ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI - ПРОДУЦЕНТ ФУМАРОВОЙ КИСЛОТЫ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФУМАРОВОЙ КИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЭТОГО ШТАММА
STRAIN OF BACTERIA ESCHERICHIA COLI - PRODUCER OF FUMARIC ACID AND METHOD OF OBTAINING FUMARIC ACID USING THIS STRAIN

Настоящее изобретение относится к биотехнологии, в частности, к штамму бактерий Escherichia coli - продуценту фумаровой кислоты, способному к эффективной продукции фумаровой кислоты из глюкозы, а так же к способу получения фумаровой кислоты, с использованием этого штамма, с улучшенным показателем коэффициента конверсии субстрата в целевой продукт.
Фумаровая кислота, непредельная четырехуглеродная дикарбоновая кислота, находящая широкое применение в различных отраслях химической, пищевой и фармацевтической промышленности.
В настоящее время мировой рынок фумаровой кислоты оценивается в 90000 т/год. Фумаровую кислоту используют в качестве полупродукта в производстве бумаги (~31500 т/год), полиэфирных смол (~13500 т/год), алкидных пластмасс (~5500 т/год) и пластификаторов (~4500 т/год), а также в косметической (~15000 т/год) и пищевой промышленности (~20000 т/год) (Roa Engel, С.А. et al., 2008, Fumaric acid production by fermentation. Appl. Microbiol. Biotechnol. 78, 379-389). Нетоксичная природа фумаровой кислоты позволяет использовать ее в производстве напитков и выпечки, а также пшеничного и ржаного хлеба, фруктовых соков, желеобразных десертов (Yang, S.T. et al., 2011, Fumaric acid. In: Moo-Young, BulterMichael, editors. Comprehensive biotechnology, 2nd Edition, 3, 163-77). Фумаровую кислоту добавляют в рацион крупного рогатого скота, что приводит к значительному снижению, более чем на 70%, выброса животными метана (Mcginn, S.M. et al., 2004, Methane emissions from beef cattle: Effects of monensin, sunflower oil, enzymes, yeast and fumaric acid. J. Anim. Sci. 82, 3346-3356). В медицине эфиры фумаровой кислоты, такие как моноэтилфумарат, монометилфумарат и диэтил- и диметил- фумараты используют при лечении псориаза (Moharregh-Khiabani, D. et al., 2009, Fumaric acid and its esters: an emerging treatment for multiple sclerosis. Curr. Neuropharmacol. 7, 60-64), значительно улучшая качество жизни пациентов.
Фумаровую кислоту рассматривают также в качестве перспективного "строительного блока" для получения широкого спектра химических веществ с высокой добавленной стоимостью, синтезируемых из нефтепродуктов. Наиболее значимым из них является 1,4-бутандиол (БДО). БДО применяют в таких отраслях промышленности как: электроника (в качестве растворителя и раствора для удаления фоторезиста, обезжиривания и очистки); фармацевтика (в качестве растворителя и средства экстракции); тонкий органический синтез (в качестве предшественника в синтезе тетрагидрофурана (ТГФ) и γ-бутиролактона (ГБЛ), полибутилентерефталатных резин для автомобильной промышленности, эластана и др.) (Paster, M. et al., 2003, Industrial bioproducts: today and tomorrow. Energetics Inc., Columbia, MD, USA).
В настоящее время фумаровую кислоту производят нефтехимическим синтезом при цис-транс изомеризации малеиновой кислоты, которую, в свою очередь; получают из малеинового ангидрида. Промышленный синтез малеинового ангидрида осуществляют при окислении бензола и ряда других ароматических соединений. Ьднако, из-за возросшей цены на бензол, на многих предприятиях в качестве исходного сырья стали использовать н-бутан (Lorences, M.J. et al., 2003, Butane oxidation to maleic anhydride: kinetic modeling and byproducts. Ind. Eng. Chem. Res. 42, 6730-6742). Реакция протекает в газовой фазе на висмутовых катализаторах с удалением паров воды при частичной конденсации. Поглощение малеинового ангидрида из газовой фазы осуществляют парами органических растворителей, с последующей фракционной перегонкой полученной смеси для выделения целевого продукта и возвращения растворителя в сорбционную колонну. Полученная гидролизом малеинового ангидрига малеиновая кислота подвергается цис-транс изомеризации в фумаровую кислоту с использованием в качестве катализаторов неорганических кислот, пероксидов или же тиомочевины (Lohbeck, К. et al., 1990, Maleic and fumaric Acids. Ullmann′s Encyclopedia of Industrial Chemistry, vol. A16. VCH, Weinheim, Germany, 53-62). Выделение и очистку продукта обычно осуществляют кристаллизацией из водной фазы.
Изомеризация малеиновой кислоты в фумаровую кислоту с помощью химических катализаторов ограничена константой равновесия реакции. Кроме того, соответствующие химические превращения протекают при повышенных температурах, обуславливающих формирование побочных продуктов термической декомпозиции малеиновой и фумаровой кислот, и тем самым снижающих конечный выход целевого продукта ниже равновесного значения (US 5783428). Указанные недостатки химического процесса получения фумаровой кислоты обусловили интерес к альтернативным методам получения этого вещества.
Фумаровая кислота является интермедиатом центрального метаболизма множества организмов. Однако, спектр организмов, обладающих установленной на сегодняшний день природной способностью к заметной продукции фумаровой кислоты, весьма узок. К микроорганизмам, с относительно выраженной способностью к формированию детектируемых количеств фумаровой кислоты в средах культивирования, относятся отдельные представители родов Rhizopus, Mucor, Cunninghamella и Circinella. При этом наилучшими показателями конверсии субстрата в фумаровую кислоту обладают такие представители рода Rhizopus как R. nigricans, R. arrhizus, R. oryzae и R. formosa. (Roa Engel, С.A. et al., 2008. Fumaric acid production by fermentation. Appl. Microbiol. Biotechnol. 78, 379-389) Несмотря на то, что способность штаммов Rhizopus к продукции фумаровой кислоты была открыта еще в начале 20-го века, особенности физиологии данного микроорганизма и сложность модификации его метаболизма вплоть до настоящего времени не позволили разработать экономически оправданного процесса микробиологического синтеза фумаровой кислоты с использованием клеток Rhizopus (Straathof A.J.J, and van Gulik W.M, 2012, Production of Fumaric Acid by Fermentation. In X. Wang et al. (eds.), Reprogramming Microbial Metabolic Pathways, 11, 225-240).
Принимая во внимание, что в структуре цены готовой продукции микробиологического синтеза стоимость сырья составляет около 40%, очевидно, что стоимость субстрата и показатель коэффициента конверсии субстрата в конечный продукт оказывают значительное влияние на себестоимость целевого вещества. В силу относительной дешевизны и значительных объемов производства, предпочтительным субстратом для микробиологического получения фумаровой кислоты является глюкоза (Straathof A.J.J, and van Gulik W.M, 2012, Production of Fumaric Acid by Fermentation. In X. Wang et al. (eds.), Reprogramming Microbial Metabolic Pathways, 11, 225-240).
Факультативно анаэробная бактерия Escherichia coli не способна к формированию заметных количеств интермедиатов цикла трикарбоновых кислот, в частности и фумаровой кислоты, при утилизации глюкозы. Тем не менее, изученность метаболизма и развитость доступного генно-инженерного инструментария позволили создать на основе клеток Е. coli высокоэффективные рекомбинантные продуценты янтарной и яблочной кислот, которые, как и фумаровая кислота, не являются природными продуктами жизнедеятельности рассматриваемой бактерии (Cao, Y. et al., 2011, Metabolically engineered Escherichia coli for biotechnological production of four-carbon 1,4-dicarboxylic acids. J Ind Microbiol Biotechnol. 38(6), 649-656; Lin, H. et al., 2005, Genetic Reconstruction of the Aerobic Central Metabolism in Escherichia coli for the Absolute Aerobic Production of Succinate. Biotechnol Bioeng. 89, 148-156; Zhang, X. et al., 2011, L-malate production by metabolically engineered Escherichia coli. Appl Environ Microbiol. 77(2), 427-434; Thakker, C. et al., 2012, Succinate production in Escherichia coli. Biotechnol J. 7(2), 213-224).
Как и большинство микроорганизмов, клетки Ε. coli формируют фумаровую кислоту в ограниченном наборе биохимических процессов. Среди них - оксидативный цикл трикарбоновых кислот, реакции с участием глиоксилатного шунта и одна из ветвей смешаннокислотного брожения, называемая восстановительной ветвью цикла трикарбоновых кислот. Основными метаболическими предшественниками в данных биохимических процессах являются пировиноградная и щавелевоуксусная кислоты, а также фосфоенолпируват и ацетил-коферментА (ацетил-КоА). При утилизации глюкозы, эти вещества являются производными, формирующимися в реакциях с участием терминальных продуктов гликолиза, или же являются прямыми продуктами данного процесса.
Физиологические условия функционирования соответствующих путей различны. Оксидативный цикл трикарбоновых кислот активен в условиях аэрации, восстановительная ветвь цикла требует условий анаэробиоза, в то время как глиоксилатный шунт способен функционировать вне зависимости от условий аэрации.
При конверсии глюкозы в фумаровую кислоту с участием оксидативной части цикла трикарбоновых кислот одна молекула фумаровой кислоты образуется из одной молекулы глюкозы и, таким образом, коэффициент конверсии глюкозы в фумаровую кислоту составляет 1/1 или 1,0 моль/моль.
При превращении глюкозы в фумаровую кислоту с формированием целевого вещества в процессе с участием глиоксилатного шунта коэффициент конверсии субстрата в целевой продукт так же составляет 1/1 или же 1,0 моль/моль.
Сочетание двух указанных путей формирования фумаровой кислоты из глюкозы характеризуется формированием двух молекул фумаровой кислоты из двух молекул глюкозы и обуславливает коэффициент конверсии 2/2 или 1 моль/моль.
В отличие от процессов биосинтеза фумаровой кислоты из глюкозы протекающих в аэробных условиях, анаэробное формирование фумаровой кислоты с участием восстановительной ветви цикла трикарбоновых кислот требует поддержания баланса восстановленных и окисленных в ходе соответствующих реакций NAD+ и NADH эквивалентов. Процессы аэробного биосинтеза фумаровой кислоты из глюкозы основаны на реакциях окисления и в результате этого сопровождаются сопутствующим формированием значительного количества восстановленных эквивалентов. В присутствии кислорода избыточные восстановленные эквиваленты реокисляются в дыхательной электронтранспортной цепи. В условиях анаэробиоза электронтранспортная цепь не активна и реокисление образованных при утилизации глюкозы восстановленных эквивалентов должно быть сопряжено с реакциями брожения. Формирование фумаровой кислоты в восстановительной ветви цикла трикарбоновых кислот, являющейся частью процессов смешаннокислотного брожения, или же анаэробного дыхания, сопряжено с расходом восстановленных эквивалентов, сформированных при гликолизе.
Достижение внутриклеточного окислительно-восстановительного баланса при анаэробном биосинтезе фумаровой кислоты из глюкозы с вовлечением в формирование целевого вещества ацетил-СоА, т.е с участием реакций оксидативной части цикла трикарбоновых кислот и глиоксилатного шунта, невозможно.
Процесс прямого биосинтеза фумаровой кислоты из глюкозы в восстановительной части трикарбоновых кислот является NAD+/NADH сбалансированным и способен обеспечить коэффициент конверсии 2 моль/моль. Это обусловлено, с одной стороны, фиксацией ССЬ на стадии образования из гликолитических интермидиатов оксалоацетата - предшественника в анаэробном пути сбраживания глюкозы в фумаровую кислоту, а с другой стороны, тем, что тогда как конверсия каждой из двух молекул оксалоацетата, полученных из интермедиатов гликолитической утилизации глюкозы, в фумаровую кислоту требует одного восстановленного эквивалента (NADH), в ходе гликолиза формируются строго соответствующее количество восстановленных эквивалентов (2 NADH на одну молекулу глюкозы, т.е. строго по 1 NADH на каждую молекулу оксалоацетата).
2
2
2
Следует отметить, что возрастающая эмиссия парниковых газов и, в частности СО, является одной из основных проблем современной технологической цивилизации. Возможность фиксации СО в процессах микробиологического синтеза веществ с высокой добавленной стоимостью расценивается как важнейшее преимущество. Расположение производства фумаровой кислоты на существующих мощностях по производству продукции спиртового брожения (этанол), сопровождающегося выбросом СО, позволит исключить расходы на транспортировку данного компонента из структуры цены продукта.
Таким образом анаэробное сбраживание глюкозы, с формированием целевого вещества в восстановительной части цикла трикарбоновых кислот представляется наиболее эффективным процессом микробиологического получения фумаровой кислоты кислоты или ее солей.
Подходы к конструированию рекомбинантных штаммов-продуцентов полезных метаболитов включают несколько основополагающих принципов. Этими принципами являются: активация ключевых путей биосинтеза целевого вещества; активация биохимических путей биосинтеза метаболитов-предшественников; инактивация путей конкурентной утилизации предшественников в побочных биохимических путях; и инактивация путей деградации продукта. В случае создания анаэробных продуцентов продуктов брожения к этим принципам добавляется необходимость инактивации путей нецелевого реокисления восстановленных эквивалентов и поддержания внутреклеточного окислительно-восстановительного баланса.
Однако, поскольку биохимические пути образования фумаровой кислоты в клетках Е. coli различаются по физиологическим условиям функционирования, модификации метаболизма бактерии, направленные на достижение эффективного формирования фумаровой кислоты в конкретных биохимических процессах, различаются.
a
a
a
a
c
a
a
a
a
В работе Сонга и соавторов (Song, C.W. et al., 2013, Metabolic engineering of Escherichia coli for the production of fumaric acid. Biotechnol. Bioeng. 110, 2025-2034) описано конструирование рекомбинантного штамма Ε. coli для аэробной продукции фумаровой кислоты из глюкозы. Первоначально авторами была осуществлена попытка получения штамма для анаэробной продукции фумаровой кислоты за счет делеций генов dhE, кодирующего алкоголь/альдегид дегидрогеназу, ldhA, кодирующего лактат дегидрогензу, и frdABCD, кодирующих компоненты фумарат редуктазного ферментативного комплекса. Предполагалось, что в результате данных модификаций в штамме будет предотвращен нецелевой расход метаболитов предшественников, ацетил-КоА и пировиноградной кислоты, в путях побочных по отношению к биосинтезу фумаровой кислоты, а также будет исключена возможность анаэробной конверсии фумаровой кислоты в янтарную. Однако соответствующий штамм CWF0 (W3110 ΔdhE ΔldhA ΔfrdABCD) не продуцировал фумаровой кислоты и был не способен к росту в условиях анаэробиоза. В результате последующего многоэтапного конструирования был получен штамм CWF811 (W3110 ΔiclR ΔfumC ΔfumA ΔfumB ΔrcA ΔptsG ΔspA ΔlI)/pTac15kppc, с инактивированными генами, кодирующими белок репрессор генов глиоксилатного шунта, три изофермента фумаразы, транскрипционный регулятор генов респираторного метаболизма, основную пермеазу глюкозы фосфоенолпируват зависимой системы транспорта Сахаров, аспартат аммоний лиазу, белок репрессор генов лактозного оперона, и обладающий повышенной экспрессией фосфоенолпируват карбоксилазы. Штамм CWF811 способен к аэробной продукции фумаровой кислоты из глюкозы с коэффициентом конверсии 0,65 моль/моль, то есть 65% от теоретически возможного значения для соответствующего процесса, протекающего в условиях аэрации. Дальнейшая попытка оптимизировать продукцию целевого вещества была предпринята при оверэкспрессии гена galP, кодирующего низкоаффиный Н+-симпортер галактозы, также способный к транспорту глюкозы. Однако, коэффициент конверсии субстрата в целевой продукт, демонстрируемый соответствующим штаммом CWF812 (W3110 ΔiclR ΔfumC ΔfumA ΔfumB ΔrcA ΔptsG ΔspA ΔlacI PgalP::Ptrc)/pTac15kppc, не только не возрос, но и обнаружил незначительное снижение до 0,62 моль/моль. Основным побочным продуктом утилизации глюкозы обоими штаммами являлась уксусная кислота, что по-видимому обусловлено присутствием в штамме интактных генов рохВ и pt-ckA, кодирующих пируват оксидазу, фосфотрансацетилазу и ацетат киназу и ответственных за формирование уксусной кислоты из пировиноградной кислоты и ацетил-КоА, соответственно.
a
В патенте CN 102618570 приведено поэтапное конструирование штамма Е. coli для продукции фумаровой кислоты в анаэробных условиях. Итоговый штамм НН5 (ΔfumA, ΔfumB, ΔfumC, ΔrcA, ΔfrdB, ΔpflB, ΔldhA) получен путем направленной делеции следующих генов:
- fumA, fumB, fumC, кодирующих белки изоферменты фумаразы,
a
- rcA, кодирующего транскрипционный регулятор генов респираторного метаболизма,
- frdB, кодирующиего один из каталитических компонентов фумарат редуктазы,
- pflB, кодирующего пируват формат лиазу и
- ldhA, кодирующего лактат дегидрогензу.
