СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО САПА
METHOD OF TREATING EXPERIMENTAL MALLEUS

Изобретение относится к микробиологии, в частности к способам экстренной профилактики и лечению сапа.
Сап является опасным инфекционным заболеванием человека и животных. При формировании острых форм заболевания (пневмония, септицемия) без антибиотикотерапии прогноз неблагоприятный, а при использовании химиопрепаратов лечение необходимо проводить длительное время, используя комбинации активных антибиотиков. Возбудитель сапа (Burkholderia mallei) обладает высокой устойчивостью к большинству известных антибиотиков (пенициллины, аминогликозиды, гликопептиды и др.), в опытах in vivo он чувствителен к некоторым тетрациклинам, хинолонам, карбапенемам, комбинированным сульфаниламидам. Меропенем относится к наиболее активным препаратам (МПК для большинства штаммов В.mallei составляет 0,5-1,0 мкг/мл). При этом максимально достижимая концентрация препарата в плазме крови составляет 50-100 мкг/мл. Одним из достоинств меропенема является его длительный постантибиотический эффект, в определенной мере компенсирующий короткий период полувыведения (1,5 ч) из организма с мочой. Меропенем достаточно эффективен при лечении инфекций, вызываемых другими видами буркхольдерий (В.pseudomallei и В.cepacia) (Cheng А.С., Currie B.J. Melioidosis: epidemiology, pathophysiology and management. Clin. Microbiol. Rev. - 2005. - Vol 18. - P.383-416; Conway S.P., Brownlee K.G., Denton M., Pecham D.G. Antibiotic treatment of multidrug-resistant organisms in cystic fibrosis. - Am. J. Respir. Med. - 2003. - Vol.2. - P.321-332). Однако в литературе отсутствуют сведения о терапевтическом эффекте меропенема при естественных и экспериментальных заболеваниях сапом. Наиболее близким аналогом в настоящее время является способ лечения острых форм сапа, включающий 2-х недельное внутривенное введение доксициклина, цефтазидима, котримоксазола и последующее проведение курса поддерживающей терапии с использованием доксициклина и азитромицина в течение 4-6 месяцев. (Estes D.M., Dow S.M., Schweizer H.P., Torres A.G. Present and future therapeutic strategies for melioidosis and glanders, - Expert. Rev. Anti. Infect. Ther. - 2010, - Vol.8. - P.325-338). В опубликованной работе по лечению сапа эффективность химиотерапии достигает 40-60%.
3
Целью изобретения является разработка способа применения химиотерапевтического средства (меропенема) для лечения острой формы сапа, смоделированной на золотистых хомячках. У золотистых хомячков при парентеральном введении В.mallei ц 5 в дозе 10 Dlm наблюдалась 100% летальность в течение первых 4 дней после заражения. Проблема подбора и оценки эффективности химиопрепаратов в опытах на животных в данном случае осложняется естественными трудностями многократного внутривенного введения антибиотика. В то же время известно, что заключение химиопрепарата в липосомальную форму обеспечивает равномерное, длительное (в пределах 3-х сут) поступление активного начала в лимфоток с последующим выходом в венозную систему при внутрибрюшинном введении, в определенной мере копируя длительную многократную капельную инфузию.
Для достижения поставленной цели использовали липосомальные препараты меропенема (Астра Зенека). Липосомальный препарат готовили по методу Szoka F., Papahandjopoulos D. Procedure for preparation of liposomes with large internal space and high capture by reverse-phase evaporation (Proc. Nat. Sci. USA. - 1978. - Vol.75, №9. - P.4194-4198.). Для этого из расчета на 5 мл липосом 56,7 мг смеси липидов (фосфатидилхолин, холестерин в соотношении 7:3) растворяли в 3,8 мл хлороформа, затем 150 мг меропенема, растворенного в дистиллированной воде в объеме 1,5 мл, добавляли к раствору липидов в органической фазе и обрабатывали на роторном миксере мощностью 500 вт при 15000 об/мин в течение 1 мин до достижения образования эмульсии, после чего при пониженном давлении в роторном испарителе полностью удаляли органический растворитель. К образовавшемуся гелю добавляли до 5 мл дистиллированную воду и тщательно перемешивали, удаление невключившегося материала осуществляли диализом. В конечном варианте включаемый материал (меропенем) находится в водной фазе геля в результате формирования липидно-хлороформной эмульсии типа «вода в масле». Полученные нами липосомы имели размеры 1,0-1,2 мкм и содержали в 1,0 мл 30 мг меропенема.
4
Опыты поставлены на золотистых хомячках весом 90-110 г, животных, высокочувствительных к сапу, у которых заболевание протекает всегда в острой форме и заканчивается летально в течение 3-7 сут в зависимости от дозы заражения, если не проводится лечение. Заражение проведено подкожно в область правой паховой складки культурой В.mallei ц 5 в дозе 10 м.к., что соответствует 10 Dlm. Лечение начинали через 4 (экстренная профилактика), 24 ч и 48 ч липосомальными формами меропенема внутрибрюшинно 3-х и 5-кратно с интервалом в 72 ч, обычный раствор меропенема, растворенный в 0,9% NaCl, вводился ежедневно подкожно и внутрибрюшинно. Во всех сериях ежедневная доза составляла 50 мг/кг веса животного. Показано, что меропенем, растворенный в 0,9% NaCl, при парентеральном ежедневном введении не обладает защитным эффектом, но несколько удлиняет продолжительность жизни павших животных по сравнению с контролем заражения. В то же время липосомальная форма меропенема обеспечивает защиту 60-100% животных (р<0,01). Тем самым установлено, что липосомальная форма меропенема обеспечивает эффективную защиту животных от острых форм сапа, вызванных инфицированием золотистых хомячков В.mallei ц 5 в дозе 10 Dlm. Способ защиты базируется на биологическом явлении перманентного выхода из липосом эффективного антибиотика (меропенема) с последующим попаданием его через внутрибрюшинный лимфоток в кровеносную систему.
