Генотипические особенности штаммов Bacillus anthracis c разным проявлением признаков, ассоциированных с патогенностью

УДК 616.981.51

Е.И.Еременко, А.Г.Рязанова, Е.А.Цыганкова, О.И.Цыганкова, А.Н.Куличенко

генотипические особенности штаммов BACILLUS ANTHRACIS c разным проявлением признаков, ассоциированных с патогенностью

ФГУЗ «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт»

Подобрана совокупность штаммов возбудителя сибирской язвы и их производных с отличающейся вирулентностью. Получена характеристика этих штаммов по фенотипическим свойствам, VNTR-, SNP- и SNR-локусам генома, плазмидному составу, генам капсуло - и токсинообразования, а также некоторым локусам, продукты которых связаны с патогенностью. Выявлена корреляция определенного MLVA-генотипа с комплексом фенотипических свойств, характерным для штаммов Bacillus anthracis с измененной вирулентностью.

Ключевые слова: B. anthracis, штаммы возбудителя сибирской язвы, фенотипические свойства, VNTR-, SNP-, SNR-локусы.

В последнее время появились новые возможности получать геномные характеристики сибиреязвенного микроба, основанные на многолокусном анализе областей генома с вариабельным числом тандемных повторов (MLVA), единичных нуклеотидных полиморфизмов (SNP) и повторов (SNR). Хотя эти характеристики связывают главным образом с географическим происхождением штаммов, нами получены предварительные данные, позволяющие предполагать связь их вариабельности с патогенными свойствами.

Нами ранее были выделены штаммы B. anthracis и их производные, отличающиеся по вирулентности.

Цель работы - получение характеристики фенотипических и генотипических свойств, предположительно или определенно ассоциирующихся с патогенностью, у штаммов с отличающейся вирулентностью и выделенных из разных экологических ниш, и получение новых данных о корреляции этих свойств с вирулентностью изолятов.

Материалы и методы

В работе использовали набор штаммов сибиреязвенного микроба, выделенных на протяжении длительного отрезка времени из разных источников, в различных географических регионах, и их производных с отличающейся вирулентностью, а также стандартный вирулентный штамм 81/1. В результате в модельной системе штаммов были представлены изоляты микроба, пребывавшего на разных стадиях жизненного цикла (табл. 1).

Определение фенотипа (ФТ) штаммов проводили согласно МУК 4.2.29.06-08 «Лабораторная диагностика и обнаружение возбудителя сибирской язвы».

О наличии плазмид судили по результатам плаз-мидного скринига, а о присутствии генов - по амплификации в полимеразной цепной реакции (ПЦР) их фрагментов. В ПЦР использовали олигонуклео-тидные праймеры к генам протективного антигена (ПА) pag, отечного фактора cja, летального фактора lef оперону прорастания спор gerX [2] (плазми-

да pXO1), капсулообразования B. anthracis capC, capBCA (плазмида pXO2) [13], к ряду генов хромосомной локализации, имеющих отношение как к проявлению патогенности, так и, вероятно, к альтернативным жизненно важным функциям: plcR (плейо-тропный транскрипционный регулятор факторов патогенности) [6], sap (белок S-слоя B. anthracis) [1], piplcba (фосфатидил инозитол-специфическая фос-фолипаза С B. anthracis), plcA (фосфатидил холин-специфическая фосфолипаза С B. thurigiensis), inA (иммунный ингибитор B. anthracis) [9], E4 (бактериофагосвязывающий участок B. anthracis) [5], rpoB (Р-субъединица РНК-полимеразы B. anthracis) [12], alo (антролизин) [14], gerYA, gerYB, gerYC (гены хромосомного оперона прорастания спор) [8].

Генотипирование штаммов проводили методом MLVA 16 хромосомных и 2 плазмидных областей генома B. anthracis с вариабельным числом тандемных повторов (VNTR) [10,11]. Генетическую вариабельность хромосомного локуса 16 Ch, содержащего SNR, и выявление SNP гена ПА методом анализа полиморфизма длины амплификационно-рестрикци-онных фрагментов (PCR-RFLP анализ) проводили в соответствии с описанием Е.А.Цыганковой [4]. Для филогенетического анализа штаммов использовали программы из пакета программного обеспечения Phylip 3.6.

