Сравнительное иммуногистохимическое исследование экспрессии муцинов в карциномах различных анатомических отделов желудка

10.

Шевела Е.Я., Сизикова С.А., Тихонова М.А. и др. Характеристика нарушений функциональной активности Т-клеток у больных лимфомами при проведении программной полихимиотерапии // Гематол. трансфузиол. 2004. №1. С.15-19.

Щербакова Э.Г. Бифилиз - механизмы действия и клиническое применение // Рос. мед. вести. 2000. №2. С.43-53.

Basso G., Buldini B., de Zen L et al. A new methodological approaches for immunophenotyping acute leukemias // Haemotologica. 2001. V.86. P.675-692.

11. Cartci F., Cartci C, Ccschia V. et al. Recovery of lymphocyte CD4+/CD8+ ratio in patients treated with lysozyme // Drug Invest. 1992. №4. R51-57.

12. Hrusak O., Porwit-MacDonald A. Antigen expression patterns reflecting genotype of acute leukemias // Leukemia. 2002. V.16. P.1233-1258.

13. Richards S.J., Jack A.S. The development of integrated hae-matolopathology laboratories: a new approach to diagnosis of leukemia and lymphoma // Clin. Lab. Haematol. 2003. V.25, No.6. P.337-345.

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ЭКСПРЕССИИ МУЦИНОВ В КАРЦИНОМАХ РАЗЛИЧНЫХ АНАТОМИЧЕСКИХ ОТДЕЛОВ ЖЕЛУДКА

Л.Е. Гаганов, И.А. Казанцева, Л.Е. Гуревич, Н.А. Корсакова

ГУ Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф. Владимирского

Проведено сравнительное иммуногистохимическое исследование экспрессии муцинов в 55 карциномах желудка, развившихся в различных его отделах и переходных зонах между ними, вне зависимости от гистологического типа опухоли. Показатели экспрессии муцинов в карциномах разных отделов желудка неоднородны. Наиболее частым экспрессируемым муцином является MUC1, наиболее редким - MUC2. Наибольшее количество опухолевых клеток экспрессировали MUC1 (высокая иммунореактивность), наименьшее - MUC2 (низкая иммунореактивность). Карциномы фундального отдела чаще, чем других отделов желудка, экспрессировали MUC1, реже - MUC5, MUC6 и MUC2. Самая большая иммунореактивность к муцинам наблюдалась в карциномах, развившихся на границах анатомических отделов. Частота и интенсивность экспрессии муцинов не зависела от глубины инвазии опухоли.

Ключевые слова: рак желудка, иммуногистохимия, муцин.

COMPARATIVE IMMUNOHISTOCHEMICAL RESEARCH OF MUCIN EXPRESSION IN CARCINOMAS

OF DIFFERENT GASTRIC DIVISIONS

L.E. Gaganov, I.A. Kazantseva, L.E. Gurevich, N.A. Korsakova

M.F. Vladimirsky Moscow Regional Clinical and Research Institute

Comparative immunohistochemical study of mucin expression (MUC1, -5АС, -6 and -2) was carried out in 55 gastric carcinomas. These mucins originated in cardiac, fundic and antral divisions of the stomach and in transition zones between them regardless of the tumor histologic type. Mucin expression indices were irregular in carcinomas of different gastric divisions. MUC1 is the most frequently expressed mucin, and MUC2 is the rarest one. The majority of tumor cells expressed MUC1 (high immunoreactivity), and the least number of them - MUC2 (low immunoreactivity). Fundic carcinomas expressed MUC1 more frequently as compared to the tumors of the other gastric parts, MUC5, MUC6 and MUC2 being expressed less often. The larger immunoreactivity was shown in carcinomas at the boarders between anatomic structures. Incidence and intensity of mucin expression was independent of the degree of tumor invasion.

Key words: gastric cancer, immunohistochemistry, mucin.

Экспрессия муцинов (MUC) карциномами желудка является важным диагностическим и прогностическим маркером, она отражает их морфологические и функциональные особенности. MUC относятся к особому подклассу высокомолекулярных гликопротеи-нов. Это олигомеры различной длины, образованные субъединицами и объединенные дисульфидными связями [4].

