Способ диагностики клинической формы лейкоплакии слизистой оболочки рта
DIAGNOSTIC TECHNIQUE OF CLINICAL FORM OF ORAL MUCOUS MEMBRANES LEUKOPLAKIA

Изобретение относится к области медицины, в частности к терапевтической стоматологии, и может быть использовано для ранней диагностики клинической формы лейкоплакии слизистой оболочки рта (СОР).
Результаты последнего национального эпидемиологического стоматологического обследования свидетельствуют о том, что заболевания слизистой оболочки рта все чаще встречаются у лиц молодого возраста, приводя у зрелого населения к утяжелению и хронизации процесса, а в некоторых случаях и к малигнизации [Гажва С.И., Грехов А.В., Горячева Т.П., Сенина-Волжская И.В. Проблема ранней диагностики онкопатологии слизистой оболочки рта (социальные аспекты). Современные проблемы науки и образования 2015; 3. URL: http://science-education.ru/ru/article/view?id=19168.; Злокачественные новообразования в России в 2015 году (заболеваемость и смертность). Под ред. Каприна А.Д., Старинского В.В., Петровой Г.В. М: МНИОИ им. П.А. Герцена - филиал ФГБУ «НМИРЦ» Минздрава России, 2017; 250 с.].
Трудности диагностики патологии обусловлены многообразием и сходством клинической картины, динамическим изменением под действием общих и местных неблагоприятных факторов (экология, травма слизистой, микробная контаминация).
Общеизвестно, что лейкоплакия - заболевание СОР, в основе которого лежит хроническое воспаление, сопровождающееся нарушением ороговения, включая гиперкератоз и паракератоз [Березин К.А. Выбор и обоснование возможностей использования иммуногистохимического метода исследований в диагностике ранних проявлений кератотических процессов слизистой оболочки рта /К.А. Березин, Е.Ю. Старцева // Уральский медицинский журнал. - 2019. -№1. - С. 30-33].
По данным некоторых отечественных и зарубежных авторов в возрастных группах от 21 до 34 лет, от 35 до 44 лет и свыше 55 лет в структуре заболеваемости СОР превалирует лейкоплакия. На настоящий момент ряд аспектов диагностики СОР нуждается в углубленном изучении, оценке эффективности, разработке алгоритмов применения [Гажва С.И. Распространенность стоматологических заболеваний слизистой оболочки полости рта и их диагностика / С.И. Гажва, Т.Б. Степанян, Т.П. Горячева // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. - 2014. - №5-1. - С. 41-44.; Гилева О.С, Либик Т.В., Позднякова А.А., Сатюкова Л.Я. Предраковые заболевания в структуре патологии слизистой оболочки полости рта. Проблемы стоматологии. - 2013. - №2. - С 3-9].
По результатам многих современных исследований определен ряд иммуногистохимических критериев, позволяющих прогнозировать, как течение деструктивного процесса в тканях СОР, так и эффективность проводимого медикаментозного лечения.
Известен способ дифференциальной диагностики красного плоского лишая слизистой оболочки полости рта и лейкоплакии полости рта с применением гистологического исследования [Ронь Г.И., Епишова А.А. Клиника, диагностика, дифференциальная диагностика красного плоского лишая, лейкоплакии и красной волчанки. Проблемы Стоматологии. - 2009. -№5 (1). - с. 34-36].
Известен способ диагностики лейкоплакии СОР путем проведения оптической когерентной томографии (ОКТ). ОКТ-признаки плоской лейкоплакии: нижний слой ярче верхнего; верхняя граница изображения ровная; яркость верхнего слоя выше, чем в норме; высота увеличена по сравнению с нормой; нижний слой неоднородный, высокой яркости, соответствует соединительнотканной строме; глубина информативного изображения в большинстве областей >1,5 мм. ОКТ-исследование веррукозной лейкоплакии отражает следующие морфологические признаки: изображение слоистое (визуализируются 3 горизонтально ориентированных слоя - между обычными для ОКТ 2 слоями образуется неоднородный слабо рассеивающий (темный) слой, соответствующий зоне взаимопроникающих удлиненных акантолитических эпителиальных выростов и папилломатозных стромальных сосочков с находящимися в них расширенными капиллярами; граница между слоями нерезкая, извилистая, местами прерывистая; верхняя граница изображения неровная за счет веррукозных выростов; верхний слой неоднородный; высота увеличена по сравнению с нормой; глубина информативного изображения в большинстве областей >1 мм. При эрозивной форме лейкоплакии ОКТ-изображения были однородными, лишенными структурности, яркими; глубина информативного изображения <1 мм. По данным ОКТ-исследования, основной критерий малигнизации процесса - потеря структурности, т.е. томограмма визуализируется в виде однородного гомогенного изображения с малой глубиной сигнала или его отсутствием [Рабинович О.Ф., Бабиченко И.И., Рабинович И.М., Тогонидзе А.А. Методы комплексной диагностики лейкоплакии слизистой оболочки рта // Стоматология. №5. 20141. Как отмечают авторы статьи, данные ОКТ-исследований эпителия могут способствовать распознаванию доброкачественного или злокачественного процессов при данном заболевании и быть клинически полезным дополнением к стандартным гистоморфологическим исследованиям.
Известен способ диагностики красного плоского лишая полости рта, глоссалгии и лейкоплакии, который осуществляют путем вычисления значений электрохимических потенциалов на слизистой оболочке рта, при котором хлорсерябряный электрод располагают в подъязычной области, а активный электрод прикладывают к спинке языка, регистрируя максимальные значения электрохимических потенциалов. При значении, равном 366,83±5,0 mV диагностируют типичную форму плоского лишая, при значении, равном 315,61±6,9 mV - эрозивно-язвенную, при значении, равном 333,56±4,3 mV диагностируют лейкоплакию, а при значении, равном 350,4±5,2 mV - глоссалгию. Устройство для измерения электрохимических потенциалов состоит из измерительного блока, заключенного в корпус, хлорсеребряного электрода сравнения, имеющего на конце съемный стерильный электролитический ключ, представленный эндодонтической канюлей, заполненной физиологическим раствором, а конец активного электрода имеет круглую, плоскую форму диаметром 8 мм [Патент РФ 2583938, 2016 г.].
Недостатком вышеперечисленных способов является невозможность определения клинических форм лейкоплакии.
Известен способ дифференциальной диагностики красного плоского лишая и лейкоплакии слизистой оболочки полости рта, включающий проведение иммуногистохимического исследования биоптата очага поражения, при этом проводят исследование по определению локализации экспрессии молекулы клеточной адгезии Е-кадгерина, и при выявлении мембранной экспрессии Е-кадгерина в пределах 99-100%, мембранно-редуцированной экспрессии в пределах 0-1%, отсутствии мембранно-цитоплазматической экспрессии и отсутствии отсутствия иммунореактивности диагностируют красный плоский лишай; при выявлении мембранной экспрессии Е-кадгерина в пределах 80-98% и мембранно-редуцированной экспрессии в пределах 2-20%, отсутствии мембранно-цитоплазматической экспрессии и отсутствии отсутствия иммунореактивности, определяют экспрессию белка пролиферативной активности Ki67 и при локализации клеток, экспрессирующих Ki67 только в базальном слое, диагностируют красный плоской лишай, а при локализации клеток, экспрессирующих Ki67 в базальном и надбазальных слоях, диагностируют лейкоплакию; при выявлении мембранной экспрессии Е-кадгерина в пределах 30-79% и мембранно-редуцированной экспрессии в пределах 7-20%, а также мембранно-цитоплазматической экспрессии в пределах 30-50% и отсутствия иммунореактивности в пределах 20-50% диагностируют лейкоплакию [Патент РФ 2651050, 2018 г.]. Недостатком способа является невозможность дифференциальной диагностики клинических форм лейкоплакии.
Известен метод дифференциальной диагностики красного плоского лишая и лейкоплакии полости рта, основанный на выявлении в биоптате с помощью иммуногистохимии пролиферирующих клеток и определении их распределения в различных слоях эпидермиса [Piggati F.M., Taveira L.A., Soares СТ. Immunohistochemical expression of bcl-2 and Ki67 in oral lichen planus and leukoplakia with different degrees of dysplasia. Int J Dermatol, 2015, 54 (2): 150-155]. Недостатком способа является невысокая точность из-за невозможности определения клинических форм лейкоплакии.
