СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ЛЕЧЕНИЯ РЕВМАТОИДНОГО АРТРИТА ПРЕПАРАТОМ ОЛОКИЗУМАБ НА ОСНОВЕ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ
METHOD FOR PREDICTION OF EFFECTIVENESS OF TREATMENT OF RHEUMATOID ARTHRITIS WITH DRUG OLOKIZUMAB BASED ON GENOTYPING

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к медицине, а именно к генетике и ревматологии, и может быть использовано для прогнозирования эффективности лечения препаратом олокизумаб у пациентов с ревматоидным артритом.
Уровень техники
Ревматоидный артрит представляет собой хроническое системное воспалительное заболевание соединительной ткани с прогрессирующим поражением суставов и аутоиммунными нарушениями. В настоящее время число больных аутоиммунными артритами достигает почти 1% населения мира, что делает его актуальной проблемой современного здравоохранения [Scherer, H.U.; Häupl, T.; Burmester, G.R. The etiology of rheumatoid arthritis. J. Autoimmun. 2020, 110, 102400.]. Характерной особенностью ревматоидного артрита является выраженный клинический полиморфизм, заключающийся в широкой вариабельности симптомов и клинических форм. В настоящее время ревматоидный артрит рассматривают как мультифакториальное заболевание, которое развивается при наличии генетической предрасположенности и провоцирующих факторов внешней среды [Karami, J.; Aslani, S.; Jamshidi, A.; Garshasbi, M.; Mahmoudi, M. Genetic implications in the pathogenesis of rheumatoid arthritis; an updated review. Gene 2019, 702, 8–16].
PTPN22
CTLA4
PADI4
ILF3, TYK2, IL20RB, TNFAIP3
На данный момент наиболее изучен вклад аллелей системы HLA в генетическую предрасположенность к развитию ревматоидного артрита, на основании которой можно выделять группы повышенного риска развития заболевания. В первую очередь это аллели HLA-DRB1, которые кодируют неблагоприятные варианты SE-эпитопа и связаны с развитием ревматоидного артрита с высоким уровнем антицитруллиновых антител (АЦА-позитивный ревматоидный артрит). Эти аллели обуславливают 18% наследственной компоненты АЦА-позитивного ревматоидного артрита и лишь 2,4% АЦА-негативного ревматоидного артрита. Патологические аллели SE-эпитопа HLA-DRB1 встречаются у 64-70% пациентов с ревматоидным артритом, 55% их здоровых родственников, но только у 35% индивидуумов в среднем в популяции [Castro-Santos, P.; Díaz-Peña, R. Genetics of rheumatoid arthritis: a new boost is needed in Latin American populations. Rev. Bras. Reumatol. (English Ed. 2016, 56, 171–177.]. Секвенирование HLA-DRB1 показало, что в европейских популяциях у больных ревматоидным артритом по частоте преобладают аллели *04:01 и *04:04, в восточной Азии - *04:05.  Аллели *04:02 и 04:03 имеют протективное значение. Кроме этого эпитопа, аминокислотные замены в позициях 11 и 13 DR4 также ассоциированы с ревматоидным артритом (аллели *04:01/*04:04/*04:05 в сравнении с DR1 *01:01) [Okada, Y.; Kim, K.; Han, B.; Pillai, N.E.; Ong, R.T.-H.; Saw, W.-Y.; Luo, M.; Jiang, L.; Yin, J.; Bang, S.-Y.; et al. Risk for ACPA-positive rheumatoid arthritis is driven by shared HLA amino acid polymorphisms in Asian and European populations. Hum. Mol. Genet. 2014, 23, 6916–6926]. В каждом из 100 геномных локусов, не относящихся к HLA и показавшим ассоциацию с ревматоидным артритом по результатам геномных ассоциативных исследований, находится, в среднем, четыре потенциальных гена-кандидата (суммарно 377 генов). Из них лишь 19 генов-кандидатов в качестве маркеров предрасположенности демонстрируют аллели, связанные с аминокислотными заменами, которые могут влиять на функциональную активность кодируемого ими белка. В качестве основных генов-кандидатов у европеоидов идентифицированы  и , у азиатов – , также отношение шансов при статистическом анализе 1,4 и более показано для генов  и некоторых других [Korczowska I. Rheumatoid arthritis susceptibility genes: An overview (2014) World J Orthop; 5(4): 544-549.]. Существенное количество ассоциированных с ревматоидным артритом полиморфизмов выявлено в генах интерлейкинов и их рецепторов. Исследователями в различных странах мира проведена значительная экспериментальная и биоинформатическая работа для выяснения генетических причин развития ревматоидного артрита. Однако с точки зрения практической ревматологии не менее важным представляется вопрос о том, могут ли генетические детерминанты помочь в персонализации и увеличении эффективности лекарственного лечения этого заболевания.
