Способ получения меланина из насекомых
METHOD FOR OBTAINING MELANIN FROM INSECTS

Изобретение относится к экологии, безотходным и ресурсосберегающим технологиям, в частности к способам переработки хитинового покрова личинки жука до и после её превращения во взрослую особь, а также биотехнологии и сельскому хозяйству, а именно к производству кормов для сельскохозяйственных животных и объектов аквакультуры.
Меланины – высокомолекулярные пигменты сетчатой нерегулярной структуры, которые отличаются разнообразным строением и физиологических функций, содержатся в волосах, коже, перья и сетчатке глаза у позвоночных, в растениях, грибах, у некоторых видов бактерий, а также в наружных покровах беспозвоночных, в том числе насекомых. Меланины – полифункциональны, они являются антиоксидантами, генопротекторами, обладают антимутагенным эффектом, способностьюсорбировать тяжелые металлы и нейтрализоватьпродукты перекисного окисления липидов.
Наиболее доступным сырьем для получения меланина животного происхождения являются чернильные мешки головоногих моллюсков, шерсть темнопигментированных животных, а также кутикула и продукты жизнедеятельности насекомых.
Большой интерес представляют насекомые, способные к разведению в искусственных контролируемых условиях. Полученная биомасса такихнасекомых может использоваться для выделениябиологически активных веществ, перспективных для практического использования.
В формировании меланина участвуют вещества полисахаридной, фенольной, белковой и липофильной природы. У насекомых он чаще всего представлен двумя видами: эумеланин и феомеланин. Наличие парамагнитных центров и разнообразие функциональных групп определяют полифункциональность меланинов.
Важным фактором в применении меланина насекомых в качестве кормовой добавки сельскохозяйственных животных и аквакультуры является его низкая токсичность, а также возможность защиты от радиации и УФ излучения.
Меланин получают синтетически из растительного и животного сырья. Синтезируют меланин из подходящих предшественников. В частности, автоокислением 5,6- дигидроксииндолов, диоксифенилаланина или из тирозина и фенилаланина в присутствии ферментов. Главным недостатком синтетических методов является высокая стоимость исходного сырья.
Одним из источников для получения меланина являются насекомые. Насекомые синтезируют меланин, который не только играет роль пигмента, придающего окраску, но также участвует в защитных реакциях, врождённом иммунитете, обладает способностью к хелатированию тяжёлых металлов. В структуре кутикулы он связан с хитином прочными ковалентными связями.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Известен способ выделения меланина из жука чернотелки Alphitobius diaperinus. Высушенных жуков измельчали до порошкообразного состояния и экстрагировали с добавлением 100 мл 3 М раствора гидроокиси калия (щелочной раствор) при периодическом перемешивании в течение 24 ч при комнатной температуре, полученный экстракт фильтровали через бумажный фильтр, нейтрализовали и закисляли до рН 2.0 концентрированной соляной кислотой, образовавшийся осадок коричневого цвета отделяли центрифугированием и промывали дистиллированной водой с последующим повторным центрифугированием, гидролизовали, гидролизат отделяли, полученный осадок 3 раза промывали дистиллированной водой с последующим высушиванием (УШАКОВА Н.А. и др. Получение и характеристика меланина Аlphitobius diaperinus. Журнал: Прикладная биохимия и микробиология, 2018, том 54, No 4, с. 408–415.). Данный способ принят нами в качестве ближайшего аналога.
Отличием заявляемого нами изобретения является использование в качестве источника выделения жука Чернотелка степная (Anatolica aucta). Чернотелка степная (Anatolica aucta) обычна для степных районов Восточной Сибири и Приольхонья.  Личинки питаются корнями травянистых растений и могут быть использованы в качестве культивируемых насекомых для биотехнологических задач, в частности для производства кормовых компонентов, в частности меланин-протеинового для использования в составе для кормов сельскохозяйственных животных и объектов аквакультуры.
