Распределение НАДФН-диафоразы и ферментов синтеза сероводорода в стенке артерий головного мозга

INFLUENCE OF ANTIOXIDANTS ON CHANGES OF THE CORTEX OF ADRENAL GLANDS AT CHRONIC ALCOHOLIC INTOXICATION

A.G. KVARATSKHELIYA, S.N. SEMYONOV

Voronezh State Medical Academy after N.N.Burdenko,

Chair of Normal Anthroponomy

Visual microscopy and morphometry show the effect of chronic alcohol intoxication on the morphological characteristics of rats' adrenal gland cortex and the modifying effect of a-tocopherol on the intensity of developing changes.

Key words: Chronic alcohol intoxication, the rats, the cortex of adrenal glands, a-tocopherol, morphometry.

УДК 612.13:577.95:816

РАСПРЕДЕЛЕНИЕ НАДФН-ДИАФОРАЗЫ И ФЕРМЕНТОВ СИНТЕЗА СЕРОВОДОРОДА В СТЕНКЕ АРТЕРИЙ ГОЛОВНОГО МОЗГА

А.Е. КОЦЮБА*

Работа выполнена на 48 крысах-самцах линии Вистар с целью изучения распределения NADPH-диафоразы, СВS и CSE в стенке церебральных сосудов разного порядка ветвления.

Ключевые слова: NADPH-диафораза, церебральные сосуды, оксид азота.

Оксид азота (NO) является основным вазодилататором, препятствующим тоническому сокращению сосудов нейронального, эндокринного и локального происхождения. Эндотелиальная NO-синтаза (NOS), принимая участие в синтезе NO эндотелием, является ключевым ферментом в регуляции тонуса кровеносных сосудов, в работе гладкомышечной мускулатуры сосудистой стенки. Согласно имеющимся представлениям, в гладкомышечных клетках сосудов синтез NO определяет индуцибельная NOS, при стимуляции которой продукция NO может возрастать в десятки раз, при этом он приобретает цитотоксические свойства [2]. В физиологических условиях NO постоянно вовлечен в адаптацию сосудистой системы к повышенным метаболическим потребностям и физическим нагрузкам [5]. Не так давно было установлено, что аналогичными NO функциями обладает и другой газ - сероводород (H2S), отмечено его влияние на сопротивление резистивных сосудов и величину артериального давления. Эндогенно H2S синтезируется из L-цистеина ферментами - цистатио-нин р-синтазой (СВS) и цистатионин у-лиазой (CSE). Считается, что СВS является источником H2S в нервной, а CSE - в сосудистой системе, в которой CSE экспрессируется в гладкомышечных клетках, но не определяется в эндотелии [6].

Цель исследования - изучение распределения NADPH-диафоразы, СВS и CSE в стенке церебральных сосудов разного порядка ветвления.

Материалы и методы исследования. Работа выполнено на 48 крысах-самцах линии Вистар массой 280-320 г. Объектом исследования служили внутренняя сонная артерия в месте входа в сонный канал (диаметр 304-284 мкм), а также ее ветви IV порядков бассейна средней мозговой артерии диаметром соответственно: 108-86 мкм, 74-46 мкм, 45-34 мкм, 30-12 мкм, 108 мкм и внутримозговые артерии - 9-6 мкм.

Для идентификации NO применялась реакция на NADPH-диафоразу, которая является маркером NOS. NADPH-диафоразу выявляли методом V. Hope а. S. Vinsent [4]. Для определения активности фермента (NADPH-диафораза; КФ 1.6.99.1) материал фиксировали 2 ч при 4°С в 4% растворе параформальдегида на 0,1 М Na-фосфатном буфере (рН 7,4), промывали в 15% растворе сахарозы в течение суток. Образцы термостатировали в течение 1 ч при 37°С в среде следующего состава: 50 мМ Трис-буфер, 0,2% Тритон Х-100, 0,8 мг/мл p-NADPH, 0,4 мг/мл НСТ (рН 8,0). Для иммунногистохимического выявления СВS и CSE отрезки внутренней сонной артерии длиной около 5 мм, а также кусочки мозга вместе с сосудами мягкой оболочки фиксировали в течение 1 ч в 4%-ном растворе параформальдегида, приготовленном на 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,4) при 4°С. Из образцов готовили крио-статные срезы толщиной 40 мкм, которые последовательно инкубировали с 1%-ной нормальной сывороткой лошади 1 ч при комнатной температуре мышиными моноклональными антителами

