СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИДРОЛИЗАТА СЫВОРОТОЧНЫХ БЕЛКОВ С ВЫСОКОЙ СТЕПЕНЬЮ ГИДРОЛИЗА И ГИДРОЛИЗАТ СЫВОРОТОЧНЫХ БЕЛКОВ С ВЫСОКОЙ СТЕПЕНЬЮ ГИДРОЛИЗА
METHOD OF PRODUCING WHEY PROTEIN HYDROLYSATE WITH HIGH DEGREE OF HYDROLYSIS AND WHEY PROTEIN HYDROLYSATE WITH HIGH DEGREE OF HYDROLYSIS

Изобретение относится к молочной промышленности, в частности к получению очищенных гидролизатов сывороточных белков с высокой степенью гидролиза, используемых при производстве широкого ассортимента гипоаллергенных продуктов питания, в том числе для детей и взрослых, страдающих тяжелыми формами пищевой аллергией.
В зарубежной патентной литературе известны способы получения гидролизатов молочного белка (в том числе сывороточного) с помощью протеаз микробиального (грибкового) происхождения.
Известен способ получения гидролизата молочного (казеина или сывороточного) белка, включающий проведение гидролиза белка, осветление получаемого гидролизата и его сушку (см. US №6589574, НКИ 426/34, 08.07.2003 г.). Гидролиз осуществляют в одну стадию с помощью ферментов из грибков Aspergyllus flavus, A. japonicus, A. niger или А. awamori. Процесс ведут в 10% растворе белка при рН 7,6-8, поддерживая рН добавлением щелочи, при температуре 40°С в течение не более 2 часов. Фермент далее инактивируют нагреванием при 65°С в течение 30 минут, гидролизат осветляют центрифугированием и высушивают распылительной сушкой. По данным авторов степень гидролиза продукта может достигать 45-50%. Недостатками данного метода - аналога заявляемого процесса является следующее:
- в ходе проведения гидролиза обязательным является поддержание значения рН с помощью раствора щелочи. Следствием этого является попадание в продукт дополнительных количеств ионов натрия, которые не могут быть удалены из гидролизата с помощью заявляемых в способе технологических подходов. Это приводит к тому, что данный гидролизат может оказаться непригодным для использования в продуктах детского и специализированного питания (слишком соленый);
- дополнительно необходима стадия относительно длительной термической инактивации фермента, которая может приводить к ухудшению качества продукта (снижению биологической ценности из-за потери части незаменимых аминокислот);
- непосредственно после проведения гидролиза и инактивации ферментов гидролизат сушат без дополнительной очистки. Это приводит к тому, что в состав продукта попадают остаточные количества нерасщепленного белкового субстрата и компоненты ферментных препаратов, которые могут сами по себе обладать аллергенным действием, что ухудшает качество продукта и снижает возможность его использования в гипоаллергенных смесях;
- гидролиз ведут в течение фиксированного времени (до 2 часов), при этом качество получаемого гидролизата не мониторируется. Заявляемая степень гидролиза 40-50% не подтверждена инструментально. Предпочтительно было бы проводить гидролиз под контролем показателя молекулярно-массового распределения и остаточной антигенности.
Известен способ получения гидролизата молочного белка (казеина), включающий проведение гидролиза белка (см. US №6372282, НКИ 426/656, 16.04.2002 г.). В способе используют ферментные препараты Flavourzyme и Sumizyme RTM из Aspergillus orhizae в сочетании с рекомбинантными амино- или карбоксипептидазами для гидролиза в одну стадию казеина. Обработку 10%-ного раствора субстрата ведут при температуре 55°С, рН 5,5, суммарном содержании ферментов до 2% по массе субстрата. Преимуществом данного аналога перед предыдущим является использование ферментного препарата с выраженной экзопептидазной активностью, что позволяет достичь более высокой степени гидролиза. Вместе с тем, предлагаемый способ также имеет недостатки, сопоставимые с вышеизложенным. Это:
- за ходом гидролиза следят по количеству высвобождаемых свободных аминокислот. Данный параметр мало пригоден при получении гидролизатов, предназначенных для использования в гипоаллергенных продуктах, так как а) он ничего не говорит о сохранении в составе гидролизата нерасщепленных антигенных структур белка; б) само по себе высокое содержание свободных аминокислот в гидролизате - это нежелательный эффект, так как при этом увеличивается осмолярность и ухудшается вкус продукта, то есть ухудшается его качество;
- по окончании гидролиза для очистки гидролизата не применяют ультрафильтрацию, вследствие чего конечный продукт загрязняется материалами ферментного препарата, которые могут обладать аллергенными свойствами и, следовательно, ухудшать вкус продукта;
- при проведении процесса используются рекомбинантные (то есть по сути генетически модифицированные) источники ферментных препаратов, не допущенные для использования в пищевой промышленности).
