СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ХИМИОТЕРАПИИ У БОЛЬНЫХ СО ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫМИ НОВООБРАЗОВАНИЯМИ ЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ ТКАНЕЙ
METHOD FOR PREDICTION OF CHEMOTHERAPEUTIC EFFECTIVENESS IN PATIENTS WITH MALIGNANT NEW GROWTHS OF EPITHELIAL TISSUES

Предлагаемое изобретение относится к области медицины, а именно к исследованию свойств биологических жидкостей химическими и физическими методами и может быть использовано в онкологии, в клинической лабораторной практике для оценки эффективности химиотерапии при лечении злокачественных новообразований эпителиальных тканей, а также мониторинга течения данных онкологических заболеваний.
Одним из главных недостатков противоопухолевого лечения является эмпирический характер его назначения, базирующийся на основных фенотипических характеристиках. Выбор лекарственной терапии осложняется отсутствием надежных прогностических факторов эффективности лечения. К существенным недостаткам противоопухолевой терапии следует отнести и ограниченную эффективность цитостатиков: диапазон их эффективности колеблется от 20 до 80%. При этом частота побочных явлений, нередко угрожающих жизни больного, остается весьма высокой. Еще одним немаловажным недостатком противоопухолевой терапии является высокая стоимость препаратов. Ожидается, что разработка маркеров химиочувствительности новообразований поможет уменьшить затраты на терапию за счет более обоснованного использования дорогостоящих лекарств. К настоящему времени молекулярная онкология предоставила врачам около 400 новых диагностических и прогностических показателей, которые используются или испытываются в клинической практике.
Молекулярные маркеры ответа опухоли на терапию фторпиримидинами изучены к настоящему моменту в наибольшей степени: продемонстрирована взаимосвязь между повышенным содержанием тимидилатсинтетазы (TS) и резистентностью новообразования к 5-фторурацилу [Aschele С., Lonardi S., Monfardini S. Thymidylate Synthase expression as a predictor of clinical response to fluoropyrimidine-based chemotherapy in advanced colorectal cancer. Cancer Treat Rev 2002; 28(1): 27-47, Formentini A., Henne-Bruns D., Kommann M. Thymidylate synthase expression and prognosis of patients with gastrointestinal cancers receiving adjuvant chemotherapy: a review. Langenbecks Arch Surg 2004; 389(5): 405-13].
Однако известный способ имеет несколько недостатков:
- уровень экспрессии тимидилатсинтетазы может различаться в первичной неоплазме и метастазах, что обуславливает необходимость дополнительных инвазивных вмешательств;
- уровень экспрессии тимидилатсинтетазы может увеличиваться уже в процессе самого лечения фторпиримидинами (Libra М., Navolanic P.M., Talamini R. et al. Thymidylate synthetase mRNA levels are increased in liver metastases of colorectal cancer patients resistant to fluoropyrimidine-based chemotherapy. BMC Cancer 2004; 4: 11);
- предполагаемая значимость статуса тимидилатсинтетазы зависит от множества обстоятельств клинического характера, в частности при метастазировании онкологического процесса результаты лечения фторпиримидинами лучше у больных с пониженным содержанием тимидилатсинтетазы, но обратная закономерность отмечается в отношении тех пациентов, которые получают адъювантное лечение теми же препаратами.
Многочисленные исследования демонстрируют взаимосвязь между низким уровнем экспрессии ERCC1 и ответом опухоли на цисплатин, карбоплатин или оксалиплатин (Rosell R., Cobo М., Isla D. et al. Applications of genomics in NSCLC. Lung Cancer 2005; 50 (Suppl 2): S 33-40.) Подобная закономерность была отмечена для целого ряда карцином, включая новообразования яичника, пищевода, желудка, толстой кишки, легкого и т.д. [Shirota Y., Stoehlmacher J., Brabender J. et al. ERCC1 and thymidylate synthase mRNA levels predict survival for colorectal cancer patients receiving combination oxaliplatin and fluorouracil chemotherapy. J Clin Oncol 2001; 19(23): 4298-304, Wamecke-Eberz U., Metzger R., Miyazono F. et al. High specificity of quantitative excision repair cross-complementing 1 messenger RNA expression for prediction of minor histopathological response to neoadjuvant radiochemotherapy in esophageal cancer. Clin Cancer Res 2004; 10(11): 3794-9, Joshi M.B., Shirota Y., Danenberg K.D. et al. High gene expression of TS1, GSTP1, and ERCC1 are risk factors for survival in patients treated with trimodality therapy for esophageal cancer. Clin Cancer Res 2005; 11(6): 2215-21, Lord R.V., Brabender J., Gandara D. et al. Low ERCC1 expression correlates with prolonged survival after cisplatin plus gemcitabine chemotherapy in non-small cell lung cancer. Clin Cancer Res 2002; 8(7): 2286-91].
