СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ КЛЕТОК ФИБРОБЛАСТОВ, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРАНСПЛАНТАТА НА ИХ ОСНОВЕ И СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ ТРАНСПЛАНТАТА

2
1. Способ выделения клеток фибробластов, заключающийся в том, что производят забор тканей кожи, полученный биоптат промывают в физиологическом растворе, дополненном человеческим альбумином, промытый биоптат подвергают обработке раствором диспазы в культуральной среде Игла в модификации Дюльбеко с содержанием глюкозы 1 г/л (ДМЕМ-LG) до отделения пленки эпидермиса от дермы, полученную дерму промывают ДМЕМ-LG и механически измельчают, фрагменты дермы распределяют по чашке Петри и заливают ДМЕМ-LG, дополненной эмбриональной телячьей сывороткой (ЭТС), раствором заменимых аминокислот (MEM NEAA) и антибиотиками, культивируют клетки, периодически сменяя культуральную среду, после того как фибробласты мигрируют из фрагментов и заполнят всю поверхность дна чашки, их снимают ферментом и отмывают культуральной средой от фермента, пропускают через фильтр и осаждают центрифугированием, клеточный осадок суспендируют в ростовой среде и высевают на культуральные флаконы, помещают в CO-инкубатор и после достижения конфлуэнтного монослоя клетки снимают ферментом, осаждают и пассируют до необходимого терапевтического количества.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что забор тканей кожи осуществляют в объеме не более 2 мм/1 мм/1 мм.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что полученный забором биоптат промывают в физиологическом растворе с человеческим альбумином в концентрации последнего 1%.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что применяемый для обработки раствор диспазы имеет концентрацию 0,1%.
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что обработку биоптата раствором диспазы в ДМЕМ-LG проводят в течение 3 часов на орбитальном шейкере при постоянном покачивании при температуре 37°C.
6. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют чашку Петри, имеющую диаметр 6 см.
7. Способ по п.1, отличающийся тем, что применяют эмбриональную сыворотку теленка (ЭСТ) с концентрацией 15% по объему добавляемой сыворотки.
2
8. Способ по п.1, отличающийся тем, что культивирование клеток проводят при температуре 37°C и при 5% концентрации CO в воздухе.
9. Способ по п.1, отличающийся тем, что при культивировании клеток культуральную среду сменяют каждые трое суток.
10. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве фермента используют ЭДТА с добавлением трипсина в концентрации 0,05%.
11. Способ по п.1, отличающийся тем, что для культивирования клеток в качестве антибиотика применяется пенициллин или стрептомицин или амфотерицин.
12. Способ по п.1, отличающийся тем, что для удаления волокон после культивирования производят фильтрацию через фильтр, имеющий размер фильтрующей ячейки 80-100 мкм.
6
2
13. Способ по п.1, отличающийся тем, что клеточный осадок высевают на культуральные флаконы из расчета 1×10 клеток/см.
14. Способ создания биотрансплантата, заключающийся в том, что после финального пассирования клетки, полученные способом по п.1, переводят на культивирование в среде с собственной сывороткой крови пациента (ССКП) или в терапевтической среде AIM-V (Gibco), фибробласты собирают с помощью фермента, дважды промывают ДМЕМ-LG путем центрифугирования - ресуспендирования, а затем физиологическим раствором, содержащим человеческий альбумин, суспендируют в физрастворе и смешивают с экстрактом икры осетровых рыб.
15. Способ по п.14, отличающийся тем, что в качестве фермента используют ЭДТА с добавлением трипсина в концентрации 0,05%.
16. Способ по п.14, отличающийся тем, что для промывки используют физиологический раствор с человеческим альбумином в концентрации последнего 1%.
6
17. Способ по п.14, отличающийся тем, что суспендирование проводят в физрастворе из расчета 1,2-1,3×10 клеток на 1 мл биотрансплантата.
6
18. Способ по п.14, отличающийся тем, что суспензию клеток смешивают с экстрактом икры осетровых рыб в соотношении 4:1, а именно: 4 части физраствора, содержащего 1,2-1,3×10 фибробластов, и 1 часть экстракта икры осетровых рыб.
19. Способ по п.14, отличающийся тем, что в качестве экстракта осетровых рыб используют препарат «Кавиар».
20. Способ по п.19, отличающийся тем, что препарат «Кавиар» используют в объеме 200 мкл на 1 мл трансплантата.
21. Способ создания биотрансплантата, заключающийся в том, что после финального пассирования клетки, полученные способом по п.1, переводят на культивирование в среде с собственной сывороткой крови пациента (ССКП) или в терапевтической среде AIM-V (Gibco), фибробласты собирают с помощью фермента, дважды промывают ДМЕМ-LG путем центрифугирования - ресуспендирования, а затем физиологическим раствором, содержащим человеческий альбумин, суспендируют в физиологическом растворе и смешивают с препаратом на основе смеси органического кремния, экстракта плаценты, гидролизата эластина и гидролизата коллагена.
22. Способ по п.21, отличающийся тем, что в качестве фермента используют ЭДТА с добавлением трипсина в концентрации 0,05%.
23. Способ по п.21, отличающийся тем, что для промывки используют физиологический раствор с человеческим альбумином в концентрации последнего 1%.
6
24. Способ по п.21, отличающийся тем, что суспендирование проводят в физиологическом растворе из расчета 1,2-1,3×10 клеток в 1 мл биотрансплантата.
6
25. Способ по п.21, отличающийся тем, что суспензию клеток смешивают с экстрактом икры осетровых рыб в соотношении 4:1, а именно: 4 части физраствора, содержащего 1,2-1,3×10 фибробластов, и 1 часть препарата на основе смеси органического кремния, экстракта плаценты, гидролизата эластина и гидролизата коллагена.
26. Способ по п.21, отличающийся тем, что в качестве препарата на основе смеси органического кремния, экстракта плаценты, гидролизата эластина и гидролизата коллагена используют препарат «Antiestrias».
27. Способ по п.26, отличающийся тем, что препарат «Antiestrias» используют в объеме 200 мкл на 1 мл трансплантата.
28. Способ применения трансплантата по п.13, включающий введение биотрансплантата в дефектные ткани папульным или тоннельным или комбинированным методами.
29. Способ применения трансплантата по п.19, включающий введение биотрансплантата в дефектные ткани папульным или тоннельным или комбинированным методами.