IL6R
Первая линия терапии при ревматоидном артрите в большинстве случаев включает метотрексат. Уже на первой линии терапии может быть целесообразно применение фармакогенетических тестов для подбора индивидуальной дозировки и снижения вероятности токсических эффектов [Smolen, J.S.; Landewé, R.B.M.; Bijlsma, J.W.J.; Burmester, G.R.; Dougados, M.; Kerschbaumer, A.; McInnes, I.B.; Sepriano, A.; van Vollenhoven, R.F.; de Wit, M.; et al. EULAR recommendations for the management of rheumatoid arthritis with synthetic and biological disease-modifying antirheumatic drugs: 2019 update. Ann. Rheum. Dis. 2020, annrheumdis-2019-216655.]. Однако к концу второго года терапии у 45% пациентов с ревматоидным артритом развивается резистентность к метотрексату. При достижении резистентности к метотрексату в качестве второй и третьей линий терапии могут быть назначены таргетные DMARD-препараты: ингибиторы фактора некроза опухолей, интерлейкина 6, CD-20 B-лимфоцитов, а также костимулирующие факторы. Целесообразность применения DMARD-препаратов в монорежиме или в сочетании определяется на основе выраженности симптомов заболевания по истечении 3 и 6 месяцев с начала применения по клиническим оценочным шкалам [Singh, J.A.; Saag, K.G.; Bridges, S.L.; Akl, E.A.; Bannuru, R.R.; Sullivan, M.C.; Vaysbrot, E.; McNaughton, C.; Osani, M.; Shmerling, R.H.; et al. 2015 American College of Rheumatology Guideline for the Treatment of Rheumatoid Arthritis. Arthritis Care Res. (Hoboken). 2016, 68, 1–25.]. Вторая линия терапии предполагает использование дорогостоящих препаратов, при этом доля резистентных случаев оценивается на уровне 30-40%. Вместе с тем, индивидуальные генетические особенности пациента могут влиять на фармакогенетику и фармакодинамику DMARD-препаратов, выраженность ответа на терапию и развитие побочных эффектов при лечении ревматоидного артрита. В настоящее время уже 18 белков, кодируемых ассоциированными с ревматоидным артритом генами, являются мишенями для одобренных регулирующими государственными органами препаратов, которые предназначены для лечения аутоиммунных заболеваний [Yarwood, A.; Eyre, S.; Worthington, J. Genetic susceptibility to rheumatoid arthritis and its implications for novel drug discovery. Expert Opin. Drug Discov. 2016, 11, 805–13.]. Сигнальный путь, запускаемый интерлейкином 6, является одним из основных провоспалительных каскадов при ревматоидном артрите и его ингибирование препаратами тоцилизумаб, сарилюмаб и некоторыми другими приводит к выраженному терапевтическому эффекту. Однако чувствительность к тоцилизумабу может различаться, например, вследствие замены аспарагина на аланин в 358 кодоне гена , который сдвигает равновесие и увеличивает относительную концентрацию растворимой формы рецептора на 35% [Maldonado-Montoro, M.; Cañadas-Garre, M.; González-Utrilla, A.; Ángel Calleja-Hernández, M. Influence of IL6R gene polymorphisms in the effectiveness to treatment with tocilizumab in rheumatoid arthritis. Pharmacogenomics J. 2018, 18, 167–172.]. При определении локусов (полиморфизмов), связанных с ревматоидным артритом, необходимо учитывать популяционные особенности частот аллелей и генотипов, их ассоциации с клиническими параметрами, присутствующими в рекомендациях профильных медицинских ассоциаций.
Одним из эффективных ингибиторов сигнального пути IL6/IL6R является олокизумаб (Olokizumab). Препарат разработан в рамках лицензионного соглашения с бельгийской фармацевтической компанией UCB Pharma S.A. и выведен российской группой компаний «Р-Фарм» на международный уровень. Олокизумаб – моноклональное антитело, которое блокирует сборку лиганд-рецепторного комплекса IL6/IL6R [Serio I, Tovoli F. Rheumatoid arthritis: new monoclonal antibodies. Drugs Today (Barc). 2018 Mar;54(3):219-230.]. В настоящее время проходят испытания III фазы CREDO (Clinical Rheumatoid Arthritis Development for Olokizumab) в России, Европе, США и Азии. Среди опубликованных источников не обнаружены данные о возможных генетических предикторах ответа на олокизумаб или побочных эффектов препарата.
