Способ получения каротиноидного комплекса из морских звезд
METHOD FOR OBTAINING A CAROTENOID COMPLEX FROM STARFISH

Изобретение относится к фармацевтической и пищевой промышленности, в частности к способам получения каротиноидного комплекса, обогащенного астаксантином.
Каротиноиды являются природными жирорастворимыми пигментами. Одним из доминантных каротиноидов морских гидробионтов считается астаксантин. В зависимости от соответствующего организма и вида аккумулирования он может присутствовать как в свободной, так и моно- или диэтерифицированной форме [Breithaupt, D.E. // J. Agric. Food. Chem., 2004, vol. 52, p. 3870-3875]. Астаксантин также может быть связан с протеинами с образованием астаксантин-протеинового комплекса [Yuan, J.P. et al. // Mol. Nutr. Food. Res., 2011, vol. 55, p. 150-165].
Как и другие каротиноиды, астаксантин обладает сильным антиоксидантным действием. Он улавливает синглетный кислород, эффективен против свободных радикалов [Miki, W. //Pure and Applied Chemistry, 1991, vol. 63(1), p. 141-146]. Активные формы кислорода (АФК) играют решающую роль в формировании воспалительной реакции организма и повышении уровня цитокинов при вирусной инфекции, сердечнососудистых и нейродегенеративных заболеваниях, диабете. Астаксантин с его уникальной молекулярной структурой проходит через двухслойную липидную мембрану, обеспечивая защиту от окислительного стресса [Kidd, Р. // Altera. Med. Rev, 2011, vol. 16, p. 355-364]. Он может поглощать и гасить АФК и свободные радикалы (супероксид-анион, перекись водорода, синглетный кислород и т.д.) как во внутреннем, так и во внешнем слоях клеточной мембраны, в отличие от большинства антиоксидантов, которые работают либо во внутреннем (например, витамин Е и {3-каротин), либо во внешнем слое мембраны (например, витамин С) [Talukdar, J. et al. // SSRN, 2020. doi: 10.2139/ssrn.3579738],
Антиоксидантная активность астаксантина в 10 раз выше, чем у других каротиноидов, а именно: зеаксантина, лютеина, кантаксантина и р-каротина, и в 100 раз больше, чем у а-токоферола [Yuan, J.P. at al. // Mol. Nutr. Food. Res., 2011, voi. 55, p.150-165]. Являясь потенциальным антиоксидантом, астаксантин может быть эффективным для улучшения функционирования сердечной мускулатуры [Baburina, Y. et al. // Antioxidants, 2019, vol. 8(12), p. 576].
Установлена противовоспалительная активность астаксантина, его способность снижать биомаркеры окислительного повреждения ДНК и воспаления, а также усиливать иммунный ответ [Park, J. S. at al. // Nutrition and Metabolism, 2010, 7, 18].
Прием астаксантина способствует протективной защите в отношении спермы и ее способности к оплодотворению, повышает возможность зачатия у женщин [Comhaire, F.H. // Asian J. Androl., 2005, vol. 7, p.257-262; Comhaire, F.H. at al. // Reprod. Biomed. Online., 2003, vol. 7 (4), p. 385-391].
Астаксантин способен улучшать когникативные функции мозга, благотворно влияя на скорость реакции, внимание, память [Satoh, A. at al // J. Clin. Biochem. Nutr., 2009, vol. 44, p.280-284]. Он оказывает выраженный нейропротекторный эффект, оказывая защиту от окислительного стресса, вызванного церебральной ишемией [Lee, D.H. // J. Clin. Biochem. Nutr., 2010. vol. 47 (2), p. 121-129].
Астаксантин оказывает положительное влияние на внешний вид человека. Был отмечен его благотворный эффект на состояние кожи, как женщин, так и мужчин [Tominaga, К. at al. // Acta Biochim. Pol., 2012, vol. 59(1), p. 43-47].
Особый интерес представляет природный астаксантин в качестве вспомогательного препарата в ослаблении цитокинового шторма, что актуально в связи с пандемией COVID 19. Установлено, что астаксантин блокирует окислительные повреждения ДНК, снижает уровень С-реактивного белка и другие биомаркеры воспаления [Talukdar, J. et al. // SSRN, 2020. doi: 10.2139/ssrn.3579738].
Астаксантин потенциально может способствовать укреплению здоровья при профилактике и лечении различных заболеваний, таких как рак, хронические воспалительные заболевания, диабет, сердечно-сосудистые заболевания, заболевания желудочно-кишечного тракта, печени, глаз, кожных покровов, а также ряда других заболеваний [Yuan, J.P. et al. // Mol. Nutr. Food. Res., 2011, vol. 55, p.150-165].
