; и
16
соединение формулы (II), в которой R обозначает аллил, а все остальные заместители представляют собой водород.
Следующие примеры служат для иллюстрации изобретения, но они не ограничивают объем изобретения.
Полученные данные свидетельствуют о том, что апрамицин обладает сильной антибактериальной активностью, в том числе в отношении М. tuberculosis, и что многие из известных определяющих устойчивость к аминогликозидам факторов не ослабляют антибактериальную активность апрамицина.
В частности, эти данные свидетельствуют о том, что:
I) Активность апрамицина в отношении бактериальной рибосомы сходна с активностью тобрамицина, гентамицина, неомицина и паромомицина. По сравнению с тобрамицином, гентамицином, неомицином и паромомицином апрамицин обладает существенно меньшей активностью в отношении мутантных бактериальных рибосом, в которых имеются одиночные остатки pPHK, свидетельствующие о полиморфизмах человеческой последовательности, например, 1408G, 1491A, 1491C. По сравнению с тобрамицином, гентамицином, неомицином и паромомицином апрамицин обладает существенно меньшей активностью в отношении бактериальных гибридных рибосом, несущих гуманизированный сайт связывания лекарственной субстанции, например, митогибрид (митохондриальный гибрид), цитогибрид (цитоплазматический гибрид), мутация глухоты 1555G, мутация глухоты 1494U (описание основных принципов и методологий приведено в заявке на патент WO 2007/112965; у Hobbie и др., Nucl. Acids Res., 35, 2007, сс.6086-6093; Hobbie и др., Proc. Natl. Acad. Soc. USA, 105, 2008, сс.20888-20893). Взятые в совокупности, эти данные свидетельствуют о том, что избирательность апрамицина на уровне мишени лекарственного средства, т.е. различное действие в отношении прокариотических и эукариотических рибосом (Bottger и др., EMBO Rep., 2, 2001, сс.318-323), выше, чем других аминогликозидов.
II) При создании изобретения неожиданно было установлено, что по сравнению с гентамицином апрамицин обладает низкой кохлеатоксичностью in vitro (в культурах ex vivo спирального (кохлеарного) органа), меньшей нефротоксичностью in vivo (опыты на морских свинках) и меньшей отоксичностью in vivo (опыты на морских свинках). Следовательно, апрамицин можно применять для человека.
Пример 1: Сравнение активности апрамицина в отношении устойчивых к метициллину клинических изолятов Staphylococcus aureus (MRSA) с активностью поступающих в продажу аминогликозидов (таблица 1)
Активность оценивали путем определения минимальных ингибирующих концентраций (MIC) согласно методу, описанному у Pflster и др., Antimicrob. Agents Chemother., 47, 2003, ее. 1496-1502. Культуры клеток из единичных колоний выращивали в LB-среде и использовали для проведения тестов по определению MIC в формате титрационного микропланшета. Стартовые культуры содержали 200 мкл бактериальных клеток с оптической плотностью 0,025 при 600 нм, соответствующее лекарственное средство добавляли в виде двукратных серийных разведении. Величину MIC определяли как концентрацию лекарственного средства, при которой имело место полное ингибирование роста культур после инкубации в течение 24 ч при 25°C. В отличие от таких широко применяемых в клинических условиях аминогликозидов, как гентамицин, сизомицин, тобрамицин, канамицин, амикацин, неомицин и паромомицин, на действие апрамицина не оказывали влияние никакие из определяющих устойчивость факторов, присутствующих в клинических изолятах MRSA.
Результаты представлены в таблице 1.
Таблица 1
Сравнение активности апрамицина в отношении клинических изолятов Staphylococcus aureus (МКЗА)устойчивых к метициллину с активностью поступающих в продажу аминогликозидов - величины MIC (мг/л), анализ методом микроразведений в LB-среде
№<sup>а</sup>
Штамм<sup>б</sup>
апрамицин
гентамицин
сизомицин
тобрамицин
канамицин A
амикацин
неомицин
паромомицин
38
70-26S
8
0,5
0,25
0,5-1
4
4
0,5-1
2-4
41
98-25S
8
0,5
0,25
0,5-1
2-4
4-8
0,5-1
4
40
87-26S
8
0,5
0,25
≥256
128-256
16-32
128
>256
44
07-12R
16
16
8
8
64
4
0,5-1
2-4
45
08-12R
8-16
16
4-8
8
64
4
0,5-1
4
43
01-08R
16-32
32-64
32-64
32
128-256
8-16
1-4
4-8
№<sup>а</sup>
Штамм<sup>б</sup>
апрамицин
гентамицин
гентамицин
тобрамицин
канамицин A
амикацин
неомицин
паромомицин
53
56-06R
8
64
32
16-32
256
8
0,5-1
2-4
42
101-06R
8
32-64
32
>25б
256
16
128
>256
46
12-06R
8-16
^256
>256
128-256
>256
32
>256
>256
47
18-06R
8-16
>256
>256
>256
>256
256
256
>256
48
20-06R
8-16
>256
>25б
>25б
>512
256
256
>256
49
23-12R
8-16
16
8
8-16
>256
8-16
>256
>256
50
31-06R
4-8
128
128-256
32-64
>256
16
64
>25б
51
36-06R
8
128
64
32-64
>256
8-16
64
>256
52
53-141
8
16-32
8
8-16
>256
16
>256
>256
<sup>а</sup> Полное название MSRA (№) представляет собой AG038 и т.д. Приведены только последние две цифры.
<sup>б</sup> Полное название штамма представляет собой 70-26S Gm<sup>R</sup> и т.д. для штаммов, название которых оканчивается S, и 07-12R Gm<sup>R</sup> и т.д. для штаммов, название которых оканчивается R или I.
Пример 2: Сравнение активности апрамицина в отношении грамотрицательных бактерий с активностью поступающих в продажу аминогликозидов (таблица 2)
Активность оценивали путем определения минимальных ингибирующих концентраций (MIC) согласно методу, описанному в примере 1.
По сравнению с гетерогенными профилями активности, характерными для гентамицина, сизомицина, тобрамицин, канамицина, неомицина и паромомицина, для апрамицина был выявлен уникальный профиль активности, на который почти не оказывали влияние основные обусловливающие устойчивость к аминогликозидам факторы.
Результаты представлены в таблице 2.
Таблица 2
Сравнение активности апрамицина в отношении грамотрицательных бактерий с активностью поступающих в продажу аминогликозидов на основе измерений минимальных ингибирующих концентраций (MIC, мг/л)
№<sup>а</sup>
Штамм<sup>б</sup>
RM<sup>б</sup>
апрамицин
гентамицин
гентамицин
тобрамицин
канамицин A
амикацин
неомицин
01
клин. изол. (Gm<sup>R</sup>)
-
4-8
4-8
-
4-8
16
8-16
16-32
02
клин.изол. (Gm<sup>R</sup>)
-
16-32
2
1
2
4-8
4
8-16
03
клин.изол. (Gm<sup>R</sup>)
-
16-32
256-512
32-128
32
16-32
4
8-16
06
ВМ13
-
4
0,5
0,25
0,5
1-2
1
2
07
BM13/pIP135
AAC(3)
8
32-64
16
4
8
4
8
08
BM13/pIP055
ANT(2”)
4
16
8
8-64
16-128
2-4
4-8
09
AAC(6')-1B
AAC(6')
8
8-16
16
64-128
256-512
8-32
8-16
36
HB101/pAT197
ANT(4')
4
0,5
0,25
16-32
16-32
32
256
37
HB101/pAG21-1
APH93')
4
0,25
0,125
1-2
>256
>256
>256
<sup>а</sup> Полное название (№) представляет собой AG01 и т.д. Приведены только последние две цифры. Все протестированные бактерии относились к видам E.coli
<sup>б</sup> клин. изол. обозначает клинический изолят; RM обозначает механизм устойчивости
Пример 3: Сравнение активности апрамицина в отношении клинических изолятов М. tuberculosis с активностью амикацина и стрептомицина (таблица 3)
Активность апрамицина (мкг/мл) в отношении клинических изолятов M. tuberculosis в сравнении с активностью амикацина и стрептомицина оценивали на основе результатов измерений с помощью устройства MGIT960 EpiCenter. R обозначает устойчивый, S обозначает чувствительный; описание методологии приведено у Springer и др., J. Clin. Microbiol., 47, 2009, сс.1773-1780. Результаты представлены в таблице 3.
