ПРИМЕНЕНИЕ CRY1AB В КОМБИНАЦИИ С CRY1BE ДЛЯ УПРАВЛЕНИЯ РЕЗИСТЕНТНОСТЬЮ НАСЕКОМЫХ
APPLICATION OF CRY1AB IN COMBINATION WITH CRY1BE TO CONTROL RESISTANCE OF INSECTS

Уровень техники
Люди выращивают кукурузу для получения продуктов питания и энергии. Люди также возделывают многие другие сельскохозяйственные культуры, включая соевые бобы и хлопчатник. Ежегодно миллиарды долларов тратятся на борьбу с насекомыми-вредителями, и еще миллиарды долларов теряются за счет ущерба, который они наносят. Синтетические органические химические инсектициды были основными инструментами, которые использовались для борьбы с насекомыми-вредителями, но биологические инсектициды, такие как инсектицидные белки, полученные из Bacillus thuringiensis (Bt), в некоторых областях сыграли весьма важную роль. Возможность получения устойчивых к насекомым растений посредством трансформации генов инсектицидных Bt-белков, привела к революционным преобразованиям в современном сельском хозяйстве, и подчеркнула важность и значение инсектицидных белков и их генов.
Некоторые Bt-белки использовали для создания устойчивых к насекомым трансгенных растений, которые к настоящему времени были успешно зарегистрированы и стали промышленно доступными. Они включают Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1Fа и Cry3Bb в кукурузе, Cry1Aс и Cry2Ab в хлопчатнике и Cry3A в картофеле.
Промышленно-доступные продукты, экспрессирующие данные белки, экспрессируют один белок, за исключением тех случаев, когда желателен комбинированный спектр 2 инсектицидных белков (например, Cry1Ab и Cry3Bb в комбинации в кукурузе для обеспечения устойчивости соответственно к чешуекрылым вредителям и корневым нематодам), или когда независимое действие белков делает их пригодными в качестве инструмента для задержки развития резистентности у чувствительных популяций насекомых (например, Cry1Aс и Cry2Аb в комбинации в хлопчатнике для обеспечения управления резистентностью у табачной листовертки). Смотри также публикацию заявки на патент США № 2009/0313717, которая относится к белку Cry2 плюс Vip3Aa, Cry1F или Cry1A для борьбы с Helicoverpa zea или armigerain. Международная заявка WO 2009/132850 относится к Cry1F или Cry1A и Vip3Aa для борьбы с Spodoptera frugiperda. Публикация заявки на патент США № 2008/0311096 частично относится к Cry1Ab для борьбы с кукурузным стеблевым мотыльком, резистентным к Cry1F (ECB; Ostrinia nubilalis (Hübner)).
То есть, некоторые свойства устойчивых к насекомым трансгенных растений, которые привели к быстрому и широкому внедрению данной технологии, также дали основание полагать, что в популяциях насекомых будет развиваться резистентность к инсектицидным белкам, продуцированным такими растениями. Было предложено несколько стратегий для того, чтобы сохранить применение Bt-признаков устойчивости к насекомым, которые включают применение действующих белков в высокой дозе в комбинации с «убежищем» и альтернативно с совместным размещением других токсинов (McGaughey et al. (1998) «B.t. Resistance Management», Nature Biotechnol., 16:144-146).
Для белков, выбранных для применения в стеках управления резистентностью насекомых (IRM), требуется проявлять их инсектицидный эффект независимо, так, чтобы резистентность, возникшая к одному белку, не придавала резистентности ко второму белку (т.е. отсутствовала перекрестная резистентность к белкам). Если, например, популяция вредителей, выбранная за счет наличия резистентности к «белку А», одновременно является восприимчивой к «белку В», то заявители утверждают, что отсутствует перекрестная резистентность и что комбинация белка А и белка В будет эффективной в задержке развития резистентности к одному белку А.
При отсутствии резистентных популяций насекомых можно провести прогностические оценки, основанные на других характеристиках, предположительно связанных с механизмом действия и возможностью развития перекрестной резистентности. Было предложено использовать опосредованное рецептором связывание для идентификации инсектицидных белков, для которых, вероятно, не характерна перекрестная резистентность (van Mellaert et al., 1999). Ключевым прогностическим показателем отсутствия перекрестной резистентности в данном подходе является тот факт, что инсектицидные белки не конкурируют за рецепторы у восприимчивых видов насекомых.
В том случае, когда два Bt-токсина конкурируют у насекомых за один и тот же рецептор, и если рецептор мутирует у этого насекомого таким образом, что один из токсинов больше не связывается с рецептором и в результате больше не проявляет инсектицидной активности против этого насекомого, то это может быть случаем, когда у насекомого также будет развиваться резистентность ко второму токсину (который конкурентно связан с тем же рецептором). То есть, насекомое обладает перекрестной резистентностью к обоим Bt-токсинам. Однако если два токсина связываются с двумя различными рецепторами, то это может быть показателем того, что насекомое не будет одновременно обладать резистентностью к этим двум токсинам.

TM
TM
Например, белок Cry1Fa используется для борьбы со многими чешуекрылыми насекомыми, включая кукурузного стеблевого мотылька (Hübner) и кукурузную листовую совку (FAW; Spodoptera frugiperda), и белок активен против огневки сахарного тростника (SCB; Diatraea saccharalis). Белок Cry1Fa, продуцированный в трансгенных растениях кукурузы, содержащий событие TC1507, ответственен за ведущий в отрасли признак резистентности насекомых в мероприятиях для борьбы с FAW. Белок Cry1Fa также входит в состав продуктов Herculex, SmartStax и WideStrike.
Возможность проводить исследования, основанные на связывании (конкурентном или гомологичном) с рецептором с использованием белка Cry1Fa была ограничена, поскольку доступный обычный метод введения метки в белки для детектирования в тестах связывания с рецептором приводил к инактивации инсектицидной активности белка Cry1Fa.
Дополнительные Cry-токсины приводятся на веб-сайте официального комитета по номенклатуре B.t. (Crickmore et al., lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/). В настоящее время известно почти 60 основных групп «Cry»-токсинов (Cry1-Cry59) с дополнительными Cyt- и VIP-токсинами и тому подобное. Многие из каждой нумерационной группы подразделяются на подгруппы под заглавной буквой, и подгруппы под заглавной буквой подразделяются на подподгруппы, обозначенные строчной буквой (например, Cry1 имеет A-L, и Cry1A имеет a-i).
Сущность изобретения
Настоящее изобретение частично относится к удивительному открытию того, что Cry1Ab и Cry1Be не конкурируют за сайты связывания в мембранных препаратах клеток кишечника кукурузного стеблевого мотылька (ECB; Ostrinia nubilalis (Hübner)) или кукурузной листовой совки (FAW; Spodoptera frugiperda). Как это будет понятно специалистам в данной области с помощью данного раскрытия, растения, которые продуцируют два эти белка (включая инсектицидные фрагменты полноразмерных белков), могут задерживать или предупреждать развитие резистентности к любому одному из данных инсектицидных белков. Кукуруза и соевые бобы являются только некоторыми предпочтительными растениями. ECB представляет предпочтительный вредитель-мишень для данной пары токсинов.
Таким образом, настоящее изобретение частично относится к применению белка Cry1Ab в комбинации с белком Cry1Be. Растения (и территории, засаженные такими растениями), которые продуцируют оба таких белка, включены в объем настоящего изобретения.
Настоящее изобретение также относится к тройным стекам или «пирамидам» из трех (или более) токсинов, в которых белки Cry1Ab и Cry1Be являются основной парой. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления пирамид комбинация выбранных токсинов обеспечивает три сайта действия против ECB. Некоторые предпочтительные пирамидные комбинации с «тремя местами действия» включают основную пару белков по настоящему изобретению плюс Cry2A, Cry1I и DIG-3 в качестве третьего белка для целенаправленного действия на ECB. Такие конкретные тройные стеки будут, по настоящему изобретению, преимущественно и поразительно обеспечивать три сайта действия против ECB. Это может помочь снизить или элиминировать необходимость в территориях-«убежищах».
