ШТАММ БАКТЕРИЙ DESULFOVIBRIO SP. ДЛЯ ОЧИСТКИ СТОЧНЫХ ВОД ОТ ИОНОВ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ
STRAIN OF BACTERIA DESULFOVIBRIO SP. FOR WASTEWATER TREATMENT FROM HEAVY METAL IONS

Штамм бактерий Desulfovibrio sp. выделен из илового отложения отстойника воды из системы охлаждения плавильных печей Челябинского металлургического комбината. Штамм характеризуется высокой устойчивостью к повышенным концентрациям ионов меди (до 600 мг/л) и других двухвалентных катионов металлов.
Изобретение относится к промышленной микробиологии и касается получения нового штамма бактерий, которые могут быть использованы в биотехнологии очистки промышленных сточных вод машиностроительных, приборостроительных, электротехнических предприятий от повышенных концентраций ионов меди и других тяжелых металлов.
Известно об использовании сульфатредуцирующих бактерий для очистки сточных вод от ионов тяжелых металлов. Биогенный сероводород в процессе биохимической очистки связывает ионы тяжелых металлов в нерастворимые сульфиды.
Известен штамм бактерий Desulfovibrio oxamicus BKM В-2465 Д (RU 2355756), характеризующийся высокой степенью очистки сточных вод от ионов тяжелых металлов при повышенных концентрациях сульфатов. Данный штамм обладает способностью очищать сточные воды от хрома (YI). Недостатком данного штамма является его способность к работе при суммарной концентрации тяжелых металлов до 190 мг/л.
Наиболее близким по сущности и достигаемому результату к заявленному изобретению является штамм бактерий Desulfovibrio sp. СВБ-2 (RU 2269571), используемый для очистки сточных вод от ионов тяжелых металлов. Предлагаемый штамм выделен из промышленного стока гальванических производств, содержащих ионы тяжелых металлов. Однако указанная в патенте суммарная концентрация тяжелых металлов в используемых очистных водах составляет 197,9 мг/л, а меди - 8,9 мг/л. В сточных водах металлургических предприятий концентрация ионов меди может достигать 300 мг/л.
Недостатком штамма СВБ-2 является недостаточно высокая устойчивость к ионам тяжелых металлов, в частности ионам меди, что существенно ограничивает его использование в биотехнологиях.
Задача изобретения - получение устойчивого к металлам, высокоактивного штамма сульфатредуцирующих бактерий, используемого для очистки сточных вод от ионов тяжелых металлов.
Технический результат - получение  штамма бактерий Desulfovibrio sp. ВКМ В-2820D, способного очищать  сточные воды от ионов тяжелых металлов.
Штамм Desulfovibrio sp. A 4/1 депонирован Всероссийской коллекцией микроорганизмов (ВКМ) Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН (ИБФМ) под регистрационным номером ВКМ В-2820D. Предлагаемый штамм Desulfovibrio sp. ВКМ В-2820D не известен в науке и технике, поэтому свойства, которые он проявляет, являются новыми. Анализ нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК штамма ВКМ В-2820D показал, что предлагаемый штамм является новым штаммом и принадлежит к роду Desulfovibrio.
Полученный штамм характеризуется следующими признаками.
Культурально-морфологические признаки патентуемого штамма определяют при его культивировании на стандартной пресноводной среде Видделя (Widdel, Bak, 1992). Температура культивирования штамма составляла +28 ºС. Выращивание проводят в течение 3-4 суток без ионов меди, 7-8 суток с добавлением ионов меди в концентрации 200 мг/л и более.
Родовое и видовое название штамма - штамм бактерий Desulfovibrio sp.
Происхождение - выделен из илового отложения отстойника воды из системы охлаждения плавильных печей Челябинского металлургического комбината. Морфологическая характеристика - форма клеток - вибрион, размером 0,5-1,0×3,0×5,0 мкм.
Спорообразование - нет.
Реакция по Граму - отрицательная.
Подвижность клеток - подвижные.
Физиологическая характеристика - отношение к кислороду - анаэроб.
