Механизм биокаталитических процессов с участием фторхинолонов в бактериях

Вестник ДВО РАН. 2010. № 5

УДК 546.65; 535.37

А.В.ПОЛИЩУК, Э.ТКАРАСЕВА, В.Е.КАРАСЕВ

Механизм биокаталитических процессов с участием фторхинолонов в бактериях

На основе современных представлений об ингибировании ДНК-гиразы и топоизомеразы IVпредложен механизм биокаталитических процессов в микроорганизмах с участием фторхинолонов.

Ключевые слова: фторхинолоны, катализ, антибиотики.

Mechanism of the biocatalytic processes in bacteria with participation of fluoroquinolones. A.V.POLISHCHUK,

E.T.KARASEVA, V.E.KARASEV (Institute of Chemistry, FEB RAS, Vladivostok).

On the basis of modern ideas of the inhibition process of DNA-gyrase and topoisomerasa IV mechanism of the biocatalytic reactions in microorganisms with the quinolones participation has been suggested.

Key words: fluoroquinolones, biocatalytic reactions, antibiotic.

При лечении инфекционных заболеваний используются фторхинолоны (структурная формула на рис. 1, центральный фрагмент), составляющие конкуренцию цефалоспоринам. В настоящее время разрабатываются фторхинолоны четвертого поколения [3].

Считается, что потенциальные возможности модификации хинолоновой структуры неисчерпаемы. Основное направление структурно-функциональных исследований хино-лонов - получение путем направленной модификации веществ с измененным антимикробным действием, повышенной активностью против микроорганизмов с приобретенной резистентностью к препаратам, измененной фармакокинетикой и т.д. Мишенью действия хинолонов являются бактериальные топоизомеразы - топоизомераза IV и ДНК-гираза, ферменты, изменяющие пространственную конфигурацию молекулы ДНК на различных этапах ее репликации. ДНК-гираза катализирует расплетение (отрицательную суперспи-рализацию) молекул ДНК. Топоизомераза IV участвует в разъединении ковалентно-замкнутых кольцевых молекул ДНК. Хинолоны, обладая низкой аффинностью к свободным молекулам топоизомеразы или ДНК, проявляют высокое сродство к комплексу ДНК-фер-мент. Принято считать, что образование тройного комплекса ДНК-фермент-хинолон приводит к нарушению репликации бактериальной ДНК и гибели клетки. Тем не менее механизм биологической активности фторхинолонов на молекулярном уровне продолжает во многом оставаться неясным несмотря на то, что подавляемый ими фундаментальный процесс жизнедеятельности - репликация ДНК - является основополагающим в молекулярной биологии. Представление о непосредственной реакции молекулы антибиотика с ДНК-гиразой и топоизомеразой IV само по себе не дает четкой картины из-за сложности этого многофункционального каталитического комплекса.

На основе современных представлений об ингибировании ДНК-гиразы и топоизоме-разы IV нами впервые предложен механизм биокаталитических процессов в микроорганизмах в присутствии фторхинолонов.

ПОЛИЩУК Анна Владимировна - кандидат химических наук, научный сотрудник, КАРАСЕВА Эмилия Тойвовна - кандидат химических наук, научный сотрудник, КАРАСЕВ Владимир Егорович - доктор химических наук, заведующий лабораторией (Институт химии ДВО РАН, Владивосток). E-mail: anpoli_anna@hotmail.com

Участок полипептидной цепи ферментов, в котором связывается хинолон, получил название хи-нолонового кармана [4] (рис. 1).

Резистентность к фторхиноло-нам формируется из-за аминокислотных замен в области хиноло-нового кармана. Для объяснения физико-химических процессов в водной среде, включающих ДНК, топоизомеразы II и IV и антибиотик, нами выдвинута гипотеза о том, что в качестве одного из основных механизмов химических процессов, протекающих в таких системах живых микроорганизмов, следует считать кислотно-основной катализ. При этом хиноло-ны, по нашему мнению, способны выступать в качестве коферментов либо антиферментов в таких реакциях. Для запуска химических реакций с участием кислотно-основного катализа требуется соблюдение ряда условий по формированию комплексных соединений, включающих группу, выступающую как донор электрона и протона, а также группу, склонную акцептировать электрон или протон [2]. Молекулы воды также участвуют в окислительно-восстановительных реакциях, поскольку гидроксильный ион ОН- как сильный донор электрона легко теряет его с образованием радикала ОНг Протон Н+(Н3О+) как сильный акцептор электрона может присоединить электрон. В водной среде, где сформирован комплекс, включающий ДНК, топоизомеразу и антибиотик (хинолон), присутствуют электронно- и протонодонорные группы, с одной стороны, и электроноакцепторные и протоноакцепторные группы - с другой. По существу, имеется донорно-акцепторный комплекс с большим количеством Н-связей (рис. 1).

Ферментативным реакциям присущи высокая эффективность, специфичность типа и избирательность в отношении соединений, с которыми индивидуальный фермент должен работать. Молекула воды, образуя водородную связь, оттягивает водород, помогая ему оторваться. При проникновении хинолона в бактериальную клетку ферментативная реакция суперспирализации с участием ДНК-гиразы нарушается. По нашему мнению, фтор-хинолон, находясь в активном центре, выступает в качестве «антифермента».

Необходимо отметить, что в активном центре фермента (серин 83, аргенин 87) реагенты должны принимать наиболее реакционные формы и ориентироваться вдоль координаты реакции. Каждое из этих действий требует определенной порции энергии [1].

