Термическая обработка проб сыворотки крови как способ повышения чувствительности ИФА в диагностике лейкоза коров

2016. - №4 (58).- С.35-40.

7. Ивницкий, Ю.Ю. Янтарная кислота в системе метаболической коррекции функционального состояния и резистентности организма /Ю.Ю. Ивницкий, А.И. Головко, Г.А. Софронов. - СПб., 1998. - 97с.

8. Лукьянова, Л.Д. Новые подходы к созданию антигипоксантов метаболического действия /Л.Д. Лукьянова //Вестник РАМН. -

1999.- № 3. - С. 18-25.

9. Папуниди, К.Х. Рекомендации по диагностике, лечению и профилактике кетозов сельскохозяйственных животных / К. Х. Папуниди, В.А. Горшков, О.А. Грачева -М., ФТНУ Росинформагротех, 2007 - 95 с.

10. Уша, Б.В. Ветеринарная гепатоло-гия. - М.: Колос, 1979. - 263 с.

ПОКАЗАТЕЛИ ПЕЧЕНОЧНЫХ МАРКЕРОВ СЫВОРОТКИ КРОВИ

ПРИ КЕТОЗЕ КОРОВ

Грачева О.А., Мухутдинова Д.М., Амиров Д.Р.

Резюме

Целью исследований явилось изучение влияния на динамику сывороточных печеночных маркеров до и после применения разработанного на кафедре терапии и клинической диагностики с рентгенологией ФГБОУ ВО Казанская ГАВМ препарата на основе янтарной кислоты и органического соединения фосфора при кетозе коров. В начале эксперимента при клиническом исследовании коров с субклиническим кетозом установлено снижение функциональной активности, проявляющегося снижением пищевой возбудимости, нарушением жвачки, дистонией преджелудков, у отдельных животных отмечалось увеличение области печеночного притупления, болезненность печени. Биохимический статус характеризовался гипербилирубинемией, диспротеинемией, ди-сферментемией, что характеризуется как гепатотоксический синдром. Установлено, что трехкратное применение испытуемого препарата в дозах 10-15 мл на животное, способствует уменьшению активности аминотрансфераз на 10-35%, гаммаглутамилтранферазы - на 35%, содержания в сыворотке крови общего билирубина на 50-60%.

CHARACTERISTICS OF HEPATIC MARKERS OF BLOOD SERUM IN COW MILK FEVER

Gracheva O.A., Mukhutdinova D.M., Amirov D.R.

Summary

The purpose of the research was to study the effect of the medication, developed on the basis of succinate acid and the organic compound of phosphorus at the Department of Therapy and Clinical Diagnostics of FSBEI HE Kazan SAVM, on the dynamics of hepatic markers before and after the application in cow milk fever. At the beginning of the experiment in clinical study of cows with subclinical milk fever a decrease of functional activity was observed, manifested by a decrease of food excitability, dysplasia of ruminant reflexes, dystonia of the predecessor; in some animals an increase of obtundation in hepatic area and hepatic soreness were observed. Biochemical status was described by hyperbilirubinemia, disproteinemia, disvermentemia, that was characterized as hepatotoxic syndrome. It has been established that a three-fold application of the experienced medication in doses of 10-15 ml per animal reduces the activity of aminotransferases by 10-35%, gamma-glutamyltranferase by 35%, and the content of total bilirubin by 50-60% in the blood serum.

УДК 619:591.111.1:616-071:578.828.11

ТЕРМИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА ПРОБ СЫВОРОТКИ КРОВИ КАК СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ИФА В ДИАГНОСТИКЕ ЛЕЙКОЗА КОРОВ

Джакаит Д.А.- аспирант; Якупов Т.Р. -д.в.н., доцент Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э.Баумана

Ключевые слова: вирус лейкоза крупного рогатого скота, иммуноферментный анализ, реакция иммунодиффузии в геле агара, антитело, антиген, циркулирующий иммунный комплекс, термическая обработка.

Key words: bovine leukemia virus, enzyme-linked immunosorbent assay, agar gel immunodiffusion reaction, antibody, antigen, circulating immune complex, heat treatment.

При хронических инфекциях, вызванных вирусами семейства Retroviridae, а также при персистентных инфекциях, в биологических жидкостях организма или на поверхности клеток появляются иммунные комплексы «антиген-антитело» [5, 8, 12]. Антитела, находясь в составе иммунных комплексов, могут участвовать в элиминации инфекционного агента, вызывать гибель инфицированной клетки и даже способствовать усилению инфекции [1]. Согласно исследованиям, проведенным Митиным Ю.А. [4], подобные иммунные комплексы выделенные из сыворотки крови, обладают низкой температурной устойчивостью и могут разрушаться в диапазоне от +38°С до +40°С.

