СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РАЗВИТИЯ ПОЛЛИНОЗА
METHOD OF PREDICTING POLLINOSIS DEVELOPMENT

Изобретение относится к области медицины, а именно к аллергологии и иммунологии, и может быть использовано для прогнозирования развития поллиноза.
Из практики медицины известен способ прогнозирования поллиноза (Яздовский В.В., Балаболкин И.И. HLA-маркеры полиаллергии при атопических заболеваниях у детей. // Иммунология. - 2000. - №1. - С.36-38), заключающийся в определении антигенного профиля системы HLA.
Недостатком способа является то, что в качестве прогностических маркеров развития поллинозов рассматривались отдельные антигены системы HLA, но не гаплотипы. По результатам многочисленных исследований, направленных на поиск иммуногенетических маркеров заболеваний, известно, что сила ассоциативных связей для целого ряда нозологий была более высокой не с отдельными специфичностями HLA, а с их сочетаниями - гаплотипами. Это обстоятельство не позволяет использовать известный способ прогнозирования поллинозов.
Изобретение направлено на повышение точности прогнозирования развития поллиноза.
Указанный технический результат достигается тем, что в венозной крови определяют антигены локусов А и В системы HLA и при наличии гаплотипов HLA-A2/B7, и/или А19/В7, и/или А19/В16, и/или А19/В35 прогнозируют высокий риск развития поллиноза, а при наличии гаплотипов HLA-A2/B17 и/или А3/В17 прогнозируют резистентность к развитию поллиноза.
Результаты исследований в области поиска генов болезней человека чрезвычайно важны для практической медицины, поскольку они позволяют предсказать болезнь у пока здорового человека. Аллергический фенотип является результатом взаимодействия как факторов внешней среды, так и генетических факторов. Известна связь между генетической предрасположенностью к развитию атопических болезней и участком хромосомы 6р, на которой расположены гены системы HLA. Актуальным представляется выяснение механизма ассоциаций между поллинозами (сезонный аллергический ринит, пыльцевая бронхиальная астма) и антигенами HLA. Идентификация генов, ответственных за развитие пыльцевой аллергии, позволит вовремя сформировать профилактические мероприятия, направленные на предотвращение болезни. Все это дает основание для применения способа прогнозирования развития поллиноза.
Представленным способом апробировано 65 коренных жителей Астраханской области русской национальности, страдающих пыльцевой аллергией. Случайным образом нами были отобраны пациенты, находившиеся на стационарном лечении в пульмонологическом отделении на аллергологических койках Александро-Мариинской областной клинической больницы г.Астрахани или обратившиеся за медицинской помощью к аллергологу-иммунологу консультативной поликлиники Александро-Мариинской областной клинической больницы г.Астрахани в период с августа 2005 г. по октябрь 2006 г. Контрольную группу составили 200 здоровых доноров - коренных астраханцев русской национальности, не имевших аллергической патологии.
У всех пациентов было проведено аллергологическое обследование, которое включало: сбор подробного аллергологического анамнеза, кожное аллергологическое тестирование, определение общего lgE в сыворотке крови.
Кожное тестирование осуществлялось при помощи скарификационных кожных проб с водно-солевыми экстрактами аллергенов из пыльцы растений производства ФГУП НПО «Аллерген» (г.Ставрополь). В 1 мл водно-солевого экстракта каждого аллергена содержалось 10000 PNU. Диагностический набор включал 23 пыльцевых аллергена: лещина, ольха, дуб, береза, ясень, клен, тимофеевка, овсяница, ежа, рожь, мятлик, райграс, лисохвост, пырей, кукуруза, конопля, полевица, одуванчик, лебеда, амброзия, подсолнечник, полынь, циклахена. Кожное тестирование проводилось в период ремиссии заболевания вне сезона цветения растений.
