Оценка способности нейтрофилов периферической крови образовывать внеклеточные ловушки у лиц, подвергшихся хроническому воздействию ионизирующей радиации

Вестник Челябинского государственного университета. 2013. № 7 (298). Биология. Вып. 2. С. 94-96.

А. А. Аклеев, И. И. Долгушин, К. Р. Валетдинова

ОЦЕНКА СПОСОБНОСТИ НЕЙТРОФИЛОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ОБРАЗОВЫВАТЬ ВНЕКЛЕТОЧНЫЕ ЛОВУШКИ У ЛИЦ, ПОДВЕРГШИХСЯ ХРОНИЧЕСКОМУ ВОЗДЕЙСТВИЮ ИОНИЗИРУЮЩЕЙ РАДИАЦИИ

Непрерывное расширение применения ионизирующих излучений в различных областях науки и техники, сельского хозяйства и медицины делает актуальной проблему изучения эффектов хронического воздействия радиации на организм человека. Данная работа посвящена оценке способности нейтрофилов периферической крови образовывать нейтрофильные внеклеточные ловушки (НВЛ) у лиц, подвергшихся хроническому воздействию радиации с низкой мощностью дозы.

Ключевые слова: ионизирующая радиация, нейтрофильные гранулоциты, нейтрофильные внеклеточные ловушки.

Введение. В современной радиобиологии и медицине накоплено недостаточно информации относительно эффектов хронического радиационного воздействия с низкой мощностью дозы, которое является неотъемлемым фактором при нахождении человека в космосе, работе на атомной электростанции или проживании на радиоактивно загрязнённых территориях. В связи с этим особый интерес представляют жители прибрежных сёл р. Течи, подвергшиеся хроническому низкоинтенсивному облучению в результате сбросов жидких радиоактивных отходов (ЖРО) ПО «Маяк» в р. Течу. Учитывая характер радиационного воздействия (внешнее — гамма- и внутреннее, преимущественно за счёт инкорпорированного в костной ткани 9^г) и высокую радиочувствительность, критическим органом являлся красный костный мозг (ККМ). Максимальная мощность дозы облучения зарегистрирована в 1951 г. и составила 1,48 Гр/г. В последующем мощность дозы постепенно снижалась и с 1985 года не превышала допустимых значений (1мГр/г). Максимальное значение накопленной дозы облучения на ККМ составило 5,6 Гр. Средняя накопленная доза на ККМ для членов расширенной когорты р. Течи составила 34 сГр. Дозы более 1 Гр получило свыше 2 тысяч человек [1].

В период максимальных сбросов среди жителей сёл, наиболее близко расположенных к ПО «Маяк», было зарегистрировано 940 случаев хронического лучевого синдрома (ХЛС) [2; 3]. Основными его проявлениями являлись транзи-торная лейкопения, в основном за счёт грануло-цитов, «сдвиг влево» в лейкоцитарной формуле, тромбоцитопения, функциональные неврологические нарушения, угнетение иммунитета и остеоалгический синдром.

Среднее число нейтрофилов в группе облучённых было снижено в первые 10 лет от начала радиационного воздействия. В последующие годы число нейтрофильных гранулоцитов постепенно повышалось и статистически значимых отличий с контролем не отмечалось. Однако, по нашим данным, через 60 лет после начала радиационного воздействия у облучённого населения вновь отмечается некоторое снижение (р = 0,004) абсолютного количества нейтрофилов периферической крови.

В отдалённые сроки актуальной становится проблема стохастических последствий облучения. Так, у жителей прибрежных сёл р. Течи по результатам эпидемиологических исследований регистрируется повышенный радиационный риск развития лейкозов и солидных новообразований [4].

В связи с этим представляется важным оценить функциональный резерв нейтрофильных гранулоцитов, играющих наряду с моноцитами важную роль в обеспечении противоопухолевого иммунитета [5-8].

Как известно, одним из основных свойств нейтрофила является его способность к фагоцитозу. Но в 2004 г. исследователями Института инфекционной биологии им. Макса Планка, работающими под руководством А. 2усЫ^ку, было открыто новое свойство этих клеток — внеклеточный захват патогенов путём формирования нейтрофильных внеклеточных ловушек (НВЛ). Способность к формированию НВЛ — сетеподобных структур, состоящих из нуклеиновых кислот, гранулированных пептидов и антимикробных молекул, является свойством, альтернативным фагоцитозу, а возможно, и более эффективным [9].

Цель. Изучить влияние хронического низкоинтенсивного ионизирующего излучения на способность нейтрофилов образовывать НВЛ.

Материалы и методы. Исследуемую группу составили 49 облучённых лиц — жителей прибрежных сёл р. Течи. В группу сравнения вошли 13 человек, проживающих в сходных социальноэкономических условиях, суммарная накопленная доза на ККМ у которых не превышала 7 сГр. Изучаемая группа была представлена 21 мужчиной (42,86 %) и 28 женщинами (57,14 %); средний возраст в группе составил 68,84±0,9 года. Группу сравнения составили 2 мужчин (15,39 %) и 11 женщин (84,61 %); средний возраст в группе составлял 64,85±1,12 года. В обеих группах преобладали лица тюркской этнической группы (59,18 % — в основной группе, 69,22 % — в группе сравнения) над лицами славянской группы (40,82 % — в основной группе и 30,78 % — в контрольной).

