Способ прогнозирования риска развития преэклампсии тяжелого течения
METHOD FOR PREDICTION OF RISK OF SEVERE PREECLAMPSIA DEVELOPMENT

Изобретение относится к области медицинской диагностики, может быть использовано для прогнозирования риска развития преэклампсии тяжелого течения.
Преэклампсия (далее ПЭ) - осложнение беременности, характеризующееся развитием эндотелиальной дисфункции, полиорганной недостаточностью, нарушением свертывающей и противосвертывающей систем, микроциркуляции, обменных процессов, иммунного ответа [Серов, В.Н. Клинические рекомендации. Акушерство и гинекология. - 4-е изд. / В.Н. Серов, Г.Т. Сухих. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2014. - 1024 с.].
В основе развития преэклампсии могут лежать следующие механизмы: торможение инвазии цитотрофобласта в спиральные артерии матки, дисфункция эндотелия, оксидантный стресс, гиперкоагуляция, нарушения микроциркуляции.
В Российской Федерации частота ПЭ варьируется по разным территориям от 17,8% до 22,2% [Радзинский, В. Е. Иммунохимическая оценка перинатального риска [Текст]. / В. Е. Радзинский, С. Г. Морозов, Л. А. Чугунова // Вестник Российского университета дружбы народов. Сер. Медицина. – 2010. – № 5. – С. 7-12]. Возникновение преэклампсии у здоровых первобеременных отмечается в 6-12% случаев, а у женщин с сопутствующей экстрагенитальной патологией – 20-40%, при этом наблюдается существенный рост тяжелых и атипичных форм преэклампсии до 24%. Ежегодно в мире погибают в среднем 50000 женщин от тяжелой формы преэклампсии, а также связанных с ней осложнений (аспирационной пневмонии, отека легких и мозга, сердечной недостаточности, инсульта, HЕLLР-синдрома и т.д.).
Важной задачей практического акушерства является прогнозирование риска развития ПЭ тяжелой степени на основании исследованных полиморфизмов генов матриксных металлопротеиназ и других возможных факторов риска с целью выявления женщин, предрасположенных к развитию преэклампсии тяжелого течения.
Ген ММР-8 находится на 11 хромосоме в области 11q22.2–q22.3. Был исследован полиморфизм, связанный с заменой нуклеотида A в положении G -477 (-477А>G ММР-8 (rs1320632)).
В изученной научно-медицинской и доступной патентной литературе авторами не было обнаружено способа прогнозирования риска развития преэклампсии тяжелого течения на основе данных о полиморфном маркере матриксных металлопротеиназ ММР-8 (rs1320632) в сочетании с другими предикторами развития данной патологии беременности.
Для оценки сложившейся патентной ситуации был выполнен поиск по охранным документам за период с 1990 по 2016 гг. Анализ документов производился по направлению: способ прогнозирования развития преэклампсии тяжелого течения на основе молекулярно-генетических данных в зависимости от полиморфных маркеров генов матриксных металлопротеиназ.
За прототип выбран патент РФ № 2568892 по заявке РФ № 2014135186/15, 28.08.2014 «Способ прогнозирования риска развития преэклампсии тяжелого течения» (Чурносов Михаил Иванович (RU), Каганович Евгения Николаевна (RU), Добродомова Ирина Сергеевна (RU), Орлова Валентина Семеновна (RU), Полоников Алексей Валерьевич (RU), Прощаев Кирилл Иванович (RU)). Способ предназначен для прогнозирования риска возникновения преэклампсии тяжелого течения у женщин русской национальности, уроженок Центрального Черноземья.  Способ включает выделение ДНК из периферической венозной крови и анализ генетических полиморфизмов -308 G/A TNF (rs1800629), +36 A/G TNFR1 (rs767455), -801 G/A SDF 1 (rs1801157), C/G MCP-1 (rs285765). Повышенный риск развития преэклампсии тяжелого течения прогнозируют при наличии сочетания генетических вариантов -801A SDF1, +36 GG TNFR1 и -308 A TNF. Пониженный риск развития преэклампсии тяжелого течения прогнозируют при наличии сочетания генетических вариантов -801 G SDF1 и G МСР (rs285765). Использование изобретения позволяет повысить эффективность выявления тяжелого течения преэклампсии. Недостаток способа заключается в том, что анализируются только определенные генетические полиморфизмы, без включения патогенетически значимых факторов развития преэклампсии тяжелой степени.
