СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЫ РИБОНУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ
METHOD FOR DETERMINING PRIMARY STRUCTURE OF RIBONUCLEIC ACIDS

Изобретение относится к области биохимии и молекулярной биологии, а именно к способу определения первичной структуры рибонуклеиновых кислот (РНК) методом обратной транскрипции (ОТ).
Определение первичной структуры (секвенирование) РНК является чрезвычайно важным инструментом молекулярной биологии, генетики, биотехнологии и фундаментальной медицины.
Наиболее распространенным способом секвенирования РНК является подход, основанный на первоначальном синтезе ДНК-копий (кДНК) исследуемой последовательности РНК, амплификации кДНК и анализе структуры продуктов амплификации (Щелкунов С.Н. Генетическая инженерия. Новосибирск, 2004).
Известен способ прямого секвенирования РНК, включающий проведение стадии обратной транскрипции в присутствии терминаторов и последующий анализ специфичных продуктов терминации (кДНК) (Maden В., Mapping 2'-O-methyl groups in ribosomal RNA. Methods, 2001, Vol.25, p.374-382). Такой подход позволяет исключить стадию амплификации кДНК, что сокращает время проведения эксперимента и трудозатраты, и, что наиболее важно, позволяет получать более полную информацию о первичной и вторичной структуре РНК.
A
M
V
2
Наиболее близким к заявляемому способу - прототипом, является способ определения первичной структуры РНК с использованием фермента обратной транскриптазы вируса миелобластоза птиц AMV (vian yeloblastosis irus Reverse Transcriptase). Данный способ включает стадии обратной транскрипции анализируемой РНК в присутствии терминаторов и анализ продуктов гель-электрофорезом. Предварительно проводят отжиг ДНК-праймера на РНК-матрице. Затем проводят элонгацию праймера в присутствии дезоксинуклеозидтрифосфатов (dNTP) и одного из терминаторов - дидезоксирибонуклеозидтрифосфатов (ddNTP). Буфер для обратной транскрипции содержит 50 мМ КС1, 50 мМ Трис-НСl (рН 8.3 при 25°С), 10 мМ MgCl, 10 мМ дитиотреита (ДТТ) и 0.5 е.а./мкл обратной транскриптазы AMV. Для определения последовательности РНК проводят четыре параллельных реакции (по одной для каждого типа нуклеотидных мономеров). кДНК-продукты всех четырех реакций анализируют параллельно на акриламидном геле (Qu L.H.et al., Improved methods for structure probing in large RNAs: a rapid 'heterologous' sequencing approach is coupled to the direct mapping of nuclease accessible sites. Application to the 5' terminal domain of eukaryotic 28S rRNA. Nucleic Acids Res, 1983, Vol.11, p.5903-5920. Maden В., Mapping 2'-O-methyl groups in ribosomal RNA. Methods, 2001, Vol.25, p.374-382). Способ обладает высокой специфичностью, то есть позволяет с высокой точностью определять последовательность нуклеотидов РНК.
Недостатком прототипа является трудоемкость способа и необходимость использования для секвенирования РНК дорогостоящего и малодоступного фермента обратной транскриптазы AMV и невозможность применения других, более распространенных ферментов, применение которых является экономически более выгодным. К тому же применение обратной транскриптазы AMV имеет ограничения за счет наличия активности РНКазы Н и ингибирования фермента примесями мажорных форм РНК в препаратах неочищенных РНК-матриц (например, суммарной РНК клеток) (Gerard G.F. et al., Reverse transcriptase (EC 2.7.7.49): the use of cloned moloney murine leukemia virus reverse transcriptase to synthesize DNA from RNA. Methods Mol Biol, 1993, Vol.16, p.73-93).
Технической задачей изобретения является упрощение и удешевление способа определения первичной структуры РНК при сохранении его высокой специфичности.
Поставленная техническая задача достигается предлагаемым способом, заключающимся в следующем.
