СПОСОБ ДЕЗИНВАЗИИ ПРОТИВ ООЦИСТ КОКЦИДИЙ ПТИЦ
METHOD FOR DISINVASION FROM BIRD COCCIDIAN OOCYSTS

Изобретение относится к области ветеринарной протозоологии и может быть использовано в птицеводческих хозяйствах промышленного типа при заболеваниях цыплят-бройлеров кокцидиозами.
В нашей стране по росту производства среди разных отраслей животноводства птицеводство занимает достойное первое место. За последние годы в птицеводстве изменилась технология производства, особенно в бройлерном производстве. Если 20-30 лет назад все бройлерное и яичное производство было сосредоточено на клеточном содержании птиц, то в настоящее время более 60% птиц в нашей стране практикуют напольное содержание (1).
Исследованиями отечественных и зарубежных ученых доказано, что каждое птицеводческое хозяйство, практикующее напольное содержание птиц, неблагополучно по паразитарным болезням и, прежде всего, по кокцидиозам. По данным литературы в кишечнике кур паразитируют девять видов эймерий (Eimeria spp.), но наиболее распространенными и патогенными являются: E. tenella, Е. necatrix, E. maxima, E. acervulina и E. brunetti. В условиях птицеводческих хозяйств у молодняка птиц часто встречается смешенная инвазия, обусловленная несколькими видами эймерий одновременно (2).
Источником инвазии является больная эймериозом и переболевшая птица, наиболее часто болеют цыплята 10-30-дневного возраста и старше. Передача инвазии в неблагополучных хозяйствах происходит через загрязненные спорулированными ооцистами эймерий кормушки, корма, воду, подстилку, инвентарь. Часто механическими разносчиками ооцист эймерий становятся синантропные птицы, грызуны, насекомые - мухи, тараканы, а также обслуживающий персонал - на обуви, одежде, предметах ухода. Различные нарушения технологии выращивания цыплят, такие как скученность птицы в помещениях, повышенная влажность воздуха и подстилки, неполноценное кормление, контакт между цыплятами и птицей старших возрастных групп и антисанитария способствуют широкому распространению эймериоза цыплят (3).
Следует помнить, что ооцисты кокцидий птиц могут сохраняться жизнеспособными во внешней среде в течение многих месяцев. Даже в зонах с прохладным дождливым летом и холодными зимами ооцисты эймерий могут сохранять жизнеспособность больше года.
Для борьбы с кокцидиозами птиц предложено большое количество препаратов как против эндогенных стадий, так и экзогенных. Проблема кокцидиозов птиц продолжает ставить задачи перед исследователями - совершенствовать меры борьбы с инвазией и разработать способы дезинвазии объектов внешней среды против ооцистов кокцидий птиц (4).
Из известных средств дезинвазии, которые применяют против экзогенных стадий кокцидий следует отметить 7%-ный раствор аммиака, 2%-ная эмульсия ортохлорфенола, 10%-ный однохлористого йода, 4%-ный раствор едкого натра, который должен иметь температуру не ниже 80°C (5). Эффективность упомянутых средств дезинвазии не устраивает запросы практики.
Учитывая все отмеченное и особую устойчивость ооцист кокцидий во внешней среде, надежное средство дезинвазии против них реально создать, используя несколько активных компонентов и вспомогательных веществ синергистов. В числе таких препаратов следует отметить тиазон и глутаровый альдегид совместно с молочной кислотой. Первый из отмеченных препаратов - тиазон, является известным нематоцидом и антисептиком. Второй из упомянутых - глутаровый альдегид, известен как высокоэффективное дезинфицирующее средство для наружного применения. Молочная кислота является антисептиком и оказывает действие на оболочку ооцист кокцидий, облегчая доступ действующим веществам (ДВ). При совместном применении против ооцист кокцидий птиц они оказывают синергетическое действие на объект, а используемые вспомогательные компоненты - поверхностно активные вещества обеспечивают очистку пола, стен и технологического оборудования от биозагрязнений и равномерно распределяют ДВ по поверхности.
В задачу исследований входило разработать эффективный способ дезинвазии против ооцистов кокцидий птиц доступными средствами, пригодными для применения как ручным, так и механизированным способом, не повреждая обрабатываемое технологическое оборудование.
