СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АПОЛИПОПРОТЕИНА Е4
METHOD FOR DETERMINATION OF APOLIPOPROTEIN E4

Настоящее изобретение обеспечивает простой и экономически эффективный способ определения статуса аполипопротеина Е (ApoE) у субъектов. Такие субъекты включают, не ограничиваясь этим, пациентов с когнитивным нарушением, деменцией и/или болезнью Альцгеймера (AD).
Среди различных генов предрасположенности, ассоциированных с риском развития болезни Альцгеймера с поздним началом (LOAD) и других неврологических расстройств, ApoE был идентифицирован в качестве сильной генетической детерминанты (Leduc et al., 2011). Ген APOE человека находится в виде трех полиморфных аллелей ε2, ε3 и ε4, частота которых во всем мире составляет 8,4%, 77,9% и 13,7% соответственно. Аполипопротеин E (ApoE) состоит из 299 аминокислот и связан с липопротеинами в плазме и цереброспинальной жидкости (Leduc et al., 2011). Различия между тремя изоформами ApoE сводятся к аминокислотам 112 и 158 (SEQ ID NO: 1), где присутствует цистеин или аргинин: ApoE2 (cys112, cys158), ApoE3 (cys112, arg158) и ApoE4 (arg112, arg158). Кроме того, риск развития AD высоко коррелирует с аллелем ApoE4. Субъекты с одним аллелем ApoE4 имеют риск развития AD в пять-шесть раз выше, и субъекты с двумя аллелями ApoE4 имеют риск развития AD более чем в 20 раз. Кроме того, наличие одной (гетерозиготной) или двух копий (гомозиготной) аллеля ApoE4 коррелирует с более ранним возрастом начала заболевания примерно на 10-20 лет в сравнении с неносителями у пациентов с поздним началом заболевания (Verghese et al., 2011, Weisgraber & Mahley 1996, Leduc et al., 2011). Результаты исследований показывают, что субъекты, которые соответствуют клиническим критериям умеренного когнитивного нарушения (MCI), и которые также являются ApoE4-позитивными, с большей вероятностью будут прогрессировать до AD в течение нескольких лет, чем субъекты, которые являются ApoE4-негативными (Aggarwal et al., 2005). Следовательно, определение генотипа ApoE можно использовать для выявления пациентов с MCI с более высоким риском прогрессирования от MCI до AD. Носители ApoE4 также по-разному отвечают на несколько видов лечения AD, например, на ингибитор ацетилхолинэстеразы, такрин, что усиливает значение того, что пациенты должны знать их генотип (Cacabelos et al. 2012).
Кроме того, статус ApoE можно использовать для прогнозирования других заболеваний (субъекты, несущие изоформу ApoE4, имеют более высокий риск развития сердечно-сосудистых заболеваний (CVD), а также имеют более высокий риск развития рака предстательной железы (патент США № 5945289)). С другой стороны, было показано, что генотип ApoE4 защищает от тяжелого повреждения печени во время гепатита С, повышает вирусную нагрузку и ускоряет прогрессирование заболевания у ВИЧ-инфицированных субъектов, а также повышает риск развития AD в результате инфекции, вызванной вирусом простого герпеса (WO 03/060158 А2). Лечение возрастной макулярной дегенерации также является более эффективным при изоформе ApoE4 (Bakbak et al., 2015).
Генотип ApoE в качестве маркера риска развития болезни Альцгеймера был впервые описан в публикации Mayeux et al., 1998 и патенте США № 5508167. Существует множество возможностей для определения генетического статуса ApoE у субъектов с использованием различных методов генотипирования.
24
Было показано, что ApoE4 гораздо более чувствителен к протеолизу, чем ApoE3 и ApoE2, и усеченные на карбоксильном конце формы ApoE4 были обнаружены в головном мозге пациентов с AD и трансгенных по ApoE4 мышей. Предполагается, что фрагментация ApЕ4 является ранним событием в патогенезе AD (Brecht W. J. et al., 2004. Neuron-specific apolipoprotein e4 proteolysis is associated with increased tau phosphorylation in brains of transgenic mice. PNAS , 2527-2534).
В головном мозге пациентов с AD было обнаружено несколько специфических, возможно, нейротоксичных, усеченных на карбоксильном конце фрагментов ApoЕ4:
фрагмент ApoE4 1-165 с молекулярной массой 19 кДа (Huang Y. et al., 2001. Apolipoprotein E fragments present in Alzheimer's disease brains induce neurofibrillary tangle-like intracellular inclusions in neurons. 98, 8838-8843);
фрагмент ApoE4 1-185 (Dafnis I. et al., 2010. An apolipoprotein E4 fragment can promote intracellular accumulation of amyloid peptide beta 42. 115, 873-884);
фрагменты ApoE4 1-191 и ApoE4 1-260 (Tanaka M., 2006. Effect of carboxyl-terminal truncation on structure and lipid interaction of human apolipoprotein E4. Biochemistry, 45(13):4240-7);
фрагмент ApoE4 1-272 (Chang S. et al., 2005. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Lipid- and receptor-binding regions of apolipoprotein E4 fragments act in concert to cause mitochondrial dysfunction and neurotoxicity. 102(51):18694-9);
фрагменты ApoE4 1-259, ApoE4 1-229 и ApoE4 1-202 (Dafnis I. et al., 2015. Influence of Isoforms and Carboxyl-Terminal Truncations on the Capacity of Apolipoprotein E To Associate with and Activate Phospholipid Transfer Protein. Biochemistry, 54(38):5856-66; Vezeridis et al., 2011. Domains of apoE4 required for the biogenesis of apoE-containing HDL. Ann. Med., 43(4):302-11);
фрагмент ApoE4 1-231 (Chou C.Y. et al., 2006. Structural and functional variations in human apolipoprotein E3 and E4. J. Biol. Chem., 281(19):13333-44);
фрагменты ApoE4 1-251 и ApoE4 1-266 (Dong L.M. 1994. Human apolipoprotein E. Role of arginine 61 in mediating the lipoprotein preferences of the E3 and E4 isoforms. J. Biol. Chem., 269(35):22358-65).
Кроме того, были исследованы усеченные на N-конце фрагменты ApoE4:
фрагмент ApoE4 72-299 (Chou C.Y. et al. 2006. Structural and functional variations in human apolipoprotein E3 and E4. J Biol Chem. 281(19):13333-44; Chou C.Y. et al. 2005. Structural variation in human apolipoprotein E3 and E4: secondary structure, tertiary structure, and size distribution. Biophys J. 88(1):455-66).

В стандартных способах генотипирования используется ДНК, выделенная из периферической венозной крови или эпителиальных клеток ротовой полости, для анализа полиморфизма гена APOE. Более часто используемым способом традиционно был анализ ПЦР-RFLP (ПЦР-полиморфизм длины рестрикционных фрагментов). Однако это трудоемкий и подверженный погрешностям метод за счет возможного неполного расщепления рестриктазами. ПЦР плюс секвенирование или масс-спектрометрия являются эффективными методами, но для них требуется дорогостоящее специальное оборудование. Для методологий ARMS-ПЦР (амплификация рефракторной мутационной системы-ПЦР) и SSP-ПЦР (метод специфических последовательностей праймеров-ПЦР) требуется анализ с помощью агарозных гелей, что, таким образом, ограничивает количество образцов, которые можно исследовать одновременно. Детектирование ПЦР в режиме реального времени по флуоресцентным кривым плавления является простым и быстрым методом, но образование праймеров-димеров может усложнить интерпретацию кривых плавления. Детектирование ПЦР в режиме реального времени по флуоресцентным кривым плавления, использование FRET (флуоресцентный резонансный перенос энергии) или TaqMan являются очень эффективными, хотя и дорогостоящими методами. Появляются все более и более экспрессные анализы ApoE на основе ДНК (например, Calero et al., 2009; Zhong et al., 2016), но все они основаны на вышеуказанных методах.
Также доступны анализы, основанные на фенотипе: например, изоэлектрическое фокусирование или 2D гель-электрофорез, которые являются довольно подверженными погрешностям за счет посттрансляционных изменений изоформ ApoE. Еще одним методом является иммунохимический анализ, который описан в патенте США № 6027896 и основан на присутствии восстанавливаемых остатков цистеина в изоформах E2 и E3, но не в E4. Уровни ApoE в биологических жидкостях также можно измерить с использованием коммерчески доступных иммуноанализов, обычно ELISA «сэндвич»-типа. С помощью таких анализов измеряют либо все ApoE в жидкостях организма, либо только ApoE4, либо оба.
Было показано, что ApoE из цереброспинальной жидкости (CSF) связывается с полипропиленовыми, полистирольными, полиэтиленовыми и стеклянными пробирками (Hesse et al., 2000, Holmquist, 1982). Основываясь на таких результатах, Hesse et al. объяснили различия в результатах анализа уровней ApoE в CSF в различных экспериментах и определили связывание ApoE с этими материалами в качестве мешающего фактора для проведения иммуноанализов. Holmquist, 1982, описывает связывание выделенных и очищенных сывороточных ApoC и ApoE с пластиковыми пробирками и стеклянными пипетками и подчеркивает вероятность погрешностей в иммуноанализах ApoE, возникающих в процессе пробоподготовки. Тот факт, что делипидированные аполипопротеины сыворотки человека сильно адсорбируются на стеклянных и пластиковых поверхностях, является причиной погрешностей в иммуноанализах методом двойных антител (например, Sandwich ELISA; Holmquist 1982, Høgåsen et al. 1993).
Høgåsen et al., 1993 показали, что кластерин прочно связывается с полистирольными микропланшетами. Эта способность к неспецифическому связыванию кластерина усиливается при добавлении твина-20. Они разработали иммуноанализ методом одного антитела, в котором они предварительно инкубировали образцы плазмы или сыворотки в PBS-T (PBS с 0,2% твина-20) на полистирольном микропланшете. Затем они детектировали и количественно определяли иммобилизованный кластерин с использованием специфического антитела к кластерину.
Настоящее изобретение использует эту способность ApoE, в частности ApoE4, прочно связываться с полимерными и стеклянными поверхностями и, таким образом, создали простой и экономически эффективный способ иммуноанализа методом одного антитела с использованием образцов крови, плазмы или сыворотки.
Как описано выше, Hesse et al., 2000 показали, что ApoE из прямо использованной CSF связывается с полимерными или стеклянными пробирками и может детектироваться после элюирования (например, с помощью элюирования SDS и последующего вестерн-блоттинга). Однако в CSF средняя концентрация общего белка составляет 0,15-0,45 мг/мл. В противоположность, в плазме и сыворотке концентрация белка в 100-500 раз выше, чем в CSF, и составляет 60-80 мг/мл. Для иммуноанализа характерно насыщать связывающие поверхности блокирующими белками (например, бычьим сывороточным альбумином) в концентрациях от 0,5 до 2 мг/мл для ингибирования неспецифического связывания белков образца с поверхностями. Концентрации ApoE в сыворотке находятся в диапазоне от 30 до 400 мкг/мл (Bury et al., 1986). Следовательно, расчетное количество ApoE4 в плазме/сыворотке составляет всего 0,02-0,5% от общего содержания белков в плазме/сыворотке, и не следует ожидать, что можно будет измерять сигнал, специфичный для ApoE4. Удивительно, но заявители могут показать, что ApoE4 из плазмы, сыворотки и даже цельной крови специфически и количественно связывается с твердыми поверхностями, даже в присутствии более чем в 200-5000 раз более высокой концентрации общего белка в образце.
Также неожиданно бело установлено, ApoE4 специфически и количественно связывается с твердыми поверхностями в присутствии блокирующих белков (например, 0,5-2 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (BSA)) в реакционном буфере. Присутствие блокирующих белков, таких как BSA, может даже усиливать связывание ApoE4 с твердой фазой.
Фактором, усиливающим специфическое связывание ApoE4 с полимерными и стеклянными поверхностями, является применение детергента. Детергенты обычно используются для предотвращения неспецифического связывания белков образцов с твердой фазой в иммуноанализах. Hesse et al. показали, что ApoE связывается с полистирольными, полипропиленовыми, полиэтиленовыми и стеклянными пробирками в присутствии 0,2% твина-20 (Hesse et al., 2000).
Предметом настоящего изобретения является способ для (а) идентификации статуса ApoE4 и/или (b) количественного определения уровней ApoE4 в образцах крови. Заключение о том, является ли субъект ApoE4-позитивным или ApoE4-негативным (a), основывается на том, что образец крови субъекта имеет уровень ApoE4 выше определенного порогового значения, которое ограничивается внутренним контролем отсечения. Количественное определение уровней ApoE4 в образцах крови (b) проводится анализом внутренних стандартов вместе с образцами и расчетом концентрации ApoE4 с использованием стандартной кривой.
Подробное описание вариантов осуществления настоящего изобретения
Предметом настоящего изобретения является способ (in vitro) детектирования аполипопротеина Е изотипа 4 (ApoE4) или его фрагментов в образце крови субъекта, включающий стадии:
а. контактирование указанного образца с твердой фазой,
контактирование указанного образца одновременно или последовательно, по меньшей мере, с одним связывающим агентом, который специфически связывается с ApoE4, с образованием тем самым комплекса ApoE4-связывающий агент, где указанный связывающий агент представляет антитело или функциональный фрагмент антитела или каркасный белок, отличный от IgG, и
b. детектирование комплекса ApoE4-связывающий агент, где указанный комплекс ApoE4-связывающий агент иммобилизован на указанной твердой фазе посредством ApoE4 или ApoE4 иммобилизован на указанной твердой фазе, и связывающий агент с ApoE4.
Предметом настоящего изобретения является способ (in vitro) детектирования аполипопротеина Е изотипа 4 (ApoE4) или его фрагментов в образце крови субъекта, включающий стадии:
а. контактирование указанного образца с твердой фазой,
контактирование указанного образца одновременно или последовательно, по меньшей мере, с одним связывающим агентом, который специфически связывается с ApoE4, с образованием тем самым комплекса ApoE4-связывающий агент, где указанный связывающий агент представляет антитело или функциональный фрагмент антитела или каркасный белок, отличный от IgG, и
b. детектирование комплекса ApoE4-связывающий агент, где указанный комплекс ApoE4-связывающий агент иммобилизован на указанной твердой фазе, где твердая фаза не покрыта каким-либо связывающим агентом или захватывающей молекулой и где связывание ApoE4 или комплекса ApoE4-связывающий агент с указанной твердой фазой происходит в присутствии детергента.
В контексте настоящего изобретения комплекс ApoE4- связывающий агент иммобилизован через ApoE4 на твердой фазе, в частности, ApoE4 иммобилизован на твердой фазе, и связывающий агент связан с ApoE4.
Предметом настоящего изобретения также является анализ, основанный на связывании аналита (ApoE4 или его фрагментов) с твердой фазой в присутствии детергента и детектировании этого иммобилизованного аналита с помощью ApoE4-специфического связывающего агента с детектируемой меткой.
ApoE4-специфический связывающий агент можно пометить прямо или опосредованно.
Предметом настоящего изобретения также является способ детектирования ApoE4 или его фрагментов, где образец крови субъекта контактирует с твердой фазой, тем самым иммобилизуя ApoE4 на указанной твердой фазе.
Образец крови выбран из группы цельной крови, сыворотки и плазмы. Плазма здесь определяется как ЭДТА-плазма, гепаринизированная плазма и/или цитратная плазма.
В контексте настоящего изобретения термин «фрагмент ApoE4» включает более короткие сплайсированные варианты ApoE4 и усеченные белки или пептиды ApoE4, или участки ApoE4 (Rohn et al., 2013; Love et al., 2015).
Эти фрагменты содержат, по меньшей мере, 6 аминокислот в длину при условии, что аминокислота 158 (аргинин, R) входит в указанный фрагмент, где последовательность, включающая аминокислоту 158, относится к SEQ ID NO:1.
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения фрагменты выбраны из группы, включающей последовательности SEQ ID. NO: 1-15.
Как здесь используется, термин «субъект» относится к живому человеку или организму, отличному от человека, предпочтительно человеку, где субъект является здоровым, предположительно здоровым, страдающим когнитивными нарушением, страдающим деменцией, в частности, болезнью Альцгеймера (AD).
В одном варианте осуществления способа по настоящему изобретению связывание ApoE4 или его фрагментов с твердой фазой происходит без взаимодействия соединяющей молекулы, которая способна связывать/соединять ApoE4 или его фрагменты с указанной твердой фазой.
В еще одном варианте осуществления способа по настоящему изобретению на время контактирования твердой фазы с образцом указанное контактирование происходит без взаимодействия указанной соединяющей молекулы.
В еще одном варианте осуществления способа по настоящему изобретению связывание ApoE4 или его фрагментов с твердой фазой происходит в присутствии детергента.
