OmpF порины бактерий рода Yersinia: молекулярно-генетические аспекты

Вестник ДВО РАН. 2014. № 1

УДК 579.25

A.М. СТЕНКОВА, Е.П. БЫСТРИЦКАЯ, К.В. ГУЗЕВ,

B.А. РАССКАЗОВ, М.П. ИСАЕВА

OmpF порины бактерий рода Yersinia: молекулярно-генетические аспекты

В обзоре систематизирована информация о генах и кодируемых ими белках OmpF поринах иерсиний, относящихся к классу неспецифических порообразующих белков наружной мембраны грамотрицательных бактерий. Эти белки обеспечивают транспорт низкомолекулярных соединений и отвечают за адаптацию бактерий к условиям окружающей среды, становясь доминантными при определенных условиях. Рассмотрены данные, касающиеся структуры OmpF поринов иерсиний, их филогенетических связей и молекулярной эволюции, а также генетического полиморфизма ompF генов.

Ключевые слова: OmpF порины, филогения, молекулярная эволюция, полиморфизм.

Yersinia OmpF porins: molecular and genetics aspects. A.M. STENKOVA, E.P. BYSTRITSKAYA, K.V. GUZEV, V.A. RASSKAZOV, M.P. ISAEVA (G.B. Elyakov Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, FEB RAS, Vladivostok).

We systematized information about genes and proteins of Yersinia, namely OmpF porins, belonging to the class of non-specifi c pore-forming proteins of the outer membrane from gram-negative bacteria. These proteins provide the transport of low molecular weight compounds and are responsible for the environment adaptation of bacteria being dominant ones under certain conditions. The paper covers data on the structure of Yersinia OmpF porins, their phylogenetic relationships and molecular evolution, and genetic polymorphism of ompF genes.

Key words: OmpF porins, phylogeny, molecular evolution, polymorphism.

Род Yersinia относится к семейству Enterobacteriaceae и включает 17 видов бактерий. Медицинское значение однозначно установлено только для трех видов: Y pestis -возбудителя чумы, Y. pseudotuberculosis - возбудителя псевдотуберкулеза и Y. enterocolitica -возбудителя кишечного иерсиниоза.

Несмотря на серьезные достижения в геномике и протеомике патогенных и непатогенных иерсиний, исследования механизмов адаптации этих бактерий к различным хозяевам и условиям окружающей среды находятся на начальном этапе.

Белки наружной мембраны (НМ) представляют особый интерес, поскольку первыми реагируют на изменения условий окружающей среды и участвуют в процессах взаимодействия микроорганизма и хозяина. К таким белкам относятся в том числе неспецифические порины - доминирующие белки НМ бактерий, которые обладают уникальными структурными свойствами и функционируют как поры, регулируя проницаемость мембраны [9, 18]. Типичная пориновая субъединица состоит из 16 р-тяжей, которые формируют антипараллельный p-баррель с короткими переплазматическими петлями и длинными наружными петлями. Три субъединицы порина образуют стабильный гомотример, который устойчив к действию детергентов и протеаз - ключевое свойство, необходимое кишечным бактериям для выживания в агрессивной среде пищеварительного тракта.

СТЕНКОВА Анна Михайловна - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, БЫСТРИЦКАЯ Евгения Петровна - аспирант, ГУЗЕВ Константин Викторович - младший научный сотрудник, РАССКАЗОВ Валерий Александрович - кандидат биологических наук, заведующий лабораторией, *ИСАЕВА Марина Петровна - кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник (Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН, Владивосток). *Е-шаП: issaeva@piboc.dvo.ru

Некоторые порины участвуют в бактериальном патогенезе, например адгезии и инвазии [12]. Способность поринов создавать протективный иммунитет против бактериальных инфекций используется при разработке вакцинных препаратов [17]. Таким образом, порины являются важным компонентом клетки, их первичная структура заключает в себе те приобретения, которые были получены видом и родом в целом в процессе эволюции. Следовательно, изучение структурной организации генов поринов иерсиний, их полиморфизма и регуляции может способствовать более глубокому пониманию генетических, эволюционных и экологических особенностей бактерий рода Yersinia. В данной статье систематизирована информация о генах и самих OmpF поринах иерсиний, их разнообразии и эволюции.