Кроме того, в предлагаемом нами способе получения меланина, он максимально очищен от примесей белков и жирных кислот, при этом сохранена его структура и свойства.
Известен способ получения хитозан-меланинового комплекса из подмора пчел [М.И. Селионова и Н.В. Погарская «Способ получения хитозан-меланинового комплекса из подмора пчел», Патент РФ №2382051, 21.07.2008]. Способ включает предварительную сушку хитин-меланинового сырья до влажности 4-6%, после чего высушенную массу перетирают до порошкообразного состояния, 10% раствором щелочи NaOH при температуре 78-82°С в течение 1,5-2,0 часов отделяют белок. 50% раствор NaOH добавляют в реакционную смесь, таким образом доводя его концентрацию до 30% от исходной. Полученный хитин-меланиновый комплекс дезацетилируют при температуре 90-95°С в течение 1,5-2,0 часов, фильтруют, при этом отфильтрованную массу получают путем промывания массы дистиллированной водой до достижения рН 7. Из оставшегося после фильтрования раствора осаждают меланин воздействием концентрированной соляной кислоты до изменения рН среды обрабатываемого раствора в кислую область и выпадения хлопьевидного осадка, представляющего собой меланин. Меланин отделяют от жидкой фазы центрифугированием, промывают, отдельно сушат хитозан и меланин при температуре 50-60°С до влажности 8-10% и смешивают их для получения конечного продукта хитозан-меланинового комплекса.
Недостатком данного способа является применение сильнощелочного раствора гидроксида натрия, что может разрушать структуру меланина.
Известен способ получения меланина из личинок черной львинки [Патент РФ №2692260]. Способ получения меланина из личинок мух черной львинки Hermetia illucens в возрасте от 25 до 35 дней заключается в том, что сначала личинки тщательно промывают и высушивают, затем помещают в экструдер и экструдирование осуществляют при температуре 37-38°С методом холодного отжима в течение одной минуты, по завершении экструдирования дают полученному экструдату отстояться до разделения на фракции при температуре от 0 до -15°С и полученный на поверхности слой меланина отделяют механическим способом, для повторного получения слоя меланина оставшуюся смесь выдерживают при комнатной температуре и полученный на поверхности слой меланина отделяют механическим способом, после чего на завершающем этапе оставшуюся смесь замораживают, затем нагревают ее до комнатной температуры и вновь полученный на поверхности слой меланина отделяют механическим способом, при определенных условиях. Способ позволяет получить меланин путем естественной переработки личинок, не прибегая к агрессивным воздействиям химических реагентов.
Недостатком такого способа является получение меланина с содержанием примесей жирных кислот, что может способствовать более быстрой порче конечного продукта.
Известны способы получения меланина из дрожжей, их различных штаммов, описанные в патентах РФ №№2116036, 2069696, 2278163 (RU). Известны другие способы получения меланина, описанные в заявках США № 20180002452 (заявитель Инсект Еври Седекс (YNSECT Evry Cedex, FR) приоритет от 04.01.2018) и 20180016357 (приоритет от 18.01.2018 (заявитель тот же), в которых описаны способы получения меланина на основе гидролиза с использованием окислителей, ферментов и энзимов..
Известен способ получения меланина, описанный в патенте RU 2582972 C1, 27.04.2016.  Однако в качестве сырья в нём используется водный экстракт чаги. Т.е. аналог предполагает выделение меланина из растительного сырья, путём воздействия химических реагентов; исключая необходимость очистки конечного продукта от посторонних примесей.
При этом в проанализированном нами уровне техники материалов о возможности использования именно Чернотелки степной (Anatolica aucta) в качестве сырья для получения меланина насекомых, а также таком способе выделения меланина из  Чернотелки степной ранее опубликовано не было.
Технической  проблемой, на решение которой направлено данное изобретение, является создание быстрого способа получения чистого меланина.
