Способ прогнозирования вероятности наступления клинической беременности у женщин с индексом массы тела от 18,5 до 28,49 в программе экстракорпорального оплодотворения на основании оценки уровня лептина в плазме крови и трансмембранного потенциала митохондрий в мононуклеарах периферической крови
METHOD FOR CLINICAL PREGNANCY PROBABILITY PREDICTION FOR WOMEN WITH A BODY MASS INDEX OF 18,5 TO 28,49 IN VITRO FERTILIZATION PROGRAMME BASED ON ASSESSMENT OF LEPTIN LEVEL IN BLOOD PLASMA AND MITOCHONDRIA TRANSMEMBRANE POTENTIAL IN PERIPHERAL BLOOD MONONUCLEAR CELLS

В настоящее время бесплодие среди супружеских пар достигает 10-15% и является одной и основных проблем современной медицины [1]. Одним из способов решения данной проблемы является лечение таких пациентов при помощи методов вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ). Одной из задач современной медицины является разработка и использование персонализированных подходов к лечению. Эта задача актуальна в том числе для репродуктивной медицины. В практических руководствах сообществ репродуктологов разных стран отмечено, что персонализированный подход к лечению женщин в программе ЭКО на основании разработки моделей прогнозирования успешности лечения повышает успешность исхода [2].
Стремительное развитие и активное внедрение современных биомедицинских технологий в широкую клиническую практику открывают новые возможности для диагностики и лечения супружеских пар с нарушениями репродуктивной функции. Принимая во внимание неуклонный рост числа женщин репродуктивного возраста, страдающих избыточной массой тела, все большую актуальность приобретает изучение молекулярных механизмов снижения фертильности у данной когорты женщин [3]. Появившиеся методы оценки состояния хронического воспаления и окислительного стресса, а также функционального состояния митохондрий открывают возможность более подробно изучить патогенез снижения фертильности.
Лептин - белок, который участвует в регуляции энергетического обмена и контролирует массу тела, влияя на аппетит и порог насыщения при потреблении пищи, а также играет важную роль в репродуктивной функции, оказывая стимулирующее действие на гипоталамо-гипофизарно-яичниковую ось при нормальных его сывороточных концентрациях. Ранее в литературе были описаны различные однофакторные модели оценки эффективности лечения в программе ЭКО, основанные на измерении концентрации лептина в плазме крови [4, 5, 6]. Однако были отмечены противоречивость данных и низкая предиктивная способность этих моделей, которую можно объяснить тем, что авторы не учитывали показатели ИМТ исследуемых ими женщин, тем самым не принимая во внимание возможность развития у них резистентности к лептину.
Одним из механизмов, ведущих к репродуктивным неудачам при ожирении, является нарушение функционального состояния митохондриального ретикулума. В последние годы была разработана система оценки критериев состояния митохондриального аппарата в клетках периферической крови с использованием проточной цитометрии. Данный метод был апробирован для исследования влияния сепсиса или ВИЧ-инфекции на состояние митохондриального аппарата, а также взаимосвязи митохондриальной дисфункции и клинических исходов [7, 8, 9]. В связи с этим, нами было проведено пилотное исследование функционального состояния митохондрий в мононуклеарах периферической крови у пациенток с нормальным, избыточным весом и ожирением, позволившее охарактеризовать взаимосвязь избыточной массы тела, функциональной активности митохондрий и успешности имплантации. На основании полученных данных нами была разработана модель оценки вероятности наступления клинической беременности в программе ЭКО у женщин с индексом массы тела от 18,5 до 28,49.
2
Результат изобретения - создание модели предикции наступления клинической беременности у женщин с 18,5≤ИМТ<28,5 кг/м при лечении бесплодия в программе ЭКО.
Результат достигается путем измерения уровня лептина в плазме крови и оценки трансмембранного потенциала мононуклеаров периферической крови (ΔΨ МПК после стимуляции суперовуляции) в день трансвагинальной пункции яичников (ТВП).
