ЛЕЧЕНИЕ РАКА С ПОМОЩЬЮ АНТИТЕЛА К СЕМАФОРИНУ 4D В КОМБИНАЦИИ С ЭПИГЕНЕТИЧЕСКИМ МОДУЛИРУЮЩИМ АГЕНТОМ
TREATMENT OF CANCER, USING ANTIBODY TO SEMAPHORIN 4D IN COMBINATION WITH EPIGENETIC MODULATING AGENT

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[0001] Данная заявка испрашивает приоритет предварительной заявки на патент США №62/473731, поданной 20 марта 2017 г., которая полностью включена в настоящую заявку посредством ссылки.
ЗАЯВЛЕНИЕ О ПЕРЕЧНЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
[0002] Содержание представленного в электронном виде перечня последовательностей в текстовом файле ASCII (название: 58008_172854_Seq-List_ST25.txt; размер: 5936 байт; дата создания: 28 февраля 2018 г.), поданного вместе с заявкой, полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0003] Семафорин 4D (SEMA4D), также известный как CD100, представляет собой трансмембранный белок, принадлежащий к семейству генов семафорина. SEMA4D экспрессируется на поверхности клетки в виде гомодимера, но после активации клетки SEMA4D может высвобождаться с поверхности клетки посредством протеолитического расщепления с образованием sSEMA4D, растворимой формы белка, которая также является биологически активной. См. Suzuki et al., Nature Rev. Immunol. 3:159-167 (2003); Kikutani et al., Nature Immunol. 9:17-23 (2008).
[0004] SEMA4D экспрессируется на высоком уровне в лимфоидных органах, включая селезенку, тимус и лимфатические узлы, и в нелимфоидных органах, таких как головной мозг и почка. В лимфоидных органах SEMA4D широко экспрессируется на покоящихся Т-клетках, но слабо экспрессируется на покоящихся В-клетках и антигенпрезентирующих клетках (АРС), таких как дендритные клетки (DC). Однако его экспрессия в этих клетках активируется после активации различными иммунологическими стимулами. Высвобождение растворимого SEMA4D из иммунных клеток также повышается при активации клеток. Было установлено, что SEMA4D участвует в развитии некоторых видов рака (Ch'ng et al., Cancer 110:164-72 (2007); Campos et al., Oncology Letters 5:1527-35 (2013); Kato et al., Cancer Sci. /02:2029-37 (2011)), и в нескольких сообщениях было сделано предположение, что одним из механизмов этого влияния является роль SEMA4D в развитии опухолевого ангиогенеза (Conrotto et al., Blood 105:4321-4329 (2005). Basile et al., J Biol. Chem. 282: 34888-34895 (2007); Sierra et al. J. Exp. Med. 205:1673 (2008); Zhou et al., Angiogenesis 75:391-407 (2012)). Рост и метастазирование опухоли включают сложный процесс перекрестных взаимодействий между опухолевыми клетками, стромой и иммунным инфильтратом, а также эндотелиальными клетками и сосудистой сетью. SEMA4D сверхэкспрессируется во множестве типов опухолей и также вырабатывается воспалительными клетками, рекрутируемыми в микроокружение опухоли. Недавние исследования дают основания предполагать, что SEMA4D играет роль в миграции, выживании, дифференцировке и организации различных типов клеток, составляющих опухолевую строму (Evans et al., Cancer Immunol. Res. 3:689-701 (2015)).
[0005] Чтобы избежать распознавания иммунной системой хозяина, раковые клетки могут адаптироваться посредством модификации экспрессируемых генов с помощью эпигенетических механизмов, без изменения последовательности геномной ДНК. Эпигенетические механизмы в основном сосредоточены на изменениях метилирования геномной ДНК и посттрансляционных модификациях гистонов, приводящих, например, к изменениям в структуре хроматина и доступности ДНК для транскрипции. Благодаря этим эпигенетическим механизмам раковые клетки могут создавать измененные наследуемые профили экспрессии генов, которые способствуют пролиферации и уклонению от распознавания иммунной системой. См., например, Maio, et al., Clin. Cancer Res. 27:4040-4047 (2015).
[0006] Клетки могут контролировать закручивание и раскручивание ДНК вокруг гистонов с помощью гистонацетилтрансфераз (HAT), которые ацетилируют остатки лизина в коровых гистонах, что обеспечивает менее компактный и более транскрипционно активный хроматин, и гистондеацетилаз (HDAC), которые удаляют ацетильные группы из остатков лизина, приводя к образованию конденсированного хроматина с подавленной транскрипцией. Модуляция активности HAT/HDAC опухолевыми клетками может привести к обширной эпигенетической модуляции экспрессии генов в опухолевых клетках, что позволяет клеткам избегать надзора со стороны иммунной системы пациента. См., например, Maio, et al., Clin. Cancer Res. 27: 4040-4047 (2015).
[0007] Стала известна возможность применения ингибиторов гистондеацетилазы (HDACi (используется в настоящей заявке как в единственном, так и во множественном числе)) в качестве средств для лечения рака. HDACi могут ингибировать пролиферацию опухолевых клеток, вызывая обширные транскрипционные изменения, активируя и/или репрессируя различные гены посредством модуляции ацетилирования/деацетилирования гистонов и/или негистоновых белков, таких как факторы транскрипции. Chueh, А.С., et al., Antioxidants & Redox Signaling 23:66-84 (2015). HDACi могут препятствовать пролиферации и выживанию клеток, например, клеточному циклу, дифференцировке и апоптозу раковых клеток. HDACi также способны усиливать иммуногенность и презентацию антигена опухолевыми клетками, что обосновывает комбинирование HDACi с иммунотерапией (Gameiro SR et al., Oncotarget 7:7390-7402 (2016)). Некоторые соединения в настоящее время находятся на ранней стадии клинических исследований в качестве потенциальных средств для лечения солидного и гематологического рака как в виде монотерапии, так и в комбинации с цитотоксическими и дифференцирующими агентами, см., например, Mottamal, М., et al., Molecules 20:3898-3941 (2015).
[0008] Метилирование геномной ДНК является подробно охарактеризованной эпигенетической модификацией. Метилирование ДНК приводит к транскрипционной пассивности, приводящей к сайленсингу генов. Gravina G. L., et al., Mol. Cancer 9:305-320 (2010). Метилированию способствуют ДНК-метилтрансферазы (DNMT), катализирующие добавление метальной группы к 5'-углероду остатков цитозина. См. тот же источник. Гиперметилированная ДНК часто встречается в опухолевых и других раковых клетках. В настоящее время различные ингибиторы ДНК-метилтрансферазы (DNMTi (используется в настоящей заявке как в единственном, так и во множественном числе)) используются или проходят исследования для лечения различных видов рака. К ним относятся аналоги дезоксирибонуклеозидов, такие как азацитидин, и ненуклеозидные аналоги, такие как антисмысловые олигонуклеотиды и низкомолекулярные ингибиторы ферментов. См. тот же источник.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0009] Данное изобретение относится к способу ингибирования, задержки или снижения роста злокачественных клеток у субъекта, страдающего от рака, включающему введение указанному субъекту комбинированной терапии, включающей эффективное количество выделенного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, специфически связывающегося с семафорином 4D (SEMA4D), и эффективное количество эпигенетического модулирующего агента. Согласно предложенному способу антитело к SEMA4D или его фрагмент могут ингибировать взаимодействие SEMA4D с его рецептором, например, плексином В1, плексином В2 или CD72. Например, согласно предложенному способу антитело к SEMA4D или его фрагмент может ингибировать опосредованную SEMA4D передачу сигналов плексином В1.
[0010] В отдельных аспектах антитело к SEMA4D или его фрагмент включает вариабельную область тяжелой цепи (VH), включающую CDR 1-3 VH, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 2, 3 и 4, соответственно, и вариабельную область легкой цепи (VL), включающую CDR 1-3 VL, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 6, 7 и 8, соответственно. В отдельных аспектах аминокислотные последовательности VH и VL включают, соответственно, SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10.
[0011] В отдельных аспектах эпигенетический модулирующий агент может включать ингибитор гистондеацетилазы (HDAC) (HDACi), ингибитор ДНК-метилтрансферазы (DNMT) (DNMTi) или любую их комбинацию.
[0012] В отдельных аспектах эпигенетический модулирующий агент может включать ингибитор гистондеацетилазы (HDAC) (HDACi). В отдельных аспектах HDAC может представлять собой HDAC I класса, HDAC IIA класса, HDAC ПВ класса, HDAC IV класса или любую их комбинацию, или HDAC может включать цинк-содержащий каталитический домен. В отдельных аспектах HDACi может связываться с цинк-содержащим каталитическим доменом HDAC. В отдельных аспектах HDACi может включать химический фрагмент, выбранный из группы, состоящей из гидроксамовой кислоты или ее соли, циклического тетрапептида, депсипептида, бензамида, электрофильного кетона, алифатической кислоты или ее соли, или любой их комбинации. Например, в отдельных аспектах HDACi может представлять собой вориностат, ромидепсин, хидамид, панобиностат, белиностат, вальпроевую кислоту или ее соль, моцетиностат, абексиностат, энтиностат, прациностат, ресминостат, гивиностат, квизиностат, кеветрин, CUDC-101, AR-42, тефиностат (CHR-2845), CHR-3996, 4SC-202, CG200745, ACY-1215, ACY-241, любую их комбинацию или любую их соль, кристалл, аморфную структуру, гидрат, производное, метаболит, изомер или пролекарство. В отдельных аспектах HDACi представляет собой энтиностат (пиридин-3-илметил-N-[[4-[(2-аминофенил)карбамоил] фенил] метил] карбамат).
[0013] В отдельных аспектах эпигенетический модулирующий агент может включать ингибитор ДНК-метилтрансферазы (DNMT) (DNMTi). В отдельных аспектах DNMT может представлять собой DNMT1, DNMT-3a, DNMT-3b или любую их комбинацию. В отдельных аспектах DNMTi может представлять собой нуклеозидный аналог, антисмысловой олигонуклеотид, низкомолекулярный ингибитор ферментов или любую их комбинацию. Например, в отдельных аспектах DNMTi может представлять собой азацитидин, децитабин, зебуларин, SGI-110, галлат эпигаллокатехина, MG98, RG108, прокаинамид, гидралазин, любую их комбинацию или любую их соль, кристалл, аморфную структуру, гидрат, производное, метаболит, изомер или пролекарство. В отдельных аспектах DNMTi представляет собой азацитидин.
[0014] В частном аспекте предложенного способа выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфически связывающееся с семафорином 4D (SEMA4D), содержит VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и эпигенетический модулирующий агент включает HDACi энтиностат. В еще одном частном аспекте предложенного способа выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфически связывающееся с семафорином 4D (SEMA4D), содержит VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и эпигенетический модулирующий агент включает DNMTi азацитидин.
[0015] Согласно предложенному способу антитело или его антигенсвязывающий фрагмент и эпигенетический модулирующий агент могут быть введены по отдельности, или они могут быть введены одновременно.
[0016] В отдельных аспектах предложенного способа введение комбинированной терапии может привести к повышению терапевтической эффективности по сравнению с введением антитела или его фрагмента или эпигенетического модулирующего агента по отдельности. Например, в отдельных аспектах повышенная терапевтическая эффективность превышает аддитивное действие, например, синергетическое действие.
[0017] В отдельных аспектах предложенного способа рак, подлежащий лечению, может представлять собой солидную опухоль, гематологическое злокачественное новообразование, любые их метастазы или любую их комбинацию. В отдельных аспектах солидная опухоль может представлять собой, например, саркому, карциному, меланому, любые их метастазы или любую их комбинацию. Более конкретно, солидная опухоль может представлять собой, например, плоскоклеточную карциному, аденокарциному, базальноклеточную карциному, почечно-клеточную карциному, протоковую карциному молочной железы, саркому мягких тканей, остеосаркому, меланому, мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, аденокарциному легкого, рак брюшины, гепатоклеточную карциному, рак желудочно-кишечного тракта, рак желудка, рак поджелудочной железы, нейроэндокринный рак, глиобластому, рак шейки матки, рак яичника, рак печени, рак мочевого пузыря, рак головного мозга, гепатому, рак молочной железы, рак ободочной кишки, колоректальный рак, карциному эндометрия или матки, рак пищевода, карциному слюнной железы, рак почки, рак печени, рак предстательной железы, рак вульвы, рак щитовидной железы, рак головы и шеи, любые их метастазы или любую их комбинацию.
[0018] В отдельных аспектах предложенного способа рак, подлежащий лечению, может представлять собой гематологическое злокачественное новообразование или его метастазы. В отдельных аспектах гематологическое злокачественное новообразование может представлять собой лейкоз, лимфому, миелому, острый миелоидный лейкоз, хронический миелоидный лейкоз, острый лимфоцитарный лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз, волосатоклеточный лейкоз, лимфому Ходжкина, неходжкинскую лимфому, множественную миелому, любые их метастазы или любую их комбинацию.
[0019] В отдельных аспектах способ, предложенный в настоящей заявке, может дополнительно включать введение дополнительной противораковой терапии, например, хирургическое вмешательство, химиотерапию, лучевую терапию, противораковую вакцину, введение иммуностимулирующего агента, адоптивную Т-клеточную терапию или терапию антителами, введение ингибитора, блокирующего иммунные контрольные точки, введение модулятора регуляторных Т-клеток (Treg) и их комбинацию.
[0020] Данное изобретение также относится к фармацевтической композиции, включающей эффективное количество выделенного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, специфически связывающегося с семафорином 4D (SEMA4D), и эффективное количество эпигенетического модулирующего агента. В отдельных аспектах фармацевтическая композиция может дополнительно включать носитель, вспомогательное вещество или любую их комбинацию.
[0021] В отдельных аспектах антитело или его фрагмент в составе предложенной композиции может включать вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую CDR 1-3 VH, содержащие SEQ ID NO: 2, 3 и 4, соответственно, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую CDR 1-3 VL, содержащие SEQ ID NO: 6, 7 и 8, соответственно. В отдельных аспектах антитело или его фрагмент в составе предложенной композиции могут включать VH и VL, которые включают, соответственно, SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10.
[0022] В отдельных аспектах эпигенетический модулирующий агент в составе предложенной фармацевтической композиции может включать ингибитор гистондеацетилазы (HDAC) (HDACi), ингибитор ДНК-метилтрансферазы (DNMT) (DNMTi) или любую их комбинацию.
[0023] В случае, когда композиция включает HDACi, он может представлять собой, например, вориностат, ромидепсин, хидамид, панобиностат, белиностат, вальпроевую кислоту или ее соль, моцетиностат, абексиностат, энтиностат, прациностат, ресминостат, гивиностат, квизиностат, кеветрин, CUDC-101, AR-42, тефиностат (CHR-2845), CHR-3996, 4SC-202, CG200745, ACY-1215, ACY-241, любую их комбинацию или любую их соль, кристалл, аморфную структуру, гидрат, производное, метаболит, изомер или пролекарство. В отдельных аспектах HDACi может представлять собой энтиностат (пиридин-3-илметил-N-[[4-[(2-аминофенил)карбамоил] фенил] метил] карбамат).
[0024] В случае, когда композиция включает DNMTi, он может представлять собой, например, азацитидин, децитабин, зебуларин, SGI-110, галлат эпигаллокатехина, MG98, RG108, прокаинамид, гидралазин, любую их комбинацию или любую их соль, кристалл, аморфную структуру, гидрат, производное, метаболит, изомер или пролекарство. В отдельных аспектах DNMTi может представлять собой азацитидин.
[0025] В частном аспекте изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей эффективное количество выделенного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, специфически связывающегося с семафорином 4D (SEMA4D), где антитело или его фрагмент включает аминокислотную последовательность VH, представляющую собой SEQ ID NO: 1, и аминокислотную последовательность VL, представляющую собой SEQ ID NO: 5; и эффективное количество HDACi энтиностата. В еще одном частном аспекте изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей эффективное количество выделенного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, специфически связывающегося с семафорином 4D (SEMA4D), где антитело или его фрагмент включает аминокислотную последовательность VH, представляющую собой SEQ ID NO: 1, и аминокислотную последовательность VL, представляющую собой SEQ ID NO: 5; и эффективное количество DNMTi азацитидина.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ/ФИГУР
[0026] На ФИГ. 1 показана схема эксперимента для исследования комбинированной терапии в примерах 1 и 2.
[0027] На ФИГ. 2А показано изменение среднего объема опухоли во времени для различных вариантов лечения в примере 1.
[0028] На ФИГ. 2В показано изменение процента выживаемости во времени для различных вариантов лечения в примере 1. Статистическая значимость была определена с использованием логрангового критерия Кокса-Мантеля. В Prism результаты представлены как незначимые (ns) при Р>0,05, значимые (обозначенные «*») при 0,01<P≤0,05, очень значимые («**») при 0,001<Р≤0,01 и чрезвычайно значимые («***») при Р≤0,001 или («****») при Р≤0,0001.
3
[0029] ФИГ. 2С представляет собой гистограмму, показывающую процент полной регрессии опухоли (объем опухоли<50 мм) для различных вариантов лечения в примере 1. Статистическая значимость была определена с использованием точного критерия Фишера, в Prism результаты представлены как незначимые (ns) при Р>0,05, значимые (обозначенные «*») при 0,01<Р≤0,05, очень значимые («**») при 0,001<Р≤0,01 и чрезвычайно значимые («***») при Р<0,001 или («****») при Р≤0,0001.
3
[0030] На ФИГ. 2D представлены те же данные, что и на ФИГ. 2С, стратифицированные в зависимости того, превысил ли объем опухоли по меньшей мере 100 мм до регрессии.
[0031] На ФИГ. 3А показано изменение среднего объема опухоли во времени для различных вариантов лечения в примере 2. Статистическая значимость была определена с использованием двухфакторного ANOVA. В Prism результаты представлены как незначимые (ns) при Р>0,05, значимые (обозначенные «*») при 0,01<Р≤0,05, очень значимые («**») при 0,001<Р≤0,01.
[0032] На ФИГ. 3В показано изменение во времени объема опухоли для отдельных контрольных животных в примере 2.
[0033] На ФИГ. 3С показано изменение во времени объема опухоли для отдельных животных, получавших антитело к SEMA4D, в примере 2.
[0034] На ФИГ. 3D показано изменение во времени объема опухоли для отдельных животных, получавших энтиностат (ENT) и контрольное антитело, в примере 2.
[0035] На ФИГ. 3Е показано изменение во времени объема опухоли для отдельных животных, получавших ENT и антитело к SEMA4D, в примере 2.
[0036] На ФИГ. 3F показано изменение процента выживаемости во времени для различных вариантов лечения в примере 2. Статистическая значимость была определена с использованием логрангового критерия Кокса-Мантеля. В Prism результаты представлены как значимые (обозначенные «*») при 0,01<Р≤0,05 и очень значимые («**») при 0,001<Р≤0,01.
[0037] На ФИГ. 4 показана схема эксперимента для исследования комбинированной терапии в примере 3.
[0038] На ФИГ. 5А показано изменение среднего объема опухоли во времени для различных вариантов лечения в примере 3. Статистическая значимость была определена с использованием двухфакторного ANOVA. ** Р≤0,01.
