СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КЛЕТОЧНОЙ МОДЕЛИ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ ВИРУСА SARS-CoV-2
METHOD OF PRODUCING A CELLULAR MODEL FOR SARS-COV-2 VIRUS ANALYSIS

Область техники, к которой относится изобретение.
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения клеточной модели на основе дифференцированной в микрофлюидной системе линии эпителиоцитов кишечника человека Caco2 для исследования вируса SARS-CoV-2.
Уровень техники.
in vitro
in vivo
Культивирование клеток в микрофлюидных системах на сегодняшний день является одним из наиболее перспективных подходов, обеспечивающих  условия, сходные с условиями , для поддержания жизнеспособности, функциональной активности и стабильности клеточных культур в течение длительного времени, с возможностью регистрации изменения параметров, характеризующих функциональный статус клеток на молекулярном уровне. Изучение клеточных структур в естественном состоянии позволяет получить новые знания о процессах, происходящих в клетках, определить способы воздействия на клетки, приводящие к тому или иному результату. Это является важным при создании эффективных лекарственных средств и разработке новых методов лечения заболеваний.
Коронавирусная инфекция COVID-19 – тяжёлая острая респираторная инфекция, вызываемая коронавирусом SARS-CoV-2 (Coronaviridae Study Group of the International Committee on Taxonomy of Viruses The species Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus: classifying 2019-nCoV and naming it SARS-CoV-2. // Nature microbiology. 2020. № 4 (5). C. 536–544). Коронавирусу SARS-CoV-2 для проникновения в клетки человека b своего воспроизводства необходима экспрессия на поверхности клетки-мишени двух ферментов: ACE2 (ангиотензин превращающего фермента 2) и TMPRSS2 (трансмембранной сериновой протеазы 2). Первый фермент служит рецептором для связывания вирусной частицы посредством S-белка с поверхностью клетки-мишени. TMPRSS2 необходим для слияния оболочки вируса с мембраной клетки-мишени. Без экспрессии трансмембранной сериновой протеазы 2 инфицирование клеток вирусом SARS-CoV-2 невозможно (Hoffmann M. [и др.]. SARS-CoV-2 Cell Entry Depends on ACE2 and TMPRSS2 and Is Blocked by a Clinically Proven Protease Inhibitor // Cell. 2020. № 2 (181). C. 271-280).
ACE2
TMPRSS2
Известно, что вирус SARS-CoV-2 инфицирует и наиболее эффективно реплицируется только в двух клеточных линиях человека: Calu3 (аденокарцинома лёгких) и Caco2 (аденокарцинома кишечника) (Chu H. [и др.]. Comparative tropism, replication kinetics, and cell damage profiling of SARS-CoV-2 and SARS-CoV with implications for clinical manifestations, transmissibility, and laboratory studies of COVID-19: an observational study // The Lancet Microbe. 2020). Высокую репликационную активность SARS-CoV-2 связывают с сочетанной экспрессией данными клеточными линиями в дифференцированном состоянии не только рецептора ACE2, но и транскрипционного варианта 1 трансмембранной сериновой протеазы TMPRSS2 [7, 8]. В нормальном эпителии легких человека соотношение экспрессии мРНК  и  составляет 1 к 32, в то время как в кишечнике – 1 к 8 (Chang K. [и др.]. The Cancer Genome Atlas Pan-Cancer analysis project. // Nature genetics. 2013. № 10 (45). C. 1113–20).
Стандартные протоколы дифференцировки клеток Calu3 и Caco2 предполагают культивирование конфлюэнтного слоя клеток от 10-14 дней для линии Calu3 [5] до 21 дня для линии Caco2 (Hégarat L. Le, Huet S., Fessard V. A co-culture system of human intestinal Caco-2 cells and lymphoblastoid TK6 cells for investigating the genotoxicity of oral compounds. // Mutagenesis. 2012. № 6 (27). C. 631–6).
