НЕНАСЫЩЕННЫЕ ЖИРНЫЕ ГИДРОКСИКИСЛОТЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ В ДЕРМАТОКОСМЕТОЛОГИИ
UNSATURATED FATTY HYDROXY ACIDS AND USE THEREOF IN DERMATOCOSMETOLOGY

Предметом настоящего изобретения являются новые ненасыщенные жирные гидроксикислоты и их применение в дерматокосметологии.
Многочисленные ненасыщенные жирные гидроксикислоты хорошо известны и описаны в литературе благодаря их биологическим свойствам и, в частности, благодаря их косметическим и фармакологическим свойствам. Например, основным липидным компонентом маточного молочка пчел является ненасыщенная жирная гидроксикислота, а именно гидрокси-10-2(транс)деценовая кислота (Edward E. Smissman et al., 1964. JOU. 29 3517-3520).
В различных документах современного уровня техники описаны способы получения ненасыщенных жирных гидроксикислот и их сложных эфиров (Lee et al., 1993, J. Org. Chem., vol.58, pages 2918-2919; Hurd et Saunders, 1952, J. Am. Chem. Soc., vol.74, pages 5324-5328; Krishnamurthy et al., 1989, Indian J. Chem. Sect. A, vol.28, pages 288-291; Plettener et al., 1995, J. Chem. Ecol., vol.21, pages 1017-1030).
Более конкретно, настоящее изобретение относится к ненасыщенным жирным гидроксикислотам, соответствующим общей формуле (I):
n
1
где R=R=R=Н и 10≤n≤14,
за исключением 16-гидрокси-2-гексадеценовой кислоты и 15-гидрокси-2-пентадеценовой кислоты.
n
1
В частных случаях осуществления изобретения предложены ненасыщенные жирные гидроксикислоты с общей формулой (I), где R=R=R=H и n=10.
Согласно другому аспекту изобретения предложены ненасыщенные жирные гидроксикислоты с общей формулой (I)
,
n
1
где R=R=Н, R=F, Cl или Br и 5≤n≤14.
1
1
В частных случаях осуществления изобретения предложены ненасыщенные жирные гидроксикислоты с общей формулой (I), где R=F и n=10 и R=F и n=8.
Согласно настоящему изобретению производные ненасыщенных жирных гидроксикислот с общей формулой (I), определенной выше, могут быть использованы в качестве активных ингредиентов в сочетании с подходящим наполнителем для получения дерматокосметологических композиций с антирадикальной, противовоспалительной, противозудной активностью, и/или для использования в лечении расстройств, связанных с кератинизацией и пигментацией, и/или для ускорения заживления.
В соответствии с изобретением предложена дерматокосметологическая композиция, имеющая антирадикальную, противовоспалительную, противозудную активность, содержащая ненасыщенную жирную гидроксикислоту общей формулы (I)
n
1
где R=H, R=H, F, Cl или Br, R=H и 5≤n≤14, за исключением 10-гидрокси-2-деценовой кислоты, в качестве активного ингредиента и дерматологически приемлемый наполнитель.
n
1
В одном из вариантов осуществления изобретения предложена дерматокосметологическая композиция, содержащая ненасыщенную жирную гидроксикислоту общей формулы (I), где R=R=R=H и n=10.
Кроме того, предложено применение ненасыщенной жирной гидроксикислоты общей формулы (I)
,
n
1
где R=H, R=H, F, Cl или Вr, R=H и 5≤n≤14, за исключением 10-гидрокси-2-деценовой кислоты, для изготовления дерматокосметологической композиции, обладающей модулирующей активностью на меланогенез, и/или на пигментацию кожи, и/или на кератинизацию кожи, и/или на заживление.
В одном из вариантов осуществления изобретения предложено применение ненасыщенной жирной гидроксикислоты общей формулы (I), определенной выше, для лечения старения кожи и белых или коричневых возрастных пятен.
В другом из вариантов осуществления изобретения предложено применение ненасыщенной жирной гидроксикислоты общей формулы (I), определенной выше, для отбеливания кожи.
Ненасыщенные жирные гидроксикислоты с общей формулой (I) особенно хорошо подходят для использования в композициях, предназначенных для лечения псориаза, зуда и/или атопического дерматита. Поэтому в одном из вариантов осуществления изобретения предложено применение ненасыщенной жирной гидроксикислоты
n
1
где R=H, R=H, F, Cl или Br, R=Н и 5≤n≤14, для изготовления дерматокосметологической композиции для лечения псориаза, зуда и/или атопического дерматита.
Благодаря их антирадикальной активности ненасыщенные жирные гидроксикислоты с общей формулой (I) также пригодны для предотвращения или ограничения ранних стадий фотоканцерогенеза кожи, и поэтому их можно использовать для профилактики и лечения различных опухолевых заболеваний кожи.
Ненасыщенные жирные гидроксикислоты с общей формулой (I) можно получить:
- посредством проведения реакции Виттига-Хорнера, а именно реакции фосфоната формулы (III):
в которой:
1
- R является таким, как определено выше в формуле (I);
2
2
2
- R представляет собой алкильную группу, линейную или разветвленную, содержащую от 1 до 6 атомов углерода, которая предпочтительно является этильной или метильной группой, причем группы R могут образовывать цикл с атомами кислорода групп OR и с соседним атомом фосфора; и
4
- R представляет собой алкильную группу, линейную или разветвленную, содержащую от 1 до 6 атомов углерода, и предпочтительно является этильной группой;
1
4
2
- или, если R=Н, посредством реакции Дебнера-Кневенагеля, а именно реакции производного малоновой кислоты формулы ROOC-CHCOOR, где R является таким, как определено выше в формуле (I), с лактолом формулы (II):
n
где R и n являются такими же, как определено выше,
с получением сложного гидроксиэфира формулы (IV):
1
в которой n, R и R являются такими же, как определено выше,
4
и, возможно, если R представляет собой группу R, определенную выше, реакции сапонификации сложного гидроксиэфира формулы (IV), с получением соответствующего производного гидроксикислоты формулы (I).
Настоящее изобретение будет проиллюстрировано примерами синтеза, приведенными ниже.
Пример 1
Процедура синтеза DHА (деценовой гидроксикислоты)
1. Стадия 1: Получение оксонан-2-она
2
2
5
3
2
2
2
3
4
43,5 г (345 ммоль) циклооктанона растворяют в 430 мл дихлорэтана. Затем к раствору добавляют 170 г (985 ммоль) мета-хлорпербензойной кислоты. Эту среду нагревают до 80°С в течение 48 часов. При комнатной температуре добавляют 400 мл насыщенного раствора NaSO и NaHCO (1/1; объем/объем). Среду энергично перемешивают в течение 18 часов. Органическую фазу отделяют и обрабатывают Kl и НO в течение 6 часов. Органическую фазу отделяют и промывают насыщенным раствором NaSO, насыщенным раствором NaCl, затем сушат над MgSO, фильтруют и концентрируют под вакуумом с получением 36 г неочищенного продукта.
Лактон очищают посредством концентрирования в пентане (60 мл), затем посредством фильтрации осадка мета-хлорбензойной кислоты, выход - 26,6 г (54%).
Полученный лактон представляет собой соединение формулы:
Определение характеристик:
ТСХ (тонкослойная хроматография): Rf=0,3 (гептан/этилацетат 7/3)
3
1Н ЯМР (300 МГц, CDCl): δ 1,42-1,49 (m, 4Н), 1,65-1,75 (m, 6Н), 2,30 (t, J=5,4 Гц, 2Н), 4,30 (t, J=5,7 Гц, 2Н).
2. Стадия частичного восстановления до лактола
4
26,6 г (187,2 ммоль) лактона разводят в 210 мл толуола в атмосфере азота. Среду охлаждают до -78°С и добавляют по каплям 156,4 мл (189,1 ммоль) диизобутилалюминия гидрида (Dibal-H) в виде раствора в толуоле с концентрацией 20%, поддерживая температуру, равную -78°С. Смесь перемешивают в течение 2 часов при -78°С. При -78°С добавляют 200 мл насыщенного раствора соли Розена. После 18 часов энергичного перемешивания при комнатной температуре двухфазную смесь фильтруют через целит, затем экстрагируют этилацетатом. Органические фазы промывают насыщенным раствором NaCl, сушат над MgSO, фильтруют и концентрируют под вакуумом с получением 26 г неочищенного продукта (25% которого составляет диольное производное, то есть выход составляет примерно 72%). Поэтому лактол, в котором уравновешены открытая и циклическая формы, используется без дополнительной очистки.
