МИКРОБНЫЙ ПРЕПАРАТ ДЛЯ ОЧИСТКИ ОБЪЕКТОВ ОТ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ
MICROBIAL PREPARATION FOR CLEANING OBJECTS FROM PETROLEUM AND PETROLEUM PRODUCTS

Изобретение относится к области экологии и прикладной микробиологии и касается микробных препаратов, которые могут быть использованы для очистки объектов от нефти и нефтепродуктов.
Известен микробный препарат на основе штамма микроорганизмов Phyllobacterium myrsinacearum DKS-1, который может быть использован для очистки от нефти и нефтепродуктов солоноватоводных экосистем (патент RU №2268934, МПК C12N 1/20, 2003).
Известен микробный препарат на основе ассоциации штаммов бактерий, продуцирующих биоэмульгаторы, который может быть использован для очистки объектов (почвы, пресной и морской моды) от нефти и нефтепродуктов (патент RU №2312891, МПК C12N 1/20, 2006).
Наиболее близким к заявляемому является известный микробный препарат для очистки объектов (почвы и воды) от нефти и нефтепродуктов, состоящий из смеси природных углеводородокисляющих (УВ) культур микроорганизмов, выделенных методом селекции из природного сообщества микроорганизмов, находящихся в очищаемой воде или почве (патент RU №2057724, МПК C02F 3/34, 1994) - прототип. При получении данного препарата селекцию культур микроорганизмов проводят традиционным методом в присутствии смеси питательной среды, содержащей, по крайней мере, соединения азота, фосфора, калия и магния, с нефтью или нефтепродуктами.
Недостатками известного микробного препарата являются его относительно невысокие скорость и эффективность очистки загрязненных объектов от нефти и нефтепродуктов, а также относительно узкая область его применения.
Технической задачей изобретения является разработка нового микробного препарата, позволяющего вести очистку различных объектов от нефти и нефтепродуктов с более высокой скоростью и эффективностью даже при повышенной концентрации соли и относительно низкой температуре, в том числе в районах с коротким тепловым периодом, а также расширение области применения микробного препарата.
5
5
Указанный технический результат достигается тем, что в известном микробном препарате для очистки объектов от нефти и нефтепродуктов, состоящем из смеси природных УВ культур микроорганизмов, выделенных методом селекции из природного сообщества микроорганизмов в присутствии смеси питательной водной среды, содержащей, по крайней мере, соединения азота, фосфора, калия и магния, с нефтью или нефтепродуктом, культуры микроорганизмов выделяют из сообщества микроорганизмов, обитающих на морских бурых водорослях, по крайней мере, одного биологического рода, и препарат используют с титром не менее 10 колониеобразующих единиц (KOE) на мл при использовании суспензии препарата в водной среде и с титром не менее 10 KOE на грамм при использовании водной суспензии препарата, иммобилизованного на твердом носителе.
В предлагаемом техническом решении селекцию культур микроорганизмов необходимо проводить в присутствии смеси водной питательной среды с нефтью или нефтепродуктом, причем более целесообразно использовать для этих целей сырую нефть. В отсутствие нефти или нефтепродукта получить микробный препарат не удается.
В качестве питательной среды, используемой при селекции МС, можно использовать традиционные для таких целей питательные среды, содержащие, по крайней мере, соединения азота, фосфора, магния и калия.
При этом микробный препарат можно хранить в виде суспензии отселектированного сообщества микроорганизмов в водной питательной среде или в воде, либо в виде высушенного отселектированного микробного сообщества (МС), а также в виде отселектированного МС, иммобилизованного на твердом носителе.
При получении микробного препарата сушить отселектированное МС, а также иммобилизовать его на твердом носителе можно как в присутствии биогенной добавки, так и в ее отсутствие. При этом биогенная добавка должна содержать, по крайней мере, соединения азота, фосфора, калия, магния. В качестве биогенной добавки можно использовать как легкорастворимые, так и труднорастворимые минеральные или органоминеральные соединения. Кроме того, биогенная добавка может содержать еще и микроэлементы.
