СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СТОМАТОЛОГИЧЕСКОЙ ПЛЕНКИ, ОБЛАДАЮЩЕЙ ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫМ ДЕЙСТВИЕМ
METHOD OF OBTAINING DENTAL FILM, WHICH HAS ANTI-INFLAMMATORY ACTION

Изобретение относится к области фармации и касается способа получения средства из растительного сырья, применяемого при воспалительных заболеваниях пародонта.
Известен способ получения лекарственных пленок для коррекции иммунологического статуса организма [6]. Недостатками известного метода является использование в качестве носителя фармакологических свойств жидкой формы из растительных объектов (настоек, жидких экстрактов), что удлиняет процесс сушки пленки и в ряде случаев приводит к неравномерному распределению пленочной массы по заливочной форме. Более того, для настоек и жидких экстрактов характерно низкое содержание действующих веществ, что в свою очередь сказывается на качестве конечной лекарственной формы - пленки.
Технический результат изобретения - получение средства из листьев какалии копьевидной (Cacalia hastata L.), применяемого при воспалительных заболеваниях пародонта, который достигается за счет использования в ходе технологического процесса сухого экстракта.
Для достижения указанного технического результата измельченный растительный материал (листья какалии копьевидной) экстрагируют 70% этанолом в соотношении сырье: экстрагент 1:(16-18) с учетом коэффициента спиртопоглощения при температуре 96-98°С в течение 1.5 час. Извлечение фильтруют в сборник. Экстракцию повторяют в тех же условиях еще два раза. Спиртовые извлечения объединяют и концентрируют до 1/30 от первоначального объема. Полученный продукт высушивают в вакуум-сушильном шкафу и измельчают на мельнице пропеллерного типа. Выход готового полупродукта (сухого экстракта) составляет 29.5-32.7% от массы растительного сырья. Полупродукт (сухой экстракт) растирают до гомогенной массы со смесью Твин 80-диметилсульфоксид-глицерин в соотношении 1:1:10, после чего вводят 5% раствор карбоксиметилцеллюлозы в соотношении 1:5 и 10% раствор желатины в соотношении 1:5 и перемешивают в течение 30 мин. После этого массу выливают в формы и высушивают при температуре 20-22°С. Через 12 ч образовавшуюся пленку снимают, нарезают лентами необходимого размера и досушивают в термостате при температуре 50-55°С. Выход готового продукта (пленки) составляет 96-97.5% от массы исходных компонентов.
Выявленные отличительные признаки позволяют сделать вывод о соответствии предлагаемого технологического решения критерию "новизна".
Предложенный способ позволяет получить прозрачную пленку желто-коричневого цвета с кисло-горьким вкусом и специфическим приятным запахом. Потеря массы при высушивании - 10-12%.
Способ иллюстрируется нижеследующими примерами.
Пример 1. 1 кг листьев какалии копьевидной измельчают на мельнице до размера частиц диаметром (сито №50 ГОСТ 214-83). Измельченное сырье загружают в экстракционный аппарат с мешалкой и внешним паровым обогревателем и заливают 16 л 70% этанола. Экстрагируют при температуре 96-98°С и периодическом помешивании в течение 1.5 ч. Извлечение фильтруют в сборник. Проводят еще две экстракции в тех же условиях, подавая в экстрактор 70% этанол в количестве, равном объему слитого. Первый слив - 13.8 л, второй - 12.9 л, третий - 12.7 л. Объединенные спиртовые извлечения упаривают примерно до 1/30 первоначального объема, подвергают очистке сепарированием и сушат на нержавеющих противнях в вакуумной сушилке при температуре 60°С в течение 8 часов и измельчают на мельнице пропеллерного типа. Получают 0.295 кг готового продукта, что составляет 29.5% экстрактивных веществ от массы исходного сырья. Сухой экстракт представляет собой рассыпчатый аморфный негигроскопичный порошок коричневого цвета с горько-кислым вяжущим вкусом и приятным специфическим запахом. Потеря массы при высушивании составляет 7.85%.
