ПОРОШКООБРАЗНЫЕ ЗЕРНОВЫЕ КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩИЕ НЕРЕПЛИЦИРУЮЩИЕСЯ ПРОБИОТИЧЕСКИЕ МИКРООРГАНИЗМЫ
POWDERY GRAIN COMPOSITIONS CONTAINING NON-REPLICATING PROBIOTIC MICROORGANISMS

Настоящее изобретение относится к области порошкообразных зерновых композиций, восстанавливаемых в молоке, детской смеси или воде. В частности, настоящее изобретение относится к порошкообразным зерновым композициям, вводимым младенцам или маленьким детям. Порошкообразные зерновые композиции могут быть использованы для усиления иммунной системы и/или лечения или профилактики воспалительных расстройств. Например, эти преимущества могут быть предоставлены пробиотическими микроорганизмами. Воплощение настоящего изобретения относится к порошкообразной зерновой композиции, содержащей нереплицирующиеся пробиотические микроорганизмы, например биоактивные подвергнутые тепловой обработке пробиотические микроорганизмы.
Грудное вскармливание является оптимальным питанием для новорожденных младенцев.
Новорожденные младенцы, таким образом, находятся на грудном вскармливании или (в случае, когда это невозможно или недостаточно) их кормят с помощью жидких детских смесей, которые напоминают содержание материнского молока настолько близко, насколько это возможно. Грудное вскармливание и/или введение детской смеси, как правило, продолжается в течение первого года жизни младенца.
Однако, как правило, в возрасте 4-6 месяцев развивается потребность и готовность к другой пище. Признаки этого заключаются в том, что младенец начинает сидеть и контролировать движения головы. Он обретает способность продвигать пищу изо рта к горлу, так чтобы координация языком позволяла младенцу глотать с ложки.
Введение твердой пищи важно для младенца с целью построения положительного отношения к пище. Это первый шаг к растущему, счастливому ребенку и к развитию пожизненных привычек здорового питания.
На этом этапе рекомендуется, чтобы младенец начал потреблять детские каши.
Детские каши будут помогать младенцу экспериментировать со вкусом, консистенцией и питанием. Однако пищеварительный тракт младенца все еще развивается и ему придется столкнуться с новой задачей: твердая пища.
Пробиотики как часть флоры кишечника помогают желудку гораздо легче переносить пищу, а также могут, например, активизировать иммунную систему. В этом смысле новым инновационным продуктом является, например, каша «Nestle Baby Cereal», содержащая культуры Bifidobacterium lactis. Эти культуры сохраняют здоровую флору пищеварительного тракта и помогают поддерживать здоровый рост и развитие.
Предполагается, что пробиотики, как правило, безопасны для младенцев. Однако в особых случаях было бы целесообразно не использовать пробиотики для младенцев без назначения врача, например, если младенец страдает нарушением иммунной системы.
Вследствие этого в данной области существует потребность в разработке порошкообразной зерновой композиции, которая обеспечивает пользу от пробиотиков и которая без каких-либо проблем может потребляться младенцами с нарушением иммунной системы.
Авторы изобретения взялись за удовлетворение этой потребности.
Следовательно, задачей настоящего изобретения являлось обеспечение порошкообразной зерновой композиции, которая легко переваривается и переносится младенцами и маленькими детьми, которая дает возможность эксперимента со вкусом, консистенцией и питанием, которая обеспечивает пользу от пробиотиков, будучи при этом простой в получении в промышленном масштабе и в идеале не теряет активности при длительном сроке хранения или при повышенных температурах.
Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что они могут решить эту задачу с помощью объекта изобретения по независимому пункту формулы изобретения. Зависимые пункты дополнительно развивают идею настоящего изобретения.
Авторы настоящего изобретения предложили порошкообразную зерновую смесь, содержащую нереплицирующиеся пробиотические микроорганизмы.
Авторы неожиданно обнаружили, что, например, по показателю иммуноусиливающего воздействия и/или по показателю противовоспалительного воздействия нереплицирующиеся пробиотические организмы могут быть еще более эффективными, чем реплицирующиеся пробиотические микроорганизмы.
Это удивительно, поскольку пробиотики часто определяются как «живые микроорганизмы, которые при введении в адекватных количествах приносят пользу здоровью организма-хозяина» (Руководство ПСО/ВОЗ). В подавляющем большинстве опубликованных работ имеют дело с живыми пробиотиками. Кроме того, в нескольких работах исследовали пользу для здоровья, привносимую нереплицирующимися бактериями, и в большинстве из них указано, что инактивация пробиотиков, например тепловой обработкой, приводит к потере их подразумеваемого благоприятного воздействия (Rachmilewitz, D., et al., 2004, Gastroenterology 126:520-528; Castagliuolo, et al., 2005, FEMS Immunol. 43:197-204; Gill, H.S. and K.J. Rutherfurd, 2001, Br. J. Nutr. 86:285-289; Kaila, M., et al., 1995, Arch.Dis.Child 72:51-53.). В некоторых исследованиях продемонстрировано, что убитые пробиотики могут сохранять некоторое воздействие на здоровье (Rachmilewitz, D., et al., 2004, Gastroenterology 126:520-528; Gill, H.S. and K.J. Rutherford, 2001, Br. J. Nutr. 86:285-289), но ясно, что живые пробиотики рассматривались в данной области до настоящего времени как более эффективные.
Следовательно, авторы настоящего изобретения предлагают порошкообразную зерновую композицию, содержащую нереплицирующиеся пробиотические микроорганизмы. Эти нереплицирующиеся пробиотические микроорганизмы все еще являются биоактивными.
Одним воплощением настоящего изобретения является порошкообразная зерновая композиция, восстанавливаемая водой, молоком или детской смесью, содержащая, по меньшей мере, 25 масс.% зернового продукта, имеющая энергетическую ценность, по меньшей мере, 0,8 ккал/г и содержащая после восстановления, по меньшей мере, 2 г /100 ккал белка, менее 4,5 г/100 ккал жира и меньше 7,5 г/100 ккал добавленных подсластителей, с меньше чем 3,75 г/100 ккал фруктозы, где порошкообразная зерновая композиция дополнительно содержит нереплицирующиеся пробиотические микроорганизмы.
Для восстановления может быть использовано любое молоко. Примерами являются, например, коровье молоко, женское молоко, козье молоко и соевое молоко. Также в восстановленной форме могут быть использованы продукты из сухого молока. Для восстановления порошкообразной зерновой композиции также могут быть использованы в восстановленной форме специализированные пищевые продукты, такие как детские искусственные питательные смеси.
Композиция, например, может быть детской кашей или зерновым молочным напитком.
Порошкообразная зерновая композиция, например, может вводиться младенцам и/или маленьким детям вплоть до 6-летнего возраста.
Детские каши известны в данной области. Детские каши представляют собой содержащие зерновые продукты композиции, которые следует вводить младенцам. Они обычно вводятся с помощью ложки и могут предлагаться, например, в виде сухой детской каши. Кодекс Алиментариус (кодекс качества пищи) содержит рекомендации о том, какие ингредиенты должны содержать детские каши.
Термин «младенец» означает ребенка в возрасте не более чем 12 месяцев.
