Рекомбинантный штамм дрожжей Pichia pastoris с увеличенной продукцией фитазы Escherichia coli
RECOMBINANT PICHIA PASTORIS YEAST STRAIN WITH INCREASED PRODUCTION OF ESCHERICHIA COLI PHYTASE

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и касается получения штаммов дрожжей Pichia pastoris, способных продуцировать фитазу.
Фосфор является важным минеральным питательным веществом для роста и развития животных. В большинстве источников сырья, используемого в животноводстве, такого, например, как зерновые и бобовые культуры, фосфор, в основном, содержится в форме фитата (мио-инозитол гексакисфосфат) [Advanced Food Research, 1982, 28, 1-92.]. Однако моногастричные животные не способны усваивать фитатный фосфор из-за отсутствия необходимого фермента в пищеварительном тракте [Can J Anim Sci., 2013, 93, 9-21.]. Кроме того, фитаты препятствуют эффективному усвоению кальция, магния, цинка, железа и других минеральных веществ комбикормов, а также связывают белки в недоступные для переваривания комплексы [Current Topics In Nutraceutical Research, 2008, 6(3), 131-144.].
Ферменты фитазы (мио-инозитол гексакисфосфат фосфогидролазы) гидролизуют фитат с отщеплением фосфатных групп и с успехом используются в качестве кормовой добавки, значительно повышая усвоение фосфора [J. Sci. Food Agric., 2015, 95, 878-896.]. Они обеспечивают высвобождение не только фитат-связанного фосфора, но также белков, макро- и микроэлементов, повышая питательные свойства кормов [British Poultry Science, 2004, 45(1), 101-108.].
В настоящее время фитазы получают путем микробиологического синтеза с использованием рекомбинантных штаммов-продуцентов, потребность промышленности в которых постоянно растет [Afr. J. Biotechnol., 2009, 8(17), 4229-4232.]. Наиболее часто для высокоэффективной продукции гетерологичных белков используют метилотрофные дрожжи Pichia pastoris [J. Mol. Recognit., 2005, 18(2), 119-138. doi: 10.1002/jmr.687], которые обладают мощными системами экспрессии и секреции рекомбинантных белков (в том числе, фитаз) и для которых разработаны питательные среды и отработан процесс ферментации с использованием культуры высокой плотности.
Для конструирования высокопродуктивных штаммов используют различные подходы.
Одним из способов, позволяющих обеспечить эффективную продукцию целевых ферментов, является оптимизация кодонового состава нуклеотидных последовательностей генов, кодирующих гетерологичные ферменты [Appl Microbiol Biotechnol., 2007, 74, 1074-1083, Appl Microbiol Biotechnol., 2006, 72(5), 1039-47.]. Для клеток микроорганизмов многих видов выявлены частоты встречаемости кодонов (http://www.kazusa.or.jp/codon/P.html), и эти данные используют для оптимизации нуклеотидных последовательностей гетерологичных генов с целью увеличения эффективности экспрессии.
Известны примеры использования оптимизированных синтетических нуклеотидных последовательностей для создания продуцентов гетерологичных фитаз на основе дрожжей Pichia pastoris.
Получены оптимизированные по кодоновому составу синтетические гены фитаз, при экспрессировании которых в P. pastoris продуктивность некоторых штаммов возросла в 2,0-2,9 раз Citrobacter amalonaticus [ВМС Biotechnology, 2015, 15, 88.], Escherichia coli [J. Agric. Food Chem., 2013, 61(25), 6007-6015., CN102586294, CN102943083], Peniophora lycii [Appl Microbiol Biotechnol., 2006, 72(5), 1039-47.], Citrobacter braakii [Acta Microbiologica Sinica, 46(6), 945-950.].
Разные варианты оптимизации гена, кодирующего фитазу из Citrobacter freundii, осуществлены в работах [Appl Biochem Biotechnol., 2010, 162, 2157-2165, Journal of Microbiological Methods, 2010, 81(2), 147-152.], где были получены штаммы с продуктивностью 193,2 ед/мл и 450 ед/мл культуральной жидкости.
