ЭКСТРАКЦИЯ БЕЛКА ИЗ КОРМОВОЙ МУКИ ИЗ ЖМЫХА СЕМЯН МАСЛИЧНОЙ КАНОЛЫ
EXTRACTION OF PROTEIN FROM FEEDING MEAL OF OIL CANOLA SEED OILCAKE

Область техники
Настоящее изобретение касается выделения белка из семян масличных, в частности белка из семян канолы.
Предшествующий уровень техники
Семена масличной канолы широко используются для выделения из них канолового масла. Семена масличной канолы измельчают для извлечения основной части масла, а чтобы выделить остаток масла, оставшуюся кормовую муку подвергают экстракции горячим растворителем, используя для этого, в основном, гексан.
Кормовая мука, получившаяся после экстракции растворителем, содержит остаточный гексан и имеет хорошо известное название «белые хлопья», а также менее известное - кормовая мука из «выжимок». Из этой кормовой муки отделяют растворитель для повторного использования прежде, чем кормовая мука из масличного жмыха пройдет через дробилку.
На стадии отделения растворителя кормовую муку из масличного жмыха часто подвергают нагреванию до температуры выше 120-140°С согласно процедуре, называемой «поджариванием». Получившаяся кормовая мука называется «поджаренной» мукой или «отработанной при высоких температурах».
Получившая после выхода из дробилки кормовая мука из масличного жмыха содержит значительные количества белка и часто используется для кормления скота. Известны технологические приемы для выделения белка канолы из остаточной кормовой муки из масличного жмыха в форме изолята белка канолы.
В US патентах 5844086 и 6005076 («Murray II»), описания которых включены в настоящее описание в качестве ссылок, описан способ выделения белковых изолятов из кормовой муки из жмыха семян масличных культур, имеющей значительное содержание жира, в том числе из кормовой муки из жмыха семян масличной канолы. Стадии этого процесса включают солюбилизацию белкового материала из кормовой муки из жмыха семян масличных, при которой солюбилизируется также жир, содержащийся в кормовой муке, и удаление жира из получившегося водного белкового раствора. Этот водный белковый раствор может быть отделен от оставшейся кормовой муки из жмыха масличных до или после стадии удаления жира. Обезжиренный белковый раствор затем концентрируют для повышения концентрации белка при поддержании практически постоянной ионной силы, после чего концентрированный белковый раствор на следующей стадии может быть подвергнут удалению жира. Затем сконцентрированный белковый раствор разбавляют, чтобы вызвать образование хлопьеподобной массы агрегированных белковых молекул в виде дискретных белковых капелек в мицеллярной форме. Этим мицеллам из белка дают осесть с образованием агрегированной, коалесцирующей, плотной, аморфной массы белкового изолята, напоминающей липкую клейковину и называемой «белковая мицеллярная масса», или РММ, которую отделяют от остальной водной фазы и высушивают.
Содержание белка в белковом изоляте (определяемое способом Кьельдаля или эквивалентным способом N×6,25) составляет, по крайней мере, 90 вес.%, он практически не денатурирован (как определено дифференциальной сканирующей калориметрией) и имеет низкое содержание жира. Термин «содержание белка» используется здесь для определения количества белка в белковом изоляте, выражаемого в расчете на сухую массу. Выход белкового изолята, получаемого по этому способу, в смысле количества белка, экстрагированного из кормовой муки из жмыха семян масличных, который получается в виде высушенного белкового изолята, был, в основном, менее 40 вес.%, обычно - около 20 вес.%.
Способ, описанный в вышеуказанных патентах, был разработан как модификация и усовершенствование способа получения белкового изолята из различных видов белоксодержащего сырья, включая семена масличных культур, как описано в US патенте 4208323 (Murray IB), описание которого включено в настоящее описание в качестве ссылки. Кормовая мука из масличных жмыхов, доступная в 1980, когда выдавался US патент 4208323, не имела примесей масла канолы соответственно периоду патентов Murray II, и, как следствие, по способу по патенту US №4208323 нельзя было получить из такой кормовой муки из жмыха семян канолы соответственно способу Murray II белоксодержащий материал с содержанием белка более 90 вес.%. В US патенте №4208323 отсутствует описание каких-либо опытов, проводимых с использованием в качестве сырья кормовой муки из жмыха семян рапса (канолы).
US патент 4208323 был разработан как усовершенствование способа, описанного в US патентах 4169090 и 4285862 (Murray IA), упомянутых в настоящем описании в качестве ссылки, за счет введения стадии концентрирования перед разбавлением для образования РММ. Последняя (из упомянутых) стадия нужна для повышения выхода белкового изолята приблизительно на 20% по сравнению со способом Murray IA.
В рассматриваемых одновременно патентных заявках США №60/288 415, поданной 4 Мая 2001, №60/326987, поданной 5 октября 2001, №60/331066, поданной 7 ноября 2001, №60/333494, поданной 26 ноября 2001, №60/374801, поданной 24 апреля 2002 и US патентной заявке №10/137391, поданной 3 мая 2002 (WO 02/089597), описания которых включены в настоящее описание в качестве ссылок, описывается способ получения белкового изолята высокой степени чистоты, с содержанием белка, по меньшей мере, около 100 вес.% (N×6,25). В вышеупомянутых патентных заявках США белковый изолят получен способом, согласно которому кормовую муку из жмыха семян канолы экстрагируют раствором соли пищевого качества, при необходимости полученный белковый раствор обрабатывают адсорбентом, связывающим пигменты, концентрируют до содержания белка, по меньшей мере, около 200 г/л, и сконцентрированный белковый раствор разбавляют охлажденной водой для образования мицелл белка, которым дают осесть с образованием агрегированной, коалесцированной плотной аморфной массы белкового изолята, напоминающей липкую клейковину и называемой «белковая мицеллярная масса», или РММ, которую отделяют от остальной водной фазы и высушивают.