Для выделения мононуклеарных клеток периферической крови (МПК) использовали периферическую венозную кровь, взятую у пациенток в цикле стимуляции суперовуляции натощак в день проведения ТВП в пробирки с этилендиаминтетраацетатом (ЭДТА) (Sarstedt). Использовали стандартную методику выделения МПК на градиенте фиколла (Sigma) плотностью 1,077 г/мл. Для оценки трансмембранного потенциала митохондрий выделенные МПК окрашивали флуоресцентным индикатором трансмембранного потенциала митохондрий 5,5',6,6'-тетрахлор-1,1'3,3'-тетраэтилбензимидазол-карбоцианином (JC1) (Life technologies) по протоколу, рекомендованному производителем, и методом проточной цитометрии оценивали распределение клеток по интенсивности окраски в зеленом и красном канале. JC-1 представляет собой катионный краситель, поглощение которого митохондриями напрямую связано с уровнем их трансмембранного потенциала. Большая концентрация JC-1 коррелирует с большим его поглощением, излучая при этом красное свечение, в то время как зеленое свечение указывает на присутствие JC-1 в качестве мономера. Показатель соотношения красного и зеленого спектров указывает на степень поляризации внутренней мембраны митохондрий.
Для оценки жизнеспособнсти клеток использовали краситель пропидий йодид (Life technologies).
Измерение проводили на проточном цитофлуориметре (BD FACS Calibur). Для каждой пробы измеряли два показателя: долю МПК с высокополяризованными митохондриями и величину, характеризующую потенциал митохондрий в МПК. Показатель, характеризующий потенциал митохондрий в клетках крови, рассчитывали как:
(М красный 1/М зеленый 1) - (М красный 2/М зеленый 2),
где М красный 1 и М зеленый 1 - медианы интенсивности свечения МПК с высокополяризованными митохондриями в интактной пробе на длинах волн 590 и 529 нм соответственно, а М красный 2 и М зеленый 2 - медианы интенсивности свечения МПК с высокополяризованными митохондриями в контрольной пробе, в которую был добавлен разобщитель дыхания карбонилцианид-4-(трифторметил)-фенилгидразон (Sigma) в конечной концентрации 7 μМ. В дальнейшем данный показатель будет обозначен как ΔΨ.
Измерение концентрации лептина в плазме проводили при помощи набора для анализа Human Adipokine Panel (измерение белков ИЛ- и лептина) на мультиплексном анализаторе Luminex 200 (Luminex Corporation, США).
Пробы венозной крови отбирали натощак в пробирки с калием-ЭДТА (Sarstedt, Германия). Для получения плазмы кровь центрифугировали при 3000 g в течение 10 мин при +4°С (4000 об/мин в роторе А 4-44 на центрифуге Eppendorf 5810R, Германия). Аликвоты плазмы (4×200 мкл) отбирали в чистые промаркированные пробирки и хранили при температере -80°С до момента проведения измерений.
Процедуру измерения проводили в соответствии с инструкцией производителя наборов. Расчет концентрации белков в плазме крови осуществляли по калибровочной кривой в программе Luminex 100 IS 2.3 (Luminex Corporation, США).
Бинарная логистическая регрессия рассчитывает вероятность наступления события (в данном случае наступление клинической беременности) в зависимости от значений независимых переменных (концентрация лептина в плазме крови, трансмембранный потенциал мононуклеаров периферической крови, измеренный после стимуляции суперовуляции).
Вероятность наступления события (вероятность наступления клинической беременности) (р) рассчитывается по формуле, имеющей общий вид:
p=exp(logit)/(1+exp(logit))
где р - искомая вероятность наступления события;
При значениях р менее 0,5 можно предположить, что измеряемое событие не наступит; в противном случае предполагается наступление события.
Согласно результатам логистической регрессии построено уравнение для предсказания вероятности наступления клинической беременности:
logit=3,39-(0,337*ΔΨ МПК после стимуляции)-(0,08*[Лептин])
Построенная модель является статистически значимой (χ2(2)=8,51, р=0,014).
Средняя точность прогнозирования вероятности наступления клинической беременности составляет 76,7%, ОШ равно 9,33.
