Иммунные нарушения при вирусиндуцированной бронхиальной астме у детей

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ АЛЛЕРГОЛОГИЯ

логических тестов. Данная система включает одностадийную очистку белка на агарозе Ni из телец включения. Результаты иммунологических исследований показали пригодность данного препарата для использования в ИФА и иммуноблотте. Полученный высокоочищенный продукт может быть использован при создании современных тест-систем для диагностики аллергии.

Работа проводилась при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ (государственный контракт № 16.512.11.2068 от 16 февраля 2011 г.).

ЛИТЕРАТУРА

2. Бызова Н. А., Сотников Д. В., Жердев А. В., и др. Иммунохроматографический анализ уровня специфического сывороточного IgE человека для диагностики аллергии на пыльцу тимофеевки луговой. Иммунология. 2010; 1: 47-51.

3. Казиев АХ., РайкисБ.Н., Пожарская В.О. Перспективы разработки рекомбинантных аллергенов. Аллергология. 2002; 2: 17-20.

REFERENCES

1. Zhu Y.Y., Machleder E.M., Chenchik A. et al. Reverse transcriptase template switching: a SMART approach for full-length cDNA library construction. Biotechniques. 2001; 30: 892-7.

2. Byzova N. A., Sotnikov D. V., Zherdev A. V., i dr. Immunologiya. 2010; 1: 47-51. (in Russian).

3. Kaziev A.Kh., Raykis B.N., Pozharskaya V.O. Allergologiya. 2002; 2: 17-20. (in Russian).

4. Erler A., Hawranek T., Kruckemeier L. et al. Proteomic profiling of birch (Betula verrucosa) pollen extracts from different origins. Proteomics. 2011; 11 (8): 1486-98.

5. Cromwell O., Hafner D., Nandy A. Recombinant allergens for specific immunotherapy. J. Allergy Clin. Immunol. 2011; 127(4): 865-72.

6. Schmidt W.M., Mueller M.W. CapSelect: a highly sensitive method for 5’ CAP-dependent enrichment of full length cDNA in PCR-mediated analyses of mRNAs. Nucleic Acid Res. 1999; 27: 31.

Поступила 18.10.12

© Л.И. АЛЛАХВЕРДИЕВА, У.М. ГУМБАТОВА, 2013 УДК 616.248-022.6-053.2-092:612.017.1]-078.33

Л.И. Аллахвердиева, У.М. Гумбатова

иммунные нарушения при бирусиндуциробанной бронхиальной астме У ДЕТЕЙ

Азербайджанский медицинский университет, Баку, Республика Азербайджан

Авторы определяли содержание основных субпопуляций лимфоцитов периферической крови, уровень интерферона (IFN)y, а также растворимой молекулы адгезии sICAM-1 в сыворотке крови больных вирусиндуцированной бронхиальной астмой (БА). Концентрацию IFNy и sICAM-1 определяли иммуноферментным методом. Показано, что в сыворотке крови больных снижается содержание IFNy. Это доказывает, что развитие Т-клеточного ответа при вирусиндуцированной БА происходит путем смещения равновесия популяций Th1 и Th2 в сторону T-хелперов второго типа. Оценка сывороточного уровня молекулы адгезии sICAM-1 выявила существенное его изменение при вирусиндуцированной БА. Полученные результаты позволяют говорить, что вирусиндуцированная БА у детей сопровождается выраженным увеличением сывороточного уровня молекулы адгезии ICAM-1, зависящим от степени тяжести заболевания, что указывает на разбалансированность иммунных реакций.

Ключевые слова: дети, респираторные вирусы, бранхиальная астма L.I. Allakhverdiyeva, U.M. Humbatova

IMMUNE DISTURBANCES IN CHILDREN WITH VIRUS-INDUCED BRONCHIAL ASTHMA

The content of main subpopulations of peripheral blood lymphocytes, level of interferon-gamma and also soluble molecules of adhesion sICAM-1 were identified in the blood serum of patients with virus-induced bronchial asthma. Concentration of interferon-gamma and sICAM-1 was determined by immunofermental method.

