СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОИНЖЕНЕРНОЙ КОНСТРУКЦИИ ДЛЯ ЗАМЕЩЕНИЯ КОСТНЫХ ДЕФЕКТОВ
METHOD FOR PRODUCING BIOENGINEERED CONSTRUCT FOR BONE DEFECT REPLACEMENT

Изобретение относится к медицине и ветеринарии, а именно к реконструктивной хирургии, предназначено для применения в области трансплантологии, травматологии, хирургии и онкологии.
Известен способ получения биоинженерной конструкции для закрытия костных дефектов с восстановлением в них костной ткани, при котором используется синтетическая основа, выделение стромальных клеток из жировой ткани или костного мозга реципиента с последующим культивированием, после чего клетки пассируют на поверхность многофункционального, биосовместимого, нерезорбируемого покрытия гибридного имплантата, представляющего собой пористую мембрану из политетрафторэтилена с размерами пор 200-500 мкм, и инкубируют в остеогенной среде в течение 14 дней (патент РФ №2416434).
Недостатки указанного аналога: синтетическая основа конструкции не имеет анатомических особенностей кости; поверхность конструкции колонизируют клетками-предшественниками костной ткани, не способными сформировать фиксирующую соединительнотканную капсулу и капиллярную сеть; при повреждении биоактивного покрытия политетрафторэтилен основы конструкции не способен обеспечить адгезию клеток на своей поверхности, что ведет к ухудшению функциональных характеристик биоимплантата и развитию местной воспалительной реакции; возможна хроническая травматизация тканей реципиента в зонах крепления конструкции к кости из-за различной плотности материалов.
Известны способы получения биоинженерных конструкций для замещения костных дефектов, в основе которых лежит насыщение культурой аутологичных мультипотентных клеток, выделенных из костного мозга, пористых матриксов из гранулированных биокерамических материалов на основе гидроксиапатита или из натуральных кораллов Acropora sp., Porites sp. [Vaccaro A.R. The Role of the Osteoconductive Scaffold in Synthetic Bone Graft // Orthopedics, 2002, V.25, №5, Suppl., P. s571-s578; Louisia S., Stromboni M., Meunier A., Sedel L, Petite H. Coral grafting supplemented with bone marrow // J Bone Joint Surg [Br], 1999; V.81-B, №4, P.719-724]. Однако установлено, что такой подход имеет значимые недостатки. В частности, биокерамические материалы в организме плохо рассасываются, и их остатки оказываются замурованными в костную ткань, что делает ее менее прочной [Сергеева Н.С., Франк Г.А., Свиридова И.К., Кирсанова В.А., Ахмедова С.А., Антохин А.И. Роль аутогенных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток в тканеинженерных конструкциях на основе натуральных кораллов и синтетических биоматериалов при замещении костных дефектов у животных. // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия, 2009, т.IV, №4, с.56-64]. Кроме того, керамику на основе гидроксиапатита можно использовать только для замещения участков костей, не несущих значительных механических нагрузок, что обусловлено хрупкостью материала и его высокой чувствительностью к коррозии под напряжением в физиологических жидкостях организма, приводящей к разрушению имплантата [Баринов С.М. Керамические и композиционные материалы на основе фосфатов кальция для медицины. // Успехи химии, 2010, 79(1), с.15-32]. Высокая порозность естественных корралов обусловливает хрупкость материала. По этой причине подобные конструкции рекомендовано использовать либо для восстановления дефектов губчатой костной ткани, либо в сочетании с металлическими пластинами, несущими опорную функцию [Demers С., Hamdy С.R., Corsi К., Chellat F., Tabrizian M., Yahia L. Natural coral exoskeleton as a bone graft substitute: A review // Bio-Medical Materials and Engineering, 2002, V.12, №1, P.15-35].
2
Наиболее близким к заявляемому изобретению (прототипом) является способ получения трансплантата "Био-матрикс имплант I" для стоматологии [патент РФ 2136298). Этот способ предусматривает деиммунизацию донорской кости, включает предварительное распиливание кости на блоки размером 3×2×1 см, получение сквозных отверстий размером от 0,1 мм до 10 мм в каждой плоскости блока, не менее одного отверстия на 1 см, обработку блоков смесью ферментов, состоящей от 0,1-1% раствора трипсина и 0,125-0,3% раствора папаина, взятых в соотношении 1:1. Затем в смеси 1% раствора перекиси водорода и 1% раствора этанола, взятых в соотношении 1:1, отмывают и заполняют каждое отверстие блока материалом, состоящим из солей двух- и/или трехвалентных металлов, коллагена, алкилпроизводных, или карбоксилалкилпроизводных, или гидроксиалкилпроизводных целлюлозы, сульфатированных гликозаминогликанов и воды, после чего костный блок замораживают, лиофилизируют и стерилизуют облучением дозой 2,5 Мград.
Недостатки прототипа: 1) при использовании имплантата, полученного указанным способом, возможно замещение костных дефектов только небольшой площади (не более 3×2×1 см), что ограничивает его применение в области стоматологии и челюстно-лицевой хирургии; 2) длительный процесс фиксации и репарации имплантата в организме реципиента.
Задачей изобретения является разработка способа получения биоинженерной конструкции для замещения костных дефектов значительных по площади, обеспечивающего сохранение физических и анатомических особенностей донорской кости, высокую прочность, быструю фиксацию в зоне имплантации и репарацию тканью реципиента, отсутствие реакции отторжения имплантата.
Задача решается тем, что в качестве основы биоинженерной конструкции используют донорскую кость, которую деиммунизируют с помощью хлорсодержащих окислителей, затем наносят гетерогенный имплантируемый гель и колонизируют мультипотентными мезенхимальными стромальными клетками (ММСК).
