ПОДЛОЖКА ДЛЯ ДЕТЕКТИРОВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ МАКРОМОЛЕКУЛ И КОМПЛЕКСОВ РАДИОНУКЛИДОВ В ВОДЕ НА ОСНОВЕ ГИГАНТСКОГО КОМБИНАЦИОННОГО РАССЕЯНИЯ

Область техники
Полезная модель относится к области технологий материалов и аналитической технике. Новизна подложки для детектирования биологических макромолекул и комплексов радионуклидов в воде состоит в использовании углеродных наностенок, декорированных наночастицами золота, для обеспечения равномерности сигнала гигантского комбинационного рассеяния по подложке, а также для обеспечения высокого коэффициента усиления и воспроизводимости сигнала.
Полезная модель может быть применена для измерения концентрации биологических макромолекул и соединений радионуклидов в водных растворах с пределом детектирования на уровне наномоль/литр, что представляет ценность для ряда областей промышленности, таких как атомная энергетика и биомедицинская диагностика.
Уровень техники
На данный момент из уровня техники известно большое количество примеров разработки подложек для спектроскопии гигантского комбинационного рассеяния (ГКР) света с целью увеличения коэффициента усиления и снижения затрат на производство. Ключевой особенностью таких подложек является неровность поверхности в нанометровом масштабе, причем применяются как решения в виде металлических поверхностей, так и в виде металлических коллоидных частиц, металлических пленок на диэлектриках и металлических матрицах. В качестве металла для подложек в большинстве случаев используют золото и серебро.
В качестве материала подложек может использоваться бумага разного типа с нанесением на нее специальных растворов красителей и коллоидных растворов серебра, а также тонкие хроматографические пластинки. Другим вариантом реализации может быть обработанная фильтрующая бумага, покрытая слоем золота или серебра, а также целлюлоза.
Широко применяется подход к проведению ГКР с применением т.н. "сэндвичей", т.е. структур, в которых ГКР-активная молекула находится между макроскопической подложкой и металлической коллоидной частицей (патенты US №6149868 A, US №6861263 В2). В этом случае открывается возможность улучшения коэффициента усиления ГКР-активности, т.к. появляется дополнительное электрическое поле между двумя компонентами "сэндвича". Геометрия подложек также является темой многих работ. Из уровня техники известно, что подложка, может быть составлена из нескольких металлических слоев (пленок), разделенных между собой слоем диэлектрика, (патент US №7242470 В2), а также известно, что многослойная структура подложки может иметь специальную регулярную геометрию, приспособленную для анализа, в том числе, биологических образцов (патент US №20130038870 А1). Другим вариантом подложки может быть подложка из регулярного массива наноструктур (патент US №7460224 В2). Другими конфигурациями подложек, известных из уровня техники являются следующие: металлическая подложка с единичной нанопроволкой (J. Am. Chem. Soc. 2009, 131, 758-762), подложка, основанная на нанопроволоках (патент US №7158219 В2), на основе платформы с вибрирующими наностержнями (патент US №20110188034 А1). Подобные структуры обеспечивают высокий коэффициент усиления локального поля, позволяющий проводить детектирование вплоть до уровня единичных молекул, однако сложны в изготовлении и зачастую не обеспечивают воспроизводимости сигнала от подложки к подложке.