Задачей настоящего исследования является расширение арсенала способов диагностики, а именно создание способа прогнозирования риска развития преэклампсии тяжелого течения по данным о генетическом полиморфизме ММР-8 (rs1320632) в сочетании с другими предикторами развития данного осложнения беременности.
Технический результат использования изобретения – получение критериев оценки риска развития преэклампсии тяжелого течения.
В соответствии с поставленной задачей был разработан способ прогнозирования преэклампсии, включающий:
-  выделение ДНК из периферической венозной крови;
- анализ полиморфизмов генов ММР-8 (rs1320632);
- прогнозирование риска развития преэклампсии тяжелого течения у женщин в зависимости от выявленных генетических вариантов по локусу ММР-8 (rs1320632) в сочетании с другими предикторами развития данной патологии беременности  для отнесения в группу женщин с ПЭ тяжелого течения  по уравнениям  линейной дискриминантной функции (далее ЛДФ):
1
1
2
3
4
y = -14,767+ 2,914х+1,439х+0,222х+14,345х;
2
1
2
3
4
y = -2,228+2,305х-0,718х+1,888х-0,254х,
1
2
3
4
1
2
где х – генетический вариант по локусу MMР-8  (rs1320632) (АА - 1; АG или GG - 0), х - наличие преэклампсии у родственников (1 - да; 0 - нет), х – наличие заболеваний, передающихся половым путем (далее ЗППП)  (1 - да; 0 - нет), х - наличие гинекологических патологий в анамнезе (1 - да; 0 - нет). Прогноз риска развития данной патологии в случае, если  y больше y.
Новизна и изобретательский уровень заключаются в том, что из уровня техники не известна возможность прогноза риска развития преэклампсии тяжелого течения у женщин по наличию генетического варианта локуса ММР-8 (rs1320632) в сочетании с другими предикторами развития данной патологии беременности.
Способ осуществляют следующим образом.
ДНК выделяют из образцов периферической венозной крови беременных в 2 этапа. На первом этапе к 4 мл крови добавляют 25 мл лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% тритон Х-100, 5 мМ MgCl2, 10 мМ трис-HCl (pH=7,6). Полученную смесь перемешивают и центрифугируют при 4ºС, 4000 об/мин в течение 20 минут. После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 4 мл раствора, содержащего 25 мМ ЭДТА (рН=8,0) и 75 мМ NaCl, ресуспензируют. Затем прибавляют 0,4 мл 10% SDS, 35 мкл протеиназы К (10 мг/мл) и инкубируют образец при 37ºС в течение 16 часов.
На втором этапе из полученного лизата последовательно проводят экстракцию ДНК равными объемами фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием при 4000 об/мин в течение 10 минут. После каждого центрифугирования производят отбор водной фазы. ДНК осаждают из раствора двумя объемами охлажденного 96% этанола. Сформированную ДНК растворяют в бидистиллированной, деионизованной воде.
Измерение концентрации ДНК осуществляют на спектрофотометре NanoDrop 2000. Концентрацию и чистоту выделенной ДНК оценивают при измерении оптической плотности (ОП) полученного раствора. Далее готовят «рабочие» концентрации образцов ДНК (10-20 нг в мкл) путем разведения «стоковой» ДНК деионизированной водой. Полученные «рабочие образцы» ДНК хранят при -80°С.