По одному из вариантов вышеописанного способа и как, в частности, описано в US патентных заявках 60/326987, 60/331066, 60/333494, 60/374801 и 10/137391, супернатант со стадии осаждения РММ обрабатывают таким образом, чтобы выделить белковый изолят, содержащий сухой белок из РММ и супернатанта. Этот способ может быть осуществлен путем концентрирования супернатанта с использованием ультрафильтрационных мембран, смешивания сконцентрированного супернатанта с влажным РММ и сушки этой смеси. Получившийся в результате изолят белков канолы содержит высокочистый белок в количестве, по меньшей мере, около 90 вес.%, предпочтительно, по крайней мере, 100 вес.% белка (N×6,25).
По другому варианту вышеописанного способа и как, в частности, подробно описано в заявках №60/331066, 60/333494, 60/374801 и 10/137391, супернатант со стадии осаждения РММ обрабатывают таким образом, чтобы получить белок из супернатанта. Этот способ может осуществляться при начальном концентрировании супернатанта с помощью ультрафильтрационных мембран и сушке концентрата. Получившийся в результате изолят белков канолы содержит высокочистый белок в количестве, по меньшей мере, около 90 вес.%, предпочтительно, по крайней мере, около 100 вес.% белка (N×6,25).
Способы, описанные в вышеупомянутых патентных заявках США, являются, в большинстве своем, способами периодического (batch) действия. В находящихся в одновременном рассмотрении патентных заявках США №60/331646, поданной 20 ноября 2001, 60/383809, поданной 30 мая 2002 и 10/298678, поданной 19 ноября 2002, описания которых включены в настоящее описание в качестве ссылок, описан непрерывный способ получения белковых изоляторов канолы. Согласно этому способу кормовую муку из жмыха семян канолы непрерывно перемешивают с раствором соли, смесь пропускают по трубопроводу, экстрагируя при этом белок из кормовой муки жмыха семян канолы с получением водного белкового раствора, при непрерывном отделении водного белкового раствора от оставшейся кормовой муки жмыха семян канолы, водный белковый раствор подвергают непрерывному селективному мембранному разделению с целью повышения содержания белка в водном белковом растворе, по крайней мере, до приблизительно 200 г/л при поддержании практически постоянной ионной силы, получившийся концентрированный белковый раствор непрерывно смешивают с охлажденной водой, чтобы вызвать образование мицелл белка, и обеспечивают непрерывное оседание белковых мицелл при непрерывном сливании супернатанта, пока в осадительной емкости не соберется желаемое количество РММ. Эта РММ удаляется из емкости для осаждения и может быть высушена. Содержание белка в РММ составляет, по меньшей мере, 90 вес.% (N×6,25), предпочтительно, по крайней мере, около 100 вес.%.
Эксперименты, описанные в этих предшествующих патентных заявках США, выполняются с использованием коммерчески доступной (продажной) кормовой муки из жмыха семян масличных, из которой был удален растворитель обычной стадией «поджаривания», обеспечивающей удаление растворителя. Использование такого сырья как кормовая мука из жмыха семян масличных для получения изолятов белка из семян масличных обеспечивает экстракционное выделение до 30 вес.% белка, содержащегося в семенах масличных, возможно вследствие денатурации белка на стадии высокотемпературного удаления растворителя.
Краткое описание изобретения
Было обнаружено, что количество белка, которое может быть экстрагировано из белков кормовой муки из жмыха семян канолы, может быть существенно увеличено, если экстракции подвергать кормовую муку, из которой удален растворитель при температуре окружающей среды. Возможность экстрагировать большее количество белка из кормовой муки делает способ экономически более выгодным. Кроме того, получают продукт лучшего качества.
В соответствии с одним аспектом изобретения описывается способ получения белкового изолята, который включает (а) дробление семян масличных с получением из них масла и кормовой муки из жмыха семян масличных, (b) экстракцию кормовой муки из жмыха семян масличных растворителем, для того, чтобы извлечь из нее остальное масло, (с) удаление растворителя из подвергнутой экстракции кормовой муки из жмыха семян масличных при температуре ниже приблизительно 50°С с получением кормовой муки, из которой удален растворитель, (d) экстрагирование этой кормовой муки из жмыха семян масличных, чтобы вызвать солюбилизацию белка в кормовой муке из жмыха семян масличных, из которой удален растворитель, и обеспечить получение водного белкового раствора с рН от примерно 5 до около 6,8, (е) отделение водного белкового раствора от оставшейся кормовой муки из жмыха семян масличных, (f) увеличение концентрации белка в водном белковом растворе, при поддержании практически постоянной ионной силы с помощью селективных мембран с получением концентрированного белкового раствора, (g) разбавление концентрированного белкового раствора водой, охлажденной до температуры ниже примерно 15°С, чтобы вызвать образование дискретных белковых частиц в водной фазе, по крайней мере, частично в форме мицелл, (h) оседание белковых мицелл с образованием аморфной липкой, гелеобразной, напоминающей клейковину белковой мицеллярной массы и (i) отделение этой белковой мицеллярной массы от супернатанта, причем содержание белка в белковой мицеллярной массе составляет, по меньшей мере, около 90 вес.% (N×6,25) в расчете на сухую массу.
В настоящем изобретении используются «белые хлопья» или «выжимки» кормовой муки, из которой при умеренной температуре ниже приблизительно 50°С, предпочтительно при около 15-30°С, был удален растворитель. Удаление растворителя можно осуществлять как при сушке воздухом кормовой муки, так и при вакуумной отгонке.
Белок может быть экстрагирован и отделен из кормовой муки, из которой удален растворитель при температуре окружающей среды, способом периодического, полупериодного и непрерывного действия, как в принципе описано в вышеупомянутых US патентных заявках.
