НОВЫЙ БИОКОНСЕРВАНТ ДЛЯ СИЛОСОВАНИЯ КОРМОВ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ
NEW BIOCONSERVANT FOR ENSILAGE OF FEEDS AND METHOD OF ITS PRODUCTION

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к технологии получения комплексных биоконсервантов - препаратов, используемых при заготовке кормов в животноводстве
В зимний период основным сочным кормом для крупного рогатого скота является силос, который обеспечивает полноценное кормление, а также позволяет максимально повысить продуктивность животных.
Качество и скорость созревания силоса зависят от того, какая микрофлора преобладает на поверхности зеленой массы. Одним из существенных недостатков заготовки такого вида корма являются значительные потери питательных веществ исходного сырья в процессе силосования, вызванные присутствием гнилостных бактерий и других нежелательных микроорганизмов, достигающие порой 25-30%. Полностью избежать этих потерь невозможно, но их можно значительно сократить за счет применения различных консервантов химического и биологического происхождения.
Применение химических препаратов в качестве консервантов имеет ряд существенных недостатков: полученный силос не является экологически чистым, может содержать токсичные и сильно пахнущие компоненты, а применяемые химические препараты небезопасны для персонала.
Альтернативой могут служить биоконсерванты, способные не только сохранять в силосе питательные вещества, но и ускорять в нем процессы ферментации. В качестве таких агентов, как правило, применяются молочнокислые (МКБ) и пропионовокислые бактерии (ПКБ), препараты на их основе в настоящее время широко применяются в России и за рубежом. Биоконсерванты выпускаются в сухой, жидкой и пастообразной форме.
В настоящее время известны биоконсерванты для силосования зеленых кормов двух поколений. Первое поколение - препараты, состоящие из гомоферментных молочнокислых бактерий (МКБ) с возможной добавкой ферментных препаратов. Недостатком этой группы препаратов является отсутствие ингибирующей активности по отношению к аэробным микроорганизмам, что может привести к значительным потерям силоса вследствие его заражения дрожжевыми и плесневыми грибками в аэробных условиях. К этой же группе можно отнести препараты, состоящие только из гетероферментных МКБ, недостатком которых является увеличение потери сухой массы силоса во время ферментации и менее привлекательные вкусовые качества, связанные с накоплением уксусной кислоты.
Препараты второго поколения [1-3] представляют собой консорциумы различных гомо- и гетероферментных МКБ и пропионовокислых бактерий (ПКБ) с возможным добавлением ферментных препаратов. В этом случае разные компоненты используемого комплекса бактерий обеспечивают достаточную выработку молочной кислоты для ферментации силоса в анаэробных условиях и, в то же время, антимикробную защиту в аэробных условиях (после вскрытия силоса). Ферментативные добавки с гидролазной (фибролитической) активностью обеспечивают переработку сложных полисахаридов растительных клеток в простые сахара, служащие субстратом для МКБ, а также повышают перевариваемость корма. Недостатком этого типа препаратов является относительно высокая стоимость ферментных препаратов.
В настоящее время появляются препараты третьего поколения [4, 5], представляющие собой консорциумы гомо- и гетероферментных МКБ, причем как минимум один из штаммов (выделенный из природных источников или генетически модифицированный) обладает той или иной гидролазной активностью, что увеличивает объем доступного для МКБ субстрата и улучшает перевариваемость кормов и при этом не требует дополнительных расходов на производство ферментативных добавок.
Наиболее близким по технической сущности к заявляемому изобретению является способ получения закваски для силосования кормов [6]. Способ предусматривает получение ассоциации штаммов молочнокислых и штамма пропионовокислых бактерий, состоящей из 2-х комплексов: 1-й комплекс - ассоциация штаммов молочнокислых бактерий Streptococcus salivarius - ЛТ1, ЛТ2, ЛТ3, ЛТ5, Enterococcus durans - ЛТ4, ЛТ6, Lactobacillus plantarum - ЛТ7 и штамма пропионово-кислых бактерий Propionibacterium freudenreihii - ЛТ8, в соотношении 3:1, которую смешивают с крупой зерновых или бобовых культур в соотношении 3:1; 2-й комплекс - ассоциация штамма пропионовокислых бактерий Propionubacterium freudenreihii - ЛТ8 и штаммов молочнокислых бактерий Streptococcus salivarius - ЛТ1, ЛТ2, ЛТ3, ЛТ5, Enterococcus durans - ЛТ4, ЛТ6, Lactobacillus plantarum - ЛТ7 в соотношении 5:1, изготовленный тем же способом, как и 1-й комплекс, которыми затем заквашивают пастеризованное молоко, жирность которого 1.5-2.5% в соотношении 1:30. Изобретение позволяет получить силос хорошего качества, но его недостатком является низкая усвояемость организмом животных.
Задачей, стоявшей перед авторами, являлось:
- создание нового комплексного биоконсерванта третьего поколения, имеющего выраженную гидролазную активность;
- разработка способа получения биоконсерванта в лиофилизированной форме, способного храниться в широком диапазоне потребительских температур и пригодного для промышленного освоения.
