СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ ПОВРЕЖДЕНИЯ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ ПРИ РЕПЕРФУЗИОННОМ СИНДРОМЕ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
METHOD FOR PREVENTING NEURAL INJURIES IN REPERFUSION SYNDROME IN EXPERIMENT

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной патофизиологии, неврологии и медицине чрезвычайных ситуаций и может быть использовано для профилактики повреждения нервной системы при реперфузионном синдроме в эксперименте.
Одной из актуальных проблем современной медицины является изучение механизмов развития постишемических состояний, приводящих к развитию реперфузионного синдрома. Указанная патология часто встречается в клинической практике ангиохирургии, трансплантологии, травматологии, неврологии, кардиологии и медицине чрезвычайных ситуаций. Известно, что в основе реперфузионной интоксикации организма лежит дисбаланс в протеиназ-ингибиторной системе, который приводит к активации протеолиза и развитию полиогранной недостаточности (Харченко В.З., Алиев Л.Л., Фомочкина И.И., Харченко С.В. Механизмы развития органопатологии при экспериментальном реперфузионном синдроме. Вестник морского врача. 2008; 6(6):168). Кроме того, при ишемии и реперфузии тканей происходит протеолитическое повреждение головного мозга, приводящее к расстройству двигательной, чувствительной и сенсомоторной сфер нервной деятельности, что обусловливает тяжелый неврологический дефицит и гибель экспериментальных животных (Харченко В.З., Мневец Р.А., Бекетов А.А., Литвинова С.В. Протеолитические механизмы повреждения головного мозга при реперфузионном синдроме. Крымский журнал экспериментальной и клинической медицины. 2018; 8(3): 81-87).
Известен способ профилактики реперфузионного синдрома в эксперименте (Cai J., Jiang Y., Zhang M., Zhao H., Li H., Li K., Zhang X., Qiao Т. Protective effects of mitochondrion-targeted peptide SS-31 against hind limb ischemia-reperfusion injury. J. Physiol. Biochem. 2018 May; 74(2): 335-343. doi: 10.1007/s 13105-018-0617-1), включающий воспроизведение модели патологии путем индуцирования ишемии задних конечностей мышей с использованием ортодонтической резиновой ленты под анестезией 1,5% пентобарбиталом и введение препарата SS-31 из семейства пептидных антиоксидантов внутрибрюшинно за 30 минут до ишемии или непосредственно перед реперфузией с последующим проведением гистопатологической оценки. Способность препарата SS-31 пересекать клеточную мембрану и накапливаться во внутренней митохондриальной мембране, снижая митохондриальную продукцию активных форм кислорода, демонстрировало уменьшение оксидативного стресса со снижением уровня малонового диальдегида и повышением активности супероксиддисмутазы и каталазы у мышей при моделировании ишемии-реперфузии задних конечностей.
К недостаткам данного способа можно отнести невысокую эффективность, так как используемый для профилактики препарат не оказывает существенного влияния на нервную систему, повреждения которой возникают при ишемии и реперфузии тканей, что может приводить к развитию опасного неврологического дефицита и являться причиной гибели экспериментальных животных.
Известен способ профилактики экспериментального реперфузионного синдрома (Geldi О., Kubat Е.,  С.S., Canbaz S. Acetaminophen Mitigates Myocardial Injury Induced by Lower Extremity Ischemia-Reperfusion in Rat Model. Braz. J. Cardiovasc. Surg. 2018 May-Jun; 33(3): 258-264. doi: 10.21470/1678-9741-2017-0218) заключающийся в том, что моделировали на животных ишемию-реперфузию нижних конечностей и осуществляли внутривенную инфузию ацетаминофена из расчета 15 мг/кг/час, начинающуюся за 15 минут до конца ишемического периода и продолжающуюся до конца периода реперфузии, проводили гистопатологическое исследование, которое показало уменьшение очагового кровоизлияния и миофибриллярного отека в миокарде при ишемии-реперфузии.
Однако, недостатком данного способа является то, что эффективность профилактики может существенно снижаться в связи с отсутствием протекторного воздействия на нервную систему, патологические изменения в которой могут быть потенциальным источником вторичной интоксикации при реперфузионном синдроме, а необходимость введения препарата как в конце ишемического периода, так и на протяжении всего реперфузионного периода зачастую затруднительно с клинической точки зрения.
