Роль низкомолекулярных белков в реализации действия лазерного излучения и переменного магнитного поля на кровь

БИОФИЗИКА

УДК 612.84

РОЛЬ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ БЕЛКОВ В РЕАЛИЗАЦИИ ДЕЙСТВИЯ ЛАЗЕРНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ И ПЕРЕМЕННОГО МАГНИТНОГО ПОЛЯ НА КРОВЬ

Г.В. Максимов, А.В. Наговицын

Исследовали изменения способности связывать кислород гемоглобином при раздельном и совместном действии "наноинтегратора", обеспечивающей низкоинтенсивное лазерное излучение (НЛИ, 655 нм) и переменное магнитное поле (ПМП), на кровь (эритроциты и плазма) в присутствии низкомолекулярных белков (НМБ). Установлено, что действие НЛИ и ПМП стимулирует увеличение поглощения кислорода на 50%, а в присутствии НМБ — на 80—100%. НИЛ снижает активность фермента супероксиддисмутазы (СДМ) крови на 60%, а в присутствии НМБ — на 40%. Совместное действие НЛИ и ПМП сначала стимулирует, а через 30 мин блокирует активность СДМ. Показано, что действие НЛИ и ПМП не только меняет антиокислительный статус крови, но стимулирует поглощение кислорода эритроцитами. Эффект воздействия излучения усиливается за счет наномолекулярных изменений структуры НМБ, которые стимулируют поглощение клеткой кислорода.

Ключевые слова: низкоинтенсивное лазерное излучение, переменное магнитное поле, кровь, низкомолекулярные белки.

Действие антиоксидантных систем (АС) плазмы крови обеспечивает не только снижение уровня активных форм кислорода (АФК), но и устраняет увеличение содержания металлов переменной валентности, в частности железа и меди, участвующих в генерации АФК (Платонов и др., 1999; Аха-лая и др., 2006). Основными антиоксидантными ферментами плазмы крови, утилизирующими супер-оксиданионрадикал (предшественник многих других АФК), являются Си, 2п-супероксиддисмугаза (СОД, КФ 1.15.1.1) и церулоплазмин (ЦП, КФ 1.16.3.1). СОД катализирует дисмутацию супероксиданион-радикала до перекиси водорода Н2О2, а ЦП, являясь полифункциональным ферментом, не только нейтрализует супероксиданионрадикал до воды без образования Н2О2, но и участвует также в транспорте, распределении и обмене меди и железа. В свою очередь Н2О2, образовавшаяся при дис-мутации супероксиданионрадикала, нейтрализуется глутатионпероксидазной системой с участием восстановленного глутатиона, составляющего большую часть пула эндогенных небелковых тиолов (НТ), а также каталазой (КФ 1.11.1.6). Действие всех вышеуказанных ферментов определяет активность АС организма, а сохранение баланса АС является исключительно важным условием для протекания метаболических процессов в организме и для оксиге-нации тканей. При нарушении баланса АС в тканях могут накапливаться токсические продукты окисления липидов и белков: гидроперекиси, ТБК-ак-

тивные продукты, карбонильные группы, что в свою очередь способствует изменению функционирования форменных элементов крови, в том числе и эритроцитов.

В настоящее время в медицине все большее распространение приобретают различные методы физиотерапевтических воздействий, среди которых не последнее место занимает применение разнообразных электромагнитных полей (ЭП). Электромагнитные поля обладают большим количеством варьируемых параметров (энергия, частота, модуляция и т.п.), которые можно использовать для каждого конкретного случая заболевания и получить высокую селективность и эффективность восстановления. Себестоимость производства и применения электромагнитных приборов в терапевтической практике зачастую значительно ниже, чем проектирование и обеспечение технологического процесса производства химических препаратов. Однако данный подход имеет и серьезные недостатки. Столь сложная многофакторная зависимость эффекта от параметров применяемого излучения не позволяет с уверенностью предсказывать получаемые результаты. В то же время научных данных, позволяющих с уверенностью говорить о механизме действия и последствиях применения различных излучений, накоплено недостаточно. В связи с этим становится актуальным использование воздействия ЭП на клетки и ткани в условиях воздействия специфического фармакологического препа-

рата. Важно, чтобы воздействие ЭП вызывало нано-молекулярные изменения конформации молекулы фармакологического препарата и усиливало суммарный эффект.