2+
В качестве субстрата для роста используют лактат, этанол, глицерин, малат, цитрат, оксалацетат, фумарат, формиат, сукцинат, простые сахара. Лактат метаболизирует по пути неполного окисления с образованием ацетата. Наибольшую скорость роста и наименьшее время удвоения демонстрирует на среде с лактатом. Наибольшая продукция белка и сероводорода зафиксирована на среде с этанолом. Штамм устойчив к ионам меди (до 600 мг/л), кобальта (до 450 мг/л), никеля (до 225 мг/л), кадмия (до 225 мг/л), хрома (до 25 мг/л). При культивировании штамма с ионами Feобразуют черный осадок сульфидов железа. Оптимальный рН среды 7,2.
Полезное свойство, в связи с которым культура депонируется, - осаждение ионов тяжелых металлов в концентрации, превышающей 200 мг/л, сероводородом.
Условия культивирования - пресноводная среда Видделя.
Условия хранения - сохраняется путем пересевов на среде культивирования или лиофилизированным.
Пример 1. Исследование способности штамма бактерий Desulfovibrio sp. ВКМ В-2820D к осаждению ионов меди.
Чистую культуру СРБ Desulfovibrio sp. ВКМ В-2820D культивировали на синтетической среде, содержащей ионы меди в концентрации 350 мг/л.
3
2
Посев проводили в стерильном ламинарном шкафу, который перед этим дезинфицировали ультрафиолетом 30 минут. Перед посевом синтетическую среду (таблица 1) доводили до кипения и затем быстро охлаждали под струей холодной воды для удаления растворенного кислорода. В охлажденную до комнатной температуры среду вносили питательные вещества (таблица 2) (в расчете на 1 л) в следующей последовательности: витамины (2 мл), раствор солей (10 мл), раствор кофакторов (1 мл), органический субстрат - лактат (1,6 мл), NaHCO (при внесении рН доводится до 7,2-7,4), HS (2 мл). Перед внесением сероводорода добавляли маточный раствор меди в количестве 4 мл на 1 литр синтетической среды.
Во флаконы на 120 мл вносили около 50 мл синтетической среды с внесенными в нее добавками и 10 мл инокулята (культуры бактерий), после чего доливали средой до верха. Резиновые пробки притирали к краям флаконов с помощью стерильной иглы, что уменьшало вероятность проникновения кислорода воздуха. В конце посева флаконы закрывали алюминиевыми колпачками, запечатывали флакон закаточной машинкой и помещали термостат при температуре 28 ºС.
На среде с ионами меди в концентрации 350 мг/л за 15 суток в среде медь осаждается в виде сульфида. Концентрация ионов меди в жидкой фазе остается 0,26 мг/л.
Пример 2. Исследование способности штамма бактерий Desulfovibrio sp.  ВКМ В-2820D к осаждению ионов никеля.
Чистую культуру СРБ Desulfovibrio sp. ВКМ В-2820D культивировали на синтетической среде, содержащей двухвалентный никель в концентрации 250 мгNi/л.
3
Посев проводили в стерильном ламинарном шкафу, который перед этим дезинфицировали ультрафиолетом 30 минут. Перед посевом синтетическую среду (таблица 1) доводили до кипения и затем быстро охлаждали под струей холодной воды для удаления растворенного кислорода. В охлажденную до комнатной температуры среду вносили питательные вещества (таблица 2) (в расчете на 1 л) в следующей последовательности: витамины (2 мл), раствор солей (10 мл), раствор кофакторов (1 мл), органический субстрат - глицерин (10 мл), лактат (0,8 мл), раствор NaHCO (рН доводили до 7,0 - 7,8), раствор сульфида натрия (2 мл). Стоковый раствор никеля добавляли в количестве 25 мл на 1 литр синтетической среды (таким образом, достигалась концентрация никеля в среде 250 мг/л).