Решение поставленной задачи достигается тем, что в качестве средства дезинвазии против ооцистов кокцидий птиц был использован составленный комплексный препарат «Эймериоцид», имеющий следующий состав: действующие вещества - тиазон 5%, глутаровый альдегид 4%, молочная кислота 3%; вспомогательные компоненты - неионовые поверхностно активные вещества 20%, вода до 100%.
Из доступных заявителю источников информации не известна указанная совокупность существующих признаков, позволяющих получать указанный технический результат, поэтому изобретение соответствует условию патентоспособности «новизна».
Заявителю не известны средства аналогичного назначения, в которых были раскрыты отличительные признаки изобретения с получением от использования его в какой-либо совокупности признаков указанного технического результата. Следовательно, изобретение соответствует условию патентоспособности «изобретательский уровень»
Доказательства промышленной применимости изобретения приводятся в следующих примерах.
Пример 1. Приготовление рабочих растворов, разведений культуры ооцист кокцидий птиц и осуществление лизис-теста с разной концентрацией препарата «Эймериоцида»
Исследования проводили в лаборатории ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт фундаментальной и прикладной паразитологии животных и растений им. К.И. Скрябина» (г. Москва). Культуру спорулированных ооцист Eimeria tenella очищали от бихромата калия, использованного в качестве консерванта, путем промывания буфером до тех пор, пока надосадочная жидкость не станет прозрачной, соблюдая следующие параметры: 250 мл, в течение 5 мин, при 20±2°C. Устанавливали процент споруляции ооцист с помощью микроскопа и камеры Мак Мастера. Раствор, содержащий ооцисты, разбавляли буфером до получения концентрации 2000 спорулированных ооцист/мл. Затем раствор помещали в колбу Эрленмейера соответствующего объема с подходящим магнитом и смешивали на магнитной мешалке непрерывно во время использования.
Для работы готовили буфер следующим образом. В начале готовили составляющие: 10%-ный раствор хлорида кальция и 10%-ный раствор сульфата магния, затем 17,5 мл первого и 5 мл второго добавили к 3300 мл дистиллированной воды и автоклавировали в течение 15 мин при 120°C.
Определяли рН приготовленного буфера с помощью прибора Аквилон-410 и его показания составили 7,2±0,23.
На следующем этапе работы проводили лизис-тест, для чего были приготовлены по 1 л рабочего раствора с 4; 5 и 6%-ной концентрацией эймериоцида, в качестве базового препарата взяли 4%-ный раствор фенола, а контролем служил раствор вышеотмеченного буфера.
Рабочий раствор с разными концентрациями комбинированного препарата «Эймериоцид» готовили следующим образом. Брали четыре стеклянные колбы на 1 л и наливали по 600 мл дистиллированной воды и в первые три из них добавляли по 40; 50 и 60 г тиазона, размешивали стеклянной палочкой и через 20 мин добавляли по 40 мл глутарового альдегида и размешивали стеклянной палочкой, оставляли на 20 мин. По истечении времени во все колбы добавляли по 30 мл молочной кислоты и снова размешивали. Через 20 мин во все емкости добавляли по 200 мл поверхностно активного вещества, объем доводили до 1 л путем добавления дистиллированной воды, тщательно размешивали в течение 10 мин и оставляли на 30 мин. По истечении отмеченного времени раствор был готов к применению. В четвертую колбу к 600 мл воды добавляли 40 г фенола, размешивали, объем доводили до 1 л, снова размешивали и раствор был готов к использованию.
Для проведения лизис-теста все приготовленные растворы дезинфектантов и буфер по отдельности помести по 50 мл в 250 мл колбы Эрленмейера и добавили по 50 мл раствора с ооцистами кокцидий в концентрации 2000 ооцист/мл. Затем эти колбы Эрленмейера ставили на вибростолик со скоростью вращения 100 об/мин на 2 ч. После этого содержимое из колбы выливали в пластиковую бутылку с завинчивающейся крышкой объемом 1500 мл. Колбу с остатком раствора несколько раз ополаскивали и сливали в пластиковую бутылку и объем доводили до 1500 мл. Для лучшего смешивания бутылку переворачивали (3 раза) и оставляли при комнатной температуре (20±2°C) в течение 24 ч. По истечении отмеченного времени раствор сливали до отметки 30 мл, осадок переливали в новую емкость объемом 100 мл, пластиковую бутылку ополаскивали несколько раз с использованием буфера, доведя объем до 50 мл.
