ВЕКТОР, КОЭКСПРЕССИРУЮЩИЙ МОЛЕКУЛЫ ДЛЯ ВАКЦИНАЦИИ И КОСТИМУЛИРУЮЩИЕ МОЛЕКУЛЫ
VECTOR, CO-EXPRESSING MOLECULES FOR VACCINATION AND COSTIMULATORY MOLECULES

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании предварительных заявок на патент США №№62/113,153, поданной 6 февраля 2015 года, и 62/174,942, поданной 12 июня 2015 года, полное содержание которых включено в настоящую заявку посредством ссылки.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящий документ относится, среди прочего, к материалам и способам для применения вакцинации и костимуляции Т-клеток с целью лечения клинического состояния у субъекта, включая материалы и способы для коэкспрессии вакцины (например, gp96-Ig) и костимулирующих молекул Т-клеток с применением одного вектора.
ОПИСАНИЕ ТЕКСТОВОГО ФАЙЛА, ПОДАННОГО ЭЛЕКТРОННЫМ СПОСОБОМ
Содержание текстового файла, поданного электронным способом, полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки: копия Перечня последовательностей в машинно-читаемом формате (название файла: HTB-021PC-SequenceListing.txt; дата записи: 4 февраля 2016 года; размер файла: 73 Кбайт).
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Рак представляет собой заболевание, возникающее в результате длительного периода генетической нестабильности, который увеличивает период жизни нормальной клетки. Событие, запускающее процесс, которое означает начало такого периода, варьирует для разных типов клеток, но, как правило, представляет собой приобретение мутации в гене-супрессоре опухоли, таком как р53 или Rb, мутации в протоонкогене, таком как KRAS или myc, или инфицирование клетки онкогенным вирусом, таким как ВПЧ 16 (вирус папилломы человека 16) или ВЭБ (вирус Эпштейна-Барр). Вне зависимости от происхождения, клетки, которые приобрели мутации в генах, позволяющие им избежать нормального контроля роста или путей гибели клеток, способны с большей вероятностью приобретать дополнительные мутации. После того как клетка приобрела «достаточное количество» мутаций, которое, как считают, обычно составляет по меньшей мере шесть, данная клетка перестает быть восприимчивой к внутренним или внешним сигналам, которые могли бы сдерживать ее рост или запустить апоптоз.
Поскольку опухоли возникают из клеток хозяина, иммунная система организма изначально является толерантной к данным клеткам. Приобретение вызывающих опухоль мутаций может привести к образованию мутантного белка, содержащего эпитоп, который является в достаточной степени чужим, чтобы стать иммуногенным, а может и не привести к образованию подобного белка. Если клетка приобретает иммуногенную мутацию, данная клетка может быть найдена и уничтожена иммунной системой хозяина - данный процесс известен как иммунный надзор (Smyth et al., Adv Immunol 2006, 90:1-50). Исследования на мышах позволили получить доказательства гипотезы иммунного надзора (Dunn et al., Nat Immunol 2002, 3:991-998; Shankaran et al., Nature 2001, 410:1107-1111; и Dunn et al., Annu Rev Immunol 2004, 22:329-360), в данных исследованиях также сделано предположение о том, что реакции системы врожденного иммунитета, помимо реакций так называемой системы приобретенного иммуннитета, могут усиливать отторжение иммуногенных опухолей (Unni et al., Proc Natl Acad Sci USA 2008, 105:1686-1691; Taieb et al., Nat Med 2006, 12:214-219; и Raulet and Guerra, Nat Rev Immunol 2009, 9:568-580). Реакции системы врожденного иммунитета можно вызвать посредством индуцированной экспрессии сигналов, активирующих NK (natural killer, природные киллеры), таких как экспрессия лиганда NKG2D, или вследствие повреждения ДНК, возникающего в результате мутагенного или вирусного процессов. Некоторые клетки, которые приобрели иммуногенные мутации, также приобретают свойство задействовать нормальные иммунные регуляторные системы, которые ослабляют аутореактивные иммунные ответы (Rabinovich et al., Annu Rev Immunol 2007, 25:267-296). Пути, управляющие активацией регуляторных механизмов хозяина, плохо изучены. Тем не менее, другие клетки могут приобрести множество онкогенных мутаций и никогда не образовать иммуногенный пептид, приводящий к активации иммунной системы хозяина. Таким образом, опухолевые клетки, которые в ходе своей трансформации образуют иммуногенный пептид, для выживания должны непрерывно уклоняться от противоопухолевых иммунных ответов, тогда как выживание опухолей, которые стали трансформированными без активации иммунной системы, может не зависеть от таких иммунных регуляторных механизмов.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Возможно, что варианты комбинированной терапии, включая комбинации или подкомбинации одного или нескольких ингибиторов контрольных точек клеточного цикла, одной или нескольких вакцин и одной или нескольких костимулирующих молекул Т-клеток, могут расширить круг страдающих от рака пациентов, которые могут получить пользу от иммунотерапии. Вакцины могут способствовать данному ответу посредством увеличения количества CD8+ Т-клеток, специфичных к опухолевому антигену, а также количества антигенов опухоли, которые распознаются данными CD8+ Т-клетками. Костимулирующие молекулы Т-клеток могут усилить ответ посредством последующего увеличения частоты и/или усиления активации Т-клеток, специфичных к опухолевому антигену, а также посредством увеличения экспрессии эффекторных молекул, уничтожающих опухоль, CD8+ Т-клетками. При использовании в комбинации с ингибиторами контрольных точек существует вероятность получения широкого диапазона в высокой степени активированных CD8+ Т-клеток, которые будут способны к инфильтрации опухоли и которые не будут ингибироваться различными путями, связанными с контрольными точками, после осуществления инфильтрации. Однако успеху вариантов комбинированной терапии препятствует то, что в данных подходах традиционно требуется введение по меньшей мере трех различных лекарственных препаратов (вакцины, молекулы, костимулирующей Т-клетки и ингибитора контрольных точек), каждый из которых характеризуется значительной стоимостью и, в некоторых случаях, токсичностью.
Настоящее изобретение основано, по меньшей мере частично, на обнаружении того, что комбинация вакцинации, например, вакцинации gp96-Ig, и костимуляции Т-клеток с одним или несколькими агонистами ОХ40, ICOS, 4-1ВВ, TNFRSF25, CD40, CD27 и/или GITR, среди прочего, обеспечивает синергический лечебный эффект по отношению к опухоли. На доклинических моделях ранее изучали отдельные независимые композиции вакцин gp96-Ig в комбинации с агонистическими антителами, нацеленными на ОХ40, ICOS, 4-1ВВ и TNFRSF25, и были продемонстрированы различные эффекты на механистическую и противоопухолевую комплементарность. Материалы и способы, описанные в настоящей заявке, являются предпочтительными по той причине, что, среди прочего, в данных материалах и способах предложена одна композиция, которая может обеспечить вакцинацию, например, gp96-Ig, и костимуляцию Т-клеток без необходимости в существовании независимых продуктов. Данные материалы и способы достигают указанной цели посредством получения одного вектора для экспрессии белка для вакцинирования (например, gp96-Ig), при этом указанный вектор был модифицирован генетическим способом для одновременной экспрессии костимулирующей молекулы, включая, без ограничения, слитые белки, такие как ICOSL-Ig, 4-1BBL-Ig, TL1A-Ig, OX40L-Ig, CD40L-Ig, CD70-Ig или GITRL-Ig, для обеспечения костимуляции Т-клеток. Векторы и способы применения указанных векторов могут обеспечить благоприятный эффект от костимуляции без необходимости в дополнительной терапии антителами для усиления активации антигенспецифичных CD8+ Т-клеток. Таким образом, комбинированную иммунотерапию можно обеспечить посредством переконструирования вектора во избежание необходимости в курсах лечения вакциной/антителом/слитым белком, что может снизить как стоимость терапии, так и риск системной токсичности.
Согласно одному аспекту в настоящем документе предложен вектор экспрессии, содержащий первую последовательность нуклеотидов, которая кодирует секретируемый белок для вакцинирования, и вторую последовательность нуклеотидов, которая кодирует слитый белок, костимулирующий Т-клетки, причем указаный слитый белок, костимулирующий Т-клетки, при введении субъекту усиливает активацию антигенспецифичных Т-клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения в настоящем документе предложен вектор экспрессии, содержащий первую последовательность нуклеотидов, которая кодирует секретируемый слитый белок gp96-Ig, и вторую последовательность нуклеотидов, которая кодирует слитый белок, костимулирующий Т-клетки, причем слитый белок, костимулирующий Т-клетки, при введении субъекту усиливает активацию антигенспецифичных Т-клеток. Вектор экспрессии может представлять собой вектор экспрессии млекопитающих. Согласно варианту реализации настоящего изобретения в секретируемом слитом белке gp96-Ig может отсутствовать последовательность KDEL gp96 (SEQ ID NO: 3). Ig-метка в слитом белке gp96-Ig может содержать Fc-область IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA или IgE человека. Слитый белок, костимулирующий Т-клетки, может представлять собой, среди прочего, OX40L-Ig или часть указанного белка, которая связывается с ОХ40, ICOSL-Ig или часть указанного белка, которая связывается с ICOS, 4-1BBL-Ig или часть указанного белка, которая связывается с 4-1BBR, TL1A-Ig или часть указанного белка, которая связывается с TNFRSF25, GITRL-Ig или часть указанного белка, которая связывается с GITR, CD40-Ig или часть указанного белка, которая связывается с CD40, или CD70-Ig или часть указанного белка, которая связывается с CD27. Ig-метка в слитом белке, костимулирующем Т-клетки, может содержать Fc-область IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA или IgE человека. Вектор экспрессии может включать ДНК или РНК.
Согласно другому аспекту в настоящем документе предложена композиция, которая содержит вектор экспрессии, содержащий первую последовательность нуклеотидов, которая кодирует секретируемый белок для вакцинирования, такой как секретируемый слитый белок gp96-Ig, и вторую последовательность нуклеотидов, которая кодирует слитый белок, костимулирующий Т-клетки, причем слитый белок, костимулирующий Т-клетки, при введении субъекту усиливает активацию антигенспецифичных Т-клеток. Вектор может представлять собой вектор экспрессии млекопитающих на основе ДНК. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения в секретируемом слитом белке gp96-Ig может отсутствовать последовательность KDEL gp96 (SEQ ID NO: 3). Ig-метка слитого белка gp96-Ig может содержать Fc-область IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA или IgE человека. Слитый белок, костимулирующий Т-клетки, может представлять собой OX40L-Ig или часть указанного белка, которая связывается с ОХ40, ICOSL-Ig или часть указанного белка, которая связывается с ICOS, 4-1BBL-Ig или часть указанного белка, которая связывается с 4-1BBR, TL1A-Ig или часть указанного белка, которая связывается с TNFRSF25, GITRL-Ig или часть указанного белка, которая связывается с GITR, CD40L-Ig или часть указанного белка, которая связывается с CD40, или CD70-Ig или часть указанного белка, которая связывается с CD27. Ig-метка в слитом белке, костимулирующем Т-клетки, может содержать Fc-область IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA или IgE человека. Вектор экспрессии может быть включен в вирус или вирусоподобную частицу или может быть включен в опухолевую клетку человека (например, опухолевую клетку человека из стабильной линии клеток, например, стабильной линии клеток НМКРЛ (немелкоклеточного рака легких), рака мочевого пузыря, меланомы, рака яичников, почечноклеточного рака, карциномы предстательной железы, саркомы, карциномы молочной железы, плоскоклеточной карциномы, карциномы головы и шеи, гепатоклеточной карциномы, карциномы поджелудочной железы или карциномы толстой кишки).
Согласно другому аспекту в настоящем документе предложена клетка, содержащая композицию, которая содержит вектор экспрессии, содержащий первую последовательность нуклеотидов, которая кодирует секретируемый белок для вакцинирования, и вторую последовательность нуклеотидов, которая кодирует слитый белок, костимулирующий Т-клетки, причем указанный слитый белок, костимулирующий Т-клетки, при введении субъекту усиливает активацию антигенспецифичных Т-клеток. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения в настоящем документе предложена клетка, содержащая композицию, которая содержит вектор экспрессии, содержащий первую последовательность нуклеотидов, которая кодирует секретируемый слитый белок gp96-Ig, и вторую последовательность нуклеотидов, которая кодирует слитый белок, костимулирующий Т-клетки, причем слитый белок, костимулирующий Т-клетки, при введении субъекту усиливает активацию антигенспецифичных Т-клеток. Такая клетка согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения может являться подходящей для применения в качестве готовой к применению терапии. Такая клетка согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения является облученной. Такая клетка согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения является живой и аттенуированной. Данные клетки согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения экспрессируют антигены опухоли, в отношении которых белок для вакцинирования (например, gp96), входящий в состав композиций согласно настоящему изобретению, играет роль шаперона. Такая клетка согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения может быть получена из стабильной линии клеток, например, из опухолевой клетки человека из стабильной линии клеток НМКРЛ, рака мочевого пузыря, меланомы, рака яичников, почечноклеточного рака, карциномы предстательной железы, саркомы, карциномы молочной железы, плоскоклеточной карциномы, карциномы головы и шеи, гепатоклеточной карциномы, карциномы поджелудочной железы или карциномы толстой кишки. Такая клетка согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения может быть получена из стабильной линии клеток рака предстательной железы. Такая клетка согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения может быть получена из стабильной линии клеток рака легких. Такая клетка согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения может быть получена из стабильной линии клеток рака мочевого пузыря. Такая клетка согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения может быть получена из стабильной линии клеток саркомы. Такая клетка согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения может быть получена из стабильной линии клеток рака хориокарциномы.
Согласно другому аспекту в настоящем документе предложен способ лечения субъекта. Указанный способ может включать введение субъекту эффективного количества композиции, описанной в настоящей заявке, например, композиции, которая содержит вектор экспрессии, содержащий первую последовательность нуклеотидов, которая кодирует секретируемый белок для вакцинирования, такой как секретируемый слитый белок gp96-Ig, и вторую последовательность нуклеотидов, которая кодирует слитый белок, костимулирующий Т-клетки, причем слитый белок, костимулирующий Т-клетки, при введении субъекту усиливает активацию антигенспецифичных Т-клеток. Вектор может быть включен в вирус или вирусоподобную частицу или может быть включен в опухолевую клетку человека. Субъект может представлять собой пациента, представляющего собой человека, страдающего от рака. Введение композиции пациенту-человеку может увеличивать активацию или пролиферацию Т-клеток, специфичных к антигену опухоли, у пациента. Например, активация или пролиферация специфичных к антигену опухоли Т-клеток у пациента может быть увеличена по меньшей мере на 25 процентов (например, по меньшей мере на 30 процентов, по меньшей мере на 40 процентов, по меньшей мере на 50 процентов, по меньшей мере на 60 процентов, по меньшей мере на 70 процентов или по меньшей мере на 75 процентов) по сравнению с уровнем активации или пролиферации специфичных к антигену опухоли Т-клеток у пациента до введения. Способ может включать введение пациенту-человеку, страдающему от рака, композиции в комбинации со средством, которое ингибирует иммуносупрессивные молекулы, образуемые опухолевыми клетками. Средство может представлять собой антитело против PD-1. Субъект может представлять собой человека с острой или хронической инфекцией (например, инфекцией вирусом гепатита С, вирусом гепатита В, вирусом иммунодефицита человека или малярией). Введение пациенту-человеку композиции может стимулировать активацию или пролиферацию Т-клеток антигенспецифичных в отношении патогенных. Молекула для костимуляции Т-клеток может усиливать активацию антигенспецифичных Т-клеток у субъекта до большего уровня, чем вакцинация gp96-Ig сама по себе.
Если не указано обратное, все технические и научные термины, используемые в настоящей заявке, имеют то же значение, которое общепринято понимается средним специалистом в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Несмотря на то, что при реализации настоящего изобретения на практике можно использовать способы и материалы, аналогичные или эквивалентные таковым, описанным в настоящей заявке, ниже описаны подходящие способы и материалы. Все публикации, заявки на патент, патенты и другие ссылки, упомянутые в настоящей заявке, полностью включены в настоящую заявку посредством ссылки. В случае противоречий преимущество имеет настоящая спецификация, включая определения. Кроме того, материалы, способы и примеры являются исключительно иллюстративными и не предназначены для ограничения.
Детали одного или нескольких вариантов реализации настоящего изобретения изложены в прилагаемых чертежах и описании ниже. Другие свойства, объекты и преимущества настоящего изобретения будут очевидны на основе описания и чертежей, а также формулы изобретения.
ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фиг. 1 представляет собой схематическое изображение дополнительного изменения исходного вектора gp96-Ig для получения комбинированного продукта на основе клеток, который кодирует в первой кассете слитый белок gp96-Ig, а во второй кассете - слитый белок, костимулирующий Т-клетки. ICOS-Fc, 4-1BBL-Fc и OX40L-Fc представлены для иллюстрации.
Фиг. 2 представляет собой схематическое изображение вектора экспрессии млекопитающих (В45), кодирующего в одной кассете экспрессии секретируемый слитый белок gp96-Ig, а во второй кассете - слитый белок, костимулирующий Т-клетки (в качестве неограничивающей иллюстрации, ICOSL-IgG4 Fc).
Фиг. 3 представляет собой иллюстрацию аллогенной опухолевой клетки, которая была трансфицирована вектором, кодирующим два секретируемых белка. Первый белок, gp96-Ig, образует секретируемый димер (гладкий), который выступает в качестве шаперона для образованных в клетках антигенов за пределами клеток. Второй белок представляет собой тримерный секретируемый слитый белок, костимулирующий Т-клетки (шероховатый), который секретируется вакцинированной клеткой и может свободно связываться с расположенным рядом костимулирующий рецептором на поверхности Т-клетки.
На фиг. 4A-4G показано, что агонистическое антитело против ОХ40 в комбинации с клеточной вакциной gp96-Ig стимулирует антигенспецифичную пролиферацию CD8, в то время как FOXP3+ Treg (Т-регуляторные клетки) остаются не подверженными воздействию. На фиг. 4A-4D представлен механизм действия клеточной вакцины gp96-Ig. На фиг. 4А клетки для вакцинации секретируют gp96-Ig вместе с образованными в клетках антигенами, или, в случае фиг. 5, 6 и 8, единичный антиген овальбумина цыпленка, который стабильно экспрессируется в данной линии клеток для вакцинации. На фиг. 4В комплексы gp96-Ig/антиген поглощаются АПК (антиген-презентирующими клетками), и антигены переносятся к молекулам МНС (major histocompatibility complex, главного комплекса гистосовместимости) класса I. На фиг. 4С перекрестная презентация антигена приводит к активации CD8+ специфичных Т-клеток. На фиг. 4D, применительно к опухоли, активированные CD8+ Т-клетки могут распознать и разрушить общие антигены опухоли на отдаленных опухолях. Фиг. 4Е представляет собой график, демонстрирующий антигенспецифичную экспансию клеток (ОТ-1) после вакцинации ImPACT (в настоящей заявке данный термин означает модифицированный (например, с делецией KDEL) слитый белок gp96-Ig или, в некоторых случаях, сконструированную линию клеток, разработанную для экспрессии слитого белка gp96-Ig) самим по себе или в комбинации с агонистическими антителами против ICOS, 4-1 ВВ или ОХ40, костимулирующими Т-клетки. Представлены данные для дней 5 и 40 после исходной вакцинации (первичный и вторичный иммунные ответы, соответственно). Последняя временная точка также соответствует 5 дням после второй, бустер-вакцинации. Только комбинация ImPACT/OX40 (AT, антитело) вызывала экспансию ОТ-1, которая значительно превышала экспансию после введения ImPACT самого по себе (*, р<0,05). Указаны повторы эксперимента. Отложенные на графике значения представляют собой среднее значение, и ошибка представляет собой СОС (стандартную ошибку среднего). Для всех данных, представленных на фиг. 4Е, порядок столбчатых диаграмм слева направо является следующим: без вакцины, ImPACT сам по себе, ImPACT плюс антитело против ICOS, ImPact плюс антитело против ОХ40 и ImPact плюс антитело против 4-1ВВ. Фиг. 4F представляет собой график, демонстрирующий количество FOXP3+ Treg в виде процента от суммарного количества CD4+ клеток. За исключением мышей, получавших ImPACT/4-1BB, у которых наблюдались флуктуации от увеличенных до уменьшенных уровней клеток FOXP3+, значительные изменения уровня Treg после лечения ImPACT отсутствовали. Данный результат подчеркивает специфичность ImPACT в отношении экспансии CD8+. Указаны повторы эксперимента. Отложенные на графике значения представляют собой среднее значение, и ошибка представляет собой СОС. Для всех данных, представленных на фиг. 4F, порядок столбчатых диаграмм слева направо является следующим: без вакцины, ImPACT сам по себе, ImPact плюс антитело против ICOS, ImPact плюс антитело против ОХ40 и ImPact плюс антитело против 4-1ВВ. Фиг. 4G представляет собой пару графиков, демонстрирующих экспансию клеток OT-1/CD8 и FOXP3+ во второй модельной системе в ответ на адъювант - алюминий. И в данном случае введение комбинации ImPACT и ОХ40(АТ) приводило к значительной пролиферации ОТ-1 в дополнение к умеренному увеличению уровня клеток FOXP3+. Указаны повторы эксперимента. Отложенные на графике значения представляют собой среднее значение, и ошибка представляет собой СОС. Для всех данных, представленных на фиг. 4G, порядок столбчатых диаграмм слева направо является следующим: без вакцины, контроль IgG и ImPact плюс антитело против ОХ40.
На фиг. 5A-5D показано, что костимулятор Т-клеток ОХ40 функционирует синергическим способом с клеточной вакциной ImPACT (gp96-Ig) для активации Т-клеток и образования антигенспецифичной экспансии CD8+. Фиг. 5А представляет собой схематическое изображение взаимодействий рецептора (ОХ40, ICOS и 4-1ВВ) и лиганда (OX40L, ICOSL и 4-1BBL) на Т-клетках и антиген-презентирующих клетках (АПК), которое способствует активации Т-клеток. Фиг. 5В представляет собой диаграмму, на которой представлена стабильная линия клеток, установленная посредством селекции клональной популяции клеток, экспрессирующих gp96-Ig/HLA-A1 (ImPACT) в сочетании с единичным антигеном овальбумина цыпленка, с целью проследить антигенспецифичную экспансию Т-клеток (клеток ОТ-I) после введения вакцины. Фиг. 5С представляет собой перечень агонистических антител мыши, костимулирующих Т-клетки, исследованных в комбинации с ImPACT для синергического действия, способствующего экспансии Т-клеток, - все из данных антител являются пригодными в различных вариантах реализации настоящего изобретения в качестве средств комбинированной терапии. Фиг. 5D представляет собой график, демонстрирующий уровни ОТ-1 у репортерных мышей FOXP3-RFP, которым инокулировали антигенспецифичные клетки ОТ-1 (CD8), меченные GFP (green fluorescent protein, зеленым флуоресцирующим белком), посредством инъекции в хвостовую вену в день -1, что определяли методом проточной цитометрии в день 43 после вакцинации ImPACT самим по себе или ImPACT в комбинации с 100 мкг агонистических антител против ОХ40, ICOS или 4-1ВВ, костимулирующих Т-клетки, в день 0. Параллельно в качестве контроля оценивали невакцинированных (без вакцины) мышей. В день 35 вновь проводили бустер-иммунизацию мышей вакциной или комбинациями вакцина/антитело. Дни вакцинации отмечены шприцами. Исходный (первичный) иммунный ответ достигал пика в день 5, и только у мышей, получавших вакцину/ОХ40(АТ), наблюдался умеренный вторичный иммунный ответ после бустер-иммунизации (стрелки). Отложенные на графике значения представляют средний процент клеток ОТ-1 от всех CD8+ клеток, и ошибка представляет собой СОС. См. также данные о количестве повторов эксперимента и статистической значимости между выборками на фиг. 4A-G.
На фиг. 6А-6С показано, что комбинация костимулятора Т-клеток OX40L с ImPACT в новом векторе для вакцинации («ComPACT») вызывала неожиданно превосходящую экспансию антигенспецифичных CD8+ Т-клеток по сравнению с совместным введением агонистического антитела против ОХ40. На фиг. 6А представлен дизайн эксперимента для сравнения (а) экспансии антигенспецифичных Т-клеток с применением исходной вакцины ImPACT (Gp96-Ig) в комбинации с агонистическим антителом против ОХ40 с (b) новой вакциной ComPACT (на данной фигуре - Gp96-Ig/OX40L-Fc). На фиг. 6В представлен пик пролиферации антигенспецифичных CD8+ Т-клеток после первичной иммунизации контрольной вакциной, вакциной, экспрессирующей овальбумин, вакциной, экспрессирующей овальбумин и gp96-Ig (ImPACT), ImPACT в комбинации с агонистическими антителами против ОХ40 или ComPACT. Для всех данных, представленных на фиг. 6В, порядок пиков слева направо является следующим: без вакцины, только контроль Ova, ImPACT, ImPACT плюс антитело против ОХ40 и ComPACT. Фиг. 6С представляет собой график, демонстрирующий экспансию ОТ-1 (аналогично фиг. 5D) в течение времени с применением мышей FOXP3-RFP, которым инокулировали клетки ОТ-1 (CD8) в день -1. Клетки OT-1/GFP анализировали методом проточной цитометрии у мышей, которые не получали вакцины, которые получали только контрольные клетки Ova, ImPACT, ImPACT + 100 мкг ОХ40(АТ) и ComPACT, в течение 46 дней с исходной вакцинацией в день 0 и бустер-иммунизацией в день 35 (отмечены шприцами). Как первичный, так и вторичный иммунные ответы (стрелки) являлись наибольшими у мышей, которые получали ComPACT, даже по сравнению с ImPACT + ОХ40(АТ). У мышей ComPACT также неожиданно сохранялись увеличенные уровни ОТ-1 в течение всего периода времени (~ дни 7-20). Отложенные на графике значения представляют собой среднее значение, и ошибка представляет собой СОС. См. также данные о количестве повторов эксперимента и статистической значимости между выборками на фиг. 7A-7F.
На фиг. 7A-7F показано, что комбинация экспрессии gp96-Ig и OX40L, ICOSL или 4-1BBL в ComPACT приводит к увеличению уровня ответа антигенспецифичных CD8 Т-клеток. Фиг. 7А-7D демонстрируют характеризацию 3Т3-версии ComPACT, которая использовалась на фиг. 6С. Клетки 3Т3 трансфицировали плазмидой, экспрессирующей овальбумин цыпленка (Ova), и один клон с высокой экспрессией устанавливали и использовали для повторной трансфекции векторами для вакцинации (gp96-Ig сам по себе, gp96-Ig/OX40L-Fc, gp96-Ig/ICOSL или gp96-Ig/4-1BBL). Вследствие этого вакцины устанавливали в том же родительском клоне Ova. Невакцинированных мышей (без вакцины) сравнивали с мышами, которые получали клетки, экспрессирующие только Ova (в качестве дополнительного контроля), ImPACT (Ova-gp96-Ig), ImPACT + агонистическое антитело против ОХ40 (ОХ40(АТ)), ComPACT (Ova-gp96-Ig/ICOSL), ComPACT (Ova-gp96-Ig/OX40L-Fc) или ComPACT (Ova-gp96-Ig/1BBL). Фиг. 7А представляет собой график, демонстрирующий секрецию Ova, которую подтверждали методом ELISA, и подтверждающий, что секреция была по существу идентичной между только контролем Ova, ImPACT и различными клетками ComPACT. Значения представляют собой среднее значение, полученное при анализе минимум 6 повторов, и ошибка представляет собой СОС. Для всех данных, представленных на фиг. 7А, порядок столбчатых диаграмм слева направо является следующим: только контроль Ova, ImPACT (3T3-ova-gp96-Ig), ComPACT (Ova-gp96-Ig/ICOSL), ComPACT (Ova-gp96-Ig/OX40L-Fc) и ComPACT (Ova-gp96-Ig/1BBL). Фиг. 7В представляет собой график, демонстрирующий секрецию gp96-Ig (определяли как IgG), которую изучали методом ELISA, и подтверждающий, что были установлены отдельные клоны ImPACT и ComPACT, которые секретировали сравнимые уровни. Значения представляют собой среднее значение, полученное при анализе минимум 6 повторов, и ошибка представляет собой СОС. Для всех данных, представленных на фиг. 7В, порядок столбчатых диаграмм слева направо является следующим: только контроль Ova, ImPACT (3T3-ova-gp96-Ig), ComPACT (Ova-gp96-Ig/ICOSL), ComPACT (Ova-gp96-Ig/OX40L-Fc) и ComPACT (Ova-gp96-Ig/1BBL). Фиг. 7С представляет собой график, демонстрирующий экспрессию мРНК ICOSL, OX40L или 4-1BBL, которую подтверждали методом кОТ-ПЦР (количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией), и подтверждающий экспрессию только в клетках ComPACT. Графические значения представляют собой среднее значение, полученное при анализе минимум 3 различных повторов, и ошибка представляет собой СОС. Для всех данных, представленных на фиг. 7С, порядок столбчатых диаграмм слева направо является следующим: только контроль Ova, ImPACT (3T3-ova-gp96-Ig), ComPACT (Ova-gp96-Ig/ICOSL), ComPACT (Ova-gp96-Ig/OX40L-Fc) и ComPACT (Ova-gp96-Ig/1BBL). На фиг. 7D представлены результаты анализа методом вестернблоттинга, демонстрирующие подтверждение экспрессии OX40L, ICOSL и 4-1BBL в клетках ComPACT. Клетки ImPACT и ComPACT обрабатывали брефелдином A (BFA) в течение 16 часов для предотвращения транспортирования и секреции белка. Затем клетки собирали, лизировали и анализировали методом ДСН-ПААГ (электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия)/вестернблоттинга. Блоты исследовали с помощью антител против OX40L (также известного как CD252), ICOSL или 4-1BBL и гистона Н3 или актина В (АСТВ) в качестве контроля нанесения. OX40L, ICOSL и 4-1BBL были обнаружены исключительно в клетках ComPACT. Фиг.7Е представляет собой график, демонстрирующий частоту CD4+FoxP3 + регуляторных Т-клеток в день 5 после указанной первичной иммунизации. Для всех данных, представленных на фиг. 7Е, порядок пиков слева направо является следующим: без вакцины, только контроль Ova, ImPACT, ImPACT плюс антитело против ОХ40 и ComPACT (на данной фигуре - Ova-gp96-Ig/OX40L-Fc). Фиг. 7F представляет собой пару графиков, демонстрирующих частоту антигенспецифичных CD8+ Т-клеток (OT-I) в периферической крови в день 42 (7 дней после бустер-иммунизации), показанную слева, и пик CD4+FoxP3+ Т-регуляторных клеток в тот же день в периферической крови. Как и на фиг. 6С, экспансия антигенспецифичных (ОТ-1) клеток после вакцинации линией клеток, экспрессирующей только Ova, ImPACT, ImPACT в комбинации с ОХ40(АТ) и ComPACT (в данном случае, Ova-gp96-Ig/OX40L-Fc), показана на 5 и 40 день после исходной вакцинации (первичный и вторичный иммунные ответы, соответственно). Последняя временная точка также соответствует 5 дням после второй, бустер-вакцинации. Уровни ОТ-1 у мышей, получавших ImPACT, ImPACT + ОХ40(АТ) и ComPACT, значительно увеличены по сравнению с мышами, получавшими только контроль Ova. У мышей, получавших ComPACT, наблюдалась наибольшая пролиферация клеток ОТ-1, которая является значительно большей, чем в случае ImPACT + ОХ40(АТ), как в точке первичного, так и в точке вторичного иммунного ответа. Указаны повторы эксперимента, и ошибка представляет собой СОС. Для всех данных, представленных на фиг. 7F, порядок пиков слева направо является следующим: без вакцины, только контроль Ova, ImPACT, ImPACT плюс антитело против ОХ40 и ComPACT (на данной фигуре - Ova-gp96-Ig/OX40L-Fc).
