АНТИТЕЛО ПРОТИВ АДРЕНОМЕДУЛЛИНА (ADM), ИЛИ ФРАГМЕНТ АНТИ-ADM АНТИТЕЛА, ИЛИ АНТИ-ADM НЕ-IG КАРКАС ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ ПРИ ВМЕШАТЕЛЬСТВЕ И ТЕРАПИИ ГИПЕРЕМИИ У ПАЦИЕНТА
ANTIBODY AGAINST ADRENOMEDULLIN (ADM), OR FRAGMENT OF ANTI-ADM ANTIBODY, OR ANTI-ADM NON-IG FRAME FOR USE IN INTERVENTION AND THERAPY OF HYPEREMIA IN PATIENT

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Настоящее изобретение относится к антителу против адреномедуллина (ADM) или фрагмент антитела против адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас для применения при вмешательстве и терапии гиперемии у пациента.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Пептид адреномедуллин (ADM) был впервые описан в 1993 году (Kitamura et al., 1993. Biochem Biophys Res Comm 192 (2):553-560) как новый гипотензивный пептид, содержащий 52 аминокислоты, который был выделен из клеточной линии феохромоцитомы человека (SEQ ID NO:20). В том же году также были описаны кДНК, кодирующая пептид-предшественник, содержащий 185 аминокислот, и полная аминокислотная последовательность этого пептида-предшественника. Пептид-предшественник, содержащий, помимо прочего, сигнальную последовательность из 21 аминокислоты на N-конце, называют «пре-проадреномедуллином» (пре-проADM). В настоящем описании все указанные положения аминокислот, как правило, относятся к пре-проADM, который содержит 185 аминокислот. Пептид адреномедуллин (ADM) является пептидом, содержащим 52 аминокислоты (SEQ ID NO:20), а именно аминокислоты 95-146 пре-проADM, из которого он образуется в результате протеолитического расщепления. К настоящему времени по существу более тщательно изучено лишь несколько пептидных фрагментов, образуемых при расщеплении пре-проADM, в частности, физиологически активные пептиды ADM и «PAMP», пептид, содержащий 20 аминокислот (22-41), расположенных после 21 аминокислоты сигнального пептида в пре-проADM. Открытие и описание ADM в 1993 году вызвали бурный рост исследовательской активности, результаты которой суммированы в различных обзорных статьях; в настоящем описании приводятся ссылки на статьи, опубликованные в выпуске «Пептиды», посвященном, в частности, ADM (Takahashi 2001. Peptides 22:1691; Eto 2001. Peptides 22:1693-1711). Дополнительный обзор можно найти у Hinson et al. 2000 (Hinson et al. 2000. Endocrine Reviews 21(2):138-167). В настоящее время по результатам научных исследований установлено, что ADM можно рассматривать в качестве полифункционального регуляторного пептида. Он высвобождается в кровоток в неактивной форме, удлиненной за счет присоединения глицина (Kitamura et al. 1998. Biochem Biophys Res Commun 244 (2):551-555). Также имеется связывающий белок (Pio et al. 2001. Journal of Biological Chemistry 276 (15):12292-12300), который является специфическим по отношению к ADM и, предположительно, также модулирует действие ADM. К физиологическим эффектам ADM, а также PAMP, которые по данным проведенных к настоящему времени исследований имеют первостепенное значение, относятся эффекты, оказывающие влияние на артериальное давление.
Следовательно, ADM является эффективным вазодилататором, и соответственно гипотензивный эффект может быть связан с определенными пептидными сегментами в C-концевой части ADM. Кроме того, было обнаружено, что вышеупомянутый физиологически активный пептид PAMP, образованный из пре-проADM, также обладает гипотензивным эффектом, хотя, по-видимому, его механизм действия отличается от механизма действия ADM (см. в дополнение к вышеупомянутым обзорным статьям Eto et al. 2001 и Hinson et al. 2000 см. также Kuwasaki et al. 1997 FEBS Lett 414 (1):105-110; Kuwasaki et al. 1999. Ann. Clin. Biochem. 36:622-628; Tsuruda et al. 2001 Life Sci. 69(2):239-245 и EP-A2 0622458). Кроме того, было обнаружено, что концентрации ADM, которые могут быть измерены в кровяном русле и других биологических жидкостях, в ряде патологических состояний значительно превышают концентрации, наблюдаемые у здоровых субъектов, служащих в качестве контроля. Таким образом, уровень ADM у пациентов с застойной сердечной недостаточностью, инфарктом миокарда, заболеваниями почек, гипертоническими расстройствами, сахарным диабетом, а также у пациентов в острой фазе шока и при сепсисе и септическом шоке значительно повышен, хотя и в разной степени. В случае некоторых из указанных патологических состояний концентрации PAMP также увеличены, однако уровни в плазме ниже по сравнению с таковыми для ADM (Eto 2001. Peptides 22:1693-1711). Имеются сообщения о том, что необычно высокие концентрации ADM наблюдаются при сепсисе, а самые высокие концентрации - при септическом шоке (Eto 2001. Peptides 22:1693-1711; Hirata et al. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 81(4):1449-1453; Ehlenz et al. 1997. Exp Clin Endocrinol Diabetes 105:156-162; Tomoda et al. 2001. Peptides 22:1783-1794; Ueda et al. 1999. Am. J. Respir. Crit. Care Med.160:132-136 и Wang et al. 2001. Peptides 22:1835-1840).
Концентрации ADM в плазме повышены у пациентов с сердечной недостаточностью и коррелируют с тяжестью заболевания (Hirayama et al. 1999. J Endocrinol 160:297-303; Yu et al. 2001. Heart 86:155-160). У этих субъектов высокое содержание ADM в плазме является независимым отрицательным прогностическим показателем (Poyner et al. 2002. Pharmacol Rev 54:233-246).
Роль MR-проADM (SEQ ID NO:33) в развитии сердечной недостаточности была изучена в нескольких исследованиях. В исследовании BACH (Maisel et al. 2010. J. Am. Coll. Cardiol. 55:2062-2076) MR-проADM оказался мощным прогностическим показателем наступления смерти в течение 90 дней, что добавило прогностическую ценность к таковой натрийуретических пептидов. Результаты, проведенного позже исследования PRIDE (Shah et al. 2012. Eur. Heart J. 33:2197-2205), подтвердили потенциальную прогностическую роль MR-проADM; MR-проADM имел самую лучшую площадь под кривой (AUC) у пациентов, умерших в течение 1 года. Аналогично, уровни MR-проADM у пациентов с хронической сердечной недостаточностью (CHF) были тесно связаны с тяжестью заболевания, а повышенные уровни пептида были тесно связаны с повышенным риском смертельного исхода в течение 12 месяцев наблюдения (van Haehling et al. 2010. European Journal of Heart Failure 12:484-491; Adlbrecht et al. 2009. European Journal of Heart Failure 11:361-366).
MR-проADM изучали во время лечения у пациентов с острой декомпенсированной сердечной недостаточностью (Boyer et al. 2012. Congest Heart Fail 18 (2):91-97): у пациентов с уровнями MR-проADM, имеющими тенденцию к повышению во время интенсивной терапии, были обнаружены признаки, связанные с персистирующей формой гиперемии. Через 12-24 часа после терапии у пациентов с повышенным уровнем MR-проADM усиливался периферический отек. Kaiser et al. измеряли уровни MR-проADM у пациентов с одножелудочковым сердцем (Kaiser et al. 2014. Europ J Heart Failure 16:1082-1088). Уровни у пациентов с нарушенной схемой Фонтена (проявляющейся в виде асцитов и периферического отека) были значительно выше по сравнению с пациентами, не страдающими болезнью Фонтена. Более того, Eisenhut размышлял о том, могут ли методы лечения, приводящие к снижению уровня адреномедуллина, снизить тяжесть и степень альвеолярного отека при пневмонии и сепсисе (Eisenhut 2006. Crit Care 10:418).
Кроме того, в данной области техники известен способ определения иммунореактивности адреномедуллина в биологических жидкостях для диагностических целей и, в частности, для диагностики сепсиса, сердечных заболеваний и рака. Согласно изобретению среднерегиональный частичный пептид проадреномедуллина (SEQ ID NO:33), содержащий аминокислоты (45-92) полного пре-проадреномедуллина, измеряли, в частности, методом иммуноанализа с по меньшей мере одним меченым антителом, специфически распознающим последовательность сред-проADM (WO 2004/090546).
В WO 2004/097423 описано применение антитела против адреномедуллину для диагностики, прогноза и лечения сердечно-сосудистых нарушений. Лечение заболеваний путем блокирования рецептора ADM также описано в данной области техники (например, WO 2006/027147, PCT/EP2005/012844), причем указанные заболевания могут представлять собой сепсис, септический шок, сердечно-сосудистые заболевания, инфекции, дерматологические заболевания, эндокринологические заболевания, нарушения обмена веществ, гастроэнтерологические заболевания, рак, воспаление, гематологические заболевания, респираторные заболевания, заболевания мышечного скелета, неврологические заболевания, урологические заболевания.
Имеются сообщения о том, что на ранней стадии сепсиса ADM улучшает работу сердца и кровоснабжение печени, селезенки, почек и тонкой кишки. Анти-ADM-нейтрализующие антитела нейтрализуют вышеупомянутые эффекты во время ранней фазы сепсиса (Wang et al. 2001. Peptides 22:1835-1840).
Что касается других заболеваний, блокирование ADM может быть в определенной степени полезным. Тем не менее, полная нейтрализация ADM также может оказаться вредной, поскольку для реализации некоторых физиологических функций может потребоваться некоторое количество ADM. Во многих сообщениях подчеркивалось, что при определенных заболеваниях введение ADM может быть полезным. В других отчетах, напротив, сообщалось, что в определенных условиях введение ADM является опасным для жизни.
В WO2013/072510 описано не-нейтрализующее анти-ADM антитело для применения в терапии тяжелого хронического или острого заболевания или острого состояния у пациента для уменьшения риска смертельного исхода для указанного пациента.
В WO2013/072511 описано не-нейтрализующее анти-ADM антитело для применения в терапии хронического или острого заболевания или острого состояния у пациента для профилактики или уменьшения дисфункции органа или органной недостаточности.
1/2
В WO2013/072512 описано не-нейтрализующее анти-ADM антитело, которое является ADM-стабилизирующим антителом, увеличивающим период полураспада (t, период полувыведения) адреномедуллина в сыворотке, крови, плазме. Указанное ADM-стабилизирующее антитело блокирует биологическую активность ADM до менее чем 80%.
В WO2013/072513 описано не-нейтрализующее анти-ADM антитело для применения в терапии острого заболевания или состояния у пациента для стабилизации кровообращения.
В WO2013/072514 описано не-нейтрализующее анти-ADM антитело для регулирования баланса жидкости у пациента с хроническим или острым заболеванием или острым состоянием.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Согласно настоящему изобретению было обнаружено, что введение анти-ADM антитела или фрагмента анти-ADM антитела, связывающегося с ADM, или анти-ADM не-Ig каркаса, связывающегося с ADM, можно использовать для вмешательства и терапии гиперемии у нуждающихся в этом пациентов.
В тексте описания «антитела» или «фрагменты антител», или «не-Ig каркасы» по изобретению способны связываться с ADM и, таким образом, направлены против ADM и, соответственно, могут называться «анти-ADM антителами», «фрагментами анти-ADM антител» или «анти-ADM не-Ig каркасами».
Преимущество введения анти-ADM антитела или фрагмента анти-ADM антитела, связывающегося с ADM, или анти-ADM не-Ig-каркаса, связывающегося с ADM, относительно введения, например, диуретиков заключается в защите почек. Указанное анти-ADM антитело или фрагмент анти-ADM антитела, связывающийся с ADM, или анти-ADM не-Ig каркас, связывающийся с ADM, не оказывает отрицательного влияния на почки, и, следовательно, не будет вызывать каких-либо связанных с этим побочных эффектов.
В соответствии с изобретением введение анти-ADM антитела или фрагмента анти-ADM антитела, связывающегося с ADM, или анти-ADM не-Ig каркаса, связывающегося с ADM, предпочтительно является системным.
В конкретном варианте осуществления указанное анти-ADM антитело или фрагмент анти-ADM антитела, связывающийся с ADM, или анти-ADM не-Ig каркас, связывающийся с ADM, можно вводить пациенту с дисфункцией сосудистого барьера или эндотелиальной дисфункцией, которая может привести к гиперемии.
Дисфункция сосудистого барьера или эндотелиальная дисфункция является системным патологическим состоянием эндотелия (внутренней оболочки кровеносных сосудов) и в широком смысле может быть определена как дисбаланс между сосудорасширяющими и сосудосуживающими веществами, вырабатываемыми эндотелием (или воздействующими на эндотелий) (Deanfield et al. 2005 J Hypertens 23 (1):7-17). Нормальные функции эндотелиальных клеток включают участие в коагуляции, адгезии тромбоцитов, функционировании иммунной системы и контроле объема и содержания электролитов во внутрисосудистом и внесосудистом пространствах. Эндотелий представляет собой клеточный монослой, который выстилает всю сердечно-сосудистую систему и регулирует многие процессы, включая тонус сосудов, тромбоз, ангиогенез и воспаление. Было показано, что эндотелиальные клетки фенотипически динамичны и, в ответ на различные локальные и системные стимулы, способны переходить из неактивного в активное состояние и наоборот (Colombo et al. 2015. Curr Heart Fail Rep. 12 (3):215-222). В последние годы новые исследования показали, что эндотелиальная дисфункция является основной причиной сердечно-сосудистых заболеваний, включая гипертензию, атеросклероз и застойную сердечную недостаточность (Gutierrez et al. 2013. European Heart Journal 34:3175-3181). Эндотелий жестко контролирует обмен жидкости из кровотока в окружающие ткани, и дисфункция этого барьера приводит к неконтролируемому выделению жидкости, что может привести к развитию гиперемии и/или отека. Общей особенностью отека (например, отека легких) является повышенная проницаемость для низкомолекулярных веществ, растворенных в воде (Rocker et al. 1987. Thorax 42:620-23).
Эндотелиальная дисфункция может быть результатом и/или способствовать развитию нескольких болезненных процессов, как это происходит при гипертензии, гиперхолестеринемии, диабете или септическом шоке. Эндотелиальная дисфункция является основным патофизиологическим механизмом, который ведет к развитию заболевания коронарной артерии и других атеросклеротических заболеваний.
Результаты доклинических исследований на моделях сепсиса/септического шока показали, что введение анти-ADM антитела вызывает увеличение концентрации био-ADM в плазме (см. пример 8, фиг. 9), и это совпадает с увеличением показателя выживаемости (Struck et al. 2013. Intensive Care Med Exp 1(1):22). Механизм, лежащий в основе этого эффекта, заключается в следующем: при внутривенном введении антитело из-за своего размера не может проникнуть через эндотелиальный барьер в интерстиций и остается в кровотоке. ADM, напротив, будучи малым пептидом, может свободно диффундировать через эндотелиальный барьер. Таким образом, антитело при введении в сильном молярном избытке относительно уровня эндогенного ADM связывает практически весь ADM, находящийся в плазме, и, как следствие достижения равновесия связывания, приводит к переходу ADM из интерстиция в кровоток. Находящийся в интерстиции ADM может связываться с гладкомышечными клетками сосудов и вызывать их расслабление, приводя к расширению сосудов. Этот эффект уменьшается при введении антитела. С другой стороны, ADM в плазме связывается с эндотелиальными клетками и тем самым стабилизирует или даже восстанавливает целостность сосудов. Таким образом, эта функция усиливается, когда уровни ADM в плазме увеличиваются вследствие введения антитела, которое является не-нейтрализующим антителом. Наконец, связывание антитела с ADM уменьшает протеолитический распад ADM.
Удивительным оказалось то, что в исследовании PROTECT (пример 6) и исследовании BIOSTAT (пример 7) у пациентов с сердечной недостаточностью концентрации био-ADM увеличивались при наличии и с увеличением тяжести гиперемии, несмотря на их лечение диуретиками. Таким образом, увеличение био-ADM у этих пациентов является антагонистическим действием организма на гиперемию в тканях. Однако естественного увеличения недостаточно для эффективного достижения такого антагонистичекого действия. Гиперемия в тканях также возникает при сепсисе. В примерах 5, 9 и 10 показано, что введение анти-ADM антитела в животных моделях сепсиса приводит к восстановлению нарушенной целостности сосудов. С учетом параллельного механизма развития гиперемии в тканях как при сепсисе, так и при сердечной недостаточности специалист в данной области будет убежден в том, что введение анти-ADM антитела должно приводить к положительному эффекту при лечении гиперемии при сердечной недостаточности, также как при сепсисе/септическом шоке.
В конкретном варианте осуществления указанное анти-ADM антитело или фрагмент анти-ADM антитела, связывающийся с ADM, или анти-ADM не-Ig каркас, связывающийся с ADM, может быть введен пациенту для применения при вмешательстве и терапии гиперемии с помощью сопутствующего способа диагностики. Указанный сопутствующий способ диагностики описан ниже.
Про-адреномедуллин или его фрагменты, состоящие из по меньшей мере 5 аминокислот, могут быть использованы в качестве раннего суррогатного маркера гиперемии и, тем самым, определяя направление терапии или вмешательства при гиперемии, что включает:
определение уровня про-адреномедуллина или его фрагментов, состоящих из по меньшей мере 5 аминокислот, в жидкости организма, полученной от указанного индивида; и
а) выявление корреляции указанного уровня про-адреномедуллина или его фрагментов со степенью гиперемии у указанного индивида или постановкой диагноза гиперемии, причем повышенный уровень, превышающий определенное пороговое значение, указывает на наличие гиперемии или степень гиперемии или,
b) выявление корреляции указанного уровня про-адреномедуллина или его фрагментов с необходимостью проведения или успехом терапии или вмешательством и терапией гиперемии у указанного индивида, причем уровень ниже определенного порогового значения указывает на успешность терапии или вмешательства и терапии гиперемии, а уровень выше определенного порогового значения указывает на необходимость проведения терапии или вмешательства и терапии гиперемии, или
c) выявление корреляции указанного уровня про-адреномедуллина или его фрагментов с оценкой вероятности уменьшения гиперемии или наличия остаточной гиперемии после терапии или вмешательства и терапии гиперемии, причем повышенный уровень, превышающий определенное пороговое значение, указывает на остаточную гиперемию после терапии или вмешательства и терапии гиперемии, тогда как уровень ниже определенного порогового значения указывает на уменьшение гиперемии после терапии или вмешательства и терапии гиперемии, или
d) выявление корреляции указанного уровня про-адреномедуллина или его фрагментов с уменьшением гиперемии или наличием остаточной гиперемией после терапии или вмешательства и терапии гиперемии, причем повышенный уровень, превышающий определенное пороговое значение, указывает на остаточную гиперемию после терапии или вмешательства и терапии гиперемии, тогда как уровень ниже определенного порогового значения указывает на уменьшение гиперемии после терапии или вмешательства и терапии гиперемии, или
e) выявление корреляции указанного уровня про-адреномедуллина или его фрагментов с оценкой решения о выписке из стационара, причем повышенный уровень, превышающий определенное пороговое значение, означает, что субъект не подлежит выписке, а уровень ниже определенного порогового значения означает, что субъект может быть выписан,
2
при этом указанный про-адреномедуллин или фрагмент выбирают из группы, содержащей про-адреномедуллин согласно SEQ ID NO:31, или PAMP согласно SEQ ID NO:32, или MR-проADM согласно SEQ ID NO:33, или ADM-NH согласно SEQ ID NO:20, или ADM-Gly согласно SEQ ID NO:34, или CT-проADM согласно SEQ ID NO:35.
Такой способ подробно описан в европейских заявках на патент ЕР 16199092 и ЕР 16178725 и включен в настоящее описание посредством ссылки. Терапия и вмешательство, указанные выше в способе диагностики, представляют собой введение указанного анти-ADM антитела или фрагмента анти-ADM антитела, связывающегося с ADM, или анти-ADM не-Ig каркаса, связывающегося с ADM.
Тяжесть гиперемии, степень гиперемии, уровень гиперемии, стадия гиперемии и т.п.используются в настоящей заявке в качестве синонимов.
2
Зрелый ADM, био-ADM и ADM-NH используются в настоящей заявке в качестве синонимов и представляют собой молекулу согласно SEQ ID NO:20.
Про-адреномедуллин или его фрагменты являются ранним, количественным и точным суррогатным маркером гиперемии при острой сердечной недостаточности и сердечной недостаточности, в частности, у индивида с острой сердечной недостаточностью и/или у индивида с сердечной недостаточностью с выраженными симптомами ухудшения и/или у индивида с симптомами сердечной недостаточности или острой сердечной недостаточности. Ранний и точный суррогатный маркер гиперемии в условиях острой сердечной недостаточности или сердечной недостаточности означает, что его концентрация и/или уровень иммунной реактивности отражает степень гиперемии.
Если указанный уровень про-адреномедуллина или его фрагментов выше определенного порогового значения, анти-ADM антитело или фрагмент анти-ADM антитела, связывающийся с ADM, или анти-ADM не-Ig каркас, связывающийся с ADM, вводят в качестве терапии или вмешательства при гиперемии.
Это означает, что в конкретном варианте осуществления объекта настоящего изобретения указанное анти-ADM антитело или фрагмента анти-ADM антитела, связывающийся с ADM, или анти-ADM не-Ig каркас, связывающийся с ADM, предназначены для применения при вмешательстве и терапии гиперемии у пациента, причем образец жидкости тела, взятый у указанных пациентов, имеет повышенный уровень проADM и/или его фрагментов, состоящих из по меньшей мере 5 аминокислот, превышающий определенное пороговое значение. Таким образом, способ диагностики с помощью указанного проADM и/или фрагментов служит в качестве сопутствующего способа диагностики.
В конкретном варианте осуществления способа диагностики указанный проADM и/или его фрагменты, состоящие из по меньшей мере 5 аминокислот, выбирают из группы, содержащей:
SEQ ID NO:31 (проADM): 164 аминокислоты (22-185 пре-проADM)
ARLDVASEF RKKWNKWALS RGKRELRMSS SYPTGLADVK AGPAQTLIRP QDMKGASRSP EDSSPDAARI RVKRYRQSMN NFQGLRSFGC RFGTCTVQKL AHQIYQFTDK DKDNVAPRSK ISPQGYGRRR RRSLPEAGPG RTLVSSKPQA HGAPAPPSGS APHFL
SEQ ID NO:32 (N-20 терминальный пептид проадреномедуллина, PAMP): аминокислоты 22-41 пре-проADM
ARLDVASEF RKKWNKWALS R
SEQ ID NO:33 (среднерегиональный проадреномедуллин, MR-проADM): аминокислоты 45-92 пре-проADM
ELRMSS SYPTGLADVK AGPAQTLIRP QDMKGASRSP EDSSPDAARI RV
2
SEQ ID NO:20 (зрелый адреномедуллин (зрелый ADM); амидированный ADM; био-ADM): аминокислоты 95-146-CONH
2
YRQSMN NFQGLRSFGC RFGTCTVQKL AHQIYQFTDK DKDNVAPRSK ISPQGY-CONH
SEQ ID NO:34 (адреномедуллин 1-52-Gly (ADM 1-52-Gly)): аминокислоты 95-147 пре-проADM
YRQSMN NFQGLRSFGC RFGTCTVQKL AHQIYQFTDK DKDNVAPRSK ISPQGYG
SEQ ID NO:35 (C-терминальный проадреномедуллин, CT-проADM): аминокислоты 148-185 пре-проADM
RRR RRSLPEAGPG RTLVSSKPQA HGAPAPPSGS APHFL
2
В конкретном варианте осуществления способа диагностики указанный проADM и/или его фрагменты, состоящие из по меньшей мере 5 аминокислот, выбирают из группы, содержащей зрелый ADM-NH (SEQ ID NO:20), ADM 1-52-Gly (SEQ ID NO:34), MR-проADM (SEQ ID NO:33) и CT-проADM (SEQ ID NO:35).
2
2
В конкретном варианте осуществления способа диагностики либо уровень зрелого ADM-NH (SEQ ID NO:20) и/или ADM 1-52-Gly (SEQ ID NO:34) - иммунореактивность либо уровень MR-проADM (SEQ ID NO:33) - иммунореактивность, либо уровень CT-проADM (SEQ ID NO:35) - иммунореактивность определяют и выявляют корреляцию с необходимостью проведения терапии или вмешательства у указанного пациента, при этом указанного пациента определяют как нуждающегося в этом, если уровень зрелого ADM-NH (SEQ ID NO:20) и/или ADM 1-52-Gly (SEQ ID NO:34) - иммунореактивность или уровень MR-проADM (SEQ ID NO:33) -иммунореактивность, или уровень CT-проADM (SEQ ID NO:35) - иммунореактивность в жидкости тела указанного индивида выше порогового значения.
2
2
В конкретном варианте осуществления способа диагностики уровень проADM и/или его фрагментов определяют с помощью по меньшей мере одного связывающего агента, выбранного из группы: связывающего агента, который связывается с областью, содержащейся в следующей последовательности зрелого ADM-NH (SEQ ID NO:20) и/или ADM 1-52-Gly (SEQ ID NO:34), и второго связывающего агента, который связывается с областью, содержащейся в последовательности зрелого ADM-NH (SEQ ID NO:20) и/или ADM 1-52-Gly (SEQ ID NO:34).
В конкретном варианте осуществления способа диагностики уровень проADM и/или его фрагментов определяют с помощью по меньшей мере одного связывающего агента, выбранного из группы: связывающего агента, который связывается с областью, содержащейся в последовательности MR-проADM (SEQ ID NO:33), и второго связывающего агента, который связывается с областью, содержащейся в последовательности MR-проADM (SEQ ID NO:33).
В конкретном варианте осуществления способа диагностики уровень проADM и/или его фрагментов определяют с помощью по меньшей мере одного связывающего агента, выбранного из группы: связывающего агента, который связывается с областью, содержащейся в последовательности CT-проADM (SEQ ID No. 35), и второго связывающего агента, который связывается с областью, содержащейся в последовательности CT-про-ADM (SEQ ID No. 35).
2
Конкретный вариант осуществления способа диагностики по изобретению представляет собой способ по настоящему изобретению, в котором указанный фрагмент может быть выбран из MR-проADM согласно SEQ ID NO:33 или зрелого ADM-NH согласно SEQ ID NO:20.
Способом диагностики по изобретению является способ, в котором уровень про-адреномедуллина или его фрагментов, состоящих из по меньшей мере 5 аминокислот, определяют с помощью связывающего агента, взаимодействующего с про-адреномедуллином или его фрагментами, состоящими из по меньшей мере 5 аминокислот.
Способом диагностики по изобретению является способ, в котором связывающий агент выбирают из группы, содержащей антитело, фрагмент антитела или не-Ig каркас, связывающийся с про-адреномедуллином или его фрагментами, состоящими из по меньшей мере 5 аминокислот.
