Влияние генотипа на экспрессию гена KitW y в раннем эмбриогенезе у мышей линии Wr

__________

ГЕНЕТИКА

Влияние генотипа на экспрессию гена в раннем эмбриогенезе у мышей линии WR

Н.Ю.Сахарова1,2, А.М.Малашенко2 , А.А.Смирнов\ Ю.А.Ковалицкая3, Е.Ф.Вихлянцева1

1 Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино

2 Научный центр биомедицинских технологий РАМН, Москва

3 Пущинский государственный университет

Исследовали влияние аллеля KitW-Y на репродуктивную способность и ранний эмбриогенез мышей линии WR. Было показано, что аллель KitW-Y несколько снижает фертильную способность самцов, но, по-видимому, не влияет на самок и на развитие доимплантационных эмбрионов in vitro. Замечено, что эмбрионы, полученные от скрещивания гетерозиготных мышей между собой, развиваются быстрее, чем контрольные. Гибель гомозиготных особей, о которой свидетельствует соотношение новорожденных детенышей, различающихся по фенотипу в основном происходит в постимплантационный период.

Ключевые слова: мутации c-kit гена, эмбриогенез мышей.

Нами было исследовано проявление аллеля KitW-Y(WY) мутации KitW(dominant spotting) c-kit гена в раннем эмбриональном развитии мышей линии WR. Эта линия была выведена в НИЛ биомоделей РАМН Светлые Горы (в настоящее время ГУ НЦБМТ) от скрещивания самок линии 129ReY(129), родственной линии 101/HY, и самца линии C57BL/6 (В6), гетерозиготного по мутантному генуW (dominant spotting Yurlovo) [12]. Современный символ этой мутации KitW-Y.

Линия WR высокочувствительна к кластогенному эффекту мутагенов (так же как линии 129 и 101) и характеризуется сильной депигментацией гетерозигот (по сравнению с линией В6), а также высокой долей гетерозиготных особей, имеющих черные пятна, т.е. участки с нормальной пигментацией волос. Причина высокой нестабильности гена KitW-Y на генотипе WR неясна. Было высказано предположение, что ослабление экспресии этого гена (ревер-

сия) может быть вызвано рекомбинацией, как это было показано для гена '^1, где реверсии составляют 3% [13]. Однако это не может объяснить высокую частоту реверсий в случае гена К^-¥, так как она обнаруживается у более чем 20% особей. Вероятно, гены-модификаторы эффекта гена К!^-¥ линииWR унаследованы от линии 129, обладающей рядом необычных характеристик — склонностью к образованию тератом семенника, очень высокой радиорезистентностью [1], а также тем, что клетки внутренней клеточной массы бластоцисты у мышей этой линии являются наиболее пригодными для получения эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) мыши [15]. Линия 129 несет нонсенс-мутацию гена ДНК-полимеразы-йота, который экспрессируется только в клетках мозга, но абсолютно неэффективен в семенниках [3].

Линия WR поддерживается скрещиванием гетерозигот между собой. В каждом помете наблюдается расщепление, что

приводит к появлению сибсов генотипа +/Ю^-¥ (WR-+/WY) и +/+ (WR-+/+). Они различаются по фенотипу. Мыши WR-+/+ характеризуются черной окраской шерсти, а у мышей WR-+/KitW-Y наблюдается сильное ослабление пигментации с встречающимися черными пятнами (рис. 1, 2).

Рис. 2

Мутация KitW, помимо того, что она изменяет окраску шерсти и нарушает кроветворение, влияет на репродуктивные способности мышей. Многочисленные аллели этой мутации различаются по пенетран-тности, экспрессивности и по мишеням своего действия [10]. Известно, что некоторые мутации, летальные для одних линий мышей, наносят лишь незначительные повреждения мышам, имеющим другой генотип [14]. Ранее мы исследовали проявление аллеля KitW-Y в доимплантационном развитии мышей линии C57BL/6JY. Было показано, что этот аллель отрицательно влияет на гаметогенез, оплодотворение и снижает жизнеспособность ранних эмбрионов в условиях in vitro [4].

