МОНОКЛОНАЛЬНОЕ АНТИТЕЛО, СПЕЦИФИЧЕСКИ СВЯЗЫВАЮЩЕЕСЯ С ТИОРЕДОКСИНОМ-1, И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ
MONOCLONAL ANTIBODY THAT SPECIFICALLY BINDS TO THIOREDOXIN-1 AND ITS USE

Область техники, к которой относится изобретение
По настоящей заявке испрашивается приоритет для заявки на патент Кореи № 10-2016-0118053, поданной 13 сентября 2016 г., раскрытие которой включено в настоящий документ посредством ссылки во всей полноте.
Настоящее изобретение относится к моноклональному антителу, специфически связывающемуся с тиоредоксином-1, и к его применению, и более конкретно, к моноклональному антителу, специфически связывающемуся с тиоредоксином-1, или к его антигенсвязывающему фрагменту, к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей тяжелую цепь и/или легкую цепь антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, к рекомбинантному вектору, включающему молекулу нуклеиновой кислоты, к клеткам-хозяевам, к способу получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, к набору для диагностики рака молочной железы, и к способу получения информации, необходимой для диагностики рака молочной железы.
Предшествующий уровень техники
Тиоредоксин (Trx) представляет собой небольшой редокс-белок размером около 12 кДа, который присутствует в восстановленном состоянии под действием тиоредоксинредуктазы благодаря NADPH-зависимому восстановлению, и включает тиоредоксин-1 (Trx1) и тиоредоксин-2 (Trx2) у млекопитающих. Тиоредоксин действует как фактор роста, удаляет перекись водорода, которая является токсичной для клеток, способствует связыванию критических факторов, относящихся к роли рибонуклеотидредуктазы и транскрипции ДНК в бактериях, и влияет на активность фактора транскрипции, такого как ядерный фактор транскрипции kB (NF-kB) в эукариотических клетках. Следовательно, тиоредоксин влияет на гибель клеток и опухоли, и таким образом, играет ключевую роль в регуляции роста раковых клеток и расщепляет дисульфидную связь другого окисленного белка, чтобы способствовать поддержанию активности в восстановленном состоянии. Тиоредоксин-1- и тиоредоксин-2-редуктазы удаляют оксид азота из цистеина в клетках млекопитающих, оказывая влияние на гибель клеток, и имеют потенциальное значение при различных заболеваниях, включая воспалительные заболевания, сердечный приступ и рак. Кроме того, иммуногистохимический анализ с использованием антитела против тиоредоксина показывает экспрессию тиоредоксина в раковых тканях человека, включая печень, толстую кишку, поджелудочную железу и шейку матки, и такая экспрессия указывает на возможность вовлечения тиоредоксина в онкогенез.
При этих обстоятельствах авторы изобретения исследовали маркер для диагностики рака молочной железы, который позволяет диагностировать рак молочной железы или обеспечивает его ранний прогноз; тиоредоксин-1 слабо экспрессируется в нормальной ткани молочной железы, но характеризуется очень высокой экспрессией в ткани рака молочной железы, демонстрируя пригодность тиоредоксина-1 в качестве маркера для диагностики рака молочной железы (патент Кореи № 10-1058230).
Для разработки диагностики in vitro (IVD) на основе иммуноферментного анализа (ИФА) с высокой точностью и высокой прецизионностью требуется пара антител, имеющих различные участки с разной аффинностью к одному и тому же антигенному белку. Кроме того, необходимо иметь систему, продуцирующую антитела, имеющие определенную аффинность, каждый раз при низких затратах. В настоящем изобретении для обнаружения тиоредоксина-1 (Trx1), присутствующего в сыворотке человека, были разработаны два типа высокоэффективных рекомбинантных моноклональных антител, которые с высокой специфичностью связываются с тиоредоксином-1, и таким образом, могут быть полезны для скрининга пациентов с раком молочной железы. Следовательно, настоящее изобретение было завершено.
Описание изобретения
Техническая проблема, решаемая изобретением
Настоящее изобретение направлено на создание моноклонального антитела, способного диагностировать рак молочной железы с высокой чувствительностью и высокой специфичностью, или его антигенсвязывающего фрагмента.
Настоящее изобретение также направлено на создание молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей тяжелую цепь и/или легкую цепь моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.
Настоящее изобретение также направлено на создание рекомбинантного вектора, включающего молекулу нуклеиновой кислоты.
Настоящее изобретение также направлено на обеспечение клеток-хозяев, включающих рекомбинантный вектор.
Настоящее изобретение также направлено на обеспечение способа получения моноклонального антитела, специфически связывающегося с тиоредоксином-1, или его антигенсвязывающего фрагмента, который включает культивирование клеток-хозяев.
Настоящее изобретение также направлено на обеспечение набора для диагностики рака молочной железы, который включает вышеописанное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.
Настоящее изобретение направлено на создание способа получения информации, необходимой для диагностики рака молочной железы, с использованием вышеописанного моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.
Техническое решение
Для решения вышеописанных проблем настоящее изобретение предлагает моноклональное антитело, специфически связывающееся с тиоредоксином-1, или его антигенсвязывающий фрагмент, которое включает вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, CDR2 легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, и CDR3 легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3; и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4, CDR2 тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5, и CDR3 тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6.
В соответствии с примерным вариантом осуществления настоящего изобретения, антитело может включать вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 13, и вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 14.
В соответствии с другим примерным вариантом осуществления настоящего изобретения, антитело может включать легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 17, и тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 18.
Настоящее изобретение также обеспечивает моноклональное антитело, специфически связывающееся с тиоредоксином-1, или его антигенсвязывающий фрагмент, которые включают вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7, CDR2 легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8 и CDR3 легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9; и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10, CDR2 тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11, и CDR3 тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 12.
В соответствии с примерным вариантом осуществления настоящего изобретения, антитело может включать вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 15, и вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16.
Согласно другому примерному варианту осуществления настоящего изобретения, антитело может включать легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 19, и тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20.
Согласно еще одному примерному варианту осуществления настоящего изобретения, антитело может включать тяжелую цепь IgG1 и легкую цепь каппа (κ).
2
В соответствии с еще одним примерным вариантом осуществления настоящего изобретения, антигенсвязывающий фрагмент может представлять собой Fab, F(ab'), F(ab'), Fv или одноцепочечную молекулу антитела.
Согласно еще одному примерному варианту осуществления настоящего изобретения, антитело может представлять собой химерное антитело, гуманизированное антитело или человеческое антитело.
Настоящее изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей тяжелую цепь и/или легкую цепь вышеописанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.
В соответствии с примерным вариантом осуществления настоящего изобретения, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая легкую цепь, может представлять собой нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 21 или нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 23.
В соответствии с примерным вариантом осуществления настоящего изобретения, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая тяжелую цепь, может представлять собой нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 22 или нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 24.
Настоящее изобретение также обеспечивает рекомбинантный вектор, включающий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую тяжелую цепь, молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую легкую цепь, или молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие как тяжелую цепь, так и легкую цепь.
Настоящее изобретение обеспечивает клетки-хозяева, включающие рекомбинантный вектор, и способ получения моноклонального антитела, специфически связывающегося с тиоредоксином-1, или его антигенсвязывающего фрагмента, который включает культивирование клеток-хозяев.
Настоящее изобретение также относится к набору для диагностики рака молочной железы, который включает вышеописанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.
В соответствии с примерным вариантом осуществления настоящего изобретения, набор может представлять собой набор для иммуноферментного анализа (ИФА).
Согласно другому примерному варианту осуществления настоящего изобретения, ИФА может быть любым, выбранным из группы, состоящей из прямого ИФА, непрямого ИФА, прямого сэндвич-ИФА и непрямого сэндвич-ИФА.
Настоящее изобретение также относится к способу получения информации, необходимой для диагностики рака молочной железы, который включает: (а) обеспечение контакта моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из п.п.1-4 с биологическим образцом, выделенным у субъекта с подозрением на наличие рака молочной железы; (b) измерение уровня экспрессии белка тиоредоксина-1, связывающегося с моноклональным антителом или его антигенсвязывающим фрагментом в биологическом образце посредством образования комплекса антиген-антитело; и (c) сравнение уровня экспрессии белка тиоредоксина-1, измеренного на этапе (b), с уровнем в контроле, и если уровень экспрессии белка выше, чем в контроле, определение субъекта как пациента, страдающего раком молочной железы.
Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает способ получения информации, необходимой для диагностики рака молочной железы, который включает: (а) покрытие твердой подложки моноклональным антителом или его антигенсвязывающим фрагментом по п.п.2, 4 или 6; (b) нанесение биологического образца, выделенного у субъекта с подозрением на наличие рака молочной железы, на твердую подложку с покрытием; (с) удаление несвязанного образца; (d) нанесение моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по пп.1, 3 или 5 на твердую подложку; (е) удаление несвязанного моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента; (f) измерение уровня экспрессии белка тиоредоксина-1; и (g) сравнение уровня экспрессии белка тиоредоксина-1, измеренного на этапе (f), с контролем, и если уровень экспрессии белка выше, чем в контроле, определение субъекта как пациента, страдающего раком молочной железы.
В соответствии с примерным вариантом осуществления настоящего изобретения, уровень экспрессии белка тиоредоксина-1 может быть измерен любым способом, выбранным из группы, состоящей из вестерн-блоттинга, ИФА, сэндвич-ИФА, радиоиммуноанализа, радиоиммунопреципитации, иммунодиффузии по Оухтерлони, иммунопреципитации, реакции связывания комплемента, иммунохроматографического анализа, FACS (клеточной сортировки с активацией флуоресценции) и анализа на белковых чипах.
Согласно другому примерному варианту осуществления настоящего изобретения, выделенный биологический образец может быть любым одним или несколькими образцами, выбранными из группы, состоящей из цельной крови, сыворотки, плазмы, ткани молочной железы и клеток молочной железы.
Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в описании, имеют то же значение, которое обычно понимают специалисты в области техники, к которой относится изобретение. Обычно используемая здесь номенклатура хорошо известна и обычно используется в данной области техники.
Определения ключевых терминов, используемых в настоящем документе, являются следующими.
Термин «антиген» относится к молекуле, которая может быть связана антителом, и может использоваться у животного для получения антитела, способного связываться с эпитопом антигена или частью молекулы. Антиген может иметь один или несколько эпитопов.
