КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ ХИТОЗАН, ГЛЮКОЗАМИН И АМИНОКИСЛОТЫ, ДЛЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОГО ПРИМЕНЕНИЯ
COMPOSITION CONTAINING CHITOSAN, GLUCOSAMINE AND AMINO ACIDS FOR AGRICULTURAL USE

Настоящая заявка испрашивает приоритет по предварительной заявке США №61/500543, поданной 23 июня 2011 г.
Область техники
В настоящей заявке описываются процессы и композиции, повышающие урожайность сельскохозяйственных культур, усиливающие защитные процессы в растениях, снижающие уровень патогенов растений и снижающие количество используемых удобрений.
Уровень техники
Микроорганизмы применяли в сельском хозяйстве и ранее. Примеры включают микроорганизмы, описанные в патентах США 4,952,229; 6,232,270 и 5,266,096.
Хитин также применяют в сельском хозяйстве в виде белкового комплекса (патент США 4,536,207) или в сочетании с различными микроорганизмами (патенты США 6,524,998 и 6,060,429)
Хитозан применяют в сельском хозяйстве в комбинации с другими компонентами. См., например, патенты США №6,649,566; 4,812,159; 6,407,040; 5,374,627 и 5,733,851. Его также применяют для обработки семян зерновых культур. См., например, патент США 4,978,381. Кроме того, в патенте США 6,524,998 описано, что хитозан можно применять в комбинации со специфическими микроорганизмами в сельском хозяйстве.
HYTb сам по себе или в комбинации с HYTc и микробиологической композицией HYTa можно применять для обработки почвы, семян, саженцев и листвы, как описано в заявке на патент США №61/355447, поданной 16 июня 2010 г. под названием Микробиологический способ и композиция для сельскохозяйственного применения, и заявке на патент США №13/160333, поданной 14 июня 2011 г. под названием Микробиологический способ и композиция, каждая из которых полностью включена в настоящую заявку посредством ссылки.
Несмотря на вышеизложенное, существует потребность в обеспечении улучшенных композиций и способов, повышающих урожай культур и снижающих количество традиционных фунгицидов и инсектицидов, применяемых в сельском хозяйстве и садоводстве.
Сущность изобретения
Настоящая заявка описывает композиции, содержащие хитозан, глюкозамин и аминокислоты, причем концентрация хитозана в указанных композициях составляет более 1,5 масс.%, а глюкозамина - более 1,5 масс.%. В предпочтительных вариантах реализации концентрация хитозана составляет от 2 до 2,5 масс.%, а глюкозамина - от 2 до 6 масс.%. Композиция также может содержать твердый хитин, но обычно в количестве не более 2 масс.%.
Композиция также может содержать микроэлементы, белок и другие полисахариды.
В общем случае композиция является жидкой, но может быть твердой. В большинстве вариантов реализации твердое вещество можно растворить в воде перед применением.
В предпочтительных вариантах реализации композиция содержит HYTd и, по меньшей мере, один из HYTa, HYTb и HYTc. В других вариантах реализации композиция содержит HYTd и два или более из HYTa, HYTb и HYTc. Композиция также может содержать HYTd, HYTa, HYTb и HYTc.
В описываемых способах почва, семена, саженцы или листва растений взаимодействуют с HYTd или любой из вышеуказанных композиций.
Кроме того, описана обработанная почвенная композиция, содержащая почву, обработанную HYTd или любой из вышеуказанных композиций.
Кроме того, описано обработанное растение, включающее растение, обработанное HYTd или любой из вышеуказанных композиций.
Кроме того, описано обработанное семя или саженец, включающие семя или саженец, обработанные HYTd или любой из вышеуказанных композиций.
Краткое описание чертежей
На фиг.1 показаны результаты обработки спаржи HYTa + HYTb.
На фиг.2 показаны результаты обработки спаржи HYTa + HYTb + HYTd.
Фиг.3 представляет собой график, на котором показано количество клубней и распределение по размеру картофеля, обработанного HYTa, по сравнению с контролем.
Фиг.4 представляет собой график, на котором показано количество клубней и распределение по массе картофеля, обработанного HYTa, по сравнению с контролем.
Фиг.5 содержит фотографии, сравнивающие картофель, полученный после обработки HYTa, с контролем.
Фиг.6 представляет собой график, на котором показано количество клубней и распределение по размеру картофеля, обработанного HYTa, по сравнению с контролем.
Фиг.7 представляет собой график, на котором показано количество клубней и распределение по массе картофеля, обработанного HYTa, HYTc, HYTc и HYTd, no сравнению с картофелем, обработанным HYTa.
Фиг.8 содержит фотографии, сравнивающие картофель, полученный после обработки HYTa, HYTc, HYTc и HYTd, с картофелем, полученным после обработки HYTa.
Фиг.9 представляет собой график, на котором показано количество клубней и распределение по размеру картофеля, обработанного HYTa, HYTc, HYTc и HYTd, по сравнению с картофелем, обработанным метамнатрием.
Фиг.10 представляет собой график, на котором показано количество клубней и распределение по массе картофеля, обработанного HYTa, HYTc, HYTc и HYTd, по сравнению с картофелем, обработанным метамнатрием.
Фиг.11 содержит фотографии, сравнивающие картофель, полученный после обработки HYTa, HYTc, HYTc и HYTd, с картофелем, обработанным метамнатрием.
Фиг.12 представляет собой блок-схему, иллюстрирующую разложение ракообразных для образования HYTb и HYTc. Затем HYTc и HYTb обрабатывают HQE с образованием HYTd, раствора с относительно высоким количеством хитозана и глюкозамина по сравнению с HYTb.
Фиг.13 представляет собой блок-схему, иллюстрирующую разложение грибов, в том числе мицелиальных грибов, дрожжей и/или насекомых для образования HYTb и HYTc. Затем HYTc и HYTb необязательно обрабатывают HQE с образованием HYTd, раствора с относительно высоким количеством хитозана и глюкозамина по сравнению с HYTb.
Подробное описание
Настоящая заявка описывает композиции, содержащие хитозан, глюкозамин и аминокислоты, причем концентрация указанного хитозана составляет более 1,5 масс.%, а указанного глюкозамина - более 1,5 масс.%. В предпочтительных вариантах реализации концентрация хитозана составляет от 2 до 2,5 масс.%, а глюкозамина - от 2 до 6 масс.%. Композиция также может содержать твердый хитин, но обычно в количестве не более 2 масс.%. Композиция также может содержать микроэлементы, белок и другие полисахариды. В общем случае композиция является жидкой, но может быть твердой. В большинстве вариантов реализации твердое вещество можно растворить в воде перед применением. В предпочтительных вариантах реализации композиция содержит HYTd. В других вариантах реализации композиция содержит HYTd и, по меньшей мере, один из HYTa, HYTb и HYTc. В других вариантах реализации композиция содержит HYTd и два или более из HYTa, HYTb и HYTc. Композиция также может содержать HYTd, HYTa, HYTb и HYTc. В описываемых способах почва, семена, саженцы или листва растений взаимодействуют с HYTd или любой из вышеуказанных композиций.