2
2
ACE2
TMPRSS2
Также известен способ дифференцироваки клеток Caco2 в микрофлюидном устройстве при токе культуральной среды под базолатеральной стороной клеток на протяжении семи дней. Недифференцированные клетки высевают на индивидуальные полиэфирные вставки с проницаемой мембраной с поверхностью 0,143 см и диаметром пор 1,0 мкм, вырезанные из HTS Transwell 96 well permeable supports (Corning, США), в количестве 60 000 клеток на лунку. Вставки с клетками помещают в микрофлюидное устройство с циркуляцией среды под вставками с колебанием давления культуральной среды от минус 20 до 20 кПа с частотой 2 Гц. Клетки инкубируют в течение 7 дней, в культуральной среде Игла с 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 0,1 мМ заменимых аминокислот, 0,1% пенициллина-стрептомицина (все реагенты Gibco, США) при 37°C и 5% CO, среду меняли трижды за 7 дней. Данный способ позволяет достичь экспрессии генов  и в соотношении 1 к 3 (Samatov T.R. [и др.]. miRNA-mediated expression switch of cell adhesion genes driven by microcirculation in chip // BioChip Journal. 2017. № 4 (11). C. 262–269).
ACE2
TMPRSS2.
Соответственно, к недостаткам существующего способа можно отнести нефизиологическое соотношение экспрессии генов  и
TMPRSS2
ACE2.
Технической проблемой является получение дифференцированного монослоя клеток линии эпителия кишечника человека Caсo2 с более высокой экспрессией мРНК по отношению к
2
Техническая проблема решается тем, что также как и в известном способе высевают недифференцированные клетки Caсo2 на полиэфирные вставки с проницаемой мембраной с поверхностью 0,143 см и диаметром пор 1,0 мкм, в количестве 60 000 ± 10% клеток на вставку; инкубируют  вставки с клетками в микрофлюидном устройстве в течение 7 дней в культуральной среде с циркуляцией среды под вставками с переменным давлением.
2
Особенность заявляемого  способа является то, что давление культуральной среды, подаваемое в микрофлюидное устройство, изменяют от минус 12 ± 25 % кПа до 12 ± 25 % кПа с частотой от 4 до 5 Гц, с обеспечением перепада скорости течения культуральной среды от 0 до 0,9 ± 15% мкл/сек. и средней скорости тока культуральной среды 5 ± 10% мкл/мин. Причем в качестве культуральной среды используют среду Игла с 10% эмбриональной телячьей сывороткой, 0,1 мМ заменимых аминокислот, 0,1% пенициллина-стрептомицина при 37°C и 5% COи заменой культуральной среды каждый второй день культивирования.
Раскрытие сущности изобретения.
ACE2
TMPRSS2
Технический результат получения дифференцированного монослоя клеток линии эпителия кишечника человека Caсo2 с соотношением экспрессии мРНК  и в интервале от 1 к 4 до 1 к 5,5.
2
при этом
Технический результат достигается при реализации способа получения клеточной модели для исследования вируса SARS-CoV-2, включающего высевание недифференцированных клеток Caсo2 на полиэфирные вставки с проницаемой мембраной с поверхностью 0,143 см и диаметром пор 1,0 мкм, в количестве 60 000 ± 10% клеток на вставку; инкубирование вставок с клетками в микрофлюидном устройстве в течение 7 дней в культуральной среде с циркуляцией среды под вставками с переменным давлением,  давление культуральной среды, подаваемое в микрофлюидное устройство, изменяютот минус 12 ± 25 % кПа до 12 ± 25 % кПа, с частотой от 4 до 5 Гц, с обеспечением перепада скорости течения культуральной среды от 0 до 0,9 ± 15% мкл/сек. и средней скорости тока культуральной среды 5 ± 10% мкл/мин.
2
В качестве культуральной среды используют среду Игла с 10% эмбриональной телячьей сывороткой, 0,1 мМ заменимых аминокислот, 0,1% пенициллина-стрептомицина при 37°C и 5% COи заменой культуральной среды каждый второй день культивирования.