За счет делений генов fumA, fumB, fumC в штамме НН5 исключена возможность интерконверсии яблочной и фумаровой кислот как в аэробной, так и в анаэробной ветвях цикла трикарбоновых кислот.Инактивация транскрипционного регулятора ArcA дерегулировала экспрессию генов, кодирующих ферменты оксидативной части цикла трикарбоновых кислот и глиоксилатного шунта. Инактивация фумарат редуктазного ферментативного комплекса, за счет делеции гена frdB, исключала одну из возможностей превращения фумаровой кислоты в янтарную. Делеция гена pflB предотвращала анаэробную конверсию пировиноградной кислоты в ацетил-КоА и, тем самым, должна была способствовать снижению эффективности побочной продукции штаммом уксусной кислоты и этанола. Инактивация гена IdhA, кодирующего лактат дегидрогензу, катализирующую образование молочной кислоты из пировиноградной с окислением эквимолярного количества NADH, способствовала как сбережению восстановленных эквивалентов, необходимых для биосинтеза фумаровой кислоты, так и препятствовала нецелевому расходу одного из метаболитов предшественников. Коэффициент молярной конверсии глюкозы в фумаровую кислоту, демонстрируемый штаммом НН5, составлял 0,7, в три раза уступая теоретически возможному максимуму.
a
a
В патенте CN 101240259 также описано конструирование штамма Е. coli для анаэробной продукции фумаровой кислоты. В качестве базового штамма для получения продуцента фумаровой кислоты использован штамм Е. coli NZN111 (W1485 Δpfl::Cam ΔldhA::Kn) с инактивированными генами ldhA и pflB, не способный анаэробно сбраживать глюкозу. После инактивации фумарат редуктазного ферментативного комплекса и введения на плазмиде гена sfcA, кодирующего малатный фермент, итоговый штамм JM125 (W1485 Δpfl::Cam ΔldhA::Kn Δfrd)/pTrc99a-sfcA восстанавливал способность анаэробно сбраживать глюкозу и приобретал способность к продукции фумаровой кислоты. Тем не менее коэффициент молярной конверсии глюкозы в фумаровую кислоту, демонстрируемый штаммом JM125, составлял 0,72, при максимально возможном значении коэффициэнта конверсии - 2,0.
Из вышеизложенного следует, что модификации, приводящие к получению штаммов Е. coli - продуцентов фумаровой кислоты, могут различаться по своему набору. Рациональный выбор генов мишений, основанный только на анализе доступной информации о функционировании целевых биохимических путей, не может надежно предопределить успеха в улучшении продукции фумаровой кислоты сконструированными штаммами. Более того, неочевидным является сохранение сконструированными штаммами способности к анаэробной утилизации глюкозы, при объединении в них генетических модификаций, влияющих на глобальную координацию метаболизма углерода и окислительно-восстановительного баланса клетки в условиях анаэробиоза.
Известные из источников информации штаммы Е. coli - анаэробные продуценты фумаровой кислоты синтезируют целевое вещество из глюкозы с выходом не превышающим нижнего порогового значения, характерного для анаэробного процесса, т.е. менее 1 моль/моль.
Задачи настоящего изобретения включают:
- конструирование штамма Е. coli, способного продуцировать фумаровую кислоту с повышенной эффективностью;
- разработка способа получения фумаровой кислоты с использованием этого штамма.
Задачи решены путем
a
a
a
a
а
- констрирования штамма Escherichia coli FUM1.0 - продуцента фумаровой кислоты, обладающего инактивированными генами ckA, pt, рохВ, ldhA, dhE, pflB, frdA, frdB, sdhA, sdhB, ceA, сеВ и ptsG, кодирующими ацетат киназу, фосфотрансацетилазу, пируват оксидазу, лактат дегидрогеназу, алкоголь/альдегид дегидрогеназу, пируват формат лиазу, каталитические субъединицы фумарат редуктазного ферментативного комплекса, каталитические субъединицы сукцинат дегидрогеназного ферментативного комплекса, изоцитрат лиазу, малат синтазу и глюкозную пермеазу, соответственно, и усиленной экспрессией генов galP и glk, кодирующих Н+-симпортер галактозы и глюкокиназу;
- разработки способа получения фумаровой кислоты путем культивирования заявляемого штамма в подходящих условиях с последующим выделением фумаровой кислоты из культуральной жидкости.
Объектом настоящего изобретения является штамм бактерий вида Escherichia coli, обладающий способностью к эффективной продукции фумаровой кислоты.
а
a
a
a
а
a
Также объектом настоящего изобретения является штамм бактерий Escherichia coli с инактивированными генами скА, pt, рохВ, ldhA, dhE, pflB, frdA, frdB, sdhA, sdhB, ceA, сеВ и ptsG, и усиленной экспрессией генов glP и glk - продуцент фумаровой кислоты.
a
a
Также объектом настоящего изобретения являются штамм бактерий Escherichia coli, в котором экспрессия генов glP и glk усилена за счет замены в хромосоме штамма нуклеотидных последовательностей природных промоторов, контролирующих экспрессию генов glP и glk, на более сильные промоторы.
Также объектом настоящего изобретения является способ получения фумаровой кислоты, включающий стадии культивирования штамма, описанного выше, в питательной среде; и выделения произведенной и накопленной фумаровой кислоты из культуральной жидкости.
Также объектом настоящего изобретения является описанный выше способ, в котором процесс культивирования штамма включает в себя аэробную стадию накопления биомассы и анаэробную стадию продукции фумаровой кислоты.
Штамм, согласно настоящему изобретению, - это штамм бактерий вида Escherichia coli, сконструированный в результате направленных генно-инженерных манипуляций.
a
a
a
а
а
Термин «штамм бактерий Escherichia coli с инактивированными генами ckA, pt, рохВ, ldhA, dhE, pflB, frdA, frdB, sdhA, sdhB, сеА, сеВ и ptsG» означает, что указанная бактерия была модифицирована таким образом, что в результате модификации такая бактерия содержит пониженное количество белков AckA, Pta, РохВ, LdhA, AdhE, PflB, FrdA, FrdB, SdhA, SdhB, AceA, АсеВ и PtsG по сравнению с немодифицированной бактерией, или указанная бактерия не способна синтезировать белки AckA, Pta, РохВ, LdhA, AdhE, PflB, FrdA, FrdB, SdhA, SdhB, AceA, АсеВ и PtsG.
а
a
a
a
а
Термин «инактивация генов скА, pt, рохВ, ldhA, dhE, pflB, frdA, frdB, sdhA, sdhB, ceA, сеВ и ptsG» означает, что естественная экспрессия модифицированных участков ДНК невозможна из-за делеций данных генов или их частей или модификации примыкающих к генам областей, которые включают последовательности, контролирующие экспрессию сответствующих генов, такие как промоторы, энхансеры, аттенуаторы, и т.д.
a
a
a
а
а
Наличие или отсутствие генов ckA, pt, рохВ, ldhA, dhE, pflB, frdA, frdB, sdhA, sdhB, сеА, сеВ и ptsG на хромомсоме бактерии можно определить известными методами, включая ПЦР, блоттинг по Саузерну, и т.п.Кроме того, уровни экспрессии гена можно оценить определением количества транскрибируемой с гена РНК с использованием различных известных методов, включая блоттинг по Нозерну, количественную ОТ-ПЦР, и т.п. Количества или молекулярные массы кодируемых генами белков могут быть определены известными методами, включая SDS-ΠΑΑΓ- электрофорез с последующим иммуноблотингом ПЦР (блоттинг по Вестерну) и т.п..
а
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
а
а
а
а
а
Ген аскА (синонимы: ЕСК2290, b2296) кодирует белок AckA (синоним: В2296), проявляющий активность ацетаткиназы, классифицируемую как К.Ф. 2.7.2.1. Ген скА (нуклеотиды с 2,411,492 по 2,412,694 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank; gi: 49175990) расположен между открытой рамкой считывания yfbV и геном pta на хромосоме штамма Е. coli К-12. Нуклеотидная последовательность гена ckA и аминокислотная последовательность белка AckA, кодируемого геном ckA, приведены в Перечне последовательностей под номерами 1 (SEQ ID NO: 1) и 2 (SEQ ID NO: 2) соответственно. Ген pt (синонимы: ЕСК2291, b2297) кодирует белок Pta (синоним: В2297), проявляющий активность фосфотрансацетилазы, классифицируемую как К.Ф. 2.3.1.8. Ген pt (нуклеотиды с 2,412,769 по 2,414,913 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank; gi: 49175990) расположен между геном ckA и открытой рамкой считывания yfcC на хромосоме штамма Е. coli К-12. Нуклеотидная последовательность гена pt и аминокислотная последовательность белка Pt, кодируемого геном pt, приведены в Перечне последовательностей под номерами 3 (SEQ ID NO: 3) и 4 (SEQ ID NO: 4) соответственно. Ген рохВ (синонимы: ЕСК0862, b0871) кодирует белок РохВ (синоним: В0871), проявляющий активность пируватоксидазы, классифицируемую как К.Ф. 1.2.5.1. Ген рохВ (нуклеотиды комплементарные нуклеотидам с 908,554 по 910,272 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank; gi: 49175990) расположен между геном ltaE и геном hcr на хромосоме штамма Е. coli К-12. Нуклеотидная последовательность гена рохВ и аминокислотная последовательность белка РохВ, кодируемого геном рохВ, приведены в Перечне последовательностей под номерами 5 (SEQ ID NO: 5) и 6 (SEQ ID NO: 6) соответственно. Ген ldhA (синонимы: ECK1377, b1380) кодирует белок LdhA (синоним: В1380), проявляющий активность лактатдегидрогеназы, классифицируемую как К.Ф. 1.1.1.28. Ген ldhA (нуклеотиды комплементарные нуклеотидам с 1,439,878 по 1,440,867 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank; gi: 49175990) расположен между геном hslJ и открытой рамкой считывания ydbH на хромосоме штамма Е. coli К-12. Нуклеотидная последовательность гена ldhA и аминокислотная последовательность белка ldhA, кодируемого геном ldhA, приведены в Перечне последовательностей под номерами 7 (SEQ ID NO: 7) и 8 (SEQ ID NO: 8) соответственно. Ген dhE (синонимы: ЕСК1235, b1241) кодирует белок AdhE (синоним: В1241), проявляющий активность алкоголь дегидрогеназы и альдегид дегидрогеназы, классифицируемые как К.Ф. 1.1.1.1. и К.Ф. 1.2.1.3. Ген dhE (нуклеотиды комплементарные нуклеотидам с 1,294,669 по 1,297,344 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank; gi: 49175990) расположен между открытой рамкой считывания ychG и открытой рамкой считывания ychE на хромосоме штамма Е. coli К-12. Нуклеотидная последовательность гена dhE и аминокислотная последовательность белка AdhE, кодируемого геном dhE, приведены в Перечне последовательностей под номерами 9 (SEQ ID NO: 9) и 10 (SEQ ID NO: 10) соответственно. Ген pflB (синонимы: ЕСК0894, b0903) кодирует белок PflB (синоним: В0903), проявляющий активность пируватформатлиазы, классифицируемую как К.Ф. 2.3.1.54. Ген pflB (нуклеотиды комплементарные нуклеотидам с 950,495 по 952,777 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank; gi: 49175990) расположен между геном pflA и геном focA на хромосоме штамма Е. coli К-12. Нуклеотидная последовательность гена pflB и аминокислотная последовательность белка PflB, кодируемого геном pfl, приведены в Перечне последовательностей под номерами 11 (SEQ ID NO: 11) и 12 (SEQ ID NO: 12) соответственно. Гены frdA и frdB (синонимы: ЕСК4150, b4154; ЕСК4149, b4153) кодируют белки FrdA и FrdB - субъединицы фумарат редуктазного ферментативного комплекса. Гены frdA и frdB (нуклеотиды, комплементарные нуклеотидам с 4,378,533 по 4,380,341, и нуклеотиды, комплементарные нуклеотидам с 4,377,806 по 4,378,540, соответственно, в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank, gi: 49175990) расположены между генами ертА и frdC на хромосоме Е. coli К-12. Нуклеотидные последовательности генов frdA и frdB и аминокислотные последовательности белков FrdA и FrdB, кодируемых генами frdA и frdB представлены в SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, соответственно. Гены sdhA и sdhB (синонимы: ECK0712, b0723; ECK0713, b0724) кодируют белки SdhA и SdhB - каталитические субъединицы сукцинат дегидрогеназного ферментативного комплекса. Гены sdhA и sdhB (нуклеотиды с 755,130 по 756,896, и нуклеотиды, с 756,912 по 757,628, соответственно, в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank, gi: 49175990) расположены между генами sdhD и sucA на хромосоме Е. coli К-12. Нуклеотидные последовательности генов sdhA и sdhB и аминокислотные последовательности белков SdhA и SdhB, кодируемых генами sdhA и sdhB представлены в SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, соответственно. Гены aceA и асеВ (синонимы: ЕСК4007, b4015; ЕСК4006, b4014) кодируют белки АсеА и АсеВ, проявляющие, соответственно, активность изоцитрат лиазы и малат синтазы, классифицируемые как К.Ф. 4.1.3.1. и К.Ф. 2.3.3.9. Гены асеА и асеВ (нуклеотиды с 4,215,132 по 4,216,436, и нуклеотиды, с 4,213,501 по 4,215,102, соответственно, в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank, gi: 49175990) расположены между генами metA и сеК на хромосоме штамма Е. coli К-12. Нуклеотидные последовательности генов сеА и сеВ и аминокислотные последовательности белков АсеА и АсеВ, кодируемых генами сеА и сеВ представлены в SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, соответственно. Ген ptsG (синонимы: ECK1087, b1101) кодирует белок PtsG (синоним: B1101), проявляющий активность пермеазы глюкозы фосфоенолпируват зависимой системы транспорта Сахаров. Ген ptsG (нуклеотиды с 1,157,092 по 1,158,525 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank; gi: 49175990) расположен между открытой рамкой считывания ycfH и геном fhuE на хромосоме штамма Е. coli К-12. Нуклеотидная последовательность гена ptsG и аминокислотная последовательность белка PtsG, кодируемого геном ptsG, приведены в Перечне последовательностей под номерами 25 (SEQ ID NO: 25) и 26 (SEQ ID NO: 26) соответственно.
a
a
a
a
а
Поскольку у представителей различных штаммов вида Escherichia coli возможны Некоторые вариации в нуклеотидных последовательностях, понятие инактивируемого гена не ограничивается генами, последовательности которых приведены в Перечне последовательностей под номерами 1 (SEQ ID No: 1), 3 (SEQ ID No: 3), 5 (SEQ ID No: 5), 7 (SEQ ID No: 7), 9 (SEQ ID No: 9), 11 (SEQ ID No: 11), 13 (SEQ ID NO: 13), 15 (SEQ ID No: 15), 17 (SEQ ID No: 17), 19 (SEQ ID No: 19), 21 (SEQ ID NO: 21), 23 (SEQ ID No: 23), 25 (SEQ ID NO: 25), но также может включать и гены, гомологичные SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 5, SEQ ID No: 7, SEQ ID No: 9, SEQ ID No: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID No: 15, SEQ ID No: 17, SEQ ID No: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID No: 23, SEQ ID NO: 25, кодирующие варианты белков AckA, Pta, PoxB, LdhA, AdhE, PflB, FrdA, FrdB, SdhA, SdhB, АсеА, АсеВ и PtsG. Термин «вариант белка» в значении, в котором он используется в настоящем изобретении, означает белок, имеющий изменения в аминокислотной последовательности, а именно делении, вставки, добавления или замены аминокислот. Количество изменений в варианте белка зависит от положения аминокислотного остатка в трехмерной структуре или типа аминокислотного остатка. Количество изменений может быть от 1 до 30, предпочтительно от 1 до 15 и наиболее предпочтительно от 1 до 5 изменений в последовательностях SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24 и SEQ ID NO: 26. Данные изменения в вариантах белка являются консервативными мутациями, при которых сохраняется функция белка. Другими словами, данные изменения могут иметь место в областях белка, некритичных для его трехмерной структуры. Это становится возможным благодаря тому, что некоторые аминокислоты обладают высокой гомологией друг к другу, и поэтому третичная структура при таких заменах не нарушается. Консервативная мутация - это мутация, при которой имеют место взаимные замены среди Phe, Trp, Tyr, если сайт замены - ароматическая аминокислота; среди Leu, Ile, Val, если сайт замены -гидрофобная аминокислота; между Gln, Asn, если сайт замены - положительно заряженная аминокислота; среди Lys, Arg, His, если сайт замены - основная аминокислота; между Asp, Glu, если сайт замены - кислая аминокислота и между Ser, Thr, если это аминокислота с гидроксильной группой. Консервативные замены являются типичными консервативными мутациями. Примеры консервативных замен включают замену Ala на Ser или Thr, замену Arg на Gin, His или Lys, замену Asn на Glu, Gin, Lys, His или Asp, замену Asp на Asn, Glu или Gin, замену Cys на Ser или Ala, замену Gin на Asn, Glu, Lys, His, Asp или Arg, замену Glu на Asn, Gin, Lys или Asp, замену Gly на Pro, замену His на Asn, Lys, Gin, Arg или Туr, замену Ile на Leu, Met, Val или Phe, замену Leu на Ile, Met, Val или Phe, замену Lys на Asn, Glu, Gin, His или Arg, замену Met на Ile, Leu, Val или Phe, замену Phe на Trp, Туr, Met, Не или Leu, замену Ser на Thr или Ala, замену Thr на Ser или Ala, замену Trp на Phe или Tyr, замену Tyr на His, Phe или Trp, и замену Val на Met, Ile или Leu. Описанные выше замены, делеции, вставки, добавления, перестановки и т.п. одного или нескольких аминокислотных остатков включают природные мутации (мутант или вариант) в зависимости от видовых различий или индивидуальных различий микроорганизмов, содержащих гены ckA, pt, рохВ, ldhA, dhE, pflB, frdA, frdB, sdhA, sdhB, ceA, сеВ и ptsG. Такие гены могут быть получены модифицированием нуклеотидной последовательности, показанной в SEQ ID No: 1, SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 5, SEQ ID No: 7, SEQ ID No: 9, SEQ ID No: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID No: 15, SEQ ID No: 17, SEQ ID No: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID No: 23 и SEQ ID NO: 25 с использованием, например, сайт-специфического мутагенеза, таким образом, что I сайт-специфический аминокислотный остаток в соответствующем кодируемом белке включает замены, делеции, вставки или добавления.