Зерновые молочные налитки являются обработанными пищевыми продуктами на основе зерновых, и необязательно, бобовых, которые разводятся водой, молоком или любой другой жидкостью, которая соответствует требованиям местного регулирующего органа, и имеют консистенцию, подходящую для питья возрастной группой, для которой предназначен данный продукт.
Как правило, энергетическая ценность, а также количество и тип белков, углеводов и липидов, присутствующих в порошкообразном зерновом продукте, должны быть тщательно урегулированы в соответствии с потребностями младенца или маленького ребенка и зависят от степени развития и возраста,
Хорошо известна необходимость в пищевых изменениях с развитием и возрастом, и порошкообразная зерновая композиция идеально отражает эти изменения.
В одном воплощении настоящего изобретения порошкообразная зерновая композиция содержит после восстановления около 2 г - 5,5 г/100 ккал белка и меньше чем 5 г/100 ккал добавленных подсластителей, с меньше чем 2,5 г/100 ккал фруктозы.
Подсластителями могут быть углеводы, выбранные, например, из группы, состоящей из сахарозы, глюкозы, фруктозы, глюкозного сиропа, меда и их комбинаций.
Вследствие содержания сахаров в зерновых, например, после гидролиза, количество общего сахара в конечной композиции, рассматриваемого как моно- и дисахариды, может превышать 5 г/100 ккал.
Порошкообразная зерновая композиция может содержать меньше чем 40 г моно- и дисахаридов, предпочтительно меньше чем 35 г моно- и дисахаридов на 100 г порошкообразной композиции.
Порошкообразная зерновая композиция может быть обогащена, например, витаминами и минералами.
Например, композиция может быть обогащена витамином B1, витамином A, витамином D, витамином E, витамином C, витамином B1, витамином B2, ниацином, пиридоксином, фолиевой кислотой, витамином B12, биотином, железом, цинком, кальцием и их комбинациями.
Например, порошкообразная зерновая композиция может содержать, по меньшей мере, 50 мкг витамина B1 на 100 ккал, 60-180 мкг витамина A на 100 ккал и/или 1-3 мкг витамина D на 100 ккал.
В качестве зерновых продуктов могут быть использованы мука грубого помола, рафинированная мука и их комбинации. Например, могут быть использованы пшеничная мука, рисовая мука, манная крупа из пшеницы, кукурузный мальтодекстрин и их комбинации.
Порошкообразные зерновые композиции могут быть получены из одного вида зерна, такого как рис или пшеница, из-за того, что однокомпонентные зерновые композиции имеют меньшую вероятность вызвать аллергические реакции.
Композиции также могут содержать ванилин. Ванилин имеет преимущество, которое заключается в том, что его вкус всеми любим, и он обладает дополнительными антиоксидантными свойствами. Как правило, композиции настоящего изобретения содержат 0,01-7 мг ванилина на 100 г восстановленного продукта.
Мед, фрукты или овощи могут быть добавлены для разнообразия вкуса и/или текстуры. Овощи и/или фрукты могут быть добавлены в виде хлопьев, порошков и/или кусочков.
Порошкообразная зерновая композиция по настоящему изобретению дополнительно может содержать пребиотики. Пребиотики могут поддерживать рост пробиотиков, до того как они станут нереплицирующимися. Под «пребиотиком» понимают неперевариваемые пищевые вещества, которые стимулируют рост полезных микроорганизмов и/или пробиотиков в кишечнике. Они не разрушаются в желудке и/или в верхней части кишечника или не адсорбируются в ЖК-тракте принимающей их персоны, но они ферментируются желудочно-кишечной микробитой и/или пробиотиками. Пребиотики, например, определены в работе Glenn R. Gibson and Marcel B. Roberfroid, Dietary Modulation of the Human Colonic Microbiota: Introducing the Concept of Prebiotics, J. Nutr. 1995 125:1401-1412.
Пребиотики, которые могут быть использованы в соответствии с настоящим изобретением, ничем особенным не ограничены и включают все пищевые вещества, которые способствуют росту в кишечнике пробиотиков и микроорганизмов, приносящих пользу здоровью. Предпочтительно они могут быть выбраны из группы, состоящей из олигосахаридов, необязательно содержащей фруктозу, галактозу, маннозу; пищевых волокон, в частности растворимых волокон, соевых волокон; инулина или их смеси. Предпочтительными пребиотиками являются фруктоолигосахариды (ФОС), галактоолигосахариды (ГОС), изомальтоолигосахариды (ИМО), ксилоолигосахариды (КОС), арабино-ксилоолоигосахариды (АКОС), маннаноолигосахариды (МОС), олигосахариды сои, гликозилсахароза (ГС), лактосахароза (ЛС), лактулоза (ЛА), палатинозоолигосахариды (ПАО), мальтоолигосахариды, камеди и/или их гидролизаты их, пектины, крахмалы и/или их гидролизаты. Например, порошкообразные зерновые композиции могут содержать олигофруктозу, инулин или их комбинацию.
Как правило, порошкообразные зерновые композиции перед потреблением смешиваются с водой, молоком или детской смесью. Например, 15 г порошкообразной зерновой композиции по настоящему изобретению могут быть смешаны с 90 мл воды.
6
12
Порошкообразная зерновая композиция по настоящему изобретению может содержать нереплицирующиеся пробиотические микроорганизмы в любом эффективном количестве, например в количестве, соответствующем около 10-10 КОЕ/г сухой массы.
«Нереплицирующиеся» пробиотические микроорганизмы включают пробиотические бактерии, которые были термически обработаны. Они включают микроорганизмы, которые являются инактивированными, мертвыми, нежизнеспособными и/или присутствуют в виде фрагментов, таких как ДНК, метаболиты, цитоплазматические соединения и/или материалы клеточной стенки.
«Нереплицирующиеся» означает, что нельзя обнаружить никаких жизнеспособных клеток и/или колониеобразующих единиц классическими способами рассева на чашках. Такие классические способы рассева на чашках сведены вместе в книге о микробиологии: James Monroe Jay, Martin J. Loessner, David A. Golden. 2005. Modern food microbiology. 7th edition, Springer Science, New York, N.Y. 790 p. Как правило, отсутствие жизнеспособных клеток может быть продемонстрировано следующим образом: на чашках с агаром отсутствует видимая колония или в жидкой среде для роста не увеличивается мутность после инокуляции различными концентрациями бактериальных препаратов ('нереплицирующихся' образцов) и инкубации в соответствующих условиях (аэробной и/или анаэробной атмосфере в течение, по меньшей мере, 24 часов).
Пробиотики определены для цели настоящего изобретения как «препараты микробных клеток или компоненты микробных клеток с полезным воздействием на здоровье или самочувствие организма-хозяина» (Salminen S, Ouwehand A. Benno Y. et al «Probiotics: how should they be defined» Trends Food Sci. Technol. 1999:10 107-10).
Возможность применения нереплицирующихся пробиотических микроорганизмов дает некоторые преимущества. У младенцев или маленьких детей с тяжелыми нарушениями иммунитета использование живых пробиотиков может быть ограничено в исключительных случаях благодаря потенциальному риску развития бактериемии. Нереплицирующиеся пробиотики могут быть использованы без каких-либо проблем.