Целью настоящей работы являлась определение влияния термической обработки на титр антител в пробах сыворотки крови и на чувствительность метода ИФА при диагностике лейкоза крупного рогатого скота.

Материалы и методы. Пробы сывороток крови получили от коров из разных хозяйств районов Республики Татарстан. Имму-ноферментый анализ исследуемых проб проводили с использованием «Набора для выявления антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота в сыворотке крови и молоке» производства ФКП «Курская биофабрика -фирма «БИОК». Реакция иммунодиффузии в геле агара поставили согласно инструкциям по применению набора для серологической диагностики лейкоза крупного рогатого скота производства ФКП «Курская биофабрика-фирма «БИОК» в Республиканской ветеринарной лаборатории г.Казани. Циркулирующие иммунные комплексы были выделены методом преципитации в полиэтиленгликоле (ПЭГ).

Результаты исследований. Для исследований по обнаружению ЦИК, методом слу-

чайной выборки, были отобраны, из числа положительно реагирующих в ИФА на лейкоз, пробы сыворотки крови. Пробы смешивали в соотношении 1:1 с 7% раствором ПЭГ-6000 в 0,1М боратном буфер (рН 8,8), перемешивали и инкубировали при +4оС в течение 72-х часов. Преципитат осаждали центрифугированием при 5000g в течение 20 минут и трижды промывали десятикратным объемом ПЭГ в концентрациях: 3,5%, 7% и 10,5% в боратном буфере. Действие ПЭГ на белковые растворы сходно с действием органических растворителей, которые могут вызвать осаждение наряду с иммунными комплексами и свободных иммуноглобулинов. Поэтому мы проводили исследование по определению титра анти-ВЛКРС антител в пуле сывороток крови до и после обработки с ПЭГ-6000. В результате было установлено, что после осаждения ЦИК из пула сывороток крови 7%-ным раствором ПЭГ титры противолейкозных антител в ИФА не изменялись и были равны титрам антител в исходной пробе.

Выделенные иммунные комплексы растворяли в физиологическом растворе и изучали их активность в ИФА. Комплексы разбивали с предварительной инкубацией проб при 60оС в течение 1 часа. Титры «связанных» анти-ВЛКРС антител в пробах достигали до 1:1024.

На следующем этапе наших исследований, пробы сывороток крови исследовали в ИФА до и после их инкубирования при 60°С в течение 1 часа. Всего исследовано 201 проба сывороток крови коров из неблагополучных по лейкозу хозяйств. 109 проб из Агрофирмы «Кама Агро», Рыбно-Слободского района и 92 проб из ООО «Серпы и Молот» Высокогорского района. Предварительно все пробы были анализированы в РИД. Результаты исследований представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Результаты влияния температурного воздействия на титр свободных анти-ВЛКРС

антител в ИФА

№ п/п Хозяйства Всего проб РИД ИФА без инкубации проб ИФА с инкубацией проб

Полож. Отр. Полож. Отр. Полож. Отр.

1 Агрофирма «Кама Агро» 109 24 85 49 60 52 57

2 ООО « Серпы и Молот» 92 - 92 2 90 5 87

Таблица 2 - Изменение показателей оптической плотности (ОП) в ИФА, проб сыворотки крови до

и после инкубирования.