0.100 кг сухого экстракта растирают в ступке с 0.400 кг смеси Твин 80-диметилсульфоксид-глицерин (1:1:10) при температуре 20-22°С в течение 20-30 мин до однородной массы темно-коричневого цвета. После этого в смесь вводят 1 л 5% раствора карбоксиметилцеллюлозы, перемешивают и приливают 4.5 л 10% раствора желатины, нагретого до температуры 40°С. Полученную смесь перемешивают в течение 30 мин, не допуская образования в пленочной массе пузырьков воздуха. Полученную пленочную массу выливают в заливочные формы слоем толщиной 3.00±0.25 мм и высушивают на воздухе при температуре 20-22°С. Через 12 ч образовавшуюся пленку снимают, нарезают лентами необходимого размера и досушивают в термостате при температуре 50-55°С до значения остаточной влажности 10-12%.
Получают 0.975 кг готового продукта, что составляет 97.5% от массы исходных компонентов. Пленка представляет собой полимерный продукт желто-коричневого цвета; 1% водный раствор пленки кисло-горького вкуса со специфическим приятным запахом. Потеря массы при высушивании пленки - 10.52%.
Пример 2. 1 кг листьев какалии копьевидной измельчают на мельнице до размера частиц диаметром (сито №50 ГОСТ 214-83). Измельченное сырье загружают в экстракционный аппарат с мешалкой и внешним паровым обогревателем и заливают 17 л 70% этанола. Экстрагируют при температуре 96-98°С и периодическом помешивании в течение 1.5 ч. Извлечение фильтруют в сборник. Проводят еще две экстракции в тех же условиях, подавая в экстрактор 70% этанол в количестве, равном объему слитого. Первый слив - 14.5 л, второй - 14.0 л, третий - 13.9 л. Объединенные спиртовые извлечения упаривают примерно до 1/30 первоначального объема, подвергают очистке сепарированием и сушат на нержавеющих противнях в вакуумной сушилке при температуре 60°С в течение 8 часов и измельчают на мельнице пропеллерного типа. Получают 0.327 кг готового продукта, что составляет 32.7% экстрактивных веществ от массы исходного сырья. Сухой экстракт представляет собой рассыпчатый аморфный негигроскопичный порошок коричневого цвета с горько-кислым вяжущим вкусом и приятным специфическим запахом. Потеря массы при высушивании составляет 8.04%.
0.100 кг сухого экстракта растирают в ступке с 0.450 кг смеси Твин 80-диметилсульфоксид-глицерин (1:1:10) при температуре 20-22°С в течение 20-30 мин до однородной массы темно-коричневого цвета. После этого в смесь вводят 1.5 л 5% раствора карбоксиметилцеллюлозы, перемешивают и приливают 5.0 л 10% раствора желатины, нагретого до температуры 40°С. Полученную смесь перемешивают в течение 30 мин, не допуская образования в пленочной массе пузырьков воздуха. Полученную пленочную массу выливают в заливочные формы слоем толщиной 3.00±0.25 мм и высушивают на воздухе при температуре 20-22°С. Через 12 ч образовавшуюся пленку снимают, нарезают лентами необходимого размера и досушивают в термостате при температуре 50-55°С до значения остаточной влажности 10-12%.
Получают 1.085 кг готового продукта, что составляет 96.4% от массы исходных компонентов. Пленка представляет собой полимерный продукт желто-коричневого цвета; 1% водный раствор пленки кисло-горького вкуса со специфическим приятным запахом. Потеря массы при высушивании пленки - 9.38%.
Пример 3. 1 кг листьев какалии копьевидной измельчают на мельнице до размера частиц диаметром (сито №50 ГОСТ 214-83). Измельченное сырье загружают в экстракционный аппарат с мешалкой и внешним паровым обогревателем и заливают 18 л 70% этанола. Экстрагируют при температуре 96-98°С и периодическом помешивании в течение 1.5 ч. Извлечение фильтруют в сборник. Проводят еще две экстракции в тех же условиях, подавая в экстрактор 70% этанол в количестве, равном объему слитого. Первый слив - 16.7 л, второй - 16.2 л, третий - 16.1 л. Объединенные спиртовые извлечения упаривают примерно до 1/30 первоначального объема, подвергают очистке сепарированием и сушат на нержавеющих противнях в вакуумной сушилке при температуре 60°С в течение 8 часов и измельчают на мельнице пропеллерного типа. Получают 0.315 кг готового продукта, что составляет 31.5% экстрактивных веществ от массы исходного сырья. Сухой экстракт представляет собой рассыпчатый аморфный негигроскопичный порошок коричневого цвета с горько-кислым вяжущим вкусом и приятным специфическим запахом. Потеря массы при высушивании составляет 8.15%.
