Аптамеры: новые молекулярные диагностические маркеры бактериальных и вирусных инфекций

НАУЧНЫЕ ОБЗОРЫ

Аптамеры: новые молекулярные диагностические маркеры бактериальных и вирусных инфекций*

Ф.М. Цимбрез1, A. Тарнок2, X. Улрих3, К. Вренгер1

1 Подразделение разработки лекарственных препаратов, отделение паразитологии, Институт биомедицины Университета Сан-Паулу, Сан-Паулу, Бразилия

2 Отделение педиатрической кардиологии, кардиологический центр Лейпцига, Трансляционный центр регенеративной медицины, Университет Лейпцига, Лейпциг, Германия

3 Отделение биохимии, Институт химии, Университет Сан-Паулу, Сан-Паулу, Бразилия

Во всем мире население подвергается риску инфекционных заболеваний, большинство из них вызывают патогенные простейшие, черви, бактерии и вирусы. Более того, существующие лекарственные препараты против патогенных агентов теряют свою эффективность из-за возрастающей и все более распространяющейся лекарственной резистентности. В связи с этим существует острая необходимость в разработке новых диагностических, а также терапевтических методов против возбудителей инфекции. Имеющаяся систематическая эволюция лигандов экспоненциальным обогащением (SELEX) представляет собой мощную технологию, избирательно направ-

ленную на выявление факторов патогенеза, а также бактерий или вирусов. SELEX использует обширную комбинаторную библиотеку олигонуклеотидов - де-зоксирибонуклеиновых кислот (ДНК) или рибонуклеиновых (РНК), которые подвергаются высокопоточному скринингу in vitro во время итерационных циклов. Отобранные лиганды, так называемые аптамеры, характеризуются высокой специфичностью и сродством с молекулой-мишенью и уже используются в диагностических и терапевтических целях. В этом небольшом обзоре мы обсудим современное состояние методики SELEX в применении к бактериальным и вирусным патогенным возбудителям.

Aptamers: novel molecules as diagnostic markers in bacterial and viral infections?

F.M. Zimbres1, A. Tarnok2, H. Ulrich3, C. Wrenger1

1 Unit for Drug Discovery, Department of Parasitology, Institute of Biomedical Science, University of Sao Paulo, Sao Paulo, Brazil

2 Department of Pediatric Cardiology, Heart Centre Leipzig, Translational Centre for Regenerative Medicine (TRM), University of Leipzig, Leipzig, Germany

3 Department of Biochemistry, Institute of Chemistry, University of Sao Paulo, Sao aulo, Brazil

Worldwide the entire human population is at risk of infectious diseases of which a high degree is caused by pathogenic protozoans, worms, bacteria, and virus infections. Moreover the current medications against pathogenic agents are losing their efficacy due to increasing and even further spreading drug resistance. Therefore, there is an urgent need to discover novel diagnostic as well as therapeutic tools against infectious agents. In view of that, the Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment (SELEX) represents a powerful technology to target selectively pathogenic

factors as well as entire bacteria or viruses. SELEX uses a large combinatorial oligonucleic acid library (DNA or RNA) which is processed a by high-flux in vitro screen of iterative cycles. The selected ligands, termed aptamers, are characterized by high specificity and affinity to their target molecule, which are already exploited in diagnostic and therapeutic applications. In this minireview we will discuss the current status of the SELEX technique applied on bacterial and viral pathogens.

Biomed. Res. Int. 2013; 2013: 731516.

doi: 10.1155/2013/731516.

* Эта статья находится в открытом доступе и распространяется в соответствии с некоммерческой лицензией «Creative Commons», которая допускает ее неограниченное использование в некоммерческих целях, а также распространение и воспроизведение в любых средствах массовой информации, если оригинальная работа процитирована надлежащим образом.

НАУЧНЫЕ ОБЗОРЫ

Из-за постоянно возрастающей численности населения, а также роста резистентности патогенных микроорганизмов человека к существующим методам лечения возникает неотложная необходимость в разработке новых диагностических и, в еще большей степени, терапевтических инструментов для решения указанных проблем в ближайшем будущем. Требуется не только разработка новых инструментов, но и (что становится еще более важной проблемой) коммерческая оценка предполагаемых затрат. В этом смысле открытие новых технологий и, более того, их последующее применение заняли важное место в лабораторных и клинических исследованиях. Как пример, инновации в области анализа высокой пропускной способности единичной клетки при цитометрии, но сегодня эти инновации также доступны для функционального анализа и при разработке лекарственных препаратов. Метод используется для выявления патогенных микроорганизмов, таких как вирусы гепатита С [1], гриппа [2] или вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) [3], а также бактерий, например Mycobacterium tuberculosis [4] или Staphylococcus aureus [5]. Техника SELEX была изобретена Gold и Szostak [6, 7]. Они использовали повторяющийся отбор in vitro, чтобы получить лиганды олигонуклеотидов высокого сродства (аптамеры) почти против любых молекул, что представляет биологический или терапевтический интерес. Аптамеры РНК и ДНК распознают мишени с высокой специфичностью и сродством. Эти лиганды высокой степени сродства можно разработать почти против любой мишени посредством повторяющихся циклов in vitro при скрининге комбинаторного набора олигонуклеотидов для связывания мишени с последующей амплификацией с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Процедуры SELEX используют библиотеки случайных олигонуклеотидов, включающие до 1012-1015 различных молекул нуклеиновой кислоты, выявляя как минимум эквивалентное число вторичных и третичных структур со-

ответствующих одноцепочечных молекул нуклеиновой кислоты [8].