Пример 2. Биопроба по экспериментальному заражению цыплят для определения эффективности Эймериоцида для инвазии
Испытание проводили в условиях вивария ФГБНУ ВНИИП им. К.И. Скрябина (г. Москва) на 60 цыплятах 14-дневного возраста, свободных от кокцидий, и корма не содержали противококцидийные препараты. Для контроля концентрации спорулированных ооцист кокцидий (2000 ооцист/мл) в работе использовали камеру Мак Мастера и микроскоп МБС, а для разбавления буфер с таким расчетом, чтобы возможно было ввести 1 мл суспензии каждому цыпленку. Для достижения хорошего смешивания материала использовали магнитную мешалку. Цыплят подвергали клиническому обследованию, индивидуальной нумерации, взвешиванию и по принципу аналогов разделили на шесть групп по 10 цыплят в каждой.
Цыплятам первой, второй и третьей групп задавали по 1 мл суспензии ооцист эймерий, обработанной 4; 5 и 6%-ными растворами препарата «Эймериоцид» внутрь орально при помощи микропипетки постепенно. Четвертой группе цыплят задавали по 1 мл суспензии ооцист эймерий, обработанной 4%-ным раствором фенола (базовый препарат). Цыплята пятой группы получали по 1 мл буферного раствора и служили «чистым» контролем. Цыплята шестой группы получили по 1 мл суспензии, содержащую 2000 ооцист/мл, и служили зараженным контролем.
Цыплята всех 6 групп за время опыта находились в аналогичных условиях содержания и имели одинаковый рацион. В течение всего периода опыта за цыплятами вели ежедневные клинические наблюдения за общим состоянием, их поведением, приемом корма и воды, видимыми физиологическими изменениями и другими.
Для установления ооцист в фекалиях от цыплят каждой группы отдельно с 6 по 12-е сутки ежедневно собирали весь помет, взвешивали, добавляли воду до объема 2000 г, смешивали смесителем в течение 5 мин. Для дальнейших исследований пробы отбирали из каждой группы в количестве 25 г, которые консервировали 4%-ным раствором бихромата калия и доводили до однородной массы путем размешивания миксером, затем перекладывали в емкости с завинчивающейся крышкой и хранили в холодильнике при +4°C.
3
Ооцист в фекалиях определяли флотационным методом с использованием насыщенного раствора натрия хлористого плотностью 1,18 г/см, а их количество подсчитывали с использованием камеры Мак Мастера. При определении навеску фекалий 1 г помещали в стеклянный стаканчик, заливали 3-5 мл флотационного раствора и перемешивали палочкой до получения однородной массы и исчезновения комков, по мере размешивания добавляли раствор до объема 30 мл. Взвесь фильтровали через ситечко в другой стаканчик, осадок на ситечке отжимали палочкой. Затем пастеровской или любой другой микропипеткой быстро переносили 0,15 мл взвеси в каждую из шести ячеек камеры, накрывали крышкой и оставляли на 3-5 мин, и за отмеченное время имеющиеся ооцисты поднимаются и прилипают к поверхности сетки камеры. При подсчете ооцист пользовались микроскопом МБС при увеличении ×100 раз. Из каждой пробы подсчитывали количество ооцист в шести ячейках камеры и выводили среднюю за каждый исследуемый день. Поскольку для исследований была отобрана проба 0,15 мл исходной взвеси материала 1:29, то есть 1/200 от 30 мл, чтобы определить количество ооцист эймерий в 1 г помета, выявленное их количество в одной ячейке (в нашем случае среднее количество из шести) умножали на 200.
Исходя из общего количества помета по каждой группе цыплят за исследуемые дни (с 6 по 12-й) и количества ооцист эймерий в 1 г экскрементов, проводили подсчет общего количества выделенных ооцист за отмеченный период.
Эффективность дезинвазии при назначении разных концентраций препарата «Эймериоцид», а также 4%-ной концентрацией базового препарата фенола определяли, исходя из процента снижения выделения ооцист эймерий после воздействия на них отмеченными препаратами по сравнению с цыплятами зараженного контроля, которым назначали по 2000 ооцист/мл.