Интеграция в состав хромосомы P. pastoris оптимизированного гена, кодирующего фитазу из Escherichia coli, привела к получению штамма с продуктивностью 237,2 ед/мл культуральной жидкости, в то время как продукция штамма P. pastoris, несущего в составе хромосомы аналогичный нативный ген, составила 100 ед/мл [J Microbiol. 2015; 8(12):е27553].
Другим способом, позволяющим получить высокопродуктивные штаммы P. pastoris, является введение в состав хромосомы множественных копий генов в составе экспрессионных кассет. Известно получение многокопийных штаммов P. pastoris путем последовательного многократного введения фрагментов ДНК в хромосому клеток с использованием Cre-1ох системы [RU 2652877]. Cre-lox система известна, как сайт-специфическая рекомбинантная технология, которая позволяет многократно вводить фрагменты ДНК в хромосому микроорганизмов, и широко применяется для внесения делеций, вставок, транслокаций и инверсий в специфические сайты клеточной ДНК [Journal of Biotechnology 131 (2007) p. 20-26; Nucleic Acids Research, 2002, V.30, No. 6, p. 2-8].
Еще одним подходом к повышению продукции целевых белков является интеграция в хромосому P. pastoris экспрессионных кассет, содержащих гены, входящие в систему ответа клетки на несвернутый белок (UPR - unfolded protein response) [Экологическая генетика, 2017, 15(2), 21-30]. В качестве таких генов используют, в частности, ген, кодирующий протеиндисульфидизомеразу (Pdi), которая выступает в качестве шаперона, ингибируя агрегацию неправильно свернутых белков; ген НАС1 из S. cervisiae, кодирующий активатор транскрипции генов UPR и другие. Так, в работе [ВМС Biotechnology, 2015, 15:88] в состав хромосомы рекомбинантного штамма Р. pastoris, продуцирующего фитазу из Citrobacter amalonaticus, интегрирован ген НАС1 из S. cervisiae, что привело к увеличению продуктивности на 40% по сравнению с исходным штаммом. Известно также, что продуктивность штаммов возрастает с увеличением количества копий гена НАС1 в составе хромосомы P. pastoris [Bioprocess. Biosyst. Eng., 2017, 40, 341-350.].
Важной задачей является создание высокоэффективного штамма-продуцента фитазы на основе дрожжей P. pastoris с использованием всех описанных выше подходов.
Задачей заявляемого изобретения является расширение арсенала рекомбинантных микроорганизмов, продуцирующих фитазу.
Задача решена путем конструирования штамма дрожжей P. pastoris, продуцирующего фитазу, содержащего в составе хромосомы множественные копии гена НАС1 из S. cervisiae и множественные копии оптимизированной последовательности гена, кодирующего фитазу E.coli.
Рекомбинантный штамм получен:
-
- последовательной интеграцией в состав хромосомы штамма Pichia pastoris (HIS4) ВКПМ Y- 4334 экспрессионной кассеты 1, в состав которой входит оптимизированная последовательность гена phyEc-mod, кодирующего фитазу E.coli;
- выщеплением маркерного гена с использованием Cre-lox системы;
- интеграцией экспрессионной кассеты 2, содержащей ген НАС1 из S. cerevisiae.
Штамм является продуцентом фитазы и депонирован в Биоресурсном центре Всероссийская Коллекция Промышленных Микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика как Pichia pastoris F16H ВКПМ Y-4646.
Культурально-морфологические характеристики заявляемого штамма.
При культивировании при температуре 28°С в течение 48 часов на агаризованной среде YP следующего состава (мас. %): пептон-2, дрожжевой экстракт -1, агар -2, вода - остальное с добавлением глюкозы (2 мас. %), клетки имеют овальную форму, 3-4 мкм в диаметре. Клетки почкуются, при этом почкование истинное, многостороннее. Истинного мицелия не образуют. Споруляция происходит при инкубации культуры на агаризованной среде следующего состава (мас. %): хлорид калия - 1.0, ацетат натрия - 0.5, глюкоза - 1.0, агар - 2.0, вода - остальное. Аски имеют тетраэдрическую форму, включают 4 аскоспоры.