Жидкость организма в соответствии с настоящим изобретением в одном из конкретных вариантов осуществления представляет собой образец крови. Образец крови может быть выбран из группы, содержащей цельную кровь, сыворотку и плазму. В конкретном варианте осуществления способа диагностики указанный образец выбирают из группы, содержащей человеческую цитратную плазму, гепариновую плазму и плазму ЭДТА.
В конкретном варианте осуществления изобретения указанное анти-ADM антитело или фрагмент анти-ADM антитела, связывающийся с ADM, или анти-ADM не-Ig каркас, связывающийся с ADM, предназначены для применения при вмешательстве и терапии гиперемии у пациента согласно любому варианту осуществления изобретения, причем указанный пациент является устойчивым к диуретикам или не отвечает на терапию диуретиками.
Другой конкретный вариант осуществления изобретения относится к указанному антителу к адреномедуллину или фрагменту антитела против адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркасу для применения при вмешательстве и терапии гиперемии у нуждающегося в этом пациента, причем указанное анти-ADM антитело или фрагмент анти-ADM антитела, или анти-АДМ не-Ig каркас связывается с N-концевой частью (аа 1-21) адреномедуллина:
YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC (SEQ ID NO:22),
и причем указанный пациент является устойчивым к диуретикам или не отвечает на терапию диуретиками.
Термин «устойчивость к диуретикам» обычно определяют как неспособность уменьшить объем внеклеточной жидкости, несмотря на активное использование диуретиков (Ravnan et al. 2002. CHF 8: 80-85). Эпштейн (Epstein) и др. определяют устойчивость к диуретикам как неспособность к экскреции по меньшей мере 90 ммоль натрия в течение 72 часов после приема 160 мг пероральной дозы фуросемида, принимаемой два раза в сутки (Epstein et al. 1977. Curr Ther Res. 21:656-667).
Адаптация к диуретикам и устойчивость к диуретикам могут быть вызваны сходными механизмами. Механизмы адаптации к диуретикам можно классифицировать на механизмы адаптации, возникающие во время действия диуретика, механизмы, вызывающие удерживание натрия в течение короткого промежутка времени (вызывающие «пост-диуретическое удерживание NaCl»), и механизмы, которые приводят к хроническому увеличению удерживания натрия («феномен торможения»). Способы адаптации почек к хроническому лечению диуретиками являются следующими. Во-первых, сегменты нефрона, расположенные ниже места действия диуретика, усиливают реабсорбцию NaCl во время введения диуретика, поскольку увеличивается доставляемая нагрузка NaCl. Во-вторых, когда концентрации диуретиков в канальцах снижаются, действие почечных канальцев направлено на удерживание Na до тех пор, пока не будет введена следующая доза диуретика. В-третьих, способность диуретика увеличивать почечную экскрецию NaCl со временем снижается, что является результатом как истощения объема внеклеточной жидкости, так и структурных и функциональных изменений самих почечных канальцев. Все эти механизмы адаптации увеличивают скорость реабсорбции NaCl и снижают эффективность терапии диуретиками. См., например, Ellison 1999. Semin Nephrol. 19(6):581-97 and De Bruyne 2003. Postgrad Med J 79:268-271.
Несмотря на сложность количественной оценки, устойчивость к диуретикам возникает у одного из трех пациентов с застойной сердечной недостаточностью. Сердечная недостаточность представляет собой наиболее распространенную клиническую ситуацию, в которой наблюдается устойчивость к диуретикам. При легкой степени застойной сердечной недостаточности устойчивость к диуретикам обычно не встречается до тех пор, пока не затронута функция почек. Однако у пациентов с умеренной и тяжелой застойной сердечной недостаточностью устойчивость к диуретикам встречается чаще и часто становится клинической проблемой (Brater 1985. Drugs 30:427-443; Taylor 2000 Cardiol Rev. 8:104-114).
2
В конкретном варианте осуществления способа диагностики используется анализ для определения уровня проADM и/или его фрагментов, состоящих из по меньшей мере 5 аминокислот, причем чувствительность указанного анализа позволяет выполнять количественное определение зрелого ADM-NH у здоровых субъектов, уровень которого составляет <70 пг/мл, предпочтительно <40 пг/мл и более предпочтительно <10 пг/мл. Указанные выше концентрации можно использовать в качестве пороговых значений для способов по настоящему изобретению.
В конкретном варианте осуществления способа диагностики используется анализ для определения уровня проADM и/или его фрагментов, состоящих из по меньшей мере 5 аминокислот, причем чувствительность указанного анализа позволяет выполнять количественное определение MR-проADM у здоровых субъектов, уровень которого составляет <0,5 нмоль/мл, предпочтительно <0,4 нмоль/мл и более предпочтительно <0,2 нмоль/мл. Указанные выше концентрации можно использовать в качестве пороговых значений для способов по настоящему изобретению.
В конкретном варианте осуществления способа диагностики используется анализ для определения уровня проADM и/или его фрагментов, состоящих из по меньшей мере 5 аминокислот, причем чувствительность указанного анализа позволяет осуществлять количественное определение CT-проADM у здоровых субъектов, уровень которого составляет <100 пмоль/мл, предпочтительно <75 пмоль/мл и более предпочтительно <50 пмоль/мл. Указанные выше концентрации можно использовать в качестве пороговых значений для способов по настоящему изобретению.
7
-1
8
-1
9
-1
10
-1
В конкретном варианте осуществления способа диагностики указанный связывающий агент имеет сродство связывания с проADM и/или его фрагментами, составляющее по меньшей мере, 10 М, предпочтительно 10 М, предпочтительное больше 10 М, наиболее предпочтительно больше 10 М. Специалист в данной области знает, что более низкое сродство можно компенсировать путем применения более высокой дозы соединений, и эта мера не приведет к выходу за рамки изобретения.
Для определения сродства антител к адреномедуллину определяли кинетику связывания адреномедуллина с иммобилизованным антителом методом поверхностного плазмонного резонанса без использования меток в системе Biacore 2000 (GE Healthcare Europe GmbH, Freiburg, Германия). Обратимую иммобилизацию антител выполняли, используя антитело к мышиному Fc, ковалентно связанное с высокой плотностью с поверхностью сенсорного чипа CM5 в соответствии с инструкциями производителя (набор мышиных антител для иммобилизации; GE Healthcare), (Lorenz et al. 2011. Antimicrob Agents Chemother. 55 (1):165-173).
В конкретном варианте осуществления способа диагностики указанный связывающий агент выбирают из группы, содержащей антитело или фрагмент антитела или не-Ig каркас, связывающийся с проADM и/или его фрагментами.
В конкретном варианте осуществления способа диагностики используют анализ для определения уровня проADM и/или его фрагментов, состоящих из по меньшей мере 5 аминокислот, причем такой анализ представляет собой сэндвич-анализ, предпочтительно полностью автоматизированный анализ.
В одном из вариантов осуществления изобретения это может быть так называемый POC-тест (в обстановке стационара, «point-of-care»), который представляет собой технологию тестирования, позволяющую выполнять тест в течение менее 1 часа рядом с пациентом без необходимости использования полностью автоматизированной системы анализа. Одним из примеров этой технологии является метод иммунохроматографического анализа.
В одном из вариантов осуществления способа диагностики такой анализ представляет собой сэндвич-иммуноанализ с использованием любого метода детектирования, включая, без ограничения, ферментную метку, хемилюминесцентную метку, электрохемилюминесцентную метку, предпочтительно полностью автоматизированный анализ. В одном из вариантов осуществления способа диагностики такой анализ представляет собой иммуноферментный сэндвич-анализ. Примеры автоматизированного или полностью автоматизированного анализа включают анализы, которые можно использовать для одной из следующих систем: Roche Elecsys, Abbott Architect, Siemens Centauer, Brahms Kryptor, BiomerieuxVidas, Alere Triage.
Разнообразные виды иммуноанализа известны и могут быть использованы для анализов и способов по настоящему изобретению, к ним относятся: радиоиммуноанализ («RIA»), гомогенный иммуноферментный анализ («EMIT»), ферментный иммуносорбентный анализ («ELISA»), иммуноанализ на основе реактивации апофермента («ARIS»), иммуноферментный экспресс-анализ и иммунохроматографический анализ.
В конкретном варианте осуществления способа диагностики по меньшей мере один из указанных двух связующих агентов является меченым для обеспечения возможности детектирования.
Объектом настоящего изобретения является антитело против адреномедуллина (ADM) или фрагмент антитела против адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас для применения при вмешательстве и терапии гиперемии у пациента, причем указанный пациент имеет заболевание или состояние, выбранное из группы, содержащей конгестивное высокое артериальное давление, набухание или задержку воды (отек), сердечную недостаточность, в частности острую сердечную недостаточность, заболевание почек или печени.
Объектом настоящего изобретения является антитело против адреномедуллина (ADM) или фрагмент антитела против адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас для применения при вмешательстве и терапии гиперемии у пациента, где указанный пациент имеет заболевание или состояние, выбранное из группы, содержащей конгестивное высокое артериальное давление, набухание или задержку воды (отек) и сердечную недостаточность, в частности острую сердечную недостаточность.
Сердечная недостаточность (СН) - это сердечное заболевание, которое возникает, когда проблемы, связанные со структурой или функцией сердца, ухудшают его способность обеспечивать кровоток, достаточный для удовлетворения потребностей организма. Это может вызывать большое разнообразие симптомов, в частности одышку в покое или во время физических упражнений, признаки задержки жидкости, такие как легочная гиперемия или набухание лодыжки, и объективные признаки нарушения структуры или функции сердца в покое.
de novo
Сердечная недостаточность - это клинический синдром, характеризующийся совокупностью симптомов и признаков, вызванных дисфункцией сердца. Она является одной из основных причин заболеваемости и смертности в развитых странах с частотой встречаемости 1-2%. Сердечную недостаточность можно подразделить на хроническую СН и острую СН. Пациенты с хронической сердечной недостаточностью могут быть классифицированы в группы стабильной хронической СН с ухудшением признаков и симптомов хронической СН и острой декомпенсацией хронической СН. Острую сердечную недостаточность (ОСН) определяют как быстрое появление признаков и симптомов сердечной недостаточности, что приводит к необходимости в срочной терапии или госпитализации. ОСН может проявляться как острая сердечная недостаточность  (впервые возникшая ОСН у пациента без предшествующей сердечной дисфункции) или острая декомпенсация хронической СН. ОСН является основной причиной госпитализации взрослых старше 65 лет. Несмотря на заметные улучшения в прогнозе для пациентов с хронической сердечной недостаточностью, в основном связанные с достижениями в терапии за последние несколько десятилетий, как краткосрочные, так и долговременные результаты все еще остаются очень плохими, если пациенты госпитализированы с декомпенсированной сердечной недостаточностью. Почти 25% пациентов, госпитализированных по причине ОСН, нуждаются в повторной госпитализации в течение 30 дней после выписки из больницы, при этом <50% выживают в течение 5 лет после госпитализации. Помимо значительного снижения выживаемости и качества жизни пострадавших пациентов, денежная нагрузка ОСН на системы здравоохранения огромна. Общая стоимость лечения сердечной недостаточности в одних только США в 2012 году оценивалась в 31 миллиард долларов, и большая часть этих расходов связана со стационарным лечением. По прогнозам, в 2030 году эти расходы вырастут до беспрецедентных размеров, 70 миллиардов долларов, из-за старения населения.
Сердечная недостаточность охватывает широкий круг пациентов, от пациентов с нормальной фракцией выброса левого желудочка (ФВЛЖ) ≥50%, согласно общепринятому мнению, также известной как СН с сохраненной ФВ (HFpEF), до пациентов с пониженной ФВЛЖ <40%, согласно общепринятому мнению, также известной как СН с пониженной ФВ (HFrEF). Пациенты с ФВЛЖ в диапазоне 40-49% представляют «серую зону», которая определяется как СН со средней ФВЛЖ (HFmrEF) (Ponikowski et al. 2016. European Heart Journal 18(8):891-975).
Основной целью лечения ОСН в условиях стационара является уменьшение гиперемии (удаление чрезмерного количества внутриклеточной и внеклеточной жидкости) и облегчение симптомов и признаков гиперемии. Диуретики остаются основным противоотечным препаратом при острой сердечной недостаточности, и почти все госпитализированные пациенты получают лекарственные вещества этого класса. Определенным группам пациентов назначают другие классы лекарственных веществ, которые увеличивают фракцию сердечного выброса и уменьшают давление наполнения, такие как инотропы и вазодилататоры. Некоторым пациентам, особенно таким, у которых отсутствует адекватный ответ на терапию диуретиками, можно назначить ультрафильтрацию.
Хотя пациенты (как правило) хорошо реагируют на терапию диуретиками, значительная часть пациентов выписывается из больницы без достижения адекватного уровня уменьшения гиперемии и нормоволемического статуса (т.е., остаточной гиперемии). В первую очередь это связано с тем, что современные подходы к клинической оценке гиперемии являются неадекватными. Имеются непротиворечивые свидетельства, указывающие на то, что наличие остаточной гиперемии при выписке из больницы связано с плохими результатами после выписки, особенно в случае повторной госпитализации. Следовательно, существует огромная неудовлетворенная потребность в более точном и надежном суррогатном маркере гиперемии, который позволил бы принимать объективное и оптимальное решение относительно адекватности достигнутого уровня гиперемии и сроков выписки из больницы.
В конкретном аспекте изобретения субъект является субъектом, страдающим сердечной недостаточностью. В другом конкретном аспекте изобретения субъект является субъектом с острой сердечной недостаточностью и/или субъектом с сердечной недостаточностью с ухудшающимися признаками, и/или субъектом с симптомами сердечной недостаточности или острой сердечной недостаточности. В одном из конкретных аспектов изобретения указанный субъект имеет острую сердечную недостаточность, которая представляет собой впервые выявленную ОСН или острую декомпенсированную СН. В другом конкретном аспекте изобретения указанный субъект имеет острую декомпенсированную хроническую сердечную недостаточность или ухудшение признаков/симптомов хронической сердечной недостаточности. В одном из конкретных аспектов изобретения указанный субъект имеет острую сердечную недостаточность, в частности, впервые выявленную ОСН.
Термин «острый» используется для обозначения быстрого начала и для описания обостренной или декомпенсированной сердечной недостаточности с эпизодами, при которых пациент может быть охарактеризован как пациент с изменением признаков и симптомов сердечной недостаточности, приводящим к необходимости в срочной терапии или госпитализации.
Термин «хронический» относится к большой продолжительности. Хроническая сердечная недостаточность - это длительное состояние, которое обычно остается стабильным при лечении симптомов (стабильная хроническая сердечная недостаточность).
Стабильная хроническая СН характеризуется:
1. наличием структурной или функциональной недостаточности сердца, которая ухудшает его способность обеспечивать кровоток, достаточный для удовлетворения потребностей организма,
2. отсутствием перегрузки объемом (проявляемой в виде легочной и/или системной гиперемии) и/или выраженного уменьшения сердечного выброса (проявляемого в виде гипотонии, почечной недостаточности и/или шокового синдрома), и при этом пациент не нуждается в срочной терапии или корректировке терапии и не требует госпитализации.
Хроническая СН с ухудшением признаков и симптомов характеризуется:
1. наличием структурной или функциональной недостаточности сердца, которая ухудшает его способность обеспечивать кровоток, достаточный для удовлетворения потребностей организма,
2. перегрузкой объемом (проявляемой в виде легочной и/или системной гиперемии) и/или выраженным уменьшением сердечного выброса (проявляемым в виде гипотонии, почечной недостаточности и/или шокового синдрома),
при этом пациент не нуждается в срочной терапии, и не требуется госпитализация, но необходима корректировка терапии.
При хронической сердечной недостаточности также может наблюдаться декомпенсация (что называется острой декомпенсированной сердечной недостаточностью или острой декомпенсированной хронической сердечной недостаточностью), что чаще всего является результатом интеркуррентного заболевания (такого как пневмония), инфаркта миокарда, аритмии, неконтролируемой гипертонии или неспособности пациента ограничивать прием жидкости, придерживаться диеты или соблюдать прием лекарств. После лечения у пациентов с острой декомпенсированной хронической сердечной недостаточностью может происходить возврат к стабильному хроническому компенсированному состоянию (стабильной хронической сердечной недостаточности).
Впервые выявленная острая СН и острая декомпенсированная хроническая СН характеризуются:
1. наличием структурной или функциональной недостаточности сердца, которая ухудшает его способность обеспечивать кровоток, достаточный для удовлетворения потребностей организма,
2. перегрузкой объемом (проявляемой в виде легочной и/или системной гиперемии) и/или выраженным уменьшением сердечного выброса (проявляемым в виде гипотонии, почечной недостаточности и/или шокового синдрома ),
при этом пациент нуждается в срочной терапии или корректировке терапии, и требуется госпитализация.
<b>Острая СН</b>
<b>Хроническая СН</b>
Впервые выявленная ОСН
Острая декомпенсированная СН=острая декомпенсированная хроническая СН
Ухудшение признаков/ симптомов хронической СН
Стабильная хроническая СН
Приведенные выше определения острой сердечной недостаточности либо впервые выявленной ОСН, либо острой декомпенсированной СН, либо острой декомпенсированной хронической СН, либо ухудшение признаков/симптомов хронической сердечной недостаточности, соответствуют определениям, приведенным в работе Voors et al., European Journal of Heart Failure (2016), 18, 716-726.
Ухудшение почечной функции часто встречается как в случае острой, так и в случае хронической сердечной недостаточности (СН), называемое в последнее время «кардиоренальным синдромом». Почечная гиперемия (ПГ) становится все более признанным потенциальным фактором, влияющим на развитие кардиоренальных синдромов, и адекватный контроль гиперемии с одновременным улучшением/сохранением функции почек был предложен в качестве основной цели мониторинга пациентов с сердечной недостаточностью (Aronson 2012. Expert Rev Cardiovasc Ther. 10:177-189).
Гиперемию при СН определяют как высокое диастолическое давление в левом желудочке, связанное с признаками и симптомами СН, такими как одышка, хрипы и/или отек. Эти признаки и симптомы, связанные с гиперемией, являются основными причинами случаев госпитализации при СН.
Хотя устранение гиперемии (и связанных с ней признаков/симптомов) и достижение нормоволемического статуса остаются основной целью терапии ОСН в стационарных условиях, не существует стандартного алгоритма или клинического инструмента для оценки гиперемии. Существующие сегодня практические методы клинической оценки гиперемии в основном сфокусированы на признаках и симптомах. В качестве суррогатных маркеров гиперемии используются результаты физического осмотра, такие как повышенное яремное венозное давление (ЯВД), периферические отеки, ортопноэ, тоны сердца S3 и гепатомегалия, или рентгенологические исследования грудной клетки, такие как кардиомегалия и интерстициальный/альвеолярный отек. Следует отметить, что, несмотря на тщательно проводимую оценку ЯВД, прогностическая ценность этих параметров для обнаружения гиперемии является незначительной или посредственной. Существует высокая неудовлетворенная потребность в наличии надежного и точного суррогатного маркера гиперемии. Существует высокая и неудовлетворенная медицинская потребность в определении, прогнозировании, оценке и/или мониторинге гиперемии и отеков с применением количественных и качественных методов. Существует необходимость в определении, прогнозировании, оценке и/или мониторинге степени гиперемии, т.е. уровня гиперемии.
Для целей настоящего изобретения степень гиперемии также может быть выражена как степень тяжести гиперемии и определена, как описано ниже. Однако специалист в данной области знает, что степень гиперемии может быть выражена другими показателями или суррогатными маркерами, такими как, например, шкала, используемая в работе Ambrosy et al. (Ambrosy et al. 2013. European Heart Journal 34 (11):835-843).
Как было описано выше, гиперемия может быть классифицирована многими различными способами. Специалист в данной области знает, что степень гиперемии может быть выражена другими показателями или суррогатными маркерами. Клиническая классификация может быть основана на физическом осмотре у постели больного для выявления наличия клинических симптомов/признаков гиперемии («влажная» или «сухая», если присутствует или отсутствует) и/или периферической гипоперфузии («холодная» или «теплая», если присутствует или отсутствует (см., например, Ponikowski et al. 2016. Eur Heart J. ehw128). Комбинация этих вариантов определяет четыре группы: теплая и влажная (хорошо перфузированная и застойная), присутствующая чаще всего; холодная и влажная (гипоперфузионная и застойная); холодная и сухая (гипоперфузионная без гиперемии); и теплая и сухая (компенсированная, хорошо перфузированная без гиперемии). Эта классификация может быть полезной для проведения терапии на начальном этапе и несет прогностическую информацию.
Как правило, симптомы и признаки ОСН отражают перегрузку жидкостью (легочная гиперемия и/или периферический отек) или, реже, уменьшение сердечного выброса при периферической гипоперфузии. Для диагностики ОСН полезным тестом может оказаться рентген грудной клетки. Венозная гиперемия легких, плевральный выпот, интерстициальный или альвеолярный отек и кардиомегалия являются наиболее специфическими признаками ОСН, хотя у 20% пациентов с ОСН рентгенограмма грудной клетки является почти нормальной.
Симптомы/признаки гиперемии (левой стороны) определяются как ортопноэ, пароксизмальная ночная одышка, легочные хрипы (двусторонние), периферические отеки (двусторонние). Симптомы/признаки гиперемии (правой стороны) определяются как дилатация яремной вены, периферический отек (двусторонний), застойная гепатомегалия, гепатоюгулярный рефлюкс, асцит, симптомы застойного кишечника (см. таблицу 12.2 в работе Ponikowski et al. 2016. Eur Heart J. ehw128).
Отек - это скопление жидкости в межклеточной ткани в результате ненормального увеличения объема межклеточной жидкости. Жидкость между интерстициальным и внутрисосудистым пространствами регулируется градиентом гидростатического давления капилляров и градиентом онкотического давления через капилляр (Trayes et al. 2013. Am Fam Physician 88 (2):102-110). Накопление жидкости происходит, когда локальные или системные условия нарушают это равновесие, приводя к увеличению капиллярного гидростатического давления, увеличению объема плазмы, снижению онкотического давления плазмы (гипоальбуминемии), повышенной проницаемости капилляров или лимфатической обструкции.
Клинически отек проявляется в виде набухания: количество интерстициальной жидкости определяется балансом гомеостаза жидкости, а повышенная секреция жидкости в интерстиций или нарушение удаления жидкости может вызвать отек. При сердечной недостаточности гидростатическое давление повышается. Причины отека, которые распространяются на все тело, могут вызывать отек во многих органах и на периферии. Например, тяжелая сердечная недостаточность может вызывать отек легких, плевральные выпоты, асцит и периферический отек.
Отек легких - это скопление жидкости в воздушных пространствах и паренхиме легких. Он приводит к нарушению газообмена и может вызвать дыхательную недостаточность. Это связано либо с неспособностью левого желудочка сердца адекватно удалять кровь из легочного кровотока («кардиогенный отек легких»), либо с повреждением паренхимы легкого или сосудистой сети легкого («некардиогенный отек легких») (Ware and Matthay 2005. N. Engl. J. Med. 353 (26):2788-96). Лечение сосредоточено на трех аспектах: во-первых, улучшение дыхательной функции, во-вторых, лечение первопричины и, в-третьих, предотвращение дальнейшего повреждения легкого. Отек легких, особенно острый, может привести к фатальному расстройству дыхания или остановке сердца из-за гипоксии. Это основная особенность застойной сердечной недостаточности.
о
Превалирующим симптомом отека легких является затрудненное дыхание, но также может включать кашель с кровью (обычно в виде розовой, пенистой мокрты), повышенное потоотделение, беспокойство и бледность кожи. Одышка может проявляться в виде ортопноэ (неспособность лежать плашмя из-за одышки) и/или пароксизмальной ночной одышки (эпизоды тяжелой внезапной одышки ночью). Это обычные симптомы хронического отека легких, вызванные недостаточностью левого желудочка. Развитие отека легких может быть связано с симптомами и признаками «перегрузки жидкостью»; это неспецифический термин для описания проявлений недостаточности левого желудочка в остальной части тела и включает периферический отек (отек ног, как правило, разного рода «вдавливания», когда кожа медленно возвращается в нормальное состояние при надавливании), повышенное яремное венозное давление и гепатомегалию, при которой печень увеличена и может быть болезненной при пальпации или даже пульсирующей. Другие признаки включают трескучие звуки в конце вдоха (звуки, слышимые в конце глубокого вдоха) при аускультации и наличие третьего тона сердца.
Как подчеркивалось ранее, клинические суррогатные маркеры имеют неоптимальную прогностическую ценность для выявления гиперемии. В так называемом исследовании PROTECT (O`Connor et al. 2012 European Journal of Heart Failure 14:605-612) для увеличения точности оценки были объединены три наиболее сильных клинических суррогатных маркера гиперемии (т.е., ЯВД, периферический отек и ортопноэ), и была разработана комплексная оценка клинической гиперемии (CCS) согласно приведенной ниже схеме:
Параметр
0
1
2
3
Периферический отек
0
Голень
Ниже колена
Выше колена
Ортопноэ
0 подушек
1 подушка
2 подушки
3 подушки
ЯВД
<6 см
6-10 см
> 10 см
-
Затем добавляли оценку по каждому из этих трех параметров для получения комплексной оценки гиперемии, показатели которой находились в пределах от 0 до 8.
Для оценки тяжести гиперемии использовали следующий алгоритм:
CCS=0, клиническая гиперемия отсутствует
CCS 1-3, слабая степень клинической гиперемии
CCS 4-5, умеренная степень клинической гиперемии
CCS ≥6, тяжелая степень клинической гиперемии
Состояния, влияющие на структуру и функцию почек, можно считать острыми или хроническими, в зависимости от их продолжительности (хроническая болезнь почек (ХБП, CKD), острая болезнь почек (ОБП, AKD) или острое повреждение почек (ОПП, AKI)).
2
ОБП характеризуется структурным поражением почек в течение <3 месяцев, и функциональными критериями, которые также наблюдаются при ОПП, или СКФ <60 мл/мин на 1,73 м в течение <3 месяцев, или уменьшением СКФ на ≥35%, или повышением уровня креатинина в сыворотке (SCr) на >50% в течение <3 месяцев (Kidney International Supplements, Vol. 2, Issue 1, March 2012, pp. 19-36).
ОПП является одним из вариантов острой болезни и расстройств почек (ОБП) и может возникать наряду с другими или без вариантов острой или хронической болезни и расстройств почек.