HYTa
В настоящем описании термин "HYTa" относится к консорциуму микроорганизмов, полученных из образцов плодородной почвы и коммерческих источников. HYTa депонирован в Американской коллекции типовых культур (ATCC), Роквилл, штат Мэриленд, США, 19 мая 2010 г. с присвоенным обозначением депозита PTA-10973.
В таблице 1 определены некоторые из микроорганизмов в составе HYTa, которые, как считается, отвечают за благоприятное действие, наблюдаемое при его применении для обработки почвы и/или листвы.
Другие микроорганизмы, содержащиеся в HYTa: Nitrobacter, Nitrosomonads, Nitrococcus, Pseudomonas, Micrococcus luteus, Actinomycete, Azotobacter vinelandii, Lactobacillus casei, Trichoderma harzianum, Bacillus licheniformis, Pseudomonas fluorescens и Streptomyces.
2
3
Активные микроорганизмы в составе HYTa включают азотфиксаторы, встречающиеся в почве в природных условиях. Указанные азотфиксаторы представляют собой Azotobacter vinelandii и Clostridium pasteurianum. Bacillus subtilis обеспечивает ферменты для расщепления растительных остатков. Bacillus cereus обеспечивает дополнительные ферменты для расщепления растительных остатков и пенициллиназу для подавления нежелательных бактерий. Bacillus megaterium разрушает сложные углеводы после расщепления остатков сельскохозяйственных культур. Lactobacillus обеспечивает питательные вещества для микроорганизмов в составе HYTa и контролирует pH окружающей среды. Организмы Nitrobacter окисляют аммиак до нитрита (NO), а микроорганизмы Nitrosomonas окисляют нитрит до нитрата (NO).
Важное свойство HYTa - фиксация атмосферного азота. Способность микроорганизмов HYTa к фиксации азота усиливается другими организмами HYTa. Для фиксации азота нужны фосфор (P), калий (K) и углерод (C). HYTa содержит микроорганизмы, способные разлагать P, K и C почвы. Кроме того, бактерии-азотфиксаторы обеспечивают азотом другие микроорганизмы в составе HYTa.
Фиксация азота может происходить бактериями Nitrosomonas, Nitrobacter, Azotobacter vinelandii и Clostridium pasteurinum, присутствующими в HYTa, не симбиотически или в симбиозе, как происходит клубеньках с помощью бактерий Rhyzobium.
Углерод, необходимый для азотфиксирующих микроорганизмов в составе HYTa, предоставляют редуценты C, которые преобразуют сложные органические соединения почвы в простые соединения, например, углеводы, спирты и органические кислоты. К редуцентам C относятся многие из вышеуказанных микроорганизмов.
Фосфор необходим микроорганизмам-азотфиксаторам для размножения; его источником является метаболическая активность редуцентов P, которые преобразуют иммобилизованный фосфор почвы в биодоступный фосфор. Редуценты P в составе HYTa включают Azotobacter, Bacillus subtilis, Pseudomonas fluorescens и Micrococcus luteus.
Калий, необходимый для азотфиксаторов, обеспечивают микроорганизмы-редуценты K, присутствующие в HYTa, которые активируют калий почвы. Редуценты K в составе HYTa включают Pseudomonas fluorescens.
Три важных микроорганизма в составе HYTa представляют собой штаммы Bacillus subtilis (SILoSil BS), Bacillus thuringiensis HD-1 и HD-73 (SILoSil ВТ) и Trichoderma harzianum (TRICHOSIL). Указанные организмы представляют собой депозит ATCC PTA-10973. Первоначально их получили от Biotecnologia Agroindustrial S.A. DE C.V., Морелия, Мичоакан, Мексика.
Bacillus subtilis ((SILoSil BS) - грамположительная мезофильная бактерия с оптимальной температурой роста от 25 до 35°C. Указанная бактерия аэробна и может расти в анаэробных условиях и использовать широкий спектр источников углерода. Указанная бактерия содержит две нитритредуктазы, одна из которых используется для ассимиляции азота. Указанная бактерия способна секретировать амилазу, протеазы, пуллуланазы, хитиназы, ксиланазы и липазы.
Bacillus thuringiensis (штаммы HD-1 и HD-2 (SILoSil ВТ)) - грамположительные факультативно-анаэробные бактерии с перитрихиальным жгутикованием. Штаммы HD-1 и HD-73 в ходе споруляции синтезируют белковые кристаллы различной геометрической формы, обладающие инсектицидной активностью. Штаммы HD-1 и HD-2 в хитинсодержащей среде секретируют экзохитиназы и могут применяться для разрушения остатков ракообразных при получении хитоолигосахаридов.
Trichoderma harzianum (TRICHOSIL) - сапрофитный гриб. Указанный гриб проявляет действие антибиотика и способен к биологической конкуренции, и поэтому обладает свойствами биологического контроля. Указанный гриб продуцирует ферменты, разрушающие клеточные стенки или обладающие комбинированным действием. Указанный гриб продуцирует глюканазы, хитиназы, липазы и внеклеточные протеазы при взаимодействии с некоторыми патогенными грибами, например, Fusarium.
Как показано выше, метаболизм каждой группы бактерий является независимым, и они существуют в тесном симбиотическом взаимодействии, обеспечивая правильное функционирование HYTa.
2
2
Кроме углерода, водорода, фосфора, калия, серы и различных микроэлементов, для оптимального роста бактерий важна смесь специфических факторов роста, например, B-комплекс, свободные L-аминокислоты и высокорастворимые микроэлементы. Для обеспечения указанных компонентов в состав HYTa включены ферментирующие дрожжи. Процесс фиксации N требует большого количества АТФ. Количества АТФ, присутствующего в естественных условиях, недостаточно для энергетического обеспечения фиксации N. Ферментация дрожжей в HYTa компенсирует указанный значительный недостаток энергии. Во время ферментации за счет дыхательного процесса образуются органические кислоты, и совместно с высвобождением фосфора редуцентами P образуется АТФ. Указанная АТФ используется в процессе биологической фиксации азота.