Наиболее близким по техническому решению к заявляемому способу является способ получения ферментативного гидролизата сывороточных белков с высокой степенью гидролиза, предусматривающий ультра и диафильтрацию раствора сывороточных белков, пастеризацию полученного концентрата, его ферментативный гидролиз, ультрафильтрацию полученного неочищенного гидролизата с разделением на фильтрат и концентрат, температурную обработку полученного фильтрата и его сушку (см. US №5112812, НКИ 514/21, 12.05.92 г.). В нем предлагается процесс получения гидролизата белков молочной сыворотки, пригодного для получения детских гипоаллергенных смесей, содержащего преимущественно пептиды с молекулярной массой (мол. м.) до 6 кДа (килодальтон), при этом практически все указанные пептиды имеют молекулярную массу от 2,0 кДа до 2,5 кДа Протеолиз проводят в две стадии. На первой стадии процесса протеолиз 5% раствора сывороточного белка проводят 2% по массе ферментом из Aspergillus orhizae (препарат под фирменным названием Rhozyme 41 PC). Процесс ведут при 50°С и рН 8,0 в режиме рН-статирования (добавление NaOH) до достижения степени гидролиза 9%. После этого смесь подвергают ультрафильтрации через мембрану 6 кДа и ретентат (составляющий 55-60% всего белка по массе) повторно гидролизуют с использованием бактериальной протеазы Alkalase (жидкий препарат) в количестве 0,5% по объему смеси. Гидролиз ведут при рН 7,5 и температуре 50°С до достижения степени гидролиза 12%, после чего проводят ультрафильтрацию. Окончательный выход белкового азота в фильтрат (пермеат) составляет 75-80%.
Недостатками данного способа является следующее:
- необходимость рН-статирования приводит к поступлению в конечный продукт дополнительных количеств ионов натрия, которые не могут быть удалены из гидролизата в рамках заявляемого технологического процесса. В результате гидролизат становится очень соленым и его использование в составе детских смесей затрудняется. В совокупности данный фактор приводит к ухудшению органолептических свойств, а значит и качества гидролизата;
- заявляемый процесс приводит к образованию больших количеств свободных аминокислот, которые поступают в конечный продукт и не могут быть удалены из гидролизата в рамках заявляемого технологического процесса. Следствием этого является снижение биологической ценности гидролизата, ухудшение его вкуса, увеличение его осмолярности и, следовательно, ухудшение его качества;
- в то же время антигенность гидролизата, получаемого в рамках данного способа и содержащего пептиды в основном с молекулярной массой 2-2,5 кДа, недостаточно низка для использования его для больных с тяжелыми формами пищевой аллергии;
- использование заявляемой двухстадийной схемы протеолиза усложняет процесс и, следовательно, удорожает продукт;
- в ходе проведения гидролиза не проводится контроль молекулярно-массового распределения и остаточной антигенности, то есть ключевых параметров, достоверно определяющих качество продукта.
Наиболее близким по техническому решению к заявляемому гидролизату с высокой степенью гидролиза является гипоаллергенная и практически безлактозная композиция, содержащая пептиды, которые образуются в результате гидролиза практически свободной от казеинов (молочной) сыворотки, в котором указанная композиция является практически безлактозной, и пептиды, образующиеся из сыворотки, имеют максимальную молекулярную массу около 6000 Дальтон, причем практически все указанные пептиды имеют молекулярную массу между 2000 и 2500 Дальтон (см. US №5112812, НКИ 514/21, 12.05.92 г.). Данная композиция получена согласно вышеописанному способу-прототипу и относится к гидролизатам с высокой степенью гидролиза.
Недостатком данного гидролизата является недостаточно низкая антигенность, не позволяющая использовать его в продуктах для больных с тяжелыми формами пищевой аллергии (к белку коровьего молока).
Как было сказано ранее, необходимость рН-статирования приводит к поступлению в гидролизат дополнительных количеств ионов натрия, которые не могут быть удалены из него в рамках заявляемого технологического процесса. В результате гидролизат становится очень соленым и его использование в составе детских смесей затрудняется. Данный гидролизат характеризуется как практически безлактозный. Но в случаях с тяжелыми формами лактазной недостаточности использование его в детских смесях нежелательно.
В совокупности все вышесказанное приводит к снижению биологической, пищевой ценности, органолептических свойств и качества описанного гидролизата.
Технический результат заявляемого изобретения на способ получения гидролизата сывороточных белков с высокой степенью гидролиза заключается в повышении биологической, пищевой ценности, органолептических свойств и качества получаемого гидролизата с высокой степенью гидролиза с возможностью его использования в гипоаллергенных смесях функционального назначения.
