СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АКТИВНОГО ФАКТОРА РОСТА ГЕПАТОЦИТОВ (HGF)
METHOD FOR OBTAINING ACTIVE HEPATOCYTE GROWTH FACTOR (HGF)

Область техники
[0001]
Настоящее изобретение относится к способу получения активного активатора фактора роста гепатоцитов (также называемого в данном документе "активным HGFA") и активного фактора роста гепатоцитов (также называемого в данном документе "активным HGF") без применения сыворотки крови животного.
Уровень техники
[0002]
HGF представляет собой фактор, обладающий активностью пролиферации паренхимальных клеток печени, который был очищен из плазмы крови от пациентов-людей с фульминантным гепатитом (патентный источник литературы 1 и непатентный источник литературы 1), и, как сообщалось, обладает различными фармакологическими эффектами, такими как противоопухолевый эффект, усиление клеточно-опосредованного иммунитета, ранозаживляющий эффект и эффект стимуляции регенерации тканей (патентный источник литературы 2).
[0003]
До настоящего времени ген, кодирующий вышеупомянутый HGF, клонировали и получали с помощью технологии рекомбинантной ДНК (патентные источники литературы 3-5). Более того, известно, что HGF принимает однонитевую и двухнитевую формы, которые состоят из 2 типов субъединиц (α-цепь размером примерно 60 кДа и β-цепь размером примерно 30 кДа), при этом однонитевая форма не обладает биологической активностью, а приобретает биологическую активность в двухнитевой форме. Кроме того, известно, что при получении с помощью технологии рекомбинантной ДНК HGF может быть получен в виде активной двухнитевой формы при культивировании с сывороткой крови животного, однако при культивировании без сыворотки крови животного большую часть продуцируемого HGF получают в виде неактивной однонитевой формы (например, патентный источник литературы 6). Поскольку протеаза, содержащаяся в сыворотке крови животного, вовлечена в превращение однонитевой неактивной формы фактора роста гепатоцитов (также называемой в данном документе "про-HGF") в двухнитевую активную форму HGF, считается, что для эффективного получения активного HGF необходимо применять сыворотку крови животного.
[0004]
С другой стороны, в последние годы основной тенденцией в получении биологического материала с помощью технологии рекомбинантной ДНК является культивирование без сыворотки крови животного во избежание риска вирусной контаминации и т.д. Соответственно, для получения активного HGF с применением среды без сыворотки крови животного необходимо превратить однонитевую форму про-HGF в активный HGF с помощью определенных средств. В качестве таких средств известны HGFA, который может превращать про-HGF в активный HGF (патентный источник литературы 7), или серинпротеаза, такая как активатор плазминогена урокиназного типа (непатентный источник литературы 2). Однако существуют проблемы, заключающиеся в том, что эти ферменты, которые могут превращать про-HGF в активный HGF, получены из сыворотки крови, и если их нужно получить путем интеграции гена в микроорганизмы или клетки животных для продуцирования, они продуцируются в форме предшественников в бессывороточной культуре, и, поэтому, их сложно применять в таком виде.
Список использованной литературы
[0005]
Патентные источники литературы
[Патентный источник литературы 1] Публикация не прошедшей экспертизу заявки на патент Японии № S63-22526.
[Патентный источник литературы 2] Патент Японии № 2747979.
[Патентный источник литературы 3] Патент Японии № 2577091.
[Патентный источник литературы 4] Патент Японии № 2859577.
[Патентный источник литературы 5] Патент Японии № 3072628.
[Патентный источник литературы 6] Патент Японии № 3213985.
[Патентный источник литературы 7] Публикация не прошедшей экспертизу заявки на патент Японии № H5-103670.
[0006]
Непатентные источники литературы
[Непатентный источник литературы 1] J. Clin. Invest., 81, 414(1988).
[Непатентный источник литературы 2] JGH 26(2011) Suppl. 1; 188-202, p. 192.
Краткое описание изобретения
Задачи, решаемые с помощью настоящего изобретения
[0007]
Целью настоящего изобретения является обеспечение способа получения активного HGFA и активного HGF без применения сыворотки крови животного.
Другой целью настоящего изобретения является обеспечение активного HGFA, активного HGF и их препаратов, полученных с помощью способа по настоящему изобретению.
Средства для решения задач
[0008]
В результате обширных исследований, проведенных авторами настоящего изобретения для решения вышеуказанных задач, было обнаружено, что путем культивирования клеток млекопитающего, экспрессирующих неактивный активатор фактора роста гепатоцитов (про-HGFA), в среде без сыворотки крови с получением надосадочной жидкости культуры и воздействия на вышеупомянутую надосадочную жидкость культуры определенной обработкой про-HGFA, содержащийся в вышеупомянутой надосадочной жидкости культуры, может быть превращен в активный HGFA. Соответственно, поскольку про-HGF, полученный при культивировании без сыворотки крови животного, может быть превращен в активный HGF с помощью активного HGFA, аналогичным образом полученного при культивировании без сыворотки крови животного, то можно получить активный HGF или препарат, содержащий его, который не содержит компонент, полученный из сыворотки крови животного.
[0009]
Соответственно, настоящее изобретение охватывает следующие аспекты.
[1] Способ получения активного активатора фактора роста гепатоцитов (HGFA), характеризующийся тем, что он предусматривает:
стадию 1:
стадию получения надосадочной жидкости культуры, содержащей про-HGFA, путем культивирования клеток млекопитающего, экспрессирующих неактивный активатор фактора роста гепатоцитов (про-HGFA), в среде без сыворотки крови, и
стадию 2:
стадию регуляции кислотности надосадочной жидкости культуры, содержащей про-HGFA, полученной на вышеуказанной стадии, до слабокислого значения с превращением про-HGFA в активный HGFA.
[0010]
[2] Способ получения в соответствии с [1], характеризующийся тем, что указанная стадия дополнительно предусматривает добавление сульфатированных полисахаридов к указанной надосадочной жидкости культуры.
[0011]
[3] Способ получения в соответствии с [1] или [2], характеризующийся тем, что указанная стадия регуляции кислотности надосадочной жидкости культуры до слабокислого значения представляет собой стадию регуляции pH до 4,0-6,0.
[0012]
[4] Способ получения в соответствии с любым из [1] - [3], характеризующийся тем, что указанную стадию регуляции кислотности надосадочной жидкости культуры до слабокислого значения выполняют при температуре 15-40°C.
[0013]
[5] Способ получения в соответствии с любым из [1] - [4], характеризующийся тем, что указанную надосадочную жидкость культуры получают после снижения показателя выживаемости клеток млекопитающего в культуре.
[0014]
[6] Способ получения в соответствии с любым из [1] - [5], характеризующийся тем, что указанная клетка млекопитающего представляет собой клетку яичника китайского хомячка (CHO).
[0015]
[7] Способ получения в соответствии с любым из [1] - [6], характеризующийся тем, что указанный про-HGFA имеет аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 2.
[0016]
[8] Способ получения в соответствии с любым из [1] - [7], характеризующийся тем, что указанная надосадочная жидкость культуры представляет собой указанную надосадочную жидкость культуры per se, результат разбавления указанной надосадочной жидкости культуры, концентрат указанной надосадочной жидкости культуры или частично очищенный продукт указанной надосадочной жидкости культуры.
[0017]
[9] Активный HGFА, где он получен с помощью способа получения в соответствии с [1] - [8].
[0018]
[10] Способ получения активного фактора роста гепатоцитов (HGF), характеризующийся тем, что он предусматривает стадию обеспечения воздействия активного HGFA в отношении надосадочной жидкости культуры, содержащей неактивный фактор роста гепатоцитов (про-HGF), с превращением указанного про-HGF в активный HGF,
где
указанная надосадочная жидкость культуры, содержащая про-HGF, представляет собой надосадочную жидкость культуры, полученную путем культивирования клеток, экспрессирующих про-HGF, в среде без сыворотки крови, и
указанный активный HGFA получен с помощью способа в соответствии с [1]-[8].
[0019]
[11] Способ получения в соответствии с [10], характеризующийся тем, что указанная среда для культивирования клеток, экспрессирующих про-HGF, представляет собой среду без каких-либо компонентов животного происхождения.
[0020]
[12] Способ получения в соответствии с [10] или [11], характеризующийся тем, что указанный про-HGF имеет аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 1.
[0021]
[13] Активный HGF, где он получен с помощью способа получения в соответствии с [10]-[12].
