Способ оценки состояния биоклетки
METHOD FOR ASSESSING STATE OF A BIOCELL

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для визуализации биологических объектов, в частности для биологических исследований одиночной клетки и различных процессов на внутриклеточном уровне.
2
2
Известен способ биологической визуализации, включающий мечение анализируемых клеточных компонент, клеток, тканей или органов флуоресцентными зондами, состоящими из биологически распознающих молекул и флуоресцентных красителей, излучающих в инфракрасной области и последующую регистрацию флуоресценцию красителей, в качестве которых используют полупроводниковые нанокристаллы PbS/CdS/ZnS, CuInS/ZnS, AgS (Патент RU 2639125; МПК G01N 21/64, G01N 33/53, B82Y 15/00; 2017 год).
Однако в известном способе визуализации не возможно наблюдение внутренней структуры клетки вследствие значительных размеров зонда, состоящего из распознающей молекулы и флуоресцентного красителя.
16
3
Известен способ изучения состояния клетки при цитомегаловирусной инфекции с помощью квантовых точек на основе CdS, включающий контакт “клеточных” тест-препаратов с коллоидным раствором квантовых точек (КТ) на основе полупроводниковых нанокристаллов сульфида кадмия (CdS) с концентрацией 10наночастиц в 1 см раствора (в случае размера наночастиц, равного 3 нм, концентрация CdS равна 12.5 мМ), регистрацию флуоресценции полученных образцов на оптическом флуоресцентном микроскопе с использованием ультрафиолетового фильтра в диапазоне длин волн от 335 до 445 нм, получение микрофотографий и их обработку с помощью стандартных программ.  Способ позволяет наблюдать изменения клеточных структур на модели продуктивной цитомегаловирусной инфекции, последовательно обнаруживая изменение веретенообразной формы клеток до округлой, разрыхление монослоя и появление образований «совиный глаз» (Ремпель С.В., Александрова Н.Н., Порываева А.П., Ремпель А.А. «Изучение состояния клетки при цитомегаловирусной инфекции с помощью квантовых точек на основе CdS», Вестник уральской медицинской академической науки, № 2, 2014, с. 190-192).
Однако известный способ не обеспечивает достаточную достоверность и воспроизводимость наблюдения внутренней структуры клетки, поскольку необходимая для неразрушающей клетки коньюгации концентрация наночастиц устанавливается путем разбавления раствора, без учета диапазона максимальной интенсивности люминесценции и концентрационного тушения.
Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ оценки состояния биоклетки путем ее визуализации, включающий получение конъюгата биоклетки и наночастиц сульфида кадмия путем помещения и выдержки клеточной культуры в коллоидный раствор, содержащий наночастицы сульфида кадмия, покрытые оболочкой из динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), нанесение полученного конъюгата на предметное стекло, облучение ультрафиолетовым излучением в диапазоне длин волн 335-425 нм, регистрацию флуоресценции, получение микрофотографий и их последующую обработку с помощью стандартных программ  (С.В. Ремпель, Н.С. Кожевникова, Н.Н. Александровна, А.А. Ремпель «Флуоресцентные наночастицы CdS для визуализации структуры клеток», Неорганические материалы, т.47, №3, с. 271-275, 2011).
Однако известный способ не обеспечивает достаточной достоверности информации вследствие невысокой чувствительности и точности наблюдения, которые обусловлены высокой концентрацией наночастиц сульфида кадмия в коллоидном растворе и не оптимальным соотношением размеров ядра (CdS) и оболочки (ЭДТА), поскольку излишнее увеличение толщины оболочки затрудняет неразрушающее проникновение флуоресцентной метки в клетку.
Таким образом, перед авторами стояла задача разработать способ оценки состояния биоклетки, обеспечивающий высокую достоверность получаемой информации за счет повышения чувствительности и точности.