Однако все вышеперечисленные методы могут быть использованы только для прогнозирования эффективности терапии определенными цитостатиками, что ограничивает их клиническое применение, а предложенные молекулярные маркеры ответа опухоли на химиотерапию в силу необходимости специального оборудования и реактивов, определяются далеко не в каждой клинической лаборатории.
Известны иммунологические методы прогнозирования эффективности лечения, основанные на количественном определении в сыворотке крови мембранных форм или растворимых форм мембранных антигенов лимфоцитов. Определение уровня таких белков в сыворотке крови больных позволяет прогнозировать эффективность лечения независимо от класса используемого цитостатика.
+
За прототип изобретения выбран способ прогнозирования эффективности химиотерапии у больных со злокачественными опухолями эпителиальных тканей, включающий исследование крови до и после лечения с количественным определением содержания CD50 антигена (Алясова А.В. Клинико-неврологические и клинико-иммунологические характеристики рака молочной железы: Автореф.…дис. д.м.н., Иваново, 2004, 43 с.).
Иммунофенотипирование мононуклеарных клеток периферической крови проводят с помощью метода непрямой иммунофлуоресценции (Воробьев В.Г., Новиков В.В., Лебедева А.И. Иммунодиагностика острых лейкозов. Н. Новгород, Изд-во НГМА, 1998, 96 с.). Для выделения мононуклеарных клеток периферической крови гепаринизированную кровь, разведенную на 1/3 средой 199, наслаивают на градиент фиколл-верографина (9 объемов крови на 3 объема градиента) и центрифугируют при 1700 об/мин в течение 40 минут при 20°C. Мононуклеарные клетки собирают из интерфазы, а затем трижды отмывают средой 199. При этом центрифугируют в течение 20 минут при 1200 об/мин.
6
На обезжиренное предметное стекло, предварительно покрытое парафилмом фирмы ′′American Can Company′′, имеющим круглые перфорации диаметром 7 мм, наносят по 20-50 мкл поли-L-лизина Serva в концентрации 50 мкг/мл. Предметное стекло помещают на 30 минут в термостат при температуре 37°C. Затем его отмывают физиологическим раствором, забуференным 0,01 молярным фосфатным буфером рН 7,4. Суспензию клеток в концентрации 2-10 кл/мл наносят по 40 мкл в лунки на предметное стекло. Предметное стекло выдерживают 30 минут при 37°C во влажной камере. Затем не прикрепившиеся к стеклу клетки отсасывают пипеткой и наносят в лунки раствор моноклональных антител (МКА) объемом 40 мкл. В контрольных образцах клетки обрабатывают физиологическим раствором взамен МКА.
Вновь инкубируют стекла при 37°C во влажной камере в течение 30 минут, после чего отмывают их в пяти порциях забуференного фосфатом физиологического раствора рН 7,4. На отмытые клетки наслаивают по 40 мкл ФИТЦ-меченных фрагментов козьих антител против мышиных иммуноглобулинов производства НПК ′′Препарат′′ и стекла инкубируют на льду во влажной камере в течение 30 минут. Затем стекла промывают в пяти порциях физиологического раствора, забуференного фосфатным буфером рН 7,4, заливают 50%-ным глицерином в физиологическом растворе и препарат закрывают предметными стеклами. Просмотр препаратов проводят с помощью люминесцентного микроскопа ЛЮМАМ-И2. Учитывают свечение при увеличении объектива x 40-100, окуляра x 2,5-10. Люминесценцию клеточной поверхности регистрируют визуально. В препарате просчитывали 200-300 клеток. Учитывают общее количество клеток и антиген-положительных клеток. Затем подсчитывают относительное содержание антиген-положительных клеток.
+
+
В результате проведенных исследований было показано, что изменение содержания CD50 клеток является устойчивым признаком, позволяющим прогнозировать исход заболевания. Снижение уровня этой популяции по окончании лечения не менее, чем в 1,2-1,6 раза, по сравнению с ее содержанием перед 1 курсом ПХТ, особенно на фоне угнетения иммунологической реактивности, свидетельствует о неэффективности проводимой терапии, возможности развития рецидива заболевания в ближайшие 4-5 месяцев или прогрессирования процесса на фоне введения цитостатиков. Напротив, в случаях повышения в процессе лечения исходно сниженного количества CD50 клеток отмечалось развитие стойкой ремиссии болезни.