[0022]
Специалистам в данной области техники должно быть понятно, что настоящее изобретение, предусматриваемое любую комбинацию одной или нескольких характеристик по настоящему изобретению, описанных выше, также охватывается объемом настоящего изобретения.
Эффекты изобретения
[0023]
В соответствии с настоящим изобретением предусмотрен способ получения активного HGFA и активного HGF без применения сыворотки крови животного.
Поскольку в способе получения активного HGF по настоящему изобретению нет необходимости в применении сыворотки крови какого-либо животного в процессе его получения, композиция, содержащая активный HGF, полученный с помощью вышеупомянутого способа получения, не содержит компонент, полученный из сыворотки крови животного, и может совершенно безопасно применяться для человека.
Краткое описание графических материалов
[0024]
На фигуре 1 показано, что HGFА из надосадочной жидкости культуры, полученный путем активации про-HGFА из надосадочной жидкости культуры, активирует про-HGF в надосадочной жидкости культуры, полученной из клеток CHO, содержащих про-HGF.
На фигуре 2 показан результат подтверждения с использованием планирования экспериментов (DoE) с учетом условий, при которых активируется про-HGFА из надосадочной жидкости культуры.
На фигуре 3 показан SDS-PAGE после хроматографической очистки с использованием мультимодального анионного обменника Capto Аdhere в качестве носителя для хроматографии и 20 мM Tris-гидрохлоридного буфера (pH 8,0), содержащего 0,25 M аргинина и 0,7 M аргинина, в качестве элюата.
На фигуре 4 показан SDS-PAGE после хроматографической очистки с использованием мультимодального анионного обменника Capto Аdhere в качестве носителя для хроматографии и 20 мM Tris-гидрохлоридного буфера (pH 8,0), содержащего 1 M аргинина, в качестве элюата.
На фигуре 5 показаны результаты SDS-PAGE при невосстанавливающих и восстанавливающих условиях для очищенного продукта на каждой стадии очистки, где очистку, аналогичную очистке из примера 5, выполняли с надосадочной жидкостью культуры, содержащей про-HGF, который не активирован HGFА из надосадочной жидкости культуры.
На фигуре 6 показан результат измерения активности клеточной пролиферации в присутствии TGFβ для очищенного HGF, полученного в примере 5.
Описание вариантов осуществления
[0025]
Ссылка в данном документе на "активный фактор роста гепатоцитов (активный HGF)", если явно не указано иное, истолковывается как относящаяся к двухнитевой активированной форме HGF и используется для установления различия от неактивного фактора роста гепатоцитов (про-HGF), который представляет собой его однонитевую неактивную форму.
[0026]
В настоящем изобретении HGF может предусматривать HGF, полученный от людей, мышей, крыс, кроликов или других животных. В настоящем изобретении HGF предпочтительно представляет собой HGF, полученный от людей.
[0027]
В настоящем изобретении HGF человека (hHGF) предусматривает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 1, или ее вариант. Вариант полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 1, предусматривает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность с добавлением, делецией или заменой одной или нескольких аминокислот аминокислотной последовательности, показанной под SEQ ID NO: 1, а также обладающий активностью HGF, аналогичной или превышающей таковую у полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 1, или который может быть активирован, чтобы обладать активностью. "Несколько", как используется в данном документе, означает 2-150, более предпочтительно 2-80, более предпочтительно 2-70, более предпочтительно 2-60, более предпочтительно 2-50, более предпочтительно 2-40, более предпочтительно 2-30, более предпочтительно 2-20, более предпочтительно 2-10 или более предпочтительно 2-5.
[0028]
Вариант полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 1, также предусматривает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 85% и более предпочтительно по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, показанной под SEQ ID NO: 1, а также обладающий активностью HGF, аналогичной или превышающей таковую у полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 1, или который может быть активирован, чтобы обладать активностью.
[0029]
Вариант полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 1, также предусматривает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, кодируемую полинуклеотидом, который гибридизируется при жестком условии с полинуклеотидом, кодирующим аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 1, а также обладающий активностью HGF, аналогичной или превышающей таковую у полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 1, или который может быть активирован, чтобы обладать активностью.
[0030]
В настоящем изобретении "жесткое условие" может включать в себя условия, при которых в случае постгибридизационной отмывки гибридизация достигается с отмывкой, например, при условии "2 X SSC, 0,1% SDS, 50°C", при условии "2 X SSC, 0,1% SDS, 42°C" или при условии "1 X SSC, 0,1% SDS, 37°C", и более жесткое условие может включать в себя условия, при которых гибридизация достигается с отмывкой, например, при условиях "2 X SSC, 0,1% SDS, 65°C", "0,5 X SSC, 0,1% SDS, 42°C", "0,2 X SSC, 0,1% SDS, 65°C" или "0,1 X SSC, 0,1% SDS, 65°C" (1 X SSC представляет собой 150 мM хлорида натрия, 15 мM цитрата натрия, pH 7,0). Более конкретно, в качестве способа, при котором используют буфер Rapid-hyb (Amersham Life Science), можно осуществлять предварительную гибридизацию при 68°C в течение 30 минут или дольше, после чего добавляют зонд и оставляют при 68°C на 1 час или дольше для обеспечения образования гибридов, а затем выполнять три отмывки в 2 X SSC и 0,1% SDS при комнатной температуре в течение 20 минут, три отмывки в 1 X SSC и 0,1% SDS при 37°C в течение 20 минут и, наконец, две отмывки в 1 X SSC и 0,1% SDS при 50°C в течение 20 минут. Более предпочтительно с применением раствора, содержащего, например, 5 X SSC, 7% (вес/об) SDS, 100 мкг/мл денатурированной ДНК из молок лососевых и 5 X раствор Денхардта (1 X раствор Денхардта содержит 0,2% поливинилпирролидона, 0,2% альбумина бычьей сыворотки крови и 0,2% фиколла), в качестве растворов для предварительной гибридизации и гибридизации, предварительную гибридизацию выполняют при 65°C в течение от 30 минут до 1 часа, а гибридизацию выполняют при той же температуре в течение ночи (6-8 часов). Кроме того, также можно выполнять, например, предварительную гибридизацию в растворе для гибридизации Expresshyb (CLONTECH) при 55°C в течение 30 минут или дольше с добавлением меченого зонда и инкубацией при 37-55°C в течение 1 часа или дольше и тремя отмывками в 2 X SSC и 0,1% SDS при комнатной температуре в течение 20 минут, а затем одной отмывкой в 1 X SSC и 0,1% SDS при 37°C в течение 20 минут. В данном документе более жесткое условие может быть достигнуто, например, путем повышения температуры для предварительной гибридизации, гибридизации или второй отмывки. Например, температура для предварительной гибридизации и гибридизации может составлять 60°C, или 65°C, или 68°C для обеспечения еще более жесткого условия. Специалисты в данной области техники смогут установить условия для получения изоформ, аллельных вариантов и соответствующих генов, полученных из других видов организмов, для гена по настоящему изобретению, учитывая различные условия, такие как другая концентрация зонда, длина зонда и время реакции, в дополнение к условиям, таким как концентрация солей в таком буфере и температура. В отношении подробного протокола способа гибридизации можно упомянуть "Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed." (Cold Spring Harbor Press (1989); в частности раздел 9.47-9.58), "Current Protocols in Molecular Biology" (John Wiley & Sons (1987-1997); в частности раздел 6.3-6.4), "DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach 2nd ed." (Oxford University (1995); в частности раздел 2.10 в отношении условий) и т.п.
[0031]
Ссылка в данном документе на "активный активатор фактора роста гепатоцитов (активный HGFA)", если явно не указано иное, истолковывается как относящаяся к активированному HGFA и используется для установления различия от неактивного активатора фактора роста гепатоцитов (про-HGFA), который представляет собой его неактивную форму.
[0032]
В настоящем изобретении HGFA может предусматривать HGFA, полученный от человека, мыши, крысы, кролика или других животных. В настоящем изобретении HGFА предпочтительно представляет собой HGFА, полученный от людей.
[0033]
В настоящем изобретении HGFA человека предусматривает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 2, или ее вариант. Вариант полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 2, предусматривает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность с добавлением, делецией или заменой одной или нескольких аминокислот аминокислотной последовательности, показанной под SEQ ID NO: 2, а также обладающий активностью HGF, аналогичной или превышающей таковую у полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 2, или который может быть активирован, чтобы обладать активностью. "Несколько", как используется в данном документе, означает 2-150, более предпочтительно 2-80, более предпочтительно 2-70, более предпочтительно 2-60, более предпочтительно 2-50, более предпочтительно 2-40, более предпочтительно 2-30, более предпочтительно 2-20, более предпочтительно 2-10 или более предпочтительно 2-5.
