СПОСОБ ОЦЕНКИ АКТИВНОСТИ ВЕРМИПРЕПАРАТА
METHOD OF ESTIMATING VERMIPREPARATION ACTIVITY

Предлагаемое изобретение относится к области фармакологии, в частности включает оценку эффективности полученных на основе дождевых червей (ДЧ) фармацевтических, косметических вермипрепаратов (ВП) и биологически активных добавок (БАД) - в процессе их производства, хранения с использованием способа биотестирования по изменению сердечной деятельности дафний.
На сегодняшний день в мире повышенный интерес вызывают фармацевтические препараты из ДЧ. Эти препараты эффективны при лечении инфекций, геронтологических, онкологических, функциональных и многих других заболеваний. Своим лечебным действием они обязаны уникальной иммунной системе ДЧ, сформировавшейся в ответ на экстремальные условия среды обитания.
Иммунная система ДЧ представлена антибиотической, ферментативной системой, комплексом специфических иммунных клеток и комплементарных белков, локализованных в основном в целомической жидкости. В связи с тем, что для производства ВП используется живое сырье (ДЧ), то количество и качество биологически активных агентов, входящих в его состав, сильно варьирует в зависимости от исходного физиологического состояния ДЧ, условий производства, хранения и использования ВП, подбора активных доз фармацевтических агентов. Поэтому требуются легко воспроизводимые, чувствительные способы экспрессной оценки эффективности ВП в сфере вермифармацевтики. Это важно еще и для выявления возможных подделок лекарственных средств и использования просроченных медикаментов как в сфере фармацевтики, так и косметики /Титов И.Н. Новые фармацевтические препараты из ДЧ / И.Н.Титов, С.С.Конин // Материалы 2-й Международной научно-практической конференции «ДЧ и плодородие почвы», 17-19 марта 2004, Владимир, Россия. Ковров, изд-во "X-PRESS", 2004. C.56-59/.
Известен способ определения оптимальных условий культивирования вермикультуры, преимущественно дождевых червей / Патент РФ №2057441 А01К 67/033, C05F 3/06, 1996/, включающий закладку тестовых проб дождевых червей в проверяемые субстраты, содержание червей в этих субстратах, последующую выборку и оценку состояния червей, перед выборкой вермикультуры. Проверяемые пробы субстратов изолируют одна от другой, выделяют червей из каждой пробы субстрата отдельно, а после подсчета и оценки активности червей сравнивают полученные значения по каждому субстрату и по результатам сравнения определяют субстрат с оптимальным составом и оптимальные условия культивирования.
Известен экспрессный способ определения готовности сред, переработанных вермикультурой /Заявка РФ №97119897, C05F 9/04, 2000/, в котором проводят биотестирование с использованием в качестве тест-объекта дафний и о полной степени переработки субстратов судят по отсутствию токсического эффекта.
7
Ближайшим аналогом является метод «Дисков», /Sun Zhenjun. Материалы работы, выполненной при поддержке Национального Фонда Естествознания Китая (Номер 30270195) и Докторского Фонда Национального Образовательного Комитета Китая (20020019029). * Corresponding автор: Телефон, 86-10-62892942; Факс, 86-10-62892498; Электронная почта, sun108@cau.edu.cn.Sun Zhenjun./, применяемый для оценки активности ВП. Для этого бактериальные клетки, выделенные на среде Луриа-Бертани, пересеваются в пробирку с 5 мл той же среды. Делают смыв бактериального налета 5 мл стерильной воды. Высевают каплю полученной суспензии на среду Луриа-Бертани для определения титра микробиологической культуры - титр составлял 10 КОЕ/мл (колониеобразующих единиц на 1 мл). Сеют суспензию на питательную среду для получения в дальнейшем сплошного газона данного микроорганизма. После того как среда с суспензией подсыхает, накладывают на нее стерильный бумажный диск диаметром 6 мм, пропитанный фракцией 20 целомической жидкости. Затем чашки переворачивают и культивируют при температуре 37°С.
Контролем служат диски, пропитанные стерильным физиологическим раствором. Антимикробная активность определяется при наблюдении за зонами супрессии бактериального роста вокруг диска.