The results show a decrease of interferon-gamma content in the blood serum of patients. It demonstrates that development of T-cell response in virus-induced bronchial asthma occurs by accent the balance of Th-1 and Th-2 populations towards type 2 T-helpers. Evaluation of serum level of sICAM-1 molecule of adhesion demonstrated its significant change in virus-induced bronchial asthma.

The obtained results allow to reveal that virus-induced bronchial asthma in children is accompanied by significant increase of serum level of sICAM-1 molecule of adhesion depending on degree of severity of the disease, that points to disbalance of immune reactions.

Key words: children, respiratory viruses,bronchial astma

Одной из причин отсутствия контроля над симптомами бранхиальной астмы (БА) у детей, несмотря на проводимую базисную терапию, является рецидивирующая респираторная вирусная инфекция. Вирусные инфекции являются важным фактором возникновения дыхательной обструкции у больных БА. Это в первую очередь связано с колонизацией вирусами эпителия дыхательных путей, клетки которого продуцируют большое количество провоспалительных цитокинов и медиаторов, усиливающих воспалительный процесс [1-3]. Повторные вирусные инфекции у детей с атопией воздействуют на иммун-

ную систему, активируя ТБ2-клетки, угнетая ТЪ1-лимфоциты, а также подавляя супрессорную функцию Т-лимфоцитов, что приводит к снижению продукции у-интерферона и других противоинфекционных факторов [4].

У детей БА сопровождается изменениями иммунологической реактивности, которые связаны со степенью тяжести, периодом заболевания или наличием сопутствующего инфицирования и касаются множества мембранных белков-рецепторов, осуществляющих и регулирующих межклеточные взаимодействия, а также их растворимых форм. Растворимые формы мем-

- 217 -

ИММУНОЛОГИЯ № 4, 2013

Характеристика количественного состава основных субпопуляций лимфоцитов у больных вирусиндуцированной бронхиальной астмой

Больные бронхиальной астмой

Популя- ционные маркеры лимфоцитов интермиттирующей легкой персистирующей среднетяжелой персистирую-щей Контроль

Доля лимфоцитов с определявшимся маркером М ± m, %

абс. % абс. % абс. % абс. %

CD3+ 51,1 ± 1,0**

CD4+ 28,8 ± 0,6**

CD8+ 22,2 ± 0,7

CD4+/CD8+ 1,33 ± 0,05*

CD16+/56+ 10,9 ± 0,5

CD19+ 16,2+0,6

Примечание. Достоверность различий по отношению к контролю *р<0,05; **p<0,001.

бранных белков клеток иммунной системы осуществляют чаще всего многофункциональное воздействие. Нарушение их равновесия может приводить к блокаде межклеточных мембранных взаимодействий и ограничению иммунного ответа [5].

Важным регулятором почти всех видов иммунного и воспалительного ответа являются адгезивные гликопротеины поверхности клеток, особенно молекулы межклеточной адгезии IcAM-1. В организме IcAM-1 существуют в мембраносвязанной и растворимой форме (sIcAM-1), которая обнаруживается в крови и других биологических жидкостях [5, 7]. Определения sIcAM-1 у больных БА немногочисленны, их результаты не позволяют сделать однозначный вывод о связи уровня sIcAM-1 с тяжестью течения заболевания.

Цель исследования - изучение характера изменения сывороточного уровня растворимой молекулы адгезии ICAM-1, установление уровня цитокина, определяющего тип иммунного ответа - интерферона у (IFNy), а также популяционного состава мононуклеарных клеток крови детей, больных вирус-индуцированной БА.

Материал и методы

Под наблюдением находилось 80 детей от 3 до 15 лет с вирусиндуцированной БА в период обострения заболевания. Диагностика аллергической патологии у наблюдаемых больных включала общепринятые методы: выяснялись данные анамнеза, проводилось общеклиническое и аллергологическое обследование. Диагноз БА ставился на основании тщательно собранного анамнеза, данных медицинской документации, клинического наблюдения, лабораторного и инструментального обследования. У 33

- легкое персистирующее и у 19 (23,8%) - среднетяжелое персистирующее течение БА. У всех больных БА имела атопическую форму. Клинические критерии атопической БА оценивали по наличию и характеру приступов удушья, кашля, свистящих хрипов, характеру сна, одышке и т.д.