Для решения поставленной задачи были подобраны штамм пропионовокислых бактерий, отличающийся высокой устойчивостью к пропионовой кислоте, а также штаммы-продуценты двух молочнокислых бактерий; на основе двух последних были получены новые высокопродуктивные штаммы, в т.ч. один штамм, устойчивый к высоким концентрациям бацитрацина, и один штамм, имеющий гидролазную активность, и разработан способ получения биоконсерванта для силосования кормов в виде лиофилизированного порошка, предусматривающий раздельное культивирование пропионовокислой бактерии и новых молочнокислых бактерий, концентрирование культуральных жидкостей, смешивание полученных биомасс с защитной средой, сублимирование биомасс и смешивание высушенных биомасс штаммов между собой в соотношении 2:2:1 и затем с веществом для нормализации титра - сухой молочной сывороткой.
При создании нового комплексного биоконсерванта авторы использовали молочнокислые бактерии Lactobacillus plantarum, Lactococcus lactis subsp. lactis и пропионовокислые бактерии Propionibacterium acidipropionici.
Выбор в качестве одного из компонентов нового комплексного биоконсерванта гомоферментной МКБ Lactococcus lactis subsp. lactis связан с известной способностью данной бактерии синтезировать не только молочную кислоту, но и низин (бактериоцин), антибиотик широкого спектра действия, применяемый в качестве безопасного биологического консерванта в пищевой промышленности многих стран. Таким образом, продуцирование низина, как антимикробного агента, способно обеспечить дополнительное функциональное преимущество разрабатываемого биоконсерванта.
1. Штаммы Lactococcus lactis относятся к отряду лактобацилл (Lactobacillales) и являются непатогенными и неспорообразующими. В эту группу входят бактерии, которые используются в ферментации молочных продуктов, овощей. МКБ вида L. lactis являются факультативными анаэробами. Они способны расти как в присутствии, так и в отсутствии воздуха.
Для решения поставленной задачи - создания комплексного биоконсерванта - необходимо было разработать новый штамм Lactococcus lactis subsp. lactis, обладающий рядом биотехнологических преимуществ перед исходным штаммом ВКПМ В-2092.
С помощью ненаправленного многоступенчатого УФ-мутагенеза и селекции был отобран новый изолят штамма Lactococcus lactis subsp. lactis FL-75 с повышенной продуктивностью при сокращенной продолжительности ферментации, резистентный к низину и устойчивый к 20 мкг/мл бацитрацина, который использовали при создании нового комплексного препарата. Новый штамм Lactococcus lactis subsp. lactis FL-75 был депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКМ B-3056 D.
2. Lactobacillus plantarum - широко распространенный вид грамположительных анаэробных неспорообразующих молочнокислых бактерий. Lactobacillus plantarum подавляют рост Escherichia coli, Bacillus subtilis, а также плесневых грибов. Для создания биоконсерванта необходимо было получить новый штамм, обладающий гликозил-гидролазной активностью. Включение в состав биоконсерванта штаммов микроорганизмов, обладающих гидролазной активностью, обеспечивает не только повышение питательной активности кормов, но и увеличение доступности простых сахаров, необходимых для синтеза молочной кислоты, и, следовательно, улучшение ферментации силоса МКБ. Введение такого компонента в комплексный биопрепарат способно улучшить общий эффект от его применения.
10
Задача была решена путем создания нового биоинженерного штамма Lactobacillus plantarum FL-1, несущего ген эндо-1,4-бета ксиланазы xynA и обладающего специфической гликозил-гидролазной активностью, достаточной для гидролиза полисахаридов растительной биомассы. Новый штамм Lactobacillus plantarum FL-1 был депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКМ B-3055 D. Для создания этого штамма был использован ген, кодирующий гликозил-гидролазу микробного происхождения, который был интегрирован в хромосомную ДНК Lactobacillus plantarum. В качестве источника гена ксилоглюканазы для последующей гетерологичной экспрессии в Lactobacillus plantarum ВКПМ B-4173 был взят штамм близкородственного микроорганизма - Bacillus licheniformis АТСС 14580 (DSM 13, NCIB 9375, NCTC 10341, NRRL NRS-1264). Полученный новый штамм высокопродуктивен. Содержание жизнеспособных клеток Lactobacillus plantarum FL-1 по окончании процесса ферментации - более 1,0×10 КОЕ/мл.
3. Для увеличения аэробной стабильности силоса могут использоваться не только МКБ, но и пропионовокислые бактерии (ПКБ) Propionibacterium acidipropionici. Пропионовокислые бактерии в процессе ферментирования растительных субстратов образуют ацетаты и пропионаты, ингибирующие развитие нежелательной микрофлоры в первые часы ферментации. Кроме того, метаболиты пропионовокислых бактерий угнетают развитие дрожжей и плесневых грибов, разрушающих белки до аммиака. ПКБ могут рассматриваться как дополнительный антимикробный компонент силосной закваски.
