Способ прогнозирования риска развития преэклампсии на основе молекулярно-генетического анализа
METHOD FOR PREDICTING THE RISK OF DEVELOPING PREECLAMPSIA BASED ON MOLECULAR GENETIC ANALYSIS

Изобретение относится к области медицинской диагностики и предназначено для прогнозирования риска развития преэклампсии на основе молекулярно-генетического анализа.
Преэклампсия (ПЭ) – мультисистемное патологическое состояние, возникающее во второй половине беременности (после 20-й недели), характеризующееся артериальной гипертензией в сочетании с протеинурией (≥0,3 г/л в суточной моче), нередко, отеками и проявлениями полиорганной/полисистемной дисфункции/недостаточности (Гипертензивные расстройства во время беременности, в родах и послеродовом периоде. Преэклампсия. Эклампсия: клинические рекомендации (протокол лечения) / Л.В. Адамян, Н.В. Артымук, Н.В. Башмакова [и др.]. – Москва, 2016. – 72 с.).
Как свидетельствуют литературные данные, частота встречаемости преэклампсии во всем мире составляет 2-8% (Сидорова И.С. Обоснование современной концепции развития преэклампсии / И.С. Сидорова, Н.А. Никитина // Акушерство и гинекология. – 2019. – № 4. – С. 26-33). ПЭ является одной из основных причин материнской смертности и перинатальных смертей (The International Federation of Gynecology and Obstetrics (FIGO) initiative on pre-eclampsia: a pragmatic guide for first-trimester screening and prevention / L.C. Poon, A. Shennan, J.A. Hyett [et al.] // Int. J. Gynecol. Obstet. – 2019. – Vol. 145, suppl. 1. – P. 1-33). При развитии тяжелой преэклампсии и эклампсии существенно повышается риск развития различных осложнений (отслойка плаценты, массивные акушерские кровотечения, ДВС-синдром, HELLP-синдром, острая почечная и печеночная недостаточность и др.) (Почему преэклампсия трансформируется в HELLP-синдром? Роль системы комплемента / А.Н. Стрижаков, Е.В. Тимохина, И.А. Федюнина [и др.] // Акушерство и гинекология. – 2020. – № 5. – С. 52-57). В последующей жизни у этих женщин значительно чаще регистрируются артериальная гипертензия, ишемическая болезнь сердца, инсульт. Дети, родившиеся в результате беременностей, осложненных ПЭ, имеют низкий вес и высокий риск развития ряда неинфекционных хронических заболеваний (Evaluation of sFlt-1/PlGF ratio for predicting and improving clinical management of pre-eclampsia: experience in a specialized perinatal care center / H. Caillon, C. Tardif, E. Dumontet [et al.] // Ann. Lab. Med. – 2018. – Vol. 38, № 2. – P. 95-101).
Этиопатогенез преэклампсии отражает широкий спектр факторов риска, а также сложность и гетерогенность данного осложнения беременности. В настоящее время к факторам риска преэклампсии относят: возраст, индекс массы тела, ожирение, возраст наступления менархе, первая беременность, многоплодная беременность, преэклампсия в предыдущую беременность, вспомогательные репродуктивные технологии, семейный анамнез преэклампсии, сопутствующая экстрагенитальная патология (сахарный диабет, артериальная гипертензия, заболевания почек и другие), курение, употребление алкоголя (Pre-pregnancy BMI, gestational weight gain and risk of preeclampsia: a birth cohort study in Lanzhou, China / Y. Shao, J. Qiu, H. Huang [et al.]. – DOI: 10.1186/s12884-017-1567-2 // BMC Pregnancy Childbirth. – 2017. – Vol. 17, № 1. – Art. 400. – URL: https://bmcpregnancychildbirth.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12884-017-1567-2).
Современные представления о патогенезе ПЭ состоят в том, что данное осложнение возникает из-за иммунной дезадаптации между матерью и плодом. В норме течение беременности связано с иммунологической толерантностью к плоду, который является генетически чужеродным объектом для организма матери. При этом, чем больше генетические различия между организмом плода и матери, тем выше иммунологическая толерантность.