0.100 кг сухого экстракта растирают в ступке с 0.350 кг смеси Твин 80-диметилсульфоксид-глицерин (1:1:10) при температуре 20-22°С в течение 20-30 мин до однородной массы темно-коричневого цвета. После этого в смесь вводят 1 л 5% раствора карбоксиметилцеллюлозы, перемешивают и приливают 5.0 л 10% раствора желатины, нагретого до температуры 40°С. Полученную смесь перемешивают в течение 30 мин, не допуская образования в пленочной массе пузырьков воздуха. Полученную пленочную массу выливают в заливочные формы слоем толщиной 3.00±0.25 мм и высушивают на воздухе при температуре 20-22°С. Через 12 ч образовавшуюся пленку снимают, нарезают лентами необходимого размера и досушивают в термостате при температуре 50-55°С до значения остаточной влажности 10-12%.
Получают 0.960 кг готового продукта, что составляет 96.0% от массы исходных компонентов. Пленка представляет собой полимерный продукт желто-коричневого цвета; 1% водный раствор пленки кисло-горького вкуса со специфическим приятным запахом. Потеря массы при высушивании пленки - 9.33%.
Разработка состава полимерной основы стоматологической пленки.
В эксперименте по определению оптимального состава полимерной основы стоматологической пленки изучались свойства 14 композиций, в состав которых входили желатина, агар и карбоксиметилцеллюлоза (КМЦ) в различных соотношениях. В качестве сопутствующих веществ для улучшения ряда показателей (адгезия, растворимость, внешний вид) использовались диметилсульфоксид, Твин 80, глицерин.
В таблице 1 приведены составы полимерных основ.
В таблице 2 описаны основные контрольные характеристики пленок, на основании которых происходил выбор оптимальной.
В результате проведенных исследований установлено, что по совокупности свойств наиболее оптимальными параметрами обладает полимерная композиция №3, которая была использована при разработке стоматологической пленки.
Таблица 1Составы полимерных основ, массовые части
№
Желатина 10% р-р
КМЦ 5% р-р
Агар 5% р-р
Диметилсульфоксид
Твин 80 20%р-р
Глицерин
Этанол 40% р-р
1
50
50
-
0.20
-
2.30
17.50
2
70
30
-
0.20
-
2.30
17.50
3
100
20
-
0.25
0.25
2.50
-
4
100
-
-
0.25
0.25
2.50
5.00
5
50
50
-
0.25
-
3.00
-
6
100
-
-
0.20
-
2.30
17.50
7
50
-
50
0.20
-
2.30
17.50
8
50
20
50
0.20
-
2.30
-
9
-
20
80
0.25
0.25
2.50
2.00
10
10
90
-
0.25
0.25
2.50
-
11
80
-
-
0.50
-
2.50
17.00
12
80
-
-
0.20
-
4.00
20.00
13
80
-
-
-
0.20
2.30
17.50
14
100
-
-
-
2.50
2.50
-
Таблица 2Результаты определения качества полимерных основ
№
ВВ
Сн
Эл
Ад
t<sub>Sol</sub>
X
1
1
1
1
3
1 (1-2)
7
2
1
1
1
3
1 (1-2)
7
3
3
3
3
3
3 (10-15)
15
4
3
3
1
1
3 (10-15)
11
5
1
1
1
3
1 (1-2)
7
6
3
1
1
1
3 (10-15)
9
7
3
2
2
1
2 (5-6)
10
8
1
2
2
1
2 (5-6)
8
9
3
3
2
1
2 (5-6)
11
10
1
1
1
1
1 (1-2)
5
11
3
1
2
1
2 (5-6)
9
12
3
2
1
2
1 (1-2)
9
13
2
3
1
2
1 (1-2)
9
14
2
3
1
1
1 (1-2)
8
Примечания: *ВВ - внешний вид, баллов; Сн - снятие с заливочной формы, баллов; Эл - эластичность, баллов; Ад - адгезия к десне, баллов; t<sub>Sol</sub> - время растворения в физиологическом растворе, баллов (мин); Х - относительная оценка качества, баллов.
Химический состав стоматологической пленки.
Проведенный химический анализ стоматологической пленки выявил наличие фенольных кислот и флавоноидов.