ОПП определяют как снижение функции почек, в том числе уменьшение СКФ, и почечная недостаточность. Критерии для диагностики ОПП и стадии тяжести ОПП основаны на изменениях объема SCr и мочи. При ОПП структурные критерии не рассматриваются (хотя и могут существовать), но отмечают увеличение креатинина сыворотки (SCr) на 50% в течение 7 дней или увеличение на 0,3 мг/дл (26,5 мкмоль/л), или олигурию. ОБП может возникать у пациентов с травмой, инсультом, сепсисом, SIRS, септическим шоком, острым инфарктом миокарда (ИМ), пост-ИМ, локальными и системными бактериальными и вирусными инфекциями, аутоиммунными заболеваниями, у пациентов с ожогами, у пациентов, перенесших хирургические операции, у пациентов с раком, заболеваниями печени, заболеваниями легких, а также у пациентов, получающих нефротоксины, такие как циклоспорин, антибиотики, в том числе аминогликозиды, и противоопухолевые препараты, такие как цисплатин.
2
Почечная недостаточность является стадией ОПП и характеризуется СКФ <15 мл/мин на 1,73 м площади поверхности тела или потребностью в заместительной почечной терапии (ЗПТ).
2
ХБП характеризуется скоростью клубочковой фильтрации (СКФ) <60 мл/мин на 1,73 м в течение >3 месяцев и повреждением почек в течение >3 месяцев (Kidney International Supplements, 2013; Vol. 3: 19-62).
Хроническое увеличение внеклеточного объема является одним из наиболее распространенных и традиционных нарушений, которые составляют группу синдромов, относящихся к терминальной стадии почечной недостаточности (ТСПН). Степень увеличения объема от легкой до умеренной может оставаться незамеченной или игнорироваться при ТСПН, но выраженная перегрузка жидкостью у этих пациентов в конечном итоге приведет к необходимости неотложной медицинской помощи, требующей госпитализации и экстрадиализа у этих пациентов. При ТСПН часто встречаются как легочная гиперемия, так и застойная сердечная недостаточность (Zoccali et al. 2013 Blood Purif 36:184-191).
Заболевание печени (также называемое печеночным заболеванием) представляет собой тип повреждения или заболевания печени. Заболевание печени может протекать по нескольким механизмам. Распространенной формой заболевания печени является вирусная инфекция, вызываемая, например, вирусом гепатита. Цирроз печени - это образование фиброзной ткани вместо клеток печени, погибших из-за множества причин, включая вирусный гепатит, чрезмерное потребление алкоголя и другие формы токсичности печени, которые вызывают хроническую печеночную недостаточность.
Застойная гепатопатия относится к спектру хронических повреждений печени, связанных с пассивной гиперемией печени, возникающей в условиях правосторонней сердечной недостаточности или в результате любого повышения центрального венозного давления, включая тяжелую легочную гипертензию (Shah and Sass 2015. Liver Res Open J. 1(1):1-10). Кардиогепатическая дисфункция часто встречается у пациентов с острой декомпенсированной сердечной недостаточностью, а кардиогепатические синдромы имеют некоторые общие патофизиологические механизмы с кардиоренальными синдромами, такие как увеличение венозной гиперемии (Nikolaou et al. 2013. European Heart Journal 34: 742-749). Конечная стадия заболевания печени приводит к серьезной задержке соли и воды. Хотя такая задержка жидкости в основном проявляется в брюшной полости в виде асцита, на более поздних стадиях можно наблюдать выраженные периферические отеки, особенно при тяжелой гипоальбуминемии (Cho and Atwood 2002. Am J Med. 113:580-586).
Вмешательство или терапия гиперемии у пациента в соответствии с настоящим изобретением может сочетаться с современными методами лечения. Согласно уровню техники, терапия или вмешательство при гиперемии может быть выбрано из группы, включающей введение диуретиков, введение инотропов, введение вазодилататоров, ультрафильтрацию, в частности, диуретики.
Кроме того, в одном из вариантов осуществления изобретения антитело против адреномедуллина (ADM) или фрагмент антитела против адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас являются моноспецифическими.
Моноспецифическое антитело против адреномедуллина (ADM) или фрагмент моноспецифического антитела против адреномедуллину, или моноспецифический анти-ADM не-Ig каркас означает, что указанное антитело или фрагмент антитела, или не-Ig каркас связывается с одной конкретной областью, состоящей из по меньшей мере 5 аминокислот, в целевой ADM. Моноспецифическое антитело против адреномедуллина (ADM) или фрагмент моноспецифического антитела против адреномедуллину, или моноспецифический анти-ADM не-Ig каркас представляет собой антитело против адреномедуллина (ADM) или фрагменты антител к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркасы, имеющие сродство к одному и того же антигену.
В другом конкретном и предпочтительном варианте осуществления анти-ADM антитело или фрагмент анти-ADM антитела или анти-ADM не-Ig-каркас, связывающийся ADM, представляет собой моноспецифическое антитело, фрагмент антитела, или не-Ig каркас, соответственно, причем моноспецифическое означает, что указанное антитело или фрагмент антитела, или не-Ig каркас связывается с одной конкретной областью, состоящей из по меньшей мере 4 аминокислот, в целевом ADM. Моноспецифические антитела или фрагменты, или не-Ig каркасы по изобретению представляют собой антитела или фрагменты, или не-Ig каркасы, имеющие сродство к одному и тому же антигену. Моноклональные антитела являются моноспецифическими, но моноспецифические антитела могут также продуцироваться другими способами, отличными от их продуцирования в обычной половой клетке.
Указанное анти-ADM антитело или фрагмент антитела, связывающийся с ADM, или не-Ig каркас, связывающийся с ADM, может представлять собой не-нейтрализующее анти-ADM антитело или фрагмент антитела, связывающийся с ADM, или не-Ig каркас, связывающийся с ADM.
В конкретном варианте осуществления указанное анти-ADM антитело, фрагмент анти-ADM антитела, или анти-ADM не-Ig каркас представляет собой не-нейтрализующее антитело, фрагмент или не-Ig каркас. Нейтрализующее анти-ADM антитело, фрагмент анти-ADM антитела, или анти-ADM не-Ig каркас способны блокировать биологическую активность ADM почти на 100%, по меньшей мере, более чем на 90%, предпочтительно, по меньшей мере, более чем на 95%.
Напротив, не-нейтрализующее анти-ADM антитело или фрагмент анти-ADM антитела, или анти-ADM не-Ig каркас блокирует биологическую активность ADM менее чем на 100%, предпочтительно менее чем на 95%, предпочтительно менее чем на 90%, более предпочтительно менее чем на 80% и еще более предпочтительно менее чем на 50%. Это означает, что биологическая активность ADM снижается до менее чем 100%, до 95% или менее, но не более, до 90% или менее, но не более, до 80% или менее, но не более, до 50% или менее, но не более. Это означает, что остаточная биологическая активность ADM, обеспечивающая связывание с не-нейтрализующим анти-ADM антителом или фрагментом анти-ADM антитела, или анти-ADM не-Ig каркасом, будет составлять более чем 0%, предпочтительно более чем 5%, предпочтительно более чем 10%, более предпочтительно более чем 20%, более предпочтительно более чем 50%.
В этом контексте (а) молекулу(ы), представляющую собой антитело или фрагмент антитела, или не-Ig каркас с «не-нейтрализующей анти-ADM активностью», для простоты называемую в настоящей заявке общим термином «не-нейтрализующее» анти-ADM антитело, фрагмент антитела или не-Ig каркас, которая, например, блокирует биологическую активность ADM до менее чем 80%, определяют как:
- молекула или молекулы, связывающие ADM, которые при добавлении в культуру линии эукариотических клеток, экспрессирующих функциональный рекомбинантный рецептор ADM человека, состоящий из CRLR (рецептор, подобный рецептору кальцитонина) и RAMP3 (белок 3, модифицирующий активность рецептора), уменьшает количество цАМФ, продуцируемого указанной клеточной линией под действием параллельно добавленного синтетического человеческого пептида ADM, причем указанный добавленный синтетический человеческий ADM добавляют в количестве, которое в отсутствие анализируемого не-нейтрализующего антитела приводит к уровню стимуляции синтеза цАМФ, составляющему половину от максимального уровня стимуляции, при этом восстановление уровня цАМФ за счет связывания указанной молекулы(молекул) с ADM происходит до степени, составляющей не более 80%, даже при добавлении не-нейтрализующей молекулы(молекул), связывающей анализируемый ADM, в количестве, в 10 раз превышающем количество, необходимое для достижения максимально возможного снижения синтеза цАМФ с помощью не-нейтрализующего антитела, подлежащего анализу.
Такое же определение применяется к другим диапазонам: 95%, 90%, 50% и т.д.
1
2
3
4
Антитело или фрагмент в соответствии с настоящим изобретением представляет собой белок, включающий один или более полипептидов, в основном кодируемых генами иммуноглобулина, которые специфически связываются с антигеном. Узнаваемые гены иммуноглобулина включают гены константной области каппа, лямбда, альфа (IgA), гамма (IgG, IgG, IgG, IgG), дельта (IgD), эпсилон (IgE) и мю (IgM), а также множество генов вариабельной области иммуноглобулинов. Полноразмерные легкие цепи иммуноглобулина обычно составляют в длину примерно 25 кДа или 214 аминокислот.
2
Полноразмерные тяжелые цепи иммуноглобулина обычно составляют в длину примерно 50 кДа или 446 аминокислот. Легкие цепи кодируются геном вариабельной области на NH-конце (длиной примерно 110 аминокислот) и геном константной области каппа или лямбда на COOH-конце. Тяжелые цепи кодируются аналогичным образом геном вариабельной области (длиной примерно 116 аминокислот) и одним из других генов константной области.
2
Основной структурной единицей антитела обычно является тетрамер, который состоит из двух идентичных пар цепей иммуноглобулина, каждая из которых имеет одну легкую и одну тяжелую цепи. В каждой паре вариабельные области легкой и тяжелой цепей связываются с антигеном, а константные области обеспечивают эффекторные функции. Иммуноглобулины также существуют во множестве других форм, включая, например, Fv, Fab и (Fab'), а также бифункциональные гибридные антитела и одиночные цепи (например, Lanzavecchia et al. 1987. Eur. J. Immunol. 17:105; Huston et al. 1988. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85:5879-5883; Bird et al. 1988. Science 242:423-426; Hood et al. 1984, Immunology, Benjamin, N.Y., 2nd ed.; Hunkapiller and Hood 1986. Nature 323:15-16). Вариабельная область легкой или тяжелой цепи иммуноглобулина включает каркасную область, прерываемую тремя гипервариабельными областями, также называемыми областями, определяющими комплементарность (CDR) (см. Sequences of Proteins of Immunological Interest, E. Kabat et al. 1983, U.S. Department of Health and Human Services). Как отмечалось выше, CDR в первую очередь ответственны за связывание с эпитопом антигена. Иммунный комплекс представляет собой антитело, такое как моноклональное антитело, химерное антитело, гуманизированное антитело или антитело человека, или функциональный фрагмент антитела, специфически связанный с антигеном.
Химерные антитела являются антителами, гены легкой и тяжелой цепей которых сконструированы, как правило, методами генной инженерией, состоящими из генов вариабельной и константной областей иммуноглобулинов, принадлежащих к разным видам. Например, вариабельные сегменты генов мышиного моноклонального антитела могут быть присоединены к человеческим константным сегментам, таким как каппа и гамма 1 или гамма 3. В одном из примеров терапевтическое химерное антитело является, таким образом, гибридным белком, состоящим из вариабельного или антигенсвязывающего домена из мышиного антитела и константного или эффекторного домена из человеческого антитела, хотя можно использовать другие виды млекопитающих или можно получить вариабельную область методами молекулярной биологии. Способы получения химерных антител хорошо известны в данной области, см., например, патент США № 5,807,715. «Гуманизированный» иммуноглобулин представляет собой иммуноглобулин, включающий человеческую каркасную область и одну или более CDR нечеловеческого иммуноглобулина (такого как мышиного, крысиного или синтетического). Иммуноглобулин нечеловеческого происхождения, обеспечивающий CDR, называют «донором», а человеческий иммуноглобулин, обеспечивающий каркас, называют «акцептором». В одном из вариантов осуществления все CDR в гуманизированном иммуноглобулине происходят из донорского иммуноглобулина. Константные области не обязательно должны присутствовать, но если имеются, они должны быть практически идентичными константным областям человеческого иммуноглобулина, т.е., идентичными на по меньшей мере примерно 85-90%, например, на примерно 95% или более. Следовательно, все части гуманизированного иммуноглобулина, за исключением, возможно, CDR, по существу идентичны соответствующим частям последовательностей природного человеческого иммуноглобулина. «Гуманизированное антитело» представляет собой антитело, содержащее гуманизированную легкую цепь и гуманизированную тяжелую цепь иммуноглобулина. Гуманизированное антитело связывается с таким же антигеном, что и донорское антитело, которое обеспечивает CDR. Акцепторный каркас гуманизированного иммуноглобулина или антитела может иметь ограниченное количество замен аминокислотами, взятыми из донорского каркаса. Гуманизированные или другие моноклональные антитела могут иметь дополнительные консервативные аминокислотные замены, которые по существу не влияют на связывание антигена или другие функции иммуноглобулина. Примерами консервативных замен являются такие, как gly, ala; val, ile, leu; asp, glu; asn, gln; ser, thr; lys, arg; и phe, tyr. Гуманизированные иммуноглобулины могут быть сконструированы методами генной инженерии (например, см. патент США № 5580089). Человеческое антитело представляет собой антитело, в котором гены легкой и тяжелой цепей имеют человеческое происхождение. Человеческие антитела могут быть получены способами, известными в данной области. Человеческие антитела могут быть получены путем иммортализации человеческой В-клетки, секретирующей представляющее интерес антитело. Иммортализация может быть достигнута, например, путем инфицирования EBV или путем слияния человеческой В-клетки с клеткой миеломы или гибридомы с получением клетки триомы. Человеческие антитела также могут быть получены методами фагового дисплея (см., например, WO91/17271; WO92/001047; WO92/20791) или выбраны из комбинаторной библиотеки человеческих моноклональных антител (см. веб-сайт Morphosys). Человеческие антитела также могут быть получены с использованием трансгенных животных, несущих ген человеческого иммуноглобулина (например, см. WO93/12227; WO 91/10741).
3
2
Таким образом, анти-ADM антитело может иметь форматы, известные в данной области техники. Примерами являются человеческие антитела, моноклональные антитела, гуманизированные антитела, химерные антитела, CDR-привитые антитела. В предпочтительном варианте осуществления изобретения антитела по настоящему изобретению представляют собой антитела, полученные рекомбинантным способом, например, IgG, типичный полноразмерный иммуноглобулин, или фрагменты антител, содержащие по меньшей мере F-вариабельный домен тяжелой и/или легкой цепи, например, химически связанные антитела (фрагмент связывающий антиген), включая, без ограничения, Fab-фрагменты, включая Fab мини-тела, одноцепочечные антитела Fab, моновалентное антитело Fab с эпитопными метками, например, Fab-V5Sx2; бивалентный Fab (мини-антитело), димеризованный с доменом СН; двухвалентный Fab или многовалентный Fab, например, образованный путем мультимеризации с помощью гетерологичного домена, например, через димеризацию доменов dHLX, например, Fab-dHLX-FSx2; F(ab')-фрагменты, scFv-фрагменты, мультимеризованные, мультивалентные и/или мультиспецифические scFv-фрагменты, бивалентные и/или биспецифические диатела, BITE (биспецифический захватчик T-клеток), трифункциональные антитела, поливалентные антитела, например, из класса, отличного от G; однодоменные антитела, например, нанотела, полученные из иммуноглобулинов верблюда или рыбы, и многие другие.
В дополнение к анти-ADM антителам в данной области техники хорошо известны другие биополимерные каркасы для получения комплексов молекулы-мишени, которые используют для получения специфических для мишени биополимеров. Примерами являются аптамеры, шпигельмеры, антикалины и конотоксины. Для иллюстрации форматов антител см. фиг. 1a, 1b и 1c.
2
В предпочтительном варианте осуществления формат анти-ADM антитела выбирают из группы, включающей фрагмент Fv, фрагмент scFv, фрагмент Fab, фрагмент scFab, фрагмент F(ab) и белок слияния scFv-Fc. В другом предпочтительном варианте осуществления формат антитела выбирают из группы, включающей фрагмент scFab, фрагмент Fab, фрагмент scFv и их конъюгаты, оптимизированные по биодоступности, такие как пегилированные фрагменты. Одним из наиболее предпочтительных форматов является формат scFab.
Не-Ig каркасы могут быть белковыми каркасами и могут использоваться в качестве имитаторов антител, поскольку они способны связываться с лигандами или антигенами. Не-Ig каркасы могут быть выбраны из группы, состоящей из не-Ig каркасов на основе тетранектина (например, описанных в US 2010/0028995), фибронектиновых каркасов (например, описанных в EP 1266025); каркасов на основе липокалинов (например, описанных в WO 2011/154420); убиквитиновых каркасов (например, описанных в WO 2011/073214), трансферриновых каркасов (например, описанных в US 2004/0023334), каркасов белка А (например, описанных в EP 2231860), каркасов на основе анкиринового повтора (например, описанных в WO 2010/060748), микропротеиновых (предпочтительно на основе микропротеинов, образующих цистеиновый узел) каркасов (например, описанных в EP 2314308), каркасов на основе домена Fyn SH3 (например, описанных в WO 2011/023685), каркасов на основе EGFR-A домена (например, описанных в WO 2005/040229) и каркасов на основе домена Kunitz (например, описанных в EP 1941867).
В одном из вариантов осуществления изобретения анти-ADM антитела по настоящему изобретению могут быть получены, как описано в Примере 1, путем синтеза фрагментов ADM в качестве антигенов. После этого агент, связывающийся с указанными фрагментами, идентифицируют описанными ниже способами или другими способами, известными в данной области техники.
Гуманизацию мышиных антител можно выполнять согласно следующей процедуре:
Для гуманизации антитела мышиного происхождения последовательность антител анализируют на структурное взаимодействие каркасных областей (FR) с определяющими комплементарность областями (CDR) и антигеном. На основе структурного моделирования выбирают подходящий FR человеческого происхождения, и последовательности мышиных CDR трансплантируют в человеческий FR. Для восстановления структурных взаимодействий, которые исчезли в результате видового переключения FR последовательностей в аминокислотные последовательности CDR или FR могут быть введены изменения. Такое восстановление структурных взаимодействий может быть достигнуто методом случайных эффектов с использованием библиотек фагового дисплея или методом направленного воздействия, осуществляемого с помощью молекулярного моделирования (Almagro and Fransson 2008. Гуманизация антител. Front Biosci. 2008 Jan 1; 13:1619-33).
2
В предпочтительном варианте осуществления формат анти-ADM антитела выбирают из группы, включающей фрагмент Fv, фрагмент scFv, фрагмент Fab, фрагмент scFab, фрагмент F(ab) и scFv-Fc слитый белок. В другом предпочтительном варианте осуществления формат антитела выбирают из группы, включающей фрагмент scFab, фрагмент Fab, фрагмент scFv и их конъюгаты, оптимизированные по биодоступности, такие как пегилированные фрагменты. Одним из наиболее предпочтительных форматов является формат scFab.
В другом предпочтительном варианте осуществления анти-ADM антитело, фрагмент анти-ADM антитела, или анти-ADM не-Ig каркас представляет собой полноразмерное антитело, фрагмент антитела или не-Ig каркас.
В предпочтительном варианте осуществления антитело против адреномедуллина или фрагмент антитела против адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас направлен и может связываться с эпитопом длиной по меньшей мере 5 аминокислот, содержащимся в ADM.
В более предпочтительном варианте осуществления антитело против адреномедуллина или фрагмент антитела против адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас направлен на и может связываться с эпитопом длиной по меньшей мере 4 аминокислоты, содержащимся в ADM.
В одном из конкретных вариантов осуществления изобретения антитело против адреномедуллина (ADM) или фрагмент анти-ADM антитела, связывающийся с адреномедуллином, или анти-ADM не-Ig-каркас, связывающийся с адреномедуллином, предназначен для применения в терапии или профилактике острого заболевания или острого состояния у пациента, причем указанное антитело или фрагмент, или каркас не являются ADM-связывающим белком-1 (фактором комплемента Н).
В одном из конкретных вариантов осуществления изобретения предоставляется антитело против адреномедуллина (ADM) или фрагмент анти-ADM-антитела, связывающийся с адреномедуллином, или анти-ADM не-Ig каркас, связывающийся с адреномедуллином, для применения в терапии или профилактике острого заболевания или острого состояния у пациента, причем указанное антитело или фрагмент антитела, или не-Ig каркас связывается с областью, состоящей из предпочтительно по меньшей мере 4 или по меньшей мере 5 аминокислот, в последовательности aa 1-42 зрелого человеческого ADM:
SEQ ID NO:23
YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTCTVQKLAHQIYQFTDKDKDNVA.
В одном из конкретных вариантов осуществления изобретения предоставляется антитело против адреномедуллина (ADM) или фрагмент анти-ADM антитела, связывающийся с адреномедуллином, или анти-ADM не-Ig-каркас, связывающийся с адреномедуллином, для применения в терапии или профилактике острого заболевания или острого состояния у пациента, причем указанное антитело или фрагмент, или каркас связывается с областью, состоящей из предпочтительно по меньшей мере 4 или по меньшей мере 5 аминокислот, в последовательности aa 1-21 зрелого человеческого ADM:
SEQ ID NO:22
YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения указанное анти-ADM антитело или фрагмент антитела против адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig-каркас связывается с областью или эпитопом ADM, который расположен в N-концевой части (aa 1-21) адреномедуллина.
В другом предпочтительном варианте осуществления указанное анти-ADM антитело или фрагмент антитела против адреномедуллину, или каркас анти-ADM не-Ig распознает и связывается с областью или эпитопом в пределах аминокислот 1-14 (SEQ ID NO:25) адреномедуллина; что означает N-концевую часть (аа 1-14) адреномедуллина. В другом предпочтительном варианте осуществления указанное анти-ADM антитело или фрагмент антитела против адреномедуллину, или каркас анти-ADM не-Ig распознает и связывается с областью или эпитопом в пределах аминокислот 1-10 адреномедуллина (SEQ ID NO:26); что означает N-концевую часть (аа 1-10) адреномедуллина.
aa 1-14 ADM
YRQSMNNFQGLRSF (SEQ ID NО: 25)
aa 1-10 ADM
YRQSMNNFQG (SEQ ID NO:26)
В другом предпочтительном варианте осуществления указанное анти-ADM антитело или фрагмент антитела против адреномедуллину, или каркас анти-ADM не-Ig распознает и связывается с областью или эпитопом в пределах аминокислот 1-6 адреномедуллина (SEQ ID NO:27); что означает N-концевую часть (аа 1-6) адреномедуллина. Как указано выше, указанная область или эпитоп предпочтительно содержит по меньшей мере 4 или по меньшей мере 5 аминокислот в длину.
aa 1-6 ADM
YRQSMN (SEQ ID NO:27)
В другом предпочтительном варианте осуществления указанное анти-ADM антитело или фрагмент антитела против адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас распознает и связывается с N-концом (aa1) адреномедуллина. N-конец означает аминокислоту 1, которая представляет собой «Y» в SEQ ID NO:20, 22 или 23; и является обязательной для связывания антитела. Антитело или фрагмент, или каркас не связываются ни с удлиненным N-концом, ни с модифицированным N-концом адреномедуллина, ни с деградированным N-концом адреномедуллина. Это означает, что в другом предпочтительном варианте осуществления изобретения анти-ADM-антитело или фрагмент антитела против адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас связывается только с областью в последовательности зрелого ADM, если N-конец ADM является свободным. В указанном варианте осуществления анти-ADM антитело или фрагмент антитела против адреномедуллину, или не-Ig каркас не связывается с областью в последовательности зрелого ADM, если указанная последовательность, например, содержится в про-ADM.
Из номеров в скобках, указанных для ясности, для конкретных областей ADM, таких как «N-концевая часть (aa 1-21)», специалист в данной области поймет, что N-концевая часть ADM состоит из аминокислот 1-21 зрелой последовательности ADM.
В другом конкретном варианте осуществления изобретения предложенное в настоящем документе анти-ADM антитело или фрагмент анти-ADM антитела, или анти-ADM не-Ig каркас не связываются с C-концевой частью ADM, т.е. aa 43-52 ADM
(SEQ ID NO:24)
PRSKISPQGY-NH2.
В одном из конкретных вариантов осуществления предпочтительно использовать анти-ADM антитело или фрагмент антитела против адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас по настоящему изобретению, где указанное антитело против адреномедуллина или указанный фрагмент антитела против адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас приводит к увеличению уровня ADM или усилению иммунореактивности ADM в сыворотке, крови, плазме на по меньшей мере 10%, предпочтительно на по меньшей мере 50%, более предпочтительно на >50%, наиболее предпочтительно на >100%.
1/2
В одном из конкретных вариантов осуществления предпочтительно использовать анти-ADM антитело или фрагмент антитела против адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас по настоящему изобретению, где указанное антитело против адреномедуллина или указанный фрагмент антитела против адреномедуллину, или не-Ig каркас представляет собой стабилизирующее ADM антитело или стабилизирующий адреномедуллин фрагмент, или стабилизирующий адреномедуллин не-Ig каркас, который увеличивает период полураспада (t; период полувыведения) адреномедуллина в сыворотке, крови, плазме на по меньшей мере 10%, предпочтительно на по меньшей мере 50%, более предпочтительно на >50%, наиболее предпочтительно на >100%.
Период полураспада (период полувыведения) ADM может быть определен в сыворотке, крови или плазме человека в отсутствие и в присутствии стабилизирующего ADM антитела или фрагмента стабилизирующего адреномедуллин антитела, или стабилизирующего адреномедуллин не-Ig каркаса, соответственно, методом иммуноанализа для количественного определения ADM.
Могут быть выполнены следующие этапы:
- ADM может быть разбавлен в цитратной человеческой плазме в отсутствие и в присутствии стабилизирующего ADM антитела или фрагмента стабилизирующего адреномедуллин антитела, или стабилизирующего адреномедуллин не-Ig каркаса, соответственно, и может быть инкубирован при 24°С.
- Аликвоты берут в выбранные моменты времени (например, в течение 24 часов), и деградацию ADM в указанных аликвотах можно остановить путем замораживания при -20°C.
- Количество ADM может быть определено методом иммуноанализа hADM напрямую, в отсутствие влияния стабилизирующего антитела на выбранный анализ. Альтернативно, аликвоту можно обработать денатурирующими агентами (такими как HCl), и после очистки образца (например, центрифугированием) pH можно нейтрализовать и провести количественную оценку ADM с помощью иммунологического анализа ADM. Альтернативно, для количественного определения ADM можно использовать способы, не относящиеся к иммуноанализу (например, RP-HPLC).
- Период полураспада ADM рассчитывают для ADM, инкубированного в отсутствие и в присутствии стабилизирующего ADM антитела или фрагмента стабилизирующего адреномедуллин антитела, или стабилизирующего адреномедуллин не-Ig каркаса, соответственно.
