Штамм Trichoderma asperellum F-1395 - продуцент гидролитического комплекса
TRICHODERMA ASPERELLUM F-1395 STRAIN - PRODUCER OF HYDROLYTIC COMPLEX

Предлагаемое изобретение относится к области биотехнологии, сельского хозяйства.  Штамм грибка Trichoderma asperellum F-1395 может быть использован в биотехнологиях как продуцент гидролитического комплекса, обладающий целлюлазной, ксиланазной, фитотоксической, расширенной фунгицидной активностями как в лабораторных, так и в промышленных масштабах. Возможно применение в сельском хозяйстве для защиты от фитопатогенов растений и почв, для увеличения всхожести семян благодаря фитотоксической активности.
Далее в тексте заявителем приведены термины, которые необходимы для облегчения однозначного понимания сущности заявленных материалов и исключения противоречий и/или спорных трактовок при выполнении экспертизы по существу.
Продуцент гидролитического комплекса - организм (штамм грибка), способный производить гидролитический комплекс, обладающий способностью расщеплять сложные вещества до более простых, например, сахара до мономеров, белков до аминокислот и т.д.
Фунгицидная активность – ингибирующее действие ферментного комплекса на микроорганизмы-патогены, вызывающие различные заболевания у растений, за счет компонентов, присутствующих в составе заявленного продуцента гидролитического комплекса.
Целлюлазная активность - способность гидролитического комплекса расщеплять целлюлитические вещества на составляющие за счет активного действующего вещества в составе комплекса.
Ксиланазная активность - способность гидролитического комплекса расщеплять ксилан на составляющие за счет активного действующего вещества в составе комплекса.
Фитотоксическая активность  - способность гидролитического комплекса улучшать всхожесть семян растений за счет активного действующего вещества в составе комплекса.
Видоспецифичность – способность одного биологического вида иметь строго определенный набор признаков/синтезировать определенный продукт в процессе жизнедеятельности данного вида.
Известна заявка на изобретение РФ № 2008108034  «Штамм гриба Trichoderma asperellum и способ его применения» от 27.08.2009 [1], сущностью является  штамм Trichoderma asperellum R2, который синтезирует комплекс ферментов, применимый в производстве кормов для животных, птиц.
Недостатком является применение иного, отличного от заявленного, штамма (R2). Продукты синтеза микроскопических грибков строго видоспецифичны. А это значит, что известный штамм синтезирует другие, отличные от заявленного, продукты синтеза. Кроме того, следует отметить отсутствие фунгицидной, ксиланазной и целлюлазной активностей продуцируемого комплекса, что также является недостатком. Недостатки ограничивают область применения, вследствие чего известное изобретение невозможно применить для защиты растений от фитопатогенов.
Известна заявка на изобретение РФ № 2008108035 «Штамм гриба Trichoderma asperellum и способ его применения (варианты)» от 27.08.2009 [2], сущностью является  штамм Trichoderma asperellum R1, который синтезирует комплекс летучих и нелетучих метаболитов, обладающих ингибирующим действием против фитопатогенов, повышающим иммунитет растений, урожайность и качество урожая, снижающий уровень инфекционного фона в почве, увеличивающий содержание гумуса почв, стимулирующий размножение азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов.
Недостатком является применение иного, отличного от заявленного, штамма (R1). Также недостатком является отсутствие ксиланазной, целлюлазной активностей. Недостатки ограничивают область применения.
Известно изобретение по патенту РФ № 2696074 «Штамм мицелиального гриба Trichoderma asperellum - продуцент комплекса эндоглюканазы, ксиланазы и пектиназ для получения белковых добавок на основе зернового и зернобобового сырья для применения в кормопроизводстве» от  16.11.2018 [3].  Сущностью является  штамм Trichoderma reesei ВКМ F-4789D, обладающий высокой эндоглюканазной, ксиланазной и пектиназной активностями для применения в кормопроизводстве.
Недостатком  известного технического решения является отсутствие целлюлазной и фунгицидной активностей, вследствие чего ферментный комплекс не может быть применен для защиты от фитопатогенов. Недостаток ограничивает область применения заявленного изобретения.
Известно изобретение по патенту РФ № 2634415 «Штамм гриба Trichoderma asperellum для получения биопрепарата комплексного действия для растениеводства» от 26.10.2017 [4], сущностью является  штамм Trichoderma asperellum OPF-19, обладающий антагонистической активностью по отношению к фитопатогенным микроорганизмам.
