ПРЕПАРАТ НА ОСНОВЕ СМЕСИ ФЛАВОНОИДОВ СО СВОБОДНЫМ В-ЦИКЛОМ И ФЛАВАНОВ КАК ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ АГЕНТ
PREPARATION BASED ON MIXTURE OF FLAVONOIDS WITH FREE B-CYCLE AND FLAVANES, AS THERAPEUTIC AGENT

Область изобретения
Данное изобретение относится к предупреждению и лечению заболеваний и состояний, связанных с агрегацией тромбоцитов и тромбозом, вызываемым тромбоцитами. В частности, настоящее изобретение относится к композиции, включающей состав смеси двух специфических классов соединений - флавоноидов со свободным В-циклом и флаванов, обозначаемой в данном контексте также как UP736, предназначенной для применения с целью предупреждения и лечения заболеваний и состояний, опосредованных агрегацией тромбоцитов и тромбозом, вызываемым тромбоцитами. Данное изобретение, кроме того, относится к способу применения UP736 в качестве адъюванта, и/или синергического, и/или потенцирующего агента в сочетании с инъекционными или пероральными противосвертывающими агентами, противотромбоцитарными агентами, нестероидными противовоспалительными лекарственными препаратами (NSAID) и избирательными ингибиторами СОХ-2. Наконец, данное изобретение относится к способу применения UP736 в комбинации с противотромбоцитарными, противосвертывающими профилактическими агентами и NSAID в качестве средства снижения дозы данных агентов, уменьшения побочных эффектов, связанных с острым или постоянным применением данных агентов; противодействия или антагонистического действия в отношении риска острого или постоянного применения данных агентов и достижения дополнительных и/или многочисленных клинических преимуществ.
Уровень техники
Высвобождение и метаболизм арахидоновой кислоты (АК) из клеточной мембраны приводит в результате к генерации метаболитов несколькими различными путями. Вероятно, два из наиболее важных пути опосредуются ферментами 5-липоксигеназой (LOX) и циклооксигеназой (СОХ). Они представляют собой параллельные пути, приводящие в результате к генерации лейкотриенов и простагландинов соответственно, которые играют важные роли в инициации и развитии воспалительного ответа и агрегации тромбоцитов. Следовательно, ферменты, ответственные за генерацию данных медиаторов, стали мишенями для многих новых лекарственных препаратов, направленных на лечение воспаления и модуляцию агрегации тромбоцитов, которые участвуют в патогенезе заболеваний, таких как ревматоидный артрит, остеоартрит и атеротромбоз.
2
Ингибирование фермента СОХ является механизмом действия, приписываемым большинству нестероидных противовоспалительных лекарственных препаратов (NSAIDS). Существует две различные изоформы фермента СОХ (СОХ-1 и СОХ-2), которые имеют гомологию последовательностей приблизительно 60%, но различаются по профилям экспрессии и функции. СОХ-1 представляет собой конститутивную форму фермента, которая связана с продукцией физиологически важных простагландинов, которые помогают регулировать нормальные физиологические функции, такие как агрегация тромбоцитов, защита клеточной функции в желудке и поддержание нормальной функции почек (см. статью Dannhardt and Kiefer (2001) Eur. J. Med. Chem 36:109-26). Вторая изоформа, COX-2, представляет собой форму фермента, которую индуцируют провоспалительные цитокины, такие как интерлейкин-1β (ИЛ-1β) и другие факторы роста (см. статьи Herschmann (1994) Cancer Metastasis Rev. 134:241-56; Xie et al. (1992) Drugs Dev. Res. 25:249-65). Данная изоформа катализирует продукцию простагландина Е2 (PGE) из арахидоновой кислоты (АА). Поскольку механизм действия ингибиторов СОХ перекрывает механизм действия большинства принятых NSAID, ингибиторы СОХ используют для лечения многих из тех же самых симптомов, включая атеротромбоз, боль и припухлость, ассоциированные с воспалением при временных состояниях и хронических заболеваниях.
Тромбоциты играют центральную роль в нормальном гемостазе. После сосудистого повреждения тромбоциты вытекают во внеклеточный матрикс через поврежденную эндотелиальную стенку, где они активируются различными компонентами внеклеточного матрикса, включая коллаген, протеогликаны, фибронектин и другие адгезивные гликопротеины. При контакте с внеклеточным матриксом с тромбоцитами проходят многочисленные и последовательные реакции, включая адгезию и изменение формы, секрецию двух типов гранул и агрегацию. Идентифицировано два сильных медиатора агрегации тромбоцитов: адениндифосфат (АДФ) и тромбоксан А2 (ТхА2). АДФ высвобождается из тромбоцитов после того, как они активируются компонентами внеклеточного матрикса. Кроме опосредования агрегации тромбоцитов АДФ также усиливает высвобождение АДФ из других тромбоцитов, формируя петлю положительной обратной связи для агрегации тромбоцитов. ТхА2 синтезируется и высвобождается из тромбоцитов и также представляет собой важный стимул агрегации тромбоцитов. Совместно с АДФ ТхА2 подготавливает аутокаталитическую реакцию, приводящую к построению увеличивающегося агрегата тромбоцитов. Агрегированные тромбоциты важны для последующего процесса свертывания крови. Данные активированные тромбоциты стимулируют местную активацию плазматических факторов свертывания, приводящую к генерации фибринового сгустка, который укрепляет агрегат тромбоцитов. Недавние исследования позволяют предположить, что все связанные с мембраной реакции системы свертывания могут быть локализованы на поверхности активированных тромбоцитов (см. статью Conde et al. (2005) Blood 106:1604-1611).
Хотя адгезия и активация тромбоцитов представляет собой ориентированный на восстановление ответ на внезапное сосудистое повреждение, неконтролируемое развитие данного процесса через серию самоподдерживающихся петель амплификации может привести к формированию тромба в просвете сосуда, сосудистой окклюзии и временной ишемии или инфаркту (см. статью Ruggeri (2002) Nat. Med. 8: 1227-34). Способность тромбоцитов участвовать в обоих нормальных процессах, гемостазе и атеротромбозе, зависит от их адгезионных свойств и их способности к очень быстрой активации в ответ на различные стимулы.
Природные тромбоциты экспрессируют только СОХ-1. Тромбоциты процессируют PGH2 с образованием в основном ТхА2, который синтезируется и высвобождается тромбоцитами в ответ на коллаген, тромбин и другие стимулы. ТхА2 вызывает необратимую агрегацию тромбоцитов посредством взаимодействия в G-белок-связанным рецептором, рецептором ТхА2. Таким образом, ТхА2 обеспечивает механизм усиления ответов тромбоцитов в отношении разнообразных агонистов. Кроме того, ТхА2 является сильным вазоконстриктором, индуцирует пролиферацию клеток гладкой мускулатуры сосудов и является проатерогенным. В качестве вазоконстриктора ТхА2 способствует правильной агрегации тромбоцитов. Ингибируя фермент СОХ-1, аспирин будет снижать продукцию ТхА2, которая приводит к пониженной агрегации тромбоцитов (см. статью Patrono et al. (2006) The New England Journal Medicine. 353:22: 237).
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Простациклины образуются в эндотелиальной выстилке артерий и сердца. Равновесие между простациклином (PGI), сильным вазодилататором, и представителем тромбоксанов, таким как ТхА2, важно для поддержания соответствующей сердечно-сосудистой функции (см. статью Bunting et al. (1983) Br. Med. Bull. 39:271). Оба, PGI и TxA2, зависят от продукции СОХ-1 и СОХ-2 в эндотелиальной выстилке артерий и в кардиоткани сердца (см. статьи Caughey et al. (2001) J Immunol, 167:2831; Ribuot et al. (2003) Cardiovascular Res 58:582). Показано, что соотношения СОХ-1 и СОХ-2 воздействуют на равновесие как PGI, так и ТхА2. СОХ-1 метаболизирует арахидоновую кислоту, превращая жирную кислоту в основном в ТхА2, тогда как индуцированная СОХ-2 воздействует на арахидоновую кислоту, трансформируя ее в PGE и PGI (см. статьи Oh-ishi (1997) Biochem. Biophys. Res. Commun. 230:110; Brock et al. (1999) J. Biol. Chem. 274:11660). PGI ингибирует агрегацию тромбоцитов в ответ на все агонисты посредством взаимодействия с рецептором PGI. ТхА2 представляет собой простаноид, в значительной степени выделенный из СОХ-1 (главным образом, из тромбоцитов), а его биосинтез высокочувствителен к ингибированию аспирином (см. статью Rocca et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:7634-9). PGI, с другой стороны, выделяют преимущественно из СОХ-2 (см. статью McAdam et al (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:272-7), и он менее чувствителен к ингибированию аспирином. Высокоизбирательное ингибирование СОХ-2 может способствовать тромбозу посредством переключения равновесия синтеза PGI (путь СОХ-2) относительно ТхА2 (путь СОХ-1) путем перевода арахидоновой кислоты на эйкозаноидный путь СОХ-1 (см. статью Gaetano (2003) Trends in Pharmacological Sciences. 24(5):245-252).
Агрегация тромбоцитов играет очень важную роль в индукции и развитии атротромбоза, который является главной причиной тромбоза глубоких вен, легочной эмболии, атеросклероза, инфаркта миокарда, тромбоза сосудов головного мозга и/или эмболии сосудов головного мозга, приводящих к цереброваскулярным событиям. Антитромбоцитарные лекарственные препараты, такие как аспирин, и противосвертывающие лекарственные препараты, такие как гепарин и варфарин (см. статью Verheugt (2005) Presse Med. 34:1325), специфические ингибиторы тромбина, такие как гирудин, дезирудин, бивалирудин, и неспецифические ингибиторы тромбина, такие как статины (см. статью Shen (2006) Front Biosci. 11:113), в настоящее время являются стандартными лекарственными препаратами, используемыми для лечения тромбоэмболии. Однако осложнения, возникающие вследствие серьезного кровотечения, являются основным побочным эффектом противосвертывающих лекарственных препаратов и высокодозной кратковременной антитромбоцитарной терапии. Применение меньших доз противосвертывающих лекарственных препаратов в комбинации с умеренной до низкой дозы антитромбоцитарных соединений, таких как аспирин, как показано, имеет значительную терапевтическую ценность в плане снижения угрозы кровотечения у пациентов из группы высокого риска (см. статью Harrington et al. (2004) Chest. 126.3 Suppl. 513S).
Вследствие необратимого ингибирования циклооксигеназы тромбоцитов и предупреждения формирования ТхА2 лекарственные препараты типа аспирина также используют в течение длительного времени для снижения риска сердечно-сосудистого заболевания, для предупреждения острого инфаркта миокарда и предупреждения острого окклюзионного инсульта (см. статью Hennekens (2002) Am. J. Manag. Care 8 (22 Suppl.):S691). Наиболее распространенным побочным эффектом, обусловленным длительным применением аспирина и других антитромбоцитарных салицилатов, является местная эрозия слизистой оболочки желудка вследствие ингибирования СОХ-1, которая важна для поддержания целостности выстилки слизистой оболочки. Данное повреждение слизистой оболочки желудка может привести от скрытой кровопотери до острого желудочно-кишечного кровотечения вследствие серьезного гастродуоденального повреждения. Краткосрочное высокодозное применение антитромбоцитарных лекарственных препаратов также связано со своим собственным риском, таким как существенно повышенная вероятность инсульта и кровотечения после хирургических процедур. Подбор оптимальной дозы представляет собой одну возможность снижения данных побочных эффектов (см. статью Kong (2004) Am. J. Cardiovasc. Drugs 4(3):151). Суточные дозы, лежащие в интервале 75 мг-150 мг, рекомендованы для длительного профилактического применения. Безусловно, любые соединения, которые могут улучшить антитромбоцитарный эффект аспиринов без повышения их побочных эффектов, будут обладать существенными терапевтическими преимуществами (см. статью Patrono et al. (2005) New Eng. J. Med. 353:22; 2373). К сожалению, в настоящее время отсутствует возможность, посредством которой можно путем применения антисекреторных агентов, таких как ингибитор протонного насоса, уменьшить риск кровотечения в верхнем отделе желудочно-кишечного тракта у пациентов, принимающих антитромбоцитарные лекарственные препараты.
В отношении токсичности аспирина и других классических NSAID, особенно образования язв желудочно-кишечного тракта и кровотечения, обусловленных избирательным ингибированием СОХ-1, в процессе разработки лекарственных препаратов используют две стратегии. Первая стратегия включает поиск избирательных ингибиторов СОХ-2, которые уменьшают желудочно-кишечные побочные эффекты путем создания резерва защитных функций СОХ-1 в слизистой оболочке желудка (см. статью DeWitt (1999) Mol. Pharmac. 4:625-631). Данная попытка привела к успешному внедрению ряда коммерческих лекарственных препаратов, таких как целекоксиб и рофекоксиб, которые проявляют избирательность в отношении СОХ-2. В клинических испытаниях избирательные ингибиторы СОХ-2 продемонстрировали существенную активность в отношении боли и других симптомов воспаления с пониженной вероятностью желудочно-кишечных событий. Однако постепенно появляется ряд побочных эффектов, связанных с применением избирательных ингибиторов СОХ-2. Например, обнаружено, что данные соединения стимулируют аллергические и астматические приступы, вызывают острую почечную недостаточность, застойную сердечную недостаточность, обостряют коронарные и цереброваскулярные заболевания, замедляют рост сломанных костей и заживление язв, подавляют иммунную систему, делая человека чувствительным к инфекции вирусного менингита, и способствуют развитию язв у пациентов с эрозиями желудка или инфекцией Helicobacter pylori (см. статью Rainsford (2001) J. Physiol. - Paris 95: 11-19). Недавние сообщения о том, что существенный противовоспалительный эффект некоторых высокоизбирательных ингибиторов СОХ-2 наблюдают только после того, как уровень дозы достигнет уровней, при которых происходит также ингибирование активности СОХ-1 (см. статью Wallace et al.91999) Br. J. Pharmac. 126:1200-1204.) совместно с генерацией противовоспалительных простаноидов посредством фермента СОХ-2 на более поздней фазе воспалительного процесса (см. статью Gilroy et al. (1999) Nature Med. 5:698-701), ставят, кроме того, вопрос об эффективности избирательных ингибиторов СОХ-2.