- Для стабилизированного ADM определяют увеличение периода полураспада по сравнению с ADM, который инкубировали в отсутствие стабилизирующего ADM антитела или фрагмента стабилизирующего адреномедуллин антитела, или стабилизирующего адреномедуллин не-Ig каркаса.
Увеличение периода полураспада ADM в два раза означает увеличение периода полураспада на 100%.
Период полураспада (период полувыведения) определяют как период, в течение которого концентрация указанного химического вещества или лекарственного средства снижается до половины его исходной концентрации в указанной жидкости или крови.
Анализ, который можно использовать для определения периода полураспада (периода полувыведения) адреномедуллина в сыворотке, крови и плазме, описан в примере 3.
В предпочтительном варианте осуществления указанное анти-ADM антитело, фрагмент анти-ADM антитела, или анти-ADM не-Ig каркас представляет собой не-нейтрализующее антитело, фрагмент или каркас. Нейтрализующее анти-ADM антитело, фрагмент анти-ADM антитела, или анти-ADM не-Ig каркас способны блокировать биологическую активность ADM почти на 100%, по меньшей мере, более чем на 90%, предпочтительно, по меньшей мере, более чем на 95%. Другими словами, это означает, что указанное не-нейтрализующее анти-ADM антитело, фрагмент анти-ADM антитела, или анти-ADM не-Ig каркас блокирует биологическую активность ADM до уровня менее 100%, предпочтительно менее чем 95%, предпочтительно менее чем 90%. В варианте осуществления, в котором указанное не-нейтрализующее анти-ADM антитело, фрагмент анти-ADM антитела или анти-ADM не-Ig каркас блокирует биологическую активность ADM до менее чем 95%, анти-ADM антитело, фрагмент анти-ADM антитела или анти-ADM не-Ig каркас, который способен блокировать биологическую активность ADM до более чем 95%, не входит в объем указанного варианта осуществления. В одном из вариантов осуществления это означает, что биологическая активность снижается до 95% или менее, но не более, предпочтительно до 90% или менее, более предпочтительно до 80% или менее, более предпочтительно до 50% или менее, но не более.
В одном из вариантов осуществления изобретения не-нейтрализующее антитело представляет собой антитело, связывающееся с областью из по меньшей мере 5 аминокислот в последовательности 1-42 зрелого человеческого ADM (SEQ ID NO:23), предпочтительно в последовательности aa 1-32 зрелого человеческого ADM (SEQ ID NO:28), или антитело, связывающееся с областью из по меньшей мере 5 аминокислот в последовательности 1-40 зрелого мышиного ADM (SEQ ID NO:29), предпочтительно в последовательности aa 1-31 зрелого мышиного ADM (SEQ ID NO:30).
В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения не-нейтрализующее антитело представляет собой антитело, связывающееся с областью по меньшей мере из 4 аминокислот в последовательности 1-42 зрелого человеческого ADM (SEQ ID NO:23), предпочтительно в последовательности 1-32 зрелого человеческого ADM (SEQ ID NO:28), или антитело, связывающееся с областью по меньшей мере из 4 аминокислот в последовательности 1-40 зрелого мышиного ADM (SEQ ID NO:29) предпочтительно в последовательности аа 1-31 зрелого мышиного ADM (SEQ ID NO:30).
аа 1-32 зрелого человеческого ADM
YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTCTVQKLAHQIYQ (SEQ ID NO:28)
аа 1-40 зрелого мышиного ADM
YRQSMNQGSRSNGCRFGTCTFQKLAHQIYQLTDKDKDGMA (SEQ ID NO:29)
аа 1-31 зрелого мышиного ADM
YRQSMNQGSRSNGCRFGTCTFQKLAHQIYQL (SEQ ID NO:30)
В конкретном варианте осуществления в соответствии с настоящим изобретением используется не-нейтрализующее анти-ADM антитело или фрагмент антитела против адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас, причем указанное анти-ADM антитело или фрагмент антитела против адреномедуллину блокирует биологическую активность ADM менее чем на 80%, предпочтительно менее чем на 50% (от исходных значений). Следует понимать, что указанное ограниченное блокирование биологической активности (означающее снижение биологической активности) ADM происходит даже при избыточной концентрации антитела, фрагмента или каркаса, что означает избыток антитела, фрагмента или каркаса по отношению к ADM. Указанное ограниченное блокирование является внутренним свойством самого ADM-связывающего агента в указанном конкретном варианте осуществления. Это означает, что максимальное ингибирование, обеспечиваемое указанным антителом, фрагментом или каркасом, составляет 80% или 50%, соответственно. В предпочтительном варианте осуществления указанное анти-ADM антитело, фрагмент анти-ADM антитела или анти-ADM не-Ig каркас блокируют/снижают биологическую активность анти-ADM до по меньшей мере 5%. Изложенное выше означает, что остается соответственно примерно 20%, или 50%, или даже 95% остаточной биологической активности ADM.
Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением предоставленные анти-ADM антитела, фрагменты анти-ADM антител и анти-ADM не-Ig каркасы не нейтрализуют соответствующую биологическую активность ADM.
in vivo
in vitro
Биологическую активность определяют как воздействие, оказываемое веществом на живой организм или ткань, или орган, или функциональную единицу  или  (например, в анализе) после взаимодействия с ним. В случае биологической активности ADM, это может быть воздействие ADM в функциональном анализе цАМФ в присутствии человеческого рекомбинантного рецептора адреномедуллина. Таким образом, согласно настоящему изобретению биологическую активность определяют с помощью функционального анализа цАМФ в присутствии рецептора адреномедуллина. Для определения биологической активности ADM с помощью такого анализа могут быть выполнены следующие этапы:
- В указанном функциональном анализе цАМФ в присутствии рецептора адреномедуллина получают кривые зависимости доза-ответ для ADM
- Можно рассчитать концентрацию ADM, обеспечивающую половину от максимальной стимуляции цАМФ,.
- При постоянных концентрациях ADM, обеспечивающих половину от максимальной стимуляции цАМФ, получают кривые доза-ответ (применяя конечную концентрацию вплоть до 100 мкг/мл) в присутствии стабилизирующего ADM антитела или фрагмента стабилизирующего адреномедуллин антитела, или стабилизирующего адреномедуллин не-Ig каркаса, соответственно.
Максимальный эффект ингибирования в указанном анализе биологической активности ADM, составляющий 50%, означает, что указанное анти-ADM антитело или указанный фрагмент антитела против адреномедуллину, или указанный анти-адреномедуллиновый не-Ig каркас, соответственно, блокирует до 50% биологической активности ADM относительно исходных значений. Максимальный эффект ингибирования в указанном анализе биологической активности ADM, составляющий 80%, означает, что указанное анти-ADM антитело или указанный фрагмент антитела против адреномедуллину, или указанный анти-адреномедуллиновый не-Ig каркас, соответственно, блокирует до 80% биологической активности ADM. Это означает блокирование биологической активности ADM не более чем на 80%, иными словами, остается примерно 20% остаточной биологической активности ADM.
Однако согласно настоящему описанию и с учетом указанного выше выражение «блокирует биологическую активность ADM» в отношении раскрытых в настоящем описании анти-ADM антител, фрагментов анти-ADM антител и анти-ADM не-Ig каркасов следует понимать только как уменьшение биологической активности ADM со 100% до 20% остаточной биологической активности ADM, предпочтительно уменьшение биологической активности ADM со 100% до 50% остаточной биологической активности ADM; но в любом случае имеется остаточная биологическая активность ADM, которую можно определить с помощью описанного выше анализа.
Биологическую активность ADM можно определить с помощью функционального анализа цАМФ в присутствии человеческого рекомбинантного рецептора адреномедуллина (биоанализ адреномедуллина) в соответствии с примером 2.
В предпочтительном варианте осуществления модулирующее антитело или фрагмент модулирующего антитела против адреномедуллину, или модулирующий анти-адреномедуллиновый не-Ig каркас используется в терапии или профилактике хронического или острого заболевания или острого состояния у пациента для стабилизации кровообращения, в частности стабилизации системного кровообращения.
1/2
«Модулирующее» анти-ADM-антитело или фрагмент модулирующего антитела против адреномедуллину, или модулирующий анти-адреномедуллиновый не-Ig каркас представляет собой антитело или фрагмент антитела против адреномедуллину, или не-Ig каркас, который увеличивает период полураспада (t период полувыведения) адреномедуллина в сыворотке, крови, плазме на по меньшей мере 10%, предпочтительно на по меньшей мере 50%, более предпочтительно на >50%, наиболее предпочтительно на >100% и блокирует биологическую активность ADM до менее чем 80%, предпочтительно до менее чем 50%, причем указанное анти-ADM антитело, фрагмент анти-ADM антитела, или анти-ADM не-Ig каркас блокирует биологическую активность ADM до по меньшей мере 5%. Эти значения, связанные с периодом полураспада и блокированием биологической активности, следует рассматривать в связи с описанным выше анализом, используемым для определения этих значений. Это означает блокирование биологической активности ADM не более чем на 80% или не более чем на 50%, соответственно.
in vivo
Такое модулирующее анти-ADM антитело или фрагмент модулирующего антитела против адреномедуллину, или модулирующий анти-адреномедуллиновый не-Ig каркас обеспечивает преимущество, заключающееся в облегчении дозирования при введении. Комбинация частичного блокирования или частичного уменьшения биологической активности адреномедуллина и увеличения периода полураспада  (увеличение биологической активности адреномедуллина) упрощает дозирование антитела против адреномедуллину или фрагмента антитела против адреномедуллину, или анти-адреномедуллинового не-Ig каркаса. В ситуации избытка эндогенного адреномедуллина (максимальная стимуляция, поздняя фаза сепсиса, шок, гиподинамическая фаза) эффект снижения активности является основным действием антитела или фрагмента, или каркаса, ограничивающим (отрицательное) воздействие адреномедуллина. В случае низких или нормальных концентраций эндогенного адреномедуллина биологический эффект антитела против адреномедуллину или фрагмента антитела против адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркаса представляет собой комбинацию уменьшения (за счет частичного блокирования) и увеличения за счет увеличения периода полураспада адреномедуллина. Таким образом, не-нейтрализующее и модулирующее антитело против адреномедуллина или фрагмент антитела против адреномедуллину, или анти-адреномедуллиновый не-Ig каркас действует как буфер биологической активности ADM, поддерживающий биологическую активность ADM в определенном физиологическом диапазоне.
В конкретном варианте осуществления изобретения антитело представляет собой моноклональное антитело или его фрагмент. В одном из вариантов осуществления изобретения анти-ADM антитело или фрагмент анти-ADM антитела представляет собой человеческое или гуманизированное антитело или его производное. В одном из конкретных вариантов осуществления одну или более (мышиных) CDR прививают на человеческое антитело или фрагмент антитела.
Объектом настоящего изобретения в одном из аспектов является человеческое CDR-привитое антитело или фрагмент этого антитела, который связывается с ADM, причем человеческое CDR-привитое антитело или фрагмент этого антитела содержит тяжелую цепь антитела (H-цепь), содержащую:
SEQ ID NO:1
GYTFSRYW
SEQ ID NO:2
ILPGSGST
и/или
SEQ ID NO:3
TEGYEYDGFDY,
и/или дополнительно содержит легкую цепь антитела (L цепь), содержащую:
SEQ ID NO:4
QSIVYSNGNTY
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ʺRVSʺ (не указанную в списке последовательностей):
RVS
и/или
SEQ ID No.: 5
FQGSHIPYT.
В одном из конкретных вариантов осуществления изобретения объектом настоящего изобретения является моноклональное антитело человека, которое связывается с ADM, или фрагмент этого антитела, который связывается с ADM, где тяжелая цепь содержит по меньшей мере одну CDR, выбранную из группы, содержащей:
SEQ ID NO:1
GYTFSRYW
SEQ ID NO:2
ILPGSGST
SEQ ID NO:3
TEGYEYDGFDY,
и где легкая цепь содержит по меньшей мере одну CDR, выбранную из группы, содержащей:
SEQ ID NO:4
QSIVYSNGNTY
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ʺRVSʺ (не указанную в списке последовательностей):
RVS
SEQ ID NO:5
FQGSHIPYT.
В более конкретном варианте осуществления объектом изобретения является моноклональное антитело человека, которое связывается с ADM, или фрагмент этого антитела, который связывается с ADM, где тяжелая цепь содержит последовательности:
SEQ ID NO:1
GYTFSRYW
SEQ ID NO:2
ILPGSGST
SEQ ID NO:3
TEGYEYDGFDY,
и где легкая цепь содержит последовательности:
SEQ ID NO:4
QSIVYSNGNTY
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ʺRVSʺ (не указанную в списке последовательностей):
RVS
SEQ ID NO:5
FQGSHIPYT.
В одном из конкретных вариантов осуществления анти-ADM антитело имеет последовательность, выбранную из группы, содержащей SEQ ID NO:6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 и 13.
-7
-8
-9
-10
Анти-ADM антитело или фрагмент антитела против адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас по настоящему изобретению имеют сродство к человеческому ADM, причем константа сродства выше чем 10М, предпочтительно 10М, предпочтительно сродство выше 10М, наиболее предпочтительно выше 10М. Специалист в данной области знает, что более низкое сродство можно компенсировать более высокой дозой соединений, и это не приведет к выходу за рамки настоящего изобретения. Константы сродства могут быть определены способом, описанным в Примере 1.
Объектом настоящего изобретения является моноклональное антитело человека или фрагмент, который связывается с ADM, или фрагмент этого антитела, для применения при вмешательстве и терапии гиперемии у пациента в соответствии с настоящим изобретением, где указанное антитело или его фрагмент содержит последовательность, выбранную из группы, содержащей:
SEQ ID NO:6 (AM-VH-C)
QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFSRYWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGSGSTNYNEKFKGKATITADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKHHHHHH
SEQ ID NO:7 (AM-VH1)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWISWVRQAPGQGLEWMGRILPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKHHHHHH
SEQ ID NO:8 (AM-VH2-E40)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWMGRILPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKHHHHHH
SEQ ID NO:9 (AM-VH3-T26-E55)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKATGYTFSRYWISWVRQAPGQGLEWMGEILPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKHHHHHH
SEQ ID NO:10 (AM-VH4-T26-E40-E55)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKATGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWMGEILPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKHHHHHH
SEQ ID NO:11 (AM-VL-C)
DVLLSQTPLSLPVSLGDQATISCRSSQSIVYSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHIPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:12 (AM-VL1)
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLNWFQQRPGQSPRRLIYRVSNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:13 (AM-VL2-E40)
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLEWFQQRPGQSPRRLIYRVSNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Объектом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция для применения при вмешательстве и терапии гиперемии у пациента, содержащая антитело или фрагмент, или каркас по настоящему изобретению.
Объектом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция для применения при вмешательстве и терапии гиперемии у пациента, содержащая антитело или фрагмент, или каркас по настоящему изобретению, где указанный пациент имеет заболевание или состояние, выбранное из группы, включающей конгестивное высокое артериальное давление, набухание или задержку воды (отек), сердечную недостаточность, в частности острую сердечную недостаточность, заболевание почек или печени.
Объектом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция для применения при вмешательстве и терапии гиперемии у пациента в соответствии с настоящим изобретением, где указанная фармацевтическая композиция представляет собой раствор, предпочтительно готовый к применению раствор.
Объектом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция для применения при вмешательстве и терапии гиперемии у пациента в соответствии с настоящим изобретением, где указанная фармацевтическая композиция находится в лиофилизированном состоянии.
Объектом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция для применения при вмешательстве и терапии гиперемии у пациента в соответствии с настоящим изобретением, где указанную фармацевтическую композицию вводят внутримышечно.
Объектом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция для применения при вмешательстве и терапии гиперемии у пациента в соответствии с настоящим изобретением, где указанную фармацевтическую композицию вводят внутрисосудисто.
Объектом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция для применения при вмешательстве и терапии гиперемии у пациента в соответствии с настоящим изобретением, где указанную фармацевтическую композицию вводят путем инфузии.
Объектом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция для применения при вмешательстве и терапии гиперемии у пациента в соответствии с настоящим изобретением, где указанная фармацевтическая композиция предназначена для системного введения.
Приведенные ниже варианты осуществления являются объектом настоящего изобретения:
1. Антитело против адреномедуллина (ADM) или фрагмент антитела против адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас для применения при вмешательстве и терапии гиперемии у нуждающегося в этом пациента.
2. Антитело против адреномедуллина (ADM) или фрагмент антитела против адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас для применения при вмешательстве и терапии гиперемии у пациента по п.1, где указанный пациент имеет заболевание или состояние, выбранное из группы, содержащей: конгестивное высокое артериальное давление, набухание или задержку воды (отек), сердечную недостаточность, в частности острую сердечную недостаточность, заболевание почек или печени.
3. Антитело против адреномедуллина (ADM) или фрагмент антитела против адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас для применения при вмешательстве и терапии гиперемии у пациента по пунктам 1 или 2, где указанный пациент имеет заболевание или состояние, выбранное из группы, содержащей: конгестивное высокое артериальное давление, набухание или задержку воды (отек), сердечную недостаточность, в частности острую сердечную недостаточность.
4. Антитело против адреномедуллина (ADM) или фрагмент анти-ADM антитела, связывающийся с адреномедуллином, или анти-ADM не-Ig каркас, связывающийся с адреномедуллином, для применения при вмешательстве и терапии гиперемии у пациента по любому из пунктов 1-3, где указанное антитело или фрагмент антитела, или не-Ig каркас являются моноспецифическими.
-7
5. Антитело против адреномедуллина (ADM) или фрагмент анти-ADM антитела, связывающийся с адреномедуллином, или анти-ADM не-Ig каркас, связывающийся с адреномедуллином, для применения при вмешательстве и терапии гиперемии у пациента по любому из пунктов 1-4, где указанное антитело или фрагмент, или каркас имеют сродство связывания ADM, составляющее по меньшей мере 10М.
6. Антитело против адреномедуллина (ADM) или фрагмент анти-ADM антитела, связывающийся с адреномедуллином, или анти-ADM не-Ig каркас, связывающийся с адреномедуллином, для применения при вмешательстве и терапии гиперемии у пациента по любому из пп.1-5, где указанное антитело или фрагмент антитела, или не-Ig каркас связывается с областью, состоящей предпочтительно из по меньшей мере 4 или по меньшей мере 5 аминокислот в последовательности aa 1-42 зрелого человеческого ADM:
YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTCTVQKLAHQIYQFTDKDKDNVA
(SEQ ID NO:23).
7. Анти-ADM антитело или фрагмент антитела против адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас для применения при вмешательстве и терапии гиперемии у пациента по любому из пунктов 1-6, где указанное антитело или фрагмент, или каркас связывается с N-концевой частью (аа 1-21) адреномедуллина:
YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC
(SEQ ID NO:22).
8. Анти-ADM антитело или фрагмент антитела против адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас для применения при вмешательстве и терапии гиперемии явлений у пациента по любому из пунктов 1-7, где указанное антитело или фрагмент, или каркас распознает и связывается с N-концом (аа 1) адреномедуллина.
9. Антитело против адреномедуллина (ADM) или фрагмент анти-ADM антитела, связывающийся с адреномедуллином, или анти-ADM не-Ig каркас, связывающийся с адреномедуллином, для применения при вмешательстве и терапии гиперемии у пациента по любому из пп.1-8, отличающееся тем, что указанное антитело или фрагмент антитела, или не-Ig каркас не связывается с С-терминальной частью ADM, имеющей последовательность aa 43-52 ADM:
2
PRSKISPQGY-NH
(SEQ ID NO:24).
10. Анти-ADM антитело или фрагмент антитела против адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас для применения при вмешательстве и терапии гиперемии у пациента по любому из пунктов 1-9, где указанное антитело или фрагмент, или каркас блокирует биологическую активность ADM на не более чем 80%, предпочтительно на не более чем 50%.
11. Анти-ADM антитело или фрагмент антитела против адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас для применения при вмешательстве и терапии гиперемии у пациента по любому из пунктов 1-10, где указанный пациент является пациентом ICU (отделения реанимации и интенсивной терапии, ICU).
12. Анти-ADM антитело или фрагмент антитела против адреномедуллину для применения при вмешательстве и терапии гиперемии у пациента по любому из пунктов 1-11, где указанное антитело или фрагмент представляет собой моноклональное антитело человека или фрагмент, который связывается с ADM, или фрагмент этого антитела, где тяжелая цепь содержит последовательности:
SEQ ID NO:1
GYTFSRYW
SEQ ID NO:2
ILPGSGST
SEQ ID NO:3
TEGYEYDGFDY,
и где легкая цепь содержит последовательности:
SEQ ID NO:4
QSIVYSNGNTY
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ʺRVSʺ (не указанную в списке последовательностей):
RVS
SEQ ID NO:5
FQGSHIPYT.
13. Моноклональное антитело человека или фрагмент, который связывается с ADM, или фрагмент этого антитела, для применения при вмешательстве и терапии гиперемии у пациента по п.12, где указанное антитело или фрагмент содержит последовательность, выбранную из группы, содержащей:
SEQ ID NO:6 (AM-VH-C)
QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFSRYWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGSGSTNYNEKFKGKATITADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKHHHHHH
SEQ ID NO:7 (AM-VH1)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWISWVRQAPGQGLEWMGRILPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKHHHHHH
SEQ ID NO:8 (AM-VH2-E40)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWMGRILPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKHHHHHH
SEQ ID NO:9 (AM-VH3-T26-E55)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKATGYTFSRYWISWVRQAPGQGLEWMGEILPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKHHHHHH
SEQ ID NO:10 (AM-VH4-T26-E40-E55)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKATGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWMGEILPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKHHHHHH
SEQ ID NO:11 (AM-VL-C)
DVLLSQTPLSLPVSLGDQATISCRSSQSIVYSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHIPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:12 (AM-VL1)
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLNWFQQRPGQSPRRLIYRVSNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:13 (AM-VL2-E40)
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLEWFQQRPGQSPRRLIYRVSNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
14. Анти-ADM антитело или фрагмента анти-ADM антитела, связывающийся с ADM, или анти-ADM не-Ig каркас, связывающийся с ADM, для применения при вмешательстве и терапии гиперемии у пациента по любому из пп.1-13, где образец жидкости организма, взятый у указанных пациентов, имеет повышенный уровень проADM и/или его фрагментов, состоящих из по меньшей мере 5 аминокислот, превышающий определенное пороговое значение.
15. Анти-ADM антитело или фрагмент анти-ADM антитела, связывающийся с ADM, или анти-ADM не-Ig каркас, связывающийся с ADM, для применения при вмешательстве и терапии гиперемии у пациента по любому из пп.1-14, где указанный пациент является устойчивым к диуретикам или не отвечает на терапию диуретиками.
16. Фармацевтическая композиция для применения при вмешательстве и терапии гиперемии у пациента, содержащая антитело, фрагмент или каркас по любому из пп.1-15.
17. Фармацевтическая композиция для применения при вмешательстве и терапии гиперемии у пациента, содержащая антитело или фрагмент, или каркас по любому из пп.1-16, где указанный пациент имеет заболевание или состояние, выбранное из группы, содержащей конгестивное высокое артериальное давление, набухание или задержку воды (отек), сердечную недостаточность, в частности острую сердечную недостаточность, заболевание почек или печени.
18. Фармацевтическая композиция для применения при вмешательстве и терапии гиперемии у пациента по п.16 или 17, где указанная фармацевтическая композиция представляет собой раствор, предпочтительно готовый к применению раствор.
19. Фармацевтическая композиция для применения при вмешательстве и терапии гиперемии у пациента по п.18, где указанная фармацевтическая композиция находится в лиофилизированном состоянии.
20. Фармацевтическая композиция для применения при вмешательстве и терапии гиперемии у пациента по любому из пп.18-19, где указанная фармацевтическая композиция вводится внутримышечно.
21. Фармацевтическая композиция для применения при вмешательстве и терапии гиперемии у пациента по любому из пп.18-19, где указанная фармацевтическая композиция вводится внутрисосудисто.
22. Фармацевтическая композиция для применения при вмешательстве и терапии гиперемии у пациента по п.21, где указанная фармацевтическая композиция вводится путем инфузии.
23. Фармацевтическая композиция для применения при вмешательстве и терапии гиперемии у пациента по любому из пп.18-22, где указанная фармацевтическая композиция предназначена для системного введения.
ПРИМЕРЫ
Следует подчеркнуть, что антитела, фрагменты антител и не-Ig каркасы в примерах по изобретению связываются с ADM и, следовательно, должны рассматриваться как анти-ADM антитела/фрагменты антител/не-Ig каркасы.
Пример 1
Создание антител и определение их констант сродства
Получали несколько человеческих и мышиных антител и определяли их константы сродства (см. Таблицы 1 и 2).
Пептиды/конъюгаты для иммунизации:
Синтезировали пептиды для иммунизации, см. Таблицу 1 (JPT Technologies, Berlin, Германия) с дополнительным N-концевым остатком цистеина (если цистеин отсутствует в выбранной последовательности ADM) для конъюгации пептидов с бычьим сывороточным альбумином (BSA). Пептиды ковалентно связывали с BSA, используя гель для сочетания типа Sulfolink (Perbio-science, Bonn, Германия). Процедуру связывания выполняли в соответствии с руководством Perbio.
Мышиные антитела
получали следующим способом:
Мышь Balb/c иммунизировали 100 мкг конъюгата пептид-BSA в дни 0 и 14 (эмульгированным в 100 мкл полного адъюванта Фрейнда) и 50 мкг в дни 21 и 28 (в 100 мкл неполного адъюванта Фрейнда). За три дня до проведения эксперимента по слиянию животное получало 50 мкг конъюгата, растворенного в 100 мкл физиологического раствора, в виде одной внутрибрюшинной и одной внутривенной инъекции.
Спленоциты, полученные из иммунизированной мыши, и клетки миеломы клеточной линии SP2/0 сливали, используя 1 мл 50% полиэтиленгликоля, в течение 30 с при 37°С. После промывки клетки высевали в 96-луночные культуральные планшеты. Гибридные клоны отбирали путем выращивания в среде HAT [культуральная среда RPMI 1640, дополненная 20% фетальной телячьей сывороткой и HAT]. Через две недели HAT среду заменяли HT средой, осуществляя три пассажа, а затем возвращали нормальную среду для культивирования клеток.
Супернатанты клеточной культуры сначала подвергали первичному скринингу в отношении антигенспецифичных антител IgG через три недели после слияния. Положительные по результат теста микрокультуры переносили в 24-луночные планшеты для размножения. После повторного тестирования отобранные культуры клонировали и повторно клонировали, используя метод серийных разведений, и определяли изотипы (см. также Lane, RD 1985. J. Immunol. Meth. 81:223-228; Ziegler et al. 1996. Horm. Metab Рез. 28:11-15).