Серологическая идентификация антигенов HLA локусов А и В осуществлялась путем исследования лимфоцитов периферической крови с помощью лимфоцитотоксической реакции. Типирование антигенов HLA I класса проводили с использованием HLA-типирующих сывороток производства ЗАО «Гисанс» (Санкт-Петербург, Россия). Принцип метода комплементзависимой цитотоксичности (КЗЦТ) заключается в двухэтапном воздействии на лимфоциты сначала иммунной сыворотки, содержащей известные специфичности, а затем комплемента.

3

5
Венозную кровь в объеме 4-5 мл собирают во флакон с плоским дном с добавлением антикоагулянта гепарина. Дефибринированную кровь в объеме 4 мл осторожно наслаивают на 2 мл градиента Lympholyte-H (плотность смеси 1,077 г/см). Центрифугируют при 1500 об/мин в течение 20 мин. Пипеткой собирают кольцо лимфоцитов из интерфазы жидкостей для отмывания от градиента Lympholyte-H. Взвесь лимфоцитов дважды отмывают средой Хенкса в течение 10 мин. При 1500 об/мин. Доводят концентрацию отмытых лимфоцитов до 2-4×10 на 0,01 мл средой Хенкса. Осевшую взвесь лимфоцитов микрошприцем Гамильтона раскапывают по 0,001 мл в лунки планшета Терасаки, где под слоем вазелинового масла находится по 0,001 мл типирующих анти-HLA сывороток, расположенных по принципу «батарейности». Смесь инкубируют в течение 60 мин. Затем в лунки планшета Терасаки добавляют по 0,005 мл цельного кроличьего комплемента и вновь инкубируют в течение 60 мин. По окончании времени инкубации под слой вазелинового масла вносят по 0,001 мл 1% раствора трепана голубого, который перед использованием смешивают в соотношении 4:1 с 4,26% раствором NaCl. Через 5-8 минут в качестве фиксатора используется 17% раствор формалина.
Лимфоциты, имеющие на поверхности определенную специфичность HLA, взаимодействуют с иммунной анти-HLA сывороткой, вызывая реакцию клеточного лизиса. Результат определяется по проникновению красящего вещества в клетки. Интенсивность реакции оценивается по количеству лизированных клеток. В случае гибели 76-100% клеток реакция считается резко положительной и оценивается на четыре плюса (++++), при гибели 50-75% лимфоцитов она оценивается как отчетливо положительная и обозначается тремя плюсами (+++), при гибели 26-50% - как положительная реакция (++), лизис 10-25% лимфоцитов расценивается как слабоположительная реакция (+) и при наличии 0-10% погибших клеток реакция оценивается как отрицательная (-). Положительным контролем служат показатели взаимодействия лимфоцитов пациента со стандартной антилимфоцитарной сывороткой (АЛС), отрицательным - с нетоксической сывороткой лиц IV группы крови.
При обработке полученных результатов были использованы методы статистического анализа. Для оценки результатов типирования вычислялись частоты антигенов HLA.
2
2
Частоты гаплотипов HLA вычислялись непрямым методом с использованием показателя степени неравновесного сцепления по формуле Маттиуса. Для определения показателя достоверности результатов рассчитывался непараметрический критерий X с поправкой Йетса. Значение X, превышавшее 3,841 (что соответствует р<0,05), рассматривалось как показатель достоверной разницы между частотами в сравниваемых группах. Для повышения точности результатов анализа использовалась поправка Бонферрони.
Для определения силы ассоциации между гаплотипом и изучаемым заболеванием рассчитывается показатель относительного риска (RR) для малых выборок по формуле Holdene-Woolf. Величина RR, равная 1, указывает на отсутствие различий в частоте встречаемости антигенов HLA у больных и в контроле. RR>1 (положительная ассоциация) означает, что данная специфичность HLA чаще регистрируется в группе больных. Этиологическая фракция (или атрибутивный риск) вычисляется для RR>1. Наибольшая величина этиологической фракции указывает на первичность ассоциативной связи исследуемой патологии с конкретным антигеном HLA. Если RR<1 (отрицательная ассоциация), то определяется величина превентивной фракции (PF). Величина PF показывает ту часть случаев, когда заболевание не развилось, благодаря наличию ассоциированного HLA- гена.