10
Глубинное культивирование Propionibacterium acidipropionici характеризуется не очень высокой концентрацией клеток бактерий в культуральной жидкости и низким выходом пропионовой кислоты, что связано с сильным ингибированием роста клеток пропионовой кислотой. Необходимо было подобрать штамм Propionibacterium acidipropionici со сниженной чувствительностью к пропионату и разработать эффективную технологию его культивирования, способную обеспечить высокое содержание жизнеспособных бактерий. В качестве такого штамма был подобран штамм Propionibacterium acidipropionici ВКПМ В-5723, характеризуемый устойчивостью к высокой (до 10 г/л) концентрации пропионовой кислоты. Содержание жизнеспособных клеток Propionibacterium acidipropionici В-5723 по окончании процесса ферментации - более 1,0×10 КОЕ/мл.
4. Для культивирования высокопродуктивных бактерий опытным путем установлено оптимальное количество посевного материала для каждой культуры: Lactobacillus plantarum FL-1 - 10% для засева посевной среды и 8% для засева ферментационной среды; Lactococcus lactis subsp. lactis FL-75 - 8-10% для засева посевной среды и 10% для засева ферментационной среды; Propionibacterium acidipropionici В-5723 - 8-10% для засева посевной и ферментационной сред.
Определено оптимальное время культивирования каждого штамма: Lactobacillus plantarum FL-1 - 20-22 ч; Lactococcus lactis subsp. lactis FL-75 - 16-18 ч; Propionibacterium acidipropionici B-5723 - 18-20 ч.
5. Для решения поставленной задачи - создание комплексного биоконсерванта - необходимо было разработать, помимо методики получения и культивирования высокопродуктивных бактерий, способ получения готовой формы препарата, в качестве которой был выбран лиофильный порошок биоконсерванта. Эмпирическим путем были установлены технологические параметры приготовления готовой формы биоконсерванта: способ концентрирования культуральной жидкости, режим сушки, оптимальное соотношение полученных микроорганизмов между собой в составе биоконсерванта, соотношение с защитной средой и с веществом для нормализации титра.
Технологическая схема предлагаемого способа получения комплексного биоконсерванта для силосования кормов включает:
1. Получение новых штаммов Lactococcus lactis subsp. lactis и Lactobacillus plantarum с улучшенными свойствами;
2. Их раздельное культивирование, а также культивирование штамма Propionibacterium acidipropionici В-5723;
3. Концентрирование культуральной жидкости (центрифугированием);
4. Смешивание с защитной средой в соотношении 1:1;
5. Сублимационную сушку полученной биомассы;
11
6. Смешивание высушенной биомассы штаммов Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactobacillus plantarum и Propionibacterium acidipropionici в соотношении 2:2:1 между собой и затем с веществом для нормализации титра - сухой молочной сывороткой (общее содержание молочнокислых и пропионовокислых бактерий - не менее 1×10 КОЕ/г).
11
Таким образом, способ предусматривает получение новых штаммов Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactobacillus plantarum методами биоинженерии, ненаправленного мутагенеза и селекции, раздельное культивирование этих штаммов и штамма Propionibacterium acidipropionici В-5723 на средах, оптимальных для каждой из культур, концентрирование полученных культуральных жидкостей путем центрифугирования, смешивание каждой из полученных биомасс с защитной средой (состоящей из сухого молока и аскорбиновой кислоты) в соотношении 1:1, сублимационную сушку полученных биомасс до конечной влажности 4%, смешивание высушенных биомасс Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactobacillus plantarum и Propionibacterium acidipropioni между собой в соотношении 2:2:1, а затем с веществом для нормализации титра - сухой молочной сывороткой (общее содержание молочнокислых и пропионовокислых бактерий - не менее 1×10 КОЕ/г).
В результате получается новый биоконсервант, содержащий высокоактивные штаммы бактерий, позволяющий успешно заквашивать трудносилосуемые корма и работать в сложных погодных условиях. Он экологически безопасен, обладает высокой технологичностью, абсолютно нетоксичен и не имеет резкого запаха.
Важными свойствами нового комбинированного биоконсерванта также являются:
- термостабильность;
- длительный срок хранения;
- сохранение высокого качества при хранении;
- экологическая безопасность;
- удобство в применении.
Кроме этого, авторами проведено успешное масштабирование процесса получения комбинированного биоконсерванта и тем самым продемонстрирована возможность проведения процесса в промышленном масштабе.
Практическое использование нового биоконсерванта позволит повысить рентабельность его производства и снизить себестоимость рациона животных, что было убедительно продемонстрировано при его испытаниях непосредственно в сельскохозяйственных организациях.
Технический результат изобретения - получен новый комплексный биоконсервант с высокими параметрами качества, выраженной гидролазной активностью, обеспечивающий повышенную усвояемость силоса.