Однако данный способ имеет ряд недостатков. Для его осуществления требуется достаточно длительное время, а также наличие специфического дорогостоящего оборудования - проточного цитофлюориметра и дорогостоящих реактивов.
Задачей предлагаемого изобретения является создание способа прогнозирования эффективности химиотерапии у больных со злокачественными новообразованиями эпителиальных тканей, которое лишено недостатков прототипа.
Поставленная задача решается тем, что в предлагаемом способе прогнозирования эффективности химиотерапии у больных со злокачественными новообразованиями эпителиальных тканей, включающем исследование крови до и после лечения, в сыворотке крови определяют уровень a1- и у-глобулинов и количественный уровень фосфора путем биохимического анализа плазмы крови до лечения и после первого курса химиотерапии и при повышении этих показателей a1-глобулинов - не менее чем в 1,2 раза, у-глобулинов - не менее чем в 1,4-1,5 раза, уровня фосфора - не менее чем в 3 раза прогнозируют эффективность применения цитостатиков.
Предлагаемое изобретение отвечает критериям «новизна» и «изобретательский уровень», т.к. в процессе проведения патентно-информационного исследования не выявлены источники патентной и научно-технической информации, которые бы порочили новизну изобретения, равно как и технических решений с существенными признаками предлагаемого способа.
Известно, что концентрация общего белка в сыворотке в норме - 65-85 г/л.
Концентрация общего белка в сыворотке зависит главным образом от синтеза и распада двух основных белковых фракций - альбумина и глобулинов. Физиологическая роль белков крови многогранна:
- поддерживают коллоидно-онкотическое давление, сохраняя объем крови, связывая воду и задерживая ее, не позволяя выходить из кровеносного русла;
- принимают участие в процессах свертывания крови;
- поддерживают постоянство рН крови, являясь одной из буферных систем крови;
- соединяясь с рядом веществ (холестерин, билирубин и др.), а также с лекарственными препаратами, доставляют эти вещества к тканям;
- поддерживают нормальный уровень катионов - кальция, железа, меди, магния в крови, образуя с ними недиализируемые соединения;
- играют важнейшую роль в иммунных процессах;
- служат резервом аминокислот;
- выполняют регулирующую функцию, входя в состав гормонов, ферментов и других биологически активных веществ.
Синтез белков плазмы крови осуществляется в основном в клетках печени и ретикулоэн-дотелиальной системы. При анализе содержания общего белка в сыворотке различают нормальный его уровень, пониженный (гипопротеинемию) и повышенный (гиперпротеинемию).
Гипопротеинемия возникает вследствие:
- недостаточного введения белка (при длительном голодании или при продолжитель ном соблюдении безбелковой диеты);
- повышенной потери белка (при различных заболеваниях почек, кровопотерях, ожогах, новообразованиях, сахарном диабете, асците);
- нарушения образования белка в организме: при недостаточности функции печени (гепатиты, циррозы, токсические повреждения), длительном лечении кортикостероидами, нарушении всасывания (при энтеритах, энтероколитах, панкреатитах);
- сочетания различных из перечисленных выше факторов.
Гиперпротеинемия нередко развивается вследствие дегидратации в результате потери части внутрисосудистой жидкости. Это происходит при тяжелых травмах, обширных ожогах, холере. При острых инфекциях содержание общего белка часто повышается вследствие дегидратации и одновременного возрастания синтеза белков острой фазы. При хронических инфекциях содержание общего белка в крови может нарастать в результате активации иммунологического процесса и повышенного образования иммуноглобулинов. Гиперпротеинемия наблюдается также при появлении в крови парапротеинов - патологических белков, вырабатываемых в большом количестве при миеломной болезни, при болезни Вальденстрема.
Определение общего белка позволяет оценить тяжесть нарушения белкового обмена у больного и назначить адекватную терапию.
Концентрация альбумина в сыворотке крови в норме - 35-50 г/л (3,5-5,0 г/дл).
Содержание альбумина в сыворотке крови составляет около 60% общего белка. Онкотическое давление плазмы на 65-80% обусловлено альбумином. Альбумины выполняют важную функцию по транспортировке многих биологически активных веществ, в частности гормонов. Они способны связываться с холестерином, билирубином. Значительная часть кальция крови также связана с альбумином. Альбумины способны соединяться с различными лекарственными веществами.
