КЛЕТОЧНАЯ ЯЧЕЙКА МИКРОФЛЮИДНОГО ЧИПА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ И/ИЛИ ИССЛЕДОВАНИЯ КЛЕТОК ИЛИ КЛЕТОЧНЫХ МОДЕЛЕЙ

Область техники, к которой относится полезная модель
Полезная модель относится к биохимии и молекулярной биологии, а именно, к устройствам для культивирования и/или исследования клеток или клеточных моделей человека, животных, растений, и/или культур вирусов со статическим и/или динамическим (проточным или замкнутым) режимом ростовой среды. В частности, заявляемое устройство может быть использовано для формирования двухслойных клеточных моделей из различных типов клеток, например, модели плаценты, с последующим изучением процессов фетоплацентарного барьера in vitro, а также для исследования влияния различных химических веществ на клетки в условиях in vitro, в т.ч. исследования токсичности и метаболизма лекарственных препаратов, и др.
Уровень техники
На сегодняшний день микрофлюидные чипы широко применяются в различных областях науки и техники. При этом в литературе активно используются и другие термины, характеризующие данную конструкцию - микрофлюидные системы, модули, микрофлюидные платформы, микрофлюидные устройства, микробиореакторы.
Наиболее эффективно микрофлюидные чипы используются в химических, биологических и медицинских исследованиях, например, для культивирования клеток, моделирования тканей и органов человека, и, в отличие от промышленных биореакторов, предназначены для максимально полного и правдоподобного воспроизведения in vitro физиологических условий in vivo (рН культуральной среды, концентрации кислорода, удаления продуктов метаболизма, поддержания состава культуральной среды, формирования физиологичных механических воздействий).
В зависимости от решаемой задачи из уровня техники известно использование микрофлюидных платформ различной конструкции и топологии. В простейшем случае, конструкция микрофлюидного чипа представляет собой две герметично соединенные пластины, на одной из которой (основа) сформированы микрофлюидные элементы -микроканалы, ячейки, клапаны и другие активные элементы, а другая является защитной. При этом известны чипы с ячейками для культивирования клеток объемом менее 1 мл, объединенными сетью каналов диаметром менее 1 мм.
В частности, из патента CN 202003576 известно устройство для формирования модели плацентарного барьера in vitro со статическим размещением ростовой среды, представляющее собой корпус, в котором расположено, по меньшей мере, одно культуральное отверстие - ячейка, в которой размещены две мембраны из поликарбоната, одна из которых - нижняя, предназначена для слоя эндотелиальных клеток, вторая - верхняя, предназначена для формирования слоя трофобластов. Расстояние между мембранами составляет 3-5 мм для обеспечения возможности формирования двухслойной клеточной модели плаценты. Корпус снабжен крышкой. Отверстие для культивирования клеточной модели имеет цилиндрическую форму. Мембрана для эндотелиальных клеток представляет собой округлое чашеобразное тело, верхняя поверхность которого больше поверхности основания. Мембрана для трофобластов представляет собой цилиндрическое тело. Эндотелиальные клетки размещают на соответствующих мембранах с последующим культивированием до образования двухслойной клеточной модели с последующим изучением ее свойств.
Недостатками известного решения является его узкое назначение - только для формирования модели плацентарного барьера. Кроме того, устройство характеризуется большим количеством зависимых элементов, требующих индивидуального исполнения. Кроме того, в устройстве используются две мембраны для двух типов клеток (трофобласта и эндотелия), которые располагаются на некотором расстоянии друг от друга, а между слоями клеток в процессе их культивирования присутствует компартмент с жидкой ростовой средой. Объем данного компартмента значительно больше, чем в условиях реальной плаценты, что создает условия для диффузии и разбавления транспортируемых веществ в ростовой среде и делает модель менее реалистичной. Кроме того, эндотелиальные клетки на нижней мембране обращены верхним (апикальным) краем к верхней мембране, на которой растут клетки трофобласта. При изучении транспорта различных веществ через данный барьер значимо увеличивается расстояние между клетками, а само вещество проходит оба слоя клеток в направлении от апикального к базальному концу клетки. В условиях организма транспорт веществ происходит от апикального к базальному краю клетки трофобласта и от базального к апикальному краю клетки эндотелия, что не отражено в предлагаемом устройстве. Кроме того, данное устройство не позволяет проводить изучение влияния динамического потока ростовой среды на свойства клеток, которое может быть реализовано в соответствующих микрофлюидных чипах.
Наиболее близким к предлагаемому решению является конструкция микрофлюидного чипа, известная из патента RU 2612904, представляющая собой основу в виде пластины, выполненную, преимущественно, из поликарбоната, на одной из сторон которой расположена эластичная пластина в виде отлитого слоя ПДМС со сформированной в нем микрофлюидной системой, имеющей планарную структуру размещения микрофлюидных элементов (например, соединенные микроканалами клеточные ячейки, микронасосы, включающие клапаны, рабочие камеры и т.д.), загерметезированной предметным стеклом. В основе пластины выполнены резьбовые отверстия, соответствующие расположению микрофлюидных элементов чипа, а также служащие для подключения к нему различных емкостей (емкости с питательной средой, емкости сбора среды, емкости сбора фильтрата) и внешних модулей (например, средства создания постоянного давления). Клеточная ячейка выполнена с возможностью герметичного размещения в ней мембранной вставки, например, типа Трансвелл, делящей своей мембраной ячейку на входную и выходную части. Ячейка может быть выполнена в виде отверстия в пластине (или пластинах) и иметь форму, например, близкую к цилиндрической, или представляющую собой усеченный конус с одним и более эластичным кольцевым выступом для герметичного размещения вставки в ячейке, при этом ячейка снабжена крышкой (пробкой) с резьбовым соединением. Крышка ячейки может иметь дополнительное уплотнение в виде эластичной кольцевой прокладки.