Несмотря на то, что настоящее изобретение раскрывается в данном документе в виде пары токсинов Cry1Ab и Cry1Be, которые по отдельности или в «пирамиде» из трех или более токсинов, которые обеспечивают устойчивость кукурузы к ECB, очевидно, понятно, что комбинации Cry1Ab и Cry1Be, описанные в данном документе, также можно использовать с дополнительными белками для целенаправленного воздействия на FAW на соевых бобах и кукурузе.
Также по настоящему изобретению можно добавить дополнительные токсины/гены. Например, если Cry1Fa подвергают стекингу с парой белков по настоящему изобретению (Cry1Fa и Cry1Be оба активны против FAW и ECB), то добавление одного дополнительного белка к данному тройному стеку, где четвертый добавленный белок направлен против ECB, будет обеспечивать три сайта действия против FAW, и три сайта действия против ECB. Такой добавленный белок (четвертый белок для направленного действия против FAW) можно выбрать из группы, состоящей из Cry1Fa, Vip3Ab и Cry1E. Это будет приводить к обеспечению стека из четырех белков, имеющего три сайта действия против двух насекомых (ECB и FAW).
Краткое описание таблиц
Таблица 1: приводятся примеры аминокислот из четырех классов аминокислот.
Краткое описание фигур
Фиг.1: представлен график, показывающий связывание в процентах меченого Cry1Ab с ECB BBMV по сравнению с Cry1Be.
Фиг.2: представлен график, показывающий связывание в процентах меченого Cry1Ab с FAW BBMV по сравнению с Cry1Be.
Фиг.3: представлен график, показывающий связывание в процентах меченого Cry1Be с FAW BBMV по сравнению с Cry1Ab.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение частично относится к удивительному открытию того, что Cry1Ab и Cry1Be не конкурируют друг с другом за сайты связывания в кишечнике кукурузного стеблевого мотылька (ECB; Ostrinia nubilalis (Hübner)) или кукурузной листовой совки (FAW; Spodoptera frugiperda). Таким образом, белок Cry1Ab можно использовать в комбинации с белком Cry1Be в трансгенной кукурузе (и других растениях, например, хлопчатнике и соевых бобах) для задержки и предупреждения развития резистентности у ECB к любому одному из данных белков. Пара белков по настоящему изобретению может быть эффективной в защите растений (таких как растения кукурузы) от повреждения ECB с резистентностью к Cry. То есть, одним применением настоящего изобретения является зашита кукурузы и других экономически важных видов сельскохозяйственных культур от повреждения и потерь урожая, вызванных популяциями ECB, у которых может развиться резистентность к Cry1Ab или Cry1Be.
Таким образом, настоящее изобретение относится к стеку для управления резистентностью у насекомых (IRM), включающему Cry1Ab и Cry1Be, для предупреждения или подавления развития резистентности ECB к одному или обоим данным белкам.
Кроме того, несмотря на то, что настоящее изобретение, раскрытое в данном документе, относится к стеку IRM, содержащему Cry1Ab и Cry1Be, для предупреждения резистентности ECB к одному или обоим данным белкам, в объеме изобретения, раскрытого в данном документе, находится то, что один или оба Cry1Ab и Cry1Be можно адаптировать, самостоятельно или в комбинации, для предупреждения резистентности FAW к одному или обоим данным белкам.
Настоящее изобретение относится к композициям для борьбы с чешуекрылыми вредителями, содержащим клетки, которые продуцируют истинный токсин-содержащий белок Cry1Ab и истинный токсин-содержащий белок Cry1Be.
Изобретение дополнительно включает хозяина, трансформированного для продукции как инсектицидного белка Cry1Ab, так и инсектицидного белка Cry1Be, где указанный хозяин является микроорганизмом или растительной клеткой. Полинуклеотид(ы) по настоящему изобретению предпочтительно находится в генетической конструкции под контролем не-Bacillus thuringiensis промотора(ов). Полинуклеотиды по настоящему изобретению могут содержать кодон, предпочтительный для применения в растениях для повышенной экспрессии.
Дополнительно предполагается, что изобретение относится к способу борьбы с чешуекрылыми вредителями, включающему контактирование указанных вредителей или окружающей среды указанных вредителей с эффективным количеством композиции, которая содержит инсектицидный белок Cry1Ab и дополнительно содержит инсектицидный белок Cry1Be.
Вариант осуществления изобретения относится к растению кукурузы, содержащему экспрессируемый в растении ген, кодирующий истинный токсин-содержащий белок Cry1Be, и экспрессируемый в растении ген, кодирующий истинный токсин-содержащий белок Cry1Ab, и семя такого растения.
Дополнительный вариант осуществления изобретения относится к растению кукурузы, где экспрессируемый в растении ген, кодирующий истинный токсин-содержащий белок Cry1Be, и экспрессируемый в растении ген, кодирующий истинный токсин-содержащий белок Cry1Ab, интрогрессированы в указанное растение кукурузы, и семени такого растения.
Как описано в примерах, опыты с конкурентным связыванием с рецептором с использованием меченных радиоактивной меткой белков Cry1Ab и Cry1Be показывают, что белок Cry1Be не конкурирует за связывание в тканях ECB или FAW, с которыми связывается Cry1Ab. Данные результаты также указывают на то, что комбинация белков Cry1Ab и Cry1Be может быть эффективным средством для подавления развития резистентности в популяциях ECB и FAW к одному из двух данных белков. Таким образом, основываясь частично на данных, описанных в настоящем документе, полагается, что совместная продукция (стекинг) белков Cry1Ab и Cry1Be может использоваться для высокоэффективного стека IRM для ECB.
К этой паре можно добавить другие белки. Например, настоящее изобретение также частично относится к тройным стекам или «пирамидам» из трех (или более) токсинов, в которых Cry1Ab и Cry1Be являются основной парой. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления пирамид выбранные токсины имеют три отдельных сайта действия против FAW. Некоторые предпочтительные пирамидные комбинации с «тремя сайтами действия» включают основную пару по настоящему изобретению плюс Cry1Fa, Vip3Ab, Cry1C, Cry1D или Cry1E в качестве третьего белка для целенаправленного действия на FAW. Данные конкретные тройные стеки по настоящему изобретению будут преимущественно и поразительно обеспечивать три места сайта против FAW. Это поможет снизить или элиминировать потребность в территориях-убежищах. Под выражением «отдельные сайты действия» понимается, что любой из данных белков не вызывает перекрестной резистентности в другом.
К настоящему изобретению также можно добавить дополнительные токсины/гены. Например, если Cry1Fa входит в состав стека с парой белков по настоящему изобретению (оба Cry1Ab и Cry1Be активны против обоих FAW и кукурузного стеблевого мотылька (ECB)), то добавление одного дополнительного белка к данному тройному стеку, где четвертый добавленный белок направлен против ECB, будет обеспечиваться три сайта действия против FAW и три сайта действия против ECB. Данный добавленный белок (четвертый белок) можно выбрать из группы, состоящей из Cry2A, Cry1I и DIG-3 (смотри заявку на патент США № 61/284278 (поданную 16 декабря 2009) и заявку на патент США № 2010/00269223). Это будет приводить к получению стека из четырех белков, содержащего три сайта действия против насекомых (ECB и FAW).
Таким образом, одной возможностью внедрения является применение пары белков по настоящему изобретению в комбинации с третьим токсином/геном и применение данного тройного стека для подавления развития резистентности у ECB и/или FAW к любому из данных токсинов. Следовательно, настоящее изобретение также частично относится к тройным стекам или «пирамидам» из трех (или более) токсинов. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления пирамид выбранные токсины имеют три отдельных сайта действия против ECB и/или FAW.
