СПОСОБ ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗНОЙ ИНФЕКЦИИ
EXPRESS DIAGNOSTIC TECHNIQUE FOR TUBERCULOUS INFECTION

Изобретение относится к области медицины, а именно к фтизиатрии, и может быть использовано для ускоренной диагностики туберкулезной инфекции.
В настоящее время треть населения Земли инфицирована микобактериями туберкулеза (МБТ) [Neurenberger E., Bishal W.R., Grosse J.H. Latent tuberculosis infection Seminars in Resp. and Critic. - Care Med. - 2004. - Vol.25, N 3. - P.317-336]. В России инфицированность детского населения до 12 лет МБТ составляет 40-60%, а к 30 годам достигает 70-100% [Н.К.Борисова «Современные взгляды на туберкулез органов дыхания у детей и подростков» // Российский педиатрический журнал, - №6, 1998, - с.44-46]. Низкая частота выявления Mycobacterium tuberculosis бактериологическими методами, длительный рост МБТ на питательных средах (до 30 дней) и сложность клинико-лабораторной диагностики туберкулеза создает необходимость для разработки экспресс-способа диагностики туберкулезной инфекции.
Результат постановки внутрикожной аллергической пробы Манту учитывают через 72 часа, но в связи с высоким процентом инфицированности населения МБТ частота подтверждения диагноза заболевания в разных возрастных группах составляет 25-50% [Бородулина Е.А., Бородулин Б.Е. Дифференциальная диагностика поствакцинальной и инфекционной туберкулиновой аллергии у детей с атопическими заболеваниями. // Проблемы туберкулеза и болезней легких, - №1, 2006, - с.9-12]. На результаты пробы Манту оказывают влияние вакцинация, неконтролируемый прием антибиотиков широкого спектра действия и наличие сопутствующей патологии, в том числе аллергопатологии [Аксенова В.А., Овсянкина Е.С., Александрова Т.М. Методы контроля качества работы при массовой туберкулинодиагностике. // Проблемы туберкулеза. - 2002, №2. - С.3-5].
Существенными недостатками бактериологического метода диагностики туберкулеза является его трудоемкость и длительность проведения лабораторных исследований. Окончательный результат исследований можно получить только через 5-6 недель. Известен ускоренный способ бактериологической диагностики туберкулеза по методу Прайса, позволяющий выделить и идентифицировать МБТ через 7-14 дней. [Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. / Под ред. А.А.Воробьева. М.: Медицинское информационное агенство, 2004. - 671 с.].
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) используется для определения наличия МБТ в организме больного. К сожалению, из-за высокой инфицированности населения МБТ, невозможно достоверно дифференцировать состояние активного инфекционного процесса от наличия МБТ в организме здорового человека [Валиев Р.Ш. с соавт. Полимеразная цепная реакция в диагностике туберкулеза. // Проблемы туберкулеза и болезней органов дыхания, 2005, №3. - С.25-27].
Широко используется для диагностики туберкулеза метод иммуноферментного анализа (ИФА), позволяющий определять наличие в организме туберкулезной инфекции по концентрации (титру) иммуноглобулинов классов IgA, IgM, IgG, IgE [Авдеенко В.Г. с соавт. Повышение эффективности иммунодиагностики туберкулеза путем применения моноклональных антител против иммуноглобулина G человека. / Клиническая лабораторная диагностика. - 1999, №6. - С.22-35; Авдеенко В.Г. с соавт. Противотуберкулезные IgE-антитела. Иммунодоминантные антигены. // Проблемы туберкулеза. - 2002, ч.1, №2. - С.30-33]. Недостатком данного способа является необходимость повторного исследования сывороток крови через 10-14 дней для выявления нарастания титра антител к МБТ, свидетельствующее об активном инфекционном процессе в организме.
Наиболее близким по техническому решению и выбранный нами в качестве прототипа является метод рентгендиагностики туберкулезной инфекции. Этот метод позволяет через 3-36 часов получить результаты обследования больного по выявлению некоторых (далеко не всех) клинических форм туберкулеза [Перельман М.И. с соавт. // Фтизиатрия. - М.: Медицина, 2004. - 519 с., с.104-105]. Применение этого метода ограничено из-за облучения пациентов рентгеновскими лучами. В связи с этим скрининговое обследование лучевыми методами проводится с 15-летнего возраста.