[0039] На ФИГ. 5В показано изменение процента выживаемости во времени для различных вариантов лечения в примере 3. Статистическая значимость была определена с использованием логрангового критерия Кокса-Мантеля. В Prism результаты представлены как незначимые (ns) при Р>0,05 или очень значимые («**») при Р≤0,01.
3
[0040] ФИГ. 5С представляет собой гистограмму, показывающую процент полной регрессии опухоли (объем опухоли <50 мм) для различных вариантов лечения в примере 3. Статистическая значимость была определена с использованием точного критерия Фишера, в Prism результаты представлены как значимые (обозначенные «*») при Р≤0,05 или очень значимые («**») при Р≤0,01.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Определения
[0041] Следует отметить, что обозначающий объект термин в единственном числе относится к одному или более указанным объектам; например, подразумевается, что «связывающая молекула» представляет собой одну или более связывающих молекул. Соответственно, термины в единственном числе, термины «один или более» и «по меньшей мере один» могут быть использованы в настоящей заявке взаимозаменяемо.
[0042] Кроме того, при использовании в настоящей заявке «и/или» следует рассматривать как конкретное описание каждого из двух указанных признаков или компонентов со вторым или без него. Таким образом, подразумевается, что термин «и/или», используемый в настоящей заявке в такой фразе, как «А и/или В», включает «А и В», «А или В», «А» (по отдельности) и «В» (по отдельности). Аналогичным образом, подразумевается, что термин «и/или», используемый в настоящей заявке в такой фразе, как «А, В и/или С», включает каждый из следующих вариантов осуществления: А, В и С; А, В или С; А или С; А или В; В или С; А и С; А и В; В и С; А (по отдельности); В (по отдельности); и С (по отдельности).
nd
rd
[0043] Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящей заявке, имеют значение, соответствующее общепринятому значению, известному специалисту в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Например, в источниках the Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2 ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3 ed., 1999, Academic Press; и Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press, для специалиста приведен общий словарь большого числа терминов, использованных в описании.
[0044] Единицы, приставки и символы приведены в их общепринятой форме согласно Systeme International de Unites (система СИ). Числовые диапазоны включают числа, определяющие диапазон. Если не указано иное, аминокислотные последовательности записаны слева направо в ориентации от аминоконца к карбоксиконцу. Заголовки, приведенные в настоящей заявке, не являются ограничениями различных аспектов изобретения, которые могут быть осуществлены со ссылкой на описание в целом. Соответственно, термины, определенные ниже, более полно определяются ссылкой на описание в целом.
[0045] Везде, где варианты осуществления описаны с помощью термина «содержащий», также предусмотрены аналогичные варианты осуществления, описанные с помощью терминов «состоящий из» и/или «по существу состоящий из».
[0046] Аминокислоты обозначены в настоящей заявке их общеизвестными трехбуквенными символами или однобуквенными символами, рекомендованными Комиссией по биохимической номенклатуре IUPAC-IUB. Нуклеотиды также обозначаются их общепринятыми однобуквенными кодами.
[0047] В контексте настоящей заявки термины «рак» и «раковый» относятся к или описывают физиологическое состояние у млекопитающих, при котором популяция клеток характеризуется бесконтрольным ростом клеток. Раковые заболевания могу быть классифицированы, например, как солидные опухоли или злокачественные новообразования, или гематологические раковые заболевания или злокачественные новообразования. Оба типа могут мигрировать в удаленные места организма в виде метастазов. Солидная опухоль может быть классифицирована, например, как саркома, карцинома, меланома или их метастазы.
[0048] Термины «пролиферативное расстройство» и «пролиферативное заболевание» относятся к расстройствам, связанным с патологической клеточной пролиферацией, таким как рак.
[0049] Термины «опухоль» и «новообразование» в контексте настоящей заявки относятся к любой массе ткани, являющейся результатом чрезмерного роста или пролиферации клеток, либо доброкачественной (нераковой), либо злокачественной (раковой), включая предраковые поражения. В отдельных вариантах осуществления опухоли, описанные в настоящей заявке, экспрессируют рецептор SEMA4D, например, плексин В1, плексин В2 и/или CD72, и/или могут экспрессировать SEMA4D.
[0050] Термины «метастазирование», «метастазы», «метастатический» и другие грамматические эквиваленты в контексте настоящей заявки относятся к раковым клеткам, которые распространяются или перемещаются из места происхождения (например, первичной опухоли) в другие области организма с развитием аналогичного ракового поражения в новом месте. «Метастатическая» или «метастазирующая» клетка представляет собой клетку, теряющую адгезивные контакты с соседними клетками и мигрирующую через кровоток или лимфу из первичного места заболевания, проникая в соседние структуры организма. Термины также относятся к процессу метастазирования, который включает, не ограничиваясь перечисленным, отделение раковых клеток от первичной опухоли, проникновение опухолевых клеток в кровоток, их выживание и миграцию в удаленное место, прикрепление и выход в новое место из кровотока и микроколонизацию в удаленном месте, а также рост и развитие опухоли в удаленном месте.
[0051] Примеры таких солидных опухолей могут включать, например, плоскоклеточную карциному, аденокарциному, базальноклеточную карциному, почечно-клеточную карциному, протоковую карциному молочной железы, саркому мягких тканей, остеосаркому, меланому, мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ), аденокарциному легкого, рак брюшины, гепатоклеточную карциному, рак желудочно-кишечного тракта, рак желудка, рак поджелудочной железы, нейроэндокринный рак, глиобластому, рак шейки матки, рак яичника, рак печени, рак мочевого пузыря, рак головного мозга, гепатому, рак молочной железы, рак ободочной кишки, колоректальный рак, карциному эндометрия или матки, рак пищевода, карциному слюнной железы, рак почки, рак предстательной железы, рак вульвы, рак щитовидной железы, рак головы и шеи, любые их метастазы или любую их комбинацию.
[0052] Примеры гематологических раковых заболеваний или злокачественных новообразований включают, не ограничиваюсь перечисленным, лейкоз, лимфому, миелому, острый миелоидный лейкоз, хронический миелоидный лейкоз, острый лимфоцитарный лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз, волосатоклеточный лейкоз, лимфому Ходжкина, неходжкинскую лимфому, множественную миелому, любые их метастазы или любую их комбинацию.
[0053] В отдельных вариантах осуществления раковые заболевания, поддающиеся лечению с помощью способов, предложенных в настоящей заявке, включают, не ограничиваясь перечисленным, саркомы, карциномы молочной железы, рак яичника, рак шейки матки, рак головы и шеи, НМРЛ, рак пищевода, рак желудка, рак почки, рак печени, рак мочевого пузыря, колоректальный рак и рак поджелудочной железы. В отдельных вариантах осуществления раковые заболевания или опухолевые клетки, поддающиеся лечению с помощью способов, предложенных в настоящей заявке, экспрессируют рецепторы плексин B1, плексин В2 или CD72 для SEMA4D.
[0054] В контексте настоящего документа подразумевается, что термин «полипептид» включает «полипептид» в единственном числе, а также несколько «полипептидов», и относится к молекуле, состоящей из мономеров (аминокислот), линейно связанных амидными связями (также известными как пептидные связи). Термин «полипептид» относится к любой цепи или цепям из двух или более аминокислот, и не относится к определенной длине продукта. Таким образом, пептиды, дипептиды, трипептиды, олигопептиды, «белок», «аминокислотная цепь» или любой другой термин, используемый для обозначения цепи или цепей из двух или более аминокислот, охватываются определением «полипептида», и термин «полипептид» может быть использован вместо или взаимозаменяемо с любым из этих терминов. Подразумевается также, что термин «полипептид» относится к продуктам постэкспрессионных модификаций указанного полипептида, в том числе, не ограничиваясь перечисленным, гликозилирования, ацетилирования, фосфорилирования, амидирования и дериватизации известными защитными/блокирующими группами, протеолитического расщепления или модификации не встречающимися в природе аминокислотами. Полипептид может происходить из естественного биологического источника или быть получен с помощью рекомбинантной технологии, однако не обязательно транслирован с заданной последовательности нуклеиновой кислоты. Он может быть получен любым способом, в том числе путем химического синтеза.
[0055] Описанный в настоящей заявке полипептид может иметь размер, составляющий приблизительно 3 или более, 5 или более, 10 или более, 20 или более, 25 или более, 50 или более, 75 или более, 100 или более, 200 или более, 500 или более, 1000 или более или 2000 или более аминокислот. Полипептиды могут иметь определенную трехмерную структуру, хотя они не обязательно имеют такую структуру. Полипептиды с определенной трехмерной структурой называются свернутыми, а полипептиды, не обладающие определенной трехмерной структурой, но способные принимать большое количество различных конформаций, называются развернутыми. В контексте настоящей заявки термин «гликопротеин» относится к белку, связанному с по меньшей мере одним углеводным фрагментом, присоединенным к белку через кислородсодержащую или азотсодержащую боковую цепь аминокислоты, например, серина или аспарагина.
[0056] Под «выделенным» полипептидом или его фрагментом, вариантом или производным подразумевается полипептид, который не находится в его естественной среде. Какой-либо определенный уровень очищения не требуется. Например, выделенный полипептид может быть просто удален из его нативной или естественной среды. Полученные рекомбинантным способом полипептиды и белки, экспрессируемые в клетках-хозяевах, считают выделенными в контексте настоящей заявки, равно как и нативные или рекомбинантные полипептиды, которые были отделены, фракционированы или частично или по существу очищены с применением любой подходящей техники.
[0057] В контексте настоящей заявки термин «не встречающийся в природе полипептид» или любые его грамматические варианты представляет собой условное определение, которое явным образом исключает только те формы полипептида, которые определены или могут быть определены или интерпретированы судьей или административным или судебным органом как «встречающиеся в природе».
[0058] Другие полипептиды, раскрытые в настоящей заявке, представляют собой фрагменты, производные, аналоги или варианты вышеупомянутых полипептидов и любую их комбинацию. Термины «фрагмент», «вариант», «производное» и «аналог», как раскрыто в настоящей заявке, включают любые полипептиды, которые сохраняют по меньшей мере некоторые свойства соответствующего нативного антитела или полипептида, например, специфичное связывание с антигеном. Фрагменты полипептидов включают, например, протеолитические фрагменты, а также делеционные фрагменты, помимо конкретных фрагментов антител, обсуждаемых в других частях настоящей заявки. Варианты, например, полипептида включают фрагменты, как описано выше, а также полипептиды с аминокислотными последовательностями, измененными вследствие аминокислотных замен, делеций или инсерций. В отдельных аспектах варианты могут быть не встречающимися в природе. Не встречающиеся в природе варианты могут быть получены с применением известных в данной области техники методов мутагенеза. Вариантные полипептиды могут содержать консервативные или неконсервативные аминокислотные замены, делеций или добавления. Производные представляют собой полипептиды, которые были изменены, чтобы приобрести дополнительные признаки, которыми не обладает исходный полипептид. Примеры включают слитые белки. Вариантные полипептиды также могут быть названы в настоящей заявке «аналогами полипептидов». В контексте настоящей заявки термин «производное» полипептида может также относиться к рассматриваемому полипептиду, в котором одна или более аминокислот были химически дериватизированы в результате реакции функциональной боковой группы. Также в качестве «производных» включены пептиды, содержащие одно или более производных двадцати стандартных аминокислот. Например, 4-гидроксипролин может заменить пролин; 5-гидроксилизин может заменить лизин; 3-метилгистидин может заменить гистидин; гомосерин может заменить серии; и орнитин может заменить лизин.
[0059] «Консервативная аминокислотная замена» представляет собой такую замену, при которой одна аминокислота заменяется другой аминокислотой со схожей боковой цепью. В данной области техники были определены семейства аминокислот со схожими боковыми цепями, в том числе основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, аспарагин, глутамин, серии, треонин, тирозин, цистеин), неполярными боковыми цепями (например, глицин, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Например, замена тирозина фенилаланином представляет собой консервативную замену. В отдельных вариантах осуществления консервативные замены в последовательностях полипептидов и антител согласно настоящему изобретению не отменяют связывания полипептида или антитела, содержащего аминокислотную последовательность, с антигеном, с которым связывается связывающая молекула. Способы идентификации нуклеотидных и аминокислотных консервативных замен, которые не устраняют связывание антигена, хорошо известны в данной области техники (см., например, Brummell et al., Biochem. 32: 1180-1 187 (1993); Kobayashi et al., Protein Eng. 12(10):879-884 (1999); и Burks et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 94:.412-417 (1997)).
[0060] Подразумевается, что термин «полинуклеотид» охватывает отдельную нуклеиновую кислоту, а также несколько нуклеиновых кислот, и относится к выделенной молекуле или конструкции нуклеиновой кислоты, например, матричной РНК (мРНК), кДНК или плазмидной ДНК (пДНК). Полинуклеотид может содержать обычную фосфодиэфирную связь или нековалентную связь (например, амидную связь, такую как встречающаяся в пептидо-нуклеиновых кислотах (ПНК)). Термины «нуклеиновая кислота» или «последовательность нуклеиновой кислоты» относятся к любому одному или более сегментам нуклеиновой кислоты, например, фрагментам ДНК или РНК, присутствующим в полинуклеотиде.
[0061] Под «выделенной» нуклеиновой кислотой или полинуклеотидом подразумевается любая форма нуклеиновой кислоты или полинуклеотида, которая отделена от ее нативного окружения. Например, очищенный гель-проникающей хроматографией полинуклеотид или рекомбинантный полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащийся в векторе, будет считаться «выделенным». Кроме того, полинуклеотидный сегмент, например, продукт ПЦР, который был сконструирован так, чтобы иметь сайты рестрикции для клонирования, считается «выделенным». Дополнительные примеры выделенного полинуклеотида включают рекомбинантные полинуклеотиды, поддерживаемые в гетерологичных клетках-хозяевах, или очищенные (частично или по существу) полинуклеотиды в ненативном растворе, таком как буфер или физиологический раствор. Выделенные молекулы РНК включают in vivo или in vitro РНК-транскрипты полинуклеотидов, где транскрипт не является транскриптом, встречающимся в природе. Выделенные полинуклеотиды или нуклеиновые кислоты дополнительно включают такие молекулы, полученные синтетическим путем. Кроме того, полинуклеотид или нуклеиновая кислота могут представлять собой или могут включать регуляторный элемент, такой как промотор, сайт связывания рибосомы или терминатор транскрипции.
[0062] В контексте настоящей заявки термин «не встречающийся в природе полинуклеотид» или любые его грамматические варианты представляет собой условное определение, которое явным образом исключает только те формы нуклеиновой кислоты или полинуклеотида, которые определены или могут быть определены или интерпретированы судьей или административным или судебным органом как «встречающиеся в природе».
[0063] В контексте настоящей заявки «кодирующая область» представляет собой часть нуклеиновой кислоты, состоящую из кодонов, транслируемых в аминокислоты. Хотя «стоп-кодон» (TAG, TGA или ТАА) не транслируется в аминокислоту, он может считаться частью кодирующей области, однако любые фланкирующие последовательности, например, промоторы, сайты связывания рибосомы, терминаторы транскрипции, интроны и тому подобное, не являются частью кодирующей области. Две или более кодирующих областей могут находиться в одной полинуклеотидной конструкции, например, на одном векторе, или в отдельных полинуклеотидных конструкциях, например, на отдельных (разных) векторах. Кроме того, любой вектор может содержать одну кодирующую область или может содержать две или более кодирующих областей, например, один вектор может по отдельности кодировать вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина и вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина. Кроме того, вектор, полинуклеотид или нуклеиновая кислота могут включать гетерологичные кодирующие области, либо слитые, либо не слитые с другой кодирующей областью. Гетерологичные кодирующие области включают, не ограничиваясь перечисленным, специализированные элементы или мотивы, такие как секреторный сигнальный пептид или гетерологичный функциональный домен.
[0064] В отдельных вариантах осуществления полинуклеотид или нуклеиновая кислота представляет собой ДНК. В случае ДНК полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, обычно может включать промотор и/или другие элементы контроля транскрипции или трансляции, функционально связанные с одной или более кодирующими областями. Функциональная связь присутствует, когда область, кодирующая генный продукт, например, полипептид, связана с одной или более регуляторными областями таким образом, что экспрессия указанного генного продукта находится под влиянием или контролем указанной регуляторной области(ей). Два фрагмента ДНК (такие как область, кодирующая полипептид, и связанный с ней промотор) являются «функционально связанными», если индукция функции промотора приводит к транскрипции мРНК, кодирующей желаемый генный продукт, и если природа связи между двумя фрагментами ДНК не препятствует способности регуляторных последовательностей экспрессии управлять экспрессией генного продукта, или не препятствует способности ДНК-матрицы транскрибироваться. Таким образом, область промотора была бы функционально связана с нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид, если бы промотор был способен осуществлять транскрипцию этой нуклеиновой кислоты. Промотор может представлять собой клеточноспецифический промотор, который управляет основной транскрипцией ДНК в заранее определенных клетках. Другие элементы контроля транскрипции, кроме промотора, например, энхансеры, операторы, репрессоры и сигналы терминации транскрипции, могут быть функционально связаны с полинуклеотидом для управления клеточноспецифической транскрипцией.
[0065] Специалистам в данной области техники известны различные области контроля транскрипции. Такие области включают, не ограничиваясь перечисленным, области контроля транскрипции, функционирующие в клетках позвоночных, такие как, не ограничиваясь перечисленным, сегменты промотора и энхансера из цитомегаловирусов (предранний промотор вместе с интроном А), вируса обезьян 40 (ранний промотор) и ретровирусов (такого как вирус саркомы Рауса). Другие области контроля транскрипции включают области, происходящие из генов позвоночных, таких как актин, белок теплового шока, бычий гормон роста и β-глобин кролика, а также другие последовательности, способные контролировать экспрессию генов в эукариотических клетках. Дополнительные подходящие области контроля транскрипции включают тканеспецифические промоторы и энхансеры, а также индуцируемые лимфокинами промоторы (например, промоторы, индуцируемые интерферонами или интерлейкинами).
[0066] Аналогично, специалистам в данной области техники известно множество элементов контроля трансляции. Такие элементы включают, не ограничиваясь перечисленным, сайты связывания рибосомы, кодоны инициации и терминации трансляции, а также элементы, полученные из пикорнавирусов (в частности, участок внутренней посадки рибосомы или IRES, также называемый последовательностью CITE).
[0067] В других вариантах осуществления полинуклеотид может представлять собой РНК, например, в форме матричной РНК (мРНК), транспортной РНК или рибосомальной РНК.
[0068] Области, кодирующие полинуклеотиды и нуклеиновые кислоты, могут быть связаны с дополнительными кодирующими областями, которые кодируют секреторные или сигнальные пептиды, управляющие секрецией полипептида, кодируемого полинуклеотидом, как раскрыто в настоящей заявке. Согласно гипотезе сигнальной последовательности белки, секретируемые клетками млекопитающих, имеют сигнальный пептид или секреторную лидерную последовательность, которая отщепляется от зрелого белка после начала экспорта растущей белковой цепи через шероховатый эндоплазматический ретикулум. Специалистам в данной области известно, что полипептиды, секретируемые клетками позвоночных, могут иметь сигнальный пептид, слитый с N-концом полипептида, который отщепляется от полного или «полноразмерного» полипептида с образованием секретируемой или «зрелой» формы полипептида. В отдельных вариантах осуществления используют нативный сигнальный пептид, например, сигнальный пептид тяжелой цепи или легкой цепи иммуноглобулина, или функциональное производное этой последовательности, которое сохраняет способность управлять секрецией функционально связанного с ней полипептида. В качестве альтернативы, может быть использован гетерологичный сигнальный пептид млекопитающего или его функциональное производное. Например, лидерная последовательность дикого типа может быть заменена лидерной последовательностью тканевого активатора плазминогена человека (TPA) или В-глюкуронидазы мыши.