2
4
ВЭЖХ. Условия: жидкостный хроматограф «Милихром А-02» на колонке (l=75 мм, ⌀ 2 мм), упакованной сорбентом Nucleosil, 100-5, С18, с эффективностью равной 5000 т.т. по пику хризена (k'=10). Вещества определяли в градиентном режиме элюирования: градиент элюента В от 15% до 70% за 23.3 мин, при расходе элюентов 0.2 мл/мин. Элюент А - смесь водного раствора фосфата калия (КНРO, 0.05 М, рН=3.0) и ацетонитрила при соотношении раствор фосфата калия: ацетонитрил 95:5 (об/об). Элюируемые вещества детектировали при 218, 236, 260 и 274 нм одновременно. Температура колонки 40°С. Количественное определение проводили методом внешнего стандарта. В качестве внешних стандартов использовали растворы индивидуальных соединений с известной концентрацией. Чистота соединений по данным ВЭЖХ составляла не менее 95%. Суммарная погрешность измерений не превышала 5%.
Около 1 г (точная навеска) пленки помещают в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, приливают 10 мл воды очищенной, присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 15 мин. После охлаждения к содержимому колбы приливают 50 мл 95% спирта этилового, присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 15 мин. После охлаждения содержимое колбы фильтруют в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят объем раствора до метки 50% спиртом этиловым.
В составе стоматологической пленки обнаружено присутствие 9 ароматических кислот, из которых идентифицированы галловая, ванилиновая, сиреневая, коричная, кофейная, феруловая и хлорогеновая кислоты. Доминирующими соединениями являются хлорогеновая и кофейная кислоты. Общее содержание фенольных кислот в стоматологической пленке составляет 1.15-1.27%. Также обнаружено присутствие флавоноидов кверцетина и кемпферола, причем их содержание составляет 0.07 и 0.02% соответственно.
Метод контроля качества стоматологической пленки.
Разработана методика количественного определения суммарного содержания фенолокислот (в пересчете на хлорогеновую кислоту) с применением спектрофотометрического метода.
Около 1 г (точная навеска) стоматологической пленки помещают в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, приливают 10 мл воды очищенной, присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 15 мин. После охлаждения к содержимому колбы приливают 50 мл 95% спирта этилового, присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 15 мин. После охлаждения содержимое колбы фильтруют в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят объем раствора до метки 50% спиртом этиловым (раствор А).
2 мл раствора А переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят объем раствора до метки 50% спиртом этиловым (раствор Б).
Оптическую плотность раствора Б измеряют при длине волны 330 нм. В качестве раствора сравнения используют 50% спирт этиловый. Суммарное содержание фенолокислот в пересчете на хлорогеновую кислоту в пленке в процентах (X) вычисляют по формуле
V
где D - оптическая плотность исследуемого раствора; К- коэффициент разбавления исследуемого раствора (1250); 531 - удельный коэффициент погашения хлорогеновой кислоты в 50% спирте этиловом при длине волны 330 нм; m - масса пленки, г; W - потеря в массе при высушивании пленки, %.
Количественная оценка велась по содержанию фенолокислот (в пересчете на хлорогеновую кислоту). В таблице 3 приведены результаты метрологического анализа полученных результатов, проведенных для трех партий стоматологической пленки.
Таблица 3Метрологические характеристики результатов количественного анализа партий стоматологической пленки
Партия пленки
<img file="00000002.tif" he="4" wi="4" img-content="undefined" img-format="tif" />
S<sup>2</sup>
S<sub>x</sub>
t(p,f)
<img file="00000003.tif" he="4" wi="11" img-content="undefined" img-format="tif" />
E
071107
0.151
3.53·10<sup>-5</sup>
1.79·10-<sup>3</sup>
2.23
0.004
2.65
241107
0.142
2.01·10<sup>-5</sup>
1.35·10<sup>-3</sup>
2.23
0.003
2.11
150508
0.170
5.53·10<sup>-5</sup>
2.24·10<sup>-3</sup>
2.23
0.005
2.94
В ходе исследований установлено, что содержание фенолокислот в пересчете на хлорогеновую кислоту в стоматологической пленке может составлять 0.14-0.17%, поэтому в качестве нижнего показателя содержания установлена величина не менее 0.10%.
Рассчитать экономическую целесообразность предлагаемого способа в настоящее время не представляется возможным, однако вышеуказанные преимущества в сочетании с простой схемой получения способствуют рациональному использованию лекарственного растительного сырья и определяют перспективность внедрения данного способа в фармацевтическую промышленность.