* ГОУ ВПО «Владивостокский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», г. Владивосток, пр. Острякова 2, тел. 8 (4232) 42-97-78

либо против цистатион р-синтазы (в разведении 1:1000), либо цистатионин у-лиазы (в разведении 1:500) (Abcam, Великобритания) при температуре 4°С в течение 18 ч, биотини-лированными антителами в разведении 1:100 (Vertor Labs, США) 2 ч, а также с авидин-пероксидазным комплексом (Vectastain Elite ABC Kit, Vertor Labs, США) 1 ч при комнатной температуре. Для выявления продуктов реакции под контролем микроскопа срезы инкубировали в субстрате для обнаружения пероксидазы (VIP Substrate Kit, Vertor Labs, США). Затем срезы промывали, обезвоживали по стандартной методике и заключали в полистерол.

Результаты и их обсуждение. Результаты исследования показали, что эндотелий внутренней сонной артерии, артерий мягкой оболочки головного мозга и внутримозговых сосудов, имеет в основном положительную реакцию на NOS, однако фермент в эндотелии определяется не во всех артериях одинаково. Отмечено, что в артериях одного и того же калибра активность NOS может существенно отличаться, окрашивая эндотелиальные клетки в разные оттенки синего цвета. В одних сосудах преципитат откладывается исключительно плотно, окрашивая эндотелий в насыщенные тона синего цвета, в других артериях, зачастую расположенных от них в непосредственной близости, интенсивность в эндотелиальных клетках невысокая, при которой клетки имеют бледно-голубой цвет. В нормально функционирующем эндотелии NO постоянно освобождается для поддержания кровеносных сосудов в состоянии дилатации [1]. Это так называемая базальная секреция NO, которая в физиологических условиях поддерживает тонус сосудов в покое и обеспечивает неадгезивность эндотелия по отношению к форменным элементам крови [5].

В мышечной оболочке, в условиях физиологической нормы, NOS выявляется не всегда и не во всех сосудах одинаково. В гладких миоцитах средней оболочки внутренней сонной артерии, пиальных артериях I и II порядков, мы наблюдали NOS крайне редко. Мышечная оболочка этих сосудов имеет в своем большинстве очень слабую интенсивность реакции, при которой клетки окрашиваются в бледно-голубой цвет. Отложения продукта реакции в мышечных клетках заметно возрастает в отдельных пиальных ветвях II и особенно III порядков, обнаруживая при этом умеренную активность фермента. В мышечных клетках сосудов мягкой оболочт головного мозгa (МОГМ) IV-V порядка и внутримозговых артериол активность NOS также определяется не постоянно, в тех сосудах в которых она выявляется, фермент имеет низкую или умеренную активность. Следовательно, как показывают наши наблюдения, в гладкомышечных миоцитах части церебральных сосудов, NOS может присутствовать и в физиологических условиях.

CSE в стенке артерий, во многом зависимую от их диаметра. Во внутренней сонной артерии и пиальных ветвях I и II порядков мелкогранулярный осадок откладывается только в гладких миоци-тах средней оболочки, маркируя их в зависимости от плотности отложения преципитата, в различные оттенки бордового цвета. Во внутренней сонной артерии интенсивность отложения продукта реакции в мышечных клетках невысока, но заметно возрастает в пиальных ветвях II и особенно III порядков. В ветвях III порядка миоциты часто обнаруживают высокую активность фермента, причем интенсивность реакции, как правило, выше в тех мышечных клетках, которые прилежат к внутренней оболочке. Хотя в артериях одного и того же порядка ветвления активность CSE существенно отличается. В средней оболочке одних сосудов преципитат откладывается исключительно плотно, окрашивая миоци-ты в интенсивно бордовый цвет, в других сосудах, зачастую расположенных рядом, интенсивность реакции невысокая, при которой мышечные клетки имеют бледно-розовый цвет. В средней оболочке более мелких пиальных и внутримозговых артериол активность CSE в большинстве образцов не определяется. Исключение составляют тонкие анастоматические ветви пиальных артерий диаметром 9-12 мкм, где миоциты нередко располагают относительно высокой активностью фермента. Кроме мышечных клеток активность CSE определяется в эндотелии пиальных и внутримозговых сосудов. При этом мелкозернистый осадок более или менее плотно откладывается по всему или большей части периметра внутренней выстилки сосудов. В ветвях пиальных артерий III-V порядков, а также внутримозговых сосудах отложение фермента в эндотелии наблюдается значительно чаще, чем в более крупных артериях. В эндотелии внутренней сонной артерии преципитат определяется в единичных случаях.