Белковые фракции сыворотки
Для разделения белковых фракций используют метод электрофореза, основанный на различной подвижности белков сыворотки в электрическом поле. Это исследование в диагностическом отношении более информативно, чем определение только общего белка или альбумина. Однако исследование на белковые фракции позволяет судить о характерном для какого-либо заболевания избытке или дефиците белка только в самой общей форме. Методом электрофореза на ацетат-целлюлозной пленке белки сыворотки делятся на фракции (табл. 1). Анализ фореграмм белков позволяет установить, за счет какой фракции у больного имеется увеличение или дефицит белка, а также судить о специфичности изменений, характерных для данной патологии.
Изменения фракции альбуминов. Увеличения абсолютного содержания альбуминов, как правило, не наблюдается.
Изменения фракции a1-глобулинов. Основными компонентами данной фракции являются a1-антитрипсин, a1-липопротеид, кислый a1-гликопротеид.
Увеличение фракции a1-глобулинов наблюдается при острых, подострых, обострении хронических воспалительных процессов; поражении печени; всех процессах тканевого распада или клеточной пролиферации.
Снижение фракции a1-глобулинов наблюдается при дефиците а1-антитрипсина, гипо-a1-липопротеидемии.
Изменения фракции а2-глобулинов. а2-фракция содержит а2-макроглобулин, гаптоглобин, аполипопротеины А, В, С, церулоплазмин.
Увеличение фракции а2-глобулинов наблюдается при всех видах острых воспалительных процессов, особенно с выраженным экссудативным и гнойным характером (пневмония, эмпиема плевры, другие виды гнойных процессов); заболеваниях, связанных с вовлечением в патологический процесс соединительной ткани (коллагенозы, аутоиммунные заболевания, ревматические заболевания); злокачественных опухолях; в стадии восстановления после термических ожогов; нефротическом синдроме; гемолизе крови в пробирке.
Снижение фракции а2-глобулинов наблюдается при сахарном диабете, панкреатитах (иногда), врожденной желтухе механического происхождения у новорожденных, токсических гепатитах.
К а-глобулинам относится основная масса белков острой фазы. Увеличение их содержания отражает интенсивность стрессорной реакции и воспалительных процессов при перечисленных видах патологии.
Изменения фракции бета-глобулинов. Бета-фракция содержит трансферрин, гемопексин, компоненты комплемента, иммуноглобулины и липопротеиды.
Рост фракции бета-глобулинов выявляют при первичных и вторичных гиперлипопротеидемиях (особенно II типа), заболеваниях печени, нефротическом синдроме, кровоточащей язве желудка, гипотиреозе.
Пониженные величины содержания бета-глобулинов выявляются при гипо-бета-липо-протеинемии.
Изменения фракции у-глобулинов. у-фракция содержит иммуноглобулины G, А, М, D, Е. Поэтому повышение содержания у-глобулинов отмечается при реакции системы иммунитета, когда происходит выработка антител и аутоантител: при вирусных и бактериальных инфекциях, воспалении, коллагенозе, деструкции тканей и ожогах. Значительная гипер-у-глобулинемия, отражая активность воспалительного процесса, характерна для хронических активных гепатитов и циррозов печени. Повышение фракции у-глобулинов наблюдается у 88-92% больных хроническим активным гепатитом, причем значительное повышение (до 26 г/л и выше) - у 60-65% больных. Почти такие же изменения отмечаются у больных при высокоактивном циррозе печени, при далеко зашедшем циррозе, при этом нередко содержание у-глобулинов превышает содержание альбуминов, что является плохим прогностическим признаком
При определенных заболеваниях могут наступить нарушения в синтезе у-глобулинов, и в крови появляются патологические протеины - парапротеины, которые регистрируются на фореграмме. Для уточнения характера этих изменений требуется проведение иммуноэлектрофореза. Такие изменения фореграмм отмечаются при миеломной болезни, болезни Вальденстрема.
Повышение содержания в крови у-глобулинов, кроме уже названных, может сопровождать следующие заболевания: ревматоидный артрит, системная красная волчанка, хронический лимфолейкоз, эндотелиомы, остеосаркомы, кандидомикоз.
Уменьшение содержания у-глобулинов бывает первичным и вторичным. Различают три основных вида первичных гипо-у-глобулинемий: физиологическую (у детей в возрасте 3-5 мес), врожденную и идиопатическую. Причинами вторичных гипо-у-глобулинемий могут быть многочисленные заболевания и состояния, приводящие к истощению иммунной системы.