Белковый изолят, полученный данным способом, может использоваться по традиционным направлениям для белковых изолятов, например для обогащения белками вырабатываемых продуктов, эмульгирования масел, при выпечке как стабилизатор формы выпекаемых изделий, как пенообразующие агенты в продуктах, которые газированы. Кроме того, белковый изолят может быть превращен в белковые волокна, которые используются как аналог мяса, может быть использован также в качестве заменителя яичного белка или добавки в пищевых продуктах, в которых яичный белок используется в качестве связующего. Изолят белка из канолы может также использоваться и как пищевая добавка. Еще одной областью применения являются корма для домашних животных, для сельскохозяйственных животных, промышленное и косметическое направление использования и предметы личной гигиены.
Краткое описание чертежей
На фиг.1-3 показаны (ВЭЖХ) хроматограммы экстрактов, полученных из кормовой муки из жмыха семян канолы, из которой был удален при комнатной температуре растворитель с использованием 0,05 М NaCl (Фиг.1), 0,10 М NaCl (Фиг.2) и в отсутствии соли при 60°С (Фиг.3).
Подробное описание изобретения
Способ данного изобретения начинается с семян масличных, в частности с семян масличной канолы, хотя способ может быть реализован и с применением семян других масличных культур, например соевых бобов, семян обычного рапса, льна, линоловой кормовой муки или кормовой муки из жмыха семян подсолнечника и горчицы. Изобретение преимущественно относится к использованию кормовой муки из жмыха семян канолы.
Семена всех масличных промывают для извлечения из них масла. Затем отделяют масло, оставшуюся кормовую муку экстрагируют растворителем (обычно используют гексан), чтобы извлечь из нее остаточные количества масла. Из полученной в результате кормовой муки удаляют растворитель, как указано в настоящем изобретении, при температуре не более около 50°С, предпочтительно примерно 15-30°С. Было обнаружено, что при удалении растворителя, как указано выше, количество белка, которое можно извлечь из кормовой муки, существенно увеличивается.
Кормовая мука, которую обрабатывают таким образом, может быть произведена способом, описанным в патентах Murray I или II по выделению белкового изолята из кормовой муки из жмыхов семян масличных, детали которого приводятся там же. Предпочтительно применяется способ, в вышеупомянутых находящихся на одновременном рассмотрении US патентах заявках №60/288415, 60/326987, 60/331066, 60/333494, 60/372165, 60/374801 и 10/137391 (WO 02/089567), так как он обеспечивает повышенный выход сухого белкового изолята в зависимости от содержания белка, экстрагированного из кормовой муки из жмыха семян масличных, который выделяют в виде белкового изолята, а белковый изолят получают с высоким содержанием белка обычно, по крайней мере, около 100 вес.%, определенным по способу Кьельдаля как содержание азота в процентах (N), умноженное на коэффициент 6,25. Или же может применяться непрерывный способ, описанный в вышеупомянутых US патентных заявках №60/331646, 60/383809 и 10/298678. Детали этих предпочтительных способов, которые применимы к белковому изоляту из канолы, описаны ниже.
Подразумевается, что обработка семян масличных для выделения из них масла может осуществляться в разных условиях и при использовании различных приспособлений в зависимости от того, какой белковый изолят выделяют из кормовой муки из жмыха семян масличных. Или же операции по выделению можно скомбинировать с целью удобства.
Первоначальная стадия способа выделения белкового изолята из кормовой муки из жмыха семян канолы включает солюбилизацию белоксодержащего материала из кормовой муки из жмыха семян канолы. Белоксодержащий материал, выделенный из кормовой муки из жмыха семян канолы, может представлять собой природный белок семян канолы или семян других масличных, или же белоксодержащий материал может представлять собой белок, модифицированный путем генных манипуляций, но обладающий характерными гидрофобными или, наоборот, противоположными по своей направленности свойствами природного белка, масло семян канолы называют также рапсовым маслом или маслом из семян рапса.
Солюбилизацию белка наиболее эффективно осуществляют с помощью раствора соли пищевого качества, так как присутствие соли увеличивает (усиливает) извлечение растворимого белка из кормовой муки из жмыха семян масличных. Если предполагается непищевое применение белкового изолята из канолы, могут применяться химические реагенты непищевого качества. Солью пищевого качества обычно считается хлорид натрия, хотя другие соли, например хлорид калия, также могут использоваться. Раствор соли пищевого качества имеет ионную силу, по крайней мере, около 0,10, предпочтительно, по крайней мере, около 0,15, чтобы обеспечить приемлемый уровень солюбилизации значительных количеств белка. С увеличением ионной силы раствора соли степень солюбилизации белка кормовой муки из жмыха семян масличных увеличивается, пока не достигнет максимальной величины. Любое дополнительное последующее повышение ионной силы не приводит к повышению общей солюбилизаци белка. Величина ионной силы раствора соли пищевого качества, которая вызывает максимум солюбилизации белка, зависит от типа использованной соли и типа исходной кормовой муки.
Ввиду более высокой степени разбавления, необходимой для осаждения белка при повышении ионной силы, обычно предпочитают работать при величине ионной силы менее примерно 0,8 и более предпочтительно - от около 0,15 до около 0,6.
В периодическом способе солевая солюбилизация белка осуществляется при температуре, по меньшей мере, около 5°С и предпочтительно вплоть до около 35°С, предпочтительно при условии перемешивания с целью сокращения срока солюбилизации, который обычно составляет от около 10 до около 60 минут. Такое осуществление солюбилизации предпочтительно, чтобы проэкстрагировать из кормовой муки из жмыха семян масличных практически максимальное количество белка с тем, чтобы обеспечить максимально возможный высокий выход продукта.
Нижнее значение температуры, равное около 5°С, выбираются потому, что солюбилизация практически не идет при более низкой температуре, в то время как повышение верхнего значения температуры более около 35°С экономически невыгодно в случае периодического способа.