Всем детям ставили кожные прик-тесты с бытовыми, эпидермальными, пищевыми и пыльцевыми аллергенами по стандартной методике. Учитывались результаты не ниже умеренно выраженных и выраженных (папула диаметром не менее 10 мм), сомнительные и слабоположительные пробы в расчет не принимались. Постановку кожных скарификацион-ных аллергопроб выполняли в период полной клинической ремиссии заболевания. При оценке результатов данных тестов преобладала сенсибилизация клещами домашней пыли

- D. Farinae и D. Pteronissinus.

Больным с интермиттирующим течением заболевания назначались агонисты р2 короткого действия по потребности. Больные с легким персистирующим течением БА получали в качестве базисной терапии ИГКС в низких дозах, агонисты Р2 пролонгированного действия, антилейкотриеновые пре-

параты. Больным со среднетяжелым персистирующим течением заболевания в качестве базисного лечения назначались ИГКС в средних дозах, антилейкотриены и/или агонисты р2 пролонгированного действия.

Выявление РНК-содержащих респираторно-синцитиального вируса, парагриппа проводили методом генодиагностики на основе ПЦР-анализа в соскобе со слизистой носа.

Определение концентрации sICAM-1 и IFNy в сыворотке крови осуществляли методом иммуноферментного анализа с помощью коммерческих тест-наборов, согласно прилагаемой к ним инструкции. Идентификацию мембранных маркеров иммунокомпетентных клеток периферической крови выполняли методом проточной цитометрии на проточном цитометре Epics XL (Beckman Coulter, Франция) с применением автоматического программного обеспечения.

Результаты исследования статистически обработаны методами непараметрического вариационного Уилкоксона и дискриминантного анализов. При разнице р<0,05 результаты считались достоверными [8].

Результаты и обсуждение

В настоящее время все большее внимание направлено на изучение проблемы участия инфекционных агентов в развитии воспалительного процесса и патогенезе БА. Персистенция инфекционных агентов у больных астмой детей обусловливает возникновение сложного многофакторного воспалительного процесса, в котором существуют черты как инфекционного, так и аллергического воспаления. Доказано, что воспаление, обусловленное вирусной инфекцией, может играть существенную роль как в дебюте, так и в прогрессировании БА [1, 2, 8].

Влияние, которое вирусная инфекция оказывает на БА, зависит от типа вируса. Для оценки роли вирусов при атопической БА нами проведено вирусологическое обследование наблюдаемых больных и установлена высокая инфициро-ванность детей с атопической БА возбудителями вирусных респираторных инфекций. Чаще всего выявляли антигены респираторно-синцитиального (РС) вируса (91,3%), который в настоящее время рассматривается как потенциальный фактор, способствующий развитию заболевания.

У большинства обследованных детей БА развивалась постепенно на фоне частых ОРВИ. Дебют заболевания был в виде упорного спазматического кашля или нетяжелого бронхообструктивного синдрома. У всех наблюдаемых больных непосредственной причиной первого бронхообструктивного синдрома являлась ОРВИ. При этом бронхообструкция развивалась на пике болезни у 59 (73,7%) детей, в период ре-конвалесценции - у 21 (26,3%) ребенка. Первый развернутый приступ удушья также отмечался на фоне ОРВИ. Большинство наблюдаемых детей - 71 (88,7%) заболели БА в возрасте до 5 лет, из них у 53 (74,6%) первый приступ бронхообструкции наблюдался на фоне ОРВИ.