а
a
a
a
а
Следовательно, варианты белков, кодируемых генами скА, pt, рохВ, ldhA, dhE, pflB, frdA, frdB, sdhA, sdhB, ceA, сеВ и ptsG, могут иметь гомологию не менее 80%, предпочтительно не менее 90%, и наиболее предпочтительно не менее 95%, по отношению к полной аминокислотной последовательности, показанной в Перечне последовательностей под номерами 2 (SEQ ID NO: 2), 4 (SEQ ID NO: 4), 6 (SEQ ID NO: 6), 8 (SEQ ID NO: 8), 10 (SEQ ID NO: 10), 12 (SEQ ID NO: 12), 14 (SEQ ID NO: 14), 16 (SEQ ID NO: 16), 18 (SEQ ID NO: 18), 20 (SEQ ID NO: 20), 22 (SEQ ID NO: 22), 24(SEQ ID NO: 24) и 26 (SEQ ID NO: 26), соответственно.
а
a
a
a
а
В связи с этим гены скА, pt, рохВ, ldhA, dhE, pflB, frdA, frdB, sdhA, sdhB, ceA, сеВ и ptsG могут быть вариантами, которые гибридизуются в жестких условиях с нуклеотидными последовательностями, приведенными в Перечне последовательностей под номерами 1 (SEQ ID No: 1), 3 (SEQ ID No: 3), 5 (SEQ ID No: 5), 7 (SEQ ID No: 7), 9 (SEQ ID No: 9), 11 (SEQ ID No: 11), 13 (SEQ ID NO: 13), 15 (SEQ ID No: 15), 17 (SEQ ID No: 17), 19 (SEQ ID No: 19), 21 (SEQ ID NO: 21), 23 (SEQ ID No: 23), 25 (SEQ ID NO: 25), или с зондом, который может быть синтезирован на основе указанной нуклеотидной последовательности. «Жесткие условия» включают такие условия, при которых специфические гибриды, например, гибриды с гомологией! не менее 60%, предпочтительно не менее 70%, более предпочтительно не менее 80%, еще более предпочтительно не менее 90%, и наиболее предпочтительно не менее 95%, образуются, а неспецифические гибриды, например, гибриды с меньшей гомологией, чем указано выше, - не образуются. Практическим примером жестких условий является однократная отмывка, предпочтительно двух- или трехкратная, при концентрации солей 1×SSC, 0.1% SDS, предпочтительно 0.1×SSC, 0.1% SDS, при 60°С.Продолжительность отмывки зависит от типа используемой для блоттинга мембраны и, как правило, такова, как рекомендовано производителем. Например, рекомендуемая продолжительность отмывки для нейлоновой мембраны Hybond™ N+ (Amersham) при строгих условиях-15 минут. Предпочтительна двух- трехкратная отмывка. Длина зонда может быть выбрана в зависимости от условий гибридизации, обычно от 100 н.п. до 1000 н.п.
Гомология между последовательностями аминокислот может быть определена с использованием известных методов, например, компьютерной программы BLAST 2.0.
а
a
a
a
a
a
a
a
a
а
Экспрессия генов скА, pt, рохВ, ldhA, dhE, pflB, frdA, frdB, sdhA, sdhB, ceA, ceB и ptsG может быть ослаблена введением мутации в соответствующий ген на хромосоме, при которой внутриклеточная активность белка, кодируемого геном, снижена или отсутствует по сравнению с немодифицированным штаммом. Такой мутацией гена может быть вставка гена устойчивости к антибиотику, или делеция гена или его части (Qiu, Ζ. and Goodman, M.F., J., 1997, Biol. Chem., 272, 8611-8617; Kwon, D.H. et al., 2000, J. Antimicrob. Chemother., 46, 793-796). Экспрессия генов ckA, pt, рохВ, ldhA, dhE, pflB, frdA, frdB, sdhA, sdhB, ceA, сеВ и ptsG также может быть ослаблена модификацией регуляторных последовательостей, таких как промотор или последовательность Shine-Dalgarno (SD) (заявка РСТ WO 95/34672; Carrier, Т.А. and Keasling, J.D., 1999, Biotechnol Prog 15, 58-64).
Следующие методы могут быть применены для введения мутаций путем генной рекомбинации. Конструируется мутантный ген, и бактерия для ее модификации трансформируется фрагментом ДНК, содержащим мутантный ген. Затем нативный ген на хромосоме замещается гомологичной рекомбинацией мутантным геном, отбирается полученный штамм. Такое замещение гена с использованием гомологичной рекомбинации может быть проведено методом с использованием линейной ДНК, известным как "Red-зависимая интеграция" или "интеграция посредством Red-системы" (Datsenko, K.Α., Wanner, B.L., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 12, 6640-6645) или методом с использованием плазмиды, репликация которой чувствительна к температуре (патент США 6,303,383 или патентная заявка Японии JP 05-007491 А). Далее, введение сайт-специфической мутации путем замещения гена с использованием вышеупомянутой гомологичной рекомбинации может также быть осуществлено с использованием плазмиды с пониженной способностью к репликации в клетке хозяина.
Экспрессия гена также может быть ослаблена вставкой транспозона или IS фактора в кодирующую область гена (патент США 5,175,107), или традиционными методами, такими как мутагенез с использованием УФ излучения или обработка нитрозогуанидином (N-метил-N′-нитро-N-нитрозогуанидин).
Инактивация гена также может быть осуществлена традиционными методами, такими как мутагенез с использованием УФ излучения или обработка нитрозогуанидином (N-метил-N′-нитро-N-нитрозогуанидин), сайт-специфический мутагенез, разрушение гена с использованием гомологичной рекомбинации, или/и мутагенез вставкой-делецией (Yu, D. et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:12: 5978-83 and Datsenko, K.A. and Wanner, B.L., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:12: 6640-45) также называемый "Red-зависимая интеграция".
Приведенное выше описание, касающееся вариантов белков, инактивации гена и других методов, может быть применимо к другим белкам, генам и конструированию бактерий, приведенным ниже.
Термин "усиление экспрессии гена" может означать, что экспрессия гена выше, чем в немодифицированном штамме, например, в штамме дикого типа. Примеры таких модификаций могут включать увеличение числа копий экспрессируемого гена в клетке, усиление экспрессии гена и т.д. Количество копий экспрессируемого гена определяют, например, путем рестрикции хромосомной ДНК с последующим блоттингом по Саузерну с использованием зонда, сконструированного на основе последовательности гена, флуоресцентной гибридизации in situ (FISH), и т.п.Уровень экспрессии гена можно определить различными известными методами, включая Нозерн-блоттинг, количественную ОТ-ПЦР, и т.п.Кроме того, штаммы, которые могут быть использованы в качестве контроля, включают, например, Escherichia coli К-12.
Ген glk (синонимы: ЕСК2384, Ь2388) кодирует белок Glk (синоним: В2388), проявляющий активность глюкокиназы, классифицируемую как К.Ф. 2.7.1.2. Ген glk (нуклеотиды комплементарные нуклеотидам с 2,506,483 по 2,507,448 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank; gi: 49175990) расположен между геном fryB и открытой рамкой считывания yfeO на хромосоме штамма Е. coli К-12. Нуклеотидная последовательность гена glk и аминокислотная последовательность белка Glk, кодируемого геном glk, приведены в Перечне последовательностей под номерами 27 (SEQ ID NO: 27) и 28 (SEQ ID NO: 28) соответственно. Ген galP (синонимы: ЕСК2938, Ь2943) кодирует белок GalP (синоним: В2943), проявляющий активность Н+-симпортера галактозы. Ген galP (нуклеотиды с 3,086,306 по 3,087,700 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank; gi: 49175990) расположен между геном metK и открытой рамкой считывания yggl на хромосоме штамма Е. coli К-12. Нуклеотидная последовательность гена galP и аминокислотная последовательность белка GalP, кодируемого геном galP, приведены в Перечне последовательностей под номерами 29 (SEQ ID NO: 29) и 30 (SEQ ID NO: 30) соответственно.
Понятие "вариант белка" также применимо для белков Glk и GalP, кодирующих глюкокиназу и Н+-симпортер галактозы. Термин "вариант белка" трактуется аналогично тому, как это описано выше.
В связи с этим гены glk и galP также могут существовать в виде вариантов, которые гибридизуются в жестких условиях с нуклеотидными последовательностями, представленными в SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, или с зондами, которые могут быть синтезированы на основе указанных нуклеотидных последовательностей, при условии, что они кодируют функциональные белки Glk и GalP. Термин "жесткие условия" трактуется аналогично тому, как это описано выше.
Методы, которые могут быть использованы для усиления экспрессии гена, включают увеличение числа копий гена. Введение гена в вектор, способный функционировать в бактерии вида Escherichia coli, может увеличивать число копий гена. Могут использоваться низкокопийные векторы. Примеры низкокопийных векторов включают, но не ограничиваются ими, pSC101, pMW118, pMW119, и т.п. Термин "низкокопийный вектор" используется для векторов, число копий которого в клетке достигает пяти.
Усиление экспрессии гена может также быть достигнуто путем введения множества копий гена в бактериальную хромосому, например, методом гомологичной рекомбинации, Mu интеграции и т.п. Например, один акт Mu интеграции позволяет ввести в бактериальную хромосому до 3 копий гена.
Число копий гена также может быть увеличено путем введения множества копий гена в хромосомную ДНК бактерии. Для введения множества копий гена в бактериальную хромосому может быть выполнена гомологичная рекомбинация с использованием в качестве целевых последовательностей - последовательностей, присутствующих в хромосоме во множестве копий. Последовательности с множеством копий в хромосомной ДНК, включают, но не ограничиваются ими, повторяющиеся ДНК или инвертированные повторы на концах транспонируемых элементов. Также возможно включить ген в состав транспозона и обеспечить его перенос для введения множества копий гена в хромосомную ДНК.
R
L
Усиление экспрессии гена также может быть достигнуто путем подстановки фрагмента ДНК под контроль сильного промотора. Примерами сильных промоторов являются lac промотор, trp промотор, trc промотор, tac промотор, P или P промоторы фага λ. Использование сильного промотора можно сочетать с увеличением копий гена.
С другой стороны, действие промотора может быть усилено, например, введением в промотор мутации, ведущей к увеличению уровня транскрипции локализованного за промотором гена. Кроме того, известно, что замена нескольких нуклеотидов в области между сайтом связывания рибосомы (ribosome binding site - RBS) и стартовым кодоном, особенно в последовательности непосредственно перед стартовым кодоном, существенно влияет на трансляционную способность мРНК. Например, обнаружен 20-кратный разброс в уровне экспрессии в зависимости от природы трех нуклеотидов, предшествующих стартовому кодону (Gold et al., 1981, Annu. Rev. Microbiol., 35, 365-403; Hui et al., 1984, EMBO J., 3, 623-629).
Кроме того, возможно ввести нуклеотидную замену в область промотора гена на бактериальной хромосоме, результатом чего является усиление функции промотора. Изменение последовательности, контролирующей экспрессию, можно осуществить, например, таким же способом, что и замена гена с использованием чувствительной к температуре плазмиды, как раскрыто в международной заявке WO 00/18935 и заявке Японии JP 1-215280 А.
Методы приготовления плазмидных ДНК, рестрикции и лигирования ДНК, трансформации, выбора нуклеотидов в качестве праймеров и т.п.могут быть обычными методами, известными специалисту в этой области. Эти методы описаны, например, в Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).
Способ получения фумаровой кислоты в общем виде.
Заявляемый способ продукции фумаровой кислоты осуществляют путем культивирования заявляемого штамма бактерий Escherichia coli в питательной среде, обеспечивающей продукцию, накопление фумаровой кислоты в культуральной жидкости и выделение фумаровой кислоты или ее соли из культуральной жидкости.
2
3
3
-
2-
Согласно заявляемому способу, культивирование штамма, выделение и очистку фумаровой кислоты или ее соли из культуральной или подобной ей жидкости осуществляют способом, подобным традиционным способам ферментации, в которых фумаровая кислота продуцируется с использованием микроорганизмов. В качестве питательной среды, используют как синтетическую, так и натуральную, при условии, что среда содержит источники углерода, азота, минеральные добавки и, если необходимо, соответствующее количество питательных добавок, необходимых для роста микроорганизмов. К источникам углерода относят различные углеводы, такие как глюкоза и сахароза, а также различные органические полиолы, такие как глицерин. В качестве источника азота используют различные неорганические соли аммония, такие как аммиак и сульфат аммония, другие соединения азота, такие как амины, природные источники азота, такие как пептон, зерновые или бобовые гидролизаты, ферментолизат микроорганизмов. В качестве минеральных добавок используют фосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат железа, сульфат марганца, хлорид кальция и подобные им соединения. При необходимости в питательную среду добавляют дополнительные источники СОи/или ионов НСО  и СО , вводимые в среду за счет газообмена или же растворения соответствующих солей.
Выращивание и инкубацию осуществляют при температуре в пределах от 30°С до 37°С, предпочтительно в пределах от 35°С до 37°С. рН среды поддерживают в пределах от 5 до 9, предпочтительно от 6,5 до 7,2. рН среды регулируют аммиаком, карбонатом кальция, различными кислотами, основаниями и буферными растворами. Культивирование в течение от 1-го до 5-ти дней приводит к накоплению фумаровой кислоты в культуральной жидкости.
Заявляемый способ включает аэробную ростовую и анаэробную продуктивную стадии.
После культивирования твердые остатки, такие как клетки, удаляют из культуральной жидкости методом центрифугирования или фильтрацией через мембрану, а затем фумаровая кислота или ее соль может быть выделена и очищена методами ионообменной хроматографии, обращеннофазовой хроматографии, концентрирования и/или кристаллизации.
Пример 1. Конструирование штаммов бактерий Escherichia coli.
Сконструированны и использованны следующие штаммы -
a
a
a
MSG0.1 (Е. coli MG1655 ΔckA, Δpt, ΔрохВ, ΔldhA, ΔdhE, ΔptsG);
a
a
a
tac
MSG0.2 (Ε. coli MG1655 ΔckA, Δpt, ΔрохВ, ΔldhA, ΔdhE, ΔptsG, P-galP);
a
a
a
tac
L
MSG1.0 (Ε. coli MG1655 ΔckA, Δpt, ΔрохВ, ΔldhA, ΔdhE, ΔptsG, P-galP, P-glk);
a
a
a
a
a
tac
L
FUM1.0 (E. coli MG1655 ΔckA, Δpt, ΔpoxB, ΔldhA, ΔdhE, ΔpflB, ΔfrdA, ΔfrdB, ΔsdhA, ΔsdhB, ΔceA, ΔceB, ΔptsG, P-galP, P-glk).
В качестве базового для конструирования всех использованных штаммов использован штамм дикого типа Escherichia coli К-12 MG1655 (ВКПМ В-6195).
1.1. Конструирование штамма MSG0.1.
a
a
a
a
a
Штамм MSG0.1 (E. coli MG1655 ΔckA, Δpt, ΔрохВ, ΔldhA, ΔadhE, ΔptsG) получен на основе штамма E.coli MG1655 в результате инактивации генов ckA-pt, рохВ, ldhA, dhE и ptsG с помощью рекомбинационной инженерии, основанной на методе, использующем λRed-зависимую гомологичную рекомбинацию. Принцип метода детально описан, например, в (Sawitzke J. et al., 2007, Recombineering: In Vivo Genetic Engineering in Ε. coli, S. enterica, and Beyond. Methods in Enzymology., 421, 171-199), а примеры ero практического применения, например, в (RU 2330883).
Первоначально все хромосомные модификации получены индивидуально с использованием в качестве реципиента штамма E.coli MG1655. На основе отобранных индивидуальных колоний штаммов, несущих маркированные целевые хромосомные модификации получены препараты соответствующих Ρ1-трансдуцирующих фагов. Далее серией последовательных трансдукций полученные модификации объединены в хромосоме целевого штамма. После каждого раунда трансдукций, из хромосомы полученных штаммов осуществляли удаление маркера устойчивости к антибиотику, фланкированного аттечмент сайтами фага лямбда, с использованием плазмиды pMWts-Int/Xis (WO 2007 013638; RU 2005123423), включающей гены Int/Xis зависимой системы сайт-специфической рекомбинации фага лямбда.
a
a
a
Первоначально получены фрагменты ДНК для инактивации генов ckA-pt, рохВ, ldhA, dhE и ptsG.