OmpF порины относятся к классу неспецифических порообразующих белков НМ гра-мотрицательных бактерий, основная функция которых - обеспечение транспорта низкомолекулярных соединений. Они отвечают за адаптацию бактерий к условиям окружающей среды, становясь доминантными белками НМ, например при недостатке питательных веществ, низкой температуре и пониженном осмотическом давлении [16].

Первичная и вторичная структуры OmpF поринов

Поскольку кристаллические структуры установлены всего для нескольких неспецифических поринов, основная информация о поринах бактерий рода Yersinia может быть получена на основе знания их первичной структуры. К сожалению, сравнительное изучение нуклеотидных последовательностей в генах поринов и аминокислотных последовательностей в самих поринах на практике сильно затруднено. Это связано с высокой степенью вариабельности последовательностей наружных петель, обусловленной их взаимодействием с элементами окружающей среды, такими как антитела, компоненты врожденной системы иммунитета, бактериоцины и фаги. Трансмембранный кор, образованный ß-тяжами барреля, является наиболее консервативной частью молекулы белка, поэтому исследователи, как правило, используют соответствующие участки их молекул для идентификации поринов.

В первых наших работах [1, 15] был проведен сравнительный анализ первичных структур OmpF поринов патогенных для человека видов иерсиний и установлены их главные особенности: высокое содержание остатков глицина (11-13 %), значительное содержание остатков кислых аминокислот (аспарагиновой и глутаминовой), отсутствие цистеина и низкое содержание лизина. Относительное содержание остатков заряженных аминокислот в среднем составляло около 25 %, ароматических - около 13 %.

В дальнейших работах было выяснено, что аминокислотный состав OmpF поринов разных видов иерсиний остается практически неизменным и закономерности в распределении основных гидрофобных и ароматических остатков сохраняются [1, 4]. Наибольшее сходство (более 70 %) OmpF порины иерсиний обнаруживают с OmpF порином Serratia marcescens [13]. Более того, OmpF порины иерсиний имеют больший процент идентичности с OmpC порином Escherichia coli (62-63%), чем с OmpF порином E. coli (52-55 %). Подобные факты осложняют идентификацию поринов и приводят к появлению в банках данных неправильно аннотированных последовательностей. Поэтому при установлении класса порина помимо определения степени сходства необходимы дополнительные данные по генному окружению и структуре промоторной области.

При сравнительном анализе OmpF иерсиний было обнаружено, что распределение вариабельных сайтов неравномерно и коррелирует с вторичной структурой белка (рис. 1). Высококонсервативные участки приходятся на ß-тяжи, высоковариабельные - на элементы неупорядоченной структуры, внешние петли. Наиболее дивергентными в OmpF пори-не иерсиний являются петли L4, L5 и L7 (0,35 ± 0,03), тогда как наиболее консервативной - петля L3 (0,028 ± 0,01).

Рис. 1. Гистограмма распределения вариабельных аминокислотных сайтов в ОшрБ поринах иерсиний. Консервативные районы, соответствующие р-тяжам, периплазматическим петлям и петле Ь3, обозначены белым цветом, вариабельные районы, соответствующие наружным петлям Ы, Ь2, Ь4-Ь8, - черным

Известно, что петля Ь3 проникает внутрь поры и участвует в механизме открытия-закрытия канала. Ключевыми остатками во взаимодействии петли Ь3 с внутренней стенкой Р-барреля служат ЬуБ16, А^41, А^82, А^132 (Р-баррель) и АБрПЗ, в1и117 (петля Ь3) [9]. Интересно, что в высококонсервативном и функционально значимом пентапептиде РБРвв петли Ь3 для всех иерсиний наблюдается замена остатка глутаминовой кислоты на неполярный валин, что может оказывать влияние на специфичность и проводимость канала.

Петли поринов являются потенциальными мишенями для связывания бактериофагов, бактерицинов, белков системы комплемента и антител [5]. Мы обнаружили [1-3, 21], что для наружных петель ОшрБ поринов иерсиний характерна высокая внутри- и межвидовая гетерогенность, которая может свидетельствовать о высокой скорости эволюции в этих участках и о функциональной значимости их в адаптации иерсиний к разнообразным условиям внешней среды. Возможно, изменение структуры «внешних» петель можно рассматривать как способ противостояния системе иммунитета хозяина, т.е. как стратегию выживания, развитую патогенными бактериями.

