Цитофлуориметрическая характеристика влияния РНКаз на клетки прои эукариот

Цитофлуориметрическая характеристика влияния РНКаз на клетки про- и эукариот

П.В. Зеленихин, К.Р. Мамедзаде, О.Н. Ильинская Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань

The cytofluorimetric characteristics of RNAse influence towards pro- and eucariotic cells

P.V. Zelenikhin, K.R. Mamedzade, O.N. Ilinskaya Kazan (Volga region) Federal University, Kazan

Цитотоксичные рибонуклеазы (РНКазы) — перспективные препараты для терапии злокачественных новообразований. Расширение спектра модельных объектов, по отношению к которым охарактеризовано действие РНКаз, позволит дать точную оценку селективности действия данных препаратов.

С помощью проточной цитометрии оценивали действие рибонуклеазы Bacillus intermedius (биназы) и РНКазы А быка на клетки эпителия легкого эмбриона коровы (ЛЭК) и Escherichia coli K12. Апоптоз клеток ЛЭК выявляли с помощью двойного окрашивания Аннексином-FITC и йодидом пропидия (PI). Жизнеспособность клеток E. coli оценивали с помощью окрашивания PI.

Ни в одной из исследованных концентраций (100 и 300 мкг/мл) биназа и РНКаза А не проявили цитотоксических свойств в отношении клеток ЛЭК и E. coli K12.

Низкая токсичность исследованных РНКаз в отношении E. coli позволяет предположить, что присутствие би-назы и РНКазы А в концентрациях, способных проявлять противоопухолевую активность, не будет иметь значительного влияния на микробную флору тканей в перспективных исследованиях in vivo. Продемонстрированное отсутствие апоптозиндуцирующей активности биназы в отношении клеток ЛЭК подтверждает селективность действия данной РНКазы на опухолевые клетки.

Ключевые слова: биназа, РНКаза А, цитотоксичные РНКазы, апоптоз, селективность, ЛЭК.

Рибонуклеазы (РНКазы) — важнейшие ферменты метаболизма РНК, функции которых заключаются в расщеплении мРНК, превращении предшественников РНК в зрелые формы, продукции малых регуляторных РНК, деградации определенных типов РНК. Клетка содержит около 20 видов экзо- и эн-дорибонуклеаз, которые могут входить в состав надмолекулярных комплексов и проявлять высокую специфичность к определенным нуклеотидным последовательностям и структурам [1]. В последние годы особое внимание уделяется биологическим эффектам рибонуклеаз, таким как контроль роста кровеносных сосудов, токсичность по отношению к клеткам опухолей, противовирусная активность. Современные представления о роли и функциях РНКаз в клетках позволяют рассматривать эти ферменты как перспективную альтернативу традиционным химиотерапевтическим средствам в щадящей терапии злокачественных новообразований. На сегодняшний день известно значительное количество РНКаз, обладающих селективным цитотоксическим действием по отношению к клеткам опухолей [2—4]. Наиболее известным ферментом этого ряда явля-

e-mail: pasha_mic@mai.ru

Cytotoxic ribonucleases (RNAses) are known to be perspective drugs for cancer therapy. The extension of model object’s range will give possibility to assess the cytotoxic RNAse’s selectivity.

We estimated the effect of Bacillus intermedius ribonuclease (binase) and bovine RNAse A to E. coli K 12 and lung epithelia of cow embryo (LEC) cells. LEC cells apoptosis was characterized with a double staining with annexin-FITC and propidium iodide (PI). E. coli K12 cell's vitality was estimate via PI staning.

Binase and RNAse A were not cytotoxic to LEC and E. coli K12 cells in investigated concentrations (100 and 300 ug/ml).

Low RNAse’s toxicity for E. coli allows to suppose the binase and RNAse A in concentrations, capable to display antitumor activity, will not to effect the tissue's microbial flora during in vivo tests. The lack of apoptosis inducing activity of binase for LEC cells confirms this RNAse selectivity for tumor cells.

Key words: binase, RNAse A, cytotoxic RNAses,

apoptosis, selectivity, LEC.