Таблица 3
Штамм №
Апрамицин
Амикацин
Стрептомицин
0,25
1
4
0,25
1
4
0,25
1
4
176949/08
R
S
S
R
S
S
S
S
S
177581/08
R
S
S
R
S
S
S
S
S
177958/08
R
S
S
R
S
S
R
S
S
178122/08
R
S
S
-
-
-
-
-
-
178242/08
R
S
S
-
-
-
-
-
-
178331/08
R
S
S
R
S
S
R
S
S
178557/08
R
S
S
R
S
S
R
S
S
178594/08
R
S
S
-
-
-
-
-
-
177712/08
R
S
S
-
-
-
-
-
-
177809/08
R
S
S
-
-
-
-
-
-
Пример 4: Активность апрамицина в отношении устойчивых ко многим лекарственным средствам клинических изолятов M. tuberculosis (таблица 4)
Активность апрамицина (мкг/мл) тестировали согласно методу, описанному в примере 3. R обозначает устойчивый, S обозначает чувствительный.
Таблица 4
Апрамицин
Штамм №
0,25
1
4
10
186005/09
R
S
S
S
186010/09
R
S
S
S
186013/09
R
S
S
S
186014/09
R
S
S
S
186002/09
R
S
S
S
Пример 5: Сравнение активности апрамицина в отношении клинических изолятов нетуберкулезных медленно растущих микобактерий с активностью амикацина (таблица 5)
Активность апрамицина и амикацина (мкг/мл) тестировали согласно методу, описанному в примере 3.
R обозначает устойчивый, S обозначает чувствительный.
Таблица 5
Апрамицин
Амикацин
Штамм №
1
4
10
1
4
10
182034/06 M. avium-intracellulare
R
S
S
R
S
S
182124/07 M. avium-intracellulare
R
S
S
R
S
S
182550/07 M. avium-intracellulare
R
S
S
R
S
S
Апрамицин
Амикацин
Штамм №
1
4
10
1
4
10
177227/06 M. kansasii
R
S
S
R
S
S
180235/06 M. kansasii
R
S
S
R
S
S
Пример 6: Сравнение активности апрамицина (мкг/мл) в отношении клинических изолятов нетуберкулезных быстро растущих микобактерий с активностью поступающих в продажу аминогликозидов (таблица 6)
Активность апрамицина оценивали с помощью стандартных анализов методом микроразведений и характеризовали по минимальной ингибирующей концентрации (MIC), выраженной в мкг/мл.
Таблица 6
Штамм №
Апрамицин
Амикацин
Канамицин
Тобрамицин
500039/08 M. abscessus
0,5
1,0
4,0
4,0
500044/09 M. massiliense
2,0
1.0
16,0
8,0
177217/10 M. massiliense
4,0
8,0
32,0
32,0
186139/07 M. massiliense
4,0
4,0
32,0
16,0
181739/08 M. bolletii
4,0
4.0
64,0
32,0
179639/10 M. massiliense
4.0
8,0
64,0
32,0
183177/08 Af. massiliense
2,0
8,0
16,0
16,0
Пример 7: Избирательность лекарственного средства - сравнение активности апрамицина в отношении различных рибосом с активностью тобрамицина, гентамицина и неомицина (таблица 7)
Для мутагенеза pPHK использовали несущий один аллель рРНК штамм Mycobacteriumn smegmatis (Sander и др., Mol. Microbiol., 22, 1996, ее. 841-848). Имеющие решающее значение нуклеотиды, которые отличают прокариотический декодирующий сайт от эукариотического, находятся в рРНК в положениях 1408 (бактериальная рибосома: A, эукариотические цитозольные рибосомы: G) и 1491 (бактериальные рибосомы: G, эукариотические цитозольные рибосомы: A, эукариотические митохондриальные рибосомы).
В бактериальную рибосому трансплантировали различные версии эукариотического сайта связывания лекарственного средства (WO 2008/092690), в результате чего получали гибридные рибосомы, которые обозначали как митогибридные рибосомы, цитогибридные рибосомы, рибосомы, несущие мутацию глухоты 1555G, рибосомы, несущие мутацию глухоты 1494U (см. описание применяемых методологии, основных принципов и гибридных рибосом у Hobbie и др.. Nucleic Acids Res., 35, 2007, cc.6086-6093; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 105, 2008, cc.3244-3249; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 105, 2008, cc.20888-20893).
Чувствительность рибосом к лекарственному средству изучали путем измерения минимальных ингибирующих концентраций согласно методу, описанному у Pflster и др., Animicrob. Agents Chemother., 47, 2003, cc.1496-1502. Для рекомбинантов, несущих соответствующие обусловленные мутациями изменения, проводили определение минимальных ингибирующих концентраций (MIC) с целью оценки чувствительности рибосом к лекарственному средству. Культуры, полученные из индивидуальных колоний, выращивали в среде LB, дополненной 0,05% Твин 80, и использовали при проведении тестов по определению MIC в формате титрационного микропланшета. Стартовые культуры содержали 200 мкл бактериальных клеток с оптической плотностью 0,025 при 600 нм, соответствующее лекарственное средство добавляли в виде двукратных серийных разведении. Величину MIC определяли как концентрацию лекарственного средства, при которой имело место полное ингибирование роста культур после инкубации в течение 72 ч при 25°C, что соответствовало 24 поколениям. Как следует из результатов, представленных в таблице 7, по сравнению с тобрамицином, гентамицином и неомицином апрамицин обладает более выраженной избирательностью в отношении бактериальных рибосом. Об этом свидетельствует тот факт, что активность апрамицина в отношении бактериальных рибосом дикого типа оказалась сходной с активностью тобрамицина, гентамицина и неомицина, но он обладал намного меньшей активностью в отношении мутантных рибосом, несущих «гуманизированные» сайты связывания лекарственного средства. Таким образом, апрамицин оказывает меньшее воздействие на митохондриальную и цитозольную рибосому млекопитающих, чем поступающие в продажу 4,5- и 4,6-аминогликозиды.
Таблица 7
Активность апрамиципа в отношении рекомбинантных рибосом
Бактериальные рибосомы
Митогибридные рибосомы
Рибосомы с мутацией глухоты 1555G
Рибосомы с мутацией глухоты 1494U
Цитогибридные рибосомы
апрамицин
1-2
1024
1024
1024
>1024
тобрамицин
1
128
16
16
512
гентамицин
1
128
16
16
10214
неомицин
1
32
8
8
1024
Пример 8: Кохлеатоксичность in vitro (таблица 8)
Кохлеарные эксплантаты, полученные из организма новорожденных мышей, обрабатывали 0,5 мМ аминогликозидом в течение 24 ч; после чего оценивали с помощью эпифлуоресцентного микроскопа повреждение волосковых клеток. Результаты представлены в таблице 8 и на фиг.1.
Таблица 8
Количество волосковых клеток
гентамицин неомицин
отсутствуют почти все волосковые клетки (внутренние и наружные)
апрамицин
нет потери волосковых клеток (<5%)
контроль без лекарственного средства
нет потери волосковых клеток (<5%)
Пример 9: Общая токсичность
Морским свинкам в течение 14 дней системно вводили аминогликозиды один раз в день в дозах, указанных в таблице 9, и затем осуществляли мониторинг в течение еще 14 дней.
Результаты представлены в таблице 9.
Таблица 9
Лекарственное средство
мг/кг в пересчете на основание
Эквивалентная доза гентамицина (мг/кг) в пересчете на основание
Количество животных
Результаты обследования
гентамицин
120
120
6
Нормальное прибавление веса
140
140
8
Значительная потеря веса
160
160
3
2 из 3 животных погибло
Лекарственное средство
мг/кг в пересчете на основание
Эквивалентная доза гентамицина (мг/кг) в пересчете на основание
Количество животных
Результаты обследования
апрамицин
152
132
2
Нормальное прибавление веса
184
160
1
Нормальное прибавление веса
217
188
5
Нормальное прибавление веса
355
309
2
Снижениеприбавления веса
432
376
5
Снижение прибавления веса
649
564
5
Снижение прибавления веса
По окончании эксперимента по одному животному из групп, которые обрабатывали апрамицином в дозах 432 и 649 мг/кг, подвергали некроскопии. У животных было выявлено хорошее общее состояние здоровья; не было обнаружено значительных повреждений и макроскопических патологий в системе интегумента, дыхательной системе, сердечно-сосудистой системе, мочеполовой системе, эндокринной системе, нервной системе, лимфатической системе, скелетно-мышечной системе и желудочно-кишечной системе.