Получение мышиных моноклональных антител:
Антитела получали стандартными методами получения антител (Marx et al., 1997. 1997. Monoclonal Antibody Production, ATLA 25, 121) и очищали с помощью белка А. Чистота антител составляла >95% по данным анализа гель-электрофореза в присутствии SDS.
Человеческие антитела:
Человеческие антитела получали методом фагового дисплея согласно следующей процедуре:
E.coli
Для выделения рекомбинантных одноцепочечных F-вариабельных доменов (scFv) к пептиду адреномедуллина применяли библиотеки человеческих наивных генов антител HAL7/8. Библиотеки генов антител подвергали скринингу, используя стратегию пэннинга, предусматривающую использование пептидов, содержащих биотиновую метку, сцепленную через два разных спейсера с последовательностью пептида адреномедуллина. Для минимизации фона неспецифических связывающих агентов применяли комбинацию циклов пэннинга с использованием неспецифически связанного антигена и связанного со стрептавидином антигена. Фаги, элюированные после третьего раунда пэннинга, использовали для получения экспрессирующих моноклональных scFv штаммов . Для оценки антигена методом ELISA использовали непосредственно супернатанты, полученные после культивирования указанных клональных штаммов (см. также Hust et al. 2011. Journal of Biotechnology 152, 159-170; Schütte et al. 2009. PLoS One 4, e6625).
Положительные клоны отбирали на основе ELISA-сигнала, положительного отношении антигена и отрицательного в отношении сенсибилизированных стрептавидином микротитровальных планшетов. Для получения дополнительных характеристик открытую рамку считывания scFv клонировали в экспрессионной плазмиде pOPE107 (Hust et al., J. Biotechn. 2011), выделяли из супернатанта культуры с помощью аффинной хроматографии с иммобилизованными ионами металлов и очищали с помощью гель-фильтрации.
Константы сродства
Для определения сродства антител к адреномедуллину оценивали кинетику связывания адреномедуллина с иммобилизованным антителом методом поверхностного плазмонного резонанса, не включающего метку, используя систему Biacore 2000 (GE Healthcare Europe GmbH, Freiburg, Германия). Обратимую иммобилизацию антител выполняли, используя антитело к мышиному Fc, ковалентно связанное с высокой плотностью с поверхностью сенсорного CM5-чипа, согласно инструкциям производителя (набор мышиных антител для иммобилизации; GE Healthcare), (Lorenz et al. 2011. Antimicrob Agents Chemother. 55 (1):165-173).
Моноклональные антитела получали к указанным ниже областям ADM человеческого и мышиного ADM, соответственно. В приведенной ниже таблице представлен набор полученных антител, которые применяли в дальнейших экспериментах. Выбор был основан на области-мишени:
Таблица 1
Номер последовательности
Антиген/Иммуноген
Область ADM
Обозначение
Константы сродстваKd (M)
SEQ ID: 14
YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC
1-21
NT-H
5,9×10<sup>-9</sup>
SEQ ID: 15
CTVQKLAHQIYQ
21-32
MR-H
2×10<sup>-9</sup>
SEQ ID: 16
CAPRSKISPQGY-NH2
C-42-52
CT-H
1,1×10<sup>-9</sup>
SEQ ID: 17
YRQSMNQGSRSNGCRFGTC
1-19
NT-M
3,9×10<sup>-9</sup>
SEQ ID: 18
CTFQKLAHQIYQ
19-31
MR-M
4,5×10<sup>-10</sup>
SEQ ID: 19
CAPRNKISPQGY-NH2
C-40-50
CT-M
9×10<sup>-9</sup>
Ниже представлен список дополнительно полученных моноклональных антител:
Таблица 2
Мишень
Источник
Номерклона
Сродство(M)
Максимальное ингибирование (%)по данным биоанализа (см. пример 2)
NT-M
Мышь
ADM/63
5,8×10<sup>-9</sup>
45
Мышь
ADM/364
2,2×10<sup>-8</sup>
48
Мышь
ADM/365
3,0×10<sup>-8</sup>
Мышь
ADM/366
1,7×10<sup>-8</sup>
Мышь
ADM/367
1,3×10<sup>-8</sup>
Мышь
ADM/368
1,9 x10<sup>-8</sup>
Мышь
ADM/369
2,0 x10<sup>-8</sup>
Мышь
ADM/370
1,6 x10<sup>-8</sup>
Мышь
ADM/371
2,0 x10<sup>-8</sup>
Мышь
ADM/372
2,5 x10<sup>-8</sup>
Мышь
ADM/373
1,8 x10<sup>-8</sup>
Мышь
ADM/377
1,5 x10<sup>-8</sup>
Мышь
ADM/378
2,2 x10<sup>-8</sup>
Мышь
ADM/379
1,6 x10<sup>-8</sup>
Мышь
ADM/380
1,8 x10<sup>-8</sup>
Мышь
ADM/381
2,4 x10<sup>-8</sup>
Мышь
ADM/382
1,6 x10<sup>-8</sup>
Мышь
ADM/383
1,8 x10<sup>-8</sup>
Мышь
ADM/384
1,7 x10<sup>-8</sup>
Мышь
ADM/385
1,7 x10<sup>-8</sup>
Мышь
ADM/403
1,2 x10<sup>-8</sup>
Мышь
ADM/395
1,2 x10<sup>-8</sup>
Мышь
ADM/396
3,0 x10<sup>-8</sup>
Мышь
ADM/397
1,5×10<sup>-8</sup>
MR-M
Мышь
ADM/38
4,5×10<sup>-10</sup>
68
MR-M
Мышь
ADM/39
5,9 x10<sup>-9</sup>
72
CT-M
Мышь
ADM/65
9,0×10<sup>-9</sup>
100
CT-M
Мышь
ADM/66
1,6×10<sup>-8</sup>
100
NT-H
Мышь
ADM/33
5,9×10<sup>-8</sup>
38
NT-H
Мышь
ADM/34
1,6×10<sup>-8</sup>
22
MR-H
Мышь
ADM/41
1,2×10<sup>-8</sup>
67
MR-H
Мышь
ADM/42
<1×10<sup>-8</sup>
MR-H
Мышь
ADM/43
2,0×10<sup>-9</sup>
73
MR-H
Мышь
ADM/44
<1×10<sup>-8</sup>
CT-H
Мышь
ADM/15
<1×10<sup>-8</sup>
CT-H
Мышь
ADM/16
1,1×10<sup>-9</sup>
100
CT-H
Мышь
ADM/17
3,7×10<sup>-9</sup>
100
CT-H
Мышь
ADM/18
<1×10<sup>-8</sup>
hADM
Фаговый дисплей
ADM/A7
<1×10<sup>-8</sup>
Фаговый дисплей
ADM/B7
<1×10<sup>-8</sup>
Фаговый дисплей
ADM/C7
<1×10<sup>-8</sup>
Фаговый дисплей
ADM/G3
<1×10<sup>-8</sup>
Фаговый дисплей
ADM/B6
<1×10<sup>-8</sup>
Фаговый дисплей
ADM/B11
<1×10<sup>-8</sup>
Фаговый дисплей
ADM/D8
<1×10<sup>-8</sup>
Фаговый дисплей
ADM/D11
<1×10<sup>-8</sup>
Фаговый дисплей
ADM/G12
<1×10<sup>-8</sup>
Получение фрагментов антител путем ферментативного расщепления:
2
2
2
Фрагменты Fab и F(ab) получали путем ферментативного расщепления мышиного полноразмерного антитела NT-M. Антитело NT-M расщепляли, используя a) набор на основе пепсина для получения F(ab) (Pierce 44988) и b) набор на основе папаина для получения Fab (Pierce 44985). Процедуры фрагментации выполняли в соответствии с инструкциями производителя. В случае F(ab)-фрагментации расщепление выполняли в течение 8 часов при 37°С. Расщепление с получением Fab-фрагментов выполняли в течение 16 часов, соответственно.
Процедура получения и очистки Fab:
Иммобилизованный папаин уравновешивали путем промывки смолы, используя 0,5 мл буфер для расщепления, и центрифугирования на колонке при 5000×g в течение 1 минуты. После этого буфер отбрасывали. Готовили обессоливающую колонку путем удаления раствора, в котором она хранилась, и промывкой буфером для расщепления с последующим центрифугированием ее каждый раз при 1000×g в течение 2 минут. В трубу вращающейся колонки, содержащую уравновешенный иммобилизованный папаин, добавляли 0,5 мл полученного образца IgG. Расщепляемую реакционную смесь инкубировали в течение 16 часов на настольном шейкере при 37°С. Колонку центрифугировали при 5000×g в течение 1 минуты для отделения продуктов расщепления от иммобилизованного папаина. После этого смолу промывали, используя 0,5 мл PBS, и центрифугировали при 5000×g в течение 1 минуты. Полученную при промывке фракцию добавляли к расщепленному антителу, в результате общий объем образца составил 1,0 мл. Колонку, заполненную NAb-белком A, уравновешивали PBS и буфером для элюции IgG при комнатной температуре. Колонку центрифугировали в течение 1 минуты для удаления раствора, в котором осуществлялось хранение (содержащего 0,02% азида натрия), и уравновешивали, добавляя 2 мл PBS, снова центрифугировали в течение 1 минуты, и прошедший через колонку отбрасывали. Образец вносили в колонку и ресуспендировали путем переворачивания. Инкубацию проводили при комнатной температуре, осуществляя смешение путем переворачивания, в течение 10 минут. Колонку центрифугировали в течение 1 минуты, получая элюат с фрагментами Fab. (Ссылки: Coulter and Harris 1983. J. Immunol. Meth. 59, 199-203.; Lindner et al. 2010. Cancer Res. 70, 277-87; Kaufmann et al. 2010. PNAS. 107, 18950-5.; Chen et al. 2010. PNAS. 107, 14727-32; Uysal et al. 2009 J. Exp. Med. 206, 449-62; Thomas et al. 2009. J. Exp. Med. 206, 1913-27; Kong et al. 2009 J. Cell Biol. 185, 1275-840).
2
Процедура получения и очистки F(ab´) фрагментов
Иммобилизованный папаин уравновешивали путем промывки смолы, используя 0,5 мл буфер для расщепления, и центрифугирования колонки при 5000×g в течение 1 минуты. После этого буфер отбрасывали. Готовили обессоливающую колонку путем удаления раствора, в котором она хранилась, и промывки буфером для расщепления, с последующим центрифугированием ее каждый раз при 1000×g в течение 2 минут. В трубу вращающейся колонки, содержащую уравновешенный иммобилизованный папаин, добавляли 0,5 мл полученного образца IgG. Расщепляемую реакционную смесь инкубировали в течение 16 часов на настольном шейкере при 37°С. Колонку центрифугировали при 5000×g в течение 1 минуты для отделения продуктов расщепления от иммобилизованного папаина. После этого смолу промывали, используя 0,5 мл PBS, и центрифугировали при 5000×g в течение 1 минуты. Полученную при промывке фракцию добавляли к расщепленному антителу, в результате общий объем образца составил 1,0 мл. Колонку, заполненную NAb-белком A, уравновешивали PBS и буфером для элюции IgG при комнатной температуре. Колонку центрифугировали в течение 1 минуты для удаления раствора, в котором осуществляли хранение (содержащего 0,02% азида натрия), и уравновешивали, добавляя 2 мл PBS, снова центрифугировали в течение 1 минуты, и прошедший через колонку отбрасывали. Образец вносили в колонку и ресуспендировали путем переворачивания. Инкубацию проводили при комнатной температуре, осуществляя смешение путем переворачивания, в течение 10 минут. Колонку центрифугировали в течение 1 минуты, получая элюат с фрагментами Fab. (Ссылки: Mariani et al. 1991. Mol. Immunol. 28:69-77; Beale 1987. Exp Comp Immunol 11:287-96; Ellerson et al. 1972. FEBS Letters 24(3):318-22; Kerbel and Elliot 1983. Meth Enzymol 93:113-147; Kulkarni et al. 1985. Cancer Immunol Immunotherapy 19:211-4; Lamoyi 1986. Meth Enzymol 121:652-663; Parham et al. 1982. J Immunol Meth 53:133-73; Raychaudhuri et al. 1985. Mol Immunol 22(9):1009-19; Rousseaux et al. 1980. Mol Immunol 17:469-82; Rousseaux et al. 1983. J Immunol Meth 64:141-6; Wilson et al. 1991. J Immunol Meth 138:111-9).
Гуманизация фрагмента антитела NT-H:
Фрагмент антитела гуманизировали методом трансплантации CDR (Jones et al. 1986. Nature 321, 522-525).
Для получения гуманизированной последовательности выполняли следующие этапы:
Экстракция общей РНК: Общую РНК экстрагировали из NT-H-гибридом, используя набор Qiagen.
Первый цикл ОТ-ПЦР: Использовали набор QIAGEN OneStep RT-PCR (номер по каталогу 210210). ОТ-ПЦР выполняли с использованием набора праймеров, специфических в отношении тяжелых и легких цепей. Для каждого образца РНК проводили реакций ОТ-ПЦР для индивидуальных 12 тяжелых цепей и 11 легких цепей, используя смесь вырожденных «прямых» праймеров, перекрывающих лидерные последовательности вариабельных областей. «Обратные» праймеры локализовали в константных областях тяжелых и легких цепей. В праймеры не встраивали никакие сайты рестрикции.
Параметры реакции: 5 x буфер из набора QIAGEN OneStep RT-PCR, 5,0 мкл; смесь dNTP (содержащая 10 мМ каждого dNTP), 0,8 мкл; набор праймеров, 0,5 мкл; смесь ферментов из набора QIAGEN OneStep RT-PCR, 0,8 мкл; матричная РНК, 2,0 мкл; не содержащая РНКазу вода до 20,0 мкл; общий объем 20,0 мкл.
Условия осуществления ПЦР: обратная транскрипция: 50°С, 30 мин; начальная активация ПЦР: 95°С, 15 мин.
Программа циклической реакции: 20 циклов при 94°С, 25 с; 54°С, 30 с; 72°С, 30 с; конечное удлинение: 72°С, 10 мин.
Второй цикл с использование «полугнездовой» ПЦР: Продукты ОТ-ПЦР, полученные в реакциях первого цикла, дополнительно амплифицировали во втором цикле ПЦР. ОТ-ПЦР выполняли для индивидуальных 12 тяжелых цепей и 11 легких цепей, используя набор праймеров для проведения «полугнездовой» ПЦР, специфических в отношении вариабельных областей антител.
Параметры реакции: 2 x смесь для ПЦР, 10 мкл; набор праймеров, 2 мкл; продукт, полученный в первом цикле ПЦР, 8 мкл; общий объем, 20 мкл; отчет о клонировании полученных с использованием гибридомы антител.
Условия проведения ПЦР: начальная денатурация в течение 5 мин при 95°С; 25 циклов при 95°С в течение 25 с, 57°С в течение 30 с, 68°С в течение 30 с; конечное удлинение 10 мин 68°С.
После завершения ПЦР образцы реакции ПЦР прогоняли в агарозном геле для визуализации амплифицированных ДНК-фрагментов. После секвенирования более 15 клонированных ДНК-фрагментов амплифицировали методом «гнездовой» ОТ-ПЦР, клонировали несколько тяжелых и легких цепей мышиных антител, и они оказались правильными. С помощью сравнительного анализа белковой последовательности и анализа CDR идентифицировали одну тяжелую цепь и одну легкую цепь. После сравнительного анализа с гомологичными человеческими каркасными последовательностями определяли полученную в результате гуманизированную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, представленной на фиг. 5. Поскольку аминокислоты в положениях 26, 40 и 55 в вариабельной области тяжелой цепи и аминокислот в положении 40 в вариабельной области легкой цепи имеют решающее значение для способности к связыванию, их можно возвращать к мышиному оригиналу. Полученные кандидаты представлены ниже. (Padlan 1991. Mol. Immunol. 28, 489-498; Harris and Bajorath. 1995. Protein Sci. 4, 306-310).
Описания последовательностей фрагментов антител (SEQ ID NO:7-14): выделены жирным шрифтом, и CDR 1, 2, 3, расположенные в хронологическом порядке, подчеркнуты; курсивом обозначены константные области; шарнирные области выделены жирным шрифтом, а гистидиновая метка обозначена жирным шрифтом и курсивом; точечная мутация в каркасной области выделена серым фоном.
Пример 2
Воздействие отобранных анти-ADM-антител на анти-ADM биологическую активность
Воздействие отобранных анти-ADM антител на ADM-биологическую активность тестировали с помощью функционального анализа цАМФ в присутствии человеческого рекомбинантного рецептора адреномедуллина (биологический анализ адреномедуллина).
Тестирование антител, мишенью которых является человеческий или мышиный адреномедуллин, с помощью функционального анализа цАМФ в присутствии человеческого рекомбинантного рецептора адреномедуллина (биоанализ на адреномедуллин)
Материалы: Клеточная линия: CHO-K1
Рецептор: адреномедуллиновый (CRLR+RAMP3)
Регистрационный номер клеточной линии, несущей рецептор: CRLR: U17473; RAMP3: AJ001016
4
2
4
2
Клетки линии CHO-K1, экспрессирующие человеческий рекомбинантный адреномедуллиновый рецептор (FAST-027C), выращенные до испытания в среде без антибиотиков, отделяли путем осторожной промывки, используя PBS-EDTA (5 мМ EDTA), выделяли центрифугированием и ресуспендировали в буфере для анализа (KRH: 5 мМ KCl, 1,25 мМ MgSO, 124 мМ NaCl, 25 мМ HEPES, 13,3 мМ глюкоза, 1,25 мМ KHPO, 1,45 мМ CaCl, 0,5 г/л BSA).
Параллельно получали кривые зависимости доза-ответ для эталонных агонистов (hADM или mADM).
Тестирование антагонистов (96 луночный планшет):
Для тестирования антагонистов смешивали 6 мкл эталонного агониста (человеческий адреномедуллин (5,63 нМ) или мышиный адреномедуллин (0,67 нМ)) с 6 мкл тестируемых образцов при различных разведениях антагониста; или с 6 мкл буфера. После инкубации в течение 60 мин при комнатной температуре добавляли 12 мкл клеток (2500 клеток/лунка). Планшеты инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. После добавления буфера для лизиса определяли процент DeltaF согласно спецификации производителя с использованием набора HTRF от Cis-Bio International (кат. № 62AM2 PEB). В качестве эталонного антагониста использовали hADM 22-52.
Тестирование антител с помощью цАМФ-HTRF анализа
Антитела к hADM (NT-H, MR-H, CT-H) тестировали в отношении антагонистической активности с помощью функционального анализа цАМФ использованием человеческого рекомбинантного рецептора адреномедуллина (FAST-027C) в присутствии 5,63 нМ человеческого ADM 1-52, используя следующие конечные концентрации антител: 100 мкг/мл, 20 мкг/мл, 4 мкг/мл, 0,8 мкг/мл, 0,16 мкг/мл.
Антитела к mADM (NT-M, MR-M, CT-M) тестировали в отношении антагонистической активности с помощью функционального анализа цАМФ с использованием человеческого рекомбинантного рецептора адреномедуллина (FAST-027C) в присутствии 0,67 нМ мышиного ADM 1-50, используя следующие конечные концентрации антител: 100 мкг/мл, 20 мкг/мл, 4 мкг/мл, 0,8 мкг/мл, 0,16 мкг/мл. Строили график зависимости ингибирования от концентрации антагониста (см. фиг. 2a-2l). Данные о максимальном уровне ингибирования индивидуальными антителами представлены в таблице 3.
Таблица 3
Антитело
Максимальный уровень ингибирования биологической активности ADM (ADM-биоанализ) (%)
NT-H
38
MR-H
73
CT-H
100
NT-M FAB
26
NT-M FAB2
28
NT-M
45
MR-M
66
CT-M
100
Неспецифический мышиный IgG
0
Пример 3
Данные о стабилизации hADM антителом к ADM
Стабилизирующее воздействие на человеческий ADM человеческими анти-ADM антителами тестировали с помощью иммуноанализа hADM.
Иммуноанализ для количественной оценки человеческого адреномедуллина
Применяли технологию люминесцентного иммуноанализа на основе мечения «сложным» эфиром акридиния с использованием покрытой «сэндвичем» пробирки.
Меченое соединение (метка): 100 мкг (100 мкл) антитела CT-H (1 мг/мл в PBS, pH 7,4, AdrenoMed AG, Германия) смешивали с 10 мкл NHS-эфира акридиния (1 мг/мл в ацетонитриле, InVent GmbH, Германия) (EP 0353971) и инкубировали в течение 20 мин при комнатной температуре. Меченое CT-H очищали ВЭЖХ-гель-фильтрацией с использованием Bio-Sil SEC 400-5 (Bio-Rad Laboratories, Inc., США). Очищенное CT-H разбавляли (300 ммоль/л фосфата калия, 100 ммоль/л NaCl, 10 ммоль/л Na-EDTA, 5 г/л бычьего сывороточного альбумина, рН 7,0). Конечная концентрация составила примерно 800000 относительных световых единиц (RLU) меченого соединения (примерно 20 нг меченого антитела) на 200 мкл. Хемилюминесценцию сложного эфира акридиния измеряли на приборе AutoLumat LB 953 (Berthold Technologies GmbH & Co. Великобритания).
Твердая фаза:
Полистирольные пробирки (Greiner Bio-One International AG, Австрия) покрывали (18 ч при комнатной температуре) антителом MR-H (AdrenoMed AG, Германия) (1,5 мкг MR-H/0,3 мл 100 ммоль/л NaCl, 50 ммоль/л TRIS/HCl, рН 7,8). После блокирования 5% бычьим сывороточным альбумином пробирки промывали PBS, pH 7,4 и сушили в вакууме.
Калибровка:
Для калибровки в анализе использовали разведения hADM (BACHEM AG, Швейцария) в 250 ммоль/л NaCl, 2 г/л Triton X-100, 50 г/л бычьего сывороточного альбумина, 20 таблеток/л коктейля ингибиторов протеазы (Roche Diagnostics AG, Швейцария).
Иммуноанализ hADM:
50 мкл образца (или калибратора (эталона)) вносили пипеткой в покрытые пробирки после добавления меченого CT-H (200 мкл), пробирки инкубировали в течение 4 ч при 4°C. Несвязанную метку удаляли путем 5-кратной промывки (каждый раз по 1 мл) отмывочным раствором (20 мМ PBS, pH 7,4, 0,1% Triton X-100).
Хемилюминесценцию, связанную с пробиркой, измеряли, используя устройство LB 953.
На фиг. 3 представлена типичная кривая зависимости интенсивности сигнала от дозы hADM, а также кривая зависимости интенсивности сигнала от дозы hADM в присутствии 100 мкг/мл антитела NT-H. NT-H не оказывало влияния на результат описанного иммуноанализа hADM.
Стабильность человеческого адреномедуллина:
Человеческий ADM разбавляли в цитратной человеческой плазме (конечная концентрация 10 нМ) и инкубировали при 24°C. В выбранные моменты времени останавливали расщепление hADM путем замораживания при -20°С. Инкубацию проводили в отсутствие и в присутствии NT-H (100 мкг/мл). Оставшийся hADM оценивали количественно с помощью описанного выше иммуноанализа hADM.
На фиг.4 представлены данные по стабильности hADM в (цитратной) человеческой плазме в отсутствие и в присутствии антитела NT-H. Период полураспада hADM в отсутствие антитела составлял 7,8 часа, а в присутствии NT-H период полураспада составлял 18,3 часа (увеличение стабильности в 2,3 раза).
Пример 4
in vivo
Определение  побочного эффекта, вызываемого антителом NT-M
В этом исследовании использовали самцов мышей C57Bl/6 в возрасте 12-15 недель (Charles River Laboratories, Германия). 6 мышам давали (10 мкл/г массы тела) дозу NT-M, равную 0,2 мг/мл. 6 мышей, использованных в качестве контроля, получали (10 мкл/г массы тела) PBS. Уровень Выживаемость и физическое состояние отслеживали в течение 14 дней. Смертность была равна 0 в обеих группах, между группой, получавшей NT-M, и контрольной группой никаких различий в физическом состоянии не наблюдалось.
Пример 5
Дозозависимая эффективность NT-H
Дозозависимую эффективность NT-H изучали на модели CLP у мышей на основе дисфункции почечного фильтрационного барьера, которую определяли иммуногистохимическим окрашиванием срезов почки. Для исследования использовали самцов мышей C57Bl/6 в возрасте 12-15 недель (Charles River Laboratories, Германия; n=6/группа, 4 группы). Перитонит индуцировали хирургическим путем под легкой анестезией изофлураном (и Римадилом 0,5 мг/кг после операции). Делали надрезы в левом верхнем квадранте брюшной полости (в норме- область локализации слепой кишки). Слепую кишку обнажали, и вокруг слепой кишки накладывали плотную лигатуру с наложением швов дистально относительно входа тонкой кишки. В слепой кишке делали один прокол с помощью иглы 24-го размера, и через рану выдавливали небольшое количество содержимого слепой кишки. Слепую кишку возвращали в брюшную полость, и участок лапаротомии закрывали. Наконец, животных возвращали в свои клетки, где они получали свободный доступ к еде и воде. Для замещения жидкости жидкости вводили подкожно 500 мкл солевого раствора. Через 18 часов после процедуры CLP и применения тестируемого изделия животных умерщвляли и почки извлекали.
Мышам вводили носитель и соединение в различных концентрациях. Носитель и соединения поставлялись спонсором в пробирках с маркировкой A, B, C и D в виде «готовых к применению» растворов. Одну внутривенную инъекцию вводили за 5 минут до процедуры CLP в дозе 0,1/2/20 мг/кг массы тела при объеме 5 мкл/г массы тела путем инъекции в хвостовую вену. Носитель представлял собой 20 мМ His/HCl, pH 6,0.
Выживших мышей обескровливали через 18 часов. У 3 дополнительных индивидуумов на группу брали 500 мкл крови через 6 ч после процедуры CLP путем обескровливания. Образцы ЭДТА-плазмы подвергали глубокой заморозке не позднее, чем через 1 час после взятия образцов.
