Действие брассинолида на скотоморфогенез трансгенных растений табака (Nicotiana tabacum L. )

УДК 581.14

Е. С. Гвоздева

ДЕЙСТВИЕ БРАССИНОЛИДА НА СКОТОМОРФОГЕНЕЗ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ ТАБАКА

Проведен сравнительный анализ влияния брассинолида (БЛ) на морфогенез этиолированных проростков растений табака исходной линии SR1 и трех трансгенных моноинсерционных линий IL18 № 7-1, IL18 № 7-11 и IL18 № 28-3 на ранних стадиях развития. БЛ в концентрации 10-6 М существенно подавлял рост корня и ги-покотиля как у нетрансгенных, так и генетически модифицированных растений. При снижении концентрации БЛ ингибирующее действие этого экзогенного гормона уменьшалось для всех изучаемых растительных объектов. Выявлены отличия в ростовых ответах этиолированных проростков трех трансгенных линий на действие БЛ как от родительской линии SR1, так и между собой.

Ключевые слова: трансгенные моноинсерционные растения табака, брассинолид, скотоморфогенез.

На рост и развитие растений оказывают влияние многочисленные внешние и внутренние факторы (свет, гормоны и др.). Растительными организмами в процессе эволюции были выработаны различные механизмы и регуляторные системы, находящиеся под контролем растительного генома и подчиняющиеся изменениям уровня экспрессии генов. К 70-80-м гг. прошлого столетия были получены доказательства, что для слаженной работы целого растения требуется сложное взаимодействие между отдельными гормонами, определяющееся не только внешними, но и внутренними условиями (концентрацией и соотношением других эндогенных регуляторов и т. п.) [1]. Позже было показано, что возможность образования каждого из фитогормонов регулируется экспрессией определенных генов [2]. К настоящему времени определены некоторые ключевые гены, содержащие промоторы, чувствительные и специфичные к фитогормонам, свету и другим факторам, и контролирующие многие важные процессы и этапы жизнедеятельности растений (фотосинтез, фотоморфогенез, формирование корня, листьев, цветков, азотфикса-ция, эмбриогенез, старение и т. д.) [3-5]. Современный уровень развития науки дает основания для формирования теории генетических регуляторных сетей, которая позволит выявить многообразие и иерархию существующих взаимодействий, например, в растительном организме и рассчитать возможные варианты его развития в зависимости от определенных условий [6]. Уже установлены отдельные компоненты этих сетей, способные на разных этапах развития контролировать несколько процессов [7-9]. Но в этом случае мутации, затрагивающие разные участки одного регуляторного гена, или встраивание гетерологичных конструкций в растительный геном приводят к нарушениям в согласованной координации отработанных меха-

низмов и затем к разнообразным изменениям физиологических функций генетически модифицированных растений. Показано, что трансгенез растений может изменять функционирование их регуляторных систем и, как результат, фенотипические проявления [10-13].

Экзогенное внесение фитогормонов также может изменять течение многих жизненно важных процессов у растительных организмов. Например, на мутантных линиях арабидопсиса и гороха было установлено, что брассиностероиды индуцируют экспрессию генов ксилоглюкан-эндотрансглюкози-лазы, а экзогенная обработка брассинолидом активизирует действие индолилуксусной кислоты, гиб-берелловой кислоты и цитокинина, стимулирует биосинтез этилена, повышает устойчивость растений к стрессу [14-19].

Целью данной работы было изучить влияние различных концентраций экзогенного брассиноли-да на морфогенез этиолированных проростков трансгенных линий табака ^18 № 7-1, ^18 № 7-11 и Ъ18 № 28-3.

В качестве объектов исследования были использованы растения табака Nicotiana tabacum К sv. Samsun исходной родительской линии SR1 (контроль) и двух трансгенных моноинсерционных линий ^18 № 7 и ^18 № 28, полученных ранее в Институте цитологии и генетики СО РАН (г. Новосибирск) методом агробактериальной трансформации растений табака линии SR1 с применением генетической конструкции, включающей ген интерлейкина-18 человека, маркерный ген и репор-терный ген uidА в плазмиде рВП01-^18 [20]. Растения трансгенных линий гомозиготны и являются потомками третьего поколения. Линии ^18 № 7 и ^18 № 28 отличаются друг от друга локусом встройки генетической конструкции. Линия ^18 № 7 была представлена потомками Т2, обозначен-

1 Работа выполнена при поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг. (Государственный контракт № П1168 от 03 июня 2010 г.).