[0034]
Вариант полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 2, также предусматривает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 85% и более предпочтительно по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, показанной под SEQ ID NO: 2, а также обладающий активностью HGFA, аналогичной или превышающей таковую у полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 2, или который может быть активирован, чтобы обладать активностью.
[0035]
Вариант полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 2, также предусматривает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, кодируемую полинуклеотидом, который гибридизируется при жестком условии с полинуклеотидом, кодирующим аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 2, а также обладающий активностью HGF, аналогичной или превышающей таковую у полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 2, или который может быть активирован, чтобы обладать активностью.
[0036]
Настоящее изобретение описывается подробно ниже.
[0037]
В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу получения активного HGFA без применения сыворотки крови животного. Конкретно способ получения активного HGFA по настоящему изобретению представляет собой способ получения активного HGFA путем воздействия на надосадочную жидкость культуры, содержащую про-HGFA, рекомбинантно экспрессированного клетками млекопитающего, определенной обработкой, за счет чего обеспечивается превращения в активный HGFA. Поскольку в соответствии со способом по настоящему изобретению сыворотку крови животного не применяют при превращении в активный HGFA, полученный про-HGFA или композиция, содержащая его, характеризуются существенно более низкой вероятностью возникновения риска контаминации инфекционными материалами, такими как вирус, полученный из клеток животных других видов или других индивидуумов, и могут использоваться для различных целей в качестве весьма безопасного биологического материала.
[0038]
Конкретно в одном варианте осуществления способ получения активного HGFA по настоящему изобретению отличается тем, что он предусматривает следующие стадии:
стадию 1:
стадию получения надосадочной жидкости культуры, содержащей про-HGFA, путем культивирования клеток млекопитающего, экспрессирующих про-HGFA, в среде без сыворотки крови, и
стадию 2:
стадию регуляции кислотности надосадочной жидкости культуры, содержащей про-HGFA, полученной на вышеуказанной стадии, до слабокислого значения с превращением про-HGFA в активный HGFA.
[0039]
В другом варианте осуществления способ получения HGFA по настоящему изобретению отличается тем, что он предусматривает стадию регуляции кислотности надосадочной жидкости культуры, содержащей про-HGFA, до слабокислого значения с превращением про-HGFA в активный HGFA, где указанная надосадочная жидкость культуры представляет собой надосадочную жидкость культуры, полученную путем культивирования клеток млекопитающего, экспрессирующих про-HGFA, в среде без сыворотки крови.
[0040]
Слабое подкисление надосадочной жидкости культуры представляет собой обработку с целью превращения про-HGFA в активный HGFA. Поскольку превращение про-HGFA в активный HGFA происходит непосредственно с помощью слабого подкисления без добавления к надосадочной жидкости культуры извне ферментов и т. д., считается, что полученные из клеток млекопитающего компоненты вовлечены в превращение про-HGFA в активный HGFA, а слабое подкисление является средством активации указанных полученных из клеток млекопитающего компонентов. Слабое подкисление можно выполнять с помощью способов, хорошо известных специалистам в данной области техники, таких как добавление, например, кислого раствора (неорганических кислот, таких как хлористоводородная кислота, серная кислота и фосфорная кислота, или органических кислот, таких как уксусная кислота, янтарная кислота и лимонная кислота) при подходящей концентрации. В одном варианте осуществления настоящего изобретения "слабокислое значение" означает диапазон pH 4,0-6,0, предпочтительно 5,0-6,0 и более предпочтительно 5,3-5,6, например, pH 5,5.
[0041]
В настоящем изобретении "надосадочная жидкость культуры, содержащая про-HGFA" (также называемая в данном документе "надосадочная жидкость культуры с про-HGFА") представляет собой фракцию, содержащую про-HGFA, который получен путем культивирования клеток млекопитающего, экспрессирующих про-HGFA, которую специалисты в данной области техники могут получить из клеточной культуры указанных клеток млекопитающего с помощью традиционных способов. Например, надосадочная жидкость культуры с про-HGFА может представлять собой фракцию, из которой остатки клеточной культуры указанных клеток млекопитающего извлечены с помощью такого способа, как центрифугирование.
[0042]
В настоящем изобретении надосадочная жидкость культуры может представлять собой любую фракцию, полученную путем применения любой обработки по отношению к надосадочной жидкости культуры до такой степени, при которой не утрачивается биологическая активность про-HGFA. Соответственно, в настоящем изобретении надосадочная жидкость культуры предусматривает без ограничения надосадочную жидкость культуры per se и результат разбавления, концентрат или частично очищенный продукт надосадочной жидкости культуры.
[0043]
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения "стадия превращения про-HGFA в активный HGFA" дополнительно предусматривает добавление сульфатированных полисахаридов к указанной надосадочной жидкости культуры. За счет добавления сульфатированных полисахаридов превращение про-HGFA в активный HGFA может быть выполнено более эффективно. Время осуществления добавления сульфатированных полисахаридов может представлять собой любой момент времени до проведения слабого подкисления указанной надосадочной жидкости культуры, одновременно с проведением слабого подкисления или после проведения слабого подкисления. Более того, количество добавляемых сульфатированных полисахаридов может варьировать в зависимости, например, от типа применяемых сульфатированных полисахаридов, и их можно добавлять в количестве 0,01-50 мг, более предпочтительно 0,1-20 мг, например, 1 мг на 1 мл указанной надосадочной жидкости культуры с про-HGFА.
[0044]
Сульфатированные полисахариды, которые можно применять в способе получения активного HGFA по настоящему изобретению, могут включать без ограничения гепарин, сульфат декстрана, сульфат хондроитина, фукоидан и его соли. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения применяют сульфат декстрана.
[0045]
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения "стадию превращения про-HGFA в активный HGFA" выполняют при температуре 15-40°C, предпочтительно 20-37°C, например, 25°C. За счет использования указанного диапазона температур превращение про-HGFA в активный HGFA может быть выполнено более эффективно.
[0046]
В способе получения активного HGFA по настоящему изобретению "стадию превращения про-HGFA в активный HGFA" выполняют в течение периода времени, достаточного для выявления требуемой активности HGFA после слабого подкисления. Такой период времени может варьировать в зависимости от pH, присутствия или отсутствия сульфатированного полисахарида, применяемого в комбинации, температурного условия и т. д., и может составлять 1-15 часов, например, 6-8 часов, после слабого подкисления.
[0047]
В одном варианте осуществления настоящего изобретения надосадочная жидкость культуры с про-HGFА представляет собой надосадочную жидкость культуры, которую получают после снижения показателя выживаемости клеток млекопитающего в культуре. Наряду со снижением показателя выживаемости клеток млекопитающего компоненты, полученные из клеток животного, которые вовлечены в превращение про-HGFA в активный HGFA, элюируются из погибших клеток и могут быть собраны в достаточном количестве в надосадочной жидкости культуры с про-HGFА. "Снижение показателя выживаемости клеток млекопитающего в культуре" в данном документе относится к снижению показателя выживаемости клеток млекопитающего после пролиферации до максимальной плотности клеток. В настоящем изобретении показатель выживаемости клеток млекопитающего в надосадочной жидкости культуры с про-HGFА составляет предпочтительно 95% или меньше, более предпочтительно 80% или меньше, например, 70%.
[0048]
Поскольку считается, что фермент, полученный из лизосомы клетки-хозяина, вовлечен в активацию про-HGFA с получением активного HGFA, фермент, полученный из лизосомы, может быть добавлен с целью обеспечения данной обработки.
[0049]
Клетки млекопитающего, которые можно применять в способе получения активного HGFA по настоящему изобретению, могут включать без ограничения клетки яичника китайского хомячка (CHO), клетки HeLa, клетки HEK (в том числе клетки HEK 293), клетки COS, клетки миеломы мыши NS0, клетки миеломы мыши Sp2/0 и т.п. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения клетки CHO применяют в качестве клеток млекопитающего, экспрессирующих про-HGFA.
[0050]
Настоящее изобретение также относится к композиции, содержащей активный HGFA, или активному HGFA, полученным с помощью способа получения активного HGFA по настоящему изобретению. Поскольку композиция, содержащая активный HGFA, или активный HGFA по настоящему изобретению могут быть получены без применения сыворотки крови животного из рекомбинантно экспрессируемого про-HGFA без применения сыворотки крови животного, их можно применять в качестве весьма безопасного биологического материала, например, для способа получения активного HGF, описанного ниже.
