СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ТИПА САХАРНОГО ДИАБЕТА
METHOD FOR DIFFERENTIAL DIAGNOSTICS OF DIABETES MELLITUS TYPE

Настоящее изобретение относится к области клинической диагностики, а именно к способам диагностики типа диабета.
Сахарный диабет относится к группе метаболических заболеваний, обусловленных дефектом секреции инсулина, нарушением действия инсулина или сочетанием этих факторов, что сопровождается гипергликемией [Торосян К.Э., Непсо Ю.Р., Новикова В.А., Пенжоян Г.А. САХАРНЫЙ ДИАБЕТ 1 ТИПА И БЕРЕМЕННОСТЬ: КЛИНИЧЕСКИЕ ПЕРСПЕКТИВЫ // Современные проблемы науки и образования. - 2016. - №4.; URL: http://www.science-education.ru/ru/article/view?id=24998].
Сахарный диабет I типа - это инсулинозависимый сахарный диабет, часто является аутоиммунным заболеванием, индуцированным хроническими стрессорными факторами внешней среды на фоне определенной генетической предрасположенности [Айламазян Э.К., Кулаков В.И., Радзинский В.Е., Савельева Г.М. Акушерство: национальное руководство. - М.: ГОЭТАР - Медиа, 2014.- 1200 с.].
Сахарный диабет первого типа развивается чаще всего в молодом возрасте (до 25-30 лет). У большинства пациентов выявляется наследственная предрасположенность к этому заболеванию. Название «инсулинозависимый» показывает, что в организме больного сахарным диабетом 1 типа нарушена выработка инсулина, и такой пациент нуждается в регулярных инъекциях этого гормона. Причиной дефицита чаще всего становятся аутоиммунные процессы, токсическое поражение поджелудочной железы [http://comp-doctor.ru/diabet/diabet-tip.php].
Диабет II типа (ранее - инсулиннезависимый или диабет взрослых) развивается в результате неэффективного использования инсулина организмом. Большинство людей с диабетом страдают именно диабетом II типа. Данный тип диабета возникает, главным образом, на фоне избыточной массы тела и недостаточной физической активности. Симптомы могут быть сходными с симптомами диабета I типа, но часто менее выражены. В результате болезнь может быть диагностирована по прошествии нескольких лет после ее начала, уже на фоне развивающихся системных осложнений. До недавнего времени диабет этого типа наблюдался лишь среди взрослых, однако в настоящее дебют заболевания наблюдается в период подросткового и юношеского возраста [https://www.who.int/ru/news-room/fact-sheets/detail/diabetes].
У больных сахарным диабетом II типа нет проблем с количеством инсулина: поджелудочная железа его исправно вырабатывает, зачастую даже в избытке. Но инсулиннезависимый сахарный диабет развивается оттого, что расположенные на клеточных мембранах инсулиновые рецепторы становятся толерантными к гормону. А без посредничества рецепторов инсулин не может осуществить свою главную задачу: обеспечить насыщение клеток основным питательным материалом - углеводами. Эта форма диабета встречается чаще. Поражает преимущественно пожилых людей, как правило, страдающих ожирением. Диабет II типа во многих случаях не требует инъекций инсулина - оттого-то он и инсулиннезависимый, но требует постоянного приема таблетированных сахароснижающих препаратов. Очень часто диабет II типа со временем становится инсулинзависимым: поджелудочная железа, интенсивно вырабатывающая «бесполезный» инсулин, истощает свой потенциал, и продукция инсулина резко падает [http://comp-doctor.ru/diabet/diabet-tip.php].
Гестационный диабет проявляется гипергликемией с показателями глюкозы крови, которые превышают нормальные. Гестационный диабет имеет место во время беременности. Женщины, имеющие такую форму диабета, имеют также повышенный риск осложнений во время беременности и родов. У них также повышен риск заболевания диабетом II типа в будущем. Чаще всего диагноз гестационного диабета устанавливают во время пренатального скрининга, а не на основе предъявляемых жалоб [https://www.who.int/ru/news-room/fact-sheets/detail/diabetes].
У женщины, ожидающей ребенка, под воздействием высоких концентраций гормонов во время беременности снижается чувствительность рецепторов к инсулину, что может привести к проявлениям гестационного сахарного диабета. Как правило, после родов диабетические проявления исчезают бесследно [http://comp-doctor.ru/diabet/diabet-tip.php].
Распространенность сахарного диабета I и II типа среди женщин фертильного возраста в РФ составляет 0,9-2%. Прегестационный сахарный диабет выявляется у 1% беременных, в 1-5% случаев развивается гестационный сахарный диабет или манифестирует истинный сахарный диабет [Айламазян Э.К., Кулаков В.И., Радзинский В.Е., Савельева Г.М. Акушерство: национальное руководство. - М.: ГОЭТАР - Медиа, 2014. - 1200 с].
Согласно «Глобальному отчету по диабету» Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) от 2016 года [Глобальный доклад по диабету. Резюме.
Всемирная организация здравоохранения. - 2016. - 8 с.], в 2014 году в мире сахарным диабетом страдали 422 миллиона взрослого населения, что в 4 раза превышало аналогичные данные от 1980 года - 108 миллионов. Увеличение заболеваемости сахарным диабетом может быть обусловлено растущими показателями избыточного веса или ожирения, низким или средним уровнем дохода в стране. В 2012 году гипергликемическое состояние явилось причиной 2,2 миллиона смертельных случаев, из которых сахарный диабет - причиной 1,5 миллиона смертельных случаев.
