Устойчивость спермы жеребцов к замораживанию под влиянием антиоксиданта SkQ1

СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2012, № 2

УДК 636.1:636.082:591.463.1:576.08

УСТОЙЧИВОСТЬ СПЕРМЫ ЖЕРЕБЦОВ К ЗАМОРАЖИВАНИЮ ПОД ВЛИЯНИЕМ АНТИОКСИДАНТА SkQ1

В.А. НАУМЕНКОВА1, Е.Е. БРАГИНА2, Е.В. НИКИТКИНА3

Оценивали криоустойчивость спермиев у жеребцов разных пород в процессе глубокого охлаждения и замораживания при введении в среду митохондриально адресованного антиоксиданта SkQ1 («ионы Скулачева»). Установили, что в присутствии SkQ1 устойчивость спермы жеребцов к замораживанию возрастает за счет улучшения сохранности акросом, митохондрий и клеточных мембран. Это приводит к повышению оплодотворяющей способности смени после криоконсервации.

Ключевые слова: сперма, замораживание, среда, компонент SkQ1, оплодотворяемость.

Keywords: sperm, freezing, medium, SkQ1 component, fertility.

Криоконсервация клеток широко применяется как в современных репродуктивных биотехнологиях, так и для решения проблем сохранения биоразнообразия (1, 2). Основной прием при криоконсервации спермы, используемой для искусственного осеменения, — ее разбавление. Совершенствование среды для разбавления семени остается актуальной задачей, поскольку после оттаивания сперматозоиды теряют свою активность на 30-40 % от первоначального значения, что приводит к снижению оплодотворяющей способности.

Сперма жеребцов, как и сперма хряков, в большой степени разбавлена секретами придаточных половых желез и подвержена окислительным реакциям, которые нежелательны при хранении. Ведется поиск веществ, подавляющих реакции окисления в сперме у этих видов (3). Особое внимание уделяется изучению действия на спермии антиоксидантов, снижающих активность процессов окисления, которые интенсивно протекают в свежеполученном эякуляте. Введение антиоксидантов в сперму приводит к гипоксическому эффекту: уменьшается концентрация активированного кислорода в среде, подавляются процессы переокисления липидов, задерживается накопление токсических перекисей, стабилизируется содержание активных групп белков (3-7). К числу препаратов нового поколения относится митохондриально направленный антиоксидант SkQ1 из класса «ионов Скулачева». По химическому составу SkQ1 близок к компоненту дыхательной цепи коэнзиму Q10, или убихинону. Причина биологической активности этих ионов заключается в способности накапливаться в митохондриях за счет мембранного потенциала, то есть без дополнительных затрат клеточной энергии на транспорт (8).

Преимущество синтезированных антиоксидантов группы SkQ1 — их способность восстанавливаться дыхательной цепью митохондрий, благодаря чему они оказывают многократное действие в отличие от классических антиоксидантов, которые утрачивают активность сразу после взаимодействия с радикалом. SkQ1 эффективно защищает мембраны митохондрий от окисления свободными радикалами (8).

Нашей целью было изучение возможности повышения криоустойчивости спермиев жеребца в процессе глубокого охлаждения и замораживания за счет введения антиоксиданта SkQ1 в среду для разбавления семени, а также проверка оплодотворяющей способности сперматозоидов, обработанных SkQ1.

Методика. В опытах (2006-2010 годы) использовали сперму от вось-

ми жеребцов разных пород, содержащихся на экспериментальной и спортивной конюшне (Всероссийский НИИ коневодства). Сперму брали на искусственную вагину (9). Каждый эякулят делили на 10 равных частей, одну разбавляли лактозо-хелато-цитратно-желточной (ЛХЦЖ) средой (контроль), остальные — ЛХЦЖ средой с добавлением SkQ1 (0,0010; 0,0020; 0,0025; 0,0030; 0,0040; 0,0050; 0,0060; 0,0080 и 0,0110 мкМ) (опыт) с целью выявления его оптимальной концентрации, обеспечивающей защитный эффект. Сперму замораживали в парах азота (9) и переносили в жидкий азот. Оттаивание образцов проводили в водяной бане при 40 °С не менее чем через 1 сут после замораживания.