Для обеспечения большей удельной площади поверхности, воспроизводимости сигнала и биосовместимости актуальным является использованием углеродных наноматериалов, в частности, оксида графена (CN 102590173) и углеродных нанотрубок (WO 2011068999). Наиболее близким решением является ГКР-подложка на основе углеродных нанотрубок, покрытых наночастицами металла, например, золота, серебра или платины (WO 2011068999). Указанное решение основано на использовании геометрии и распределения электронной плотности в углеродных нанотрубках для обеспечения заданных характеристик локального поля при нанесении частиц с плазмонным резонансом, что является важным для оптимизации проводимости структуры на наномасштабе. В подложке использованы натрубки диаметром 1-40 нм и длиной 1 нм-10 мкм. Применение наноструктурированных подложек с углеродными нанотрубками, имеющими узкое распределение по геометрическим характеристикам благодаря отработанным в других областях техники технологическим процессам, позволяет достичь воспроизводимости свойств подложек и, как следствие, распределения локального поля, что является принципиальным для детектирования сигнала ГКР. В заявке (WO 2011068999) указано, что при использовании сложных методов детектирования (например, с помощью зонда атомно-силового микроскопа) можно достичь высокого усиления сигнала и проводить детектирование на уровне единичных молекул, что, однако, невозможно сделать при анализе сигнала от ансамбля молекул, адсорбированных на подложку, с использованием стандартной техники для детектирования сигнала комбинационного рассеяния. Работоспособность модели демонстрируется на тестовом аналите-родамине, обладающем электронным поглощением в области плазмонного резонанса наночастиц, что само по себе обеспечивает усиление сигнала комбинационного рассеяния за счет резонансного возбуждения. При этом намного более актуальным для практических применений является детектирование биологических макромолекул (например, белков), у которых электронное поглощение в видимой области спектра отсутствует. Будучи основанной на применении углеродных наноматериалов (наностенок) и обладая преимуществами указанного решения, заявляемая подложка является более простой в изготовлении и заточена, прежде всего, на детектирование молекул и комплексов металлов с отсутствием резонанса поглощения в видимой области. Так, при росте нанотрубок используется дополнительный катализатор, т.е. сначала на подложку, например, кремний, наносится слой катализатора в несколько нанометров, например железо, никель, кобальт. Обычно используются металлы переходных групп. После чего данный образец помещается в CVD реактор, где и происходит рост нанотрубок из катализатора. При росте наностенок, используемых в данной полезной модели, отсутствует стадия нанесения катализатора. Также после роста катализатор практически невозможно удалить и для многих биологических применений катализаторы являются токсичными. Далее, контроль ориентации нанотрубок, а также их диаметра, имеет важное значение для обеспечения максимального коэффициента усиления, однако данная процедура сложна технически. При росте наностенок достаточно варьировать параметры плазмы, что приводит к разной морфологии, и как следствие к разным оптическим характеристикам всей системы. Также в процессе изготовления подложек на основе углеродных наностенок используется коммерчески доступное магнетронное распыление, в то время как для покрытия нанотрубок используется ALD технология (атомно-слоевое осаждение), которая позволят покрывать их на всю длину, либо коллоидные растворы, которые достаточно тяжело равномерно наносить.
Раскрытие полезной модели
Задача полезной модели - разработка структуры подложки, обеспечивающей детектирование количественного содержания биологических макромолекул, в частности, белков, а также комплексов радионуклидов, в частности, координационных соединений урана(VI), в воде или водном растворе, при их концентрациях в диапазоне от наномоль/литр до микромоль/литр с использованием калибровочной кривой.
Техническим результатом, обеспечиваемым заявляемой полезной моделью, является равномерное усиление локального электромагнитного поля по поверхности подложки при облучении его лазерным излучением видимого диапазона для детектирования сигнала гигантского комбинационного рассеяния адсорбированных молекул аналита и воспроизводимость сигнала в разных точках одной подложки и от подложки к подложке.
Таким образом, заявляемая подложка за счет использования наностенок из графена (слоев графена), а также наличия определенной морфологии наностенок, характеризующейся их толщиной и высотой, обеспечивает высокую чувствительность определения биологических макромолекул и комплексов радионуклидов в водном растворе с использованием метода ГКР. Кроме того, подложки являются стабильными на воздухе не менее, чем 2 суток.
-2
2
2
2
Поставленная задача решается тем, что подложка для детектирования биологических макромолекул и комплексов радионуклидов в воде на основе гигантского комбинационного рассеяния представляет собой трехслойную структуру, первый слой которой выполнен в виде планарной подложки, второй слой выполнен из углеродных наностенок, состоящих из листов графена, расположенных преимущественно перпендикулярно поверхности подложки, третий слой выполнен в виде пленки из золота толщиной 50-200 нм, при этом второй слой выполнен толщиной от 100 нм до 10 мкм с толщиной наностенок от 0.3 до 10 нм, удельной плотностью расположения наностенок на подложке от 5 до 20 мкм, эффективной площадью поверхности 3-40 мкм на 1 мкм планарной подложки (получаемой посредством использования 1 г углерода ~ на 1000 м) и разбросом параметров высоты наностенок не более 20% от среднего значения.
Решение данной задачи достигается за счет использования подложки, покрытой углеродными наностенками, декорированными золотыми наночастицами, что обеспечивает большую удельную площадь поверхности, равномерное распределение локального электромагнитного поля, создаваемого наночастицами золота, а также высокий коэффициент усиления электромагнитного поля вблизи подложки за счет плазмонных свойст наночастиц и электронного взаимодействия наночастиц с углеродными наностенками. При этом для детектирования молекул-аналитов используется сигнал комбинационного рассеяния света, который усиливается за счет локального поля вблизи подложки.