Среди возможностей внедрения по настоящему изобретению будет применение двух, трех или более белков из белков по настоящему изобретению в районах с возделыванием сельскохозяйственных культур, где могут развиться резистентные популяции ECB и/или FAW.
Руководство по применению Cry1Fa и Cry1Be (для борьбы с ECB и/или FAW) смотри в заявке на патент США № 61/284290 (поданной 16 декабря 2009). С Cry1Fa, активным против ECB (и FAW), Cry1Ab плюс Cry1Be, плюс Cry1Be по настоящему изобретению преимущественно и удивительно обеспечиваются три сайта действия против ECB. Это может помочь снизить или элиминировать потребность в территориях-убежищах.

TM
TM

TM
TM
Белок Cry1Fa входит в состав продуктов Herculex, SmartStax и WideStrike. Пару генов по настоящему изобретению (Cry1Ab и Cry1Be) можно объединить, например, в продукте на основе Cry1Fa, таком как Herculex, SmartStax и WideStrike. Следовательно, пара белков по настоящему изобретению может быть эффективной в снижении давления отбора на данные и другие белки. Таким образом, пару белков по настоящему изобретению можно использовать в комбинациях из трех генов для кукурузы и других растений (например, хлопчатника и соевых бобов).
Как уже обсуждалось выше, к настоящему изобретению также можно добавить дополнительные токсины/гены. Для целенаправленного воздействия на ECB можно использовать Cry2A, Cry1I и/или DIG-3. Смотри, например, заявку на патент США № 61/284278 (поданную 16 декабря 2009) и заявку на патент США № 2010/00269223. Информацию по комбинации Cry1F и Cry1Ab (для борьбы с ECB) смотри в публикации заявки на патент США № 2008/0311096.
Растения (и территории, засаженные такими растениями), которые продуцируют любую из комбинаций белков по настоящему изобретению, включаются в объем настоящего изобретения. Также можно добавить дополнительные токсины/гены, но конкретные стеки, обсужденные выше, преимущественно и поразительно обеспечивают многочисленные сайты действия против ECB и/или FAW. Это может помочь снизить или элиминировать потребность в территориях-убежищах. Таким образом, поле площадью более 10 акров, засаженное такими растениями, включается в объем изобретения.
GENBANK также можно использовать для получения последовательностей любого из генов и белков, которые обсуждаются в данном документе. Смотри Приложение А ниже. Также можно использовать патенты. Например, в патенте США № 5188960 и патенте США № 5827514 описаны истинный токсин-содержащие белки Cry1F, подходящие для применения в осуществлении изобретения. В патенте США № 6218188 описаны ДНК-последовательности, оптимизированные для применения в растениях, кодирующие истинные токсин-содержащие белки Cry1Fa, которые подходят для использования в настоящем изобретении.
Комбинации белков, описанные в данном документе, можно использовать для борьбы с чешуекрылыми вредителями. Взрослые чешуекрылые насекомые, бабочки и мотыльки питаются, главным образом, нектаром цветов и являются основными эффекторами опыления. Почти все личинки чешуекрылых насекомых, т.е. гусеницы, питаются на растениях, и многие из них являются серьезными вредителями. Гусеницы питаются на поверхности и внутри листьев, или на корнях или стебле растений, тем самым лишая растение питательных веществ и часто разрушая физическую поддерживающую структуру растения. Кроме того, гусеницы питаются на фруктах, хлопке и хранящихся зернах, а также цветах, разрушая эти продукты, предназначенные для продажи, или серьезно снижают их качество. В том смысле, в котором в данном документе используется термин «чешуекрылые вредители», он относится к различным стадиям развития вредителя, включая личиночные стадии.
Некоторые химерные токсины по настоящему изобретению включают полный N-концевой фрагмент, соответствующий истинному токсину Bt-токсина, в той же точке после конца фрагмента истинного токсина белок имеет переход в гетерологичную последовательность протоксина. N-концевой, активный в качестве инсектицида фрагмент токсина в Bt-токсине, далее относится к «истинному токсину». Переход сегмента истинного токсина в сегмент гетерологичного протоксина находится примерно в соединении токсина/протоксина, или альтернативно фрагмент нативного протоксина (простирающийся за фрагментом истинного токсина) может сохраниться, с переходом в гетерологичный протоксин, расположенным даунстрим.
В качестве примера один химерный токсин по настоящему изобретению имеет полный фрагмент истинного токсина белка Cry1Ab (аминокислоты 1-601) и/или гетерологичный протоксин (примерно аминокислоты 602 до С-конца). В одном предпочтительном варианте осуществления фрагмент химерного токсина, содержащий протоксин, получают из белка-токсина Cry1Ab. В предпочтительном варианте осуществления фрагмент химерного токсина, содержащий протоксин, получают из белка-токсина Cry1Ab.
Специалистам в данной области, очевидно, понятно, что Bt-токсины, даже внутри определенного класса, такого как Cry1Be, до некоторой степени будут варьировать в длине и точном положении перехода от фрагмента истинного токсина к фрагменту протоксина. Как правило, токсины Cry1Be имеют длину примерно от 1150 до примерно 1200 аминокислот. Обычно переход от фрагмента истинного токсина к фрагменту протоксина составляет примерно от 50% до примерно 60% от полной длины токсина. Химерный токсин по настоящему изобретению будет включать полную экспансию данного N-концевого фрагмента истинного токсина. Таким образом, химерный токсин будет включать, по меньшей мере, примерно 50% от полной длины Cry1Be. Это будет составлять, по меньшей мере, примерно 590 аминокислот. В отношении фрагмента протоксина, то полная экспансия фрагмента протоксина Cry1Ab будет простираться от конца фрагмента истинного токсина до С-конца молекулы.
Гены и токсины
. Гены и токсины, пригодные для применения по настоящему изобретению, включают не только раскрытые полноразмерные последовательности, но также фрагменты данных последовательностей, варианты, мутанты и слитые белки, которые сохраняют специфическую пестицидную активность токсинов, конкретно приведенных в качестве примера. В том смысле, в котором в данном документе используются термины «варианты» или «вариации» генов, они относятся к нуклеотидным последовательностям, которые кодируют одни и те же токсины, или которые кодируют эквивалентные токсины, обладающие пестицидной активностью. В том смысле, в котором в данном документе используется термин «эквивалентные токсины», он относится к токсинам, обладающим такой же или по существу такой же биологической активностью против вредителей-мишеней, как и токсины по настоящему изобретению.
В том смысле, в котором в данном документе используется этот термин, границы представляют примерно 95% (Cry1Ab's и Cry1Be's), 78% (Cry1Ab's и Cry1Be's) и 45% (Cry1's) идентичность последовательностей согласно «Revision of the Nomenclature for the Bacillus thuringiensis Pesticidal Crystal Proteins», N. Crickmore, D.R. Zeigler, J. Feitelson, E. Schnepf, J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum and D.H. Dean. Microbiology and Molecular Biology Reviews (1998), Vol. 62:807-813. Эти пороги отсечения молекулярной массы также могут быть применимы только к истинным токсинам.
Специалистам в данной области, очевидно, понятно, что гены, кодирующие активные токсины, можно идентифицировать и получить несколькими способами. Конкретные гены или фрагменты генов, приведенные в качестве примера, можно получить из изолятов, депозированных в коллекции культур, как описано выше. Данные гены или их фрагменты, или варианты, также можно сконструировать синтетическим путем, например, при использовании синтезатора генов. Вариации генов можно легко сконструировать с использованием обычных способов получения точечных мутаций. Также фрагменты данных генов можно получить с использованием промышленно доступных экзонуклеаз или эндонуклеаз, следуя стандартным процедурам. Например, можно использовать ферменты, такие как Bal31, или сайт-направленный мутагенез для методичного отсечения нуклеотидов от концов таких генов. Также гены, которые кодируют активные фрагменты, можно получить с использованием различных рестриктаз. Протеазы можно использовать для непосредственного получения активных фрагментов данных токсинов.