2
Термин «антитело» или «Ab» представляет собой молекулу иммуноглобулина, которая может распознавать конкретную мишень или антиген, например, углевод, полинуклеотид, липид или полипептид, через один или несколько участков распознавания антигена, расположенных в вариабельной области молекулы иммуноглобулина, и связываться с ним. Используемый в настоящей заявке термин «антитело» может относиться к любому типу антител, который включает моноклональное антитело; поликлональное антитело; «антигенсвязывающий фрагмент» антитела, обладающий способностью специфически связываться со специфическим антигеном (например, Trx1), например, Fab, Fab', F(ab'), Fd, Fv, Fc и т.д.; изолированный гипервариабельный участок (CDR); биспецифичное антитело; гетероконъюгированное антитело или его мутант; антитело или гибридный белок, имеющий антигенсвязывающий фрагмент (например, доменное антитело); одноцепочечный вариабельный фрагмент (ScFv) и однодоменное антитело [например, антитела акулы и верблюда]; макситело, минитело, интратело, дитело, триатело, тетратело, v-NAR и бис-scFv; гуманизированное антитело; химерное антитело; и все другие модифицированные конфигурации молекулы иммуноглобулина, включая участок распознавания антигена с необходимой специфичностью (включая гликозилированные варианты антитела, варианты аминокислотной последовательности антитела и ковалентно модифицированное антитело), но не ограничивается ими. Антитело может быть получено от мыши, крысы, человека или иметь любое другое происхождение (включая химерное или гуманизированное антитело).
Антитело или полипептид, которое «специфически связывается» со специфической мишенью или антигеном (например, белком Trx1), является термином, обычно принятым в данной области техники, и способ определения такого специфического связывания также широко известен в данной области техники. Считается, что конкретная молекула имеет «специфическое связывание», когда она реагирует или связывается со специальной клеткой или материалом чаще, быстрее, последовательнее и/или с более высокой аффинностью, чем с другим типом клеток или материалом. Специфическое антитело «специфически связывается» со специфической мишенью или антигеном с более высокой аффинностью, более высокой связывающей активностью, более быстро и/или более последовательно, чем при связывании с другим материалом.
D
D
d
a
D
d
a
D
D
D
D
D
Используемый в настоящей заявке термин «аффинность связывания» или «K» относится к равновесной константе диссоциации взаимодействия конкретного антигена-антитела. K представляет собой отношение скорости диссоциации (также называемой «скоростью высвобождения» или «k») к скорости связывания или «функциональной скорости» или «k (константе скорости ассоциации)». Следовательно, K представляет собой k/k, которая выражается как молярная концентрация (M). Таким образом, чем ниже K, тем выше аффинность связывания. Следовательно, K 1 мкМ указывает на более низкую аффинность связывания по сравнению с K 1 нМ. Значение Kантитела может быть определено с использованием метода, широко известного в данной области техники. Один метод определения K антитела обычно использует поверхностный плазмонный резонанс с применением биосенсорной системы, например, системы Biacore.
Термин «вектор» включает молекулу нуклеиновой кислоты, способную доставлять связанной другую нуклеиновую кислоту. Один тип вектора представляет собой «плазмиду» и относится к кольцевой двухцепочечной петле ДНК, в которую может быть вставлен дополнительный фрагмент ДНК. Вектор другого типа представляет собой вирусный вектор, и здесь дополнительный фрагмент ДНК может быть присоединен к вирусному геному. Некоторые векторы могут быть самореплицированы в клетках-хозяевах, в которые они введены (например, бактериальный вектор, имеющий бактериальный источник репликации, и эписомальный вектор млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомальный вектор млекопитающих) могут быть интегрированы в геном клеток-хозяев при введении в клетки-хозяева, и таким образом, реплицированы в соответствии с геномом хозяина. Кроме того, некоторые векторы могут направлять экспрессию функционально связанных генов. Векторы обозначаются как «рекомбинантные векторы экспрессии» (или просто как «векторы экспрессии») в описании. Как правило, вектор экспрессии, используемый в методике рекомбинантной ДНК, часто присутствует в форме плазмиды. Термины «плазмида» и «вектор», используемые в настоящей заявке, представляют собой наиболее широко используемые типы векторов, и таким образом, могут использоваться взаимозаменяемо. Однако настоящее изобретение включает различные типы векторов экспрессии, имеющих одинаковую функцию, например, вирусные векторы (например, ретровирус с дефицитной репликацией, аденовирус и аденоассоциированный вирус).
Термин «клетки-хозяева» используется для экспрессии клеток, которые трансформированы, или трансформированы последовательностью нуклеиновой кислоты для экспрессии выбранного интересующего гена. Термин охватывает потомство материнских клеток независимо от того, идентично ли потомство исходному родителю в морфологическом или генетическом аспекте, если присутствует выбранный ген.
Преимущественные эффекты
Моноклональное антитело по настоящему изобретению обладает превосходной аффинностью связывания с тиоредоксином-1, тем самым очень избирательно связывается с тиоредоксином-1, и обладает очень высокой чувствительностью и специфичностью, благодаря чему эффективно используется при скрининге пациентов с раком молочной железы. Кроме того, обнаружение тиоредоксина-1 с использованием моноклонального антитела, специфически связывающегося с тиоредоксином-1 по настоящему изобретению, а не обнаружение с использованием обычного диагностического биомаркера рака молочной железы CA15-3, демонстрирует исключительно высокую чувствительность и специфичность; следовательно, точность и надежность диагностики рака молочной железы могут быть значительно увеличены.
Описание чертежей
Фигура 1 демонстрирует карту расщепления рекомбинантного вектора, экспрессирующего антиген тиоредоксина-1, и результат изотипирования антитела, полученного в примере 1.
Фигура 2 демонстрирует аминокислотные последовательности легкой цепи (а) и тяжелой цепи (b) антитела 9G7(AB1), полученного в примере 1.
Фигура 3 демонстрирует аминокислотные последовательности легкой цепи (а) и тяжелой цепи (b) антитела 2В4 (АВ2), полученного в примере 1.
Фигура 4 демонстрирует набор карт расщепления рекомбинантного вектора, экспрессирующего легкую цепь (а) и тяжелую цепь (b) антитела В264 с высокой аффинностью.
Фигура 5 демонстрирует набор карт расщепления рекомбинантного вектора, экспрессирующего легкую цепь (а) и тяжелую цепь (b) антитела В266 с высокой аффинностью.
Фигура 6 показывает результаты идентификации восстановленных (+) и невосстановленных (-) состояний антител с использованием ДСН-ПАГЭ (электрофореза на полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия), где (а) – результат для антитела В264, а (b) – результат для антитела В266.
Фигура 7 показывает результаты идентификации восстановленного (+) и невосстановленного (-) состояний антитела B266-1 с использованием ДСН-ПАГЭ, в котором антитело B266-1 получают путем изменения Fc-части антитела B266 на человеческий IgG1.
Фигура 8 демонстрирует результаты анализа аффинности антитела В266-1 и антитела В264, где (а) показывает значение реакции в соответствии с концентрацией антитела и её график, и (b) показывает результат анализа аффинности антител с использованием программы Prism.
Фигура 9 представляет собой график, показывающий чувствительность и специфичность посредством ROC-анализа (зависимости чувствительности от частоты ложно положительных заключений) результатов ИФА с использованием антитела B266-1 и антитела B264.
Способы осуществления изобретения
Далее настоящее изобретение будет описано более подробно.
Как описано выше, авторы изобретения подтвердили посредством предыдущих исследований, что тиоредоксин-1 экспрессируется в нормальной ткани молочной железы на низком уровне, но экспрессируется в ткани рака молочной железы на очень высоком уровне. Таким образом, доказано, что тиоредоксин-1 полезен в качестве маркера для диагностики рака молочной железы.
Поэтому посредством дальнейших исследований авторы изобретения разработали моноклональное антитело, которое с высокой специфичностью связывается с тиоредоксином-1 и является полезным при скрининге пациентов с раком молочной железы. Моноклональное антитело по настоящему изобретению с высокой специфичностью связывается с тиоредоксином-1 благодаря превосходной аффинности связывания с тиоредоксином-1 и обладает очень высокой чувствительностью и специфичностью, так что его можно эффективно использовать при скрининге пациентов с раком молочной железы. Кроме того, выявление тиоредоксина-1 с использованием моноклонального антитела по настоящему изобретению, которое специфически связывается с тиоредоксином-1, а не выявление CA15-3, который является другим обычно используемым биомаркером для диагностики рака молочной железы, проявляет превосходную чувствительность и специфичность, так что точность и достоверность диагностики рака молочной железы могут быть значительно увеличены.
Настоящее изобретение обеспечивает моноклональное антитело, связывающееся с тиоредоксином-1 (Trx1), или его антигенсвязывающий фрагмент.
Моноклональное антитело по настоящему изобретению может быть получено с использованием множества способов, известных в данной области техники, таких как гибридомные технологии, рекомбинация и фаговый дисплей, и способом их комбинации. Например, моноклональное антитело может быть получено с использованием гибридомного способа, который известен в данной области техники. Используемый в настоящей заявке термин «моноклональное антитело» не ограничивается антителом, полученным с использованием гибридомной техники. Термин «моноклональное антитело» относится к антителу, полученному из одного клона любого эукариота, прокариота или фагового клона, но не относится к способу его получения.
Способ получения и скрининга конкретного антитела с использованием гибридомной техники является распространенным и хорошо известным в данной области техники. В качестве неограничивающего примера мышь можно иммунизировать целевым антигеном или клетками, экспрессирующими его. Когда иммунная реакция выявляет, например, антитело, специфичное к антигену, выделяемое из сыворотки мыши, собирают селезенку мыши для выделения клеток селезенки. Затем клетки селезенки гибридизируют с любыми подходящими клетками миеломы, например, P3U1, P3X63-Ag8, P3X63-Ag8-U1, P3NS1-Ag4, SP2/0-Ag14 или P3X63-Ag8-653, известным способом. Гибридому отбирают и клонируют путем лимитирующего разведения. После этого клон гибридомы оценивают по его способности быть клеткой, секретирующей антитело, способное связываться с антигеном, способом, известным в данной области техники. Как правило, асцитическая жидкость, содержащая высокий уровень антител, может быть получена путем инъекции положительных клонов гибридомы в брюшную полость мыши. В типичном варианте осуществления настоящего изобретения антиген Trx1 получают путем трансфекции E.coli рекомбинантным вектором, имеющим карту расщепления, показанную на фиг.1(а). После этого селезенку крысы, иммунизированной антигеном, отделяют, и клетки, слитые с клетками миеломы (sp2/0), продуцирующие антитело, реагирующее с Trx1, идентифицируют с помощью ИФА.
Примерное моноклональное антитело по настоящему изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент могут включать (а) или (b), как изложено ниже, которые могут упоминаться как B264 или B266-1, соответственно:
(а) вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, CDR2 легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, и CDR3 легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3; и вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4, CDR2 тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5, и CDR3 тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6; или
(b) вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1 легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7, CDR2 легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8, и CDR3 легкой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9; и вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1 тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10, CDR2 тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11, и CDR3 тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 12.
Используемый в настоящей заявке термин «участок, определяющий комплементарность (CDR)» относится к аминокислотной последовательности гипервариабельной области тяжелой цепи или легкой цепи в иммуноглобулине. Каждая из тяжелых цепей (CDRH1, CDRH2 и CDRH3) и легких цепей (CDRL1, CDRL2 и CDRL3) имеет три CDR, и эти CDR обеспечивают ключевые контактные остатки, когда антитело связывается с антигеном или эпитопом.
