СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧИСЛА КОПИЙ ТРАНСГЕНА В ОБРАЗЦЕ ДНК
METHOD FOR TRANSGENE COPY COUNT IN DNA SAMPLE

Изобретение относится к молекулярной генетике, в частности к способам определения копийности трансгенов, и может быть использовано для анализа трансгенных организмов в лабораторных экспериментах и в биотехнологических работах.
Известен способ определения числа копий трансгена, состоящий в том, что образец ДНК, выделенный из ткани трансгенного организма, подвергают Southern-блот-гибридизации с радиоактивно меченым зондом. Параллельно проводят гибридизацию с образцами аналогичного гена, в которых известно число копий трансгена. С гибридизационными пробами проводят радиоавтографию. О числе копий трансгена судят по интенсивности засвеченных пятен на радиоавтограмме. (Nucleic Acids Res. 2006; 34(8): 2154-2165. The human vitamin D-binding protein gene contains locus control determinants sufficient for autonomous activation in hepatic chromatin. Tomoko Hiroki, Young-Han Song, Stephen A. Liebhaber, and Nancy E. Cooke)
К недостаткам этого известного способа следует отнести низкую чувствительность и точность, затруднения в интерпретации результатов, а также необходимость использования радиоактивных материалов. Этот способ выбран нами в качестве прототипа.
Задачей изобретения является повышение чувствительности и точности определения числа копий трансгена.
Поставленная задача решается благодаря тому, что в способе определения числа копий трансгена, включающем сравнение образца ДНК, выделенного из трансгенного организма, с образцами ДНК известной копийности, предусмотрены следующие отличия:
подбирают праймеры к опытному трансгену;
синтезируют маркер копийности (МК) - фрагмент ДНК, имеющий вставку в амплифицируемом фрагменте ДНК и определяют число его копий в пробирке;
проводят серию конкурентных ПЦР с подобранными праймерами и двумя матрицами - опытным образцом и различными разведениями маркера копийности в одной пробирке;
продукты амплификации разделяют электрофорезом в агарозном геле и окрашивают бромистым этидием;
фотографируют окрашенную электрофореграмму и измеряют оптическую плотность полос ампликонов;
строят калибровочную кривую, по которой рассчитывают количество копий трансгена.
Сущность предложенного способа заключается в следующем. Подбирают праймеры к фрагменту трансгена. Затем создают генную конструкцию, в составе которой присутствует амплифицируемый фрагмент трансгена, увеличенный с помощью вставки на 10-15%. Праймеры для трансгена должны подходить и для маркера копийности. При этом продукты амплификации с подобранными праймерами при использовании в качестве матрицы трансгена и маркера копийности будут отличаться по размерам, что легко выявить на электрофореграмме. Ограничения по размерам вставки связаны с тем, что вставка недостаточного размера может затруднить различение продуктов амплификации на электрофореграмме, а излишне большая вставка может привести к изменениям условий амплификации.
В качестве маркера копийности использовали продукт амплификации фрагмента гена со вставкой.
Выделив и очистив маркер копийности и зная его размеры и молекулярный вес, нетрудно путем измерения на спектрофотометре оптической плотности при длине волны 260 нм рассчитать концентрацию и число копий маркера копийности в единице объема. Для определения числа копий трансгена в анализируемом образце ДНК трансгенного организма проводили конкурентную ПЦР в пробах, содержащих одновременно анализируемый образец ДНК (в одинаковых концентрациях) и маркер копийности в последовательных разведениях в качестве матриц, которые конкурировали за общие праймеры.
По окончании ПЦР продукты амплификации разделяли электрофорезом в агарозном геле с бромистым этидием и получали цифровое изображение окрашенной электрофореграммы, которую обрабатывали программой PhotoM 1.31 (http://t-lambda.chat.ru/download.html). С ее помощью измеряли оптическую плотность полос ампликонов. Строили график, где по оси Х - значения lg числа копий маркера копийности в пробах, а на оси Y - отношение оптической плотности полосы ампликона маркера копийности к сумме оптических плотностей обоих ампликонов (маркера копийности и трансгена). Число копий трансгена в анализируемом образце будет равно числу копий маркера копийности при Y=0,5. Это значение легко найти на графике.
Использование в заявляемом способе реакции ПЦР позволяет значительно увеличить чувствительность определения по сравнению с прототипом за счет многократного удвоения исходных амплифицируемых фрагментов трансгена. Высокая чувствительность способа определения числа копий трансгена важна в тех случаях, когда возникает необходимость анализировать микроколичества исходного материала, например при исследовании эмбрионов и микроорганизмов.