Частотные характеристики двухлокусных гаплотипов HLA класса I локусов А и В, наиболее часто встречавшихся в анализируемой выборке у пациентов с поллинозами, представлены в таблице 1.
Анализ частоты регистрации гаплотипов HLA у больных поллинозами показал, что наибольший уровень идентификации приходился на те комбинации, которые представлены часто регистрирующимися специфичностями. Так, с высокой частотой встречались двухлокусные гаплотипы HLA-A1/B5 (2,33%), А1/В8 (4,53%), А2/В5 (1,33%), А2/В13 (2,51%), А2/В40 (3,05%), А2/Вх (2,31%), А3/В27 (1,12%), А9/В13 (1,34%), А10/В18 (4,79%). Уровень частот указанных гаплотипов был свойственен здоровым лицам в контрольной группе.
Вместе с тем, в анализируемой выборке зарегистрированы изменения частотных характеристик для ряда гаплотипических сочетаний как в сторону их повышения, так и в сторону их понижения по сравнению с контролем.
Для анализа силы и направленности ассоциации для каждого гаплотипа HLA, уровень регистрации которого в группе больных поллинозами отличался от такового в контроле, рассчитывались показатели RR, EF и PF (таблица 2).
Так, в группе пациентов отмечалось статистически значимое повышение частоты встречаемости следующих двухлокусных гаплотипов HLA:
2
- А2/В7 (10,78%>4,58%; RR=3,31; EF=0,12; X=4,830; р<0,05);
2
с
- А19/В7 (6,15%>0,04%; RR=19,49; EF=0,06; X=13,192; p<0,001; p<0,02);
2
с
- А19/В16 (4,62%>0,84%; RR=5,25; EF=0,08; X=7,566; р<0,0025; p<0,05);
2
- А19/В35 (4,23%>0,44%; RR=7,45; EF=0,07; X=5,163; р<0,02).
Достоверно реже, по сравнению с контрольной группой, у больных поллинозами типировались следующие двухлокусные гаплотипы HLA:
2
- А2/В17 (0,56%<1,97%; RR=0,23; PF=0,08; Х=6,109; р<0,05),
2
- А3/В17 (0,13%<1,05%; RR=0,37; PF=0,07; X=4,147; р<0,05).
Таким образом, нами установлена положительная ассоциация поллиноза с двухлокусными гаплотипами HLA-A2/B7, А19/В7, А19/В16, А19/В35, что позволяет отнести их к маркерам повышенного риска развития поллиноза в популяции русских астраханской геногеографической зоны.
Резистентность к развитию поллиноза обусловлена присутствием в антигенном профиле индивидуума обладающих протективным эффектом гаплотипов HLA-A2/B17, А3/В17. Ниже приводятся результаты апробации.
Пример 1. Больная Т., 1984 г.р., русская, студентка. Обратилась к аллергологу консультативной поликлиники Александро-Мариинской областной клинической больницы г.Астрахани с жалобами на выделения из носа, чиханье, нарушение носового дыхания, зуд носа, неба, глаз, слезотечение в летние месяцы. Вышеуказанные жалобы наиболее интенсивно выражены в утренние часы. В период ухудшения здоровья беспокоят также раздражительность, общая утомляемость и отсутствие аппетита.
Анамнез заболевания и аллергологический анамнез: Больной считает себя с 20 лет, когда в период июль-сентябрь стала отмечать симптомы ринита и конъюнктивита. Вышеописанные симптомы заболевания появляются при контакте с растениями, особенно в ветреную погоду и в период пребывания на природе. В период обострений принимала антигистаминные препараты и сосудосуживающие капли. Последний год в период обострения самостоятельно делала инъекции дипроспана с хорошим эффектом. Перекрестной пищевой сенсибилизации не отмечает.