Примерное моноклональное антитело по настоящему изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент могут включать (с) или (d), как указано ниже, и могут упоминаться как B264 или B266-1, соответственно:
(c) вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 13, и вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 14; или
(d) вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 15, и вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16.
Примерное моноклональное антитело по настоящему изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент могут включать (е) или (f), как указано ниже, которые могут упоминаться как B264 или B266 соответственно:
(е) легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 17, и тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 18; или
(f) легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 19, и тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20.
Примерное моноклональное антитело по настоящему изобретению упоминается как B264, B265, B266, B267, B268 или B269 и наиболее предпочтительно B264 или B266-1. B266-1 представляет собой моноклональное антитело, в котором Fc-часть B266 модифицирована на человеческий IgG1.
Структурная единица встречающегося в природе антитела обычно включает тетрамер. Тетрамер обычно состоит из двух пар идентичных полипептидных цепей, и каждая пара имеет одну полноразмерную легкую цепь (обычно имеющую молекулярную массу около 15 кДа) и одну полноразмерную тяжелую цепь (обычно имеющую молекулярную массу около 50 до 70 кДа). Амино-конец каждой из легкой цепи и тяжелой цепи обычно включает вариабельную область примерно с 100-110 или более аминокислотами, участвующими в распознавании антигена. Карбоксильный конец каждой цепи определяет константную область, обычно участвующую в функции эффектора. Легкая цепь человека обычно классифицируется на легкие цепи κ и λ. Тяжелая цепь обычно классифицируется на тяжелые цепи µ, δ, γ, α и ε, которые определяют изотипы антитела, такие как IgM, IgD, IgG, IgA и IgE, соответственно. IgG имеет некоторые подклассы, включая IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, но не ограничивается ими. IgM имеет подклассы, включающие IgM1 и IgM2, но не ограничивается ими. Аналогично, IgA разделяется на подклассы, включающие IgA1 и IgA2, но не ограничивается ими. В полноразмерной легкой и тяжелой цепи вариабельные и константные области, как правило, связаны «J» областью примерно из 12 или более аминокислот, и тяжелая цепь также включает «D» область примерно из 10 или более аминокислот. Вариабельная область каждой пары легкая цепь/ тяжелая цепь обычно образует антигенсвязывающий участок. В соответствии с примерным вариантом осуществления настоящего изобретения, в моноклональном антителе по настоящему изобретению тяжелая цепь может представлять собой изотип IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA или IgM, а легкая цепь может представлять собой κ-цепь или λ цепь, и предпочтительно, легкую цепь к и тяжелую цепь IgG1.
2
2
2
В моноклональном антителе по настоящему изобретению или его антигенсвязывающем фрагменте «его антигенсвязывающий фрагмент» означает фрагмент, имеющий антигенсвязывающую функцию, и включает Fab, F(ab'), F(ab'), Fv или одноцепочечную молекулу антитела. Среди фрагментов, связывающих антитела, Fab представляет собой структуру, имеющую вариабельные области легкой и тяжелой цепи, и константную область легкой цепи и первую константную область (СН1) тяжелой цепи, и включает один антигенсвязывающий участок. F(ab') отличается от Fab тем, что имеет шарнирную область, включающую один или несколько цистеиновых остатков на С-конце домена CH1 тяжелой цепи. F(ab') образован дисульфидной связью между цистеиновыми остатками в шарнирной области Fab'. Fv представляет собой наименьший фрагмент антитела, имеющий только вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи. Такой фрагмент антитела может быть получен с использованием протеазы, предпочтительно посредством технологии рекомбинации генов. Например, Fab может быть получен путем расщепления всего антитела папаином, а фрагмент F(ab') может быть получен путем расщепления всего антитела пепсином.
Типичным антителом по настоящему изобретению может быть химерное антитело, гуманизированное антитело или полное человеческое антитело.
Химерное антитело может быть получено путем объединения вариабельных доменов легкой цепи и тяжелой цепи (VL и VH), полученных из клеток-продуцентов одного типа, и константных доменов легкой цепи и тяжелой цепи, полученных из антитела другого типа, с использованием средств рекомбинации. Как правило, химерное антитело использует вариабельный домен грызуна или кролика и константный домен человека для получения антитела, обычно имеющего человеческий домен. Получение такого химерного антитела широко известно в данной области техники и может быть достигнуто стандартными способами. Также считается, что человеческая константная область химерного антитела по настоящему изобретению может быть выбрана из константной области IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgG5, IgG6, IgG7, IgG8, IgG9, IgG10, IgG11, IgG12, IgG13, IgG14, IgG15, IgG16, IgG17, IgG18 или IgG19.
Гуманизированное антитело сконструировано так, что оно содержит домен иммуноглобулина, более похожий на человеческий, и включает гипервариабельную область антитела животного происхождения. Это достигается путем тщательного изучения последовательности гипервариабельной петли вариабельной области в моноклональном антителе и адаптации последовательности к структуре цепи человеческого антитела.
Полное человеческое антитело представляет собой молекулу антитела, которая включает CDR, так что полные последовательности как легкой цепи, так и тяжелой цепи получены из гена человека.
Настоящее изобретение также относится к молекуле (молекулам) нуклеиновой кислоты, кодирующей тяжелую цепь и/или легкую цепь моноклонального антитела по настоящему изобретению или его антигенсвязывающего фрагмента.
Используемый в настоящей заявке термин «молекула нуклеиновой кислоты» охватывает молекулы ДНК (гДНК и кДНК) и РНК, а в молекуле нуклеиновой кислоты нуклеотид, который является основной единицей, также включает аналог, в котором модифицирован сахар или основная часть, а также природный нуклеотид. Последовательности молекул нуклеиновых кислот, кодирующих вариабельные области тяжелой цепи и легкой цепи по настоящему изобретению, могут быть модифицированы. Модификация включает вставки, делеции или неконсервативные или консервативные замены нуклеотидов.
Молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению интерпретируется как включающая также нуклеотидную последовательность, имеющую существенную идентичность нуклеотидной последовательности, описанной выше. Под существенной идентичностью понимается нуклеотидная последовательность, проявляющая по меньшей мере 80% гомологии, по меньшей мере 90% гомологии в одном конкретном примере, или по меньшей мере 95% гомологии в другом конкретном примере, когда нуклеотидная последовательность по настоящему изобретению выровнена так, чтобы соответствовать другой последовательность, насколько это возможно, и выровненную последовательность анализируют с использованием алгоритма, обычно применяемого в данной области техники.
В соответствии с примерным вариантом осуществления настоящего изобретения молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая легкую цепь моноклонального антитела по настоящему изобретению, может состоять из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 21, а молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая тяжелую цепь моноклонального антитела по настоящему изобретению, может состоять из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 22.
Согласно другому примерному варианту осуществления настоящего изобретения, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая тяжелую цепь моноклонального антитела по настоящему изобретению, может состоять из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 23, а молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая легкую цепь моноклонального антитела по настоящему изобретению, может состоять из нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 24.
Настоящее изобретение также относится к рекомбинантному вектору, который включает молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую тяжелую цепь, молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую легкую цепь в моноклональном антителе, или обе молекулы нуклеиновой кислоты.
Рекомбинантная векторная система по настоящему изобретению может быть сконструирована различными способами, известными в данной области техники. Вектор по настоящему изобретению обычно может быть сконструирован как вектор для клонирования или вектор для экспрессии. Кроме того, вектор по настоящему изобретению может быть сконструирован с использованием прокариотических или эукариотических клеток в качестве хозяина. Например, вектор по настоящему изобретению представляет собой вектор экспрессии, и когда прокариотические клетки используют в качестве хозяина, вектор обычно включает мощный промотор, способный выполнять транскрипцию (например, tac-промотор, lac-промотор, lacUV5-промотор, lpp-промотор, pLλ-промотор, pRλ-промотор, rac5-промотор, amp-промотор, recA-промотор, SP6-промотор, trp-промотор или Т7-промотор), участок связывания рибосомы для инициации трансляции и терминирующие последовательности транскрипции/трансляции. Когда E.coli (например, HB101, BL21, DH5α и т.д.) используют в качестве клетки-хозяина, промоторные и операторные области пути биосинтеза триптофана E.coli и промотор pLλ можно использовать в качестве регуляторных областей. Когда Bacillus используют в качестве клетки-хозяина, промотор гена токсичного белка Bacillus thuringiensis или любой промотор, способный экспрессироваться в Bacillus, может использоваться в качестве регуляторной области.
Между тем, рекомбинантный вектор по настоящему изобретению может быть получен путем манипулирования плазмидой, используемой в данной области техники (например, pCL, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, серии pGEX, серии pET или pUC19), фагом (например, λgt4 • λB, λ-Charon, λΔz1 или M13) или вирусом (например, SV40).
Когда вектор по настоящему изобретению представляет собой вектор экспрессии, а в качестве хозяина используют эукариотические клетки, вектор обычно имеет промотор, полученный из генома клеток млекопитающих (например, промотор металлотионина, промотор β-актина, промотор гемоглобина человека или промотор креатина мышц человека) или промотор, полученный из вируса млекопитающего (например, поздний промотор аденовируса, промотор вируса коровьей оспы 7.5K, промотор SV40, промотор цитомегаловируса (CMV), промотор tk HSV, промотор вируса опухоли молочной железы мыши (MMTV), промотор LTR ВИЧ, промотор вируса Молони, промотор вируса Эпштейна-Барр (EBV) или промотор вируса саркомы Рауса (RSV)) и последовательность полиаденилирования в качестве последовательности терминации транскрипции.
Рекомбинантный вектор по настоящему изобретению может быть гибридизирован с другой последовательностью, чтобы облегчить очистку антитела, экспрессированного из рекомбинантного вектора. Гибридной последовательностью может быть, например, глутатион-S-трансфераза (Amersham Pharmacia Biotech, США); мальтозо-связывающий белок (NEB, США); FLAG (IBI, США); последовательность метки, такая как 6x His (гексагистидин; Qiagen, США), Pre-S1 или c-Myc; или лидирующая последовательность, такая как ompA или pelB. Кроме того, поскольку белок, экспрессируемый из вектора по настоящему изобретению, представляет собой антитело, экспрессированное антитело может быть легко очищено с использованием колонки с белком А без дополнительной последовательности для очистки.
Между тем, рекомбинантный вектор по настоящему изобретению включает ген устойчивости к антибиотикам, обычно используемый в данной области техники в качестве селективного маркера, например, ген устойчивости к ампициллину, гентамицину, карбенициллину, хлорамфениколу, стрептомицину, канамицину, генетицину, неомицину или тетрациклину.