Таким образом, можно оценить вероятность наступления клинической беременности в программе ЭКО на основании оценки представленных независимых переменных (ΔΨ МПК и уровень лептина, измеренные после стимуляции суперовуляции).
Пример
I. Прогнозирование вероятности наступления клинической беременности провели у пациентки N 30 лет, обратившейся для проведения программы ЭКО и ПЭ по поводу трубно-перитонеального фактора бесплодия. Из анамнеза: 1 внематочная беременность, в 2011 г. проведена лапароскопия, правосторонняя тубэктомия по поводу внематочной беременности, в 2013 г. - лапароскопия, тубэктомия слева по поводу левостороннего гидросальпинкса. Данная попытка ЭКО вторая. Перед началом программы ЭКО проводилось измерение веса и роста, на основании которого расчитывался показатель индекса массы тела (ИМТ).
Вес - 61,8 кг
Рост - 1,6 м
2
ИМТ - 24,14 кг/м
Кровь для исследования концентрации лептина и трансмембранного потенциала мононуклеаров периферической крови у пациентки N брали натощак из локтевой вены в стерильную пробирку в цикле стимуляции суперовуляции в день проведения ТВП.
Результат проведенных измерений у пациентки N:
Концентрация лептина - 5,8 пг/мл
ΔΨ МПК, измеренный после стимуляции суперовуляции, - 14,77 у.е.
Вероятность (р) наступления клинической беременности у данной пациентки расчитывали по вышеописанной формуле:
logit=3,39-(0,337* ΔΨ МПК после стимуляции)-(0,08*[Лептин])=3,39-(0,337*14,77)-(0,08*5,8)=-2,05
p=exp(logit)/(1+exp(logit))=0,82
Рассчитанная вероятность р указывает на возможность того, что истинное значение результативного показателя попадет в расчетный прогнозируемый исход, в данном случае - на наступление клинической беременности в данной попытке ЭКО.
В результате проведения программы ЭКО у пациентки наступила клиническая беременность.
II. Прогнозирование вероятности наступления клинической беременности провели у пациентки X 30 лет, обратившейся для проведения программы ЭКО и ПЭ по поводу трубно-перитонеального фактора бесплодия. В анамнезе 2 беременности: 1 самопроизвольный выкидыш на позднем сроке беременности в 2009 г. и 1 - левосторонняя внематочная беременность в 2010 г. В 2010 г проведена лапаротомия, левосторонняя тубэктомия по поводу внематочной беременности, в 2009 и 2013 гг. - гистероскопия, РДВ. Данная попытка ЭКО первая. Перед началом программы ЭКО проводилось измерение веса и роста, на основании которого был рассчитан показатель индекса массы тела (ИМТ).
Вес - 72 кг
Рост - 1,7 м
2
ИМТ - 24,91 кг/м
Кровь для исследования концентрации лептина и трансмембранного потенциала мононуклеаров периферической крови у пациентки X брали натощак из локтевой вены в стерильную пробирку в цикле стимуляции суперовуляции в день проведения ТВП.
Результат проведенных измерений у пациентки X:
Концентрация лептина - 15,84 пг/мл
ΔΨ МПК, измеренный после стимуляции суперовуляции, - 11,70 у.е.
Вероятность (р) наступления клинической беременности у данной пациентки расчитывали по вышеописанной формуле:
logit=3,39-(0,337* ΔΨ МПК после стимуляции)-(0,08*[Лептин])=3,39-(0,337*11,7)-(0,08*15,84)=-1,82
p=exp(logit)/(1+exp(logit))=0,14
Рассчитанная вероятность р указывает на низкую вероятность наступления беременности в данном цикле лечения.
В результате проведения программы ЭКО у пациентки беременность не наступила.
III. Прогнозирование вероятности наступления клинической беременности провели у пациентки Z 32 лет, обратившейся для проведения программы ЭКО и ПЭ по поводу трубно-перитонеального фактора бесплодия. В анамнезе оперативных вмешательств и беременностей не было. Данная попытка ЭКО первая. Перед началом программы ЭКО проводилось измерение веса и роста, на основании которого был рассчитан показатель индекса массы тела (ИМТ).
