СПОСОБ ПРОВЕДЕНИЯ ПЦР И ПЦР-ПДРФ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ АЛЛЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ Waxy-ГЕНОВ ПШЕНИЦЫ
METHOD OF CARRYING OUT PCR AND PCR-RFLP FOR IDENTIFICATION OF ALLELIC VERSIONS OF Waxy-GENES OF WHEAT

Описание изобретения
Изобретение относится к области биохимии, а также селекции и семеноводства, в частности к молекулярной идентификации генотипов пшеницы по аллельным вариантам Waxy-генов для маркер-вспомогательной селекции сортов с высокими мукомольно-хлебопекарными и технологическими свойствами зерна.
/
/
/
/
Одним из подходов к идентификации аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы является способ проведения ПЦР (полимеразная цепная реакция) с праймерами: 4F: 5-AAGAGCAACTACCAGT-3 и 4R: 5-TCGTACCCGTCG-ATGAAGTCGA-3, инициирующими амплификацию соответствующих аллель-специфичных продуктов Wx-Al-, Wx-Bl- и Wх-Dl-локусов. [1].
Существенным недостатком данного способа проведения ПЦР [1] является невозможность идентификации нуль-аллеля Wx-Blb от активного аллеля Wx-Ble, а также трудность дискриминации Wx-Ala от Wx-Alg.
Цель изобретения - разработка способа проведения ПЦР и ПЦР-ПДРФ (полимеразная цепная реакция-полиморфизм длины рестрикционных фрагментов) для эффективной идентификации аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы.
2
/
/
/
Нами разработан способ проведения ПЦР и ПЦР-ПДРФ для идентификации аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы, схожий с прототипом [1], включающий пробоподготовку ДНК пшеницы, внесение выделенной пробы ДНК в реакционную смесь для ПЦР, состоящую из dHO, дНТФ, буферной системы, Taq ДНК полимеразы, праймеров, проведение ПЦР, гель-электрофорезную детекцию, с тем отличием, что на этапе ПЦР используется прямой праймер: 4F-c: 5-CCCCCAAGAGCAACTACCAGT-3(SEQ ID NO: 1), а процедура ПДРФ-анализа проводится с эндонуклеазным расщеплением ампликонов рестриктазой AcsI.
Условия проведения реакции
Выделение геномной ДНК из зерновок растений яровой пшеницы осуществляли сорбционным способом («ДНК-сорб С», ЦНИИЭМ, Россия).
ПЦР и ПЦР-ПДРФ выполняли согласно протоколам идентификации аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы, представленным в табл.1-2.
Детекцию результатов ДНК-анализа проводили методом горизонтального электрофореза в 3% агарозном геле в буфере TBE (pH 8,0), содержащем этидий бромид в концентрации 0,5 мкг/мл, с последующей визуализацией амплифицированных продуктов в ультрафиолетовом трансиллюминаторе (λ=310 нм).
Размеры фрагментов ДНК оценивали по подвижности в сравнении со стандартными ДНК маркерами.
В работе были использованы продукты для молекулярно-биологических исследований производства ООО «СибЭнзим», Россия.
Выравнивание частичных нуклеотидных последовательностей аллелей Waxy-генов пшеницы: CLUSTAL W (v.1.83).
ПЦР-ПДРФ-моделирование: NEBcutter v.2.0.
Заключение
По результатам практических исследований, направленных на апробацию предложенного способа проведения ПЦР и ПЦР-ПДРФ, нами получен обеспечиваемый заявленным способом технический результат, выраженный в эффективной идентификации аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы, ввиду корректной интерпретации генерируемых ПЦР-продуктов (фиг.3) и ПЦР-ПДРФ-фрагментов (фиг.4), сопоставимых с расчетными данными (фиг.1-2).
Источники информации
1. Vanzetti, L.S. Genetic variability for waxy genes in Argentinean bread wheat germplasm / L.S. Vanzetti, L.A. Pfluger, M. Rodriguez-Quijano, J.M. Carrillo, M. Helguera // Electronic Journal of Biotechnology. - 2009. - V.12. - N.1. - P.1-9.
Табл.1
Протокол ПЦР для идентификации аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы (прототип)
Протокол ПЦР
Реагенты
Исходная концентрация
Рабочая концентрация
1 проба (мкл)
10 проб (мкл)
dH<sub>2</sub>O
13,4
134
dNTPs
2,5 мМ
0,25 мМ
2
20
Буфер
10×
1×
2
20
Taq ДНК полимераза
5 ед
1 ед
0,2
2
4F
50 мкМ
0,5 мкМ
0,2
2
4R
50 мкМ
0,5 мкМ
0,2
2
Проба ДНК
2
ВСЕГО
20
Нуклеотидные последовательности праймеров:
4F: 5<sup>/</sup>-AAGAGCAACTACCAGT-3<sup>/</sup> (16 н.)
4R: 5<sup>/</sup>-TCGTACCCGTCGATGAAGTCGA-3<sup>/</sup> (22 н.)
