СПОСОБ ИНДУКЦИИ АНТИПРОЛИФЕРАТИВНОГО, ЦИТОТОКСИЧЕСКОГО ЭФФЕКТА В ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТКАХ ЛИНЕЙНЫХ И СВЕЖЕВЫДЕЛЕННЫХ КУЛЬТУР
METHOD OF ANTIPROLIFERATIVE AND CYTOTOXIC EFFECT INDUCTION IN TUMOR CELL LINES AND FRESHLY ISOLATED TUMOUR CELL CULTURES

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальным исследованиям в онкологии, и может быть использовано для получения цитотоксического действия на опухолевые клетки in vitro.
Известно, что многие макро- и микроэлементы участвуют в различных метаболических процессах, а при патологии их обмен может нарушаться.
Общеизвестна роль железа в транспорте кислорода, цинка в формировании молекул гормонов тимуса. С другой стороны, металлы и их соединения обладают способностью подавлять рост клеток. Металлы, например платина, входят в состав некоторых химиопрепаратов.
Известна концепция о влиянии микроэлементов на иммунный гомеостаз в норме и патологии, а также о необходимости коррекции микроэлементного статуса организма с целью повышения противоопухолевой резистентности (Кудрин А.В., Громова О.М. Микроэлементы в иммунологии и онкологии. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2007. 544 с). Согласно приведенным в монографии данным в группу важнейших микроэлементов входят железо (Fe), медь (Cu), цинк (Zn).
Однако в монографии отсутствуют сведения о влиянии на биологические процессы металлов в виде наночастиц, которые в силу своего размера обладают повышенной способностью к проникновению в клетки и встраиванию в различные метаболические цепи.
Известен способ применения нанотехнологий для молекулярной визуализации, молекулярной диагностики и таргетной терапии раковых заболеваний (Nie Shuming et al., Nanotechnology application in Cancer // Annual Review of Biomedical Engineering. 2007. Vol.9. P.257-288; Иванов A.B. и соавт. Методы нанотехнологии в исследовании биологических структур // 6 Всероссийская научно-практическая конференция «Отечественные противоопухолевые препараты». (Москва, 24-26 марта 2007). Росс., биотерапевт. ж. 2007. Т.6. №1. С.74; Рапопорт Н.Я. Мультифункциональные наночастицы для комбинированного имаджинга в терапии опухолей // Там же. С.79).
0,5
0,5
2
4
В экспериментальных исследованиях показано, что магнитные наночастицы, содержащие 5-фторурацил, угнетают рост рака печени (Wang Jian-ming et al. Экспериментальное исследование по лечению при раке печени с помощью магнитного нацеливания наночастиц //.Clin. J. Hepatobiliary Surg. 2007. 13. №9. С.621-623). Данная работа использована нами в качестве прототипа. Установлено отсутствие негативного действия наночастиц металлов на морфологию нормальных тканей, в частности они не вызывают гемолиза эритроцитов крови (Cong Xiaoming et al. Биосовместимость наночастиц MnZnFeO используемых в гипертермии опухолей // J. Southeast Univ. Natur. Sci. Ed. 2007. 37. №3. С.476-480). Установлено также, что введение нанодисперсионного железа нормализует показатели крови коров, инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота, которых авторы предлагают использовать в качестве биологической модели для исследования различных форм лейкоза человека (Павлов Г.В. и соавт. Влияние нанодисперсионного железа при лейкозе животных // Нанотехнологии и информационные технологии - технологии XXI века: Материалы Международной научно-практической конференции. (Москва, 24-26 мая 2006 г.). М., 2006. С.117-118).
Однако в литературе отсутствуют данные об исследовании влияния наночастиц металлов на пролиферативные свойства опухолевых клеток. Целью изобретения является определение эффективности антипролиферативного действия наночастич металлов на моделях линейных и свежевыделенных культур опухолевых клеток.