Определение характеристик:
ТСХ: Rf=0,4 (гептан/этилацетат 6/4)
1
3
Н ЯМР (300 МГц, CDCl): δ 1,34-1,68 (m, 10Н), 2,45 (t, J=5,4 Гц, 2Н), 3,66 (t, J=6,6 Гц, 2Н), 9,78 (t, J=1,8 Гц, 1Н).
3. Стадия 3: Реакция Виттига-Хорнера
4
19 г (131,8 ммоль) лактола растворяют в 250 мл этанола. К среде добавляют 31,4 мл (158,1 ммоль) триэтилфосфонацетата в присутствии 27,3 г (197,5 ммоль) карбоната калия. Реакционную среду нагревают до 40°С в течение 18 часов. При комнатной температуре реакционную среду гидролизуют 200 мл дистиллированной воды и экстрагируют этилацетатом. Органические фазы промывают насыщенным раствором NaCl, сушат над MgSO, фильтруют и концентрируют под вакуумом с получением 20 г неочищенного продукта.
Полученный сложный эфир очищают посредством хроматографии с элюированием смесью гептана/этилацетата в соотношении 7/3; получают 15 г продукта (выход 53%).
Полученный сложный эфир является соединением формулы:
Определение характеристик:
ТСХ: Rf=0,4 (гептан/этилацетат 7/3)
1
3
Н ЯМР (300 МГц, CDCl): δ 1,24-1,38 (m, 9Н), 1,43-1,50 (m, 2Н), 1,51-1,57 (m, 2Н), 2,15-2,21 (q, 2Н), 3,60-3,64 (t, 2Н), 4,14-4,20 (t, 2Н), 5,77-5,82 (d, J=15,6 Гц, 1Н), 6,91-6,98 (dt, J=15,6 Гц, 1Н).
4. Стадия 4: Реакция сапонификации
4
0,60 г (2,81 ммоль) сложного гидроксиэфира растворяют в 10 объемах тетрагидрофурана. Медленно добавляют 3,4 мл (6,75 ммоль) 2М раствора гидроксида натрия. Среду нагревают до 65°С в течение 3 часов. По окончании реакции среду гидролизуют посредством добавления 3М раствора хлористоводородной кислоты до получения рН 2. Смесь концентрируют досуха и затем экстрагируют водную фазу этилацетатом. Органические фазы промывают насыщенным раствором NaCl, сушат над MgSO, фильтруют и концентрируют под вакуумом с получением 0,6 г неочищенного продукта.
Ожидаемое производное ненасыщенной гидроксикислоты получают в форме белого твердого вещества посредством перекристаллизации из ацетонитрила на холоде, выход - 0,37 г (71%).
Полученное производное гидроксикислоты является соединением формулы:
Определение характеристик:
ТСХ: Rf=0,1 (гептан/этилацетат 6/4)
1
3
Н ЯМР (300 МГц, CDCl): δ 1,33-1,37 (m, 6Н), 1,45-1,49 (m, 2Н), 1,55-1,58 (m, 2Н), 2,20-2,25 (q, 2Н), 3,62-3,66 (t, 2Н), 5,79-5,84 (d, J=15,6 Гц, 1Н), 7,03-7,10 (dt, J=15,6 Гц, 1Н).
+
Масс-спектроскопия: [M-Na] 209 (расчетное значение 186).
Температура плавления: 62,5°С±1°С.
Пример 2
1
Процедура синтеза α-фторированного производного 10-гидрокси-2-фтордеценовой кислоты: (R=F, n=6)
Модифицирована только стадия 3: начиная с лактола (0,89 г, 7,7 ммоль), проводят реакцию Виттига-Хорнера в присутствии метилдиэтилфосфонфторацетата (2,1 г, 9,2 ммоль) и карбоната калия (1,6 г, 11,5 ммоль) в этаноле (9 мл) при 40°С. Стадию 4 проводят согласно ранее описанному протоколу. Продукт, полученный после перекристаллизации, имеет форму цис/транс-смеси.
Полученное производное гидроксикислоты является соединением формулы:
Определение характеристик:
ТСХ: Rf=0,1 (гептан/этилацетат 6/4)
1
3
Н ЯМР (300 МГц, CDCl): δ 1,36-1,62 (m, 20Н), 2,27-2,30 (m, 2Н, цис-форма), 2,50-2,58 (m, 2Н, транс-форма), 3,69 (m, 4Н), 6,05 (dt, J=21,6 Гц, 1 Н, транс-форма) и 6,25 (dt, J=40,8 Гц, 1Н, цис-форма).
+
Масс-спектроскопия: [M-Na] 227 (расчетное значение 204).
Пример 3
Процедура синтеза 9-гидрокси-2t-ноненовой кислоты
Протокол синтеза DHA применяется к циклопентанону для получения 9-гидрокси-2t-ноненовой кислоты.
Определение характеристик:
ТСХ: Rf=0,1 (гептан/этилацетат 6/4)
1
3
Н ЯМР (300 МГц, CDCl): δ 1,36-1,61 (m, 8Н), 2,22-2,27 (m, 2Н), 3,67 (t, J=6,3 Гц, 2Н), 5,84 (dt, J=15,6 Гц, 1Н), 7,09 (dt, J=15,6 Гц, 1Н).
+
Масс-спектроскопия: [M-Na] 195 (расчетное значение 172).
Пример 4
Процедура синтеза 11-гидрокси-2t-ундеценовой кислоты
Протокол синтеза DHA применяется к циклононанону для получения 11-гидрокси-2t-ундеценовой кислоты.
Определение характеристик:
ТСХ: Rf=0,1 (гептан/этилацетат 6/4)
3
1Н ЯМР (300 МГц, CDCl): δ 1,33-1,61 (m, 12Н), 2,20-2,28 (m, 2Н), 3,66 (t, J=6,0 Гц, 2Н), 5,84 (dt, J=15,9 Гц, 1Н), 7,09 (dt, J=15,9 Гц, 1Н).
+
Масс-спектроскопия: [M-Na] 223 (расчетное значение 200).
Пример 5
Процедура синтеза 12-гидрокси-2t-додеценовой кислоты
Протокол синтеза DHA применяется к циклодеканону для получения 12-гидрокси-2t-додеценовой кислоты.
Определение характеристик:
ТСХ: Rf=0,1 (гептан/этилацетат 6/4)
3
1Н ЯМР (300 МГц, CDCl): δ 1,35-1,56 (m, 14Н), 2,20-2,27 (m, 2Н), 3,55 (t, J=6,6 Гц, 2Н), 5,80 (dt, J=15,6 Гц, 1Н), 6,96 (dt, J=15,6 Гц, 1Н).
+
Масс-спектроскопия: [M-Na] 237 (расчетное значение 214).
Пример 6
Процедура синтеза 12-гидрокси-2-фтор-2t-додеценовой кислоты
Протокол синтеза DHA, фторированного в положении 2 (Пример 2), применяется к циклодеканону для получения 12-гидрокси-2-фтор-2-додеценовой кислоты в форме цис/транс-смеси.
Определение характеристик:
ТСХ: Rf=0,1 (гептан/этилацетат 6/4)
1
3
Н ЯМР (300 МГц, CDCl): δ 1,34-1,56 (m, 14Н), 2,24-2,27 (m, 2Н цис-форма) или 2,49-2,54 (m, 2Н транс-структура), 3,55 (t, J=6,6 Гц, 2Н), 5,97 (dt, J=21,9 Гц, 1Н транс-структура) или 6,10 (dt, J=55,2 Гц, 1Н, цис-форма).
+
Масс-спектроскопия: [M-Na] 255 (расчетное значение 232).
Пример 7
Процедура синтеза 13-гидрокси-2t-тридеценовой кислоты
Протокол синтеза DHA применяется к оксациклододекан-2-ону для получения 13-гидрокси-2t-тридеценовой кислоты.
Определение характеристик:
ТСХ: Rf=0,1 (гептан/этилацетат 6/4)
3
1Н ЯМР (300 МГц, CDCl): δ 1,27-1,63 (m, 16Н), 2,21-2,28 (m, 2Н), 3,64 (t, J=3,6 Гц, 2Н), 5,84 (dt, J=15,6 Гц, 1Н), 7,09 (dt, J=15,6 Гц, 1Н).
