УЛУЧШЕННЫЕ СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПТИДНЫХ КОНЪЮГАТОВ И ЛИНКЕРОВ

1. Способ получения соединения формулы 5а
включающий
(i) взаимодействие 9а и 11 в присутствии ангидрида 1-пропанфосфоновой кислоты (Т3Р) с получением соединения 13а
2
(ii) каталитическое гидрирование с использованием Pd/С соединения 13а в растворе THF:HO с, по крайней мере, приблизительно 50% ТНF, с получением соединения формулы 14а
(iii) объединение раствора 14а в THF с соединением формулы 15 в реакции, по существу, без основания, с получением соединения 6а
(iv) взаимодействие соединения формулы 6а с соединением формулы 19а в THF в присутствии DCC, с получением соединения 20а
(v) объединение 20а с ε-аминосодержащим пептидом 2, растворенном в апротонном полярном пятнадцатом растворителе, с получением биоконъюгата 3а
и, необязательно, дополнительно включающий следующие стадии
(vi) растворение соединения 3а в ДМСО;
(vii) прибавление гистидинового буфера при рН от приблизительно 5,5 до приблизительно 7,5 к раствору ДМСО и За стадии (vi);
(viii) прибавление антитела, содержащего вариабельный легкий участок, включающий SEQ ID NO:5, и вариабельный тяжелый участок, включающий SEQ ID NO:6, к раствору стадии (vii), так что молярное соотношение пептид:антитело составляет от приблизительно 1,8:1 до приблизительно 3:1;
(ix) перемешивание смеси образованной на стадии (viii) при средней скорости для предотвращения вспенивания реакционной смеси на протяжении, по крайней мере, приблизительно 1 ч при рН от приблизительно 5,5 до приблизительно 7,5 и при температуре от приблизительно 5°С до 35°С;
(х) фильтрование раствора из (ix) для экстракции конъюгата пептид-линкер антитело 5а.
где q=1, 2, 3, 4 или 5, Х=F или Cl, m=3, 4 или 5.
2. Способ по п. 1, где реакция между 9а и 11 проводится в присутствии первого растворителя, выбираемого из группы, включающей тетрагидрофуран (THF), 2-метилтетрагидрофуран, 1-метил-2-пирролидинон (NMP), N,N-диметилформамид (DMF), N,N-диметилацетамид (DMAc), 1-метил-2-пирролидинон, этилацетат (EtOAc) и ацетонитрил (MeCN), и предпочтительно MeCN, и где реакция, необязательно, проводится в присутствии первого основания, выбираемого из группы, включающей триметиламин, триэтиламин, трибутиламин, DIPEA, пиридин, DBU, DABCO, 2,3-лютидин, 2,4-лютидин, 2,5-лютидин, 2,6-лютидин, 3,4-лютидин, 3,5-лютидин, и предпочтительно DIPEA.
2
3. Способ по п. 1, где перед гидрированием в THF/HO, соединение 13а обрабатывают активированным углем и активированный уголь, необязательно, выбирают из группы, включающей SX-Plus, Darco S-51HF, Е Supra USP, SX-Ultra, CASP, Darco G-60 и CGSP.
1
4
1
4
1
4
4. Способ по п. 1, где раствор соединения 6а перегоняют в вакууме, после чего прибавляют седьмой растворитель, включающий С-C алкилацетат, получая состав растворителя от приблизительно 25%THF/75% С-С алкилацетата до приблизительно 100% С-С алкилацетата и где седьмой растворитель, необязательно, выбирают из группы, включающей метилацетат, этилацетат, i-пропилацетат, н-пропилацетат, н-бутилацетат и предпочтительно i-пропилацетат, и где соотношение между шестым и седьмым растворителями составляет от 25:75 до 0:100.
5. Способ по п. 1, где, по крайней мере, приблизительно 1 эквивалент соединения 19а прибавляют к соединению 6а или 6b, и DCC прибавляют к реакции при температуре от -10°С до +10°С и предпочтительно приблизительно от +3°С до +5°С, и где реакция между соединением 19а и или 6а, или 6b имеет место в десятом растворителе, выбираемом из группы, включающей THF, дихлорметан, 2-метилтетрагидрофуран, N,N-диметилформамид и N,N-диметилацетамид и предпочтительно THF, и где X является F, и m=5.