Поскольку вероятность протекания или скорость химического процесса определяется энергией возбужденного донорно-акцепторного комплекса, включающего ДНК-гиразу, хинолон и воду, то, чем ниже расположены Т1) уровни, тем выше их заселенность. Это в свою очередь приводит к большему числу актов, совершаемых в единицу времени. Одним из условий формирования низколежащих электронных возбужденных состояний таких систем является обязательность Н-связывания донора и акцептора. В интервале pH 1,5-8, характерного для желудочно-кишечного тракта млекопитающих, наблюдается сосуществование анионной, катионной и нейтральной форм фторхинолона в различных концентрациях [6]. Это облегчает протонный обмен. На рис. 2 на примере антибиотика ципрофлоксацина (cfqH) оценены интервалы между величинами энергий S1 - состояний нейтральной, анионной и катионной форм.

Рис. 1. Модель хинолонового кармана ДНК-гиразы [5]

Данные рассчитаны из спектров поглощения и люминесценции различных протолитических форм cfqH. Оценка величин энергетических зазоров показывает, что эти значения лежат в достаточно узком интервале - 1,5—5,0 ккал/моль. В таком случае активационные барьеры при переходе от одной протолитической формы к другой невелики. Это позволяет путем небольших физических воздействий (оптического или термического) преодолевать профили энергии вдоль пути ферментативной реакции. С физической точки зрения одновременное участие различных протолитических форм антибиотика способствует сглаживанию уровней энергии промежуточных соединений системы с помощью невалентных взаимодействий. Другими словами, участие протолитических форм фторхинолонов в ферментативных превращениях шлифует профиль вдоль пути реакции так, чтобы «шероховатости» не превышали нескольких килокалорий на моль (рис. 2). Как видно из рис. 1, точками прикрепления хинолона к фосфатной группе (ионная связь через посредство Mg2+) ДНК являются атомы кислорода карбонильной и карбоксильной групп. Азот пиперазинильного кольца образует водородную связь с гуанином и аспарагином. Заместители (С2Н5-, С3Н5-, СН3-группы) в молекуле хинолона вступают в гидрофобное взаимодействие с неполярными группировками ДНК.

Фторхинолон присутствует в топоизомеразе в виде цвиттер-иона или катиона. Второй участник ферментативной реакции - одна или несколько аминокислот. В обзоре [5]

Рис. 2. Схема энергетических уровней 80 ^ Б1* переходов различных протолитических форм cfqH в водном растворе

Рис. 3. Схема взаимодействия c ATP 6-гидроксиметил-7,8-дигидроптерина

приводится вариант модели химического связывания фторхинолона с ДНК-гиразой с непосредственным участием аденина, цитозина, гуанина и тимина (рис. 1).

Фосфатогруппы ДНК взаимодействуют с хинолоном как через связывание атомами кислорода карбонильной и карбоксильной групп с комплексообразователем - ионом Mg2+, так и непосредственно путем H-связывания с атомом азота пиперазинильной группы (R7).

С учетом данных [4] нами выдвинута гипотеза о том, что при встраивании хинолона в клетку бактерии, например Escherichia coli, вместо близкого по строению 6-гидрокси-метил-7,8-дигидроптерина и при последующем взаимодействии с аденозинтрифосфатной группой через HPPK-киназу (пирофосфокиназу) по схеме (рис. 3б) антибиотик меняет весь ход каталитической реакции, протекающий в E. coli. В свою очередь после закрепления хинолона в активном центре возможен перенос протона с аминокислоты субстрата на молекулу антибиотика и обратно. Образовавшиеся при этом основные центры готовы акцептировать протон. Для полноты общей картины стадийности химических процессов необходим учет конформационных превращений антибиотика, в том числе возможности вращения карбоксильной группы вокруг связи C-COOH. Эффективность и специфичность антибиотика в качестве кофермента или антифермента достигаются за счет заимствования части энергии при связывании реагентов с аминокислотами и азотистыми основаниями при многоточечных контактах. Оптимальные условия протекания каждой стадии создаются за счет структурных и электронных изменений на предшествующих стадиях.

ЛИТЕРАТУРА

1. Иванов В.И. Как работают ферменты // Соросовский образоват. журн. 1996. № 9. С. 26-32.

2. Калниньш К.К. Электронное возбуждение в химии. СПб.: Изд-во СПГУТД, 1998. 327 с.

3. Hooper D.C. Mode of action of fluoroquinolones // Drugs. 1999. Vol. 58, N 2. P. 6-10.

4. Lescop E., Lu Z., Liu Q. et al. Dynamics of the conformational transitions in the assembling of the Michaelis complex of a bisubstrate enzyme: A 15N relaxation study of Escherichia coli 6-hydroxymethyl-7,8-dihydropterin pyro-phosphokinase // Biochem. 2009. Vol. 48. P. 302-312.

5. Mitscher L.A. Bacterial topoisomerase inhibitors: quinolone and pyridone antibacterial agents // Chem. Rev. 2005. Vol. 105(2). P. 559-592.

6. Sun J., Sakai S., Tauchi Y. et al. Determination of lipophilicity of two quinolone antibacterials, ciprofloxacin and grepafloxacin, in the protonation equilibrium // Eur. J. Pharm. Biopharm. 2002. Vol. 54. P. 51-58.