При осуществлении способа в непрерывном режиме экстракцию белка из кормовой муки из жмыха семян канолы выполняют любым способом, подходящим для проведения непрерывной экстракции белка из кормовой муки из жмыха семян канолы. В одном варианте кормовую муку из жмыха семян канолы непрерывно смешивают с солевым раствором и смесь пропускают через трубопровод такой длины и при такой скорости потока, которые обеспечивают длительность пребывания в нем, достаточные для обеспечения желаемой степени экстракции согласно раскрытым здесь условиям. При непрерывном осуществлении способа стадия солевой солюбилизации приводится быстро, в течение около 10 минут, предпочтительно также осуществление солюбилизации, чтобы проэкстрагировать практически максимальное количество белка из кормовой муки из жмыха семян канолы. Солюбилизацию в способе непрерывного режима предпочтительно ведут при повышенных температурах, предпочтительно выше около 35°С, как правило, выше около 65°С или еще выше.
Водный раствор соли пищевого качества и кормовая мука из жмыха семян канолы имеют рН от около 5 до около 6,8, чтобы обеспечить возможность сформироваться мицеллам белка в изоляте, как более подробно описано ниже.
В пределах и вблизи пределов указанного диапазона значений рН образование белкового изолята в виде мицелл происходит только частично и с более низким выходом, чем те, которые возможны при других значениях указанного диапазона рН. По этой причине предпочтительны значения рН от около 5,3 до около 6,2.
рН раствора соли пищевого качества может быть установлен в любой точке внутри диапазона от около 5 до около 6,8 для стадии экстрагирования с использованием любой подходящей кислоты пищевого качества, например соляной, или щелочи пищевого качества, например гидроксида натрия, по желанию. Если предполагается непищевое применение белкового изолята канолы, могут применяться химические реагенты непищевого качества.
Концентрация кормовой муки из жмыха семян масличных в растворе соли пищевого качества во время стадии солюбилизации может варьировать очень широко. Обычно концентрация составляет от около 5 до около 15 вес.%/объем.
На стадии экстракции белка водным солевым раствором может проявляться дополнительный эффект солюбилизации жиров, которые могут присутствовать в кормовой муке семян канолы, что приводит к появлению жиров в водной фазе.
Раствор белка, полученный со стадии экстракции, чаще всего имеет концентрацию белка от около 5 до около 40 г/л, предпочтительно от около 10 до около 30 г/л.
Водную фазу, полученную со стадии экстракции, можно потом отделить от оставшейся кормовой муки семян канолы любым известным для этого способом, например вакуум-фильтрацией с последующим центрифугированием и/или фильтрацией для удаления остатков муки. Отделенные остатки муки могут быть высушены для дальнейшего использования или удаления.
Цвет полученного изолята белков канолы можно улучшить, получив более светлый и менее интенсивный желтый цвет, подмешав в сепарированный водный белковый раствор измельченный активированный уголь или другое адсорбирующее пигмент средство и затем удалив этот адсорбент, обычно - фильтрацией, с получением белкового раствора. Диафильтрация сепарированного водного белкового раствора, до или после концентрирования, как описывается ниже, также может быть использована для удаления пигмента.
Стадия удаления пигмента может осуществляться по любой известной технологии, вообще при температуре среды, окружающей водный белковый раствор, с применением любого подходящего адсорбирующего пигмент средства. Измельченный активированный уголь используют в количестве от около 0,025% до около 5 вес.%/объем, предпочтительно от около 0,05% до около 2 вес.%/объем.
Если кормовая мука из жмыха семян канолы содержит значительные количества жира, как описывается в вышеупомянутых US патентах 5844086 и 6005076, тогда проводят описанные в них стадии обезжиривания сепарированного водного белкового раствора и концентрированного водного белкового раствора, описанных ниже. Если осуществляется стадия улучшения цвета, то такая стадия может проводиться перед первым обезжириванием.
Как альтернатива экстрагированию кормовой муки из жмыха семян масличных водным раствором соли пищевого качества, такая экстракция может проводиться и одной водой, хотя экстрагирование водой приводит к извлечению меньшего количества белка из кормовой муки из жмыха семян масличных, чем экстрагирование водным раствором соли пищевого качества. Если применяется именно вода, то соль пищевого качества может быть добавлена (в указанных ниже концентрациях) к белковому раствору после его отделения от оставшейся кормовой муки из жмыха семян масличных для того, чтобы поддержать количество белка в растворе в течение стадии концентрирования, описанной ниже. При осуществлении стадий удаления пигмента и/или первого обезжиривания соль пищевого качества обычно добавляется после завершения этих операций.
Другой альтернативной процедурой является экстрагирование кормовой муки из жмыха семян масличных раствором соли пищевого качества при сравнительно высокой величине рН, выше примерно 6,8, в основном, вплоть до 9,8. рН раствора соли пищевого качества может быть доведен до щелочных значений рН с помощью любой подходящей щелочи пищевого качества, например водного раствора гидроксида натрия. Если применяется такой вариант, водная фаза, получившаяся в результате экстракции кормовой муки из жмыха масличных, затем отделяется от оставшейся кормовой муки любым известным способом, например вакуум-фильтрацией, с последующим центрифугированием и/или фильтрацией для удаления оставшейся кормовой муки. Отделенная оставшаяся кормовая мука может быть высушена для дальнейшего использования или удаления.
рН водного белкового раствора, полученного путем экстракции при высоких рН, доводят до от около 5 до около 6,8, предпочтительно от около 5,3 до около 6,2, как описано выше, перед осуществлением дальнейших технологических стадий, как описывается ниже. Доведение рН можно проводить с помощью любой подходящей кислоты пищевого качества, например соляной кислоты.
Водный белковый раствор затем концентрируют для повышения в нем концентрации белка при сохранении практически постоянной ионной силы. Такое концентрирование, в основном, проводят, чтобы получить концентрированный белковый раствор с содержанием белка, по крайней мере, около 200 г/л, предпочтительно, по крайней мере, около 250 г/л.
