ОБНАРУЖЕНИЕ ГЛЮТЕНОВЫХ ПЕПТИДОВ В ЖИДКОСТЯХ ОРГАНИЗМА ЧЕЛОВЕКА
DETECTION OF GLUTEN PEPTIDES IN HUMAN BODY FLUIDS

Цель настоящего изобретения
Настоящее изобретение относится к способу обнаружения и количественного определения глютеновых пептидов, устойчивых к перевариванию в желудочно-кишечном тракте, в биологических жидкостях человека, предпочтительно моче, с помощью иммунологических анализов. Указанную методику применяют в области клинической медицины как для мониторинга соблюдения безглютеновой диеты пациентами с целиакией, пациентами с нецелиакийной чувствительностью к глютену, пациентами с аллергией на глютен и пациентами с любым типом чувствительности к глютеновым белкам, так и для точной постановки диагноза рефрактерная целиакия. Настоящее изобретение также можно применять в клиническом исследовании целиакии для подтверждения эффективности будущих стратегий, относящихся к устранению или снижению глютеновой токсичности.
Предшествующий уровень техники настоящего изобретения
Целиакия (CD) представляет собой аутоиммунное нарушение, вызванное потреблением глютеновых белков, встречающихся в пшенице, ячмене, ржи и некоторых сортах овса (Arent-Hansen et al., 2004; Kagnoff, 2007; Comino et al., 2011), которое поражает приблизительно 1% общей популяции (Rubio-Tapia et al, 2009; Lionetti and Catassi, 2011; Bernardo and , 2012; Sapone et al., 2012). Потребление глютена вызывает воспалительную реакцию в верхнем отделе тонкой кишки, что приводит к повреждению тканей и атрофии кишечных ворсинок.
Несмотря на то, что большинство белков в пищевом рационе расщепляются желудочно-кишечными протеазами до простых аминокислот, дипептидов или трипептидов, глютеновые белки перевариваются не полностью и остаются в кишечнике (Ganapathy et al., 2006; Fasano 2009; Comino et al., 2012). Указанные пептиды способны к интернализации в клетки кишечника и, в результате этого, их глутаминовые остатки могут быть дезаминированы тканевой трансглутаминазой (tTG). Дезаминированные пептиды вызывают иммунологическую реакцию, производя снижение всасывания в кишечнике, которое может вызывать развитие таких симптомов, как диарея, анемия, задержка роста, потеря массы тела, поражения костей, неврологические осложнения, злокачественная опухоль и т.д. (Alaedini and Green, 2005; Catassi and Fasano, 2008; Tack et al., 2010).
Существует убедительное доказательство, подтверждающее основной вклад эпитопов, относящихся к происходящему из альфа-2 глиадина пшеницы 33-мерному пептиду (остатки 57-89) или содержащихся в нем, в глютеновую иммунотоксичность у пациентов с целиакией. Глютеновые эпитопы с высокой иммуногенностью расположены в областях глиадинов, богатых пролиновыми и глутаминовыми остатками (Shan et al., 2002; Туе-Din et al., 2010; Comino et al., 2011; Real et al., 2012; Dessi et al., 2013).
В настоящее время строгое соблюдение безглютеновой диеты (GFD) является единственным эффективным лечением CD и других случаев глютеновой непереносимости. У большинства пациентов строгое соблюдение GFD всего через несколько месяцев приводит к быстрому и полному восстановлению нормального строения и функции слизистой оболочки тонкой кишки, а также к ремиссии симптомов и нормализации серологических анализов (Bernardo and , 2012; Hall et al., 2013). Следовательно, мониторинг соблюдения пациентами с целиакией режима терапии играет исключительно важную роль для того, чтобы избежать прямых или непрямых кумулятивных повреждений и подтвердить, что сохранение любых симптомов не обусловлено нарушением (сознательным или непреднамеренным) соблюдения GFD.
Мониторинг GFD влечет за собой ряд ограничений, обусловленных своими социальными и экономическими последствиями. Приблизительно больше половины производимых в настоящее время продуктов питания содержат глютен пшеницы, ячменя, ржи или овса, включая в себя те, в которых он присутствует только в качестве загустителя или связующего средства (Freeman, 2013). Обнаружили связь между нарушением соблюдения GFD и диареей, расстройством пищеварения, остеопорозом, анемией вследствие недостаточности железа, депрессией и бесплодием, симптомами, которые исчезают или улучшаются, до определенной степени, за счет соблюдения GFD. Известно, что несоблюдение строгой GFD может в 4,3 раза увеличивать возможность возникновения лимфомы (Lebwohl and Green, 2003). Эти наблюдения позволили выдвинуть предположение о важности соблюдения GFD в снижении симптомов, предотвращении дефицита питательных веществ и улучшении качества жизни пациента. Тем не менее, различные исследования на основе биопсии кишечника указывают на то, что по меньшей мере одна треть пациентов с CD не соблюдают GFD в полной мере (Ciacci et al., 2002; Silvester and Rashid, 2007; Barratt et al, 2011; Matoori et al., 2013). Кроме того, от 36% до 55% полностью соблюдающих GFD пациентов не достигают полной гистологической ремиссии, возможно, вследствие непреднамеренного потребления глютена (Stoven et al, 2012; Tio et al., 2012; Hall et al., 2013; Matoori et al., 2013). Тем не менее, воздействие глютена на указанных пациентов за счет приема пищи было обозначено как безопасное, однако содержание следовых количеств глютена не объясняет высокое число пациентов, у которых отсутствует полная ремиссия гистологического повреждения слизистой оболочки (Koning et al., 2013).
Аналогично, полагают, что часть популяции пациентов с целиакией не отвечает положительно на GFD и страдает от симптомов персистирующей или рецидивирующей мальабсорбции и атрофии кишечных ворсинок. Можно предположить наличие у указанной популяции рефрактерной целиакии (RCD), редкого заболевания (приблизительно 5%-10% пациентов с CD), которое возникает у пациентов без выраженного положительного ответа на GFD (Al-Toma et al., 2007; Freeman, 2009; Rubio-Tapia and Murray, 2010). Несмотря на то, что RCD описана у пациентов с предполагаемым полным отсутствием потребления глютена, неумышленное потребление и гиперчувствительность к небольшому количеству глютена также могут запустить симптомы, присущие указанной патологии.
Существует высокое процентное отношение пациентов с целиакией (приблизительно 90%) среди тех, кто заявляет о возникновении симптомов потребления глютена в течение недели ( et al., 2014). Например, в некоторых случаях тяжелой диареи у медицинских работников существуют сомнения при идентификации того, вызвана ли она тяжелой инфекцией или потреблением глютена. Единственным инструментом, доступным в этом последнем случае, является идентификация инфекционного агента, которая может являться сложной, принимая во внимание количество микроорганизмов-возбудителей, а также стоимость и время, необходимые для проведения микробиологического анализа.
В настоящее время доступны маркеры для оценки соблюдения GFD пациентами с целиакией, которые включают в себя наблюдение за улучшением симптомов, беседу по поводу диеты и снижение или нормализацию специфических для CD антител, таких как антитела к тканевой трансглутаминазе (анти-tTG) или антитела к дезамидированным глютеновым пептидам (ADG) (Dipper et al., 2009; Sharkey et al., 2013; Vallejo et al., 2013; Vives-Pi et al., 2013). Тем не менее, отсутствует единое мнение в отношении частоты проведения контролей или лучших параметров для оценки указанного соблюдения, в дополнение к тому факту, что некоторые из указанных способов продемонстрировали существенные ограничения (Bai et al., 2012). Был предложен контроль с использованием антител к tTg или антител ADG в качестве маркеров; тем не менее, как правило, они становятся отрицательными через год после начала GFD, в дополнение к тому, что они не указывают на полное заживление слизистой оболочки кишечника (Tursi et al, 2003; Sharkey et al., 2013). Указанные типы маркеров являются более применимыми для подтверждения нарушения соблюдения GFD, чем для подтверждения строгого соблюдения GFD. Следовательно, серологические способы могут являться недостаточно чувствительными для обнаружения нерегулярных нарушений диеты, которые препятствуют полному выздоровлению (Kaukien et al., 2002; 2007; Tursi et al., 2006). Следовательно, они не являются прямым способом демонстрации потребления глютена для того, чтобы избежать вредных эффектов. В действительности, последствия нарушений диеты можно измерить только путем наблюдения за воспалением слизистой оболочки и/или атрофии кишечных ворсинок, что потребует проведения биопсии кишечника и, следовательно, введение пациента в наркоз, с вытекающими возможными рисками, дискомфортом и затратами на медицинское обслуживание.