В качестве прототипа выбран способ профилактики реперфузионного синдрома в эксперименте (Фомочкина И.И. Патогенетическая коррекция метаболических нарушений при реперфузионных расстройствах в эксперименте. Таврический медико-биологический вестник. 2010; 13(3): 206-212), включающий моделирование патологии путем наложения резиновых жгутов под эфирным наркозом на обе задние конечности животных на уровне паховой складки с проведением реваскуляризации конечностей через 6 часов и использованием для профилактики ишемии-реперфузии поливалентного ингибитора протеиназ Гордокса в дозе 10000 КИЕ/кг массы тела животного, разведенного в изотоническом растворе NaCl, вводимого однократно внутрибрюшинно за 30 минут до снятия жгутов с последующей оценкой изменений в протеиназ-ингибиторной системе путем изучения активности ферментов протеолиза в сывортке крови.
К недостаткам указанного способа относятся следующие: недостаточная эффективность, что связано с возможностью повреждения нервной системы при развитии реперфузионного синдрома, а также обоснование результативности профилактики ишемии только за счет определения активности протеиназ и их ингибиторов в сыворотке крови, без учета оценки состояния протеиназ-ингибиторной системы в супернатантах гомогенатов головного мозга и в сыворотках крови из сонных артерий и яремных вен, оценки патоморфологических изменений головного мозга, что может свидетельствовать о купировании ишемически-реперфузионных повреждений в эксперименте не в полной мере.
Проведенный патентно-информационный поиск не выявил способов профилактики повреждения нервной системы при реперфузионном синдроме в эксперименте с существенными признаками заявляемого способа.
Исходя из вышеприведенного уровня техники, при профилактике реперфузионного синдрома в эксперименте проблемой является комплексное воздействие на все звенья его патогенеза, в том числе связанные с повреждением центральной нервной системы, с учетом роли системной активации ферментов протеолиза и снижения содержания в организме их ингибиторов.
Технический результат заключается в повышении эффективности профилактики реперфузионных повреждений со стороны нервной системы при восстановлении кровотока в ранее ишемизированных тканях.
Разработка более эффективного способа профилактики повреждения нервной системы при экспериментальном реперфузионном синдроме за счет сочетанного применения поливалентного ингибитора протеиназ и ноотропного комплексного средства даст возможность решить вышеуказанную проблему.
Предлагается, как и в прототипе, использовать поливалентный ингибитор протеиназ Гордокс, вводимый внутрибрюшинно за 30 минут до реваскуляризации тканей при моделировании патологии путем наложения резиновых жгутов на обе задние конечности животных на уровне паховой складки, проводить оценку состояния протеиназ-ингибиторной системы в сыворотке крови.
Сущность заявляемого изобретения заключается в том, что в способе профилактики повреждения нервной системы при реперфузионном синдроме в эксперименте, включающем использование поливалентного ингибитора протеиназ Гордокса из расчета 10000 КИЕ/кг массы тела животного, вводимого за 30 минут перед реваскуляризацией тканей однократно внутрибрюшинно при моделировании патологии путем наложения резиновых жгутов на обе задние конечности животных на уровне паховой складки, и последующую оценку состояния протеиназ-ингибиторной системы в сыворотке крови, согласно изобретению, дополнительно через 5 минут после введения препарата Гордокс вводят препарат Церебролизин из расчета 0,7 мл/кг массы тела животного однократно внутрибрюшинно, а оценку состояния протеиназ-ингибиторной системы проводят в сыворотках крови из сонных артерий и яремных вен, в супернатантах гомогенатов головного мозга, оценивают патоморфологические изменения головного мозга,
Заявляемый способ коррекции реперфузионного синдрома разработан впервые.
Причинно-следственная связь между совокупностью существенных признаков и обеспечиваемым изобретением техническим результатом, состоит в следующем: дополнительное применение препарата Церебролизин в сочетании с препаратом Гордокс, вводимых внутрибрюшинно однократно перед реваскуляризацией тканей, позволяет предупредить развитие молекулярных и патоморфологических изменений в тканях мозга, предупредить системную активацию протеолиза, снизить возможность возникновения неврологического дефицита и предотвратить гибель исследуемых животных.