Выделенную ДНК подвергают полимеразной цепной реакции с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров. Последовательность праймеров и зондов для полиморфизма гена матриксных металлопротеиназ ММР-8 (rs1320632) были взяты из литературного источника [Association between -799 C/T single nucleotide polymorphism of the MMP-8 promoter region and thoracic aortic dissection [Text] / Y. Li, N. Li, W. Ma [et al.] // Mol. Med. Rep. – 2014. – Vol. 10, № 4. – P. 1857-1862].
Для исследования локуса ММР-8 (rs1320632) методом ПЦР готовят реакционную смесь объемом 25 мкл: 6,7 мМ трис-HСl (рH=8,8), 2,5мМ MgСl2, 0,1 мкг геномной ДНК, по 10 пкмоль каждого праймера, по 5 пкмоль каждого зонда, по 200 мкМ dАTР, dGTР, dСTР, dTTР и 1 единицу активной Tаq-полимеразы. После денатурации выполняют 40 циклов амплификации по схеме: отжиг праймеров и денатурация. Олигонуклеотидные праймеры и зонды синтезированы фирмой «Синтол».
Изобретение характеризуется:
Фиг.1. Дискриминации аллелей методом детекции TaqMan зондов по данным величин ОЕФ (относительные единицы флуоресценции) каждого зонда на амплификаторе CFX96 (Bio-Rad) c детектирующей системой в режиме реального времени полиморфизма ММР-8 (rs1320632), где  - гомозиготы AA ММР-8 (rs1320632),  - гомозиготы GG ММР-8 (rs1320632),  - гетерозиготы AG ММР-8 (rs1320632),  - отрицательный контроль.
Фиг.2. В таблице представлены показатели линейной дискриминантной функции (ЛДФ) для женщин с преэклампсией тяжелого течения и без преэклампсии с учетом предикторов развития данного осложнения беременности и генетических факторов.
Возможность использования предложенного способа для оценки риска развития преэклампсии тяжелого течения подтверждает анализ результатов обследования 1045 женщин: 468 женщин с диагнозом преэклампсия и 577 женщин с физиологическим течением беременности (контрольная группа). В исследуемые выборки включались индивидуумы русской национальности, являющиеся уроженками Центрально-Черноземного региона России и не имеющие родства между собой. Возраст в группе беременных с ПЭ варьировался от 17 до 45 лет (в среднем 27,74±5,4 лет), а в контрольной группе - от 15 до 49 лет (в среднем 27,80±6,5 лет) (р>0,05). Таким образом, группа контроля не отличалась от основной группы по возрасту, полу, национальности и месту рождения.
Диагностику преэклампсии осуществляли сотрудники Перинатального центра областной клинической больницы Святителя Иоасафа г. Белгорода в соответствии с Международной классификацией болезней 10-го пересмотра. Степень тяжести преэклампсии оценивали по критериям Федеральных клинических рекомендаций «Гипертензивные расстройства во время беременности, в родах и послеродовом периоде. Преэклампсия. Эклампсия» [Гипертензия во время беременности. Преэклампсия. Эклампсия: клинич. протокол [Электронный ресурс]. / Науч. центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В. И. Кулакова Минздравсоцразвития России; Ин-т Здоровья семьи; Проект «Мать и Дитя»; рук. авт. кол.: Г. Т.  Сухих, Н. В. Вартапетова. – Москва, 2012. – 51 с. – Режим доступа: http://www.volgmed.ru/uploads/files/2013-4/18295]. Типирование молекулярно-генетических маркеров осуществляли в лаборатории «Молекулярной генетики человека» медицинского факультета Белгородского государственного национального исследовательского университета. Формирование базы данных и статистические расчеты осуществляли с использованием программы «STATISTICA 6.0». Прогнозирование риска развития ПЭ тяжелого течения осуществляли с использованием дискриминантного анализа [Реброва, О. Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA [Текст]. / О. Ю. Реброва. – [3-е изд.]. – Москва: Медиа Сфера, 2006. – 305 с.: ил.; Боровиков, В. П. Statistica: искусство анализа данных на компьютере [Текст]. / В. П. Боровиков. – 2-е изд. – Санкт-Петербург: Питер, 2003. – 688 с.].