Филогенетические связи и молекулярная эволюция OmpF поринов

Гены, кодирующие OmpF порины, являются по отношению друг к другу орто-логами, т.е. потомками общего предкового гена, которые присутствуют в геномах разных видов. В данном случае можно предположить, что ompF гены должны эволюционировать сопряженно с видообразованием и, следовательно, должны отражать особенности эволюционного пути того или иного вида. Для получения целостной картины о филогенетических отношениях генов OmpF поринов иерсиний мы провели исследование ДНК 69 штаммов, представляющих 14 видов бактерий рода Yersinia [21]. Все взятые в работу штаммы иерсиний были генотипированы на основе объединенного филогенетического дерева генов «домашнего хозяйства» - 16S рДНК и gyrB.

В общем, как и ожидалось, ompF ген показал большую дивергенцию (сходство около 87 %), чем 16S рДНК и gyrB гены (сходство около 94,9 %). Обнаружено, что филогенетические связи большинства видов иерсиний по ompF гену топологически соответствуют таковым по генам «домашнего хозяйства» с хорошей бутстреп-поддержкой (75-100 %) (рис. 2А, см. вклейку).

Для ряда видов иерсиний наблюдалось значительное увеличение степени дивергенции с образованием генетически дистантных групп, что может быть обусловлено либо внутри /межвидовой рекомбинацией, либо адаптивной эволюцией гена OmpF порина. Известно, что рекомбинации способны значительно влиять на филогенетические связи организмов. Полученные результаты филогенетического анализа ompF генов иерсиний указывают на возможные рекомбинационные события в гене у некоторых штаммов и даже видов. Используя программный пакет RDP3, включающий наиболее популярные методы выявления

рекомбинационных перестроек (RDP, MaxChi, Chimera и GENECONV), мы обнаружили четыре события, затрагивающие штаммы Y. intermedia, Y. aleksiciae и Y. mollaretii (рис. 2В). Интересно, что во всех случаях хорошо совпадает район одной рекомбинационной точки (431-501 н.п.), который попадает на 6-й ß-тяж белковой молекулы.

Филогенетическое дерево участка ompF гена (1-501 н.п.) (рис. 2Б) для этих видов иерсиний и их ближайших филогенетических соседей отражает топологию, схожую с таковой для 16S рДНК-gyrB генов. Следует обратить особое внимание на то, что участок гена (1-501 н.п.) кодирует тяжи и петли, участвующие в образовании зоны межсубъединичного взаимодействия (рис. 3, см. с. 2 обложки).

Обнаруженные нами в ompF гене бактерий рода Yersinia как внутривидовая (Y. intermedia), так и межвидовая (Y. aleksiciae и Y. mollaretii) рекомбинации могут вносить существенный вклад в формирование гетерогенных по данному признаку популяций. Поскольку эволюция бактериальных геномов сильно зависит от таких процессов, как горизонтальный перенос генов и гомологичная рекомбинация, оба эти процесса ускоряют адаптацию микроорганизма за счет создания новых аллелей. Например, ранее было показано, что в основе возникновения разных классов поринов рода Neisseria и их полиморфизма лежат как рекомбинация, так и горизонтальный перенос генов [10].

В результате проведенного нами сравнительного анализа ompF генов иерсиний [21] установлено, что разные участки гена эволюционируют с разной скоростью в зависимости от структурно-функциональной организации белковой молекулы. Внутривидовая дивергенция (рис. 4, см. вклейку) различалась у разных видов не только по степени гетерогенности, но и по локализации гетерогенных участков в гене, что, возможно, обусловлено видовым разнообразием функционирования доменов OmpF порина.

Известно, что большой вклад в эволюцию белков вносит мутационный процесс. Данные, полученные на основе идентификации генов, находящихся под действием положительного отбора, у штаммов E. coli и Shigella flexneri [19] свидетельствуют о существенной доле генов белков НМ среди других выявленных генов. Пять из 18 пориновых локусов (lamB, ompC, ompF, ompW и fhuA) показали значительную положительную селекцию. Установлено, что сайты, расположенные в петле L9 LamB порина и находящиеся под действием положительной селекции, участвуют в связывании с фагом [7].

Нами исследован характер эволюции ompF гена иерсиний, определены скорости синонимичных и несинонимичных замен [21]. Поскольку ряд ompF аллелей содержит сигналы рекомбинационных событий, они были исключены из дальнейшего анализа. Было установлено, что большинство участков ompF генов иерсиний, кодирующих как трансмембранные ß-тяжи, так и наружные петли, испытывает давление очистительного отбора. В некоторых наружных петлях обнаружены сайты, находящиеся под положительным отбором (рис. 5, см. с. 3 обложки). Интерес представляет тот факт, что у разных групп иерсиний эти сайты локализованы в разных петлях.