Как здесь используется, детергент выбран из группы анионных детергентов (например, додецилсульфата натрия (SDS)), катионных детергентов (например, цетилтриметиламмония бромида (CTAB)), цвиттер-ионных детергентов (например, CHAPS) и неионных детергентов (например, твина-20, тритона Х-100).

Примеры неионных детергентов включают сложные эфиры эпокси-жирных кислот, например, твин-20 (полиоксиэтилен сорбитан монолаурат), твин-80 (полиоксиэтилен сорбитан моноолеат), тритон (смеси алкиловых полиэфиров спиртов, например, тритон X-100, тритон X-114), Brij 35 и Brij 58 (лауриловый эфир полиоксиэтилена), Nonidet P-40 (октилфеноловый эфир полиоксиэтилена), Lubrol PX (аддукт полиэтиленоксида и алкилового эфира), Berol EMU 043 (C16, C18 жирный спирт с 10 оксиэтиленовыми цепями); дезокси-BIGCHAP, дигитонин, HECAMEG, N-D-глюко-N-метилалканамид (MEGA-8, 9, 10), н-октил-D-глюкопиранозид, rac.-1-олеоилглицерин, Pluronic F-68, сахарозу монолаурат, сапонин из квиллайи; и тому подобное.
Цвиттер-ионные детергенты включают, не ограничиваясь этим, CHAPS, CHAPSO, н-октил-β-D-глюкопиранозид, сульфобетаин SB 12 и сульфобетаин SB 14.
Примеры катионных детергентов включают бензетония хлорид, цетилпиридиния хлорид моногидрат, цетилтриметиламмония бромид (CTAB), додецилтриметиламмония бромид (DTAB) и тому подобное.
В качестве примера анионного детергента следует указать додецилсульфат натрия (SDS), додецилсульфат лития (LiDS), холат натрия, дезоксихолат натрия, N-лауроилсаркозина натриевую соль, 1-декансульфоновой кислоты натриевую соль, 1-додекансульфоновой кислоты натриевую соль, 1-гептансульфоновой кислоты натриевую соль безводную, 1-гексансульфоновой кислоты натриевую соль безводную, 1-нонансульфоновой кислоты натриевую соль, 1-октансульфоновой кислоты натриевую соль, 1-пентансульфоновой кислоты натриевую соль безводную и так далее.
В одном варианте осуществления способа по настоящему изобретению концентрация детергента в реагенте предпочтительно составляет от 0,0001 до 10% (мас./об.) и особенно предпочтительно от 0,01 до 1% (мас./об.). Специалист в данной области знает, что можно предусматривать применение определенного диапазона концентраций для каждого конкретного детергента.
В предпочтительном варианте осуществления способа по настоящему изобретению твин-20 используется в концентрации 0,001-10%, предпочтительно 0,01-1%, наиболее предпочтительно 0,2-0,5%. В еще одном варианте осуществления способа по настоящему изобретению тритон Х-100 используется в концентрации 0,001-0,5%, предпочтительно 0,01-0,2%, наиболее предпочтительно 0,05-0,1%.
В настоящем изобретении детергенты необходимы для связывания ApoE4 или его фрагментов с твердой фазой, но они не функционируют в качестве соединяющих или связывающих молекул. Детергенты должны присутствовать в реакционном буфере, поскольку связывания ApoE4 с твердой фазой не происходит в буфере для образцов без детергента (см. пример 4).
В предпочтительном варианте осуществления способа по настоящему изобретению связывающий агент является специфически связывающим агентом для ApoE4 или его фрагментов.
7
-1
8
-1
9
-1
10
-1
В дополнительном варианте осуществления способа по настоящему изобретению связывающий агент представляет антитело или функциональный фрагмент антитела или каркасный белок, отличный от IgG, с константой аффинности связывания, по меньшей мере, 10 М, предпочтительно 10 М, предпочтительной константой аффинности выше 10 М, наиболее предпочтительно выше 10 М.
В контексте настоящего изобретения «молекулы связывающего агента» представляют собой молекулы, которые можно использовать для связывания молекул-мишеней или представляющих интерес молекул, т.е. аналитов (в контексте настоящего изобретения ApoE4 и его фрагментов), из образца. Таким образом, молекулы связывающего агента должны иметь адекватную форму, как в пространственном отношении, так и в отношении поверхностных свойств, таких как поверхностный заряд, гидрофобность, гидрофильность, наличие или отсутствие доноров и/или акцепторов Льюиса, чтобы специфически связывать молекулы-мишени или представляющие интерес молекулы. Таким образом, связывание может быть опосредовано, например, ионными, ван-дер-ваальсовыми, пи-пи, сигма-пи, гидрофобными или обусловленными водородными связями взаимодействиями или комбинацией двух или более вышеуказанных взаимодействий между захватывающими молекулами и молекулами-мишенями или представляющими интерес молекулами. В контексте настоящего изобретения молекулы связывающего агента могут, например, быть выбраны из группы, включающей молекулу нуклеиновой кислоты, молекулу углевода, молекулу PNA, белок, антитело, пептид или гликопротеин. Предпочтительно молекулы связывающего агента представляют антитела, включая их фрагменты с достаточной аффинностью к молекуле-мишени или представляющей интерес молекуле, и в том числе рекомбинантные антитела или фрагменты рекомбинантных антител, а также химически и/или биохимически модифицированные производные указанных антител или фрагментов, полученных из вариантной цепи длиной, по меньшей мере, 12 аминокислот.
2

Анти-ApoE4-антитело может иметь форматы, известные в данной области. Примерами являются человеческие антитела, моноклональные антитела, гуманизированные антитела, химерные антитела, CDR-привитые антитела. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения антитела по настоящему изобретению представляют рекомбинантно полученные антитела, такие как IgG, обычный полноразмерный иммуноглобулин, или фрагменты антител, содержащие, по меньшей мере, F-(фрагмент) вариабельного домена тяжелой и/или легкой цепи, например, химические сшитые антитела (антигенсвязывающий фрагмент), включая, не ограничиваясь этим, Fab-фрагменты, в том числе Fab минитела, антитело в виде одноцепочечного Fab, антитело в виде одновалентного Fab с эпитопными метками, например Fab-V5S×2; бивалентный Fab (миниантитело), димеризованный с СН3-доменом; бивалентный Fab или мультивалентный Fab, например, полученный путем мультимеризации с помощью гетерологичного домена, например, путем димеризации dHLX-доменов, например, Fab-dHLX-FS×2; F(ab')-фрагменты, scFv-фрагменты, мультимеризованные, мультивалентные и/или мультиспецифические scFv-фрагменты, бивалентные и/или биспецифические димерные антитела (диатела), BITE (биспецифический активатор Т-клеток), трехфункциональные антитела, поливалентные антитела, например, из класса, отличного G; однодоменные антитела, например, нанотела, полученные из иммуноглобулинов представителей верблюдовых или рыб, и многие другие форматы.
В дополнение к анти-ApoE4-антителам в данной области хорошо известны другие биополимерные каркасы, которые образуют комплекс с молекулой-мишенью, и их используют для получения высокоспецифичных для мишеней биополимеров. Примерами являются аптамеры, шпигельмеры, антикалины и конотоксины.
Каркасы, отличные от Ig, могут представлять белковые каркасы, и они могут использоваться в качестве миметиков антител, поскольку они способны связываться с лигандами или антигенами. Каркасы, отличные от Ig, можно выбрать из группы, включающей каркасы, отличные от Ig, на основе тетранектина (например, описанные в заявке на патент США № 2010/0028995), каркасы на основе фибронектина (например, описанные в ЕР 1266025), каркасы на основе липокалина (например, описанные в WO 2011/154420), каркасы на основе убиквитина (например, описанные в WO 2011/073214), каркасы на основе трансферрина (например, описанные в заявке на патент США № 2004/0023334), каркасы на основе белка А (например, описанные в EP 2231860), каркасы на основе анкириновых повторов (например, описанные в WO 2010/060748), каркасы на основе микропротеинов (предпочтительно микропротеинов, образующих «цистиновый узел») (например, описанные в EP 2314308), каркасы на основе домена SH3 киназы Fyn (например, описанные в WO 2011/023685), каркасы на основе домена EGFR-A (например, описанные в WO 2005/040229) и каркасы на основе домена Кунитца (например, описанные в EP 1941867). Каркасы, отличные от Ig, могут представлять пептидные или олигонуклеотидные аптамеры. Аптамеры обычно получают их отбором из большого пула случайных последовательностей, и они представляют короткие олигонуклеотидные цепи (ДНК, РНК или XNA; Xu et al., 2010, Deng et al., 2014) или короткие вариабельные пептидные домены, присоединенные к белковому каркасу (Li et al., 2011).
7
-1
8
-1
9
-1
10
-1
Связывающие агенты, которые можно использовать для определения уровня ApoE4 или его фрагментов, имеют константу аффинности к ApoE4 на уровне, по меньшей мере, 10 М, предпочтительно 10 М, предпочтительную константу аффинности выше 10 М, наиболее предпочтительно выше 10 М. Специалист в данной области знает, что можно предусматривать возможность компенсировать более низкую аффинность путем применения более высокой дозы соединений, и эта мера не приведет к выходу за рамки объема изобретения.
В более предпочтительном варианте осуществления способа по настоящему изобретению связывающий агент помечен детектируемой меткой для детектирования после связывания с ApoE4.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения метка связывающего агента выбрана из группы, включающей хемилюминесцентную метку, ферментную метку, флуоресцентную метку, метку на основе радиоактивного йода. Количество меченого антитела, связанного с аналитом, затем измеряют соответствующим методом.
В еще одном варианте осуществления способа по настоящему изобретению метка связывающего агента выбрана из группы, включающей криптаты редкоземельных металлов или хелаты редкоземельных металлов в сочетании с флуоресцентным красителем или хемилюминесцентным красителем, в частности, красителем цианинового типа.
Предпочтительные способы детектирования уровня ApoE4 или его фрагментов включают иммуноанализы в различных форматах, например, таких как радиоиммуноанализ (RIA), хемилюминесцентный и флуоресцентный иммуноанализ, твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), чип-шарики на основе люминекса, белковые микрочипы и экспрессные форматы тестов, например, такие как иммунохроматографические методы с тест-полосками.
В контексте настоящего изобретения анализы на основе флуоресценции включают применение красителей, которые, например, могут быть выбраны из группы, включающей FAM (5- или 6-карбоксифлуоресцеин), VIC, NED, флуоресцеин, флуоресцеинизотиоцианат (FITC), IRD-700/800, цианиновые красители, такие как CY3, CY5, CY3.5, CY5.5, Cy7, ксантен, 6-карбокси-2',4',7',4,7-гексахлорфлуоресцеин (HEX), TET, 6-карбокси-4',5'-дихлор-2',7'-диметоксифлуоресцеин (JOE), N,N,N',N'-тетраметил-6-карбоксиродамин (ТАМРА), 6-карбокси-X-родамин (ROX), 5-карбоксиродамин-6G (R6G5), 6-карбоксиродамин-6G (RG6), родамин, родамин зеленый, родамин красный, родамин 110, красители BODIPY, такие как BODIPY TMR, орегон зеленый, кумарины, такие как умбеллиферон, бензимиды, такие как Hoechst 33258; фенантридины, такие как техаский красный, Yakima Yellow, Alexa Fluor, PET, бромистый этидий, акридиновые красители, карбазольные красители, феноксазиновые красители, порфириновые красители, полиметиновые красители и тому подобное.
В контексте настоящего изобретения анализы на основе хемилюминесценции включают применение красителей, действие которых основано на физических принципах, описанных для хемилюминесцентных материалов в Энциклопедии химической технологии Кирка-Отмера. Предпочтительными хемилюминесцентными красителями являются эфиры акридиния.
Хемилюминесцентная метка может представлять метку на основе эфира акридиния, стероидные метки, включая изолюминоловые метки и тому подобное.
Ферментные метки могут представлять лактатдегидрогеназу (LDH), креатининкиназу (CPK), щелочную фосфатазу, аспартатаминотрансферазу (AST), аланинаминотрансферазу (ALT), кислую фосфатазу, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу и тому подобное.
В еще одном варианте осуществления способа по настоящему изобретению твердая фаза выбрана из группы, включающей полимерную поверхность (например, полистирол), стеклянную поверхность, целлюлозу и производные целлюлозы (например, нитроцеллюлозу, поливинилиденфторид, нейлон). В еще одном конкретном варианте осуществления способа по настоящему изобретению твердая фаза выбрана из группы, включающей стеклянные или полимерные поверхности, где полимерная поверхность включает, не ограничиваясь этим, полистирол, поли(дивинилбензол), стирол-акриловый сополимер, стирол-бутадиеновый сополимер, стирол-дивинилбензольный сополимер, поли(стирол-оксиэтилен), полиметилметакрилат, полиуретан, полиглутаральдегид, полиэтиленимин, поливинилпирролидон, N,N'-метилен-бис-акриламид, полиолефины, полиэтилен, политетрафторэтилен, полиэтилентерефталат, полипропилен, поливинилхлорид, поливинилацетат, полиакрилонитрил, полисульфон, поли(сульфоновый эфир), полидиметилсилоксан, пиролизованные материалы, блок-сополимеры и сополимеры вышеуказанных соединений, силиконы или диоксид кремния.
Любой материал является пригодным для такой поверхности/твердой фазы, при условии, что он служит для достижения целей настоящего изобретения. Предпочтительные примеры поверхностей включают полимерные поверхности и стеклянные поверхности. Группа полимерных поверхностей включает, не ограничиваясь этим: полистирол, поли(дивинилбензол), стирол-акриловый сополимер, стирол-бутадиеновый сополимер, стирол-дивинилбензольный сополимер, поли(стирол-оксиэтилен), полиметилметакрилат, полиуретан, полиглутаральдегид, полиэтиленимин, поливинилпирролидон, N,N'-метилен-бис-акриламид, полиолефины, полиэтилен, политетрафторэтилен, полиэтилентерефталат, полипропилен, поливинилхлорид, поливинилацетат, полиакрилонитрил, полисульфон, поли(сульфоновый эфир), полидиметилсилоксан, пиролизованные материалы, блок-сополимеры и сополимеры вышеуказанных соединений, силиконы или диоксид кремния, целлюлозу и производные целлюлозы (например, нитроцеллюлозу, поливинилиденфторид, нейлон). Предпочтительным материалом для поверхности является полистирол.

Полистирол представляет гидрофобный полимер, который легко дериватизируется производителем. Микротитрационные планшеты для EIA обычно изготовлены из: 1) немодифицированного полистирола (например, планшеты pureGrade BRANDplates), 2) модифицированного полистирола, который имеет ионизированную и гидрофобную поверхность (например, планшеты lipoGrade BRANDplates, планшеты Thermo Scientific Microlite 1+), 3) полистирола, оптимизированного для связывания IgG (гидрофильного и гидрофобного; например, планшеты Greiner High Binding, immuneBRANDplates) или 3) полистирола с гидрофильной или слабо связывающей поверхностью (например, планшеты Thermo Scientific MultiSorp, hydroGrade BRANDplates). Полимерные поверхности, в том числе полистирольные микропланшеты, модифицируются физической бомбардировкой энергетическими частицами (ионами, электронами, быстрыми нейтралами и/или радикалами) и/или фотонами ультрафиолетового излучения или химическими реакциями на поверхности или рядом с ней (например, обработкой кислотой или обработкой органосиланами) (Hegemann et al., 2003, WO 9203732, DE 2018523 A1). Предпочтительной твердой фазой для настоящего изобретения является высокосвязывающий полистирольный микропланшет.
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения твердая фаза является немодифицированной (чистой) или модифицированной для того, чтобы быть гидрофильной, гидрофобной или оптимизированной для связывания IgG (высокосвязывающая: гидрофильная и гидрофобная) физической бомбардировкой энергетическими частицами (ионами, электронами, быстрыми нейтралами и/или радикалами) и фотонами ультрафиолетового излучения и/или химическими реакциями на поверхности или рядом с ней (например, обработкой кислотой или обработкой органосиланами).
В еще одном конкретном варианте осуществления способа по настоящему изобретению поверхность твердой фазы используют в подходящих формах, таких как планшеты, мультилуночные планшеты, пробирки или шарики, пластины, пленки, частицы, магнитные или немагнитные частицы. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения форма поверхности твердой фазы представляет собой микротитрационный планшет.
В более конкретном варианте осуществления способа по настоящему изобретению образец крови субъекта контактирует с ненасыщенной твердой фазой. Это означает, что твердая фаза на время, когда она контактирует с образцом, не является насыщенной/покрытой блокирующими агентами и/или связывающими молекулами, и/или стабилизирующими белками и/или соединяющими молекулами.
Однако блокирующие агенты или стабилизирующие белки могут поддерживать имеющееся связывание ApoE4 или его фрагментов с твердой фазой и связывающим агентом, когда образец уже конактировал с твердой фазой, что означает, что стабилизирующие/блокирующие молекулы/белки могут необязательно присутствовать на время детектирования комплекса иммобилизованный ApoE4-связывающий агент (на заявленной стадии b).