Линейные фрагменты ДНК для делеций целевых генов получены при помощи ПЦР с использованием пар праймеров P1 (SEQ ID NO: 31) и Р2 (SEQ ID NO: 32), Р5 (SEQ ID NO: 33) и P6 (SEQ ID NO: 34), P9 (SEQ ID NO: 35) и PI0 (SEQ ID NO: 36), P13 (SEQ ID NO: 37) и P14 (SEQ ID NO: 38), P17 (SEQ ID NO: 39) и P18 (SEQ ID NO: 40) и плазмиды pMW118-attL-Cm-attR (Каташкина Ж.И. и др., 2005 Направленное изменение уровня экспрессии генов в бактериальной хромосоме. Мол. Биол., 39 (5), 823-831) в качестве матрицы.
a
a
a
a
a
a
Праймеры Р1, Р5, Р9, Р13 и Р17 содержат участки ДНК размером в 36 нуклеотидов, гомологичные участкам ДНК, расположенным на 5′-концах генов ckA, рохВ, ldhA, dhE и ptsG, и участки ДНК размером 28 нуклеотидов, комплементарные участку ДНК, расположенному на 3′-конце области ttR. Праймеры Р2, Р6, PIO, PI4 и PI8 содержат участки ДНК размером в 36 нуклеотидов, комплементарные участкам ДНК, расположенным на 3′-концах генов pt, рохВ, ldhA, dhE и ptsG, а также участки ДНК размером 28 нуклеотидов, гомологичные участку ДНК, расположенному на 5′-конце области ttL. Температурный профиль для ПЦР: денатурация при 95°С в течение 5 мин; последующие 25 циклов: 30 сек при 95°С, 30 сек при 52°С, 1 мин при 72°С; и заключительная полимеризация: 7 мин при 72°С. Использовали Taq ДНК полимеразу, соответствующий буфер и дезоксирибонуклеозидтрифосфаты производства Fermentas (Литва).
a
a
a
a
a
a
Полученные ПЦР-продукты длиной 1700 п.н. для инактивации генов ckA-pt, рохВ, ldhA, dhE, и ptsG, индивидуально очищали электрофорезом в агарозном геле и выделяли, в соответствии с рекомендациями производителя, с помощью Qiagen QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, США). Итоговые фрагменты содержат ген устойчивости к хлорамфениколу (ген ct, кодирующий хлорамфениколацетилтрансферазу), фланкированный сайтами ttL и ttR фага лямбда, а также 36-ти звенные области фланговой гомологии с кодирующими областями целевых генов.
Интеграцию полученных линейных фрагментов ДНК в хромосому штамма Е. coli MG1655 осуществляли с использованием системы Red-зависимой гомологичной рекомбинации фага λ.
araB
Для этого рекомбинантные ДНК вводили электротрансформацией в индивидуальные клоны штамма Е. coli MG1655, содержащего плазмиду pKD46 с термочувствительным репликоном. Плазмида pKD46 (Datsenko, К.А. and Wanner, B.L., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(12):6640-6645) содержит ДНК-фрагмент фага λ длиной 2154 п. н. (позиции с 31088 по 33241 нуклеотидной последовательности с инвентарным номером J02459 в базе данных GenBank), а также содержит гены λ Red-гомологичной системы рекомбинации (гены γ, β, ехо) под контролем промотора P, индуцируемого арабинозой. Плазмида pKD46 необходима для интеграции линейных ДНК в хромосому штамма.
600
2
R
R
S
Электрокомпетентные клетки штамма Е. coli MG1655, содержащего плазмиду pKD46, получали следующим образом: ночную культуру штамма Е. coli MG1655, содержащего плазмиду pKD46, выращивали при 30°С в среде LB с добавкой ампициллина (100 мг/л) и разводили в 100 раз, добавляя 10 мл среды SOB (Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), содержащей ампициллин и L-арабинозу (10 мМ). Полученную культуру растили с перемешиванием при 30°С до достижения OD≈0,8, после чего придавали клеткам свойства электрокомпетентности, путем концентрирования в 100 раз и трехкратного отмывания ледяной деионизированной НО. Электропорацию проводили с использованием 70 мкл клеток и ~300 нг индивидуального ПЦР-продукта. После электропорации клетки инкубировали в 1 мл среды SOC (Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) при 37°C в течение 2.5 часов, после чего высевали на чашки с L-агаром, содержащим 30 мкг/мл хлорамфеникола, и выращивали при 37°С для отбора Cm-рекомбинантов. Удаление плазмиды-помощника pKD46 осуществляли рассевом клонов до отдельных колоний на агаризованной LB среде с селекцией устойчивых к хлорамфениколу и чувствительных к ампициллину CmAp вариантов.
R
S
a
a
a
Факты соответствия предполагаемых и полученных экспериментально структур хромосом отобранных CmAp колоний подтверждали ПЦР анализом с помощью пар локус-специфичных праймеров Р3 (SEQ ID NO: 41) и Р4 (SEQ ID NO: 42), Р7 (SEQ ID NO: 43) и P8 (SEQ ID NO: 44), P11 (SEQ ID NO: 45) и P12 (SEQ ID NO: 46), P15 (SEQ ID NO: 47) и P16 (SEQ ID NO: 48), P19 (SEQ ID NO: 49) и P20 (SEQ ID NO: 50), для оперона ckA-pt и генов рохВ, ldhA, dhE и ptsG, соответственно. Температурный профиль для ПЦР-проверки: денатурация при 95°С в течение 10 мин; профиль для 30 циклов: 30 сек при 95°С, 30 сек при 50°С, 2 мин при 72°С; заключительный шаг: 7 мин при 72°С.
a
a
a
a
a
Длина продуктов ПЦР, полученных в результате реакций с использованием в качестве матрицы клеток родительского штамма MG1655, составляла 3351 п.н. для интактного оперона ckA-pt, 1872 п.н. для интактного гена рохВ, 1299 п.н. для интактного гена ldhA, 2903 п.н. для интактного гена dhE и 1494 п.н. для интактного гена ptsG. Длина продуктов ПЦР, полученных в результате реакции с использованием в качестве матрицы клеток мутантных штаммов, составляла 1920 п.н. для инактивированного оперона ckA-pta, 1852 п.н. для инактивированного гена рохВ, 2008 п.н. для инактивированного гена ldhA, 1926 п.н. для инактивированного гена dhE и 1759 п.н. для инактивированного гена ptsG.
R
S
a
a
a
На основе отобранных индивидуальных CmAp колоний штаммов с замененными геном ct опероном ackA-pt и генами рохВ, ldhA, dhE и ptsG по стандартной методике (Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) получены препараты соответствующих P1-трансдуцирующих фагов.
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
4
2
9
R
R
S
R
S
S
Штамм Ε. coli с делетированными генами ckA-pt получен переносом в хромосому штамма Е. coli MG1655 фрагмента хромосомы, с опероном ckA-pt, замененным геном ct, фланкированным аттечмент сайтами фага лямбда, с использованием препарата трансдуцирующего фага, несущего целевую маркированную генетическую модификацию. Для этого клетки Штамма Е. coli MG1655 выращивали в течение ночи при 37°С в среде LB (Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Клетки из 500 мкл ночной культуры штамма-реципиента собирали центрифугированием, ресуспендировали в 100 мкл буфера, содержащего 0,1 M MgSO и 5 мМ CaCl, добавляли препарат трансдуцирующего фага, в разведении соответствующем 10 фаговых частиц/мл, и инкубировали 20 мин при 37°С. Клетки осаждали центрифугированием, промывали 1 мл стерильной воды, высевали на чашку с L-агаром, содержащим 30 мкг/мл хлорамфеникола, и выращивали при 37°С для отбора Cm-трансдуктантов. Очистку полученных трансдуктантов от остаточных фаговых частиц осуществляли рассевом клонов до отдельных колоний на агаризованной LB среде с последующей селекцией устойчивых к хлорамфениколу Cm вариантов. В хромосомах клонов, формирующих наиболее быстрорастущие колонии правильной формы, подтверждали замену генов оперона ckA-pt геном ct, фланкированным аттечмент сайтами фага лямбда, ПЦР анализом с помощью локус-специфичных праймеров Р3 (SEQ ID NO: 41) и Р4 (SEQ ID NO: 42). Температурный профиль для ПЦР-проверки: денатурация при 95°С в течение 10 мин; профиль для 30 циклов: 30 сек при 95°С, 30 сек при 50°С, 2 мин при 72°С; заключительный шаг: 7 мин при 72°С. Использовали Taq ДНК полимеразу, соответствующий буфер и дезоксинуклеозидтрифосфаты производства Fermentas (Литва). Длина продуктов ПЦР, полученных в результате реакций с использованием в качестве матрицы клеток родительского штамма MG1655, составляла 3351 п. н. для интактного оперона ckA-pt. Длина продуктов ПЦР, полученных в результате реакции с использованием в качестве матрицы клеток полученных трансдуктантов, составляла 1920 п.н. для оперона ckA-pt, замененного геном ct, фланкированным аттечмент сайтами фага лямбда. С целью удаления из хромосом трансдуктантов маркера устойчивости к антибиотику, отобранные клоны трансформировали плазмидой pMWts-Int/Xis (WO 2007 013638; RU 2005123423). Селекция трансформированных клонов производилась с использованием среды LB, содержащей ампициллин (100 мкг/мл). Ген ct был удален из трансформированных клонов путем выращивания отдельных колоний штаммов на чашках с LB средой с селекцией чувствительных к хлорамфениколу и устойчивых к ампициллину CmAp вариантов. Удаление гена ct из хромосом трансдуктантов и делецию в них генов оперона ckA-pt подтверждали ПЦР с помощью соответствующих локус-специфичных праймеров Р3 и Р4. Температурный профиль для ПЦР-проверки: денатурация при 95°С в течение 10 мин; профиль для 30 циклов: 30 сек при 95°С, 30 сек при 50°С, 2 мин при 72°С; заключительный шаг: 7 мин при 72°С. Длина продуктов ПЦР, полученных в результате реакций с использованием в качестве матрицы клеток родительского штамма MG1655, составляла 3351 п.н. для интактного оперона ckA-pt. Длина продуктов ПЦР, полученных в результате реакции с использованием в качестве матрицы клеток штамма с делетированным опероном ckA-pt, составляла 323 п.н. В результате последующего излечивания клонов от плазмиды-помощника pMWts-Int/Xis, проведенного с помощью повторного рассева до отдельных колоний на чашках с LB средой и селекции CmAp - вариантов, получен штамм Е. coli MG1655 (ΔckA-pt) с делетированным генами ckA-pt.
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
R
S
R
S
S
Штамм Е. coli с делетированными генами ckA-pt и рохВ получен переносом в хромосому штамма Е. coli MG1655 (ΔckA-pt) фрагмента хромосомы, с геном рохВ, замененным геном ct, фланкированным аттечмент сайтами фага лямбда, с использованием препарата трансдуцирующего фага, несущего целевую маркированную генетическую модификацию, как описано выше. Очистку полученных трансдуктантов от остаточных фаговых частиц осуществляли рассевом клонов до отдельных колоний на агаризованной LB среде с последующей селекцией устойчивых к хлорамфениколу Cm вариантов. В хромосомах клонов, формирующих наиболее быстрорастущие колонии правильной формы, подтверждали замену гена рохВ геном ct, фланкированным аттечмент сайтами фага лямбда, ПЦР анализом с помощью локус-специфичных праймеров Р7 (SEQ ID NO: 43) и Р8 (SEQ ID NO: 44). Температурный профиль для ПЦР-проверки: денатурация при 95°С в течение 10 мин; профиль для 30 циклов: 30 сек при 95°С, 30 сек при 50°С, 2 мин при 72°С; заключительный шаг: 7 мин при 72°С. Использовали Taq ДНК полимеразу, соответствующий буфер и дезоксинуклеозидтрифосфаты производства Fermentas (Литва). Длина продуктов ПЦР, полученных в результате реакций с использованием в качестве матрицы клеток родительского штамма MG1655 (ΔckA-pt), составляла 1872 п. н. для интактного гена рохВ. Длина продуктов ПЦР, полученных в результате реакции с использованием в качестве матрицы клеток полученных трансдуктантов, составляла 1852 п.н. для гена рохВ, замененного геном ct, фланкированным аттечмент сайтами фага лямбда. С целью удаления из хромосом трансдуктантов маркера устойчивости к антибиотику, отобранные клоны трансформировали плазмидой pMWts-Int/Xis (WO 2007013638; RU 2005123423). Селекция трансформированных клонов производилась с использованием среды LB, содержащей ампициллин (100 мкг/мл). Ген ct был удален из трансформированных клонов путем выращивания отдельных колоний штаммов на чашках с LB средой с селекцией чувствительных к хлорамфениколу и устойчивых к ампициллину CmAp вариантов. Удаление гена ct из хромосом трансдуктантов и делецию в них генов оперона ckA-pt и гена рохВ подтверждали ПЦР с помощью соответствующих пар локус-специфичных праймеров Р3 (SEQ ID NO: 41), Р4 (SEQ ID NO: 42) и P7 (SEQ ID NO: 43), P8 (SEQ ID NO: 44). Температурный профиль для ПЦР-проверки: денатурация при 95°С в течение 10 мин; профиль для 30 циклов: 30 сек при 95°С, 30 сек при 50°С, 2 мин при 72°С; заключительный шаг: 7 мин при 72°С. Длина продуктов ПЦР, полученных в результате реакций с использованием в качестве матрицы клеток исходного штамма MG1655, составляла 3351 п.н. для интактного оперона ckA-pt и 1872 п.н. для интактного гена рохВ. Длина соответствующих продуктов ПЦР, полученных в результате реакции с использованием в качестве матрицы клеток штамма с делетированными опероном ckA-pt и геном рохВ, составляла 323 п.н. и 255 п.н.. В результате последующего излечивания клонов от плазмиды-помощника pMWts-Int/Xis, проведенного с помощью повторного рассева до отдельных колоний на чашках с LB средой и селекции CmAp-вариантов, получен штамм Е. coli MG1655 (ΔckA-pt, ΔрохВ) с делетированным генами ckA-pt и рохВ.
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
R
S
R
S
S
Штамм Е. coli с делетированными генами ckA-pt, рохВ и ldhA получен переносом в хромосому штамма Е. coli MG1655 (ΔckA-pt, ΔрохВ) фрагмента хромосомы, с геном ldhA, замененным геном ct, фланкированным аттечмент сайтами фага лямбда, с использованием препарата трансдуцирующего фага, несущего целевую маркированную генетическую модификацию, как описано выше. Очистку полученных трансдуктантов от остаточных фаговых частиц осуществляли рассевом клонов до отдельных колоний на агаризованной LB среде с последующей селекцией устойчивых к хлорамфениколу Cm вариантов. В хромосомах клонов, формирующих наиболее быстрорастущие колонии правильной формы, подтверждали замену гена ldhA геном ct, фланкированным аттечмент сайтами фага лямбда, ПЦР анализом с помощью локус-специфичных праймеров P11 (SEQ ID NO: 45) и Р12 (SEQ ID NO: 46). Температурный профиль для ПЦР-проверки: денатурация при 95°С в течение 10 мин; профиль для 30 циклов: 30 сек при 95°С, 30 сек при 50°С, 2 мин при 72°С; заключительный шаг: 7 мин при 72°С. Использовали Taq ДНК полимеразу, соответствующий буфер и дезоксинуклеозидтрифосфаты производства Fermentas (Литва). Длина продуктов ПЦР, полученных в результате реакций с использованием в качестве матрицы клеток родительского штамма MG1655 (ΔckA-pt, ΔрохВ), составляла 1299 п.н. для интактного гена ldhA. Длина продуктов ПЦР, полученных в результате реакции с использованием в качестве матрицы клеток полученных трансдуктантов, составляла 2008 п.н. для гена ldhA, замененного геном ct, фланкированным аттечмент сайтами фага лямбда. С целью удаления из хромосом трансдуктантов маркера устойчивости к антибиотику, отобранные клоны трансформировали плазмидой pMWts-Int/Xis (WO 2007013638; RU 2005123423). Селекция трансформированных клонов производилась с использованием среды LB, содержащей ампициллин (100 мкг/мл). Ген ct был удален из трансформированных клонов путем выращивания отдельных колоний штаммов на чашках с LB средой с селекцией чувствительных к хлорамфениколу и устойчивых к ампициллину CmAp вариантов. Удаление гена ct из хромосом трансдуктантов и делецию в них генов оперона ckA-pt, гена рохВ и гена ldhA подтверждали ПЦР с помощью соответствующих пар локус-специфичных праймеров Р3 (SEQ ID NO: 41) и Р4 (SEQ ID NO: 42), Р7 (SEQ ID NO: 43) и P8 (SEQ ID NO: 44), P11 (SEQ ID NO: 45) и Ρ12 (SEQ ID NO: 46). Температурный профиль для ПЦР-проверки: денатурация при 95°С в течение 10 мин; профиль для 30 циклов: 30 сек при 95°С, 30 сек при 50°С, 2 мин при 72°С; заключительный шаг: 7 мин при 72°С. Длина продуктов ПЦР, полученных в результате реакций с использованием в качестве матрицы клеток исходного штамма MG1655, составляла 3351 п.н. для интактного оперона ckA-pt, 1872 п.н. для интактного гена рохВ и 1299 п.н. для интактного гена ldhA. Длина соответствующих продуктов ПЦР, полученных в результате реакции с использованием в качестве матрицы клеток штамма с делетированными опероном ckA-pt, геном рохВ и геном ldhA составляла 323 п.н., 255 п.н. и 411 п.н. В результате излечивания клонов от плазмиды-помощника pMWts-Int/Xis, проведенного с помощью повторного рассева до отдельных колоний на чашках с LB средой и селекции CmAp-вариантов, получен штамм Е. coli MG1655 (ΔckA-pt, ΔрохВ, ΔldhA) с делетированным генами ckA-pt, рохВ и ldhA.