Результаты и обсуждение

Из 10 фенотипических признаков вариабельными оказались 5: капсуло- и токсинообразование in vitro, рост на минимальной синтетической среде без триптофана, лизис отмытых эритроцитов барана и гидролиз альбумина.

Дефектность фенотипических признаков не всегда могла объясняться отсутствием плазмид или отрицательными результатами ПЦР с праймерами к их генам (табл. 2).

Так, ряд штаммов не продуцировал токсин в тесте in vitro при наличии плазмиды токсинобразова-ния pXO1 и определяемых в ПЦР фрагментов генов

Таблица 1

Происхождение использованных в работе штаммов B. anthracis

Исходные штаммы или производные

Источник, место выделения штамма, метод отбора производного

81/1

Содержимое карбункула больного сибирской язвой

137-1, 137-2, 137П, 140-1, 140-2, 140П Почва старого скотомогильника

140П Cap- Штамм 140 П, селекция по признаку капсулообразования

140П Cap- б/м Штамм 140П Cap-, пассирование через организм белой мыши

12/16 12/16-S, 12/16-1 12/16-1 IV п. Содержимое карбункула больного сибирской язвой (Республика Дагестан) Штамм 12/16, селекция по признаку капсулообразования Штамм 12/16-1, пассирование через организм белой мыши

228 Труп овцы

228/2, 228/4, 228/8 Штамм 228, селекция по признаку капсулообразования

228 прот Штамм 228, селекция по признаку независимости от триптофана

1(CO) 1(CO)-S, (CO)-S Cap-1(CO) RBA9-1, 1(CO) RBA9-4 1 (CO) RK-1 Труп крупного рогатого скота (Республика Северная Осетия-Алания) Штамм 1(CO), селекция по признаку капсулообразования Штамм 1(CO), селекция по признаку устойчивости к сибиреязвенному бактериофагу BA9 Штамм 1(CO), селекция по признаку устойчивости к сибиреязвенному бактериофагу К

14/41 Содержимое язвы больного сибирской язвой

14/41-1, 14/41-1aSM Штамм 14/4, селекция по признаку капсулообразования

14/41 Trp+ Штамм 14/4, селекция по признаку независимости от триптофана

pag, lef, cya. Эти штаммы были вирулентными для белых мышей, но авирулентными или умеренно вирулентными для кроликов. Вариант 1(CO)RK-1 был неспособен к прорастанию спор в атмосфере с повышенным содержанием СО2, что не позволяло оценить его капсуло- и токсинообразование in vitro, хотя он имел полный набор генов прорастания спор и других исследованных генов. Все остальные штаммы также имели хромосомные гены прорастания спор ger Y(A, B, C). Плазмидный ген gerX отсутствовал у pXO1-вариантов, однако это не сказывалось на способности их спор прорастать in vitro. Лишены этой плазмиды и соответствующих генов штаммы 1(CO) RBA9-1, 228/4 и 1(CO) RBA9-4, при этом последние два не имели также капсульной плазмиды pXO2 и ее генов (cap BCA, capC). Штаммы 137-1, 137-2, 137П, 140-1, 140-2, 140П Cap-, 12/16-1, 228/2, 228/8, 1(CO)-S Cap-14/41-1 и 14/41 Trp+ не имели плазмиды pXO2, генов capC, capBCA, и не продуцировали капсулу in vivo и in vitro. Все моно- и бесплазмидные штаммы, а также вариант 1(CO) RK-1 были авирулентными для всех лабораторных животных.

У всех штаммов, кроме дефектного по генам plcA и in A варианта 1(CO) RBA9-1, амплифицирова-лись фрагменты генов фосфолипаз, однако лецити-назную активность обнаруживал только 14/41 Trp+.