Более прямое измерение потребления глютена могло бы предоставить ценную информацию в мониторинге пациента: обнаружение нарушения соблюдения GFD до анатомического повреждения, обнаружение непреднамеренного потребления и оценку степени соблюдения лечения в течение начального периода (после постановки диагноза, когда пациенты менее ознакомлены с диетой), обеспечение простого и надежного подтверждения полученных результатов. Следовательно, чувствительные и надежный маркер для мониторинга и обнаружения потребления глютена являлся бы применимым инструментом для правильного соблюдения GFD и, вероятно, для точной диагностики RCD.
Более ранние работы продемонстрировали, что моноклональные антитела к 33-мерному пептиду, G12 и А1, полученные против основного иммуногенного пептида α-глиадина, являются в высокой степени применимыми в обнаружении токсических глютеновых пептидов, как в клиническом исследовании, так и исследовании пищи ( et al., 2008а; 2008b; Ehren у col., 2009; Comino et al., 2012; Real et al., 2014). Определение глютеновых пептидов в кале недавно было предложено в качестве стратегии для прямого подтверждения соблюдения GFD. Анализы на основе антител G12 и А1 позволили обнаружить происходящие из глютена пептиды, которые выводятся с калом человека, с определенной корреляцией с количеством потребленного глютена (Comino et al., 2012). Мониторинг переваренного глютена в кале в группе волонтеров, подвергнутых строгой GFD, указал на то, что однократное потребление глютена можно обнаружить путем измерения указанных реактивных пептидов в кале, определяя их выведение через 2-4 дня, без дополнительного потребления глютена.
Некоторые внекишечные симптомы CD, такие как герпетиформный дерматит, остеопороз, неврологические нарушения и т.д., трудно объяснить без предположения о присутствии пептидов в крови после потребления глютена у пациентов с целиакией (Chirdo et al., 1998; Stern et al., 2001; Riestra, 2008; Ludvigsson and Green, 2011). Следовательно, наиболее удобные инструменты констатации нарушения соблюдения GFD представляют собой те, которые напрямую обнаруживают присутствие иммуногенных глютеновых пептидов в образцах от человека, поскольку присутствие указанных пептидов в организме пациента с целиакией будет наиболее прямым и однозначным путем определения того, употребил ли индивидуум глютен или нет.
На сегодняшний день существуют немногочисленные прямые ресурсы контроля соблюдения GFD у указанных пациентов. Обнаружение глютеновых пептидов в кале характеризуется недостатком в том, что манипуляции с образцами являются неудобными, и в том, что их можно обнаружить только в течение 24 ч после потребления, и необходим способ начальной экстракции пептида.
Akobeng АК, Thomas AG. 2008. Systematic review: tolerable amount of gluten for people with coeliac disease. Aliment Pharmacol Ther; 27: 1044-1052.
Alaedini A, Green P. 2005. Narrative review: coeliac disease: understanding a complex autoimmune disorder. Am. College Phys; 142: 289-298.
Al-toma A, Verbeek WH, Mulder CJ.. 2007. The management of complicated coeliac disease. Dig Dis; 25: 230-236.
Arentz-Hansen H, Fleckenstein B, Molberg ∅, Scott H, Koning F, Jung G, Roepstorff P, Lundin KE, Sollid LM. 2004. The molecular basis for oat intolerance in patients with coeliac disease. PLoS Medic; 1: 84-92.
Bai J, Zeballos E, Fried M, Corazza GR, Schuppan D, Farthing MJG, Catassi C, Greco L, Cohen H, Krabshuis JH. 2012. WGOOMGE Practice Guideline Coeliac Disease. World Gastroenterol News; 2: S1-S8.
Barratt SM, Leeds JS, Sanders DS. 2011. Quality of life in coeliac disease is determined by perceived degree of difficulty adhering to a gluten-free diet, not the level of dietary adherence ultimately achieved. J Gastrointest Liver Dis; 20: 241-245.
Bernardo D,  AS. 2012. Developing strategies to improve the quality of life of patients with gluten intolerance in patients with and without coeliac disease. Eur J Intern Med; 23:6-8.
Catassi С, Fabiani E, Iacono G, D’Agate C, Francavilla R, Biagi F, Volta U, Accomando S, Picarelli A, De Vitis I, et al. 2007. A prospective, double blind, placebo-controlled trial to establish a safe gluten threshold for patients with coeliac disease. Am J Clin Nutr; 85: 160-166.
Catassi C, Fasano A. 2008. Coeliac disease. Curr Opin Gastroenterol; 24: 687-691.
Ciacci C, Cirillo, M, Cavallaro R, Mazzacca G. 2002. Long-term follow-up of coeliac adults on gluten-free diet: prevalence and correlates of intestinal damage. Digestion; 66: 178-185.
Comino I, Real A, de Lorenzo A, Cornell H,  MA, Barro F, Lorite P, Torres MI, Cebolla A, Sousa C. 2011. Diversity in oat potential immunogenicity: basis for the selection of oat varieties with no toxicity in coeliac disease. Gut; 60: 915-922.
Comino I, Real A, Vivas S, , Caminero A, Nistal E, Casqueiro J,  A, Cebolla A, Sousa C. 2012. Monitoring of gluten-free diet compliance in coeliac patients by assessment of gliadin 33-mer equivalent epitopes in feces. Am J Clin Nutr; 95: 670-677.
Dessi M, Noce A, Vergovich S, Noce G Daniele N. 2013. Safety Food in Coeliac Disease Patients: A Systematic Review. Food and Nutrition Sciences; Vol. 4 No. 7A: 55-74.
Dipper CR, Maitra S, Thomas R, Lamb С A, McLean-Tooke A P, Ward R, Smith D, Spickett G, Mansfield JC. 2009. Alimentary Pharmacology & Therapeutics. Anti-tissue Transglutaminase Antibodies in the Follow-up of Adult Coeliac Disease. Aliment Pharmacol Ther; 30: 236-244.
Ehren J,  B, Martin E, Bethune MT, Gray GM, Khosla C. 2009. A food-grade enzyme preparation with modest gluten detoxification properties. PLoS One; 21: e6313.
Esteban M, Castano A. 2009. Non-invasive matrices in human biomonitoring: a review. Environ Int; 35: 438-449.
Fasano A. 2009.Surprises from coeliac disease. Sci Am; 301: 54-61.
Freeman HJ. 2009. Adult coeliac disease and its malignant complications. Gut Liver; 3: 237-246.
Freeman HJ. 2013. Non-dietary forms of treatment for adult coeliac disease. World J Gastrointest Pharmacol Ther; 4: 108-112.
Ganapathy V, Gupta N, Martindale RG. Physiology of the gastrointestinal tract. 4th ed. New York, NY: Johnson LR, 2006.
Gibert A, Kruizinga A G, Neuhold S, Houben G F, Canela M A, Fasano A, Catassi C. 2013. Might gluten traces in wheat substitutes pose a risk in patients with coeliac disease? A population-based probabilistic approach to risk estimation. Am J Clin Nutr; 97: 109-116.
Hall NJ, Rubin GP, Charnock A. 2013. Intentional and inadvertent infringement in adult coeliac disease. A cross-sectional survey. Appetite; 68: 56-62.
Hischenhuber C, Crevel R, Jarry B, Maki M, Moneret-Vautrin DA, Romano A, Troncone R, Ward R. 2006. Review article: safe amounts of gluten for patients with wheat allergy or coeliac disease. Aliment Pharmacol Ther; 23: 559-575.
Kagnoff F. 2007. Overview and pathogenesis of coeliac disease. Gastroenterology, 128: S10-S18.
Kaukinen K, Peraaho M, Lindfors K, et al. 2007. Persistent small bowel mucosal villous atrophy without symptoms in coeliac disease. Aliment Pharmacol Ther; 25: 1237-1245.
Kaukinen K, Sulkanen S, Maki M, et al. 2002. IgA-class transglutaminase antibodies in evaluating the efficacy of gluten-free diet in coeliac disease. Eur J Gastroenterol Hepatol; 14: 311-315.
Koning F, Mol M, Mearin M L. 2013. The million-dollar question: is "gluten-free" food safe for patients with coeliac disease? Am J Clin Nutr; 97: 3-4.
ML, Kaukinen K, Laurila K, Vuotikka P, Koivurova OP,  T, Marcantonio A, Adelman DC,  M. 2014. Glutenase ALV003 Attenuates Gluten-Induced Mucosal Injury in Patients With Coeliac Disease. Gastroenterology; 146: 1649-1658.
Lebwohl B, Green PH. 2003. Screening for coeliac disease. N Engl J Med; 349: 1673-1674.