В 2004 г. лекарственный препарат Vioxx (рофекоксиб) был добровольно изъят с рынка после клинического испытания, показавшего, что с течением времени данный высокоизбирательный ингибитор СОХ-2 повышает риск сердечного приступа более чем в два раза по сравнению с другим NSAID, напроксеном. Кроме того, клиническое испытание, включающее целебрекс (целекоксиб), финансируемое Национальным институтом рака, показало, что длительное высокодозное применение данного избирательного ингибитора СОХ-2 более чем в два раза увеличивает риск сердечного приступа. Возникли также соображения относительно сердечно-сосудистого риска, связанного с другим избирательным ингибитором СОХ-2, Бекстра (валдекоксиб) (см. статью Meier В. Marketing Intensified Trouble for Pain Pills. The New York Times, 19 декабря, 2004). В действительности обзор современной научной литературы показал, что повышенный риск сердечно-сосудистого события, связанного с приемом рофекоксиба (Vioxx) и других избирательных ингибиторов СОХ-2, отмечают уже с 2000 г. (см. статьи Juni et al. (2004) Lancet. 364(9450): 2021-2029; Clark (2004) Drug Safety 27(7):427-456). Имеются дополнительные факты, которые указывают на то, что основной причиной данной кардиотоксичности является чрезвычайно высокая избирательность СОХ-2 у данного класса лекарственных препаратов (см. статью Neal et al. (2004) J. Pharm Sci. 7(3):332-336).
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Недавно полученные результаты показывают, что СОХ-2 экспрессируется в здоровых органах, таких как плотное пятно почек/cTALH и медуллярные интерстициальные клетки (см. статью Harris et al. (август. 2004 г.) Acta Physiol Scand 181(4):543-7); в эндотелиальных клетках (см. статью Parente and Perretti (январь 2003 г.) Biochem Pharmacol. 65(2): 153-9) и в головном мозге (см. статью Hoffmann (ноябрь 2000 г.) Curr Med Chem. 7(11): 1113-20). В почках фермент СОХ-2 необходим для продукции PGE и PGI (простациклина) из арахидоновой кислоты. PGI, в частности, является ключевым регулятором натриевого равновесия в организме (см. статью Harris (2000) J Am Soc Nephrol 11:2387). Ингибирование PGE и PGI посредством избирательных ингибиторов СОХ-2 в почках приводит к удерживанию натрия и воды и повышению кровяного давления, поскольку PGE снижает повторное всасывание натрия, тогда как PGI является сильным вазодилататором, который поддерживает равновесие между почечным кровотоком и скоростью клубочковой фильтрации или, проще говоря, количеством мочи, образующимся в организме. PGI также стимулирует высвобождение ренина, которое вызывает увеличение уровня высвобождения альдостерона, который затем повышает вторичное всасывание натрия и секрецию калия (см. статьи Carmichael and Shankel (1985) Am J Med 78:992; Whelton and Hamilton (1991) J Clin Pharmacol 31:588). Для поддержания надлежащей почечной перфузии почки повышающим образом регулируют синтез PGI, чтобы противодействовать эффектам вазоконстрикторов для поддержания надлежащей почечной функции. У самых здоровых пациентов соответствующее кровяное давление поддерживается на основании их собственного уравновешивания поглощения жидкостей и выделения мочи без воздействия соединений, вызывающих вазоконстрикцию или вазодилатацию. Для данных пациентов не требуются эффекты вазоконстрикторов, сбалансированные PGI. Однако обнаружено, что у пациентов с высоким кровяным давлением Vioxx еще более повышает кровяное давление (см. статьи Lamarque (2004) Bulletin du Cancer (Montrouge) 91.SI 17; Whelton et al. (2001) Am J Ther 5:85). Данное повышение кровяного давления может вносить вклад в повышенную вероятность острого инфаркта миокарда (AMI) (см. статью Deray (2004) Presse Med 33:483).
2
2
2
2
2
Ферменты СОХ-2 также индуцируют экспрессию PGE и PGI в сердце, что защищает от острого инфаркта миокарда (AMI) (см. статью Dai and Kloner (2004) J Cardiovascul Pharmacol Therapeutics 9:51). Недавние исследования как на кроликах, так и на мышах показали, что при вызванном AMI СОХ-2 существенно регулируется на повышение, действуя так, чтобы остановить событие, в качестве медиатора против инфаркта (см. статьи Shinmura et al. (2000) PNAS 97: 10197; Guo et al. (2000) Basic Res Cardiol 95:479). Данная активность против инфаркта препятствует дальнейшему относительно имеющегося повреждению, сохраняя тем самым сердечную функцию, (см. статью Bolli et al. (2002) Am J Physiol 282:H1943). На моделях на животных исследователи показали, что уровни PGI не действуют, когда крысам вводят избирательный ингибитор СОХ-2 по сравнению с плацебо. Данное отсутствие PGI препятствует тому, что сердца крыс противодействуют индуцированному событию AMI (см. статьи Bolli et al. (2002) Am J Physiol 282:H1943; Shinmura et al. (2002) Am. J Physiol 283:H2534). При избирательном ингибировании СОХ-2 ТхА2 образуется на значительно более высоком уровне по сравнению с PGI. Вазоконстрикция посредством ТхА2 уравновешивается PGb-индуцируемой вазодилатацией, которая снижает кровоток в артериях в области сердца. Данное уменьшение кровотока и ограничение доставки питательных веществ и кислорода может склонить равновесие у чувствительных пациентов в сторону AMI (см. статью Bing and Lomnicka (2002) J. Am Coll. Cardiol 39:521).
В итоге недавняя оценка изоформ циклооксигеназы и их функции продемонстрировала, что отсутствие заметного ингибирования СОХ-1 является убедительным объяснением наблюдаемого повышения сердечно-сосудистых побочных эффектов, ассоциированных с Vioxx (рофекоксибом) и другими высокоизбирательными ингибиторами СОХ-2. Рекомендуют даже избегать применения высокоизбирательных в отношении СОХ-2 NSAID без применения подходящих ингибиторов СОХ-1 (например, низкодозного аспирина), (см. статью Neal et al. (2004) J. Pharm. Pharmaceut. Sci. 7(3):332-336).
2
Современные попытки борьбы с воспалением сосредоточены на поиске агентов, которые ингибируют как циклооксигеназу, так и липоксигеназу ( см. статьи Parente (2001) J. Rheumatol. 28:2375-2382; Bertolini et al. (2001) Pharmac. Res. 44:437-450). Ингибиторы, которые демонстрируют двойную специфичность в отношении СОХ и LOX, имели бы очевидное преимущество в плане ингибирования множества путей метаболизма арахидоновой кислоты. Данные ингибиторы блокировали бы воспалительные эффекты простагландинов (PG), а также эффекты множества лейкотриенов (LT) путем ограничения их продукции. Это включает вазодилатацию, проницаемость сосудов и хемотаксические эффекты PGE, LTB4, LTD4 и LTE4, известных также как медленно реагирующая субстанция анафилаксии. Среди них LTB4 обладает наиболее сильными хемотаксическими и хемокинетическими эффектами (см. Moore (1985) в монографии Prostanoids: pharmacological, physiological and clinical relevance, Cambridge University Press, N.Y., стр. 229-230).
2
Важность блокирования воспалительных эффектов PGE, а также эффектов множества лейкотриенов (LT) основана на том, что недавно обнаружено, что существенные недостатки избирательных ингибиторов СОХ-2 ассоциированы с переключением пути арахидоновой кислоты на путь липоксигеназы, вызывая тем самым сверхпродукцию провоспалительных, хемотаксических, повреждающих желудок и бронхоконстрикторных лейкотриенов (см. статью Celotti and Laufer (2001) Pharmac. Res. 43:429-436).
Показано, что вызываемое NSAID воспаление желудка во многом обусловлено метаболитами LOX, в частности LTC4 и LTB4 (см. статью Kirchner et al. (1997) Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids 56:417-423). Лейкотриены вносят вклад в значительное число повреждений желудочного эпителия путем стимуляции инфильтрации лейкоцитов, окклюзии микрососудов, снижения кровотока в слизистой оболочке и высвобождения медиаторов, протеаз и свободных радикалов. Избирательные ингибиторы LOX продемонстрировали значительное снижение тяжести или предупреждение образования язвы, индуцируемое индометацином (см. статью Fosslien (1998) Annals Clin. Lab. Sci. 28:67-81). Установлено, что посредством ингибирования путей СОХ аспирин и другие ингибиторы СОХ переключают метаболиты арахидоновой кислоты на путь LOX, вызывая повышенное высвобождение бронхосуживающих лейкотриенов наряду с повышением уровней цистеиниллейкотриенов, которое приводит к хроническому риноконъюнктивиту, носовым полипам и астме, сходной с затянувшейся вирусной респираторной инфекцией. Преобладание индуцированной аспирином астмы (AIA) в астматической популяции составляет приблизительно от 10 до 20%, и для лечения пациентов с AIA использовали антилейкотриеновые лекарственные препараты (см. статью Babu and Salvi (2000) Chest 118: 1470-1476).
Двойные ингибиторы также демонстрируют другие терапевтические преимущества. Показано, что они снижают коронарную вазоконстрикцию в сердце, пораженном артритом, на модели на крысах (см. статью Gok et al. (2000) Pharmac. 60:41-46) и существенно снижают вызываемые ангиотензином II сокращения во внутренней артерии молочной железы человека (см. статью Stanke-Labesque et al. (2000) Cardiovascular Res. 47:376-383). Активация опиоидного рецептора может вызвать пресинаптическое ингибирование высвобождения нейтромедиатора, опосредованное метаболитами LOX арахидоновой кислоты в нейронах среднего мозга. Эффективность опиоидов синергически повышают обработкой нейронов головного мозга двойными ингибиторами СОХ и LOX. Это может привести к созданию обезболивающих препаратов для ЦНС, включающих комбинации пониженных доз опиоидов и двойных ингибиторов COX/LOX (см. статью Christie et al. (1999) Infiamm. Res. 48:1-4). Двойные ингибиторы СОХ и LOX могут также предупреждать вызываемое белком хрусталика глазное воспаление на обеих, ранней и поздней, фазах (см. статью Chang et al. J. Ocular Pharmac. 5:353-360).
Двойные ингибиторы СОХ и LOX не только подавляют простагландины, которые делают вклад в острые воспалительные состояния, но также участвуют в накоплении фагоцитарных лейкотриенов, которые непосредственно связаны с симптомами хронического воспаления. Кроме того, двойные ингибиторы также обеспечивают защиту сердца от активности ингибирования СОХ-1. Данные свойства предполагают, что для двойных ингибиторов СОХ и LOX могут иметь явные преимущества относительно избирательных ингибиторов СОХ-2 и NSAID. Данное утверждение, как показано, обосновано на моделях in vivo с использованием потенциальных синтетических лекарственных препаратов (см. статью Fiorucci et al. (2001) Biochem. Pharmac. 62:1433-1438).
Раскрытие изобретения
Настоящее изобретение относится в основном к композиции, полученной для применения с целью предупреждения и лечения заболеваний и состояний, связанных с агрегацией тромбоцитов, и вызываемого тромбоцитами тромбоза. Данную композицию в данном контексте обозначают как UP736. Композиция состоит из смеси двух специфических классов соединений - флавоноидов со свободным В-циклом и флаванов. Композиции, состоящие из флавоноидов со свободным В-циклом, флаванов и их смесей, описаны в патентной заявке США No. 10/091362, поданной 1 марта 2002 г., под названием "Identification of Free В-ring Flavonoids as Potent COX-2 Inhibitors" (Идентификация флавоноидов со свободным В-циклом как сильных ингибиторов СОХ-2), в патентной заявке США No. 10/104477, поданной 22 марта 2002 г., под названием "Isolation of а Dual Сох-2 and 5-Lipoxygenase Inhibitor from Acacia" (Выделение двойного ингибитора Сох-2 и 5-липоксигеназы из Acacia) и в патентной заявке США No. 10/427746, поданной 22 июля 2003 г., под названием "Formulation with Dual Сох-2 and 5-Lipoxygenase Inhibitory Activity" (Препарат с активностью двойного ингибитора Сох-2 и 5-липоксигеназы). Каждая из данных ссылок включена в данном контексте в виде ссылки во всей своей полноте.
В настоящее изобретение включена новая композиция, состоящая из смеси по меньшей мере одного флавоноида со свободным В-циклом, по меньшей мере одного флавана и по меньшей мере одного агента, выбранного из группы, состоящей из инъекционного противосвертывающего агента, выбранного из группы, включающей, но без ограничения перечисленным, гепарин, дальтепарин, эноксапарин и тинцапарин, перорального противосвертывающего агента, выбранного из группы, включающей, но без ограничения перечисленным, варфарин, антагонисты витамина К и ингибиторы редуктазы витамина К; антитромбоцитарного агента, выбранного из группы, включающей, но без ограничения перечисленным, аспирин, клопидогрел и дипиридамол, лекарственного препарата против стенокардии, выбранного из группы, включающей, но без ограничения перечисленным, нитраты, β-блокаторы, блокаторы кальция, ингибиторы ангиотензин-конвертирующего фермента и активаторы калиевых каналов; нестероидного противовоспалительного лекарственного препарата (NSAID), выбранного из группы, включающей, но без ограничения перечисленным, ацетаминофен, ибупрофен, напроксен, диклофенак, салицилаты и индометацин или избирательный ингибитор СОХ-2, выбранный из группы, включающей, но без ограничения перечисленным, рофекоксиб, целекоксиб, этодолак и мелоксикам.
Соотношение флавоноидов со свободным В-циклом и флаванов в композиции можно подвести на основе показателей и специфических требований относительно предупреждения и лечения специфического заболевания или состояния. В основном соотношение флавоноидов со свободным В-циклом и флаванов может лежать в интервале от приблизительно 99:1 флавоноидов со свободным В-циклом:флаванов до приблизительно 1:99 флавоноидов со свободным В-циклом:флаванов. В специфических вариантах осуществления настоящего изобретения соотношение флавоноидов со свободным В-циклом к флаванам выбрано из группы, состоящей из приблизительно 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80 и 10:90. В предпочтительном варианте осуществления изобретения соотношение флавоноидов со свободным В-циклом к флаванам в предложенной композиции составляет приблизительно 85:15. Флавоноиды со свободным В-циклом и флаваны можно синтезировать и/или выделить из одного растения или множества растений. В предпочтительном варианте осуществления флавоноиды со свободным В-циклом выделены из растения или растений рода Scutellaria и флаваны выделены из растения или растений рода Acacia и Uncaria.
Настоящее изобретение далее включает способы лечения и предупреждения заболеваний и состояний, относящихся к агрегации тромбоцитов и вызываемому тромбоцитами тромбозу. Способ заключается во введении нуждающемуся в этом хозяину композиции, включающей смесь флавоноидов со свободным В-циклом и флаванов, синтезированных и/или выделенных из одного растения или множества растений. Эффективность данного способа демонстрируют, используя очищенные ферменты, на различных клеточных линиях и множестве моделей на животных.