Отсутствие экспрессии некоторых признаков при наличии их генетических детерминант могло объясняться нарушением генетической регуляции, например, вследствие мутации в гене плейотропного транскрипционного регулятора факторов патогенности plcR [6].

MLVA-генотипирование штаммов по 6 хромосомным и 2 плазмидным локусам [10] позволило идентифицировать 7 отличающихся генотипов

140-2

140-1

137-2

137-1

137П

81/1

140пСар-б.м 12/16-1-IVn 228прот 1

1(СО) RBA9-1

1(СО) RBA9-

1(СО) RK-1

14/41-1

14/41 Тгр+

228/8

140П

140ПСар-

12/16

12/16-S

12/16-1

i(co)-s

l(CO)-S Сар-14/41

14/41-laSM

228

228/2

228/4

Кластеризация MLVA-генотипов штаммов В. anthracis на основе анализа 13 хромосомных локусов:

I - 8 из 10 локусов Ceb-Bams (Le Fleche. et al., 2000);

II - 5 из 6 локусов

Таблица 2

Фенотипическая и геномная характеристика штаммов сибиреязвенного микроба

Фенотипические признаки Геномная характеристика

Исходные Плазмиды/гены Хромосомные гены MLVA

штаммы или производные Cap+CO2 C ІЗ + 2O Tox Trp Hly Prt Lec Spo Ger Vir* pXO1/ pagA, cya, lef, gerX pXO2/ capBCA, capC, amiC in A, plcA sap, gerYA, gerYB, gerYC, rpoB, piplcba, alo, E4, dlp-1,dlp-2, plcR, dhp73.009 генотип по 8 ло-кусам [10]

81/1 + - + + + + - + + ++ + + + + 1

137-1 - - + + - - - + + - + - + + 1Н24

137-2 - - + + - - - + + - + - + + 1Н2

137П - - + + - - - + + - + - + + 1Н2

140-1 - - + + - - - + + - + - + + 1Н2

140-2 - - + + - - - + + - + - + + 1Н2

140 П + + - - - - - + + + + + + + 2

140П Cap- - - - - - - - + + - + - + + 2Н2

140П Cap- б/м + - + + + + - + + ++ + + + + 1

12/16 + - - - - - - + + + + + + + 2

12/16-S + + - - - - - + + + + + + + 2

12/16-1 - - - - - - - + + - + - + + 2Н2

12/16-1IV п + - + + + + - + + ++ + + + + 1

228 + - - - - - - + + + + + + + 2

228/2 - - - - - - - + + - + - + + 2Н2

228/4 - - - - - - - + + - - - + + 2Н12*

228/8 - - + + - - - + + - + - + + 1Н2

228 прот + - + + + + - + + + + + + + 1

1(CO) + - + + + + - + + + + + + + 1

1(CO)-S + + - - - - - + + + + + + + 2

1(CO)-S Cap- - - - - - - - + + - + - + + 2Н

1(CO) RBA9-1 + - - + - - - + + + - + - + 1НГ

1(CO) RBA9-4 - - - + + + - + + - - - + + 1Н12

1 (CO) RK-1 ** - ** + + + - + - - + + + + 1

14/41 + - - - - - - + + + + + + + 2

14/41-1 - - + + - - - + + - + - + + 3Н

14/41-1aSM + + - - - - - + + + + + + + 2

14/41 Trp+ - - + + - - + + + - + - + + 3Н

Примечания: Cap+CO2 -капсулообразование in vitro в атмосфере с 5-25 % СО2; Cap+O2 - капсулообразование in vitro в воздушной атмосфере; Tox - токсинообразование in vitro; Trp - рост на минимальной питательной среде без триптофана; Hly - гемолиз отмытых эритроцитов барана; Prt -протеолиз альбумина и гемоглобина; Lec - лецитиназная активность; Spo - спорообразование; Ger - прорастание спор; Vir* - вирулентность для лабораторных животных: «++» - высокая для белых мышей и кроликов; «+» - высокая для белых мышей, умеренная для кроликов; «±» - высокая для белых мышей, отсутствие для кроликов; «-» - отсутствие для всех видов животных; «**» - признак невозможно определить; H - отсутствие амплификации локусов: v - pXOlaat; * - pXO2at; ♦ - pXOlaat и pXO2at.