Кроме того, предоставление нереплицирующихся пробиотических микроорганизмов позволяет осуществлять горячее восстановление с сохранением пользы для здоровья.
Композиции по настоящему изобретению содержат нереплицирующиеся пробиотические микроорганизмы в количестве, достаточном, по меньшей мере, для получения пользы для здоровья. Количество, достаточное для осуществления этого, определяется как «терапевтически эффективная доза». Количества, эффективные для данной цели, будут зависеть от множества факторов, известных специалистам в данной области, таких как масса и общее состояние здоровья младенца или маленького ребенка, и воздействие пищевой матрицы.
В профилактических применениях композиции по изобретению вводят потребителю, восприимчивому к или, в ином случае, имеющему риск развития расстройства, в количестве, которое является достаточным для, по меньшей мере, частичного уменьшения риска развития данного расстройства. Такое количество определяется как «профилактически эффективная доза». Опять же, точное количество зависит от множества факторов, таких как состояние здоровья и масса младенца, и от воздействия пищевой матрицы.
Специалист в данной области будет способен скорректировать соответствующим образом терапевтически эффективную дозу и/или профилактически эффективную дозу.
Как правило, композиция по настоящему изобретению содержит нереплицирующиеся пробиотические микроорганизмы в терапевтически эффективной дозе и/или в профилактически эффективной дозе.
Как правило, терапевтически эффективная доза и/или профилактически эффективная доза находится в интервале около 0,005 мг - 1000 мг нереплицирующихся пробиотических микроорганизмов на суточную дозу.
4
12
4
12
По показателю численных количеств нереплицирующиеся микроорганизмы после «высокотемпературной кратковременной» обработки могут присутствовать в композиции в количестве, соответствующем 10 до 10 эквивалентных КОЕ/г сухой композиции. Очевидно, нереплицирующиеся микроорганизмы не образуют колоний, соответственно, данный термин понимается как количество нереплицирующихся микроорганизмов, которые получено из 10 и 10 КОЕ/г реплипирующихся бактерий. Включаются микроорганизмы, которые являются инактивированными, нежизнеспособными или мертвыми или присутствуют в виде фрагментов, таких как ДНК или клеточная стенка и/или цитоплазматические соединения. Другими словами, количество микроорганизмов, которое содержит состав, выражается в виде колониеобразующей способности (КОЕ), того количества микроорганизмов, как если бы все микроорганизмы были живыми независимо от того, являются ли они, по сути, нереплицирующимися, то есть инактивированными или мертвыми, фрагментированными или находятся в смеси любых из представленных состояний.
4
9
5
9
Предпочтительно, если нереплицирующиеся микроорганизмы присутствуют в количественном эквиваленте от 10 до 10 КОЕ/г сухой композиции, а еще более предпочтительно в количественном эквиваленте в диапазоне от 10 до 10 КОЕ/г сухой композиции.
Пробиотики могут быть сделаны нереплицирующимися любым способом, известным в данной области.
Доступными в настоящее время технологиями приведения пробиотических штаммов в нереплицирующееся состояние являются тепловая обработка, γ-облучение, УФ-облучение и применение химических агентов (формалина, парафармальдегида).
Для приведения пробиотиков в нереплицирующееся состояние предпочтительным было бы применение метода, который является относительно простым в применении в производственной обстановке пищевой промышленности.
В настоящее время большинство продуктов на рынке, содержащих пробиотики, инактивируется тепловой обработкой в процессе их производства. Следовательно, было бы удобно, если бы было можно подвергать пробиотики тепловой обработке, или вместе с полученным продуктом, или, по меньшей мере, аналогичным образом, с сохранением при этом или с улучшением полезных свойств пробиотиков, или даже с приобретением нового полезного для потребителя свойства.
Однако инактивация пробиотических микроорганизмов тепловыми обработками связано в литературе, как правило, по меньшей мере, с частичной потерей пробиотической активности.
Авторы неожиданно обнаружили, что приведение пробиотических микроорганизмов в нереплицирующееся состояние, например, тепловой обработкой не приводит к потере пробиотических благоприятных воздействий, но, наоборот, может усилить существующие благоприятные воздействия и даже создать новые благоприятные воздействия.
Поэтому одно воплощение настоящего изобретения представляет собой порошкообразную зерновую композицию, где нереплицирующиеся пробиотические микроорганизмы были приведены в нереплицирующееся состояние тепловой обработкой.
Такая тепловая обработка может быть проведена, по меньшей мере, при 71,5°C в течение, по меньшей мере, 1 секунды.
Могут быть применены длительные тепловые обработки или кратковременные тепловые обработки.
В настоящее время в промышленных масштабах, как правило, предпочтительными являются кратковременные тепловые обработки, такие как УВТ-подобные тепловые обработки. Данный тип тепловой обработки снижает бактериальную обсемененность и снижает время обработки, тем самым уменьшая порчу питательных веществ.
Авторы впервые демонстрируют, что пробиотические микроорганизмы, подвергнутые тепловой обработке при высоких температурах в течение коротких периодов времени, демонстрируют противовоспалительные иммунные профили независимо от их начальных свойств. Конкретнее, с помощью этой тепловой обработки либо развивается новый противовоспалительный профиль, либо улучшается существующий противовоспалительный профиль.
Таким образом, стало возможным получение нереплицирующихся пробиотических микроорганизмов с противовоспалительным иммунным профилем путем использования специфических параметров тепловой обработки, которые соответствуют типичной промышленно применяемой тепловой обработке, даже если живые эквиваленты не являются противовоспалительными штаммами.
Поэтому, например, такая тепловая обработка может представлять собой высокотемпературную обработку при около 71,5-150°C в течение около 1-120 секунд. Высокотемпературная обработка может представлять собой высокотемпературную/кратковременную (ВТКВ) обработку или ультравысокотемпературную (УВТ) обработку.
Пробиотические микроорганизмы могут быть подвергнуты высокотемпературной обработке при около 71,5-150°C в течение короткого периода времени около 1-120 секунд.
Более предпочтительно микроорганизмы могут быть подвергнуты высокотемпературной обработке при около 90-140°C, например 90°-120°C, в течение короткого периода времени около 1-30 секунд.
Данная высокотемпературная обработка приводит микроорганизмы, по меньшей мере, частично в нереплицирующееся состояние.
Высокотемпературная обработка может быть проведена при нормальном атмосферном давлении, но также может быть проведена при высоком давлении. Типичные диапазоны давления составляют от 1 до 50 бар, предпочтительно от 1 до 10 бар, еще более предпочтительно от 2 до 5 бар. Очевидно, что предпочтительно, если пробиотики являются инактивированными тепловой обработкой в среде, которая является либо жидкой, либо твердой, при применении тепла. Идеальное применяемое давление будет, следовательно, зависеть от природы композиции, в которой представлены микроорганизмы, и от используемой температуры.
Высокотемпературная обработка может быть проведена в температурном диапазоне около 71,5-150°C, предпочтительно около 90-120°C, еще более предпочтительно около 120-140°C.
