Дополнительные возможности метода ДНК-анализа в коневодстве

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ВОЗМОЖНОСТИ МЕТОДА ДНК-АНАЛИЗА В КОНЕВОДСТВЕ

ADDITIONAL FEATURES OF THE METHOD OF DNA ANALYSIS IN HORSE BREEDING

УДК 636.1:575.17:577.29

В.В. Калашников

директор ГНУ ВНИИ коневодства, академик М.М. Дергунова

канд. с.-х. наук, ГНУ НИИ Аграрных проблем Хакасии

А.М. Зайцев, Л.А. Храброва, М.А. Зайцева

канд. с.-х. наук ГНУ ВНИИ коневодства

V.V. Kalashnikov, M.M. Dergunova, A.M. Zaicev, L.A.Hrabrova, M.A. Zaiceva

The All-Russian Research Institute for Horsebreeding

Key words: horse, paleontological material, DNA, phylogeny

Аннотация

В статье представлены результаты апробации методик по выделению из палеонтологического материала лошадей, живших на территории Хакасии в I и IX веках н.э. и первые результаты генотипирования по микросателлитам ДНК.

Summary

The article presents the results of testing methods to allocate paleontological material of horses living on the territory of Khakassia in I and IX centuries AD and the first results of genotyping by DNA microsatellites.

Основным направлением прикладных научных работ лаборатории генетики ВНИИ коневодства с конца 70-х годов прошлого века является проведение контроля достоверности происхождения племенных лошадей (подробнее - в предыдущем номере журнала). Эта обязательная в мировой практике конного дела процедура определила то, что наиболее известна и для владельцев лошадей, и в научном сообществе деятельность института именно в этом направлении. Несмотря на значимость этих работ, а также на то, что сегодня лаборатория института - единственная в России сертифицированная Международным обществом по изучению генетики животных (1ЭАС) нужно сказать, что отечественная генетика в коневодстве далеко не ограничена контролем происхождения.

Значительное внимание всегда уделялось исследованиям, направленным на изучение филогенетиче-

ской эволюции пород и внутрипородных групп лошадей. Постоянное накопление данных тестирования сначала по полиморфным системам белков и групп крови, а затем и микросателлитов ДНК позволило не только получить характерные генетические профили пород, но и проследить в динамике изменения генетической структуры, связанные с уровнем и направлением селекционного воздействия. Эти исследования позволяют контролировать уровень генетического разнообразия и оптимизировать схемы селекционного совершенствования пород лошадей.

Однако данные мониторинга генетической структуры за период, охватывающий несколько десятилетий, не всегда дают ответы на ключевые вопросы, основными из которых являются проблемы возникновения или существенного улучшения селекционируемых признаков. В ряде случаев эти вопросы сопряжены с необходи-

мостью выявления точного исторического времени и степени взаимовлияния пород. Применяемые методы исторического анализа зачастую слишком субъективны. В связи с этим возникла необходимость выбора метода, позволяющего четко определять филогенетические взаимоотношения пород, и в качестве максимально достоверного был выбран ДНК-анализ археологического и палеонтологического материала. Большинство археологических находок древних лошадей, доступных для исследования найдены в курганных захоронениях.

В 2013 году в лаборатории генетики проведена апробация методик работы с археологическим материалом и получены первые результаты при изучении генотипа по микросателлитам ДНК лошадей, живших на территории Хакасии в I и IX веках н.э.

Современные лошади Хакасии в значительной степени подвергались метизации, в связи с чем достаточно сложно судить о том, что представляли собой их предки. Еще во времена тагарской культуры (VIII — 11 вв. до н.э.) лошади в Хакасии широко использовались как упряжные и верховые, а также для получения мяса конины. На рубеже II вв. до н.э. территория Западной и Южной Сибири была захвачена гуннами, и местное поголовье испытало влияние других пород и значительно дифференцировалось фенотипически. Это позволило в ^ вв. н.э. получать крупных резвых верховых лошадей, которые были широко известны даже в Китае.

