КОМПОЗИЦИЯ, СТИМУЛИРУЮЩАЯ ИММУННЫЙ ОТВЕТ, СОДЕРЖАЩАЯ НАНОЧАСТИЦЫ НА ОСНОВЕ СОПОЛИМЕРА МЕТИЛВИНИЛОВОГО ЭФИРА МАЛЕИНОВОГО АНГИДРИДА
COMPOSITION, STIMULATING IMMUNE RESPONSE, WHICH CONTAINS NANOPARTICLES BASED ON COPOLYMER OF METHYLVINYL ETHER OF MALEIC ANHYDRIDE

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к применению наночастиц на основе сополимера метилвинилового эфира малеинового ангидрида, необязательно содержащих аллерген или антиген и/или иммуностимулирующий агент, в качестве адъюванта в иммунотерапии и вакцинах. Также настоящее изобретение относится к композициям, стимулирующим иммунный ответ, содержащим указанные наночастицы.
Уровень техники, предшествующий изобретению
Как известно, существуют высокоиммуногенные антигены, которые способны индуцировать защитные иммунные ответы у пациента, хотя существуют другие антигены, которые не индуцируют указанный защитный ответ или которые индуцируют очень слабый иммунный ответ. Как правило, иммунный ответ хозяина на слабый иммуногенный антиген может быть стимулирован посредством совместного введения с адъювантом.
Адъюванты
.
Адъювантом является любое вещество, которое усиливает иммунный ответ на антиген, с которым он смешан. Адъюванты, главным образом, действуют посредством трех механизмов: i) формирования антигенного или аллергенного депозита в месте вакцины, из которого биологически активный продукт будет выделяться в течение различного периода времени; ii) доставки антигена или аллергена к антиген-презентующим клеткам; iii) индуцирования секреции интерлейкина.
Некоторыми классическими примерами адъювантов являются соли алюминия (Alhydrogel) и катехоламины (которые усиливают Th2 ответ) и липополисахарид грамотрицательных бактерий и определенные последовательности CpG (которые усиливают Th1 ответ). С другой стороны, многочисленные исследования показывают, что определенные небиологические векторы, такие как микрочастицы (сферические частицы полимерной природы, покрытые веществом) или липосомы (сферические пузырьки с водной центральной полостью, покрытые различными бимолекулярными фосфолипидами и холестериновыми пленками), также могут действовать как адъюванты [Eldridge et al., Infect Immun, 59 (1991) 2978-2986; O`Hagan et al., Vaccine, 18 (2000) 1793-1801; Murillo et al., Vaccine, 30 (2001) 4099-4106].
Другим типом небиологических векторов, который может рассматриваться для использования в качестве адъювантов, являются твердые частицы коллоидных систем с размером менее микрометра, также называемые наночастицами, которые подразделяются на матриксные наносферы и везикулярные нанокапсулы [Orecchioni and Irache, Formes pharmaceutiques pour application locale. Lavoisier Tech and Doc., Paris, (1996) 441-457]. Нанокапсулы являются везикулярными системами, образованными внутренними полостями, которые окружены полимерной мембраной или стенкой. Наносферы являются матриксными формами, образованными пространственной полимерной сеткой. В обоих случаях молекулы биологически активного вещества могут быть растворены, захвачены или связаны с макромолекулярной структурой (в наносферах) или инкапсулированы полимерной мембраной (в нанокапсулах) и даже могут быть адсорбированы на поверхности наночастицы.
Распространение наночастиц в организме, как правило, зависит от его физикохимических характеристик (главным образом, размера и свойств поверхности), определяющих его взаимодействие с биологической средой. Таким образом, наночастицы являются фармакологическими формами, которые вызывают особенный интерес для иммунотерапии или в качестве адъювантов вакцины для введения антигенов и/или аллергенов.
Как правило, наиболее значимые возможности, предоставляемые такими векторами небиологической природы, являются следующими (i) они защищают инкапсулированный материал от химической, ферментативной или иммунологической инактивации при введении и на месте действия; (ii) они улучшают транспорт биологически активной молекулы к труднодоступным местам и ее проникновение в клетку; (iii) они пролонгируют время пребывания лекарственного средства в организме и контролируют его высвобождение; (iv) они повышают специфическую активность посредством избирательности, эффективности и регуляции концентрации инкапсулированных материалов в клетки мишени и/или молекулы мишени; и (v) они повышают стабильность материала, в который они введены в процессе производства, транспортировки и хранения медицинского препарата.
Применение адъювантов в вакцинации
Применение частиц адъювантов в форме эмульсий, микрочастиц ISCOMS или липосом были оценены ранее несколькими исследовательскими группами [см.: Singh et al., Int J Parasitology 33 (2003) 469-478].
Bordetella pertussis
Chlamidia trachomatis
Salmonella Typhimurium
Захват антигена «антиген-презентующими клетками» повышается, если эти антигены связаны с полимерными частицами или находятся внутри них. На протяжении многих лет в качестве контролируемых антиген производящих систем на людях и животных использовались биодеградируемые и биосовместимые полиэфиры [Okad et al., J Pharm Sci, 12 (1995) 1-99; Putney et al., Nat Biotechnol, 16 (1998) 153-157]. В отличие от аллюминевых адъювантов микрочастицы эффективны для индуцирования клеточных и цитотоксичных иммунных ответов у мышей [Nixon et al., Vaccine 14 (1996) 1523-1530; Maloy et al., Immunology 81 (1994)661-667; Moore et al., Vaccine 13 (1995) 1741-1749]. Пероральная иммунизация микрочастицами у мышей индуцирует сильные иммунные ответы на слизистой и на системном уровне по сравнению с инкапсулированными антигенами [Chalacombe et al., Immunology 176 (1992) 164-168; Eldrige et al., J Control Rel 11 (1990) 205-214; O`Hagan et al., Novel Delivery Systems for Oral Vaccines (1990) 175-205]. Эта способность является результатом интернализации антигена посредством специализированных клеток лимфоидной ткани слизистых оболочек [O`Hagan, J Anat, 189 (1996) 477-482]. Было показано, что мукозальная иммунизация различными корпускулярными системами эффективна против различных патогенов, таких как  [Chaill et al., Vaccine 13 (1995) 455-462; Jones et al., Vaccine 15 (1997) 814-817; Shahin et al., Infect Immun, 63 919950 1195-1200; Conway et al., Vaccine 19 (2001) 1940-1950],  [Whittum-Hudson et al., Nat Med 2 (1996) 1116-1121],  [Allaoui-Attarki et al., Infect Immun 65 (1997) 853-857] и Brucella [Murillo et al., Vaccine, 19 (2001) 4099-4106].
Применение адъювантов в иммунотерапии
,
Аллергические заболевания являются патологическим проявлением вызванным негативным иммунным ответом (реакция гиперчувствительности) на, по сути, безвредные макромолекулы, называемые аллергенами. Такая реакция гиперчувствительности проявляется приблизительно у 30% мировой популяции, главным образом в индустриально развитых странах. Реакция гиперчувствительности является причиной таких заболеваний, как аллергические риниты, бронхиальная астма, пищевые аллергии и аллергии на лекарственные средства и насекомых [Settipane et al., Allergy Proc, 15 (1994) 21-25].
В Испании этот тип заболеваний характерен для возрастной группы от 4 до 17 лет и составляет 13,3%; среди них у 6,4% возникает бронхиальная астма, показатель смертности от астмы в Испании составляет 1,5/100000 жителей.
2a
2b
3
1
Согласно механистической теории аллергические заболевания возникают в результате нарушения баланса между двумя основными типами ответов, которые могут возникнуть после активации хелперных Т-клеток: Th1 и Th2. Цитокины, находящиеся во внешней среде клетки, действуют определенным образом, направляя дифференциацию незрелых Т-клеток (Th0) таким образом, что присутствие интерлейкина 12 (IL-12), гамма-интерферона (INF-γ), инрелейкина 18 (IL-18) и альфа-интерферона (INF-α) индуцирует дифференциацию в Th1, которые в основном характеризуются продукцией большого количества INF-γ и в меньшей степени интерлейкина 2 (IL-2) и бета-интерферона (INF-β). Последующая стимуляция В-клеток в этом типе ответа ведет к повышению продукции IgG, IgG, IgG. С другой стороны, если Th0 клетка находится в окружающей среде, в которой преобладают интерлейкин 4 (IL-4) и простагландин Е2 (PGE2), то будет происходить дифференциация в Th2, для которой характерен синтез большого количества IL-4, интерлейкина 5 (IL-5) и интерлейкина 13 (IL-13), и синтез IgG и IgЕ, а биотип напрямую вовлечен в триггерный процесс [Hannah et al., Ann Rev Immunol, 21 (2003) 579-628].
Важность преобладания Th2 аллергенспецифического типа ответа при аллергических заболеваниях была подтверждена большим числом исследований [Romagnani, Ann Rev Immunol, 12 (1994) 227; Bousquet et al., Allergy, 53 (1998) 1-42; Majori et al., Clin Exp Allergy, 30 (2000) 341-347]. Клетки с фенотипом Th2 являются клетками, способными только непосредственно распознать аллергенные пептиды, и принимают участие в продукции IgЕ В-клетками, активации и продукции мастоцитов, активации и созревании эозинофилов, что было показано как на животных моделях, так и у людей [Cohn et al., Pharmacology and Therapeutics, 88 (2000) 187-196].
Таким образом, функциональное преобладание клеток Th2 над клетками Th1 ведет к аллергическому ответу, тогда как функциональное преобладание клеток Th1 над клетками Th2 может ингибировать аллергический ответ [Martin et al., Alergol Immunol Clin, 17 (2002) 104-110].
4
in vivo
На основании других исследований было сделано утверждение, что ингибирование Th2 ответа с преобладанием Th1 может привести к развитию аутоиммуных заболеваний, поэтому было бы правильно усиливать иммунную регуляцию баланса Th1/Th2 посредством увеличения популяций регуляторных Т-клеток (Tr) и IL-10, и фактора роста β Т-клеток (TGF-β). Это могло бы привести к синтезу IgG и антител IgА (медиаторы невоспалительного ответа) и к подавлению продукции IgЕ В-клетками [Akids et al., Immunology, 103 (2001) 131-136; Akids et al., J Clin Invest, 102 (1998) 98-106; Blaser et al., Int Arch Allergy Immunol, 117 (1998) 1-10]. Недавние исследования подтвердили важность IL-10 в инактивации Th2-клеток (Gruning et al., J Exp Med, 185 (1997) 1089-1099; Adachi et al., Int Arch Allergy Immunol, 118 (1999) 391-394] и также было обнаружено, что введение IL-10  оказывает благотворное влияние при аллергиях у животных [Zuany-Amorim et al., J Clin Invest, 95 (2003) 2644-2651; Stampfli et al., Am J Respir Cell Mol Biol, 21 (1999) 586-596; Hall et al., Vaccine, 21 (2003) 549-561]. На этом основании было сделано предположение, что IL-10 играет важную регуляторную роль в гиперактивной характеристике Th2-клеток у пациентов с аллергией.
IL-10 может играть важную физиопатологическую роль в противодействии воспалительным заболеваниям (болезнь Крона, ревматоидные артриты, псориаз и т.д.), некоторым вирусным инфекциям (гепатит С, инфекции, вызванные вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ) и т.д.) и даже в подавлении побочных эффектов при трансплантации органов. Таким образом, непосредственное применение IL-10 или, кроме того, применение адъювантов, стимулирующих продукцию IL-10, может оказать огромное воздействие на лечение этих заболеваний [Аsadullah et al., Pharmacol Rev, 55, (2003) 241-269]. В настоящий момент ведутся исследования возможности такого лечения аутоиммунных заболеваний, таких как ревматоидные артриты [Feldman et al., Annu Rev Immunol (1996) 397-440; Katsikis et al., J Exp Med (1994) 1517-1527; Chomarat et al., J Immunol (1995) 1432-1439]. Противовоспалительная и регуляторная роль цитокина, таким образом, является существенной и в случае Th1 (аутоиммунные заболевания) и в случае Th2 (аллергия) гиперактивных ответов.
Существует, главным образом, три подхода в лечении аллергических заболеваний (i) избегание любых контактов с аллергеном; (ii) использование антигистаминных препаратов; и (iii) лечение посредством иммунотерапии. Принимая во внимание, что первые два способа могут в некоторых случаях быть неподходящими, иммунотерапия могла бы стать наиболее подходящим способом контроля.
Специфическая иммунотерапия аллергенами представляет собой повторное введение аллергенов пациентам с IgЕ-опосредованными нарушениями в целях обеспечения защиты против аллергических симптомов и воспалительных реакций, связанных с природным воздействием этих аллергенов [Jutel, M., J Immunol, 154 (1995) 4178-4194].
Brucella
Salmonella
Это альтернативное лечение направлено на усиление функционального преобладания Th1 ответа по сравнению с Th2 ответом, что будет ингибировать аллергические симптомы. Модуляция Th1 также может использоваться в других процессах, таких как контроль посредством вакцинации против бактериальных внутриклеточных паразитов (таких как и ).