ется РНКаза лягушки Rana pipiens — онконаза [4], успешно проходящая клинические испытания как противоопухолевый препарат в терапии злокачественных новообразований почек, поджелудочной железы и легких. Для РНКаз, как агентов противоопухолевой терапии, основное значение имеет фактор избирательного действия по отношению к опухолевым клеткам. От деструктивного действия РНКаз млекопитающих клетку защищает эволюци-онно сложившаяся система защиты, опосредованная действием специфического цитозольного ингибитора РНКаз (ИР) [5]. Поэтому для разработки потенциальных противоопухолевых средств весьма перспективны РНКазы, не относящиеся к РНКазам млекопитающих и нечувствительные к действию ИР [6]. К таковым относятся микробные РНКазы. Кроме того, широкие возможности для биоинженерии и практической наработки этих ферментов делает их особо привлекательными для разработки новых терапевтических средств.

Определение молекулярных детерминант РНКаз, ответственных за проявление их цитотоксических свойств по отношению к злокачественным и нормаль-

ным клеткам человека, а также изучение их иммуно-генной активности позволит обосновать возможность применения микробных РНКаз и биоинженерных конструкций на их основе в лечении злокачественных новообразований и наметить технологические подходы к решению проблемы получения функционально активных терапевтических белков. Ранее мы показали, что РНКаза Bacillus intermedius — биназа -обладает избирательным цитотоксическим действием в отношении клеток ряда опухолевых линий [7, 8], однако без расширения спектра приложения ферментного препарата невозможно дать точную оценку селективности его действия.

Целью настоящей работы явилась цитофлуо-риметрическая оценка действия биназы на клетки нормального эпителия легкого эмбриона коровы, как «модели» клеток эпителия легких млекопитающих, и бактерий Escherichia coli K12, как «модели» прокариотических клеток, в сравнении с воздействием панкреатической РНКазы А.

Материал и методы

Для экспериментальных исследований использовали две различные РНКазы: биназу — гуанилспеци-фичную РНКазу Bacillus intermedius 7Р дикого типа (молекулярная масса 12.3 кДа, 109 аминокислотных остатков, pI = 9.5) [9] и панкреатическую РНКазу А быка (Вектор, Россия). Высокая каталитическая активность биназы подтверждена как в отношении синтетических субстратов [10], так и природной высокополимерной РНК дрожжей рода Candida [11]. Уровень гидролизующей РНК активности РНКазы А (Acat/KM около 109/Mxc) [12] сопоставим с активностью биназы.

Оценку цитотоксического действия РНКаз осуществляли с помощью клеточной линии эпителия легких эмбриона коровы (ЛЭК) (Российская коллекция клеточных культур позвоночных, Россия) и клеток Escherichia coli K12 (Коллекция кафедры микробиологии КФУ).

Клетки ЛЭК культивировали в питательной среде DMEM (Sigma), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Sigma, США), 2 мМ глутамина (Sigma, США) и по 100 единиц/мл пенициллина и стрептомицина, при 37°С в атмосфере 5% СО2. Культивирование Escherichia coli K12 осуществляли на среде Луриа-Бертани (LB-бульон) следующего состава: дрожжевой экстракт (Difco, США) — 5 г, трип-тон (Difco, США) — 10 г, NaCl — 10 г, H2O — 1000 мл, рН 7,0. Суспензию клеток ЛЭК засевали в 6-луночные планшеты для клеточных культур 3х105 кл./лунку и культивировали до образования 60% монослоя. Затем среду заменяли на свежую, содержащую РНКазы (100 и 300 мкг/мл), либо без РНКаз (контрольный вариант). Через 24 ч клетки диспергировали с помощью 0,25% раствора трипсина (Sigma, США), ресуспендировали осторожным пипетированием, дважды отмывали охлажденным натрий-фосфатным буфером (PBS, Sigma, США) и полученную суспензию использовали для цитофлуориметрического анализа. Ночную культуру Escherichia coli K12 ресу-спендировали в свежем LB-бульоне (контрольный вариант), либо в среде, содержащей 100 и 300 мкг/мл биназы или РНКазы А, (конечная концентрация 106 кл./мл), инкубировали 24 ч при 37°С. Затем клетки отмывали охлажденным PBS и использовали для цитофлуориметрического анализа.

Изменение характеристик клеток фиксировали с помощью проточного цитофлуориметра FACSCanto II (BD, США).

Апоптогенное действие ферментных препаратов на клетки ЛЭК характеризовали с помощью FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I (BD Pharmingen, США) [13], в качестве позитивного контроля использовали классический индуктор апоптоза кам-птотецин в концентрации 50 мМ [14]. Изменение жизнеспособности клеток E. coli K12 под действием РНКаз определяли с помощью окрашивания йодидом пропидия (PI), как описано в работе L. Shi с со-авт. (2007) [15].