Наиболее близким аналогом изобретения является способ дифференциальной диагностики различных форм лейкоплакии, заключающийся в том, что проводят иммуногистохимическое исследование гистологических срезов биоптата из очага поражения, определяют показатели изменений слизистой оболочки рта по классификации ВОЗ 2005 г., а также экспрессию иммуногистохимического маркера пролиферации Ki-67. Гистологически установлено, что при гиперплазии отмечается увеличение толщины эпителия в связи с увеличением одного из компонентов базального, шиповатого (акантоз) или поверхностного (гипер-, паракератоз) обычно в комбинации с последним без нарушения в развитии и без какой-либо клеточной атипии. Небольшое увеличение плотности клеток и клеточная атипия могут наблюдаться на фоне воспаления. Простая или плоская гиперплазия, при которой базальная мембрана остается хорошо определяемой в виде линии, отделяющей утолщенный эпителий от подлежащей стромы. Простая гиперплазия может сопровождаться воспалительными изменениями и проявлять реактивные (атипичные) цитологические изменения. Термины плоскоклеточная интраэпителиальная неоплазия характеризуют повреждения слизистой с вовлечением плоского эпителия различной толщины с нарушением развития, ориентации, полярности клеточных слоев и цитологическими изменениями с ядерной атипией, полиморфизмом и повышенной митотической активностью. При гистологических исследованиях эти изменения имеют определенный биологический потенциал для перехода в плоскоклеточный ороговевающий рак. При интраэпителиальной неоплазии 1-й степени в многослойном плоском эпителии имеются клетки с немного измененными цитологическими характеристиками, но они ограничены нижней третью эпителия, при этом сохраняется нормальное созревание эпителиальных клеток в верхних 2/3 эпителия. Митозы могут выявляться, но ограничены базальным слоем и имеют нормальную конфигурацию, может наблюдаться кератоз. При плоскоклеточной интраэпителиальной неоплазии 2-й степени измененные клетки с атипическими цитологическими характеристиками отмечаются в нижней и средней трети эпителия. Клеточная атипия более выявлена по сравнению с SIN 1: в ядрах определяются выраженные ядрышки. Дифференцировка сохраняется в верхней трети слизистой оболочки, митозы нормального вида могут отмечаться в парабазальном и промежуточном слоях. При плоскоклеточной интраэпителиальной неоплазии 3-й степени (SIN 3) атипические клетки проявляют выраженную ядерную изменчивость и сильную митотическую активность, занимая более 2/3 эпителиального слоя. Они не образуют скоплений и в них нет цитологической атипии, характерной для карциномы in situ. Дифференцировка клеток сохранена в поверхностных слоях, как доказательство фокального поверхностного плоскоклеточного дифференцирования и фокального сохранения межклеточных контактов. Митозы, включая атипические, могут располагаться в верхней трети эпителия. Может присутствовать ассоциативный кератоз. По мере нарастания неопластических изменений в эпителии, в подлежащей дерме усиливаются воспалительные явления, сопровождающиеся инфильтрацией лимфоцитами. При лейкоплакии без признаков клеточной атипии пролиферация клеток отмечается в базальном и парабазальном клеточных слоях, при лейкоплакии с диспластическими изменениями также пролиферируют клетки шиповатого слоя [Тогонидзе А.А. Оптимизация диагностики и лечения лейкоплакии слизистой оболочки рта // Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук. Москва. 2015]. Недостатком прототипа является невозможность определения клинических форм лейкоплакии.
Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа дифференциальной диагностики клинических форм лейкоплакии СОР.
Достигаемый технический результат состоит в повышении точности и объективности способа за счет получения дифференциальных количественных характеристик патологических кератотических процессов слизистой оболочки рта, являющихся ранними диагностическими критериями развития различных клинических форм лейкоплакии.
Предлагаемый способ диагностики клинических форм лейкоплакии СОР осуществляется следующим образом. Проводят забор из очага поражения биоптата слизистой оболочки в области щек размером в пределах 3 см у больных лейкоплакией СОР. Материал фиксируют в 10% нейтральном формалине по Лилли или жидкости Боуэна. Согласно общепринятой методике после соответствующей проводки по спиртам возрастающей концентрации проводят обработку в ксилоле и заливку в парафин [Саркисов Д.С., Перов Ю.Л. Микроскопическая техника.- М.: Медицина, 1996.- 544 с.]. Срезы толщиной 4-5 мкм изготавливают на санном микротоме Leica SM 2000R. Полученные микропрепараты окрашивают гематоксилином и эозином, по Ван Гизону, а также по пикро-Маллоли. Последний способ окраски позволяет идентифицировать «молодой», «зрелый» и «старый» фибрин [Зербино Д.Д. Методика для определения «возраста» фибрина при синдроме диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови / Д.Д. Зербино, Л.Л. Лукасевич // Архив патологии. - 1984. - №8. - С.72-75.].
Для иммуногистохимического исследования парафиновые срезы расправляют в водяной бане Гистобат LEICA HI 1210 и помещают на предметные стекла, обработанные поли-L-лизином и высушивают при температуре 35°С в течение одного часа [Белянин В.Л., Цыплаков Д.Э. Иммуногистохимия. В кн.: Диагностика реактивных гиперплазий лимфатических узлов. - СПб-Казань, 1999. - С. 33-54; Петров С.В., Райхлин Н.Т. Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей человека.- 4 изд., доп. и перераб., Казань, 2012. - 624 с.]. После депарафинировании, промывки и обезвоживания проводят демаскировку антигенов в цитратном буфере (DAKO: Target Retrieval Solution, рН 6,0, код S 169984-2). Подавление эндогенной пероксидазы проводят при помощи 3% раствора перекиси водорода. Для постановки иммуногистохимических реакций с выявлением тканевых антигенов используют набор моноклональных антител (МКАТ) (табл. 1).
При помощи морфометрической сетки случайного шага С.Б. Стефанова определяют площади структурных компонентов ткани. Затем в проценты соответственно переводят количество пересечений сетки, приходящихся отдельно на каждую из изучаемых структур [Стефанов С.Б. Морфометрическая сетка случайного шага как средство ускоренного измерения элементов морфогенеза // Цитология. - 1974. -№6 - С 785-787.]. Используя морфометрическую окулярную сетку Г.Г. Автандилова, анализируют клеточный состав, выражая количество клеток в процентах от их общего количества в исследуемой части среза [Автандилов Г.Г. Медицинская морфометрия. - М.: Медицина, 1990.- 382 с.].
При обнаружении утолщения эпителиального пласта, выражающегося в значении площадей рогового слоя эпителия 8,73±0,97%, поверхностного слоя эпителия 4,18±0,44%, промежуточного слоя эпителия 30,35±3,34%, базального слоя эпителия - 8,74±2,01%, базальной мембраны эпителия 1,20±0,17%, собственной пластинки слизистой оболочки и подслизистой основы 42,86±4,77%, кровеносных сосудов собственной пластинки слизистой оболочки 3,94±0,63%; увеличения пролиферативной активности клеток, преимущественно базального слоя эпителия, подтверждаемого содержанием Ki 67(+) элементов 2,783±0,179%, а также содержанием CD 45(+) клеток - 15,372±0,836%, CD 3(+) Т-лимфоцитов - 8,020±1,010%, CD 20(+) В-лимфоцитов - 10,664±1,016%, CD 38(+) плазматических клеток - 5,376±1,322, CD 68(+) макрофагов - 5,624±1,004%, МРО(+) нейтрофильных лейкоцитов - 7,420±0,650% диагностируют плоскую форму лейкоплакии СОР.
При обнаружении утолщения эпителиального пласта, выражающегося в значении площадей рогового слоя эпителия 10,08±2,57%, поверхностного слоя эпителия 6,68±0,76%, промежуточного слоя эпителия 31,5±3,98%, базального слоя эпителия 10,53±0,86%, базальной мембраны эпителия 2,82±0,41%, собственной пластинки слизистой оболочки и подслизистой основы 34,08±4,00%, кровеносных сосудов собственной пластинки слизистой оболочки 4,31±0,48%; увеличения митотической активности клеток в базальных и парабазальных клетках эпителия, подтверждаемого содержанием Ki 67(+) элементов 3,548±1,008%, а также содержании CD 3(+) Т-лимфоцитов - 5,270±1,235%; CD 20(+) В-лимфоцитов - 7,473±1,189%; CD 38(+) плазматических клеток - 3,045±0,879% и CD 68(+) макрофагов - 4,060±0,691%, CD 45(+) клеток - 18,372±0,836% и МРО(+) нейтрофильных лейкоцитов 3,832±0,561% диагностируют веррукозную форму лейкоплакии.
Для эрозивно-язвенной формы лейкоплакии свойственен более выраженный процесс пролиферации слоев эпителия. Отличительной особенностью эрозивно-язвенной формы лейкоплакии является также формирование эрозий с нарушением эпителиальной выстилки или более глубоких язвенных дефектов, достигающих мышечного слоя щеки. При значении площадей рогового слоя эпителия 13,67±2,73%, поверхностного слоя эпителия 8,53±1,46%, промежуточного слоя эпителия 39,7±4,09%, базального слоя эпителия 13,07±2,34%, базальной мембраны эпителия 3,22±0,54%, собственной пластинки слизистой оболочки и подслизистой основы 10,27±2,69%, кровеносных сосудов собственной пластинки слизистой оболочки 5,81±1,29%, лейкоцитарно-некротических масс 5,73±1,13%; содержании Ki 67(+) пролиферирующих клеток в количестве 2,510±0,194%; CD 3(+) Т-лимфоцитов - 5,520±0,926%; CD 20(+) В-лимфоцитов - 8,423±1,098%; CD 38(+) плазматических клеток - 4,035±0,990% и CD 68(+) макрофагов - 6,322±1,025%, а также выраженной экспрессии МКАТ против CD 45(+) клеток в количестве 19,252±1,489%, особенно на поверхности дефекта слизистой оболочки и в собственной пластинке слизистой оболочки; содержании МРО(+) нейтрофильных лейкоцитов 15,184±0,734%, диагностируют эрозивно-язвенную форму лейкоплакии.