Вес - 54,8 кг
Рост - 1,58 м
2
ИМТ - 21,95 кг/м
Кровь для исследования концентрации лептина и трансмембранного потенциала мононуклеаров периферической крови у пациентки Z брали натощак из локтевой вены в стерильную пробирку в цикле стимуляции суперовуляции в день проведения ТВП.
Результат проведенных измерений у пациентки X:
Концентрация лептина - 3,09 пг/мл
ΔΨ МПК, измеренный после стимуляции суперовуляции, - 6,09 у.е.
Вероятность (р) наступления клинической беременности у данной пациентки расчитывали по вышеописанной формуле:
logit=3,39-(0,337* ΔΨ МПК после стимуляции)-(0,08*[Лептин])=3,39-(0,337*6,09)-(0,08*3,09)=1,09
p=exp(logit)/(1+exp(logit))=0,75
Рассчитанная вероятность р указывает на высокую вероятность наступления клинической беременности в данном цикле лечения.
В результате лечения в программе ЭКО у пациентки наступила клиническая беременность.
Согласно полученным данным прогноз оценки вероятности наступления клинической беременности при проведении программ ЭКО носит достоверный характер. Следовательно, способ прогнозирования вероятности положительного исхода лечения в программе ЭКО с использованием оценки функционального состояния митохондрий в мононуклеарах периферической крови, а также измерения концентрации лептина в плазме крови, может быть использован в клинико-лабораторной практике с целью предикции исходов программы ЭКО.
Список использованной литературы
1) Lifestyle factors and reproductive health: taking control of your fertility / R. Sharma [et al.] // Reprod Biol Endocrinol. - 2013. - Vol. 16, №11. - P. 66.
2) Choi В., Bosch E., Lannon B.M., Leveille M.C., Wong W.H., Leader A., Pellicer A., Penzias A.S., Yao M.W. / Personalized prediction of first-cycle in vitro fertilization success // Fertil Steril. // - 2013. - Vol. 99. - №7. - P. 1905-1911.
3) Talmor, A. Female Obesity and Infertility / A. Talmor, B. Dunphy // Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. - 2015. - Vol. 29, №4. - P. 498-506
4) Llaneza-Suarez D., Llaneza P., Gonzalez C, De-La-Fuente P., Garcia-Ochoa C, Garrido P., Castanon V., Perez-Lopez F.R. / Assessment of follicular fluid leptin levels and insulin resistance as outcome predictors in women undergoing in vitro fertilization-intracytoplasmic sperm injection // Fertil Steril.// -2014. - Vol. 102. - №6. - P. 1619-1625.
5) Asimakopoulos В., Koster F., Felberbaum R., Tripsiannis G., Caglar G.S., Nikolettos N., Al-Hasani S., Diedrich K. / Intrafollicular and circuk ing concentrations of leptin do not predict the outcome inlVF-ICSI cycles // Reprod Sci. // - 2009. - Vol. 16. - №1. - P. 113-119.
6) Anifandis G., Koutselini E., Louridas K., Liakopoulos V., Leivaditis K., Mantzavinos Т., Sioutopoulou D., Vamvakopoulos N. / Estradiol and leptin as conditional prognostic IVF markers // Reproduction // - 2005. - Vol. 129. - №4. - P. 531-534.
7) Weiss S.L., Selak M.A., Tuluc F., Perales Villarroel J., Nadkarni V.M., Deutschman C.S., Becker L.B. / Mitochondrial dysfunction in peripheral blood mononuclear cells in pediatric septic shock // Pediatr Crit Care Med. // - 2015. - Vol. 16. - №1. - P. e4-e12.
8) Chiu H.Y., Tsao L.Y., Yang R.C. / Heat-shock response protects peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from hydrogen peroxide-induced mitochondrial disturbance // Cell Stress Chaperones. // - 2009. - Vol. 14. - №2. - P. 207-217.
9) Garrabou G et al. The effects of sepsis on mitochondria. J Infect Dis. 2012 Feb 1; 205(3): 392-400.