Масс-спектроскопия: [M-Na]+ 251 (расчетное значение 228).
Пример 8
Процедура синтеза 14-гидрокси-2t-тетрадеценовой кислоты
Протокол синтеза DHA применяется к оксациклотридекан-2-ону для получения 14-гидрокси-2t-тетрадеценовой кислоты.
Определение характеристик:
ТСХ: Rf=0,1 (гептан/этилацетат 6/4)
3
1Н ЯМР (300 МГц, CDCl): δ 1,29-1,35 (m, 14Н), 1,46-1,61 (m, 4Н), 2,21-2,29 (m, 2Н), 3,66 (t, J=6,6 Гц, 2Н), 5,84 (dt, J=15,6 Гц, 1Н), 7,09 (dt, J=15,6 Гц, 1Н).
+
Масс-спектроскопия: [M-Na] 265 (расчетное значение 242).
Пример 9
Процедура синтеза 14-гидрокси-2-фтор-тетрадеценовой кислоты
Протокол синтеза DHA, фторированного в положении 2 (Пример 2), применяется к оксациклотридекан-2-ону для получения 14-гидрокси-2-фтор-тетрадеценовой кислоты в форме цис/транс-смеси.
Определение характеристик:
ТСХ: Rf=0,1 (гептан/этилацетат 6/4).
3
1Н ЯМР (300 МГц, CDCl): δ 1,29 (m, 28Н), 1,42-1,62 (m, 8Н), 2,27-2,31 (m, 2Н, цис-форма), 2,51-2,56 (m, 2Н, транс-форма), 3,68 (t, J=6,6 Гц, 2Н), 3,70 (t, J=6,6 Гц, 2Н), 6,04 (dt, J=21,3 Гц, 1Н, транс-форма), 6,27 (dt, J=33,0 Гц, 1Н, цис-форма).
+
Масс-спектроскопия: [M-Na] 283 (расчетное значение 260).
Пример 10
Процедура синтеза 17-гидрокси-2t-гептадеценовой кислоты
Протокол синтеза DHA применяется к циклопентадеканолиду для получения 17-гидрокси-2t-гептадеценовой кислоты.
Определение характеристик:
ТСХ: Rf=0,1 (гептан/этилацетат 6/4).
3
1Н ЯМР (300 МГц, CDCl): δ 1,27-1,32 (m, 20Н), 1,46-1,61 (m, 4Н), 2,20-2,29 (m, 2Н), 3,67 (t, J=6,6 Гц, 2Н), 5,84 (dt, J=15,6 Гц, 1Н), 7,08 (dt, J=15,6 Гц, 1Н).
+
Масс-спектроскопия: [M-Na]307 (расчетное значение 284).
Пример 11
Процедура синтеза 17-гидрокси-2-фтор-гептадеценовой кислоты
Протокол синтеза DHA, фторированного в положении 2 (Пример 2), применяется к циклопентадеканолиду для получения 17-гидрокси-2-фтор-гептадеценовой кислоты в форме цис/транс-смеси.
Определение характеристик:
ТСХ: Rf=0,1 (гептан/этилацетат 6/4).
3
1Н ЯМР (300 МГц, CDCl): δ 1,27 (m, 40Н), 1,45-1,62 (m, 8Н), 2,24-2,32 (m, 2Н, цис-форма), 2,50-2,58 (m, 2Н, транс-форма), 3,69 (t, J=6,6 Гц, 4Н), 6,05 (dt, J=21,6 Гц, 1Н, трансформа) и 6,26 (dt, J=40,8 Гц, 1Н, цис-форма).
-
Масс-спектроскопия: [М-Н] 301 (расчетное значение 302).
Температура плавления: 77°С±1°С.
Пример 12
Процедура синтеза 18-гидрокси-2t-октадеценовой кислоты: (R1=Н, n=14)
Протокол синтеза DHA применяется к гексациклодеканолиду для получения 18-гидрокси-2t-октадеценовой кислоты.
Определение характеристик:
ТСХ: Rf=0,1 (гептан/этилацетат 6/4).
3
1Н ЯМР (300 МГц, CDCl): δ 1,27-1,65 (m, 26Н), 2,19-2,39 (m, 2Н), 3,67 (t, J=6,6 Гц, 2Н), 5,83 (dt, J=15,6 Гц, 1Н), 7,09 (dt, J=15,6 Гц, 1Н).
+
Масс-спектроскопия: [M-Na] 321 (расчетное значение 298).
Пример 13
Определение характеристик 16-гидрокси-2t-гексадеценовой кислоты
Определение характеристик:
ТСХ: Rf=0,1 (гептан/этилацетат 6/4).
3
1Н ЯМР (300 МГц, CDCl): δ 1,27-1,32 (m, 18Н), 1,46-1,61 (m, 4Н), 2,21-2,28 (m, 2Н), 3,66 (t, J=6,6 Гц, 2Н), 5,85 (dt, J=15,6 Гц, 1Н), 7,09 (dt, J=15,6 Гц, 1Н).
+
Масс-спектроскопия: [M-Na] 293 (расчетное значение 270).
Пример реакции Дебнера-Кневенагеля с использованием оксациклотридеканола
1,4 г (7,0 ммоль) оксациклотридеканола (полученного согласно протоколу частичного восстановления лактола) растворяют под потоком азота в 4 объемах пиридина в присутствии 1,09 г (10% моль) малоновой кислоты и 0,11 мл пиперидина. Реакционную смесь нагревают до 80°С в течение 1 часа 30 минут, затем нагревают с дефлегматором в течение 2 часов. При комнатной температуре раствор выливают на 3М раствор HCl (50 мл). Отфильтрованное твердое вещество промывают водой, затем перекристаллизовывают в ацетонитриле (с получением 1,2 г, что соответствует выходу, равному 70%).
Производные ненасыщенных жирных гидроксикислот согласно настоящему изобретению стали объектом многочисленных экспериментов, которые продемонстрировали их достоинства как активных ингредиентов дерматологических и/или косметических композиций.
Исследование антирадикального эффекта на активированных формах кислорода (АФK)
В ходе нормального метаболизма клеток во время эпизодического воздействия на кожу стрессовых агентов или во время патологических изменений кожи образуются химически активные формы кислорода, которые также называют Активированными Формами Кислорода (АФК) (Y.M.W. Janssen et al., 1993). Эти АФК, описанные как очень химически активные метаболиты, играют важную роль во многих процессах, таких как воспаление, старение и опухолевый рост.
АФК считаются «вторичными мессенджерами» во внутриклеточных сигнальных процессах, относящихся к окислительному стрессу, и, следовательно, ранними медиаторами воспаления (A.Van Der Vliet and A.Bast, 1992).
Их избыточная продукция приводит к существенным нарушениям в клетке. Поэтому некоторые клеточные компоненты являются основными мишенями окислительного стресса: могут повреждаться липидные компоненты плазматической мембраны (перекисное окисление липидов), белки (денатурация и деградация) и генетический материал или ДНК (мутации). Клетки способны ограничивать эти окислительные повреждения за счет различных систем антирадикальной защиты (ферментных и неферментных антиоксидантов) (B.P.Yu, 1994; Н.Stelling et al., 1999).
Тем не менее, в определенных условиях АФК образуются в таких количествах, что внутриклеточной антиоксидантной активности недостаточно; поэтому такие АФК становятся факторами, индуцирующими воспалительные нарушения и старение тканей (Y.Miyachi et al., 1986; М.Kress et al., 1995).
2
2
2
Существуют различные химические вещества (например, НO) или физические факторы (например, УФ-А), способные создавать окислительный стресс in vitro. Продуцируемые АФК повреждают различные клеточные мишени (мембраны, ДНК или белки), и это повреждение можно анализировать с использованием широко используемых биохимических методик, таких как анализ субстратов тиобарбитуровой кислоты (TBARS) в случае перекисного окисления липидов или анализ in vitro внутриклеточных АФК с помощью зонда HDCF-DA.
2
2
2
2
Мы разработали модель для исследования in vitro окислительного стресса, вызываемого системой НO/железо, поскольку НO генерирует большое количество внутриклеточных АФК в результате цепной реакции, запускаемой окислением мембранных липидов.
