LACTOBACILLUS SALIVARIUS CJLS1511, КОМПОЗИЦИЯ КОРМОВОЙ ДОБАВКИ ДЛЯ ЖИВОТНЫХ, СОДЕРЖАЩАЯ УКАЗАННУЮ БАКТЕРИЮ ИЛИ ЕЕ МЕРТВЫЕ КЛЕТКИ, И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ УКАЗАННЫХ МЕРТВЫХ КЛЕТОК
LACTOBACILLUS SALIVARIUS CJLS1511, FODDER ADDITIVE COMPOSITION FOR ANIMALS CONTAINING SAID BACTERIUM OR DEAD CELLS THEREOF, AND METHOD OF PRODUCING SAID DEAD CELLS

Область техники
Настоящее изобретение относится к новому Lactobacillus salivarius CJLS1511, к композиции для добавления в корм для животных, содержащей вышеупомянутый микроорганизм или его инактивированные бактериальные клетки, и к способу получения инактивированных бактериальных клеток.
Предшествующий уровень техники
Микроорганизм Lactobacillus sp. представляет собой лактобактерию, которая осуществляет гомоферментацию или гетероферментацию и обычно обнаруживается в кишечниках животных, включая человека, и процесс ферментации молочных продуктов и овощей. Микроорганизмы Lactobacillus sp. представляют собой продуцирующие молочную кислоту бактерии, обнаруживаемые обычно в кишечном тракте животных, и осуществляют гомоферментацию или гетероферментацию с использованием молочных продуктов и овощей в качестве своих субстратов. Известно, что микроорганизмы Lactobacillus sp. поддерживают кишечную среду у животных в кислом состоянии, ингибируют чрезмерный рост опасных бактерий, таких как Е. coli и Clostridium, оказывают положительный эффект на диарею и запор у животных и способствуют синтезу витаминов, снижают уровень холестерина в сыворотке и обладают противораковой активностью, и так далее.
Были проведены исследования на пробиотиках в качестве кормовых добавок согласно вышеупомянутым свойствам микроорганизмов Lactobacillus sp. Бактериальная диарея у домашнего скота приводит к снижению скорости роста и выживаемости. Поэтому, с целью повышения продуктивности домашнего скота, различные антибиотики добавляют в рацион кормления животных в фармацевтической дозе. Однако в последние годы во всем мире обсуждается проблема устойчивости к антибиотикам из-за их чрезмерного использования. Таким образом, правительства во многих странах начали ограничивать применение антибиотиков в кормах для животных, (доступная для всеобщего ознакомления заявка на патент Кореи No. 10-1998-78358) (McEwen and Fedorka-Cray, Antimicrobial use and resistance in animals, Clinical infectious Diseases, Volume 34, June 2002, pages S93-S106).
Документы уровня техники
(Патентный документ 1) Korean Patent Laid-Open Publication No. 10-1998-78358
(Непатентный документ 1) Clinical infectious Diseases, Volume 34, June 2002, pages S93-S106
Техническая проблема
В настоящем изобретении предложены кормовые добавки, содержащие новый микроорганизм Lactobacillus sp., способные усиливать прирост массы тела животного, иммунный статус, способность животных противостоять заболеванию и ингибирование чрезмерного роста опасных бактерий в кишечном тракте животных.
Техническое решение
Согласно примеру воплощению настоящего изобретения, предложен Lactobacillus salivarius CJLS1511 (KCCM11829P) или его инактивированные бактериальные клетки.
Согласно другому примеру воплощения настоящего изобретения, предложена композиция кормовых добавок для животных, содержащая Lactobacillus salivarius CJLS1511 (KCCM11829P) или его инактивированные бактериальные клетки.
Согласно другому примеру воплощения настоящего изобретения, предложено в форме кормовой добавки для животных, как описано выше.
Согласно другому примеру воплощения настоящего изобретения, предложен способ получения инактивированного Lactobacillus salivarius CJLS1511 (KCCM11829P), включающий:
культивирование Lactobacillus salivarius CJLS1511 (KCCM11829P) с получением культурального раствора,
нагревание культурального раствора при определенной температуре в диапазоне от 70°С до 160°С,
охлаждение нагретого культурального раствора до конкретной температуры в диапазоне от 10°С до 6°С, и
выделение инактивированного Lactobacillus salivarius CJLS1511 (KCCM11829P) из охлажденного культурального раствора.