Краткое описание чертежей
Заявляемая полезная модель поясняется следующими фигурами, где на фиг. 1 схематично изображена заявляемая кювета; на фиг. 2 приведено изображение подложки, полученное с помощью сканирующей электронной микроскопии; на фиг. 3 приведено изображение подложки с нанесенным образцом (БСА, 1 мкмоль/литр), полученное с помощью сканирующей электронной микроскопии; на фиг. 4 приведено изображение спектра комбинационного рассеяния белка бычьего сывороточного альбумина в концентрации 1 мкмоль/литр; на фиг. 5 приведено изображение спектра комбинационного рассеяния нитрата уранила в концентрации 100 нмоль/литр.
Позициями на схеме обозначены: 1 - кремниевая подложка (первый слой), 2 - углеродные наноструктуры (наностенки) (второй слой), 3 - золотое покрытие (пленка, состоящая из нанокристаллитов золота) (третий слой).
Осуществление полезной модели
Подложка представляет собой трехслойную структуру. Первый слой 1 представляет из себя планарную плоскую подложку, например, из диэлектрика, или металла. В качестве подложки могут быть выбраны материалы, которые имеют температуру плавления выше 400°С, например, кварц, кремний, титан, никель и др. На подложку в процессе газофазного осаждения наносятся углеродные структуры 2 из углеродосодержащей среды. В качестве процесса газофазного осаждения могут использоваться такие процессы как «горячая» нить, СВЧ разряд, ВЧ разряд, индуктивно-связанная плазма, комбинированная с емкостно-связанной плазмой. В качестве источника углерода могут выступать следующие газы: метан, ацителен, пропан. Также могут использоваться смеси указанных газов с азотом, аргоном, водородом. В данном случае использовалось плазмохимического осаждение в разряде постоянного тока в атмосфере метана с водородом. Время получения данных структур может варьироваться от нескольких минут до 30 часов. В результате такого осаждения были получены структуры, состоящие из sp2 углерода, которые располагаются практически перпендикулярно поверхности и состоят из графеновых слоев. Данные структуры могут быть охарактеризованы удельной поверхностью, латеральным размером единичных наностенок, толщиной наностенок (количеством графеновых листов), общей толщиной пленки. Параметры пленки могут варьироваться. Высота углеродных структур или толщина второго слоя (измеряя от поверхности подложки до поверхности металлической пленки) может быть в диапазоне от 100 нм до 10 мкм; средняя длинна наностенок варьируется в диапазоне от 100 нм до 10 мкм; толщина ребер (единичного углеродного листа) варьируется от 0.3 до 10 нм. Для нанесения слоя металла 3, который будет приводить к усилению оптического сигнала могут быть использоваться самые различные методы, такие как атомно-слоевое осаждение, термическое испарение, магнетронное распыление, распыление электронным лучом и др. Оптимальным технологическим процессом является нанесение тонкой металлической пленки магнетронным распылением мишени. При этом скорость распыления, а также температура подложки может варьироваться в широких пределах. Скорость распыления мишени варьируется от 0.05 нм/с до 5 нм/с, температура подложки при напылении может варьироваться от -50 до 1000°С, время напыления составляет от 1 до 10000 секунд.
Устройство работает следующим образом.
На поверхность подложки равномерно наносится и высушивается водная суспензия исследуемого вещества. Для нанесения вещества могут быть использованы разные методы, такие как нанесение капли и ее высушивание, капание на вращающуюся подложку, опускание подложки в раствор и др. После испарения жидкости готовая к исследованию подложка помещается под лазерный луч спектрометра, где подвергается стандартной процедуре измерений. Для исследования биологических макромолекул, например, белков, и комплексов радионуклидов, например, координационых соединений урана(VI), могут быть использованы разные длины волн, например, 532 и 633 нм, при этом для каждой длины волны необходимо получение отдельной калибровочной кривой. Измерения могут выполняться на коммерчески доступных лазерных микроскопах, например, Nanofinder-S (SolInstruments, Белоруссия), LabRAM или Т64000 (Horiba Jobin-Yvon, Япония-Франция), inVia (Renishaw, Великобритания) и др. Предпочтительным является использование объектива и настроек фокусировки, позволяющих измерять сигнал из лазерного пятна размером около 10 мкм для оптимального усреднения сигнала по «горячим точкам» и во избежание эффекта «мерцания». Детектирование сигнала осуществляется использованием CCD-камеры или ФЭУ, для определения концентрации образца в растворе необходимо предварительное измерение калибровочной кривой (зависимости интенсивности характеристичной линии в спектре комбинационного рассеяния от концентрации вещества). Для определения интенсивности спектры следует измерить не менее чем в 10 точках и усреднить. Для контроля качества подложек рекомендуется провести предварительные тесты на 1) равномерность распределения точек с наиболее высоким коэффициентом усиления сигнала по подложке путем его картирования, 2) воспроизводимость интенсивности сигнала при заданной концентрации от подложки к подложке.