Однако известное техническое решение обладает рядом существенных недостатков. При вводе Трансвелла в ячейку под мембраной Трансвелла образуются пузырьки воздуха, которые негативно влияют на рост клеток или поддержание их ростовых свойств, и, соответственно, качество проводимых исследований. В известной ячейке не предусмотрены средства вывода пузырьков воздуха из клеточной ячейки. Образовавшиеся пузырьки воздуха под нижней поверхностью мембраны Трансвелла ограничивают контакт клеток с питательной средой в процессе их культивирования, препятствуя поступлению питательных веществ и газов к клеткам, что приводит к нарушению их нормальной физиологии, перехода клеток в стрессовое состояние. Это, в свою очередь, может стать причиной гибели клеток и нарушения целостности монослоя. Кроме того, часть пузырьков воздуха с мембраны Трансвелла в процессе культивирования (при заполнении системы средой для культивирования клеток) может попадать в систему микрофлюидных каналов, что также отрицательно сказывается на проводимых исследованиях в связи с нарушением стабильности потока перемещаемой по микроканалам среды и повышением сопротивления монослоя. При закручивании крышки в ячейке создается избыточное давление, негативно влияющее на клетки, размещенные на мембране Транвелла. При установке в ячейку Трансвелла с предварительно сформированной клеточной моделью, например, моделью плацентарного барьера, из-за конструктивных особенностей ячейки и пробки возможна деформация сформированных монослоев. Кроме того, конструкция, материал и технология изготовления ячейки и крышки не обеспечивают требуемой стерильности ячейки для проведения исследований. Крышка состоит из пробки и уплотнительного кольца (резина, бутадиен), которое при постоянном воздействии спиртосодержащих материалов и агрессивных сред быстро разрушается, что в последствии приводит к плохой герметизации полости ячейки. Поскольку для герметичного подключения к чипу различных модулей управления и герметизации клеточных ячеек требуется применение пробок, уплотнительных прокладок и манжет, известная конструкция не обеспечивает необходимый уровень эргономичности и удобства эксплуатации, и также препятствует поддержанию стерильности в процессе эксплуатации чипа.
Раскрытие полезной модели
Задача, решаемая настоящей полезной моделью, заключается в преодолении перечисленных выше недостатков посредством разработки конструкции ячейки микрофлюидного чипа для размещения Трансвелла с клеточной моделью для последующего ее культивирования и/или исследования in vitro, в т.ч. в динамическом, проточном или замкнутом, или статическом режимах ростовой среды.
Заявляемое устройство позволяет проводить исследование в т.ч. многослойной/двухслойной клеточной модели, сформированной на пористой мембране Трансвелла с противоположных ее сторон, например, имитирующей модель плаценты. При этом с помощью заявляемого устройства возможны изучение ее фетоплацентарного барьера в статическом или динамическом режиме ростовой среды, оценка целостности барьера, образованного слоем клеток, имитирующих эндотелий, пористой мембраной из культурального пластика и слоем клеток, имитирующих трофобласт, изучение газового обмена в плаценте и др. в условиях in vitro, приближенных к in vivro.
Техническим результатом полезной модели является повышение качества исследования (снижение погрешности получаемых результатов), за счет снижения риска повреждения или гибели клеток как в процессе установки Трансвелла с клетками в ячейку, так и в процессе культивирования клеток. Это достигается посредством использования конструкции клеточной ячейки, элементы которой обеспечивают «мягкую» установку в ней Трансвелла - на начальном этапе введения Трансвела в клеточную ячейку происходит центрирование Трансвелла, затем, при приближении к дну ячейки, постепенное уплотнение нижней части Трансвелла; а также дробление воздушных пузырьков, которые образуются на нижней поверхности мембраны при установке Трансвелла, на более мелкие с последующим их отводом/выводом/удалением из полости клеточной ячейки. Качество проводимых исследований повышается в т.ч. и за счет использования заявляемой ячейки с крышкой (без резьбы), которая при ее установке не создает избыточного давления, негативно влияющего на клетки, размещенные на мембране вставки Транвелл. Заявляемая конструкция также обеспечивает стерильность полости ячейки, за счет снижения риска контаминации в процессе взаимодействия с чипом и вблизи клеточной ячейки.
Технический результат достигается тем, что микрофлюидный чип содержит основу, включающую клеточную ячейку, выполненную с возможностью размещения в ней культуральной вставки типа Трансвелл, и снабженную пробкой, а также размещенный на основе слой из формовочного материала со сформированой микрофлюидной системой заданной топологии, и уплотнительный слой из формовочного материала, размещенный на основе со стороны, противоположной размещению слоя с микрофлюидной системой, и со стороны внутренней поверхности клеточной ячейки, при этом внутренняя поверхность клеточной ячейки с уплотнительным слоем имеет ступенчатый профиль и рельеф, обеспечивающий центрирование Трансвелла и вывод пузырьков воздуха, образующихся со стороны нижней поверхности мембраны Трансвелла при его установке в ячейку.