Технический результат достигается тем, что в способе получения ферментативного гидролизата сывороточных белков с высокой степенью гидролиза, предусматривающем ультра и диафильтрацию раствора сывороточных белков, пастеризацию полученного раствора концентрата сывороточных белков, его ферментативный гидролиз, ультрафильтрацию полученного неочищенного гидролизата с разделением на фильтрат и концентрат гидролизата, температурную обработку полученного фильтрата и его сушку, в качестве раствора сывороточных белков используют раствор, приготовленный из сухого концентрата сывороточных белков, а на ферментативный гидролиз подают раствор концентрата сывороточных белков после ультра и диафильтрации, доведенный до массовой доли сухих веществ 4,8-5,0%, причем гидролиз ведут при фермент-субстратном соотношении 5%, ультрафильтрацию неочищенного гидролизата осуществляют на мембранах с пропускной способностью по мол. м. 5 кДа и 2 кДа, при постоянном возврате получаемого концентрата на ультрафильтрацию, после чего полученный фильтрат дополнительно очищают ультрафильтрацией на мембранах с пропускной способностью по мол. м. 5 кДа и 2 кДа, при постоянном возврате получаемого концентрата на ультрафильтрацию, и полученный фильтрат второго прогона, содержащий очищенный гидролизат, перед температурной обработкой концентрируют обратным осмосом до массовой доли сухих веществ 10-15%, затем сгущают до массовой доли сухих веществ 43-45%, а в качестве температурной обработки применяют пастеризацию.
Заявляемый технический результат достигается в результате сочетания следующих факторов:
Экспериментально было установлено, что проведение ферментативного гидролиза раствора концентрата сывороточных белков с массовой долей сухих веществ 4-5% при фермент-субстратном соотношении 5% позволяет получить в рамках заявляемого способа гидролизат с более высокой степенью расщепления белкового компонента, соответственно с более низкой антигенностью, а значит с повышенной биологической и пищевой ценностью.
При снижении фермент-субстратного соотношения ниже 5% снижается глубина гидролиза и неприемлемо возрастают потери белкового субстрата при последующей ультрафильтрации. При увеличении фермент-субстратного соотношения выше 5% увеличивается накопление в гидролизате свободных аминокислот, повышающих осмолярность продукта и ухудшающих его вкус, что приводит к снижению органолептических свойств и качества гидролизата. Кроме того, при этом неприемлемо увеличивается расход ферментного препарата, что приводит к удорожанию продукта.
Экспериментально было установлено, что ультрафильтрация неочищенного гидролизата на мембранах с пропускной способностью по мол. м. 5 кДа и 2 кДа при многократном возврате получаемого концентрата неочищенного гидролизата на ультрафильтрацию и дополнительная ультрафильтрация фильтрата неочищенного гидролизата на мембранах с пропускной способностью по мол. м. 5 кДа и 2 кДа при многократном возврате получаемого концентрата на ультрафильтрацию позволяет добиться максимальной очистки получаемого гидролизата при его максимальном выходе от исходного количества белкового субстрата. Если возврат гидролизата на повторную ультрафильтрацию не проводить, то получаем гидролизат более низкого качества с недостаточно низкой антигенностью.
Применяемая схема двухступенчатой ультрафильтрации 5 и 2 кДа более селективна, чем использованная в прототипе ультрафильтрация через мембраны 6 кДа, что приводит к лучшей очистке гидролизата от антигенных структур и следовательно улучшает качество продукта. Применение мембран с пропускной способностью ниже 2 кДа приводит к снижению выхода готового продукта и к увеличению в нем массовой доли свободных аминокислот, то есть, соответственно, к удорожанию продукта и снижению его качества. Применение мембран с пропускной способностью более 5 кДа приводит к неприемлемому возрастанию остаточной антигенности продукта, что делает невозможным его использование в гипоаллергенных смесях.
Достоинством заявляемого способа в сравнении с прототипом является отсутствие необходимости рН-статирования, так как благодаря оптимально подобранной технологии снижение рН в процессе гидролиза, обусловленное высвобождением свободных аминокислот, идет до значений не ниже рН 6,0±0,2, что отвечает оптимуму рН применяемого ферментного препарата. Применяемый ферментный препарат «Флавозим» (Flavourzyme) обладает высокой комплексной как экзо-, так и эндопептидазной активностью, что позволяет провести глубокий гидролиз белка в одну стадию. При этом не требуется поддержания постоянного рН (рН-статирования) путем постоянного добавления щелочи, то есть в конечный продукт поступает значительно меньше солей, чем в прототипе, что улучает органолептические свойства получаемого гидролизата, а значит и его качество. Специфичность применяемого в заявляемом способе ферментного препарата такова, что при его действии на субстрат образуется относительно меньшее количество свободных ароматических аминокислот и их коротких пептидов, обладающих горьким вкусом. Вследствие чего вкусовые качества получаемого продукта улучшаются.
