ЛИНИИ СТИМУЛИРУЮЩИХ КЛЕТОК ДЛЯ EX VIVO РАЗМНОЖЕНИЯ И АКТИВАЦИИ КЛЕТОК-НАТУРАЛЬНЫХ КИЛЛЕРОВ

1. Генетически популяция сконструированных клеток, которая не экспрессирует молекулы главного комплекса гистосовместимости (ГКГС) I,
причем указанная популяция сконструированных клеток получена из иммортализованной клетки,
причем указанная популяция сконструированных клеток модифицирована для экспрессии мембраносвязанного интерлейкина-15 (mbIL15),
причем указанная популяция сконструированных клеток модифицирована для экспрессии мембраносвязанного лиганда 4-1ВВ (4-1BBL),
причем указанная популяция сконструированных клеток модифицирована для экспрессии по меньшей мере одного дополнительного мембраносвязанного интерлейкина, который стимулирует активацию иммунных клеток,
причем указанная популяция сконструированных клеток не экспрессирует молекулы главного комплекса гистосовместимости (ГКГС) I, и
при этом совместное культивирование указанной популяции сконструированных клеток с популяцией иммунных клеток приводит к активации и размножению по меньшей мере одной субпопуляции иммунных клеток.
2. Популяция сконструированных клеток по п. 1, в которой mbIL15 кодируется нуклеотидной последовательностью, содержащей SEQ ID NO. 1.
3. Популяция сконструированных клеток по п. 1, в которой 4-1BBL кодируется нуклеотидной последовательностью, содержащей SEQ ID NO. 13.
4. Популяция сконструированных клеток по п. 1, в которой каждая из мембраносвязанных молекул соединена с трансмембранным доменом человеческого CD8α.
5. Популяция сконструированных клеток по п. 4, в которой трансмембранный домен человеческого CD8α содержит последовательность SEQ ID NO. 18.
6. Популяция сконструированных клеток по п. 1, характеризующаяся тем, что эта популяция сконструированных клеток получена из линии клеток, выбранной из группы, состоящей из клеток К562, линии клеток опухоли Вильмса HFWT, линии клеток опухоли эндометрия HHUA, линии клеток меланомы HMV-II, линии клеток гепатобластомы HuH- 6, линий клеток мелкоклеточного рака легкого Lu-130 или Lu-134-А, линий клеток нейробластомы NB19 или NB69, линии клеток эмбрионального рака яичка NEC 14, линии клеток рака шейки матки ТСО-2 и линии клеток нейробластомы TNB1.
7. Популяция сконструированных клеток по п. 1, характеризующаяся тем, что эта популяция сконструированных клеток не экспрессирует молекулы ГКГС II.
8. Популяция сконструированных клеток по п. 1, характеризующаяся тем, что эта популяция сконструированных клеток получена из клеток К562.
9. Популяция сконструированных клеток по любому из пп. 1-8, в которой интерлейкин содержит IL12A или его фрагмент.
10. Популяция сконструированных клеток по п. 9, в которой IL12A содержит последовательность SEQ ID NO. 4.
11. Популяция сконструированных клеток по любому из пп. 1-8, в которой интерлейкин включает IL12B или его фрагмент.
12. Популяция сконструированных клеток по п. 11, в которой IL12B содержит последовательность SEQ ID NO. 6.
13. Популяция сконструированных клеток по любому из пп. 1-8, в которой интерлейкин содержит IL12A и IL12B или их фрагменты.
14. Популяция сконструированных клеток по любому из пп. 1-8, характеризующаяся тем, что эта популяция сконструированных клеток дополнительно экспрессирует мембраносвязанный ИЛ 8 (mbIL18) или его фрагмент.
15. Популяция сконструированных клеток по п. 14, в которой IL18 содержит последовательность SEQ ID NO. 8.