Цифровые способы обработки изображения электрофореграммы повышают точность определения, дают возможность количественно измерить оптическую плотность окрашенных полос продуктов амплификации. Прототип предполагает такие процедуры, как экспонирование меченых образцов с рентгеновскими пластинками с последующим их проявлением и фиксацией. Каждый из этих этапов также может вносить искажения в конечный результат. В отличие от прототипа, способ не предусматривает использование радиоактивных материалов, в связи с чем является более безопасным и удобным. Изобретение позволяет повысить чувствительность и точность определения числа копий трансгена. Возможность осуществления заявляемого изобретения подтверждается следующим примером.
Пример
Имелся плазмидный вектор, содержащий репортерный ген LacZ. Этим вектором были трансформированы зиготы мыши и пересажены в матку суррогатной матери. На стадии 10,5 суток развития эмбрионы были извлечены. Из амниотических оболочек выделена хромосомная ДНК и проанализирована на наличие трансгена. Анализ осуществляли методом ПЦР с использованием праймеров, подобранных к гену LacZ: прямой 5'-acaggaaggccagacgcgaa-3' и обратный 5'-ggcaacatggaaatcgctga-3'. Амплифицируемый фрагмент гена LacZ составляет 283 пары оснований и имеет в положении 234-го основания сайт узнавания эндонуклеазой рестрикции AatII.
В результате анализа был выявлен трансгенный эмбрион.
Для определения числа копий трансгена в образце трансгенной ДНК была создана вспомогательная генетическая конструкция - маркер копийности. Для этого в ген LacZ плазмидного вектора по сайту AatII была лигирована вставка двухцепочного олигонуклеотида следующего состава:
За счет вставки при проведении ПЦР с теми же праймерами с использованием маркера копийности в качестве матрицы (по сравнению с использованным трансгеном) амплифицируемый фрагмент увеличивается на 30 пар оснований и составляет 312 пар оснований.
Маркер копийности (МК) был выделен, очищен. Его концентрацию (6 мкг/мл) определили на спектрофотометре.
Общая длина ампликона со вставкой - 312 п.н.
Молекулярный вес ампликона - 202488
Расчет числа копий МК осуществляли с помощью он-лайн сервиса
http://molbiol.ru/scripts/01 07.html:
23
- 1 Моль, 6×10 копий (число Авагадро) - весят 202488 г
23
6
- или 6×10 копий весят 202488×10 мкг
- 1 мл МК содержит 6 мкг
- Следовательно, в 1 мл МК содержится 17844153727630 копий молекул.
Ставили конкурентную ПЦР с подобранными праймерами. В каждой пробе содержались две матрицы: образец ДНК трансгенного эмбриона и маркер копийности в различных концентрациях. Состав реакционной пробы до внесения маркера копийности приведен в таблице.
Таблица
Реагент
Конечная концентрация
Стерильная деионизованная вода
до объема 20 мкл
10×Taq буфер "Sintol"
1×
2 mM dNTP "Fermentas"
0,2 мМ
Праймер прямой
0,4 мкМ
Праймер обратный
0,4 мкМ
Taq ДНК полимераза 5 Е/мкл Termostar "Sintol"
2 Е
25 мМ MgCl<sub>2</sub>
2,5 мМ
ДНК-матрица эмбриона №18
45 нг
Маркер копийности вносили в пробы в количествах: 28, 56, 140, 279 и 560 копий на пробу. Режим амплификации: 95° - 5 мин, (95° - 30 сек, 57° - 30 сек, 72° - 30 сек) - 32 цикла, 72° - 5 мин.
Амплификацию образцов проводили на термоциклере «Терцик». По окончании реакции по 10 мкл реакционной смеси вносили в лунки 2% агарозного геля с бромистым этидием и проводили электрофорез. Изображение электрофореграммы в УФ свете получали на приборе «БИОСКАН» (фиг.1). С помощью программы PhotoM 1.31 измерили оптическую плотность полос ампликонов на инвертированном изображении электрофореграммы, после чего строили калибровочный график (фиг.2).
Равенство числа копий МК и трансгена в пробе имеет место при значении ординаты графика 0,5. По графику при У=0,5 значение Х (lg числа копий) равно 2,02, следовательно, число копий трансгена в каждой из проб равно 105.
Краткое описание чертежей
Фиг.1. Инвертированное изображение электрофореграммы в УФ свете продуктов амплификации конкурентной ПЦР.
2 - лидирующий ампликон, с матрицы гена LacZ трансгенного эмбриона;
1 - матрицей для отстающего ампликона служит МК.
Фиг.2. Калибровочный график расчета числа копий трансгена в образце ДНК.
По оси ординат - отношение оптической плотности ампликона трансгена к суммарной оптической плотности ампликонов МК и трансгена на электрофореграмме.
По оси ординат - десятичный логарифм числа копий МК в пробе.