В контексте настоящего изобретения термин «блокирующие агенты» включает, не ограничиваясь этим, растворы белков (например, бычьего сывороточного альбумина, человеческого сывороточного альбумина, молочных белков, казеина, рыбьего желатина) или цельную сыворотку (например, телячью сыворотку).
В одном варианте осуществления способа по настоящему изобретению твердая поверхность не покрыта каким-либо связывающим агентом или захватывающей молекулой. Как здесь используется, определение термина «связывающий агент», приведено выше.
В контексте настоящего изобретения «захватывающие молекулы» представляют молекулы, которые можно использовать для связывания молекул-мишеней или представляющих интерес молекул, т.е. аналитов (т.е. в контексте настоящего изобретения пептида(ов)) из образца. Таким образом, захватывающие молекулы должны иметь адекватную форму, как в пространственном отношении, так и в отношении поверхностных свойств, таких как поверхностный заряд, гидрофобность, гидрофильность, наличие или отсутствие доноров и/или акцепторов Льюиса, чтобы специфически связывать молекулы-мишени или представляющие интерес молекулы. Таким образом, связывание может быть опосредовано, например, ионными, ван-дер-ваальсовыми, пи-пи, сигма-пи, гидрофобными или обусловленными водородными связями взаимодействиями или комбинацией двух или более вышеуказанных взаимодействий между захватывающими молекулами и молекулами-мишенями или представляющими интерес молекулами. В контексте настоящего изобретения захватывающие молекулы могут, например, быть выбраны из группы, включающей молекулу нуклеиновой кислоты, молекулу углевода, молекулу PNA, белок, антитело, пептид или гликопротеин. Предпочтительно захватывающие молекулы представляют антитела, включая их фрагменты с достаточной аффинностью к мишени или представляющей интерес молекуле, и в том числе рекомбинантные антитела или фрагменты рекомбинантных антител, а также химически и/или биохимически модифицированные производные указанных антител или фрагментов, полученных из вариантной цепи длиной, по меньшей мере, 12 аминокислот.
В еще одном варианте осуществления способа по настоящему изобретению стабилизирующий белок поддерживает имеющееся связывание ApoE4 или его фрагментов из образца крови с твердой фазой, где указанный белок может быть необязательно добавлен в реакционный буфер.
Реакционные буферы для иммуноанализов обычно содержат стабилизирующие/блокирующие белки (например, бычий сывороточный альбумин, человеческий сывороточный альбумин, молочные белки, казеин, желатин, иммуноглобулины). Эти дополнительные белки предотвращают неспецифическое связывание с твердой фазой и стабилизируют партнеров по связыванию (связывающий агент и антиген), а также взаимодействие связывающий агент-антиген. Удивительно, что добавление таких стабилизирующих/блокирующих белков в реакцию усиливает связывание ApoE4 или его фрагментов с твердой фазой (см. пример 6).
В еще одном варианте осуществления способа по настоящему изобретению стабилизирующий белок выбран из группы, включающей бычий сывороточный альбумин (BSA), человеческий сывороточный альбумин, казеин, молочные белки, иммуноглобулины, стабилизирующие аминокислоты (например, аланин, аргинин, глицин, изолейцин, лизин, пролин, серин) и тому подобное. Предпочтительным стабилизирующим белком является бычий сывороточный альбумин (BSA).
В еще одном варианте осуществления способа по настоящему изобретению концентрация BSA находится в диапазоне 0-10%, предпочтительно 0,2-5%, наиболее предпочтительно 0,5-2,5%.
В еще одном конкретном варианте осуществления способа по настоящему изобретению присутствие других белков, отличных от ApoE4, в образце крови не влияет на детектирование ApoE4 или его фрагментов.
В еще одном варианте осуществления способа по настоящему изобретению контактирование образца крови субъекта с твердой фазой и контактирование указанного образца, по меньшей мере, с одним связывающим агентом, который специфически связывается с ApoE4 или его фрагментом, происходит в одностадийной или двустадийной процедуре (см. пример 5).
В контексте настоящего изобретения термин «одностадийная процедура» означает, что иммобилизация ApoE4 или его фрагментов на твердой фазе и связывание ApoE4 или его фрагментов с меченым связывающим агентом (например, антителом) выполняются одновременно в одном и том же сосуде. Во время такого рода процедуры ApoE4 один, и затем специфический связывающий агент и/или комплексы ApoE4-связывающий агент иммобилизуются на твердой фазе.
Как здесь используется, термин «двустадийная процедура» означает, что иммобилизация ApoE4 или его фрагментов на твердой фазе и связывание ApoE4 или его фрагментов специфическим связывающим агентом происходит на временные точки постадийно, необязательно, со стадией промывания между стадиями инкубации. Например, ApoE4 может быть вначале иммобилизован на твердой фазе, и затем ApoE4-специфический меченный связывающий агент будет связываться с иммобилизованным ApoE4. Другая возможность состоит в том, что ApoE4 и ApoE4-специфический меченный связывающий агент инкубируют на первой стадии для обеспечения образования комплексов ApoE4-связывающий агент, и на второй стадии комплексы ApoE4-связывающий агент иммобилизуют на твердой фазе.
В еще одном конкретном варианте осуществления способа по настоящему изобретению комплекс ApoE4-связующий агент детектируется качественно или количественно, где качественное детектирование комплекса ApoE4-связующий агент указывает на присутствие ApoE4 или его фрагментов в указанном образце, и где количественное определение комплекса ApoE4-связывающий агент указывает на концентрацию ApoE4 или его фрагментов в указанном образце.
В еще одном варианте осуществления способа по настоящему изобретению количественное определение концентрации ApoE4 или его фрагментов показывает, насколько субъекты являются гомозиготными или гетерозиготными по аллелям ApoE4.
В еще одном конкретном варианте осуществления способа по настоящему изобретению присутствие комплекса ApoE4-связывающий агент коррелирует с риском развития/заболеваемостью AD.
В одном конкретном варианте осуществления способа по настоящему изобретению детектирование ApoE4 используется для определения риска развития болезни Альцгеймера (AD).
Предметом настоящего изобретения также является способ прогнозирования риска заболеваемости болезнью Альцгеймера, а также медицинских последствий всех вышеуказанных заболеваний и инфекций.
В одном варианте осуществления способа по настоящему изобретению детектирование иммобилизованного ApoE4 в комплексе ApoE4-связывающий агент используется для классификации субъекта, как ApoE4-позитивного или ApoE4-негативного, когда уровень детектированного ApoE4 в комплексе ApoE4-связывающий агент выше определенного порогового значения, где указанное пороговое значение определяется конкретным значением внутреннего положительного контроля.
В еще одном варианте осуществления способа по настоящему изобретению уровень комплекса ApoE4-связывающий агент выше определенного порогового значения является прогностическим для повышенного риска заболеваемости AD, где указанное пороговое значение определяется внутренним контролем отсечения.
Согласно способу по настоящему изобретению ApoE4-позитивные образцы крови субъектов имеют значение выше, чем конкретный уровень внутреннего контроля отсечения (= порогового значения). В более предпочтительном варианте осуществления пороговое значение примерно в 1,5-100 раз ниже уровня в ApoE4-позитивных образцах, предпочтительно в 1,5-20 раз ниже, наиболее предпочтительно в 1,5-10 раз ниже. ApoE4-негативные образцы имеют значение ниже, чем внутренний контроль отсечения. В более предпочтительном варианте осуществления пороговое значение примерно в 10-10000 раз выше, чем уровень в ApoE4-негативных образцах, предпочтительно в 50-5000 раз выше, наиболее предпочтительно в 100-1000 раз выше.
В контексте настоящего изобретения уровень ApoE4 выше указанного порогового значения указывает на присутствие ApoE4 у пациента и, таким образом, высокий риск развития/заболеваемости AD. Уровень ApoE4 ниже указанного порогового значения указывает на отсутствие ApoE4 у пациента и, таким образом, низкий риск развития/заболеваемости AD.
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения для качественного детектирования комплекса ApoE4-связывающий агент уровень ApoE4 или его фрагментов измеряют с помощью иммуноанализа с использованием антител или фрагментов антител. ApoE4-позитивные и ApoE4-негативные образцы разделяются по пороговому значению, который определяется конкретным внутренним контролем отсечения, где все ApoE4-негативные образцы показывают только фоновый сигнал, и все ApoE4-позитивные образцы имеют сигнал, по меньшей мере, в 1,5 раза выше, чем контроль отсечения (см. примеры 5, 6 и 7).
Еще одним вариантом осуществления настоящего изобретения является оценка измеренных единиц (т.е. единиц флуоресценции, люминесценции, ферментативной реакции и т. д.), которые соответствуют уровню детектированных уровней ApoE4, которые можно анализировать количественно с использованием калибраторов ApoE4 со стандартными концентрациями (см. пример 7). Посредством количественного анализа ApoE4-позитивная группа по настоящему изобретению может быть дополнительно разделена на две группы, которые соответствуют субъектам, которые являются гомозиготными или гетерозиготными по аллелям ApoE4 с использованием определенного порогового значения. Такое конкретное пороговое значение можно определить анализом ранее генотипированных гомозиготных или гетерозиготных образцов.
Одним из вариантов осуществления настоящего изобретения является корреляция присутствия ApoE4/комплекса ApoE4- связывающий агент с риском развития/заболеваемости AD. Оценка результатов указывает на низкий риск развития/заболеваемости AD у ApoE4-негативных субъектов и указывает на высокий риск развития/заболеваемости AD у ApoE4-позитивных субъектов.
В одном варианте осуществления изобретения способ используется для стратификации риска или стратификации применения терапевтических мероприятий для заболевания или патологического состояния, ассоциированного с повышенными уровнями ApoE4.
В еще одном варианте осуществления изобретения заболевание или патологическое состояние выбрано из группы когнитивного нарушения и нейродегенеративных заболеваний, включая деменцию и/ или болезнь Альцгеймера.
Предметом изобретения также является анализ, который обеспечивает осуществление способа детектирования ApoE4 или его фрагментов.
В контексте настоящего изобретения анализ включает все тестовые компоненты, которые необходимы для осуществления способа по настоящему изобретению. Однако, как здесь указывалось, «анализ» представляет собой не только коробку или блок, содержащий указанные тестовые компоненты, а скорее функциональную комбинацию всех взаимодействующих компонентов, обеспечивающую осуществление заявленного способа по настоящему изобретению.

Указанный анализ по настоящему изобретению обеспечивает осуществление способа по настоящему изобретению также в виде полностью автоматизированной системы анализа, например, на платформе, доступной на рынке (Roche cobas, Abbott Architect, Siemens Centauer, Brahms Kryptor, Biomerieux Vidas, Alere Triage).
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения анализ обеспечивает осуществление способа детектирования ApoE4 или его фрагментов в образце крови субъекта, включающего следующие стадии:
а. контактирование указанного образца с твердой фазой,
контактирование указанного образца одновременно или последовательно, по меньшей мере, с одним связывающим агентом, который специфически связывается с ApoE4, с образованием тем самым комплекса ApoE4-связывающий агент, где указанный связывающий агент представляет антитело или функциональный фрагмент антитела или каркасный белок, отличный от IgG, и
b. детектирование комплекса ApoE4-связывающий агент, где указанный комплекс ApoE4-связывающий агент иммобилизован на указанной твердой фазе через ApoE4 или ApoE4 иммобилизован на указанной твердой фазе, и связывающий агент с ApoE4.
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения анализ обеспечивает осуществление способа детектирования ApoE4 или его фрагментов в образце крови субъекта, включающего следующие стадии:
а. контактирование указанного образца с твердой фазой,
контактирование указанного образца одновременно или последовательно, по меньшей мере, с одним связывающим агентом, который специфически связывается с ApoE4, с образованием тем самым комплекса ApoE4-связывающий агент, где указанный связывающий агент представляет антитело или функциональный фрагмент антитела или каркасный белок, отличный от IgG, и
b. детектирование комплекса ApoE4-связывающий агент, где указанный комплекс ApoE4-связывающий агент иммобилизован на указанной твердой фазе через ApoE4 или ApoE4 иммобилизован на указанной твердой фазе, где твердая фаза не покрыта каким-либо связывающим агентом или захватывающей молекулой и где связывание ApoE4 или комплекса ApoE4-связывающий агент с указанной твердой фазой происходит в присутствии детергента.
В контексте настоящего изобретения указанный анализ обеспечивает осуществление способа по настоящему изобретению, где комплекс ApoE4-связывающий агент иммобилизован на твердой фазе через ApoE4, и связывающий агент связан с ApoE4.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения указанный анализ обеспечивает осуществление способа по настоящему изобретению, где связывание ApoE4 с твердой фазой происходит без взаимодействия соединяющей молекулы (которая способна связывать/соединять ApoE4 или его фрагменты) с указанной твердой фазой).
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения указанный анализ обеспечивает осуществление способа по настоящему изобретению, где на время контактирования твердой фазы с образцом указанное контактирование происходит без взаимодействия указанной соединяющей молекулы.
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения указанный анализ обеспечивает осуществление способа по настоящему изобретению, где связывание ApoE4 с твердой фазой происходит в присутствии детергента.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения указанный анализ обеспечивает осуществление способа по настоящему изобретению, где концентрация детергента в реагенте предпочтительно составляет от 0,0001 до 10% (мас./об.) и особенно предпочтительно от 0,01 до 1% (мас./об.). Специалист в данной области знает, что можно предусматривать применение определенного диапазона концентраций для каждого конкретного детергента.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанный анализ обеспечивает осуществление способа по настоящему изобретению, где твин-20 используется в концентрации 0,001-10%, предпочтительно 0,01-1%, наиболее предпочтительно 0,2-0,5%. В еще одном варианте осуществления способа по настоящему изобретению тритон Х-100 используется в концентрации 0,001-0,5%, предпочтительно 0,01-0,2%, наиболее предпочтительно 0,05-0,1%.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанный анализ обеспечивает осуществление способа по настоящему изобретению, где связывающий агент специфически связывается с ApoE4 или его фрагментами.
7
-1
8
-1
9
-1
10
-1
В дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения указанный анализ обеспечивает осуществление способа по настоящему изобретению, где связывающий агент представляет антитело или функциональный фрагмент антитела или каркасный белок, отличный IgG, с константой аффинности связывания, по меньшей мере, 10 М, предпочтительно 10 М, предпочтительной константой аффинности выше 10 М, наиболее предпочтительно выше 10 М.
В более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанный анализ обеспечивает осуществление способа по настоящему изобретению, где связывающий агент помечен детектируемой меткой для детектирования после связывания с ApoE4.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанный анализ обеспечивает осуществление способа по настоящему изобретению, где метка связывающего агента выбрана из группы, включающей хемилюминесцентную метку, ферментную метку, флуоресцентную метку, метку на основе радиоактивного йода. Количество меченого антитела, связанного с аналитом, затем измеряют соответствующим методом.
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения указанный анализ обеспечивает осуществление способа по настоящему изобретению, где метка связывающего агента выбрана из группы, включающей криптаты редкоземельных металлов или хелаты редкоземельных металлов в сочетании с флуоресцентным красителем или хемилюминесцентным красителем, в частности, красителем цианинового типа.
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения указанный анализ обеспечивает осуществление способа по настоящему изобретению, где твердая фаза выбрана из группы, состоящей из полимерной поверхности (например, полистирола), стеклянной поверхности, целлюлозы и производных целлюлозы (например, нитроцеллюлозы, поливинилиденфторида, нейлона).
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения указанный анализ обеспечивает осуществление способа по настоящему изобретению, где твердая фаза выбрана из группы, состоящей из стеклянных или полимерных поверхностей, где полимерная поверхность включает, не ограничиваясь этим, полистирол, поли(дивинилбензол), стирол-акриловый сополимер, стирол-бутадиеновый сополимер, стирол-дивинилбензольный сополимер, поли(стирол-оксиэтилен), полиметилметакрилат, полиуретан, полиглутаральдегид, полиэтиленимин, поливинилпирролидон, N,N'-метилен-бис-акриламид, полиолефины, полиэтилен, политетрафторэтилен, полиэтилентерефталат, полипропилен, поливинилхлорид, поливинилацетат, полиакрилонитрил, полисульфон, поли(сульфоновый эфир), полидиметилсилоксан, пиролизованные материалы, блок-сополимеры и сополимеры вышеуказанных соединений, силиконы или диоксид кремния.
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения указанный анализ обеспечивает осуществление способа по настоящему изобретению, где твердая фаза является немодифицированной (чистой) или модифицированной для того, чтобы быть гидрофильной, гидрофобной или оптимизированной для связывания IgG (высокосвязывающая: гидрофильная и гидрофобная) физической бомбардировкой энергетическими частицами (ионами, электронами, быстрыми нейтралами и/или радикалами) и фотонами ультрафиолетового излучения и/или химическими реакциями на поверхности или рядом с ней (например, обработкой кислотой или обработкой органосиланами).