[0069] В настоящей заявке раскрыты отдельные связывающие молекулы или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные. Термин «связывающая молекула» в случае, если он не относится специально к полноразмерным антителам, охватывает полноразмерные антитела, а также антигенсвязывающие субъединицы, фрагменты, варианты, аналоги или производные таких антител, например, сконструированные молекулы антител или фрагменты, связывающие антиген таким же образом, как молекулы антител, но в которых используется другой каркас.
[0070] В контексте настоящей заявки термин «связывающая молекула» относится в самом широком смысле к молекуле, которая специфически связывается с рецептором, например, эпитопом или антигенной детерминантой. Как описано далее в настоящей заявке, связывающая молекула может содержать один или более «антигенсвязывающих доменов», описанных в настоящей заявке. Неограничивающим примером связывающей молекулы является антитело или его фрагмент, который сохраняющее способность антигенспецифического связывания.
[0071] В контексте настоящей заявки термины «связывающий домен» или «антигенсвязывающий домен» относятся к области связывающей молекулы, которая необходима и достаточна для специфического связывания с эпитопом. Например, «Fv», например, вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи антитела, либо в виде двух отдельных полипептидных субъединиц, либо в виде одной цепи, считается «связывающим доменом». Другие связывающие домены включают, не ограничиваясь перечисленным, вариабельную область тяжелой цепи (VHH) антитела, полученного из вида семейства верблюдовых, или шесть областей, определяющих комплементарность иммуноглобулина (CDR), экспрессируемых в фибронектиновом каркасе. «Связывающая молекула», как описано в настоящей заявке, может включать один, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать или более «антигенсвязывающих доменов».
nd
[0072] Термины «антитело» и «иммуноглобулин» в настоящей заявке могут быть использованы взаимозаменяемо. Антитело (или его фрагмент, вариант или производное, как раскрыто в настоящей заявке) включает по меньшей мере вариабельный домен тяжелой цепи (для видов семейства верблюдовых) или по меньшей мере вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи. Основные структуры иммуноглобулинов в системах позвоночных относительно хорошо изучены. См., например, Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2 ed. 1988). Если не указано иное, термин «антитело» охватывает все в диапазоне от небольшого антигенсвязывающего фрагмента антитела до полноразмерного антитела, например, антитело IgG, включающее две полные тяжелые цепи и две полные легкие цепи, антитело IgA, включающее четыре полные тяжелые цепи и четыре полные легкие цепи, и необязательно включающее J-цепь и/или секреторный компонент, или антитело IgM, включающее десять или двенадцать полных тяжелых цепей и десять или двенадцать полных легких цепей, и необязательно включающее J-цепь.
1
4
1
2
3
4
1
2
[0073] Как более подробно обсуждается ниже, термин «иммуноглобулин» включает различные широкие классы биохимически различимых полипептидов. Специалистам в данной области будет понятно, что тяжелые цепи подразделяются на гамма, мю, альфа, дельта или эпсилон (γ, μ, α, δ, ε) и среди них существуют некоторые подклассы (например, γ-γ или α1-α2). Именно природа этой цепи определяет «класс» антитела как IgG, IgM, IgA IgG или IgE, соответственно. Подклассы (изотипы) иммуноглобулинов, например, IgG, IgG, IgG, IgG, IgA, IgA и т.д., хорошо охарактеризованы и, как известно, обеспечивают функциональную специализацию. Модифицированные версии каждого из этих классов и изотипов легко различимы специалистом в данной области техники с учетом настоящего описания и, соответственно, находятся в пределах объема настоящего изобретения.
[0074] Легкие цепи подразделяются на каппа или лямбда (κ, λ). Каждый класс тяжелой цепи может быть связан с легкой каппа- или лямбда-цепью. Как правило, легкая и тяжелая цепи ковалентно связаны друг с другом, а «хвостовые» части двух тяжелых цепей связаны друг с другом ковалентными дисульфидными связями или нековалентными связями, когда молекулы иммуноглобулинов генерируются гибридомами, В-клетками или генетически сконструированными клетками-хозяевами. В тяжелой цепи аминокислотные последовательности проходят от N-конца на разветвленных концах Y-образной конфигурации до С-конца в нижней части каждой цепи. Базовая структура отдельных антител, например, антител IgG, включает две субъединицы тяжелой цепи и две субъединицы легкой цепи, ковалентно связанные через дисульфидные связи с образованием «Y»-образной структуры, также называемой в настоящей заявке структурой «H2L2».
[0075] Как легкие, так и тяжелые цепи делятся на области структурной и функциональной гомологии. Термины «константный» и «вариабельный» используются в отношении функции. В этой связи следует понимать, что вариабельные домены частей как легкой (VL), так и тяжелой (VH) цепей определяют распознавание антигена и специфичность. И наоборот, константные домены легкой цепи (CL) и тяжелой цепи (CH1, СН2 или СН3) придают биологические свойства, такие как секреция, трансплацентарный перенос, связывание Fc-рецептора, связывание комплемента и тому подобное. Принято, что номера доменов константной области возрастают при удалении от антигенсвязывающего сайта или аминоконца антитела. N-концевая часть является вариабельной областью, а С-концевая часть является константной областью; домены СН3 (или СН4 в случае IgM) и CL фактически содержат карбоксиконец тяжелой и легкой цепей, ответственно.
[0076] Как указано выше, вариабельная область (то есть, «связывающий домен») позволяет связывающей молекуле селективно распознавать и специфически связывать эпитопы на антигенах. То есть домен VL и домен VH, или подмножество областей, определяющих комплементарность (CDR), связывающей молекулы, например, антитела, объединяются, образуя вариабельную область, определяющую трехмерный антигенсвязывающий сайт. Более конкретно, антигенсвязывающий сайт определяется тремя CDR на каждой из цепей VH и VL. Некоторые антитела образуют более крупные структуры. Например, IgA может образовывать молекулу, включающую две единицы H2L2, J-цепь и секреторный компонент, все из которых ковалентно связаны дисульфидными связями, a IgM может образовывать пентамерную или гексамерную молекулу, включающую пять или шесть единиц H2L2 и, необязательно, J-цепь, ковалентно связанные дисульфидными связями.
[0077] Шесть «областей, определяющих комплементарность» или «CDR», присутствующие в каждом антигенсвязывающем домене, представляют собой короткие несмежные последовательности аминокислот, расположенные определенным особым, образуя антигенсвязывающий домен при принятии антителом его трехмерной конфигурации в водной среде. Остальная часть аминокислот в связывающем домене, называемая «каркасными» областями, проявляет меньшую межмолекулярную вариабельность. Каркасные области в основном принимают конформацию В-листа, a CDR образуют петли, которые соединяют, а в некоторых случаях являются частью структуры В-листа. Таким образом, каркасные области способствуют формированию каркаса, обеспечивающего расположение CDR в правильной ориентации посредством межцепочечных нековалентных взаимодействий. Связывающий домен, образованный занявшими свои положения CDR, определяет комплементарность поверхности к эпитопу на иммунореактивном антигене. Эта комплементарная поверхность способствует нековалентному связыванию антитела с его распознанным эпитопом. Аминокислоты, составляющие CDR и каркасные области, соответственно, могут быть легко идентифицированы для любой данной вариабельной области тяжелой или легкой цепи специалистом в данной области техники, поскольку они были определены различными способами (см. источники «Sequences of Proteins of Immunological Interest,)) Kabat, E., et al., U.S. Department of Health and Human Services, (1983); и Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 79(5:901-917 (1987), полностью включенные в настоящую заявку посредством ссылки).
[0078] В случае, когда существует два или более определений термина, который используется и/или принят в данной области техники, подразумевается, что определение термина, используемое в настоящей заявке, включает все такие значения, если явно не указано иное. Конкретным примером является использование термина «область, определяющая комплементарность» («CDR») для описания несмежных антигенсвязывающих сайтов, присутствующих в вариабельной области полипептидов как тяжелой, так и легкой цепи. Эти конкретные области были описаны, например, Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, «Sequences of Proteins of Immunological Interest)) (1983) и Chothia et al., J. Mol. Biol 79(5:901-917 (1987), которые включены в настоящую заявку посредством ссылки. В сравнении друг с другом определения согласно Kabat и Chothia включают перекрывающиеся аминокислоты или подгруппы аминокислот. Тем не менее подразумевается, что использование любого из этих определений (или других определений, известных специалистам в данной области техники) для ссылки на CDR антитела или его варианта входит в объем термина, как определено и используется в настоящей заявке, если не указано иное. Соответствующие аминокислоты, включающие CDR, как определено в каждом из приведенных выше источников, приведены ниже в таблице 1 для сравнения. Точные номера остатков, включающих конкретную CDR, будут варьировать в зависимости от последовательности и размера CDR. Специалисты в данной области техники могут рутинным образом определить, какие аминокислотные остатки содержат конкретную CDR, при заданной аминокислотной последовательности вариабельной области антитела.
[0079] Kabat et al. также определили систему нумерации последовательностей вариабельных доменов, которая применима к любому антителу. Специалист в данной области техники может однозначно применить эту систему «нумерации согласно Kabat» к любой последовательности вариабельного домена, не полагаясь на какие-либо экспериментальные данные помимо самой последовательности. В контексте настоящей заявки термин «нумерация согласно Kabat» относится к системе нумерации, установленной Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, «Sequence of Proteins of Immunological Interest)) (1983). Однако, если явным образом не указано использование системы нумерации согласно Kabat, для всех аминокислотных последовательностей в настоящей заявке используется последовательная нумерация.
2
[0080] Связывающие молекулы, например, антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные, включают, не ограничиваясь перечисленным, поликлональные, моноклональные, человеческие, гуманизированные или химерные антитела, одноцепочечные антитела, эпитоп-связывающие фрагменты, например, Fab, Fab' и F(ab'), Fd, Fvs, одноцепочечные Fv (scFv), одноцепочечные антитела, дисульфид-связанные Fvs (sdFv), фрагменты, содержащие домен VL или VH, фрагменты, полученные посредством экспрессионной библиотеки Fab. Молекулы ScFv известны в данной области техники и описаны, например, в патенте США 5892019. Молекулы иммуноглобулинов или антител, входящие в объем настоящего изобретения, могут быть любого типа (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY), класса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или подкласса молекулы иммуноглобулина.
[0081] Под «специфически связывается» обычно подразумевается, что связывающая молекула, например, антитело или его фрагмент, вариант или производное, связывается с эпитопом посредством своего антигенсвязывающего домена, и что связывание подразумевает некоторую степень комплементарности антигенсвязывающего домена и эпитопа. Согласно этому определению связывающая молекула «специфически связывается» с эпитопом, когда она связывается с этим эпитопом посредством своего антигенсвязывающего домена легче, чем она связывается со случайным, неродственным эпитопом. Термин «специфичность» используется в настоящей заявке для определения относительной аффинности, с которой определенная связывающая молекула связывается с определенным эпитопом. Например, считается, что связывающая молекула «А» обладает более высокой специфичностью к данному эпитопу, чем связывающая молекула «В», или можно сказать, что связывающая молекула «А» связывается с эпитопом «С» с более высокой специфичностью, чем ее специфичность для родственного эпитопа «D».
-2
-1
-2
-1
-3
-1
-3
-1
-4
-1
-4
-1
-5
-1
-5
-1
-6
-1
-6
-1
-7
-1
-7
-1
[0082] Можно сказать, что раскрытая в настоящей заявке связывающая молекула, например, антитело или его фрагмент, вариант или производное, связывает антиген-мишень со скоростью диссоциации (k(off)), меньшей или равной 5 X 10 с, 10 с, 5 X 10 с, 10 с, 5 X 10 с, 10 с, 5 X 10 с, или 10 с 5 X 10 с, 10 с, 5 X 10 с, или 10 с.
3
-1
-1
3
-1
-1
4
-1
-1
4
-1
-1
5
-1
-1
5
-1
-1
6
-1
-1
6
-1
-1
7
-1
-1
[0083] Можно сказать, что раскрытая в настоящей заявке связывающая молекула, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное, связывает антиген-мишень со скоростью ассоциации (k(on)), большей или равной 10 М с, 5 X 10 М с, 10 М с, 5 X 10 М с, 10 М с, 5 X 10 М с, 10 М с, или 5 X 10 М с, или 10 М с.
[0084] Говорят, что связывающая молекула, например, антитело или его фрагмент, вариант или производное, конкурентно ингибирует связывание референсного антитела или антигенсвязывающего фрагмента с данным эпитопом, если она избирательно связывается с этим эпитопом в той степени, в которой она блокирует, до некоторой степени, связывание референсного антитела или антигенсвязывающего фрагмента с эпитопом. Конкурентное ингибирование может быть определено любым способом, известным в данной области техники, например, конкурентным анализом ELISA. Можно сказать, что связывающая молекула конкурентно ингибирует связывание референсного антитела или антигенсвязывающего фрагмента с данным эпитопом по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 60% или по меньшей мере на 50%.
nd
[0085] В контексте настоящей заявки термин «аффинность» относится к показателю силы связывания отдельного эпитопа с одним или более связывающими доменами, например, молекулой иммуноглобулина. См., например, Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2 ed. 1988), страницы 27-28. В контексте настоящей заявки термин «авидность» относится к общей стабильности комплекса между популяцией связывающих доменов и антигеном. См., например, Harlow, страницы 29-34. Авидность связана как с аффинностью отдельных связывающих доменов в популяции к конкретным эпитопам, так и с валентностью иммуноглобулинов и антигена. Например, взаимодействие между двухвалентным моноклональным антителом и антигеном с высокоповторяющейся структурой эпитопа, такой как полимер, будет иметь высокую авидность. Взаимодействие между двухвалентным моноклональным антителом и рецептором, присутствующим с высокой плотностью на поверхности клетки, также будет иметь высокую авидность.
[0086] Связывающие молекулы или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные, как раскрыто в настоящей заявке, также могут быть описаны или охарактеризованы с точки зрения их перекрестной реактивности. В контексте настоящей заявки термин «перекрестная реактивность» относится к способности связывающей молекулы, например, антитела или его фрагмента, варианта или производного, специфичного к одному антигену, реагировать со вторым антигеном; мера родства между двумя различными антигенными веществами. Таким образом, связывающая молекула является перекрестно реактивной, если она связывается с эпитопом, отличным от того, который индуцировал ее образование. Перекрестно-реактивный эпитоп обычно содержит большое количество комплементарных структурных признаков, содержащихся в индуцирующем эпитопе, и в некоторых случаях может фактически соответствовать лучше, чем оригинальный.
d
-2
-2
-3
-3
-4
-4
-5
-5
-6
-6
-7
-7
-8
-8
-9
-9
-10
-10
-11
-11
-12
-12
-13
-13
-14
-14
-15
-15
[0087] Связывающая молекула, например, антитело или его фрагмент, вариант или производное, также может быть описана или охарактеризована с точки зрения ее аффинности связывания с антигеном. Например, связывающая молекула может связываться с антигеном с константой диссоциации или K не более 5 × 10 М, 10 М, 5 × 10 М, 10 М, 5 × 10 М, 10 М, 5× 10 М, 10 М, 5 × 10 М, 10 М, 5 × 10 М, 10 М, 5 × 10 М, 10 М, 5 × 10 М, 10 М, 5 × 10 M, 10 M, 5 × 10 М, 10 М, 5 × 10 М, 10 М, 5 × 10 М, 10 М, 5 × 10 М, 10 М, 5 × 10 М или 10 М.
[0088] Фрагменты антител, включая одноцепочечные антитела или другие связывающие домены, могут существовать по отдельности или в комбинации с одним или более из следующего: шарнирная область, домены CH1, СН2, СН3 или СН4, J-цепь или секреторный компонент. Также включены антигенсвязывающие фрагменты, которые могут включать любую комбинацию вариабельной области(ей) с одним или более из шарнирной области, доменов CH1, СН2, СН3 или СН4, J-цепи или секреторного компонента. Связывающие молекулы, например, антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, могут иметь происхождение от любого животного, включая птиц и млекопитающих. Антитела могут представлять собой антитела человека, мыши, осла, кролика, козы, морской свинки, верблюда, ламы, лошади или курицы. В еще одном варианте осуществления вариабельная область может происходить от хрящевых рыб (например, от акул). В контексте настоящей заявки «человеческие» антитела включают антитела, содержащие аминокислотную последовательность человеческого иммуноглобулина, и включают антитела, выделенные из библиотек человеческого иммуноглобулина или из животных, трансгенных по одному или более человеческим иммуноглобулинам, и некоторые из них могут экспрессировать эндогенные иммуноглобулины, как описано ниже и, например, в патенте США №5939598 авторами Kucherlapati et al.
[0089] В контексте настоящей заявки термин «субъединица тяжелой цепи» включает аминокислотные последовательности, полученные из тяжелой цепи иммуноглобулина, связывающая молекула, например, антитело, содержащее субъединицу тяжелой цепи, включает по меньшей мере одно из: домена VH, домена СН1, шарнирного (например, верхней, средней и/или нижней шарнирной области) домена, домена СН2, домена СН3, домена СН4 или их варианта или фрагмента. Например, связывающая молекула, например, антитело или его фрагмент, вариант или производное, может включать, помимо домена VH, домен СН1; домен СН1, шарнир и домен СН2; домен СН1 и домен СН3; домен СН1, шарнир и домен СН3; или домен СН1, шарнирный домен, домен СН2 и домен СН3. В отдельных аспектах связывающая молекула, например, антитело или его фрагмент, вариант или производное, может включать, помимо домена VH, домен СН3 и домен СН4; или домен СН3, домен СН4 и J-цепь. Кроме того, в связывающей молекуле для применения в изобретении могут отсутствовать определенные части константной области, например, весь или часть домена СН2. Специалисту в данной области техники будет ясно, что эти домены (например, субъединица тяжелой цепи) могут быть модифицированы таким образом, что они будут отличаться по аминокислотной последовательности от исходной молекулы иммуноглобулина.
[0090] Субъединицы тяжелой цепи связывающей молекулы, например, антитела или ее фрагмента, могут включать домены, полученные из разных молекул иммуноглобулина. Например, субъединица тяжелой цепи полипептида может включать домен СН1, полученный из молекулы IgG1, и шарнирную область, полученную из молекулы IgG3. В другом примере субъединица тяжелой цепи может включать шарнирную область, полученную частично из молекулы IgG1 и частично из молекулы IgG3. В другом примере субъединица тяжелой цепи может содержать химерный шарнир, полученный частично из молекулы IgG1 и частично из молекулы IgG4.
[0091] В контексте настоящей заявки термин «субъединица легкой цепи» включает аминокислотные последовательности, полученные из легкой цепи иммуноглобулина. Субъединица легкой цепи включает по меньшей мере один из домена VL или CL (например, Cκ или Cλ).