Кормление и условия содержания опытных цыплят всех групп за время испытания были одинаковые. Так, в виварии, где содержали цыплят, температура воздуха равнялась 22±2°C, влажность воздуха 60±5%.
Цыплята первой, второй и третьей групп, которым задавали суспензию ооцист эймерий, обработанную разными концентрациями эймериоцида, имели среднюю массу (на 14-й день - 12.04.2015) 254,5; 262,3; 256,2 г соответственно. Цыплята четвертой группы, получавшие суспензию ооцист, обработанную базовым препаратом фенолом, имели среднюю массу 262,8 г, а контрольные цыплята пятой группы в среднем весили 248,6 г. Живая масса цыплят шестой группы, которых использовали в качестве зараженного контроля, составила 247,5 г.
Общее состояние опытных цыплят после назначения суспензии ооцист эймерий, обработанной разными концентрациями эймериоцида, рекомендованной дозой фенола, а также чистой культуры спорулированных ооцист, оценивали по данным клинических наблюдений, которые показали наличие определенного угнетенного состояния, они были малоактивны и забивались в кучу. Каких-либо осложнений при назначении суспензии с ооцистами и после нее не отмечено. Со второго дня после начала опыта по данным общеклинических наблюдений цыплята, получавшие суспензию ооцист, обработанную разными препаратами и их концентрациями, чистой культурой спорулированных ооцист, и контрольные не отличались друг от друга.
Через 5 суток после назначения суспензии ооцист проводили второе взвешивание опытных и контрольных цыплят. Результаты взвешиваний показали, что цыплята 1; 2 и 3-й групп, которым назначили суспензию ооцист, обработанную различными концентрациями эймериоцида, имели средний прирост к исходной массе тела 285,6; 302,3 и 308,5 г соответственно. Цыплята 4-й группы, получавшие суспензию ооцист, обработанную фенолом, имели средний прирост к исходной массе тела 276,3 г, а у цыплят 5-й контрольной группы данный показатель составил 280,2 г. Тогда как у цыплят 6-й группы прирост к исходной массе тела составил 261,5 г.
При определении ооцист в фекалиях опытных цыплят, собранных с 6 по 12-е сутки после назначения обработанной дезинфектантами суспензии, их находили в определенном количестве, но не во всех группах. Так, при исследовании опытных цыплят 1-й группы, которым назначали суспензию ооцист, обработанную 4%-ной концентрацией эймериоцида, ооцист эймерий в фекалиях находили только через 5 суток в количестве 7 экз. или 1,2 на камеру и средний показатель в 1-й камере за период исследований составил 0,15. Количество ооцист в 1 г помета составило 31, что в проценте от контроля - 0,686. Отсюда интенсэффективность эймериоцида в 4%-ной концентрации или процент снижения количества ооцист после воздействия на них препаратом равняется 99,31% (табл. 1).
При исследовании проб помета от цыплят 2 и 3-й групп, которым давали суспензию ооцист, обработанную 5 и 6%-ной концентрацией эймериоцида, ни в одном случае ооцист не находили, что дает нам основание говорить о 100%-ной эффективности эймериоцида в отмеченных концентрациях против ооцист кокцидий птиц.
После назначения суспензии ооцист, обработанной 4%-ной концентрацией фенола (базовый препарат), у цыплят 4-й группы ооцист в помете находили во все сроки исследований (с 1 по 7-й день) в количестве от 0,12 до 21,3 в камере, а средний показатель в 1-й камере за период исследований составил 5,73. Количество ооцист в 1 г помета по этой группе равнялось 1146, что составляет 25,35% от контроля. Отсюда интенсэффективность фенола в 4%-ной концентрации против ооцист кокцидий составила 74,65%.
Цыплята 5-й группы, которые получали буфер без ооцист, служили незараженным контролем и во все сроки исследований оставались свободными от инвазии.
Цыплята 6-й группы, получавшие по 2000 спорулированных ооцист/мл во все сроки исследований с пометом, выделяли ооцисты в количестве от 0,2 до 39,5 в камере, и средний показатель в 1-й камере за период исследований составил 22,6. Количество ооцист в 1 г помета по этой группе составило 4520, и данный показатель использовался как исходный при расчете процента снижения количества ооцист или интенсэффективность испытанных в опыте препаратов.