Фармакотерапевтические свойства стоматологической пленки.
Фармакотерапевтическая эффективность стоматологической пленки при повреждении тканей пародонта у белых крыс с помощью наложения шелковой лигатуры в зубодесневую борозду. Исследования произведены на 84 белых крысах линии Wistar обоего пола массой 160-180 г. Повреждение пародонта у животных вызывали путем наложения шелковой лигатуры в зубодесневую борозду [1]. Стоматологическую пленку накладывали на десну ежедневно, с фиксацией ее в течение 5 минут. Животным контрольной группы накладывали пленку, не содержащую растительное средство по аналогичной схеме. В качестве препарата сравнения использовали 3% раствор настойки календулы лекарственной, которым орошали полость рта животных по аналогичной схеме. Исследования проводили на 3, 7 и 14 сутки с начала эксперимента. Для объективной оценки состояния пародонта определяли гигиенический статус ротовой полости животных по методу Грина-Вермильона и интенсивность кровоточивости - по методу Мюллемана [4]. Для гистологического исследования материал фиксировали в 10% нейтральном формалине с последующей декальцинацией в 7% азотной кислоте. Полученные на санном микротоме срезы окрашивали гематоксилин эозином [7]. Для оценки влияния стоматологической пленки на состояние перекисного окисления липидов в крови определяли содержание малонового диальдегида (МДА) общепринятым методом [2] и диеновых конъюгатов (ДК) - спектрофотометрическим методом [3]. Для оценки влияния фитопленки на состояние антиоксидантной системы организма при повреждении тканей пародонта активность каталазы в сыворотке крови исследовали по методу М.А.Королюк [5] супероксиддисмутазы (СОД) в плазме крови - по методу С.Чевари [9] и содержание восстановленного глутатиона в крови - по методу Т.Anderson [10]. Значимость различий между указанными параметрами среди экспериментальных групп оценивали с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни. Различия считались существенными при Р≤0,05 [8].
Результаты исследований показали, что у животных контрольной группы на 3 сутки исследования наблюдались отек десны, гиперемия, накопление остатков пищи в области фиксации лигатуры, фибринозный налет. Гигиенический индекс и интенсивность кровоточивости составлял 1,6 и 1,8 балла соответственно. Морфологические исследования показали, что у животных контрольной группы в десне выявлялись дистрофические изменения эпителия, отек и воспалительная инфильтрация подэпителиальной соединительно-тканной стромы. На 7 сутки исследования у животных отмечались выраженный отек десны, ее гиперемия и интенсивный фибринозный налет. Гигиенический индекс и интенсивность кровоточивости составляли 2,3 и 2,0 балла соответственно. При микроскопическом исследовании в десне крыс наблюдались отек, нарушения со стороны микроциркуляторного русла: сосуды были полнокровны, в части из них определялись сладж-комплексы. Воспалительные инфильтраты выявлялись в более глубоких участках пародонта, на уровне периодонта. На 14 сутки исследования десна животных контрольной группы выглядела цианотичной, индекс кровоточивости составлял 2,5 балла. В периодонтальной ткани определялась выраженная реакция со стороны сосудов микроциркуляторного русла в виде их полнокровия, стромального отека и очагов лимфостаза. Отмечалась локальная клеточная инфильтрация в соединительнотканной строме десны. У большинства животных наблюдались разрушение эпителиального покрова слизистой оболочки десны и углубление зубодесневой борозды.
При аппликации стоматологической пленки на десну крыс было установлено, что на 3, 7 и 14 сутки опыта гигиенический статус тканей пародонта был значительно ниже такового у животных контрольной группы и составлял соответственно 0,7; 1,0 и 2,0 балла. У животных опытной группы процессы воспаления в десне были менее выражены, о чем свидетельствовало снижение степени кровоточивости по сравнению с таковой у крыс контрольной группы на 20, 25 и 16% соответственно. Микроскопическое исследование тканей пародонта животных опытной группы показало, что на 3 и 7 сутки эксперимента наблюдались характерные для гингивита морфологические признаки: отек и воспалительная инфильтрация подэпителиальной соединительнотканной стромы десны и нарушения со стороны микроциркуляции. На 14 сутки наблюдения в ткани периодонта животных опытной группы сохранялись клеточная инфильтрация, расстройства кровообращения, признаки мезенхимальной дистрофии в виде набухания и деструкции волокнистых структур соединительной ткани. Не отмечалось повреждение эпителиального покрова слизистой оболочки десны. Наряду с этим в инфильтратах выявлялись проявления активного новообразования капилляров, что свидетельствует о репаративных процессах в десне. Результаты макро- и микроскопических исследований показали, что во все исследуемые сроки фармакотерапевтическая эффективность стоматологической пленки не уступает, а в большинстве случаев превосходит таковую препарата сравнения - настойки календулы лекарственной.
