СПОСОБ УДАЛЕНИЯ ЗАГРЯЗНЯЮЩЕЙ НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ ИЗ РЕАКЦИЙ ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПЦИИ И АМПЛИФИКАЦИИ

1. Способ удаления загрязняющей нуклеиновой кислоты из реакции обратной транскрипции, при котором используют ДНКазу, которая, по существу, необратимо инактивируется путем нагревания при температуре примерно 50°С в течение 5 мин, и которая, по существу, специфична в отношении двухцепочечной ДНК.
2. Способ удаления загрязняющей нуклеиновой кислоты из полимеразной цепной реакции (ПЦР) с горячим стартом, где указанная реакция представляет собой барьерную комбинацию ПЦР с горячим стартом и/или включает ДНК-полимеразу с горячим стартом, при котором используют ДНКазу, которая, по существу, необратимо инактивируется путем нагревания при температуре примерно 50°С в течение 5 мин, и которая, по существу, специфична в отношении двухцепочечной ДНК.
3. Способ по любому из пп.1 и 2, где реакционную смесь для обратной транскрипции, комбинацию для ПЦР с горячим стартом, смесь для ПЦР с горячим стартом или любой из их индивидуальных компонентов приводят в контакт с ДНКазой в условиях, которые дают возможность для расщепления любой загрязняющей двухцепочечной ДНК, и затем реакционную смесь нагревают для инактивации ДНКазы.
4. Способ обратной транскрипции in vitro нуклеиновой кислоты-мишени, при котором осуществляют стадию обработки реакционной смеси для обратной транскрипции ДНКазой, которая, по существу, необратимо инактивируется путем нагревания при температуре примерно 50°С в течение 5 мин и которая, по существу, специфична в отношении двухцепочечной ДНК, перед началом реакции обратной транскрипции.
5. Способ по п.3, где реакционная смесь для обратной транскрипции представляет собой полную смесь, и ее нагревают при рабочей температуре фермента для обратной транскрипции для инактивации ДНКазы.
6. Способ по п.4, где реакционная смесь для обратной транскрипции представляет собой полную смесь, и ее нагревают при рабочей температуре фермента для обратной транскрипции для инактивации ДНКазы.
7. Способ по любому из пп.4-6, при котором осуществляют один или более чем один цикл, включающий одну или более чем одну из следующих стадий:
(1) отжиг праймера,
(2) удлинение цепи относительно полинуклеотида с праймером,
(3) плавление полинуклеотидного дуплекса.
8. Способ по любому из пп.1 и 4-6, где за указанной реакцией обратной транскрипции следует реакция амплификации нуклеиновой кислоты.
9. Способ по п.8, где указанная реакция амплификации нуклеиновой кислоты представляет собой ПЦР, лигазную цепную реакцию (ЛЦР), амплификацию с вытеснением цепи (SDA), самоподдерживающуюся репликацию последовательности (3SR) или изотермальную петлевую амплификацию (ИПА), предпочтительно ПЦР.
10. Способ по п.8, где реакцию обратной транскрипции и реакцию амплификации осуществляют в одном реакционном сосуде.
11. Способ ПЦР с горячим стартом, где указанная реакция представляет собой барьерную комбинацию для ПЦР с горячим стартом и/или включает ДНК-полимеразу с горячим стартом, включающий стадию обработки комбинации/смеси для ПЦР с горячим стартом или ДНК-полимеразы с горячим стартом ДНКазой, которая, по существу, необратимо инактивируется путем нагревания при температуре примерно 50°С в течение 5 мин и которая, по существу, специфична в отношении двухцепочечной ДНК, перед началом ПЦР с горячим стартом.
12. Способ по любому из пп.9-11, при котором дополнительно осуществляют множество циклов, включающих одну или более чем одну из следующих стадий:
(1) плавление полинуклеотидного дуплекса,
(2) отжиг праймера,
(3) удлинение цепи относительно полинуклеотида с праймером.
13. ДНКаза, которая, по существу, необратимо инактивируется путем нагревания при температуре примерно 50°С в течение 5 мин и которая, по существу, специфична в отношении двухцепочечной ДНК.
