Оценка системы скрещивания в популяциях Pinus cembra L. (Pinaceae) с помощью изоферментных и микросателлитных маркеров

ОЦЕНКА СИСТЕМЫ СКРЕЩИВАНИЯ В ПОПУЛЯЦИЯХ PINUS CEMBRA L.

(PINACEAE) С ПОМОЩЬЮ ИЗОФЕРМЕНТНЫХ И МИКРОСАТЕЛЛИТНЫХ

МАРКЕРОВ

Е.А. МУДРИК, кандидат биологических наук;

М.М. БЕЛОКОНЬ, кандидат биологических наук;

Ю.С. БЕЛОКОНЬ, Е В. ЖУЛИНА, Д.В. ПОЛИТОВ, доктор биологических наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, Москва, Россия

Введение

Анализ системы скрещивания перекрестноопыляемых растений имеет ключевое значение для выявления роли инбридинга в формировании генетической изменчивости и дифференциации популяций, особенно у видов с фрагментированным ареалом. Сокращение ареала и, как следствие, изоляция и затруднение потока генов приводят к изменениям в генетической структуре популяций, в том числе и к нарушению оптимального соотношения доли само- и перекрестного опыления растений. Сосна кедровая европейская (Pinus cembra L.), реликтовый вид субальпийского пояса Альп и Карпат, испытывает хроническое антропогенное воздействие вследствие интенсивного землепользования и вырубки лесов, что отрицательно отражается на внутривидовом уровне генетического разнообразия. Так, ранее с использованием изоферментов в качестве генетических маркеров нами был показан высокий уровень инбридинга в популяциях на восточной границе распространения P. cembra - в Украинских Карпатах [1-4]. Особенности системы скрещивания этого вида в основной, альпийской, части ареала практически не изучены. В единственной популяции из Итальянских Альп, где оценки системы скрещивания были получены по трем алллозимным локусам [5], уровень ауткроссинга был выше, чем в карпатских, но ниже, чем у близкородственного широкоареального вида - сосны кедровой сибирской (Pinus sibirica Du Tour) [1, 2]. В этой связи представляет интерес исследование уровня инбридинга P. cembra из центральной части ареала, что более полно отобразит направление генетических процессов в популяциях различного географического происхождения и вида в целом. В настоящее время для анализа системы скрещивания разных древесных растений все большее применение находят маркеры изменчивости ДНК, а именно микросателлитные локусы (SSR - single sequence repeat) [6, 7]. В пользу их использования свидетельствует кодоминантность, полиаллельность и высокий уровень полиморфизма, а также потенциально большая селективная нейтральность по сравнению с изоферментами. Исследований, посвященных прямым сравнениям оценок системы скрещивания по этим двум классам маркеров, практически нет. Данная работа посвящена анализу параметров системы скрещивания P. cembra в альпийских популяциях с одновременным использованием традиционных молекулярно-генетических маркеров (изоферменты) и маркеров «нового поколения» (ядерные микросателлиты).

Объекты и методы исследования

В качестве материала для исследования использовали семена от свободного опыления двух популяций P. cembra из западной и восточной частей Австрийских Альп: Умхаузен (25 деревьев, 47° 05' с.ш., 10° 01' в.д, 1800-1980 м н.у.м.) и Пааль (30 деревьев, 47° 02' с.ш., 14° 01' в.д., 1650-1900 м н.у.м.). Особенности репродуктивной биологии хвойных позволяют при одновременном анализе гаплоидного эндосперма (мегагаметофита) и диплоидного зародыша одного семени идентифицировать материнский и отцовский аллели в генотипе зародыша, что учитывается при расчете доли самоопыления и повышает точность и устойчивость ее оценок. Согласно рекомендациям К.Ритланда [8], от каждого материнского дерева анализировали по 8 семян (отдельно гаплоидный эндосперм и диплоидный зародыш), при этом выборки зародышей составили соответственно 200 и 240 образцов в двух изученных популяциях. Генотипы материнских деревьев устанавливали по сегрегации аллелей среди эндоспермов. В качестве изоферментных маркеров использовали полиморфные локусы алкогольдегидрогеназы (Aclh-I). формиатдегидрогеназы (Fdh), лейцинаминопептидазы (Lap-3), малатдегидрогеназы (Mdh-2, Mdh-4) и фосфоглюкомутазы (Pgm-1), для которых идентификация аллелей и генотипов была наиболее надежна и в гаплоидных, и диплоидных тканях семени. Электрофорез изоферментов