Локализация СВS в мозге, по некоторым сведениям, ограничи-

вается исключительно нейронами [3,7]. Однако как показали наши наблюдения, СВS определяется также в эндотелии пиальных сосудов IV, V порядков и внутримозговых артериол. Светло-коричневые пылевидные гранулы маркируют внутреннюю выстилку этих сосудов по всему периметру или большей его части, при этом численная плотность сосудов с положительной реакцией на СВS, значительно выше в веществе мозга, чем в артериолах МОГМ.

Таким образом, местом образования H2S в стенке церебральных артерий могут быть гладкие миоциты средней оболочки и эндотелий, в которых определяется активность СВS и CSE -ферментов, участвующих в синтезе этого газа. Однако наличие и распределение этих ферментов в структурных элементах стенки артерий тесно связано с калибром и локализацией сосудов. Экспрессия СВS и CSE обычно наблюдается только в эндотелии мелких пиальных и внутримозговых артериол, CSE - в мышечных клетках внутренней сонной артерии и пиальных ветвях I-III порядков. Хотя имеется достаточно большое количество сосудов, в которых экспрессии исследуемых ферментов не отмечено. Высказывается предположение, что роль H2S в эндотелии и мышечных клетках сосудах существенно отличается [8]. В эндотелии он выступает посредником в высвобождении вазорелаксантов, прежде всего, NO и EDHF, но не оказывает непосредственного влияния на тонус сократительных клеток.

Исследование выполнено при финансовой поддержке Федерального агентства по науке и инновациям. Федеральная целевая программа «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» (госконтракт №14.740.11.0186).

Литература

1. Адашева Т.В., Задионченко В.С., Сандомирская А.П. // Российский медицинский журнал,- 2002.-Т.10, N° 1.-С. 11-16.

2. Бондарь И.А., Климонтов В.В., Поршенников И.А. // Сахарный диабет,- 1999.-№4.-С. 11-14.

3. Dombkowski R.A., RussellM.J., Olson K.R. // Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol.,- 2004.-Vol.286.-Р. 678-685.

4. Hope B.T., Vincent S.R. //J. Neurochem. Cytochem.,- 1989-Vol. 37.-P. 653-661.

5. Luscher T.F, Barton M. //Clin. Cardiol.,- 1997.-Vol.20.-P.

3-10.

6.Olson K.R., Donald J.A. //Acta Histochem.,- 2009.-Vol.111, N 3.-P. 244-256.

7. Perry B., McNeill В., Elia E. //Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol.,- 2009.-Vol.296, №1.-Р. 133-140.

8. Shibuya N., Mikami Y., Kimura Y. //J. Biochem.,- 2009.-Vol. 146, №5.-Р. 623-626.

DISTRIBUTION OF NADPH-DIAPHORASE AND ENZYME SYNTHESIS OF HYDROGEN SULFIDE IN THE WALLS OF BRAIN ARTERIAS

А^Е. KOTSYUBA Vladivostok State Medical University

The article presents the results of studying 48 rat males of Wis-tar line concerning the distribution of NADPH-diaphorase, cystathio-nine-p-synthetase and cystathionine p-lyase in the walls of cerebral vessels of a different embranchment order.

Key words: NADPH-diaforaza, cerebral vessels, oxid nitrogen.

УДК 616.344+612.014=616.42-092.9:543.23

ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРНО-КЛЕТОЧНЫХ ПРЕОБРАЗОВАНИЙ ЛИМФАТИЧЕСКОГО РЕГИОНА ПОДВЗДОШНОЙ КИШКИ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ СПОСОБА ВВЕДЕНИЯ ТОКСИЧЕСКОЙ ДОЗЫ СЕЛЕНИТА НАТРИЯ

И.И. КОШЕЛЕВА*

При экспериментальном введении токсической дозы селенита натрия различными способами (перорально, внутрибрюшинно) характер и степень выраженности структурно - клеточных преобразований в лимфатическом регионе подвздошной кишки, зависят от топо-графо-анатомического положения лимфоидных образований и последовательности участия их в процессе обработки лимфы. Ключевые слова: селенит натрия, подвздошная кишка, лимфатический регион.