[0051]
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу получения активного HGF. Способ получения активного HGF по настоящему изобретению предусматривает обеспечение воздействия активного HGFA, полученного с помощью способа получения активного HGFA по настоящему изобретению, в отношении надосадочной жидкости культуры, содержащей про-HGF, рекомбинантно экспрессируемый в среде аналогично без сыворотки крови, с превращением про-HGF в активный HGF. В соответствии с данным способом, поскольку активный HGF может быть получен без применения сыворотки крови животного на всех стадиях, в том числе получения активного HGFA, используемого для превращения в активный HGF, полученный активный HGF или композицию, содержащую его, можно применять в качестве весьма безопасного фармацевтического материала, у которого устраняется риск контаминации инфекционными материалами, такими как вирус.
[0052]
Конкретно в одном варианте осуществления способ получения активного HGF по настоящему изобретению характеризуется тем, что он предусматривает стадию обеспечения воздействия активного HGFA в отношении надосадочной жидкости культуры, содержащей про-HGF, с превращением указанного про-HGF в активный HGF,
где
указанная надосадочная жидкость культуры, содержащая про-HGF, представляет собой надосадочную жидкость культуры, полученную путем культивирования клеток, экспрессирующих про-HGF, в среде без сыворотки крови, и
указанный активный HGFA получен с помощью вышеуказанного способа получения активного HGFA по настоящему изобретению.
[0053]
Более того, в другом варианте осуществления способ получения активного HGF по настоящему изобретению характеризуется тем, что он предусматривает следующие стадии:
стадию A:
стадию регуляции кислотности надосадочной жидкости культуры, содержащей про-HGFA, до слабокислого значения с превращением про-HGFA в активный HGFA, где указанная надосадочная жидкость культуры представляет собой надосадочную жидкость культуры, полученную путем культивирования клеток млекопитающего, экспрессирующих про-HGFA, в среде без сыворотки крови,
стадию B:
стадию получения надосадочной жидкости культуры, содержащей про-HGF, путем культивирования клеток, экспрессирующих про-HGF, в среде без сыворотки крови, стадию C:
стадию обеспечения воздействия активного HGFA, полученного на указанной стадии A, в отношении надосадочной жидкости культуры, содержащей про-HGF, полученной на указанной стадии B, с превращением указанного про-HGF в активный HGF.
[0054]
В настоящем изобретении "надосадочная жидкость культуры, содержащая про-HGF", представляет собой фракцию, содержащую про-HGF, который получен путем культивирования клеток, экспрессирующих про-HGF, и специалисты в данной области техники могут получить ее из культуры указанных клеток с помощью традиционных способов. Например, надосадочная жидкость культуры, содержащая про-HGF, может представлять собой фракцию, из которой остатки клеточной культуры указанных клеток млекопитающего извлечены с помощью такого способа, как центрифугирование.
[0055]
В способе получения активного HGF по настоящему изобретению надосадочную жидкость культуры, полученную путем культивирования клеток млекопитающего, экспрессирующих про-HGFA, в среде без сыворотки крови, можно использовать как таковую, или результат разбавления, концентрат или частично или полностью очищенный продукт вышеупомянутой надосадочной жидкости культуры можно использовать в качестве активного HGFA, воздействие которого в отношении надосадочной жидкости культуры, содержащей про-HGF, обеспечивают.
[0056]
В настоящем изобретении клетку млекопитающего, экспрессирующую про-HGFA, можно получить без ограничения путем создания вектора, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую про-HGFA, и введения его в клетку-хозяина млекопитающего с обеспечением трансформации. Аналогично клетку млекопитающего, экспрессирующую про-HGF, можно получить путем создания вектора, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую про-HGF, и введения его в клетку-хозяина с обеспечением трансформации.
[0057]
Вектор генной экспрессии и т.д. можно применять в качестве вышеописанного вектора. "Вектор генной экспрессии" представляет собой вектор, который обладает функцией экспрессии последовательности оснований, которую имеет представляющая интерес нуклеиновая кислота, и может включать последовательность промотора, последовательность энхансера, последовательность репрессора, последовательность инсулятора и т.п. для контроля экспрессии указанной последовательности оснований. Эти последовательности конкретно не ограничены при условии, что они функционируют в клетке-хозяине.
[0058]
Способ создания вектора, содержащего представляющую интерес нуклеиновую кислоту, хорошо известен специалистам в данной области техники, и специалисты в данной области техники могут соответствующим образом выбрать подходящий способ. Например, такие способы могут включать без ограничения лигазную реакцию, при которой используется сайт расщепления рестрикционным ферментом и т.п. (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987) Section 11.4-11.11; Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Press (1989) Section 5.61-5.63).
[0059]
Клетки, экспрессирующие про-HGF, конкретно не ограничены при условии, что они могут экспрессировать про-HGF, и включают, например, клетки насекомых, клетки эукариотов, клетки млекопитающих. Что касается эффективной экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей про-HGF, полученной от человека, предпочтительно применять клетки млекопитающего, например, клетки CHO, клетки HEK (в том числе клетки HEK 293), клетки HeLa, клетки NS0 или клетки миеломы мыши SP2/0. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения клетки CHO применяют в качестве клетки млекопитающего, экспрессирующей про-HGF.
[0060]
Способы введения вышеуказанного вектора в клетку-хозяина хорошо известны, и специалисты в данной области техники могут соответствующим образом выбрать подходящий способ. Примеры введения вектора в клетку-хозяина могут включать без ограничения способ электропорации (Chu et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15: 1311-26), способ с применением катионных липосом, способ перфорации электрическим импульсом (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987) Section 9.1-9.9), способ прямой инъекции с применением капиллярной стеклянной трубки, способ микроинъекции, липофекцию (Derijard (1994) Cell 7: 1025-37; Lamb (1993) Nature Genetics 5: 22-30; Rabindran et al. (1993) Science 259: 230-4), способ с применением липофектамина (Thermo Fisher Scientific), способ с применением фосфата кальция (Chen and Okayama (1987) Mol. Cell. Biol. 7: 2745-52), способ с применением DEAE декстрана (Lopata et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12: 5707-17; Sussman and Milman (1985) Mol. Cell. Biol. 4: 1642-3), реактива FreeStyle MAX (Thermo Fisher Scientific) и т.п.
[0061]
Что касается бессывороточной среды, применяемой для культивирования клеток, экспрессирующих про-HGFA, и клеток, экспрессирующих про-HGF, специалисты в данной области техники могут соответствующим образом выбрать подходящую композицию в зависимости от применяемого типа клетки-хозяина и т.д. Более того, специалисты в данной области техники также могут соответствующим образом выбрать другие условия культивирования, например, без ограничения температура культивирования может быть соответствующим образом выбрана из 35,5-37,5°C, и период культивирования может быть выбран из 5-20 дней. Для про-HGFA период культивирования может быть установлен в соответствии с целевым показателем выживаемости. Концентрация диоксида углерода при культивировании может составлять 5% CO2 в соответствии с общепринятым протоколом.
[0062]
В одном варианте осуществления способ получения активного HGF по настоящему изобретению характеризуется тем, что после указанной стадии он дополнительно предусматривает стадию очистки активного HGF. Данная стадия может предусматривать очистку про-HGF, который может оставаться в препарате, содержащем активный HGF.
[0063]
Способ очистки, который можно применять в настоящем изобретении, конкретно не ограничен, при условии, что он обеспечивает очистку без утраты физиологической активности белка. В частности, в настоящем изобретении предпочтительно применять хроматографическую очистку с использованием носителя смешанного типа.
[0064]
Носитель смешанного типа также называют носителем комбинированного типа, и он представляет собой носитель для хроматографии, в котором лиганды с двумя или более типами свойств объединены в одном носителе. В частности, в настоящем изобретении, что касается очистки активного HGF, активный HGF может быть эффективно очищен с помощью хроматографической очистки с использованием носителя смешанного типа, обладающего характеристиками гидрофобности и ионообменного носителя.
[0065]
Примеры "носителя смешанного типа, обладающего характеристиками гидрофобности и ионообменного носителя", который можно применять в способе по настоящему изобретению, могут включать без ограничения Capto Аdhere, Capto MMC, HEA HyperCel, PPA HyperCel, MEP HyperCel, TOYOPEARL MX-Trp-650M и т.п.