Известен способ комплексной переработки панцирей ракообразных гидробионтов, использование которого позволяет получать концентрат каротиноидов, включая астаксантин, а также концентрат липидов [RU 2179816, 27.02.2002]. Сущность способа состоит в следующем: сырье - панцирь краба камчатского измельчают, экстрагируют ацетоном. Полученный экстракт отделяют фильтрованием. Сырье повторно экстрагируют, экстракты объединяют, фильтруют, затем упаривают. Остаток экстрагируют органическим растворителем (гексан, петролейный эфир). Органическую фазу отделяют и упаривают в вакууме. Продукт представляет собой концентрат каротиноидов, включая астаксантин, в комплексе с другими липидами. Выход липидной фракции составляет 0,61-0,68%. Выход каротиноидов составляет 3,57 мг/100 г сырья.
К недостаткам известного способа относится его пожароопасность в связи с использованием ацетона, петролейного эфира, а также невысокое содержание астаксантина в целевом продукте.
Известен способ получения каротиноидов из морских звезд Asterina pectinifera и Asterias amurensis [Т. Maoka, М. Tsushima, Т. Matsuno // Сотр. Biochem. Physiol. 1989, vol. 93B, №4, p. 829-834]. Сущность способа состоит в следующем: каротиноиды экстрагируют из сырья ацетоном, затем переводят в систему эфир - н-гексан (1:1) добавлением воды. Экстракт концентрируют при низком давлении в атмосфере азота при температуре 40°С.Каротиноиды очищают препаративной тонкослойной хроматографией на силикагеле в системе ацетон - н-гексан (3:7) с последующей идентификацией с помощью ВЭЖХ. Выделены 34 каротиноида в количестве 5 мг / 100 г сырья из A. pectinifera и 2,1 мг/100 г сырья из A. amurensis. Помимо астаксантина, определены пектенолон, 4-гидроксиаллоксантин, 4-кетоаллоксантин, зеаксантин и другие каротиноиды.
К недостаткам способа относится то, что способ является лабораторным и не годится для промышленного применения. Используются много пожароопасных реагентов: ацетон, эфир, н-гексан, а содержание и выход каротиноидов из сырья очень низкий.
Известен способ получения цитотоксических каротиноидов из морских звезд вида Marthasterias glasialis [F. Ferreres, D. Pereira et al. // J. Sep.Sci 2010, vol. 33, p. 2250-2257]. Сущность способа состоит в следующем: образцы очищают, промывают морской водой, лирфильно высушивают и измельчают, затем трехкратно экстрагируют метанолом и ацетоном в темноте. Экстракт выпаривают досуха. Выделение и очистку каротиноидов проводят методом ВЭЖХ. Основными идентифицированными каротиноидами были астаксантин, лютеин, зеаксантин. Выход общей каротиноидной фракции составил как в метанольном, так и в ацетоновом экстракте около 1%, при этом содержание астаксантина в метанольном экстракте - 0,01%, в ацетоновом экстракте - 0,001% от общего количества сухого сырья.
К недостаткам способа относятся: низкий выход каротиноидов, использование пожароопасных (ацетон) и токсичных (метанол) реактивов. Способ является лабораторным, к промышленному использованию непригоден.
Наиболее близким к заявляемому техническому решению является способ получения каротиноидного комплекса из морских звезд вида Patiria pectinifera [RU 2469732 C1, 20.12.2012].
Сущность способа состоит в следующем. Сырье обезвоживают 96% этиловым спиртом в течение 60-90 мин, затем экстрагируют 96% этиловым спиртом при соотношении сырье этанол 1:(1-1,2) с добавлением пищевой кислоты в соотношении спирт: кислота 100.(1-1,2) и аскорбиновой кислоты в соотношении спирт: аскорбиновая кислота 1000.(1-1,2) при 15-25°С без доступа воздуха и света в течение 24-48 ч, далее экстракт фильтруют, концентрируют в вакууме при 40-60°С, затем полученный концентрат разбавляют дистиллированной водой до содержания этилового спирта в полученном растворе 20-30% и пропускают через колонку с полихромом-1, уравновешенным 20-30% этиловым спиртом, далее сорбент промывают градиентом этилового спирта с 30 до 50%, а целевой продукт элюируют 60-65% этиловым спиртом, затем элюат упаривают в вакууме при 40-60°С, полученный концентрат растворяют в 96% этиловом спирте, отстаивают 22-24 ч при (-18°С), центрифугируют, затем этанольный раствор упаривают в вакууме при 40-60°С.