2
Реакционную смесь, состоящую из анализируемого образца РНК и праймера, инкубируют 2 мин при 70°С и охлаждают до 4°С. Далее добавляют один из ddNTP до соответствующей конечной концентрации: ddATP до 4.0-6.0 мкМ, ddCTP до 2.0-3.0 мкМ, ddGTP до 4.0-6.0 мкМ, ddTTP (или ddUTP) до 4.0-6.0 мкМ. Конечная концентрация dNTP, соответствующего присутствующему ddNTP, составляет 20-30 мкМ, остальных дезоксирибонуклеозидтрифосфатов - 80-130 мкМ. К полученной смеси добавляют буфер для обратной транскрипции так, что конечная реакционная смесь содержит: 50 мМ КСl, 50 мМ Трис-НСl (рН 8.3 при 25°С), 10 мМ дитиотреита (ДТТ), 4 мМ MgCl, 1.6-2.4 мМ соли Мn (II) и обратную транскриптазу MMLV до концентрации 3.0-6.7 е.а./мкл. Смесь инкубируют 30-120 мин при 37-45°С. Продукты реакции секвенирования анализируют акриламидным гель-электрофорезом.
Определяющими отличительными признаками заявляемого способа, по сравнению с прототипом, являются:
M
M
L
V
1. Для определения последовательности РНК используют обратную транскриптазу вируса лейкемии мышей Молони (MMLV) (oloney urine eukemia irus Reverse Transcriptase) в концентрации 3.0-6.7 е.а./мкл, что позволяет упростить способ определения первичной структуры РНК и снизить стоимость анализа при сохранении высокой точности определения последовательности РНК.
Обратная транскриптаза MMLV (ЕС 2.7.7.49) является хорошо изученным ферментом и широко применяется в молекулярной биологии, генетике, биотехнологии, генетической инженерии. В настоящее время ее применяют для синтеза первой цепи кДНК в методиках, основанных на ОТ-ПЦР, ОТ-ПЦР в реальном времени, в частности при селективном анализе 3'-роlу(А)-форм РНК; большое распространение получили подходы, основанные на первоначальном получении меченых ДНК-копий исследуемых РНК. (Gerard G.F. et al., Reverse transcriptase: the use of cloned Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase to synthesize DNA from RNA. Mol Biotechnol, 1997, Vol.8, p.61-77.) Синтез ДНК по матрице РНК, катализируемый обратной транскриптазой MMLV, происходит с высокой точностью (1 ошибка на 30000 включенных нуклеотидов) (Gerard G.F. et al., Reverse transcriptase (EC 2.7.7.49): the use of cloned moloney murine leukemia virus reverse transcriptase to synthesize DNA from RNA. Methods Mol Biol, 1993, Vol.16, p.73-93). Благодаря высокой точности копирования РНК, обратную транскриптазу MMLV можно применять для определения последовательности РНК.
Однако до настоящего времени обратную транскриптазу MMLV не применяли для прямого секвенирования РНК, так как в стандартных условиях терминаторы ddNTP не проявляют субстратных свойств по отношению к этому ферменту, то есть не включаются этим ферментом в растущую цепь ДНК-транскрипта. Используемая в заявленном способе рекомбинантная форма фермента является белковым продуктом укороченного гена ро1 вируса MMLV, содержащим ДНК-полимеразный домен, но лишенным домена РНКазы Н («Биосан», Новосибирск).
2
2. Для обратной транскрипции используют в качестве специфических терминаторов соответствующие дидезоксирибонуклеозидтрифосфаты (ddNTP), а в качестве буферной смеси используют смесь, содержащую 50 мМ КСl, 50 мМ Трис-НСl (рН 8.3 при 25°С), 10 мМ ДТТ, 4 мМ MgCl, 1.6-2.4 мМ водорастворимой соли Мn (II), что позволяет упростить способ определения первичной структуры РНК за счет обеспечения возможности получать специфичные продукты терминации в присутствии терминаторов ddNTP благодаря изменению субстратной специфичности используемого фермента обратной транскриптазы MMLV.
3. Элонгацию праймера на РНК-матрице осуществляют при 37-45°С в течение 30-120 минут, что позволяет упростить способ определения первичной структуры РНК за счет обеспечения возможности проведения секвенирования РНК на основе широко доступных реагентов и фермента обратной транскриптазы MMLV.
Таким образом, использование для секвенирования РНК обратной транскриптазы MMLV вкупе с модифицированным составом реакционной смеси для обратной транскрипции и режимом ее проведения позволяет получить качественно новый технический результат, а именно упрощение и удешевление известного способа при сохранении высокой точности определения последовательности РНК.
Продукты реакции секвенирования могут быть детектированы посредством различных меток, включенных в состав исходного праймера, нуклеотидных мономеров или терминаторов.