ными IL18 № 7-1 и IL18 № 7-11.

Семидневные проростки получали из семян табака, культивируемых в темноте в стерильных условиях на агаризованной среде MS [21] с добавлением БЛ (брассинолида) в различных концентрациях (10-6, 10-7, 10-8, 10-9 М). В качестве контроля использовали варианты без внесения гормона. Брассинолид любезно предоставлен чл.-корр. НАН Беларуси В. А. Хрипачем (лаб. химии стероидов Института биоорганической химии НАН Беларуси, Минск).

После фиксации проростков в 70 %-м этаноле определяли площадь семядольных листьев с помощью микроскопа «БИОЛАМ» Р2У42 (150*), окулярного и объективного микрометров, длину гипо-котилей и корней измеряли под бинокулярной лупой БМ-51-2 (8,75*).

Ростовые параметры определяли для 200 растений в каждом варианте. Статистическую обработку и построение диаграмм проводили с помощью электронных таблиц «MS Excel 2003» и прикладного пакета StatSoft, вычисляя среднее арифметическое (X) анализируемых параметров, стандартное отклонение (о), стандартную ошибку (SE) и двухсторонний интервал (d) для средних значений всех исследованных переменных. Выборки имели нормальное распределение, для определения достоверности данных использовали параметрический критерий Стьюдента. Различия считали достоверными при уровне значимости р < 0.05.

В ходе проведения экспериментов было выявлено, что в контрольном варианте Т-0 (без внесения БЛ) все этиолированные трансгенные проростки отличались от родительской линии SR1 меньшими размерами гипокотиля и семядольных листьев (рис. 1, 2). У проростков линий SR1 и IL18 № 28-3 длина корня была одинакова и превосходила данный показатель у линий I118 № 7-1 и I118 № 7-11 в

1.3 раза (рис. 3). Необходимо отметить, что сходство по площади семядольных листьев, длине гипо-котиля и корня внутри каждой независимой линии I118 № 7-1 и I118 № 7-11 позволяет говорить об отсутствии сомаклональной вариабельности у исследуемых трансгенных растений табака.

БЛ (10-6 М) существенно подавлял рост семядольных листьев, гипокотиля и корня как у нетран-сформированных, так и генетически модифицированных растений. При снижении концентрации БЛ до 10-7 М и 10-9 М ингибирующее действие экзогенного гормона уменьшалось для всех линий табака.

Наблюдалось изменение морфогенетических признаков у проростков трансгенных линий табака. При действии БЛ 10-6 М гипокотили проростков всех исследуемых линий образовывали «петлю» у основания семядолей (рис. 4, а), а корни -

Т-0 ИТ-БЛ-10-6 ИТ-БЛ-10-7 ИТ-БЛ-10-8 ПТ-БЛ-10-9

Рис. 1. Длина гипокотиля 7-дневных проростков табака исходной родительской SR1 и трансгенных IL18 № 7-1, IL18 № 7-11 и IL18 № 28-3 линий, выращенных в условиях темноты без брассинолида (Т-0) и с добавлением брассинолида в концентрации 10-6 (Т-БЛ-10-6), 10-7 (Т-БЛ-10-7), 10-8 (Т-БЛ-10-8) и 10-9 (Т-БЛ-10-9) М

0.6-

SR1 I118 № 7-1 I118 № 7-11 I118 № 28-3

Т-0 ИТ-БЛ-10-6 пТ-БЛ-10-7 пТ-БЛ-10-8 ПТ-БЛ-10-9

Рис. 2. Площадь семядольных листьев 7-дневных проростков табака исходной родительской SR1 и трансгенных IL18 № 7-1, IL18 № 7-11 и IL18 № 28-3 линий, выращенных в условиях темноты без брассинолида (Т-0) и с добавлением брассинолида в концентрации 10-6 (Т-БЛ-10-6), 10-7 (Т-БЛ-10-7), 10-8 (Т-БЛ-10-8) и 10-9 (Т-БЛ-10-9) М

SR1 1118 № 7-1 1118 № 7-11 I118 № 28-3

Т-0  Т-БЛ-10-6 ИТ-БЛ-10-7 иТ-БЛ-10-8 ПТ-БЛ-10-9

Рис. 3. Длина корня 7-дневных проростков табака исходной родительской SR1 и трансгенных IL18 № 7-1, IL18 № 7-11 и IL18 № 28-3 линий, выращенных в условиях темноты без брассинолида (Т-0) и с добавлением брассинолида в концентрации 10-6 (Т-БЛ-10-6), 10-7 (Т-БЛ-10-7), 10-8 (Т-БЛ-10-8) и 10-9 (Т-БЛ-10-9) М