Стадия концентрирования может осуществляться любым известным способом, который удобно выполнять в периодическом или непрерывном режиме, например, используя известную селективную мембранную технологию, например ультрафильтрацию или диафильтрацию, с помощью мембран, например мембран на основе полых волокон или спирально закрученных, с подходящим молекулярно-весовым отсечением, например, около 3000-50000 дальтон, относящихся к разделяющим мембранным материалам и приспособлениям, и при непрерывном режиме осуществления способа, распределенным по размеру с целью обеспечения желаемой степени, концентрирования при прохождении через мембраны водного белкового раствора.
Стадия концентрирования может осуществляться при любой подходящей температуре, обычно от около 20°С до около 60°С и в течение времени, необходимого для обеспечения требуемой степени концентрирования. Температура и другие использующиеся условия до некоторой степени зависят от мембранной установки, используемой для концентрирования и достижения желаемой степени концентрации белка.
Концентрирование белкового раствора до концентрации выше около 200 г/л на этой стадии не только повышает уровень выхода процесса выше почти 40% в отношении проэкстрагированного белка, который выделяется в виде сухого белкового изолята, предпочтительно выше около 80%, но также снижает концентрацию соли в конечном белковом изоляте после высушивания. Возможность контролировать концентрацию соли в изоляте является важной с точки зрения применения изолята, когда колебания концентраций соли обусловливают функциональные и вкусовые особенности конкретного пищевого назначения.
Как известно, ультрафильтрация и подобные селективные мембранные технологии позволяют низкомолекулярным веществам проходить через мембраны и задерживаться более высокомолекулярным веществам. Низкомолекулярные вещества включают не только ионы солей пищевого качества, но также и низкомолекулярные примеси, экстрагируемые из сырья, например углеводы, пигменты и непищевые факторы, а также любые низкомолекулярные части белковых молекул. Величину отсечения по молекулярному весу для мембран выбирают таким образом, чтобы обеспечить снижение значительной доли белка в растворе, позволяя проходить загрязняющим примесям, учитывая различные мембранные материалы и установки.
В зависимости от того, какая температура применяется на стадии концентрирования, концентрированный белковый раствор может быть подогрет до температуры, по крайней мере, около 2°С и вплоть до около 60°С, предпочтительно от около 25°С до около 40°С, чтобы уменьшить вязкость концентрированного белкового раствора для облегчения превращения на следующей стадии разбавления и мицеллообразования. Концентрированный белковый раствор нельзя нагревать выше температуры, при которой при разбавлении концентрированного белкового раствора охлажденной водой не будут образоваться мицеллы. Концентрированный белковый раствор может быть, при желании, подвергнут последующей операции обезжиривания, как это описано в вышеупомянутых US патентах 5844086 и 6005076.
Концентрированный белковый раствор, полученный на стадии концентрирования и необязательной стадии обезжиривания, затем разбавляют для обеспечения мицелообразования путем смешивания концентрированного белкового раствора с таким объемом охлажденной воды, который необходим для достижения желаемой степени разбавления. В зависимости от доли белка канолы, который хотят получить в виде мицелл и содержания белка в супернатанте, степень разбавления концентрированного белкового раствора может быть разной. В общем при более высоких степенях разбавления более высокая часть белка канолы остается в водной фазе.
Если хотят получить самое большое количество белка в виде мицелл, концентрированный белковый раствор разбавляют примерно в 15 раз или менее, предпочтительно в 10 раз или менее.
Охлажденная вода, с которой смешивают концентрированный белковый раствор, имеет температуру менее примерно 15°С, в основном от около 3°С до около 15°С, предпочтительно меньше примерно 10°С, так как повышенный выход белкового изолята в форме белковой мицеллярной массы достигается при таких пониженных температурах, если используется разбавление.
При осуществлении способа в периодическом режиме концентрированный белковый раствор добавляют к неподвижной массе охлажденной воды желаемого объема, как уже обсуждалось выше. Разбавление концентрированного белкового раствора и последующее снижение ионной силы вызывают образование похожей на облака массы высокоассоциированных белковых молекул в форме отдельных капелек в мицеллярной форме. При периодическом режиме осуществления способа белковым мицеллам дают осесть в массе охлажденной воды с образованием агрегированной коалесцентной, плотной аморфной напоминающей липкую клейковину белковой мицеллярной массы РММ. Осадок может быть собран, например, центрифугированием. Такое индуцированное осаждение снижает содержание жидкости в белковой мицеллярной массе, уменьшая тем самым содержание влаги в целом от около 70 вес.% до около 95 вес.% до величины, в основном, составляющей от около 50 вес.% до около 80 вес.% на общую мицеллярную массу. Снижение влагосодержания в мицеллярной массе таким образом также снижает содержание окклюдированной соли в мицеллярной массе и в связи с этим содержание соли в высушенном изоляте.
Или же, стадия разбавления может осуществляться в непрерывном режиме при непрерывном пропускании концентрированного белкового раствора в одно впускное отверстие Т-образной трубы с одновременной подачей охлаждающей воды в другое впускное отверстие Т-образной трубы, обеспечивая смешение в трубопроводе. Охлаждающая вода поступает внутрь Т-образной трубы со скоростью, достаточной для достижения желаемой степени разбавления.
Смешивание концентрированного белкового раствора и разбавляющей воды в трубопроводе вызывает образование мицелл и смесь непрерывно выпускают из выходного отверстия Т-образной трубы в емкость для оседания, из которой супернатанту при переполнении емкости дают переливаться через край. Смесь предпочтительно подают в массу жидкости в емкости для осаждения таким образом, чтобы минимизировать турбулентность внутри массы жидкости.