[0092] Связывающие молекулы, например, антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные, могут быть описаны или охарактеризованы в контексте эпитопа(ов) или части(ей) антигена, который они распознают или специфически связывают. Часть антигена-мишени, которая специфически взаимодействует с антигенсвязывающим доменом антитела, представляет собой «эпитоп» или «антигенную детерминанту». Антиген-мишень может содержать один эпитоп или по меньшей мере два эпитопа и может включать любое количество эпитопов, в зависимости от размера, конформации и типа антигена.
[0093] Как указывалось ранее, структуры субъединиц и трехмерная конфигурация константных областей различных классов иммуноглобулинов хорошо известны. В контексте настоящей заявки термин «домен VH» включает аминоконцевой вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина, и термин «домен СН1» включает первый (наиболее аминоконцевой) домен константной области тяжелой цепи иммуноглобулина. Домен СН1 соседствует с доменом VH и является аминоконцевым относительно шарнирной области молекулы тяжелой цепи обычного иммуноглобулина.
[0094] В контексте настоящей заявки термин «домен СН2» включает часть молекулы тяжелой цепи, которая простирается, например, от приблизительно 244 аминокислоты до 360 аминокислоты антитела IgG, в соответствии с традиционными системами нумерации (аминокислоты с 244 по 360, система нумерации согласно Kabat; и аминокислоты 231-340, система нумерации EU; см. Kabat ЕА et al., цитируемый выше. Домен СН3 простирается от домена СН2 до С-конца молекулы IgG и содержит приблизительно 108 аминокислот. Некоторые классы иммуноглобулинов, например, IgM, дополнительно включают область СН4.
[0095] В контексте настоящей заявки термин «шарнирная область» включает часть молекулы тяжелой цепи, которая соединяет домен СН1 с доменом СН2. Шарнирная область содержит приблизительно 25 аминокислот и является гибкой, что позволяет двум N-концевым антигенсвязывающим областям перемещаться независимо.
[0096] В контексте настоящей заявки термин «дисульфидная связь» включает ковалентную связь, образованную между двумя атомами серы. Аминокислота цистеин содержит тиольную группу, которая может образовывать дисульфидную связь или мостик со второй тиольной группой. В некоторых молекулах IgG области СН1 и CL связаны дисульфидной связью, а две тяжелых цепи связаны двумя дисульфидными связями в положениях, соответствующих положениям 239 и 242 по системе нумерации согласно Kabat (положение 226 или 229, система нумерации EU).
[0097] В контексте настоящей заявки термин «химерное антитело» относится к антителу, в котором иммунореактивная область или сайт получены или происходят из первого вида, а константная область (которая может быть интактной, частичной или модифицированной) получена из второго вида. В некоторых вариантах осуществления целевая связывающая область или сайт будут происходить из источника, не являющегося человеком (например, мыши или примата), а константная область является человеческой.
[0098] Термины «полиспецифическое антитело» или «биспецифическое антитело» относятся к антителу, содержащему связывающие домены для двух или более разных эпитопов в одной молекуле антитела. Другие связывающие молекулы, помимо канонической структуры антитела, могут быть сконструированы с двумя специфичностями связывания. Связывание эпитопа биспецифическими или полиспецифическими антителами может быть одновременным или последовательным. Триомы и гибридные гибридомы являются двумя примерами клеточных линий, которые могут секретировать биспецифические антитела. Биспецифические антитела также могут быть сконструированы рекомбинантными технологиями. (Strohlein and Heiss, Future Oncol. 6:1387-94 (2010); Mabry and Snavely, IDrugs. 73:543-9 (2010)). Биспецифическое антитело также может представлять собой диатело.
[0099] В контексте настоящей заявки термин «сконструированное антитело» относится к антителу, в котором вариабельный домен либо в тяжелой, либо в легкой цепи, либо в обеих изменен в результате по меньшей мере частичной замены одной или более аминокислот либо в CDR, либо в каркасных областях. В отдельных аспектах полный набор CDR из антитела известной специфичности может быть привит на каркасные области гетерологичного антитела. Хотя альтернативные CDR могут быть получены из антитела того же класса или даже подкласса, что и антитело, из которого получены каркасные области, CDR также могут быть получены из антитела другого класса, например, из антитела животного другого вида. Сконструированное антитело, в котором одна или более «донорских» CDR из антитела известной специфичности, не являющегося человеческим, привиты на каркасную область человеческой тяжелой или легкой цепи, называется в настоящей заявке «гуманизированным антителом». В отдельных аспектах не все CDR заменены полным набором CDR из донорской вариабельной области, и, тем не менее, антигенсвязывающая способность донора все же может быть передана вариабельным доменам реципиента. С учетом объяснений, изложенных, например, в патентах США №№5585089, 5693761, 5693762 и 6180370, получение функционального сконструированного или гуманизированного антитела будет в пределах компетенции специалистов в данной области техники, либо путем проведения рутинных экспериментов, либо путем метода проб и ошибок.
[0100] В контексте настоящей заявки термин «сконструированный» включает манипулирование молекулами нуклеиновой кислоты или полипептида синтетическими средствами (например, с помощью рекомбинантных технологий, синтеза пептидов in vitro, ферментативного или химического связывания пептидов или какой-либо комбинации этих методов).
[0101] В контексте настоящей заявки термины «связанный», «слитый» или «слияние», или другие грамматические эквиваленты могут использоваться взаимозаменяемо. Эти термины относятся к объединению двух или более элементов или компонентов любыми средствами, включая химическое конъюгирование или рекомбинантные технологии. «Слияние с сохранением рамки считывания» относится к объединению двух или более открытых рамок считывания (ORF) полинуклеотида для образования непрерывной более длинной ORF таким образом, что сохраняется трансляционная рамка считывания исходных ORF. Таким образом, рекомбинантный слитый белок представляет собой один белок, содержащий два или более сегментов, которые соответствуют полипептидам, кодируемым исходными ORF (эти сегменты обычно не являются соединенными подобным образом в природе). Хотя рамку считывания таким образом делают непрерывной по всем слитым сегментам, сегменты могут быть физически или пространственно разделены, например, последовательностью внутрирамочного линкера. Например, полинуклеотиды, кодирующие CDR вариабельной области иммуноглобулина, могут быть слиты с сохранением рамки считывания, но могут быть разделены полинуклеотидом, кодирующим по меньшей мере одну каркасную область иммуноглобулина или дополнительные области CDR, при условии, что «слитые» CDR транслируются совместно, как часть непрерывного полипептида.
[0102] В контексте полипептидов «линейная последовательность» или «последовательность» представляет собой порядок аминокислот в полипептиде в направлении от аминоконца к карбоксиконцу, в котором аминокислоты, которые соседствуют друг с другом в последовательности, являются смежными в первичной структуре полипептида. Часть полипептида, которая является «аминоконцевой» или «N-концевой» по отношению к другой части полипептида, представляет собой часть, которая находится раньше в последовательной полипептидной цепи. Аналогичным образом, часть полипептида, которая является «карбоксиконцевой» или «С-концевой» по отношению к другой части полипептида, представляет собой часть, которая находится позже в последовательной полипептидной цепи. Например, в типичном антителе вариабельный домен является «N-концевым» относительно константной области, а константная область является «С-концевой» относительно вариабельного домена.
[0103] Термин «экспрессия» в контексте настоящей заявки относится к процессу, посредством которого ген продуцирует биохимический продукт, например, полипептид. Этот процесс включает в себя любое проявление функционального присутствия гена в клетке, включая, не ограничиваясь перечисленным, нокдаун гена, а также как временную экспрессию, так и стабильную экспрессию. Он включает, не ограничиваясь перечисленным, транскрипцию гена в матричную РНК (мРНК) и трансляцию такой мРНК в полипептид(ы). Если конечный желаемый продукт является биохимическим продуктом, экспрессия включает создание этого биохимического продукта и любых предшественников. Экспрессия гена производит «генный продукт». В контексте настоящей заявки генный продукт может представлять собой либо нуклеиновую кислоту, например, матричную РНК, полученную путем транскрипции гена, либо полипептид, транслируемый с транскрипта. Генные продукты, описанные в настоящей заявке, также включают нуклеиновые кислоты с посттранскрипционными модификациями, такими как полиаденилирование, или полипептиды с посттрансляционными модификациями, такими как метилирование, гликозилирование, добавление липидов, связывание с другими белковыми субъединицами или протеолитическое расщепление, и тому подобное.
[0104] В контексте настоящей заявки термин «эпигенетическая модификация(ии)» относится к стабильно наследуемому фенотипу(ам), возникающему в результате хромосомных изменений без изменений в последовательности ДНК. Эпигенетические модификации могут в некоторых случаях приводить к заболеванию или расстройству, такому как рак. Berger, SL, et al., Genes Dev. 23:781-783 (2009). Эпигенетические модификации обычно включают изменения в структуре хроматина, которые могут привести к сверхэкспрессии и/или репрессии генов, контролирующих клеточные процессы, такие как дифференцировка, пролиферация и/или апоптоз. Такие модификации могут включать, например, метилирование ДНК и ацетилирование гистонов. См., например, Gnyska, A., et al., Anticancer Res. 33:2989-2996 (2013).
[0105] В контексте настоящей заявки термин «эпигенетический модулирующий агент» относится к агенту, например, терапевтическому агенту, который может влиять, например, блокировать, уменьшать, обращать вспять или ослаблять, вызывающую заболевание эпигенетическую модификацию, таким самым обеспечивая лечение заболевания, например, рака. Примеры эпигенетических модулирующих агентов включают ингибиторы ДНК-метилтрансферазы (DNMTi) и ингибиторы гистондеацетилазы (HDACi). Различные HDACi и DNMTi одобрены или проходят исследования для лечения отдельных видов рака. Примеры агентов раскрыты в других частях настоящей заявки.
[0106] В контексте настоящей заявки термины «ингибитор(ы) гистондеацетилазы» или «ингибитор(ы) HDAC» или «HDACi» относятся к соединению или соединениям, способным ингибировать деацетилирование гистонов in vivo, in vitro или в обоих случаях. HDAC ингибируют активность по меньшей мере одной гистондеацетилазы. В результате ингибирования деацетилирования по меньшей мере одного гистона происходит повышение количества ацетилированного гистона, и накопление ацетилированного гистона может быть использовано как биологический маркер для оценки активности HDAC.
[0107] В контексте настоящей заявки термины «ингибитор(ы) ДНК-метилтрансферазы» или «ингибитор(ы) DNMT» или «DNMTi» относятся к соединению или соединениям, способным ингибировать гиперметилирование ДНК и/или сверхэкспрессию ДНК-метилтрансферазы («DNMT») in vivo, in vitro или в обоих случаях. В результате ингибирования сверхэкспрессии DNMT и/или активности DNMT DNMTi может, например, восстанавливать экспрессию аберрантно сайленсированных генов, таких как гены-супрессоры опухолей.
[0108] В контексте настоящей заявки термин «связывающая молекула к SEMA4D» относится к молекуле, специфически связывающейся с SEMA4D, например, к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, варианту или производному. Термин «антитело к SEMA4D» в случае, если он не относится специально к полноразмерным антителам, таким как встречающиеся в природе антитела, охватывает полноразмерные антитела, а также антигенсвязывающие фрагменты, а также антигенсвязывающие фрагменты, варианты, аналоги или производные таких антител, например, встречающиеся в природе молекулы антител или иммуноглобулинов, или сконструированные молекулы антител или фрагменты, связывающие антиген таким же образом, как молекулы антител.
[0109] Такие термины, как «лечение» или «лечить», или «облегчение» или «облегчать» относятся к терапевтическим мерам, которые излечивают, замедляют, уменьшают симптомы и/или останавливают или замедляют прогрессирование существующего диагностированного патологического состояния или расстройства. Такие термины, как «предотвращать», «предотвращение», «избегать», «сдерживание» и тому подобное, относятся к профилактическим или предупредительным мерам, предотвращающим развитие недиагностированного целевого патологического состояния или расстройства. Таким образом, «те, кто нуждается в лечении», могут включать тех, кто уже имеет расстройство; тех, кто предрасположен к развитию расстройства; и тех, у кого расстройство необходимо предотвратить.
[0110] Термин «терапевтически эффективное количество» относится к количеству антитела, полипептида, полинуклеотида, малой органической молекулы или другого лекарственного средства, эффективному для «лечения» заболевания или расстройства у субъекта или млекопитающего. В случае рака терапевтически эффективное количество лекарственного средства может уменьшить количество раковых клеток; замедлить или остановить деление раковых клеток, уменьшить или замедлить увеличение размера опухоли; ингибировать, например, подавлять, замедлять, предотвращать, останавливать, задерживать или обращать вспять инфильтрацию раковых клеток в периферические органы, включая, например, распространение рака в мягкие ткани и кость; ингибировать, например, подавлять, замедлять, предотвращать, уменьшать, останавливать, задерживать или обращать вспять метастазирование опухоли; ингибировать, например, подавлять, замедлять, предотвращать, останавливать, задерживать или обращать вспять рост опухоли; облегчать до некоторой степени один или более симптомов, связанных с раком, снижать заболеваемость и смертность; улучшать качество жизни; или обеспечить комбинацию таких эффектов. Если лекарственное средство предотвращает рост существующих раковых клеток и/или уничтожает их, его можно назвать цитостатическим и/или цитотоксическим.
[0111] Под «субъектом», или «индивидуумом», или «животным», или «пациентом», или «млекопитающим» подразумевается любой субъект, в частности, млекопитающее, для которого желательны диагностика, прогноз или терапия. Млекопитающие включают людей, домашних животных, сельскохозяйственных животных и животных зоопарка, животных, принимающих участие в спорте или домашних животных, таких как собаки, кошки, морские свинки, кролики, крысы, мыши, лошади, свиньи, коровы, медведи и так далее.
[0112] В контексте настоящей заявки выражения, такие как «субъект, который получит пользу от терапии» и «животное, нуждающееся в лечении», включают субъектов, таких как млекопитающие, которые получили бы пользу от введения терапии, как описано в настоящей заявке, такой как антитело, содержащее один или более антигенсвязывающих доменов, в комбинации с эпигенетическим модулирующим агентом, например, HDACi, DNMTi и/или их комбинацией.
[0113] Термин «иммуномодулирующая терапия» или «иммунотерапия» относится к лечению, которое воздействует на заболевание или расстройство у субъекта путем индукции и/или усиления иммунного ответа у этого субъекта. Иммуномодулирующая терапия включает противораковые вакцины, иммуностимулирующие агенты, адоптивную Т-клеточную терапию или терапию антителами, и блокирование иммунных контрольных точек (Lizee et al. Ann. Rev. Med. 64:71-90 (2013)).
[0114] Термин «иммуномодулирующий агент» относится к активным агентам для иммунотерапии. Иммуномодулирующие агенты включают разнообразные рекомбинантные, синтетические и природные препараты. Примеры иммуномодулирующих агентов включают, не ограничиваясь перечисленным, интерлейкины, такие как IL-2, IL-7, IL-12; цитокины, такие как гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), интерфероны; различные хемокины, такие как CXCL13, CCL26, CXCL7; антагонисты, блокирующие иммунные контрольные точки, такие как анти-CTLA-4, анти-PD-1 или анти-PD-Ll (лиганд PD-1), анти-LAG3, анти-TIM3, анти-В7-Н3, синтетические цитозинфосфат-гуанозиновые (CpG) олигодезоксинуклеотиды, глюканы; и модуляторы регуляторных Т-клеток (Treg), такие как циклофосфамид.
Описание полипептида-мишени - SEMA4D
[0115] В контексте настоящей заявки термины «семафорин 4D», «SEMA4D» и «полипептид SEMA4D» используются взаимозаменяемо, равно как и «SEMA4D» и «Sema4D». В отдельных вариантах осуществления SEMA4D экспрессируется на поверхности клетки или секретируется ей. В еще одном варианте осуществления SEMA4D является мембранносвязанным. В еще одном варианте осуществления SEMA4D является растворимым, например, sSEMA4D. В еще одном варианте осуществления SEMA4D может включать полноразмерный SEMA4D или его фрагмент, или вариантный полипептид SEMA4D, где фрагмент SEMA4D или вариантный полипептид SEMA4D сохраняет некоторые или все функциональные свойства полноразмерного SEMA4D.
[0116] Полноразмерный человеческий белок SEMA4D представляет собой гомодимерный трансмембранный белок, состоящий из двух полипептидных цепей молекулярной массой 150 кДа. SEMA4D принадлежит семейству рецепторов клеточной поверхности семафоринов, и его также называют CD100. Как человеческий, так и мышиный SEMA4D/Sema4D может быть протеолитически отщеплен от его трансмембранной формы с образованием растворимых форм с молекулярной массой 120 кДа, что приводит к образованию двух изоформ Sema4D (Kumanogoh et al., J. Cell Science 77(5:3464 (2003)). Семафорины состоят из растворимых и мембранносвязанных белков, которые первоначально были определены как факторы аксонального наведения, которые играют важную роль в установлении точных связей между нейронами и их соответствующей мишенью. SEMA4D, структурно считающийся семафорином IV класса, состоит из аминоконцевой сигнальной последовательности, за которой следует характерный домен «Sema», содержащий 17 консервативных остатков цистеина, Ig-подобный домен, богатый лизином участок, гидрофобная трансмембранная область и цитоплазматический хвост.
[0117] Полипептид SEMA4D включает сигнальную последовательность из приблизительно 13 аминокислот, за которой следует домен семафорина из приблизительно 512 аминокислот, иммуноглобулиноподобный (Ig-подобный) домен из приблизительно 65 аминокислот, богатый лизином участок из 104 аминокислот, гидрофобная трансмембранная область из приблизительно 19 аминокислот и цитоплазматический хвост из 110 аминокислот. Консенсусный сайт фосфорилирования тирозина в цитоплазматическом хвосте подтверждает предсказанную связь SEMA4D с тирозинкиназой (Schlossman et al., Eds. (1995) Leucocyte Typing V (Oxford University Press, Oxford).
[0118] Известно, что SEMA4D имеет по меньшей мере три функциональных рецептора: плексин В1, плексин В2 и CD72. Плексин В1 экспрессируется в нелимфоидных тканях, и было показано, что он является высокоаффинным (1 нМ) рецептором для SEMA4D (Tamagnone et al., Cell99:71-80 (1999)). Было показано, что стимуляция посредством SEMA4D передачи сигналов плексином В1 вызывает коллапс конусов роста нейронов и вызывает коллапс удлинения отростков и апоптоз олигодендроцитов (Giraudon et al., J. Immunol. 772:1246-1255 (2004); Giraudon et al., NeuroMolecular Med. 7:207-216 (2005)). После связывания с SEMA4D передача сигналов плексином В1 опосредует инактивацию R-Ras, приводя к снижению опосредованного интегрином прикрепления к внеклеточному матриксу, а также к активации RhoA, приводя к коллапсу клеток путем перестройки цитоскелета (Kruger et al., Nature Rev. Mol. Cell Biol. (5:789-800 (2005); Pasterkamp, TRENDS in Cell Biology 75:61-64 (2005)). Плексин B2 обладает средней аффинностью к SEMA4D, и последнее сообщение свидетельствует о том, что плексин В2 экспрессируется на кератиноцитах и активирует SEMA4D-положительные γδ Т-клетки, способствуя регенерации эпителия (Witherden et al., Immunity 37:314-25 (2012)).