Целью настоящей работы было исследование влияния генотипа WR на экспрес-

сию того же аллеля в доимплатнационный период развития. Для определения жизнеспособности зародышей мышей в пренатальный период онтогенеза, несущих мутацию KitW-Y на генотипе WR, мы оценивали соотношение новорожденных детенышей, различающихся по фенотипу, состояние эмбрионального материала, находившегося в яйцеводах на 2-й день беременности, и развитие полученных зародышей in vitro.

Материалы и методы

В опытах были использованы мыши линии WR/Y с генотипом aa,+/KitW-Y, различающиеся по фенотипу: черные с генотипом aa (+/+) и гетерозиготы +/KitW-Y, характеризующиеся ослабленной пигментацией. В первой серии опытов детенышей получали при различных вариантах скрещивания гетерозиготных мышей: (+/+ х +/ KitW-Y), (+/ KitW-Y х +/+) и (+/ KitW-Y х +/ KitW-Y). Как только появлялась разница в окраске детенышей (в среднем, через неделю после рождения), подсчитывали количество детенышей разного фенотипа.

Во второй серии опытов исследовали соотношение развивающихся эмбрионов и неоплодотворенных или неразвивающих-ся после оплодотворения яйцеклеток, полученных при промывании яйцеводов самок на 2-й день после спаривания. В этой серии использовали следующие варианты скрещивания мышей: (+/+ х +/KitW-Y), (+/ KitW-Y х +/+), (+/KitW-Y х +/KitW-Y) и (+/+ х +/+).

В третьей серии опытов исследовали развитие in vitro 2-клеточных зародышей, полученных от скрещивания между собой гетерозиготных мышей^/^^^ х +/KitW-Y) и мышей, несущих дикий аллель kit-гена (+/ + х +/+).

Для вымывания и культивирования эмбрионов использовали модифицированную среду Виттена [2]. Культивирование проводили при 37оС и 5% содержании СО2 в атмосфере в течение 72 ч. Каждые 24 ч

Таблица 1

Расщепление по фенотипу в потомстве мышей, несущих аллель

Вид скрещивания Количество Из них

новорожденных +/KitW-Y +/+^)

+/+ х+/КІ1№У 483 232 (с черным пятном - 20,6%) 251

+/КІ1№У х +/+ 204 99 105

+/КІГ-У х +/КІ1№У 161 107 54

определяли количество развивающихся зародышей и стадии, на которых они находились, с помощью инвертированного микроскопа МБИ-13 (Россия).

Результаты и обсуждение

Первая серия. Расщепление по фенотипу детенышей, несущих аллель KitW"Y

Анализ полученных результатов, приведенных в табл. 1, показывает, что при скрещивании самок +/+ с самцами +/КИ^-¥ детеныши с мутантной окраской составляют 58,3%, а с черной («дикой») — 41,7%; при скрещивании самок+/КИ^-¥ с самцами+/ + — 48,0% и 52,0%, соответственно. При скрещивании гетерозиготных мышей между собой мутантные детеныши составляют 66,5% и «дикие» — 33,5%.

Таким образом, обратное скрещивание гетерозиготных мышей с «дикими» независимо от того, кто был носителем мутации, самец или самка, приводит в потомстве к расщеплению по фенотипу в соотношении, близкому к 1:1 (1,0:1,08 и 1,0:1,1, соответственно). Это показывает, что все гетерозиготные особи выживают, т. е. в гетерозиготном состоянии исследуемая мутация не нарушает пренатального развития.

При скрещивании гетерозиготных мышей между собой — ^/КИ^^ х +/КИ^,-¥) соотношение мутантных и «диких» мышат составляет 1,98:1,0 (то есть, 2:1). Согласно закономер-

ностям менделевского расщепления, при выживании всего потомства следовало бы ожидать другого соотношения, а именно 3:1. Таким образом, наши данные свидетельствуют о том, что одна четверть мышат, несущих мутантный ген, погибает в пренатальном периоде онтогенеза. Приведенные выше результаты обратного скрещивания говорят о том, что все гетерозиготные детеныши выживают. Следовательно, погибают до рождения только гомозиготные особи.

