Распределение электрофоретических фракций белковых продуктов из семян льна

678.562:633.854.59

РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИХ ФРАКЦИЙ БЕЛКОВЫХ ПРОДУКТОВ ИЗ СЕМЯН ЛЬНА

И.В. ШУЛЬВИНСКАЯ, В.Г. ЩЕРБАКОВ, А.В. БАРБАШОВ

Кубанский государственный технологический университет

В результате исследований [1] нами были разработаны термические и биохимические способы получения модифицированных белковых продуктов из семян льна. В ходе термической модификации белкового комплекса варьировали начальную влажность, температуру нагревания семян и продолжительность тепловой обработки. Белковые продукты, термомодифицированные при 40, 60 и 80°С, были обозначены как БПЛ-40, БПЛ-60, БПЛ-80; белковый продукт из немо-дифицированных семян льна - БПЛ-1; белковый продукт, полученный путем протеолитической модификации - частичным ферментативным гидролизом (семена льна предварительно увлажняли, прогревали и затем проращивали в течение 48 ч), - БПЛ-48. Подбор соответствующих температурных режимов прорастания обусловлен известной резистентностью запасных белков к действию собственных протеолитических ферментов. Выбранный интенсивный температурный режим при замачивании семян (25-28° С) активировал специфические протеазы, отщепляющие один или два коротких пептида, после чего вся белковая молекула становилась доступной для протеолиза.

Цель данной работы - сравнение влияния термической и протеолитеческой модификаций белковых продуктов, полученных из семян льна сорта Ручеек, на их фракционный состав.

Количественную оценку распределения электрофоретических фракций белковых продуктов проводили методом капиллярного электрофореза на анализаторе Капель-103Р (фирма «Люмекс», Санкт-Петербург).

Качественную оценку модифицированных фракций осуществляли, оценивая площади пиков на их хроматограммах по отношению к данным по немодифи-цированным белкам семян льна того же сорта. На рис. 1-5 представлены электорофореграммы соответственно БПЛ-1, БПЛ-48, БПЛ-40, БПЛ-60 и БПЛ-80.

Исходные белковые продукты из семян льна представлены на электрофоретических спектрах в основном одной фракцией, появляющейся на 16-й мин, с

площадью 937,45 тАи • с, что составляет около 88% от общей площади электрофоретических пиков (рис. 1).

Первые 3 минорных компонента со временем удерживания х 13-14 мин количественно незначительны -от 2,28 до 9,51 и 8,83 тАИ • с соответственно, что составляет 1,92% от общей площади пиков.

Остальные 4 минорные фракции белкового комплекса, появляющиеся на 31-й мин, также присутствуют в минимальных количествах: площади их пиков колеблются в диапазоне 2,01-5,45 тАИ • с (6,61% от общей площади фракций). Таким образом, нативный белковый комплекс семян льна сорта Ручеек представлен одним доминирующим пиком и 7-8 минорными электрофоретическими пиками. Общая площадь пиков контрольного образца составляет 1067,91 тАИ • с.

По сравнению с контрольным образцом в БПЛ-48 (рис. 2) количество разделившихся фракций осталось без изменений, но общая площадь электрофоретических пиков уменьшилась на 40%: с 1067,91 до 643,45 тАИ • с. Изменился и общий вид хроматограммы: так, если хроматограмма контрольного образца имеет пологий сглаженный характер, то на хроматограмме БПЛ-48 пики четко фрагментированы и резче обособлены друг от друга.

Время удерживания фракций составляет 212 с, причем начало выхода первых минорных фракций в БПЛ-1 и в БПЛ-48 практически одинаково - 12,18 и 11,53 мин соответственно.

Анализируя хроматограммы БПЛ-1 и БПЛ-48, можно предположить, что ограниченный гидролиз белкового комплекса семян льна комплексом собственных протеиназ привел помимо разукрупнения олигомерных белков к отщеплению от белковых доменов концевых остатков гидрофильных участков полипеп-тидных цепей белковых глобул. При дальнейшем гидролизе, очевидно, произошел переход белкового азота в небелковый, что привело к уменьшению абсолютной площади вышедших фракций. Характер электрофоре-граммы, отражающей протеолиз запасных белков в семенах льна, соответствует схеме гидролиза запасного

Рис. 1

Рис. 2

белка в семенах вики при прорастании, предложенной в 1976-1982 гг. А. Д. Шутовым с сотрудниками [2, 3].