Заболевания и состояния, связанные с агрегацией тромбоцитов и вызываемым тромбоцитами тромбозом, которые можно предупреждать и лечить согласно способу, представленному в изобретении, включают, но без ограничения перечисленным, тромбоз глубоких вен, легочную эмболию, атеросклероз, инфаркт миокарда, тромбоз сосудов головного мозга и/или эмболию сосудов головного мозга, приводящие к цереброваскулярным событиям, тромбозу периферической циркуляции и/или микроциркуляции, приводящей к ишемии и инфаркту, фибрилляции предсердий, которая ассоциирована со стазом крови и формированием тромбоза в левом предсердии, тромбогенными центрами, включая искусственные имплантаты, такие как механические сердечные клапаны, дефибрилляторы, хирургические имплантаты для доставки лекарственных препаратов и искусственные бедра, суставы и другие экзогенные органы.
Настоящее изобретение далее включает способы применения UP736 в качестве адъюванта, и/или синергического, и/или потенцирующего агента, которые заключаются во введении нуждающемуся в этом хозяину эффективного количества представленной композиции, включающей смесь по меньшей мере одного флавоноида со свободным В-циклом, по меньшей мере одного флавана и по меньшей мере одного агента, выбранного из группы, состоящей из инъекционного противосвертывающего агента, перорального противосвертывающего агента, антитромбоцитарного агента, агента против стенокардии, нестероидного противовоспалительного лекарственного препарата (NSAID) или избирательного ингибитора СОХ-2. Примеры инъекционных противосвертывающих агентов включают, но без ограничения перечисленным, гепарин, дальтепарин, эноксапарин и тинцапарин. Примеры пероральных противосвертывающих агентов включают, но без ограничения перечисленным, варфарин, антагонисты витамина К и ингибиторы редуктазы витамина К. Примеры антитромбоцитарных агентов включают, но без ограничения перечисленным, аспирин, клопидогрел и дипиридамол. Примеры лекарственных препаратов против стенокардии включают, но без ограничения перечисленным, нитраты, β-блокаторы, блокаторы кальция, ингибиторы ангиотензин-конвертирующего фермента и активаторы калиевых каналов. Нестероидные противовоспалительные лекарственные препараты (NSAID) включают, но без ограничения перечисленным, ацетаминофен, ибупрофен, напроксен, диклофенак, салицилаты и индометацин. Наконец, примеры избирательных ингибиторов СОХ-2 включают, но без ограничения перечисленным, рофекоксиб, целекоксиб, этодолак и мелоксикам.
Настоящее изобретение также включает способ уменьшения стандартной дозы антитромбоцитарного, противосвертывающего, профилактического агентов, NSAID и избирательных ингибиторов СОХ-2 для достижения либо равного, либо улучшенного клинического результата. Способ заключается во введении нуждающемуся в этом хозяину эффективного количества композиции, включающей смесь по меньшей мере одного флавоноида со свободным В-циклом и по меньшей мере одного флавана в комбинации с указанным антитромбоцитарным, противосвертывающим, профилактическим агентом, NSAID или избирательным ингибитором СОХ-2.
Настоящее изобретение далее включает композицию и способ применения UP736 к качестве адъюванта, и/или синергического, и/или потенцирующего агента в сочетании с по меньшей мере одним нестероидным противовоспалительным лекарственным препаратом (NSAID), выбранным из группы включающей, но без ограничения перечисленным, ацетаминофен, ибупрофен, напроксен, диклофенак, салицилаты, индометацин и по меньшей мере один избирательный ингибитор СОХ-2, выбранный из группы, включающей, но без ограничения перечисленным, рофекоксиб, целекоксиб, этодолак и мелоксикам. Указанная композиция и способ позволяют уменьшить дозу NSAID, требующихся для достижения либо равного, либо улучшенного клинического результата, приводя к уменьшению побочных эффектов, ассоциированных с острым или постоянным применением данных агентов, и противодействию или антагонистическому действию в отношении рисков острого или постоянного применения NSAID. Данный способ представляет также средства достижения дополнительного и/или множества клинических преимуществ, как подробно описано ниже. Способ заключается во введении нуждающемуся в этом хозяину эффективного количества композиции, включающей смесь флавоноидов со свободным В-циклом и флаванов в комбинации с по меньшей мере одним NSAID и по меньшей мере одним избирательным ингибитором СОХ-2 и фармацевтически приемлемым носителем.
Настоящее изобретение также включает композицию и способ снижения или устранения побочных эффектов, связанных с острым или постоянным применением антитромбоцитарного, противосвертывающего, профилактического агентов, NSAID и избирательных ингибиторов СОХ-2, посредством введения указанного агента в сочетании с UP736. Способ заключается во введении нуждающемуся в этом хозяину эффективного количества композиции, включающей смесь флавоноидов со свободным В-циклом и флаванов в комбинации с по меньшей мере антитромбоцитарным, противосвертывающим, профилактическим агентом, NSAID или избирательным ингибитором СОХ-2 и фармацевтически приемлемым носителем.
Настоящее изобретение, кроме того, включает способ противодействия или антагонистического действия в отношении рисков, связанных с острым или постоянным применением антитромбоцитарного, противосвертывающего, профилактического агентов, NSAID или избирательных ингибиторов СОХ-2, посредством совместного введения указанного агента с UP736. Способ заключается во введении нуждающемуся в этом хозяину эффективного количества композиции, включающей смесь флавоноидов со свободным В-циклом и флаванов в комбинации с указанным антитромбоцитарным, противосвертывающим, профилактическим агентом или NSAID и фармацевтически приемлемый носитель.
Наконец, настоящее изобретение включает способы достижения дополнительного и/или множества клинических преимуществ путем совместного введения антитромбоцитарного, противосвертывающего, профилактического агентов, NSAID и избирательных ингибиторов СОХ-2 в комбинации с UP736. Как обсуждают ниже, UP736 является сильным антиоксидантом, который регулирует продукцию информационной РНК NFκB и PPAR-γ, приводя к специфической понижающей регуляции TNFα, ИЛ-1β, IL-6 и других провоспалительных цитокинов на уровнях как экспрессии генов, так и продукции белков. Способ заключается во введении нуждающемуся в этом хозяину эффективного количества композиции, включающей смесь флавоноидов со свободным В-циклом и флаванов, синтезированных и/или выделенных из одного растения или множества растений, в комбинации с антитромбоцитарным, противосвертывающим, профилактическим агентом, NSAID или избирательным ингибитором СОХ-2 и фармацевтически приемлемым носителем.
Флавоноиды со свободным В-циклом, называемые также в данном контексте флавонами и флавонолами со свободным В-циклом, которые могут быть использованы в соответствии со следующим изобретением, включают соединения, иллюстрируемые следующей общей формулой:
в которой
1
2
3
4
5
2
2
3
+
-
R, R, R, R и R независимо друг от друга выбраны из группы, состоящей из -Н, -ОН, -SH, OR, -SR, -NH, -NHR, -NR, -NR X углерода, кислорода, азота или серы, гликозида из одного или комбинации множества сахаров, включая, но без ограничения перечисленным, альдопентозы, метилальдопентозу, альдогексозы, кетогексозу и их химические производные;
в которой
R представляет собой алкильную группу, включающую от 1 до 10 атомов углерода, и
X выбрано из группы фармацевтически приемлемых противоионов, включая, но без ограничения перечисленным, гидроксил, хлорид, йодид, сульфат, фосфат, ацетат, фторид, карбонат и т.п.
Флаваны, которые могут быть использованы в соответствии со следующим изобретением, включают соединения, иллюстрируемые следующей общей формулой:
в которой
1
2
3
4
5
3
3
2
2
3
+
-
R, R, R, R и R независимо друг от друга выбраны из группы, состоящей из -Н, -ОН, -SH, -ОСН, -SCH, -OR, -SR, -NH, -NRH, -NR, -NR X, сложных эфиров упомянутых замещающих групп, включая, но без ограничения перечисленным, сложные эфиры галлата, ацетата, циннамоила и гидроксициннамоила, тригидроксибензоиловые сложные эфиры и каффеоиловый сложный эфир и их химические производные; углерода, кислорода, азота или серы, гликозида из одного или комбинации множества сахаров, включая, но без ограничения перечисленным, альдопентозы, метилальдопентозу, альдогексозы, кетогексозу и их химические производные; димерные, тримерные и другие полимеризованные флаваны,
в которой
R представляет собой алкильную группу, включающую от 1 до 10 атомов углерода, и
X выбрано из группы фармацевтически приемлемых противоионов, включая, но без ограничения перечисленным, гидроксил, хлорид, йодид, сульфат, фосфат, ацетат, фторид, карбонат и т.п.
Флавоноиды со свободным В-циклом, представленные в данном изобретении, могут быть получены способами синтеза и/или экстрагированы из растения или растений из семейств растений, включая, но без ограничения перечисленным, Annonaceae, Asteraceae, Bignoniaceae, Combretaceae, Compositae, Euphorbiaceae, Lahiatae, Lanranceae, Leguminosae, Moraceae, Pinaceae, Pteridaceae, Sinopteridaceae, Ulmaceae и Zingiberaceae. Флавоноиды со свободным В-циклом могут быть экстрагированы, сконцентрированы и очищены из родов высших растений, включающих, но без ограничения перечисленным, Desmos, Achyrocline, Oroxyhim, Buchenavia, Anaphalis, Cotula, Gnaphalium, Helichrysum, Centaurea, Eupatorium, Baccharis, Sapium, Scutellaria, Molsa, Colebrookea, Stachys, Origanum, Ziziphora, Lindera, Actinodaphne, Acacia, Denis, Glycyrrhiza, Millettia, Pongamia, Tephrosia, Artocarpus, Ficus, Pityrogramma, Notholaena, Pinus, Ulmus и Alpinia.
Биологически активные флаваны, представленные в данном изобретении, могут быть получены способами синтеза и/или экстрагированы из растения или растений, выбранных из рода Acacia и/или Uncaria. В предпочтительном варианте осуществления растение Acacia выбрано из группы, включающей, но без ограничения перечисленным, A. catechu, A. concinna, A. farnesiana, А. Senegal, A. speciosa, A. arabica, A. caesia, A. pennata, A. sinuata, A. mearnsii, А. picnantha, A. dealbata, A. auriculiformis, A. holoserecia и A. mangium. В предпочтительном варианте осуществления растение Uncaria выбрано из группы, состоящей из Uncaria gambir, U. lanosa, U. hirsute, U. africana, U. elliptica, U. orientalis, U. attenuate, U. acida, U. homomalla, U. sessilifructus, U. sterrophylla, U. bernaysii, U. sinensis, U. callophylla, U. rhychophylla, U. tomentosa, U. longiflora, U. hirsute, U. cordata и U. borneensis.
В предпочтительном варианте осуществления флавоноиды со свободным В-циклом выделяют из растения или растений рода Scutellaria и флаваны выделяют из растения или растений родов Acacia и Uncaria.
Как отмечено выше, соотношение флавоноидов со свободным В-циклом к флаванам может лежать в интервале от приблизительно 99:1 флавоноидов со свободным В-циклом:флаванов до приблизительно 1:99 флавоноидов со свободным В-циклом:флаванов. В специфических вариантах осуществления настоящего изобретения соотношение флавоноидов со свободным В-циклом к флаванам выбрано из группы, состоящей из приблизительно 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80 и 10:90. В предпочтительном варианте осуществления изобретения соотношение флавоноидов со свободным В-циклом:флаванов в представленной композиции составляет приблизительно 85:15.
Следует иметь в виду, что как предшествующее общее описание, так и последующее детальное описание являются только иллюстративными и объясняющими и не ограничивающими изобретение, как оно заявлено.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 представлена хроматограмма HPLC стандартизованного экстракта, выделенного из корней S. baicalensis (партия # RM052302-01), имеющего содержание флавоноидов со свободным В-циклом 82,2%. Как можно видеть на чертеже, при использовании HPLC/PDA/MC представлены данные по следующим десяти соединениям: байкалин, вогонин-7-глюкуронид, ороксилин А 7-глюкуронид, норвогонин-7-глюкуронид, скутелларин, крисин и ороксилин А.
На фиг.2 представлена хроматограмма HPLC флаванов, экстрагированных из A. catechu с помощью 80% МеОН в воде.
На фиг. 3 графически представлено время кровотечения и процент увеличения времени кровотечения в группах лечения относительно контроля с носителем при использовании комбинированных результатов из примера 11 (n=9-10). Среднее время кровотечения и процент увеличения времени кровотечения в группах лечения относительно контроля с носителем представляют и анализируют, используя t-критерий Стьюдента. Удлинение времени кровотечения в группах лечения выражают как процент увеличения времени кровотечения относительно контроля с носителем.
На фиг. 4 графически представлены результаты, полученные в примере 12. В данном примере UP736 перорально вводят в дозе 100 мг/кг либо в виде монокомпонента, либо в комбинации с аспирином в концентрации 3, 10 и 30 мг/кг группам по 5 самцов мышей, полученных из ICR, с массой тела 22±2 г за 1 час до трансфекции в конец (0,3 мм) хвоста каждого животного. Кроме того, мышам аналогичным образом вводят аспирин в виде монотерапии в дозе 3, 10, 30 и 100 мг/кг. Увеличение времени кровотечения на 50 процентов или более (50%) относительно контрольной группы животных считают существенным.
Детальное описание предпочтительных вариантов осуществления
В данном контексте используют различные термины для рассмотрения аспектов настоящего изобретения. Следующие определения представлены с целью помочь в понимании описания компонентов данного изобретения.
Следует отметить, что термин "какой-либо" или "неопределенный" объект относится к одному или более из данных объектов, например флавоноид относится к одному или более флавоноидов. В таком случае термины "какой-либо" или "неопределенный", "один или более" и "по меньшей мере один" в данном контексте используют взаимозаменяемо.
"Флавоноиды со свободным В-циклом", как используют в данном контексте, представляют собой специфический класс флавоноидов, которые не имеют замещающих групп на ароматическом В-цикле, как проиллюстрировано следующей общей структурой:
в которой
1
2
3
4
5
2
2
3
+
-
R, R, R, R и R независимо друг от друга выбраны из группы, состоящей из -Н, -ОН, -SH, OR, -SR, -NH, -NHR, -NR, -NR X, углерода, кислорода, азота или серы, гликозида из одного или комбинации множества сахаров, включая, но без ограничения перечисленным, альдопентозы, метилальдопентозу, альдогексозы, кетогексозу и их химические производные;
в которой
R представляет собой алкильную группу, включающую от 1 до 10 атомов углерода, и
X выбрано из группы фармацевтически приемлемых противоионов, включая, но без ограничения перечисленным, гидроксил, хлорид, йодид, сульфат, фосфат, ацетат, фторид, карбонат и т.п.