Практическое применение:
1. Силосование зеленой массы кукурузы в молочно-восковой спелости с внесением нового биологического консерванта в количестве 2 и 3 г/т способствует получению корма высокого качества по органолептической оценке (запах, цвет, структура). В силосе с внесением 3 г/т биоконсерванта активная кислотность составила 4.0-4.2 единиц с благоприятным соотношением молочной и уксусной кислот при отсутствии масляной кислоты.
2. Внесение нового биологического консерванта в количестве 2 и 3 г/т при силосовании зеленой массы кукурузы способствует сокращению потерь протеина в 2.3 раза (сохранность протеина при самоконсервировании 89.30 против 95.52%) по сравнению с самоконсервированием, что подтверждается меньшим (11.4 в опыте против 19.6 мг %) количеством аммиака в силосе.
3. При консервировании зеленой массы люцерны в фазе бутонизации с добавлением нового биологического консерванта в количестве 6.0 г/т был получен хороший результат по таким показателям, как активная кислотность, накопление аммиака, органических кислот брожения.
4. Внесение нового биологического консерванта в дозе 6.0 г/т при сенажировании зеленой массы люцерны в фазе бутонизации обеспечивает снижение потерь протеина в 2.0-2.1 раза по сравнению с самоконсервированием.
5. Скармливание молочным коровам кукурузного силоса в молочно-восковой спелости с внесением нового биологического консерванта в количестве 3 г/т обеспечивает увеличение надоя молока 4%-ной жирности на 4.0% по сравнению с контрольной группой животных. При этом скармливание силоса не оказало существенного влияния на содержание жира, белка и соматических клеток в молоке.
6. Использование в рационе молочных коров кукурузного силоса с внесением нового биологического консерванта способствовало сокращению затрат обменной энергии и концентратов соответственно на 2.8% и 3.9% по сравнению с контрольной группой животных.
7. Использование в рационах коров кукурузного силоса с внесением нового биологического консерванта приводило к оптимизации процессов в рубце, повышению уровня летучих жирных кислот (ЛЖК) и содержания биомассы и бактерий при снижении количества аммиака на 19.1% (P<0.05), что свидетельствует об улучшении переваримости и усвоения азота в рубце коров, интенсивности преджелудочного пищеварения.
8. Скармливание дойным коровам кукурузного силоса с внесением нового биологического консерванта в количестве 3 г/т не оказывает отрицательного действия на состояние здоровья, о чем свидетельствуют биохимические показатели крови животных, которые находились в пределах физиологической нормы.
9. Скармливание молочным коровам в течение 100 дней кукурузного силоса с внесением нового биологического консерванта обеспечило экономию 2600 рублей на 1 корову.
Сущность заявляемой группы изобретений иллюстрируется, но не ограничивается следующими примерами.
Пример 1
Питательные среды
Агаризованная среда
Агаризованная среда MRS.
Среда MRS является полноценной агаризованной средой для поддержания и хранения бактериальных штаммов.
Состав среды MRS (в г/л): мясной пептон - 10.0; мясной экстракт - 10.0; дрожжевой экстракт - 5.0; глюкоза - 20.0; натрия ацетат - 5.0; твин 80 - 1.0; гидрофосфат калия - 2.0; аммоний лимоннокислый 2-замещенный - 2.0; сульфат магния - 0.2; сульфат марганца - 0.05; агар бактериологический - 15.0; вода дистиллированная до 1 л; pH до стерилизации 6.4±0.2 (доводят 10% раствором гидроксида натрия). Стерилизация 0.8 атм, 30 минут.
Среды для глубинного культивирования Lactobacillus plantarum FL-1
Посевная среда (ПС1)
Состав посевной среды (г/л): меласса - 20.0; кукурузный экстракт - 5.0; дрожжевой экстракт - 5.0; сульфат железа(II) - 0.05. сульфат марганца - 0.05; гидрофосфат калия - 2.0; ацетат натрия - 5.0; мел - 0.5; лапрол - 2.2 мл/л. вода питьевая до 1 л. pH 7.0-7.2.
Ферментационная среда (ФС1)
Состав ферментационной среды (г/л): меласса - 20.0; глюкоза - 20.0; кукурузный экстракт - 5.0; дрожжевой экстракт - 3.0; сульфат железа(II) - 0.05; сульфат марганца - 0.05; гидрофосфат калия - 2.0; ацетат натрия - 5.0; мел - 0.5; лапрол - 2.2 мл/л; вода водопроводная до 1 л; pH 7.0-7.2.
Среды для глубинного культивирования Lactococcus lactis subsp. lactis FL-75
Посевная среда (ПС2)
Состав посевной среды (г/л): лактоза - 20.0; кукурузный экстракт - 10.0; дрожжевой экстракт - 5.0; пептон мясной - 5.0; сульфат магния - 2.0; мел - 5.0; гидроортофосфат калия - 2.0; лапрол - 2.2; вода водопроводная до 1 л; pH до стерилизации - 7.1±0.1.
