СПОСОБ И СИСТЕМА ДЛЯ НЕРАЗРУШАЮЩЕГО IN OVO ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОЛА ПТИЦЫ
METHOD AND SYSTEM FOR NON-DESTRUCTIVE IN OVO DETERMINATION OF BIRD SEX

ОПИСАНИЕ
Область техники, к которой относится настоящее изобретение
Настоящее изобретение относится к способу неразрушающего определения in ovo пола у видов яйцекладущих, в частности, у видов птиц, более конкретно, у вида Gallus gallus. Способ в соответствии с настоящим изобретением, кроме того, относится к отбору яиц мужского пола и яиц женского пола, а также к получению групп живых животных с использованием этих отобранных яиц.
Яйцекладущие животные откладывают яйца с непродолжительным эмбриональным развитием в организме матери или вообще без такового. Выращивание яйцекладущих животных и их яиц обеспечивает постоянно растущую часть мирового производства белка, а также различные другие крупные промышленные процессы, такие как производство вакцин. В настоящее время наиболее важные способы выращивания яйцекладущих животных включают в себя разведение видов птиц, таких как домашняя птица, и культивирование водных организмов, т.е. выращивание водных организмов, таких как рыба, ракообразные и моллюски. В частности, курица, а точнее джунглевая курица, т.е. вид Gallus gallus domesticus, безусловно, является наиболее выращиваемым видом яйцекладущих в мире.
Уровень техники настоящего изобретения
Оплодотворенные куриные яйца имеют тенденцию обеспечивать примерно равное распределение самцов и самок животных. Однако по разным причинам при управлении инкубаторно-птицеводческой станцией может быть желательно разделение животных по различным характеристикам, в частности, по полу. Например, при коммерческом производстве домашней курицы и яиц инкубация и выращивание цыплят мужского пола крайне нежелательны, что приводит к выбраковке миллиардов цыплят мужского пола каждый год.
В настоящее время в обоих случаях смешанные популяции вылупившихся цыплят подвергаются разделению по половому признаку путем визуальной оценки молоди животных, а иногда даже взрослой популяции, в тех случаях, когда молодь не имеет соответствующих признаков. В любом случае это очень трудоемкий процесс, требующий высококвалифицированных операторов и, как правило, очень стрессовый для животных.
Более того, для коммерческого производства яиц инкубация и выращивание цыплят мужского пола крайне нежелательны, что приводит к выбраковке миллиардов цыплят мужского пола каждый год. Кроме того, имеется процент яиц, которые не оплодотворены или не содержат жизнеспособного эмбриона в начале инкубационного периода, что значительно снижает производительность инкубаторов на инкубаторно-птицеводческих станциях.
Кроме того, если взрослых животных разделяют по полу, то все популяции необходимо выращивать до минимального возраста, в то время как только половина выращенных таким образом животных используется для размножения после разделения. Другие проблемы могут возникать, когда наличие, например, мужской популяции может приводить к снижению производительности, например, из-за каннибализма и снижения плотности фермерского хозяйства.
Кроме того, имеется процент яиц, которые не оплодотворены или не содержат жизнеспособного эмбриона в начале инкубационного периода, что значительно снижает производительность инкубаторов, используемых на инкубаторно-птицеводческих станциях, в частности, для яиц домашней птицы.
В результате требуется производственная мощность инкубатора, которая по меньшей мере вдвое превышает необходимую, если не возможен ранний отбор по полу, позволяющий отбирать в основном только мужские или женские эмбрионы.
Соответственно, это будет иметь большое значение для окружающей среды благодаря уменьшению количества энергии и других необходимых ресурсов, а в равной степени и для устранения ненужных животных путем выбраковки, а также для снижения стресса недавно вылупившихся животных, если способ был доступен на ранней стадии, что позволило определить пол эмбрионов птиц до стадии инкубации, что также позволило значительно увеличить производственную мощность инкубаторно-птицеводческой станции. Дополнительным преимуществом могло стать то, что этот способ также позволял бы отбирать жизнеспособные эмбрионы по сравнению с неоплодотворенными и/или иным образом нежизнеспособными яйцами, что еще больше повысило бы эффективность процесса вылупления.
В литературе раскрываются различные способы, качающиеся определений пола птичьего эмбриона посредством выявления некоторых метаболитов в яйцах, например, с помощью ЯМР-спектроскопии, например, см. Y. Feng et al., Appl. Magn. Reson. (2007), 32, 257-268; с помощью анализа HPLC, см. Gu D.-C. et al., Chinese Journal of Animal Science, Vol. 7, 23-25, а также с помощью применения специфически связывающего целевые молекулы биомаркера, который позволяет проводить количественную флуоресцентную микроскопию, см., например, WO 2006/124456 для определения присутствия эстрогенного стероидного соединения в качестве маркера. Обычно отмечают, что стероиды представляют собой довольно крупные молекулы, которые с трудом испаряются.
Недостаток большинства способов, упомянутых выше в настоящем документе, заключается в том, что они не способны обеспечить неразрушающее определение пола курицы, так как требуются большие количества метаболитов, что может не позволить эмбриону существовать и полностью развиваться после забора образца. Кроме того, для этих способов требуется использование оборудования, которое обычно не используется на птицеферме из-за стоимости или сложности, не говоря уже о предоставлении соответствующей производительности для коммерческого выращивания кур.
В WO 2014/021715 раскрывается способ неразрушающего определения пола, стадии развития и/или жизнеспособности птичьего эмбриона в яйце, включающий (а) выявление по меньшей мере первого соединения-маркера развития, выбранного из сахаров и/или аминокислот, их предшественников и метаболитов, в яйце в период времени от начала инкубации яйца до вылупления; (b) измерение количества по меньшей мере первого выявляемого соединения-маркера развития и (с) сравнение количества с базовой линией, установленной для мужского пола и женского пола, стадии развития эмбриона и/или живого и умершего или неразвитого эмбриона, для определения у эмбриона жизнеспособности, мужского пола или женского пола и/или стадии развития эмбриона. Хотя раскрытый способ очень полезен для определения пола, возраста и стадии развития эмбриона, он требует относительно больших количеств образцов из-за низкой чувствительности некоторых методов количественного измерения. Кроме того, некоторые автоматизированные способы трудно реализовать в режиме непрерывного реального времени процесса вылупления, например, с использованием методов ядерного резонанса или методов спектрального резонанса, в том числе спектроскопии комбинационного рассеяния света. Другие способы, хотя и быстрые, требуют наличия относительно дорогого оборудования и/или применения специальных химикатов, таких как маркеры флуоресценции, для конкретных биомаркерных молекул.
Следовательно, сохраняется потребность в более быстром и более чувствительном способе неразрушающего определения пола, а также стадии развития и/или жизнеспособности эмбриона яйцекладущих животных in ovo.
Сущность настоящего изобретения
Поэтому, цель настоящего изобретения заключается в обеспечении способа неразрушающей идентификации характеристики эмбриона Gallus gallus domesticus in ovo, при этом способ включает:
(a) получение образца материала, ассоциированного с яйцом, содержащим эмбрион, и
(b) измерение значения оценки на наличие и концентрацию по меньшей мере первого биомаркера в образце, указывающего на характеристику эмбриона, и
(c) применение порога к значению оценки и количеству, полученному на стадии (b), для идентификации характеристики для эмбриона, ассоциированной с наличием и концентрацией биомаркера,
при этом по меньшей мере первый биомаркер содержит аминосоединение, имеющее молекулярную массу в диапазоне от 140 до 190 г/моль, и при этом наличие и концентрация биомаркера коррелирует с вероятностью развития эмбриона во взрослую особь мужского пола или во взрослую особь женского пола.
Следующая цель заключается в обеспечении системы, способной выполнять анализ яйца в режиме реального времени в удаленных местоположениях, таких как инкубаторно-птицеводческие станции или объекты культивирования водных организмов. Эти и другие цели решаются с помощью устройства и способа в соответствии с настоящим изобретением.
Согласно следующему аспекту заявляемый способ также относится к множеству жизнеспособных яиц женского пола, обеспечивая отбор яиц преимущественно мужского пола или яиц преимущественно женского пола. Согласно следующим аспектам заявляемый способ также относится к популяции молоди животных, получаемой способом в соответствии с настоящим изобретением. Согласно следующим аспектам заявляемый способ также относится к применению множества яиц, получаемых данным способом, для получения продуктов питания для животного и/или человека, для получения и/или выделения косметических, лекарственных и/или питательных соединений, для получения метана посредством ферментации, для получения вакцин и/или для получения высококачественных удобрений.
Согласно следующим аспектам заявляемый способ также относится к системе выявления и анализа пола эмбрионов яйцекладущих животных, содержащей предпочтительно полностью автоматизированное устройство для осуществления заявляемых способов.
Настоящее изобретение также относится к системе, в которой средство идентификации пола реализуют в программном обеспечении на электронном устройстве, сопряженном со спектроскопической системой, и предпочтительно в которой средство идентификации содержит средства программного обеспечения, находящиеся в компьютере.
Краткое описание графических материалов
Далее настоящее изобретение описывается более подробно со ссылкой на сопровождающие графические материалы, в которых показан предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения. Настоящее изобретение, однако, может быть осуществлено во многих других формах и не должно ограничиваться вариантами осуществления, изложенными в настоящем документе; скорее данные варианты осуществления представлены для того, чтобы настоящее раскрытие было подробным и полным, а также полностью представляло объем настоящего изобретения специалистам в данной области.
На фиг. 1 изображена А) модель классификации логистической регрессии по одному признаку, представляющему собой концентрацию 3-[(2-аминоэтил)сульфанил]бутановой кислоты, с точностью более чем 90% для прогнозирования пола; и В) логистическая регрессия по 2 признакам, при этом при применении моделей логистической регрессии по двум биомаркерам точность может быть повышена до >95% точности со дня 10.
На фиг. 2 показан спектр LDPD биомаркера в соответствии с настоящим изобретением в серийном тесте, автоматизированном высокопроизводительном тесте. Способ обеспечивает не только измерение наличия биомаркера, но также и абсолютной концентрации в течение менее чем 10 секунд на отдельном образце.
На фиг. 3 показаны хроматограммы соединений с разными пиковыми значениями масс, варьирующими от 220 до 145, выделенными за 850 секунд из образцов мужского пола (темно-серый цвет) и женского пола (светло-серый цвет).
Подробное описание настоящего изобретения
Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют то же значение, что обычно известно рядовому специалисту в области, к которой принадлежит настоящее изобретение. Терминология, используемая в описании настоящего изобретения, приводится в настоящем документе исключительно с целью описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения настоящего изобретения.
Используемые в настоящем документе термины «птичьи» и «птица» включают в себя особей мужского пола или особей женского пола любых видов птиц, но главным образом охватывают домашнюю птицу, которую коммерчески выращивают для яиц или мяса. Следовательно, термины «птичьи» и «птица», в частности, охватывают красную и серую джунглевую курицу, цыпленка, индеек, уток, гусей, перепела, голубей, страуса, эму и фазанов.
Используемый в настоящем документе термин «инкубация» относится к способу, которым птицы высиживают свои яйца, и к развитию эмбриона в яйце после выхода из тракта несушки. Период инкубации в настоящем документе относится к непрерывному промежутку времени, на протяжении которого конкретное яйцо подвергается условиями, имитирующим высиживание до вылупления, т.е. появления птиц, в том числе любой обработке или перемещению, например, из инкубатора на инкубаторно-птицеводческую станцию, при условии, что развитие птицы не остановлено.
Используемый в настоящем документе термин «in ovo» относится к эмбрионам, содержащимся в яйце до вылупления. Настоящее изобретение может применяться на практике с птицами любого типа, в том числе без ограничения с яйцами (одомашненной) курицы, индейки, утки, гуся, перепела и фазана.
Используемые в настоящем документе термины «инъекция» и «инъецирование» охватывают способы введения устройства (как правило, удлиненного устройства) в яйцо или эмбрион, в том числе способы доставки или выпускания вещества в яйцо или эмбрион, способы извлечения вещества (т.е. образца) из яйца или эмбриона и/или способы введения детекторного устройства в яйцо или эмбрион.
Используемый в настоящем документе термин «масс-спектрометрия» относится к аналитической методике, которая сортирует ионы на основании их масс. Масс-спектрометрию, как правило, используют для химического анализа во многих ситуациях, и она может быть применена для любого образца от комплексной смеси нефтяных продуктов до продуктов генной инженерии. Проще говоря, масс-спектр даст картину точного химического состава образца.