Фрагменты и эквивалентные варианты, которые сохраняют пестицидную активность приведенных в качестве примера токсинов, будут находиться в объеме настоящего изобретения. Также за счет вырожденности генетического кода широкий ряд различных ДНК-последовательностей может кодировать аминокислотные последовательности, раскрытые в данном документе. Специалистам в данной области хорошо известно получение таких альтернативных ДНК-последовательностей, кодирующих одни и те же или по существу одни и те же токсины. Такие вариантные ДНК-последовательности находятся в объеме настоящего изобретения. В том смысле, в котором в данном документе используется термин «по существу одни и те же» последовательности, он относится к последовательностям, которые имеют аминокислотные замены, делеции, добавления или инсерции, которые не оказывают существенного отрицательного влияния на пестицидную активность. Фрагменты генов, кодирующих белки, которые сохраняют пестицидную активность, также входят в объем данного определения.
Дополнительным способом идентификации генов, кодирующих токсины, и фрагментов генов, пригодных для настоящего изобретения, является применение олигонуклеотидных зондов. Такие зонды представляют детектируемые нуклеотидные последовательности. Эти последовательности можно детектировать с использованием соответствующей метки или их можно сделать изначально флуоресцентными, как описано в международной заявке WO 93/16094. Как хорошо известно в данной области, если молекула зонда и образец нуклеиновой кислоты гибридизуются с образованием сильной связи между двумя молекулами, то разумно предположить, что зонд и образец имеют значительную гомологию. Предпочтительно гибридизацию проводят в жестких условиях с использованием методов, известных в данной области, описанных, например, Keller G.H., M.M. Manak (1987) DNA Probes, Stockton Press, New York, N.Y., pp. 169-170. Некоторые примеры концентраций солей и комбинаций температуры являются следующими (в порядке увеличения жесткости): 2X SSPE или SSC при комнатной температуре; 1X SSPE или SSC при 42°С; 0,1X SSPE или SSC при 42°С; 0,1X SSPE или SSC при 65°С. Детектирование зонда обеспечивает способ определения известным путем того, имела ли место гибридизация. Такой анализ зонда обеспечивает быстрый способ идентификации генов, кодирующих токсины по настоящему изобретению. Нуклеотидные сегменты, которые используются в качестве зондов по изобретению, можно синтезировать с использованием ДНК-синтезатора и стандартных методов. Такие нуклеотидные последовательности также можно использовать в качестве ПЦР-праймеров для амплификации генов по настоящему изобретению.
Вариантные токсины.
Некоторые токсины по настоящему изобретению конкретно приводятся в качестве примера в данном документе. Поскольку данные токсины являются только примерами токсинов по настоящему изобретению, то, очевидно, понятно, что настоящее изобретение включает вариантные или эквивалентные токсины (и нуклеотидные последовательности, кодирующие эквивалентные токсины), обладающие такой же или аналогичной пестицидной активностью примерного токсина. Эквивалентные токсины должны обладать аминокислотной гомологией с примерным токсином. Как правило, такая аминокислотная гомология будет составлять более 75%, предпочтительно более 90% и наиболее предпочтительно более 95%. Аминокислотная гомология будет наиболее высокой в наиболее важных областях токсина, которые отвечают за биологическую активность или принимают участие в определении трехмерной конфигурации, которая в конечном итоге ответственна за биологическую активность. В этом отношении приемлемы некоторые аминокислотные замены, и можно ожидать, что такие замены находятся в областях, которые не являются важными для проявления активности, или представляют собой консервативные аминокислотные замены, которые не оказывают отрицательного влияния на трехмерную конфигурацию молекулы. Например, аминокислоты можно разделить на следующие классы: неполярные, незаряженные полярные, основные и кислые. Консервативные замены, посредством которых аминокислота одного класса замещается другой аминокислотой того же типа, находятся в объеме настоящего изобретения, при условии, что замена существенно не изменяет биологическую активность соединения. Ниже приводится перечень примеров аминокислот, относящихся к каждому классу.
Таблица 1
Примеры аминокислот в четырех классах аминокислот
<img file="00000001.tif" he="38" wi="156" img-content="undefined" img-format="tif" />
В некоторых случаях также можно провести неконсервативные замены. Критическим фактором является то, что такие замены не должны существенно снижать биологическую активность токсина.
Рекомбинантные хозяева.
Гены, кодирующие токсины по настоящему изобретению, можно ввести в широкий ряд микробных или растительных хозяев. Экспрессия гена токсина, прямо или опосредованно, приводит к внутриклеточной продукции и сохранению пестицида. Коньюгационный перенос и рекомбинантный перенос можно использовать для получения Bt-штамма, который экспрессирует оба токсина по настоящему изобретению. Также можно трансформировать другие микроорганизмы-хозяева одним или обоими генами токсинов для получения синергического эффекта. Относительно подходящих микроорганизмов-хозяев, например, Pseudomonas, то микробы можно применить в положение вредителя, где они будут пролиферировать и поглощаться. Результатом является борьба с вредителем. Альтернативно микроорганизм, содержащий ген токсина, можно обработать в условиях, которые пролонгируют активность токсина и стабилизируют клетку. Затем на обработанную клетку, которая сохраняет токсическую активность, можно воздействовать средой вредителя-мишени.
В том случае, когда ген Bt-токсина вводят в микроорганизм-хозяин с помощью подходящего вектора, и на указанный хозяин воздействуют средой в живом состоянии, то важно, чтобы использовались определенные микроорганизмы-хозяева. Выбирают микроорганизмы-хозяева, о которых известно, что они обитают в «фитосфере» (филлоплане, филлосфере, ризосфере и/или ризоплане) одной или более интересующих культур. Данные микроорганизмы выбирают таким образом, чтобы они были способны успешно конкурировать в определенной окружающей среде (культура и другие насекомые-обитатели) с микроорганизмами дикого типа для обеспечения стабильного поддержания и экспрессии гена, экспрессирующего полипептид-пестицид, и желательно, обеспечения повышенной защиты пестицида от деградации и инактивации в окружающей среде.
Известно большое количество микроорганизмов, которые обитают в филлоплане (на поверхности листьев растений) и/или ризосфере (в почве, окружающей корни растений) широкого ряда важных сельскохозяйственных культур. Такие микроорганизмы включают бактерии, водоросли и грибы. Особый интерес представляют микроорганизмы, такие как бактерии, например, родов Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophillius, Agrobactenum, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azobacter, Leuconostoc и Alacaligenes; грибы, в частности, дрожжи, например, родов Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula и Aureobasidium. Особый интерес представляют такие виды бактерий, которые обитают в фитосфере, как Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobactenium tumefaciens, Rhodopseudomonas spheroids, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus и Azotobacter vinlandii, и виды дрожжей фитосферы, такие как Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces roseus, S. odorus, Kluyveromyces veronae и Aureobasidium pollulans. Особый интерес представляют пигментированные микроорганизмы.
Имеется большое количество способов интродукции Bt-гена, кодирующего токсин, в микроорганизм-хозяин в условиях, которые обеспечивают стабильное сохранение и экспрессию гена. Эти способы хорошо известны специалистам в данной области и описаны, например, в патенте США № 5135867, который включен в данный документ для сведения.
Обработка клеток.
Bacillus thuringiensis или рекомбинантные клетки, экспрессирующие Bt-токсины, можно обработать для пролонгирования активности токсинов и стабилизации клетки. Пестицидная микрокапсула, которая образуется, содержит Bt-токсин или Bt-токсины в клеточной структуре, которая стабилизирована и будет защищать токсин, когда микрокапсула подвергается воздействию окружающей среды вредителя-мишени. Подходящие клетки-хозяева могут включать прокариоты или эукариоты, и обычно ограничиваются клетками, которые не продуцируют веществ, токсичных для высших организмов, таких как млекопитающие. Однако можно использовать микроорганизмы, которые продуцируют вещества, токсичные для высших организмов, в том случае, когда токсичные вещества являются нестабильными, или их содержание является достаточно низким для того, чтобы избежать проявления любой возможной токсичности для млекопитающего-хозяина. В качестве хозяев особый интерес представляют прокариоты и низшие эукариоты, такие как грибы.