Вектор, экспрессирующий антитело по настоящему изобретению, может представлять собой векторную систему, экспрессирующую как легкую цепь, так и тяжелую цепь с использованием одного вектора, или векторной системы, соответственно экспрессирующей легкую цепь и тяжелую цепь, используя два вектора. В последнем случае два вектора вводят в клетки-хозяева путем совместной трансформации и направленной трансформации. Совместная трансформация представляет собой метод отбора клеток, экспрессирующих как легкую, так и тяжелую цепь, после введения в клетки-хозяева векторных ДНК, соответственно кодирующих легкую цепь и тяжелую цепь. Направленная трансформация представляет собой метод отбора клеток, трансформированных вектором, включающим легкую цепь (или тяжелую цепь), трансформации выбранных клеток, экспрессирующих легкую цепь, вектором, включающим тяжелую цепь (или легкую цепь), и наконец, отбора клеток, экспрессирующих как легкую цепь, так и тяжелую цепь.
Настоящее изобретение также относится к клеткам-хозяевам, включающим рекомбинантный вектор по настоящему изобретению. Клетки-хозяева представляют собой клетки, трансформированные рекомбинантным вектором по настоящему изобретению. Клетки-хозяева, способные стабильно и непрерывно клонировать и экспрессировать вектор по настоящему изобретению, могут представлять собой любые клетки-хозяева, известные в данной области техники, и включают прокариотические клетки-хозяева, например, Bacillus sp., такие штаммы, как Escherichia coli, Bacillus subtilis и Bacillus thuringiensis, Streptomyces, Pseudomonas (например, Pseudomonas putida), Proteus mirabilis или Staphylococcus (например, Staphylococcus carnosus), но настоящее изобретение ими не ограничивается.
В качестве эукариотических клеток-хозяев, подходящих для вектора, могут применяться многоклеточные грибы, такие как штаммы Aspergillus sp., принадлежащие к типу Ascomycota и Neurospora crassa, и одноклеточные грибы, содержащие ферменты, такие как дрожжи, такие как Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae и Schizosaccharomyces, другие клетки низших эукариот, клетки высших эукариот, такие как клетки, полученные от насекомых, и клетки, полученные от растений или млекопитающих.
4
2
Используемый в настоящей заявке термин «трансфекция» относится к введению представляющего интерес гена в клетки-хозяева с использованием рекомбинантного вектора по настоящему изобретению, и используется в том же значении, что и «трансформация». Следовательно, «трансфекция» и/или «трансформация» в клетки-хозяева может быть выполнена с помощью подходящей стандартной технологии, известной в данной области техники, в соответствии с клетками-хозяевами, включая способы введения нуклеиновой кислоты в организм, клетки, ткань или орган. Такие способы включают электропорацию, слияние протопластов, осаждение фосфатом кальция (CaPO), осаждение хлоридом кальция (CaCl), перемешивание с использованием волокна из карбида кремния; трансформацию, опосредованную агробактериями, ПЭГ, декстрансульфатом, липофектамином, и трансформацию, опосредованную сушкой/ингибированием, но настоящее изобретение не ограничено этим.
Настоящее изобретение также относится к способу получения моноклонального антитела, специфически связывающегося с тиоредоксином-1, или его антигенсвязывающего фрагмента, который включает культивирование клеток-хозяев.
Культивирование клеток-хозяев для получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента можно проводить в подходящей среде, известной в данной области техники, в условиях культивирования. Процесс культивирования может быть легко отрегулирован в соответствии со штаммом рядовым специалистом в данной области техники. Клеточную культуру классифицируют на суспензионную культуру или зависимую от прикрепления культуру, в зависимости от способа выращивания, и периодическую культуру, культуру с подпиткой или непрерывную культуру в соответствии с методом культивирования. Среда, используемая в культуре, должна удовлетворять требованиям для конкретных штаммов.
Среда, используемая в культуре клеток животных, включает различные источники углерода, источники азота и микроэлементы. Примерами источников углерода, используемых в настоящей заявке, могут быть углеводы, такие как глюкоза, сахароза, лактоза, фруктоза, мальтоза, крахмал и целлюлоза; липиды, такие как соевое масло, подсолнечное масло, касторовое масло и кокосовое масло; жирные кислоты, такие как пальмитиновая кислота, стеариновая кислота и линолевая кислота; спирты, такие как глицерин и этанол; и органические кислоты, такие как уксусная кислота. Эти источники углерода могут использоваться независимо или в комбинации. Примеры используемых в настоящей заявке источников азота включают органические источники азота, такие как пептоны, дрожжевые экстракты, говяжий бульон, солодовые экстракты, кукурузный экстракт (CSL) и порошок соевых бобов, и неорганические источники азота, такие как мочевина, сульфат аммония, хлорид аммония, фосфат аммония, карбонат аммония и нитрат аммония. Эти источники азота могут использоваться независимо или в комбинации. Среда может включать дигидрофосфат калия, гидрофосфат дикалия и соответствующую натрийсодержащую соль в качестве источника фосфора. Кроме того, среда может содержать соль металла, такую как сульфат магния или сульфат железа. Кроме того, могут быть включены аминокислота, витамин и подходящий предшественник.
Во время культивирования соединения, такие как гидроксид аммония, гидроксид калия, аммиак, фосфорная кислота и серная кислота, могут быть добавлены в клеточную культуру подходящим способом для регулирования рН клеточной культуры. Кроме того, образование пузырьков может быть ингибировано с использованием противовспенивающего агента, такого как сложный эфир полигликоля жирной кислоты, во время культивирования. Кроме того, для поддержания аэробного состояния культуры клеток в клеточную культуру вводят кислород или кислородсодержащий газ (например, воздух). Температура культуры клеток обычно составляет от 20 до 45°С, а предпочтительно от 25 до 40°С.
Антитело, полученное путем культивирования клеток-хозяев, может быть использовано без очистки, или может быть использовано путем очистки с высокой степенью чистоты с использованием различных традиционных методов, например, диализа, солевого осаждения и хроматографии. Среди этих методов наиболее широко используется хроматография, и типы и порядок колонок могут быть выбраны для ионообменной хроматографии, эксклюзионной хроматографии или аффинной хроматографии в соответствии с характеристикой антитела или метода культивирования.
Настоящее изобретение обеспечивает набор для диагностики рака молочной железы, который включает моноклональное антитело по настоящему изобретению или его антигенсвязывающий фрагмент, и способ получения информации, необходимой для диагностики рака молочной железы, с его использованием.
Используемый в настоящей заявке термин «диагностика» относится к подтверждению наличия или особенности патологического состояния. Для целей настоящего изобретения диагностика заключается в подтверждении того, присутствует ли рак молочной железы или нет.
Белок тиоредоксин-1 является диагностическим маркером рака молочной железы и характеризуется высокой экспрессией в ткани рака молочной железы по сравнению с нормальной тканью молочной железы.
В соответствии с примерным вариантом осуществления настоящего изобретения диагностический набор для диагностики рака молочной железы может представлять собой набор для иммуноферментного анализа (ИФА), и предпочтительно один или более из группы, состоящей из прямого ИФА, непрямого ИФА, прямого сэндвич-ИФА и непрямого сэндвич-ИФА. В примерном варианте осуществления настоящего изобретения два типа антител, включенных в набор сэндвич-ИФА включают моноклональное антитело B266-1 в качестве покрывающего антитела, и моноклональное антитело B264 в качестве идентифицирующего антитела.
Набор для диагностики рака молочной железы по настоящему изобретению может дополнительно включать средство или реагент, известный в данной области техники, который используется в иммунологическом анализе, в дополнение к антителу против Trx1.
Здесь иммунологический анализ может быть проведен любым из способов, способных измерить связывание антитела с антигеном. Такие способы, известные в данной области техники, включают, например, вестерн-блоттинг, ИФА, радиоиммунопреципитацию, радиальную иммунодиффузию, иммунофлуоресцентный анализ, иммуноблоттинг, иммунодиффузию по Оухтерлони, ракетный иммуноэлектрофорез, иммуногистохимическое окрашивание, иммунопреципитационный анализ, реакцию связывания комплемента, FACS (клеточную сортировку с активацией флуоресценции) и анализ на белковых чипах, но настоящее изобретение этим не ограничивается.
В качестве инструмента или реагента, используемого в иммунологическом анализе, могут быть включены подходящий носитель или подложка, маркер, способный генерировать выявляемый сигнал, солюбилизатор, чистящий агент или стабилизатор. Когда маркер представляет собой фермент, подходящие носители включают субстрат, способный измерять активность фермента, подходящий буферный раствор, вторичное антитело, меченное хромогенным ферментом или флуоресцентным материалом, хромогенный субстрат или агент, останавливающий реакцию, но настоящее изобретение не ограничивается этим.
Антитело против Trx1, включенное в набор по настоящему изобретению, предпочтительно фиксируют на подходящем носителе или подложке, используя различные способы, раскрытые в документе, и примеры подходящих носителей и подложек включают фосфатно-солевой буферный раствор, полистирол, полиэтилен, полипропилен, полиэфир, полиакрилонитрил, фторсодержащую смолу, агарозу, целлюлозу, нитроцеллюлозу, декстран, сефадекс, сефарозу, липосому, карбоксиметилцеллюлозу, полиакриламид, полистирол, габбро, фильтровальную бумагу, ионообменную смолу, пластиковую пленку, пластиковую пробирку, сополимер полиамин-метил-винилового эфира малеиновой кислоты, сополимер аминокислоты, сополимер этилена и малеиновой кислоты, нейлон, металл, стекло, стеклянную гранулу и магнитную частицу. Другие твердые подложки включают планшет для культивирования клеток, планшет для ИФА, пробирку и полимерную пленку. Подложка может иметь любую возможную форму, например, сферическую (гранула), цилиндрическую (пробирка или внутренняя часть лунки) или плоскую (лист или тест-полоска) форму.
3
14
32
35
36
51
57
58
59
90
125
131
186
Маркер, способный генерировать выявляемый сигнал, способен качественно или количественно измерять образование комплекса антиген-антитело и может представлять собой, например, фермент, флуоресцентный материал, лиганд, светящийся материал, микрочастицу, окислительно-восстановительную молекулу или радиоизотоп. В качестве фермента можно использовать β-глюкуронидазу, β-D-глюкозидазу, уреазу, пероксидазу (например, пероксидазу хрена), щелочную фосфатазу, ацетилхолинэстеразу, глюкозооксидазу, гексокиназу, малатдегидрогеназу, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, инвертазу или люциферазу. В качестве флуоресцентного материала можно использовать флуоресцеин, изотиоцианат, родамин, фикоэритрин, фикоцианин, аллофикоцианин или флуоресцеин изотиоцианат. В качестве лиганда можно использовать производное биотина, а в качестве светящегося материала можно использовать сложный эфир акридиния или люциферин. В качестве микрочастицы можно использовать коллоидное золото или окрашенный латекс, а в качестве окислительно-восстановительной молекулы могут быть использованы ферроцен, рутениевый комплекс, виологен, хинон, ион Ti, ион Cs, диимид, 1,4-бензохинон или гидрохинон. В качестве радиоизотопа можно использовать H, C, P, S, Cl, Cr, Co, Co, Fe, Y, I, I или Re. Однако кроме материалов, перечисленных выше, может быть использован любой, который может применяться в иммунологическом анализе.