Клеточная ячейка имеет высоту, обеспечивающую размещение в ней вставки типа Трансвелл и пробки с зазором относительно верхнего торца вставки Транвелл, исключающим контакт с его поверхностью.
Профиль внутренней поверхности клеточной ячейки может иметь две ступени, при этом часть клеточной ячейки, соответствующая верхней ступени, выполнена цилиндрической формы диаметром не менее 2 мм и высотой не менее 2 мм, а форма внутренней поверхности части клеточной ячейки, соответствующей нижней ступени, является рельефной, образованной чередующимися протяженными продольными каналами, имеющими форму части цилиндра большего и меньшего диаметров, соответственно, с внутренним диаметром данной части клеточной ячейки не менее 1,5 мм, высотой не менее 2 мм, при этом каналы большего диаметра предназначены для центрирования и вывода более крупных пузырьков при вводе Трансвелла в ячейку, а каналы меньшего диаметра расположены между каналами большего диаметра и предназначены для вывода остаточных пузырьков меньшего диаметра. Каналы большего диаметра имеют длину L1, равную 1/2 - 1/4 высоты нижней ступени h1, и диаметр, не менее 1 мм, а каналы меньшего диаметра имеют длину L2, превышающую длину каналов большего диаметра, на величину не менее чем 1/4, и диаметр, не менее 0,4 мм, при этом количество каналов большего и меньшего диаметров выполнено от 6 до 16. В конкретном варианте реализации длина канала большего диаметра составляет L1=h1/3, длина канала меньшего диаметра L2=h1/2.
Толщина уплотнительного слоя на поверхности основы составляет не менее 1 мм. Уплотнительный слой из формовочного материала на поверхности основы со стороны, противоположной размещению фикрофлюидной системы, и, по меньшей мере, на части внутренней поверхности, по меньшей мере, части отверстий основы, представляет собой единую эластичную деталь.
Поперечные размеры ступеней ступенчатого профиля внутренней поверхности клеточной ячейки выполнены с уменьшением по направлению к микрофлюидной системе.
Микрофлюидная система содержит микрофлюидные элементы в виде клеточной ячейки для культивирования клеточных моделей тканей и органов млекопитающих, микронасоса для обеспечения движения питательной среды по микроканалам и технологического отверстия для доступа к питательной среде, объединенных микрожидкостными каналами с образованием контура для циркуляции питательной среды.
В качестве основы использована пластина из поликарбоната или полистирола. Основа со стороны размещения уплотнительного слоя снабжена бортиками, высота которых равна толщине слоя формовочного материала.
Краткое описание чертежей
Полезная модель поясняется чертежами, где на фиг. 1 - представлен поперечный разрез клеточной ячейки; фиг. 2 - 6 представлены изображения клеточной ячейки, демонстрирующие процесс установки Трансвелла и введения среды роста и клеточной модели для проведения исследований; на фиг. 7-8 представлены изображения основы заготовки чипа, общий вид и вид сверху, соответственно; на фиг. 9 - изображение фрагмента фиг. 8 в поперечном разрезе по линии А-А, где представлено отверстие, соответствующее клеточной ячейке; на фиг. 10 - общий вид варианта выполнения микрофлюидного чипа, снабженного пробкой, где на местном разрезе представлен фрагмент, показывающий внутреннюю структуру чипа со слоями из формовочного материала (ПДМС) на поверхностях основы заготовки и уплотнительным слоем (ПДМС) в отверстии основы; на фиг. 11 - вариант выполнения микрофлюидного чипа, вид сверху, на фиг. 12 - поперечный разрез клеточных ячеек и микронасоса по линии Б-Б микрофлюидного чипа на фиг. 10; на фиг. 13 - продольный разрез пробки 12.
Позициями на чертежах обозначены: 1 - клеточная ячейка микрофлюидного чипа; 2 - основа микрофлюидного чипа; 3 - слой формовочного материала с микрофлюидной системой; 4 - микрофлюидный чип; 5 - уплотнительный слой из формовочного материала на поверхности основы, расположенной с противоположной стороны от поверхности со слоем 3; 6 - уплотнительный слой из формовочного материала, расположенный на, по крайней мере, части поверхности отверстий 7 основы; 7 - отверстие в основе чипа, соответствующее клеточной ячейке; 8 - бортик для уплотнительного слоя, расположенный по периметру основы; 9 - верхняя ступень отверстия основы, соответствующего клеточной ячейке (часть отверстия большего диаметра); 10 - нижняя ступень отверстия основы, соответствующего клеточной ячейке (часть отверстия меньшего диаметра); 11-уплотнительный слой формовочного материала в отверстии основы в форме «звездочки»; 12 - пробка для герметизации отверстий чипа; 13 - оптически прозрачная пластина, герметизирующая микрофлюидную систему (предметное стекло); 14 - опорные площадки; 15 - канал большего диаметра для первичного вывода пузырьков; 16 - канал меньшего диаметра для вторичного вывода пузырьков; 17 - пинцет; 18 - наконечник пипетки; 19 - Трансвелл; 20 выступы пробки 12; 21 - углубления в выступах 20; 22 - зубцы на выступах 20 пробки 12.
Осуществление полезной модели
Терминам и выражениям, используемым в настоящей заявке, придают следующие значения.
«Микрофлюидная система» - набор микрофлюидных элементов, объединенных системой микроканалов.