Микроскопическими, культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими методами было показано, что предлагаемый препарат состоит из бактерий, относящихся к различным биологическим родам, например, таким как Pseudomonas, Bacillus, Rhodococcus, Mycobacterium, Acinetobacter, Phyllobacterium, Marinobacter, Alcanivorax, Oleispira, Cycloclasticus и т.д. В предлагаемом изобретении для выделения культур микроорганизмов могут быть использованы различные морские бурые водоросли, например, бурые водоросли биологических родов Fucus sp., Laminarya sp., Phyllariella sp. и т.д. Эти водоросли широко распространены в морских экосистемах, например, в Белом море, Баренцевом море и Дальневосточных морях и т.д. Можно использовать, как бурые водоросли одного биологического рода, например рода Fucus sp., так и водоросли двух и более биологических родов.
Сушку биомассы препарата можно осуществлять как лиофильно, так распылением суспензии биомассы препарата в газовом потоке, например, в воздухе, в азоте, в аргоне и т.д.
В качестве твердого носителя для иммобилизации отселектированного МС можно использовать различные неорганические и органические, преимущественно пористые объекты, например, такие как природные пористые цеолиты, перлит, торф, опилки, почву и др.
Иммобилизацию можно проводить путем обработки носителя суспензией отселектированного сообщества микроорганизмов в жидкой среде посредством распыления, смешения и т.д. с последующей сушкой, которую можно осуществлять как при атмосферном, так и при пониженном давлении.
2
3
2
4
2
4
4
Микробный препарат получают следующим образом. Образцы бурых водорослей собирают, как правило, в зоне литорали. Фрагменты таллома (кусочки водорослей) размером примерно от 1 см или более помещают в водную питательную среду, например, следующего состава (г/л): KNO - 4,0; KHPO - 0,6; NaHPO - 1,4; MgSO - 0,8; NaCl - 20,0. В качестве источника углерода для жизнедеятельности МС используют либо нефтепродукт, либо, преимущественно, сырую нефть, вводимые в питательную среду в количестве нескольких массовых процентов. pH среды с нефтью 7,0.
Для получения культуры, окисляющей нефть или нефтепродукт, МС, засеянное как описано выше, инкубируют на лабораторной качалке при скорости вращения 280-300 об/мин, при температуре преимущественно не выше 15°С. Таким методом получают так называемую накопительную культуру микроорганизмов, за развитием которой наблюдают визуально и микроскопически. Через семь суток накопительную культуру помещают в холодильник, поддерживающий температуру в 10-12°С.
Селекцию УВ сообщества микроорганизмов проводят в течение нескольких месяцев, путем последовательных нескольких (5-6) пересевов 1 мл накопительной культуры в новую порцию питательной среды с нефтью или нефтепродуктом указанного выше состава.
Культивируемое разнообразие бактерий и определение титра микроорганизмов в накопительной культуре осуществляют путем десятикратного разведения стерильной среды без нефти и высева 0,01 мл накопительной культуры на чашки Петри, содержащие среду, состоящую из мясопептонного бульона и сусла, взятых в соотношении 1:1, с добавлением 1,7% агар-агара. После этого чашки Петри инкубируют при 10°С в течение 7 дней.
Из отдельных колоний микроорганизмов, выросших в этих условиях, традиционными методами выделяют штаммы чистых культур микроорганизмов. Способность чистых культур микроорганизмов потреблять УВ сырой нефти проверяют в тех же условиях, что и у накопительной культуры.
Морфологические и культуральные свойства колоний микроорганизмов, их микроскопию и проверку их окрашиваемости по Граму изучают традиционными микробиологическими методами.
Используемый в изобретении микробный препарат представляет собой смесь бактерий, включает одиночные клетки и их группирования в недлинные цепочки или иные скопления, за счет выделяемой слизи. Морфологически - это палочки разных размеров и толщины, кокки, коккобациллы, изогнутые палочки, у-образные пары клеток. Некоторые из них подвижные, другие - нет. Бактерии являются гетеротрофными аэробами, сапротрофными, грамположительными и грамотрицательными, не разжижающими агар, использующими простые субстраты, такие как углеводы, аминокислоты, органические кислоты, спирты и углеводороды.
Предлагаемый микробный препарат не обладает токсичными и токсигенными свойствами, не обладает раздражающими действиями на слизистые оболочки, не аллергичен. Он продуцирует биологические поверхностно-активные вещества, которые повышают скорость и степень очистки от нефти и нефтепродуктов.