Проведение пастеризации необходимо для обеспечения микробиологических показателей продукта, удовлетворяющих гигиеническим требованиям согласно СанПиН 2.3.2.1078-01, п.3.3.5. При уменьшении времени и (или) температуры пастеризации ниже предлагаемых значений возрастает риск развития в продукте микроорганизмов, что приводит к ухудшению качества и безопасности продукта. При увеличении температуры и (или) времени пастеризации сверх предлагаемых значений возрастают потери незаменимых аминокислот, что приводит к снижению биологической ценности и, следовательно, качества продукта. При этом также увеличивается образование побочных нежелательных примесей, обусловленных реакциями свободных аминокислот в продукте между собой и с остаточными количествами лактозы, включая соединения Майара, меланоидины, продукты карамелизации. Эти примеси придают продукту нежелательную окраску, то есть ухудшают его качество.
Проведение обратного осмоса позволяет сконцентрировать продукт перед распылительной сушкой до приемлемых концентраций. Если обратный осмос не проводить, то на сушку подавался бы слишком разбавленный раствор (с большим содержанием воды), что резко замедляло бы процесс сушки, повышало его энергоемкость, удорожало продукт и приводило к ухудшению его растворимости, то есть качества продукта.
Заявляемый способ позволяет получить безлактозный гидролизат (а в прототипе - практически безлактозный). Это достигается тем, что в качестве раствора сывороточных белков используют раствор, приготовленный из сухого концентрата сывороточных белков.
В отличие от прототипа в заявляемом изобретении степень удаления (элиминации) нерасщепленного белка и антигенных структур из продукта контролируется более чувствительными и специфичными методами эксклюзионной жидкостной хроматографии высокого давления и иммуноферментного анализа, которые адекватны поставленной задаче. Это позволяет гарантированно получить продукт более высокого качества, с меньшим содержанием нерасщепленных белков и аллергенов, по сравнению со способом прототипа, где данные методы контроля не применяются.
Заявляемая совокупность признаков заявляемого способа позволяет получить ферментативный гидролизат сывороточных белков с высокой степенью гидролиза с повышенной биологической и пищевой ценностью, улучшенным качеством и органолептическими свойствами. Это дает возможность его использования в гипоаллергенных смесях для больных с тяжелыми формами пищевой аллергии.
Отклонение от заявляемых признаков в большую или меньшую сторону приводит к снижению пищевой и биологической ценности получаемого гидролизата, ухудшению его качества и органолептических свойств.
Технический результат заявляемого изобретения на гидролизат с высокой степенью гидролиза, полученного заявляемым способом, заключается также в повышении биологической, пищевой ценности, органолептических свойств и качества получаемого гидролизата с возможностью его использования в гипоаллергенных смесях функционального назначения.
-5
Технический результат достигается тем, что в гидролизате с высокой степенью гидролиза, более 75% белкового материала сосредоточено во фракции низкомолекулярных пептидов в диапазоне молекулярных масс 0,5-2 кДа, содержание пептидов с диапазоном молекулярных масс 2-4,5 кДа не превосходит 18%, содержание пептидов с молекулярной массой более 4,5 кДа не превышает 7%, а остаточная антигенность белков коровьего молока не превышает 1·10 по массе белкового компонента. Заявляемый гидролизат получен заявляемым способом.
Заявляемый технический результат достигается в результате сочетания следующих факторов:
-5
- в заявляемом ферментативном гидролизате более 75% белкового материала сосредоточено во фракции низкомолекулярных пептидов в диапазоне молекулярных масс 0,5-2 кДа, что позволяет достичь более низкой остаточной антигенности (в сравнении с прототипом), не превышающей 1-10 по массе белкового компонента. Благодаря этому гидролизат в качестве белкового компонента может быть использован для получения продуктов для лечебного питания детей и взрослых, с тяжелыми формами пищевой аллергии и непереносимости белков коровьего молока;
- благодаря проведению гидролиза без рН-статирования заявляемый гидролизат содержит меньшее количество солей, что улучшает его вкусовые характеристики в сравнении с прототипом и благоприятствует для его использования в составе детских смесей;
- заявляемый гидролизат безлактозный и может быть использован в детских смесях для больных с тяжелыми формами лактазной недостаточности;
Все вышесказанное доказывает в сравнении с прототипом повышенные биологическую и пищевую ценность, органолептические свойства, качество заявляемого гидролизата.
Способ получения ферментативного гидролизата сывороточных белков с высокой степенью гидролиза осуществляют следующим образом.
Для производства гидролизата сывороточных белков с высокой степенью гидролиза сухой концентрат сывороточных белков (КСБ) растворяют в режиме непрерывной циркуляции в питьевой воде с температурой 43÷47°С до получения раствора с массовой долей сухих веществ 2÷3%.
Полученный раствор концентрата сывороточных белков (раствор сывороточных белков КСБ) охлаждают до температуры 6÷8°С и оставляют набухать в течение 3÷3,5 часов при постоянном перемешивании. Затем определяют группу чистоты. Если раствор необходимо очистить, его подогревают до температуры 38÷42°С и очищают на кларификаторе. Раствор сывороточных белков КСБ пастеризуют при температуре 70-74°С с выдержкой 14÷18 с, охлаждают до температуры 50÷55°С и отправляют на ультра- и диафильтрацию для полного удаления лактозы.