6. Способ по п. 1, где антитело содержит константную область легкой цепи, включающую последовательность, выбираемую из группы, содержащей SEQ ID NO: 9, 10, 11, и 12 или их варианты, содержащие между 1 и 5 аминокислотами замены, делеции или вставки, и константную область тяжелой цепи, включающую последовательность, выбираемую из группы, содержащей SEQ ID NO: 13, и 14 или их варианты, содержащие между 1 и 5 аминокислотами замены, делеции или вставки, и где антитело включает легкую цепь, содержащую SEQ ID NO 3 или их варианты, содержащие между 1 и 5 аминокислотами замены, делеции или вставки, и тяжелую цепь, содержащую SEQ ID NO:4 или их варианты, содержащие между 1 и 5 аминокислотами замены, делеции или вставки.
7. Способ по п. 1, где q=2, n, когда присутствует, =1, m, когда присутствует, =5, и х, когда присутствует, =F.
8. Способ получения соединения формулы 13а
где q=1, 2, 3, 4 или 5, отличающийся тем, что
реагируют в присутствии ангидрида 1-пропанфосфоновой кислоты (Т3Р).
9. Способ по п. 8, где реакция между 9а и 11 проводится в присутствии первого растворителя, выбираемого из группы включающей тетрагидрофуран (THF), 2-метилтетрагидрофуран, 1-метил-2-пирролидинон (NMP), N,N-диметилформамид (DMF), N,N-диметилацетамид (DMAc), 1-метил-2-пирролидинон, этилацетат (EtOAc) и ацетонитрил (MeCN), и предпочтительно MeCN, и где реакция, необязательно, проводится в присутствии первого основании, выбираемого из группы, включающей триметиламин, триэтиламин, трибутиламин, DIPEA, пиридин, DBU, DABCO, 2,3-лютидин, 2,4-лютидин, 2,5-лютидин, 2,6-лютидин, 3,4-лютидин, 3,5-лютидин, и предпочтительно DIPEA.
10. Способ по п. 8, где q=2, n, когда присутствует, =1, m, когда присутствует, =5, и х, когда присутствует, =F.
11. Способ получения соединения формулы 14а,
где q=1, 2, 3, 4 или 5, включающий каталитическое гидрирование с использованием Pd/С соединения 13а,
2
и отличающийся тем, что реакцию проводят в растворе THF:HO с, по крайней мере, приблизительно 50% THF, необязательно, по крайне мере, приблизительно 60%, по крайней мере, приблизительно 70%, по крайней мере, приблизительно 80% и, по крайней мере, приблизительно 90%.
2
12. Способ по п. 11, где перед гидрированием в THF/HO, соединение 13а обрабатывают активированным углем и активированный уголь, необязательно, выбирают из группы включающей SX-Plus, Darco S-51HF, E Supra USP, SX-Ultra, CASP, Darco G-60 и CGSP.
13. Способ по п. 11, где q=2, n, когда присутствует, =1, m, когда присутствует, =5, и х, когда присутствует, =F.
14. Способ получения соединения формулы 6а
где q=1, 2, 3, 4 или 5; включающий реакцию раствора соединения 14а
в шестом растворителе, включающем THF,
с соединением 15
и отличающийся тем, что реакция проводится, по существу, без основания.
1
4
1
4
1
4
15. Способ по п. 14, где раствор соединения 6а перегоняют в вакууме, после чего прибавляют седьмой растворитель, включающий C-С алкилацетат, получая состав растворителя от приблизительно 25%THF/75% С-С алкилацетата до приблизительно 100% С-С алкилацетата и где седьмой растворитель, необязательно, выбирают из группы, включающую метилацетат, этилацетат, i-пропилацетат, н-пропилацетат, н-бутилацетат и предпочтительно i-пропилацетат, и где соотношение между шестым и седьмым растворителями составляет от 25:75 до 0:100.
16. Способ по п. 14, где q=2, n, когда присутствует, =1, m, когда присутствует, =5, и х, когда присутствует, =F.
17. Способ кристаллизации соединения формулы 6а, включающий
(i) растворение кислоты 6а в восьмом растворителе, содержащем THF;
(ii) необязательно, обработку активированным углем и последующее фильтрование упомянутого активированного угля;
(iii) концентрирование кислоты 6а в растзоре THF до от приблизительно 2 до приблизительно 20 об.;
(iv) прибавление от приблизительно 1 до приблизительно 50 об. девятого растворителя, содержащего 2-пропанол;
(v) концентрирование раствора кислоты 6а в THF и 2-пропаноле до от приблизительно 2 до приблизительно 50 об.;
(vi) охлаждение концентрированного раствора кислоты 6 до от приблизительно -25°С до приблизительно 10°С.
18. Способ по п. 17, где q=2, n, когда присутствует, =1, m, когда присутствует, =5, и х, когда присутствует, =F.