На основании построенной методом дискриминантного анализа статистической модели прогнозирования риска развития преэклампсии тяжелого течения с учетом патогенетически значимых признаков, характеризующих медико-биологический статус женщин до беременности, таких как  возраст возникновения беременности, показатели артериального давления, наличие ЗППП, семейный анамнез и т.д., а также генетических характеристик по исследуемым локусам матриксных металлопротеиназ, была разработана модель прогнозирования ПЭ тяжелого течения, которая включала четыре статистически значимых признака: наличие преэклампсии у родственников, наличие гинекологических патологий в анамнезе, наличие заболеваний, передающихся половым путем, и генетический вариант по локусу MMР-8 (rs1320632), которые при проведении данного анализа получили значение критерия Уилкса 0,292 при F(4,654)=396,10 и р<0,0000. Параметры дискриминантного анализа представлены в таблице на фиг. 2.
Полученные данные позволяют сделать вывод, что изучаемые группы беременных с преэклампсией тяжелого течения и без преэклампсии по набору из всех исследованных признаков показывают неслучайную межгрупповую дисперсию. Анализ показателей F-критериев и вероятности статистической ошибки 1-го рода (р) по каждому из признаков указывает на то, что по исследуемым показателям р<0,05. Это свидетельствует о возможности их включения в дискриминантный анализ.
В группе беременных с тяжелым течением ПЭ точность распознавания равна 74,70%, а в группе женщин без ПЭ -100,00%. В среднем данный показатель составляет 96,81%.
С целью проверки работоспособности модели в анализ нами были дополнительно включены две пациентки. У 1-й пациентки, у беременной С., определены следующие показатели: генетический вариант по локусу MMР-8 (rs1320632) - АG+GG, наличие преэклампсии у родственников - да, наличие заболеваний, передающихся половым путем, – да,  наличие гинекологических патологий в анамнезе – да.
1
2
Подставляя полученные значения показателей в вышеуказанные уравнения линейной дискриминантной функции, получают значения  y и y:
1
y= -14,767+ 2,914*0+1,439*1+0,222*1+14,345*1=1,23;
2
y= -2,228+2,305*0-0,718*1+1,888*1-0,254*1=-1,31.
1
2
Поскольку значение y больше y,сделан вывод о необходимости отнесения беременной С. в группу с повышенным уровнем риска развития ПЭ тяжелого течения. Дальнейшее наблюдение подтвердило правильность прогноза.
У беременной З. определены следующие показатели: генетический вариант по локусу MMР-8 (rs1320632) - АА, наличие преэклампсии у родственников - нет, наличие заболеваний, передающихся половым путем, – нет,  наличие гинекологических патологий в анамнезе – нет.
1
2
Подставляя полученные значения показателей в вышеуказанные уравнения линейной дискриминантной функции, получают значения  y и y:
1
y= -14,767+ 2,914*1+1,439*0+0,222*0+14,345*0=-11,762;
2
y= -2,228+2,305*1-0,718*0+1,888*0-0,254*0=0,077.
2
1
Поскольку значение yбольше y,сделан вывод, что нет необходимости отнесения беременной З. в группу с повышенным уровнем риска развития ПЭ тяжелого течения. Дальнейшее наблюдение подтвердило правильность прогноза.
Разработанный  способ прогнозирования позволит формировать группы риска по развитию преэклампсии тяжелого течения среди женщин русской национальности, являющихся уроженками Центрально-Черноземного региона России, при планировании беременности и на ранних сроках беременности, что будет способствовать более эффективному осуществлению лечебно-профилактических мероприятий по предупреждению данной патологии беременности.