эндоспермов и зародышей семян проводили на соседних дорожках крахмального геля по описанной ранее методике [9]. В качестве микросателлитных маркеров использовали локусы Pclb, Pel 8, Рс23 [10]. Выделение ДНК осуществляли с помощью набора реагентов DIAtom™ DNA Prep 100, электрофорез ПЦР-продуктов проводили в полиакриламидном геле в трис-ЭДТА-боратной буферной системе, окрашивание гелей - раствором бромистого этидия с последующей визуализацией в УФ-свете. Средние однолокусные (4) и многолокусные (/ГТ1) оценки степени перекрестного опыления производили с помощью программы MLTR 3.0 [8, 11], для расчета параметров генетической изменчивости использовали надстройку для электронной таблицы MS Excel - GenAlex 6.1 [12].

Результаты и обсуждение

Средние значения однолокусной оценки (4) для шести изоферментных локусов существенно отличались в двух изученных популяциях и составили соответственно 0,925 в западно- и 0,774 в восточноавстрийской выборках (табл. 1). Многолокусная оценка (im=0,916) в популяции Умхаузен соответствовала однолокусной, а в популяции Пааль была значительно выше (/,„=0.880). но в среднем между обеими выборками отличалась только на уровне ошибки. При допущении, что полное перекрестное опыление (ауткроссинг) принимается за 1, процент инбредных семян в изучаемых популяциях составил от 8,4 (Умхаузен) до 12% (Пааль). Главная причина инбридинга заключается в самоопылении растений, однако в выборке Пааль помимо собственно самоопыления около 10 % скрещиваний происходит между близкородственными растениями (biparental inbreeding), на что указывает существенная разница значений At=tm - 4 =0,107.

Таблица 1

Значения параметров системы скрещивания в популяциях сетЪга по данным

изоферментных и микросателлитных (88Ы) маркеров

ока-затель Популяция

Австрийские Альпы Украинские Карпаты [3, 4]

Умхаузен Пааль Горганы Яйко

зоферменты SSR ¡оферменты SSR юферменты зоферменты

4 ),925±0,080 823±0,039 ,774±0,049 ,819±0,044 ,706±0,070 ),645±0,058

4п ),916±0,070 879±0,036 ,880±0,036 ,893±0,038 ,748±0,064 ),700±0,054

п 4 -0,009 0,056 0,107 0,074 0,042 0,056

IS(exp) 0,044 0,064 0,064 0,057 0,172 0,215

F1S 0,025 0,080 0,080 0,120 0,113 0,229

Примечание. 4 - однолокусная оценка, /т - многолокусная оценка, 1<\к - фактический коэффициент инбридинга, ^(ехр) - ожидаемый коэффициент инбридинга.

Полученные оценки показателей ауткроссинга превышают таковые для Р. cembra из Итальянских Альп (tm = 0,808) [5] и особенно Украинских Карпат, уровень инбридинга которых достигает 25-30% [3, 4] (табл. 1). Вероятная причина такого разброса значений заключается в низкой эффективной численности и плотности растений Р. cembra в Украинских Карпатах (древостой на 70-80% состоят из ели, что создает экранирующий эффект и затрудняет перенос пыльцы Р. cembra), тогда как достаточно высокие значения ауткроссинга в выборках из основной части ареала в Австрийских Альпах соответствуют данным, установленным для близкородственного вида с широким ареалом - Р. sibirica (/m = 0,882) [1, 2]. Уровень инбридинга в обеих австрийских популяциях Р. cembra, оцененный с помощью индекса фиксации Райта (Fis), в среднем оказался невысоким и показал дефицит гетерозигот соответственно 2,5 и 6,4% (табл. 1). В карпатских выборках дефицит гетерозигот был больше -11,3 и 22,9%. В целом полученные значения FiS соответствовали ожидаемым (/''[Si:V,;p:i). рассчитанным из значений /ГТ1 по формуле -Fis(exP)= (l-t)/(l+t) [13].