Обработка почек для иммуногистохимии:
Мышей умерщвляли обескровливанием, поэтому почка не была наполнена кровью, и ее сразу вынимали. После вскрытия почку разрезали в сагиттальной плоскости, получая две полные половинки. Две половинки почки помещали как минимум в 10-кратный объем 10% формалина (4% нейтрального буферного раствора формальдегида: Fischer 639 3113). Две половинки, раздельно (не прикрепленные), помещали в 5 мл чашку, заполненную 10% формалином и (образцы могли быть получены по почте во время фиксации) фиксировали в течение 6 дней при комнатной температуре (дегидратация и заливка парафином в течение ночи: промывка dH20 в течение 2 часов, 40% этанолом в течение 1 часа, 70% этанолом в течение 1 часа 2 раза, 80% этанолом в течение 1 часа, 90% этанолом в течение 1 часа, 100% этанолом в течение 1 часа 2 раза, ксилолом при 40°C в течение 1,5 часов, ксилолом при 45°C в течение 1,5 часов, парафином при 60°C в течение 1 часа 3 раза, укладка в кассету). Левую почку сразу при получении рассекали на срезы, фиксировали формалином в течение 6 дней и заливали парафином. Срезы толщиной 5 мкм депарафинизировали, подвергали воздействию HIER, 10% козьей или ослиной сыворотки, 1° антител (VEGF, Alb, Ang1) 2°ab антикроличьих или антикозьих IgG-AP, затем хромагена Dako REAL и выполняли контрастное окрашивание гематокслином. Слайды анализировали, используя программное обеспечение Axio Vision (rel. 4.8) (Zeiss, Jena Германия), и результаты представляли в виде средней денситометрической плотности красного цвета.
Согласно денситометрической оценке окрашенных почек на альбумин все три протестированные дозы привели к значительно более низкому накоплению внесосудистого альбумина с несколько более низким эффектом, наблюдаемым для дозы 20 мг/кг (фиг. 6).
Известно, что VEGF увеличивает проницаемость эндотелиальных сосудов и, следовательно, действует в качестве биомаркера, позволяющего оценить состояние барьерной функции почек. Как показано на фиг. 7, во всех тестируемых дозах наблюдается значительно более низкая экспрессия VEGF, не зависящая от дозы.
Известно, что ангиопоэтин-1 защищает от этой VEGF-индуцированной утечки плазмы и, следовательно, его уровень должен находиться в обратной зависимости от уровня экспрессии VEGF. На фиг. 8 показано, что это является достоверным для всех протестированных доз.
В этом исследовании эффективность трех разных доз NT-H, введенных внутривенно за 5 минут до операции, оценивали на модели CLP-индуцированного перитонита у мышей. NT-H достоверно улучшает сосудистую целостность почек у мышей с сепсисом по сравнению с группой плацебо для всех испытанных доз. NT-H оказывает благоприятный эффект в широком диапазоне доз с небольшой тенденцией уменьшения эффекта при 20 мг/кг.
Кроме того, результаты этого исследования указывают на то, что применение антитела NT-H оказывает положительный эффект путем уменьшения проницаемости эндотелиальных сосудов и, следовательно, предотвращая или защищая от экстравазации сосудистой жидкости и, наконец, от гиперемии и/или отека.
Пример 6
Исследование PROTECT
Изучение популяции и измерения
Более детально это исследование описано у Massie et al. 2010. N Engl. J Med. 363:1419-1428; Weatherleyfunctioned al. 2010. J Card Fail. 16:25-35; Voors et al. 2011. J Am Coll Cardiol. 57:1899-1907. Вкратце, в исследовании принимало участие 2033 пациента с острой сердечной недостаточностью с нарушением функции почек (расчетный клиренс креатинина находился в пределах от 20 до 80 мл/мин согласно формуле Кокрофта-Голта), которые были поделены на группы, получающие ролофиллин или плацебо. Протокол исследования PROTECT был одобрен этическим комитетом в отношении каждого участника, и от всех участников было получено письменное информированное согласие.
Био-ADM измеряли в плазме, собранной во время оценки исходного уровня у 1572 госпитализированных пациентов с ОСН, включенных в исследование PROTECT (все исходные образцы доступны). PROTECT (расшифровывается как «плацебо-контролируемое рандомизированное исследование селективного антагониста аденозиновых рецепторов A1, ролофиллина, у пациентов, госпитализированных с острой декомпенсированной сердечной недостаточностью и объемной перегрузкой для оценки эффекта лечения гиперемии и функцию почек») было многоцентровым, рандомизированным, двойным слепым исследованием, в котором проводили сравнение ролофиллина с плацебо у 2033 пациентов, госпитализированных по поводу ОСН.
Результаты исследования
Как отмечалось ранее, клинические суррогатные маркеры имеют неоптимальную прогностическую ценность для выявления гиперемии. В этом анализе были объединены три наиболее сильных клинических суррогатных маркера гиперемии (т.е. JVP, периферические отеки и ортопноэ) с целью повышения точности оценки, и был разработан комплексный клинический показатель гиперемии (CCS), согласно приведенной ниже схеме.
Параметр
0
1
2
3
Периферический отек
0
голень
Ниже колена
Выше колена
Ортопноэ
0 подушек
1 подушка
2 подушки
3 подушки
JVP
<6 см
6-10 см
>10 см
-
Затем добавляли оценку по каждому из этих трех параметров для получения комплексной оценки гиперемии, показатели которой находились в пределах от 0 до 8. Аналогичная схема использовалась ранее Ambrosy et al. (Ambrosy et al. 2013. European Heart Journal 34 (11):835-843).
Для оценки тяжести гиперемии использовали следующий алгоритм:
CCS=0, клиническая гиперемия отсутствует
CCS 1-3, слабая степень клинической гиперемии
CCS 4-5, умеренная степень клинической гиперемии
CCS ≥6, тяжелая степень клинической гиперемии
Ответ на диуретики определяли как потерю веса к дню 4 на 40 мг дозы диуретика.
Концентрацию гемоглобина определяли, равной 0 (если наблюдалось снижение или отсутствие изменений уровня гемоглобина к дню 4 по сравнению с исходным уровнем) или 1 (если наблюдалось увеличение уровня гемоглобина к дню 4 по сравнению с исходным уровнем).
Значимую остаточную гиперемию определяли как CCS ≥2 на основе оценок JVP, ортопноэ и отека к дню 7.
Статистический анализ
Исходные клинические характеристики и биомаркеры, включая био-ADM, обобщали по степени выраженности клинической гиперемии на исходном уровне (схема представлена выше). Исходные факторы, независимо связанные с тяжестью клинической гиперемии на исходном уровне, определяли с помощью многопараметрической модели логистической регрессии (переменную CCS записывали в виде бинарного результата с двумя уровнями: 0=легкий/умеренный (CCS <6) и 1=тяжелый (CCS≥ 6)).
Связь между исходными уровнями био-ADM и ответом на диуретики (непрерывная переменная) оценивали с помощью линейного регрессионного анализа. Для концентрации гемоглобина и значимой остаточной гиперемии выполняли бинарный логистический регрессионный анализ. Многофакторные модели использовали для оценки скорректированных связей между уровнями био-ADM и этими результатами.
Результаты
В Таблице 4 показано, что концентрации био-ADM увеличиваются в зависимости от тяжести гиперемии.
Таблица 4: Исходные клинические переменные и биомаркеры тяжести клинической гиперемии на исходном уровне
Слабо выраженная клиническая гиперемияN=212
Клиническая гиперемия средней тяжестиN=528
Сильно выраженная клиническая гиперемияN=667
P-тренд
Мужчин, % (N)
65,6 (139)
68,4 (361)
65,4 (436)
0,656
Возраст (годы)
71,5±11,7
71,1±11,3
70,8±10,7
0,427
ИМТ (кг/м<sup>2</sup>)
26,5±4,4
27,8±5,3
29,9±6,4
<0,001
ФВЛЖ (%)
32,1±13,4
33,2±13,4
32,2±13,4
0,808
САД (мм Hg)
124,2±17,9
125,2±17,4
124,3±17,3
0,773
ДАД (мм Hg)
72,9±12,2
73,3±11,4
74,1±11,6
0,118
ЧСС (уд./мин)
77,6±13,6
79,1±15,4
81±15,9
0,002
ЧД (в мин)
20 [18-22]
20 [18-24]
21 [18-24]
0,001
Ортопноэ, % (N)
Без подушки
17,9 (38)
4 (21)
0 (0)
ref.
Одна подушка (10 см)
36,8 (78)
14,8 (78)
2,5 (17)
<0,001
Две подушки (20 см)
33,0 (70)
56,6 (299)
31,8 (212)
<0,001
> 30 градусов
12,3 (26)
24,6 (130)
65,7 (438)
<0,001
Хрип в легких, % (N)
< 1/3
25,5 (54)
33,5 (177)
28,9 (193)
ref.
1/3-2/3
57,1 (121)
51,5 (272)
48,9 (326)
0,333
> 2/3
17,5 (37)
15 (79)
22,2 (148)
0,101
Отек, % (N)
0
56,6 (120)
15,3 (81)
0 (0)
ref.
1+
29,2 (62)
33,1 (175)
5,7 (38)
<0,001
2+
13,2 (28)
43,2 (228)
47,2 (315)
<0,001
3+
0,9 (2)
8,3 (44)
47,1 (314)
<0,001
JVP, % (N)
< 6 см
42,5 (90)
12,3 (65)
2,4 (16)
ref.
6-10 см
52,4 (111)
62,3 (329)
34,9 (233)
<0,001
> 10 см
5,2 (11)
25,4 (134)
62,7 (418)
<0,001
NYHA, % (N)
I
0,9 (2)
1,5 (8)
0,7 (5)
0,784
II
24,1 (51)
15 (79)
14,4 (96)
0,779
III
50,5 (107)
50,4 (266)
47,4 (316)
0,668
IV
14,6 (31)
28,6 (151)
34,6 (231)
0,494
Анамнез
COPD, % (N)
15,1 (32)
20,1 (106)
22 (146)
0,039
Инсульт, % (N)
8 (17)
8,3 (44)
10,9 (73)
0,111
Сосудистое заболевание, % (N)
12,3 (26)
11,6 (61)
9,3 (62)
0,145
Гипертензия, % (N)
78,8 (167)
77,7 (410)
82,6 (551)
0,075
Сахарный диабет, % (N)
38,7 (82)
44,1 (233)
48,1 (321)
0,013
Гиперхолестеринемия, % (N)
58 (123)
50 (264)
51,1 (340)
0,189
Инфаркт миокарда, % (N)
52,8 (112)
50,1 (264)
49,4 (328)
0,424
Стенокардия, % (N)
20,8 (44)
20,7 (109)
24 (160)
0,187
Ишемическая болезнь сердца, % (N)
68,9 (146)
70,4 (371)
71,4 (475)
0,468
Фибрилляция предсердий, % (N)
44,3 (94)
53,0 (279)
59,8 (396)
<0,001
Госпитализация после СН, % (N)
41,5 (88)
47,2 (249)
53,4 (356)
0,001
PCI, % (N)
34,0 (71)
26,5 (139)
23,3 (154)
0,003
CABG, % (N)
26,3 (55)
20,6 (108)
22,5 (149)
0,514
Электрокардиостимулятор, % (N)
9,9 (21)
11 (58)
11,4 (76)
0,556
Лекарства во время госпитализации
ACEI/ARB, % (N)
78,3 (166)
75,7 (399)
75,6 (504)
0,492
Бета-блокатор, % (N)
82,1 (174)
75,1 (396)
75,1 (501)
0,089
MRA, % (N)
41,5 (88)
44,8 (236)
47,5 (317)
0,110
Дигоксин, % (N)
20,3 (43)
30,6 (161)
31,3 (209)
0,009
Биомаркеры
Альбумин (г/дл)
<b>4,0 [3,7-4,3]</b>
<b>3,9 [3,6-4,2]</b>
<b>3,8 [3,5-4,1]</b>
<b><0,001</b>
ALT(Ед./л)
20 [14-32]
21 [15-32]
21 [15-30]
0,299
AST (Ед./л)
23 [17-31]
24 [19-33]
25 [20-33]
0,210
Бикарбонат (мЭкв./л)
23,6±3,4
24,2±3,6
24±3,9
0,485
BUN (мг/дл)
29 [22-42]
28 [21-40]
31 [22-42]
0,057
Хлорид (мЭкв./л)
102 [99-105]
101 [98-104]
101 [98-104]
0,085
Креатинин (мг/дл)
1,4 [1,1-1,8]
1,4 [1,1-1,8]
1,4 [1,1-1,8]
0,59
Общий холестерин (мг/дл)
154,5 [122-183,5]
146,5 [123-173,8]
134 [110-164]
<0,001
Глюкоза (мг/дл)
126 [104,5-155]
126 [101-168]
128 [103-162]
0,663
Гемоглобин (г/дл)
12,6±1,8
12,5±1,8
12,5±1,9
0,716
Количество тромбоцитов (*10<sup>9</sup>/л)
221 [180-278]
218 [170-268]
211 [168-260]
0,020
Калий (ммоль/л)
4,3±0,6
4,3±0,6
4,3±0,6
0,723
Количество эритроцитов (*10<sup>9</sup>/л)
4,2±0,6
4,2±0,6
4,2±0,6
0,200
Натрий (ммоль/л)
140 [137-142]
140 [138-142]
140 [137-142]
0,139
Триглицериды (ммоль/л)
96 [66-132,5]
89 [65-130]
83 [64-112]
0,003
Мочевая кислота (мг/дл)
8,5±2,5
8,8±2,6
9,1±2,5
0,003
Лейкоциты (*10<sup>9</sup>/л)
7,9 [6,5-10]
7,3 [6,2-9,1]
7,3 [5,9-9]
0,003
Гематокрит (%)
39,5±5,4
39,4±5,6
40,1±5,9
0,09
BNP (пг/мл)
406,8 [255,8-648,2]
437,4 [247,9-797,1]
487,9 [274,8-874]
0,002
cTnI (пг/мл)
12,0 [5,8-38,2]
9,8 [5,2-20,1]
10,8 [5,8-22,7]
0,046
био-ADM (пг/мл)
<b>30,0 [20,2-46,1]</b>
<b>37,4 [22,5-66,8]</b>
<b>55,4 [31,4-102,6]</b>
<b><0,001</b>
Кроме того, с помощью многопараметрической логистической регрессии было продемонстрировано, что био-ADM является независимым прогностическим показателем тяжести гиперемии и наиболее сильным среди всех других доступных переменных (таблица 5).
Таблица 5: Исходные факторы, независимо связанные с тяжестью исходной клинической гиперемии в многопараметрической модели логистической регрессии (тяжелая в сравнении с легкой/средней)
Переменная
Отношение рисков[95% CI]
P-значение
Госпитализация после СН
1,40 [1,11-1,75]
0,004
ИМТ
1,06 [1,04-1,08]
<0,001
Сывороточный альбумин
0,56 [0,43-0,74]
<0,001
био-ADM, log
1,58 [1,38-1,82]
<0,001
Площадь под кривой (AUC) для полной модели составляла 0,69, отдельные AUC: био-ADM=0,66, ИМТ=0,61, сывороточный альбумин=0,58, госпитализация после СН=0,54.
Существует очень небольшое количество исходных клинических переменных или биомаркеров, связанных с тяжестью исходной клинической гиперемии, и био-ADM, по-видимому, является наиболее сильным из них.
Кроме того, проанализировано, может ли био-ADM прогнозировать уменьшение гиперемии. В таблице 6 показано, что био-ADM является независимым прогностическим показателем значимой остаточной гиперемии к дню 7.
Таблица 6: Связь между исходными уровнями био-ADM и маркерами уменьшения гиперемии
Маркер уменьшения гиперемии<b></b>
<b>Нескорректированная</b>
<b>Скорректированная</b>
Оценка[95% CI]
P-значение
Оценка[95% CI]
P-значение
Значимая остаточная гиперемия к дню 7*
1,98[1,70-2,32]
<0,001
1,30[1,10-1,60]**
0,009
Ответ на диуретики к дню 4
0,02[-0,02-0,06]
0,350
-
-
Концентрация гемоглобина к дню 4
0,82[0,71-0,94]
0,004
0,90[0,78-1,04]#
0,160
* определяется как композитный показатель гиперемии > 2 к дню 7
** скорректированный относительно исходных переменных, включая ортопноэ, JVP, периферический отек, историю PCI, кардиостимулятор, применение ACEI/ARB, ИМТ, ДАД, BUN, гематокрит и BNP
# скорректированный относительно исходного показателя клинической гиперемии (важно: ~30% данных по гемоглобину отсутствуют)
Исходные уровни био-ADM являются независимым прогностическим показателем значимой остаточной гиперемии к дню 7.
Как и следовало ожидать для маркера гиперемии, концентрации био-ADM были тем выше, чем больше диуретиков было использовано в терапии (таблицы 7 и 8).
Таблица 7: Общая IV доза диуретиков до дня 7 или выписка (если это произошло раньше) в тертилях исходных уровней био-ADM; PROTECT
Тертиль 1
Тертиль 2
Тертиль 3
P-тренд
Общая IV доза диуретиков ко дню 7 или выписка (если раньше), мг
200,0 [92,6-352,8]
280,0 [135,5-494,4]
400,0 [200-882]
<0,001
<b>Нескорректированный</b>
<b>Скорректированный</b>
β (se)
p-значение
β (se)
p-значение
био-ADM
3,4 (0,3)
<0,001
2,2 (0,3)
<0,001
Таблица 8: Нескорректированная и скорректированная связь между исходными уровнями био-ADM и общей IV дозой диуретиков до дня 7 или выписка, если раньше; линейный регрессионный анализ; PROTECT
* скорректированная относительно возраста, систолического артериального давления, уровня креатинина, азота мочевины крови (BUN), альбумина, натрия, перенесенной ранее госпитализации по поводу СН, исходной композитной оценки гиперемии (CCS) и ИМТ; следует отметить, что в этой модели связь была наиболее устойчивой для био-ADM, исходной CCS и почечной функции
В том же наборе образцов также определяли MR-проADM. Исходные характеристики по тертилям MR-проADM приведены в таблице 9: Аналогично био-ADM, увеличение уровней MR-проADM связано с увеличением степени отека.
Таблица 9: Исходные характеристики по тертилям MR-проADM
Переменная
Тертиль 1
Тертиль 2
Тертиль 3
P-тренд
N=516
N=515
N=516
MR-проADM (нмоль/л)
0,24 [0,14-0,29]
0,55 [0,47-0,67]
1,25 [0,94-1,88]
Пол
65,9 (340)
64,3 (331)
69,4 (358)
0,235
Возраст (год)
70,1±11,1
71,3±10,9
71,3±11,4
0,073
ИМТ (кг/м<sup>2</sup>)
28±5,5
28,9±5,9
29,5±6,5
<0,001
ФВЛЖ (%)
32,9±13,4
33,5±12,3
31,3±13,8
0,178
САД (мм Hg)
126,3±17,5
125,9±17,1
122,2±17,4
<0,001
ДАД (мм Hg)
74,1±12,1
74,3±11,6
72,6±11,7
0,033
ЧСС (уд./мин)
78,7±14,4
79,8±15,4
81,2±16,5
0,008
ЧД (в мин)
20 [18-24]
20 [18-24]
22 [18,8-24]
0,698
Ортопноэ
Без подушки
3,5 (18)
4,3 (22)
3,3 (17)
ref.
Одна подушка
12,8 (66)
10,5 (54)
13,2 (68)
0,819
Две подушки
43,4 (224)
43,3 (223)
34,5 (178)
0,619
>30 градусов
39,1 (202)
41,2 (212)
48,1 (248)
0,439
Хрипы
Нет
8,3 (43)
7,6 (39)
11,2 (58)
ref.
<1/3
24,6 (127)
29,1 (150)
32,6 (168)
0,849
1/3-2/3
58,3 (301)
53 (273)
45,7 (236)
0,012
>2/3
8,5 (44)
10,3 (53)
10,3 (53)
0,622
Отек
0
16,3 (84)
14,8 (76)
12,2 (63)
ref.
1+
24,8 (128)
17,5 (90)
15,3 (79)
0,324
2+
39,7 (205)
40 (206)
40,5 (209)
0,112
3+
19,2 (99)
27,8 (143)
31,8 (164)
<0,001
JVP
<6 см
11 (57)
9,3 (48)
12,6 (65)
ref.
6-10 см
45,3 (234)
42,3 (218)
40,3 (208)
0,22
>10 см
34,7 (179)
37,7 (194)
37,4 (193)
0,755
NYHA
I
1,7 (9)
0,8 (4)
0,6 (3)
0,024
II
17,4 (90)
17,5 (90)
13,8 (71)
0,062
III
50,6 (261)
49,3 (254)
44,8 (231)
0,07
IV
25,6 (132)
29,1 (150)
33,7 (174)
0,114
COPD
18,6 (96)
19,2 (99)
21,9 (113)
0,185
Инсульт
8,7 (45)
8 (41)
11,2 (58)
0,164
Сосудистое заболевание
10,1 (52)
11,9 (61)
11,9 (61)
0,37
Гипертензия
79,1 (408)
83,3 (429)
78,7 (406)
0,876
Сахарный диабет
44,6 (230)
46 (237)
47,5 (245)
0,349
Гиперхолестеринемия
53,8 (277)
52,6 (271)
46,9 (242)
0,027
Инфаркт миокарда
49,2 (252)
50,5 (260)
50,4 (260)
0,708
Стенокардия
22,5 (116)
21,2 (109)
23,9 (123)
0,59
Ишемическая болезнь сердца
69,2 (355)
72,8 (375)
69,6 (359)
0,898
Фибрилляция предсердий
48 (246)
56,5 (290)
58,8 (302)
0,001
Госпитализация после СН
44,8 (231)
48,9 (252)
53,3 (275)
0,006
PCI
27,5 (140)
25,6 (131)
24,9 (127)
0,344
CABG
21,4 (109)
21,9 (112)
23,2 (119)
0,472
Электрокардиостимулятор
8 (41)
13,4 (69)
13 (67)
0,012
ACEI/ARB
77,7 (401)
78,6 (404)
71,5 (369)
0,02
бета-блокатор
79,1 (408)
74,5 (383)
72,5 (374)
0,014
MRA
44,6 (230)
45,9 (236)
45 (232)
0,901
Дигоксин
28,7 (148)
30,7 (158)
27,3 (141)
0,631
<b>Стандартные лабораторные параметры</b>
Альбумин (г/дл)
3,9 [3,6-4,2]
3,9 [3,6-4,2]
3,8 [3,5-4]
<0,001
ALT(Ед./л)
21 [15-30]
20 [15-31]
21 [15-34]
0,003
AST (Ед./л)
24 [18-31]
25 [19-32,8]
26 [19-37]
0,003
Бикарбонат (мЭкв./л)
24,5±3,6
24,4±3,7
23,3±3,8
<0,001
BUN (мг/дл)
25 [19-33]
29 [22-38,2]
38 [28-51]
<0,001
Хлорид (мЭкв./л)
101 [99-104]
101 [99-104]
101 [97-104]
0,023
Креатинин (мг/дл)
1,2 [1-1,5]
1,4 [1,1-1,7]
1,6 [1,3-2,1]
<0,001
Общий холестерин (мг/дл)
151 [126-181,2]
146 [119-174]
129 [107,5-159,5]
<0,001
Глюкоза (мг/дл)
129,5 [104-171,5]
126 [103-164]
128 [101-155]
0,013
Гемоглобин (г/дл)
12,8±1,9
12,6±1,7
12,2±1,9
<0,001
Количество тромбоцитов (*10<sup>9</sup>/л)
227 [180-277]
214,5 [172-266,5]
207 [161,5-263]
0,011
Калий (ммоль/л)
4,3±0,6
4,2±0,6
4,3±0,6
0,22
Количество эритроцитов (*10<sup>9</sup>/л)
4,3±0,6
4,2±0,6
4,1±0,6
<0,001
Натрий (ммоль/л)
140 [138-142]
140 [138-143]
139 [136-142]
<0,001
Триглицериды (ммоль/л)
101 [71-138,5]
83 [63-118]
81 [61-107]
<0,001
Мочевая кислота (мг/дл)
8,3±2,4
8,9±2,4
9,7±2,8
<0,001
Лейкоциты (*10<sup>9</sup>/л)
7,7 [6,3-9,2]
7,3 [6,1-9,1]
7,2 [5,9-9,3]
0,591
Гематокрит (%)
40,4±5,8
40±5,5
38,9±5,9
<0,001
<b>Биомаркеры</b>
IL-6 (пг/мл)
9,1 [5,3-16,5]
10,8 [6,4-19,9]
14,3 [8,8-26]
0,037
CRP (нг/мл)
12566,3 [6334,9-25975,8]
13306,5 [7168,3-27844,1]
16044,9 [8412,3-29966,3]
0,015
D-Димер (нг/мл)
134 [90,6-301]
155,5 [90,6-340,8]
180,3 [90,6-374,7]
0,017
PIGR (нг/мл)
292,2 [197,5-500,4]
363 [263,5-531,6]
578,8 [371,4-999]
<0,001
Пентраксин-3 (нг/мл)
3,4 [2,2-6]
3,9 [2,8-6]
5,5 [3,6-8,9]
<0,001
GDF-15 (нг/мл)
3,6 [2,5-5,8]
4 [3-6,1]
6,3 [4,3-6,3]
<0,001
RAGE (нг/мл)
4,7 [3,4-6,5]
4,9 [3,6-6,4]
5,4 [4-7,4]
<0,001
TNF-R1a (нг/мл)
2,6 [1,7-4]
2,9 [2,2-3,9]
4,4 [3,2-5,9]
<0,001
PCT (нг/мл)
14 [8-31]
20 [11-41]
35,5 [18-78]
<0,001
Миелопероксидаза (нг/мл)
33,9 [17,7-78,5]
30,9 [18,7-60]
32,8 [17-66,2]
0,209
Сидекан-1 (нг/мл)
7,7 [6,4-9,5]
8,1 [6,9-9,4]
9,6 [8,1-11,6]
<0,001
Периостин (нг/мл)
4 [2,3-6,8]
5,8 [3,5-8,8]
7,3 [4,3-11,2]
<0,001
Галектин-3 (нг/мл)
32 [25,2-43,1]
34 [26,5-44,1]
42,7 [32,5-55,9]
<0,001
Остеопонтин (нг/мл)
98,3 [66,3-149,9]
106,4 [74,2-150,3]
133,8 [100,7-190,8]
<0,001
ET1 (пг/мл)
5,7 [4,2-7,6]
6,7 [5,1-9]
7,9 [6,1-11]
<0,001
BNP (пг/мл)
310,8 [189,8-548,6]
477,2 [262,6-783,3]
630,1 [341,3-1063]
<0,001
NT-proCNP (пг/мл)
34 [22-48]
42 [31-58]
53 [38-74,2]
<0,001
ST-2 (нг/мл)
1,8 [0,9-5,6]
2,8 [1-5,7]
6,1 [2,7-10,9]
<0,001
VEGFR (нг/мл)
0,3 [0,2-0,4]
0,4 [0,2-0,5]
0,5 [0,3-0,8]
<0,001
Ангиогенин (нг/мл)
1940 [1229,1-2950,6]
1979,3 [1388,1-3093,5]
1675,8 [1178,7-2552,6]
0,007
Мезотелин (нг/мл)
81,6 [65,6-97]
83,6 [73,6-94,2]
94,5 [83,7-108,1]
<0,001
Нейропилин SAND (нг/мл)
10,6 [6,6-15,8]
11,6 [8,1-16,8]
14,8 [10,8-20,4]
<0,001
Troy (пг/мл)
72 [49-110]
84 [64-115]
114 [83-153]
<0,001
био-ADM
28 [17,2-53,5]
42,9 [27,1-74,2]
70,9 [40,3-120,3]
<0,001
LTBR (нг/мл)
0,3 [0,2-0,5]
0,4 [0,3-0,5]
0,5 [0,4-0,7]
<0,001
ESAM (нг/мл)
59,2 [53,4-68]
60,2 [55,6-65,8]
66,3 [60,5-71,7]
<0,001
KIM-1(пг/мл)
273,4 [169,1-484,6]
296 [181,3-480,4]
316,8 [199,3-492,9]
0,485
NGAL(нг/мл)
64,8 [44,2-98,6]
81,8 [54,2-123]
107,2 [70,4-175,2]
<0,001
PSAP-B(нг/мл)
34 [25,3-49,7]
36,9 [27,9-47,8]
45,4 [34,1-61,1]
<0,001
WAP4C(нг/мл)
18,2 [8,7-38,8]
22,6 [13,9-38,5]
45,8 [26,9-67,8]
<0,001
cTnI(пг/мл)
9,3 [5,1-19,5]
10,9 [5,6-21,2]
12,5 [6,3-27,2]
0,078
Пример 7
Исследование BIOSTAT
Дополнительные анализы выполняли в исследовании BIOSTAT (изучение биологии для специализированного лечения при хронической сердечной недостаточности). Это исследование подробно описано (WWW.BIOSTAT-CHF.EU; Voors et al. 2016. Eur J Heart Fail. Jun; 18 (6):716-26). В исследовании BIOlogy, посвященном специализированному лечению хронической сердечной недостаточности (BIOSTAT-CHF), приняли участие 2516 пациентов с ухудшающимися признаками и/или симптомами сердечной недостаточности из 11 европейских стран, которые, как предполагалось, получили неоптимальное медицинское лечение. Еще 1738 пациентов из Шотландии были включены в группу валидации. В целом, обе группы пациентов были хорошо подобраны. Большинство пациентов были госпитализированы по поводу острой сердечной недостаточности, а у остальных было отмечено ухудшение признаков и/или симптомов сердечной недостаточности в поликлиниках. Примерно половина пациентов была отнесена к классу III согласно классификации Нью-йоркской ассоциации кардиологов, и 7% пациентов из этого класса против 34% пациентов в группе валидации имели сердечную недостаточность с сохраненной фракцией выброса. Согласно плану исследования, все пациенты получали диуретики, но с учетом критериев включения в обеих группах пациенты не получали оптимальную медицинскую терапию, согласно фактическим данным. В фазе наблюдения было одобрено повышение дозы до рекомендуемых в руководстве доз.