д е ж з

Рис. 4. Варианты ответных реакций гипокотиля и корня этиолированных 7-дневных проростков табака на действие разных концентраций БЛ: а - образование «петли» в верхней части гипокотиля, б - образование «крючка» корнем проростка, в - раскручивание «петли» гипокотиля, г - изменение кривизны «крючка» корня, д - гипокотильный «крючок» (apical hook), е - горизонтальная ориентация корня, ж - раскрытие апикального «крючка», з - удлинение корня и разрастание корневых волосков. Фото Е. С. Гвоздевой, Ю. В. Медведевой

«крюк» (рис. 4, б). Подобный эффект описан в ряде экспериментальных работ, связанных с действием этилена [22-26]. Это «тройная реакция» этиолированных проростков (ингибирование растяжения, утолщение и горизонтальная ориентация стебля), у проростков двудольных растений формируется гипокотильный крюк (apical hook), тормозится рост главного корня, но активизируется рост боковых корней. Показано, что ранения, водный дефицит, низкая температура и высокие концентрации ауксинов, цитокининов и брассиностероидов усиливают биосинтез этилена [22-26].

В варианте с БЛ 10-7 М апикальная «петля» ги-покотиля сохранялась только у проростков исходной родительской линии SR1. У трансгенных линий IL18 № 7-1, IL18 № 7-11 и IL18 № 28-3 наблюдали последующее «раскручивание петли» с ориентацией семядольных листьев вертикально вверх (рис. 4, в). Эта же концентрация БЛ незначительно стимулировала рост корня и изменяла кривизну «крючка» у всех 4-х линий (рис. 3 и 4, г). Подобные изменения могут быть сопряжены с различной степенью восстановления градиента полярного транспорта ауксина [27, 28].

Концентрация БЛ (10-8 М) способствовала полному освобождению семядольных листьев из семенной оболочки, что всегда характерно для пророст-

ков, выращиваемых на белом или селективном свету. У проростков линий SR1, 1118 № 7-1 и 1118 № 7-11 также отмечали наличие гипокотильного крючка (рис. 4, д), свойственного для этиолированных проростков двудольных растений из-за этилен-индуци-рованного асимметричного роста [27, 28]. Как у не-трансгенных, так и трансгенных линий растений табака корень относительно гипокотиля ориентировался под углом в 90°, корневые волоски более интенсивно разрастались на той стороне, которая соприкасалась с питательной средой (рис. 4, е).

В отличие от других концентраций БЛ 10-9 М стимулировал рост семядольных листьев проростков всех изучаемых линий (рис. 2). При этом в верхней части гипокотиля отсутствовал апикальный крюк (рис. 4, ж). Известно, что в темноте брасси-ностероиды снимают запрет на реализацию фото-морофогенетических реакций растений [29, 30]. У проростков линий SR1, 1118 № 7-1 и 1118 № 7-11 БЛ (10-9 М) также способствовал дальнейшему удлинению корня и разрастанию корневых волосков (рис. 4, з).

Выявленные морфологические особенности скотоморофогенеза трансгенных линий 1118 № 7-1, 1118 № 7-11 и 1118 № 28-3 под влиянием БЛ позволяют предположить, что это может быть сопряжено с изменением фитогормонального статуса.

Ранее нами было показано, что на ранних стадиях онтогенеза этиолированные проростки исходной линии SR1 и трансгенной линии 1118 № 7-1 существенно отличаются по количественному содержанию рибозид зеатина, индолилуксусной и аб-сцизовой кислот [31, 32].

Известно, что продукты гетерологичных генов вовлекаются в модификацию жирных кислот в модельных растительных объектах [33]. Можно предположить, что в данном эксперименте рекомбинантный белок - продукт гетерологичной конструкции, встроенной в геном исследуемых растений табака, может быть вовлечен в метаболические пути растения. Различия в ответных морфологических

реакциях трансгенных растений табака между линиями 1118 № 7-1, 1118 № 7-11 и 1118 № 28 можно объяснить разным уровнем экспрессии целевых генов, так как ранее нами было показано, что клеточные культуры табака линий 1118 № 7-1 и 1118 № 7-11 продуцировали белок интерлейкина-18 человека более активно, чем линия 1118 № 28-3 [34].