В эпителиальных тканях человека установлено девять типов муцинов: MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, МиС5АС, MUC5В, MUC6, MUC7, MUC8. Они подразделяются на мембранно-связанные (MUC1, MUC3) и секреторные. Мембранно-связанные MUC интенсивно экспрессируются на апикальной поверхности эпителия и характеризуются наличием гидрофобного аминокислотного «хвоста», посредством которого молекула муцина крепится к мембране эпителиоцита. Секреторные MUC формируют вязкий высокогидратированный гель, покрывающий эпителиоциты [6, 7].

В клетках, продуцирующих муцины, хорошо развиты шероховатый эндоплазматический ретикулум и аппарат Гольджи, обеспечивающие гликозилирование белка, после завершения которого муцины упаковываются в секреторные гранулы. Секреция муцинов осуществляется посредством экзоцитоза [5, 10]. В слизистой оболочке желудка муцины осуществляют функцию защиты эпителия от бактериальных (в т.ч. Helicobacter pylori), ферментных, токсических, химических и механических воздействий, а также передают сигналы, стимулирующие иммунные реакции [2, 13].

В норме слизистая оболочка желудка содержит MUC1, MUC5АС и MUC6. Экспрессия MUC1 наблюдается в слизистых клетках покровно-ямочного эпителия антрального отдела, фокально - в эпителиоцитах желёз фундального и антрального отделов; MUC5АС интенсивно вырабатывается фовеолярным эпителием всех отделов. MUC6 продуцируется железами антрального типа, а также мукопептидными клетками шеечной зоны желез антрального и фундального отделов желудка. В очагах кишечной метаплазии появляется экспрессия MUC2, который в норме синтезируется бокаловидными клетками кишечника [12].

В карциномах желудка нарушаются как количественные, так и качественные показатели секреции муцинов, при этом искажение и (или) исчезновение экспрессии желудочных муцинов с появлением кишечных муцинов не обязательно ассоциировано с кишечной метаплазией [14, 16]. В многочисленных исследованиях, проводившихся в последнее десятилетие, предпринимались попытки систематизировать эти изменения, использовать показатели экспрессии того или иного муцина в качестве прогностического маркера и на этой основе создать иммунофенотипи-ческую классификацию карцином желудка, однако результаты этих исследований фрагментарны и край-

не противоречивы [3, 8, 9, 11, 12, 15, 17]. В частности, не дана комплексная оценка экспрессии различных типов муцинов в карциномах всех анатомических отделов желудка.

В настоящем исследовании предпринято сравнительное изучение иммуногистохимической экспрессии MUC1, -5АС, -6 и -2 в карциномах желудка, развившихся в кардиальном, фундальном и антральном отделах и переходных зонах между ними, вне зависимости от гистологического типа опухоли.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Исследован операционный материал 55 гастрэк-томий, выполненных по поводу рака. Возраст оперированных пациентов - от 27 до 75 лет, мужчин было 30, женщин - 25. В кардии локализовалось 11 опухолей, на границе кардии и тела (переходная зона I) - 8, в теле - 9, на границе тела и антрального отдела (переходная зона II) - 10, в антральном отделе - 17. Стадийность исследованных карцином по системе TNM была следующей: Tins и Т1 - по одному наблюдению, Т2 - 14 и Т3 - 39.

По гистологическим типам раковые опухоли распределились следующим образом: аденокарциномы различной степени дифференцировки - 12 наблюдений, низкодифференцированные аденокарциномы с перстневидноклеточным и (или) недифференцированным компонентом - 22, перстневидноклеточный рак, в части случаев с наличием недифференцированного компонента рака - 20, недифференцированный рак - одно наблюдение.

Для иммуногистохимического (ИГХ) исследования материал фиксировали в 10% забуференном формалине. Срезы толщиной 5 мкм депарафини-ровали по стандартной схеме и проводили ИГХ-исследование пероксидазно-антипероксидазным методом (ПАП). Использовали моноклональные антитела к муцинам (Novocastra). Инкубация с первичными антителами проводилась после предварительной обработки срезов в микроволновом режиме по принятой методике [1]. На следующих этапах применяли KIT фирмы DAKO (invision, Mouse/Rabbit); в качестве хромогена использовали диаминобензи-дин - ДАВ+ (DAKO), ядра клеток докрашивали гематоксилином Майера.