Бытовой, эпидермальной, грибковой, лекарственной аллергии нет. У ближайших родственников аллергических заболеваний не отмечалось. У аллерголога раньше не обследовалась, занималась самолечением.
12
9
9
Status praesens: Рост - 168 см, вес - 65 кг. Нормостенического телосложения. Кожные покровы чистые, обычной окраски. Периферические лимфатические узлы не увеличены. Дыхание через нос затруднено, чихание. Конъюнктивы обоих глаз гиперемированы. Отек век. В легких везикулярное дыхание. Хрипов нет. ЧДД-16 в 1'. Границы абсолютной и относительной сердечной тупости в пределах нормы. Тоны сердца ясные, ритмичные. PS-76 уд. в 1 мин. АД-115/75 мм рт.ст. Живот мягкий, не вздут, безболезненный. Печень не увеличена. Кишечник мягкий, безболезненный на всем протяжении. Дизурии и периферических отеков нет. Данные обследования: OAK: Er - 4,25×10/л, Нв - 122 г/л, ЦП - 0,9; Tr - 187×10/л, Le - 6,8×10/л, п-2, с-66, л-30, м-2, СОЭ - 9 мм/ч.
Общий иммуноглобулин Е - 85,9 МЕ/мл.
Результаты скарификационных кожных тестов с пыльцевыми аллергенами (проведены в период ремиссии заболевания): конопля+++, лебеда+++. Результаты скарификационных кожных тестов с бытовыми, эпидермальными, пищевыми аллергенами отрицательные.
По результатам клинико-лабораторного обследования в AM ОКБ установлен заключительный клинический диагноз: Аллергический ринит, средней степени тяжести, интермиттирующее течение. Аллергический конъюнктивит. Пыльцевая аллергия. Сенсибилизация к аллергенам из пыльцы конопли и лебеды. HLA-фенотип пациентки: А1, А2, В7, В40.
Таким образом, наличие в антигенном профиле гаплотипа HLA-А2/В7 обусловило формирование у больной пыльцевой аллергии.
Пример 2. Больная К., 1977 г.р., русская, врач. Обратилась к аллергологу консультативной поликлиники Александро-Мариинской областной клинической больницы г.Астрахани с жалобами на выделения из носа, чиханье, нарушение носового дыхания, отечность глаз, зуд носа, неба и глаз, слезотечение, чувство «заложенности» и стеснения в грудной клетке, приступообразный кашель с выделением прозрачной скудной мокроты, одышку с периодическими приступами удушья в летне-осенний период. В период обострения заболевания беспокоят также выраженная общая слабость, потливость, быстрая утомляемость и снижение работоспособности, плохой сон и отсутствие аппетита.
Анамнез заболевания и аллергологический анамнез: Больной считает себя с 1992 г., когда в летние и ранние осенние месяцы впервые стала отмечать признаки конъюнктивита, ринита. Вышеописанные симптомы заболевания усиливаются при контакте с травами. В 2005 году в возрасте 28 лет впервые присоединились симптомы атопической бронхиальной астмы: приступообразный кашель с выделением скудной мокроты, периодические приступы удушья. Подобная симптоматика возникает во второй половине июля и сохраняется до середины октября месяца.
Обследовалась у аллерголога в 2002 и 2004 годах. Занималась самолечением. По профессии врач линейной бригады МУЗ ГССМП. В период обострений принимает антигистаминные препараты, деконгестанты, метилксантины. Отмечает перекрестную пищевую аллергию на некоторые сорта натурального меда. Множественная лекарственная аллергия: на сульфаниламиды (отек Квинке), эритромицин (крапивница). В течение 5 лет курила по 3-4 сигареты в день. Семейный анамнез: у матери - бронхиальная астма; у дочери аллергологом диагностирован сезонный аллергический ринит.
Бытовой, эпидермальной, грибковой аллергии нет.