«Микрофлюидный элемент» - составная часть микрофлюидного контура, реализующая определенную функцию, например, соединительный канал, клапан, клеточная ячейка, технологическое отверстие и т.д. При этом микрофлюидные элементы характеризуются объемами порядка микро-, нано- и пиколитров.
«Микрофлюидный чип» - структура, содержащая основу в виде пластины с отверстиями, на одной стороне которой размещен слой затвердевшего формовочного материала со сформированной в нем микрофлюидной системой заданной топологии, герметизированной нижним слоем в виде оптически прозрачной пластины.
«Заготовка микрофлюидного чипа» - часть микрофлюидного чипа, содержащая основу в виде пластины с отверстиями и размещенным на одной из ее сторон слоем затвердевшего формовочного материала со сформированной в нем микрофлюидной системой заданной топологии.
«Основа заготовки микрофлюидного чипа» - часть микрофлюидного чипа в виде пластины, служащая твердым основанием для размещения на нем, по меньшей мере, слоя формовочного материала с микрофлюидной системой.
«ПДМС» - полидиметилсилоксан (ПДМС) - химическое соединение, линейный полимер диметилсилоксана, газопроницаемый эластичный органический материал, который может использоваться для изготовления различных изделий путем заливки в соответствующую оснастку (форму), последующего отверждения и извлечения из оснастки (формы).
«Клеточная модель» - клетки животного, в том числе человеческого, происхождения, выращиваемые (культивируемые) в условиях in vitro для изучения любых показателей жизнедеятельности клеток при созданных условиях культивирования.
2
5
8
2
«Трансвелл» - культуральная вставка или емкость для выращивания клеток или клеточных моделей, используемая в микрофлюидных устройствах при проведении исследований клеточных моделей. Трансвеллы имеют форму цилиндра или усеченного конуса, объем от 100±25 мкл до 1,5±0,15 мл, верхний диаметр от 4,26±0,50 мм до 24±0,5 мм, нижний диаметр от 4,26±0,50 мм до 24±0,5 мм, высоту от 6±0,5 мм до 20±0,5 мм, дно выполнено в виде пористой мембраны площадью от 0,143 до 4,67 см, с диаметром пор от 0,4 до 8,0 мкм и плотностью пор от 1×10 до 1×10 пор на 1 см. Трансвеллы могут быть выполнены из полиэстера, поликарбоната или политетрафторэтилена. Из уровня техники известны Трансвеллы фирмы Corning Inc. В заявляемом устройстве могут использоваться любые стандартизованные типы Трансвеллов. В материалах настоящего описания Трансвелл указан как частный случай использования емкости с пористой мембраной из культурального пластика для размещения биологических структур для проведения исследований или формирования/культивирования клеточной модели.
«Мембрана» - пористая пластина для культивирования клеточных сред, структур, тканей.
«Культуральная среда» - жидкость или гель сложного состава, предназначенные для поддержания роста микроорганизмов, клеток животных или человека.
Остальным терминам и выражениям придается обычное для своего контекста значение, известное специалистам в данной сфере. Однако настоящую полезную модель не следует ограничивать выбранной специальной терминологией. Специалисты в соответствующей области должны понимать, что можно использовать и другие термины, равно как и другие известные из уровня техники средства и методы для реализации полезной модели.
Ниже представлено более детальное описание заявляемого решения.
В общем виде микрофлюидный чип 4 для культивирования клеток (фиг. 10) включает основу 2, например, в виде пластины из твердого полимера, которая может быть выполнена различной формы и размеров (определяемых назначением чипа и топологией его микрофлюидной системы), и снабжена отверстиями (в частном случае может быть только одно отверстие), соответствующими элементам микрофлюидной системы, например, под клеточные ячейки 7, каналы для подвода/отвода питательной среды и др. На одной стороне пластины основы размещен эластичный слой 3 (из формовочного материала) со сформированной в нем микрофлюидной системой, включающей микрофлюидные элементы, соединенные микрожидкостными каналами, загерметизированные, например, предметным стеклом 13. Одновременно со слоем эластичного (формовочного) материала с микрофлюидной системой может быть сформирован уплотнительный слой 5 на стороне основы заготовки, противоположной стороне с микрофлюидной системой, выполняющий функцию уплотнительного элемента при герметизации отверстий основы, а также уплотнительный слой 6, расположенный, по крайней мере, на части поверхности отверстий 7 основы 2 (фиг. 12) для обеспечения герметичного размещения в ней вставки типа Трансвелл 19 (фиг. 3). В частном варианте реализации заявляемого решения слой из эластичного материала может покрывать всю внутреннюю боковую поверхность клеточной ячейки 1 и иметь определенный рельеф 11 (фиг. 1), обеспечивающий удаление пузырьков воздуха, которые образуются со стороны нижней торцевой поверхности мембраны Трансвелла в момент его установки в клеточную ячейку 1 (фиг. 3-4). В предпочтительном варианте осуществления заявляемого решения уплотнительные слои 5 и 6 - на поверхности пластины основы 2 и на внутренних поверхностях отверстий 7 пластины основы, выполнены в виде единой эластичной детали (фиг. 1, фиг. 12). При этом уплотнительный слой 5 на поверхности основы 2 заготовки может служить, например, для герметичного подключения системы подачи воздуха к чипу и/или уплотнения размещаемых в отверстиях заготовки крышек или пробок 12 (фиг. 6, фиг. 10), что позволяет исключить множество отдельных уплотнительных деталей, например, уплотнительных колец. Сформированные в процессе изготовления чипа уплотнения 6 внутри отверстий 7 с определенным рельефом 11 поверхности обеспечивают, в частности, исключение образования пузырей воздуха при погружении в них клеточных вставок (Трансвеллов) (фиг. 3-4).