В методике SELEX применяют обширную комбинаторную библиотеку олигонуклеотидов, исходный оли-гонуклеотидный пул (ДНК или РНК), состоящий из внутреннего случайного участка между двумя постоянными участками. Далее внимание обращают исключительно на разработку аптамеров ДНК. Набор ДНК, состоящий из частично рандомизированных последовательностей ДНК (внутренний случайный участок между постоянными последовательностями), амплифицирован с помощью обычной ПЦР. Полученную двухцепочечную ДНК денатурируют и с помощью гель-электрофореза разделяеют на одноцепочечную. Одноцепочечную ДНК изолируют и впоследствии инкубируют с соответствующими молекулами-мишенями - позитивный отбор. После этапа инкубации сформированный комплекс аптамера и мишени отделяют от несвязавшихся аптамеров и используют в ПЦР для амплификации аптамеров, связанных с мишенью (рис. 1, a). На заключительном этапе негативные циклы (рис. 1, б) выполняют для удаления аптамеров, которые связываются неопределенным образом или не связываются с желаемыми молекулами-мишенями. В результате этого несвязанные аптамеры восстанавливают, амплифицируют с помощью ПЦР и используют в следующем (позитивном) цикле отбора. В дальнейшем из окончательно отобранных «библиотек» для верификации консенсусной последовательности мотивов идентифицируются и выравниваются последовательности аптамеров. При необходимости, чтобы оптимизировать аптамеры для любой желаемой цели после завершения SELEX, возможна последующая модификация, например процессинг, стабилизация и прикрепление флуоресцентных меток.

После первого цикла отбора in vitro против выбранной молекулы-мишени элюированные аптамеры амплифицируют с помощью ПЦР, чтобы восстановить библиотеку ДНК для следующего цикла SELEX. Число циклов зависит

Клонирование и упорядочение заключительного набора ДНК

Модификации после завершения SELEX

АПТАМЕРЫ

Постоянный Случайный Постоянный

I I

1

Восстановление комплекса

л/v

АА

✓Ov

ал

АЛ

Инкубация ДНК с мишенью

АЛ

лК

Амплификаци

щ

Денатурация

АА

Инкубация ДНК

без мишени

лл

Восстановление несвязанного материала

(негативный отбор)^^ w/v

б

Рис. 1. Схематическая иллюстрация методики SELEX. Объяснения даны в тексте

а

от сродства взаимодействия аптамера с мишенью, а также от точности, заданной в каждом цикле отбора. После нескольких итеративных циклов SELEX аптамеры отбирают в соответствии с их молекулами-мишенями (этап позитивного отбора) (см. рис. 1, а). Если молекулы-мишени высокой чистоты не используются, набор необходимо подвергнуть воздействию различных загрязняющих молекул для выбраковывания этих молекул (этап негативного отбора) (см. рис. 1, б). Затем заключительный набор аптамеров высокого сродства клонируют и устанавливают последовательность для определения консенсусных мотивов, отвечающих за вторичные/третичные структуры, взаимодействующие с молекулой-мишенью [9]. Эти структуры включают множество различных констелляций и, среди прочих, структуры по типу «стебель-петля».

Сравнение ДНК- и РНК-структур по типу «стебель-петля» позволило предположить, что молекулы на основе ДНК менее стабильны. В то же время благодаря отсутствию гидроксильной группы у 2'-углеродного атома рибозы ДНК характеризуется большей гибкостью, что, следовательно, приводит к более высокому разнообразию структурных констелляций [10]. В отличие от ДНК-аптамеров, РНК-аптамеры требуют обратной транскрипции до амплификации с помощью ПЦР, и, с точки зрения стабильности, им, возможно, необходимы модификации, такие как замена группы 2'-OH рибозы на 2'-амино-, 2'-фтор или О-метиленовую группу, чтобы продлить период полувыведения из биологических жидкостей [11, 12]. В отличие от РНК-аптамеров, которые подлежат модификациям для предотвращения их разрушения рибонуклеа-зой, ДНК-аптамерам не нужны никакие модификации для достижения стабильности при различном применении. Кроме того, ДНК-аптамеры можно легко модифицировать для прикрепления к ним каких-либо химических групп, например флуоресцентных красок или биотина [13]. Биоти-нилированные аптамеры впоследствии можно применять в экспериментах с «отпусканием», используя магнитные шарики, покрытые стрептавидином [14, 15], или визуализировать мишени, используя флуоресцентные репортеры [16]. Способность к связыванию аптамера обусловлена его последовательностью и способностью складывания в структуры по типу «стебель-петля» (рис. 2) [13, 17]. Комплексы аптамер-мишень часто демонстрируют низкие константы диссоциации, которые колеблются от нано- до

пикомолярных уровней [9, 18], что сопоставимо с уровнями диссоциации моноклональных антител.