№ п/п Хозяйства РИД ИФА без инкубации проб ИФА с инкубацией проб

Яе8и11 ОП ОП

1. ООО «Агрофирма им. + + 1,471 + 1,786

2. В.П.Дементьева» - - 0,163 - 0,168

3. + + 1,493 + 1,550

4. ООО «Ак Барс Дрожжан- + + 1,105 + 1,380

5. ное» - - 0,159 - 0,198

6. + + 1,287 + 1,689

7. - - 0,173 - 0,173

8. - - 0,151 - 0,151

9. - - 0,126 - 0,144

10. + + 1,106 + 1,407

11. - + 0,800 + 1,105

12. + + 1,353 + 1,705

13. - - 0,420 + 0,781

14. - - 0,400 + 0,987

15. А/Ф Актаныш + + 1,854 + 1,957

16. - - 0,152 + 0,733

17. - + 0,579 + 2,082

18. - - 0,097 + 0,647

19. - - 0,067 + 1,237

20. - + 0,597 + 2,077

21. - + 0,550 + 2,207

22. - + 0,753 + 2,082

23. - - 0,354 + 1,618

24. - + 0,602 + 1,937

25. - + 0,563 + 2,128

26. - - 0,400 + 1,987

27. КФА «Низамов А.А» + + 0,954 + 0,981

28. - - 0,158 - 0,212

29. - - 0,122 - 0,127

30. - - 0,096 - 0,145

31. - + 0,943 + 0,965

32. - - 0,140 - 0,148

33. - - 0,094 - 0,169

По результатам исследования, количество положительных проб в ИФА до и после их инкубации по сравнению с РИД, значительно увеличилось. Из 85 отрицательно реагирующих в РИД проб полученных от агрофирмы Кама Агро», 28 реагировали положительно в ИФА (25 проб в ИФА без инкубации сывороток и еще 3 пробы в ИФА с инкубацией сывороток крови). Из 92 отрицательно реагирующих в РИД проб полученных от ООО «Серпы и Молот», 2 стали положительнными в ИФА до инкубации и дополнительно 3 реагировали положительно после инкубации при

60°С в течение 1 -го часа.

В целях проверки достоверности полученных результатов были проведены исследования методом ИФА проб сывороток крови коров из 7-и разных хозяйств Дрожановского и Актанышского районов с учетом ОП лунок планшета.

Всего исследованы 33 пробы, с различной реакцией в РИД. Результаты исследования представлены в таблице 2.

Из исследованного количества 8 проб сывороток крови были положительные и 25 были отрицательные в РИД. Из числа отрица-

тельных в РИД проб, 8 реагировали положительно в ИФА до температурного воздействия и еще 7 после инкубирования при 60°С в течение 1 часа. Показатели ОП лунок в большинстве случаев увеличивались, однако следует отметить, что во многих пробах отрицательных в РИД и в ИФА, в целом оставались неизменными.

Показатели оптической плотности в результате температурного воздействия у некоторых проб увеличились на 1,5 пунктов и более.

Обсуждение результатов. Проведенные исследования доказывают, что ВЛКРС инфекция сопровождается образованием иммунных комплексов, в составе которых обнаруживаются «скрытые» противовирусные антитела.

Увеличение титров свободных антител после инкубирования объясняется диссоциацией иммунных комплексов, спецификой динамики образования антител и иммунных комплексов при лейкозе.

Исследования по обнаружению циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) при разных заболеваниях доказаны в работах многих исследователей [9,11,13].

Большинством исследователей отмечается, что определение циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) имеет большое значение в мониторинге эпизоотической ситуации по лейкозу и может служить индикатором инфицированности животных вирусом [3,14].

Иммунные комплексы в сыворотке крови человека и животных могут формироваться из любых классов или подклассов иммуноглобулинов. По данным и^аг^агоп Н. et а!. (1992) и иммунные комплексы в сыворотке крови ВЛКРС-серопозитивных коров содержат антигены вируса и IgG и ^М Соотношение антител в комплексах («связанные антитела») меняется с возрастом животного и стадией болезни [2,7,10]. При уменьшении титров свободных антител наблюдается, в большинстве случаев, увеличение титров «связанных» антител, т.е. повышается степень образования циркули-рующих иммунных комплексов. При этом титры свободных антител могут снижаться до минимальных значений [6]. Эти данные свидетельствуют о том, что разовые серологические тесты в диагностике лейкоза могут быть не эффективными.

Разработанный способ диссоциации ЦИК при лейкозе и выявлять в ИФА «связанные» антитела без изменения их активности. Определение специфичных анти-тел в составе

иммунных комплексов позволяет увеличить достоверность выявления больных лейкозом животных по сравнению с традиционно применяемым методом обнаружения свободных антител в сыворотке крови не менее чем на 20%.

По результатам наших исследований, инкубирование сыворотки крови крупного рогатого скота при 60°С в течение 1 часа привело к увеличению титров свободных проти-волейкозных антител, что было доказано увеличением количества положи-тельных проб в ИФА. Увеличение титров свободных антител в исследуемых пробах и количества положительных проб после их инкубирования объясняется диссоцияции в них циркулирующих иммунных комплексов. Есть и положительные пробы, ОП которых оставались неизменными до и после диссоциации ЦИК (пробы №27,31). Данный факт означает, что титры «свободных» антител в крови животных были на пике, а ЦИК - на уровне минимальных значений.

Заключение. Определение специфических анти-ВЛКРС антител в составе иммунных комплесков позволяет увеличить достоверность выявления инфицированных и больных лейкозом животных по сравнению с традиционно применяемым методом обнаружения антител в сыворотке крови. Термическая обработка проб сыворотки крови повышает чувствительность метода ИФА для выявления больных и инфицированных животных, что имеет важное значение в мониторинге эпизоотической ситуации по лейкозу в разных хозяйствах.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Абелян, А.В. Иммунологическая нейтрализация вируса иммунодефицита человека первого типа / А.В. Абелян // Успехи современной биологии. 1997. -Т.117. - №5. - С.549-967.