16. Популяция сконструированных клеток по любому из пп. 1-8, характеризующаяся тем, что эта популяция сконструированных клеток дополнительно экспрессирует мембраносвязанный IL21 (mbIL21) или его фрагмент.
17. Популяция сконструированных клеток по п. 16, в которой IL21 содержит последовательность SEQ ID NO. 10 или ее фрагмент.
18. Популяция сконструированных клеток по п. 1, в которой клетки экспрессируют мембраносвязанный IL22 (mbIL22) или его фрагмент.
19. Популяция сконструированных клеток по п. 18, в которой IL22 содержит последовательность SEQ ID NO. 12 или ее фрагмент.
20. Популяция сконструированных клеток по любому из пп. 1-8, в которой клетки дополнительно содержат мембраносвязанное анти-CD3 антитело (mbα-CD3), фрагмент этого антитела или scFv.
21. Популяция сконструированных клеток по п. 20, в которой mbα-CD3 представляет собой моноклональное антитело.
22. Популяция сконструированных клеток по п. 21, в которой mbα-CD3 нацелено на эпитоп в нуклеотидной последовательности CD3-эпсилон SEQ ID NO. 15.
23. Популяция сконструированных клеток по п. 20, в которой mbα-CD3 представляет собой scFv.
24. Популяция сконструированных клеток по п. 23, в которой scFv содержит последовательность SEQ ID NO. 17.
25. Способ размножения иммунных клеток, включающий совместное культивирование образца крови, содержащего иммунные клетки, с популяцией сконструированных клеток по любому из пп. 1-24.
26. Способ по п. 25, в котором иммунные клетки представляют собой клетки-натуральные киллеры (NK).
27. Генетически популяция сконструированных клеток, которая не экспрессирует молекулы главного комплекса гистосовместимости (ГКГС) I,
причем указанная популяция сконструированных клеток получена из раковой клетки,
причем указанная популяция сконструированных клеток модифицирована для экспрессии мембраносвязанного интерлейкина-15 (mbIL15),
причем указанная популяция сконструированных клеток модифицирована для экспрессии мембраносвязанного лиганда 4-1ВВ (4-1BBL),
причем указанная популяция сконструированных клеток модифицирована для экспрессии по меньшей мере одного дополнительного мембраносвязанного интерлейкина, стимулирующего активацию иммунных клеток, и
при этом совместное культивирование указанной популяции сконструированных клеток с популяцией иммунных клеток приводит к активации и размножению по меньшей мере одной субпопуляции иммунных клеток.
28. Популяция сконструированных клеток по п. 27, в которой интерлейкин включает IL12A или его фрагмент.
29. Популяция сконструированных клеток по п. 28, в которой IL12A содержит последовательность SEQ ID NO. 4.
30. Популяция сконструированных клеток по п. 28, в которой интерлейкин включает IL12B или его фрагмент.
31. Популяция сконструированных клеток по п. 30, в которой IL12B содержит последовательность SEQ ID NO. 6.
32. Популяция сконструированных клеток по п. 27, в которой интерлейкин включает IL12A и IL12B или их фрагменты.
33. Популяция сконструированных клеток по любому из пп. 27-32, характеризующаяся тем, что эта популяция сконструированных клеток дополнительно экспрессирует мембраносвязанный IL18 (mbIL18) или его фрагмент.
34. Популяция сконструированных клеток по п. 33, в которой IL18 содержит последовательность SEQ ID NO. 8.
35. Популяция сконструированных клеток по любому из пп. 27-34, характеризующаяся тем, что эта популяция сконструированных клеток экспрессирует мембраносвязанный IL21 (mbIL21) или его фрагмент.
36. Популяция сконструированных клеток по п. 35, в которой IL21 содержит последовательность SEQ ID NO. 10 или ее фрагмент.
37. Популяция сконструированных клеток по любому из пп. 27-36, характеризующаяся тем, что эта популяция сконструированных клеток экспрессирует мембраносвязанный IL22 (mbIL22) или его фрагмент.