Сопоставление направленности изменений содержания альбуминов и глобулинов с изменениями общего содержания белка дает основание для заключения, что гиперпротеинемия чаще связана с гиперглобулинемиями, в то время как гипопротеинемия чаще связана с гипоальбуминемией.
Кислый a1-гликопротеин в сыворотке. Содержание кислого a1-гликопротеина в сыворотке в норме составляет 13,4-34,1 мкмоль/л.
Кислый a1-гликопротеин (орозомукоид) - белок плазмы крови, наиболее богатый углеводами. Обладает способностью ингибировать активность протеолитических ферментов, изменять адгезивность тромбоцитов, подавлять иммунореактивность, связывать многие медикаменты (пропранолол) и некоторые гормоны (прогестерон).
Орозомукоид относится к белкам острой фазы. Его синтез, как реактанта острой фазы, стимулируется липополисахаридами, высвобожденными из макрофагов, активированных интерлейкином-6. Содержание орозомукоида в крови увеличивается при воспалительных процессах (инфекции, ревматические заболевания, травмы, хирургические вмешательства), опухолях. Исследование этого показателя в динамике позволяет оценивать динамику протекания воспалительного процесса, а при опухолях, в случае их оперативного лечения, диагностировать возникновение рецидива.
Снижение содержания орозомукоида может быть выявлено в раннем детском возрасте, при беременности (в ранние сроки), тяжелых поражениях печени, нефротическом синдроме, приеме эстрогенов, контрацептивов.
a1-антитрипсин. Уровень активности а1-антитрипсина в норме у мужчин 2,1-3,5 кЕД/л, у женщин - 2,4-3,8 кЕД/л.
а1-антитрипсин является гликопротеидом, синтезируемым печенью. Функционально он обеспечивает 90% активности, ингибирующей трипсин в крови. Этот гликопротеид тормозит действие не только трипсина, но и химотрипсина, эластазы, калликреина, катепсинов и других ферментов тканевых протеаз.
Содержание а1-антитрипсина в сыворотке крови повышается при воспалительных процессах: острых, подострых и хронических инфекционных заболеваниях, острых гепатитах и циррозе печени в активной форме, некротических процессах, состояниях после операции, в восстановительной фазе термических ожогов, при вакцинации, остром и хроническом панкреатите.
Содержание а1-антитрипсина в сыворотке крови повышается при злокачественных новообразованиях: раке (особенно шейки матки) и метастазах, лимфоме (особенно лимфогранулематозе).
Выраженный врожденный дефицит a1-антитрипсина часто сочетается с ювенильной базальной эмфиземой легких, муковисцидозом.
Приобретенный дефицит а1-антитрипсина встречается при нефротическом синдроме, гастроэнтеропатии с потерей белка, острой фазе термических ожогов. Снижение а1-антитрипсина в крови может быть у больных вирусным гепатитом вследствие нарушения его синтеза в печени. Повышенное расходование этого гликопротеида при респираторном дистресс-синдроме, остром панкреатите, коагулопатиях также приводит к снижению его содержания в крови.
Неорганический фосфор в сыворотке
Фосфор в организме содержится в составе неорганических (фосфаты кальция, магния, калия и натрия) и органических (углеводы, липиды, нуклеиновые кислоты и др.) соединений. Фосфор необходим для образования костей и клеточного энергетического обмена. Примерно 85% всего фосфора в организме находится в костях, большая часть остального количества - внутри клеток и только 1% - во внеклеточной жидкости. Фосфаты представляют собой главный внутриклеточный анион. В клеточных элементах крови фосфор встречается только в составе органических соединений, а в сыворотке крови содержатся в основном неорганические фосфаты, определение количества которых представляет наибольший интерес для клиники. Примерно 40% не использованного организмом фосфора выводится с калом, а остальное - с мочой. Нормальные величины содержания неорганического фосфора в сыворотке представлены в табл. 2.
Роль фосфорных соединений заключается в том, что они служат пластическим материалом, участвуют в регуляции кислотно-основного состояния и в различных процессах обмена углеводов, жиров и белков. Фосфор участвует в образовании нуклеиновых кислот, нуклеотидов, фосфолипидов и других соединений. Концентрация фосфора ниже 0,3 ммоль/л ведет к нарушению энергетического обмена клеток.