В качестве хромогенного субстрата для фермента, например, когда в качестве ферментного маркера выбрана пероксидаза хрена (HRP), в качестве субстрата может быть использован раствор, содержащий 3-амино-9-этилкарбазол, 5-аминосалициловую кислоту, 4-хлор-1-нафтол, о-фенилендиамин, 2,2'-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфокислоту), 3,3-диаминобензидин, 3,3',5,5'-тетраметилбензидин, о-дианизидин или 3,3-диметоксибензидин. Кроме того, когда щелочная фосфатаза выбрана в качестве ферментного маркера, в качестве субстрата можно использовать раствор, содержащий 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат, нитросиний тетразолий или п-нитрофенилфосфат. Кроме того, когда β-D-галактозидаза выбрана в качестве ферментного маркера, в качестве субстрата можно использовать раствор, содержащий о-нитрофенил-β-D-галактозид или 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-галактопиранозид. Кроме них, могут быть использованы различные ферменты и хромогенные вещества для ферментов, которые известны в данной области техники.
Согласно примерному варианту осуществления настоящего изобретения, способ получения информации, необходимой для диагностики рака молочной железы по настоящему изобретению, может быть выполнен с помощью следующих этапов:
(а) обеспечение контакта любого одного типа моноклонального антитела по настоящему изобретению или его антигенсвязывающего фрагмента с биологическим образцом, выделенным от субъекта с подозрением на наличие рака молочной железы;
(b) измерение уровня экспрессии белка тиоредоксина-1, связывающегося с моноклональным антителом или его антигенсвязывающим фрагментом в биологическом образце посредством образования комплекса антиген-антитело; а также
(c) сравнение уровня экспрессии белка тиоредоксина-1, измеренного на стадии (b), с уровнем контроля, и если уровень экспрессии белка выше, чем в контроле, определение субъекта как пациента, страдающего раком молочной железы.
Согласно другому примерному варианту осуществления настоящего изобретения способ получения информации, необходимой для диагностики рака молочной железы по настоящему изобретению, может быть выполнен со следующими этапами:
(а) покрытие твердой подложки моноклональным антителом или его антигенсвязывающим фрагментом по п.п.2, 4 или 6;
(b) нанесение биологического образца, выделенного от субъекта с подозрением на наличие рака молочной железы, на твердую подложку с покрытием;
(с) удаление несвязанного образца;
(d) нанесение моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по п.п.1, 3 или 5 на твердую подложку;
(е) удаление несвязанного моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента;
(f) измерение уровня экспрессии белка тиоредоксина-1; и
(g) сравнение уровня экспрессии белка тиоредоксина-1, измеренного на этапе (f), с контролем, и если уровень экспрессии белка выше, чем в контроле, определение субъекта как страдающего раком молочной железы.
Используемый в настоящей заявке термин «выделенный биологический образец» включает ткань (ткань молочной железы), клетки (клетки молочной железы), цельную кровь, плазму, сыворотку, кровь, слюну, синовиальную жидкость, мочу, мокроту, лимфатическую жидкость, спинномозговую жидкость, образец аутопсии ткани (мозга, кожи, лимфатических узлов, спинного мозга или тому подобного), надосадочную жидкость клеточной культуры или разрушенные эукариотические клетки, которые отличаются по уровню экспрессии белка Trx1, который является маркером рака молочной железы, и включает образец, полученный из первичной опухоли или метастатической опухоли. Эти биологические образцы, которыми манипулируют или не манипулируют, могут реагировать с моноклональным антителом по настоящему изобретению для подтверждения уровня экспрессии белка Trx1.
Используемый в настоящей заявке термин «субъект» включает млекопитающих, включая корову, свинью, овцу, курицу, собаку и человека, птиц и т.д., и любого субъекта, у которого подозревают наличие рака молочной железы, не ограничиваясь этим.
Далее настоящее изобретение будет подробно описано со ссылкой на примеры, чтобы помочь в понимании настоящего изобретения. Однако примеры согласно настоящему изобретению могут быть модифицированы во множестве различных форм, и не следует истолковывать, что объем настоящего изобретения ограничен следующими примерами. Примеры из настоящего изобретения предоставлены для более полного объяснения настоящего изобретения специалистам в данной области техники.
Примеры
Пример 1
Приготовление антигена человеческого тиоредоксина-1 (Trx1)
1-1. Получение вектора экспрессии Trx1
Ген был синтезирован на основе использования кодона E.coli для экспрессии гена, кодирующего белок тиоредоксина-1 человека, в E.coli. Последовательность синтезированного гена тиоредоксина-1 человека показана в таблице 1 ниже.
Таблица 1
Последовательность праймера, используемого для амплификации гена человеческого тиоредоксина-1, показана в таблице 2 ниже.
Таблица 2
Для амплификации гена для клонирования в плазмиде была проведена полимеразная цепная реакция (ПЦР). 10 пмоль гена, синтезированного в качестве матрицы, 10 пмоль каждого из праймеров (hTrx1-For и hTrx1-Rev), dNTP (по 2,5 мМ), полимеразу Exprime taq и буферный раствор перемешивали. Реакцию в этом растворе проводили в течение 35 циклов при 95°С в течение 2 минут, при 95°С в течение 30 секунд, при 55°С в течение 30 секунд и при 70°С в течение 20 секунд, и далее при 70°С в течение 2 минут, а затем реакцию останавливали. Амплифицированный ген очищали, а затем для клонирования участка EcoRV, присутствующего в участке множественного клонирования (MCS) плазмиды pUC57, плазмиду обрабатывали соответствующей рестриктазой и очищали. Плазмиду, обработанную очищенным геном и рестриктазу, лигазу и буферный раствор смешали и проводили реакцию. Для трансформации E.coli DH5α с помощью плазмиды компетентную клеточную линию DH5α E.coli нагревали при 4°С, смешивали с раствором, смешанным с плазмидой, и проводили реакцию при 4°С в течение 30 минут. После реакции клетки подвергали тепловому шоку при 42°С в течение 30 с, стабилизировали при 4°С в течение 2 мин, распределяли на твердой среде Луриа-Бертани (LB), содержащей антибиотик (50 мкг/мл ампициллина) до однородной абсорбции, и культивировали при 37°С в течение 16 часов или более. Плазмиду с геном тиоредоксина-1 человека подвергали скринингу из колоний, выращенных в культуральной среде.
1-2. Экспрессия и очистка Trx1
Скринированную плазмиду, содержащую ген тиоредоксина-1 человека, очищали, а затем для экспрессии белка штамм E.coli BL21 трансформировали очищенной плазмидой в соответствии со способом, описанным выше. Для экспрессии белка тиоредоксина-1 из трансформированного штамма штамм культивировали в бульоне LB, содержащем антибиотик, до ОП600 = 0,5 при 37°С и дополнительно культивировали в течение 3 часов, добавляя изопропил-β-D-тиогалактопиранозид (IPTG) до концентрации 1 мМ. Затем проводили ДСН-ПАГЭ для подтверждения экспрессии белка. Для очистки белка полученную клеточную линию разрушали с помощью ультразвука и затем центрифугировали (12000 об./мин, 30 мин, 4°С), получая таким образом надосадочную жидкость. Коммерческое антитело против тиоредоксина I (LF-MA0055, Abfrontier) добавляли к полученной надосадочной жидкости для связывания с экспрессированным тиоредоксином-1, белок A/G PLUS-агарозу (sc-2003, Santa Cruz), которая связывалась с антителом, добавляли для реакции с ним, а затем проводили центрифугирование и очистку. После этого чистота и молекулярная масса полученного продукта были подтверждены с помощью ДСН-ПАГЭ.
Пример 2
Получение и очистка Trx1-специфического моноклонального антитела.
2-1. Иммунизация мышей
Очищенный белок тиоредоксина-1 человека смешивали с адъювантом, а затем вводили мышам (BALB/c), и кровь мышей собирали и подвергали ИФА для подтверждения продукции антител. После двух иммунизаций было подтверждено, что титр антител (1:5000) увеличивается должным образом.
2-2. Гибридизация клеток и получение гибридомы
В-лимфоциты выделяли из селезенки, полученной у иммунизированной мыши, и гибридизировали с культивируемыми клетками миеломы (sp2/0). Гибридизированные клетки культивировали в среде (среда НАТ), содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин, и клетки (гибридомы), в которых гибридизированы только миеломная клетка и В-лимфоцит, избирательно культивировали.
2-3. Отбор клеток гибридомы, продуцирующих Trx1-специфическое моноклональное антитело
В полученных клетках гибридомы три типа антител, которые реагируют с человеческим белком тиоредоксин-1, были подтверждены с помощью ИФА. Гибридома, продуцирующая антитело, которое реагирует с антигеном, была выбрана из ИФА-положительных клеток с использованием метода лимитирующих разведений.
2-4. Получение и очистка моноклональных антител
Полученные три типа гибридом вводили мышам, а затем асцитическую жидкость получали от каждой мыши и очищали с использованием аффинной хроматографии с белком А. Очищенное антитело идентифицировали с помощью ДСН-ПАГЭ.
Пример 3
Идентификация изотипа моноклонального антитела
Три изотипа антител, полученные в примере 2, были подтверждены с использованием набора для изотипирования моноклональных антител мыши Rapid ELISA (Pierce, Cat. 37503).
В результате, как показано на Фиг.1(b), было подтверждено, что тяжелая цепь моноклонального антитела 2B4 представляет собой IgG1, тяжелая цепь моноклонального антитела 8F3 представляет собой IgG12a, а тяжелая цепь моноклонального антитела 9G7 представляет собой IgG2b, и все легкие цепи представляют собой каппа типы.
Пример 4
Анализы аминокислотных последовательностей моноклональных антител 9G7 (AB1) и 2B4 (AB2)
Были проанализированы аминокислотные последовательности тяжелой цепи и легкой цепи моноклональных антител 9G7 (AB1) и 2B4 (AB2) трех типов моноклональных антител, полученных в примере 2. В качестве последовательности, способной к слиянию с Fc областью, которая подходит для обратной трансляции и экспрессии рекомбинации, была определена аминокислотная последовательность. Последовательность, определенную выравниванием гэпа IMTG, выравнивали, и гипермутированные и полные части CDR3 были найдены с использованием таблицы гипермутации. Последовательности были идентифицированы с использованием точных карт масс пептидов (фиг. 2 и 3), а гипермутация и CDR3 были подтверждены с использованием спектров МС/МС.
Пример 5
Сравнение аффинности и определение антител с помощью ИФА
Положение, доступное для гипермутации, определяли в аминокислотной последовательности, полученной с помощью вышеописанного процесса, и следовательно, гены были синтезированы путем изменения аминокислотных последовательностей четырех типов (B266, B297, B268 и B269) из 9G7 (AB1) и двух типов (B264 и B265) 2B4 (AB2). Шесть типов антител, полученных выше (B264-B269), были экспрессированы, и затем с помощью ИФА было подтверждено сродство каждого антитела к антигену (числа после «Т» в таблицах 3-5 представляют номера производственных серий, соответственно).