Получают комплекс каротиноидов, содержащий астаксантин, лютеин, β-каротин. Выход составляет 0,8-1,00% от веса исходного сырья (4-5% от веса сухого сырья). Содержание астаксантина в полученном каротиноидном комплексе в пределах от 30 до 50%.
К недостаткам способа относится относительно низкое содержание астаксантина в каротиноидном комплексе, использование больших количеств этилового спирта для экстракции сырья, что снижает экономичность процесса и повышает его пожароопасность. Процесс длительный, так только экстракция может идти до 48 часов. К тому же этанол экстрагирует большое количество разнообразных липидов, что затрудняет очистку целевого продукта, увеличивает продолжительность промывки сорбента градиентом этилового спирта и повышает его расход.
Технической проблемой, решаемой изобретением, является повышение содержания астаксантина в каротиноидном комплексе, упрощение и удешевление процесса его получения.
Поставленная задача решается тем, что в известном способе получения каротиноидного комплекса из морских звезд вида Patiria pectinifera, включающем экстракцию и хроматографическую очистку целевого продукта на полихроме-1, согласно изобретению промытое и подсушенное сырье экстрагируют 0,125-0,250 N водным раствором органической или неорганической пищевой кислоты (рН 1-2), при соотношении сырье: кислота 1-(1:1,2) в течение 12-14 ч, при перемешивании, затем раствор сливают, а сырье повторно экстрагируют пищевой кислотой, далее полученные экстракты объединяют, центрифугируют при 1000-3000 об/мин в течение 5-15 мин, после чего фильтруют, затем фильтрат, содержащий водорастворимый белок-каротиноидный комплекс подкисляют раствором используемой в процессе кислоты до рН 1-2 и пропускают его через колонку с полихромом-1, уравновешенным 0,125-0,250 N водным раствором органической или неорганической пищевой кислоты (рН 1-2), далее колонку промывают последовательно водой и градиентом этилового спирта от 30 до 50%, затем каротиноидный комплекс элюируют 60-96% этиловым спиртом, элюат упаривают в вакууме при температуре 40-60°С до полного удаления растворителя, далее концентрат растворяют в 96% этиловом спирте и раствор отстаивают 22-24 ч при (-18°С), далее выпавший осадок отделяют центрифугированием, а спиртовой раствор упаривают в вакууме при 40-60°С.
Получают комплекс каротиноидов, содержащий астаксантин и его ацетиленовые производные. Выход составляет 0,32-0,46% от веса исходного сырья (1,6-2,3% от веса сухого сырья). Содержание астаксантина в полученном каротиноидном комплексе в пределах от 40 до 65% в зависимости от качества используемого сырья и от 60 до 85% вместе с его ацетиленовыми производными.
Технический результат, обеспечиваемый изобретением, заключается в повышении содержания астаксантина в каротиноидном комплексе в среднем в 1,3 раза по сравнению с содержанием его в каротиноидном комплексе, полученном известным способом. В отличие от прототипа заявляемый способ обеспечивает получение каротиноидного комплекса, который обогащен как астаксантином, так и его ацетиленовыми производными, т.е. соединениями близкими по структуре к астаксантину. Известно, что ацетиленовые липиды, в том числе и каротиноиды обладают противоопухолевым эффектом. [Kilimnik, A. et al. // М JPhar, 2016, vol. 1(1), p. 005; Dembitsky, V. M. et al. //Natural Product Communications, 2006, vol. 1(9), p. 773-881].
Заявляемый способ более технологичен и экономичен по сравнению с прототипом, т.к. не требует использования дорогостоящего этилового спирта для экстракции сырья. Для очистки целевого продукта требуются небольшие объемы этого растворителя. Отсутствие необходимости обезвоживать сырье и меньшая продолжительность экстракции, позволяет снизить временные затраты на 11-38 часов. А центрифугирование перед фильтрацией позволяет сократить продолжительность последней в 3-4 раза.
Сущность метода заключается в следующем: морские звезды Patiria pectinifera, свежевыловленные или дефростированные, сортируют, отделяют от посторонних примесей и морских гидробионтов других видов, помещают на сетчатый фильтр, промывают пресной технической или питьевой водой от песка, ила и остатков морской воды, подсушивают для удаления избыточной поверхностной влаги. Дальнейший процесс экстракции проводится в водной среде, поэтому обезвоживание сырья не требуется. Это сокращает расходы этанола и снижает длительность процесса на 60-90 мин.
