СПОСОБЫ УСИЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ РЕКОМБИНАНТНОГО АДЕНОАССОЦИИРОВАННОГО ВУРУСА, ПРОДУЦИРУЕМОГО БАКУЛОВИРУСНОЙ СИСТЕМОЙ

1. Нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую модифицированную последовательность Козак и капсидные белки VP1, VP2 и VP3 аденоассоциированного вируса (AAV), причем модифицированная последовательность Козак выбрана из SEQ ID NO: 2-11.
2. Нуклеиновая кислота по п. 1, в которой модифицированная последовательность Козак представляет собой SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 9.
3. Нуклеиновая кислота по п. 1, в которой капсидные белки VP1, VP2 и VP3 происходят из серотипа AAV5.
4. Нуклеиновая кислот по п. 1 или 2, дополнительно содержащая промоторную последовательность.
5. Нуклеиновая кислота по п. 4, в которой промоторная последовательность представляет собой промоторную последовательность полиэдрина (polh).
6. Нуклеиновая последовательность по любому из пп. 1-5, в которой модифицированная последовательность Козак содержит ко дон инициации трансляции капсидного белка VP1.
7. Нуклеиновая кислота по п. 6, в которой кодон инициации трансляции капсидного белка VP1 представляет собой AUG.
8. Нуклеиновая кислота по любому из пп. 1-7, в которой нуклеиновая кислота упакована в вирусную частицу, необязательно бакуловирусную частицу.
9. Клетка насекомого, содержащая нуклеиновую кислоту по любому из пп. 1-8.
10. Клетка насекомого по п. 9, в которой нуклеиновая кислота интегрирована в геном клетки насекомого.
11. Способ продукции рекомбинантного AAV (rAAV) в клетке насекомого, в котором rAAV происходит из серотипа AAV5, причем способ включает:
a) трансфекцию клетки насекомого в
i) бакуловирусе, содержащем нуклеиновую кислоту по п. 1;
ii) бакуловирусе, содержащем нуклеиновую кислоту, кодирующую белок Rep AAV;
iii) бакуловирусе, содержащем нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидные последовательности двух инвертированных концевых повторов (ITR) AAV, фланкирующие ген, представляющий интерес, функционально связанный с промоторной последовательностью;
b) культивирование клетки насекомого в условиях, подходящих для продукции rAAV; и
c) извлечение rAAV из клетки насекомого.
12. Способ продукции рекомбинантного AAV (rAAV) в клетке насекомого, в котором rAAV происходит из серотипа AAV5, причем способ включает:
a) трансфекцию клетки насекомого по п. 9 или 10 нуклеиновой кислотой, необязательно в бакуловирусе, содержащую нуклеотидные последовательности двух инвертированных концевых повторов (ITR) AAV, фланкирующие ген, представляющий интерес, функционально связанный с промоторной последовательностью;
b) культивирование клетки насекомого в условиях, подходящих для продукции rAAV; и
c) извлечение rAAV из клетки насекомого.
13. Способ по п. 11 или 12, в котором клетка насекомого представляет собой клетку Sf9.
14. Нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую модифицированную последовательность Козак и капсидные белки VP1, VP2 и VP3 аденоассоциированного вируса (AAV), в которой модифицированная последовательность Козак выбрана из SEQ ID NO: 13-32.
15. Нуклеиновая кислота по п. 14, в которой модифицированная последовательность Козак представляет собой SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 или SEQ ID NO: 32.
16. Нуклеиновая кислота по п. 14, в которой капсидные белки VP1, VP2 и VP3 происходят из серотипа AAV8.
17. Нуклеиновая кислот по п. 14 или 16, дополнительно содержащая промоторную последовательность.
18. Нуклеиновая кислота по п. 17, в которой промоторная последовательность представляет собой промоторную последовательность полиэдрина (polh).
19. Нуклеиновая последовательность по любому из пп. 14-18, в которой модифицированная последовательность Козак содержит кодон индициации трансляции капсидного белка VP 1.
20. Нуклеиновая кислота по п. 19, в которой кодон инициации трансляции капсидного белка VP1 представляет собой AUG.
21. Нуклеиновая кислота по любому из пп. 14-20, в которой нуклеиновая кислота упакована в вирусную частицу, необязательно бакуловирусную частицу.
22. Клетка насекомого, содержащая нуклеиновую кислоту по любому из пп. 14-21.
23. Клетка насекомого по п. 22, в которой нуклеиновая кислота интегрирована в геном клетки насекомого.
24. Способ продукции рекомбинантного AAV (rAAV) в клетке насекомого, в котором rAAV происходит из серотипа AAV8, причем способ включает:
a) трансфекцию клетки насекомого в
i) бакуловирусе, содержащем нуклеиновую кислоту по п. 14;
ii) бакуловирусе, содержащем нуклеиновую кислоту, кодирующую белок Rep AAV;
iii) бакуловирусе, содержащем нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидные последовательности двух инвертированных концевых повторов (ITR) AAV, фланкирующие ген, представляющий интерес, функционально связанный с промоторной последовательностью;
b) культивирование клетки насекомого в условиях, подходящих для продукции rAAV; и
c) извлечение rAAV из клетки насекомого.
