Способ нормализации пищеварения у животных путем введения парентерально панкреатических ферментов
METHOD FOR NORMALIZING DIGESTION IN ANIMALS BY ADMINISTERING PARENTERAL PANCREATIC ENZYMES

Изобретение относится к сельскому хозяйству, а именно ветеринарии и может быть использовано для профилактики заболеваний и лечения болезней пищеварения у животных.
Известно, что панкреатические ферменты, в том числе трипсин, который вырабатывается поджелудочной железой, находятся в крови животных и человека (Ротман, 2002, Коротько, 2013, Вертипрахов, 2016). Известно, что кристаллический трипсин (https://medi.ru/) - ферментный препарат протеолитического действия, получаемый из поджелудочной железы крупного рогатого скота, обладает выраженными противовоспалительными и противоотечными свойствами, способен расщеплять омертвевшие участки тканей, фибринозные образования, вязкие секреты и экссудаты. По отношению к здоровым тканям фермент неактивен и безопасен в связи с наличием в них ингибиторов трипсина (специфических и неспецифических). Не влияет на систему гемостаза. Показаниями для применения фармакопейного трипсина являются: бронхоэктатическая болезнь, абсцессы легких, экссудативный плеврит, послеоперационные ателектазы, эмпиема плевры; лечение гнойных ран и ожогов; хронические гнойные отиты, гнойные синуситы, гаймориты; острые тромбофлебиты; острые и хронические одонтогенные остеомиелиты; воспалительно-дистрофические формы пародонтоза; острые ириды и иридоциклиты, кровоизлияния в камере глаза и отеки окологлазничных тканей после травм и операций, непроходимость слезоотводящих путей. Таким образом, препарат трипсин не содержит в наставлении показаний о применении с целью лечения и профилактики болезней пищеварения.
Ранее существовала гипотеза о том, что трипсин оказывает регуляторное действие на функцию поджелудочной железы по принципу обратной связи: чем больше его активность в крови, тем ниже секреторная деятельность поджелудочной железы по выделению данного фермента с панкреатическим соком (Laporte, J.C., Tremolieres J., 1971). Мы дополнили данную гипотезу положением о том, что это бывает не всегда, а в постпрандиалную фазу пищеварения, когда активность протеаз (трипсина) может нарастать параллельно в кишечнике и крови (Фисинин В.И., Вертипрахов В.Г, Титов В.Ю., Грозина А.А., 2018). Следовательно, в процессе исследований установлена корреляция между трипсином в крови и дуоденальным содержимым. Это послужило основанием для изучения влияния панкреатических ферментов, введенных парентерально в организм птицы в виде разбавленного панкреатического сока, на метаболизм и активность дуоденальных пищеварительных ферментов и применением панкреатических ферментов с целью нормализации функции пищеварения у животных.
Используя в своих экспериментах панкреатический сок кур, мы применяем не один фермент трипсин, а комплексный препарат, в который входят основные ферменты поджелудочной железы: амилаза, липаза и общие протеазы. Аналогом может служить ткань поджелудочной железы животных, поскольку содержит все эти ферменты подобно панкреатическому соку (Вертипрахов В.Г., 2004).
Технический результат - использование трипсина или его аналогов с новым показанием - для нормализации процессов пищеварения в кишечнике.
Задачей изобретения является расширение диапазона применения препарата по сравнению с показаниями, прописанными для кристаллического трипсина.
Поставленная задача решается способом парентерального введения панкреатических ферментов животным для нормализации пищеварения, включающим раствор трипсина, приготовленный из кристаллического трипсина, разбавленного физиологическим раствором в соотношении 1:500 и введенный внутримышечно в дозе 1,0 мл.
Поскольку трипсин кристаллический готовится из поджелудочных желез крупного рогатого скота, то в экспериментах на птице решили использовать ферментный препарат для инъекций, полученный от кур. Таким препаратом может быть панкреатический сок, полученный от сложно оперированной птицы в хроническом эксперименте. Стерильный панкреатический сок в количестве 0,1-0,2 мл мы разбавляем стерильным физиологическим раствором 1:10 или 1:20 и вводим курам внутримышечно или внутривенно с целью изучения его влияния на организм животного.