[0119] В лимфоидных тканях CD72 используется в качестве низкоаффинного (300 нМ) рецептора SEMA4D (Kumanogoh et al, Immunity 73:621-631 (2000)). В-клетки и антигенпрезентирующие клетки (АРС) экспрессируют CD72, а антитела к CD72 обладают многими эффектами, присущими sSEMA4D, такие как усиление вызванных CD40 В-клеточных ответов и сбрасывание CD23 В-клетками. Считается, что CD72 действует как отрицательный регулятор В-клеточных ответов, рекрутируя тирозин-фосфатазу SHP-1, которая может связываться со многими ингибирующими рецепторами. Взаимодействие SEMA4D с CD72 приводит к диссоциации SHP-1 и потере этого отрицательного сигнала активации. Было показано, что SEMA4D способствует стимуляции Т-клеток и агрегации и выживанию В-клеток in vitro. Добавление SEMA4D-экспрессирующих клеток или sSEMA4D усиливает вызванную CD40 пролиферацию В-клеток и выработку иммуноглобулина in vitro, и ускоряет ответы антител in vivo (Ishida et al., Inter. Immunol. 75:1027-1034 (2003); Kumanogoh and H. Kukutani, Trends in Immunol. 22:670-676 (2001)). sSEMA4D усиливает вызванное CD40 созревание DC, в том числе активацию костимулирующих молекул и повышенную секрецию IL-12. Кроме того, sSEMA4D может ингибировать миграцию иммунных клеток, что можно обратить вспять путем добавления блокирующих мышиных антител к SEMA4D (Elhabazi et al., J. Immunol. 166:4341-4347 (2001); Delaire et al., J. Immunol. 766:4348-4354 (2001)).
[0120] Sema4D экспрессируется на высоком уровне в лимфоидных органах, включая селезенку, тимус и лимфатические узлы, и в нелимфоидных органах, таких как головной мозг, сердце и почка. В лимфоидных органах Sema4D широко экспрессируется на покоящихся Т-клетках, но слабо экспрессируется на покоящихся В-клетках и антигенпрезентирующих клетках (АРС), таких как дендритные клетки (DC).
[0121] Клеточная активация повышает поверхностную экспрессию SEMA4D, а также образование растворимого SEMA4D (sSEMA4D). Профиль экспрессии SEMA4D дает основания предполагать, что он играет важную физиологическую и патологическую роль в иммунной системе. Было показано, что SEMA4D способствует активации, агрегации и выживанию В-клеток; усиливает вызванную CD40 пролиферацию и выработку антител; усиливает ответ антител на Т-зависимые антигены; повышает пролиферацию Т-клеток; усиливает созревание дендритных клеток и способность стимулировать Т-клетки; и непосредственно участвует в демиелинизации и аксональной дегенерации (Shi et al., Immunity 73:633-642 (2000); Kumanogoh et al., J. Immunol. 7(59:1175-1181 (2002); и Watanabe et al., J. Immunol. 767:4321-4328 (2001)).
Антитела к SEMA4D
[0122] Антитела, связывающие SEMA4D, были описаны в уровне техники. См., например, публикации заявок на патент США №№2008/0219971 A1, US 2010/0285036 A1 и US 2006/0233793 A1, международные патентные заявки WO 93/14125, WO 2008/100995 и WO 2010/129917, и Herold et al., Int. Immunol. 7:1-8 (1995), все из которых включены в настоящую заявку посредством ссылки.
[0123] Изобретение в общем относится к способу ингибирования, задержки или снижения роста опухоли или метастазов у субъекта, например, больного раком человека, включающему введение антитела, специфически связывающегося с SEMA4D, или его антигенсвязывающего фрагмента, варианта или производного, и эффективного количества эпигенетического модулирующего агента, например, ингибитора гистондеацетилазы (HDAC) (HDACi), ингибитора ДНК-метилтрансферазы (DNMT) (DNMTi) или любой их комбинации. HDACi и DNMTi подробно описаны в других частях настоящей заявки. В отдельных вариантах осуществления антитело к SEMA4D блокирует взаимодействие SEMA4D с одним или более его рецепторами, например, плексином B1, плексином В2 и/или CD72. В отдельных вариантах осуществления раковые клетки экспрессируют плексин B1 и/или плексин В2. Антитела к SEMA4D, обладающие этими свойствами, могут быть использованы в способах, предложенных в настоящей заявке. Антитела, которые могут быть использованы, включают, не ограничиваясь перечисленным, Mab (моноклональные антитела) VX15/2503, 67, 76, 2282 и их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные, которые полностью описаны в US 2010/0285036 A1 и US 2008/0219971 A1. Дополнительные антитела, которые могут быть использованы в способах, предложенных в настоящей заявке, включают антитело BD16, описанное в US 2006/0233793 A1, а также его антигенсвязывающие фрагменты, варианты или их производные; или любое из MAb 301, Mab 1893, Mab 657, Mab 1807, Mab 1656, Mab 1808, Mab 59, Mab 2191, Mab 2274, Mab 2275, Mab 2276, MAb 2277, MAb 2278, MAb 2279, MAb 2280, MAb 2281, MAb 2282, MAb 2283, MAb 2284 и MAb 2285, а также любые их фрагменты, варианты или производные, как описано в US 2008/0219971 A1. В отдельных вариантах осуществления антитело к SEMA4D для применения в способах, предложенных в настоящей заявке, связывает человеческий, мышиный или как человеческий, так и мышиный SEMA4D. Также подходят антитела, которые связываются с тем же эпитопом, что и любое из вышеупомянутых антител, и/или антитела, которые конкурентно ингибируют связывание или активность любого из вышеупомянутых антител.
[0124] В отдельных вариантах осуществления антитело к SEMA4D или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или его производное, подходящее для способов, предложенных в настоящей заявке, имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере приблизительно на 80%, приблизительно на 85%, приблизительно на 88%, приблизительно на 89% приблизительно на 90%, приблизительно на 91%, приблизительно на 92%, приблизительно на 93%, приблизительно на 94% или приблизительно на 95% идентичную аминокислотной последовательности молекулы референсного антитела к SEMA4D, например, молекул, описанных выше. В дополнительном варианте осуществления последовательность связывающей молекулы по меньшей мере приблизительно на 96%, приблизительно на 97%, приблизительно на 98%, приблизительно на 99% или на 100% идентична последовательности референсного антитела.
[0125] В отдельных аспектах антитело к SEMA4D или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное может ингибировать взаимодействие SEMA4D с его рецептором, например, плексином В1, плексином В2 или CD72. В отдельных аспектах антитело к SEMA4D или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное может ингибировать опосредованную SEMA4D передачу сигналов плексином В1.
[0126] В отдельных аспектах антитело к SEMA4D или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное конкурентно ингибирует связывание референсного антитела, содержащего вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, с SEMA4D. В отдельных аспектах антитело к SEMA4D или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное связывается с тем же эпитопом SEMA4D, что и референсное антитело, содержащее VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и VL, содержащую аминокислоту последовательность SEQ ID NO: 5. В отдельных аспектах VH антитела к SEMA4D или его антигенсвязывающего фрагмента, варианта или производного содержит три области, определяющие комплементарность (CDR): HCDR1, HCDR2 и HCDR3, и VL содержит три CDR: LCDR1, LCDR2 и LCDR3, где CDR содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8, соответственно, за исключением по меньшей мере одной, двух, трех, четырех, пяти или шести одиночных консервативных аминокислотных замен в одной или более CDR. В отдельных аспектах CDR содержат аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8, соответственно.
[0127] В отдельных аспектах VH антитела к SEMA4D или его антигенсвязывающего фрагмента, варианта или производного содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100%. идентичную SEQ ID NO: 1, и VL антитела к SEMA4D или его антигенсвязывающего фрагмента, варианта или производного содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% идентичную SEQ ID NO: 5; или VH содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% идентичную SEQ ID NO: 9, и VL содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% идентичную SEQ ID NO: 10. В отдельных аспектах VH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и VL содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5; или VH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, и VL содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10.
[0128] Для применения в способах, предложенных в настоящей заявке, также включены полипептиды, кодирующие антитела к SEMA4D или их антигенсвязывающие фрагменты, варианты или производные, как описано в настоящей заявке, полинуклеотиды, кодирующие такие полипептиды, векторы, содержащие такие полинуклеотиды, и клетки-хозяева, содержащие такие векторы или полинуклеотиды, все из которых предназначены для продуцирования антител к SEMA4D или их антигенсвязывающих фрагментов, вариантов или производных для применения в способах, предложенных в настоящей заявке.
[0129] Подходящие биологически активные варианты антител к SEMA4D согласно изобретению могут быть использованы в способах согласно настоящему изобретению. Такие варианты сохраняют желаемые свойства связывания родительского антитела к SEMA4D. Способы получения вариантов антител обычно доступны в данной области техники.
[0130] Способы мутагенеза и изменения нуклеотидных последовательностей хорошо известны в данной области техники. См. например, Walker and Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York); Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 52:488-492 (1985); Kunkel et al., Methods Enzymol. 154:367-382 (1987); Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, N.Y.); патент США 4873192; и цитируемые в нем ссылки; указанные источники включены в настоящую заявку посредством ссылки. Руководство по выбору подходящих аминокислотных замен, которые не влияют на биологическую активность представляющего интерес полипептида, содержится в модели согласно Dayhoff et al. (1978) в Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.), стр. 345-352, полностью включенном в настоящую заявку посредством ссылки. В модели Dayhoff et al. используется матрица сходства аминокислот на основе закрепившихся точечных мутаций (РАМ) (матрица РАМ 250) для определения подходящих консервативных аминокислотных замен. В отдельных аспектах используются консервативные замены, такие как замена одной аминокислоты на другую, имеющую схожие свойства. Примеры консервативных аминокислотных замен, согласно матрице РАМ 250 модели Dayhoff et al., включают, не ограничиваясь перечисленным, Gly↔Ala, Val↔Ile↔Leu, Asp↔Glu, Lys↔Arg, Asn↔Gln и Phe↔Trp↔Tyr.
[0131] При конструировании вариантов связывающей молекулы к SEMA4D, например, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, представляющих интерес полипептидов, модификации вносятся таким образом, чтобы варианты продолжали обладать желаемыми свойствами, например, были способны специфически связываться с SEMA4D, например, человеческим, мышиным или как человеческим, так и мышиным SEMA4D, например, экспрессируемым на поверхности или секретируемым клеткой, и обладали активностью блокирования SEMA4D, как описано в настоящей заявке. В отдельных аспектах мутации, внесенные в ДНК, кодирующей вариантный полипептид, поддерживают рамку считывания и не создают комплементарных областей, которые могли бы образовать вторичную структуру мРНК. См. публикацию заявки на европейский патент №75444.
[0132] Способы измерения специфичности связывания связывающей молекулы к SEMA4D, например, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, варианта или производного, включают, не ограничиваясь перечисленным, стандартные анализы конкурентного связывания, анализы для мониторинга секреции иммуноглобулинов Т-клетками или В клетками, анализы пролиферации Т-клеток, анализы апоптоза, анализы ELISA и тому подобное. См., например, такие анализы, раскрытые в WO 93/14125; Shi et al., Immunity 73:633-642 (2000); Kumanogoh et al., J. Immunol. 7(59:1175-1181 (2002); Watanabe et al., J. Immunol. 7(57:4321-4328 (2001); Wang et al., Blood 97:3498-3504 (2001); и Giraudon et al., J. Immunol. 772:1246-1255 (2004), все из которых включены в настоящую заявку посредством ссылки.
[0133] Способы измерения антиангиогенной способности антитела к SEMA4D или его антигенсвязывающего фрагмента, варианта или производного хорошо известны в данной области техники.
[0134] При обсуждении в настоящей заявке того, является ли какой-либо конкретный полипептид, включая константные области, CDR, домены VH или домены VL, раскрытые в настоящей заявке, по меньшей мере приблизительно на 65%, приблизительно на 70%, приблизительно на 75%, приблизительно на 80%, приблизительно на 85%, приблизительно на 90% приблизительно на 91%, приблизительно на 92%, приблизительно на 93%, приблизительно на 94%, приблизительно на 95%, приблизительно на 96%, приблизительно на 97%, приблизительно на 98%, приблизительно на 99% или даже приблизительно на 100% идентичным другому полипептиду, % идентичности может быть определен с использованием способом и компьютерных программ/программного обеспечения, известных в данной области техники, таких как, не ограничиваясь перечисленным, программа BESTFIT (пакет для анализа последовательностей Wisconsin, версия 8 для Unix, Genetics Computer Group, Университетский исследовательский парк, 575 Science Drive, Мадисон, штат Висконсин 53711). В BESTFIT для того, чтобы найти сегмент наилучшей гомологии двух последовательностей, используется алгоритм локальных гомологий согласно Smith and Waterman (1981)Adv. Appl. Math. 2:482-489. При использовании программы BESTFIT или любой другой программы для выравнивания последовательностей для определения того, является ли конкретная последовательность, например, на 95% идентичной референсной последовательности согласно настоящему изобретению, параметры, разумеется, устанавливают таким образом, чтобы процент идентичности вычислялся по всей длине референсной полипептидной последовательности, и были разрешены гэпы в гомологии вплоть до 5% от общего числа аминокислот в референсной последовательности.
[0135] В целях настоящего изобретения процент идентичности последовательностей может быть определен с использованием алгоритма поиска гомологии Смита-Уотермана с использованием поиска аффинных гэпов с штрафом за открытие гэпа, равным 12, и штрафом за расширение гэпа, равным 2, с матрицей BLOSUM 62. Алгоритм поиска гомологии Смита-Уотермана изложен в Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482-489. Вариант может, например, отличаться от референсного антитела к SEMA4D (например, MAb VX15/2503, 67, 76 или 2282) на всего лишь от 1 до 15 аминокислотных остатков, на всего лишь от 1 до 10 аминокислотных остатков, например на 6-10, на всего лишь 5, на всего лишь 4, 3, 2 или даже на 1 аминокислотный остаток.
[0136] Константная область антитела к SEMA4D может быть мутирована для изменения эффекторной функции несколькими способами. См., например, патент США №6,737,056 В1 и публикацию заявки на патент США №2004/0132101 А1, где раскрыты мутации Fc, которые оптимизируют связывание антител с Fc-рецепторами.
[0137] В отдельных антителах к SEMA4D или их фрагментах, вариантах или производных, подходящих для использования в способах, предложенных в настоящей заявке, Fc-часть может быть мутирована для снижения эффекторной функции с использованием методов, известных в данной области техники. Например, делеция или инактивация (посредством точечных мутаций или других средств) домена константной области может снизить связывание Fc-рецептора циркулирующего модифицированного антитела, тем самым улучшив локализацию опухоли. В других случаях модификации константной области, согласующиеся с настоящим изобретением, снижают связывание комплемента и, таким образом, уменьшает время полужизни в сыворотке. Могут быть использованы и другие модификации константной области для модификации дисульфидных связей или олигосахаридных фрагментов, которые обеспечивают улучшенную локализацию благодаря повышенной антигенной специфичности или гибкости антитела. Полученный в результате физиологический профиль, биодоступность и другие биохимические эффекты модификаций, такие как локализация опухоли, биораспределение и время полужизни в сыворотке, могут быть легко измерены и количественно определены с использованием хорошо известных иммунологических методов без проведения излишних экспериментов.
[0138] Антитела к SEMA4D для использования в способах, предложенных в настоящей заявке, включают производные, которые модифицированы, например, ковалентным присоединением молекулы любого типа к антителу таким образом, что ковалентное присоединение не препятствует специфическому связыванию антитела с его родственным эпитопом. Например, не ограничиваясь перечисленным, производные антител включают антитела, которые были модифицированы, например, путем гликозилирования, ацетилирования, пегилирования, фосфорилирования, амидирования, дериватизации известными защитными/блокирующими группами, протеолитического расщепления, связывания с клеточным лигандом или другим белком и т.д. Любая из множества химических модификаций может быть осуществлена известными методами, включая, не ограничиваясь перечисленным, специфическое химическое расщепление, ацетилирование, формилирование и т.д. Кроме того, производное может содержать одну или более нестандартных аминокислот.
[0139] «Консервативная аминокислотная замена» представляет собой такую аминокислотную замену, при которой аминокислотный остаток заменяют аминокислотным остатком, содержащим боковую цепь со схожим зарядом. Семейства аминокислотных остатков, содержащих боковые цепи со схожими зарядами, были определены в уровне техники. Эти семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серии, треонин, тирозин, цистеин), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). В качестве альтернативы, мутации могут быть введены случайным образом по всей или части кодирующей последовательности, например, путем насыщающего мутагенеза, и полученные мутанты могут быть подвергнуты скринингу на биологическую активность для выявления мутантов, сохраняющих активность (например, способность связывать полипептид к SEMA4D, блокировать взаимодействие SEMA4D с его рецептором или ингибировать, задерживать или уменьшать метастазы у субъекта, например, больного раком).
[0140] Например, можно вводить мутации только в каркасных областях или только в областях CDR молекулы антитела. Введенные мутации могут быть молчащими или нейтральными миссенс-мутациями, то есть, не влиять или мало влиять на способность антитела связывать антиген. Эти типы мутаций могут быть полезны для оптимизации использования кодонов или улучшения продукции антител гибридомой. И наоборот, ненейтральные миссенс-мутации могут изменять способность антитела связывать антиген. Специалист в данной области техники способен разработать и испытать мутантные молекулы с желаемыми свойствами, такими как отсутствие изменения активности связывания антигена или изменение активности связывания (например, улучшения активности связывания антигена или изменение специфичности антитела). После мутагенеза кодируемый белок может быть обычным образом экспрессирован, и может быть определена функциональная и/или биологическая активность кодируемого белка (например, способность иммуноспецифически связывать по меньшей мере один эпитоп полипептида SEMA4D) с использованием методик, описанных в настоящей заявке, или путем стандартных методик модификации, известных в данной области техники.
[0141] В отдельных вариантах осуществления антитела к SEMA4D для использования в способах, предложенных в настоящей заявке, содержат по меньшей мере одну оптимизированную область, определяющую комплементарность (CDR). Под «оптимизированной CDR» подразумевается, что CDR была модифицирована и оптимизирована для улучшения аффинности связывания и/или активности против SEMA4D, которая придается антителу к SEMA4D, содержащему оптимизированную CDR. «Активность против SEMA4D» или «активность блокирования SEMA4D» может включать активность, модулирующую одну или более из следующих активностей, связанных с SEMA4D: активация, агрегация и выживание В-клеток; вызванная CD40 пролиферация и выработка антител; ответ антител на Т-зависимые антигены; пролиферация Т-клеток или других иммунных клеток; созревание дендритных клеток; демиелинизация и аксональная дегенерация; апоптоз плюрипотентных нейтральных предшественников и/или олигодендроцитов; индукция миграции эндотелиальных клеток; ингибирование спонтанной миграции моноцитов; ингибирование, задержка или снижение роста или метастазирования опухолевых клеток, связывание с плексином В1 или другим рецептором на клеточной поверхности, или любую другую активность, связанную с растворимым SEMA4D или SEMA4D, экспрессируемым на поверхности SEMA4D+ клеток. В частном варианте осуществления активность против SEMA4D включает способность ингибировать, задерживать или уменьшать метастазы опухоли, либо в сочетании с ингибированием, задержкой или снижением роста первичных опухолевых клеток и метастазов опухоли, либо независимо от роста первичных опухолевых клеток и метастазов опухоли. Активность против SEMA4D может также быть связана со снижением частоты возникновения или тяжести заболеваний, связанных с экспрессией SEMA4D, включая, не ограничиваясь перечисленным, некоторые виды рака, включая лимфомы, аутоиммунные заболевания, воспалительные заболевания, включая воспалительные заболевания центральной нервной системы (ЦНС) и периферической нервной системы (ПНС), отторжение трансплантата и инвазивный ангиогенез. Примеры оптимизированных антител на основе мышиного антитела к SEMA4D MAb BD16 были описаны в публикации заявки на патент США №2008/0219971 А1, международной патентной заявке WO 93/14125 и Herold et al., Int. Immunol. 7:1-8 (1995), все из которых полностью включены в настоящую заявку посредством ссылки. Модификации могут включать замену аминокислотных остатков в CDR, так что антитело к SEMA4D сохраняет специфичность к антигену SEMA4D и обладает улучшенной аффинностью связывания и/или улучшенной активностью против SEMA4D.