Гистопатология почек, доза апрамицина 432 мг/кг.
Описание: небольшое количество мелких лимфоплазмоцитарных агрегатов в почечном интерстиции. Указанные изменения затрагивали менее 5% почечной массы на срезах.
Интерпретация: умеренное многоочаговое интерстициальное лимфоплазмоцитарное воспаление.
Комментарии: Степень воспаления в интерстиции минимальна и ее следует рассматривать как случайное фоновое проявление для видов животных. Канальцевый некроз или другие проявления нефротоксичности гистологическим путем не выявлены.
Гистопатология почек, доза апрамиципа 649 мг/кг.
Описание: небольшое количество мелких очагов канальцевой дегенерации и регенерации в поверхностном корковом слое. Указанные изменения затрагивали менее 5% почечной массы на срезах.
Интерпретация: умеренный многоочаговый канальцевый некроз.
Комментарии: В рассматриваемых срезах очаги канальцевого некроза минимальны и маловероятно, что они нарушали почечную функцию.
Пример 10: Кохлеатоксичность in vivo по результатам оценки слухового ответа ствола головного мозга (ABR) (фиг.2б)
Морским свинкам системно вводили в течение 14 дней аминогликозиды один раз в день в указанных дозах, после этого им давали восстановиться в течение 14 дней, затем осуществляли оценку ABR после обработки. Результаты представлены на фиг.2б.
Пример 11: Синтез производных апрамицина
С использованием стандартных процедур синтезировали следующие соединения:
9
10
13
16
ETH 99: Соединение формулы (II), в которой RR обозначает C=O, R обозначает γ-амино-α-гидроксибутирил, R обозначает метил, а все остальные заместители представляют собой водород, тетрауксусная соль;
7
16
ETH 100: Соединение формулы (II), в которой R обозначает γ-амино-α-гидроксибутирил, R обозначает метил, а все остальные заместители представляют собой водород, тетрауксусная соль;
3
7
16
ETH 101: Соединение формулы (II), в которой R и R обозначают γ-амино-α-гидроксибутирил, R обозначает метил, а все остальные заместители представляют собой водород, тетрауксусная соль;
7
ETH 102: Соединение формулы (II), в которой R обозначает γ-амино-α-гидроксибутирил, R обозначает метил, а все остальные заместители представляют собой водород, тетрауксусная соль;
7
16
ETH 103: Соединение формулы (II), в которой R обозначает γ-фталоиламино-α-гидроксибутирил, R обозначает метил, а все остальные заместители представляют собой водород, тетрауксусная соль;
13
16
ETH 105: Соединение формулы (II), в которой R обозначает γ-амино-α-гидроксибутирил, R обозначает метил, а все остальные заместители представляют собой водород, тетрауксусная соль.
Схема 1
2
3
2
2
2
2
2
2
2
Реагенты и условия: a) ZCl, NaCO, MeOH/HO; 74%. б) NaH, ДМФ; 68%. в) Pd(OH)/C, H (1 атм), диоксан/AcOH/HO 4:4:1; 95% соединения 10·3 AcOH; 90% соединения 12·4 AcOH; 85% соединения 14·4 AcOH, т.е. ETH 99, и 12% соединения 15, т.е. ETH 105 (из соединения 13). г) Ba(OH)-HO, диоксан/HO 2:1; 70% соединения 11. д) (бензилокси-(8)-4-карбониламино)-2-гидроксимасляная кислота, N-гидроксисукцинимид, DCC, EtsN, ТГФ; 85%.
1,3,2,7',4”-Пентакис-N-(бензилоксикарбонил)апрамицин (соединение 8)
2
3
2
2
3
f
3
3
2
eq
eq
ax
ax
3
2
61
71
5
2l
25
1
13
+
+
Бензилоксикарбонилхлорид (26,9 г, 157 ммолей) добавляли по каплям при интенсивном перемешивании к смеси апрамицина (соединение 1; 10 г, 18,5 ммоля) и NaCO (29,5 г, 278 ммолей) в смеси 3:7 HO/MeOH (240 мл) при 0°C. Смесь перемешивали в течение 30 мин при 0°C и в течение 20 ч при 26°C. После добавления MeOH (200 мл) неорганический осадок удаляли фильтрацией и выпаривали фильтрат.Остаток растирали с HO. Водную фазу удаляли. Органическую фазу растворяли в MeOH/AcOEt и предварительно адсорбировали на силикагель. После FC (AcoEt/CHCl/MeOH 4:4:0→4:4:1) получали соединение 8 (8,95 г, 74%). Твердое вещество белого цвета. R (CHCl/AcOEt/MeOH 4:4: 1) 0,35. ИК (ATR): 3388w, 3331 w, 2944w, 1692s, 1520m, 1454m, 1405m, 1306m, 1246m, 1141m, 1074m, 1016s, 996s, 772m, 735m, 695s. [a]D=+68,7 (c=1,0, MeOH). H-ЯМР (600 МГц, CDOD): 7,44-7,19 (m, 25H аром.); 5,34-5,24 (m, H-C(1'), H-C(8'), H-C(1”)); 5,17-4,97, 4,18-4,09, 3,89-3,73, 3,70-3,37, 3,24-3,18 (несколько m, H-C(1), H-C(3), (H-C(4), H-C(5), H-C(6), H-C(2'), H-C(4'), H-C(5'), H-C(6'), H-C(7'), H-C(8'), H-C(2”), H-C(3”), H-C(4”), H-C(5”), H-C(6”), 5 CHPh); 3,11 (s, NMe); 2,09-2,03 (m, H-C(2), H-C(3')); 1,77 (q, J=11,8, H-C(3')); 1,46 (q, J=12,5, H-C(2)). C-ЯМР (150 МГц, CDOD): 159,77, 159,11, 158,68, 158,67, 158,20 (5 s, 5 C=0); 138,36, 138,31, 138,27, 138,05, 138,02 (5s аром.); 129,52-128,89 (несколько d аром.); 101,15 (d, C(1')); 99,60 (d, C(l")); 98,50 (d, C(8')); 96,29, 95,75 (2 d); 92,30 (d); 85,30, 82,78, 78,62, 76,64, 76,34 (5 d); 74,10, 74,04, 73,78, 71,87, 71,66, 71,48 (6d); 68,71, 67,78, 67,69, 67,66, 67,56 (5t, 5 PhCH); 68,09, 67,98 (2d); 66,69 (d); 63,19 (t, (6”)); 62,83, 60,97 (2d); 55,51, 54,78, 52,91, 52,15, 51,88, 51,71, 51,45 (7d); 33,39, 31,40 (2 t, C(2), C(3')); 30,11 (q, N/Me). HR-MALDI-MC: 1232,4540 (100, [M+Na], CHNNaO ; рассчитано 1232,4539).
