Усиление эффективности кандидатной вакцины против гриппа сочетанием консервативных последовательностей гемагглютинина и м2 белка

Усиление эффективности кандидатной вакцины против гриппа сочетанием консервативных последовательностей гемагглютинина и М2 белка

Л. М. Цыбалова1 (sovet@influenza.spb.ru), Л.А. Степанова1, Р.Ю. Котляров2, Е. А. Блохина2, М.А. Шуклина1, Е.С. Марданова2, А. В. Коротков1, М. В. Потапчук1, Н. В. Равин2

1 ФГБУ «НИИ гриппа» Минздрава России, Санкт-Петербург

2 ФГУ «ФИЦ «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН, Москва

Резюме

Разработка универсальной вакцины против гриппа - вакцины, направленной на все субтипы вирусов гриппа человека, - является наиболее актуальной современной задачей в специфической профилактике гриппа. В настоящей статье дана сравнительная характеристика специфической активности нескольких вариантов рекомбинантного вакцинного белка, включающего антигенные детерминанты вируса гриппа - эктодомен белка М2 (М2е) и фрагмент второй субъединицы гемагглютинина (аминокислотная последовательность 76 -130). В качестве белка-носителя и адъюванта был выбран флагеллин - белок Salmonella typhlmurlum как полноразмерный, так и с делетированной гипервариабельной частью.

На экспериментальных животных показана высокая иммуногенность препаратов и способность предотвращать летальность при инфицированнии вирусом гриппа. Наибольшей протективностью обладал гибридный белок Flg-HA2-4M2 - полноразмерный флагеллин с НА2 (76 - 130) и М2е на С-конце. Препарат обеспечивал 100% выживаемость при заражении высокой дозой вируса гриппа A(H3N2) - 10 LD50. Белки, содержащие только полноразмерный флагеллин с М2е или укороченную форму флагеллина с М2е на С-конце и с НА2 в гипервариабельном участке, защищали 75% животных от летальной инфекции. Белок Flg-HA2-4M2 перспективен для дальнейшего исследования в качестве вакцины. Ключевые слова: грипп, вакцинация, рекомбинантный белок, иммуногенность, протективность

Strengthening the Effectiveness of the Candidate Influenza Vaccine by Combining Conserved Sequences of Hemagglutinin and M2 protein

L.M. Tsybalova1 (sovet@lnfluenza.spb.ru), L.A. Stepanova1, R.Yu. Kotlyarov2, E.A. Blokhlna2, M.A. Shukllna1, E.S. Mardanova2, A.V. Korotkov1, M.V. Potapchuk1, N.V. Ravln2

1 Federal State Budget Instltutlon Research «Instltute of Influenza»of the Mlnlstry of Healthcare of the Russlan Federation, St. Petersburg

2 Federal State Instltutlon «The Federal Research Centre «Fundamentals of Blotechnology» of the Russlan Academy of Sclences, Moscow Abstract

The development of unlversal lnfluenza vacclne - a vacclne dlrected to all subtypes of human lnfluenza A vlruses - ls the really actual problem task. Thls paper presents the comparatlve characterlstlc of the speclflc actlvlty of varlous recombinant protelns conslstlng of antlgenlc determlnants of lnfluenza A vlrus - the ectodomaln of the M2 proteln (M2e) and a fragment of the second subunlt of the hemagglutlnln (the amlno acld sequence 76 - 130). Flagellln - Salmonella typhlmurlum proteln was used as carrler proteln and as adjuvant. We use two forms of flagellln: full slze and wlth deleted hypervarlable reglon. The protelns showed hlgh lmmunogenlclty, and the ablllty to prevent lethal lnfectlon of lnfluenza vlrus ln mlce. Full-length flagellln wlth HA2 (76 - 130) and M2e on the C-termlnus (proteln Flg-HA2-4M2e) demonstrated the most protectlve propertles. It provldes 100% survlval lmmunlzed mlce that were challenge wlth a hlgh dose of lnfluenza A (H3N2) - 10 LD50. Protelns contalnlng only full slzed flagellln wlth M2e or flagellln truncated form wlth M2e at the C-termlnus and HA2 wlthln the hypervarlable reglon, protected 75% of anlmals from lethal lnfectlon. Proteln Flg-HA2-4M2e ls promlslng for further study as a vacclne.