+
-
-
+
+
+
На фиг. 8А-8Е показано, что ComPACT увеличивал экспансию антигенспецифичных CD8+, в то время как антитело против ОХ40 приводило к неспецифичной активации Т-клеток. Фиг. 8А представляет собой серию графиков, демонстрирующих суммарные количества мононуклеарных клеток (МНК), CD4, CD8, ОТ-I и ОТ-II клеток у мышей, которые либо не получали лечения, либо были вакцинированы ImPACT, ImPACT + ОХ40(АТ) или ComPACT (на данной фигуре - Gp96-Ig/OX40L-Fc). Как и в случае фиг. 5D и 6С, репортерным мышам FOXP3-RFP инокулировали клетки ОТ-1 посредством инъекции в хвостовую вену в день -1, вакцинировали мышей в день 0 и умерщвляли в день 8 для анализа, который включал анализ клеток, полученных из растворов после промывки брюшной полости, методом проточной цитометрии. Лечение ComPACT вызывало устойчивый ОТ-1 (CD8)-специфичный ответ, тогда как лечение ОХ40(АТ) приводило к увеличению уровня всех подтипов Т-клеток, включая FOXP3+ CD4 клетки. Отложенные на графике значения представляют собой среднее значение, полученное при анализе минимум 3 мышей, и ошибка представляет собой СОС. Для всех данных, представленных на фиг. 8А, порядок пиков слева направо является следующим: без лечения, ImPACT, ImPACT плюс антитело против ОХ40 и ComPACT (на данной фигуре - Gp96-Ig/OX40L-Fc). Фиг. 8В представляет собой серию графиков, демонстрирующих количества CD127KLRG1, CD127KLRG1 и CD127KLRG1 клеток, которые соответствуют предшественникам клеток памяти, короткоживущим эффекторным клеткам и клеткам памяти, соответственно, в день 8 после первичной иммунизации. Клетки были получены из селезенки (верхние чертежи) и брюшной полости (нижние чертежи). Для всех данных, представленных на фиг. 8В, порядок пиков слева направо является следующим: без лечения, только Ova, ImPACT, ComPACT (Ova-gp96-Ig/ICOSL), ComPACT (Ova-gp96-Ig/OX40L-Fc) и ComPACT (Ova-gp96-Ig/1BBL). Фиг. 8C представляет собой серию графиков, демонстрирующих уровни ИФНγ (интерферона гамма), ФНОα (фактора некроза опухоли альфа), ИЛ (интерлейкина) 2, ИЛ6 и ИЛ5. Сыворотку цельной крови отбирали от мышей, результаты анализа которых представлены на фиг. 8А выше, в день 8, и проводили анализ цитокинов с применением набора LEGENDPLEX™ от BioLegend и проточного цитометра. В соответствии с данными фиг. 8А, введение ОХ40(АТ) вызывало неспецифичный системный иммунный ответ с увеличением уровней не только ИФНγ, ФНОα и ИЛ2, но также ИЛ6 и ИЛ5. Отложенные на графике значения представляют собой среднее значение, полученное при анализе минимум 3 мышей, и ошибка представляет собой СОС. Для всех данных, представленных на фиг. 8С, порядок пиков слева направо является следующим: без лечения, ImPACT, ImPACT плюс антитело против ОХ40 и ComPACT (на данной фигуре - Gp96-Ig/OX40L-Fc). Фиг. 8D представляет собой серию графиков, демонстрирующих уровни экспрессии генов ИФНγ, ФНОα и гранзима-В (GZMB). Анализ активаторов генов Т-клеток методом кОТ-ПЦР продемонстрировал специфичность ComPACT исключительно к активации антигенспецифичных CD8 (OT-I+) клеток по сравнению с ОХ40(АТ), которые неспецифично активировали как эндогенные (OT-I-), так и антигенспецифичные CD8 (OT-I+) клетки. Клетки, полученные из растворов после промывки брюшной полости, на фиг. 8А выше, сортировали на популяции ОТ-1- и ОТ-1+ CD8-клеток. Собирали суммарную РНК, проводили обратную транскрипцию и анализ методом кПЦР. Показаны уровни экспрессии генов ИФНγ, ФНОα и GZMB, нормированные к 18S мРНК, причем результат для первого повтора введения только ImPACT принимали за 1. Отложенные на графике значения представляют собой среднее значение, полученное при анализе минимум 3 мышей, и ошибка представляет собой СОС. Для всех данных, представленных на фиг. 8D, порядок столбчатых диаграмм слева направо является следующим: ImPACT, ImPACT плюс антитело против ОХ40 и ComPACT (на данной фигуре - Gp96-Ig/OX40L-Fc). На фиг. 8Е представлено количество регуляторных Т-клеток (Treg) FOXP3 в спленоцитах и дренирующем опухоль лимфатическом узле (ДОЛУ) у мышей. Для всех данных, представленных на фиг. 8Е, порядок пиков слева направо является следующим: без лечения, ImPACT, ImPACT плюс антитело против ОХ40 и ComPACT (на данной фигуре - Gp96-Ig/OX40L-Fc).
+
-
+
-
+
+
На фиг. 9А-9С показано, что введение ComPACT (на данной фигуре - Gp96-Ig/OX40L-Fc) приводит к активации антигенспецифичных CD8 Т-клеток, тогда как совместное введение ОХ40(АТ) вызывает неспецифичную активацию иммунных клеток, включая увеличение уровня FOXP3 Treg как в селезенке, так и в лимфатических узлах. Фиг. 9А представляет собой серию графиков, демонстрирующих суммарные количества клеток МНК, CD4, CD8, ОТ-I и ОТ-II у мышей, не получавших лечения, или вакцинированных ImPACT, ImPACT + ОХ40(АТ) или ComPACT. Как и на фиг. 5D и 6С, репортерным мышам FIR инокулировали клетки ОТ-1 посредством инъекции в хвостовую вену в день -1, вакцинировали мышей в день 0 и умерщвляли в день 8 для анализа, включая анализ клеток, полученных из селезенки, методом проточной цитометрии. У мышей, получавших ОХ40(АТ), наблюдалось увеличение уровня всех подтипов Т-клеток, включая клетки CD4/FOXP3+. У мышей, получавших ComPACT, наблюдался устойчивый ОТ-1 (CD8)-специфичный ответ, который значительно превышал ответ, вызванный ОХ40(АТ). Отложенные на графике значения представляют собой среднее значение, полученное при анализе минимум 3 мышей, и ошибка представляет собой СОС. Для всех данных, представленных на фиг. 9А, порядок пиков слева направо является следующим: без лечения, ImPACT, ImPACT плюс антитело против ОХ40 и ComPACT. Фиг. 9В представляет собой серию графиков, демонстрирующих суммарные количества клеток МНК, CD4, CD8, ОТ-I и ОТ-II у мышей, не получавших лечения, или вакцинированных ImPACT, ImPACT+ОХ40(АТ) или ComPACT, как на фиг. 9А, за исключением анализа в периферических лимфатических узлах. Для всех данных, представленных на фиг. 9В, порядок пиков слева направо является следующим: без лечения, ImPACT, ImPACT плюс антитело против ОХ40 и ComPACT. Фиг. 9С представляет собой серию графиков, демонстрирующих экспрессию мРНК активаторных генов Т-клеток (АСТВ, ИЛ2 и перфорина 1 (PRF1)). Анализ методом кОТ-ПЦР позволил выявить активацию антигенспецифичных ОТ-1 (CD8) у мышей, получавших ComPACT, по сравнению с неспецифичной активацией эндогенных и антигенспецифичных ОТ-1 CD8 клеток у мышей, получавших ОХ40(АТ). Клетки, полученные из растворов после промывки брюшной полости на фиг. 8А выше, сортировали на популяции ОТ-1 и ОТ-1 CD8 клеток. Собирали суммарную РНК, проводили обратную транскрипцию и анализ методом кПЦР. Уровни АСТВ согласовывались между популяциями клеток и вариантами лечения, выступающими в качестве контроля. Уровни ИЛ2 были значительно увеличены в ОТ-1 клетках мышей, которые получали ImPACT, ImPACT+ОХ40(АТ) и ComPACT, что свидетельствует о значительной активации Т-клеток при применении всех вакцин/комбинаций. В соответствии с фиг. 8С уровни PRF1 были неспецифично увеличены как во фракциях ОТ-1, так и в ОТ-1 CD8 мышей, которые получали ОХ40(АТ), в то время как у мышей, получавших ComPACT, наблюдалось только увеличение уровня ОТ-1 клеток. Отложенные на графике значения представляют собой среднее значение, полученное при анализе минимум 3 мышей, и ошибка представляет собой СОС. Для всех данных, представленных на фиг. 9С, порядок столбчатых диаграмм слева направо является следующим: ImPACT, ImPACT плюс антитело против ОХ40 и ComPACT.
5
6
На фиг. 10А-10С показано, что у мышей, несущих опухоль, введение ComPACT (на данной фигуре - Gp96-Ig/OX40L-Fc) приводило к образованию максимального количества лимфоцитов, внедряющихся в опухоль, и регрессии опухоли. Фиг. 10А представляет собой схему эксперимента. Мышам BALB/C подкожно инокулировали 2×10 клеток СТ26, что соответствовало дню 0. В дни 6 и 11 мышей либо не вакцинировали, либо вакцинировали ImPACT, ImPACT + ОХ86(АТ), ComPACT или ОХ86(АТ) самим по себе. Терапия вакциной включала 1×10 клеток или 100 мкг антитела. Фиг. 10В представляет собой график, демонстрирующий площадь опухоли в указанные дни после инокуляции опухоли в день 0, отложенную на графике как среднее значение, полученное минимум от 5 экспериментальных мышей на выборку, с ошибкой в виде СОС. Фиг. 10С представляет собой график, демонстрирующий площадь опухоли в день 21 исследования. Для всех данных, представленных на фиг. 10С, порядок пиков слева направо является следующим: без вакцины, только контроль СТ26, только антитело против ОХ40, ImPACT, ImPACT плюс антитело против ОХ40 и ComPACT.
5
На фиг. 11А-11Е показано, что лечение ComPACT (на данной фигуре - Gp96-Ig/OX40L-Fc) привело к CD8+-специфичной инфильтрации опухоли, замедлению роста опухоли, увеличению общей выживаемости и значительному отторжению опухоли на модели карциномы толстой и прямой кишок СТ26. На фиг. 11А в день 0 мышам инокулировали 5×10 опухолевых клеток СТ26, которые инъецировали подкожно в заднюю подвздошную область. Мышей либо не вакцинировали, либо вакцинировали в дни 4, 7 и 10 родительскими клетками СТ26, ОХ40(АТ) самим по себе, ImPACT самим по себе, ImPACT + ОХ40(АТ) или ComPACT. Когорту мышей умерщвляли в день 12 для генетического анализа опухоли. За оставшимися мышами наблюдали в течение 30 дней для определения площади опухоли и общей выживаемости. На фиг. 11В представлен анализ экспрессии генов опухоли в день 12. Из диссоциированных опухолей выделяли суммарную РНК, проводили обратную транскрипцию и анализ методом кПЦР. Значения нормировали к 18S мРНК, и результат первого повтора «без лечения» принимали за 1. Для всех данных, представленных на фиг. 11В, порядок столбчатых диаграмм слева направо является следующим: без лечения, только контроль СТ26, только антитело против ОХ40, ImPACT, ImPACT плюс антитело против ОХ40 и ComPACT.
На фиг. 11С анализировали AH1-тетрамер/антигенспецифичные CD8+ клетки у мышей, получавших лечение. Для всех данных, представленных на фиг. 11С, порядок пиков слева направо является следующим: без лечения, только контроль СТ26, только антитело против ОХ40, ImPACT, ImPACT плюс антитело против ОХ40 и ComPACT. На фиг. 11D представлена площадь опухоли, которую измеряли ежедневно в течение 21 дней после исходной инокуляции опухоли. На фиг. 11Е общую выживаемость определяли в течение периода времени 30 дней. 80% мышей, получавших ComPACT, выжили согласно критерию эксперимента, и у 47% мышей (7 из 15) наблюдалось полное отторжение развившейся опухоли. У одной мыши, получавшей только ОХ40(АТ), наблюдалось отторжение опухоли ко дню 24, и у одной мыши, получавшей ImPACT + ОХ40(АТ), наблюдалось отторжение опухоли ко дню 25.
5
5
На фиг. 12A-12D показано, что ComPACT (на данной фигуре - Gp96-Ig/OX40L-Fc) вызывает экспансию антигенспецифичных CD8+, задержку роста опухоли, увеличение общей выживаемости и отторжение опухоли на модели агрессивной меланомы B16.F10-ova. На фиг. 12А мышам адаптивно переносили 5×10 клеток ОТ-I в день -1, а затем в день 0 инокулировали 5×10 опухолевых клеток В16.F10-ova, которые инъецировали подкожно в заднюю подвздошную область. Мышей либо не вакцинировали, либо вакцинировали в дни 4, 7 и 10 родительскими клетками B16.F10-ova, ОХ40(АТ) самим по себе, ImPACT самим по себе, ImPACT + ОХ40(АТ) или ComPACT. На фиг. 12В показана экспансия антигенспецифичных CD8+ (ОТ-I) после лечения в течение периода времени 25 дней. На фиг. 12С площадь опухоли измеряли в течение всего периода времени 25 дней после исходной инокуляции опухоли. На фиг. 12D определяли общую выживаемость в течение периода времени 30 дней. Приблизительно 78% мышей, получавших ComPACT, выжили, и у 11% мышей, получавших ComPACT, наблюдалось полное отторжение развившейся опухоли. Только группа, получавшая ComPACT, включала особи с полным отторжением опухоли: 1 из 9 мышей или приблизительно 11%.
2
2
Фиг. 13 представляет собой график, демонстрирующий экспансию ОТ-1 в течение времени (аналогично фиг. 5D и 6С) у мышей FOXP3-RFP, которым инокулировали клетки ОТ-1 (CD8) в день -1. Клетки OT-1/GFP анализировали у мышей, не получавших вакцину, получавших только клетки контроля Ova, ComPACT (gp96-Ig/OX40L или gp96-Ig/TL1A) или ComPACT (gp96-Ig/OX40L+TL1A) в течение 46 дней с исходной вакцинацией в день 0 и бустер-иммунизацией в день 35, методом проточной цитометрии. Отложенные на графике значения представляют собой среднее значение, и ошибка представляет собой СОС.ComPACT (gp96-Ig/OX40L+TL1A) представляет собой комбинированную инъекцию, включающую ComPACT-OX40L и ComPACT-TL1A (т.е. две различные линии клеток в одном шприце).
Фиг. 14 представляет собой график, демонстрирующий эффекты ComPACT на пролиферацию и активацию овальбумин-специфичных CD8+ Т-клеток (OTI). Мышей C57BL/6 иммунизировали ImPACT самим по себе или ComPACT (gp96-Ig/OX40L), ComPACT (gp96-Ig/4-ICOSL) или ComPACT (gp96-Ig/4-1BBL) в день 0. В указанные дни контролировали частоту ОТ-1 в периферической крови.
5
2
2
Фиг. 15 представляет собой график, демонстрирующий эффект ComPACT на кинетику роста опухоли на модели карциномы толстой и прямой кишок СТ26. В день 0 мышам инокулировали 5×10 опухолевых клеток СТ26, которые инъецировали подкожно в заднюю подвздошную область. Мышей либо не вакцинировали, либо вакцинировали в дни 4, 7 и 10 родительскими клетками СТ26, ImPACT самим по себе, ImPACT + агонистом TNFRSF25 (4С12 ab), 4С12 (AT) самим по себе, PD-1 (AT) самим по себе, 4С12 (AT) и PD-1 (AT), ComPACT (gp96-Ig/OX40L или gp96-Ig/TL1A), ComPACT (gp96-Ig/OX40L) + PD-1 (AT) или ComPACT (gp96-Ig/OX40L+TL1A). За мышами наблюдали в течение 30 дней для измерения площади опухоли. ComPACT (gp96-Ig/OX40L+TL1A) представляет собой комбинированную инъекцию, включающую ComPACT-OX40L и ComPACT-TL1A (т.е. две различные линии клеток в одном шприце).
Фиг. 16 представляет собой график, демонстрирующий эффект ComPACT на общую выживаемость мышей на модели карциномы толстой и прямой кишок СТ26. Мыши получали опухолевые клетки СТ26, и мышей вакцинировали, как описано на фиг. 15.
Фиг. 17 представляет собой график, демонстрирующий количество OX40L человека, образуемых вакциной, специфичной к предстательной железе человека (HS-1020, линия клеток PC-3).
Фиг. 18 представляет собой график, демонстрирующий количество OX40L человека, образуемых вакциной, специфичной к легким человека (HS-120, линия клеток AD100).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Различные секретируемые белки, т.е. белки для вакцинации, описанные в настоящей заявке, можно использовать для стимуляции иммунного ответа in vivo. Например, аллогенные клеточные вакцины на основе секретируемого белка теплового шока gp96-Ig могут обеспечить высокую частоту ответов поликлональных CD8+ Т-клеток на фемтомолярные концентрации антигенов опухоли посредством примирования перекрестнореагирующим антигеном in vivo (Oizumi et al., J Immunol 2007, 179(4):2310-2317). Однако множество иммуносупрессивных механизмов, выработанных развившейся опухолью, могут ослабить активность данного подхода на основе вакцины. Для оценки потенциальной применимости комбинированной иммунотерапии для пациентов с прогрессирующим заболеванием проводили системное сравнение блокирующих антител против PD-1, PD-L1, CTLA-4 и LAG-3 на моделях долговременной меланомы B16-F10 у мышей (см. примеры в настоящей заявке), которые продемонстрировали превосходство комбинации вакцинации gp96-Ig и блокады PD-1 по сравнению с другими контрольными точками. Синергическая противоопухолевая польза может являться следствием тройной комбинации вакцинации gp96-Ig, блокады PD-1 и костимуляции Т-клеток с применением одного из следующих средств: агониста ОХ40 (например, слияния лиганд OX40-Ig (OX40L-Ig) или фрагмента указанного белка, который связывается с ОХ40), агониста индуцибельного костимулятора Т-клеток (ICOS) (например, слияния лиганд ICOS-Ig (ICOSL-Ig) или фрагмента указанного белка, который связывается с ICOS), агониста CD40 (например, слитого белка CD40L-Ig или фрагмента указанного белка), агониста CD27 (например, слитого белка CD70-Ig или фрагмента указанного белка), агониста 4-1ВВ (например, слияния лиганд 4-1BB-Ig (4-1BBL-Ig) или фрагмента указанного белка, который связывается с 4-1ВВ), агониста TNFRSF25 (например, слияния TL1A-Ig или фрагмента указанного белка, который связывается с TNFRSF25) или агониста индуцированного глюкокортикоидами рецептора фактора некроза опухоли (glucocorticoid induced tumor necrosis factor receptor, GITR) (например, слияния лиганд GITR-Ig (GITRL-Ig) или фрагмента указанного белка, который связывается с GITF). Однако воодушевление для развития такой тройной комбинации сдерживается предполагаемой стоимостью таких вариантов терапии. Чтобы решить данную проблему, векторы, экспрессирующие белок для вакцинирования (например, векторы, экспрессирующие gp96-Ig), были переконструированы для одновременной экспрессии костимулирующего белка Т-клеток (например, ICOSL-Ig, 4-1BBL-Ig или OX40L-Ig) с целью обеспечения костимулирующей пользы без необходимости в терапии дополнительным антителом. В настоящей заявке предложены переконструированные векторы, а также способы применения указанных векторов. Когда gp96-Ig и данные костимулирующие слитые белки секретировались аллогенными линиями клеток, наблюдалась усиленная активация антигенспецифичных CD8+ Т-клеток (см. примеры в настоящей заявке). Таким образом, комбинированную иммунотерапию можно обеспечить посредством переконструирования вектора во избежание потребности полностью отделить курсы лечения вакциной/антителом/слитым белком.
Белки для вакцинации
Белки для вакцинации (вакцинные белки) могут вызывать иммунные ответы, которые находят применение в настоящем изобретении. Согласно различным вариантам реализации в настоящем изобретении предложены векторы экспрессии, содержащие первую последовательность нуклеотидов, которая кодирует секретируемый белок для вакцинирования, и вторую последовательность нуклеотидов, которая кодирует слитый белок, костимулирующий Т-клетки. Также предложены композиции, содержащие векторы экспрессии согласно настоящему изобретению. Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения такие композиции применяют в способах лечения субъектов для стимуляции иммунных ответов у субъекта, включая усиление активации антигенспецифичных Т-клеток у субъекта. Композиции согласно настоящему изобретению находят применение при лечении различных заболеваний, включая рак.
Белок теплового шока (heat shock protein, hsp) gp96, находящийся в эндоплазматическом ретикулуме (ЭР), выступает в качестве шаперона для пептидов на их пути к молекулам МНС класса I и II. Gp96, полученные из опухолевой клетки и используемые в качестве вакцины, могут вызывать специфичный противоопухолевый иммунитет, предположительно, посредством транспортирования опухоль-специфичных пептидов к антиген-презентирующим клеткам (АПК) (J Immunol 1999, 163(10):5178-5182). Например, gp96-связанные пептиды перекрестно презентируются CD8-клеткам дендритными клетками (ДК).
Была разработана система вакцинации для противоопухолевой терапии посредством трансфекции опухолевых клеток слитым белком gp96-Ig G1-Fc, которая приводит к секреции gp96-Ig в комплексе с пептидами опухоли для которых он выступает в качестве шаперона (см. публикацию J Immunother 2008, 31(4):394-401 и ссылки, упоминаемые в данной публикации). Парентеральное введение опухолевых клеток, секретирующих gp96-Ig, запускает устойчивую экспансию антигенспецифичных CD8 цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) в комбинации с активацией системы врожденного иммунитета. Секретируемый опухолью gp96 вызывает рекрутирование ДК и клеток-природных киллеров (natural killer, NK) в участок секреции gp96 и опосредует активацию ДК. Затем поглощение gp96 и его пептидов для которых он выступает в качестве шаперона посредством эндоцитоза запускает перекрестную презентацию пептида с участием молекул основного МНС класса I, а также мощную когнатную активацию CD8 независимо от CD4 клеток.
Векторы, предложенные в настоящей заявке, содержат первую последовательность нуклеотидов, которая кодирует слитый белок gp96-Ig. Кодирующая область gp96 человека составляет 2412 оснований в длину (SEQ ID NO: 1) и кодирует белок длиной 803 аминокислоты (SEQ ID NO: 2), который содержит сигнальный пептид длиной 21 аминокислоту на аминоконце, потенциальную трансмембранную область, обогащенную гидрофобными остатками, и пептидную последовательность удержания в ЭР на карбоксильном конце (учетный № GENBANK X15187; см. публикацию Maki et al., Proc Natl Acad Sci USA 1990, 87:5658-5562). Последовательности ДНК и белка gp96 человека являются следующими:
Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую слияние gp96-Ig, можно получить с применением способов, описанных в патенте США №8,685,384, который полностью включен в настоящую заявку посредством ссылки. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения часть gp96 слитого белка gp96-Ig может содержать всю последовательность gp96 дикого типа или часть указанной последовательности (например, последовательности человека, представленной в SEQ ID NO: 2). Например, секретируемый слитый белок gp96-Ig может содержать первые 799 аминокислот SEQ ID NO: 2, таким образом, что в нем отсутствует С-концевая последовательность KDEL (SEQ ID NO: 3). В качестве альтернативы, часть gp96 слитого белка может содержать аминокислотную последовательность, которая содержит одну или несколько замен, делеций или добавлений по сравнению с первыми 799 аминокислотами последовательности gp96 дикого типа, таким образом, что данная последовательность характеризуется идентичностью последовательности по меньшей мере 90% (например, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%) полипептиду дикого типа.
По всему тексту настоящей заявки проценты идентичности последовательности между конкретной последовательностью нуклеиновой кислоты или аминокислотной последовательностью и последовательностью, указанной под конкретным идентификационным номером последовательности, определяют следующим образом. Сначала последовательность нуклеиновой кислоты или аминокислотную последовательность сравнивают с последовательностью, представленной в конкретном идентификационном номере последовательности, с применением программы BLAST 2 Sequences (Bl2seq) из автономной версии BLASTZ, содержащей версию BLASTN 2.0.14 и версию BLASTP 2.0.14. Данную автономную версию BLASTZ можно получить в интернете по адресу fr.com/blast или ncbi.nlm.nih.gov. Инструкции, поясняющие, как применять программу Bl2seq, можно найти в файле для чтения, прилагаемом к BLASTZ. Bl2seq позволяет проводить сравнения между двумя последовательностями с применением алгоритма BLASTN или BLASTP. BLASTN используют для сравнения последовательностей нуклеиновой кислоты, тогда как BLASTP используют для сравнения аминокислотных последовательностей. Для сравнения двух последовательностей нуклеиновой кислоты параметры задают следующим образом: -i соответствует файлу, содержащему первую последовательность нуклеиновой кислоты, которая подлежит сравнению (например, C:\seq1.txt); -j соответствует файлу, содержащему вторую последовательность нуклеиновой кислоты, которая подлежит сравнению (например, C:\seq2.txt); -р соответствует blastn; -о соответствует любому желаемому названию файла (например, C:\output.txt); -q соответствует -1; -r соответствует 2; и все другие параметры оставляют на значениях по умолчанию. Например, для получения файла выходных данных, содержащего сравнение между двумя последовательностями, можно использовать следующую команду: C:\Bl2seq -i c:\seq1.txt -j c:\seq2.txt -р blastn -о c:\output.txt -q -1 -r 2. Для сравнения двух аминокислотных последовательностей параметры Bl2seq устанавливают следующим образом: -i соответствует файлу, содержащему первую аминокислотную последовательность, которая подлежит сравнению (например, C:\seq1.txt); -j соответствует файлу, содержащему вторую аминокислотную последовательность, которая подлежит сравнению (например, C:\seq2.txt); -р соответствует blastp; -о соответствует любому желаемому названию файла (например, C:\output.txt); и все другие параметры оставляют на значениях по умолчанию. Например, для получения файла выходных данных, содержащего сравнение между двумя аминокислотными последовательностями, можно использовать следующую команду: C:\Bl2seq -i c:\seq1.txt -j c:\seq2.txt -р blastp -о c:\output.txt. Если две сравниваемые последовательности обладают гомологией, тогда указанный файл выходных данных будет содержать данные области гомологии в виде выровненных последовательностей. Если две сравниваемые последовательности не обладают гомологией, тогда указанный файл выходных данных не будет содержать выровненных последовательностей.
После выравнивания определяют количество совпадений посредством подсчета количества положений, в которых идентичный нуклеотид или остаток аминокислоты присутствует в обеих последовательностях. Процент идентичности последовательности определяют посредством деления количества совпадений на длину последовательности, представленной в идентифицированной последовательности (например, SEQ ID NO: 1), или на заданную длину (например, 100 последовательных нуклеотидов или остатков аминокислот последовательности, представленной в идентифицированной последовательности), после чего умножают полученное значение на 100. Например, последовательность нуклеиновой кислоты, которая содержит 2200 совпадений при выравнивании с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1, на 91,2 процентов идентична последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1 (т.е. 2000 2412×100=91,2). Следует отметить, что величину процента идентичности последовательности округляют до ближайшей десятой. Например, 75,11, 75,12, 75,13 и 75,14 округляют в меньшую сторону до 75,1, тогда как 75,15, 75,16, 75,17, 75,18 и 75,19 округляют в большую сторону до 75,2. Также следует отметить, что значение длины всегда будет целым числом.
Таким образом, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения часть gp96 нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый полипептид gp96-Ig, может кодировать аминокислотную последовательность, которая отличается от полипептида gp96 дикого типа в одном или нескольких положениях аминокислот так, что указанная последовательность содержит одну или несколько консервативных замен, неконсервативных замен, сплайс-вариантов, изоформ, гомологов из других видов и полиморфизмов.
В настоящей заявке «консервативная замена» означает замену остатка аминокислоты другим, подобным с биологической точки зрения, остатком. Как правило, биологическое подобие, как указано выше, отражает замены последовательности дикого типа консервативными аминокислотами. Например, консервативные замены аминокислот будут, как ожидается, оказывать незначительный эффект или не будут оказывать эффекта на биологическую активность, особенно если количество замен составляет менее 10% от общего количества остатков в полипептиде или белке. Консервативные замены могут быть осуществлены, например, на основании подобия полярности, заряда, размера, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатической природы вовлеченных остатков аминокислот. 20 существующих в природе аминокислот можно распределить на следующие шесть стандартных групп аминокислот: (1) гидрофобные: Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) нейтральные гидрофильные: Cys, Ser, Thr; Asn, Gln; (3) кислые: Asp, Glu; (4) основные: His, Lys, Arg; (5) остатки, которые влияют на ориентацию цепи: Gly, Pro; и (6) ароматические: Trp, Tyr, Phe. Соответственно, консервативные замены могут быть осуществлены посредством замены аминокислот другими аминокислотами, приведенными в той же группе из шести стандартных групп аминокислот, представленных выше. Например, замена Asp на Glu сохраняет один отрицательный заряд в модифицированном таким образом полипептиде. Помимо этого, глицин и пролин могут быть замещены друг другом на основании способности данных остатков нарушать α-спирали. Дополнительные примеры консервативных замен аминокислот включают, без ограничения, замену одного гидрофобного остатка другим, таким как изолейцин, валин, лейцин или метионин, или замену одного полярного остатка другим, такую как замена аргинина лизином, глутаминовой кислоты - аспарагиновой кислотой или глутамина - аспарагином и т.п. Термин «консервативная замена» также включает использование замещенного остатка аминокислоты вместо незамещенного родительского остатка аминокислоты при условии, что антитела, нарабатываемые против замещенного полипептида, также являются иммунореактивными в отношении незамещенного полипептида.
В настоящей заявке «неконсервативные замены» определены как замены аминокислот другими аминокислотами, которые относятся к другой группе из шести стандартных групп аминокислот с (1) по (6), представленных выше.
Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения замены могут также включать неклассические аминокислоты (например, селеноцистеин, пирролизин, N-формилметионин β-аланин, ГАМК (гамма-аминомасляную кислоту) и δ-аминолевулиновую кислоту, 4-аминобензойную кислоту (ПАБК), D-изомеры общепринятых аминокислот, 2,4-диаминомасляную кислоту, α-аминоизомасляную кислоту, 4-аминомасляную кислоту, Abu, 2-аминомасляную кислоту, γ-Abu, ε-Ahx, 6-аминогексановую кислоту, Aib, 2-аминоизомасляную кислоту, 3-аминопропионовую кислоту, орнитин, норлейцин, норвалин, гидроксипролин, саркозин, цитруллин, гомоцитруллин, цистеиновую кислоту, т-бутилглицин, т-бутилаланин, фенилглицин, циклогексилаланин, β-аланин, фтор-аминокислоты, сконструированные аминокислоты, такие как β-метиламинокислоты, Сα-метиламинокислоты, Nα-метиламинокислоты и аналоги аминокислот в целом).
Мутации также могут быть введены в последовательности нуклеотидов слитых белков согласно настоящему изобретению посредством ссылки на генетический код, в том числе, принимая во внимание вырожденность кодонов.
Часть Ig («Ig-метка») слитого белка gp96-Ig может содержать, например, невариабельную часть молекулы иммуноглобулина (например, молекулы IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA или IgE). Как правило, такие части содержат по меньшей мере функциональные домены СН2 и СН3 константной области тяжелой цепи иммуноглобулина. Слияния можно также осуществить с применением карбокси-конца Fc-части константного домена или области, которая является непосредственно аминоконцевой относительно СН1 тяжелой или легкой цепи. Ig-метка может быть получена из иммуноглобулина млекопитающего (например, человека, мыши, обезьяны или крысы), но иммуноглобулин человека может быть в особенности пригодным, когда слияние gp96-Ig предназначено для применения у людей in vivo.
ДНК, кодирующие константные области легкой или тяжелой цепей иммуноглобулина, известны или легко доступны из библиотек кДНК. См., например, публикации Adams et al., Biochemistry 1980, 19:2711-2719; Gough et al., Biochemistry 1980 19:2702-2710; Dolby et al., Proc Natl Acad Sci USA 1980, 77:6027-6031; Rice et al., Proc Natl Acad Sci USA 1982, 79:7862-7865; Falkner et al., Nature 1982, 298:286-288; и Morrison et al., Ann Rev Immunol 1984, 2:239-256. Поскольку множество иммунологических реактивов и систем мечения доступны для обнаружения иммуноглобулинов, слитые белки gp96-Ig можно легко обнаружить и количественно определить посредством множества иммунологических методик, известных в данной области техники, таких как твердофазный иммуноферментный анализ (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), иммунопреципитация и сортировка флуоресцентно-активированных клеток (fluorescence activated cell sorting, FACS). Аналогично, если метка пептида представляет собой эпитоп, антитела против которого являются легко доступными, такие реактивы можно использовать с методиками, упомянутыми выше, для обнаружения, количественного определения и выделения слияний gp96-Ig.
Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения слитый белок gp96-Ig и/или слияния костимулирующих молекул содержат линкер. Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения линкеры могут быть получены из существующих в природе мультидоменных белков или представляют собой эмпирические линкеры, описанные, например, в публикациях Chichili et al., (2013), Protein Sci. 22(2):153-167, Chen et al., (2013), Adv Drug Deliv Rev. 65(10):1357-1369, полное содержание которых включено в настоящую заявку посредством ссылки. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения линкер можно разработать с применением баз данных по конструированию линкеров и компьютерных программ, таких как таковые, описанные в публикациях Chen et al., (2013), Adv Drug Deliv Rev. 65(10):1357-1369 и Crasto et. al., (2000), Protein Eng. 13(5):309-312, полное содержание которых включено в настоящую заявку посредством ссылки.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения линкер представляет собой синтетический линкер, такой как PEG (полиэтиленгликоль).
Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения линкер представляет собой полипептид. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения линкер составляет в длину менее приблизительно 100 аминокислот. Например, линкер может составлять в длину менее приблизительно 100, приблизительно 95, приблизительно 90, приблизительно 85, приблизительно 80, приблизительно 75, приблизительно 70, приблизительно 65, приблизительно 60, приблизительно 55, приблизительно 50, приблизительно 45, приблизительно 40, приблизительно 35, приблизительно 30, приблизительно 25, приблизительно 20, приблизительно 19, приблизительно 18, приблизительно 17, приблизительно 16, приблизительно 15, приблизительно 14, приблизительно 13, приблизительно 12, приблизительно 11, приблизительно 10, приблизительно 9, приблизительно 8, приблизительно 7, приблизительно 6, приблизительно 5, приблизительно 4, приблизительно 3 или приблизительно 2 аминокислот. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения линкер является гибким. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения линкер является жестким. Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения линкер по существу состоит из остатков глицина и серина (например, приблизительно 30% или приблизительно 40%, или приблизительно 50%, или приблизительно 60%, или приблизительно 70%, или приблизительно 80%), или приблизительно 90%, или приблизительно 95% или приблизительно 97% глицинов и серинов).
Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения линкер представляет собой шарнирную область антитела (например, IgG, IgA, IgD и IgE, включая подклассы (например, IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, а также IgA1 и IgA2)). Шарнирная область, обнаруженная в антителах классов IgG, IgA, IgD и IgE, выступает в качестве подвижного спейсера, позволяющего части Fab свободно двигаться в пространстве. В отличие от константных областей шарнирные домены являются разнообразными со структурной точки зрения, и как последовательность, так и длина данных доменов варьирует среди классов и подклассов иммуноглобулинов. Например, длина и подвижность шарнирной области варьирует среди подклассов IgG. Шарнирная область IgG1 содержит аминокислоты 216-231, и, поскольку является легко подвижной, Fab-фрагменты могут вращаться относительно своей оси симметрии и перемещаться в пределах сферы, центр которой расположен в первом из двух дисульфидных мостиков, образованных между тяжелыми цепями. IgG2 содержит более короткий шарнир, чем IgG1, с 12 остатками аминокислот и четырьмя дисульфидными мостиками. В шарнирной области IgG2 отсутствует остаток глицина, данная область является относительно короткой и содержит жесткую полипролиновую двойную спираль, стабилизированную дополнительными дисульфидными мостиками, образованными между тяжелыми цепями. Данные свойства ограничивают подвижность молекулы IgG2. IgG3 отличается от других подклассов своей уникальной расширенной шарнирной областью (приблизительно в четыре раза более длинной, чем шарнир IgG1), содержащей 62 аминокислоты (включая 21 пролин и 11 цистеинов) и образующей негибкую полипролиновую двойную спираль. В IgG3 Fab-фрагменты расположены относительно далеко от Fc-фрагмента, что придает молекуле большую подвижность. Удлиненный шарнир также отвечает за большую молекулярную массу IgG3 по сравнению с другими подклассами. Шарнирная область IgG4 является более короткой, чем таковая IgG1, и ее подвижность является промежуточной между таковой IgG1 и IgG2. Подвижность шарнирных областей, по имеющимся сведениям, уменьшается в следующем порядке: IgG3>IgG1>IgG4>IgG2.
n
8
6
n
n
4
4
n
Дополнительные иллюстративные линкеры включают, но не ограничены указанными, линкеры, содержащие последовательность LE, GGGGS (SEQ ID NO: 26), (GGGGS) (n=1-4) (SEQ ID NO: 27), (Gly) (SEQ ID NO: 28), (Gly) (SEQ ID NO: 29), (EAAAK) (n=1-3) (SEQ ID NO: 30), A(EAAAK)A (n=2-5) (SEQ ID NO: 31), AEAAAKEAAAKA (SEQ ID NO: 32), A(EAAAK)ALEA(EAAAK)A (SEQ ID NO: 33), PAPAP (SEQ ID NO: 34), KESGSVSSEQLAQFRSLD (SEQ ID NO: 35), EGKSSGSGSESKST (SEQ ID NO: 36), GSAGSAAGSGEF (SEQ ID NO: 37) и (XP), причем X обозначает любую аминокислоту, например, Ala, Lys или Glu.
Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения линкер может являться функциональным. Например, без ограничения, линкер может функционировать для улучшения фолдинга и/или стабильности, улучшения экспрессии, улучшения фармакокинетики и/или улучшения биологической активности композиций согласно настоящему изобретению. В другом примере линкер может функционировать для нацеливания композиций на конкретный тип или локализацию клеток.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения пептид gp96 может являться слитым с шарниром, доменами СН2 и СН3 IgG1 мыши (Bowen et al., J Immunol 1996, 156:442-449). Данная область молекулы IgG1 содержит три остатка цистеина, которые в норме вовлечены в образование дисульфидных связей с другими цистеинами в молекуле Ig. Поскольку ни один из цистеинов не является необходимым для функционирования пептида в качестве метки, один или несколько из данных остатков цистеина можно заменить остатком другой аминокислоты, такой как, например, серин.
Различные лидерные последовательности, известные в данной области техники, также можно использовать для эффективной секреции слитых белков gp96-Ig из клеток бактерий и млекопитающих (см. публикацию von Heijne, J Mol Biol 1985, 184:99-105). Лидерные пептиды можно выбрать, исходя из предназначенной клетки-хозяина, и такие лидерные пептиды могут включать последовательности бактерий, дрожжей, вирусов, животных и млекопитающих. Например, лидерный пептид гликопротеина D вируса герпеса является подходящим для применения во множестве клеток млекопитающих. Другой лидерный пептид для применения в клетках млекопитающих может быть получен из области V-J2-C цепи каппа иммуноглобулина мыши (Bernard et al., Proc Natl Acad Sci USA 1981, 78:5812-5816). Последовательности ДНК, кодирующие пептидные метки или лидерные пептиды, известны или легко доступны из библиотек или от коммерческих поставщиков и являются подходящими в слитых белках, описанных в настоящей заявке.
Более того, согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения gp96 согласно настоящему изобретению можно заменить одним или несколькими белками для вакцинации. Например, среди белков для вакцинации присутствуют различные белки теплового шока. Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения белок теплового шока представляет собой один или несколько из малых hsp, членов семейства hsp40, hsp60, hsp70, hsp90 и hspl 10, включая фрагменты, варианты, мутанты, производные или комбинации указанных белков (Hickey, et al., 1989, Mol. Cell. Biol. 9:2615-2626; Jindal, 1989, Mol. Cell. Biol. 9:2279-2283).
Костимуляция Т-клеток
В дополнение к слитому белку gp96-Ig векторы экспрессии, предложенные в настоящей заявке, могут кодировать один или несколько модификаторов биологического ответа. Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения векторы экспрессии согласно настоящему изобретению могут кодировать одну или несколько костимулирующих молекул Т-клеток.
+
Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения векторы экспрессии согласно настоящему изобретению обеспечивают устойчивую экспансию антигенспецифичных CD8 цитотоксичных Т-лимфоцитов (ЦТЛ). Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения векторы экспрессии согласно настоящему изобретению селективно стимулируют CD8 цитотоксичные Т-лимфоциты (ЦТЛ) и по существу не стимулируют типы Т-клеток, которые могут являться предопухолевыми и которые включают, но не ограничены указанными, Treg, CD4+ и/или CD8+ Т-клетки, экспрессирующие один или несколько ингибиторных рецепторов контрольных точек, клетки Th2 и клетки Th17. Ингибиторные рецепторы контрольных точек означают рецепторы (например, CTLA-4, В7-Н3, В7-Н4, TIM-3), экспрессируемые на иммунных клетках, которые предотвращают или ингибируют неконтролируемые иммунные ответы. Например, векторы экспрессии согласно настоящему изобретению по существу не стимулируют FOXP3 регуляторные Т-клетки. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения данная селективная стимуляция CD8 Т-клеток отличается от неспецифичной стимуляции Т-клеток, наблюдаемой при комбинированной терапии слиянием gp-96 и антителом против костимулирующих молекул Т-клеток.
Например, вектор может кодировать агонист ОХ40 (например, слияние лиганд OX40-Ig (OX40L-Ig) или фрагмент указанного белка, который связывается с ОХ40), агонист индуцибельного костимулятора Т-клеток (ICOS) (например, слияние лиганд ICOS-Ig (ICOSL-Ig) или фрагмент указанного белка, который связывается с ICOS), агонист CD40 (например, слитый белок CD40L-Ig или фрагмент указанного белка), агонист CD27 (например, слитый белок CD70-Ig или фрагмент указанного белка) или агонист 4-1ВВ (например, слияние лиганд 4-1BB-Ig (4-1BBL-Ig) или фрагмент указанного белка, который связывается с 4-1ВВ). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вектор может кодировать агонист TNFRSF25 (например, слияние TL1A-Ig или фрагмент указанного белка, который связывается с TNFRSF25) или агонист индуцированного глюкокортикоидами рецептора фактора некроза опухоли (GITR) (например, слияние лиганд GITR-Ig (GITRL-Ig) или фрагмент указанного белка, который связывается с GITR), или агонист CD40 (например, слияние CD40 лиганд-Ig (CD40L-Ig) или фрагмент указанного белка, который связывается с CD40); или агонист CD27 (например, слияние лиганд CD27-Ig (например, CD70L-Ig) или фрагмент указанного белка, который связывается с CD40).
ICOS представляет собой индуцибельную костимулирующую рецепторную молекулу Т-клеток, которая демонстрирует некоторую гомологию с CD28 и CTLA-4 и взаимодействует с В7-Н2, экспрессируемым на поверхности антиген-презентирующих клеток. ICOS вовлечена в регуляцию клеточно-опосредованных и гуморальных иммунных ответов.
4-1ВВ представляет собой трансмембранный гликопротеин типа 2, принадлежащий к суперсемейству ФНО, который экспрессируется на активированных Т-лимфоцитах.
ОХ40 (также называемая CD134 или TNFRSF4) представляет собой костимулирующую молекулу Т-клеток, которая связывается с OX40L и часто индуцируется антиген-презентирующими клетками и другими типами клеток. Известно, что ОХ40 усиливает экспрессию цитокинов и выживаемость эффекторных Т-клеток.
GITR (TNFRSF18) представляет собой костимулирующую молекулу Т-клеток, которая связывается с GITRL и преимущественно экспрессируется на FoxP3+ регуляторных Т-клетках. GITR играет значительную роль в поддержании и функционировании Treg в пределах микроокружения опухоли.
TNFRSF25 представляет собой костимулирующую молекулу Т-клеток, которая экспрессируется преимущественно в CD4+ и CD8+ Т-клетках после стимуляции антигеном. Передача сигналов посредством TNFRSF25 обеспечивается TL1A и функционирует для усиления чувствительности Т-клеток к опосредованной рецептором ИЛ-2 пролиферации когнатным антигензависимым образом.
H
CD40 представляет собой костимулирующий белок, обнаруженный на различных антиген-презентирующих клетках, который играет роль в активации данных клеток. Связывание CD40L (CD154) на клетках T с CD40 активирует антиген-презентирующие клетки и индуцирует множество нижестоящих эффектов.
CD27 представляет собой костимулирующую молекулу Т-клеток, принадлежащую к суперсемейству ФНО, которая играет роль в образовании и долгосрочном поддержании Т-клеточного иммунитета. Данная молекула связывается с лигандом CD70 в различных иммунологических процессах.
Дополнительные костимулирующие молекулы, которые можно применять в настоящем изобретении, включают, но не ограничены указанными, HVEM, CD28, CD30, CD30L, CD40, CD70, LIGHT (CD258), В7-1 и В7-2.
В отношении слияний gp96-Ig часть Ig («метка») слитого белка, костимулирующего Т-клетки, может содержать невариабельную часть молекулы иммуноглобулина (например, молекулы IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA или IgE). Такие части, описанные выше, как правило, содержат по меньшей мере функциональные домены СН2 и СН3 константной области тяжелой цепи иммуноглобулина. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения пептид, костимулирующий Т-клетки, может быть слитым с шарниром, доменами СН2 и СН3 IgG1 мыши (Bowen et al., J Immunol 1996, 156:442-449). Метка Ig может быть получена из иммуноглобулина млекопитающего (например, человека, мыши, обезьяны или крысы), но иммуноглобулин человека может быть в особенности пригодным, когда слияние gp96-Ig предназначено для применения у людей in vivo. И в данном случае ДНК, кодирующие константные области легкой или тяжелой цепи иммуноглобулина, известны или легко доступны из библиотек кДНК. Различные лидерные последовательности, описанные выше, также можно использовать для секреции слитых белков, костимулирующих Т-клетки, из клеток бактерий и млекопитающих.
Предложены типичная оптимизированная последовательность нуклеотидов (SEQ ID NO: 4), кодирующая внеклеточный домен ICOSL человека, слитый с Ig, и аминокислотная последовательность кодируемого слияния (SEQ ID NO: 5):
Предложены типичная оптимизированная последовательность нуклеотидов (SEQ ID NO: 6), кодирующая внеклеточный домен 4-1BBL человека, слитый с Ig, и кодируемая аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 7):
Предложены типичная оптимизированная последовательность нуклеотидов (SEQ ID NO: 8), кодирующая внеклеточный домен TL1A человека, слитый с Ig, и кодируемая аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 9):
Предложены типичная оптимизированная последовательность нуклеотидов (SEQ ID NO: 10), кодирующая OX40L-Ig человека, и кодируемая аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 11):
Типичные последовательность нуклеотидов и аминокислотная последовательность TL1A человека представлены в SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 13, соответственно:
Типичные последовательность нуклеотидов и аминокислотная последовательность HVEM человека представлены в SEQ ID NO: 38 (учетный № CR 456909) и SEQ ID NO: 39, соответственно (учетный № CR 456909):
Типичные последовательность нуклеотидов и аминокислотная последовательность CD28 человека представлены в SEQ ID NO: 40 (учетный № NM_006139) и SEQ ID NO: 41, соответственно:
Типичные последовательность нуклеотидов и аминокислотная последовательность CD30L человека представлены в SEQ ID NO: 42 (учетный № L 09753) и SEQ ID NO: 43, соответственно:
Типичные последовательность нуклеотидов и аминокислотная последовательность CD40 человека представлены в SEQ ID NO: 44 (учетный № NM_001250) и SEQ ID NO: 45, соответственно:
Типичные последовательность нуклеотидов и аминокислотная последовательность CD70 человека представлены в SEQ ID NO: 46 (учетный № NM_001252) и SEQ ID NO: 47, соответственно:
Типичные последовательность нуклеотидов и аминокислотная последовательность LIGHT человека представлены в SEQ ID NO: 48 (учетный № CR 541854) и SEQ ID NO: 49, соответственно:
Согласно различным вариантам реализации в настоящем изобретении предложены варианты, содержащие любую из последовательностей, описанных в настоящей заявке, например, последовательность, которая характеризуется идентичностью последовательности по меньшей мере приблизительно 60% или по меньшей мере приблизительно 61%, или по меньшей мере приблизительно 62%, или по меньшей мере приблизительно 63%, или по меньшей мере приблизительно 64%, или по меньшей мере приблизительно 65%, или по меньшей мере приблизительно 66%, или по меньшей мере приблизительно 67%, или по меньшей мере приблизительно 68%, или по меньшей мере приблизительно 69%, или по меньшей мере приблизительно 70%, или по меньшей мере приблизительно 71%, или по меньшей мере приблизительно 72%, или по меньшей мере приблизительно 73%, или по меньшей мере приблизительно 74%, или по меньшей мере приблизительно 75%, или по меньшей мере приблизительно 76%, или по меньшей мере приблизительно 77%, или по меньшей мере приблизительно 78%, или по меньшей мере приблизительно 79%, или по меньшей мере приблизительно 80%, или по меньшей мере приблизительно 81%, или по меньшей мере приблизительно 82%, или по меньшей мере приблизительно 83%, или по меньшей мере приблизительно 84%, или по меньшей мере приблизительно 85%, или по меньшей мере приблизительно 86%, или по меньшей мере приблизительно 87%, или по меньшей мере приблизительно 88%, или по меньшей мере приблизительно 89%, или по меньшей мере приблизительно 90%, или по меньшей мере приблизительно 91%, или по меньшей мере приблизительно 92%, или по меньшей мере приблизительно 93%, или по меньшей мере приблизительно 94%, или по меньшей мере приблизительно 95%, или по меньшей мере приблизительно 96%, или по меньшей мере приблизительно 97%, или по меньшей мере приблизительно 98% или по меньшей мере приблизительно 99% любой из последовательностей, раскрытых в настоящей заявке (например, SEQ ID NO: 1-13 и 38-49).
Согласно различным вариантам реализации в настоящем изобретении предложена аминокислотная последовательность, содержащая одну или несколько мутаций аминокислот относительно любой из последовательностей белка, описанных в настоящей заявке. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения одна или несколько мутаций аминокислот могут быть независимо выбраны из консервативных или неконсервативных замен, вставок, делеций и усечений, описанных в настоящей заявке.
Блокада контрольных точек/блокада иммуносупрессии опухоли
Некоторые опухоли человека могут быть устранены иммунной системой пациента. Например, введение моноклонального антитела, нацеленного на молекулы иммунных «контрольных точек», может привести к полному ответу и ремиссии опухоли. Механизм действия таких антител, как считают, заключается в ингибировании иммунных регуляторных молекул, которые опухоли поглощают в качестве защиты от противоопухолевого иммунного ответа. Посредством ингибирования данных молекул «контрольных точек» (например, с помощью антагонистических антител) CD8+ Т-клеткам пациента можно позволить пролиферировать и разрушать опухолевые клетки.
Например, введение моноклонального антитела, нацеленного, в качестве примера и без ограничения, на CTLA-4 или PD-1, может привести к полному ответу и ремиссии опухоли. Механизм действия таких антител, как считают, заключается в ингибировании CTLA-4 или PD-1, которые опухоли поглощают в качестве защиты от противоопухолевого иммунного ответа. Посредством ингибирования данных молекул «контрольных точек» (например, с помощью антагонистических антител) CD8+ Т-клеткам пациента можно позволить пролиферировать и разрушать опухолевые клетки.
Таким образом, векторы, предложенные в настоящей заявке, можно использовать в комбинации с одним или несколькими блокирующими антителами, нацеленными на молекулы иммунных «контрольных точек». Например, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения векторы, предложенные в настоящей заявке, можно использовать в комбинации с одним или несколькими блокирующими антителами, нацеленными на молекулы, такие как CTLA-4 или PD-1. Например, векторы, предложенные в настоящей заявке, можно использовать в комбинации со средством, которое блокирует, уменьшает и/или ингибирует PD-1 и PD-L1 или PD-L2 и/или связывание PD-1 с PD-L1 или PD-L2 (в качестве неограничивающего примера, одно или несколько средств, которые выбраны из ниволумаба (ONO-4538/BMS-936558, MDX1106, OPDIVO, BRISTOL MYERS SQUIBB), пембролизумаба (KEYTRUDA, Merck), пидилизумаба (CT-011, CURE TECH), MK-3475 (MERCK), BMS 936559 (BRISTOL MYERS SQUIBB), MPDL3280A (ROCHE)). Согласно варианту реализации настоящего изобретения векторы, предложенные в настоящей заявке, можно использовать в комбинации со средством, которое блокирует, уменьшает и/или ингибирует активность CTLA-4 и/или связывание CTLA-4 с одним или несколькими рецепторами (например, CD80, CD86, АР2М1, SHP-2 и PPP2R5A). Например, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения иммуномодулирующее средство представляет собой антитело, такое как, в качестве неограничивающего примера, ипилимумаб (MDX-010, MDX-101, Yervoy, BMS) и/или тремелимумаб (Pfizer). Блокирующие антитела против данных молекул могут быть получены, например, в компаниях Bristol Myers Squibb (Нью-Йорк, штат Нью-Йорк), Merck (Кенилворт, штат Нью-Джерси), MedImmune (Гейтерсберг, штат Мериленд) и Pfizer (Нью-Йорк, штат Нью-Йорк).
Векторы, предложенные в настоящей заявке, также можно использовать в комбинации с одним или несколькими блокирующими антителами, нацеленными на молекулы иммунных «контрольных точек», такие как, например, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, 2 В4, CD160 (также называемая BY55), CGEN-15049, киназы CHK 1 и CHK2, A2aR, СЕАСАМ (например, СЕАСАМ-1, СЕАСАМ-3 и/или СЕАСАМ-5), GITR, GITRL, галектин-9, CD244, CD160, TIGIT, SIRPα, ICOS, CD172a и TMIGD2, а также различные лиганды семейства В-7 (включая, но не ограничиваясь указанными, В7-1, В7-2, B7-DC, В7-Н1, В7-Н2, В7-Н3, В7-Н4, В7-Н5, В7-Н6 и В7-Н7).
Векторы и клетки-хозяева
В настоящем документе предложены конструкции нуклеиновой кислоты, которые кодируют слитый белок на основе белка для вакцинирования (например, слитый белок gp96-Ig) и слитый белок, костимулирующий Т-клетки, которые могут экспрессироваться в прокариотических и эукариотических клетках. Например, в настоящем документе предложены векторы экспрессии (например, векторы на основе ДНК или РНК), содержащие последовательности нуклеотидов, которые кодируют слияние белка для вакцинирования (например, слияние gp96-Ig) и слитый белок, костимулирующий Т-клетки (например, OX40L-Ig или часть указанного белка, которая специфично связывается с ОХ40, ICOSL-Ig или часть указанного белка, которая специфично связывается с ICOS, 4-1BBL-Ig или часть указанного белка, которая специфично связывается с 4-1BBR, CD40L-Ig или часть указанного белка, которая специфично связывается с CD40, CD70-Ig или часть указанного белка, которая специфично связывается с CD27, TL1A-Ig или часть указанного белка, которая специфично связывается с TNFRSF25, или GITRL-Ig или часть указанного белка, которая специфично связывается с GITR). Помимо этого, в настоящем документе предложены способы получения векторов, описанных в настоящей заявке, а также способы введения векторов в соответствующие клетки-хозяева для экспрессии кодируемых полипептидов. Как правило, способы, предложенные в настоящей заявке, включают конструирование последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих слитый белок на основе белка для вакцинирования (например, слитый белок gp96-Ig) и слитый белок, костимулирующий Т-клетки, и клонирование последовательностей, кодирующих слитые белки, в векторе экспрессии. Вектор экспрессии может быть введен в клетки-хозяева или включен в вирусные частицы, любые из которых можно вводить субъекту, например, для лечения рака или инфекции. Например, вакцины на основе gp96-Ig могут быть получены для стимуляции антигенспецифичных иммунных ответов против отдельных антигенов, экспрессируемых вирусом иммунодефицита обезьян, вирусом иммунодефицита человека, вирусом гепатита С и малярией. Иммунные ответы на данные вакцины можно усилить посредством коэкспрессии слитого белка, костимулирующего Т-клетки, в векторе gp96-Ig.
Последовательности ДНК или кДНК, кодирующие слияние белка для вакцинирования (например, слияние gp96-Ig) и слитый белок, костимулирующий Т-клетки, можно получить (и, при необходимости, модифицировать) с применением общепринятых способов клонирования ДНК и мутагенеза, способов амплификации ДНК и/или методов синтеза. Как правило, последовательность, кодирующую слитый белок на основе белка для вакцинирования (например, слитый белок gp96-Ig) и/или слитый белок, костимулирующий Т-клетки, можно встроить в клонирующий вектор для целей генетической модификации и репликации до экспрессии. Каждая кодирующая последовательность может быть функционально связанной с регуляторным элементом, таким как промотор, с целью экспрессии кодируемого белка в подходящих клетках-хозяевах in vitro и in vivo.
Векторы экспрессии могут быть введены в клетки-хозяева для получения секретируемых белков для вакцинации (например, gp96-Ig) и слитых белков, костимулирующих Т-клетки. Существует множество доступных методик введения нуклеиновых кислот в живые клетки. Методики, подходящие для переноса нуклеиновой кислоты в клетки млекопитающих in vitro, включают применение липосом, электропорацию, микроинъекцию, слияние клеток, системы на основе полимеров, DEAE-декстрана, вирусную трансдукцию, метод преципитации на основе фосфата кальция и т.д. Для переноса генов in vivo также можно использовать множество методик и реактивов, включая липосомы; природные носители на основе полимеров, таких как хитозан и желатин; вирусные векторы также являются подходящими для трансдукции in vivo. В некоторых случаях желательно обеспечить нацеливающее средство, такое как антитело или лиганд, специфичный к мембранному белку поверхности клетки. Когда применяют липосомы, для нацеливания и/или облегчения поглощения можно использовать белки, которые связываются с мембранным белком поверхности клетки, участвующем в эндоцитозе, например, белки капсида или фрагменты указанных белков, тропные к конкретному типу клеток, антитела против белков, которые проходят интернализацию при прохождении клеточного цикла, белки, нацеленные во внутриклеточную локализацию и увеличивающие период полужизни в клетке. Методика рецептор-опосредованного эндоцитоза описана, например, в публикациях Wu et al., J. Biol. Chem. 262, 4429-4432 (1987); и Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990).
Когда применимо, можно также использовать средства для доставки генов, такие как, например, последовательности интеграции. В данной области техники известно множество последовательностей интеграции (см., например, публикации Nunes-Duby et al., Nucleic Acids Res. 26:391-406, 1998; Sadwoski, J. Bacteriol., 165:341-357, 1986; Bestor, Cell, 122(3):322-325, 2005; Plasterk et al., TIG 15:326-332, 1999; Kootstra et al., Ann. Rev. Pharm. Toxicol., 43:413-439, 2003). Данные последовательности включают рекомбиназы и транспозазы. Примеры включают Cre (Sternberg and Hamilton, J. Mol. Biol., 150:467-486, 1981), лямбда (Nash, Nature, 247, 543-545, 1974), FIp (Broach, et al., Cell, 29:227-234, 1982), R (Matsuzaki, et al., J. Bacteriology, 172:610-618, 1990), срС31 (см., например, публикацию Groth et al., J. Mol. Biol. 335:667-678, 2004), «спящая красавица», транспозазы семейства mariner (Plasterk et al., ссылка выше) и компоненты для интеграции вирусов, таких как ААВ (аденоассоциированный вирус), ретровирусы и антивирусы, содержащие компоненты, которые обеспечивают интеграцию вируса, такие как последовательности LTR (long terminal repeat, длинного концевого повтора) ретровирусов или лентивируса и последовательности ITR (inverted terminal repeat, инвертированного концевого повтора) ААВ (Kootstra et al., Ann. Rev. Pharm. Toxicol., 43:413-439, 2003).
Клетки можно культивировать in vitro либо клетки могут быть, например, сконструированными генетическим способом. Клетки-хозяева могут быть получены от нормальных или пораженных субъектов, включая здоровых людей, пациентов, страдающих от рака, и пациентов с инфекционным заболеванием, из архивов частных лабораторий, общественных коллекций культур, таких как Американская коллекция типовых культур, или у коммерческих поставщиков.
Клетки, которые можно использовать для получения и секреции слитых белков gp96-Ig и слитых белков, костимулирующих Т-клетки, in vivo, включают, без ограничения, эпителиальные клетки, эндотелиальные клетки, кератиноциты, фибробласты, мышечные клетки, гепатоциты; клетки крови, такие как Т-лимфоциты, В-лимфоциты, моноциты, макрофаги, нейтрофилы, эозинофилы, мегакариоциты или гранулоциты, различные стволовые клетки или клетки-предшественники, такие как гематопоэтические стволовые клетки или клетки-предшественники (например, полученные из костного мозга), клетки пуповинной крови, периферической крови, эмбриональной печени и т.д., а также опухолевые клетки (например, опухолевые клетки человека). Выбор типа клеток зависит от типа опухоли или инфекционного заболевания, которые необходимо лечить или предотвратить, и может быть определен специалистом в данной области техники.
Различные клетки-хозяева обладают характерными и специфичными механизмами посттрансляционного процессинга и модификации белков. Можно выбрать клетку-хозяина, которая модифицирует и процессирует экспрессируемые продукты генов специфичным образом, аналогично способу, которым реципиент процессирует свои белки теплового шока (hsp). С целью получения больших количеств gp96-Ig может быть предпочтительно, чтобы тип клетки-хозяина, который используют для экспрессии гетерологичных генов, являлся достаточно хорошо охарактеризованным и разработанным для процесса крупномасштабного производства. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения клетки-хозяева являются аутологичными по отношению к пациенту, которому впоследствии вводят слияние согласно настоящему изобретению или рекомбинантные клетки, секретирующие слитые белки согласно настоящему изобретению.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения экспрессирующая конструкция, предложенная в настоящей заявке, может быть введена в антигенную клетку. В настоящей заявке антигенные клетки могут включать предраковые клетки, инфицированные возбудителем инфекции, вызывающим рак, таким как вирус, но которые еще не являются неопластическими, или антигенные клетки, которые подверглись воздействию мутагена или агента, вызывающего рак, такого как агент, повреждающий ДНК, или, например, ионизирующее излучение. Другие клетки, которые можно использовать, представляют собой предраковые клетки, которые находятся в процессе перерождения от нормальной к неопластической форме, что характеризируется морфологией либо физиологической или биохимической функцией.
Как правило, раковые клетки и предраковые клетки, используемые в способах, предложенных в настоящей заявке, происходят от млекопитающих. Предусматриваемые млекопитающие включают людей, домашних животных (например, собак и кошек), домашний скот (например, овец, крупный рогатый скот, коз, свиней и лошадей), лабораторных животных (например, мышей, крыс и кроликов) и животных в зоопарке или диких животных, живущих на свободе.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения раковые клетки (например, опухолевые клетки человека) можно использовать в способах, описанных в настоящей заявке. Раковые клетки обеспечивают антигенные пептиды, которые становятся нековалентно связанными с экспрессируемыми слитыми белками gp96-Ig. Также можно использовать линии клеток, происходящие от предраковых поражений, раковую ткань или раковые клетки при условии, что клетки линии клеток содержат по меньшей мере одну или несколько антигенных детерминант наряду с антигенами на целевых раковых клетках. Можно использовать раковые ткани, раковые клетки, клетки, инфицированные агентом, вызывающим рак, другие предраковые клетки и линии клеток, происходящие от человека. Раковые клетки, оперативно удаленные у пациента, которому в конечном итоге будут введены слитые белки, могут быть в особенности пригодными, несмотря на то, что также можно использовать аллогенные клетки. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения раковая клетка может происходить из стабильной линии опухолевых клеток, такой как, без ограничения, стабильная линия клеток немелкоклеточной карциномы легкого (НМКРЛ), рака мочевого пузыря, меланомы, рака яичников, почечноклеточного рака, карциномы предстательной железы, саркомы, карциномы молочной железы, плоскоклеточной карциномы, карциномы головы и шеи, гепатоклеточной карциномы, карциномы поджелудочной железы или карциномы толстой кишки.
Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения слитые белки согласно настоящему изобретению обеспечивают как костимуляцию Т-клеток, так и презентацию различных антигенов опухолевых клеток. Например, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения гибриды белка для вакцинирования согласно настоящему изобретению (например, слияния gp96) выступает в качестве шаперона для данных различных антигенов опухоли. Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения опухолевые клетки секретируют множество антигенов. Иллюстративные, но не ограничивающие антигены, которые могут секретироваться, представляют собой: MART-1/Melan-A, gp100, дипептидилпептидазу IV (DPPIV), белок, связывающий аденозиндеаминазу (adenosine deaminase-binding protein, ADAbp), циклофилин b, антиген, ассоциированный с раком толстой и прямой кишок (CRC)-0017-1A/GA733, раково-эмбриональный антиген (carcinoembryonal antigen, СЕА) и иммуногенные эпитопы САР-1 и САР-2 указанного антигена, etv6, aml1, простатический специфический антиген (prostate-specific antigen, PSA) и иммуногенные эпитопы PSA-1, PSA-2 и PSA-3 указанного антигена, простатический специфический мембранный антиген (prostate-specific membrane antigen, PSMA), рецептор T-клеток/CD3-дзета цепь, семейство антигенов опухоли MAGE (например, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, MAGE-A12, MAGE-Xp2 (MAGE-B2), MAGE-Хр3 (MAGE-B3), MAGE-Xp4 (MAGE-B4), MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-C4, MAGE-C5), семейство антигенов опухоли GAGE (например, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7, GAGE-8, GAGE-9), BAGE, RAGE, LAGE-1, NAG, GnT-V, MUM-1, CDK4, тирозиназу, p53, семейство MUC, HER2/neu, p21ras, RCAS1, α-фетопротеин, Е-кадгерин, α-катенин, β-катенин и γ-катенин, p120ctn, gp100 Pmel117, PRAME, NY-ESO-1, cdc27, белок аденоматозного полипоза толстой кишки (АРС), фодрин, коннексин 37, Ig-идиотип, р15, gp75, ганглиозиды GM2 и GD2, вирусные продукты, такие как белки вируса папилломы человека, семейство антигенов опухоли Smad, lmp-1, NA, кодируемый ВЭБ ядерный антиген (EBNA)-1, гликогенфосфорилазу головного мозга, SSX-1, SSX-2 (HOM-MEL-40), SSX-1, SSX-4, SSX-5, SCP-1 СТ-7, c-erbB-2, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD37, CD56, CD70, CD74, CD138, AGS16, MUC1, GPNMB, Ep-CAM, PD-L1, PD-L2, PMSA, антигены рака мочевого пузыря, такие как ACTL8, ADAM22, ADAM23, ATAD2, ATAD2B, BIRC5, CASC5, СЕР290, СЕР55, CTAGE5, DCAF12, DDX5, FAM133A, IL13RA2, IMP3, KIAA0100, MAGEA11, MAGEA3, MAGEA6, MPHOSPH10, ODF2, ODF2L, OIP5, PBK, RQCD1, SPAG1, SPAG4, SPAG9, TMEFF1, TTK и антигены рака предстательной железы, такие как PRAME, BIRC5, СЕР55, ATAD2, ODF2, KIAA0100, SPAG9, GPATCH2, ATAD2B, СЕР290, SPAG1, ODF2L, CTAGE5, DDX5, DCAF12, IMP3. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антигены представляют собой эндогенные ретровирусные антигены человека. Иллюстративные антигены могут также включать антигены эндогенных ретровирусов человека, которые включают, но не ограничены указанными, эпитопы, полученные из по меньшей мере части Gag, по меньшей мере части Tat, по меньшей мере части Rev, по меньшей мере части Nef и по меньшей мере части gp160.
Также согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения слияния белка для вакцинирования согласно настоящему изобретению (например, слияния gp96) обеспечивают адъювантный эффект, который затем позволяет иммунной системе пациента при использовании в различных способах, описанных в настоящей заявке, активироваться против заболевания, представляющего интерес.
L
Для экспрессии белка для вакцинирования (например, gp96-Ig) и слитых белков, костимулирующих Т-клетки, в способах, предложенных в настоящей заявке, можно использовать как прокариотические, так и эукариотические векторы. Прокариотические векторы включают конструкции на основе последовательности Е. coli (см., например, публикацию Makrides, Microbiol Rev 1996, 60:512-538). Неограничивающие примеры регуляторных областей, которые можно использовать для экспрессии в Е. coli, включают lac, trp, lpp, phoA, recA, tac, Т3, T7 и λP. Неограничивающие примеры прокариотических векторов экспрессии могут включать векторы серии λgt, такие как λgt11 (Huynh et al., in "DNA Cloning Techniques, Vol. I: A Practical Approach," 1984, (D. Glover, ed.), pp.49-78, IRL Press, Oxford), и векторы серии pET (Studier et al., Methods Enzymol 1990, 185:60-89). Однако прокариотические системы хозяин-вектор не могут осуществлять многие элементы посттрансляционного процессинга клеток млекопитающих. Таким образом, эукариотические системы хозяин-вектор могут быть в особенности пригодными.
Для экспрессии белка для вакцинирования (например, gp96-Ig) и слияний, костимулирующих Т-клетки, в клетках-хозяевах млекопитающих можно использовать множество регуляторных областей. Например, можно использовать ранний и поздний промоторы SV40, немедленно-ранний промотор цитомегаловируса (ЦМВ) и промотор длинного концевого повтора вируса саркомы Рауса (Rous sarcoma virus long terminal repeat, RSV-LTR). Индуцибельные промоторы, которые могут являться пригодными в клетках млекопитающих, включают, без ограничения, промоторы, связанные с геном металлотионеина II, промоторы в длинных концевых повторах вируса опухоли молочной железы мышей, отвечающие на глюкокортикоиды (mouse mammary tumor virus glucocorticoid responsive long terminal repeats, MMTV-LTR), промоторы гена β-интерферона и гена hsp70 (см. публикации Williams et al., Cancer Res 1989, 49:2735-42; и Taylor et al., Mol Cell Biol 1990, 10:165-75). Промоторы теплового шока или стресс-промоторы также могут обладать преимуществом для управления экспрессией слитых белков в рекомбинантных клетках-хозяевах.
Согласно варианту реализации настоящее изобретение предусматривает применение индуцибельных промоторов, способных временно обеспечивать высокий уровень экспрессии в ответ на сигнал. Иллюстративные индуцибельные контрольные области экспрессии включают таковые, содержащие индуцибельный промотор, который стимулируется сигналом, таким как низкомолекулярное химическое соединение. Конкретные примеры можно найти, например, в патентах США №№5,989,910, 5,935,934, 6,015,709 и 6,004,941, каждый из которых полностью включен в настоящую заявку посредством ссылки.
Регуляторные области животных, которые демонстрируют тканеспецифичность и применяются в трансгенных животных, также можно использовать в клетках опухоли конкретного типа ткани: контрольную область гена I эластазы, которая активна в ацинарных клетках поджелудочной железы (Swift et al., Cell 1984, 38:639-646; Ornitz et al., Cold Spring Harbor Symp Quant Biol 1986, 50:399-409; и MacDonald, Hepatology 1987, 7:425-515); контрольную область гена инсулина, которая активна в бета-клетках поджелудочной железы (Hanahan, Nature 1985, 315:115-122), контрольную область гена иммуноглобулина, которая активна в лимфоидных клетках (Grosschedl et al., Cell 1984, 38:647-658; Adames et al., Nature 1985, 318:533-538; и Alexander et al., Mol Cell Biol 1987, 7:1436-1444), контрольную область вируса опухоли молочной железы мышей, которая активна в клетках яичек, молочной железы, в лимфоидных и тучных клетках (Leder et al., Cell 1986, 45:485-495), контрольную область гена альбумина, которая активна в печени (Pinkert et al., Genes Devel, 1987, 1:268-276), контрольную область гена альфа-фетопротеина, которая активна в печени (Krumlauf et al., Mol Cell Biol 1985, 5:1639-1648; и Hammer et al., Science 1987, 235:53-58); контрольную область гена альфа-1-антитрипсина, которая активна в печени (Kelsey et al., Genes Devel 1987, 1:161-171), контрольную область гена бета-глобина, которая активна в миелоидных клетках (Mogram et al., Nature 1985, 315:338-340; и Kollias et al., Cell 1986, 46:89-94); контрольную область гена основного белка миелина, которая активна в клетках-олигодендроцитах головного мозга (Readhead et al., Cell 1987, 48:703-712); контрольную область гена легкой цепи миозина-2, которая активна в скелетных мышцах (Sani, Nature 1985, 314:283-286), и контрольную область гена гонадотропного релизинг-гормона, которая активна в гипоталамусе (Mason et al., Science 1986, 234:1372-1378).
Вектор экспрессии может также содержать элементы-энхансеры транскрипции, такие как таковые, обнаруженные в вирусе SV40, вирусе гепатита В, цитомегаловирусе, генах иммуноглобулинов, металлотионеина и β-актина (см. публикации Bittner et al., Meth Enzymol 1987, 153:516-544; и Gorman, Curr Op Biotechnol 1990, 1:36-47). Помимо этого, вектор экспрессии может содержать последовательности, которые обеспечивают поддержание и репликацию вектора в более чем одном типе клетки-хозяина или интеграцию вектора в хромосому хозяина. Такие последовательности включают, без ограничения, точки начала репликации, автономно повторяющиеся последовательности (autonomously replicating sequence, ARS), центромерную ДНК и теломерную ДНК.
-
-
-
Помимо этого, вектор экспрессии может содержать один или несколько селектируемых или поддающихся скринингу генов-маркеров для изначального выделения, обнаружения или отслеживания клеток-хозяев, которые содержат ДНК, кодирующую слитые белки, описанные в настоящей заявке. Для длительного производства слитых белков gp96-Ig и костимулирующих молекул Т-клеток с высоким выходом может быть пригодной стабильная экспрессия в клетках млекопитающих. Множество систем селекции можно использовать для клеток млекопитающих. Например, гены тимидинкиназы вируса простого герпеса (Wigler et al., Cell 1977, 11:223), киназы гипоксантингуанин-фосфорибозилтрансферазы (Szybalski and Szybalski, Proc Natl Acad Sci USA 1962, 48:2026) и аденин-фосфорибозилтрансферазы (Lowy et al., Cell 1980, 22:817) можно применять в tk, hgprt или aprt клетках, соответственно. Помимо этого, устойчивость к антиметаболитам можно применять в качестве основы для селекции с использованием дегидрофолатредуктазы (dhfr), которая обеспечивает устойчивость к метотрексату (Wigler et al., Proc Natl Acad Sci USA 1980, 77:3567; O'Hare et al., Proc Natl Acad Sci USA 1981, 78:1527); с использованием gpt, которая обеспечивает устойчивость к микофеноловой кислоте (Mulligan and Berg, Proc Natl Acad Sci USA 1981, 78:2072); с использованием неомицинфосфотрансферазы (neo), которая обеспечивает устойчивость к аминогликозиду G-418 (Colberre-Garapin et al., J Mol Biol 1981, 150:1); и с использованием гигромицинфосфотрансферазы (hyg), которая обеспечивает устойчивость к гигромицину (Santerre et al., Gene 1984, 30:147). Также можно использовать другие селектируемые маркеры, такие как гистидинол и Zeocin™.
Пригодные клетки-хозяева млекопитающих включают, без ограничения, клетки, полученные от людей, обезьян и грызунов (см., например, публикацию Kriegler in "Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual," 1990, New York, Freeman & Co.). Такие клетки включают линии клеток почки обезьяны, трансформированные SV40 (например, COS-7, АТСС CRL 1651); линии почки эмбриона человека (например, 293, 293-EBNA или клетки 293, субклонированные для роста в суспензионной культуре (Graham et al., J Gen Virol 1977, 36:59); клетки почки новорожденного хомяка (например, BHK, АТСС CCL 10); клетки яичников китайского хомячка-DHFR (например, СНО, Urlaub and Chasin, Proc Natl Acad Sci USA 1980, 77:4216); клетки сертоли мыши (Mather, Biol Reprod 1980, 23:243-251); клетки фибробластов мыши (например, NIH-3T3), клетки почки обезьяны (например, CV1 АТСС CCL 70); клетки почки африканской зеленой мартышки (например, VERO-76, АТСС CRL-1587); клетки карциномы шейки матки человека (например, HELA, АТСС CCL 2); клетки почки собаки (например, MDCK, АТСС CCL 34); клетки печени крысы линии buffalo (например, BRL 3А, АТСС CRL 1442); клетки легких человека (например, W138, АТСС CCL 75); клетки печени человека (например, Hep G2, НВ 8065); и опухолевые клетки молочной железы мыши (например, ММТ 060562, АТСС CCL51). Иллюстративные типы раковых клеток для экспрессии слитых белков, описанных в настоящей заявке, включают линии клеток фибробластов мыши, NIH3T3, линию клеток карциномы легких Льюис мыши, LLC, линию клеток мастоцитомы мыши, Р815, линию клеток лимфомы мыши, EL4 и его овальбумин-продуцирующий трансфектант, E.G7, линию клеток меланомы мыши, B16F10, линию клеток фибросаркомы мыши, МС57, линию клеток мелкоклеточной карциномы легких человека, SCLC №2 и SCLC №7, линию клеток аденокарциномы легких человека, например, AD100, и линию клеток рака предстательной железы человека, например, РС-3.
Для получения слитых белков gp96-Ig и костимулирующих молекул Т-клеток с клетками млекопитающих также можно использовать множество систем экспрессии на основе вирусов. Векторы с применением скелетов ДНК вирусов были получены из вируса 40 обезьян (SV40) (Hamer et al., Cell 1979, 17:725), аденовируса (Van Doren et al., Mol Cell Biol 1984, 4:1653), аденоассоциированного вируса (McLaughlin et al., J Virol 1988, 62:1963) и вирусов папилломы крупного рогатого скота (Zinn et al., Proc Natl Acad Sci USA 1982, 79:4897). Когда в качестве вектора экспрессии используют аденовирус, донорную последовательность ДНК можно лигировать с контрольным комплексом транскрипции/трансляции аденовируса, например, с поздним промотором и трехчленной лидерной последовательностью. Затем данный слитый ген можно встроить в геном аденовируса посредством рекомбинации in vitro или in vivo. Вставка в несущественную область генома вируса (например, в область Е1 или Е3) может привести к получению рекомбинантного вируса, который является жизнеспособным и способным к экспрессии гетерологичных продуктов в инфицированных хозяевах. (См., например, публикацию Logan and Shenk, Proc Natl Acad Sci USA 1984, 81:3655-3659).
Вирус папилломы крупного рогатого скота (bovine papillomavirus, BPV) может инфицировать множество высших позвоночных, включая человека, и ДНК данного вируса реплицируется в виде эписомы. Для рекомбинантной экспрессии генов было разработано множество челночных векторов, которые существуют в клетках млекопитающих в виде стабильных многокопийных (20-300 копий на клетку) внехромосомных элементов. Как правило, данные векторы содержат сегмент ДНК BPV (целый геном или 69% трансформирующий фрагмент), промотор с широким диапазоном хозяев, сигнал полиаденилирования, сигналы сплайсинга, селектируемый маркер и «неядовитые» последовательности плазмиды, которые позволяют вектору размножаться в Е. coli. После конструирования и амплификации в бактерии экспрессирующие конструкции генов переносят в культивируемые клетки млекопитающих посредством, например, копреципитации с фосфатом кальция. В случае клеток-хозяев, которые не проявляют трансформированный фенотип, селекцию трансформантов проводят с применением доминантного селектируемого маркера, такого как устойчивость к гистидинолу и G418.
В качестве альтернативы, можно использовать промотор 7.5К коровьей оспы. (См., например, публикации Mackett et al., Proc Natl Acad Sci USA 1982, 79:7415-7419; Mackett et al., J Virol 1984, 49:857-864; и Panicali et al., Proc Natl Acad Sci USA 1982, 79:4927-4931.). В случаях, когда используют клетки-хозяева человека, можно применять векторы на основе точки начала репликации (OriP) вируса Эпштейна-Барр (ВЭБ) и ядерный антиген 1 ВЭБ (EBNA-1; фактор репликации, действующий в транс-положении). Такие векторы можно использовать с широким диапазоном клеток-хозяев человека, например, EBO-pCD (Spickofsky et al., DNA Prot Eng Tech 1990, 2:14-18); pDR2 и λDR2 (доступны от Clontech Laboratories).
gp96-Ig и слитые белки, костимулирующие Т-клетки, также могут быть получены с помощью систем экспрессии на основе ретровирусов. Можно использовать ретровирусы, такие как вирус мышиного лейкоза Молони, поскольку большинство последовательностей генов вируса могут быть удалены и заменены экзогенной кодирующей последовательностью, тогда как утраченные вирусные функции можно обеспечить в trans. В отличие от трансфекции ретровирусы могут эффективно инфицировать и переносить гены в широкий диапазон типов клеток, включая, например, первичные гематопоэтические клетки. Более того, диапазоном хозяев для инфекции ретровирусным вектором можно манипулировать посредством выбора оболочки, которая используется для упаковки вируса.
Например, ретровирусный вектор может содержать 5'-длинный концевой повтор (LTR), 3'-LTR, сигнал упаковки, бактериальную точку начала репликации и селектируемый маркер. Последовательность, кодирующая слитый белок gp96-Ig, может быть, например, встроена в положение между 5'-LTR и 3'-LTR, так что при транскрипции с 5'-LTR промотора транскрибируется клонированная ДНК. 5'-LTR содержит промотор (например, промотор LTR), область R, область U5 и участок связывания праймера в указанном порядке. Последовательности нуклеотидов данных элементов LTR хорошо известны в данной области техники. Гетерологичный промотор, а также множество маркеров для отбора по чувствительности к лекарственным препаратам, также могут быть включены в векторы экспрессии для облегчения селекции инфицированных клеток. См. публикации McLauchlin et al., Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 1990, 38:91-135; Morgenstern et al., Nucleic Acid Res 1990, 18:3587-3596; Choulika et al., J Virol 1996, 70:1792-1798; Boesen et al., Biotherapy 1994, 6:291-302; Salmons and Gunzberg, Human Gene Ther 1993, 4:129-141; и Grossman and Wilson, Curr Opin Genet Devel 1993, 3:110-114.
Любой из клонирующих векторов и векторов экспрессии, описанных в настоящей заявке, можно синтезировать и сконструировать из известных последовательностей ДНК с применением методик, известных в данной области техники. Регуляторные области и элементы-энхансеры могут иметь различное происхождение, как природное, так и синтетическое. Некоторые векторы и клетки-хозяева могут быть получены коммерческим способом. Неограничивающие примеры пригодных векторов описаны в Приложении 5 руководства Current Protocols in Molecular Biology, 1988, ed. Ausubel et al., Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience, которое включено в настоящую заявку посредством ссылки; и в каталогах коммерческих поставщиков, таких как Clontech Laboratories, Stratagene Inc. и Invitrogen, Inc.
Способы лечения
Вектор экспрессии, предложенный в настоящей заявке, может быть включен в композицию для введения субъекту (например, экспериментальному животному или млекопитающему, такому как человек, страдающему от клинического состояния, такого как рак или инфекция). Например, вектор экспрессии можно вводить субъекту для лечения рака или инфекции. Таким образом, в настоящем документе предложены способы лечения клинических состояний, таких как рак или инфекция, векторами экспрессии, предложенными в настоящей заявке. Инфекция может представлять собой, например, острую инфекцию или хроническую инфекцию. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения инфекция может представлять собой инфекцию вирусом гепатита С, вирусом гепатита В, вирусом иммунодефицита человека или малярией. Способы могут включать введение субъекту вектора экспрессии, клетки, содержащей вектор экспрессии, или вируса или вирусоподобной частицы, содержащей вектор экспрессии, в условиях, при которых прогрессирование или симптом клинического состояния у субъекта уменьшается терапевтическим способом.
Согласно различным вариантам реализации настоящее изобретение относится к вариантам рака и/или опухолям; например, к лечению или предотвращению вариантов рака и/или опухолей. Варианты рака или опухоли означают неконтролируемый рост клеток и/или аномально увеличенную выживаемость клеток, и/или ингибирование апоптоза, которое препятствует нормальному функционированию органов и систем организма. В данное понятие включены доброкачественные и злокачественные варианты рака, полипы, гиперплазия, а также латентные опухоли или микрометастазы. Также включены клетки, которые характеризуются аномальной пролиферацией, которой не препятствует иммунная система (например, клетки, инфицированные вирусом). Рак может представлять собой первичный рак или метастатический рак. Первичный рак может представлять собой область раковых клеток в участке возникновения, которая становится обнаруживаемой клиническим способом, и может представлять собой первичную опухоль. Напротив, метастатический рак может представлять собой распространение заболевания из одного органа или части в другие неприлежащие орган или часть. Метастатический рак может быть вызван раковой клеткой, которая приобрела способность проникать и инфильтровать окружающие нормальные ткани в локальной области, образовывая новую опухоль, которая может представлять собой локальный метастаз. Рак также может быть вызван раковой клеткой, которая приобрела способность проникать через стенки лимфатических и/или кровеносных сосудов, после чего раковая клетка становится способной циркулировать в кровотоке (посредством этого становится циркулирующей опухолевой клеткой) в другие участки и ткани организма. Рак может быть вызван процессом, таким как лимфатическое или гематогенное метастазирование. Рак также может быть вызван опухолевой клеткой, которая перемещается в другой участок, повторно проникает через сосуды или стенки, продолжает размножаться и, в конце концов, образует другую обнаруживаемую клиническим способом опухоль. Рак может представлять собой данную новую опухоль, которая может являться метастатической (или вторичной) опухолью.
Рак может быть вызван опухолевыми клетками, которые метастазировали и которые могут представлять собой вторичную или метастатическую опухоль. Клетки опухоли могут быть подобными таковым в исходной опухоли. В качестве примера, если рак молочной железы или рак толстой кишки метастазирует в печень, вторичная опухоль, при присутствии в печени, состоит из аномальных клеток молочной железы или клеток толстой кишки, а не из аномальных клеток печени. Опухоль в печени, таким образом, может представлять собой метастатический рак молочной железы или метастатический рак толстой кишки, а не рак печени.
Рак может образоваться из любой ткани. Рак может образоваться из меланомы, толстой кишки, молочной железы или предстательной железы, и вследствие этого может быть образован клетками, которые изначально являлись клетками кожи, толстой кишки, молочной железы или предстательной железы, соответственно. Рак может также являться гематологическим злокачественным образованием, которое может представлять собой лимфому. Рак может проникать в ткань, такую как печень, легкие, мочевой пузырь или кишечник.
Иллюстративные варианты рака, которые можно лечить, включают, но не ограничены указанными, карциномы, например, различные подтипы, включая, например, аденокарциному, базальноклеточную карциному, плоскоклеточную карциному и переходно-клеточную карциному), саркомы (включая, например, костей и мягких тканей), лейкозы (включая, например, острый миелоидный, острый лимфобластный, хронический миелоидный, хронический лимфоцитарный и волосатоклеточный лейкоз), лимфомы и миеломы (включая, например, ходжкинские и неходжкинские лимфомы, миелому легких цепей, несекретирующую миелому, MGUS (monoclonal gammapathy of undetermined significance, моноклональную гаммапатию неустановленной этиологии) и плазмацитомы), а также варианты рака центральной нервной системы (включая, например, головного мозга (например, глиомы (например, астроцитому, олигодендроглиому и эпендимому), менингиому, аденому гипофиза и нейромы и опухоли спинного мозга (например, менингиомы и нейрофибромы).
Типичные варианты рака и/или опухоли согласно настоящему изобретению включают, но не ограничены указанными, базальноклеточную карциному, рак желчных протоков; рак мочевого пузыря; рак костей; рак головного мозга и центральной нервной системы; рак молочной железы; рак брюшной полости; рак шейки матки; хориокарциному; рак толстой и прямой кишок; рак соединительной ткани; рак пищеварительной системы; рак эндометрия; рак пищевода; рак глаза; рак головы и шеи; рак желудка (включая рак желудочно-кишечного тракта); глиобластому; гепатокарциному; гепатому; интраэпителиальную неоплазию; рак почки или ренальный рак; рак гортани; лейкоз; рак печени; рак легких (например, мелкоклеточный рак легких, немелкоклеточный рак легких, аденокарциному легких и плоскоклеточную карциному легких); меланомы; миелому; нейробластому; рак ротовой полости (губ, языка, рта и глотки); рак яичников; рак поджелудочной железы; рак предстательной железы; ретинобластому; рабдомиосаркому; рак прямой кишки; рак дыхательной системы; карциному слюнных желез; саркому; рак кожи; плоскоклеточный рак; рак желудка; рак яичка; рак щитовидной железы; рак матки или рак эндометрия; рак мочевыделительной системы; рак вульвы; лимфому, включая ходжкинские и неходжкинские лимфомы, а также В-клеточную лимфому (включая неходжкинскую лимфому (НХЛ) низкой степени злокачественности/фолликулярную НХЛ; мелкоклеточную лимфоцитарную (МЛ) НХЛ; НХЛ средней степени злокачественности/ фолликулярную НХЛ; диффузную НХЛ средней степени злокачественности; иммунобластную НХЛ высокой степени злокачественности; лимфобластную НХЛ высокой степени злокачественности; мелкоклеточную НХЛ с нерассеченными ядрами высокой степени злокачественности; НХЛ с массивным поражением; мантийноклеточную лимфому; СПИД-ассоциированную лимфому; и макроглобулинемию Вальденстрема; хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ); острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ); волосатоклеточный лейкоз; хронический миелобластный лейкоз; а также другие карциномы и саркомы; и посттрансплантационное лимфопролиферативное расстройство (post-transplant lymphoproliferative disorder, PTLD) и аномальную пролиферацию сосудов, связанную с факоматозами, отек (такой как отек, связанный с опухолями головного мозга) и синдром Мейгса.
Согласно некоторым аспектам слияния согласно настоящему изобретению используют для устранения внутриклеточных патогенов. Согласно некоторым аспектам слияния согласно настоящему изобретению используют для лечения одной или нескольких инфекций. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения слитые белки согласно настоящему изобретению используют в способах лечения вирусных инфекций (включая, например, ВИЧ (вирус иммунодефицита человека) и ВГС (вирус гепатита С)), паразитарных инфекций (включая, например, малярию) и бактериальных инфекций. Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения инфекции вызывают иммуносупрессию. Например, ВИЧ-инфекции часто приводят к иммуносупрессии у инфицированных субъектов. Соответственно, описанное в другом месте в настоящей заявке лечение таких инфекций может включать согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения модулирование иммунной системы посредством слитых белков согласно настоящему изобретению для способствования иммунной стимуляции вместо иммунного ингибирования. В качестве альтернативы, в настоящем изобретении предложены способы лечения инфекций, которые вызывают иммуноактивацию. Например, инфекции гельминтами желудочно-кишечного тракта были связаны с хронической иммунной активацией. Согласно данным вариантам реализации лечение таких инфекций может включать модулирование иммунной системы посредством слитых белков согласно настоящему изобретению для способствования иммунному ингибированию вместо иммунной стимуляции.
Согласно различным вариантам реализации в настоящем изобретении предложены способы лечения вирусных инфекций, включая, без ограничения, острые или хронические вирусные инфекции, например, дыхательных путей, инфекции вирусом папилломы, инфекцию вирусом простого герпеса (ВПГ), инфекцию вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ) и вирусные инфекции внутренних органов, такие как инфекции вирусами гепатита. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вирусная инфекция вызвана вирусом семейства Flaviviridae. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вирус семейства Flaviviridae выбран из вируса желтой лихорадки, вируса лихорадки Западного Нила, вируса денге, вируса японского энцефалита, вируса энцефалита Сент-Луис и вируса гепатита С. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения вирусная инфекция вызвана вирусом семейства Picornaviridae, например, полиовирусом, риновирусом, вирусами Коксаки. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения вирусная инфекция вызвана членом семейства Orthomyxoviridae, например, вирусом гриппа. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения вирусная инфекция вызвана членом семейства Retroviridae, например, лентивирусом. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения вирусная инфекция вызвана членом семейства Paramyxoviridae, например, респираторным синцитиальным вирусом, вирусом парагриппа человека, рубулавирусами (например, вирусом свинки), вирусом кори и метапневмовирусом человека. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения вирусная инфекция вызвана членом семейства Bunyaviridae, например, хантавирусом. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения вирусная инфекция вызвана членом семейства Reoviridae, например, ротавирусом.
Согласно различным вариантам реализации в настоящем изобретении предложены способы лечения паразитарных инфекций, таких как протозойные или гельминтные инфекции. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения паразитарная инфекция вызвана протозойным паразитом. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения oritiziab паразит выбран из простейших желудочно-кишечного тракта, тканевых простейших или простейших крови. Иллюстративные протозойные паразиты включают, но не ограничены указанными, Entamoeba hystolytica, Giardia lamblia, Cryptosporidium muris, Trypanosomatida gambiense, Trypanosomatida rhodesiense, Trypanosomatida crusi, Leishmania mexicana, Leishmania braziliensis, Leishmania tropica, Leishmania donovani, Toxoplasma gondii, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, Plasmodium malariae, Plasmodium falciparum, Trichomonas vaginalis и Histomonas meleagridis. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения паразитарная инфекция вызвана гельминтным паразитом, таким как нематоды (например, Adenophorea). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения паразит выбран из Secementea (например, Trichuris trichiura, Ascaris lumbricoides, Enterobius vermicularis, Ancylostoma duodenale, Necator americanus, Strongyloides stercoralis, Wuchereria bancrofti, Dracunculus medinensis). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения паразит выбран из трематод (например, кровяных сосальщиков, печеночных сосальщиков, кишечных сосальщиков и легочных сосальщиков). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения паразит выбран из: Schistosoma mansoni, Schistosoma haematobium, Schistosoma japonicum, Fasciola hepatica, Fasciola gigantica, Heterophyes heterophyes, Paragonimus westermani. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения паразит выбран из цестод (например, Taenia solium, Taenia saginata, Hymenolepis nana, Echinococcus granulosus).
Согласно различным вариантам реализации в настоящем изобретении предложены способы лечения бактериальных инфекций. Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения бактериальная инфекция вызвана грамположительной бактерией, грамотрицательной бактерией, аэробной и/или анаэробной бактерией. Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения бактерия выбрана из, но не ограничиваясь указанными, Staphylococcus, Lactobacillus, Streptococcus, Sarcina, Escherichia, Enterobacter, Klebsiella, Pseudomonas, Acinetobacter, Mycobacterium, Proteus, Campylobacter, Citrobacter, Nisseria, Baccillus, Bacteroides, Peptococcus, Clostridium, Salmonella, Shigella, Serratia, Haemophilus, Brucella и других организмов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения бактерия выбрана из, но не ограничиваясь указанными, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas acidovorans, Pseudomonas alcaligenes, Pseudomonas putida, Stenotrophomonas maltophilia, Burkholderia cepacia, Aeromonas hydrophilia, Escherichia coli, Citrobacter freundii, Salmonella typhimurium, Salmonella typhi, Salmonella paratyphi, Salmonella enteritidis, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Serratia marcescens, Francisella tularensis, Morganella morganii, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Providencia alcalifaciens, Providencia rettgeri, Providencia stuartii, Acinetobacter baumannii, Acinetobacter calcoaceticus, Acinetobacter haemolyticus, Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis, Yersinia intermedia, Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis, Bordetella bronchiseptica, Haemophilus influenzae, Haemophilus parainfluenzae, Haemophilus haemolyticus, Haemophilus parahaemolyticus, Haemophilus ducreyi, Pasteurella multocida, Pasteurella haemolytica, Branhamella catarrhalis, Helicobacter pylori, Campylobacter fetus, Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, Borrelia burgdorferi, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Legionella pneumophila, Listeria monocytogenes, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Kingella, Moraxella, Gardnerella vaginalis, Bacteroides fragilis, Bacteroides distasonis, группы гомологии Bacteroides 3452A, Bacteroides vulgatus, Bacteroides ovalus, Bacteroides thetaiotaomicron, Bacteroides uniformis, Bacteroides eggerthii, Bacteroides splanchnicus, Clostridium difficile, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium leprae, Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium ulcerans, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pyogenes, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus intermedius, Staphylococcus hyicus, подвид hyicus, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus hominis или Staphylococcus saccharolyticus. Вектор или векторы экспрессии, клетки или частицы, которые будут вводить, могут быть смешаны, инкапсулированы, конъюгированы или каким-либо другим способом связаны с другими молекулами, молекулярными структурами или смесями компонентов, таких как, например, липосомы, молекулы, нацеленные на рецепторы или клетки, или составы для перорального, местного или иного применения для способствования поглощению, распределению и/или всасыванию. В некоторых случаях вектор экспрессии может содержаться в клетке, которую вводят субъекту, или может содержаться в вирусе или вирусоподобной частице. Вектор, клетка или частица, которые вводят, могут находиться в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем.
