Молекулярные полифлуореновые щетки с боковыми цепями полиметакриловой кислоты
MOLECULAR POLYFLUORENE BRUSHES WITH POLYMETHACRYLIC ACID SIDE CHAINS

Изобретение относится к химии высокомолекулярных соединений, а именно к новым соединениям спирторастворимых полифлуореновых молекулярных щеток с боковыми цепями полиметакриловой кислоты.
В последнее десятилетие активно развивающимся направлением в полимерной химии является синтез и исследование разветвленных полимерных систем с хорошо определенной структурой, носящих название “полимерных щеток” (polymer brushes). Ярким примером подобных систем являются молекулярные полимерные щетки, представляющие собой привитые сополимеры, состоящие из “скелета” основной цепи и ковалентно присоединенных к нему боковых цепей.
В работах китайских ученых (Zhang Z., Lu X., Fan Q., Hu W., Huang W. Conjugated polyelectrolyte brushes with extremely high charge density for improved energy transfer and fluorescence quenching applications. Polym. Chem. 2011. V. 2. No. 10. P. 2369-2377 и Zhao H., Hu W., Ma H., Jiang R., Tang Y., Ji Y., Hou B., Deng W., Fan Q. Photo-Induced Charge-Variable Conjugated Polyelectrolyte Brushes Encapsulating Upconversion Nanoparticles for Promoted siRNA Release and Collaborative Photodynamic Therapy under NIR Light Irradiation. Adv. Funct. Mater. 2017. V. 27. P. 1702592.) разработан способ получения полимерных щеток с полифлуореновой основной цепью и боковыми цепями поли-N,N'-диметиламиноэтилметакрилата методом ATRP на полифлуореновом макроинициаторе. Полученные полимерные щетки водорастворимы, люминесцируют с квантовым выходом 52% и могут быть кватернизованы для придания им новых свойств. Например, были получены объекты с цвиттер-ионной природой. Они были применены для покрытия апконверсионных наночастиц для фотодинамической терапии, которые также несли в себе малые интерфирирующие РНК за счет связывания с катионом от полимерных щеток.
В работах ученых (Yang C., Liu H., Zhang Y., Xu Z., Wang X., Cao B., Wang M. Hydrophobic-sheath segregated macromolecular fluorophores: colloidal nanoparticles of polycaprolactone-grafted conjugated polymers with bright far-red/near-infrared emission for biological imaging. Biomacromolecules. 2016. V. 17 No. 5. P. 1673-1683 и Yang C., Huang S., Wang X., Wang M. Theranostic unimolecular micelles of highly fluorescent conjugated polymer bottlebrushes for far red/near infrared bioimaging and efficient anticancer drug delivery. Polym. Chem. 2016. V. 7. No. 48. P. 7455-7468.) разработан синтез полимерных щеток с полифлуореновой основной цепью и боковыми цепями поли-ε-капролактона и сополимера поли-ε-капролактон-блок-поли-олигоэтиленгликольметакрилата, люминесцирующих в красной области спектра. Данные амфифильные полимерные системы могут быть использованы для солюбилизации и направленной доставки гидрофобных веществ.