При сопоставлении полученных нами данных по прорастанию семян льна, рапса и сурепицы, в том числе электрофореграмм и протеолитической активности ферментов в полученных модифицированных белковых продуктах [4, 5], и результатов других исследователей [6, 7] можно предположить, что в начальный период прорастания, охватывающий у различных растений 1-3 сут после замачивания семян, не происходит расщепления белков в алейроновых зернах протеазами при их совместном присутствии в этих органеллах. Это объясняется либо отсутствием специфических протеаз, либо структурными особенностями нативных запасных белков, препятствующими их протеолитиче-скому расщеплению. Имеющиеся данные свидетельствуют, что оба эти обстоятельства могут быть причиной, обусловливающей указанный лаг-период в распаде запасных белков при прорастании.

Известно [2, 3], что в основе указанной резистентности запасных белков к действию протеолитических ферментов лежит отсутствие в зрелых семенах растений эндопептидаз, способных гидролизовать запасные белки без их предварительной модификации. По данным [3], в основе указанной модификации лежат реакции ограниченного протеолиза Гидролизу при участии протеазы, названной авторами протеазой-А, подвергаются в первую очередь участки субъединиц, расположенные на концах полипептидных цепей и выходящие на поверхность белковой глобулы. Указанная протеаза отсутствует в зрелых семенах растения и появляется лишь на 2-3-й день прорастания. В результате такого воздействия от молекулы легумина отщепляются 1-2 коротких пептида, после чего вся молекула вследствие конформационных изменений под влиянием протеолиза становится доступной для других протеаз, в первую очередь эндопептидазы-5 и карбокси-пептидазы-С. Первая представляет собой эндопептидазу, осуществляющую распад модифицированных запасных белков до крупных пептидов. Эта протеаза, как и протеаза-А, отсутствует в сухих семенах, и ее активность быстро нарастает при прорастании. Карбокси-пептидаза-С присутствует в алейроновых зернах, однако она не действует на нативные запасные белки. Действие этой протеазы направлено на крупные пептиды, образующиеся при деградации модифицированных запасных белков под влиянием протеазы-В. В результате действия протеазы-В и карбоксипептидазы-С на продукты модификации и частичного распада за-

пасных белков образуются свободные аминокислоты и короткие пептиды. Последние затем гидролизуются пептидазами (в основном аминопептидазами и дипептидазами) до свободных аминокислот.

Согласно [2, 3, 8], роль протеазы-А не ограничивается ее действием на нативный белок, эта протеаза продолжает гидролизовать модифицированный белок, отщепляя от него короткие пептиды.

Таким образом, распад запасных белков в прорастающих семенах осуществляется путем воздействия различных протеаз на запасные белки, продукты их модификации и более или менее полной деградации. Характерная особенность этого процесса - строгая последовательность в действии отдельных протеаз. Так, протеаза-А создает необходимые условия для «включения» протеазы-В, а образующиеся под влиянием последней крупные пептиды являются субстратом для карбоксипептидазы-С, при этом лишь карбоксипепти-даза-С присутствует уже в алейроновых зернах зрелых семян, в то время как остальные протеиназы - А и В -синтезируются на 2-3-е сут прорастания и затем транспортируются в алейроновые зерна. Последний этап деградации запасных белков, а именно расщепление коротких пептидов, осуществляется, по всей вероятности, уже не в алейроновых зернах.

Под влиянием термообработки (термомодификации) в белковом комплексе семян льна также отмечено разукрупнение олигомерных белков семян. Происходит увеличение числа белковых фракций с уменьшением их общей площади по сравнению с контролем. Так, при термообработке при 40°С число пиков увеличилось с 8 до 15 (рис. 3), причем число первых минорных фракций сократилось до двух (11-я и 13-я мин выхода) с уменьшением суммарной площади до 1,59 против 1,92% в БПЛ-1. Основная, наиболее значительная белковая фракция имеет время удерживания 13 мин и площадь 740 тАи • с, что составляет 87% от общей площади вышедших фракций. Вторая значительная фракция - 58,27 тАИ • с - выходит на 26-й мин, что на 6 мин раньше, чем в контрольном образце. Далее, с 29-й по 38-ю мин появляются еще 9 мелких - со средней площадью 2,59 тАИ • с - компонентов, отсутствовавших в исходном образце семян. На 39-й и 40-й мин выходят 2 заключительные фракции с увеличенной площадью - до 0,89 и 0,69% против 0,19 и 0,18% соответственно.