Вследствие этого в настоящем документе также предложены композиции, содержащие вектор или опухолевую клетку либо вирусную частицу, которая содержит вектор, кодирующий секретируемый слитый полипептид gp96-Ig и слитый полипептид, костимулирующий Т-клетки, описанные в настоящей заявке, в комбинации с физиологически и фармацевтически приемлемым носителем. Физиологически и фармацевтически приемлемый носитель может содержать любой из хорошо известных компонентов, пригодных для иммунизации. Носитель может облегчать или усиливать иммунный ответ на антиген, вводимый в вакцине. Составы на основе клеток могут содержать буферы для поддержания предпочтительного диапазона рН, соли или другие компоненты, которые презентируют антиген индивидууму, в композиции, которая стимулирует иммунный ответ на антиген. Физиологически приемлемый носитель также может содержать один или несколько адъювантов, которые усиливают иммунный ответ на антиген. Фармацевтически приемлемые носители включают, например, фармацевтически приемлемые растворители, суспендирующие средства или любые другие инертные с фармакологической точки зрения носители для доставки соединений субъекту. Фармацевтически приемлемые носители могут являться жидкими или твердыми, и могут быть выбраны с учетом планируемого способа введения таким образом, чтобы обеспечить предпочтительный объем, консистенцию и другие необходимые транспортные и химические свойства при использовании в комбинации с одним или несколькими терапевтическими соединениями и любыми другими компонентами данной фармацевтической композиции. Типичные фармацевтически приемлемые носители включают, без ограничения: воду, солевой раствор, связывающие средства (например, поливинилпирролидон или гидроксипропилметилцеллюлозу); наполнители (например, лактозу или декстрозу и другие сахара, желатин или сульфат кальция), смазывающие вещества (например, крахмал, полиэтиленгликоль или ацетат натрия), разрыхлители (например, крахмал или натрия крахмал гликолят) и смачивающие средства (например, лаурилсульфат натрия). Композиции могут быть приготовлены в состав для подкожного, внутримышечного или интрадермального введения или для введения любым способом, приемлемым для иммунизации.
Адъювант означает вещество, которое при добавлении к иммуногенному средству, такому как опухолевая клетка, экспрессирующая секретируемый белок для вакцинирования (например, gp96-Ig) и слитые полипептиды, костимулирующие Т-клетки, неспецифично усиливает или стимулирует иммунный ответ на агент в реципиенте-хозяине после воздействия смеси. Адъюванты могут включать, например, эмульсии типа «масло в воде», эмульсии типа «вода в масле», алюминий (соли алюминия), липосомы и микрочастицы, такие как полистирол, крахмал, полифосфазен и полилактиды/полигликолиды.
Адъюванты могут также включать, например, смеси сквалена (SAF-I), мурамилпептиды, производные сапонина, препараты клеточной стенки микобактерий, монофосфориллипид А, производные миколовой кислоты, поверхностно-активные вещества на основе неионных блоксополимеров, Quil А, субъединицу В холерного токсина, полифосфазен и его производные, а также иммуностимулирующие комплексы (ISCOM), такие как таковые, описанные в публикации Takahashi et al., Nature 1990, 344:873-875. С целью ветеринарного применения и с целью получения антител в животных можно использовать митогенные компоненты адъюванта Фрейнда (полного и неполного). У людей пригодным адъювантом является неполный адъювант Фрейнда (НАФ). Различные подходящие адъюванты хорошо известны в данной области техники (см., например, публикации Warren and Chedid, CRC Critical Reviews in Immunology 1988, 8:83; и Allison and Byars, in Vaccines: New Approaches to Immunological Problems, 1992, Ellis, ed., Butterworth-Heinemann, Boston). Дополнительные адъюванты включают, например, бациллу Кальмета-Герена (BCG), DETOX (содержащий скелет клеточной стенки Mycobacterium phlei (CWS) и монофосфориллипид А из Salmonella minnesota (MPL)) и т.п. (см., например, публикации Hoover et al., J Clin Oncol 1993, 11:390; и Woodlock et al., J Immunother 1999, 22:251-259).
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вектор можно вводить субъекту один или несколько раз (например, один раз, два раза, от двух до четырех раз, от трех до пяти раз, от пяти до восьми раз, от шести до десяти раз, от восьми до 12 раз или более 12 раз). Вектор, предложенный в настоящей заявке, можно вводить один или несколько раз в день, один или несколько раз в неделю, один раз в две недели, один или несколько раз в месяц, один раз в два или три месяца, один раз в три - шесть месяцев или один раз в шесть - 12 месяцев. Вектор можно вводить в течение любого подходящего периода времени, такого как период от приблизительно 1 дня до приблизительно 12 месяцев. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, например, период введения может составлять от приблизительно 1 дня до 90 дней; от приблизительно 1 дня до 60 дней; от приблизительно 1 дня до 30 дней; от приблизительно 1 дня до 20 дней; от приблизительно 1 дня до 10 дней; от приблизительно 1 дня до 7 дней. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения период введения может составлять от приблизительно 1 недели до 50 недель; от приблизительно 1 недели до 50 недель; от приблизительно 1 недели до 40 недель; от приблизительно 1 недели до 30 недель; от приблизительно 1 недели до 24 недель; от приблизительно 1 недели до 20 недель; от приблизительно 1 недели до 16 недель; от приблизительно 1 недели до 12 недель; от приблизительно 1 недели до 8 недель; от приблизительно 1 недели до 4 недель; от приблизительно 1 недели до 3 недель; от приблизительно 1 недели до 2 недель; от приблизительно 2 недель до 3 недель; от приблизительно 2 недель до 4 недель; от приблизительно 2 недель до 6 недель; от приблизительно 2 недель до 8 недель; от приблизительно 3 недель до 8 недель; от приблизительно 3 недель до 12 недель; или от приблизительно 4 недель до 20 недель.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения после того, как была введена начальная доза (иногда называемая «примирующей» дозой) вектора, и был достигнут максимальный антигенспецифичный иммунный ответ, можно вводить одну или несколько бустер-доз вектора, предложенного в настоящей заявке. Например, бустер-дозу можно вводить приблизительно через 10-30 дней, приблизительно через 15-35 дней, приблизительно через 20-40 дней, приблизительно через 25-45 дней или приблизительно через 30-50 дней после примирующей дозы.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения способы, предложенные в настоящей заявке, можно использовать для контроля над ростом солидной опухоли (например, над ростом опухоли молочной железы, предстательной железы, меланомы, ренальной опухоли, толстой кишки или шейки матки) и/или метастазирования. Способы могут включать введение эффективного количества вектора экспрессии, описанного в настоящей заявке, субъекту, который нуждается в таком введении. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения субъект представляет собой млекопитающее (например, человека).
Векторы и способы, предложенные в настоящей заявке, могут быть пригодными для стимуляции иммунного ответа против опухоли. Такой иммунный ответ является полезным при лечении или облегчении признаков или симптомов, связанных с опухолью. В настоящей заявке «лечение» означает уменьшение, предотвращение и/или обратное развитие симптомов у индивидуума, которому был введен вектор, описанный в настоящей заявке, по сравнению с симптомами у индивидуума, который не получал лечения. Практикующему специалисту очевидно, что способы, описанные в настоящей заявке, следует использовать в сочетании с непрерывными клиническими оценками, проводимыми квалифицированным практиком (врачом или ветеринаром), для определения последующей терапии. Такие оценки будут способствовать и информировать в ходе обследования о том, стоит ли увеличить, уменьшить или продолжать вводить конкретную дозу лечения, способ введения и т.д.
Способы, предложенные в настоящей заявке, таким образом, можно использовать для лечения опухоли, включая, например, рак. Способы можно использовать, например, для ингибирования роста опухоли посредством предотвращения дальнейшего роста опухоли, посредством замедления роста опухоли или посредством вызова регрессии опухоли. Таким образом, способы можно использовать, например, для лечения рака, такого как рак легких. Следует понимать, что субъект, которому вводят соединение, не должен страдать от конкретного травматического состояния. По сути, векторы, описанные в настоящей заявке, можно вводить с профилактической целью до развития симптомов (например, пациенту, у которого наблюдается ремиссия после рака). Термины «терапевтический» и «терапевтически», а также производные данных терминов используют для включения терапевтического, паллиативного и профилактического применения. Таким образом, в настоящей заявке под «лечением или облегчением симптомов» понимают уменьшение, предотвращение и/или обратное развитие симптомов у индивидуума, которому было введено терапевтически эффективное количество композиции, по сравнению с симптомами у индивидуума, который не получал такого введения.
В настоящей заявке термины «эффективное количество» и «терапевтически эффективное количество» означают количество, достаточное для обеспечения желаемого терапевтического (например, противоракового, противоопухолевого или противоинфекционного) эффекта у субъекта (например, человека, которому был поставлен диагноз рака или инфекции). Противоопухолевый и противораковый эффекты включают, без ограничения, модуляцию роста опухоли (например, замедление роста опухоли), размера опухоли или метастазирования, уменьшение токсичности и побочных эффектов, связанных с конкретным противораковым средством, облегчение или минимизацию клинической патологии или симптомов рака, увеличение выживаемости субъекта сверх таковой, которую в противном случае ожидают при отсутствии такого лечения, и предотвращение роста опухоли у животного, у которого до введения отсутствует образование опухоли, т.е. профилактическое введение. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения введение эффективного количества вектора или композиции, клетки или вирусной частицы, содержащей вектор, может увеличивать активацию или пролиферацию специфичных к антигену опухоли Т-клеток у субъекта. Например, активация или пролиферация специфичных к антигену опухоли Т-клеток у субъекта может быть увеличена по меньшей мере на 10 процентов (например, по меньшей мере на 25 процентов, по меньшей мере на 50 процентов или по меньшей мере на 75 процентов) по сравнению с уровнем активации или пролиферации специфичных к антигену опухоли Т-клеток у субъекта до введения.
Противоинфекционные эффекты включают, например, уменьшение количества инфекционных агентов (например, вирусов или бактерий). Если клиническое состояние у субъекта, лечение которого проводят, представляет собой инфекцию, введение вектора, предложенного в настоящей заявке, может стимулировать активацию или пролиферацию патогенных антигенспецифичных Т-клеток у субъекта. Например, введение вектора может привести к активации у субъекта антигенспецифичных Т-клеток до уровня, большего, чем таковой, который достигается посредством вакцинации gp96-Ig самой по себе.
Специалисту очевидно, что эффективное количество вектора можно уменьшить или увеличить посредством точной регулировки и/или посредством введения более одной дозы (например, посредством одновременного введения двух различных генетически модифицированных опухолевых клеток, содержащих вектор) либо посредством введения вектора с другим средством (например, антагонистом PD-1) для усиления терапевтического эффекта (например, синергическим способом). Вследствие этого в настоящем документе предложен способ приспособления введения/лечения к конкретным требованиям, специфичным данному млекопитающему. Терапевтически эффективные количества можно определить, например, посредством начального введения относительно низких количеств и использования последовательного увеличения количества с параллельной оценкой благоприятных эффектов. Таким образом, способы, предложенные в настоящей заявке, можно применять сами по себе или в комбинации с другими хорошо известными вариантами терапии опухолей, для лечения пациента, страдающего от опухоли. Специалист в данной области техники легко определит преимущественные варианты применения векторов и способов, предложенных в настоящей заявке, например, для удлинения ожидаемой продолжительности жизни пациента, страдающего от рака, и/или для улучшения качества жизни пациента, страдающего от рака (например, пациента, страдающего от рака легких).
Варианты комбинированной терапии и конъюгация
Согласно некоторым вариантам реализации в настоящем изобретении предложены способы, которые также включают введение субъекту дополнительного средства. Согласно некоторым вариантам реализации настоящее изобретение относится к совместному введению и/или совместному приготовлению в состав.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения введение белка для вакцинирования (например, gp96-Ig) и одной или нескольких костимулирующих молекул действует синергическим способом при совместном введении с другим средством и осуществляется в дозах, которые являются меньшими, чем дозы, которые обычно применяют при использовании таких средств в форме монотерапии.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, включая, без ограничения, варианты применения при раке, настоящее изобретение относится к химиотерапевтическим средствам в качестве дополнительных средств. Примеры химиотерапевтических средств включают, но не ограничены указанными, алкилирующие средства, такие как тиотепа и CYTOXAN циклофосфамид; алкилсульфонаты, такие как бусульфан, импросульфан и пипосульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбоквон, метуредопа и уредопа; этиленимины и метиламеламины, включая алтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметилоломеламин; ацетогенины (например, буллатацин и буллатацинон); камптотецин (включая синтетический аналог топотекан); бриостатин; каллистатин; СС-1065 (включая его синтетические аналоги адозелезин, карзелезин и бизелезин); криптофицины (например, криптофицин 1 и криптофицин 8); доластатин; дуокармуцин (включая синтетические аналоги KW-2189 и СВ1-ТМ1); элеутеробин; панкратистатин; саркодиктиин; спонгистатин; азотистые иприты, такие как хлорамбуцил, хлорнафазин, холофосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлоретамин, гидрохлорид мехлоретаминоксида, мелфалан; новембихин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урациловый иприт; нитрозомочевины, такие как кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин и ранимустин; антибиотики, такие как энедииновые антибиотики (например, калихеамицин, в частности калихеамицин гамма II и калихеамицин омега II (см., например, публикацию Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); динемицин, включая динемицин А; бифосфонаты, такие как клодронат; эсперамицин; а также неокарциностатиновый хромофор и родственные хромофоры хромопротеиновых энедииновых антибиотиков), аклациномизины, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицины, кактиномицин, карабицин, каминомицин, карцинофиллин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, доксорубицин ADRIAMYCIN (включая морфолинодоксорубицин, цианоморфолинодоксорубицин, 2-пирролинодоксорубицин и дезоксидоксорубицин), эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марселломицин, митомицины, такие как митомицин С, микофеноловую кислоту, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин; антиметаболиты, такие как метотрексат и 5-фторурацил (5-ФУ); аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметотрексат; пуриновые аналоги, такие как флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин; пиримидиновые аналоги, такие как анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин; андрогены, такие как калустерон, дромостанолона пропионат, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон; анти-адреналовые соединения, такие как миноглютетимид, митотан, трилостан; аналоги фолиевой кислоты, такие как фролиновая кислота; ацеглатон; альдофосфамидгликозид; аминолевулиновую кислоту; энилурацил; амсакрин; бестрабуцил; бисантрен; эдатраксат; демеколцин; диазиквон; элформитин; эллиптиния ацетат; эпотилон; этоглуцид; галлия нитрат; гидроксимочевину; лентинан; лонидаинин; майтансиноиды, такие как майтансин и ансамитоцины; митогуазон; митоксантрон; мопиданмол; нитраэрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; лозоксантрон; подофиллиновую кислоту; 2-этилгидразид; прокарбазин; полисахаридный комплекс PSK (JHS Natural Products, Eugene, Oreg.); разоксан; ризоксин; сизофуран; спирогерманий; тенуазоновую кислоту; триазиквон; 2,2',2''-трихлортриэтиламин; трихотецены (например, токсин Т-2, верракурин А, роридин А и ангуидин); уретан; виндесин; дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабинозид («Ara-С»); циклофосфамид; тиотепу; таксоиды, например, паклитаксел TAXOL (Bristol-Myers Squibb Oncology, Принстон, Нью-Джерси), состав паклитаксела на основе наночастиц, полученный генноинженерными методами из альбумина и не содержащий кремофора ABRAXANE (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, 111.), и доксетаксел TAXOTERE (Rhone-Poulenc Rorer, Антони, Франция); хлоранбуцил; гемцитабин GEMZAR; 6-тиогуанин; меркаптопурин; метотрексат; аналоги платины, такие как цисплатин, оксалиплатин и карбоплатин; винбластин; платину; этопозид (VP-16); ифосфамид; митоксантрон; винкристин; винорелбин NAVELBINE; новантрон; тенипозид; эдатрексат; дауномицин; аминоптерин; кселоду; ибандронат; иринотекан (Camptosar, СРТ-11) (включая схемы лечения иринотеканом с 5-ФУ и лейковорином); ингибитор топоизомеразы RFS 2000; дифторметилорнитин (DMFO); ретиноиды, такие как ретиноевая кислота; капецитабин, комбретастатин; лейковорин (LV); оксалиплатин, включая схему лечения оксалиплатином (FOLFOX); лапатиниб (TYKERB); ингибиторы РКС-α, Raf, H-Ras, РЭФР - рецептора эпидермального фактора роста (например, эрлотиниб (Tarceva)) и ФРСЭ-А - фактора роста сосудистого эндотелия, которые снижают уровень пролиферации клеток, и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из указанных соединений. Помимо этого, способы лечения могут также включать использование ионизирующего излучения. Помимо этого, способы лечения могут также включать использование фотодинамической терапии.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, включая, без ограничения, варианты применения при инфекционных заболеваниях, настоящее изобретение относится к противоинфекционным средствам в качестве дополнительных средств. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения противоинфекционное средство представляет собой противовирусное средство, включая, но не ограничиваясь указанными, абакавир, ацикловир, адефовир, ампренавир, атазанавир, цидофовир, дарунавир, делавирдин, диданозин, докозанол, эфавиренз, элвитегравир, эмтрицитабин, энфувиртид, этравирин, фамцикловир и фоскарнет. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения противоинфекционное средство представляет собой антибактериальное средство, включая, но не ограничиваясь указанными, цефалоспориновые антибиотики (цефалексин, цефуроксим, цефадроксил, цефазолин, цефалотин, цефаклор, цефамандол, цефокситин, цефпрозил и цефтобипрол); фторхинолоновые антибиотики (ципро, левакин, флоксин, текин, авелокс и норфлокс); тетрациклиновые антибиотики (тетрациклин, миноциклин, окситетрациклин и доксициклин); пенициллиновые антибиотики (амоксициллин, ампициллин, пенициллин V, диклоксациллин, карбенициллин, ванкомицин и метициллин); монобактамовые антибиотики (азтреонам); и карбапенемовые антибиотики (эртапенем, дорипенем, имипенем/циластатин и меропенем). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения противоинфекционные средства включают противомалярийные средства (например, хлорхинин, хинин, мефлохин, примахин, доксициклин, артеметер/лумефантрин, атоваквон/прогуанил и сульфадоксин/пириметамин), метронидазол, тинидазол, ивермектин, пирантела памоат и альбендазол.
Другие дополнительные средства описаны в других местах настоящей заявки, включая блокирующие антитела, нацеленные на молекулы иммунных «контрольных точек».
Субъекты и/или животные
Способы, описанные в настоящей заявке, предназначены для применения с любым субъектом, который может получить пользу от данных способов. Таким образом, «субъекты», «пациенты» и «индивидуумы» (термины используются взаимозаменяемо) включают людей, а также субъектов, отличных от людей, в частности, одомашненных животных.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения субъект и/или животное представляет собой млекопитающее, например, человека, мышь, крысу, морскую свинку, собаку, кошку, лошадь, корову, свинью, кролика, овцу или нечеловекообразного примата, такого как обезьяна, шимпанзе или павиан. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения субъект и/или животное представляет собой животное, отличное от млекопитающего, такое как, например, данио-рерио. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения субъект и/или животное может содержать клетки, меченные флуоресцентной меткой (например, GFP). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения субъект и/или животное представляет собой трансгенное животное, содержащее флуоресцентную клетку.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения субъект и/или животное представляет собой человека. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения человек представляет собой человека детского возраста. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения человек представляет собой взрослого человека. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения человек представляет собой человека пожилого возраста. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения человека можно называть пациентом.
Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения возраст человека находится в диапазоне от приблизительно 0 месяцев до приблизительно 6 месяцев, от приблизительно 6 до приблизительно 12 месяцев, от приблизительно 6 до приблизительно 18 месяцев, от приблизительно 18 до приблизительно 36 месяцев, от приблизительно 1 до приблизительно 5 лет, от приблизительно 5 до приблизительно 10 лет, от приблизительно 10 до приблизительно 15 лет, от приблизительно 15 до приблизительно 20 лет, от приблизительно 20 до приблизительно 25 лет, от приблизительно 25 до приблизительно 30 лет, от приблизительно 30 до приблизительно 35 лет, от приблизительно 35 до приблизительно 40 лет, от приблизительно 40 до приблизительно 45 лет, от приблизительно 45 до приблизительно 50 лет, от приблизительно 50 до приблизительно 55 лет, от приблизительно 55 до приблизительно 60 лет, от приблизительно 60 до приблизительно 65 лет, от приблизительно 65 до приблизительно 70 лет, от приблизительно 70 до приблизительно 75 лет, от приблизительно 75 до приблизительно 80 лет, от приблизительно 80 до приблизительно 85 лет, от приблизительно 85 до приблизительно 90 лет, от приблизительно 90 до приблизительно 95 лет или от приблизительно 95 до приблизительно 100 лет.
Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения субъект представляет собой животное, отличное от человека, и вследствие этого настоящее изобретение относится к ветеринарному применению. Согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения животное, отличное от человека, представляет собой домашнее животное. Согласно другому конкретному варианту реализации настоящего изобретения животное, отличное от человека, представляет собой домашний скот. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения субъект представляет собой пациента-человека, страдающего от рака, который не может получать химиотерапию, например, пациент не отвечает на химиотерапию или является слишком больным, чтобы образовалось подходящее терапевтическое окно для химиотерапии (например, испытывает слишком много побочных эффектов, лимитирующих дозу или режим). Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения субъект представляет собой пациента-человека, страдающего от рака, с прогрессирующим и/или метастатическим заболеванием.
В настоящей заявке «аллогенная клетка» означает клетку, которая не происходит от индивидуума, которому вводят данную клетку, иными словами, обладает отличной от индивидуума генетической структурой. Аллогенную клетку, как правило, получают из того же вида, что и индивидуум, которому вводят клетку. Например, аллогенная клетка может представлять собой клетку человека, раскрытую в настоящей заявке, для введения пациенту-человеку, такому как пациент, страдающий от рака. В настоящей заявке «аллогенная опухолевая клетка» означает опухолевую клетку, которая не происходит от индивидуума, которому вводят аллогенную клетку. Как правило, аллогенная опухолевая клетка экспрессирует один или несколько антигенов опухоли, которые могут стимулировать иммунный ответ против опухоли у индивидуума, которому вводят клетку. В настоящей заявке «аллогенная раковая клетка», например, клетка рака легких, означает раковую клетку, которая не происходит от индивидуума, которому вводят аллогенную клетку.
В настоящей заявке «генетически модифицированная клетка» означает клетку, которая была модифицирована генетическим способом для экспрессии экзогенной нуклеиновой кислоты, например, посредством трансфекции или трансдукции.
Все технические и научные термины, используемые в настоящей заявке, имеют то же значение, которое общепринято понимается средним специалистом в области техники, к которой относится настоящее изобретение, если не указано обратное.
В настоящей заявке формы единственного числа также конкретно включают формы множественного числа терминов, к которым они относятся, если контекст однозначно не диктует обратное. В настоящей заявке, если конкретно не указано обратное, слово «или» используется во «включающем» смысле «и/или», а не в «исключающем» смысле «или/или». В спецификации и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа включают формы множественного числа, если контекст однозначно не диктует обратное.
Термин «приблизительно» в настоящей заявке означает «ориентировочно», «в районе», «примерно» или «около». Когда термин «приблизительно» используют в сочетании с диапазоном числовых значений, данный термин изменяет этот диапазон за счет расширения границ выше и ниже изложенных числовых значений. Как правило, термин «приблизительно» в настоящей заявке используют для изменения числового значения выше или ниже указанного значения на отклонение 20%. В настоящей спецификации, будь то в переходной фразе или в объеме формулы изобретения, термины «включает/включают», «содержит/содержат» и «включая» следует интерпретировать как имеющие открытое значение. Иными словами, данные термины следует интерпретировать синонимично с фразами «включающий по меньшей мере», «содержащий по меньшей мере» или «включая по меньшей мере». При использовании в контексте процесса термин «включающий» означает, что процесс включает по меньшей мере указанные этапы, но может включать дополнительные этапы. При использовании в контексте соединения или композиции термин «содержащий» означает, что соединение или композиция содержит по меньшей мере указанные свойства или компоненты, но может также содержать дополнительные свойства или компоненты.
Настоящее изобретение дополнительно описано в следующих примерах, которые не ограничивают объем настоящего изобретения, описанный в формуле изобретения.
ПРИМЕРЫ
Пример 1 - Иммунотерапия на основе сконструированного вектора, содержащего gp96-Ig и слитые белки, костимулирующие Т-клетки, вызывает превосходящий антигенспецифичный ответ CD8+ Т-клеток
Аллогенные клеточные вакцины на основе секретируемого белка теплового шока gp96-Ig могут обеспечить высокую частоту ответов поликлональных CD8+ Т-клеток на фемтомолярные концентрации антигенов опухоли посредством примирования перекрестнореагирующим антигеном in vivo. Множество иммуносупрессивных механизмов, выработанных развившейся опухолью, могут ослабить активность данного подхода на основе вакцины. Как описано ниже, систематическое сравнение блокирующих антител против PD-1, PD-L1, CTLA-4 и LAG-3 на моделях долговременной меланомы В16-F10 у мышей продемонстрировало превосходство комбинации вакцинации gp96-Ig и блокады PD-1 по сравнению с другими контрольными точками. Тройные комбинации вакцинации gp96-Ig, блокады PD-1 и костимуляции Т-клеток с применением агонистов ОХ40, ICOS или 4-1ВВ обеспечивали синергическую противоопухолевую пользу.
Вектор экспрессии gp96-Ig переконструировали для одновременной коэкспрессии ICOSL-Ig, 4-1BBL-Ig или OX40L-Ig, таким образом, обеспечивая костимулирующую пользу без необходимости в дополнительной терапии антителами. Как описано ниже, совместная секреция gp96-Ig и данных костимулирующих слитых белков в аллогенной линии клеток приводила к усилению активации антигенспецифичных CD8+ Т-клеток. Таким образом, комбинированную иммунотерапию можно обеспечить посредством переконструирования вектора во избежание потребности в курсах лечения вакциной/антителом/слитым белком, и, что важно, данная комбинированная терапия может ограничить как стоимость терапии, так и риск системной токсичности.
Пример 2 - Переконструирование вектора вакцины + костимулятора
Стратегию переконструирования вектора применяли для встраивания вакцины и слитых белков, костимулирующих Т-клетки, в один вектор. Более конкретно, исходный вектор gp96-Ig переконструировали для получения комбинированного продукта IO на основе клеток, который секретирует как слитый белок gp96-Ig, так и различные слитые белки, костимулирующие Т-клетки (фиг. 1 и 2). Объединенная локальная секреция вакцины и костимулирующих слитых белков (фиг. 3) может активировать Т-клетки, специфичные к антигенам опухоли, и, как предполагают, усиливает антигенспецифичный иммунитет при ограниченной стоимости и системной токсичности, в особенности в комбинации с введением средства (например, антитела против PD-1), которое ингибирует иммуносупрессивные молекулы, образуемые опухолевыми клетками.
Пример 3 - Исследования ImPACT по сравнению с ComPACT in vivo
Материалы и методы
2
Культура клеток и получение линии клеток вакцины: клетки 3Т3 поддерживали в среде IMDM с глутамином и 10% бычьей сывороткой роста (Bovine Growth Serum, BGS) при температуре 37°С в 5% СО. Родительскую линию клеток 3Т3-Ovalbumin-Hygro устанавливали с применением скелета плазмиды, устойчивой к гигромицину, pcDNA3.1, кодирующего овальбумин цыпленка (Ova), посредством нуклеофекции с помощью наборов 4D-NUCLEOFECTOR™ и Cell Line NUCLEOFECTOR™ Kit SE (Lonza) согласно инструкциям производителя. Проводили скрининг отдельных клонов клеток, секретирующих увеличенный уровень овальбумина, методом ELISA, и данные клоны использовали для получения 3T3-Ova-Gp96-Ig (ImPACT) и 3T3-Ova-Gp96-Ig/OX40L-Fc (ComPACT) посредством нуклеофекции плазмиды рВ45, устойчивой к G418, кодирующей Gp96-Ig мыши или Gp96-Ig и внеклеточный домен OX40L-Fc, соответственно. И в этом случае отдельные клоны клеток как ImPACT, так и ComPACT получали посредством селекции на основе антибиотика, затем проводили скрининг клонов, секретирующих аналогичные уровни IgG мыши, и данные клоны использовали для последующего анализа. Экспрессию мРНК OX40L подтверждали методом кОТ-ПЦР, и уровни белка оценивали методом вестернблоттинга.
2
Клетки СТ26 поддерживали в IMDM с глутамином и 10% эмбриональной бычьей сывороткой при температуре 37°С в 5% СО. Версии СТ26 ImPACT (CT26-Gp96-Ig) и ComPACT (CT26-Gp96-Ig/OX40L-Fc) получали с применением тех же плазмид экспрессии, указанных выше, однако линию клеток СТ26 трансфицировали плазмидами с применением реактива EFFECTENE Transfection Reagents (Qiagen) согласно инструкциям производителя. Отдельные клоны клеток выделяли в условиях селекции на основе антибиотиков и проводили скрининг данных клеток методом ELISA для выявления секреции IgG мыши. Экспрессию мРНК OX40L подтверждали методом кОТ-ПЦР.
Линии клеток B16.F10 сначала устанавливали посредством получения родительского клона ova (B16.F10-ova: описан выше для клеток 3Т3). Затем версии B16.F10-ova ImPACT (B16.F10-ova-gp96-Ig) и ComPACT (B16.F10-ova-gp96-Ig/Fc-OX40L) вновь трансфицировали идентичными плазмидами, описанными выше, и проводили селекцию по увеличенному уровню секреции gp96-Ig.
b
b
Модели у мышей, перенос OT-I/OT-II и анализ: Антигенспецифичные CD8 Т-клетки выделяли из селезенок мышей OT-I/EGFP, несущих трансгены рецептора Т-клеток TCRα-V2 и TCRβ-V5, которые распознают остатки овальбумина 257-264 в ходе перекрестной презентации антигена молекулами H2K МНС класса I. Антигенспецифичные CD4 Т-клетки выделяли из селезенок мышей ОТ-II, экспрессирующих α- и β-цепь рецептора Т-клеток мыши, которая является комплементарной корецептору CD4 и является специфичной для остатков овальбумина цыпленка 323-339 в ходе перекрестной презентации антигена молекулами I-A МНС класса II.
2
4
3
6
6
Вкратце, мышей умерщвляли посредством асфиксии СО с последующим смещением шейных позвонков, и селезенку препарировали в стерильный ФБР (фосфатный буферный раствор) + 2 мМ EDTA. Спленоциты диссоциировали от ткани и пропускали через фильтр размером пор 100 мкМ. Клетки осаждали центрифугированием при 1200 об./мин. в течение 5 минут, и красные кровяные клетки лизировали посредством добавления 5 мл 1X лизирующего буфера ACK (150 мМ NHCl, 10 мМ KHCO и 1 мМ EDTA) в течение 1-2 минут при комнатной температуре. После лизиса добавляли эквивалентный объем 1X ФБР, и клетки снова осаждали центрифугированием при 1200 об./мин. в течение 5 минут. Из суммарных спленоцитов выделяли ОТ-I (CD8) и ОТ-II (CD4) с применением наборов для выделения CD4 и CD8 от StemCell Technologies согласно инструкциям производителя. ОТ-I (0,5×10 клеток на мышь) и ОТ-II (1×10 клеток на мышь) переносили посредством внутривенных (ВВ) инъекций в хвостовую вену мышам, трансгенным по FOXP3-RFP (чтобы отследить регуляторные Т-клетки: Treg). День ВВ инъекции соответствовал дню эксперимента -1.