Предлагаемое изобретение иллюстрируется следующими фигурами, на которых представлены гистограммы: на фиг. 1 - морфометрическая сетка случайного шага, наложенная на микропрепарат неизмененной слизистой оболочки. Окраска гематоксилином и эозином, х 100. На фиг. 2 - морфометрическая сетка случайного шага, наложенная на микропрепарат слизистой оболочки с явлениями лейкоплакии. Окраска гематоксилином и эозином, х 100. На фиг. 3 - морфометрическая окулярная сетка Г.Г. Автандилова при подсчете клеточного инфильтрата в собственной пластинке слизистой оболочки. Окраска гематоксилином и эозином, х 800. На фиг. 4 - морфометрическая окулярная сетка Г.Г. Автандилова при подсчете лейкоцитов в собственной пластинке слизистой оболочки. Экспрессия МКАТ против CD 45. LSAB-метод с докраской гематоксилином, х 800. На фиг. 5 - Плоская форма лейкоплакии. Акантоз. Окраска гематоксилином и эозином, х 200. На фиг. 6 - Плоская форма лейкоплакии. Гиперкератоз. Окраска гематоксилином и эозином, х 200. На фиг. 7 - Плоская форма лейкоплакии. Неравномерная экспрессия МКАТ против пан-цитокератинов в эпителии. LSAB-метод с докраской гематоксилином. х 400. На фиг. 8 - Плоская форма лейкоплакии. Лимфоплазмоцитарная и макрофагальная инфильтрация собственной пластинки слизистой. Окраска гематоксилином и эозином, х 400. На фиг. 9 - Плоская форма лейкоплакии. Расширение просвета и полнокровие сосудов собственной пластинки слизистой оболочки и подслизистой основы. Окраска гематоксилином и эозином, х 200. На фиг. 10 - Плоская форма лейкоплакии. «Зрелый» фибрин в просвете сосудов собственной пластинки слизистой оболочки. Окраска по пикро-Маллори. х 400. На фиг. 11 - Плоская форма лейкоплакии. Отложения «старого» фибрина вокруг сосудов собственной пластинки слизистой оболочки. Окраска по пикро-Маллори. х 400. На фиг. 12 - Веррукозная форма лейкоплакии. Ороговение эпителия с формированием «жемчужин». Окраска гематоксилином и эозином, х 300. На фиг. 13 - Веррукозная форма лейкоплакии. Экспрессия МКАТ против пан-цитокератинов в клетках эпителия и в «жемчужинах». LSAB-метод с докраской гематоксилином, х 400. На фиг. 14 - Веррукозная форма лейкоплакии. Экспрессия МКАТ против Ki 67 в ядрах пролиферирующих клеток базального и парабазального слоев. LSAB-метод с докраской гематоксилином, х 400. На фиг. 15 - Веррукозная форма лейкоплакии. Неравномерная окраска, утолщение и расщепление базальной мембраны эпителия. Реакция с МКАТ против коллагена IV типа. LSAB-метод с докраской гематоксилином, х 400. На фиг. 16 - Веррукозная форма лейкоплакии. Положительная реакция на фибрин в «жемчужине» ороговевающего эпителия. Окраска по пикро-Маллори. х 300. На фиг. 17 - Веррукозная форма лейкоплакии. Диффузная воспалительная клеточная инфильтрация собственной пластинки слизистой оболочки и подслизистой основы с выраженной экспрессией МКАТ против CD 45. Окраска гематоксилином и эозином, х 200. На фиг. 18 - Веррукозная форма лейкоплакии. Инфильтрация Т-лимфоцитами и макрофагами собственной пластинки слизистой оболочки с проникновением клеток в эпителиальный пласт. Реакция с МКАТ против CD 3. LSAB-метод с докраской гематоксилином, х 400. На фиг. 19 - Веррукозная форма лейкоплакии. Инфильтрация В-лимфоцитами собственной пластинки слизистой оболочки с проникновением клеток в эпителиальный пласт. Реакция с МКАТ против CD 20. LSAB-метод с докраской гематоксилином, х 400. На фиг. 20 - Веррукозная форма лейкоплакии. Склероз собственной пластинки слизистой оболочки и подслизистой основы. Окраска по ван Гизону. х 200. На фиг. 21 - Веррукозная форма лейкоплакии. Высокая экспрессия МКАТ против виментина в собственной пластинке слизистой оболочки. LSAB-метод с докраской гематоксилином, х 400. На фиг. 22 - Веррукозная форма лейкоплакии. Отложение «зрелого» и «старого» фибрина в собственной пластинке слизистой оболочки. Окраска по пикро-Маллори. х 400. На фиг. 23 - Веррукозная форма лейкоплакии. Набухание и десквамация эндотелия в просвет сосудов собственной пластинки слизистой оболочки. Реакция с МКАТ против CD 31. LSAB-метод с докраской гематоксилином, х 400. На фиг. 24 - Эрозивно-язвенная форма лейкоплакии. Воспалительная клеточная инфильтрация, очаговый некроз и нарушение эпителиальной выстилки. Окраска гематоксилином и эозином, х 300. На фиг. 25 - Эрозивно-язвенная форма лейкоплакии. Высокая экспрессия МКАТ против миелопероксидазы на поверхности эрозии и в собственной пластинке слизистой оболочки. LSAB-метод с докраской гематоксилином, х 200. На фиг. 26 - Эрозивно-язвенная форма лейкоплакии. Внесосудистый фибрин вокруг фрагмента эпителия в зоне эрозии. Окраска по пикро-Маллори. х 400.
Нами был изучен архивный материал, полученный выборочным методом от 37 больных с плоской формой лейкоплакии слизистой оболочки рта, от 31 больного с веррукозной формой лейкоплакии, от 27 больных с эрозивно-язвенной формой лейкоплакии, проживающих в Казани и обратившихся в стоматологическое отделение РКОД Министерства здравоохранения России в течение последних двух лет. В качестве контроля послужили фрагменты слизистой оболочки щеки 52 практически здоровых лиц, погибших от случайных причин (судебно-медицинские вскрытия). Забор секционного материала производили в патологоанатомическом отделении РКОД Министерства здравоохранения России и бюро судебно-медицинской экспертизы. Критериями выбора секционного материала служили: возраст от 20 до 55 лет, участок всей толщины слизистой оболочки преддверья рта в области премоляров размерами в пределах 3 см. Забор гистологического материала проводили в доступной области перехода прикрепленной слизистой оболочки альвеолярного отростка верхней и/или нижней челюсти в слизистую оболочку щеки или губы в области очага поражения.
Материал фиксировали в 10% нейтральном формалине по Лилли или жидкости Боуэна. Согласно общепринятой методике после соответствующей проводки по спиртам возрастающей концентрации следовала обработка в ксилоле и заливка в парафин. Срезы толщиной 4-5 мкм изготавливали на микротоме Leica SM 2000R. Полученные препараты окрашивали гематоксилином и эозином, по ван Гизону, а также по пикро-Маллори, что позволяло идетифицировать «молодой», «зрелый» и «старый» фибрин. Для иммуногистохимического исследования парафиновые срезы расправляли в водяной бане Гистобат LEICA HI 1210 и помещали на предметные стекла, обработанные поли-L-лизином, и высушивали при температуре 35°С в течение одного часа. После депарафинирования, промывки и обезвоживания следовала демаскировка антигенов в цитратном буфере (DAKO: Target Retrieval Solution, рН 6,0, код S 169984-2). Подавление эндогенной пероксидазы проводилось при помощи 3% раствора перекиси водорода. Иммуногистохимическое исследование с выявлением тканевых антигенов проводили с помощью набора моноклональных антител (МКАТ) (табл. 1).
Первые антитела разводили специальным буфером с компонентом, препятствующим неспецифическому связыванию антител (DAKO: Antibody Diluent with Background Reducing Component, код S3002). Экспозиция первых МКАТ составляла 1 час при постоянной (30°С) температуре, поддерживаемой при помощи нагревательной платы (гистоплата LEICA HI 1220). Затем стекла со срезами промывали в течение 10 минут в Трис-буфере. Связывание первых антител с клеточными и структурными элементами определяли при помощи стандартного биотин-стрептавидин-пероксидазного метода (DAKO: LSAB+System-HRP, код К0690) с диаминобензидином в качестве хромогена. После промывки в дистиллированной воде препараты дополнительно окрашивали гаматоксилином Майера в течение 1-2 мин. Затем следовала повторная промывка в воде (15 мин.), дегидратация в 96% спирте (10 мин.) и осветление в карбол-ксилоле (5 мин.). Срезы заключали в канадский бальзам или в специальные среды фирмы DAKO (Ultramount, Faramount, код S302580-2).