При обработке обычно клетки должны быть интактными и в основном находиться в пролиферативной форме, лучше не в форме спор, хотя, в некоторых случаях можно использовать споры.
Обработку клетки микроорганизма, например, микроорганизма, содержащего ген или гены Bt-токсина, можно проводить химическим или физическим методами, или комбинацией химического и/или физического методов, при условии, что метод не оказывает отрицательного влияния на свойства токсина и не снижает способности клеток защищать токсин. Примерами химических реагентов являются галогенированные соединения, в частности, галогенсодержащие соединения с 17-80 атомами. Конкретнее, можно использовать иод в мягких условиях и в течение достаточного периода времени для достижения желаемых результатов. Другие подходящие способы включают обработку альдегидами, такими как глутаральдегид; противоинфекционными препаратами, такими как зефиран хлорид и цетилпиридиний хлорид; спиртами, такими как изопропиловый и этиловый спирт; различными гистологическими фиксаторами, такими как иодный раствор Люголя, фиксатор Буэна, различные кислоты и фиксатор Хелли (смотри Humason, Gretchen L., Animal Tissue Techniques, W.H. Freeman and Company, 1967) или обработку комбинацией физического (нагревание) и химического агентов, которые сохраняют и пролонгируют активность токсина, продуцированного в клетке, когда клетку вводят в среду хозяина. Примерами физических методов являются коротковолновое облучение, такое как гамма-облучение, и рентгеновское облучение, УФ-облучение, лиофилизация и тому подобное. Способы обработки клеток микроорганизмов раскрыты в патентах США № 4695455 и 4695462, которые включены в данный документ для сведения.
Как правило, клетки имеют повышенную стабильность структуры, которая повышает устойчивость к воздействию условий окружающей среды. В тех случаях, когда пестицид находится в проформе, то метод обработки клеток следует выбрать таким образом, чтобы не ингибировать процессинг проформы в зрелую форму пестицида под действием патогена вредителя-мишени. Например, формальдегид будет поперечно сшивать белки и может ингибировать процессинг проформы полипептида-пестицида. Способ обработки должен сохранять, по меньшей мере, значительную часть биологической доступности или биологической активности токсина.
Характеристики, представляющие особый интерес при выборе клетки-хозяина для целей продукции, включают простоту введения Bt-гена или Bt-генов хозяину, доступность экспрессионных систем, эффективность экспрессии, стабильность пестицида в хозяине и наличие дополнительных генетических свойств. Характеристики, представляющие особый интерес для применения в качестве микрокапсулы пестицида, включают защитные свойства для пестицида, такие как толщина клеточных стенок, пигментация и внутриклеточная упаковка или образование телец включения; выживаемость в водной среде; отсутствие токсичности для млекопитающих; привлекательность для захвата вредителями; простота в индукции гибели и фиксации без повреждения токсина и тому подобное. Другие факторы включают простоту формуляции и обращения, экономические соображения, стабильность при хранении и тому подобное.
Рост клеток.
Клетку-хозяин, содержащую инсектицидный Bt-ген или Bt-гены, можно культивировать в любой обычной питательной среде, в которой ДНК-конструкция обеспечивает избирательное преимущество, обеспечивая селективную среду, в которой по существу все или все клетки сохраняют Bt-ген. Затем можно собрать такие клетки с использованием обычных методов. Альтернативно клетки можно обработать до сбора.
Bt-клетки, продуцирующие токсины по изобретению, можно культивировать с использованием обычных в данной области сред и методов ферментации. После осуществления цикла ферментации бактерии можно собрать первым отделением спор и кристаллов Bt из культурального бульона способами, известными в данной области. Выделенные споры и кристаллы Bt можно формулировать в виде смачиваемого порошка, жидкого концентрата, гранул и других препаративных форм с добавлением поверхностно-активных веществ, диспергаторов, инертных носителей и других компонентов для облегчения обращения с ними и их применения против конкретных вредителей-мишеней. Такие препаративные формы и способы применения известны в данной области.
Препаративные формы.
Формулированные гранулы-приманки, содержащие аттрактант и споры, кристаллы и токсины Bt-изолятов, или рекомбинантные микроорганизмы, содержащие гены, полученные из Bt-изолятов, раскрытых в данном документе, можно вносить в почву. Формулированный продукт также можно применять в виде покрытия семен или агента для обработки корней, общей обработки растений на более поздних стадиях вегетационного периода. Для обработки растений и почвы Bt-клетками можно использовать смачиваемые порошки, гранулы или дусты, которые получают смешением с различными инертными веществами, такими как неорганические минеральные вещества (филлосиликаты, карбонаты, сульфаты, фосфаты и тому подобное) или материалы растительного происхождения (такие как измельченная сердцевина кукурузного початка, рисовая шелуха, скорлупа орехов и тому подобное). Препаративные формы могут включать адъюванты прилипатели, стабилизирующие агенты, другие пестицидные добавки или поверхностно-активные вещества. Жидкие препаративные формы могут быть на водной или неводной основе, и их можно применять в виде пен, гелей, суспензий, эмульгируемых концентратов или тому подобное. Ингредиенты могут включать реологическую добавку, поверхностно-активные вещества, диспергаторы или полимеры.
2
4
Специалистам в данной области, очевидно, понятно, что концентрация пестицида будет варьировать в широких пределах в зависимости от природы конкретной формуляции, в частности, является ли она концентратом или предназначена для непосредственного применения. Пестицид будет находиться в концентрации, составляющей, по меньшей мере, 1% мас., или концентрация может равняться 100% мас. Сухие препаративные формы будут содержать примерно 1-95% мас. пестицида, в то время как жидкие препаративные формы обычно будут содержать примерно 1-60% мас. твердых частиц в жидкой фазе. В препаративных формах обычно будет находиться примерно от 10 до примерно 10 клеток/мг. Такие препаративные формы будут применяться в количествах примерно от 50 мг (жидкость или сухое вещество) до 1 кг или более на га.
Препаративные формы можно применять в среде обитания чешуекрылого вредителя, например, на листья или в почву, опрыскиванием, опылением, поливом или тому подобное.
Трансформация растений.
Предпочтительный рекомбинантный хозяин для продукции инсектицидных белков по настоящему изобретению представляет собой трансформированное растение. Гены, кодирующие Bt-белки токсины, раскрытые в данном документе, можно вставить в растительные клетки с использованием различных способов, хорошо известных в данной области. Например, имеется большое количество клонирующих векторов, содержащих репликационную систему Escherichia coli, и маркер, который позволяет отобрать трансформированные клетки для проведения инсерции чужеродных генов в высшие растения. Векторы включают, среди прочего, например, pBR322, серии pUC, серии M13mp, pACYC184. Следовательно, фрагмент ДНК, содержащий последовательность, кодирующую Bt-белок токсин, можно вставить в вектор в подходящем сайте рестрикции. Полученную плазмиду используют для трансформации E. coli. Клетки E. coli культивируют в подходящей питательной среде, затем собирают и лизируют. Плазмиду выделяют. Как правило, проводят анализ последовательности, рестрикционный анализ, электрофорез и используют другие биохимические-молекулярные биологические методы в качестве методов анализа. После каждой манипуляции используемую ДНК-последовательность можно расщепить и присоединить к следующей ДНК-последовательности. Каждую последовательность плазмиды можно клонировать в одну и ту же или разные плазмиды. В зависимости от способа вставки желаемых генов в растение, могут быть необходимы другие ДНК-последовательности. Например, если для трансформации растительной клетки используют Ti- или Ri-плазмиду, то, по меньшей мере, правую границу, но часто правую и левую границу Т-ДНК Ti- или Ri-плазмиды, следует соединить в виде фланкирующей области генов, предназначенных для вставки. Применение Т-ДНК для трансформации растительных клеток интенсивно исследовалось и в достаточной мере описано в Европейском патенте 120516, Lee and Gelvin (2008), Hoekema (1985), Fraley et al. (1986) и An et al. (1985), и хорошо известно в данной области.