Сахарный диабет, независимо от типа, способен привести к инфаркту, инсульту, почечной недостаточности, ампутации ног, потере зрения и поражению нервов, повышает суммарный риск преждевременной смерти. Не компенсированный полностью сахарный диабет во время беременности увеличивает вероятность гибели плода и развития множества осложнений [Global report on diabetes. World Health Organization. - Paris. - 2016. - 88 p.].
Гипергликемия является наиболее важным фактором риска для врожденных пороков развития, перинатальной заболеваемости и перинатальной смертности у женщин с сахарным диабетом I и II типов [Murphy H.R., Elleri D., Allen J.M. et al. Pathophysiology of postprandial hyperglycaemia in women with type 1 diabetes during pregnancy //Diabetologia. 2012 Feb. 55(2):282-93.]. Наиболее удручающими являются перинатальные исходы у женщин с сахарным диабетом I типа [Murphy H.R., Steel S.A., Roland J.M. et al. Obstetric and perinatal outcomes in pregnancies complicated by Type 1 and Type 2 diabetes: influences of glycaemic control, obesity and social disadvantage // Diabet Med. 2011 Sep.28(9): 1060-7.].
Сахарный диабет во время беременности повышает риск последующего развития ожирения или СД II типа у ребенка [Global report on diabetes. World Health Organization. - Paris. - 2016. - 88 р.]. По данным Американской ассоциации клинических эндокринологов и Американского колледжа эндокринологии (American association of clinical endocrinologists and American College of Endocrinology - AACE/ACE) (2015), установлена линейная зависимость между концентрацией глюкозы в крови беременной и весом новорожденного, частотой макросомии плода и родоразрешения путем операции кесарева сечения [Handelsman Y., Bloomgarden Z.T., Grunberger G., Umpierrez G., Zimmerman R.S. AACE Task Force for Developing a Diabetes. AACE/ACE Diabetes Guidelines, Endocr Pract. 2015;21(Suppl 1).]. В отчете ВОЗ (2016) также указывается, что неконтролируемый сахарный диабет во время беременности может оказывать негативное воздействие на мать и плод, существенно увеличивает риск потери плода, врожденных пороков развития, мертворождения, перинатальной смертности, акушерских осложнений и материнской заболеваемости и смертности. Таким образом, своевременная диагностика сахарного диабета у беременных - важнейшая задача современной медицины.
Современные методы диагностики сахарного диабета базируется на биохимических показателях уровня глюкозы в крови и уровня гликированного гемоглобина, а также использовании иммуноферментного анализа для определения антител к бета-клеткам поджелудочной железы, инсулину, глютаматдекарбоксилазе. Таким образом, ближайшими аналогами заявленного изобретения являются применение биохимического анализа вкупе с применением клинического анализа и ИФА [American Diabetes Association. 2. Classification and Diagnosis of Diabetes: Standards of Medical Care in Diabetes-2019. Diabetes Care. 2019;42(Suppl 1):S13-S28. doi:10.2337/dc19-S002].
В настоящее время диагностика сахарного диабета является клинически сложной задачей. В соответствии с рекомендациями ВОЗ, Российской Ассоциации Эндокринологов, а также международной Диабетической Ассоциации, клиническая диагностика сахарного диабета проводится по совокупности нескольких лабораторных и антропометрических показателей. В частности, диагноз сахарного диабета устанавливается по наличию антител к бета-клеткам поджелудочной железа (что включает также установление аутоиммунной природы заболевания), антител к глутамат-декарбоксилазе, антитела к инсулину, показатели С-пептида инсулина, а также показатели уровня глюкозы в крови (натощак и при различных нагрузках) и уровень гликированного гемоглобина. Как видно, установление диагноза является весьма длительным и дорогостоящим, более того большая часть анализов проводится с использования ИФА (иммуноферментного анализа). Несмотря на достаточно высокую специфичность и точность анализа по совокупности всех показателей (до 90% и до 75%, соответственно), современные подходы в диагностике не позволяют провести анализ достаточно быстро и экономически выгодно. Более того, в зависимости от антропометрических и эпигенетических факторов, во многих случаях выявление заболевания происходит уже на поздних сроках заболевания, когда провести корректирующую терапию с высокой эффективностью уже не представляется возможным.
Из уровня техники известен способ получения аналитической тест-системы (MRM-теста) для мультиплексной идентификации и количественного измерения содержания интересующих белков в биологическом образце по содержанию соответствующих им протеотипических маркерных пептидов, предусматривающий следующие стадии:
1) выявление уникальных для белка протеотипических маркерных пептидных последовательностей;
2) отбор по меньшей мере двух маркерных протеотипических пептидных последовательностей белка, наиболее пригодных для исследования методом мониторинга множественных реакций;
3) предсказание фрагментов пептидов;
4) предсказание MRM-теста в виде перечня маркерных пептидов, их фрагментов и наилучших параметров детекции методом мониторинга множественных реакций;
5) синтез одного или нескольких маркерных пептидов;
6) определение профиля переходов одного и нескольких синтетических маркерных пептидов методом мониторинга множественных реакций в условиях ускоренного хроматографического градиента;
7) оптимизация MRM-теста в соответствии с полученными профилями, удаление из набора пептидных фрагментов, характеризующихся наименьшими значениями интенсивности в масс-спектре;
8) очистка пептидов, синтезированных на стадии 5);
9) подготовка биологического образца, предусматривающая удаление мажорных белков;
10) идентификация белка в биологическом образце с заколом синтетических пептидов методом мониторинга множественных реакций в условиях нормального хроматографического градиента на основании профилей, полученных на стадии 6);
11) определение значений времени удержания маркерных пептидов с внесением установленных значений в MRM-тесты;
12) проведение мультиплексных калибровочных измерений в условиях нормального хроматографического градиента в буферном растворе очищенных синтетических пептидов на фоне смеси не имеющих к ним отношения белков и/или пептидов;
13) количественное измерение содержания маркерных пептидов в биологическом образце в условиях нормального хроматографического градиента с вводом синтетических пептидов; и
14) суждение о содержании интересующих белков в биологическом образце по содержанию соответствующих им протеотипических маркерных пептидов, количественно определенных на стадии 13) [патент РФ RU2595835]. Данный способ представляет собой общий подход к идентификации белков протеома и сам по себе неприменим для выявления сахарного диабета 1 типа у беременных.