5
5
Микробный препарат можно использовать в виде суспензии отселектированного МС в водной среде с тиром микроорганизмов не менее 10 KOE/мл. При использовании водной суспензии препарата, иммобилизованного на твердом носителе, концентрация микроорганизмов на носителе должна составлять не менее 10 KOE/г носителя. Предлагаемый препарат экологичен и может быть использован для очистки различных объектов, таких как вода, в том числе, морская, почва, металлические и другие загрязненные поверхности от нефти и нефтепродуктов, в том числе при повышенной концентрации соли в различных географических широтах, в том числе в районах Крайнего Севера и других районах с коротким тепловым периодом.
Препарат способен очищать объекты от нефти и нефтепродуктов только в присутствии влаги. В ее отсутствие микробный препарат неэффективен. Очистку объектов с помощью предлагаемого микробного препарата можно осуществлять как в присутствии биогенной добавки, так и в ее отсутствие. При этом биогенная добавка должна содержать, по крайней мере, соединения азота, фосфора, калия и магния.
Контроль за эффективностью и скоростью очистки объектов от нефти и нефтепродуктов можно проводить с помощью любых традиционных для таких целей методов, например, таких как, хроматография, гравиметрия, респирометрия и т.д.
Предлагаемый препарат удобен для использования. Хранят микробный препарат в виде его суспензии в водной питательной среде, либо в замороженном виде после отделения микроорганизмов от питательной среды, либо в высушенном виде, а также в иммобилизованном виде на твердом носителе после высушивания. Срок годности препарата, хранящегося в виде суспензии в питательной среде при 10°С, без пересева в новую питательную среду составляет не менее 6 месяцев. Высушенный препарат, а также иммобилизованный препарат может храниться более года.
Преимущества предлагаемого препарата иллюстрируют следующие примеры.
Пример 1.
2
3
2
4
2
4
4
Образцы морских бурых водорослей биологического рода Fucus sp. собирают в зоне литорали Белого моря в районе Кандалакшской губы при температуре морской воды 12°С. Кусочки таллома водоросли, размером около 2 см помещают в стерильные конические стеклянные колбы, емкостью 750 мл, заполненные 100 мл водной питательной среды, содержащей растворенные нижеуказанные соли, взятые в количестве (г/л): KNO - 4,0; KHPO - 0,6; NaHPO - 1,4; MgSO - 0,8; NaCl - 20,0. В колбы добавляют по 2 мл сырой Бакинской нефти, используемой в качестве источника углерода для жизнедеятельности МС. Колбы закрывают стерильными ватно-марлевыми пробками и закрепляют на лабораторной качалке. Включают качалку, работающую со скоростью 300 об/мин, и проводят инкубацию МС при 12°С в течение 7 суток. Затем колбы помещают в холодильник с температурой 10°С. За развитием культур микроорганизмов наблюдают визуально и микроскопически.
Селекцию УВ сообщества микроорганизмов проводят в течение 2,5 месяцев путем последовательных 10 пересевов 1 мл полученной суспензии микроорганизмов в 100 мл новой вышеуказанной питательной среды с нефтью.
8
Культивируемое разнообразие бактерий МС и определение титра микроорганизмов в полученном сообществе осуществляют путем десятикратного разведения в стерильной среде без нефти и высева 0, 01 мл этой культуры на чашки Петри, содержащие среду, состоящую из мясопептонного бульона и сусла, взятых в соотношении 1:1, с добавлением 1,7% агар-агара. После этого чашки Петри инкубируют при 10°С в течение 7 дней. Получают микробный препарат с титром 10KOE/мл, содержащий 10 биологических родов грамотрицательных и грамположительных бактерий, следующего морфологического состава: кокки, палочки, изогнутые и коринеформные бактериальные клетки.
Способность полученного микробного препарата очищать морскую воду от нефти и нефтепродуктов проверяют в микрокосмном эксперименте, имитирующем условия Белого моря. Эксперимент проводят при 12°С в специальных павильонах Беломорской биологической станции МГУ им. М.В.Ломоносова в 3-х пластиковых аквариумах, объемом 5 л с площадью зеркала аквариума 30×40 см, с протоком морской воды и имитацией физико-химических и биологических условий акватории Белого моря. Скорость протока регулируют таким образом, чтобы соответствовать скорости колебания воды в прибойной зоне моря.
10
Микробную биомассу отделяют от питательной среды центрифугированием при 8 тыс.об/мин и полученную густую пастообразную массу, содержащую 10 KOE/мл, хранят в замороженном виде.