Задачей настоящего изобретения является разработка ускоренного способа лабораторной диагностики туберкулезной инфекции, основанного на определении основных иммунологических показателей, отражающих развитие туберкулезной инфекции, и преобразовании иммунологических показателей в виде единой шкалы, позволяющей получать стандартные и сопоставимые иммунологические результаты обследования больного.
+
спонт
Технический результат предлагаемого способа включает определение в сыворотке крови пациента количества моноцитов с рецептором CD14 (Мц), мелкомолекулярных иммунных комплексов (ЦИК 7,5%), функциональной активности нейтрофилов в тесте спонтанного восстановления нитросинего тетразолия (HCT) иммуноглобулинов класса Е (IgE), кортизола (K), умножение полученных иммунологических показателей на коэффициенты, соответствующие активному туберкулезному процессу (первые показатели), и на коэффициенты, соответствующие физиологической норме для данного пациента (вторые показатели), если суммарное значение первых показателей и константы патологического процесса больше суммы вторых показателей и константы физиологической нормы, то ставится диагноз туберкулезной инфекции.
+
спонт
спонт
Технический результат достигается тем, что согласно изобретению в сыворотке крови пациента определяют количество моноцитов с рецептором CDl4 (Мц), мелкомолекулярных иммунных комплексов (ЦИК 7,5%), функциональной активности нейтрофилов в тесте спонтанного восстановления нитросинего тетразолия (НСТ), иммуноглобулинов класса Е (IgE), кортизола (K), умножают полученные иммунологические показатели на коэффициенты, соответствующие активному туберкулезному процессу (первые показатели), и на коэффициенты, соответствующие физиологической норме пациента (вторые показатели), если суммарное значение первых показателей и константы патологического процесса больше суммы вторых показателей и константы физиологической нормы, то ставится диагноз туберкулезной инфекции; коэффициенты показателей Мц, ЦИК 7,5%, НСТ, IgE, K и константа при развитии патологического процесса равны 1,088; -0,65; 0,085, 0,007; 0,009; -54,629, а при физиологической норме пациента 1,033; -0,100; 0,051; 0,004; 0,006; -44,106 соответственно.
Сущность способа достигается тем, что способ экспресс диагностики туберкулезной инфекции основан на преобразовании полученных иммунологических показателей пациента в стандартизированные с использованием коэффициентов и константы, отражающих развитие патологического процесса (первые показатели), и коэффициентов и константы, отражающих физиологическую норму для данного пациента (вторые показатели). При суммарном значении первых показателей больше вторых ставят диагноз туберкулезной инфекции.
По сравнению с прототипом предлагаемый способ осуществляется в лабораторных условиях и не оказывает влияние на здоровье пациента, сокращает время, необходимое для постановки диагноза заболевания, и при использовании персонального компьютера позволяет ускорить получение окончательного результата исследований.
Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.
+
спонт
У пациента берут кровь в объеме 5 мл в 2 пробирки, одна из которых (1) содержит 250 мкл гепарина [разводим 5000 ЕД гепарина (5 мл) в 62,5 мл физиологического раствора]. Обе пробирки центрифугируют при 1500 об/мин в течение 30 мин на градиенте фиколл-верографина, затем удаляют надосадочную жидкость. В пробирке с гепарином (1) рецепторы к липополисахаридам (CD14) на моноцитах (Мц) определяют методом проточной цитофлюориметрии на аппарате «FACScan» фирмы "Becton Dicenson» при добавлении моноклональных антител, меченных FITS. Содержимое второй (2) пробирки делят на 2 части. В содержимом одной части определяют восстановление нитросинего тетразолия (НСТ) в спонтанном тесте без добавления пирогенала (3). Пробу инкубируют при температуре 37°С в течение 30-40 мин, центрифугируют при 1500 об/мин в течение 30 мин, прореагировавшие клетки наносят на предметное стекло и подсчитывают количество клеток, используя световой микроскоп с увеличением в 630 раз. Из другой части (4) цельной крови получают сыворотку и определяют количество циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК 7,5%) с добавлением полиэтиленгликоля (ПЭГ) 7,5% концентрации (5) и учитывают результат с помощью спектрофотометра. Оставшуюся часть сыворотки вносят в планшеты с реактивами для определения концентрации IgE (6) и кортизола (7) в реакции иммуноферментного анализа (ИФА). Планшеты инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 30 мин, затем учитывают результаты на спектрофотометре (см. чертеж). Затем умножаем полученные иммунологические показатели на коэффициенты, соответствующие активному туберкулезному процессу (первые показатели) и на коэффициенты, соответствующие физиологической норме пациента (вторые показатели). Определяем сумму первых показателей и константы патологического процесса, а затем сумму вторых показателей и константы, отражающих физиологическую норму данного пациента. При суммарном значении первых показателей больше вторых ставим диагноз туберкулезной инфекции. Если первый суммарный показатель меньше второго, то туберкулезной инфекции нет.