Несмотря на то, что было описано применение различных небиологических векторов, например наночастиц, таких как адъюванты, в иммунотерапии или вакцинах для введения антигенов и/или аллергенов, до сих пор существует потребность в создании альтернативных адъювантов взамен существующих с целью увеличения арсенала возможностей для производства вакцин и композиций для иммунотерапии. Преимущественно указанные адъюванты должны быть эффективными для иммунизации или иммунотерапии при пероральном введении без необходимости применения очень высоких доз аллергенов и антигенов. Как известно, несмотря на возможные преимущества пероральной иммунизации в терапевтических или профилактических целях должны быть решены некоторые сложности, связанные с тем, что требуемая для благотворного клинического эффекта доза иммуногенных или аллергенных активных ингредиентов является чрезмерно высокой по причине потери иммуногенной активности. Таким образом, как правило, из-за низкой стабильности аллергена или антигена в желудочно-кишечном тракте (pH и присутствие гидролитических ферментов) дозы должны быть всегда более высокими (вплоть до 200 кратного повышения), чем при подкожном введении [Taudorf et al., J Allergy Clin Immunol (1987) 153-161; Creticos et al., J Allergy Clin Immunol (1990) 165]. Кроме того, слизистая желудочно-кишечного тракта является труднопреодолимым барьером для абсорбции этих макромолекул.
Неожиданно было обнаружено, что наночастицы на основе сополимера метилвинилового эфира малеинового ангидрида, необязательно содержащие аллерген или антиген и/или иммуностимулирующий агент, способны стимулировать или усиливать иммунный ответ при введении пациенту, что позволяет использовать их в иммунотерапии и вакцинах. Указанные наночастицы являются стабильными при пероральном приеме, обладают удовлетворительными биоадгезивными характеристиками и, таким образом, могут использоваться при иммунизации или иммунотерапии с применением различных способов введения, включая пероральный прием, без необходимости применения таких высоких доз аллергена или антигена, как те, которые были указаны в разделе, касающемся предшествующего уровня техники. Кроме того, указанные наночастицы являются низкотоксичными, биодеградируемыми и простыми для получения.
Наночастицы сополимера метилвинилового эфира малеинового ангидрида
В патентной заявке WO 02/069938, принадлежащей тому же заявителю, описываются наночастицы сополимера метилвинилового эфира малеинового ангидрида (PVM/MA), способ их получения и применение в качестве носителя лекарственных средств. Указанный сополимер PVM/MA структурно состоит из двух дифференцированных функциональных групп, имеющих различные характеристики растворимости: гидрофобная эфирная группа и ангидридная группа. Карбоксильная группа является солюбилизирующим агентом, так как способна растворять полимер, если он ионизирован, а эфирная группа является гидрофобной, то есть препятствует проникновению воды в полимер [Heller et al., J Appl Polym Sci, 22 (1978) 1991-2009]. Синтетические сополимеры PVM/MA имеют очень различное применение. Gantrez AN широко применяется в качестве загустителя и флоккулирующего агента, дентального адгезива, наполнителя таблеток для перорального приема, наполнителя для трансдермальных пластырей и т.п. С другой стороны, было описано применение этих сополимеров для контролируемого высвобождения лекарственных средств [Heller et al.,J Appl Polym Sci, 22 (1978) 1991-2009] и в матриксных формах, для локального высвобождения лекарственного средства при офтальмологическом применении [Finne et al., J Pharm Sci, 80 (1991) 670-673; Finne et al., Int J Pharm, 78 (1992) 237-241].
Наночастицы на основе PVM/MA имеют биоадгезивные характеристики [Arbуs et al., Int J Pharm, (2002)129-136] и, таким образом, при пероральном приеме они могут взаимодействовать с пейеровыми бляшками, которые содержат 20% всех лимфоцитов организма и запускают усиленный иммунный ответ на те антигены и/или аллергены, которые были введены с водным раствором.
Наночастицы на основе PVM/MA являются коллоидными системами, которые способны удерживать биологически активные вещества посредством: (i) растворения или захвата макромолекулярных структур или матрикса, (ii) ковалентного связывания лекарственного средства с ангидридными группами сополимера и (iii) абсорбционных процессов, опосредованных слабыми связями. Чрезмерная реактивность сополимера PVM/MA из-за циклических ангидридных групп также способствует захвату молекул, лекарственных средств или других субстанций. В патентной заявке WO 02/069938 описывается применение наночастиц сополимера PVM/MA в качестве носителей лекарственных средств, в частности 5-фториодина, ганцикловира и антисмыслового олигонуклеотида ISIS 2922.
Краткое описание изобретения
Объектом настоящего изобретения является композиция, стимулирующая иммунный ответ у пациента, используемая в качестве адъюванта в иммунотерапии и вакцинах, стабильная при пероральном введении, обладающая удовлетворительными биоадгезивными характеристиками в отношении взаимодействия со слизистыми оболочками, способная необязательно нести аллерген или антиген и/или иммуностимулирующий агент и высвобождать указанный агент контролируемым способом и, таким образом, используемая при иммунизации или иммунотерапии путем введения различными способами лекарственного средства, включая пероральное.
in vivo
Неожиданно было обнаружено, что наночастицы на основе сополимера метилвинилового эфира малеинового ангидрида, необязательно содержащие аллерген или антиген и/или иммуностимулирующий агент, способны стимулировать или усиливать иммунный ответ при их введении пациенту, что делает возможным их применение в иммунотерапии и вакцинах. В частности, было обнаружено, что указанные наночастицы просты в получении, обладают удовлетворительными биоадгезивными характеристиками, являются низкотоксичными и биодеградируемыми (например, они растворяются или разлагаются в течение периода времени, приемлемого для желаемой формы применения, в случае терапии , если они доступны в физиологическом растворе с уровнем рН 6-9 и температурой в промежутке от 25 до 40°С).
Кроме того, одним из аспектов настоящего изобретения является композиция, стимулирующая иммунный ответ, содержащая наночастицы на основе сополимера метилвинилового эфира малеинового ангидрида. Указанные наночастицы могут дополнительно содержать аллерген или антиген и/или иммуностимулирующий агент, который может содержаться внутри указанных наночастиц и/или, по крайней мере, частично покрывать поверхность указанных наночастиц. Если необходимо, указанные метаболические пути также могут содержать перекрестно-связывающий агент. Указанная композиция, необязательно, может быть в лиофилизированной форме.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к вакцине или иммунотерапевтической композиции, содержащей указанную композицию, стимулирующую иммунный ответ. В одном из конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения указанная иммунотерапевтическая вакцина или композиция является составом, подходящим для перорального приема, тогда как в другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанная иммунотерапевтическая вакцина или композиция является составом, подходящим для парентерального введения.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению указанной композиции, стимулирующей иммунный ответ, при производстве вакцины или иммунотерапевтической композиции.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению указанной композиции, стимулирующей иммунный ответ, при производстве фармакологической композиции для селективной стимуляции иммунного Th1 ответа, или при производстве фармакологической композиции для селективной стимуляции иммунного Th2 ответа, или при производстве фармакологической композиции для сбалансированной стимуляции иммунных Th1 и Th2 ответов.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения композиции, стимулирующей иммунный ответ, содержащей указанные наночастицы на основе PVM/MA и аллерген или антиген и/или иммуностимулирующий агент, в котором предусмотрено добавление указанного аллергена или антигена и/или иммуностимулирующего агента в органический раствор, содержащий указанный сополимер PVM/MA перед десольватацией в водно-спиртовом растворе, или, в качестве альтернативы, инкубация указанного аллергена или указанного антигена и/или с иммуностимулирующим агентом с указанными наночастицами PVM/MA. В указанном способе, кроме того, может быть дополнительно предусмотрены элиминация органического растворителя и/или этапы очистки, а также этапы стабилизации наночастиц, полученных с помощью перекрестно-связывающих агентов. Указанный способ может необязательно предусматривать дополнительный этап лиофилизации.
Краткое описание чертежей
На фигуре 1 представлен график, показывающий зависимость высвобождения овальбумина (%) из составов NP-I, NP-II, NP-III, NP-IV во времени (дни).
1
2a
На фигуре 2 представлен график, показывающий зависимость уровней специфических антител против овальбумина (IgG, IgG) после трансдермальной иммунизации мышей Balb/c раствором овальбумина (OVA) в свободной форме, овальбумином, адсорбированным в альгидрогеле (OVA-Alum), и пустыми наночастицами (NP), NP-I, NP-II, NP-III, NP-IV во времени.
1
2a
На фигуре 3 представлен график, показывающий зависимость уровней специфических антител против овальбумина (IgG, IgG) после пероральной иммунизации мышей Balb/c раствором овальбумина (OVA) в свободной форме и пустыми наночастицами (NP), NP-I, NP-II, NP-III, NP-IV во времени.
1
2a
На фигуре 4 представлен график, показывающий зависимость уровней специфических антител против овальбумина (IgG, IgG) после пероральной иммунизации мышей Balb/c различными дозами инкапсулированного овальбумина (NP-III25 и NP-III50) и пустыми наночастицами (NP) во времени.
1
На фигуре 5 представлен график, показывающий зависимость уровней специфических антител против овальбумина (IgG) после трансдермальной иммунизации мышей Balb/c раствором овальбумина, свободного от (OVA), овальбумином, абсорбированном на альгидрогеле (OVA-Alum), и пустыми наночастицами (NP), NP-I, NP-II, NP-III, NP-V, NP-VI и NP-VII во времени.
2a
На фигуре 6 представлен график, показывающий зависимость уровней специфических антител против овальбумина (IgG) после трансдермальной иммунизации мышей Balb/c раствором овальбумина, свободного от (OVA), овальбумином, абсорбированном на альгидрогеле (OVA-Alum), и пустыми наночастицами (NP), NP-I, NP-II, NP-III, NP-V, NP-VI и NP-VII во времени.
На фигуре 7 представлен график, показывающий зависимость концентрации сыворотки IL-10 после трансдермальной иммунизации мышей Balb/c раствором овальбумина, свободного от (OVA), овальбумина, абсорбированного на альгидрогеле (OVA-Alum), и пустыми наночастицами (NP), NP-I, NP-II, NP-III, NP-V, NP-VI и NP-VII во времени.
1
2a
На фигуре 8 представлен график, показывающий зависимость уровней специфических антител против овальбумина (IgG, IgG) после трансдермальной иммунизации мышей Balb/c раствором овальбумина, овальбумином, абсорбированном на альгидрогеле (OVA-Alum) OVASAL и раствором овальбумина (OVA) во времени.
На фигуре 9 представлен результат разделения экстракта НЕ электрофорезом на полиакриламидном геле с натрий додецил сульфатом (SDS-PAGE) и окрашивания Coomassie на белок (10 мкг на лунку).
На фигуре 10 представлен результат иммуноблоттинга экстракта НЕ перед (А) и после (В) инкапсуляции с использованием смеси сывороток инфицированных кур.
2
S. enteritidis
На фигуре 11 представлен график, показывающий результаты эксперимента по интраперитониальной защите у мышей Balb/c с летальной дозой 10 колониеобразующих единиц (КОЕ)  3934.
На фигуре 12 представлена столбиковая диаграмма высвобождения IFN-γ (A) и IL-4 (B) клетками селезенки мышей Balb/c, рестимулированных экстрактом НЕ.
1
2a.
На фигуре 13 представлена столбиковая диаграмма, показывающая результат непрямого ELISA на сыворотках мышей Balb/c в сравнении с экстрактом НЕ с использованием антител IgG и IgG
Подробное описание изобретения
Неожиданно было обнаружено, что наночастицы на основе сополимера метилвинилового эфира малеинового ангидрида, необязательно содержащие аллерген или антиген и/или иммуностимулирующий агент, способны стимулировать или усиливать иммунный ответ при их введении пациенту, что позволяет использовать их в иммунотерапии и вакцинах.
Термин «пациент», используемый в настоящем описании, включает в себя любое животное, обладающее иммунной системой, предпочтительно, млекопитающее, более предпочтительно, человек.
Одним из аспектов настоящего изобретения является композиция, стимулирующая иммунный ответ, обозначенная в настоящем описании как композиция по изобретению, содержащая наночастицы на основе сополимера метилвинилового эфира малеинового ангидрида. Указанные наночастицы могут дополнительно содержать аллерген или антиген и/или иммуностимулирующий агент, который может содержаться внутри указанных наночастиц и/или, по крайней мере, частично покрывать поверхность указанных наночастиц. Если желательно, указанные наночастицы также могут содержать перекрестно-связывающий агент.
Под использующимся в настоящем описании термином «наночастицы» понимают коллоидные системы твердых частиц размером менее чем 1,0 микрометр, предпочтительно, в пределах от 10 до 900 нанометров (нм), и к ним относятся матриксные наносферы и везикулярные нанокапсулы. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения средний размер указанных наночастиц составляет менее чем 400 нм.
Наночастицы, присутствующие в композиции по настоящему изобретению, включают сополимер метилвинилового эфира малеинового ангидрида или PVM/MA. Указанный сополимер PVM/MA является известным продуктом, который может быть получен подходящими способами, например посредством полимеризации ацетилена с малеиновым ангидридом, или может быть закуплен на рынке. В этом смысле, компания International Specialty Products (ISP) производит сополимеры PVM/MA, имеющие различную молекулярную массу, представленные под торговой маркой Gantrez AN. Как правило, для осуществления настоящего изобретения на практике молекулярная масса указанного сополимера PVM/MA может изменяться в очень широком диапазоне от 100 до 2400 кДа, более предпочтительно, от 200 до 2000 кДа. В одном из вариантов настоящего изобретения предпочтительной молекулярной массой сополимера PVM/MA является молекулярная масса от 180 до 250 кДа.