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
R
S
R
S
S
Штамм Е. coli с делетированными генами ckA-pt, рохВ, ldhA и dhE получен переносом в хромосому штамма Е. coli MG1655 (ΔckA-pt, ΔрохВ, ΔldhA) фрагмента хромосомы, с геном dhE, замененным геном ct, фланкированным аттечмент сайтами фага лямбда, с использованием препарата трансдуцирующего фага, несущего целевую маркированную генетическую модификацию, как описано выше. Очистку полученных трансдуктантов от остаточных фаговых частиц осуществляли рассевом клонов до отдельных колоний на агаризованной LB среде с последующей селекцией устойчивых к хлорамфениколу Cm вариантов. В хромосомах клонов, формирующих наиболее быстрорастущие колонии правильной формы, подтверждали замену гена dhE геном ct, фланкированным аттечмент сайтами фага лямбда, ПЦР анализом с помощью локус-специфичных праймеров Р15 (SEQ ID NO: 47) и PI6 (SEQ ID NO: 48). Температурный профиль для ПЦР-проверки: денатурация при 95°С в течение 10 мин; профиль для 30 циклов: 30 сек при 95°С, 30 сек при 50°С, 2 мин при 72°С; заключительный шаг: 7 мин при 72°С. Использовали Taq ДНК полимеразу, соответствующий буфер и дезоксинуклеозидтрифосфаты производства Fermentas (Литва). Длина продуктов ПЦР, полученных в результате реакций с использованием в качестве матрицы клеток родительского штамма MG1655 (ΔckA-pt, ΔрохВ, ΔldhA), составляла 2903 п.н. для интактного гена dhE. Длина продуктов ПЦР, полученных в результате реакции с использованием в качестве матрицы клеток полученных трансдуктантов, составляла 1926 п.н. для гена dhE, замененного геном ct, фланкированным аттечмент сайтами фага лямбда. С целью удаления из хромосом трансдуктантов маркера устойчивости к антибиотику, отобранные клоны трансформировали плазмидой pMWts-Int/Xis (WO 2007 013638; RU 2005123423). Селекция трансформированных клонов производилась с использованием среды LB, содержащей ампициллин (100 мкг/мл). Ген ct был удален из трансформированных клонов путем выращивания отдельных колоний штаммов на чашках с LB средой с селекцией чувствительных к хлорамфениколу и устойчивых к ампициллину CmAp вариантов. Удаление гена ct из хромосом трансдуктантов и делению в них генов оперона ckA-pt, гена рохВ, гена ldhA и гена dhE подтверждали ПЦР с помощью соответствующих пар локус-специфичных праймеров Р3 (SEQ ID NO: 41) и Р4 (SEQ ID NO: 42), Р7 (SEQ ID NO: 43) и P8 (SEQ ID NO: 44), P11 (SEQ ID NO: 45) и P12 (SEQ ID NO: 46), P15 (SEQ ID NO: 47) и PI6 (SEQ ID NO: 48). Температурный профиль для ПЦР-проверки: денатурация при 95°С в течение 10 мин; профиль для 30 циклов: 30 сек при 95°С, 30 сек при 50°С, 2 мин при 72°С; заключительный шаг: 7 мин при 72°С. Длина продуктов ПЦР, полученных в результате реакций с использованием в качестве матрицы клеток исходного штамма MG1655, составляла 3351 п.н. для интактного оперона ckA-pt, 1872 п.н. для интактного гена рохВ, 1299 п.н. для интактного гена ldhA и 2903 п.н. для интактного гена dhE. Длина соответствующих продуктов ПЦР, полученных в результате реакции с использованием в качестве матрицы клеток штамма с делетированными опероном ckA-pt, геном рохВ, геном ldhA и геном adhE составляла 323 п.н., 255 п.н., 411 п.н. и 329 п.н.. В результате излечивания клонов от плазмиды-помощника pMWts-Int/Xis, проведенного с помощью повторного рассева до отдельных колоний на чашках с LB средой и селекции CmAp-вариантов, получен штамм Е. coli MG1655 (ΔckA-pt, ΔрохВ, ΔldhA, ΔdhE) с инактивированными генами ckA-pt, рохВ, ldhA и dhE.
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
R
S
R
S
S
Штамм Е. coli с делетированными генами ckA-pt, рохВ, ldhA, dhE и ptsG получен переносом в хромосому штамма Е. coli MG1655 (ΔckA-pt, ΔрохВ, ΔldhA, ΔadhE) фрагмента хромосомы, с геном ptsG, замененным геном ct, фланкированным аттечмент сайтами фага лямбда, с использованием препарата трансдуцирующего фага, несущего целевую маркированную генетическую модификацию, как описано выше. Очистку полученных трансдуктантов от остаточных фаговых частиц осуществляли рассевом клонов до отдельных колоний на агаризованной LB среде с последующей селекцией устойчивых к хлорамфениколу Cm вариантов. В хромосомах клонов, формирующих наиболее быстрорастущие колонии правильной формы, подтверждали замену гена ptsG геном ct, фланкированным аттечмент сайтами фага лямбда, ПЦР анализом с помощью локус-специфичных праймеров Р19 (SEQ ID NO: 49) и Р20 (SEQ ID NO: 50). Температурный профиль для ПЦР-проверки: денатурация при 95°С в течение 10 мин; профиль для 30 циклов: 30 сек при 95°С, 30 сек при 50°С, 2 мин при 72°С; заключительный шаг: 7 мин при 72°С. Использовали Taq ДНК полимеразу, соответствующий буфер и дезоксинуклеозидтрифосфаты производства Fermentas (Литва). Длина продуктов ПЦР, полученных в результате реакций с использованием в качестве матрицы клеток родительского штамма MG1655 (ΔckA-pt, ΔрохВ, ΔldhA, ΔdhE), составляла 1494 п.н. для интактного гена ptsG. Длина продуктов ПЦР, полученных в результате реакции с использованием в качестве матрицы клеток полученных трансдуктантов, составляла 1759 п.н. для гена ptsG, замененного геном cat, фланкированным аттечмент сайтами фага лямбда. С целью удаления из хромосом трансдуктантов маркера устойчивости к антибиотику, отобранные клоны трансформировали плазмидой pMWts-Int/Xis (WO 2007 013638; RU 2005123423). Селекция трансформированных клонов производилась с использованием среды LB, содержащей ампициллин (100 мкг/мл). Ген ct был удален из трансформированных клонов путем выращивания отдельных колоний штаммов на чашках с LB средой с селекцией чувствительных к хлорамфениколу и устойчивых к ампициллину CmAp вариантов. Удаление гена ct из хромосом трансдуктантов и делецию в них генов оперона ckA-pt, гена рохВ, гена ldhA, гена dhE и гена ptsG подтверждали ПЦР с помощью соответствующих пар локус-специфичных праймеров Р3 (SEQ ID NO: 41) и Р4 (SEQ ID NO: 42), Р7 (SEQ ID NO: 43) и P8 (SEQ ID NO: 44), P11 (SEQ ID NO: 45) и P12 (SEQ ID NO: 46), P15 (SEQ ID NO: 47) и P16 (SEQ ID NO: 48), P19 (SEQ ID NO: 49) и P20 (SEQ ID NO: 50). Температурный профиль для ПЦР-проверки: денатурация при 95°С в течение 10 мин; профиль для 30 циклов: 30 сек при 95°С, 30 сек при 50°С, 2 мин при 72°С; заключительный шаг: 7 мин при 72°С. Длина продуктов ПЦР, полученных в результате реакций с использованием в качестве матрицы клеток исходного штамма MG1655, составляла 3351 п.н. для интактного оперона ckA-pt, 1872 п.н. для интактного гена рохВ, 1299 п.н. для интактного гена ldhA, 2903 п.н. для интактного гена dhE и 1494 п.н. для интактного гена ptsG. Длина соответствующих продуктов ПЦР, полученных в результате реакции с использованием в качестве матрицы клеток штамма с делетированными опероном ckA-pt, геном рохВ, геном ldhA, геном dhE и геном ptsG составляла 323 п.н., 255 п.н., 411 п.н., 329 п.н. и 162 п.н.. В результате излечивания клонов от плазмиды-помощника pMWts-Int/Xis, проведенного с помощью повторного рассева до отдельных колоний на чашках с LB средой и селекции CmAp-вариантов, получен штамм Е. coli MG1655 (ΔckA-pt, ΔрохВ, ΔldhA, ΔdhE, ΔptsG) с инактивированными генами ckA-pt, рохВ, IdhA, dhE и ptsG, названный MSG0.1.
1.2. Конструирование штамма MSG0.2.
а
a
a
а
a
a
tac
tac
Штамм MSG0.2 (E. coli MG1655 ΔскА, Δpt, ΔрохВ, ΔldhA, ΔdhE, ΔptsG, P-galP) получен на основе штамма MSG0.1 (Е. coli MG1655 ΔскА, Δpt, ΔрохВ, ΔldhA, ΔdhE, ΔptsG) в результате замены в нем нативной регуляторной области гена galP промотором P.
tac
Первоначально целевая хромосомная модификации была получена индивидуально с использованием в качестве реципиента штамма E.coli MG1655. Для усиления экспрессии гена galP укороченный вариант промотора P, обеспечивающий конститутивную транскрипцию в LacI позитивных штаммах, был интегрирован в хромосому реципиентного штамма перед кодирующим участком гена galP. На основе полученного штамма, несущего маркированную целевую хромосомную модификацию получен препарат соответствующего Р1-трансдуцирующего фага. Далее Ρ1-трансдукций полученная модификация была внесена в хромосому целевого штамма. После трансдукций, из хромосомы полученного штамма осуществляли удаление маркера устойчивости к антибиотику, фланкированного аттечмент сайтами фага лямбда, с использованием плазмиды pMWts-Int/Xis (WO 2007 013638; RU 2005123423), включающей гены Int/Xis зависимой системы сайт-специфической рекомбинации фага лямбда.
Первоначально был получен фрагмент ДНК для замены нативной регуляторной области гена galP.
tac
tac
tac
Получение вышеупомянутого искусственного фрагмента ДНК, для интеграции в соответствующий участок бактериальной хромосомы, осуществлялось в несколько стадий. На первой стадии, с помощью ПЦР получен фрагмент ДНК, содержащий в начале участок узнавания эндонуклеазы рестрикции BglII, промотор P, 18 нуклеотидов комплементарных области предшествующей кодирующей части гена galP и 18 нуклеотидов комплементарных 5′-концевой области кодирующей части гена galP. ПЦР проводили с использованием праймеров Р21 (SEQ ID NO: 51) и Р22 (SEQ ID NO: 52) и плазмиды pDR540 (последовательность с инвентарным номером U13847 в базе данных GenBank; gi: 595699) в качестве матрицы. Праймер Р21 содержит участок узнавания BglII и область гомологичную 5′-концу промотора P. Праймер Р22 содержит 18 нуклеотидов комплементарных области предшествующей кодирующей части гена galP, 18 нуклеотидов комплементарных 5′-концевой области кодирующей части гена galΡ и область, комплементарную 3′-концу промотора P. Температурный профиль для ПЦР: денатурация при 95°С в течение 5 мин; последующие 25 циклов: 30 сек при 95°С, 30 сек при 51°С, 60 сек при 72°С; и заключительная полимеризация: 7 мин при 72°С. Использовали Pfu ДНК полимеразу, соответствующий буфер и дезоксирибонуклеозидтрифосфаты производства Fermentas (Литва).
R
a
a
a
Параллельно осуществляли вторую стадию конструирования фрагмента ДНК. Фрагмент ДНК, содержащий маркер Cm, кодируемый геном ct, получен при помощи ПЦР с использованием праймеров Р23 (SEQ ID NO: 53) и Р24 (SEQ ID NO: 54) и плазмиды pMW118-attL-Cm-attR (Каташкина Ж.И. и др., 2005 Направленное изменение уровня экспрессии генов в бактериальной хромосоме. Мол. Биол., 39 (5), 823-831) в качестве матрицы. Праймер Р23 содержит 36 нуклеотидов гомологичных участку ДНК, расположенному на 174 нуклеотида ранее кодирующей области гена galP и участок ДНК размером 28 нуклеотидов, комплементарный участку ДНК, расположенному на 3′-конце области ttR. Праймер Р24 содержит участок узнавания BglII и участок ДНК размером 28 нуклеотидов, гомологичный участку ДНК, расположенному на 5′-конце области ttL. Температурный профиль для ПЦР: денатурация при 95°С в течение 5 мин; последующие 25 циклов: 30 сек при 95°С, 30 сек при 52°С, 1 мин при 72°С; и заключительная полимеризация: 7 мин при 72°С. Использовали Taq ДНК полимеразу, соответствующий буфер и дезоксинуклеозидтрифосфаты производства Fermentas (Литва).
Полученные фрагменты ДНК очищали в агарозном геле и выделяли, в соответствии с рекомендациями производителя, с помощью Qiagen QIAquick Gel Extraction Kit, с последующим осаждением этанолом.
nd
Два полученных фрагмента ДНК были обработаны эндонуклеазой рестрикции BglII с последующим лигированием с использованием Т4 ДНК-лигазы в соответствии со стандартной процедурой (Maniatis T., Fritsch Ε.F., Sambrook, J.: Molecular Cloning:A Laboratory Manual. 2 edn. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
tac
a
a
a
Продукт лигирования амплифицировали с помощью ПЦР с использованием праймеров Р22 (SEQ ID NO: 52) и Р23 (SEQ ID NO: 53). Температурный профиль для ПЦР: денатурация при 98°С в течение 1 мин; последующие 30 циклов: 15 сек при 98°С, 15 сек при 55°С, 1 мин при 72°С; и заключительная полимеризация: 7 мин при 72°С. Использовали Phusion ДНК полимеразу и соответствующий буфер производства Finnzymes; дезоксинуклеозидтрифосфаты производства Fermentas (Литва). Полученный ПЦР-продукт длиной 1756 п. н., очищали электрофорезом в агарозном геле и выделяли, в соответствии с рекомендациями производителя, с помощью Qiagen QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, США). Итоговый фрагмент содержал промотор P, ген устойчивости к хлорамфениколу (ген ct, кодирующий хлорамфениколацетилтрансферазу), фланкированный сайтами ttL и ttR фага лямбда, а также 36-звенные области фланговой гомологии с участком ДНК предшествующим кодирующей области гена galP и участком ДНК, включающим 5′-регион кодирующей области гена galP.
Интеграцию полученного линейного фрагмента ДНК в хромосому штамма Е. coli MG1655 осуществляли с использованием системы Red-зависимой гомологичной рекомбинации фага λ.
Для этого рекомбинантную ДНК вводили электротрансформацией в клетки штамма Е. coli MG1655, содержащего плазмиду pKD46 (Datsenko, К.А. and Wanner, B.L., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(12):6640-6645).
R
R
S
Электрокомпетентные клетки штамма Ε. coli MG1655, содержащего плазмиду pKD46, получали как описано выше. Электропорацию проводили с использованием 70 мкл клеток и ~300 нг индивидуального ПЦР-продукта. После электропорации клетки инкубировали в 1 мл среды SOC (Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) при 37°C в течение 2.5 часов, после чего высевали на чашки с L-агаром, содержащим 30 мкг/мл хлорамфеникола, и выращивали при 37°С для отбора Cm-рекомбинантов. Удаление плазмиды-помощника pKD46 осуществляли рассевом клонов до отдельных колоний на агаризованной LB среде с селекцией устойчивых к хлорамфениколу и чувствительных к ампициллину CmAp вариантов.
R
S
a
a
Факт соответствия предполагаемой и полученной экспериментально структур хромосомы соответствующих CmAp колоний подтверждали ПЦР анализом с помощью локус-специфичных праймеров Р25 (SEQ ID NO: 55) и Р25 (SEQ ID NO: 56). Длина продуктов ПЦР, полученных в результате реакций с использованием в качестве матрицы клеток родительского штамма MG1655 и праймеров Р25 и Р26 составляла 317 п.н. для интактной регуляторной области гена glP. Длина продукта ПЦР, полученного в результате реакции с использованием в качестве матрицы клеток мутантного штамма и праймеров Р25 и Р26, составляла 1845 п.н. для модифицированной регуляторной области гена glP. Также в хромосомах полученных клонов соответствие запланированной и экспериментально полученной нуклеотидной последовательности нового регуляторного элемента, введенного перед кодирующей областью гена galP, было подтверждено секвенированием.
R
S
tac
a
На основе отобранного CmAp варианта штамма, в котором нативная регуляторная область гена galP заменена промотором P, сопряженным с геном ct, фланкированным аттечмент сайтами фага лямбда, получен препарат соответствующего Р1-трансдуцирующего фага.