"Флаваны", как используют в данном контексте, относятся к специфическому классу флавоноидов, которые можно в основном представить следующей общей структурой:
в которой
1
2
3
4
5
3
3
2
2
3
+
-
R, R, R, R и R независимо друг от друга выбраны из группы, состоящей из -Н, -ОН, -SH, -ОСН, -SCH, -OR, -SR, -NH, -NRH, -NR, -NR X, сложных эфиров упомянутых замещающих групп, включая, но без ограничения перечисленным, сложные эфиры галлата, ацетата, циннамоила и гидроксициннамоила, тригидроксибензоиловые сложные эфиры и каффеоиловый сложный эфир и их химические производные; углерода, кислорода, азота или серы, гликозида из одного или комбинации множества сахаров, включая, но без ограничения перечисленным, альдопентозы, метилальдопентозу, альдогексозы, кетогексозу и их химические производные; димерный, тримерный и другие полимеризованные флаваны, в которой
R представляет собой алкильную группу, включающую от 1 до 10 атомов углерода, и
X выбрано из группы фармацевтически приемлемых противоионов, включая, но без ограничения перечисленным, гидроксил, хлорид, йодид, сульфат, фосфат, ацетат, фторид, карбонат и т.п.
Термин "терапевтический", как используют в данном контексте, включает лечение и/или профилактику. При использовании терапевтический относится к человеку, а также животным.
Термин "фармацевтически или терапевтически эфективная доза или количество" относится к уровню дозы, достаточному для того, чтобы вызвать требуемый биологический результат. Данным результатом может быть облегчение признаков, симптомов или причин болезни или любое другое изменение биологической системы, которое необходимо.
Термин "плацебо" относится к замене фармацевтически или терапевтически эффективной дозы или количественной дозы, достаточной для того, чтобы вызвать требуемую биологическую реакцию, которая может облегчить признаки, симптомы или причины болезни, неактивной субстанцией.
"Хозяин" или "пациент" является живым субъектом, человеком или животным, которому вводят композиции, описанные в данном контексте. Таким образом, изобретение, описанное в данном контексте, можно использовать в ветеринарии, а также применительно к человеку, и термины "пациент" или "хозяин" не следует истолковывать ограничивающим образом. В случае ветеринарного применения интервалы доз можно определить, как описано ниже, принимая во внимание массу тела животного.
Термин "экспрессия гена" относится к транскрипции гена в мРНК.
Термин "экспрессия белка" относится к трансляции мРНК в белок.
Настоящее изобретение относится, в основном, к композиции, полученной для применения с целью предупреждения и лечения заболеваний и состояний, связанных с агрегацией тромбоцитов и вызываемым тромбоцитами тромбозом. Данную композицию называют в данном контексте UP736. Композиция включает отдельные или смесь двух специфических классов соединений - флавоноидов со свободным В-циклом и флаванов.
Соотношение флавоноидов со свободным В-циклом и флаванов в композиции можно подвести на основе показателей и специфических требований относительно предупреждения и лечения специфического заболевания или состояния. В основном соотношение флавоноидов со свободным В-циклом и флаванов может лежать в интервале от приблизительно 99:1 флавоноидов со свободным В-циклом:флаванов до приблизительно 1:99 флавоноидов со свободным В-циклом:флаванов. В специфических вариантах осуществления настоящего изобретения соотношение флавоноидов со свободным В-циклом к флаванам выбрано из группы, состоящей из приблизительно 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70, 20:80 и 10:90. В предпочтительном варианте осуществления изобретения соотношение флавоноидов со свободным В-циклом к флаванам в предложенной композиции составляет приблизительно 85:15.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения стандартизованный экстракт флавоноидов со свободным В-циклом включает активные соединения чистоты 1-99% (по массе) от общего содержания флавоноидов со свободным В-циклом, как определено в примерах 3, 4 и 8. Байкалин представляет собой основной активный компонент в экстракте, который составляет приблизительно 50-90% (по массе) общих флавоноидов со свободным В-циклом. В предпочтительном варианте осуществления стандартизованный экстракт включает >70% флавоноидов со свободным В-циклом, из которых >75% флавоноидов со свободным В-циклом составляет байкалин.
В одном варианте осуществления стандартизованный экстракт флаванов включает активные соединения чистоты 1-99% (по массе) общих флаванов, как определено в примерах 5, 6 и 7. Катехин является основным активным компонентом в экстракте и составляет 50-90% (по массе) от общих флаванов. В предпочтительном варианте осуществления стандартизованный экстракт флаванов включает >50% общих флаванов, в котором >70% флаванов составляет катехин.
В одном варианте осуществления UP736 получают смешиванием либо растительных экстрактов, как детально описано выше, либо их синтетических эквивалентов в соотношении от 99:1 до 1:99 (флавоноиды со свободным В-циклом:флаваны). Предпочтительное соотношение флавоноидов со свободным В-циклом к флаванам составляет 85:15 флавоноидов со свободным В-циклом:флаванов, как определено в примере 9. Концентрация флавоноидов со свободным В-циклом в UP736 может составлять приблизительно от 1% до 99%, и концентрация флаванов в UP736 может составлять от 99% до 1%. В предпочтительном варианте осуществления изобретения концентрация общих флавоноидов со свободным В-циклом в UP736 составляет приблизительно 75% при содержании байкалина приблизительно 60% от общей массы UP736, и концентрация общих флаванов в UP736 составляет приблизительно 10% при содержании катехина приблизительно 9%. В данном варианте осуществления общие активные компоненты (флавоноиды со свободным В-циклом и флаваны) в UP736 составляют >80% от общей массы.
Настоящее изобретение включает оценку различных композиций флавоноидов со свободным В-циклом и флаванов с использованием ферментативных и in vivo моделей с целью оптимизации состава и получения требуемой физиологической активности. В настоящее время заявителю настоящего изобретения не известно ни о каких сообщениях о препарате, включающем комбинацию только флавоноидов со свободным В-циклом и флаванов в качестве основных биологически активных компонентов для лечения заболевания и состояний. Отсутствие замещения одного из ароматических циклов флавоноида со свободным В-циклом играет очень важную роль в обеспечении эффективности данных соединений. В отличие от других нестероидных противовоспалительных лекарственных препаратов (NSAID) и природных соединений флавоноиды со свободным В-циклом, такие как байкалин, имеют ароматический цикл с низкой полярностью с одной стороны молекулы и высокополярный глюкуронид и две гидроксильные группы с другой стороны. Данная структурная конфигурация дает возможность данным соединениям быть направленными на ткани и клетки. Комбинация флавоноидов со свободным В-циклом с флаванами для получения представленной композиции, называемой в данном контексте UP736, дает синергический и сильный модулятор путей как СОХ, так и LOX эйкозаноидной системы.
В данном контексте ясно продемонстрировано, что комбинация флавоноидов со свободным В-циклом и флаванов обеспечивает более сбалансированную модуляцию ферментов СОХ-1 и СОХ-2. Например, аспирин, избирательный ингибитор СОХ-1, который более чем в 150 раз избирателен в отношении СОХ-1, вызывает желудочно-кишечные побочные эффекты. Напротив, Vioxx, целебрекс и Бекстра, которые являются избирательными ингибиторами СОХ-2, обладающими в 50-200 раз большей активностью в отношении фермента СОХ-2, не вызывают такого значительного желудочно-кишечного повреждения, однако данные избирательные в отношении СОХ-2 лекарственные препараты повышают риски сердечно-сосудистых событий.
50
50
50
50
Профиль ингибирования СОХ-1 и СОХ-2 очищенным компонентом байкалином, который выделен из S. baicalensis, показывает почти удвоенную селективность в отношении СОХ-2 (определяют, что IC для СОХ-1 составляет 0,44 мкг/мл/ед. фермента, и IC для СОХ-2, как определяют, составляет 0,28 мкг/мл/ед.). При этом профиль ингибирования СОХ-1 и СОХ-2 представленной композицией, включающей больше чем 90% катехинов, выделенных из А. catechu, является почти в три раза более избирательным в отношении СОХ-1. Для катехина IC ингибирования СОХ-1 рассчитывают как 0,11 мкг/мл/ед. фермента, и IC для СОХ-2 рассчитывают как 0,42 мкг/мл/ед.
Комбинация смеси флавоноидов со свободным В-циклом, экстрагированная из корней S. baicalensis, и флаванов, выделенных из коры A. catechu в соотношении 80:20, предназначенная для получения представленной композиции, называемая в дальнейшем UP736, обеспечивает сбалансированную избирательность СОХ-1 относительно СОХ-2 2:1. Данный препарат, который обеспечивает равновесие между более высокой активностью байкалина в отношении СОХ-2 и более высокой активностью катехина в отношении СОХ-1, дает оптимальную модуляцию пути эйкозаноидов без желудочно-кишечных побочных эффектов, ассоциированных с избирательными в отношении СОХ-1 NSAID, и риска в отношении сердечно-сосудистой системы, ассоциированного с избирательными ингибиторами СОХ-2.
Важно также, что механизм действия полностью различен у доступных в настоящее время лекарственных препаратов и природной формулы UP736. Аспирин, Vioxx, целебрекс и бекстра необратимо связываются с ферментом СОХ посредством ковалентных связей с образованием тесно связанных комплексов фермент-ингибитор. Данное резкое взаимодействие полностью меняет активный центр фермента и боковой карман и разрушает фермент (см. статью Walker et al. (2001) Biochem. 357:709-718). Флавоноиды в UP736, с другой стороны, ингибируют фермент СОХ посредством более слабого и обратимого связывания вследствие своих антиоксидантных свойств. В данном процессе взаимодействия не происходит необратимого изменения структуры и функции фермента СОХ, которое приводит в результате улученной к значительной мере переносимости и профилю безопасности UP736.
Ингибирование активности LOX экстрактом флаванов, выделенным из А. catechu, оценивают с использованием анализа in vitro, направленного на скрининг липоксигеназы. Вследствие добавления флаванов к флавоноидам со свободным В-циклом UP736 ингибирует также активность 5-липоксигеназы (LOX). Ингибирование LOX приводит в результате к снижению накопления фагоцитарных лейкотриенов, которые непосредственно связаны с симптомами хронического воспаления, в также снижает потенциальные желудочно-кишечные побочные эффекты. Очевидно, что комбинация флавоноидов со свободным В-циклом с флаванами дает дополнительное преимущество существенного снижения продукции лейкотриенов. Данное снижение продукции лейкотриенов намного превышает действие традиционных нестероидных противовоспалительных лекарственных препаратов, таких как ибупрофен, в плане повышения активности и снижения побочных эффектов, обсуждаемых в разделе, посвященном предшествующему уровню техники.
Преимущества препарата, включающего смесь экстрактов флавоноида со свободным В-циклом и флавана, также продемонстрирована в двух исследованиях на животных, которые показали, что новая композиция проявляет неожиданные синергические эффекты. Композиция, используемая в данных двух исследованиях, включает смесь флавоноидов со свободным В-циклом, полученных из экстракта семян Oroxylum indicum (10,0 г) (партия # 040723), имеющую содержание флавоноида со свободным В-циклом кристина 62,3%, и флаванов, выделенных из экстракта целого растения Urticaria gambir (40,0 г) (партия # UG0407-050420) с общим содержанием катехина 32,5%. Комбинация двух вышеуказанных экстрактов в соотношении компонентов смеси 80:20 представляет препарат под названием UP736 (50,0 г, партия #ВН-283-14-1). Экстракт индивидуального флавоноида со свободным В-циклом из семян Oroxylum indicum, экстракт флавана из целого растения Unicaria gambir и комбинацию данных экстрактов (UP736) вводят перорально в дозе 100 мг/кг, используя индометацин как контроль на модели острого воспаления на животных, Тест опухания уха у мышей. Подавление опухания уха (подавление на 50,8%) при использовании UP736 существенно выше, чем при такой же дозе индивидуальных компонентов 36,5% при использовании экстракта Uncaria gambir и 31,7% при использовании экстракта Oroxylum indicum соответственно.
В другом анализе in vivo подавления опухания уха у мышей, вызываемого арахидоновой кислотой, также наблюдают синергические эффекты при использовании препарата, называемого UP736-K, который был смешан в соотношении 9:1 с экстрактом флавоноида со свободным В-циклом из корней S. baicalensis, включающим 25% байкалин, и 40% экстрактом катехина из целого растения Uncaria gambir. UP736-K включает 24% байкалина и 4% катехинов. Экстракт индивидуального флавоноида со свободным В-циклом из корней S. baicalensis, экстракт флавана из целых растений Unicaria gambir и комбинацию данных экстрактов (UP736-K) вводят перорально в дозе 100 мг/кг, используя индометацин как контроль. UP736-K демонстрирует статистически значимое улучшение в плане уменьшения отека относительно каждого из индивидуальных экстрактов.
max
max
Кроме того, вследствие различной биологической доступности, т.е. скорости и процента биологически активных соединений, проникающих через мембрану эпителиальных клеток, и местных концентраций биологически активных соединений, комбинация двух различных типов соединений (флаванов с более высокой полярностью относительно флавоноидов со свободным В-циклом с более низкой полярностью) дает как быстрое местное подавление COX/LOX биологически активными флаванами совместно с более длительно продолжающейся модуляцией пути COX/LOX физиологически активными флавоноидами со свободным В-циклом. Для флавоноидов со свободным В-циклом в UP736 необходимо около двух часов после перорального введения для достижения эффективных концентраций. Однако, сывороточная концентрация флавоноидов со свободным В-циклом будет оставаться выше терапевтических уровней в течение приблизительно 10 часов после перорального введения. Для компенсации отсутствия быстрой биодоступности у флавоноидов со свободным В-циклом препарат флаванов типа катехина дает дополняющее преимущество. Исследования биодоступности катехинов, кверцетина и эпигаллокатехин-3-галлата (см. статьи Као et al. (2000) Endocrinology 1410): 980-987; Koga and Meydani (2001) Am. J. Clin. Nutr. 73:941-948; Lee et al. (2002) Cancer Epidemiol. Biomarker Prevention 11:1025-1032) показывают, что C и T катехина проявляется быстро (приблизительно через 45 минут), и полупериод существования составляет, как сообщают, 2 часа. Вследствие этого путем комбинирования флавоноидов со свободным В-циклом с флаванами, быстро проникающими катехинами, достигают эффективных сывороточных концентраций в течение приблизительно 0,5 часа после перорального введения. Когда концентрация катехина падает, второй активный компонент, флавоноиды со свободным В-циклом, достигают биоактивных концентраций, которые будут продолжаться до 12 часов после перорального введения. В заключение, разрабатывают препарат UP736, который обладает быстрыми местными эффектами COX/LOX, обусловленными флаванами, такими как катехин, и более длительными эффектами, обусловленными флавоноидами со свободным В-циклом, такими как байкалин. Данные синергические и дополняющие эффекты также будут реализованы посредством местной доставки состава.