Цель работы заключалась в исследовании действия переменного магнитного поля (ПМП), низкоинтенсивного лазерного излучения (НИЛИ), а также низкомолекулярных пептидов (НМП) на способность эритроцитов сорбировать кислород.

Методика

Исследование проведено на самцах белых беспородных крыс массой 272 ±11 г. Отбор крови осуществляли из яремной вены (3 мл с гепарином (10 ЕД на 1 мл)). После удаления плазмы и отделения лимфоцитов осажденные эритроциты суспендировали в среде инкубации. Подсчет содержания клеток в суспензии проводится с использованием камеры Горяева. Содержание кислорода в плазме крови определяли с помощью коммерческого анализатора "ЭКСПЕРТ-001", Россия (Максимова и др., 2002).

Активность фермента супероксиддисмутазы (СОД) оценивали спектрофотометрически по способности плазмы крови (100 мкл) ингибировать автоокисление адреналина в адренохром на спектрофотометре "Hitachi-556" (Япония). Уровень фермента церулоплазмина (ЦП) в плазме крови определяли с помощью субстрата ортофенилендиамина (ОФД) при температуре 37° с последующей остановкой реакции серной кислотой и измерением оптической плотности (496 нм). Активность каталазы в плазме крови определяли с использованием гемолизата крови в качестве источника фермента и 0,03%-й перекиси водорода в качестве субстрата. После 10-минутной ферментативной реакции с помощью добавления молибдата натрия спектрофотометрически (410 нм) измеряли количество субстрата, не разрушенного каталазой.

Для определения уровня природных антиок-сидантов крови, небелковых тиолов, использовали кровь (0,5 мл), из которой с помощью ЭДТА и три-хлоруксусной кислоты (ТХУ) экстрагировали тиолы. После центрифугирования к супернатанту добавляли трис-HCl буфер с рН 8,9 и раствор дитионитробен-зойной (ДТНБ) кислоты в метаноле. Спектрофото-метрирование проводили при 412 нм.

Уровень вторичных продуктов окисления определяли с помощью измерения количества ТБК-активных продуктов в плазме крови, используя способность малонового диальдегида (продукта окисления липидов) образовывать с тиобарбитуровой кислотой продукт, содержание которого определяется спектрофотометрически (535 нм) (Ахалая и др., 2006).

Результаты исследования

В ходе проведенного исследования действия ЭП установлено, что изменений в содержании ЦП не наблюдалось, в то время как НИЛИ (655 нм) вызывал дозозависимое снижение активности СОД в крови животных на 60% при максимальной дозе облучения. ПМП повышало активность фермента на 40%. При совместном действии НИЛИ и ПМП наблюдали комплексное изменение активности СОД: сначала происходило некоторое увеличение активности фермента, но спустя полчаса наблюдалось ее заметное понижение. Характер зависимости изменений активности от дозы совпадает с математической суммой кривых отдельных воздействий (НИЛИ и ПМП), что свидетельствует о суммации эффектов воздействия на кровь (рис. 1, А).

При облучении плазмы крови НИЛИ и ПМП вызывали одинаковый эффект, арифметическая сумма которого не совпадала с результатами проводившегося совместного облучения и соответствовала эффекту действия только ПМП. По-видимому, в данном случае воздействие ПМП было насыщающим, что говорит в пользу схожих механизмов

Рис. 1. Влияние НИЛИ и ПМП на активность СОД в цельной крови (А) и в плазме (Б).

1 — НИЛИ; 2 — ПМП; 3 — НИЛИ и ПМП; 4 — сумма НИЛИ и ПМП

5 ВМУ, биология, № 3

Рис. 2. Уровень гидроперекисей (А) и ТБК-активных продуктов (Б).

1 — контроль; 2 — НИЛИ цельной крови; 3 — облучение ПМП цельной крови; 4 — НИЛИ плазмы крови; 5 — облучение ПМП плазмы крови.

действия обоих факторов при облучении плазмы крови (рис. 1, Б).