Ультра- и диафильтрацию полученного раствора сывороточных белков КСБ проводят на ультрафильтрационной установке с пропускной способностью мембран по молекулярной массе (мол. м.) 20 кДа (килодальтон) при температуре 48÷52°С, рН 6,5÷7,0 и давлении 1,5÷6 бар с получением концентрата, содержащего высокомолекулярную фракцию КСБ (ВМФ КСБ), и фильтрата, содержащего низкомолекулярную фракцию КСБ-лактозу.
Ультрафильтрационное концентрирование раствора сывороточных белков КСБ ведут до содержания сухих веществ в получаемом концентрате 17÷20%. Для увеличения выхода ВМФ КСБ в процессе ультрафильтрации в установку подают диафильтрационную воду с температурой 48÷52°С. Процесс диафильтрации считают законченным при массовой доле сухих веществ в фильтрате 0%. При достижении содержания сухих веществ в концентрате КСБ 17÷20% последний отправляют в танк ферментации, в котором концентрат разбавляют технологической водой до массовой доли сухих веществ 4,8÷5,0%.
Полученный раствор пастеризуют при температуре 70÷74°С с выдержкой 14÷18 с и охлаждают до температуры 50÷52°С.
Для получения гидролизата сывороточного белка с глубокой степенью гидролиза используют промышленный фементный препарат «Флавозим 500 МГ» (Flavozyme 500 MG) фирмы Novozymes (Дания).
Фермент предварительно растворяют в питьевой воде с температурой 35÷45°С до образования раствора с массовой долей сухих веществ 9÷10% при фермент-субстратном соотношении 5% (5% от массовой доли белка в КСБ) и вносят при постоянном перемешивании в подготовленный к ферментативному гидролизу 4,8÷5,0% раствор концентрата КСБ. Ферментативный гидролиз проводят при температуре 48÷52°С и постоянном перемешивании. Фермент-субстратное соотношение составляет 5% на сухой белок, рН в процессе гидролиза снижается со значения 6,8÷7,2 до 5,8÷6,2 благодаря высвобождению свободных аминокислот.
-3
Продолжительность гидролиза 16÷22 часа (до тех пор, пока распределение пептидов по молекулярным массам не перестает изменяться, а массовая доля антигенов молочной сыворотки в белковом компоненте продукта становится меньшей 10).
Полученный неочищеный гидролизат сывороточных белков (ГСБ) направляют на ультрафильтрацию, которую проводят на установке с пропускной способностью мембран 5 кДа и 2 кДа с получением концентрата, содержащего высокомолекулярную фракцию ГСБ (ВМФ ГСБ), и фильтрата, содержащего низкомолекулярную фракцию ГСБ (НМФ ГСБ).
Для увеличения выхода низкомолекулярной фракции ГСБ получаемый концентрат ГСБ возвращают на ультрафильтрацию на мембранах 5 кДа и 2 кДа, предварительно смешивая с неочищенным гидролизатом.
Для увеличения выхода низкомолекулярной фракции ГСБ, содержащейся в фильтрате, в конце процесса ультрафильтрации в концентрат добавляют умягченную технологическую воду.
Подачу концентрата ГСБ на ультрафильтрацию прекращают при достижении так называемого «мертвого объема» высокомолекулярной фракции концентрата (концентрат становится желеобразной массой, не разбавляемой водой).
Для обеспечения более полной очистки гидролизата от крупных пептидов, обладающих повышенной антигенностью, полученный фильтрат первого прогона дополнительно подают на установку ультрафильтрации с пропускной способностью мембран 5 и 2 кДа с разделением на фильтрат и концентрат второго прогона. Для увеличения выхода низкомолекулярной фракции получаемый концентрат второго прогона возвращают на ультрафильрацию через мембраны 5 и 2 кДа, смешивая с фильтратом первого прогона.
Полученный фильтрат второго прогона, содержащий низкомолекулярную фракцию ГСБ - очищенный гидролизат, направляют на установку обратного осмоса (ОО) для предварительного сгущения - концентрирования. Давление на выходе из установки ОО 35÷40 бар, температура концентрируемого раствора 30÷35°С.
Фильтрат второго прогона, содержащий очищенный гидролизат, концентрируют на установке ОО до содержания сухих веществ в получаемом концентрате 10-15%.
Фильтрат, полученный при сгущении на установке ОО, отправляют в дренаж, концентрат, содержащий очищенный гидролизат, именуемый в дальнейшем «гидролизат», - в емкость хранения концентрата.
Затем сгущение концентрата с ОО, содержащего очищенный гидролизат, продолжают на вакуум-выпарной установке до массовой доли сухих веществ 43÷45%.
Сгущенный гидролизат пастеризуют, например, при температуре 76÷80°С с выдержкой 45÷75 с и направляют на сушку, которую осуществляют на распылительной сушилке при следующих режимах:
- температура воздуха на входе в сушильную башню - 170÷180°С
- температура воздуха на выходе из сушильной башни - 75÷85°С.