2
2
2
3+
Наконец, в предпочтительном варианте осуществления препарата, который имеет значительные количества флавоноидов со свободным В-циклом (80% по массе) при сравнительно более низкой концентрации флаванов (20% по массе), более сильные антиоксидантные флаваны будут работать как природные консерванты против окислительного разрушения флавоноидов со свободным В-циклом и для нейтрализации и забуферивания композиции, обеспечивающей доставку основных активных компонентов - флавоноидов со свободным В-циклом - при оптимальном рН и условиях ионизации. Катехин включает четыре фенольные гидроксильные группы, которые делают соединение более кислотным и чувствительным к окислительному стрессу. Чрезвычайно высокая способность поглощения кислородных радикалов (ORAC при 20000) катехина демонстрирует его антиоксидантные свойства. Основываясь на стресс-тесте чистого катехина в различных условиях, таких как pH, существование НО и ионов металлов, определяют (данные имеются, но не показаны), что катехин стабилен в нейтральных условиях как при 4°С, так и при 40°С, но не в основных условиях или под воздействием ионов металлов, таких как Fe. Катехин разлагается даже в слабощелочных условиях (рН=7,5). Однако он может быть сохранен с помощью ряда консервантов, включающих, но без ограничения перечисленным, хлорид олова (SnCl), бисульфат натрия/метабисульфит (SBS) и другие консерванты.
В настоящее изобретение включена новая композиция, содержащая смесь по меньшей мере одного флавоноида со свободным В-циклом, по меньшей мере одного флавана и по меньшей мере одного агента, выбранного из группы, состоящей из инъекционного противосвертывающего агента, выбранного из группы, включающей, но без ограничения перечисленным, гепарин, далтепарин, эноксапарин и тинцапарин; перорального противосвертывающего агента, выбранного из группы, включающей, но без ограничения перечисленным, варфарин, антагонисты витамина К и ингибиторы редуктазы витамина К; антитромбоцитарный агент, выбранный из группы, включающей, но без ограничения перечисленным, аспирин, клопидогрел и дипиридамол; лекарственного препарата против стенокардии, выбранного из группы, включающей, но без ограничения перечисленным, нитраты, β-блокаторы, блокаторы кальция, ингибиторы ангиотензин-конвертирующего фермента и активаторы калиевых каналов; нестероидный противовоспалительный лекарственный препарат (NSAID), выбранный из группы, включающей, но без ограничения перечисленным, ацетаминофен, ибупрофен, напроксен, диклофенак, салицилаты и индометацин, или избирательный ингибитор СОХ-2, выбранный из группы, включающей, но без ограничения перечисленным, рофекоксиб, целекоксиб, этодолак и мелоксикам.
Настоящее изобретение далее включает способы лечения и предупреждения заболеваний и состояний, связанных с агрегацией тромбоцитов и вызываемым тромбоцитами тромбозом. Тромбоз представляет собой нежелательное образование кровяных сгустков, который могут быть венозными или артериальными. UP736 можно использовать как антитромоцитарный, противосвертывающий и профилактический агент для предупреждения и лечения вышеупомянутых заболеваний и состояний. Способ заключается во введении нуждающемуся в этом хозяину эффективного количества композиции, включающей смесь флавоноидов со свободным В-циклом и флаванов, синтезированных и/или выделенных из одного растения или множества растений.
Заболевания и состояния, связанные с агрегацией тромбоцитов и вызываемым тромбоцитами тромбозом, которые можно предупредить и лечить согласно способу, представленному в данном изобретении, включают, но без ограничения перечисленным, тромбоз глубоких вен, легочную эмболию, атеросклероз, инфаркт миокарда, тромбоз сосудов головного мозга и/или эмболию сосудов головного мозга, приводящие к цереброваскулярным событиям, тромбозу периферической циркуляции и/или микроциркуляции, приводящему к ишемии и инфаркту, фибрилляции предсердий, которая ассоциирована со стазом крови и формированием тромбоза в левом предсердии, тромбогенными центрами, включая искусственные имплантаты, такие как механические сердечные клапаны, дефибрилляторы, хирургические имплантаты для доставки лекарственных препаратов и искусственные бедра, суставы и другие экзогенные органы.
Настоящее изобретение далее включает способы применения UP736 в качестве адъюванта, и/или синергического, и/или потенцирующего агента, которые заключаются во введении нуждающемуся в этом хозяину эффективного количества представленной композиции, включающей смесь по меньшей мере одного флавоноида со свободным В-циклом, по меньшей мере одного флавана и по меньшей мере одного агента, выбранного из группы, состоящей из инъекционного противосвертывающего агента, перорального противосвертывающего агента, антитромбоцитарного агента, агента против стенокардии, нестероидного противовоспалительного лекарственного препарата (NSAID) или избирательного ингибитора СОХ-2. Примеры инъекционных противосвертывающих агентов включают, но без ограничения перечисленным, гепарин, дальтепарин, эноксапарин и тинцапарин. Примеры пероральных противосвертывающих агентов включают, но без ограничения перечисленным, варфарин, антагонисты витамина К и ингибиторы редуктазы витамина К. Примеры антитромбоцитарных агентов включают, но без ограничения перечисленным, аспирин, клопидогрел и дипиридамол. Примеры лекарственных препаратов против стенокардии включают, но без ограничения перечисленным, нитраты, β-блокаторы, блокаторы кальция, ингибиторы ангиотензин-конвертирующего фермента и активаторы калиевых каналов. Нестероидные противовоспалительные лекарственные препараты (NSAID) включают, но без ограничения перечисленным, ацетаминофен, ибупрофен, напроксен, диклофенак, салицилаты и индометацин. Наконец, примеры избирательных ингибиторов СОХ-2 включают, но без ограничения перечисленным, рофекоксиб, целекоксиб, этодолак и мелоксикам.
Настоящее изобретение также включает способ уменьшения стандартной дозы антитромбоцитарного, противосвертывающего, профилактического агентов, NSAID и избирательных ингибиторов СОХ-2 для достижения либо равного, либо улучшенного клинического результата. Способ заключается во введении нуждающемуся в этом хозяину эффективного количества композиции, включающей смесь по меньшей мере одного флавоноида со свободным В-циклом и по меньшей мере одного флавана либо синтезированного и/либо выделенного из одного растения или множества растений, и фармацевтически приемлемый носитель в комбинации с указанным антитромбоцитарным, противосвертывающим, профилактическим агентом, NSAID или избирательным ингибитором СОХ-2.
UP736 представляет собой природный продукт, выделенный из двух традиционных растений, которые включают антиоксиданты и другие природные пищевые соединения, которые поддерживают организм различными путями. UP736 не является избирательным ингибитором СОХ-2, но он в 2,25 раза более избирателен в отношении СОХ-1 по сравнению с СОХ-2 и, кроме того, действительно ингибирует 5-липоксигеназу (LOX), которая регулирует путь, который приводит к образованию множества вазодилатирующих и хемотаксических лейкотриенов. Природная ингибирующая активность UP736 в отношении СОХ-2, как оценивают по ферментному ингибированию, приблизительно в 50-400 раз менее эффективна по сравнению с высокоизбирательными в отношении СОХ-2 лекарственными препаратами рофекоксибом и целекоксибом, как показано в табл. 1.
Таблица 1.
Активность UP736 в отношении СОХ-2 по сравнению с известными ингибиторами СОХ-2
Соединение
Избирательность в отношении СОХ-2 по сравнению с СОХ-1
Рофекоксиб
250
Целекоксиб
30
Ликофелон
1
UP736
0,44
Индометацин
0,016
Аспирин
0,006
UP736 является сильным антиоксидантом, который естественным образом регулирует образование информационной РНК NFκB и PPAR-γ, приводя в специфической понижающей регуляции TNFα, ИЛ-1β, ИЛ-6 и других провоспалительных цитокинов на уровнях как экспрессии генов, так и продукции белков.
Настоящее изобретение далее включают композицию и способ применения UP736 в качестве адъюванта, и/или синергического, и/или потенцирующего агента в сочетании с по меньшей мере одним нестероидным противовоспалительным лекарственным препаратом (NSAID), включая, но без ограничения перечисленным, ацетаминофен, ибупрофен, напроксен, диклофенак, салицилаты, индометацин, и по меньшей мере один из избирательных ингибиторов СОХ-2, включая, но без ограничения перечисленным, рофекоксиб, целекоксиб, этодолак и мелоксикам. Указанная композиция и способ снижают дозу NSAID, необходимых для достижения либо равного, либо улучшенного клинического результата, приводя к уменьшению побочных эффектов, ассоциированных с острым или постоянным применением NSAID, и противодействия или антагонистического действия в отношении рисков острого или постоянного применения NSAID. Данный способ представляет также средства достижения дополнительного и/или множества клинических преимуществ, обусловленных специфической понижающей регуляцией TNFα, ИЛ-1β, ИЛ-6 и других провоспалительных цитокинов, как описано выше.
Настоящее изобретение также включает композицию и способ снижения или устранения побочных эффектов, связанных с острым или постоянным применением антитромбоцитарного, противосвертывающего, профилактического агентов, NSAID и избирательных ингибиторов СОХ-2, посредством введения указанного агента в сочетании с UP736. Способ заключается во введении нуждающемуся в этом хозяину эффективного количества композиции, включающей смесь флавоноидов со свободным В-циклом и флаванов, синтезированных и/или выделенных из одного растения или множества растений, в комбинации с указанным антитромбоцитарным, противосвертывающим, профилактическим агентом, NSAID или избирательным ингибитором СОХ-2 и фармацевтически приемлемым носителем.
Настоящее изобретение, кроме того, включает способ противодействия или антагонистического действия в отношении рисков, связанных с острым или постоянным применением антитромбоцитарного, противосвертывающего, профилактического агентов, NSAID или избирательных ингибиторов СОХ-2, посредством совместного введения указанного агента с UP736. Способ заключается во введении нуждающемуся в этом хозяину эффективного количества композиции, включающей смесь флавоноидов со свободным В-циклом и флаванов, синтезированных и/или выделенных из одного растения или множества растений, в комбинации с указанным антитромбоцитарным, противосвертывающим, профилактическим агентом или NSAID, и фармацевтически приемлемый носитель.
Наконец, настоящее изобретение включает способы достижения дополнительного и/или множества клинических преимуществ путем совместного введения антитромбоцитарного, противосвертывающего, профилактического агентов, NSAID и избирательных ингибиторов СОХ-2 в комбинации с UP736. Как отмечено выше, UP736 является сильным антиоксидантом, который регулирует продукцию информационной РНК NFκB и PPAR-γ, приводя к специфической понижающей регуляции TNFα, ИЛ-1β, IL-6 и других провоспалительных цитокинов на уровнях как экспрессии генов, так и продукции белков. Способ заключается во введении нуждающемуся в этом хозяину эффективного количества композиции, включающей смесь флавоноидов со свободным В-циклом и флаванов, синтезированных и/или выделенных из одного растения или множества растений, в комбинации с антитромбоцитарным, противосвертывающим, профилактическим агентом, NSAID или избирательным ингибитором СОХ-2 и фармацевтически приемлемым носителем.
Настоящее изобретение направлено на терапевтические композиции, включающие терапевтические агенты, представленные в настоящем изобретении. Терапевтические агенты, представленные в данном изобретении, можно ввести любым подходящим способом, включая, например, парентеральное, наружное, пероральное или местное введение, такое как внутрикожное, посредством инъекции или с помощью аэрозоля. Конкретный способ введения будет зависеть от состояния, которое лечат. Предполагают, что введение агентов, представленных в настоящем изобретении, можно осуществить через жидкость тела или любую мишень или любую ткань, доступную для прохождения через нее жидкости тела. В предпочтительном варианте осуществления изобретения агент вводят в пероральной дозе. Данную доставку можно осуществить местно в любую пораженную область. Терапевтическая композиция может быть введена в ряде унифицированных дозированных форм в зависимости от способа введения. Например, унифицированные дозированные формы, подходящие для перорального введения животному, включают порошок, таблетки, пилюли и капсулы. Предпочтительные способы доставки терапевтической композиции, представленной в настоящем изобретении, включают внутривенное введение и местное введение, например, посредством инъекции или местного введения. Терапевтический реагент, представленный в настоящем изобретении, может быть введен любому животному, предпочтительно млекопитающим и более предпочтительно человеку.
Для конкретных способов доставки терапевтическую композицию, представленную в настоящем изобретении, можно получить так, чтобы она включала другие компоненты, такие как фармацевтически приемлемый наполнитель, адъювант и/или носитель. Например, композиции, представленные в настоящем изобретении, могут быть получены в наполнителе, который может переносить животное, которого предполагают лечить. Примеры данных наполнителей включают, но без ограничения перечисленным, целлюлозу, диоксид кремния, декстраны, сахарозу, гликолят крахмала натрия, фосфат кальция, сульфат кальция, воду, солевой раствор, раствор Рингера, раствор декстрозы, маннит, раствор Хенка и другие водные физиологически сбалансированные солевые растворы. Можно также использовать неводные носители, такие как жирные масла, кунжутное масло, этилолеат или триглицериды. Другие эффективные препараты включают суспензии, содержащие агенты, повышающие вязкость, такие как карбоксиметилцеллюлоза натрий, сорбит или декстран. Наполнители могут также включать минимальные количества добавок, таких как субстанции, которые повышают изотоничность и химическую стабильность. Примеры буферов включают фосфатный буфер, бикарбонатный буфер, Трис-буфер, гистидин, цитрат и глицин или их смеси, тогда как примеры консервантов включают тимеросал, м- или о-крезол, формалин и бензиловый спирт. Стандартные препараты могут быть либо жидкими инъекционными, либо твердыми, которые можно ввести в подходящей жидкости в виде суспензии или раствора для инъекций. Таким образом в нежидком препарате наполнитель может включать декстрозу, человеческий сывороточный альбумин, консерванты и т.п., к которым перед введением добавляют стерильную воду или солевой раствор.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения композиция может также включать адъювант или носитель. Адъюванты, как правило, представляют собой субстанции, которые в основном усиливают действие препарата при предупреждении и лечении показаний, связанных с путями СОХ и LOX. Подходящие адъюванты включают, но без ограничения перечисленным, адъювант Фрейнда, другие компоненты бактериальной клеточной стенки, соли альбумина, соли кальция, квасцы; бор, гистидин, глюкозаминсульфаты, хондроитинсульфат, глюконат меди, полинуклеотиды, витамин D, витамин К, токсоиды, хрящ акулы и крупного рогатого скота, белки сыворотки, белки вирусной оболочки, другие бактериальные препараты, γ-интерферон, адъюванты на основе блок-сополимеров, такие как адъювант Хантера (Vaxcel™, Inc. Norcross, Ga.); адъюванты Райби (доступны в фирме ImmunoChern Research, Inc., Hamilton, Mont.) и сапонины и их производные, такие как Quil А (доступен в фирме Superfos Biosector A/S, Denmark). Носители, как правило, представляют собой соединения, которые повышают полупериод существования терапевтической композиции в организме животного, которое лечат. Подходящие носители включают, но без ограничения перечисленным, полимерные препараты с контролируемым высвобождением, биоразлагаемые имплантаты, липосомы, бактерии, вирусы, масла, сложные эфиры и гликоли.