В ходе экспериментов по определению нуклеотидной последовательности РНК методом обратной транскрипции учитывалась вторичная структура анализируемой молекулы РНК. Наличие структурированных и термодинамически прочных участков, а также присутствие модифицированных нуклеотидов в составе РНК-матрицы затрудняют продвижение фермента по матрице, что может проявляться в появлении неспецифических продуктов терминации реакции элонгации. При разработке предлагаемого способа использовали сложные структурированные природные РНК-матрицы (РНК клеток человека). На их основе проводили подбор условий проведения реакции элонгации и оптимизацию прямого секвенирования РНК. Данное условие обеспечивает эффективность разработанного способа и успешность его применения в научно-исследовательских работах.
Пример 1. Определение первичной структуры (секвенирование) рибосомной РНК клеток человека в присутствии терминаторов ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP
В качестве РНК-матриц использовали 18S и 28S рибосомные (рРНК) в составе препаратов суммарных РНК клеток человека. Выделение суммарной РНК клеток человека проводили с использованием реагента Trizol (Invitrogen, США) согласно протоколу производителя.
260
Полученные осадки клеточной РНК высушивали и растворяли в деионизованной воде, растворы хранили при -70°С. Концентрацию РНК в препаратах определяли спектрофотометрически при длине волны 260 нм с учетом коэффициента экстинкции для РНК ε=25 л/г×см.
Качество полученных препаратов РНК, а также сохранность РНК в процессе выделения и при хранении анализировали электрофорезом в 2% агарозном геле по стандартной методике с использованием буфера RNA Loading Dye (Fermentas, Латвия) для нанесения РНК на гель. В качестве внешнего стандарта использовали РНК маркеры «RiboRuler Low Range RNA Ladder» и «RiboRuler High Range RNA Ladder» производства Fermentas, Латвия.
В качестве праймеров использовали дезоксирибоолигонуклеотиды, комплементарные 18S рибосомной РНК (рРНК) человека («Биосан», Новосибирск).
32
2
2
Реакционную смесь, состоящую из суммарной клеточной РНК (2.5 мкг) и 2 пмоль 5'-[P]-меченого праймера, инкубировали 2 мин при 70°С и охлаждали до 4°С. Добавляли один из ddNTP до соответствующей конечной концентрации: ddATP до 4.0 мкМ, ddCTP до 2.0 мкМ, ddGTP до 4.0 мкМ, ddTTP до 4.0 мкМ. Конечная концентрация dNTP, соответствующего присутствующему ddNTP, составляла 20 мкМ, остальных dNTP - 80 мкМ. К полученной смеси добавляли буфер для обратной транскрипции так, что конечная реакционная смесь содержала 50 мМ КСl, 50 мМ Трис-НСl (рН 8.3 при 25°С), 4 мМ MgCl, 1.6 мМ MnCl, 10 мМ ДТТ и обратную транскриптазу MMLV до концентрации 3.0 е.а./мкл. Смесь инкубировали при 37°С в течение 30 минут.
Анализ продуктов обратной транскрипции проводили гель-электрофорезом в 12% денатурирующем (8 М мочевина) полиакриламидном геле (соотношение бис-акриламид: акриламид 1:20) по стандартной методике (Digweed M.T. et al. RNA sequencing. Advanced Methods in Protein Microsequence Analysis. Ed. by Witmann-Leibold et al., 1986, p.364-386). По завершении электрофореза проводили авторадиографию кДНК в геле (фиг.1).
Представленные результаты электрофоретического разделения продуктов ОТ (фиг.1) позволяют заключить, что заявляемый способ позволяет эффективно, с высокой специфичностью проводить определение первичной последовательности РНК методом обратной транскрипции. Нуклеотидная последовательность, определенная с помощью заявляемого способа, соответствует известной последовательности анализируемого участка 18S рРНК. В приведенном примере анализировали участок 1775-1842 18S рРНК, используя в качестве праймера дезоксирибоолигонуклеотид, комплементарный участку 1849-1869 18S рРНК-матрицы. (Здесь и в последующих примерах нумерация нуклеотидов приведена в соответствии с «snoRNABase, a comprehensive database of human H/ACA and C/D box snoRNAs»; www-snoma.biotoul.fr.)