Примеры конкретного использования способа
Пример 1
Больной X., 1992 года рождения, обратился в ГЛПУ ТО «ОПТД» по направлению фельдшера из школы с жалобами на зуд в области постпрививочного знака БЦЖ, увеличение его в размере в течение последнего года. БЦЖ поставлена в роддоме - рубец 12 мм. Проба Манту положительная во все годы наблюдения. 12.03.2007 г. поставлена проба Манту - размер папулы 15 мм.
+
спонт
У больного взяли кровь в количестве по 5 мл в 2 пробирки, одна из которых содержала гепарин. Обе пробирки центрифугировали при 1500 об/мин в течение 30 мин на градиенте фиколл-верографина, затем удаляли надосадочную жидкость. В пробирке с гепарином рецепторы к липополисахаридам на моноцитах (CD14) определяли методом проточной цитофлюориметрии на аппаратае «FACScan» фирмы "Becton Dicenson» при добавлении моноклональных антител, меченных FITS. Содержимое второй пробирки делили на 2 части. Из одной части готовили спонтанный тест для определения восстановления нитросинего тетразолия (НСТ) без добавления пирогенала. Пробу инкубировали при температуре 37°С в течение 30-40 мин и центрифугировали при 1500 об/мин в течение 30 мин. Прореагировавшие клетки наносили на предметные стекла и подсчитывали, используя световой микроскоп с увеличением в 630 раз. Из другой части цельной крови получали сыворотку и определяли количество циркулирующих иммунных комплексов с добавлением полиэтиленгликоля (ПЭГ) 7,5% концентрации, затем учитывали результат с помощью спектрофотометра. Оставшуюся часть сыворотки вносили в планшеты с реактивами для определения концентрации IgE и кортизола в реакции ИФА. Планшеты инкубировали в термостате при температуре 37°С в течение 30 мин, затем учитывали результаты на спектрофотометре.
Результат иммунологического обследования:
+
спонт
CD14- 88,2%; НСТ - 18%; ЦИК 7,5% - 43 усл.ед.опт.пл.; IgE - 24,1 МЕ/мл; кортизол - 237 нмоль/л.
Определяем стандартизированные первые показатели, соответствующие активному туберкулезному процессу, умножив полученные иммунологические показатели на коэффициенты 88,2·1,087928=95,9; 18·(-0,06494)=(-1,169); 43·0,08577=3,6; 24,1·0,007352=0,17; 237·0,009401=2,22.
Определяем сумму первых показателей и константы патологического процесса 95,9+(-1,17)+3,6+0,17+2,22+(-54,6288)=46,09.
Определяем стандартизированные вторые показатели, соответствующие физиологической норме пациента, умножив полученные иммунологические показатели на коэффициенты 88,2·1,033075=91,1; 18·(-0,1002)=(-1,8); 43·0,050673=2,17; 24,1·0,004278=0,1; 237·0,006463=1,53.
Определяем сумму вторых показателей и константы, отражающей физиологическую норму данного пациента 91,1+(-1,8)+2,17+0,1+1,53+(-44,1056)=49,02.
Первый суммарный показатель меньше второго. Туберкулезной инфекции нет.
Заключение. У больного туберкулезной инфекции нет. Имеется индивидуальная повышенная чувствительность к МБТ.
Клинический диагноз:
Келлоидный рубец.