Полезные эффекты
Lactobacillus salivarius CJLS1511 согласно примерному воплощению настоящего изобретения или его инактивированные бактериальные клетки могут иметь превосходные способности деградации нейтральных липидов, адсорбции эндотоксинов, ингибирования роста патогенных бактерий и улучшения активности пищеварительных ферментов.
Композиции кормовых добавок для животных или их комбикорма, содержащие Lactobacillus salivarius CJLS1511 согласно примерному воплощению настоящего изобретения или его инактивированные бактериальные клетки, могут улучшать результаты роста животного и улучшать иммунный статус, тем самым способствуя выздоровлению животного от заболевания, вызванного патогенами.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
На ФИГ. 1 показано полученное с помощью электронного микроскопа изображение штамма Lactobacillus salivarius CJLS1511 или его инактивированных (мертвых) бактериальных клеток.
На ФИГ. 2 показано филогенетическое дерево Lactobacillus salivarius CJLS1511.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ВОПЛОЩЕНИЙ
Далее настоящее изобретение будет описано подробно. Характеристики, которые не описаны в описании изобретения, могут быть адекватно распознаны и установлены специалистом в области техники или в областях, аналогичной этой, и, таким образом, их подробности не будут включены.
Согласно примеру воплощения настоящего изобретения предложен Lactobacillus salivarius CJLS1511 (KCCM11829P) или его инактивированные бактериальные клетки.
«Инактивированные бактериальные клетки Lactobacillus salivarius CJLS1511 (KCCM11829P)» могут представлять собой, например, мертвый Lactobacillus salivarius CJLS1511 (KCCM11829P), более конкретно, инактивированный нагреванием Lactobacillus salivarius CJLS1511.
Авторы настоящего изобретения получали конец тонкого кишечника от бройлера, промывали стерильной дистиллированной водой, наносили штрихами на среду MRS, дополненную 0,001% бромфениколом пурпурным (ВСР), и анаэробно культивировали при 37°С. При этом примерно 50 продуцирующих молочную кислоту штаммов были выбраны и пересеяны. Эти штаммы подвергали вторичному выделению посредством способа морфологического разделения с получением таким образом 24 видов бацилл. 24 вида бацилл подвергали третьему выделению посредством сравнения с точки зрения способности к антибактериальной активности и активности пищеварительных ферментов, таким образом получая 10 штаммов. Определяли устойчивость против желчи, кислотоустойчивость и способность продуцирующих молочную кислоту штаммов прилипать к стенкам кишечных клеток животного, и среди них выделили один штамм, у которого ферментация сахаров, ингибирование роста патогенных бактерий, активность пищеварительных ферментов и расщепление нейтральных липидов были наилучшими.
Выделенный продуцирующий молочную кислоту штамм был назван Lactobacillus salivarius CJLS1511 и депонирован 12 апреля 2016 (Accession No.: KCCM11829P) в Корейском центре культур микроорганизмов (KCCM).
Морфологические и физиологические характеристики Lactobacillus salivarius CJLS1511 показаны в Таблице 1 ниже.
Кроме того, Lactobacillus salivarius CJLS1511 имеет форму палочки, как показано на ФИГ. 1, и не образует споры. Когда штамм инактивируют, различие между живыми клетками и мертвыми клетками подтверждают по активности гликопротеина на поверхности клеточной стенки.
Биохимический анализ Lactobacillus salivarius CJLS1511 выполняли с использованием набора API. В результате его идентифицировали как способного к ферментации углеводов аналогично Lactobacillus salivarius АТСС11741 или стандартному штамму KCCM 40210, как показано в Таблице 2 ниже. Согласно анализу 16s рРНК, который выполняли с помощью Macrogen, Inc., его идентифицировали как имеющего молекулярно-биологические свойства, на 99% аналогичные таковым у Lactobacillus salivarius АТСС11741 или стандартного штамма KCCM 40210, как показано на ФИГ. 2.
Lactobacillus salivarius CJLS1511 (KCCM11829P) может быть превосходным по кислотоустойчивости, устойчивости против желчи, антибактериальной активности, по активности пищеварительных ферментов и деградации нейтральных липидов, и может эффективно улучшать эффективность питания и прирост массы тела животного при использовании в качестве кормовых добавок для животных или комбикорма для них.