Качество спермы оценивали при просмотре в световом микроскопе по подвижности сперматозоидов до и после замораживания. Выживаемость спермиев после оттаивания определяли при температуре 2-4 °С по времени сохранения подвижности. Для изучения ультраструктуры использовали сперматозоиды двух жеребцов (Нарзан и Тагай), у которых исследовали нативную (свежевзятую неразбавленную) сперму и сперму после замораживания-оттаивания, разбавленную ЛХЦЖ средой с добавлением оптимального количества компонента SkQ1 (опыт) и без указанного антиоксиданта (контроль). Образцы разводили изотоническим раствором NaCl в соотношении 1:10, добавляли фиксатор — 2,5 % раствор глутарового альдегида («Ted Pella Inc.», США), приготовленный на 0,1 М какодилатном буфере (рН 7,2) («Sigma», США), центрифугировали 15 мин при 1000 об/мин, удаляли надосадочную жидкость, осадок фиксировали тем же фиксатором, дофиксировали 1 % раствором осмиевой кислоты («Serva», Германия) и заливали в эпон («Fluka», Германия). Ультратонкие срезы получали на ультрамикротоме Reichert ЦкгаСи III (Австрия), докрашивали водным раствором уранилацетата и цитратом свинца («Serva», Германия) и просматривали в электронном микроскопе Hitachi700 (Япония), анализируя состояние акросом и митохондрий. Проницаемость клеточных мембран оценивали с помощью флуоресцентного красителя бромистого этидия по доле (%) окрашенных клеток в соответствии с приведенной методикой (10).

При оценке оплодотворяющей способности эякулят от одного жеребца (Малыш) делили на две части: одну разбавляли средой ЛХЦЖ с добавлением оптимального количества SkQ1, другую — средой без добавления этого компонента. Процедуры подготовки спермы к замораживанию, замораживания и оттаивания выполняли, как описано выше. Осеменяемых кобыл разделили на опытную и контрольную группы (соответственно четыре и три особи). В первой группе при осеменении использовали сперму, замороженную и оттаянную в среде с SkQ1, во второй — сперму, разбавленную средой, не содержащей SkQ1. Эффективность осеменения учитывали по результатам вымывания эмбрионов на 8-е сут после овуляции.

Статистическую обработку осуществляли с помощью методов вариационной статистики по Н.А. Плохинскому (11).

Результаты. В предварительном эксперименте мы установили оптимальные криопротективные концентрации SkQ1 — 0,0010-0,0030 мкМ (табл. 1). При этих дозах период регистрации подвижных сперматозоидов в образце (показатель выживаемости спермиев) после оттаивания увеличивался по сравнению с контролем на 6 ч (при Р > 0,95). Для последующих экспериментов в качестве оптимальной была выбрана концентрация SkQ1 0,0030 мкМ, обеспечивающая повышение выживаемости спермиев после замораживания-оттаивания относительно контроля.

При замораживании-оттаивании наиболее выраженные ультраструк-турные изменения спермиев у жеребцов происходили с акросомой (рис. 1).

Интактная акросома представляет собой плоскую цистерну с матриксом средней электронной плотности, плотно примыкающую к ядру сперматозоида и покрывающую 2/з передней части головки. При замораживании-оттаивании увеличивается число сперматозоидов с поврежденной акросо-мой. В частности, повышается доля сперматозоидов с деградацией акро-сомы (то есть происходит акросомная реакция — разрушение акросомы с формированием мембранных пузырьков и выходом содержимого). Еще один тип аномалии акросомы — «запустение» (матрикс акросомы становится электронно-прозрачным вследствие потери внутреннего электронноплотного содержимого) (12). После криоконсервации отмечается также рост числа сперматозоидов с изменением электронной плотности матрикса митохондрий (12, 13).

1. Подвижность и выживаемость спермиев жеребцов при замораживании -оттаивании в лактозо-хелато-цитратно-желточной среде, содержащей антиоксидант 8к01 в разных концентрациях

Бкд1, мкМ Подвижность, балл Выживаемость при 0 °С, ч

до замораживания | после оттаивания

0 5,0±0,20 2,5±0,10 120±10

0,0010 5,0±0,35 2,5±0,15 126 ±12

0,0020 5,0±0,30 2,5±0,20 126 ±13

0,0025 5,0±0,27 2,5±0,20 126 ±13

0,0030 5,0±0,30 2,5±0,20 126±14

0,0040 5,0±0,25 2,5±0,15 120 ±13

0,0050 5,0±0,30 2,0±0,20 108±13

0,0060 5,0±0,20 2,0±0,10 96±11

0,0080 4,5±0,20 1,8±0,10 92±10

0,0110 4,0±0,20 1,8±0,10 84±8

Рис. 1. Электронная микрофотография головки спермия жеребца после замораживания-оттаивания в лактозо-хелато-цитратно-желточной среде: 1 — ин-

тактная (нормальная) акросома, 2 — акросома с электронно-прозрачным матриксом, 3 — хроматин, 4 — шейка спермия.