Ранее Smith с соавторами [20] исследовали адаптивную эволюцию в четырех группах поринов нейссерий и выявили положительную эволюцию в участках, кодирующих наружные петли поринов, в группе Neisseria gonorrhoeae, тогда как остальные porB аллели не показывали наличия какой-либо адаптивной эволюции. Авторы предположили, что ведущую роль в возникновении положительного отбора играет иммунная система хозяина, а различия между разными пориновыми аллелями объяснили различиями иммунного ответа на N. gonorrhoeae и N. meningitidis. Последующие исследования в этой области [8, 22] подтвердили наличие аминокислотных остатков, находящихся под сильным положительным отбором, в наружных петлях PorB N. meningitidis и показали действие очистительной селекции на трансмембранные участки белковой молекулы, обусловленное структурной функцией.

При исследовании эволюции белок-кодирующих генов часто определяют индексы предпочтения определенных кодонов, например индекс адаптации кодонов (CAI, Codon

Adaptation Index). Чем выше значение этого индекса, тем сильнее смещение в предпочтении определенных кодонов и тем выше уровень экспрессии гена. Мы показали, что для иерсиний значения индекса CAI генов рибосомных белков (высокоэкспрессируемых генов) варьировали от 0,615 до 0,717, тогда как значения этого индекса у ompF генов были несколько выше - от 0,702 до 0,793 [21]. Следовательно, в ompF гене иерсиний наблюдается строгое предпочтение определенных кодонов, что свидетельствует о высоком уровне экспрессии этого гена.

Генетический полиморфизм ompF генов Y. pseudotuberculosis

Исследование популяционной структуры патогенного вида - крайне важная задача для решения ряда вопросов молекулярной эпидемиологии инфекции, в первую очередь в отношении определения доминирующих и минорных генотипов. Псевдотуберкулезная инфекция, этиологическим агентом которой является Y. pseudotuberculosis, регистрируется во многих странах мира. Известно, что на территории Сибири и Дальнего Востока циркулирует возбудитель, относящийся к дальневосточному патогенному типу YPMa+ HPI-, вызывающему системную инфекцию [11]. Поскольку псевдотуберкулез характеризуется большим разнообразием клинических форм и вариантов, можно предположить, что причины такой патологии могут быть обусловлены генетической гетерогенностью популяции Y. pseudotuberculosis.

Нами был проведен филогенетический и эволюционный анализ ompF генов 63 штаммов Y. pseudotuberculosis, выделенных из различных источников по всему миру и представляющих все известные серотипы и биовары [14]. Эволюционная дивергенция ompF гена для всех штаммов в среднем составила 0,041 ± 0,004. Популяционная структура Y. pseudotuberculosis была представлена более чем 30 уникальными аллелями ompF гена, которые формировали 7 групп на филогенетическом дереве. Доминирующими аллелями Y. pseudotuberculosis были штаммы с IP32953-, IP31758- и YPIII ompF генами. Установлено, что все исследуемые штаммы Y. pestis попадают в группу YPIII ompF-подобных генов. Как известно, Y. pestis недавно эволюционировала от Y. pseudotuberculosis [6] и, по-видимому, от штаммов с YPIII ompF геном.

Мы обнаружили также, что штаммы Y. similis, недавно выделенного вида из Y. pseudotuberculosis, по ompF гену вместе со штаммами Y. pseudotuberculosis формируют три наиболее генетически гетерогенные группы (IV-VI). Ранее нами было показано, что у видов Y. pseudotuberculosis, Y. similis и Y. pestis топологии филогенетических деревьев по ompF гену и 16S rDNA-gyr5 генам сильно различаются, что указывает на межвидовую гомологичную рекомбинацию либо адаптивную эволюцию в ompF гене [21].