Для оценки обнаруженных изменений использовались рекомендации по патоморфологической диагностике в соответствии с современными требованиями доказательной медицины [Петров С.В., Райхлин Н.Т. Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей человека. - 4 изд., доп. и перераб., Казань, 2012. - 624 с.].
При определении площадей структурных компонентов ткани применялась морфометрическая сетка случайного шага С.Б. Стефанова, а для подсчета клеток - морфометрическая окулярная сетка Г.Г. Автандилова.
Принцип работы с морфометрической сеткой случайного шага заключается в следующем (фиг. 1): сетку накладывают непосредственно на микропрепарат и под малым увеличением (окуляр х7, объектив - х10) подсчитывают количество пересечений сетки, приходящихся на каждую из изучаемых структур. Положение сетки на гистологическом срезе несколько раз произвольно меняют, каждый раз повторяя подсчет. Полученное в результате подсчета общее число пересечений сетки, приходящихся на весь срез, принимают за 100%. Затем в проценты соответственно переводят количество пересечений сетки, приходящихся отдельно на каждую из изучаемых структур.
В слизистой оболочке рта таким образом можно, например, определить толщину эпителиального пласта, в частности участков ороговения, при их появлении (фиг. 2), рассчитать площадь кровеносных сосудов и т.д. Таким образом можно исследовать любые структуры в зависимости от цели исследования.
Для количественного изучения клеточного состава используется морфометрическая сетка Г.Г. Автандилова, которая закрепляется внутри окуляра микроскопа. Она содержит 25 или 100 точек, которые визуализируются в поле зрения при просмотре микропрепарата (фиг. 3). Изучение объектов следует проводить под большим увеличением: окуляр х10, объектив х90 (иммерсия), в крайнем случае - х40. Подсчитывается количество точек, приходящихся на различные клеточные элементы. Поле зрения на микропрепарате 20 или 40 раз меняют, произвольно перемещая его на предметном столике микроскопа, каждый раз повторяя подсчет. Таким образом, учитывается 500-1000 точек, приходящихся на различные клетки. Общее количество точек (500 или 1000) принимается за 100%. Затем вычисляется процентное соотношение различных типов клеток.
Указанный морфометрический метод можно применять при рутинных окрасках гистологических срезов гематоксилином, эозином и по Ван Гизону. В то же время, эти окраски не дают возможности точно идентифицировать все клеточные элементы, встречающиеся в слизистой оболочке. Для этого необходимо использование иммуногистохимического метода [Березин К.А. Выбор и обоснование возможностей использования иммуногистохимического метода исследований в диагностике ранних проявлений кератотических процессов слизистой оболочки рта / К.А. Березин, Е.Ю. Старцева // Уральский медицинский журнал. - 2019. - №1. - С. 30-33.] с применением широкой панели моноклональных антител (МКАТ). При этом высокоспецифичном методе на гистологическом срезе отчетливо выявляются только искомые клетки, окрашенные соответствующими МКАТ, что существенно облегчает их подсчет (фиг. 4).
Полученные таким образом морфометрические данные позволяют не только дать количественную оценку обнаруженных изменений, но и провести статистический анализ с вычислением критерия Стьюдента и определением достоверности различий (Р) между изучаемыми параметрами. Так, например, можно сравнивать по различным параметрам нормальную и патологически измененную слизистую оболочку, а также проследить динамику морфологических изменений при различных заболеваниях. При этом возможна разработка диагностических и прогностических алгоритмов.
Как видно из полученных морфометрических данных, при развитии плоской формы лейкоплакии происходит утолщение эпителиального пласта, прежде всего за счет промежуточного слоя, площадь которого увеличивается с 15,70±2,79% (контроль) до 30,35±3,34%, что вызвано акантозом и гиперкератозом (фиг. 5, 6). Кроме того, появляются, нехарактерные для нормальной слизистой оболочки, участки ороговения, площадь которых составляет 8,73±0,97% (табл. 2). При этом происходит утолщение базальной мембраны эпителия - до 1,20±0,17% (фиг. 7). Наблюдаемое расширение просвета и полнокровие кровеносных сосудов собственной пластинки слизистой оболочки сопровождается увеличением занимаемой их площади до 3,94±0,63% (фиг. 9, 10). Площадь поверхностного слоя эпителия составляет 4,18±0,44%, площадь базального слоя - 8,74±2,01%, площадь собственной пластинки слизистой оболочки и подслизистой основы 42,86±74,77% от общей площади среза (табл. 2).
В собственной пластинке слизистой оболочки и в подслизистой основе при этой форме лейкоплакии обнаруживаются очаговые или диффузные клеточные инфильтраты (табл. 3). Морфометрический анализ клеточного состава на иммуногистохимических препаратах показал, что происходит увеличение, как общего числа CD 45(+) клеток - до 15,372±0,836%, так и отдельных клеточных элементов. При этом преобладают CD 3(+) Т-лимфоциты - 8,020±1,010%, CD 20(+) В-лимфоциты - 10,664±1,016% и CD 38(+) плазматические клетки - 5,376±1,322, со значительной примесью МРО(+) нейтрофильных лейкоцитов - 7,420±0,650% (табл. 3). Содержание CD 68(+) макрофагов несколько меньше - 5,624±1,004% (фиг. 8). Обращает на себя внимание увеличение пролиферативной активности клеток, преимущественно базального слоя эпителия, что подтверждается наличием 2,783±0,179% Ki 67(+) элементов (табл. 3).
При веррукозной форме лейкоплакии эпителиальная выстилка еще более утолщена, прогрессируют явления гиперкератоза и акантоза с увеличением площади промежуточного слоя эпителия до 31,5±3,98% (табл. 2). Площадь рогового слоя составляет 10,08±2,57% (фиг. 12, 13). В отличие от плоской формы лейкоплакии, значительно возрастает пролиферация и расширение базального слоя до 10,53±0,86% (табл. 2). Базальная мембрана занимает 2,82+0,41% от общей площади среза (фиг. 15). Площадь собственной пластинки слизистой оболочки и подслизистой основы составляет 34,08±4,00%. Прогрессируют микроциркуляторные расстройства, что сопровождается увеличением площади кровеносных сосудов собственной пластинки слизистой оболочки - до 4,31±0,48% (табл. 2, фиг. 23).
Анализ клеточного состава выявляет высокую митотическую активность в базальных и парабазальных клетках - Ki 67(+) элементы составляют 3,548±1,008% (табл. 3, фиг. 14). По сравнению с плоской формой лейкоплакии, значительно увеличивается воспалительная клеточная инфильтрация собственной пластинки слизистой оболочки и подслизистой основы с выраженной экспрессией МКАТ против CD 45(+) клеток - 18,372±0,836% (фиг. 17). Воспаление носит преимущественно хронический характер с преобладанием лимфоцитов, плазматических клеток и макрофагов: превалируют CD 3(+) Т-лимфоциты - 5,270±1,235%, CD 20(+) В-лимфоциты - 7,473±1,189%, CD 38(+) плазматические клетки - 3,045±0,879% и CD 68(+) макрофаги - 4,060±0,691% (фиг.18, 19, 23). МРО(+) нейтрофильные лейкоциты, судя по реакции с МКАТ против миелопероксидазы, в клеточных инфильтратах составляют меньшинство -3,832±0,561% (табл. 3).
Для эрозивно-язвенной формы лейкоплакии свойственен более выраженный процесс пролиферации слоев эпителия (табл. 2). Отличительной особенностью эрозивно-язвенной формы лейкоплакии является также формирование эрозий с нарушением эпителиальной выстилки или более глубоких язвенных дефектов, достигающих мышечного слоя щеки (фиг. 24, 26). Как видно из полученных морфометрических данных, при развитии эрозивно-язвенной формы значительно увеличивается значение площади рогового слоя эпителия 13,67±2,73%, площади поверхностного слоя 8,53±1,46%, площадь промежуточного слоя составляет 39,7±4,09%, площадь базального слоя 13,07±2,34%, площадь базальной мембраны эпителия 3,22±0,54%, площадь собственной пластинки слизистой оболочки и подслизистой основы 10,27±2,69%, площадь кровеносных сосудов собственной пластинки слизистой оболочки - 5,81°1,29% (табл. 2). Наблюдается увеличение экспрессии МКАТ против CD 45(+) клеток в количестве 19,252±1,489%, особенно на поверхности дефекта слизистой оболочки и в собственной пластинке слизистой оболочки; при этом обнаруживаются лейкоцитарно-некротические массы, площадь которых достигает - 5,73±1,13% (табл. 2, фиг. 25). Несколько меняется и характер воспалительной реакции - часто имеет место хроническое воспаление в стадии обострения. Так, в клеточном инфильтрате наряду с лимфоцитами, плазматическими клетками и макрофагами появляется большое количество МРО(+) нейтрофильных лейкоцитов - 15,184±0,734%. Содержание Ki 67(+) пролиферирующих клеток составляет 2,510±0,194%; выраженная экспрессия МКАТ; CD 3(+) Т-лимфоциты - 5,520±0,926%; CD 20(+) В-лимфоциты - 8,423±1,098%; CD 38(+) плазматические клетки - 4,035±0,990% и CD 68(+) макрофаги - 6,322±1,025% (табл. 3).