38. Популяция сконструированных клеток по п. 37, в которой IL22 содержит последовательность SEQ ID NO. 12 или ее фрагмент.
39. Популяция сконструированных клеток по любому из пп. 27-38, характеризующаяся тем, что эта популяция сконструированных клеток дополнительно содержит мембраносвязанное анти-CD3 антитело (mbα-CD3), фрагмент этого антитела или scFv.
40. Популяция сконструированных клеток по п. 39, в которой mbα-CD3 представляет собой моноклональное антитело.
41. Популяция сконструированных клеток по п. 39 или 40, в которой mbα-CD3 нацелено на эпитоп в нуклеотидной последовательности CD3-эпсилон SEQ ID NO. 15.
42. Популяция сконструированных клеток по п. 39, в которой mbα-CD3 представляет собой scFv.
43. Популяция сконструированных клеток по п. 42, в которой scFv содержит последовательность SEQ ID NO. 17.
44. Популяция сконструированных клеток по любому из пп. 27-43, характеризующаяся тем, что эта популяция сконструированных клеток получена из линии клеток, выбранной из группы, состоящей из клеток К562, линии клеток опухоли Вильмса HFWT, линии клеток опухоли эндометрия HHUA, линии клеток меланомы HMV-П, линии клеток гепатобластомы HuH- 6, линий клеток мелкоклеточного рака легкого Lu-130 или Lu-134-A, линий клеток нейробластомы NB19 или NB69, линии клеток эмбрионального рака яичка NEC 14, линии клеток рака шейки матки ТСО-2 и линии клеток нейробластомы TNB1.
45. Популяция сконструированных клеток по любому из пп. 27-44, в которой сконструированные клетки не экспрессируют молекулы ГКГС II.
46. Популяция сконструированных клеток по п. 45, в которой сконструированные клетки получены из клеток К562.
47. Популяция сконструированных клеток по любому из пп. 27-46, в которой каждая из мембраносвязанных молекул связана с трансмембранным доменом CD8α человека.
48. Популяция сконструированных клеток по п. 47, в которой трансмембранный домен CD8α человека содержит последовательность SEQ ID NO. 18.
49. Популяция сконструированных клеток по любому из пп. 27-48, в которой mbIL15 кодируется нуклеотидной последовательностью, содержащей SEQ ID NO. 1.
50. Популяция сконструированных клеток по любому из пп. 27-49, в которой mb4-1BBL кодируется нуклеотидной последовательностью, содержащей SEQ ID NO. 13.
51. Популяция генетически сконструированных клеток, которая не экспрессирует молекулы главного комплекса гистосовместимости (ГКГС) I,
причем указанная популяция сконструированных клеток получена из раковой клетки,
причем указанная популяция сконструированных клеток модифицирована для экспрессии мембраносвязанного интерлейкина-15 (mbIL15),
причем указанная популяция сконструированных клеток модифицирована для экспрессии мембраносвязанного лиганда 4-1ВВ (4-1BBL),
причем указанная популяция сконструированных клеток модифицирована для экспрессии мембраносвязанного анти-CD3-антитела (mbα-CD3), которое стимулирует активацию иммунных клеток, и
при этом совместное культивирование указанной популяции сконструированных клеток с популяцией иммунных клеток приводит к активации и размножению по меньшей мере одной субпопуляции иммунных клеток.
52. Популяция сконструированных клеток по п. 51, в которой mbα-CD3 представляет собой моноклональное антитело.
53. Популяция сконструированных клеток по п. 51 или 52, в которой mbα-CD3 нацелено на эпитоп в нуклеотидной последовательности CD3-эпсилон SEQ ID NO. 15.
54. Популяция сконструированных клеток по п. 51, в которой mbα-CD3 представляет собой scFv.
55. Популяция сконструированных клеток по п. 54, в которой scFv содержит последовательность SEQ ID NO. 17.