Протеомика (англ. Proteomics) - область молекулярной биологии, посвященная идентификации и количественному анализу белков (иными словами, высокопроизводительному исследованию белков). Совокупность всех белков клетки называют протеомом [James P. Protein identification in the post-genome era: the rapid rise of proteomics. (англ.) // Quarterly Reviews Of Biophysics. - 1997. - November (vol. 30, no. 4). - P. 279-331. - PMID 9634650]. Из уровня техники известно, что данные, полученные методами протеомики, могут быть использованы для формирования более глубокого понимания причин возникновения различных нозологических фенотипов, например, нейродегенеративных, а также в целях разработки методов лечения. С помощью протеомики осуществляется поиск антигенов, пригодных для создания новых вакцин. Идентификация белков, которые аномально экспрессируются при различных раковых заболеваниях, имеет огромное значение для диагностики с помощью биомаркеров, прогнозирования и лечения рака [Нолтинг Б. Новейшие методы исследования биосистем. - М.: ТЕХНОСФЕРА, 2005. - С. 185. - 256 с. - ISBN 94836-044-Х.].
В рамках клинического исследования протеома беременных женщин, страдающих различными типами сахарного диабета (гестационный сахарный диабет, сахарный диабет I и II типа), были выявлены маркеры, аномальное содержание которых в протеоме коррелирует с развитием сахарного диабета I, II типа, а также гестационного сахарного диабета у беременных. Данные маркеры позволяют проводить дифференциальную диагностику на малом объеме биологического материала (используемый в работе объем плазмы крови составлял 2 мкл) и выявлять первичные причины развития диабета первого типа, что позволяет более точно говорить о его этиологии, и прогнозировать его течение. Средние значения содержания белков в протеоме женщин контрольной группы представлены в таблице 1.
В таблице 2 представлены динамические изменения относительного содержания белков протеома участников исследования с диагностированным диабетом (I, II типа, гестационным сахарным диабетом) по отношению к контрольной группе (беременные женщины).
Полученные данные позволили разработать метод малоинвазивного мониторинга развития патологии. Учитывая корреляцию различных маркеров, предложенный метод дает возможность наблюдать полномасштабную протеомную картину сахарного диабета. Установлена связь между различными маркерными белками и процессами липидного и углеводного обмена, а также гемостаза. В предложенном способе маркерами нарушения гемостаза и липидного обмена могут служить белки АМВР, Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H2, Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H1, Kininogen-1, Apolipoprotein A-I, Apolipoprotein E.
Белок АМВР, или предшественник альфа-1 микроглобулина, является секретеруемым белком, ингибитором гранулоцитарной эластазы и, в меньшей степени, трипсина. Способен связывать гем, иммуноглобулины класса А, обладает дополнительной каталитической активностью, направленной на димеризацию некоторых белков плазмы крови. Принимает участие в клеточных процессах рецептор-опосредованного эндоцитоза, а также системных процессах негативной регуляции клеточного иммунного ответа. Фрагмент белка массой 28 кДа является надежным маркером в клинической диагностике диабетической нефропатии у пациентов на фоне сахарного диабета II типа (СД2). Уровень АМВР положительно коррелирует с активностью протекания осложнений на фоне СД2, а также достаточно хорошо коррелирует с уровнем глюкозы в крови [Shore N, Khurshid R, Saleem M. Alpha-1 microglobulin: a marker for early detection of tubular disorders in diabetic nephropathy. J Ayub Med Coll Abbottabad. 2010 Oct-Dec;22(4):53-5. PMID: 22455261]. Существует также данных о корреляции уровня АМВР с тяжестью течения диабетической ретинопатии у пациентов с СД1 и СД2 [Martin Р, Tindall Н, Harvey JN, Handley ТМ, Chapman С, Davies JA. Glomerular and tubular proteinuria in type 1 (insulin-dependent) diabetic patients with and without retinopathy. Ann Clin Biochem. 1992 May; 29 (Pt 3):265-70. doi:10.1177/000456329202900302. PMID: 1376979.]. При этом у пациентов с сахарным диабетом I типа (СД1) наиболее важной диагностической ценностью является содержание белка АМВР в моче, тогда как у пациентов с сахарным диабетом II типа (СД2) - в крови [Parisa Mortaji, Brent Wagner, Chapter 4 - Biomarkers in diabetic kidney disease, Kidney Biomarkers, Academic Press, 2020, Pages 185-208, ISBN 9780128159231, https://doi.org/10.1016/B978-0-12-815923-1.00004-3].