Сущность изобретения поясняется следующими клиническими примерами.
Пример 1.
В клинику терапевтической стоматологии обратился больной С., 48 лет, с жалобами на шероховатость, чувство жжения, на наличие белых пятен в области преддверия рта.
Из анамнеза заболевания: около года назад больной обратил внимание на изменение цвета слизистой оболочки десны. К врачу не обращался. В последнее время усилилась белесоватость очага. Появилось ощущение сухости во рту.
Из анамнеза жизни. В анамнезе диагностирован хронический гастрит, сахарный диабет. Курит с 17 лет. Профессиональных вредностей не было. Объективный осмотр: внешних изменений нет, лицо симметричное; на слизистой оболочке щек по линии смыкания зубов симметрично определяется потеря блеска слизистой оболочки, в виде вытянутой линии визуализируется пятно с белым налетом не удаляющееся при поскабливании, с нечеткими контурами. Поверхность слизистой оболочки в месте поражения сухая, немного шероховатая на ощупь, собирается в толстую складку. Пальпация безболезненная, очагов уплотнения не обнаруживается. Видимых признаков воспаления нет. Регионарные лимфатические узлы не увеличены. На всех поверхностях фронтальных зубов в большом количестве имеются над- и поддесневые зубные отложения темно-желтого цвета. На 1.7, 1.6, 2.5, 4.7, 3.6, 3.7 зубах определяются кариозные полости зубов и острые края зубов. На пришеечной поверхности 3.4,3.3,3.2,3.1,4.1,4.2,4.3,4.4,1.6,1.7,2.6,2.7 зубов определяются большое количество над- и поддесневых зубных отложений коричневого цвета.
Дополнительные методы исследования:
Индекс гигиены (Greene- Vermillion) - 2,5 (плохой уровень гигиены)
Стоматоскопия: резко выделяется слой ороговевшего серо-белого эпителия, рядом с которым сохраняется нормальная слизистая оболочка. Люминесцентное исследование: голубое свечение участка поражения. Оптическая когерентная томография (ОКТ): изображение слоистое, дифференцируются два горизонтально ориентированных слоя; нижний слой ярче верхнего слоя; граница между слоями контрастная, ровная и непрерывная; верхняя граница изображения ровная; верхний слой неоднородный, соответствует многослойному плоскому эпителию; яркость выше, чем в норме, поверхность особенно яркая; высота увеличена по сравнению с нормой; нижний слой неоднородный, высокой яркости, соответствует соединительно-тканной строме; глубина информативного изображения в большинстве областей более 1,5 мм.
Цитограмма: отмечается обильное количество эпителиальных клеток по сравнению со здоровым участком. Повышена десквамация ороговевших эпителиальных клеток, как безъядерных, так и ядросодержащих.
Гистология: ороговение эпителия слизистой оболочки на значительном протяжении, т.е. явление гиперкератоза. Отмечается также утолщение эпителиального покрова слизистой оболочки без выраженного акантоза. Выражен зернистый слой эпителия. Соединительная ткань полнокровная, отечная, разрыхленная нейтрофилами и плазматическими клетками. Слой поверхностных клеток состоит из 6-8 рядов, что значительно превышает обычное соотношение клеточных слоев. Поверхностные клетки тесно прилегают друг к другу, ядра в них гиперхромны, вытянуты, протоплазма плотная, однородная, эозинофильная.
Предварительный диагноз: лейкоплакия.
По предлагаемому способу было проведено иммуногистохимическое и морфометрическое исследование биоптата очага поражения слизистой оболочки рта.
Определено: площадь рогового слоя эпителия - 8,73%, площадь поверхностного слоя эпителия - 4,18%, площадь промежуточного слоя эпителия - 30,35%, площадь базального слоя - 8,74%, площадь базальной мембраны - 1,20%, площадь собственной пластинки слизистой оболочки и подслизистой основы - 42,86%, площадь кровеносных сосудов собственной пластинки слизистой оболочки - 3,94% от общей площади среза. Содержание Ki 67(+) пролиферирующих клеток - 2,783%; количество CD 45(+) клеток - 15,372%; CD 3(+) Т-лимфоцитов - 8,020%; CD 20(+) В-лимфоцитов - 10,664%; CD 38(+) плазматических клеток -5,376% и CD 68(+) макрофагов - 5,624%, МРО(+) нейтрофильных лейкоцитов - 7,420%, что позволило диагностировать у пациента плоскую форму лейкоплакии слизистой оболочки щеки и назначить ему соответствующую терапию, приведшую к значительной положительной динамике со стороны патологического процесса.
Окончательный диагноз: Лейкоплакия идиопатическая слизистой оболочки щеки К13.20, плоская стадия.
Пример 2.
В клинику терапевтической стоматологии обратилась больная А., 50 лет, с целью профилактического осмотра. К врачу-стоматологу не обращалась в течение двух лет. Жалобы: отсутствуют. Из анамнеза жизни. В анамнезе диагностирован сахарный диабет декомпенсированной формы. Курит с 18 лет. Профессиональных вредностей не было.
Объективный осмотр: внешних изменений нет, лицо симметричное; на слизистой оболочке щек по линии смыкания зубов определяется потеря блеска слизистой оболочки и несколько пятен различной формы с белым налетом не удаляющееся при поскабливании, с нечеткими контурами. Поверхность слизистой оболочки в месте поражения сухая, немного шероховатая на ощупь, собирается в толстую складку. Пальпация безболезненная, очагов уплотнения не обнаруживается. Окружающая слизистая оболочка слегка гиперемированная. На отечной слизистой оболочке щек выражены отпечатки зубов. Регионарные лимфатические узлы не увеличены. На всех поверхностях зубов в большом количестве имеются над- и поддесневые зубные отложения темно-желтого цвета. Определяются пломбы с нарушенной герметичностью к твердым тканям 3.6, 3.7, 4.5, 4.7 зубов и острые края зубов. На пришеечной поверхности 3.4,3.3,3.2,3.1,4.1,4.2,4.3,4.4,1 зубов определяются большое количество над- и поддесневых зубных отложений темно-желтого цвета.
Дополнительные методы исследования:
Индекс гигиены (Greene- Vermillion) - 2,0 (плохой уровень гигиены)
Стоматоскопия: резко выделяется слой ороговевшего серо-белого эпителия, рядом с которым сохраняется нормальная слизистая оболочка. Люминесцентное исследование: голубое свечение участка поражения.
Оптическая когерентная томография (ОКТ): изображение слоистое, дифференцируются два горизонтально ориентированных слоя; нижний слой ярче верхнего слоя; граница между слоями контрастная, ровная и непрерывная; верхняя граница изображения ровная; верхний слой неоднородный, соответствует многослойному плоскому эпителию; яркость выше, чем в норме, поверхность особенно яркая; высота увеличена по сравнению с нормой; нижний слой неоднородный, высокой яркости, соответствует соединительно-тканной строме; глубина информативного изображения в большинстве областей более 1,5 мм.
Цитограмма: отмечается обильное количество эпителиальных клеток по сравнению со здоровым участком. Повышена десквамация ороговевших эпителиальных клеток, как безъядерных, так и ядросодержащих. Гистология: ороговение эпителия слизистой оболочки на значительном протяжении, т.е. явление гиперкератоза. Гиперплазия отмечается в слое шиповатых клеток (акантоз) и в слое базальных клеток. Соединительная ткань полнокровная, отечная, разрыхленная нейтрофилами и плазматическими клетками. Архитектура ткани без особенностей, клеточная атипия отсутствует.
Предварительный диагноз: лейкоплакия.
По предлагаемому способу было проведено иммуногистохимическое и морфометрическое исследование биоптата очага поражения слизистой оболочки рта.
Определено: площадь рогового слоя эпителия - 8,23%, площадь поверхностного слоя эпителия - 4,48%, площадь промежуточного слоя эпителия - 32,55%, площадь базального слоя - 7,74%, площадь базальной мембраны - 1,1%, площадь собственной пластинки слизистой оболочки и подслизистой основы - 42,29%, площадь кровеносных сосудов собственной пластинки слизистой оболочки - 3,61% от общей площади среза. Содержание Ki 67(+) пролиферирующих клеток 2,604%; CD 45(+) клеток - 14,536%; CD 3(+) Т-лимфоцитов - 7,01%; CD 20(+) В-лимфоцитов - 9,648%; CD 38(+) плазматических клеток - 4,054% и CD 68(+) макрофагов - 4,62%, МРО(+) нейтрофильных лейкоцитов - 6,77%, что позволило диагностировать у пациента плоскую форму лейкоплакии слизистой оболочки щеки и назначить ему соответствующую терапию, приведшую к значительной положительной динамике со стороны патологического процесса. Окончательный диагноз: Лейкоплакия идиопатическая слизистой оболочки щеки К13.20, плоская стадия.
Пример 3.