Недостатком известного изобретения является то, что помимо применения иного штамма (OPF-19), используются споры грибка, а не его продукт. Данный недостаток говорит об отсутствии ксиланазной, целлюлазной активностей, что также ограничивает области применения.
Известно изобретение по патенту WO / 2014/089951 «Trichoderma asperellum strain GY20 and paste preparation for preventing and treating Fusarium oxysporum schl. F. Sp. Fragariae» от  29.04.2013 [5]. Сущностью является  штамм Trichoderma asperellum GY20, на основе которого производится препарат в виде пасты для защиты клубники от Fusarium oxysporum.
Недостатком является ограниченная биологическая активность, проявляющаяся только в защите от одного фитопатогена (Fusarium oxysporum), а также отсутствие ксиланазной, целлюлазной активности.
Известен штамм Trichoderma reesei M18.2, подвергнутый воздействию мутагенных факторов Морозова, Ю.В «Ксиланазы Trichoderma reesei – биосинтез и применение для гидролиза зерновых кормов» [6], который при культивировании на послеспиртовой барде способен к активному синтезу ксиланаз и целлюлаз.
Послеспиртвая барда – отход спиртового производства, а значит, его наличие ограничено и зависит от многих факторов, в т.ч. экономических затрат, что существенно отличается при использовании стандартной питательной среды для культивирования микромицета. Ограниченность в получении послеспиртовой барды является недостатком известного технического решения.  Помимо прочего, у известного штамма отсутствует целлюлазная активность, что ограничивает его область применения.
Наиболее близким по существу заявленного технического решения, выбранного заявителем в качестве  прототипа, является штамм гриба Trichoderma asperellum F-1087 патент РФ № 2620971 «Штамм Trichoderma asperellum - продуцент гидролитических ферментов и пептидных метаболитов и его применение» от 30.05.2017  [7], который синтезирует комплекс ферментов и пептидных метаболитов, обладающих антибактериальной, противоопухолевой, фунгицидной, ферментативной активностями, применимый в биотехнологии, а также в сельском хозяйстве для подавления фитопатогенов.
Недостатками прототипа являются:
1)   использование отличного от заявленного технического решения штамма Trichoderma asperellum F-1087, синтезирующий продукт, обладающий нижеприведенными недостатками;
2) синтез продуктов с ксиланазной активностью равной 8,82 МЕ/мл, что в 40 раз ниже ксиланазной активности заявленного технического решения;
3)  отсутствие у прототипа фитотоксической активности, вследствие чего становится невозможным применение прототипа для обработки семян с целью улучшения их всхожести;
4) синтез продуктов с целлюлазной активностью ниже, чем в  заявленном техническом решении (1,1 МЕ/мл у прототипа,  против 1,37 МЕ/мл у заявленного технического решения);
5) фунгицидная активность только против двух фитопатогенов (Aspergillus niger, Fusarium oxysporum).
Целью заявленного технического решения является получение штамма – продуцента гидролитического комплекса.
Техническим результатом заявленного технического решения являются:
1 - использование штамма Trichoderma asperellum F-1395, синтезирующего гидролитический комплекс;
2 - повышение ксиланазной активности;
3 - обеспечение фитотоксической активности;
4 - повышение целлюлазной активности;
5 - обеспечение расширенной фунгицидной активности.
Сущностью заявленного технического решения является  штамм Trichoderma asperellum F-1395  – продуцент гидролитического комплекса, обладающий целлюлазной, ксиланазной, фитотоксической, фунгицидной активностями. Штамм Trichoderma asperellum F-1395 – продуцент гидролитического комплекса по п.1, отличающийся тем, что обладает повышенной ксиланазной активностью, равной  335 МЕ/мл и  повышенной целлюлазной активностью, равной 1,37 МЕ/мл. Штамм Trichoderma asperellum F-1395 – продуцент гидролитического комплекса по п.1, отличающийся тем, что обладает фитотоксической активностью для улучшения всхожести семян  в сельском хозяйстве. Штамм Trichoderma asperellum F-1395 – продуцент гидролитического комплекса по п.1, отличающийся тем, что обладает фунгицидной активностью для борьбы с фитопатогенами растений в сельском хозяйстве.