HYTa содержит ферменты и полезные почвенные микроорганизмы, замещающие микроорганизмы, истощенные вследствие интенсивного применения химикатов, что приводит к снижению урожаев культур. За счет усиления микробиологической активности в почве с помощью HYTa указанные бактерии вызывают более эффективное поглощение питательных веществ и микроэлементов растениями.
Некоторые из микроорганизмов, входящих в состав HYTa, проникающих как в почву, так и в корневую систему растения, преобразуют гумус. Указанный процесс обеспечивает растение усиленным питанием. Это повышает количество питательных веществ и незаменимых элементов, присутствующих в почве, которые могут поглощаться растениями.
Применение HYTa самого по себе или в комбинации с хитином, хитозаном, глюкозамином и/или аминокислотами (1) обеспечивает питательные вещества и элементы почвы, повышающие урожай культур на 25-55%, (2) снижает высвобождение газов парникового эффекта, (3) повышает эффективность минеральных удобрений (3) снижает применение традиционных фунгицидов и других пестицидов, (4) повышает продукцию регуляторов роста растений, (5) улучшает структуру, обработку почвы, проницаемость и удерживание воды, (6) удаляет химические остатки и (7) сдвигает pH почвы в область нейтральных pH.
Микробиологические композиции
HYTa можно применять отдельно или в комбинации с одним или более компонентов, выбранных из группы, состоящей из одной или более аминокислот, хитина, хитозана и/или глюкозамина. В некоторых случаях в микробиологическую композицию включают ацетил-D-глюкозамин. Микробиологическая композиция содержит всевозможные комбинации вышеуказанных компонентов. Особенно предпочтительные комбинации включают: (1) HYTa и хитин; (2) HYTa и хитозан; (3) HYTa и глюкозамин; (4) HYTa и аминокислоты; (5) HYTa, хитин и аминокислоты; (6) HYTa, хитин, хитозан и аминокислоты; (7) HYTa, хитозан, глюкозамин и аминокислоты; (8) HYTa, хитозан и глюкозамин и (9) HYTa, хитин, хитозан, глюкозамин и аминокислоты, причем последняя комбинация является особенно предпочтительной. HYTb и, в особенности, HYTd являются предпочтительными источниками хитозана, глюкозамина и аминокислот.
Если HYTa растет в присутствии хитина, хитозана и/или аминокислот, он может содержать остаточный хитин, хитозан и/или аминокислоты. При некоторых обстоятельствах, культура бактерий HYTa содержит описанную микробиологическую композицию и ее можно вносить непосредственно в почву, семена, саженцы или листву растений. В качестве альтернативы, в композицию для изменения или дополнения ее состава можно добавить один или несколько второстепенных компонентов.
В настоящей заявке термин "аминокислоты" относится к композиции, содержащей две или более аминокислоты. Аминокислоты включают триптофан, гистидин, треонин, тирозин, валин, метионин, изолейцин, лейцин, фенилаланин, лизин, аспарагиновую кислоту, цистеин, глутаминовую кислоту, глутамин, серин, глицин, аланин, пролин, аспарагин и аргинин. В предпочтительных вариантах реализации аминокислоты обеспечиваются за счет применения HYTb (см. ниже).
В настоящей заявке термин "хитин" относится к биополимеру, состоящему преимущественно из повторяющихся единиц бета-1-4-связанного N-ацетил-D-глюкозамина. Хитин встречается в природе в качестве основного структурного материала экзоскелета животных, например, членистоногих (Arthropoda), например, ракообразных, насекомых, пауков и т.д., моллюсков (Mollusca), например, брюхоногих, головоногих и т.д., кишечнополостных (Coelentara), например, таких организмов, как гидроиды и медузы, и круглых червей (Nematoda), например, некольчатых червей. Хитин также встречается в различных грибах, включая члены рода Fusarium. Хитин можно выделить из указанных природных источников обработкой щелочами или путем биоразложения. Молекулярная масса хитина варьирует в зависимости от его источника и способа выделения. В предпочтительных вариантах реализации хитин получают в виде твердого вещества при биоразложении хитинсодержащих членистоногих {Arthropods), как описано в заявках Bioderpac., Предпочтительный диаметр хитина составляет приблизительно 50-75 микрон для облегчения его нанесения посредством капельных и разбрызгивающих систем орошения.
В настоящей заявке термин "хитозан" представляет собой полисахарид, состоящий преимущественно из повторяющихся единиц D-глюкозамина. Хитозан получают дезацетилированием хитина. Степень дезацетилирования по сравнению с хитином составляет предпочтительно более 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% и 95%. Предпочтительно, чтобы уровень дезацетилирования был достаточен для растворимости хитозана в воде при кислых pH. Молекулярная масса хитозана варьирует в зависимости от его источника и способа выделения. Хитозан включает олигомеры хитозана. В предпочтительных вариантах реализации хитозан осаждают при pH 9,0 из водной фракции, полученной при биоразложении хитинсодержащих членистоногих, как описано в заявках Bioderpac.
В настоящей заявке термин "олигомер хитозана" относится к хитозану, содержащему два или более повторяющихся звеньев D-глюкозамина и, в случае неполного дезацетилирования хитина, одну или более единиц N-ацетил-D-глюкозамина. В предпочтительных вариантах реализации олигомеры хитозана получают из водной фракции, полученной при биоразложении хитинсодержащих членистоногих, как описано в заявках Bioderpac. В некоторых вариантах реализации олигомеры хитозана используют в качестве второго компонента микробиологической композиции.
В настоящей заявке термин "глюкозамин" относится к аминомоносахариду. В предпочтительных вариантах реализации указанный моносахарид представляет собой углеводный остаток, который образует каркас биополимеров хитина и хитозана. Глюкозамин присутствует в водной фракции, полученной при биоразложении хитинсодержащих членистоногих, как описано в заявках Bioderpac. Глюкозамин индуцирует в растениях синтез хитиназы в качестве средства защиты от хитинсодержащих вредителей.
HYTb и HYTc
В настоящей заявке термин "HYTb" относится к водной фракции, а "HYTc" относится к твердой фракции, полученной при биоразложении хитинсодержащих членистоногих, например, описанным заявке на патент США №61/289706, поданной 23.12.09 под названием "Биодеградация побочных продуктов ракообразных", заявке на патент США №61/299869, поданной 20.01.10 под названием "Способ биоразложения и микробиологическая композиция", заявке на патент США №61/355365, поданной 16.06.2010 под названием "Способ и композиция для биоразложения", и заявке PCT/EP 2010/070285, поданной 20.12.2010 под названием «Способ и композиция для биоразложения», каждая из которых полностью включена в настоящий документ посредством ссылки.