[0066]
Хроматографическая очистка с использованием указанного носителя смешанного типа может быть выполнена путем адсорбции активного HGF, содержащегося в растворе для загрузки в колонку, на указанном носителе смешанного типа, а затем промывки буфером для удаления примесей с последующим элюированием. Буфер для удаления примесей может быть выбран на основании pH, электрической проводимости, компонента буфера, концентрации солей или добавок, которые обеспечивают адсорбцию белка, который является целью очистки, на носителе, при этом снижают аффинность между примесями и носителем.
[0067]
Примеры применяемых раствора для загрузки в колонку и буфера включают без ограничения фосфатные соли, цитратные соли, ацетатные соли, сукцинатные соли, малеатные соли, боратные соли, Tris (основание), HEPES, MES, PIPES, MOPS, TES или трицин и т.п.
[0068]
Применяемые раствор для загрузки в колонку и буфер могут содержать аминокислоты. Примеры таких аминокислот могут включать без ограничения глицин, аланин, аргинин, серин, треонин, глутаминовую кислоту, аспарагиновую кислоту, гистидин, их производные и т.п.
[0069]
В настоящем изобретении можно применять раствор для загрузки в колонку, который характеризуется подходящими значениями pH и концентрации солей для адсорбции активного HGF на указанном носителе смешанного типа. Такой диапазон pH представляет собой pH 6,0-10,0, более предпочтительно pH 7,0-9,0, например, pH 8,0. Более того, такая концентрация солей составляет 0,01-5 M, предпочтительно 0,1-2 M, например, 1 M. Вышеуказанная концентрация солей может быть получена с использованием, например, 0,001 M - 4 M хлорида натрия, хлорида калия, хлорида кальция, цитрата натрия, сульфата натрия, сульфата аммония или их комбинации.
[0070]
В настоящем изобретении элюирование активного HGF можно выполнять с использованием буфера, который будет снижать аффинность между указанным носителем смешанного типа и активным HGF. Такой буфер предусматривает буфер, содержащий по меньшей мере 0,1 M аргинина, более предпочтительно по меньшей мере 0,3 M аргинина, еще более предпочтительно по меньшей мере 0,4 M аргинина, например, 0,7 M аргинина. Более того, в комбинации с аргинином или вместо него также можно использовать буфер, содержащий ион магния (Mg2+). В качестве альтернативы элюирование активного HGF также можно выполнять поэтапным способом, при котором поэтапно снижают pH с элюированием активного HGF.
[0071]
В одном варианте осуществления настоящего изобретения указанная очистка может дополнительно предусматривать очистку с помощью одной или нескольких дополнительных процедур хроматографии после очистки с помощью носителя смешанного типа, содержащего группу для ионного обмена и группу для гидрофобного взаимодействия. Это позволит получить активный HGF с более высокой чистотой. Такая хроматографическая очистка предусматривает без ограничения, например, хроматографическую очистку, при которой используют носитель смешанного типа, анионообменный носитель, катионообменный носитель, носитель для гидрофобного взаимодействия, носитель для разделения по весу, носитель для гель-фильтрации, обращенно-фазовый носитель, носитель на основе гидроксиапатита, носитель на основе фтороапатита, носитель на основе сульфатированной целлюлозы или носитель на основе сульфатированной агарозы и т.п.
[0072]
Следует отметить, что термины, применяемые в данном документе, используются для описания конкретных вариантов осуществления и не предназначены для ограничения настоящего изобретения.
[0073]
Более того, термин "содержащий", используемый в данном документе, если контекст явно не указывает, что подразумевается иное, означает наличие описываемых объектов (таких как компоненты, стадии, элементы и числа) и не исключает наличие других объектов (таких как компоненты, стадии, элементы и числа).
[0074]
Если не указано иное, все термины, используемые в данном документе (в том числе технические и научные термины), имеют те же значения, которые широко известны специалистам в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Используемые в данном документе термины, если явно не указано иное, следует истолковывать как имеющие значения, соответствующие значениям в данном документе и в соответствующих областях техники, и не следует истолковывать как имеющие упрощенные или чрезмерно формальные значения.
[0075]
Такие термины, как первый и второй, иногда используются для выражения различных элементов, и следует понимать, что эти элементы не ограничиваются этими терминами. Эти термины используются исключительно с целью установления различия между одним элементом и другим, и, например, можно описывать первый элемент как второй элемент и аналогичным образом описывать второй элемент как первый элемент без отступления от объема настоящего изобретения.
[0076]
Далее настоящее изобретение описывается более конкретно с помощью примеров. Однако настоящее изобретение может быть осуществлено с помощью различных вариантов осуществления и не должно истолковываться как ограничиваемое примерами, описываемыми в данном документе.
Примеры
[0077]
Далее настоящее изобретение конкретно описывается с демонстрацией примеров, однако настоящее изобретение не ограничивается данными примерами.
[Пример 1]
Клетки CHO, которые рекомбинантно экспрессируют полноразмерный про-HGFA, размораживали в разработанной на заказ среде EX-CELL (от SAFC) в колбе T75 (от Corning, 430421), разращивание культуры выполняли в шейкерной колбе объемом 250 мл (от Corning, 431144), а затем культивировали в течение 10 дней в емкости для культивирования объемом 7 л (от ABLE/Biott, BCP-07) с установкой 121 об/мин при 36,5°C. Показатель выживаемости клеток в день 10 культивирования составлял 47,1%. После завершения культивирования клетки удаляли путем центрифугирования и микрофильтрации через фильтр с размером пор 0,2 мкм (от Sartorius, 5445307H7--00), и собранную надосадочную жидкость с про-HGFA хранили в замороженном виде до применения.
[0078]
В стеклянный стакан объемом 100 мл помещали 50 мл надосадочной жидкости культуры с про-HGFА, полученной аналогично тому, как описано выше, добавляли 5 мл, что составляло 1/10 объема надосадочной жидкости, водного раствора декстрана сульфата натрия с концентрацией 10 г/л (мол. масса 500000), а затем pH регулировали до 5,3 с помощью 2 M хлористоводородной кислоты. После регуляции pH смесь подвергали фильтрации с применением фильтра с размером пор 0,2 мкм, а затем помещали в шейкерную колбу объемом 250 мл. Пятипроцентный диоксид углерода продували в течение 60 секунд, а затем обеспечивали протекание реакции при комнатной температуре со скоростью перемешивания, установленной на 80 об/мин, в течение 6 часов. Реакция активации протекала при pH приблизительно 5,5. Забор образцов выполняли через 6 часов реакции, и активность HGFA измеряли с применением синтетического пептида в качестве субстрата. Синтетический субстрат H-D-Val-Leu-Arg-pNA.2AcOH (от Bachem, L-1885) растворяли в буфере на основе 50 мM Tris-HCl, 0,15 M хлорида натрия, 10 мM хлорида кальция (pH 7,5), содержащем 0,25% BSA, и регулировали концентрацию до 2 мM. Его вносили в количестве 100 мкл/лунка в необходимое число лунок 96-луночного планшета и добавляли по 10 мкл каждого из надосадочной жидкости культуры с HGFА, которую подвергали активационной обработке, положительного контроля и необработанной надосадочной жидкости культуры с про-HGFА. В качестве положительного контроля использовали надосадочную жидкость культуры с HGFА, которую предварительно активировали и подтвердили ее способность активировать в достаточной степени про-HGF. Планшет защищали от света с помощью алюминиевой фольги и инкубировали при 37°C в течение 1 часа. Поглощение считывали с помощью планшетного ридера от TECAN (405 нм), и значение активности HGFA рассчитывали путем вычитания значения поглощения необработанной надосадочной жидкости культуры с про-HGFА от исходного значения поглощения. В результате было подтверждено, что значение активности образца с HGFA после активации составляло 0,577, что сопоставимо со значением активности положительного контроля. Предполагается, что про-HGFA активируется под действием фермента, полученного из клетки-хозяина CHO, поскольку никакие ферменты и т.п. не добавляли извне к этому реакционному раствору. Более того, когда к раствору добавляли 1 M Tris после 7,6 часов реакции для регуляции pH до 7,0, а затем раствор хранили в замороженном виде в течение 2 дней для проверки изменения значения активности HGFA, значительного снижения значения активности не наблюдали, при этом значение активности непосредственно после нейтрализации составляло 0,653, в день 1 заморозки составляло 0,667 и в день 2 заморозки составляло 0,679, что демонстрирует стабильность в течение 2 дней после активации (таблица 1).
