УСТРОЙСТВО ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ ФОТОИНДУЦИРОВАННОГО ЦИТОЛИЗА

Полезная модель относится к медицинской технике, а именно к устройствам для исследования фотоиндуцированного цитолиза, и может быть использована для определения индивидуальной чувствительности пациентов к фотовоздействию при планировании фотодинамической терапии, для подбора индивидуальной дозы облучения, для исследования антиоксидантных или прооксидантных свойств фармакологических препаратов или токсинов в условиях, приближенных к физиологическим. Для этих целей в качестве облучаемого объекта можно использовать эритроциты человека. Также полезная модель позволяет оценивать чувствительность взвеси различных опухолевых клеток к фотодинамической терапии, подбирать дозы облучения для различных типов опухолей, исследовать чувствительность культур различных микроорганизмов к бактерицидному действию облучения.
Механизм фотоиндуцированного цитолиза связан с повреждающим действием на эритроцит или другую клетку активных форм кислорода.
Известно исследование фотоиндуцированного цитолиза, проводимое в два этапа: облучение (обычно, при комнатной или стандартной температуре), и приборная регистрация лизиса клеток (Divyamani Srinivasan, Nandhini Muthukrishnan, Gregory A.Johnson, Alfredo Erazo-Oliveras, Jongdoo Lim, Eric E.Simanek, and Jean-Philippe Pellois. Conjugation to the Cell-Penetrating Peptide TAT Potentiates the Photodynamic Effect of Carboxytetramethylrhodamine//PLoS One. 2011; 6(3):el7732). Для регистрации цитолиза авторы использовали прибор проточной цитометрии. При этом результаты микроскопии клеток подвергали компьютерному анализу. В работе проводился анализ 10-20 изображений. Облучение взвеси эритроцитов производили без перемешивания, в связи с чем эритроциты получали разные дозы облучения. Термостатирование при 37°С отсутствовало как на стадии облучения, так и на стадии регистрации гемолитической кривой, что может привести к нарушению теплового режима физиологического процесса. Дискретная регистрация степени, а не динамики гемолиза снижает точность измерения и воспроизводимость результатов.
Известен метод регистрации фотогемолиза (Потапенко А.Я. и др. Фотогемолиз, сенсибилизированный псораленом: зависимость от рН. // Биофизика. - 2007. - Т. 52, N 3. - С.510-514.), который включает облучение смеси эритроцитов и фотосенсибилизатора при комнатной температуре в двухсантиметровой кювете, инкубацию смеси при 37°С в водяной бане и регистрацию гемолиза с помощью фотоэлектроколориметра. Определяли динамику повышения светопропускания от 70 до 98 процентов (диапазон -23%). Скорость гемолиза определяли по величине Т50, то есть времени, требующемуся для лизиса 50% клеток.
К недостаткам следует отнести тот факт, что облучение и исследование клеточной суспензии проводили без перемешивания, термостатирование при 37°С отсутствовало как на стадии облучения, так и на стадии регистрации гемолитической кривой. Работа прибора в ручном режиме не позволяет провести достаточное количество измерений для построения надежной гемолитической кривой и не дает возможности измерять изменение оптической плотности при быстром гемолизе из-за низкой частоты фиксации экспериментальных точек.
Технический результат, достигаемый полезной моделью, заключается в максимальном приближении условий исследования фоточувствительности клеток к физиологическим и повышении точности и воспроизводимости результатов.
Сущность полезной модели заключается в достижении заявленного технического результата в устройстве для исследования фотоиндуцированного цитолиза, содержащем кюветный отсек для клеточной суспензии, источник излучения, вызывающего цитолиз, и средство регистрации лизиса клеток, в котором средство регистрации лизиса клеток содержит размещенные на одной оптической оси источник света, коллиматор, формирующий параллельный световой луч, фильтр на область 700-800 нм, установленные перед кюветным отсеком, и фоторегистратор с диодной системой детекции, установленный за кюветным отсеком, а также цифровой преобразователь и средство обработки данных, при этом кюветный отсек выполнен термостатированным, экранированным и снабжен встроенной магнитной мешалкой.
Предпочтительным является устройство со сменным источником излучения, вызывающего цитолиз.
Термостатирование кюветного отсека со встроенной магнитной мешалкой и экранирование его для предотвращения рассеяния дозы облучения суспензии обеспечивают унификацию дозы облучения клеток и стандартизацию условий исследования. Это позволяет получить высокую степень воспроизводимости результатов и приближение условий исследования фоточувствительности клеток к воздействию на организм прооксидантов и антиоксидантов, проводимых in vitro, к соответствующим условиям in vivo.