В клинику терапевтической стоматологии обратился больной О., 56 лет, с жалобами на шероховатость слизистой оболочки в области щек. Из анамнеза заболевания: около месяца назад больной обратил внимание на изменение цвета слизистой оболочки десны. К врачу не обращался. В последнее время появилось ощущение сухости во рту. Из анамнеза жизни. В анамнезе диагностирован хронический гастрит, гастродуаденит. Курит с 17 лет. Профессиональных вредностей не было. Объективный осмотр: внешних изменений нет, лицо симметричное; на слизистой оболочке щек по линии смыкания зубов определяется потеря блеска слизистой оболочки, в виде вытянутой линии визуализируется пятно с белым налетом не удаляющееся при поскабливании, с нечеткими контурами. Поверхность слизистой оболочки в месте поражения сухая, немного шероховатая на ощупь, собирается в толстую складку. Пальпация безболезненная, очагов уплотнения не обнаруживается. Видимых признаков воспаления нет. Регионарные лимфатические узлы не увеличены. На всех поверхностях зубов в большом количестве имеются налеты и над- и поддесневые зубные отложения темно-желтого цвета. Определяются кариозные полости зубов и острые края зубов. Дополнительные методы исследования:
Индекс гигиены (Greene- Vermillion) - 2,0 (плохой уровень гигиены)
Стоматоскопия: резко выделяется слой ороговевшего серо-белого эпителия, рядом с которым сохраняется нормальная слизистая оболочка. Люминесцентное исследование: голубое свечение участка поражения.
Оптическая когерентная томография (ОКТ): изображение слоистое, дифференцируются два горизонтально ориентированных слоя. Нижний слой ярче верхнего слоя; граница между слоями контрастная, ровная и непрерывная; верхняя граница изображения ровная; верхний слой неоднородный, соответствует многослойному плоскому эпителию; яркость выше, чем в норме, поверхность особенно яркая; высота увеличена по сравнению с нормой; нижний слой неоднородный, высокой яркости, соответствует соединительно-тканной строме; глубина информативного изображения в большинстве областей более 1,5 мм.
Цитограмма: отмечается обильное количество эпителиальных клеток по сравнению со здоровым участком. Повышена десквамация ороговевших эпителиальных клеток, как безъядерных, так и ядросодержащих.
Гистология: ороговение эпителия слизистой оболочки на значительном протяжении, т.е. явление гиперкератоза. Гиперплазия отмечается в слое шиповатых клеток (акантоз) и в слое базальных клеток. Соединительная ткань полнокровная, отечная, разрыхленная нейтрофилами и плазматическими клетками. Архитектура ткани без особенностей, клеточная атипия отсутствует.
Предварительный диагноз: лейкоплакия.
По предлагаемому способу было проведено иммуногистохимическое и морфометрическое исследование биоптата очага поражения слизистой оболочки рта.
Обнаружено: площадь рогового слоя эпителия - 8,36%, площадь поверхностного слоя эпителия - 4,45%, площадь промежуточного слоя эпителия - 27,25%, площадь базального слоя - 10,34%, площадь базальной мембраны - 1,3%, площадь собственной пластинки слизистой оболочки и подслизистой основы - 43,86%, площадь кровеносных сосудов собственной пластинки слизистой оболочки - 4,44%. Содержание Ki 67(+) пролиферирующих клеток - 2,962%»; количество CD 45(+) клеток - 16,208%; CD 3(+) Т-лимфоцитов - 9,03%; CD 20(+) В-лимфоцитов - 11,68%; CD 38(+) плазматических клеток - 6,608%) и CD 68(+) макрофагов -6,628%, МРО(+) нейтрофильных лейкоцитов - 8,07%, что позволило диагностировать у пациента плоскую форму лейкоплакии слизистой оболочки щеки и назначить ему соответствующую терапию, приведшую к значительной положительной динамике со стороны патологического процесса.
Окончательный диагноз: Лейкоплакия идиопатическая слизистой оболочки щеки К13.20, плоская стадия.
Пример 4.
В клинику терапевтической стоматологии обратился больной С., 46 лет, с жалобами на шероховатость, чувство стянутости, на наличие непонятных образований на боковой поверхности щеки и наличие белого пятна. Из анамнеза заболевания: около года назад больной обратил внимание на необычный вид слизистой оболочки щеки слева. К врачу не обращался. В течение 2 месяцев появилось жжение и болезненность слизистой оболочки левой щеки, что и послужило поводом обращения к врачу-стоматологу. Образования стали мешать при еде и при разговоре.
Из анамнеза жизни. В анамнезе диагностирован хронический гастрит. Курит с 17 лет, примерно 10 сигарет в день.
Объективный осмотр: внешних изменений нет, лицо симметричное, кожные покровы чистые. Регионарные лимфатические узлы не увеличены. На слизистой оболочке обоих щек щеки определяются плотные участки гиперкератоза белого цвета размером 1-1,5 см в диаметре, с ограниченными бляшками с полигональными контурами и четкими границами, возвышающимися над уровнем окружающей слизистой на 2 мм, неправильной формы, с шероховатой поверхностью, неудаляющиеся при поскабливании. Видимой воспалительной реакции по периферии нет. Пальпация безболезненная, определяется поверхностное уплотнение очага. На всех поверхностях зубов в большом количестве имеются налеты и над- и поддесневые зубные отложения темно-желтого цвета. Определяются кариозные полости зубов и острые края зубов. Дополнительные методы исследования:
Индекс гигиены (Greene- Vermillion) - 2,0 (плохой уровень гигиены)
Люминесцентное исследование: фиолетовое свечение участка поражения.
Электронно-микроскопическое исследование: истончение базальной мембраны и признаки значительного омоложения клеток шиповатого и базального слоев эпителиального пласта.
Цитограмма: отмечается увеличенное количество эпителиальных клеток промежуточной зрелости. Отмечается клеточная дегенерация, лишь отдельные клетки сохраняют ядра.
Стоматоскопия: определяется резко утолщенный слой эпителия. Оптическая когерентная томография (ОКТ): изображение слоистое, дифференцируются три горизонтально ориентированных слоя - между обычными для ОКТ двумя слоями определяется неоднородный слабо рассеивающий (темный) слой, соответствующий зоне взаимопроникающих удлиненных акантотических эпителиальных выростов и папилломатозных стромальных сосочков с находящимися в них расширенными капиллярами; граница между слоями нерезкая, извилистая, местами прерывистая; верхняя граница изображения неровная за счет веррукозных выростов; верхний слой неоднородный; высота увеличена по сравнению с нормой; Яркость высокая, особенно у поверхности; нижний слой неоднородный, умеренной яркости; визуализируются линейные структуры низкой яркости с контрастными границами, что соответствует накоплению в строме межтканевой жидкости (отеку).
Гистология: гиперкератоз, мощный акантоз с удлинением и утолщением эпителиальных островков, иногда с явлениями дискомплексации клеток.
Предварительный диагноз: лейкоплакия.
По предлагаемому способу было проведено иммуногистохимическое и морфометрическое исследование биоптата очага поражения слизистой оболочки рта.
Определено: площадь рогового слоя эпителия - 10,08%, площадь поверхностного слоя эпителия - 6,68%, площадь промежуточного слоя эпителия - 31,5%, площадь базального слоя - 10,53%, площадь базальной мембраны - 2,82%, площадь собственной пластинки слизистой оболочки и подслизистой основы - 34,08%, площадь кровеносных сосудов собственной пластинки слизистой оболочки - 4,31%. Содержание Ki 67(+) пролиферирующих клеток - 3,548%; CD 45(+) клеток - 18,372%, МРО(+) нейтрофильных лейкоцитов - 3,832%; CD 3(+) Т-лимфоцитов - 5,270%; CD 20(+) В-лимфоцитов - 7,473%»; CD 38(+) плазматических клеток - 3,045%» и CD 68(+) макрофагов - 4,060%, что позволило диагностировать у пациента веррукозную форму лейкоплакии.
Окончательный диагноз: Лейкоплакия идиопатическая слизистой оболочки щеки слева К13.20, веррукозная стадия.
В результате своевременной постановки диагноза пациенту был выбран подходящий метод лечения, способствующий положительному клиническому эффекту.
Пример 5.
В клинику терапевтической стоматологии обратилась больная С., 53 лет, с жалобами на дискомфорт в области рта.
Из анамнеза заболевания: около года назад больная обратила внимание на необычный вид слизистой оболочки щеки слева. К врачу не обращалась. В течение 4 месяцев появились бородавчатые разрастания белого цвета, мешающие при еде и при разговоре.
Из анамнеза жизни. В анамнезе диагностирован хронический гастродуаденит, холецистит, сахарный диабет.
Объективный осмотр: внешних изменений нет, лицо симметричное, кожные покровы чистые. Регионарные лимфатические узлы не увеличены. На слизистой оболочке обоих щек щеки определяются очаги поражения в виде плотных, бугристых бородавчатых разрастаний с широким основанием, безболезненных, не спаянных с подлежащей слизистой оболочкой, резко возвышающихся над уровнем окружающей слизистой оболочкой.
Пальпация безболезненная. На зубах 1.5, 1.7, 4.6, 4.7 имеются старые пломбы с острыми краями. На пришеечной поверхности 3.4,3.3,3.2,3-1,4.1,4.2,4.3,4.4,1 зубов определяются большое количество над- и поддесневых зубных отложений коричневого цвета.