Экспрессию муцинов оценивали по количеству иммунореактивных клеток на 100 учтенных при 400-кратном увеличении. По результатам оценки были сформированы пять групп наблюдений: 1-я -минимальная иммунореактивность (окрашено от 1-5 опухолевых клеток), 2-я - слабая (6-25), 3-я - умеренная (26-50), 4-я - высокая (более 50), 5-я - отсутствие ИГХ-окрашивания. В качестве условного контроля

была использована внеопухолевая слизистая оболочка соответствующих отделов желудка.

Статистическую обработку проводили посредством пакета программ SigmaPlot 11.0 и Microsoft Excel. Характеристика распределения представлена вычислением средней арифметической (M) и стандартного отклонения (s) в виде M±s. Для сравнения частот использовали критерий х2 Пирсона для таблиц сопряжённости. Различия считали значимыми при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В результате проведенного исследования установлено, что в клетках покровно-ямочного эпителия антрального отдела желудка выявлялась мембранно-цитоплазматическая, а в эпителии желез антрального и фундального отделов - диффузная цитоплазматическая экспрессия MUC1; MUC5AC экспрессировался в фовеолярном эпителии всех отделов в виде диффузного цитоплазматического окрашивания; MUC6 выявлялся в эпителии желез антрального отдела и муко-пептидных клетках шеечной зоны фундального отдела желудка в виде диффузного цитоплазматического и пе-ринуклеарного окрашивания; MUC2 визуализировался диффузным цитоплазматическим окрашиванием в бокаловидных клетках очагов кишечной метаплазии.

Экспрессия MUC1, MUC5AC, MUC6 и MUC2 в большинстве опухолевых клеток карцином желудка была диффузной цитоплазматической (рис. 1, 2, 3), мембранно-цитоплазматической (рис. 4) и апикальной (рис. 5). В трёх наблюдениях экспрессия MUC2 была ядерной.

Результаты исследования частоты экспрессии муцинов в карциномах желудка вне зависимости от стадии опухоли и анатомического отдела представлены на рис. 6.

Рис. 1. Экспрессия MUC1 в низкодифференцированной аденокарциноме желудка (диффузное окрашивание цитоплазмы). х400

Количество карцином, экспрессирующих МиС1 (52 наблюдения), достоверно больше карцином, экспрессирующих МиС5АС, МиС6 и МиС2: х2=37,645 с тремя степенями свободы р<0,001. Количество карцином, экспрессирующих МиС5АС, МиС6 и МиС2, примерно одинаково (28, 26 и 25 наблюдений соответственно). Наименьшее число карцином экспресси-ровали МиС2 (при сравнении с МиС5АС и МиС6 различия недостоверны х2=0,340 с 2 df; р=0,844).

В табл. 1 представлено распределение карцином, экспрессирующих муцины, по анатомическим отделам. Во всех отделах преобладали карциномы, экспресси-рующие МиС1 (7-16 наблюдений в разных отделах желудка (10,4±3). В кардиальном, фундальном и ан-тральном отделах это различие было достоверным (р=0,004, р<0,001, р=0,035 соответственно). Карциномы, экспрессирующие МиС5АС, встречались в 1-11 наблюдениях (в среднем 5,6±4); МиС6 - в 1-9 (5,2±3),

Рис. 2. Экспрессия МиС2 в умеренно дифференцированной аденокарциноме желудка (диффузное окрашивание цитоплазмы). х200

Рис. 3. Экспрессия МиС5АС в перстневидноклеточном раке желудка (диффузное окрашивание цитоплазмы). х400

Рис. 4. Экспрессия МиС6 в перстневидноклеточном раке желудка (мембранно-цитоплазматическое окрашивание). х400

Рис. 5. Экспрессия МиС1 в высокодифференцированной аденокарциноме желудка (апикальное окрашивание). х400