Статистическую обработку результатов проводили в программе Statistica 6.0 с использованием непараметрического U-критерия Манна — Уитни (уровень статистической значимости р < 0,05).

Результаты

Цитометрическая оценка жизнеспособности клеток бактерий в присутствии биназы и РНКазы А показала, что ни в одной из исследованных концентраций (100 и 300 мкг/мл) ферментные препараты не оказывали достоверного токсического воздействия на культуру микроорганизмов (рис. 1). Жизнеспособность бактерий после 24 ч культивирования, определенная по числу PI-негативных клеток, составила 94,1%, 94,6%, 94,8%, 93,8% для вариантов с содержанием биназы 100 мкг/мл, 300 мкг/мл, РНКазы А 100 мкг/мл и 300 мкг/мл, соответственно, в то время как в варианте без добавления ферментов доля живых клеток составила 93,3%.

100

90

80

70

60

50

40

30

20

10

0

6,7

93,3

5,9

94,1

5,4

94,6

5,2

94,8

6,2

93,8

Л Мертвые [. Живые

К Б100 Б300 А100 А300

Концентрация РНКазы, мкг/мл

Рис. 1. Выживаемость Escherichia coli K12 под действием РНКаз: РНКазы А (А) и биназы (Б):

К - контрольный вариант без внесения РНКаз в среду культивирования

Анализ апоптозиндуцирующей активности биназы и РНКазы А в отношении клеток ЛЭК выявил сходный характер действия данных препаратов. Ни в одной из использованных концентраций биназа и РНКаза А не индуцировали апоптоз клеток эпителия легких эмбриона коровы (рис. 2). Доля клеток, находящихся в состоянии апоптоза, через 25 ч. культивирования составляла 6,5% и 7,2%, 6,4% и 6,8% для вариантов с концентрациями биназы 100 мкг/мл и 300 мкг/мл, РНКазы А 100 мкг/мл и 300 мкг/мл, соответственно,

что не имело достоверных отличий от контрольного варианта, в котором доля апоптотических клеток составляла 6%. В то же время, известный индуктор апоптоза камптотецин обладал выраженной апопто-зиндуцирующей активностью в отношении данных клеток, вызывая апоптоз у 31,7% клеток.

100 90 % 80 и 70

50

40

30

20

10

94

6,5

93

7,2

92,8

6,4

93,6

6,8

93.2

31,7

68,3

А - НА

К Б100 Б300 А100 А300 Кам

Концентрация РНКазы, мкг/мл

Рис. 2. Апоптоз клеток ЛЭК под действием РНКаз: РНКазы А (А) и биназы (Б):

К - контрольный вариант без внесения РНКаз в среду культивирования; Кам - обработка индуктором апоптоза камптотецином

Обсуждение

Угнетающее рост бактерий действие определенных микробных РНКаз в высоких концентрациях установлено [16], однако, в отличие от биназы, токсичность непосредственно РНКазы А в отношении бактерий не изучалась. В то же время, для катионной РНКазы из эозинофильных гранул человека — члена семейства РНКазы А — известно, что она обладает антистафилококковой активностью [17]. Кожа человека обладает РНКазной активностью, что объясняется секрецией кератиноцитами РНКазы 7, проявляющей антимикробное действие в отношении широкого спектра патогенов [18]. Биназа способна оказывать токсическое действие на клетки бакте-

рий, но лишь в значительно более высоких концентрациях (выше 1000 мкг/мл), чем использовалась в настоящем исследовании, также известны ростостимулирующие эффекты этого фермента в низких концентрациях 0,001—1 мкг/мл [16]. Таким образом, можно предположить, что присутствие биназы и РНКазы А в концентрациях, способных проявлять противоопухолевую активность [7], не будет иметь значительного влияния на микробную флору тканей в перспективных исследованиях in vivo.