Инактивированный Lactobacillus salivarius CJLS1511 (KCCM11829P) проявляет конкурентное ингибирование адгезии с опасными кишечными бактериями, посредством этого способствуя формированию кишечной флоры, и липотейхоевая кислота, которая представляет собой компонент клеточной стенки, которая вымывается, когда клеточные мембраны инактивированных бактериальных клеток разрушаются в тонком кишечнике, может препятствовать колонизации вредных кишечных бактерий на слизистой оболочке кишечника. Кроме того, инактивированные клетки Lactobacillus salivarius CJLS1511 (KCCM11829P) имеют более высокую гидрофобность и флокулируемость, чем живые клетки, и таким образом, могут прикрепляться к патогенным микроорганизмам и эндотоксинам лучше, чем это делают живые клетки, таким образом улучшая способность противостоять заболеванию. Также, когда животных кормят инактивированными микроорганизмами Lactobacillus salivarius CJLS1511 (KCCM11829P), могут быть улучшены как масса тела животного, так и коэффициент усвоения корма.
Lactobacillus salivarius CJLS1511 (KCCM11829P) или его инактивированные бактериальные клетки также могут включать защитный агент. Примеры защитного агента включают по меньшей мере один из дрожжей, дрожжевого экстракта, моносахаридов, полисахаридов, крахмалов и сахаров, таких как нерафинированный сахар и рафинированный сахар. Конкретно, защитный агент может включать по меньшей мере один, выбранный из группы, состоящей из дрожжевого экстракта, декстрозы и нерафинированного сахара. При использовании защитного агента можно предохранить Lactobacillus salivarius CJLS1511 (KCCM11829P) или его инактивированные бактериальные клетки от внешней среды для предупреждения заражения и для продления их срока годности.
Согласно другому примеру воплощения настоящего изобретения, предложена композиция кормовой добавки для животных, содержащая Lactobacillus salivarius CJLS1511 (KCCM11829P) или его инактивированные бактериальные клетки. Конкретно, композиция кормовой добавки для животных может включать инактивированные бактериальные клетки Lactobacillus salivarius CJLS1511 (KCCM11829P).
Композиция кормовых добавок для животных может дополнительно включать эксципиент. Эксципиент не ограничен особым образом и может представлять собой любой эксципиент, который обычно используют в данной области техники. Примеры эксципиентов могут включать сахариды, такие как лактоза, D-маннит, D-сорбит, сахароза и так далее, камеди, такие как ксантановая камедь, гуаровая камедь, аравийская камедь и так далее, крахмалы, такие как кукурузный крахмал, картофельный крахмал и так далее, неорганические соли, такие как фосфат кальция, сульфат кальция, осажденный карбонат кальция и так далее.
8
10
8
9
8
Композиция кормовых добавок для животных может включать описанный выше Lactobacillus salivarius CJLS1511 (KCCM11829P) или его инактивированные бактериальные клетки в количестве от 1,0×10 КОЕ (колониеобразующая единица) до 1,0×10 КОЕ на 1 грамм композиции. Конкретно, количество может составлять от 1,0×10 КОЕ до 3,0×10 КОЕ и может составлять, например, 5×10 КОЕ на 1 грамм композиции.
Композиция кормовых добавок для животных может иметь форму порошков, пеллет, гранул и тому подобного. Количество Lactobacillus salivarius CJLS1511 (KCCM11829P) или его инактивированных бактериальных клеток в композиции кормовых добавок для животного может иметь диапазон от 0,1% масс. до 10% масс., конкретно от 0,1% масс. до 7% масс. Когда композиция включает штамм или его инактивированные бактериальные клетки в вышеописанном диапазоне, можно доводить до максимума деградацию нейтральных липидов, адсорбцию эндотоксинов, ингибирование роста патогенных бактерий и повышать активность пищеварительных ферментов композиции для добавления в рацион кормления животных.
Согласно другому примеру воплощения настоящего изобретения, предложен корм для животных, полученный путем использования композиции кормовых добавок для животных, как описано выше. Корм для животных может быть получен смешиванием композиции кормовых добавок для животных согласно примерам воплощения настоящего изобретения с обычным кормом для животных. Количество композиции кормовых добавок для животных по настоящему изобретению в корме для животных может составлять от 0,1% масс. до 1% масс. общей массы корма для животных.
Корм для животных не ограничивается особым образом и может представлять собой корм для домашних животных. Термин «домашнее животное» относится к животным и домашним питомцам для производства продуктов животноводства и морепродуктов, которые являются полезными для людей, таких как молоко, мясо, яйца, шерсть, кожа, перья и так далее. Конкретно, корм для животных предоставляется домашним животным, таким как собаки, коровы, куры, свиньи, лошади и так далее. Более конкретно, его можно предоставлять домашней птице, более конкретно, бройлеру.