Тяжелая цепь H2 интер-альфа-трипсинового ингибитора, наряду с другими изоформами тяжелых цепей, является регулятором воспалительной реакции и интермедиантом в регуляции NF-kB сигнального клеточного пути. При этом изоформы Н2 и Н4 являются показателями острой воспалительной реакции, что зачастую используется в клинической практике при мониторинге онкололических, инфекционных и системных заболевания, в частности красной волчанки и СД. Снижение серологической концентрации изоформы Н2 было отмечено в некоторых клинических исследованиях у пациентов с СД2 и гестационным сахарным диабетом (ГСД) при остром нарушении функционирования бета-клеток поджелудочной железы [Hull RL, Shen ZP, Watts MR, Kodama K, Carr DB, Utzschneider KM, Zraika S, Wang F, Kahn SE. Long-term treatment with rosiglitazone and metformin reduces the extent of, but does not prevent, islet amyloid deposition in mice expressing the gene for human islet amyloid polypeptide. Diabetes. 2005 Jul;54(7):2235-44. doi: 10.2337/diabetes.54.7.2235. PMID: 15983227]. При этом у таких пациентов достаточно быстро прогрессирует внутреннее хроническое воспаление внутренних тканей, в особенности, органов ЖКТ и секреции, за счет Н2-индуцированного синтеза фактора некроза опухоли-альфа (ФНО-α) [Cirulli V, Halban PA, Rouiller DG. Tumor necrosis factor-alpha modifies adhesion properties of rat islet В cells. J Clin Invest. 1993 May;91(5): 1868-76. doi: 10.1172/JCI116403. PMID: 8098044; PMCID: РМС288179]. Также существуют данные, что у пациентов с нарушением функционирования поджелудочной железы и гипергликемией изоформы тяжелых цепей H1 и Н2 могут быть неспецифически фосфорилированы, что модулирует их активность и нарушает трансмиссию по NF-kB-опосредованному сигнальному пути [Sharma А, Сох J, Glass J, Lee TJ, Kodeboyina SK, Zhi W, Ulrich L, Lukowski Z, Sharma S. Serum Glycoproteomic Alterations in Patients with Diabetic Retinopathy. Proteomes. 2020 Sep 13;8(3):25. doi: 10.3390/proteomes8030025. PMID: 32933222; PMCID: РМС7565786].
Кининоген является важнейшим регулятором системы свертывания крови и представляет собой ингибитор тиольных протеаз. Одной из функций кинонегена является снижение уровня глюкозы в крови, по этой причине у пациентов с СД в подавляющем большинстве случаев наблюдается повышению концентрации и активности кининогена, как ответная реакция организма на гипергликемическое состояние. Однако, наблюдаемый уровень повышения кининогена, зачастую, не является достаточны для достижения ответной компенсаторной реакции. Лечение пациентов с СД стрептозоцином вызывает большее повышение активности кинонегана и влечет за собой заметное снижение уровня глюкозы в крови, однако одновременно с этим у таких пациентов повышается и уровень брадикинина, обладающего выраженным гипотензивным эффектом [Rothschild AM, Melo VL, Reis ML, Foss MC, Gallo L Jr. Kininogen and prekallikrein increases in the blood of streptozotocin-diabetic rats are normalized by insulin in vivo and in vitro. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 1999 Aug; 360(2):217-20. doi: 10.1007/s002109900068. PMID: 10494893]. Вместе с тем повышение уровня кининогена у пациентов с СД, вызванное гипергликемическим состоянием, приводит к активным процессам ангиогенеза и патологическим процессам на уровне гемодинамики, в частности активации тромбоцитов, что вызывает повышенный риск тромбозов и хроническую гипертензию. Последствиями таких нарушений, как правило, становятся повреждения стенок сосудов, стимуляция окислительных воспалительных реакций и нарушение функционирования почек, приводящее, в конечном итоге, к диабетической нефропатии [Na Nakorn Р, Pannengpetch S, Isarankura-Na-Ayudhya P, Thippakorn С, Lawung R, Sathirapongsasuti N, Kitiyakara C, Sritara P, Vathesatogkit P, Isarankura-Na-Ayudhya C. Roles of kininogen-1, basement membrane specific heparan sulfate proteoglycan core protein, and roundabout homolog 4 as potential urinary protein biomarkers in diabetic nephropathy. EXCLI J. 2020 Jun 24;19:872-891. doi: 10.17179/excli2020-1396. PMID: 32665774; PMCID: РМС7355151]. Отмечено, что наиболее выражены и прогрессирующими такие изменения наблюдаются у пациентов с СД1, где в более, чем в 90% случаях может наблюдаться двукратное повышение концентрации кининогена в крови [Vitova L, Tuma Z, Moravec J, Kvapil M, Matejovic M, Mares J. Early urinary biomarkers of diabetic nephropathy in type 1 diabetes mellitus show involvement of kallikrein-kinin system. BMC Nephrol. 2017 Mar 30;18(1):112. doi: 10.1186/s12882-017-0519-4. PMID: 28359252; PMCID: РМС5372325].