В работах (Yakimansky A.V., Meleshko T.K., Ilgach D.M., Bauman M.A., Anan’eva T.D., Klapshina L.G., Lermontova S.A., Balalaeva I.V., Douglas W.E. Novel regular polyimide-graft-(polymethacrylic acid) brushes: Synthesis and possible applications as nanocontainers of cyanoporphyrazine agents for photodynamic therapy. J. Polym. Sci. Part A: Polym. Chem. 2013. V. 51. No. 20. P. 4267-4281 и Shilyagina N.Y., Peskova N.N., Lermontova S.A., Brilkina A.A., Vodeneev V.A., Yakimansky A.V., Klapshina L.G., Balalaeva I.V. Effective delivery of porphyrazine photosensitizers to cancer cells by polymer brush nanocontainers. Journal of Biophotonics. 2017. V. 10. No. 9. P. 1189-1197.) разработаны методы получения новых молекулярных щеток с основной полиимидной цепью и боковыми поливиниловыми цепями различной природы методом контролируемой полимеризации (ATRP), синтезирован ряд высокомолекулярных мультицентровых макроинициаторов с регулируемой степенью функционализации на основе гидроксилсодержащих полиимидов. С помощью полимеризации по механизму ATRP ряда виниловых мономеров (метилметакрилата, трет-бутилметакрилата, стирола, н-бутикрилата, трет-бутикрилата) на мультицентровых полиимидных макроинициаторах синтезированы новые привитые сополиимиды с боковыми цепями как гомополимеров, так и блок-сополимеров.
Полученные полиимидные щетки, растворимые в спирте и воде, с боковыми цепями полиметакриловой кислоты, могут использоваться в качестве наноконтейнеров для порфиразиновых агентов фотодинамической терапии рака и для создания нанокомпозитных мультислойных прочных оболочек полых микро- и нанокапсул для различных приложений.
В данных работах было показано, что молекулярные щетки с основной полиимидной цепью и боковыми цепями полиметакриловой кислоты обеспечивают высокую эффективность и селективность доставки агентов фотодинамической терапии, таких как цианопорфиразины в клетки различных опухолей, что было показано экспериментами in vivo и in vitro.
В патенте РФ № 2750037 описаны молекулярные щетки с целлюлозной основной цепью и боковыми цепями полиметакриловой кислоты, которые были получены в несколько стадий. Сначала синтезирован макроинициатор, содержащий боковые α-бромизобутиратные группы путем модификации целлюлозы α-бромизобутироил бромидом. Далее методом ATRP трет-бутилметакрилата от целлюлозного макроинициатора получены полимерные щетки с боковыми цепями поли-трет-бутилметакрилата, которые кислотным гидролизом трифторуксусной кислотой были превращены в амфифильную щетку с боковыми цепями полиметакриловой кислоты. Данные полимерные щетки характеризуются водо- и спирторастворимостью. Они так же, как и описанные выше полимерные щетки с полиимидной основной цепью, способны солюбилизировать гидрофобные агенты фотодинамической терапии и отличаются тем, что являются биоразлагаемым материалом, который может быть легко удален из организма.
Однако выше описанные полимерные щетки с боковыми цепями полиметакриловой кислоты не люминесцируют, что не позволяет определить механизм транспорта содержимого и локализацию щеток в клеточном пространстве.
В патенте РФ №2736483 описаны молекулярные люминесцирующие щетки с полифлуореновой основной цепью и боковыми цепями поли-алкилоксазолинов, которые обладают термочувствительностью и являются биосовместимыми и водорастворимыми. Данные полимерные щетки были получены методом «прививка через» путем поликонденсации по Сузуки оксазолиновых макромономеров.
Недостатком данного метода является то, что у полученных полимерных щеток невысокая степень полимеризации основной цепи из-за стерических препятствий, а также имеются сложности с очисткой конечного продукта от примесей Pd катализатора и непрореагировавшего макромономера.
Задачей предлагаемого изобретения является создание нового соединения - полифлуореновой щетки с боковыми цепями полиметакриловой кислоты, обладающего интенсивной люминесценцией, устойчивостью при хранении в условиях комнатной температуры, спирторастворимостью, проявляющего полиэлектролитные и амфифильные свойства.
Указанная задача решается предлагаемым изобретением - синтез полифлуореновой щетки с боковыми цепями полиметакриловой кислоты.
Предлагаемые в настоящей заявке молекулярные щетки с основной полифлуореновой цепью и боковыми цепями полиметакриловой кислоты обладают всеми достоинствами полиимидных щеток, но в отличие от них и от аналогичных целлюлозных щеток, описанных выше, флуоресцируют с высокими квантовыми выходами, что может быть использовано для визуализации при изучении механизма их действия в организме и для диагностики.