Высокотемпературная обработка может быть проведена в течение короткого периода времени около 1-120 секунд, предпочтительно около 1-30 секунд, еще более предпочтительно около 5-15 секунд.
Данные временные интервалы обозначают время, в течение которого пробиотические микроорганизмы подвергаются воздействию данной температуры. Следует заметить, что микроорганизмы предоставляются в зависимости от природы и количества композиции, а в зависимости от структуры используемого нагревательного прибора время нагревания может отличаться.
Однако, как правило, композицию по настоящему изобретению и/или микроорганизмы обрабатывают с помощью высокотемпературной кратковременной обработки (ВТКВ), мгновенной пастеризации или с помощью ультравысокотемпературной обработки (УВТ).
УВТ-обработка является ультравысокотемпературным технологическим способом или ультравысокотемпературной обработкой (оба сокращенно УВТ), включающие, по меньшей мере, частичную стерилизацию композиции нагреванием в течение короткого периода времени, около 1-10 секунд, при температуре, превышающей 135°C (275°F), которая является температурой, необходимой для уничтожения бактериальных спор в молоке. Например, обработка молока данным способом при использовании температуры, превышающей 135°C, позволяет снизить бактериальную нагрузку/обсемененнось в течение необходимого периода удержания (до 2-5 сек), что позволяет осуществить проточную операцию.
Существует два основных типа систем УВТ: прямая и непрямая системы. В прямой системе продукты обрабатывают инъекцией пара, или нагнетанием пара, тогда как в непрямой системе продукты нагревают с помощью плоского теплообменника, трубчатого теплообменника или скребкового теплообменника. Комбинация систем УВТ может быть применена на любой стадии или множестве стадий в процессе приготовления продукта.
ВТКР-обработка определяется следующим образом (высокотемпературная/кратковременная): способ пастеризации, разработанный для достижения 5-кратного логарифмического уменьшения, уничтожения 99,9999% от числа жизнеспособных микроорганизмов в молоке. Этого достаточно, как считается, для разрушения почти всех дрожжей, плесени и распространенных бактерий, вызывающих порчу, а также гарантирует достаточное разрушение распространенных патогенных устойчивых к тепловой обработке организмов. В ВТКВ-процессе молоко нагревают до 71,7°C (161°F) в течение 15-20 секунд.
Мгновенная пастеризация является способом тепловой пастеризации скоропортящихся напитков, таких как фруктовые и овощные соки, пиво и молочные продукты. Она осуществляется до заполнения в контейнеры для того, чтобы уничтожить микроорганизмы, вызывающие порчу, и для того, чтобы сделать продукты безопаснее и увеличить срок их хранения. Жидкость движется в контролируемом непрерывном потоке, одновременно, подвергаясь температурам от 71,5°C (160°F) до 74°C (165°F) в течение около 15-30 секунд.
Для цели настоящего изобретения термин «кратковременная высокотемпературная обработка» должен включать высокотемпературные кратковременные (ВТКВ) обработки, УВТ-обработки, и, например, мгновенную пастеризацию.
Так как такая тепловая обработка обеспечивает получение нереплицирующихся пробиотиков с улучшенным противовоспалительным профилем, то порошкообразная зерновая композиция по настоящему изобретению может быть предназначена для применения в профилактике или лечении воспалительных расстройств.
Воспалительные расстройства, которые могут быть подвергнуты лечению или профилактике с помощью композиции, полученной согласно настоящему изобретению, ничем конкретно не ограничены. Например, они могут быть выбраны из группы, состоящей из острых воспалений, таких как сепсис, ожоги, и хронических воспалений, таких как воспалительное заболевание кишечника, например, болезнь Крона, язвенный колит, паучит; некротический энтероколит; кожных воспалений, таких как воспаление, индуцированное УФ или химическими соединениями, экзема, раздраженная кожа; синдрома раздраженной толстой кишки; воспаления глаз; аллергии, астмы; и их комбинаций.
Если для придания пробиотическим микроорганизмам свойства нереплицируемости используются продолжительные тепловые обработки, то такая тепловая обработка может проводиться в температурном интервале около 70-150°C в течение около 3 минут - 2 часов, предпочтительно в интервале 80-140°C в течение от 5 минут до 40 минут.
В то время, как из уровня техники известно, что бактерии, ставшие нереплицирующимися с помощью продолжительной тепловой обработки, как правило, менее эффективны, чем живые клетки по части расширения их пробиотических свойств, авторам настоящего изобретения удалось продемонстрировать, что подвергнутые тепловой обработке пробиотики являются лучшими при стимулировании иммунной системы по сравнению с их живыми эквивалентами.
Настоящее изобретение также относится к порошкообразной зерновой композиции, содержащей пробиотические микроорганизмы, которые стали нереплицирующимися с помощью тепловой обработки, предпочтительно с помощью высокотемпературной обработки при, по меньшей мере, 70°C в течение, по меньшей мере, 3 минут.
Иммуноусиливающие воздействия нереплицирующихся пробиотиков были подтверждены иммунопрофилированием in vitro. В используемой in vitro-модели применяется анализ профиля цитокинов из мононуклеаров периферической крови человека (РВМС), и данная модель согласуется со стандартной моделью, известной в данной области для проверки иммуномодулирующих соединений (Schultz et al., 2003, Journal of Dairy Research 70, 165-173; Taylor et al., 2006, Clinical and Experimental Allergy, 36, 1227-1235; Kekkonen et al., 2008, World Journal of Gastroenterology, 14, 1192-1203).
In vitro-анализ РВМС использовался несколькими авторами/исследовательскими группами, например, для классификации пробиотиков согласно их иммунному профилю, т.е. их противовоспалительным характеристикам (Kekkonen et al., 2008, World Journal of Gastroenterology, 14, 1192-1203). Например, было показано, что данный анализ позволяет спрогнозировать противовоспалительное воздействие кандидатов в пробиотики в мышиных моделях кишечного колита (Foligne, B., et al., 2007, World J. Gastroenterol. 13:236-243). Более того, данный анализ регулярно используется для считывания данных при клинических испытаниях, и было показано, что он дает результаты, которые согласуются с клиническими исходами (Schultz et al., 2003, Journal of Dairy Research 70, 165-173; Taylor et al., 2006, Clinical and Experimental Allergy, 36, 1227-1235).
Аллергические заболевания неуклонно растут на протяжении последних десятилетий, и в настоящее время они рассматриваются ВОЗ как эпидемия. В общем виде аллергию рассматривают как результат дисбаланса между Th1- и Th2-ответами иммунной системы, который приводит к сильному сдвигу по направлению к продуцированию Th2-медиаторов. Таким образом, аллергия может подавляться, подвергаться отрицательной регуляции или может предотвращаться путем восстановления соответствующего баланса между Th1- и Th2-ветвями иммунной системы. Это подразумевает необходимость уменьшения ответов Th2 или увеличения, по меньшей мере, временно Th1-ответов. Последний, являясь предполагаемой характерной чертой вторичного иммунного ответа, часто сопровождается, например, более высокими уровнями IFNγ, TNF-α и IL-12 (Kekkonen et al., 2008, World Journal of Gastroenterology, 14, 1192-1203; Viljanen M. et al., 2005, Allergy, 60, 494-500).