Корм для животных может включать компоненты, такие как углеводы, белки, липиды, витамины, минералы и так далее, которые являются важнейшими питательными веществами для роста животных. «Белок» может представлять собой животный белок или растительный белок, например, мясо, мясо птицы, рыбную муку, соевый белок, молочный белок, глютен или тому подобное. Примеры «углевода» могут включать злаки или бобы, такие как кукуруза, рис, пшеница, ячмень, овес, соевые бобы, или их смеси. «Липид» может представлять собой животный жир, растительный жир и произведенные из мяса жиры, или тому подобное. В другом случае, в дополнение к вышеописанному компоненту дополнительно можно включать другие компоненты, которые добавляют функциональные свойства корму для животных. Альтернативно, могут быть включены сахара, соли, специи, приправы, усилитель вкуса и тому подобное.
Согласно другому примеру воплощения настоящего изобретения, предложен способ получения инактивированных бактериальных клеток Lactobacillus salivarius CJLS1511 (KCCM11829P), включающий:
культивирование Lactobacillus salivarius CJLS1511 (KCCM11829P) для получения культурального раствора,
нагревание культурального раствора при температуре от 70°С до 160°С,
охлаждение нагретого культурального раствора до температуры в диапазоне от 10°С до 60°С, и
выделение инактивированных бактериальных клеток Lactobacillus salivarius CJLS1511 (KCCM11829P) из охлажденного культурального раствора.
Конкретно, на стадии культивирования Lactobacillus salivarius CJLS1511 (KCCM11829P) для получения культурального раствора можно использовать агаровую среду, в частности, среду MRS. Культивирование можно осуществлять при температуре от 25°С до 40°С в течение от 5 до 48 часов, более конкретно при 30-40°С в течение от 12 до 36 часов, более конкретно при 35-40°С в течение от 20 до 30 часов, получая таким образом культуральный раствор.
Затем культуральный раствор нагревают при температуре от 70°С до 160°С. Нагревание может быть осуществлено при помощи средств прямого нагревания или средств косвенного нагревания, может быть осуществлено при помощи средств косвенного нагревания, таких как теплообменник. Нагревание может быть осуществлено в диапазоне температур от 80°С до 150°С, более конкретно от 90°С до 120°С. Lactobacillus salivarius CJLS1511 может быть инактивирован или уничтожен посредством нагревания.
Нагретый культуральный раствор может быть быстро охлажден до температуры от 10°С до 60°С, конкретно от 20°С до 50°С, или например может быть быстро охлажден вплоть до 4°С. Охлаждение может быть выполнено со скоростью от 10°С/мин до 60°С/мин, конкретно от 20°С/мин до 50°С/мин, более конкретно от 30°С/мин до 40°С/мин. Затем инактивированные бактериальные клетки могут быть отделены от охлажденного культурального раствора с получением инактивированных бактериальных клеток Lactobacillus salivarius CJLS1511 (KCCM11829P).
Способ получения инактивированных бактериальных клеток Lactobacillus salivarius CJLS1511 (KCCM11829P) также может включать смешивание отделенных инактивированных бактериальных клеток с защитным агентом. После этого способ дополнительно может включать распыление полученной смеси инактивированных бактериальных клеток и защитного агента. Посредством смешивания защитного агента, как описано выше, и распыления смеси можно предохранять инактивированные бактериальные клетки от загрязнения из внешней среды и облегчать распределение инактивированных бактериальных клеток.
Защитный агент не ограничен особым образом, но, например, может представлять собой по меньшей мере один из дрожжей, дрожжевого экстракта, моносахаридов, полисахаридов, крахмалов и сахаров, таких как нерафинированный сахар и рафинированный сахар. Конкретно, защитный агент может включать по меньшей мере один, выбранный из группы, состоящей из дрожжевого экстракта, декстрозы и нерафинированного сахара.
Распыление можно осуществлять путем сублимационной сушки, распылительной сушки или распылительной флокуляцией. Более конкретно, можно использовать распылительную сушку. Распылительная сушка также называется сушкой с атомизированием и представляет собой способ, при котором жидкость распыляют одновременно в горячем потоке, чтобы мгновенно получать сухой продукт в жидкой фазе. В качестве способа распыления жидкости, существует способ центробежного распыления с использованием роторного диска и способ распыления под давлением с использованием сопла высокого давления. С целью осуществления распылительной сушки нежирного молока и так далее, можно использовать известное оборудование для распылительной сушки, используя эти способы распыления.