В патентной литературе не описано применение молекулярных щеток с основной полифлуореновой цепью и боковыми цепями полиметакриловой кислоты в качестве носителей для агентов фотодинамической терапии.
Данная работа выполнена при поддержке гранта Правительства Российской Федерации для государственной поддержки научных исследований, проводимых под руководством ведущих ученых (контракт 14.W03.31.0022) от 26.04.2018.
Способ получения молекулярной полифлуореновой щетки с боковыми цепями полиметакриловой кислоты, включающий получение полифлуоренового мультицентрового макроинициатора путем синтеза мономера - 2,7-дибром-9,9-бис(3-гидроксипил) флуорена, полифлуорена с боковыми гидроксильными группами методом поликонденсации по Сузуки и модификацией полифлуорена α-бромизобутироил бромидом с добавлением иодида калия; взаимодействие полученного макроинициатора с трет-бутилметакрилатом с использованием анизола, хлорида меди (II), 2-этилгексаноат олова (II), 4,4'-динонил-2,2'-бипиридина и получение конечного продукта путем обработки сополимера полифлуорена с политрет-бутилметакрилатными боковыми цепями в хлористом метилене трифторуксусной кислотой общей структурной формулы:
где:
n - степень полимеризации основной цепи (20-100);
m - степень полимеризации боковых цепей (10-150).
3
4
В качестве исходных компонентов используют коммерческие реактивы: 2,7-дибромфлуорен (97%, Aldrich), 3-бромпропан-1-ол (98%, Aldrich), тетрабутиламмоний бромид (99%, Aldrich), α-бромизобутироил бромид (98%, Aldrich), триэтиламин (99,5%, Aldrich), трифенилфосфин (99%, Aldrich), 9,9-диоктилфлуорен-2,7-дибороновой кислоты-бис(1,3-пропандиоловый) эфир (97%, Aldrich), тетракис(трифенилфосфит) палладия Pd(0)(PPh) (99%, Aldrich), трикаприлметиламмоний хлорид (Aliquat 336, Aldrich), пинаколиновый эфир фенилбороновой кислоты (97% Aldrich), бром бензол (99%, Aldrich), 4,4'-динонил-2,2'-бипиридил (97%, Aldrich), хлорид меди (II) (99%, Aldrich) перед использованием высушен в вакууме при 50°C; 2-этилгексаноат олова (II) (Aldrich), анизол (99%, Aldrich) перед использованием перегнан над натрием дважды в атмосфере аргона; гидроксид натрия (ЧДА, Вектон), сульфат натрия (безводный, Вектон), карбонат калия (ЧДА, Вектон), иодид калия (ЧДА, Вектон), хлористый метилен (ХЧ, Вектон), хлороформ (ХЧ, Вектон), этилацетат (ХЧ, Вектон), диметилсульфоксид (ХЧ, Вектон) перед использованием высушен над молекулярными ситами 3А; метиловый спирт (ХЧ, Вектон), тетрагидрофуран ТГФ (ХЧ, Вектон), трет-бутилметакрилат ТБМА - в качестве мономера (98%, Aldrich) предварительно очищен с помощью вакуумной перегонки; модифицированный меркаптогруппами силикагель - QuadraSil MP (20-100 micron, Alfa Aesar).