Li PKT, Burdmann EA, Mehta RL. 2013. Acute kidney injury: Global health alert. Transplantation; 5: 653-657.
Lionetti E, Catassi C. 2011. New clues in coeliac disease epidemiology, pathogenesis, clinical manifestations, and treatment. Int Rev Immunol; 30: 219-231.
Ludvigsson JF, Green PH. 2011. Clinical management of coeliac disease. J Intern Med; 269: 560-571.
Matoori S, Fuhrmann G, Leroux JC. 2013. Coeliac disease: a challenging disease for pharmaceutical scientists. Pharm Res; 30: 619-626.
B, Bethune MT, Comino I, Manyani H, Ferragud M,  MC, Cebolla A, Khosla C, Sousa C. 2008a. Toward the assessment of food toxicity for coeliac patients: characterization of monoclonal antibodies to a main immunogenic gluten peptide. PLoS One 3: e2294.
B, Cebolla A, Manyani H,  M,  M, Thomas M del C,  MC, Sousa C. 2008b. Sensitive detection of cereal fractions that are toxic to coeliac disease patients by using monoclonal antibodies to a main immunogenic wheat peptide. Am J Clin Nutr; 87: 405-414.
Pinches M, Betts C, Bickerton S, Burdett L, Thomas H, Derbyshire N, Jones H B, Moores M. 2012. Evaluation of novel renal biomarkers with a cisplatin model of kidney injury: gender and dosage differences. Toxicol Pathol; 40: 522-533.
Osman A. et al. 2001. A monoclonal antibody that recognizes a potential coeliac-toxic repetitive pentapeptide epitope in gliadins. European Journal of Gastroenterology & Hepatology; 13: 1189-1193.
Pisitkun T, Johnstone R, Knepper MA. 2006. Discovery of urinary biomarkers. Mol Cell Proteomics; 5: 1760-1771.
Real A, Comino I, de Lorenzo L,  F, Gil-Humanes J,  MJ, , Torres MI, Cebolla , Sousa C, Barro F,  F. 2012. Molecular and immunological characterization of gluten proteins isolated from oat cultivars that differ in toxicity for coeliac disease. PLoS One; 7: e48365.
Real A, Comino I, Moreno ML,  MA, Lorite P, Torres MI, Cebolla A, Sousa C. 2014. Identification and in vitro reactivity of coeliac immunoactive peptides in an apparent gluten-free beer. PLoS One. 6: e100917.
Riestra, S. 2008. Enfermedades asociadas. Polanco I. (ed.) en Libro bianco de la Enfermedad Coeliaca, Madrid, , pp. 41-49.
Rubio-Tapia A, Kyle RA, Kaplan E L, Johnson DR, Page W, Erdtmann F, Brantner TL, Kim WR, Phelps TK, Lahr BD, Zinsmeister AR, Melton LJ, Murray JA. 2009. Increased prevalence and mortality in undiagnosed coeliac disease. Gastroenterology; 137: 88-93.
Rubio-Tapia A, Murray JA. 2010. Classification and management of refractory coeliac disease. Gut; 59: 547-557.
Sapone A, Bai JC, Ciacci C, et al. 2012. Spectrum of gluten-related disorders: consensus on new nomenclature and classification. BMC Med; 10: 13.
Shan L, Molberg ∅, Parrot I, Hausch F, Gray G M, Sollid L M, Khosla C. 2002. Structural basis for gluten intolerance in coeliac sprue. Science; 297: 2275-2279.
Sharkey L M, Corbett G, Currie E, Lee J, Sweeney N, Woodward J M. 2013. Optimising delivery of care in coeliac disease-comparison of the benefits of repeat biopsy and serological follow-up. Aliment Pharmacol Ther; 38: 1278-1291.
Silvester JA, Rashid M. 2007. Long-term follow-up of individuals with coeliac disease: an evaluation of current practice guidelines. Can J Gastroenterol; 21: 557-564.
Stern M, Ciclitira PJ, Van Eckert R, Feighery C, Janssen FW,  E, Mothes T, Troncone R, Wieser H. 2001. Analysis and clinical effects of gluten in coeliac disease. Eur J Gastroenterol Hepatol; 13: 741-747.
Stoven S, Murray JA, Marietta E. 2012. Coeliac disease: advances in treatment via gluten modification. Clin Gastroenterol Hepatol; 10: 859-862.
Tack GJ, Verbeek WH, Schreurs MW, Mulder CJ. 2010. The spectrum of coeliac disease: epidemiology, clinical aspects and treatment. Nat Rev Gastroenterol Hepatol; 7: 204-213.
Tio M, Cox MR, Eslick GD. 2012. Meta-analysis: coeliac disease and the risk of all-cause mortality, any malignancy and lymphoid malignancy. Aliment Pharmacol Ther; 35: 540-551.
Tursi A, Brandimarte G, Giorgetti GM. 2003. Lack of usefulness of anti-transglutaminase antibodies in assessing histologic recovery after gluten-free diet in coeliac disease. J Clin Gastroenterol; 37: 387-391.
Tursi A, Brandimarte G, Giorgetti G M et al. 2006. Endoscopic and histological findings in the duodenum of adults with coeliac disease before and after changing to a glutenfree diet: a 2-year prospective study. Endoscopy; 38: 702-707.
Туе-Din JA, Stewart JA, Dromey JA, Beissbarth T, van Heel DA, Tatham A, Henderson K, Mannering SI, Gianfrani C, Jewell DP, et al. 2010. Comprehensive, quantitative mapping of T cell epitopes in gluten in coeliac disease. Sci Transl Med; 2: 41ra51.
Vallejo-Diez S, Bernardo D, Moreno Mde L,  A,  L, Calvo C, Sousa C, Garrote JA, Cebolla A, Arranz E. 2013. Detection of specific IgA antibodies against a novel deamidated 8-mer gliadin peptide in blood plasma samples from coeliac patients. PLoS One; 22: e80982.
Vives-Pi M, Takasawa S, Pujol-Autonell I, Planas R, Cabre E, Ojanguren I, Montraveta M, Santos AL, Ruiz-Ortiz E. 2013. Biomarkers for diagnosis and monitoring of coeliac disease. J Clin Gastroenterol; 47: 308-313.
Раскрытие настоящего изобретения
Образцы мочи являются в высокой степени перспективными вследствие простоты, с которой получают образец, неинвазивности, простоты манипуляций, легкой гомогенизации, низкой стоимости и легкой транспортировки и хранению. Пептиды и низкомолекулярные белки (<10 кДа) свободно фильтруются клубочком почки. Тем не менее, существуют несколько исследований на низкомолекулярных пептидах или фрагментах белка, содержащихся в моче вследствие технической сложности измерения пептидов в присутствии белков в разбавленных образцах и широкого диапазона предполагаемых пептидов.
В настоящем изобретении показано, как глютеновые иммуногенные пептиды (GIP) можно обнаружить в образцах биологических жидкостей человека, предпочтительно в моче индивидуумов с целиакией, путем концентрирования пептидов в моче и обнаружения с использованием иммунохроматографических тест-полосок с антителом к 33-меру, что является применимым в клинических и мониторинговых исследованиях GFD, а также в постановке диагноза RCD.
Согласно настоящему изобретению раскрыт способ неинвазивного мониторинга соблюдения безглютеновой диеты посредством обнаружения и количественного определения иммуногенных глютеновых пептидов, устойчивых к перевариванию в желудочно-кишечном тракте, в биологических жидкостях человека и предпочтительно моче. Указанные иммуногенные происходящие из глютена пептиды, устойчивые к расщеплению в кишечнике, содержат эпитопы глютенового пептида, обнаруживаемые с помощью антител, используемых в иммунологических анализах. Следовательно, присутствие или отсутствие иммуногенных глютеновых пептидов, устойчивых к ферментативному расщеплению в кишечнике, обнаруживают с помощью иммунологических анализов на основе реактивных антител, направленных против них. Сигнал о реактивности в отношении таких пептидов можно получить с помощью разнообразных иммунологических техник, включая в себя иммунохроматографию, биосенсоры, анализы ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ), обнаружение с использованием магнитных частиц и т.д. Если биологическая жидкость человека содержит небольшую концентрацию глютеновых пептидов, способ может нуждаться в концентрировании иммуногенных пептидов путем пропускания жидкости через колонки в качестве стадии, предшествующей иммунологическому анализу. Указанная методика является применимой в области клинической медицины как для подтверждения соблюдения безглютеновой диеты пациентами с целиакией, пациентами с аллергией к глютену или пациентами с любым типом чувствительности к глютеновым белкам, так и в точной постановке диагноза рефрактерная целиакия (RCD), т.е. в тех случаях, когда симптомы продолжаются, несмотря на предполагаемое полное отсутствие потребления глютена. Настоящее изобретение является также применимым для клинического исследования CD для подтверждения эффективности будущих стратегий, относящихся к устранению или снижению глютеновой токсичности.