50
Применение указанного сополимера PVM/MA имеет особые преимущества, позволяя широко использовать его в фармацевтике вследствие его низкой токсичности (LD=8-9 г/кг перорально) и его превосходной биосовместимости. Кроме того, он прост в получении и может реагировать с другими гидрофильными веществами, благодаря своим функциональным группам, без использования обычно используемых органических реагентов (производные глютаральдегида и карбодиимида), обладающих значительной токсичностью [Arbуs et al., J. Controlled Rel., 83 (2002) 321-330]. Сополимер PVM/MA нерастворим в водной среде, но присутствующая в нем ангидридная группа гидролизуется, образуя карбоксильные группы. Раствор является слабым и зависит от условий, в которых он получен. Благодаря доступности функциональных групп в PVM/MA при инкубировании в водной среде происходит ковалентное связывание молекул с нуклеофильными группами, такими как гидроксильные или аминогруппы. Указанные наночастицы PVM/MA также обладают биоадгезивными свойствами [Arbуs et al., Int J Pharm, (2002) 129-136], таким образом, при пероральном введении они взаимодействуют с пейеровыми бляшками, которые содержат 20% всех лимфоцитов организма и запускают усиленный иммунный ответ на те антигены и/или аллергены, которые были введены вместе с водным раствором.
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения композиция по настоящему изобретению включает наночастицы на основе PVM/MA, не содержащие антиген или аллерген и иммуностимулирующий агент. Указанные наночастицы в настоящем описании называются «пустыми» наночастицами и могут быть легко получены способом, например, описанным в патентной заявке WO/069938, полное содержание которой приведено в данном описании в качестве ссылки. В качестве иллюстрации указанные пустые наночастицы легко получают десольватацией водно-спиртовой фазой раствора сополимера PVM/MA в ацетоне. Образовавшиеся наночастицы могут быть приведены в состояние стабильной водной суспензии или лиофилизированы. Необязательно может быть введен перекрестно-связывающий агент. Может быть использован фактически любой перекрестно-связывающий агент, содержащий одну или более функциональную группу, которая может взаимодействовать с ангидридными группами сополимера PVM/MA, преимущественно, полиамин или углевод, например аминокислота, белок, -оз или -озид и т.п., например, лизин, аргинин, гистидин, водорастворимые белки, поли-L-лизин, поли-L-аргинин, и т.п., предпочтительно, 1,3-диаминопропан.
Указанные пустые наночастицы могут выступать в роли адъюванта при вакцинации или в иммунотерапии, при совместном введении с вакцинами или композициями для иммунотерапии (иммунотерапевтическими композициями), содержащими антиген или аллерген соответственно, вызывая эффект стимуляции иммунного ответа после введения вакцины или иммунотерапевтической композиции и пустых наночастиц. На фигуре 12 показано, что введение пустых наночастиц индуцирует секрецию значительного количества IFN-γ. Совместное введение вакцины или иммунотерапевтической композиции и наночастиц может быть одновременным или последовательным в разное время в любом порядке, например первой может быть введена вакцина или иммунотерапевтическая композиция и затем наночастицы, или наоборот. В качестве альтернативы указанная вакцина или иммунотерапевтическая композиция и указанные наночастицы могут быть введены одновременно. Вакцина или иммунотерапевтическая композиция и наночастицы также могут быть введены в одной и той же композиции или различных композициях. Доза вводимых пустых наночастиц может изменяться в широких пределах, например, приблизительно от 0,01 до приблизительно 10 мг/кг массы тела, предпочтительно, от 0,1 до 2 мг/кг массы тела.
В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения композиция по настоящему изобретению включает наночастицы на основе PVM/MA, заполненные аллергеном или антигеном и/или иммуностимулирующим агентом.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения композиция по настоящему изобретению включает наночастицы на основе PVM/MA, заполненные аллергеном или антигеном, где указанные наночастицы на основе PVM/MA включают аллерген или антиген.
Lolium perenne, Poa pretense, Cynodon dactylon, Festuca pratensis, Dactylis glomerata, Secale cereale, Hordeum vulgare, Avena sativa, Triticum sativa
Artemisia vulgaris, Chenopodium album, Plantago lanceolata, Traxacum vulgare, Parietaria judaica, Salsola kali, Urtica dioica
Olea europea, Plantus sp., Cupressus sp
Dermatophagoides pteronyssinus, Dermatophagoides farinae, Acarus siro, Blomia tropicalis, Euroglyphus maynei, Glyciphagus domesticus, Lepidoglyphus destructor, Tyrophagus putrescentiae
Alternaria alternata, Cladosporium herbarum
Penicillium notatum
Использованный в настоящем описании термин «аллерген» относится к веществу, к которому пациент чувствителен и которое является причиной иммунной реакции, например аллерген цветочной пыльцы, аллерген насекомых, пищевые аллергены или аллергены пищевых продуктов, компоненты, присутствующие в слюне, клещи и жалящие насекомые, вызывающие гиперреакцию у пациента, компоненты, присутствующие в растениях, индуцирующие реакцию чувствительности у пациента, и т.д. Следовательно, например, также может быть использован белок пыльцы растений, такой как, пыльца растений () пыльца из других растений (таких как, ), или пыльца деревьев (таких как, .) и т.д. Также может быть использован белок насекомых, таких как пылевой клещ (такие, как, ) и т.д. Другой аллерген может быть получен из грибков и эпителия животного (, эпителий собак, эпителий кошек, эпителий лошади, смесь пера и пуха разных видов водоплавающих птиц,  и т.д.), а также компонентов пищевых продуктов и т.д. Фактически в композиции по настоящему изобретению может быть использован любой аллерген для заполнения наночастиц; однако в конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанный аллерген представляет собой овальбумин (OVA) - белок, который широко используется в качестве экспериментальной модели аллергии.
Salmonella enteritidis
Использованный в настоящем описании термин «антиген» относится к природному или рекомбинантному иммуногенному продукту, полученному из высшего организма или из микроорганизма, например бактерии, вируса, паразита, протозоа, грибка и т.д., содержащему один или более эпитопов, например структурные компоненты указанного организма; токсины, например экзотоксины и т.д. Фактически в композиции по настоящему изобретению может быть использован любой антиген для заполнения наночастиц; однако в конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанный антиген является экстрактом НЕ .
Salmonella enteritidis
Salmonella
Salmonella enteritidis
Salmonella enteritidis
Salmonella
Salmonella enteritidis
Salmonella enteritidis
Как известно,  в пищевых продуктах является обычным агентом желудочно-кишечного тракта человека, наиболее часто выявляемым при пищевых отравлениях (60% случаев, при которых был выделен этот агент). Птица и субпродукты из птицы признаны главным источником  и самым главным источником инфекций человека, вызываемых . Инфекция является зоонозом, передаваемым посредством переваривания зараженных пищевых продуктов или воды, и в настоящее время является пандемией. Для контроля сальмонеллеза Всемирная Организация Здравоохранения (ВОЗ) и Европейский Союз опубликовали рекомендации по мониторингу и уничтожению инфекции  у птиц из-за очевидной эффективности для человеческой популяции. Для контроля  у птиц используют антибиотики, конкурентное исключение, генетический отбор птиц и вакцин, также улучшение гигиенических условий на фермах по разведению птиц. Из этих мер наиболее распространенной и самой практичной следует считать вакцинацию как самый простой и недорогой в использовании метод. Несмотря на широкое применение ослабленных живых вакцин и (убитых бактериальных) вакцин обе они являются достаточно неэффективными на птицеводческих фермах (куриных и других видов птиц) [Zhang-Barder et al., Vaccine, 17 (1999) 2538-2545]. Помимо своей низкой эффективности, большим недостатком живых вакцин является их вирулентный потенциал у животных с подавленным иммунитетом, а также их способность изменять инвазивный статус. Кроме того, вакцины должны быть введены парентерально и они взаимодействуют с обычными серологическими диагностическими тестами. Инактивированные (убитые) бактерии не обладают остаточной вирулентности, но они не индуцируют клеточный иммунный ответ. Требуется введение сильного адъюванта и существует необходимость многократного ревакцинирования. Альтернативой могло бы стать применение субклеточных вакцин, которые способны стимулировать соответствующий иммунный ответ против инфекции, вызванной . Несмотря на высокую степень защиты, описанную для этих вакцин на стадии эксперимента, как и в случае убитым бактериальным вакцинам, для них требуются многократные бустер-дозы для получения приемлемой степени защиты [Powell, Pharm Res, 13 (1996) 1777-1785]. С другой стороны, при пероральном введении происходит денатурация и расщепление в желудочно-кишечном тракте [Langer et al., Adv Drug Deliv. Rev, 28 (1997) 97-119], и таким образом, этот тип вакцин должен вводиться парентерально, что связанно с определенными материально-техническим и экономическими затруднениями. Антигены  могут быть инкапсулированы в наночастицы PVM/MA, описанные в настоящем описании выше, с целью решения этих трудностей.
Аллерген или антиген, присутствующий в этом варианте композиции по настоящему изобретению, может по крайней мере частично покрывать поверхность указанных наночастиц и/или заполнять указанные наночастицы. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанный аллерген или антиген покрывает всю или часть поверхности указанных наночастиц. Этот вариант осуществления изобретения используется для селективной стимуляции Th2 ответа у пациента. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанный аллерген или антиген инкапсулирован в указанные PVM/MA наночастицы. Этот вариант осуществления изобретения используется для стимуляции сбалансированного Th1 и Th2 ответа или для преобладания Th1 ответа.
PVM/MA наночастицы, заполненные аллергеном или антигеном, легко могут быть получены способом, аналогичным описанному в патентной заявке WO02/069938. В качестве иллюстрации указанные наночастицы, заполненные аллергеном или антигеном, легко могут быть получены десольватацией жидкой фазой, например водно-спиртовой фазой, такой как жидкая фаза, образованная этанолом и водой, раствора сополимера PVM/MA в органическом растворителе, таком как полярный органический растворитель, например ацетон. Образовавшиеся наночастицы могут быть приведены в состояние водной суспензии или они могут быть лиофилизированы. В зависимости от момента, в который был добавлен аллерген или антиген, будут получены различные составы с различными соотношениями аллергена или антигена (см. составы, такие как, NP I, NP II, NP III, NP IV, и NP НЕ 3934, описание в примерах 1 и 6). В качестве иллюстрации, при необходимости покрытия аллергеном или антигеном всей или части поверхности наночастицы указанный аллерген или указанный антиген инкубируют после упаривания органических растворителей. Подобным образом, при необходимости инкапсулирования аллергена или антигена внутрь наночастиц указанный аллерген или указанный антиген инкубируют, аллерген или антиген при этом диспергирован в растворителе, предпочтительно, в растворителе, в котором находится раствор сополимера PVM/MA или способный смешиваться с указанным растворителем, такой как, предпочтительно, полярный органический растворитель или растворитель, способный смешиваться с растворителем полимерного раствора, например ацетон. Перед введением указанной жидкой фазы проводят десольватацию раствора сополимера PVM/MA. Если необходимо, необязательно может быть введен перекрестно-связывающий агент, который упомянут выше в контексте пустых наночастиц.
Конкретно, в другом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения композиции по настоящему изобретению, содержащей наночастицы сополимера PVM/MA, заполненные аллергеном или антигеном, где указанные наночастицы сополимера PVM/MA включают аллерген или антиген, указанный способ включает стадии:
а) десольватации органического раствора сополимера PVM/MA, растворенного в органическом растворителе с водно-спиртовым раствором;
b) удаления органических растворителей с получением наночастиц; и
с) введения указанного аллергена или указанного антигена в указанный органический раствор сополимера PVM/MA перед десальватацией указанного органического раствора сополимера PVM/MA или, в качестве альтернативы, инкубации указанного аллергена или указанного антигена с указанными наночастицами, полученными на стадии b).
Органическим растворителем, в котором растворен сополимер PVM/MA, может быть любой растворитель, в котором растворим указанный сополимер, обычно полярный растворитель, такой как кетон, например ацетон. Жидкой фазой, используемой для проведения указанной десольватации, может быть любой водно-спиртовой раствор, содержащий спирт и воду, например этанол и воду, например спирт и вода фармацевтической категории (согласно заявке очищенная вода или вода для инъекции). Преимущественно соотношение раствора сополимера: водно-спиртового раствора составляет от 1:1 до 1:10, предпочтительно, 1:4. Затем органические растворители удаляют любым подходящим способом, например посредством упаривания при пониженном давлении, и в среде немедленно образуются наночастицы с получением стабильной водной мутной суспензии.
Введение аллергена или антигена в органический раствор сополимера PVM/MA перед десольватацией указанного органического раствора сополимера PVM/MA позволяет получить наночастицы, внутри которых содержится аллерген или антиген. Преимущественно, указанный аллерген или антиген введен, растворен или диспергирован в том же самом органическом растворителе, что и органический раствор сополимера PVM/MA, или в том, который способен смешиваться с указанным растворителем, таким как полярный органический растворитель, например ацетон. В качестве альтернативы инкубирование указанного аллергена или указанного антигена с наночастицами, полученными на стадии b), позволяет получить наночастицы, у которых аллерген или антиген покрывает всю или часть внешней поверхности наночастиц. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения инкубирование аллергена или антигена с наночастицами проводят в водной среде.