[0079]
[Таблица 1]
Образец
A405
Значение активности HGFA
Измерение 1
Надосадочная жидкость культуры с про-HGFА
0,100
-
6 часов после активации
0,677
0,577
Положительный контроль
0,709
0,609
Измерение 2
Надосадочная жидкость культуры с про-HGFА
0,110
-
7,6 часов после активации(перед нейтрализацией)
0,803
0,693
7,6 часов после активации(после нейтрализации)
0,763
0,653
День 1 хранения в замороженном виде после нейтрализации
0,777
0,667
День 2 хранения в замороженном виде после нейтрализации
0,789
0,679
Положительный контроль
0,714
0,604
Таблица 1. Значения активности HGFA после активирующей обработки
[0080]
Клетки CHO, которые рекомбинантно экспрессируют про-HGF, размораживали в разработанной на заказ среде EX-CELL в колбе T75, разращивание культуры выполняли в шейкерной колбе объемом 250 мл и емкости для культивирования объемом 7 л, а затем ее культивировали в течение 9 дней в емкости для культивирования объемом 20 л с установкой 144 об/мин при 36,5°C. Показатель выживаемости в день 9 культивирования составлял 90,6%. После фильтрации с удалением клеток 19,14 кг надосадочной жидкости культуры с про-HGF, которую подвергали микрофильтрации через фильтр с размером пор 0,2 мкм (от Sartorius, 5445307H9--00), загружали в емкость для культивирования объемом 30 л. Туда добавляли 0,96 кг, что составляло 1/20 объема надосадочной жидкости культуры с HGF, надосадочной жидкости культуры с HGFА, которую активировали, возвращали до pH 7,0 и хранили в замороженном виде в течение 2 дней, и обеспечивали протекание реакции с перемешиванием при 30 об/мин при 25°C. Следует отметить, что загружаемая надосадочная жидкость культуры с активированным HGFА характеризовалась значением активности, сопоставимым с измеренной активностью HGFA у положительного контроля. Забор образцов выполняли через приблизительно 20 часов реакции, и состояние активации про-HGF подтверждали с помощью SDS-PAGE с использованием 5-20% полиакриламидного геля (от DRC, NXV-271HP). Наблюдали полосу, соответствующую одной нити, при невосстанавливающем условии, а при восстанавливающем условии после активации однонитевое вещество не наблюдалось, а разделялось на α- и β-цепи, и, таким образом, подтверждали достаточную активацию про-HGF (фигура 1).
[0081]
[Пример 2]
С помощью планирования экспериментов (DoE) исследовали правильность параметров активации про-HGFA, описанных в примере 1, которые представляли собой pH (5,3-5,5) и температуру реакции (комнатная температура). Условия эксперимента устанавливали с помощью центрального композиционного планирования с использованием программного обеспечения JMP (от SAS Institute), и раствор для активационной обработки про-HGFA получали аналогичным описанному в примере 1 способом. Следует отметить, что регуляцию pH осуществляли в трех условиях, pH 5,0, 5,5 и 6,0, с помощью 2 M хлористоводородной кислоты. По 100 мкл каждого помещали в пробирки объемом 1,5 мл и обеспечивали протекание реакции, оставляя их при этом при 20°C, 28,5°C и 37°C. Забор образцов выполняли через 3, 6, 9 и 15 часов реакции, и активность HGFA измеряли с применением синтетического пептида в качестве субстрата. Значение активности HGFA получали путем вычитания значения (A405) необработанной надосадочной жидкости культуры с про-HGFА. Строили график поверхности отклика с помощью статистического анализа значений активности HGFA, полученных в общей сложности с 27 условиями, и диапазон со значением активности 0,4 или больше был показан белым цветом. Согласно этому результату было обнаружено, что условие, которое обеспечивает наиболее высокое значение активности HGFA, представляет собой pH 5,4 и температуру реакции 26,1°C, и что значение активности HGFA может быть получено в широком диапазоне (фигура 2).
[0082]
[Пример 3]
2 мл мультимодального анионного обменника Capto Аdhere (от GE Healthcare, 28-4058-44) предварительно уравновешивали с помощью 20 мM Tris-гидрохлоридного буфера (pH 8,0), содержащего 2 M хлорида натрия. К 32 мл надосадочной жидкости культуры, содержащей активный HGF, добавляли хлорид натрия с получением 1 M. Эту надосадочную жидкость культуры загружали в колонку с расходом 2 мл/мин и собирали пропущенный раствор. После завершения загрузки пропускали 20 мM Tris-гидрохлоридный буфер (pH 8,0), содержащий 2 M хлорида натрия, в количестве, соответствующем 3-кратному объему колонки, с целью промывки, и собирали элюат. После завершения промывки пропускали 20 мM Tris-гидрохлоридный буфер (pH 8,0), содержащий 0,25 M аргинина, в количестве, соответствующем 3-кратному объему колонки, с целью промывки, и собирали элюат. Затем стадию пропускания 20 мM Tris-гидрохлоридного буфера (pH 8,0), содержащего 0,7 M аргинина, в количестве, соответствующем 1-кратному объему колонки, для сбора элюата повторяли 5 раз. Наконец пропускали 20 мM Tris-гидрохлоридный буфер (pH 8,0), содержащий 1,0 M аргинина, в количестве, соответствующем 3-кратному объему колонки, для сбора элюата. На фигуре 3 показан результат проведения SDS-PAGE при невосстанавливающем условии с растворами, собранными в данном способе. Используемым для SDS-PAGE гелем был XV-PANTERA (NXV-271HP) от DRC, и используемым маркером молекулярной массы был окрашенный в синий белковый стандарт Precision Plus Protein (161-0373) от BIORAD. Образцы подвергали анализу SDS-PAGE после осуществления 10-минутной тепловой обработки в буфере Лэммли для образцов при 60°C. Электрофорез выполняли при постоянном напряжении, составляющем 150 В, и после завершения электрофореза гель окрашивали с помощью PAGE Blue83 от COSMO BIO для подтверждения разделенных белков. При сравнении раствора для загрузки в колонку и пропущенного раствора интенсивность полосы HGF, соответствующей молекулярной массе около 75000, была меньше у пропущенного раствора, что указывает на его адсорбцию на носителе. HGF не элюировался при пропускании 20 мM Tris-гидрохлоридного буфера (pH 8,0), содержащего 2 M хлорида натрия. Компонент, содержащий много примесей, элюировался при последующей промывке с помощью 20 мM Tris-гидрохлоридного буфера (pH 8,0), содержащего 0,25 M аргинина. Затем HGF элюировался при пропускании 20 мM Tris-гидрохлоридного буфера (pH 8,0), содержащего 0,7 M аргинина.
[0083]
[Пример 4]
1 мл мультимодального анионного обменника Capto Аdhere (от GE Healthcare, 28-4058-44) предварительно уравновешивали с помощью 20 мM Tris-гидрохлоридного буфера (pH 8,0), содержащего 2 M хлорида натрия. К 8 мл надосадочной жидкости культуры, содержащей активный HGF, добавляли равное количество 20 мM Tris-гидрохлоридного буфера (pH 8,0), содержащего 2 M хлорида натрия, с получением 1 M. Эту надосадочную жидкость культуры загружали в колонку и собирали пропущенный раствор. После завершения загрузки пропускали 20 мM Tris-гидрохлоридный буфер (pH 8,0), содержащий 2 M хлорида натрия, в количестве, соответствующем 3-кратному объему колонки, с целью промывки, и собирали элюат. Пропускали количество, соответствующее 5-кратному объему колонки, 20 мM Tris-гидрохлоридного буфера (pH 8,0), содержащего 1 M аргинина, и собирали элюат. На фигуре 4 показан результат проведения SDS-PAGE при невосстанавливающем условии с растворами, собранными в данном способе. Используемым для SDS-PAGE гелем был XV-PANTERA (NXV-271HP) от DRC, и используемым маркером молекулярной массы был окрашенный в синий белковый стандарт Precision Plus Protein (161-0373) от BIORAD. Образцы подвергали анализу SDS-PAGE после осуществления 10-минутной тепловой обработки в буфере Лэммли для образцов при 60°C.
