Проточная цитометрия в исследовании клеток опухоли при лимфогранулематозе и лимфосаркоме

HODGKIN’S DISEASE: A STUDY OF PROGNOSTIC

FACTORS IN A RANDOMIZED TRIAL

B. M. Aliev, G. V. Kruglova, N. F. Kondratieva, R. T. Aralbaev, M. M. Kaversneva

For the period 1979—1983 104 patients were treated for Hodgkin’s Disease; 60 of them were considered as those, with favorable prognosis and 44 with unfavorable, according to their perfomance status, including age, stage, histologic type and ESR-test. Patients were randomized into groups either for radiotherapy alone or radiotherapy plus chemotherapy. Both treatment modalities were effected in “non-aggressive” way for favorable group or in “aggressive” way for the group .with unfavorable prognosis. Complete remission was obtained in 103 (99 %) of patients. In the favorable and unfavorable groups 5-year survival rate was 98 and 88 % with 80 and 68 % of patients free of disease. Combined treatment versus radiotherapy alone proved to be beneficial in both groups, providing prolongation of disease-free interval: 88 and 61 % (p<0,001). Repeated complete remissions were obtained in 91 % in favorable group versus only 57 % in the group - with unfavorable prognosis. The size of lesions or their “biologic activity” are proved to have influence on the rate of recurrence in patients treated with radiation alone.

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 1990 УДК 616-006.441/442-018

Г. Н. Зубрихина, Н. А. Пробатова, Ю. В. Червонобаб,

Л. М. Родионова, Е. В. Флейшман, О. В. Чистякова,

Р. М. Пропп, И. А. Финогенова

ПРОТОЧНАЯ ЦИТОМЕТРИЯ В ИССЛЕДОВАНИИ КЛЕТОК ОПУХОЛИ ПРИ ЛИМФОГРАНУЛЕМАТОЗЕ И ЛИМФОСАРКОМЕ

НИИ клинической онкологии, НИИ канцерогенеза

Метод проточной цитометрии (ПЦ), широко используемый для определения плоидности и пролиферативной активности клеток солидных опухолей, применяется в последние годы в оценке прогноза заболевания. По мнению большинства авторов [10, 11], диплоидные опухоли, по распределению ДНК не отличающиеся от распределения ДНК клеток нормальных тканей, имеют лучший прогноз, чем анеуплоидные, в ядрах клеток которых наблюдаются значительные нарушения в содержании ДНК. Диплоидные опухоли составляют, как правило, 25—30 % всех солидных опухолей. Относительно распределения содержания ДНК в клетках при лимфогранулематозе и лимфосаркоме сведений меньше, и они во многом противоречивы [4, 8, 9]. Большинство авторов отмечают, что анеуплоидные опухоли при лимфосаркоме встречаются гораздо реже, чем при солидных опухолях, и прогностическая значимость их недостаточно ясна.

Целью настоящего исследования было изучить распределение клеток опухоли при биопсии лимфатических узлов по плоидности и пролифе-

ративной активности и сопоставить полученные данные с морфологическим вариантом опухоли, длительностью ремиссий и выживаемостью больных.

Материалы и методы. Обследовано 94 больных (50 мужчин и 44 женщины), которым в амбулаторных условиях ВОНЦ проводилась биопсия [83] лимфатических узлов и биопсии опухоли желудка и кишки во время гастро- и кол оное копи и [II]. В 20 наблюдениях выявлена гиперплазия лимфатического узла, в 21 — лимфогранулематоз, в 53 — лимфосаркома.