и (CapToxTrpHlyPrt), с избирательной вирулентностью и авирулентные.

Известно о географической приуроченности генотипов штаммов сибиреязвенного микроба [3, 7,

10]. Весьма неожиданным оказалось полное совпадение по 7 из 8 локусов генотипа № 2 атипичных штаммов из нашей коллекции с генотипом № 89, который имел единственный штамм, выделенный в Северной Каролине (США), вирулентность которого не описана [10]. Ввиду явной территориальной разобщенности регионов, где были выделены штаммы, сходство их генотипов едва ли могло быть следствием общего географического происхождения или завоза материа-

ла, содержащего возбудитель сибирской язвы. Более вероятным представляется, что этот штамм так же, как и наши штаммы из кластера B, имеет ассоциированные с патогенностью атипичные свойства и соответствующий генотип.

Было также установлено, что у некоторых штаммов, в частности 12/16 и 14/41, имелось по два аллеля ряда локусов, что могло подтверждать значительную гетерогенность их клеточной популяции на уровне генома.

Анализ SNP гена ПА и полиморфизма SNR в хромосомном локусе 16 Ch не выявил какой-либо общей закономерности в вариабельности.

Таким образом, выявлены альтернативные состояния хромосомных VNTR-маркеров у штаммов с отличающимся фенотипом, ассоциированным с вирулентностью. Установлено, что определенный MLVA-генотип штаммов может коррелировать с комплексом ассоциированных с патогенностью свойств возбудителя сибирской язвы, присущим всем атипичным штаммам, независимо от места и метода их выделения. Полученные результаты свидетельствуют о значительной перестройке генома B. anthracis у таких штаммов. Механизм и сущность этой реорганизации не ясны, как и значение для возможности альтернативного пути размножения микроба в почве. Недавно представлены свидетельства более динамичного, чем ранее представлялось, жизненного цикла B. anthracis, в котором взаимодействия с бактериофагами вызывают фенотипические изменения у сибиреязвенного микроба и появление лизогенных производных с резко возросшими возможностями для выживания во внешней среде [15]. В этой связи перспективным представляется изучение не только особенностей экспрессии и вариабельности нуклеотидной последовательности генов, связанных с вирулентностью, у типичных и атипичных штаммов, но и состояния лизогении.

Исследования поддержаны грантом РФФИ (проект № 08-04-000895).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Цыганкова О.И., Еременко Е.И., Рязанова А.Г., Цыганкова Е.А. Мультиплексная амплификационная тест-система для идентификации и дифференциации Bacillus anthracis. Журн. микро-биол., эпидемиол. и микробиол. 2005; 3:69-74.

2. Цыганкова О.И., Еременко Е.И., Рязанова А.Г. Новые праймеры к последовательности гена ger Х и их применение для характеристики штаммов Bacillus anthracis. В кн.: Актуальные проблемы эпидемиологической безопасности: Матер. юбил. науч.-практ. конф.. Ставрополь; 2002. С. 295-6.

3. Цыганкова О.И., Еременко Е.И., Брюханов А.Ф. и др. Генотипирование штаммов сибиреязвенного микроба на терри-

Жи стран СНГ. Журн. микробиол., эпидемиол. и микробиол.

; 6(прил.):51-6.

4. Цыганкова Е.А., Еременко Е.И., Цыганкова О.И., Рязанова А.Г. Полиморфизм гена протективного антигена у вариантов штаммов B. anthracis, обнаруживаемый методом PCRRFLP-анализа. В кн.: Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории стран-участников Содружества Независимых Государств: Матер. IX Науч.-практ. конф.; 2 октября 2008; Волгоград. Волгоград; 2008. С. 149-50.