Вкратце, в способе биоразложения членистоногих для разложения членистоногих или отходов членистоногих применяют микробиологическую композицию. Указанный способ представляет собой молочнокислое брожение. Микробиологическая композиция содержит микроорганизмы, которые продуцируют ферменты, которые могут разлагать хитинсодержащие компоненты членистоногих на хитин, хитозан, N-ацетилглюкозамин и глюкозамин. Она также содержит микроорганизмы, которые продуцируют ферменты, которые могут разлагать белки и жиры с получением аминокислот и липидов.
Предпочтительную микробиологическую композицию для разложения членистоногих называют HQE. HQE депонирована в Американской коллекции типовых культур (ATCC), Манассас, штат Виргиния, США, 27 апреля 2010 г. с присвоенным патентным обозначением депозита PTA-10861.
В предпочтительном варианте реализации морское членистоногое является ракообразным, а предпочтительное ракообразное является креветкой. Побочный продукт переработки креветок включает головогрудь и/или экзоскелет креветок.
В процессе биоразложения предпочтительно, чтобы ферментация являлась факультативной аэробной ферментацией. Кроме того, предпочтительно, чтобы ферментацию осуществляли при температуре приблизительно 30-40°C. pH предпочтительно составляет менее приблизительно 6, более предпочтительно - менее приблизительно 5,5. В то же время pH следует поддерживать выше приблизительно 4,3. Ферментацию проводят в течение приблизительно 24-96 часов. В некоторых вариантах реализации ферментацию проводят в течение приблизительно 24-48 часов, а более предпочтительно - 24-36 часов. Указанное время брожения значительно короче, чем типичное время брожения, описанное ранее и составлявшее от 10 до 15 дней для достижения практически аналогичного гидролиза, хотя и без обнаруживаемого формирования хитозана и глюкозамина.
Разделение смеси предпочтительно осуществляют центрифугированием (например, приблизительно 920 g). Кроме того, можно использовать гравитационное разделение, однако оно не является предпочтительным из-за времени, необходимого для разделения.
Смесь разделяют на три фракции: твердую, водную и липидную. Твердая фракция содержит хитин и называется HYTc. Водная фракция содержит гидролизат белка, аминокислоты, хитозан и глюкозамин и называется HYTb. Липидная фракция содержит стерины, витамин A и E и каротиноидные пигменты, например, астаксантин.
Применение HQE в способе биодеградации является предпочтительным. В других вариантах реализации предпочтительным является добавление предварительно полученного HYTb к HQE или ферментационной среде. Как описано выше, HYTb содержит аминокислоты, хитозан, глюкозамин и микроэлементы, в том числе кальций, магний, цинк, медь, железо и марганец. HYTb также содержит ферменты, например, молочнокислые ферменты, протеазы, липазы, хитиназы, молочную кислоту, полипептиды и другие углеводы. HYTb может также содержать неактивные микроорганизмы от предыдущего процесса биоразложения. Такие микроорганизмы могут реактивироваться и, в комбинации с HQE, способствовать более надежному биоразложению по сравнению с применением HQE отдельно, как описано в другом варианте реализации в настоящей заявке.
Более подробно, указанный способ включает следующие этапы:
a. Активацию микробных клеток в углеводном основном растворе для стимуляции их роста и образования биомассы.
b. Перемалывание побочных продуктов креветок (головогруди и экзоскелета) с получением однородной пасты.
c. Однородное смешивание пасты побочного продукта креветок с, по меньшей мере, 10% активного инокулята.
d. Регулировка pH до значений менее 6,0 в смеси с использованием раствора лимонной кислоты для ингибирования роста микроорганизмов и стимуляции развитию микробных клеток, входящих в состав инокулята.
e. Ферментация смеси в периодической перемешиваемой системе при температурах в диапазоне от 30 до 40°C, в течение, по меньшей мере, 96 часов при pH, поддерживаемом на уровне менее 5,0. Периодически выполняют мониторинг pH. Если pH превышает 5,0, добавляют цитратный буфер в таком количестве, чтобы поддерживать pH ниже 5,0.
f. Центрифугирование продукта брожения для разделения трех основных фракций: хитина, жидкого гидролизата и пигментированной пасты.
g. Промывка неочищенного хитина и повторный сбор промывных вод для восстановления мелких твердых частиц или минеральных компонентов.
h. Высушивание хитина и его хранение.
i. Высушивание и хранение жидкого гидролизата.
j. Пигментированную пасту (липидную фракцию) хранят в закрытом резервуаре для сохранения.
Для лучшего понимания указанного способа и основ его эксплуатации приведена ссылка на следующее подробное описание.
Активация микробных клеток
Микробную композицию, описанную в настоящей заявке, используют в качестве инокулята. Инокулят HQE содержит от приблизительно 2,5 до 3,0% (масс/об) микроорганизмов. HQE активируют разбавлением до 5% в растворе тростникового сахара (конечная концентрация тростникового сахара 3,75%) и инкубируют при 37°C в течение 5 дней. Предпочтительно добавляют HYTb (10 мл на литр культуры) для обеспечения источника минералов и естественных аминокислот. Рост микроорганизмов оценивали по оптической плотности, измеренной при 540 нм. Активация завершалась при оптической плотности приблизительно 1,7. Концентрация микроорганизмов после активации составляла приблизительно 1,9-3,0% (масс/об).
Подготовка образцов
Образцы побочного продукта переработки креветок получали на предприятиях по переработке креветок. Слегка размороженный и измельченный остаток (1500 г на партию) смешивают с 99 граммами тростникового сахара (конечная концентрация 6,6% масс.%) и 85,5 мл активированной HQE 5% (об/масс) (оптическая плотность клеток = 1,7). Затем корректируют pH до величины 5,5 с помощью 2 М лимонной кислоты.
Контроль ферментации
Смесь инкубируют при 36°C и периодическом перемешивании в течение 96 часов. В процессе ферментации pH контролируют с помощью потенциометра, а общую титруемую кислотность (TTA, %) определяют титрованием 0,1 н. NaOH до получения pH 8,5. TTA выражали в процентах молочной кислоты.
Условия разделения
Продукт ферментации представляет собой вязкий силос интенсивного оранжевого цвета из-за наличия астаксантина. Указанный силос центрифугируют (5°C) при 1250 об/мин (930 g) в течение 15 мин с получением хитина, жидкого гидролизата и пигментной пасты. Верхнюю фазу (пигментную пасту) отделяют вручную. Жидкие гидролизаты отделяют декантацией, а осадок, который представляет собой неочищенный хитин, промывают дистиллированной водой для отделения мелких твердых частиц. Полученную жидкость собирают и высушивают. Неочищенный хитин, жидкие гидролизаты и мелкие твердые частицы высушивают при 60°C. Все фракции хранят без доступа света.