2
Заявляемый способ получения биоинженерной конструкции осуществляют следующим образом. Кость человека или животного очищают от мягких тканей. При толщине стенки кости более 5 мм ее перфорируют. Затем кость помещают в деиммунизирующий 5-10% раствор, приготовленный из сухой смеси хлорита натрия, перхлората натрия, натрия хлорида в соотношении 7:2:1 и дистиллированной воды. Кость полностью погружают в приготовленный раствор и выдерживают в темноте от 1 до 4 месяцев в зависимости от размеров и толщины стенки кости. Костно-мозговой канал промывают раствором указанного состава 1 раз в 3 суток. Деиммунизированную кость хранят при t=-70°C в смеси диметилсульфоксида и 6% раствора декстрана в соотношении 1:9 в 0,9% растворе хлорида натрия. Затем деиммунизированную кость последовательно промывают в дистиллированной воде и стерильном 0,9% растворе хлорида натрия, поверхность покрывают гетерогенным имплантируемым гелем, таким как «Сферогель» или «Матригель». Для получения ММСК у реципиента производят забор костного мозга. Мононуклеарные клетки выделяют на градиенте фиколл-урографин (плотность 1,077) центрифугированием при 900 g. Затем клетки дважды отмывают от фиколла, центрифугируют при 600 g в среде RPMI 1640. Из полученной суспензии методом иммуномагнитной сепарации выделяют мезенхимальные CD 271+ клетки, которые культивируют в среде MACS NH Expansion Medium (Miltenyi Biotec), содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки, L-глутамина 2 мМ, пенициллина G 100 МЕ/мл, стрептомицина 100 мкг/ мл, в пластиковых культуральных флаконах при t 37°C и 5% CO в течение 2-3 пассажей. Затем среду с взвешенными клетками удаляют и фракцию, способную к адгезии, культивируют в течение 3-6 пассажей в среде указанного состава. Оценивают фенотип клеток методом проточной цитометрии. Клетки равномерно распределяют по поверхности конструкции сразу после нанесения геля. Для заселения конструкции используют суспензию клеток, содержащую не менее 85% CD271+ клеток. Конструкцию помещают в среду RPMI 1640, содержащую 10% фетальной телячьей сыворотки, L-глутамина 2 мМ, пенициллина G 100 МЕ/мл, стрептомицина 100 мкг/ мл, и инкубируют при 37°C в течение 3-10 суток.
Прочность полученной биоинженерной конструкции изучали на сжатие по показателям «предел текучести», «модуль упругости» и «предел прочности» в соответствие с ГОСТ 4651-82 на участке деформационной кривой от 10 до 30 МПа. Для проведения исследований использовали лучевые и плечевые кости пяти взрослых собак, подвергнутых эвтаназии вследствие получения травм, несовместимых с жизнью. Средний возраст животных 9±1,2 года. Кости очищали от мягких тканей, из костно-мозгового канала удаляли остатки костного мозга. Для сравнительного анализа использовали диафизарные фрагменты костей цилиндрической формы высотой 20 мм. Подготовленные фрагменты костей были разделены на две группы: контрольная и опытная (фрагменты костей обработаны по заявляемому способу). Испытания на сжатие проводились на универсальной испытательной машине Zwick/Roell z020. Результаты исследования представлены в таблице.
Кость
Группа
Предел текучести δ<sub>0,2,</sub> МПа
Модуль упругости, МПа
Предел прочности, МПа
Плечевая
опытная
84±2,1
1740±353
89±2,1
контрольная
81±12,5
1602±102
90±5,2
Лучевая
опытная
78±8,2
1720±233
87±16,3
контрольная
79±21,0
1852±212
94±18,6
Достоверных различий в группах сравнения не выявлено (p>0.05),
Реакцию острого отторжения биоинженерной конструкции и ее репарацию клетками донора изучали на мышах линии СВА. Для получения биоинженерной конструкции по заявляемому способу использовали бедренные кости мышей. Далее выполняли гетеротопную сингенную имплантацию полученной биоинженерной конструкции мышам линии Balb/c под кожу на спине. Через 3 месяца после имплантации биоинженерную конструкцию извлекали и проводили морфологическое исследование.
Изобретение иллюстрировано фигурами 1-4.
Фиг.1 - продольный срез биоинженерной конструкции из бедренной кости мыши через 3 месяца после гетеротопной сингенной имплантации. Ув.100.
Фиг.2 - продольный срез биоинженерной конструкции из бедренной кости мыши с сохранением структуры губчатого вещества костно-мозгового канала через 3 месяца после гетеротопной сингенной имплантации. Ув.200.
Фиг.3 - реколонизация клетками поверхности биоинженерной конструкции из бедренной кости мыши через 3 месяца после гетеротопной сингенной имплантации. Ув.400.
Фиг.4 - реколонизация клетками донорской ткани биоинженерной конструкции из бедренной кости мыши через 3 месяца после гетеротопной сингенной имплантации. Ув.900.
Через 3 месяца после гетеротопной сингенной имплантации признаки механической и ферментативной деградации макро- и микроструктуры биоинженерной конструкции не наблюдали (Фиг.1, 2). На фиг.3 и 4 представлена реколонизация бесклеточной костной основы имплантированной биоинженерной конструкции клетками реципиента. На поверхности конструкции - формирование клеточного слоя, морфологически сходного с тканью надкостницы (Фиг.3), и соединительно-тканного слоя (Фиг.2).
Технический результат
Заявляемый способ обеспечивает замещение костных дефектов, значительных по площади, высокую прочность, быструю фиксацию и репарацию конструкции в зоне имплантации, не приводит к развитию реакции отторжения.