Key words: lnfluenza, vacclnatlon, recombinant proteln, lmmunogenlclty, protectlon

Введение

Главная задача в области профилактики гриппа в настоящее время заключается в создании вакцин, эффективных против широкого круга вирусов. Преимущество такого рода универсальных вакцин над традиционными очевидно: отсутствует необходимость в ежегодном получении новых реассортан-тов и обновлении штаммового состава вакцин; исключаются случаи несоответствия циркулирующих в конкретном сезоне вирусов и вирусов, вошедших

в состав вакцин; исключается отставание в наработке нужного количества вакцин от скорости распространения нового вируса; не требуется ежегодная вакцинация населения.

Постановка задачи создания универсальных вакцин стала возможной благодаря появлению ДНК рекомбинантных технологий. Они позволили перейти от базисного правила создания вакцин Л. Пастера: «выделить микроорганизм, инактиви-ровать и ввести в макроорганизм» к методам, так

называемой, «обратной вакцинологии» [1], в основе которых лежит анализ in silico всех белков инфекционного агента и выбор в качестве имму-ногенов тех, что отвечают целям разрабатываемой вакцины. По отношению к вакцинам, защищающим от всех субтипов вируса гриппа А, такими белками могут быть внутренние вирусные белки, общие для разных субтипов.

В силу высокой консервативности и обильной презентации на инфицированных клетках, эктодо-мен белка М2 (М2е) - один из наиболее популярных кандидатов для создания универсальных вакцин [2 - 5]. Рядом авторов была показана, в том числе и в клинических исследованиях, высокая иммуногенность конструкций c М2е на разных белковых носителях: флагеллине, коровом антигене вируса гепатита В, Р-белке норовируса, на на-ночастицах золота и т.д. [3, 5 - 7]. Большинство кандидатных вакцин с М2е ускоряло выздоровление при последующем заражении вирусами гриппа, уменьшало выраженность симптомов, предотвращало гибель лабораторных животных. Вместе с тем, очевидно, что для более полного купирования инфекции необходимо комбинировать М2е с другими белками, индуцирующими вирус-нейтра-лизующие антитела (АТ). Одна из стратегий создания вакцин широкой направленности заключается во включении в состав вакцинного белка второй субъединицы гемагглютинина (НА2). В отличие от первой субъединицы гемагглютинина (НА1) вторая субъединица (стебель) менее подвержена мутациям и является более консервативной [8]. Показано, что антитела к М2е и эпитопам НА2 защищают от инфекции при пассивном переносе сывороток от иммунных животных [9] и что комбинация этих эпи-топов в одном препарате делает его более эффективным и универсальным [10].

Значимость НА2 специфических антител для ге-теросубтипической защиты обусловлено их кросс-реактивностью, которая реализуется несколькими путями: НА2 специфические антитела ингибируют слияние вирусной и клеточной мембран, предотвращают конформационные изменения НА, индуцируемые низким рН, блокируют процесс внедрения пептида слияния в эндосомальную мембрану. Ряд авторов показали эффективность включения в вакцину укороченного фрагмента НА2, содержащего пептид слияния и большую а-спираль [8, 11]. Нейтрализующие АТ к эпитопам НА образуются при вакцинации и естественной инфекции, но относительно в небольшом количестве. Предполагается, что эти АТ бустировались во время пандемии 2009 года и внесли вклад в затухание циркуляции сезонных (допандемических) вирусов гриппа А(Н^1).

Вместе с тем, и М2е, и НА2 76 - 130, имея небольшой молекулярный вес, являются сами по себе слабыми иммуногенами и нуждаются в крупной молекуле-носителе. В качестве белкового носителя вирусных пептидов был взят флагел-

лин - жгутиковый белок Salmonella typhimurium. Флагеллин обладает выраженными адъювантными свойствами, так как является лигандом TLR5 и через адаптерный белок MyD88 активирует клетки CD4+ и дальнейшую индукцию синтеза специфических иммуноглобулинов. Еще одним преимуществом флагеллина как носителя является возможность введения гибридных белков на его основе интраназально.

Цель настоящего исследования состояла в создании рекомбинантных белков, включающих консервативные для вируса гриппа А антигенные детерминанты и в оценке их иммуногенности и протективности.