Способ получения полифлуореновой щетки с боковыми цепями полиметакриловой кислоты включает в себя следующие стадии:
Получение полифлуорена с боковыми гидроксильными группами
Сначала синтезирован мономер - 2,7-дибром-9,9-бис(3-гидроксипропил) флуорена по схеме:
1
Методика синтеза мономера состоит в следующем. В трехгорлую колбу взвешены 3,86 г (11,9 ммоль) 2,7-дибромфлуорена и 0,76 г (2,3 ммоль) тетрабутиламмоний бромида и растворены в 60 мл диметилсульфоксида, пропуская через раствор аргон. Смесь перемешивается в течение 30 минут. Затем добавляется 10 мл 50%-го раствора NaOH. Реакционная масса нагревается до 85°С и в течение 20 минут добавляются по каплям 4 мл (45,2 ммоль) 3-бромпропан-1-ола. После окончания реакции смесь выливается в воду, экстрагируется этилацетатом. Органический слой высушен над сульфатом натрия. Растворитель удален на ротационном испарителе. Полученный продукт очищен перекристаллизацией из хлороформа. Выход: 60%. H ЯМР (ДМСО-d6, 400 MГц) δ = 7.8 (д, 2H), 7.6 (с, 2H), 7.5 (д, 2H), 4.2 (т, 2H), 3.1 (кв, 4H), 2.0 (т, 4H), 0.6 (м, 4H).
Затем синтезирован полифлуорен с боковыми гидроксильными группами путем поликонденсации по Сузуки согласно схеме:
Методика синтеза полифлуорена PFOH состоит в следующем.
3
4
2
3
В стеклянную круглодонную колбу взвешиваются навески 0,5704 г (0,001 моль) 9,9-диоктилфлуорен-2,7-дибороновой кислоты-бис(1,3-пропандиоловый) эфира, 0,4400 г (0,001 моль) 2,7-дибром-9,9-бис(3-гидроксипропил) флуорена, 0,01 г (0,038 ммоль) трифенилфосфина. Колба закрывается холодильником и адаптером с отводом для ввода проб и вакуумным краном (Aldrich Z530255). Затем система вакуумируется и заполняется аргоном 3 раза. В перчаточном боксе в атмосфере аргона вносится навеска 0,01 г (0,00865 ммоль) катализатора Pd(0)[PPh]. Установка выносится из бокса, вакуумируется и заполняются аргоном 3 раза. Затем в систему вводится с помощью шприца через септу в адаптере раствор 0,02 г трикаприлметиламмоний хлорида в 1,5 мл анизола, 14,5 мл анизола и 10 мл раствора 2М KCO (раствор в бидистилированной воде). Реакция проводится в микроволновом реакторе CEM Discover SP при температуре 98°С и мощности 80 Вт (Режим: SPS mode, ΔT=2°С). Спустя 90 минут в систему с помощью шприца добавляется раствор 0,012 г (3 мол.%) пинаколинового эфира фенилбороновой кислоты в 1 мл анизола и реакция продолжается при 95°С. Через час к реакционной массе добавляется 400 мкл бром бензола в 1 мл анизола и реакция продолжается еще 90 минут.
2
3
Растворы KCO, трикаприлметиламмоний хлорида и анизола продуваются аргоном в течение часа перед добавлением в систему.
По окончании реакции смесь разбавляется ТГФ, декантируется, сушится над сульфатом натрия. Далее для удаления катализатора раствор пропускается через слой модифицированного силикагеля (QuadraSil MP). Полимер высаживается в метиловый спирт. Выпавший полимер выделяется на фильтре Шотта, промывается метанолом 4 раза, водой, снова метанолом. Далее полимер переосаждается из раствора ТГФ в метанол, фильтруется и высушивается в вакууме при 50°С. Выход: 75%.
Получение полифлуореного макроинициатора
Синтез полифлуоренового макроинициатора осуществлен по следующей схеме:
Методика синтеза макроинициатора состоит в следующем. В 24 мл сухого ТГФ растворено 0,470 г РFOH, затем добавлено 0,3149 г иодида калия и 1,41 мл (10,1 ммоль) триэтиламина. Реакционная масса перемешивается в атмосфере аргона, охлаждаясь на ледяной бане, 10 мин. Далее прибавляется по каплям 0,94 мл (7,6 ммоль) α-бромизобутирил бромид, после чего реакционная смесь перемешивается при 0°С в течение 2 ч. Затем смесь медленно нагревается до комнатной температуры и перемешивается еще в течение 24 часов. После окончания реакции раствор фильтруется от соли, концентрируется и высаживается в метиловый спирт. Порошок промывается метанолом, водой, метанолом. Далее полимер переосаждается, фильтруется, промывается метанолом, а затем сушится в вакууме при 50°С. Степень прохождения реакции - степень функционализации, определена методом 1Н ЯМР спектроскопии (Фиг. 1а) на приборе: Bruker AC-400, 400 МГц, равна 93%.