Нашествие Чингисхана в XIII в. и массовое скрещивание с монгольскими лошадьми привело к уменьшению калибра хакасской лошади и распространению типичных фенотипических особенностей степных лошадей. По свидетельству академика П.С. Палласа, изучавшего Хакасию в 1771-1772 гг., большую часть поголовья составляли невысокие лошади, имевшие длинную жёсткую шерсть, выносливые и неприхотливые, с большим разнообразием мастей. В ХХ веке существенное влияние на генофонд хакасской лошади оказало улучшение местного поголовья тяжеловозами и рысаками. Эти мероприятия позволили в массе увеличить живую массу и крупность лошадей, но в еще большей степени способствовали увеличению фенотипической разнородности популяции.

Рис. 2 и 3. Археологический материал

Рис. 1. Этапы выделения ДНК

Для восстановления исторической картины развития хакасской лошади был проведен фрагментный анализ ДНК двух точно датированных образцов из курганных захоронений в пойме реки Абакан.

Для выделения ДНК использовался набор PrepFiler Express™ Forensic DNA Extraction и автоматическая станция AutoMate Express™ Forensic DNA Extraction System. Оптимальное количество образца порошкообразной консистенции было определено эмпирически и составило 50 мг, однако оно может варьировать в зависимости от возраста образца, характера субстрата и условий сохранения до обнаружения.

Выделенные пробы ископаемых образцов амплифи-цировали c использованием двух наборов флюоресцентно меченых праймеров для мультиплексной ПЦР (Таблица 1). Более приемлемым при работе с малыми концентрациями ДНК по сравнению со стандартным StockMarks for Horses оказался разработанный совместно с ООО «Г ордиз» экспериментальный набор.

Фрагментный анализ проводили с использованием генетического анализатора АВ3130 (Applied Biosystems). В пробе № 1 типировано 6 локусов, а в пробе № 2 - девять, что свидетельствует о деградации ДНК в зависимости от срока хранения. Определенные локусы характеризуются самыми короткими фрагментами из всей 17-плексной панели, что вполне объ-

Используемый набор Количество ДНК Полученный результат

№і №2

Стандартный Applied Biosystems Stock Marks for Horses і мкл 0 локусов 0 локусов

Экспериментальный і мкл 6 локусов 9 локусов

ООО Гордиз, г. Москва 1,5 мкл 3 локуса 4 локуса

Таб. 1. Результаты применения двух разных наборов флюоресцентно меченых праймеров для мультиплексной ПЦР

яснимо, учитывая срок хранения образцов. При сравнении генетических характеристик лошадей, использована принятая система популяционно-генетического анализа по показателям частот встречаемости генотипов и аллелей с использованием программы <^а^юа 6.0». На основании частот встречаемости аллелей рассчитаны коэффициенты генетического сходства между современными представителями местных пород и ископаемыми «хакасскими» лошадьми.

Результаты проведенного кластерного анализа генетического сходства изученных пород лошадей наглядно демонстрирует дендрограмма (Рисунок 4).

Ископаемые лошади образуют единый кластер, к которому примыкают современная «хакасская» лошадь и бурятская порода. Далее к этому кластеру примыкают вятская, мезенская и печорская породы соответственно. Отдельной ветвью стоят тувинская и забайкальская лошади.

Литература:

1. Калашников В.В., Храброва Л.А., Зайцев А.М. Прикладная генетика в коневодстве/ Farm Animals. Май 2013. № 2. С. 60-62.

Рис. 4. Дендрограмма генетических расстояний между современными представителями и ископаемыми лошадьми по локусам микросателлитов ДНК

2. Дергунова М.М., Коломеец Ю.Ю., Храброва Л.А. Молекулярно-генетические особенности хакасской лошади/ Коневодство и конный спорт. 2012. № 6. С. 8-9.

3. Калашников В.В., Храброва Л.А., Зайцев А.М., Калин-кова Л.В., Зайцева М.А. Изучение полиморфизма са-теллитной ДНК лошадей заводских и местных пород/ Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук. 2010. № 6. С. 48-50.