Подготовленное сырье загружают в реактор и заливают «под зеркало» экстрагент, представляющий собой 0,125-0,250 N раствор любой разрешенной в пищевой промышленности неорганической или органической кислоты (рН 1-2) при соотношении сырье. кислота 1-(1:1,2). Экстракцию проводят в течение 12-14 ч, при перемешивании и контроле значений рН. В результате экстракции раствором кислоты извлекают водорастворимые комплексы белок-каротиноид. Гидрофобные соединения, например, свободные каротиноиды и каротиноиды, этерифицированные с жирными кислотами, раствор кислоты не экстрагирует (в отличие от этанола).
После окончания процесса экстракции раствор сливают, сырье повторно заливают раствором соответствующей кислоты (кратность процедуры определяется истощением сырья). Полученные экстракты объединяют, центрифугируют при 1000-3000 об/мин в течение 5-15 мин (рН 1-2), после чего фильтруют. Концентрирование в вакууме не требуется в отличие от способа-протитопа, в котором высокая концентрация этанола препятствует взаимодействию каротиноидного комплекса с сорбентом, вследствие чего процедура концентрирования экстракта необходима, в первую очередь, для отгона излишков спирта. Отсутствие концентрирования экстракта под вакуумом сокращает длительность заявляемого способа и упрощает его.
При экстракции сырья кислым водным раствором извлекается белково-каротиноидный комплекс (фиг. 1А).
Разделение комплекса на белковую и каротиноидную составляющую проводят на гидрофобном сорбенте полихром-1. Для этого в полученном фильтрате доводят значение рН до 1-2, подкисляя его раствором кислоты используемой в процессе, после чего пропускают его через колонку с полихромом-1, уравновешенным 0,125-0,250 N водным раствором той же пищевой кислоты (рН 1-2).
Колонку с адсорбированным белково-каротиноидным комплексом промывают последовательно водой и градиентом этилового спирта от 30 до 50% для удаления кислоты и соединений белковой природы (фиг 2).
Каротиноиды элюируют 60-96% этиловым спиртом (фиг 1Б). Элюат упаривают в вакууме при температуре 40-60°С до полного удаления растворителя.
Отделение каротиноидного комплекса от фосфолипидов осуществляют растворением концентрата в 96% этиловом спирте и отстаиванием раствора в морозильной камере (-18°С) в течение 22-24 ч с последующим центрифугированием и упариванием раствора в вакууме при температуре 40-60°С.
Получают темно-красную маслянистую массу, представляющую собой смесь астаксантина и его ацетиленовых производных. Полученный каротиноидный комплекс хорошо растворим в растительном масле и этиловом спирте. Содержание астаксантина в комплексе, составляет 40-65%, в зависимости от качества используемого сырья, а вместе с его ацетиленовыми производными - 60-85%.
Анализ экстрактов и полученного каротиноидного комплекса выполняли методами спектрофотометрии в УФ и видимом диапазонах (UV-VIS) (фиг. 3) и хромато-масс-спектрометрии с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ/МС) (фиг. 4).
Спектрофотометрию в УФ и видимом диапазонах проводили на спектрофотометре СФ-200 (ОКБ «Спектр», г. Санкт-Петербург, Россия). Использованы кварцевые кюветы с толщиной слоя 1 см.
Хромато-масс-спектрометрию с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ/МС) проводили на хромато-масс-спектрометре LSMS-IT-TOF с жидкостным хроматографом LC-20A и детектором на диодной матрице SPD-M20A (Shimadzu, Япония).
На фиг. 1 представлены UV-VIS спектры: (А) - водно-кислотного экстракта звезды P. pectinifera, (Б) - водно-спиртового элюата (60-96%) с полихрома-1. Спектр (Б) имеет характерные для каротиноидов области поглощения (350-550 нм). В спектре (А) данные области поглощения не наблюдаются, что подтверждает отсутствие в исходном водно-кислотном экстракте свободных каротиноидов. Появление в образце (Б) характерных для каротиноидов пиков поглощения в UV-VIS спектре свидетельствует о денатурации и диссоциации этиловым спиртом белково-каротиноидного комплекса с получением каротиноидного комплекса, обогащенного астаксантином.
На фиг. 2 представлен UV-VIS спектр 30-50% водно-спиртовых промывных вод с полихрома-1. Спектр имеет характерную для белков область поглощения (278 нм). Это свидетельствует об отделении белков от белково-каротиноидного комплекса и удалении их из целевого продукта.