Настоящая заявка согласно первому аспекту относится к определению одного или нескольких аминосоединений, имеющих молекулярную массу в диапазоне от 140 до 190 г/моль, предпочтительно от 150 до 170 г/моль.
3
1
2
1
2
3
3
2
3
2
2
2
2
6
13
2
Заявители неожиданно обнаружили, что специфический метаболит, структурный изомер этионина, указывает на то, будет ли эмбрион развиваться в птенца мужского пола или женского пола. Предпочтительно, биомаркерное соединение характеризуется формулой RSCRHCRHCOOH (I), в которой предпочтительно R представляет собой СН, Н, NH, R представляет собой СН, Н, NH, a R представляет собой -(CH)-NH, или его структурными изомерами. Более предпочтительно, биомаркерное соединение характеризуется формулой CHNOS. Более предпочтительно, оно может быть выбрано из аминокислот, таких как 2-амино-4-этилсульфанилбутановая кислота (также называемая этионином) или ее структурные изомеры, в том числе без ограничения 4-(метилсульфанил)изовалин, 4-(метилсульфанил)изовалин (также известный как 2-амино-2-метил-4-(метилсульфанил)бутановая кислота), N- или изопропилцистеин, 3-(метил-сульфанил)валин, 4-(метилсульфанил)валин, 3-метил-3-сульфанил-изовалин, 4-(метилсульфанил)изовалин, 2-амино-3-метил-4-метилсульфанил-масляная кислота, 5-(метилсульфанил)норвалин, 2-амино-3-метил-3-сульфанилпентановая кислота, метил-3-сульфанил-валинат, метилсульфония метионин, N-метил-D-метионин; 5-амино-6-сульфанилгексановая кислота или подобные; из сложных эфиров аминокислот, таких как метил-2-амино-4-метилсульфанил)бутаноат (также известный как метилметионинат) или его структурные изомеры, такие как этилметил-цистеинат, изопропил-цистеинат, N-пропилцистеинат, или родственных соединений, таких как 2-[(2-гидроксиэтил)сульфанил]-N-метилпропанамид; этилгомоцистеинат, 2-изопропил-1,2-тиазолидин-1,1-диоксид, 1-амино-2,2-диэтоксиэтан-1-тион, 3-[(2-гидроксиэтил)сульфанил]-N-метилпропанамид, пропил-2-амино-3-сульфанилпропаноат, 2-(метиламино)-4-(метилсульфанил)бутановая кислота, 2-[(2-аминоэтил)сульфанил]-2-метилпропановая кислота, 3-[(2-аминоэтил)сульфанил]-2-метилпропановая кислота, 3-[(2-аминоэтил)сульфанил]бутановая кислота, 4-[(2-аминоэтил)сульфанил]бутановая кислота, 2-амино-3-(пропилсульфанил)пропановая кислота, 2-амино-3-(пропан-2-илсульфанил)пропановая кислота и 3-[(2-аминоэтил)сульфанил]бутановая кислота. Соединения или изомеры могут быть рацемическими или могут содержать энантиомеры или стереоизомеры в подходящих отношениях и количествах.
6
13
2
W
Предпочтительно, соединение характеризуется молекулярной формулой CHNOS и моноизотопной массой M 163,0690. В настоящее время оно, по-видимому, идентифицировано как (3-[(2-аминоэтил)сульфанил]бутановая кислота), характеризующаяся структурой согласно общей формуле I:
Заявители выяснили, что концентрация соединения (I) или структурных изомеров, которые могут считаться непротеиногенной аминокислотой, в аллантоисной жидкости на протяжении периода инкубации может быть успешно использована для определения пола эмбриона в яйце, с очень высокой достоверностью. В качестве дополнительного преимущества, этот биомаркер сравнительно легко экстрагируется и/или испаряется, и, поэтому, его можно анализировать относительно легко по сравнению, например, со стероидными соединениями.
Стадия (а) включает получение образца материала, ассоциированного с яйцом, содержащим эмбрион.
Способы и устройство согласно вариантам осуществления настоящего изобретения могут быть использованы для идентификации одной или нескольких характеристик яйца в любой момент времени на протяжении периода эмбрионального развития, также называемого периодом его инкубации. Варианты осуществления настоящего изобретения не ограничиваются конкретным днем на протяжении периода эмбрионального развития.
Способ в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно включает (a1) обеспечение образца, содержащего жидкость яйца; и (а2) получение спектра образца. Необязательная стадия (а3) устраняет предпочтительно мутность образцов подходящим способом, таким как ультрафильтрация или центрифугирование. Как изложено выше, тогда как инвазивные способы позволяют напрямую отбирать образцы и подвергать отобранную жидкость анализу, предпочтительно, чтобы анализ проводился неинвазивно, по причине эффективности такого способа анализа и того факта, что скорлупа яйца и его оболочки остаются неперфорированными. Любой подходящий способ может быть использован для проведения такого неинвазивного анализа.
Если используется неинвазивный способ, то термин «жидкость» в настоящем документе может относиться к летучим соединениям, которые могут быть удалены из яйца без прокола яичной скорлупы. Это можно успешно выполнить путем помещения яйца в камеру выявления, необязательно под небольшим давлением, и путем подачи высвобождаемых летучих соединений для подходящего способа идентификации и количественного определения. В данном случае могут применяться указанные выше способы масс-спектроскопии (МС), в том числе с применением спектрометра ионной подвижности (IMS).
Если анализ выполняют инвазивно, то он обычно включает выделение образца яичного материала. Образец предпочтительно отбирают из эмбриональной жидкости, предпочтительно из аллантоисной жидкости в случае видов птиц, так как это наименее вероятно повредит эмбриону. Аллантоисная жидкость обычно является экскреторной средой для азотсодержащих метаболитов птичьего эмбриона.
Подходящие способы и устройство для прокола яиц и инвазивного отбора образцов материала яйца раскрыты, например, в US-A-20070137577, WO-A-00/22921 или WO-A-99/34667. Взятый таким образом образец затем предпочтительно подвергают подходящему протоколу для обеспечения выявления маркеров развития и анализу относительных и/или абсолютных количеств присутствующих маркеров развития.
Аллантоисная жидкость начинает формироваться приблизительно в день 3 инкубации, как описано в Hamburger, V and Hamilton, HL (1951). "A series of normal stages in the development of the chick embryo". Journal of Morphology 88 (1): 49-92. Там указывается, что аллантоис был различим через 65 часов после инкубации в виде короткого толстостенного кармана; еще не везикулярным. Через 72 часа аллантоис был везикулярным, переменного размера; в среднем по размеру среднего мозга, что указывает на то, что аллантоис и аллантоисная жидкость присутствуют на день 3. В результате, способ в соответствии с настоящим изобретением может быть применен на день 3, если необходимо исследовать аллантоисную жидкость.
Аллантоис достигает максимального объема приблизительно на день 13 инкубации, а затем уменьшается в объеме по мере продолжения инкубации из-за потери влаги и всасывания жидкости, но все еще присутствует в значительных объемах на день 18 инкубации.
Аллантоисная жидкость отделяется от яичной скорлупы внутренней и внешней подскорлупными оболочками и хорионаллантоисными оболочками. Хотя аллантоисная жидкость охватывает всю периферию оплодотворенного яйца, аллантоисная жидкость, как правило, скапливается в верхней части яйца непосредственно под оболочками, расположенными над воздушной камерой.
Накопление аллантоисной жидкости в верхней части яйца происходит под действием силы тяжести и смещения плотным эмбрионом и желточным мешком. Попытка аккуратно отобрать аллантоисную жидкость через верхнюю часть яйца, когда яйцо находится в вертикальном положении, может быть затруднена из-за изменчивости воздушного пространства у яиц. Гравитация может быть использована для объединения аллантоисной жидкости в ограниченном месте. Когда яйцо поворачивается по своей продольной оси, аллантоисная жидкость будет скапливаться на верхней стороне яйца, непосредственно под скорлупой. Расположение яйца по его продольной оси обеспечивает применимость аллантоисной жидкости для извлечения образца.
Экстракция материала, такого как аллантоисная жидкость, из яиц может быть выполнена различными путями, в том числе проколом яичной скорлупы и введением канюли для отбора образцов через оболочки. Затем образец отобранной жидкости может быть извлечен, при этом оболочку и/или скорлупу функционально закупоривают подходящим герметиком или обеспечивают самостоятельное закупоривание.
Как указано выше, любой подходящий способ может быть использован для выполнения неинвазивного анализа. Согласно другому предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения неинвазивный способ может включать твердофазную микроэкстракцию (SPME) в совокупности с подходящим аналитическим устройством. SMPE относится к методике твердофазной экстракции отбора образцов, которая включает применение волокна, покрытого экстрагирующей фазой, которая может быть жидкой (полимер) или твердой (сорбент) и которая экстрагирует разные виды аналитов (в том числе как летучие, так и нелетучие) из разных видов сред, которые могут быть в жидкой или газовой фазе. Количество аналитов, экстрагируемых волокном, пропорционально их концентрации в образце в случае достижения равновесия или в случае кратковременного предравновесия с помощью конвекции или перемешивания. Он может быть предпочтительно совмещен с IMS, так что могут быть непосредственно измерены летучие вещества.
Хотя в нескольких публикациях, как правило, раскрывается использование неинвазивных способов, например, в US-A-2011/144473 и US-A-7950349, эти публикации лишь неопределенно описывают общие спектры излучения, что на практике не позволяет выбрать пол эмбриона. Способ в соответствии с настоящим изобретением отличается, в частности, от раскрытых способов тем, что определяется наличие специфических компонентов в яйце, что может быть преимущественно выполнено с использованием вторичных производных спектров, которые позволяют избирательно искать абсолютные и относительные количества одного или нескольких соединений-маркеров развития.
Яйца, содержащие эмбрионы мужского пола и женского пола, демонстрируют различия в химическом составе на молекулярном уровне. На микроскопическом уровне эмбрионы также демонстрируют различия в размере, форме и клеточной морфологии.
Способ в соответствии с настоящим изобретением успешно обеспечивает определение пола эмбриона. Предпочтительно, определение выполняют в период от 1 до 15 дней, более предпочтительно от 2 до 14, еще более предпочтительно от 3 до 13 и еще более предпочтительно от 4 до 12 дней после начала инкубации, например, выполняют стадию а) предпочтительно в период времени от 6 до 12 дней после начала инкубации яйца.
Это позволяет избежать затрат на инкубацию яиц, которые или являются нежизнеспособными, и/или имеют нежелательный пол. Кроме того, может быть определена фактическая стадия развития яйца. Для видов с более коротким или более длинным временем инкубации, чем у домашней курицы, могут быть применены другие подходящие периоды.
Образец может представлять собой любое представляющее интерес биологическое вещество, но предпочтительно биологическую ткань и предпочтительно биологическую жидкость, такую как кровь или плазма.
Стадия (b) включает измерение значения оценки на наличие и концентрацию по меньшей мере первого биомаркера в образце, указывающего на характеристику эмбриона.
Способ в соответствии с настоящим изобретением основан на корреляции наблюдаемых массовых сигналов с эталонными массами и спектрами известных биомаркеров. Эталонные данные предпочтительно хранятся на компьютерном сервере, что позволяет выполнять всю процедуру под управлением компьютера. Сигналы коррелируют с эталонными стандартами путем сравнения, например, с использованием вычислительных функций, как описывается в настоящем изобретении.
Предпочтительно, сигналы характеризуют как «положительные» или «отрицательные» в зависимости от того, достигнут ли пороговый уровень подобия; сигналы, которые являются отрицательными и не достигают порогового уровня подобия, в способе отбрасываются, тогда как те сигналы, которые являются положительными, сопоставляются с биомаркерами и обеспечивают диагностику наличия указанных биомаркеров в биологическом образце.
В случае применения стандартов оценка сигналов биомаркера может быть рассчитана по отношению между сигналом биомаркера, присутствующего в образце, и внутренним стандартом, добавленным к образцу. Несколько биомаркеров могут быть проанализированы одинаково, что приводит к получению окончательного оценочного коэффициента.
Предпочтительно, один или несколько внутренних стандартов эталонных биомаркеров, меченных атомной меткой, добавляют к образцу перед анализом с помощью масс-спектрометрии. Это позволяет определять и оценивать абсолютную интенсивность сигнала путем измерения интенсивности сигнала биомаркера и сравнения его с интенсивностью сигнала одного или нескольких известных внутренних стандартов. Такие стандарты, например, могут быть помечены изотопом, что делает показания анализа очень точными, а также выгодными с точки зрения определения абсолютного количества. Встроенные последовательности калибровки в скрининге позволят измерять абсолютные уровни биомаркеров в образце.
