ПОЛИПЕПТИДЫ, ОБЛАДАЮЩИЕ ЛИПАЗНОЙ АКТИВНОСТЬЮ, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ РАЗДЕЛЕНИЯ ПШЕНИЦЫ

1. Способ разделения пшеничной муки на две или более фракций, включающих фракцию клейковины и фракцию крахмала, предусматривающий стадии:
f) смешивания пшеничной муки и воды;
g) добавления одного или нескольких полипептидов, обладающих липазной активностью;
h) инкубирования смеси в течение заранее определенного периода времени;
i) разделения смеси на две или более фракций, включающих богатую клейковиной фракцию и богатую крахмалом фракцию;
j) извлечения двух или более фракций, включающих богатую клейковиной фракцию и богатую крахмалом фракцию;
,
где один или несколько полипептидов, обладающих липазной активностью, выбраны из полипептидов, обладающих липазной активностью и характеризующихся идентичностью последовательности с одной из SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 или 24, составляющей по меньшей мере 60%, например по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100%.
2. Способ по п. 1, где на стадии a) воду и пшеничную муку смешивают в соотношении, составляющем 0,1-3 л воды на кг пшеничной муки, предпочтительно 0,5-2,5 л воды на кг пшеничной муки, предпочтительно 1-2 л воды на кг пшеничной муки.
3. Способ по п. 1 или 2, где один или несколько полипептидов, обладающих липазной активностью, добавляют в количествах от 0,1 до 500 мкг ферментного белка на грамм пшеничной муки (мкг ЕР/г пшеницы), например, в диапазоне от 1 до 200 мкг ЕР/г пшеничной муки, например, в диапазоне от 5 до 100 мкг ЕР/г пшеничной муки.
4. Способ по любому из предыдущих пунктов, где ксиланазу добавляют вместе с одним или несколькими полипептидами, обладающими липазной активностью.
5. Способ по п. 4, где ксиланаза выбрана из ксиланаз, принадлежащих к семействам GH8, GH10 или GH11.
,
6. Способ по п. 5, где ксиланаза представляет собой ксиланазу GH8 и характеризуется идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 21, составляющей по меньшей мере 60%, например по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97% по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100%.
,
7. Способ по п. 5, где ксиланаза представляет собой ксиланазу GH10 и характеризуется идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 22, составляющей по меньшей мере 60%, например по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100%.
8. Способ по любому из пп. 4-7, где ксиланазу добавляют в количестве, составляющем 0,0005-1,5 мг ферментного белка на г пшеничной муки, предпочтительно 0,001-1 мг ферментного белка на г пшеничной муки, предпочтительно 0,01-0,5 мг ферментного белка на г пшеничной муки, предпочтительно 0,025-0,25 мг ферментного белка на г пшеничной муки.
9. Способ по любому из предыдущих пунктов, где инкубацию на стадии c) проводят в течение периода продолжительностью от 5 мин до 8 ч, предпочтительно от 15 мин до 4 ч.
10. Способ по любому из предыдущих пунктов, где стадию d) проводят в трехфазном сепараторе, и при этом получают богатую клейковиной фракцию, богатую крахмалом фракцию и богатую пентозаном/волокном фракцию.
11. Способ по любому из предыдущих пунктов, характеризующийся одним или несколькими преимуществами по сравнению с аналогичным способом без добавления полипептида, обладающего липазной активностью, выбранными из пониженной вязкости в суспензии пшеничной муки, более высокого показателя извлечения белка и более высокой производительности на стадии разделения.
12. Полипептид, обладающий липазной активностью, выбранный из группы, состоящей из
(i)
(а) полипептида, характеризующегося по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью последовательности со зрелым полипептидом под SEQ ID NO: 2;
(b) полипептида, кодируемого полинуклеотидом, который гибридизуется в условиях низкой жесткости с последовательностью, кодирующей зрелый полипептид, под SEQ ID NO: 1 или полноразмерной последовательностью, комплементарной ей;
(c) полипептида, кодируемого полинуклеотидом, характеризующимся 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью последовательности с последовательностью, кодирующей зрелый полипептид, под SEQ ID NO: 1;
(d) варианта зрелого полипептида под SEQ ID NO: 2, характеризующегося заменой, делецией и/или вставкой по одному или нескольким положениям; и
(e) фрагмента полипептида (a), (b), (c) или (d), который обладает липазной активностью;
(ii)
(a) полипептида, характеризующегося по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью последовательности со зрелым полипептидом под SEQ ID NO: 4;
(b) полипептида, кодируемого полинуклеотидом, который гибридизуется в условиях средней жесткости с последовательностью, кодирующей зрелый полипептид, под SEQ ID NO: 3 или полноразмерной последовательностью, комплементарной ей;
(c) полипептида, кодируемого полинуклеотидом, характеризующимся по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью последовательности с последовательностью, кодирующей зрелый полипептид, под SEQ ID NO: 3;
(d) варианта зрелого полипептида под SEQ ID NO: 4, характеризующегося заменой, делецией и/или вставкой по одному или нескольким положениям;
(e) фрагмента полипептида (a), (b), (c) или (d), который обладает липазной активностью;
(iii)
(а) полипептида, характеризующегося по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью последовательности со зрелым полипептидом под SEQ ID NO: 6;