1.3,2'-Трис-N-(бензилоксикарбонил)-7'-N,6'-O-карбонил-4”-N-6”-O-карбонилапрамицин (соединение 9)
3
f
2
D
5
2
eq
ax
eq
eq
ax
ax
5
2
47
55
5
19
25
1
13
+
+
Раствор соединения 8 (3,123 г, 2,58 ммоля) в безводном ДМФ (20 мл) обрабатывали NaH (198 мг, 5,16 ммоля, 60%-ная дисперсия в минеральном масле) при 0°C. Реакционной смеси давали нагреться до 26°C в течение 2 ч и перемешивали еще в течение 2 ч при 26°C. Реакцию прекращали путем добавления 1н. водн. АсОН (5 мл) и реакционную смесь выпаривали досуха. Полученный сироп растворяли в MeOH/AcOEt и предварительно адсорбировали на силикагель. После FC (AcOEt/CHCl/MeOH 4:4:0→4:4:1) получали соединение 9 (1,75 г, 68%), твердое вещество белого цвета. R (CHCl/AcOEt/MeOH 4:4:1) 0,20. ИК (ATR): 3317w (br.), 2937w, 1750 (sh.), 1704s, 1697s, 1525m, 1454m, 1410m, 1339m, 1256m, 1139m, 1075s, 1027s, 1002s, 980s, 757m, 739s, 697s. [a] =+64,6 (c=1,0, MeOH/45 мкл DMSO). H-ЯМР (600 МГц, Pyr-d): 9,49 (s, HN-C(4”)); 8,35 (s, HN-C(1), HN-C(3)); 7,79 (s, HN-C(2')); 7,45-7,26 (m, 15H аром.); 5,83-5,63 (m, H-C(1'), H-C(1”)); 5,40-5,06 (m, H-C(6”), H-C(8'), 3 CHPh); 5,00 (br. s, 4 OH); 4,50-1,46 (H-C(4”), H-C(6”)); 4,33 (t, J=10,3, H-C(6”)); 4,24-4,12 (m, H-C(4), H-C(2'), Н-С(2”), Н-С(5”)); 4,02-3,97 (m, Н-С(1), Н-С(5)); 3,87-3,78 (m, H-C(3), H-C(4'), H-C(5')); 3,68 (t, J=9,7, H-C(3”)); 3,43 (br. d, J=9,0, H-C(7')); 2,87 (s, NMe); 2,61-2,58 (m, H-C(3')); 2,39-2,37 (m, H-C(2)); 2,31 (q, J=11,6, H-C(3')); 2,23-2,19 (m, H-C(2)). C-ЯМР (150 МГц, Pyr-d): 157,91, 157,19, 156,70, 156,46, 153,19 (5s, 5 С=O); 138,14, 137,95, 137,34 (3s аром.); 128,99-128,14 (несколько d аром.); 100,29 (d, C(1')); 96,04 (d, C(1”)); 91,07 (d, C(8')); 84,03 (d, C(4)); 78,16, 76,31, 73,11 (3d, C(4'), C(5'), C(2”)); 71,83 (d, C(4”)); 70,31 (d, C(6')); 68,37 (t, C(6”)); 66,69, 66,27, 66,29 (3t, 3 Phch); 66,21 (d, C(5)); 65,81 (d, C(6)); 63,88 (d, C(5”)); 59,65 (d, (7')); 58,13 (d, C(3”)); 52,82 (d, C(1)); 51,79 (d, C(3)); 51,39 (d, C(2')); 35,23, 32,49 (2 t, C(2), C(3')); 29,66 (q, NMe). HR-MALDI-MC: 1016,3383 (100, [M+Na], CHNNaO ; рассчитано 1016,3389).
Триацетат 7'-N,6'-O-карбонил-4”-N,6”-O-карбонилапрамицина (соединение 10)
2
2
2
2
2
2
2
eq
ax
eq
eq
ax
2
ax
2
22
40
5
12
1
13
+
+
Раствор соединения 9 (30 мг, 30 мкмолей) в 80% водн. AcOH (1,0 мл) и диоксане (0,8 мл) обрабатывали 20% Pd(OH)/C (30 мг) и перемешивали в атмосфере H (1 атм) в течение 15 ч. Смесь фильтровали через целит, промывали с помощью HO и выпаривали фильтрат. Раствор остатка в HO промывали с помощью CHCl. После лиофилизации водного раствора получали соединение 10-3 AcOH (22 мг, 95%). Твердое вещество светло-коричневого цвета. ИК (ATR): 3349w (br.), 3222w (br.), 2924w, 1747m, 1707m, 1552s, 1407s, 1147m (sh), 1098m (sh), 1078m (sh), 1026s (sh), 980s, 760m. H-ЯМР (500 МГц, DO): 5,63 (d, J=3,4, H-C(1')); 5,35 (d, J=3,8, H-C(1”)); 5,24 (d, J=1,7, H-C(8')); 5,06 (dd, J=9,4, 3,2, H-C(6')); 4,67 (включен в сигнал HOD), H-C(5')); 4,30 (dd, J=9,8, 4,9, H-C(6”)); 4,20 (dd, J=9,4, 1,7, H-C(7')); 4,13 (t, J=10,4, H-C(6”)); 3,98 (td, J=10,1, 4,8, H-C(5”)); 3,88 (td, J=10,9, 4,0, H-C(4')); 3,82 (t, J=9,7, H-C(4)); 3,70 (dd, J=9,5, 4,0, H-C(2”)); 3,64-3,60 (m, H-C(3”); 3,54 (m, H-C(5), H-С(2')); 3,47 (t, J=9,7, Н-С(6)); 3,40-3,34 (m, H-C(3)); 3,27-3,19 (m, H-C(1), H-C(4”)); 2,82 (s, HMe); 2,40 (dt, J=12,8, 4,0, H-C(2)), 2,28 (dt, J=10,9, 4,3, H-C(3')); 1,98 (q, J=12,0, H-C(3')), 1,82 (br. s, 3 MeCO); 1,73 (q, J=12,9, H-C(2)). C-ЯМР (125 МГц, DO): 180,17 (s, 4 000); 159,02 (s, MeNC=0); 155,21 (s, HNC=0); 95,56 (d, C(1')); 94,56 (d, C(1')); 90,18 (d, C(8')); 78,27 (d, C(4)); 74,97 (d, C(5)); 72,35 (d, C(6)); 70,52 (d, C(2”)); 69,63 (d, C(3”)); 69,20 (d, C(6')); 67,62 (t, C(6”)); 65,11 (d, C(5')); 64,03 (d, C(4')); 61,99 (d, C(5”)); 58,87(d, C(7')); 55,52 (d, C(4”)); 49,58 (d, C(1)); 48,42 (d, C(3)); 47,71 (d, C(2')); 29,08 (q, NMe); 28.51, 28,39 (2t, C(2), C(3')); 22,81 (q, 3 MeC=O). HR-MALDI-MC: 566,2670 (100, [M+H] CHNO ; рассчитано 566,2673).
1,3,2'-Трис-N-(бензилоксикарбонил)-7'-N,6'-O-карбонилапрамицин (соединение 11)
2
2
2
2
2
3
f
3
5
2
2
eq
eq
ax
ax
5
2
46
57
5
18
25
1
13
+
+
Раствор соединения 9 (0,2 г, 0,2 ммоля) в смеси 2:1 диоксан/HO (15 мл) обрабатывали Ba(OH)·HO (76 мг, 0,4 ммоля) и перемешивали при 70°C в течение 3 ч. После охлаждения до комнатной температуры смесь нейтрализовали с помощью CO и упаривали. HO удаляли путем совместного выпаривания с толуолом. Остаток растворяли в МеОН и фильтровали через целит. Объединенные фильтрат и смывы упаривали. После FC (CHCl/MeOH/водн. МНз (25%) 80:20:0→80:15:5) получали соединение 11 (136 мг, 70%), твердое вещество белого цвета. R (CHCI3/МеОН/водн. NH (25%) 70:15:2) 0,20. ИК (ATR): 3306w (br.), 2937w, 1744m (sh.), 1690s, 1530m, 1455m, 1392m, 1302m (sh.), 1255m, 1224m, 1131 m, 1070m (sh.), 1032s, 1000s, 852m, 736m, 696s. [a]n=+64,7 (с=0,5, MeOH). H-ЯМР (600 МГц, Pyr-d): 8,56 (d, J=8,1, HN-C(1)); 8,41 (d, J=8,4, HN-C(3)); 8,00 (d, J=7,3, HN-C(2')); 7,46-7,22 (m, 15H аром.); 5,80-5,76 (m, H-C(1'), H-C(1')); 5,47-5,01 (m, H-C(6'), H-C(7'), H-C(8'), 3 CHPh, NH, 5 OH); 4,44 (t, J=9,2, H-C(5”)); 4,38 (dd, J=11,7, 2,6, H-C(6”)); 4,23-1,17, 4,07-1,04, 4,00-3,84 (несколько m, H-C(1), H-C(3), H-C(4), H-C(5), H-C(6), H-C(2'), H-C(4'), H-C(1”), H-C(2”), H-C(3”)); 3,43 (dd, J=8,8, 2,3, H-C(5')); 3,34 (t, J=9,6, H-C(4”)); 2,87 (s, NMe); 2,55-2,52 (m, H-C(3')); 2,45-2,41 (m, H-C(2)); 2,34 (q, J=11,7, H-C(3')); 2,22 (q, J=12,7, H-C(3')). C-ЯМР (150 МГц, Pyr-d): 157,87, 157,22, 156,76, 156,59 (4s, 4 C=O); 138,15, 137,98, 137,49 (3s аром.); 129,03-128,16 (несколько d аром.); 100,16 (d, C(1')); 95,29 (d, C(1”)); 91,00 (d, C(8')); 83,73 (d); 78,24, 76,34, 76,04, 74,67, 73,37, 70,74 (6d); 66,72, 66,30, 66,25, (3t, 3 PhCH); 66,35, 65,84 (d); 63,30 (t, C(6”)); 59,65 (d); 55,72 (d); 52,81, 51,79, 51,31 (3d); 35,50, 32,73 (2t, C(2), C(3')); 29,77 (q, NMe). HR-MALDI-MC: 990,3590 (100, [M+Na], CHNNaO ; рассчитано 990,3590).