После интеграции вставленной ДНК в геном растения она является относительно стабильной. Обычно вектор для трансформации содержит селектируемый маркер, который придает трансформированным растительным клеткам резистентность, среди прочего, к биоциду или антибиотику, такому как биалафос, канамицин, G418, блеомицин или гигромицин. Индивидуально используемый маркер, следовательно, позволит отобрать трансформированные клетки лучше, чем клетки, которые не содержат вставленную ДНК.
Имеется большое количество методов для инсерции ДНК в растительную клетку-хозяин. Такие методы включают трансформацию Т-ДНК с использованием Agrobacterium tumefaciens или Agrobacterium rhizogenes в качестве трансформирующего агента, слияние, инъекцию, биологическую баллистику (бомбардировку микрочастицами) или электропорацию, а также другие возможные методы. Если для трансформации используют Agrobacteria, то ДНК, предназначенную для вставки, клонируют в специальные плазмиды, а именно в промежуточный вектор или бинарный вектор. Промежуточные векторы можно интегрировать в Ti- или Ri-плазмиду гомологичной рекомбинацией благодаря последовательностям, которые являются гомологичными к последовательностям Т-ДНК. Ti- или Ri-плазмида также содержит vir-область, необходимую для переноса Т-ДНК. Промежуточные векторы не могут реплицироваться самостоятельно в Agrobacteria. Промежуточный вектор можно перенести в Agrobacterium tumefaciens с помощью плазмиды-хелпера (конъюгацией). Бинарные векторы могут реплицироваться в E. coli и Agrobacteria. Они включают селективный ген-маркер и линкер или полилинкер, который вставлен в рамку правой и левой пограничных областей Т-ДНК. Их можно непосредственно трансформировать в Agrobacteria (Holsters et al., 1978). При использовании в качестве клетки-хозяина Agrobacterium должны содержать плазмиду, несущую vir-область. Vir-область необходима для переноса Т-ДНК в растительную клетку. Могут содержаться дополнительные Т-ДНК. Трансформированную таким образом бактерию используют для трансформации растительных клеток. Экспланты растений преимущественно можно культивировать с Agrobacterium tumefaciens или Agrobacterium rhizogenes для переноса ДНК в растительную клетку. Затем можно регенерировать целые растения из инфицированного растительного материала (например, кусочков листа, сегментов стебля, корней, а также протопластов или культивированных в суспензии клеток) в подходящей среде, которая может содержать антибиотики или биоциды по изобретению. Затем полученные таким образом растения можно тестировать на присутствие вставленной ДНК. Отсутствуют особые требования в отношении плазмид в случае методов инъекции и электропорации. Можно использовать обычные плазмиды, например, такие как производные pUC.
Трансформированные клетки развиваются в растениях обычным путем. Они могут образовать зародышевые клетки и передать трансформированный признак(и) потомству растений. Такие растения можно выращивать обычным путем и скрещивать с растениями, которые имеют те же трансформированные наследственные факторы или другие наследственные факторы. Полученные гибриды имеют соответствующие фенотипические свойства.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения растения следует трансформировать генами, в которых кодон предпочтительно оптимизирован для применения в растениях. Смотри, например, патент США № 5380831, который включен в данный документ для сведения. Несмотря на то, что в данном документе в качестве примера приводятся усеченные токсины, хорошо известно в области Bt-токсинов, что токсины массой 130 kDa (полная длина) имеют N-концевой фрагмент, который является истинным токсином, и С-концевой фрагмент является «хвостом» протоксина. Таким образом, соответствующие «хвосты» можно использовать с усеченными/истинными токсинами по настоящему изобретению. Смотри, например, патент США № 6218188 и патент США № 6673990. Кроме того, в данной области известны способы получения синтетических Bt-генов для применения в растениях (Stewart and Burgin, 2007). Одним неограничивающим примером предпочтительного трансформированного растения является фертильное растение кукурузы, содержащее экспрессируемый в растении ген, кодирующий белок Cry1Ab, и дополнительно содержащий второй экспрессируемый в растении ген, кодирующий белок Cry1Be.
th
Перенос (или интрогрессию) признака(ов), определяемого Cry1Ab и Cry1Be, в инбредные линии кукурузы можно осуществить рекуррентной селекцией, например, обратным скрещиванием. В этом случае требуемую рекуррентную родительскую форму вначале скрещивают с инбредным донором (нерекуррентной родительской формой), который несет соответствующий ген(ы) для признаков, определяемых Cry1Ab и Cry1Be. Потомство данного гибрида затем обратно скрещивают с рекуррентной родительской формой с последующей селекцией полученного потомства на требуемый признак(признаки), который предназначен для переноса от нерекуррентной родительской формы. После трех, предпочтительно, четырех, более предпочтительно пяти и более поколений обратных гибридов с рекуррентной родительской формой с селекцией на требуемый признак(и), потомство будет гетерозиготным в отношении локусов, контролирующих признак(и), который переносится, но будет таким же как рекуррентная родительская форма в отношении большинства или почти всех других генов (смотри, например, Poehlman&Sleper (1995) Breeding Field Crops, 4 Ed., 172-175; Fehr (1987) Principles of Cultivar Development, Vol. 1: Theory and Technique, 360-376).
Стратегии управления резистентностью насекомых (IRM).
Например, Roush et al. описывают стратегии, основанные на двух токсинах, так называемое «нагромождение» или «стекинг» для контроля инсектицидных трансгенных культур (The Royal Society. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. (1998) 353, 1777-1786).
На веб-сайте Агентства по защите окружающей среды США (epa.gov/oppbppd1/biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006.htm) приводятся следующие требования для обеспечения нетрансгенных (т.е. не-Bt) убежищ (раздел не-Bt культуры/кукуруза) для применения с трансгенными культурами, продуцирующими один Bt-белок, активный против вредителей-мишеней.
«Специфическими структурированными требованиями для Bt-защищенной (Cry1Ab и Cry1Fa) кукурузы от кукурузного стеблевого мотылька продукты являются следующими:
структурированные убежища: 20% убежищ не-чешуекрылых с Bt-кукурузой в Кукурузном поясе; 50% убежищ не-чешуекрылых с Bt-кукурузой в кукурузном поясе
Блоки
1. Внутренний (т.е. в Bt-поле)
2. Внешний (т.е. отдельные поля в пределах 1/2 мили (1/4 мили, если возможно) от Bt-поля для максимального произвольного скрещивания)
Полосы в поле
Полосы должны иметь ширину, по меньшей мере, 4 ряда (предпочтительно 6 рядов) для снижения эффектов, связанных с передвижением личинок».
Кроме того, Национальная Ассоциация производителей кукурузы на их веб-сайте (ncga.com/insect-resistance-management-fact-sheet-bt-corn) также приводит аналогичные указания в отношении требований для убежищ. Например:
«Требования в отношении IRM кукурузного стеблевого мотылька:
засадить, по меньшей мере, 20% территорий с кукурузой гибридами убежища;
в районах с производством хлопка убежище должно составлять 50%;
должны высаживаться в пределах 1/2 мили от гибридов убежища;
убежище можно засевать в виде полос в Bt-поле; полосы убежища должны быть шириной, по меньшей мере, 4 ряда
убежище можно обработать обычными пестицидами только, если достигаются экономические пороги для вредителя-мишени;
нельзя использовать опрыскиваемые инсектициды на основе Bt на кукурузе убежища;
соответствующее убежище должно быть засажено в каждом хозяйстве с Bt-кукурузой».