На 3, 7 и 14 сутки опыта у животных контрольной группы наблюдалась активация процессов перекисного окисления липидов: содержание МДА увеличивалось 1,9; 3,3 и 4,0 раза, концентрация ДК - в 1,4; 2,4 и 3,4 раза соответственно по сравнению с таковыми показателями у животных интактной группы. Интенсификация процессов перекисного окисления липидов сопровождалась снижением активности антиоксидантных ферментов: каталазы и СОД, содержания восстановленного глутатиона по сравнению с таковыми у животных интактной группы во все сроки наблюдения (табл.4). Применение стоматологической пленки у животных на фоне повреждения тканей пародонта, вызывало ингибирование процессов перекисного окисления липидов и повышение антиоксидантного статуса организма. Так, у животных опытной группы, на 3, 7 и 14 сутки опыта содержание МДА снижалось на 28, 32 и 24%, а концентрация ДК - на 24, 38 и 30% соответственно и активность каталазы повышалась в 1,2; 1,6 и 1,9 раза, СОД - в 1,4; 1,5 и 1,4 раза и содержание восстановленного глутатиона - на 10, 23 и 28% соответственно по сравнению с таковыми у животных контрольной группы.
Таким образом, при аппликации на десну стоматологической пленки наблюдаются менее выраженные структурные изменения в тканях пародонта и отмечается появление репаративных процессов, что обусловлено способностью исследуемого средства ингибировать процессы перекисного окисления липидов и активировать антиоксидантную систему при повреждении тканей пародонта.
Фармакотерапевтическая эффективность стоматологической пленки при повреждении тканей пародонта, вызванных хронической иммобилизацией белых крыс. Исследования проведены на 40 белых крысах линии Wistar обоего пола с исходной массой тела 160-180 г. Хронический иммобилизационный стресс у белых крыс вызывали ежедневным помещением голодных животных в тесные домики на 6 часов в течение 12 дней. Животным первой опытной группы ежедневно перед иммобилизацией накладывали на десну стоматологическую пленку. В качестве препарата сравнения использовали настойку календулы лекарственной в виде 3% раствора, которым орошали полость рта животных второй опытной группы, крысам контрольной группы накладывали пленку, не содержащую растительный экстракт, по аналогичной схеме.
Исследования проводили на 12 сутки с начала эксперимента. Влияние хронического стресса на состояние пародонта оценивали по клинической картине и гистологическим исследованиям. Для гистологического исследования нижнюю челюсть крыс фиксировали в 10% нейтральном формалине с последующей декальцинацией в 7% азотной кислоте. Полученные на санном микротоме срезы окрашивали гематоксилин-эозином и по Ван Гизону [7]. Показатели периферической крови определяли на автоматическом гематологическом анализаторе «Абакус» со стандартным набором реактивов (Австрия). Реакцию перекисного окисления липидов при хроническом стрессе определяли по содержанию в крови животных малонового диальдегида (МДА) [2] и диеновых коньюгатов (ДК) [3].
Таблица 4Влияние стоматологической пленки на показатели перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы организма при повреждении тканей пародонта у белых крыс
Показатели
Группы животных
Интактная
Контрольная
Стоматологическая пленка
3% Р-р настойки календулы лекарственной
1
2
3
4
5
3 сутки
МДА, нмоль/г
0,90±0,01
1,68±0,05*
1,21±0,09**
1,33±0,56
ДК, ед.оп.
1,50±0,03
2,09±0,09*
1,58±0,07**
1,80±0,42
Каталаза, мкат/л
12,50±0,38
7,13±0,15*
8,50±0,04**
8,80±0,19**
СОД, мкмоль/мл
26,2±1,16
12,25±1,09*
16,68±0,78**
16,25±0,86**
Восстановленный глутатион, мкмоль/мл
627,3±11,2
471,7±23,4*
502,3±45,7
486,9±29,6
7 сутки
МДА, нмоль/г
0,90±0,01
2,94±0,11*
2,01±0,08**
2,28±0,12**
ДК, ед. оп.