Вторая серия. Состояние яйцеклеток на 2-й день после спаривания

Как показывают наши данные (табл. 2), при всех вариантах скрещивания часть яйцеклеток в яйцеводах остается неоплодот-воренной или после оплодотворения не приступает к дроблению и погибает на ста-

Таблица 2 Состояние яйцеклеток на 2-й день после оплодотворения у мышей, несущих аллель

Вид скрещивания Количество полученных яйцеклеток Неразвившиеся яйцеклетки

Кол-во %

+/+ X +/КІ1№У 224 * 0 40,2

+/ КІГ-У х +/+ 142 44 30,1

+/КГ-У х +/КІ1№У 140 * 4 ио 38,6

+/+ х +/+ х WR) 211 58 27,5

дии зиготы. Больше всего неразвивающих-ся яйцеклеток наблюдается при скрещивании самок +/+ с самцами +/КИ^-¥ (40,2%) и гетерозиготных мышей между собой (38,6%). Эти значения достоверны по отношению к контролю (р < 0,05). При скрещивании самок +/КИ^-¥ с самцами +/+ гибель яйцеклеток меньше и составляет 30,1%, что близко к показателю их гибели в случае скрещивания между собой мышей +/+ (27,5%).

Эти результаты позволяют предположить, что мутация КИ^-¥ на генотипе WR в большей степени нарушает оплодотворяющую способность сперматозоидов, чем жизнеспособность яйцеклеток. Возможно, этим объясняется тот факт, что доля неразвивающихся яйцеклеток при скрещивании мутантных самцов как с мутантными, так и с «дикими» (+/+) самками одинакова.

Результаты наблюдений зародышей, полученных из яйцеводов на 2-й день беременности представлены в табл. 3. Согласно литературным данным [6], в это время в яйцеводах зародыши находятся на стадии

2 бластомеров. Наши эксперименты показали, что большее количество полученных эмбрионов находилось на стадии 2 бластомеров, однако, часть зародышей была на стадиях 4 и 8 бластомеров.

В группах (+/+ х +/Кі^-¥), (+/Кі^-¥ х +/+) и (+/+ х +/+) количество 2-клеточных зародышей было почти одинаковым — 90,3%, 86,7% и 85,7%. В группе (+/Кі^-¥ х +/Кі^-¥) доля 2-клеточных зародышей составила 72,1% от общего количества развивающихся зародышей.

На стадии 4 бластомеров в группе (+/+ х +/Кі^-¥) было 5,2% зародышей. В группах (+/Кі^-¥ х +/+) и (+/Кі^-¥ х +/Кі^-¥) этот показатель составлял 10,2% и 11,6%. В контрольной группе (+/+ х +/+) на этой стадии находилось 14,4% зародышей.

На стадии 8 бластомеров больше всего оказалось зародышей в группе (+/Кі^-¥ х +/Кі^-¥) — 16,3%, что достоверно выше по отношению к контролю (р < 0,05). В группах (+/+ х +/Кі^-¥) и (+/Кі^-¥ х +/+) таких зародышей было гораздо меньше — 4,5% и 3,1%. В группе (+/+ х +/+) среди 153 зародышей был обнаружен лишь один 8-клеточный.

Эти данные показывают, что зародыши мышей линии WR на 2-й день после спаривания составляют гетерогенную группу. Часть зародышей по своему развитию явно опережают других. Проблема гетерохронии в период дробления детально обсуждена в нашей предыдущей работе, посвященной исследованию особенностей проявления аллелей Кі^-У и Кі^-¥ в раннем эмбриоге-

Таблица 3

Распределение жизнеспособных зародышей по стадиям развития на 2-й день после оплодотворения

Вид скрещивания Количество жизнеспособных зародышей Стадия 2 бластомеров Стадия 4 бластомеров Стадия 8 бластомеров

Кол-во % Кол-во % Кол-во %

+/+ х +/КІ^-У 134 121 90,3 7* 5,2 6* 4,5

+/КІ^-У х Ч +/+ 98 85 86,7 10 10,2 3 3,1

+/КІ^ х +/КІ^ 86 62* 72,1 10 11,6 14* 16,3

+/+ х +/+ Ч WR) 153 130 85 22 14,4 1 0,7

незе мышей [7]. Результаты, полученные в настоящей работе, показывают, что эта особенность аллеля КИ^^ сохраняется и в раннем развитии мышей линии WR. Наибольшее количество зародышей (27,9%), опережающих в своем развитии остальных, было обнаружено в группе (+/К11^^ х +/К!^-¥).