n
n
звми
Степень полимеризации основной цепи n определяется условиями поликонденсации (время синтеза, мольное соотношение мономеров). В данном изобретении n находится в пределах 20-100. Характеризуется этот параметр значением M макроинициатора, а именно M/MM,
где:
звми
MM - молекулярная масса звена макроинициатора.
Получение полифлуореновой молекулярной щетки с привитыми поли трет-бутилметакрилатными цепями
Синтез привитых сополимеров полифлуорен-прив-ПТБМА осуществлен с помощью метода контролируемой радикальной полимеризации по схеме:
где:
n - степень полимеризации основной цепи (20-100);
m - степень полимеризации боковых цепей (10-150).
2
В колбу Шленка взвешивается 0,03 г (0,029 ммоль) макроинициатора, 0,0078 г (0,059 ммоль) CuCl и 0,0502 г (0,123 ммоль) 4,4'-динонил-2,2'-бипиридила, добавляется 7,6 мл анизола (20 объем%) и 1,9 мл (11,7 ммоль) трет-бутилметакрилата, которые предварительно продуты аргоном в течение часа. Колба закрывается резиновой септой и в атмосфере аргона добавляется 23,7 мг (0,059 ммоль) 2-этилгексаноата олова (II) в 0,5 мл анизола. Реакция проводится на магнитной мешалке при температуре масляной бани 80°С в течение 2 часов. Конверсия: 50%.
n
n
зв
Степень полимеризации боковых цепей m определяется мольным соотношением инициирующая группа макроинициатора : мономер и конверсией мономера. В данном изобретении m находится в пределах 10-150. Характеризуется этот параметр значением M боковых цепей, а именно M/MM,
где:
зв
MM - молекулярная масса звена боковых цепей.
Кинетика полимеризации изучена методом газовой хроматографии (на приборе Shimadzu GC-2010 Plus) с использованием внутреннего стандарта. Линейность кинетического графика первого порядка свидетельствует об отсутствии реакций обрыва цепи (Фиг. 2).
Получение молекулярных полифлуореновых щеток с боковыми цепями полиметакриловой кислоты
Синтез привитого полифлуоренового сополимера, содержащего полиметакриловую кислоту в боковых цепях, осуществлен по схеме:
В раствор сополимера с гомополимерными ПТБМА боковыми цепями концентрации 4 мас.% в свежеперегнанном хлористом метилене вносится свежеперегнанная трифторуксусная кислота в мольном соотношении трет-бутильная группа : трифторуксусная кислота = 1:10. Реакция проводится при комнатной температуре при постоянном перемешивании в течение 24 ч. Затем растворитель выпаривается, осадок переосаждается из этилового спирта в хлористый метилен. Полимер сушится в вакууме при 40°С.
Структура полученных амфифильных сополимеров подтверждена методами 1Н ЯМР спектроскопии (Фиг. 1б) по исчезновению сигнала протонов трет-бутильных групп и ИК-спектроскопии на ИК-Фурье спектрометре Shimadzu IRAffinity-1S с приставкой однократного НПВО Quest single ATR attachment (Specac), по изменению полос колебаний карбонильных групп (Фиг. 3).