При непрерывном режиме проведения способа мицеллам белка дают осесть в емкости для осаждения с образованием агрегированной, коалесцентной, плотной аморфной, напоминающей липкую клейковину белковую мицеллярную массу (РММ), и процесс продолжается до тех пор, пока желаемое количество РММ не соберется на дне емкости для осаждения, откуда скопившуюся РММ удаляют.
Сочетание в способе условий концентрирования белкового раствора до содержания белка, по крайней мере, около 200 г/л и использование фактора разбавления менее чем около 15 приводит к более высоким выходам, часто существенно более высоким, в зависимости от выделения белка в форме белковой мицеллярной массы из экстракта кормовой муки, и более чистым изолятам в зависимости от содержания белка, которое достигается с использованием любых известных из уровня техники технологий получения белкового изолята, описанных в вышеупомянутых US патентных заявках.
Осевший изолят отделяют от остальной водной фазы или супернатанта такими способами как декантация остальной водной фазы от осевшей массы или центрифугирование. РММ может использоваться во влажном виде или может быть высушена до сухого состояния любым известным способом, например сушкой распылением, сублимационной сушкой или барабанной вакуум-сушкой.
Сухая РММ имеет высокое содержание белка, выше около 90 вес.% белка, предпочтительно, по крайней мере, около 100 вес.% белка (вычислено способом Кьельдаля N×6,25) и она практически не денатурирована (как показано с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии). Сухая РММ, выделенная из жиросодержащей кормовой муки из жмыха семян масличных, имеет также низкое содержание остаточных жиров, в то время как применение способов по вышеупомянутым US патентам 5844086 и 6005076 обеспечивает содержание жира ниже примерно 1 вес.%.
Супернатант со стадии образования РММ и осаждения содержит значительные количества белка канолы, не осажденного на стадии разбавления, и его обрабатывают, чтобы выделить белковый изолят канолы. Супернатант со стадии разбавления и последующего удаления РММ концентрируют для повышения в нем содержания белка. Такое концентрирование осуществляют с помощью любой известной селективной мембранной технологии, например ультрафильтрации с помощью мембран с подходящим молекулярно-весовым отсечением, позволяющей веществам с низким молекулярным весом, в том числе соли пищевого качества и другим небелковым низкомолекулярным веществам, экстрагированным из белкового сырья, проходить через мембрану, при этом белки канолы остаются в растворе. Могут использоваться ультрафильтрационные мембраны с молекулярно-весовым отсечением от около 3000 до 10000 дальтон с учетом материалов, из которых изготовлены мембраны, и конфигурации. Концентрирование супернатанта таким образом также уменьшает объем жидкости, которую нужно высушить, чтобы выделить белок. Супернатант, как правило, перед высушиванием концентрируют до содержания в нем белка от около 100 до около 400 г/л, предпочтительно от около 200 до около 300 г/л. Такое концентрирование можно осуществлять в периодическом режиме или непрерывном режиме, как описано выше для стадии концентрирования белкового раствора.
Концентрированный супернатант может быть высушен любым подходящим способом, например сушкой распылением, способом сублимационной сушки или вакуумного барабанного высушивания, до сухого состояния для получения в дальнейшем изолята белков канолы. Такой получаемый затем изолят белков канолы имеет высокое содержание белка, выше примерно 90 вес.%, предпочтительно, по крайней мере, около 100 вес.% белка (вычислено как N×6,25) и он практически не денатурирован (как определено дифференциальной сканирующей калориметрией).
При желании, по крайней мере, часть влажной РММ может быть соединена с, по крайней мере, частью концентрированного супернатанта до сушки этих объединенных белковых потоков любым подходящим способом, чтобы обеспечить объединенный изолят белков канолы в соответствии с изобретением. Относительные соотношения белковых материалов, смешиваемых друг с другом, подбираются так, чтобы обеспечить желаемый белковый профиль в композиции изолята белков канолы 2S/7S/12S. Или же высушенные белковые изоляты могут быть объединены в любых желаемых соотношениях, чтобы обеспечить в смеси любой желаемый специальный 2S/7S/12S профиль белков. Объединенная композиция изолятов белков канолы имеет высокое содержание белка, выше около 90 вес.%, предпочтительно, по крайней мере, около 100 вес.% (вычислено N×6,25), и он практически не денатурирован (как определено дифференциальной сканирующей калориметрией).
В другом альтернативном варианте способа, когда только часть концентрированного супернатанта смешивается с только частью РММ и полученная смесь высушивается, остаток концентрированного супернатанта может быть высушен так же, как и любой остаток РММ. Далее, сухая РММ и высушенный супернатант могут быть смешаны в сухом виде в любых желаемых пропорциях, как описано выше.
Действуя подобным образом, можно получить ряд изолятов белков канолы, в форме высушенной РММ, высушенного супернатанта и высушенных смесей РММ и супернатанта, взятых в различных весовых соотношениях, в основном, от около 5:95 до около 95:5 по весу, что может быть хорошо для обеспечения различных функциональных и питательных свойств.
Как альтернатива разбавления концентрированного белкового раствора в охлажденной воде и обработки получившихся осадка и супернатанта, как описано выше, белок можно выделить из концентрированного белкового раствора путем диализа концентрированного раствора белка для уменьшения в нем содержания соли. Снижение концентрации соли в концентрированном белковом растворе приводит к образованию мицелл белка в диализной трубке. После диализа мицеллам белка дают осесть, собирают и высушивают, как описано выше. Супернатант со стадии осаждения белковых мицелл может быть обработан, как описано выше, для выделения из него дополнительного количества белка. Или же, может быть высушено непосредственно содержимое диализной трубки. Последняя альтернативная процедура полезна и выгодна, когда требуются малые количества белка (в масштабах лаборатории).