Структуры аптамеров по типу «стебель-петля» играют фундаментальную роль в связывании молекулы-мишени. Соответствующие консенсусные последовательности связывания аптамеров с (a) гликопротеином E2 вируса гепатита С на поверхности клеток [24] и (б) белки внешней мембраны S. enterica серовара Typhimurium [25] были проанализированы с помощью программы [26] MFoLd для прогнозирования вторичных структур.

Кроме того, аптамеры способны различать изоформы белка [19], а также различные конформационные формы того же самого белка [20]. Более того, аптамеры могут денатурироваться и восстанавливать свою структуру при изменении температуры. Также они образуются путем итеративного процесса in vitro, а не in vivo, как это происходит в случае антител животного происхождения [16].

В ближайшем будущем аптамеры высокого сродства на основе олигонуклеотидов, как ожидается, во многих случаях заменят антитела, главным образом благодаря своей стабильности, непептидной структуре и независимости от животных ресурсов. Кроме того, полезные характеристики аптамеров уже использовались в борьбе с инфекционными заболеваниями, что будет описано ниже.

ПРИМЕНЕНИЕ АПТАМЕРОВ

ПРИ ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЯХ

ЧЕЛОВЕКА

Инфекционными заболеваниями страдает и человечество, и животный мир. Кроме того, постоянно растет уровень резистентности патогенных микроорганизмов к имеющимся лекарственным препаратам, что ухудшает состояние здоровья населения во всем мире, особенно в развивающихся странах, где инфекционные болезни обусловливают высокую заболеваемость и смертность [21]. Все эти факторы в сочетании с постоянным увеличением численности населения и ростом лекарственной резистентности микроорганизмов стимулировали научные исследования по поиску новых диагностических инструментов и химио-терапевтических препаратов, способных справиться с патогенными агентами. В данной статье мы сосредоточимся на применении методики SELEX для борьбы с бактериальными и вирусными инфекциями человека.

рис. 2. Прогнозированная структура избранных одноцепочечных ДНК-аптамеров

АПТАМЕРЫ и БАКТЕРИАЛЬНЫЕ ИНФЕКЦИИ

Рост заболеваемости туберкулезом наряду с малярией и ВИЧ-инфекцией служит огромной проблемой здравоохранения, затрагивающей миллионы людей во всем мире. В настоящее время существует только одна вакцина против туберкулеза на основе аттенуированного штамма Mycobacterium bovis «БЦЖ» - бацилла Кальметта-Герена, однако в регионах, эндемичных по туберкулезу, вакцина обладает лишь ограниченной эффективностью [22]. В 2007 г. Chen и соавт. [23] изолировали аптамер NK2 с высоким сродством и специфичностью к мембранным белкам на поверхности вирулентного штамма M. tuberculosis H37Rv, не представленного в вакцине БЦЖ. Кроме того, связывание аптамера NK2 с H37Rv привело к тому, что CD4+ T-клетки стали вырабатывать повышенное количество интерферона-у, который, как известно, является защитным цитокином против инфекций M. tuberculosis. Исследование селезенки мышей, получавших аптамер NK2, свидетельствовало об уменьшении количества бактерий, по сравнению с контрольной группой [23]. Эти результаты подчеркивают эффективность аптамера NK2 как препарата против микобактерий туберкулеза (см. таблицу).

Другой распространенный возбудитель Salmonella играет большую роль в бактериальных пищевых инфекциях. Приблизительно 25% всех больных, страдающих диареей пищевого происхождения, нуждаются в госпитализации. Чаще всего причиной заболевания служит сальмонеллез, вызванный мультирезистентными штамма-

ми Salmonella enterica (серовар Typhimurium DT104) или S. enterica (серовар Newport) [27]. Кроме того, сальмонеллы составляют весомую долю в группе болезнетворных микроорганизмов, поражающих мясомолочный скот, включая коров [28], свиней [29], цыплят [30] и индюков [31]. Чтобы оценить потенциал аптамеров против мульти-резистентных штаммов S. enterica (серовар Typhimurium), к белку наружной бактериальной мембраны был применен метод SELEX с использованием аптамеров ДНК путем негативного отбора против белка наружной бактериальной мембраны Escherichia coli и липополисахаридов (этап негативного отбора). Затем были выявлены аптамеры, которые селективно взаимодействуют только с белками наружной бактериальной мембраны (см. таблицу) [25].

Известно, что введение фимбрий типа IVB S. enterica серовара Typhimurium A21-6 в моноциты человека THP-1 демонстрирует более высокую активность, чем введение мутантного штамма S. enterica серовара Typhimurium без фимбрий. Для вмешательства в формирование и доступность фимбрий типа IVB была применена методика SELEX, позволившая обнаружитьодноцепочечные РНК-аптамеры, которые селективно связываются с фимбриями и таким образом препятствуют попаданию инфекции в моноциты человека THP-1 [32]. Анализ консенсусной последовательности определил структуру по типу «стебель-петля», которая могла бы стать возможным связывающим участком аптамера [32]. Таким образом, эти РНК-аптамеры рассматриваются в качестве нового препарата для блокирования бактериального патогенеза.