Следует отметить, что у зародышей в группе (+/+ х +/+), также обнаружена тенденция к более быстрому переходу на стадию 4 бластомеров (14,4% случаев). Можно предположить, что это связано с тем, что при создании линии WR была использована линия С57БЬ/6^¥/+ и, возможно, какая-то модификация аллеля КИ^-¥, не влияющая на окраску шерсти, но определяющая временные параметры дробления, сохранилась в геноме мышей WR. Кроме того, исследование цитогенетического эффекта тиоТЭФ (химического мутагена) показало, что по чувствительности к тиоТЭФ мыши WR генотипов +/+ и +/КИ%,-¥ очень близки друг к другу. Было высказано предположение, что необычная чувствительность линии WR-+/+ связана с тем, что в процессе ее выведения были отобраны гомозиготы по генам, повышающим чувствительность к тиоТЭФ, унаследованным от линий 129 и В6 [5]. Возможно, что это родство определяет и общую тенденцию к более быстрому развитию. Оба высказанных предположения требуют дальнейшей проверки.

Третья серия. Развитие in vitro 2-клеточных зародышей мышей линии WR

В этой серии были использованы зародыши, полученные от скрещивания между собой гетерозиготных мышей (+/KitW-Y X +/KitW-Y). Контролем служили зародыши группы (+/+ X +/+). Результаты наблюдений представлены в табл. 4.

Через 24 ч культивирования продолжили свое развитие в подопытной группе 100% зародышей, и в контрольной группе — 95,8%. В обеих группах наблюдались зародыши на стадии 4 или 8 бластомеров. Однако распределение по стадиям было различным. Зародыши в группе (+/KitW-Y X +/ KitW-Y ) в достоверно большем числе случаев (70,9%) достигли более поздних стадий (стадии 8 бластомеров) по сравнению с контрольной группой, в которой большинство зародышей находились на стадии 4 бластомеров (67%). Кроме того, следует отметить, что в группе (+/KitW-Y X +/KitW-Y) большее количество 8-клеточных зародышей приступило к компактизации, т.е. к первичной морфологической дифференцировке на внешние и внутренние клетки.

Через 48 ч развитие продолжили в группе (+/KitW-Y X +/KitW-Y) 91,1% зародышей и в группе (+/+ X +/+) — 80% от первоначального их количества. Во время наблюдения зародыши в обеих группах находились

Таблица 4

Развитие in vitro зародышей мышей, несущих аллель KitW-Y

Вид скрещивания Количество 2 клеточных зародышей Культивирование

24 ч 48 ч 72 ч

+/KitW-Y x +/KitW-Y 79 4 бл - 23* 6-8 бл - 56* 8 бл - 2 морулы 48 ранние бластоцисты - 22* Бластоцисты - 68

+/+ x +/+ (WR x WR) 100 4 бл - 67 6-8 бл - 28 8 бл - 5 морулы - 64 ранние бластоцисты - 11 Бластоцисты - 64

также на разных стадиях развития, в основном на стадии многоклеточной морулы. В обеих группах были обнаружены ранние бластоцисты. Анализ распределения зародышей по стадиям показывает, что зародыши в подопытной группе несколько опережают по развитию зародышей в контрольной группе, но это опережение статистически недостоверно. Так, на стадиях поздней (компактной многоклеточной) мору-лы в группе (+/KitW-Y X +/KitW-Y) было 60,7% зародышей, а ранних бластоцист — 27,8%, в группе (+/+ X +/+) морулы составляли 64% зародышей, а ранние бластоцисты 11%.

Через 72 ч культивирования основным показателем успешного развития было достижения зародышами стадии бластоцисты, последней стадии доимплантационного периода эмбриогенеза. В группе (+/KitW- Y X +/ KitW-Y) этой стадии достигли 86,1% зародышей, а в группе (+/+ X +/+) — 64%.