Во флаконы на 120 мл вносили около 50 мл синтетической среды с внесенными в нее добавками и 10 мл инокулята (культуры бактерий), после чего доливали средой до верха. Резиновые пробки притирали к краям флаконов с помощью стерильной иглы, что уменьшало вероятность проникновения кислорода воздуха. В конце посева флаконы закрывали алюминиевыми колпачками, запечатывали флакон закаточной машинкой и помещали термостат при температуре 28 ºС.
Начало образования кристаллического сульфида никеля происходит в течение 7 суток, а стабильная кристаллическая фаза сульфида образуется в течении 20 суток.
Пример 3. Исследование способности штамма бактерий Desulfovibrio sp. ВКМ В-2820D к осаждению ионов кобальта.
Чистую культуру СРБ Desulfovibrio sp.  ВКМ В-2820D культивировали на синтетической среде, содержащей двухвалентный кобальт в концентрации 400 мгСо(II)/л.
3
Посев проводили в стерильном ламинарном шкафу, который перед этим дезинфицировали ультрафиолетом 30 минут. Перед посевом синтетическую среду (таблица 1) доводили до кипения и затем быстро охлаждали под струей холодной воды для удаления растворенного кислорода. В охлажденную до комнатной температуры среду вносили питательные вещества (таблица 2) (в расчете на 1 л) в следующей последовательности: витамины (2 мл), раствор солей (10 мл), раствор кофакторов (1 мл), органический субстрат - глицерин (10 мл), лактат (0,8 мл), раствор NaHCO (рН доводили до 7,0 - 7,8), раствор сульфида натрия (2 мл). Стоковый раствор кобальта добавляли в количестве 40 мл на 1 литр синтетической среды (таким образом, достигалась концентрация кобальта в среде 400 мг/л).
Во флаконы вносили около 50 мл синтетической среды с внесенными в нее добавками и 10 мл инокулята (культуры бактерий), после чего доливали средой до верха. Резиновые пробки притирали к краям флаконов с помощью стерильной иглы, что уменьшало вероятность проникновения кислорода воздуха. В конце посева флаконы закрывали алюминиевыми колпачками, запечатывали флакон закаточной машинкой и помещали термостат при температуре 28 ºС.
Начало образования кристаллического сульфида кобальта происходит в течение 12 суток, а стабильная кристаллическая фаза сульфида образуется в течении 25 суток.
Пример 4. Исследование способности штамма бактерий Desulfovibrio sp. ВКМ В-2820D к осаждению ионов кадмия.
Чистую культуру СРБ Desulfovibrio sp. ВКМ В-2820D культивировали на синтетической среде, содержащей двухвалентный кадмий в концентрации 75 мгCd(II)/л.
3
Посев проводили в стерильном ламинарном шкафу, который перед этим дезинфицировали ультрафиолетом 30 минут. Перед посевом синтетическую среду (таблица 1) доводили до кипения и затем быстро охлаждали под струей холодной воды для удаления растворенного кислорода. В охлажденную до комнатной температуры среду вносили питательные вещества (таблица 2) (в расчете на 1 л) в следующей последовательности: витамины (2 мл), раствор солей (10 мл), раствор кофакторов (1 мл), органический субстрат - глицерин (10 мл), лактат (0,8 мл), раствор NaHCO (рН доводили до 7,0 - 7,8), раствор сульфида натрия (2 мл). Стоковый раствор кадмия добавляли в количестве 7,5 мл на 1 литр синтетической среды (таким образом, достигалась концентрация кадмия в среде 75 мг/л).
Во флаконы объемом 120 мл вносили около 50 мл синтетической среды с внесенными в нее добавками и 10 мл инокулята (культуры бактерий), после чего доливали средой до верха. Резиновые пробки притирали к краям флаконов с помощью стерильной иглы, что уменьшало вероятность проникновения кислорода воздуха. В конце посева флаконы закрывали алюминиевыми колпачками, запечатывали флакон закаточной машинкой и помещали термостат при температуре 28 ºС.
Кристаллизация сульфида кадмия начинается после 10 суток культивирования, при культивировании 18 суток сульфид кадмия кристаллизуется полностью.