Результаты количественного ультраструктурного исследования спермиев у двух жеребцов (Нарзан и Тагай) в нативной сперме, после замораживания-оттаивания (контроль) и замораживания-оттаивания с добавлением Бкр1 в концентрации 0,0030 мкМ (опыт) продемонстрировали (рис. 2), что у жеребца Нарзана с хорошими показателями при традиционном спермиологическом исследовании доля ин-тактных головок (то есть головок с правильной формой ядра, конденсированным хроматином и нормальной акросомой) с 75 % снижалась после замораживания-оттаивания как в контрольном (до 53 %), так и в опытном (до 57 %) образце. Доля спермиев с деградацией акросомы не изменялась при замораживании-оттаивании (в нативной сперме, контроле и опыте — соответственно 7; 9 и 8 %). Число спермиев с электронно-прозрачной «пустой» акросомой увеличивалось с 2 % в нативной сперме до 38 и 35 % в контроле и опыте. Процедура криоконсервации практически не влияла на ультраструктуру митохондрий (доля спермиев с нормальными митохондриями в нативных образцах, контроле и опыте составляла 91; 86 и 90 %).

При криоконсервации образца, полученного от другого жеребца — Тагая с низкими показателями подвижности сперматозоидов в нативной

сперме, добавление Бкр1 в среду в значительно большей степени повлияло на сохранность ультраструктуры половых клеток: содержание сперматозоидов с интактными головками в нативной сперме (до замораживания) и в опыте (замораживание-оттаивание в присутствии Бкр1) равнялось 66 %.

ж 1°°т1 ____________100ГI_______________________П-ПЬ

I Ю''ЛЯ  ГГТТ ю''г-л т_______________Ш -

I “''щ-ш и _ б°\лт I

1‘: 11^X1 I

Интактные Деградация Пустая Интактные Интактные Деградация Пустая Интактные

актные Деградация Пустая Интактные головки акросомы акросома митохондрии

100 80 60 40 20 0

у

Интактные Деградация Пустая Интактные головки акросомы акросома митохондрии

Рис. 2. Сохранность ультраструктуры спермиев у жеребцов Нарзана (А) и Тагая (Б) (соответственно с хорошей и сниженной подвижностью половых клеток при традиционном спермиологиче-ском исследовании) до замораживания (а) и после замораживания-оттаивания в лактозо-хелато-цитратно-желточной среде без добавления антиоксиданта 8к01 (б) или с добавлением 8к01 (0,0030 мкМ) (в).

После стандартного замораживания-оттаивания (контроль) содержание сперматозоидов с интактными головками составляло только 53 %. На деградацию акросомы добавление Бкр1 не влияло: доля спермиев с такими изменениями увеличивалась с 2 до 9 % после замораживания-оттаивания как в контрольном, так и в опытном образце. В то же время добавление Бкр1 оказывало защитное действие, повышая сохранность матрикса акросом и митохондрий. Так, содержание сперматозоидов с «пустыми» акросомами до замораживания составляло 11 %, после замораживания-оттаивания в контрольной группе — 38 %, при добавлении Бкр1 — 25 %. Доля сперматозоидов с нормальной морфологией митохондрий до замораживания спермы равнялась 96 %, после замораживания-оттаивания в контрольной группе снижалась до 61 %, в варианте с замораживанием-оттаиванием в среде, содержащей Бкр1, — не отличалась от таковой в нативной сперме.

2. Показатели жизнеспособности спермиев жеребцов после замораживания-оттаивания в лактозо-хелато-цитратно-желточной среде с добавлением компонента 8к01

Подвижность, Выживаемость Проницаемость клеточной мем-

балл при 0 °С, ч браны для бромистого этидия, %

Опыт (8к01, 0,0030 мкМ) 2,2±0,14 94±7,6 52,0±3,20

Контроль 2,0±0,12 86±5,8 64,0±3,90

При исследовании проницаемости клеточной мембраны для бромистого этидия (табл. 2) было установлено, что число окрашенных этим интеркалирующим агентом клеток, то есть мертвых спермиев с нарушенной проницаемостью мембран, при введении в разбавитель компонента Бкр1 снижалось на 12,0 % по сравнению с контрольным вариантом, а подвижность и выживаемость половых клеток оказалась соответственно на 9,1 и 8,5 % выше контрольной.

Для оценки оплодотворяющей способности спермы использовали эякулят, полученный от жеребца Малыша, у которого ее качественные показатели полностью отвечали нормативным требованиям: содержание сперматозоидов в эякуляте — не менее 2*108/мл, подвижность — не ниже 5 баллов, выживаемость — не менее 96 ч. При осеменении кобыл этой спермой в опытной группе оплодотворение произошло у трех из четырех кобыл, тогда как в контрольной группе — только у одной из трех. Наблюдаемое повышение оплодотворяющей способности спермы при введении компонента Бкр1 в разбавитель, использованный для замораживания-от-

таивания, можно объяснить более высокой сохранностью ультраструктуры половых клеток.