CYP1B1, CYP2C9, ESR2, FCGR3A
SHBG
ESR1
Известен способ одновременного генотипирования десятков полиморфизмов (SNP), ассоциированных с тяжестью клинического проявления ревматоидного артрита и лабораторными показателями при этом заболевании. Так, 41 SNP были охарактеризованы как система маркеров, ассоциированная с эррозивным поражением суставов. Из них полиморфизмы в генах  и  чаще встречались у пациентов с высоким уровнем ревматоидного фактора. Они были ассоциированы с тяжестью поражения суставов как по данным мета-анализа (р = 0.004, 0.0007, 0.0002, 0.013 и 0.015), так и по данным регистра DREAM (р = 0.000081, 0.0022, 0.00074, 0.0067 и 0.0087). Три гаплотипа гена  имели в этой системе протективное значение (р = 0.009, 0.002 и 0.002). Таким образом, была предложена система SNP, ассоциированная с тяжестью поражения суставов у больных серопозитивным ревматоидным артритом [Sánchez-Maldonado JM, Cáliz R, Canet L, Horst RT, Bakker O, den Broeder AA, Martínez-Bueno M, Canhão H, Rodríguez-Ramos A, Lupiañez CB, Soto-Pino MJ, García A, Pérez-Pampin E, González-Utrilla A, Escudero A, Segura-Catena J, Netea-Maier RT, Ferrer MÁ, Collantes-Estevez E, López Nevot MÁ, Li Y, Jurado M, Fonseca JE, Netea MG, Coenen MJH, Sainz J. Steroid hormone-related polymorphisms associate with the development of bone erosions in rheumatoid arthritis and help to predict disease progression: Results from the REPAIR consortium. Sci Rep. 2019 Oct 15;9(1):14812. doi: 10.1038/s41598-019-51255-0.]. Недостатком данного метода является присутствие в системе только генов гормонов и их рецепторов без учета других генов-кандидатов, ограниченная предиктивная ценность (низкое отношение шансов) и применимость только к больным серопозитивным ревматоидным артритом.
NUBPL
Известен способ определения генетических полиморфизмов для прогнозирования ответа на препараты - ингибиторы фактора некроза опухолей. Способ опробован на 755 пациентах, получавших ифликсимаб (n = 397), этанерцепт (n = 155) и адалимумаб (n = 203). В качестве прогностического фактора ответа на этанерцепт выступает полиморфизм rs2378945 в гене , ассоциированный с неблагоприятным прогнозом (p = 0.003), для других препаратов – rs2378945, rs12142623, и rs4651370. Генотипирование осуществляется с помощью метода ПЦР и последующего удлинения внутренних праймеров с детекцией продуктов реакции на капиллярном секвенаторе в режиме фрагментного анализа  [Ferreiro-Iglesias A., Montes A., Perez-Pampin E., Canete J.D., Raya E., Magro-Checa C., Vasilopoulos Y., Caliz R., Ferrer M.A., Joven B., Carreira P., Balsa A., Pascual-Salcedo D., Blanco F.J., Moreno-Ramos M.J., Manrique-Arija S., Ordonez M.D., Alegre-Sancho J.J., Narvaez J., Navarro-Sarabia F., Moreira V., Valor L., Garcia-Portales R., Marquez A., Gomez-Reino J.J., Martin J., Gonzalez A. Evaluation of 12 GWAS-drawn SNPs as biomarkers of rheumatoid arthritis response to TNF inhibitors. A potential SNP association with response to etanercept. PLoS One. 2019; 14(2): e0213073. doi: 10.1371/journal.pone.0213073.].
Недостатком данного способа является ограниченный набор полиморфизмов, отсутствие ассоциативных маркеров на другие типы DMARD-препаратов, успешно применяемых для лечения ревматоидного артрита, в частности, олокизумаб.