Другие микробиологические композиции для получения HYTb и HYTc представлены в следующей таблице 2.
Указанные микроорганизмы предпочтительно получены из HQE и относятся к Bacillus subtilis ((SILoSil BS), Bacillus cereus (Bioderpac, 2008), Bacillus megaterium (Bioderpac, 2008), Azotobacter vinelandii (Bioderpac, 2008), Lactobacillus acidophilus (Bioderpac, 2008), Lactobacillus casei (Bioderpac, 2008), Trichoderma harzianum (TRICHOSIL), Rhizobium japonicum (Bioderpac, 2008), Clostridium pasteurianum (Bioderpac, 2008), Bacillus licheniformis (Bioderpac, 2008), Pseudomonas fluorescens (Bioderpac, 2008), Bacillus thuringiensis strains HD-1 and HD-73 (SILoSil ВТ), Streptomyces (Bioderpac, 2008), Micrococcus (Bioderpac, 2008), Nitrobacter (Bioderpac, 2008) и Proteus (Bioderpac, 2008). Каждый из этих организмов легко выделить из HQE и рекомбинировать с образованием описанной микробиологической композиции для разложения членистоногих с получением HYTb и HYTc.
HYTb
HYTb содержит аминокислоты (приблизительно 12 масс.%), хитозан (приблизительно 1,2 масс.%), глюкозамин (приблизительно 1 масс.%) и микроэлементы (приблизительно 6 масс.%), в том числе кальций, магний, цинк, медь, железо и марганец. Он также содержит ферменты, например, в числе прочего, молочнокислые ферменты, протеазы, липазы, хитиназы, молочную кислоту, полипептиды и другие углеводы. Удельный вес HYTb обычно составляет приблизительно 1,050-1,054. Среднее содержание некоторых аминокислот в HYTb представлено в таблице 2.
В некоторых вариантах реализации HYTb может представлять собой второй компонент, который объединяют с HYTa или применяют отдельно в качестве удобрения для почвы и/или при опрыскивании листвы.
HYTc
3
Основным компонентом HYTc является хитин. Его средняя молекулярная масса равна приблизительно 2300 дальтон, и он составляет приблизительно 64 масс.% композиции. Приблизительно 6% HYTc содержит минералы, включая кальций, магний, цинк, медь, железо и марганец, около 24 масс.% белка и 6% воды. Его удельный вес равен приблизительно 272 кг/м. В некоторых вариантах реализации HYTc может представлять собой второй компонент, который объединяют с HYTa или применяют отдельно в качестве удобрения для почвы и/или при опрыскивании листвы.
HYTa предпочтительно применяют с HYTb и HYTc в комбинации или отдельно в качестве удобрения для почвы или при опрыскивании листвы.
Микроорганизмам в составе HYTa необходимы микроэлементы кальций, магний, сера, бор, марганец, цинк, молибден, железо, медь, натрий и кремний. Эти важные микроэлементы часто можно получить за счет токсичных химических реакций, которые не подходят для органической сертифицированной продукции. Соответственно, предпочтительным является получение указанных микроэлементов из органических источников, например, HYTb и/или HYTc.
HYTd
HYTd получают путем ферментации хитина с микробиологической композицией, например, HQE, суспендированной в HYTb. Указанный способ аналогичен способу, описанному выше для получения HYTb и HYTc, за исключением того, что субстратом является хитин, например, HYTc, а не хитинсодержащие членистоногие.
Фиг.12 представляет собой блок-схему, иллюстрирующую разложение ракообразных для образования HYTb и HYTc. Затем HYTc и HYTb обрабатывают HQE с образованием HYTd, раствора с относительно высоким количеством хитозана и глюкозамина по сравнению с HYTb.
Фиг.13 представляет собой блок-схему, иллюстрирующую разложение грибов, в том числе мицелиальных грибов, дрожжей и/или насекомых для образования HYTb и HYTc. Затем HYTc и HYTb перерабатываются HQE с образованием HYTd.
HYTb уже содержит хитозан (приблизительно 0,5-1,5 масс.%) и глюкозамин (приблизительно 0,5-1,5 масс.%). Количество хитозана и глюкозамина в HYTd составляет приблизительно 2-2,5 масс.% хитозана и приблизительно 2-5 масс.% глюкозамина. Это является увеличением количества хитозана и глюкозамина по сравнению с HYTb, где содержится приблизительно 0,5-2,5 масс.% хитозана и приблизительно 0,5-5 масс.% глюкозамина.
HYTd в неразбавленном состоянии аналогичен HYTb, но содержит большее количество хитозана и глюкозамина. HYTd содержит аминокислоты (приблизительно 5-12 масс.%) и микроэлементы (приблизительно 6 масс.%), в том числе кальций, магний, цинк, медь, железо и марганец. Он также содержит ферменты, например, в числе прочего, молочнокислые ферменты, протеазы, липазы, хитиназы, молочную кислоту, полипептиды и другие углеводы. В некоторых вариантах реализации степень ацетилирования получаемого хитозана составляет 20% или менее, предпочтительно 15% или менее, более предпочтительно 10% или менее, еще более предпочтительно 8% или менее и наиболее предпочтительно 5% или менее. Предпочтительное содержание некоторых аминокислот в HYTd аналогично HYTb. См. таблицу 3.
HYTd предпочтительно содержит 12 масс.% L-аминокислот (аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, серина, гистидина, глицина, треонина, аланина, пролина, аргинина, валина, метионина, изолейцина, триптофана, фенилаланина, лизина и треонина) и 5 масс.% глюкозамина и хитозана. HYTd также предпочтительно содержит один или более или все из растворимых минералов (P, Ca, Mg, Zn, Fe и Cu), ферментов и молочной кислоты, содержащихся в продукте гидролиза хитина, а также другие полисахариды.
В настоящей заявке термин "глюкозамин" включает глюкозамин или смесь глюкозамина и N-ацетилглюкозамина. В большинстве вариантов реализации HYTd содержит глюкозамин и N-ацетилглюкозамин.
HYTd может также содержать не полностью гидролизованные частицы хитина. В общем случае ферментационную смесь фильтруют для удаления крупных частиц хитина. Фильтрат содержит, как правило, не более 2 масс.% хитина.
Активация HYTa
Вышеуказанную микробиологическую композицию можно применять для обработки почвы, семян, саженцев и/или листвы растений. Вместе с тем, HYTa вначале активируют перед применением.