Гипофосфатемия
Гипофосфатемия может возникать вследствие нарушений всасывания фосфора в кишечнике, повышения его экскреции почками или перехода внутрь клеток. Тяжелая гипофосфатемия (менее 1 мг %, или менее 0,32 ммоль/л), как правило, указывает на снижение общего количества фосфата в организме и наблюдается при злоупотреблении алкоголем, респираторном алкалозе, нарушении всасывания в кишечнике, тяжелых ожогах, лечении диабетического кетоацидоза, переедании, приеме средств, связывающих фосфат.
Умеренная гипофосфатемия (1-2,5 мг %, или 0,32-0,80 ммоль/л) не всегда обусловлена истощением общих запасов фосфата. Кроме причин, перечисленных выше, ее могут вызывать: инфузия глюкозы, дефицит витамина D в пище или снижение его всасывания в кишечнике, повышенные потери фосфата через почки, что имеет место при гиперпаратиреозе, во время диуретической фазы острого тубулярного некроза, после пересадки почки, при наследственной гипофосфатемии, сцепленной с X-хромосомой Фанкони, паранеопластической остеомаляции и при увеличении объема внеклеточной жидкости.
Клинические проявления гипофосфатемии наблюдаются только при истощении общего запаса фосфата в организме и падении уровня фосфата в сыворотке ниже 1 мг % (менее 0,32 ммоль/л). Нарушения мышечной системы включают слабость, рабдомиолиз, сниженную функцию диафрагмы, дыхательную и застойную сердечную недостаточность. К неврологическим нарушениям относятся парестезии, дизартрия, спутанность сознания, ступор, судороги и кома. Изредка отмечаются гемолиз, тромбоцитопатия и метаболический ацидоз. Хроническая гипофосфатемия вызывает рахит у детей и остеомаляцию у взрослых.
Гиперфосфатемия
Гиперфосфатемия чаще всего обусловлена почечной недостаточностью, но она встречается и при гипопаратиреозе, псевдогипопаратиреозе, рабдомиолизисе, распаде опухоли, метаболическом и респираторном ацидозе, а также после введения избытка фосфора. Гиперфосфатемия встречается при акромегалии, гипервитаминозе D, костных заболеваниях (множественная миелома, заживление переломов), сахарном диабете, болезни Иценко-Кушинга, иногда при аддисоновой болезни, при токсикозах беременности, усиленной мышечной работе. Период заживления костных переломов сопровождается гиперфосфатемией, что является благоприятным признаком. Гиперфосфатемия при нефритах и нефрозах (10-20 мг %) - один из неблагоприятных прогностических признаков; часто заболевание сопровождается понижением резервной щелочности.
Клинические проявления гиперфосфатемии обусловлены гипокальциемией и эктопической кальцификацией мягких тканей, включая кровеносные сосуды, роговицу, кожу, почки и периартикулярную ткань. Хроническая гиперфосфатемия способствует развитию почечной остеодистрофии.
Определение концентрации фосфора в крови чаще всего назначается при нарушениях обмена кальция.
Отличительные признаки, а именно определение в сыворотке крови уровней a1- и у-глобулинов, количественного уровня фосфора до лечения и после первого курса химиотерапии, а также изменения этих показателей проявили в заявляемой совокупности новые свойства, явным образом не вытекающие из уровня техники в данной области и не очевидные для специалиста. Идентичной совокупности признаков в проанализированной литературе не обнаружено.
Предлагаемый способ поясняется графическим материалом - фиг. 1-3.
На фиг. 1 показано содержание al-глобулинов в плазме крови больных с рецидивом злокачественных новообразований: рак толстого кишечника до лечения, рак мочевого пузыря до лечения; после 1-го курса химиотерапии при наличии объективного эффекта терапии: рак толстого кишечника; рак мочевого пузыря; после 1-го курса химиотерапии при прогрессии заболевания: рак толстого кишечника; рак мочевого пузыря
* - различия с показателями контрольной группы статистически значимы (р<0,05)
На фиг. 2 показано содержание у-глобулинов в плазме крови больных с рецидивом злокачественных новообразований: рак толстого кишечника до лечения; рак мочевого пузыря до лечения; после 1-го курса химиотерапии при наличии объективного эффекта терапии: рак толстого кишечника; рак мочевого пузыря; после 1-го курса химиотерапии при прогрессии заболевания: рак толстого кишечника; рак мочевого пузыря
* - различия с показателями контрольной группы статистически значимы (р<0,05)
На фиг. 3 - содержание фосфора в плазме крови больных с рецидивом злокачественных новообразований: рак толстого кишечника до лечения; рак мочевого пузыря до лечения; после 1-го курса химиотерапии при наличии объективного эффекта терапии: рак толстого кишечника; рак мочевого пузыря; после 1-го курса химиотерапии при прогрессии заболевания: рак толстого кишечника; рак мочевого пузыря
* - различия с показателями контрольной группы статистически значимы (р<0,05)
Предлагаемое изобретение обеспечивает при использовании следующий технический эффект:
- снижение времени осуществления прогнозирования эффективности химиотерапии цитостатиками;
- уменьшение себестоимости производимой диагностики;
- увеличение чувствительности метода прогнозирования эффективности химиотерапии цитостатиками.