Гистологический вариант лимфогранулематоза устанавливали в соответствии с классификацией ВОЗ (1976 г.), лим-фосаркомы — в соответствии с видоизмененной классификацией ВОЗ [2, 3]. Во всех случаях параллельно

с гистологическим исследованием проводили изучение цитологических мазков-отпечатков с опухоли. Материал для исследования забирали в день операции. Кусочки опухоли, предназначенные для исследования методом ПЦ, делили на 2—3 части, делали с каждого контрольные мазки-отпечатки и готовили суспензию клеток [1]. Исследование проводили на проточном цитометре ICP11 (PHYWE, ФРГ). Использовали фиксированные этанолом клетки с последующей окраской их специфическими для ДНК красителями: этидиумом бромидом и митрамицином в равных

объемах. В качестве контроля использовали лимфоциты здоровых лиц (доноров). Опухоль считали диплоидной, если на ДНК-гистограмме определялся один пик (G1), близкий по интенсивности флуоресценции ядрам лимфоцитов, и анеу-плоидной, если наряду с пиком диплоидных клеток виден был один или несколько дополнительных пиков [13]. Для характеристики степени анеуплоидии клеток использовали индекс ДНК (ИДНК), который вычисляли как отношение интенсивности флуоресценции анеуплоидных ‘клеток к диплоидным. ИДНК диплоидных клеток принимали за 1, ИДНК анеуплоидных опухолей был больше 1. Пролиферативную активность клеток опухоли, оценивали по количеству клеток в S и G2M фазах клеточного цикла и их суммы — индексу пролиферации (ИП). Пролиферативную активность анеуплоидных опухолей определяли, если число анеуплоидных клеток превышало 50 %. Цитогенетическое исследование клеток опухолей проводили с помощью метода дифференциальной окраски хромосом (G-banding method).

Выживаемость и длительность ремиссии производили по методу Life Table (ВОЗ, 1979 г.). Выживаемость больных определяли с момента установления диагноза. Продолжительность полной ремиссии отсчитывали с момента ее констатации, частичной ремиссии — от начала лечения до первых признаков прогрессирования. Для сопоставления кривых выживаемости использовали метод Вилкоксона в модификации для метода Life Table.

Результаты исследования. У больных лимфогранулематозом гистологический вариант опухоли оказался следующим: нодулярный склероз— 8 больных, смешанно-клеточный вариант — 8 и вариант с лимфоидным истощением — 5 больных. Распределение ДНК во всех случаях: как при лимфогранулематозе, так и при гиперплазии лимфоузла — было диплоидным, пролиферативная активность клеток опухолевой ткани различалась незначительно. ИП при гиперплазии составил 10,4± 1,3%, при лимфогранулематозе 11,4±1,1 %• Число клеток в S-фазе клеточного цикла колебалось от 0 до 15,2 % при лимфогранулематозе и от 0 до 15 % при гиперплазии лимфатического узла и в среднем по группе составля-

Таблица I

Пролиферативная активность клеток лимфатических узлов при гиперплазии и лимфогранулематозе

Морфологическая характеристика Ч нсло Содержант ДНК

больных CI S G2 МП

Г иперплазия 20 89,6+1,3 4,8+0,7 5,7+0,7 10,4 + 1.3

Лимфогранулематоз 21 88,6+1,1 5,2+0,8 6,2±0,5 1 1,4+1,1

р>0,05

Распределение больных лимфосаркомой по стадиям, гистологическому варианту и плоидиости опухоли

Число больных Пролимфоцитарный вариант Бластный вариант

Стахіия заболевания с круглыми ядрами с растепленными ядрами лнмфо- плазмоци- тарный микро- лимфо- бластный с извитыми ядрами макро- лимфо- бластный иммуно- бластный

1-11IA ШБ—IV 27

В с е г о... 53

В скобках указано число больных с анеуплоидными опухолями.

ло 6,2±0,5 % и 5,7±0,7 % соответственно (табл. 1).

Среди больных лимфосаркомой 25 были с пролимфоцитарным вариантом опухоли (12 — с круглыми ядрами, 11 — с расщепленной

формой ядер и 2 — с полиморфно-клеточной лимфоплазмоцитарной лимфосаркомой) и 28 — с бластным вариантом: 19 лимфобластным (3 — микролимфобластным, 1 — с извитыми, convoluted, ядрами, 15 — макролимфобластным) и 9 — иммунобластным. Распределение больных лимфосаркомой в зависимости от гистологического варианта, стадии и плоидности опухоли представлено в табл. 2.