56. Популяция сконструированных клеток по любому из пп. 51-55, в которой клетки дополнительно экспрессируют по меньшей мере один мембраносвязанный интерлейкин или его фрагмент.
57. Популяция сконструированных клеток по п. 56, в которой интерлейкин включает IL12A или его фрагмент.
58. Популяция сконструированных клеток по п. 57, в которой IL12A содержит последовательность SEQ ID NO. 4.
59. Популяция сконструированных клеток по любому из пп. 56-58, в которой по меньшей мере один мембраносвязанный интерлейкин или его фрагмент включает IL12B или его фрагмент.
60. Популяция сконструированных клеток по п. 59, в которой IL12B, по меньшей мере один мембраносвязанный интерлейкин или его фрагмент содержит последовательность SEQ ID NO. 6.
61. Популяция сконструированных клеток по любому из пп. 56-60, в которой по меньшей мере один мембраносвязанный интерлейкин или его фрагмент содержит IL12A и IL12B или их фрагменты.
62. Популяция сконструированных клеток по любому из пп. 56-61, в которой клетки дополнительно экспрессируют мембраносвязанный IL18 (mbIL15) или его фрагмент.
63. Популяция сконструированных клеток по п. 62, в которой IL18 содержит последовательность SEQ ID NO. 8.
64. Популяция сконструированных клеток по любому из пп. 56-63, в которой клетки экспрессируют мембраносвязанный IL21 (mbIL21) или его фрагмент.
65. Популяция сконструированных клеток по п. 64, в которой IL21 содержит последовательность SEQ ID NO. 10 или ее фрагмент.
66. Популяция сконструированных клеток по любому из пп. 56-65, в которой клетки экспрессируют мембраносвязанный IL22 (mbIL22) или его фрагмент.
67. Популяция сконструированных клеток по п. 66, в которой IL22 содержит последовательность SEQ ID NO. 12 или ее фрагмент.
68. Популяция сконструированных клеток по любому из пп. 25-67, в которой сконструированные клетки пригодны для размножения иммунных клеток.
69. Популяция сконструированных клеток по п. 68, в которой размноженные иммунные клетки представляют собой NK-клетки.
70. Способ размножения NK-клеток, включающий совместное культивирование образца, содержащего NK-клетки, с популяцией сконструированных клеток по любому из пп. 25-69.
71. Способ получения популяции сконструированных клеток по любому из пп. 25-69, включающий:
трансдукцию клеток первой конструкцией, кодирующей mbIL15 с получением первой трансдуцированной популяции клеток,
размножение этой первой трансдуцированной популяции клеток,
трансдукцию первой трансдуцированной популяции клеток второй конструкцией, кодирующей 4-1BBL, с получением второй трансдуцированной популяции клеток,
трансдукцию второй трансдуцированной популяции клеток третьей конструкцией, кодирующей по меньшей мере одну дополнительную молекулу, способную стимулировать иммунные клетки, с получением третьей трансдуцированной популяции клеток, и
размножение третьей трансдуцированной популяции клеток.
72. Множество нуклеиновых кислот для применения в получении популяции сконструированных клеток по любому из пп. 25-69, включающее по меньшей мере 3 из следующего:
нуклеиновая кислота, кодирующая mbIL15,
нуклеиновая кислота, кодирующая 4-1BBL,
нуклеиновая кислота, кодирующая mbIL12A,
нуклеиновая кислота, кодирующая mbIL12B,
нуклеиновая кислота, кодирующая mbIL18,
нуклеиновая кислота, кодирующая mbIL21,
нуклеиновая кислота, кодирующая mbIL22, и
нуклеиновая кислота, кодирующая mbα-CD3.
73. Множество нуклеиновых кислот по п. 72, характеризующееся тем, что это множество нуклеиновых кислот выполнено в виде одной конструкции.
74. Множество нуклеиновых кислот по п. 72, в котором mbIL15 кодируется нуклеотидной последовательностью, содержащей SEQ ID NO. 1.