Поставленная задача решена в способе оценки состояния биоклетки путем ее визуализации, включающем получение конъюгата биоклетки и наночастиц сульфида кадмия путем помещения и выдержки клеточной культуры в коллоидном водном растворе, содержащем наночастицы сульфида кадмия, покрытые оболочкой из динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), нанесение полученного конъюгата на предметное стекло, облучение ультрафиолетовым излучением в диапазоне длин волн 335-425 нм, регистрацию флуоресценции, получение микрофотографий и их последующую обработку с помощью стандартных программ, в  котором используют коллоидный водный раствор с концентрацией  наночастиц сульфида кадмия, покрытых оболочкой из динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты, равной 3,0-3,5 мМ, при этом  соотношение сульфида кадмия (ядро) и динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (оболочка) равно, масс.%: сульфид кадмия – 8.78 ÷ 8.92; динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты – 91.08 ÷ 91.22.
В настоящее время из патентной и научно-технической литературы не известен способ оценки состояния биоклетки путем использования для диагностики состояния биоклетки регистрации свечения конъюгата, образованного клеточной культурой и флуоресцентными метками, покрытым оболочкой, под действием ультрафиолетового излучения, в котором для получения конъюгата используют коллоидный раствор с концентрацией  наночастиц сульфида кадмия, покрытых оболочкой из динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты, равной 3,0-3,5 мМ, при соотношении сульфид кадмия (ядро) и динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (оболочка) равно, масс.%: сульфид кадмия - 8.78 ÷ 8.92; динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты - 91.08 ÷ 91.22.
Исследования, проведенные авторами, позволили сделать вывод, что для получения максимальной интенсивности свечения флуоресцентной метки, обеспечивающей чувствительность и точность наблюдения, концентрация наночастиц сульфида кадмия в коллоидном растворе должна находиться в оптимальном интервале, не выше и не ниже крайних значений этого интервала.  Выполнение этого условия достигается путем использования концентрации сульфида кадмия в растворе, равной 3,0 - 3.5 мМ. При этом получают раствор с полупроводниковыми наночастицами CdS со средним диаметром ядра около 3 нм. Наночастицы CdS такого размера (значение близко к значению радиуса экситона Бора для CdS) обеспечивают режим сильного конфаймента и являются квантовыми точками (КТ) с диапазоном флуоресценции, зависящим от зависящим от размера. При исследовании оптических свойств водных коллоидных растворов авторами обнаружено, что концентрация наночастиц значительно влияет на интенсивность флуоресценции, а, следовательно, и чувствительность и точность определения мишени при визуализации. С одной стороны, недостаточная концентрация наночастиц CdS снижает интенсивность резонансной передачи энергии возбуждения от наночастиц к биологическим структурам клетки (белки, митохондрии и т.п.) для последующего высвечивания. С другой стороны, превышение некоторой концентрации наночастиц CdS в растворе приводит к передаче энергии от наночастицы к наночастицы при столкновениях (за счет безизлучательного и излучательного механизма) с дальнейшей безизлучательной релаксацией внутри наночастицы. Такое явление способствует тушению флуоресценции и снижению чувствительности анализа. Выбранная концентрация наночастиц сульфида кадмия обеспечивает неразрушающий способ подготовки конъюгатов клеток с флуоресцентными метками (наночастицами сульфида кадмия), отсутствие концентрационного тушения, и, как следствие, максимальную интенсивность флуоресценции.
Для получения стабильного водного раствора наночастиц сульфида кадмия в качестве стабилизатора используют динатриевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА).  Ионы ЭДТА адсорбируются на поверхности наночастиц сульфида кадмия, образуя координационные связи с поверхностными атомами кадмия, и предотвращают агломерацию частиц. Однако, как показали исследования, проведенные авторами, существенное значение имеет соотношение наночастиц сульфида кадмия и количество вводимой в коллоидный раствор динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА). Исходя из того, что средний диаметр ядра (CdS) равен ~ 3 нм, оптимальная толщина стабилизирующей оболочки должна быть равной 2 - 3 нм. Это условие соблюдается при использовании в водном коллоидном растворе соотношения, масс.%: сульфид кадмия - 8.78 ÷ 8.92; динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты - 91.08 ÷ 91.22. Уменьшение содержания сульфида кадмия и увеличение содержания ЭДТА ведет к увеличению толщины оболочки. Это приводит к снижению интенсивности процессов поглощения падающей световой энергии и передачи ее наблюдаемому объекту. При увеличении содержания сульфида кадмия и уменьшении содержания ЭДТА возможна агломерация некоторой части наночастиц сульфида кадмия, что снижает интенсивность излучения а, следовательно, точность и чувствительность анализа. Таким образом, предлагаемое авторами соотношение между наночастицами сульфида кадмия и стабилизатором ЭДТА обеспечивает неразрушающее проникновение флуоресцентной метки в клетку, максимальную интенсивность флуоресценции и, как следствие, повышение достоверности получаемой информации за счет повышения точности.