Аффинность к трем типам антигенов, то есть к депротеинизированному Trx1, Fc-связывающему Trx1 (Trx1-Fc) и His-меченному Trx1 (Trx1-His), определяли с помощью прямого ИФА, и результаты последовательно показаны в таблицах 3-5. Как показано в таблицах 3-5, B264 в виде IgG1(κ) и B266 в виде IgG2b (κ) проявляли наибольшую аффинность к трем типам антигенов.
Таблица 3
Результаты реакции на депротеинизированные антигены Trx1
Таблица 4
Результаты реакции на Trx1-Fc антигены
Таблица 5
Результаты реакции на Trx1-His антигены
Аминокислотные последовательности антител в264 и в266 с высокой аффинностью показаны в таблице 6 ниже.
Таблица 6
Пример 6
Получение антител B264 и B266
6-1. Приготовление плазмид, экспрессирующих антитела B264 и B266
Поскольку аминокислотные последовательности антител B264 и B266 идентифицированы, как показано в таблице 6, гены, соответствующие легкой и тяжелой цепям соответствующих антител, могут быть химически синтезированы. Синтезированные генные последовательности приведены в таблице 7 ниже. Синтезированные гены были клонированы в pcDNA3.0.
Таблица 7
6-2. Экспрессия и очистка антител B264 и B266
Клеточную линию HEK293 совместно трансфицировали с pcDNA3-SSJ11-L и pcDNA3-SSJ11-H для экспрессии антитела B264, или pcDNA3-SSJ12-L и pcDNA3-SSJ12-H для экспрессии антитела B266 и культивировали в течение 7 дней. Клеточную линию культивировали, и рекомбинантные моноклональные антитела, секретируемые в культуральную среду, собирали и очищали с помощью хроматографии на носителе с белком А. Элюент, содержащий рекомбинантные моноклональные антитела, концентрировали ультрафильтрацией, и антитела получали с высокой чистотой с использованием стерильного фильтра 0,2 мкм.
Чистоту и размер очищенных антител определяли с помощью ДСН-ПАГЭ. В результате ДСН-ПАГЭ, как показано на фиг.6, было подтверждено, что антитела B264 и B266 экспрессируются с размерами, например, 47 кДа для тяжелой цепи и 25 кДа для легкой цепи в восстанавливающих условиях, и 150 кДа в невосстанавливающих условиях, позволяя предположить, что размеры соответствуют оценочным размерам.
Пример 7
Подтверждение конъюгации двух типов моноклональных антител, полученных с помощью сэндвич-ИФА
2
3
3
3
100 мкл буфера для покрытия (0,015 М NaCO, 0,035 М NaHCO, 0,003 М NaN, pH 9,6) и 100 нг антитела для покрытия (B266) смешивали и распределяли в каждую лунку, и реакцию O/N проводили при 4°С. Распределяли 200 мкл 1% БСА-содержащего ФБР (PBSA; блокирующий буфер) на лунку и подвергали реакции при комнатной температуре в течение 60 минут. После этого вводили 20 мкл антигена (50; 25; 12,5 или 0 нг), 80 мкл детектирующего антитела (меченного биотином B264; B264-B), проводили реакцию полученной смеси при 37°С в течение 90 минут. Реакционный раствор удаляли, и промывание осуществляли путем распределения 200 мкл ФБР, содержащего 0,05% Твин 20 (PBST; промывочный буфер), в каждую лунку. Вышеописанный процесс выполняли трижды.
100 мкл стрептавидина-HRP, разведенного 1:200, добавляли в каждую лунку, и проводили реакцию при 37°С в течение 30 минут. После того, как реакционный раствор был удален, промывание осуществляли путем распределения 200 мкл ФБР, содержащего 0,05% Твин 20 (PBST; промывочный буфер), в каждую лунку. Вышеописанный процесс выполняли трижды.
2
4
По 100 мкл раствора ТМВ распределяли в каждую лунку и проводили реакцию в темноте при комнатной температуре в течение 10 минут; 100 мкл 2,5 М раствора серной кислоты (HSO; останавливающий буфер) добавляли в каждую лунку, и результат оценивали при 450 нм.
В результате, как показано в таблице 8, значение реакции увеличивается в зависимости от концентрации антигена, что свидетельствует об обнаружении антигена этими антителами. Тем не менее, так как значение ОП является высоким, когда нет антигена, необходим эксперимент по улучшению производительности с использованием антител.
Таблица 8
Сэндвич-ИФА с использованием B266 в качестве покрывающего антитела и B264 в качестве идентифицирующего антитела
Trx1 (нг/мл)
0
12,5
25
50
ОП<sub>450нм</sub>
0,828
1,226
1,506
2,257
Пример 8
Изменение изотипа Fc-части для улучшения эффективности антител
Поскольку система экспрессии антитела является временной трансфекцией с использованием рекомбинантной плазмиды, а не гибридомы, среди этих рекомбинантных плазмид плазмиду, имеющую тяжелую цепь, совместно трансфицировали с плазмидой, имеющей другой изотип тяжелой цепи. То есть плазмида, имеющая ген, кодирующий другую тяжелую цепь, а не pcDNA3-SSJ12-H из pcDNA3-SSJ12-L и pcDNA3-SSJ12-H, использованных для экспрессии 9G7 (AB1), была котрансфицирована.
Антитело (B266-1), в котором Fc-часть B266 заменена на человеческий IgG1, было получено вышеописанным способом. Характеристики антитела были определены с помощью ДСН-ПАГЭ (фиг.7).
Аминокислотные последовательности CDR1-CDR3 легких цепей и CDR1-CDR3 тяжелых цепей окончательно выбранных моноклональных антител B264 и B266-1 показаны в таблице 9, а аминокислотные последовательности вариабельных областей легкой цепи и вариабельных областей тяжелой цепи показаны в таблице 10.
Таблица 9
Аминокислотная последовательность
B264 легкая цепь CDR1
SRISYM (SEQ ID NO: 1)
B264 легкая цепь CDR2
DTS (SEQ ID NO: 2)
B264 легкая цепь CDR3
HQRSSYP (SEQ ID NO: 3)
B264 тяжелая цепь CDR1
GFNIKDTF (SEQ ID NO: 4)
B264 тяжелая цепь CDR2
IDPANGNT (SEQ ID NO: 5)
B264 тяжелая цепь CDR3
A (SEQ ID NO: 6)
B266-1 легкая цепь CDR1
QSIVHSNGNTY (SEQ ID NO: 7)
B266-1 легкая цепь CDR2
KVS (SEQ ID NO: 8)
B266-1 легкая цепь CDR3
FQGSHVP (SEQ ID NO: 9)
B266-1 тяжелая цепь CDR1
GFNIKDTF (SEQ ID NO: 10)
B266-1 тяжелая цепь CDR2
IDPANGNT (SEQ ID NO: 11)
B266-1 тяжелая цепь CDR3
A (SEQ ID NO: 12)
Таблица 10
Аминокислотная последовательность
B264вариабельная область легкой цепи
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSRISYMYWYQQKPGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISTMEAEDAATYYCHQRSSYP (SEQ ID NO: 13)
B264Вариабельная область тяжелой цепи
EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKDTFMHWVKQRPEQGLEWIGRIDPANGNTKYDPKFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSED TAVYYCA (SEQ ID NO:14)
B266-1Вариабельная область легкой цепи
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVP (SEQ ID NO:15)
B266-1Вариабельная область тяжелой цепи
EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTASGFNIKDTFMHWVKQRPEQGLEWIGRIDPANGNTKYDPKFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCA (SEQ ID NO:16)
Пример 9
Подтверждение конъюгации моноклональных антител B266-1 и B264, полученных с помощью сэндвич-ИФА
100 мкл буфера для покрытия и 100 нг антитела для покрытия (B266-1) смешивали и распределяли в каждую лунку, и реакцию O/N проводили при 4°С. Промывание осуществляли путем добавления 200 мкл промывочного буфера. Вышеописанный процесс выполняли два раза.
По 200 мкл PBSA распределяли в каждую лунку, и проводили реакцию при комнатной температуре в течение 120 минут, а затем добавляли 20 мкл антигена (25 или 0 нг), 80 мкл детектирующего антитела (B264-B), и реакцию проводили при 37°С в течение 90 минут. Реакционный раствор удаляли, а затем проводили промывание путем добавления 200 мкл промывочного буфера в каждую лунку. Вышеописанный процесс выполняли трижды.
100 мкл стрептавидина-HRP, разведенного 1:200, добавляли в каждую лунку, реакцию проводили при 37°С в течение 30 минут, реакционный раствор удаляли, а затем проводили промывание, добавляя 200 мкл промывочного буфера в каждую лунку. Вышеописанный процесс выполняли трижды.
100 мкл раствора ТМВ добавляли в каждую лунку, реакцию проводили в темных условиях при комнатной температуре в течение 10 минут, 100 мкл останавливающего буфера добавляли в каждую лунку, и результат оценивали при 450 нм.
В результате, как показано в таблице 11, было подтверждено, что антитела соответствующим образом реагируют с антигенами, и значение холостой пробы уменьшилось по сравнению с антителами, использованными в примере 6.
Таблица 11
Сэндвич-ИФА с использованием B266-1 в качестве покрывающего антитела и B264 в качестве идентифицирующего антитела
Trx1 (нг/мл)
0
25
ОП<sub>450нм</sub>
0,425
0,415
1,571
1,426
Пример 10
Анализ аффинности моноклонального антитела к антигену
Два типа моноклональных антител, специфически действующих на антиген Trx1, были экспрессированы с использованием системы временной трансфекции с применением плазмиды, и таким образом, стабильно продуцировались. Чтобы подтвердить аффинность к антигену, анализ проводили с помощью ИФА (фигура 8 (а)).
100 мкл буфера для покрытия и 100 нг Trx1 смешивали и распределяли в каждую лунку, а затем проводили реакцию при 4°С в течение 16 часов или более. После удаления реакционного раствора 200 мкл PBSA распределяли в каждую лунку и проводили реакцию при 37°С в течение 120 минут. После удаления реакционного раствора полученное антитело B266-1 или B264 разводили в 1/5 от 0,1 мкМ и распределяли в каждую лунку по 100 мкл, а затем проводили реакцию при 37°С в течение 120 минут. После того, как реакционный раствор был удален, промывание осуществляли путем добавления 200 мкл промывочного буфера в каждую лунку. Вышеописанный процесс выполняли два раза.
Проводили реакцию 100 мкл конъюгата человеческой IgG-HRP (разведенного до 1: 4000) в качестве антитела B266-1 с 100 мкл мышиного IgG-HRP (разведенного до 1: 4000) в качестве антитела B264 при 37°С в течение 60 минут. После того, как реакционный раствор был удален, промывание осуществляли путем добавления 200 мкл промывочного буфера в каждую лунку. Вышеописанный процесс выполняли трижды.