Status praesens: Рост - 154 см, вес - 76 кг. Повышенного питания. Кожные покровы чистые, обычной окраски, на момент осмотра следов от расчесов на коже нет. Слабая отечность век. Умеренная ринорея. Периферические лимфатические узлы не увеличены. Дыхание через нос затруднено. В легких ослабленное везикулярное дыхание. Свистящие хрипы в нижних отделах. ЧДД-19 в 1'. Границы абсолютной и относительной сердечной тупости в пределах нормы. Тоны сердца приглушены, ритмичные. PS-82 уд. в 1 мин. АД-125/80 мм рт. ст. Живот мягкий, не вздут, безболезненный. Печень не увеличена. Кишечник мягкий, безболезненный на всем протяжении. Дизурии и периферических отеков нет.
12
9
10
Данные обследования: OAK: Er - 4,45×10/л, Нв - 125 г/л, ЦП - 0,9; Tr - 355,8×10/л, Le - 5,9×10/л, эозинофилы - 9, б-1, п-4, с-58, л-26, м-2, СОЭ - 18 мм/ч.
Общий иммуноглобулин Е - 66,1 МЕ/мл. Спирометрия: ФЖЕЛ - 3,46 л (84%), ОФВ1 - 1,71 (51%), ОФВ1/ФЖЕЛ - 50%.
Результаты скарификационных кожных тестов с пыльцевыми аллергенами (проведены в период ремиссии): клен+, ежа+, лисохвост+, тимофеевка+, подсолнечник+++, одуванчик+, полынь+++, лебеда++, амброзия+, циклахена++. Результаты скарификационных кожных тестов с бытовыми, эпидермальными, пищевыми аллергенами отрицательные.
По результатам клинико-лабораторного обследования установлен заключительный клинический диагноз: Бронхиальная астма, аллергическая форма, легкое персистирующее течение. Аллергический ринит, персистирующее течение, средней степени тяжести. Аллергический конъюнктивит. Пыльцевая аллергия, перекрестная пищевая аллергия. Сенсибилизация к аллергенам из пыльцы деревьев, злаковых и сорных трав.
HLA-фенотип пациентки: А1, А19, В35, В70.
Результаты иммуногенетического исследования показали, что присутствующий в HLA-фенотипе пациентки гаплотип HLA- A19/B35 способствовал развитию поллиноза.
Пример 3. Больной О., 1950 г.р., русский, инженер. Обратился к аллергологу консультативной поликлиники Александро-Мариинской областной клинической больницы г.Астрахани с жалобами на затруднение носового дыхания.
Аллергологический анамнез: Пыльцевой, бытовой, эпидермальной, грибковой, лекарственной аллергии нет. У матери поллиноз: аллергический ринит, аллергический конъюнктивит.
Status praesens: Рост - 178 см, вес - 80 кг. Нормостенического телосложения. Кожные покровы чистые, обычной окраски. Периферические лимфатические узлы не увеличены. Дыхание через нос не затруднено. Видимые слизистые обычной окраски. В легких везикулярное дыхание. Хрипов нет. ЧДД-14 в 1'. Границы абсолютной и относительной сердечной тупости в пределах нормы. Тоны сердца ясные, ритмичные. PS-86 уд. в 1 мин. АД-120/75 мм рт. ст. Живот мягкий, не вздут, безболезненный. Печень не увеличена. Кишечник мягкий, безболезненный на всем протяжении. Дизурии и периферических отеков нет.
12
9
9
Данные обследования: OAK: Er - 4,5×10/л, Нв - 130 г/л, ЦП - 0,9; Tr - 192×10/л, Le - 7,8×10/л, п-2, с-70, л-28, м-2, СОЭ - 10 мм/ч.
Общий иммуноглобулин Е - 37,1 МЕ/мл.
Результаты скарификационных кожных тестов с пыльцевыми, бытовыми, эпидермальными, пищевыми аллергенами отрицательные.
Консультация оториноларинголога: искривление носовой перегородки. Рекомендовано оперативное лечение.
По результатам клинико-лабораторного обследования установлено отсутствие у больного поллиноза. HLA-фенотип пациента: А1, А3, В8, В17.