Аполипопротеоины A1 и E - это многофункциональные белки, выполняющие ключевую роль в транспорте и обмене липидов, холестерола, а также опосредованную функцию в регуляции окисления жирных кислоты и их синтеза. В виду того, что СД является комплексным нарушением метаболизма жиров и углеводов, роль АРОЕ и АРОА1 в клинической диагностике чрезвычайно важны. Однако использовать эти серологические маркеры необходимо только в комплексе с другими диагностическими значимыми и более специфичными маркерами, так как информация по уровню аполипопротеионов при гипергликемии довольно противоречива. К примеру, по данным клинического исследования пациентов с СД2, уровень глюкозы в крови, а также активность диабетического состояния положительно коррелирует с концентрацией АРОА1 и его отношением к АРОВ [Gao L, Zhang Y, Wang X, Dong H. Association of apolipoproteins A1 and В with type 2 diabetes and fasting blood glucose: a cross-sectional study. BMC Endocr Disord. 2021 Apr 1; 21(1):59. doi: 10.1186/s12902-021-00726-5. PMID: 33794863; PMCID: PMC8017773]. Однако другое популяционное исследование показало, что низкий уровень АРОА1 и АРОЕ является хорошим и надежным предиктивным маркеров риска развитии СД2 и пациентов с нарушением инсулиновой резистентности [Wu X, Yu Z, Su W, Isquith DA, Neradilek MB, Lu N, Gu F, Li H, Zhao XQ. Low levels of ApoA1 improve risk prediction of type 2 diabetes mellitus. J Clin Lipidol. 2017 Mar-Apr;l 1(2): 362-368. doi: 10.1016/j jacl.2017.01.009. Epub 2017 Jan 25. PMID: 28502492.]. Перспективное клиническое исследование показало, что частота развития СД2 в течение 7 лет наблюдения на 62% выше у тех пациентов, у которых наблюдается повышенный базовый уровень АРОА1 [Brahimaj A, Ligthart S, Ikram MA, Hofman A, Franco OH, Sijbrands EJ, Kavousi M, Dehghan A. Serum Levels of Apolipoproteins and Incident Type 2 Diabetes: A Prospective Cohort Study. Diabetes Care. 2017 Mar;40(3):346-351. doi: 10.2337/dc16-1295. Epub 2016 Dec 28. PMID: 28031419]. Роль АРОЕ в развитии диабетического состояния также обладает некоторой неопределенностью, однако в большинстве клинических исследований указывается на повышенный уровень АРОЕ в развитии СД1 и СД2, но некоторое снижение при ГСД. В частности, во многих исследованиях указывается на значимость определенных полиморфизмов в развитии гипергликемии, что некоторыми авторами воспринимается ключевой причиной нарушения транспорта холестерола и обмена углеводов, приводящее к развитию диабетического состояния [El-Lebedy, D., Raslan, Н.М. & Mohammed, A.M. Apolipoprotein E gene polymorphism and risk of type 2 diabetes and cardiovascular disease. Cardiovasc Diabetol 15, 12 (2016). https://doi.org/10.1186/s12933-016-0329-l]. В частности, в одном из последних обзоров указывается прямая корреляция между тяжестью диабетического состояния, диабетической нефропатией и уровнем АРОЕ в плазме крови человека [Jiang Y, Ma L, Han С, Liu Q, Cong X, Xu Y, Zhao T, Li P, Cao Y. Effects of Apolipoprotein E Isoforms in Diabetic Nephropathy of Chinese Type 2 Diabetic Patients. J Diabetes Res. 2017;2017:3560920. doi: 10.1155/2017/3560920. Epub 2017 Feb 23. PMID: 28326331; PMCID: РМС5343254]. В некоторых случаях указывается на прямую корреляцию между уровнем АРОЕ у пациентов с СД1 и СД2 и снижением когнитивных способностей с частотой до 20% [Shinohara M, Tashiro Y, Suzuki К, Fukumori A, Bu G, Sato N. Interaction between APOE genotype and diabetes in cognitive decline. Alzheimers Dement (Amst). 2020 Feb 6;12(1):e12006. doi: 10.1002/dad2.12006. PMID: 32211501; PMCID: РМС7085280]. Однако, положение пациентов с ГСД в данном случае, как правило, рассматривается отдельно, так как в условиях гестационного сахарного диабета в клинической практике наблюдается обратная корреляция между АРОЕ, гестационным сроком и уровнем глюкозы в крови, что может интерпретироваться, как попытка активации компенсаторных механизмов, задействующих транспорт триглицеридов и окисление полиненасыщенных жирных кислот у таких пациентов [Ramanjaneya М, Butler АЕ, Bashir М, Bettahi I, Moin ASM, Ahmed L, Elrayess MA, Hunt SC, Atkin SL, Abou-Samra AB. apoA2 correlates to gestational age with decreased apolipoproteins A2, C1, C3 and E in gestational diabetes. BMJ Open Diabetes Res Care. 2021 Mar; 9(1):e001925. doi: 10.1136/bmjdrc-2020-001925. PMID: 33674281; PMCID: РМС7938976].
Полученные данные о взаимосвязанных клеточных процессах с учетом полуколичественных величин позволяют определить пределы нормы содержания тех или отдельных маркеров или их сочетаний в различных группах исследования и провести дифференциальные уровни их содержания в группах с сахарным диабетом I, II типа, а также в группах с гестационным сахарным диабетом.
Таким образом, техническим результатом заявленного изобретения является повышение точности анализа в диагностике сахарного диабета у беременных женщин, а также расширение арсенала существующих способов анализа в диагностике диабета.