У большинства больных (37) опухоли были диплоидными, у 16 (30,2 %) — анеуплоидными. Число анеуплоидных опухолей преобладало при властном варианте лимфосаркомы (13/28— 48,4 %) по сравнению с пролимфоцитарным (3/25—12 %). В 6 случаях проведено цитогенетическое исследование клеток опухоли: в 3 случаях с бластным вариантом опухоли и в 3 — с пролимфоцитарным при нормальном числе хромосом (46) опухоль была диплоидной. Отклонение в кариотипе с увеличением или уменьшением числа хромосом на одну не улавливалось данным методом, и содержание ДНК расценивалось как диплоидное и было представлено одним пиком клеток на ДНК-гистограммах. И лишь при числе хромосом 49 на ДНК-гистограмме

наряду с диплоидной четко выявлялась линия клеток с околодиплоидным (ИДНК-1,14) значением ДНК (см. рис.). При кариотипе с почти удвоенным числом хромосом (п=84—85), ИДНК (1,93) также указывал на околотетраплоидное значение ДНК, близкое к удвоенному (4с).

При пролимфоцитарной лимфосаркоме анеупло-идное распределение ДНК выявлено в 1 случае лимфосаркомы с круглыми ядрами и в 2 — ,с расщепленной формой ядер. Все случаи [3] пролимфоцитарной лимфосаркомы, при которых 'выявлено анеуплоидное распределение ДНК, имели свои особенности, главной из которых было наличие бластных форм. В двух из них вариант определялся как пролимфоцитарно-лим-фобластный. Число анеуплоидных клеток колебалось от 31,6 до 38,8 %, ИДНК — от 1,2 до 2, т. е. линия анеуплоидных клеток располагалась или вблизи диплоидной линии контрольных лимфоцитов, или приближалась к удвоенному их значению.

При бластных вариантах лимфосаркомы морфологический вариант опухоли, отражающий в какой-то степени размер клеток и ядер (мик-ролимфобластный, макролимфобластныи, иммуно-бластный), не коррелировал с плоидностью опухоли: все случаи (3—100 %) микролимфо-бластной лимфосаркомы оказались анеуплоидными почти с удвоенным значением ДНК. (ИДНК 1,93—2,0), при макролимфобластном варианте

Распределение ДНК в клетках лимфосаркомы при различном числе хромосом.

а—диплоидное распределение ДНК в клетках опухоли при нормальном числе (46) хромосом;

б — анеуплоидное распределение ДНК с околодиплоидным (ИДНК—1,14) расположением клеток опухоли (кариотип 49 хромосом);

в анеуплоидное распределение ДНК с околотетраплоидным (ИДНК —1,93) расположением клеток опухоли (кариотип 84—85 хромосом).

Выживаемость больных пролимфоцитарным и властным вариантом лимфосаркомы

Выживаемость, °/ /О

Морфологически;} вариант опухоли Число боль- ных I год 3 года 5 лет Медиана. мес

Пролимфоцитарный 25 81,4 81,4 81,4 Не достигнута

Властный 28 81,5 44,3 р*<0,001 44,3 33,3

В с е г о... 53 90,1 61,2 61,2 74,4

* р — властные варианты по сравнению с пролимфо-цитарными.

(75 %) [6] случаев были анеуплоидными (ИДНК 1,14—2,1), тогда как при иммунобластном варианте лишь 44 % [4] оказались анеуплоидными с колебаниями ИДНК от 1,3 до 2,0.

ИДНК анеуплоидных опухолей колебался в широких пределах (1,1—2,1) чаще [7] линия анеуплоидных клеток располагалась в около-тетраплоидной области (ИДНК=1,9—2,1).