Известен также способ генотипирования пациентов из группы риска по развитию ревматоидного артрита, реализованный в тест-системе HLA-ДНК-ТЕХ. В этой технологии осуществляется генотипирование аллелей локуса DRB1 методом мультипраймерной аллель-специфичной ПЦР в реальном времени (РУ № ФСР 2008/03891 от 27.09.2017 г.).  Исследование с использованием данного комплекта реагентов состоит из этапов выделения ДНК (пробоподготовки) и ПЦР-амплификации в режиме реального времени. В реакционную смесь для амплификации введены ДНК-зонды, каждый из которых несет флуоресцентную метку и гаситель флуоресценции. При образовании специфичного продукта ДНК-зонд разрушается, действие гасителя прекращается, что ведет к возрастанию уровня флуоресценции. Уровень флуоресценции пропорционален количеству специфических ампликонов и измеряется на каждом цикле ПЦР. Комплект реагентов включает реакционные смеси для типирования 13 групп аллелей DRB1: *01, *03, *04, *07, *08, *09, *10, *11, *12, *13, *14, *15, *16. Количество анализируемой ДНК должно быть не менее 1 нг, время проведения амплификации занимает от 2,5 часов. В результате удается выявить аллели, в частности, *04, ассоциированные с ревматоидным артритом и другими аутоиммунными заболеваниями.
Недостатком данного способа является анализ только локуса DRB1, что не позволяет определить неблагоприятные аллели, не относящиеся к HLA, но тем не менее связанные с развитием, клиническим течением и ответом на терапию ревматоидного артрита.
TNFA
Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ прогнозирования эффективности лечения ревматоидного артрита моноклональными антителами к ФНО-альфа на основе аллельного полиморфизма промотора гена ФНО (патент RU 2 485 511 C2). Способ основан на генотипировании полиморфизма в позиции -857 гена . При выявлении у пациента аллеля Т в гомо- или гетерозиготном состоянии прогнозируют высокую вероятность эффективности терапии препаратом инфликсимаб, в отличие от пациентов с генотипом С/С.
Недостатком прототипа является отсутствие в тест-системе других значимых полиморфизмов и генов-кандидатов ревматоидного артрита, кроме того, способ не предназначен для прогноза эффективности иных таргетных препаратов, в частности, олокизумаба.
Технической проблемой, на решение которой направлено изобретение, является определение предикторов развития эффективного клинического ответа на лечение олокизумабом у больных ревматоидным артритом, что позволило бы индивидуализировать терапию.
Раскрытие сущности изобретения
Техническим результатом предложенного изобретения является возможность прогнозирования эффективности применения препарата олокизумаб при лечении ревматоидного артрита на основании результатов молекулярно-генетического анализа.
IL1B
ABCC1
FPGS
IL6R
TNFRSF1A
AMPD1
PADI4
TLR5
ABCB1
IL17A
TNFAIP3
DHODH
IL1RN
IL2RB
IL18
STAT4
AIRE
IL2RA
IL1B
IL1B
ABCC1
FPGS
IL6R
TNFRSF1A
AMPD1
PADI4
TLR5
ABCB1
IL17A
IL17A
TLR5
IL1B
ABCC1
TNFAIP3
ABCB1
DHODH
IL1RN
IL2RB
IL18
PADI4
TNFRSF1A
PADI4
IL1B
IL1B
AMPD1
IL18
IL17A
STAT4
AIRE
IL2RA
PADI4
PADI4
PADI4
Указанный технический результат достигается за счет реализации способа, согласно которому осуществляют генотипирование 27 полиморфизмов в 18 генах: rs1143623, rs1143634 и rs16944 (); rs3784864 (), rs10987742 (), rs2228145 (), rs767455 и rs1800692 (), rs17602729 (), rs874881, rs2240336, rs1748032, rs2240335, rs11203367 и rs2301888 (), rs5744174 (), rs2032582 (), rs1974226 (), rs6920220 (), rs3213422 (), rs419598 (), rs3218253 (), rs360722 и rs360718 (), rs7574865 (), rs760426 (), rs2104286 (), распределяют полиморфизмы по трем группам, первая  из которых включает полиморфизмы rs1143623 (), rs16944 (), rs3784864 (), rs10987742 (), rs2228145 (), rs767455 (), rs17602729 (), rs2240336 (), rs5744174 (), rs2032582 (), rs1974226 (), ассоциированные с ранним ответом на лечение олокизумабом, вторая  – полиморфизмы rs1974226 (), rs5744174 (), rs16944 (), rs3784864 (), rs6920220 (), rs2032582 (), rs3213422 (), rs419598 (), rs3218253 (), rs360722 (), rs1748032 (), rs1800692 (), rs2301888 (), rs1143634 (),  ассоциированные с поздним ответом на лечение олокизумабом и третья – полиморфизмы rs1143634 (), rs17602729 (), rs360718 (), rs1974226 (), rs7574865 (), rs760426 (), rs2104286 (), rs874881 (), rs2240335 (), rs11203367 (), ассоциированные с гепатотоксичностью. Определяют генотипы для каждого из указанных полиморфизмов исследуемых генов и проводят оценку встречаемости ассоциированных аллелей в гомозиготном и гетерозиготном состояниях в соответствии с балльной шкалой, присваивая значения баллов в соответствии с таблицей 1. Рассчитывают суммы баллов К1, К2 и К3 для каждой из трех групп полиморфизмов, соответственно, и при полученных значениях К1>6 или К2>7 и при значении К3<5, прогнозируют высокую эффективность лечения препаратом олокизумаб.