Технический результат обеспечивает способ дифференциальной диагностики типа сахарного диабета у беременных, включающий:
- забор образца крови пациента;
- пробоподготовку образца крови пациента с получением аналита;
- определение содержания в качестве маркеров сахарного диабета в аналите белков Protein АМВР и/или Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H2, Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H1, Kininogen-1, Apolipoprotein A-I, Apolipoprotein E и при значении относительного содержания Protein АМВР не менее 1,15% от общего содержания белков в аналите при отсутствии у пациента диагноза «ожирение» и/или при значении относительного содержания Kininogen-1 в диапазоне 0,44 - 0,58% от общего содержания белков в аналите выявляют сахарный диабет первого типа, при значении относительного содержания Kininogen-1 в диапазоне 0,41 - 0,44% от общего содержания белков в аналите выявляют сахарный диабет второго типа, при значении относительного содержания Protein АМВР в диапазоне 0,77 - 0,90% от общего содержания белков в аналите и/или при значении относительного содержания Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H2 в диапазоне 0,29 - 0,31% от общего содержания белков в аналите и/или при значении относительного содержания Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H1 в диапазоне 0,26 - 0,28% от общего содержания белков в аналите и/или при значении относительного содержания Apolipoprotein A-I в диапазоне 1,88 - 2,28% от общего содержания белков в аналите и/или при значении относительного содержания Apolipoprotein Е не менее 0,61% и не более 0,79% от общего содержания белков в аналите выявляют гестационный сахарный диабет.
Определение содержания маркеров сахарного диабета в аналите может осуществляться методами иммуноферментного анализа, хромато-масс-спектрометрии или любыми другими методами, позволяющими определять содержание указанных маркеров.
Например, определение содержания маркеров сахарного диабета первого типа в аналите методом хромато-масс-спектрометрии может осуществляться следующим образом.
Для проведения анализа отбирают 1-2 мкл пробы плазмы крови человека. К 2 мкл (около 100 мкг белка) пробы плазмы добавляют 10 мкл денатурирующего раствора, состоящего из 5 М мочевины, 15% ацетонитрила, 0,5% дезоксихолиевой кислоты натриевой соли, 300 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 6.0) и 5 мМ ТСЕР (трис-(2-карбоксиэтил)фосфин). Раствор инкубируют при температуре 45°С в течение 20 минут для восстановления сульфогидрильных групп аминокислотных остатков цистеина. Затем добавляют 1,5 мкл раствора 2%-го раствора 4-винилпиридина в 30% пропан-2-оле до конечной концентрации около 0,2%. Реакцию алкилирования 4-винилпиридином проводят при комнатной температуре (22±2°С) в течение 30 минут. Объем пробы доводят до 100 мкл (расчетная концентрация белка в пробе составляет 1 мкг/мкл) 100 мМ раствором триэтиламмония бикарбоната для достижения реакции среды до рН=7,5-8,5.
Далее проводят ферментативное расщепление белков трипсином, предварительно разведенном в 30 мМ уксусной кислоте до конечной концентрации 200 нг/мкл, в два этапа, на первом из которых добавляют трипсин в соотношении 1:50 (по массе белка), а на втором этапе - аликвоту трипсина, эквивалентную соотношению 1:100 (по массе белка). В обоих случаях реакцию ферментативного гидролиза проводят при температуре 38°С в течение 3-х часов на каждом этапе. Реакцию останавливают путем добавления 2 мкл 10% раствора муравьиной кислоты.
Полученные растворы высушивают под вакуумом при температуре 30°С в режиме V-HV (вакуум, летучие соединения) в течение 40-60 минут. Сухой остаток проб восстанавливают в 100 мкл раствора 0,5%) муравьиной кислоты (до конечной концентрации пептидов 1 мкг/мкл). С полученной после восстановления пробой проводят хромато-масс-спектрометрический анализ.
2
Хроматографическое разделение проводят на системе Ultimate 3000 RSLC Nano (Thermo Scientific) с установленным объемом петли инжектора 5 мкл и коэффициент вымывания пробы из петли - 3 (три полных объема петли перед переключением клапана в режим загрузки). Образцы постоянно термостатируют в пределах температуры +5±0,5°С. На колонку наносят 5 мкл пробы. Скорость отбора пробы 12 мкл/мин, скорость инжекции пробы 15 мкл/мин. Скорость потока аналитического насоса 0,3 мкл/мин, ограничение по давлению не более 800 бар (номинальное ограничение не более 1000 бар) с динамическим ускорением потока при градиенте 0,996 мкл/мин. Коэффициент вязкости на канале «А» - 101%, на канале «В» - 64,7%. Аналитическое время - 55 минут, время уравновешивания 13 минут, общее время анализа 68 минут. Разделение пептидов проводят в градиенте подвижной фазы «А» (водный раствор 0,01% муравьиной кислоты, 0,03% уксусной кислоты, рН=2,5-2,7 в зависимости от температуры раствора в пределах 18-20°С), и подвижная фаза «В» (90% ацетонитрила, 10% метанола, 0,01%) муравьиной кислоты, 0.03% уксусной кислоты) на стационарной фазе Acclaim Pepmap (геометрия 75 мкм × 150 мм, 1,8 мкм, 60А). Начальные условия градиента элюции 98% «А»:2% «В», скорость потока 0,3 мкл/мин, давление на колонку 310-320 бар, скорость загрузки на обогащающую колонку - 15 мкл/мин. В ходе хроматографического разделения применяют динамическое изменение скорости потока до 0,45 мл/мин при высоком относительном содержании подвижной фазы «В» в целях увеличения эффективности промывки колонки от связанных гидрофобных компонентов.