Число анеуплоидных клеток в анеуплоидных опухолях колебалось в широких пределах (от 21 до 79,4 %), в 6 случаях превышая 50 %, что позволило в этих наблюдениях оценить пролиферативную активность анеуплоидной линии клеток, в 5 случаях оказавшуюся очень высокой: ИП превышал 25 %, число клеток в Б-фазе клеточного цикла — 15 %. В одном наблюдении ее можно было оценить как умеренную (число клеток в Э-фазе было 12,7 %). В диплоидных опухолях пролиферативная активность клеток была ниже, чем в анеуплоидных, однако в диплоидных опухолях при властных вариантах лимфосаркомы число клеток в Б-фазе клеточного цикла было достоверно выше (р<0,01) в среднем по группе, чем при пролимфоцитарном варианте, и составило 8±1,4 % и 4,7±0,7 % соответственно. При анализе индивидуальных показателей выявлено, что при бластных вариантах в 4 случаях число клеток в ранней Э-фазе клеточного цикла превышало 10%, тогда как при про-лимфоцитарных ни в одном случае не было выше 10 %. Это можно расценить как высокую пролиферативную активность клеток опухоли, однако не исключена возможность наличия при бластных вариантах анеуплоидных клеток, близких по содержанию ДНК к диплоидным. При небольшом их количестве не всегда возможно определить, является ли представленная популяция однородной с большим числом клеток в ранней Б-фазе клеточного цикла или состоит из разнородных по содержанию ДНК линий клеток. В некоторых случаях увеличение коэффициента вариации диплоидного пика ( су[), отражающего его ширину, является косвенным показателем наличия анеуплоидных клеток, и опухоли в таких случаях можно расценивать как анеуплоидные [14]. В наших наблюдениях су 1 был в пределах 5 %, что соответствует су 1 нормальных лимфоцитов (3,93±0,1 %). Это не позволило высказаться определенно в пользу наличия анеуплоидных клеток, и опухоли учиты-

вались как диплоидные с большим числом клеток в ранней Б-фазе клеточного цикла.

3- и 5-летняя выживаемость и медиана длительности жизни больных властными вариантами опухоли была достоверно (р<0,001) меньше, чем пролимфоцитарными (табл. 3).

Поскольку анеуплоидные опухоли встречались главным образом при бластных вариантах лим-фосаркомы, анализ выживаемости в зависимости от плоидности опухоли проведен только у больных этой группы. В среднем по группе выживаемость больных диплоидными и анеуплоидкы-ми опухолями не различалась. 5-летняя выживаемость составила 40,5 и 48,7 %; Ме была равна 36,4 и 35,4 мес соответственно (р>0,05). При ШБ—IV стадиях заболевания больные с анеуплоидными опухолями жили меньше, чем больные с диплоидными: все больные с анеуплоидными опухолями погибли в течение 3 лет, медиана длительности жизни в этой группе была 21 ±5,8 мес, 3-летняя выживаемость больных с диплоидными опухолями составила 30 %, и Ме оказалась выше (31,3±18,4 мес). Однако различия оказались недостоверными, возможно, из-за малого числа наблюдений.

Длительность безрецидивного периода как среди больных пролимфоцитарным, так и властным вариантом лимфосаркомы четко коррелировала со стадией процесса внутри каждой группы (табл. 4). При I—ША стадиях длительность безрецидивного периода у больных пролимфоцитарным и властным вариантами была одинаковой, при ШБ—IV стадиях она была достоверно выше у больных пролимфоцитарной лимфосар-комой. Длительность безрецидивного периода у больных с диплоидными опухолями ШБ—IV стадий процесса была выше, чем у больных с анеуплоидными опухолями тех же стадий, однако статистической достоверности не получено.

Выводы. Изучение содержания ДНК методом проточной цитометрии позволило установить, что во всех случаях лимфогранулематоза (21) и в большинстве случаев (37—69,8 %) лимфосаркомы распределение ДНК было диплоидным и не отличалось от распределения ДНК

Таблица 4

Длительность безрецидивного течения у больных с различными вариантами лимфосаркомы, %

Длите:1 ь-ность безреци-ливного течения Пролимфо- цитарный вариант Властный вариант

I —ША ШБ—IV 1 —ША III-IVB

Все опу- холи д А

1 год 92,3 61,3 100 46,7 40,0 60,0

3 года 83,9 38,0 79,2 20,0 30,0 0

5 лет 60,5 7,6 63,6 0 30,0 0

Медиана, Не дос- 24,6 Не дос- 11,3 10,0 14,0

мес тигнута тигнута

р'<0,05 р'<0;05 р">0,05

Число

больных 14 11 13 15 10 5

Примечание. Д — диплоидные опухоли, А — анеуплоидные опухоли, р' — I—ША стадия по сравнению с ШБ—IV стадией, р" — Д-опухоли по сравнению с А-опу-холями.