Один вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой препарат с контролируемым высвобождением, который способен медленно высвобождать композицию, представленную в настоящем изобретении, в организм животного. Как используют в данном контексте, препарат с контролируемым высвобождением включает композицию, представленную в настоящем изобретении, в носителе с контролируемым высвобождением. Подходящие носители с контролируемым высвобождением включают, но без ограничения перечисленным, биосовместимые полимеры, другие полимерные матрицы, капсулы, микрокапсулы, болюсные препараты, осмотические насосы, диффузионные устройства, липосомы, липосферы и чрескожные доставляющие системы. Другие препараты с контролируемым высвобождением, представленные в настоящем изобретении, включают жидкости, которые при введении животному образуют твердое вещество или гель in situ. Предпочтительные препараты с контролируемым высвобождением являются биоразрушаемыми (т.е. биоразлагаемыми).
После изготовления терапевтической композиции ее можно хранить в стерильных флаконах в виде раствора, суспензии, геля, эмульсии, твердого вещества или дегидратированного либо лиофилизированного порошка или непосредственно капсулированной и/или таблетированной с другими инертными носителями для перорального применения. Данные препараты можно хранить в форме, готовой к применению или требующей восстановления непосредственно перед введением. Путь введения препаратов, включающих композиции для системной доставки, может быть пероральным, подкожным, внутримышечным, внутривенным, интраназальным или вагинальным либо с помощью ректального суппозитория.
Количество композиции, которое будет эффективным при лечении конкретного нарушения или состояния, будет зависеть от природы нарушения или состояния, которое можно установить стандартными клиническими методами. Кроме того, анализы in vitro или in vivo необязательно можно использовать как вспомогательные при определении оптимальных интервалов доз. Точная доза, предназначенная для применения препарата, будет также зависеть от способа введения и тяжести или степени развития заболевания или состояния, и ее следует определять в соответствии с мнением лечащего врача и ситуацией для каждого пациента. Эффективные дозы можно экстраполировать на основании кривых зависимости доза-ответ, полученных в тест-системах in vitro или на моделях на животных. Например, эффективное количество композиции легко можно определить путем введения ступенчатых доз композиции и наблюдения требуемого эффекта.
Способ лечения, предложенный в данном изобретении, включает внутреннее или наружное введение нуждающемуся в этом пациенту терапевтически эффективного количества композиции, включающей смесь флавоноидов со свободным В-циклом и флаванов или смесь по меньшей мере одного флавоноида со свободным В-циклом, одного флавана и одного агента, выбранного из группы, состоящей из инъекционного противосвертывающего агента, перорального противосвертывающего агента, антитромбоцитарного агента, лекарственного препарата против стенокардии, нестероидного противовоспалительного лекарственного препарата (NSAID) или избирательного ингибитора СОХ-2. Чистота смеси включает, но без ограничения перечисленным, 0,01-100%, в зависимости от используемого метода получения соединения(ий). В предпочтительном варианте осуществления дозы смеси флавоноидов со свободным В-циклом и флаванов и содержащих их фармацевтических композиций представляют собой эффективное нетоксичное количество, как правило, выбранное интервала 0,01-200 мг/кг массы тела. Компетентные специалисты в данной области, используя рутинное клиническое тестирование, способны определить оптимальные дозы для конкретного заболевания, которое лечат.
Общий способ получения экстрактов описан в Примере 1. Процесс экстракции обеспечивает получение органического и водного экстракта для каждого из исследуемых видов. Результаты экстракции различных видов приводят в табл.2. Для эффективной идентификации активных соединений из растительных экстрактов используют способ высокоэффективного фракционирования, как описано в примере 2. Вкратце, активные органические и водные экстракты фракционируют, используя два различных метода соответственно. Фракции собирают в 96-луночные планшеты с глубокими лунками. Затем каждую из фракций тестируют на биологическую активность.
Разделение, очистка и идентификация активных флавоноидов со свободным В-циклом, присутствующих в органическом экстракте Scutellaria orthocalyx, описаны в примере 3. Со ссылкой на фиг.1 показывают десять соединений, причем байкалин идентифицирован как основной активный компонент.
В примере 4 и табл.3 приводят содержание и количество флавоноидов со свободным В-циклом в пяти активных растительных экстрактах из трех различных видов растений. Флавоноиды со свободным В-циклом присутствуют в значительно больших количествах в органических экстрактах по сравнению с водными экстрактами.
50
Разделение, очистка и идентификация активных компонентов, присутствующих в органическом экстракте Acacia catechu, описана в примере 5. Используя метод, описанный в примере 5, катехин и эпикатехин идентифицируют как два основных активных соединения в органическом экстракте из корней Acacia catechu, имеющем значения IC 5-7 мкг/мл. Количественная оценка с помощью HPLC активных экстрактов из Acacia catechu и Urticaria gambit описана в примере 6. Результаты приведены в табл.4, которая показывает, что содержание флаванов в органическом и водном экстрактах А. catechu, как определяют с помощью HPLC, составляет 30,4% и 1,0% соответственно. Пример 7 описывает общий способ получения стандартизованного экстракта из Acacia. В данном примере флаваны из А. catechu экстрагируют различными системами растворителей. Результаты приводят в табл.5. Усовершенствованный способ, предложенный в данном изобретении, включает: экстракцию измельченной биомассы растения, содержащей флаваны, органическим растворителем или комбинацией органического растворителя(ей) и/или воды; нейтрализацию и концентрирование нейтрализованного экстракта и очистку указанного экстракта перекристаллизацией и/или хроматографией. Из табл.5 можно видеть, что 80% метанол в воде является одним из наиболее предпочтительных растворителей для экстракции флаванов из растений Acacia. Как показано выше, данные флаваны можно выделить из растений родов Acacia и Urticaria. Способ, представленный в данном изобретении, можно распространить на выделение данных соединений из любого растительного источника, включающего данные соединения.
Пример 8 описывает общий способ получения стандартизованного экстракта из различных видов Scutellaria. В примере 8 флавоноиды со свободным В-циклом из двух видов Scutellaria экстрагируют различными системами растворителей. Результаты приводят в табл.6 и 7. Способ, представленный в данном изобретении, включает экстракцию измельченной биомассы растения, содержащей флавоноиды со свободным В-циклом, одним или комбинацией органического растворителя(ей) и/или воды; нейтрализацию и концентрирование нейтрализованного экстракта и очистку указанного экстракта перекристаллизацией и/или хроматографией. Как показано выше, данные флавоноиды со свободным В-циклом можно выделить из родов больше чем двадцати семейств растений. Способ, представленный в данном изобретении, можно распространить на выделение данных соединений из любого растительного источника, включающего данные соединения.
Пример 9 описывает общий способ получения композиции UP736, которая включает патентованную смесь двух стандартизованных экстрактов, включающую флавоноиды со свободным В-циклом и флаваны соответственно. В общем способе, представленном в примере 9, композицию получают, используя два стандартизованных экстракта, выделенных из Acacia и Scutellaria соответственно, вместе с наполнителями или без них. Экстракт Acacia, используемый в примере 9, включает >60% общих флаванов, таких как катехол и эпикатехин, и экстракт Scutellaria включает >70% флавоноидов со свободным В-циклом, основным из которых является байкалин. Экстракт Scutellaria включает другие минорные количества флавоноидов со свободным В-циклом, как показано в табл.8. Один или более наполнителей необязательно добавляют к представленной композиции. Количество добавляемого наполнителя может быть подведено на основе действительного содержания каждого требуемого ингредиента в активном виде. Таблица смешивания для каждой отдельной партии продукта должна создаваться на основе описания продукта и результатов QC для отдельной партии ингредиентов. Рекомендовано введение дополнительных количеств активных ингредиентов в интервале 2-5% для соответствия описанию продукта. Пример 9 иллюстрирует таблицу смешивания, которая создана для одной партии UP736 (партия #G1702). Получают также различные соотношения смеси приготовленного продукта UP736, тестированные на биологическую активность.
Пример 10 демонстрирует синергический эффект, которым обладает композиция, включающая смесь UP736 и аспирин, в отношении агрегации тромбоцитов, вызываемой арахидоновой кислотой. Результаты приведены в табл.9 и 10, которые демонстрируют, что, хотя UP736 в виде монокомпонента обладает низкой антиагрегационной активностью в концентрациях 10 мкМ, антиагрегационный эффект аспирина существенно повышается при таких низких дозах UP736, как 0,007 мкМ.
Снижение дозы аспирина могло бы теоретически уменьшить риск осложнений, связанных с кровотечением. Однако очень низкая доза аспирина может быть неэффективной при лечении или предупреждении ряда заболеваний и состояний. Например, для длительного лечения острого инфаркта миокарда эффект доз меньше чем 75 мг в день не выражен (см. статью Hennekens (2002) Am J. Manag. Care 8(22 Suppl):S691-700). Кроме того, у пациентов, которые не реагируют на низкие дозы аспирина, появляется устойчивость к аспирину (см. статью Patrono (2005) Thromb. Haemost. S: 1597-602). Настоящее изобретение решает проблему путем использования UP736 для потенцирования активности в отношении агрегации тромбоцитов, в значительной степени связанную с низкими дозами аспирина.
Пример 11 иллюстрирует, что UP736 в виде монокомпонента и в комбинации с аспирином обладает незначительным эффектом на время кровотечения. Результаты приведены в табл.11-14.
Отметим, что на протяжении данной заявки приведены различные ссылки. Каждый материал специально включен в данном контексте во всей своей полноте в виде ссылки.
Следующие примеры представлены только с иллюстративными целями и не предназначены для ограничения объема изобретения.
Примеры
Следующие примеры представлены только с иллюстративными целями и не предусматривают ограничения объема изобретения.
Пример 1. Получение органических и водных экстрактов из растения Acacia, Uncaria и Scutellaria
Растительный материал из коры Acacia catechu (L.) WMd., надземных частей Uncaria hirsute, надземных частей Uncaria sinensis, коры Uncaria tomentosa, корней Scutellaria orthocalyx, корней Scutellaria baicalensis или целого растения Scutellaria lateriflora измельчают до получения размера частиц не больше 2 мм. Затем высушенный измельченный растительный материал (60 г) переносят в колбу Эрленмеймера и добавляют метанол:дихлорметан (1:1) (600 мл). Смесь встряхивают в течение одного часа, фильтруют и биомассу снова экстрагируют смесью метанол:дихлорметан (1:1) (600 мл). Органические экстракты объединяют и упаривают под вакуумом для получения органического экстракта (см. табл 2 ниже). После органической экстракции биомассу сушат на воздухе и экстрагируют один раз ультрачистой водой (600 мл). Водный раствор фильтруют и лиофилизируют, получая водный экстракт (см. табл.2 ниже).
Таблица 2.
Выход органических и водных экстрактов видов Acacia, Uncaria и Scutellaria
Растительный источник
Количество
Органический экстракт
Водный экстракт
Acacia catechu, кора
60 г
27,2 г
10,8 г
Scutellaria orthocalyx, корни
60 г
4,04 г
8,95 г
Scutellaria baicalensis, корни
60 г
9,18 г
7,18 г
Scutellaria lateriflora (целое растение)
60 г
6,54 г
4,08 г
Uncaria hirsute, надземные части
60 г
2,41 г
0,90 г
Uncaria sinensis, надземные части
60 г
3,94 г
1,81 г
Uncaria tomentosa, кора
60 г
6,47 г
2,31 г
Пример 2. НТР-фракционирование активных экстрактов
Органический экстракт (400 мг) из активного растения нагружают на предварительно упакованную экспресс-колонку (2 см ID×8,2 см, 10 г силикагеля). Колонку элюируют, используя высокоэффективную систему очистки (НТР) Hitachi с градиентом подвижной фазы (А) 50:50 EtOAc:гексан и (В) метанол из 100% А в 100% В в течение 30 минут при скорости потока 5 мл/мин. Разделение мониторируют, используя УФ-детектор широкополосной волны, и фракции собирают в 96-луночный планшет с глубокими лунками по 1,9 мл/лунку, используя коллектор фракций Джилсона. Планшет для образцов сушат под низким вакуумом и центрифугированием. ДМСО (диметилформамид) (1,5 мл) используют для растворения образцов в каждой ячейке и часть (100 мкл) отбирают для биологического анализа ингибирования.
Водный экстракт (750 мг) из активного растения растворяют в воде (5 мл), фильтруют через шприц-фильтр 1 мкм и переносят в емкость объемом 4 мл для жидкостной хроматографии высокого давления (HPLC). Затем раствор вводят в автоматический пробоотборник на предварительно упакованной обращенно-фазовой колонке (С-18, размер частиц 15 мкм, 2,5 см ID×10 см с предколоночной вставкой). Колонку элюируют, используя высокоэффективную систему очистки (НТР) с градиентом подвижной фазы (А) вода и (В) метанол из 100% А в 100% В в течение 20 минут с последующим 100% метанолом в течение 5 минут при скорости потока 10 мл/мин. Разделение мониторируют, используя УФ-детектор широкополосной волны, и фракции собирают в 96-луночный планшет с глубокими лунками по 1,9 мл/лунку, используя коллектор фракций Джилсона. Планшет для образцов лиофилизируют. Ультрачистую воду (1,5 мл) используют для растворения образцов в каждой ячейке и часть (100 мкл) отбирают для биологического анализа ингибирования.