Массовая доля сухих веществ в конечном продукте 95%.
В процессе сушки гидролизат поступает в инстантайзер, где порошок охлаждается, собирается в контейнеры (биг-беги) и направляется на промежуточное хранение, где может храниться не более 10 месяцев. Выход продукта составляет 60-65%.
Пример 1
Сухой концентрат сывороточных белков в количестве 2202 кг растворяют в режиме непрерывной циркуляции в питьевой воде с температурой 45°С до получения раствора с массовой долей сухих веществ (СВ) 2,5% (рН раствора 6,91 ед). Полученный раствор охлаждают до температуры 8°С и оставляют набухать в течение 3,5 часов при постоянном перемешивании, затем раствор пастеризуют при температуре 72°С с выдержкой 16 с, охлаждают до температуры 52°С и направляют на ультра- и диафильтрацию.
Ультра- и диафильтрацию проводят на ультрафильтрационой установке с полисульфоновыми мембранами UF DHT 20-63 38/3 0FF, пропускная способность которых 20 кД по молекулярной массе. Раствор сывороточных белков разделяют на концентрат, содержащий ВМФ КСБ, и фильтрат, содержащий НМФ КСБ (лактозу).
Для увеличения выхода ВМФ КСБ в процессе ультрафильтрационной обработки в установку подают диафильтрационную воду, подогретую до температуры 50°С. Поток диафильтрационной воды составляет около 1500 л/час. Фильтрат в процессе УФ-обработки отправляют в дренаж. Остатки НМФ и ВМФ из установки проталкивают технологической водой до содержания сухих веществ в фильтрате и концентрате 0,01%.
Получают 10951 л концентрата с массовой долей сухих веществ 18,5% и рН 6,8 ед, который затем разбавляют технологической водой до содержания сухих веществ в растворе 5%, пастеризуют при температуре 72°С с выдержкой 16 с и охлаждают до температуры гидролиза 52°С.
Ферментативный гидролиз полученного 5% раствора ВМФ КСБ (40520 л) ведут с использованием промышленного ферментного препарата «Флавозим 500 МГ» («Flavozyme 500 MG») фирмы Novozymes (Дания), полученного из штамма Aspergillus oryzae (при фермент-субстратном соотношении 5% (5% от массы сухого белка в КСБ - 88 кг) в течение 20 часов.
Ферментный препарат предварительно растворяют в 792 л питьевой холодной воды до получения раствора с массовой долей сухих веществ 10%, который при постоянном перемешивании вносят в вышеприготовленный раствор ВМФ КСБ. Ферментативный гидролиз ведут при температуре 52°С при постоянном контроле за температурой в течение 20 часов без рН-статирования..
После 10 и 20 часов гидролиза отбирают пробы неочищенного гидролизата (проба 1 и проба 2 соответственно) и исследуют методом эксклюзионной хроматографии высокого давления (определение массово-молекулярного распределения). Данные представлены втаблице 1.
На фиг.1 и фиг.2 представлены хроматограммы неочищенного гидролизата после 10 и 20 часов соответственно. Ось ординат - оптические плотности при длине волны 280 нм (относительные единицы), ось абцисс - молекулярные массы (кДальтоны). Массовую долю антигенов молочной сыворотки проб 1 и 2 определяют методом торможения непрямого твердофазного иммуноферментного анализа (см. таблицу 2). Показатель рН в пробах 1 и 2 составил 5,86 и 5,82 ед. соответственно.
По окончании гидролиза полученный неочищенный гидролизат направляют на ультрафильтрацию на полисульфоновых мембранах с пропускной способностью 5 и 2 кД, подключенных параллельно (используют мембраны UF AES5-B-6338S/30&UF АЕ10-В-6338/30). Гидролизат разделяют на концентрат, содержащий ВМФ, и фильтрат, содержащий НМФ.
Для увеличения выхода НМФ в конце процесса ультрафильтрации в концентрат подают умягченную технологическую воду, подогретую до 50°С. Остатки НМФ из установки проталкивают водой до содержания СВ в фильтрате 0,001%. Получают 38089 л фильтрата первого прогона с содержанием сухих веществ 5%. Отбирают пробу, в которой методом эксклюзионной хроматографии высокого давления определяют массово-молекулярное распределение пептидов по фракциям (проба 3). Данные представлены в таблице 1. На фиг.3 приведена эксклюзионная хроматограмма пробы 3. Определение остаточной антигенности пробы 3 проводят методом торможения непрямого твердофазного анализа. Данные представлены в таблице 2.
Получаемую ВМФ в процессе фильтрации постоянно возвращают в емкость с неочищенным гидролизатом, где ВМФ перемешивается с последним и подается на ультрафильтрацию (для оптимизации процесса и увеличения выхода НМФ), а по окончании очистки - отправляют в дренаж.