Многочисленные исследования указывают на мультифакториальность преэклампсии, что предполагает оценку генетического компонента в развитии данного осложнения беременности. В настоящее время научные исследования, посвященные молекулярно-генетическому исследованию преэклампсии, активно проводятся по всему миру.
Поиск генов-кандидатов основан на их возможной роли в патогенезе преэклампсии (A review of candidate genes and pathways in preeclampsia-an integrated bioinformatical analysis / M.A. Mohamad, N.F. Mohd Manzor, N.F. Zulkifli [et al.]. – DOI: 10.3390/biology9040062 // Biology (Basel). – 2020. – Vol. 9, № 4. – Art. 62. – URL: https://www.mdpi.com/2079-7737/9/4/62/htm). Исходя из того, что развитие преэклампсии связывают с развитием окислительного стресса и воспалительного процесса, приводящих к эндотелиальной дисфункции, многие исследования направлены на поиск генов-кандидатов, участвующих в этих процессах: гены эндотелиальной дисфункции, гены вазоактивных факторов, гены иммунных и воспалительных реакций, гены окислительного стресса, гены липидного обмена, гены ренин-ангиотензин-альдостероновой системы, гены наследственных тромбофилий.
В основе патогенеза преэклампсии лежит эндотелиальная дисфункция, связанная с развитием окислительного стресса и воспалительных реакций. В формирование этих процессов вовлечены множество различных факторов (материнские, средовые, генетические). При этом генетические факторы играют наиболее значимую роль.
2
2
Ген UGT2B4 кодирует фермент УДФ-глюкуронозилтрансферазы 2B4, который участвует в процессах образования коньюгатов (глюкуронирования) ксенобиотиков, половых гормонов, билирубина и др. с молекулами глюкуроновой кислоты, обеспечивая их инактивацию (http://www.genecards.org/). Полиморфные локусы rs13111134 и rs2013573 гена UGT2B4 находятся в неравновесии по сцеплению между собой (r=0,69) и связаны с уровнем транскрипции генов UGT2B4 и UGT2A3P7 (11 SNPs, сильно сцепленных (r≥0,8) с rs13111134 также связаны с уровнем экспрессии этих генов). Также rs13111134 UGT2B4 имеет важное регуляторное значение: находится в TF-связывающих доменах для 4 факторов транскрипции: SIX5_disc2, Znf143_disc1, ATF3_known3, AP-1_disc7. При этом аллель А rs13111134 UGT2B4, связанный с повышенным риском возникновения ПЭ, способствует повышению афинности ко всем 4 факторам транскрипции. Результаты ранее проведенных исследований указывают на наличие ассоциаций полиморфных маркеров rs2013573 UGT2B4, rs13111134 UGT2B4 с возрастом менархе (Yermachenko, A. UGT2B4 previously implicated in the risk of breast cancer is associated with menarche timing in Ukrainian females / A. Yermachenko, V. Dvornyk // Gene. – 2016. – Vol. 590, № 1. – P. 85-89.). Согласно результатов работы He C. et al. (A large-scale candidate gene association study of age at menarche and age at natural menopause / C. He, P. Kraft, D. I. Chasman [et al.] // Hum. Genet. – 2010. – Vol. 128, № 5. – Р. 515-527), аллель С rs13111134 UGT2B4 и аллель C rs2013573 UGT2B4 связаны с поздним менархе.
С практической точки зрения представляется крайне необходимым выделение критериев индивидуального прогнозирования риска развития ПЭ на основании исследованных полиморфных вариантов гена UGT2B4 и других возможных факторов риска с целью выявления беременных, предрасположенных к преэклампсии.
В Российской Федерации исследования о вовлеченности генетических вариантов rs2013573-rs13111134 гена UGT2B4 в формирование предрасположенности к ПЭ отсутствуют.