Вследствие простоты процесса, предпочтительно, чтобы инактивированные бактериальные клетки и защитный агент были смешаны для получения смеси, затем смесь суспендируют в воде, полученную суспензию подвергают распылительной сушке, где, в частности, температура на входе горячего воздуха составляет от 120°С до 200°С, предпочтительно от 130°С до 170°С, и температура на выходе составляет от 30°С до 150°С, предпочтительно от 50°С до 100°С. Количество добавляемого защитного агента может представлять собой от 0,1 до 300 массовых частей, конкретно от 0,1 до 200 массовых частей, на основе 100 массовых частей инактивированных бактериальных клеток.
В качестве примера, количество дрожжей или дрожжевого экстракта, подлежащих добавлению, составляет от 0,04 до 50 массовых частей, предпочтительно от 0,1 до 10 массовых частей, количество моносахаридов, подлежащих добавлению, составляет от 1 до 100 массовых частей, предпочтительно от 10 до 50 массовых частей, и количество сахаров, подлежащих добавлению, составляет от 0,2 до 50 массовых частей, предпочтительно от 0,4 до 10 массовых частей.
Было подтверждено, что когда физиологически приемлемые неорганические вещества, такие как карбонат кальция и так далее, которые являются труднорастворимыми в воде, используют в качестве добавки в процессе распыления, особенно в процессе распылительной сушки, процесс осуществляли легко. Здесь количество неорганического вещества в композиции кормовых добавок для животных составляет от 1 до 99% масс., конкретно от 1 до 90% масс. и более конкретно от 1 до 10% масс. В качестве примера композиция кормовых добавок для животных содержит от 0,05 до 50% масс., предпочтительно от 0,5 до 20% масс., более предпочтительно от 0,5 до 15% масс. порошка инактивированных бактериальных клеток и от 5 до 80% масс., предпочтительно от 5 до 50% и более предпочтительно от 5 до 20% масс. неорганических веществ.
8
10
8
9
8
Композиция кормовых добавок для животных может включать описанный выше Lactobacillus salivarius CJLS1511 (KCCM11829P) или его инактивированные бактериальные клетки в количестве от 1,0×10 КОЕ до 1,0×10 КОЕ на 1 грамм композиции. Конкретно, количество может составлять от 1,0×10 КОЕ до 3,0×10 КОЕ и в одном примере может составлять 5×10 КОЕ.
Ниже описание и функции настоящего изобретения будут описаны более подробно предпочтительно посредством примерных воплощений настоящего изобретения. Следует отметить, что Примеры, которые описаны ниже, предложены только для конкретного иллюстрирования настоящего изобретения и, следовательно, настоящее изобретение не ограничивается следующими Примерами.
Характеристики, которые не описаны в описании изобретения, могут быть в достаточном объеме и технически установлены специалистом в области техники и, следовательно, их подробности не будут включены.
Пример
Примеры 1-6
Безопасность, кислотоустойчивость, устойчивость против желчи, антимикробную активность, активность пищеварительных ферментов и активность расщепления триглицеридов штамма Lactobacillus salivarius CJLS1511 (KCCM11829P) по настоящему изобретению оценивали следующим образом, используя Lactobacillus salivarius KCCM 40210, известный в данной области техники, в качестве эталонного штамма.
Экспериментальный пример 1: Оценка безопасности Lactobacillus salivarius CJLS1511 (KCCM11829P)
С целью оценки безопасности штамма Lactobacillus salivarius CJLS1511 (KCCM11829P), проводили гемолитический тест, тест разжижения желатина, подтверждение присутствия опасных метаболитов (аммиака) и тест дезаминирования фенилаланина, согласно способу тестирования оценки безопасности, представленному стандартом Организации корейской биотехнологической промышленности. Их результаты показаны в Таблице 3 ниже.
Как подтверждено в Таблице 3, было обнаружено, что Lactobacillus salivarius CJLS1511 (KCCM11829P) демонстрировал отрицательные результаты в каждом из: теста разжижения желатина, теста дезаминирования фенилаланина и теста на подтверждение аммиака, и демонстрировал безопасность в гемолитическом тесте.
Экспериментальный пример 2: Оценка кислотоустойчивости Lactobacillus salivarius CJLS1511 (KCCM11829P)
-6
Штамм Lactobacillus salivarius CJLS1511, который до этого культивировали в среде MRS, и стандартный штамм Lactobacillus salivarius KCCM 40210, который представлял собой штамм сравнения, разбавляли до 10 раствором MRS, доведенным до рН 2, 3 и 7, соответственно. Каждый разбавленный раствор штамма культивировали при 37°С, наносили штрихами на агаровую среду MRS согласно предварительно заданному периоду времени и анаэробно культивировали в течение 48 часов. Затем определяли количество колоний. Результаты теста на кислотоустойчивость показаны в Таблице 4 ниже.