Как утверждает Roush et al. (на страницах 1780 и 1784 правой колонки, например), «стекинг» или «нагромождение» двух различных белков, где каждый эффективен против вредителей-мишеней и с низкой или отсутствием перекрестной резистентности, позволяет использовать меньшее убежище. Roush предлагает, что при наличии успешного стека размер убежища менее 10% может обеспечить сравнимое с примерно 50% убежищем управление резистентностью для одного (непирамидного) признака. Для имеющихся в настоящее время пирамидированных продуктов Bt-кукурузы Агентство по охране окружающей среды требует наличия значительно меньшего (в общем 5%) структурированного убежища для засевания не-Bt-кукурузой по сравнению с продуктами с одним признаком (в общем 20%).
Имеются различные пути обеспечения эффектов IRM убежища, включая различные геометрические паттерны высадки в полях (упомянутые выше) и смеси семян в мешках, как дополнительно обсуждается Roush et al. (выше) и в патенте США № 6551962.
Все приведенные выше или аналогичные соотношения убежища можно использовать для настоящих двойных или тройных стеков или пирамид. Для тройных стеков с тремя сайтами действия против одного вредителя-мишени целью будет нулевое убежище (или, например, менее чем 5% убежище). Это особенно верно для производственных земель, например, площадью более 10 акров.
Все патенты, заявки на патент, предварительные заявки и публикации, относящиеся к или цитированные в данном документе, в полном объеме включены в данный документ для сведения в той степени, до которой они не противоречат положениям данной заявки.
Если не указано или не подразумевается иначе, то в том смысле, в котором в данном документе используются термины «а», «an» и «the», они означают, «по меньшей мере, один».
Последующие примеры иллюстрируют способы осуществления изобретения. Примеры не следует рассматривать в качестве ограничивающих изобретение. Все проценты выражены в % мас., и все соотношения смесей растворителей выражены в объемных соотношениях, если не указано иначе. Все значения температуры выражены в градусах Цельсия.
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Мечение
I Cry-белков
125
Иодирование Cry-токсинов.
125
125
125
Очищенные усеченные Cry-токсины иодировали с использованием иодогранул или иодогена (Pierce). Вкратце, две иодогранулы дважды промывали 500 мкл забуференного фосфатом физиологического раствора PBS (20 мМ фосфата натрия, 0,15М NaCl, рН 7,5) и помещали в центрифужную пробирку емкостью 1,5 мл за свинцовым экраном. К этому добавляли 100 мкл PBS. В вытяжном шкафу и с использованием необходимых приемов работы с радиоактивными веществами 0,5 мкюри NaI (17,4 кюри/мг, серия 0114, Amersham) добавляли к раствору иодогранул в PBS. Компоненты повергали взаимодействию в течение 5 мин при комнатной температуре, затем к раствору добавляли 2-25 мкг высокоочищенного усеченного Cry-белка и подвергали взаимодействию еще в течение 3-5 мин. Реакцию останавливали удалением раствора с иодогранулами и реакционную смесь наносили на спин-колонку Zeba емкостью 0,5 мл для обессоливания (InVitrogen), уравновешенную PBS. Иодогранулы дважды промывали каждый раз по 10 мкл PBS и промывной раствор также наносили на колонку для обессоливания. Радиоактивный раствор элюировали через колонку для обессоливания центрифугированием при 1000×g в течение 2 мин. В случае Cry1Da для введения радиоактивной метки использовали метод с иодогеном. При использовании данного метода Cry-токсин в 100 мМ фосфатном буфере (рН 8) вначале очищали от полисахаридов (LPS) пропусканием несколько раз через небольшую колонку с полимиксином емкостью 0,5 мл. В пробирку с иодогеном (Pierce Chem., Co) добавляли 20 мкг LPS-несодержащего Cry1Da-токсина, затем 0,5 мкюри NaI. Реакционную смесь встряхивали в течение 15 мин при 25°С. Раствор удаляли из пробирки и добавляли 0,2М нерадиоактивного NaI для гашения реакции. Белок диализировали против PBS с 3 сменами буфера для удаления несвязанного I.
TM
Радиоактивную чистоту иодированных Cry-белков определяли электрофорезом SDS-PAGE, визуализировали с использованием фосфорного экрана и анализировали на гамма-счетчике. Вкратце, 2 мкл радиоактивного белка разделяли SDS-PAGE. После разделения гели высушивали с использованием аппарата для высушивания гелей BioRad, следуя инструкциям изготовителя. Высушенные гели визуализировали, обернув их в пленку Mylar (толщиной 12 мкм) и экспонировали на многоразовых фосфорных экранах Dynamics (35×43 см) в течение 1 ч. Пластинки визуализировали с использованием прибора Molecular Dynamics Storm 820 phosphoroimager и визуализированные изображения анализировали с использованием программного обеспечения ImageQuant. Радиоактивную полосу вместе с зонами непосредственно выше и ниже полосы вырезали из геля с использованием лезвия для бритвы и определяли радиоактивность на гамма-счетчике. Радиоактивность обнаруживали только в полосе Cry-белка и в зонах ниже полосы. Радиоактивность не детектировали выше полосы, указывая на то, что все радиоактивные примеси состояли из более мелких белковых компонентов по сравнению с Cry-белком. Возможно, данные компоненты представляли собой продукты деградации.
Пример 2. Протокол приготовления BBMV
Получение и фракционирование солюбилизированных BBMV.
2
2
2
Личинки последней стадии развития Spodoptera frugiperda, Ostrinia nubilalis или Heleothis. zea выдерживали без корма в течение ночи и затем утром измельчали после охлаждения на льду в течение 15 мин. Извлекали ткань средней кишки из полости тела, оставляя заднюю кишку, присоединенную к интегументу. Среднюю кишку помещали в 9× объем охлажденного на льду буфера для гомогенизации (300 мМ маннита, 5 мМ ЭГТА, 17 мМ Трис основания, рН 7,5) с добавлением смеси ингибиторов протеаз (конечная концентрация компонентов смеси (в мкМ) составляет AEBSF (500), EDTA (250 мМ), бестатин (32), Е-64 (0,35), лейпептин (0,25) и апротинин (0,075) (Sigma P-2714), разбавленной согласно рекомендациям изготовителя. Ткань гомогенизировали 15 ходами стеклянного гомогенизатора для тканей. BBMV готовили осаждением с помощью MgCl по методу Wolfersberger (1993). Вкратце, равный объем 24 мМ раствора MgCl в 300 мМ растворе маннита смешивали с гомогенатом средней кишки, перемешивали в течение 5 мин и выдерживали на льду в течение 15 мин. Раствор центрифугировали при 2500×g в течение 15 мин при 4°С. Супернатант оставляли и осадок суспендировали в исходном объеме 0,5× разбавленного буфера для гомогенизации и вновь центрифугировали. Два супернатанта объединяли, центрифугировали при 27000×g в течение 30 мин при 4°С с получением фракции BBMV. Осадок суспендировали в 10 мл буфера для гомогенизации и добавляли ингибиторы протеаз и вновь центрифугировали при 27000×g в течение 30 мин при 4°С для отмывки BBMV. Полученный осадок суспендировали в буфере для хранения BBMV (10 мМ HEPES, 130 мМ KCl, 10% глицерина, рН 7,4) до концентрации примерно 3 мг/мл белка. Концентрацию белка определяли с использованием метода Брэдфорда (1976) с бычьим сывороточным альбумином (BSA) в качестве стандарта. Определение активности щелочной фосфатазы проводили до замораживания проб с использованием метода Sigma, следуя инструкциям изготовителя. Специфическая активность данного фермента-маркера во фракции BBMV, как правило, была в 7 раз выше по сравнению с фракцией гомогената средней кишки. BBMV разливали на аликвотные порции по 250 мкл, быстро замораживали в жидком N и хранили при -80°С.
Пример 3. Способ оценки связывания
I-меченных Cry-белков с белками BBMV
125
Связывание
I-меченных Cry-белков с белками BBMV.