Дополнительные методы исследования:
Индекс гигиены (Greene- Vermillion) - 2,0 (плохой уровень гигиены)
Люминесцентное исследование: фиолетовое свечение участка поражения.
Электронно-микроскопическое исследование: истончение базальной мембраны и признаки значительного омоложения клеток шиповатого и базального слоев эпителиального пласта.
Цитограмма: отмечается увеличенное количество эпителиальных клеток промежуточной зрелости. Отмечается клеточная дегенерация, лишь отдельные клетки сохраняют ядра.
Стоматоскопия: определяется резко утолщенный слой эпителия. Оптическая когерентная томография (ОКТ): изображение слоистое, дифференцируются три горизонтально ориентированных слоя - между обычными для ОКТ двумя слоями определяется неоднородный слабо рассеивающий (темный) слой, соответствующий зоне взаимопроникающих удлиненных акантотических эпителиальных выростов и папилломатозных стромальных сосочков с находящимися в них расширенными капиллярами; граница между слоями нерезкая, извилистая, местами прерывистая; верхняя граница изображения неровная за счет веррукозных выростов; верхний слой неоднородный; высота увеличена по сравнению с нормой; Яркость высокая, особенно у поверхности; нижний слой неоднородный, умеренной яркости; визуализируются линейные структуры низкой яркости с контрастными границами, что соответствует накоплению в строме межтканевой жидкости (отеку).
Гистология: гиперкератоз, мощный акантоз с удлинением и утолщением эпителиальных островков, иногда с явлениями дискомплексации клеток.
Предварительный диагноз: лейкоплакия.
По предлагаемому способу было проведено иммуногистохимическое и морфометрическое исследование биоптата очага поражения слизистой оболочки рта.
Определено: площадь рогового слоя эпителия - 12,28%, площадь поверхностного слоя эпителия 6,18%, площадь промежуточного слоя эпителия - 29,2%, площадь базального слоя - 11,33%, площадь базальной мембраны - 2,62%, площадь собственной пластинки слизистой оболочки и подслизистой основы - 34,41%, площадь кровеносных сосудов собственной пластинки слизистой оболочки - 3,98%. Содержание Ki 67(+) пролиферирующих клеток - 2,54%; CD 45(+) клеток - 17,536%, МРО(+) нейтрофильных лейкоцитов 3,271%; CD 3(+) Т-лимфоцитов - 4,035%; CD 20(+) В-лимфоцитов - 6,284%; CD 38(+) плазматических клеток - 2,166% и CD 68(+) макрофагов - 3,369%, что позволило диагностировать у пациента веррукозную форму лейкоплакии.
Окончательный диагноз: Лейкоплакия идиопатическая слизистой оболочки щеки слева К13.20, веррукозная бородавчатая стадия.
В результате своевременной постановки диагноза пациенту был выбран подходящий метод лечения, способствующий положительному клиническому эффекту.
Пример 6.
В клинику терапевтической стоматологии обратилась больная С., 49 лет, с жалобами на шероховатость, чувство стянутости, на наличие непонятных образований на боковой поверхности щеки и наличие белого пятна. Из анамнеза заболевания: около года назад больная обратила внимание на необычный вид слизистой оболочки щеки слева. К врачу не обращалась. В течение 2 месяцев появилось жжение и болезненность слизистой оболочки левой щеки, что и послужило поводом обращения к врачу-стоматологу. Образования стали мешать при еде и при разговоре.
Из анамнеза жизни. В анамнезе диагностирован аутоиммунный тиреоидит с 18 лет.
Объективный осмотр: внешних изменений нет, лицо симметричное, кожные покровы чистые. Регионарные лимфатические узлы не увеличены. На слизистой оболочке обоих щек щеки определяются плотные участки гиперкератоза белого цвета размером 1-1,5 см в диаметре, с ограниченными бляшками с полигональными контурами и четкими границами, возвышающимися над уровнем окружающей слизистой на 2 мм, неправильной формы, с шероховатой поверхностью, неудаляющиеся при поскабливании. Видимой воспалительной реакции по периферии нет. Пальпация безболезненная, определяется поверхностное уплотнение очага. Определяются пломбы с нарушенной герметичностью к твердым тканям 3.6, 3.7, 4.5, 4.7 зубов и острые края зубов. На пришеечной поверхности 3.4,3.3,3.2,3.1,4.1,4.2,4.3,4.4,1 зубов определяются большое количество над- и поддесневых зубных отложений темно-желтого цвета. На зубах 3.5, 3.6, 3.7 имеются металлокерамические коронки с дефектами в виде сколов металлокерамического покрытия с острыми краями. Частичная вторичная адентия.
Дополнительные методы исследования:
Индекс гигиены (Greene- Vermillion) - 2,0 (плохой уровень гигиены)
Люминесцентное исследование: свечение с желтоватым оттенком с переходом в фиолетовый.
Электронно-микроскопическое исследование: истончение базальной мембраны и признаки значительного омоложения клеток шиповатого и базального слоев эпителиального пласта.
Цитограмма: отмечается увеличенное количество эпителиальных клеток промежуточной зрелости. Отмечается клеточная дегенерация, лишь отдельные клетки сохраняют ядра.
Стоматоскопия: определяется резко утолщенный слой эпителия. Оптическая когерентная томография (ОКТ): изображение слоистое, дифференцируются три горизонтально ориентированных слоя - между обычными для ОКТ двумя слоями определяется неоднородный слабо рассеивающий (темный) слой, соответствующий зоне взаимопроникающих удлиненных акантотических эпителиальных выростов и папилломатозных стромальных сосочков с находящимися в них расширенными капиллярами; граница между слоями нерезкая, извилистая, местами прерывистая; верхняя граница изображения неровная за счет веррукозных выростов; верхний слой неоднородный; высота увеличена по сравнению с нормой; Яркость высокая, особенно у поверхности; нижний слой неоднородный, умеренной яркости; визуализируются линейные структуры низкой яркости с контрастными границами, что соответствует накоплению в строме межтканевой жидкости (отеку).
Гистология: мощный гиперкератоз, редко сочетающийся с паракератозом, гранулез, минимальный акантоз и небольшая инфильтрация стромы. Предварительный диагноз: лейкоплакия.
По предлагаемому способу было проведено иммуногистохимическое и морфометрическое исследование биоптата очага поражения слизистой оболочки рта.
Определено: площадь рогового слоя эпителия - 7,91%, площадь поверхностного слоя эпителия - 7,24%, площадь промежуточного слоя эпителия - 29,1%, площадь базального слоя - 10,49%, площадь базальной мембраны - 3,1%, площадь собственной пластинки слизистой оболочки и подслизистой основы - 37,48%, площадь кровеносных сосудов собственной пластинки слизистой оболочки - 4,68%. Содержание Ki 67(+) пролиферирующих клеток - 4,556%; CD 45(+) клеток - 19,208%, МРО(+) нейтрофильных лейкоцитов 4,393%; CD 3(+) Т-лимфоцитов - 6,505%; CD 20(+) В-лимфоцитов - 8, 662%; CD 38(+) плазматических клеток - 3,924% и CD 68(+) макрофагов - 4,751%, что позволило диагностировать у пациента веррукозную форму лейкоплакии.
В результате своевременной постановки диагноза пациенту был выбран подходящий метод лечения, способствующий положительному клиническому эффекту.
Окончательный диагноз: Лейкоплакия идиопатическая слизистой оболочки щеки слева К13.20, веррукозная бляшечная стадия.
Пример 7.
В клинику терапевтической стоматологии обратился больной Г., 57 лет, с жалобами на болезненность слизистой оболочки левой щеки, усиливающуюся при разговоре и приеме пищи.
Из анамнеза заболевания: около двух месяцев назад больной обратил внимание на чувство стянутости и шершавости слизистой оболочки левой щеки. К врачу не обращался. В течение 5 дней назад появилась болезненность слизистой оболочки правой щеки, что и послужило поводом обращения к врачу-стоматологу.
Из анамнеза жизни. В анамнезе диагностирован хронический гастрит, аллергические реакции на некоторые пищевые продукты и лекарственные средства. Курит с 13 лет, примерно 5-7 сигарет в день. В течение последних 13 лет работает маляром на строительных объектах. Объективный осмотр: внешних изменений нет, лицо симметричное, кожные покровы чистые. Регионарные лимфатические узлы не увеличены. На слизистой оболочке левой щеки имеется несоскабливающийся участок ороговения размером 4×4 см серого цвета, возвышающийся над уровнем окружающей слизистой оболочкой и шершавый на ощупь. В центральной части очага поражения определяется язва неправильной формы, резко болезненная при дотрагивании, не склонная к заживлению.
На пришеечной поверхностях 3.4,3.3,3.2,3.1,4.1,4.2,4.3,4.4,1.6,1.7,2.6,2.7 зубов определяются большое количество над- и поддесневых зубных отложений коричневого цвета.