Порошкообразная зерновая композиция по настоящему изобретению, следовательно, позволяет осуществить лечение или проведение профилактики расстройств, которые связаны с нарушением иммунной защиты.
Следовательно, расстройства, связанные с нарушением иммунной защиты, которые могут быть подвергнуты лечению или профилактике с помощью композиции, полученной с применением настоящего изобретения, ничем конкретно не ограничены.
Например, они могут быть выбраны из группы, состоящей из инфекций, конкретно, бактериальных, вирусных, грибных и/или паразитарных инфекций; фагоцитарного дефицита; иммунодепрессии от легкой до тяжелой стадии, как, например, иммунодепрессии, индуцированной стрессом или иммунодепрессивными лекарственными средствами, химиотерапией или лучевой терапией; естественных состояний менее иммунокомпетентных иммунных систем, таких как иммунные системы новорожденных; аллергий; и их комбинаций.
Порошкообразная зерновая композиция, описанная в настоящем изобретении, позволяет также увеличить ответ объекта на вакцины, в частности на пероральные вакцины.
Эффективным будет любое количество нереплицирующихся микроорганизмов. Однако, как правило, предпочтительно, если, по меньшей мере, 90%, предпочтительно, по меньшей мере, 95%, более предпочтительно, по меньшей мере, 98%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 99%, идеально, по меньшей мере, 99,9%, наиболее идеально все пробиотики являются нереплицирующимися.
В одном воплощении настоящего изобретения все микроорганизмы являются нереплицирующимися.
Следовательно, в порошкообразной зерновой композиции по настоящему изобретению, по меньшей мере, 90%, предпочтительно, по меньшей мере, 95%, более предпочтительно, по меньшей мере, 98%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 99%, идеально, по меньшей мере, 99,9%, наиболее идеально все пробиотики являются нереплицирующимися.
Все пробиотические микроорганизмы могут использоваться для целей настоящего изобретения.
Например, пробиотические микроорганизмы могут быть выбраны из группы, состоящей из бифидобактерий, лактобацилл, пропионовых бактерий или их комбинаций, например Bifidobacterium longum, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium adolescentis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum, Lactococcus lactis, Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis, Lactococcus diacetylactis, Lactococcus cremoris, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii, Escherichia coli и/или их смесей.
Детская каша согласно настоящему изобретению может, например, содержать нереплицирующиеся пробиотические микроорганизмы, выбранные из группы, состоящей из Bifidobacterium longum NCC 3001, Bifidobacterium longum NCC 2705, Bifidobacterium breve NCC 2950, Bifidobacterium lactis NCC 2818, Lactobacillus johnsonii La1, Lactobacillus paracasei NCC 2461, Lactobacillus rhamnosus NCC 4007, Lactobacillus reuteri DSM 17938, Lactobacillus reuteri ATCC55730, Streptococcus thermophilus NCC 2019, Streptococcus thermophilus NCC 2059, Lactobacillus casei NCC 4006, Lactobacillus acidophilus NCC 3009, Lactobacillus casei ACA-DC 6002 (NCC 1825), Escherichia coli Nissle, Lactobacillus bulgaricus NCC 15, Lactococcus lactis NCC 2287 или из их комбинаций.
Все такие штаммы являются или депонированными согласно Будапештскому договору и/или являются коммерчески доступными.
Штаммы, депонированные согласно Будапештскому договору, представлены ниже:
Bifidobacterium longum NCC 3001:
ATCC BAA-999
Bifidobacterium longum NCC 2705:
CNCM I-2618
Bifidobacterium breve NCC 2950
CNCM I-3865
Bifidobacterium lactis NCC 2818:
CNCM I-3446
Lactobacillus paracasei NCC 2461:
CNCM I-2116
Lactobacillus rhamnosus NCC 4007:
CGMCC 1.3724
Streptococcus themophilus NCC 2019:
CNCM I-1422
Streptococcus themophilus NCC 2059:
CNCM I-4153
Lactococcus lactis NCC 2287:
CNCM I-4154
Lactobacillus casei NCC 4006:
CNCM I-1518
Lactobacillus casei NCC 1825:
ACA-DC 6002
Lactobacillus acidophilus NCC 3009:
ATCC 700396
Lactobacillus bulgaricus NCC 15:
CNCM I-1198
Lactobacillus johnsonii La1
CNCM I-1225
Lactobacillus reuteri DSM17938
DSM 17938
Lactobacillus reuteri ATCC55730
ATCC 55730
Escherichia coli Nissle 1917:
DSM 6601
Штаммы, обозначенные как ATCC, депонированы в патентном депозитории ATCC, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110, USA.
Штаммы, обозначенные как CNCM, депонированы в COLLECTION NATIONALE DE CULTURES DE MICROORGANISMES (CNCM), 25 rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS Cedex 15, France.
Штаммы, обозначенные как CGMCC, депонированы в China General Microbiological Culture Collection Center, Института микробиологии Китайской академии наук, Zhongguancun, P.O. Box 2714, Beijing 100080, China.
Штаммы, обозначенные как ACA-DC, депонированы в Greek Coordinated Collections of Microorganisms, лаборатории молочных продуктов департамента науки и технологии продуктов питания, сельскохозяйственного университета Афин, 75, Iera odos, Botanikos, Athens, 118 55, Greece.
Штаммы, обозначенные как DSM, депонированы в DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7 B, 38124 Braunschweig, GERMANY.
Специалист в данной области поймет, что можно свободно комбинировать все признаки описанного в данном документе изобретения, не выходя при этом за рамки изобретения.
Дополнительные преимущества и особенности настоящего изобретения очевидны из приведенных ниже Примеров и Фигур.
Фигуры 1A и B демонстрируют усиление противовоспалительных иммунных профилей пробиотиков, подвергнутых «кратковременной высокотемпературной обработке».
Фигура 2 демонстрирует не обладающие противовоспалительными свойствами пробиотические штаммы, которые становятся противовоспалительными, т.е. которые демонстрируют ярко выраженные противовоспалительные иммунные профили in vitro после «кратковременной высокотемпературной обработки».
Фигуры 3A и B демонстрируют пробиотические штаммы, используемые в коммерчески доступных продуктах, которые демонстрируют усиление или появление новых противовоспалительных иммунных профилей in vitro после «кратковременной высокотемпературной обработки».
Фигуры 4A и B демонстрируют молочные заквасочные штаммы (т.е. Lc1-заквасочные штаммы), которые демонстрируют усиление или появление новых противовоспалительных иммунных профилей in vitro при тепловой обработке высокими температурами.
Фигура 5 демонстрирует не обладающий противовоспалительными свойствами пробиотический штамм, который демонстрирует противовоспалительный иммунный профиль in vitro после обработки с помощью ВТКВ.
Фигура 6: анализ основных компонентов на основе данных РВМС (IL-12p40, IFN-γ, TNF-α, IL-10), полученных с использованием живых и подвергнутых тепловой обработке (140°C в течение 15 секунд) форм пробиотических и молочных заквасочных штаммов. Все данные характеризуют один штамм или живой вид, подвергнутый тепловой обработке, идентифицированный по его NCC-номеру или по названию.