Церебролизин используют в клинической практике при нейродегенеративных заболеваниях, энцефалопатии, ишемическом инсульте и других состояниях. Однако, в настоящее время отсутствуют исследования, изучающие возможность использования Церебролизина при системном реперфузионном синдроме, возникающем после реваскуляризации ранее ишемизированных периферических тканей.
Способ осуществляют следующим образом.
Исследования были проведены с использованием 90 крыс-самцов линии «Wistar» массой 170-200 грамм, разделенных на 5 серий: контрольную, включающую 10 интактных животных, и четыре экспериментальные.
В экспериментальных сериях моделировали реперфузионный синдром путем наложения жгутов под эфирным наркозом на обе задние конечности на уровне паховой складки сроком на 2 часа и 6 часов с последующим их снятием, ширина сдавления тканей составляла 2-3 мм. Критерием правильности наложения жгута являлось отсутствие отека конечностей и бледность их окраски; реваскуляризацию производили одномоментно рассечением жгутов (Харченко В.З., Кубышкин А.В., Фомочкина И.И. и др. Молекулярные механизмы развития экстремальных состояний и их коррекция. Симферополь; 2011). Эвтаназию крыс экспериментальных серий и забор материала проводили через 6 часов или 12 часов после реваскуляризации конечностей в зависимости от принадлежности к серии эксперимента.
Экспериментальные исследования проводили в соответствии с требованиями «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, которые используются в исследовательских и других научных целях» (Strasburg, 18.03.1986). Материалы для исследований получали путем декапитации наркотизированных крыс.
Животные содержались в условиях 12/12-часового свето-темнового режима при температуре 22±1°С и получали стандартный корм и питьевую воду ad libitum. Температура помещения, в котором проводились эксперименты, составляла 19-21°С. Все исследования и измерения проводились на оборудовании, которое прошло метрологическую проверку и экспертизу.
За 30 минут до снятия жгутов осуществляли внутрибрюшинное введение препарата Гордокс из расчета 10000 КИЕ/кг массы тела животного, спустя 5 минут в группах с сочетанной терапией внутрибрюшинно вводили препарат Церебролизин из расчета 0,7 мл/кг массы тела животного.
В таблице 1 приведено распределение крыс по сериям эксперимента.
Крысы каждой из 4 экспериментальных серий были разделены на 3 группы: нелеченые крысы (n=10), профилактика реперфузионного синдрома препаратом Гордокс из расчета 10000 КИЕ/кг массы тела (n=5), профилактика сочетанным применением препаратов Гордокс из расчета 10000 КИЕ/кг массы тела и Церебролизин из расчета 0,7 мл/кг массы тела (n=5).
Для оценки состояния протеиназ-ингибиторной системы определяли эластазоподобную активность (ЭПА), трипсиноподобную активность (ТПА), антитриптическую активность (АТА) и активность кислотостабильных ингибиторов протеаз (КСИ) в супернатантах гомогенатов головного мозга, а также в сыворотках крови, полученных из сонных артерий и яремных вен путем их пунктирования. Исследование неспецифических протеиназ и их ингибиторов проводили с использованием энзиматических методов на поверенном спектрофотометре «Biomat 5» (Великобритания).
Для определения ЭПА в термостатированной кювете спектрофотометра «BioMate 5» (Великобритания) смешивали 0,01 мл сыворотки крови с 0,05М раствором натрий-фосфатного буфера (рН=6,5) до конечного объема пробы, равного 2,9 мл; при изучении ЭПА супернатантов гомогенатов головного мозга использовали 0,2 мл изучаемого материала. Пробу выдерживали в течение 5 минут, после чего к ней добавляли 0,1 мл 0,01М раствора синтетического субстрата N-t-BOC-аланил-р-нитрофенилового эфира (БАНФЭ) в ацетонитриле. Прирост оптической плотности измеряли при длине волны, равной 347,5 нм и фиксировали на нулевой и 10 минутах после добавления субстрата, используя также и контрольные растворы.