Способ в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно может быть выполнен двумя путями: с использованием внутренних стандартов для обеспечения эталона для количественного определения интенсивности сигнала и без таких стандартов. Таким образом, согласно одному варианту осуществления один или несколько внутренних стандартов добавляют к образцу перед анализом с помощью масс-спектрометрии. Предпочтительно, внутренние стандарты метят. Предпочтительно, абсолютная интенсивность сигнала для каждого сигнала биомаркера затем может быть оценена путем измерения интенсивности сигнала биомаркера и сравнения с интенсивностью сигнала одного или нескольких известных внутренних стандартов. При альтернативном осуществлении образец обрабатывают без добавления внутренних стандартов. Согласно такому варианту осуществления относительную интенсивность сигнала оценивают путем измерения отношения между интенсивностями сигнала отдельного биомаркера в образце и интенсивностью сигнала эталона для группы образцов.
Предпочтительно, выбранной характеристикой может быть вероятная жизнеспособность или нежизнеспособность эмбриона для достижения полного роста для вылупления. Дополнительной предпочтительной выбранной характеристикой является прогноз вероятной стадии развития и времени, необходимого для развития эмбриона для вылупления в условиях инкубации. Предпочтительно, способ включает применение одного или нескольких из метода магнитно-резонансной визуализации, метода спектрального резонанса; аналитического хроматографического метода в совокупности с одним или несколькими подходящими детекторами, флуоресцентной спектроскопии и/или аналитических способов, включающих биомаркерные селективные реагенты.
Идентификация и количественное определение одного или нескольких биомаркеров могут быть выполнены любым подходящим способом. Предпочтительно, это может быть выполнено методом магнитно-резонансной визуализации, в том числе методами ядерного резонанса; методами спектрального резонанса, в том числе UV/VIS, инфракрасной или спектроскопией комбинационного рассеяния; аналитическими способами, такими как GC или HPLC, в совокупности с подходящими детекторами; флуоресцентной спектроскопией; ферментными иммуносорбентными анализами, в том числе влажными и сухими способами, например, с использованием способа с импрегнированным субстратом, и с применением полученных приемлемым образом селективных аптамеров или подобных селективных реагентов.
Как правило, также могут быть использованы количественные методы спектрального резонанса, в том числе инфракрасной или спектроскопии комбинационного рассеяния, предпочтительно с использованием вторичных спектров для определения наличия и абсолютных, и/или относительных количеств маркеров развития, присутствующих в яйце. Хотя в нескольких публикациях раскрывается использование неинвазивных способов, например, в US-A-2011/144473 и US-A-7950349, эти публикации лишь неопределенно описывают общие спектры излучения; которые на практике не позволяют выбрать стадию развития, жизнеспособность и/или пол эмбриона. Способ в соответствии с настоящим изобретением отличается, в частности, от раскрытых способов тем, что определяется наличие специфических компонентов в яйце, что может быть преимущественно выполнено с использованием вторичных производных спектров, которые позволяют избирательно искать абсолютные и относительные количества одного или нескольких соединений-маркеров развития. В частности, дифференциальная инфракрасная спектроскопия на основе преобразования Фурье (FTIR) и Фурье-спектроскопия комбинационного рассеяния или их комбинация могут быть предпочтительно использованы для достижения необходимой точности и воспроизводимости, тогда как методы ядерного магнитного резонанса могут быть приемлемым образом использованы для определения природы маркеров развития и для установления базовой линии системы калибровки. Способ в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно обеспечивает определение жизнеспособности, и/или пола эмбриона, и/или предпочтительно стадий развития от начала инкубации яйца до вылупления. Согласно предпочтительному варианту осуществления образец может быть анализирован любым масс-спектрометрическим способом, подходящим для выявления и получения спектра, который идентифицирует и определяет абсолютное и относительное количество биомаркеров, присутствующих в образце. Предпочтительно, образец может быть анализирован с помощью способа, который обеспечивает анализ в режиме реального времени в течение менее чем 20 секунд, более предпочтительно менее чем 15 секунд на образец.
Примеры включают в себя прямую инфузию с использованием статических принципов наноэлектрораспыления, анализ введения в поток или введение в поток с обогащением образца. Предпочтительно, масс-спектрометрический анализ включает в себя масс-спектрометрию с электрораспылительной ионизацией (ESI), времяпролетную масс-спектрометрию с лазерной ионизацией и десорбцией из жидкой матрицы (MALDI-TOF), времяпролетную масс-спектрометрию или поверхностную лазерную десорбционную ионизацию (SELDI-TOF). Масс-спектрометр предпочтительно работает в тандемном и/или обзорном режиме.
Предпочтительно, образец может быть обработан перед масс-спектроскопическим анализом так, что обработка образца включает в себя отделение образца с помощью твердофазной экстракции (SPE), газовой хроматографии, одно- или многофазной жидкостной хроматографии высокого давления (HPLC).
В качестве альтернативы, если биомаркерные соединения могут быть измерены извне, может быть выполнен прямой неинвазивный анализ посредством прямых неинвазивных измерений на целых яйцах с использованием, например, технологии IMS, изложенной выше.
Предпочтительные способы масс-спектрометрической характеристики биомаркеров включают ионизацию лазерной десорбцией с использованием матрицы (MALDI) и ионизацию электрораспылением (ESI), любая из которых предпочтительно может быть объединена с времяпролетным (TOF) или другими типами масс-спектрометрических датчиков для определения массы и/или паттерна фрагментации биомаркера. Предпочтительно, масс-спектрометрия может быть использована в тандеме с хроматографической и другими методиками разделения в настоящем документе. MALDI функционирует путем воздействия импульсов лазера на образец. Данная обработка выпаривает и ионизирует образец. Затем определяют молекулярные массы (массы) заряженных ионов на анализаторе TOF. В этом устройстве электрическое поле ускоряет заряженные молекулы по направлению детектора, и по различиям в продолжительности времени, которое требуется ионизированным фрагментам для достижения детектора, т.е. их времени пролета, выявляют молекулярные массы биомаркеров, при этом меньшие соединения достигают детектора раньше. Данный способ генерирует профили массы образца, то есть профили молекулярных масс и количеств соединений в смеси. Эти профили могут затем использоваться для идентификации известных биомаркеров из баз данных биомаркеров.
Благодаря интерфейсу ESI-MS с жидкостной хроматографией (LC/MS/MS) элюирующиеся соединения из колонки LC вводят в источник ионов масс-спектрометра. Напряжение подается на тонкую иглу. Затем игла распыляет капли в масс-спектрометрический анализатор, где капли испаряются, и ионы биомаркера высвобождаются в соответствии с различными зарядовыми состояниями, которые фрагментированы и по которым можно определить состав. В качестве альтернативы, SPE (твердофазная экстракция) или газовая хроматография могут быть связаны с масс-спектрометром.
В частности, SPE/MS/MS нашла применение для автоматизированного и высокопроизводительного промышленного применения способа в соответствии с настоящим изобретением, такого как с использованием устройства Agilent Rapidfire MS (Rapidfire является зарегистрированным товарным знаком компании Agilent Inc.); источника ионов LDTD (абсорбционной спектроскопии на основе настраиваемого диодного лазера) (LDTD является зарегистрированным товарным знаком компании Phytronics Inc.) Phytronics.
63
Следующее устройство, которое нашло применение, представляет собой калиброванный спектрометр ионной подвижности (IMS), основанный на подвижности ионов в газовой фазе в электрическом поле. В данном случае ионы вещества, генерируемые в результате частичного разряда, УФ-лампы или источника Ni, внутри так называемой ионизационной камеры отделяются друг от друга по пути через дрейфовую трубку в соответствии с их молекулярной массой и/или геометрической структурой. Затем устройство измеряет характерные времена дрейфа ионов через эту трубку, позволяя быстро обнаруживать, идентифицировать, а также количественно определять вещество с чрезвычайно высокой чувствительностью и в течение нескольких секунд на образец.
Предпочтительно, масс-спектрометрический анализ включает масс-спектрометрию с ионизацией электрораспылением (ESI), времяпролетную масс-спектроскопию с лазерной ионизацией и десорбцией из жидкой матрицы (MALDI-TOF), времяпролетную масс-спектроскопию или поверхностную лазерную десорбционную ионизацию (SELDI-TOF), SPE/MS/MS, источник ионов LDTD (абсорбционной спектроскопии на основе настраиваемого диодного лазера) и/или применение датчика подвижности ионов (IMS).
Масс-спектрометрическая система предпочтительно представляет собой MS с ионизацией электрораспылением (ESI), времяпролетную MS с лазерной ионизацией и десорбцией из жидкой матрицы (MALDI-TOF) или времяпролетную MS или поверхностную лазерную десорбционную ионизацию (SELDI-TOF) или абсорбционную MS на основе настраиваемого диодного лазера (LDID). В частности, SPE/MS/MS нашла применение для автоматизированного и высокопроизводительного промышленного применения способа в соответствии с настоящим изобретением, такого как с использованием устройства Agilent Rapidfire MS (Rapidfire является зарегистрированным товарным знаком компании Agilent Inc.); источника ионов LDTD (абсорбционной спектроскопии на основе настраиваемого диодного лазера) (LDTD является зарегистрированным товарным знаком компании Phytronics Inc.) Phytronics.
63
Следующее устройство, которое находит применение, представляет собой калиброванный спектрометр ионной подвижности (IMS), основанный на подвижности ионов в газовой фазе в электрическом поле. В данном случае ионы вещества, генерируемые в результате частичного разряда, УФ-лампы или источника Ni, внутри так называемой ионизационной камеры отделяются друг от друга по пути через дрейфовую трубку в соответствии с их молекулярной массой и/или геометрической структурой. Затем устройство измеряет характерные времена дрейфа ионов через эту трубку, позволяя быстро обнаруживать, идентифицировать, а также количественно определять вещество с чрезвычайно высокой чувствительностью и в течение нескольких секунд на образец.
Предпочтительно, образец может быть обработан перед анализом. Предпочтительно, обработка образца включает в себя отделение образца с помощью твердофазной экстракции (SPE), газовой хроматографии, одно- или многофазной жидкостной хроматографии высокого давления (HPLC). Предпочтительно, один или несколько внутренних стандартов эталонных биомаркеров добавляют к образцу перед анализом. Предпочтительно, абсолютную интенсивность сигнала оценивают путем измерения интенсивности сигнала биомаркера и сравнения ее с интенсивностью сигнала одного или нескольких известных внутренних стандартов. Предпочтительно, способ является полностью автоматизированным.
Предпочтительно, осматривают множество яиц на предмет одной или нескольких эмбриональных характеристик.
Предпочтительно, способ дополнительно включает определение того, является ли эмбрион в яйце жизнеспособным и мужского пола, или жизнеспособным и женского пола, или нежизнеспособным, и отделение множества жизнеспособных яиц мужского пола от множества жизнеспособных яиц женского пола, и одного или нескольких нежизнеспособных яиц.
Предпочтительно, способ дополнительно включает идентификацию по меньшей мере одного биомаркера из ряда биомаркеров из образца и сравнение концентрации по меньшей мере одного биомаркера со значениями того же биомаркера в отдельных куриных эмбрионах с известными характеристиками, при этом более высокая или более низкая концентрация в отношении порога одного или нескольких биомаркеров является показателем того, является ли эмбрион мужского пола или женского пола, жизнеспособным или нежизнеспособные, и/или показателем стадии развития эмбриона.
Стадия (с) включает применение порога к значению оценки и количеству, полученному на стадии (b), для идентификации характеристики для эмбриона, ассоциированной с наличием и концентрацией биомаркера. Предпочтительно, стадия (с) дополнительно включает (i) корреляцию каждого соответствующего сигнала или сигнатуры биомаркера с эталонным биомаркером путем сопоставления спектра каждого корреляционного сигнала с ожидаемым спектром корреляционного эталонного биомаркера с использованием меры подобия для определения по меньшей мере одного положительно корреляционного сигнала; (ii) измерение интенсивности каждого положительно корреляционного сигнала и оценки его абсолютной и/или относительной интенсивности сигнала; и (iii) применение порога к значению оценки, полученной из функции подобия, для определения характеристики эмбриона, ассоциированной с наличием и концентрацией коррелируемого биомаркера.