Значения многолокусной оценки степени ауткроссинга австрийской Р. cembra на основе анализа трех микросателлитных локусов оказались близкими в обеих популяциях и соответствовали изоферментным данным. Однако значения 4 не отличались между популяциями, как это было показано по аллозимам. Положительная разница At=tm—ts

свидетельствует о близкородственных скрещиваниях в обеих выборках. Уровень инбридинга (8 и 12%), установленный с помощью микросателлитных локусов, был выше, чем по изоферментным. Завышенные значения 1<]к по микросателлитам могут быть связаны со спецификой использования данных маркеров: существует вероятность неучтенных гетерозиготных зародышей в случае, если их генотипы содержат т.н. нуль-аллели. Из-за мутаций в зоне отжига праймеров некоторые аллели микросателлитных локусов не амплифицируются в ПЦР, что затрудняет идентификацию гетерозиготных генотипов.

Уровень генетической изменчивости австрийских популяций P. cembra по данным микросателлитных локусов оказался значительно выше, чем по изоферментным (табл. 2). Это объясняется высоким полиморфизмом SSR-маркеров: среднее число аллелей (Ад) на изоферментный локус в выборках материнских деревьев и зародышей семян было в пределах 2,0-3,3, тогда как в случае с микросателлитами ~ 6,7-8,0 (деревья) и 9,0-12,3 (зародыши).

Таблица 2

Генетическая изменчивость австрийских популяций Л/шж сетЪга в выборках материнских деревьев (Д) и зародышей их семян (3) по данным изоферментных и

микросателлитных маркеров

Выборка Маркер

изоферменты микросателлиты

Na Но яЕ FÏS Na Но яЕ FÏS

Умхаузен д 2,000 0,159±0 050 0,188±0 073 0,037± 0,069 6,667 0,600±0 262 0,573±0 248 -0,045± 0,041

3 2,333 0,172±0 069 0,181±0 073 0,025± 0,027 9,000 0,536±0 238 0,576±0 252 0,080± 0,035

Пааль Д 2,833 0,353±0 106 0,287±0 06Ç -0,171± 0,080 8,000 0,575±0 207 0,571±0 211 -0,026± 0,026

3 3,333 0,248±0 071 0,265±0 07С 0,080± 0,039 12,333 0,451±0 207 0,530±0 242 0,120± 0,043

Примечание. Ад - среднее число аллелей на локус, Н0 - наблюдаемая гетерозиготность, НЕ -ожидаемая гетерозиготность, ^ - коэффициент инбридинга.

Недостаток гетерозигот в выборках зародышей у хвойных, обусловленный самоопылением и частично скрещиваниями между совместно произрастающими родственными растениями (семейственная структура), как правило, нивелируется к репродуктивной стадии деревьев, приводя генетическую структуру популяции к равновесному состоянию согласно закону Харди-Вайнберга или к небольшому эксцессу гетерозигот (отбор против инбредного потомства и балансирующий отбор в пользу гетерозигот) [1, 2, 14]. Наглядное проявление этой тенденции можно наблюдать в выборке Пааль, где значение наблюдаемой аллозимной гетерозиготности было существенно выше у материнских деревьев (0,353), чем у зародышей (0,248). При сравнении микросателлитной гетерозиготности на разных онтогенетических стадиях подобная тенденция к повышению ее уровней в репродуктивной части популяции также наблюдается (табл. 2), что в некоторой степени противоречит представлениям о селективной нейтральности микросателлитов. Отрицательные значения коэффициента инбридинга Fis в изучаемых популяциях P. cembra свидетельствуют о дефиците гетерозигот у зародышей и их слабом избытке в выборках материнских растений. Однако в связи с большими, чем по аллозимам, статистическими ошибками микросателлитных оценок, об устойчивости этой тенденции и возможных ее объяснениях можно будет судить лишь при анализе более репрезентативного массива данных.

Выводы

Анализ системы скрещивания в двух популяциях P. cembra из Австрийских Альп выявил высокую степень перекрестного опыления растений как с использованием изоферментных, так и микросателлитных локусов. Многолокусные оценки ауткроссинга в этих популяциях по изоферментам значительно превышали данные, полученные ранее для карпатских выборок Р.

cembra. Показана эффективность одновременного применения двух классов генетических маркеров - аллозимов и микросателлитов - для анализа системы скрещивания и выявления причин инбридинга в популяциях хвойных.