Для оценки сложившейся патентной ситуации был выполнен поиск по охранным документам за период с 1990 по 2021 гг. Анализ документов производился по направлению: способ прогнозирования риска развития преэклампсии на основе молекулярно-генетических данных в зависимости от полиморфных маркеров гена UGT2B4. Источники информации: сайты Федерального института промышленной собственности http://fips.ru.
В изученной научно-медицинской и доступной патентной литературе авторами не было обнаружено способа прогнозирования риска развития ПЭ на основе данных о полиморфных локусах rs2013573 и rs13111134 гена UGT2B4.
Из области техники известен патент № 2730958 «Способ диагностики тяжелой преэклампсии у беременных» по заявке № 2019122327, от 16.07.2019. Способ включает определение в плазме крови беременной концентрации внеклеточной ДНК (вк ДНК), число копий рибосомальной ДНК в составе внеклеточной ДНК (вк рДНК), число копий митохондриальной ДНК в составе внеклеточной ДНК (вк мтДНК), нуклеазную активность ДНКазы 1; в ядерной ДНК лейкоцитов определяют число копий геномной рибосомальной ДНК (геном рДНК), число копий геномной митохондриальной ДНК (геном мтДНК) и при вк ДНК более 1000 нг/мл, вк рДНК более 1000, вк мтДНК более 200, отношении вк рДНК к геном рДНК более 2, отношении вк мтДНК к геном мтДНК более 1,64, нуклеазной активности ДНКазы 1 более 10 ед/мл - диагностируют тяжелую преэклампсию. Недостатком этого способа является возможность прогнозирования только тяжелого течения преэклампсии, трудоемкость выполнения, сложность подсчетов, и кроме того не учитывается роль генетических полиморфизмов.
Известен способ диагностики преэклампсии путем определения в крови беременных женщин концентрации фактора некроза опухоли альфа (ФНОα), фактора роста плаценты (ФРП) и плацентарного альфа-1 микроглобулина (ПАМГ), значения индекса инсулинорезистентности (HOMA-IR), уровней инсулина и лептина, и при значении этих показателей в сроки 11-14 недель и 18-21 недель беременности (RU 2693412 С1, Тезиков Е.Ю. и др. 20.11.2018). На основании данных полученных маркеров прогнозируют риск развития ранней или поздней ПЭ. Недостатком данного способа является его трудоемкость, заключающаяся в определении достаточно большого количества показателей в первом и втором триместрах беременности. Каждый из перечисленных в методе параметров может быть повышен при наличии различных патологических состояний, не связанных с беременностью, что может снижать специфичность данного метода. Не учитываются генетические факторы.
За прототип выбран патент № 2699974 (по заявке 2018142290 от 30.11.2018) описан способ прогнозирования риска развития преэклампсии у женщин с хронической артериальной гипертензией. Способ включает забор венозной крови, выделение геномной ДНК, проведение полимеразной цепной реакции синтеза ДНК и исследование полиморфизма гена альдостеронсинтазы CYP11B2 С(-344)Т и ангиотензиногена AGT T704C, оценивают уровень среднего артериального давления при первой явке в женскую консультацию до 12 недель беременности, учитывают факт наличия или отсутствия регулярной антигипертензивной терапии до наступления беременности и рассчитывают дискриминантную функцию (Y) по формуле: Y=0,21×Ф1+0,18×Ф2+0,31×Ф3+0,29×Ф4, где Ф1 - присутствие в генотипе женщины аллеля AGT 704С: да - 1 балл, нет - 0 баллов; Ф2 - присутствие в генотипе женщины аллеля CYP11B2 (-344)Т: да - 1 балл, нет - 0 баллов; Ф3 - наличие среднего артериального давления при первой явке в женскую консультацию до 12 недель беременности выше 95 мм рт.ст.: да - 1 балл, нет - 0 баллов; Ф4 - регулярная антигипертензивная терапия до наступления беременности: отсутствие - 1 балл, наличие - 0 баллов, и при значении Y, равном 0,68 или более, прогнозируют повышенный риск развития преэклампсии у женщин с хронической артериальной гипертензией, уроженок Центрального региона России. Недостатком данного способа является возможность его применения только у женщин с хронической артериальной гипертензией, установленной до наступления беременности, не учитываются другие генетические полиморфизмы.