Изучение популяции
Пациенты соответствовали следующим критериям включения:
- возраст ≥18 лет с симптомами впервые проявившейся или обострившейся сердечной недостаточности,
- наличие объективных доказательств сердечной дисфункции, документально подтвержденных
- фракция выброса левого желудочка ≤40% ИЛИ,
- концентрации BNP в плазме и/или N-терминального фрагмента предшественника мозгового натрийуретического пептида (NT-proBNP) >400 пг/мл или >2000 пг/мл, соответственно,
- лечение пероральным или внутривенным введением фуросемида ≥40 мг/сутки или его эквивалентом на момент включения,
- ранее не получали лечение препаратами с доказанной эффективностью [ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента (ACE)/антагонисты рецепторов ангиотензина (ARB) и бета-блокаторы] или получали ≤50% целевых доз этих препаратов на момент включения,
- ожидается, что лечащий врач инициирует или повысит дозу ингибиторов ACE/ARB и/или бета-блокаторов.
Пациентов зачисляли в стационарные или амбулаторные отделения. Примерно 2/3 госпитализировали, а 1/3 наблюдали в амбулаторных условиях.
В настоящем изобретении была проанализирована подгруппа пациентов, включающая пациентов всех типов, участвующих в исследовании (n=1806), у которых было проведено измерение биомаркеров на исходном уровне.
Как и в исследовании PROTECT (пример 6), также и в исследовании BIOSTAT, повышение уровня био-ADM коррелировало с увеличением тяжести гиперемии (таблица 10).
Таблица 10: Исходные клинические переменные и стандартные биомаркеры в зависимости от степени выраженности периферического отека; BIOSTAT
Отсутствует
Голень
Ниже колена
Выше колена
P-тренд
<b>N =734</b>
<b>N =532</b>
<b>N =408</b>
<b>N =132</b>
Возраст (лет)
68 [59,7-76,2]
70,7 [62,6-78,6]
72,4 [64,2-78,8]
74,3 [64,6-80,4]
<0,001
ИМТ (кг/м<sup>2</sup>)
26,5 [23,9-29,4]
27,1 [23,9-30,4]
28,7 [24,8-33,8]
30,5 [26,2-34,9]
<0,001
ФВЛЖ (%)
30 [25-35]
30 [25-37]
30 [23-38]
35 [25-43,8]
0,002
ДАД (мм Hg)
75,8±12,9
74,2±12,8
74,3±14,6
72,5±13
0,004
ЧСС (уд./мин)
75 [65-85]
78,5 [68,2-90]
80 [70-92]
80 [70-92,2]
<0,001
Ортопноэ
21,5 (158)
40,4 (215)
50,7 (207)
61,4 (81)
<0,001
Хрипы >1/3 областей легкого
5,6 (41)
10,7 (57)
16,4 (67)
28,8 (38)
<0,001
Повышенный уровень JVP
11,2 (82)
29,7 (158)
38 (155)
47 (62)
<0,001
NYHA
I
2,7 (20)
0,8 (4)
1 (4)
15,2 (20)
ref.
II
48,2 (354)
31 (165)
14,7 (60)
57,6 (76)
0,402
III
39,2 (288)
53,2 (283)
62,7 (256)
21,2 (28)
<0,001
IV
8,2 (60)
13,5 (72)
18,1 (74)
6,1 (NA)
<0,001
Гепатомегалия
8 (59)
16,2 (86)
22,3 (91)
27,3 (36)
<0,001
Анамнез
Сахарный диабет
27,1 (199)
32,7 (174)
43,6 (178)
36,4 (48)
<0,001
Фибриллиция предсердий
38,6 (283)
49,1 (261)
56,4 (230)
55,3 (73)
<0,001
ACEI/ARB
73,8 (542)
74,6 (397)
66,7 (272)
57,6 (76)
<0,001
Бета-блокатор
86,8 (637)
83,1 (442)
78,2 (319)
75 (99)
<0,001
Биомаркеры
АЛЬБУМИН1 (г/л)
33 [28-39]
32 [27-37,5]
31 [26-35]
30 [24,2-33,8]
<0,001
AST (Ед./л)
24 [19-32]
26 [19-36]
28 [21-37]
29 [24-40,8]
0,003
Гамма-GT (Ед./л)
39,7 [24-79,5]
61 [30-107,8]
69 [40-142,3]
98,5 [55-174,5]
<0,001
BUN (ммоль/л)
10,1 [7,1-16,5]
12,0 [7,8-19,3]
11,9 [8,3-19,9]
11,3 [7,4-18,4]
0,001
Общий холестерин (ммоль/л)
4,4 [3,7-5,2]
4 [3,3-4,9]
3,8 [3,1-4,5]
3,1 [2,8-3,7]
<0,001
Гемоглобин (г/дл)
13,5±1,8
13±1,9
13,1±1,9
12,4±2,1
<0,001
Триглицериды (ммоль/л)
1,3 [1-1,8]
1,2 [0,9-1,5]
1,1 [0,9-1,5]
0,9 [0,8-1,2]
<0,001
Гематокрит (%)
40,6±5,1
39,7±5,4
39,8±5,6
38,3±5,8
<0,001
BNP (пг/мл)
<b>489,1 [225-812]</b>
<b>663,8 [322-1192]</b>
<b>792,5 [487-1471]</b>
<b>759,0 [557-2023]</b>
<b>0,02</b>
бил-ADM (пг/мл)
<b>26,1 [19,2-37,8]</b>
<b>36,7 [24,6-54,4]</b>
<b>52,8 [34,4-86,7]</b>
<b>82,8 [49,4-141,2]</b>
<b><0,001</b>
В том же наборе образцов также определяли MR-проADM. Исходные характеристики по тертилям MR-проADM приведены в таблице 11: Аналогично био-ADM, увеличение уровней MR-проADM связано с увеличением степени отека.
Таблица 11: Исходные характеристики по тертилям MR-проADM
Переменная
Тертиль 1
Тертиль 2
Тертиль 3
P-тренд
N =
704
703
703
MR-проADM (нмоль/л)
0,3 [0,2-0,3]
0,5 [0,4-0,6]
1 [0,8-1,5]
<0,001
Пол
74,6 (525)
72,1 (507)
73 (513)
0,498
Возраст (год)
65,3 [57-73,8]
71,2 [62,9-78,4]
74,3 [65,2-80,4]
<0,001
ИМТ (кг/м<sup>2</sup>)
26,8 [23,9-30,4]
27,3 [24,2-30,9]
27,1 [24,1-30,7]
0,051
ФВЛЖ (%)
30 [25-35]
30 [25-37,2]
30 [25-38]
0,297
САД (мм Hg)
126,3±20,8
125,8±23,4
121,2±21,1
<0,001
ДАД (мм Hg)
76,4±13,3
75,2±13,3
72,3±13
<0,001
ЧСС (уд./мин)
75 [65-86]
77 [68-90]
77 [67-90]
0,015
Наличие ортопноэ
23 (162)
35,8 (252)
45,1 (317)
<0,001
Хрипы >1/3 областей легких
6,4 (45)
11,9 (84)
12,9 (91)
0,074
Отек
0
45 (317)
32,9 (231)
23,2 (163)
ref.
1+
20,5 (144)
26,3 (185)
26,5 (186)
<0,001
2+
11,9 (84)
17,2 (121)
27,0 (190)
<0,001
3+
2,1 (15)
4,8 (34)
11,0 (77)
<0,001
Повышенный уровень JVP
14,9 (105)
20,9 (147)
32,4 (228)
<0,001
NYHA
I
2,7 (19)
2,6 (18)
1 (7)
ref.
II
46 (324)
37,7 (265)
21,5 (151)
0,751
III
40,1 (282)
48,1 (338)
55,3 (389)
0,002
IV
7,8 (55)
9,7 (68)
18,8 (132)
<0,001
Гепатомегалия
9,7 (68)
12,8 (90)
19,8 (139)
<0,001
S3
9,7 (68)
9,7 (68)
9,5 (67)
0,935
<b>Анамнез</b>
COPD
15,1 (106)
17,4 (122)
18,9 (133)
0,054
Инсульт
7,1 (50)
10 (70)
11,5 (81)
0,005
Сосудистое заболевание
8,5 (60)
12,5 (88)
12,5 (88)
0,017
Гипертензия
60,8 (428)
64,3 (452)
61,3 (431)
0,842
Сахарный диабет
25,6 (180)
35,3 (248)
36,7 (258)
<0,001
Инфаркт миокарда
29,7 (209)
39,5 (278)
42,1 (296)
<0,001
Фибрилляция предсердий
37,1 (261)
46,4 (326)
53,5 (376)
<0,001
Госпитализация после СН
27,8 (196)
30,4 (214)
34,3 (241)
0,009
PCI
17 (120)
21,2 (149)
23,6 (166)
0,002
CABG
12,2 (86)
17,8 (125)
21,8 (153)
<0,001
ACEI/ARB
75,7 (533)
73,1 (514)
66,4 (467)
<0,001
Бета-блокатор
84,9 (598)
83,5 (587)
80,1 (563)
0,016
<b>Стандартные лабораторные параметры</b>
Альбумин (г/л)
34 [29-39]
33 [27-37]
30 [24-36]
<0,001
ALT(Ед./л)
27 [18-40]
25 [17-39]
23 [15-35]
0,452
AST (Ед./л)
24 [20-33]
25,9 [18-35]
27 [20-36]
0,087
Гамма-GT (Ед./л)
40,8 [25-84]
52 [28-99]
76 [32,5-132,4]
<0,001
Щелочная фосфатаза (мкг/л)
80 [63-114,8]
83 [65-111]
91 [69-123,5]
0,087
BUN (ммоль/л)
8,9 [6,4-13,3]
11 [7,4-16,2]
15 [9,5-25]
<0,001
Креатинин (мг/дл)
89,3 [75,8-106,1]
100 [84,6-123,4]
124,6 [98-167]
0,61
Общий холестерин (ммоль/л)
4,5 [3,8-5,5]
4,2 [3,4-4,9]
3,6 [3-4,5]
<0,001
Глюкоза (мг/дл)
6 [5,3-7,5]
6,4 [5,4-8,5]
6,5 [5,4-7,9]
0,22
Гемоглобин (г/дл)
13,7±1,7
13,3±1,8
12,5±1,9
<0,001
Количество тромбоцитов (*10<sup>9</sup>/л)
221 [183-264]
220 [173-263]
208 [161-258]
0,001
Калий (ммоль/л)
4,3 [4-4,6]
4,2 [3,9-4,5]
4,2 [3,8-4,6]
0,003
Количество эритроцитов (*10<sup>12</sup>/л)
4,6 [4,2-5]
4,5 [4,1-4,9]
4,2 [3,8-4,7]
<0,001
Натрий (ммоль/л)
140 [138-142]
140 [137-142]
139 [136-141]
<0,001
Триглицериды (ммоль/л)
1,3 [1-1,7]
1,3 [0,9-1,8]
1,1 [0,9-1,5]
<0,001
Лейкоциты (*10<sup>9</sup>/л)
7,7 [6,6-9,2]
8 [6,5-9,8]
7,7 [6,3-9,7]
0,529
Гематокрит (%)
41,3±4,9
40,2±5,2
38,2±5,4
<0,001
<b>Биомаркеры</b>
IL-6 (пг/мл)
3,7 [2-6,8]
5,1 [2,8-8,9]
8,2 [4,5-16,5]
<0,001
CRP (нг/мл)
11872,9 [4810,7-25356,7]
12266,6 [5506,4-25955,3]
16350,1 [7718,9-29386,1]
0,004
D-Димер (нг/мл)
101,9 [101,9-101,9]
101,9 [101,9-146,5]
101,9 [101,9-194,3]
0,032
PIGR (нг/мл)
71,5 [44-106,5]
123,6 [89,8-177,3]
216,3 [153,8-311,2]
<0,001
Пентраксин-3 (нг/мл)
1,3 [0,8-2,1]
2 [1,4-3,1]
3,3 [2,1-5,2]
<0,001
GDF-15 (нг/мл)
2,6 [2,2-3,1]
3,4 [3-4]
4,4 [3,8-5,3]
<0,001
RAGE (нг/мл)
2 [1,4-2,7]
2,9 [2,1-4]
3,8 [2,8-5]
<0,001
TNF-R1a (нг/мл)
0,6 [0,3-0,8]
1 [0,8-1,4]
1,9 [1,3-2,7]
<0,001
PCT (пг/мл)
6,2 [3,7-16,1]
16 [8,2-31,6]
36,6 [18,9-82,2]
<0,001
Миелопероксидаза (нг/мл)
24,3 [20,6-30,2]
28,4 [24,1-34,8]
31,1 [26,6-38,9]
<0,001
Синдекан-1 (нг/мл)
1,2 [0,6-2,1]
2,2 [1,4-3,5]
3,9 [2,5-6,1]
<0,001
Периостин (нг/мл)
3,9 [2,3-6,5]
6,2 [4-9,5]
9,2 [5,9-14,9]
<0,001
Галектин-3 (нг/мл)
17,6 [13,2-24,7]
20,3 [15,4-27]
26,8 [19,1-37,7]
<0,001
Остеопонтин (нг/мл)
176,3 [147,2-206,4]
215,4 [187,2-247]
260,2 [227,7-298,8]
<0,001
ET1 (пг/мл)
4,4 [3,5-5,9]
5,3 [4-6,7]
6,6 [5,1-9,1]
<0,001
BNP (пг/мл)
515 [219,9-957,5]
598,3 [260,7-1162]
1032 [639-1641,5]
0,004
NT-proCNP (пг/мл)
5,2 [5,2-5,2]
5,3 [5,2-11,2]
14,7 [6,2-27,4]
<0,001
ST-2 (нг/мл)
4,2 [2,3-9,1]
8,3 [4,5-15,6]
20,4 [10,1-36,1]
<0,001
VEGFR (нг/мл)
0,1 [0,1-0,1]
0,1 [0,1-0,2]
0,2 [0,1-0,4]
<0,001
Ангиогенин(нг/мл)
6202,1 [4115,9-9654,5]
4484,4 [3193-6378,8]
3672 [2629-5151,6]
<0,001
Мезотелин (нг/мл)
47,7 [42,4-53,1]
53,7 [48,7-59,5]
60,4 [54,2-68,8]
<0,001
Нейропилин SAND (нг/мл)
17 [13,5-20,8]
21,3 [17,5-25,5]
26,6 [21,4-31,6]
<0,001
Troy (пг/мл)
0,1 [0,1-0,2]
0,3 [0,2-0,4]
0,4 [0,3-0,7]
<0,001
LTBR (нг/мл)
0,1 [0,1-0,1]
0,2 [0,1-0,2]
0,2 [0,2-0,3]
<0,001
ESAM (нг/мл)
57,1 [51,6-62,2]
64,2 [59,2-69,1]
71 [65,8-78]
<0,001
NGAL(нг/мл)
45,6 [30,7-72,4]
59 [37,5-87,6]
82,7 [51-135,4]
<0,001
PSAP-B(нг/мл)
25,5 [17,2-33]
31,6 [24,4-37,4]
37 [29,4-43,1]
<0,001
WAP4C(нг/мл)
0,7 [0,5-1,2]
1,4 [0,9-2,3]
3,5 [2-6,2]
<0,001
cTnI(пг/мл)
9,6 [5-23,5]
12,6 [7,2-27]
16,5 [9,5-35,9]
0,098
Пример 8
Введение NT-H здоровым людям
Исследование проводили на здоровых мужчинах в виде рандомизированного, двойного слепого, плацебо-контролируемого исследования путем введения единичных эскалирующих доз антитела NT-H посредством внутривенной (iv) инфузии в 3 последовательных группах, в каждой по 8 здоровых мужчин (1-я группа 0,5 мг/кг, 2-я группа 2 мг/кг, 3-я группа 8 мг/кг) (n=6 активных, n=2 плацебо в каждой группе).
Основными критериями включения были письменное информированное согласие, возраст 18-35 лет, согласие на использование надежного способа контрацепции и показатель ИМТ в пределах от 18 до 30 кг/м².
Испытуемые получили одну в/в дозу антитела NT-H (0,5 мг/кг; 2 мг/кг; 8 мг/кг) или плацебо посредством медленно вводимой инфузии, в течение 1-го часа, в исследовательской клинике.
Исходные значения ADM в 4 группах не различались. Медианные значения ADM были равны 7,1 пг/мл в группе плацебо, 6,8 пг/мл в первой группе лечения (0,5 мг/кг), 5,5 пг/мл во второй группе лечения (2 мг/кг) и 7,1 пг/мл в третьей группе лечения (8 мг/мл).
Результаты свидетельствуют о том, что у здоровых людей значения ADM быстро увеличивались в течение первых 1,5 часов после введения антитела NT-H, затем достигали плато и медленно снижались (фиг. 9).
Пример 9
Введение антител NT-H свиньям в экспериментальной модели септического шока "двойного удара"
Для индукции сердечной недостаточности и для изучения влияния антител NT-H на гемодинамические и клинические показатели, включая функцию сердца, использовали достоверную модель септического шока "двойного удара" у свиней (Simon TP et al., Crit Care. 2012 Jan 25; 16 (1): R16).
16 самок немецких свиней Landrace анестезировали и переводили на искусственное дыхание (n=16; среднее значение массы тела (МТ) ± стандартное отклонение (SD)=33±1,5 кг) и следовали стандартным процедурам по уходу за лабораторными животными. Это исследование было одобрено институциональным и местным комитетом по уходу и использованию животных (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen, Germany, 84-02.04.2015.A037).
2
2
Животным предварительно вводили азаперон (1-2 мг/кг массы тела) и кетамин (10 мг/кг массы тела), а общую анестезию индуцировали внутривенной инъекцией пропофола (1-2 мг/кг массы тела). Животных перорально интубировали и клали в положение лежа на спине. Общую анестезию поддерживали инфузиями пропофола и фентанила. Для вентиляции животных выбирали режим вентиляции с контролируемым давлением с фракцией кислорода во вдыхаемой смеси 0,5, соотношением вдох/выдох 1:1,5, со значением PEEP, установленным на 5 см HO, и дыхательным объемом 8-10 мл/кг массы тела. Частоту дыхания устанавливали для поддержания PaCO на уровне 3,5-4,5 кПа. Внутреннюю температуру тела поддерживали выше 37,5°С с помощью согревающего одеяла. Два центральных венозных катетера вводили во внешнюю яремную вену и бедренную вену, а артериальный катетер PICCO вводили в бедренную артерию посредством чрескожной пункции.
В конце исследования животных умерщвляли в присутствии ветеринара путем введения летальной дозы Наркорена (Merial, Hallbergmoos, Германия), пока они еще находились под глубоким наркозом.
E. coli
11
В этой модели септический шок вызывали использовали сгусток  в количестве 7-9×10 колониеобразующих единиц (КОЕ) на кг/МТ.
Измерения гемодинамических показателей:
Все измерения внутрисосудистого давления выполняли на уровне средней части грудной клетки, и значения получали в конце выдоха. Непрерывно регистрировали частоту сердечных сокращений, среднее артериальное давление (MAP), центральное венозное давление (CVP) и изменение ударного объема (SVV). Сердечный выброс (СО) измеряли с помощью транспульмональной термодилюции (PICCO, Pulsion medical systems, Feldkirchen, Германия). Внесосудистая вода в легких (EVLW), внутригрудной объем крови (ITBV) и глобальный конечный диастолический объем (GEDV) рассчитывали по стандартной формуле.
Протокол эксперимента:
Во время катетеризации животные получали 10 мл/кг массы тела/час сбалансированного кристаллоидного раствора. Геморрагический шок индуцировали кровотечением у животных через катетер бедренной вены. Кровотечение у животных не прекращали до тех пор, пока значение MAP не уменьшилось вдвое относительно исходного значения. Геморрагический шок поддерживали в течение 45 минут, после чего количество жидкости восстановливали сбалансированным кристаллоидным раствором для восстановления исходного среднего артериального давления. Через 2 часа после геморрагического шока кровь, собранную во время геморрагического шока, повторно переливали. В качестве второго удара индуцировали сепсис, путем введения сгустка E. coli в брюшную полость через 6 часов после геморрагического шока. Животных случайным образом делили на группы, получающие либо антитела против адреномедуллину, либо раствор носителя. Терапию антителом или раствором носителя начинали сразу после индукции сепсиса. Антитело/раствор носителя в количестве 2 мг/кг массы тела вводили в течение 30 минут. Через 4 часа после индукции сепсиса начинали терапию септического шока, используя сбалансированные кристаллоиды и норадреналин, при необходимости. Объемное замещение и вазопрессор титровали для поддержания центрального венозного давления на уровне 8-12 мм рт.ст., среднего артериального давления выше 65 мм рт.ст. и центрального венозного насыщения кислородом на уровне 70%, согласно рекомендациям кампании Surviving Sepsis. Терапию сепсиса продолжали еще 8 часов. Образцы плазмы и ЭДТА для проведения нескольких измерений получали до инициации геморрагического шока, до индукции сепсиса и через 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10 и 12 часов после индукции сепсиса и до измерения хранили при -80°С. Геморрагический и септический шок не инициировали у животных из групп SHAM, но, независимо от этого, они получали такое же лечение, включая введение всех внутрисосудистых катетеров, срединную лапаротомию и слепое применение антитела/раствора носителя и сбора образцов крови, как у септических животных. График лечения и взятия образцов крови приведен на фиг. 10.
Как и ожидалось, концентрация ADM в плазме начала увеличиваться после индукции сепсиса в обеих группах. Это увеличение было ускорено введением антитела NT-H вместе с индукцией сепсиса. В то время как в группе, принимавшей носитель, наблюдалось увеличение примерно до 30 пг/мл через час после индукции сепсиса, в это же время в группе лечения этот показатель достиг уровня 265 пг/мл. В группе лечения было достигнуто устойчивое состояние на уровне примерно 1100 пг/мл через 3 часа после введения антитела NT-H, в то время как в группе носителя наблюдалось постоянное увеличение концентрации ADM до 700 пг/мл к концу эксперимента (фиг. 11). Применение антител NT-H также вызывало увеличение ADM в плазме у ложно симулированных животных. Этот результат был аналогичен результатам, наблюдаемым у здоровых людей (пример 8).
-1
-1
-1
Частота сердечных сокращений (ЧСС) увеличилась в точке кровотечения при геморрагическом шоке для компенсации потери объема, и вернулась к исходным значениям после возмещения объема кристаллоидным раствором и кровью. После индукции сепсиса частота сердечных сокращений оставалась постоянной на уровне 60-65 мин в течение первого часа, после чего она стала увеличиваться, причем скорость увеличения была выше в группе носителя, по сравнению с группой лечения антителом с конечными значениями 125 мин (носитель) по сравнению с 98 мин (лечение) (фиг. 12).
Сердечный выброс (СО) является показателем объема крови, перекачиваемой сердцем, в частности левым или правым желудочком, за единицу времени. Значения CO могут быть представлены с использованием множества физических единиц, например, в л/мин. Сердечный выброс в этом исследовании был значительно ниже в группе, получавшей NT-H антитело, по сравнению с группой, получавшей носитель (фиг. 13).
Потребность в жидкости (фиг. 14 и 15) и норадреналине (фиг. 16) для поддержания постоянного среднего артериального давления была значительно меньше у группы, получавшей NT-H антитело, по сравнению с группой, получавшей носитель. Важно отметить, что только треть животных, получавших NT-H, впали в шок (например, для поддержания целевого значения MAP требовалась поддержка вазопрессора), тогда как для всех контрольных животных, принимавших носитель, требовался вазопрессор (фиг. 17). Суточный объем мочи у группы, принимавшей антитела NT-H, не отличался от таковой у группы носителя. Снижение потребности в жидкостях при применении антител NT-H, особенно с учетом снижения потребности в норадреналине, свидетельствует о том, что из кровообращения уходит меньше жидкости и, следовательно, в группе, получавшей антитела NT-H, наблюдалось меньше случаев гиперемии.
-5
Под сосудистым сопротивлением понимается сопротивление кровотоку, создаваемой всей сосудистой системой, за исключением легочной сосудистой системы. Системное сосудистое сопротивление (SVR) используется в расчетах артериального давления, кровотока и сердечной функции. SVR, в единицах дин.сек.см, рассчитывали по результатам других измерений по формуле:
SVR=80×(MAP-CVP)/CO. SVR увеличивается для «сжатия» сосудов артериального контура в попытке сохранить артериальное давление. Как показано на фиг. 18, системное сосудистое сопротивление в этой модели животных было выше в группе, получавшей NT-H, по сравнению с группой, получавшей носитель.
