Разработка нового моноклонального антитела к хитиназоподобному белку ykl-39 для иммуногистохимии

разработка нового моноклонального антитела

к хитиназоподобному белку YKL-39 для иммуногистохимии

А.н. Грачев1, д.В. Самойлова1, С.н. Курочкин2, О.В. Ковалева1

1ФГБУ«Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России;

Россия, 115478 Москва, Каширское ш., 24; 2ООО «ПраймБиоМед»; Россия, 117246 Москва, Научный пр-д, 20, стр. 3

Контакты: Алексей Николаевич Грачев alexei.gratchev@gmail.com

Введение. Хитиназоподобные белки у млекопитающих образуются в зоне воспаления и опухолевого роста. Отдельные представители семейства хитиназоподобных белков изучаются как потенциальные биомаркеры опухолей (глиомы, рака предстательной железы и яичников). Одним из охарактеризованных белков данного класса является YKL-39. Известный также как хитиназа-3-подобный белок 2, YKL-39представляет собой секреторный белок хондроцитов, принадлежащий к семейству гликозил-гидролазы 18. Его самая высокая экспрессия наблюдается в хондроцитах, синовиоцитах, легких и сердце, а также в макрофагах.

Цель исследования — получение антител к человеческому YKL-39, применимых в широком спектре методов. Материалы и методы. Используя рекомбинантный полноразмерный человеческий YKL-39 в качестве антигена, методом гибридомной технологии мы получили мышиные моноклональные антитела 1B2G4, которые специфически связываются с YKL-39 в иммуноферментном анализе.

Результаты и заключение. Полученные антитела были успешно протестированы с использованием методов иммуноблот-тинга, иммуноцитохимии, иммунофлуоресценции и иммуногистохимии с использованием парафиновых срезов. Установлено, что антитела связываются с полноразмерным белком YKL-39 и не взаимодействуют с другими хитиназоподобными белками.

Ключевые слова: моноклональные антитела, хитиназоподобные белки, иммуногистохимический метод

DOI: 10.17650/1726-9784-2019-18-2-27-31

DEVELOPMENT OF A NOVEL MONOCLONAL ANTIBODY AGAINST CHITINASE-LIKE PROTEIN YKL-39

APPLICABLE FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY

A. N. Gratchev1, D . V Samoilova1, S. N. Kurochkin2, O. V Kovaleva1

1N.N.. Blokhin National Medical Research Center of Oncology Ministry of Health of Russia; 24 Kashirskoe Sh., Moscow 115478, Russia;

2PrimeBioMed; Build. 20, 3 Nauchnij Proezd, Moscow 117246, Russia

Introduction. Mammalian chitinase-like proteins are produced in the areas of inflammation and in tumors. Some members of chiti-nase-like proteins family are studied as potential biomarkers of tumors (glioma, prostate and ovary). YKL-39 also known as chiti-nase-3-like 2 (CHI3L2) is a secreted protein produced by chondrocytes. Its high expression is also found in synoviocytes, lung heart and macrophages.

The aim of this study was the development of highly specific monoclonal antibodies against human YKL-39.

Materials and methods. Using recombinant full-length human YKL-39 as immunogen using hybridoma technology we have generated monoclonal antibody 1B2G4, that specifically binds YKL-39 in ELISA.

Results and conclusion. Obtained antibody was successfully tested in Western blot, immunocytochemistry, immunofluorescence and immunohistochemistry on FFPE sections. It was shown that the antibody binds the full-length YKL-39 protein and does not interact with other chitinase-like proteins.

Key words: monoclonal antibody, chitinase-like protein, immunohistochemistry

Введение

Проблема точной диагностики онкологических заболеваний сохраняет актуальность на протяжении нескольких десятилетий. В качестве маркеров для

диагностики используются белки, нуклеиновые кислоты, везикулы, секретируемые опухолевыми клетками, а также сами опухолевые клетки. Стандартные иммуноцитохимические и иммуногистохимические