Электрофорез выполняли при постоянном напряжении, составляющем 150 В, и после завершения электрофореза гель окрашивали с помощью PAGE Blue83 от COSMO BIO для подтверждения разделенных белков. При сравнении раствора для загрузки в колонку и пропущенного раствора интенсивность полосы HGF была меньше у пропущенного раствора, что указывает на его адсорбцию на носителе. HGF не элюировался при пропускании 20 мM Tris-гидрохлоридного буфера (pH 8,0), содержащего 2 M хлорида натрия. Активный HGF элюировался при последующем элюировании с помощью 20 мM Tris-гидрохлоридного буфера (pH 8,0), содержащего 1 M аргинина.
[0084]
[Пример 5]
К надосадочной жидкости культуры, содержащей активный HGF, полученной способом из примера 1, добавляли равное количество 40 мM Tris-гидрохлоридного буфера (pH 8,0), содержащего 2 M хлорида натрия, а затем pH регулировали до 8,0. Вышеуказанный раствор загружали в колонку с Capto Аdhere (GE Healthcare, 17-5444-05), уравновешенную с помощью 20 мM Tris-гидрохлоридного буфера (pH 8,0), содержащего 2 M хлорида натрия, и после завершения загрузки выполняли промывку с помощью буфера, используемого для уравновешивания. Колонку промывали 20 мM Tris-гидрохлоридным буфером (pH 8,0), содержащим 0,25 M хлорида аргинина, после чего выполняли элюирование с помощью 20 мM Tris-гидрохлоридного буфера (pH 8,0), содержащего 0,7 M хлорида аргинина, и собирали фракцию, содержащую HGF.
[0085]
Фракцию очистки посредством Capto Аdhere объединяли, раствор, разбавленный в 7 раз с помощью 20 мM Tris-гидрохлоридного буфера (pH 7,5), содержащего 0,012% полисорбата-80, загружали в колонку с Capto Q (GE Healthcare, 17-5316-05), уравновешенную с помощью 20 мM Tris-гидрохлоридного буфера (pH 7,5), содержащего 0,012% полисорбата-80, и после завершения загрузки выполняли промывку с помощью буфера, используемого для уравновешивания. Пропущенный через колонку раствор и промывочный раствор объединяли в виде фракции очистки посредством Capto Q.
[0086]
Фракцию очистки посредством Capto Q загружали в колонку с UNOsphere S (Bio-Rad 156-0117), уравновешенную с помощью 20 мM фосфатного буфера (pH 7,5), и после завершения загрузки ее промывали с помощью буфера, используемого для уравновешивания. После завершения промывки с помощью того же раствора ее промывали с помощью 20 мM фосфатного буфера (pH 7,5), содержащего 0,4 M хлорида натрия, а затем адсорбированный HGF элюировали с помощью 20 мM фосфатного буфера (pH 7,5), содержащего 0,6 M хлорида натрия, в виде фракции очистки посредством UNOsphere S.
[0087]
К фракции очистки посредством UNOsphere S добавляли 20 мM фосфатного буфера (pH 7,5), содержащего 5 M хлорида натрия, с регуляцией концентрации хлорида натрия в растворе до 3,3 M и pH до 7,5. Колонку с Phenyl Sepharose HP (GE Healthcare, 17-1082-04) уравновешивали с помощью 20 мM фосфатного буфера (pH 7,5), содержащего 3,3 M хлорида натрия, а затем в нее загружали вышеуказанный раствор HGF. После завершения загрузки колонку промывали с помощью буфера, используемого для уравновешивания. Адсорбированный HGF элюировали с помощью линейного градиента буфера для уравновешивания (A) и 20 мM фосфатного буфера (pH 7,5) (B) (от 30 до 100% B).
[0088]
[Пример 6]
Для надосадочной жидкости культуры, содержащей раствор неактивированного про-HGF, в который не добавляли активный HGFA, очистку посредством Capto Аdherese, очистку посредством CaptoQ, очистку посредством UNOsphereS и замену буфера для концентрации UF выполняли аналогично, как в примере 5. Показанные на фигуре 5 результаты SDS-PAGE при невосстанавливающих и восстанавливающих условиях для образцов, полученных на каждой стадии, показывают, что неактивированный про-HGF также очищается с помощью данного способа очистки.
[0089]
[Пример 7]
Для активного HGF, полученного в примере 5, измеряли активность клеточной пролиферации в присутствии TGFβ-1. Использовали эпителиальные клетки легкого норки Mv 1 Lu (№ линии клеток: JCRB9128), добавляли активный HGF к клеткам, рост которых подавлялся в присутствии трансформирующего фактора роста β-1 (TGFβ-1), и активность активного HGF в отношении их пролиферации на основании антагонистического действия в отношении активности TGFβ-1 определяли с измерением титра (Journal of Immunological Methods, 258, 1-11, 2001).
[0090]
В каждую лунку 96-луночного планшета добавляли 50 мкл TGFβ-1 (4 нг/мл), по 50 мкл каждого из международного эталонного стандарта HGF (код NIBSC: 96/564) или HGF (0, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, 512 и 1024 нг/мл) и 100 мкл суспензии эпителиальных клеток легкого норки (1 X 105 клеток/мл) и культивировали при 37°C, 5% концентрации CO2 в течение 3 дней, а затем жизнеспособные клетки окрашивали с помощью набора для подсчета клеток (DOJINDO LABORATORIES, № по кат. 343-07623). С применением данных поглощения при 450 нм, полученных с помощью микропланшетного ридера, строили сигмоидальные кривые для каждого из международного эталонного стандарта HGF и HGF (фигура 6). Значения EC50 международного эталонного стандарта HGF и HGF составляли 13,4 и 15,4 нг/мл соответственно, и HGF, полученный с помощью вышеописанного способа получения, характеризовался активностью, эквивалентной таковой у международного эталонного стандарта HGF.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  EISAI R&D MANAGEMENT CO., LTD.
<120>  Способ получения активного фактора роста гепатоцитов (HGF)
<130>  ESAP1601F
<150>  JP2016-054128
<151>  2016-03-17
<160>  2
<170>  PatentIn версия 3.5
<210>  1
<211>  697
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  1
Gln Arg Lys Arg Arg Asn Thr Ile His Glu Phe Lys Lys Ser Ala Lys
1               5                   10                  15
Thr Thr Leu Ile Lys Ile Asp Pro Ala Leu Lys Ile Lys Thr Lys Lys
20                  25                  30
Val Asn Thr Ala Asp Gln Cys Ala Asn Arg Cys Thr Arg Asn Lys Gly
35                  40                  45
Leu Pro Phe Thr Cys Lys Ala Phe Val Phe Asp Lys Ala Arg Lys Gln
50                  55                  60
Cys Leu Trp Phe Pro Phe Asn Ser Met Ser Ser Gly Val Lys Lys Glu
65                  70                  75                  80
Phe Gly His Glu Phe Asp Leu Tyr Glu Asn Lys Asp Tyr Ile Arg Asn
85                  90                  95
Cys Ile Ile Gly Lys Gly Arg Ser Tyr Lys Gly Thr Val Ser Ile Thr
100                 105                 110
Lys Ser Gly Ile Lys Cys Gln Pro Trp Ser Ser Met Ile Pro His Glu
115                 120                 125
His Ser Phe Leu Pro Ser Ser Tyr Arg Gly Lys Asp Leu Gln Glu Asn
130                 135                 140
Tyr Cys Arg Asn Pro Arg Gly Glu Glu Gly Gly Pro Trp Cys Phe Thr
145                 150                 155                 160
Ser Asn Pro Glu Val Arg Tyr Glu Val Cys Asp Ile Pro Gln Cys Ser
165                 170                 175
Glu Val Glu Cys Met Thr Cys Asn Gly Glu Ser Tyr Arg Gly Leu Met
180                 185                 190
Asp His Thr Glu Ser Gly Lys Ile Cys Gln Arg Trp Asp His Gln Thr
195                 200                 205
Pro His Arg His Lys Phe Leu Pro Glu Arg Tyr Pro Asp Lys Gly Phe
210                 215                 220
Asp Asp Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Gln Pro Arg Pro Trp Cys
225                 230                 235                 240
Tyr Thr Leu Asp Pro His Thr Arg Trp Glu Tyr Cys Ala Ile Lys Thr
245                 250                 255
Cys Ala Asp Asn Thr Met Asn Asp Thr Asp Val Pro Leu Glu Thr Thr
260                 265                 270
Glu Cys Ile Gln Gly Gln Gly Glu Gly Tyr Arg Gly Thr Val Asn Thr