Если необходимо, необязательно может быть введен перекрестно-связывающий агент для улучшения стабильности наночастиц, как описано выше, в контексте пустых наночастиц.
Полученные наночастицы, заполненные аллергеном или антигеном, могут быть очищены подходящим способом, например центрифугированием, ультрацентрифугированием, тангенциальной фильтрацией или упариванием, включая использование вакуума.
И, наконец, если необходимо, наночастицы, заполненные аллергеном или антигеном, могут быть лиофилизированы с целью продолжительного хранения и консервации. Могут быть использованы стандартные криопротекторы, предпочтительно, в концентрации, составляющей от 0,1 до 10% от общей массы композиции для облегчения процесса лиофилизации.
Наночастицы, заполненные аллергеном или антигеном, могут действовать как адъювант при вакцинации или иммунотерапии и стимулировать иммунный ответ после их введения пациенту, как показано в примерах 3-6.
Дозы для введения наночастиц, заполненных аллергеном или антигеном, изменяются в широком диапазоне, например, приблизительно от 0,01 до 10 мг/кг массы тела, предпочтительно, от 0,1 до 2 мг/кг массы тела.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения композиция по настоящему изобретению содержит наночастицы на основе PVM/MA, заполненные иммуностимулирующим агентом, где указанные наночастицы на основе PVM/MA содержат иммуностимулирующий агент.
Brucella ovis
Используемый в настоящем описании термин «иммуностимулирующий агент» или «иммуномодулятор» относится к продукту, который способен усиливать специфический или неспецифический иммунный ответ, например, к белкам или пептидам, действующим как природные адъюванты, стимулирующие ответ иммунной системы на аллерген или антиген, бактериальные липополисахариды, компоненты клеточных стенок грамположительных бактерий (мурамил дипептид (MDP)), CpG последовательности ДНК, выделяемые растением, главным образом сапонин, выделяемый растением и т.д. Фактически любой иммуностимулирующий агент может быть использован для получения наночастиц, заполненных иммуностимулирующим агентом, композиции по настоящему изобретению, тем не менее в конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанным иммуностимулирующим агентом является крупный липополисахарид .
Указанный иммуностимулирующий агент может по крайней мере частично покрывать поверхность указанных наночастиц и/или содержаться в указанных наночастицах. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанный иммуностимулирующий агент покрывает всю или часть поверхности указанных наночастиц PVM/MA, хотя в другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанный иммуностимулирующий агент инкапсулирован в указанные наночастицы PVM/MA.
Наночастицы PVM/MA, заполненные иммуностимулирующим агентом, легко могут быть получены способом, аналогичным описанному выше для получения наночастиц PVM/MA, заполненных аллергеном или антигеном, но с заменой указанного аллергена или антигена иммуностимулирующим агентом. Таким образом, в зависимости от момента, в который был введен иммуностимулирующий агент, будут получены различные составы с различными их соотношениями (см. пример 1 или 4). В качестве иллюстрации, когда необходимо, чтобы иммуностимулирующий агент покрыл всю или часть поверхности наночастиц, указанный иммуностимулирующий агент инкубируют после упаривания органических растворителей. Подобным образом, если необходимо, иммуностимулирующий агент инкапсулируют внутрь наночастиц. Для этого указанный иммуностимулирующий агент инкубируют. При этом агент диспергируют или растворяют в растворителе, преимущественно таком же, в котором находится раствор сополимера PVM/MA, или в растворителе, способном смешиваться с указанным растворителем сополимера. Предпочтительно это полярный органический растворитель или растворитель, способный смешиваться с растворителем полимерного раствора, например ацетоном. Перед введением указанной жидкой фазы проводят десольватацию раствора сополимера PVM/MA. Если необходимо, необязательно может быть введен перекрестно-связывающий агент, который упомянут выше в связи с пустыми наночастицами, для улучшения стабильности наночастиц.
Наночастицы, заполненные иммуностимулирующим агентом, могут быть очищены подходящим способом, как упомянутый выше в связи с наночастицами, заполненными аллергеном или антигеном.
Если необходимо, наночастицы, заполненые иммуностимулирующим агентом, также могут быть сублимированы с использованием стандартных криопротекторов, предпочтительно, в концентрации, составляющей от 0,1 до 10% от общей массы композиции.
Наночастицы, заполненные иммуностимулирующим агентом, могут действовать как адъювант при вакцинации или иммунотерапии и стимулировать иммунный ответ после их введения пациенту.
Дозы для введения наночастиц, заполненных иммуностимулирующим агентом, изменяются в широком диапазоне, например, приблизительно от 0,01 до приблизительно 10 мг/кг массы тела, предпочтительно от 0,1 до 2 мг/кг массы тела.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения композиция по настоящему изобретению содержит наночастицы PVM/MA, заполненные аллергеном или антигеном с иммуностимулирующим агентом, где указанные наночастицы PVM/MA содержат аллерген или антиген и иммуностимулирующий агент.
Аллерген или антиген, так же как и стимулирующий агент, присутствующий в этом варианте композиции по настоящему изобретению, может, по крайней мере, частично покрывать поверхность указанных наночастиц и/или заполнять указанные наночастицы.
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанный аллерген или антиген покрывает всю или часть поверхности указанных наночастиц, хотя иммуностимулирующий агент содержится внутри указанных наночастиц, обнаружено, что этот конкретный вариант осуществления изобретения позволяет селективно стимулировать Th2 ответ у пациента.
В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанный аллерген или антиген инкапсулирован в наночастицы PVM/MA, в то время как указанный стимулирующий агент, по крайней мере, частично покрывает поверхность указанных наночастиц.
Этот вариант осуществления изобретения используется для стимуляции сбалансированного Th1 и Th2 ответа или ответа с преобладанием Th1 ответа.
В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения как аллерген или антиген, так и иммуностимулирующий агент инкапсулирован в указанные наночастицы PVM/MA.
Наночастицы PVM/MA, содержащие аллерген или антиген и иммуностимулирующий агент, легко могут быть получены способом, аналогичным способу, который описан выше. В зависимости от момента, в который аллерген или антиген и иммуностимулирующий агент был введен, будут получены различные составы с различными соотношениями указанных продуктов. В качестве иллюстрации, аналогично, если необходимо, иммуностимулирующий агент покрывает всю или часть поверхности наночастицы, для этого указанный иммуностимулирующий агент инкубируют после упаривания органических растворителей. Подобным образом, если необходимо, иммуностимулирующий агент инкапсулируют внутрь указанных наночастиц. Для этого указанный иммуностимулирующий агент инкубируют. Иммуностимулирующий агент диспергируют или растворяют в растворителе, преимущественно в котором находится раствор сополимера PVM/MA, или в растворителе, способном смешиваться с указанным растворителем сополимера. Предпочтительно это полярный органический растворитель или растворитель, способный смешиваться с растворителем полимерного раствора, например ацетон. Перед введением указанной жидкой фазы проводят десольватацию раствора сополимера PVM/MA. Подобным образом, если необходимо, чтобы аллерген или антиген покрыл всю или часть поверхности наночастиц, то указанный аллерген или антиген инкубируют после упаривания органических растворителей. Подобным образом, если необходимо, аллерген или антиген инкапсулируют внутрь указанных наночастиц. Для этого указанный аллерген или антиген инкубируют. Аллерген или антиген диспергируют или растворяют в растворителе, преимущественно, в котором находится раствор сополимера PVM/MA, или в растворителе, способном смешиваться с указанным растворителем сополимера. Предпочтительно это полярный органический растворитель или растворитель, способный смешиваться с растворителем полимерного раствора, например ацетон. Перед введением указанной жидкой фазы проводят десольватацию раствора сополимера PVM/MA. Подобным образом, когда необходимо, чтобы аллерген или антиген и иммуностимулирующий агент был инкапсулирован внутрь указанных наночастиц, то указанный аллерген или антиген инкубируют, необязательно смешивают с указанным иммуностимулирующим агентом, который диспергирован или растворен в растворителе, преимущественно в котором находится раствор сополимера PVM/MA, или способный смешиваться с указанным растворителем, такой как предпочтительно полярный органический растворитель или растворитель, способный смешиваться с растворителем полимерного раствора, например ацетон. Перед введением указанной жидкой фазы проводят десольватацию раствора сополимера PVM/MA. В любом случае, если необходимо, необязательно может быть введен перекрестно-связывающий агент к полученным наночастицам для улучшения их стабильности, как описано выше в связи с пустыми наночастицами.
А именно, в другом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения композиции по настоящему изобретению, содержащей наночастицы сополимера PVM/MA, заполненные аллергеном или антигеном и иммуностимулирующим агентом, где указанные наночастицы сополимера PVM/MA включают аллерген или антиген и иммуностимулирующий агент. Указанный способ включает стадии:
а) десольватации органического раствора сополимера PVM/MA, растворенного в органическом растворителе с водно-спиртовым раствором;
b) удаления органических растворителей с получением наночастиц; и
с) введения указанного аллергена или указанного антигена и/или указанного иммуностимулирующего агента в указанный органический раствор сополимера PVM/MA перед десальватацией указанного органического раствора сополимера PVM/MA или в качестве альтернативы инкубирование указанного аллергена или указанного антигена или указанного иммуностимулирующего агента с указанными наночастицами, полученными на стадии b).
Стадии а) и b) проводят способом, аналогичным тому, который описан выше в контексте способа получения композиции по настоящему изобретению, содержащей наночастицы сополимера PVM/MA, заполненные аллергеном или антигеном. Стадию с) проводят способом, аналогичным способу, описанному выше, в связи с указанным способом, при этом делая соответствующие модификации для введения иммуностимулирующего агента, либо для указанного органического раствора сополимера PVM/MA перед десольватацией указанного органического раствора сополимера PVM/MA, либо для необязательного введения аллергена или антигена, или в качестве альтернативы инкубируют указанный иммуностимулирующий агент с указанными наночастицами, полученными на стадии b), необязательно частично покрытыми указанным аллергеном или антигеном, согласно описанному выше.
Если необходимо, необязательно может быть введен перекрестно-связывающий агент для улучшения стабильности полученных наночастиц. Полученные наночастицы, заполненные аллергеном или антигеном и иммуностимулирующим агентом, могут быть очищены подходящим способом, например центрифугированием, ультрацентрифугированием, тангенциальной фильтрацией или упариванием, включая использование вакуума.
И, наконец, если необходимо, наночастицы, заполненные аллергеном или антигеном, могут быть лиофилизированы для продолжительного хранения и консервации. Могут быть использованы стандартные криопротекторы, предпочтительно, в концентрации, составляющей от 0,1 до 10% от общей массы композиции для облегчения процесса лиофилизации.
Наночастицы, заполненные аллергеном или антигеном и иммуностимулирующим агентом, могут действовать как адъювант при вакцинации или иммунотерапии и стимулируют иммунный ответ после их введения пациенту, как показано в примерах 3-6.
Дозы введения наночастиц, заполненных аллергеном или антигеном и иммуностимулирующим агентом, изменяются в широком диапазоне, например, приблизительно от 0,01 до 10 мг/кг массы тела, предпочтительно от 0,1 до 2 мг/кг массы тела.
Если необходимо, композиция по настоящему изобретению может быть в лиофилизированной форме или в форме, подходящей для перорального введения или парентерального введения. Лиофилизацию проводят подходящим способом, необязательно в присутствии подходящих криопротекторов, например сахарозы, маннитола, трегаллозы, глицерина, лактозы, сорбитола, поливинилпирролидона и т.п., предпочтительно, концентрация составляет от 0, 1 до 10% от общей массы композиции. Для получения различных форм, подходящих для перорального или парентерального введения, могут быть использованы подходящие наполнители и носители, пригодные для получения необходимых фармакологических форм для введения. Информация об указанных носителях и наполнителях, так же как и информация об указанных формах, подходящих для перорального или парентерального введения композиции по настоящему изобретению, может быть найдена в фармацевтических справочниках.
Brucella, Salmonella
Staphylococcus,
Escherichia coli
.