(b) полипептида, кодируемого полинуклеотидом, который гибридизуется в условиях низкой жесткости с последовательностью, кодирующей зрелый полипептид, под SEQ ID NO: 5, соответствующей ей последовательностью cDNA или полноразмерной последовательностью, комплементарной ей;
(c) полипептида, кодируемого полинуклеотидом, характеризующимся по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью последовательности с последовательностью, кодирующей зрелый полипептид, под SEQ ID NO: 5 или соответствующей ей последовательностью cDNA;
(d) варианта зрелого полипептида под SEQ ID NO: 6, характеризующегося заменой, делецией и/или вставкой по одному или нескольким положениям;
(e) фрагмента полипептида (a), (b), (c) или (d), который обладает липазной активностью;
(iv)
(а) полипептида, характеризующегося по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью последовательности со зрелым полипептидом под SEQ ID NO: 10;
(b) полипептида, кодируемого полинуклеотидом, который гибридизуется в условиях низкой жесткости с последовательностью, кодирующей зрелый полипептид, под SEQ ID NO: 9, соответствующей ей последовательностью cDNA или полноразмерной последовательностью, комплементарной ей;
(c) полипептида, кодируемого полинуклеотидом, характеризующимся по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью последовательности с последовательностью, кодирующей зрелый полипептид, под SEQ ID NO: 9 или соответствующей ей последовательностью cDNA;
(d) варианта зрелого полипептида под SEQ ID NO: 10, характеризующегося заменой, делецией и/или вставкой по одному или нескольким положениям;
(e) фрагмента полипептида (a), (b), (c) или (d), который обладает липазной активностью;
(v)
(a) полипептида, характеризующегося по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью последовательности со зрелым полипептидом под SEQ ID NO: 14;
(b) полипептида, кодируемого полинуклеотидом, который гибридизуется в условиях низкой жесткости с последовательностью, кодирующей зрелый полипептид, под SEQ ID NO: 13, соответствующей ей последовательностью cDNA или полноразмерной последовательностью, комплементарной ей;
(c) полипептида, кодируемого полинуклеотидом, характеризующимся по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью последовательности с последовательностью, кодирующей зрелый полипептид, под SEQ ID NO: 13 или соответствующей ей последовательностью cDNA;
(d) варианта зрелого полипептида под SEQ ID NO: 14, характеризующегося заменой, делецией и/или вставкой по одному или нескольким положениям;
(e) фрагмента полипептида (a), (b), (c) или (d), который обладает липазной активностью;
(vi)
(a) полипептида, характеризующегося по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью последовательности со зрелым полипептидом под SEQ ID NO: 24;
(b) полипептида, кодируемого полинуклеотидом, который гибридизуется в условиях низкой жесткости с последовательностью, кодирующей зрелый полипептид, под SEQ ID NO: 23, соответствующей ей последовательностью cDNA или полноразмерной последовательностью, комплементарной ей;
(c) полипептида, кодируемого полинуклеотидом, характеризующимся по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью последовательности с последовательностью, кодирующей зрелый полипептид, под SEQ ID NO: 23 или соответствующей ей последовательностью cDNA;
(d) варианта зрелого полипептида под SEQ ID NO: 24, характеризующегося заменой, делецией и/или вставкой по одному или нескольким положениям;
(e) фрагмента полипептида (a), (b), (c) или (d), который обладает липазной активностью.
13. Полипептид по п. 12, содержащий или состоящий из SEQ ID NO: 2, 4, 6, 10, 14 или 24 или зрелого полипептида под SEQ ID NO: 2, 4, 6, 10, 14 или 24.
14. Полипептид по п. 13, где зрелый полипептид представляет собой аминокислоты 20-413 последовательности под SEQ ID NO: 2, аминокислоты 16-339 последовательности под SEQ ID NO: 4, аминокислоты 16-339 последовательности под SEQ ID NO: 6, аминокислоты 18-343 последовательности под SEQ ID NO: 10, аминокислоты 17-185 последовательности под SEQ ID NO: 14 или аминокислоты 20-339 последовательности под SEQ ID NO: 24.
15. Полипептид по любому из пп. 12-14, который представляет собой вариант зрелого полипептида под SEQ ID NO: 2, 4, 6, 10, 14 или 24, содержащий замену, делецию и/или вставку по одному или нескольким положениям.
16. Полипептид по пп. 12-14, который представляет собой фрагмент из SEQ ID NO: 2, 4, 6, 10, 14 или 24, при этом фрагмент обладает липазной активностью.
17. Композиция, содержащая полипептид по любому из пп. 12-16.
18. Состав на основе цельного бульона или композиция на основе культуры клеток, содержащие полипептид по любому из пп. 12-16.
19. Полинуклеотид, кодирующий полипептид по любому из пп. 12-16.
20. Конструкция на основе нуклеиновой кислоты или вектор экспрессии, содержащие полинуклеотид по п. 19, функционально связанный с одной или несколькими регуляторными последовательностями, которые управляют выработкой полипептида у экспрессирующего хозяина.
21. Рекомбинантная клетка-хозяин, содержащая полинуклеотид по п. 19, функционально связанный с одной или несколькими регуляторными последовательностями, которые управляют выработкой полипептида.
22. Способ получения полипептида, обладающего липазной активностью, предусматривающий культивирование клетки-хозяина по п. 21 в условиях, благоприятных для выработки полипептида.
23. Способ по п. 22, дополнительно предусматривающий извлечение полипептида.