Известно, что лазер с длиной волны 632,8 нм, с одной стороны, повышает активность СОД путем депротонизации гистидинового остатка в активном центре белка-фермента, а с другой — может вызвать разрушение комплексов N0 • с некоторыми альбуминами плазмы и гемоглобином. Возможно, что наблюдаемые эффекты изменения активности СОД обусловлены воздействием как N0-, так и других АФК.

В связи с этим в следующей серии экспериментов изучали изменения содержания промежуточных и вторичных продуктов окислительных процессов при облучении крови и плазмы НИЛИ и ПМП (рис. 2).

В данной серии экспериментов обнаружили лишь тенденцию увеличения уровня ГП (рис. 2, А). В то же время достоверное (14—22%) повышение ТБК-активных продуктов в плазме крови после облучения как ПМП, так и действия НИЛИ (рис. 2, Б) может быть причиной ингибирования активности СОД.

Изменение уровня десорбции кислорода эритроцитами крови при действии ПМП и НИЛИ

Параметры и серии эксперимента Уровень кислорода в среде

Раствор + ПМП + НИЛИ 0,47 ± 0,05 100

Кровь + ПМП + НИЛИ 0,71+0,05 150

Кровь + ПМП + НИЛИ на фоне действия вигеро-на (10-7 М) 0,84 + 0,05 178

Кровь + ПМП + НИЛИ на фоне действия виготи-на (10-7М) 0,94 + 0,05 200

Индуцированные вращающимся магнитным полем и красным лазером (655 нм) изменения активности СОД в плазме крови указывают на высокую чувствительность данного фермента к этим воздействиям по сравнению с ЦП и причиной наблюдаемых изменений может быть накопление АФК в исследуемых образцах после воздействий. Повышение активности СОД в цельной крови после воздействия ПМП, возможно, связано с изменением степени адсорбции внеклеточной СОД на поверхности форменных элементов крови, что может вызвать общее изменение ее количества в плазме. Данное предположение было проверено в экспериментах, в которых воздействие ЭП меняли за счет добавления в среду инкубации НМП (таблица).

В следующей серии экспериментов исследовали изменения сорбционной способности эритроцитов при совместном действии НИЛИ и ПМП на эритроциты крови, обработанной НМП. Предполагалось, что в данном случае наномолекулярные изменения структуры НМП, вызванные действием НИЛИ и ПМП окажут влияние на десорбцию кислорода гемоглобином крови (таблица). Установлено, что действие НИЛИ и ПМП, снимулирует на 50% сброс крови в среду инкубации эритроцитов. Однако при инкубации эритроцитов с НМП (вигерон и виготин) сброс кислорода усиливался и составлял от 78 до 100%. Таким образом, воздействие НИЛИ и ПМП не только меняет АС крови, но и способствует сбросу кислорода эритроцитами. Этот эффект усиливается за счет наномо-лекулярных изменений структуры НМП, которые, проникая в клетку, стимулируют сброс кислорода. Сказанное свидетельствует о том, что НИЛИ, ПМП и НМП являются факторами восстановления от гипоксии, вызывая изменения в плазме и клетках крови на наномолекулярном уровне. Иными словами, излучения и протеины с нанометровы-ми размерами стимулируют восстановление клеток от гипоксии и могут широко использоваться в клинике.

Обсуждение

Итак, изменение активности СОД и ЦП в организме может существенно сказаться на общем АС. Снижение активности этих двух ферментов может

привести к избыточному накоплению супероксида-нион-радикала, который служит инициатором целого каскада опасных для организма реакций, таких как: (1) ускорение процессов пероксидации липидов и как следствие нарушение их барьерной и транспортной функций; (2) способность реагировать с монооксидом азота с образованием токсичного соединения пероксинитрита, одновременно блокируя сигнальные функции N0 и вызывая процессы окислительного повреждения биологических молекул и структур клетки; (3) способность восстанавливать ионы железа до Бе+2, которые ускоряют липопероксидацию.

В случае увеличения активности ферментов АС ожидается общее повышение устойчивости организма к стрессовым нагрузкам, что может рассматриваться как способ облегчения многих заболеваний и предотвращения вредных побочных эффектов ряда лекарственных веществ.