В предпочтительных вариантах реализации HYTa активируют путем инкубирования инокулята HYTa в водном растворе в течение 24-168 часов, позволяя микроорганизмам вырасти и размножиться перед применением в способе обработки почвы, семян, саженцев и/или листвы растений. Условия инкубирования влияют на общие исходные свойства HYTa.
В одном варианте реализации инокулят HYTa разбавляют водой в соотношении 1/100 и инкубируют при температуре приблизительно 36°C при pH 6,8-7,1 в течение от приблизительно 24 до приблизительно 168 часов (7 дней). Во время указанной активации необязательно можно использовать HYTb. Микроорганизмы-азотфиксаторы Azotobacter vinelandii и Clostridium pasteurianum размножаются в ростовых условиях при пониженной концентрации азота. Кроме того, при снижении концентрации кислорода размножаются Lactobacilli, в том числе Lactobacillus acidophilus and Lactobacillus casei. Количество колониеобразующих единиц (КОЕ) некоторых бактерий в активированной HYTa представлены в таблице 3:
HYTa, полученная после этого инкубирования, сохраняет полезные свойства HYTa, но особенно подходит в качестве почвоулучшителя для обработки почв, обедненных азотом, с учетом способности Azotobacter vinelandii and Clostridium pasteurianum к азотфиксации.
Если присутствуют или предположительно присутствуют почвенные патогены, например, мицелиальные грибы из рода Fusarium или нематоды, HYTa можно активировать практически в тех же условиях, но в присутствии хитина. Хитин стимулирует размножение хитин-чувствительных микроорганизмов, например, Pseudomonas fluorescens, Trichoderma harzianum, Bacillus thuringiensis, Streptomyces sp., Nitrobacter sp., Micrococcus sp. и Bacillus subtilis. HYTa, полученная в этих условиях, обладает противогрибковым, фунгицидным, противонемотидным, нематоцидным и инсектицидным свойствами в той мере, в какой такие патогены содержат хитин. Такие микробиологические композиции можно применять для обработки почвы, семян, саженцев и/или листвы растений. Такие микробиологические композиции также обладают способностью фиксировать азот, как и при вышеуказанном инкубировании в отсутствие хитина.
В дополнение к инкубированию с хитином, HYTa можно активировать с хитином и аминокислотами. Предпочтительным источником хитина является HYTc. При использовании HYTc белок и минералы в составе HYTc также присутствуют во время активации.
Кроме того, HYTa можно активировать в присутствии аминокислот и хитозана. Предпочтительным источником аминокислот и хитозана является HYTb и/или HYTd. При использовании HYTb и/или HYTd глюкозамин и другие компоненты в составе HYTb и/или HYTd также присутствуют во время активации.
Необязательно HYTa можно инкубировать с хитином, аминокислотами и хитозаном. Предпочтительным источником хитина является HYTc. Предпочтительным источником аминокислот и хитозана является HYTb и/или HYTd. При использовании HYTb, HYTd и HYTc другие компоненты указанных составов также присутствуют во время активации.
Применение активированной HYTa
Активированную HYTa можно применять отдельно или в комбинации с другими компонентами, например, хитином (например, HYTc), хитозаном, глюкозамином и аминокислотами (например, HYTb и/или HYTd) для обработки почвы, семян, саженцев или листвы. В некоторых вариантах реализации комбинации указанных компонентов можно применять в виде смеси. В других вариантах реализации их можно применять по отдельности. В других вариантах реализации указанные компоненты можно применять в разное время.
В одном варианте реализации активированный HYTa можно вносить в почву, на семена или саженцы, или использовать для внекорневого внесения путем непосредственного нанесения на листву. В то же время, если присутствуют растительные патогены, то предпочтительно, чтобы микробиологическая композиция содержала активированный HYTa, хитин и/или хитозан. В качестве альтернативы, HYTa можно активировать в присутствии хитина. Хитозан, как известно, оказывают бактерицидное, фунгицидное и противовирусное действие, а также способен стимулировать рост растений и индуцировать устойчивость растений к патогенам. В других вариантах реализации частью микробиологической композиции является глюкозамин.
В предпочтительном варианте реализации активированную HYTa наносят на почву, семена, саженцы и/или листву отдельно или в комбинации с хитином (предпочтительно, HYTc) и/или хитином, хитозаном и аминокислотами (например, HYTb, HYTd и/или HYTc). Предпочтительным является применение HYTa в комбинации с хитином, хитозаном, глюкозамином и аминокислотами. HYTc является предпочтительным источником хитина, в то время как HYTb и/или HYTd являются предпочтительным источником хитозана, глюкозамина и аминокислот. Тем не менее, компоненты микробиологической композиции, а именно HYTa, хитин, хитозан, глюкозамин и аминокислоты можно применять по отдельности или в любой комбинации или субкомбинации. Их можно применять одновременно или последовательно, в любом заданном порядке. Однако предпочтительный способ применения состоит в их первоначальном одновременном применении. Применение вышеуказанных компонентов предусматривает непосредственную обработку патогенов растений, индукцию путей устойчивости к патогенам у растений и подкормку микроорганизмов HYTa, природной непатогенной почвенной флоры и растения.
Если почву изначально обрабатывают микробиологической композицией, включающей только активированную HYTa, существует возможность заселения почвы микроорганизмами, присутствующими в композиции, и изменения ее таксономического состава. В некоторых ситуациях начальная колонизация HYTa обеспечивает малое количество питательных веществ или вообще не обеспечивает растение питательными веществами. В таких случаях важно поддерживать запас питательных веществ в почве для поддержания как роста микробов при колонизации ризосферы, так и роста растений. Возможно, необходимо повторить применение HYTa, в зависимости от цикла роста растения и режима питания. В других случаях может быть достаточно обеспечить дополнительное внесение аминокислот, хитина и/или хитозана, например. HYTb и HYTc, в предварительно обработанную почву.
Если HYTa используют в комбинации с, например, HYTb, HYTd и/или HYTc, для микроорганизмов HYTa и растений, присутствующих в обработанной почве, доступны дополнительные питательные вещества.
В таблице 5 приведена типичная четырнадцатинедельная программа применения HYTa, HYTb и HYTc при капельном поливе растений, возделываемых в почве. Приведены значения на гектар. Для HYTa и HYTb значения выражены в литрах в неделю. Для HYTc значения выражены в килограммах в неделю.