28 Оригинальные статьи

методы анализа с использованием антител к извест- ния применяли DMEM c добавлением 0,294 мг/мл ным белкам-маркерам опухоли позволяют класси- L-глутамина и 10 % фетальной бычьей сыворотки фицировать тип новообразований, оценить степень (PAA Laboratories, Австрия), 0,1 мг/мл стрептомици-их злокачественности и определить стратегию тера- на, 100 ЕД/мл пенициллина. пии. Хитиназоподобные белки (ХПБ) у млекопитаю- Получение экспрессирующих векторов щих часто образуются в зоне воспаления и опухо- Для получения бактериального штамма, экспрес-левого роста. В последнее время отдельные пред- сирующего рекомбинантный белок YKL-39, его ко-ставители семейства изучаются как потенциальные дирующая последовательность была заклонирована биомаркеры различных заболеваний человека, в том в вектор pET45b (+). Кодирующая последователь-числе солидных опухолей (глиомы, рака предстатель- ность YKL-39 человека была амплифицирована ной железы и яичников). Одним из охарактеризован- на матрице комплементарной ДНК, полученной из ных белков данного класса является YKL-39. Известный матричной РНК клеток линии глиобластомы LN229 также как хитиназа-3-подобный белок 2 (CHI3L2), с использованием ген-специфических праймеров YKL-39 представляет собой секреторный белок хон- YKL-39 F3006 XhoI 5'-ACT TCT CGA GAC CAT GGG дроцитов, принадлежащий к семейству гликозил-ги- AGC AAC CAC C и YKL-39 R3006 HindIII 5'-TAG дролазы 18. Его самая высокая экспрессия наблюда- AAA GCT TCA AGG AGC CAA GGC TTC, со встро-ется в хондроцитах, синовиоцитах, в легких и сердце, енными сайтами эндонуклеаз рестрикции XhoI и HindIII а также в макрофагах. В последних экспрессия YKL-39 соответственно. Амплифицированные фрагменты ДНК стимулируется трансформирующим фактором роста очищали и клонировали в вектор pET45b (+) между бета [1]. На сегодняшний день YKL-39 может счи- сайтами XhoI и HindIII. В результате была получена таться маркером остеоартрита и обнаруживается плазмида pET45b-YKL39, несущая кодирующую в синовиальной жидкости и сыворотке крови паци- последовательность гена YKL-39 человека. Отсут-ентов [2—4]. Повышенный уровень экспрессии гена ствие мутаций в полученной последовательности YKL-39 выявлен у пациентов с болезнью Альцгейме- проверяли при помощи секвенирования. ра и в глиобластомах [5]. Какую функцию выполняет данный белок в глиобластомах на данный момент, Экспрессия и очистка рекомбинантного белка неизвестно, однако предполагают, что он может от- Для экспрессии рекомбинантного белка YKL-39 вечать за пролиферативную способность клеток и ре- использовали бактерии E. coli штамма BL21DE3. моделирование внеклеточного матрикса [6]. Также Бактерии, трансформированные плазмидой pET45b-показано, что YKL-39 является проангиогенным фак- YKL-39, стимулировали IPTG в конечной концент-тором и хемоаттрактантом для моноцитов, способ- рации 1 мМ в течение 3 ч при 37 °C. Полученные ствующим метастазированию. У пациентов с раком бактерии лизировали с помощью ультразвука, и по-молочной железы повышенный уровень экспрессии лученные лизаты использовали для выделения белка. YKL-39 после неоадъювантной химиотерапии ука- На I стадии полученные тельца включения экс-зывает на высокий риск метастазирования и плохой трагировали 5 М мочевиной в PBST в течение 1 ч при ответ на терапию [7]. За счет того, что данный белок комнатной температуре. На II стадии для лизиса те-секретируем, на него возлагают надежды как на по- лец включения был использован буфер следующего тенциальный маркер, пригодный для ранней диагно- состава: 0,5 М аргинина, 6 М мочевины, 20 мМ Трис, стики. Существуют данные, доказывающие, что вне- рН 10,0, 50 мМ дитиотреитола, 5 мМ этилендиамин-сение ХПБ в панель маркеров различных тестов тетрауксусной кислоты, 10 мМ глицина. Лизис осу-приводит к повышению их чувствительности и спец- ществляли в течение 12 ч при +4 °С. Полученный ифичности. лизат центрифугировали при 10 000 об/мин в течение Цель исследования — разработка нового монокло- 5 мин и температуре +4 °С. Рефолдинг белков про-нального антитела, обладающего специфичностью водили путем перевода гель-фильтрацией на колонке к белку YKL-39 человека, которое может быть ис- «Сефадекс G-25» в буфер следующего состава: 0,5 М пользовано в иммунодиагностике и прогностической NaCL, 4 М мочевины, 0,5 М аргинина, 1 мМ этилен-оценке течения опухолевых заболеваний у человека. диаминтетрауксусной кислоты, 10 мМ цистеамина, 2 мМ имидазола, PBST — до 50 мл с последующей Материалы и методы инкубацией в течение 12—36 ч при +4 °С. Дальней-культивирование клеток шую очистку белков производили металл-хелатной В исследовании была использована клеточная хроматографией (IMAC) на колонке IMAC Sepharose линия глиобластомы человека LN229. Клетки куль- 6 Fast Flow (GE Неа1Шсаге, 17-0921-08). Белок нано-тивировали в CO2-инкубаторе (при 37 °C, в атмосфе- сили на колонку IMAC Sepharose 6 FastFlow, уравно-ре 5 % CO2). В качестве среды для культивирова- вешенную буфером. Колонку промывали ступенчатым

РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ | RUSSiAN JOURNAL OF BiOTHERAPY 2'2019 том 181 vol. 18

градиентом концентрации имидазола. Эффективная элюция белка YKL-39 с минимальными примесями происходит при 75 мМ имидазола. Полученный в результате процедуры очистки белок YKL-39 был использован в качестве антигена для иммунизации мышей.

Получение моноклонального антитела

Первичная иммунизация мышей Balb/c (самок 18 г) проводилась путем введения около 30 мкг антигена (рекомбинантный белок YKL-39) с полным адъюван-том Фрейнда (1 : 1) в лапы и холку. Бустирование антигеном с неполным адъювантом Фрейнда проводили через 2 нед после первичной иммунизации. Гибридизацию (слияние) спленоцитов мышей с клеточной линией Sp 2/0 делали через 3 дня (на 4-й день) после бустирования с помощью PEG 1500. В среду для посадки гибридом (RPMI-1640 с 15 % Fetal CloneI) добавляли нейтрализующие антитела в соответствии с рекомендациями производителя. Полученные ги-бридомы были рассажены на три 96-луночных планшета по 150 мкл суспензии в лунку и оставлены на 1O дней, после чего были протестированы методом иммуноферментного анализа.

иммуноферментный анализ

Рекомбинантный YKL-39 адсорбировали на поверхности лунок 96-луночного планшета в концентрации 5 мкг/мл в течение ночи при +4 °С. Далее лунки промывали 3 раза буфером PBS и блокировали 5 % раствором BSA в PBS в течение 2 ч при 37 °С. Далее планшеты инкубировали с моноклональными антителами. После 3-кратной отмывки раствором PBST проводили инкубацию с пероксидазным конъ-югатом антител против мыши (HRPanti-mouse IgG) в разведении 1 : 10 000 в течение 1 ч при 37 °C. После 3-кратной отмывки раствором PBST в каждую лунку добавляли 100 мкл субстрата тетраметилбензидина и инкубировали до развития окраски в течение 1O мин. Реакцию останавливали добавлением в лунки по 25 мкл 10 % раствора серной кислоты. Измерение оптической плотности проводили при длине волны 450 нм.

иммуноблоттинг

Клеточные лизаты получали из субконфлюент-ного монослоя клеток с использованием буфера RIPA, содержащего смесь ингибиторов протеаз (* 10 protease cocktail inhibitor, Roche, Швейцария). Концентрацию полученных лизатов определяли методом Бредфорда, на гель наносили 50 мкг белка. Белки разделяли в SDS-полиакриламидном геле, после чего перемещали на нитроцеллюлозную мембрану методом мокрого переноса по стандартному протоколу (прибор Mini Trans-Blot, Bio-Rad Laboratories Inc., США). Мембрану инкубировали в 5 % растворе

обезжиренного молока (Bio-Rad Laboratories Inc., США) в течение 1 ч. Затем ее инкубировали в течение 12 ч со соответствующими первичными антителами при +4 °С с последующей стандартной отмывкой, после чего мембрану инкубировали 1—1,5 ч при комнатной температуре с вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена. После стандартной отмывки мембрану проявляли с помощью реагента для хемилюминесцентной реакции ECL. Указанную реакцию регистрировали на приборе Kodak Gel Logic 2200 Imaging System с последующей обработкой с помощью программы Kodak Molecular Imaging Soft ware SE ver. 5.0.1.27.

иммуноцитохимия и иммуноцитофлуоресценция

Культуру LN229 выращивали на покровных стеклах до достижения 30 % конфлюентности. Клетки фиксировали в течение 15 мин в 3,7 % параформальде-гида с последующей промывкой в PBS («ПанЭко», Россия). После фиксации и промывок клетки инкубировали с антителом к YKL-39 в течение 1 ч при комнатной температуре, а затем с козьими антителами к иммуноглобулинам мыши, конъюгированными с флуорохромом Alexa-488 (Jackson Immunoresearch, США), или полимерной пероксидазой хрена («Прайм-БиоМед», Россия) 40 или 15 мин соответственно при комнатной температуре. Для визуализации окрашивания в нефлуоресцентном методе добавляли субстрат 3,3-диаминобензидин хромоген на 5—10 мин («ПраймБиоМед», Россия). Препараты заключали в среду на водной основе и оценивали результаты при помощи микроскопа Olympus BX-53 (Cheminst, Германия), сопряженного с камерой Infinity 2 (Lume-nera, США).