Фигура 7 демонстрирует соотношения IL-12p40/IL-10 живых и подвергнутых тепловой обработке штаммов (85°C, 20 мин). В целом, тепловая обработка при 85°C в течение 20 мин приводит к увеличению соотношений IL-12p40/IL-10 в отличие от данных, соответствующих «кратковременным высокотемпературным обработкам» по настоящему изобретению (Фигуры 1, 2, 3, 4 и 5).
Фигура 8 демонстрирует усиление in vitro секреции цитокинов из человеческих клеток РВМС, стимулированных бактериями, подвергнутыми тепловой обработке.
Фигура 9 демонстрирует процент интенсивности диареи, наблюдаемой у OVA-сенсибилизированных мышей, стимулированных физиологическим раствором (отрицательный контроль), OVA-сенсибилизированных мышей, стимулированных OVA (положительный контроль) и у OVA-сенсибилизированных мышей, стимулированных OVA и обработанных бактериями Bifidobacterium breve NCC2950, которые были подвергнуты тепловой обработке, или живыми бактериями. Результаты представлены в виде процента интенсивности диареи (Среднее значение ±SEM, рассчитанное на основе 4 независимых экспериментов), при 100% интенсивности диареи, соответствующих симптомам, развивающимся в группе положительного контроля (мыши, сенсибилизированные и стимулированные аллергеном).
Пример 1
Методика
Бактериальные препараты
Предполагается, что польза для здоровья, получаемая под действием живых пробиотиков на иммунную систему хозяина, как правило, является специфичной в зависимости от штамма. Было продемонстрировано, что пробиотики, индуцирующие IL-10 на высоком уровне и/или индуцирующие про-воспалительные цитокины на низком уровне in vitro (РВМС-анализ), являются сильными противовоспалительными штаммами in vivo (Foligne, B., et al., 2007, World J. Gastroenterol. 13:236-243).
Для исследования противовоспалительных свойств пробиотиков, подвергнутых тепловой обработке, использовали несколько пробиотических штаммов. Этими штаммами были штаммы Bifidobacterium longum NCC 3001, Bifidobacterium longum NCC 2705, Bifidobacterium breve NCC 2950, Bifidobacterium lactis NCC 2818, Lactobacillus paracasei NCC 2461, Lactobacillus rhamnosus NCC 4007, Lactobacillus casei NCC 4006, Lactobacillus acidophilus NCC 3009, Lactobacillus casei ACA-DC 6002 (NCC 1825) и Escherichia coli Nissle. Также протестировали несколько штаммов заквасочных культур, включающих некоторые штаммы, коммерчески используемые для получения Lc-ферментированных продуктов Nestle: Streptococcus thermophilus NCC 2019, Streptococcus thermophilus NCC 2059, Lactobacillus bulgaricus NCC 15 и Lactococcus lactis NCC 2287.
2
2
Бактериальные клетки культивировали в условиях, оптимизированных для каждого штамма в 5-15 л биореакторах. Можно использовать все типичные среды для бактериального роста. Такие среды известны специалистам в данной области. При коррекции pH до значения 5,5 непрерывно добавляли 30% раствор щелочи (либо NaOH, либо Ca(OH)). Введением CO в свободное пространство над продуктом поддерживали достаточные анаэробные условия, E. coli при этом культивировали в стандартных аэробных условиях.
9
10
Бактериальные клетки собирали с помощью центрифугирования (5000g, 4°C) и ресуспендировали в фосфатно-солевом буфере (PBS) в достаточном объеме с целью достижения конечной концентрации около 10-10 КОЕ/мл. Часть препарата замораживали при -80°C в 15% глицерине. Другую часть клеток подвергали тепловой обработке с помощью:
- ультравысокой температуры 140°C в течение 15 сек; путем инжекции глухого пара;
- кратковременной высокотемпературной обработки (ВТКВ): 74°C, 90°C и 120°C в течение 15 сек путем инжекции глухого пара;
- продолжительной низкотемпературной обработки (85°C, 20 мин) в водяной бане.
После тепловой обработки образцы держали замороженными на -80°C до момента использования.
In vitro-иммунопрофилирование бактериальных препаратов
5
6
Определяли иммунные профили живых и подвергнутых тепловой обработке бактериальных препаратов (т.е. способность индуцировать секрецию специфических цитокинов из клеток крови человека in vitro). Человеческие мононуклеары перефирической крови (РВМС) выделяли из кровяных фильтров. После разделения клеток в градиенте плотности, мононуклеарные клетки собирали и отмывали дважды сбалансированным солевым раствором Хенкса. Затем клетки ресуспендировали в среде Дульбекко, модифицированной по способу Исков (Iscove′s Modified Dulbecco′s Medium) (IMDM, «Sigma»), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки («Bioconcept», Париж, Франция), 1% L-глутамин («Sigma»), 1% пенициллин/стрептомицин («Sigma») и 0,1% гентамицин («Sigma»). Затем РВМС (7×10 клеток/на лунку) инкубировали с живыми или подвергнутыми тепловой обработке бактериями (эквивалентное количество 7×10 КОЕ/на лунку) в 48-луночных планшетах в течение 36 ч. Воздействия живых и подвергнутых тепловой обработке бактерий тестировали на РВМС из 8 доноров-индивидуумов, разделенных на два отдельных эксперимента. Через 36 часов инкубации культуральные чашки замораживали и хранили при -20°C до проведения измерения цитокинов. Профилирование цитокинов осуществляли параллельно (т.е. в одном и том же эксперименте на одних и тех же партиях РВМС) для живых бактерий и для их подвергнутых тепловой обработке эквивалентов.
Уровни цитокинов (IFN-γ, IL-12p40, TNF-α и IL-10) в надосадочных жидкостях клеточных культур через 36 часов инкубации определяли тИФА («R&D DuoSet Human IL-10», «BD OptEIA Human IL12p40», «BD OptEIA Human TNFα», «BD OptEIA Human IFN-γ») следуя инструкциям изготовителей. IFN-γ, IL-12p40 и TNF-α являются провоспалительными цитокинами, тогда как IL-10 является мощным противовоспалительным медиатором. Результаты выражены в виде средних значений (пг/мл)+/- SEM от 4 доноров-индивидуумов и представляют два индивидуальных эксперимента, каждый из которых осуществлен с 4 донорами. Соотношение IL-12p40/IL-10 рассчитывают для каждого штамма в качестве прогнозируемой величины in vivo противовоспалительного эффекта (Foligne, B., et а1., 2007, World J. Gastroenterol. 13:236-243).
Числовые значения для цитокинов (пг/мл), определенные с помощью тИФА (см. выше) для каждого штамма, заносили в программное обеспечение «BioNumerics v5.10» («Applied Maths», Синт-Мартенс-Латем, Бельгия). Анализ главных компонентов (РСА, расчетный метод) осуществляли на основе этой группы данных. Вычитание средних значений по признакам и деление на вариантность по признакам было включено в данный анализ.
Результаты
Противовоспалительные профили, полученные с помощью обработок типа Ультравысокотемпературной обработки (УВТ)/Высокотемпературной кратковременной обработки (ВТКВ).