Таким образом, отмечена одинаковая ответная реакция трансгенных линий 1118 № 7-1 и 1118 № 7-11 на действие БЛ в концентрации с 10-6 до 10-9 М, но более чувствительная, чем у исходной родительской линии SR1. В отличие от трансгенных линий 1118 № 7-1 и 1118 № 7-11 линия 1118 № 28 оказалась менее чувствительной к воздействию БЛ.

Список литературы

1. Полевой В. В., Саламатова Т. С. Физиология роста и развития растения. Л., 1991. 239 с.

2. Кулаева О. Н. О регуляции экспрессии генов в растительных клетках // Физиол. растений. 1978. Т. 25. № 5. С. 990-1008.

3. Шестаков С. В. Молекулярная генетика фотосинтеза // Соросовский образовательный журнал. 1998. № 9. С. 22-27.

4. Лутова Л. А., Проворов Н. А., Тиходеев О. Н., Тихонович И. А., Ходжайова Л. Т., Шишкова С. О. Генетика развития растений / под ред. чл.-корр. РАН С. Г. Инге-Вечтомова. СПб.: Наука, 2000. 539 с.

5. Будаев Р. А. Роль гена Bractea в регуляции развития структуры соцветия и цветка у Arabidopsis thaliana (L.) Heynh: дис. ... канд. биол. наук. М., 2007. 105 с.

6. Ананько Е. А., Колпаков Ф. А., Подколодная О. А., Игнатьева Е. В., Горячковская Т. Н. и др. Генные сети. Отчетная сессия ИЦиГ СО РАН. Новосибирск, 1999. 18 с. http://www.bionet.nsc.ru/ICIG/session/1999/rus/part1/1_18.pdf

7. Quail P. Photosensory perception and signalling in plant cells: new paradigms? // Current Opinion in Cell Biology. 2002. Vol. 14. № 2. P. 180-188.

8. Цыганкова В. А., Галкина Л. А., Мусатенко Л. И., Сытник К. М. Генетический контроль роста и развития растений. Гены фотоморфогенеза и регуляция их экспрессии светом // Биополимеры и клетка. 2004. Т. 20. № 6. С. 451-471.

9. Busov V. B., Brunner A. M., Strauss S. H. Genes for control of plant stature and form // New Phytologist. 2008. Vol. 177. P. 589-607.

10. Peters J. L., Szell M., Kendrick R. E. The expression of light - regulated genes in the high - pigment-1 mutant of tomato // Plant Physiology. 1998. Vol. 117. P. 797-807.

11. Thiele A., Herold M., Lenk I. et al. Heterologous expression of Arabidopsis phitochrom B in transgenic potato influences photosynthetic performance and tuber development // Ibid. 1999. Vol. 120. P. 73-81.

12. Абдеев Р. М., Мусийчук К. А., Голденкова И. В., Сотченков Д. В., Салехи Джузани Г. Р. и др. Изменение морфологии и фитогормонального статуса у трансгенных растений табака в результате экспрессии бактериальной термостабильной целлюлазы // Физиол. растений. 2004. Т. 51. № 5. С. 714-720.

13. Рукавцова Е. Б. Получение и характеристика трансгенных растений, синтезирующих новые биологически активные соединения: дис. ... д-ра биол. наук. Пущино, 2009. 48 с.

14. Хрипач В. А., Лахвич Ф. А., Жабинский В. Н. Брассиностероиды. Минск: Наука и техника, 1993. 287 с.

15. Прусакова Л. Д., Чижова С. И. Роль брассиностероидов в росте, устойчивости и продуктивности растений // Агрохимия. 1996. № 11. С. 137-150.

16. Clouse S. D., Sasse J. M. BRASSINOSTEROIDS: Essential regulators of plant growth and development // Ann. Rev. of Plant Physiol. and Plant Molec. Biol. 1998. Vol. 49. P. 427-451.

17. Li J., Chory J. Brassinosteroid actions in plants // J. of Experimental Botany. 1999. Vol. 50. № 332. Р. 275-282.

18. De Grauwe L., Vandenbussche F., Tietz O. et al. Auxin, ethylene and brassinosteroids: tripartite control of growth in the Arabidopsis Hypocotyl // Plant and Cell Physiol. 2005. Vol. 46. № 6. Р. 827-836.

19. Luo X.-M., Lin W.-H., Zhu S., Zhu J.-Y., Sun Y., Fan X.-Y., Cheng M., Hao Y., Oh E. et al. Integration of light- and brassinosteroid-signaling pathways by a GATA transcription factor in arabidopsis // Developmental Cell. 2010. Vol. 19(6). P. 872-883.