Заявители выяснили, что наличие 3-[(2-аминоэтил)сульфанил]бутановой кислоты в количестве 50 нг/мл или больше в аллантоисной жидкости в день 7, 8 или 9 коррелирует с эмбрионом женского пола, тогда как наличие биомаркера, присутствующего при менее чем 50 нг/мл коррелирует с эмбрионом мужского пола. Предпочтительно, 3-[(2-аминоэтил)сульфанил]бутановая кислота присутствует в количестве от 0,1 до 45 нг/мл, более предпочтительно в количестве от 1 до 40 нг/мл в яйцах мужского пола в день 7, 8 или 9. Предпочтительно, 3-[(2-аминоэтил)сульфанил]бутановая кислота присутствует в количестве от 50,1 до 150 нг/мл, более предпочтительно в количестве от 55 до 140 нг/мл в яйцах женского пола в день 7, 8 или 9.
Тогда как этот единственный биомаркер уже может давать почти полную определенность желаемой характеристики, по меньшей мере первый и второй биомаркер или даже больше биомаркеров предпочтительно могут быть выявлены и анализированы одновременно. Абсолютные и/или относительные количества по меньшей мере первого и второго маркеров затем могут быть использованы для определения одной или нескольких характеристик даже с повышенной достоверностью.
Настоящее изобретение также предпочтительно относится к способу селективной инкубации птенцов видов яйцекладущих со специфической характеристикой, включающему обеспечение множества яиц от видов и подвергание яиц способу, раскрываемому в настоящем документе, для определения характеристики эмбриона и отбора яиц с желаемой характеристикой с формированием отобранного множества яиц, и инкубацию отобранных яиц до вылупления одного или нескольких из птенцов.
Настоящее изобретение также предпочтительно относится к системе выявления и анализа пола эмбриона видов яйцекладущих, содержащей:
(i) систему забора образцов для взятия образцов из отдельных яиц;
(ii) аналитическую систему для сбора спектров;
(iii) средство идентификации пола и/или жизнеспособности, программным образом идентифицирующее сигналы, ассоциированные с одним или несколькими биомаркерами из одного или нескольких образцов, анализируемых аналитической системой, при этом средство дополнительно выполняет анализ, сравнивая сигналы с сохраненной библиотекой данных зарегистрированных контрольных спектров образца и/или с внутренним стандартом, для идентификации эмбриональной характеристики; и
(iv) средство вывода, связывающее информацию одной или нескольких эмбриональных характеристик с образцом и/или анализируемым яйцом.
Предпочтительно, средство идентификации реализуют в программном обеспечении на электронном устройстве, сопряженном с аналитической системой.
Настоящее изобретение также предпочтительно относится к применению множества яиц, получаемого способом в соответствии с настоящим изобретением, для получения продуктов питания для животного и/или человека, для получения и/или выделения косметических, лекарственных и/или питательных соединений, для получения метана посредством ферментации и/или для получения высококачественных удобрений.
Используемый в настоящем документе термин «аллантоисная жидкость» охватывает аллантоисную жидкость с наличием или без наличия других яичных материалов, полученных из птичьих яиц. Например, термин «аллантоисная жидкость» может включают в себя смесь крови и аллантоисной жидкости. Варианты осуществления настоящего изобретения не ограничиваются извлечением материала из аллантоисной жидкости или из областей вблизи верхней поверхности яйца. Удаление материала из аллантоисной жидкости, как описывается в настоящем изобретении, представлено исключительно в качестве одного из примеров возможных вариантов осуществления настоящего изобретения. Различные материалы, в том числе без ограничения амнион, желток, скорлупа, альбумин, ткань, оболочка и/или кровь, могут быть извлечены из яйца и проанализированы с проведением спектрофотометрического анализа для идентификации пола эмбриона, как описывается ниже.
При желании материал может быть извлечен из яиц, имеющих практически любую ориентацию. Используемый в настоящем документе термин «заданное местоположение» обозначает фиксированное положение или глубину внутри яйца. Например, устройство может быть введено в яйцо на фиксированную глубину и/или в фиксированное положение в яйце. Согласно альтернативным вариантам осуществления инъекция может быть осуществлена на основе информации, полученной из яйца, например, относительно положения эмбриона или субгерминальной полости внутри яйца.
В способе в соответствии с настоящим изобретением маркеры развития могут предпочтительно анализироваться инвазивно или неинвазивно.
Предпочтительно, определение выполняют в период от 1 до 15 дней, более предпочтительно от 2 до 14, еще более предпочтительно от 3 до 13 и еще более предпочтительно от 4 до 12 дней после начала инкубации, например, выполняют стадию а) предпочтительно в период времени от 6 до 12 дней после начала инкубации яйца. Кроме того, может быть определена фактическая стадия развития яйца.
Предпочтительно определение характеристики эмбриона в соответствии с настоящим изобретением выполняют как неразрушающий способ, т.е. позволяющий тестируемым таким образом эмбрионам расти, если это желательно, или подвергать их дальнейшим стадиям, таким как in ovo получение вакцин, при условии, что эмбрион жизнеспособен, или для выращивания яиц мужского пола для исключительно мужской популяции кур, например, для производства мяса, или для использования выращиваемых таким образом цыплят в других целях.
Термин «сравнение спектров» предпочтительно может включать в себя одновариантный или предпочтительно многовариантный анализ измеренных спектров и определение ассоциации птичьего эмбриона с определенной популяцией. Стадия может включать определение наличия определенных пиков сигнала в спектре посредством многовариантного статистического анализа спектральных данных. Программа многовариантного статистического анализа предпочтительно включает в себя программу анализа главных компонентов и/или программу регрессионного анализа частичных наименьших квадратов. Таким образом, настоящее изобретение также относится к способу, устройству и системе для определения пола и/или жизнеспособности эмбриона птицы in ovo, включающим в себя многовариантную программу статистического анализа, а также к осуществляемому микропроцессором способу для определения этого. Предпочтительно, стадия (b) дополнительно включает в себя стадию нормализации эффектов интенсивности из-за разности концентраций между любыми двумя образцами.
Преимущественно, это выполняют с использованием дискриминационного анализа частичных наименьших квадратов (PLS-DA). Способ предпочтительно включает математическую обработку данных меченого соединения и включает многовариантный анализ, такой как РСА (анализ главных компонент), предпочтительно с последующим контролируемым анализом, более предпочтительно PLS-DA (дискриминационным анализом частичных наименьших квадратов) или даже более предпочтительно с ортогональным PLSDA или с аналогичными подходящими статистическими подходами. Стадия сопоставления с образцом в заявляемом способе будет идентифицировать определенную меру подобия. С использованием меры подобия подтверждают корректную структуру биомаркера. Это подтверждение выполняют с помощью спектрального соответствия. Спектральное соответствие выполняют путем сравнения спектров образца и эталонных спектров в базе данных. Для положительной идентичности на этой стадии требуется соответствующая корреляция, чтобы подтвердить точность определения. Подходящие пороговые значения и меры подобия будут очевидны для специалистов в данной области. Данный способ пытается уменьшить большие объемы данных до управляемого размера и применить статистически управляемую модель для определения скрытых переменных, указывающих на скрытые отношения между наблюдаемыми данными.
Средство идентификации характеристики затем фильтрует данные образца, которые будут идентифицировать представляющие интерес кластеры среди образцов. Кластеры представляют подобия среди образцов и используются для идентификации профилей пола. Предпочтительно, анализ включает в себя анализ главных компонент (РСА) и PLS-DA. РСА использует математические алгоритмы для определения различий и подобия в наборе данных. РСА трансформирует число возможно родственных переменных в меньшее число неродственных переменных, которые называются главными компонентами. Первая главная компонента учитывает как можно большую изменчивость данных. Каждая добавленная компонента пытается учесть как можно большую часть оставшейся изменчивости в данных. Собранные данные могут быть упорядочены в матрицу, и РСА выполняется для «собственных значений» и «собственных векторов» квадратно-симметричной матрицы с суммами квадратов и перекрестных произведений. Собственный вектор, ассоциированный с наибольшим собственным значением, имеет то же направление, что и первая главная компонента. Собственный вектор, ассоциированный со вторым наибольшим собственным значением, определяет направление второй главной компоненты. Сумма собственных значений равна трассировке квадратной матрицы, а максимальное число собственных векторов равно количеству строк (или столбцов) этой матрицы. После определения можно построить экранные графики рассчитанных собственных значений. Специалистам в данной области будет понятно, что ряд различных алгоритмов может использоваться для вычисления собственных значений и собственных векторов. Данные отображают с использованием двух графиков: i) графика оценок, который показывает кластеризацию группы, и ii) графика нагрузок, на котором спектральные данные, ответственные за кластеризацию группы, идентифицируются как те, что находятся на наибольшем расстоянии от источника.
Способ в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно может определять, является ли эмбрион в яйце жизнеспособным и мужского пола или жизнеспособным и женского пола, и отделять множество жизнеспособных яиц мужского пола от множества жизнеспособных яиц женского пола и множества нежизнеспособных яиц, проводить отбор преимущественно яиц мужского пола, или преимущественно яиц женского пола, или преимущественно нежизнеспособных яиц. При желании отобранные жизнеспособные яйца женского пола или мужского пола могут быть подвергнуты способу инкубации и вылупления для формирования популяции животных преимущественно женского пола или мужского пола.
Яйца могут быть использованы для различных применений, например, для получения вакцин, путем предпочтительно инъецирования вируса или подобного вирусу материала в каждое яйцо, идентифицированное как содержащее живой эмбрион и имеющее мужской пол или женский пол. Затем после соответствующей инкубации инъецированных таким образом яиц вакцину или материал на основе вакцин можно выделять из инкубируемых яиц. Дополнительный предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу выявления наличия вещества в образце жидкости яйца, при этом может быть достаточно образца, как правило, в диапазоне от 0,1 до 35 мкл.
Мера подобия предпочтительно включает корреляционный индекс удерживания и паттерн фрагментации, ассоциированный с положительно корреляционным сигналом.
Далее статистически значимое подобие может быть выявлено и зарегистрировано как релевантные биомаркерные идентичности или множественные биомаркерные идентичности. Определение статистически значимых подобий включает использование баз данных, а также алгоритмов, разработанных для удовлетворения требований способа.
Это может включать, в частности, при определении применимости биомаркера для нового применения, контролируемый многовариантный анализ, предпочтительно дискриминационный анализ частичных наименьших квадратов PLS-DA или ортогональный дискриминационный анализ частичных наименьших квадратов для данных.
Предпочтительно, характеристика, которая подлежит определению, включает в себя пол, возраст, стадию развития и/или жизнеспособность эмбриона в яйце. Для промышленного применения множество яиц проверяют на предмет одной или нескольких эмбриональных характеристик.
Способ в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно полностью автоматизирован, что обеспечивает анализ биомаркеров в образце, ассоциированном с яйцом, который является автоматическим и точным. Таким образом, анализ основан на масс-спектрометрии для идентификации биомаркеров. Предпочтительно, способ фильтрует и скринирует массу и идентичность наборов данных, которые основаны на каждом из уникальных свойств заряда, массы и паттерна фрагментации, ассоциированных с определенными идентифицируемыми биомаркерами в образце.
Путем сопоставления данных анализа меченого соединения с библиотекой образцов известного пола может быть дополнительно улучшена избирательность определения пола. Способ в соответствии с настоящим изобретением, кроме того, предпочтительно включает определение того, является ли эмбрион в яйце жизнеспособным и мужского пола или жизнеспособным и женского пола, а также выполнение отделения множества жизнеспособных яиц мужского пола от множества жизнеспособных яиц женского пола, проведение отбора преимущественно яиц мужского пола или преимущественно яиц женского пола. Отобранные таким образом жизнеспособные яйца женского пола или мужского пола предпочтительно могут быть подвергнуты способу инкубации и вылупления для формирования популяции животных преимущественно женского пола или мужского пола.
Способ в соответствии с настоящим изобретением позволяет одновременно анализировать сотни или тысячи яиц и сотни или тысячи биомаркеров в образце, взятом из каждого яйца. Способ основан на базе данных биомаркеров, которая, как было показано, ассоциирована с характеристикой, включающей в себя масс-данные и спектральные данные для каждого из биомаркеров, и позволяет точно идентифицировать биомаркеры с помощью подходящего программного обеспечения в данном образце.
Кроме того, база данных может быть создана для определенных видов путем скрининга биомаркеров, присутствующих в образце, и устранения нежелательных сигналов на основе индекса времени удерживания, который коррелирует со временем попадания соединения в детектор массы. Следовательно, многие последовательности могут быть проанализированы в течение минут, и данные биомаркеры могут быть идентифицированы с высокой достоверностью. Таким образом, способ является автоматизированным, высокопроизводительным, может использоваться относительно неквалифицированными специалистами и, поэтому, подходит для применения в удаленных местоположениях, например, на инкубаторно-птицеводческих станциях и куриных или рыбных фермах.