Способ может применяться для оценки эффективности лечения препаратом у индивидов европеоидной расы, в частности, российских пациентов.
Осуществление изобретения
Ниже представлено более детальное описание реализации заявляемого изобретения, которое не ограничивает объем притязаний заявляемого изобретения, а демонстрирует возможность осуществления изобретения с достижением заявляемого технического результата.
IL1B, ABCC1, FPGS, IL6R, TNFRSF1A, AMPD1, PADI4, TLR5, ABCB1, IL17A, TNFAIP3, DHODH, IL1RN, IL2RB, IL18, STAT4, AIRE, IL2RA
IL1B
ABCC1
FPGS
IL6R
TNFRSF1A
AMPD1
PADI4
TLR5
ABCB1
IL17A
IL17A
TLR5
IL1B
ABCC1
TNFAIP3
ABCB1
DHODH
IL1RN
IL2RB
IL18
PADI4
TNFRSF1A
IL1B
AMPD1
IL18
IL17A
STAT4
AIRE
IL2RA
PADI4
На этапе пробоподготовки из образца периферической крови пациента с диагностированным ревматоидным артритом (объемом 1-4 мл) выделяют геномную ДНК в количестве не менее 10 нг/мкл одним из наборов, имеющих регистрационное удостоверение, например, ДНК-сорб-В (ФБУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора), Проба-Фиколл (ДНК-технология). Концентрацию полученного препарата ДНК измеряют на флуориметре, например, Qubit 2.0/3.0 с помощью набора реагентов, предназначенного для малых концентраций двухцепочной ДНК, например, Qubit dsDNA HS Assay. Далее проводят амплификацию библиотек с пулами праймеров, специфичных к анализируемым генам ,и комплектом реагентов Ion AmpliSeq™ Library Kit Plus, Ion Xpress™ Barcode Adapters 1-96 Kit согласно протоколам производителя (ThermoFisherScientific). Далее проводят подготовку и загрузку чипов на автоматической станции Ion Chef™ Instrument, высокопроизводительное секвенирование полученной амплификационной библиотеки осуществляют на полупроводниковом секвенаторе Ion S5™ System (ThermoFisherScientific). При этомособенность заявляемого способа заключается в том, что генотипируют не-HLA гены (полиморфизмы), которые собраны в группы в зависимости от конкретного прогностического клинического критерия. Первая группа включает полиморфизмы rs1143623 и rs16944 (), rs3784864 (), rs10987742 (), rs2228145 (), rs767455 (), rs17602729 (), rs2240336 (), rs5744174 (), rs2032582 () и rs1974226 (), показавшие ассоциацию с ранним ответом на олокизумаб на 12-ой неделе применения препарата. Вторая группа состоит из полиморфизмов, ассоциированных с поздним ответом на олокизумаб на 24-ой неделе лечения этим препаратом: rs1974226 (), rs5744174 (), rs16944 и rs1143634 (), rs3784864 (), rs6920220 (), rs2032582 (), rs3213422 (), rs419598 (), rs3218253 (), rs360722 (), rs1748032 и rs2301888 (), rs1800692 (). Третья группа полиморфизмов предназначена для оценки риска побочных эффектов (безопасности) олокизумаба и включает локусы, ассоциированные с гепатотоксичностью: rs1143634 (), rs17602729 (), rs360718 (), rs1974226 (), rs7574865 (), rs760426 (), rs2104286 (), а также rs874881, rs2240335 и rs11203367 (). Полиморфизмы, включенные в группы для оценки прогностических критериев, выбраны на основе предварительного исследования 125 образцов ДНК, полученных от пролеченных олокизумабом больных ревматоидным артритом после прогрессирования на фоне лечения метотрексатом (частично эти подгруппы перекрываются). Для расчета относительного риска при рецессивной модели наследования присваивают 1 балл гомозиготному ассоциированному генотипу, при других генотипах – 0 баллов. Если классифицирующим признаком является встречаемость аллеля, то при наличии ассоциированного аллеля присваивают 1 балл, при отсутствии – 0 баллов. Для каждой из совокупности полиморфизмов в группе раннего, позднего ответа и в группе по гепатотоксичности определен пороговый балл, при сравнении с которым делают вывод об эффективности терапии олокизумабом. В таблице 1 приведен состав групп тестируемых полиморфизмов, ассоциированных с клиническими характеристиками генотипов и их условные баллы для расчета прогноза эффективности олокизумаба.