Режим амплификации:
×1: 94°C - 4 мин
×40: 94°C - 30 сек, 58°C - 30 сек, 72°C - 30 сек
×1: 72°C - 7 мин
ХРАНЕНИЕ +10°C
Электрофорез в 3% агарозе
Интерпретация ПЦР-продуктов:
Наличие 257 (261) bp=Wx-Ala или Wx-Alg (Wx-Ble) // отсутствие = Wx-Alb
Наличие 227 bp=Wx-Bla // отсутствие = Wx-Blb или Wx-Ble
Наличие 299 bp=Wx-Dla // отсутствие = Wx-Dlb
Табл.2
Протокол ПЦР и ПЦР-ПДРФ для идентификации аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы (предлагаемый способ)
Протокол ПЦР
Реагенты
Исходная концентрация
Рабочая концентрация
1 проба (мкл)
10 проб (мкл)
dH<sub>2</sub>O
13,4
134
dNTPs
2,5 мМ
0,25 мМ
2
20
Буфер
10×
1×
2
20
Taq ДНК полимераза
5 ед
1 ед
0,2
2
4F-c
50 мкМ
0,5 мкМ
0,2
2
4R
50 мкМ
0,5 мкМ
0,2
2
Проба ДНК
2
ВСЕГО
20
Нуклеотидные последовательности праймеров:
4F-c: 5<sup>/</sup>-CCCCCAAGAGCAACTACCAGT-3<sup>/</sup> (21 н.)
4R: 5<sup>/</sup>-TCGTACCCGTCGATGAAGTCGA-3<sup>/</sup> (22 н.)
Режим амплификации:
×1: 94°C - 4 мин
×40: 94°C - 30 сек, 64°C - 30 сек, 72°C - 30 сек
×1: 72°C - 7 мин
ХРАНЕНИЕ +10°C
Электрофорез в 3% агарозе
Интерпретация ПЦР-продуктов:
Наличие 262 (266) bp=Wx-Ala (Wx-Ble) // отсутствие = Wx-Alb или Wx-Alg
Наличие 232 bp=Wx-Bla // отсутствие = Wx-Blb или Wx-Ble
Наличие 304 bp=Wx-Dla // отсутствие = Wx-Dlb
Протокол ПДРФ
Реагенты
Исходная концентрация
Рабочая концентрация
1 проба (мкл)
10 проб (мкл)
dH<sub>2</sub>O
1,75
17,5
BSA
10 мг/мл
0,1 мг/мл
0,25
2,5
SE-буфер W
10×
1×
2,5
25
AcsI
20 U
10 U
0,5
5
ПЦР-проба
20
ВСЕГО
25
Инкубация при 50°C в течение 3 часов
Электрофорез в 3% агарозе
Интерпретация ПЦР-продуктов:
Наличие 148/114 bp=Wx-Ala // отсутствие = Wx-Alb или Wx-Alg
Наличие 148/84 bp=Wx-Bla // отсутствие = Wx-Blb или Wx-Ble
Наличие 266 bp=Wx-Ble
Наличие 156/148 bp=Wx-Dla // отсутствие = Wx-Dlb
Краткое описание графических материалов
Пояснение к фиг.1.
Выравнивание фланкируемых с праймерами 4F+4R нуклеотидных последовательностей аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы, AcsI-рестрикционное картирование и моделирование AcsI-ПЦР-ПДРФ-профилей.
Пояснение к фиг.2.
Выравнивание фланкируемых с праймерами 4F-c+4R нуклеотидных последовательностей аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы, AcsI-рестрикционное картирование и моделирование AcsI-ПЦР-ПДРФ-профилей.
Пояснение к фиг.3.
Электрофореграмма технического результата предложенного способа проведения ПЦР и прототипа для идентификации аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы.
Обозначения: A) прототип (праймеры 4F+4R). B) предложенный способ проведения ПЦР (праймеры 4F-c+4R). M) ДНК-маркеры 100-1500 bp (СибЭнзим). 1-9) генотипы пшеницы с комбинациями Waxy-аллелей: 1-4) Wx-Ala/Bla/Dla; 5-7) Wx-Alg/Bla/Dla. 8-9) Wx-Ala/Blb/Dla.
Пояснение к фиг.4.
Электрофореграмма технического результата предложенного способа проведения ПЦР-ПДРФ для идентификации аллельных вариантов Waxy-генов пшеницы.
Обозначения: M) ДНК-маркеры 50-100 bp (СибЭнзим). 1) ПЦР-профиль генотипа пшеницы с комбинацией аллелей Wx-Ala/Bla/Dla (304/262/232 bp). 2-7) AcsI-ПЦР-ПДРФ-профили генотипов пшеницы с комбинациями Waxy-аллелей: 2) Wx-Ala/Bla/Dla (156/148/114/84 bp); 3-5) Wx-Alg/Bla/Dla (156/148/84 bp); 6-7) Wx-Ala/Blb/Dla (156/148/114 bp).