Тетраацетат 7'-N,6'-O-карбонилапрамицина (соединение 12)
2
2
2
2
2
2
2
eq
eq
ax
2
ax
2
22
39
5
12
22
40
12
1
13
+
+
+
Раствор соединения 11 (30 мг, 31 мкмоль) в 80% водн. AcOH (1,0 мл) и диоксане (0,8 мл) обрабатывали 20% Pd(OH)/C (30 мг) и перемешивали в атмосфере H (1 атм) в течение 15 ч. Смесь фильтровали через целит, промывали HO. Объединенные фильтрат и смывы упаривали. Раствор остатка в HO промывали CHCl. После лиофилизации водного раствора получали соединение 12-4 AcOH (22,5 мг, 90%), твердое вещество светло-коричневого цвета. ИК (ATR): 3321 w (br.), 3162w (br.), 2928w, 1742m, 1539s, 1403s, 1338m, 1030m (sh), 988s, 925m, 759m. H-ЯМР (500 МГц, DO): 5,64 (br. s, H-C(1')); 5,39 (d, J=3,4, H-C(1”)); 5,28 (br. s, H-C(8')); 5,09 (dd, J=9,3, 3,3, H-C(6')); 4,76 (включен в сигнал HOD), H-C(5')); 4,24 (dd, J=9,3, 1,5, H-C(7')); 3,97-3,88 (m, H-С(4'), Н-С(3”)); 3,82-3,69 (m, Н-С(4), Н-С(2”), Н-С(5”), 2 H-C(6”)); 3,60-3,56 (m, Н-С(5), Н-С(2')); 3.51 (t, J=9,7, Н-С(6)); 3,35-3,29 (m, H-C(3)); 3,26 (td, J=14,1, 6,9, H-C(1)); 3,20 (t, J=10,0, H-C(4”)); 2,88 (s, NMe); 2,41-2,39 (m, H-C(2)), 2,36-2,33 (m, H-C(3')); 2,03 (q, J=12,0, H-C(3')), 1,88 (br. s, 4 MeCO); 1,73 (q, J=12,9, H-C(2)). C-ЯМР (125 МГц, DO): 181,07 (s, 4 CO=O); 159,16 (s, MeNC=O); 95,84 (d, C(1')); 93,57 (d, C(1”)); 90,46 (d, C(8')); 79,45 (d, C(4)); 75,18 (d, C(5)); 72,63 (d, C(6)); 70,52 (d, C(2”)); 69,63, 69,20 (2 d, C(6'), C(3”)); 65,52 (d, C(5')); 64,24 (d, C(4'); 62,41 (d, C(5”)); 60,16 (t, C(6”)); 59,08 (d, C(7')); 52,17 (d, C(4”)); 49,84 (d, C(1)); 48,50 (d, C(3)); 47,88 (d, C(2')); 29,25 (q, NMe); 28,56, 28,26 (2t, C(2), C(3')); 22,99 (q, 4 MeC=O). HR-MALDI-MC: 588,2495 (27, [M+Na], CHNNaO ; рассчитано 588,2493), 566,2673 (52, [M+H], CHN5O; рассчитано 566,2673).
1.3.2'-Трис-N-(бензилоксикарбонил)-7'-N,6'-O-карбонил-4”-N-[(2S)-4-амино-2-гидроксибутирил]апрамицин (соединение 13)
2
2
3
3
f
3
3
D
3
2
2
2
2
2
eq
eq
2
3
ax
ax
3
58
70
6
22
25
1
13
+
+
Смесь, содержащую (бензилокси-(S)-4-карбониламино)-2-гидроксимасляную кислоту (19 мг, 75 мкмолей), N-гидроксисукцинимид (8,6 мг, 75 мкмолей) и DCC (15,4 мг, 75 мкмолей) в безводном ТГФ (2 мл), перемешивали при 26°C в течение 2,0 ч. Смесь обрабатывали раствором соединения 11 (60 мг, 62 мкмоля) и триэтиламина (17 мкл, 122 мкмоля) в безводном ТГФ (3 мл) и перемешивали в течение 20 ч. После упаривания получали твердое вещество белого цвета, которое растворяли в CHCl/MeOH и предварительно абсорбировали на силикагеле. После FC (CHCl/MeOH/водн. NH (25%) 90:10:0→90:10:1) получали соединение 13 (63 мг, 85%), твердое вещество белого цвета. R (CHCl/MeOH/водн. NH (25%) 75:15:2) 0,9. ИК (ATR): 3330m (br.), 2936w, 1748w(sh), 1696s, 1527s, 1454w, 1407w, 1263m, 1141 m, 1033s, 1002s, 738m, 697m. [a] =+52,6 (с=0,5, МеОН). H-ЯМР (500 МГц, CDOD): 7,44-7,25 (m, 20H аром.); 5,23 (d, J=3,8, H-C(1')); 5,14 (br. s, H-C(8'), H-C(1')); 5,09-5,00 (m, 4 CHPh); 4,99 (br. d, J=7,8, H-C(6')); 4,66 (dd, J=9,3, 2,1, H-C(7')); 4,58 (dd, J=10,5, 2,7, СН(ОН)СНСН); 4,12 (m, H-C(4')); 3,95 (t, J=9,5, H-C(4)); 3,70-3,43 (m, H-C(5), H-C(6), H-C(2'), H-C(5'), H-C(2”), H-C(3”), H-C(4”), H-C(5”), 2 H-C(6”)); 3,33-3,20 (m, H-C(1), H-C(3), CH(OH)CHCH); 2,78 (s, NMe); 2,15-2,07 (m, H-C(2), H-C(3')); 2,01-1,85 (m, CH(OH)CHCH), H-C(3')); 1,55 (q, J=12,1, H-C(2)). C-ЯМР (125 МГц, CDOD): 177,67 (s, NC=O); 159,79 (s, MeNC=O); 159,03, 158,70, 158,13, 158,05 (5 s); 138,44, 138,38, 138,26, 138,03 (4 s аром.); 129,79-128,83 (несколько d аром.); 101,12 (d, C(1')); 96,18 (d, C(1”)); 92,46 (d, C(8')); 85,20 (d, C(6)); 78,11 (d); 76,31 (d); 73,87 (d); 73,71 (d); 71,58 (d); 70,94, 67,92, 67,63, 67,44 (4 t, 4 PhCH2); 66,65 (t, (6”)); 63,14 (d); 60,88 (d); 53,48 (d); 52,74 (d); 52,19 (d); 51,88 (d); 38,12 (t); 35,81 (t); 35,39 (t); 33,00 (t); 30,03 (q, NMe). HR-MALDI-MC: 1225,4458 (100, [M+Na], CHNNaO ; рассчитано 1225,4435).