Образец может быть подвергнут анализу масс без процедур предварительного разделения. Согласно такому варианту осуществления образец предпочтительно анализируют путем прямой инфузии с использованием, например, статических принципов наноэлектрораспыления, анализа введения в поток или введения в поток с обогащением образца.
Предпочтительно, образец обрабатывают перед анализом масс, предпочтительно для отделения компонентов образца перед загрузкой их в масс-спектрометр. Например, обработка образца включает отделения образца одно- или многофазной жидкостной хроматографией высокого давления (HPLC), газовой хроматографией (GC) или твердофазной экстракцией (SPE).
Масс-спектрометрическая система предпочтительно представляет собой MS с ионизацией электрораспылением (ESI), времяпролетную MS с лазерной ионизацией и десорбцией из жидкой матрицы (MALDI-TOF) или времяпролетную MS или поверхностную лазерную десорбционную ионизацию (SELDI-TOF) или абсорбционную MS на основе настраиваемого диодного лазера (LDID).
Способ в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно является автоматизированным и выполняется под контролем компьютера. Идентификацию биомаркеров в образце выполняют путем сравнения с эталонными данными для биомаркеров, предпочтительно, эталонная масса и спектральные данные для множества биомаркеров хранятся в компьютере. Эталонные масс-спектры для определенного биомаркера предпочтительно представляют собой усредненные спектры, полученные из фактических и измеренных данных, полученных расчетом кластеризации, как изложено ниже. Биомаркер может быть релевантным сам по себе, в сочетании с другими маркерами, для характеристики, которая объективно измеряется и оценивается как показатель состояния, такого как пол, возраст и жизнеспособность или статус питания. Применимым биомаркером может быть любой идентифицируемый и измеряемый индикатор, ассоциированный с конкретным состоянием или заболеванием, при этом существует корреляция между наличием или содержанием биомаркера и некоторым аспектом состояния, включая наличие стадии развития. Корреляция может быть качественной, количественной или как качественной, так и количественной. Обычно биомаркером является соединение, фрагмент соединения или группа соединений. Такими соединениями могут быть любые соединения, обнаруженные в организме или продуцируемые организмом, в том числе белки и пептиды, нуклеиновые кислоты, аминокислоты, сахара и другие соединения. Биомаркер может быть описан как «характеристика, которая объективно измеряется и оценивается как индикатор состояния, такого как пол, возраст и жизнеспособность или статус питания». Биомаркером является любой идентифицируемый и измеримый индикатор, связанный с конкретным состоянием или заболеванием, при этом существует корреляция между наличием или уровнем биомаркера и некоторым аспектом состояния, включая наличие стадии развития. Корреляция может быть качественной, количественной или как качественной, так и количественной. Биомаркеры также могут включать в себя соединения, которые являются метаболитами меченых молекул-предшественников, которые были введены в овулирующий родительский организм, а затем метаболизированы эмбрионом в ходе его развития с выделением меченых метаболитов в качестве биомаркеров.
Базу данных контрольных спектров, собранных из контрольных образцов, предпочтительно первоначально составляют путем выбора образцов определенного пола данной куриной расы. Полной библиотекой или базой данных считают содержащую образцы обоих полов.
В частности, типизация основана на спектральных различиях, которые проявляются во всех частях как ультрафиолетового, так и видимого диапазона. В настоящее время происхождение этих различий неизвестно, но это может быть связано с внутренними различиями поглощения на молекулярном уровне.
Кроме того, вычислительные средства содержат программные средства, находящиеся в компьютере.
Специалисту в данной области должно быть понятно, что могут быть рассмотрены дополнительные варианты осуществления, в том числе системы и способы для характеристики других компонентов яйца и их составляющих, таких как без ограничения аллантоисная жидкость, яичный желток, яичный белок и яичная скорлупа.
Настоящее изобретение также относится к отбору яиц, а после вылупления - к птенцу или популяции птенцов, получаемых данным способом.
Настоящее изобретение также относится к способу, системе и пищевому продукту для in ovo определения пола, жизнеспособности и/или стадии развития эмбрионов видов яйцекладущих в более общих терминах, т.е. без ограничения курицей или даже более конкретно Gallus gallus domesticus.
Следовательно, настоящее изобретение также относится к способу определения in ovo пола, жизнеспособности и/или стадии развития эмбриона видов яйцекладущих. Способ в соответствии с настоящим изобретением, кроме того, относится к отбору яиц мужского пола и яиц женского пола, а также к получению групп живых животных с использованием таких отобранных яиц. Яйцекладущие животные откладывают яйца, с непродолжительным эмбриональным развитием в организме матери или вообще без такового. Это репродуктивный способ большинства рыб, амфибий, рептилий, всех птиц и большинства насекомых, моллюсков и паукообразных. Выращивание яйцекладущих животных и их яиц обеспечивает постоянно растущую часть мирового производства белка, а также различные другие крупные промышленные процессы, такие как производство вакцин. В настоящее время наиболее важные способы выращивания яйцекладущих животных включают в себя разведение видов птиц, таких как домашняя птица, и культивирование водных организмов, т.е. выращивание водных организмов, таких как рыба, ракообразные и моллюски.
Настоящее изобретение также относится к способу идентификации пола, жизнеспособности и/или стадии развития эмбриона яйцекладущих in ovo, включающему а) обеспечение пищевого продукта, содержащего меченый материал-предшественник, содержащий по меньшей мере одно меченое соединение-предшественник, которое является приемлемым для применения в качестве добавки в пищу овулирующему родительскому организму, и b) инкубацию яйца на протяжении подходящего периода для обеспечения метаболизма меченого соединения-предшественника с образованием по меньшей мере одного меченого соединения в подходящем количестве; и с) подвергание яйца или образца из яйца анализу для определения наличия и количества одного или нескольких меченых соединений, и d) определение пола, жизнеспособности и/или стадии развития эмбриона яйцекладущих по данным, полученным на стадии (с).
Оплодотворенные яйца большинства видов яйцекладущих имеют тенденцию обеспечивать примерно равное распределение самцов и самок животных. Однако по разным причинам при управлении инкубаторно-птицеводческой станцией может быть желательно разделение животных по различным характеристикам, в частности, по полу. Например, при коммерческом производстве домашней курицы и яиц инкубация и выращивание цыплят мужского пола крайне нежелательна, что приводит к выбраковке миллиардов цыплят мужского пола каждый год. При производстве мелких ракообразных и креветок желательно выращивать исключительно женскую популяцию из-за способов, необходимых для стимулирования созревания яиц.
В настоящее время в обоих случаях смешанные популяции вылупившихся животных подвергают разделению по половому признаку путем визуальной оценки молоди, а иногда даже взрослой популяции, если у подростков нет подходящих признаков. В любом случае, это очень трудоемкий процесс, требующий высококвалифицированных операторов и, как правило, очень стрессовый для животных. Кроме того, если взрослых животных разделяют по полу, то все популяции необходимо выращивать до минимального возраста, в то время как только половина выращенных таким образом животных используется для размножения после отделения. Дополнительные проблемы могут возникать, когда присутствие, например, мужской популяции может привести к снижению производительности, например, из-за каннибализма и снижения плотности фермерского хозяйства, о чем сообщалось, например, в случае пресноводной креветки М. rosenbergii.
Также в рыбоводстве определение половой принадлежности или пола рыбы позволило бы вырастить преимущественно мужские или женские однополые популяции, что позволило бы более конкретно ориентироваться на рост и здоровье популяции, как это практикуется в настоящее время для нильской тилапии, которую культивируют предпочтительно в виде исключительно мужской популяции. Опять же, у большинства рыб только у молоди на поздней стадии или во взрослой стадии пол может быть определен визуальным осмотром, так что сложные паттерны скрещивания и специфические популяции должны быть установлены с «супермужскими» гибридами, которые могут быть склонны к усилению наличия генетических нарушений и которые также могут быть склонны к определенным заболеваниям, связанным с размножением очень небольшой генетической популяции.
Кроме того, имеется процент яиц, которые являются неоплодотворенными или не содержат жизнеспособный эмбрион на начало периода инкубации, что сильно снижает производительность инкубаторов, используемых на инкубаторно-птицеводческих станциях, в частности, для яиц домашней птицы.
В результате требуется производственная мощность инкубатора, которая по меньшей мере вдвое больше необходимой, если не возможен ранний отбор по полу, позволяющий отбирать в основном только мужские или женские эмбрионы.
Соответственно, это будет иметь большое значение для окружающей среды благодаря уменьшению количества энергии и других необходимых ресурсов, а в равной степени и для устранения ненужных животных путем выбраковки, а также для снижения стресса недавно вылупившихся животных, если способ был доступен на ранней стадии, что позволило определить пол эмбрионов птиц до фазы инкубации, что также позволило значительно увеличить производственная мощность инкубаторно-птицеводческой станции. Дополнительным преимуществом было бы, если бы данный способ также позволял отбирать жизнеспособные эмбрионы по сравнению с неоплодотворенными и/или иным образом нежизнеспособными яйцами, что еще больше повысило бы эффективность процесса вылупления.
В отношении рыб или мелких ракообразных были опубликованы различные способы, в основном основанные на PCR или антителах. Однако они довольно дорогие и сложные.
Следовательно, сохраняется потребность в более быстром и более легком в применении способе неразрушающего определения пола, а также стадии развития и/или жизнеспособности эмбриона яйцекладущих животных in ovo.
Поэтому, следующая цель настоящего изобретения заключается в обеспечении способа идентификации характеристики эмбриона видов яйцекладущих in ovo, при этом способ включает: (а) подвергание образца материала, ассоциированного с яйцом, содержащим эмбрион, масс-спектрометрическому анализу и регистрацию индекса времени удерживания и соответствующей массы и массы для каждого выявляемого сигнала; (b) корреляцию массы, соответствующей каждому сигналу, с эталонной базой данных биомаркерных масс, специфических для видов, с получением корреляции между одним или несколькими сигналами и одним или несколькими эталонными биомаркерами; (с) подтверждение корреляции между каждым корреляционным сигналом и эталонным биомаркером путем сопоставления масс-спектра каждого корреляционного сигнала с масс-спектром корреляционного эталонного биомаркера с использованием меры подобия для определения по меньшей мере одного положительно корреляционного сигнала; и (d) измерение интенсивности каждого положительно корреляционного сигнала и оценивание его абсолютной или относительной интенсивности сигнала; и (е) применение порога к значению оценки, полученному из функции распознавания, с определением характеристики для эмбриона, ассоциированной с наличием и концентрацией коррелируемого биомаркера.
Следующая цель заключается в обеспечении такого инструментария для применения на инкубаторно-птицеводческих станциях. Еще одной целью является обеспечение системы, способной выполнять анализ яиц в режиме реального времени в удаленных местоположениях, таких как инкубаторно-птицеводческие станции или объекты культивирования водных организмов. Эти и другие цели осуществляются с помощью устройства и способа в соответствии с настоящим изобретением. Следовательно, настоящее изобретение относится к способу идентификации одного или нескольких биомаркеров, ассоциированных с характеристикой эмбриона видов яйцекладущих in ovo, при этом способ включает анализ множества образцов от множества яиц видов с известным полом на масс-спектрометре с получением множества масс-спектров для установления биомаркерного паттерна и выполнение распознавания паттернов по масс-спектрам с получением биомаркерного паттерна, и определение биомаркеров и содержаний биомаркеров, ассоциированных по меньшей мере с одной характеристикой эмбриона, на основании биомаркерного паттерна.
Согласно следующему аспекту заявляемый способ также относится к множеству жизнеспособных яиц женского пола, обеспечивая отбор яиц преимущественно мужского пола или яиц преимущественно женского пола. Согласно следующим аспектам заявляемый способ также относится к популяции молоди животных, получаемой способом в соответствии с настоящим изобретением. Согласно следующим аспектам заявляемый способ также относится к применению множества яиц, получаемых способом, для получения продуктов питания для животного и/или человека, для получения и/или выделения косметических, лекарственных и/или питательных соединений, для получения метана посредством ферментации, для получения вакцин и/или для получения высококачественных удобрений.
Согласно следующим аспектам заявляемый способ также относится к системе выявления и анализа пола эмбрионов яйцекладущих животных, содержащей предпочтительно полностью автоматизированное устройство для осуществления заявляемых способов.