20. Турчинович А. А., Дейнеко Е. В., Шумный В. К. Получение трансгенных растений табака - продуцентов интерлейкина-18 человека // Докл. Академии наук. 2004. Т. 395. № 5. С. 704-707.

21. Murashige T, Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture // Plant Physiol. 1962. Vol. 15. P. 473-497.

22. Чканников Д. И., Макеев А. М., Микитюк О. Д., Петелина Г. Г. Факторы коррелятивного ингибирования // Рост растений. Первичные механизмы. М.: Наука. 1978. С. 75-80.

23. Кулаева О. Н. Как регулируется жизнь растений // Соросовский образоват. журн. 1995. № 1. С. 20-27.

24. Bleecker A. B., Schaller G. E. T. The Mechanism of Perception // Plant Physiol. 1996. Vol. 111. P. 653-660.

25. Konishi M., Yanagisawa S. Signaling crosstalk between ethylene and other molecules // Plant Biotechnol. 2005. № 22. Р. 401-407.

26. Santner A., Calderon-Villalobos А. L.-I., Estelle M. Plant hormones are versatile chemical regulators of plant growth // Nature Chem. Biol. 2009. № 5. Р. 301-307.

27. Lehman A., Black R., Ecker J. R. Hookless1, an ethylene response gene, is required for differential cell elongation in the Arabidopsis hook // Cell. 1996. Vol. 85. № 2. P. 183-194.

28. Raz V., Ecker J. R. Regulation of differential growth in the apical hook of Arabidopsis // Developmental. 1999. № 126. Р. 3661-3668.

29. Goda H., Sawa S., Asami T., Fujioka S., Shimada Y., Yoshida S. Comprehensive comparison of auxin-regulated and brassinosteroid-regulated genes in Arabidopsis // Plant Physiol. 2004. Vol. 134. P. 1555-1573.

30. Goda H., Shimada Y., Asami T. et al. Microarray analysis of brassinosteroid-regulated genes in Arabidopsis // Plant Physiol. 2002. Vol. 130(3). Р. 1319-1334.

31. Гвоздева Е. С., Карначук Р. А., Дейнеко Е. В. Фотоморфогенез трансгенных растений табака на ранних этапах онтогенеза // Ноосфер-ные знания и технологии: сб. трудов / под ред. проф. Г. В. Майера. Вып. 2. Томск: Изд-во НТЛ, 2006. С. 47-50.

32. Карначук Р. А., Гвоздева Е. С., Ефимова М. В. Световая регуляция морфогенеза растений табака, трансформированных геном интерлейкина-18 человека // Физиол. растений. 2008. Т. 55. № 4. С. 560-564.

33. Шимшилашвили Х. Р. Изучение экспрессии генов, вовлеченных в модификацию жирных кислот, на экспериментальных моделях: дис. ... канд. биол. наук. М., 2010. 194 с.

34. Карначук Р. А., Дорофеев В. Ю., Гвоздева Е. С., Медведева Ю. В., Ефимова М. В. и др. Создание клеточной культуры трансгенного табака с геном интерлейкина-18 человека как продуцента белков медицинского назначения // Вестн. Томского гос. ун-та. 2007. № 1(75). С. 75-86.

Гвоздева Е. С., кандидат биологических наук, доцент, доцент кафедры.

Томский государственный университет.

Пр. Ленина, 36, Томск, Россия, 634050.

E-mail: ivanova_ls@rambler.ru

Материал поступил в редакцию 15.05.2012.

E. S. Gvozdeva

THE ACTION OF BRASSINOLIDE ON SKOTOMORPHOGENESIS OF TRANSGENIC TOBACCO PLANTS

A comparative analysis of the effect brassinolide (BL) on the morphogenesis of the etiolated seedlings of non-transgenic (SR1) and three transgenic monoinsertion lines (IL18 № 7-1, IL18 № 7-11, and IL18 № 28-3) of Nicotiana tabacum L. on the early stages of ontogenesis was carry out. BL (10-6 M) significantly inhibited the growth of root and hypocotyl as at the non-transgenic, so and the genetically modified plants. The inhibitory effect of BL for all studied plant object decreased by lower concentration. The difference in the growth responses of etiolated seedlings for three transgenic and non-transgenic lines caused by exogenous BL was detected.

Key words: transgenic monoinsertion tobacco plants, brassinolide, skotomorphogenesis.

Tomsk State University.

Pr. Lenina, 36, Tomsk, Russia, 634050.

E-mail: ivanova_ls@rambler.ru