Известно, что некоторые цитотоксичные РНКазы, такие как онконаза [19], BS-РНКаза [20], избирательно индуцируют апоптоз опухолевых клеток. Однако механизм относительной избирательности их действия не установлен. Выдвигаются предположения, что селективность действия цитотоксичных РНКаз связана с высокой катионностью молекул ферментов и их нечувствительностью к действию ИР [19, 20]. Частично данная гипотеза подтверждается установленной возможностью приобретения цитотоксических свойств нецитотоксичной РНКа-зой А при ее димеризации [21], что позволяет ей избежать действия ИР. В то же время, нами ранее показано, что в реализации избирательности действия цитотоксичных бактериальных РНКаз, помимо каталитической активности и катионности, имеют значение экспрессирующиеся опухолевой клеткой определенные онкогены, такие, как kit [8], AML1-ETO [22] или ras [23]. Отмечается также, что селективность цитотоксических РНКаз в отдельных случаях может быть невысокой [4], что приводит к индукции апоптоза не только малигнизированных, но и нормальных клеток в результате действия этих ферментов. Вышесказанное подчеркивает необходимость расширения спектра линий опухолевых и нормальных клеток, в отношении которых охарактеризовано действие данных потенциальных терапевтических агентов. Выявленное нами отсутствие цитотоксического действия биназы в отношении клеток нетрансформированного эпителия эмбрионального легкого является еще одним шагом в этом направлении, позволяющем в перспективе конструировать противоопухолевые агенты на основе РНКаз с максимальной селективностью действия.

Благодарности

Работа поддержана грантом РФФИ (12-04-01226а).

0

ЛИТЕРАТУРА:

1. Deutscher M.P., Li Z. Exoribonucleases and their multiple roles in RNA metabolism. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 2001; 66: 67-105.

2. Ulyanova V., Vershinina V., Ilinskaya O. Barnase and binase: twins with distinct fates. FEBS J. 2011; 278(19): 3633-43.

3. Fang E.F., Ng T.B. Ribonucleases of different origins with a wide spectrum of medicinal applications. Biochim. Biophys. Acta. 2011; 1815(1): 65-74.

4. Ardelt W., Ardelt B., Darzynkiewicz Z. Ribonucleases as potential modalities in anticancer therapy. Eur. J. Pharmacol. 2009; 625(1-3): 181-9.

5. Leland P., Raines R. Cancer chemotherapy - ribonucleases to the rescue Chemistry and Biology 2001; 8: 405-13.

6. Arnold U. Aspects of the cytotoxic action of ribonucleases. Curr. Pharm. Biotechnol. 2008; 9(3): 161-8.

7. Зеленихин П.В., Колпаков А.И., Черепнев Г.В. и др. Индукция апоптоза опухолевых клеток биназой. Молекулярная биология 2005; 39(3): 457-63.

8. Mitkevich V.A., Petrushanko I.Y., Kretova O.V. et al. Oncogenic c-kit transcript is a target for binase. Cell Cycle 2010; 9(13): 2674-8.

9. Schulga A., Kurbanov F., Kirpichnikov M. et al. Comparative study of binase and barnase: experience in chimeric ribonucleases. Protein Engineering 1998; 11: 773-80.

10. Yakovlev G.I., Moiseyev G.P., Struminskaya N.K. et al. Mutational analysis of the active site of RNase of Bacillus intermedius (BINASE). FEBS Lett. 1994; 354: 305-6.

11. Ilinskaya O.N., Ivanchenko O.B., Karamova N.S. et al. SOS-inducing ability of native and mutant microbial ribonucleases. Mut. Res. 1996; 354: 203-9.

12. Park C., Raines R.T. Catalysis by ribonuclease A is limited by the rate of substrate association. Biochemistry 2003; 42: 3509-18.

13. FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I, http://researcher. nsc.gov.tw/public/woody/Data/98611333871.pdf

14. Smolewski P., Grabarek J., Lee B. et al. Kinetics of HL-60 cell entry to apoptosis during treatment with TNF-alpha or camptothecin assayed by the stathmo-apoptosis method. Cytometry 2002; 47: 143-9.

15. Shi L., Günther S., Hübschmann T. et al. Limits of propidium iodide as a cell viability indicator for environmental bacteria. Cytometry 2007; 71(8): 592-8.

16. Ilinskaya O.N., Ivanchenko O.B., Karamova N.S. Bacterial ribonuclease: mutagenic effect in microbial test-systems. Mutagenesis 1995; 10(3): 165-70.

17. Rosenberg H.F. Recombinant human eosinophil cationic protein. Ribonuclease activity is not essential for cytotoxicity. J. Biol. Chem. 1995; 270: 7876-81.

18. Harder J., Schroder J.M. RNase 7, a novel innate immune defense antimicrobial protein of healthy human skin. J. Biol. Chem. 2002; 277: 46779-84.