Исследуемые пробиотические штаммы подвергали воздействию серии тепловых обработок (Ультравысоктемпературная (УВТ), Высокотемпературная кратковременная (ВТКВ) и при 85°C в течение 20 мин) и сравнивали их иммунные профили с профилями живых клеток in vitro. При инкубации с человеческими клетками РВМС живые микроорганизмы (пробиотики и/или молочные заквасочные культуры) индуцировали продуцирование цитокинов на разном уровне (Фигуры 1, 2, 3, 4 и 5). Тепловая обработка этих микроорганизмов модифицировала уровни цитокинов, полученных с помощью РВМС, зависимым от температуры образом. «Высокотемпературные кратковременные» обработки (120°C или 140°C в течение 15 сек) давали нереплицирующиеся бактерии с противовоспалительными иммунными профилями (Фигуры 1, 2, 3 и 4). Фактически, штаммы, подвергнутые обработке типа УВТ (140°C, 15 сек), индуцировали менее про-воспалительные цитокины (TNF-α, IFN-γ, IL-12p40), при этом с сохранением или с индукцией дополнительной выработки IL-10 (по сравнению с живыми эквивалентами). Полученные в результате соотношения IL-12p40/IL-10 были ниже для любых штаммов, подвергнутых обработке типа УВТ, по сравнению с живыми клетками (Фигуры 1, 2, 3 и 4). Это наблюдение также было верным для бактерий, подвергнутых обработке типа ВТКВ, т.е. подвергнутых воздействию 120°C в течение 15 сек (Фигуры 1, 2, 3 и 4) или 74°C и 90°C в течение 15 сек (Фигура 5). Тепловые обработки (обработки типа УВТ или типа ВТКВ) обладали аналогичным эффектом в отношении in vitro иммунных профилей пробиотических штаммов (Фигуры 1, 2, 3 и 5) и молочных заквасочных культур (Фигура 4). Анализ основных компонентов на основе данных РВМС, полученных с живыми и подвергнутыми тепловой обработке (140°C, 15 сек) пробиотическими и молочными заквасочными штаммами, выявил, что живые штаммы распространялись вдоль оси x, что говорит о том, что штаммы демонстрируют очень разные иммунные профили in vitro, от слабых (левая панель) до сильных (правая панель) индукторов провоспалительных цитокинов. Штаммы, подвергнутые тепловой обработке, кластеризуются на левой панели графика, демонстрируя, что про-воспалительные цитокины гораздо слабее индуцируются с помощью штаммов, подвергнутых тепловой обработке (Фигура 6). Напротив, бактерии, подвергнутые тепловой обработке при 85°C в течение 20 мин, индуцировали больше провоспалительных цитокинов и меньше IL-10 по сравнению с живыми клетками, которые приводят к получению более высоких соотношений IL-12p40/IL-10 (Фигура 7).
Противовоспалительные профили, усиленные или полученные обработками типа УВТ и ВТКВ.
Штаммы, подвергнутые обработкам УВТ и ВТКВ, демонстрируют противовоспалительные профили независимо от соответствующих им исходных иммунных профилей (живые клетки). Было показано, что пробиотические штаммы, известные как противовоспалительные in vivo и демонстрирующие противовоспалительные профили in vitro (B. longum NCC 3001, B. longum NCC 2705, B. breve NCC 2950, B. lactis NCC 2818) демонстрируют усиленные противовоспалительные профили in vitro после «кратковременных высокотемпературных» обработок. Как показано на Фигуре 1, соотношения IL-12p40/IL-10 штаммов Bifidobacterium, подвергнутых обработке типа УВТ, были ниже, чем эти соотношения у живых эквивалентов, демонстрируя, таким образом, улучшенные противовоспалительные профили образцов, подвергнутых обработке типа УВТ. Более удивительно то, что получение противовоспалительных профилей с помощью обработок типа УВТ и ВТКВ подтверждалось для живых штаммов, не являющихся противовоспалительными. Оба штамма как живые L. rhamnosus NCC 4007, так и L. paracasei NCC 2461 демонстрируют высокие соотношения IL-12p40/IL-10 in vitro (Фигуры 2 и 5). Было показано, что два штамма не обладают защитными свойствами против TNBS-индуцированного колита у мышей. Соотношения IL-12p40/IL-10, индуцированные с помощью L. rhamnosus NCC 4007 и L. paracasei NCC 2461, существенно снижались после «кратковременных высокотемпературных» обработок (УВТ или ВТКВ), достигая уровня настолько низкого, как уровень, полученный с использованием штаммов Bifidobacterium. Эти низкие соотношения IL-12p40/IL-10 являются следствием низких уровней выработки IL-12p40, и с отсутствием изменений (Z. rhamnosus NCC 4007) или мощной индукцией секреции IL-10 (L. paracasei NCC 2461) (Фигура 2).
Как следствие:
- противовоспалительные профили живых микроорганизмов могут быть усилены с помощью тепловых обработок типа УВТ и ВТКВ (например, В. longum NCC 2705, В. longum NCC 3001, В. breve NCC 2950, В. lactis NCC 2818);
- противовоспалительные профили могут быть получены для живых микроорганизмов, не являющихся противовоспалительными (например, L. rhamnosus NCC 4007, L. paracasei NCC 2461, молочные закваски S. thermophilus NCC 2019), с помощью тепловых обработок типа УВТ и типа ВТКВ;
- Противовоспалительные профили также были продемонстрированы для штаммов, выделенных из коммерчески доступных продуктов (Фигуры 3 A & B), включающих пробиотический штамм E. coli.
Влияние обработок типа УВТ/ВТКВ было аналогичным для тестируемых пробиотиков и молочных заквасочных культур, например бифидобактерий и стрептококков.
Обработки типа УВТ/ВТКВ применялись к нескольким штаммам лактобацилл, бифидобактерий и стрептококков, демонстрирующим различные иммунные профили in vitro. Все штаммы индуцировали меньше провоспалительных цитокинов после обработок типа УВТ/ВТКВ, чем их живые эквиваленты (Фигуры 1, 2, 3, 4, 5 и 6), демонстрируя, что эффект обработок типа УВТ/ВТКВ, оказываемый на иммунные свойства полученных в результате нереплицирующихся бактерий, может быть общим для всех пробиотиков, конкретно, для штаммов лактобацилл и бифидобактерий и конкретных штаммов Е. coli, a также для всех молочных заквасочных культур, конкретно, для стрептококков, лактококков и лактобацилл.
Пример 2
Методика
Бактериальные препараты
Пять пробиотичесих штаммов использовали для исследования иммуностимулирующих свойств нереплицирующихся пробиотиков: 3 бифидобактерии (B. longum NCC3001, B. lactis NCC2818, B. breve NCC2950) и 2 лактобациллы (L. paracasei NCC2461, L. rhamnosus NCC4007).
Бактериальные клетки выращивали на MRS периодической ферментацией при 37°C в течение 16-18 часов без контроля pH. Бактериальные клетки откручивали (5,000 g, 4°C) и ресуспендировали в фосфатно-солевом буфере до разведения в соленой воде для достижения конечной концентрации около 10E10 КОЕ/мл. B. longum NCC3001, В. lactis NCC2818, L. paracasei NCC2461, L. rhamnosus NCC4007 подвергали тепловой обработке при 85°C в течение 20 мин в водяной бане. B. breve NCC2950 подвергали тепловой обработке при 90°C в течение 30 минут в водяной бане. Повергнутые тепловой обработке бактериальные суспензии разделяли на аликвоты и хранили замороженными при -80°C до использования. Живые бактерии хранили при -80°C в PBS- 15% глицерин до использования.