Целью настоящего изобретения является применение иммунологических техник на основе антител, которые распознают иммуногенные происходящие из глютена пептиды, устойчивые к расщеплению в кишечнике, в образцах биологических жидкостей человека. Согласно конкретному варианту осуществления настоящего изобретения моча представляет собой предпочтительную биологическую жидкость для обнаружения пептидов, поскольку существует возможность ее получения в больших объемах, чем другие жидкости организма, такие как слюна, пот, сыворотка и т.д., тем самым облегчая работу по сбору образцов. Предпочтительное применение согласно настоящему изобретению представляет собой обнаружение потребления глютена у пациентов, у которых диагностировали некоторую степень глютеновой чувствительности и которых подвергают мониторингу вследствие ее наличия. Предпочтительным является применение для подтверждения потребления глютена в течение постановки диагноза CD, подтверждения соблюдения GFD пациентами, которым поставили диагноз целиакия и для обнаружения случая потенциальной глютеновой интоксикации у любого пациента с иммунотоксической глютеновой чувствительностью. Настоящее изобретение основано на применении иммунологических техник, в которых используют антитела, которые распознают иммунотоксические глютеновые пептиды, устойчивые к перевариванию в желудочно-кишечном тракте.
Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к in vitro способу обнаружения и/или количественного определения глютена, потребленного человеком, далее в настоящем документе "способ согласно настоящему изобретению", который предусматривает приведение биологической жидкости от указанного человека в контакт по меньшей мере с одним антителом, которое специфически распознает эпитопы глютенового белка, чья аминокислотная последовательность содержит по меньшей мере одну треть пролинов и одну треть глутаминов, причем распознавание эпитопов антителами является показателем того, что человек употребил глютен.
Согласно конкретному варианту осуществления количество эпитопов, распознаваемых антителом по отношению к контролю, является показателем количества потребленного глютена и/или периода времени, истекшего с момента потребления глютена. Специалисту в настоящей области техники понятно, что контроль определяют, например, с помощью предела количественного определения данной техники (QL), который можно рассчитать с помощью калибровочной кривой или прямой с использованием образца (такого как известные количества очищенного пептида, содержащего эпитопы, распознаваемые антителом), как показано в примерах, сопровождающих настоящее описание (см. пример 1). Стандартной практикой для специалиста в настоящей области техники является установление указанного QL для выяснения количества эпитопов, распознаваемых антителом. Как указано ранее, указанные эпитопы содержатся в пределах иммунотоксических глютеновых пептидов, устойчивых к перевариванию в желудочно-кишечном тракте.
Согласно настоящему изобретению "биологическую жидкость" понимают как любой жидкий образец, полученный от субъекта, в частности от человека. Техники, используемые для получения биологических жидкостей субъекта, широко известны специалисту в настоящей области техники, и являются стандартной практикой лабораторий. Примеры биологических жидкостей включают в себя без ограничения слюну, спинномозговую жидкость, пот, слюну, сыворотку, мокроту, кровь и мочу. Согласно конкретному варианту осуществления биологическая жидкость выбрана из группы, состоящей из мочи, слюны, пота и сыворотки.
Термин "антитело" относится к молекулам иммуноглобулина или активным частям молекул иммуноглобулина, т.е. к молекулам, содержащим антигенсвязывающий сайт, который специфически связывается (имунологически реагирует) с ними. Согласно настоящему изобретению антиген представляет собой любой из иммунотоксических глютеновых пептидов, устойчивых к перевариванию в желудочно-кишечном тракте (далее в настоящем документе "пептиды согласно настоящему изобретению"), содержащих эпитопы, обнаруживаемые с помощью антител. Примеры частей иммунологически активных молекул иммуноглобулина включают в себя фрагменты F(ab) и F(ab')2, которые можно получить, например, неограничивающим образом, путем обработки антитела таким ферментом, как пепсин. Другой пример выбора активных частей иммуноглобулинов, известный в предшествующем уровне техники настоящего изобретения, проводят с помощью техник генной инженерии с использованием вариабельных областей иммуноглобулинов.
Антитело согласно настоящему изобретению может являться поликлональным (как правило, включая в себя различные антитела, направленные на детерминанты или различные эпитопы) или моноклональным (направленным на одну детерминанту в антигене). Выражение "моноклональное антитело" относится к популяции молекул антитела, содержащих только один вид антигоенсвязывающего сайта, способного иммунологически реагировать с конкретным эпитопом антигена. Тем не менее, как известно специалисту в настоящей области техники, следует отметить, что если эпитопы являются очень сходными и взаимосвязанными, моноклональное антитело будет способно распознавать различные эпитопы.
Моноклональное антитело можно биохимически изменить посредством генетической манипуляции, или оно может являться синтетическим, при этом у антигена, вероятно, может отсутствовать части или все части, не являющиеся необходимыми для распознавания пептида согласно настоящему изобретению, будучи замещенными другими частями, которые обеспечивают антителу дополнительные благоприятные свойства.
Антитело согласно настоящему изобретению может являться химерным. Таким образом, область тяжелой и/или легкой цепи является идентичной или эквивалентной соответствующим последовательностям в антителах определенного вида или принадлежащим классу или подклассу определенных антител, при этом оставшаяся(иеся) цепь(и) является(ются) идентичной(ыми) или эквивалентной(ыми) соответствующим последовательностям в антителах, происходящих от другого вида или принадлежащих другому классу или подклассу антител, и фрагментах указанных антител, так чтобы они проявляли требуемую реактивность.
Способ согласно настоящему изобретению предусматривает по меньшей мере одно антитело, которое специфически распознает эпитопы глютеновых белков, чья аминокислотная последовательность содержит по меньшей мере одну треть пролинов и одну треть глутаминов. Согласно настоящему изобретению предусмотрено, что аминокислотная последовательность содержит по меньшей мере одну треть пролинов и одну треть глутаминов, если число пролиновых аминокислот в данной аминокислотной последовательности представляет собой одну треть относительно общего числа аминокислот, содержащих указанную последовательность, и если число глутаминовых аминокислот в данной аминокислотной последовательности представляет собой одну треть относительно общего числа аминокислот, содержащих указанную последовательность.
Согласно конкретному варианту осуществления эпитопы глютенового белка выбраны из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 и/или их дезаминированных производных. Примеры антител, которые можно использовать в контексте настоящего изобретения, включают в себя без ограничения моноклональные антитела А1 и G12, которые были получены за счет реактивности в отношении 33-мера альфа-глиадина пшеницы, хотя также можно использовать другие антитела, которые распознают пептиды, устойчивые к расщеплению глютена, такие как антитела R5 или антитела к 8-меру омега-глиадина.
Согласно конкретному варианту осуществления антитела, которые специфически распознают эпитопы глютенового белка, чья аминокислотная последовательность содержит по меньшей мере одну треть пролинов и одну треть глутаминов, выбраны из группы, состоящей из моноклонального антитела G12, моноклонального антитела А1 и моноклонального антитела R5. Указанные и другие моноклональные антитела, которые можно использовать для осуществления на практике настоящего изобретения, являются коммерчески доступными. Антитело А1 является коммерчески доступным от Biomedal, S.L. в виде антитела к 33-меру глиадина, АВ-4747. Антитело G12 является коммерчески доступным от Biomedal, S.L. в виде антитела к 33-меру глиадина, АВ-4748. Антитело R5 является коммерчески доступным под торговыми названиями R7001: RIDASCREEN Gliadin (R-Biopharm), R7002: RIDASCREENFAST Gliadin (R-Biopharm), R7021: RIDASCREEN Gliadin competitive (R-Biopharm), INgezim Gluten (Ingenasa).
Обнаружение и/или количественное определение пептидов в биологических жидкостях человека можно провести, например, без ограничения с помощью иммунологических анализов, иммунохроматографии с использованием тест-полосок, иммунопреципитации, иммуномагнитного разделения, белковых биочипов, иммунофлуоресценции путем обнаружения с помощью флуоресцентных частиц в проточной цитометрии, электрохимических биосенсоров, электрохимических биосенсоров на основе плазменного резонанса (например, BIACORE™), термоэлектрических, наномеханических и оптических биосенсоров и, коротко говоря, любой известной иммунологической техники, которая является достаточно чувствительной и специфической, чтобы гарантировать обнаружение и количественное определение глютеновых пептидов.