Как подтверждено в Таблице 4, Lactobacillus salivarius CJLS1511 показывал меньшее снижение количества жизнеспособных клеток, чем стандартный штамм Lactobacillus salivarius KCCM 40210, который представлял собой штамм сравнения, при рН от 2 до 4, обладая, таким образом, превосходной кислотоустойчивостью.
Экспериментальный пример 3: Оценка устойчивости против желчи Lactobacillus salivarius CJLS1511 (KCCM11829P)
-6
Штамм Lactobacillus salivarius CJLS1511, который до этого культивировали в среде MRS, и стандартный штамм Lactobacillus salivarius KCCM 40210, который представлял собой штамм сравнения, доводили до рН 4, соответственно, и концентрацию раствора желчных кислот (медицинская желчь) доводили до 0%, 0,3% и 1%, соответственно, и разбавляли до 10 раствором MRS. Каждый разбавленный раствор штамма культивировали при 37°С, наносили штрихами на агаровую среду MRS согласно предварительно заданному периоду времени и анаэробно культивировали в течение 48 часов. Затем определяли количество колоний. Результаты определения количество жизнеспособных клеток сведены в Таблицу 5 ниже:
Как видно из Таблицы 5, количество жизнеспособных клеток Lactobacillus salivarius CJLS1511 снижалось как в 0,3%, так и в 1% растворах желчных кислот (медицинская желчь) при рН 4. Однако снижение количества жизнеспособных клеток было намного ниже, чем у стандартного штамма Lactobacillus salivarius KCCM 40210, и таким образом, было обнаружено, что заявленный штамм мог быть выращен, даже если желчные кислоты эндогенно присутствовали в организме животного.
Экспериментальный пример 4: Оценка антимикробной активности Lactobacillus salivarius CJLS1511 (KCCM11829P)
5~6
Три патогена (Е. coli K88, Е. coli АТСС 25922, Salmonella typhimurium KCCM 25922, Salmonella cholerasuis KCCM 10709), которые культивировали в жидкой среде TSB (триптический соевый бульон) (BD, USA) в течение 24 часов, равномерно наносили штрихами в концентрации 10 КОЕ/мл, используя стерильную ватную палочку.
9
После нанесения штрихами штаммы Lactobacillus salivarius CJLS1511 и стандартный Lactobacillus salivarius KCCM 40210 разбавляли буфером PBS до 10 КОЕ/мл, соответственно, в бумажном диске с диаметром 4 мм и затем переносили в 50 мкл. Разбавленный раствор оставляли стоять при комнатной температуре до тех пор, пока он не проникал достаточно в бумажный диск и затем аэробно культивировали при 37°С в течение 18 часов. Здесь разбавленный раствор включал только штаммы, которые подвергали центрифугированию (3000 g, 10 минут) для супернатанта после культивирования и промывали буфером PBS (натрий-фосфатный буфер) 3 раза. Размер кольца ингибирования определяли по разнице между диаметром целого прозрачного кольца и диаметром агаровой бороздки. Результаты показаны в Таблице 6 ниже.
Как подтверждено в Таблице 6, как Lactobacillus salivarius CJLS1511, так и стандартный штамм Lactobacillus salivarius KCCM 40210 показывали ингибирующее пролиферацию действие против патогенных микроорганизмов. Однако было подтверждено, что штамм Lactobacillus salivarius CJLS1511 имел более высокую антибактериальную активность, чем активность стандартного штамма Lactobacillus salivarius KCCM 40210.
Эти результаты получали благодаря самому штамму, а не эффекту посредством метаболитов, продуцированных Lactobacillus salivarius CJLS1511, которые демонстрировали, при использовании для домашнего скота, что рост опасных микроорганизмов может быть подавлен.
Экспериментальный пример 5: Оценка активностей пищеварительных Ферментов Lactobacillus salivarius CJLS1511 (KCCM11829P)
Оценку расщепляющей активности пищеварительных ферментов выполняли для определения того, представлял ли собой штамм лактобактерию, имеющую ферменты, способные разлагать углеводы, белки и фосфорсодержащие соединения.