Тетраацетат 7'-N,6'-O-карбонил-4”-N-[(2S)-4-амино-2-гидроксибутирил]апрамицина (соединение 14, т.е. ETH 99)
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
eq
eq
a
ax
b
2
ax
2
2
2
2
2
2
26
45
3
14
1
13
-
-
Раствор соединения 13 (25 мг, 21 мкмоль) в 80% водн. AcOH (1,0 мл) и диоксане (0,8 мл) обрабатывали 20% Pd(OH)/C (25 мг) и перемешивали в атмосфере H (1 атм) в течение 15 ч. Смесь фильтровали через целит, промывали HO. Объединенные фильтрат и смывы упаривали. Раствор остатка в HO промывали CHCl. После лиофилизации водного раствора получали соединение 14, т.е. ETH 99 (16 мг, 85%), твердое вещество светло-коричневого цвета. ИК (ATR): 3170w (br.), 2936w, 1747w, 1548s, 1403s, 1339m, 1038m (sh), 992s, 759m. H-ЯМР (500 МГц, DO): 5,69 (d, J=3,6, H-C(1')); 5,41 (d, J=3,8, H-C(1”)); 5,33 (d, J=2,1, H-C(8')); 5,16 (dd, J=9,3, 3,4, H-C(6')); 4,80 (включен в сигнал HOD), H-C(5')); 4,35 (dd, J=8,2, 4,0, CH(OH)CH); 4,29 (dd, J=9,3, 2,1, H-C(7')); 3,99 (td, J=11,0, 4,1, H-C(4')); 3,90-3,74 (m, H-C(4), H-C(2”), H-C(3”), H-C(4”), H-C(5”)); 3,68-3,54 (m, H-C(5), H-C(6), H-C(2'), 2 H-C(6”)); 3,32-3,26 (m, H-C(1), H-C(3)); 3,21-3,14 (m, CH(OH)CHCH); 2,94 (s, NMe); 2,43-2,38 (m, H-C(2), H-C(3')); 2,22-2,16 (m, CH(OH)CH); 2,11 (q, J=12,1, H-C(3')), 2,06-2,00 (m, CH(OH)CH); 1,88 (br. s, 4 MeCO); 1,76 (q, J=12,1, H-C(2)). C-ЯМР (125 МГц, DO): 180,17 (s, 4 OC=O); 175,83 (s, NC=O); 159,03 (s, MeNC=O); 95,67 (d, C(1')); 93,57 (d, C(1”)); 90,12 (d, C(8')); 80,15 (d, C(4)); 75,13 (d, C(5)); 72,67 (d, C(6)); 71,29 (d, C(2”)); 70,73 (d, C(3”)); 69,44, 69,33, 69,30 (3d, CHCH(OH)CO), С(6'), С(5”)); 65,12, 64,12 (2d, C(4”), C(5')); 60,46 (t, C(6”)); 59,02 (d, C(7')); 51,11 (d, C(4”)); 49,85 (d, C(1)); 48,40 (d, C(3)); 47,82 (d, C(2')); 36,34 (t, CH(OH)CHCH); 30,68 (t, CH(OH)CHCH); 29,85 (d, C(2)); 29,10 (q, NMe); 28,65 (t, C(3')); 22,98 (q, 4 MeC=O). HR-MALDI-MC (режим отрицательных ионов): 665,3001 (100, [M-H], CHHO ; рассчитано 665,2994;
4”-N-[(2S)-4-Амино-2-гидроксибутирил]апрамицин (соединение 15. т.е. ETH 105)
2
2
2
2
2
3
3
3
3
2
2
2
2
2
3
2
2
2
2
2
eq
a
2
eq
b
2
ax
ax
25
48
6
13
25
49
6
13
1
+
+
+
+
Раствор соединения 13 (50 мг, 41,6 мкмоля) в смеси 2:1 диоксан/HO (9 мл) обрабатывали Ba(OH)·HO (15,7 мг, 83 мкмоля) и перемешивали при 50°C в течение 6 ч. После охлаждения до комнатной температуры смесь нейтрализовали с помощью CO и упаривали (HO удаляли путем совместного упаривания с толуолом). Остаток растворяли в MeOH и фильтровали через целит. Объединенные фильтрат и смывы упаривали. Остаток фильтровали через небольшую подушку из силикагеля (CHCl/MeOH/водн. NH (25%) 80:20:0→80:15:1). Фракции, элюированные с использованием CHCl/MeOH/водн. NH (25%) 80:15:1 (MALDI-MC: 1196,5) собирали и упаривали. Раствор остатка (5,0 мг) в 80% водном растворе AcOH (1,0 мл) обрабатывали 20% Pd(OH)/C (5 мг) и перемешивали в атмосфере H (1 атм) в течение 15 ч. Смесь фильтровали через целит, промывали HO. Объединенные фильтрат и смывы выпаривали. Раствор остатка в HzO промывали CHCl. После осуществления лиофилизации и FC (MeOH/водн. NH (25%) 7:3) получали соединение 15, т.е. ETH 105 (3,2 мг, 12%), твердое вещество белого цвета. ИК (ATR): 3284w (br.), 2928w, 1637m, 1573m, 1455m, 1387m, 1336m, 1086s 1028s, 993s, 834m. H-ЯМР (600 МГц, DO): 5,37 (d, J=3,7, H-C(1')); 5,05 (d, J=3,6, H-C(1”)); 4,85 (d, J=9,0, H-C(8')); 4,33-1,26 (m, H-C(6'), СН(ОН)СНСН); 3,90-3,45 (несколько m, H-C(2'), H-C(5'), Н-С(2”), Н-С(3”), Н-С(4”), Н-С(5”), 2 Н-С(6”)); 3,47 (td, J=9,0, 3,7, H-C(5)); 3,29 (t, J=9,0, H-C(6)); 3,17-2,97 (m, H-C(4), H-C4'), CH(OH)CHCH); 2,88-2,84 (m, H-C(1)); 2,80-2,72 (m, H-C(3)); 2,70 (dd, J=8,8, 2,8, H-C(7')); 2,34 (s, NMe); 2,12-2,06 (m, H-C(3'), CH(OH)CHCH); 2,02-1,90 (m, H-C(2), CH(OH)CHCH); 1,72-1,63 (m, H-C(3'); 1,26-1,19 (m, H-C(2). HR-MALDI-MC: 663,3178 (39, [M+Na], CHNNaO ; рассчитано 663,3177), 641,3359 (100, [M+H], CHNO ; рассчитано 641,3358).
Схема 2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Реагенты и условия: a) Zn(OAc)·2HO, ДМФЛ/HO; 42%. б) Pd(OH)/C, H (1 атм), диоксан/AcOH/HO 4:4:1; 90% соединения 18-4 AcOH, т.е. RTH 102; 80% соединения 21·4 AcOH, т.е. ETH 101; 90% соединения 22·4 AcOH, т.е. ЕТН 100. в) Ni(OAc) 4HO, ДМФ/HO; 10% соединения 19 и 45% соединения 20.
1-N-[(2S)-4-(Бензилоксикарбониламино)-2-гидроксибутирил]апрамицин (соединение 17).
2
3
2
3
3
f
2
3
2
2
2
2
eq
eq
ax
a
2
b
2
ax
2
2
2
2
2
2
2
2
33
54
6
15
33
55
6
l5
1
13
+
+
+
+
Раствор соединения 1 (400 мг, 0,74 ммоля) в смеси 1:5 HO/ДМФ (30 мл) обрабатывали дегидратом ацетата цинка (II) (652 мг, 2,97 ммоля, см. у Kirst и др., Tet. Lett., 22, 1981, с.295; Alien и др., J. Med. Chem., 30, 1987, с.333) и перемешивали в течение 1 ч. Смесь обрабатывали N-[(2S)-4-(бензилоксикарбониламино)-2-гидроксибутирил]сукцинимидом, DE 2555405) (соединение 16; 372 мг, 1,1 ммоля) и перемешивали в течение 15 ч при 26°C. После выпаривания растворителей остаток растворяли в CHCl/MeOH/водн. NH (25%) 3:3:1 и предварительно абсорбировали на силикагель. После осуществления FC (CHCl/MeOH/водн. NH (25%) 10:10:1→3:3:1→0:4:1) и лиофилизации получали соединение 17 (240 мг, 42%), пушистое твердое вещество белого цвета. R(MeOH/25% водн. МНз 4:1) 0,29. ИК (ATR): 33280w (br.),2944w, 1692w 1644w, 1531 m, 1454w, 1407w, 1337w, 1265w, 1058s, 1033s, 1000s, 858m, 735m, 695s. H-ЯМР (500 МГц, DO): 7,48-7,40 (m, 5H аром.); 5,69 (d, J=3,7, H-C(1')); 5,51 (d, J=3,9, H-C(1”)); 5,21 (d, J=8,5, H-C(8')); 5,13 (br. s, PhCH); 4,59 (t, J=2,7, H-C(6')); 4,21 (dd, J=8,4, 3,8, CH(OH)CHCH); 4,01-3,93 (m, H-C(4'), H-C(3”), Н-С(5”)); 3,90-3,86 (m, H-C(3)); 3,84-3,79 (m, H-C(6), H-С(5”), Н-С(6”)); 3,72-3,62 (m, Н-С(5), Н-С(2'), Н-С(2”)); 3,55 (t, J=12,0, Н-С(4)); 3,41-3,38 (m, H-C(1)); 3,36 (dd, J=8,5, 2,8, H-C(7')); 3,32-3,27 (m, СН(OH)CHCH); 3,13 (t, J=10,2, H-C(4”)); 2,81 (s, NMe); 2,40 (dt, J=7,8, 3,3, H-C(3')); 2,23 (dt, J=13,0, 4,1, H-C(2)); 2,05 (q, J=11,6, H-C(3')); 2,03-1,97 (m, CH(OH)CHCH); 1,88-1,78 (m, CH(OH)CHCH); 1,71 (q, J=12,7, H-C(2)). C-ЯМР (125 МГц, DO): 176,24 (s, C=O); 158,15 (s, C=O); 136,29 (s, аром.); 128,57-127,44 (несколько d, аром.); 95,74 (d, C(1')); 94,37 (d, C(1”)); 92,94 (d, C(8')); 75,61 (d, C(5)); 73,56 (d, C(4)); 70,27-69,01 (несколько d, C(6), C(4”), C(5'), C(2”), C(5”), CH(OH)CHCH); 66,64 (t, PhCH); 65,94 (d, C(3”)); 62,78 (d, C(6')); 60,30 (t, C(6”)); 59,38 (d, C(7')); 51,92 (d, C(4”)); 48,76 (d, C(1)); 48,60 (d, C(3)); 47,91 (d, C(2')); 36,35 (t, CH(OH)CHCH); 33,25 (t, CH(OH)CHCH); 30,88 (t, C(2)); 30,06 (q, NMe); 30,27 (t, C(3')). HR-MALDI-MC: 797,3538 (63, [M+Na], CHNNaO ; рассчитано 797,3545), 775,3707 (100, [M+H] CHNO ; рассчитано 77563725).