19. Lee J.E., Raines R.T. Ribonucleases as novel chemotherapeutics : the ranpirnase example. BioDrugs 2008; 22(1): 53-8.

20. Spalletti-Cernia D., Sorrentino S., Di Gaetano S. et al. Higly selective toxic and proapoptotic effects of two dimeric ribonucleases on thyroid cancer cells compared to the effects of doxorubicin. Brit. J. Cancer. Res. 2004; 90: 270—7.

21. Di Donato A., Cafaro V., D'Alessio G. Ribonuclease A can be transformed into a dimeric ribonuclease with antitumor activity. J. Biol. Chem. 1994; 269(26): 17394-6.

22. Mitkevich V.A., Petrushanko I.Y., Spirin P.V. et al. Sensitivity of acute myeloid leukemia Kasumi-1 cells to binase toxic action depends on the expression of KIT and AML1-ETO oncogenes. Cell Cycle 2011; 10(23): 4090-7.

23. Ilinskaya O.N., Dreyer F., Mitkevich V.A. et al. Changing the net charge from negative to positive makes ribonuclease Sa cytotoxic. Protein Sci. 2002; 11(10): 2522-5.

Поступила 15.08.2012

VTherakos

С їй: і ей * i.i її upúHrjtiiJia ¿кпрдььраирвльнини фшиЗмрс.ш L v \HL .VIS

іїікгтсакігрпордпміиі'і фотсфсрл npcjaunn ccíioli ці сії-л. ослпаїнкиІІ іш

3LL?ttiüllUII дейпфсда и И nHÍI) ЧіЛмІН і ! С П ku I Ifiil -ЦІ h, ltpc,IHâfl|l.rçjlLllil vHlfijm-i ЛІІКМЧ ф0ТіМС«<иГча-1М MTOJ4W І К -île іі.’ііі Ігііифа-IL-IIIMJ j

ПЯÍ! Н ¡tf Ч t(K+í*Í АШІГКНЙІ A (.12ÍI -З ¡ДО 1)41

їПИЧГІІТИИЙ'

jJIeKHIIC ЛШШШІІЧкіСКІМ., ШуСиИШЧуННЫР., .IcpMllj.LülKVfbUIl И >и]Ш11|ф<|иГН1НМ.1. ufiUil£|kdUlitt ;4 Токіопші uric темпа в гпшфлчп нпп,

* .ТКітпс^ьнІІ .ЭСрЧЭТП Г.

* L K.l'.'l'i ї'-'і" 'І1 '« 4Li.inil.il

ч рспаїлімиїгмй ífitfml.

. 11 ¡- і*.: мі-. * .пн  ,і11 її

ш »UiHI-!UL'!lirí рсаКШШ ірНКИГІИІПШ Іфч'ІНВ W ІНМН1 <Ї*ТІ IX І Скобсяпіігі н cnriL'uu:

Бслінвсіюсііі ніг п і її ні її і :

- I!, ¡Ili p.l'fï.14 І II. Ц-UJ раї/ш \і і ии, Уп(ґ]іии.и.ір.

» IILK.MH^IL'llHCpllVQ Я<ЛЗуіІ1РНМ! НчСх'ЛІІИ.

[* лгклшчсшк рисо UPJJÇTJIBX

У осу ні к і fu с і ніс нчпрллв іюсгу плг тіл вигишагу.пита,

* ч іпрллі. .лладсіїїія В. СІІСГСОД.

II  >.І II. . fci'i'ü-*, їм і„ чіриї |і iu'ih|Lillp.‘lliKi kfnibli I „ 111  -г  ..,

- ti 11.1 і in , II. |i .і-, мг.мм I :ajLiir..vi |4  i¡i. ¡ ,. l ¡; .| н irHtflluc Ир*" !•V,> |ч- .

« при іігийм:ііі№.іі/іг йяі иЧіігк'і'іі L L.i4 йлсалривна слпсмы м.иііггрллсн

IJfinC І П І А Ш ріГні 11 II щЛсДуДЗШИЕИЛ :

-.l'.XÎHtX- NU 1И.І ІЬ- К'КПШС J. 14 иііЧ'ГїІЗСЇЧ

* Ш*СТр>КІ1ІІЯ JliriifVir J II рЦСДСОЛЫЛ ЧЛІСрі J on ІІЄКЛНРШИЛ МПМШаЮГЕЬ-Viithi^iKii rlfilt1

.•SlICfepjnilfe ftCMCfl^HUlKL

III.Il ±i un i >>.i і il І.ІІЦІІН npjllli isphi.