Рис. 6. Гистограмма частоты экспрессии муцинов карциномами желудка

Таблица 1

Распределение карцином, экспрессирующих муцины, по анатомическим отделам желудка

Тип муцина Отделы и переходные зоны М±Б

антральный зона II фундальный зона I кардиальный

МЮ 16 (п=17) 9 (п=10) 9 (п=9) 7 (п=8) 11 (п=11) 10,4±3

М11С5АС 11 (п=17) 6 (п=10) 1 (п=9) 7 (п=8) 3 (п=11) 5,6±4

М11С6 9 (п=17) 5 (п=10) 1 (п=9) 6 (п=8) 5 (п=11) 5,2±3

М11С2 9 (п=17) 3 (п=10) 1 (п=9) 5 (п=8) 7 (п=11) 5,0±3

X2 (3 с 8,607 7,673 24,000 2,011 13,162 -

р 0,035 0,053 <0,001 0,57 0,004 -

МиС2 - в 1-9 (5±3). Карциномы кардиального и фун-дального отделов экспрессировали МиС1 во всех случаях. Самая редкая экспрессия МиС5АС, МиС6 и МиС2 была в фундальном отделе (по одному наблюдению). На границах анатомических отделов различия в частоте экспрессии были несущественными (для переходной зоны I - р=0,57; для переходной зоны II - р=0,053).

На рис. 7 приведены данные о распределении карцином по степени иммунореактивности (минимальная, слабая, умеренная и высокая). Карциномы, экспрессирующие МиС1, имели преимущественно высокую иммунореактивность (27 случаев). Карциномы с умеренной иммунореактивностью (8 случаев) несколько чаще обнаруживались в кардии и фундальном отделе (3 и 2 случая соответственно); со слабой и минимальной иммунореактивностью (11 и 5 случаев) чаще локализовались в антральном отделе.

Степень иммунореактивности карцином к МиС5АС была высокой в 10 случаях, в том числе в антральном отделе (4 случая), кардиальном отделе и переходной зоне I (2 и 3 наблюдения соответственно), в переходной зоне II (одно наблюдение). Карциномы с умеренной иммунореактивностью выявлены в переходной зоне II и антральном отделе (по 2 наблюдения) и в переходной зоне I (одно наблюдение). Слабая иммунореактивность обнаружена в карциномах переходных зон, а также в антральном и фундальном отделах (соответственно в, 2, 3, 2 и одном случаях). Карциномы с минимальной иммунореактивностью локализовались в антральном отделе (3 наблюдения), в переходной зоне I и кардии (по одному наблюдению).

Карциномы, экспрессирующие МиС6, имели высокую иммунореактивность в 4 наблюдениях, из них в

антральном отделе - 2 случая, в переходных зонах - по одному. Чаще встречалась умеренная и слабая иммунореактивность (7 и 9 случаев соответственно). Опухоли с умеренной иммунореактивностью наблюдались в кардии и переходной зоне I (по 3 наблюдения), переходной зоне II и антральном отделе (по одному случаю). Карциномы со слабой иммунореактивностью локализовались в переходных зонах и антральном отделе (2, 3 и 2 наблюдения соответственно), кардии и фундальном отделе (по одному случаю). Минимальная иммунореактивность выявлена в 4 случаях карцином антрального отдела и в одном - при карциноме кардии.

Среди 25 карцином, экспрессирующих МиС2, опухоли с высокой иммунореактивностью обнаружены в 2 наблюдениях (в кардии и антральном отделе); с умеренной иммунореактивностью - в 3 (в кардии, антральном отделе и переходной зоне I). Карциномы со слабой иммунореактивностью представлены 8 наблюдениями (в кардиальном отделе - 3 случая, антральном - 2, фундальном и переходных зонах - по одному). Опухоли с минимальной иммунореактивностью выявлены в 12 наблюдениях (в антральном отделе 5 случаев, кардии - 2, переходных зонах - по одному). Изложенные различия достоверны (х2=66 с 12 с^; р<0,001).