Тетраацетат 1-N-[(2S)-4-амино-2-гидроксибутирил]апрамицина (соединение 18. т.е. ETH 102).
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
a
2
eq
eq
b
2
ax
ax
2
2
2
2
2
2
2
2
2
25
48
6
13
25
49
6
13
1
13
+
+
+
+
Раствор соединения 17 (25 мг, 32 мкмоля) в 80% водн. AcOH (1,0 мл) и диоксане (0,8 мл) обрабатывали 20% Pd(OH)/C (25 мг) и перемешивали в атмосфере H (1 атм) в течение 15 ч. Смесь фильтровали через целит, промывали HO. Объединенные фильтрат и смывы выпаривали. Раствор остатка в HO промывали CHCl. После лиофилизации водного раствора получали соединение 18-4 АсОН, т.е. ЕТН 102 (25,6 мг, 90%), пушистое твердое вещество белого цвета. ИК (ATR): 3205m (br.), 1633m, 1540s, 1404s, 1339m, 1131s (sh.), 1102s, 996s. H-ЯМР (500 МГц, DO): 5,66 (d, J=3,5, H-C(1')); 5,44 (d, J=3,9, H-C(1”)); 5,16 (d, J=8,5, H-C(8')); 4,54 (t, J=1,7, H-C(6')); 4,28 (dd, J=7,8, 4,1, СН(ОН)СНСН); 3,96 (t, J=10,3, H-C(3”), H-C(5”)); 3,89 (td, J=10,8, 6,8, H-С(3)); 3,85-3,72 (m, H-C(6), Н-С(5')); 3,67-3,58 (m, H-C(4), H-C(2'), H-C(4'), H-C(2”), H-C(6”)); 3,50 (t, J=9,8, H-C(5)); 3,43-3,37 (m, H-C(1)); 3,33 (dd, J=8,4, 2,5, H-C(7')); 3,13-3,08 (m, H-C(4'), CH(OH)CHCH); 2,76 (s, NMe); 2,34 (dt, J=10,8, 5,0, CH(OH)CHCH); 2,20 (dt, J=12,9, 4,2, H-C(2)); 2,17-2,08 (m, H-C(3')); 2,03-1,92 (m, СН(OH)CHCH), H-С(3-)); 1,71 (q, J=12,7, H-C(2)). C-ЯМР (125 МГц, DO): 181,30 (s, MeCOH); 175,61 (s, C=O); 95,77 (d, C(1')); 94,65 (d, C(1”)); 93,11 (d, C(8')); 75,87 (d, C(4)); 73,78 (d, C(5)); 70,51 (d, C(2”)); 69,74-69,54 (несколько d, C(6), C(4'), C(5'), C(4”), C(5”), CH(OH)CHCH); 66,15 (d, C(3”)); 62,93 (d, C(6')); 60,54 (t, C(6”)); 59,56 (d, C(7')); 52,23 (d, C(4”)); 49,06 (d, C(1)); 48,78 (d, C(3)); 48,12 (d, C(2')); 36,58 (t, CH(OH)CHCH); 30,89 (t, C(2)); 30,70 (t, C(3')); 30,27 (q, NMe); 27,24 (t, CH(OH)CHCH); 23,29 (MeCOH). HR-MALDI-MC: 663,3180 (24, [M+Na], CHNNaO ; рассчитано 663,3177), 641,3363 (52, [M+H] CHNO ; рассчитано 641,3358).
3,2'-Бис-М-[(28')-4-(бензилоксикарбониламино)-2-гидроксибутирил]апрамицин (соединение 19) и 2'-N-[(2S)-4-(бензилоксикарбониламино)-2-гидроксибутирил]апрамицин (соединение 20).
3
3
3
f
3
2
2
2
2
2
2
a
2
eq
ax
45
67
7
19
45
68
7
19
f
3
2
2
2
2
2
2
eq
eq
ax
ax
2
2
2
2
2
2
2
2
33
54
6
15
33
55
6
15
+
+
+
+
1
13
+
+
+
+
Раствор соединения 1 (200 мг, 0,37 ммоля) в смеси 1:4 Н20/ДМФ (25 мл) обрабатывали тетрагидратом ацетата никеля(П) (369 мг, 1,48 ммоля, см. у Kirst и др., Tet. Lett., 22, 1981, с.295; Alien и др., J. Med. Chem., 30, 1987, с.333) и перемешивали в течение 1 ч. Смесь обрабатывали N-[(2S)-4-(бензилоксикарбониламино)-2-гидроксибутирил]сукцинимидом (16; 194 мг, 0,55 ммоля) и перемешивали в течение 15 ч при 26°C. После выпаривания растворителей остаток растворяли в смеси CHCl/MeOH/водн. NH (25%) 3:3:1 и предварительно адсорбировали на силикагель. После осуществления FC (CHCl/MeOH/водн. NH3 (25%) 10:10:1→3:3:1→0:4:1) и лиофилизации получали соединение 19 (37 мг, 10%) и соединение 20 (129 мг, 45%). Данные для соединения 19: пушистое твердое вещество белого цвета. R (MeOH/25% водн. NH 4:1) 0,42. ИК (ATR): 3242w (br.), 2940w, 1692w, 1646w, 1532w, 1455w, 1341w, 1267w, 1054s, 1033s, 1000s, 860w, 735m, 697m. 'Н-ЯМР (400 МГц, DO): 7,41-7,32 (m, 10H аром.); 5,40, 5,38 (2 d, J=3,7, H-C(1'), H-C(1')); 5,10 (d, J=8,5, Н-С(8')); 5,05 (t, J=10,6, 2 PhCH); 4,50 (t, J=2,6, H-C(6')); 4,18-4,12 (m, 2 CH(OH)CHCH); 4,07-3,34 (m, 12H); 3,28-3,14 (m, H-C(7'), 2 CH(OH)CHCH); 3,06-2,98 (m, 1H); 2,73 (s, NMe); 2,42-2,30 (m, 2 CH(OH)-CHCH); 2,14-2,02 (m, H-C(2)); 1,98-1,88 (m, 2H); 1,84-1,69 (m, 2H); 1,66-1,56 (m, H-C(2)). HR-MALDI-MC: 1032,4340 (63, [M+Na], CHNNaO ; рассчитано 1032,4349), 1010,4579 (100, [M+H], CHNO ; рассчитано 1010,4570). Данные для соединения 20: Твердое вещество белого цвета. R (MeOH/25% водн. NH 4:1) 0,15. ИК (ATR): 3280w(br.), 2944w, 1692w, 1644w, 1531 w, 1454w, 1337w, 1265w, 1058s, 1033s, 1000s, 858w, 735m, 695m. H-ЯМР (400 МГц, DO): 7,44-7,35 (m, 5H аром.); 5,50 (d, J=3,0, H-C(1')); 5,43 (d, J=3,9, H-C(1”)); 5,15 (d, J=8,5, H-C(8')); 5,07 (br. s, PhCH); 4,58 (t, J=2,6, H-C(6')); 4,15 (dd, J=7,7, 4,5, CH(OH)CHCH); 4,11-4,03 (m, Н-С(2'), H-C(3”), H-C(5”)); 3,88-3,78 (m, H-C(4), H-C(4'), 2 H-C(6”)); 3,68-3,63 (m, H-C(5'), H-C(2”)); 3,55 (q, J=9,4, H-C(5), H-C(6)); 3,47-3,40 (m, H-C(3)); 3,37 (dd, J=8,6, 2,8, H-C(7')); 3,29-3,21 (m, H-C(1), H-C(4”), CH(OH)CHCH); 2,82 (s, HMe); 2,48 (dt, J=12,6, 6,6, H-C(2)); 2,10-2,04 (m, H-C(3')); 2,04-1,75 (m, H-C(2), H-C(3"), CH(OH)CHCH). C-ЯМР (100 МГц, DO): 175,48 (s, (OH)CHC=O); 158,31 (s, C=O); 136,52 (s, аром.); 128,86, 128,45, 127,70 (3 d, аром.); 96,68 (d, C(1')); 94,50 (d, C(1”)); 92,83 (d, С(8')); 75,40 (d); 72,74 (d); 70,52 (d); 69,80, 69,46, 69,17 (3 d); 68,28 (d); 66,81 (t, PhCH); 62,85 (d); 60,51 (t, C(6”)); 59,50 (d); 52,27 (d); 49,86 (d); 49,15 (d); 47,11 (d); 36,60 (t, СН(ОН)СНСН); 33,37 (t, CH(OH)CHCH); 30,18 (q, NMe); 28,44 (t, С(2)); 28,21 (t, C(3')). HR-MALDI-MC: 797,3538 (63, [M+Na], CHNNaO ; рассчитано 797,3545), 775,3707 (100, [M+H], CHNO ; рассчитано 775,3725).