Микрофлюидная система может быть выполнена с произвольной топологией - проточной, замкнутой, одноконтурной, многоконтурной, кроме того микрофлюидная система может содержать одну или несколько ячеек для культивирования различных клеточных моделей.
В качестве формовочного материала при отливке заготовки 3 чипа могут быть использованы эластичные термопласты или реактопласты, например, силоксаны, полиуретаны, полимеры OSTE+. В предпочтительном варианте осуществления полезной модели в качестве формовочного материала используют газопроницаемый эластичный органический материал - полидиметилсилоксан (ПДМС).
Слой 3 эластичного затвердевшего формовочного материала с микрофлюидной системой, сформированный на основе 2 заготовки (фиг. 12), может иметь толщину, например, от 0,1 до 5 мм, при этом в местах расположения таких элементов, как клапаны, толщина слоя может лежать в диапазоне от 0,05 до 1 мм (толщина мембран клапанов или рабочей камеры). Размер микрофлюидных каналов (высота) может составлять от 0,1 до 2 мм. Толщина уплотнительного слоя 5 на поверхности основы заготовки (со стороны, противоположной расположению микрофлюидной системы) может составлять от 0,5 до 10 мм. Толщина уплотнительного слоя 6 или 11 внутри отверстий может составлять от 0,1 до 1 мм. При этом толщина основы 2 может варьироваться от 2 до 16 мм.
Конструкция готового микрофлюидного чипа допускает использование специальной пробки 12 (фиг. 10) для герметизации отверстий основы заготовки, например, отверстий, соответствующих клеточным ячейкам и лунке для смены среды. В частном варианте, данная пробка представляет собой монолитную деталь 12, выполненную, например, из полистирола, одновременно закрывающую технологическое отверстие и клеточные ячейки микрофлюидного чипа, которая заменяет несколько отдельных резьбовых крышек и уплотнителей к ним, создающих избыточное давление при закручивании. Данная деталь может быть выполнена в виде пластины, снабженной тремя выступами на нижней стороне. Форма и взаимное расположение данных выступов соответствуют внутренней форме и взаимному расположению технологического отверстия и отверстий клеточных ячеек микрофлюидного чипа (фиг. 10). Выступы 20 пробки могут быть выполнены с углублениями 21 (например, круглого сечения) в торцевых частях, что предотвращает возникновение избыточного давления в микрофлюидной системе чипа при установке на него данной пробки. Кроме того, выступы 20 могут быть дополнительно снабжены зубцами 22 для фиксации и центрирования выступов пробки в отверстиях чипа. Таким образом, использование данной пробки 12 предотвращает возникновение избыточного давления, а также существенно упрощает стерилизацию микрофлюидного чипа, предотвращая попадание загрязнений и нежелательных микроорганизмов внутрь лунок. Пробка может иметь и другое конструктивное выполнение в зависимости от количества и расположения отверстий основы, требующих герметизации.
Варианты решения микрофлюидной системы.
Микрофлюидная система, формируемая на поверхности заготовки 2 чипа, может представлять собой набор различных микрофлюидных элементов, назначение которых определяется в зависимости от целей использования чипа. Микрофлюидные элементы объединены системой микрожидкостных каналов (микроканалов). В качестве микрофлюидных элементов могут выступать, например, клеточные ячейки для культивирования клеточных моделей, различные клапаны и рабочие камеры (мембраны), обеспечивающие движение питательной среды по микроканалам, а также обеспечивающие гашение скачков давления и скорости движения питательной среды (демпфирующие элементы), технологические отверстия (лунки) для доступа к питательной среде чипа. При этом клапаны могут быть выполнены с возможностью уменьшения просвета микрофлюидного канала вплоть до его герметичного перекрытия, или могут обеспечивать «отключение» ответвления микрофлюидного канала.
В одном из вариантов, формируемая микрофлюидная система может содержать рабочую камеру с мембраной, выполненной с возможностью изменения объема рабочей камеры, которая в совокупности с подключенными к ней клапанами, может реализовывать функцию насоса-маршрутизатора (микронасоса), обеспечивающего перекачивание жидкостей в заданном направлении между любой парой клапанов.
В частности, микрофлюидная система может содержать несколько (от 1 до 5) клеточных ячеек и микронасос, объединенные микроканалами, образующими как минимум, один контур для циркуляции питательной среды. При этом в различных ячейках могут располагаться различные модели, например, на основе различных линий клеток. Данный вариант позволяет бесконтактно сокультивировать до 5 типов клеток.
В другом варианте выполнения микрофлюидная система может содержать микронасос, две клеточные ячейки, демпфирующий элемент и технологическое отверстие, объединенные микрожидкостными каналами с образованием замкнутого контура для циркуляции питательной среды. Использование чипа с данной структурой микрофлюидных элементов позволяет осуществлять бесконтактное сокультивирование, а также комплексное моделирования этапов метастазирования, как на стороне первичной опухоли, так и на стороне метастаза.
Система микрофлюидных каналов может иметь более одного контура циркуляции.
В частности, микрофлюидная система может быть выполнена по аналогии с описанными в патентах RU 2612904, RU 171690, RU 2584598.