В еще одном конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанный анализ обеспечивает осуществление способа по настоящему изобретению, где поверхность твердой фазы используется в подходящих формах, таких как планшеты, мультилуночные планшеты, пробирки или шарики, пластины, пленки, частицы, магнитные или немагнитные частицы. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения форма поверхности твердой фазы представляет собой микротитрационный планшет.
В более конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанный анализ обеспечивает осуществление способа по настоящему изобретению, где образец крови субъекта контактирует с ненасыщенной твердой фазой. Это означает, что твердая фаза на время, когда она контактирует с образцом, не является насыщенной/покрытой блокирующими агентами и/или связывающими молекулами, и/или стабилизирующими белками и/или соединяющими молекулами.
Однако блокирующие агенты или стабилизирующие белки могут поддерживать имеющееся связывание ApoE4 или его фрагментов с твердой фазой и связывающим агентом, когда образец уже связан с твердой фазой, что означает, что стабилизирующие/блокирующие молекулы/белки могут необязательно присутствовать на время детектирования комплекса иммобилизованный ApoE4-связывающий агент (на заявленной стадии b).
В одном варианте осуществления настоящего изобретения указанный анализ обеспечивает осуществление способа по настоящему изобретению, где твердая фаза не покрыта каким-либо связывающим агентом или захватывающей молекулой. Как здесь используется, определение термина «связывающий агент», приведено выше.
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения указанный анализ обеспечивает осуществление способа по настоящему изобретению, где стабилизирующий белок поддерживает имеющееся связывание ApoE4 из образца крови с твердой фазой, где указанный белок может быть необязательно добавлен в реакционный буфер.
В одном дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения указанный анализ обеспечивает осуществление способа по настоящему изобретению, где стабилизирующий белок выбран из группы, включающей бычий сывороточный альбумин (BSA), человеческий сывороточный альбумин, казеин, молочные белки, иммуноглобулины, стабилизирующие аминокислоты (например, аланин, аргинин, глицин, изолейцин, лизин, пролин, серин) и тому подобное. Предпочтительным стабилизирующим белком является бычий сывороточный альбумин (BSA).
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения указанный анализ обеспечивает осуществление способа по настоящему изобретению, где концентрация BSA находится в диапазоне 0-10%, предпочтительно 0,2-5%, наиболее предпочтительно 0,5-2,5%.
В еще одном конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанный анализ обеспечивает осуществление способа по настоящему изобретению, где присутствие других белков, отличных от ApoE4, в образце крови не влияет на детектирование ApoE4 или его фрагментов.
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения указанный анализ обеспечивает осуществление способа по настоящему изобретению, где контактирование образца крови субъекта с твердой фазой и контактирование указанного образца, по меньшей мере, с одним связывающим агентом, который специфически связывается с ApoE4 или его фрагментом, происходит в одностадийной или двустадийной процедуре (см. пример 5).
В еще одном конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанный анализ обеспечивает осуществление способа по настоящему изобретению, где способ детектирования ApoE4 или его фрагментов, комплекса ApoE4-связывающий агент, детектирует качественно или количественно, где качественное детектирование комплекса ApoE4-связующий агент указывает на присутствие ApoE4 или его фрагментов в указанном образце, и где количественное определение комплекса ApoE4-связывающий агент указывает на концентрацию ApoE4 или его фрагментов в указанном образце.
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения указанный анализ обеспечивает осуществление способа по настоящему изобретению, где количественное определение концентрации ApoE4 показывает, насколько субъекты являются гомозиготными или гетерозиготными по аллелям ApoE4.
В еще одном конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанный анализ обеспечивает осуществление способа по настоящему изобретению, где присутствие комплекса ApoE4-связывающий агент коррелирует с риском развития/заболеваемости AD.
В одном конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанный анализ обеспечивает осуществление способа по настоящему изобретению, где детектирование ApoE4 или его фрагментов используется для определения риска развития болезни Альцгеймера (AD).
В еще одном конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанный анализ обеспечивает осуществление способа по настоящему изобретению, где детектирование ApoE4 или его фрагментов используется для прогнозирования риска заболеваемости болезнью Альцгеймера, а также медицинских последствий всех вышеуказанных заболеваний и инфекций.
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения указанный анализ обеспечивает осуществление способа по настоящему изобретению, где детектирование иммобилизованного ApoE4 в комплексе ApoE4-связывающий агент используется для классификации субъекта, как ApoE4-позитивного или ApoE4-негативного, когда уровень детектированного ApoE4 в комплексе ApoE4-связывающий агент выше определенного порогового значения, где указанное пороговое значение определяется конкретным значением внутреннего положительного контроля.
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения указанный анализ обеспечивает осуществление способа по настоящему изобретению, где уровень комплекса ApoE4-связывающий агент выше определенного порогового значения является прогностическим для повышенного риска заболеваемости AD, где указанное пороговое значение определяется внутренним контролем отсечения.
Согласно способу по настоящему изобретению ApoE4-позитивные образцы крови субъектов со значением выше, чем уровень отсечения, где отсечение определяют измерением ApoE4-негативного образца и ApoE4-позитивного образца и вычислением отношения.
В одном варианте осуществления отношение рассчитывается следующим образом:
нег
поз
[Сигнал]CO+коэффициент X, умноженный на [Сигнал]CO, где коэффициент равен >0 и <1.
Согласно способу по настоящему изобретению в одном варианте осуществления ApoE4-позитивные образцы крови субъектов имеют значение выше, чем уровень отсечения (порогового значения), где пороговое значение определяют измерением сигнала отрицательного контроля ApoE4 и вычислением от 1,5- до 100000-кратного сигнала, более предпочтительно от 10- до 50000-кратного сигнала, еще более предпочтительно от 20- до 20000-кратного сигнала, наиболее предпочтительно от 50- до 10000-кратного сигнала, наиболее предпочтительно от 100- до 1000-кратного сигнала. Согласно способу по настоящему изобретению ApoE4-позитивные образцы крови субъектов имеют значение выше, чем уровень отсечения (порогового значения), где пороговое значение определяют измерением сигнала положительного контроля ApoE4 и умножением значения сигнала на коэффициент > 0 и <1, более предпочтительно >0,01 и <0,8, еще более предпочтительно >0,05 и <0,5, наиболее предпочтительно >0,1 и <0,25.
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения анализ используется для определения уровня ApoE4 и его фрагментов, содержащих, по меньшей мере, 6 аминокислот, где чувствительность определения в указанном анализе позволяет детектировать/количественно определять ApoE4 и его фрагменты в образце крови субъектов, и она составляет <1 нг/мл, предпочтительно <5 нг/мл, более предпочтительно <10 нг/мл и еще более предпочтительно <25 нг/мл.
Предметом изобретения также является анализ, который обеспечивает осуществление способа по настоящему изобретению, где уровень ApoE4 или его фрагментов измеряют с использованием иммуноанализа, включающего один или несколько захватывающих зондов, направленных против одного или нескольких эпитопов ApoE4 или их фрагментов.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения указанный иммуноанализ выбран из группы, включающей радиоиммуноанализ (RIA), гомогенный иммуноферментный иммуноанализ (EMIT), твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), иммуноанализ с реактивацией апофермента (ARIS), иммуноанализ с тест-полоской и иммунохроматографические анализы.
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения таким анализом может быть так называемый POC-тест (анализ на месте лечения), который представляет технологию тестирования, которая позволяет выполнять анализ в течение менее 1 ч рядом с пациентом без необходимости в полностью автоматизированной системы анализа. Одним из примеров этой технологии является технология иммунохроматографического анализа.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения таким анализом является иммуноанализ методом одного антитела с применением любого типа технологии детектирования, включая, не ограничиваясь этим, ферментную метку, хемилюминесцентную метку, электрохемилюминесцентную метку, предпочтительно полностью автоматизированный анализ. Примеры автоматизированного или полностью автоматизированного анализа включают анализы, которые можно использовать для одной из следующих систем: Roche Elecsys, Abbott Architect, Siemens Centauer, Brahms Kryptor, Biomerieux Vidas, Alere Triage.
Еще одним предметом настоящего изобретения является анализ, который обеспечивает осуществление способа по настоящему изобретению, включающий тестовые компоненты:
а. один связывающий агент, направленный против эпитопа, входящего в последовательность ApoE4 или его фрагментов, где связывающий агент помечен детектируемой меткой,
b. твердую фазу (например, планшет, пробирку, шарики, пластину),
с. реакционный буфер, содержащий детергент.
Еще один вариант осуществления настоящего изобретения представляет анализ, который обеспечивает осуществление способа по настоящему изобретению, включающий:
а. один связывающий агент, направленный против эпитопа, входящего в последовательность ApoE4 или его фрагментов, где связывающий агент помечен детектируемой меткой,
b. полимерную или стеклянную твердую фазу, предпочтительно высокосвязывающий полистирольный микропланшет,
с. реагент, который содержит детергент, предпочтительно 0,2% твина-20.
Анализ может дополнительно включать контроли:
необходим, по меньшей мере, один из следующих контролей: отрицательный контроль, контроль отсечения и положительный контроль,
контроли могут представлять образцы с известной концентрацией ApoE4 (нативного, очищенного или рекомбинантного).
Еще один вариант осуществления настоящего изобретения представляет анализ, который обеспечивает осуществление способа по настоящему изобретению, для количественного определения ApoE4 или его фрагментов в образце субъекта, включающий:
а. один связывающий агент, направленный против эпитопа, входящего в последовательность ApoE4 или его фрагментов, где связывающий агент помечен детектируемой меткой,
b. полимерную или стеклянную твердую фазу, предпочтительно высокосвязывающий полистирольный микропланшет,
с. реагент, который содержит детергент, предпочтительно 0,2% твина-20.
Анализ может дополнительно включать один или несколько калибраторов:
калибратором могут быть образцы с известной концентрацией ApoE4 (нативного, очищенного или рекомбинантного).
Еще один вариант осуществления настоящего изобретения представляет анализ, который обеспечивает способ детектирования ApoE4 или его фрагментов, состоящий из:
одного связывающего агента, направленного против эпитопа, входящего в последовательность ApoE4 или его фрагментов, содержащих, по меньшей мере, 6 аминокислот, где связывающий агент помечен детектируемой меткой,
полимерной или стеклянной твердой фазы, предпочтительно высокосвязывающего полистирольного микропланшета,
реагента, который содержит детергент, предпочтительно 0,2% твина-20,
контролей и/или калибраторов,
промывочного буфера,
реагентов для измерения.
Еще одним предметом настоящего изобретения является набор для детектирования ApoE4 или его фрагментов в образце крови субъекта.
Как указано в данном документе, «набор» представляет собой коробку, содержащую комбинацию материалов, которые необходимы для осуществления способа по настоящему изобретению, в частности, детектирования ApoE4 и его фрагментов в образце крови субъекта.
Еще одним предметом настоящего изобретения является набор для детектирования ApoE4 и его фрагментов в образце крови субъекта, содержащий:
а. один связывающий агент, направленный против эпитопа, входящего в последовательность ApoE4 или его фрагментов, где связывающий агент помечен детектируемой меткой,
b. твердую фазу (например, планшет, пробирку, шарики, пластину),
с. реакционный буфер, содержащий детергент.
Еще один вариант осуществления настоящего изобретения представляет набор для детектирования ApoE4 и его фрагментов в образце крови субъекта, содержащий:
один связывающий агент, направленный против эпитопа, входящего в последовательность ApoE4 или его фрагментов, где связывающий агент помечен детектируемой меткой,
полимерную или стеклянную твердую фазу, предпочтительно высокосвязывающий полистирольный микропланшет,
реагент, который содержит детергент, предпочтительно 0,2% твина-20.
Набор может дополнительно содержать контроли:
необходим, по меньшей мере, один из следующих контролей: отрицательный контроль, контроль отсечения и положительный контроль,
контролями могут быть образцы с известной концентрацией ApoE4 (нативного, очищенного или рекомбинантного).
Еще один вариант осуществления настоящего изобретения представляет набор для количественного определения ApoE4 или его фрагментов в образце субъекта, содержащий:
один связывающий агент, направленный против эпитопа, входящего в последовательность ApoE4 или его фрагментов, где связывающий агент помечен детектируемой меткой,
полимерную или стеклянную твердую фазу, предпочтительно высокосвязывающий полистирольный микропланшет,
реагент, который содержит детергент, предпочтительно 0,2% твина-20.
Набор может дополнительно содержать один или несколько калибраторов:
калибратором могут быть образцы с известной концентрацией ApoE4 (нативного, очищенного или рекомбинантного).
Еще одним вариантом осуществления настоящего изобретения является набор для детектирования ApoE4 или его фрагментов в образце крови субъекта, состоящий из:
одного связывающего агента, направленного против эпитопа, входящего в последовательность ApoE4 или его фрагментов, содержащих, по меньшей мере, 6 аминокислот, где связывающий агент помечен детектируемой меткой,
полимерной или стеклянной твердой фазы, предпочтительно высокосвязывающего полистирольного микропланшета,
реагента, который содержит детергент, предпочтительно 0,2% твина-20,
контролей и/или калибраторов,
промывочного буфера,
реагентов для измерения.
Еще одним вариантом осуществления настоящего изобретения является применение связывающего агента для детектирования ApoE4 или его фрагментов в образце крови субъекта, включающее стадии:
а. контактирование указанного образца с твердой фазой,
контактирование указанного образца одновременно или последовательно, по меньшей мере, с одним связывающим агентом, который специфически связывается с ApoE4, с образованием тем самым комплекса ApoE4-связывающий агент, где указанный связывающий агент представляет антитело или функциональный фрагмент антитела или каркасный белок, отличный от IgG, и
b. детектирование комплекса ApoE4-связывающий агент, где указанный комплекс ApoE4-связывающий агент иммобилизован на указанной твердой фазе через ApoE4 или ApoE4 иммобилизован на указанной твердой фазе и связывающий агент с ApoE4.
Еще одним вариантом осуществления настоящего изобретения является применение связывающего агента для детектирования ApoE4 или его фрагментов в образце крови субъекта, включающее стадии:
а. контактирование указанного образца с твердой фазой,
контактирование указанного образца одновременно или последовательно, по меньшей мере, с одним связывающим агентом, который специфически связывается с ApoE4, с образованием тем самым комплекса ApoE4-связывающий агент, где указанный связывающий агент представляет антитело или функциональный фрагмент антитела или каркасный белок, отличный от IgG, и
b. детектирование комплекса ApoE4-связывающий агент, где указанный комплекс ApoE4-связывающий агент иммобилизован на указанной твердой фазе через ApoE4 или ApoE4 иммобилизован на указанной твердой фазе, где твердая фаза не покрыта указанным связывающим агентом или захватывающей молекулой и где связывание ApoE4 или комплекса ApoE4-связывающий агент с указанной твердой фазой происходит в присутствии детергента.
В контексте настоящего изобретения заявление о применении связывающего агента в способе по настоящему изобретению является синонимом заявленного способа по настоящему изобретению, включающего все вышеуказанные варианты осуществления.
Следующие варианты осуществления также являются предметом настоящего изобретения:
1. Способ (in vitro) детектирования аполипопротеина Е изотипа 4 (ApoE4) или его фрагментов в образце крови субъекта, включающий стадии:
а. контактирование указанного образца с твердой фазой,
контактирование указанного образца одновременно или последовательно, по меньшей мере, с одним связывающим агентом, который специфически связывается с ApoE4, с образованием тем самым комплекса ApoE4-связывающий агент, где указанный связывающий агент представляет антитело или функциональный фрагмент антитела или каркасный белок, отличный от IgG, и
b. детектирование комплекса ApoE4-связывающий агент, где указанный комплекс ApoE4-связывающий агент иммобилизован на указанной твердой фазе через ApoE4.
2. Способ (in vitro) детектирования аполипопротеина Е изотипа 4 (ApoE4) или его фрагментов в образце крови субъекта, включающий стадии:
а. контактирование указанного образца с твердой фазой,
контактирование указанного образца одновременно или последовательно, по меньшей мере, с одним связывающим агентом, который специфически связывается с ApoE4, с образованием тем самым комплекса ApoE4-связывающий агент, где указанный связывающий агент представляет антитело или функциональный фрагмент антитела или каркасный белок, отличный от IgG, и
b. детектирование комплекса ApoE4-связывающий агент, где указанный комплекс ApoE4-связывающий агент иммобилизован на указанной твердой фазе, где твердая фаза не покрыта указанным связывающим агентом или захватывающей молекулой и где связывание ApoE4 или комплекса ApoE4-связывающий агент с указанной твердой фазой происходит в присутствии детергента.