Пример 2
Больная А., 1994 года рождения, поступила в стационар ГЛПУ ТО «ОПТД» 26.07.2007 г. с жалобами на субфебрилитет в течение 3 мес., сухой кашель в течение 2 мес. БЦЖ поставлена в роддоме - рубец 8 мм. Проба Манту положительная с рождения, в 2004 г. увеличение папулы на 6 мм. В ноябре 2006 г. поставлена проба Манту - размер папулы 11 мм.
+
У больной взяли кровь по 5 мл в 2 пробирки, одна из которых содержала 250 мкл гепарина. Пробирки центрифугировали при 1500 об/мин в течение 30 мин на градиенте фиколл-верографина, затем удаляли надосадочную жидкость. В пробирке с гепарином рецепторы к липополисахаридам на моноцитах (CD14) определяли методом проточной цитофлюориметрии на аппаратае «FACScan» фирмы "Becton Dicenson» при добавлении моноклональных антител, меченных FITS. Содержимое второй пробирки делили на 2 части. Из одной части готовили спонтанный тест для определения восстановления нитросинего тетразолия (НСТ) без добавления пирогенала. Пробу инкубировали при температуре 37°С в течение 30-40 мин и центрифугировали при 1500 об/мин в течение 30 мин. Прореагировавшие клетки наносили на предметные стекла и изучали под микроскопом путем простого подсчета. Из другой части крови получали сыворотку и определяли количество циркулирующих иммунных комплексов с добавлением полиэтиленгликоля (ПЭГ) 7,5% концентрации. Учет результата проводили на спектрофотометре. Оставшуюся часть сыворотки вносили в планшеты с реактивами для определения концентрации IgE и кортизола в реакции ИФА. Планшеты инкубировали в термостате при температуре 37°С в течение 30 мин, затем учитывали результат на спектрофотометре.
Результат иммунологического обследования:
+
спонт
CD14 - 77,7%; НСТ - 49%; ЦИК 7,5% - 145 усл.ед.опт.пл.; IgE - 384 МЕ/мл; кортизол - 1133 мкм/л.
Определяем стандартизированные первые показатели, соответствующие активному туберкулезному процессу, умножив полученные иммунологические показатели на коэффициенты
77,7·1,087928=84,5; 49·(-0,06494)=(-3,18); 145·0,08577=12,3; 384·0,007352=2,82; 1133·0,009401=10,7.
Определяем сумму первых показателей и константы патологического процесса 84,5+(-3,18)+12,3+2,82+10,7+(-54,6288)=52,5.
Определяем стандартизированные вторые показатели, соответствующие физиологической норме пациента, умножив полученные иммунологические показатели на коэффициенты 77,7·1,033075=80,3; 49·(-0,1002)=4,91; 145·0,050673=7,35; 384·0,004278=1,64; 1133·0,006463=7,32.
Определяем сумму вторых показателей и константы, отражающей физиологическую норму данного пациента
80,3+(-4,91)+7,35+1,64+7,32+(-44,1056)=47,6
Первый суммарный показатель больше второго. У пациента туберкулезная инфекция.
Клинический диагноз: Инфильтративный туберкулез 6 сегмента правого легкого, фаза распада и обсеменения. МБТ(+) 1А группа. Заключение: учитывая положительную пробу Манту с рождения, можно предположить, что поствакцинальная аллергия сменилась развитием постинфекционной аллергии без документально подтвержденного угасания. Выявленные изменения по рентгенограмме свидетельствуют о давности специфического воспаления, приведшего к распаду легочной ткани и обсеменения окружающей ткани.
Пример 3
Больная Б., 1990 года рождения, поступила в стационар ГЛПУ ТО «ОПТД» в 15.07.2007 г. Жалоб не предъявляет. БЦЖ в роддоме - рубец 4 мм. Проба Манту положительная монотонная с рождения. 15.07.2007 г. поставлена проба Манту - папула 12 мм.