Ферментационная среда (ФС2)
Состав ферментационной среды (г/л): лактоза - 30.0; кукурузный экстракт - 25.0; дрожжевой экстракт - 5.0; пептон мясной - 5.0; сульфат магния - 2.0; мел - 5.0; гидроортофосфат калия - 2.0; лапрол - 0.5; вода водопроводная до 1 л; pH до стерилизации - 6.9±0.1.
Среды для глубинного культивирования Propionibacterium acidipropionici ВКПМ В-5723
Посевная среда (ПС3)
Состав посевной среды (г/л): меласса - 10.0; кукурузный экстракт - 20.0; лактоза - 0.5; сульфат аммония - 0.5; гидроортофосфат калия - 0.2; лапрол - 2.2; вода водопроводная до 1 л; pH до стерилизации - 7.3±0.1.
Ферментационная среда (ФС3)
Состав ферментационной среды (г/л): меласса - 10.0; кукурузный экстракт - 20.0; лактоза - 0.5; сульфат аммония - 0.5; гидроортофосфат калия - 0.2; лапрол - 2.2; вода водопроводная до 1 л; pH до стерилизации - 7.3±0.1.
Защитная среда для лиофильно высушенных культур
Состав защитной среды (г/л): сухое молоко - 262.5; аскорбиновая кислота - 52.5; вода дистиллированная до 1 л. pH 7.0. Пастеризация при температуре 75-78°C в течение 30 минут.
Пример 2. Получение штамма Lactococcus lactis subsp. lactis FL-75 (ВКМ B-3056 D)
Объектом селекции послужил штамм Lactococcus lactis ВКПМ B-2092. В качестве критерия отбора проверяемых изолятов использовали способность к синтезу бактериоцина (низин А).
С помощью ненаправленного многоступенчатого УФ-мутагенеза и селекции был отобран новый изолят FL-75, обладающий повышенной продуктивностью при сокращенной продолжительности ферментации, высокой резистентностью к продуцируемому антибиотику низину и антибиотику бацитрацину.
УФ-мутагенез
2
В качестве мутагенного фактора были использованы УФ-лучи с длиной волны 254 нм (лампа Mineralight, мощность 30 Вт). Водную суспензию клеток помещали на расстояние 30-40 см от лампы, при этом интенсивность излучения лампы составляла 0.25 мВт/см.
6
Суспензию клеток фильтровали через стерильный ватный фильтр или через фильтровальную воронку Шотта (размер пор 100 мкм). В полученной суспензии при помощи камеры Горяева-Тома подсчитывали концентрацию клеток. При необходимости суспензию разводили до концентрации (1.5-2)*10 кл/мл. После подсчета и разведения суспензия подвергалась облучению в открытой чашке Петри.
Степень выживаемости колоний определяли по соотношению выросших колоний на контрольных чашках и после облучения УФ. Выросшие изолированные колонии пересевали на агаризованную среду, затем выращивали в ферментационной среде.
Характеристика полученного нового мутантного штамма Lactococcus lactis subsp. lactis FL-75 (ВКМ B-3056 D)
- Время культивирования штамма составляет 16-18 ч;
10
- Содержание жизнеспособных клеток в культуральной жидкости по окончании процесса ферментации составляет свыше 1×10 КОЕ/мл:
- Устойчив к 20 мкг/мл бацитрацина;
- Отобранные изоляты при проведении ферментации в колбах способны синтезировать низина на 30-40% больше чем исходный штамм.
Морфология. Клетки кокки, расположенные одиночно, парами, цепочками. Колонии белые, мелкие, округлой формы. Окраска по Грамму - грамположительная.
Физиолого-биохимические признаки. Факультативный анаэроб, оптимальная температура культивирования 28-37°C, pH среды 6,8-7,0. Желатину не разжижает, нитраты не восстанавливает, каталазо-оксидазоотрицательный, сбраживает из углеводов: глюкозу, лактозу, галактозу, ксилозу, сахарозу, мальтозу, арабинозу, слабо - маннозу, рамнозу; из спиртов: сорбит, глицерин; слабо - маннит. Индола, сероводорода не образует. Молоко быстро свертывает, не пептонизирует, продолжительность свертывания молока при внесении 1% инокулята - 13-14 ч.
Родовая принадлежность штамма Lactococcus lactis subsp. lactis FL-75 (ВКМ B-3056 D) определена на основании исследования морфологии, физиолого-биохимических свойств и секвенирования генов 16S РНК.
Культивирование в колбах
Посевной материал выращивали на среде ПС в стационарных условиях при 37±1°C в течение 24 часов. Объем посевной среды для культивирования в колбах объемом 750 мл составлял 100 мл. Культивирование осуществлялось на ротационной качалке при 220-240 об/мин, 37±1°C в течение 24 часов.
Посевным материалом в объеме 10 мл засевали 100 мл ФС и выращивали в колбах Эрленмейера объемом 750 мл в стационарных условиях при 37±1°C в течение 24 часов. Объем посевного материала составлял 10% от объема ферментационной среды. Культивирование проводили при 200 об/мин, при температуре 37±1°C в течение 20-24 часов.