Согласно следующим аспектам настоящее изобретение относится к способу идентификации пола, жизнеспособности и/или стадии развития эмбриона яйцекладущих in ovo, включающему а) обеспечение пищевого продукта, содержащего меченый материал-предшественник, содержащий по меньшей мере одно меченое соединение-предшественник, которое является приемлемым для применения в качестве добавки в пищу овулирующему родительскому организму, и b) инкубацию яйца на протяжении подходящего периода для обеспечения метаболизма меченого соединения-предшественника с образованием по меньшей мере одного меченого соединения в подходящем количестве; и с) подвергание яйца или образца из яйца анализу для определения наличия и количества одного или нескольких меченых соединений, и d) определение пола, жизнеспособности и/или стадии развития эмбриона яйцекладущих по данным, полученным на стадии (с).
Настоящее изобретение также относится к системе, в которой средство идентификации пола реализуют в программном обеспечении на электронном устройстве, сопряженном со спектроскопической системой, и предпочтительно в которой средство идентификации содержит средства программного обеспечения, находящиеся в компьютере.
На фиг. 1 изображена А) модель классификации логистической регрессии по одному признаку. Прогностические модели одного признака оценивали по всем измеряемым признакам и наибольшую точность наблюдали с использованием признака 1599, который обеспечивает >90% точность со дня 9. В) Логистическая регрессия по 2 признакам. Модели логистической регрессии оценивали по всем возможным парам измеряемых признаков. После проверки робастности измерений наилучшую характеристику достигали с помощью комбинации признаков 1599 и 507, обеспечивающей >95% точность со дня 10.
Способ в соответствии с настоящим изобретением, таким образом, относится к относительному определению свойства, такого как пол. Это может быть существенно улучшено путем добавления дополнительных признаков и путем, например, удаления отклоняющихся значений или яиц с сомнительными признаками с существенным повышением тем самым точности.
На фиг. 3 показаны хроматограммы соединений с разными пиковыми значениями масс, варьирующими от 220 до 145, выделенными за 850 секунд из образцов мужского пола (темно-серый цвет) и женского пола (светло-серый цвет).
Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют то же значение, что обычно известно рядовому специалисту в области, к которой принадлежит настоящее изобретение. Терминология, используемая в описании настоящего изобретения, приводится в настоящем документе исключительно с целью описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения настоящего изобретения. Многие виды яйцекладущих выращивают коммерческим путем.
Фраза «культивирование водных организмов» включает культивирование пресноводных и морских популяций в контролируемых условиях и может отличаться от промышленного рыболовства, при котором вылавливают диких рыб и других морских животных.
Используемый в настоящем документе термин «рыбы» включает в себя всех жаберных водных имеющих череп животных, у которых отсутствуют конечности с пальцами. В это определение включены живущие в настоящее время миксины, миноги, а также виды хрящевых и костных рыб, будь то морских или пресноводных рыб. Важные виды или семейства рыб, которые культивируют в коммерческих целях, включают в себя представителей семейства пресноводных рыб Cyprinidae, таких как карпы, настоящие гольяны и их родственники, например, барбусы, усачи, сомы, и Pangasiida, белый амур, карп обыкновенный, пестрый толстолоб, обыкновенный толстолоб, катля, обыкновенный карась и т.п.; Salmonidae, в том числе лосось, форель, гольцы, пресноводные сиги и хариусы, например, атлантический лосось, морская форель и радужная форель; Serranidae, такие как баррамунди или азиатский морской окунь, японский морской окунь, европейский морской окунь; Latidae; Sparidae, такие как морской лещ и порги; Cichlidae, такие как тилапия Нила или Мозамбика, и Acipenseridae, такие как атлантический или белужий осетр.
Используемый в настоящем документе термин «ракообразные» относится к группе являющихся раздельнополыми и размножающихся половым путем видов членистоногих, которые включают в себя таких хорошо известных животных, как крабы, лобстеры, раки, мелкие ракообразные.
Используемый в настоящем документе термин «крабы» означает десятиногих ракообразных отряда Brachyura.
Используемый в настоящем документе термин «мелкое ракообразное» и/или «креветка» относится к любому виду культивируемого ракообразного, такому как культивируемые в соленой или солоноватой воде Penaeidae, предпочтительно креветки рода Penaeus, в том числе гигантская тигровая креветка P. monodon, тихоокеанская белая креветка Litopenaeus vannamei; западная голубая креветка (P. stylirostris); китайская белая креветка (P. chinensis); креветка курума (P. japonicus); индийская белая креветка (Р. indicus); банановая креветка (P. merguiensis) и другие представители семейств Caridea или Dendrobranchiata; и культивируемые в пресной воде ракообразные, такие как, например, Macrobrachium rosenbergii. М. nipponense и М. malcolmsonii; рак рода Astacoidea и Parastacoidea, такой как Procambarus clarkii; и культивируемые виды лобстера из семейств Nephropidae и Homaridae, а также лангусты из семейства Palinuridae.
Используемый в настоящем документе термин «моллюски» относится к большому филуму беспозвоночных животных, известному как отряд Mollusca, в том числе головоногие моллюски, такие как кальмар, каракатица и осьминог; двустворчатые моллюски, такие как панцирные, скафоподы и лопатоногие, которые являются раздельнополыми и характеризуются внешним оплодотворением.
Используемые в настоящем документе термины «птичьи» и «птица» включают в себя особей мужского пола или особей женского пола любых видов птиц, но главным образом охватывают домашнюю птицу, которую коммерчески выращивают для яиц или мяса. Следовательно, термины «птичьи» и «птица», в частности, охватывают красную и серую джунглевую курицу, цыпленка, индеек, уток, гусей, перепела, голубей, страуса, эму и фазанов.
Используемый в настоящем документе термин «инкубация» относится к способу, которым яйцекладущие животные, такие как птицы, высиживают свои яйца, и к развитию эмбриона в яйце после выхода из тракта взрослой особи. Период инкубации в настоящем документе относится к непрерывному промежутку времени, на протяжении которого конкретное яйцо подвергается условиями, имитирующим высиживание до вылупления, т.е. появления птиц, в том числе любую обработку или перемещение, например, из инкубатора на инкубаторно-птицеводческую станцию, при условии, что развитие животного не остановлено.
Используемый в настоящем документе термин «in ovo» относится к эмбрионам, содержащимся в яйце до вылупления. Настоящее изобретение может применяться на практике с яйцом любого типа птицы, рыбы, моллюска, рептилии или ракообразного, в том числе без ограничения с яйцами (одомашненной) курицы, индейки, утки, гуся, перепела и фазана, яйцами рыбы, такой как карп, лосось или тилапия; яйцами мелких ракообразных или креветок и яйцами моллюсков.
Используемые в настоящем документе термины «инъекция» и «инъецирование» охватывают способы введения устройства (как правило, удлиненного устройства) в яйцо или эмбрион, в том числе способы доставки или выпускания вещества в яйцо или эмбрион, способы извлечения вещества (т.е. образца) из яйца или эмбриона и/или способы введения детекторного устройства в яйцо или эмбрион.
Используемый в настоящем документе термин «масс-спектрометрия» относится к аналитической методике, которая сортирует ионы на основании их масс. Масс-спектрометрию, как правило, используют для химического анализа во многих ситуациях, и она может быть применена для любого образца от комплексной смеси нефтяных продуктов до продуктов генной инженерии. Проще говоря, масс-спектр даст картину точного химического состава образца.
Масс-спектр представляет собой график зависимости ионного сигнала от отношения массы к заряду. Эти спектры используют для определения элементной или изотопной сигнатуры образца, масс частиц и молекул, а также для выяснения химической структуры молекул. Масс-спектрометрия ионизирует химические соединения с образованием заряженных молекул или фрагментов молекул и измеряет их отношение массы к заряду.
В типичной процедуре MS образец, который может быть твердым, жидким или газообразным, ионизируют, например, бомбардируя его электронами. Это может вызывать распад некоторых молекул на заряженные фрагменты. Эти ионы затем разделяются в соответствии с их отношением массы к заряду, обычно путем их ускорения и воздействия на них электрическим или магнитным полем. Ионы с одинаковым отношением массы к заряду будут подвергаться одинаковому отклонению.
Ионы выявляют с помощью подходящего механизма, способного обнаруживать заряженные частицы, такого как электронный умножитель. Результаты отображаются в виде спектров относительного содержания выявленных ионов в зависимости от отношения массы к заряду. Атомы или молекулы в образце могут быть идентифицированы путем корреляции известных масс с идентифицированными массами или с помощью характерного паттерна фрагментации. В настоящем контексте масс-спектрометрию применяют для идентификации и обнаружения подходящих биомаркеров. Масс-спектрометрия (MS) является ценной аналитической методикой, поскольку она измеряет существенные свойства молекулы, ее массу, с очень высокой чувствительностью. Таким образом, MS можно использовать для измерения широкого спектра биомаркерных молекул и широкого спектра образцов материалов. Как известно, правильная подготовка образцов имеет решающее значение для генерации сигнала MS, разрешения и чувствительности спектров. Поэтому, подготовка образца является важной составляющей общей осуществимости и чувствительности анализа.
Предпочтительные способы масс-спектрометрической характеристики биомаркеров включают ионизацию лазерной десорбцией с использованием матрицы (MALDI) и ионизацию электрораспылением (ESI), любая из которых предпочтительно может быть объединена с времяпролетным (TOF) или другими типами масс-спектрометрических датчиков для определения массы и/или паттерна фрагментации биомаркера. Предпочтительно, масс-спектрометрия может быть использована в тандеме с хроматографической и другими методиками разделения в настоящем документе.
MALDI функционирует путем воздействия импульсов лазера на образец. Данная обработка выпаривает и ионизирует образец. Затем определяют молекулярные массы (массы) заряженных ионов на анализаторе TOF. В этом устройстве электрическое поле ускоряет заряженные молекулы по направлению детектора, и по различиям в продолжительности времени, которое требуется ионизированным фрагментам для достижения детектора, т.е. их времени пролета, выявляют молекулярные массы биомаркеров, при этом меньшие соединения достигают детектора раньше.
Данный способ генерирует профили массы образца, то есть профили молекулярных масс и количеств соединений в смеси. Эти профили могут затем использоваться для идентификации известных биомаркеров из баз данных биомаркеров.
Благодаря интерфейсу ESI-MS с жидкостной хроматографией (LC/MS/MS) элюирующиеся соединения из колонки LC вводят в источник ионов масс-спектрометра. Напряжение подается на тонкую иглу. Затем игла распыляет капли в масс-спектрометрический анализатор, где капли испаряются и ионы биомаркера высвобождаются в соответствии с различными зарядовыми состояниями, которые фрагментированы и по которым можно определить состав. В качестве альтернативы, SPE (твердофазная экстракция) или газовая хроматография могут быть связаны с масс-спектрометром. В частности, SPE/MS/MS нашла применение для автоматизированного и высокопроизводительного промышленного применения способа в соответствии с настоящим изобретением, такого как с использованием устройства Agilent Rapidfire MS (Rapidfire является зарегистрированным товарным знаком компании Agilent Inc.); или устройства лазернодиодной или термоионной десорбции LDID.
Тандемная масс-спектрометрия (MS/MS) включает активацию иона-предшественника посредством столкновений с целевым газом и может давать заряженные и нейтральные фрагменты. Природа ионов-фрагментов, а также их интенсивности часто указывают на структуру иона-предшественника и, таким образом, могут давать полезную информацию для идентификации неизвестных аналитов, а также обеспечивать полезную методику скрининга для различных классов аналитов. Активация посредством множественных столкновений продлевает время активации и позволяет придавать ионам-предшественникам более высокую энергию. Более высокое давление газа для соударений также предполагает более высокие скорости столкновительной релаксации.
Предпочтительно определение характеристики эмбриона в соответствии с настоящим изобретением выполняют как неразрушающий способ, т.е. позволяющий тестируемым таким образом эмбрионам расти, если это желательно, или подвергать его дальнейшим стадиям, таким как in ovo получение вакцин, при условии, что эмбрион жизнеспособен.
Используемый в настоящем документе термин «аллантоисная жидкость» охватывает аллантоисную жидкость с наличием или без наличия других яичных материалов, полученных из птичьих яиц. Например, термин «аллантоисная жидкость» может включают в себя смесь крови и аллантоисной жидкости. Варианты осуществления настоящего изобретения не ограничиваются извлечением материала из аллантоисной жидкости или из областей вблизи верхней поверхности яйца. Удаление материала из аллантоисной жидкости, как описывается в настоящем изобретении, представлено исключительно в качестве одного из примеров возможных вариантов осуществления настоящего изобретения. Различные материалы, в том числе без ограничения амнион, желток, скорлупа, альбумин, ткань, оболочка и/или кровь, могут быть извлечены из яйца и проанализированы для проведения спектрофотометрического анализа для идентификации пола эмбриона, как описывается ниже.