Таким образом, наблюдения за развитием in vitro дают возможность считать, что присутствие аллеля KitW-Y не снижает жизнеспособности зародышейWR и их потенциала развития. Так как группа (+/KitW-Y X +/KitW-Y) помимо зародышей дикого и гетерозиготного типа содержала и гомозиготных зародышей, то можно думать, что изучаемый мутантный аллель на генотипе WR не оказывает отрицательного действия на раннее эмбриональное развитие не только в гетерозиготном, но и в гомозиготном состоянии в противоположность тому, что наблюдается в случае зародышей, несущих аллель KitW-Y на генотипе C57BL/6 [4]. Наши данные также показывают, что зародыши в группе (+/KitW-Y X +/KitW-Y) быстрее достигают стадий 8-бластомеров, компактной морулы и бластоцисты, чем зародыши контрольной группы. Это подтверждает наши предположения о влиянии аллеля KitW-Y на временные параметры дробления. Можно думать, что у ранних зародышей мышей WR, несущих аллель KitW-Y, ускоряется прохождение периода дробле-

ния. Аналогичное ускорение было показано и для мышей C57BL/6 [4].

Наши наблюдения также позволяют предположить, что у самцовWR аллель KitW-Y вызывает нарушение оплодотворяющей способности сперматозоидов, так как независимо от того, несет ли самка этот аллель или нет, количество неразвиваю-щихся яйцеклеток на 2-й день после спаривания с гетерозиготными самцами больше, чем при аналогичном спаривании с самцами, несущими дикий аллель. Сравнение с данными, полученными на мышах C57BL/6 [4], показывает, что аллель KitW-Y по-разному влияет на фертильные способности мышей с разным генотипом. У гетерозиготных мышей WR отрицательное действие этого аллеля проявляется гораздо слабее, чем у мышей C57BL/6.

Такой же вывод следует из сравнения развития in vitro зародышей мышей WR и C57BL/6. В условиях культивирования зародыши, полученные от гетерозиготных мышей C57BL/6, проявляют пониженную жизнеспособность по сравнению с контрольными зародышами. По-видимому, в этом случае прекращают развитие, в основном, гомозиготные зародыши [4]. В случае мышей WR развитие зародышей с аллелем KitW-Y не отличается от развития контрольных зародышей.

В заключение следует сказать, что мыши, несущие мутации, сходные с человеческими, представляют собой удобные модели для изучения сложных генетических взаимодействий, которые определяют проявление наследственных болезней. Известно, что фенотипическое проявление мутаций, определяющих некоторые формы рака, в значительной степени зависят от основного генотипа [8]. Генотип мышей влияет и на проявление мутации в гене рецептора эпидермального фактора роста, необходимом для регуляции эмбрионального развития. Показано, что в зависимости от генотипа мышей мутация в этом гене прекращает развитие на разных стадиях [16].

В этом отношении исследования по влиянию генотипа на фенотипическое проявление мутации Kit W и его аллелей очень нужны, так как известно, что такая же мутация есть и у человека [9]. Важность c-kit-гена определяется тем, что он участвует в процессах, связанных с делением, диффе-ренцировкой и миграцией клеток. Некоторые его аллели способствуют малигниза-ции клеток крови [14]. В последнее время большое внимание обращается на значение мутаций в этом гене и в гаметогенезе [11]. Полученные нами данные о проявлении аллеля KitW-Y у мышей WR важны для изучения сложных генетических взаимодействий, которые определяют проявление мутаций в c-kit-гене в зависимости от основного генотипа.

Литература

1. Бландова З.К., Вахрушева М.П., Малашенко А.М. и др. Пятнистые стерильные самцы — новая мутация Dominant Spotting в 5 хромосоме мыши // Генетика. 1986. Т. 22. С.1025-1032.

2. Березовская О.П., Межевикина Л.М., Веп-ринцев Б.Н. Метод культивирования ранних эмбрионов линейных мышей // Онтогенез. 1986. Т.17. №5. С.553-555.