6
В дни 0 и 35 (в случае мышей, получавших бустер-иммунизацию) мышей либо не вакцинировали, либо вакцинировали родительским клоном 3Т3-Ova в качестве контроля, вакцинировали ImPACT (самим по себе или в комбинации с 100 мкг агонистических антител против ICOS (BioLegend, №313512), 4-1ВВ (антитело 3Н3, Bio-X-Cell) или ОХ40 (антитело ОХ86, Bio-X-Cell), или вакцинировали ComPACT. Вакцинации состояли из 1×10 клеток и вводились посредством интраперитонеальной инъекции (ИП). Лимфоциты собирали из периферической крови и анализировали методом проточной цитометрии в течение времени.
5
5
5
2
2
5
Модель опухоли СТ26 и анализ: Для исследований опухоли СТ26 мышам BALB/C инокулировали 2×10 или 5×10 опухолевых клеток посредством подкожной инъекции в заднюю подвздошную область, что соответствовало дню 0. Для исследований B16.F10-ova мышам C57BL/6 инокулировали в заднюю подвздошную область 5×10 опухолевых клеток, что соответствовало дню 0. В дни вакцинации мышей, несущих опухоль, либо не вакцинировали, либо вакцинировали обработанными митомицином-С (Sigma) клетками ImPACT, ImPACT + 100 мг антитела против OX86 (называемого в настоящей заявке ОХ40(АТ)) или ComPACT. Площадь опухоли (мм) и общую выживаемость оценивали в зависимости от времени. Критерий 30-дневной выживаемости включал суммарную площадь опухоли менее 175 мм с отсутствием признаков изъязвления опухоли. Животные с полным ответом, у которых опухоли образовались и впоследствии отторгались после лечения, представлены на фиг. 12, чертеж D и фиг. 11, чертеж Е. Когорту мышей, которым инокулировали 2×10 клеток, умерщвляли через 11 дней после инокуляции опухоли. Опухоли данных мышей вырезали, трипсинизировали при температуре 37°С в течение 10 минут, диссоциировали и пропускали через клеточный фильтр с диаметром пор 100 мкМ. Клетки осаждали центрифугированием, красные кровяные клетки лизировали (как описано выше), выделяли РНК, проводили обратную транскрипцию и анализ методом кПЦР (см. ниже). Для анализа АН1-тетрамера в спленоцитах и генетического анализа ткани опухоли проводили эвтаназию когорты экспериментальных мышей СТ26 в день 12. Опухоли данных мышей вырезали, трипсинизировали при температуре 37°С в течение 10-15 минут, диссоциировали и гомогенизировали с применением фильтра с диаметром пор 100 мМ. Клетки осаждали центрифугированием и обрабатывали для выделения РНК (см. ниже).
Проточная цитометрия: Проточную цитометрию и сортировку клеток проводили на приборе Sony SH800. Для внеклеточного окрашивания осадок клеток ресуспендировали в 1X буфере ФБР, содержащем 1% бычий сывороточный альбумин (БСА), 0,02% азид натрия и 2 мМ EDTA и соответствующие антитела, и инкубировали на льду в темноте в течение 30 минут. После этого клетки промывали в буфере для проточной цитометрии, ресуспендировали, а затем анализировали. Для внутриклеточного окрашивания клетки фиксировали и пермеабилизовали с применением набора FOXP3 Fix/Perm от BioLegend, окрашивали, как описано выше, промывали в буфере для проточной цитометрии, ресуспендировали, а затем анализировали. Использованные антитела представляли собой PE/Cy7-CD4 (Sony, 1102640), AF700-CD8a (Sony, 1103650), APC-TCR Vβ5.1,5.2 (Sony, 1297530), PacificBlue-TCR Vα2 (Sony, 1239080), APC-KLRG1 (BioLegend, 138412), BV421-CD44 (BioLegend, 103039), BV605-CD127 (BioLegend, 135025), APC-Ki67 (BioLegend, 652406), PE/Cy7-IFNγ (Biolegend, 505826) и BV421-IL2 (BioLegend, 503825).
6
ELISA: Стандартные условия ELISA задавали таким образом, что в 1 мл культуральной среды высевали 1×10 клеток, и супернатант анализировали через 24 часа. Планшеты для ELISA с высоким связыванием сенсибилизировали 10 мкг/мл IgG мыши (Jackson Laboratories №115-005-062) в натрий-бикарбонатном буфере. Сенсибилизированные планшеты инкубировали в течение ночи при температуре 4°С. На следующее утро планшеты промывали 3 раза TBS-T (50 мМ Tris, 150 мМ NaCl и 0,05% Tween 20), блокировали в течение 1 часа казеиновым блокирующим буфером (Sigma) и снова промывали 3 раза TBS-T. В сенсибилизированные планшеты для ELISA вносили по 50 мкл супернатантов клеток вместе со стандартным набором образцов IgG мыши на 11 точек и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. Планшеты промывали 3 раза TBS-T, добавляли 50 мкл детектирующего антитела (Jackson Laboratories №115-035-071) и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре в темноте. Планшеты промывали 3 раза TBS-T, в каждую лунку добавляли по 100 мкл субстрата SUREBLUE™ ТМВ Microwell Peroxidase Substrate (KPL) и инкубировали при комнатной температуре в течение 20 минут в темноте. Для остановки реакции в каждую лунку добавляли по 100 мкл серной кислоты, и планшеты немедленно анализировали на считывающем устройстве для планшетов BioTek. Образцы анализировали по меньшей мере в трех повторах в нескольких разведениях.
Выделение РНК и кОТ-ПЦР: Суммарную РНК получали с применением наборов RNeasy и RNeasy Micro (Qiagen) согласно рекомендациям производителя, включая обработку РНКазой непосредственно на колонке. Для синтеза кДНК с применением набора для синтеза ДНК First-strand от OriGene использовали суммарно 1 мкг (с применением RNeasy) или 100 нг (с применением RNeasy Micro) РНК. кПЦР проводили с применением КАРА SYBR FAST, зеленой мастер-микс SYBR (Kapa Biosystems), а затем анализировали на приборе Roche Lightcycler. Значения нормировали к 18S мРНК и представляли в виде среднего значения ± стандартная ошибка среднего (СОС) минимум для 3 биологических повторов; все образцы анализировали в трех повторах. Последовательности использованных праймеров являлись следующими:
ИФН гамма: F: 5'-CTGCCACGGCACAGTCATTG-3' (SEQ ID NO: 14)
R: 5'-gccagttcctccagatatcc-3' (SEQ ID NO: 15)
ФНО альфа: F: 5'-CCACGCTCTTCTGTCTACTG-3' (SEQ ID NO: 16)
R: 3'-gccatagaactgatgagaggg-3' (SEQ ID NO: 17)
гранзим-В F: 5'-CTACTGCTGACCTTGTCTCTG-3' (SEQ ID NO: 18)
R: 3'-agtaaggccatgtagggtcg-3' (SEQ ID NO: 19)
ИЛ-2 F: 5'-CTGCGGCATGTTCTGGATTTGACT-3' (SEQ ID NO: 20)
R: 5'-AGTCCACCACAGTTGCTGACTCAT-3' (SEQ ID NO: 21)
перфорин-1 F: 5'-GACACAGTAGAGTGTCGCATG-3' (SEQ ID NO: 22)
R: 5'-aagcatgctctgtggagctg-3' (SEQ ID NO: 23)
бета-актин F: 5'-aaggccaaccgtgaaaagat-3' (SEQ ID NO: 24)
R: 5'-gtggtacgaccagaggcatac3' (SEQ ID NO: 25)
Анализ методом вестернблоттинга: клетки ImPACT и ComPACT обрабатывали в течение 16 часов брефелдином-А для ингибирования транспорта и секреции белка. Затем клетки лизировали в буфере RIPA (25 мМ Tris-HCL, 150 мМ NaCl, 1% NP-40, 1% дезоксихолат Na и 0,1% SDS), содержащем 1X полный коктейль ингибиторов протеазы (Roche), в течение 10 минут на льду. Концентрацию белка определяли с применением набора DC Protein Assay (Bio-Rad), и анализировали 20 мкг белка. Использованные антитела представляли собой: CD252 (OX40L, Abcam № ab 156285, разведение 1:1000), антитело против гистона Н3 (Active Motif №61278, 1:10000), гистона Н4 (Active Motif №61300, 1:10000) и бета-актина (Abcam № ab 8226, 1:10000).
2
Анализ цитокинов LEGENDplex: Экспериментальным мышам проводили эвтаназию посредством асфиксии СО со смещением шейных позвонков, и цельную кровь собирали посредством пункции сердца. Красным кровяным клеткам позволяли осесть под действием силы тяжести в течение 1 часа при комнатной температуре, и оставшиеся клетки осаждали центрифугированием при 1200 об./мин. в течение 5 минут. Затем сыворотку переносили в новую пробирку Eppendorf объемом 1,5 мл. Анализ цитокинов проводили с применением набора LEGENDPLEX™ Cytokine Analysis (BioLegend) согласно рекомендациям производителя на приборе Sony SH800.
Статистический анализ: Количество повторов эксперимента (N) показано на фигурах. Если не указано обратное, отложенные на графике значения представляют собой среднее значение, полученное минимум в 3 различных экспериментах, и ошибка представляет собой СОС. Статистическую значимость (р-значение) определяли с применением неспаренного параметрического t-критерия с поправкой Уэлча. Значимые р-значения отмечены звездочкой (*), и соответствующее р-значение отмечено на каждой фигуре.
Результаты
Во множестве новых исследований будут оценивать, является ли добавление терапевтической вакцины или костимулирующих Т-клетки антител эффективной стратегией увеличения доли отвечающих пациентов и устойчивости клинических ответов. Реализация данной стратегии ограничена несколькими факторами, в том числе неполным пониманием того, какие средства могут обеспечить синергическую пользу, будут ли токсичности таких комбинаций переносимыми, и, в конце концов, как система здравоохранения будет управлять такими комбинациями.
Для исследования потенциальной синергии между вакциной и отдельными молекулами, костимулирующими Т-клетки, проводили серию исследований в формате один на один на доклинических моделях на мышах. С применением вакцины на основе клеток, экспрессирующих модифицированный секретируемый слитый белок gp96-Ig (фиг. 4А), проводили исследования для изучения того, обеспечит ли совместное введение агонистических антител, нацеленных на ОХ40, 4-1ВВ или ICOS, дополнительную костимуляцию антигенспецифичных CD8+ Т-клеток (фиг. 5А-5С). Иммунизация мышей C57BL/6, которым адаптивно переносили овальбумин-специфичные CD8+ Т-клетки (ОТ-I), вакциной 3T3-ova-gp96-Ig приводила к пролиферации клеток ОТ-I до уровня 10% от CD8+ Т-клеток периферической крови. Данный ответ можно увеличить вдвое посредством дополнительного введения агонистических антител против ОХ40, но не костимулирующих антител против 4-1ВВ или ICOS (фиг. 5D).
Костимуляция Т-клеток посредством OX40L запускается антиген-презентирующими клетками посредством локального воспаления в пространственно ограниченном микроокружении в течение 2-5 дней. Введение агонистических антител против рецептора ОХ40 обеспечивает системную костимуляцию, которая может сохраняться в течение нескольких недель. Поскольку вакцины, как правило, вводят местно, были проведены эксперименты для определения того, может ли слитый белок OX40L (Fc-OX40L) коэкспрессироваться во второй кассете gp96-Ig, содержащей плазмиду, в качестве стратегии для ограничения системной костимуляции и обеспечения возможности комбинированной иммунотерапии одним соединением (фиг. 6А). С целью проверки обоснованности концепции получали клетки 3Т3, коэкспрессирующие растворимый овальбумин и gp96-Ig сам по себе («ImPACT») или gp96-Ig в сочетании с Fc-OX40L, ICOSL или 4-1BBL. Проводили стабильную селекцию данных линий клеток для обнаружения секреции аналогичных количеств ova и gp96-Ig (фиг. 7А и 7В). Экспрессию Fc-OX40L, ICOSL или 4-1BBL оценивали методом ОТ-ПЦР и вестернблоттинга (фиг. 7С и 7D), и, как показано, экспрессия являлась функционально активной в супернатантах культуры клеток согласно анализу секреции ИЛ-2 из первичных спленоцитов.
Активность ImPACT in vivo самого по себе или в комбинации с агонистическими антителами против ОХ40 сравнивали с ComPACT с применением модели ОТ-I, описанной на фиг. 5. В данном эксперименте использовали различные линии клеток, поскольку применение котрансфекций, описанных выше, было невозможным при использовании кассеты с устойчивостью к неомицину, экспрессирующей ova, на фиг. 5. Поскольку ComPACT вводили местно, можно было не ожидать значительных первичного и вторичного иммунных эффектов по сравнению с комбинацией ImPACT с агонистическим антителом против ОХ40, которое вводили системно. Однако, как показано на фиг. 6В и 6С, иммунизация ComPACT обеспечивала неожиданную и значительно улучшенную пролиферацию клеток ОТ-I после первичной иммунизации ImPACT самим по себе или в комбинации с агонистическими антителами против ОХ40. Пик экспансии в периферической крови увеличивался в день 5 при применении ComPACT, но более важным являлась длительность ответа до дней 6-20.
+
-
-
+
+
+
Вторичный иммунный ответ на агонистические антитела против ОХ40 в комбинации с вакцинацией является относительно слабым в компартменте антигенспецифичных CD8. Вторичный ответ оценивали посредством повторной иммунизации мышей в день 35 после первичной иммунизации (фиг. 6С). В то время как комбинация агонистических антител против ОХ40 обеспечивала относительно слабый вторичный иммунный ответ на ОТ-I, у мышей, получавших ComPACT, наблюдался вторичный иммунный ответ, магнитуда которого почти совпадала с магнитудой первичного иммунного ответа (фиг. 6С). Анализ спленоцитов и перитонеальных клеток мышей, получавших ComPACT, методом проточной цитометрии позволил выявить заметное увеличение уровня клеток CD127KLRG1 по сравнению с другими группами, что свидетельствует об увеличении уровня предшественников клеток памяти (фиг. 8В). Данный эффект наблюдался с различными вариантами ComPACT, включая ComPACT (OX40L), ComPACT (ICOSL) и ComPACT (4-1BBL), но не наблюдался при введении агонистического антитела против ОХ40. Различные варианты ComPACT не вызывали увеличения уровня короткоживущих эффекторных клеток (CD127KLRG1, фиг. 8В), которое наблюдалось при введении агонистического антитела против ОХ40. ComPact, однако, увеличивал уровень Т-клеток памяти (CD127KLRG1) в селезенке (фиг. 8В). Полученные данные свидетельствуют, что местное введение слитых белков на основе агонистов OX40L, ICOSL или 4-1BBL значительно увеличивало как первичный, так и вторичный иммунные ответы в компартменте антигенспецифичных CD8, что коррелировало с увеличением уровня предшественников клеток памяти и удлинением фазы спада после примирования. Помимо этого, полученные данные также позволили выявить новый и неожиданный механизм действия в случае мышей, получавших ComPACT, по сравнению с получавшими ImPACT+/- агонистическое антитело против ОХ40.
Возможно, что причиной увеличения первичного и вторичного иммунных ответов в компартменте антигенспецифичных CD8 при местном введении OX40L являлось уменьшение нецелевой активации, обеспеченное системным введением агонистических антител против ОХ40. Для изучения данной гипотезы перитонеальные клетки, спленоциты и клетки дренирующего опухоль лимфатического узла (ДОЛУ) выделяли в день 8 от мышей, которых иммунизировали ImPACT +/- агонистическое антитело против ОХ40 или ComPACT, и анализировали методом проточной цитометрии и количественной ОТ-ПЦР (кОТ-ПЦР), чтобы разграничить нецелевую иммунную активацию и антигенспецифичный ответ.Анализ перитонеальных клеток, выделенных в день 8 после первичной иммунизации, свидетельствовал об увеличении количества суммарных мононуклеарных клеток, клеток ОТ-I и ОТ-II у мышей, получавших ComPACT, но также об увеличении количеств суммарных CD4 клеток у мышей, получавших агонистические антитела против ОХ40 (фиг. 8А). Увеличение уровней суммарных CD4+ клеток и FOXP3+ регуляторных Т-клеток (Treg) было обнаружено в брюшной полости, селезенке и ДОЛУ у мышей, получавших агонистические антитела против ОХ40 (фиг. 8А и 8Е). Напротив, мыши, получавшие ComPACT, специфично амплифицировали антигенспецифичные ОТ-I (CD8+) и ОТ-II (CD4+) клетки без видимой стимуляции клеток Treg (фиг. 8А и 8Е). Аналогичные результаты также наблюдались в селезенке и лимфатических узлах, что свидетельствует о системной экспансии суммарных CD4 клеток, а также антигенспецифичных CD4 клеток (фиг. 9А и 9В). Уровень CD4+FoxP3+регуляторных Т-клеток (Treg) также был увеличен в случае агониста ОХ40, но не у животных, получавших ComPACT. Анализ цитокинов в сыворотке также продемонстрировал системное увеличение уровня ИФНγ, ФНОα, ИЛ-5 и ИЛ-6 у мышей, получавших агонистические антитела против ОХ40 (фиг. 8С). Для исследования клеточного источника системного увеличения уровня цитокинов проводили ОТ-ПЦР на суммарных CD8+ клетках или клетках ОТ-I в день 8 после иммунизации. У мышей, получавших ComPACT, наблюдалось увеличение уровня ИФНγ, ФНОα и гранзима-В, которые были выделены из популяции ОТ-I, тогда как у мышей, получавших агонистические антитела против ОХ40, наблюдалось увеличение как уровня ОТ-I, так и суммарной популяции CD8 (фиг. 8D).
Полученные данные свидетельствуют, что слитые белки OX40L можно обеспечивать местным способом посредством стабильной трансфекции плазмидой, коэкспрессирующей вакцину на основе белка теплового шока gp96-Ig. Первоначальная оценка выполнимости того, являлись ли секретируемые концентрации Fc-OX40L достаточными для обеспечения костимуляции, продемонстрировала, что указанная костимуляция являлась достижимой, и, что неожиданно, более эффективной, чем при системном введении агонистических антител против ОХ40.
Костимулированные клетки ОТ-I образовывали эквивалентные уровни эффекторных цитокинов, как и клетки ОТ-I, костимулированные антителом против ОХ40, и, как можно ожидать, вызывали увеличение цитотоксической активности против клетки-мишени.
Для исследования функциональной активности ImPACT+/- антитела против ОХ40 по сравнению с ComPACT на модели опухоли у мышей клетки СТ26 стабильно трансфицировали данными конструкциями, как описано для клеток 3Т3 на фиг. 7 (фиг. 10А-10С). В одной серии экспериментов мышам инокулировали клетки СТ26 в день 0, а затем мышам вводили обработанные митомицином-С клетки СТ26, CT26-gp96-Ig, CT26-gp96-Ig в комбинации с агонистическими антителами против ОХ40 или с СТ26 ComPACT в дни 6 и 11 после инокуляции опухоли. Во второй серии экспериментов мышам инокулировали клетки СТ26 в день 0, а затем мышей иммунизировали обработанными митомицином-С клетками СТ26, CT26-ImPACT, CT26-ImPACT в комбинации с агонистическим антителом против ОХ40 или клетками СТ26-ComPACT в дни 4, 7 и 10 после инокуляции опухоли (фиг. 11А). Анализ методом количественной ОТ-ПЦР на ткани опухоли, выделенной в день 12 после инокуляции опухоли, позволил выявить увеличение экспрессии CD8a, ИЛ-2 и ИФНγ в группах, получавших комбинации агонистического антитела против ОХ40, ImPACT, ComPACT и ImPACT + агонистическое антитело против ОХ40, что свидетельствует об активации иммунных клеток и инфильтрации опухоли. Как ожидалось, только у мышей, получавших агонистические антитела против ОХ40 (сами по себе или в сочетании с ImPACT), наблюдалось увеличение экспрессии CD4 и FoxP3 в опухоли (фиг. 11В). СТ26-антигенспецифичная экспансия CD8+, которую определяли посредством окрашивания AH1-тетрамера, была значительно увеличена приблизительно в 4 раза у мышей, получавших ImPACT + антитело против ОХ40, и приблизительно в 5 раз у мышей, получавших ComPACT, по сравнению с группой, не получавшей лечения (фиг. 11В). Прогрессирование опухоли, как показано, было строго заблокировано у мышей, получавших ImPACT + агонист ОХ40 или ComPACT, по сравнению с контролем или группами монотерапии (фиг. 11D). Это приводило к значительному увеличению долговременной выживаемости и более высокой степени полного отторжения опухоли у мышей, получавших ComPACT (фиг. 11Е, 80% и приблизительно 47%, соответственно), по сравнению с результатами, которые наблюдались на модели опухоли B16.F10. Соответственно, ComPACT вызывает мощную антигенспецифичную экспансию Т-клеток и инфильтрацию опухоли, замедление роста опухоли и обеспечивает значительные преимущества выживаемости.
Модель опухоли меланомы B16.F10 у мышей представляет собой агрессивную опухоль и, как правило, эффективно не излечивается с применением агонистических антител против ОХ40. С целью оценки вакцины на основе gp96-Ig на модели опухоли B16.F10 получали линию клеток B16.F10-ova. Помимо этого, потом получали вакцины B16.F10-ova-ImPACT и -ComPACT посредством стабильной трансфекции векторами gp96-Ig и gp96-Ig-Fc-OX40L, соответственно. Сравнимые уровни секреции gp96-Ig из линий клеток B16.F10-ImPACT и -ComPACT сравнивали методом ELISA, и экспрессию Fc-OX40L в линии клеток B16.F10-ova-ComPACT также подтверждали методом кОТ-ПЦР. Мышам адаптивно переносили клетки ОТ-I за день до инокуляции опухоли B16.F10-ova (что соответствовало дню -1, фиг. 12А). Затем на мышах исследовали антигенспецифичный ответ клеток ОТ-I после вакцинации в дни 4, 7 и 10 обработанными митомицином-С клетками B16.F10-ova, B16.F10-ova-ImPACT, B16.F10-ova-ImРАСТ в комбинации с агонистическими антителами против ОХ40 или с B16.F10-ova-ComPACT (фиг. 12В). Сообразно с данными, полученными на модельной системе 3Т3-ova, у мышей, получавших В16.F10-ova-ComPACT, наблюдалась устойчивая экспансия клеток ОТ-I между днями 10 и 19 (что соответствовало дням с 6 по 15 после исходной вакцинации), которая была большей, чем таковая, наблюдаемая в случае ImPACT +/- агонистические антитела против ОХ40, с устойчивой кинетикой в фазе спада, аналогичной показателям, которые наблюдались ранее. Соответственно, у мышей, вакцинированных B16.F10-ova-ComPACT, наблюдался более мощный противоопухолевый эффект, чем у мышей, получавших обе вакцинации ImPACT +/- агонистическое антитело против ОХ40 (фиг. 12С). Долговременная выживаемость мышей, получавших ComPACT, составила приблизительно 78%, причем у 11% мышей наблюдалось полное отторжение агрессивных опухолей. Для сравнения, у мышей, вакцинированных ImPACT самим по себе, и у мышей, получавших ImPACT + агонистическое AT (антитело) ОХ40, показатели общей выживаемости составляли 50% и 62,5%, соответственно (фиг. 12D).
2
2
2
Функциональные активности дополнительных вариантов ComPACT исследовали с применением ранее описанного анализа иммунизации, а также анализа переноса ОТ-I. Более конкретно, методом проточной цитометрии анализировали клетки OT-1/GFP мышей, не получавших вакцины, получавших только контрольные клетки Ova, ComPACT (gp96-Ig/OX40L или gp96-Ig/TL1A) или ComPACT (gp96-Ig/OX40L+TL1A), который представляет собой смесь линии клеток ComPACT-OX40L и линии клеток ComPACT-TL1A, в течение 46 дней, с исходной вакцинацией в день 0 и бустер-вакцинацией в день 35 (фиг. 13). Как первичный, так и вторичный иммунные ответы были сильными у мышей, получавших ComPACT (gp96-Ig/OX40L или gp96-Ig/TL1A) или ComPACT (gp96-Ig/OX40L+TL1A). У мышей, получавших ComPACT или ComPACT, также неожиданно сохранялись увеличенные уровни ОТ-1 в течение времени (~ дни 7-20). Дополнительно, мышей C57BL/6 иммунизировали ImPACT самим по себе или ComPACT (gp96-OX40L, gp96-Ig/4-1BBL или gp96-Ig/ICOS-L) в день 0 (фиг. 14). Результаты свидетельствуют, что различные ComPACT усиливали пролиферацию клеток OTI по сравнению с ImPACT.
2
Активности дополнительных вариантов ComPACT in vivo также исследовали на модели карциномы толстой и прямой кишок СТ26. Более конкретно, мыши не получали лечения, либо мышей вакцинировали в дни 4, 7 и 10 родительскими клетками СТ26, ImPACT самим по себе, ImPACT+агонистом TNFRSF25 (4С12 ab), 4С12 (AT) самим по себе, PD-1 (AT) самим по себе, 4С12 (AT) и PD-1 (AT), ComPACT (gp96-Ig/OX40L или gp96-Ig/TL1A), ComPACT (gp96-Ig/OX40L)+PD-1 (AT) или ComPACT (gp96-Ig/OX40L+TL1A) (фиг. 15). Результаты свидетельствуют, что лечение ComPACT самим по себе (gp96-Ig/OX40L или gp96-Ig/TL1A) и в комбинации с PD-1 значительно уменьшало рост опухоли. Как показано на фиг. 16, лечение ComPACT самим по себе (gp96-Ig/OX40L или gp96-Ig/TL1A) и в комбинации с PD-1 также значительно усиливало выживаемость мышей.
Изучали экспрессию ComPACT в линии клеток рака человека. Более конкретно, линию клеток рака предстательной железы человека (например, РС-3) или линию клеток аденокарциномы легких человека (например, AD100) трансфицировали ComPACT (gp96-Ig/OX40L). См. фиг. 17 и 18, соответственно. Результаты свидетельствуют, что обе линии клеток продуцировали и экскретировали OX40L.
Взятые вместе, полученные данные продемонстрировали, что комбинированную иммунотерапию можно обеспечить посредством объединения нескольких комплементарных средств, в данном случае, вакцины и слитого белка, костимулирующего Т-клетки, в одном соединении. Обеспечение костимуляции Т-клеток посредством Fc-OX40L, который кодировался вектором и секретировался клетками, было возможным и приводило к усилению пролиферации антигенспецифичных CD8+ Т-клеток во время как первичной, так и вторичной иммунизации (бустер-иммунизации), по сравнению с агонистическими антителами против ОХ40. Т-клетки, активированные объединенной вакциной и костимулятором, образовывали ИФНγ, ИЛ-2, ФНОα и гранзим-В, что не сопровождалось нецелевой пролиферацией Т-клеток и увеличением уровня системных воспалительных цитокинов, которые наблюдались при использовании агонистических антител против ОХ40. Важно отметить, что данный подход также усиливал терапевтический противоопухолевый иммунитет на модели прогрессирующего рака толстой кишки мыши. Взятые вместе, полученные результаты обеспечивают стратегию реализации комбинированной иммунотерапии, которая может не основываться на двойной или тройной комбинации антител, и которая может обеспечить большую безопасность и эффективность для пациентов в связи с уменьшенной нецелевой активацией Т-клеток.
ДРУГИЕ ВАРИАНТЫ РЕАЛИЗАЦИИ
Следует понимать, что, несмотря на то, что настоящее изобретение было описано в сочетании с его подробным описанием, вышеупомянутое описание призвано проиллюстрировать, а не ограничить объем настоящего изобретения, который определен объемом прилагаемой формулы изобретения. Прочие аспекты, преимущества и модификации относятся к объему прилагаемой формулы изобретения.
Содержание любого отдельного раздела может в равной степени применяться ко всем разделам.
ВКЛЮЧЕНИЕ ПОСРЕДСТВОМ ССЫЛКИ
Все патенты и публикации, упомянутые в настоящей заявке, полностью включены в настоящую заявку посредством ссылки.
Публикации, которые обсуждаются в настоящей заявке, предложены исключительно для их раскрытия до даты подачи настоящей заявки. Ничто в настоящей заявке не следует истолковывать как признание того, что настоящее изобретение не дает права датировать такое изобретение задним числом на основании предыдущего изобретения.
В настоящей заявке все заголовки приведены исключительно с организационной целью и не предназначены для ограничения настоящей заявки.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  Heat Biologics, Inc.