иммуногистохимический анализ

Иммуногистохимическое исследование проводили на операционном материале, фиксированном 10 % нейтральным формалином, забуференным фосфатными солями, в течение 24 ч. После гистологической проводки материал заливали в парафин и затем готовили срезы толщиной 2—4 мкм. Срезы монтировали на специальные высокоадгезивные стекла (SuperFrost Plus, ApexLab) и высушивали в течение 18 ч при 37 °С.

Срезы депарафинизировали ксилолом, регидри-ровали в спиртах с объемной долей изопропанола 100 (I, II), 70 и 50 % по 5 мин в каждом и промывали в дистиллированной воде. Блокировку эндогенной пероксидазы проводили в 3 % растворе перекиси водорода в течение 10 мин. Срезы инкубировали с антителами к YKL-39, а затем с антителами к иммуноглобулинам мыши, конъюгированными с полимерной пероксидазой хрена. Окрашивание проявляли при помощи субстрата 3,3-диаминобензидин

2 3 кДа б

а

в

А

V W3S:

о»

75

50

37

25

рис. 1. Иммуноблоттинг тотальныхлизатов клеток LN229

Fig. 1. Immunoblotting of total protein LN229 cell lysates

рис. 2. Иммуногистохимическй анализ YKL-39 в парафиновых срезах здоровой почки. Окрашивание проводили при помощи антител ан-ти^^-39 клон 1B2G4. Специфическая гранулярная окраска цитоплазмы клеток канальцев на парафиновом срезе ткани, фиксированном формалином, свидетельствует о наличии клеток, экспрессирующих YKL-39. х 100

Fig. 2. Immunocytochemical analysis of YKL-39 in paraffin sections of a healthy kidney. The sample was stained with anti-YKL-39 clone 1B2G4 antibodies. Specific granular staining of the cytoplasm of the renal tubules fixed withformalin indicates presence of cells expressing YKL-39. х100

хромогена в течение 5—10 мин. Результаты оценивали с помощью микроскопа Olympus BX-53 (Cheminst, Германия).

Результаты

Для разработки новых моноклональных антител к ХПБ YKL-39 в качестве иммуногена был использован полноразмерный рекомбинантный белок. В результате иммунизации был получен 21 клон гибридом, производящих антитела, связывающиеся с антигеном.

В результате дальнейшего клонирования и анализа кросс-реактивности с другими ХПБ был отобран 1 клон 1B2G4, взаимодействующий при иммунофер-ментном анализе с YKL-39 и не взаимодействующий с его ближайшими гомологами YKL-40 и SI—CLP (данные не показаны).

Для подтверждения специфичности антител дополнительно был проведен анализ белка YKL-39

методом иммуноблоттинга в тотальных лизатах клеток глиобластомы LN229, в качестве контроля был использован рекомбинантный белок, выделенный из E. coli (рис. 1а). Было показано, что в клеточных лиза-тах LN229 антитела 1B2G4 узнают 2 изоформы белка размерами 39 и 48 кДа (см. рис. 1а), что характерно для ХПБ [8, 9]. Далее полученные антитела 1B2G4 тестировали методом иммуноцитохимии и иммуно-флуоресценции, после чего анализ клеток LN229 выявил окрашивание цитоплазматических гранул, характерных для секретируемых белков (рис. 16, в).

Антитела к белку YKL-39, клон 1B2G4 тестировали методом иммуногистохимии на парафиновых срезах нормальной почки. Температурную демаскировку антигена проводили в цитратном буфере рН 6,0, окрашивание срезов — по стандартному протоколу. Полученные результаты представлены на рис. 2. Наблюдается четкая цитоплазматическая окраска

клеток эпителия почечных канальцев, характерная для окрашивания антителами к УКЪ-39 [10].

Заключение

Таким образом, антитела, продуцируемые гибри-домой YKL-39, клон 1B2G4 специфически работают

в иммуноферментном анализе, иммуноцитохимии, непрямой иммунофлуоресценции, иммуноблоттин-ге на тотальных лизатах клеточной линии LN229 и рекомбинантном белке, иммуногистохимии на тканях почки. Антитела связываются с полноразмерным белком YKL-39 и не взаимодействуют с другими ХПБ.

ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES

1. Gratchev A., Schmuttermaier C., Mamidi S. et al. Expression

of Osteoarthritis Marker YKL-39 is Stimulated by Transforming Growth Factor Beta (TGF-beta) and IL-4 in Differentiating Macrophages. Biomark Insights 2008;3:39-44.

2. Hu B., Trinh K., Figueira W.F. et al. Isolation and sequence of a novel human chondrocyte protein related to mammalian members of the chitinase protein family. J Biol Chem 1996;271(32):19415-20.

3. Steck E., Breit S., Breusch S.J. et al. Enhanced expression of the human chitinase 3-like 2 gene (YKL-39) but not chitinase 3-like 1 gene (YKL-40) in osteo-arthritic cartilage. Biochem Biophys Res Commun 2002;299(1):109-15.

4. Knorr T., Obermayr F., Bartnik E. et al. YKL-39(chitinase 3-like protein 2), but not YKL-40(chitinase 3-like protein 1), is up regulated in osteoarthritic

chondrocytes. Ann Rheum Dis 2003;62(10):995-8.

5. Colton C.A., Mott R.T., Sharpe H. et al. Expression profiles for macrophage alternative activation genes in AD and in mouse models of AD. J Neuroinflammation 2006;3:27.

DOI: 10.1186/1742-2094-3-27.

6. Miyatake K., Tsuji K., Yamaga M. et al. Human YKL39 (chitinase 3-like protein 2), an osteoarthritis-associated gene, enhances proliferation and type II collagen expression in ATDC5 cells. Biochem Biophys Res Commun 2013;431(1):52-7.

DOI: 10.1016/j.bbrc.2012.12.094.

7. Liu T., Larionova I., Litviakov N. et al. Tumor-associated macrophages

in human breast cancer produce new monocyte attracting and pro-angiogenic factor YKL-39 indicative for increased metastasis after neoadjuvant chemotherapy. Oncoimmunology

2018;7(6):e1436922.

DOI: 10.1080/2162402X.2018.1436922.

8. Kzhyshkowska J., Mamidi S., Gratchev A. et al. Novel stabilin-1 interacting chitinase-like protein (SI-CLP) is up-regulated in alternatively activated macrophages and secreted

via lysosomal pathway. Blood

2006;107(8):3221-8.

DOI: 10.1182/blood-2005-07-2843.

9. Renkema G.H., Boot R.G., Au F.L. et al. Chitotriosidase, a chitinase, and the 39-kDa human cartilage glycoprotein, a chitin-binding lectin, are homologues of family 18 glycosyl hydrolases secreted by human macrophages. Eur J Biochem 1998;251(1-2):504-9.

10. Uhlen M., Fagerberg L., Hallstrom B.M. et al. Proteomics. Tissue-based map of the human proteome. Science 2015;347(6220):1260419. DOI: 10.1126/science.1260419.

вклад авторов

А.Н. Грачев: разработка дизайна и планирование работы, написание статьи; Д.В. Самойлова, С.Н. Курочкин: получение данных; О.В. Ковалева: получение и анализ данных, написание статьи. Authors' contributions

A.N. Grachev: study design and planning, manuscript preparation;

D.V. Samoylova, S.N. Kurochkin: data accumulation;

O.V. Kovalyova: receipt and analysis and manuscript preparation.

ORCID авторов/ORCID of authors

А.Н. Грачев/A.N. Gratchev: https: //orcid.org/0000-0003-2137-1866 О.В. Ковалева/O.V. Kovaleva: https: //orcid.org/0000-0001-6132-9924 Д.В. Самойлова/D.V. Samoilova: https: //orcid.org/0000-0001-5639-0835 С.Н. Курочкин/S.N. Kurochkin: https: //orcid.org/0000-0002-8043-3871

конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.

Финансирование. Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 17-04-01857), фонда развития Центра разработки и коммерциализации новых технологий «Сколково».

Finansing. The study was performed with the support from the Russian Foundation for Basic Research (grant No. 17-04-01857), Foundation for Development of the New Technologies Development and Commercialization Center "Skolkovo".

информированное согласие. Все пациенты подписали информированное согласие на участие в исследовании. Informed consent. All patients gave written informed consent to participate in the study.

Статья поступила: 24.10.2018. Принята в печать: 12.04.2019. Article reseived: 24.10.2018. Accepted for publication: 12.04.2019.