- 218 -

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ АЛЛЕРГОЛОГИЯ

На первом году жизни ОРВИ переболели 45 (56,2%) детей (более 4 раз в год). После первого года жизни 53 (66,2%) ребенка с БА страдали частыми ОРВИ (более 5 раз в год). Максимальную заболеваемость ОРВИ отмечали в возрасте от 3 до 7 лет, что, возможно, связано с посещением детьми дошкольных учреждений.

Таким образом, у обследованных детей отмечалась клиническая связь симптомов обострения БА с интеркуррентными острыми респираторными инфекциями. У всех больных присоединение респираторной вирусной инфекции сопровождалось обострением БА. Частота обострений БА варьировала от 4 до 10 раз в год, респираторной вирусной инфекции колебалась от 4 до 8 раз в год и в среднем составила 6,4 ± 0,7 раза за год.

В связи с этим нами проведено исследование ряда иммунологических показателей у детей с БА, ассоциированной с наличием маркера инфицированности респираторным синцитиальным вирусом. При оценке иммунологических показателей у детей были выявлены изменения, характерные для IgE-опосредуемых аллергических болезней. В результате исследования установлено, что наличие у детей с БА маркера оппортунистической инфекции ассоциируется с изменениями в популяционном составе мононуклеарных клеток периферической крови.

Анализ полученных результатов показал, что в контрольной группе детей количество CD3+-клеток составило в среднем 61,0 ± 1,8%. В группе больных интермиттирующей БА оно оказывалось заметно ниже - 51,1 ± 1,0% (р<0,001). В группе больных легкой персистирующей БА количество CD3+-клеток - 45,4 ± 1,5% (р<0,001), а при среднетяжелой персистирующей форме заболевания - 36,8 ± 1,3% (р<0,001) (см. таблицу). Причем падение общей численности Т-лимфоцитов отмечалось у 60,7% обследованных.

Изучение распределения субпопуляций иммунокомпетентных клеток с идентификационными CD-маркерами периферической крови больных вирусиндуцированной БА выявило тенденцию к снижению их относительной численности. Так, в группе больных интермиттирующей БА достоверно снижался уровень CD4+Т-хелперных клеток (28,8 ± 0,6% против 37,4 ± 1,1% в контрольной группе, р < 0,001), тогда как численность цитотоксических CD8+Т-лимфоцитов не менялась (22,2 ± 0,7% против 23,6 ± 1,0% в контрольной группе, р>0,05). В группе больных легкой персистирую-щей БА среднее содержание CD4+-лимфоцитов 25,0 ± 1,0% (р<0,001), а CD8+-лимфоцитов - 20,3 ± 0,8% (р<0,05). При среднетяжелой персистирующей БА относительное содержание как хелперной, так и супрессорной субпопуляции Т-лимфоцитов достоверно снижалось и составило соответственно 18,8 ± 0,7% (р<0,001) и 18,0 ± 0,9% (р<0,001).

Содержание NK-клеток (CD16/56+) при интермиттирующей БА составило 10,9 ± 0,5% (р>0,05), при легкой персисти-рующей - 9,3 ± 0,7% (р<0,05), при среднетяжелой персисти-рующей - 8,1 ± 0,7% (р<0,001), тогда как у здоровых лиц оно было выше - 12,7 ± 0,8%.

Процент В-лимфоцитов (CD19+) выявляли на уровне 14,3+1,0% в группе контроля, 16,2+0,6% (р>0,05) у лиц ин-термиттирующим, 16,7+0,6% (р<0,05) у больных с легким персистирующим и 19,5+0,6% (р<0,001) со среднетяжелым персистирующим течением заболевания.

В реализации гуморальных и клеточных механизмов иммунного ответа важную роль играют цитокины. В связи с этим в исследовании клеточно-опосредованного иммунного ответа при БА представляет интерес изучение уровня цитокинов, определяющих тип иммунного ответа. Поэтому в настоящей работе было проведено количественное исследование уровня IFNy у больных вирусиндуцированной БА. Нарушения в цитокиновом звене иммунитета проявлялись недостаточностью IFNy в сыворотке крови. Показано, что уровень IFNy был достоверно снижен во всех исследованных группах больных (рис. 1).