Поставленная цель достигается тем, что используют наночастицы меди, железа или цинка, при этом культуру клеток линии миеломы Х563 инкубируют с указанными наночастицами в течение 30 минут, клетки костномозгового пунктата больных множественной миеломой инкубируют с указанными наночастицами в течение 45 минут при 37°С, а ткань рака легкого культивируют с указанными наночастицами в диффузионных камерах, подшитых в брюшную полость крыс в течение 6 дней.
Изобретение "Способ индукции антипролиферативного, цитотоксического эффекта в опухолевых клетках линейных и свежевыделенных культур" является новым, так как оно неизвестно из уровня медицины при исследовании влияния наночастиц металлов на пролиферативную активность и свойства опухолевых клеток.
Новизна изобретения заключается в том, что используют наночастицы меди, железа или цинка, при этом культуру клеток линии миеломы Х563 инкубируют с указанными наночастицами в течение 30 минут, клетки костномозгового пунктата больных множественной миеломой инкубируют с указанными наночастицами в течение 45 мин при 37°С, а ткань рака легкого культивируют с указанными наночастицами в диффузионных камерах, подшитых в брюшную полость крыс в течение 6 дней.
Изобретение является промышленно применимым, так как может быть использовано в здравоохранении при проведении экспериментальных исследований в онкологии.
"Способ индукции антипролиферативного и цитотоксического эффектов в опухолевых клетках линейных и свежевыделенных культур" выполняется следующим образом.
1. Влияние инкубации с НЧ на культуру линейных и свежевыделенных клеток миеломы.
6
А/. Влияние НЧ на состояние культуры линии миеломных клеток мыши Х563. Суспензионную культуру миеломных клеток мыши (плазмоцитов) линии Х563 в концентрации 0,8×10/мл культивируют в полной культуральной среде. К 50 мкл культуры добавляют по 10 мкл взвеси НЧ меди, железа и цинка (1 мкг/мл) и инкубируют 30 мин в термостате; в контрольную пробу добавляют эквивалентный объем среды. Затем готовят мазки и окрашивают по Романовскому-Гимзе, а также ставят тест с трипановым синим, по результатам которого оценивают процент погибших клеток в каждой пробе и устанавливают, что наибольшей цитотоксичностью обладают НЧ меди, которые вызывают повышение процента погибших клеток с 10% (контроль) до 37% (табл.1). Окрашенные мазки подвергают цитологическому исследованию в светооптическом микроскопе и устанавливают, что клетки культуры после инкубации с НЧ увеличены в размерах, гиперхромны, имеют признаки дистрофических изменений в виде кариопикноза, кариорексиса, кариолизиса, вакуолизации ядра и цитоплазмы, в ряде случаев от клеток остаются «тени» (фиг.1, 2, 3, 4, на которых представлены клетки контрольной культуры Х563 и клетки после действия НЧ цинка, железа и меди соответственно). Максимально выраженные изменения гибели клеток наблюдаются при действии НЧ меди (табл.1).
Таблица 1
Влияние инкубации с НЧ металлов на количество погибших и дистрофически измененных клеток культуры Х563
Показатели
Пробы
Контроль
Cu
Zn
Fe
Погибшие клетки (%)
10
37
26
24
Клетки с дистрофическими изменениями (%)
10
75
41
25
Примечание. Опыт ставили с концентрацией НЧ 1 мкг/мл.
Б/. Влияние НЧ металлов на состояние плазматических бластных клеток больных множественной миеломой.
Клетки костного мозга больной К. (Диагноз: множественная миелома, выявлена впервые, лечения не проводилось, в стернальном пунктате 24% плазматических бластных клеток) выделяют из стернального пунктата и инкубируют с НЧ меди, железа и цинка в концентрации 1 мкг/мл в течение 45 мин при 37°C. Затем ставят аннексиновый тест для оценки апоптоза и готовят цитологические препараты. Результаты представлены в табл.2. Для оценки гибели клеток использовали аннексиновый тест, а не тест с трипановым синим, так как последний не дает возможности отдифференцировать погибшие плазмобласты от других костномозговых клеток, а в аннексиновом тесте это представляется возможным. В табл.2 представлена суммарная гибель плазмобластов (апоптоз + некроз), а также раздельная по этим двум видам.