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения
Пример 1
Этот пример иллюстрирует способ по изобретению. Образцы (75 г) кормовой муки из жмыха семян канолы, из которой воздушным путем был удален растворитель при температуре окружающей среды (20°С), добавили к пробам (500 мл) 0,15М NaCl при температуре окружающей среды или комнатной температуре (RT), 55°С, 60°С и 65°С, перемешивали 30 минут при поддержании постоянной температуры раствора для получения водных белковых растворов. Пробы водного белкового раствора отбирали для анализа через 5, 10, 15, 20 и 30 минут. Использованную муку отделяли центрифугированием при 10000×g в течение 5 минут и высушивали сублимационным способом.
Определяли концентрации белка различных водных белковых растворов, полученных в этих опытах, результаты представлены в нижеследующей таблице 1.
Таблица I
Концентрация белка в экстрактах, вес.%
Время экстракции (мин)
KТ*
55°С
60°С
65°С
5
2,97
3,33
3,33
3,37
10
3,21
3,39
3,52
3,40
15
3,22
3,47
3,59
3,41
20
3,21
3,51
3,53
3,39
30
3,17
3,46
3,63
3,14
* Комнатная температура (20°С)
Как видно из приведенных данных, экстракция при повышенной температуре идет быстрее, чем при комнатной. Экстракция в плане максимума концентрации белка достигает равновесия в течение 5 минут при повышенных температурах, в то время как экстракция при комнатной температуре занимает 10 минут. Когда температура экстракции поднималась от комнатной температуры до 60°С, концентрация белка в экстракте повышалась выше 10%, в то время как дальнейшее повышение температуры приводило к незначительно понижающейся экстрагируемости.
Основываясь на данных по концентрации белка, приведенных в таблице I, вычисляли экстрагируемость белка, результаты приведены в нижеследующей таблице II.
Таблица II
Экстрагируемость белка при различных температурах*
Температура (°С)
Экстрагируемость (вес.%)
RT
50,1
55
54,0
60
55,9
65
53,9
*Определенное в процентах количество экстрагированного по отношению к общему содержанию белка в кормовой муке.
Как видно из этих данных, экстрагируемость белка из кормовой муки из жмыха семян канолы превышает 50 вес.% при всех исследуемых значениях температуры, что является существенным превышением 30%-ного (по весу) максимума, достигаемого при использовании имеющейся в продаже «поджаренной» кормовой муки из жмыха семян канолы.
Пример 2
В этом примере исследовалось влияние различных параметров на экстрагируемость белков.
В первой серии экспериментов образцы по 50 г (а) кормовой муки из жмыха семян канолы, из которой воздушным путем был удален растворитель при температуре окружающей среды (20°С), или (b) имеющейся в свободной продаже кормовой муки из жмыха семян канолы, из которой растворитель был удален обычным «поджариванием» («поджаренная» продажная мука), были добавлены к 500 мл 0,05 М или 0,10 М NaCl раствора при комнатной температуре (20°С) и их подвергали перемешиванию в течение 15 минут. Смесь центрифугировали при 5000×g в течение 10 минут для удаления отработанной кормовой муки.
Во второй серии экспериментов, 500 мл воды без соли сначала нагревали до 60°С в пластинчатом теплообменном аппарате для нагревания и затем к ней добавляли (а) 50 г кормовой муки из жмыха семян канолы, из которой предварительно воздушным путем был удален растворитель при температуре окружающей среды (20°С) (мука из «выжимок») или (b) имеющуюся в продаже кормовую муку из жмыха семян канолы, из которой был удален растворитель общеизвестным способом «поджаривания», перемешивали в течение 15 минут при поддержании постоянной температуры. Экстракт отделяли от отработанной муки центрифугированием при 5000×g в течение 10 минут.
Вычисляли концентрацию белка в различных водных белковых растворах, полученных в этих экспериментах, результаты приведены в нижеследующей таблице III.
Таблица III
Содержание белка в экстрактах (вес.%)
Раствор 0,05 М соли
Раствор 0,10 М соли
Вода 60°С
Кормовая мука, из которой удален растворитель при температуре окружающей среды
2,09
2,04
1,38
«Поджаренная» продажная кормовая мука
0,75
0,85
0,60
Экстрагируемость белков из разновидностей кормовой муки определяли на основе данных по содержанию белка из Таблицы III, и эти результаты показаны в Таблице IV.
Таблица IV
Экстрагируемость белка (вес.%)*
Раствор 0,05 М соли
Раствор 0,10 М соли
Вода 60°С
Кормовая мука, из которой удален растворитель при температуре окружающей среды
49,6
48,4
32,7
«Поджаренная» продажная кормовая мука
17,0
20,0
14,0
*Определенное в процентах количество экстрагированного белка по отношению к общему содержанию белка в кормовой муке.
Данные таблицы IV показывают, что экстрагируемость кормовой муки из «выжимок» при обеих концентрациях соли сравнима с таковой при 15 вес.% кормовой муки и 0,15%-ной концентрации соли при комнатной температуре (см. Таблицу II выше). Экстракция белка из кормовой муки из «выжимок» с помощью 0,05 М NaCl сравнима с таковой при 0,10 М NaCl. В случаях, когда соль не добавляют, экстрагируемость белка при повышенной температуре значительно ниже по сравнению с вариантом, когда используют 0,05 М и 0,10 М соли при комнатной температуре. Во всех случаях, тем не менее, Экстрагируемость белка и содержание белка были значительно выше, чем те, что получались при использовании «поджаренной» имеющейся в продаже кормовой муки.
Третья серия экспериментов осуществлялась при комнатной температуре тем же самым образом, что описан выше, но при концентрациях солей 0,01 М, 0,02 М, 0,03 М, 0,04 М и 0,05 М.
Экстрагируемость белка определяли для каждого экстракта, и результаты показаны в следующей Таблице V.