75. Множество нуклеиновых кислот по п. 72, в котором 4-1BBL кодируется нуклеотидной последовательностью, содержащей SEQ ID NO. 13.
76. Множество нуклеиновых кислот по п. 72, в котором mbIL12A кодируется нуклеотидной последовательностью, содержащей SEQ ID NO. 3.
77. Множество нуклеиновых кислот по п. 72, в котором mbIL12B кодируется нуклеотидной последовательностью, содержащей SEQ ID NO. 5.
78. Множество нуклеиновых кислот по п. 72, в котором mbIL18 кодируется нуклеотидной последовательностью, содержащей SEQ ID NO. 7.
79. Множество нуклеиновых кислот по п. 72, в котором mbIL21 кодируется нуклеотидной последовательностью, содержащей SEQ ID NO. 9 или ее фрагмент.
80. Множество нуклеиновых кислот по п. 72, в котором mbIL22 кодируется нуклеотидной последовательностью, содержащей SEQ ID NO. 11 или ее фрагмент.
81. Множество нуклеиновых кислот по п. 72, в котором mbα-CD3 кодируется нуклеотидной последовательностью, содержащей SEQ ID NO. 16.
82. Множество нуклеиновых кислот по п. 72, в котором каждая из этого множества нуклеиновых кислот дополнительно содержит GFP-метку.
83. Способ размножения NK-клеток, включающий:
a) получение образца периферической крови, содержащей смешанную популяцию иммунных клеток, содержащую NK-клетки и Т-клетки,
b) приведение в контакт смешанной популяции клеток с популяцией сконструированных клеток, демонстрирующей пониженную экспрессию ГКГС I и модифицированной для экспрессии:
i) мембраносвязанного интерлейкина-15 (mbIL15),
ii) лиганда 4-1ВВ (4-1BBL), и
iii) по меньшей мере одной дополнительной молекулы, стимулирующей активацию иммунных клеток, и
c) совместное культивирование этой смешанной популяции клеток со сконструированными клетками в течение периода времени, достаточного для размножения NK-клеток смешанной популяции иммунных клеток, с размножением иммунных NK-клеток.
84. Способ по п. 83, дополнительно включающий удаление Т-клеток из смешанной популяции до или после совместного культивирования.
85. Модифицированная линия клеток, включающая клетки миелоидного лейкоза К562, в которых отсутствуют молекулы главного комплекса гистосовместимости I, причем указанные клетки миелоидного лейкоза К562 являются генномодифицированными для экспрессии мембраносвязанного интерлейкина-15, лиганда 4-1ВВ и мембраносвязанного анти-CD3 антитела.
86. Модифицированная линия клеток, содержащая клетки миелоидного лейкоза К562, в которых отсутствуют молекулы главного комплекса гистосовместимости I, причем указанные клетки миелоидного лейкоза К562 являются генномодифицированными для экспрессии мембраносвязанного интерлейкина-15, мембраносвязанного лиганда 4-1 ВВ и по меньшей мере одного дополнительного мембраносвязанного интерлейкина.
87. Модифицированная линия клеток по п. 86, в котором дополнительным мембраносвязанным экспрессированным интерлейкином является интерлейкин-12.
88. Модифицированная линия клеток по п. 86, в котором дополнительным мембраносвязанным экспрессированным интерлейкином является интерлейкин-18.
89. Модифицированная линия клеток по п. 86, в котором дополнительными экспрессированными мембраносвязанными интерлейкинами являются интерлейкин-12 и интерлейкин-18.
90. Модифицированная линия клеток по любому из пп. 86-89, дополнительно включающая мембраносвязанное анти-CD3-антитело.
91. Модифицированная линия клеток по любому из пп. 86-90, дополнительно включающая одно или более из mbIL12A, mbIL12B, mbIL18, mbIL21, mbIL22 и mbα-CD3.