Таблица 2
Влияние инкубации с НЧ металлов на количество погибших и дистрофически измененных плазмобластов стернального пунктата больного множественной миеломой
Пробы
Погибшие плазматические бластные клетки (%)
Дистрофически измененные плазматические бластные клетки (%)
ранний апоптоз
поздний апоптоз
некроз
Суммарная гибель
Контроль
7
5
0
12
39
НЧ меди (1 мкг/мл)
14
14
5
33
59
НЧ цинка (1 мкг/мл)
12
5
1
18
50
НЧ железа (1 мкг/мл)
5
3
0
8
45
Примечание. Опыт ставили с 100 мкл взвеси клеток и 100 мкл взвеси НЧ.
Из табл.2 видно, что инкубация с НЧ меди вызывает повышение процента погибших плазматических бластных клеток с 12 до 33%, при этом стимулируют как апоптоз, так и некроз опухолевых клеток; количество клеток с дистрофическими изменениями также возрастает (с 39 до 59%). Другие НЧ металлов вызывают незначительное повышение гибели опухолевых клеток (цинк) или не вызывают его вообще (железо). Итак, по результатам, полученным как на линейных, так и на свежевыделенных миеломных (плазматических бластных) клетках, НЧ меди обладают максимальным цитотоксическим эффектом и могут найти применение в качестве антипролиферативных средств.
2. Влияние НЧ на опухолевые клетки рака легкого, культивируемые в диффузионных камерах (ДК).
Фрагмент опухоли больного И. (диагноз: периферический рак верхней доли левого легкого, выявлен впервые, лечения не проводилось, гистология: умереннодифференцированный плоскоклеточный рак без ороговения) был взят при проведении операции пневмонэктомии. Опухоль измельчали ножницами, вносили в диффузионные камеры, состоящие из двух пластмассовых колец с наклеенными на них целлюлозными фильтрами (Сынпор, диаметр пор 0,23 мкм), в пространство между которыми вносили взвесь НЧ меди, цинка или железа в концентрации 1 мкг/мл в объеме 0,1 мл; таким образом там находилось 0,1 мкг НЧ. В контрольные камеры вносили равный объем физиологического раствора. Камеры имплантировали в брюшную полость белых беспородных крыс по 3 камеры на каждое животное и оставляли там на 6 дней. Затем камеры извлекали, разделяли на фильтры; фильтры фиксировали 96° этанолом, проводили через спирты с понижающейся концентрацией до дистиллированной воды, после чего окрашивали гематоксилином, проводили по ряду спиртов с повышающейся концентрацией до абсолютного, просветляли в ксилоле и на предметных стеклах заключали в канадский бальзам. Окрашивали гематоксилином. Приготовленные таким образом препараты ксенографтов опухолей исследовали под микроскопом. Полученные результаты представлены на фиг.5, 6, 7, 8 и в табл.3. При просмотре препаратов под микроскопом установлено отсутствие, вплоть до полного, опухолевых клеток при использовании НЧ меди (фиг.5). НЧ цинка вызывает менее выраженное цитотоксическое действие (фиг.6); при действии НЧ железа наблюдались отдельные скопления опухолевых клеток (фиг.7). В контрольных препаратах отмечался сплошной рост опухолевых клеток в виде слоя, покрывающего весь фильтр (фиг.8).