Пример.
2
2+
Для реализации заявляемого решения были изготовлены подложки, которые были использованы для детектирования тестовой биологической макромолекулы (бычьего сывороточного альбумина, БСА); и детектирования иона уранила UO в воде.
2
4
Подложки изготавливались следующим образом. Пластина из полированного кремния толщиной 100 мкм помещалась в камеру установки плазменного осаждения в разряде постоянного тока (Podlovchenko, В.I., Krivchenko, V.A., Maksimov, Y.М., Gladysheva, Т.D., Yashina, L.V., Evlashin, S.А., & Pilevsky, А.А. (2012). Specific features of the formation of Pt (Cu) catalysts by galvanic displacement with carbon nanowalls used as support. Electrochimica Acta, 76, 137-144). Рабочую камеру одновременно наполняли газами H и СН, скорости подачи которых составляли 10 л/ч и 1 л/ч, соответственно. Давление рабочей смеси газов в камере составляло 150 торр. Осаждение углеродных структур на ее поверхности осуществляли в процессе нагрева подложки до температуры 1000°С в течение 30 минут.
2
-2
2
2
Далее подложку с синтезированными на ее поверхности углеродными структурами помещали в камеру установки магнетронного распыления в разряде постоянного тока (Krivchenko, V.A., Evlashin, S.A., Mironovich, K.V., Verbitskiy, N.I., Nefedov, A.,  С., & Rakhimov, А.Т. (2013). Carbon nanowalls: the next step for physical manifestation of the black body coating. Scientific reports, №3) для нанесения золотого покрытия. Распыление золотой мишени высокой чистоты (99.999%) происходило в атмосфере аргона, причем давление газа составляло 50 мТорр. Плотность мощности разряда, используемого для распыления мишени составляла 5.5 Вт/см. Скорость распыления составляла 0.75 нм/с, расстояние между мишенью и подложкой со структурами составляло 5 см. Морфология и другие параметры подложек контролировались с помощью сканирующей электронной микроскопии с использованием установки Carl Zeiss Supra 40, полученное изображение подложки приведено на фиг. 2. Средний размер углеродных наностенок составил 600 мкм, плотность упаковки стенок (или удельная плотность расположения наностенок на подложке) - 7 мкм. Оптимальная толщина пленки из золота составила 150 нм, эффективная площадь поверхности составила 5 мкм на 1 мкм планарной подложки, разбросом параметров высоты наностенок составил 10% от среднего значения.
На полученные подложки наносили 5 мкл водного раствора содержащего тестовый аналит - белок бычий сывороточный альбумин (БСА) в диапазоне концентрации от 10 нмоль/литр до 100 мкмоль/литр или нитрат уранила в диапазоне концентрации от 10 нмоль/литр до 10 мкмоль/литр, после чего подложки высушивали и помещали для измерений на конфокальный микроскоп Nanofinder-S (Solinstruments, Беларусь). Изображение подложки с нанесенным образцом (БСА, 1 мкмоль/литр), полученное с помощью сканирующей электронной микроскопии, приведено на фиг. 3, из которой можно видеть, что образец равномерно распределен по поверхности подложки. Лазерное излучение длинны волны 633 нм, по мощности не превосходящее 10 мВт, с помощью объектива 40× увеличением фокусировали на поверхности образца с исследуемым веществом. После чего объектив микроскопа был использован для сбора отраженного излучения, содержащего компоненты усиленного сигнала от исследуемого вещества. Собранное излучение пропускали через спектральную систему с целью удаления из спектра компоненты, связанной с релеевским рассеянием. После чего отфильтрованное излучение фокусировали на детектор (CCD-камеру) для последующего преобразования в цифровой формат. Время накопления сигнала в одной точке составляло 3 с, измерения для каждой концентрации проводили не менее чем в 10 точках. Обработку спектров выполняли в программе Origin версии 9.0.
На основе измерений спектров от образцов с заранее известной концентрацией детектируемой молекулы (БСА или уранила) была получена калибровочная кривая, представляющая из себя зависимость отношения интенсивности наиболее яркой спектральной линии от концентрации аналита. Калибровочная для измеренных образцов была линейна в двойном логарифмическом масштабе. Спектры БСА (1 мкмоль/литр) и уранила (10 мкмоль/литр), полученный с использованием описанной методики, приведены на фиг. 4 и фиг. 5, соответственно. Оцененный предел детектирования составил 1 нмоль/литр.
2
2+
Таким образом, была продемонстрирована высокая чувствительность и возможность количественного определения белковых макромолекул и соединений радионуклидов (на примере уранила UO) в водном растворе.