Заявленный штамм депонирован в Биоресурсном Центре Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (БРЦ ВКПМ), ФГБУ ГосНИИгенетика, под регистрационным номером F-1395  25 июля 2017 года.
Заявленное техническое решение иллюстрируется Примерами 1 – 4, Таблицей 1 и Таблицей 2 сопоставительного анализа.
Штамм Trichoderma asperellum F-1395 обнаружен в естественных условиях в почве республики Татарстан на территории ООО Тепличный Комбинат «Майский».  Хранится в музее лаборатории сельскохозяйственной биохимии и биотехнологии Института фундаментальной медицины и биологии Казанского (Приволжского) федерального университета (сокращ. – КФУ), г. Казань и в БРЦ ВКПМ, ФГБУ ГосНИИгенетика, г. Москва.
Штамм Trichoderma asperellum F-1395 охарактеризован в  научно-исследовательской лаборатории «Структурная биология», ИФМиБ, КФУ.
Штамм Trichoderma asperellum F-1395 культивируют приведенным далее способом (методом) выращивания, штамм характеризуется приведенными далее отличительными свойствами.
Культурально-морфологические особенности штамма.
Колонии штамма гриба, выращенные на питательной среде Чапека, при температуре плюс 28 °С растут быстро, достигая из центра до краев чашки Петри диаметром 100 мм за 4 - 5 суток. При росте образуют до 5 концентрических колец, с интенсивным спороношением. Мицелий бесцветный, стелющийся, паутинистый. Цвет мицелия от зеленого до темно-желтого. Спороношение появляется на 4-6 сутки роста, в центральной части колонии более темные концентрические кольца по мере удаления от центра к краю. Обратная сторона колонии бесцветная или слабовато-желтая. Пигмент в питательную среду не выделяется. Экссудат обычно отсутствует. Запах слабый грибной. Гифы бесцветные, гладкие 2 - 4 мкм в диаметре, со вздутиями и толстостенными клетками. Хламидоспоры терминальные, интеркалярные, сферические или яйцевидные, бледно-зеленые, гладкие, от 4,5 до 15,0 мкм в диаметре. Спорангиеносцы бутылевидные, прямые, древовидно-разветвленные, чащу формируются в подушечках и редко в воздушном мицелии. Спорангиеносцы Спорангиеносцы симметричные и завершаются двумя или более фиалидами. Ширина спорангиеносца преимущественно от 2,8 до 4,0 мкм. Конидии имеют темно-зеленый цвет, формы от шаровидных до сферических, или яйцевидных, мелко-шиповатые, размером 3,4-3,6 на 3,0-4,0 мкм. На питательной среде PDA и SNA наблюдается бедный рост колонии.
Биохимические особенности штамма.
Отношение к источникам углерода: хорошо усваивает глюкозу, крахмал. Растет на средах, содержащих галактозу, лактозу, сахарозу, крахмал. Не усваивает целлюлозу и хитин.
Отношение к источникам азота: усваивает аммонийные формы азота и органический азот аминокислот. Восстанавливает нитраты.
Оптимальные условия и состав среды для культивирования штамма.
Штамм гриба растет в интервале значений pH от 2,5 до 9,5. Оптимальное значение pH 5,0-6,0. В более кислых условиях (pH 2,5 - 5,0) и в более щелочных (pH 7,0 - 9,5) изменяются морфологические характеристики культуры: замедлено спорообразование. Для культивирования штамма применимы плотные питательные среды: агар, сусло-агар,  Чапека, SNA. Аэроб. Оптимальная температура для роста культуры гриба плюс 26 – 28 °C, длительность культивирования до массовой споруляции – от 4 до 6 суток, в зависимости от состава среды и температуры культивирования. Нетоксичен для человека, теплокровных животных, пчел и земляных червей.
Условия хранения штамма.
Штамм хранят в виде конидиальных спор на питательной среде Чапека с добавлением 10-20% - го глицерина,  при температуре минус 70 °C.
Технический результат жизнедеятельности штамма гриба Trichoderma asperellum F-1395 заключается в его способности активно продуцировать гидролитический комплекс с целлюлазной, ксиланазной, фитотоксической, расширенной фунгицидной активностями. Штамм гриба Trichoderma asperellum F-1395 хорошо растет на жидкой питательной среде, при росте выделяет гидролитический комплекс с повышенной целлюлазной, повышенной ксиланазной, фитотоксической, расширенной фунгицидной активностями, что является его преимуществом в сравнении с прототипом [7].