Обзор аптамеров против бактериальных и вирусных патогенных микроорганизмов человека

Аптамеры тип аптамера Микроорганизм Мишень ссылка

NK2 ДНК-аптамер Mycobacterium tuberculosis (штамм H37Rv) Мембранные белки [23]

33 ДНК-аптамер Salmonella enterica серовар Typhimurium Наружные белки мембран (OMP) [25]

S-PS8.4 РНК-аптамер Salmonella enterica серовар Typhimurium Фимбрии типа IVB [32]

SA20, SA23, SA31, SA34 SA43 ДНК-аптамер Staphylococcus aureus (штамм MRSA) Вся бактериальная клетка [33]

ZE2 ДНК-аптамер Вирус гепатита C Поверхностный гликопротеин E2 оболочки вируса гепатита С [24]

Последовательность (1), последовательность аптамера (2)и последовательность аптамера (3) ДНК-аптамер Вирус птичьего гриппа H5N1 Гемагглютинин [34]

FO21 и FO24 ДНК-аптамер Вирус бешенства (RABV) RABV-инфицированные клетки BHK-21 [35]

A-1 и Ch A-1 РНК-аптамер Вирус иммунодефицита человека 1 типа (HIV-1) gp120 [36]

RT1t49 ДНК-аптамер [37]

70,5,70,8, 80,55, 80,93 и T1,1 РНК-аптамер [38]

Изоляты TPK, TPK-подобные изоляты и изоляты, не относящиеся к TPK РНК-аптамер Вирус иммунодефицита человека 1 типа (HIV-1) Обратная транскриптаза вируса [39]

70,8, 13, 70, 15, 80, 55, 65, 70, 28, 70,28t34 и 1,1 РНК-аптамер [40]

1,1 и 1,3a РНК-аптамер [41]

Бактерии, такие как S. aureus или E. coli, присутствуют в организме человека в норме. Например, S. aureus выделяется приблизительно у 20% здоровых взрослых, транзиторное носительство встречается у 50% населения. Стрептококки играют важную роль в развитии вну-трибольничных инфекций, поражающих пациентов со сниженным иммунитетом. Этот микроорганизм вызывает широкий спектр заболеваний, в том числе опасных для жизни, например пневмонию или эндокардит [42]; он становится значимым болезнетворным агентом, поражающим человека, особенно вследствие появления штаммов метициллин-резистентного стафилококка S. aureus (MRSA). Эти бактерии, как известно, вырабатывают мощные белковые токсины и экспрессируют белки клеточной поверхности, которые могут связываться с антителами и, таким образом, инактивировать их функцию [43]. Точно установлено, что бактерии могут экспрессировать различные комбинации молекул для контроля собственной пролиферации на различных стадиях роста [44, 45]. Они могут даже образовывать вариации антигенов, позволяющие избежать иммунной реакции со стороны хозяина [46, 47]. Чтобы справиться с этими бактериальными механизмами, X. Cao и соавт. разработали целый набор специфических маркеров [33]. Они получили панель одно-цепочечных ДНК-аптамеров с высокой специфичностью и чувствительностью в отношении S. aureus. Выделенные аптамеры были сгруппированы в различные семейства на основании гомологии последовательностей, а также подобия их прогнозированной вторичной структуры. Впоследствии были выявлены 5 аптамеров, которые распознавали различные молекулярные мишени, а их комбинация оказалась намного эффективней для обнаружения различных штаммов S. aureus, чем применение каждого по отдельности. Эти результаты ясно демонстрируют, что ряд аптамеров, специфичных для одной бактерии, можно применять в качестве высокоизбирательного диагностического инструмента и даже потенциально заблокировать цикл роста болезнетворного микроорганизма [33].

АПТАМЕРЫ ПРИ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЯХ

Гепатит С - инфекционное заболевание, вызываемое вирусом гепатита С, регистрируемое приблизительно у 3% населения в мире; вирусный гепатит С у 80% зараженных людей поражает клетки печени, приводя в некоторых случаях к циррозу. В настоящее время не разработано никакой эффективной вакцины, и лечение этого инфекционного заболевания основано на монотерапии интерфероном-a или его сочетании с рибавирином [4850]. Однако эффективность терапии недостаточна, лечение дорогое и сопряжено с риском серьезных побочных эффектов [48, 49, 51]. Чтобы открыть новые методы выявления и избирательного подавления быстрой пролиферации вируса, была разработана методика систематической эволюции лигандов экспоненциальным обогащением на поверхности живых клеток (CS-SELEX). Впоследствии ее применяли для отбора одноцепочечных ДНК-аптамеров,

направленных на поверхностный гликопротеин E2 оболочки вируса гепатита С [24]. Одноцепочечный ДНК-аптамер, который специфически связывает гликопротеин E2 оболочки вируса гепатита С, назвали ZE2. Считается, что аптамер ZE2 конкурентно ингибирует гликопротеин E2 оболочки вируса гепатита С путем связывания с CD81, важным рецептором вируса гепатита С, и в значительной степени блокирует вирус гепатита С в клеточной культуре гепатоцитов человека. Таким образом, благодаря своей эффективности аптамер ZE2 заслуживает особого внимания в качестве возможного нового кандидата для диагностики и лечения вирусного гепатита С.