Таблица 1. Полиморфизмы, тестируемые для прогноза эффективности лечения олокизумабом у больных ревматоидным артритом на второй линии терапии.
<b>Группа</b>
<b>Полиморфизм (ген)</b>
<b>Генотип</b>
<b>Балл</b>
<b>Сумма баллов</b>
<b>Пороговый балл</b>
Ранний ответ
rs1143623 (<i>IL1B</i>)
C/C
1
К1
6
rs16944 (<i>IL1B</i>)
G/G
1
rs3784864 (<i>ABCC1</i>)
G/*
1
rs10987742 (<i>FPGS</i>)
T/*
1
rs2228145 (<i>IL6R</i>)
A/A
1
rs767455 (<i>TNFRSF1A</i>)
C/*
1
rs17602729 (<i>AMPD1</i>)
G/G
1
rs2240336 (<i>PADI4</i>)
C/C
1
rs5744174 (<i>TLR5</i>)
A/A
1
rs2032582 (<i>ABCB1</i>)
C/*
1
rs1974226 (<i>IL17A</i>)
T/*
1
Поздний ответ
rs1974226 (<i>IL17A</i>)
T/*
1
К2
7
rs5744174 (<i>TLR5</i>)
A/A
1
rs16944 (<i>IL1B</i>)
G/G
1
rs3784864 (<i>ABCC1</i>)
G/*
1
rs6920220 (<i>TNFAIP3</i>)
G/G
1
rs2032582 (<i>ABCB1</i>)
C/*
1
rs3213422 (<i>DHODH</i>)
A/A
1
rs419598 (<i>IL1RN</i>)
C/*
1
rs3218253 (<i>IL2RB</i>)
G/G
1
rs360722 (<i>IL18</i>)
G/G
1
rs1748032 (<i>PADI4</i>)
T/*
1
rs1800692 (<i>TNFRSF1A</i>)
A/A
1
rs2301888 (<i>PADI4</i>)
A/*
1
rs1143634 (<i>IL1B</i>)
G/G
1
Гепатотоксичность
rs1143634 (<i>IL1B</i>)
G/G
1
К3
5
rs17602729 (<i>AMPD1</i>)
G/G
1
rs360718 (<i>IL18</i>)
C/C
1
rs1974226 (<i>IL17A</i>)
T/*
1
rs7574865 (<i>STAT4</i>)
T/T
1
rs760426 (<i>AIRE</i>)
G/G
1
rs2104286 (<i>IL2RA</i>)
C/C
1
rs874881 (<i>PADI4</i>)
G/G
1
rs2240335 (<i>PADI4</i>)
C/C
1
rs11203367 (<i>PADI4</i>)
T/*
1
где * - любой аллель
Пациентов, имеющих сумму баллов К1 в группе раннего ответа на олокизумаб и/или сумму баллов К2 в группе позднего ответа на олокизумаб выше порогового балла (значения), относят к группе предположительно высокой эффективности терапии олокизумабом при условии, что сумма баллов K3 в группе полиморфизмов, ассоциированных с гепатотоксичностью, меньше порогового балла и соблюдении действующих клинических рекомендаций профессиональных медицинских ассоциаций по назначению DMARD-препаратов.
Использование в клинической практике заявляемого способа позволяет достичь прогностического результата: генотипирование позволяет отобрать пациентов с прогрессией ревматоидного артрита после лечения метотрексатом и высокой вероятностью эффективного применения олокизумаба относительно среднепопуляционного уровня.
1/n
Аналитические чувствительность и специфичностьспособа определяли путем сравнения генотипов 100 больных ревматоидным артритом, резистентных к метотрексату и получающих олокизумаб, с результатами генотипирования методом секвенирования по Сэнгеру («золотым стандартом» определения герминальных полиморфизмов/мутаций). Для расчета нижней границы интервала, в котором находится «истинное» значение анализируемого показателя с доверительной вероятностью С = 90% использовалась следующая формула: (1-C/100) *100%, где: n – общее число исследуемых проб с истинно положительными (отрицательными) результатами реализации предложенного способа, подтвержденные с помощью секвенирования по Сэнгеру, C – доверительная вероятность, в данном исследовании принята равной 90%. Аналитические чувствительность и специфичность составили 100% (90% ДИ 97,72-100).