На агаризованной среде YP с добавлением глюкозы (2 мас. %) колонии светло-бежевого цвета с ровным краем, матовой поверхностью, линзовидным профилем и пастообразной консистенцией. При росте в жидкой среде YP следующего состава (мас. %): пептон-2, дрожжевой экстракт -1, вода - остальное с добавлением глюкозы (2 мас. %), при 28°С в течение 24 ч культивирования - жидкость мутная, осадок белый, коагуляции не наблюдается, пристеночных пленок не образует.
Физиолого-биохимические характеристики:
Штамм способен к росту как в аэробных, так и в анаэробных условиях.
В качестве единственного источника углерода способен использовать метанол, этанол, глюкозу, глицерин, лактат, сукцинат, не способен ассимилировать мальтозу, сахарозу, ацетат, крахмал, лактозу.
При культивировании в присутствии метанола штамм способен синтезировать фитазу.
Изобретение проиллюстрировано следующими фигурами:
Фиг. 1 Экспрессионная кассета 1.
Фиг. 2 Экспрессионная кассета 2.
Пример 1. Конструирование штамма дрожжей Pichia pastoris, содержащего оптимизированный ген phyEc-mod, кодирующий фитазу E.coli
При конструировании интегративной экспрессионной кассеты используют метод "фьюжн-ПЦР" [Gene. 1989 Apr 15; 77(1):61-8.].
Последовательность гена phyEc-mod, кодирующего фитазу E.coli, оптимизированную с использованием вышеупомянутых правил оптимизации, синтезируют известным методом [Journal of Microbiological Methods, 2010, 81(2), 147-152.].
Полученную ДНК последовательность встраивают в экспрессионную кассету 1, размером 8830 п.н. (фиг. 1), в состав которой входят следующие генетические элементы:
1. Ген phyEc-mod, встроенный в единую рамку считывания с нуклеотидной последовательностью сигнального пептида α-фактора, под контролем модифицированного АОХ1 промотора [ВМС Biotechnology. - 2015, - V. 15, - Р. 88].
2. Терминатор транскрипции ТТАОХ1.
3. Дрожжевой селективный маркер HIS4, комплементирующий у дрожжей Pichia pastoris мутацию в гене HIS4, Cre-рекомбиназу под контролем промотора АОХ1, фланкированные сайтами lox 66 и lox 71.
4. Область интеграции NS - фрагмент гена, кодирующего 18S rRNA.
-
8
9
Интегративную экспрессионную кассету 1 трансформируют в клетки штамма Pichia pastoris (HIS4) ВКПМ Y-4334, которые предварительно выращивают в жидкой питательной среде YP с добавлением глюкозы (2 мас. %) до концентрации 1×10 клеток на 1 мл. Клетки отделяют центрифугированием, промывают в ледяной стерильной воде, а затем в ледяном растворе 1М сорбитола. Затем клетки инкубируют в 25 мМ растворе дитиотрейтола в течение 15 минут и промывают в ледяном растворе 1М сорбитола. Далее клетки ресуспендируют в ледяном растворе 1 М сорбитола в концентрации 1-5×10 клеток на 1 мл. Аликвоту, объемом 40 мкл клеточной суспензии, переносят в охлажденный эппендорф, добавляют 400 нг ДНК экспрессионной интеграционной кассеты, и инкубируют во льду 5 минут. Смесь клеток и ДНК переносят в предварительно охлажденную кювету для электропорации. Электропорацию проводят при следующих условиях: 1,5 кВ, 400 Ом, 25uF. После порации добавляют 1 мл ледяного раствора 1М сорбитола.
2
4
2
4
4
4
2
2
4
3
4
Селекцию трансформантов ведут в течение 5 суток при температуре 30°С на агаризованной среде М9 следующего состава (мас. %): NaHPO - 0,6; KHPO - 0,3; NaCl - 0,05; NHCl - 0,1; MgSO 7HO - 0,065; агар - 2; глюкоза - 2; CaCl - 0,07; биотин, мг - 0,0002; кальций пантотенат - 0,04; фолиевая кислота - 0,0002; ниацин - 0,04; р-аминобензойная к-та - 0,02; пиридоксин гидрохлорид - 0,04; рибофлавин - 0,02; тиамин гидрохлорид - 0,04; борная кислота - 0,05; CuSO- 0,004; KJ - 0,01; FeCl - 0,02; натрий молибдат - 0,02; ZnSO - 0,04, вода - остальное.