Задачей настоящего исследования является расширение арсенала методов диагностики, а именно создание способа прогнозирования риска развития ПЭ на основе данных о полиморфных локусах rs2013573 и rs13111134 гена UGT2B4.
Технический результат использования изобретения – получение критериев оценки риска развития ПЭ у беременных русской национальности, уроженок Центрально-Черноземного региона РФ, на основе данных о полиморфных локусах rs2013573 и rs13111134 гена UGT2B4, включающий:
- выделение ДНК из периферической венозной крови;
- анализ полиморфизмов rs2013573 и rs13111134 гена UGT2B4;
- прогнозирование высокого риска развития ПЭ у беременных при выявлении гаплотипа GА гаплоблока rs2013573-rs13111134 гена UGT2B4.
Новизна и изобретательский уровень заключаются в том, что из уровня техники не известна возможность прогноза развития ПЭ у беременных на основе данных о гаплотипе GА гаплоблока rs2013573-rs13111134 гена UGT2B4.
Способ осуществляют следующим образом.
2
Выделение геномной ДНК из периферической крови осуществляют методом фенольно-хлороформной экстракции (Miller, S.A. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells / S.A. Miller, D.D. Dykes, H.F. Polesky // Nucleic. Acids. Res. – 1988. – Vol. 16, № 3. – P. 1215) в два этапа. На первом этапе к 4 мл крови с ЭДТА добавляют 25 мл лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% тритон Х-100, 5 мМ MgCl, 10 мМ трис-HCl (pH=7,6). Полученную смесь перемешивают и центрифугируют при 4ºС, 4000 об/мин в течение 20 минут. После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 4 мл раствора, содержащего 25 мМ ЭДТА (рН=8,0) и 75 мМ NaCl, ресуспензируют. Затем прибавляют 0,4 мл 10% SDS, 35 мкл протеиназы К (10 мг/мл) и инкубируют образец при 37ºС в течение 16 часов.
На втором этапе из полученного лизата последовательно проводят экстракцию ДНК равными объемами фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием при 4000 об/мин в течение 10 минут. После каждого центрифугирования производят отбор водной фазы. ДНК осаждают из раствора двумя объемами охлажденного 96% этанола. После лиофилизации полученную ДНК растворяют в бидистиллированной, деионизованной воде и хранят при -20°С.
Генотипирование образцов ДНК было выполнено в Центре коллективного пользования «Медицинская геномика» Томского национального исследовательского медицинского центра РАН на базе НИИ медицинской генетики (использовался метод MALDI и масс-спектрометр MassARRAY Analyzer 4 (фирма производитель “Seqeunom”, страна производства США). Для генотипирования использовали образцы ДНК в концентрации 10-20 нг в микролитре общим обьемом 10 мкл. В процессе экспериментального анализа образцов выполняли следующие этапы: проведение мультиплексной ПЦР; осуществление SAP-реакции; выполнение iPLEX реакции с последующим обессоливанием и нанесением на SpectroCHIP; процедуры ионизации и анализа спектров с помощью масс-спектрометрии MALDI-TOF (Степанов, В.А. Мультиплексное генотипирование однонуклеотидных полиморфных маркеров методом масс-спектрометрии MALDI-TOF: частоты 56 SNP в генах иммунного ответа в популяциях человека / В. А. Степанов, Е. А. Трифонова // Молекулярная биология. – 2013. – Т. 47, № 6. – С. 976-986).
perm
Гаплоблоки конструировались на основе алгоритма «Confidence intervals» (Gabriel S.B. et al., 2002) (при D’>0,8), имплементированном в программу gPLINK v2.050 (279. PLINK: a tool set for whole-genome association and population-based linkage analyses / S. Purcell, B. Neale, K. Todd-Brown [et al.] // Am. J. Hum. Genet. – 2007. – Vol. 81, № 3. – Р. 559-575). Так же с помощью вышеуказанного программного обеспечения проводился анализ ассоциаций гаплотипов с изучаемыми фенотипами методами логистической регрессии с необходимыми ковариатами и пермутационными процедурами (выполнялось 1000 пермутаций). Показатель p<0,05 при анализе ассоциаций гаплотипов был принят за статистически значимый.