При сравнительном анализе белок-кодирующей части ompF генов Y. pseudotuberculosis (рис. 6, см. с. 3 обложки) выявлено, что среди наружных петель наиболее гетерогенными являются петли L1 (0.258), L6 (0.179) и L8 (0.197). Самый высокий уровень идентичности обнаружен для петли L3 (0.004). Петли L5 и L6 содержали делеции и/или инсерции. Из трансмембранных участков наиболее дивергентными были тяжи 8-9в (0.019) и 12-13в (0.038). Наблюдаемый полиморфизм ompF генов Y. pseudotuberculosis может быть связан, с одной стороны, с возможной гомологичной рекомбинацией между штаммами Y. pseudotuberculosis и Y. similis, с другой - с действием адаптивной эволюции.

При анализе отдельных функциональных участков молекулы было установлено, что петли L1, L2 и L8 находятся под сильным положительным отбором [14, 21]. Судя по всему, диверсификация ompF гена Y. pseudotuberculosis произошла под действием адаптивной эволюции до появления новых видов Y. similis и Y. pestis. Ряд авторов полагает, что положительный отбор, действующий на разные петли поринов, является важным механизмом адаптации патогенных микроорганизмов к иммунной системе хозяина, летальным атакам фагов и антимикробным препаратам [8, 10, 19, 20].

Заключение

Порины остаются объектом пристального внимания исследователей на протяжении последних десятилетий. Причиной этому служат их исключительные свойства: отсутствие протяженных гидрофобных участков, характерных для трансмембранных белков; особое распределение аминокислотных остатков, приводящее к формированию внутренней гидрофильной и внешней гидрофобной поверхностей; чрезвычайная стабильность белковой молекулы. Порины участвуют также во взаимодействии с клетками хозяина и служат мишенями для компонентов системы иммунитета, бактериоцинов и фагов. Ключевой их функцией является обеспечение поступления питательных веществ в клетку и удаление метаболитов из нее.

Наши исследования, касающиеся структуры OmpF поринов иерсиний, их филогенетических связей и молекулярной эволюции, а также генетического полиморфизма кодирующих их ompF генов, позволяют сделать следующие выводы: 1) участки ompF генов иерсиний эволюционируют с разной скоростью; 2) существует выраженный внутривидовой и межвидовой полиморфизм OmpF поринов; 3) ompF ген в роду Yersinia подвержен как внутривидовой, так и межвидовой внутригенной рекомбинации; 4) ompF ген находится под действием очистительной селекции, а отдельные его участки испытывают адаптивную эволюцию. Через изучение такого ключевого молекулярного компонента бактериальной клетки, как OmpF порины, становится возможным яснее понять молекулярные основы широкой адаптации бактерий рода Yersinia к различным условиям и причины их распространенности.

ЛИТЕРАТУРА

1. Гузев К.В., Исаева М.П., Новикова О.Д., Соловьева Т.Ф., Рассказов В.А. Молекулярная характеристика OmpF-подобных поринов патогенных Yersinia // Биохимия. 2005. Т. 70, № 10. C. 1338-1345.

2. Стенкова А.М. Молекулярные и экологические аспекты формирования гетерогенной структуры OmpF поринов непатогенных иерсиний // Вестн. ДВО РАН. 2009. № 6. С. 84-89.

3. Стенкова А.М., Исаева М.П., Рассказов В.А. Разработка многопраймерной ПЦР для идентификации бактерий рода Yersinia и дифференциации патогенных видов (Y pestis, Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica) // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2008. № 3. С. 18-23.

4. Чистюлин Д.К., Новикова О.Д., Портнягина О.Ю., Хоменко В.А., Вакорина Т.И., Ким Н.Ю., Исаева М.П., Лихацкая Г.Н., Соловьева Т.Ф. Выделение и характеристика OmpF-подобного порина наружной мембраны Yersinia ruckeri // Биол. мембраны. 2012. Т. 29, № 3. С. 156-164.

5. Achouak W., Heulin T., Pages J.-M. Multiple facets of bacterial porins // FEMS Microbiol. Lett. 2001. Vol. 199. P. 1-7.

6. Achtman M., Zurth K., Morelli G., Torrea G., Guiyoule A., Carniel E. Yersinia pestis, the cause of plague, is a recently emerged clone of Yersinia pseudotuberculosis // Proc. Nat. Acad. Sci. 1999. Vol. 96. P. 14043-14048.

7. Andersen C., Bachmeyer C., Tauber H., Benz R., Wang J., Michel V, Newton S.M., Hofnung M., Charbit A. In vivo and in vitro studies of major surface loop deletion mutants of the Escherichia coli K-12 maltoporin: Contribution to maltose and maltooligosaccharide transport and binding // Mol. Microbiol. 1999. Vol. 32. P. 851-867.