Как упоминалось ранее, композиция по настоящему изобретению стимулирует или усиливает иммунный ответ после ее введения пациенту и, таким образом, может быть использована в качестве адъюванта в вакцинах или иммунотерапии. Действительно, композиция по настоящему изобретению обладает способностью селективно стимулировать один из двух путей иммунного ответа (Тh1 или Тh2) или оба пути одновременно сбаласированно, и, таким образом, она может быть использована в вакцине или иммунотерапевтических составах, согласно стимулируемому ответу. В качестве иллюстрации, как правило, для вакцинной композиции требуется в зависимости от механизмов патогенности организма, из которого происходит антиген (внутриклеточный или внеклеточный, токсинзависимый, жгутикзависимый и т.п.), стимуляция Тh1 ответа (внутриклеточный, как в случае с  и т.п.) или Тh2 ответа (внутриклеточный, как в случае с , энтеротоксигенная бактерия и т.п.). Подобным образом, в качестве иллюстрации, требуется толерантная индукция для иммунотерапевтического состава ввиду наличия двух типов ответа, например сбалансированное индуцирование Тh1 и Тh2 ответовКак правило, для стимуляции избирательного Тh2 ответа составы будут содержать наночастицы PVM/MA, полностью или частично покрытые аллергеном или антигеном, в то время как для сбалансированной стимуляции Тh1 и Тh2 ответов или с преобладанием Тh1 ответа составы будут содержать наночастицы PVM/MA, в которые антиген или аллерген будет инкапсулирован, и указанные наночастицы преимущественно будут содержать перекрестно-связывающий агент. В любом из ранее указанных случаев, если необходимо, наночастицы могут содержать иммуностимулирующий агент.
st
Кроме того, другой аспект настоящего изобретения относится к вакцине или иммунотерапевтической композиции, включающей терапевтически эффективное количество композиции, стимулирующей иммунный ответ (композиции по настоящему изобретению), вместе с фармацевтически приемлемым носителем или наполнителем. Указанная вакцина или иммунотерапевтическая композиция может быть в любой фармацевтической форме, вводимой любым путем, например пероральным, парентеральным, ректальным и т.п. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанная вакцина или иммунотерапевтическая композиция является фармацевтической формой для перорального приема, хотя в другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанная вакцина или иммунотерапевтическая композиция является фармацевтической формой для парентерального введения, например внутримышечного (i.m.), подкожного (s.c.), внутривенного (i.v.), интраперитонеального (i.p.), интрадермального (i.d.) и т.п. Дозы для различных форм введения лекарственных средств в общем случае и способы их получения могут быть взяты в «Tratado de Farmacia Galénica», С.Faulí I Trillo, 1 Edition, 1993, Luzán 5, S.A. de Ediciones.
Композиция по настоящему изобретению, находясь в указанной иммунотерапевтической вакцине или композиции, полученной по настоящему изобретению, включает наночастицы PVM/MA. Указанные наночастицы могут, кроме того, содержать аллерген или антиген и/или иммуностимулирующий агент, который может содержаться внутри указанных наночастиц и/или по крайней мере частично покрывать поверхность указанных наночастиц. Аналогично, указанные частицы необязательно могут содержать перекрестно-связывающий агент.
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения композиция по настоящему изобретению, находясь в указанной иммунотерапевтической вакцине или композиции, полученной по настоящему изобретению, включает пустые наночастицы PVM/MA, необязательно вводится перекрестно-связывающий агент. В этом случае композицию по настоящему изобретению вводят совместно с вакциной или иммунотерапевтическими композициями, содержащими антиген или аллерген, соответственно стимулируя иммунный ответ после введения указанной вакцины или иммунотерапевтической композиции и пустых наночастиц. Совместное введение указанной вакцины или иммунотерапевтической композиции и пустых наночастиц может осуществляться одновременно или последовательно в различное время, в любом порядке, например первой может быть введена вакцина или иммунотерапевтическая композиция и затем пустые наночастицы, или наоборот. В качестве альтернативы, указанная вакцина или иммунотерапевтическая композиция и указанные пустые наночастицы могут быть введены одновременно. В этом случае вакцина или иммунотерапевтическая композиция и пустые наночастицы могут быть введены в одной и той же композиции или в различных композициях.
В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения композиция по настоящему изобретению, находясь в указанной иммунотерапевтической вакцине или композиции, полученной по настоящему изобретению, включает наночастицы PVM/MA, где указанные наночастицы PVM/MA, кроме того, содержат аллерген или антиген и, если это необходимо, перекрестно-связывающий агент.
В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения композиция по настоящему изобретению, находясь в указанной иммунотерапевтической вакцине или композиции, полученной по настоящему изобретению, включает наночастицы PVM/MA, где указанные наночастицы PVM/MA, кроме того, содержат иммуностимулирующий агент и, если это необходимо, перекрестно-связывающий агент.
В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения композиция по настоящему изобретению, находясь в указанной иммунотерапевтической вакцине или композиции, полученной по настоящему изобретению включает наночастицы PVM/MA, где указанные наночастицы PVM/MA, кроме того, содержат аллерген или антиген и иммуностимулирующий агент и, если это, необходимо перекрестно-связывающий агент.
Иммунотерапевтическая вакцина или композиция, полученная по настоящему изобретению, содержит композицию по настоящему изобретению в терапевтически эффективной дозе, например, в количестве, которое подходит для усиления или стимуляции иммунного ответа. Кроме того, количество композиции по настоящему изобретению, находящейся в вакцине или иммунотерапевтической композиции, полученной по настоящему изобретению, может изменяться в широком диапазоне в зависимости от других факторов, среди которых тип наночастиц (пустые или заполненные аллергеном или антигенами и/или иммуностимулирующим агентом) и т.п. Кроме того, в конкретном варианте осуществления настоящего изобретения, изобретение относится к вакцине или иммунотерапевтической композиции, содержащей:
<u>Компонент</u>
<u>% от общей массы</u>
Наночастицы PVM/MA
84-99,998%
Перекрестно-связывающий агент
0,001-1%
Аллерген или антиген
0,001-15%
Указанная иммунотерапевтическая вакцина или композиция необязательно может содержать криопротектор в количестве, достаточном для защиты наночастиц во время процесса лиофилизирования.
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанный аллерген содержит аллергены, экстрагируемые из пыльцы, аллергены, экстрагируемые из насекомых, или аллергены, экстрагируемые из пищевых продуктов.
Salmonella spp.
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанный антиген содержит иммуногены, экстрагируемые из организма, например, экстрагируемые мембраной
Как было указано ранее, композиция по настоящему изобретению способна стимулировать или усиливать иммунный ответ после введения пациенту, таким образом, она может быть использована в качестве адъюванта в вакцинах или иммунотерапии и, в частности, способна селективно стимулировать один из двух путей иммунного ответа (Th1 или Th2) или даже оба пути одновременно и сбалансированно.
Кроме того, в другом аспекте настоящее изобретение относится к применению композиции по настоящему изобретению при производстве вакцины или иммунотерапевтической композиции.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению композиции по настоящему изобретению при производстве фармацевтической композиции для селективной стимуляции или стимуляции с преобладанием, или усиления Th1 иммунного ответа.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению композиции по настоящему изобретению при производстве фармацевтической композиции для селективной стимуляции или стимуляции с преобладанием, или усиления Th2 иммунного ответа.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению композиции по настоящему изобретению при производстве фармацевтической композиции для сбалансированной стимуляции или усиления Th1 и Th2 иммунных ответов.
Применение композиции по настоящему изобретению для вакцинации или иммунотерапии имеет определенные преимущества, которые включают:
- применение фармацевтических форм, которые являются биодеградируемыми в нормальных условиях организма и которые получены из полимеров и материалов, приемлемых в фармакологической и медицинской практике;
- проведение иммунотерапии с использованием наночастиц и введение вакцинного препарата на основе наночастиц, который защищает инкапсулированный аллерген или антиген от преждевременной инактивации;
- получение иммунотерапевтического препарата и вакцины на основе наночастиц, которые демонстрируют замедленное высвобождение в течение времени; период времени, в течение которого будет происходить контролируемое высвобождение, будет зависеть от условий микроокружающей среды в месте введения;
- введение наночастичного адъюванта на основе наночастиц, которые передают свои характеристики (безвредность, биодеградация, авирулентность), он может применяться у людей и животных для иммунотерапевтических целей и при вакцинации посредством различных видов введения; и
- введение наночастичного адъюванта на основе наночастиц, которые передают свой биоадгезивный потенциал в желудочно-кишечном тракте, делая пероральное введение возможным видом введения.
Следующие примеры иллюстрируют изобретение, но не ограничивают его.
Примеры
Следующие примеры описывают получение различных типов наночастиц на основе PVM/MA, которые необязательно содержат аллергены или антигены и/или иммуностимулирующий агент, и демонстрируют способность указанных наночастиц действовать в качестве адъювантов в иммунотерапии или при вакцинации.
Основной способ получения наночастицы
Основной способ получения наночастицы PVM/MA включает десольватацию указанного сополимера в ацетоне с последующим введение этанола. В полученный в результате раствор введен такой объем воды, который немедленно образует частицы посередине в виде мутной суспензии. Затем органические растворители (этанол и ацетон) удаляют посредством упаривания при низком давлении, частицы остаются в стабильной водной суспензии [Arbos et al., J Control Rel, 83 (2002) 321-330]. В зависимости от момента, в который были введены аллергены или антигены, и где возможно применен иммуностимулирующий агент, будут получены различные композиции с различными их соотношениями (см. примеры 1, 5 и 6). В качестве примера:
А
Для получения композиций, содержащих аллерген или антиген, инкапсулированный в наночастицы (составы NP I и NP VI): инкубирование с аллергеном или антигеном для инкапсулирования проводится после упаривания органических растворителей.
В
Для получения композиций, содержащих аллерген или антиген, полностью или частично покрывающий внешнюю поверхность наночастиц (составы NP II, NP III, NP IV, NP V, NP VII, OVASAL и NP HE): перед введением этанола и воды инкубируют аллерген или антиген, диспергированный в ацетоне.
Следующий этап состоит в введении перекрестно-связывающего агента, которым в этом случае является 1,3-диаминопропаном, в составы NP III, NP V, NP VII, OVASAL, NP HE (в общей сложности 5 мкг/мг полимера) и NP IV (10 мкг/мг полимера).
Brucella
ovis
Составы NP V, NP VI и NP VII содержат иммуностимулирующий агент, состоящий из крупного липополисахарида (R-LPS) . Коротко, для его введения в случае состава NP V инкубирование с указанным иммуностимулирующим агентом проводят после упаривания органических растворителей, хотя в случаях с составами NP VI и NP VII R-LPS инкубируют после введения этанола и воды (см. примеры 1.4.2, 1.4.3 и 1.4.4).
Очистка наночастицы проводится посредством ультрацентрифугирования. И, наконец, очищенные наночастицы лиофилизируют для увеличения срока хранения и консервации.
Характеристика наночастицы
Размер и дзета-потенциал наночастицы были определены в Zetamaster (Malvern Instruments/Optilas, Spain).
Содержание инкапсулированного белка (активный ингредиент) было определено посредством анализа с микробицинхониновой кислоты (Micro BCA, Pierce, USA).
Brucella ovis
Крупный липополисахарид  (R-LPS), адсорбированный или инкапсулированный в наночастицы, был определен косвенно посредством одного из его эксклюзивных маркеров КDO (3-дезокси-D-манно-окто-2-улосоноковая кислота) методом с применением тиобарбитуровой кислоты [Warren, J Biol Chem, 243 (1959) 1971-1975].
Определение антитела против OVA, цитокина и IL-10
1
2а
Сыворотка антител против OVA была исследована ELISA с конъюгатами анти-IgG  и анти-IgG(Sigma-Aldrich Chemiе, Germany). Коротко, для проведения этого исследования были использованы 96-луночные планшеты (EB, Thermo Labsystems, Vantaa, Finland), каждая лунка содержала 1 мкг овальбумина, который был зафиксирован при температуре 4°С в течение 15 часов; были проведены последовательно 5 промываний, каждое в течение 1 минуты в промывном аппарате ELISA (Thermo Labsystems, Vantaa, Finland), сыворотки были введены в серийные растворы, начиная от 1:40, они были выдержаны при температуре 37°С в течение 4 часов, и были проведены последовательно 5 промываний, каждое в течение 1 минуты; затем коньюгат был инкубирован в течение 2 часов с пероксидазой, кроме того, были проведены последовательно 5 промываний, каждое в течение 1 минуты, субстрат [ABTS (2,2'-азино-бис(3-этилбензен-тиазолин-6-сульфониковая кислота) (Sigma-Aldrich Chemiе, Germany)] был введен и считывание было проведено при 405 нм в считывающем устройстве (iEMS Reader MF, Labsystems, Vantaa, Finland) после 30 минут инкубации при комнатной температуре.
Цитокины (IFN-γ, IL-4) были исследованы с применением наборов ELISA (Biosource, USA) в супернатантах из рестимулированных клеток селезенки предварительно иммунизированных мышей.
IL-10 был исследован в сыворотках крови предварительно центрифугированных при 800 х g в течение 10 минут. IL-10 был исследован посредством набора ELISA (Biosource, USA).
Метод элекрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE)
Профиль образцов белка был определен с помощью SDS-PAGE [Laemmli, Nature, 227 (1970) 680-685] при 15% концентрации акриламида и бисакриламида (Biorad), взятых в соотношении 37,5:1 соответственно, в 125 мМ Tris-HCl (pH 6,8) и 0,1% SDS в геле. Использованный электродный буфер содержал 30 мМ Tris-HCl (pH 8,3), 192 мМ глицина и 0,1% SDS. Образец был обработан при 100°С в течение 10 минут в 62,5 мМ Tris-HCl (pH 6,8), 10% глицерина, 2% SDS, 5% β-меркаптоэтанола и 0,002% бромфенола голубого. Электрофорез был проведен в 8 х 7 см геля с постоянной плотностью 15 мА/гель. Гель был окрашен Coomassie blue [King, Anal Biochem, 71 (1976) 223-230]. Для этой цели он был инкубирован в 3% водном растворе трихлоруксусной кислоты в течение 1 часа для его закрепления. Окрашивание было проведено с 0,25% раствором Coomassie blue с инкубированием в 50% метаноле и 10% уксусной кислоте в течение 1 часа, и образцы были обесцвечены 50% метанолом и 20% уксусной кислотой до того момента, пока стали видимыми. Приблизительные молекулярные массы компонентов образца были определены путем сравнения их электрофоретической подвижности с маркером со стандартной молекулярной массой (Rainbow, Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden), содержащим миозин (220 кДа), фосфорилазу b (97 кДа), альбумин бычьей сыворотки (66 кДа), овальбумин (45 кДа), карбоангидразу (30 кДа), ингибитор трипсина (20,1 кДа) и лизоцим (14,3 кДа).