Для установления интенсэффективности использованных в своей работе дезинфектантов или процента снижения количества ооцист использовали следующую формулу:
,
где ИЭ - интенсэффективность препарата, %,
к
КО - количество ооцист у цыплят контрольной группы,
д
КО - количество ооцист у цыплят, получавших обработанные дезинфектантом ооцисты.
Используя полученные нами в опыте данные, определяли интенсэффективность эймериоцида в 4%-ной концентрации
В концентрациях 5 и 6% эймериоцид против ооцист кокцидий показал 100%-ную эффективность.
Взятый в качестве базового препарата фенол 4%-ный показал против ооцист эймерий
Пример 3. Производственное испытание эффективности эймериоцида против ооцистов кокцидий птиц
Эффективность эймериоцида 5%-ного против ооцист кокцидий птиц в производственном испытании устанавливали опытным путем с искусственной закладкой ооцист на контрольные площадки по сравнению с базовым препаратом фенолом 4%-ным при экспозиции 2 ч. Учитывая особенности строения ооцист кокцидий, которые покрыты плотной защитной оболочкой, и в отличие от микроорганизмов и яиц гельминтов практически невозможно по внешнему виду и путем окраски определить насколько губительно действовал препарат для дезинвазии.
На этот главный вопрос может ответить только биопроба на цыплятах, которую проводили в условиях птицефабрики «Петелинская» Московской области в птичнике №45. Общее поголовье цыплят-бройлеров кросс КОББ при посадке - 35,4 тыс. На 10-й день после посадки цыплят проводили выборочный отбор 20 проб помета и их исследовали флотационным методом. По результатам исследований все пробы помета были свободны от ооцист эймерий.
На 14-й день после посадки для биопробы по оценке действия эймериоцида и базового препарата фенола на ооцисты кокцидий в условиях птичника №45 были отобраны 30 цыплят, которых подвергали индивидуальному взвешиванию, нумерации, разделили на три группы по 10 в каждой и содержали в клетках изолированно по группам.
По условиям опыта ограничений в кормлении цыплят не было, их кормили сухим гранулированным комбикормом для бройлеров 1-35-дневного возраста по зоотехническим нормам, который условно назывался: стартовый, ростовый и финишный. Потребление воды было без ограничений. За время производственного испытания кормление и условия содержания цыплят всех групп были одинаковые. Температура воздуха в птичнике №45, где находились группы, была 25,2°C, влажность воздуха 60±5%.
Цыплята первой группы, которым задавали суспензию ооцист эймерий, обработанную на опытной площадке 5%-ным раствором эймериоцида, имели на 14-й день среднюю массу тела 356,3 г. Живая масса цыплят второй группы, получавшей суспензию ооцист, обработанную базовым препаратом фенолом, равнялась 342,4 г. Живая масса цыплят группы зараженного контроля на день начала опыта в среднем составила 338,5 г.
Общее состояние опытных цыплят после назначения суспензии ооцист эймерий, обработанной 5%-ным раствором эймериоцида и фенола, а также чистой культурой спорулированных ооцист, оценивали по данным ежедневных клинических наблюдений. На основании этих наблюдений в течение 36 ч после назначения у цыплят было угнетенное состояние, они оставались малоактивными, забивались в кучу, что скорее всего было вызвано стрессом, обусловленным отловом, взвешиванием и заражением путем дачи ооцист эймерий. Осложнений при назначении суспензии с ооцистами и после него не было отмечено. С конца второго дня после назначения суспензии ооцист, обработанной эймериоцидом, фенолом и чистой культурой спорулированных ооцист, цыплята разных групп не отличались друг от друга.