Вирус гриппа H5N1, также известного как птичий грипп, представляет собой разновидность вирус гриппа типа А, с которым связаны основные эпидемии и пандемии. Поэтому (помимо использования других терапевтических инструментов) отбор аптамеров против вируса типа А (H5N1) также привлек внимание исследователей. R. Wang и соавт. [34] начали с библиотеки одноцепо-чечной ДНК и осуществили первые раунды циклов отбора с использованием гемагглютинина вируса гриппа А (H5N1). Впоследствии в качестве мишени использовался весь вирус H5N1. После различных раундов позитивного отбора SELEX и очистки отобранных пулов олигонуклео-тидов - связанных, чтобы не служить в качестве мишеней для подтипов вируса птичьего гриппа (H5N2, H5N3, H5N9, H7N2, H2N2 и H9N2), аптамеры клонировали и упорядочили. Обнаруженные консенсусные последовательности были проанализированы для прогнозирования вторичных структур, что привело к идентификации петель шпилек и выпуклых петель, которые, как полагают, играют важную роль в связывании мишени. При помощи резонанса поверхностного плазмона был выявлен один апта-мер, обладающий высокой способностью к связыванию с константой диссоциации вируса H5N1 менее 5 нм.

Бешенство - зооноз, который вызывается вирусом бешенства (RABV) и передается с инфицированной слюной при укусе или прямом контакте со слизистой оболочкой. Заражение этим вирусом вызывает острый энцефалит, заканчивающийся комой и смертью. Этому заболеванию подвержены многие теплокровные млекопитающие. В настоящее время нет утвержденных рекомендаций по назначению лекарственных препаратов, применяемых после появления первых клинических симптомов. Поскольку данное заболевание всегда имеет летальный исход, разработка дешевого и эффективного лекарственного средства чрезвычайно актуальна. С этой целью отобрали аптамеры против клеток, инфицированных вирусом бешенства, с использованием методики CeLL-SELEX [35]. Эти аптамеры впоследствии применили для анализа титра вируса, который ясно продемонстрировал ингибирование клеток, инфицированных вирусом бешенства, в то время как ингибирования вируса собачьей чумы или собачьего парвовируса не наблюдалось. Кроме того, в тестах in vivo аптамеры в определенной степени защищали мышей от заражения бешенством. Интересно, что отобранные аптамеры обладали защитным свойством: когда мыши были привиты аптамерами перед введением CVS-11, умерло

приблизительно 15% животных, в то время как при использовании аптамеров для лечения погибли почти все животные [35].

Появление вирусов с лекарственной резистентностью характерно и для других патогенных агентов, в том числе ВИЧ. Приблизительно 30 лет назад было обнаружено, что ВИЧ содержит несколько маленьких последовательностей РНК или участков, которые могут специфически связываться с вирусными или клеточными белками с высокой степенью сродства. Функциональные исследования показали, что эти вирусные РНК-белковые комплексы можно использовать в терапевтических целях, что было продемонстрировано для небольших участков РНК ВИЧ, которые называются TAR. Такие комплексы можно применять для торможения репликации ВИЧ в клеточных моделях [52]. Гликопротеин gp120 оболочки вируса ВИЧ-1 играет основную роль при заражении CD4-позитивных-клеток. Слияние клеток инициируется взаимодействием между gp120 и CD4 (см. табл.). С учетом этого механизма были созданы РНК-аптамеры, которые селективно связываются с гликопротеином gp120 [53, 54]. В гуманизированной мышиной модели, где репликация ВИЧ-1 и истощение T-клеток имитируют то, что происходит в организме человека, C.P. Neff и соавт. [36] обнаружили, что аптамер анти-др120 подавил репликацию ВИЧ-1 и предотвратил опосредованное вирусном снижение концентрации T-клеток.