5. Dwyer K.G., Lamonica J.M., Schumacher J.A. et al. Identification of Bacillus anthracis specific chromosomal sequences by suppressive subtractive hybridization. BMC Genomics. 2004;

6. Easterday W.R.,Van Ert M.N., Simonson T.S. et al. Use of

single nucleotide polymorphisms in the plcR gene for specific identification of B. anthracis. J. Clin. Microbiol. 2005; 43(4):1995-7.

7. EremenkoE.I., Tsygankova O.I., TsygankovaE.A., Ryazanova A.G. Molecular diversity of Bacillus anthracis wild and laboratory strains. In: International Conference on Bacillus anthracis, B. cereus, and B. thuringiensis «Bacillus - ACT 2007». Oslo, Norway; 2007; 60 (poster 1).

8. Guidi-Rontani C., Duflot E., Ruffle S. et al. Identification and characterization of a germination operon on the chromosome of Bacillus anthracis. Direct submission, submitted (02-SEP-1999). GenBankACCESSION AF182371.

9. Guttmann D.M., Ellar D.J. Phenotypic and genotypic comparisons of 23 strains from the Bacillus cereus complex for selection of known and putative B. thuringiensis virulence factors. FEMS Microbiol. Lett. 2000; 188:7-13.

10. Keim P., Price L.B., Klevytska A.M. et al. Multiple locus variable number tandem repeat analysis reveals genetic relationships within B. anthracis. J. Bacteriol. 2000; 182(10):2928-36.

11. Le Fleche P., Hauck Y., Onteniente L. et al. A tandem repeats database for bacterial genomes: application to the genotyping of Yersiniapestis and B. anthracis. BMC Microbiology. 2001; 1(1):2.

12. Qi Y., Patra G., LiangX. et al. Utilization of the rpoB gene as a specific chromosomal marker for real-time PCR detection of Bacillus anthracis. Appl. Environ. Microbiol. 2001; 67:3720-27.

13. Ramisse V, Patra G., Garringue H. et al. Identification and characterization of Bacillus anthracis by multiplex PCR analysis of sequences on plasmids pXO1 and pXO2 and chromosomal DNA. FEMS Microbiol. Lett. 1996; 145:9-16.

14. Shannon J.G., Ross C.L., Koehler T.M., Rest R.F. Characterization of anthrolysin O, the Bacillus anthracis cholesterol-dependent cytolysin. Infect. Immun. 2003; 71(6):3183-89.

15. SchuchR., Fischetti V.A. The Secret Life oftheAnthraxAgent Bacillus anthracis: Bacteriophage-Mediated Ecological Adaptations. PLoS ONE 4(8): e6532.doi: 10.1371/journal.pone.0006532.

E.I.Eremenko, A.G.Ryazanova, E.A.Tsygankova, O.I.Tsygankova, A.N.Kulichenko

Genotypic Peculiarities of Bacillus anthracis Strains with Different Manifestation of Pathogenicity-Associated Features

Stavropol Research Anti-Plague Institute

The set of Bacillus anthracis strains and their derivatives with distinct virulence was selected. The strains were characterized as regards phenotypic properties, VNTR-, SNP- and SNR-loci, plasmid composition, genes of toxin and capsule production, and some pathogenecity-related loci. Correlation between certain MLVA-genotype and a set of phenotypic properties indicative of the strains with altered virulence was revealed.

Key words: B.anthracis, strains of anthrax agent, phenotypic properties, VNTR-, SNP-,SNR-loci.

Об авторах:

Еременко Е.И., Рязанова А.Г., Цыганкова Е.А., Цыганкова О.И., Куличенко А.Н. Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт. 355035, Ставрополь, ул. Советская, 13-15. E-mail: anthraxlab@mail.ru

Authors:

Eremenko E.I., Ryazanova A.G., Tsygankova E.A., Tsygankova, KulichenkoA.N. Stavropol Research Anti-Plague Institute. 355035, Stavropol, Sovetskaya St., 13-15. E-mail: anthraxlab@mail.ru

Поступила 12.01.10.