Таким образом, авторами предлагается способ определения состояния биоклетки, обеспечивающий повышения достоверности получаемой информации за счет увеличения чувствительности и точности наблюдений, что в свою очередь позволяет с максимальной вероятностью констатировать наличие здоровых клеток в биоматериале или клеток с разрушенной цитоплазмой и ядром под воздействием вирусов. В предлагаемом способе возможность наблюдения отдельных деталей клетки реализуется за счет безизлучательного переноса энергии от наночастиц CdS к белкам и другим молекулам, составляющим клетку. Перенос энергии по механизму Фёрстера (за счет диполь-дипольного взаимодействия) на расстояниях от 2 до 5 нм может осуществляться при условиях, что наночастицы CdS и молекула расположены близко друг от друга, спектры излучения наночастиц CdS и поглощения молекулы перекрываются, время переноса энергии от наночастицы CdS к молекуле должно быть меньше времени жизни возбуждённого состояния наночастицы CdS, приводящего к излучательной релаксации. Проведенные эксперименты и расчеты времени, необходимого для излучательной релаксации возбужденного экситона в CdS показали, что в предлагаемом способе все условия выполняются.
Предлагаемый способ может быть осуществлен следующим образом.
В пробирку с коллоидным водным раствором с концентрацией  наночастиц сульфида кадмия, покрытых оболочкой из динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), равной 3,0-3,5 мМ, при этом  соотношение сульфида кадмия (ядро) и динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (оболочка) равно, масс.%: сульфид кадмия - 8.78 ÷ 8.92; динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты - 91.08 ÷ 91.22,  помещают клеточные культуры на покровных стеклах и выдерживают в течение определенного времени (30 – 40 мин.). После этого покровные стекла с конъюгатами клеток и флуоресцента вынимают и высушивают на воздухе. Подготовленные конъюгаты используют для визуального анализа на флуоресцентном микроскопе. Возбуждение флуоресценции проводят облучением УФ светом в диапазоне 335 – 425 нм. Благодаря высокой фотостабильности наночастиц не накладывается ограничений на время наблюдения под действием УФ. Регистрацию необходимых изображений производят с помощью цифровой камеры микроскопа с последующей обработкой (в случае необходимости) с помощью стандартных программ. После наблюдения подготовленные образцы не требуют специальных условий хранения и пригодны для повторного анализа в течение неограниченного времени. Предлагаемый способ можно применять для цитологических исследований жизнедеятельности клеток, изучения патогенеза вирусных инфекций и противовирусного действия различных препаратов на модели клеточных культур, в методах иммуно-флуоресцентного анализа.
На фиг. 1 представлена микрофотография здоровых клеток суточной линии ФЛЕЧ, конъюгированных с КТ CdS стабилизированных с помощью оболочки из ЭДТА.
На фиг. 2 представлена микрофотография здоровых клеток VERO, конъюгированных с КТ CdS стабилизированных с помощью оболочки из ЭДТА.
На фиг. 3 представлена микрофотография клеток VERO, заражённых ВПГ, конъюгированных с КТ CdS стабилизированных с помощью оболочки из ЭДТА.
Предлагаемый способ иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1.