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
tac
tac
tac
tac
tac
tac
R
S
R
S
S
Штамм Ε. coli с делетированными генами ckA-pt, poxB, ldhA, dhE и ptsG, и усиленной экспрессией гена galP, получен переносом в хромосому штамма MSG0.1 (Е. coli MG1655 ΔckA-pt, ΔрохВ, ΔldhA, ΔdhE, ΔptsG) фрагмента хромосомы, в котором нативная регуляторная область гена galP заменена промотором P, сопряженным с геном cat, фланкированным аттечмент сайтами фага лямбда, с использованием препарата трансдуцирующего фага, несущего целевую маркированную генетическую модификацию, как описано выше. Очистку полученных трансдуктантов от остаточных фаговых частиц осуществляли рассевом клонов до отдельных колоний на агаризованной LB среде с последующей селекцией устойчивых к хлорамфениколу Cm вариантов. В хромосомах клонов, формирующих наиболее быстрорастущие колонии правильной формы, замену нативной регуляторной области гена galP промотором P, сопряженным с геном ct, фланкированным аттечмент сайтами фага лямбда, подтверждали ПЦР анализом с помощью локус-специфичных праймеров Р25 (SEQ ID NO: 55) и Р26 (SEQ ID NO: 56). Температурный профиль для ПЦР-проверки: денатурация при 95°С в течение 10 мин; профиль для 30 циклов: 30 сек при 95°С, 30 сек при 50°С, 2 мин при 72°С; заключительный шаг: 7 мин при 72°С. Использовали Taq ДНК полимеразу, соответствующий буфер и дезоксинуклеозидтрифосфаты производства Fermentas (Литва). Длина продуктов ПЦР, полученных в результате реакций с использованием в качестве матрицы клеток родительского штамма MSG0.1, составляла 317 п.н. для интактной регуляторной области гена galP. Длина продуктов ПЦР, полученных в результате реакции с использованием в качестве матрицы клеток полученных трансдуктантов, составляла 1845 п.н. п.н. для регуляторной области гена galP, замененной промотором P, сопряженным с геном ct, фланкированным аттечмент сайтами фага лямбда. С целью удаления из хромосом трансдуктантов маркера устойчивости к антибиотику, отобранные клоны трансформировали плазмидой pMWts-Int/Xis. Селекция трансформированных клонов производилась с использованием среды LB, содержащей ампициллин (100 мкг/мл). Ген ct был удален из трансформированных клонов путем выращивания отдельных колоний штаммов на чашках с LB средой с селекцией чувствительных к хлорамфениколу и устойчивых к ампициллину CmAp вариантов. Удаление гена ct из хромосом трансдуктантов и делецию в них генов оперона ckA-pt, гена рохВ, гена ldhA, гена dhE, и гена ptsG, а также факт наличия промотора P, перед геном galP, подтверждали ПЦР с помощью соответствующих пар локус-специфичных праймеров Р3 (SEQ ID NO: 41) и Р4 (SEQ ID NO: 42), Р7 (SEQ ID NO: 43) и P8 (SEQ ID NO: 44), PI 1 (SEQ ID NO: 45) и P12 (SEQ ID NO: 46), P15 (SEQ ID NO: 47) и PI6 (SEQ ID NO: 48), P19 (SEQ ID NO: 49) и P20 (SEQ ID NO: 50), P25 (SEQ ID NO: 55) и P26 (SEQ ID NO: 56). Температурный профиль для ПЦР-проверки: денатурация при 95°С в течение 10 мин; профиль для 30 циклов: 30 сек при 95°С, 30 сек при 50°С, 2 мин при 72°С; заключительный шаг: 7 мин при 72°С. Длина продуктов ПЦР, полученных в результате реакций с использованием в качестве матрицы клеток исходного штамма MG1655, составляла 3351 п.н. для интактного оперона ckA-pt, 1872 п.н. для интактного гена рохВ, 1299 п.н. для интактного гена ldhA, 2903 п.н. для интактного гена dhE, 1494 п.н. для интактного гена ptsG и 317 п.н. для интактной регуляторной области гена galP. Длина соответствующих продуктов ПЦР, полученных в результате реакции с использованием в качестве матрицы клеток штамма с делетированными опероном ckA-pt, геном рохВ, геном ldhA, геном dhE, геном ptsG и содержащими промотор P перед геном galP составляла 323 п.н., 255 п.н., 411 п.н., 329 п.н., 162 п.н. и 248 п.н.. В результате излечивания клонов от плазмиды-помощника pMWts-Int/Xis, проведенного с помощью повторного рассева до отдельных колоний на чашках с LB средой и селекции CmAp-вариантов, получен штамм Е. coli MG1655 (ΔckA-pt, ΔрохВ, ΔldhA, ΔdhE, ΔptsG, P-galP) с инактивированными генами ckA-pt, рохВ, ldhA, dhE и ptsG, и усиленной экспрессией гена galP, названный MSG0.2.
1.3. Конструирование штамма MSG 1.0.
а
a
a
a
a
a
tac
L
tac
L
Штамм MSG1.0 (Е. coli MG1655 ΔскА, Δpt, ΔрохВ, ΔldhA, ΔdhE, ΔptsG, P-galP, P-glk) получен на основе штамма MSG0.2 (Ε. coli MG1655 ΔckA-pt, ΔрохВ, ΔldhA, ΔdhE, ΔptsG, P-galP) в результате замены в нем нативной регуляторной области гена glk промотором P фага лямбда.
L
Первоначально целевая хромосомная модификации была получена индивидуально с использованием в качестве реципиента штамма E.coli MG1655. Для усиления экспрессии гена glk промотор P фага лямбда был интегрирован в хромосому реципиентного штамма перед кодирующим участком гена glk. На основе полученного штамма, несущего маркированную целевую хромосомную модификацию получен препарат соответствующего Р1-трансдуцирующего фага. Далее P1-трансдукций полученная модификация была внесена в хромосому целевого штамма. После трансдукции, из хромосомы полученного штамма осуществляли удаление маркера устойчивости к антибиотику, фланкированного аттечмент сайтами фага лямбда, с использованием плазмиды pMWts-Int/Xis (WO 2007 013638; RU 2005123423), включающей гены Int/Xis зависимой системы сайт-специфической рекомбинации фага лямбда.
Первоначально был получен фрагмент ДНК для замены нативной регуляторной области гена glk.
L
L
L
Получение вышеупомянутого искусственного фрагмента ДНК, для интеграции в соответствующий участок бактериальной хромосомы, осуществлялось в несколько стадий. На первой стадии, с помощью ПЦР получен фрагмент ДНК, содержащий в начале участок узнавания эндонуклеазы рестрикции BglII, P фага лямбда и 35 нуклеотидов комплементарных области предшествующей кодирующей части гена glk. ПЦР проводили с использованием праймеров Р27 (SEQ ID NO: 57) и Р28 (SEQ ID NO: 58) и геномной ДНК фага лямбда (последовательность с инвентарным номером NC_001416.1 в базе данных GenBank, gi: 9626243) в качестве матрицы. Праймер Р27 содержит участок узнавания Bglll и область гомологичную 5′-концу промотора P. Праймер Р28 содержит 35 нуклеотидов комплементарных области предшествующей кодирующей части гена glk и область, комплементарную 3′-концу промотора P. Температурный профиль для ПЦР: денатурация при 95°С в течение 5 мин; последующие 25 циклов: 30 сек при 95°С, 30 сек при 51°С, 60 сек при 72°С; и заключительная полимеризация: 7 мин при 72°С. Использовали Pfu ДНК полимеразу, соответствующий буфер и дезоксирибонуклеозидтрифосфаты производства Fermentas (Литва).
R
a
a
a
Параллельно осуществляли вторую стадию конструирования фрагмента ДНК. Фрагмент ДНК, содержащий маркер Cm, кодируемый геном ct, получен при помощи ПЦР с использованием праймеров Р29 (SEQ ID NO: 59) и Р24 (SEQ ID NO: 54) и плазмиды pMW118-attL-Cm-attR (Каташкина Ж.И. и др., 2005 Направленное изменение уровня экспрессии генов в бактериальной хромосоме. Мол. Биол., 39 (5), 823-831) в качестве матрицы. Праймер Р29 содержит 36 нуклеотидов гомологичных участку ДНК, расположенному на 135 нуклеотида ранее кодирующей области гена glk и участок ДНК размером 28 нуклеотидов, комплементарный участку ДНК, расположенному на 3′-конце области ttR. Праймер Р24 содержит участок узнавания BglII и участок ДНК размером 28 нуклеотидов, гомологичный участку ДНК, расположенному на 5′-конце области ttL. Температурный профиль для ПЦР: денатурация при 95°С в течение 5 мин; последующие 25 циклов: 30 сек при 95°С, 30 сек при 52°С, 1 мин при 72°С; и заключительная полимеризация: 7 мин при 72°С. Использовали Taq ДНК полимеразу, соответствующий буфер и дезоксинуклеозидтрифосфаты производства Fermentas (Литва).
Полученные фрагменты ДНК очищали в агарозном геле и выделяли, в соответствии с рекомендациями производителя, с помощью Qiagen QIAquick Gel Extraction Kit, с последующим осаждением этанолом.
nd
Два полученных фрагмента ДНК были обработаны эндонуклеазой рестрикции BglII с последующим лигированием с использованием Т4 ДНК-лигазы в соответствии со стандартной процедурой (Maniatis T., Fritsch Ε.F., Sambrook, J.: Molecular Cloning:A Laboratory Manual. 2 edn. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
L
a
a
a
Продукт лигирования амплифицировали с помощью ПЦР с использованием праймеров Р28 (SEQ ID NO: 58) и Р29 (SEQ ID NO: 59). Температурный профиль для ПЦР: денатурация при 98°С в течение 1 мин; последующие 30 циклов: 15 сек при 98°С, 15 сек при 55°С, 1 мин при 72°С; и заключительная полимеризация: 7 мин при 72°С. Использовали Phusion ДНК полимеразу и соответствующий буфер производства Finnzymes; дезоксинуклеозидтрифосфаты производства Fermentas (Литва). Полученный ПЦР-продукт длиной 1955 п.н., очищали электрофорезом в агарозном геле и выделяли, в соответствии с рекомендациями производителя, с помощью Qiagen QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, США). Итоговый фрагмент содержал промотор P фага лямбда, ген устойчивости к хлорамфениколу (ген ct, кодирующий хлорамфениколацетилтрансферазу), фланкированный сайтами ttL и ttR фага лямбда, а также области фланговой гомологии с участком ДНК предшествующим кодирующей области гена glk на 135 нуклеотидов и участком ДНК непосредственно предшествующим кодирующей области гена glk.
Интеграцию полученного линейного фрагмента ДНК в хромосому штамма Е. coli MG1655 осуществляли с использованием системы Red-зависимой гомологичной рекомбинации фага λ.
Для этого рекомбинантную ДНК вводили электротрансформацией в клетки штамма Е. coli MG1655, содержащего плазмиду pKD46 (Datsenko, К.A. and Wanner, B.L., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(12):6640-6645).
R
R
S
Электрокомпетентные клетки штамма Ε. coli MG1655, содержащего плазмиду pKD46, получали как описано выше. Электропорацию проводили с использованием 70 мкл клеток и ~300 нг индивидуального ПЦР-продукта. После электропорации клетки инкубировали в 1 мл среды SOC (Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) при 37°C в течение 2.5 часов, после чего высевали на чашки с L-агаром, содержащим 30 мкг/мл хлорамфеникола, и выращивали при 37°С для отбора Cm-рекомбинантов. Удаление плазмиды-помощника pKD46 осуществляли рассевом клонов до отдельных колоний на агаризованной LB среде с селекцией устойчивых к хлорамфениколу и чувствительных к ампициллину CmAp вариантов.
R
S
Факт соответствия предполагаемой и полученной экспериментально структур хромосомы соответствующих CmAp колоний подтверждали ПЦР анализом с помощью локус-специфичных праймеров Р30 (SEQ ID NO: 60) и Р31 (SEQ ID NO: 61). Длина продуктов ПЦР, полученных в результате реакций с использованием в качестве матрицы клеток родительского штамма MG1655 и праймеров Р30 и Р31 составляла 234 п.н. для интактной регуляторной области гена glk. Длина продукта ПЦР, полученного в результате реакции с использованием в качестве матрицы клеток мутантного штамма и праймеров Р30 и Р31, составляла 2015 п.н. для модифицированной регуляторной области гена glk. Также в хромосомах полученных клонов соответствие запланированной и экспериментально полученной нуклеотидной последовательности нового регуляторного элемента, введенного перед кодирующей областью гена glk, было подтверждено секвенированием.
R
S
L
a
На основе отобранного CmAp варианта штамма, в котором нативная регуляторная область гена galP заменена промотором P фага лямбда, сопряженным с геном ct, фланкированным аттечмент сайтами фага лямбда, получен препарат соответствующего P1-трансдуцирующего фага.
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
а
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
tac
L
L
L
tac
L
tac
L
tac
L
R
S
R
S
S
Штамм Е. coli с делетированными генами ckA-pt, рохВ, ldhA, dhE и ptsG, и усиленной экспрессией генов galP и glk, получен переносом в хромосому штамма MSG0.2 (Е. coli MG1655 ΔckA-pt, ΔрохВ, ΔldhA, ΔdhE, ΔptsG, P-galP) фрагмента хромосомы, в котором нативная регуляторная область гена glk заменена промотором P фага лямбда, сопряженным с геном ct, фланкированным аттечмент сайтами фага лямбда, с использованием препарата трансдуцирующего фага, несущего целевую маркированную генетическую модификацию, как описано выше. Очистку полученных трансдуктантов от остаточных фаговых частиц осуществляли рассевом клонов до отдельных колоний на агаризованной LB среде с последующей селекцией устойчивых к хлорамфениколу Cm вариантов. В хромосомах клонов, формирующих наиболее быстрорастущие колонии правильной формы, замену нативной регуляторной области гена glk промотором P фага лямбда, сопряженным с геном ct, фланкированным аттечмент сайтами фага лямбда, подтверждали ПЦР анализом с помощью локус-специфичных праймеров Р30 (SEQ ID NO: 60) и Р31 (SEQ ID NO: 61). Температурный профиль для ПЦР-проверки: денатурация при 95°С в течение 10 мин; профиль для 30 циклов: 30 сек при 95°С, 30 сек при 50°С, 2 мин при 72°С; заключительный шаг: 7 мин при 72°С. Использовали Taq ДНК полимеразу, соответствующий буфер и дезоксинуклеозидтрифосфаты производства Fermentas (Литва). Длина продуктов ПЦР, полученных в результате реакций с использованием в качестве матрицы клеток родительского штамма MSG0.2, составляла 234 п.н. для интактной регуляторной области гена glk. Длина продуктов ПЦР, полученных в результате реакции с использованием в качестве матрицы клеток полученных трансдуктантов, составляла 2015 п.н. п.н. для регуляторной области гена glk, замененной промотором P фага лямбда, сопряженным с геном ct, фланкированным аттечмент сайтами фага лямбда. С целью удаления из хромосом трансдуктантов маркера устойчивости к антибиотику, отобранные клоны трансформировали плазмидой pMWts-Int/Xis. Селекция трансформированных клонов производилась с использованием среды LB, содержащей ампициллин (100 мкг/мл). Ген ct был удален из трансформированных клонов путем выращивания отдельных колоний штаммов на чашках с LB средой с селекцией чувствительных к хлорамфениколу и устойчивых к ампициллину CmAp вариантов. Удаление гена ct из хромосом трансдуктантов и делецию в них генов оперона ckA-pt, гена рохВ, гена ldhA, гена dhE, и гена ptsG, а также факт наличия промотора P, перед геном galP, и промотора P фага лямбда перед геном glk подтверждали ПЦР с помощью соответствующих пар локус-специфичных праймеров Р3 (SEQ ID NO: 41) и Р4 (SEQ ID NO: 42), Р7 (SEQ ID NO: 43) и P8 (SEQ ID NO: 44), P11 (SEQ ID NO: 45) и P12 (SEQ ID NO: 46), P15 (SEQ ID NO: 47) и P16 (SEQ ID NO: 48), P19 (SEQ ID NO: 49) и P20 (SEQ ID NO: 50), P25 (SEQ ID NO: 55) и P26 (SEQ ID NO: 56), P30 (SEQ ID NO: 60) и Р3 1 (SEQ ID NO: 61). Температурный профиль для ПЦР-проверки: денатурация при 95°С в течение 10 мин; профиль для 30 циклов: 30 сек при 95°С, 30 сек при 50°С, 2 мин при 72°С; заключительный шаг: 7 мин при 72°С. Длина продуктов ПЦР, полученных в результате реакций с использованием в качестве матрицы клеток исходного штамма MG1655, составляла 3351 п.н.; для интактного оперона ckA-pt, 1872 п.н. для интактного гена рохВ, 1299 п.н. для интактного гена ldhA, 2903 п.н. для интактного гена dhE, 1494 п.н. для интактного гена ptsG, 317 п.н. для интактной регуляторной области гена galP и 234 п.н. для интактной регуляторной области гена glk. Длина соответствующих продуктов ПЦР, полученных в результате реакции с использованием в качестве матрицы клеток штамма с делетированными опероном скА-pt, геном рохВ, геном ldhA, геном dhE, геном ptsG и содержащими промотор P перед геном galP и промотор P фага лямбда перед геном glk составляла 323 п.н., 255 п.н., 411 п.н., 329 п.н., 162 п.н., 248 п.н. и 418 п.н.. В результате излечивания клонфв от плазмиды-помощника pMWts-Int/Xis, проведенного с помощью повторного рассева до отдельных колоний на чашках с LB средой и селекции CmAp-вариантов, получен штамм Е. coli MG1655 (ΔckA, Δpt, ΔрохВ, ΔldhA, ΔdhE, ΔptsG, P-glP, P-glk) с инактивированными генами ckA-pt, рохВ, ldhA, dhE и ptsG, и усиленной экспрессией генов glP и glk, названный MSG1.0.