2
2
Этот способ основан на использовании флуоресцентного зонда - 6-карбокси-2',7'-дихлордигидрофлуоресцеина диацетата диацетоксиметилового эфира (HDCF-DA), который после проникновения в клетку дезацетилируется внутриклеточными эстеразами и образует HDCF. Этот продукт окисляется внутриклеточными АФК до ярко флуоресцирующего соединения - 2',7'-дихлорфлуоресцеина (DCF) (Suematsu М. Et al., 1996, Free Radicals Practical Approach, Punchard ed., p.83-99).
Материалы и методы, использованные для анализа in vitro внутриклеточных АФК, указаны ниже.
а) Клеточный материал
Фибробластные клетки кожи мыши линии L929.
б) Материал:
- Микропланшет с 96 лунками с плоским основанием.
- Цитофлуориметр Cytofluor II: см. PERCEPTIVE BIOSYSTEMS.
в) Реагенты
Реагенты для культивирования клеток:
- Культуральная среда Игла в модификации Дульбекко (DMEM)
- Фетальная сыворотка телят (ФСТ)
- Фосфатный буфер (PBS) с рН 7
- Трипсин-ЭДТА(1Х)
Флуоресцентный зонд:
- 6-карбокси-2',7'-дихлордигидрофлуоресцеина диацетата диацетоксиметиловый эфир (РМ. 675,43)
Продукты для стимуляции клеток:
2
2
- Перекись водорода (НO) 3%: см. GIFRER (Gifrer Barbezat Laboratory)
2+
- Двойной сульфат аммония и двухвалентного железа (Fe)
3+
- Двойной сульфат аммония и трехвалентного железа (Fe)
г) Исследованные продукты:
Исследованные концентрации не являются цитотоксичными концентрациями. Цитотоксичность определяли с использованием способа с нейтральным красным после инкубации продукта в течение 3 часов.
Антирадикальным продуктом сравнения является витамин Е или α-токоферол (РМ: 430.7) (SIGMA, см.: Т-1539).
Маточный раствор готовят в концентрации 400 мг/мл в ДМСО и хранят при -20°С. Раствор для предварительной обработки готовят непосредственно перед опытом в концентрации 400 мкг/мл в культуральной среде без фетальной сыворотки телят.
Для оценки производных ненасыщенных жирных гидроксикислот раствор готовят на свежеприготовленной культуральной среде с концентрациями в диапазоне 0,02, 0,2, 2 и 20 нг/мл.
е) Протокол:
Посев клеток:
2
Клетки-фибробласты линии L929 засевали на микропланшеты с 96 лунками и плоским основанием в 100 мкл DMEM с добавлением 10% фетальной сыворотки телят, затем их инкубировали в течение ночи при 37°С во влажной атмосфере с 5%-ным содержанием СO.
Контрольный планшет без клеток оценивали по 6 лункам.
Предварительная обработка клеток:
Разведения продуктов, подлежащих испытанию, и молекул сравнения производили с использованием культуральной среды без ФСТ, затем наносили их 7 лунок в количестве 100 мкл на лунку.
2
Затем клетки инкубировали в течение 3 часов при 37°С во влажной атмосфере, содержавшей 5% СO.
«Холостые» (естественная флуоресценция клеток), «контрольные» (базальная продукция АФК) и «стимулированные» (продукция АФК после окислительной обработки) покрывали 100 мкл DMEM.
«Контрольные» клетки инкубировали с зондом, но не производили ни предварительной обработки, ни обработки.
«Стимулированные» клетки инкубировали с зондом и производили обработку, но не предварительную обработку.
«Холостые» клетки не подвергали предварительной обработке, не инкубировали с зондом и не обрабатывали.
Инкубация клеток с зондом и окислительным стрессом:
2
2
Клетки промывали PBS 1Х в количестве 100 мкл на ячейку. Затем их инкубировали в течение 30 минут при 37°С во влажной атмосфере, содержавшей 5% СO, с 50 мкл зонда HDCF-DA в концентрации 5 мкМ.
2
2
2
2
2
После 30 минут контакта с зондом клетки инкубировали в течение 30 минут при 37°С во влажной атмосфере, содержавшей 5% СO, с добавлением 25 мкл НO в концентрации 800 мкМ и 25 мкл раствора трехвалентного железа и двухвалентного железа в концентрации 8 мМ с получением конечной концентрации НO, равной 200 мкМ, и концентрации трехвалентного и двухвалентного железа, равной 2 мМ.
2
Затем клетки промывали PBS 1Х в количестве 100 мкл на ячейку, после чего инкубировали их в течение 30 минут при 37°С во влажной атмосфере, содержавшей 5% СO, со 100 мкл PBS 1Х.
2
Эта инкубация в течение 1 часа 30 минут при 37°С дает возможность внутриклеточным эстеразам дезацетилировать зонд до HDCF, который может быть окислен АФК до DCF - флуоресцирующего соединения, образование которого пропорционально содержанию внутриклеточных АФК.
возбуждения
испускания
Интенсивность флуоресценции определяют с помощью цитофлуориметра при λ=485 нм и λ=530 нм. Она отражает количество образовавшихся внутриклеточных АФК.
Схема протокола опыта:
Расчет % защиты против продукции внутриклеточных АФК.
Приведенное ниже отношение позволяет рассчитать для каждой исследованной концентрации продукта % защиты против продукции внутриклеточных АФК (поскольку интенсивность флуоресценции (ИФ) отражает выделение внутриклеточных АФК).
Значения, приведенные в таблице ниже, представляют собой проценты ингибирования внутриклеточной продукции АФК после экзогенного окислительного стресса по сравнению с «холостыми» клетками (100%) и «стимулированными» клетками (0%).
Средние проценты защиты для 13 молекул, исследованных в 4 концентрациях на клетках линии L929, представлены в Таблице 1 ниже.
Таблица 1
Анализ защиты против внутриклеточной продукции АФК для 13 молекул, являющихся производными ненасыщенных жирных гидроксикислот: Ингибирование внутриклеточной продукции АФК в процентах.
Витамин Е 400 мкг/мл
47%
Соединение формулы I
Дозы
n
R
R<sub>n</sub>
R<sub>1</sub>
0,02 нг/мл
0,2 нг/мл
2 нг/мл
20 нг/мл
3
Н
Н
F
3
-3
-32
-51
3
Н
Н
H
21
15
11
14
4
Н
Н
F
10
6
-4
-36
4
Н
Н
Н
17
9
9
0
5
Н
Н
H
56
47
46
36
6
Н
Н
F
15
4
5
-9
6
Н
Н
H
33
9
Н
Н
Н
9
10
6
-22
10
Н
Н
F
29
16
0
-19
10
Н
Н
H
11
4
-20
-34
13
Н
Н
F
36
28
14
-9
13
Н
Н
Н
3
13
-1
-10
14
Н
Н
F
6
-17
-26
-42
Предварительная инкубация: 3 часа.
Количество испытаний = 3 для всех соединений.
Количество испытаний = 18 для витамина Е.
2
2
2+
3+
In vitro на клеточном уровне экзогенный стресс, вызванный HO/Fe-Fe, способен индуцировать продукцию внутриклеточных АФК, выявляемую с помощью флуоресцентного зонда.
В заключение следует отметить, что нефторированные производные ненасыщенных жирных гидроксикислот к короткими цепями (С9 и С10), по-видимому, особенно эффективны в отношении антирадикальной защиты клеток.
Исследование антирадикального эффекта. Анализ перекисного окисления липидов.
Кроме того, в ходе нормального метаболизма клеток во время случайного воздействия на кожу стрессовых агентов или во время патологических изменений кожи образуются химически активные формы кислорода, которые также называют Свободными Радикалами Кислорода (СРК) (Y.M.W.Janssen et al., 1993). Эти СРК, описанные как очень химически активные метаболиты, играют важную роль во многих процессах, таких как воспаление, старение и опухолевый рост.
СРК считаются «вторичными мессенджерами» во внутриклеточных сигнальных процессах, относящихся к окислительному стрессу, и, следовательно, ранними медиаторами воспаления (A.Van Der Vliet and A.Bast, 1992).