Для исследования использовалась периферическая венозная кровь. Нейтрофилы выделяли путём центрифугирования предварительно разбавленной физиологическим раствором крови на двойном градиенте плотности фиколл-урографина в течение 40 мин при 1 500 об./мин. Выделенные клетки дважды отмывали стерильным физиологическим раствором путём центрифугирования по 7 мин при 1 500 об./мин. Концентрацию нейтрофилов доводили до 5 • 106 клеток/мл. В стерильную пробирку типа эппендорф отбирали 100 мкл клеточной взвеси и добавляли 20 мкл препарата-активатора «Пирогенал» с содержанием действующего вещества 0,02 мкг/мл, что соответствует средней терапевтической дозе [10]. В контрольную пробирку вносились нейтрофилы без активатора. Клетки инкубировали в термостате в течение 30 мин при 37 °С. Окрашивание нейтрофилов и оценку результатов реакции проводили по методике, предложенной И. И. Долгушиным и со-авт. [11]. На предметное стекло наносили 2 капли клеточной взвеси (по 20 мкл каждая), окрашивали акридиновым оранжевым и готовили препарат «раздавленная капля». Учёт реакции проводили с помощью люминесцентного микроскопа Zeiss Imager. A2 при 63-кратном увеличении под масляной иммерсией. Производился количественный подсчёт сегментоядерных нейтрофилов, нейтро-филов с недифференцированным ядром и собственно НВЛ на 100 клеток.

Результаты исследования были обработаны при помощи пакета прикладных программ Statistica (версия 6.0, StatSoft, USA).

Результаты и обсуждение. В исследуемой и контрольной группах при использовании препарата «Пирогенал» отмечено статистически значимое увеличение относительного количества нейтрофилов с недифференцированным ядром и НВЛ при более низком содержании клеток с сегментированным ядром, чем в пробах без активатора. У облучённых лиц насчитывается большее количество нейтрофилов с недифференцированным ядром и НВЛ при меньшем содержании нейтрофилов с сегментированным ядром по сравнению с лицами группы сравнения (статистически незначимые различия). Таким образом, статистически значимых отличий в способности нейтрофилов образовывать НВЛ у облучённых людей по сравнению с лицами группы контроля выявлено не было.

Полученные результаты могут быть объяснены тем, что воздействие малых доз ионизирующего излучения происходило порядка 55-60 лет назад, и за прошедший промежуток времени функциональная активность гранулоцитов, вероятно, восстановилась.

Выводы и заключение. Обращает на себя внимание тенденция к повышению способности нейтрофилов в группе облучённых лиц образовывать НВЛ, что может быть связано либо с достаточно полным восстановлением функциональной активности нейтрофилов или даже восстановлением с «компенсаторным избытком» у хронически облучённых людей либо с началом истощения их функционального резерва на фоне длительного воздействия радиации, инволюционных процессов и хронической патологии, поскольку образование НВЛ — это также один из способов клеточной гибели. Для подтверждения наметившихся тенденций требуется увеличение объёма выборки, а также оценка влияния факторов нерадиационной природы (возраст, пол, наличие хронических заболеваний, вредных привычек и т. д.) на способность нейтрофилов образовывать НВЛ.

Список литературы

1. Медико-биологические и экологические последствия радиоактивного загрязнения реки Течи / под ред. А. В. Аклеева, М. Ф. Киселёва. М., 2000.

2. Kossenko, M. Analysis of chronic radiation sickness cases in the population of the Southern Urals / M. Kossenko, A. Akleyev, M. Degteva, V. Kozheu-rov, R. Degtyaryova. Chelyabinsk : Urals Research Center for Radiation Medicine, 1994. AFRRI, Contract Report 91-1.

3. Chronic Radiation Sickness among Techa Riverside Residents. Chelyabinsk : Urals Research Center for Radiation Medicine, 1998. AFRRI, Contract Report 98-1.

4. Krestinina L. Yu. Protracted radiation exposure and cancer mortality in the Techa River Cohort / L. Yu. Krestinina, D. L. Preston, E. V. Ostroumova [et al.] // Radiat. Res 2005. № 164. P. 602-611.

5. Kui, Z. Spontaneous regression of advanced cancer: Identification of a unique genetically determined, age-dependent trait in mice / Z. Kui, M. C. Willington, A. M. Hicks [et al.] // PNAS. 2003. Vol. 100, № 11. P. 6682-6687.

6. Kui, Z. The effect of aging on cellular immunity against cancer in SR/CR mice / Z. Kui, M. C. Willington // Cancer Immunol. Immunother. 2004. Vol. 53. P. 473-478.

7. Hicks, A. M. Effector mechanism of the anticancer immune responses of macrophages in SR/CR mice / A. M. Hicks, M. C. Willington, W. Du [et al.] // Cancer Immunity. 2006. Vol. 6. P. 1-9.

8. Hicks, A. M. Transferable anticancer innate immunity in spontaneous regression / complete resistance mice / A. M. Hicks, G. Riedlinger, M. C. Willington [et al.] // PNAS. 2006. Vol. 103, № 20. P. 77537758.

9. Brinkmann, V. Neutrophil extracelllulartraps kill bacteria / V. Brinkmann, U. Rechard, C. Goosmann [et al.] // Science. 2004. Vol. 303. P. 1532-1535.

10. Шишкова, Ю. С. Влияние препарата «Пирогенал» на образование нейтрофиль-ных внеклеточных ловушек / Ю. С. Шишкова, А. Ю. Савочкина, А. И. Рыжкова, Е. А. Мезенцева // Мед. наука и образование Урала. 2009. № 3. С. 23-25.

11. Долгушин, И. И. Технологии определения и роль нейтрофильных внеклеточных ловушек в антимикробной защите / И. И. Долгушин, Ю. С. Шишкова, А. Ю. Савочкина, А. И. Рыжкова, И. В. Курносенко, В. П. Евтушенко // Вестн. РАМН. 2010. № 4. С. 26-30.