На хроматограмме белкового продукта, подвергну -того термомодификации при 60°С (рис. 4), насчитывается 12 характерных пиков, общей площадью 1038,94

Рис. 5

тАи  с. Первые два пика с незначительной площадью - 3,47 и 9,32 тАИ  с - имеют время удерживания 12 мин. Доминирующая фракция выходит на 14-й мин, занимая 91% общей площади вышедших фракций. Площади последующих 4 вышедших фракций, как и в образце БПЛ-40, составляют около 6% (58,08 тАИ  с). Далее, с 28-й до 35-ю мин, появляются еще 8 фракций -против 9 в БПЛ-40 - со средней площадью 2,08 тАИ  с.

Анализируя профиль доминирующей фракции, можно отметить тенденцию к дифференциации, которая становится более явной на электрофореграмме БПЛ-80 (рис. 5). Количество вышедших фракций соответствует 17 пикам с суммарной площадью 891,20 тАИ  с. Выход первых фракций начинается уже на 11-й мин. Дифференциация основной фракции приводит к появлению на ее месте 8 новых компонентов, 2 из которых имеют значительные площади - 265,76 и 419,94 тАИ  с. С 28-й мин появляются 6 оставшихся фракций, средняя площадь которых составляет около 6,17 тАИ  с.

Следует отметить, что положение пиков фракций на электрофореграммах остается практически постоянным в пределах ошибки опыта. В тех случаях, когда под влиянием термообработки фракции сливаются в одну, их совместная полоса - пик - расположена приблизительно посредине между пиками ранее существовавших фракций. Пики фракций отличаются по скорости движения на хроматограммах. Как следует из хроматограмм, термомодифицированные белковые продукты существенно отличаются от исходных белковых продуктов из семян льна. В зависимости от глубины денатурации белка, возрастающей от 40 до 80°С, высота пиков снижается, растет число электрофоретических фракций с уменьшением их интенсивности, что подтверждает появление в прогретых до 80°С белковых продуктах глубоко денатурированных белков.

По количеству и по относительной и абсолютной площади пиков разделяющихся фракций электрофоре-

граммы близки, хотя имеют характерные пики соответствующие менее денатурированным белкам по времени появления и конфигурации. Таким образом, под влиянием термомодификации в белковых продуктах появляется значительное количество денатурированных белков, отличающихся от исходных белковых продуктов молекулярными массами и более однородным фракционным составом.

Сравнивая характер электрофореграмм белков, подвергнутых протеолитической и термический модификациям, можно заключить, что направленность модифицирующих воздействий собственными протеина-зами практически идентична (по полученным фракциям) направленности температурных воздействий на белковый комплекс при 60°С. В то же время, термомодификация при 80°С вызвала более глубокие изменения белков, отразившиеся на хроматограммах максимальным количеством обособившихся фракций низкомолекулярных пептидов и аминокислот.

ЛИТЕРАТУРА

1. Шульвинская И.В., Щербаков В.Г., Барбашов А.В.

Влияние ограниченного гидролиза на биохимические и функциональные свойства белков семян льна // Изв. вузов. Пищевая техноло -гия. - 2006. - № 5. - С. 30-32.

2. Соболев А.М. Запасные липиды в семенах растений. -М.: Наука, 1985. - 112 с.

3. Шутов А.Д., Бульмага В.П., Болдт В.К., Вайнтрауб М.А. Исследование модификации запасных белков вики при прорастании и ограниченном протеолизе // Биохимия. - 1981. - 46. -С. 841-850.

4. Пат. 2286065 РФ, МПК51 А23.1 1/14; А 23; 3/144; А23.1 3/30; А231 3/34. Способ получения биомодифицированного рапсово -го белкового продукта / В.Г. Лобанов, А.Д. Минакова, И.В. Шульвинская и др.; Куб. гос. техн. ун-т. // БИПМ. - 2004. - № 30.

5. Шульвинская И.В., Щербаков В.Г. Анализ распределения электрофоретических фракций термомодифицированных бел -ковых продуктов из семян рапса и сурепицы // Изв. вузов. Пищевая технология. - 2006. - № 6. - С. 23-25.

6. Курчаева Е.Е. Исследование условий ферментативно -го гидролиза белков чечевицы // Прогрессивные технологии и обо -рудование для пищевой промышленности: Материалы конф. - Воро -неж, 2004. - С. 110-114.

7. Соболев А.М., Суворов В.И. О некоторых особенно -стях белков алейроновых зерен // Растительные белки и их биосин -тез. - М., 1975. - С. 126-136.

8. Щербакова Е.В. Применение биотехнологических методов при переработке растительного масличного сырья. - Красно -дар, 2006. - 288 с.

Кафедра биохимии и технической микробиологии

Поступила 30.03.07 г.