125
125
125
4
2
4
Для определения оптимального количества белка BBMV в тестах по оценке связывания строили кривую насыщения. I-меченный Cry-белок (0,5 нМ) инкубировали в течение 1 ч при 28°С с различными количествами белка BBMV в пределах 0-500 мкг/мл в буфере для связывания (8 мМ NaHPO, 2 мМ KHPO, 150 мМ NaCl, 0,1% бычьего сывороточного альбумина, рН 7,4). Общий объем составлял 0,5 мл. Связанный с I Cry-белок отделяли от несвязанного белка отбором 150 мкл реакционной смеси в трех параллелях из центрифужной пробирки емкостью 1,5 мл в центрифужную пробирку емкостью 500 мкл и центрифугированием проб при 14000×g в течение 6 мин при комнатной температуре. Супернатант осторожно удаляли и осадок осторожно промывали три раза буфером для связывания, охлажденным на льду. Дно центрифужной пробирки, содержащее осадок, отрезали и помещали в стеклянную культуральную пробирку размером 13×75 мм. Определяли радиоактивность проб в течение 5 мин на гамма-счетчике. Из значения радиоактивности пробы вычитали фоновую радиоактивность (в данном случае реакцию проводили с любым белком) и строили график зависимости от концентрации белка BBMV. Оптимальное количество белка, которое использовали, составило 0,15 мг/мл белка BBMV.
125
Для определения кинетики связывания строили кривую насыщения. Вкратце, BBMV (150 мкг/мл) инкубировали в течение 1 ч при 28°С с возрастающими концентрациями I-меченного Cry-токсина в пределах от 0,01 до 10 нМ. Общее связывание определяли отбором аликвотных порций 150 мкл каждой концентрации в трех параллелях, центрифугированием пробы и определением радиоактивности, как описано выше. Аналогичным образом определяли неспецифическое связывание с добавлением к реакционной смеси 1000 нМ гомологичного трипсинизированного нерадиоактивного Cry-токсина для насыщения всех неспецифических сайтов связывания рецептора. Специфическое связывание рассчитывали, как разницу между общим связыванием и неспецифическим связыванием.
125
125
Тесты гомологичного и гетерологичного конкурентного связывания проводили с использованием 150 мкг/мл белка BBMV и 0,5 нМ I-меченного Cry-белка. Концентрация конкурентного немеченого Cry-токсина, добавленного в реакционную смесь, находилась в пределах от 0,045 до 1000 нМ и его добавляли одновременно с радиоактивным лигандом для гарантии реального конкурентного связывания. Инкубацию проводили в течение 1 ч при 28°С и определяли количество I-меченного Cry-белка, связанного с рецептором токсина, как описано выше, с вычитанием неспецифического связывания. При полном отсутствии лиганда-конкурента детектировали 100% общее связывание. По результатам анализа строили полулогарифмический график зависимости общего специфического связывания в процентах от концентрации добавленного конкурентного лиганда.
Пример 4. Резюме по результатам
125
125
125
На фиг.1 показано специфическое связывание в процентах I Cry1Ab (0,5 нМ) в BBMV из ECB с конкуренцией немеченым гомологичным Cry1Ab (♦) и гетерологичным Cry1Be (•). Кривая вытеснения для гомологичной конкуренции с Cry1Ab представляет сигмоидальную по форме кривую, показывающую 50% вытеснение радиоактивного лиганда примерно при 0,5 нМ Cry1Ab. Cry1Be также вытесняет I Cry1Be из сайта связывания, но для этого требуется концентрация примерно 40 нМ (в 80 раз выше по сравнению с необходимой концентрацией Cry1Ab) для вытеснения 50% I Cry1Ab из сайта связывания.
125
125
На фиг.2 показано специфическое связывание в процентах I Cry1Ab (0,5 нМ) в BBMV из FAW с конкуренцией немеченым гомологичным Cry1Ab (♦) и гетерологичным Cry1Be (•). Кривая вытеснения для гомологичной конкуренции с Cry1Ab представляет сигмоидальную по форме кривую, показывающую 50% вытеснение радиоактивного лиганда примерно при 0,3 нМ Cry1Ab. Cry1Be вытесняет I Cry1Ab из сайта связывания на 50% в концентрации примерно 300 нМ или примерно в 1000 раз выше по сравнению с необходимой концентрацией для Cry1Ab. Ошибки в виде черточек представляют пределы значений, полученных по данным двойных параллельных определений.
125
125
На фиг.3 показано специфическое связывание в процентах I Cry1Be (0,5 нМ) в BBMV из FAW с конкуренцией немеченым гомологичным Cry1Be (♦) и гетерологичным Cry1Ab (•). Кривая вытеснения для гомологичной конкуренции с Cry1Be представляет сигмоидальную по форме кривую, показывающую 50% вытеснение радиоактивного лиганда примерно при 2 нМ Cry1Be. Cry1Ab в концентрации 1000 нМ (в 2000 раз выше по сравнению с вытесненным I Cry1Be) приводит примерно к 50% вытеснению. Имеется примерно в 500 раз более низкая аффинность Cry1Ab в конкуренции за связывание Cry1Be. Ошибки в виде черточек представляют пределы значений, полученных по данным трех параллельных определений.
Литература
95,
Heckel, D.G., Gahan, L.J., Baxter, S.W., Zhao, J.Z., Shelton, A.M., Gould, F., and Tabashnik. B.E. (2007). The diversity of Bt resistance genes in species of Lepidoptera. J Invertebr Pathol 192-197.
65,
Luo, K., Banks, D., and Adang, M.J. (1999). Toxicity, binding, and permeability analyses of four bacillus thuringiensis cryl delta-endotoxins using brush border membrane vesicles of spodoptera exigua and spodoptera frugiperda. Appl. Environ. Microbiol. 457-464.
Palmer, M, Buchkremer, M, Valeva, A, and Bhakdi, S. Cysteine-specific radioiodination of proteins with fluorescein maleimide. Analytical Biochemistry 253, 175-179. 1997. Ref Type: Journal (Full)
Sambrook, J. and Russell, D.W. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory).
Schlenz, M. L., Babcock, J. M., and Storer, N. P. Response of Cry1F-resistant and Susceptible European Corn Borer and Fall Armyworm Colonies to Cry1A.105 and Cry12Ab2. DAI 0830, 2008. Indianapolis, Dow AgroSciences. Derbi Report.
(Heleothis zed).
Sheets, J.J. and Storer, N.P. Analysis of Cry1Ac Binding to Proteins in Brush Border Membrane Vesicles of Corn Earworm Larvae Interactions with Cry1F Proteins and Its Implication for Resistance in the Field. DAI-0417, 1-26. 2001. Indianapolis, Dow AgroSciences.
A 94,
Tabashnik, B.E., Liu, Y.B., Finson. N., Masson, L., and Heckel, D.G. (1997). One gene in diamondback moth confers resistance to four Bacillus thuringiensis toxins. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. 1640-1644.
62,
Tabashnik, B.E., Malvar, T., Liu, Y.B., Finson. N., Borthakur, D., Shin, B.S., Park, S.H., Masson. L., de Maagd, R.A., and Bosch, D. (1996). Cross-resistance of the diamondback moth indicates altered interactions with domain II of Bacillus thuringiensis toxins. Appl. Environ. Microbiol. 2839-2844.
287,
Tabashnik, B.E., Roush, R.T., Earle, E.D., and Shelton, A.M. (2000). Resistance to Bt toxins. Science 42.
24,
Wolfersberger, M.G. (1993). Preparation and partial characterization of amino acid transporting brush border membrane vesicles from the larval midgut of the gypsy moth (Lymantria dispar). Arch. Insect Biochem. Physiol 139-147.
71,
Xu, X., Yu, L., and Wu, Y. (2005). Disruption of acadherin gene associated with resistance to Cry 1 Ac {delta}-endotoxin of Bacillus thuringiensis in Helicoverpa armigera. Appl Environ Microbiol 948-954.