275                 280                 285
Ile Trp Asn Gly Ile Pro Cys Gln Arg Trp Asp Ser Gln Tyr Pro His
290                 295                 300
Glu His Asp Met Thr Pro Glu Asn Phe Lys Cys Lys Asp Leu Arg Glu
305                 310                 315                 320
Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Ser Glu Ser Pro Trp Cys Phe Thr
325                 330                 335
Thr Asp Pro Asn Ile Arg Val Gly Tyr Cys Ser Gln Ile Pro Asn Cys
340                 345                 350
Asp Met Ser His Gly Gln Asp Cys Tyr Arg Gly Asn Gly Lys Asn Tyr
355                 360                 365
Met Gly Asn Leu Ser Gln Thr Arg Ser Gly Leu Thr Cys Ser Met Trp
370                 375                 380
Asp Lys Asn Met Glu Asp Leu His Arg His Ile Phe Trp Glu Pro Asp
385                 390                 395                 400
Ala Ser Lys Leu Asn Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asp Asp Ala
405                 410                 415
His Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Gly Asn Pro Leu Ile Pro Trp Asp Tyr
420                 425                 430
Cys Pro Ile Ser Arg Cys Glu Gly Asp Thr Thr Pro Thr Ile Val Asn
435                 440                 445
Leu Asp His Pro Val Ile Ser Cys Ala Lys Thr Lys Gln Leu Arg Val
450                 455                 460
Val Asn Gly Ile Pro Thr Arg Thr Asn Ile Gly Trp Met Val Ser Leu
465                 470                 475                 480
Arg Tyr Arg Asn Lys His Ile Cys Gly Gly Ser Leu Ile Lys Glu Ser
485                 490                 495
Trp Val Leu Thr Ala Arg Gln Cys Phe Pro Ser Arg Asp Leu Lys Asp
500                 505                 510
Tyr Glu Ala Trp Leu Gly Ile His Asp Val His Gly Arg Gly Asp Glu
515                 520                 525
Lys Cys Lys Gln Val Leu Asn Val Ser Gln Leu Val Tyr Gly Pro Glu
530                 535                 540
Gly Ser Asp Leu Val Leu Met Lys Leu Ala Arg Pro Ala Val Leu Asp
545                 550                 555                 560
Asp Phe Val Ser Thr Ile Asp Leu Pro Asn Tyr Gly Cys Thr Ile Pro
565                 570                 575
Glu Lys Thr Ser Cys Ser Val Tyr Gly Trp Gly Tyr Thr Gly Leu Ile
580                 585                 590
Asn Tyr Asp Gly Leu Leu Arg Val Ala His Leu Tyr Ile Met Gly Asn
595                 600                 605
Glu Lys Cys Ser Gln His His Arg Gly Lys Val Thr Leu Asn Glu Ser
610                 615                 620
Glu Ile Cys Ala Gly Ala Glu Lys Ile Gly Ser Gly Pro Cys Glu Gly
625                 630                 635                 640
Asp Tyr Gly Gly Pro Leu Val Cys Glu Gln His Lys Met Arg Met Val
645                 650                 655
Leu Gly Val Ile Val Pro Gly Arg Gly Cys Ala Ile Pro Asn Arg Pro
660                 665                 670
Gly Ile Phe Val Arg Val Ala Tyr Tyr Ala Lys Trp Ile His Lys Ile
675                 680                 685
Ile Leu Thr Tyr Lys Val Pro Gln Ser
690                 695
<210>  2
<211>  620
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  2
Gln Pro Gly Gly Asn Arg Thr Glu Ser Pro Glu Pro Asn Ala Thr Ala
1               5                   10                  15
Thr Pro Ala Ile Pro Thr Ile Leu Val Thr Ser Val Thr Ser Glu Thr
20                  25                  30
Pro Ala Thr Ser Ala Pro Glu Ala Glu Gly Pro Gln Ser Gly Gly Leu
35                  40                  45
Pro Pro Pro Pro Arg Ala Val Pro Ser Ser Ser Ser Pro Gln Ala Gln
50                  55                  60
Ala Leu Thr Glu Asp Gly Arg Pro Cys Arg Phe Pro Phe Arg Tyr Gly
65                  70                  75                  80
Gly Arg Met Leu His Ala Cys Thr Ser Glu Gly Ser Ala His Arg Lys
85                  90                  95
Trp Cys Ala Thr Thr His Asn Tyr Asp Arg Asp Arg Ala Trp Gly Tyr
100                 105                 110
Cys Val Glu Ala Thr Pro Pro Pro Gly Gly Pro Ala Ala Leu Asp Pro
115                 120                 125
Cys Ala Ser Gly Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys Ser Asn Thr Gln
130                 135                 140
Asp Pro Gln Ser Tyr His Cys Ser Cys Pro Arg Ala Phe Thr Gly Lys
145                 150                 155                 160
Asp Cys Gly Thr Glu Lys Cys Phe Asp Glu Thr Arg Tyr Glu Tyr Leu
165                 170                 175
Glu Gly Gly Asp Arg Trp Ala Arg Val Arg Gln Gly His Val Glu Gln
180                 185                 190
Cys Glu Cys Phe Gly Gly Arg Thr Trp Cys Glu Gly Thr Arg His Thr
195                 200                 205
Ala Cys Leu Ser Ser Pro Cys Leu Asn Gly Gly Thr Cys His Leu Ile
210                 215                 220
Val Ala Thr Gly Thr Thr Val Cys Ala Cys Pro Pro Gly Phe Ala Gly
225                 230                 235                 240
Arg Leu Cys Asn Ile Glu Pro Asp Glu Arg Cys Phe Leu Gly Asn Gly
245                 250                 255
Thr Gly Tyr Arg Gly Val Ala Ser Thr Ser Ala Ser Gly Leu Ser Cys
260                 265                 270
Leu Ala Trp Asn Ser Asp Leu Leu Tyr Gln Glu Leu His Val Asp Ser
275                 280                 285
Val Gly Ala Ala Ala Leu Leu Gly Leu Gly Pro His Ala Tyr Cys Arg
290                 295                 300
Asn Pro Asp Asn Asp Glu Arg Pro Trp Cys Tyr Val Val Lys Asp Ser
305                 310                 315                 320
Ala Leu Ser Trp Glu Tyr Cys Arg Leu Glu Ala Cys Glu Ser Leu Thr
325                 330                 335
Arg Val Gln Leu Ser Pro Asp Leu Leu Ala Thr Leu Pro Glu Pro Ala
340                 345                 350
Ser Pro Gly Arg Gln Ala Cys Gly Arg Arg His Lys Lys Arg Thr Phe
355                 360                 365
Leu Arg Pro Arg Ile Ile Gly Gly Ser Ser Ser Leu Pro Gly Ser His
370                 375                 380
Pro Trp Leu Ala Ala Ile Tyr Ile Gly Asp Ser Phe Cys Ala Gly Ser
385                 390                 395                 400
Leu Val His Thr Cys Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Ser His
405                 410                 415
Ser Pro Pro Arg Asp Ser Val Ser Val Val Leu Gly Gln His Phe Phe
420                 425                 430
Asn Arg Thr Thr Asp Val Thr Gln Thr Phe Gly Ile Glu Lys Tyr Ile
435                 440                 445
Pro Tyr Thr Leu Tyr Ser Val Phe Asn Pro Ser Asp His Asp Leu Val
450                 455                 460
Leu Ile Arg Leu Lys Lys Lys Gly Asp Arg Cys Ala Thr Arg Ser Gln
465                 470                 475                 480
Phe Val Gln Pro Ile Cys Leu Pro Glu Pro Gly Ser Thr Phe Pro Ala
485                 490                 495
Gly His Lys Cys Gln Ile Ala Gly Trp Gly His Leu Asp Glu Asn Val
500                 505                 510
Ser Gly Tyr Ser Ser Ser Leu Arg Glu Ala Leu Val Pro Leu Val Ala
515                 520                 525
Asp His Lys Cys Ser Ser Pro Glu Val Tyr Gly Ala Asp Ile Ser Pro
530                 535                 540
Asn Met Leu Cys Ala Gly Tyr Phe Asp Cys Lys Ser Asp Ala Cys Gln
545                 550                 555                 560
Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Ala Cys Glu Lys Asn Gly Val Ala Tyr
565                 570                 575
Leu Tyr Gly Ile Ile Ser Trp Gly Asp Gly Cys Gly Arg Leu His Lys
580                 585                 590
Pro Gly Val Tyr Thr Arg Val Ala Asn Tyr Val Asp Trp Ile Asn Asp
595                 600                 605
Arg Ile Arg Pro Pro Arg Arg Leu Val Ala Pro Ser
610                 615                 620
<---