Выделение боковых цепей ПТБМА из привитых сополимеров
3
Навеска привитого сополимера (0.1 г) растворяется в 15 мл свежеперегнанного ТГФ, затем добавляется 10 мл 5 мас.% раствора KOH в CHOH. Реакционная смесь выдерживается в стеклянной емкости с винтовой крышкой (Schott Duran, Germany) трое суток при 90°С. По окончании реакции, смесь нейтрализуется соляной кислотой. Затем продукт концентрируется, высаживается в воду и многократно промывается осадителем (водой). Порошок высушивается при 40°С в вакууме.
Молекулярно-массовые характеристики полученных полимеров изучены методом гель-приникающей хроматографии на хроматографе: Agilent-1260 Infinity, в ТГФ при 40°С (Фиг. 4). Для расчета молекулярных масс использовались полистирольные стандарты. Видно, что хроматограммы унимодальны. Этот факт, узкодисперсность выделенных боковых цепей и отсутствие реакции обрыва цепи свидетельствуют о контролируемости процесса полимеризации.
Таблица. Молекулярно-массовые характеристики полимеров
Образец
M<sub>n</sub>
M<sub>w</sub>
M<sub>n</sub>/M<sub>w</sub>
Макроинициатор
21000
31500
1.5
ПФ-прив-ПТБМА
137000
288000
2.1
Выделенные боковые цепи (линейный ПТБМА)
4500
6000
1.3
Люминесцентные свойства полимеров
Полученные полимерные щетки излучают свет в синей области спектра при облучении УФ светом с длиной волны 384 нм. Спектры поглощения растворов макроинициатора, ПФ-прив-ПТБМА и ПФ-прив-ПМАК практически идентичны (Фиг. 5). Квантовые выходы люминесценции полимеров были определены относительно стандарта - сульфат хинина в 1,0 Н серной кислоте, согласно методике, описанной в работе: Demas J. N., Crosby G. A. J. Phys. Chem. 1971. V. 75. P. 991-1024. Квантовый выход люминесценции макроинициатора = 0,61, ПФ-прив-ПТБМА = 0,77, ПФ-прив-ПМАК = 0,64. Спектры поглощения получены на спектрофотометре Shimadzu UV-1900, спектры флуоресценции - на спектрофлуориметре Shimadzu RF-6000.
Графические материалы:
1
Фиг. 1. H ЯМР спектры:
a) макроинициатора;
б) полифлуорен с привитыми цепями поли-трет-бутилметакрилата ПФ-прив-ПТБМА и полифлуорен с привитыми цепями полиметакриловой кислоты ПФ-прив-ПМАК.
Фиг. 2. Кинетический график первого порядка полимеризации трет-бутилметакрилата на полифлуореновом макроинициаторе.
Фиг. 3. ИК-спектры полимерных щеток ПФ-прив-ПТБМА и ПФ-прив-ПМАК.
Фиг. 4. Хроматограммы макроинициатора: ПФ-прив-ПТБМА и выделенных боковых цепей ПТБМА.
Фиг. 5. Спектральные характеристики полимеров:
a) cпектр поглощения ПФ-прив-ПМАК;
3
3
б) спектры флуоресценции макроинициатора (в CHCl), ПФ-прив-ПТБМА (в CHCl) и ПФ-прив-ПМАК (в этаноле).
Таким образом, в результате получено новое полимерное соединение, представляющее собой порошок белого цвета, обладающее устойчивостью при хранении в условиях комнатной температуры, спирторастворимостью, флуоресценцией в синей области и реакционной способностью карбоксильных групп.
Технический результат предлагаемого изобретения заключается в следующем: молекулярные полифлуореновые щетки с боковыми цепями полиметакриловой кислоты могут быть использованы для создания оболочек нано- и микрокапсул, применяемых для целевой доставки лекарств, а также в качестве солюбилизирующих наноконтейнеров для гидрофобных соединений, используемых в целях фотодинамической терапии и диагностики. Такие сополимеры являются перспективными для использования в медицине, биохимии, микроэлектронике и в других современных высокотехнологичных областях.