При желании материал может быть извлечен из яиц, имеющих практически любую ориентацию. Используемый в настоящем документе термин «заданное местоположение» означает фиксированное положение или глубину внутри яйца. Например, устройство может быть введено в яйцо на фиксированную глубину и/или в фиксированное положение в яйце. Согласно альтернативным вариантам осуществления инъекция может быть осуществлена на основе информации, полученной из яйца, например, относительно положения эмбриона или субгерминальной полости внутри яйца.
В качестве альтернативы, особенно в случае яиц моллюска, рыбы или мелкого ракообразного, высокая просвечиваемость таких яиц, а также их сравнительно небольшой размер относительно птичьих яиц может позволить прямой, неинвазивный анализ посредством прямых, неинвазивных измерений на целых яйцах.
Термин «сравнение спектров» предпочтительно может включать в себя одновариантный или предпочтительно многовариантный анализ измеренных спектров и определение ассоциации птичьего эмбриона с определенной популяцией. Стадия может включать определение наличия определенных пиков сигнала в спектре посредством многовариантного статистического анализа спектральных данных. Программа многовариантного статистического анализа предпочтительно включает в себя программу анализа главных компонентов и/или программу регрессионного анализа частичных наименьших квадратов. Таким образом, настоящее изобретение также относится к способу, устройству и системе для определения пола и/или жизнеспособности эмбриона птицы in ovo, включающим в себя многовариантную программу статистического анализа, а также к осуществляемому микропроцессором способу для определения этого.
Следовательно, сравнение предпочтительно включает оценку вероятности пола для образца с использованием многовариантного анализа измеренных спектров и определение ассоциации птичьего эмбриона с определенной популяцией. Преимущественно, его выполняют с использованием дискриминационного анализа частичных наименьших квадратов (PLS-DA).
Способ предпочтительно включает в себя математическую обработку данных меченого соединения и включает многовариантный анализ, такой как РСА (анализ главных компонент), предпочтительно с последующим контролируемым анализом, более предпочтительно PLS-DA (дискриминационным анализом частичных наименьших квадратов) или даже более предпочтительно с ортогональным PLSDA или с аналогичными подходящими статистическими подходами.
Стадия сопоставления с образцом в заявляемом способе будет идентифицировать определенную меру подобия. С использованием меры подобия подтверждают корректную структуру биомаркера. Это подтверждение выполняют с помощью спектрального соответствия. Спектральное соответствие выполняют путем сравнения спектров образца и эталонных спектров в базе данных. Для положительной идентичности на этой стадии требуется соответствующая корреляция, чтобы подтвердить точность определения. Подходящие пороговые значения и меры подобия будут очевидны для специалистов в данной области.
Данный способ пытается уменьшить большие объемы данных до управляемого размера и применить статистически управляемую модель для определения скрытых переменных, указывающих на скрытые отношения между наблюдаемыми данными.
Средство идентификации характеристики затем фильтрует данные образца, которые будут идентифицировать представляющие интерес кластеры среди образцов. Кластеры представляют подобия среди образцов и используются для идентификации профилей пола. Предпочтительно, анализ включает в себя анализ главных компонент (РСА) и PLS-DA.
РСА использует математические алгоритмы для определения различий и подобия в наборе данных. РСА трансформирует число возможно родственных переменных в меньшее число неродственных переменных, которые называются главными компонентами. Первая главная компонента учитывает как можно большую изменчивость данных. Каждая добавленная компонента пытается учесть как можно большую часть оставшейся изменчивости в данных. Собранные данные могут быть упорядочены в матрицу, и РСА выполняется для «собственных значений» и «собственных векторов» квадратно-симметричной матрицы с суммами квадратов и перекрестных произведений.
Собственный вектор, ассоциированный с наибольшим собственным значением, имеет то же направление, что и первая главная компонента. Собственный вектор, ассоциированный со вторым наибольшим собственным значением, определяет направление второй главной компоненты. Сумма собственных значений равна трассировке квадратной матрицы, а максимальное число собственных векторов равно количеству строк (или столбцов) этой матрицы. После определения можно построить экранные графики рассчитанных собственных значений. Специалистам в данной области будет понятно, что ряд различных алгоритмов может использоваться для вычисления собственных значений и собственных векторов. Данные отображают с использованием двух графиков: i) графика оценок, который показывает кластеризацию группы, и ii) графика нагрузок, на котором спектральные данные, ответственные за кластеризацию группы, идентифицируются как те, что находятся на наибольшем расстоянии от источника.
Способ в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно включает (a1) обеспечение образца, содержащего жидкость яйца; и (а2) получение спектра образца. Предпочтительно, стадия (b) дополнительно включает стадию нормализации эффектов интенсивности из-за различий в концентрации между любыми двумя образцами. Необязательная стадия (а3) устраняет предпочтительно мутность образцов подходящим способом, таким как ультрафильтрация или центрифугирование.
Предпочтительно, эмбрион является эмбрионом птицы, эмбрионом рептилии, ракообразного, рыбы или моллюска. Наиболее предпочтительно, тестированию подвергают птичьи эмбрионы из-за важного значения выращивания домашней птицы и из-за сравнительно крупного размера яиц, что позволяет отбор образцов.
Способ в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно может определять то, является ли эмбрион в яйце жизнеспособным и мужского пола, или жизнеспособным и женского пола, и разделять тестируемые яйца на множество жизнеспособных яиц мужского пола и множество жизнеспособных яиц женского пола, а также множество нежизнеспособных яиц, обеспечивая отбор яиц преимущественно мужского пола, или яиц преимущественно женского пола, или преимущественно нежизнеспособных яиц. При желании отобранные жизнеспособные яйца женского пола или мужского пола могут быть подвергнуты способу инкубации и вылупления с образованием популяции животных преимущественно женского пола или мужского пола.
Признаки, которые характеризуют настоящее изобретение, как в отношении организации и способа осуществления, так и в отношении других его целей и преимуществ, станут более понятными из последующего описания, используемого вместе с прилагаемыми графическими материалами. Следует четко понимать, что графические материалы предназначены для иллюстрации и описания, а не для ограничения настоящего изобретения. Эти и другие достигнутые цели, а также предлагаемые преимущества настоящего изобретения станут более понятными, поскольку последующее описание сопровождается графическими материалами.
Способы и устройство согласно вариантам осуществления настоящего изобретения могут быть использованы для идентификации одной или нескольких характеристик яйца в любой момент времени на протяжении периода эмбрионального развития, также называемого периодом его инкубации. Варианты осуществления настоящего изобретения не ограничиваются конкретным днем на протяжении периода эмбрионального развития.
Способ в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно может быть выполнен двумя путями: с использованием внутренних стандартов для обеспечения эталона для количественного определения интенсивности сигнала и без таких стандартов. Таким образом, согласно одному варианту осуществления один или несколько внутренних стандартов добавляют к образцу перед анализом с помощью масс-спектрометрии. Предпочтительно, внутренние стандарты метят. Предпочтительно, абсолютная интенсивность сигнала для каждого сигнала биомаркера затем может быть оценена путем измерения интенсивности сигнала биомаркера и сравнения с интенсивностью сигнала одного или нескольких известных внутренних стандартов. При альтернативном осуществлении образец обрабатывают без добавления внутренних стандартов. Согласно такому варианту осуществления относительную интенсивность сигнала оценивают путем измерения отношения между интенсивностями сигнала отдельного биомаркера в образце и интенсивностью сигнала эталона для группы образцов.
Мера подобия предпочтительно включает корреляционный индекс удерживания и паттерн фрагментации, ассоциированный с положительно корреляционным сигналом.
Далее статистически значимое подобие может быть выявлено и зарегистрировано как релевантные биомаркерные идентичности или множественные биомаркерные идентичности. Определение статистически значимых подобий включает использование баз данных, а также алгоритмов, разработанных для удовлетворения требований метода.
Это может включать, в частности, при определении применимости биомаркера для нового применения, контролируемый многовариантный анализ, предпочтительно дискриминационный анализ частичных наименьших квадратов, PLS-DA или ортогональный дискриминационный анализ частичных наименьших квадратов для данных.
Предпочтительно, характеристика, которая подлежит определению, включает в себя пол, возраст, стадию развития и/или жизнеспособность эмбриона в яйце. Для промышленного применения множество яиц проверяют на предмет одной или нескольких эмбриональных характеристик.
В способе в соответствии с настоящим изобретением база данных может быть создана для определенных видов путем скрининга биомаркеров, присутствующих в образце, и устранения нежелательных сигналов на основе индекса времени удерживания, который коррелирует со временем попадания соединения в детектор массы. Следовательно, многие последовательности могут быть проанализированы в течение минут, и данные биомаркеры могут быть идентифицированы с высокой достоверностью. Таким образом, способ является автоматизируемым, высокопроизводительным и может использоваться относительно неквалифицированными специалистами и, поэтому, подходит для применения в удаленных местоположениях, например, на инкубаторно-птицеводческих станциях и куриных или рыбных фермах.
Образец может быть подвергнут анализу масс без процедур предварительного разделения. Согласно такому варианту осуществления образец предпочтительно анализируют путем прямой инфузии с использованием, например, статических принципов наноэлектрораспыления, анализа введения в поток или введения в поток с обогащением образца.
Масс-спектрометрическая система предпочтительно представляет собой MS с ионизацией электрораспылением (ESI), времяпролетную MS с лазерной ионизацией и десорбцией из жидкой матрицы (MALDI-TOF) или времяпролетную MS или поверхностную лазерную десорбционную ионизацию (SELDI-TOF) или абсорбционную MS на основе настраиваемого диодного лазера (LDID).
В частности, SPE/MS/MS нашла применение для автоматизированного и высокопроизводительного промышленного применения способа в соответствии с настоящим изобретением, такого как с использованием устройства Agilent Rapidfire MS (Rapidfire является зарегистрированным товарным знаком компании Agilent Inc.); источника ионов LDTD (абсорбционной спектроскопии на основе настраиваемого диодного лазера) (LDTD является зарегистрированным товарным знаком компании Phytronics Inc.) Phytronics.
Как изложено выше, настоящее изобретение также относится к пищевому продукту для определения пола, жизнеспособности и/или стадии развития эмбриона, а также к применению меченого соединения-предшественника в пище для животного. Заявители неожиданно выяснили, что добавление подходящих соединений-предшественников в пищу овулирующему родительскому организму приводит к иной экспрессии метаболитов соединений-предшественников в яйце на протяжении эмбрионального развития.
В результате яйца демонстрируют измеряемую вариацию некоторых метаболитов в зависимости от характеристики эмбриона, такой как пол эмбриона. Предпочтительно, по меньшей мере одно меченое соединение-предшественник выбрано из соединения, которое приводится как пищевая добавка, допустимая Управлением США по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) и/или Европейской комиссией. В частности, подходящее меченое соединение-предшественник может быть выбрано из бутилированного гидроксианизола (ВНА) и/или родственного соединения бутилированного гидрокситолуола (ВНТ), которое представляет собой фенольное соединение, соответственно добавляемое в пищевые продукты для сохранения жиров. ВНА в настоящем документе относится к смеси изомеров 3-трет-бутил-4-гидроксианизола и 2-трет-бутил-4-гидроксианизола; тогда как ВНТ относится к 3,5-ди-трет-бутил-4-гидрокситолуолу; также известному как метил-ди-трет-бутилфенол; 2,6-ди-трет-бутил-пара-крезол. ВНА и ВНТ являются известными антиоксидантами; полагают, что кислород реагирует преимущественно с ВНА или ВНТ, а не окисляет жиры или масла, защищая тем самым их от порчи. В дополнение к способности окисляться ВНА и ВНТ являются жирорастворимыми. Меченый материал-предшественник предпочтительно добавляют в пищевой продукт в количестве, рассчитанном для обеспечения заданной концентрации или каждого меченого соединения в продукте. Предпочтительно, меченый материал-предшественник добавляют в продукт в количестве, рассчитанном для обеспечения заданной концентрации или каждого меченого соединения в яйце или образце яйца при концентрации в диапазоне от 5 частей на миллиард до 5 частей на миллион, более предпочтительно в диапазоне от приблизительно 10 до 1000 частей на миллиард и еще более предпочтительно от 50 до 500 частей на миллиард.
Меченый материал предпочтительно может содержать более чем одно меченое соединение, при этом относительные количества меченого соединения выбирают для обеспечения идентифицируемой характеристики для пола, жизнеспособности и/или стадии развития эмбриона яйцекладущих, при этом анализ яйца или образца яйца выполняют для идентификации характеристики относительных количеств меченых соединений. Анализ предпочтительно выполняют с использованием масс-спектрометра, такого как, например, датчик подвижности ионов. Образец может быть сначала подвергнут жидкостной хроматографии, газовой хроматографии или комбинации газовой хроматографии, которую предпочтительно объединяют с подходящим датчиком. Альтернативой MS датчику может быть пламенно-фотометрический детектор.