Фильтрат первого прогона дополнительно пропускают через установку ультрафильтрации с пропускной способностью мембран 5 и 2 кДа с разделением на фильтрат и концентрат второго прогона. Это позволяет обеспечить более полную очистку гидролизата от крупных пептидов, обладающих повышенной антигенностью.
Для увеличения выхода НМФ в конце процесса ультрафильтрации в концентрат второго прогона подают умягченную технологическую воду, подогретую до 50°С. Остатки НМФ из установки проталкивают водой до содержания СВ в фильтрате 0,001%. Получают около 32760 л фильтрата второго прогона с содержанием сухих веществ 5%. Отбирают пробу, в которой методом эксклюзионной хроматографии высокого давления определяют массово-молекулярное распределение пептидов по фракциям (проба 4). Данные представлены в таблице 1. На фиг.4 приведена эксклюзионная хроматограмма пробы 4. Массовую долю антигенов молочной сыворотки пробы 4 определяют методом торможения непрямого твердофазного анализа. Данные представлены в таблице 2. Показатель рН пробы 4 - 5,95 ед.
Для увеличения выхода НМФ в процессе ультрафильтрации получаемый концентрат (ВМФ) второго прогона по ходу процесса возвращают в танк с фильтратом после первого прогона, где концентрат второго прогона смешивают с фильтратом первого прогона и подают на ультрафильтрацию. По окончании процесса концентрат второго прогона остается в УФ-установке и затем смывается моющим раствором.
Фильтрат второго прогона, содержащий очищенный гидролизат, направляют на установку обратного осмоса для предварительного сгущения. Режимы сгущения: давление на выходе из установки 36 бар, температура концентрируемого раствора 30°С. Используют полисульфоновые мембраны типа 40-RO-SF384 ОС с пропускной способностью мембран 1 кДа.
Фильтрат второго прогона концентрируют до содержания сухих веществ в концентрате, сходящего с установки ОО 15%. Фильтрат с ОО отправляют в дренаж. Концентрат, именуемый в дальнейшем «гидролизат», охлаждают до температуры 4°С, собирают в промежуточную емкость для последующего сгущения. Остатки концентрата из установки проталкивают технологической водой до содержания сухих веществ 0%. Получают 10265 л гидролизата с массовой долей сухих веществ 15%.
Последующее сгущение осуществляют на вакуум-выперной установке до содержания сухих веществ в гидролизате 44%. Сгущеную смесь пастеризуют при температуре 78°С с выдержкой 60 сек и направляют на сушильную установку.
Сгущеный гидролизат высушивают на распылительной сушилке при следующих режимах: температура воздуха на входе в сушильную башню 176°С, температура воздуха на выходе из сушильной башни 85°С.
Получают 1431 кг гидролизата с содержанием сухих веществ 96,5%. Выход гидролизата составляет 64,9%.
Полученный гидролизат исследуют на содержание сухих веществ, общий азот, молекулярно-массовое распределение (ММР), остаточную антигенность, осмолярность, золу, активную кислотность (проба 5). Данные по ММР представлены в таблице 1, массовая доля антигенов молочной сыворотки - в таблице 2, остальные характеристики гидролизата представлены в таблице 3. На фиг.5 приведена эксклюзионная хроматограмма пробы 5.
Таблица 1
№
Диапазон молекулярных масс, кДа
Содержание фракции (весовое интегрирование хроматограммы), %
Проба 1
Проба 2
Проба 3
Проба 4
Проба 5
1
Более 275
6,9
4,1
0
0
0
2
275-126
0,9
0,5
0
0
0
3
126-72,4
0,8
0,9
0
0
0
4
72,4-22,4
8,8
5,5
0
0
0
5
22,4-10,2
1,8
1,7
0
0
0
6
10,2-4,5
14,4
8,4
5,1
4,9
6,1
7
4,5-1,7
12,7
12,4
12,2
13,3
13,5
8
Менее 1,7
53,6
66,5
82,7
81,8
80,4
Таблица 2
№
Наименование пробы
Массовая доля антигенов молочной сыворотки в белковом компоненте продукта
Кратность снижения антигенности в сравнении с нерасщепленным белком молочный сыворотки, раз
1
Проба 1
1,6·10<sup>-3</sup>
600
2
Проба 2
1,7·10<sup>-4</sup>
5800
3
Проба 3
1,0·10<sup>-5</sup>
96000
4
Проба 4
9,0·10<sup>-7</sup>
1200000
5
Проба 5
1·10<sup>-7</sup>
1000000
Таблица 3
№
Наименование характеристики гидролизата
Значение характеристики
1
Общий азот, %
12,3
2
Содержание сухих веществ, %
96,5
3
Зола, %
5,2
4
Активная кислотность, ед. рН
5,84-6,72
5
Осмолярность, мОсм/кг H<sub>2</sub>O
до 700
Как видно из таблицы 1 в гидролизате максимальное содержание пептидов сосредоточено в диапазоне молекулярных масс менее 1,7 кДа, что характеризует данный продукт как гидролизат с высокой степенью гидролиза. Анализ остаточной антигенности данного гидролизата показал снижение антигенности в 1000000 раз (таблица 2), что позволяет использовать его в составе гипоаллергенных продуктов лечебной направленности. Гидролизат растворяется в теплой питьевой воде с образованием мутного раствора с небольшим количеством осадка (до 40% по массе сухих веществ). Запах и вкус - специфический, консистенция - мелкий порошок, цвет - кремовый.