Иммуноблоттинг
Иммуноблоттинг был проведен согласно ранее описанному протоколу [Towbin & Staehelin, Proc Natl Acad Sci USA, 76 (1979) 4350-4354]. Кратко, после проведения обработки образцов SDS-PAGE гель был пропущен через нитроцеллюлозные мембраны с размером пор 0,45 мкм (Schleicher & Schuell, Dassel, Germany). Пропуск был осуществлен с использованием полусухого метода посредством Trans-Blot SD, Semy-Dry transfer Cell system (Bio-Rad, Richmond, USA) при 200 мА, 5 В в течение 30 минут, в трансферном буфере 25 мМ Tris-HCl (pH 8,3), 192 мМ глицина и 10% метанола.
Пример 1
Иммунотерапия
Получение и характеристика наночастиц на основе сополимера метилвинилового эфира малеинового ангидрида с овальбумином
Выбранный белок был альбумином (OVA), поскольку на данный момент он широко используется в качестве экспериментальной модели аллергии.
Около 50% белка, содержащегося в белых яйцах, представляет овальбумин. Он является мономерным фосфогликопротеином, содержащим 385 аминокислот, с молекулярной массой от 43 до 45 кДа [Johnsen and Elsayed, Mol Immunol, 27 (1990) 821]. Овальбумин является яичным белком, обладающим наибольшей аллергенностью, немедленно индуцирующим гиперчувствительность I типа, опосредованную IgE.
Описанный ниже способ является пригодным для получения лекарственных форм с наночастицами коллоидного типа, которые могут быть использованы для иммунотерапии.
1.1 Получение пустых наночастиц (NP)
100 мг сополимера метилвинилового эфира малеинового ангидрида (PVM/MA) [Gantrez AN 119] были растворены в 5 мл ацетона. Последовательно в эту фазу были введены 10 мл этанола и 10 мл деионизированной воды при магнитном перемешивании. Полученная в результате смесь была подвергнута гомогенизации в течение 5 минут. Суспензия наночастиц затем была подвергнута выпариванию при низком давлении до тех пор, пока оба органических растворителя не были удалены, и конечный объем был доведен водой до 10 мл.
Раствор был подвергнут очистке посредством ультрацентрифугирования (20 минут при 27000 х g). Супернатанты были удалены, и осадок был ресуспендирован в воде или в 5% водном растворе сахарозы. И, наконец, полученная в результате суспензия наночастиц была лиофилизирована, что позволило сохранить все ее первоначальные качества.
Полученные пустые наночастицы (NP) имели средний размер менее 200 нм и суммарный поверхностный заряд -45,1 мВ (см. Таблицу 1).
1.2 Получение наночастиц, покрытых овальбумином (NPI)
100 мг сополимера метилвинилового эфира малеинового ангидрида (PVM/MA) [Gantrez AN 119] были растворены в 5 мл ацетона. Последовательно в эту фазу были введены 10 мл этанола и 10 мл деионизированной воды при магнитном перемешивании. Полученная в результате смесь была подвергнута гомогенизации в течение 5 минут.Суспензия наночастиц затем была подвергнута упариванию при низком давлении до тех пор, пока оба органических растворителя не были удалены, и конечный объем был доведен водой до 5 мл. Этот раствор был инкубирован в течение 1 часа при комнатной температуре с 5 мл водного раствора овальбумина, содержащего 10 мг белка.
Смесь была подвергнута очистке посредством ультрацентрифугирования (20 минут при 27000 х g). Супернатанты были удалены, и осадок был ресуспендирован в воде или в 5% водном растворе сахарозы. И, наконец, полученная в результате суспензия наночастиц была лиофилизирована, что позволило сохранить все ее первоначальные качества.
Полученные наночастицы (NPI) имели средний размер менее 300 нм и суммарный поверхностный заряд -61,3 мВ и содержание овальбумина составило 54,7 мкг/мг полимера (см. Таблицу 1).
1.3 Получение наночастиц с инкапсулированным овальбумином (NPII, NPIII и NPIV)
TM
100 мг сополимера метилвинилового эфира малеинового ангидрида (PVM/MA) [Gantrez AN 119] были растворены в 4 мл ацетона, кроме того, в то время как 5 мг овальбумина были диспергированы в 1 мл ацетона посредством ультразвуковой обработки (Microson) или ультразвуковой ванны в течение 1 минуты с охлаждением. Дисперсия овальбумина была введена в полимерную суспензию и перемешана в течение 30 минут при комнатной температуре. Последовательно в эту фазу были введены 10 мл этанола и 10 мл деионизированной воды при магнитном перемешивании. Полученная в результате смесь была подвергнута гомогенизации в течение 5 минут. Суспензия наночастиц затем была подвергнута упариванию при низком давлении до тех пор, пока оба органических растворителя не были удалены, и конечный объем был доведен водой до 10 мл. Полученные наночастицы были инкапсулированы OVA (NPII). В случае составов NPIII и NPIV тогда же мог быть введен перекрестно-связывающий агент: 0,05 мл и 0,1 мл 1% раствора 1,3-диаминопропана соответственно.
Смесь была подвергнута очистке посредством ультрацентрифугирования (20 минут при 27000 х g). Супернатанты были удалены, и осадок был ресуспендирован в воде или в 5% водном растворе сахарозы. И, наконец, полученная в результате суспензия наночастиц была лиофилизирована, что позволило сохранить все ее первоначальные качества.
Полученные наночастицы имели средний размер менее 300 нм и суммарный поверхностный заряд -41,4 мВ в случае NPII, -50,8 мВ в случае NPIII, -57,5 мВ в случае NPIV, и содержание овальбумина было близко к 30 мкг/мг полимера (см. Таблицу 1).
Brucella ovis
1.4 Получение наночастиц с овальбумином и крупным липополисахаридом  (NPV, NPVI, NPVII)
Brucella ovis
1.4.1 Выделение и характеристика комплекса крупного липополисахарида
Brucella ovis
Brucella ovis
Использованный экстракт является крупным полисахаридом  (R-LPS). R-LPS был получен описанным ранее способом (Galanos et al., Eur. J. Biochem. (1969), 245-249). После культивирования бактерий  они были ресуспендированы в абсолюте этанола с перемешиванием при температуре 4°С в течение ночи в закрытом контейнере. Затем клетки были центрифугированы (6000 х g, 20 минут, 4°С) и ресуспендированы в ацетоне с перемешиванием в течение 12 часов при температуре 4°С в закрытом контейнере. Последовательно клетки были собраны центрифугированием (6000 х g, 20 минут, 4°С), они были ресуспендированы в этиловом эфире и были выдержаны при комнатной температуре в течение от 3 до 4 часов с магнитным перемешиванием. Затем они были вновь центрифугированы (6000 х g, 20 минут, 4°С) и были подвергнуты упариванию для сухого состояния. Для проведения экстракции клетки смешивали до проведения гомогенизации с петролейным эфиром, простым эфиром фенола и хлороформом в соотношении 8:5:2 соответственно. Смесь центрифугировали (8000 х g, 15 минут, комнатная температура) и собирали супернатант. Осадок в пробирке был реэкстрагирован при тех же условиях еще дважды. Весь супернатант был объединен, и петролейный эфир и эфир хлороформа были выпарены в ротационном испарителе. Фенольный осадок был осажден дистиллированной водой и центрифугирован (8000 х g, 30 минут, комнатная температура). Затем он был дважды промыт с фенолом и дважды с этиловым эфиром. После последнего центрифугирования оставшийся этиловый эфир был извлечен под вакуумом, осадок в пробирке был ресуспендирован в деионизированной воде и был подвергнут диализу. Диализный мешок был центрифугирован (100000 х g, 6 часов, 4°С), осадок в пробирке был ресуспендирован в деионизированной воде и подвергнут лиофилизации.
Количество R-LPS было определено косвенно посредством одного из его эксклюзивных маркеров KDO с ипользованием метода с применением тиобарбитуровой кислоты.
Brucella ovis
Наночастицы с инкапсулированным овальбумином и R-LPS
на поверхности (NP V).
1.4.2
TM
Brucella ovis
100 мг сополимера метилвинилового эфира малеинового ангидрида [Gantrez AN 119] были растворены в 4 мл ацетона, кроме того, в то время как 5 мг овальбумина были диспергированы в 1 мл ацетона посредством ультразвуковой обработки (Microson) или ультразвуковой ванны в течение 1 минуты с охлаждением. Дисперсия овальбумина была введена в сополимерную суспензию и перемешана в течение 30 минут при комнатной температуре. Последовательно в эту фазу были введены 10 мл этанола и 10 мл деионизированной воды при магнитном перемешивании. Полученная в результате смесь была подвергнута гомогенизации в течение 5 минут. Суспензия наночастиц затем была подвергнута упариванию при низком давлении до тех пор, пока оба органических растворителя не были удалены, и конечный объем был доведен водой до 9 мл. Этот раствор был выдержан в течение 1 часа при комнатной температуре с 1 мл водной дисперсии (предварительно была проведена обработка ультразвуком в течение 1 минуты), содержащей 1 мг R-LPS .
Смесь была подвергнута очистке посредством ультрацентрифугирования (20 минут при 27000 х g). Супернатанты были удалены, и осадок был ресуспендирован в воде или в 5% водном растворе сахарозы. И, наконец, полученная в результате суспензия наночастиц была лиофилизирована, что позволило сохранить все ее первоначальные качества.
Полученные наночастицы (NP V) имели средний размер менее 300 нм и суммарный поверхностный заряд -46,1 мВ, содержание овальбумина составило 64,1 мкг/мг полимера и 15,2 мкг R-LPS /мг полимера (см. Таблицу 1).
Brucella ovis
Наночастицы с инкапсулированным R-LPS  и овальбумином на поверхности (NP VI).
1.4.3
Brucella ovis
TM
100 мг сополимера метилвинилового эфира малеинового ангидрида [Gantrez AN 119] были растворены в 4 мл ацетона, кроме того, в то же время 1 мг R-LPS  был диспергирован в 1 мл ацетона посредством ультразвуковой обработки (Microson) или ультразвуковой ванны в течение 1 минуты с охлаждением. Дисперсия R-LPS была введена в сополимерную суспензию и перемешана в течение 30 минут при комнатной температуре. Последовательно в эту фазу были введены 10 мл этанола и 10 мл деионизированной воды при магнитном перемешивании. Полученная в результате смесь была подвергнута гомогенизации в течение 5 минут. Суспензия наночастиц затем была подвергнута упариванию при низком давлении до тех пор, пока оба органических растворителя не были удалены, и конечный объем был доведен водой до 5 мл. Этот раствор был инкубирован в течение 1 часа при комнатной температуре с 5 мл водного раствора, содержащего 5 мг овальбумина.
Смесь была подвергнута очистке посредством ультрацентрифугирования (20 минут при 27000 х g). Супернатанты были удалены, и осадок был ресуспендирован в воде или в 5% водном растворе сахарозы. И, наконец, полученная в результате суспензия наночастиц была лиофилизирована, что позволило сохранить все ее первоначальные качества.
Полученные наночастицы (NP VI) имели средний размер менее 300 нм и суммарный поверхностный заряд -56,9 мВ, содержание овальбумина составило 68,5 мкг/мг полимера и 12,1 мкг R-LPS /мг полимера (см. Таблицу 1).
Brucella ovis
Наночастицы с инкапсулированным овальбумином и R-LPS
на поверхности (NP VII)
1.4.4
TM
Brucella ovis
100 мг сополимера метилвинилового эфира малеинового ангидрида [Gantrez AN 119] были растворены в 3 мл ацетона, кроме того, в то же время 5 мг овальбумина были диспергированы в 1 мл ацетона посредством ультразвуковой обработки (Microson) или ультразвуковой ванны в течение 1 минут с охлаждением, и 1 мг R-LPS  был диспергирован в 1 мл ацетона, так же была проведена ультразвуковая обработка с охлаждением. Дисперсия овальбумина была введена в дисперсию R-LPS и эта смесь была введена в сополимерную суспензию и перемешана в течение 30 минут при комнатной температуре. Последовательно в эту фазу были введены 10 мл этанола и 10 мл деионизированной воды при магнитном перемешивании. Полученная в результате смесь была подвергнута гомогенизации в течение 5 минут. Суспензия наночастиц затем была подвергнута упариванию при низком давлении до тех пор, пока оба органических растворителя не были удалены, и конечный объем был доведен водой до 10 мл.
Смесь была подвергнута очистке посредством ультрацентрифугирования (20 минут при 27000 х g). Супернатанты были удалены, и осадок был ресуспендирован в воде или в 5% водном растворе сахарозы. И, наконец, полученная в результате суспензия наночастиц была лиофилизирована, что позволило сохранить все ее первоначальные качества.