SCHREIBER, Taylor
FROMM, George
<120>  ВЕКТОР, КОЭКСПРЕССИРУЮЩИЙ GP96-IG И КОСТИМУЛИРУЮЩИЕ МОЛЕКУЛЫ
<130>  HTB-021PC
<150>  US 62/113,153
<151>  2015-02-06
<150>  US 62/174,942
<151>  2015-06-12
<160>  49
<170>  PatentIn версия 3.5
<210>  1
<211>  2412
<212>  ДНК
<213>  Homo sapiens
<400>  1
atgagggccc tgtgggtgct gggcctctgc tgcgtcctgc tgaccttcgg gtcggtcaga       60
gctgacgatg aagttgatgt ggatggtaca gtagaagagg atctgggtaa aagtagagaa      120
ggatcaagga cggatgatga agtagtacag agagaggaag aagctattca gttggatgga      180
ttaaatgcat cacaaataag agaacttaga gagaagtcgg aaaagtttgc cttccaagcc      240
gaagttaaca gaatgatgaa acttatcatc aattcattgt ataaaaataa agagattttc      300
ctgagagaac tgatttcaaa tgcttctgat gctttagata agataaggct aatatcactg      360
actgatgaaa atgctctttc tggaaatgag gaactaacag tcaaaattaa gtgtgataag      420
gagaagaacc tgctgcatgt cacagacacc ggtgtaggaa tgaccagaga agagttggtt      480
aaaaaccttg gtaccatagc caaatctggg acaagcgagt ttttaaacaa aatgactgaa      540
gcacaggaag atggccagtc aacttctgaa ttgattggcc agtttggtgt cggtttctat      600
tccgccttcc ttgtagcaga taaggttatt gtcacttcaa aacacaacaa cgatacccag      660
cacatctggg agtctgactc caatgaattt tctgtaattg ctgacccaag aggaaacact      720
ctaggacggg gaacgacaat tacccttgtc ttaaaagaag aagcatctga ttaccttgaa      780
ttggatacaa ttaaaaatct cgtcaaaaaa tattcacagt tcataaactt tcctatttat      840
gtatggagca gcaagactga aactgttgag gagcccatgg aggaagaaga agcagccaaa      900
gaagagaaag aagaatctga tgatgaagct gcagtagagg aagaagaaga agaaaagaaa      960
ccaaagacta aaaaagttga aaaaactgtc tgggactggg aacttatgaa tgatatcaaa     1020
ccaatatggc agagaccatc aaaagaagta gaagaagatg aatacaaagc tttctacaaa     1080
tcattttcaa aggaaagtga tgaccccatg gcttatattc actttactgc tgaaggggaa     1140
gttaccttca aatcaatttt atttgtaccc acatctgctc cacgtggtct gtttgacgaa     1200
tatggatcta aaaagagcga ttacattaag ctctatgtgc gccgtgtatt catcacagac     1260
gacttccatg atatgatgcc taaatacctc aattttgtca agggtgtggt ggactcagat     1320
gatctcccct tgaatgtttc ccgcgagact cttcagcaac ataaactgct taaggtgatt     1380
aggaagaagc ttgttcgtaa aacgctggac atgatcaaga agattgctga tgataaatac     1440
aatgatactt tttggaaaga atttggtacc aacatcaagc ttggtgtgat tgaagaccac     1500
tcgaatcgaa cacgtcttgc taaacttctt aggttccagt cttctcatca tccaactgac     1560
attactagcc tagaccagta tgtggaaaga atgaaggaaa aacaagacaa aatctacttc     1620
atggctgggt ccagcagaaa agaggctgaa tcttctccat ttgttgagcg acttctgaaa     1680
aagggctatg aagttattta cctcacagaa cctgtggatg aatactgtat tcaggccctt     1740
cccgaatttg atgggaagag gttccagaat gttgccaagg aaggagtgaa gttcgatgaa     1800
agtgagaaaa ctaaggagag tcgtgaagca gttgagaaag aatttgagcc tctgctgaat     1860
tggatgaaag ataaagccct taaggacaag attgaaaagg ctgtggtgtc tcagcgcctg     1920
acagaatctc cgtgtgcttt ggtggccagc cagtacggat ggtctggcaa catggagaga     1980
atcatgaaag cacaagcgta ccaaacgggc aaggacatct ctacaaatta ctatgcgagt     2040
cagaagaaaa catttgaaat taatcccaga cacccgctga tcagagacat gcttcgacga     2100
attaaggaag atgaagatga taaaacagtt ttggatcttg ctgtggtttt gtttgaaaca     2160
gcaacgcttc ggtcagggta tcttttacca gacactaaag catatggaga tagaatagaa     2220
agaatgcttc gcctcagttt gaacattgac cctgatgcaa aggtggaaga agagcccgaa     2280
gaagaacctg aagagacagc agaagacaca acagaagaca cagagcaaga cgaagatgaa     2340
gaaatggatg tgggaacaga tgaagaagaa gaaacagcaa aggaatctac agctgaaaaa     2400
gatgaattgt aa                                                         2412
<210>  2
<211>  803
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  2
Met Arg Ala Leu Trp Val Leu Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Thr Phe
1               5                   10                  15
Gly Ser Val Arg Ala Asp Asp Glu Val Asp Val Asp Gly Thr Val Glu
20                  25                  30
Glu Asp Leu Gly Lys Ser Arg Glu Gly Ser Arg Thr Asp Asp Glu Val
35                  40                  45
Val Gln Arg Glu Glu Glu Ala Ile Gln Leu Asp Gly Leu Asn Ala Ser
50                  55                  60
Gln Ile Arg Glu Leu Arg Glu Lys Ser Glu Lys Phe Ala Phe Gln Ala
65                  70                  75                  80
Glu Val Asn Arg Met Met Lys Leu Ile Ile Asn Ser Leu Tyr Lys Asn
85                  90                  95
Lys Glu Ile Phe Leu Arg Glu Leu Ile Ser Asn Ala Ser Asp Ala Leu
100                 105                 110
Asp Lys Ile Arg Leu Ile Ser Leu Thr Asp Glu Asn Ala Leu Ser Gly
115                 120                 125
Asn Glu Glu Leu Thr Val Lys Ile Lys Cys Asp Lys Glu Lys Asn Leu
130                 135                 140
Leu His Val Thr Asp Thr Gly Val Gly Met Thr Arg Glu Glu Leu Val
145                 150                 155                 160
Lys Asn Leu Gly Thr Ile Ala Lys Ser Gly Thr Ser Glu Phe Leu Asn
165                 170                 175
Lys Met Thr Glu Ala Gln Glu Asp Gly Gln Ser Thr Ser Glu Leu Ile
180                 185                 190
Gly Gln Phe Gly Val Gly Phe Tyr Ser Ala Phe Leu Val Ala Asp Lys
195                 200                 205
Val Ile Val Thr Ser Lys His Asn Asn Asp Thr Gln His Ile Trp Glu
210                 215                 220
Ser Asp Ser Asn Glu Phe Ser Val Ile Ala Asp Pro Arg Gly Asn Thr
225                 230                 235                 240
Leu Gly Arg Gly Thr Thr Ile Thr Leu Val Leu Lys Glu Glu Ala Ser
245                 250                 255
Asp Tyr Leu Glu Leu Asp Thr Ile Lys Asn Leu Val Lys Lys Tyr Ser
260                 265                 270
Gln Phe Ile Asn Phe Pro Ile Tyr Val Trp Ser Ser Lys Thr Glu Thr
275                 280                 285
Val Glu Glu Pro Met Glu Glu Glu Glu Ala Ala Lys Glu Glu Lys Glu
290                 295                 300
Glu Ser Asp Asp Glu Ala Ala Val Glu Glu Glu Glu Glu Glu Lys Lys
305                 310                 315                 320
Pro Lys Thr Lys Lys Val Glu Lys Thr Val Trp Asp Trp Glu Leu Met
325                 330                 335
Asn Asp Ile Lys Pro Ile Trp Gln Arg Pro Ser Lys Glu Val Glu Glu
340                 345                 350
Asp Glu Tyr Lys Ala Phe Tyr Lys Ser Phe Ser Lys Glu Ser Asp Asp
355                 360                 365
Pro Met Ala Tyr Ile His Phe Thr Ala Glu Gly Glu Val Thr Phe Lys
370                 375                 380
Ser Ile Leu Phe Val Pro Thr Ser Ala Pro Arg Gly Leu Phe Asp Glu
385                 390                 395                 400
Tyr Gly Ser Lys Lys Ser Asp Tyr Ile Lys Leu Tyr Val Arg Arg Val
405                 410                 415
Phe Ile Thr Asp Asp Phe His Asp Met Met Pro Lys Tyr Leu Asn Phe
420                 425                 430
Val Lys Gly Val Val Asp Ser Asp Asp Leu Pro Leu Asn Val Ser Arg
435                 440                 445
Glu Thr Leu Gln Gln His Lys Leu Leu Lys Val Ile Arg Lys Lys Leu
450                 455                 460
Val Arg Lys Thr Leu Asp Met Ile Lys Lys Ile Ala Asp Asp Lys Tyr
465                 470                 475                 480
Asn Asp Thr Phe Trp Lys Glu Phe Gly Thr Asn Ile Lys Leu Gly Val
485                 490                 495
Ile Glu Asp His Ser Asn Arg Thr Arg Leu Ala Lys Leu Leu Arg Phe
500                 505                 510
Gln Ser Ser His His Pro Thr Asp Ile Thr Ser Leu Asp Gln Tyr Val
515                 520                 525
Glu Arg Met Lys Glu Lys Gln Asp Lys Ile Tyr Phe Met Ala Gly Ser
530                 535                 540
Ser Arg Lys Glu Ala Glu Ser Ser Pro Phe Val Glu Arg Leu Leu Lys
545                 550                 555                 560
Lys Gly Tyr Glu Val Ile Tyr Leu Thr Glu Pro Val Asp Glu Tyr Cys
565                 570                 575
Ile Gln Ala Leu Pro Glu Phe Asp Gly Lys Arg Phe Gln Asn Val Ala
580                 585                 590
Lys Glu Gly Val Lys Phe Asp Glu Ser Glu Lys Thr Lys Glu Ser Arg
595                 600                 605
Glu Ala Val Glu Lys Glu Phe Glu Pro Leu Leu Asn Trp Met Lys Asp
610                 615                 620
Lys Ala Leu Lys Asp Lys Ile Glu Lys Ala Val Val Ser Gln Arg Leu
625                 630                 635                 640
Thr Glu Ser Pro Cys Ala Leu Val Ala Ser Gln Tyr Gly Trp Ser Gly
645                 650                 655
Asn Met Glu Arg Ile Met Lys Ala Gln Ala Tyr Gln Thr Gly Lys Asp
660                 665                 670
Ile Ser Thr Asn Tyr Tyr Ala Ser Gln Lys Lys Thr Phe Glu Ile Asn
675                 680                 685
Pro Arg His Pro Leu Ile Arg Asp Met Leu Arg Arg Ile Lys Glu Asp
690                 695                 700
Glu Asp Asp Lys Thr Val Leu Asp Leu Ala Val Val Leu Phe Glu Thr
705                 710                 715                 720
Ala Thr Leu Arg Ser Gly Tyr Leu Leu Pro Asp Thr Lys Ala Tyr Gly
725                 730                 735
Asp Arg Ile Glu Arg Met Leu Arg Leu Ser Leu Asn Ile Asp Pro Asp
740                 745                 750
Ala Lys Val Glu Glu Glu Pro Glu Glu Glu Pro Glu Glu Thr Ala Glu
755                 760                 765
Asp Thr Thr Glu Asp Thr Glu Gln Asp Glu Asp Glu Glu Met Asp Val
770                 775                 780
Gly Thr Asp Glu Glu Glu Glu Thr Ala Lys Glu Ser Thr Ala Glu Lys
785                 790                 795                 800
Asp Glu Leu
<210>  3
<211>  4
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  3
Lys Asp Glu Leu
1
<210>  4
<211>  1455
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность
<400>  4
atgagactgg gaagccctgg cctgctgttt ctgctgttca gcagcctgag agccgacacc       60
caggaaaaag aagtgcgggc catggtggga agcgacgtgg aactgagctg cgcctgtcct      120
gagggcagca gattcgacct gaacgacgtg tacgtgtact ggcagaccag cgagagcaag      180
accgtcgtga cctaccacat cccccagaac agctccctgg aaaacgtgga cagccggtac      240
agaaaccggg ccctgatgtc tcctgccggc atgctgagag gcgacttcag cctgcggctg      300
ttcaacgtga ccccccagga cgagcagaaa ttccactgcc tggtgctgag ccagagcctg      360
ggcttccagg aagtgctgag cgtggaagtg accctgcacg tggccgccaa tttcagcgtg      420
ccagtggtgt ctgcccccca cagcccttct caggatgagc tgaccttcac ctgtaccagc      480
atcaacggct accccagacc caatgtgtac tggatcaaca agaccgacaa cagcctgctg      540
gaccaggccc tgcagaacga taccgtgttc ctgaacatgc ggggcctgta cgacgtggtg      600
tccgtgctga gaatcgccag aacccccagc gtgaacatcg gctgctgcat cgagaacgtg      660
ctgctgcagc agaacctgac cgtgggcagc cagaccggca acgacatcgg cgagagagac      720
aagatcaccg agaaccccgt gtccaccggc gagaagaatg ccgccacctc taagtacggc      780
cctccctgcc cttcttgccc agcccctgaa tttctgggcg gaccctccgt gtttctgttc      840
cccccaaagc ccaaggacac cctgatgatc agccggaccc ccgaagtgac ctgcgtggtg      900
gtggatgtgt cccaggaaga tcccgaggtg cagttcaatt ggtacgtgga cggggtggaa      960
gtgcacaacg ccaagaccaa gcccagagag gaacagttca acagcaccta ccgggtggtg     1020
tctgtgctga ccgtgctgca ccaggattgg ctgagcggca aagagtacaa gtgcaaggtg     1080
tccagcaagg gcctgcccag cagcatcgaa aagaccatca gcaacgccac cggccagccc     1140
agggaacccc aggtgtacac actgccccct agccaggaag agatgaccaa gaaccaggtg     1200
tccctgacct gtctcgtgaa gggcttctac ccctccgata tcgccgtgga atgggagagc     1260
aacggccagc cagagaacaa ctacaagacc acccccccag tgctggacag cgacggctca     1320
ttcttcctgt actcccggct gacagtggac aagagcagct ggcaggaagg caacgtgttc     1380
agctgcagcg tgatgcacga agccctgcac aaccactaca cccagaagtc cctgtctctg     1440
tccctgggca aatga                                                      1455
<210>  5
<211>  484
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность
<400>  5
Met Arg Leu Gly Ser Pro Gly Leu Leu Phe Leu Leu Phe Ser Ser Leu
1               5                   10                  15
Arg Ala Asp Thr Gln Glu Lys Glu Val Arg Ala Met Val Gly Ser Asp
20                  25                  30
Val Glu Leu Ser Cys Ala Cys Pro Glu Gly Ser Arg Phe Asp Leu Asn
35                  40                  45
Asp Val Tyr Val Tyr Trp Gln Thr Ser Glu Ser Lys Thr Val Val Thr
50                  55                  60
Tyr His Ile Pro Gln Asn Ser Ser Leu Glu Asn Val Asp Ser Arg Tyr
65                  70                  75                  80
Arg Asn Arg Ala Leu Met Ser Pro Ala Gly Met Leu Arg Gly Asp Phe
85                  90                  95
Ser Leu Arg Leu Phe Asn Val Thr Pro Gln Asp Glu Gln Lys Phe His
100                 105                 110
Cys Leu Val Leu Ser Gln Ser Leu Gly Phe Gln Glu Val Leu Ser Val
115                 120                 125
Glu Val Thr Leu His Val Ala Ala Asn Phe Ser Val Pro Val Val Ser
130                 135                 140
Ala Pro His Ser Pro Ser Gln Asp Glu Leu Thr Phe Thr Cys Thr Ser
145                 150                 155                 160
Ile Asn Gly Tyr Pro Arg Pro Asn Val Tyr Trp Ile Asn Lys Thr Asp
165                 170                 175
Asn Ser Leu Leu Asp Gln Ala Leu Gln Asn Asp Thr Val Phe Leu Asn
180                 185                 190
Met Arg Gly Leu Tyr Asp Val Val Ser Val Leu Arg Ile Ala Arg Thr
195                 200                 205
Pro Ser Val Asn Ile Gly Cys Cys Ile Glu Asn Val Leu Leu Gln Gln
210                 215                 220
Asn Leu Thr Val Gly Ser Gln Thr Gly Asn Asp Ile Gly Glu Arg Asp
225                 230                 235                 240
Lys Ile Thr Glu Asn Pro Val Ser Thr Gly Glu Lys Asn Ala Ala Thr
245                 250                 255
Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu
260                 265                 270
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
275                 280                 285
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
290                 295                 300
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
305                 310                 315                 320
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
325                 330                 335
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Ser
340                 345                 350
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Ser Lys Gly Leu Pro Ser Ser
355                 360                 365
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Asn Ala Thr Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
370                 375                 380
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
385                 390                 395                 400
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
405                 410                 415
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
420                 425                 430
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
435                 440                 445
Val Asp Lys Ser Ser Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
450                 455                 460
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
465                 470                 475                 480
Ser Leu Gly Lys
<210>  6
<211>  1305
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность
<400>  6
atgtctaagt acggccctcc ctgccctagc tgccctgccc ctgaatttct gggcggaccc       60
agcgtgttcc tgttcccccc aaagcccaag gacaccctga tgatcagccg gacccccgaa      120
gtgacctgcg tggtggtgga tgtgtcccag gaagatcccg aggtgcagtt caattggtac      180
gtggacggcg tggaagtgca caacgccaag accaagccca gagaggaaca gttcaacagc      240
acctaccggg tggtgtccgt gctgaccgtg ctgcaccagg attggctgag cggcaaagag      300
tacaagtgca aggtgtccag caagggcctg cccagcagca tcgagaaaac catcagcaac      360
gccaccggcc agcccaggga accccaggtg tacacactgc cccctagcca ggaagagatg      420
accaagaacc aggtgtccct gacctgtctc gtgaagggct tctacccctc cgatatcgcc      480
gtggaatggg agagcaacgg ccagcctgag aacaactaca agaccacccc cccagtgctg      540
gacagcgacg gctcattctt cctgtacagc agactgaccg tggacaagag cagctggcag      600
gaaggcaacg tgttcagctg cagcgtgatg cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag      660
aagtccctgt ctctgagcct gggcaaggcc tgtccatggg ctgtgtctgg cgctagagcc      720
tctcctggat ctgccgccag ccccagactg agagagggac ctgagctgag ccccgatgat      780
cctgccggac tgctggatct gagacagggc atgttcgccc agctggtggc ccagaacgtg      840
ctgctgatcg atggccccct gagctggtac agcgatcctg gactggctgg cgtgtcactg      900
acaggcggcc tgagctacaa agaggacacc aaagaactgg tggtggccaa ggccggcgtg      960
tactacgtgt tctttcagct ggaactgcgg agagtggtgg ccggcgaagg atccggctct     1020
gtgtctctgg ctctgcatct gcagcccctg agatctgctg ctggcgctgc tgctctggcc     1080
ctgacagtgg acctgcctcc tgcctctagc gaggccagaa acagcgcatt cgggtttcaa     1140
ggcagactgc tgcacctgtc tgccggccag agactgggag tgcatctgca cacagaggcc     1200
agagccaggc acgcctggca gctgactcag ggcgctacag tgctgggcct gttcagagtg     1260
acccccgaga ttccagccgg cctgcctagc cccagatccg aatga                     1305
<210>  7
<211>  434
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность
<400>  7
Met Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1               5                   10                  15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20                  25                  30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35                  40                  45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50                  55                  60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65                  70                  75                  80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85                  90                  95
Ser Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Ser Lys Gly Leu Pro Ser
100                 105                 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Asn Ala Thr Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115                 120                 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130                 135                 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145                 150                 155                 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165                 170                 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180                 185                 190
Thr Val Asp Lys Ser Ser Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195                 200                 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210                 215                 220
Leu Ser Leu Gly Lys Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala
225                 230                 235                 240
Ser Pro Gly Ser Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu
245                 250                 255
Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe
260                 265                 270
Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser
275                 280                 285
Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu
290                 295                 300
Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val
305                 310                 315                 320
Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu
325                 330                 335
Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser
340                 345                 350
Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala
355                 360                 365
Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu
370                 375                 380
His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala
385                 390                 395                 400
Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly
405                 410                 415
Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg
420                 425                 430
Ser Glu
<210>  8
<211>  1284
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность
<400>  8
atgtctaagt acggccctcc ctgccctagc tgccctgccc ctgaatttct gggcggaccc       60
agcgtgttcc tgttcccccc aaagcccaag gacaccctga tgatcagccg gacccccgaa      120
gtgacctgcg tggtggtgga tgtgtcccag gaagatcccg aggtgcagtt caattggtac      180
gtggacggcg tggaagtgca caacgccaag accaagccca gagaggaaca gttcaacagc      240
acctaccggg tggtgtccgt gctgaccgtg ctgcaccagg attggctgag cggcaaagag      300
tacaagtgca aggtgtccag caagggcctg cccagcagca tcgagaaaac catcagcaac      360
gccaccggcc agcccaggga accccaggtg tacacactgc cccctagcca ggaagagatg      420
accaagaacc aggtgtccct gacctgtctc gtgaagggct tctacccctc cgatatcgcc      480
gtggaatggg agagcaacgg ccagcctgag aacaactaca agaccacccc cccagtgctg      540
gacagcgacg gctcattctt cctgtacagc agactgaccg tggacaagag cagctggcag      600
gaaggcaacg tgttcagctg cagcgtgatg cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag      660
aagtccctgt ctctgagcct gggcaagatc gagggccgga tggatagagc ccagggcgaa      720
gcctgcgtgc agttccaggc tctgaagggc caggaattcg cccccagcca ccagcaggtg      780
tacgcccctc tgagagccga cggcgataag cctagagccc acctgacagt cgtgcggcag      840
acccctaccc agcacttcaa gaatcagttc cccgccctgc actgggagca cgaactgggc      900
ctggccttca ccaagaacag aatgaactac accaacaagt ttctgctgat ccccgagagc      960
ggcgactact tcatctacag ccaagtgacc ttccggggca tgaccagcga gtgcagcgag     1020
atcagacagg ccggcagacc taacaagccc gacagcatca ccgtcgtgat caccaaagtg     1080
accgacagct accccgagcc cacccagctg ctgatgggca ccaagagcgt gtgcgaagtg     1140
ggcagcaact ggttccagcc catctacctg ggcgccatgt ttagtctgca agagggcgac     1200
aagctgatgg tcaacgtgtc cgacatcagc ctggtggatt acaccaaaga ggacaagacc     1260
ttcttcggcg cctttctgct ctga                                            1284
<210>  9
<211>  427
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность
<400>  9
Met Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1               5                   10                  15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20                  25                  30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35                  40                  45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50                  55                  60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65                  70                  75                  80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85                  90                  95
Ser Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Ser Lys Gly Leu Pro Ser
100                 105                 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Asn Ala Thr Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115                 120                 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130                 135                 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145                 150                 155                 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165                 170                 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180                 185                 190
Thr Val Asp Lys Ser Ser Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195                 200                 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210                 215                 220
Leu Ser Leu Gly Lys Ile Glu Gly Arg Met Asp Arg Ala Gln Gly Glu
225                 230                 235                 240
Ala Cys Val Gln Phe Gln Ala Leu Lys Gly Gln Glu Phe Ala Pro Ser
245                 250                 255
His Gln Gln Val Tyr Ala Pro Leu Arg Ala Asp Gly Asp Lys Pro Arg
260                 265                 270
Ala His Leu Thr Val Val Arg Gln Thr Pro Thr Gln His Phe Lys Asn
275                 280                 285
Gln Phe Pro Ala Leu His Trp Glu His Glu Leu Gly Leu Ala Phe Thr
290                 295                 300
Lys Asn Arg Met Asn Tyr Thr Asn Lys Phe Leu Leu Ile Pro Glu Ser
305                 310                 315                 320
Gly Asp Tyr Phe Ile Tyr Ser Gln Val Thr Phe Arg Gly Met Thr Ser
325                 330                 335
Glu Cys Ser Glu Ile Arg Gln Ala Gly Arg Pro Asn Lys Pro Asp Ser
340                 345                 350
Ile Thr Val Val Ile Thr Lys Val Thr Asp Ser Tyr Pro Glu Pro Thr
355                 360                 365
Gln Leu Leu Met Gly Thr Lys Ser Val Cys Glu Val Gly Ser Asn Trp
370                 375                 380
Phe Gln Pro Ile Tyr Leu Gly Ala Met Phe Ser Leu Gln Glu Gly Asp
385                 390                 395                 400
Lys Leu Met Val Asn Val Ser Asp Ile Ser Leu Val Asp Tyr Thr Lys
405                 410                 415
Glu Asp Lys Thr Phe Phe Gly Ala Phe Leu Leu
420                 425
<210>  10
<211>  1107
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность
<400>  10
atgtctaagt acggccctcc ctgccctagc tgccctgccc ctgaatttct gggcggaccc       60
agcgtgttcc tgttcccccc aaagcccaag gacaccctga tgatcagccg gacccccgaa      120
gtgacctgcg tggtggtgga tgtgtcccag gaagatcccg aggtgcagtt caattggtac      180
gtggacggcg tggaagtgca caacgccaag accaagccca gagaggaaca gttcaacagc      240
acctaccggg tggtgtccgt gctgaccgtg ctgcaccagg attggctgag cggcaaagag      300
tacaagtgca aggtgtccag caagggcctg cccagcagca tcgagaaaac catcagcaac      360
gccaccggcc agcccaggga accccaggtg tacacactgc cccctagcca ggaagagatg      420
accaagaacc aggtgtccct gacctgtctc gtgaagggct tctacccctc cgatatcgcc      480
gtggaatggg agagcaacgg ccagcctgag aacaactaca agaccacccc cccagtgctg      540
gacagcgacg gctcattctt cctgtacagc agactgaccg tggacaagag cagctggcag      600
gaaggcaacg tgttcagctg cagcgtgatg cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag      660
aagtccctgt ctctgagcct gggcaagatc gagggccgga tggatcaggt gtcacacaga      720
tacccccgga tccagagcat caaagtgcag tttaccgagt acaagaaaga gaagggcttt      780
atcctgacca gccagaaaga ggacgagatc atgaaggtgc agaacaacag cgtgatcatc      840
aactgcgacg ggttctacct gatcagcctg aagggctact tcagtcagga agtgaacatc      900
agcctgcact accagaagga cgaggaaccc ctgttccagc tgaagaaagt gcggagcgtg      960
aacagcctga tggtggcctc tctgacctac aaggacaagg tgtacctgaa cgtgaccacc     1020
gacaacacca gcctggacga cttccacgtg aacggcggcg agctgatcct gattcaccag     1080
aaccccggcg agttctgcgt gctctga                                         1107
<210>  11
<211>  368
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность
<400>  11
Met Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1               5                   10                  15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20                  25                  30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35                  40                  45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50                  55                  60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65                  70                  75                  80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85                  90                  95
Ser Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Ser Lys Gly Leu Pro Ser
100                 105                 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Asn Ala Thr Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115                 120                 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130                 135                 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145                 150                 155                 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165                 170                 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180                 185                 190
Thr Val Asp Lys Ser Ser Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195                 200                 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210                 215                 220
Leu Ser Leu Gly Lys Ile Glu Gly Arg Met Asp Gln Val Ser His Arg
225                 230                 235                 240
Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val Gln Phe Thr Glu Tyr Lys Lys
245                 250                 255
Glu Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln Lys Glu Asp Glu Ile Met Lys
260                 265                 270
Val Gln Asn Asn Ser Val Ile Ile Asn Cys Asp Gly Phe Tyr Leu Ile
275                 280                 285
Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser Gln Glu Val Asn Ile Ser Leu His Tyr
290                 295                 300
Gln Lys Asp Glu Glu Pro Leu Phe Gln Leu Lys Lys Val Arg Ser Val
305                 310                 315                 320
Asn Ser Leu Met Val Ala Ser Leu Thr Tyr Lys Asp Lys Val Tyr Leu
325                 330                 335
Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu Asp Asp Phe His Val Asn Gly
340                 345                 350
Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn Pro Gly Glu Phe Cys Val Leu
355                 360                 365
<210>  12
<211>  1588
<212>  ДНК
<213>  Homo sapiens
<400>  12
tcccaagtag ctgggactac aggagcccac caccaccccc ggctaatttt ttgtattttt       60
agtagagacg gggtttcacc gtgttagcca agatggtctt gatcacctga cctcgtgatc      120
cacccgcctt ggcctcccaa agtgctggga ttacaggcat gagccaccgc gcccggcctc      180
cattcaagtc tttattgaat atctgctatg ttctacacac tgttctaggt gctggggatg      240
caacagggga caaaataggc aaaatccctg tccttttggg gttgacattc tagtgactct      300
tcatgtagtc tagaagaagc tcagtgaata gtgtctgtgg ttgttaccag ggacacaatg      360
acaggaacat tcttgggtag agtgagaggc ctggggaggg aagggtctct aggatggagc      420
agatgctggg cagtcttagg gagcccctcc tggcatgcac cccctcatcc ctcaggccac      480
ccccgtccct tgcaggagca ccctggggag ctgtccagag cgctgtgccg ctgtctgtgg      540
ctggaggcag agtaggtggt gtgctgggaa tgcgagtggg agaactggga tggaccgagg      600
ggaggcgggt gaggaggggg gcaaccaccc aacacccacc agctgctttc agtgttctgg      660
gtccaggtgc tcctggctgg ccttgtggtc cccctcctgc ttggggccac cctgacctac      720
acataccgcc actgctggcc tcacaagccc ctggttactg cagatgaagc tgggatggag      780
gctctgaccc caccaccggc cacccatctg tcacccttgg acagcgccca cacccttcta      840
gcacctcctg acagcagtga gaagatctgc accgtccagt tggtgggtaa cagctggacc      900
cctggctacc ccgagaccca ggaggcgctc tgcccgcagg tgacatggtc ctgggaccag      960
ttgcccagca gagctcttgg ccccgctgct gcgcccacac tctcgccaga gtccccagcc     1020
ggctcgccag ccatgatgct gcagccgggc ccgcagctct acgacgtgat ggacgcggtc     1080
ccagcgcggc gctggaagga gttcgtgcgc acgctggggc tgcgcgaggc agagatcgaa     1140
gccgtggagg tggagatcgg ccgcttccga gaccagcagt acgagatgct caagcgctgg     1200
cgccagcagc agcccgcggg cctcggagcc gtttacgcgg ccctggagcg catggggctg     1260
gacggctgcg tggaagactt gcgcagccgc ctgcagcgcg gcccgtgaca cggcgcccac     1320
ttgccaccta ggcgctctgg tggcccttgc agaagcccta agtacggtta cttatgcgtg     1380
tagacatttt atgtcactta ttaagccgct ggcacggccc tgcgtagcag caccagccgg     1440
ccccacccct gctcgcccct atcgctccag ccaaggcgaa gaagcacgaa cgaatgtcga     1500
gagggggtga agacatttct caacttctcg gccggagttt ggctgagatc gcggtattaa     1560
atctgtgaaa gaaaacaaaa caaaacaa                                        1588
<210>  13
<211>  426
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  13
Met Glu Gln Arg Pro Arg Gly Cys Ala Ala Val Ala Ala Ala Leu Leu
1               5                   10                  15
Leu Val Leu Leu Gly Ala Arg Ala Gln Gly Gly Thr Arg Ser Pro Arg
20                  25                  30
Cys Asp Cys Ala Gly Asp Phe His Lys Lys Ile Gly Leu Phe Cys Cys
35                  40                  45
Arg Gly Cys Pro Ala Gly His Tyr Leu Lys Ala Pro Cys Thr Glu Pro
50                  55                  60
Cys Gly Asn Ser Thr Cys Leu Val Cys Pro Gln Asp Thr Phe Leu Ala
65                  70                  75                  80
Trp Glu Asn His His Asn Ser Glu Cys Ala Arg Cys Gln Ala Cys Asp
85                  90                  95