19. Способ получения соединения формулы 20b, включающий взаимодействие соединения формулы 6b с соединением формулы 19а в десятом растворителе в присутствии DCC
где q=1, 2, 3, 4 или 5, n=1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30, X=F или Cl, и m=3, 4 или 5.
20. Способ по п. 19, где, по крайней мере, приблизительно 1 эквивалент соединения 19а прибавляют к соединению 6а или 6b, и где DCC прибавляют к реакции при температуре от -10°С до +10°С и предпочтительно приблизительно от +3°С до +5°С, и где реакция между соединением 19a и или 6а, или 6b имеет место в десятом растворителе, выбираемом из группы, включающей THF, дихлорметан, 2-метилтетрагидрофуран, N,N-диметилформамид и N,N-диметилацетамид и предпочтительно THF, и где X является F, и m=5.
21. Способ по п. 19, где q=2, n, когда присутствует, =1, m, когда присутствует, =5, и х, когда присутствует, =F.
22. Способ конъюгирования ε-аминосодержащего пептида 2 с линкером формулы 6b, включающий:
(i) растворение пептида 2 в апротонном полярном пятнадцатом растворителе,
(ii) реакцию 6b с от приблизительно 1 до приблизительно 10 эквивалентами 19а в THF, с получением соединения 20b;
(iii) объединение 20b с пептидом 2, с получением биоконъюгата 3b
где n=1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30, q=1, 2, 3, 4 или 5, Х=F или Cl, и m=3, 4 или 5.
23. Способ по п. 22, где, по крайней мере, приблизительно 1 эквивалент соединения 19а прибавляют к соединению 6a или 6b, и где DCC прибавляют к реакции при температуре от -10°С до +10°С и предпочтительно приблизительно от +3°С до +5°С, и где реакция между соединением 19а и или 6а, или 6b имеет место в десятом растворителе, выбираемом из группы, включающей THF, дихлорметан, 2-метилтетрагидрофуран, N,N-диметилформамид и N,N-диметилацетамид и предпочтительно THF, и где X является F, и m=5.
24. Способ по п. 22, где q=2, n, когда присутствует, =1, m, когда присутствует, =5, и х, когда присутствует, =F.
25. Способ конъюгирования пептида формулы 3b с антителом, включающий стадии:
(i) растворение соединения 3b в ДМСО:
(ii) прибавление гистидинового буфера при рН от приблизительно 5,5 до приблизительно 7,5 к раствору ДМСО и 3b стадии (i);
(iii) прибавление антитела, содержащего вариабельный легкий участок, включающий SEQ ID NO:5, и вариабельный тяжелый участок, включающий SEQ ID NO:6, к раствору стадии (ii), где антитело является раствором с приблизительно 10 мМ гистидинового и приблизительно 10 мМ глицинового буфера, содержащего приблизительно 2% (м/м) цукрозы, так что молярное соотношение пептид:антитело составляет от приблизительно 1,8:1 до приблизительно 3:1;
(iv) перемешивание смеси образованной на стадии (vi) при средней скорости для предотвращения вспенивания реакционной смеси на протяжении, по крайней мере, приблизительно 1 часа при рН от приблизительно 5,5 до приблизительно 7,5 и при температуре от приблизительно 5°С до 35°С;
(v) фильтрование раствора из (iv) для экстракции конъюгата пептид-линкер-антитело 5b,
где n=1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30, q=1, 2, 3, 4 или 5.
26. Способ по п. 25, где антитело содержит константную область легкой цепи, включающую последовательность, выбираемую из группы, содержащей SEQ ID NO: 9, 10, 11, и 12 или их варианты, содержащие между 1 и 5 аминокислотами замены, делеции или вставки, и константную область тяжелой цепи, включающую последовательность, выбираемую из группы, содержащей SEQ ID NO: 13, и 14 или их варианты, содержащие между 1 и 5 аминокислотами замены, делеции или вставки, и где антитело включает легкую цепь, содержащую SEQ ID NO:3 или их варианты, содержащие между 1 и 5 аминокислотами замены, делеции или вставки, и тяжелую цепь, содержащую SEQ ID NO:4 или их варианты, содержащие между 1 и 5 аминокислотами замены, делеции или вставки.
27. Способ по п. 25, где q=2, n, когда присутствует, =1, m, когда присутствует, =5, и х, когда присутствует, =F.
28. Соединение, имеющее структуру, выбираемую из группы, включающей:
где q=1, 2, 3, 4 или 5, n=1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, и X представляет собой любой галоген, и m=3, 4 или 5.