Полученные наночастицы (NP VII) имели средний размер менее 300 нм и суммарный поверхностный заряд -46,1 мВ, содержание овальбумина составило 54,7 мкг/мг полимера и 13,8 мкг R-LPS /мг полимера (см. Таблицу 1).
1.5 Характеристика наночастицы
Физикохимическая характеристика различных композиций показана в Таблице 1.
Согласно собранным результатам было установлено, что когда наночастицы были покрыты овальбумином (NP I и NP VI), размер увеличивался и дзета-потенциал становился более отрицательным, в то время как, если овальбумин находился внутри наночастиц (NP II, NP III, NP IV, NP V и NP VII), размер так же как и дзета-потенциал не изменялся по сравнению с пустыми наночастицами (NP).
В то же время было установлено, что размеры наночастиц уменьшались по мере того, как было уменьшено количество введенного перекрестно-связывающего агента и незначительно уменьшено количество овальбумина.
Присутствие R-LPS на поверхности наночастицы вынуждает количество инкапсулированного овальбумина увеличиваться (NP V в сравнении с NP II), хотя, если R-LPS преимущественно находится внутри наночастиц, количество адсорбированного овальбумина не изменяется (NP VI в сравнении с NP I).
Таблица 1Физикохимическая характеристика различных композиций (с данными, полученными как средние±стандартное отклонение n=10)
Размер (нм)
Дзета-потенциал (мВ)
Инкапсу-лированныйOVA (мкг/мг)
Эффективность инкапсу-ляции(%)
R-LPS (мкг/мг)
NP
158±3
-45,1±0,5
---
---
---
NP I
300±4
-61,3±3,8
67,8±20,2
47,50±2,12
---
NP II
205±1
-41,4±2,5
36,1±3,8
50,48±5,32
---
NP III
239±4
-50,8±2,9
30,1±4,5
42,14±6,30
---
NP IV
270±2
-57,5±3,1
31,4±4,2
44,08±5,88
---
NP V
152
-46,1
64,1±2,9
89,74±4,06
15,2±0,5
NP VI
287
-56,9
68,5±2,4
47,95±1,68
12,1±0,6
NP VII
135
-43,7
54,7±1,9
76,58±2,66
13,8±3,0
Выход наночастиц составил приблизительно 70%.
Пример 2
in vitro
Тест  высвобождения овальбумина из наночастиц
in vitro
Для проведения оценки выделения овальбумина  наночастицы были инкубированы в 1 мл PBS (фосфатно-буферный солевой раствор рН 7,4) в пробирках «Эппендорф» с концентрацией, приблизительно равной 8 мг/мл. Эти пробирки были инкубированы в термостате при температуре 37°С с ротацией, и образцы подвергали центрифугированию через заранее определенные промежутки времени при 26500 х g в течение 20 минут, собирая супернатант для его дальнейшего исследования. Высвобожденный овальбумин был измерен в супернатанте с использованием метода с применением бицинхониновой кислоты.
Полученная кривая выделения овальбумина показана на фигуре 1; было установлено, что в композиции NP I овальбумин высвободился гораздо быстрее, чем в композициях NP II, NP III и NP IV, которые показали аналогичный профиль высвобождения. Это происходит потому, что в композиции NP I овальбумин адсорбирован на внешней поверхности наночастиц, поэтому инициируется высвобождение (взрыв) гораздо более резкое, чем у других композиций, в которых часть овальбумина инкапсулирована (NP II, III и IV). В то же время в профилях высвобождения NP II, NP III и NP IV можно было наблюдать, что по мере того, как количество перекрестно-связывающего агента увеличивается, процентное соотношение высвободившегося овальбумина незначительно уменьшается.
Пример 3
Количественная оценка продуцирования антител против OVA после иммунизации овальбумином у мышей BALB/c
Были иммунизированы 65 мышей BALB/c, разделенные затем на 13 групп согласно схеме введения.
1
Для контроля использовались: раствор, свободный от овальбумина (OVA) (10 мкг внутрикожно и 25 мкг перорально), пустые наночастицы (NP) (внутрикожно и перорально) и овальбумин, адсорбированный на альгидрогеле (OVA-Alum) (10 мкг внутрикожно), в качестве позитивного контроля индуцирования Th2 ответа, характеризующегося высокими титрами IgG [Faquim-Mauro et al., Int Immunol, 12 (2000) 1733-1740].
Оставшиеся группы были инокулированы внутрикожно (10 мкг OVA) или перорально (25 мкг OVA), отличиями в обработке было:
А) раствор овальбумина (OVA) внутрикожно
B) раствор овальбумина (OVA) перорально
С) овальбумин, адсорбированный на альгидрогеле (OVA-Alum), внутрикожно
D) пустые наночастицы (NP) внутрикожно
Е) пустые наночастицы (NP) перорально
F) наночастицы, покрытые овальбумином (NP I), внутрикожно
G) наночастицы, покрытые овальбумином (NP I), перорально
H) наночастицы с инкапсулированым овальбумином (NP II) внутрикожно
I) наночастицы с инкапсулированым овальбумином (NP II) перорально
J) наночастицы с перекрестно-связывающим агентом 1,3-диаминопропаном с инкапсулированым овальбумином (NP III и NP IV) внутрикожно
K) наночастицы с перекрестно-связывающим агентом 1,3-диаминопропаном с инкапсулированым овальбумином (NP III и NP IV) перорально.
Последовательные извлечения крови были проведены на 7, 14, 28 и 35 дни после иммунизации. Сыворотки каждой группы были собраны и заморожены при температуре -80°С для их последующего исследования.
1
2a
1
2а
Уровни антител против OVA (IgG и IgG) были определены в различных сыворотках посредством ELISA, и полученные данные показаны на фигуре 2 и 3. Было установлено, что наночастицы, содержащие овальбумин (NP I, NP II, NP III и NP IV), каждый из которых покрывал наночастицы или был в них инкапсулирован, усилили иммунный ответ к овальбумину в растворе. На 14 день после введения указанных композиций с наночастицами повысили титр IgG в сыворотках мышей на 3 или 6 логарифмических единиц в зависимости от типа. В то же время в сыворотке мышей, которым был введен OVA-Alum, антитела IgG отсутствовали в течение всего эксперимента, хотя у мышей, которым был введен NP III на 35 день после иммунизации, они достигли титра в 5120.
Это показывает, что в основном указанные NP композиции (NP I, NP II, NP III и NP IV) способны увеличивать титры антител и Th1 и Th2, но, в частности, композиция NP III является самой иммуногенной.
1
2а
В то же время, если титры мышей из группы, принимавшей NP III, сравнить с титрами мышей группы, принимавшей NP IV, можно увидеть, что там наблюдается оптимальное перекрестное связывание (Пример 2, последний абзац), постольку поскольку, хотя они имеют похожие кривые IgG, титры IgG для NP III немного больше, чем в случае с NP IV.
1
2а
Сопоставляя результаты, полученные у мышей при пероральном введении, было установлено, что только NP III явился той композицией, которая индуцировала поддающиеся количественному измерению уровни антител IgG и IgG (фиг.3).
После подтверждения этого в таких же экспериментальных условиях композиция NP III оказалась самой эффективной, подобное исследование было проведено с модифицированием вводимой дозы NP III. В этом случае следующие композиции были введены (перорально) животным:
А) пустые наночастицы (NP)
В) 25 мкг инкапсулированого овальбумина с наночастицами, перекрестно-связанными с 1,3-диаминопропаном с инкапсулированным овальбумином (NP III - 25)
С) 50 мкг инкапсулированого овальбумина с наночастицами, перекрестно-связанными с 1,3-диаминопропаном с инкапсулированным овальбумином (NP III-50).
2а
В этом случае полученные результаты (фигура 4) показывают, что уровни IgG против OVA в сыворотке были значительно выше, когда доза составляла 50 мкг.
Пример 4.
Brucella ovis
Количественная оценка продуцирования антител против OVA и интерлейкина 10 (IL-10) после введения наночастиц овальбумина с липополисахаридом
Были иммунизированы 40 мышей BALB/c, разделенные на 8 групп, согласно форме введения. Во всех группах было осуществлено внутрикожное введение (10 мкг овальбумина). В этот раз отличия в терапии были:
А) раствор овальбумина (OVA)
В) овальбумин, абсорбированный на альгидрогеле (OVA-Alum)
С) пустые наночастицы (NP)
D) наночастицы, покрытые овальбумином (NP I)
Е) наночастицы, перекрестно-связанные с 1,3-диаминопропаном с инкапсулированым овальбумином (NP III)
Brucella ovis
F) наночастицы, перекрестно-связанные с 1,3-диаминопропаном с инкапсулированым овальбумином и покрытые  R-LPS (NP V)
Brucella ovis
G) наночастицы с инкапсулированным  R-LPS и покрытые овальбумином (NP IV)
Brucella ovis
H) наночастицы, перекрестно-связанные с 1,3-диаминопропаном с овальбумином и инкапсулированным  R-LPS (NP VII).
Группа, которой был введен овальбумин, адсорбированный на альгидрогеле (OVA-Alum), была взята в качестве позитивного контроля эксперимента.
Последовательные извлечения крови были проведены на 7, 14, 28, 35, 42 и 49 дни после иммунизации. Образцы были обработаны (см. пример 3) и полученные результаты показаны на фигурах 5 и 6.
Ответ IgG
1
1
1
(Фигура 5): NP III, NP V и NP VII индуцировали высокие уровни IgG более быстро и более интенсивно, чем контрольная композиция (OVA-Alum). Только на 49 день после иммунизации составы на основе наночастиц и контроль (OVA-Alum) показали сходные уровни. И наконец, R-LPS на поверхности наночастиц не оказывал индуцирующего эффекта на уровни IgG.
1
1
В то же время NP I также показывает большой потенциал индуцирования продуцирования антител IgG. Кроме того, как в предыдущем случае, этот феномен был быстрее и интенсивнее, чем у контрольной композиции. Когда R-LPS введен внутрь наночастиц, покрытых OVA, было установлено значительное сокращение в сыворотке титра IgG в сравнении с NP I и контрольными композициями.
Ответ IgG
2а
2а
2а
2а
: на фигуре 6 показаны титры IgG в сыворотке мышей. В этом случае ни одна из контрольных композиций (OVA, NP, OVA-Alum) не индуцировала титры антител. Однако композиции с инкапсулированным OVA были способны обеспечить высокие титры IgG, главным образом когда R-LPS был адсорбирован на внешней поверхности наночастиц (композиция NP V). В то же время NP I проявил себя гораздо более эффективным, чем NP IV для индуцирования Th1 ответа, измеренного в титре сыворотке IgG.
IL-10
: на фигуре 7 показаны уровни IL-10 сыворотки, которые были определены посредством набора ELISA (Biosource, Camarillo, USA). В этом случае ни одна из контрольных композиций не смогла индуцировать секрецию IL-10 сыворотки. Кроме того, все композиции с наночастицами в большей или меньшей степени индуцировали секрецию цитокина. Композиция с овальбумином, адсорбированным на поверхности NP (NP I), позволяет индуцировать максимальное значение IL-10 гораздо быстрее, чем остальные композиции. Кроме того, введение LPS (NP VI) значительно замедляет (14 дней) секрецию цитокина. В то же время NP III показал, что является самой эффективной композицией для индуцирования IL-10 сыворотки, приводя к уровням, которые оказались в два раза выше, чем у NP I, хотя задержка во времени составила одну неделю. Введение R-LPS в инкапсулированные частицы OVA (NP V и NP VII) позволяет индуцировать более дискретные уровни IL--10, но с максимальным значением в течение двух недель после введения. Этот потенциал композиций для индуцирования значительных уровней IL-10 предполагает применение их в качестве возможной терапии при заболеваниях, характеризующихся дисбалансом в балансе Th1/Th2 через регуляцию этого цитокина [Zuany-Amorim et al., J Clin Invest, 95 (1995) 2644-2651; Stampfli et al., Am J Respir Cell Mol Biol, 21 (1999) 586-596; Нall et al, Vaccine, 21 (2003) 549-561].
Пример 5
Salmonella enteritidis
Получение, характеристика и введение наночастиц с экстрактом ChE
Salmonella enteritidis
5.1 Выделение экстракта ChE
Salmonella enteritidis
ChE (хаотропный экстракт) бактериальный экстракт был получен посредством следующего протокола, описанного ранее Altman et al. (Altman et al., Biochem J (1982) 505-513). Инокулум (инокулят)  в стабильной фазе был инкубирован в колбах, содержащих 400 мл среды BHI (бульон с сердечно-мозговым экстрактом Brain Heart Infusion, Difco Lab., Detroit, USA) при температуре 37°С в течение 48 часов, без перемешивания. Клетки были последовательно центрифугированы (7000 х g, 30 минут) и промыты с PBS (фосфатно-буферный солевой раствор; 10 ммоль; pH 7,4). Бактериальный экстракт был получен после обработки клеточного осадка в пробирке 3М KSCN/PBS с магнитным перемешиванием (1 час, комнатная температура) и последовательно центрифугирован (35000 х g, 30 минут). Супернатант, который содержал экстракт ChE, был собран и подвергнут диализу первый раз от PBS и затем от деионизированной воды. И наконец, он был лиофилизирован и хранился при температуре 4°С до момента дальнейшего использования.