Предпочтительно, по меньшей мере одно из меченых соединений, присутствующих в образце, взятом из яйца, может быть отделено, дериватизировано или концентрировано перед анализом, после стадии анализа жидкости яйца инвазивно или неинвазивно. Предпочтительно, эмбрион, характеристика которого подлежит исследованию, является эмбрионом птицы, эмбрионом рептилии, эмбрионом ракообразного, эмбрионом рыбы или эмбрионом моллюска. Более предпочтительно, эмбрион является эмбрионом птицы, предпочтительно вида Gallus gallus domesticus, или при этом эмбрион является эмбрионом вида ракообразного, выбранного из группы, включающей в себя Peneidae, Astacoidea и Parastacoidea, Macrobrachiae; Astacoidea; Parastacoidea; Nephropidae и Homaridae, или при этом эмбрион является эмбрионом видов рыб, предпочтительно выбранного из карпа, тилапии, сома, морского леща, морского окуня, тунца, скумбрии, бонитоса или желтохвоста.
Настоящее изобретение также относится к пищевому продукту, применяемому для овулирующих животных-родителей, содержащему подходящее количество меченого соединения-предшественника.
Оценка вероятности пола для образца предпочтительно включает применение контролируемого многовариантного анализа, предпочтительно дискриминационного анализа частичных наименьших квадратов, PLS-DA или ортогонального дискриминационного анализа частичных наименьших квадратов для данных.
Предпочтительно, отклоняющиеся значения могут быть удалены из популяции, что тем самым еще больше усиливает достоверность определения, а также способствует получению яиц, подлежащих использованию для других целей.
Способ в соответствии с настоящим изобретением, кроме того, предпочтительно включает разделение яиц на множества яиц мужского пола или женского пола; кроме того, он также может предпочтительно включать определение жизнеспособности эмбриона и разделение яиц на одно или несколько, предпочтительно множество, жизнеспособных яиц и нежизнеспособных яиц.
Способ в соответствии с настоящим изобретением, в котором отклоняющиеся значения удаляют из популяции, предпочтительно дополнительно включает определение того, является ли эмбрион в яйце жизнеспособным и мужского пола, или жизнеспособным и женского пола, и отделение множества жизнеспособных яиц мужского пола от множества жизнеспособных яиц женского пола и отклоняющихся значений для обеспечения отбора преимущественно яиц мужского пола или преимущественно яиц женского пола.
Кроме того, способ в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно включает подвергание отобранных жизнеспособных яиц женского пола или мужского пола способу инкубации и вылупления для формирования популяции животных преимущественно женского пола или мужского пола.
Жизнеспособность эмбриона предпочтительно может быть определена с использованием измеряемых биомаркеров. Для неоплодотворенных яиц, а также умерших эмбрионов через определенный промежуток времени (т.е. через несколько минут после окончания метаболизма) измеряемые результаты явно полностью выходят за пределы окна измерения, что приводит к отклоняющимся значениям, которые удаляются из жизнеспособных яиц. В равной степени, по меньшей мере в случае эмбрионов птиц, при использовании образцов, например, аллантоиса, они очень быстро после окончания метаболической активности станут нарушенными и в конечном итоге желтыми из-за растворения оболочек, которые удерживают яичный желток отдельно. Кроме того, могут быть измерены сердцебиение или ток крови для определения эмбриональных метаболических активностей.
Настоящее изобретение также относится к применению множества яиц, получаемых раскрываемым в настоящем документе способом получения продуктов питания для животного и/или человека, для получения и/или выделения косметических, лекарственных и/или питательных соединений, для получения метана посредством ферментации, для получения вакцин и/или для получения высококачественных удобрений.
Далее представлены неограничивающие примеры для иллюстрации настоящего изобретения.
Пример 1. Транспортировка и хранение образцов
Для исследования биомаркеров использовали платформы определения профиля нескольких аналитических метаболитов, они представляли собой биогенные амины, отрицательные полярные липиды, определение нецелевого глобального профиля и GC-MS.
Для стадии исследования анализировали 100 образцов. Другой набор из 350 образцов из яиц с разными исходными значениями в отношении питания и расы анализировали для стадии подтверждения, при этом исследуемые биомаркеры для пола и возраста определяли по меньшей мере на двух платформах.
Первые 150 образцов аллантоисной жидкости (от бурой курицы) собирали в дни 7-11 инкубации и хранили при -80°С.
Данные определения генетического пола для данных образцов получали с использованием метода PCR. Отбирали образцы для пола на день, тогда как избыточные образцы данного набора использовали для анализа ЯМР. Затем метаболический профиль этих образцов анализировали с использованием амина, полярных отрицательных липидов, CG-MS (для соединений сахара) и платформ определения глобального профиля.
Другие 300 образцов аллантоисной жидкости собирали на инкубаторно-птицеводческой станции в течении дней 7-11 инкубации бурой курицы.
Анализ генетического пола обеспечивали, но не использовали до построения статистической модели. Данные образцы использовали для подтверждения признаков, обнаруженных предварительным анализом определения глобального профиля. Кроме того, 59 образцов собирали из белых яиц (линии Hey CV 24) и также использовали для данного подтверждающего исследования.
Аликвоты
Образцы оттаивали на протяжении ночи при 4°С перед их аликвотированием. Образцы откручивали на вортексе и вручную аликвотировали следующим образом: 5 мкл для аминного определения профиля, 50 мкл для определения профиля полярного отрицательного липида и 100 мкл для GC-MS (анализа соединений сахара). Создавали пул контроля качества (QC) путем отбора равных количеств из каждого образца с последующим тщательным смешиванием.
Схема партий
Для стадии исследования образцы рандомизировали и распределяли на две партии для измерений аминов. Для отрицательных липидов и определения глобального профиля образцы исследовали одной партией. В качестве повторностей выбирали каждые семь образцов, а также включали калибровочные линии, QC и пустые контроли. В качестве QC анализировали каждые 10 образцов, их использовали для оценивания качества данных и для коррекции по аналитическому сигналу. Пустые контроли использовали для вычитания фоновых уровней из исследуемых образцов.
Необработанные данные предварительно обрабатывали с использованием программного обеспечения Agilent MassHunter Quantitative Analysis (Agilent, версия B.05.01).
Аминное определение профиля
Все упомянутое оборудование, расходные материалы и программное обеспечение обеспечивала компания Waters (Etten-Leur, The Netherlands), если не указано иное. Аминная платформа охватывает аминокислоты и биогенные амины с использованием стратегии дериватизации AccQ-меткой, адаптированной компанией Waters. Вкратце, образцы аллантоисной жидкости (по 5 мкл каждый) дополняли раствором внутреннего стандарта (таблица 1), а затем депротеинизировали с помощью МеОН (Actu-All Chemicals). Надосадочную жидкость (10000 оборотов в минуту, 10°С, 10 минут) сушили в условиях вакуума. Остаток восстанавливали в боратном буфере (рН 8,5) с 6-аминохинолил-N-гидроксисукцинимидилкарбаматным (AQC) реагентом. Реакцию дериватизации нейтрализовали с помощью 10 мкл 20% муравьиной кислоты (Acros Organics). Надосадочную жидкость (10000 оборотов в минуту, 10°С, 10 минут) переносили во флаконы и помещали в охлажденный (10°С) поддон авто дозатора до инъекции (1 мкл) в систему UPLC-MS/MS.
Анализ данных
13
15
Полученные данные оценивали и определенные MRM пики интегрировали с использованием программного обеспечения TargetLynx. MRM пики нормализовали с использованием соответствующих внутренних стандартов, для анализа аминокислот использовали их CN-меченные аналоги, а для других аминов использовали наиболее близкий элюирующий внутренний стандарт. Образцы пустого контроля использовали для коррекции по фону. Применяли собственные разработанные алгоритмы с использованием объединенных образцов QC для коррекции по сдвигам в чувствительности масс-спектрометра в партии.
Анализ данных исследования выполняли для выяснения того, может ли быть обнаружен половой признак. Для этого применяли одновариантные и многовариантные стандартные способы анализа данных в BMFL, которые обычно используются авторами настоящего изобретения для обнаружения биомаркеров.
Затем образцы подвергали тестированию на автоматизированном устройстве совмещенной SPE/MS/MS Rapidfire с высокой пропускной способностью, а также на устройстве LDPD Phytronix. Результаты показывают, что пол жизнеспособных яиц определяли с точностью более чем 95%, менее чем за 10 секунд на образец. На фиг. 1 показана итоговая достоверность определения пола, которая составляла более чем 95% в день 9 или день 10, когда два биомаркера рассматривали вместе.
Вылупление
Серии из 25 яиц, считающихся яйцами мужского пола или женского пола, которые были подвергнуты отбору образцов, как указано выше, и тестированию, обеспечивали вылупление с использованием коммерческого инкубационного устройства и типичных условий инкубации. Все птенцы успешно вылупились из яиц, демонстрируя переносимость отбора образцов. Вылупившиеся цыплята полностью соответствовали популяции либо мужского пола, либо женского пола.
Пример 2. Неинвазивное определение с использованием летучих соединений и твердофазной микроэкстракции (SPME)
Сбор образцов летучих соединений выполняли путем переноса отдельно яйца в стеклянный сосуд, запечатываемый алюминиевой фольгой и металлической крышкой. Затем сосуд помещали на нагревательную пластину, поддерживая температуру внутри сосуда на уровне 37°С. Яйцо в сосуде оставляли на 15 минут для достижения равновесия со свободным пространством в сосуде. Сборный волокнистый материал кондиционировали перед использованием в соответствии с инструкциями производителя. Затем вводили волокно и экстракцию проводили в течение 50 минут. После экстракции волокно вводили в инжектор газового хроматографа на 5 минут для десорбции аналитов при 250°С в режиме без разделения. Яйцо возвращали в инкубатор сразу после сбора летучих соединений. Пустые контроли готовили путем проведения SPME в пустом сосуде и перед анализом проводили рекондиционирование волокна, чтобы гарантировать отсутствие пиков и хорошее качество процедуры SPME.
Летучие соединения, высвобождаемые из яйца, затем измеряли газовой хроматографией на Agilent Technologies (Wilmington, DE, USA) 7890A, оборудованном масс-селективным детектором Agilent Technologies (MSD 5975C). Хроматографическое разделение проводили на колонке HP-5MS UI (5% фенилметилсилокс), 30 м × 0,25 м ID с толщиной пленки 25 м (Agilent) с использованием гелия в качестве газа-носителя со скоростью потока 1 мл/минута. Использовали одноквадрупольный масс-спектрометр с электронной ионизацией (EI, 70 эВ). Масс-спектрометр работал в режиме SCAN. Для экстракции летучих соединений использовали волокно для твердофазной микроэкстракции (SPME) с размером пор 60 мкм PDMS/DVB Stableflex 24 калибра. Необработанные данные преобразовывали в формат CDF с использованием MSD Chemstation F.01.00.1903. Сценарий XCMS разрабатывали и применяли к программному обеспечению R (R, версия 3.2.0) для выполнения выбора пикового значения. Для этого использовали метод «matchedFilter» с fwhm = 4 (Peakwidth), шаг = 0,5 (окно Mass) и snthresh =5 (S/N). Использовали Metaboanalyst 3.0 для статистического анализа. Наконец, использовали MassHunter Qualitative Analysis В.005.00 для ручной проверки наиболее важных характеристик в соответствии с полученными результатами. NIST Mass Spectral Library версии 2.0 использовали для идентификации.
В данном способе из TIC каждого образца получали 1486 признаков различных масс при разных временах удерживания в секундах. После извлечения эти признаки обрабатывали с применением одновариантного способа с Test с использованием Metaboanalyst 3.0 для идентификации половых отличительных признаков с уверенностью 99%.
Заявители выяснили, что особенно важным биомаркером, показывающим значительную разницу между яйцами мужского пола и женского пола, является бутилированный гидрокситолуол, который представляет собой производное ВНТ, в качестве предшественника.
Яйца женского пола показывали значительно более высокую концентрацию бутилированного гидрокситолуола по сравнению с яйцами мужского пола. Следовательно, применение меченого предшественника привело к созданию биомаркера, который позволяет различать куриные эмбрионы мужского и женского пола в яйцеклетке in ovo с высокой степенью достоверности совершенно неинвазивным способом.