Ингибиторы гистондеацетилазы (HDACi)
[0142] В контексте настоящей заявки термины «ингибитор(ы) гистондеацетилазы», «ингибитор(ы) HDAC» и «HDACi» используются взаимозаменяемо и могут относиться к одному HDACi или нескольким HDACi.
[0143] Гистонацетилтрансферазы (HAT) и гистондеацетилазы (HDAC) регулируют статус ацетилирования гистонов. Гистонацетилтрансферазы представляют собой ферменты, ацетилирующие остатки лизина в коровых гистонах, что обеспечивает менее компактный и более транскрипционно активный хроматин, что приводит к экспрессии генов. HDAC, напротив, представляют собой ферменты, катализирующие удаление ацетильных групп из остатков лизина в аминоконцевых хвостах нуклеосомных коровых гистонов. HDAC могут быть разделены на три класса на основе структурной гомологии. HDAC I класса (HDAC 1, 2, 3 и 8) связаны с геном дрожжей RPD3. Класс IIA (HDAC 4, 5, 7 и 9) имеет сходство с геном дрожжей Hda1. Класс III, также известный как сиртуины, относится к гену Sir2 и включает SIRT1-7. Класс IV, содержащий только HDAC 11, имеет общие характеристики как с I, так и со II классом. См., например, Mottamal, М., et al., Molecules 20:3898-3941 (2015).
[0144] Некоторые ингибиторы HDAC действуют путем связывания с цинк-содержащим каталитическим доменом HDAC. Они могут быть классифицированы на основе химического фрагмента, который связывается с ионом цинка, или как циклические тетрапептиды, которые связываются с ионом цинка посредством тиольной группы. См., например, Drummond, D.C., et al., Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 45:495-528 (2005). К ним относятся, не ограничиваясь перечисленным: гидроксамовые кислоты (или гидроксаматы), такие как трихостатин А; циклические тетрапептиды (такие как трапоксин В) и депсипептиды; бензамиды; электрофильные кетоны; и соединения алифатических кислот (короткоцепочечные жирные кислоты (SCFA), такие как фенилбутират и вальпроевая кислота). См., например, Porcu, М., and Chiarugi, A., Trends Pharmacolog. Sci. 2(5:94-103 (2005). Более конкретно, ингибиторы HDAC включают, не ограничиваясь перечисленным, гидроксамовые кислоты вориностат (SAHA), белиностат (PXD101), LAQ824 и панобиностат (LBH589); и бензамиды: энтиностат (MS-275), CI994 и моцетиностат (MGCD0103). HDAC, относящиеся к III классу сиртуинов, зависят от NAD+(никотинамидадениндинуклеотида) и поэтому ингибируются никотинамидом, а также производными NAD, дигидрокумарином, нафтопираноном и 2-гидроксинафтальдегидами. См. тот же источник.
[0145] Неограничивающие примеры ингибиторов HDAC для применения для ингибирования гистондеацетилазы, индукции терминальной дифференцировки, остановки роста клеток и/или апоптоза в злокачественных клетках, и/или индукции дифференциации, остановки роста клеток и/или апоптоза опухолевых клеток в опухоли, перечислены в таблице 2. При этом подразумевается, что ингибиторы HDAC включают любые соли, кристаллические структуры, аморфные структуры, гидраты, производные, метаболиты, стереоизомеры, структурные изомеры и пролекарства ингибиторов HDAC, описанных в настоящей заявке.
[0146] В отдельных вариантах осуществления ингибиторы HDAC, подходящие для способов, предложенных в настоящей заявке, включают энтиностат, вориностат, ромидепсин, хидамид, панобиностат, белиностат, вальпроевую кислоту, моцетиностат, абексиностат, прациностат, ресминостат, гивиностат, квизиностат, кеветрин, CUDC-101, 4SC-202, ACY-241, AR-42, тефиностат, CHR-3996, риколиностат (ACY-1215) и/или CD200745. Некоторые одобренные FDA ингибиторы HDAC для лечения рака, а также ингибиторы HDAC, которые в настоящее время проходят или прошли клинические исследования, перечислены ниже.
[0147] Ингибиторы HDAC, одобренные Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA). Вориностат был лицензирован FDA США в октябре 2006 года для лечения кожной Т-клеточной лимфомы (CTCL). Ромидепсин (торговое наименование Истодакс) был лицензирован FDA США в ноябре 2009 года для лечения кожной Т-клеточной лимфомы (CTCL). Хидамид был одобрен Китаем в 2015 году для лечения периферической Т-клеточной лимфомы (PTCL). Панобиностат (торговое наименование Фаридак) был лицензирован FDA США в феврале 2015 года для лечения множественной миеломы. Белиностат (PXD101) был лицензирован FDA для лечения периферической Т-клеточной лимфомы в 2014 году.
[0148] В одном неограничивающем аспекте ингибитор HDAC представляет собой энтиностат (ENT). Энтиностат имеет химическое название по IUPAC пиридин-3-илметил-N-[[4-[(2-аминофенил)карбамоил]фенил]метил]карбамат. ENT, также известный как SNDX-275 и MS-275, является ингибитором HDAC I класса (Syndax Pharmaceuticals). ENT является бензамидным ингибитором гистондеацетилазы, ингибирующим HDAC1 и HDAC3 с IC50 0,51 мкМ и 1,7 мкМ. В настоящее время ENT проходит клинические исследования для лечения различных видов рака. Ингибиторы ДНК-метилтрансферазы
[0149] В контексте настоящей заявки термины «ингибитор(ы) ДНК-метилтрансферазы», «ингибитор(ы) DNMT» и «DNMTi» используются взаимозаменяемо и могут относиться к одному DNMTi или нескольким DNMTi.
[0150] ДНК-метилтрансферазы катализируют добавление метальных групп к 5'-углероду остатков цитозина. В раковых клетках сайленсинг генов-супрессоров опухолей происходит посредством метилирования, опосредованного DNMT. Gravina et al., Molecular Cancer 9:305-320 (2010). Существует несколько изоформ DNMT, включая DNMTI, DNMT-3a и DNMT-3b. См. тот же источник. Были идентифицированы различные DNMTi, и два из них были одобрены для лечения рака в Соединенных Штатах. Классы молекул включают нуклеозидные аналоги, антисмысловые олигонуклеотиды, низкомолекулярные ингибиторы ферментов и агенты, блокирующие взаимодействие DNMT с ДНК.
[0151] Неограничивающие примеры DNMTi для применения для ингибирования ДНК-метилтрансфераз, индукции терминальной дифференцировки, остановки роста клеток и/или апоптоза в злокачественных клетках, и/или индукции дифференцировки, остановки роста клеток и/или апоптоза опухолевых клеток в опухоли, перечислены в таблице 3. При этом подразумевается, что ингибиторы DNMTi включают любые соли, кристаллические структуры, аморфные структуры, гидраты, производные, метаболиты, стереоизомеры, структурные изомеры и пролекарства ингибиторов DNMTi, описанных в настоящей заявке.
[0152] В отдельных вариантах осуществления ингибиторы DNMT, подходящие для способов, предложенных в настоящей заявке, включают азацитидин, децитабин, зебуларин, SGI-110, галлат эпигаллокатехина, MG98, RG108, прокаинамид и/или гидралазин. Некоторые одобренные FDA ингибиторы DNMT для лечения рака, а также ингибиторы DNMT, которые в настоящее время проходят или прошли клинические исследования, перечислены ниже.

[0153] DNMTi, одобренные Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) и находящиеся на стадии клинических исследований. Азацитидин, продаваемый под названием VIDAZA был одобрен FDA для лечения миелодиспластического синдрома (МДС) 19 мая 2004 года и находится на стадии клинических исследований для лечения распространенных солидных опухолей. Было показано, что азацитидин усиливает активность ингибиторов иммунных контрольных точек (ICP) на доклинических моделях меланомы и рака ободочной кишки путем активации пути интерферона (IFN) и обращения подавления вирусных антигенов, что делает опухоль более иммуногенной и чувствительной к эффективной терапии ICP. (Li et al., Oncotarget 5:587 (2014) and Roulois et al., Cell 162:961 (2015)). Кроме того, было показано, что азацитидин повышает экспрессию раково-тестикулярных антигенов (СТА) в опухолях, что приводит к повышению активности Т-клеток против СТА у пациентов с МДС, острым миелоидным лейкозом (ОМЛ) и хроническим миеломоноцитарным лейкозом (ХММЛ) (Gang, AO. et al. Blood Cancer J. doi: 10.1038/bcj.2014.14.(2014)). Juergens, RA. et al., (Cancer Discov. 1:598-607 (2011)) использовали азацитидин и энтиностат при рефрактерном распространенном НМРЛ. Шесть пациентов из этого исследования были включены в дополнительное исследование (Wrangle, J., et al., Oncotarget 4:2067-2079 (2013)) с ингибиторами иммунных контрольных точек, где пять пациентов продемонстрировали ответы. См. также: blogs.biomedcentral.com/on-biology/2015/03/26/improving-lung-cancer-immunotherapy-using-epigenetic-approaches/ (посещено 16 марта 2017 г.).

[0154] Децитабин, продаваемый под названием DACOGEN, одобрен для лечения МДС, а также одобрен в Европе для лечения ОМЛ и проходит клинические исследования для лечения ОМЛ. SGI-110 находится в фазе II клинических исследований для лечения ОМЛ. MG98 завершил I фазу клинических исследований для лечения распространенных солидных опухолей. ECGC завершил II фазу клинических исследований для лечения рака предстательной железы.
[0155] В одном неограничивающем аспекте DNMTi представляет собой азацитидин. Азацитидин является химическим аналогом нуклеозида цитозина. Азацитидин способен, среди прочего, встраиваться в ДНК, вызывая гипометилирование ДНК посредством ковалентного связывания с DNMT, предотвращая синтез ДНК и приводя к цитотоксичности и деградации захваченного DNMT. Stresemann, С, and Lyko, F., Int. J. Cancer 123:8-13 (2008).
Способы лечения с использованием терапевтических связывающих молекул к SEMA4D и эпигенетического модулирующего агента, например, HDACi и/или DNMTi
[0156] В настоящем изобретении предложен способ ингибирования, задержки или снижения роста злокачественных клеток у субъекта, страдающего от рака, путем введения субъекту комбинированной терапии, содержащей эффективное количество выделенной связывающей молекулы, специфически связывающейся с SEMA4D, например, антитела к SEMA4D или его антигенсвязывающего фрагмента, варианта или производного, в комбинации с эффективным количеством эпигенетического модулирующего агента, например, HDACi, DNMTi и/или их комбинации. Примеры антител к SEMA4D и эпигенетических модулирующих агентов подробно описаны в других частях настоящей заявки. В отдельных аспектах введение комбинированной терапии, предложенной в настоящей заявке, может частично или полностью ингибировать рост опухоли или злокачественных клеток, может задержать прогрессирование опухоли и рост злокачественных клеток у субъекта, может предотвратить распространение метастазов у субъекта, может уменьшить размер опухоли субъекта, например, чтобы обеспечить более успешное хирургическое удаление, может уменьшить сосудистую сеть опухоли у субъекта или может привести к любой комбинации положительных терапевтических ответов у субъекта. Примеры терапевтических ответов, которые могут быть достигнуты, описаны в настоящей заявке.
[0157] В отдельных аспектах введение комбинированной терапии может привести к повышению терапевтической эффективности по сравнению с введением антитела к SEMA4D или его фрагмента или эпигенетического модулирующего агента по отдельности. В отдельных аспектах улучшенная эффективность лечения является синергетической и превышает аддитивную эффективность каждого отдельного агента. В отдельных аспектах улучшенная эффективность лечения по сравнению с любым агентом, вводимым по отдельности, измеренная, например, по увеличенной задержке роста опухоли (TGD), увеличенной частоте регрессии опухоли, например, полной регрессии опухоли, или увеличенной выживаемости, составляет по меньшей мере 5%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 5%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 100%, по меньшей мере 150%, по меньшей мере 200%, по меньшей мере 250%, по меньшей мере 300%, по меньшей мере 350%, по меньшей мере 400%, по меньшей мере 450%, по меньшей мере 500%, по меньшей мере 550%, по меньшей мере 600%, по меньшей мере 650%, по меньшей мере 700%, по меньшей мере 750%, по меньшей мере 800%, по меньшей мере 850%, по меньшей мере 900%, по меньшей мере 950% или по меньшей мере 1000%. В отдельных аспектах улучшенная эффективность лечения по сравнению с аддитивной эффективностью обоих агентов, вводимых по отдельности, измеренная, например, по увеличенной задержке роста опухоли (TGD), увеличенной частоте регрессии опухоли, например, полной регрессии опухоли, или увеличенной выживаемости, составляет по меньшей мере 5%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 5%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 100%, по меньшей мере 150%, по меньшей мере 200%, по меньшей мере 250%, по меньшей мере 300%, по меньшей мере 350%, по меньшей мере 400%, по меньшей мере 450%, по меньшей мере 500%, по меньшей мере 550%, по меньшей мере 600%, по меньшей мере 650%, по меньшей мере 700%, по меньшей мере 750%, по меньшей мере 800%, по меньшей мере 850%, по меньшей мере 900%, по меньшей мере 950% или по меньшей мере 1000%.
[0158] В отдельных аспектах антитело к SEMA4D или его фрагмент может представлять собой VX15/2503, mAb 67 или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное. Например, антитело или его фрагмент может включать вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую CDR 1-3 VH, содержащие SEQ ID NO: 2, 3 и 4, соответственно, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую CDR 1-3 VL, содержащие SEQ ID NO: 6, 7 и 8, соответственно, или VH и VL содержат, соответственно, SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10.
[0159] В отдельных аспектах способ, предложенный в настоящей заявке, включает введение антитела к SEMA4D или его антигенсвязывающего фрагмента, варианта или производного, и HDACi, ингибирующего HDAC, который может представлять собой HDAC I класса, IIA класса, IIB класса, IV класса, и/или любую их комбинацию, например, HDAC содержит цинк-содержащий каталитический домен. В отдельных аспектах HDACi может включать фрагмент, связывающийся с цинк-содержащим каталитическим доменом HDAC. Например, в отдельных аспектах HDACi может включать один или более, или комбинацию химических фрагментов, таких как, не ограничиваясь перечисленным, гидроксамовая кислота или ее соль, циклический тетрапептид, депсипептид, бензамид, электрофильный кетон и/или алифатическую кислоту или ее соль. Неограничивающие примеры HDACi, которые могут быть использованы в способе лечения, предложенном в настоящей заявке, включают вориностат, ромидепсин, хидамид, панобиностат, белиностат, вальпроевую кислоту или ее соль, моцетиностат, абексиностат, энтиностат, прациностат, резминостат, гивиностат, квизиностат, кеветрин, CUDC-101, AR-42, тефиностат (CHR-2845),CHR-3996, 4SC-202, CG200745, ACY-1215, ACY-241 и/или любую их комбинацию. В отдельных аспектах HDACi может представлять собой энтиностат (пиридин-3-илметил-N-[4-[(2-аминофенил)карбамоил]фенил]метил]карбамат).
[0160] В отдельных аспектах способ, предложенный в настоящей заявке, включает введение антитела к SEMA4D или его антигенсвязывающего фрагмента, варианта или производного, и DNMTi, ингибирующего DNMT1, DNMT-3a, DNMT-3b и/или любую их комбинацию. Например, в отдельных аспектах DNMTi может включать один или более, или комбинацию химических фрагментов, таких как, не ограничиваясь перечисленным, азацитидин, децитабин, зебуларин, SGI-110, галлат эпигаллокатехина, MG98, RG108, прокаинамид, гидралазин и/или любую их комбинацию. В отдельных аспектах DNMTi может представлять собой азацитидин.
[0161] Согласно способу, предложенному в настоящей заявке, связывающая молекула к SEMA4D, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или его производное, и эпигенетический модулирующий агент, например, HDACi, DNMTi или любая их комбинация, могут быть введены по отдельности или одновременно. Любой из агентов может быть введен раньше, чем другой, или агенты могут быть введены одновременно, например, в одном препарате. Кроме того, способы дозирования, препараты агентов и/или режимы дозирования могут быть одинаковыми или разными.
[0162] Согласно способу, предложенному в настоящей заявке, связывающую молекулу к SEMA4D, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или его производное, специфически связывающееся с SEMA4D, и эпигенетический модулирующий агент, например, HDACi, DNMTi и/или любую их комбинацию, вводят субъекту, страдающему от рака. Рак субъекта может быть впервые диагностирован, или, в отдельных аспектах, введение может следовать за более традиционными методами лечения рака. В отдельных аспектах введение комбинированной терапии, предложенной в настоящей заявке, может применяться в качестве профилактической меры у субъекта, в высокой степени предрасположенного к развитию определенного вида рака, или для предотвращения рецидива рака, который ранее подвергался лечению. Рак субъекта может представлять собой, например, солидную опухоль, гематологическое злокачественное новообразование, любые их метастазы или любую их комбинацию.
[0163] В отдельных аспектах рак субъекта представляет собой солидную опухоль или ее метастазы. Солидная опухоль может представлять собой, например, саркому, карциному, меланому, любые их метастазы или любую их комбинацию. Примеры солидных опухолей, подлежащих лечению в соответствии со способом, предложенным в настоящей заявке, включают, не ограничиваясь перечисленным, плоскоклеточную карциному, аденокарциному, базальноклеточную карциному, почечно-клеточную карциному, протоковую карциному молочной железы, саркому мягких тканей, остеосаркому, меланому, мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, аденокарциному легкого, рак брюшины, гепатоклеточную карциному, рак желудочно-кишечного тракта, рак желудка, рак поджелудочной железы, нейроэндокринный рак, глиобластому, рак шейки матки, рак яичника, рак печени, рак мочевого пузыря, рак головного мозга, гепатому, рак молочной железы, рак ободочной кишки, колоректальный рак, карциному эндометрия или матки, рак пищевода, карциному слюнной железы, рак почки, рак печени, рак предстательной железы, рак вульвы, рак щитовидной железы, рак головы и шеи, любые их метастазы или любую их комбинацию.