Размещенные на одной оптической оси источник света, коллиматор, формирующий параллельный световой луч, фильтр на область 700-800 нм, установленные перед кюветным отсеком, и фоторегистратор с диодной системой детекции, установленный за кюветным отсеком, позволяют вести практически непрерывную регистрацию результатов при помощи цифрового преобразователя и средства обработки данных, как в процессе облучения, так и после него, проводить достаточное количество измерений для построения надежной гемолитической кривой. Это дает возможность использовать модель для точных количественных оценок влияния фотосенсибилизаторов на фоточувствительность клеток.
Введение в оптическую систему сменного лазерного или светодиодного источника разных длин волн, интенсивности и степени поляризации для облучения суспензии клеток расширяет возможности устройства для исследования фотоиндуцированного цитолиза.
На фиг.1 представлена блок-схема заявленного устройства для исследования фотоиндуцированного цитолиза; на фиг.2 - гемолитическая кривая, полученная в результате исследования.
Устройство для исследования фотоиндуцированного цитолиза (фиг.1) содержит термостатированный (37°С) и экранированный кюветный отсек 1, снабженный встроенной магнитной мешалкой 2, для клеточной суспензии, сменный источник 3 излучения, вызывающего цитолиз, - лазер или лазерные светодиоды. Облучение смеси может производиться как непосредственно, при помещении источника 3 над кюветой 1, так и через световод (на фигуре не показан). Для регистрации лизиса клеток предусмотрены размещенные на одной оптической оси источник света 4, коллиматор 5, формирующий параллельный световой луч, фильтр 6 на область 700-800 нм, установленные перед кюветным отсеком 1, фоторегистратор 7 с диодной системой детекции, установленный за кюветным отсеком 1, цифровой преобразователь 8 и компьютер 9 с программным обеспечением регистрации динамики оптической плотности инкубационной смеси. Оптическая плотность регистрируется в непрерывном режиме с 5-секундными интервалами и определением параметров цитолиза.
Устройство работает, например, следующим образом. Для исследования фоточувствительности эритроцитов пациента получают пробу цитратной крови. Эритроциты отделяют от плазмы путем центрифугирования (1500 об/мин, 15 мин), трижды отмывают физиологическим раствором и готовят стандартную взвесь (1,2 млн. клеток/мл). В экранированной кювете 1 готовят инкубационную смесь, содержащую 0,1 мл стандартной взвеси эритроцитов, буферный раствор (рН 7,2-7,4) и фотосенсибилизатор, например, радахлорин (OOO «РАДАФАРМА», Россия). Инкубационную смесь в течение трех минут прогревают при 37°С в кюветном отсеке 1 при постоянном перемешивании с помощью встроенной магнитной мешалки 2, затем проводят облучение инкубационной смеси источником 3, например, лазером ШАТЛ-1 (633 нм, выходная мощность - 12 мВт, Россия). После завершения облучения (5-30 минут) регистрируют в непрерывном режиме оптическую плотность содержимого кюветы. Для этого включают источник света 4, расходящийся пучок света от которого формируется системой линз коллиматора 5 в параллельный в соответствии с размерами кюветы. Далее свет проходит через фильтр 6 на область 700-800 нм, который минимизирует паразитное рассеяние света во взвеси клеток, увеличивая тем самым чувствительность метода. Измерение динамики оптической плотности взвеси в кюветном отсеке 1 проводится чувствительной к указанной выше спектральной области диодной системой детекции 7. С помощью цифрового преобразователя 8 и компьютера 9 с программным обеспечением регистрации динамики оптической плотности инкубационной смеси получают гемолитическую кривую (фиг.2), по которой определяют параметры гемолитического процесса: T-lag - интервал времени от завершения облучения до начала гемолиза, V, - скорость гемолитического процесса (тангенс угла наклона кривой гемолиза) и Т50 - время от завершения облучения до лизиса 50% эритроцитов инкубационной смеси.
Использование полезной модели обеспечивает высокую степень воспроизводимости результатов и приближение условий исследования фоточувствительности клеток и воздействию на организм прооксидантов и антиоксидантов, проводимых in vitro, к соответствующим условиям in vivo.
Применение адекватных методов обработки полученных данных дает возможность использовать модель для точных количественных оценок влияния фотосенсибилизаторов на фоточувствительность клеток в условиях, максимально приближенных к применяемым при фотодинамической терапии.