Glu Gln Ala Ser Gln Val Ala Leu Glu Asn Cys Ser Ala Val Ala Asp
100                 105                 110
Thr Arg Cys Gly Cys Lys Pro Gly Trp Phe Val Glu Cys Gln Val Ser
115                 120                 125
Gln Cys Val Ser Ser Ser Pro Phe Tyr Cys Gln Pro Cys Leu Asp Cys
130                 135                 140
Gly Ala Leu His Arg His Thr Arg Leu Leu Cys Ser Arg Arg Asp Thr
145                 150                 155                 160
Asp Cys Gly Thr Cys Leu Pro Gly Phe Tyr Glu His Gly Asp Gly Cys
165                 170                 175
Val Ser Cys Pro Thr Pro Pro Pro Ser Leu Ala Gly Ala Pro Trp Gly
180                 185                 190
Ala Val Gln Ser Ala Val Pro Leu Ser Val Ala Gly Gly Arg Val Gly
195                 200                 205
Val Phe Trp Val Gln Val Leu Leu Ala Gly Leu Val Val Pro Leu Leu
210                 215                 220
Leu Gly Ala Thr Leu Thr Tyr Thr Tyr Arg His Cys Trp Pro His Lys
225                 230                 235                 240
Pro Leu Val Thr Ala Asp Glu Ala Gly Met Glu Ala Leu Thr Pro Pro
245                 250                 255
Pro Ala Thr His Leu Ser Pro Leu Asp Ser Ala His Thr Leu Leu Ala
260                 265                 270
Pro Pro Asp Ser Ser Glu Lys Ile Cys Thr Val Gln Leu Val Gly Asn
275                 280                 285
Ser Trp Thr Pro Gly Tyr Pro Glu Thr Gln Glu Ala Leu Cys Pro Gln
290                 295                 300
Val Thr Trp Ser Trp Asp Gln Leu Pro Ser Arg Ala Leu Gly Pro Ala
305                 310                 315                 320
Ala Ala Pro Thr Leu Ser Pro Glu Ser Pro Ala Gly Ser Pro Ala Met
325                 330                 335
Met Leu Gln Pro Gly Pro Gln Leu Tyr Asp Val Met Asp Ala Val Pro
340                 345                 350
Ala Arg Arg Trp Lys Glu Phe Val Arg Thr Leu Gly Leu Arg Glu Ala
355                 360                 365
Glu Ile Glu Ala Val Glu Val Glu Ile Gly Arg Phe Arg Asp Gln Gln
370                 375                 380
Tyr Glu Met Leu Lys Arg Trp Arg Gln Gln Gln Pro Ala Gly Leu Gly
385                 390                 395                 400
Ala Val Tyr Ala Ala Leu Glu Arg Met Gly Leu Asp Gly Cys Val Glu
405                 410                 415
Asp Leu Arg Ser Arg Leu Gln Arg Gly Pro
420                 425
<210>  14
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность
<400>  14
ctgccacggc acagtcattg                                                   20
<210>  15
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность
<400>  15
gccagttcct ccagatatcc                                                   20
<210>  16
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность
<400>  16
ccacgctctt ctgtctactg                                                   20
<210>  17
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность
<400>  17
gccatagaac tgatgagagg g                                                 21
<210>  18
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность
<400>  18
ctactgctga ccttgtctct g                                                 21
<210>  19
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность
<400>  19
agtaaggcca tgtagggtcg                                                   20
<210>  20
<211>  24
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность
<400>  20
ctgcggcatg ttctggattt gact                                              24
<210>  21
<211>  24
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность
<400>  21
agtccaccac agttgctgac tcat                                              24
<210>  22
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность
<400>  22
gacacagtag agtgtcgcat g                                                 21
<210>  23
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность
<400>  23
aagcatgctc tgtggagctg                                                   20
<210>  24
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность
<400>  24
aaggccaacc gtgaaaagat                                                   20
<210>  25
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность
<400>  25
gtggtacgac cagaggcata c                                                 21
<210>  26
<211>  5
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность
<400>  26
Gly Gly Gly Gly Ser
1               5
<210>  27
<211>  5
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность
<400>  27
Gly Gly Gly Gly Ser
1               5
<210>  28
<211>  8
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность
<400>  28
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1               5
<210>  29
<211>  6
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность
<400>  29
Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1               5
<210>  30
<211>  5
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность
<400>  30
Glu Ala Ala Ala Lys
1               5
<210>  31
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность
<400>  31
Ala Glu Ala Ala Ala Lys Ala
1               5
<210>  32
<211>  12
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность
<400>  32
Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala
1               5                   10
<210>  33
<211>  46
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность
<400>  33
Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys
1               5                   10                  15
Glu Ala Ala Ala Lys Ala Leu Glu Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala
20                  25                  30
Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala
35                  40                  45
<210>  34
<211>  5
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность
<400>  34
Pro Ala Pro Ala Pro
1               5
<210>  35
<211>  18
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность
<400>  35
Lys Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu Gln Leu Ala Gln Phe Arg Ser
1               5                   10                  15
Leu Asp
<210>  36
<211>  14
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность
<400>  36
Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr
1               5                   10
<210>  37
<211>  12
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая последовательность
<400>  37
Gly Ser Ala Gly Ser Ala Ala Gly Ser Gly Glu Phe
1               5                   10
<210>  38
<211>  852
<212>  ДНК
<213>  Homo sapiens
<400>  38
atggagcctc ctggagactg ggggcctcct ccctggagat ccacccccaa aaccgacgtc       60
ttgaggctgg tgctgtatct caccttcctg ggagccccct gctacgcccc agctctgccg      120
tcctgcaagg aggacgagta cccagtgggc tccgagtgct gccccaagtg cagtccaggt      180
tatcgtgtga aggaggcctg cggggagctg acgggcacag tgtgtgaacc ctgccctcca      240
ggcacctaca ttgcccacct caatggccta agcaagtgtc tgcagtgcca aatgtgtgac      300
ccagccatgg gcctgcgcgc gagccggaac tgctccagga cagagaacgc cgtgtgtggc      360
tgcagcccag gccacttctg catcgtccag gacggggacc actgcgccgc gtgccgcgct      420
tacgccacct ccagcccggg ccagagggtg cagaagggag gcaccgagag tcaggacacc      480
ctgtgtcaga actgcccccc ggggaccttc tctcccaatg ggaccctgga ggaatgtcag      540
caccagacca agtgcagctg gctggtgacg aaggccggag ctgggaccag cagctcccac      600
tgggtatggt ggtttctctc agggagcctc gtcatcgtca ttgtttgctc cacagttggc      660
ctaatcatat gtgtgaaaag aagaaagcca aggggtgatg tagtcaaggt gatcgtctcc      720
gtccagcgga aaagacagga ggcagaaggt gaggccacag tcattgaggc cctgcaggcc      780
cctccggacg tcaccacggt ggccgtggag gagacaatac cctcattcac ggggaggagc      840
ccaaaccatt aa                                                          852
<210>  39
<211>  283
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  39
Met Glu Pro Pro Gly Asp Trp Gly Pro Pro Pro Trp Arg Ser Thr Pro
1               5                   10                  15
Lys Thr Asp Val Leu Arg Leu Val Leu Tyr Leu Thr Phe Leu Gly Ala
20                  25                  30
Pro Cys Tyr Ala Pro Ala Leu Pro Ser Cys Lys Glu Asp Glu Tyr Pro
35                  40                  45
Val Gly Ser Glu Cys Cys Pro Lys Cys Ser Pro Gly Tyr Arg Val Lys
50                  55                  60
Glu Ala Cys Gly Glu Leu Thr Gly Thr Val Cys Glu Pro Cys Pro Pro
65                  70                  75                  80
Gly Thr Tyr Ile Ala His Leu Asn Gly Leu Ser Lys Cys Leu Gln Cys
85                  90                  95
Gln Met Cys Asp Pro Ala Met Gly Leu Arg Ala Ser Arg Asn Cys Ser
100                 105                 110
Arg Thr Glu Asn Ala Val Cys Gly Cys Ser Pro Gly His Phe Cys Ile
115                 120                 125
Val Gln Asp Gly Asp His Cys Ala Ala Cys Arg Ala Tyr Ala Thr Ser
130                 135                 140
Ser Pro Gly Gln Arg Val Gln Lys Gly Gly Thr Glu Ser Gln Asp Thr
145                 150                 155                 160
Leu Cys Gln Asn Cys Pro Pro Gly Thr Phe Ser Pro Asn Gly Thr Leu
165                 170                 175
Glu Glu Cys Gln His Gln Thr Lys Cys Ser Trp Leu Val Thr Lys Ala
180                 185                 190
Gly Ala Gly Thr Ser Ser Ser His Trp Val Trp Trp Phe Leu Ser Gly
195                 200                 205
Ser Leu Val Ile Val Ile Val Cys Ser Thr Val Gly Leu Ile Ile Cys
210                 215                 220
Val Lys Arg Arg Lys Pro Arg Gly Asp Val Val Lys Val Ile Val Ser
225                 230                 235                 240
Val Gln Arg Lys Arg Gln Glu Ala Glu Gly Glu Ala Thr Val Ile Glu
245                 250                 255
Ala Leu Gln Ala Pro Pro Asp Val Thr Thr Val Ala Val Glu Glu Thr
260                 265                 270
Ile Pro Ser Phe Thr Gly Arg Ser Pro Asn His
275                 280
<210>  40
<211>  4900
<212>  ДНК
<213>  Homo sapiens
<400>  40
taaagtcatc aaaacaacgt tatatcctgt gtgaaatgct gcagtcagga tgccttgtgg       60
tttgagtgcc ttgatcatgt gccctaaggg gatggtggcg gtggtggtgg ccgtggatga      120
cggagactct caggccttgg caggtgcgtc tttcagttcc cctcacactt cgggttcctc      180
ggggaggagg ggctggaacc ctagcccatc gtcaggacaa agatgctcag gctgctcttg      240
gctctcaact tattcccttc aattcaagta acaggaaaca agattttggt gaagcagtcg      300
cccatgcttg tagcgtacga caatgcggtc aaccttagct gcaagtattc ctacaatctc      360
ttctcaaggg agttccgggc atcccttcac aaaggactgg atagtgctgt ggaagtctgt      420
gttgtatatg ggaattactc ccagcagctt caggtttact caaaaacggg gttcaactgt      480
gatgggaaat tgggcaatga atcagtgaca ttctacctcc agaatttgta tgttaaccaa      540
acagatattt acttctgcaa aattgaagtt atgtatcctc ctccttacct agacaatgag      600
aagagcaatg gaaccattat ccatgtgaaa gggaaacacc tttgtccaag tcccctattt      660
cccggacctt ctaagccctt ttgggtgctg gtggtggttg gtggagtcct ggcttgctat      720
agcttgctag taacagtggc ctttattatt ttctgggtga ggagtaagag gagcaggctc      780
ctgcacagtg actacatgaa catgactccc cgccgccccg ggcccacccg caagcattac      840
cagccctatg ccccaccacg cgacttcgca gcctatcgct cctgacacgg acgcctatcc      900
agaagccagc cggctggcag cccccatctg ctcaatatca ctgctctgga taggaaatga      960
ccgccatctc cagccggcca cctcaggccc ctgttgggcc accaatgcca atttttctcg     1020
agtgactaga ccaaatatca agatcatttt gagactctga aatgaagtaa aagagatttc     1080
ctgtgacagg ccaagtctta cagtgccatg gcccacattc caacttacca tgtacttagt     1140
gacttgactg agaagttagg gtagaaaaca aaaagggagt ggattctggg agcctcttcc     1200
ctttctcact cacctgcaca tctcagtcaa gcaaagtgtg gtatccacag acattttagt     1260
tgcagaagaa aggctaggaa atcattcctt ttggttaaat gggtgtttaa tcttttggtt     1320
agtgggttaa acggggtaag ttagagtagg gggagggata ggaagacata tttaaaaacc     1380
attaaaacac tgtctcccac tcatgaaatg agccacgtag ttcctattta atgctgtttt     1440
cctttagttt agaaatacat agacattgtc ttttatgaat tctgatcata tttagtcatt     1500
ttgaccaaat gagggatttg gtcaaatgag ggattccctc aaagcaatat caggtaaacc     1560
aagttgcttt cctcactccc tgtcatgaga cttcagtgtt aatgttcaca atatactttc     1620
gaaagaataa aatagttctc ctacatgaag aaagaatatg tcaggaaata aggtcacttt     1680
atgtcaaaat tatttgagta ctatgggacc tggcgcagtg gctcatgctt gtaatcccag     1740
cactttggga ggccgaggtg ggcagatcac ttgagatcag gaccagcctg gtcaagatgg     1800
tgaaactccg tctgtactaa aaatacaaaa tttagcttgg cctggtggca ggcacctgta     1860
atcccagctg cccaagaggc tgaggcatga gaatcgcttg aacctggcag gcggaggttg     1920
cagtgagccg agatagtgcc acagctctcc agcctgggcg acagagtgag actccatctc     1980
aaacaacaac aacaacaaca acaacaacaa caaaccacaa aattatttga gtactgtgaa     2040
ggattatttg tctaacagtt cattccaatc agaccaggta ggagctttcc tgtttcatat     2100
gtttcagggt tgcacagttg gtctctttaa tgtcggtgtg gagatccaaa gtgggttgtg     2160
gaaagagcgt ccataggaga agtgagaata ctgtgaaaaa gggatgttag cattcattag     2220
agtatgagga tgagtcccaa gaaggttctt tggaaggagg acgaatagaa tggagtaatg     2280
aaattcttgc catgtgctga ggagatagcc agcattaggt gacaatcttc cagaagtggt     2340
caggcagaag gtgccctggt gagagctcct ttacagggac tttatgtggt ttagggctca     2400
gagctccaaa actctgggct cagctgctcc tgtaccttgg aggtccattc acatgggaaa     2460
gtattttgga atgtgtcttt tgaagagagc atcagagttc ttaagggact gggtaaggcc     2520
tgaccctgaa atgaccatgg atatttttct acctacagtt tgagtcaact agaatatgcc     2580
tggggacctt gaagaatggc ccttcagtgg ccctcaccat ttgttcatgc ttcagttaat     2640
tcaggtgttg aaggagctta ggttttagag gcacgtagac ttggttcaag tctcgttagt     2700
agttgaatag cctcaggcaa gtcactgccc acctaagatg atggttcttc aactataaaa     2760
tggagataat ggttacaaat gtctcttcct atagtataat ctccataagg gcatggccca     2820
agtctgtctt tgactctgcc tatccctgac atttagtagc atgcccgaca tacaatgtta     2880
gctattggta ttattgccat atagataaat tatgtataaa aattaaactg ggcaatagcc     2940
taagaagggg ggaatattgt aacacaaatt taaacccact acgcagggat gaggtgctat     3000
aatatgagga ccttttaact tccatcattt tcctgtttct tgaaatagtt tatcttgtaa     3060
tgaaatataa ggcacctccc acttttatgt atagaaagag gtcttttaat ttttttttaa     3120
tgtgagaagg aagggaggag taggaatctt gagattccag atcgaaaata ctgtactttg     3180
gttgattttt aagtgggctt ccattccatg gatttaatca gtcccaagaa gatcaaactc     3240
agcagtactt gggtgctgaa gaactgttgg atttaccctg gcacgtgtgc cacttgccag     3300
cttcttgggc acacagagtt cttcaatcca agttatcaga ttgtatttga aaatgacaga     3360
gctggagagt tttttgaaat ggcagtggca aataaataaa tacttttttt taaatggaaa     3420
gacttgatct atggtaataa atgattttgt tttctgactg gaaaaatagg cctactaaag     3480
atgaatcaca cttgagatgt ttcttactca ctctgcacag aaacaaagaa gaaatgttat     3540
acagggaagt ccgttttcac tattagtatg aaccaagaaa tggttcaaaa acagtggtag     3600
gagcaatgct ttcatagttt cagatatggt agttatgaag aaaacaatgt catttgctgc     3660
tattattgta agagtcttat aattaatggt actcctataa tttttgattg tgagctcacc     3720
tatttgggtt aagcatgcca atttaaagag accaagtgta tgtacattat gttctacata     3780
ttcagtgata aaattactaa actactatat gtctgcttta aatttgtact ttaatattgt     3840
cttttggtat taagaaagat atgctttcag aatagatatg cttcgctttg gcaaggaatt     3900
tggatagaac ttgctattta aaagaggtgt ggggtaaatc cttgtataaa tctccagttt     3960
agcctttttt gaaaaagcta gactttcaaa tactaatttc acttcaagca gggtacgttt     4020
ctggtttgtt tgcttgactt cagtcacaat ttcttatcag accaatggct gacctctttg     4080
agatgtcagg ctaggcttac ctatgtgttc tgtgtcatgt gaatgctgag aagtttgaca     4140
gagatccaac ttcagccttg accccatcag tccctcgggt taactaactg agccaccggt     4200
cctcatggct attttaatga gggtattgat ggttaaatgc atgtctgatc ccttatccca     4260
gccatttgca ctgccagctg ggaactatac cagacctgga tactgatccc aaagtgttaa     4320
attcaactac atgctggaga ttagagatgg tgccaataaa ggacccagaa ccaggatctt     4380
gattgctata gacttattaa taatccaggt caaagagagt gacacacact ctctcaagac     4440
ctggggtgag ggagtctgtg ttatctgcaa ggccatttga ggctcagaaa gtctctcttt     4500
cctatagata tatgcatact ttctgacata taggaatgta tcaggaatac tcaaccatca     4560
caggcatgtt cctacctcag ggcctttaca tgtcctgttt actctgtcta gaatgtcctt     4620
ctgtagatga cctggcttgc ctcgtcaccc ttcaggtcct tgctcaagtg tcatcttctc     4680
ccctagttaa actaccccac accctgtctg ctttccttgc ttatttttct ccatagcatt     4740
ttaccatctc ttacattaga catttttctt atttatttgt agtttataag cttcatgagg     4800
caagtaactt tgctttgttt cttgctgtat ctccagtgcc cagagcagtg cctggtatat     4860
aataaatatt tattgactga gtgaaaaaaa aaaaaaaaaa                           4900
<210>  41
<211>  220
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  41
Met Leu Arg Leu Leu Leu Ala Leu Asn Leu Phe Pro Ser Ile Gln Val
1               5                   10                  15
Thr Gly Asn Lys Ile Leu Val Lys Gln Ser Pro Met Leu Val Ala Tyr
20                  25                  30
Asp Asn Ala Val Asn Leu Ser Cys Lys Tyr Ser Tyr Asn Leu Phe Ser
35                  40                  45
Arg Glu Phe Arg Ala Ser Leu His Lys Gly Leu Asp Ser Ala Val Glu
50                  55                  60
Val Cys Val Val Tyr Gly Asn Tyr Ser Gln Gln Leu Gln Val Tyr Ser
65                  70                  75                  80
Lys Thr Gly Phe Asn Cys Asp Gly Lys Leu Gly Asn Glu Ser Val Thr
85                  90                  95
Phe Tyr Leu Gln Asn Leu Tyr Val Asn Gln Thr Asp Ile Tyr Phe Cys
100                 105                 110
Lys Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser
115                 120                 125
Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro
130                 135                 140
Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly
145                 150                 155                 160
Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile
165                 170                 175
Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met
180                 185                 190
Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro
195                 200                 205
Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
210                 215                 220
<210>  42
<211>  1906
<212>  ДНК
<213>  Homo sapiens
<400>  42
ccaagtcaca tgattcagga ttcaggggga gaatccttct tggaacagag atgggcccag       60
aactgaatca gatgaagaga gataaggtgt gatgtgggga agactatata aagaatggac      120
ccagggctgc agcaagcact caacggaatg gcccctcctg gagacacagc catgcatgtg      180
ccggcgggct ccgtggccag ccacctgggg accacgagcc gcagctattt ctatttgacc      240
acagccactc tggctctgtg ccttgtcttc acggtggcca ctattatggt gttggtcgtt      300
cagaggacgg actccattcc caactcacct gacaacgtcc ccctcaaagg aggaaattgc      360
tcagaagacc tcttatgtat cctgaaaaga gctccattca agaagtcatg ggcctacctc      420
caagtggcaa agcatctaaa caaaaccaag ttgtcttgga acaaagatgg cattctccat      480
ggagtcagat atcaggatgg gaatctggtg atccaattcc ctggtttgta cttcatcatt      540
tgccaactgc agtttcttgt acaatgccca aataattctg tcgatctgaa gttggagctt      600
ctcatcaaca agcatatcaa aaaacaggcc ctggtgacag tgtgtgagtc tggaatgcaa      660
acgaaacacg tataccagaa tctctctcaa ttcttgctgg attacctgca ggtcaacacc      720
accatatcag tcaatgtgga tacattccag tacatagata caagcacctt tcctcttgag      780
aatgtgttgt ccatcttctt atacagtaat tcagactgaa cagtttctct tggccttcag      840
gaagaaagcg cctctctacc atacagtatt tcatccctcc aaacacttgg gcaaaaagaa      900
aactttagac caagacaaac tacacagggt attaaatagt atacttctcc ttctgtctct      960
tggaaagata cagctccagg gttaaaaaga gagtttttag tgaagtatct ttcagatagc     1020
aggcagggaa gcaatgtagt gtggtgggca gagccccaca cagaatcaga agggatgaat     1080
ggatgtccca gcccaaccac taattcactg tatggtcttg atctatttct tctgttttga     1140
gagcctccag ttaaaatggg gcttcagtac cagagcagct agcaactctg ccctaatggg     1200
aaatgaaggg gagctgggtg tgagtgttta cactgtgccc ttcacgggat acttctttta     1260
tctgcagatg gcctaatgct tagttgtcca agtcgcgatc aaggactctc tcacacagga     1320
aacttcccta tactggcaga tacacttgtg actgaaccat gcccagttta tgcctgtctg     1380
actgtcactc tggcactagg aggctgatct tgtactccat atgaccccac ccctaggaac     1440
ccccagggaa aaccaggctc ggacagcccc ctgttcctga gatggaaagc acaaatttaa     1500
tacaccacca caatggaaaa caagttcaaa gacttttact tacagatcct ggacagaaag     1560
ggcataatga gtctgaaggg cagtcctcct tctccaggtt acatgaggca ggaataagaa     1620
gtcagacaga gacagcaaga cagttaacaa cgtaggtaaa gaaatagggt gtggtcactc     1680
tcaattcact ggcaaatgcc tgaatggtct gtctgaagga agcaacagag aagtggggaa     1740
tccagtctgc taggcaggaa agatgcctct aagttcttgt ctctggccag aggtgtggta     1800
tagaaccaga aacccatatc aagggtgact aagcccggct tccggtatga gaaattaaac     1860
ttgtatacaa aatggttgcc aaggcaacat aaaattataa gaattc                    1906
<210>  43
<211>  234
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  43
Met Asp Pro Gly Leu Gln Gln Ala Leu Asn Gly Met Ala Pro Pro Gly
1               5                   10                  15
Asp Thr Ala Met His Val Pro Ala Gly Ser Val Ala Ser His Leu Gly
20                  25                  30
Thr Thr Ser Arg Ser Tyr Phe Tyr Leu Thr Thr Ala Thr Leu Ala Leu
35                  40                  45
Cys Leu Val Phe Thr Val Ala Thr Ile Met Val Leu Val Val Gln Arg
50                  55                  60
Thr Asp Ser Ile Pro Asn Ser Pro Asp Asn Val Pro Leu Lys Gly Gly
65                  70                  75                  80
Asn Cys Ser Glu Asp Leu Leu Cys Ile Leu Lys Arg Ala Pro Phe Lys
85                  90                  95
Lys Ser Trp Ala Tyr Leu Gln Val Ala Lys His Leu Asn Lys Thr Lys
100                 105                 110
Leu Ser Trp Asn Lys Asp Gly Ile Leu His Gly Val Arg Tyr Gln Asp
115                 120                 125
Gly Asn Leu Val Ile Gln Phe Pro Gly Leu Tyr Phe Ile Ile Cys Gln
130                 135                 140
Leu Gln Phe Leu Val Gln Cys Pro Asn Asn Ser Val Asp Leu Lys Leu
145                 150                 155                 160
Glu Leu Leu Ile Asn Lys His Ile Lys Lys Gln Ala Leu Val Thr Val
165                 170                 175
Cys Glu Ser Gly Met Gln Thr Lys His Val Tyr Gln Asn Leu Ser Gln
180                 185                 190
Phe Leu Leu Asp Tyr Leu Gln Val Asn Thr Thr Ile Ser Val Asn Val
195                 200                 205
Asp Thr Phe Gln Tyr Ile Asp Thr Ser Thr Phe Pro Leu Glu Asn Val
210                 215                 220
Leu Ser Ile Phe Leu Tyr Ser Asn Ser Asp
225                 230
<210>  44
<211>  1629
<212>  ДНК
<213>  Homo sapiens
<400>  44
tttcctgggc ggggccaagg ctggggcagg ggagtcagca gaggcctcgc tcgggcgccc       60
agtggtcctg ccgcctggtc tcacctcgct atggttcgtc tgcctctgca gtgcgtcctc      120
tggggctgct tgctgaccgc tgtccatcca gaaccaccca ctgcatgcag agaaaaacag      180
tacctaataa acagtcagtg ctgttctttg tgccagccag gacagaaact ggtgagtgac      240
tgcacagagt tcactgaaac ggaatgcctt ccttgcggtg aaagcgaatt cctagacacc      300
tggaacagag agacacactg ccaccagcac aaatactgcg accccaacct agggcttcgg      360
gtccagcaga agggcacctc agaaacagac accatctgca cctgtgaaga aggctggcac      420
tgtacgagtg aggcctgtga gagctgtgtc ctgcaccgct catgctcgcc cggctttggg      480
gtcaagcaga ttgctacagg ggtttctgat accatctgcg agccctgccc agtcggcttc      540
ttctccaatg tgtcatctgc tttcgaaaaa tgtcaccctt ggacaagctg tgagaccaaa      600
gacctggttg tgcaacaggc aggcacaaac aagactgatg ttgtctgtgg tccccaggat      660
cggctgagag ccctggtggt gatccccatc atcttcggga tcctgtttgc catcctcttg      720
gtgctggtct ttatcaaaaa ggtggccaag aagccaacca ataaggcccc ccaccccaag      780
caggaacccc aggagatcaa ttttcccgac gatcttcctg gctccaacac tgctgctcca      840
gtgcaggaga ctttacatgg atgccaaccg gtcacccagg aggatggcaa agagagtcgc      900
atctcagtgc aggagagaca gtgaggctgc acccacccag gagtgtggcc acgtgggcaa      960
acaggcagtt ggccagagag cctggtgctg ctgctgctgt ggcgtgaggg tgaggggctg     1020
gcactgactg ggcatagctc cccgcttctg cctgcacccc tgcagtttga gacaggagac     1080
ctggcactgg atgcagaaac agttcacctt gaagaacctc tcacttcacc ctggagccca     1140
tccagtctcc caacttgtat taaagacaga ggcagaagtt tggtggtggt ggtgttgggg     1200
tatggtttag taatatccac cagaccttcc gatccagcag tttggtgccc agagaggcat     1260
catggtggct tccctgcgcc caggaagcca tatacacaga tgcccattgc agcattgttt     1320
gtgatagtga acaactggaa gctgcttaac tgtccatcag caggagactg gctaaataaa     1380
attagaatat atttatacaa cagaatctca aaaacactgt tgagtaagga aaaaaaggca     1440
tgctgctgaa tgatgggtat ggaacttttt aaaaaagtac atgcttttat gtatgtatat     1500
tgcctatgga tatatgtata aatacaatat gcatcatata ttgatataac aagggttctg     1560
gaagggtaca cagaaaaccc acagctcgaa gagtggtgac gtctggggtg gggaagaagg     1620
gtctggggg                                                             1629
<210>  45
<211>  277
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  45
Met Val Arg Leu Pro Leu Gln Cys Val Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr
1               5                   10                  15
Ala Val His Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu
20                  25                  30
Ile Asn Ser Gln Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val
35                  40                  45
Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu
50                  55                  60
Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gln His
65                  70                  75                  80
Lys Tyr Cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr
85                  90                  95
Ser Glu Thr Asp Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr
100                 105                 110
Ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly
115                 120                 125
Phe Gly Val Lys Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu
130                 135                 140
Pro Cys Pro Val Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys
145                 150                 155                 160
Cys His Pro Trp Thr Ser Cys Glu Thr Lys Asp Leu Val Val Gln Gln
165                 170                 175
Ala Gly Thr Asn Lys Thr Asp Val Val Cys Gly Pro Gln Asp Arg Leu
180                 185                 190
Arg Ala Leu Val Val Ile Pro Ile Ile Phe Gly Ile Leu Phe Ala Ile
195                 200                 205
Leu Leu Val Leu Val Phe Ile Lys Lys Val Ala Lys Lys Pro Thr Asn
210                 215                 220
Lys Ala Pro His Pro Lys Gln Glu Pro Gln Glu Ile Asn Phe Pro Asp
225                 230                 235                 240
Asp Leu Pro Gly Ser Asn Thr Ala Ala Pro Val Gln Glu Thr Leu His
245                 250                 255
Gly Cys Gln Pro Val Thr Gln Glu Asp Gly Lys Glu Ser Arg Ile Ser
260                 265                 270
Val Gln Glu Arg Gln
275
<210>  46
<211>  913
<212>  ДНК
<213>  Homo sapiens
<400>  46
ccagagaggg gcaggctggt cccctgacag gttgaagcaa gtagacgccc aggagccccg       60
ggagggggct gcagtttcct tccttccttc tcggcagcgc tccgcgcccc catcgcccct      120
cctgcgctag cggaggtgat cgccgcggcg atgccggagg agggttcggg ctgctcggtg      180
cggcgcaggc cctatgggtg cgtcctgcgg gctgctttgg tcccattggt cgcgggcttg      240
gtgatctgcc tcgtggtgtg catccagcgc ttcgcacagg ctcagcagca gctgccgctc      300
gagtcacttg ggtgggacgt agctgagctg cagctgaatc acacaggacc tcagcaggac      360
cccaggctat actggcaggg gggcccagca ctgggccgct ccttcctgca tggaccagag      420
ctggacaagg ggcagctacg tatccatcgt gatggcatct acatggtaca catccaggtg      480
acgctggcca tctgctcctc cacgacggcc tccaggcacc accccaccac cctggccgtg      540
ggaatctgct ctcccgcctc ccgtagcatc agcctgctgc gtctcagctt ccaccaaggt      600
tgtaccattg cctcccagcg cctgacgccc ctggcccgag gggacacact ctgcaccaac      660
ctcactggga cacttttgcc ttcccgaaac actgatgaga ccttctttgg agtgcagtgg      720
gtgcgcccct gaccactgct gctgattagg gttttttaaa ttttatttta ttttatttaa      780
gttcaagaga aaaagtgtac acacaggggc cacccggggt tggggtggga gtgtggtggg      840
gggtagtggt ggcaggacaa gagaaggcat tgagcttttt ctttcatttt cctattaaaa      900
aatacaaaaa tca                                                         913
<210>  47
<211>  193
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  47
Met Pro Glu Glu Gly Ser Gly Cys Ser Val Arg Arg Arg Pro Tyr Gly
1               5                   10                  15
Cys Val Leu Arg Ala Ala Leu Val Pro Leu Val Ala Gly Leu Val Ile
20                  25                  30
Cys Leu Val Val Cys Ile Gln Arg Phe Ala Gln Ala Gln Gln Gln Leu
35                  40                  45
Pro Leu Glu Ser Leu Gly Trp Asp Val Ala Glu Leu Gln Leu Asn His
50                  55                  60
Thr Gly Pro Gln Gln Asp Pro Arg Leu Tyr Trp Gln Gly Gly Pro Ala
65                  70                  75                  80
Leu Gly Arg Ser Phe Leu His Gly Pro Glu Leu Asp Lys Gly Gln Leu
85                  90                  95
Arg Ile His Arg Asp Gly Ile Tyr Met Val His Ile Gln Val Thr Leu
100                 105                 110
Ala Ile Cys Ser Ser Thr Thr Ala Ser Arg His His Pro Thr Thr Leu
115                 120                 125
Ala Val Gly Ile Cys Ser Pro Ala Ser Arg Ser Ile Ser Leu Leu Arg
130                 135                 140
Leu Ser Phe His Gln Gly Cys Thr Ile Ala Ser Gln Arg Leu Thr Pro
145                 150                 155                 160
Leu Ala Arg Gly Asp Thr Leu Cys Thr Asn Leu Thr Gly Thr Leu Leu
165                 170                 175
Pro Ser Arg Asn Thr Asp Glu Thr Phe Phe Gly Val Gln Trp Val Arg
180                 185                 190
Pro
<210>  48
<211>  723
<212>  ДНК
<213>  Homo sapiens
<400>  48
atggaggaga gtgtcgtacg gccctcagtg tttgtggtgg atggacagac cgacatccca       60
ttcacgaggc tgggacgaag ccaccggaga cagtcgtgca gtgtggcccg ggtgggtctg      120
ggtctcttgc tgttgctgat gggggccggg ctggccgtcc aaggctggtt cctcctgcag      180
ctgcactggc gtctaggaga gatggtcacc cgcctgcctg acggacctgc aggctcctgg      240
gagcagctga tacaagagcg aaggtctcac gaggtcaacc cagcagcgca tctcacaggg      300
gccaactcca gcttgaccgg cagcgggggg ccgctgttat gggagactca gctgggcctg      360
gccttcctga ggggcctcag ctaccacgat ggggcccttg tggtcaccaa agctggctac      420
tactacatct actccaaggt gcagctgggc ggtgtgggct gcccgctggg cctggccagc      480
accatcaccc acggcctcta caagcgcaca ccccgctacc ccgaggagct ggagctgttg      540
gtcagccagc agtcaccctg cggacgggcc accagcagct cccgggtctg gtgggacagc      600
agcttcctgg gtggtgtggt acacctggag gctggggagg aggtggtcgt ccgtgtgctg      660
gatgaacgcc tggttcgact gcgtgatggt acccggtctt acttcggggc tttcatggtg      720
tga                                                                    723
<210>  49
<211>  240
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  49
Met Glu Glu Ser Val Val Arg Pro Ser Val Phe Val Val Asp Gly Gln
1               5                   10                  15
Thr Asp Ile Pro Phe Thr Arg Leu Gly Arg Ser His Arg Arg Gln Ser
20                  25                  30
Cys Ser Val Ala Arg Val Gly Leu Gly Leu Leu Leu Leu Leu Met Gly
35                  40                  45
Ala Gly Leu Ala Val Gln Gly Trp Phe Leu Leu Gln Leu His Trp Arg
50                  55                  60
Leu Gly Glu Met Val Thr Arg Leu Pro Asp Gly Pro Ala Gly Ser Trp
65                  70                  75                  80
Glu Gln Leu Ile Gln Glu Arg Arg Ser His Glu Val Asn Pro Ala Ala
85                  90                  95
His Leu Thr Gly Ala Asn Ser Ser Leu Thr Gly Ser Gly Gly Pro Leu
100                 105                 110
Leu Trp Glu Thr Gln Leu Gly Leu Ala Phe Leu Arg Gly Leu Ser Tyr
115                 120                 125
His Asp Gly Ala Leu Val Val Thr Lys Ala Gly Tyr Tyr Tyr Ile Tyr
130                 135                 140
Ser Lys Val Gln Leu Gly Gly Val Gly Cys Pro Leu Gly Leu Ala Ser
145                 150                 155                 160
Thr Ile Thr His Gly Leu Tyr Lys Arg Thr Pro Arg Tyr Pro Glu Glu
165                 170                 175
Leu Glu Leu Leu Val Ser Gln Gln Ser Pro Cys Gly Arg Ala Thr Ser
180                 185                 190
Ser Ser Arg Val Trp Trp Asp Ser Ser Phe Leu Gly Gly Val Val His
195                 200                 205
Leu Glu Ala Gly Glu Glu Val Val Val Arg Val Leu Asp Glu Arg Leu
210                 215                 220
Val Arg Leu Arg Asp Gly Thr Arg Ser Tyr Phe Gly Ala Phe Met Val
225                 230                 235                 240
<---