Одно из исследованных нами излучений, а именно низкочастотное магнитное поле, проявило себя в качестве фактора, повышающего активность СОД. Этот факт свидетельствует о принципиальной воз-

можности улучшения антиоксидантного статуса организма при использовании для этой цели электромагнитных излучений.

Итак, действие НИЛИ и ПМП не только меняет антиокислительный статус крови, но и способствует сбросу кислорода эритроцитами. Эффект воздействия излучения на кровь может усиливаться за счет параллельного воздействия наномоле-кулярных структур, которые, проникая в клетку стимулируют сброс кислорода. Вероятно, данный механизм наномолекулярного интегрирования воздействия НИЛИ и ПМП является существенным фактором восстановления организма в условиях функциональной и патологической гипоксии (Лунева и др., 2002; Максимов и др., 2000; Рогаткин, Лапаева, 2003).

Авторы благодарны ООО "Клиника новых медицинских технологий АН" за предоставленную возможность использовать наномолекулярное интегрирование при действии низкомолекулярных пептидов на кровь.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Ахалая М.Я., Платонов А.Г., Байжу-м а н о в А . А . 2006. Кратковременное охлаждение повышает антиоксидантный статус и общую устойчивость животных // Бюл. эксперимент. биол. и мед. 141. № 1. 31—34.

Лунева О.Г., Гендель Л.Я., Кругляков а К . Е . 2002. Особенности связывания органических неэлектролитов эритроцитарной мембраной // Биофизика. 46. № 1. 38—44.

Максимов Г.В., Максимова Н.В., Чур и н А. А ., Орлов С.Н., Рубин А.Б. 2000. Исследование изменений конформации порфирина гемоглобина при первичной гипертензии // Биохимия. 66. № 3. 365—370.

Максимова Н.В, Наговицын А.В., Максимов Г . В . 2002. Роль ионного транспорта в регуляции сродства гемоглобина к кислороду при сахарном диабете // Бюл. эксперимент. биол. и мед. 133. № 4. 456—458.

Платонов А.Г., Ахалая М.Я., Деев Л.И., Кудряшов Ю.Б. 1999. Защитные эффекты МИГИ-К при УФ-облучении животных // Радиационная биология. Радиоэкология. 39. № 2—3. 313—317.

Рогаткин Д.А., Лапаева Л.Г. 2003. Перспективы развития неинвазивной спектрофотометриче-ской диагностики в медицине // Мед. техника. № 4. 31—36.

Поступила в редакцию 25.12.07

ROLE OF LOW-MOLECULAR PROTEINS IN REALIZATION OF ACTION OF LASER RADIANCE AND VARIABLE MAGNETIC FIELD ON BLOOD

G.V. Maksimov, A.V. Nagovitsyn

Investigated changes of ability to bind oxygen a haemoglobin at separate and joint action of the special device "nanointegrator", which will consist from low power laser radiance (LPLR, 655nm) and variable magnetic field (VMF) on blood (erythrocytes of blood, a blood plasma) at the presence of low-molecular proteins (LMP). It is established, that action LPLR and VMF stimulates reset of oxygen on 50%, and at erythrocytes incubation with LMP reset of oxygen grows on 80—100%. It is revealed, that at action LPLR decrease of activity of an enzyme of superoxide dismutase of blood on 60% is observed, and action VMF — activated an enzyme on 40%. Joint action LPLR and VMF on blood all over again resulted in augmentation of activity, and in 30 minutes — reduced activity superoxide dismutase. It is established, that action LPLR and VMF not only changes the antioxidative status of blood, but also promotes reset

6 ВМУ, биология, № 3

of oxygen by erythrocytes. The effect of influence of radiance on blood strengthens for the account nanomolecular changes of LMP structure which insinuating in a cell stimulate reset of oxygen.

Key words: low power laser radiance, variable magnetic field, blood, low-molecular proteins.

Сведения об авторах

Максимов Георгий Владимирович — докт. биол. наук, проф. кафедры биофизики биологического факультета МГУ. Тел. (495)939-19-66; e-mail: gmaksimov@mail.ru

Наговицын Анатолий Васильевич — науч. сотр. кафедры биофизики биологического факультета МГУ. Тел. (495)939-19-66; e-mail: gmaksimov@mail.ru