Культивирование продуцента Lactococcus lactis subsp. lactis FL-75 (ВКМ B-3056 D) в 100-л ферментере.
Предварительно подготовленный аппарат заполняют на 2/3 объема водопроводной водой, при постоянном перемешивании вносят расчетное количество кукурузного экстракта. После этого вносят необходимое количество лактозы, и перемешивают в течение 3-5 минут. Затем добавляют оставшиеся компоненты, и после их полного растворения в аппарат вносят расчетное количество солей. По окончании смешивания объем доводят до расчетного. Активную кислотность в среде до стерилизации доводят до значения 7.0-7.2 раствором 20% гидроокиси натрия.
Загружаемые компоненты:
4
3
2
4
Лактоза - 1400 г, кукурузный экстракт - 700 г, дрожжевой экстракт - 350 г, пептон мясной - 350 г, MgSO - 140 г, CaCO - 350 г, KHPO - 140 г, лапрол - 150 мл.
Расчетный объем на начало процесса - 70 л. Стерилизация в течение 40 минут при 125-127°C и давлении 1,3-1,5 атм.
В качестве посевного материала используют односуточную культуру.
Количество посевного материала составляет 10% от рабочего объема ферментера. После посева культуры проверяют активную кислотность, которая должна находиться в пределах 6.8-7.0
Режим процесса культивирования продуцента Lactococcus lactis subsp. lactis FL-75 (ВКМ B-3056 D).
Время ферментации - 16-18 часов
Температура ферментации - 37°C+1°C.
pH во время культивирования поддерживается автоматически 20% NaOH на уровне 6.0-6.2 первые 10-12 часов, затем происходит самопроизвольное падение не ниже 4.5. Расход 20% NaOH - 8-10 литров. Ферментация без доступа воздуха. Избыточное давление в аппарате 0.05-0.07 МПа.
В конце процесса ферментации готовая культуральная жидкость имеет следующие параметры:
1. pH 4.5-4.8.
2. Содержание остаточных редуцирующих веществ (РВ) - не более 0.5%
10
3. Содержание жизнеспособных клеток - не менее 1×10 КОЕ/мл.
Обработка культуральной жидкости
Полученную культуральную жидкость концентрируют путем центрифугирования. Для этого используют проточную центрифугу J-1250 (15000 об/мин). Скорость потока - 120 л/час. После окончания процесса центрифугирования полученный осадок взвешивают, смешивают с защитной средой в соотношении 1:1, разливают в лотки слоем 0.8-1.2 см и помещают в сублиматор.
Получают 0,72 кг биомассы. Содержание сухих веществ 20-25%. Объем защитной среды - 0,72 л.
Лиофильная сушка
В камере сублиматора продукт замораживают в течение 8-10 часов при температуре -35°C и сушат при этой температуре 18 часов, затем повышают температуру до -15°C и в этом режиме продукт сохнет еще 10 часов. Через 10 часов температуру увеличивают до 25±5°C и производят сушку продукта в течение еще 10 часов.
11
Получают 0,35 кг целевого продукта. Влажность не более 4%. Содержание жизнеспособных бактерий - не менее 5×10 КОЕ/г.
Полученный сухой концентрат собирают, измельчают на мельнице и хранят в сухом, прохладном, защищенном от света месте.
Пример 3. Культивирование штамма Propionibacterium acidipropionici ВКПМ В-5723
Хранение, поддержание и глубинное культивирование
Культура Propionibacterium acidipropionici может храниться:
1. В лиофильно высушенном состоянии в ампулах (флаконах) при температуре 4±2°C не менее трех лет;
2. При температуре от -80°C и ниже в виде глицериновой суспензии в течение 1 года без потери жизнеспособности.
Культивирование в колбах
Посевной материал выращивали на среде ПС в стационарных условиях при 30±1°C в течение 24 часов. Объем посевного материала для культивирования в 750-мл колбах составлял 100 мл. Культивирование осуществляли на ротационной качалке при 220-240 об/мин, 30±1°C в течение 24 часов.
Посевным материалом в объеме 10 мл засевали 100 мл ФС и выращивали в 750-мл колбах Эрленмейера в стационарных условиях при 30±1°C в течение 24 часов. Объем посевного материала составлял 10% от объема ферментационной среды.
Культивирование штамма Propionibacterium acidipropionici ВКПМ В-5723 в 100-л ферментере
Подготовка ферментационной среды осуществляется аналогично примеру 1.
Загружаемые компоненты:
Состав ферментационной среды (г/л): меласса - 10.0; кукурузный экстракт - 20.0; лактоза - 0.5; сульфат аммония - 0.5; гидроортофосфат калия - 0.2; лапрол - 2.2; вода водопроводная до 1 л; pH до стерилизации - 7.3±0.1.
Расчетный объем на начало процесса - 70 л. В качестве посевного материала использовали односуточную культуру.
Количество посевного материала составляет 10% от рабочего объема ферментера. После посева культуры проверяют активную кислотность, которая должна находиться в пределах 6.8-7.0.