Тетраацетат 3,2'-бис-N-[(2S)-4-амино-2-гидроксибутирил]апрамицина (соединение 21. т.е. ETH 101)
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
29
55
7
15
25
49
6
13
1
+
+
+
+
Раствор соединения 19 (10 мг, 9,9 мкмоля) в 80% водн. АсОН (1,0 мл) и диоксане (0,8 мл) обрабатывали 20% Pd(OH)/C (10 мг) и перемешивали в атмосфере Н (1 атм) в течение 15 ч. Смесь фильтровали через целит, промывая HO. Объединенные фильтрат и смывы упаривали. Раствор остатка в HO промывали CHCl. После лиофилизации водного раствора получали соединение 21'·4 AcOH, т.е. ETH 101 (7,8 мг, 80%), твердое вещество белого цвета. ИК (ATR): 3205m (br.), 2936 т, 1641 s, 1550s, 1406s, 1341 т, 1268w, 1099s, 1056s, 1014s, 994s, 862w. H-ЯМР (600 МГц, DO): 5,52 (d, J=4,2, H-C(1')); 5,46 (d, J=3,6, H-C(1”)); 5,21 (d, J=9,0, H-C(8')); 4,60 (br. s, H-C(6')); 4,36-4,29 (m, 2 CH(OH)CHCH); 4,19-3,27 (m, 13H); 3,21-3,09 (m, 2 CH(OH)CHCH); 2,81 (s, NMe); 2,50-2,42 (m, 1H); 2,24-2,11 (m, 3H); 2,07-1,94 (m, 3H); 1,92 (s, MeCOH); 1,80-1,72 (т, 1 Н). HR-MALDI-MC: 764,3680 (23, [М+Na], CHNNaO ; рассчитано 764,3657), 742,3837 (100, [M+H], CHNO ; рассчитано 742,3834).
Тетраацетат 2'-N-[(2S)-4-амино-2-гидроксибутирил]апрамицина (соединение 22. т.е. ETH 100)
2
1
13
+
+
+
+
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
eq
eq
a
2
ax
ax
b
2
2
2
2
2
2
2
2
2
25
48
6
13
25
48
6
13
Раствор соединения 20 (25 мг, 32,3 мкмоля) в 80% водн. AcOH (1,0 мл) и диоксане (0,8 мл) обрабатывали 20% Pd(OH)/C (25 мг) и перемешивали в атмосфере H (1 атм) в течение 15 ч. Смесь фильтровали через целит, промывая HO. Объединенные фильтрат и смывы упаривали. Раствор остатка в HO промывали CHCl. После лиофилизации водного раствора получали соединение 22'·4 AcOH, т.е. ETH 100 (25,6 мг, 90%). ИК (ATR): 3178w (br.), 3067w, 2940w, 1631w, 1531w, 1462w, 1407w, 1331 w, 1274w, 1045s, 994s, 973w (sh.), 863w. H-ЯМР (600 МГц, DO): 5,42 (d, J=3,7, H-C(1')); 5,37 (d, J=3,9, H-C(1”)); 5,09 (d, J=8,5, H-C(8')); 4,50 (t, J=2,4, H-C(6')); 4,20 (dd, J=8,5, 4,0, CH(OH)CHCH); 4,05 (dt, J=12,8, 4,1, H-C(2')); 3,99 (t, J=12,0, H-C(3”), Н-С(5”)); 3,84 (td, J=10,8, 4,3, H-C(4')); 3,77-3,74 (m, 2 H-C(6”)); 3,70 (dd, J=15,0, 5,4, H-C(5')); 3,62 (dd, J=10,0, 2,3, H-C(4)); 3,57 (dd, J=9,8, 3,9, H-C(2”)); 3,52 (dd, J=9,8, 8,2, H-С(5)); 3,48 (t, J=9,7, H-C(6)); 3,39 (ddd, J=15,5, 12,6, 4,8, H-C(3)); 3,29 (dd, J=8,6, 2,7, H-C(7')); 3,22 (ddd, J=12,3, 10,1, 4,1, H-C(1)); 3,15 (t, J=10,3, H-C(4”); 3,04 (t, J=7,5, CH(OH)CHCH); 2,73 (s, HMe); 2,40 (dt, J=12,6, 4,2, H-C(2)); 2,08-2,00 (m, H-C(3'), CH(OH)CHCH); 1,91-1,76 (m, H-С(2), H-С(3-), CH(OH)CHCH)); 1,79 (s, MeCOH). C-ЯМР (150 МГц, DO): 174,58 (s, 00); 96,60 (d, C(1')); 94,27 (d, C(1”)); 92,63 (d, C(8')); 78,40, 75,02, 72,40 (3d, C(5), C(6), C(2”)); 70,23 (d, C(4)); 69,58, 69,27, 69,21 (3 d, C(5'), C(5”), CH(OH)CHCH); 67,97 (d, C(3”)); 66,62 (d, C(4')); 62,58 (d, C(6')); 60,17 (t, C(6”)); 59,21 (d, C(7')); 51,92 (df, C(4”)); 49,61 (d, C(l)); 48,89 (d, C(3)); 46,91 (d, C(2')); 36,49 (t, CH(OH)CHCH); 30,59 (t, CH(OH)CHCH); 29,86 (q, NMe); 28,14 (t, C(2)); 27,92 (t, C(3')). HR-MALDI-MC: 663,3147 (53, [M+Na], CHNNaO ; рассчитано 663,3177), 641,3339 (100, [M+H], CHNO ; рассчитано 641,3358).
Пример 12: Активность производных апрамицина в отношении различных рибосом (таблица 10)
Активность оценивали путем определения минимальных ингибирующих концентраций (MIC) согласно методу, описанному в примере 1. Более подробное описание методологии приведено в примере 7. Результаты представлены в таблице 10.
Таблица 10
Результаты определения MIC (мкг/мл) производных апрамицина
Бактерии дикого типа
Бактерии, несущие цитогибридную рибосому
Бактерии, несущие митогибридную рибосому
Бактерии, несущие рибосому с мутацией глухоты 1555G
Бактерии, несущие рибосому с мутацией глухоты 1494U
Апрамицин
1,0-2,0
>256,0
>256,0
>256,0
>256,0
ETH 99
2,0-4,0
>256,0
>256,0
и.о.
н.о.
ETH 100
2,0-4,0
>256,0
>256,0
>256,0
>256,0
ETH 102
4.0
>256,0
>256,0
>256,0
>256,0
ETH 103
8.0
>256,0
>256,0
>256,0
>256,0
ETH 105
4,0
>256,0
>256,0
>256,0
>256,0