Методику SELEX также применили к вирусной обратной транскриптазе, необходимой для репликации, определив РНК- и ДНК-аптамеры, которые связываются с многочисленными эпитопами обратной транскриптазы вируса с высоким сродством и специфичностью [37, 38, 55]. Среди этих аптамеров привлекли внимание псевдоузлы РНК, которые связываются с обратной транскриптазой ВИЧ-1 на наномолярном уровне [39-41], ингибируют ее каталитическую активность [38] и тормозят репликацию ВИЧ в куль-

туре клеток [40, 56, 57]. Эти результаты подчеркивают, что связывание аптамеров с обратной транскриптазой ВИЧ-1 представляет собой новый многообещающий инструмент, который может использоваться в терапевтических целях.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Как описано выше, бактериальные и вирусные инфекционные заболевания представляют собой большую угрозу для человека. Следует признать, что современная терапия теряет свою эффективность и существует острая необходимость в открытии и разработке новых лекарственных препаратов и методов быстрой диагностики. В этом смысле технология SELEX с использованием аптамеров не только представляет собой мощный инструмент для выявления новых диагностических маркеров, но и позволяет вмешаться в пролиферацию болезнетворных микроорганизмов человека [16]. Методика с использованием аптамеров уже проходит множество клинических испытаний при заболеваниях человека [58]. VEGF165-связанный аптамер, Macugen, недавно был запущен в серийное производство в качестве антиангиогенного лекарственного средства при неоваскулярной возрастной макулярной дегенерации [59, 60]. Macugen оказался прорывом в терапевтическом использовании аптамеров, что стимулирует разработку других аптамеров против инфекционных заболеваний, как описано в этом небольшом обзоре и обобщено в таблице.

Благодарности

Эта работа финансирована грантами 2009/54325-2, 2010/20647-0 и 2011/19703-6, а также немецко-бразильским сетевым проектом (грант 2012/50393-6) Fundafao de Amparo a Pesquisa do Estado de Silo Paulo (FAPESP) и Федеральным министерством образования и исследований Германии (BMBF, PtJ-био, 1315883).

СВЕДЕНИЯ О ВЕДУШИХ АВТОРАХ

Хеннинг Улрих (Henning Ulrich) - отделение биохимии, Институт химии, Университет Сан-Паулу, Сан-Паулу, Бразилия E-mail: henning@iq.usp.br

Карстен Вренгер (Carsten Wrenger) - подразделение разработки лекарственных препаратов, отделение паразитологии, Институт биомедицины Университета Сан-Паулу, Сан-Паулу, Бразилия E-mail: cwrenger@icb.usp.br

AUTEPATYPA/REFERENCES_

1. Shi G., Yagyu F., Shimizu Y. et al. Flow cytometric assay using two fluorescent proteins for the function of the internal ribosome entry site of hepatitis C virus. Cytometry. 2011; Vol. 79 (8). Pt A: 653-60.

2. Gondois-Rey F., Granjeaud S., Kieu S.L.T., Herrera D. et al. Multiparametric cytometry for exploration of complex cellular dynamics. Cytometry. 2012; Vol. 81 (4). Pt A: 332-42.

3. Pollara J., Hart L., Brewer F. et al. High-throughput quantitative analysis of HIV-1 and SIV-specific ADCC-mediating antibody responses. Cytometry. 2011; Vol. 79 (8). Pt A: 603-12.

4. Mateos-Perez J.M., Redondo R., Nava R. et al. Comparative evaluation of autofocus algorithms for a real-time system for

automatic detection of Mycobacterium tuberculosis. Cytometry. 2012; Vol. 81 (3). Pt A: 213-21.

5. Ruger M., Bensch G., Tungler R., Reichl U. A flow cytometric method for viability assessment of Staphylococcus aureus and Burkholderia cepacia in mixed culture. Cytometry. 2012; Vol. 81 (12). Pt A: 1055-66.

6. Ellington A.D., Szostak J.W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 1990; Vol. 346 (6287): 818-22.

7. Tuerk C., Gold L. Systemic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 1990; Vol. 249 (4968): 505-10.

8. Ulrich H., Martins A.H.B., Pesquero J.B. RNA and DNA aptamers in cytomics analysis. Curr Protocols Cytometry. 2005; Vol. 7: 1-39.

9. Ulrich H., Martins A.H.B., Pesquero J.B. RNA and DNA aptamers in cytomics analysis. Cytometry. 2004; Vol. 59 (2). Pt A: 220-31.

10. Harada K., Frankel A.D. Identification of two novel arginine binding DNAs. EMBO J. 1995; Vol. 14 (23): 5798-811.

11. Davydova A.S., Vorobjeva M.A., Venyaminova A.G. Escort aptamers: new tools for the targeted delivery of therapeutics into cells. Acta Naturae. 2011; Vol. 3. P. 12-29.

12. Ng E.W.M., Shima D.T., Calias P., Cunningham E.T. Jr. et al. Pegaptanib, a targeted anti- VEGF aptamer for ocular vascular disease. Nat Rev Drug Discov. 2006; Vol. 5 (2): 123-32.

13. Nery A.A., Wrenger C., Ulrich H. Recognition of bio- markers and cell-specific molecular signatures: aptamers as capture agents. J Separation Sci. 2009; Vol. 32 (10): 1523-30.

14. Murphy M.B., Fuller S.T., Richardson P.M., Doyle S.A. An improved method for the in vitro evolution of aptamers and applications in protein detection and purification. Nucl Acids Res. 2003; Vol. 31 (18): e110.

15. Rybak J.-N., Scheurer S.B., NeriD., Elia G. Purification of biotinylated proteins on streptavidin resin: a protocol for quantitative elution. Proteomics. 2004; Vol. 4 (8): 2296-9.