* ГОУ ВПО «Омская государственная медицинская академия» Минздрав-соцразвития России, Кафедра анатомии человека, 644043, г. Омск, ул. Партизанская 20, тел.: 8 (3812) 24-43-84

При экспериментальном введении токсической дозы селенита натрия различными способами (перорально, внутрибрю-шинно), характер и степень выраженности структурноклеточных преобразований в лимфатическом регионе подвздошной кишки, зависят от топографо-анатомического положения лимфоидных образований и последовательности участия их в процессе обработки лимфы.

Цель исследования. В последнее время в нашей стране очень возрос интерес к эссенциальному микроэлементу селену -необходимому для нормальной жизнедеятельности организма человека. Он является одним из антиоксидантов непрямого действия, защищает организм от оксидантного стресса и обладает антиканцерогенными свойствами [1]. Основным источником поступления селена в организм являются продукты питания, и уровень его абсорбции не зависит от селенового статуса организма. Однако до настоящего времени нет критериев физиологической нормы потребления этого биотика, и чрезмерное применение селен содержащих препаратов, может привести к развитию гиперселеноза, состоянию, когда оксидантные свойства преобладают над антиоксидантными [2].

В обеспечении окислительного гомеостаза в организме главную роль играет лимфатическая система. Любое нарушение внутренней среды организма немедленно сказывается на ее морфофункциональных показателях. Она одной из первых реагирует на изменение эндоэкологического равновесия, при этом ее роль может быть сформулирована как дренажно-детоксикационная. Лимфатическая система имеет высокие потенциальные возможности в обеспечении процессов адаптации организма [3,4].

То, что селен в организм чаще всего поступает через желудочно-кишечный тракт, и послужило основанием для исследования лимфатического региона подвздошной кишки при различных (пероральный и внутрибрюшинный) способах введения токсических доз селенита натрия.

Материал и методы исследования. В работе использовали крыс-самцов породы Вистар, 7-8 месячного возраста, массой тела 180-200 г из вивария ЦНИЛ ОмГМА. Животным в течение 5 дней перорально и внутрибрюшинно вводили токсическую дозу селенита натрия из расчета 5 мг на кг массы тела. Объектом исследования служили брыжейка тонкой кишки, участок подвздошной кишки с пейеровой бляшкой и верхний брыжеечный лимфатический узел. Материал забирали на 2 сутки (после однократного введения), на 6 сутки (полный курс) и на 14 сутки (9 сутки после отмены). Интактные животные составили группу контроля.

Стенку кишки и регионарный лимфатический узел подвергали гистологической обработке по стандартной методике, полученный материал исследовали на микроскопе МБС-10. Статистическую обработку выполняли при помощи вариационного анализа, по методике, применяемой для нормального распределения признаков с использованием пакета статистических программ Excel 2007; STATISTICA 6,0.

Результаты и их обсуждение. При пероральном применении токсической дозы селенита натрия уже на 2 сутки отмечали уменьшение площади среза стенки подвздошной кишки и межклеточных пространств подслизистой основы, и увеличение площади лимфатического капилляра, это свидетельствует об усилении фильтрации тканевой жидкости и активации процессов лимфообразования. Увеличение численности всех клеточных форм в стенке кишки указывает на возросшую антигенную нагрузку на стенку.

Уменьшение площади пейеровой бляшки на 2 сутки эксперимента происходит в основном за счет уменьшения в ее структуре площади межузелковой зоны. В герминативном центре вторичных узелков ее в ответ на антигенную стимуляцию, происходит увеличение численности лимфоидных, митотически делящихся клеток. Возрастание численности дегенерирующих форм клеток является свидетельством того, что лимфа, проходящая через пейерову бляшку, высокотоксичная.

Общая площадь среза верхнего брыжеечного лимфатического узла на 2 сутки эксперимента снижается. Значение К/М индекса его возрастает и становится близкими к 1,0, и остается таковым на протяжении всего эксперимента. Морфотип узла изменяется от фрагментированного [5] - в контроле на промежуточный, главным образом, за счет уменьшения площади синусной системы. Это создает благоприятные условия для обмена веществ между лимфой и лимфоидной тканью, то есть при поступлении в организм токсической дозы селенита натрия лимфатический узел стремиться усилить детоксикационную функцию