Через 12 суток после назначения суспензии ооцист проводили второе индивидуальное взвешивание опытных и контрольных цыплят. Данные взвешиваний показали, что цыплята 1-й группы, получавшие суспензию ооцист, обработанную эймериоцидом, имели средний прирост к исходной массе тела 705,6 г, что составляет 197,8% (р<0,05). Цыплята второй группы, получавшие суспензию ооцист, обработанную фенолом, имели средний прирост к исходной массе тела 603 г или 176,2%. Тогда как цыплята 3-й контрольной группы, получавшие чистую культуру спорулированных ооцист, имели средний прирост к исходной массе тела 584,3 г, что составляет 172,6%. Результаты взвешиваний дают основание предположить, что у цыплят 1-й группы, получавших суспензию ооцист, обработанную эймериоцидом, было наименьшее отрицательное влияние эймериоза на прирост массы тела по сравнению с контрольной группой. Так, прирост массы тела у цыплят первой группы за 12 суток был на 103,5 г больше по сравнению с зараженным контролем (р<0,05). Безусловно, у цыплят зараженного контроля эймериозная инвазия протекала интенсивно и оказала свое влияние на основной продуктивный показатель молодняка - прирост массы тела. Хотя основным и прямым показателем наличия инвазионного процесса у цыплят были данные исследований по определению количества выделяющихся с пометом ооцист, они подтвердили наши предположения.
При исследовании собранных с 6 по 12-е сутки после дачи ооцист проб помета из разных групп цыплят были выделены ооцисты, но их количество заметно отличалось. У цыплят 1-й группы, которым назначали суспензию ооцист, обработанную 5%-ным раствором эймериоцида, ооцист эймерий в помете находили во все сроки исследований в количестве от 1 до 5 экз., а среднее количество в одной камере за все исследования составило 3,7 экз. Количество ооцист в 1 г исследуемого помета составило 740 экз., что в проценте от зараженного контроля - 2,75 (табл. 2-3). Далее определяли интенсэффективность эймериоцида в 5%-ной концентрации или процент снижения ооцист после воздействия на них препаратом, и она составила 97,25%.
У цыплят 2-й группы, которым давали суспензию ооцист, обработанную 4%-ным раствором фенола (базовый препарат), ооцист в камере находили во все сроки исследований (с 1-го по 7-й день) в количестве от 35 до 88 и средний показатель в одной камере за период исследований составил 55,1. Количество ооцист в 1 г исследуемого помета от цыплят второй группы составило 11028 экз. или в проценте от зараженного контроля 40,96. Далее определяли интенсэффективность фенола в 4%-ной концентрации или процент снижения количества ооцист после воздействия на них препаратом, и она составила 59,03%.
Цыплята 3-й группы, которым задавали по 2000 спорулированных ооцист/мл во все сроки исследования с пометом выделяли ооцисты эймерий в количестве от 86 до 342, а средний показатель в 1-й камере за период исследований составил 134,6 экз. Количество ооцист в 1 г помета по данной группе зараженного контроля составило 26920 и этот показатель использовался как исходный при расчете снижения количества ооцист или интенсэффективности использованных в производственном испытании препаратов «Эймериоцид» и фенола.
2
Полученные результаты показали, что эймериоцид 5%-ный в испытанной дозе 0,5 л на 1 м, при экспозиции 2 ч в условиях производства оказался высокоэффективным средством для дезинвазии против ооцист кокцидий птиц, интенсэффективность составила 97,25±1,61%. Тогда как эффективность базового препарата фенола 4%-ного равнялась 59,03±5,73%.
2
Таким образом, комплексный препарат «Эймериоцид» 5%-ный для дезинвазии объектов внешней среды в птицеводстве в дозе 0,5 л на 1 м при экспозиции 2 ч показал против ооцистов кокцидий 97,25-100%-ную интенсэффективность. Предложенный способ, включающий в себя использование комплексного препарата «Эймериоцид» против ооцистов кокцидий обеспечивает высокую интенсэффективность при кокцидиозах птиц.
Источники информации
1. Акбаев М.Ш. и др. Паразитология и инвазионные болезни животных. - М., 1998. - 743 с.
2. Вершинин И.И. Кокцидиозы животных и их дифференциальная диагностика. - Екатеринбург, 1996. - 264 с.
3. Методические рекомендации по борьбе с эймериозами изоспорозами животных. - М., 1994, РАСХН. - 30 с.
4. Сафиуллин Р.Т., Забашта А.П. Эффективность и экономичность монлара, кокцисана и элонкограна при эймериозе цыплят // Труды ВИГИС. - М., 2002. - Т.38. - С. 30-35.
5. Черепанов А.А. Методические рекомендации по испытанию средств дезинвазии в ветеринарии. - М., 1999. - 16 с.