Таблица V
Экстрагируемость белка из кормовой муки из «выжимок» при низких концентрациях соли
Концентрация соли (М)
Экстрагируемость белка (вес.%)
0,05
49,6
0,04
43,4
0,03
38.8
0,02
40,3
0,01
38,5
Из данных, представленных в Таблице V, видно, что существенное снижение экстрагируемости белка наблюдалось при концентрациях соли от 0,04 М до 0,05 М, при этом напрашивается вывод о том, что минимальная концентрация соли, необходимая для получения хорошего выхода белка в раствор экстракта, составляет 0,05 М.
Колонка Varian для высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC), 30 см BioSep S3000 Sige Exclusion Chromatography (SEC), содержащая гидрофильно-связываемую на основе диоксида кремния жесткую поддерживающую среду, с диаметром 5 микрон, размером 290 Ангстрем, пригодная для разделения глобулярных белков с величиной молекулы от 5000 до 700000 дальтон, использовалась для анализа серии стандартов белкового происхождения для определения времени удерживания (RT) при измерении А=280 нм и скорости элюции 1,0 мл/мин. Стандартные BioRad белки соответствуют области от 17000 дальтон (миоглобин) до 670 000 (тироглобулин) при использовании витамина В 12, добавляемого как низкомолекулярный маркер массы в 1350 дальтон. Каждый компонент анализируют при 280 нм и при скорости элюции 1,0 мл/мин. Раствор соли с доведенным рН, содержащий азид натрия в качестве антибактериального агента, использовали как растворитель при использовании колонки и для растворения сухих образцов. Оказалось, что для анализа элюанта достаточно 25-50 мкл пробы. HPLC Prostar система автоматически вычисляла время удерживания и площадь пиков и печатала краткий отчет протекания процесса.
Пробы экстрактов, приготовленных, как описано в этом примере, анализировали на каждой колонке. На основе площади пиков пересчитали долю каждого пика. Все пики на различных анализах (по площади) были пересчитаны, а затем были по отдельности пересчитаны три основные белковые фракции: 12S, 7S и 2S. Полученные результаты в графическом виде отражены на фиг.1-3.
На каждой хроматограмме виден отчетливый пик, соответствующий 7S фракции белков канолы и небольшой «всплеск», соответствующий 12S фракции белков канолы. Пик, соответствующий 2S фракции белков канолы, присутствует среди пиков других компонентов экстракта. Пики в низкомолекулярной области хроматограммы отчетливо не определяются, но похоже соответствуют азотсодержащим соединениям небелковой природы, например коротким пептидам и свободным аминокислотам, а также другим соединениям, содержащимся в кормовой муке, таким как производные фенолов, глюкозинолаты и фитаты.
Пример 3.
В этом примере показано получение изолята белков канолы из кормовой муки из жмыха семян канолы, из которой воздушным путем удален растворитель.
160 кг кормовой муки из «выжимок» канолы, из которой при 20°С воздухом был удален растворитель, добавили к 1602 л 0,15 М NaCl при 17,6°С и перемешивали в течение 30 минут, чтобы получить водный белковый раствор с содержанием белка 21,4 г/л. Спустя 15 минут после начала экстракции добавили 0,05 вес.% аскорбиновой кислоты. Доля экстрагированного белка от общего белка, содержащегося в кормовой муке, составила 51,6%.
Оставшуюся кормовую муку удалили и промыли на полотне вакуумного фильтра. Получившийся белковый раствор был очищен центрифугированием и фильтрацией с получением 1270 л очищенного белкового раствора с содержанием белка 16,2 г/л.
1270 л проэкстрагированного белкового раствора были доведены до объема 71 л концентрированием с помощью ультрафильтрационной системы с использованием мембран с отсечением по молекулярному весу 5000 дальтон. Экстрагированный белковый раствор был затем подвергнут диафильтрации с использованием диафильтрационной системы с мембранами с отсечением по молекулярному весу 5000 дальтон, и 5000 л (5 объемов ретентата) 0,15 М солевого раствора, содержащего 0,05 вес.% аскорбиновой кислоты, с получением конечного объема в 31 л и содержанием белка 226 г/л. Ретентат пастеризовали при 60°С в течение 10 минут.
Концентрированный и диализованный раствор разделили на три порции: 30 л, 30 л и 8 л соответственно. Первую порцию при 30°С разбавили 1:15 450 мл профильтрованной при 4°С воды. Белое облако белковых мицелл сразу же образовалось и ему дали осесть. Верхний слой разбавляющей воды был удален. Эту же процедуру осуществили со второй и третьей порциями. Осажденная вязкая липкая масса (РММ) была собрана со дна емкости. Было установлено, что содержание белка в сухой белковой массе составило 102,4 вес.% (N×6,25) с.в. (Величина содержания азота определялась с помощью Leco FP 328 Nitrogen Determinator). Продукту присвоили обозначение BW-AA020-C17-03A-C300.
988 л супернатанта со стадии мицеллообразования были сконцентрированы до 38 л с помощью ультрафильтрационной системы, в которой применяются мембраны с отсечением по молекулярному весу 5000 дальтон. Концентрированный супернатант был затем подвергнут диафильтрации на диафильтрационной системе с мембранами, обеспечивающими отсечение по молекулярному весу 5000 дальтон, и с 130 л (4 объема ретентата) воды до конечного объема 38 л и с содержанием белка 194 г/л.
Сконцентрированный и подвергнутый диафильтрации раствор был разбавлен до консистенции, пригодной для прокачивания по трубопроводу, и затем был подвергнут распылительной сушке. В высушенном белковом продукте содержание белка составило 97,6 вес.% (N×6,25) с.в. Продукту присвоили обозначение BW-AA020-C17-03A-C200.
Выводы
Настоящее изобретение обеспечивает усовершенствованный способ получения изолятов белка из кормовой муки из жмыха семян масличных за счет использования указанной кормовой муки, из которой удален растворитель при температуре окружающей среды, с обеспечением более высокой степени экстракции белка из кормовой муки, что является более выгодным с экономической точки зрения. В рамках данного изобретения возможны модификации.