Таким образом, согласно конкретному варианту осуществления контакт между биологической жидкостью и антителами проводят посредством иммунологического способа, выбранного из группы, состоящей из следующего: иммунохроматографические тест-полоски, флуоресцентные иммуномикрочастицы, магнитные иммуночастицы, непрямой ELISA, конкурентный ELISA, «сэндвич»-ELISA, вестерн-блоттинг, электрохимические биосенсоры, биосенсоры на основе плазмонного резонанса, термоэлектрические биосенсоры и наномеханические биосенсоры. Согласно конкретному варианту осуществления сигнал иммунохроматографической тест-полоски количественно определяют с помощью считывающего устройства.
Согласно предпочтительному способу обнаружения глютеновых пептидов можно использовать иммунохроматографический анализ с использованием тест-полосок. Способ согласно настоящему изобретению должен теоретически обеспечивать возможность обнаружения в моче конкретного потребления глютена, эквивалентный 50 мг глютена пшеницы в день, что представляет собой количество, находящееся в максимальном диапазоне, описанном для GFD или, в соответствующих случаях, минимальное количество, составляющее 6,48 нг иммуногенных пептидов глютена (GIP)/мл мочи.
Предпочтительная цель настоящего изобретения представляют собой иммунологические аналитические наборы или устройства на основе антител, реактивных в отношении глютеновых пептидов, обнаруженных в моче, которые, как было доказано, являются устойчивыми к перевариванию в желудке и иммуногенными. Указанные пептиды, вероятно, могут проникать в кровоток и впоследствии выводиться; включая в себя пептиды, распознаваемые антителами А1 и G12.
Применение указанных аналитических способов и наборов для выявления потребления глютена, независимо от того, произошло ли это за счет примеси к потребленным пищевым продуктам, за счет небрежного отношения к обращению с пищевыми продуктами или за счет нерегулярного сознательного/непреднамеренного потребления продуктов, содержащих глютен, также представляет собой цель настоящего изобретения. Другой целью настоящего изобретения является применение обнаружения указанных иммунотоксических пептидов в образцах мочи для целей клинического исследования CD для подтверждения эффективности будущих видов терапии, относящихся к снижению или устранению глютеновой токсичности, которые включают в себя ферментативные виды терапии с помощью пролилэндопептидаз, устранение проламинов из глютена злаковых зерен, виды терапии с использованием секвестранта иммунотоксического пептида, детоксификацию вредных глютеновых пептидов в обработанных пищевых продуктах и другие альтернативные виды терапии.
С другой стороны, согласно настоящему изобретению также предусмотрено применение иммунологических техник для количественного определения обнаружения глютена в таких биологических жидкостях человека, как моча. Как упоминалось ранее, иммунологические способы могут представлять собой иммунохроматографические тест-полоски, флуоресцентные иммуномикрочастицы, анализы вестерн-блоттинг, анализы ELISA, биосенсоры на основе электрохимических реакций, катализируемых ферментами, прикрепленными к антителам, покрытые антителом магнитные частицы, поверхностный плазмонный резонанс, другие оптические биосенсоры, термоэлектрические биосенсоры или любой другой способ из способов, существующих в настоящей области техники, в которых посредством концентрирования аналита (пептидов) можно измерить с помощью антитела.
Следовательно, как упоминалось ранее, указанные способы отличаются тем, что в них предпочтительно используют по меньшей мере одно антитело, способное к обнаружению эпитопов, содержащих по меньшей мере одну треть пролинов и одну треть глутаминов в своей последовательности, такие как в следующих последовательностях: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, и случайные замены глутамата на глутамин в указанных пептидах, которые могут происходить за счет дезаминирования, опосредованной трансглутаминазами. Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения антитела, используемые в иммунологических техниках, могут представлять собой G12 и, в более широком смысле, А1, вследствие их доказанной специфичности и чувствительности. Согласно настоящему изобретению также предусмотрено применение других антител, таких как R5, которое, как правило, используют для измерения глютена в пищевых продуктах и которое реагирует с эпитопами, сходными с последовательностью SEQ ID NO: 9, которую также можно обнаружить в глютеновых пептидах, устойчивых к перевариванию в желудочно-кишечном тракте, которые, несмотря на более низкую специфичность и чувствительность, чем у пептидов, сходных с 33-мерным пептидом, могут характеризоваться достаточной чувствительностью, поскольку они реагируют с пептидами, устойчивыми к протеазам, типичными для злаковых проламинов, которые являются токсическими для пациентов с целиакией.
Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения предусмотрено применение иммунохроматографических тест-полосок на основе антител к 33-меру альфа-глиадина, антител G12 и А1, которые обеспечивают возможность полуколичественного и быстрого обнаружения глютеновых пептидов/белков, содержащихся в образцах мочи.
Другая цель настоящего изобретения состоит в конкретном применении иммунологических способов на основе моноклональных антител G12, А1 и R5, конъюгированных с ферментом, которое обеспечивает возможность количественного анализа с использованием хромогенных, флуорогенных или люминесцентных субстратов. Обнаружение связи антиген-антитело можно провести с помощью субстратов, которые вызывают образование растворимых окрашенных продуктов, которые можно измерить в спектрофотометре, или которые вызывают образование нерастворимых окрашенных продуктов, которые образуют осадок на сайте антитела, субстратов, которые производят излучение света, которое обнаруживают, например, с использованием люминометра или фотографической пленки, биотина, впоследствии обнаруживаемого с помощью авидина/стрептавидина (прикрепленных к маркеру), флуорохромов, таких как, например, флуоресцеин и родамин, и т.д. В указанном способе можно использовать образец глиадина, гидролизованный глиадин, полномерный 33-мерный пептид (SEQ ID NO: 1) или часть его последовательности, составляющую по меньшей мере восемь аминокислот.
Специалисту в настоящей области техники будет понятно, что обнаружение и/или количественное определение глютена, потребленного человеком, требует построения калибровочной кривой, которая обеспечит возможность анализа данных, полученных в биологической жидкости, чтобы сделать вывод относительно того, употребил ли индивидуум глютен или нет, а также относительно количества потребленного глютена.
Следовательно, согласно конкретному варианту осуществления обнаружение и/или количественное определение глютена, потребленного человеком, предусматривает построение калибровочной кривой с использованием пептидов, содержащих последовательность SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 или их дезаминированные производные.
Согласно другому конкретному варианту осуществления обнаружение и/или количественное определение глютена, потребленного человеком, предусматривает построение калибровочной кривой с использованием обработанных пепсином-трипсином глютеновых проламинов.
Согласно настоящему изобретению предусмотрено обнаружение глютена, потребленного индивидуумом, с помощью количественного определения иммуногенных глютеновых пептидов, выведенных с его мочой и другими биологическими жидкостями человека, такими как слюна, пот или сыворотка.
Согласно настоящему изобретению предусмотрен аналитический способ контроля для подтверждения соблюдения GFD, а также для исключения возможности неконтролируемого потребления глютена пациентами, которые, как подозревают, страдают от так называемой RCD.
Следовательно, согласно конкретному варианту осуществления человек соблюдает GFD. Таким образом, на основе указанной характеристики людей обнаружение глютена с помощью способа согласно настоящему изобретению является показателем того, что человек не соблюдает GFD.
Применение настоящего способа для подтверждения эффективности терапевтических стратегий, которые снижают или устраняют глютеновую токсичность посредством ферментативной глютеновой детоксификации (например, Alvine Pharmaceuticals Ltd., США; или DSM, Нидерланды), посредством секвестрации токсических проламинов с помощью полимеров во избежание их гидролиза (например, BiolineRX, Израиль) или других альтернативных видов терапии, образуют часть настоящего изобретения. Образцы мочи пациентов с целиакией, подвергаемых клиническим анализам или терапевтическому назначению в будущем, также можно контролировать, поскольку эффективность терапии можно определить путем измерения присутствия или отсутствия пептидов в моче через несколько часов после потребления контролируемого количества глютена, вместе с видами терапии, которые устраняют иммунотоксические пептиды, или после приема в пищу продуктов, обработанных с помощью методики, которая предотвращает интернализацию иммунотоксических пептидов в организм индивидуума.
Отсутствие в настоящее время единого мнения в клинической практике относительно того, как контролировать GFD и осуществлять определение случаев непреднамеренного воздействия глютена за счет примесей в пищевых продуктах, можно разрешит путем проведения простых иммунологических анализов образцов мочи. Работники здравоохранения могут посчитать указанные способы применимыми для мониторинга пациентов с целиакией и в разработке будущих клинических анализов для того, чтобы прийти к определенному заключению с учетом статуса заболевания пациента.