Так, в группе больных интермиттирующей БА содержание IFNy в сыворотке крови составило 52,5 ± 2,0 пкг/мл, при легкой персистирующей - 42,1 ± 2,4 пкг/мл, при среднетяже-

пкг/мл

Рис. 1. Содержание INFy в сыворотке крови больных вирусиндуци-рованной бронхиальной астмой

лой персистирующей - 36,1 ± 3,6 пкг/мл, в контроле - 77,8 ± 2,5 пкг/мл (р<0,001). Снижение уровня IFNy показывает, что развитие Т-клеточного ответа при вирусиндуцированной БА происходит путем смещения равновесия популяций Th1 и Th2 в сторону T-хелперов второго типа.

В настоящее время имеются данные о том, что многие поверхностные антигены иммунокомпетентных клеток могут находиться не только в мембранной, но и в растворимой форме, принимая непосредственное участие в реализации иммунного ответа. Важным регулятором почти всех видов иммунного и воспалительного ответа являются адгезивные гликопротеины поверхности клеток, в связи с чем для исследования был выбран представитель молекул адгезии - ICAM-1. В настоящее время известно, что интенсивный сход молекул IcAM-1 с мембраны активированных клеток способствует сдерживанию чрезмерной активации иммунной системы [6]. Также следствием таких процессов в целом может стать ограничение иммунных реакций, направленных на эффективную элиминацию вирусов, что в свою очередь может явиться одним из факторов персистенции и хронизации инфекции.

Проведенная нами оценка сывороточного уровня молекулы адгезии показала существенное его изменение при вирус-индуцированной БА. Если в контрольной группе содержание sICAM-1 соответствовало 8,2 ± 1,5 нг/мл, то у больных

нг/мл

Рис. 2. Содержание sICAM-1 в сыворотке крови детей, больных ви-русиндуцированной бронхиальной астмой.

- 219 -

ИММУНОЛОГИЯ № 4, 2013

интермиттирующей БА средний уровень в сыворотке крови превысил нормальные значения в 16,5 раза (р<0,001) и составил 135,6 ± 5,5 нг/мл. У больных легкой персистирующей БА среднее значение sIcAM-1 в сыворотке крови 172,4 ± 3,7 нг/мл, а у больных среднетяжелой персистирующей формой заболевания - 208,9 ± 6,4 нг/мл, что превышало контрольные значения в 21,0-25,4 раза соответственно (рис. 2).

Таким образом, растворимые формы поверхностных антигенов клеток иммунной системы человека наряду с мембранными антигенами принимают участие в формировании иммунных механизмов, направленных на защиту от чужеродных агентов, в том числе и от вирусов.

Суммируя результаты проведенных исследований, можно заключить, что у больных вирусиндуцированной БА наблюдается пониженный уровень IFNy, что свидетельствует о доминирующей активации Th2 звена иммунного ответа. Также было установлено, что вирусиндуцированная БА у детей сопровождается достоверным снижением показателей Т-клеточного иммунитета с тенденцией к росту показателей В-клеточного звена иммунной системы. Вирусиндуциро-ванная БА у детей сопровождается выраженным увеличением сывороточного уровня молекулы адгезии ICAM-1, зависящим от степени тяжести заболевания, что указывает на разбалансированность иммунных реакций. В связи с этим, сывороточное содержание растворимого ICAM-1 антигена может быть использовано в качестве дополнительного показателя тяжести течения вирусиндуцированной БА.

ЛИТЕРАТУРА

1. Балаболкин И.И., Сенцова Т.Б., Булгакова В.А., Рылеева И.В. Влияние вирусных инфекций на состояние гуморального и клеточного иммунитета у детей с аллергическими заболеваниями // Иммунология. 2005; 26(1): 21-6.

2. Клименко В.А., Адарюкова Л.М., Плахотная О.Н. и др. Ви-русиндуцированная БА у детей: состояние проблемы и пути решения. Астма и аллергия. 2011; 4: 50-7.