Пример 2. Процесс проводят аналогично примеру 1, только содержание сухих веществ в исходном растворе сывороточных белков составляет 2%, а после ультра- и диафильтрации на установке с пропускной способностью мембран по молекулярной массе 20 кДа получают концентрат с массовой долей сухих веществ 20% и на ферментативный гидролиз подают концентрат сывороточных белков с массовой долей сухих веществ 4,8%. Концентрирование фильтрата второго прогона на установке обратного осмоса ведут до содержания сухих веществ в концентрате 12%. Получают 1365 кг гидролизата с содержанием сухих веществ 97,0%. Молекулярно-массовое распределение полученного сухого гидролизата приведено в таблице 4.
Таблица 4
№
Диапазон молекулярных масс, кДа
Содержание фракции (весовое интегрирование хроматограммы), %
1
10,2-4,5
6,0
2
4,5-1,7
16,0
3
Менее 1,7
78,0
-6
Остаточная антигенность сухого продукта составила 7,5-10 по массе белка, что позволяет применять гидролизат для создания заменителей женского молока для лечебного питания детей с тяжелыми формами пищевых аллергий. Азот - 12,4%, зола - 3,2%. Выход гидролизата 62%.
Пример 3. Процесс проводят аналогично примеру 1, только содержание сухих веществ в исходном растворе сывороточных белков составляет 3%, а после ультра- и диафильтрации на установке с пропускной способностью мембран по молекулярной массе 20 кДа получают концентрат с массовой долей сухих веществ 17%, на ферментативный гидролиз подают концентрат сывороточных белков с массовой долей сухих веществ 4,9%. Концентрированно фильтрата второго прогона на установке обратного осмоса ведут до содержания сухих веществ в концентрате 15%. Последующее сгущение проводят до содержания сухих веществ в гидролизате 45%.
Получают 1390 кг гидролизата с содержанием сухих веществ 97,0%. Выход гидролизата 63%. Молекулярно-массовое распределение полученного сухого гидролизата приведено в таблице 5.
Таблица 5
№
Диапазон молекулярных масс, кДа
Содержание фракции (весовое интегрирование хроматограммы), %
1
10,2-4,5
5,5
2
4,5-1,7
12,5
3
Менее 1,7
81,0
-7
Остаточная антигенность сухого продукта составила 2·10 по массе белка, что позволяет применять гидролизат в качестве белкового компонента ЗЖМ для лечебного питания детей с тяжелыми формами пищевых аллергий. Азот - 12,3%, зола - 4,3%.
-5
Пример 4. Процесс осуществляют аналогично примеру 1, только фермент-субстратное соотношение составляет 4,5% от массы белка. Остаточная антигенность полученного продукта составила 5·10 по массе белка, данный показатель остаточной антигенности характерен для гидролизатов со средней степенью гидролиза, а значит, вышеизложенный режим проведения гидролиза следует признать непригодным.
-5
Пример 5. Процесс осуществляют аналогично примеру 2, только процесс очищения гидролизата после протеолиза на мембранах с пропускной способностью 2 и 5 кД ведут в одну стадию. Получают 1000 кг сухого гидролизата с остаточной антигенностью 2,8·10 по массе белка. Данный гидролизат недостаточно очищен, с более высокой антигенностью, что не позволяет использовать его в лечебных целях больными с тяжелой формой пищевой аллергшии.
Заявляемый способ позволяет получить безлактозный ферментативный гидролизат с высокой степенью гидролиза, который можно использовать при проектировании продуктов для детей первого года и старше с пищевой аллергией различной этиологии, с синдромом мальабсорбции, лактазной недостаточности, галактоземией, гипотрофией II-III степеней, а также в послеоперационный период при операциях на кишечнике.
Заявляемый способ позволяет получить гидролизат с низкой антигенностью, но более низкой осмолярностью и лучшим вкусом, чем смесь аминокислот.
Заявляемый гидролизат содержит минимально возможное количество неорганических солей (в процессе гидролиза неорганические соли не вносятся, так как не требуется поддержание оптимума рН при данных условиях проведения гидролиза).
Полученный гидролизат (вследствие низкого содержания неорганических солей) оптимально подходит для дальнейшей нанообработки, если ставится задача получения продукта с улучшенными органолептическими свойствами и пептидно-аминокислотной смеси с еще более низкой остаточной антигенностью.
Использование одного ферментного препарата значительно упрощает и удешевляет производственный процесс.