Примеры конкретного выполнения
Исследования проводили на курах-несушках кросса Хайсекс белый 6-7-месячного возраста в количестве 10 голов в соответствие с требованиями Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (ETS №123, Страсбург, 1986). Куры содержались в виварии ВНИТИП с соблюдением оптимальных условий содержания: температура в помещении составляла 18-20°С, продолжительность освещения 14 часов в сутки, влажность в помещении и рацион питания соответствовали рекомендациям ВНИТИП (2014). В ходе исследований от кур, прооперированных по методу Ц,Ж. Батоева, С.Ц. Батоевой (1970), получали чистый панкреатический сок, который использовали для инъекций. От других кур получали во время опыта дуоденальный химус через вживленную заблаговременно канюлю в 12-перстную кишку (Фисинин В.И., Вертипрахов В.Г. и др., 2017). В проведенных опытах выявлены доказательства регуляторного воздействия панкреатических ферментов, введенных парентерально курам на процессы пищеварения и обмен веществ.
Опыт 1. Изучение влияния трипсина на активность пищеварительных ферментов в дуоденальном химусе и крови у кур.
Трипсин кристаллический разводили стерильным физиологическим раствором 1:500 (на 10 мг 5,0 мл), после разведения хранили в холодильнике +4°С. Инъекции выполняли курам внутривенно по 2,0 мл, разбавляя раствор трипсина до активности 70 ед/л, что соответствует активности фермента в крови. При внутримышечной инъекции вводили по 1,0 мл раствора трипсина.
Биохимические методы. Дуоденальный химус, полученный через 20 минут после приема корма от фистулированных кур, в количестве 3-5 мл центрифугировали при 3000 об/мин в течение 3 минут. Надосадочную жидкость разводили раствором Рингера (рН 7,2) в соотношении 1:10 и выполняли определение активности пищеварительных ферментов. Активность амилазы устанавливали по гидролизу крахмала (Батоев, 2001) с использованием КФК-3 («Загорский оптико-механический завод», Россия) при длине волны 670 нм и выражали в миллиграммах расщепленного крахмала на 1 мл химуса в течение 1 мин. Липолитическую активность измеряли на полуавтоматическом биохимическом анализаторе BS-3000P с проточной кюветой («Sinnowa Medical Science & Technology Co., Ltd», Китай) с использованием набора реактивов для липазы (ООО «ДИАКОН-BET», Россия). Активность протеаз определяли по расщеплению казеина по Гаммерстену («EMD Millipore Corp., Billerica»,CIIIA) с колориметрическим контролем на КФК-3 при длине волны 450 нм (Батоев, 2001).
Кровь брали из подкрыльцовой вены, в количестве 2-3 мл. В качестве антикоагулянта использовался 3,8% раствор цитрата натрия в объемном соотношении с пробой крови 1:10. Пробу центрифугировали при 5000 об/мин в течение 5 минут для отделения плазмы от форменных элементов.
Активность трипсина в плазме крови изучали, используя в качестве субстрата нитроанилид бензоил DL-аргинина (BAPNA), на полуавтоматическом биохимическом анализаторе BS3000P (КНР) кинетическим методом (Вертипрахов, Грозина, 2018). Активность амилазы и липазы в плазме крови выполняли на биохимическом автоматическом анализаторе Chem well 2900 (Т) (США) с использованием соответствующих наборов реагентов Human (Германия).
Статистические методы. Для статистической обработки результатов использовали программное обеспечение JMP Trial 14.1.0, с помощью которого выполняли расчет среднего значения (М) и стандартные ошибки среднего (±SEM), определяли достоверность различий по t-критерию Стьюдента. Различия считали статистически значимыми при p<0,05.
Результаты исследования показывают, что существенные изменения происходят в активности протеаз дуоденального химуса (табл. 1).
*p≤0,05
При внутривенном введении раствора трипсина курам отмечается снижение активности протеаз в дуоденальном химусе на 25,7% (p≤0,05) по сравнению с контрольным периодом, что подтверждает регуляторное действие протеолитического фермента в крови на экзокринную функцию поджелудочной железы, поскольку панкреатические ферменты составляют основную часть дуоденальных пищеварительных ферментов.
Опыт 2. Определения активности протеаз дуоденального химуса при внутривенном введении трипсина курам
Опыт выполняли аналогично опыту 1 (табл. 2)
Результаты выполненных исследований показывают, что у кур имеются индивидуальные особенности в активности пищеварительных ферментов. В большинстве случаев активность ферментов после внутривенной инъекции раствора трипсина увеличивается за исключением протеаз, которые, наоборот, под действием трипсина крови снижаются. Так, у курицы №14 активность дуоденальных протеаз снизилась на 40,8%, у курицы №13 - на 40,0%, у курицы №15 - в 10,6 раза. Повышение протеолитической активности наблюдается у курицы №12 на 42,3% по сравнению с контрольным периодом. Таким образом, повышение активности трипсина в крови действует по принципу обратной связи и регулирует активность протеаз в дуоденальном содержимом кур. Подобным эффектом обладает и разбавленный панкреатический сок, введенный парентерально курам.