+
У больной взяли кровь по 5 мл в 2 пробирки, одна из которых содержала 250 мкл гепарина. Обе пробирки центрифугировали при 1500 об/мин в течение 30 мин на градиенте фиколл-верографина, затем удаляли надосадочную жидкость. В пробирке с гепарином рецепторы к липополисахаридам на моноцитах (CD14) определяли методом проточной цитофлюориметрии на аппаратае «FACScan» фирмы "Becton Dicenson» при добавлении моноклональных антител, меченных FITS. Содержимое второй пробирки делили на 2 части. Из одной части готовили спонтанный тест для определения восстановления нитросинего тетразолия (НСТ) без добавления пирогенала. Пробу инкубировали при температуре 37°С в течение 30-40 мин и центрифугировали при 1500 об/мин в течение 30 мин. Прореагировавшие клетки наносили на предметное стекло и подсчитывали количество клеток, используя световой микроскоп с увеличением в 630 раз. Из другой части цельной крови получали сыворотку и определяли количество циркулирующих иммунных комплексов с добавлением полиэтиленгликоля (ПЭГ) 7,5% концентрации. Учитывали результат с использованием спектрофотометра. Оставшуюся часть сыворотки вносили в планшеты с реактивами для определения концентрации IgE и кортизола в реакции ИФА. Планшеты инкубировали в термостате при температуре 37°С в течение 30 мин, затем учитывали результаты на спектрофотометре. Результат иммунологического обследования:
+
спонт
CD14 - 71,7%; НСТ - 49%; ЦИК 7,5% - 118 усл.ед.опт.пл.; IgE - 110 МЕ/мл; кортизол - 769 нмоль/л.
Определяем стандартизированные первые показатели, соответствующие активному туберкулезному процессу, умножив полученные иммунологические показатели на коэффициенты
71,7·1,087928=78,0; 49·(-0,06494)=(-3,18); 118·0,08577=9,98; 110·0,007352=0,81; 769·0,009401=7,23.
Определяем сумму первых показателей и константы патологического процесса 78+(-3,18)+9,98+0,81+7,23+(-54,6288)=38,2.
Определяем стандартизированные вторые показатели, соответствующие физиологической норме пациента, умножив полученные иммунологические показатели на коэффициенты
71,7·1,033075=74,1; 49·(-0,1002)=(-4,91); 118·0,050673=5,98; 110·0,004278=0,47; 769·0,006463=4,97.
Определяем сумму вторых показателей и константы, отражающей физиологическую норму данного пациента
74,1+(-4,91)+5,98+0,47+4,97+(-44,1056)=36,5.
Первый суммарный показатель больше второго. У пациента туберкулезная инфекция.
Клинический диагноз: Инфильтративный туберкулез 1-2 сегмента правого легкого, фаза распада. МБТ(-) 1А гр.
Учитывая наличие положительных проб Манту с рождения, расцененных как тубинфицирование, предположить о развитии активного специфического воспаления не представлялось возможным. Несмотря на это, выявленные изменения по рентгенограмме свидетельствуют о давности специфического воспаления.
Приведенные примеры иллюстрируют возможность применения предложенного способа для диагностики активных форм туберкулеза.
Предложенный способ апробирован на базе ГЛПУ ТО «ОПТД» и ГЛПУ ТО «Противотуберкулезный санаторий Верхний Бор». Под наблюдением находилось 60 больных. В таблице 1 представлены результаты определения суммарных иммунологических показателей и константы у пациентов и их индивидуальной физиологической нормы, которым был поставлен диагноз туберкулезной инфекции по результатам клинико-лабораторных обследований больных. Предложенный способ позволяет выявлять туберкулезную инфекцию у пациентов с положительной пробой Манту (таблица 2). Из 13 обследованных лиц туберкулезная инфекция установлена у 8 пациентов.
Стоимость проведения рентгендиагностики туберкулеза по результатам обследования больных на 100 пациентов составляет 58056 руб., при использовании предлагаемого способа - 54528 руб. Экономический эффект диагностики туберкулеза по сравнению с прототипом на 100 больных составляет 3528 руб. В таблице 3 представлен экономический эффект при постановке диагноза туберкулеза у одного больного предлагаемым способом диагностики по сравнению рентгендиагностикой и клинико-лабораторными методами обследования больного.
Предложен простой, не влияющий на здоровье пациентов, экспресс способ диагностики туберкулезной инфекции, не требующий больших материальных затрат и позволяющий при использовании персонального компьютера ускорить и автоматизировать процесс получения окончательного результата иммунологических исследований. Экспресс способ диагностики туберкулезной инфекции в 75% обеспечивает совпадение диагностики туберкулеза с результатами клинико-лабораторного обследования больного.