3. Способ согласно вариантам осуществления 1 или 2, где ApoE4 или его фрагменты иммобилизованы на указанной твердой фазе, и связывающий агент связан с ApoE4.
4. Способ согласно вариантам осуществления 1-3, где фрагменты ApoE4 содержат, по меньшей мере, 6 аминокислот в длину при условии, что аминокислота 158 (аргинин) входит в указанный фрагмент, где последовательность, включающая аминокислоту 158, относится к SEQ ID NO:1.
5. Способ согласно вариантам осуществления 1-4, где связывание ApoE4 или комплекса ApoE4-связывающий агент с указанной твердой фазой происходит без взаимодействия соединяющей молекулы, которая способна связывать ApoE4 или его фрагменты с указанной твердой фазой.
6. Способ согласно вариантам осуществления 1-5, где на время контактирования твердой фазы с образцом указанное контактирование происходит без взаимодействия указанной соединяющей молекулы.
7. Способ согласно вариантам осуществления 1-6, где связывание ApoE4 или комплекса ApoE4-связывающий агент с указанной твердой фазой происходит в присутствии детергента.
8. Способ согласно вариантам осуществления 1-7, где комплекс ApoE4-связывающий агент детектируется качественно или количественно.
9. Способ согласно вариантам осуществления 1-8, где количественное определение комплекса ApoE4-связывающий агент указывает на концентрацию ApoE4 в указанном образце, где концентрация показывает, насколько субъекты являются гомозиготными или гетерозиготными по аллелям ApoE4.
7
-1
8
-1
9
-1
10
-1
10. Способ согласно вариантам осуществления 1-9, где связывающий агент представляет антитело или функциональный фрагмент антитела или каркасный белок, отличный от IgG, с константой аффинности связывания, по меньшей мере, 10 М, предпочтительно 10 М, предпочтительной константой аффинности выше 10 М, наиболее предпочтительно выше 10 М.
11. Способ согласно вариантам осуществления 1-10, где связывающий агент помечен меткой для детектирования, где указанная метка выбрана из группы, включающей хемилюминесцентную метку, ферментную метку, флуоресцентную метку или метку на основе радиоактивного йода.
12. Способ согласно вариантам осуществления 1-11, где детектирование ApoE4 используется для классификации субъекта, как ApoE4-позитивного или ApoE4-негативного, когда уровень детектированного ApoE4 выше определенного порогового значения, где указанное пороговое значение определяется конкретным значением внутреннего положительного контроля.
13. Способ согласно вариантам осуществления 1-12, где твердая фаза выбрана из группы, состоящей из полимерной поверхности (например, полистирола), стеклянной поверхности, целлюлозы и производных целлюлозы (например, нитроцеллюлозы, поливинилиденфторида, нейлона).
14. Способ согласно вариантам осуществления 1-13, где твердая фаза выбрана из группы стеклянных или полимерных поверхностей, где полимерная поверхность включает, не ограничиваясь этим, полистирол, поли(дивинилбензол), стирол-акриловый сополимер, стирол-бутадиеновый сополимер, стирол-дивинилбензольный сополимер, поли(стирол-оксиэтилен), полиметилметакрилат, полиуретан, полиглутаральдегид, полиэтиленимин, поливинилпирролидон, N,N'-метилен-бис-акриламид, полиолефины, полиэтилен, политетрафторэтилен, полиэтилентерефталат, полипропилен, поливинилхлорид, поливинилацетат, полиакрилонитрил, полисульфон, поли(сульфоновый эфир), полидиметилсилоксан, пиролизованные материалы, блок-сополимеры и сополимеры вышеуказанных соединений, силиконы или диоксид кремния.
15. Способ согласно вариантам осуществления 1-14, где указанный образец крови контактирует с ненасыщенной твердой фазой.
16. Способ согласно вариантам осуществления 1-15, где твердая фаза не покрыта каким-либо связывающим агентом или захватывающей молекулой.
17. Способ согласно вариантам осуществления 1-16, где необязательный стабилизирующий белок в реакционном буфере стабилизирует связывание ApoE4 и его фрагментов в образце крови с твердой фазой посредством блокирования сайтов неспецифического связывания и взаимодействия с конформацией ApoE4, где стабилизирующий белок выбран из группы, включающей бычий сывороточный альбумин (BSA), человеческий сывороточный альбумин, казеин, молочные белки, иммуноглобулины, стабилизирующие аминокислоты (например, аланин, аргинин, глицин, изолейцин, лизин, пролин, серин), и предпочтительно стабилизирующим белком является бычий сывороточный альбумин (BSA).
18. Способ согласно вариантам осуществления 1-17, где концентрация BSA в качестве стабилизирующего белка находится в диапазоне 0-10%, предпочтительно, 0,2-5%, наиболее предпочтительно 0,5-2,5%.
19. Способ согласно вариантам осуществления 1-18, где детергент выбран из группы анионных детергентов (например, додецилсульфата натрия (SDS)), катионных детергентов (например, цетилтриметиламмония бромида (CTAB)), цвиттер-ионных детергентов (например, CHAPS) и/или неионных детергентов (например, твина-20, тритона X-100).
20. Способ согласно вариантам осуществления 1-19, где концентрация твина-20 выбрана в диапазоне 0,001-10%, предпочтительно 0,01-1%, наиболее предпочтительно 0,2-0,5%.
21. Способ согласно вариантам осуществления 1-20, где концентрация тритона Х-100 выбрана в диапазоне 0,001-0,5%, предпочтительно 0,01-0,2%, наиболее предпочтительно 0,05-0,1%.
22. Способ согласно любому из предшествующих вариантов осуществления, где образец крови выбран из группы цельной крови, сыворотки и цитратной плазмы, гепаринизированной плазмы, ЭДТА-плазмы.
23. Способ согласно любому из предшествующих вариантов осуществления, где субъект выбран из группы, включающей живого человека или организм человека, предпочтительно субъекта-человека, где субъект является здоровым, предположительно здоровым, страдающим когнитивным нарушением, деменцией, в частности, AD.
24. Набор, содержащий:
а. один связывающий агент, направленный против эпитопа, входящего в последовательность ApoE4 или его фрагментов, где связывающий агент помечен детектируемой меткой,
b. твердую фазу (например, планшет, пробирку, шарики, пластину),
с. реакционный буфер, содержащий детергент.
25. Применение набора согласно любому из предшествующих вариантов осуществления для детектирования и/или количественного определения ApoE4 или его фрагментов in vitro в образце крови субъекта.
26. Применение способа согласно любому из предшествующих вариантов осуществления для стратификации риска или стратификации применения терапевтических мероприятий для заболевания или патологического состояния, ассоциированного с повышенными уровнями ApoE4.
27. Применение способа согласно любому из предшествующих вариантов осуществления, где заболевание или патологическое состояние выбрано из группы когнитивного нарушения и нейродегенеративных заболеваний, включая деменцию и/или болезнь Альцгеймера (AD).
28. Способ согласно любому из предшествующих вариантов осуществления для выявления риска развития AD, где повышенный уровень ApoE4 выше определенного порогового значения является прогностическим для повышенного риска развития AD.
29. Способ согласно любому из предшествующих вариантов осуществления, где указанное присутствие ApoE4 или комплекса ApoE4-связывающий агент коррелирует с риском развития/заболеваемости AD.
Примеры
Пример 1
Получение антител и определение их констант аффинности
- Пептиды/конъюгаты для иммунизации:
Синтезировали специфический пептид ApoE4 для иммунизации и специфический контрольный пептид ApoE2/3, см. таблицу 1 (JPT Technologies, Берлин, Германия). Пептид ApoE4 синтезировали с дополнительным N-концевым остатком цистеина для обеспечения конъюгации пептида с бычьим сывороточным альбумином (BSA). Пептид ковалентно связывали с BSA с использованием связывающего геля Sulfolink (Perbio-science, Бонн, Германия). Процедуру сочетания выполняли в соответствии с руководством Perbio.
Таблица 1
<b>Пептиды</b>
<b>Область ApoE</b>
<b>Описание</b>
<b>Константа аффинности </b><b>[M</b><sup><b>-1</b></sup><b>]</b>
Cys-EDVRGRLVQYR
109-119 ApoE4
Иммуноген
2,1 × 10<sup>9</sup>
EDVCGRLVQYR
109-119 ApoE2/3
Контрольный пептид
-
- Иммунизация мышей, слияние иммунных клеток и скрининг:
Мышей Balb/c иммунизировали 100 мкг конъюгата пептид-BSA на сутки 0 и 14 (эмульгировали в 100 мкл полного адъюванта Фрейнда) и 50 мкг на сутки 21 и 28 (в 100 мкл неполного адъюванта Фрейнда). За 3 суток до проведения эксперимента по слиянию животные получали 50 мкг конъюгата, растворенного в 100 мкл физиологического раствора, в виде одной внутрибрюшинной и одной внутривенной инъекции.
Спленоциты от иммунизированных мышей и клетки миеломной клеточной линии SP2/0 подвергали слиянию с 1 мл 50% полиэтиленгликоля в течение 30 с при 37°С. После промывания клетки высевали в 96-луночные планшеты для культивирования клеток. Гибридные клоны селектировали культивированием в среде HAT [культуральная среда RPMI 1640, с добавлением 20% эмбриональной сыворотки теленка и добавки HAT]. Через две недели среду HAT заменяли средой HT на три пассажа с последующим возвратом в нормальную среду для культивирования клеток.
Супернатанты клеточных культур подвергали первичному скринингу на антигенспецифичные IgG антитела через три недели после слияния. Положительные тестированные микрокультуры переносили в 24-луночные планшеты для размножения. После повторного тестирования выбранные культуры клонировали и реклонировали с использованием метода предельных разведений, и определяли изотипы (Lane et al., 1985, Ziegler et., al. 1996).
- Получение моноклональных антител
Антитела получали с использованием стандартных методов получения антител (Marx et al., 1997) и очищали с помощью белка А. Чистота антител составляла >95% на основе результатов анализа электрофорезом в SDS-геле.
- Константы аффинности
Для определения аффинности антитела к ApoE4, исследовали кинетику связывания рекомбинантного ApoE4 с иммобилизованным антителом с помощью поверхностного плазмонного резонанса без меток с использованием системы Biacore 2000 (GE Healthcare Europe GmbH, Фрейбург, Германия). Обратимую иммобилизацию антител проводили с использованием антитела против мышиного Fc, ковалентно связанного с высокой плотностью с поверхностью сенсора CM5, в соответствии с инструкциями производителя (набор для захвата мышиных антител; GE Healthcare).
- Процедура мечения (индикатор)

100 мкг (100 мкл) антитела (1 мг/мл в PBS, pH 7,4) смешивали с 10 мкл NHS-эфира акридиния (1 мг/мл в ацетонитриле, InVent GmbH, Германия; ЕР 0 353 971) и инкубировали в течение 20 мин при комнатной температуре. Меченые антитела очищали гель-фильтрационной ВЭЖХ на Bio-Sil SEC 400-5 (Bio-Rad Laboratories, Inc., США). Очищенные меченые антитела разбавляли (300 ммоль/л фосфата калия, 100 ммоль/л NaCl, 10 ммоль/л Na-ЭДТА, 5 г/л бычьего сывороточного альбумина, pH 7,0). Конечная концентрация составляла примерно 800000 относительных световых единиц (RLU) меченого соединения (примерно 20 нг меченого антитела) на 200 мкл. Хемилюминесценцию эфира акридиния измеряли с использованием AutoLumat LB 953 (Berthold Technologies GmbH & Co. KG).
Пример 2
Анализ образцов плазмы с известным генотипом. Используя соответствующие плазму и цельную кровь, можно генетически анализировать статус ApoE генотипированием и измерением уровней ApoE4 в соответствующей плазме с помощью анализа ApoE4 по настоящему изобретению.
2.1 Методы
- Генотипирование
Генетический анализ 180 образцов цельной крови проводили Medigenomix, Ebersberg, Deutschland. ДНК из образцов выделяли и ген ApoE секвенировали, используя секвенирование по Сэнгеру (Sanger & Coulson 1975).
- Процедура анализа ApoE4
Анализ методом одного антитела к ApoE4 проводили одностадийной процедурой. Образцы плазмы непосредственно пипетировали в лунки 96-луночного микротитрационного планшета (Greiner, Lumitrac600, высокосвязывающий полистирол; из расчета 20 мкл образца на лунку) в двух повторах. В каждый микропланшет добавляли контроль отсечения с низким уровнем ApoE4 (рекомбинантный ApoE4 [4 мкг/мл] в ApoE4-негативной плазме человека, 20 мкл на лунку, в двух повторах). В лунки вносили 200 мкл реакционного буфера (PBS с 0,2% твина-20, 1% BSA, 0,1% бычьего IgG, 0,1% овечьего IgG и 0,02% мышиного IgG, pH 7,4) с меченым эфиром акридиния анти-ApoE4-антителом (индикатор). Микропланшеты инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Несвязанный индикатор удаляли, промывая 4 раза раствором для промывания (20 мМ PBS, pH 7,4, 0,1% тритона X-100). Люминесценцию (в относительных световых единицах (RLU)) измеряли с использованием люминометра MTP (Centro LB960, Berthold Technologies GmbH, Bad Wildbad).
2.2 Результаты
На фиг. 1a приведены результаты анализа ApoE4, дифференцированные по генотипу. С помощью контроля отсечения можно легко разделить ApoE4-позитивные и ApoE4-негативные образцы по значениям RLU. Все ApoE4-негативные образцы имеют значения RLU ниже 3000 RLU, и все ApoE4-позитивные образцы имеют значения RLU выше 3000 RLU. Отрицательные образцы в основном показывают только фоновый сигнал в иммунном анализе, и отсутствие сигнала ApoE4. На фиг. 1b приведена соответствующая ROC-кривая. С использованием площади под кривой (AUC), равной 1, анализ точно дифференцирует ApoE4-позитивные и ApoE4-негативные образцы.
Пример 3
Анализ связывания ApoE4 с различными полимерными и стеклянными поверхностями с/без детергента.
3.1 Методы
- Предварительная инкубация образцов плазмы на полимерных или стеклянных поверхностях:
Каждый ApoE4-позитивный образец плазмы разделяли на аликвотные порции по 120 мкл, которые инкубировали в пробирках из разных материалов (полистирола (PS), полипропилена (PP), полиэтилентерефталата (PET) и стекла), по две пробирки на каждый материал. К одной половине аликвотных порций до инкубации добавляли 0,1% тритона Х-100, и другую половину обрабатывали равным объемом PBS. Все пробирки инкубировали при комнатной температуре в течение ночи.
- Анализ методом одного антитела к ApoE4
20 мкл каждого препарата, а также контроля без предварительной инкубации, пипеткой вносили в высокосвязывающий микротитрационный планшет Greiner из расчета на лунку. Затем проводили анализ ApoE4, как описано в примере 2. Измеренную концентрацию ApoE4 рассчитывали относительно концентрации в соответствующем контрольном образце (определенном как 100%).
3.2 Результаты
Образцы, обработанные детергентом, показывали существенное снижение уровня ApoE4 после предварительной инкубации в полимерных или стеклянных пробирках, потеря составляла примерно 50% (см. фиг. 2). Различия между типом поверхности, на которой образцы предварительно инкубировали, отсутствовали. После предварительной инкубации образцов, не обработанных детергентом, наблюдали незначительную потерю сигнала ApoE4, но не такую значимую, как при использовании детергента.
Детергент усиливал связывание ApoE4 с полимерными или стеклянными поверхностями.
Пример 4
Анализ того, насколько детергенты функционируют в качестве соединяющих молекул между ApoE4 и твердой фазой.
4.1 Методы
- Покрытие микротитрационных планшетов (МТП)
2
2
2
В три высокосвязывающих микротитрационных планшета Greiner вносили 300 мкл на лунку либо ddHO, 0,05% раствора тритона X-100 в ddHO или 0,4% раствора тритона X-100 в ddHO (по одному планшету на каждый вариант). Планшеты инкубировали в течение ночи при комнатной температуре. После этого МТР трижды промывали 1×PBS и непосредственно использовали для одностадийного анализа методом одного антитела к ApoE4.
- Анализ методом одного антитела к ApoE4
20 мкл плазмы ApoE4-позитивных и ApoE4-негативных образцов, а также контроль отсечения (4 мкг/мл рекомбинантного ApoE4 в плазме человека) пипеткой вносили в предварительно обработанные высокосвязывающие микропланшеты Greiner из расчета на лунку. Половину лунок заполняли 200 мкл буфера с индикатором (PBS с 1% BSA, 0,1% бычьего IgG, 0,1% овечьего IgG и 0,02% мышиного IgG, pH 7,4 + меченное эфиром акридиния анти-ApoE4-антитело), содержащего 0,05% тритона Х-100, и другую половину заполняли тем же буфером с индикатором, но без детергента (0% тритона Х-100). Микропланшеты инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Несвязанный индикатор удаляли, промывая 4 раза раствором для промывания (20 мМ PBS, pH 7,4, 0,1% тритона X-100). Люминесценцию (в относительных световых единицах (RLU)) измеряли с использованием люминометра MTP (Centro LB960, Berthold Technologies GmbH, Bad Wildbad).