Salmonella enteritidis
5.2 Получение наночастиц с овальбумином и ChE (OVASAL)
TM
100 мг сополимера метилвинилового эфира малеинового ангидрида [Gantrez AN 119] были растворены в 3 мл ацетона, в то же время 5 мг овальбумина и 5 мг экстракта ChE были диспергированы в 2 мл ацетона посредством ультразвуковой обработки (Microson) в течение 1 минуты с охлаждением. Дисперсия овальбумина и дисперсия ChE были введены в полимерную суспензию и перемешаны в течение 30 минут при комнатной температуре. Последовательно в эту фазу были введены 10 мл этанола и 10 мл деионизированной воды при магнитном перемешивании. Полученная в результате смесь была подвергнута гомогенизации в течение 5 минут. Суспензия наночастиц затем была подвергнута упариванию при низком давлении до тех пор, пока оба органических растворителя не были удалены, и конечный объем был доведен водой до 10 мл. Затем этот раствор был инкубирован с 0,1 мл 1% раствора 1,3-диаминопропана.
Смесь была подвергнута очистке посредством ультрацентрифугирования (20 минут при 27000 х g). Супернатанты были удалены, и осадок был ресуспендирован в воде или в 5% водном растворе сахарозы. И, наконец, полученная в результате суспензия наночастиц была сублимирована.
Количественная оценка продуцирования антител против OVA после иммунизации с OVASAL у мышей BALB/c
5.3
Внутрикожно 10 мкг овальбумина были иммунизированы 15 мышей, разделенные на 3 группы, согласно полученной обработке:
А) раствор овальбумина (OVA)
В) овальбумин, адсорбированный на альгидрогеле (OVA-Alum)
Salmonella enteritidis
С) наночастицы овальбумина и ChE  (OVASAL)
1
2а
После введения различных композиций на 7, 14, 28, 35, 42 и 49 дни была взята кровь из ретроорбитального сплетения, и образцы были обработаны, как указано в примере 3. Полученные результаты показаны на фигуре 8. Неожиданно OVASAL значительно повысил титр IgG, хотя титр IgG остался на очень низком уровне. Это показывает, что эта композиция оказалась способна усилить только Th2 ответ, который был также гораздо более быстрым и интенсивным, чем у контрольной композиции (OVA-Alum). Эти результаты позволяют думать о возможном применении заявляемой композиции в качестве адъюванта в вакцинах с получением высоких уровней антител или против токсинов, вырабатываемых микроорганизмами. Также было бы возможно применение при определенных аутоиммунных заболеваниях, характеризующихся чрезмерно высоким Th1 ответом в острой фазе.
Пример 6
Salmonella enteritidis
Получение и характеристика биодеградируемых наночастиц с экстрактом НЕ  (NP НЕ 3934)
Salmonella enteritidis
6.1 Выделение и характеристика НЕ антигенного комплекса 3934
S. enteritidis
Salmonella enteritidis
Используемый антиген является экстрактом поверхностных белков , названным НЕ (горячим солевым эксрактом Hot Saline Extract) из-за того факта, что он выделяет антигенный комплекс в солевой среде и с нагревом. Этот НЕ содержит фосфолипиды, поверхностные белки и чистый липополисахарид (S-LPS). Экстракт НЕ был получен способом, описанным ранее [Gamazo et al., Infect. Immun. (1989) 1419-1426]. После культивирования бактерий  3934 в пробирках, содержащих триптиказосоевый бульон (TSB), бактерии были центрифугированы при 7000 х g в течение 30 минут и дважды были промыты солевым раствором. Живые клетки были ресуспендированы в солевом растворе (10 г влажных клеток в 100 мл) и нагреты в паровом потоке при 100°С в течение 15 минут. После центрифугирования (12000 х g, 10 минут) супернатант был подвергнут диализу в течение 5 дней для удаления деионизированной воды. Подвергшийся диализу материал был ультрацентрифугирован в течение 4 часов при 60000 х g, и осадок в пробирке (НЕ) был ресуспендирован в деионизированной воде, лиофилизирован и хранился при комнатной температуре.
Salmonella enteritidis
.
Характеристика включает определение процентного соотношения белка и липополисахарида. Определение количества белка было проведено посредством метода Лоури. Экстракт антигена  3934 содержит приблизительно 31% белка. Количество LPS было определено напрямую посредством одного из его эксклюзивных маркеров KDO с применением способа с использованием тиобарбитуровой кислоты. Посредством этого метода было установлено 0,86% KDO, соответствующее 65% S-LPS
Salmonella enteritidis
6.2 Продуцирование и физикохимические характеристики наночастиц с экстрактом НЕ  3934 (NP HE 3934)
Сначала 100 мг сополимера метилвинилового эфира малеинового ангидрида были растворены в 5 мл ацетона; антигенный экстракт НЕ (4 мг), также ресуспендированный в 1 мл ацетона, был введен в этот раствор и подвергнут смешиванию с магнитным перемешиванием. Этот раствор был инкубирован в течение 15 минут при комнатной температуре. Последовательно в эту фазу были введены 10 мл этанола и такой же объем воды. Полученная в результате смесь была подвергнута гомогенизации в течение 5 минут. Суспензия наночастиц затем была подвергнута упариванию при низком давлении до тех пор, пока оба органических растворителя не были удалены, и конечный объем был доведен водой до 10 мл.
Суспензия была подвергнута очистке посредством ультрацентрифугирования (10 минут при 35000 х g). Супернатанты были удалены, и осадок был ресуспендирован в 5% водном растворе сахарозы м/о (масса/объем). И, наконец, полученная в результате суспензия наночастиц была лиофилизирована, что позволило сохранить все ее первоначальные качества.
Конечный состав суспензии наночастиц перед лиофилизацией:
Сополимер метилвиниловогоэфира малеиновогоангидрида [Gantrez AN 119]
1,0% w/v (м/о)
Экстракт антигена
0,4%
Сахароза
5,0%
Вода для инъекций
до 10 мл
Размер и поверхностный заряд наночастиц определялись перед лиофилизацией. Средний размер полученных наночастиц составлял менее 200 нм и отрицательный суммарный поверхностный заряд (-20,1±3,2 мВ). Конечный выход продукта определяли после процесса лиофилизации. Исходная масса сополимера составила 100 мг, в конце процесса было определено количество, перешедшее в наночастицы, и это было выражено в процентном соотношении к исходной массе сополимера.
Количество экстракта определяли с использованием метода с применением бицинхониновой кислоты. С этой целью брали аликвоту (1 мл) суспензии наночастиц до введения перекрестно-связывающего агента. Перед проверкой этих данных эта смесь была исследована колориметрическим методом с применением бицинхониновой кислоты на белок. Наночастицы расщепляли введением 0,1 н NaOH и эту смесь анализировали в отношении белка колориметрическим методом с бицинхолиновой кислотой. В этот образец был введен раствор бицинхониновой кислоты с 5% сульфатом меди в соотношении 100:2; смесь выдерживали 1,5 часа при температуре 37°С и затем проводили измерения спектрофотометром с длинной волны 562 нм.
Заполняемость экстрактом была выражена как количество экстракта в мкг на мг наночастиц, и эффективность инкапсуляции была определена отношением общего количества инкапсулированного экстракта к исходному количеству.
Таблица 2 показывает заполняемость экстрактом наночастиц (мкг экстракта/мг наночастиц) и эффективность инкапсуляции (%).
Таблица 2Физикохимические характеристики наночастиц Gantrez AN 119, заполненных экстрактом антигена
Композиция
Размер (нм)
Инкапсулированныйэкстракт (мкг/мг)
ЭффективностьИнкапсуляции<sup>а</sup> (%)
NP
171,4±3,9
---
---
NP-HE
<i>S. enteritidis</i>
178±55,4
18,1±6,6
45,2±5,4
<sup>а</sup>: эффективность инкапсуляции - процент инкапсулированного НЕ и он был высчитан, как количество инкапсулированного экстракта антигена, умноженное на 100 и разделенное на исходное количество.
S. enteritidis
На фигуре 9 показан стандартный белок HE , в котором различные компоненты могут быть разделены на: порин (приблизительно 36 кДа), OmpA (34 кДа) и фибрин SEF 14 (14 кДа) и SEF21 (21 кДа). Посредством электрофореза с додецил сульфатом натрия на полиакриламидном геле (SDS-PAGE) и иммуноблоттингом было подтверждено, что икапсулированный экстракт сохранил структурную целостность и антигенные свойства. На фигуре 10 показан антигенный профиль экстракта перед и после инкапсуляции.
Пример 7
Исследование защиты у мышей, обеспечиваемой введением интраперитонеально вакцины NP НЕ 3934
Были использованы группы девятинедельных мышей BALB/c, каждая группа состояла из 10 животных. Вакцинация была проведена вакцинным препаратом с наночастицами (NP НЕ 3934), описанным в Примере 6, в соотношении 30 мкг экстракта на животное, включая также контрольных животных: i) такое же количество соответствующих пустых наночастиц; ii) 30 мкг/животное экстракт НЕ в свободной форме, неинкапсулированный; iii) 200 мкл коммерческой вакцины Salenvac (Intervet UK Limited, Walton, England); iv) солевой раствор.
2
S. enteritidis
S. enteritidis
Через десять дней после вакцинации они были интраперитонеально инокулированы летальной дозой 10 КОЕ штамма  3934 и после этой инокуляции было определено число животных, умерших от салмонеллеза. Результаты эксперимента по защите показывают, что препарат вакцины на основе наночастиц (NP НЕ 3934) при введении подкожно защищает от подобно защите, вызываемой коммерческой вакциной Salenvac, так же как и экстракт НЕ антигена, введенный в свободной форме (НЕ Se 3934).
Результаты показывают, что инкапсуляция экстрактов НЕ в наночастицы не повышает уровни защиты у мышей. В то же время иммунизация мышей пустыми наночастицами индуцирует неспецифический иммунный ответ, который обеспечивает защиту в течение трех недель. Кроме того, следует отметить, что способ введения НЕ антигена, как в свободной, так и в инкапсулированной форме, был проведен интраперитониально. В более ранних исследованиях предполагалось, что пероральное или интраназальное введение неинкапсулированных антигенов могло быть причиной их деградации, прежде чем они достигнут мест взаимодействия с антиген-презентующими клетками.
2a
1
Кроме того, через 10 дней после вакцинации были проведены исследования иммунитета, обеспеченного наночастицами, введенными в момент экспериментальной инфекции, определялось количество IFN-γ и уровни продуцирования IL-4 (типичные для Th1 и Th2 типов иммунного ответа соответственно), выработанного клетками селезенки мышей (фигура 12). Также было определено продуцирование антител IgG и IgG в крови (Th1 и Th2 соответственно) (фигура 13).
Для изучения иммунного баланса Th1/Th2, индуцированного свободным и инкапсулированным экстрактами НЕ у мышей, участвовавших в исследовании, были определены IFN-γ и уровни продуцирования IL-4, выработанного клетками селезенки иммунизированных животных (фигура 12). На Панели А показаны индуцированные уровни IFN-γ, демонстрирующие повышение указанного продуцирования у мышей, иммунизированных наночастицами (NP HE 3934). В противовес на Панели В показано, как незначительно возрастает уровень продуцирования IL-4 у мышей, иммунизированных экстрактом НЕ (НЕ 3934) в свободной форме, и у мышей, иммунизированных наночастицами NP HE 3934. Принимая во внимание полученные результаты, можно подтвердить, что инкапсуляция экстрактов НЕ в наночастицы способствует повышению Th1 типа иммунного ответа, подтвержденного повышением продуцирования IFN-γ по сравнению с Th2.
S. enteritidis
S. enteritidis
2a
1
2a
1
Было исследовано посредством прямого ELISA продуцирование специфических антител против экстрактов НЕ  3934 у иммунизированных мышей (фигура 13). У неиммунизированных мышей или мышей, иммунизированных пустыми наночастицами (пустые NP), не продуцировались антитела IgG или IgG против экстракта НЕ 3934. Уровни IgG, определенные анализом ELISA, были значительно выше, чем уровни IgG во всех сыворотках, полученных от мышей. Кроме того, не наблюдалось повышение серологической реакции у мышей, иммунизированных экстрактами NP НЕ (НЕ 3934), в сравнении с реакцией, показанной мышами, иммунизированными экстрактами НЕ (НЕ 3934) в свободной форме.
2a
1
S. enteritidis
IgG является доминирующим изотипом антитела в Th1 иммунных ответах, хотя IgG обладает такой же функцией для Th2 иммунных ответов, которые могли бы подтвердить результаты, полученные в исследовании высвобождения IFN-γ и IL-4, демонстрирующие, что интраперитонеальное введение наночастиц с экстрактами НЕ индуцирует преобладание Th1 типа иммунного ответа. Это введение обеспечивает такую же степень защиты от сальмонеллеза, как и при введении антигена в свободной форме. Кроме того, как было описано ранее, применение этих не инкапсулированных антигенов через слизистую оболочку могло бы не дать эти уровни защиты, наблюдаемые в этом эксперименте, из-за кислоты и разрушения ферментами, которое они могли испытать, проходя через желудочно-кишечный тракт животного.