[0164] В отдельных аспектах рак представляет собой гематологическое злокачественное образование или его метастазы. Примеры гематологических злокачественных новообразований, подлежащих лечению в соответствии со способом, предложенным в настоящей заявке, включают, не ограничиваясь перечисленным, лейкоз, лимфому, миелому, острый миелоидный лейкоз, хронический миелоидный лейкоз, острый лимфоцитарный лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз, волосатоклеточный лейкоз, лимфому Ходжкина, неходжкинскую лимфому, множественную миелому, любые их метастазы или любую их комбинацию.
[0165] В отдельных аспектах способ лечения рака, предложенный в настоящей заявке, может дополнительно включать введение дополнительной противораковой терапии. Дополнительная противораковая терапия может проводиться одновременно с введением комбинированной терапии, предложенной в настоящей заявке, до проведения комбинированной терапии, предложенной в настоящей заявке, или после проведения комбинированной терапии, предложенной в настоящей заявке. В отдельных аспектах дополнительная терапия может включать, не ограничиваясь перечисленным, хирургическое вмешательство, химиотерапию, лучевую терапию, введение противораковой вакцины, введение иммуностимулирующего агента, адоптивную Т-клеточную терапию или терапию антителами, введение ингибитора, блокирующего иммунные контрольные точки, введение модулятора регуляторных Т-клеток (Treg) или комбинацию этих видов терапии.
+
[0166] Введение эпигенетического модулирующего агента, например, HDACi, DNMTi и/или любой их комбинации, в комбинации со связывающей молекулой к SEMA4D, например, антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, вариантом или производным, может быть эффективным для лечения различных злокачественных и незлокачественных опухолей. Под «противоопухолевой активностью» подразумевается снижение скорости пролиферации или накопления злокачественных клеток и, следовательно, снижение скорости роста существующей опухоли или опухоли, возникшей в ходе терапии, и/или разрушение существующих неопластических (опухолевых) клеток или новообразованных неопластических клеток, и, следовательно, уменьшение общего размера опухоли в ходе терапии. «Противоопухолевая активность» может также включать стимуляцию иммунной инфильтрации опухоли, сдвиг в сторону функциональных, опухолеспецифических, секретирующих IFNγ CD8цитотоксических Т-клеток, увеличение отношения эффекторных Т-клеток к регуляторным Т-клеткам, повышение Т-клеточной активности, инфильтрацию и активацию антигенпрезентирующих клеток, которые перекрестно презентируют опухолевые антигены и локально активируют опухолеспецифические Т-клетки, сниженный опухолеассоциированный ангиогенез, ингибирование прогрессирования опухоли и увеличенную выживаемость. Например, терапия эпигенетическим модулирующим агентом, например, HDACi, DNMTi и/или их комбинацией, и антителом к SEMA4D может вызывать физиологический ответ, например, ингибирование, задержку или снижение роста опухоли или злокачественных клеток и метастазов, что полезно при лечении рака, связанного с клетками, экспрессирующими SEMA4D, у человека.
[0167] В отдельных аспектах комбинированная терапия эпигенетическим модулирующим агентом, например, HDACi, DNMTi и/или их комбинацией, и связывающей молекулой к SEMA4D, например, антителом или его фрагментом, может применяться в качестве лекарственного средства, в частности, для применения при лечении или профилактике рака или для применения при предраковом состоянии или поражении. В отдельных аспектах комбинированная терапия эпигенетическим модулирующим агентом, например, HDACi, DNMTi и/или их комбинацией, и связывающей молекулой к SEMA4D, например, антителом или его фрагментом, может применяться для лечения рака со сверхэкспрессией SEMA4D или рака, связанного с клетками, экспрессирующими SEMA4D.
[0168] В соответствии со способами лечения, предложенными в настоящей заявке, введение эпигенетического модулирующего агента, например, HDACi, DNMTi и/или их комбинации, и связывающей молекулы к SEMA4D, например, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, варианта или производного, как определено в других местах настоящей заявки, может применяться для стимулирования положительного терапевтического ответа у субъекта, страдающего от рака или предрасположенного к развитию рака. Подразумевается, что «положительный терапевтический ответ» в отношении рака включает улучшение заболевания в связи с «противоопухолевой» активностью, подразумевает снижение скорости пролиферации или накопления злокачественных клеток и, следовательно, снижение скорости роста существующей опухоли или опухоли, возникшей в ходе терапии, и/или разрушение существующих неопластических (опухолевых) клеток или новообразованных неопластических клеток, и, следовательно, уменьшение общего размера опухоли в ходе терапии. Такие положительные терапевтические ответы не ограничены способом введения. Способы, предложенные в настоящей заявке, могут применяться для ингибирования, задержки или снижения роста опухоли, роста злокачественных клеток и метастазов у субъекта, страдающего от рака. Таким образом, в качестве неограничивающего примера, улучшение заболевания можно охарактеризовать как снижение роста опухоли или отсутствие опухолей. Как описано в других частях настоящей заявки, терапевтический ответ, достигаемый при введении предложенной комбинированной терапии, может превышать соответствующий терапевтический ответ, достигаемый при введении эпигенетического модулирующего агента или связывающей молекулы к SEMA4D по отдельности. В отдельных аспектах достигаемый терапевтический ответ превышает аддитивный ответ, ожидаемый при введении двух агентов. Другими словами, достигаемый терапевтический ответ является синергетическим. В отдельных аспектах синергетический ответ может привести к более эффективному лечению, более быстрому лечению или может позволить проводить лечение с меньшими дозами агентов в комбинированной терапии.
Фармацевтические композиции и способы введения
[0169] В данном изобретении предложена композиция, например, фармацевтическая композиция, включающая эффективное количество связывающей молекулы к SEMA4D, например, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, варианта или производного, и эффективное количество эпигенетического модулирующего агента, например, HDACi, DNMTi и/или их комбинации. Композиция может дополнительно содержать один или более фармацевтически приемлемых носителей или вспомогательных веществ, и/или один или более дополнительных терапевтических агентов, примеры которых раскрыты в других частях настоящей заявки. Подходящие связывающие молекулы к SEMA4D и эпигенетические модулирующие агенты для применения в такой фармацевтической композиции предложены в настоящей заявке.
[0170] В отдельных аспектах фармацевтическая композиция включает эффективное количество антитела к SEMA4D или его антигенсвязывающего фрагмента, включающего VH и VL, где VH и VL содержат аминокислотные последовательности CDR, содержащиеся в MAb VX15/2503 и в MAb 67, а именно, HCDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID N0: 2, HCDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, HCDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, LCDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, LCDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, и LCDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8. В отдельных аспектах фармацевтическая композиция включает эффективное количество антитела к SEMA4D или его антигенсвязывающего фрагмента, включающего аминокислотные последовательности VH и VL MAb VX15/2503, а именно VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5.
[0171] В отдельных аспектах фармацевтическая композиция включает эффективное количество HDACi энтиностата. В отдельном аспекте фармацевтическая композиция включает эффективное количество DNMTi азацитидина.
[0172] Иллюстративная фармацевтическая композиция, предложенная в настоящей заявке, включает эффективное количество MAb VX15/2503 и эффективное количество энтиностата. Еще одна иллюстративная фармацевтическая композиция, предложенная в настоящей заявке, включает эффективное количество MAb VX15/2503 и эффективное количество азацитидина. В отдельных аспектах «эффективное количество» конкретного агента, включенного в предложенную фармацевтическую композицию, может отличаться от, например, быть меньше, чем количество агента, которое было бы эффективным в качестве монотерапии. В отдельных аспектах терапевтическая эффективность фармацевтической композиции, предложенной в настоящем документе, превышает аддитивное действие включенных в нее агентов при введении по отдельности.
[0173] Способ введения эпигенетического модулирующего агента в комбинации со связывающей молекулой к SEMA4D, например, антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, вариантом или производным, может быть, например, пероральным, парентеральным, ингаляционным или местным. Термин «парентеральный» в контексте настоящей заявки включает, например, внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное, внутримышечное, подкожное, ректальное или вагинальное введение. Режимы введения двух агентов могут быть одинаковыми или разными. При том, что все указанные формы введения явным образом включены в объем способов, предложенных в настоящей заявке, неограниченным примером формы для введения является раствор для инъекций, в частности, для внутривенной или внутриартериальной инъекции или капельного вливания. Подходящая фармацевтическая композиция для инъекций может содержать буфер (например, ацетатный, фосфатный или цитратный буфер), поверхностно-активное вещество (например, полисорбат), необязательно стабилизирующий агент (например, человеческий альбумин) и т.д. Однако в других способах, совместимых с содержанием настоящей заявки, эпигенетический модулирующий агент и/или связывающая молекула к SEMA4D, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное, могут быть доставлены непосредственно в место нежелательной клеточной популяции, тем самым увеличивая воздействие терапевтического агента на пораженную ткань.
[0174] Способы получения и введения комбинированной терапии, предложенной в настоящей заявке, включающей эпигенетический модулирующий агент, например, HDACi, DNMTi и/или их комбинацию, в комбинации со связывающей молекулой к SEMA4D, например, антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, вариантом или производным, нуждающемуся в этом субъекту, хорошо известны или легко могу быть определены специалистами в данной области техники.
[0175] Как обсуждается в настоящей заявке, эпигенетический модулирующий агент, например, HDACi, DNMTi и/или их комбинация, в комбинации со связывающей молекулой к SEMA4D, например, антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, вариантом или производным, могут быть введены в фармацевтически эффективном количестве для лечения рака in vivo. В этой связи следует понимать, что раскрытые эпигенетический модулирующий агент и связывающая молекула могут быть введены в состав препарата таким образом, чтобы облегчить введение и способствовать стабильности активного агента. В отдельных вариантах осуществления фармацевтические композиции в соответствии со способами, предложенными в настоящей заявке, включают фармацевтически приемлемый, нетоксичный, стерильный носитель, такой как физиологический раствор, нетоксичные буферы, консерванты и тому подобное. Для целей настоящего применения фармацевтически эффективное количество эпигенетического модулирующего агента и связывающей молекулы представляет собой количество, достаточное для воздействия на активность по меньшей мере одной эпигенетической модификации в раковой клетке, например, для снижения активности гистондеацетилазы или активности ДНК-метилтрансферазы, и для достижения эффективного связывания с мишенью и достижения пользы, например, антипролиферативного действия, ингибирования, задержки или снижения роста и метастазов опухоли и злокачественных клеток, предотвращения дальнейшего разрастания опухоли, уменьшения размера опухоли, уменьшения сосудистой сети опухоли и уменьшения количества раковых клеток, у субъекта, страдающего от рака, и/или для того, чтобы можно было наблюдать уменьшение одного или более симптомов, связанных с заболеванием.
[0176] Фармацевтические композиции, используемые в способах, предложенных в настоящей заявке, могут включать фармацевтически приемлемые носители, такие как, например, ионообменные вещества, оксид алюминия, стеарат алюминия, лецитин, сывороточные белки, такие как человеческий сывороточный альбумин, буферные вещества, такие как фосфаты, глицин, сорбиновую кислоту, сорбат калия, смеси частичных глицеридов насыщенных растительных жирных кислот, воду, соли или электролиты, такие как протаминсульфат, гидрофосфат натрия, гидрофосфат калия, хлорид натрия, соли цинка, коллоидный диоксид кремния, трисиликат магния, поливинилпирролидон, вещества на основе целлюлозы, полиэтиленгликоль, натрий карбоксиметилцеллюлозу, полиакрилаты, воски, блок-сополимеры полиэтилена и полиоксипропилена, полиэтиленгликоль и шерстяной жир.
[0177] Препараты для парентерального введения могут включать стерильные водные или неводные растворы, суспензии и эмульсии. Неограничивающими примерами неводных растворителей являются пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло, и инъецируемые органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Водные носители включают, например, воду, спиртовые/водные растворы, эмульсии или суспензии, в том числе физиологический раствор и забуференные среды. Фармацевтически приемлемые носители включают, не ограничиваясь перечисленным, 0,01-0,1 М, например, 0,05 М фосфатный буфер или 0,8% физиологический раствор. Другие общепринятые носители для парентерального введения включают растворы фосфата натрия, раствор Рингера с декстрозой, декстрозу и хлорид натрия, раствор Рингера с лактатом или нелетучие масла. Носители для внутривенного введения включают восполнители жидкостей и питательных веществ, восполнители электролитов, например, на основе раствора Рингера с декстрозой, и тому подобное. Могут также присутствовать консерванты и другие добавки, такие как, например, противомикробные средства, антиоксиданты, комплексообразующие агенты и инертные газы, и тому подобное.
th
[0178] Неограничивающие примеры фармацевтических композиций, подходящих для инъецирования, включают стерильные водные растворы (при наличии водорастворимости) или дисперсии, и стерильные порошки для экстемпорального приготовления стерильных инъецируемых растворов или дисперсий. В таких случаях композиция должна быть стерильной и текучей в такой степени, чтобы ее легко можно было ввести с помощью шприца. Композиции обычно составляют так, чтобы они были стабильными в условиях производства и хранения и могли быть защищены от загрязняющего действия микроорганизмов, например, бактерий и грибов. Носитель может представлять собой растворитель или дисперсионную среду, содержащую, например, воду, этанол, многоатомный спирт (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль, и тому подобное) и их подходящие смеси. Надлежащая текучесть может поддерживаться, например, с помощью покрытия, такое как лецитин, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии, а также применения поверхностно-активных веществ. Подходящие препараты для применения в терапевтических способах, раскрытых в настоящей заявке, описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co.) 16 ed. (1980).
[0179] Предотвращение действия микроорганизмов может быть достигнуто путем применения различных антибактериальных и антимикотических агентов, например, парабенов, хлорбутанола, фенола, аскорбиновой кислоты, тимеросала и тому подобного. В композицию могут быть включены изотонические агенты, например, сахара, многоатомные спирты, такие как маннит, сорбит, или хлорид натрия. Пролонгированная абсорбция инъекционных композиций может быть обеспечена путем включения в композицию агента, замедляющего абсорбцию, например, моностеарата алюминия и желатина.
[0180] Стерильные инъекционные растворы могут быть приготовлены путем включения активных ингредиентов (например, эпигенетического модулирующего агента, например, HDACi, DNMTi и/или их комбинации, в комбинации с антителом к SEMA4D или его антигенсвязывающим фрагментом, вариантом или производным, по отдельности или в комбинации с другими активными агентами) в необходимом количестве в подходящий растворитель с одним или комбинацией ингредиентов, перечисленных в настоящей заявке, по мере необходимости, с последующей стерилизацией фильтрацией. Обычно дисперсии получают путем включения активного соединения в стерильный носитель, содержащий основную дисперсионную среду и другие требуемые ингредиенты из перечисленных выше. В случае стерильных порошков для получения стерильных инъекционных растворов два неограничивающих примера способов получения представляют собой вакуумную сушку и лиофилизацию, которые обеспечивают получение порошка активного ингредиента с любым дополнительным требуемым ингредиентом из его раствора, предварительно стерилизованного фильтрацией. Препараты для инъекций обрабатывают, разливают в контейнеры, такие как ампулы, пакеты, бутылки, шприцы или флаконы, и герметизируют в асептических условиях в соответствии со способами, известными в данной области техники. Кроме того, препараты могут быть упакованы и продаваться в форме набора. Такие готовые изделия предпочтительно могут иметь этикетки или инструкции по применению, указывающие, что входящие в состав композиции подходят для лечения субъекта, страдающего от рака или предрасположенного к его развитию.
[0181] Парентеральные препараты могут представлять собой однократную болюсную дозу, инфузию или нагрузочную болюсную дозу с последующей поддерживающей дозой. Эти композиции могут быть введены через определенные фиксированные или переменные интервалы, например, раз в сутки, или по мере необходимости.
[0182] Некоторые применяемые фармацевтические композиции могут быть введены перорально в приемлемой дозированной форме, включая, например, капсулы, таблетки, водные суспензии или растворы. Некоторые фармацевтические композиции также могут быть введены в виде интраназального аэрозоля или ингалируемого препарата. Такие композиции могут быть приготовлены в виде растворов в физиологическим растворе с использованием бензилового спирта или других подходящих консервантов, ускорителей всасывания для увеличения биодоступности и/или других традиционных солюбилизирующих или диспергирующих агентов.
[0183] Количество эпигенетического модулирующего агента, например, HDACi, DNMTi и/или их комбинации, и связывающей молекулы к SEMA4D, например, антитела или его фрагмента, варианта или производного, для объединения с материалами носителя для приготовления дозированной формы для однократного введения будет варьироваться в зависимости от подлежащего лечению субъекта и конкретного способа введения. Композиция может быть введена в виде однократной дозы, многократных доз или в течение установленного периода времени в виде инфузии. Режимы дозирования также можно регулировать для получения оптимального желаемого ответа (например, терапевтического или профилактического ответа).
[0184] В соответствии с объемом настоящего изобретения эпигенетический модулирующий агент, например, HDACi, DNMTi и/или их комбинация, в комбинации со связывающей молекулой к SEMA4D, например, антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, вариантом или производным, могут быть введены человеку или другому животному в соответствии с вышеупомянутыми способами лечения в количестве, достаточном для достижения терапевтического эффекта. Эпигенетический модулирующий агент в комбинации со связывающей молекулой к SEMA4D, например, антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, вариантом или производным, могут быть введены такому человеку или другому животному в обычной дозированной форме, полученной объединением антитела и эпигенетического модулирующего агента с обычным фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем в соответствии с известными методиками. Специалисту в данной области техники будет ясно, что форма и характер фармацевтически приемлемого носителя или разбавителя диктуется количеством активного ингредиента, с которым он должен быть объединен, способом введения и другими хорошо известными переменными. Специалистам в данной области техники будет ясно, что можно использовать коктейль, содержащий эпигенетический модулирующий агент и связывающую молекулу.
[0185] Под «эффективным количеством» подразумевается количество эпигенетического модулирующего агента, например, HDACi, DNMTi и/или их комбинации, и количество связывающей молекулы к SEMA4D, например, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, варианта или производного, которые при введении вызывают положительный терапевтический ответ в отношении лечения пациента с заболеванием, подлежащим лечению, например, антипролиферативное действие, предотвращение дальнейшего разрастания опухоли, уменьшение размера опухоли, уменьшение сосудистой сети опухоли, уменьшение количества раковых клеток, ингибирование, задержка или снижение роста опухолевых и/или злокачественных клеток, и/или метастазов у субъекта, страдающего от рака, и/или можно наблюдать уменьшение одного или более симптомов, связанных с заболеванием.
[0186] Терапевтически эффективные дозы композиций, описанных в настоящей заявке, например, для антипролиферативного действия, предотвращения дальнейшего разрастания опухоли, уменьшения размера опухоли, уменьшения сосудистой сети опухоли, уменьшения количества раковых клеток, ингибирования, задержки или снижения роста опухолевых и/или злокачественных клеток, и/или метастазов у субъекта, страдающего от рака, и/или уменьшения одного или более симптомов, связанных с заболеванием, может варьироваться в зависимости от множества различных факторов, включая способы введения, целевое место, физиологическое состояние пациента, является ли пациент человеком или другим животным, вводятся ли другие лекарственные средства, и является ли лечение профилактическим или терапевтическим. В отдельных вариантах осуществления пациент представляет собой человека, но животные, отличные от человека, включая трансгенных животных, также могут подвергаться лечению. Дозировки для лечения могут быть подобраны с применением рутинных способов, известных специалистам в данной области техники, для оптимизации безопасности и эффективности.