4.2 Результаты
Если детергенты будут функционировать в качестве соединяющей молекулы между ApoE4 и твердой фазой, то должен быть сильный сигнал, когда анализ ApoE4 проводится на планшетах, обработанных детергентом, без какого-либо детергента в аналитическом буфере, возможно, даже в зависимости от концентрации. Но это был не тот вариант. Все образцы, а также контроль отсечения, не показывали сигнала на любом предварительно обработанном планшете, когда анализ проводили в аналитическом буфере без детергента (см. фиг. 3). Сигналы как ApoE4-позитивных, так и ApoE4-негативных образцов находились на базовой линии на одном уровне и, следовательно, их невозможно было дифференцировать друг от друга. Напротив, когда анализ проводили с присутствием детергента в аналитическом буфере, то в ApoE4-позитивных образцах и контроле отсечения появлялся значительный сигнал. Этот сигнал также не зависел от количества тритона X-100, связанного с MTP.
Детергент является необходимым компонентом буфера в анализе ApoE4. Покрытие детергентом MTP и добавление образца и буфера, не содержащего детергент, не приводит к достоверному сигналу. Это показывает, что детергент в большей степени необходим в его подвижной форме, а не в иммобилизованной форме, возможно в качестве соединяющей молекулы.
Пример 5
- Процедура одностадийного анализа
Анализ методом одного антитела к ApoE4 проводили, как описано в примере 2. В одностадийной процедуре образцы и индикаторное антитело инкубировали вместе в течение 1 ч при комнатной температуре. Люминесценцию (в относительных световых единицах (RLU)) измеряли с использованием люминометра MTP (Centro LB960, Berthold Technologies GmbH, Bad Wildbad). При добавлении в каждый микропланшет был контроль отсечения с низким уровнем ApoE4 (рекомбинантный ApoE4 [4 мкг/мл] в ApoE4-негативной плазме человека; 20 мкл на лунку, в двух повторах).
- Двустадийная процедура анализа
В двустадийной процедуре образцы плазмы непосредственно пипетировали в лунки 96-луночного микротитрационного планшета (Greiner, Lumitrac600, высокосвязывающий полистирол; 20 мкл образца на лунку) в двух повторах. При добавлении в каждый микропланшет был контроль отсечения с низким уровнем ApoE4 (рекомбинантный ApoE4 [4 мкг/мл] в ApoE4-негативной плазме человека; 20 мкл на лунку, в двух повторах). Лунки заполняли 200 мкл реакционного буфера (PBS с 0,2% твина-20, 1% BSA, 0,1% бычьего IgG, 0,1% овечьего IgG и 0,02% мышиного IgG, pH 7,4). Микропланшеты инкубировали в течение ночи при комнатной температуре (= стадия 1). После этого микропланшеты промывали 4 раза раствором для промывания (20 мМ PBS, pH 7,4, 0,1% тритона X-100) и 200 мкл реакционного буфера с меченым эфиром акридиния анти-ApoE4-антителом вносили в лунки. Микропланшеты инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре (= стадия 2) и снова промывали 4 раза раствором для промывания. Люминесценцию (в относительных световых единицах (RLU)) измеряли с использованием люминометра MTP (Centro LB960, Berthold Technologies GmbH, Bad Wildbad).
Для более прямого сравнения двух вариантов процедуры анализа значения RLU преобразовывали в относительные единицы «кратность изменения по сравнению с контролем отсечения».
5.2 Результаты
В данном случае короткую (1 ч) одностадийную процедуру сравнивали с длинной (в течение ночи/2 ч) двустадийной процедурой. Относительные световые единицы (RLU) одностадийного анализа были примерно в десять раз ниже, чем RLU в двустадийном анализе (см. таблицу 2). Но это отношение было верным только для каждого ApoE4-позитивного образца и контроля отсечения. Значения для ApoE4-негативных образцов оставались одинаково низкими в любом формате анализа. Значения для образцов относительно внутреннего контроля отсечения были примерно одинаковыми в каждом анализе (см. фиг. 4), и с помощью каждого анализа можно было дифференцировать ApoE4-позитивные от ApoE4-негативных образцов.
Таблица 2
<b>ApoE4 статус</b>
<b>Образцы</b>
<b>Одностадийный анализ</b>
<b>Двустадийный анализ</b>
<b>RLU</b>
<b>кратность изменения по сравнению с контролем отсечения</b>
<b>RLU</b>
<b>кратность изменения по сравнению с контролем отсечения</b>
позитивный
P1
16,126
2,75
162,422
3,19
P2
19,917
3,40
217,180
4,26
P3
17,034
2,91
126,767
2,49
P4
9,665
1,65
98,857
1,94
негативный
P5
79
0,0135
88
0,0017
P6
71
0,0121
62
0,0012
кратность изменения по сравнению с контролем отсечения
5,861
1,00
50,986
1,00
Пример 6
Влияние блокирующего/стабилизирующего агента (BSA) на связывание ApoE4 с твердой фазой.
6.1 Методы
Анализ ApoE4 проводили двустадийной процедурой, где первую стадию (связывание ApoE4 с твердой фазой) проводили в присутствии или в отсутствии BSA. Вторую стадию (связывание анти-ApoE4-антитела с иммобилизованным ApoE4) проводили в аналитическом буфере, содержащем 1% BSA.
Образцы плазмы и контроль отсечения с низким уровнем ApoE4 (рекомбинантный ApoE4 [4 мкг/мл] в ApoE4-негативной плазме человека) непосредственно пипетировали в лунки 96-луночного микротитрационного планшета (Greiner, Lumitrac600 высокосвязывающий полистирол; 20 мкл образца на лунку). В лунки вносили 200 мкл реакционного буфера (PBS с 0,2% твина-20, 0,1% бычьего IgG, 0,1% овечьего IgG и 0,02% мышиного IgG, pH 7,4), который содержал 1% BSA или не содержал BSA (0% BSA). Микропланшеты инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре (= стадия 1). После этого микропланшеты промывали 4 раза раствором для промывания (20 мМ PBS, pH 7,4, 0,1% тритона X-100) и 200 мкл 1% BSA-содержащего реакционного буфера с меченым эфиром акридиния анти-ApoE4-антителом вносили в лунки. Микропланшеты инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре (= стадия 2) и снова промывали 4 раза раствором для промывания. Люминесценцию (в относительных световых единицах (RLU)) измеряли с использованием люминометра MTP (Centro LB960, Berthold Technologies GmbH, Bad Wildbad).
6.2 Результаты
Сигналы образцов, инкубированных в буфере без BSA, были достоверно ниже, чем с присутствием BSA в реакционной смеси (см. таблицу 3, фиг.5). С помощью обоих вариантов анализа было возможным дифференцировать ApoE4-позитивные и ApoE4-негативные образцы с использованием контроля отсечения. Следовательно, BSA не является необходимым для связывания ApoE4, но неожиданно он существенно усиливал связывание ApoE4 с твердой фазой и, таким образом, можно необязательно добавлять его в реакционный буфер для усиления сигналов. Такой результат является неожиданным, поскольку BSA обычно используется для блокирования неспецифических сигналов и часто сопровождается более низкими сигналами после добавления BSA.
Таблица 3
<b>ApoE4 статус</b>
<b>Образцы</b>
<b>Одностадийный анализ</b>
<b>Двустадийный анализ</b>
<b>RLU</b>
<b>кратность изменения по сравнению с контролем отсечения</b>
позитивный
A1
69,708
9,76
253,321
10,15
A2
40,772
5,71
278,431
11,16
A3
20,839
2,92
187,286
7,51
A4
75,446
10,57
271,817
10,89
A5
44,542
6,239
297,033
11,906
A6
84,069
11,776
239,914
9,616
негативный
A7
472
0,066
2,776
0,111
A8
401
0,056
244
0,010
A9
119
0,017
97
0,004
кратность изменения по сравнению с контролем отсечения
7.139
1
24,949
1
Пример 7
Количественное определение ApoE4 в образцах плазмы.
7.1 Методы
Анализ ApoE4 проводили, как описано в примере 2. Для количественного определения уровней ApoE4 в плазме использовали калибраторы. Рекомбинантный ApoE4 последовательно разводили в ApoE4-негативной плазме человека с получением калибровочной кривой в диапазоне концентраций 0,01-21,87 мкг/мл. Концентрацию ApoE4 в образцах рассчитывали с использованием калибровочной кривой на основе линейной регрессии. Образцы, которые показали значения RLU выше самого высокого стандартного значения, разводили ApoE4-негативной плазмой человека и замеряли повторно. Контроль отсечения с определенной концентрацией 4 мкг/мл также измеряли в качестве контроля для стандартной кривой.
7.2 Результаты
В диапазоне концентраций от 0,01 до 21,87 мкг/мл ApoE4 линейно разводится (см. фиг. 6). В таблице 4 приведены измеренные значения RLU и рассчитанные концентрации ApoE4. ApoE4-позитивные образцы имели концентрации в диапазоне 9,7-30,4 мкг/мл. Концентрация всех ApoE4-негативных образцов во всех случаях составляла <0,1 мкг/мл (фоновое значение в анализе). Концентрация контроля отсечения равнялась 4 мкг/мл, точно так же, как измерено с помощью калибраторов, разбавленных перед измерением.
Таблица 4
<b>ApoE4 статус</b>
<b>Образцы</b>
<b>Концентрация ApoE4 [мкг/мл]</b>
позитивный
A
22,3
B
25,2
C
9,7
D
21,9
E
30,4
негативный
F
<0,1
G
<0,1
H
<0,1
кратность изменения по сравнению с контролем отсечения
4,0
Пример 8
Влияние предварительного покрытия белком на связывание ApoE4 с твердой фазой.
8.1 Методы
2
4
2
4
2
96-луночный микротитрационный планшет (Greiner, Lumitrac600 высокосвязывающий полистирол) предварительно покрывали 300 мкл на лунку человеческой сыворотки (ApoE4-негативной) или насыщенным раствором, содержащим 6,5 мМ KHPO, 3,5 мМ NaHPO×2 HO, 3% Karion (сахар) и 0,5% BSA в течение 18 ч при комнатной температуре. После инкубации микропланшеты промывали 4 раза раствором для промывания (20 мМ PBS, pH 7,4, 0,1% тритона X-100).
Затем проводили анализ ApoE4 в одностадийной процедуре (как описано в примере 2).
Образцы плазмы (ApoE4-позитивные и ApoE4-негативные) и образцы рекомбинантного ApoE4 (рекомбинантный ApoE4 в ApoE4-негативной плазме человека) непосредственно пипетировали в лунки 96-луночного микротитрационного планшета (20 мкл образца на лунку). Лунки заполняли 200 мкл реакционного буфера (PBS с 0,2% твина-20, 0,1% бычьего IgG, 0,1% овечьего IgG и 0,02% мышиного IgG, pH 7,4), содержащего меченное эфиром акридиния анти-ApoE4-антитело. После этого микропланшеты промывали 4 раза раствором для промывания (20 мМ PBS, pH 7,4, 0,1% тритона X-100). Люминесценцию (в относительных световых единицах (RLU)) измеряли с использованием люминометра MTP (Centro LB960, Berthold Technologies GmbH, Bad Wildbad).
8.2 Результаты
Как показано на фиг. 7 (A) ApoE4-позитивные образцы ЭДТА-плазмы давали достоверный сигнал на необработанной твердой фазе. Напротив, лунки, предварительно обработанные белок-содержащим раствором (либо BSA, либо сывороткой человека), не давали сигнала.
Аналогично, как показано на фиг. 7 (B), ApoE4-негативные образцы ЭДТА-плазмы, содержащие различные концентрации рекомбинантного ApoE4, давали достоверный сигнал на необработанных лунках, но не давали сигнал, когда инкубацию проводили в лунках, предварительно обработанных белком.
Ссылки
Aggarwal N.T., Wilson R.S., Beck T.L. et al. The apolipoprotein E epsilon4 allele and incident Alzheimer's disease in persons with mild cognitive impairment. Neurocase. 2005; 11(1):3-7.
Bakbak B. et al., 2015. Association of Apolipoprotein E Polymorphism with Intravitreal Ranibizumab Treatment Outcomes in Age-Related Macular Degeneration. Current eye research, 3683(October), pp. 1-5.
Bury J. et al., 1986. Apolipoprotein E quantified by enzyme-linked immunosorbent assay. Clin Chem., 32(2), pp. 265-70.
Cacabelos R. et al., 2012. Genomics of dementia: APOE - And CYP2D6-related pharmacogenetics. International Journal of Alzheimer's Disease, 2012(518901).

Calero O. et al., 2009. Apolipoprotein E genotyping method by Real Time PCR, a fast and cost-effective alternative to the TaqMan and FRET assays. J. Neurosci. Methods, 183(2), pp. 238-40.
Deng B. et al., 2014. Aptamer binding assays for proteins: The thrombin example-A review. Analytica Chimica Acta, 837, pp. 1-15.
Hegemann D., Brunner H. & Oehr C., 2003. Plasma treatment of polymers for surface and adhesion improvement. Nuclear Instruments and Methods in Physics, 208, pp. 281-286.
Hesse C. et al., 2000. Measurement of Apolipoprotein E (apoE) in Cerebrospinal Fluid. Neurochemical Research, 25(4), pp. 511-517.
Høgåsen K. et al., 1993. Quantitation of vitronectin and clusterin Pitfalls and solutions in enzyme immunoassays for adhesive proteins. Journal of Immunological Methods, 160, pp. 107-115.
Holmquist L., 1982. Loss of human serum apolipoproteins C and E during manipulation of diluted solutions. Journal of Lipid Research, 23, pp. 357-359.
Kirk-Othmer, Encyclopedia of chemical technology, 4th ed., executive editor, J. I. Kroschwitz; editor, M. Howe-Grant, John Wiley & Sons, 1993, vol. 15, p. 518-562, включено здесь посредством ссылки, в том числе цитаты на страницах 551-562.
Lane R.D. (1985). A short-duration polyethylene glycol fusiontechnique for increasing production of monoclonal antibody-secreting hybridomas. J. Immunol. Meth., 81: 223-228
Leduc V. et al., 2011. Function and comorbidities of apolipoprotein e in Alzheimer's disease. International Journal of Alzheimer's disease, 2011(974361).
Li J. et al., 2011. Peptide aptamers with biological and therapeutic applications. Current medicinal chemistry, 18(27), pp. 4215-22.
Love J.E. et al., 2015. Alternative splicing in Alzheimer´s Disease. J Parkinsons Dis Alzheimers Dis. 2(2). pii: 6.
Marx et al., Monoclonal Antibody Production, ATLA 25, 121, 1997
Mayeux R. et al., 1998. Utility of the Apolipoprteoin E Genotype in the Diagnosis of Alzheimer's Disease. N. Engl. J. Med., 338(8), pp. 506-511.
Rohn T.T., 2013. Proteolytic cleavage of apolipoprotein E4 as the keystone for the heightened risk associated with Alzheimer's disease, Int. J. Mol. Sci., 14(7):14908-22.
Sanger F., Coulson A.R. (May 1975). "A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase". J. Mol. Biol., 94 (3): 441-8
Verghese P.B., Castellano J.M. & Holtzman D.M., 2011. Roles of Apolipoprotein E in Alzheimer's disease and other neurological disorders. Lancet neurology, 10(3), pp. 241-252.
Weisgraber K.H. & Mahley R.W., 1996. Human apolipoprotein E: the Alzheimer's disease connection. Federation of American Societies for Experimental Biology, 10, pp. 1485-94.
Xu Y., Yang X. & Wang E., 2010. Review: Aptamers in microfluidic chips. Analytica chimica acta, 683(1), pp. 12-20.
Ziegler B. et al. (1996) Glutamate decarboxylase (GAD) is not detectable on the surface of rat islet cells examined by cytofluorometry and complement-dependent antibody-mediated cytotoxicity of monoclonal GAD antibodies, Horm. Metab. Res. 28: 11-15)
Zhong L. et al., 2016. A rapid and cost-effective method for genotyping apolipoprotein E gene polymorphism. Molecular Neurodegeneration, 11(2), pp. 1-8.