16. Ulrich H., Wrenger C. Disease-specific biomarker discovery by aptamers. Cytometry. 2009; Vol. 75 (9). Pt A: 727-33.

17. Famulok M., Mayer G., Blind M. Nucleic acid aptamers -from selection in vitro to applications in vivo. Accounts Chem Res. 2000; Vol. 33 (9): 591-9.

18. Tombelli S., Minunni M., Mascini M. Analytical applications of aptamers. Biosensors Bioelectronics. 2005; Vol. 20 (12): 2424-34.

19. Conrad R., Ellington A.D. Detecting immobilized protein kinase C isozymes with RNA aptamers. Anal Biochem. 1996; Vol. 242 (2): 261-5.

20. Sekiya S., Nishikawa F., Noda K., Kumar P.K. et al. In vitro selection of RNA aptamers against cellular and abnormal isoform of mouse prion protein. Nucleic Acids Symp Ser. 2005; N 49: 361-2.

21. Renslo A.R., McKerrow J.H. Drug discovery and development for neglected parasitic diseases. Nat Chem Biol. 2006; Vol. 2 (12): 701-10.

22. Bloom B., Fine P. The BCG experience: implications for future vaccines against tuberculosis. Tuberculosis: Pathogenesis, Protection and Control / ed. B.R. Bloom. Washington, DC : ASM Press, 1994: 531-57.

23. Chen F., Zhou J., Luo F., Mohammed A.-B. et al. Aptamer from whole-bacterium SELEX as new therapeutic reagent against virulent Mycobacterium tuberculosis. Biochem Biophys Res Commun. 2007; Vol. 357 (3): 743-8.

24. Chen F., Hu Y., Li D., Chen H. et al. CS-SELEX generates high-affinity ssDNA aptamers as molecular probes for hepatitis C virus envelope glycoprotein E2. PLoS One. 2009; Vol. 4 (12). Article ID e8142.

25. JoshiR., Janagama H., DwivediH. P. et al. Selection, characterization, and application of DNA aptamers for the capture and detection of Salmonella enterica serovars. Mol Cell Probes. 2009; Vol. 23 (1): 20-8.

26. Zuker M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Res. 2003; Vol. 31 (13): 3406-15.

27. Gupta A., Fontana J., Crowe C. et al. Emergence of multidrug-resistant Salmonella enterica serotype Newport infections resistant to expanded-spectrum cephalosporins in the United States. J Infect Dis. 2003; Vol. 188 (11): 1707-16.

28. Wells S.J., Fedorka-Cray P.J., Dargatz D.A., Ferris K. et al. Fecal shedding of Salmonella sp P. by dairy cows on farm and at cull cow markets. J Food Prot. 2001; Vol. 64 (1): 3-11.

29. Malorny B., Hoorfar J. Toward standardization of diagnostic PCR testing of fecal samples: lessons from the detection of salmonellae in pigs. J Clin Microbiol. 2005; Vol. 43 (7): 3033-7.

30. Carli K.T., Eyigor A., Caner V. Prevalence of Salmonella serovars in chickens in Turkey. J Food Prot. 2001; Vol. 64 (11): 1832-5.

31. Nayak R., Kenney P.B., Keswani J., Ritz C. Isolation and characterisation of Salmonella in a turkey production facility. Br Poultry Sci. 2003; Vol. 44 (2): 192-202.

32. Pan Q., Zhang X.-L., Wu H.-Y. et al. Aptamers that preferentially bind type IVB pili and inhibit human monocytic-cell invasion by Salmonella enterica serovar typhi. Antimicrob Agents Chemother. 2005; 49 (10): 4052-60.

33. Cao X., Li S., Chen L. et al. Combining use of a panel of ssDNA aptamers in the detection of Staphylococcus aureus. Nucleic Acids Res. 2009; Vol. 37 (14): 4621-8.

34. Wang R., Zhao J., Jiang T. et al. Selection and characterization of DNA aptamers for use in detection of avian influenza virus H5N1. J Virol Methods. 2013; Vol. 189: 362-9.

35. Liang H.R., Liu Q., Zheng X.X. et al. Aptamers targeting rabies virus-infected cells inhibit viral replication both in vitro and in vivo. Virus Res. 2013; Vol. 173 (2): 398-403.

36. Neff C.P., Zhou J., Remling L. et al. An aptamer-siRNA chimera suppresses HIV-1 viral loads and protects from helper CD4+ T cell decline in humanized mice. Sci Transl Med. 2011; Vol. 3 (66). Article ID 66ra6.

37. Fisher T.S., Joshi P., Prasad V.R. Mutations that confer resistance to template-analog inhibitors of human immunodeficiency virus (HIV) type 1 reverse transcriptase lead to severe defects in HIV replication. J Virol. 2002; Vol. 76 (8): 4068-72.

38. Held D.M., Kissel J.D., Saran D., MichalowskiD. et al. Differential susceptibility of HIV-1 reverse transcriptase to inhibition by RNA aptamers in enzymatic reactions monitoring specific steps during genome replication. J Biol Chem. 2006; Vol. 281 (35): 25712-22.