3. Сенцова Т.Б., Балаболкин И.И., Булгакова В.А., Короткова Т.Н. Острые респираторные вирусные инфекции и их профилактика у детей с атопическими болезнями. Вопросы современной педиатрии. 2003; 2 (3): 8-17.

4. Баранов А.А., Балаболкин И.И. Детская аллергология. М.; 2006.

5. Польнер А.А., Минин Д.С., Польнер С.А. Роль молекул адгезии в аллергическом воспалении при бронхиальной астме, аллергическом рините и других заболеваниях. Иммунология. 1998; 19(2): 13-7.

6. Александров А.В., Джексон А.М., Румянцев А.Г. Анализ механизма модуляции межклеточных молекул адгезии ICAM. Иммунология, 1997; 18(1): 4-13.

7. Jun C.D., Carman C.V., Sambra D.R. еt al. Ultrastructure and function of dimeric, soluble intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1). J. Biol. Chem. 2001; 276(31): 29019-27.

8. Боровиков В.П. Популярное введение в программу STATISTICA. М. - Компьютер Пресс; 1998.

REFERENCES

1. Balabolkin I.I., Sentsova T.B., Bulgakova V.A., Ryleeva I.V Im-munologiya. 2005; 26(1): 21-6.

2. Klimenko V.A., Adaryukova L.M., Plakhotnaya O.N. et al. Astma i allergiya. 2011; 4: 50-7.

3. Sentsova T.B., Balabolkin I.I., Bulgakova V.A., Korotkova T.N. Voprosy sovremennoy pediatrii. 2003; 2(3): 8-17.

4. BaranovA.A., Balabolkin I.I. Children’s Allergology. M.; 2006.

5. Pol’ner A.A., Minin D.S., Pol’ner S.A. Immunologiya. 1998; 19(2): 13-7.

6. Aleksandrov A.V., Dzhekson A.M., Rumyantsev A.G. Immunologiya, 1997; 18(1): 4-13.

7. Jun C.D., Carman C.V., Sambra D.R. et al. Ultrastructure and function of dimeric, soluble intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1). J. Biol. Chem. 2001; 276(31): 29019-27.

8. Borovikov V.P. Popular introduction to the program STATISTICA. M. - Computer Press; 1998.

Поступила 20.11.12

ОБЗОРЫ

© А.Д. ДОНЕЦКОВА, А.А. ЯРИЛИН, 2013 УДК 616.438-092:612.112.94.014.3.017.1

А.Д. Донецкова, А.А. Ярилин

t-рецепторные эксцизионные кольца и значимость их определения в клинике

ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, 115478, Москва

В обзоре представлены данные о структурах, формирующихся во время созревания Т-лимфоцитов на этапе перестройки генов Т-клеточного рецептора - Т-рецепторных эксцизионных кольцах (ТРЭК), с акцентом на возможности использования результатов их определения в клинической практике. В периферическом отделе иммунной системы ТРЭК присутствуют главным образом в Т-клетках, недавно эмигрировавших из тимуса, которые не успели поделиться после выхода из вилочковой железы. Содержание ТРЭК в периферических Т-лимфоцитах отражает интенсивность двух процессов - эмиграции Т-клеток из тимуса и уровня пролиферативных процессов на периферии. Поскольку в отсутствие интенсивной антигенной стимуляции уровень пролиферации Т-клеток на периферии варьирует слабо, содержание ТРЭК можно рассматривать преимущественно как показатель Т-лимфопоэтической функции тимуса. Выявление ТРЭК с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) в настоящее время является наиболее надежным и достаточно широко используемым методом оценки функционального состояния тимуса человека. Основными областями патологии, при которых исследование недавних эмигрантов из тимуса на клиническом уровне стало реальностью, являются первичные Т-клеточные иммунодефициты, ВИЧ-инфекция/СПИД, пересадка гемопоэтических клеток, а также аутоиммунная патология.

Ключевые слова: функция тимуса, Т-рецепторные эксцизионные кольца, недавние эмигранты из тимуса

- 220 -