Дополнительные методы исследования:
Индекс гигиены (Greene- Vermillion) - 2,6 (очень плохой уровень гигиены)
Стоматоскопия: выражена неравномерность процесса: чередование гиперкератозных участков с дефектами эпителия.
Люминесцентное исследование: на месте участка поражения наблюдается коричневое свечение.
Цитограмма: отмечается увеличенное количество эпителиальных клеточных структур с явлениями дискератоза.
Бактериологическое исследование: лейкоциты-2-3 в поле зрения, кокки - в большом количестве, мицелий и споры гриба рода Candida не обнаружены.
Гистология - выраженный гиперкератоз и паракератоз, нарушение целостности СОР в виде поражения базальной мембраны, иногда даже с ее прорывом и признаками клеточной воспалительной реакции. Инфильтрация стромы данной формы достигает максимума. Явление дискомплексации клеток.
Предварительный диагноз: лейкоплакия.
По предлагаемому способу было проведено иммуногистохимическое и морфометрическое исследование биоптата очага поражения слизистой оболочки рта.
Обнаружено: площадь рогового слоя эпителия - 11,17%, площадь поверхностного слоя эпителия - 7,3%, площадь промежуточного слоя эпителия - 42,83%, площадь базального слоя - 14,87%, площадь базальной мембраны - 3,02%, площадь собственной пластинки слизистой оболочки и подслизистой основы - 11,48%, площадь кровеносных сосудов собственной пластинки слизистой оболочки - 4,73%, площадь лейкоцитарно-некротических масс - 4,6% от общей площади среза. Содержание Ki 67(+) пролиферирующих клеток - 2,704%; CD 45(+) клеток - 20,741%; CD 3(+) Т-лимфоцитов - 6,446%; CD 20(+) В-лимфоцитов -9,521%; CD 38(+) плазматических клеток - 5,025%) и CD 68(+) макрофагов - 7,347%, МРО(+) нейтрофильных лейкоцитов 15,198%), что позволило диагностировать у пациента эрозивно-язвенную форму лейкоплакии слизистой оболочки щеки и назначить ему соответствующую терапию, приведшую к значительной положительной динамике со стороны патологического процесса.
Окончательный диагноз: Лейкоплакия идиопатическая слизистой оболочки щеки слева К13.20, эрозивно-язвенная стадия.
Пример 8.
В клинику терапевтической стоматологии обратился больной М., 53 лет, с жалобами на болезненность слизистой оболочки правой щеки, усиливающуюся при разговоре и приеме пищи.
Из анамнеза заболевания: около года назад больной обратил внимание на чувство стянутости и шершавости слизистой оболочки правой щек. К врачу не обращался. В течение 2 дней назад появилась болезненность слизистой оболочки правой щеки, что и послужило поводом обращения к врачу-стоматологу.
Из анамнеза жизни. В анамнезе диагностирован хронический гастрит, гипотиреоз. Курит с 15 лет. В течение последних 23 лет работает на компрессорном заводе в цеху с вредными условиями труда. Объективный осмотр: внешних изменений нет, лицо симметричное, кожные покровы чистые. Регионарные лимфатические узлы не увеличены. На слизистой оболочке правой щеки имеется несоскабливающийся участок ороговения размером 3×4 см серого цвета, возвышающийся над уровнем окружающей слизистой оболочкой. В центральной части кератотического участка определяется эрозия неправильной формы, резко болезненная при дотрагивании.
На пришеечной поверхностях 3.4,3.3,3.2,3.1,4.1,4.2,4.3,4.4 зубов определяются большое количество над- и поддесневых зубных отложений светло-коричневого цвета.
Дополнительные методы исследования:
Индекс гигиены (Greene- Vermillion) - 2,5 (плохой уровень гигиены)
Стоматоскопия: выражена неравномерность процесса: чередование гиперкератозных участков с дефектами эпителия.
Люминесцентное исследование: на месте участка поражения наблюдается коричневое свечение.
Цитограмма: отмечается увеличенное количество эпителиальных клеточных структур с явлениями дискератоза.
Бактериологическое исследование: лейкоциты-2-3 в поле зрения, кокки - в большом количестве, мицелий и споры гриба рода Candida не обнаружены. Гистология - выраженный гиперкератоз и паракератоз, нарушение целостности СОР в виде поражения базальной мембраны, иногда даже с ее прорывом и признаками клеточной воспалительной реакции. Инфильтрация стромы данной формы достигает максимума. Явление дискомплексации клеток. Предварительный диагноз: лейкоплакия. Проведено обследование по предлагаемому способу.
Определено: площадь рогового слоя эпителия - 13,67%, площадь поверхностного слоя эпителия - 8,53%, площадь промежуточного слоя эпителия - 39,7%, площадь базального слоя - 13,07%, площадь базальной мембраны - 3,22%, площадь собственной пластинки слизистой оболочки и подслизистой основы - 10,27%, площадь кровеносных сосудов собственной пластинки слизистой оболочки - 5,81%, площадь лейкоцитарно-некротических масс - 5,73% от общей площади среза. Содержание Ki 67(+) пролиферирующих клеток определено в количестве 2,510%; CD 45(+) клеток - 19,252%; CD 3(+) Т-лимфоцитов - 5,520%; CD 20(+) В-лимфоцитов - 8,423%; CD 38(+) плазматических клеток - 4,035% и CD 68(+) макрофагов - 6,322%, МРО(+) нейтрофильных лейкоцитов 15,184, что позволило диагностировать у пациента эрозивно-язвенную форму лейкоплакии слизистой оболочки щеки и назначить ему соответствующую терапию, приведшую к значительной положительной динамике со стороны патологического процесса.
Окончательный диагноз: Лейкоплакия идиопатическая слизистой оболочки щеки справа К13.20, эрозивно-язвенная стадия.
Пример 9.
В клинику терапевтической стоматологии обратилась больная Г., 49 лет, с жалобами на самопроизвольные боли, усиливающиеся от действия всех видов раздражителей.
Из анамнеза заболевания: около месяца назад больная обратила внимание на чувство стянутости и шершавости слизистой оболочки щек. К врачу не обращалась. В течение 2 дней назад появилась болезненность слизистой оболочки левой щеки, что и послужило поводом обращения к врачу-стоматологу.
Из анамнеза жизни. В анамнезе диагностирован хронический холецистит, сахарный диабет с 25 лет. Не курит. В течение последних 15 лет работает маляром на строительных объектах.
Объективный осмотр: внешних изменений нет, лицо симметричное, кожные покровы чистые. Регионарные лимфатические узлы не увеличены. На слизистой оболочке правой щеки имеется участок ороговения серого цвета, возвышающийся над уровнем окружающей слизистой оболочкой. В очаге поражения определяется эрозия неправильной формы, резко болезненная, не склонная к заживлению. Поверхность очага шершавая на ощупь. На пришеечной поверхностях 3.4,3.3,3.2,3.1,4.1,4.2,4.3,4.4 зубов определяются большое количество над- и поддесневых зубных отложений темно-желтого цвета.
Дополнительные методы исследования:
Индекс гигиены (Greene- Vermillion) - 2,5 (плохой уровень гигиены)
Стоматоскопия: выражена неравномерность процесса: чередование гиперкератозных участков с дефектами эпителия.
Люминесцентное исследование: на месте участка поражения наблюдается коричневое свечение.
Цитограмма: отмечается увеличенное количество эпителиальных клеточных структур с явлениями дискератоза.
Бактериологическое исследование: лейкоциты-2-3 в поле зрения, кокки - в большом количестве, мицелий и споры гриба рода Candida не обнаружены.
Гистология - выраженный гиперкератоз и паракератоз, нарушение целостности СОР в виде поражения базальной мембраны, иногда даже с ее прорывом и признаками клеточной воспалительной реакции. Инфильтрация стромы данной формы достигает максимума. Явление дискомплексации клеток.
Предварительный диагноз: лейкоплакия.
Проведено обследование по предлагаемому способу.
Определено: площадь рогового слоя эпителия - 15,77%, площадь поверхностного слоя эпителия - 7,23%, площадь промежуточного слоя эпителия - 43,00%, площадь базального слоя - 11,55%, площадь базальной мембраны - 2,84%, площадь собственной пластинки слизистой оболочки и подслизистой основы - 8,67%, площадь кровеносных сосудов собственной пластинки слизистой оболочки - 5,00%, площадь лейкоцитарно-некротических масс - 5,94% от общей площади среза. Содержание Ki 67(+) пролиферирующих клеток - 2,316%; CD 45(+) клеток - 17,763%; CD 3(+) Т-лимфоцитов - 4,594%; CD 20(+) В-лимфоцитов - 7,325%; CD 38(+) плазматических клеток - 3,045% и CD 68(+) макрофагов - 5,297%), МРО(+) нейтрофильных лейкоцитов - 3,271%, что позволило диагностировать у пациента эрозивно-язвенную форму лейкоплакии слизистой оболочки щеки и назначить ему соответствующую терапию, приведшую к значительной положительной динамике со стороны патологического процесса.
Окончательный диагноз: Лейкоплакия идиопатическая слизистой оболочки щеки справа К13.20, эрозивно-язвенная стадия.