2
2
2
2
2
2
Готовили по 100 мл растворов NaS и CdCl и EDTA. Для этого брали 0.336; 0. 319 и 0.521 г. гидратированных солей NaS, CdCl и EDTA, соответственно. Растворы NaS и CdCl смешивали в равных объемах, с немедленным добавлением ЭДТА. Далее раствор обрабатывали ультразвуком в течение 5 минут. Получали водный коллоидный раствор наночастиц CdS с оболочкой из ЭДТА с концентрацией сульфида кадмия 3.5 mM при соотношении, масс.%: сульфид кадмия – 8.92; ЭДТА – 91.08.  В пробирку с полученным раствором помещали клеточную культуру ФЛЕЧ на покровном стекле, инкубировали 30 мин. В пробирку с полученным раствором помещали клеточную культуру ФЛЕЧ на покровном стекле, инкубировали 30 мин. Штамм диплоидных клеток ФЛЭЧ получен в лаборатории клеточных культур ЕНИИВИ (Екатеринбуржский НИИ вирусных инфекций). Среда поддержания Игла МЕМ + ГЛА. Покровное стекло вынимали и высушивали. Конъюгаты на покровном стекле наблюдали во флуоресцентном микроскопе Leica 2500М, облучая УФ с длиной волны около 425 нм. Микрофотографии получали с помощью цифровой камеры Leica DFC 320.  Наблюдали здоровую клетку правильной формы, с хорошо выраженной структурой, просматривались неоднородности цитоплазмы, клеточное ядро правильной овальной формы (см. фиг. 1).
Пример 2.
2
2
2
2
2
2
Готовили по 100 мл растворов NaS и CdCl и EDTA. Для этого брали 0.307; 0. 292 и 0.476 г. гидратированных солей NaS, CdCl и EDTA, соответственно. Растворы NaS и CdCl смешивали в равных объемах, сразу добавляли ЭДТА. Далее раствор обрабатывали ультразвуком в течение 5 минут. Получали водный коллоидный раствор наночастиц CdS с оболочкой из ЭДТА с концентрацией сульфида кадмия 3.2 mM при соотношении, масс.%: сульфид кадмия – 8.81; ЭДТА – 91.19.  В пробирку с полученным раствором помещали перевиваемые клетки VERO, культивированные на покровных стеклах, инкубировали 40 мин. В пробирку с полученным раствором помещали перевиваемые клетки почек обезьяны Vero, культивированные на покровных стеклах, инкубировали 40 мин. Перевиваемые клетки культивировали на покровных стеклах в питательной среде RPMJ, содержащей глютамин и 10% сыворотку крупного рогатого скота при 37°С. Концентрация суспензии составляла 100000 клеток на миллилитр. Покровное стекло вынимали и высушивали. Конъюгаты на покровном стекле наблюдали во флуоресцентном микроскопе Leica 2500М, облучая УФ с длиной волны около 335 нм. Микрофотографии получали с помощью цифровой камеры Leica DFC 320.  Наблюдали здоровую клетку правильной формы, с хорошо выраженной структурой, просматривались неоднородности цитоплазмы, клеточное ядро правильной овальной формы со светящимися скоплениями внутри ядра (см. фиг. 2).
Пример 3.
2
2
2
2
2
2
Готовили по 100 мл растворов NaS и CdCl и EDTA. Для этого брали 0.288; 0. 274 и 0.447 г. гидратированных солей NaS, CdCl и EDTA, соответственно. Растворы NaS и CdCl смешивали в равных объемах, с немедленным добавлением ЭДТА. Далее раствор обрабатывали ультразвуком в течение 5 минут. Получали водный коллоидный раствор наночастиц CdS с оболочкой из ЭДТА с концентрацией сульфида кадмия 3.0 mM при соотношении, масс.%: сульфид кадмия – 8.78; ЭДТА – 91.22.  В пробирку с полученным раствором помещали клетки VERO на третьи сутки после заражения вирусом простого герпеса, инкубировали 30 мин. Инфекционный титр вируса составлял 4,5 lg ТЦП50/мл в 0,02 мл.  Покровное стекло вынимали и высушивали. Конъюгаты на покровном стекле наблюдали во флуоресцентном микроскопе Leica 2500М, облучая УФ с длиной волны около 400 нм. Микрофотографии получали с помощью цифровой камеры Leica DFC 320.  Наблюдали светящиеся неоднородные деструктурированные скопления, четкой структуры клетки и ядра не наблюдалось (см. фиг. 3).
Таким образом, авторами предлагается способ оценки состояния биоклетки, обеспечивающий высокую степень достоверности получаемой информации за счет повышения чувствительности и точности наблюдений, что позволяет с высокой степенью достоверности оценить состояние биоклетки: является ли она здоровой или заражена вирусом.