1.4. Конструирование заявляемого штамма FUM1.0.
а
a
a
a
a
a
a
а
a
tac
L
tac
L
Штамм FUM1.0 (Ε. coli MG1655 ΔскА, Δpt, ΔрохВ, ΔldhA, ΔdhE, ΔpflB, ΔfrdA, ΔfrdB, ΔsdhA, ΔsdhB, ΔceA, ΔceB, ΔptsG, P-galP, P-glk) был получен на основе штамма MSG1.0 (Ε. coli MG1655 ΔckA, Δpta, ΔрохВ, ΔldhA, ΔdhE, ΔptsG, P-galP, P-glk) в результате инактивации в нем генов pflB, frdA, frdB, sdhA, sdhB, сеА и ceB.
Первоначально все хромосомные модификации получены индивидуально с использованием в качестве реципиента штамма E.coli MG1655. На основе отобранных индивидуальных колоний штаммов, несущих маркированные целевые хромосомные модификации получены препараты соответствующих Р1-трансдуцирующих фагов. Далее серией последовательных трансдукций полученные модификации объединены в хромосоме целевого штамма. После каждого раунда трансдукций, из хромосомы полученных штаммов осуществляли удаление маркера устойчивости к антибиотику, фланкированного аттечмент сайтами фага лямбда, с использованием плазмиды pMWts-Int/Xis (WO 2007 013638; RU 2005123423), включающей гены Int/Xis зависимой системы сайт-специфической рекомбинации фага лямбда.
а
a
Первоначально получены фрагменты ДНК для инактивации генов pflB, frdA и frdB, sdhA и sdhB, сеА и ceB.
Линейные фрагменты ДНК для делений целевых генов получены при помощи ПЦР с использованием пар праймеров Р32 (SEQ ID NO: 62) и Р33 (SEQ ID NO: 63), Р36 (SEQ ID NO: 64) и P37 (SEQ ID NO: 65), P40 (SEQ ID NO: 66) и P41 (SEQ ID NO: 67), P44 (SEQ ID NO: 68) и P45 (SEQ ID NO: 69) и плазмиды pMWl 18-attL-Cm-attR (Каташкина Ж.И. и др., 2005 Направленное изменение уровня экспрессии генов в бактериальной хромосоме. Мол. Биол., 39 (5), 823-831) в качестве матрицы.
a
a
а
a
Праймеры Р32, Р36, Р40, и Р44 содержат участки ДНК размером в 36 нуклеотидов, гомологичные участкам ДНК, расположенным на 5′-концах генов pflB, frdA, sdhA и ceB, и участки ДНК размером 28 нуклеотидов, комплементарные участку ДНК, расположенному на 3′-конце области ttR. Праймеры Р33, Р37, Р41 и Р45 содержат участки ДНК размером в 36 нуклеотидов, комплементарные участкам ДНК, расположенным на 3′-Концах генов pflB, frdB, sdhB и сеА, а также участки ДНК размером 28 нуклеотидов, гомологичные участку ДНК, расположенному на 5′-конце области ttL. Температурный профиль для ПЦР: денатурация при 95°С в течение 5 мин; последующие 25 циклов: 30 сек при 95°С, 30 сек при 52°С, 1 мин при 72°С; и заключительная полимеризация: 7 мин при 72°С. Использовали Taq ДНК полимеразу, соответствующий буфер и дезоксирибонуклеозидтрифосфаты производства Fermentas (Литва).
а
a
a
a
a
Полученные ПЦР-продукты длиной 1700 п.н. для инактивации генов pflB, frdA и frdB, sdhA и sdhB, сеА и ceB, индивидуально очищали электрофорезом в агарозном геле и выделяли, в соответствии с рекомендациями производителя, с помощью Qiagen QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, США). Итоговые фрагменты содержат ген устойчивости к хлорамфениколу (ген ct, кодирующий хлорамфениколацетилтрансферазу), фланкированный сайтами ttL и ttR фага лямбда, а также 36-ти звенные области фланговой гомологии с кодирующими областями целевых генов.
Интеграцию полученных линейных фрагментов ДНК в хромосому штамма Е. coli MG1655 осуществляли с использованием системы Red-зависимой гомологичной рекомбинации фага λ.
Для этого рекомбинантную ДНК вводили электротрансформацией в индивидуальные клоны штамма Е. coli MG1655, содержащего плазмиду pKD46 (Datsenko, К.А. and Wanner, B.L., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(12):6640-6645).
R
R
S
Электрокомпетентные клетки штамма Ε. coli MG1655, содержащего плазмиду pKD46, получали как описано выше. Электропорацию проводили с использованием 70 мкл клеток и ~300 нг индивидуального ПЦР-продукта. После электропорации клетки инкубировали в 1 мл среды SOC (Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) при 37°C в течение 2.5 часов, после чего высевали на чашки с L-агаром, содержащим 30 м кг/мл хлорамфеникола, и выращивали при 37°С для отбора Cm-рекомбинантов. Удаление плазмиды-помощника pKD46 осуществляли рассевом клонов до отдельных колоний на агаризованной LB среде с селекцией устойчивых к хлорамфениколу и чувствительных к ампициллину CmAp вариантов.
R
S
a
а
Факты соответствия предполагаемых и полученных экспериментально структур хромосом отобранных CmAp колоний подтверждали ПЦР анализом с помощью пар локус-специфичных праймеров Р34 (SEQ ID NO: 70) и Р35 (SEQ ID NO: 71), P38 (SEQ ID NO: 72) и P39 (SEQ ID NO: 73), P42 (SEQ ID NO: 74) и P43 (SEQ ID NO: 75), P46 (SEQ ID NO: 76) и P47 (SEQ ID NO: 77), для гена pflB, теть frdA и frdB, генов sdhA и sdhB, и генов ceA и сеВ, соответственно. Температурный профиль для ПЦР-проверки: денатурация при 95°С в течение 10 мин; профиль для 30 циклов: 30 сек при 95°С, 30 сек при 50°С, 2 мин при 72°С; заключительный шаг: 7 мин при 72°С.
а
а
а
а
Длина продуктов ПЦР, полученных в результате реакций с использованием в качестве матрицы клеток родительского штамма MG1655, составляла 2566 п.н. для интактного гена pfl, 2676 п.н. для интактных генов frdA и frdB, 2731 п.н. для интактных генов sdhA и sdhB, и 3267 п.н. для генов сеА и сеВ. Длина продуктов ПЦР, полученных в результате реакции с использованием в качестве матрицы клеток мутантных штаммов, составляла 1983 п.н. для инактивированного гена pflB, 1839 п.н. для инактивированных генов frdA и frdB, 1931 п.н. для инактивированных генов sdhA и sdhB, и 2030 п.н. для инактивированных генов сеА и сеВ.
R
S
a
а
а
На основе отобранных индивидуальных CmAp колоний штаммов с замененными геном ct геном pflB, и генами frdA и frdB, генами sdhA и sdhB, и генами сеА и сеВ по стандартной методике (Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) получены препараты соответствующих Ρ1-трансдуцирующих фагов.
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
а
a
a
a
a
tac
L
tac
L
tac
L
tac
L
R
S
R
S
S
Штамм Ε. coli с делетированными генами ckA-pt, рохВ, ldhA, dhE, pflB и ptsG, и усиленной экспрессией генов galP и glk, получен переносом в хромосому штамма MSG1.0 (Ε. coli MG1655 ΔckA, Δpt, ΔрохВ, ΔldhA, ΔdhE, ΔptsG, p-galP, P-glk) фрагмента хромосомы с геном pflB, замененным геном cat, фланкированным аттечмент сайтами фага лямбда, с использованием препарата трансдуцирующего фага, несущего целевую маркированную генетическую модификацию, как описано выше. Очистку полученных трансдуктантов от остаточных фаговых частиц осуществляли рассевом клонов до отдельных колоний на агаризованной LB среде с последующей селекцией устойчивых к хлорамфениколу Cm вариантов. В хромосомах клонов, формирующих наиболее быстрорастущие колонии правильной формы, подтверждали замену гена pflB геном ct, фланкированным аттечмент сайтами фага лямбда, ПЦР анализом с помощью локус-специфичных праймеров Р34 (SEQ ID NO: 70) и Р35 (SEQ ID NO: 71). Температурный профиль для ПЦР-проверки: денатурация при 95°С в течение 10 мин; профиль для 30 циклов: 30 сек при 95°С, 30 сек при 50°С, 2 мин при 72°С; заключительный шаг: 7 мин при 72°С. Использовали Taq ДНК полимеразу, соответствующий буфер и дезоксинуклеозидтрифосфаты производства Fermentas (Литва). Длина продуктов ПЦР, полученных в результате реакций с использованием в качестве матрицы клеток родительского штамма MSG1.0, составляла 2566 п.н. для интактного гена pflB. Длина продуктов ПЦР, полученных в результате реакции с использованием в качестве матрицы клеток полученных трансдуктантов, составляла 1983 п.н. для гена pflB, замененного геном ct, фланкированным аттечмент сайтами фага лямбда. С целью удаления из хромосом трансдуктантов маркера устойчивости к антибиотику, отобранные клоны трансформировали плазмидой pMWts-Int/Xis (WO 2007 013638; RU 2005123423). Селекция трансформированных клонов производилась с использованием среды LB, содержащей ампициллин (100 мкг/мл). Ген ct был удален из трансформированных клонов путем выращивания отдельных колоний штаммов на чашках с LB средой с селекцией чувствительных к хлорамфениколу и устойчивых к ампициллину CmApвариантов. Удаление гена ct из хромосом трансдуктантов и делению в них генов оперона ckA-pt, гена рохВ, гена ldhA, гена dhE, гена pflB и гена ptsG, а также факт наличия промотора P, перед геном galP, и промотора P фага лямбда перед геном glk подтверждали ПЦР с помощью соответствующих пар локус-специфичных праймеров Р3 (SEQ ID NO: 41) и Р4 (SEQ ID NO: 42), Р7 (SEQ ID NO: 43) и P8 (SEQ ID NO: 44), P11 (SEQ ID NO: 45) и P12 (SEQ ID NO: 46), P15 (SEQ ID NO: 47) и P16 (SEQ ID NO: 48), P34 (SEQ ID NO: 70) и P35 (SEQ ID NO: 71), PI9 (SEQ ID NO: 49) и P20 (SEQ ID NO: 50), P25 (SEQ ID NO: 55) и P26 (SEQ ID NO: 56), P30 (SEQ ID NO: 60) и P31 (SEQ ID NO: 61). Температурный профиль для ПЦР-проверки: денатурация при 95°С в течение 10 мин; профиль для 30 циклов: 30 сек при 95°С, 30 сек при 50°С, 2 мин при 72°С; заключительный шаг: 7 мин при 72°С. Длина продуктов ПЦР, полученных в результате реакций с использованием в качестве матрицы клеток исходного штамма MG1655, составляла 3351 п.н. для интактного оперона ckA-pt, 1872 п.н. для интактного гена рохВ, 1299 п.н. для интактного гена ldhA, 2903 п.н. для интактного гена dhE, 2566 п.н. для интактного гена pflB, 1494 п.н. для интактного гена ptsG, 317 п.н. для интактной регуляторной области гена galP и 234 п.н. для интактной регуляторной области гена glk. Длина соответствующих продуктов ПЦР, полученных в результате реакции с использованием в качестве матрицы клеток штамма с делетированными опероном ckA-pt, геном рохВ, геном ldhA, геном dhE, геном pflB, геном ptsG и содержащими промотор P перед геном galP и промотор P фага лямбда перед геном glk составляла 323 п.н., 255 п.н., 411 п.н., 329 п.н., 386 п.н., 162 п.н., 248 п.н. и 418 п.н.. В результате излечивания клонов от плазмиды-помощника pMWts-Int/Xis, проведенного с помощью повторного рассева до отдельных колоний на чашках с LB средой и селекции CmAp-вариантов, получен штамм Е. coli MG1655 (ΔскА, Δpta, ΔрохВ, ΔldhA, ΔdhE, ΔpflB, ΔptsG, P-galP, P-glk) с инактивированными генами ckA-pt, poxB, ldhA, dhE, pflB и ptsG, и усиленной экспрессией генов galP и glk.
a
a
a
а
a
a
a
а
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
tac
L
tac
L
tac
tac
L
tac
L
R
S
R
S
S
Штамм Ε. coli с делетированными генами ckA-pt, poxB, ldhA, dhE, pflB, frdA, frdB и ptsG, и усиленной экспрессией генов galP и glk, получен переносом в хромосому штамма Е. coli MG1655 (ΔскА, Δpt, ΔрохВ, ΔldhA, ΔdhE, ΔpflB, ΔptsG, P-galP, P-glk) фрагмента хромосомы с генами frdA и frdB, замененными геном cat, фланкированным аттечмент сайтами фага лямбда, с использованием препарата трансдуцирующего фага, несущего целевую маркированную генетическую модификацию, как описано выше. Очистку полученных трансдуктантов от остаточных фаговых частиц осуществляли рассевом клонов до отдельных колоний на агаризованной LB среде с последующей селекцией устойчивых к хлорамфениколу Cm вариантов. В хромосомах клонов, формирующих наиболее быстрорастущие колонии правильной формы, подтверждали замену генов frdA и frdB геном ct, фланкированным аттечмент сайтами фага лямбда, ПЦР анализом с помощью локус-специфичных праймеров Р38 (SEQ ID NO: 72) и Р39 (SEQ ID NO: 73). Температурный профиль для ПЦР-проверки: денатурация при 95°С в течение 10 мин; профиль для 30 циклов: 30 сек при 95°С, 30 сек при 50°С, 2 мин при 72°С; заключительный шаг: 7 мин при 72°С. Использовали Taq ДНК полимеразу, соответствующий буфер и дезоксинуклеозидтрифосфаты производства Fermentas (Литва). Длина продуктов ПЦР, полученных в результате реакций с использованием в качестве матрицы клеток родительского штамма MG1655 (ΔскА, Δpt, ΔрохВ, ΔldhA, ΔdhE, ΔpflB, ΔptsG, P-galP, P-glk), составляла 2676 п. н. для интактных генов frdA и frdB. Длина продуктов ПЦР, полученных в результате реакции с использованием в качестве матрицы клеток полученных трансдуктантов, составляла 1839 п.н. для генов frdA и frdB, замененных геном cat, фланкированным аттечмент сайтами фага лямбда. С целью удаления из хромосом трансдуктантов маркера устойчивости к антибиотику, отобранные клоны трансформировали плазмидой pMWts-Int/Xis (WO 2007 013638; RU 2005123423). Селекция трансформированных клонов производилась с использованием среды LB, содержащей ампициллин (100 мкг/мл). Ген ct был удален из трансформированных клонов путем выращивания отдельных колоний штаммов на чашках с LB средой с селекцией чувствительных к хлорамфениколу и устойчивых к ампициллину CmAp вариантов. Удаление гена ct из хромосом трансдуктантов и делецию в них генов оперона ckA-pt, гена рохВ, гена ldhA, гена dhE, гена pflB, генов frdA и frdB, и гена ptsG, а также факт наличия промотора P, перед геном galP, и промотора Pl фага лямбда перед геном glk подтверждали ПЦР с помощью соответствующих пар локус-специфичных праймеров Р3 (SEQ ID NO: 41) и Р4 (SEQ ID NO: 42), Р7 (SEQ ID NO: 43) и P8 (SEQ ID NO: 44), P11 (SEQ ID NO: 45) и Ρ12 (SEQ ID NO: 46), P15 (SEQ ID NO: 47) и Ρ16 (SEQ ID NO: 48), P34 (SEQ ID NO: 70) и P35 (SEQ ID NO: 71), P38 (SEQ ID NO: 72) и P39 (SEQ ID NO: 73), P19 (SEQ ID NO: 49) и P20 (SEQ ID NO: 50), P25 (SEQ ID NO: 55) и P26 (SEQ ID NO: 56), P30 (SEQ ID NO: 60) и P31 (SEQ ID NO: 61). Температурный профиль для ПЦР-проверки: денатурация при 95°С в течение 10 мин; профиль для 30 циклов: 30 сек при 95°С, 30 сек при 50°С, 2 мин при 72°С; заключительный шаг: 7 мин при 72°С. Длина продуктов ПЦР, полученных в результате реакций с использованием в качестве матрицы клеток исходного штамма MG1655, составляла 3351 п.н. для интактного оперона ckA-pt, 1872 п.н. для интактного гена рохВ, 1299 п.н. для интактного гена ldhA, 2903 п.н. для интактного гена dhE, 2566 п.н. для интактного гена pflB, 2676 п.н. для интактных генов frdA и frdB, 1494 п.н. для интактного гена ptsG, 317 п.н, для интактной регуляторной области гена galP и 234 п.н. для интактной регуляторной области гена glk. Длина соответствующих продуктов ПЦР, полученных в результате реакции с использованием в качестве матрицы клеток штамма с делетированными опероном ckA-pt, геном рохВ, геном ldhA, геном dhE, геном pflB, генами frdA и frdB, геном ptsG и содержащими промотор P перед геном galP и промотор P фага лямбда перед геном glk составляла 323 п.н., 255 п.н., 411 п.н., 329 п.н., 386 п.н., 242 п.н., 162 п.н., 248 п.н. и 418 п.н.. В результате излечивания клонов от плазмиды-помощника pMWts-Int/Xis, проведенного с помощью повторного рассева до отдельных колоний на чашках с LB средой и селекции CmAp-вариантов, получен штамм Е. coli MG1655 (ΔckA, Δpt, ΔрохВ, ΔldhA, ΔadhE, ΔpflB, ΔfrdA, ΔfrdB, ΔptsG, P-galP, P-glk) с инактивированными генами ckA-pt, рохВ, ldhA, dhE, pflB, frdA, frdB и ptsG, и усиленной экспрессией генов galP и glk.