Благодарность

Выражаем большую признательность за предоставление семян P. cembra из Австрийских Альп Dr. Silvio Schtieler (Федеральный исследовательский центр по лесам, Вена, Австрия) в рамках сотрудничества, инициированного грантом РФФИ 08-04-92670 АНФ-з «Молекулярно-генетические маркеры, филогеография и популяционная генетика для устойчивого лесного хозяйства: Евроазиатская перспектива». Работа поддержана программами Президиума РАН «Биологическое разнообразие» (подпрограмма «Генофонды и генетическое разнообразие») и «Происхождение биосферы и эволюция био-геологических систем» (направление II), ОБН РАН «Биоресурсы России: Оценка состояния и фундаментальные основы мониторинга», а также ФЦП «Научно-педагогические кадры инновационной России» (направление 1.1, Госконтракт 02.740.11.0281).

Список литературы

1. Политов Д.В., Крутовский К.В., Алтухов Ю.П. Характеристика генофондов популяций кедровых сосен по совокупности изоферментных локусов // Генетика.-1992.-Т. 28, № 1.-С. 93-114.

2. Politov D.V., Krutovskii K.V. Allozyme polymorphism, heterozygosity, and mating system of stone pines (Pinus, subsection Cembrae) // Proceedings International workshop on subalpine stone pines and their environment: The status of our knowledge. Ogden, Utah: USDA Forest Service Intermountain Research Station, 1994.-P. 36-42.

3. Система скрещивания и возрастная динамика уровней инбридинга в популяциях Pinus cembra L. Украинских Карпат / Политов Д.В., Пирко Н.Н., Пирко Я.В., Мудрик Е.А., Белоконь М.М., Коршиков И.И // Науков1 записки Тернопшьського нацюнального псдагопчного ушверситету ¡м.Володимира Гнатюка. Се pi я: Бюлопя.-2007. - Т. 3, № 33. - С. 80-85.

4. Analysis of mating system in two Pinus cembra L. populations of the Ukrainian Carpathians / Politov D.V., Pirko Ya.V., Pirko N.N., Mudrik E.A., Korshikov I.I. // Annals of Forest Research (ICAS).- 2008. - V. 51.-P. 11-18.

5. Lewandowski A., Burczyk J. Mating system and genetic diversity in natural populations of European larch (Larix decidua) and stone pine (Pinus cembra) located at higher elevations // Silvae Genetica. - 2000. - V. 49, № 3. - P. 158-161.

6. Lian C.L., Miwa M., Hogetsu T. Outcrossing and paternity analysis of Pinus densiflora (Japanese red pine) by microsatellite polymorphism // Heredity. - 2001. - V. 87. - P. 88-98.

7. Use of molecular markers for estimating breeding parameters: a case study in a Pinus pinaster Ait. progeny trial / Gaspar M.J., de-Lucas A., Alia R., Paiva J.A.P., Hidalgo E., Louzada J., Almeida H., Gonzalez-Martinez S.C. // Tree Genetics & Genomes. - 2009. - V. 5, № 4. - P. 609-616.

8. Ritland K. Estimation of mating systems // Isozymes in Plant Genetics and Breeding. Amsterdam: Elsevier Science Publishers, 1983. - P. 289-302.

9. Аллозимный полиморфизм европейской кедровой сосны, Pinus cembra L. в горных популяциях Альп и Восточных Карпат / Белоконь М.М., Политов Д.В., Белоконь Ю.С., Алтухов Ю.П.//Генетика.-2005.-Т. 41, № 11.-С. 1538-1551.

10. Isolation and characterization of polymorphic nuclear microsatellite loci in Pinus cembra L. / Salzer K., Sebastiani F., Gugerli F., Buonamici A., Vendramin G.G. // Molecular Ecology Resources. - 2009. - V. 9. - P. 858-861.

11. Ritland K. Extensions of models for the estimation of mating systems using n independent loci // Heredity. - 2002. - V. 88. - P. 221-228.

12.Peakall R., Smouse P.E. GenAlex 6: Genetic Analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research // Molecular Ecology Notes. - 2006. - V. 6. - P. 288-295.

13.Brown A.H.D., Burdon J.J., Jarosz A.M. Isozyme analysis of plant mating systems // Isozymes in plant biology. Dioscorides Press; Portland Oregon; USA, 1989. - P. 73-86.

14. Altukhov Yu.P. The role of balancing selection and overdominance in maintaining allozyme polymorphism // Genetica. - 1991. - V. 85, № 1. - P. 79-90.

Рекомендовано к печати д.б.н. Коба В.П.