Пример 10
Введение NT-H при ЛПС-индуцированной эндотоксемии у крыс
Целью данного исследования было изучение влияния HAM8101 на проницаемость сосудов печени и почек после ЛПС-индуцированной эндотоксемии у крыс.
Дозы 0,02, 0,1, 0,5 и 2,5 мг HAM8101/кг массы тела или PBS вводили внутривенно (в виде однократной болюсной инъекции) самцам крыс линии Wistar (n=8 на группу) (см. таблицу 12). Для индукции эндотоксемии через пять вводили минут 2,5 или 5 мг ЛПС/кг массы тела (группу с 2,5 мг ЛПС/кг использовали только для тестирования подходящей дозы ЛПС без проведения оценки). Образцы крови брали через 3, 6 и 24 часа после введения ЛПС и HAM8101.
Через 24 часа после введения раствора ЛПС медленно вводили Evans Blue путем инъекции в хвостовую вену, и животных убивали через 15 минут и перфузировали гепаринизированным солевым раствором (50 МЕ/мл). Почки и печень удаляли, взвешивали и измельчали, и после дальнейших манипуляций определяли концентрацию Evans Blue в ткани (спектроскопическое поглощение при 620 нм), который является показателем проницаемости сосудов. Кроме того, из мочевого пузыря до перфузии собирали мочу.
Таблица 12: Экспериментальные группы и дозы
<b>Группа</b>
<b>Доза HAM8101</b><b>[мг/кг]</b>
<b>Доза LPS</b><b>[мг/кг]</b>
<b>N</b>
A (Контроль)
NaCl
NaCl
8
B (Плацебо; только для тестирования подходящей дозы LPS, без дальнейшей оценки)
NaCl
2,5
6
C (Плацебо)
NaCl
5
8
D
2,5
5
8
E
0,5
5
8
F
0,1
5
8
G
0,02
5
8
График зависимости концентрации rADM в плазме от времени в группе плацебо (NaCl+ЛПС) показал увеличение концентрации в течение первых 6 часов после применения ЛПС с достижением пиковой концентрации в плазме, равной 140 пг/мл, с последующим снижением до 64 пг/мл через 24 часа.
Уровни общего rADM дополнительно увеличивались дозозависимым способом после введения HAM8101 до максимальной концентрации rADM 550 пг/мл в случае дозы 2,5 мг/кг и 270 пг/мл в случае дозы 0,5 мг/кг через 3 часа после введения ЛПС и HAM8101. Более низкие дозы 0,1 и 0,02 мг/кг не привели к дальнейшему увеличению концентрации по сравнению с увеличением уровня rADM, вызванным введением ЛПС (19А). При нормализации общего уровня rADM по отношению к уровням, достигнутым в группе плацебо в соответствующие моменты времени, уровни максимального пика увеличились в 5,3 и 2,7 раза в группе 2,5 и 0,5 мг/кг, соответственно. Это увеличение общей концентрации ADM в плазме по сравнению с исходным уровнем было более высоким, чем у здоровых животных (коэффициент 3 для 2,5 мг/кг) и септических мышей (коэффициент 2). Более низкие дозы 0,1 и 0,02 мг/кг не приводили к увеличению общего уровня rADM, превышающего уровни, достигаемые при введении только LPS (19B).
Крысам вводили NaCl (здоровые, зеленый) или ЛПС в дозе 5 мг/кг массы тела (плацебо, красный); крысам дополнительно вводили разные дозы либо NaCl (плацебо, красный), либо HAM8101 (синий) в виде однократной внутривенной болюсной инъекции за 5 минут до введения ЛПС. Уровни rADM определяли через 3, 6 и 24 часа после введения ЛПС и представляли в виде (A) средних значений ± SEM или в виде (B) x-кратной индукции по сравнению с группой плацебо в соответствующий момент времени.
Проницаемость сосудов значительно увеличивалась после введения ЛПС. При этом, при введении HAM8101 в дозах от 0,1 до 2,5 мг/кг HAM8101 в почках наблюдалось четкое и значимое снижение проницаемости сосудов (см. фиг. 20A). При дозе 0,1 мг/кг восстановление проницаемости до нормального здорового состояния было значительно более эффективным по сравнению с дозами 0,5 и даже 2,5 мг/кг (р<0,05). Для подтверждения достоверности этого эффекта необходимы дополнительные исследования. При этом доза 0,02 мг/кг, напротив, практически не оказывала никакого положительного влияния на проницаемость сосудов. Данные по проницаемости сосудов в печени продемонстрировали аналогичную тенденцию, но не были статистически значимыми (см. фиг. 20B).
Крысам вводили NaCl (контроль, зеленый) или ЛПС в дозе 5 мг/кг массы тела (плацебо, красный); затем им дополнительно вводили разные дозы либо NaCl (плацебо, красный), либо HAM8101 (синий) виде однократной внутривенной болюсной инъекции за 5 минут до введения ЛПС. Проницаемость сосудов измеряли путем определения концентрации Evans Blue в (A) почках и (B) тканях печени через 24 часа после введения LPS и лечебного агента. Значения приведены в виде среднего значения ± SEM; р-значения <0,05 считались статистически значимыми.
В заключение, в этой модели эндотоксемии у крыс ведение HAM8101 в дозах, начиная с 0,1 мг/кг, привело к значимому восстановлению целостности сосудов в почках. Для печени был получен аналогичный сопоставимый эффект, который, однако, не был статистически значимым. Однако неясно, является ли этот эффект реальным, либо он является результатом использованного метода обнаружения. Было отмечено значимое увеличение общего уровня rADM в плазме в случае введения HAM8101 в дозах, выше 0,1 мг/кг.
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ
SEQ ID NO:1
GYTFSRYW
SEQ ID NO:2
ILPGSGST
SEQ ID NO:3
TEGYEYDGFDY
SEQ ID NO:4
QSIVYSNGNTY
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ʺRVSʺ (не указанную в списке последовательностей):
RVS
SEQ ID NO:5
FQGSHIPYT
SEQ ID NO:6 (AM-VH-C)
QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFSRYWIEWVKQRPGHGLEWIGEILPGSGSTNYNEKFKGKATITADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKHHHHHH
SEQ ID NO:7 (AM-VH1)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWISWVRQAPGQGLEWMGRILPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKHHHHHH
SEQ ID NO:8 (AM-VH2-E40)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWMGRILPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKHHHHHH
SEQ ID NO:9 (AM-VH3-T26-E55)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKATGYTFSRYWISWVRQAPGQGLEWMGEILPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKHHHHHH
SEQ ID NO:10 (AM-VH4-T26-E40-E55)
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKATGYTFSRYWIEWVRQAPGQGLEWMGEILPGSGSTNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTEGYEYDGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKHHHHHH
SEQ ID NO:11 (AM-VL-C)
DVLLSQTPLSLPVSLGDQATISCRSSQSIVYSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHIPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:12 (AM-VL1)
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLNWFQQRPGQSPRRLIYRVSNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:13 (AM-VL2-E40)
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVYSNGNTYLEWFQQRPGQSPRRLIYRVSNRDSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:14 (человеческий ADM 1-21)
YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC
SEQ ID NO:15 (человеческий ADM 21-32)
CTVQKLAHQIYQ
SEQ ID NO:16 (человеческий ADM C-42-52)
2
CAPRSKISPQGY-CONH
SEQ ID NO:17 (мышиный ADM 1-19)
YRQSMNQGSRSNGCRFGTC
SEQ ID NO:18 (мышиный ADM 19-31)
CTFQKLAHQIYQ
SEQ ID NO:19 (мышиный ADM C-40-50)
2
CAPRNKISPQGY-CONH
SEQ ID NO:20 (зрелый человеческий адреномедуллин (зрелый ADM); амидированный ADM; био-ADM): аминокислоты 1-52 или аминокислоты 95-146 про-ADM
2
YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTCTVQKLAHQIYQFTDKDKDNVAPRSKISPQGY-CONH
SEQ ID NO:21 (мышиный ADM 1-50)
2
YRQSMNQGSRSNGCRFGTCTFQKLAHQIYQLTDKDKDGMAPRNKISPQGY-CONH
SEQ ID NO:22 (1-21 человеческого ADM):
YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTC
SEQ ID NO:23 (1-42 человеческого ADM):
YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTCTVQKLAHQIYQFTDKDKDNVA
SEQ ID NO:24 (aa 43-52 человеческого ADM)
PRSKISPQGY-NH2
SEQ ID NO:25 (aa 1-14 человеческого ADM)
YRQSMNNFQGLRSF
SEQ ID NO:26 (aa 1-10 человеческого ADM)
YRQSMNNFQG
SEQ ID NO:27 (aa 1-6 человеческого ADM)
YRQSMN
SEQ ID NO:28 (aa 1-32 человеческого ADM)
YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTCTVQKLAHQIYQ
SEQ ID NO:29 (aa 1-40 мышиного ADM)
YRQSMNQGSRSNGCRFGTCTFQKLAHQIYQLTDKDKDGMA
SEQ ID NO:30 (aa 1-31 мышиного ADM)
YRQSMNQGSRSNGCRFGTCTFQKLAHQIYQL
SEQ ID NO:31 (проADM): 164 аминокислоты (22-185 пре-проADM))
ARLDVASEF RKKWNKWALS RGKRELRMSS SYPTGLADVK AGPAQTLIRP QDMKGASRSP EDSSPDAARI RVKRYRQSMN NFQGLRSFGC RFGTCTVQKL AHQIYQFTDK DKDNVAPRSK ISPQGYGRRR RRSLPEAGPG RTLVSSKPQA HGAPAPPSGS APHFL
SEQ ID NO:32 (N-20 терминальный пептид проадреномедуллина, PAMP): аминокислоты 22-41 пре-проADM)
ARLDVASEF RKKWNKWALS R
SEQ ID NO:33 (срединный проадреномедуллин, MR-проADM): аминокислоты 45-92 пре-проADM)
ELRMSS SYPTGLADVK AGPAQTLIRP QDMKGASRSP EDSSPDAARI RV
SEQ ID NO:34 (адреномедуллин 1-52-Gly (ADM 1-52-Gly)): аминокислоты 95-147 пре-проADM)
YRQSMN NFQGLRSFGC RFGTCTVQKL AHQIYQFTDK DKDNVAPRSK ISPQGYG
SEQ ID NO:35 (C-терминальный проадреномедуллин, CT-проADM): аминокислоты 148-185 пре-проADM)
RRR RRSLPEAGPG RTLVSSKPQA HGAPAPPSGS APHFL
ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фиг. 1а: Иллюстрация форматов антител: Fv и scFv варианты.
Фиг. 1b: Иллюстрация форматов антител: гетерологичные слияния и бифункциональные антитела.
Фиг. 1с: Иллюстрация форматов антител: бивалентные антитела и биспецифические антитела.
Фиг. 2:
а: кривая зависимости ответа от дозы человеческого ADM. Максимальная стимуляция цАМФ регулировали до достижения 100% активации.
b: кривая зависимости ингибирования от дозы человеческого ADM 22-52 (антагонист ADM-рецептора) в присутствии 5,63 нМ hADM.
c: кривая зависимости ингибирование от дозы CT-H в присутствии 5,63 нМ hADM.
d: кривая зависимости ингибирование от дозы MR-H в присутствии 5,63 нМ hADM.
е: кривая зависимости ингибирование от дозы NT-H в присутствии 5,63 нМ hADM.
f: кривая зависимости ответа от дозы мышиного ADM. Максимальная стимуляция цАМФ регулировали до достижения 100% активации.
g: кривая зависимости ингибирование от дозы человеческого ADM 22-52 (антагонист ADM-рецептора) в присутствии 0,67 нМ mADM.
h: кривая зависимости ингибирование от дозы CT-M в присутствии 0,67 нМ mADM.
i: кривая зависимости ингибирование от дозы MR-M в присутствии 0,67 нМ mADM.
j: кривая зависимости ингибирование от дозы NT-M в присутствии 0,67 нМ mADM.
2
k: продемонстрировано ингибирование ADM с использованием F(ab) NT-M и Fab NT-M.
2
l: продемонстрировано ингибирование ADM с использованием F(ab) NT-M и Fab NT-M.
На фиг. 3: типичная кривая зависимости сигнала от дозы hADM и кривая зависимости сигнала от дозы hADM в присутствии 100 мкг/мл антитела NT-H.
На фиг. 4 показана стабильность hADM в (цитратной) человеческой плазме в отсутствие и в присутствии антитела NT-H.
Фиг. 5: Сравнительный анализ структуры Fab с гомологичными человеческими каркасными последовательностями.
Фиг. 6: Накопление альбумина в сосудах через 18 ч после введения разных доз CLP и NT-M.
Фиг. 7: Экспрессия VEGF через 18 ч после процедуры CLP и введения NT-M в разных дозах.
Фиг. 8: Экспрессия ангиопоэтина-1 через 18 часов после процедуры CLP и введения NT-M в разных дозах.
Фиг. 9: Изменение концентрации ADM у здоровых людей после введения разных доз NT-H в течение 60 дней.
Фиг. 10: График лечения и взятия образцов крови у свиней в модели "двойного удара".
Фиг. 11: Концентрации ADM в группе, получавшей носитель (квадраты), и группе лечения (точки) (средние значения ± SEM) (p=0,003 для взаимодействия; от t=7 ч до t=19 ч, многофакторный, время * группа).
Фиг.12: Частота сердечных сокращений в группе, получавшей носитель (квадраты), и группе лечения (точки) (средние значения ± SEM), p=0,097 для взаимодействия (от t=7 ч до t=19 ч, многофакторный, время * группа).
Фиг. 13: Сердечный выброс в группе, получавшей носитель (квадраты), и группе лечения (точки) (средние значения ± SEM) (t-тест: p<0,05 для t=9, 10, 11 час).
Фиг. 14: Потребность/введение объема в группе, получавшей носитель (квадраты), и группе лечения (точки) (средние значения ± SEM) (t-тест в точке 17 часов: p=0,034; t-тест в точке 19 часов: p=0,045).
Фиг. 15: Потребность/введение накопленного объема в группе, получавшей носитель (квадраты), и группе лечения (точки) (средние значения ± SEM) (p=0,039 для t-теста в точке 19 часов; p=0,036 для критерия Манна-Уитни в точке 19 часов).
Фиг. 16: Потребность/введение норадреналина в группе, получавшей носитель (квадраты), и группе лечения (точки) (средние значения ± SEM).
Фиг. 17: Потребность в вазопрессоре в группе, получавшей носитель (квадраты), и группе лечения (точки) (критерий хи-квадрат при t=19 ч: p=0,014 для взаимодействия (от t=7 ч до t=19 ч, многофакторный, время * группа: 0,019).
Фиг. 18: Системное сосудистое сопротивление в группе, получавшей носитель (квадраты), и группе лечения (точки) (средние значения ± SEM) (t-тест: 15 ч: р=0,069; 17 ч: р=0,037; 19 ч: р=0,066).
Фиг. 19: Концентрации rADM в ЛПС-индуцированной модели эндотоксемии у крыс.
Фиг 20: Сосудистая проницаемость в модели эндотоксемии у крыс.
--->
СПИСКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  АДРЕНОМЕД АГ
<120>  АНТИТЕЛО ПРОТИВ АДРЕНОМЕДУЛЛИНА (ADM), ИЛИ ФРАГМЕНТ АНТИ-ADM
АНТИТЕЛА, ИЛИ АНТИ-ADM НЕ-IG КАРКАС ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ ПРИ ВМЕШАТЕЛЬСТВЕ
И ТЕРАПИИ ГИПЕРЕМИИ У ПАЦИЕНТА
<130>  A75133WO
<150>  EP16204847.4
<151>  2016-12-16
<150>  EP16206305.1
<151>  2016-12-22
<150>  EP17197176.5
<151>  2017-10-18
<160>  36
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  8
<212>  белок
<213>  человек
<400>  1
Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Tyr Trp
1               5
<210>  2
<211>  8
<212>  белок
<213>  человек
<400>  2
Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr
1               5
<210>  3
<211>  11
<212>  белок
<213>  человек
<400>  3
Thr Glu Gly Tyr Glu Tyr Asp Gly Phe Asp Tyr
1               5                   10
<210>  4
<211>  11
<212>  белок
<213>  человек
<400>  4
Gln Ser Ile Val Tyr Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
1               5                   10
<210>  5
<211>  9
<212>  белок
<213>  человек
<400>  5
Phe Gln Gly Ser His Ile Pro Tyr Thr
1               5
<210>  6
<211>  225
<212>  белок
<213>  человек
<400>  6
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Tyr
20                  25                  30
Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50                  55                  60
Lys Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Thr Glu Gly Tyr Glu Tyr Asp Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115                 120                 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130                 135                 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145                 150                 155                 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165                 170                 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180                 185                 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195                 200                 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys His His His His His
210                 215                 220
His
225
<210>  7
<211>  225
<212>  белок
<213>  человек
<400>  7
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Tyr
20                  25                  30
Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Arg Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Thr Glu Gly Tyr Glu Tyr Asp Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115                 120                 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130                 135                 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145                 150                 155                 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165                 170                 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180                 185                 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195                 200                 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys His His His His His
210                 215                 220
His
225
<210>  8
<211>  225
<212>  белок
<213>  человек
<400>  8
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Tyr
20                  25                  30
Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Arg Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Thr Glu Gly Tyr Glu Tyr Asp Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115                 120                 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130                 135                 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145                 150                 155                 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165                 170                 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180                 185                 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195                 200                 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys His His His His His
210                 215                 220
His
225
<210>  9
<211>  225
<212>  белок
<213>  человек
<400>  9
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Tyr
20                  25                  30
Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Thr Glu Gly Tyr Glu Tyr Asp Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115                 120                 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130                 135                 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145                 150                 155                 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165                 170                 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180                 185                 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195                 200                 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys His His His His His
210                 215                 220
His
225
<210>  10
<211>  225
<212>  белок
<213>  человек
<400>  10
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Tyr
20                  25                  30
Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Thr Glu Gly Tyr Glu Tyr Asp Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115                 120                 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130                 135                 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145                 150                 155                 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165                 170                 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180                 185                 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195                 200                 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys His His His His His
210                 215                 220
His
225
<210>  11
<211>  219
<212>  белок
<213>  человек
<400>  11
Asp Val Leu Leu Ser Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Asp Gln Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Tyr Ser
20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85                  90                  95
Ser His Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115                 120                 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130                 135                 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145                 150                 155                 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165                 170                 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180                 185                 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195                 200                 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210                 215
<210>  12
<211>  219
<212>  белок
<213>  человек
<400>  12
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1               5                   10                  15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Tyr Ser
20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85                  90                  95
Ser His Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115                 120                 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130                 135                 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145                 150                 155                 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165                 170                 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180                 185                 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195                 200                 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210                 215
<210>  13
<211>  219
<212>  белок
<213>  человек
<400>  13
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1               5                   10                  15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Tyr Ser
20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85                  90                  95
Ser His Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115                 120                 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130                 135                 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145                 150                 155                 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165                 170                 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180                 185                 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195                 200                 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210                 215
<210>  14
<211>  21
<212>  белок
<213>  человек
<400>  14
Tyr Arg Gln Ser Met Asn Asn Phe Gln Gly Leu Arg Ser Phe Gly Cys
1               5                   10                  15
Arg Phe Gly Thr Cys
20
<210>  15
<211>  12
<212>  белок
<213>  человек
<400>  15
Cys Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln
1               5                   10
<210>  16
<211>  12
<212>  белок
<213>  человек
<400>  16
Cys Ala Pro Arg Ser Lys Ile Ser Pro Gln Gly Tyr
1               5                   10
<210>  17
<211>  19
<212>  белок
<213>  мышиный
<400>  17
Tyr Arg Gln Ser Met Asn Gln Gly Ser Arg Ser Asn Gly Cys Arg Phe
1               5                   10                  15
Gly Thr Cys
<210>  18
<211>  12
<212>  белок
<213>  мышиный
<400>  18
Cys Thr Phe Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln
1               5                   10
<210>  19
<211>  12
<212>  белок
<213>  мышиный
<400>  19
Cys Ala Pro Arg Asn Lys Ile Ser Pro Gln Gly Tyr
1               5                   10
<210>  20
<211>  52
<212>  белок
<213>  человек
<400>  20
Tyr Arg Gln Ser Met Asn Asn Phe Gln Gly Leu Arg Ser Phe Gly Cys
1               5                   10                  15
Arg Phe Gly Thr Cys Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln
20                  25                  30
Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp Asn Val Ala Pro Arg Ser Lys Ile Ser
35                  40                  45
Pro Gln Gly Tyr
50
<210>  21
<211>  50
<212>  белок
<213>  мышиный
<400>  21
Tyr Arg Gln Ser Met Asn Gln Gly Ser Arg Ser Asn Gly Cys Arg Phe
1               5                   10                  15
Gly Thr Cys Thr Phe Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln Leu Thr
20                  25                  30
Asp Lys Asp Lys Asp Gly Met Ala Pro Arg Asn Lys Ile Ser Pro Gln
35                  40                  45
Gly Tyr
50
<210>  22
<211>  21
<212>  белок
<213>  человек
<400>  22
Tyr Arg Gln Ser Met Asn Asn Phe Gln Gly Leu Arg Ser Phe Gly Cys
1               5                   10                  15
Arg Phe Gly Thr Cys
20
<210>  23
<211>  42
<212>  белок
<213>  человек
<400>  23
Tyr Arg Gln Ser Met Asn Asn Phe Gln Gly Leu Arg Ser Phe Gly Cys
1               5                   10                  15
Arg Phe Gly Thr Cys Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln
20                  25                  30
Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp Asn Val Ala
35                  40
<210>  24
<211>  10
<212>  белок
<213>  человек
<400>  24
Pro Arg Ser Lys Ile Ser Pro Gln Gly Tyr
1               5                   10
<210>  25
<211>  14
<212>  белок
<213>  человек
<400>  25
Tyr Arg Gln Ser Met Asn Asn Phe Gln Gly Leu Arg Ser Phe
1               5                   10
<210>  26
<211>  10
<212>  белок
<213>  человек
<400>  26
Tyr Arg Gln Ser Met Asn Asn Phe Gln Gly
1               5                   10
<210>  27
<211>  6
<212>  белок
<213>  человек
<400>  27
Tyr Arg Gln Ser Met Asn
1               5
<210>  28
<211>  32
<212>  белок
<213>  человек
<400>  28
Tyr Arg Gln Ser Met Asn Asn Phe Gln Gly Leu Arg Ser Phe Gly Cys
1               5                   10                  15
Arg Phe Gly Thr Cys Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln
20                  25                  30
<210>  29
<211>  40
<212>  белок
<213>  мышиный
<400>  29
Tyr Arg Gln Ser Met Asn Gln Gly Ser Arg Ser Asn Gly Cys Arg Phe
1               5                   10                  15
Gly Thr Cys Thr Phe Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln Leu Thr
20                  25                  30
Asp Lys Asp Lys Asp Gly Met Ala
35                  40
<210>  30
<211>  31
<212>  белок
<213>  мышиный
<400>  30
Tyr Arg Gln Ser Met Asn Gln Gly Ser Arg Ser Asn Gly Cys Arg Phe
1               5                   10                  15
Gly Thr Cys Thr Phe Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln Leu
20                  25                  30
<210>  31
<211>  164
<212>  белок
<213>  человек
<400>  31
Ala Arg Leu Asp Val Ala Ser Glu Phe Arg Lys Lys Trp Asn Lys Trp
1               5                   10                  15
Ala Leu Ser Arg Gly Lys Arg Glu Leu Arg Met Ser Ser Ser Tyr Pro
20                  25                  30
Thr Gly Leu Ala Asp Val Lys Ala Gly Pro Ala Gln Thr Leu Ile Arg
35                  40                  45
Pro Gln Asp Met Lys Gly Ala Ser Arg Ser Pro Glu Asp Ser Ser Pro
50                  55                  60
Asp Ala Ala Arg Ile Arg Val Lys Arg Tyr Arg Gln Ser Met Asn Asn
65                  70                  75                  80
Phe Gln Gly Leu Arg Ser Phe Gly Cys Arg Phe Gly Thr Cys Thr Val
85                  90                  95
Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp
100                 105                 110
Asn Val Ala Pro Arg Ser Lys Ile Ser Pro Gln Gly Tyr Gly Arg Arg
115                 120                 125
Arg Arg Arg Ser Leu Pro Glu Ala Gly Pro Gly Arg Thr Leu Val Ser
130                 135                 140
Ser Lys Pro Gln Ala His Gly Ala Pro Ala Pro Pro Ser Gly Ser Ala
145                 150                 155                 160
Pro His Phe Leu
<210>  32
<211>  20
<212>  белок
<213>  человек
<400>  32
Ala Arg Leu Asp Val Ala Ser Glu Phe Arg Lys Lys Trp Asn Lys Trp
1               5                   10                  15
Ala Leu Ser Arg
20
<210>  33
<211>  48
<212>  белок
<213>  человек
<400>  33
Glu Leu Arg Met Ser Ser Ser Tyr Pro Thr Gly Leu Ala Asp Val Lys
1               5                   10                  15
Ala Gly Pro Ala Gln Thr Leu Ile Arg Pro Gln Asp Met Lys Gly Ala
20                  25                  30
Ser Arg Ser Pro Glu Asp Ser Ser Pro Asp Ala Ala Arg Ile Arg Val
35                  40                  45
<210>  34
<211>  53
<212>  белок
<213>  человек
<400>  34
Tyr Arg Gln Ser Met Asn Asn Phe Gln Gly Leu Arg Ser Phe Gly Cys
1               5                   10                  15
Arg Phe Gly Thr Cys Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln
20                  25                  30
Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp Asn Val Ala Pro Arg Ser Lys Ile Ser
35                  40                  45
Pro Gln Gly Tyr Gly
50
<210>  35
<211>  76
<212>  белок
<213>  человек
<400>  35
Arg Arg Arg Arg Arg Ser Leu Pro Glu Ala Gly Pro Gly Arg Thr Leu
1               5                   10                  15
Val Ser Ser Lys Pro Gln Ala His Gly Ala Pro Ala Pro Pro Ser Gly
20                  25                  30
Ser Ala Pro His Phe Leu Arg Arg Arg Arg Arg Ser Leu Pro Glu Ala
35                  40                  45
Gly Pro Gly Arg Thr Leu Val Ser Ser Lys Pro Gln Ala His Gly Ala
50                  55                  60
Pro Ala Pro Pro Ser Gly Ser Ala Pro His Phe Leu
65                  70                  75
<210>  36
<211>  118
<212>  белок
<213>  человек
<400>  36
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<---