Способ является промышленно применимым, т.к. может быть использован в лечебных учреждениях онкологического профиля для оптимизации лечения злокачественных новообразований, прогнозирования течения заболевания и коррекции проводимой терапии.
Для подтверждения положительного эффекта исследованы и проанализированы образцы крови 14 больных с рецидивом рака эпителиальных тканей, подтвержденным гистологически, до лечения и после проведения первого курса химиотерапии. Первая группа включала пациентов с рецидивом рака толстого кишечника: 3 мужчин и 4 женщины в возрасте 57-62 лет. Все входящие в нее больные имели IV стадию заболевания. Вторая группа состояла из больных рецидивом рака мочевого пузыря: 5 мужчин и 2 женщин в возрасте 48-64 года. Все входящие в нее больные имели III стадию заболевания, установленную в соответствии с международной классификацией TNM.
Лечение при рецидиве рака толстого кишечника включало 8 курсов полихимиотерапии по схеме FOLFIRI: иринотекан, фторурацил, лейковорин, при раке мочевого пузыря - 6 курсов ПХТ по схеме CMV: карбоплатин, метотрексат, винбластин (Переводчикова Н.И., 2010). Пациенты обеих групп наблюдались на протяжении года и в зависимости от отдаленных результатов лечения были разделены на две подгруппы: с достигнутым объективным эффектом (частичный ответ или стабилизация) или прогрессией заболевания. Оценку результатов лечения опухоли проводили с помощью компьютерной томографии с использованием критериев RESIST (версия 1.0), исследование выполнялась до начала лечения и через каждые 8 недель на протяжении терапии и последующего наблюдения. Биохимические параметры плазмы крови - общий белок и белковые фракции, а также уровень макроэлементов оценивали на анализаторе ′′КонеЛаб 20/20i′′ (Финляндия). Статистическая обработка данных проводилась с использованием пакета программ Microsoft Excel, Biostat 4.3.
Проведенные исследования показали, что для прогнозирования эффективности химиотерапии важна совокупность следующих диагностических особенностей: содержания a1- и у-глобулинов и уровня фосфора в плазме крови после первого курса полихимиотерапии.
При оценке белкового гомеостаза плазмы крови после первого курса химиотерапии было обнаружено статистически значимое изменение уровня a1- и у-глобулинов, разнонаправленное в зависимости от последующей эффективности проводимой терапии. Так, при достижении объективного эффекта химиотерапии у больных с рецидивом рака толстого кишечника уже после 1 курса лечения наблюдалось увеличение уровня a1-глобулинов в 1,76 раза, а при рецидиве рака мочевого пузыря - в 1,2 раза. В случае последующей прогрессии заболевания в обеих группах было выявлено снижение содержания a1-глобулинов (фиг. 1).
Кроме того, в случаях последующего достижения частичного ответа или стабилизации опухолевого процесса в ответ на полихимиотерапию наблюдалось увеличение содержания у-глобулинов: в 1,42 раза при рецидиве рака толстого кишечника и в 1,59 раза при рецидиве рака мочевого пузыря (фиг. 2).
При анализе изменений уровней макроэлементов после проведения 1 курса полихимиотерапии в случае последующей успешности проведенного лечения в плазме крови значительно (в 3,97 раза у больных рецидивом рака толстого кишечника и 3,51 раза у больных рецидивом рака мочевого пузыря) возрастает уровень фосфора (табл. 3).