Более подробный анализ характера роста клеток в ДК и их состояния под иммерсионным увеличением выявил следующее. При инкубации опухоли с НЧ меди на фильтрах наблюдаются обширные пятна лизиса, в которых видны нити (остатки разрушенных опухолевых клеток). Определяются редкие небольшие россыпи или очажки одиночных опухолевых клеток, большая часть которых дистрофически изменена; в ядрах сохранившихся клеток содержится одно небольшое ядрышко или (реже) несколько мелких пылевидных, что говорит об угнетении процессов белкового синтеза. Изредка встречаются гигантские многоядерные клетки.
Действие НЧ цинка вызывает образование на фильтрах среди зон лизиса очагов однослойной культуры и отдельно лежащих опухолевых клеток с выраженным полиморфизмом и анизоморфизмом. В ядрах клеток содержатся 1-2 небольших ядрышка или несколько пылевидных. В некоторых очагах видны гигантские многоядерные клетки (до 14 в поле зрения).
При действии НЧ железа отмечены как небольшие, так и крупные очаги однослойной опухолевой культуры, местами с зачатками многослойности, в которых клетки расположены разреженно, реже плотно. Хорошо выражен клеточный полиморфизм. Ядрышки множественные пылевидные. Встречаются скопления гигантских многоядерных клеток (до 26 в поле зрения) и очаги фибробластоподобных (веретенообразных) клеток. Встречаются также поля и пятна лизиса культуры.
В контрольных ДК отмечен рост крупных очагов однослойной и многослойной культуры с выраженным полиморфизмом клеток. Ядрышки множественные мелкие. Количество гигантских многоядерных клеток - от 3 до 20 в поле зрения.
Подсчет в препаратах процента дистрофически измененных опухолевых клеток с явлениями кариопикноза, кариорексиса, кароилизиса, вакуолизации цитоплазмы и ядра позволил установить, что НЧ меди проявляют наибольшее повреждающее действие на опухолевые клетки, культивируемые в ДК; менее интенсивным действием обладают НЧ цинка и самым слабым - НЧ железа (табл.3).
Таблица 3.
Влияние инкубации с НЧ металлов на количество дистрофически измененных клеток рака легкого, культивируемых в диффузионных камерах
Воздействие
Количество дистрофически измененных клеток (%)
ДК №1 (n=10)
ДК №2 (n=10)
ДК №3 (n=10)
М±m (n=30)
Контроль
20,5±1,9
15,5±0,9
19,0±1,4
18,3±0,87
НЧ железа
40,1±3,5*
34,8±4,0*.
37,9±2,4*
37,6±1,82*
НЧ меди
93,9±1,6*
95,1±2,3*
91,1±2,3*
93,4±1,09*
НЧ цинка
61,7±1,9*
79,1±4,4*
58,1±1,8*
66,3±2,28*
Примечание. Подсчет проводили в трех диффузионных камерах (ДК) в каждой в 10 полях зрения; * - статистически достоверные отличия от контроля; жирным шрифтом выделены данные, статистически достоверно превышающие данные всех других проб.
Таким образом, показано цитотоксическое действие инкубации с наночастицами металлов, наиболее выраженное у НЧ меди, на различные опухолевые клетки, выражающееся в индукции гибели и резком подавлении пролиферации линейных и свежевыделенных культур, что подтверждено различными методами.
Технико-экономическая эффективность «Способа индукции антипролиферативного, цитотоксического эффекта в опухолевых клетках линейных и свежевыделенных культур» заключается в том, что использование металлов в виде наночастиц способствует повышению процента гибели опухолевых клеток при исследовании in vitro и в диффузионных камерах, причем процент гибели выше при действии НЧ меди по сравнению с НЧ цинка и железа. Цитологическое исследование также показало увеличение процента дистрофически измененных клеток культуры, инкубированной с НЧ, по сравнению с контролем. Очевиден цитотоксический эффект: НЧ меди стимулируют как апоптоз, так и некроз опухолевых клеток, НЧ цинка усиливают апоптоз. При действии НЧ меди в клетках культуры развиваются дистрофические изменения в виде кариопикноза, кариорексиса, кариолизиса и вакуолизации цитоплазмы и ядра.