в клетках лимфатических узлов при гиперплазии. При лимфогранулематозе обнаруживается, как правило, диплоидное распределение ДНК [12, 14], при лимфосаркоме анеуплодные опухоли встречаются в 15—45 % случаев, по данным разных авторов [19, 20, 21]. В наших исследованиях анеуплоидное распределение ДНК выявлено в 30,2 % случаев, чаще при властных вариантах (46,4%), чем при пролимфоцитарных (12 %), т. е. обнаружена связь между морфологическим вариантом опухоли и плоидностью, 6ДН2КО между различными вариантами властной лимфосаркомы и плоидностью опухоли корреляции не выявлено. На связь между плоидностью, морфологическим вариантом опухоли и иммунологическим типом властных клеток указывают ряд авторов [17, 20, 21].

Нарушение кариотипа при лимфосаркоме встречалось чаще, чем выявлялось методом ПЦ, анеуплоидия клеток сочеталась с гипердиплоид-ным кариотипом (>47 хромосом), хотя отдельные авторы описывают наличие анеуплоидии при нормальном числе хромосом  [5, 15]. Таким образом, разделение опухолей на диплоидные и анеуплоидные методом ПЦ возможно при значительном изменении в кариотипе, когда число хромосом превышает 47.

Пролиферативная активность анеуплоидных опухолей была выше, чем диплоидных, а среди диплоидных — при властных вариантах по сравнению с пролимфоцитарными (р<0,01).

Не получено достоверных различий выживаемости больных в зависимости от плоидности опухоли ни в целом по группе, ни по стадиям процесса, хотя больные ШБ—IV стадией заболевания с анеуплоидными опухолями жили несколько меньше, чем в той же стадии с диплоидными опухолями. По данным одних авторов [7, 14, 16], выживаемость больных при неходжкин-ских лимфомах связана с плоидностью опухоли, по данным же других [6, 17, 18], такой зависимости не обнаружено.

Таким образом, изучение содержания ДНК методом проточной цитометрии позволило установить различный характер распределения ДНК при лимфопролиферативных заболеваниях, выявить относительно большую частоту анеуплоидных опухолей и более высокую их пролиферативную активность при властных вариантах лймфосаркомы по сравнению с пролимфоцитарными. Установить связь между плоидностью опухоли, выживаемостью больных и длительностью безрецидивного периода болезни не удалось.

ЛИТЕРАТУРА

1. Зубрихина Г. Н., Соколова И. Н., Чистякова О. В. // Арх. пат,— 1989,— № 8,— С. 16—20.

2. Краевский Н. А., Пробатова Н. А.. Ермилова Е. Д. // Арх. пат,— 1980,— № 1,— С. 87—90.

3. Пробатова Н. А. Морфологические варианты лимфосаркомы (дифференциальная диагностика, морфофункциональные критерии, вопросы гистогенеза): Автореф. дисс. ... докт. мед. наук.— М., 1982.

4. Bauer К. D., Merkel D. Е., Winter 1. N. et al. // Cancer Res.— 1986,— Vol. 46,— P. 3173—3178.

5. Bernheim A., Berger R. // Nouv. rev. franc;. Hemat.— 1989,— Vol. 31, N 2,— P. 140—141.

6. Booking A., Chatelain R., Auffermann W. et al. // Anticancer Res.— 1986,— Vol. 6.— P. 1205—1216.

7. Bunn P. A., Whang-Peng J., Carney D. N. et al. // J. cl in. Invest.— 1980.— Vol. 65.— P. 1440—1448.

8. Costa A. // Basic and Applied Histochemistry.— 1981.— Vol. 25.

9. Diamond L. W., Nathwani B. N.. Rappaporl H. // Cancer.— 1982,— Vol. 50,— P. 1122—1135.

10. Frankfurt O. S., Slocum H £ustum J. M. et al. //

Cytometry.- 19«4.— Vol. 5,— P. 71—80.

