СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭКСТРАКТА ИЗ РАСТЕНИЙ РОДА SALIX
METHOD OF OBTAINING EXTRACT FROM SALIX PLANTS

Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа получения экстракта, содержащего салицилаты, из измельченной воздушно-высушенной коры или побегов с листьями растений рода Salix.
Растения рода Salix содержат в коре, ветвях и листьях большое число фенольных гликозидов, в частности салицин и его производные, обладающие лекарственными свойствами. Экстракты из этих растений широко используются в фитотерапии многих стран и обладают антиревматическими, антисептическими, противовоспалительными, обезболивающими свойствами [1]. Также доказано, что экстракт коры ивы ингибирует рост опухолевых раковых клеток человека in vivo и in vitro [2].
Известны многочисленные способы выделения биологически активных веществ из предварительно высушенного и измельченного растительного сырья с помощью экстрагентов (50-94% этиловый спирт, метиловый спирт, этилацетат, диэтиловый эфир и др.) [3, 4, 5 и др.]. Выбор конкретного метода экстракции и режима его осуществления, как правило, определяется особенностями перерабатываемого сырья и получаемого целевого продукта.
Однако применение ядовитых и пожароопасных органических экстрагентов требует неукоснительного выполнения достаточно строгих правил и мер безопасности. Полученный данным способом экстракт обладает недостаточно высоким содержанием биологически активных веществ.
1
3
Наиболее близким по технической сущности является способ получения экстракта из растений рода Salix, согласно которому экстракцию коры и побегов производят С-С спиртами, или их смесью, или водными растворами спиртов, или чистой водой, или ацетоном при температуре от 10°С до 80°С, предпочтительно при 25°С [6].
Способ-прототип обеспечивает получение экстракта без воздействия на экстрагируемое растительное сырье высокой температуры, что препятствует разложению термолабильных биологических веществ. Использование в качестве экстрагентов гидрофильных соединений (спиртов, воды, ацетона) обеспечивает высокую степень экстракции салицилатов. Однако данные условия процесса экстракции не обеспечивают максимально возможного извлечения биологически активных веществ, находящихся внутри клеток растений, так как при реализации способа не происходит эффективного разрушения клеточной стенки растения.
Техническим результатом данного изобретения является увеличение выхода экстрактивных веществ и сохранение биологической ценности экстракта.
Указанный технический результат при осуществлении изобретения достигается тем, что измельченная воздушно-высушенная кора или побеги с листьями растений рода Salix экстрагируются буферным раствором фосфорного калия с рН 5,5 и гидромодулем 1:50 в течение 20 часов при температуре 65±5°С с одновременным добавлением в количестве 0,1% от массы растительного сырья ферментного комплекса, содержащего ферменты целлюлазу и β-глюканазу, с последующими инактивацией ферментов при температуре 100±5°С в течение 10 минут, фильтрованием экстракта, центрифугированием, упариванием и сушкой. Концентрацию салицилатов определяют с помощью ВЭЖХ по отработанной методике [7].
Коммерческие ферментные препараты могут обладать несколькими ферментативными активностями, важным для изобретения является то, что препарат должен проявлять по крайней мере целлюлазную и β-глюканазную активности. Это связано с высоким содержанием в клеточных стенках растений целлюлозы и гемицеллюлозы и необходимостью их расщепления.
Целлюлоза представляет собой линейный полисахарид, состоящий из остатков глюкозы, которые соединены β-1,4-глюкозидными связями. Она встречается в клеточных стенках растений, где она часто присутствует вместе с лигнином и гемицеллюлозой. Ферменты, которые принимают участие в реакциях расщепления целлюлозы, относятся к целлюлазам. В способе согласно настоящему изобретению целлюлаза расщепляет структуры клеточных стенок растений.
Целлюлазы можно подразделить, например, на эндоцеллюлазы, экзоцеллюлазы, экзоцеллобиогидролазы и целлобиазы. Эндоцеллюлазы, т.е. 1,4-β-D-глюканглюканогидролазы, произвольно расщепляют β-1,4-связи в сердцевине молекулы целлюлозы и в результате расщепления образуются олигосахариды. Экзоцеллюлазы, т.е. 1,4-β-D-глюканглюкогидралазы, расщепляют β-1,4-связи на конце молекулы, освобождая глюкозу. Их действие на целлобиозу является замедленным. Экзоцеллобиогидролазы, т.е. 1,4-β-D-глюканцеллобиогидролазы, расщепляют вышеуказанные связи на невосстанавливающем конце молекулы, образуя целлобиозу, и целлобиазы, т.е. β-D-глюкозидглюкогидролазы, расщепляют целлобиозу до глюкозы. Для гидролиза целлюлозы до глюкозы требуется эндоглюканаза (1,4-β-D-глюканглюканогидролаза, ЕС 3.2.1.4), которая расщепляет связи в сердцевине молекулы и также замещенные субстраты, но не разрушает кристаллическую целлюлозу, целлобиогидролаза (1,4-β-D-глюканцеллобиогидролаза, ЕС 3.2.1.91), которая расщепляет кристаллическую целлюлозу, и β-глюкозидаза (β-D-глюкозидглюкогидролаза, ЕС 3.2.1.21), которая является целлобиазой, которая расщепляет целлобиозу и целлоолигосахариды до глюкозы.
β-глюканазы расщепляют β-D-глюканы, т.е. полимеры глюкозы, которые могут быть разветвлены и могут содержать как β-1,3-связи, так и β-1,4-связи [8].