Согласно другому конкретному варианту осуществления человек соблюдает терапию, направленную на избегание потребления глютена и/или профилактику образования иммуногенных глютеновых пептидов. В этом контексте обнаружение глютена с использованием способа согласно настоящему изобретению является показателем того, что терапия, применяемая к указанному человеку, не является эффективной.
Специалисту в настоящей области техники понятно, что перед приведением биологической жидкости от человека в контакт с антителом пептиды, обнаруженные в биологической жидкости, можно концентрировать.
Согласно конкретному варианту осуществления способа согласно настоящему изобретению предварительное концентрирование пептидов проводят в образцах мочи посредством системы твердофазной экстракции (SPE), с помощью обратимого физико-химического связывания пептидов с матрицей и последующего нарушения их связывания после элюирования с помощью раствора соответствующего состава, что будет обеспечивать возможность открепления пептидов от матрицы. Кроме того, концентрирование можно провести путем взаимодействия со специфическими антителами, иммобилизованными в хроматографических смолах или в магнитных частицах.
Впоследствии концентрированные полипептиды глютена элюируют с использованием меньшего объема подходящего раствора, совместимого с последующим количественным определением посредством иммунологических способов, например, иммунохроматографических тест-полосок, в которых используют по меньшей мере одно антитело к пептиду проламина, предпочтительно распознаваемому без ограничения вышеупомянутыми антителами A1, G12 и R5. Для количественного определения количества пептида способ можно дополнить с использованием эталонных образцов, или стандартного образца, с интактными глютеновыми белками или предпочтительно глютеновыми полипептидами, гидролизованными пепсином и трипсином или синтезированными. Интенсивность сигнала известных количеств пептидного стандарта будет служить для экстраполяции количества пептида в образце, определяя калибровочную кривую.
Специалисту в настоящей области техники понятно, что существует возможность проведения способа согласно настоящему изобретению in vivo в организме человека, что также предусмотрено настоящим изобретением.
С другой стороны, согласно настоящему изобретению также предусмотрены наборы для осуществления способа согласно настоящему изобретению на практике. Таким образом, согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к набору для обнаружения глютена в биологических жидкостях, далее в настоящем документе «набор согласно настоящему изобретению», содержащему следующее:
а) стандартный образец, выбранный из следующего:
- образец пептида, содержащий последовательность SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 или их дезаминированные производные, и
- стандартный образец обработанных пепсином-трипсином глютеновых проламинов, и
b) по меньшей мере одно антитело, которое специфически распознает эпитопы глютенового белка, чья аминокислотная последовательность содержит по меньшей мере одну треть пролинов и одну треть глутаминов.
Согласно конкретному варианту осуществления набора согласно настоящему изобретению эпитопы глютенового белка выбраны из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 и/или их дезаминированных производных.
Как указано ранее, способ согласно настоящему изобретению может предусматривать стадию концентрирования пептидов, присутствующих в биологической жидкости от человека. С этой целью можно использовать среду или матрицу, которая обеспечивает возможность физико-химического связывания пептидов, встречающихся в жидкости, и впоследствии их элюирования с использованием забуференного водного раствора. Альтернативно, также их можно концентрировать путем взаимодействия со специфическими антителами, иммобилизованными в хроматографических смолах или в магнитных частицах.
Следовательно, согласно другому конкретному варианту осуществления набор согласно настоящему изобретению содержит твердую среду связывания пептида и/или водный забуференный реакционный раствор. Указанные компоненты обеспечивают возможность концентрирования пептидов, встречающихся в биологической жидкости, для их последующего анализа.
Согласно другому конкретному варианту осуществления набора согласно настоящему изобретению антитело выбрано из группы, состоящей из моноклонального антитела G12, моноклонального антитела А1 и моноклонального антитела R5, причем согласно другому конкретному варианту осуществления антитело содержится в пределах иммунохроматографической тест-полоски, причем согласно другому конкретному варианту осуществления антитело связано с ферментом.
В заключение, согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к применению набора согласно настоящему изобретению для осуществления способа согласно настоящему изобретению на практике.
Во всем описании настоящего изобретения и формуле изобретения слово "содержит" и его варианты не предусматривают исключение других технических характеристик, добавок, компонентов или стадий. Специалисты в настоящей области техники должны логически предположить другие цели, преимущества и характеристики настоящего изобретения частично из настоящего описания и частично из осуществления настоящего изобретения на практике. Следующие примеры и фигуры предусмотрены в качестве иллюстрации и не преследуют цель ограничить настоящее изобретение.
Краткое описание фигур
Фигура 1. Взаимоотношение между концентрацией образца глиадина и интенсивностью количественного сигнала считывающего устройства QI тест-полосок. Среднее значение интенсивности, среднеквадратичное(ые) отклонение(я), относительное среднеквадратичное отклонение (RSD) рассчитывали для каждого стандартного образца. Функцию Rodbard рассчитывали с использованием программного обеспечения для считывающего устройства с параметрами, представленными в таблице.
Фигура 2А и 2В. Кинетика удаления и появления GIP в образцах мочи здоровых индивидуумов (n=13), подвергнутых диете с контролем глютена. Полуколичественное определение глютеновых пептидов/белков посредством иммунохроматографических тест-полосок с антителом G12 в образцах мочи здоровых индивидуумов после соблюдения GCD, подвергали GFD до момента, когда реактивные глютеновые пептиды становились необнаруживаемыми. После этого, их подвергали GCD для подтверждения появления GIP снова в образцах мочи. Три-шесть образцов мочи в день собирали от каждого индивидуума в течение 4 дней (фигура 2А). Пример представляет сбор полосок IC, реагирующих с образцами мочи от индивидуума, который принял участие в исследовании (аН6). Синяя полоса представляет собой положительный внутренний контроль, который показывает, что устройство функционировало правильно, и розовая полоса показывает присутствие глютеновых пептидов. Фигура 2В) Кинетика выведения GIP у четырех здоровых индивидуумов (аН1-аН2). GIP, глютеновые иммуногенные пептиды; GCD, глютенсодержащая диета; GFD, безглютеновая диета.
Фигура 3. In vivo мониторинг выведения с мочой происходящих из глютена пептидов у здоровых индивидуумов после контролируемого потребления глютена. Три дозы глютена вводили (10, 25 и 50 мг) здоровым индивидуумам, которые потребляли GFD в течение одной недели. Показаны четыре независимых эксперимента, соответствующих образцам, измеряемым в трех параллелях для потреблений 25 и 50 мг глютена у четырех здоровых индивидуумов. GIP, глютеновые иммуногенные пептиды; GFD, безглютеновая диета.
Фигура 4. Мониторинг соблюдения GFD пациентами с целиакией посредством обнаружения и количественного определения GIP в образцах мочи. В исследование включали пациентов с целиакией после соблюдения GFD>2 лет и здоровых индивидуумов, которые принимали участие в качестве положительных контролей, потребляющих GFD. Участников делили на две группы согласно возрасту: взрослые (>16) и дети (0-15). Каждая точка представляет значение среднего поглощения (OD=450 нм) анализируемого образца мочи каждого индивидуума. В соответствии с пределом количественного определения указанной техники (QL=0,8 нг/мл, показано линией), индивидуумов со значением GIP, превышающим или равным QL, считали положительными в отношении присутствия GIP, тогда как индивидуумов с содержанием GIP, составляющим меньше чем QL, считали отрицательными. *р<0,0001 (t-критерий Стьюдента). GIP, глютеновые иммуногенные пептиды; GFD, безглютеновая диета; GCD, глютенсодержащая диета; QL, предел количественного определения.
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Концентрирование, обнаружение и полуколичественное определение иммуногенных глютеновых пептидов в моче с использованием иммунохроматографических тест-полосок.
Согласно настоящему варианту осуществления показано, как иммуногенные глютеновые пептиды можно количественно определить в моче, несмотря на предполагаемое пищеварение в желудочно-кишечном тракте, после процесса предварительного концентрирования. Глютен представляет собой сложную смесь белков, содержащих глиадины и глютенины в пшенице и эквивалентных белков в ячмене, ржи и некоторых сортах овса. Глиадины и глютенины характеризуются уникальным аминокислотным составом с высоким содержанием пролина (15%), гидрофобных аминокислот (19%) и глутамина (35%); следовательно, они образуют структуру, устойчивую к полному расщеплению с помощью протеаз поджелудочной железы. После недавней демонстрации того, что иммунохроматографические тест-полоски 33-мера альфа-глиадина, на основе антител G12, А1 и R5, могут обнаружить гидролизованные глютеновые пептиды в кале и образцах пива с высокой степенью чувствительности ( et al., 2008; Real et al., 2014; Osman et al., 2001), возник вопрос, выводятся ли также глютеновые пептиды с мочой.