Несмотря на наличие наследственной отягощенности по поллинозу, у больного за 56 лет жизни не сформировалась пыльцевая аллергия. При иммуногенетическом исследовании у пациента определен гаплотип А3/В17, что позволило прогнозировать резистентность к развитию поллиноза. Это свидетельствует о высокой прогностической роли определения антигенного профиля HLA.
Предлагаемым способом достигнуто повышение точности прогнозирования развития поллиноза на 85%. Использование генетических методов в клинической практике позволит предупредить формирование пыльцевой аллергии и вовремя начать профилактические мероприятия.
Достоинством способа является его высокая достоверность, простота лабораторного выполнения, что указывает на возможность широкого применения в аллергологических стационарах и кабинетах.
Таблица 1
Частота регистрации некоторых двухлокусных гаплотипов HLA у больных поллинозами
Гаплотип HLA
Частота регистрации гаплотипа(%)
Гаплотип HLA
Частота регистрации гаплотипа(%)
Больные n=65
Контроль n=200
Больные n=65
Контроль n=200
А1/В5
2,326
2,671
А9/В16
1,677
0,928
А1/В8
4,532
3,736
А9/В17
0,312
1,396
А1/В16
1,615
0,061
А9/В35
2,778
1,880
А1/В18
0,317
0,325
А9/Вх
0,499
1,490
А2/В5
1,328
1,549
А10/В7
2,077
0,259
А2/В7
10,781
4,577
А10/В18
4,786
3,010
А2/В13
2,512
2,871
А10/В35
2,718
0,318
А2/В15
1,745
1,649
А10/Вх
1,544
2,540
А2/В16
3,076
1,311
А11/В7
2,875
1,373
А2/В17
0,558
1,969
А11/В12
0,522
0,488
А2/В35
3,708
1,112
А11/В17
0,166
0,974
А2/В40
3,053
2,871
А11/В35
3,108
1,475
А2/Вх
2,314
3,450
А19/В7
6,154
0,044
А3/В7
2,778
4,093
А19/В8
0,127
0,029
А3/В16
0,788
0,436
А19/В16
4,615
0,836
А3/В17
0,134
1,052
А19/В18
0,791
1,321
А3/В27
1,118
1,253
А19/В35
4,225
0,443
А3/В35
3,541
1,629
А28/В7
0,344
0,280
А3/В40
2,784
1,394
А28/В18
0,127
0,388
А9/В7
3,889
1,086
А28/В35
0,734
0,109
А9/В13
1,342
1,045
Ах/В16
0,929
1,890
А9/В13
1,342
1,045
Ах/В16
0,929
1,890
Таблица 2
Степень достоверности, RR, EF и PF в установленных ассоциациях поллинозов и гаплотипов HLA локусов А и В
Гаплотип HLA
Больные поллинозам и n=65
Контроль n=200
Критерий X<sup>2</sup>
RR
EF
PF
Частота в %
Частота в %
А1/В16
1,215
0,061
1,587
8,66
-
-
А2/В7
10,781
4,577
4,830
3,31
0,12
-
А2/В16
3,076
1,311
2,224
2,88
-
-
А2/В17
0,558
1,969
6,109
0.23
-
0,08
А2/В35
3,708
1,112
1,192
2,76
-
-
А3/В16
0,788
0,436
0,811
1,88
-
-
А3/В17
0,134
1,052
4,147
0,37
-
0,07
А3/В35
3,541
1,629
3,077
2,23
0,12
-
А9/В7
3,889
1,086
0,245
3,15
-
-
А10/В7
2,077
0,259
2,956
6,42
0,07
-
А10/В35
2,718
0,318
2,733
7,83
0,08
-
А19/В7
6,154
0,044
13.192
19,49
0,06
-
А19/В8
0,127
0,029
1,228
1,87
-
-
А19/В16
4,615
0,836
7,566
5,25
0,08
-
А19/В35
4,225
0,443
5,163
7,45
0,07
-