8. Bennett J.S., Callaghan M.J., Derrick J.P., Maiden M.C.J. Variation in the Neisseria lactamica porin, and its relationship to meningococcal PorB // Microbiology. 2008. Vol. 154. P. 1525-1534.

9. Cowan S.W., Schirmer T., Rummel G., Steiert M., Ghosh R., Pauptit A., Jansonius J.N., Rosenbusch J.P. Crystal structures explain functional properties of two Escherichia coli porins // Nature. 1992. Vol. 358. P. 727-733.

10. Derrick J.P., Urwin R., Suker J., Feavers I.M., Maiden M.C.J. Structural and evolutionary inference from molecular variation in Nesseria porins // Infect. and Immun. 1999. Vol. 67. P. 2406-2413.

11. Fukushima H., Matsuda Y., Seki R., Tsubokura M., Takeda N., Shubin F.N., Paik I.K., Zheng X.B. Geographical heterogeneity between Far Eastern and Western countries in prevalence of the virulence plasmid, the superantigen Yersinia pseudotuberculosis-derived mitogen, and the high-pathogenicity island among Yersinia pseudotuberculosis strains // J. Clin. Microbiol. 2001. Vol. 39, N 10. P. 3541-3547.

12. Galdiero S., Falanga A., Cantisani M., Tarallo R., Della Pepa M.E., D'Oriano V., Galdiero M. Microbe-host interactions: structure and role of Gram-negative bacterial porins // Curr. Protein Pepts Sci. 2012. Vol. 13, N 8. P. 843-854.

13. Hutsul J.-A., Worobec E. Molecular characterization of the Serratia marcescens OmpF porin, and analysis of S. marcescens OmpF and OmpC osmoregulation // Microbiology. 1997. Vol. 143. P. 2797-2806.

14. Isaeva M.P., Stenkova A.M., Guzev K.V., Bystritskaya E.P., Shubin F.N., Rasskazov V.A., Rakin A.V. Diversity and adaptive evolution of major porin gene (ompF) in Yersinia pseudotuberculosis // Adv. Exp. Med. Biol. 2012. Vol. 954. P. 39-43.

15. Issaeva M.P., Guzev K.V., Novikova O.D., Solovjeva T.F., Degtyarev S., Rasskazov V.A. Porin from Yersinia pseudotuberculosis: cloning and analysis of primary structure // Adv. Exp. Med. Biol. 2003. Vol. 529. P. 257-260.

16. Liu X., Ferenci T. An analysis of multifactorial influences on the transcriptional control of ompF and ompC porin expression under nutrient limitation // Microbiology. 2001. Vol. 147, N 11. P. 2981-2989.

17. Morena-Eutimio M.A., Tenorio-Calvo A., Pastelin-Palacios R., Perez-Shibayama C., Gil-Cruz C., LopezSantiago R., Baeza I., Fernandez-Mora M., Bonifaz L., Isibasi A., Calva E., Lopez-Macias C. Salmonella typhi OmpS1 and OmpS2 porins are potent protective immunogens with adjuvant properties // Immunology. 2013. Vol. 139, N 4. P. 459-471.

18. Nikaido H. Molecular basis of bacterial outer membrane permeability revisited // Microbiol., Mol. Biol. Rev. 2003. Vol. 67. P. 593-656.

19. Petersen L., Bollback J.P., Dimmic M., Hubisz M., Nielsen R. Genes under positive selection in Escherichia coli // Genome Res. 2007. Vol. 17, N 9. P. 1336-1343.

20. Smith N.H., Smith J.M., Spratt B.G. Sequence evolution of the porB gene of Neisseria gonorrhoeae and Neisseria meningitidis: evidence of positive Darwinian selection // Mol. Biol. and Evol. 1995. Vol. 12. P. 363-370.

21. Stenkova A.M., Isaeva M.P., Shubin F.N., Rasskazov V.A., Rakin A.V. Trends of the major porin gene (ompF) evolution: insight from the genus Yersinia // PloS one. 2011. Vol. 6, N 5. e20546.

22. Urwin R., Holmes E.C., Fox A.J., Derrick J.P., Maiden M.C.J. Phylogenetic evidence for frequent positive selection and recombination in the meningococcal surface antigen PorB // Mol. Biol. and Evol. 2002. Vol. 19, N 10. P. 1686-1694.