СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНАТОКСИНА Bordetella pertussis
METHOD FOR OBTAINING ANATOXIN Bordetella pertussis

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для получения бесклеточной коклюшной вакцины.
Широкая иммунизация населения противококлюшными вакцинами привела к адаптации коклюшного микроба к сложившимся условиям, что послужило изменениям в его геноме, вследствие чего ген субъединицы А коклюшного токсина циркулирующих штаммов стал нести аллельный вариант ptx A1 (AJ245366), вместо ptx A2 (AJ245267) и ptx A4 (AJ245368), присущих вакцинным штаммам, что привело к возможности появления штаммов Bordetella pertussis с повышенной токсигенной активностью. Выделение этих штаммов и адаптация их для получения анатоксина B. pertussis может служить одним из способов повышения активности вакцинных препаратов.
Вследствие этого эффективность вакцинации населения коклюшными вакцинами, в том числе бесклеточными коклюшными вакцинами, снизилась, что привело к периодическим вспышкам заболевания. Поэтому повышение специфической активности бесклеточной коклюшной вакцины является актуальным и важным для ее совершенствования.
Известен способ получения анатоксина Bordetella pertussis путем культивирования коклюшных бактерий в жидкой питательной среде, отделения супернатанта, выделение из него токсина осаждением 3-7%-ным раствором гексаметафосфата натрия в присутствии 0,002-0,006М растворов соляной, серной и трихлоруксусной кислот при pH=3,4-3,6; детоксикацию токсина проводят в 8-12%-ном растворе сахарозы.
(RU 1369042, A61К 39/10, 1995 г.)
Известен свежевыделенный штамм бактерий Bordetella pertussis - продуцент коклюшного токсина.
(RU 2407788 С1, 2010  г.)
Задачей изобретения является разработка способа получения бесклеточной коклюшной вакцины.
Техническим результатом заявленного способа является повышение активности и снижение токсичности полученной бесклеточной коклюшной вакцины.
Для достижения указанного технического результата в способе получения бесклеточной коклюшной вакцины путем культивирования коклюшных бактерий в жидкой питательной среде, отделения супернатанта от микробной массы центрифугированием, выделения из него коклюшного токсина, детоксикации его формалином в присутствии сахарозы в термостате, сорбции анатоксина на геле гидроокиси алюминия, согласно изобретению в качестве продуцента коклюшного токсина используют свежевыделенный штамм Bordetella pertussis №287, при этом детоксикацию указанного токсина Bordetella pertussis проводят в течение 19-20 суток, полученный анатоксин соединяют с анатоксинами вакцинных штаммов №203 и №305, берут их в соотношении соответственно 1:0,5:0,5, добавляют в смесь физиологический раствор с фосфатным буфером и сорбируют смесь анатоксинов на геле гидроокиси алюминия.
Сущность изобретения поясняется на следующем примере.
Пример. Лиофилизированный свежевыделенный штамм Bordetella pertussis №287, культивируют на чашках Петри со средой Борде-Жангу в течение 2-3 суток, затем пересевают 10-15 типичных колоний на пробирки со средой Борде-Жангу. Смыв с пробирок 2-3 пассажа переносят в колбы Эрленмейера с полусинтетической жидкой питательной средой (100 мл) и анионообменной смолой, колбы помещают в шуттель аппарат и выращивают при r=36±1°C до конца экспоненциальной фазы. После морфологического контроля полученную маточную культуру пересевают в матрацы с синтетической жидкой питательной средой, добавляют анионообменную смолу и культивирование проводят в течение 120 часов в статических условиях при t=36±1°C.
После окончания культивирования надосадочную жидкость отделяют от микробных клеток центрифугированием при 12500 об/мин в течение 60 минут. Токсин из центрифугата отделяют осаждением с помощью 3-7% раствора гексаметафосфата натрия, 2н. серной, 2н. соляной, 2н. трихлоруксусной кислотами в изоэлектрической зоне pH=3,4-3,6, осадок отделяют центрифугированием при 12500 об/мин в течение одного часа, осторожно промывают дистиллированной водой, растворяют в 1/15М фосфатном буфере, гомогенизируют на электрическом гомогенизаторе в течение 12 секунд, затем добавляют сахарозу до концентрации 10% и выдерживают в холодильнике в течение одного часа при периодическом осторожном перемешивании. К смеси добавляют формалин до концентрации 0,4% и смесь помещают в термостат при 36,5°C. Обезвреживание проводят 19-20 суток, периодически осторожно перемешивая смесь. По окончании смесь помещают в холодильник. Полученный анатоксин соединяют с анатоксинами вакцинных штаммов №203 и №305, берут их в соотношении соответственно 1:0,5:0,5. Добавляют в смесь физиологический раствор с фосфатным буфером и сорбируют смесь анатоксинов на геле гидроокиси алюминия (добавляют 1 мг геля гидроксида алюминия в 1 мл смеси (2 дозы для человека). Смесь шуттелируют на холоду в течение одного часа и переносят в холодильник.
Протективные свойства коклюшных вакцин исследовали на модели интрацеребрального заражения мышей, иммунизированных коклюшной вакциной, полученной заявленным способом, в сравнении с таковой, полученной известным способом. Результаты исследований приведены в таблице 1.
50
50
Как следует из данных таблицы 1, несмотря на очень высокую заражающую дозу - 3846 LD (по требованию ВОЗ не менее 100 LD), все препараты бесклеточной коклюшной вакцины обладали выраженной протективной активностью (по требованию ВОЗ не менее 8 МЗЕ/мл), при этом активность препаратов, полученных заявленным способом (20,8 МЗЕ/мл), в 2 раза превосходила таковую, полученную известным способом (9,0 МЗЕ/мл).
Результаты изучения безопасности бесклеточных коклюшных вакцин, полученных известным и заявленным способом, представлены в таблице 2.
Как следует из данных таблицы 2, все исследуемые препараты бесклеточных коклюшных вакцин были безопасны, поскольку по требованиям ВОЗ безопасными считаются препараты, после введения которых прирост массы тела мышей через 7 дней составляет не менее 60% по отношению к контролю.
Исследование сенсибилизирующих свойств препаратов проводили в опытах изучения их сенсибилизирующего действия к гистамину в опытах на мышах (таблица 3).
Как следует из данных таблицы 3, все препараты бесклеточных коклюшных вакцин не сенсибилизировали мышей к гистамину ни в одной, ни в двух иммунизирующих дозах для человека, что также свидетельствует о низких сенсибилизирующих свойствах этих препаратов.
Полученные данные свидетельствуют о высокой протективной активности препарата, полученного заявляемым способом, превышающей в 2 раза таковую препаратов, полученных известным способом. Данные препараты были нетоксичны в иммунизирующей дозе для человека и не сенсибилизировали мышей к гистамину в дозах, более 2 доз для человека.
Преимущество изобретения в том, что разработан способ получения высокоактивной и малотоксичной бесклеточной коклюшной вакцины, превышающей в 2 раза по протективной активности препараты, полученные известным способом. Способ может быть использован в практике здравоохранения для получения бесклеточной коклюшной вакцины для профилактики коклюшной инфекции.