Материалы и методы

Конструирование и экспрессия рекомбинантных белков. В качестве консервативных пептидов вируса гриппа, предназначенных для включения в состав рекомбинантных вакцинных белов, были выбраны:

M2h - консенсусная последовательность протеина М2е штаммов вируса гриппа А человека: SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD;

M2k - M2e вируса птичьего высоко патогенного гриппа A/Kurgan/05/2005 H5N1: SLLTEVETPTRNEWECRCSDSSD;

НА2 - консенсусная аминокислотная последовательность (ак 76 - 130) второй субъединицы НА вирусов гриппа А субтипов Н3 и Н7, относящихся ко второй филогенетической группе: RIQDLEKYVED TKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFEKTRRQL RENA.

Соответственно на основе флагеллина были сконструированы три белка:

Flg-4M2е - молекула флагеллина с присоединенными на С конце двумя копиями М2к в последовательности M2h-M2k-M2h- М2к;

Flg-HА2-4M2е - последовательность флагеллина, к которой на С конце присоединен консенсус-ный фрагмент для субтипов Н3 и Н7 второй субъединицы (ак 76 - 130) НА и последующие 4 копии М2е (M2h-M2k-M2h- M2k);

FlgSh-HA2-4M2е - молекула флагеллина, в которой гипервариабельная (ГВ) часть заменена на консенсусный фрагмент второй субъединицы НА (ак 76-130) вирусов гриппа А II филогенетической группы. К С-концу присоединены 4 копии М2е пептида от человеческих и птичьего вирусов.

Аминокислотная последовательность НА2 разных вирусов была взята из баз данных GISAID и GenBank. Последовательности выравнивали с использованием сервера MAFFT и алгоритмов FFT-NS-i, FFT-NS-2 и анализировали в программном пакете Unipro UGENE v.1.14.0. Поиск экспериментальных B- и СD4+ T-клеточных эпитопов, гомологичных участкам НА2, проводили в базе данных Immune Epitope Database. Поиск вероятных Т-клеточных эпитопов осуществляли с использованием NetCTLpan1.1 Server.

Искусственно созданные гены, кодирующие химерные белки, вводили в плазмиду pQE30 (Qiagen) с помощью стандартных генно-инженерных методов. Были получены экспрессионные векторы: pQE30-Flg-4M2e, pQE30-Flg-HA2-4M2e, pQE30-FlgSh-HA2-4M2e. Для создания штаммов-продуцентов рекомбинантных белков соответствующими экспрессионными векторами трансформировали штамм E. coli DLT1270 - производный от штамма DH10B, в хромосому которого интегрирован ген репрессора лактозного оперона lacI. Культуры штаммов-продуцентов выращивали в среде LB при 37 °С, при достижении оптической плотности культуры OD 600 ~ 0,5 - 0,6 в среду вносили IPTG (до 0,1 мМ). Штаммы-продуценты рекомбинантных белков культивировали далее 12 - 14 часов при 28 °C (Flg-4M2e), 4 часа при 28 °C (Flg-HA2-4M2e), либо в течение ночи при 30 °С (FlgSh-HA2-4M2e). От клеточного лизата белки очистили с помощью металло-аффинной хроматографии на Ni сорбенте. Белковые препараты анализировали с помощью SDS-PAGE.

Электрофорез и иммуноблот. Электрофорез в полиакриламидном геле (ЭФ в ПААГ) проводили в денатурирующих условиях по методу Лэммли. Подробное описание методики приведено ранее [4]. Полосы рекомбинантных белков определяли окрашиванием мембраны мышиными монокло-нальными анти-М2е АТ 14C2 (ab5416, Abcam, UK) и кроличьим поликлональными АТ, специфичными для бактериального флагеллина (ab93713, Abcam, UK). Мембрану инкубировали 1 час при комнатной температуре с первичными антителами, разведенными в ФБР с 0,1% Твин 20 (ФБРТ) и 3% БСА, затем отмывали в ФБРТ. Белки выявляли окрашиванием мембраны в течение 1 часа при комнатной температуре вторичными антителами (козьи анти-мыши-ные IgG, Abcam, UK), меченными пероксидазой хрена и последующей инкубацией в течение 5 мин с субстратом TMB (тетраметилбензидин) Immunoblot solution (Invitrogen, США).