На фиг. 3 представлен UV-VIS спектр каротиноидного комплекса, обогащенного астаксантином и его ацетиленовыми производными. Спектр имеет характерные для каротиноидов области поглощения (350-550 нм).
На фиг. 4 (А, Б) представлены результаты хромато-масс-спектрометрического анализа с использованием ВЭЖХ/МС каротиноидного комплекса, выделенного из морской звезды P. Pectinifera, содержащего в качестве основного компонента астаксантин и его ацетиленовые производные.
А. ВЭЖХ каротиноидного комплекса (X - время удерживания вещества, мин; Y - интенсивность поглощения при 450 нм).
1 - 7,8,7',8'-тетрадегидроастаксантин;
2 - 7,8-дидегидроастаксантин;
3 - астаксантин;
4 - астаксантин, пектенолон, 4-гидроксиаллоксантин, 4-кетоаллоксантин;
5 - 4-гидроксиаллоксантин, пектенолон, 4-кетоаллоксантин;
6 - 7,8,7',8'-тетрадегидроастаксантин, неидентифицированные каротиноиды;
7 - 7,8-дидегидроастаксантин, 7,8,7',8'-детрадегидроастаксантин;
8 - астаксантин, неидентифицированные каротиноиды.
Б. МС спектр пика каротиноидов с временем удержания 7,266 мин.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1
Сырье - свежевыловленные морские звезды вида Patiria pectinifera в количестве 10 кг очищают от посторонних примесей, помещают на сетчатый фильтр, промывают пресной технической или питьевой водой и дают стечь избыточной влаге. Подготовленное сырье загружают в эмалированный реактор с герметично закрывающейся крышкой или полимерную емкость, разрешенную для контакта с пищевыми продуктами, и заливают 10 л раствора 0,125 N соляной кислоты с рН 2. Экстракцию проводят в течение 12 ч при перемешивании каждые 3-4 ч и контролем рН 2. Экстракт сливают, процесс повторяют трехкратно.
Полученные экстракты объединяют, центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 мин, после чего фильтруют. В полученном фильтрате доводят значение рН до 2, добавляя 4 N раствор соляной кислоты, и пропускают через колонку с полихромом-1, уравновешенным 0,125 N раствором соляной кислоты (рН 2). Колонку с адсорбированными каротиноидами промывают водой, а затем градиентом этилового спирта 30→50%. Каротиноиды элюируют 96% этиловым спиртом. Полученный элюат упаривают в вакууме до полного удаления растворителя при температуре 60°С. Концентрат элюата растворяют в 1 л 96% этилового спирта и помещают в морозильную камеру (-18°С) на 22 ч. Выпавший осадок липидов отделяют центрифугированием при -18°С, 3000 об/мин в течение 30 минут. Спиртовой раствор упаривают в вакууме при температуре 60°С.
Получают 46 г каротиноидного комплекса, содержащего 18,4 г астаксантина.
Пример 2
Сырье - 10 кг морских звезд Patiria pectinifera, замороженных и хранившихся при -18°С, дефростируют помещают на сетчатый фильтр, промывают пресной технической или питьевой водой и дают стечь избыточной влаге. Подготовленное сырье загружают в эмалированный реактор с герметично закрывающейся крышкой или полимерную емкость, разрешенную для контакта с пищевыми продуктами, и заливают 12 л раствора 0,250 N щавелевой кислоты с рН 1. Экстракцию проводят в течение 14 ч при перемешивании каждые 3-4 ч и контролем рН 1. Экстракт сливают, процесс повторяют двукратно.
Полученные экстракты объединяют, центрифугируют при 1000 об/мин в течение 15 мин, после чего фильтруют. В полученном фильтрате доводят значение рН до 1, добавляя 3 N раствор щавелевой кислоты, и пропускают через колонку с полихромом-1, уравновешенным 0 250 N раствором щавелевой кислоты (рН 1). Колонку с адсорбированными каротиноидами промывают водой, а затем градиентом этилового спирта 30→50%. Каротиноиды элюируют 60% этиловым спиртом. Полученный элюат упаривают в вакууме до полного удаления растворителя при температуре 40°С. Концентрат растворяют в 1 л 96% этилового спирта и помещают в морозильную камеру (-18°С) на 24 ч. Выпавший осадок липидов отделяют центрифугированием при -18°С, 3000 об/мин в течение 30 минут. Спиртовой раствор упаривают в вакууме при температуре 40°С.
Получают 32 г каротиноидного комплекса, содержащего 20,8 г астаксантина.