Технический результат
заключается в получении меланина, максимально очищенного от примесей белков и жирных кислот, с обеспечением сохранения его структуры и свойств.
о
Технический результат способа получения меланина из жука Чернотелки обеспечивается за счет промывания и высушивания жуков, измельчения их до порошкообразного состояния с последующей экстракцией меланина, отличающийся тем, что используют кутикулу жука Чернотелка степная (Anatolica aucta), которую после высушивания измельчают до размера частиц от 1 до 8мм, провоят 3-х кратную экстракцию полученного порошка дистиллированной водой при нагревании в 90С и перемешивании в течение 3-х часов, к полученному водному экстракту добавляют 25% раствор хлористоводородной кислоты до изменения pH 1,0-2,0, полученную смесь перемешивают и оставляют на 24 часа, выпавший темно-бурый осадок меланина отфильтровывают и высушивают, затем заливают 60% раствором этанола, полученную смесь отстаивают в течение 4 часов, надосадочную жидкость сливают, полученный темно-бурый осадок высушивают при температуре 50°С.
ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ  ИЗОБРЕТЕНИЯ.
Технологический процесс состоит из следующих последовательных стадий обработки.
о
Кутикулу жука Чернотелка степная (Anatolica aucta) высушивают и измельчают до размера частиц от 1 до 8мм. Затем провоят 3-х кратную экстракцию полученного порошка дистиллированной водой при нагревании в 90С и перемешивании в течение 3-х часов с получением водного экстракта кутикулы чернотелки степной (Anatolica aucta).
К полученному водному экстракту кутикулы чернотелки степной (Anatolica aucta) добавляют 25% раствор соляной кислоты до рН 1,0-2,0. Полученную смесь перемешивают и оставляют на 24ч.
Выпавший темно-бурый осадок меланина отфильтровывают при помощи воронки Бюхнера, под вакуумом, через бумажный фильтр, и высушивают при температуре не более 50 градусов до стабилизации веса сухой массы. Далее осадок заливают 60% раствором этанола, с целью очистки от примесей жирных кислот. Затем снова отстаивают в течение 4 часов, надосадочную жидкость сливают, полученный осадок фильтруют под вакуумом, через бумажный фильтр с последующим высушиванием при температуре 50°С.
На выходе получают порошок тёмно-коричневого цвета, который представляет собой очищенный от белковых и липофильных веществ меланин.
Пример 1.  К 100 мл водного экстракта кутикулы чернотелки степной (Anatolica aucta) добавляли 25% раствор соляной кислоты до изменения рН 1,0, полученную смесь перемешивали и оставляли на 24ч. Выпавший осадок меланина отфильтровывали, высушивали. Далее осадок заливали 60% раствором этанола, с целью очистки от примесей жирных кислот, фильтровали, высушивали при температуре 50°С. На выходе получали порошок тёмно-коричневого цвета.
Пример 2. К 100 мл водного экстракта кутикулы чернотелки степной (Anatolica aucta) добавляли 25% раствор соляной кислоты до изменения рН 2,0, полученную смесь перемешивают и оставляют на 12 часов. Выпавший осадок меланина отфильтровывали, высушивали. Далее осадок заливали дистилированной водой, и осаждение меланина 25% раствором соляной кислоты проводили ещё 2 раза. Полученный осадок заливали 60% раствором этанола, фильтровали, высушивали при температуре 50°С. На выходе получали порошок коричневого цвета.
Меланин такой чистоты, полученный в результате осуществления предлагаемого способа, может быть использован по всем известным направлениям применения меланина, о которых говорилось выше, в том числе, и в медицине, для получения ранозаживляющих препаратов и биологически активных добавок для лечения таких заболеваний, как ангина, гастрит, герпес, в косметологии, биоинженерии, а также в промышленности для создания водоотталкивающих покровов на различных механических поверхностях, электронике, промышленности.