Лабораторные животные. Иммунизация. В исследовании были использованы линейные мыши (самки) Ва^/c массой 18 - 20 г (возраст 6 -8 недель), полученные из питомника «Столбовая» ГУ «Научный центр биомедицинских технологий» РАН. Животных содержали в виварии ФГБУ «НИИ гриппа» Минздрава России в соответствии с действующими правилами. Мышей иммунизировали интраназально рекомбинантными белками в дозе 6 мкг/0,1 мл трехкратно с интервалом 3 нед. Иммунизацию проводили после ингаляционной анестезии смесью 2 - 3 % изофлюран, 30 % О2, 70 % N20. Контрольным мышам вводили и/н 0,1 мл ФБР. Все исследования проводили в соответствии с СП 2.2.1.3218-14 «Санитарно-эпидемиологические требования к устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)». Протокол опыта был утвержден Комиссией по биоэтике ФГБУ «НИИ гриппа»

(протокол заседания Комиссии по биоэтике №10/1 от 14 марта 2016 г.).

Получение сывороток крови и бронхоальвео-лярных лаважей. Образцы крови и бронхоальве-олярные лаважи (БАЛ) получали от пяти мышей каждой группы через 2 недели после третьей иммунизации, после эвтаназии в С02-камере (Vet Tech Solutions, Великобритания). Для получения сыворотки кровь инкубировали в течение 30 мин при температуре 37 °С. После образования сгустков крови образцы помещали на поверхность льда и охлаждали в течение 1 ч с последующим центрифугированием в течение 15 мин при 400 g. Аликвоты сыворотки крови (по 30 мкл) замораживали при температуре -20 °С. Для получения БАЛ труп животного фиксировали на операционном столике. Производили разрез кожи по средней линии от нижней челюсти. В нижнюю часть трахеи в направлении легких вводили катетер на глубину 3 - 5 мм. Дважды промывали бронхи и легкие 1 мл ФБР. БАЛ центрифугировали в течение 15 мин при 400 g, отбирали аликвоты надосадка и замораживали их при температуре -20 °С.

Иммуноферментный анализ. Сыворотки и БАЛ исследовали в ИФА с использованием 96-луночных планшет (Greiner, Германия). Титры антител определяли индивидуально у 5 мышей каждой группы. В качестве твердой фазы использовали синтетические пептиды (5мкг/мл), синтезированные в НПО «Верта», Санкт-Петербург : M2ek SLLTEVETPTRNEWECRCSDSSD (M2e вируса гриппа А/Курган/05/05 (H5N1), M2eh SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD (консенсусная последовательность М2е вирусов гриппа А человека), или очищенный вирус А/Аичи/2/68 (H3N2) (2 мкг/мл) в ФБР (рН 7.2). Планшеты выдерживали в течение ночи при 4 °С. ИФА проводили по ранее описанной методике [4].

Вирусы и заражение мышей. На 14-й день после последней иммунизации мышей Balb/c (по 8 мышей в опытных и контрольной группах) заражали адаптированным к мышам вирусом гриппа А/Аичи/2/68 (H3N2), полученным из Коллекции вирусов гриппа и ОРЗ ФГБУ «НИИ гриппа» Минздрава России, в дозе 10LD50. Вирус А/Аичи/2/68 (H3N2) был адаптирован к мышам путем серии пассажей (мышь/куриный эмбрион). Вирус сохранил антигенные свойства исходного дикого штамма, но приобрел способность летально инфицировать мышей. Вирус вводили интраназально в объеме 50 мкл/мышь после ингаляционной анестезии. После заражения проводили ежедневное наблюдение за животными. Протективное действие ре-комбинантных белков оценивали по динамике падения массы тела, выживаемости мышей после заражения и репродукции вируса в легких. В качестве отрицательного контроля в эксперименте использовали мышей, которым вводили 0,1 мл ФБР.