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
tac
L
tac
L
tac
L
tac
L
tac
L
R
S
R
S
S
Штамм Ε. coli с делетированными генами ckA-pt, рохВ, ldhA, dhE, pflB, frdA, frdB, sdhA, sdhB и ptsG, и усиленной экспрессией генов galP и glk, получен переносом в хромосому штамма Е. coli MG1655 (ΔckA, Δpt, ΔрохВ, ΔldhA, ΔdhE, ΔpflB, ΔfrdA, ΔfrdB, ΔptsG, P-galP, P-glk) фрагмента хромосомы с генами sdhA и sdhB, замененными геном cat, фланкированным аттечмент сайтами фага лямбда, с использованием препарата трансдуцирующего фага, несущего целевую маркированную генетическую модификацию, как описано выше. Очистку полученных трансдуктантов от остаточных фаговых частиц осуществляли рассевом клонов до отдельных колоний на агаризованной LB среде с последующей селекцией устойчивых к хлорамфениколу Cm вариантов. В хромосомах клонов, формирующих наиболее быстрорастущие колонии правильной формы, подтверждали замену генов sdhA и sdhB геном cat, фланкированным аттечмент сайтами фага лямбда, ПЦР анализом с помощью локус-специфичных праймеров Р42 (SEQ ID NO: 74) и Р43 (SEQ ID NO: 75). Температурный профиль для ПЦР-проверки: денатурация при 95°С в течение 10 мин; профиль для 30 циклов: 30 сек при 95°С, 30 сек при 50°С, 2 мин при 72°С; заключительный шаг: 7 мин при 72°С. Использовали Taq ДНК полимеразу, соответствующий буфер и дезоксинуклеозидтрифосфаты производства Fermentas (Литва). Длина продуктов ПЦР, полученных в результате реакций с использованием в качестве матрицы клеток родительского штамма MG1655 (ΔckA, Δpt, ΔрохВ, ΔldhA, ΔdhE, ΔpflB, ΔfrdA, ΔfrdB, ΔptsG, P-galP, P-glk), составляла 2731 п.н. для интактных генов sdhA и sdhB. Длина продуктов ПЦР, полученных в результате реакции с использованием в качестве матрицы клеток полученных трансдуктантов, составляла 1931 п.н. для генов sdhA и sdhB, замененных геном ct, фланкированным аттечмент сайтами фага лямбда. С целью удаления из хромосом трансдуктантов маркера устойчивости к антибиотику, отобранные клоны трансформировали плазмидой pMWts-Int/Xis (WO 2007 013638; RU 2005123423). Селекция трансформированных клонов производилась с использованием среды LB, содержащей ампициллин (100 мкг/мл). Ген ct был удален из трансформированных клонов путем выращивания отдельных колоний штаммов на чашках с LB средой с селекцией чувствительных к хлорамфениколу и устойчивых к ампициллину CmAp вариантов. Удаление гена ct из хромосом трансдуктантов и делецию в них генов оперона ckA-pt, гена рохВ, гена ldhA, гена dhE, гена pflB, генов frdA и frdB, генов sdhA и sdhB и гена ptsG, а также факт наличия промотора P, перед геном galP, и промотора P фага лямбда перед геном glk подтверждали ПЦР с помощью соответствующих пар локус-специфичных праймеров Р3 (SEQ ID NO: 41) и Р4 (SEQ ID NO: 42), Р7 (SEQ ID NO: 43) и P8 (SEQ ID NO: 44), PI 1 (SEQ ID NO: 45) и P12 (SEQ ID NO: 46), P15 (SEQ ID NO: 47) и P16 (SEQ ID NO: 48), P34 (SEQ ID NO: 70) и P35 (SEQ ID NO: 71), P38 (SEQ ID NO: 72) и P39 (SEQ ID NO: 73), P42 (SEQ ID NO: 74) и P43 (SEQ ID NO: 75), P19 (SEQ ID NO: 49) и P20 (SEQ ID NO: 50), P25 (SEQ ID NO: 55) и P26 (SEQ ID NO: 56), P30 (SEQ ID NO: 60) и P31 (SEQ ID NO: 61). Температурный профиль для ПЦР-проверки: денатурация при 95°С в течение 10 мин; профиль для 30 циклов: 30 сек при 95°С, 30 сек при 50°С, 2 мин при 72°С; заключительный шаг: 7 мин при 72°С. Длина продуктов ПЦР, полученных в результате реакций с использованием в качестве матрицы клеток исходного штамма MG1655, составляла 3351 п.н. для интактного оперона ckA-pt, 1872 п.н. для интактного гена рохВ, 1299 п.н. для интактного гена ldhA, 2903 п.н. для интактного гена dhE, 2566 п.н. для интактного гена pflB, 2676 п.н. для интактных генов frdA и frdB, 2731 п.н. для интактных генов sdhA и sdhB, 1494 п.н. для интактного гена ptsG, 317 п.н. для интактной регуляторной области гена galP и 234 п.н. для интактной регуляторной области гена glk. Длина соответствующих продуктов ПЦР, полученных в результате реакции с использованием в качестве матрицы клеток штамма с делетированными опероном ckA-pta, геном рохВ, геном ldhA, геном dhE, геном pflB, генами frdA и frdB, генами sdhA и sdhB, геном ptsG и содержащими промотор P перед геном galP и промотор P фага лямбда перед геном glk составляла 323 п.н., 255 п.н., 411 п.н., 329 п.н., 386 п.н., 242 п.н., 334 п.н., 162 п.н., 248 п.н. и 418 п.н.. В результате излечивания клонов от плазмиды-помощника pMWts-Int/Xis, проведенного с помощью повторного рассева до отдельных колоний на чашках с LB средой и селекции CmAp-вариантов, получен штамм Е. coli MG1655 (ΔclA, Δpta, ΔрохВ, ΔldhA, ΔdhE, ΔpflB, ΔfrdA, ΔfrdB, ΔsdhA, ΔsdhB, ΔptsG, P-galP, P-glk) с инактивированными генами ckA-pt, рохВ, ldhA, dhE, pflB, frdA, frdB, sdhA, sdhB и ptsG, и усиленной экспрессией генов galP и glk.
a
a
a
a
а
а
a
a
а
а
а
а
a
а
a
a
а
а
a
a
a
a
a
a
а
а
a
a
a
а
а
a
a
a
а
а
a
a
a
a
a
a
a
а
tac
L
tac
L
tac
L
tac
L
tac
L
R
S
R
S
S
Штамм Ε. coli с делетированными генами ckA-pt, poxB, ldhA, dhE, pflB, frdA, frdB, sdhA, sdhB, ceA, сеВ и ptsG, и усиленной экспрессией генов galP, и glk, получен переносом в хромосому штамма Е. coli MG1655 (ΔскА, Δpt, ΔрохВ, ΔldhA, ΔdhE, ΔpflB, ΔfrdA, ΔfrdB, ΔsdhA, ΔsdhB, ΔptsG, P-galP, P-glk) фрагмента хромосомы с генами сеА и сеВ, замененными геном cat, фланкированным аттечмент сайтами фага лямбда, с использованием препарата трансдуцирующего фага, несущего целевую маркированную генетическую модификацию, как описано выше. Очистку полученных трансдуктантов от остаточных фаговых частиц осуществляли рассевом клонов до отдельных колоний на агаризованной LB среде с последующей селекцией устойчивых к хлорамфениколу Cm вариантов. В хромосомах клонов, формирующих наиболее быстрорастущие колонии правильной формы, подтверждали замену генов сеА и сеВ геном ct, фланкированным аттечмент сайтами фага лямбда, ПЦР анализом с помощью локус-специфичных праймеров Р46 (SEQ ID NO: 76) и Р47 (SEQ ID NO: 77). Температурный профиль для ПЦР-проверки: денатурация при 95°С в течение 10 мин; профиль для 30 циклов: 30 сек при 95°С, 30 сек при 50°С, 2 мин при 72°С; заключительный шаг: 7 мин при 72°С. Использовали Taq ДНК полимеразу, соответствующий буфер и дезоксинуклеозидтрифосфаты производства Fermentas (Литва). Длина продуктов ПЦР, полученных в результате реакций с использованием в качестве матрицы клеток родительского штамма MG1655 (ΔскА, Δpt, ΔрохВ, ΔldhA, ΔdhE, ΔpflB, ΔfrdA, ΔfrdB, ΔsdhA, ΔsdhB, ΔptsG, P-galP, P-glk), составляла 3267 п. н. для интактных генов асеА и асеВ. Длина продуктов ПЦР, полученных в результате реакции с использованием в качестве матрицы клеток полученных трансдуктантов, составляла 2030 п.н. для генов сеА и сеВ, замененных геном ct, фланкированным аттечмент сайтами фага лямбда. С целью удаления из хромосом трансдуктантов маркера устойчивости к антибиотику, отобранные клоны трансформировали плазмидой pMWts-Int/Xis (WO 2007 013638; RU 2005123423). Селекция трансформированных клонов производилась с использованием среды LB, содержащей ампициллин (100 мкг/мл). Ген ct был удален из трансформированных клонов путем выращивания отдельных колоний штаммов на чашках с LB средой с селекцией чувствительных к хлорамфениколу и устойчивых к ампициллину CmAp вариантов. Удаление гена ct из хромосом трансдуктантов и делецию в них генов оперона ckA-pt, гена рохВ, гена ldhA, гена dhE, гена pflB, генов frdA и frdB, генов sdhA и sdhB, генов сеА и сеВ, и гена ptsG, а также факт наличия промотора P, перед геном galP, и промотора P фага лямбда перед геном glk подтверждали ПЦР с помощью соответствующих пар локус-специфичных праймеров Р3 (SEQ ID NO: 41) и Р4 (SEQ ID NO: 42), Р7 (SEQ ID NO: 43) и P8 (SEQ ID NO: 44), P11 (SEQ ID NO: 45) и P12 (SEQ ID NO: 46), P15 (SEQ ID NO: 47) и P16 (SEQ ID NO: 48), P34 (SEQ ID NO: 70) и P35 (SEQ ID NO: 71), P38 (SEQ ID NO: 72) и P39 (SEQ ID NO: 73), P42 (SEQ ID NO: 74) и P43 (SEQ ID NO: 75), P46 (SEQ ID NO: 76) и P47 (SEQ ID NO: 77), P19 (SEQ ID NO: 49) и P20 (SEQ ID NO: 50), P25 (SEQ ID NO: 55) и P26 (SEQ ID NO: 56), P30 (SEQ ID NO: 60) и P31 (SEQ ID NO: 61). Температурный профиль для ПЦР-проверки: денатурация при 95°С в течение 10 мин; профиль для 30 циклов: 30 сек при 95°С, 30 сек при 50°С, 2 мин при 72°С; заключительный шаг: 7 мин при 72°С. Длина продуктов ПЦР, полученных в результате реакций с использованием в качестве матрицы клеток исходного штамма MG1655, составляла 3351 п.н. для интактного оперона ckA-pt, 1872 п.н. для интактного гена рохВ, 1299 п.н. для интактного гена ldhA, 2903 п.н. для интактного гена dhE, 2566 п.н. для интактного гена pflB, 2676 п.н. для интактных генов frdA и frdB, 2731 п.н. для интактных генов sdhA и sdhB, 3267 п.н. для интактных генов сеА и сеВ, 1494 п.н. для интактного гена ptsG, 317 п.н. для интактной регуляторной области гена galP и 234 п.н. для интактной регуляторной области гена glk. Длина соответствующих продуктов ПЦР, полученных в результате реакции с использованием в качестве матрицы клеток штамма с делетированными опероном ckA-pt, геном рохВ, геном ldhA, геном dhE, геном pflB, генами frdA и frdB, генами sdhA и sdhB, генами сеА и сеВ, геном ptsG и содержащими промотор P перед геном galP и промотор P фага лямбда перед геном glk составляла 323 п.н., 255 п.н., 411 п.н., 329 п.н., 386 п.н., 242 п.н., 334 п.н., 433 п.н., 162 п.н., 248 п.н. и 418 п.н.. В результате излечивания клонов от плазмиды-помощника pMWts-Int/Xis, проведенного с помощью повторного рассева до отдельных колоний на чашках с LB средой и селекции CmAp-вариантов, получен штамм Е. coli MG1655 (ΔckA, Δpta, ΔрохВ, ΔldhA, ΔdhE, ΔpflB, ΔfrdA, ΔfrdB, ΔsdhA, ΔsdhB, ΔceA, ΔceB, ΔptsG, P-galP, P-glk) с инактивированными генами ckA-pt, рохВ, ldhA, ΔdhE, pflB, frdA, frdB, sdhA, sdhB, ceA, сеВ и ptsG, и усиленной экспрессией генов galP и glk, названный Escherichia coli FUM1.0.
Пример 2. Продукция фумаровой кислоты заявляемым штаммом бактерий Escherichia coli FUM1.0.
3
Клетки штамма FUM1.0 или контрольного исходного штамма MG1655 выращивают в течение ночи в среде М9 (Sambrook, J., Fritsch, Ε.F., and Maniatis, T., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), содержащей 2 г/л глюкозы, при 37°С. По 5 мл полученных ночных культур разбавляют в 10 раз, добавляют 45 мл среды М9, содержащей 5 г/л триптона и 10 г/л глюкозы. Полученные культуры выращивают в колбах объемом 750 мл закрытых ватными пробками при 37°С на роторной качалке при 250 об/мин в течение 20 часов. Полученные клеточные суспензии центрифугируют в течение 15 минут при 4000 об/мин при 4°С. Осадки ресуспендируют в 15 мл минимальной солевой среды М9, содержащей 4,5 г/л глюкозы и 4,5 г/л NaHCO. Затем проводят инкубацию полученных клеточных культур в течение 24 часов в пробирках объемом 15 мл закрытых невентилируемыми пробками при 37°С на роторной качалке при 250 об/мин. Концентрации органических кислот и остаточной глюкозы в культуральной жидкости, освобожденной от биомассы центрифугированием, определяют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием системы Waters HPLC system (Waters, Milford, MA, USA). Для измерения концентраций органических кислот используют обращенно-фазовая колонка ReproSil-Pur C18-AQ (4×250 mm, 5 µm, Dr. Maisch, Ammerbuch, Germany). Детекцию осуществляют при длине волны 210 нм. В качестве подвижной фазы используют водный раствор фосфорной кислоты (100мМ) с ацетонитрилом и метанолом (каждый в объемной концентрации 0,5%) со скоростью потока 1 мл/мин. Для измерения концентрации глюкозы, система Waters HPLC system укомплектована рефрактивным детектором Waters 2414 и колонкой Spherisorb-NH2 (4.6×250 mm, 5 µm, Waters, USA). В качестве подвижной фазы используют смесь ацетонитрил/этилацетат/вода (объемное соотношение 76/4/20) со скоростью потока 1 мл/мин. Вещества идентифицируют при сравнении времени их удерживания с временем удерживания соответствующих стандартов.
Концентрацию этанола в культуральной жидкости определяют методом газовой хроматографии с пламенно-ионизационным детектором на колонке OmegaWax (30 м, 0,25 мм в.д., 0,25 мкм толщина пленки) ("Supelco", США). Используют хроматограф GC-17A "Shimadzu" (Япония), оснащенный автосамплером AOC-20i. В качестве газа носителя используют гелий с постоянной скоростью потока 1,5 мл/мин. Температура термостата колонки - 4 минуты 40°С с последующим подъемом до 200°С со скоростью 30°С /мин, выдержкой 1 мин и возвратом к начальной температуре. Температура инжектора = 150°С. Температура детектора = 240°С.
Молярные концентрации потребленной штаммами глюкозы, накопленных метаболитов и молярный выход фумаровой кислоты в результате соответствующих пробирочных ферментаций представлены в Таблице 1, из которой следует, что коэффициент конверсии глюкозы в фумаровую кислоту демонстрируемый заявляемым штаммом бактерий Escherichia coli FUM1.0 в анаэробной продуктивной фазе составляет 1,31 моль/моль, достигая 65,5% от теоретически возможного максимума, и значительно превосходит показатели всех известных на сегодняшний день бактериальных штаммов продуцентов фумаровой кислоты.
Таблица 1
Штамм
Потребленная глюкоза
Молочная кислота
Уксусная кислота
Этанол
Янтарная кислота
Фумаровая кислота
Молярный выход фумаровой кислоты
мМ
мМ
мМ
мМ
мМ
мМ
моль/моль
MG1655
25,0
12,8±0,3
10,2±0,5
12,3±0,4
3,7±0,1
-
-
FUM1.0
25,0
-
3,0±0,2
14,9±0,3
-
32,8±0,5
1,31±0,02