39. Burke D.H., Scates L., Andrews K., Gold L. Bent pseudoknots and novel RNA inhibitors of type 1 human immunodeficiency virus (HIV-1) reverse transcriptase. J Mol Biol. 1996; Vol. 264 (4): 65066.

40. JoshiP., Prasad V.R. Potent inhibition of human immunodeficiency virus type 1 replication by template analog reverse transcriptase inhibitors derived by SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment). J Virol. 2002; Vol. 76 (13): 6545-57.

41. Tuerk C., MacDougal S., Gold L. RNA pseudoknots that inhibit human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase. Proc Natl Acad Sci USA. 1992; Vol. 89 (15): 6988-92.

42. Lowy F.D. Medical progress: Staphylococcus aureus infections. N Engl J Med. 1998; Vol. 339 (8): 520-32.

43. Qtaishat N.M., Gussin H.A., Pepperberg D.R. Cysteine-terminated B-domain of Staphylococcus aureus protein A as a scaffold for targeting GABA(A) receptors. Anal Biochem. 2013; Vol. 432: 49-57.

44. Beier D., Gross R. Regulation of bacterial virulence by two- component systems. Curr Opin Microbiol. 2006; Vol. 9 (2): 143-52.

45. Bronner S., Monteil H., Prevost G. Regulation of virulence determinants in Staphylococcus aureus: complexity and applications. FEMS Microbiol Rev. 2004; Vol. 28 (2): 183-200.

46. Loughman A., Sweeney T., Keane F.M., Pietrocola G. et al. Sequence diversity in the A domain of Staphylococcus aureus fibronectin-binding protein A. BMC Microbiol. 2008; Vol. 8. Article 74.

47. van der Woude M.W., Baumler A.J. Phase and antigenic variation in bacteria. Clin Microbiol Rev. 2004; Vol. 17 (3): 581-611.

48. Bellecave P., Moradpour D. A fresh look at interferonalpha signaling and treatment outcomes in chronic hepatitis C. Hepatology. 2008; Vol. 48: 1330-3.

49. Boyer N., Marcellin P. Pathogenesis, diagnosis and management of hepatitis C. J Hepatol. 2000; Vol. 32 (1): 98-112.

50. Liu C.H., Liu C.J., Lin C.L. et al. Pegylated interferon-alpha-2a plus ribavirin for treatment-naive Asian patients with hepatitis C virus genotype 1 infection: a multicenter, randomized controlled trial. Clin Infect Dis. 2008; Vol. 47: 1260-9.

51. Sarasin-Filipowicz M., Oakeley E.J., Duong F.H.T. et al. Interferon signaling and treatment outcome in chronic hepatitis C. Proc Natl Acad Sci USA. 2008; Vol. 105 (19): 7034-9.

52. Sullenger B.A., Gallardo H.F., Ungers G.E., Gilboa E. Overexpression of TAR sequences renders cells resistant to human immunodeficiency virus replication. Cell. 1990; Vol. 63 (3): 601-8.

53. Dey A.K., Khati M., Tang M., Wyatt R. et al. An aptamer that neutralizes R5 strains of human immunodeficiency virus type 1 blocks gp120-CCR5 interaction. J Virol. 2005; Vol. 79 (21): 13806-10.

54. KhatiM., Schuman M., Ibrahim J., Sattentau Q. et al. Neutralization of infectivity of diverse R5 clinical isolates of human immunodeficiency virus type 1 by gp120-binding 2'F-RNA aptamers. J Virol. 2003; Vol. 77 (23): 12692-8.

55. Jaeger J., Restle T., Steitz T.A. The structure of HIV-1 reverse transcriptase complexed with an RNA pseudoknot inhibitor. EMBO J. 1998; Vol. 17 (15): 4535-42.

56. Chaloin L., Lehmann M.J., Sczakiel G., Restle T. Endogenous expression of a high-affinity pseudoknot RNA aptamer suppresses replication of HIV-1. Nucleic Acids Res. 2002; Vol. 30 (18): 4001-8.

57. Lange M.J., Sharma T.K., A.S. Whatley et al. Robust suppression of HIV replication by intracellularly expressed reverse transcriptase aptamers is independent of ribozyme processing. Mol Ther. 2012: Vol. 20: 2304-14.

58. Ulrich H., Wrenger C. Identification of aptamers as specific binders and modulators of cell-surface receptor activity. Methods Mol Biol. 2013; Vol. 986: 17-39.

59. Ferrara N., Gerber H.-P., LeCouter J. The biology of VEGF and its receptors. Nat Med. 2003; Vol. 9 (6): 669-76.

60. Ruckman J., Green L.S., Beeson J. et al. 2'-fluoropyrimidine RNA-based aptamers to the 165-amino acid form of vascular endothelial growth factor (VEGF165): inhibition of receptor binding and VEGF-induced vascular permeability through interactions requiring the exon 7-encoded domain. J Biol Chem. 1998; Vol. 273 (32): 20556-67.