Возможность использования предложенного способа для оценки прогнозирования риска развития ПЭ у беременных подтверждает анализ результатов наблюдений 997 пациенток, из них 366 беременных с ПЭ и 631 женщин контрольной группы. Основные медико-биологические и клинико-анамнестические характеристики беременных с преэклампсией и женщин группы контроля отражены в таблице 1.
Общая характеристика беременных с преэклампсией и женщин контрольной группы
Таблица 1
В выборку для исследования вошли женщины с преэклампсией и/или задержкой роста плода и женщины контрольной группы (с физиологическим течением беременности), давшие свое информированное согласие на участие в данной исследовательской работе и соответствующие ряду критериев: русский этнос, место рождения и проживания – регион Центрального Черноземья России. Основаниями для исключения женщин из исследовательской выборки были отказ от участия в данной работе, наличие родства между ними различной степени, выявление тяжелых хронических заболеваний, проводящих к декомпенсации, нерусский этнос и иные (нежели Центральное Черноземье России) места рождения и/или проживания.
Клиническое, клинико-лабораторное, клинико-инструментальное обследование беременных и новорожденных детей, верификация диагноза осложнений беременности – ПЭ, ЗРП (или их отсутствие), сбор медико-биологической информации, результатов клинического, клинико-лабораторного, клинико-инструментального обследования беременных и новорожденных детей в специально разработанные анкеты и формирование электронной базы данных проводилось сертифицированными врачами профильных отделений перинатального центра Белгородской областной клинической больницы Святителя Иоасафа.
adj
При расчете частот гаплотипов и анализе их ассоциаций  у индивидуумов установлена связь с формированием преэклампсии гаплотипа GА  гаплоблока rs2013573-rs13111134 гена UGT2B4.  Гаплотип GА  гаплоблока rs2013573-rs13111134 гена UGT2B4 является фактором риска  развития ПЭ у женщин (OR=1,88).
В качестве примеров конкретного применения разработанного способа приведено обследование русских пациенток, уроженок Центрально-Черноземного региона РФ и не являющихся родственницами между собой:  проведено генетическое исследование по локусам rs2013573-rs13111134 гена UGT2B4.
У пациентки Г. была взята венозная кровь, при генотипировании ДНК-маркеров был выявлен гаплотип GА  гаплоблока rs2013573-rs13111134 гена UGT2B4, что позволило отнести пациентку в группу больных с высоким риском развития ПЭ. Дальнейшее наблюдение подтвердило данное осложнение беременности у пациентки.
У пациентки Д. была взята венозная кровь, при генотипировании ДНК-маркеров был выявлен гаплотип AG гаплоблока rs2013573-rs13111134 гена UGT2B4, что позволило отнести пациентку в группу беременных с низким риском развития ПЭ. Дальнейшее наблюдение не подтвердило преэклампию у пациентки Д.
У пациентки Л. была взята венозная кровь, при генотипировании ДНК-маркеров был выявлен гаплотип АA гаплоблока rs2013573-rs13111134 гена UGT2B4, что позволило отнести пациентку в группу беременных с низким риском развития ПЭ. Дальнейшее наблюдение не подтвердило преэклампию у пациентки.
У пациентки Е. была взята венозная кровь, при генотипировании ДНК-маркеров был выявлен гаплотип GG гаплоблока rs2013573-rs13111134 гена UGT2B4, что позволило отнести пациентку в группу беременных с низким риском развития ПЭ. При дальнейшем наблюдение данное осложнение беременности у беременной не подтвердилось.
Применение данного способа позволит на доклиническом этапе формировать среди пациенток группы риска и своевременно реализовывать в этих группах необходимые лечебно-профилактические мероприятия по предупреждению развития ПЭ.