Варианты решения основы микрофлюидного чипа.
Основа 2 чипа представляет собой пластину 2 (фиг. 7), преимущественно выполненную фрезерованием из оптически прозрачного материала, например, из листа полистирола или поликарбоната, и обеспечивающую жесткость и прочность конструкции микрофлюидного чипа. Возможны и другие известные из уровня техники варианты изготовления основы - например, литьем или штамповкой.
Размеры и форма пластины определяются топологией и составом микрофлюидной системы. Пластина может быть снабжена отверстиями 7, количество и расположение которых соответствует количеству и расположению микрофлюидных элементов микрофлюидной чипа (фиг. 7, 10). При этом отверстия 7 в пластине могут быть выполнены различной геометрической формы, например, цилиндрической или представлять собой усеченный конус, прямоугольник, и могут быть выточены посредством фрезерного станка с ЧПУ.
В предпочтительном варианте осуществления полезной модели в качестве основы 2 заготовки используют пластину, выполненную прямоугольной формы и размерами, соответствующими размеру стандартного предметного стекла по ГОСТ 9284-75 «Межгосударственный стандарт стекла предметные для микропрепаратов», например, размером 26×76 мм, что обеспечивает оптимальное расположение на пластине по меньшей мере, пяти отверстий 7, соответствующих микрофлюидным элементам, объединенным по меньшей мере, одним контуром циркуляции, а также обеспечивает возможность проведения исследований методами оптической микроскопии. При этом часть отверстий 7 пластины 2 могут быть предназначены для ячеек, по крайней мере, одно отверстие может являться технологическими и служить для замены среды в ячейках, другая часть отверстий может быть предназначена для клапанов и рабочих камер микронасосов и служить для подключения, например, систем подачи воздуха к микронасосам. Кроме того, пластина может содержать отверстия, предназначенные для подключения к чипу различных датчиков и измерительных приборов.
Отверстие для ячейки выполнено с обеспечением герметичного размещения в нем клеточной вставки (например, мембранной вставки Transwell), частично или полностью заполненной моделью (слоем клеток, фрагментом ткани, скаффолдом с клетками и т.д.).
В одном из вариантов, для формирования микрофлюидной системы, предназначенной для сокультивирования нескольких различных моделей, например, на основе различных линий клеток, объединенных одним контуром циркуляции, основа 2 может представлять собой пластину с, по крайней мере, шестью отверстиями (фиг. 7), по меньшей мере, два из которых соответствуют клеточным ячейкам 7 чипа 4, одно является технологическим и соответствует лунке для смены среды, и, по меньшей мере, три отверстия, выполненные меньшего диаметра, служат для подключения системы подачи воздуха к микронасосу. Расположение отверстий в основе 2, как правило, продиктовано условиями эксплуатации чипа и удобством подключения внешних элементов.
Одна из сторон основы 2 заготовки, противоположная стороне со слоем 3 формовочного материала с микрофлюидной системой, может быть выполнена с ограничительным бортиком 8 (фиг. 7, 8), расположенным по периметру основы, при этом высота бортика соответствует толщине уплотнительного слоя.
Варианты решения клеточных ячеек.
В одном из вариантов выполнения микрофлюидного чипа, по меньшей мере, часть отверстий, в основе заготовке чипа, снабженных уплотнительным слоем, и предназначенных для размещения вставок Трансвелл, может иметь ступенчатый продольный профиль поверхности. При этом поперечные размеры ступеней могут быть выполнены с уменьшением по направлению к слою с микрофлюидной системой.
В одном из вариантов осуществления заявляемого решения профиль внутренней поверхности клеточной ячейки, характеризуется наличием двух ступеней (фиг. 1-3), при этом клеточная ячейка имеет высоту, обеспечивающую размещение в ней вставки типа Трансвелл 19 (фиг. 3) и пробки 12 (фиг. 6) с технологическим зазором относительно верхнего торца вставки Транвелл 19, исключающим контакт с его поверхностью. При этом часть клеточной ячейки (верхняя часть), соответствующая верхней ступени 9, выполнена цилиндрической формы и имеет диаметр и высоту, обеспечивающие плотное размещение выступа 20 пробки 12 (фиг. 6) с зазором не менее 0,5 мм не более 7 мм относительно верхнего торца Трансвелла 19.
Форма нижней части клеточной ячейки, соответствующей нижней ступени является рельефной, и в одном из вариантов выполнения состоит из чередующихся протяженных продольных каналов в виде выемок/желобков, например, имеющих форму части цилиндра, большего 15 и меньшего 16 диаметров, соответственно (фиг. 1-2). При этом каналы большего диаметра 15 (фиг. 1-2) предназначены для центрирования и вывода более крупных пузырьков воздух при вводе Трансвелла 19 в ячейку 1, и имеют длину L1, равную 1/2 - 1/4 высоты нижней ступени h1. Диаметр канала 15 имеет величину не менее 0,8 мм, количество и шаг размещения каналов зависит от диаметра клеточной ячейки, и для ячейки диаметром 5,4 мм количество каналов 15 может быть от 3 до 8. Каналы меньшего диаметра 16 (фиг. 1-2) расположены между каналами большего диаметра 15 и предназначены для вывода остаточных пузырьков и снятия чрезмерного усилия/нагрузки на мембрану с клетками при установке Трансвелла 19 в ячейку 1 (фиг. 3-4), и имеют длину L2, превышающую длину каналов 15, например, на величину не менее чем 1/4. В частном варианте реализации клеточной ячейки длина канала 15 составляет L1=h1/3, длина канала 16 - L2=h1/2. Диаметр канала 16 имеет величину не менее 0,4 мм с шагом размещения, который также зависит от диаметра клеточной ячейки и для ячейки диаметром 5,4 мм количество каналов 16 может быть от 3 до 8.