Заявленный штамм Trichoderma asperellum F-1395 может быть использован для промышленного получения биопрепаратов для защиты растений от фитопатогенов, для обработки семян и почвы перед посевом. Исследование гидролитического комплекса из культуральной жидкости штамма Trichoderma asperellum F-1395 показало, что гидролитический комплекс обладает ксиланазной активностью, равной 335 МЕ/мл; целлюлазной активностью, равной  1,37 МЕ/мл; фитотоксической активностью для улучшения всхожести семян зерновых, зернобобовых, овощных, декоративных и сорных культур;  фунгицидной активностями против корневой гнили, альтернариоза, фузариоза, черной ножки, фитофтороза.
Заявленное изобретение иллюстрируется следующими примерами.
ПРИМЕР 1. Получение штамма Trichoderma asperellum F-1395 – продуцента гидролитического комплекса.
3
2
4
4
2
2
2
Получают посевной материал. Для получения посевного материала культуру штамма Trichoderma asperellum F-1395 выращивают известным методом глубинного культивирования на питательной среде Чапека состава (г/л): глюкоза – 30;   NaNO – 3;  KHPO – 1;  MgSO х 7HО – 0,5; KCl – 0, 5; FeSO4 х 7HO – 0,01;   агар-агар – 15;   НО – остальное.
6
Культивирование осуществляют при плюс  28 °С, в темноте, в течение 168 часов (7 суток). По истечении указанного срока с поверхности колоний дистиллированной водой смывают споры штамма грибов. Полученную суспензию разбавляют до содержания 10 спор/мл и в дальнейшем используют в качестве инокулята для засева глубинных культур.
4
2
4
Для биосинтеза комплекса биологически активных соединений полученный инокулят засевают в стерильную природную экспериментальную среду с экстрактом ржаных пентозанов (состав, %: растворенные пентозаны - 0,2; белок - 0,5; (NH)SO - 0,5), разлитую в колбы, содержащую по 100 мл среды. Культуры выращивают в течение 72-120 часов (3-5 суток) на лабораторных качалках в интенсивностью качания 200 об./мин при 28 °С при исходном значении рН - 6.0. Клетки отделяют центрифугированием. Полученные пробы исследуют, хранят и  употребляют по целевым назначениям.
ПРИМЕР 2. Определение ксиланазной и целлюлазной активностей штамма Trichoderma asperellum F-1395 – продуцента гидролитического комплекса.
Получают штамм Trichoderma asperellum F-1395 – продуцент гидролитического комплекса штамма Trichoderma asperellum F-1395 по примеру 1.
Определение ксиланазной и целлюлазной активностей проводят по методу  Konig [8].
Приготовление образца.
Для приготовления образца 0,2-0,5 г образца взвешивают в 100 мл колбе и растворяют с перемешиванием в 100 мл натрий-ацетатного буфера (рН-6,0). Далее образцы разбавляют до конечной концентрации, то есть приблизительно до концентрации 0,2-0,7 IU/мл для ксиланаз, 0,15-0,25 IU/мл для целлюлаз. Исследования проводят в трех повторностях. Разбавленный образец в количестве 0,06 мл  помещают в пробирку на 5 мин на водяную баню 40°С. Затем к нему добавляют 0,6 мл субстрата и перемешивают. Через 20 минут инкубации реакция прерывается добавлением 0,3 мл динитросалициловой кислоты (DNSA).
Приготовление субстрата для измерения ксиланазной активности.
Для приготовления субстрата 750 мг ксилана помещают в 40 мл натрий-ацетатного буфера (рН-6,0). Ксилан растворяют на водной бане при 100 °С, охлаждают до 24-26 °С, доводят рН 5,0 25%-ым НCl, объем доводят до 50 мл натрий-ацетатным буфером.
Приготовление субстрата для измерения целлюлазной активности.
Суспендируют 2 г карбоксиметилцеллюлазы (КМЦ) в 40 мл натрий-ацетатного буфера. КМЦ растворяют на водной бане при 100 °С, охлаждают до 24-26 °С, доводят рН 5,0  25%-ым НCl, объем доводят до 50 мл натрий-ацетатным буфером.
После окончания процедур по примеру 2 образцы и стандарты центрифугируют, надосадочную жидкость отбирают, затем ее инкубируют 10 мин в кипящей водной бане, охлаждают на ледяной бане 5 минут, добавляют 3 мл воды. Адсорбцию измеряют при 530 нм на спектрофотометре.