Пример 3. Выделение и очистка активных флавоноидов со свободным В-циклом из органического экстракта Scutellaria
1
+
Органический экстракт (5 г) из корней Scutellaria orthocalyx, выделенный, как описано в примере 1, нагружают на предварительно упакованную экспресс-колонку (120 г силикагеля, 40 мкм размер частиц 32-69 мкм, 25 см ID×4 см, 10 г силикагеля) и элюируют, используя градиент подвижной фазы (А) 50:50 EtOAc:гексан и (В) метанол из 100% А в 100% В в течение 60 минут при скорости потока 15 мл/мин. Фракции собирают в тест-пробирки по 10 мл/фракцию. Растворитель выпаривают под вакуумом и образец в каждой фракции растворяют в 1 мл ДМСО и аликвоту 20 мкл переносят в 96-луночный планшет с мелкими лунками и тестируют на биологическую активность (данные не показаны). Основываясь на результатах биологического анализа, активные фракции #31-#39 объединяют и упаривают. Анализ посредством HPLC/PDA и ЖХ/МС дает основное соединение с временем удержания 8,9 минут и МС-пиком при 272 m/е. Продукт далее очищают на полупрепаративной колонке С18 (25 см×1 см) и градиентом подвижной фазы (А) вода и (В) метанол в течение 45 минут при скорости потока 5 мл/минуту. Собирают 88 фракций, получая 5,6 мг твердого вещества светло-желтого цвета. Чистоту определяют с помощью HPLC/PDA и ЖХ/МС и сравнения со стандартами и данными ЯМР-спектроскопии. Данные H ЯМР-спектроскопии: δ ppm (DMSO-d6) 8,088 (2Н, m, Н-3',5'), 7,577 (3Н, m, Н-2',4',6'), 6,932 (1Н, s, Н-8), 6,613 (1Н, s, Н-3). МС: [М+1] = 271 m/е. Соединение идентифицируют как байкалеин.
С помощью хроматографии на препаративной колонке С-18 выделяют и идентифицируют другие флавоноиды со свободным В-циклом при использовании стандартизованного экстракта, выделенного из корней Scutellaria baicalensis (партия # RM052302-01), имеющего содержание флавоноидов со свободным В-циклом 82,2%. Используя HPLC/PDA/MC, представляют одиннадцать структур, как проиллюстрировано на фиг.1. Со ссылкой на фиг.1 одиннадцать идентифицированных соединений представляют собой байкалин, вогонин-7-глюкуронид, ороксилин А 7-глюкуронид, байкалеин, вогонин, кристин-7-глюкуронид, 5-метил-вогонин-7-глюкуронид, скулелларин, норвогонин, кристин и ороксилин А.
Пример 4. Количественная оценка HPLC флавоноидов со свободным В-циклом в активных экстрактах, выделенных из Scutellaria orthocalyx (корни), Scutellaria baicalensis (корни) и Oroxylum indicum (семена)
Подтверждают присутствие и количество флавоноидов со свободным В-циклом в пяти активных экстрактах, выделенных из трех различных видов растений, и приводят данные в табл. 3. Флавоноиды со свободным В-циклом подвергают количественному анализу с помощью HPLC, используя колонку Luna С-18 (250×4,5 мм, 5 мкм) при использовании 1% фосфорной кислоты и градиента ацеонитрила от 80% до 20% в течение 22 минут. Флавоноиды со свободным В-циклом определяют при использовании УФ-детектора при длине волны 254 нм и идентифицируют на основе времени удержания по сравнению со стандартами флавоноидов со свободным В-циклом.
Таблица 3.
Содержание флавоноидов со свободным В-циклом в активных растительных экстрактах
Активные экстракты
Масса экстракта
%, экстрагируемый из биомассы
Общее количество флавоноидов со свободным В-циклом
% флавоноидов со свободным В-циклом в экстракте
Scutellaria orthocalyx (водный экстракт)
8,95 г
14,9%
0,2 мг
0,6%
S. orthocalyx (органическийэкстракт)
3,43 г
5,7%
1,95 мг
6,4%
S. baicalensis (водныйэкстракт)
7,18 г
12,0%
0,03 мг
0,07%
S. baicalensis (органический экстракт)
9,18 г
15,3%
20,3 мг
35,5%
Oroxylum indicum (органическийэкстракт)
6,58 г
11,0%
0,4 мг
2,2%
Пример 5. Выделение и очистка активных соединений из органического экстракта Acacia catechu
Органический экстракт (5 г) из корней A. catechu, выделенный, как описано в примере 1, нагружают на предварительно упакованную колонку для экспресс-хроматографии (120 г диоксида кремния, 40 мкм размер частиц 32-60 мкм, 25 см×4 см) и элюируют градиентом подвижной фазы (А) 50:50 EtOAc:гексан и (В) метанол от 100% А до 100% В в течение 60 минут при скорости потока 15 мл/мин. Фракции собирают с тест-пробирки по 10 мл/фракцию. Растворитель упаривают под вакуумом и образец из каждой фракции растворяют в ДМСО (1 мл) и аликвоту 20 мкл переносят в 96-луночный планшет с мелкими лунками и тестируют на биологическую активность (данные не приводят). Основываясь на результатах биологического анализа, активные фракции #32-#41 объединяют и упаривают, получая 2,6 г твердого вещества. Анализ HPLC/PDA и ЖХ/МС показывает два основных соединения со временем удержания 15,8 и 16,1 минут соответственно. Продукт далее очищают на полупрепаративной колонке С18 (25 см×1 см), на которую нагружают 212,4 мг продукта и элюируют градиентом подвижной фазы (А) вода и (В) ацетонитрил (ACN) в течение 60 минут при скорости потока 5 мл/минуту. Собирают 88 фракций и выделяют два активных соединения, соединение 1 (11,5 мг) и соединение 2 (16,6 мг). Чистоту определяют сравнением данных HPLC/PDA ЖХ/МС со стандартами (катехином и эпикатехином) и по данным ЯМР-спектроскопии.
13
1
+
Соединение 1. Данные С ЯМР-спектроскопии: δ ppm (ДМСО-d6) 27,84 (С4), 66,27 (С3), 80,96 (С2), 93,78 (С9), 95,05 (С7), 99,00 (С5), 114,48 (С12), 115,01 (С15), 118,36 (С16), 130,55 (С11), 144,79 (С14), 155,31 (С6), 156,12 (С10), 156,41 (С8). Данные H ЯМР-спектроскопии: δ ppm (ДМСО-d6) 9,150 (1Н, s, ОН), 8,911 (1Н, s, ОН), 8,835 (1Н, s, ОН), 8,788 (1Н, s, ОН), 6,706 (1Н, d, J=2 Гц, Н2'), 6,670 (1Н, d, J=8,0 Гц, Н-6'), 6,578 (1Н, dd, J=2, 8 Гц, Н-5'), 5,873 (1Н, d, J=2 Гц, Н8), 5,670 (1Н, d, J=2 Гц, Н6), 4,839 (1Н, d, J=4 Гц, ОН), 4,461 (1Н, d, J=7,3 Гц, Н2), 3,798 (1Н, m, Н3), 2,625 (1Н, m, H4b), 2,490 (1Н, m, Н4а), МС: [М+1] = 291 m/е. Данное соединение идентифицируют как катехин.
13
1
+
Соединение 2. Данные С ЯМР-спектроскопии: δ ppm (ДМСО-d6) 28,17 (С4), 64,87 (С3), 78,02 (С2), 94,03 (С9), 95,02 (С7), 98,44 (С5), 114,70 (С12), 114,85 (С15), 117,90 (С16), 130,56 (С11), 144,39 (С14), 155,72 (С6), 156,19 (С10), 156,48 (С8). Данные Н ЯМР-спектроскопии: δ ppm (ДМСО-d6) 9,083 (1Н, s, ОН), 8,873 (1Н, s, ОН), 8,777 (1Н, s, ОН), 8,694 (1Н, s, ОН), 6,876 (1Н, d, 3=2 Гц, Н2'), 6,646 (2Н, s, Н-5', G), 5,876 (1Н, d, J =2 Гц, Н8), 5,700 (1Н, d, J =2 Гц, Н6), 4,718 (1Н, s, ОН), 4,640 (1Н, d, J=4,5 Гц, Н2), 3,987 (1Н, d, J=4,5 Гц, Н3), 2,663 (1Н, dd, J=4,6, 6,3 Гц, H4b), 2,463 (1Н, dd, J=4,6, 6,3 Гц, H4a), МС: [M+1] = 291 m/e. Данное соединение идентифицируют как эпикатехин.
Пример 6. Количественная оценка с помощью HPLC активных экстрактов из Acacia catechu и Unicaria gambir
Содержание флаванов в органическом и водном экстрактах, выделенных из ядра древесины Acacia catechu, количественно определяют с помощью HPLC, используя детектор PhotoDiode Array (HPLC/PDA) и колонку Luna C18 (250 мм×4,6 мм). Флаваны элюируют с колонки, используя градиент ацетонитрила от 10% до 30% АЦН в течение 20 мин, а затем 60% АЦН в течение пяти минут. Результаты приводят в табл.4. Профиль очистки HPLC показан на фиг.2. Флаваны количественно определяют на основании времени удержания и данных PDA при использовании катехола и эпикатехина в качестве стандартов. Время удержания для двух основных флаванов составляет 12,73 минуты и 15,76 минут соответственно.
Таблица 4.
Содержание флаванов в активных растительных экстрактах
Активные экстракты из ядра древесины Acacia catechu
Масса экстракта
%, экстрагируемый из биомассы
% флаванов в экстракте
Водный экстракт
10,8 г
18,0%
0,998%
Органический экстракт
27,2 г
45,3%
30,37%
Содержание флаванов в стандартизованном экстракте (партия #UG0407-050420), выделенном из целых растений Urticaria gambir, количественно определяют с помощью HPLC, используя детектор PhotoDiode Array (HPLC/PDA) и колонку Luna С18 (250 мм×4,6 мм). Флаваны элюируют с колонки, используя градиент ацетонитрила от 10% до 30% АЦН в течение 20 мин, а затем 60% АЦН в течение пяти минут. Флаваны количественно определяют на основании времени удержания и данных PDA при использовании катехина в качестве стандартов как 28,6% катехин и 3,9% эпикатехин.
Пример 7. Получения стандартизованного экстракта из Acacia catechu
Acacia catechu (500 мг измельченной коры) экстрагируют следующими системами растворителей: (1) 100% воды, (2) 80:20 вода: метанол, (3) 60:40 вода:метанол, (4) 40:60 вода:метанол, (5) 20:80 вода:метанол, (6) 100% метанол, (7) 80:20 метанол:ТГФ (тетрагидрофуран), (8) 60:40 метанол:ТГФ. Экстракты концентрируют и сушат под низким вакуумом. Идентификацию химических компонентов в каждом экстракте осуществляют HPLC при использовании детектора PhotoDiode Array (HPLC/PDA) и колонки С18 250 мм×4,6 мм. Химические компоненты количественно определяют на основании времени удержания и данных PDA при использовании катехина и эпикатехина в качестве стандартов. Результаты приводят в табл.5. Как показано в табл.5, экстракт флаванов, полученный из экстракта растворителями с использованием системы 80% метанол/вода, дает самую высокую концентрацию флавановых компонентов.
Таблица 5.
Растворители для получения стандартизованных флавановых экстрактов из Acacia catechu
Растворитель дляэкстракции
Массаэкстракта
%, экстрагируемыйиз биомассы
Общееколичествокатехинов
% катехинов в экстракте
100% воды
292,8 мг
58,56%
13 мг
12,02%
Вода:метанол (80:20)
282,9 мг
56,58%
13 мг
11,19%
Вода:метанол (60:40)
287,6 мг
57,52%
15 мг
13,54%
Вода:метанол (40:60)
264,8 мг
52,96%
19 мг
13,70%
Вода:метанол (20:80)
222,8 мг
44,56%
15 мг
14,83%
100% метанол
215,0 мг
43,00%
15 мг
12,73%
Метанол:ТГФ (80:20)
264,4 мг
52,88%
11 мг
8,81%
Метанол:ТТФ (60:40)
259,9 мг
51,98%
15 мг
9,05%
Пример 8. Получение стандартизованных экстрактов флавоноидов со свободным В-циклом из Scutellaria species
Scutellaria orthocalyx (500 мг измельченных корней) дважды экстрагируют 25 мл следующих систем растворителей: (1) 100% вода, (2) 80:20 вода:метанол, (3) 60:40 вода:метанол, (4) 40:60 вода:метанол, (5) 20:80 вода:метанол, (6) 100% метанол, (7) 80:20 метанол:ТГФ, (8) 60:40 метанол:ТГФ. Экстракты объединяют, концентрируют и сушат под низким вакуумом. Идентификацию химических компонентов осуществляют с помощью HPLC, используя детектор PhotoDiode Array (HPLC/PDA) и колонки С18 250 мм×4,6 мм. Химические компоненты количественно оценивают на основании времени удержания и данных PDA, используя байкалеин, байкалин, скутеллареин и вогонин в качестве стандартов. Результаты приводят в табл.6.
Таблица 6.
Количественное определение флавоноидов со свободным В-циклом, экстрагированных из Scutellaria orthocalyx
Растворитель для экстракции
Масса экстракта
%,экстрагируемый из биомассы
Общееколичествофлавоноидов
% флавоноидов в экстракте
100% воды
96 мг
19,2%
0,02 мг
0,20%
Вода:метанол (80:20)
138,3 мг
27,7%
0,38 мг
0,38%
Вода:метанол (60:40)
169,5 мг
33,9%
0,78 мг
8,39%
Вода:метанол (40:60)
142,2 мг
28,4%
1,14 мг
11,26%
Вода:метанол (20:80)
104,5 мг
20,9%
0,94 мг
7,99%
100% метанол
57,5 мг
11,5%
0,99 мг
10,42%
Метанол:ТГФ (80:20)
59,6 мг
11,9%
0,89 мг
8,76%
Метанол:ТГФ (60:40)
58,8 мг
11,8%
1,10 мг
10,71%
Scutellaria baicalensis (1000 мг измельченных корней) дважды экстрагируют, используя 50 мл смеси метанола и воды, следующим образом: (1) 100% воды, (2) 70:30 вода:метанол, (3) 50:50 вода:метанол, (4) 30:70 вода:метанол, (5) 100% метанола. Экстракты объединяют, концентрируют и сушат под низким вакуумом. Идентификацию химических компонентов осуществляют с помощью HPLC, используя детектор PhotoDiode Array (HPLC/PDA) и колонку С18 250 мм×4,6 мм. Химические компоненты в каждом экстракте количественно оценивают на основании времени удержания и данных 10 PDA, используя байкалеин, байкалин, скутеллареин и вогонин в качестве стандартов. Результаты приводят в табл.7.
Таблица 7.