Периодичность введения микробиологической композиции в систему орошения должна быть такой, при которой микробиологическая композиция способна достичь корневой системы и оставаться там в течение ночи, во время отдыха корневой системы. Для максимальной производительности HYTc его следует наносить в то же время в смеси с HYTa. Указанную процедуру следует продолжать, пока растение продолжает плодоносить. Указанный протокол охватывает все этапы развития растения, включая прорастание, корнеобразование, рост растения, цветение, завязывание плодов, сбор и повторный сбор урожая. Указанный протокол предназначен для возможности получения максимального урожая и предусматривает аспекты питания, биостимуляции и защиту от заболеваний, например, нематод и грибов.
Указанный способ можно осуществить путем обработки почвы с получением обработанной почвы. В некоторых случаях указанный способ применяют повторно. В некоторых случаях растения, саженцы или семена уже присутствуют в почве до обработки микробиологической композицией. В других случаях растения, саженцы или семена пересаживают в почву после обработки микробиологической композицией.
В общем случае перед применением определяют число гектаров или акров, подлежащих обработке. Затем рекомендуемое количество активированной HYTa на гектар или акр умножают на обрабатываемую площадь и разводят в достаточном количестве воды для орошения или опрыскивания почвы или растений на площади, подлежащей обработке. Аналогичную процедуру можно осуществлять для жидкой HYTb и/или HYTd. HYTc, поскольку он является твердым веществом, можно вносить непосредственно в виде твердого вещества или в виде суспензии в воде. HYTc предпочтительно измельчают до частиц микронного размера перед применением.
Указанный способ подходит для неплодородной почвой. Такие почвы, как правило, обладают, по меньшей мере одной из следующих характеристик: низкой катионообменной емкостью, низкой водоудерживающей способностью, низким содержанием органических веществ и низким уровнем доступных питательных веществ. В общем случае неплодородные почвы не поддерживают интенсивного роста растений и/или дают низкие урожаи.
Для систем без почвы, например, гидропонных, применяют аналогичный протокол, но с ежедневным распределением согласно программе подкормки и орошения.
Микробиологические композиции можно применять для любого растения, включая люцерну, банан, ячмень, брокколи, морковь, кукурузу, огурец, чеснок, виноград, лук-порей, дыню, лук, картофель, малину, рис, сою, кабачки, клубнику, сахарный тростник, помидор и арбуз, но не ограничиваясь ими.
При нанесении в качестве почвоулучшителя микробная композиция, содержащая HYTa, хитин, аминокислоты и хитозан, улучшает урожайность сельскохозяйственных культур в среднем приблизительно на 25%-55% по сравнению с 15-25% ростом урожайности культур, наблюдаемым для E2001. От Karl Co. SA de CV, Навохоа, штат Сонора, Мексика.
Микробиологические композиции также могут приводить к снижению количества используемого хитина. Например, известно применение хитина в качестве почвоулучшителя. Как правило, используют приблизительно 600 кг хитина на гектар. Однако положительный эффект от такого применения не наблюдался в течение шести месяцев. При активации HYTa в присутствии хитина, а затем объединении с хитином и применении в качестве почвоулучшителя благоприятные эффекты наблюдались через семь дней при использованием лишь 4-6 кг хитина на гектар.
Хотя настоящее описание направлено в первую очередь на применение описанных микробных композиций HYTb, HYTc и/или HYTd в сельском хозяйстве, такие композиции или их компоненты и способы также можно применять в садоводстве для улучшенного образования листвы и цветов и снижения применения традиционных инсектицидов и фунгицидов.
При внесении HYTd и активированной HYTa, HYTb и/или HYTc в почву, семена, саженцы или листву получают обработанную почву, обработанные семена, обработанные саженцы, обработанную листву и обработанные растения. HYTd также является новой композицией. Таким образом, почва, семена, саженцы, листва и растения, обработанные HYTd и HYTa, HYTb и/или HYTc, также являются новыми. Поскольку HYTd, HYTa, HYTb и HYTc, как правило, разбавляют перед применением, почва, семена, саженцы и листва, как правило, содержат компоненты HYTd, HYTa, HYTb и/или HYTc в разбавленном виде.
Почву, обработанную HYTa, определяют как почву, содержащую один или несколько уникальных для HYTa микроорганизмов, диспергированных в обработанной почве. Такие микроорганизмы можно генетически обнаружить в обработанной почве с помощью биочипа, обнаруживающего популяции микроорганизмов на основе ДНК. См., например, публикацию США 2007/0015175, включенную в настоящий документ посредством ссылки. Кроме того, можно применять другие методы, известные специалистам в данной области техники, например, ПЦР. Особенно предпочтительными микроорганизмами в составе HYTa являются Bacillus subtilis (SILoSil BS), Bacillus thuringiensis штамм HD-1, Bacillus thuringiensis штамм HD-73 (SILoSil ВТ) и Trichoderma harzianum (TRICHOSIL), каждый из которых можно выделить из депозита HYTa или получить из Biotecnologia Agroindustrial S.A. DE C.V., Морелия, Мичоакан, Мексика. Trichoderma harzianum (TRICHOSIL) является наиболее предпочтительным микроорганизмом, поскольку она играет важную роль при активации HYTa, вызывая межкомпонентный синергизм с другими микроорганизмами в составе HYTa. В дальнейшем идентификацию одного или более из этих микроорганизмов можно при необходимости объединить с идентификацией других микроорганизмов в составе HYTa для подтверждения наличия HYTa или следов наличия HYTa. Trichoderma harzianum (TRICHOSIL) депонирована в ATCC 6 октября 2011 года с присвоенным патентным обозначением депонирования PTA-12152. Bacillus subtilis (SILoSil BS) депонирована в ATCC 7 октября 2011 года с присвоенным патентным обозначением депонирования PTA-12153. Штаммы Bacillus thuringiensis HD-1 и HD-73 (SILoSil BS) депонированы в ATCC 31 мая 2012 года с присвоенным патентным обозначением депонирования PTA-12967.
Аналогичным образом определяют обработанные семена, саженцы, листву и растения. В указанных случаях микроорганизмы HYTa находятся на поверхности обработанных семян, саженцев, листвы и растений.
В настоящем документе термин "состоящий практически из" в связи с HYTa, HYTb и HYTc означает любую из HYTa, HYTb и/или HYTc по отдельности или в комбинации без дополнительных микроорганизмов.
Способ получения HYTd
Способ получения HYTd описан в заявке на патент США №61/500527, поданной 23 июня 2011 г. под названием «Процесс получения хитина и производных хитина», прямо включенной в настоящую заявку посредством ссылки.
Вкратце, HQE или родственную хитин-разрушающую микробиологическую композицию активируют и добавляют к HYTb. Добавляют твердый хитин и сбраживают смесь в течение 3-7 дней. Указанный хитин можно получить из HYTc или других источников, например, путем химической обработки или биоразложения хитинсодержащих грибов, мицелиальных грибов, дрожжей и/или насекомых. HYTc является предпочтительным источником хитина. В предпочтительном случае хитин является микронизированным. Можно использовать микронизированный хитин или остаточный хитин.