Ферментативную активность рассчитывают по формуле (1):
IU = ((PB1-PB0)*D)/20H,                     (1)
где:
- IU - активность фермента (МЕ-международные единицы);
- PB1 и PB0 - редуцирующие вещества после и до ферментолиза, соответственно;
- D - разбавление фермента перед внесением в реакционную смесь;
- H - дозировка препарата, мл;
- 20 - время ферментолиза, мин.
Установлено, что штамм Trichoderma asperellum F-1395 синтезирует при росте гидролитический комплекс с целлюлазной активностью, равной 1,37 МЕ/мл,  ксиланазной активностью, равной  335 МЕ/мл.
ПРИМЕР 3. Определение фитотоксической активности штамма Trichoderma asperellum F-1395 – продуцента гидролитического комплекса.
Получают штамм Trichoderma asperellum F-1395 – продуцент гидролитического комплекса штамма Trichoderma asperellum F-1395 по примеру 1.
Фитотоксичность оценивают на зерновых (пшеница, рожь, ячмень, кукуруза), зернобобовых (люцерна, горох, клевер), овощных (огурец, томаты, редис, кресс-салат), декоративных (гвоздики, розы) и сорных культурах (щерица, подмаренник, бодяг).
Для определения фитотоксической активности отбирают по 100 семян и замачивают  в культуральной жидкости в трех разведениях 1:100, 1:10, 1:1. Через 24 часа семена раскладываю на увлажненную фильтровальную бумагу в чашке Петри.
Готовят контроль - семена, замоченные в дистиллированной воде и стерильной питательной среде.
Через 24 часа подсчитывают всхожесть семян, на 3 сутки подсчитывают энергию прорастания и длину проросток и корней. На 7 сутки измеряют длину проросток и корней, определяют сухую и сырую массу проростков и корней. Фитотоксическую активность подсчитывают по формуле (2):
Аф = 100-((Дх-Дн/Дк-Дн)*100),                (2)
где:
-  Аф - фитотоксическая активность ингибирования роста корней, %;
- Дх - средняя длина корней (проростков) на 7 сутки в опытном варианте, см;
- Дк - средняя длина корней (проростков) на 7 сутки в контроле, см;
- Дн - начальная длина корней (проростков), см.
Рассчитанная по формуле (2) фитотоксическая активность (способность гидролитического комплекса улучшать всхожесть семян растений за счет активного действующего вещества в составе комплекса) по сравнению с контролем представлены в Таблице 1.
Таблица 1
Фитотоксическая активность штамма  Trichoderma asperellum F-1395 по сравнению с контролем
Семена тест культур
Фитотоксическая активность до обработки  (контроль), %
Фитотоксическая активность после  обработки, %
Пшеница
2
5
Рожь
1,5
5
Ячмень
2,3
3
Кукуруза
1,8
4,5
Люцерна
4,2
8
Горох
1,5
6,2
Клевер
6,3
14,6
Огурец
2
3,8
Томаты
1,8
4,3
Редис
5,7
8,9
Кресс-салат
4,9
12
Гвоздика
4,8
9,4
Роза
5,6
8,5
Щерица
6,95
13
Подмаренник
1,2
4,1
Бодяг
2
3,9
Основываясь на изложенном выше, можно сделать вывод о том, что в среднем фитотоксическая активность штамма Trichoderma asperellum F-1395 способствует увеличению всхожести семян зерновых, зернобобовых, овощных, декоративных и сорных культур в 1,5 раза. Таким образом, опытным путем  доказано, что штамм  Trichoderma asperellum F-1395 – продуцент гидролитического комплекса является достаточно эффективным средством для обработки сельскохозяйственных семян перед посевом для улучшения всхожести.
ПРИМЕР 4. Определение фунгицидной активности штамма Trichoderma asperellum F-139 – продуцента гидролитического комплекса биологически активных соединений.
Получают штамм Trichoderma asperellum F-1395 – продуцент гидролитического комплекса штамма Trichoderma asperellum F-1395 по примеру 1.
Фунгицидную активность оценивают против распространенных возбудителей сельскохозяйственных растений в Поволжском регионе:
- корневой гнили (Bipolaris spp.),
- альтернариозы (Alternaria spp.),
- фузариозы (Fusarium spp.),
- черной ножки (Rhizoctonia solani),
- фитофторозы (Phytophthora spp.).