2. Жавненко, В.М. Циркуляция антигенов, антител и иммунных комплексов в сыворотке крови коров, больных лейкозом. / В.М. Жавненко, В.В. Черняк.// Иммунология и иммунотерапия лейкозов человека и животных. Тез. докл. Всесоюзн. Конф. Ташкент, - 1984, С.49-50.

3. Логинов, С.И. Иммунные комплексы при лейкозе крупного рогатого скота/ С.И. Логинов // Ветериная патология / Современные достижения и проблемы клеточной биотехнологии и иммунологии в ветеринарной медицине - 2003-

№1.- с.85-87.

4. Митин, Ю.А. Иммунологические аспекты патогенеза и диагностики ВИЧ-инфекции.: Автореф. дис. доктора мед.наук / С.Петербург, 1997, - 40с.

5. Ройт, А., Бростофф Дж., Миел Д. Иммунология / Пер. с англ. - М.: Мир, 2000. - 592с.

6. Якупов, Т.Р. Динамика изменений титров «свободных» и «связанных» антител у инфицированных ВЛКРС коров // Т.Р.Якупов, Н.З.Хазипов // Ученые записки КГАВМ.-2009.- Т.197.- С.150-154.

7. Cynthia, J, Circulating Immune Complexes (Cic) As Marker For Disease Progress In Oral Cancer. Nerurkar A. V.& Karjodkar F.R. // Indian J. Clini. Biochem 2007; 22: 114 117.

8. Gillet N, Mechanism of leukemogenesis induced by bovine leukemia virus: prospects for novel anti-retroviral therapies in humans. Florins A, Boxus M, Burteau C et al (2007) // Retrovirology 2007; 4:18-49.

9. Golda, R, The presence and structure of circulating immune complexes in patients with prostate tumors. Med. Sci. Wolski Z, Wyszomirska GM, Madalinski K,

Michalkiewicz J. Monit 2004; 10: 23-7.

10. Kelley, M.C. Tumor associated antigen TA-90 immune complex assay predicts subclinical metastasis and survival for patients with early stage melanoma. Cancer 1998;83: 1355-1361.

11. Rojko, J.L., Evans MG, Price SA, Han B, Waine G, DeWitte M, Haynes J, Freimark B, Martin P, Raymond JT, Evering W, Rebelatto MC, Schenck E, Horvath C. Formation, Clearance, Deposition, Patho-genicity, and Identification of Biopharmaceu-tical-related Immune Complexes. Toxicologic Pathology (2014). 42 (4): 725.

12. Terukazu Odawara, Misao Onuma, Hiroyasu Yochikawa et.al. Circulating Immune Complexes Levels in Cows with Enzootic Bovine Leukemia // Jpn. J. Vet.Sci., 1987.-v.49.-p657-661.

13. Shmagel & cheresshnev. Molecular bases of immune complex pathology. Biochem (Moscow) 74, 469-479 (2009).

14. Ungar-Waron H. Circulating immune complexes in bovine leukemia virus (BLV)-infected cattle / H.Ungar-Waron, J.Brenner, R.Paz, Z.Trainin // Vet. Immunol. Immunopathol. 1992 Oct: 34 (1-2): 173-9; 5.

ТЕРМИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА ПРОБ СЫВОРОТКИ КРОВИ КАК СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ИФА В ДИАГНОСТИКЕ ЛЕЙКОЗА КОРОВ

Джакаит Д.А, Якупов Т.Р.

Резюме

Настоящие исследования проводились в целях определения влияния термической обработки проб сывороток крови на чувствительности теста иммуноферментного анализа при диагностике лейкоза крупного рогатого скота.

Результаты исследований доказывают, что после осаждения циркулирующих иммунных комплексов из пула сывороток крови крупного рогатого скота титры противолейкозных антител в ИФА не изменялись и были равны титрам антител в исходной пробе. Диссоциация этих компле-сков с предварительной инкубацией проб при 60оС в течение 1 часа привело к увеличению титров «свободных» анти-ВЛКРС антител в пробах.

Установлено, что термическая обработка проб сывороток крови, может быть фактором повышения чувствительности ИФА диагностики лейкоза крупного рогатого скота. Инкубирование сыворотки крови крупного рогатого скота при 60°С в течение 1 часа привело к увеличению титров свободных противолейкозных антител, что было доказано увеличением количества положительных проб в ИФА. Оптическая плотность (ОП) лунок планшета отрицательных проб после их термической обработки практически не меняются.