Диагностическую чувствительность определяли как долю пациентов, относящихся к группе предположительно высокой эффективности олокизумаба по результатам применения предложенного способа и показавших улучшение состояния по шкалам DAS28 и/или ACR20/50 при отсутствии признаков гепатотоксичности, к общему количеству пациентов со снижением интенсивности ревматоидного артрита по шкалам  DAS28 и/или ACR20/50 при отсутствии признаков гепатотоксичности к 24-ой неделе применения олокизумаба. Диагностическая чувствительность составила 87%.
Диагностическую специфичность определяли как долю образцов, относящихся к группе предположительно среднепопуляционной эффективности олокизумаба и/или повышенного риска гепатотоксичности по результатам применения предложенного способа и не показавших улучшение состояния по шкалам DAS28 (ACR20/50) и/или признаки гепатотоксичности, к общему количеству пациентов с отсутствием достоверного снижения интенсивности ревматоидного артрита по шкалам DAS28 (и/или ACR20/50), а также повышением уровня печеночных ферментов и признаками гепатотоксичности к 24-ой неделе применения олокизумаба. Диагностическая специфичность составила 72%.
Настоящее изобретение поясняется конкретными примерами выполнения, демонстрирующими возможность достижения требуемого технического результата.
Пример 1.
Пациент К., 54 лет, с диагнозом ревматоидный артрит серопозитивный М.05.08, прогрессирование на фоне лечения метотрексатом.
Метод исследования: высокопроизводительное секвенирование панели полиморфизмов, ассоциированных с эффективностью олокизумаба.
В результате исследования определены генотипы для каждого из указанных полиморфизмов исследуемых генов и проведена оценка встречаемости ассоциированных аллелей в гомозиготном и гетерозиготном состояниях в соответствии с балльной шкалой, представленной в таблице 1.
Определены следующие генотипы, представленные в Таблице 2.
Таблица 2.
<b>Группа</b>
<b>Полиморфизм</b>
<b>Генотип</b>
<b>Балл</b>
<b>Сумма баллов</b>
Ранний ответ
rs1143623
G/A
0
К1=6
rs16944
A/G
0
rs3784864
G/A
1
rs10987742
C/T
1
rs2228145
A/A
1
rs767455
T/T
0
rs17602729
A/A
0
rs2240336
C/T
0
rs5744174
A/A
1
rs2032582
A/C
1
rs1974226
C/T
1
Поздний ответ
rs1974226
C/T
1
<b>К2=9</b>
rs5744174
A/A
1
rs16944
A/G
0
rs3784864
G/A
1
rs6920220
G/G
1
rs2032582
A/C
1
rs3213422
A/C
0
rs419598
T/C
1
rs3218253
A/A
0
rs360722
A/A
0
rs1748032
C/T
1
rs1800692
A/A
1
rs2301888
G/A
1
rs1143634
G/A
0
Гепатотоксичность
rs1143634
G/A
0
К3=3
rs17602729
A/A
0
rs360718
C/C
1
rs1974226
C/T
1
rs7574865
T/G
0
rs760426
A/A
0
rs2104286
T/C
0
rs874881
G/C
0
rs2240335
C/A
0
rs11203367
T/C
1
Заключение: сумма баллов К2 для группы полиморфизмов, ассоциированных с поздним ответом на лечение олокизумабом, превышала пороговое значение, и сумма баллов К3 для группы полиморфизмов, ассоциированных с гепатотоксичностью, была меньше порогового значения, в связи с чем была спрогнозирована высокая эффективность терапии олокизумабом.
Пациенту был назначен олокизумаб в дозировке 64 мг каждые 2 недели подкожно. К 16-ой неделе применения препарата была достигнута низкая активность заболевания (DAS28 < 3.2). Негативных явлений не наблюдалось.
Пример 2.
Пациентка Н., 59 лет, с диагнозом ревматоидный артрит серопозитивный М.05.08, прогрессирование на фоне лечения метотрексатом.
Метод исследования: высокопроизводительное секвенирование панели полиморфизмов, ассоциированных с эффективностью олокизумаба.
В результате исследования определены генотипы для каждого из указанных полиморфизмов исследуемых генов и проведена оценка встречаемости ассоциированных аллелей в гомозиготном и гетерозиготном состояниях в соответствии с балльной шкалой, представленной в таблице 1.
Определены следующие генотипы, представленные в Таблице 3.