Для определения фунгицидной активности на чашку Петри, засеянную одним из фитопатогенов, помещают пропитанный гидролитическим комплексом (штамма) диск фильтровальной бумаги диаметром 7 мм.
Контроль – фильтровальный диск, пропитанный  дистиллированной водой. В течение семи суток инкубации при плюс 28 °С определяют фунгицидную активность путем измерения величины диаметра d зоны подавляемости патогенных микроорганизмов.
По истечении 7 суток роста измеряют, например – линейкой, размер диаметра d зоны подавляемости.
При этом общепринято считать, что чем больше, например – в диаметре, размер зоны подавляемости роста патогенного микроорганизма – тем бόльшую фунгицидную активность оказывает заявленный штамм.
Опытным путем установлено, что заявленный штамм (с диаметром d зоны подавления) подавляет рост;
-  Bipolaris spp. с d = 28 мм,
- Alternaria spp. с d = 21 мм,
- Fusarium spp. с d = 18 мм,
- Rhizoctonia solani с d = 9 мм,
- Phytophthora spp. с d = 14 мм.
Основываясь на изложенном, можно сделать вывод, что выделяемый штамм Trichoderma asperellum F-1395 – продуцент гидролитического комплекса может быть достаточно эффективно использован для подавления болезней сельскохозяйственных культур.
Приведенные примеры использования предлагаемого изобретения показывают его повышенную целлюлазную и ксиланазную активности, фитотоксическую активность для улучшения всхожести семян  в сельском хозяйстве, фунгицидную активность для борьбы с фитопатогенами растений в сельском хозяйстве, что доказывает его эффективность в биотехнологиях, для разработки биопрепаратов для защиты сельскохозяйственных растений от фитопатогенов.
Таким образом, представляется возможным констатировать достижение всех задач и технических результатов, поставленных в заявленном техническом решении, а именно;
1 - использован штамм Trichoderma asperellum F-1395 - продуцент гидролитического комплекса (см. пример 1);
2 - повышена ксиланазная активность  в 40 раз -  с 8,82 МЕ/мл у прототипа до 335 МЕ/мл у заявленного технического решения (см. пример 2);
3 – обеспечена фитотоксическая активность для улучшению всхожести  семян зерновых, зернобобовых, овощных, декоративных и сорных культур (см. пример 3);
4 - повышена целлюлазая активность  - с 1,1 МЕ/мл у прототипа до 1,37 МЕ/мл у заявленного технического решения (см. пример 2);
5- обеспечена расширенная фунгицидная активность против корневой гнили (Bipolaris spp.), альтернариозы (Alternaria spp.), фузариозы (Fusarium spp.), черной ножки (Rhizoctonia solani), фитофторозы (Phytophthora spp.) по сравнению с прототипом, который активен только против Aspergillus niger, Fusarium oxysporum (см. пример 4);
Заявленное техническое решение удовлетворяет условию патентоспособности «новизна», предъявляемому к изобретениям, так как при определении уровня техники не обнаружено средство, которому присущи признаки, идентичные (то есть совпадающие по исполняемой ими функции и форме выполнения этих признаков) всем признакам, перечисленным в формуле изобретения, включая характеристику назначения.
Заявленное техническое решение соответствует условию патентоспособности критерию «изобретательский уровень», предъявляемому к изобретениям, поскольку из исследованного уровня техники не выявлены технические решения, имеющие признаки, совпадающие с существенными признаками заявленного изобретения, и не установлена известность влияния существенных признаков на указанный технический результат.
Заявленное техническое решение соответствует условию патентоспособности «промышленная применимость», так как его можно реализовать в промышленном производстве  биопрепаратов для защиты растений от фитопатогенов, для  увеличения всхожести семян путем обработки семян и почвы перед посевом.
ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ ИСТОЧНИКИ
1. Патент РФ №  2008108034. МПК C12N 9/42 (2006.01), C12N 1/14 (2006.01), C12R 1/885 (2006.01). Штамм гриба Trichoderma asperellum и способ его применения. Опубликован: 27.08.2009.
2. Патент РФ № 2008108035. МПК A01N 63/00 (2006.01), C12N 1/14 (2006.01), C12R 1/885 (2006.01) «Штамм гриба Trichoderma asperellum и способ его применения (варианты)» Опубликован: 27.08.2009.