Но данный метод весьма трудоемкий и малооперативный. Для получения ответа требуется значительный промежуток времени. Более того, для реализации «Дискового» метода необходима микробиологическая лаборатория и соответствующим образом подготовленные специалисты.
Задачей предлагаемого изобретения является удешевление анализа ВП и других препаратов, проявляющих биологическую активность, повышение чувствительности и экспрессности метода оценки эффективности ВП с использованием теста по изменению частоты сердцебиения дафнии.
Поставленная задача достигается тем, что в качестве тест-объекта используют самок рачков Daphnia magna Straus 2-2,5 недельного возраста, для приготовления испытуемого раствора берут навеску вермипрепарата, смешивают с дехлорированной водопроводной водой 100:1 в течение часа, суспензию освобождают от крупных частичек препарата центрифугированием, помещают в нее указанных рачков и выдерживают 30 минут, при этом критерием активности вермипрепарата является снижение частоты сердцебиения рачков.
Отличие нашего способа заключается в том, что мы предлагаем для диагностики активности ВП использовать конкретную физиологическую реакцию изменения частоты сердцебиения, а не выживаемость, плодовитость. Физиологическая кардиореакция дафний всегда более чувствительна, чем ответ по летальности, и менее длительна, чем ожидание потомства дафний, а также нарастания микробиальной биомассы. Способ осуществляется следующим образом:
Для тестирования используют самок ветвистоусых рачков Daphnia magna Straus 1-2,5 недельного возраста. Период привыкания рачков к условиям эксперимента не более 60 минут. Специальной подготовки тест-объекта к анализу не требуется, тестирование проводят при комнатной температуре 20±2°С. Берут навеску ВП (мелкодисперсного сухого порошка из ДЧ) и смешивают на магнитной мешалке с дехлорированной водопроводной водой в массовых единицах 100:1 в течение 1 часа. Затем суспензию освобождают от крупных частичек препарата центрифугированием в течение 5 минут при 4000 об/мин. Температура суспензии 20±2°С. В стаканчики приливают 30 мл суспензии, туда же помещают 5 дафний и выдерживают 30 минут. Обязателен контроль. В контроле используется дехлорированная водопроводная вода комнатной температуры без смешивания с ВП. Для получения инактивированного ВП сухой порошок из ДЧ прогревают в течение 30 минут при температуре 70°С.
Спустя 30 минут у трех рачков подсчитывают число сердечных сокращений. Для этого рачка помещают на предметное стекло с углублением, для того чтобы в момент трехкратного подсчета капля не высыхала, и сердцебиение не изменилось. С помощью секундомера и механического счетчика для подсчетов элементов крови в течение 15 секунд под бинокуляром считают число ударов сердца.
Критерием активности ВП являлось снижение частоты сердцебиения рачков. Полученные данные отражены на Фиг.1 и Фиг.2.
На Фиг.1 показан график кардиотоксичности вермипрепарата для дафнии. На основании графика можно сделать вывод, что АВП в концентрации 60 мг/мл интенсивно понижает частоту сердцебиения рачков в сравнении с ИВП и водой. ВП обладает широким спектром воздействий на множество физиологических процессов. И поэтому часть агентов ВП выступает в качестве токсикантов, блокирующих сердцебиение дафнии, а часть обладает стимулирующим эффектом, продлевающим жизнь дафнии за счет улучшения обмена веществ, кислородного питания. В данных опытах имеет место первый случай. Поскольку термическая обработка понижает физиологическую активность ИВП, несмотря на то что в дождевых червях содержатся некоторые термостабильные активные вещества, ИВП слабее подавляет сердцебиение дафний, чем АВП.
На Фиг.2 показан график частоты сердцебиения дафнии. Опираясь на данные графика, можно сделать вывод, что гомогенат из планарий резко снижает сердцебиение дафнии, что возможно обусловлено их токсическим эффектом, а для гомогенатов из байкальских олигохет и губок этот эффект много слабее подавляет сердцебиение дафний. Предлагаемая методика более экспрессная - 1-1,5 часа, и более чувствительная. Применение этого способа для оценки активности и эффективности фармацевтических и косметических ВП связано с его высокой чувствительностью и коротким периодом получения ответа, а также возможностью его использования для определения активных доз фармацевтически и косметически активных агентов.