і|hii_' и >.•: miuçiiüc иik.iL- :?iiiL ю.ї ні юн ci гшв пр/иісдурилі г іибара ihx ..

икривсиїїя гчччкл^рн

і II.. III-. IIL- I іЬМІл .i.iiikU Ч , lia ULIbІ рЧ ГІЛ ÿirii. : I L S. її.  ішфдошіві II ІфОіевиІІІіІ llf lllÇvvJ

яЬ»оьаГ(і

t чгі г 'їв ї ї* нчигіісічиги к і Pi-і iinp.Mii «.«гірк - S-ряіі г.іИіііЧйРг^, ШнсАняргг*'і

* Спид« -üoifYHciiiuu, мічпаїїгпівя cnricua. ікпіналянлшя вмлс-игь ciw-tomjc

і 1СІІШ 111 11V L .1 • Il 11 h 1111 --II II іІСрііффЛЧССКї>Л tpOlii, Л iJiXf II k КОСІ lliZMti Ы4НГВ

» Hac4чніяї С»ч-гЄчі ДЛЯ Ги^їрсіГі апїі*Мат>ічсс:кріІ інЗрліхігчя fcpïrtiii CHJCOKIM уривікч BJI ІІКСГЮГОбпоПМ КЛСТПК IIDC.IC H^KHICVIVpU

* Sl'|!.i\ Ij.iIlHLlad.1!  11HI kl і >. І її І ь üüjufiüSb , к,гч-|||1  fUukJX № il|4>ruui.iüU

* І l*4ii‘.J|li II . I L* il L- rnilri SrffUA. lit ІІІІИ-.Н ні ceiujîûllillli: ijril І рмфуі НріШІІІЕеяі

»№шатпсді|ГУі раиелгп. Ештшгешы кровн в сосггктстшт с m "JE! ^

U10T1HKT1.H1 H fUiïUffUUII

* { *ІГГ£Ш іірл.шгіішчніл ДЛЯ ГТрІїиеіИМІІЯ 1 КЛ£ТЇМІІВА іершіїш I^r

||ИОвФМИМ»41> ІЮАУЧСНЖ! HMUMKMItifr И|ЧИи)

І Ч'і|і--/нгі и «.(ЧІНІІ м 1ІІ № мли||іі«гі! Uip і Ц.ІЧ '-з 11 ч-’.иіі Р |л».рМі:і»й f tí^M і ««ifl 4m rf4F " У., ’ІГ IIL’II ru k piihlr СйАприЮТЛ! k СТІН UpTIIUf MC-Jllfc.il II ГОТПВи .ГШЙ 1Л.ІкІІЄЙ!ІІС-ГП

ііспожьювшіш Ікрдонлігсрішіля, іілрдіялішіїїе in vitaxs_ JiqicnnaaiiiK iijiiikht}' її лр. К

>К.ТШ.ІКІ|ЧГЧІМ№ irpuriBHRC.Ik ООО яііинпвяипшіяіл MfJIfllflürMIÏ Тш.І№І«ГЛН» Москві, ул. іівліоі 1'ріи м». х 4. ьпрп. J 5. іс.і.'фвіл:

Mb

4!г_Г(Ч|М0^ іі_ haï іПітііійг.ііі , ГІЦІПКИкіМІЇ -n hài; ІІУиІІЯг.ГЦ. pUJBj ^V*pv;il(l<fnrt,(iriJ

1 и і ііЧаїЛ LiljiiiiLjiii il j и rrivrrua 4.Щ к |i Jiirinm ft lUMMMV fc-.lrtiik m ліиіг

Bio Vrrhivr І - ї Ьгпппагвіггіч-. L III to

Circrou pii. L-411 шип и j обра ипіп сіваюнмі. мшв

Я !! II и.ш .:ічіиік II, чпсрлі!! ..... і|яч . l л

- НпііпчП parral гпикпш dvrfB їй (ігнн •чірвіпі рн> время яриікіііга

n І Гро грл MU 11 IK’D ІВНРрйЖІІНІІІВВ

* Лаїлисіиі ur«iHJEki.iiipoBJMiiun QpiJiv^cç L о ьр л ш j L і врсыв fuCoru f ПфКМШМ