Масс-спектрометрический анализ проводят на гибридном масс-спектрометре высокого разрешения Orbitrap Fusion (Thermo Scientific) с источником ионизации NSI в режиме положительной электростатической ионизации и динамическим потенциалом на входной S-линзе. Прекурсорные ионы регистрируют с использованием орбитального масс-анализатора с разрешением 60К в диапазоне m/z 425-1250 с максимальной скоростью накопления ионов - 15 миллисекунд, или минимальным числом интеграции - 4е5 ионов. Селекция по зарядному состоянию z=2+…6+, активное динамическое исключение после шести сканов (n=6) в течение 4 секунд длительностью 180 секунд с ассиметричной изоляцией +10 / -25 ppm. Пик-зависимая активация сканирования на уровне 40% высоты хроматографического пика при средней величине FWHM=24 секунды и уровнем сигнала к шуму не менее 150. Тандемное сканирование проводят после изоляции через квадруполь с окном изоляции ±0,75 Th со сдвигом 0,5 Th. Тип активации - HCD, относительная энергия активации - 27% с переменным смещением +/-20%. Тип детектора фрагментных ионов - орбитальный с разрешением 15К с максимальным временем накопления 47 миллисекунд, или числом интеграции ионов - 5е4.
Исходные файлы данных (raw-формат, получаемые при записи данных с масс-спектрометров производства Thermo Fisher) были конвертированы mgf-формат с помощью программы MSConvert (ProteomeWizard). Идентификацию проводят против базы данных аминокислотных последовательностей белков (база с аминокислотными последовательностями в формате FASTA с ограничением таксономической группы «Human», доступна на открытом репозитории Uniprot, версия актуализируется каждые 3-4 месяца) с включением обращенных последовательностей для верификации полученных идентификаций. Для проведения поиска в качестве гидролизующего фермента был выбран трипсин (специфическое расщепление по остаткам лизина и аргинина, если в положении Р1 не стоит пролин) с максимальным допустимым числом пропущенных внутренних участков расщепления не более одного. Разрешенные зарядные состояния были от z=2+ до z=6+ с допустимой точностью измерения прекурсорного иона ±5 ppm и допустимой точностью измерения фрагментного иона ±0,01 Да. Переменной модификацией, используемой для поиска и обнаружения, были дезамидирование Q/E, однократное окисление метионина и 4-гидроксипролин. Фиксированной модификацией было пиридилэтилирование 4-винилпиридином. Результаты верифицируют по уровню отсечения FDR=1% (false discovery rate) на основе суммарной частоты ложных положительных результатов для спектров, соответствующих пептидам (PSM, peptide-spectra match).
Качественный состав протеома определяют по идентификациям белков, которые проводили с помощью программного обеспечения Search Gui версии 3.3 (Compomics, Бельгия) по поисковому алгоритму X!Tandem Vengeance версии 12.15.2. Количественный анализ проводят на основании показателя NSAF (нормированный показатель спектральной интенсивности) в выборке общих для группы проб белков после выравнивания по интенсивности опорных спектров. Выборку интересующих белков нормируют по показателям NSAF на сумму их парциального вклада в субпротеоме исследования и выравнивали по отношению к контрольным пробам. Динамические изменения индивидуальных белков анализируют с использованием открытой программы Heatmapper (Канада), а парную кластеризацию - с помощью программы Pairwise Distance (Канада). Изменения рассчитываются по отношению к контрольным пробам или их группе и проверяются на корректность кластеризации к той или иной группе исследования через ранговый коэффициент корреляции Кендала. Численно динамические изменения выражаются в единицах FC (folds change) или в логарифмической величине FC, если изменения превышают FC>10.
Определение концентрации маркеров сахарного диабета в аналите может осуществляться методами иммуноферментного анализа. Как вариант, в этих целях могут быть использованы коммерческие ИФА - наборы, известные из уровня техники. Определение концентрации маркера в аналите производится в соответствии с инструкцией к соответствующему набору. Так, для определения концентрации в образце белка АМВР может быть, например, использован коммерческий набор АМВР (Human) ELISA Kit [http://www.abnova.com/products/products_detail.asp?catalog_id=KA1406]. Для определения концентрации в образце белка Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H2 может быть, например, использован коммерческий набор Human Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H2(ITIH2) ELISA kit [https://www.cusabio.com/ELISA-Kit/Human-Inter-alpha-trypsin-inhibitor-heavy-chain-H2ITIH2-ELISA-kit-85242.html]. Для определения концентрации в образце белка и/или Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H1 может быть, например, использован коммерческий набор Human ITIH1 (Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H1) ELISA Kit [https://xpressbio.com/product/human-itih1inter-alpha-trypsin-inhibitor-heavy-chain-h1-elisa-kit/]. Для определения концентрации в образце белка Kininogen-1 может быть, например, использован коммерческий набор Human KNG1 ELISA Kit [https://www.mybiosource.com/human-elisa-kits/kng1/8244647]. Для определения концентрации в образце белка Apolipoprotein A-I может быть, например, использован коммерческий набор Human apoA1 ELISA PRO kit [https://www.mabtech.com/products/human-apoal-elisa-pro-kit_3710-1hp-2?ppc_keyword=apolipoprotein%20ai%20assay&gclid=Cj0KCQjwzYGGBhCTARIsAHdMTQz-ADGpuvLBzxZSHwcbSXQ6SnF0xE0UpkxyhCJ0RbX5t9hrBB8Ibb8aAiXVEALw_wcB]. Для определения концентрации в образце белка Apolipoprotein Е может быть, например, использован коммерческий набор Apolipoprotein Е Human ELISA Kit [https://www.thermofisher.com/elisa/product/Apolipoprotein-E-Human-ELISA-Kit/EHAPOE] или любые другие наборы, позволяющие осуществлять определение концентрации указанных в таблице 1 маркеров сахарного диабета. При этом определение общего содержания белков в аналите может осуществляться методами, известными из уровня техники. Например, в этих целях может быть использован метод спектрофотометрии.