Опыт 3. Активность ферментов в дуоденальном химусе на фоне инъекции разбавленного куриного панкреатического сока (ПС)
Результаты представлены в таблицах 3 и 4.
Примечание: * - различия достоверны с состоянием до введения препарата, p<0,05
Данные таблицы 3 показывают, что инъекция курам-несушкам разбавленного панкреатического сока оказывает существенное влияние на активность дуоденальных протеолитических ферментов. Спустя 30 минут после внутривенного введения раствора активность протеаз в химусе снижается в 2 раза, при этом активность амилазы и липазы существенно не изменяется. Это свидетельствует об аналогичном характере действия панкреатического сока и раствора трипсина (опыт 2) на активность протеаз в кишечнике.
Для того, чтобы исключить зависимость активности трипсина от вводимой внутривенно дозы ферментов и доказать регулирующее действие ферментов панкреатического сока на функциональное состояние организма мы выполнили эксперимент в котором инъекцию выполняли внутримышечно. Данные опыта представлены в таблице 4.
Примечание - * различия достоверны по сравнению с контролем, p≤0,05
Из данной таблицы 3 видно, что после приема корма в контроле в дуоденальном химусе активность амилазы за 30 минут постпрандиальной фазы возрастает в 1,3 раза, активность липазы - в 2,6 раз, активность протеаз - в 2,1 раза.
Инъекция разбавленного панкреатического сока оказывает существенное влияние на активность протеолитических ферментов в дуоденальном химусе в течение 30 минут, снижая показатель на 38,5% по сравнению с контролем. Активность амилазы в опытной группе увеличивается на 13,3% по сравнению с контролем. Таким образом, внутримышечная инъекция разбавленного панкреатического сока оказывает регулирующее влияние на активность дуоденальных протеаз и амилазы в постпрандиальную фазу пищеварения.
Опыт 4. Изучение влияния тканевого препарата из поджелудочных желез свиней на метаболизм и продуктивность животных.
Для проведения научно-хозяйственного опыта было сформировано 2 группы поросят - отъемышей (по 20 голов в каждой): первая группа была контрольной, поросятам второй группы вводили подкожно из расчета 0,1 мл/кг массы 1 раз в неделю тканевый препарат из поджелудочной железы. В течение опыта еженедельно учитывали прирост массы поросят и потребление кормов. По окончании опыта выполняли общий анализ крови общепринятыми методами.
В первом периоде научно-хозяйственного опыта поросята содержались на рационе, который имел в своем составе зерновые культуры (пшеницу, овес, отруби пшеничные, витаминно-минеральный премикс и добавки лимитирующих аминокислот: лизина и метионина). Содержание сырого протеина не превышало 12,4%. Результаты представлены в табл. 5.
Из данной таблицы видно, что среднесуточный прирост массы поросят 1 опытной группы выше на 6,7%, чем в контроле, а затраты корма на единицу продукции ниже на 4,0% по сравнению с контрольной группой. Следовательно, результаты опыта указывают на то, что разница между показателями средней живой массы поросят контрольной и опытной группы не является достоверной, однако наглядно просматривается тенденция повышения продуктивности поросят, которым еженедельно ставили подкожно препарат, приготовленный из ткани поджелудочной железы.
Результаты исследований крови представлены в таблице 6.
Данные таблицы показывают, что количество лейкоцитов увеличивается в крови поросят опытной группы на 10,4%, эритроцитов - на 8,5% (p<0,05), тромбоцитов - на 15,6% (p<0,05), гемоглобина - на 3,7%. Таким образом, введенный парентерально препарат из поджелудочной железы способствует повышению продуктивности и гематологических показателей крови поросят.
Работа выполнена при финансовой поддержке подпрограммы «Изучение механизмов адаптации системы пищеварения млекопитающих животных и птицы к рационам с различным ингредиентным составом кормов» (рук. академик РАН Фисинин В.И.) программы «Инновационные технологии в решении проблем развития агропромышленного комплекса России» (протокол заседания комиссии по конкурсному отбору крупных проектов по проведению фундаментальных научных исследований по приоритетным направлениям, определяемым президиумом Российской академии наук от 26 июня 2019 года)