14. ДНКаза или ее ферментативно активный фрагмент, имеющие последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 1 или последовательность, которая по меньшей мере на 60% идентична ей, но где пролиновый остаток в положении 237 в SEQ ID NO: 1 или эквивалентный пролин в других последовательностях модифицирован, удален или замещен, где указанная ДНКаза или ее ферментативно активный фрагмент, по существу, необратимо инактивируются путем нагревания при температуре примерно 50°С в течение 5 мин, и которые, по существу, специфичны в отношении двухцепочечной ДНК.
15. ДНКаза или ее ферментативно активный фрагмент по п.14, имеющие последовательность SEQ ID NO: 5 или последовательность, которая по меньшей мере на 60% идентична ей, но где пролиновый остаток в положении 214 в SEQ ID NO: 5 или эквивалентный пролин в других последовательностях модифицирован, удален или замещен, где указанная ДНКаза или ее ферментативно активный фрагмент, по существу, необратимо инактивируются путем нагревания при температуре примерно 50°С в течение 5 мин и которые, по существу, специфичны в отношении двухцепочечной ДНК.
16. ДНКаза или ее фрагмент по п.14 или 15, имеющие последовательность ДНКазы, полученной из видов типа Arthropodoa, но где эквивалент пролинового остатка в положении 237 в SEQ ID NO: 1 модифицирован, удален или замещен.
17. ДНКаза или ее фрагмент по п.16, имеющие последовательность ДНКазы, полученной из видов подтипа, выбранного из Crustacea, Hexpoda, Chelicerata или Myriapoda, но где эквивалент пролинового остатка в положении 237 в SEQ ID NO: 1 модифицирован, удален или замещен.
18. ДНКаза или ее фрагмент по п.16, имеющие последовательность ДНКазы, полученной из видов, выбранных из Pandalus borealis, Paralithodes camtschaticus (королевский краб), Marspenus japonicus (креветка kuruma) или Penaeus japonicus, но где эквивалент пролинового остатка в положении 237 в SEQ ID NO: 1 модифицирован, удален или замещен.
19. ДНКаза или ее фрагмент по п.18, имеющие последовательность ДНКазы, полученной из Pandalus borealis, но где эквивалент пролинового остатка в положении 237 в SEQ ID NO: 1 модифицирован, удален или замещен.
20. ДНКаза по любому из пп.13-15, имеющая последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 7.
21. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая ДНКазу по любому из пп.13-20.
22. Молекула нуклеиновой кислоты по п.21, содержащая нуклеотидную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 8.
23. Применение ДНКазы по любому из пп.13-20 в качестве агента для удаления загрязнения в способе амплификации нуклеиновой кислоты.
24. Применение ДНКазы по любому из пп.13-20 в способе по любому из пп.1-12.
25. Способ выделения и очистки ДНКазы или ее фрагмента по любому из пп.13-20, включающий экспрессию указанной ДНКазы или ее фрагмента в подходящей клетке-хозяине и затем выделение ДНКазы из указанных клеток-хозяев и/или сред, в которых выращивали указанные клетки.
26. Набор для осуществления способа по любому из пп.1-12, содержащий ДНКазу по любому из пп.13-20 и/или нуклеиновую кислоту по п.21 или 22; и возможно один или более чем один из следующих:
(1) нуклеотидтрифосфат;
(2) олигонуклеотидный праймер;
(3) фермент обратной транскрипции;
(4) ДНК-полимераза;
(5) ДНК-лигаза; и
(6) рестрикционный фермент.
27. Композиция для осуществления способа по любому из пп.1-12, содержащая ДНКазу по любому из пп.13-20 и/или нуклеиновую кислоту по п.21 или 22; и возможно один или более чем один из следующих:
(1) нуклеотидтрифосфат;
(2) олигонуклеотидный праймер;
(3) фермент обратной транскрипции;
(4) ДНК-полимераза;
(5) ДНК-лигаза и
(6) рестрикционный фермент.