Наличие целевого гена phyEc-mod в составе хромосомной ДНК полученных трансформантов определяют методом ПЦР с использованием проверочных праймеров PhyEc-m-F catggcgtaagagcaccaac, PhyEc-m-R gcaggtattctagcctcgtt.
Наличие ПЦР-фрагмента размером 1172 п.н. подтверждает присутствие синтетического гена в составе хромосомы полученных трансформантов.
Для отбора наиболее продуктивных трансформантов проводят их культивирование в жидкой ферментационной питательной среде по следующей схеме.
Посевную культуру выращивают на косяках с плотной питательной средой YP с добавлением глюкозы (2 мас. %) при 28°С в течение 48 ч. Посев ферментационной среды осуществляют путем смыва (1 мл среды YP) культуры с косяка в колбу (500 мл), содержащую 50 мл среды YP, содержащую 1% глюкозы.
Ферментацию проводят при 28°С на качалке (250 об/мин) в течение 24 ч. Далее экспрессию гена фитазы индуцируют путем добавления 1% метанола каждые 24 часа в течение 3 дней.
Продуктивность трансформантов Pichia pastoris оценивают по активности фитазы, образовавшейся в культуральной жидкости. Для этого клетки трансформанта осаждают центрифугированием, а супернатант используют для определения фитазной активности модифицированным методом Фиске-Субарроу [. J Microbiol Methods, 1999, 39(1), 17-22.].
По результатам ферментации отбирают наиболее продуктивный трансформант Pichia pastoris, и делают высев клеток до единичных колоний на полной среде YP с добавлением глюкозы (2 мас. %). Далее полученные колонии тестируют на выщепление гена HIS4. Для этого каждую колонию пересевают на минимальную среду М9 в двух вариантах без добавления и с добавлением гистидина до конечной концентрации 1 мг/мл. Отбирают колонию, которая растет на среде с добавлением гистидина и не растет на среде без его добавления. Далее в отобранную колонию клеток снова трансформируют экспрессионную кассету 1 как описано выше и повторяют все действия, отбирая наиболее продуктивный трансформант, потерявший способность расти на минимальной среде М9 без добавления гистидина. Процедуру повторяют несколько раз.
В отобранный наиболее продуктивный трансформант трансформируют, как описано выше, экспрессионную кассету 2 размером 5521 п.н., содержащую в своем составе следующие генетические элементы:
1. Ген НАС1, кодирующий НАС1 из S. cervisiae, под контролем GAP промотора.
2. Терминатор транскрипции ТТАОХ1.
3. Дрожжевой селективный маркер HIS4, комплементирующий у дрожжей Pichia pastoris мутацию в гене HIS4.
4. Область интеграции NS - фрагмент гена, кодирующего 18S rRNA.
Многокопийность вставок достигается за счет использования в качестве плеча для интеграции ДНК последовательности NS, позволяющей осуществлять интеграцию кассет в состав хромосомы по локусам гена, кодирующего 18S рРНК, которых в P. pastoris насчитывается около 20 копий [RU 2388823].
Наличие гена НАС1 в составе хромосомной ДНК полученных трансформантов подтверждают методом ПЦР с использованием проверочных праймеров HACprF atggaaatgactgattttgaactaacta, Prov-r tctaaggcgaattaattcgcggc.
Наличие ПЦР-фрагмента размером 743 п.н. подтверждает присутствие гена НАС1 в составе хромосомы полученных трансформантов.
Для отбора наиболее продуктивных трансформантов проводят их культивирование в жидкой ферментационной питательной среде по описанной выше схеме.
По результатам ферментации отбирают наиболее продуктивный трансформант Pichia pastoris, который в указанных условиях синтезирует фитазу E.coli в концентрации 1215 ед/мл культуральной жидкости. Трансформант депонирован в Биоресурсном центре Всероссийская Коллекция Промышленных Микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика как Pichia pastoris F16H ВКПМ Y-4646.