Для определения наличия протеазной активности, снятое молоко 0,5% (масс./об.) добавляли в агаровую среду MRS. Для определения наличия целлюлазной активности, агаровую среду MRS дополняли метилцеллюлозой 0,2% (масс./об.). Для определения наличия α-амилазной активности, кукурузный крахмал 0,2% (масс./об.) добавляли в агаровую среду MRS. Для определения наличия фитазной активности, кальциевую соль фитиновой кислоты 0,5% (масс./об.) добавляли в среду. Штаммы, выделенные в каждой из полученных выше сред, наносили штрихами, культивировали в течение 24 часов и наблюдали.
Наличие или отсутствие активности α-амилазы и активности целлюлазы определяли после промывания 24-часовых культуральных сред, обрабатывали 2% реагентом конго красный (Sigma, USA) с последующим промыванием 1 М хлоридом натрия (NaCl) и подтверждением наличия или отсутствия окрашивания. Затем наличие или отсутствие активности протеазы и активности фитазы подтверждали по присутствию прозрачного кольца, и его результаты показаны в Таблице 7 ниже.
От 1 до 10 мм: +, от 11 до 20 мм: ++, от 21 до 30 мм: +++
Как подтверждено в Таблице 7, было обнаружено, что Lactobacillus salivarius CJLS1511 имел более высокую активность пищеварительных ферментов, такую как активность протеазы, активность фитазы, активность расщепления целлюлозы и активность амилазы, чем стандартный штамм Lactobacillus salivarius KCCM 40210.
Эти результаты демонстрировали, что при использовании Lactobacillus salivarius CJLS1511 для домашнего скота может быть улучшена эффективность питания.
Экспериментальный пример 6: Оценка активности расщепления нейтральных липидов Lactobacillus salivarius CJLS1511 (KCCM11829P)
В результате изучения активности гидролазы солей желчных кислот (BSH) Lactobacillus salivarius CJLS1511 было подтверждено, что белый осадок образовывался в плотной среде MRS, дополненной 2 мМ тауродезоксихолата гидрата (TDCA, Sigma, USA), и, таким образом, активность ферментов присутствовала. Кроме того, характер седиментации был аналогичен таковому у стандартного штамма Lactobacillus salivarius KCCM 40210, который представлял собой TDCA-положительный контрольный штамм. Однако в среде, дополненной 2 мМ гликодезоксихолата натрия (GDCA, Sigma, USA), Lactobacillus salivarius CJLS1511 штамм рос хорошо, но стандартный штамм Lactobacillus salivarius KCCM 40210 показывал отсутствие осаждения и рос плохо. Эти результаты представлены в Таблице 8 ниже.
О: Осадок образовывался, X: осадок не образовывался, +: рост, -: нет роста
Как видно из Таблицы 8, Lactobacillus salivarius CJLS1511 имел высокую устойчивость против желчи и превращался в форму, способную разлагать нейтральные липиды посредством продуцирования BSH, было обнаружено, что Lactobacillus salivarius CJLS1511 представлял собой функциональный штамм, который мог влиять на массу тела при использовании у животных.
Пример получения 1
Lactobacillus salivarius CJLS1511 и стандартный штаммы Lactobacillus salivarius KCCM 40210 наносили штрихами на агаровые среды MRS с помощью петли, соответственно, и культивировали при 37°С в течение 48 часов с получением культуральных растворов.
Затем каждый культуральный раствор нагревали косвенным образом при температуре 100°С, используя теплообменник, и быстро охлаждали вплоть до 10°С со скоростью от 30 до 100 л/мин. Инактивированные бактериальные клетки отделяли от быстро охлажденного культурального раствора посредством центрифугирования (3000 g, 10 минут) с получением инактивированных бактериальных клеток Lactobacillus salivarius CJLS1511 и Lactobacillus salivarius KCCM 40210, соответственно.
Пример получения 2
Стандартные штаммы Lactobacillus salivarius CJLS1511 и Lactobacillus salivarius KCCM 40210 наносили штрихами на агаровые среды MRS с помощью петли, соответственно, и культивировали при 37°С в течение 48 часов с получением культуральных растворов.
Затем каждый культуральный раствор нагревали косвенным образом при температуре 100°С, используя теплообменник, и быстро охлаждали вплоть до 10°С со скоростью от 30 до 100 л/мин. Инактивированные бактериальные клетки отделяли от быстро охлажденного культурального раствора посредством центрифугирования (3000 g, 10 минут) с получением инактивированных Lactobacillus salivarius CJLS1511 и Lactobacillus salivarius KCCM 40210, соответственно. Затем дрожжевой экстракт, декстрозу и нерафинированный сахар смешивали с ними, соответственно. Каждую смесь суспендировали в воде, и полученную суспензию подвергали распылительной сушке для получения порошка. Здесь в частности, распылительную сушку выполняли в условиях, при которых температура на входе горячего воздуха составляла 150°С, и температуре на выходе составляла 100°С. В качестве защитного агента, добавляли 20 массовых частей дрожжевого экстракта, добавляли 30 массовых частей декстрозы и добавляли 5 массовых частей нерафинированного сахара, на основе 100 массовых частей инактивированных бактериальных клеток.