* Í." 1111 * Г me --1171: і II.I iVtipv.i-iii-i NIC

11c rpcfryrTEi Счнмпсчи тигчсти ліАчрлі ллв хрлшснпв I lVLiIJ СНСГСЬШ ti-нЛгсЬш L' UlklCIIJCf i-7 .ll.h-jfh'M I

- 1ІХІЦЧІІ4 lL ! ptKllilUk. ІІр-ЧірлЬІИ. ІЬч. liUii^uí IIUjí l .Il il

* UoanJi MLVTU и иазл 11

- Мдоудормглч WIL'ICU-I П'К|Ц1ІІЬІГ1 ВиигЙГІВІРГ 4 ^іа ^ •Ч ! Гр* ІЧ »|*И

- Н^і^іиіс {каїсрсТчіІІіііні? іінгтвііяв iiLkuaucT раічссілі^іів.ісіік . ....... ^

обрлхп. Ш C.lÿ’UC 4X1 ICI НУ №11 ИВ 'НСЖТ|111,1СС1'Ы итЄтпКЗуЄпЄ5іі

ГІлраиеірм! -4-і чкоипі нлітролл и упушк-кшів .ііхтуггслі въ'лючхыт їв ceña:

Мни и и iJhIhI vfViniirn л II.LJJM 1.1 ±%cica

Шриль ллв ¡шептіїв

I l II І П рм |иіи - її пир II |IIK1 |1ЭЧГ<.| ІІВ-ГІІ МЧШ^*!!ЛВ1Г-|Ц

- М lili нчшпртсі ICVIlCflïrypilUC нппГшшл

* Ch с у гс игкс і тгвл p>inof о nepemxj сюралиі in іірогрзкічпнл d талрллглпхгезв в л.шир хія

SpjMrtIIIJ

її' ^ 111 мі. . 11 ЛЭ kl.l

* ПпсттігиПі тточегртчгпсни рвічгр гчузтпя

IkhTlipCiHUilTMUUll ІфЛІІЛСС LiiML-pi.iJk.il ДІВ kllS.Ill'll CJKMIIUU

. ІІСІ ШііЖІкрСГЦ |4J«.ViJ J llhfmKJjllkiil UkLlJ.|HK lid 1|ЧЛІ^иІІґ II Ы Ita.lLHIdilllL! іч'^рі il|i4

- l^ralmiicib MlMfeiU СМІМІЖИІ Mi-Wflrtr»-»»!*! і|и*Пнрі.і^

Гпсіїгча > IIJM И. iff І? ІГИ nAp;|si|rt4

» llcnmviCIMHIIC НГТриИ'Н&и ЖЯЛКТШТ «ЛИНЕЕН иря IICpfHCIIICIIHII І'-Гірв 1IL.1

- Oniei ГЮ mCfULUjy ikiyfiifl utfjuMtó Нматрпина

Графив ИШірВЖДІВкІІІСЯ

И W VIЛІЛТІІІ и«!!.'«!с-sis.ru

Глілпіпиг «.uirpila lu I.Ill ».kl.HÉtiHpbtidHiaii ÿltn і. i.i.m. і. її un. ( іІК.ішч- 11 і рМллиіі I

КОМІ і- IçpriW f'r |ír.¡i и л,шн п.п.мишриияннн ь. ІгШ'Р н икршпМі лиі»г^і:ц .

* CvlfGrv НРС ллв кудЬпі p-ip*.'!íwiiii  і i>!  ичі. -. і на і- гіш .

NK. K.1CTDK. Т- ÜL1CJOE

+ і clK'jr« Іїї''  і V-  тапирчлі.її« gçinjiinii г-, i- ¡итог Hvr^-I-Uhiifiû I I'l'l HUÍ- вріг (U С Vllt :« Il

SC.G'1 Л* my.-ЧИ Í|4iPfKiH............ і ¡ч ¡' . . і 11 і ->-.111 Hr і IIV-’III.—

K.KTOK. NK-tlCldK, Т"ІЛСІІМ

* ККГ дія гултівіцпвшіа ле ц пшип іслгглс

Ji[i іііі'У рйЛІ.кіиК- ii-IIILil ^'BE-IJiíe

(ь.іг-іянм in і-тр іViïmO CflILiro ніп-пьніїн

Д ія уВй.ІІГ-чіІЛІІЛ ГСЧОІІІНІЗРіеСКІІЯ Іірснспіггпріїия BJKTUK, NK t-lClOlL.

T-HLwrrnH и neii.iptniiuv клеток:.

L

в

z

t