Указанный способ позволяет составлять полные и модульные диагностические панели для проведения мониторингового анализа и подтверждающего анализа в диагностике сахарного диабета.
В случае ранней диагностики и оценки риска развития данной патологии возникает возможность проведения своевременной корректирующей или компенсаторной терапии.
Проведение исследования в формате диагностической панели по предложенным в рамках изобретения маркерам или их сочетаниям возможно в формате иммуноферментного анализа (ИФА) или масс-спектрометрического (МС) анализа. При этом, преимуществами МС анализа является индифферентность к типу белкового маркера, более высокая чувствительность, высокая производительность (возможность проведения анализа за 15-30 минут в расчете на одного пациента), невысокий уровень затрат на анализ, высокая точность измерения сигнала маркеров, возможность составления модульных диагностических панелей без дополнительных финансовых затрат за несколько минут в зависимости от цели проведения анализа (диагностика, наблюдение, подтверждение) без ущерба производительности, а также возможность проведения количественного анализа протеомного профиля пациента, направленного на оценку риска развития сахарного диабета первого типа.
Заявленный способ иллюстрируется нижеследующими примерами.
Пример 1
Пациентка С, 25 лет, первая нормально протекающая беременность. Наследственность не отягощена. Отмечает в последнее время периодическое чувство слабости, испытывает жажду. При обследовании уровень глюкозы натощак составил 7,3 ммоль/л. Направлена к эндокринологу с предварительным диагнозом сахарный диабет 1 типа.
Показатели глюкозотолерантного теста в 4 точках: 7,3; 14,0; 9,7; 7,8 ммоль/л, соответственно.
На сроке 29 недель проведено протеомное исследование плазмы крови на наличие маркеров диабета в соответствии с заявленным способом. Результаты исследования приведены в таблице 3.
На основании полученных данных можно сделать вывод о том, что пациент страдает сахарным диабетом 1 типа.
В качестве дополнительного подтверждающего лабораторного исследования методом ИФА определялось содержание антител к бета-клеткам поджелудочной железы, инсулину, глютаматдекарбоксилазе. Результаты исследования приведены в таблице 4.
На основании полученных данных поставлен диагноз - сахарный диабет 1 типа.
Таким образом, использование заявленного способа позволяет осуществлять анализ в диагностике диабета 1 типа с высокой точностью.
Пример 2
Пациентка А, 23 года, первая нормально протекающая беременность. Наследственность отягощена. Отмечает периодическое чувство слабости, испытывает жажду. При обследовании уровень глюкозы натощак составил 7,1 ммоль/л. Направлена к эндокринологу с предварительным диагнозом сахарный диабет II типа.
Показатели глюкозотолерантного теста в 4 точках: 7,1; 13,5; 9,4; 7,3 ммоль/л, соответственно.
На сроке 29 недель проведено протеомное исследование плазмы крови на наличие маркеров диабета в соответствии с заявленным способом. Результаты исследования приведены в таблице 5.
На основании полученных данных можно сделать вывод о том, что пациент страдает сахарным диабетом II типа.
В качестве дополнительного подтверждающего лабораторного исследования методом твердофазного ИФА определялось содержание С-пептида и инсулина в аналите. Результаты исследования приведены в таблице 6.
На основании полученных данных поставлен диагноз - сахарный диабет II типа.
Таким образом, использование заявленного способа позволяет осуществлять анализ в диагностике диабета II типа с высокой точностью.
Пример 3
Пациентка В, 27 лет, первая нормально протекающая беременность. Наследственность не отягощена. Отмечает периодическое чувство слабости, испытывает жажду. При обследовании уровень глюкозы натощак составил 7,2 ммоль/л. Направлена к эндокринологу с предварительным диагнозом гестационный сахарный диабет.
Показатели глюкозотолерантного теста в 4 точках: 7,2; 13,4; 9,6; 7,3 ммоль/л, соответственно.
На сроке 29 недель проведено протеомное исследование плазмы крови на наличие маркеров диабета в соответствии с заявленным способом. Результаты исследования приведены в таблице 7.
На основании полученных данных можно сделать вывод о том, что пациент страдает гестационным сахарным диабетом.
На основании полученных данных поставлен диагноз - гестационный сахарный диабет.
По итогам проведенного исследования пациентке была назначена диета. По прошествии 1 недели было проведено определение уровня глюкозы в крови (метод биохимии крови). При обследовании уровень глюкозы натощак составил 6,8 ммоль/л. Также проведено определение уровня глюкозы в крови методом случайного обнаружения. При обследовании уровень глюкозы натощак составил 9,1 ммоль/л. На основании полученных данных поставлен диагноз - гестационный сахарный диабет.
Таким образом, использование заявленного способа позволяет осуществлять анализ в диагностике гестационного сахарного диабета с высокой точностью.