11. Fmalander V., Taylor Hedley £>., Tattarshall M. // J. clin. Path.— 1984,— Vol. 37,— P. 961—974.

12. Hagemeister F. B., Raber M„ Barlogie B. et al. // Proc.

Amer. Ass. Cancer Res.— 1981.— Vol. 22.— P. 42.

13. Hiddemann W., Schuman 1., Andreef M. et al. // Cytometry.— 1984.— Vol. 5.— P. 445—446.

14. Joensuu H„ Soderstrom K-, Klemi P., Eerola F. // Cancer.— 1987,— Vol. 60,— P. 3042—3048.

15. Lakkalla-Paranko Т., Franssila K-, Lappalainen K. et al. // Cytometry Suppl.— 1987.— Vol. 1.— P. 388.

16. McLaughlin P., Osborne B., Johnston D. et al. // Cancer Res.— 1988,— Vol. 48,— P. 6614—6619.

17. Morgan D. R., Williamson J. M. S., Quirke P. et al. // Brit. J. Cancer.— 1986.— Vol. 54.— P. 643—649.

18. Roos G., Pige U., Lenner P. et al. // Oncol.— 1985.— Vol. 3,— P. 233—242.

19. Srigley J., Barlogie B., Butler J. J. et al. // Blood.— 1985,— Vol. 65,— P. 1090—1096.

20. Stanley J., Levine A. М., Fisher R. /. et al. // J. clin. Invest.— 1984,— Vol. 73,— P. 1201 — 1214.

21. Wain S. L., Braylan R. S., Borowitz M. J. // Cancer.— 1987,— Vol. 60,— P. 2403—2411.

Поступила 18.01.90

FLOW CYTOMETRY ANALYSIS OF LYMPHNODE CELLS IN LYMPHOMAS

G. N. Zubrikhina, N. A. Probatova, Ju. V. Chervonobab,

L. M. Rodionova, E. V. Fleishman, О. V. Chistyakova, R. M. Propp, I. A. Finogenova

DNA content by flow cytometric analysis was studied

in 94 patients with lymphoproliferative diseases (20—hyperplasia of lymphnode, 21—Hodgkin’s disease and 53 — non-Hodgkin’s malignant lymphoma). DNA distribution was diploid in all cases of hyperplasia and Hodgkin’s diseases and didn’t differ from DNA distributions in normal tissues. 16 cases (30,2 %) of non-Hodgkin’s lymphoma were aneuploid mainly in the cases (13) with blast type of cells. There were blast cells in three cases of prolymphocytic lymphomas with aneuploid DNA distribution patterns. Karyotypically abnormal tumors observed more often than aneuploid tumors. DNA aneuploidy revealed when karyotype has 49 chromosomes.

The proliferative activity was higher in aneuploid tumors than in diploid ones and among diploid tumors it was higher in the tumors with blast type of cells. There were no evident associations of the survival and free of disease period with DNA eneuploidy. Patients with aneuploid tumors in IIIB—IV stage of disease appeared to have worse prognosis than with diploid ones in the same stages althought this was not statistically significant.

© Л. А. ДУРНОВ, Л. А. МАХОНОВА, 19Э0

УДК 616-006-053.2-08

Л. А. Дурное, Л. А. Махонова

СТРАТЕГИЯ ПРОГРАММНОЙ ТЕРАПИИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ОПУХОЛЕЙ У ДЕТЕЙ

НИИ детской онкологии

Злокачественные новообразования у детей отличаются от таковых у взрослых преобладанием сарком, локализацией поражения, быстротой мета-стазирования и распространением опухолевого роста. Наиболее часто (до 35—40 %) это опухоли лимфоидной клетки и макрофагальной системы, т. е. иммунокомпетентной ткани ребенка.

Учитывая это, можно предполагать, что в этиологии и патогенезе заболевания большое значе-