Таким образом, поверхность нижней части ячейки, соответствующей нижней ступени, имеет рельефную форму, определяемую формой чередующихся каналов 15 и 16, которая по окончании каналов 16 (по мере перемещения Трансвелла в процессе его установки в ячейку) переходит в цилиндрическую форму, при этом нижняя ступень завершается выступающими опорными площадками 14 для Трансвелла, которые имеют конфигурацию, не перекрывающую канал и распределяющую нагрузку по периметру дна Трансвелла. Количество, размеры и геометрия каналов 15, размещаемых на данной ступени, определяются их функцией - необходимостью вывода пузырьков воздуха на этапе ввода Трансвелла в ячейку, а также равномерного центрирования и распределения давления, исключающего возникновение дефекта монослоя в случае установки Трансвелла, уже содержащего предварительно сформированную клеточную модель. Количество, размеры и геометрия каналов 16 также определяются их функцией - необходимостью вывода остаточных пузырьков воздуха на этапе уплотнения Трансвелла в клеточной ячейке.
Ступенчатый цилиндрический продольный профиль поверхности клеточной ячейки может включать количество ступеней больше двух. В одном из вариантов ячейка может иметь трехступенчатый профиль поверхности, где третья ступень может быть сформирована следом за второй ступенью по направлению к микрофлюидной системе. В данном варианте выполнения третья ступень может быть выполнена высотой не менее 2 мм и внутренним диаметром не менее 1 мм, которая усиливает эффект «дробления» пузырьков воздуха (на более мелкие) с обеспечением их отвода из полости ячейки через каналы 15 и 16.
В частном варианте выполнения отверстия в основе 2 (фиг. 7) также могут быть выполнены ступенчатой формы в продольном сечении фиг. 9, что обеспечивает в процессе отливки формирование уплотнительного слоя 6 фиг. 1 на внутренней поверхности отверстий в основе 2. На фиг. 12 показана форма отверстий под клеточную ячейку, форма отверстий микронасоса и форма отверстия под лунку для смены среды.
Таким образом, сформированный рельеф уплотнительного слоя в клеточной ячейке обеспечивает центрирование и плотную посадку Трансвелла в ячейке, а также удаление пузырьков воздуха, которые образуются в процессе установки Трансвелла в клеточной ячейке.
Данная конструкция ячейки является особенно актуальной при культивировании двухслойных клеточных моделей биологических барьеров (плацентарных), предварительно выращенных на пористой мембране культуральной вставки Трансвелла. Рельефный продольный профиль поверхности ячейки обеспечивает измельчение пузырьков воздуха, образующихся на дне мембранной вставки Трансвелл и их вывод через систему каналов при установке вставки Трансвелла в ячейку. Конструкция ячейки обеспечивает размещение Трансвелла с двухслойной клеточной моделью с возможностью контакта всех клеток, размещенных со стороны нижней поверхности пористой мембраны, с культуральной средой, обеспечивая условия для дальнейшего роста и поддержания жизнеспособности клеток. При этом клетки на верхней поверхности пористой мембраны культуральной вставки Трансвелла после установки в ячейку находятся в условиях статичной культуральной среды, а клетки на нижней поверхности - в условиях динамического потока культуральной среды, создающего напряжение сдвига. Такие условия имитируют физиологические условия биологических барьеров в живом организме. Так, в плацентарном барьере клетки трофобласта окружены кровью матери, которая не имеет постоянного потока, а клетки эндотелия постоянно омываются движущейся по сосудам кровью плода. Аналогичным образом в гематоэнцефалическом барьере эндотелий испытывает напряжение сдвига под действием протекающей крови, а клетки нейроглии окружены статической околоклеточной жидкостью. В кишечном барьере эпителий окружен статичным содержимым просвета кишки, а клетки эндотелия испытывают напряжение сдвига от крови. Подобным образом устроены и другие биологические барьеры в живом организме. Таким образом, получаемая с помощью разработанной ячейки модель биологического барьера in vitro имитирует реальные физиологические условия, позволяя изучать свойства данных барьеров в стандартизированном окружении.
Изготовление микрофлюидного чипа.
Процесс изготовления микрофлюидного чипа 4 включает этап получения основы 2, этап формирования заготовки чипа, который включает формирование на основе 2 слоев 3, 4 и 6 или 11 из формовочного материала, а также этап фиксации на заготовке, со стороны расположения микрофлюидной системы, пластины 13 из оптически прозрачного материала, обеспечивающей герметизацию микрофлюидных элементов и микроканалов и формирующую нижний слой чипа. При этом в качестве фиксируемой пластины преимущественно используют стандартное предметное стекло.
Для получения основы 2 в пластине из оптически прозрачного материала, предпочтительно, полистирола, посредством, например, фрезерного станка, вытачивают (при необходимости) отверстия в местах, соответствующих расположению микрофлюидных элементов чипа. Заготовку микрофлюидного чипа изготавливают посредством отливки слоя формовочного материала на поверхности подготовленной пластины 2, которая может быть реализована любыми известными из уровня техники способами и средствами. В качестве формовочного материала преимущественно используют полидиметил сил океан (ПДМС).