Количественное определение флавоноидов со свободным β-циклом, экстрагированных из Scutellaria baicalensis
Растворитель для экстракции
Масса экстракта
%, экстрагируемый из биомассы
Общее количествофлавоноидов
% флавоноидов в экстракте
100% воды
277,5 мг
27,8%
1 мг
0,09%
Вода:метанол (70:30)
338,6 мг
33,9%
1,19 мг
11,48%
Вода:метанол (50:50)
304,3 мг
30,4%
1,99 мг
18,93%
Вода:метанол (30:70)
293,9 мг
29,4%
2,29 мг
19,61%
100% метанол
204,2 мг
20,4%
2,73 мг
24,51%
Пример 9. Получение препарата со стандартизованным экстрактом флавоноидов со свободным В-циклом из корней Scutellaria baicalensis и стандартизованным экстрактом флаванов из коры Acacia catechu
Представленную новую композицию, называемую в данном контексте UP736, получают, используя два стандартизованных экстракта, выделенных из Acacia и Scutellaria соответственно, совместно с одним или более наполнителей. Общий пример получения данной композиции приведен ниже. Экстракт Acacia, используемый в данном примере, включает >60% общих флаванов, таких как катехол и эпикатехин, и экстракт Scutellaria включает >70% флавоноидов со свободным В-циклом, которые в основном представлены байкалином. Экстракт Scutellaria включает минорные количества других флавоноидов со свободным В-циклом, как показано в табл.8. К представленной композиции добавляют один или более наполнителей. Соотношение флавана и флавоноидов со свободным В-циклом можно подвести на основе показаний и специфических требований в плане биологической активности продукта. Количество наполнителей можно подвести, основываясь на действительном активном содержании каждого ингредиента. Таблица смешивания для каждой отдельной партии продукта должна создаваться на основе описания продукта и результатов QC для отдельной партии ингредиентов. Рекомендовано введение дополнительных количеств активных ингредиентов в интервале 2-5% для соответствия описанию продукта. Табл.8 иллюстрирует таблицу смешивания, которая создана для одной партии UP736 (партия #G1702).
Экстракт корней Scutellaria baicalensis (38,5 кг) (партия # RM052302-01) с содержанием флавоноидов со свободным В-циклом 82,2% (байкалин); экстракт коры Acacia catechu (6,9 кг) (партия # RM052902-01) с общим содержанием флаванов 80,4% и наполнитель (5,0 кг Candex) смешивают, получая препарат UP736 (50,4 кг), имеющий соотношение смеси 85:15. В табл.8 представляют количественную оценку активных флавоноидов со свободным В-циклом и флаванов данной специальной партии UP736 (партия #G1702), установленную с использованием способов, предложенных в Примерах 4 и 6.
Согласно табл.8, данная специальная партия UP736 включает 86% общих активных ингредиентов, в том числе 75,7% флавоноидов со свободным В-циклом и 10,3% флаванов. Из данной партии UP736 (50,0 кг) получают конечный продукт с двумя различными уровнями доз в форме капсул: 125 мг/дозу (60 капсул) и 250 мг/дозу (60 капсул).
С помощью того же подхода получают две других партии UP736, используя комбинацию стандартизованного экстракта флавоноида со свободным В-циклом из корней Scutellaria baicalensis и стандартизованного экстракта флавана из коры Acacia catechu, имеющую соотношение в смеси 50:50 и 20:80 соответственно.
Таблица 8
Содержание флаваноидов со свободным В-циклом и флавана в UP736
Активные компоненты
Содержание, %
1. Флавоноиды
а. Байкалин
62,5%
б. Минорные флавоноиды
i. Вогонин-7-глюкуронид
6,7%
ii. Ороксилин А 7-глюкуронид
2,0%
iii. Байкалеин
1,5%
iv. Вогонин
1,1%
v. Крисин-7-глюкуронид
0,8%
vi. 5-метил-вогонин-7-глюкуронид
0,5%
vii. Скутелларин
0,3%
viii. Норвогонин
0,3%
ix. Крисин
<0,2%
х. Ороксилин А
<0,2%
в. Общие флавоноиды со свобоным В-циклом
75,7%
2. Флаваны
а. Катехин
9,9%
б. Эпикатехин
0,4%
в. Субобщие флаваны
10,3%
3. Общие активные ингредиенты
86%
Пример 10. Демонстрация синергического эффекта композиции, включающей смесь UP736 и аспирина, на ингибирование агрегации тромбоцитов, вызываемой арахидоновой кислотой
Синергический эффект композиции, включающей смесь UP736 и аспирина, на ингибирование агрегации тромбоцитов, вызываемой арахидоновой кислотой, продемонстрировано в анализе агрегации тромбоцитов с использованием плазмы, богатой тромбоцитами, полученной от новозеландских кроликов. На кроликов (2,75±0,25 кг) воздействуют цитратом натрия (конечная концентрация 0,13 М). UP736, аспирин или их комбинации растворяют в 0,3% ДМСО и инкубируют с плазмой при 37°С в течение 5 минут. Агонистический или антагонистический эффект соединений количественно оценивают по оптической плотности агрегации. Критерий значимости, используемый для агонистического эффекта, состоит в ≥50% агрегации тромбоцитов относительно ответа на арахидоновую кислоту. Критерий значимости, используемый для антагонистического эффекта, состоит в ≥50% ингибировании агрегации тромбоцитов, вызываемой арахидоновой кислотой. В данном анализе различные концентрации UP736 (10, 2 и 0,2 мкМ) и аспирина (30 и 3 мкМ) тестируют отдельно либо как агонист, либо как антагонист агрегации тромбоцитов в богатой тромбоцитами плазме кроликов. В табл. 9 показывают результаты теста (Тест#1).
Таблица 9.
Синергический эффект смесей UP736 и аспирина на ингибирование вызываемой АК агрегации тромбоцитов
Концентрацияаспирина (мкМ)
КонцентрацияUP736 (мкМ)
N
Агонистический эффект
Антагонистический эффект
0
10,0
2
0%
3%
0
2,0
2
0%
0%
0
0,2
2
0%
0%
3,0
10,0
2
0%
100%
3,0
2,0
2
0%
100%
3,0
0,2
2
0%
100%
30,0
0
2
0%
100%
3,0
0
2
0%
1%
В другом анализе (тест#2), проводимом в таких же экспериментальных условиях, тестируют смеси UP736 в более низких концентрациях (0,2, 0,067, 0,022 и 0,007 мкМ) и аспирин в концентрации 3 мкМ. Результаты приводят в табл.10.
Результаты исследования агрегации тромбоцитов демонстрируют, что UP736 в виде монокомпонента имеет низкую агрегационную активность в концентрациях до 10 мкМ (табл.9 и 10). Однако активность аспирина в отношении агрегации тромбоцитов в очень низкой дозе (3 мкМ) существенно повышается с помощью UP736 даже в самой низкой из тестрируемых концентраций (0,007 мкМ).
Таблица 10.
Синергический эффект смеси UP736 и аспирина на ингибирование вызванной АК агрегации тромбоцитов
Концентрацияаспирина (мкМ)
КонцентрацияUP736 (мкМ)
N
Агонистическийэффект
Антагонистическийэффект
0
0,2
2
0%
9%
3,0
0,2
2
0%
100%
3,0
0,067
2
0%
100%
3,0
0,022
2
0%
100%
3,0
0,007
2
0%
100%
3,0
0
2
0%
8
Пример 11. Эффект UP736 и смесей UP736 и аспирина на время кровотечения
Хотя UP736 проявляет синергический эффект с аспирином при ингибировании агрегации тромбоцитов (Таблицы 9 и 10), UP736 ни в виде монопрепарата, ни в комбинации с аспирином не показывает существенного эффекта на время кровотечения у мышей. Анализ времени кровотечения проводят согласно методу, описанному в статьях Minsker and Kling (1997) Thrombosis Research 10:619-622) и Butler et al. (1982) Thromb Haemostas 47:46-49. Тест-продукты вводят пяти самцам мышей ICR за один час до стандартизованного отсечения конца (1,0 мм) каждого хвоста. Мышей, закрепленных в держателе, немедленно подвешивают вертикально, причем концы хвостов погружают в тест-пробирку, содержащую солевой раствор, при 37°С. Максимальное время отсечения не устанавливают. Измерения начинают, когда наблюдают действительное кровотечение, и заканчивают, когда кровотечение прекращается, в течение 15 секунд или любого более длительного времени. Данные анализируют, используя t-критерий Стьюдента. В одном анализе (тест#3) аспирин в виде монопрепарата в дозе 3, 10, 65 и 100 мг/кг или UP736 в дозе 100 мг/кг в виде монопрепарата или в комбинации с аспирином в дозе 3, 10 и 65 мг/кг вводят перорально группам из 5 самцов мышей ICR. Результаты приводят в табл.11, которая показывает среднее время кровотечения и процент превышения времени кровотечения в группах лечения относительно контроля с введением носителя. Ссылаясь на табл.11, результаты демонстрируют, что эффект UP736 на время кровотечения не является существенным, и эффект UP736 в комбинации с аспирином в повышенных концентрациях, лежащих в интервале от 3 мг/кг до 65 мг/кг, ограничен и не превышает эффекта, вызываемого 100 мг/кг аспирина в виде монопрепарата. Анализ повторяют в тех же экспериментальных условиях (тест#4). Результаты приводят в табл.12, которая показывает среднее время кровотечения и процент превышения времени кровотечения в группах лечения относительно контроля с введением носителя (n=5). Как можно видеть в табл.11 и 12, в двух экспериментах получают очень хорошо совместимые результаты. Данные из двух экспериментов объединяют и представляют в табл.13 и на фиг.3 (n= 9-10).
Таблица 11.
Среднее время кровотечения и % увеличения времени кровотечения в тесте #3 (n=5)
Группа лечения
Среднее время кровотечения ±SD* (с)
% изменения относительно группы, получающей носитель
Носитель
65±1,0
-
3 мг/кг аспирина
77,2±13,0
18,7↑
10 мг/кг аспирина
74,4±15,4
14,5↑
65 мг/кг аспирина
105±15,1
61,5*↑
100 мг/кг аспирина
119±14,0
83*↑
3 мг/кг аспирина +
82±12,6
26,2†↑
100 мг/кг UP736
10 мг/кг аспирина + 100 мг/кг UP736
76,5±17,7
17,7†↑
65 мг/кг аспирина + 100 мг/кг UP736
113,2±33,3
74,2†↑
100 мг/кг UP736
76,4±13,0
17.5↑
* - стандартное отклонение
Таблица 12.
Среднее время кровотечения и % увеличения времени кровотечения в тесте #4 (n=5)
Группа лечения
Среднее время кровотечения ±SD (сек.)
% изменения относительно группы, получающей носитель
Носитель
72,6±13,0
-
3 мг/кг аспирина
89,4±9,7
23,1↑
10 мг/кг аспирина
84,6±9,0
16.5↑
65 мг/кг аспирина
96±6,4
32,2*↑
100 мг/кг аспирина
126,2±14,3
73,8*↑
3 мг/кг аспирина + 100 мг/кг UP736
92±9,3
26,7*↑
10 мг/кг аспирина + 100 мг/кг UP736
92,6±16,4
27,5*↑
65 мг/кг аспирина + 100 мг/кг UP736
112,8±16,0
55,3*↑
100 мг/кг UP736
83,4±6,8
14,9↑
Таблица 13.
Среднее время кровотечения и % увеличения времени кровотечения (тест #3 и #4 (n=9-10))
Группа лечения
Среднее время кровотечения ±SD (с)
% изменения относительно группы, получающей носитель
Значение Р
Носитель
68,8±12,0
-
-
3 мг/кг аспирина
83,3±12,6
21,7↑
0,016854
10 мг/кг аспирина
79,5±13,1
15,6↑
0,072734
65 мг/кг аспирина
100,5±11,9
46,1↑
1.32Е-05
100 мг/кг аспирина
122,6±13,9
78,2↑
2.85Е-08
3 мг/кг аспирина + 100 мг/кг UP736
87,0±11,7
26,5↑
0,002958
10 мг/кг аспирина + 100 мг/кг UP736
85,4±25,5
24,1↑
0,028458
65 мг/кг аспирина + 100 мг/кг UP736
113,0±25,5
64,2↑
0,00013
100 мг/кг UP736
79,9±10,5
16,1↑
0,041085
Для подтверждения результатов времени кровотечения UP736 или UP736 в комбинации с аспирином снова тестируют в независимом исследовании (Test #5) с использованием модифицированного осуществленного способа. UP736 вводят перорально в дозе 100 мг/кг в виде монопрепарата или в комбинации с аспирином в дозе 3, 10 и 30 мг/кг группам из 5 самцов мышей ICR с массой тела 22±2 г за 1 час до отсечения конца (0,3 мм) каждого хвоста. Кроме того, мышам аналогичным образом дают аспирин в дозе 3, 10, 30 и 100 мг/кг. Мышей, закрепленных в держателе, немедленно подвешивают вертикально, причем 2 концевых см каждого хвоста погружают в тест-пробирку, содержащую солевой раствор, при 37°С. Устанавливают максимальное время отсечения 180 с. Если кровотечение прекращается, в течение 15 секунд или позднее в любое время в течение 180 секунд периода наблюдения измерения прекращают и любое последующее кровотечение не принимают во внимание. Увеличение времени кровотечения на 50% или более (50%) относительно контрольной группы животных считают значимым. Результаты согласуются с полученными в вышеописанных экспериментах (тест #3 и #4). Эффект UP736 в дозе 100 мг/кг на время кровотечения не является существенным, и эффект UP736 в дозе 100 мг/кг в комбинации с аспирином в дозе 30 мг/кг меньше, чем эффект, обусловленный аспирином в виде монопрепарата в дозе 100 мг/кг (см. табл.14 и фиг.4).
Таблица 14.
Среднее время кровотечения и % увеличения времени кровотечения в тесте #5 (n=5)
Группа лечения
Среднее время кровотечения ±SD (с)
% изменения относительно группы, получающей носитель
Носитель
44,4±15,0
-
3 мг/кг аспирина
42,8±26,2
0
10 мг/кг аспирина
39,8±22,4
0
65 мг/кг аспирина
56,4±27,3
27↑
100 мг/кг аспирина
75,0±38,8
70*↑
Носитель 2 (20% ДМСО)
55,4±32,5
-
3 мг/кг аспирина + 100 мг/кг UP736
53,2±27,1
0↑
10 мг/кг аспирина + 100 мг/кг UP736
69,6±45,4
27↑
30 мг/кг аспирина + 100 мг/кг UP736
87,2±59,2
58*↑
100 мг/кг UP736
45,4±23,1
0