Таблица 3
<b>Группа</b>
<b>Полиморфизм</b>
<b>Генотип</b>
<b>Балл</b>
<b>Сумма баллов</b>
Ранний ответ
rs1143623
С/С
1
<b>К1=7 </b>
rs16944
G/G
1
rs3784864
G/A
1
rs10987742
C/T
1
rs2228145
A/A
1
rs767455
C/C
1
rs17602729
G/G
1
rs2240336
C/T
0
rs5744174
G/G
0
rs2032582
A/A
0
rs1974226
C/C
0
Поздний ответ
rs1974226
C/C
0
К2=7
rs5744174
G/G
0
rs16944
G/G
1
rs3784864
G/A
1
rs6920220
G/G
1
rs2032582
A/A
0
rs3213422
A/C
0
rs419598
T/T
0
rs3218253
G/G
1
rs360722
G/G
1
rs1748032
C/T
1
rs1800692
G/G
0
rs2301888
G/A
1
rs1143634
G/A
0
Гепатотоксичность
rs1143634
G/A
0
К3=2
rs17602729
G/G
1
rs360718
A/C
0
rs1974226
C/C
0
rs7574865
G/T
0
rs760426
A/A
0
rs2104286
T/T
0
rs874881
G/C
0
rs2240335
C/A
0
rs11203367
T/C
1
Заключение: сумма баллов К1 для группы полиморфизмов, ассоциированных с ранним ответом на лечение олокизумабом, превышала пороговое значение, и сумма баллов К3 для группы полиморфизмов, ассоциированных с гепатотоксичностью, была меньше порогового значения, в связи с чем была спрогнозирована высокая эффективность терапии олокизумабом.
Пациенту был назначен олокизумаб в дозировке 64 мг каждые 2 недели подкожно.  Выраженный эффект развивался через 12 недель от начала введения препарата и сохранялся на протяжении всего периода лечения (24 недели). В ходе лечения была достигнута низкая активность заболевания (DAS28 < 3.2).
Пример 3.
Пациентка Р., 35 лет, с диагнозом ревматоидный артрит серопозитивный М.05.08, прогрессирование на фоне лечения метотрексатом.
Метод исследования: высокопроизводительное секвенирование панели полиморфизмов, ассоциированных с эффективностью олокизумаба.
В результате исследования определены генотипы для каждого из указанных полиморфизмов исследуемых генов и проведена оценка встречаемости ассоциированных аллелей в гомозиготном и гетерозиготном состояниях в соответствии с балльной шкалой, представленной в таблице 1.
Определены следующие генотипы, представленные в  Таблице 4.
Таблица 4
<b>Группа</b>
<b>Полиморфизм</b>
<b>Генотип</b>
<b>Условный балл</b>
<b>Сумма баллов</b>
Ранний ответ
rs1143623
С/С
1
К1=6
rs16944
A/G
0
rs3784864
G/A
1
rs10987742
C/T
1
rs2228145
A/С
0
rs767455
T/С
1
rs17602729
G/G
1
rs2240336
C/C
1
rs5744174
A/G
0
rs2032582
A/A
0
rs1974226
C/C
0
Поздний ответ
rs1974226
C/C
0
К2=6
rs5744174
A/G
0
rs16944
A/G
0
rs3784864
G/A
1
rs6920220
G/G
1
rs2032582
A/A
1
rs3213422
A/A
0
rs419598
T/T
0
rs3218253
G/G
1
rs360722
G/G
1
rs1748032
C/C
0
rs1800692
A/G
0
rs2301888
G/G
0
rs1143634
G/G
1
Гепатотоксичность
rs1143634
G/G
1
<b>К3=5 </b>
rs17602729
G/G
1
rs360718
A/C
0
rs1974226
C/C
0
rs7574865
G/G
0
rs760426
A/A
0
rs2104286
T/T
0
rs874881
G/G
1
rs2240335
C/C
1
rs11203367
T/T
1
Заключение: сумма баллов К1, К2 для групп полиморфизмов, ассоциированных с ранним и поздним ответом на лечение олокизумабом, соответственно, не превышала пороговое значение, и сумма баллов для группы полиморфизмов, ассоциированных с гепатотоксичностью, была равна пороговому значению, в связи с чем была спрогнозирована эффективность терапии олокизумабом, не превышающая среднепопуляционные характеристики.
Пациенту был назначен олокизумаб в дозировке 64 мг каждые 2 недели подкожно.  Однако в ходе лечения лишь к 24 недели были достигнуты показатели, соответствующие умеренной активности заболевания (DAS28=3,5).
Таким образом, использование предлагаемого способа позволяет спрогнозировать клинический ответ на лечение олокизумабом. Данный способ может быть использован для персонализированного подбора терапии для больных ревматоидным артритом, в частности, в российской популяции.