3. Патент RU 2696074.   МПК C12N 1/14 (2006.01), C12N 9/24 (2006.01), C12R 1/885 (2006.01). Приоритет от  16.11.2018. Опубликован  30.07.2019. Описание патента: Штамм мицелиального гриба Trichoderma asperellum - продуцент комплекса эндоглюканазы, ксиланазы и пектиназ для получения белковых добавок на основе зернового и зернобобового сырья для применения в кормопроизводстве.
4. Патент РФ № 2634415.  МПК C12N 1/14 (2006.01), A01N 63/04 (2006.01). Штамм гриба Trichoderma asperellum для получения биопрепарата комплексного действия для растениеводства. Опубликован: 26.10.2017.
5. Патент WO2014089951. МПК C12N 1/14 (2006.01), A01N 63/04 (2006.01), A01N 25/00 (2006.01), A01P 3/00 (2006.01).  Trichoderma asperellum strain GY20 and paste preparation for preventing and treating Fusarium oxysporum schl. F. SP. Fragariae. Опубликован: 19.06.2014.
6. Ксиланазы Trichoderma reesei – биосинтез и применение для гидролиза зерновых кормов/ Ю.В. Морозова, Е.В. Скворцов, Ф.К. Алимова// Уч. Зап. Каз.Ун. серия Ест. Науки.-2013.-Т.155.-кн.2.-С. 127-137
7. Патент РФ № 2620971. МПК C12N 1/14 (2006.01), A61K 35/66 (2015.01), C12R 1/01 (2006.01). Штамм Trichoderma asperellum - продуцент гидролитических ферментов и пептидных метаболитов и его применение. Опубликован: 30.05.2017.
König J. Determination of xylanase, β-glucanase, and cellulase activity / J. König, R. Grasser, H. Pikor, K. Vogel// Anal Bioanal Chem.-2002.-V.374.- P. 80–87.
Существенный признак
заявка РФ  2008108034
заявка  РФ  2008108035
патент РФ 2634415
Ксиланазы Trichoderma reesei – биосинтез и применение для гидролиза зерновых кормов
патент WO / 2014/089951
патент РФ2696074
Прототиппатент РФ 2620971
Заявленное техническоерешение
Используемый штамм
R2
R1
OPF-19
М18.2
GY20
F-4789D
F-1087
F-1395
В основе -  продукт грибка
+
+
-
-
+
+
+
+
В основе -  сам грибок
-
-
+
+
-
-
-
-
Ксиланазная активность
-
-
-
+
-
+
+8,82 МЕ/мл
+335 МЕ/мл
Целлюлазная активность
-
-
-
+
-
-
+1,1 МЕ/мл
+1,37 МЕ/мл
Фунгицидная активность
-
+
+
-
+/- (против  одного патогена)
-
+(2 вида возбудителя)
+(5 видов возбудителей)
Фитотоксичес-кая активность
-
-
+
-
-
-
-
+
Для защиты растений
-
+
+
-
+- (только против одного патогена)
-
+
+
Для увеличения всхожести
-
+
+
-
-
-
-
+
Совпадает с заявленным решением Да/нет
Нетотсутствует фунгицидная, ксиланазная, целлюлазная
Нетотсутствие ксиланазной, целлюлазной
Нетотсутствии ксиланазной, целлюлазной
Нетотсутствует целлюлазная
Нетотсутствие ксиланазной, целлюлазной активности, фунгицидная только против Fusarium oxysporum)
Нетотсутствие целлюлазной и фунгицидной
Да, но отличается тем, что :1)   использован штамм Trichoderma asperellum F-1087, синтезирующий продукт, обладающий нижеприведенными недостатками;2) синтез продуктов с ксиланазной активностью равной 8,82 МЕ/мл, что в 40 раз ниже ксиланазной активности заявленного технического решения;3)  отсутствие у прототипа фитотоксической активности, вследствие чего становится невозможным применение прототипа для обработки семян с целью улучшения их всхожести;4) синтез продуктов с целлюлазной активностью ниже, чем в  заявленном техническом решении (1,1 МЕ/мл у прототипа,  против 1,37 МЕ/мл у заявленного технического решения);5) фунгицидная активность только против двух фитопатогенов (Aspergillus niger, Fusarium oxysporum).
Заявленное решение имеет отличное от прототипа количество активностей