В экстракции салицилатов хорошие результаты были достигнуты, например, с помощью препарата Laminex™ BG, произведенного компанией Genencor Internetional. Указанный ферментный препарат получен из штамма Trichoderma reesei, наиболее активно он проявляет целлюлазную и β-глюканазную активности, а также ксиланазную, липазную и протеазную активности. Входящие в его состав ферменты расщепляют β-глюканы, пентозаны и связанные углеводы, встречающиеся в растительных субстратах.
При осуществлении предлагаемого способа происходит
- дезинтеграция клеточной стенки растений ферментным комплексом, что позволяет увеличить выход целевого продукта за счет повышения интенсивности процесса экстракции;
- осуществление экстракции растительного сырья при рН 5,5 предотвращает разложение фенольных соединений (производных салицина), что происходит при более высоких рН, и обеспечивает сохранение биологической ценности экстракта;
- конечный этап инактивации ферментов и стерилизации предотвращает контаминацию экстракта.
Способ осуществляется следующим образом.
Подготовленное сырье загружают в экстрактор и заливают при гидромодуле 1:50 буферным раствором фосфорного калия с рН 5,5, что исключает разложение салицилатов. Одновременно вводят ферментный препарат, содержащий целлюлазу и β-глюканазу, в количестве 0,1% от массы сырья. В результате происходит дезинтеграция растительных клеток и высокоэффективная экстракция фенольных веществ из растительных тканей в жидкую фазу. Затем экстракт выдерживают при температуре 100±5°С в течение 10 минут, для инактивации ферментов, фильтруют, центрифугируют, упаривают и сушат. Концентрацию салицилатов определяют с помощью ВЭЖХ по отработанной методике [7].
Технический результат достигается в интервале температур экстракции 65±5°С, подтверждающие данные относятся к растительному сырью ивы одного биологического происхождения и представлены в таблице 1. Варьирование температуры 100±5°С не относится к процессу экстракции и не влияет на выход салицилатов, а связано с инактивацией ферментов и стерилизацией экстракта после завершения процесса экстракции, что может проводится в любом диапазоне температур от 95 до 105°С.
Таблица 1
Выход общего салицина при разных температурах экстракции коры ивы
Образец
Температура, °С
Концентрация салицилатов, %
Среднее
1
60
7,86
7,58
2
60
7,29
3
65
7,51
7,48
4
65
7,45
5
70
7,06
7,47
6
70
7,88
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Воздушно-высушенную кору ивы измельчают и экстрагируют буферным раствором фосфорного калия при рН 5,5 с добавлением ферментного препарата, содержащего ферменты целлюлазу и β-глюканазу в количестве 0,1% от веса коры. Соотношение сырья и экстрагента по массе 1:50. Экстрагирование проводят при температуре 65°С в течение 20 часов, затем стерилизуют при температуре 100°С в течение 10 минут, фильтруют, центрифугируют, упаривают и сушат. Концентрацию салицилатов определяют с помощью ВЭЖХ по отработанной методике [7]. Концентрация общего салицина в зависимости от происхождения образцов коры может составлять до 15% от массы исходного воздушно-сухого сырья.
Пример 2. Воздушно-высушенные побеги ивы вместе с листьями измельчают и экстрагируют буферным раствором фосфорного калия при рН 5,5 с добавлением ферментного препарата, содержащего ферменты целлюлазу и β-глюканазу в количестве 0,1% от веса коры. Соотношение сырья и экстрагента по массе 1:50. Экстрагирование проводят при температуре 65°С в течение 20 часов, затем стерилизуют при температуре 100°С в течение 10 минут, фильтруют, центрифугируют, упаривают и сушат. Концентрацию салицилатов определяют с помощью ВЭЖХ по отработанной методике [7]. Концентрация общего салицина в зависимости от происхождения образцов побегов с листьями может составлять до 5% от массы исходного воздушно-сухого сырья.
Предлагаемый способ позволяет интенсифицировать процесс экстракции фенольных соединений из растительного сырья при сохранении биологической ценности экстракта.
Источники информации
2
1. Differentiation of extractive and synthetic salicin. The H aromatic pattern of natural 2-hydroxybenzyl alcohol. / E. Brenna, G. Fronza, et al. // Journal of agricultural and food chemistry. - 2004. - V.52. - P.7747-7751.
2. Willow leaves' extracts contain anti-tumor agents effective against three cell types / Hany A. El-Shemy, Ahmed M. Aboul-Enein, et al. // PLoS One. - Giza: Public Library of Science, - 2007. - 1. 1. - 5 p.
3. Государственная фармакопея СССР. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье. - M.: Медицина, 1989. - 400 с.
4. Запрометов М.Н. Фенольные соединения. / М.Н. Запрометов. - M.: Наука, 1993. - 271 с.
5. RU 2174011 C2, опубл. 20.05.2001.
6. WO 2007006384 A1, опубл. 18.01.2007.
7. HPLC-MS/MS analysis of willow bark extracts contained in pharmaceutical preparations. / B. Kammerer, R. Kahlich, et al. // Phytochemical Analysis. - 2005. -V.16. - P.470-478.
8. Саловарова В.П. Эколого-биотехнологические основы конверсии растительных субстратов: Учеб. пособие. / В.П.Саловарова, Ю.П.Козлов. - М.: Изд-во РУДН, 2001. - 331 с.