Определение ТПА проводили по следующей схеме: 0,03 мл сыворотки крови или 0,2 мл супернатанта гомогената головного мозга разводили до 2 мл 0,05М трис-HCl буферного раствора (рН=8,0) и добавляли 1 мл 1,5 мМ синтетического субстрата N-бензоил-L-аргинина этилового эфира (БАЭЭ). Измерения БАЭЭ-эстеразной активности проводили в термостатированной кювете спектрофотометра «BioMate 5» (Великобритания), регистрируя прирост оптической плотности при длине волны, равной 253 нм на нулевой и тридцатой минутах.
1
1
2
Принцип метода измерения активности α-антитрипсина в сыворотке крови основан на торможении расщепления трипсином белковых и низкомолекулярных субстратов N-α-бензоил-L-аргинин-паранитроанилида (БАПНА). В кюветах спектрофотометра готовили опытные и контрольные пробы. Опытные пробы содержали по 0,1 мл разведенной в 50 раз сыворотки крови или 0,2 мл неразведенного супернатанта гомогената, 0,05М трис-HCl буфер (рН=8,0) в количестве 1,8 мл в случае изучения сыворотки крови или 1,7 мл при исследовании супернатантов гомогенатов головного мозга и 0,1 мл раствора трипсина - 10 мкг. Контрольная проба содержала 1,9 мл трис-HCl буфера и 0,1 мл раствора трипсина - 10 мкг. Обе пробы выдерживали в термостатированных кюветах спектрофотометра в течение 5 минут. Затем добавляли в каждую из проб по 1 мл раствора БАЭЭ, быстро перемешивали и измеряли прирост оптической плотности при 253 нм против пробы, содержащей только реактивы. Отсчеты проводили каждую минуту в течение 5 минут (Нартикова В.Ф., Пасхина Т.С. Унифицированный метод определения активности α-антитрипсина и α-макроглобулина в сыворотке (плазме) крови человека. Вопросы медицинской химии. 1979; (4): 494-499).
2
2
Определение уровня КСИ производили по величине антитриптической активности 5%-ного ТХУ-экстракта биологической жидкости. Для выполнения анализа готовили две опытные пробы. Для первой, в кювете спектрофотометра «BioMate 5» (Великобритания) смешивали 0,1-1 мл нейтрализованного 5%-ного ТХУ-экстракта (0,2-1 мг) с 10 мкг трипсина в 0,1 мл 2,5 мМ HCl, содержащем 0,01М CaCl и 0,05М трис-HCl буферный раствор (рН=7,8), добавляемый до конечного объема пробы 2,0 мл; для второй - в кювете спектрофотометра смешивали по 10 мкг трипсина в 0,1 мл 2,5 мМ HCl, содержащем 0,01 М CaCl с 1,9 мл 0,05 М трис-HCl буферного раствора (рН=7,8). Пробы выдерживали в термостатированных кюветах спектрофотометра в течение 5 минут, после чего к ним прибавляли 1 мл 1,5 мМ БАЭЭ в 0,05 М трис-HCl буфере (рН=7,8). Прирост оптической плотности в опытных пробах измеряли при длине волны 253 нм против пробы, делая отсчеты каждую минуту в течение 5 минут.
Активность КСИ в тканях головного мозга изучали после обработки 1 мл супернатантов гомогенатов головного мозга 0,112 мл 50% трихлоруксусной кислоты (ТХУ) и осуществляли экспозицию на водяной бане при температуре 60°С. Пробу охлаждали, проводили нейтрализацию 3Н раствором NaOH. Полученный 5%-ный ТХУ-экстракт центрифугировали при 5000 об/мин. Дальнейшее определение активности КСИ проводили, следуя алгоритму, аналогичному методике определения АТА (Оглобина О.Г. и др. Активность протеиназ гранулоцитов и уровень кислотостабильных ингибиторов протеиназ в бронхоальвеолярном секрете детей с бронхопатиями различной этиологии. Вопросы медицинской химии. 1980; (3): 387-392).