Их избыточная продукция приводит к существенным нарушениям в клетке. Поэтому некоторые клеточные компоненты являются основными мишенями окислительного стресса: могут повреждаться липидные компоненты плазматической мембраны (перекисное окисление липидов), белки (денатурация и деградация) и генетический материал или ДНК (мутации). Клетки способны ограничивать эти окислительные повреждения за счет различных систем антирадикальной защиты (ферментных и неферментных антиоксидантов) (В.Р.Yu, 1994; Н.Stelling et al., 1999).
Тем не менее, в определенных условиях СРК образуются в таких количествах, что внутриклеточной антиоксидантной активности недостаточно; поэтому такие СРК становятся факторами, индуцирующими воспалительные нарушения и старение тканей (Y.Miyachi et al., 1986; М.Kress et al., 1995).
С целью оценки антирадикальной активности различных гидроксилированных производных согласно настоящему изобретению мы проанализировали их способность обеспечивать защиту против нарушений клеточных мембран, вызванных окислительным (химическим) стрессом, по сравнению со стандартным антиоксидантом - витамином Е.
Плазматическая мембрана является основной и первичной мишенью СРК, и, поскольку в ней содержится много липидов, она является местом усиленного перекисного окисления (A.W.Girotti, 1985). Перекиси, образующиеся в ходе этого окисления липидов, также являются очень химически активными и способны разрушать белковый и генетический материал.
Для оценки повреждений мембран мы измеряли перекисное окисление липидов посредством количественного анализа in vitro комплексов, состоящих из продуктов окисления липидов и тиобарбитуровой кислоты. Такие комплексы называются TBARS (субстратами тиобарбитуровой кислоты) и дали анализу название: анализ на TBARS.
2
2
2+
3+
'
Для имитации химического окислительного стресса мы обрабатывали клетки-фибробласты линии L929 комплексом, состоявшим из перекиси водорода (НO) и железа (Fe/Fe), воспроизводя таким образом реакцию Фентона, являющуюся источником СРК и, в частности, гидроксильного радикала (ОН) (D.A.Vessey et al., 1992):
2
2
2+
'
-
3+
НO+Fe→ОН+ОН+Fe
2
2
2+
3+
Продукты оценивали на клетках-фибробластах мыши линии L929. Клетки проходили предварительную обработку различными концентрациями продуктов в течение 16 часов, а затем их стимулировали комплексом НO- Fe/Fe (200 мкМ-1 мМ) в течение 1 часа.
Маточные растворы: 100 мг/мл в этаноле при 4°С.
Конечные растворы: 0,02 нг/мл.
Перекисное окисление мембранных липидов анализировали посредством измерения TBARS (см. Протокол PLN°2 согласно Morliere et al., 1991).
Принцип анализа:
В кислой среде при 95°С образуются комплексы, называемые TBARS (реакционно-способное вещество тиобарбитуровой кислоты), между продуктами окисления липидов (малоновым диальдегидом, или МДА) и тиобарбитуровой кислотой (ТБК), которые можно анализировать по их флуоресценции, путем сравнения со стандартным диапазоном флуоресценции МДА. Результаты анализа TBARS выражают в пмоль/мкг белка. Белки и TBARS анализируют во внутриклеточной среде.
Расчет процента защиты клеточных мембран:
По результатам расчета TBARS в пмоль/мкг белка мы рассчитали эффективность защиты против окисления мембранных липидов для различных продуктов.
Было выполнено четыре независимых эксперимента. В ходе этих экспериментов были оценены различные соединения (анализ не позволял оценивать более 10 молекул одновременно). Соединения, оценивавшиеся несколько раз, были выбраны по результатам, полученным в другом анализе, в котором также измерялась антирадикальная активность (количественный анализ на активированные формы кислорода, АФК).
Использованная в данном эксперименте модель (реакция Фентона) индуцирует значительное перекисное окисление липидов в фибробластах L929. Это массивное выделение гидроксильного радикала ОН' вызывает на клеточном уровне окислительный стресс, в частности на уровне мембран. Однако в этом типе окислительной реакции продукты перекисного окисления липидов находятся в клетках, и поэтому содержание TBARS количественно определяется во внутриклеточной среде.
2
2
2+
3+
Витамин Е в дозе 400 мкг/мл снижает перекисное окисление липидов, вызванное комплексом НO-Fe/Fe, и очень эффективно защищает клеточные мембраны.
В Таблице II представлены результаты 4 экспериментов.
Очевидно, что гидроксилированные производные обладают стабильной и воспроизводимой антиоксидантной активностью. Это относится, в частности, к производным с короткой углеродной цепью.
Таблица II
Защита мембранных липидов различными гидроксилированными производными
Защита мембранных липидов в %
Исследованные молекулы
№ эксперимента
Среднее значение
Стандартное отклонение
Вит. Е 400 мкг/мл
4
44,66
25,85
Соединение формулы I
n
R
R<sub>n</sub>
R<sub>1</sub>
6
Н
Н
Н
3
52,91
8,81
6
Н
Н
F
3
40,65
16,83
4
Н
Н
F
3
36,54
41,69
13
Н
Н
Н
1
22,10
3
Н
Н
F
1
38,14
13
Н
Н
F
3
7,39
16,23
10
Н
Н
Н
1
27,18
4
Н
СН<sub>3</sub>
Н
2
57,75
3,15
10
Н
Н
F
3
13,13
13,37
14
Н
Н
F
1
35,30
4
Н
Н
Н
2
37,88
26,28
9
Н
Н
Н
3
8,72
48,78
3
Н
Н
Н
2
15,7
29,93
Модель in vitro, представленная в данном исследовании, отражает последствия воздействия значительного окислительного стресса на основную клеточную мишень, которой является плазматическая мембрана. Поэтому количественный анализ перекисного окисления липидов является хорошим маркером окислительного стресса и обеспечивает возможность оценки антиоксидантного действия активных ингредиентов на гидроксильные радикалы на уровне клеточной мембраны.
Витамин Е, антиоксидантная молекула, обеспечивает возможность подтверждения правильности этой модели и эффективности защиты клеточных мембран против окислительного стресса.
Дифференциация кератиноцитов
Эпидермис участвует в основной функции кожи, которой является устойчивость к влияниям окружающей среды и защита от них. Это многослойный плоский ороговевающий эпителий, который постоянно обновляется. Гомеостаз и регенерация тканей основаны на клетках-кератиноцитах, опорных клетках и растворимых факторах, которые в непосредственной близости от клеток способствуют межклеточным взаимодействиям и взаимодействиям клеток с межклеточным матриксом.
Роговой слой, последняя стадия дифференциации эпидермиса, образуется в результате трех основных процессов: образования кератиновых филаментов, «ороговения» кератиноцитов и образования межклеточного липидного цемента, организованного в виде пластинчатых структур.
Внутри эпидермиса состав и природа липидов варьируют в зависимости от стадии дифференциации, в которой находятся кератиноциты. Так, во время движения базальных слоев клеток к клеткам рогового слоя, наблюдается значительное снижение содержания фосфолипидов, которые в слоях живых клеток отвечают за целостность плазматических мембран; параллельно отмечается повышение содержания нейтральных липидов (свободных жирных кислот и триглицеридов) и стеролов (холестерина), а также очень значительное увеличение содержания сфиголипидов и, в частности, церамидов. На уровне рогового слоя обнаруживается 40-50% сфинголипидов, 20-27% холестерина и 9-26% свободных жирных кислот. Церамиды связаны ковалентными связями с остатками глутаминовой кислоты инволюкрина - предшественника роговой оболочки. Жирные кислоты благодаря своей гидрофобной природе участвуют в регуляции непроницаемости кожи, холестерин участвует в регуляции текучести мембран.
Многочисленные специфические белки рогового слоя (или stratum corneum) (слоя, придающего барьерную функцию эпидермису) образуются на уровне зернистого слоя, состоящего из последних кератиноцитов, обладающих способностью к транскрипции и трансдукции, прежде чем произойдет лизис ядра, сопровождающий ороговение.
Программа дифференциации кератиноцитов основана, главным образом, на эволюции структурных белков, которыми являются кератины и которые способствуют архитектурной целостности эпидермиса. Их экспрессия варьирует в зависимости от степени зрелости эпидермапьных клеток. В супрабазальных слоях появляются основной кератин 1 и кислый кератин 10, так называемые кератины терминальной дифференциации.