Таким образом предлагаемый способ состоит из предварительного получения инкапсулированного меропенема и моделирования острой формы сапа у чувствительных к этой инфекции лабораторных животных - для этого формируют 3 группы животных: одной проводится лечение инкапсулированным меропенемом, второй группе - меропенемом в обычном растворе для инъекций и третья группа - контрольная, которой лечение не проводится. Для получения эффективных концентраций инкапсулированного меропенема были подобраны оптимальные соотношения ингредиентов по вышеуказанному составу.
Примеры конкретного выполнения:
3
Пример 1. В опыт взяты 4 группы золотистых хомячков по 10 животных в каждой, заражение проведено подкожно в паховую область правой задней конечности штаммом В.mallei ц 5, взвесь бактерий вводили в дозе 10 м.к. (10 Dlm) в объеме 0,5 мл. Лечение меропенемом начиналось через 24 ч после инфицирования; липосомальный препарат (15 мг в 0,5 мл) вводился трехкратно, внутрибрюшинно с интервалом в 72 ч, последняя инъекция (3-я) сделана на 7-й день после заражения. Меропенем, растворенный в 0,9% NaCl, вводили ежедневно (15 мг в 0,5 мл) подкожно в контралатеральную заднюю конечность или внутрибрюшинно в той же дозе. Срок наблюдения за животными - 14 дней после заключительной инъекции антибиотика. Показано, что меропенем в растворе 0,9% NaCl защитным эффектом не обладает при обоих способах введения, в то же время препарат в той же суммарной дозе, введенной в липосомальной форме, защищал 60% зараженных животных при значительном увеличении сроков средней продолжительности жизни павших животных (табл.1).
4
3
1
4
Пример 2. Для выяснения значения роли начала лечения и кратности введения препарата золотистым хомячкам, зараженным 10 м.к. (10 Dlm), вводили липосомальную форму меропенема через 4 ч (экстренная профилактика), 24 ч и 48 ч после инфицирования, а затем в той же дозе (15 мг/0,5 мл) препарат вводили через каждые 72 ч 5-кратно (табл.2). Учет результатов опыта проводили через 10 сут после заключительной инъекции антибиотика, т.е. через 21 сут после исходного заражения. Обращает на себя внимание факт, что во всех контролях ни одно животное не прожило более 6 дней после подкожной инъекции взвеси В.mallei ц 5 в любой дозе от 10 до 10 м.к. В то же время все животные, леченные липосомальной формой меропенема, выжили и были забиты хлороформом на 26-й день после заражения. На вскрытии специфические для сапа поражения лимфоузлов и паренхиматозных органов не обнаружены.
Таким образом, применение предлагаемого способа значительно увеличило выживаемость лабораторных животных в острой форме сапа при введении инкапсулированного меропенема.
Таблица 1
Эффективность лечения экспериментального сапа золотистых хомячков меропенемом в различных формах введения
Препарат меропенема, доза
Способ введения меропенема, кратность
Способ заражения В.mallei ц 5, доза
Л
Т (сут)
% защиты
в липосомах 15 мг/72 ч
в/брюшинно, 3
п/кожно 10<sup>4</sup> м.к.
4/10
17,5
60
в растворе 0,9% NaCl 5 мг/24 ч
в/брюшинно, 10
п/кожно 10<sup>4</sup> м.к.
10/10
7,0
0
в растворе 0,9% NaCl 5 мг/24 ч
п/кожно, 10
п/кожно 10<sup>4</sup> м.к.
10/10
5,7
0
Контроль заражения - 1
-
п/кожно 10<sup>4</sup> м.к.
10/10
4,0
0
Контроль заражения - 2
-
п/кожно 10<sup>1</sup> м.к.
10/10
4,5
0
Примечания для таблиц 1 и 2:
Л - летальность, в числителе число погибших животных, в знаменателе число зараженных животных,
Т - средняя продолжительность жизни павших животных.
Таблица 2
Эффективность лечения экспериментального сапа липосомальной формой меропенема (15 мг/72 ч) в разные сроки от момента инфицирования, доза заражения 10<sup>3</sup> Dlm В.mallei ц 5
Время введения препарата
Кратность введения
Л
Т
% защиты
Через 4 ч
3
4/10
18
60%
Через 4 ч
5
0/10
-
100%
Через 24 ч
3
4/10
17,4
60%
Через 24 ч
5
0/10
-
100%
Через 48 ч
3
9/10
17,2
10%
Через 48 ч
5
0/9
-
100%
Контроль заражения
-
10/10
4,1
-