Пример конкретного выполнения
Микрофлюидный чип 4 (фиг. 10) с заявляемым решением клеточной ячейки 1 (фиг. 1) был апробирован на серии из 5 микрофлюидных чипов.
В качестве механической основы 2 конструкции микрофлюидных чипов выступала пластина из полистирола размером 80×30 мм, толщиной 8 мм, также обработанная фрезерованием. В пластине было изготовлено шесть сквозных отверстий фиг. 8. Пластина была снабжена бортиками высотой 1 мм. В продольном сечении отверстия 7 пластины 2 были выполнены ступенчатой формы (фиг. 9). Наружный диаметр отверстий пластины, соответствующих клеточным ячейкам и лунке для смены среды составлял 12 мм, а отверстий, соответствующих мембранам микронасоса - 6 мм. Отверстия, соответствующие мембранам (клапанам и рабочей камере) микронасоса и лунке для смены среды (технологическое отверстие), были выполнены двухступенчатыми. Вторые ступени отверстий для клапанов микронасоса были выполнены с диаметром 3 мм, для рабочей камеры - 3.4 мм, для технологического отверстия - 5.7 мм. Отверстия, соответствующие клеточным ячейкам, были выполнены аналогично лунке для смены среды. Для формирования слоя с микрофлюидной системой и уплотнительного слоя была использована оснастка из двух частей (мастер и форма отливки), в которую была помещена основа с отверстиями, при этом оснастка имела рельеф внутренней поверхности, обеспечивающей при заливке в нее формовочного материала формирование на противоположных поверхностях основы слоя 3 с микрофлюидной системой, уплотнительных слоев 5 и 11 в виде единой пленочной детали (фиг. 10). Таким образом, полученная заготовка содержала с нижней стороны слой отвержденного ПДМС с микрофлюидной системой толщиной 1,5 мм, с верхней и в на боковой поверхности клеточных ячеек - слой уплотнительного из отвержденного ПДМС толщиной 1 мм. При этом высота микрофлюидных каналов составляла 300 мкм, толщина мембран из ПДМС в местах расположения клапанов и рабочей камеры насоса составляла 400 мкм. В качестве формовочного материала был использован полидиметилсилоксан (ПДМС) Dow Corning Sylgard 184 в составе 10 массовых частей основания на 1 часть отвердителя. На полученной заготовке со стороны ее нижней поверхности осуществляли фиксацию предметного стекла.
Изготовленные микрофлюидные чипы с предложенной конструкцией клеточной ячейки характеризовались высоким качеством за счет исключения образования пузырьков воздуха в каналах, быстротой и удобством эксплуатации, минимальным количеством элементов при стерилизации. Изделия были подвержены успешной стерилизации на поглощенных дозах в 15 кГр и максимальной допустимой в 45 кГр.
Были проведены тесты по использованию миклюфлюидных чипов с клеточной ячейкой оригинальной конструкции для культивирования двухслойных клеточных моделей биологических плацентарных барьеров, предварительно выращенных на пористой мембране культуральной вставки Трансвелл. Шаги по установке Трансвелла в ячейку микрофлюидного чипа показаны на фиг. 2-6. В частности, на фиг. 2 показан процесс введения среды для культивирования клеток в канал микрофлюидной системы, после чего в ячейку устанавливали Трансвелл с клеточной моделью плацентарного барьера фиг. 3-4, затем в Трансвелл с клетками вводили свежую питательную среду фиг.5 и ячейку закрывали герметичной крышкой фиг.6, после чего чип подключали к системе циркулирования питательной среды и помещали в инкубатор для дальнейших исследований.
Данная конструкция чипа продемонстрировала свою работоспособность в процессе непрерывной эксплуатации в течение месяца. В ходе культивирования двухслойной клеточной модели был установлен надежный контакт клеток, размещенных на нижней поверхности мембраны Трансвелла, с культуральной средой, что обеспечило оптимальные условия для дальнейшего роста и поддержания жизнеспособности клеток, чего не получалось достичь при использовании микрофлюидного чипа с клеточной ячейкой, описанной в прототипе. Клетки на верхней поверхности пористой мембраны культуральной вставки Трансвелл после установки в ячейку находились в условиях статичной культуральной среды, а клетки на нижней поверхности - в условиях динамического потока культуральной среды, создающих напряжение сдвига и имитирующих физиологические условия биологических барьеров в живом организме.
По итогам проведенного эксперимента зафиксировано снижение погрешности получаемых результатов и повышение процента жизнеспособных клеток по сравнению с экспериментом, проведенном на чипе по прототипу, за счет удаления пузырьков воздуха, образующихся со стороны нижней поверхности мембраны Трансвелла при его установке в ячейку. Во всех проведенных экспериментах зафиксировано отсутствие повреждения мембран. При исследовании опытного образца под микроскопом визуально не были идентифицированы дефекты и трещины на поверхности мембран. Таким образом, получаемая с помощью разработанной ячейки модель биологического барьера in vitro имитирует реальные физиологические условия, позволяя изучать свойства данных барьеров в стандартизированном окружении.
Конструкция предлагаемого чипа позволяет подбирать оптимальные режимы для культивирования различных типов клеток, позволяет проводить все виды микроскопических исследований, включая прижизненную визуализацию клеток в течение длительного времени.