[0187] Количество эпигенетического модулирующего агента, например, HDACi, DNMTi и/или их комбинации, в комбинации со связывающей молекулой к SEMA4D, подлежащее введению, легко может быть определено специалистом в данной области техники без излишних экспериментов с учетом раскрытия, приведенного в настоящей заявке. Факторы, влияющие на режим введения и соответствующее количество эпигенетического модулирующего агента и связывающей молекулы, включают, не ограничиваясь перечисленным, тяжесть заболевания, анамнез, а также возраст, рост, массу тела, состояние здоровья и физическое состояние индивидуума, проходящего терапию. Аналогичным образом, количество эпигенетического модулирующего агента и связывающей молекулы, подлежащее введению, будет зависеть от режима введения и от того, подвергнется ли субъект введению однократной или многократных доз этого агента.
[0188] Также предложено применение эпигенетического модулирующего агента, например, HDACi, DNMTi и/или их комбинации, в комбинации со связывающей молекулой к SEMA4D, например, антителом или его фрагментом, вариантом или производным, при изготовлении лекарственного средства для лечения субъекта, страдающего от рака, и в некоторых аспектах дополнительно включающее предварительное лечение с помощью по меньшей мере одной другой терапии. Под «получившим предварительное лечение» или «предварительным лечением» подразумевается, что субъект получил одну или более других терапий (например, получал по меньшей мере одну другую противораковую терапию) до приема лекарственного средства, содержащего эпигенетический модулирующий агент в комбинации со связывающей молекулой к SEMA4D, например, антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, вариантом или производным. «Получивший предварительное лечение» или «предварительное лечение» включает субъектов, получавших по меньшей мере одну другую терапию в течение 2 лет, в течение 18 месяцев, в течение 1 года, в течение 6 месяцев, в течение 2 месяцев, в течение 6 недель, в течение 1 месяца, в течение 4 недель, в течение 3 недель, в течение 2 недель, в течение 1 недели, в течение 6 дней, в течение 5 дней, в течение 4 дней, в течение 3 дней, в течение 2 дней или даже в течение 1 дня до начала лечения лекарственным средством, содержащим эпигенетический модулирующий агент, например, HDACi, например, энтиностат, и/или DNMTi, например, азацитидин, и связывающую молекулу к SEMA4D, например, моноклональное антитело VX15/2503, раскрытое в настоящей заявке, или его антигенсвязывающий фрагмент, вариант или производное. Не обязательно, чтобы субъект отвечал на предварительное лечение предшествующей терапией или терапиями. Таким образом, субъект, получающий лекарственное средство, содержащее эпигенетический модулирующий агент в комбинации со связывающей молекулой к SEMA4D, например, антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, вариантом или производным, мог ответить или мог не ответить на предварительное лечение предшествующей терапией, или на одну или более предшествующих терапий, если предшествующее лечение включало несколько терапий.
[0189] Способы, предложенные в настоящей заявке, также предусматривают применение эпигенетического модулирующего агента, например, HDACi, DNMTi и/или их комбинации, в комбинации со связывающей молекулой к SEMA4D, например, антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, вариантом или производным, при производстве лекарственного средства для лечения субъекта, страдающего от рака, где лекарственное средство применяют у субъекта, также получающего лечение по меньшей мере одной другой терапией. Доступные виды терапии, раскрытые в настоящей заявке, включают, не ограничиваясь перечисленным, хирургическое вмешательство, лучевую терапию, противораковую вакцину, введение иммуностимулирующего агента, адоптивную Т-клеточную терапию или терапию антителами, введение ингибитора, блокирующего иммунные контрольные точки, введение модулятора регуляторных Т-клеток (Treg) или их комбинацию.
nd
[0190] В настоящем изобретении используются, если не указано иное, общепринятые методы клеточной биологии, клеточного культивирования, молекулярной биологии, трансгенной биологии, микробиологии, рекомбинантных ДНК и иммунологии, которые известны специалистам в данной области техники. Такие методы всецело описаны в литературе. См., например, Sambrook et al., ed. (1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual (2 ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press); Sambrook et al., ed. (1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Springs Harbor Laboratory, NY); D. N. Glover ed., (1985) DNA Cloning, Volumes I and II; Gait, ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; Mullis et al. патент США №4683195; Hames and Higgins, eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Hames and Higgins, eds. (1984) Transcription And Translation; Freshney (1987) Culture Of Animal Cells (Alan R. Liss, Inc.); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press) (1986); Perbal (1984) A Practical Guide To Molecular Cloning; the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, (Cold Spring Harbor Laboratory); Wu et al., eds., Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155; Mayer and Walker, eds. (1987) Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Academic Press, London); Weir and Blackwell, eds., (1986) Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986); и Ausubel et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Baltimore, Md.).
nd
nd
th
[0191] Общие принципы конструирования антител изложены в Borrebaeck, ed. (1995) Antibody Engineering (2 ed.; Oxford Univ. Press). Общие принципы конструирования белков изложены в Rickwood et al., eds. (1995) Protein Engineering, A Practical Approach (IRL Press at Oxford Univ. Press, Oxford, Eng.). Общие принципы антител и связывания антитело-гаптен изложены в: Nisonoff (1984) Molecular Immunology (2 ed.; Sinauer Associates, Sunderland, Mass.); и Steward (1984) Antibodies, Their Structure and Function (Chapman and Hall, New York, N.Y.). Кроме того, можно следовать стандартным методам иммунологии, известным в данной области техники и конкретно не описанным, как изложено в Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York; Stites et al., eds. (1994) Basic and Clinical Immunology (8 ed; Appleton & Lange, Norwalk, Conn.) и Mishell and Shiigi (eds) (1980) Selected Methods in Cellular Immunology (W.H. Freeman and Co., NY).
[0192] Стандартные справочные работы, в которых изложены общие принципы иммунологии, включают Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York; Klein J., Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination (John Wiley & Sons, NY (1982)); Kennett et al., eds. (1980) Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension in Biological Analyses (Plenum Press, NY); Campbell (1984) «Monoclonal Antibody Technology)) in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, ed. Burden et al., (Elsevier, Amsterdam); Goldsby et al., eds. (2000) Kuby Immunology (4th ed.; W.H. Freeman and Co., NY); Roitt et al. (2001) Immunology (6th ed.; London: Mosby); Abbas et al. (2005) Cellular and Molecular Immunology (5th ed.; Elsevier Health Sciences Division); Kontermann and Dubel (2001) Antibody Engineering (Springer Verlag); Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press); Lewin (2003) Genes VIII (Prentice Hall, 2003); Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press); Dieffenbach and Dveksler (2003) PCR Primer (Cold Spring Harbor Press).
[0193] Все цитируемые выше источники, а также все источники, цитируемые в настоящей заявке, полностью включены в нее посредством ссылки.
[0194] Следующие примеры приведены только с целью иллюстрации, а не для ограничения.
Примеры
[0195] Пример 1: Введение энтиностата (ENT) и антитела к SEMA4D увеличивает выживаемость, значительно задерживает рост опухоли и увеличивает процент полной регрессии опухоли
3
3
3
3
[0196] Было протестировано действие комбинированного введения ENT и MAb к SEMA4D на выживаемость, рост опухоли и регрессию опухоли на мышиной модели опухоли. Клетки Colon26 (500000 клеток) подкожно имплантировали мышам Balb/c. Мыши получали 1) контрольное Ig (10 мг/кг, в/б, еженедельно × 5, начиная со 2 дня) (n=20); 2) контрольное Ig (10 мг/кг, в/б, еженедельно × 5, начиная со 2 дня) + ENT (20 мг/кг, 3 р/нед × 2 недели, начинали, когда средний объем опухоли составлял ~300 мм) (n=21); 3) антитело к SEMA4D/MAb 67 (10 мг/кг, в/б, еженедельно × 5 недель, начиная со 2 дня) (n=24); или 4) антитело к SEMA4D/MAb 67 (10 мг/кг, в/б, еженедельно × 5 недель, начиная со 2 дня) и ENT (20 мг/кг, 3 р/нед × 2 недели, начинали, когда средний объем опухоли составлял ~300 мм) (n=26) (схема эксперимента приведена на ФИГ. 1). Объем опухолей в ходе лечения был одинаковым среди контрольных и экспериментальной групп. Проводили анализ выживаемости методом Каплана-Мейера для оценки функции выживаемости, измеряли изменение объема опухоли для определения скорости роста опухоли, и оценивали частоту полной регрессии опухоли, определяя процент мышей без опухоли. Процент полной регрессии (% CR) также стратифицировали в зависимости от того, превышал ли объем опухоли по меньшей мере 100 мм до регрессии. Статистическую значимость определяли с использованием логрангового критерия Кокса-Мантеля для выживаемости, двухфакторного ANOVA для объема опухоли и точного критерия Фишера для CR. В Prism результаты представлены как незначимые (ns) при Р>0,05, значимые (обозначенные «*») при 0,01<Р≤0,05, очень значимые («**») при 0,001<Р≤0,01, чрезвычайно значимые («***») при Р≤0,001, и наиболее значимые («****») при Р≤0,0001. Мышей, у которых не развивались опухоли или у которых развивалось изъязвление опухоли до достижения опухолями объема 700 мм, исключали из анализа.
3
[0197] Синергетическое действие на задержку роста опухоли наблюдалось в группе, которой вводили комбинацию ENT и антитела к SEMA4D/MAb 67 (максимальная задержка роста опухоли (TGD) 782%) по сравнению с группами, которым вводили любой из агентов по отдельности: 107% TGD с SEMA4D/MAb 67 и 214% TGD с ENT (ФИГ. 2А). Мыши, получавшие ENT и антитело к SEMA4D/MAb 67, также продемонстрировали значительное улучшение выживаемости по сравнению с мышами, получавшими ENT или антитело к SEMA4D/MAb 67 (р<0,05) (ФИГ. 2В). Кроме того, комбинированное лечение ENT и антителом к SEMA4D/MAb 67 значительно увеличило частоту полной регрессии опухоли (62%***), особенно среди опухолей, объем которых превышал 100 мм до регрессии, по сравнению с любым из агентов по отдельности (ФИГ. 2С и 2D). Эти результаты показывают, что лечение ENT и антителом к SEMA4D MAb улучшило выживаемость, снизило рост опухоли и привело к регрессии более крупных сформировавшихся опухолей.
[0198] Пример 2: Введение ENT и антитела к SEMA4D увеличивает выживаемость, снижает рост опухоли и увеличивает частоту полной регрессии
3
3
3
[0199] Клетки Colon26 (500000 клеток) подкожно имплантировали мышам Balb/c. Мыши получали 1) контрольное Ig (10 мг/кг, еженедельно × 5 недель, начиная со 2 дня (n=12)); 2) контрольное Ig (10 мг/кг, еженедельно × 5 недель, начиная со 2 дня) и ENT (20 мг/кг, 3 р/нед × 2 недели, начинали, когда средний объем опухоли составлял ~250 мм) (n=9); 3) антитело к SEMA4D/MAb 67 (10 мг/кг, в/б, еженедельно × 5 недель, начиная со 2 дня) (n=8); или 4) антитело к SEMA4D/MAb 67 (10 мг/кг, еженедельно × 5 недель, начиная со 2 дня) и ENT (20 мг/кг, 3 р/нед × 2 недели, начинали, когда средний объем опухоли составлял ~250 мм) (n=13). Объем опухолей в ходе лечения был одинаковым среди контрольных и экспериментальной групп. Средний объем опухоли, кривые выживаемости Каплана-Мейера и частота полной регрессии опухоли показаны для каждой группы. Статистическую значимость определяли с использованием двухфакторного ANOVA, логрангового критерия Кокса-Мантеля и точного критерия Фишера, соответственно. В Prism результаты представлены как незначимые (ns) при Р>0,05, значимые (обозначенные «*») при 0,01<Р≤0,05, очень значимые («**») при 0,001Р≤0,01 и чрезвычайно значимые («***») при Р≤0,001. Мышей, у которых не развивались опухоли или у которых развивалось изъязвление опухоли до достижения опухолями объема 700 мм, исключали из анализа.
[0200] Мыши, получавшие ENT и антитело к SEMA4D/MAb 67, демонстрировали максимальную TGD, составлявшую 705%, в то время как мыши, получавшие антитело к SEMA4D/MAb67, демонстрировали задержку роста опухоли, составлявшую 119% (ФИГ. 3А). Комбинированное лечение мышей с помощью ENT и антитела к SEMA4D/MAb 67 также увеличивало частоту полной регрессии опухоли (62%**) по сравнению с группами, получавшими контрольное Ig и ENT (25%*) (ФИГ. 3B-3D). Кроме того, мыши, получавшие ENT и антитело к SEMA4D/MAb 67, продемонстрировали значительное улучшение выживаемости по сравнению с мышами, получавшими контрольное Ig (Р<0,001) или контрольное Ig и ENT (р<0,01) (ФИГ. 3Е). Эти результаты демонстрируют, что комбинированное лечение с помощью ENT и антитела к SEMA4D MAb привело к увеличению выживаемости, снижению роста опухоли и устранению опухолей.
[0201] Пример 3: Введение азацтидина (AZA) и антитела к SEMA4D увеличивает выживаемость, значительно задерживает рост опухоли и увеличивает процент полной регрессии опухоли
3
3
3
[0202] Было протестировано действие комбинированного введения AZA и MAb к SEMA4D на выживаемость, рост опухоли и регрессию опухоли на мышиной модели опухоли. Клетки Colon26 (500000 клеток) подкожно имплантировали мышам Balb/c. Мыши получали: группа 1: контрольное Ig (10 мг/кг, в/б, еженедельно × 4, начиная со 2 дня (n=12)); группа 2: антитело к SEMA4D/MAb 67 (10 мг/кг, в/б, еженедельно × 4, начиная со 2 дня (N=8)); группа 3: контрольное Ig (10 мг/кг, в/б, еженедельно × 4, начиная со 2 дня + AZA (0,8 мг/кг, 3 р/нед X 4 дозы, начиная с 22-24 дня, когда средний объем опухоли составлял ~200 мм (n=10)); и группа 4: антитело к SEMA4D/MAb 67 (10 мг/кг, в/б, еженедельно × 4, начиная со 2 дня + AZA (0,8 мг/кг, 3 р/нед X 4 дозы, начиная с 22 - 24 дня, когда средний объем опухоли составлял ~200 мм (n=9)). Схема эксперимента приведена на ФИГ. 4). За мышами наблюдали в течение 60 дней или до тех пор, пока объемы опухолей не достигли приблизительно 1500 мм.
3
[0203] Объемы опухолей в ходе лечения были одинаковыми среди контрольных и экспериментальной групп. Проводили анализ выживаемости методом Каплана-Мейера для оценки функции выживаемости, измеряли изменение объема опухоли для определения скорости роста опухоли, и оценивали частоту полной регрессии опухоли, определяя процент мышей без опухоли. Статистическую значимость определяли с использованием логрангового критерия Кокса-Мантеля для выживаемости, двухфакторного ANOVA для объема опухоли и точного критерия Фишера для полной регрессии опухоли. В Prism результаты представлены как незначимые при Р>0,05, значимые (обозначенные «*») при 0,01<Р≤0,05 или очень значимые («**») при 0,001<Р≤0,01. Мышей, у которых не развивались опухоли или у которых развивалось изъязвление опухоли до достижения опухолями объема 700 мм, исключали из анализа.
[0204] Мыши, получавшие AZA и антитело к SEMA4D/MAb67, демонстрировали максимальную TGD, составлявшую 705%, в то время как мыши, получавшие антитело к SEMA4D/MAb67, демонстрировали задержку роста опухоли, составлявшую 119% (ФИГ. 5А). Мыши, получавшие AZA и антитело к SEMA4D/MAb 67, также продемонстрировали значительное улучшение выживаемости по сравнению с контрольными мышами (р<0,001) и почти значимое улучшение выживаемости по сравнению с агентом антителом к SEDMA4D/MAb67 по отдельности (р=0,0697) (ФИГ. 5 В). Кроме того, комбинированное лечение AZA и антителом к SEMA4D/MAb 67 значительно увеличивало частоту полной регрессии опухоли до 78% (р<0,01) по сравнению с контрольным Ig (17%) (ФИГ. 5С). Эти результаты показывают, что лечение AZA и антителом к SEMA4D MAb улучшило выживаемость, снизило рост опухоли и привело к регрессии более крупных сформировавшихся опухолей.
[0205] Ширина и объем настоящего изобретения не ограничивается любым из описанных выше иллюстративных вариантов осуществления, но должны быть определены только в соответствии с нижеследующей формулой изобретения и ее эквивалентами.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  Vaccinex, Inc.
EVANS, Elizabeth
SMITH, Ernest
ZAUDERER, Maurice
<120>  ЛЕЧЕНИЕ РАКА С ПОМОЩЬЮ АНТИТЕЛА К СЕМАФОРИНУ 4D
В КОМБИНАЦИИ С ЭПИГЕНЕТИЧЕСКИМ МОДУЛИРУЮЩИМ АГЕНТОМ
<130>  58008-172854
<150>  62/473,731
<151>  2017-03-20
<160>  10
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  118
<212>  ПРT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VH VX15/2503
<400>  1
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Asp Tyr
20                  25                  30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Gln Ile Asn Pro Thr Thr Gly Gly Ala Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50                  55                  60
Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Tyr Tyr Tyr Gly Arg His Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  2
<211>  10
<212>  ПРT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  HCDR1 VX15/2503
<400>  2
Gly Tyr Ser Phe Ser Asp Tyr Tyr Met His
1               5                   10
<210>  3
<211>  17
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  HCDR2 VX15/2503
<400>  3
Gln Ile Asn Pro Thr Thr Gly Gly Ala Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>  4
<211>  9
<212>  ПРT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  HCDR3 VX15/2503
<400>  4
Tyr Tyr Tyr Gly Arg His Phe Asp Val
1               5
<210>  5
<211>  111
<212>  ПРT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VL VX15/2503
<400>  5
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp
20                  25                  30
Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35                  40                  45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp
50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65                  70                  75                  80
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85                  90                  95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210>  6
<211>  15
<212>  ПРT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  LCDR1 VX15/2503
<400>  6
Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn
1               5                   10                  15
<210>  7
<211>  7
<212>  ПРT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  LCDR2 VX15/2503
<400>  7
Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser
1               5
<210>  8
<211>  9
<212>  ПРT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  LCDR3 VX15/2503
<400>  8
Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Tyr Thr
1               5
<210>  9
<211>  118
<212>  ПРT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VH Mab 67
<400>  9
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Asp Tyr
20                  25                  30
Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser Pro Glu Asn Ser Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Gln Ile Asn Pro Thr Thr Gly Gly Ala Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50                  55                  60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Gln Leu Lys Ser Leu Thr Ser Glu Glu Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Thr Arg Tyr Tyr Tyr Gly Arg His Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  10
<211>  111
<212>  ПРT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VL Mab 67
<400>  10
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp
20                  25                  30
Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35                  40                  45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65                  70                  75                  80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85                  90                  95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
<---