Вблизи рогового слоя кератины взаимодействуют с белками с высоким содержанием гистидина с образованием относительно гомогенной смеси, которая заполняет корнеоциты. Эти белки являются производными предшественника, профилагрина, который представляет собой большую молекулу ([MB]>450 кДа), запасы которой хранятся на уровне зернистого слоя. Это белок, N- и С-терминальные домены которого связывают кальций, а его дефосфорилирование и частичный протеолиз приводят к образованию филагрина. Филагрин катализирует образование дисульфидных мостиков между кератиновыми филаментами и способствует их объединению с образованием внутрикорнеоцитарного матрикса. С другой стороны, в результате протеолиза он является источником аминокислот и пептидных производных, которые придают роговому слою определенные влагоудерживающие свойства.
В роговом слое корнеоциты содержат, главным образом, кератиновые филаменты, погруженные в плотный матрикс, который окружен толстой и прочной белковой стенкой: роговой оболочкой. Белки-предшественники этой структуры, находящиеся на внутренней стороне плазматической мембраны, синтезируются кератиноцитами шиповидного слоя, но их сшивки - с участием ферментов трансглутаминаз - образуются в шиповидном и зернистом слоях. Многочисленные белки цитозоля, ассоциированные с мембранной фракцией кератиноцитов или хранящиеся в зернах кератогиалина, участвуют в образовании роговой оболочки. Можно, например, отметить инволюкрин (68 кДа) с высоким содержанием глутамина и лизина.
Непроницаемость рогового слоя обусловлена, главным образом, гидрофобным липидным межклеточным цементом, который связывает друг с другом корнеоциты. Содержание липидов в эпидермисе является конечным результатом липогенеза в кератиноцитах и сальных железах. В нормальном эпидермисе в глубоких слоях преобладает смесь нейтральных и полярных липидов, которая прогрессивно заменяется более неполярным содержимым, включающим церамиды. В этом липогенезе, а значит, и в синтезе церамидов, участвуют многочисленные белки. Среди них обнаружен белок DES2 (сфинголипид- С4-гидроксилаза/дельта-4-десатураза): он обладает активностью гидроксилазы дигидроцерамидов, которая участвует в синтезе фитоцерамидов, а его экспрессия индуцируется процессом дифференциации (Mizutani Y. et al., 2004). Липиды, синтезируемые кератиноцитами, движутся к поверхности кожи в пластинчатых тельцах - кератиносомах. Они секретируются в межклеточные пространства и образуют непрерывные слои, расположенные параллельно клеточным мембранам корнеоцитов. Эта реорганизация липидов, происходящая в ходе дифференциации эпидермиса, подключает некоторое число переносчиков липидов из семейства ABC-транспортеров (аденозинтрифосфат-связывающих кассетных транспортеров). Среди этих транспортеров некоторые обнаруживают экспрессию, индуцируемую в ходе дифференциации кератиноцитов (АВСВ1, АВСС1, АВСС3, АВСС4 и ABCG1), экспрессия других подавляется (АВСВ9 и ABCD1), а третьи не подвергаются никакой регуляции. Роль транспортеров, экспрессия которых индуцируется, была изучена: например, ABCG1 участвует в транслокации холестерина в кератиноциты, находящиеся в процессе дифференциации. Экспрессия некоторых членов другого семейства транспортеров - FATP (белки-транспортеры жирных кислот), таких как FATP1, FATP3, FATP4 и FATP5, индуцируется в ходе дифференциации кератиноцитов. Эти транспортеры участвуют в реорганизации пула нейтральных липидов (Kielar et al., 2003).
Нормальные кератиноциты человека (НКЧ), пролиферируют и дифференцируются in vitro, с образованием стратифицированных слоев, имитирующих базовую организацию кожи. Внеклеточные концентрации кальция, превышающие 0,1 мМ, запускают каскад геномных и негеномных явлений, которые переводят кератиноциты из фазы пролиферации в фазу дифференциации. Дифференциацию кератиноцитов можно оценить посредством анализа экспрессии нескольких маркеров, таких как кератины 1 и 10, трансглутаминаза 1, десатураза DES2, инволюцин, транспортеры FATP4 и ABCG1. Поэтому мы оценивали эффект некоторых гидроксиалкеновых карбоновых кислот в модели с культивированием клеток in vitro.
План исследования можно схематично представить следующим образом: дифференциация НКЧ in vitro и отбор проб для анализа.
Условия культивирования клеток и отбора проб
Нормальные кератиноциты человека (НКЧ) выделяли из эксплантатов кожи. Их культивировали в среде KSFM (Gibco) с низкой концентрацией кальция (0,1 мМ), содержащей 25 мкг/мл ВРЕ (гипофизарного экстракта коров) и 1,5 нг/мл EGF (эпителиального фактора роста). Через двадцать четыре часа после посева индуцировали дифференциацию посредством добавления кальция (конечная концентрация 1,2 мМ). Активные вещества добавляли или не добавляли одновременно с кальцием в концентрациях, равных 100 и 1 мкг/мл, чтобы определить, оказывают ли они усиливающий эффект на дифференциацию. Клетки анализировали через 48 часов после добавления кальция и продуктов.
Экстракция РНК и ПЦР с обратной транскрипцией (RT-PCR) в реальном времени
Общую РНК экстрагировали из кератиноцитов на холоде.
После обратной транскрипции мРНК в кДНК выполняли ПЦР на планшетах с 96 лунками (прибор для количественной ПЦР iCycler, производства компании BioRad). Экспрессию транскриптов трансглутаминазы, десатуразы (DES2), ABCG1 и FATP4 нормализовали относительно экспрессии стандартных генов (GAPDH, UBC, HPRT). Уровень экспрессии в пробах, обработанных кальцием и активным веществом, сравнивали с уровнем экспрессии в пробах, обработанных только кальцием.
Результаты относительно эффектов продуктов в концентрации 1 мкг/мл приведены в таблицах ниже.
Соединение формулы I
Фактор индукции против контроля (СаСl<sub>2</sub> 1,2 мМ)
TG1
DES2
ABCG1
FATP4
n
R
R<sub>n</sub>
R<sub>1</sub>
Вит. D3 1 мкМ
1,5
2,0
2,0
1,1
3
Н
Н
F
1,5
1,7
1,5
1,2
3
Н
Н
Н
1,2
1,6
1,5
1,4
4
Н
Н
F
1,6
2,2
2,6
1,3
4
Н
Н
Н
1,2
1,0
1,2
1,0
5
Н
Н
Н
1,5
1,8
2,7
1,0
6
Н
Н
F
1,2
1,3
1,3
1,0
6
Н
Н
Н
1,1
1,7
1,9
1,2
9
Н
Н
Н
1,4
1,8
1,5
1,2
10
Н
Н
F
1,4
1,6
1,4
1,0
10
Н
Н
Н
1,5
2,0
1,4
1,2
13
Н
Н
F
4,2
9,0
4,8
2,2
13
Н
Н
Н
1,4
3,0
3,0
1,4
14
Н
Н
F
1,7
2,8
4,0
1,0
В дозе 1 мкг/мл все продукты оказывали умеренный эффект на экспрессию маркеров дифференциации.
Эффекты продуктов в концентрации 100 мкг/мл
Соединение формулы I
Фактор индукции против контроля (CaCl<sub>2 </sub>1,2 мМ)
TG1
DES2
ABCG1
FATP4
n
R
R<sub>n</sub>
R<sub>1</sub>
Вит. D3 10 мкМ
8,3
11,0
3,1
1,3
3
H
H
F
0,9
1,9
1,2
1,2
3
H
H
H
2,6
2,4
4,0
1,2
4
H
H
F
1,7
3,2
2,6
1,4
4
H
H
H
1,7
2,2
2,5
1,4
6
H
H
F
7,8
10,3
6,3
1,9
6
H
H
H
12,3
11,5
6,6
2,5
9
Н
Н
Н
14,8
51,7
13,8
4,5
10
Н
Н
F
3,5
16,0
4,6
2,3
10
Н
Н
Н
31,4
125,8
25,5
5,9
Витамин D3 в концентрации 10 мкМ усиливает экспрессию транскриптов трансглутаминазы 1, DES2 и ABCG1 в 8,3, 11,1 и 3,1 раза, соответственно, по сравнению с контролем, обработанным только кальцием. С другой стороны, экспрессия FATP4 не модулируется в результате обработки витамином D3.