В табл. 2 представлены показатели иммуноре-активности карцином желудка к муцинам (в каждом отделе для каждого из муцинов учтено по 1000 репрезентативных опухолевых клеток). Наиболее высокие показатели наблюдались в карциномах, экспрессирующих МиС1 (среднее 494±67 клеток). В карциномах кардиального отдела иммунореактивными оказались

Рис. 7. Распределение карцином по степени иммунореактивности к муцинам

446 клеток, фундального - 524, антрального - 401, переходных зон I и II - по 546 и 551 клеток соответственно (х2=71 с 4 df, р<0,001).

Иммунореактивность карцином к MUC5AC (среднее 186±131) была минимальной в фундальном отделе - выявлено 7 иммунореактивных клеток, в кардиальном отделе она составила 116 клеток, в ан-тральном - 222, в переходных зонах I и II - по 354 и 229 клеток соответственно (х2=452 с 4 df, р<0,001).

Иммунореактивность карцином к MUC6 была минимальной в фундальном отделе - выявлено 6 иммунореактивных клеток, в кардиальном отделе - 125, в антральном - 121, в переходных зонах I и II - 293 и 135 клеток соответственно (х2=356 с 4 df, р<0,001).

Иммунореактивность карцином к MUC2 была минимальной в фундальном отделе (выявлено 2 имму-нореактивные клетки); в кардиальном отделе - 151, в антральном - 102, в переходных зонах I и II - 106 и 19 клеток соответственно (х2=227 с 4 df, р<0,001).

На рис. 8 видно, что наиболее высока иммунореактивность в карциномах, развившихся на границах анатомических отделов желудка (p<0,001). Исключением явились карциномы, экспрессирующие MUC2, показатели иммунореактивности которых в переходных зонах I и II были ниже, чем в кардии и антральном отделе. Следует отметить, что частота и интенсивность экспрессии муцинов не зависела от стадии рака желудка по системе TNM.

Рис. 8. Распределение иммунореактивных клеток в карциномах различных анатомических отделов желудка

Таблица 2

Число иммунореактивных к муцинам клеток в карциномах различных анатомических отделов желудка

Тип муцина Отделы и переходные зоны M±s

антральный зона II фундальный зона I кардиальный

MUC1* 401 551 524 546 446 494±67

MUC5AC** 222 229 7 354 116 186±131

MUC6*** 121 135 6 293 125 136±102

MUC2**** 102 19 2 106 151 76±63

х2 (3 df) 77,281 874,628 1732,829 449,943 454,303 -

р <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 -

* р<0,001 при сравнении результатов между отделами для МиС1; ** р<0,001 для МиС5АС; *** р<0,001 для МиС6; **** р<0,001 для МиС2.

Выявлено, что экспрессия муцинов в карциномах разных отделов желудка неоднородна. Наиболее частым экспрессируемым муцином является МиС1, наиболее редким - МиС2. Карциномы кардиального и фундального отдела чаще, чем других отделов желудка, экспрессировали МиС1. Реже всего экспрессия МиС5АС, МиС6 и МиС2 наблюдалась в фундальном отделе. Различия в экспрессии муцинов между карциномами кардии, антрального отдела и переходных зон были несущественными. Наибольшее количество опухолевых клеток экспрессировали МиС1 (высокая иммунореактивность), наименьшее - МиС2 (низкая иммунореактивность). Наибольшая иммунореактивность к муцинам наблюдалась в карциномах, развившихся на границах анатомических отделов. Частота и интенсивность экспрессии муцинов не зависела от глубины инвазии опухоли.

ВЫВОДЫ

Результаты фрагмента проводимого комплексного исследования, посвященного оценке инвазивных свойств и прогноза карцином разных отделов желудка, свидетельствуют о том, что показатели функциональной активности опухолевых клеток по продукции муцинов в карциномах разных анатомических отделов желудка могут коррелировать с иммунофенотипом опухоли (определённый набор кератинов), степенью экспрессии молекул адгезии (Е-кадхерин) и проли-феративной активностью. В результате исследования будет дана характеристика иммунофенотипической и функциональной гетерогенности раковых опухолей желудка, что может иметь значение для прогноза течения заболевания.