92. Модифицированная линия клеток, включающая клетки миелоидного лейкоза К562, в которых отсутствуют молекулы главного комплекса гистосовместимости I, в которых указанные клетки миелоидного лейкоза К562 являются генномодифицированными для экспрессии мембраносвязанного интерлейкина-15, мембраносвязанного лиганда 4-1ВВ, мембраносвязанного анти-CD3-антитела и по меньшей мере одного дополнительного мембраносвязанного интерлейкина.
93. Модифицированная линия клеток по п. 92, в которой дополнительным экспрессированным мембраносвязанным интерлейкином является интерлейкин-12.
94. Модифицированная линия клеток по п. 92, в которой дополнительным экспрессированным мембраносвязанным интерлейкином является интерлейкин-18.
95. Модифицированная линия клеток по п. 92, в которой дополнительными экспрессированными мембраносвязанными интерлейкинами являются интерлейкин-12 и интерлейкин-18.
96. Модифицированная линия клеток по п. 92, в которой по меньшей мере один дополнительный интерлейкин содержит один или более из mbIL12A, mbIL12B, mbIL18, mbIL21 и mbIL22.
97. Популяция NK-клеток, размноженная путем культивирования смешанной клеточной культуры, содержащей NK-клетки и Т-лимфоциты с модифицированной линией клеток по любому из пп. 85-86.
98. Применение популяции NK-клеток по п. 97 для лечения рака или инфекционного заболевания.
99. Применение популяции сконструированных клеток по любому из пп. 25-69 для применения при размножении популяции иммунных клеток, причем эта популяция иммунных клеток пригодна для применения при лечении рака или инфекционного заболевания, и причем эта популяция иммунных клеток включает NK-клетки.
100. Способ лечения рака или инфекционного заболевания, включающий:
введение субъекту с раком или инфекционным заболеванием композиции, содержащей размноженную популяцию иммунных клеток,
причем указанные иммунные клетки были размножены путем совместного культивирования иммунных клеток со популяцией сконструированных клеток,
причем указанная популяция сконструированных клеток получена из раковой клетки,
причем указанная популяция сконструированных клеток модифицирована для экспрессии мембраносвязанного интерлейкина-15 (mbIL15),
причем указанная популяция сконструированных клеток модифицирована для экспрессии мембраносвязанного лиганда 4-1ВВ (4-1BBL),
причем указанная популяция сконструированных клеток модифицирована для экспрессии по меньшей мере одного дополнительного мембраносвязанного интерлейкина, стимулирующего активацию иммунных клеток,
причем совместное культивирование указанной популяции сконструированных клеток с популяцией иммунных клеток приводит к активации и размножению по меньшей мере одной субпопуляции иммунных клеток, и
при этом указанную по меньшей мере одну субпопуляцию иммунных клеток вводят указанному субъекту.
101. Способ по п. 100, в котором введенная субпопуляция клеток содержит NK-клетки.
102. Способ лечения рака или инфекционного заболевания, включающий:
введение субъекту с раком или инфекционным заболеванием композиции, содержащей размноженную популяцию иммунных клеток,
причем указанные иммунные клетки были размножены путем совместного культивирования иммунных клеток с популяцией сконструированных клеток,
причем указанная популяция сконструированных клеток получена из раковой клетки,
причем указанная популяция сконструированных клеток модифицирована для экспрессии мембраносвязанного интерлейкина-15 (mbIL15),
причем указанная популяция сконструированных клеток модифицирована для экспрессии мембраносвязанного лиганда 4-1ВВ (4-1BBL),
причем указанная популяция сконструированных клеток модифицирована для экспрессии анти-CD3- антитела,
причем совместное культивирование указанной популяции сконструированных клеток с популяцией иммунных клеток приводит к активации и размножению по меньшей мере одной субпопуляции иммунных клеток, и
при этом указанную по меньшей мере одну субпопуляцию иммунных клеток вводят указанному субъекту.