1,50±0,03
3,62±0,45*
2,23±0,10**
2,59+0,12**
Каталаза, мкат/л
12,50±0,38
3,6±0,19*
5,7±0,12**
5,3±0,13**
СОД, мкмоль/мл
26,2±1,16
8,74±0,32*
13,26±1,01**
10,41±0,97
Восстановленный глутатион, мкмоль/мл
627,3±11,2
346,32±12,9*
427,13±21,9**
392,94±27,9
14 сутки
МДА, нмоль/г
0,90±0,01
3,68±0,34*
2,79±0,12**
3,12±0,34
ДК, ед. оп.
1,50±0,03
5,12±0,12*
3,58±0,23**
3,83±0,19**
Каталаза, мкат/л
12,50±0,38
1,30±0,09*
2,40±0,12**
1,90±0,14**
СОД, мкмоль/мл
26,2±1,16
6,7410,34*
9,63±0,47**
8,24±0,45**
Восстановленный глутатион, мкмоль/мл
627,3±11,2
252,7±10,9*
323,7±12,4**
312,7±21,2**
Примечание. * - различия достоверны по сравнению с показателями у животных интактной группы при Р<0,05; ** - различия достоверны по сравнению с показателями у животных контрольной группы при Р<0,05.
Состояние антиоксидантной системы организма при повреждении пародонта оценивали по активности каталазы в сыворотке крови [5], супероксид-дисмутазы (СОД) в плазме крови [9] и содержанию восстановленного глутатиона в крови [10]. Значимость различий между указанными параметрами среди экспериментальных групп оценивали с помощью непараметрического критерия Манна - Уитни. Различия считались существенными при Р≤0,05 [8].
Результаты исследований показали, что 12-дневная иммобилизация вызывала у животных контрольной группы выраженные признаки катарального гингивита: отек слизистой на протяжении всего пародонта, гиперемия десны с ярко выраженным сосудистым рисунком, визуально выявлялся зубной налет. Кровоточивость десен наблюдалась только при легком зондировании. У животных первой опытной группы признаки клинического воспаления десны были менее выражены по сравнению с контролем, так наблюдались небольшие изменения в цвете десны, отек слизистой выявлялся только в области маргинального пародонта, сосудистый рисунок у большинства животных был слабо выражен. У животных второй опытной группы отек слизистой определялся в области маргинального пародонта и межзубного сосочка, отмечался умеренный сосудистый рисунок.
Патоморфологические исследования показали, что у животных контрольной группы в десне выявлялись дистрофические изменения эпителия, отек и воспалительная инфильтрация подэпителиальной соединительнотканной стромы, нарушения со стороны микроциркуляторного русла: сосуды полнокровны, в части из них определялись сладж-комплексы. Микроскопическое исследование тканей пародонта животных опытных групп показало, что на 12 сутки эксперимента наблюдались характерные для гингивита морфологические признаки: отек и воспалительная инфильтрация подэпителиальной соединительнотканной стромы десны и нарушения со стороны микроциркуляции. При этом у 30% животных получавших аппликацию фитопленки воспалительный инфильтрат под эпителиальным подкреплением отсутствовал.
Исследования периферической крови показали, что у животных контрольной группы наблюдалась анемия (табл.5). О выраженности воспалительного процесса свидетельствовало повышение количества лейкоцитов по сравнению с таковыми показателями у животных интактной группы. У животных опытных групп наблюдалась менее выраженная анемия по сравнению с данными у животных контрольной группы. Снижение СОЭ и лейкоцитоза свидетельствовало о менее выраженном воспалительном процессе при применении исследуемых средств.
Таблица 5Влияние стоматологической пленки на показатели периферической крови белых крыс при хроническом иммобилизационном стрессе
Показатели
Группы животных
Интактная
Контрольная (стресс)
Опытная 1 (стоматологическая пленка)
Опытная 2 (3% раствор настойки календулы)
Гемоглобин, г/л
130,4±0,97
110,1±0,81*
126,6±2,05**
113,8±1,41
Лейкоциты, ×10<sup>9</sup>/л
3,8±0,18
6,7±0,51*
4,5±0,39**
4,8±0,42
СОЭ, мм/час
1,3±0,11
1,8±0,08
1,4±0,09**
1,4±0,13
Примечание. Различия существенны по сравнению с показателями у животных: * - интактной группы; ** - контрольной группы.
