РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК, КОДИРУЮЩАЯ СИНТЕЗ; СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ И ЛЕКАРСТВЕННЫЙ ПРЕПАРАТ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА ЛИЗОСТАФИНА

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК, кодирующая синтез, характеризуется созданием рекомбинантной плазмиды pBBSLis2, для этого использован вектор экспрессии pNCMO2, которая содержит ген рекомбинантного зрелого лизостафина для синтеза и секреции в клетках Bacillus brevis, кроме того содержит P2 промотор, при этом сделан рестрикционный анализ Pstl и Kpnl, переосаждение этанолом, отобраны Amp- и Nm-резистентные клоны, выполнено культивирование клеток трансформированного штамма.
2. Способ получения рекомбинантной плазмидной ДНК по п. 1, включающий культивирование клеток трансформированного штамма, ультрафильтрацию и хроматографическую очистку культуральной жидкости для элюции целевого продукта - зрелого лизостафина, отличающийся тем, что для клонирования зрелого лизостафина в векторной плазмиде pNCMO2 синтезируют два праймера, секретируют зрелый лизостафин в Bacillus brevis, определяют NH2 - концевой остаток формилметионин препролизостафина как остаток -143 и NH2 - концевой аланин зрелого лизостафина определяют как остаток с +1, фрагмент 1,5-т.н.п. плазмидной ДНК, которая содержит лизостафиновый ген из Staphylococcus simulans и его последовательности примыкания, полностью сиквенируют, исходно ген кодирует препрофермент Mr=42205 bp, выявляют NH2 - концевые последовательности, трансформируют плазмиду-вектор pNCMO2, содержую промотор P2, в Е. coli HB101, отбирают Amp-резистентные клоны, культивируют Е. coli HB101, выделяют плазмидную-векторную ДНК pNCMO2, делают рестрикцию PstI и KpnI, переосаждают этанолом и культивируют трансформированные клетки Baccillus brevis в жидкой среде МТ с pH 7.0 при 30-37°C 120 об/мин в течение 48-64 часов, при этом резистентность Baccillus brevis с плазмидой pBBSLis2 к неомицину составляет до 10 µg/ml, кроме того осуществляют осадок клеток, отмывают секретированный белок, используют для хромотографии сертифицированный катионообменник, значение pH фильтрата доводят до 5-6, затем фильтрат наносят на колонку с КМ-сефарозой в Н+-форме, контроль сорбции ведут по наличию в элюате бактериолитической активности, колонку с сорбированным ферментом промывают физиологическим раствором: 0,5 М трис-HCl-буфером, pH 8,5, до значения оптической плотности при длине волны 280 нм в промывных водах ≤0,01, экстракцию лизостафина проводят 0,05 М глициновым буфером, содержащим 0,15 М NaCl, pH 10,0, и контролируют, каждые 24 часа, продукцию рекомбинантного белка.
3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что культивируют трансформированные клетки Baccillus brevis в жидкой среде МТ следующего состава на 1 литр среды:
Глюкоза 10,0 - г/л;
Полипептон 10,0 - г/л;
Meat экстракт 5,0 - г/л;
Дрожжевой экстракт 2,0 - г/л;
4
2
FeSO 7·HO 10,0 - мг/л;
4
2
MnSO 4·HО 10,0 - мг/л;
4
2
ZnSO 7HO 1,0 - мг/л;
2
2
MgCl 6·HO 4,1 - г/л.
4. Способ по п. 2, отличающийся тем, что культивируют трансформированные клетки Baccillus brevis в жидкой среде ТМ следующего состава на 1 литр среды:
Глюкоза 10,0 - г/л;
Полипептон 10,0 - г/л;
Meat экстракт 5,0 - г/л;
Дрожжевой экстракт 2,0 - г/л;
4
2
FeSO 7·HO 10,0 - мг/л;
4
2
MnSO 4·HO 10,0 - мг/л;
4
2
ZnSO 7·HO 1,0 - мг/л.
+
5. Способ по п. 2, отличающийся тем, что отделяют субстанции с молекулярной массой до 50 кДа, осуществляют промывку физраствором, значение pH фильтрата доводят до 5-6, затем фильтрат наносят на колонку с КМ-сефарозой в Н-форме, выполняют контроль сорбции, сорбированный ферментом промывают физиологическим раствором, 0,5 М трис-HCl-буфером, имеющим pH 8,5, до значения оптической плотности в промывных водах ≤0,01 при длине волны 280 нм, при этом экстракцию лизостафина проводят 0,05 М глициновым буфером, содержащим 0,15 М NaCl, pH 10,0, удаляют минорные примеси, собирают фракцию содержащую лизостафин, значение pH элюата целевого белка доводят до 5,5-6,0 1М ацетатаммонийным буфером, концентрируют путем высаливания сульфатом аммония, центрифугируют при 8000 об/мин, после чего осадок перерастворяют в забуференном ацетатом аммония физиологическом растворе pH 5,5-6,0, раствор наносят на колонку с сефадексом G 25 уравновешенным буфером для лиофилизации, низкомолекулярные примеси отделяют, собирая фракцию целевого белка, контроль параметров проводят по наличию бактериолитической активности и спектрофотометрически и по СДС-ПААГ электрофорезу, раствор фермента хранят замороженным при (-40)-(-80)°C в пластиковой таре.
6. Лекарственный препарат рекомбинантного белка, характеризующийся тем, что для приготовления раствора использовано активное вещество лизостафин и
вспомогательные добавки, при следующем весовом соотношении в миллиграммах (мг) на 1 флакон/20 ЕД:
Лизостафин от 25 до 27,5 мкг
Натрий хлористый 8,8 мг
Натрия фосфат однозамещенный 2-водный 0, 3 мг
Натрия фосфат двузамещенный 12-водный 2,9 мг
Полиглюкин 12 мг
7. Лекарственный препарат рекомбинантного белка, характеризующийся тем, что для приготовления раствора использовано активное вещество лизостафин и вспомогательные добавки, при следующем весовом соотношении в миллиграммах (мг) на 1 флакон/50 ЕД:
Лизостафин от 62,5 до 65 мкг
Натрий хлористый 8,8 мг
Натрия фосфат однозамещенный 2-водный 0,3 мг
Натрия фосфат двузамещенный 12-водный 2,9 мг
Полиглюкин 12 мг