Применение HYTd
HYTd можно применять в качестве биостимулятора роста корней и листвы и в качестве фунгицида.
Если HYTd используют отдельно в качестве фунгицида, предпочтительно применять HYTd в количестве 20 литров на гектар.
Если HYTd используют для обработки растений в состоянии стресса, предпочтительно применять HYTd в количестве 3-10 литров на гектар.
HYTd также можно применять в количестве 3-5 литров на гектар.
HYTd можно вносить непосредственно в почву и/или на листву.
HYTd можно применять в сочетании с другими компонентами, например, HYTb, HYTc и/или HYTa. При применении с другими компонентами HYTd можно объединять с компонентом с образованием новых композиций. Такие композиции можно вносить непосредственно в почву и/или на листву. В качестве альтернативы, HYTd и один или более из HYTa, HYTb и/или HYTc можно применять по отдельности или в разное время.
Пример 1
Следующий протокол использовали для обработки почвы с растениями спаржи.
Результаты показаны на фиг.1 и 2. Как видно, при отсутствии применения любого продукта HYT получено сравнительно небольшое растение с плохим развитием корней. По мере прохождения исследований 2, 3 и 4 видно, что каждая обработка приводила к улучшенному развитию листвы и корней.
Пример 2
В данном примере продемонстрировано благоприятное действие обработки картофеля HYTa по сравнению с контролем.
Почва содержала 1% органического вещества или менее и имела pH 7,3-7,5. В течение теста на гектар вносили:
- 400-600 кг сульфата аммония.
- 250-400 кг 11-52-0, фосфора.
- 300 кг сульфата калия.
- 150-200 кг нитрата калия.
- 50-100 кг сульфата магния.
- 25-50 кг сульфата цинка.
- HYTa - 10 л
Два литра HYTa на гектар почвы вносили при первом внесении воды. При посадке в почву вносили 4 литра HYTa на гектар. После развития столонов в почву вносили 2 литра HYTa на гектар. После достижения клубнями размера 4 см в почву вносили 2 литра HYTa на гектар.
Результаты представлены в таблице 7.
Наиболее ценной популяцией картофеля является гигантский картофель, затем картофель 1-го, 2-го и 3-го размера. Следующие два размера можно применять для переработки картофеля или семенного материала. На фиг.3 и 4 графически представлены результаты из таблицы 7. Как можно видеть, существует значительное увеличение количества клубней и массы картофеля первого и второго размеров. Фиг.5 содержит фотографии, сравнивающие полученный картофель.
Пример 3
В данном примере продемонстрировано благоприятное действие обработки картофеля HYTa, HYTb, HYTc и HYTd по сравнению с обработкой картофеля HYTa.
Почва содержала 1% органического вещества или менее и имела pH 7,3-7,5. В течение исследования на гектар вносили:
- 400-600 кг сульфата аммония.
- 250-400 кг 11-52-0, фосфора.
- 300 кг сульфата калия.
- 150-200 кг нитрата калия.
- 50-100 кг сульфата магния.
- 25-50 кг сульфата цинка.
- HYTa - 10 л
- HYTb - 8 л
- HYTc - 4 кг
- HYTd - 5 л
Два литра HYTa на гектар почвы вносили при первом внесении воды. При посадке в почву вносили 4 литра HYTa, 3 килограмма HYTc и 5 литров HYTd на гектар. После развития столонов в почву вносили 2 литра HYTa на гектар. После достижения клубнями размера 4 см в почву вносили 2 литра HYTa на гектар.
После начала формирования клубней на листья растений каждые 6-10 дней наносили 1 литр HYTb. Эту процедуру повторяли восемь раз.
Результаты представлены в таблице 8.
На фиг.6 и 7 графически представлены результаты из таблицы 8. Как можно видеть, существует значительное увеличение количества и массы картофеля с гигантского по третий размер по сравнению с обработкой картофеля только HYTa. Фиг.8 содержит фотографии, сравнивающие полученный картофель.
Пример 4
В данном примере продемонстрировано благоприятное действие обработки картофеля HYTa, HYTb, HYTc и HYTd по сравнению с обработкой картофеля метамнатрием в почве, зараженной грибами. Результаты представлены в таблице 9.
Почву обрабатывали согласно описанию в примере 3. HYTa, HYTc и HYTd вносили, как описано в примере 2, Вносили триста литров метамнатрия на гектар.
На фиг.9 и 10 графически представлены результаты из таблицы 9. Как можно видеть, существует значительное увеличение количества клубней и массы картофеля с гигантского, первого и третьего размера по сравнению с обработкой картофеля метамнатрием. Фиг.11 содержит фотографии, сравнивающие полученный картофель.
Метамнатрий - препарат для окуривания почвы, применяемый в качестве пестицида, гербицида и фунгицида. Его применение запрещено в некоторых странах в связи с природоохранными соображениями. Обработка HYTa, HYTb, HYTc и HYTd помогает избежать применения метамнатрия в определенных областях, тем самым снижая воздействие на окружающую среду и затраты на применение этого препарата для окуривания почвы.
Пример 5
В данном примере продемонстрировано действие обработки HYTa и HYTc огурца, зараженного нематодой Rhabditis и грибком Fusarium oxisporum.
В почву вносили десять литров HYTa и 3 килограмма HYTc на гектар. Указанную процедуру повторяли через 8 дней.
Результаты показаны в таблице 10.
Как можно видеть, популяция указанных организмов существенно снижалась через 18 дней после обработки.
Пример 6
В данном примере продемонстрировано действие обработки HYTa, HYTc и HYTd помидора, зараженного грибком Fusarium oxisporum.
В почву вносили пять литров HYTa, 1 килограмм HYTc и 5 литров HYTd на гектар. Указанную обработку повторяли каждые 15 дней.
Результаты показаны в таблице 11.
Как видно, обработка HYTa, HYTc и HYTd значительно снижала количество колониеобразующих единиц гриба.
Пример 6а
Листву растений помидора, зараженных гнилью (грибком Phytophthora infestans), обрабатывали HYTd. Два, 4, 6 и 8 литров HYTd разбавляли 100 л воды на гектар. Контролем являлись необработанные помидоры. Через неделю заражение прекратили. Грибок на контрольной культуре к тому времени развился до ватоподобной плесени, что привело к повреждению растений и развитию некроза (результаты не показаны). Оптимальное количество HYTd для обработки Phytophthora infestans составило 6 литров на гектар.