25. Способ продукции рекомбинантного AAV (rAAV) в клетке насекомого, в котором rAAV происходит из серотипа AAV8, при этом способ включает:
a) трансфекцию клетки насекомого по п. 22 или 23 нуклеиновой кислотой, необязательно в бакуловирусе, содержащую нуклеотидные последовательности двух инвертированных концевых повторов (ITR) AAV, фланкирующие ген, представляющий интерес, функционально связанный с промоторной последовательностью;
b) культивирование клетки насекомого в условиях, подходящих для продукции rAAV; и
c) извлечение rAAV из клетки насекомого.
26. Способ по п. 24 или 25, в котором клетка насекомого представляет собой клетку Sf9.
27. Нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую модифицированную последовательность Козак и капсидные белки VP1, VP2 и VP3 аденоассоциированного вируса (AAV), в которой модифицированная последовательность Козак выбрана из SEQ ID NO: 34-45.
28. Нуклеиновая кислота по п. 27, в которой модифицированная последовательность Козак представляет собой SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 или SEQ ID NO: 42.
29. Нуклеиновая кислота по п. 27, в которой капсидные белки VP1, VP2 и VP3 происходят из серотипа AAV9.
30. Нуклеиновая кислот по п. 27 или 29, дополнительно содержащая промоторную последовательность.
31. Нуклеиновая кислота по п. 30, в которой промоторная последовательность представляет собой промоторную последовательность полиэдрина (polh).
32. Нуклеиновая последовательность по любому из пп. 27-31, в которой модифицированная последовательность Козак содержит кодон инициации трансляции капсидного белка VP1.
33. Нуклеиновая кислота по п. 32, в которой кодон инициации трансляции капсидного белка VP1 представляет собой AUG.
34. Нуклеиновая кислота по любому из пп. 27-33, в которой нуклеиновая кислота упакована в вирусную частицу, необязательно бакуловирусную частицу.
35. Клетка насекомого, содержащая нуклеиновую кислоту по любому из пп. 27-34.
36. Клетка насекомого по п. 35, в которой нуклеиновая кислота интегрирована в геном клетки насекомого.
37. Способ продукции рекомбинантного AAV (rAAV) в клетке насекомого, в котором rAAV происходит из серотипа AAV9, причем способ включает:
a) трансфекцию клетки насекомого в
i) бакуловирусе, содержащем нуклеиновую кислоту по п. 27;
ii) бакуловирусе, содержащем нуклеиновую кислоту, кодирующую белок Rep AAV;
iii) бакуловирусе, содержащем нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидные последовательности двух инвертированных концевых повторов (ITR) AAV, фланкирующие ген, представляющий интерес, функционально связанный с промоторной последовательностью;
b) культивирование клетки насекомого в условиях, подходящих для продукции rAAV; и
c) извлечение rAAV из клетки насекомого.
38. Способ продукции рекомбинантного AAV (rAAV) в клетке насекомого, в котором rAAV происходит из серотипа AAV9, причем способ включает:
a) трансфекцию клетки насекомого по п. 35 или 36 нуклеиновой кислотой, необязательно в бакуловирусе, содержащую нуклеотидные последовательности двух инвертированных концевых повторов (ITR) AAV, фланкирующие ген, представляющий интерес, функционально связанный с промоторной последовательностью;
b) культивирование клетки насекомого в условиях, подходящих для продукции rAAV; и
c) извлечение rAAV из клетки насекомого.
39. Способ по п. 37 или 38, в котором клетка насекомого представляет собой клетку Sf9.
40. Нуклеиновая кислота по п. 1, в которой модифицированная последовательность Козак представляет собой последовательность, представленную в SEQ ID NO: 9.
41. Нуклеиновая кислота по п. 27, в которой модифицированная последовательность Козак представляет собой последовательность, представленную в SEQ ID NO: 42
42. Способ идентификации последовательности инициации трансляции VP1 для продукции частиц rAAV в клетке-хозяине, причем способ включает
введение каждого из множества генов различных рекомбинантных генов капсида в клетки-продуценты, при этом каждый ген отличающегося рекомбинантного капсидного гена имеет отличающуюся последовательность Козак, окружающую кодон инициации трансляции VP1,
выделение частиц rAAV из клеток-продуцентов, в которых частицы rAAV содержат капсидные белки, продуцируемые на основе рекомбинантных генов капсида, и
оценку частиц rAAV, продуцируемых на основе генов различных рекомбинантных генов капсида.
43. Способ по п. 42, в котором клетка-продуцент представляет собой клетку насекомого или клетку млекопитающего.
44. Способ по п. 42, в котором кодон инициации трансляции VP1 представляет собой кодон ATG/AUG.
45. Способ по п. 42, в котором частицы rAAV оценивают на основе определения их относительного содержания VP1/VP2/VP3, их продуктивности, содержания в них ДНК, их инфицирующей способности или комбинации из них двух или более.