7
Для иммобилизации препарата осуществляют ресуспендирование 1 мл препарата в 1 л вышеуказанной питательной среды без нефти с последующим введением в полученную суспензию 300 г твердого плавучего носителя, в качестве которого используют природный цеолит. Полученную смесь перемешивают в течение 10 мин при комнатной температуре, затем цеолит с иммобилизованным препаратом отделяют от суспензии и сушат при комнатной температуре до воздушно сухого состояния. Получают микробный препарат, иммобилизованный на твердом носителе, содержащий 10 KOE/г носителя. На поверхность каждого из аквариумов, заполненных морской водой, вносят по 100 мл сырой Бакинской нефти, затем на водную поверхность каждого из аквариумов вносят по 5 г цеолита с иммобилизованным на нем микробным препаратом. Опыт проводят при 12°С в течение 7 суток. За это время эффективность очистки морской воды от нефти, определенная гравиметрическим методом, составляет в среднем 96%.
Пример 2.
3
2
4
2
4
4
5
Опыт проводят аналогично примеру 1, однако полученный биопрепарат на цеолите не иммобилизуют, и в качестве очищаемого объекта используют 200-литровую металлическую бочку, загрязненную изнутри нефтью. В бочку заливают 200 л морской воды, затем туда добавляют 3 мл полученного биопрепарата и биогенную добавку, содержащую 80 г KNO, 12 г KHPO; 28 г NaHPO и 16 г MgSO. Получают водную суспензию препарата с титром 1.5×10 KOE/мл. Опыт проводят в течение 5 суток при 10°С при периодическом интенсивном перемешивании. За это время эффективность очистки бочки от нефти достигает 90%.
Пример 3 (контрольный, по прототипу).
Опыт проводят аналогично примеру 1, однако культуру микроорганизмов выделяют из морской воды, загрязненной нефтепродуктами и взятой из акватории Мурманского морского порта. За 7 суток эффективность очистки морской воды от нефти составляет 51%.
Пример 4.
2
Опыт проводят аналогично примеру 1, однако при получении биологически активного препарата используют смесь образцов морских бурых водорослей биологических родов Laminarya sp. и Phyllariella sp., обитающих в акватории Баренцева моря, селекцию природного сообщества микроорганизмов проводят в присутствии дизельного топлива, биопрепарат на цеолите не иммобилизуют и лиофильно сушат, а в качестве очищаемого объекта используют поверхность трех участков засоленной почвы площадью по 1 м, каждый из которых равномерно загрязнен 600 мл дизельного топлива.
3
2
4
2
4
4
5
В 10 л воды суспендируют полученный препарат, затем туда добавляют биогенную добавку, содержащую 0,8 г KNO, 0,12 г KHPO; 0,28 г NaHPO и 0,16 г MgSO. Получают водную суспензию препарата с титром 1×10 KOE/мл. Каждый участок загрязненной почвы перекапывают и рыхлят, затем каждый участок равномерно обрабатывают 10 л вышеназванной водной суспензии препарата. Опыт проводят при 12°С. За 7 суток эффективность очистки почвы от дизельного топлива составляет в среднем 86%.
Пример 5.
8
Опыт проводят аналогично примеру 1, однако используют микробный препарат, иммобилизованный на твердом носителе - цеолите, с титром 10 KOE/г носителя, и очистку воды осуществляют от мазута. За 9 суток эффективность очистки морской воды от мазута составляет в среднем 92%.
Пример 6 (контрольный, с меньшим, чем заявлено титром препарата).
4
Опыт проводят аналогично примеру 2, однако используют водную суспензию микробного препарата с титром 10 KOE/мл. За 5 суток эффективность очистки бочки от нефти составила 40%.
Пример 7 (контрольный, с меньшим, чем заявлено титром препарата).
4
Опыт проводят аналогично примеру 1, однако используют водную суспензию препарата с титром 10 KOE/г носителя. За 7 суток эффективность очистки морской воды от нефти составила 50%.
Таким образом, из примеров видно, что предложенный новый микробный препарат действительно позволяет повысить эффективность очистки объектов от нефти и нефтепродуктов с 51 до 92-96% и существенно повышает скорость процесса очистки даже при повышенной концентрации соли и относительно низкой температуре в условиях Крайнего Севера России, что обусловлено микробиологическим составом препарата. Кроме того, препарат существенно расширяет область своего применения, распространяя ее на любые твердые объекты, загрязненные нефтью или нефтепродуктами.