- Время ферментации - 18-20 часов.
- Температура ферментации - 29°C±1°C.
- pH в начале ферментации - 6.8-7.0.
- Ферментация без доступа воздуха.
- Перемешивание постоянное.
- Избыточное давление в аппарате 0.05-0.07 МПа.
10
Содержание жизнеспособных клеток в культуральной жидкости 1,1×10 КОЕ/мл к 20 часам культивирования. Штамм отличается высокой скоростью роста по сравнению с родительским штаммом, который достигает такого же количества жизнеспособных клеток в среде только к 28-30 часам роста.
Обработка культуральной жидкости
Центрифугирование полученной культуральной жидкости осуществляется аналогично примеру 1. Получают 0,63 кг биомассы. Содержание сухих веществ 30-32%. Объем защитной среды - 0,63 л.
Лиофильная сушка
11
Сушку биомассы проводят в условиях, аналогичных примеру 1, с получением 0,37 кг целевого продукта. Влажность не более 4%. Содержание жизнеспособных бактерий не менее 5×10 КОЕ/г.
Полученный сухой концентрат собирают, измельчают на мельнице и хранят в сухом, прохладном, защищенном от света месте.
Пример 4. Трансформация штамма L. plantarum плазмидой pKS1-xynA
Для создания биоинженерного продуцента ксиланазы был выбран штамм L. plantarum ВКПМ В-4173.
4
2
4
2
2
4
Электропорацию L. plantarum проводили по известной методике с некоторыми модификациями. Для проведения электропорации штамм L. plantarum культивировали в жидкой среде MRS состава (г/л): бактопептон - 10.0, мясной экстракт - 10.0, дрожжевой экстракт - 5.0, глюкоза - 20.0, Твин-80 - 1.0, аммоний лимоннокислый - 2.0, натрий уксуснокислый - 5.0, MgSO×7HO - 0.1, MnSO×5HO - 0.05, NaHPO - 2.0.
Культивирование проводили в 50-мл закрытых пробирках Falkon без перемешивания при 35°C в течение ночи.
2
Далее 1 мл ночной культуры пересевали в 100 мл среды MRS и растили клетки без перемешивания при 35°C до оптической плотности 0,85 при длине волны 600 нм (время роста составляло примерно 3-4 часа). Подросшую культуру клеток охлаждали льдом и центрифугировали при охлаждении со скоростью 3000 об/мин в течение 10 мин. После этого полученный осадок клеток дважды промывали холодным раствором 10 мМ MgCl, центрифугируя каждый раз 10 мин при 3000 об/мин. Далее клетки дважды промывали раствором, содержащим 0,5 М сахарозы и 10% глицерина, центрифугируя при этом 10 мин при 4000 об/мин. Затем осадок клеток ресуспендировали в 1 мл раствора, содержащего 0,5 М сахарозы и 10% глицерина.
После этого к аликвоте готовых электрокомпетентных клеток объемом 50 мкл было добавлено 5 мкл плазмиды pKS1-xynA, несущей ген ксиланазы. Смесь с плазмидой переносили в специальную кювету для электропорации с расстоянием между электродами 1 мм.
Электропорацию проводили с помощью автоматического электропоратора Bio-Rad Xcell GenePulser при 25 μF, 200 Ом, V=1300 V. При данных условиях среднее время пульса составило 4,9-5,0 мсек.
Затем к суспензии клеток добавляли 500 мкл среды MRS и инкубировали в течение 2-3 часов. После этого трансформанты высевали на чашки Петри с агаризованной средой MRS, содержащей 100 мг/л канамицина (Km). Чашки инкубировали в течение 3 дней при 30°C.
3
Эффективность трансформации составляла 1×10 КОЕ/мкг ДНК.
Скрининг трансформантов на чашках с ксиланом
Выросшие трансформанты перекалывали на чашки Петри с MRS-агаром, содержащим 1% ксилан и Km, по 48 колоний на чашку. Используя матрицу, делали дубликаты клонов на чашках с MRS-агаром и Km без ксилана. После выращивания клонов при 30°C чашки с ксиланом заливали 0,1% раствором Конго-красного, инкубировали 30 мин при 50°C и отмывали 1 М NaCl в течение 15 мин. В качестве отрицательного контроля использовали штамм L. plantarum, трансформированный плазмидой pKS1 без вставки. В качестве положительного контроля использовали штамм В. licheniformis В10956 (АТСС 14580), который выращивали на отдельных чашках без антибиотика. Клоны, продуцирующие рекомбинантную ксиланазу, после окраски Конго-красным были окружены прозрачным гало на красном фоне. Таким образом, были отобраны рекомбинантные клоны L. plantarum/pKS1-xynA.