Репродукция вирусов гриппа в легких. На 6-ые сутки после заражения у 3 мышей из каждой группы после эвтаназии забирали легкие. Легкие го-

могенизировали, центрифугировали в течение 15 мин при 3000 об/мин. До начала работы все образцы были заморожены и хранились при температуре -20 °С. Выделение вируса проводили титрованием легочной суспензии мышей на культуре клеток MDCK. Клетки заражали серийными десятикратными разведениями легочного гомогената (в квадрипликатах) от 10-1 до 10-8 и инкубировали в термостате (36,0 ± 0,5 °С) в течение 72 часов. Уровень репродукции вируса в культуральной жидкости оценивали в реакции гемагглютинации эритроцитов с 1% взвесью в физиологическом растворе. Инфекционную активность вируса рассчитывали по методу Рида и Менча (1938 г.). За титр вируса принимали величину, противоположную десятичному логарифму наибольшего разведения вируса, способного вызвать положительную реакцию гемагглютинации и выражали в логарифмах 50% тканевой цитопатической инфекционной дозы вируса (^ ТЦИД50).

Статистическая обработка. Статистическую обработку данных проводили в программе GraphPad Рп7т V 6.0. Статистическую значимость различий титров антител оценивали с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни и сравнение показателей выживаемости - критерия Мантела-Кокса. Различия считали значимыми при р < 0.05.

Результаты и их обсуждение

В процессе работы были синтезированные химерные гены, которые кодировали 3 белка, включающие молекулу флагеллина (полноразмерную или с удаленной гипервариабельной частью), экто-домены М2 белка высоко патогенного вируса грип-

па птиц А(Н5N1) и консенсусную аминокислотную последовательность М2е вирусов гриппа человека, а также аминокислотную последовательность 76 - 130 второй субъединицы гемагглютинина, консенсусную для вирусов гриппа А субтипов Н3 и Н7. Последовательность расположения пептидов в рекомбинантных вакцинных белках представлена на рис. 1А.

Выбор консенсусной последовательности гемагглютинина субтипов Н3 и Н7 вируса гриппа обусловлен их эпидемической значимостью. Вирус А(Н3N2) циркулирует в человеческой популяции с 1968 года, вызывая практически ежегодно эпидемии гриппа. Вирус А ^N9) - один из вирусов природного резервуара, рассматривается специалистами как возможный донор генов для будущего пандемического вируса [12].

Последовательность НА2 76 - 130 представляет собой большую -спираль, эпитопы которой является мишенью для моноклональных антител [3, 8]. Аминокислотная последовательность фрагмента 76 - 130 НА2 двух субтипов Н3 и Н7 имеет гомологию в 63,6%; с учетом замен на аминокислоты с аналогичными физико-химическими свойствами гомология составляет 80%.

Оба целевых пептида М2е и НА2 имеют Т-клеточные ^4+, СD8+) и В-клеточные эпитопы. К настоящему времени получен ряд моноклональ-ных антител (мАТ), реагирующих с В-клеточными эпитопами М2е и НА2 (76 - 130). Так, мАТ ^1, взаимодействуют с ак 76 - 106 и обладают нейтрализующей способностью в отношении вирусов A(H3N2) 1968 - 2003 годов циркуляции [8]. Моноклональные антитела FE1, специфичны к участку125 - 175 НА2 и ингибируют фьюзоген-

Рисунок 1.

Схема молекулы флагеллина

В

Примечание: Вестерн-Блотинг рекомбинантных белков (4 - 9). Дорожка НМ-маркеры молекулярного веса в кДа Дорожки:1, 4, 7 - белок Flg НА2-4М2е; 2, 5, 8 - белок Flg 4М2е; 3, 6, 9 - белок FlgSh-HА2-4M2е.

А

Б

ную активность вируса гриппа А [14]. МАТ CR6261 ингибируют рН-индуцированное конформационное изменение вирусов гриппа Н1 и Н5 и обладают нейтрализующей активностью [4], взаимодействует преимущественно с а-спиралью НА2. Для М2е еще в 1980-е годы было получено мАТ 14С2, взаимодействующее с аминокислотной последовательностью 1 - 10.

После трансформации E. coli плазмидами, содержащими химерные гены, были получены три белка: FlgНА-4М2е, FlgShНА-4М2е, Flg4М2е. В белке FlgShНА-4М2е (см. рис. 1А) вариабельная часть Flg была заменена на ак 76 - 130 от второй субъединицы НА вирусов гриппа филогенетической группы II. Как видно на рисунке 1Б в белках FlgНА-4М2е и Flg4М2е целевые белки находятся на С-конце флагеллина. Последовательность аминокислот в пептиде М2е вируса птиц А(Н5N1), по сравнению с консенсусной последовательностью аминокислот вирусов гриппа человека отличается на 3 аминокислоты в положениях 8 (Т ^ I), 15 (Е ^ G) и 19 (S N); по сравнению с М2е вируса А/ Калифорния/05/09, имеет одну лишь замену N12S и индуцирует антитела, хорошо взаимодействующие с М2е вируса А ^1N1)pdm09 [15].