Известно, что химиотерапевтические препараты воздействуют на опухолевые клетки, вызывая в них апоптоз или некроз. Это иммуногенные процессы, сопровождающиеся освобождением воспалительных медиаторов. В случае успешности химиотерапии разрушению злокачественных клеток будет сопутствовать развитие воспалительной реакции организма. Именно этим может быть обусловлен рост уровня у-глобулинов - продуктов дифференцированных В-клеток, осуществляющих гуморальное звено иммунного ответа. Одновременно происходит активация различных тканевых протеаз, и вследствие адаптивной реакции в крови закономерно увеличивается содержания белков, ингибирующих их активность: a1-антитрипсина и кислого a1-гликопротеина, которые входят во фракцию a1-глобулинов. Активно пролиферирующие малигнизированные клетки характеризуются высокой удельной концентрацией фосфора, входящего в состав нуклеиновых кислот, который при их разрушении под действием химиопрепаратов попадает в кровь. Кроме того, в ходе первичного или вторичного некроза (некроза после апоптоза) идет разрушение плазматической мембраны, в состав которой также входит значительное количество фосфолипидов. Все перечисленное, вероятно, и объясняет наблюдающийся феномен - повышение уровня фосфора в крови больных в случаях последующего достижения объективного эффекта. При неэффективности лечения и прогрессии заболевания наблюдается противоположный эффект.
Представленные данные свидетельствуют о том, что предлагаемый способ прогноза эффективности химиотерапии в короткие сроки позволяет установить чувствительность пациентов к используемым цитостатикам с тем, чтобы в зависимости от полученных результатов либо продолжить их введение, либо выбрать другую схему лечения. Способ имеет низкую себестоимость диагностического исследования, что делает доступным его широкое использования в клинике.
Способ прогнозирования эффективности химиотерапии у больных со злокачественными новообразованиями эпителиальных тканей осуществляют следующим образом.
С помощью биохимического анализа исследуют плазму крови до лечения и после первого курса химиотерапии. Для этого у пациента «натощак» берут венозную кровь и получают из нее сыворотку в количестве 2,0 мл. Помещают в автоматический анализатор Конелаб. Измерение показателей проводят в автоматическом режиме согласно инструкции к прибору. Определяют уровень a1- и у-глобулинов и количественный уровень фосфора. При повышении a1-глобулинов не менее чем в 1,2 раза, у-глобулинов не менее чем в 1,4-1,5 раза, уровня фосфора не менее чем в 3 раза прогнозируют эффективность применения цитостатиков.
Пример конкретного исполнения дан в виде выписок из истории болезни.
Пример 1. Пациентка Б., 60 лет, рецидив рака толстого кишечника (IV стадия заболевания, установленная в соответствии с международной классификацией TNM). Диагноз заболевания подтвержден гистологически. При проведении биохимического анализа крови на автоматическом селективном анализаторе ′′КонеЛаб 20/20i′′ (Финляндия) до лечения в плазме крови выявлены следующие показатели: a1-глобулины - 4,02%;
у-глобулины - 16,53%; содержание фосфора - 1,08 мМ/л.
Лечение включало 8 курсов полихимиотерапии по схеме FOLFIRI: иринотекан, фторурацил, лейковорин. После первого курса полихимиотерапии произошло увеличение вышеприведенных показателей: a1-глобулины - 6,06%; у-глобулины - 34,05%; содержание фосфора - 5,3 мМ/л. Оценку результатов лечения опухоли проводили с помощью компьютерной томографии с использованием критериев RESIST (версия 1.0), исследование выполнялась до начала лечения и через каждые 8 недель на протяжении терапии и последующего наблюдения. Пациентка наблюдалась на протяжении года. По прошествии этого времени у пациентки выявлена частичная регрессия опухолевых очагов.
Пример 2. Пациент Т., 57 лет, рецидив рака мочевого пузыря (III стадия заболевания, установленная в соответствии с международной классификацией TNM). Диагноз заболевания подтвержден гистологически. При проведении биохимического анализа крови на автоматическом селективном анализаторе ′′КонеЛаб 20/20i′′ (Финляндия) до лечения в плазме крови выявлены следующие показатели: a1-глобулины - 5,43%; у-глобулины - 20,44%; содержание фосфора - 1,2 мМ/л. Лечение 6 курсов ПХТ по схеме CMV: карбоплатин, метотрексат, винбластин. После первого курса полихимиотерапии произошло снижение вышеприведенных показателей: a1-глобулины - 3,98%; у-глобулины - 18,5%; содержание фосфора - 0,7 мМ/л. Оценку результатов лечения опухоли проводили с помощью компьютерной томографии с использованием критериев RESIST (версия 1.0), исследование выполнялась до начала лечения и через каждые 8 недель на протяжении терапии и последующего наблюдения. Пациент наблюдался на протяжении года. По прошествии этого времени была выявлена прогрессия опухолевого процесса.