Иммунопрофилирование in vitro бактериальных препаратов
5
6
Определяли иммунные профили живых и подвергнутых тепловой обработке бактериальных препаратов (т.е. способность индуцировать секрецию специфических цитокинов из клеток крови человека in vitro). Человеческие мононуклеары перефирической крови (РВМС) выделяли из кровяных фильтров. После разделения клеток в градиенте плотности, мононуклеарные клетки собирали и отмывали дважды сбалансированным солевым раствором Хенкса. Затем клетки ресуспендировали в среде Дульбекко, модифицированной по способу Исков (Iscove′s Modified Dulbecco′s Medium) (IMDM, «Sigma»), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки («Bioconcept», Париж, Франция), 1% L-глутамин («Sigma»), 1% пенициллин/стрептомицин («Sigma») и 0,1% гентамицин («Sigma»). РВМС (7×10 клеток/на лунку) затем инкубировали с живыми или подвергнутыми тепловой обработке бактериями (эквивалентное количество 7×10КОЕ/на лунку) в 48-луночных планшетах в течение 36 ч. Воздействия живых и подвергнутых тепловой обработке бактерий тестировали на РВМС из 8 доноров-индивидуумов разделенных на два отдельных эксперимента. Через 36 часов инкубации культуральные чашки замораживали и хранили при -20°C до проведения измерения цитокинов. Профилирование цитокинов осуществляли параллельно (т.е. в одном и том же эксперименте на одних и тех же партиях РВМС) для живых бактерий и для их подвергнутых тепловой обработке эквивалентов.
Уровни цитокинов (IFN-γ, IL-12p40, TNF-α и IL-10) в надосадочных жидкостях клеточных культур через 36 часов инкубации определяли тИФА («R&D DuoSet Human IL-10», «BD OptEIA Human IL12p40», «BD OptEIA Human TNF», «BD OptEIA Human IFN-γ»), следуя инструкциям изготовителей. IFN-γ, IL-12p40 and TNF-α являются провоспалительными цитокинами, тогда как IL-10 является мощным противовоспалительным медиатором. Результаты выражаются в виде средних значений (пг/мл)+/- SEM от 4 доноров-индивидуумов и характеризуют два индивидуальных эксперимента, каждый из которых осуществлен с 4 донорами.
In vivo воздействие живых и подвергнутых тепловой обработке Bifidobacterium breve NCC2950 при предотвращении аллергической диареи
9
Мышиную модель аллергической диареи применяли для проверки Th1-промотирующего воздействия B. breve NCC2950 (Brandt E.B et al. JCI 2003; 112(11):1666-1667). После сенсибилизации (2 перитонеальные инъекции Овальбумина (OVA) и алюминиевокалиевыми квасцами с интервалом 14 дней; дни 0 и 14) самцы мышей Balb/c перорально стимулировали OVA 6 раз (дни 27, 29, 32, 34, 36, 39), что привело к временным клиническим симптомам (диарея) и изменениям иммунных параметров (концентрации в плазме общего IgE, OVA-специфичного IgE, мушиной протеазы 1 тучных клеток, т.е. MMCP-1). Bifidobacterium breve NCC2950 живые или подвергнутые тепловой обработке при 90°C в течение 30 минут вводили зондом за 4 дня до сенсибилизации OVA (дни -3, -2, -1, 0 и дни 11, 12, 13 и 14) и в течение периода стимулирования (дни 23-39). Использовали ежедневную бактериальную дозу около 10КОЕ или эквивалент КОЕ/мышь.
Результаты
Индукция секреции «провоспалительных» цитокинов после тепловой обработки.
Способность подвергнутых тепловой обработке бактериальных штаммов стимулировать секрецию цитокинов человеческими мононуклеарными клетками периферической крови (РВМС) оценивали in vitro. Иммунные профили на основе четырех цитокинов в результате стимуляции РВМС инактивированными тепловой обработкой бактериями сравнивали с профилями, индуцированными живыми бактериальными клетками в том же самом in vitro анализе.
Подвергнутые тепловой обработке препараты помещали на чашки и оценивали отсутствие каких-либо жизнеспособных единиц. Подвергнутые тепловой обработке бактериальные препараты не продуцируют колонии после рассевания.
Живые пробиотики индуцировали другие и штаммозависимые уровни продуцирования цитокинов при инкубации с человеческими РВМС (Фигура 8). Тепловая обработка пробиотиков модифицирует уровни цитокинов, выработанных РВМС, по сравнению с их живыми эквивалентами. Подвергнутые тепловой обработке бактерии индуцируют больше провоспалительных цитокинов (TNF-α, IFN-γ, IL-12p40), чем производят их живые эквиваленты. Напротив подвергнутые тепловой обработке бактерии индуцируют подобные или более низкие количества IL-10 по сравнению с живыми клетками (Фигура 8). Эти данные говорят о том, что подвергнутые тепловой обработке бактерии лучше способны стимулировать иммунную систему, чем их живые эквиваленты и, следовательно, лучше способны усиливать ослабленную иммунную защиту. Другими словами in vitro данные иллюстрируют улучшенное иммуноусиливающее воздействие бактериальных штаммов после тепловой обработки.
Для иллюстрации усиленного воздействия подвергнутых тепловой обработке B. breve NCC2950 (по сравнению с живыми клетками) на иммунную систему, живые и подвергнутые тепловой обработке B. breve NCC2950 (штамм A) проверяли в животной модели аллергической диареи.
По сравнению с положительной контрольной группой, интенсивность диареи значительно и сообразно снижалась после тепловой обработки с помощью B. breve NCC2950 (41,1%±4,8), тогда как после обработки живыми B. breve NCC2950 интенсивность диареи снижалась только на 20±28,3%. Эти результаты говорят о том, что подвергнутые тепловой обработке B. breve NCC2950 демонстрируют усиленное защитное воздействие против аллергической диареи по сравнению с их живыми эквивалентами (Фигура 9).
Как следствие, было показано, что способность пробиотиков усиливать иммунную защиту после тепловой обработки была улучшена.
Пример 3
Готовую к употреблению детскую кашу получают путем смешивания 15 г состава с 90 мл воды. Сухая композиция может быть получена любым способом, известным специалистам в данной области.
Для младенцев в возрасте 6-12 месяцев
Ингредиенты: пшеничная мука, манная крупа (пшеница), минеральное вещество (железо), витамины (C, ниацин, B6, тиамин), кукурузный мальтодекстрин.
Энергетическая ценность
228кДж/15 г
Белок
1,7 г/15 г
Жир
0,3 г/15 г
Углеводы
11,3/15 г (3,6 г приходится на сахар)
Пробиотики
10<sup>8</sup> КОЕ/15 г подвергнутых тепловой обработке (85°C в течение 20 мин) Bifidobacterium longum NCC 3001