ЛИТЕРАТУРА

1. Гуревич Л.Е., Исаков В.А. Использование в иммуноги-стохимических исследованиях метода восстановления антигенной специфичности воздействием микроволн на ткани, фиксированные формалином и заключенные в парафин // Арх. пат. 1999. №2. С.48-50.

2. Allen A., Flemstrom G., Garner A., Kivilaakso E. Gastroduo-denal mucosal protection // Phisiol. Rev. 1993. V.73. P.823-857.

3. Barresi V., Vitarelli E., Grosso M. et al. Relationship between immunoexpression of mucin peptide cores MUC1 and MUC2 and Lauren's histologic subtypes of gastric carcinomas // Eur. J. Histochem. 2006. V.50, No.4. P.301-309.

4.

5.

8.

9.

10.

11.

12.

13.

14.

15.

16.

17.

Carlstedt I., Lindgen H., Sheehan J.K. The macromollecular structure of human cervical-mucus glycoproteins. Studies on fragments obtained after reduction of disulfide bridges and after subsequent trypsin digestion // Biochem. J. 1983. V.213. P.427-435.

Engelmann K., Kinlough C.L., Müller S. et al. Transmembrane and secreted MUC1 probes show trafficking-depen-dent changes in O-glycan core profiles // Glycobiology. 2005. V.15, No.11. P.1111-1124.

Gendler J.S., Spicer A.P. Epithelial mucin genes // Ann. Rev. Physiol. 1995. V.57. P.607-634.

Hilkens J., Buijs F. Biosynthesis of MAM-6, an epithelial si-alomucin. Evidence for involvement of a rare proteolytic cleavage step in the endoplasmic reticulum // J. Biol. Chem. 1988. V.263. P.4215-4222.

LiX-H., Zheng H-C., Wang Z-G. et al. The Clinicopathological and Prognostic Significance of MUC-1 Expression in Japanese Gastric Carcinomas: An Immunohistochemical Study of Tissue Microarrays // Anticancer Res. 2008. V.28, No.2A. P.1061-1067.

LillehojE.P., Lu W., Kiser T. et al. MUC1 inhibits cell proliferation by a beta-catenin-dependent mechanism // Biochim. Biophys. Acta. 2007. V.1773, No.7. P.1028-1038. Litvinov S.V., Hilkens J. The epithelial sialomucin, episialin, is sialylated during recycling // J. Biol. Chem. 1993. V.268. P.21364-21371.

Motoshita J., Oue N., Nakayama H. DNA methylation profiles of differentiated-type gastric carcinomas with distinct mucin phenotypes // Japan. Cancer Ass. 2005. V.96, No.8. P.474-479.

Pinto-de-SousaJ., DavidL., ReisCelso A. et al. Mucins MUC1, MUC2, MUC5AC and MUC6 expression in the evaluation of differentiation and clinico-biological behavior of gastric carcinoma // Virch. Arch. 2002. V.440. P.304-310. Schmitz J.M., Durham C.G., Ho S.B., Lorenz R.G. Gastric Mucus Alterations Associated With Murine Helicobacter Infection // J. Histochem. Cytochem. 2009. V.57, No.5. P.457-467. Wada R., Yamaguchi T., Tanizaki T. Mucin phenotypic expression and p53 gene abnormality of gastric super-minute well-differentiated adenocarcinoma: re-evaluation with relationship between histogenesis of well-differentiated adenocarcinoma and intestinal metaplasia in distal stomach // J. Carcin. 2005. No.4. P.14.

Wang R.-Q., Fang D.-C. Alterations of MUC1 and MUC3 expression in gastric carcinoma: relevance to patient clinicopathological features // J. Clin. Path. 2003. V.56. P.378-384. Wei X., Xu H., Kufe D. Human MUC1 oncoprotein regulates p53-responsive gene transcript! on in the genotoxic stress response // Cancer Cell. 2005. No.2. P.167-178. Zheng H., Takahashi H., Nakajima T. et al. MUC6 down-regulation correlates with gastric carcinoma progression and a poor prognosis: an immunohistochemical study with tissue microarrays // J. Cancer Res. Clin. Oncol. 2006. V.132, No.12. P.817-823.