Гидрофобность и флокулируемость инактивированных бактериальных клеток, полученных в Примере получения 1, тестировали способом, описанным ниже. Сравнивали прирост массы тела и коэффициент усвоения корма для базового рациона кормления с добавленным инактивированным Lactobacillus salivarius CJLS1511 и для базового рациона кормления, не включающего клетки.
Экспериментальный пример 7: Оценка гидрофобности и коагрегации живых клеток и инактивированных клеток Lactobacillus salivarius CJLS1511 (KCCM11829P)
Для подтверждения различия в гидрофобности и флокулируемости живых клеток и инактивированных клеток Lactobacillus salivarius CJLS1511 оценивали реакцию автофлокуляции и теста на коагрегацию.
600
600
Тест на коагрегацию выполняли посредством добавления 1 мл толуола к 3 мл лактобактерий, разбавленных так, чтобы ОП в сравнении с живыми клетками и инактивированными клетками Lactobacillus salivarius CJLS1511 равнялась 0,5, с последующим перемешиванием на вортексе в течение 90 секунд. Затем каждую смесь оставляли отстаиваться на водяной бане при 37°С в течение 1 часа, удаляли толуол и определяли ОП водного слоя раствора.
600
Реакцию коагрегации выполняли путем смешивания живых клеток и инактивированных клеток Lactobacillus salivarius CJLS1511 с патогенными микроорганизмами (Е. coli K88, Salmonella typhimurium KCCM 25922, Salmonella cholerasuis KCCM 10709) в одинаковом количестве (патогенные микроорганизмы : живые клетки или мертвые клетки = 1:1 (каждых по 1,5 мл)) с получением смеси и добавления 1 мл толуола к 3 мл смеси, соответственно, с последующим перемешиванием на вортексе в течение 90 секунд. Затем каждую смесь оставляли отстаиваться на водяной бане при 37°С в течение 1 часа, удаляли толуол и определяли ОП водного слоя раствора.
600
600
600
Гидрофобность (%) вычисляли по формуле 100 × (начальная ОП - ОП через 1 час)/начальная ОП
Результаты реакции самоагрегации и реакции коагрегации между живыми клетками и инактивированными клетками показаны в Таблице 9 ниже.
Как видно из Таблицы 9, и реакция автофлокуляции, и реакция коагрегации проявлялась в 1,5 раза выше у инактивированного Lactobacillus salivarius CJLS1511, чем у живых клеток. Есть основания полагать, что на внеклеточную гидрофобность и агрегацию микроорганизмов влияют характеристики и структура поверхности белков клеточной поверхности, и инактивированные Lactobacillus salivarius CJLS1511 имеют повышенную гидрофобность и агрегацию благодаря отличию структуры белков на клеточной поверхности от таковой у живых клеток, как представлено на ФИГ. 1. Как результат, ожидается, что штамм можно использовать в качестве функционального штамма, который влияет на способность предохранять от заболевания посредством прикрепления к эндотоксинам.
Экспериментальный пример 8: Сравнения корма, содержащего инактивированный Lactobacillus salivarius CJLS1511 (KCCM11829P), с обычным базовым кормом
Бройлеров кормили обычным рационом кормления, обогащенным 0,2% (масс./масс.) инактивированного Lactobacillus salivarius CJLS1511, и базовым рационом кормления без его включения (контрольная группа), в течение 29 суток так же, как в нормальном периоде кормления и определяли начальную среднюю массу тела (г), конечную среднюю масса тела (г), среднесуточный прирост (г/с), среднесуточное потребление корма (г/с) и коэффициент усвоения корма, соответственно. Результаты показаны в Таблице 10 ниже.
а,б
Средние значения для разных букв значительно отличаются (р меньше 0,05).
Как показано в Таблице 10, группа, получавшая инактивированный Lactobacillus salivarius CJLS1511 по настоящему изобретению, показала лучшие эффекты по приросту массы тела и по коэффициенту усвоения корма по сравнению с таковыми у контрольной группы, которая не получала инактивированный Lactobacillus salivarius CJLS1511.
Название депозитарного органа: Корейский центр культур микроорганизмов (KCCM) (за границей)