Последовательности
SEQ ID NO: 1
SEQ ID NO: 2 (человеческий преApoE4 1-317,
включая сигнальную последовательность
)
SEQ ID NO: 3 (фрагмент ApoE4 1-165)
SEQ ID NO: 4 (фрагмент ApoE4 1-185)
SEQ ID NO: 5 (фрагмент ApoE4 1-191)
SEQ ID NO: 6 (фрагмент ApoE4 1-202)
SEQ ID NO: 7 (фрагмент ApoE4 1-229)
SEQ ID NO: 8 (фрагмент ApoE4 1-231)
SEQ ID NO: 9 (фрагмент ApoE4 1-251)
SEQ ID NO: 10 (фрагмент ApoE4 1-259)
SEQ ID NO: 11 (фрагмент ApoE4 1-260)
SEQ ID NO: 12 (фрагмент ApoE4 1-266)
SEQ ID NO: 13 (фрагмент ApoE4 1-271)
SEQ ID NO: 14 (фрагмент ApoE4 1-272)
SEQ ID NO: 15 (ApoE4 72-299)
Описание фигур
Фиг. 1:
(A) Анализ образцов плазмы с известным генотипом ApoE. Концентрации ApoE4 в плазме коррелируют с генетическим статусом (низкие значения для ApoE4-негативных образцов, высокие значения для ApoE4-позитивных образцов; статистический анализ: критерий Манна-Уитни).
(B) ROC-кривая анализа ApoE4 с генотипом (AUC - площадь под кривой).
Фиг. 2:
Результаты измерения уровней ApoE4 после предварительной инкубации в пробирках из различного материала с добавлением и без добавления детергента (PS - полистирол, PP - полипропилен, PET - полиэтилентерефталат).
Фиг. 3:
Результаты измерения уровней ApoE4 в MTP после предварительной обработки MTP с/без детергента (тритона X-100). Аналитический буфер содержал тритон X-100 (0,05%) или не содержал детергента (0%), образцы анализировали в одностадийной процедуре. Показан контроль отсечения (A), два ApoE4-позитивных образца D1 (B) и D2 (C) и ApoE4-отрицательный образец D3 (D).
Фиг. 4:
Сравнение одностадийного и двустадийного анализа ApoE4. Пунктирная линия показывает значение контроля отсечения. Каждый образец со значениями ниже такого значения отсечения является ApoE4-негативным, и каждый образец со значениями выше порогового значения является ApoE4-позитивным.
Фиг. 5:
Анализ связывания ApoE4 с твердой фазой в присутствии (1%)/ отсутствии (0%) BSA. Пунктирная линия показывает значение контроля отсечения (C) в соответствующем варианте анализа.
Фиг. 6:
Линейная регрессия стандартов ApoE4 в диапазоне концентраций от 0,01 до 21,87 мкг/мл.
Фиг. 7:
Результаты измерение уровней ApoE4 после предварительной обработки твердой фазы белковым раствором (бычьим сывороточным альбумином или человеческой сывороткой).
(A) Результаты измерения ApoE4-позитивных и ApoE4-негативных образцов в нативной ЭДТА-плазме.
(B) Результаты измерения растворов рекомбинантного ApoE4.
--->
Список последовательностей
<110>  sphingotec GmbH
<120>  СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АПОЛИПОПРОТЕИНА Е4
<130>  S75097WO
<150>  EP 16 193 587.9
<151>  2016-10-12
<160>  15
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  299
<212>  Белок
<213>  Homo sapiens
<400>  1
Lys Val Glu Gln Ala Val Glu Thr Glu Pro Glu Pro Glu Leu Arg Gln
1               5                   10                  15
Gln Thr Glu Trp Gln Ser Gly Gln Arg Trp Glu Leu Ala Leu Gly Arg
20                  25                  30
Phe Trp Asp Tyr Leu Arg Trp Val Gln Thr Leu Ser Glu Gln Val Gln
35                  40                  45
Glu Glu Leu Leu Ser Ser Gln Val Thr Gln Glu Leu Arg Ala Leu Met
50                  55                  60
Asp Glu Thr Met Lys Glu Leu Lys Ala Tyr Lys Ser Glu Leu Glu Glu
65                  70                  75                  80
Gln Leu Thr Pro Val Ala Glu Glu Thr Arg Ala Arg Leu Ser Lys Glu
85                  90                  95
Leu Gln Ala Ala Gln Ala Arg Leu Gly Ala Asp Met Glu Asp Val Arg
100                 105                 110
Gly Arg Leu Val Gln Tyr Arg Gly Glu Val Gln Ala Met Leu Gly Gln
115                 120                 125
Ser Thr Glu Glu Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Lys Leu
130                 135                 140
Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala Asp Asp Leu Gln Lys Arg Leu Ala
145                 150                 155                 160
Val Tyr Gln Ala Gly Ala Arg Glu Gly Ala Glu Arg Gly Leu Ser Ala
165                 170                 175
Ile Arg Glu Arg Leu Gly Pro Leu Val Glu Gln Gly Arg Val Arg Ala
180                 185                 190
Ala Thr Val Gly Ser Leu Ala Gly Gln Pro Leu Gln Glu Arg Ala Gln
195                 200                 205
Ala Trp Gly Glu Arg Leu Arg Ala Arg Met Glu Glu Met Gly Ser Arg
210                 215                 220
Thr Arg Asp Arg Leu Asp Glu Val Lys Glu Gln Val Ala Glu Val Arg
225                 230                 235                 240
Ala Lys Leu Glu Glu Gln Ala Gln Gln Ile Arg Leu Gln Ala Glu Ala
245                 250                 255
Phe Gln Ala Arg Leu Lys Ser Trp Phe Glu Pro Leu Val Glu Asp Met
260                 265                 270
Gln Arg Gln Trp Ala Gly Leu Val Glu Lys Val Gln Ala Ala Val Gly
275                 280                 285
Thr Ser Ala Ala Pro Val Pro Ser Asp Asn His
290                 295
<210>  2
<211>  317
<212>  Белок
<213>  Homo sapiens
<400>  2
Met Lys Val Leu Trp Ala Ala Leu Leu Val Thr Phe Leu Ala Gly Cys
1               5                   10                  15
Gln Ala Lys Val Glu Gln Ala Val Glu Thr Glu Pro Glu Pro Glu Leu
20                  25                  30
Arg Gln Gln Thr Glu Trp Gln Ser Gly Gln Arg Trp Glu Leu Ala Leu
35                  40                  45
Gly Arg Phe Trp Asp Tyr Leu Arg Trp Val Gln Thr Leu Ser Glu Gln
50                  55                  60
Val Gln Glu Glu Leu Leu Ser Ser Gln Val Thr Gln Glu Leu Arg Ala
65                  70                  75                  80
Leu Met Asp Glu Thr Met Lys Glu Leu Lys Ala Tyr Lys Ser Glu Leu
85                  90                  95
Glu Glu Gln Leu Thr Pro Val Ala Glu Glu Thr Arg Ala Arg Leu Ser
100                 105                 110
Lys Glu Leu Gln Ala Ala Gln Ala Arg Leu Gly Ala Asp Met Glu Asp
115                 120                 125
Val Arg Gly Arg Leu Val Gln Tyr Arg Gly Glu Val Gln Ala Met Leu
130                 135                 140
Gly Gln Ser Thr Glu Glu Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg
145                 150                 155                 160
Lys Leu Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala Asp Asp Leu Gln Lys Arg
165                 170                 175
Leu Ala Val Tyr Gln Ala Gly Ala Arg Glu Gly Ala Glu Arg Gly Leu
180                 185                 190
Ser Ala Ile Arg Glu Arg Leu Gly Pro Leu Val Glu Gln Gly Arg Val
195                 200                 205
Arg Ala Ala Thr Val Gly Ser Leu Ala Gly Gln Pro Leu Gln Glu Arg
210                 215                 220
Ala Gln Ala Trp Gly Glu Arg Leu Arg Ala Arg Met Glu Glu Met Gly
225                 230                 235                 240
Ser Arg Thr Arg Asp Arg Leu Asp Glu Val Lys Glu Gln Val Ala Glu
245                 250                 255
Val Arg Ala Lys Leu Glu Glu Gln Ala Gln Gln Ile Arg Leu Gln Ala
260                 265                 270
Glu Ala Phe Gln Ala Arg Leu Lys Ser Trp Phe Glu Pro Leu Val Glu
275                 280                 285
Asp Met Gln Arg Gln Trp Ala Gly Leu Val Glu Lys Val Gln Ala Ala
290                 295                 300
Val Gly Thr Ser Ala Ala Pro Val Pro Ser Asp Asn His
305                 310                 315
<210>  3
<211>  165
<212>  Белок
<213>  Homo sapiens
<400>  3
Lys Val Glu Gln Ala Val Glu Thr Glu Pro Glu Pro Glu Leu Arg Gln
1               5                   10                  15
Gln Thr Glu Trp Gln Ser Gly Gln Arg Trp Glu Leu Ala Leu Gly Arg
20                  25                  30
Phe Trp Asp Tyr Leu Arg Trp Val Gln Thr Leu Ser Glu Gln Val Gln
35                  40                  45
Glu Glu Leu Leu Ser Ser Gln Val Thr Gln Glu Leu Arg Ala Leu Met
50                  55                  60
Asp Glu Thr Met Lys Glu Leu Lys Ala Tyr Lys Ser Glu Leu Glu Glu
65                  70                  75                  80
Gln Leu Thr Pro Val Ala Glu Glu Thr Arg Ala Arg Leu Ser Lys Glu
85                  90                  95
Leu Gln Ala Ala Gln Ala Arg Leu Gly Ala Asp Met Glu Asp Val Arg
100                 105                 110
Gly Arg Leu Val Gln Tyr Arg Gly Glu Val Gln Ala Met Leu Gly Gln
115                 120                 125
Ser Thr Glu Glu Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Lys Leu
130                 135                 140
Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala Asp Asp Leu Gln Lys Arg Leu Ala
145                 150                 155                 160
Val Tyr Gln Ala Gly
165
<210>  4
<211>  185
<212>  Белок
<213>  Homo sapiens
<400>  4
Lys Val Glu Gln Ala Val Glu Thr Glu Pro Glu Pro Glu Leu Arg Gln
1               5                   10                  15
Gln Thr Glu Trp Gln Ser Gly Gln Arg Trp Glu Leu Ala Leu Gly Arg
20                  25                  30
Phe Trp Asp Tyr Leu Arg Trp Val Gln Thr Leu Ser Glu Gln Val Gln
35                  40                  45
Glu Glu Leu Leu Ser Ser Gln Val Thr Gln Glu Leu Arg Ala Leu Met
50                  55                  60
Asp Glu Thr Met Lys Glu Leu Lys Ala Tyr Lys Ser Glu Leu Glu Glu
65                  70                  75                  80
Gln Leu Thr Pro Val Ala Glu Glu Thr Arg Ala Arg Leu Ser Lys Glu
85                  90                  95
Leu Gln Ala Ala Gln Ala Arg Leu Gly Ala Asp Met Glu Asp Val Arg
100                 105                 110
Gly Arg Leu Val Gln Tyr Arg Gly Glu Val Gln Ala Met Leu Gly Gln
115                 120                 125
Ser Thr Glu Glu Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Lys Leu
130                 135                 140
Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala Asp Asp Leu Gln Lys Arg Leu Ala
145                 150                 155                 160
Val Tyr Gln Ala Gly Ala Arg Glu Gly Ala Glu Arg Gly Leu Ser Ala
165                 170                 175
Ile Arg Glu Arg Leu Gly Pro Leu Val
180                 185
<210>  5
<211>  191
<212>  Белок
<213>  Homo sapiens
<400>  5
Lys Val Glu Gln Ala Val Glu Thr Glu Pro Glu Pro Glu Leu Arg Gln
1               5                   10                  15
Gln Thr Glu Trp Gln Ser Gly Gln Arg Trp Glu Leu Ala Leu Gly Arg
20                  25                  30
Phe Trp Asp Tyr Leu Arg Trp Val Gln Thr Leu Ser Glu Gln Val Gln
35                  40                  45
Glu Glu Leu Leu Ser Ser Gln Val Thr Gln Glu Leu Arg Ala Leu Met
50                  55                  60
Asp Glu Thr Met Lys Glu Leu Lys Ala Tyr Lys Ser Glu Leu Glu Glu
65                  70                  75                  80
Gln Leu Thr Pro Val Ala Glu Glu Thr Arg Ala Arg Leu Ser Lys Glu
85                  90                  95
Leu Gln Ala Ala Gln Ala Arg Leu Gly Ala Asp Met Glu Asp Val Arg
100                 105                 110
Gly Arg Leu Val Gln Tyr Arg Gly Glu Val Gln Ala Met Leu Gly Gln
115                 120                 125
Ser Thr Glu Glu Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Lys Leu
130                 135                 140
Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala Asp Asp Leu Gln Lys Arg Leu Ala
145                 150                 155                 160
Val Tyr Gln Ala Gly Ala Arg Glu Gly Ala Glu Arg Gly Leu Ser Ala
165                 170                 175
Ile Arg Glu Arg Leu Gly Pro Leu Val Glu Gln Gly Arg Val Arg
180                 185                 190
<210>  6
<211>  202
<212>  Белок
<213>  Homo sapiens
<400>  6
Lys Val Glu Gln Ala Val Glu Thr Glu Pro Glu Pro Glu Leu Arg Gln
1               5                   10                  15
Gln Thr Glu Trp Gln Ser Gly Gln Arg Trp Glu Leu Ala Leu Gly Arg
20                  25                  30
Phe Trp Asp Tyr Leu Arg Trp Val Gln Thr Leu Ser Glu Gln Val Gln
35                  40                  45
Glu Glu Leu Leu Ser Ser Gln Val Thr Gln Glu Leu Arg Ala Leu Met
50                  55                  60
Asp Glu Thr Met Lys Glu Leu Lys Ala Tyr Lys Ser Glu Leu Glu Glu
65                  70                  75                  80
Gln Leu Thr Pro Val Ala Glu Glu Thr Arg Ala Arg Leu Ser Lys Glu
85                  90                  95
Leu Gln Ala Ala Gln Ala Arg Leu Gly Ala Asp Met Glu Asp Val Arg
100                 105                 110
Gly Arg Leu Val Gln Tyr Arg Gly Glu Val Gln Ala Met Leu Gly Gln
115                 120                 125
Ser Thr Glu Glu Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Lys Leu
130                 135                 140
Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala Asp Asp Leu Gln Lys Arg Leu Ala
145                 150                 155                 160
Val Tyr Gln Ala Gly Ala Arg Glu Gly Ala Glu Arg Gly Leu Ser Ala
165                 170                 175
Ile Arg Glu Arg Leu Gly Pro Leu Val Glu Gln Gly Arg Val Arg Ala
180                 185                 190
Ala Thr Val Gly Ser Leu Ala Gly Gln Pro
195                 200
<210>  7
<211>  229
<212>  Белок
<213>  Homo sapiens
<400>  7
Lys Val Glu Gln Ala Val Glu Thr Glu Pro Glu Pro Glu Leu Arg Gln
1               5                   10                  15
Gln Thr Glu Trp Gln Ser Gly Gln Arg Trp Glu Leu Ala Leu Gly Arg
20                  25                  30
Phe Trp Asp Tyr Leu Arg Trp Val Gln Thr Leu Ser Glu Gln Val Gln
35                  40                  45
Glu Glu Leu Leu Ser Ser Gln Val Thr Gln Glu Leu Arg Ala Leu Met
50                  55                  60
Asp Glu Thr Met Lys Glu Leu Lys Ala Tyr Lys Ser Glu Leu Glu Glu
65                  70                  75                  80
Gln Leu Thr Pro Val Ala Glu Glu Thr Arg Ala Arg Leu Ser Lys Glu
85                  90                  95
Leu Gln Ala Ala Gln Ala Arg Leu Gly Ala Asp Met Glu Asp Val Arg
100                 105                 110
Gly Arg Leu Val Gln Tyr Arg Gly Glu Val Gln Ala Met Leu Gly Gln
115                 120                 125
Ser Thr Glu Glu Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Lys Leu
130                 135                 140
Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala Asp Asp Leu Gln Lys Arg Leu Ala
145                 150                 155                 160
Val Tyr Gln Ala Gly Ala Arg Glu Gly Ala Glu Arg Gly Leu Ser Ala
165                 170                 175
Ile Arg Glu Arg Leu Gly Pro Leu Val Glu Gln Gly Arg Val Arg Ala
180                 185                 190
Ala Thr Val Gly Ser Leu Ala Gly Gln Pro Leu Gln Glu Arg Ala Gln
195                 200                 205
Ala Trp Gly Glu Arg Leu Arg Ala Arg Met Glu Glu Met Gly Ser Arg
210                 215                 220
Thr Arg Asp Arg Leu
225
<210>  8
<211>  231
<212>  Белок
<213>  Homo sapiens
<400>  8
Lys Val Glu Gln Ala Val Glu Thr Glu Pro Glu Pro Glu Leu Arg Gln
1               5                   10                  15
Gln Thr Glu Trp Gln Ser Gly Gln Arg Trp Glu Leu Ala Leu Gly Arg
20                  25                  30