Таким образом, был продемонстрирован стимулирующий эффект производных ненасыщенных жирных гидроксикислот согласно настоящему изобретению на дифференциацию.
Анализ противовоспалительного эффекта на уровне липидных медиаторов воспаления
Кератиноциты - наиболее многочисленные на уровне эпидермиса клетки - в ответ на многочисленные внеклеточные факторы, присутствующие в окружающей их среде, выделяют биологически активные медиаторы, а именно простагландины и лейкотриены, которые играют важную роль в инициации и модулировании кожной воспалительной реакции, а также участвуют в регулировании иммунного ответа. Простагландин PG6KF1-альфа является одним из основных метаболитов, продуцируемых стимулированными кератиноцитами, и представителем модуляторов продукции метаболитов, образующихся в результате метаболизма арахидоновой кислоты по циклооксигеназному пути.
ПРОТОКОЛ:
6
2
Суспензию кератиноцитов в культуральной среде DMEM с 10% фетальной сыворотки телят распределяли по планшетам с 6 лунками (1,2·10 клеток/лунку) и инкубировали в течение 16 часов при 37°С в атмосфере, содержавшей 5% СO. Затем кератиноциты промывали PBS для удаления не сцепленных клеток, после чего воздействовали на них продуктами, подлежащими испытанию, разведенными в DMEM без фетальной сыворотки телят (которая может влиять на результаты количественного анализа).
Концентрация, исследованная в культуре, равна 3 мкг/мл. Она была выбрана после предварительного испытания, посвященного оценке цитотоксичности (с нейтральным красным), и не является цитотоксичной.
Каждая обработка была выполнена на 3 лунках. Клетки предварительно инкубировали в течение 60 минут с продуктами, подлежащими испытанию, после чего добавляли агент, стимулирующий каскад арахидоновой кислоты (ионофор кальция), на 5 часов: ионофор кальция А23187 использовали в концентрации 1 мкМ.
После культивирования в течение 5 часов отбирали культуральную среду из каждой ячейки, центрифугировали ее при 3000 об/мин и хранили при -80°С.
Продукцию простагландина 6KF1α в каждом анализе измеряди с использованием набора для иммуноферментного твердофазного анализа (ELISA) производства компании EUROMEDEX.
РЕЗУЛЬТАТЫ:
Результаты выражены в процентах активности по отношению к стимулированному контролю.
Соединение формулы I
% ингибирующей активности исследуемой молекулы на продукцию PG6KF1α
Воспаление
n
R
R<sub>n</sub>
R<sub>1</sub>
3 мкг/мл
3
Н
Н
Н
29
4
Н
Н
F
30
4
Н
Н
Н
4
Н
СН<sub>3</sub>
Н
8
Н
Н
Н
32
8
Н
Н
F
44
9
Н
Н
Н
31
10
Н
Н
F
18
10
Н
Н
Н
Не активно
13
Н
Н
F
14
13
Н
Н
Н
25
Противовоспалительные свойства: Ингибирование синтеза провоспалительного цитокина IL8
Барьерная функция кожи обеспечивает защиту от факторов окружающей среды, а кератиноциты эпидермиса могут прямо реагировать на широкий спектр раздражителей или аллергенов и принимать активное участие в воспалительных и иммунных процессах, происходящих в коже, в частности за счет продукции провоспалительных цитокинов, медиаторов белковой природы. Среди этих биологически активных молекул первичными цитокинами считаются IL1α (интерлейкин 1α) и TNFα (фактор некроза опухолей α); их выделения достаточно для того, чтобы вызвать воспаление, поскольку они индуцируют молекулы адгезии на уровне эндотелиальных клеток и факторы хемотаксиса, такие как хемокины. Система хемокинов регулирует движение лейкоцитов во время воспалительной реакции и необходима для взаимодействия между врожденным и адаптивным иммунными ответами.
В данном исследовании мы сконцентрировались, в частности, на хемокине - интерлейкине 8, который принимает большое участие в развитии иммунного ответа и основной функцией которого является рекрутинг и активация полинуклеарных нейтрофилов, а именно стимуляция высвобождения ими провоспалительных молекул.
В данном исследовании, выполненном с использованием 96-луночных планшетов, мы оценивали активность гидроксиалкеновых кислот в отношении продукции интерлейкина 8, индуцируемой в кератиноцитах форболовым эфиром РМА и ионофором кальция А23187.
ПРОТОКОЛ:
4
2
Суспензию кератиноцитов в KSFM с добавками распределяли по 96-луночным планшетам (3·10 клеток/лунку) и инкубировали в течение 16 часов при 37°С в атмосфере, содержавшей 5% СO. Затем кератиноциты промывали PBS с целью удаления не сцепленных с лунками клеток, после чего воздействовали на них продуктами, подлежащими исследованию, разведенными в KSFM без добавок (которые могли повлиять на результаты анализа).
Концентрация, исследованная на культуре клеток, была равна 3 мкг/мл. Она была выбрана по результатам предварительного испытания, в котором оценивалась цитотоксичность (с нейтральным красным), и не является цитотоксичной.
Для каждой обработки было использовано 3 лунки. Клетки предварительно инкубировали в течение 60 минут с продуктами, подлежащими исследованию, затем стимулировали; параллельно были проведены отрицательные контроли без стимулирующих веществ: форбола миристата ацетата (РМА) 1 мкМ + ионофора кальция (А23187) 0,1 мкМ.
2
Инкубация в течение 6 часов при 37°С в атмосфере влажного воздуха, содержавшего 5% СO.
Культуральную среду из каждой лунки отбирали, центрифугировали при 3000 об/мин и хранили при -80°С.
Анализ на цитокин: IL8 определяли иммуноферментным способом с использованием набора для иммуноферментного твердофазного анализа (ELISA) производства компании Immunotech.
РЕЗУЛЬТАТЫ:
Результаты приведены в процентах активности по отношению к стимулированному контролю.
Соединение формулы I
% ингибирующей активности оцениваемых молекул на продукцию PG6KF1α
Воспаление
n
R
R<sub>n</sub>
R<sub>1</sub>
3 мкг/мл
3
Н
Н
Н
50
4
Н
Н
F
Не активно
4
Н
Н
Н
15
4
Н
СН<sub>3</sub>
Н
Не активно
6
Н
Н
Н
Не определено
8
Н
Н
Н
Не активно
8
Н
Н
F
Не активно
9
Н
Н
Н
16
10
Н
Н
F
30
10
Н
Н
Н
30
13
Н
Н
F
107
13
Н
Н
Н
62
14
Н
Н
Н
Не активно
Соединения согласно настоящему изобретению оценивались в отношении их противовоспалительной активности через влияние на высвобождение интерлейкина 8 кератиноцитами человека (НКЧ), стимулированными сложным эфиром форбола РМА и ионофором кальция А23187.
Было проведено три независимых эксперимента: объединение полученных данных позволило доказать противовоспалительный потенциал следующих двух соединений:
n
1
n=13, R=R=Н, R=F
n
1
n=13, R=R=R=Н
Для концентрации, в которой оценивалась каждая молекула, и после расчета эффективной 50%-ной дозы наши результаты показывают следующее:
Соединение формулы 1
% ингибирования при 3 мкг/мл
ED<sub>50</sub>
n
R
R<sub>n</sub>
R<sub>1</sub>
13
Н
Н
F
107
<3 мкг/мл
13
Н
Н
Н
62
<3 мкг/мл
Воспаление и зуд: анализ потока кальция после стимуляции PAR2-рецепторов
Рецептор под названием «Активируемый протеазой рецептор-2» (PAR-2) участвует в физиопатологии многих заболеваний, включающих в себя воспалительные реакции.
PAR2 экспрессируется различными типами клеток кожи: кератиноцитами, миоэпителиальными клетками потовых желез, волосяными фолликулами, дендритическими клетками дермы и эндотелиальными клетками собственной пластинки и дермы (Steinhoff et al., 1999; Santulli et al., 1995). Меланоциты не экспрессируют этот рецептор (Seiberg et al., 2000), хотя PAR-2 играет важную роль в пигментации, способствуя переносу меланина из меланоцитов в кератиноциты (Sharlow et al., 2000).