Во-первых, проводили анализ, в котором собирали образцы мочи здоровых индивидуумов, которые соблюдали нормальную глютенсодержащую диету (GCD) (n=10). Принимая внимание, что глютеновые пептиды, как предполагают, присутствуют в моче в очень низких концентрациях, авторы настоящего изобретения предусмотрели проведение стадии предварительного концентрирования, на которой, вероятно, также удаляют потенциально вызывающий помехи материал для улучшения возможностей обнаружения GIP. Индивидуумов-волонтеров делили на две группы: одна группа (n=10) получала не стандартизированную диету, которая включала в себя ежедневное потребление глютена, и другую группу (n=10) подвергали GFD в течение одной недели. От участвующих в исследовании индивидуумов получали письменное согласие. Следующий протокол проводили с целью исследования:
- Диета: Все субъекты, которые участвовали в исследовании, были проинструктированы в отношении соблюдения установленной диеты. Таким образом, те, которые потребляли GCD, получали инструкции по глютенсодержащей диете, и те, которые потребляли GFD, получали инструкции в отношении разрешенных пищевых продуктов. В конце исследования соблюдение условий диеты определяли посредством структурированной беседы.
- Сбор образцов мочи: Образцы мочи собирали от субъектов, которые принимали участие в исследовании, в стерильные пробирки Falcon и впоследствии переносили в бутылки и хранили при -20°C до их анализа. Все образцы гомогенизировали и аликвотировали меньше чем через три часа после мочеиспускания.
- Концентрирование пептидов и очищение образцов мочи: Технику SPE использовали для концентрирования пептидов и удаления примесей из собранных образцов мочи. Используемые октадецилсилановые картриджи предварительно кондиционировали с помощью 1 мл муравьиной кислоты в концентрации 0,1% в 80% метаноле посредством применения вакуума и элюент удаляли. Далее 7,5 мл трифторуксусной кислоты (TFA) добавляли и после применения вакуума элюент удаляли. Отдельно смесь 5 мл 50% мочи в TFA центрифугировали в течение 10 мин при 2500 g и представляющие интерес концентрированные пептиды элюировали с помощью 1 мл буферного раствора PBS, совместимого с тест-полосками Glutentox.
После концентрирования образцов мочи всех здоровых индивидуумов (n=20) впоследствии с использованием SPE картриджей обнаружение GIP проводили в образцах мочи индивидуумов, включенных в две различных группы на основании диеты с использованием иммунохроматографических тест-полосок Glutentox Sticks (Biomedal, S.L., Севилья, Испания). Глютеновые пептиды обнаруживали во всех концентрированных образцах мочи субъектов GCD. Тем не менее, токсические глютеновые пептиды не обнаруживали ни в одном концентрированном образце мочи субъектов GFD. Указанные результаты показывают, что сигнал зависел от потребления глютена.
Для определения корреляции концентрации GIP и выходного сигнала анализируемых иммунохроматографических тест-полосок, считывающее устройство для тест-полосок калибровали с использованием синтетического пептидного стандарта 33-мера альфа-глиадина и мочи пациента, который соблюдал GFD более двух лет, и чьи сывороточные маркеры проанализировали с подтверждением строгого соблюдения пациентом диеты. Для подтверждения отрицательного потребления пациентом глютена, качественный анализ проводили с использованием анти-GIP тест-полосок Glutentox, содержащих антитела G12, в концентратах мочи и кала согласно протоколу, установленному Comino с соавт. (2012). Серию из пяти стандартов 33-мерного пептида в концентрации, составляющей 3,12, 6,25, 12,5, 25, 50, 75, 100 и 200 нг/мл получали и добавляли к контрольному образцу мочи, собирая значение пиковой высоты линии IC тест-полоски, которую оценивали с использованием Glutentox Reader (Biomedal S.L., Севилья, Испания). Среднее значение рассчитывали в каждом стандарте, а также его среднеквадратичное отклонение (SD) и относительное среднеквадратичное отклонение (RSD). Средние значения использовали для расчета калибровочной функции, которую приводили к функции Rodbard (фигура 1). Далее калибровочную функцию вводили в программное обеспечение считывающего устройства для анти-GIP IC тест-полосок для количественного определения GIP в образцах мочи. Предела количественного определения (QL) указанной техники устанавливали на 6,48 нг GIP/мл мочи.
Как только подтвердили воспроизводимость способа обнаружения глютена в моче, анализ проводили с целью полуколичественного определения содержания GIP в образцах мочи. С этой целью проводили анализ, в котором с помощью беседы в отношении диеты подтверждали то, что участвующие в исследовании здоровые индивидуумы потребляли глютен (n=10, 7 женщин и 3 мужчины, средний возраст которых составил 23-39). Критерии включения в исследование предусматривали отсутствие заболеваний, симптомов со стороны пищеварительной системы, лекарственных средств, антибиотиков в течение последних двух месяцев и отсутствие семейной истории CD. Всех участников исследовали в отношении CD, получая нормальные содержания tTG в сыворотке и их фенотип HLA-DQ не представлял собой DQ-2/-8. Уровни гемоглобина и биохимический анализ крови, включая в себя почечные и печеночные пробы, как обнаружили, попадали в диапазон нормальных значений. Указанное исследование было одобрено местным Комитетом по биоэтике "Hospital Virgen de Valme" (Севилья, Испания). Получали письменное согласие участвующих в исследовании индивидуумов. Образцы мочи собирали от индивидуумов после нормальной глютенсодержащей диеты (хлеб, макароны, печенью и т.д.). Присутствие происходящих из глютена пептидов в концентрированных экстрактах мочи определяли с использованием иммунохроматографических тест-полосок на основе антитела G12 (IC, Glutentox Sticks) путем считывания интенсивности сигнала с использованием Glutentox Reader. Образцы погружали в разбавляющий раствор, предложенный производителем. Иммунохроматографические тест-полоски погружали в различные образцы (300 мкл) в течение 10 минут и оставляли высыхать на воздухе. В этом случае зарегистрировали значения выведения глютеновых пептидов с мочой у всех индивидуумов, составляющие больше чем 20 нг/мл.
Пример 2. Мониторинг иммуногенных происходящих из глютена пептидов в образцах мочи индивидуумов после контролируемой глютенсодержащей диеты.
В настоящем примере показано, как можно определить время удаления и появления потребленного глютена в образцах мочи с использованием IC тест-полосок на основе антитела G12. С этой целью 13 здоровых волонтеров (9 женщин и 4 мужчин со средним возрастом, составляющим 23-65 лет) подвергали различным условиям диеты. Образцы мочи собирали от указанных индивидуумов, которые соблюдали GCD и которых подвергали безглютеновой диете (GFD), пока содержание GIP не становилось необнаруживаемым в образцах мочи. После этого, вновь вводили GCD и собирали новые образцы мочи. Всего 3-6 различных образцов мочи от каждого индивидуума собирали каждый день. На фигуре 2А показан репрезентативный пример сбора IC тест-полосок, реагирующих с образцами мочи, собранными в течение периода исследования здорового субъекта (АН6). Кинетика выведения GIP у 4 из анализируемых 13 здоровых волонтеров (АН1, АН5, АН8 и АН12) выявила, что потребленный глютен полностью выводился через 16-34 часов после начала GFD у всех проанализированных индивидуумов (фигура 2В).
После повторного введения глютена в диету GIP обнаруживали в образцах мочи через 3-9 часов. Различия в выведении, наблюдаемые между индивидуумами, можно объяснить диетой, типом глютенсодержащих пищевых продуктов и изменчивостью гидролитической способности пищеварительной системы (главным образом, ферментов) и активностями микроорганизмов. У 12 из 13 здоровых индивидуумов на GFD количества GIP в моче являлось ниже, чем QL настоящего способа. Другие пациенты изначально характеризовались хорошим соблюдением GFD; тем не менее, сигнал, составляющий 40 нг GIP/мл мочи, обнаруживали на третий день анализа, как показано на графике индивидуума АН12. При беседе в конце исследования указанный индивидуум подтвердил непреднамеренное потребление йогурта со злаками (пшеницы, среди прочего) за несколько часов до одного из сборов образцов мочи.