Phe Trp Asp Tyr Leu Arg Trp Val Gln Thr Leu Ser Glu Gln Val Gln
35                  40                  45
Glu Glu Leu Leu Ser Ser Gln Val Thr Gln Glu Leu Arg Ala Leu Met
50                  55                  60
Asp Glu Thr Met Lys Glu Leu Lys Ala Tyr Lys Ser Glu Leu Glu Glu
65                  70                  75                  80
Gln Leu Thr Pro Val Ala Glu Glu Thr Arg Ala Arg Leu Ser Lys Glu
85                  90                  95
Leu Gln Ala Ala Gln Ala Arg Leu Gly Ala Asp Met Glu Asp Val Arg
100                 105                 110
Gly Arg Leu Val Gln Tyr Arg Gly Glu Val Gln Ala Met Leu Gly Gln
115                 120                 125
Ser Thr Glu Glu Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Lys Leu
130                 135                 140
Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala Asp Asp Leu Gln Lys Arg Leu Ala
145                 150                 155                 160
Val Tyr Gln Ala Gly Ala Arg Glu Gly Ala Glu Arg Gly Leu Ser Ala
165                 170                 175
Ile Arg Glu Arg Leu Gly Pro Leu Val Glu Gln Gly Arg Val Arg Ala
180                 185                 190
Ala Thr Val Gly Ser Leu Ala Gly Gln Pro Leu Gln Glu Arg Ala Gln
195                 200                 205
Ala Trp Gly Glu Arg Leu Arg Ala Arg Met Glu Glu Met Gly Ser Arg
210                 215                 220
Thr Arg Asp Arg Leu Asp Glu
225                 230
<210>  9
<211>  251
<212>  Белок
<213>  Homo sapiens
<400>  9
Lys Val Glu Gln Ala Val Glu Thr Glu Pro Glu Pro Glu Leu Arg Gln
1               5                   10                  15
Gln Thr Glu Trp Gln Ser Gly Gln Arg Trp Glu Leu Ala Leu Gly Arg
20                  25                  30
Phe Trp Asp Tyr Leu Arg Trp Val Gln Thr Leu Ser Glu Gln Val Gln
35                  40                  45
Glu Glu Leu Leu Ser Ser Gln Val Thr Gln Glu Leu Arg Ala Leu Met
50                  55                  60
Asp Glu Thr Met Lys Glu Leu Lys Ala Tyr Lys Ser Glu Leu Glu Glu
65                  70                  75                  80
Gln Leu Thr Pro Val Ala Glu Glu Thr Arg Ala Arg Leu Ser Lys Glu
85                  90                  95
Leu Gln Ala Ala Gln Ala Arg Leu Gly Ala Asp Met Glu Asp Val Arg
100                 105                 110
Gly Arg Leu Val Gln Tyr Arg Gly Glu Val Gln Ala Met Leu Gly Gln
115                 120                 125
Ser Thr Glu Glu Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Lys Leu
130                 135                 140
Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala Asp Asp Leu Gln Lys Arg Leu Ala
145                 150                 155                 160
Val Tyr Gln Ala Gly Ala Arg Glu Gly Ala Glu Arg Gly Leu Ser Ala
165                 170                 175
Ile Arg Glu Arg Leu Gly Pro Leu Val Glu Gln Gly Arg Val Arg Ala
180                 185                 190
Ala Thr Val Gly Ser Leu Ala Gly Gln Pro Leu Gln Glu Arg Ala Gln
195                 200                 205
Ala Trp Gly Glu Arg Leu Arg Ala Arg Met Glu Glu Met Gly Ser Arg
210                 215                 220
Thr Arg Asp Arg Leu Asp Glu Val Lys Glu Gln Val Ala Glu Val Arg
225                 230                 235                 240
Ala Lys Leu Glu Glu Gln Ala Gln Gln Ile Arg
245                 250
<210>  10
<211>  259
<212>  Белок
<213>  Homo sapiens
<400>  10
Lys Val Glu Gln Ala Val Glu Thr Glu Pro Glu Pro Glu Leu Arg Gln
1               5                   10                  15
Gln Thr Glu Trp Gln Ser Gly Gln Arg Trp Glu Leu Ala Leu Gly Arg
20                  25                  30
Phe Trp Asp Tyr Leu Arg Trp Val Gln Thr Leu Ser Glu Gln Val Gln
35                  40                  45
Glu Glu Leu Leu Ser Ser Gln Val Thr Gln Glu Leu Arg Ala Leu Met
50                  55                  60
Asp Glu Thr Met Lys Glu Leu Lys Ala Tyr Lys Ser Glu Leu Glu Glu
65                  70                  75                  80
Gln Leu Thr Pro Val Ala Glu Glu Thr Arg Ala Arg Leu Ser Lys Glu
85                  90                  95
Leu Gln Ala Ala Gln Ala Arg Leu Gly Ala Asp Met Glu Asp Val Arg
100                 105                 110
Gly Arg Leu Val Gln Tyr Arg Gly Glu Val Gln Ala Met Leu Gly Gln
115                 120                 125
Ser Thr Glu Glu Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Lys Leu
130                 135                 140
Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala Asp Asp Leu Gln Lys Arg Leu Ala
145                 150                 155                 160
Val Tyr Gln Ala Gly Ala Arg Glu Gly Ala Glu Arg Gly Leu Ser Ala
165                 170                 175
Ile Arg Glu Arg Leu Gly Pro Leu Val Glu Gln Gly Arg Val Arg Ala
180                 185                 190
Ala Thr Val Gly Ser Leu Ala Gly Gln Pro Leu Gln Glu Arg Ala Gln
195                 200                 205
Ala Trp Gly Glu Arg Leu Arg Ala Arg Met Glu Glu Met Gly Ser Arg
210                 215                 220
Thr Arg Asp Arg Leu Asp Glu Val Lys Glu Gln Val Ala Glu Val Arg
225                 230                 235                 240
Ala Lys Leu Glu Glu Gln Ala Gln Gln Ile Arg Leu Gln Ala Glu Ala
245                 250                 255
Phe Gln Ala
<210>  11
<211>  260
<212>  Белок
<213>  Homo sapiens
<400>  11
Lys Val Glu Gln Ala Val Glu Thr Glu Pro Glu Pro Glu Leu Arg Gln
1               5                   10                  15
Gln Thr Glu Trp Gln Ser Gly Gln Arg Trp Glu Leu Ala Leu Gly Arg
20                  25                  30
Phe Trp Asp Tyr Leu Arg Trp Val Gln Thr Leu Ser Glu Gln Val Gln
35                  40                  45
Glu Glu Leu Leu Ser Ser Gln Val Thr Gln Glu Leu Arg Ala Leu Met
50                  55                  60
Asp Glu Thr Met Lys Glu Leu Lys Ala Tyr Lys Ser Glu Leu Glu Glu
65                  70                  75                  80
Gln Leu Thr Pro Val Ala Glu Glu Thr Arg Ala Arg Leu Ser Lys Glu
85                  90                  95
Leu Gln Ala Ala Gln Ala Arg Leu Gly Ala Asp Met Glu Asp Val Arg
100                 105                 110
Gly Arg Leu Val Gln Tyr Arg Gly Glu Val Gln Ala Met Leu Gly Gln
115                 120                 125
Ser Thr Glu Glu Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Lys Leu
130                 135                 140
Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala Asp Asp Leu Gln Lys Arg Leu Ala
145                 150                 155                 160
Val Tyr Gln Ala Gly Ala Arg Glu Gly Ala Glu Arg Gly Leu Ser Ala
165                 170                 175
Ile Arg Glu Arg Leu Gly Pro Leu Val Glu Gln Gly Arg Val Arg Ala
180                 185                 190
Ala Thr Val Gly Ser Leu Ala Gly Gln Pro Leu Gln Glu Arg Ala Gln
195                 200                 205
Ala Trp Gly Glu Arg Leu Arg Ala Arg Met Glu Glu Met Gly Ser Arg
210                 215                 220
Thr Arg Asp Arg Leu Asp Glu Val Lys Glu Gln Val Ala Glu Val Arg
225                 230                 235                 240
Ala Lys Leu Glu Glu Gln Ala Gln Gln Ile Arg Leu Gln Ala Glu Ala
245                 250                 255
Phe Gln Ala Arg
260
<210>  12
<211>  266
<212>  Белок
<213>  Homo sapiens
<400>  12
Lys Val Glu Gln Ala Val Glu Thr Glu Pro Glu Pro Glu Leu Arg Gln
1               5                   10                  15
Gln Thr Glu Trp Gln Ser Gly Gln Arg Trp Glu Leu Ala Leu Gly Arg
20                  25                  30
Phe Trp Asp Tyr Leu Arg Trp Val Gln Thr Leu Ser Glu Gln Val Gln
35                  40                  45
Glu Glu Leu Leu Ser Ser Gln Val Thr Gln Glu Leu Arg Ala Leu Met
50                  55                  60
Asp Glu Thr Met Lys Glu Leu Lys Ala Tyr Lys Ser Glu Leu Glu Glu
65                  70                  75                  80
Gln Leu Thr Pro Val Ala Glu Glu Thr Arg Ala Arg Leu Ser Lys Glu
85                  90                  95
Leu Gln Ala Ala Gln Ala Arg Leu Gly Ala Asp Met Glu Asp Val Arg
100                 105                 110
Gly Arg Leu Val Gln Tyr Arg Gly Glu Val Gln Ala Met Leu Gly Gln
115                 120                 125
Ser Thr Glu Glu Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Lys Leu
130                 135                 140
Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala Asp Asp Leu Gln Lys Arg Leu Ala
145                 150                 155                 160
Val Tyr Gln Ala Gly Ala Arg Glu Gly Ala Glu Arg Gly Leu Ser Ala
165                 170                 175
Ile Arg Glu Arg Leu Gly Pro Leu Val Glu Gln Gly Arg Val Arg Ala
180                 185                 190
Ala Thr Val Gly Ser Leu Ala Gly Gln Pro Leu Gln Glu Arg Ala Gln
195                 200                 205
Ala Trp Gly Glu Arg Leu Arg Ala Arg Met Glu Glu Met Gly Ser Arg
210                 215                 220
Thr Arg Asp Arg Leu Asp Glu Val Lys Glu Gln Val Ala Glu Val Arg
225                 230                 235                 240
Ala Lys Leu Glu Glu Gln Ala Gln Gln Ile Arg Leu Gln Ala Glu Ala
245                 250                 255
Phe Gln Ala Arg Leu Lys Ser Trp Phe Glu
260                 265
<210>  13
<211>  271
<212>  Белок
<213>  Homo sapiens
<400>  13
Lys Val Glu Gln Ala Val Glu Thr Glu Pro Glu Pro Glu Leu Arg Gln
1               5                   10                  15
Gln Thr Glu Trp Gln Ser Gly Gln Arg Trp Glu Leu Ala Leu Gly Arg
20                  25                  30
Phe Trp Asp Tyr Leu Arg Trp Val Gln Thr Leu Ser Glu Gln Val Gln
35                  40                  45
Glu Glu Leu Leu Ser Ser Gln Val Thr Gln Glu Leu Arg Ala Leu Met
50                  55                  60
Asp Glu Thr Met Lys Glu Leu Lys Ala Tyr Lys Ser Glu Leu Glu Glu
65                  70                  75                  80
Gln Leu Thr Pro Val Ala Glu Glu Thr Arg Ala Arg Leu Ser Lys Glu
85                  90                  95
Leu Gln Ala Ala Gln Ala Arg Leu Gly Ala Asp Met Glu Asp Val Arg
100                 105                 110
Gly Arg Leu Val Gln Tyr Arg Gly Glu Val Gln Ala Met Leu Gly Gln
115                 120                 125
Ser Thr Glu Glu Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Lys Leu
130                 135                 140
Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala Asp Asp Leu Gln Lys Arg Leu Ala
145                 150                 155                 160
Val Tyr Gln Ala Gly Ala Arg Glu Gly Ala Glu Arg Gly Leu Ser Ala
165                 170                 175
Ile Arg Glu Arg Leu Gly Pro Leu Val Glu Gln Gly Arg Val Arg Ala
180                 185                 190
Ala Thr Val Gly Ser Leu Ala Gly Gln Pro Leu Gln Glu Arg Ala Gln
195                 200                 205
Ala Trp Gly Glu Arg Leu Arg Ala Arg Met Glu Glu Met Gly Ser Arg
210                 215                 220
Thr Arg Asp Arg Leu Asp Glu Val Lys Glu Gln Val Ala Glu Val Arg
225                 230                 235                 240
Ala Lys Leu Glu Glu Gln Ala Gln Gln Ile Arg Leu Gln Ala Glu Ala
245                 250                 255
Phe Gln Ala Arg Leu Lys Ser Trp Phe Glu Pro Leu Val Glu Asp
260                 265                 270
<210>  14
<211>  272
<212>  Белок
<213>  Homo sapiens
<400>  14
Lys Val Glu Gln Ala Val Glu Thr Glu Pro Glu Pro Glu Leu Arg Gln
1               5                   10                  15
Gln Thr Glu Trp Gln Ser Gly Gln Arg Trp Glu Leu Ala Leu Gly Arg
20                  25                  30
Phe Trp Asp Tyr Leu Arg Trp Val Gln Thr Leu Ser Glu Gln Val Gln
35                  40                  45
Glu Glu Leu Leu Ser Ser Gln Val Thr Gln Glu Leu Arg Ala Leu Met
50                  55                  60
Asp Glu Thr Met Lys Glu Leu Lys Ala Tyr Lys Ser Glu Leu Glu Glu
65                  70                  75                  80
Gln Leu Thr Pro Val Ala Glu Glu Thr Arg Ala Arg Leu Ser Lys Glu
85                  90                  95
Leu Gln Ala Ala Gln Ala Arg Leu Gly Ala Asp Met Glu Asp Val Arg
100                 105                 110
Gly Arg Leu Val Gln Tyr Arg Gly Glu Val Gln Ala Met Leu Gly Gln
115                 120                 125
Ser Thr Glu Glu Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Lys Leu
130                 135                 140
Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala Asp Asp Leu Gln Lys Arg Leu Ala
145                 150                 155                 160
Val Tyr Gln Ala Gly Ala Arg Glu Gly Ala Glu Arg Gly Leu Ser Ala
165                 170                 175
Ile Arg Glu Arg Leu Gly Pro Leu Val Glu Gln Gly Arg Val Arg Ala
180                 185                 190
Ala Thr Val Gly Ser Leu Ala Gly Gln Pro Leu Gln Glu Arg Ala Gln
195                 200                 205
Ala Trp Gly Glu Arg Leu Arg Ala Arg Met Glu Glu Met Gly Ser Arg
210                 215                 220
Thr Arg Asp Arg Leu Asp Glu Val Lys Glu Gln Val Ala Glu Val Arg
225                 230                 235                 240
Ala Lys Leu Glu Glu Gln Ala Gln Gln Ile Arg Leu Gln Ala Glu Ala
245                 250                 255
Phe Gln Ala Arg Leu Lys Ser Trp Phe Glu Pro Leu Val Glu Asp Met
260                 265                 270
<210>  15
<211>  228
<212>  Белок
<213>  Homo sapiens
<400>  15
Lys Ala Tyr Lys Ser Glu Leu Glu Glu Gln Leu Thr Pro Val Ala Glu
1               5                   10                  15
Glu Thr Arg Ala Arg Leu Ser Lys Glu Leu Gln Ala Ala Gln Ala Arg
20                  25                  30
Leu Gly Ala Asp Met Glu Asp Val Arg Gly Arg Leu Val Gln Tyr Arg
35                  40                  45
Gly Glu Val Gln Ala Met Leu Gly Gln Ser Thr Glu Glu Leu Arg Val
50                  55                  60
Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp
65                  70                  75                  80
Ala Asp Asp Leu Gln Lys Arg Leu Ala Val Tyr Gln Ala Gly Ala Arg
85                  90                  95
Glu Gly Ala Glu Arg Gly Leu Ser Ala Ile Arg Glu Arg Leu Gly Pro
100                 105                 110
Leu Val Glu Gln Gly Arg Val Arg Ala Ala Thr Val Gly Ser Leu Ala
115                 120                 125
Gly Gln Pro Leu Gln Glu Arg Ala Gln Ala Trp Gly Glu Arg Leu Arg
130                 135                 140
Ala Arg Met Glu Glu Met Gly Ser Arg Thr Arg Asp Arg Leu Asp Glu
145                 150                 155                 160
Val Lys Glu Gln Val Ala Glu Val Arg Ala Lys Leu Glu Glu Gln Ala
165                 170                 175
Gln Gln Ile Arg Leu Gln Ala Glu Ala Phe Gln Ala Arg Leu Lys Ser
180                 185                 190
Trp Phe Glu Pro Leu Val Glu Asp Met Gln Arg Gln Trp Ala Gly Leu
195                 200                 205
Val Glu Lys Val Gln Ala Ala Val Gly Thr Ser Ala Ala Pro Val Pro
210                 215                 220
Ser Asp Asn His
225
<---