Сериновые протеазы, генерируемые эпидермисом, оказывают хемотактические эффекты, индуцирующие рекрутинг лейкоцитов в коже. Они также участвуют в регуляции гомеостаза, митогенеза и дифференциации эпидермиса и модулируют барьерную функцию кожи. Кроме того, сериновые протеазы участвуют в физиопатологии кожных болезней, связанных с воспалением, иммунной защитой организма, канцерогенезом, фиброзом и стимуляцией нервов.
Предполагается, что влияние сериновых протеаз на физиологические и физиопатологические свойства кожи отчасти связано с PAR-рецепторами. Действительно, рецепторы PAR-2 гиперэкспрессированы в эпидермисе, дерме и сосудах при воспалительных заболеваниях кожи, таких как атопический дерматит, плоский лишай и псориаз (Steinhoff et al., 1999). Также предполагается, что рецепторы PAR-2 играют роль в развитии зуда у пациентов с атопическим дерматитом (Steinhoff et al., 2003).
Активация PAR-2 трипсиноподобной протеазой индуцирует продукцию IL-8 кератиноцитами (НаСаТ) (Hou et al., 1988). Недавно было продемонстрировано, что IL-8, хемоаттрактивный цитокин для лейкоцитов, обеспечивает инфильтрацию нейтрофилов в эпидермис у пациентов с Psoriasis vulgaris (Iwakin et al., 2004).
Внутриклеточная сигнализация с участием PAR-2 рецепторов частично связана с мобилизацией внутри- и внеклеточного кальция.
Поэтому мы решили оценить активность производных гидроксикислот формулы I против рецепторов PAR-2 по их влиянию на входящий поток кальция в клетку, возникающий после специфической стимуляции PAR-2 рецепторов трипсина, присутствующих в кератиноцитах человека линии НаСаТ.
Эта методика основана на использовании этерифицированного флуоресцентного зонда из АМ-группы, поскольку этерификация способствует его проникновению в клетку посредством простой диффузии. Использованным зондом был зонд Fluo-4/АМ. Только у дезэтерифицированной формы, связанной с ионом кальция, можно возбудить флуоресценцию (при длине волны 485 нм), при этом она излучает при длине волны 535 нм.
Ингибирование (в процентах) потока кальция, вызванного трипсином
% стимуляции
Стандартное отклонение
% ингибирования
Без зонда
3,82
0,79
-
Трипсин 10 нМ
13,67
3,14
-
STI 1 мкМ
8,39
2,85
54
R=R<sub>n</sub>=H
0,1 мкг/мл
13,78
0,82
-1
R<sub>1</sub>=F
0,3 мкг/мл
13,06
1,47
6
n=13
1 мкг/мл
12,74
1,25
9
3 мкг/мл
12,97
0,92
7
10 мкг/мл
9,55
1,96
42
R=R<sub>n</sub>-R<sub>1</sub>=H
10 мкг/мл
15,33
3,00
-17
n=10
30 мкг/мл
14,10
3,42
-4
100 мкг/мл
9,84
3,26
39
R=R<sub>n</sub>=R<sub>1</sub>=H
10 мкг/мл
14,68
2,56
-10
n=14
30 мкг/мл
12,90
3,58
8
100 мкг/мл
11,37
2,62
23
Стимуляция трипсином
В случае кератиноцитов, происходящих из линии (НаСаТ):
Производные гидроксикислот общей формулы (I), указанные в таблице, приведенной выше, обладали ингибирующей активностью в отношении потока кальция, вызванного трипсином, при концентрации трипсина, равной 10 мкг/мл, и концентрации двух веществ, указанных ниже, равной 100 мкг/мл.
In vitro на клеточном уровне специфическая стимуляция рецепторов PAR-2 трипсином вызывает мобилизацию внутри- и внеклеточного кальция, обнаруживаемую с помощью флуоресцентного зонда.
В использованных нами экспериментальных условиях и в исследованных концентрациях соединения с общей формулой (I), указанные в приведенной выше таблице, достоверно модулировали активность против рецепторов PAR-2.
Эффект производных жирных гидроксикислот на синтез меланина in vitro
Меланоциты - это клетки звездчатой формы, в небольшом количестве присутствующие в базальном слое эпидермиса. Их основная функция состоит в обеспечении меланогенеза - процесса, с помощью которого в специализированных органеллах, меланосомах, синтезируется меланин, который затем транспортируется и распределяется между соседними кератиноцитами через их дендритоподобные отростки. Этот контакт с кератиноцитами приводит к возникновению пигментации кожи - механизму защиты эпидермиса против мутагенных эффектов ультрафиолетовых лучей. Каждый меланоцит связан примерно с тридцатью шестью кератиноцитами, образуя так называемую «эпидермальную единицу меланизации».
Меланогенез состоит из серии ферментативных и спонтанных реакций, предшественником для которых является тирозин. В этом процессе участвуют три основных фермента: тирозиназа, тирозиназо-связанные белки 1 и 2 (TRP1 и TRP2) (1). Тирозиназа катализирует преобразование тирозина в допахинон. После этого возможны два пути синтеза: эумеланогенез и феомеланогенез. Преобразование допахинона в эумеланин осуществляется в серии последовательных окислительных реакций с участием TRP-1 и TRP-2. Эумеланин является коричнево-черным пигментом с низким содержанием серы, и он обеспечивает фотопротекцию. В ходе феомеланогенеза к допахинону присоединяются молекулы с высоким содержанием серы с образованием феомеланина - желто-оранжевого пигмента, обнаруживаемого в коже рыжеволосых людей.
Физиологическим стимулом для синтеза меланина является солнечный свет, который вызывает увеличение количества меланоцитов, неосинтез меланина и морфологические изменения меланоцитов, состоящие в увеличении числа дендритов и ускорении транспорта меланосом в кератиноциты. На молекулярном уровне воздействие солнечного света стимулирует синтез и секрецию альфа-меланоцитстимулирующего гормона. A-MSH увеличивает концентрацию цАМФ в меланоцитах, что активирует фактор транскрипции, Mitf, который, в свою очередь, стимулирует транскрипционную активность генов, кодирующих тирозиназу, TRP-1 и TRP-2.
Известно, что некоторые экзогенные молекулы также оказывают отрицательное регулирующее влияние на меланогенез. Гидрохинон ингибирует синтез меланина, выступая в качестве субстрата для тирозиназы и обращая на себя ее активность.
Нами был проанализирован модулирующий эффект производных ненасыщенных жирных гидроксикислот на меланогенез. Для этого было проведено измерение синтеза меланина посредством колориметрического анализа на линии клеток меланомы мышей: линия B16-F10.
Эффект продуктов был исследован в исходной ситуации и после стимуляции меланогенеза α-MSH с целью определения их депигментирующей способности.
Анализ меланина
Внеклеточная и внутриклеточная концентрации меланина были измерены посредством спектрометрии при длине волны 405 нм согласно протоколу (Anob et al., 1999). Количество пигмента определяли с использованием стандартного набора для определения меланина и анализа с использованием программного обеспечения Microwin (Berthold Biotechnologies). Анализ общего белка был выполнен на пробах внутриклеточного меланина с использованием способа ВСА-Copper при длине волны 540 нм. Набор стандартных растворов был приготовлен с использованием стандартного белка BSA (бычьего сывороточного альбумина).
РЕЗУЛЬТАТЫ
В исходных условиях α-MSH в концентрации 1 мкМ увеличивал продукцию меланина на 100% по сравнению с контрольными клетками.
Этому увеличению концентрации меланина препятствуют депигментирующие агенты, такие как гидрохинон в концентрации 1 мкг/мл или витамин С в концентрации 40 мкг/мл, которые ингибировали действие α-MSH на 60%.
В исходных условиях при концентрации 30 мкг/мл:
n
1
- Соединение общей формулы I при n=10, R=R=H, R=F ингибировало синтез меланина на 30-45%, тогда как в присутствии α-MSH то же соединение в концентрации 30 мкг/мл обеспечивало ингибирование на 45-60%.
1
n
- Соединение общей формулы I при n=10, R=R=R=H в концентрации 30 мкг/мл обнаруживало меньшую активность, чем предыдущее соединение, а именно ингибирование на 15% в исходных условиях, тогда как в присутствии α-MSH ингибирующий потенциал этого соединения в отношении данного меланотропного вещества был сходным с предыдущим соединением, то есть составлял 45-60%.
В концентрации 10 мкг/мл ингибиторная активность этих двух кислот в отношении индукции меланогенеза α-MSH составляла примерно 35%.