3. ГенингЛ.Б., МакароваА.В., МалашенкоА.М., Тарантул В.З. Фальшивая нота ДНК-поли-меразы-йота в ансамбле сторожей генома млекопитающих // Биохимия. 2006. Т. 71. № 2. С. 201-207.

4. Коломиец О.Л.,Л.Ф. Курило, МалашенкоА.М, Сахарова Н.Ю., Чеботарева Т.А. Изучение эффектов мутантного гена dominant spotting-Yurlovo (KitW-Y) на сперматогенез, раннее эмбриональное развитие и плодовитость мышей линии C57BL/6JY // Генетика. 2005. Т. 41. № 10. С. 1377 - 1386.

5. Малашенко А.М., СурковаН.И. Новая линия WR- высокочувствительная к цитогенетическому эффекту тиоТЭФ // Цитология и генетика. 1979. Т.13. № 5. С. 387-391.

6. Пратт Х. Эксперименты с предимпланта-ционными эмбрионами мышей. Биология развития млекопитающих. Методы. — М.: Мир, 1990. С. 27-647.

7. Сахарова Н.Ю., Малашенко А.М, Вихлянце-ва Е.Ф., Ковалицкая Ю.А. Влияние аллелей KitW-V и Ю^^мутации dominant spotting на продолжительность стадий дробления и жизнеспособность ранних эмбрионов мышей // Биомедицина. № 3, 2006.

8. Dietrich W.F., LanderE.S., Smith J.E. etal. Genetic Identification of Mom-1, a Major Modifi-cier Locus Affecting Min-Induced Intestinal Neoplasia in the Mouse // Cell. 1993. V. 75. P. 631-639.

9. Fleishman R.A., Saltman D.L., Stastny V. et al. Deletion of c-kit protooncogene in the human developmental defect piebald trait // PNAS. 1991. V. 90. P. 10885-10889.

10. Green M.C. Catalog of mutant genes and polymorphic loci // Genetic Variants and Strains of the Laboratory Mouse/ Second ed. Eds. Lyon M.F., Searle A.G. Oxford; N.Y.: Univ Press. Oxford. 1989. P.12-403.

11. Kissel H., Timochina I., Hardy M.P. et al. Point mutation in Kit receptor tyrosine kinase reveals essential roles for kit signalling in spermatogenesis and oogenesis without affecting other Kit responses //EMBO J. 2000. V. 12. P. 13121326.

12. Malashenko A. Yurlovo W — Suggested Symbol WY // Mouse New Letters. 1976. No. 37. P. 61.

13. Panthier J.J., Guenet J.L., Condamine H. et al. Evidence for mitotic recombination in Wel/+ heterozygous mice // Genetics. 1990. V. 125. P. 175-182.

14. Pearson H. Surviving a knockout blow // Nature. 2002. V. 415. P. 9-8.

15. Seong E, Saunders T.L., Stewart C.L. et al. To knockout in 129 or in C57BL/6: that is the question // Trends Genet. 2004. V. 20. P. 59-62.

16. Threadgill D.W., Dlugosz A.A., Hansen L.A. et al. Target disruption of mouse EFGF receptor: effect of genetic background on mutant prenotype // Science. 1995. V. 269. P. 230 - 234.

THE EARLY EMBRYONIC DEVELOPMENT OF MICE WR BEARING ALLELE KITW-Y N.Yu.Sakharova, [A.M.Malashenko, |A.A.Smirnov, Yu.A.Kovalitskaya, E.F.Vikhlyantseva

Institute of Theoretical and Experimental Biophysics of RAS, Pushchino Research Center for Biomedical Technology of RAMS, Moscow Pushchino State University

The allele KitW-Y influence on reproductive ability and early embryonic development of mice WR was investigated. It was shown that allele KitW-Y slightly reduced the male fertility and had no apparent effect on female fertility and viability of preimplantation embryos. The embryos, derived from mating between heterozygous females and males, developed in vitro more quickly than control ones. The relation between new-born mice-cubs with different phenotype showed that the homozygous embryo mortality occurred in postimplantation period for the most part.

Key words: c-kit gene mutation, mice embriogeneze.