Также оценивали патоморфологические изменения головного мозга методом световой микроскопии. Забор тканей для гистологического исследования производили путем выделения участков головного мозга размером 1×1×0,5 см.
Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием вариационной статистики с вычислением средних величин (М), их стандартными отклонениями (m) и оценкой t-критерия Стьюдента, если распределение отличалось от нормального, то использовали U-критерий Манна-Уитни. Достоверными считали показатели при р<0,05. Данные расчеты выполнялись в среде электронных таблиц Microsoft Office Excel.
Экспериментальное моделирование реперфузионного синдрома позволило провести учет летальности и выживаемости исследуемых животных.
Относительная выживаемость крыс в группах с коррекцией, а также у нелеченых животных 1 и 2 серий составляла 100%. В то же время моделирование 6-часового ишемического периода без коррекции после восстановления кровотока приводило к гибели животных - относительная летальность 10% у нелеченых крыс 3-й серии и 30% у нелеченых крыс 4-й серии.
На основании проведенных экспериментов установлено, что при нелеченом реперфузионном синдроме в сонных артериях активность ферментов протеолиза увеличивалась пропорционально времени ишемического и реперфузионного периода (прирост ЭПА - до 20,0%, ТПА - до 101,8%) по сравнению с интактными крысами. При этом в яремных венах тенденция роста активности протеиназ была более выражена - так, максимальное увеличение ЭПА составляло 59,3%, а ТПА - 223,6%. При введении поливалентного ингибитора протеиназ ЭПА и ТПА в среднем снижались до значений, превышающих контрольные на 14,0% и 47,0% соответственно, а при использовании его сочетания с церебропротектором - до нормальных показателей.
У нелеченых крыс также происходило резкое снижение ингибиторного потенциала сыворотки крови - снижение КСИ до 63,1% по сравнению с контролем.
Использование комбинации Гордокса и Церебролизина сопровождалось снижением КСИ до 14,6%.
Аналогичная тенденция наблюдалась и при исследовании супернатантов гомогенатов головного мозга. Активность ферментов протеолиза в супернатантах гомогенатов головного мозга при нелеченом реперфузионном синдроме была резко повышена (ЭПА - до 250,9%), ТПА - до 84,4%), что в сериях с 6-часов ишемическим периодом сопровождалось снижением активности ингибиторов протеиназ (АТА до - 35,8%, а активность КСИ - до 52,6%).
Использование Гордокса незначительно улучшало исследуемые показатели, в то время как применение его комбинации с Церебролизином приводило к нормализации изучаемых показателей во всех сериях исследования - снижение КСИ до 9,4% по сравнению с контролем.
В таблице 2 представлена сравнительная динамика состояния протеиназ-ингибиторной системы у крыс 4 серии в зависимости от применяемой терапии.
На примере крыс 4-й серии, ишемический период - 6 часов, реперфузионный период - 12 часов, представлена динамика изменения активности ферментов протеолиза ЭПА, ТПА, и их ингибиторов АТА, КСИ, в различных биологических материалах при исследуемых схемах коррекции по отношению к показателям у интактных крыс - контрольная серия.
При применении сочетанной терапии препаратами Гордокс и Церебролизин наблюдается четкая тенденция к нормализации изучаемых показателей.
Проведенный статистический анализ продемонстрировал достоверность полученных данных. Протеолитическое повреждение головного мозга у нелеченых крыс приводило к его морфологическим изменениям, которые заключались в перицеллюлярном и периваскулярном отеке, скоплении микроглиальных клеток вокруг нейронов с пикнотичными ядрами, полнокровии сосудов вещества головного мозга, наличии петехиальных кровоизлияний.
При использовании заявляемого способа сосуды ворсин хориоидного сплетения были умеренно полнокровны с сохранением эпендимальной выстилки. В сером веществе нисслевская зернистость в большинстве нейронов была сохранена, признаки зернистой дистрофии имели лишь единичные клетки. Кроме того, не наблюдались явления перицеллюлярных и периваскулярных отеков.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что применение предложенной схемы профилактики повреждений нервной системы при реперфузионном синдроме в заявляемом способе предупреждает системную активацию протеолиза и повреждение головного мозга, предотвращая гибель экспериментальных животных.