Теоретическая молекулярная масса белков Flg4М2е, Flg-HА2-4M2е и FlgSh-HА2-4M2е составляла 66 kDa, 73,9 кДа и 55 кДа соответственно, что

совпадало с электрофоретической подвижностью этих белков в ПААГ (рис. 1В).

Подлинность белков была подтверждена в Ве-стерн-блотинге. Очищенные с помощью хроматографии белки взаимодействовали с М2е специфическими моноклональными антителами 14С2 и антителами к флагеллину (см. рис. 1В).

Иммуноферментный анализ сывороток крови мышей, иммунизированных вакцинными белками с разной локализацией НА2, выявил взаимодействие с синтетическими пептидами М2е1л и М2ек до титров 1:60 000 - 1:90 000 с отсутствием статистически достоверных различий в уровнях анти-М2е IgG (см. рис. 1А). Таким образом, удаление гипервариабельной части в молекуле Flg и замена ее на НА2 не отразились на уровне индуцируемых М2е-специфических антител. Это логично, так как показано, что лиганды TLR 5, активизирующие клетки врожденного иммунитета, а через них клетки CD4+ и далее образование специфических антител, расположены именно в консервативной части молекулы флагеллина [16].

Иммунный ответ привитых мышей на НА2 также оценивали в реакции иммуноферментного анализа. Как видно на рисунке 2Б, более высокие титры IgG (1:1100) обнаружены в сыворотках мышей, привитых белком с локализацией НА 76 - 130 в гипервариабельной части молекулы флагеллина (р < 0,01). В

Рисунок 2.

Среднее геометрическое титров IgG в сыворотке

Примечание: Достоверных различий между опытными группами нет. Достоверное отличие от контрольных групп р < 0.01.

Рисунок 3.

Динамика массы тела (А) и гибели (Б) мышей, иммунизированных рекомбинантными белками, после заражения вирусом гриппа А/АюМ/2/68 (H3N2) в дозе 10LD

Примечание: Статистическую значимость определяли с помощью теста Манна-Уитни. Различия между опытными и контрольной группами статистически достоверны р ? 0,05.

целом, белки, содержащие НА2, расширяли спектр специфических иммуноглобулинов, что предположительно должно было повысить их защитные свойства по сравнению с белком Flg 4М2е. Обладают ли образующиеся антитела вирус-нейтрализующи-ми свойствами - предмет дальнейшего изучения. Также как и вопрос может ли последовательность 76 - 130 НА2, локализованная в гипервариабельной (ГВ) части молекулы флагеллина, индуцировать образование специфических клеток CD8+, как это было показано в отношении некоторых белков, встроенных в ГВ часть флагеллина [16].

Уровни М2е-специфичных ^ и ^А в БАЛ после иммунизации каждым из трех кандидатных вакцинных белков не имели статистически значимых различий (рис. 2В, Г).

По данным литературы, основными защитными механизмами, индуцируемыми гибридными белками, содержащими пептиды с М2е и НА2, является антитело-зависимая цитотоксичность и комплемент-опосредованная NK-клеточная элиминация инфицированных клеток [3, 17], то есть вакцинные препараты на основе консервативных белков не предотвращают инфекцию, но значительно облегчают клиническую симптоматику заболевания и исключают летальные исходы.

Для ответа на вопрос: насколько иммунизация сконструированными белками защищает организм от последующей инфекции вирусом гриппа, было проведено заражение всех групп мышей высокой дозой (10LD50) вируса А/Аичи/2/68 ^N2) (рис. 3 А, Б). При этом 100% выживаемость наблю-

Рисунок 4.

Титры вирусов в легких мышей, иммунизированных рекомбинантными белками, на 6-й день после заражения вирусом гриппа А/АюМ/2/68 (H3N2) в дозе 10LD50

Примечание: Данные выражены в виде Lg ТСЮ50. Нижний предел обнаружения составляет 0,51д ТСЮ50. Статистическую значимость определяли с помощью теста Манна-Уитни. *р < 0,05 значения между вакцинированными и контрольными группами.