100 мкл раствора ТМВ распределяли в каждую лунку, реакцию проводили в темных условиях при комнатной температуре в течение 10 минут, добавляли 100 мкл останавливающего буфера в каждую лунку, и результат оценивали при 450 нм. Полученные значения анализировали с использованием Prism (Graphpad) (фиг. 8 (b)).
D
D
D
D
-11
-10
-10
-12
В результате анализа аффинности покрывающего антитела B266-1 и идентифицирующего антитела B264 было подтверждено, что величина для холостой пробы является высокой из-за реакционной способности B266-1, но для B266-1 и B264 увеличивается степень связывания в соответствии с повышением концентрации антигена. Это показывает, что B266-1 и B264 связаны с антигеном. Когда значение равновесной константы диссоциации (K) вычисляли посредством анализа с использованием программы Prism, значение K B266-1 составило 1,1х10, а K B264 составило 1,3х10. Когда значение K находилось между 10 и 10, было оценено, что антитело имеет пикомолярный (пМ) уровень чувствительности к антигену, что свидетельствовало, что B266-1 и B264 имеют высокий уровень чувствительности к антигену.
Пример 11
Сэндвич-ИФА сыворотки крови больного раком молочной железы
Сэндвич-ИФА с использованием антитела для покрытия (B266-1) готовили следующим образом.
Раствор антител для покрытия 1 мкг/мл готовили добавлением 100 мл буфера для покрытия и 0,1 мл 1 мг/мл B266-1. 100 мкл приготовленного раствора антитела для покрытия наносили в каждую лунку 96-луночного планшета и проводили реакцию при 4°С в течение 12 часов. Раствор антител удаляли, и промывание осуществляли путем добавления 200 мкл 0,05% PBST в каждую лунку. Промывание проводили трижды. 200 мкл PBSA добавляли в каждую лунку, и реакцию (процесс блокирования) проводили при 4°С в течение 4 часов. PBSA удаляли, а затем 96-луночный планшет сушили в термогигростате (20°С, 30% ОВ) в течение 3 часов.
После этого идентифицирующее антитело (B264) биотинилировали следующим образом.
Диметилсульфоксид (ДМСО) смешивали с 20 мг/мл биотин-7-NHS, получая тем самым 2 мг/мл биотин-7-NHS. 15 мкл (30 мкг) 2 мг/мл биотин-7-NHS добавляли к 1 мг/мл антитела В264 и проводили реакцию при 15-25°С в течение 2 часов. Реакционный раствор добавляли в AMICON ultra-15 (Millipore), заполняли раствором PBS до конечного объема и центрифугировали при 3600хg до объема 0,5 мл. Процесс выполняли трижды. Раствор антител (биотинилированный B264; B264-B), оставшийся на фильтре AMICON, переносили в пробирку на 1,5 мл и заполняли PBSA до конечной концентрации 0,3 мг/мл.
Впоследствии детекцию человеческого антигена Trx1 из сыворотки крови пациента с раком молочной железы проводили следующим образом.
2
4
Стандартный раствор антигена распределяли в первый ряд 96-луночного планшета, покрытого антителом для покрытия. Добавляли 20 мкл сыворотки, полученной у пациентов с раком молочной железы, а затем добавляли 80 мкл (0,3 мг/мл) раствора B264-B. После этого, после реакции при 37°С в течение 60 минут, реакционный раствор антиген-антитело удаляли, а затем проводили промывание путем добавления 200 мкл PBST в каждую лунку. Процесс промывания был выполнен трижды. Добавляли 100 мкл разведения 1:400 стрептавидина-HRP (R & D Systems) и проводили реакцию при 37°С в течение 30 минут. После окончания реакции реакционный раствор удаляли и проводили промывание, добавляя 200 мкл PBST в каждую лунку. Процесс промывания выполняли трижды. Добавляли 100 мкл раствора ТМВ (Sure Blue), и реакцию проводили при комнатной температуре в течение 15 минут в темноте. Добавляли 100 мкл 2 н раствора HSO и измеряли поглощение при 450 нм с использованием ридера микропланшетов.
Наконец, проводили ROC-анализ следующим образом.
Чувствительность и специфичность рассчитывали путем анализа результатов ИФА с использованием моноклональных антител B266-1 и B264 против Trx1. Когда пороговое значение составляло 10,8 нг/мл, чувствительность составляла 93,0%, а специфичность составляла 97,4% (фиг. 9).
Пример 12
Сравнительный анализ с другим набором ИФА для диагностики рака молочной железы
В этом примере для оценки эффективности рекомбинантных моноклональных антител B266-1 и B264 проводили сравнительный анализ с другим набором ИФА для обнаружения другого биомаркера CA15-3 для диагностики рака молочной железы (таблица 12).
В результате, как показано в таблице 12, при использовании моноклонального антитела, специфически связывающегося с Trx1, чувствительность и специфичность были значительно выше, чем у CA15-3.
Таблица 12
Сравнение набора по настоящему изобретению с набором AxSYM CA15-3
Trx1
CA15-3 (AxSYM)
Чувствительность (%)
93
54
Специфичность (%)
97,4
94
Испытуемый образец
Сыворотка
Сыворотка и плазма
Промышленная применимость
Моноклональное антитело по настоящему изобретению обладает превосходной аффинностью связывания с тиоредоксином-1, таким образом, очень избирательно связывается с тиоредоксином-1, и обладает очень высокой чувствительностью и специфичностью, благодаря чему эффективно используется при скрининге пациентов с раком молочной железы. Кроме того, выявление тиоредоксина-1 с использованием моноклонального антитела, специфически связывающегося с тиоредоксином-1 по настоящему изобретению, а не обнаружение с использованием обычного диагностического биомаркера рака молочной железы CA15-3, демонстрирует исключительно высокую чувствительность и специфичность, а следовательно, точность и надежность диагностики рака молочной железы может быть значительно повышена, что свидетельствует о высокой промышленной применимости моноклонального антитела по настоящему изобретению.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  E&S Healthcare Co., Ltd.
<120>  MONOCLONAL ANTIBODY SPECIFICALLY BINDING TO THIOREDOXIN-1, AND
USE THEREOF
<130>  PCT5036720
<150>  KR 10-2016-0118053
<151>  2016-09-13
<160>  27
<170>  PatentIn version 3.2
<210>  1
<211>  6
<212>  PRT
<213>  Artificial
<220>
<223>  Light chain CDR1 of monoclonal antibody B264
<400>  1
Ser Arg Ile Ser Tyr Met
1               5
<210>  2
<211>  3
<212>  PRT
<213>  Artificial
<220>
<223>  Light chain CDR2 of monoclonal antibody B264
<400>  2
Asp Thr Ser
1
<210>  3
<211>  7
<212>  PRT
<213>  Artificial
<220>
<223>  Light chain CDR3 of monoclonal antibody B264
<400>  3
His Gln Arg Ser Ser Tyr Pro
1               5
<210>  4
<211>  8
<212>  PRT
<213>  Artificial
<220>
<223>  Heavy chain CDR1 of monoclonal antibody B264
<400>  4
Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Phe
1               5
<210>  5
<211>  8
<212>  PRT
<213>  Artificial
<220>
<223>  Heavy chain CDR2 of monoclonal antibody B264
<400>  5
Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr
1               5
<210>  6
<211>  1
<212>  PRT
<213>  Artificial
<220>
<223>  Heavy chain CDR3 of monoclonal antibody B264
<400>  6
Ala
1
<210>  7
<211>  11
<212>  PRT
<213>  Artificial
<220>
<223>  Light chain CDR1 of monoclonal antibody B266-1
<400>  7
Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
1               5                   10
<210>  8
<211>  3
<212>  PRT
<213>  Artificial
<220>
<223>  Light chain CDR2 of monoclonal antibody B266-1
<400>  8
Lys Val Ser
1
<210>  9
<211>  7
<212>  PRT
<213>  Artificial
<220>
<223>  Light chain CDR3 of monoclonal antibody B266-1
<400>  9
Phe Gln Gly Ser His Val Pro
1               5
<210>  10
<211>  8
<212>  PRT
<213>  Artificial
<220>
<223>  Heavy chain CDR1 of monoclonal antibody B266-1
<400>  10
Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Phe
1               5
<210>  11
<211>  8
<212>  PRT
<213>  Artificial
<220>
<223>  Heavy chain CDR2 of monoclonal antibody B266-1
<400>  11
Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr
1               5
<210>  12
<211>  1
<212>  PRT
<213>  Artificial
<220>
<223>  Heavy chain CDR3 of monoclonal antibody B266-1
<400>  12
Ala
1
<210>  13
<211>  94
<212>  PRT
<213>  Artificial
<220>
<223>  Light chain variable region of monoclonal antibody B264
<400>  13
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Arg Ile Ser Tyr Met
20                  25                  30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35                  40                  45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50                  55                  60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Thr Met Glu Ala Glu
65                  70                  75                  80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Arg Ser Ser Tyr Pro
85                  90
<210>  14
<211>  97
<212>  PRT
<213>  Artificial
<220>
<223>  Heavy chain variable region of monoclonal antibody B264
<400>  14
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20                  25                  30
Phe Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala
<210>  15
<211>  100
<212>  PRT
<213>  Artificial
<220>
<223>  Light chain variable region of monoclonal antibody B266-1
<400>  15
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85                  90                  95
Ser His Val Pro
100
<210>  16
<211>  97
<212>  PRT
<213>  Artificial
<220>
<223>  Heavy chain variable region of monoclonal antibody B266-1
<400>  16
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20                  25                  30
Phe Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala
<210>  17
<211>  212
<212>  PRT
<213>  Artificial
<220>
<223>  Light chain of monoclonal antibody B264
<400>  17
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Arg Ile Ser Tyr Met
20                  25                  30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35                  40                  45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50                  55                  60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Thr Met Glu Ala Glu
65                  70                  75                  80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Thr Phe
85                  90                  95
Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr
100                 105                 110
Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala
115                 120                 125
Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val
130                 135                 140
Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser
145                 150                 155                 160
Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr
165                 170                 175
Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys
180                 185                 190
Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn
195                 200                 205
Arg Asn Glu Cys
210
<210>  18
<211>  452
<212>  PRT
<213>  Artificial
<220>
<223>  Heavy chain of monoclonal antibody B264
<400>  18
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20                  25                  30
Phe Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Leu Leu Gln Tyr Ser Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu
115                 120                 125
Ala Pro Gly Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys
130                 135                 140
Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Ser Val Thr Val Thr Trp Asn Ser
145                 150                 155                 160
Gly Ser Leu Ser Ser Ser Val His Thr Phe Pro Ala Leu Leu Gln Ser
165                 170                 175
Gly Leu Tyr Thr Met Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp
180                 185                 190
Pro Ser Gln Thr Val Thr Cys Ser Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr
195                 200                 205
Thr Val Asp Lys Lys Leu Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn
210                 215                 220
Pro Cys Pro Pro Cys Lys Glu Cys His Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu
225                 230                 235                 240
Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Asn Ile Lys Asp Val
245                 250                 255
Leu Met Ile Ser Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260                 265                 270
Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val
275                 280                 285
Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser
290                 295                 300
Thr Ile Arg Val Val Ser Thr Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met
305                 310                 315                 320
Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ser
325                 330                 335
Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ile Lys Gly Leu Val Arg Ala Pro
340                 345                 350
Gln Val Tyr Ile Leu Pro Pro Pro Ala Glu Gln Leu Ser Arg Lys Asp
355                 360                 365
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Val Gly Phe Asn Pro Gly Asp Ile Ser
370                 375                 380
Val Glu Trp Thr Ser Asn Gly His Thr Glu Glu Asn Tyr Lys Asp Thr
385                 390                 395                 400
Ala Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Ile Tyr Ser Lys Leu
405                 410                 415
Asn Met Lys Thr Ser Lys Trp Glu Lys Thr Asp Ser Phe Ser Cys Asn
420                 425                 430
Val Arg His Glu Gly Leu Lys Asn Tyr Tyr Leu Lys Lys Thr Ile Ser
435                 440                 445
Arg Ser Pro Gly
450
<210>  19
<211>  219
<212>  PRT
<213>  Artificial
<220>
<223>  Light chain of monoclonal antibody B266
<400>  19
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85                  90                  95
Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
115                 120                 125
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
130                 135                 140
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
145                 150                 155                 160
Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165                 170                 175
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu
180                 185                 190
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser
195                 200                 205
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210                 215
<210>  20
<211>  443
<212>  PRT
<213>  Artificial
<220>
<223>  heavy chain of monoclonal antibody B266
<400>  20
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Tyr Ile Asn Pro Thr Ser Asp Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50                  55                  60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Ala Ser Glu Gly Gly Phe Leu Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100                 105                 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr
115                 120                 125
Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu
130                 135                 140
Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp
145                 150                 155                 160
Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165                 170                 175
Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser
180                 185                 190
Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser
195                 200                 205
Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys
210                 215                 220
Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro
225                 230                 235                 240
Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr
245                 250                 255
Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser
260                 265                 270
Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg
275                 280                 285
Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile
290                 295                 300
Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn
305                 310                 315                 320
Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys
325                 330                 335
Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu
340                 345                 350
Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe
355                 360                 365
Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala
370                 375                 380
Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr
385                 390                 395                 400
Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly
405                 410                 415
Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His
420                 425                 430
Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
435                 440
<210>  21
<211>  660
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  Light chain of monoclonal antibody B264
<400>  21
gacgtgctga tgacacagac accactcagc ctccctgtga gcctgggcga ccaggcctct     60
atttcttgcc ggtctagcca gagcatcgtg cactccaacg gcaacacata cttggagtgg    120
tatctacaga agcccggcca gtcccctaag ctgctgatat acaaggtgtc taaccgcttc    180
tccggcgtgc ccgacaggtt ctctggcagc ggctctggca ccgacttcac cctcaaaata    240
tctagggtgg aggccgagga cctgggcgtg tactactgct tccagggctc ccacgttcca    300
tacacattcg gcggcggcac aaagttggaa attaagcgcg ctgacgcagc cccaacagtg    360
agcatctttc ctccatcctc tgaacaactt acctctggag gagcctctgt ggtgtgtttc    420
ctgaacaact tctacccaaa ggacatcaat gtgaagtgga agattgatgg ctctgagaga    480
cagaatggag tgctgaactc ctggacagac caggacagca aggacagcac ctacagtatg    540
agtagcaccc tgaccctgac caaggatgaa tatgagagac acaactccta cacttgtgag    600
gctacccaca agaccagcac cagcccaatt gtcaaatcct tcaacaggaa tgagtgttaa    660
<210>  22
<211>  1332
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  Heavy chain of monoclonal antibody B264
<400>  22
caggtgcagc tccagcagtc cggcgccgaa ctggccagac ctggcgccag cgtgaagatg     60
agctgcaagg cctccggcta cacattcaca tcttacacca tgcactgggt gaagcagaga    120
cccggccagg gcctggagtg gattggctac attaacccaa catccgacta cacaaactac    180
aaccagaagt tcaaggacaa ggccacactc accgccgaca agtcttctag cacagcctac    240
atgcagctgt ctagcctgac aagcgaggac tctgccgtgt acttctgcgc ctctgagggc    300
ggcttcctgt actacttcga ctactggggc cagggcacca ccctgaccgt gtcctctgcc    360
aaaacgacac ccccatctgt ctatccactg gcccctggat ctgctgccca aactaactcc    420
atggtgaccc tgggatgcct ggtcaagggc tatttccctg agccagtgac agtgacctgg    480
aactctggat ccctgtccag cggtgtgcac accttcccag ctgtcctgca gtctgacctc    540
tacactctga gcagctcagt gactgtcccc tccagcacct ggcccagcga gaccgtcacc    600
tgcaacgttg cccacccggc cagcagcacc aaggtggaca agaaaattgt gcccagggat    660
tgtggttgta agccttgcat atgtacagtc ccagaagtat catctgtctt catcttcccc    720
ccaaagccca aggatgtgct caccattact ctgactccta aggtcacgtg tgttgtggta    780
gacatcagca aggatgatcc cgaggtccag ttcagctggt ttgtagatga tgtggaggtg    840
cacacagctc agacgcaacc ccgggaggag cagttcaaca gcactttccg ctcagtcagt    900
gaacttccca tcatgcacca ggactggctc aatggcaagg agttcaaatg cagggtcaac    960
agtgcagctt tccctgcccc catcgagaaa accatctcca aaaccaaagg cagaccgaag   1020
gctccacagg tgtacaccat tccacctccc aaggagcaga tggccaagga taaagtcagt   1080
ctgacctgca tgataacaga cttcttccct gaagacatta ctgtggagtg gcagtggaat   1140
gggcagccag cggagaacta caagaacact cagcccatca tggacacaga tggctcttac   1200
ttcgtctaca gcaagctcaa tgtgcagaag agcaactggg aggcaggaaa tactttcacc   1260
tgctctgtgt tacatgaggg cctgcacaac caccatactg agaagagcct ctcccactct   1320
cctggtaaat aa                                                       1332
<210>  23
<211>  639
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  Light chain of monoclonal antibody B266
<400>  23
cagatcgtgc tcacacagtc tccagccatc atgagcgcct ctcctggcga gaaggtgaca     60
atgacctgct ctgcctctag ccgcatttct tacatgtact ggtatcagca gaagccaggc    120
acctccccta agaggtggat atacgacaca tccaagctgg cctccggcgt gcccgcccgg    180
ttcagcggct ctggcagcgg cacaagctac tccctgacaa ttagcacgat ggaggccgag    240
gacgccgcca catactactg ccaccagcgc tcgtcctacc caacattcgg cgccggcaca    300
aaattggaac tgaagagagc tgacgcagcc ccaacagtga gcatctttcc tccatcctct    360
gaacaactta cctctggagg agcctctgtg gtgtgtttcc tgaacaactt ctacccaaag    420
gacatcaatg tgaagtggaa gattgatggc tctgagagac agaatggagt gctgaactcc    480
tggacagacc aggacagcaa ggacagcacc tacagtatga gtagcaccct gaccctgacc    540
aaggatgaat atgagagaca caactcctac acttgtgagg ctacccacaa gaccagcacc    600
agcccaattg tcaaatcctt caacaggaat gagtgttaa                           639
<210>  24
<211>  1359
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  heavy chain of monoclonal antibody B266
<400>  24
gaggtgcagt tacaacagtc cggcgccgag ctagtgaagc caggcgccag cgtgaagctg     60
tcttgcacag ccagcggctt caacattaag gacaccttca tgcactgggt gaagcagaga    120
cctgagcagg gcttagagtg gattggccgg atcgaccccg ccaacggcaa cacaaagtac    180
gacccaaagt tccagggcaa ggccacaatt accgccgaca catcttccaa cacagcctac    240
ctccagctgt cgtctctcac cagcgaggac accgccgtgt actactgcgc cctgctccag    300
tactccgcga tggactactg gggccagggc acatctgtga ccgtgtctag cgccaagacc    360
accccaccat ccgtgtaccc actcgcccca ggctgcggcg acaccacagg ctctagcgtg    420
acactgggct gcctggtgaa gggctacttc cccgagtctg tgacagtgac ctggaactct    480
ggctctctgt ctagctctgt gcacaccttc cccgccctgc tgcaatccgg cctgtacaca    540
atgtcttctt ctgtgacagt gcctagctct acatggccat ctcagacagt gacatgctct    600
gtggcccacc ccgcctctag cacaaccgtg gacaagaagc tggagccatc cggccctatt    660
tctacaatta acccttgccc tccttgcaaa gaatgccaca agtgccccgc cccaaacctg    720
gagggcggcc cttctgtgtt cattttccct cctaacatta aggacgtgct gatgatcagc    780
ctcaccccaa aggtgacatg cgtggtggtg gacgtgtccg aggacgaccc tgacgtgcag    840
atttcttggt tcgtgaacaa cgtggaggtg cacaccgccc agacccagac ccaccgggag    900
gactacaact ccaccattcg ggtggtgtct acactgccta ttcagcacca ggactggatg    960
agcggcaaag agttcaagtg caaggtgaac aacaaggacc tgccatctcc tattgagaga   1020
acaatttcta agattaaggg cctggtgcgc gcccctcagg tgtacattct gcctcctccc   1080
gccgagcagc tgagccggaa ggacgtgtcc ctcacatgcc tcgtggtggg cttcaaccct   1140
ggcgacatta gcgtggagtg gacatctaac ggccacacag aagaaaacta caaggacaca   1200
gcccctgtgc tcgactccga cggctcttac ttcatatact ctaagctgaa catgaaaaca   1260
tctaagtggg aaaagaccga ctctttctct tgcaacgtgc ggcacgaggg cctgaagaac   1320
tactacctca agaaaaccat tagcagaagt ccaggctaa                          1359
<210>  25
<211>  315
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  Human Thioredoxin-1
<400>  25
atggtcaaac agatcgaatc aaaaaccgca tttcaagaag ccctggacgc cgctggtgac     60
aaactggtcg tggtggactt tagtgctacc tggtgcggcc cgtgtaaaat gattaaaccg    120
tttttccata gcctgtctga aaaatacagt aacgttatct ttctggaagt ggatgttgat    180
gactgccagg acgtcgcgag cgaatgcgaa gtgaaatgta tgccgacgtt ccagtttttc    240
aaaaaaggtc aaaaagtcgg tgaatttagc ggtgccaaca aagaaaaact ggaagccacg    300
attaacgaac tggtg                                                     315
<210>  26
<211>  22
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  Human Thioredoxin-1 forward primer
<400>  26
taatggtcaa acagatcgaa tc                                              22
<210>  27
<211>  31
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  Human Thioredoxin-1 reverse primer
<400>  27
caccagttcg ttaatcgtgg taatgaaagc t                                    31
<---