После потребления глютена между индивидуумами наблюдали высокую степень изменчивости в концентрации и времени выведения реакционноспособных глютеновых пептидов. При подтверждении воспроизводимости способа для обнаружения глютена в моче авторы настоящего изобретения исследовали, существует ли корреляция между количеством потребленного глютена и количеством GIP, измеренного в моче с использованием настоящей методики. В соответствии с недавними систематическими обзорами общее ежедневное потребление глютена, составляющее меньше чем 10-50 мг, может вызвать гистологические нарушения (Hischenhuber et al, 2006; Catassi et al, 2007; Akobeng у Thomas, 2008; Gibert et al., 2013). Для подтверждения того, способна ли методика анти-GIP LFT обнаружить низкое потребление глютена в образцах мочи, устанавливали определенные количества потребленного глютена (10-50 мг), которые вводили четырем здоровым индивидуумам (фигура 3). Один тип глютена использовали во всех случаях. Индивидуумы получали стандартную часть продукта, чтобы исключить изменчивость вследствие введения глютена из различных источников. Вводили начальную микродозу, составляющую 10 мг глютена, и содержание глютена в собранных образцах мочи измеряли с использованием анти-GIP LFT. Далее вводили дозы, составляющие 25 и 50 мг, и количества GIP в моче также измеряли, пока реакционноспособные глютеновые пептиды не становились необнаруживаемыми. После потребления количества пищи, эквивалентного 50 мг глютена, GIP обнаруживали в моче у всех анализируемых индивидуумов, и, следовательно, предел обнаружения (DL) настоящего способа составляет 50 мг глютена. Тем не менее, введение 25 мг глютена производило измеряемые сигналы в IC тест-полосках после анализа моча трех из четырех проанализированных индивидуумов (АН2, АН4 и АН10), хотя сигнал был лишь немного выше, чем QL у АН10. У все индивидуумов отсутствовали обнаруживаемые сигналы после потребления 10 мг. Вариации, наблюдаемые между индивидуумами, вероятно, обусловлены индивидуальными различиями в метаболизме и диетах, кишечной микрофлоре и вариациях в потреблении пищевых продуктов за день.
Пример 3. Мониторинг соблюдения безглютеновой диеты в образцах мочи пациентов с целиакией.
В настоящем примере показано, как соблюдение GFD пациентами с целиакией можно подвергнуть мониторингу посредством определения иммуногенных глютеновых пептидов в моче с использованием системы быстрого обнаружения на основе IC тест-полосок с антителом G12 (Glutentox Sticks, Biomedal, S.L.). Высокое процентное отношение пациентов с целиакией с частичным восстановлением слизистой оболочки кишечника, вероятно, вследствие неумышленных приемов в пищу, обусловило необходимость в неинвазивном маркере, который обеспечивает возможность краткосрочного мониторинга соблюдения GFD. В процессе прохождения глютена через желудочно-кишечный тракт, большая его часть подвергается гидролизу. Для оценки применимости способа для мониторинга потребления глютена у пациентов с целиакией, исследовали образцы мочи от 76 здоровых индивидуумов (42 взрослых и 34 ребенка), которые соблюдали GCD, и 58 пациентов с целиакией в ремиссии (27 взрослых и 31 ребенок), которые соблюдали GFD в течение >2 лет.
Образцы мочи здоровых индивидуумов после потребления глютенсодержащей диеты во всех случаях характеризовались содержаниями GIP, превышающими QL настоящего способа (76 из 76, 100% положительные по GIP в моче). Диапазон значений GIP в моче у здоровых индивидуумов варьировал, составляя 6,54-604 нг/мл мочи у взрослых и 6,48-369 нг/мл мочи у детей, т.е. в 57-93 раза выше, чем QL настоящего способа, что указывает на то, что на выведение глютеновых пептидов оказывает существенное влияние диета, типы глютенсодержащих пищевых продуктов и/или такие характеристики индивидуума, как кишечная микрофлора. Если анализ проводили в моче пациентов с целиакией, содержание GIP в моче составляло меньше, чем QL настоящего способа только у 41% взрослых и у 55% детей с CD в клинической ремиссии. Явное нарушение соблюдения GFD наблюдали у других индивидуумов с целиакией, у которых содержание GIP находилось в диапазоне от 4,5 до 12 раз выше, чем QL (6,48-78,12 и 6,48-29,69 нг GIP/мл мочи, у взрослых и у детей, соответственно).
Пример 4. Мониторинг безглютеновой диеты в образцах мочи, собранных в течение 24-часового периода у индивидуумов, подвергнутых глютенсодержащей или безглютеновой диетам.
В настоящем примере показано, как GFD можно подвергнуть мониторингу во всех образцах мочи, собранных в течение 24-часового периода, с использованием иммунохроматографической считывающей системы с помощью антител к GIP. Вещества, удаление которых происходит с помощью почек, не выводятся с одинаковой скоростью или в одинаковых количествах в различные временные интервалы в течение дня или в течение ночи; при нормальных условиях выведения меньшее количество мочи выделяется ночью, чем в течение дня. Следовательно, случайный образец мочи может не дать изображение, единое для возможных конкретных потреблений глютена в течение 24-часового периода. Анализ 24-часовых образцов мочи в дополнение к исследованиям сыворотки использовали, как правило, для получения релевантных данных при многих нарушениях.
Следовательно, целью настоящего исследования являлось определение способности настоящей техники измерять происходящие из глютена пептиды в 24-часовых образцах мочи в качестве показателя соблюдения GFD пациентами с целиакией. С этой целью трое здоровых индивидуумов, которые соблюдали GCD и один пациент с целиакией в ремиссии с GFD>2 лет принимали участие в исследовании. Все образцы мочи от четырех взрослых участников, выделенные в течение 24-часового периода, собирали отдельно. Каждый образец мочи анализировали отдельно для определения содержания глютена в нем и после этого все образцы мочи помещали в один контейнер. Обнаружение и количественное определение GIP с помощью IC тест-полосок проводили в четырех 24-часовых образцах. Трое здоровых индивидуумов показали содержания GIP как в индивидуальных образцах мочи, так и в 24-часовом образце, причем содержание глютеновых пептидов находилось в диапазоне 12,4-87,6 нг/мл. Тем не менее, содержания GIP в образцах мочи пациента с целиакией составляло меньше, чем QL настоящего способа и в 24-часовом образце. Измерения GIP, полученные в дискретных образцах мочи, являлись очень сходными с полученными в полных 24-часовых образцах. Следовательно, результаты показали, что количество глютена в 24-часовой моче предоставляет ценную информацию в отношении среднего значения метаболизма и выведения глютена, потребленного в течение полного 24-часового периода, у индивидуума.
Пример 5. Мониторинг безглютеновой диеты в образцах мочи с использованием биосенсора.
В настоящем примере показано, как можно определить количество GIP в моче с использованием биосенсора. Это селективная и количественная техника для прямого обнаружения происходящих из глютена пептидов без необходимости маркеров. С этой целью антитело к GIP иммобилизовали на гидрофобной матрице размером 100 нм с 2% декстраном. Буфер, в котором разводят антитело, должен обеспечивать возможность электростатического взаимодействия между антителом к GIP и декстрановой матрицей для облегчения образования связей. В водной среде рКа групп матрицы составляет приблизительно 4. Концентрации иммобилизации антител находятся в диапазоне от 30 до 130 мкМ, хотя они зависят от используемого антитела к GIP. Указанная иммобилизация создает резонансный сигнал, который собирают с помощью датчика, его называют базальный сигнал. Далее мочу пропускают через исследуемый сенсорный чип. Если она содержит GIP, в датчике образуется изменение сигнала, которое представляет собой ответ, прямо пропорциональный взаимодействию между GIP и антителом. В итоге, поверхность отмывают для удаления остаточной мочи, оставляя антитело к GIP прикрепленным. Таким образом, поверхность готова для нового анализа.
Пример 6. Мониторинг безглютеновой диеты в образцах мочи посредством системы парамагнитных и хемилюминесцентных частиц.
В настоящем примере показано, как присутствие глютеновых пептидов в моче можно определить с использованием покрытой антителом к GIP частицы. Антитело к иммуногенному глютеновому пептиду, G12, иммобилизуют в 0,2 мкм магнитных частицах. Приблизительно 0,1 мл магнитных частицы с минимальной концентрацией, составляющей 107 частиц/мл, приводят в контакт с 2 мл мочи для захвата содержащихся в ней пептидов в пробирке Эппеендорф. Способ отмывки и связывания частиц со стенками пробирки проводят посредством общепринятых способов, используемых специалистами в настоящей области техники, с использованием магнитного адаптера для пробирки (Life Technologies, Miltenji, Sepmag). Антитело к GIP, конъюгированное с пероксидазой, которое должно связаться только с теми частицами, в которых обнаружили GIP с двумя эпитопами. После отмывки с использованием связывания/устранения связывания со стенками пробирки, реагирующей на магнитное поле, обнаружение проводили с помощью применения люминофора и люминометр использовали для количественного определения сигнала. Сигнал, превышающий отрицательный контроль образца без GIP, указывает на присутствие глютеновых пептидов.