Таким образом, добавление в криопротективную среду митохондри-ально адресованного антиоксиданта SkQ1 способствует лучшей сохранности мембран, акросом и митохондрий в спермиях жеребцов и тем самым повышает устойчивость этих половых клеток к замораживанию. Обработанные SkQ1 сперматозоиды сохраняют способность к нормальному оплодотворению (более того, их оплодотворяющая способность возрастает). Полученные данные свидетельствуют о целесообразности использования указанного компонента в качестве криопротектора при замораживании спермы.

Л И Т Е Р А Т У Р А

1. С в и р и д о в Б.Е., Ш а п и е в И.Ш., С и л и н Ю.В. Криоконсервация и использование бластодермальных клеток кур для получения химерных особей. С.-х. биол., 2009, 2: 62-64.

2. Б а г и р о в В.А., Г л а д ы р ь Е.А., Э р н с т Л.К., К л е н о в и ц к и й П.М., 3 и н о в ь е в а Н.А., Н а с и б о в Ш.Н. Сохранение и рациональное использование генетических ресурсов яка (Bos mutus). С.-х. биол., 2009, 2: 37-42.

3. Н а р и ж н ы й А.Г. Действие синтетических антиоксидантов. Свиноводство, 1978, 1: 24-25.

4. П р о к о п ц е в В., Р у с т е н о в А., М о р о з Л. Действие унитиола на сперму хряков. С.-х. биол., 1974, 9(4): 581-584.

5. К о р б а н Н., М о р о з Л., Ш а п и е в И. Метод замораживания спермы жряка. Свиноводство, 1977, 12: 29.

6. Н а у к В.А., Г у с ь к о в а А.М. Особенности перекисного окисления липидов при замораживании спермы быков и хряков-производителей. Докл. ВАСХНИЛ, 1983, 2: 27-29.

7. Г о л ы ш е в Н.А. Совершенствование технологии замораживания семени хряков. Животноводство, 1985, 7: 49-51.

8. С к у л а ч е в В.П. Попытка биохимиков атаковать проблему старения. «Мегапроект» по проникающим ионам. Первые итоги и перспективы (обзор). Биохимия, 2007, 72(12): 1572-1586.

9. Рекомендации по замораживанию и длительному хранению в жидком азоте спермы же-ребцов-производителей. М., 1978.

10. A e s c h b a c h e r M., R e i n h a r d t C.A., Z b i n d e n G. A rapid cell membrane permeability test using fluorescent dyes and flow cytometry. Cell Biol. Toxicol., 1986, 2: 247-255.

11. П л о х и н с к и й Н.А. Алгоритмы биометрии /Под ред. Б.В. Гнеденко. Изд. 2-е. М., 1980.

12. A l v a r e n g a M.A., L a n d i m - A l v a r e n g a F.C., M o r e i r a R.M., C e z a r in o M.M. Acrosomal ultrastructure of stallion spermatozoa cryopreserved with ethylene glycol using two packaging systems. Equine Veter. J., 2000, 32(6): 541-545.

13. L e o n a r d o F.C. Evaluation of Stallion Sperm Morphology. Clin. Techn. Equine Practice, 2007, 6(4): 249-264.

1ГНУ Всероссийский НИИ коневодства Россельхозакадемии,

391105 Рязанская обл., Рыбновский р-н, пос. Дивово, e-mail: vniik08@mail.ru;

2НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МТУ им. М.В. Ломоносова,

119899 г. Москва, ул. Академика Хохлова, 4, корп. 1;

3Всероссийский НИИ генетики и разведения сельскохозяйственных животных Россельхозакадемии,

196601 г. Санкт-Петербург—Пушкин, Московское ш., 55-а

RESISTANCE OF STALLION’S SPERM TO FREEZING DUE TO INTRODUCTION OF SKQ1 ANTIOXIDANT TO THE MEDIUM

V.A. Naumenkova1, E.E. Bragina2, E.V. Nikitkina3 S u m m a r y

The cryoresistance of stallion’s sperm was studied during deep cooling and freezing after introduction to the medium of antioxidant SkQ1 preparation. It was established, that SkQ1 introduction rises the resistance of stallion’s sperm to freezing due to improvement of safety of acrosomes, mitochondrions and cellular membranes, and thus, lead to the increase of semen fertilizing capacity.

Поступила в редакцию 7 июля 2011 года