Интеграция гена xynA в хромосому L. plantarum
В основе процесса интеграции гена xynA в хромосому L. plantarum лежит механизм двойной гомологичной рекомбинации. Для получения штамма L. plantarum с интегрированным в хромосому геном xynA, трансформанты L. plantarum/pKS1-xynA, отобранные на предыдущей стадии, выращивали при 30°C многократно пересевая на чашки с MRS-агаром без Km, контролируя ксиланазную активность с помощью Конго-красного. Затем с целью элиминации плазмидного вектора пересевы и выращивание клонов проводили при 37°C. Каждый из клонов последней генерации перекалывали на чашки, содержащие: 1) MRS-агар без Km; 2) MRS-агар+Km; 3) MRS-агар+ксилан без Km. Чашки с ксиланом окрашивали Конго-красным.
Полученный биоинженерный штамм Lactobacillus plantarum FL-1 (ВКМ B-3055 D) обладает следующими свойствами:
- время культивирования штамма составляет не более 20 часов;
10
- содержание жизнеспособных клеток в культуральной жидкости по окончании процесса ферментации составляет свыше 1×10 КОЕ/мл.
Биоинженерный штамм FL-1 обладает гликозил-гидролазной (ксиланазной) активностью. Для штамма Lactobacillus plantarum FL-1 была получена индивидуальная генетическая характеристика с помощью технологии ДНК-фингерпринтинга с проведением дальнейшего анализа наборов продуктов амплификации.
Морфология. Клетки - длинные палочки с изогнутыми концами, расположенные одиночно и парами. Колонии белого цвета, блестящие. Штамм хорошо растет на среде MRS Бифидум, образуя блестящие колонии белого цвета с ровными краями. Окраска по Грамму - грамположительная.
Физиолого-биохимические свойства. Факультативный анаэроб, каталазоотрицательный, цитохромоксидазоотрицательный. Аммиак из аргинина не образует. Нитраты не редуцирует. Желатину не разжижает. Сбраживает: глюкозу, целлобиозу, эскулин, фруктозу, глюконат, галактозу, лактозу, мальтозу, маннит, маннозу, мелибиозу, салицин, Д-раффинозу, сорбит, сахарозу, трегалозу, Д-арабинозу, рибозу, мелизитозу.
Идентификация штамма Lactobacillus plantarum FL-1 до рода выполнена на основании исследования морфологии, физиолого-биохимических свойств, секвенирования генов 16S РНК.
Культивирование нового биоинженерного штамма Lactobacillus plantarum FL-1
В асептических условиях колбы с посевной средой засеваются клетками культуры. Колбы помещаются в термостат при 30°C на 24 часа, а затем инокулят используется для засева ферментеров (в объеме 10%).
Культивирование нового штамма проводили на установке вместимостью 100 литров. Посев аппарата осуществляли инокулятом из колб. Через 24 часа посевную среду анализировали по следующим показателям: при микроскопии клетки морфологически должны соответствовать Lactobacillus plantarum FL-1, pH 4.7-5.0.
10
Количество жизнеспособных клеток в культуральной жидкости к 22 часам роста достигает 1,12×10 КОЕ/мл.
Центрифугирование биомассы
Центрифугирование полученной культуральной жидкости осуществляется аналогично примеру 1. Получают 0,70 кг биомассы. Содержание сухих веществ 25-30%. Объем защитной среды - 0,70 л.
Лиофильная сушка
11
Сушку биомассы проводят в условиях, аналогичных примеру 1. Получают 0,39 кг целевого продукта. Влажность не более 4%. Содержание жизнеспособных бактерий не менее 5×10 КОЕ/г.
Полученный сухой концентрат собирают, измельчают на мельнице и хранят в сухом, прохладном, защищенном от света месте.
Пример 5. Получение готовой формы нового биоконсерванта
Смешивание концентратов
11
Для получения стандартного продукта с общим содержанием жизнеспособных клеток молочнокислых и пропионовокислых бактерий не менее 1×10 КОЕ/г используют смеситель периодического действия. В подготовленный смеситель насыпается порциями 3,5 кг сухой молочной сыворотки и вносится по 0,35 кг порошка биомассы Lactobacillus plantarum и Lactococcus lactis subsp. lactis и 0,175 кг порошка Propionibacterium acidipropionici. Содержимое тщательно перемешивается в течение 20 мин. После перемешивания содержимое смесителя ссыпается в полиэтиленовые мешки и хранится в сухом прохладном месте.
Используемые источники
1. Nancy J. Tomes Bacterial treatment to preserve silage // US 4981705, 1989.
2. Connie Benfeldt, Heike Ursula Morgenstern Strains of propionibacterium // US 20150150298, 2013.
3. Владимирова Е.Г., Саубенова М.Г., Иллялетдинов А.Н., Карпова Г.В. Способ получения корма из растительного сырья // RU 2155496, 1997.
4. Victor Nsereko, Christine Dengler, Brenda Smiley Acetyl esterase producing strains and methods of using same // US 7718415, 2008.
5. Victor Nsereko, William Rutherford, Brenda K. Smiley, Annette Spielbauer Ferulate esterase producing strains and methods of using same // EP 1784085, 2005.
6. Трофименков B.H., Лужецкий B.К. Способ получения закваски для силосования кормов // RU 2265655, 2003.