Таблица 6Влияние стоматологической пленки на показатели перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы организма при хроническом стрессе у белых крыс
Показатели
Группы животных
Интактная
Контрольная (стресс)
Опытная 1 (стоматологическая пленка)
Опытная 2 (3% раствор настойки календулы)
МДА, нмоль/г
0,9±0,01
2,72±0,15*
2,24±0,18
2,46±0,16
ДК, ед.оп.
1,5±0,03
4,4±0,34*
2,8±0,34**
4,1±0,58
Каталаза, мкат/л
12,5±0,38
8,3±0,45*
10,7±0,73**
7,9±1,33
СОД, мкмоль/мл
26,2±1,16
16,3±1,59*
20,9±1,34**
17,05±1,11
Восстановленный глутатион, мкмоль/мл
627,3±11,2
433,2±29,42*
461,6±19,22
387,6+25,74
Примечание. Различия существенны по сравнению с показателями у животных: * - интактной группы; ** - контрольной группы.
Установлено, что хронический иммобилизационный стресс сопровождается индукцией ПОЛ и угнетением антиокислительной системы организма (табл.6). Так, у животных контрольной группы концентрация МДА и ДК в сыворотке крови повышалась в 3,0 и 2,9 раза, активность каталазы и СОД, а также содержание восстановленного глутатиона снижались на 34, 38 и 31% соответственно по сравнению с таковыми показателями у животных интактной группы. Более выраженное стресспротекторное действие фитопленки по сравнению с настойкой календулы лекарственной обусловлено его выраженным антиоксидантным действием. Представленные в таблице 2 результаты показывают, что аппликация на десну крыс стоматологической пленки на фоне иммобилизационного стресса снижают в сыворотке крови концентрацию ДК в 1,6 раз и повышают активность каталазы и СОД в среднем на 28% по сравнению с таковыми показателями у животных контрольной группы (табл.6).
Таким образом, хронический иммобилизационный стресс вызывает патологические изменения во внутренних органах и выраженные воспалительные изменения в пародонте на фоне активации перекисного окисления липидов и снижения эндогенной антиоксидантной системы организма. Курсовое введение ЭКК и аппликация на десну стоматологической пленки оказывают стресспротекторное действие, улучшая состояние микроциркуляции, устраняя отечность и усиливая трофику в тканях пародонта за счет ингибирования ПОЛ и активации антиоксидантной системы организма.
Источники информации
1. Воложин А.И., Виноградова С.И, Патогенез экспериментального пародонтита у кроликов // Стоматология. - 1991. - №4. - С.10-12.
2. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. М., 1972. 115 с.
3. Гаврилов В.Б., Мишкорудная М.И. Спектрофотометрическое определение содержания гидроперекисей липидов в плазме крови // Лаб. дело. - 1983. - №3. - С.33-35.
4. Григорян А.С., Грудянов А.И., Рабухина Н.А., Фролова О.А. Болезни пародонта. М., 2004. 288 с.
5. Королюк М.А., Иванова Л.И., Майорова И.Г., Токарев В.Е. Методы определения активности каталазы // Лаб. дело. - 1998. - №6. - С.16-19.
6. Мизина П.Г., Куркин В.А. Лекарственные фитопленки с фенилпропаноидами как лечебно-профилактические средства // Химия и компьютерное моделирование. Бутлеровские сообщения. - 2003. - №1. - С.229-236. - прототип.
7. Микроскопическая техника: Руководство / Под ред. Д.С.Саркисова, Ю.Л.Перова. М.: Медицина, 1996. 544 с.
8. Сергиенко В.И., Бондарева И.Б. Математическая статистика в клинических исследованиях. М., 2001. 256 с.
9. Чевари С., Чаба И., Секей Й. Роль супероксиддисмутазы в окислительных процессах клетки и метод определения ее в биологических материалах // Лаб. дело. - 1985. - №11. - С.678-681.
10. Anderson Т.Omeprazole drug interaction studies // Clin. Pharmacokinet. - 1991. - Vol.21. - №38. - P.1603.