Пример 2. Определение первичной структуры (секвенирование) рибосомной РНК клеток человека в присутствии терминаторов ddATP, ddCTP, ddGTP, ddUTP
Определение первичной структуры РНК заявляемым способом проводили аналогично примеру 1, за исключением того что вместо дидезокситимидин трифосфата (ddTTP) использовали дидезоксиурацил трифосфата (ddUTP). В качестве праймера использовали дезоксирибоолигонуклеотид, комплементарный участку 1849-1869 18S рРНК-матрицы.
32
2
2
Реакционную смесь, состоящую из суммарной клеточной РНК (3.0 мкг) и 3.0 пмоль 5 '-[Р]-меченого праймера, инкубировали 2 мин при 70°С и охлаждали до 4°С. Добавляли один из ddNTP до соответствующей конечной концентрации: ddATP до 6.0 мкМ, ddCTP до 3.0 мкМ, ddGTP до 6.0 мкМ, ddUTP до 6.0 мкМ. Конечная концентрация dNTP, соответствующего присутствующему ddNTP, составляла 30 мкМ, остальных dNTP - 130 мкМ. К полученной смеси добавляли буфер для обратной транскрипции так, что конечная реакционная смесь содержала 50 мМ КСl, 50 мМ Трис-НСl (рН 8.3 при 25°С), 4 мМ MgCl, 2.4 мМ MnCl, 10 мМ ДТТ и обратную транскриптазу MMLV до концентрации 6.7 е.а./мкл. Смесь инкубировали в течение 120 мин при 45°С.
Представленные на фиг.2 результаты электрофоретического разделения продуктов обратной транскрипции позволяют заключить, что ddUTP выступает в качестве субстрата обратной транскриптазы MMLV. При этом в результате обратной транскрипции в присутствии ddUTP образуются кДНК-продукты, соответствующие по длине положению аденозинов в РНК-матрице, эти продукты совпадают по подвижности с продуктами, образующимися в присутствии ddTTP.
Пример 3. Применение заявляемого способа секвенирования РНК для определения положения модифицированных нуклеотидов в составе молекул РНК
Природные РНК, особенно тРНК и рРНК, содержат большое количество модифицированных (неканонических) нуклеотидов. Определение положения таких нуклеотидов является неотъемлемой частью исследований по изучению структуры и функций конкретных форм РНК.
Определение первичной структуры РНК заявляемым способом проводили аналогично примерам 1 и 2. В качестве праймера использовали дезоксирибоолигонуклеотид, комплементарный участку 1519-1538 18S рРНК.
32
2
2
Реакционную смесь, состоящую из суммарной клеточной РНК (2.0 мкг) и 2.0 пмоль 5'-[P]-мeчeнoгo праймера, инкубировали 2 мин при 70°С и охлаждали до 4°С. Добавляли один из ddNTP до соответствующей конечной концентрации: ddATP до 5.0 мкМ, ddCTP до 2.5 мкМ, ddGTP до 5.0 мкМ, ddUTP до 5.0 мкМ. Конечная концентрация dNTP, соответствующего присутствующему ddNTP, составляла 25 мкМ, остальных dNTP - 100 мкМ. К полученной смеси добавляли буфер для обратной транскрипции так, что конечная реакционная смесь содержала 50 мМ КСl, 50 мМ Трис-НСl (рН 8.3 при 25°С), 4 мМ MgCl, 2.0 мМ Мn(ОАс), 10 мМ ДТТ и ревертазу MMLV до концентрации 3.0 е.а./мкл. Смесь инкубировали в течение 75 минут при 42°С.
На фиг.3 представлен результат электрофоретического разделения продуктов обратной транскрипции, полученных с использованием заявляемого способа, параллельно с продуктами ОТ фрагментов гидролизованной РНК.
Из данных фиг.3 видно, что G1490 18S рРНК имеет 2'-О-метильную группу, что согласуется с литературными данными (Kiss-Laszlo Z. et al., Site-specific ribose methylation of preribosomal RNA: a novel function for small nucleolar RNAs. Cell, 1996, Vol.85, p.1077-1088).
Использование заявляемого способа позволит упростить и удешевить известный способ при сохранении его высокой специфичности.
Заявляемый способ определения последовательности РНК может быть использован как для de novo исследования структуры РНК, так и для подтверждения структуры синтетических поли- и олигорибонуклеотидов. Кроме того, способ может быть использован для характеризации качества препаратов РНК, выделенных из биологических материалов, в том числе для анализа качества препаратов РНК, выделенных из органов, тканей или клеток человека, используемых в диагностике заболеваний человека.