Осуществление изобретения.
Заявляемый способ, также как и известный, основан на инкубации и дифференцировке монослоя клеток Caсo2, который осуществляется при постоянном токе культуральной среды под базолатеральной стороной клеток.
2
2
Недифиринцированные клетки Caсo2, полученные из Российской коллекции культур клеток позвоночных (Институт цитологии РАН) высевали на индивидуальные полиэфирные вставки с проницаемой мембраной с поверхностью 0,143 см и диаметром пор 1,0 мкм, вырезанные из HTS Transwell 96 well permeable supports (Corning, США), в количестве от 54 000 до 66 000 клеток на вставку. Подсчет клеток осуществляли с помощью клеточного счетчика Countess (Invitrogen, США). Вставки с клетками помещали в микрофлюидное устройство с циркуляцией среды под вставками при давлении от минус 15 до минус 9 кПа и от 9 до 15 кПа при частоте изменения давления 4 и 5 Гц. В качестве микрофлюидного устройства использовали микробиореактор БАВР.422522.001 по ТУ 9443-001-89584548-2014 (ООО НТЦ «БиоКлиникум», Россия). Клетки инкубировали в течение 7 дней, в культуральной среде Игла с 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 0,1 мМ заменимых аминокислот, 0,1% пенициллина-стрептомицина при 37°C и 5% CO, среда менялась трижды за 7 дней.
ACE2
TMPRSS2
ACE2
TMPRSS2
ACTB
GAPDH
ACE2
TMPRSS2
Экспрессию мРНК генов  и  оценивали на седьмой день инкубации методом полимеразной цепной реакции. По завершении инкубации к клеткам добавляли 130 мкл лизирующего буфера Qiazol Lysis Reagent (Qiagen, Германия), клеточный лизат переносили в пробирку 1,5 мл, объем лизата доводили с помощью Qiazol Lysis Reagent до 700 мкл. Выделение тотальной РНК осуществляли с помощью набора реагентов miRNeasy Mini Kit (Qiagen) согласно протоколу производителя. Реакцию обратной транскрипции проводили для 1 мкг РНК с использованием коммерческого набора QuntiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen). На одну реакцию ПЦР-РВ брали 1 мкл разбавленной в 32 раза смеси после обратной транскрипции. Концентрации праймеров составляли 250 нМ, дНТФ («Синтол», Россия) - 0,25 мМ, Taq-полимеразы («Синтол», Россия) – 0,07 мМ в объеме 25 мкл. Оценивали экспрессию мРНК двух референсных генов и генов  и c помощью следующих праймеров:  (F: 5`-CCACGAAACTACCTTCAACTCC-3`, R: 5`-CTCGTCATACTCCTGCTTGCT-3`);  (F: 5`-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3`, R: 5`-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3`); (F: 5`-GTGGAGCACTGACTGGAGC-3`, R: 5`-GACAGGA GGCTCGTAAGGTG-3`); (5`-GTCCCCACTGTCTACGAGGT-3`, R: 5′-CAGACGACGGGGTTGGAAG-3′).
За накоплением продукта в процессе ПЦР-РВ следили по увеличению флуоресцентного сигнала интеркалирующего красителя SYBR Green I (Invitrogen) с помощью амплификатора ДТ-96 (ООО «НПО ДНК-Технология») c использованием программы RealTime PCR. Программа термоциклирования состояла из активации полимеразы при 94°С в течение 10 минут, 50 циклов плавления в течение 20 сек при 94°С с последующим отжигом праймеров при 64°С в течение 10 секунд и элонгацией при 72°С. Для каждой пары праймеров реакция проводилась параллельно в трех лунках.
ACE2
TMPRSS2
По результатам полимеразной цепной реакции, сопряженной с обратной транскрипцией, соотношение экспрессий  и составило от 1 к 4 до 1 к 5,5.
Пример 1.
Изучение влияния культивирования монослоя клеток линии Caсo2 в условиях микроциркуляции с помощью анализа транскриптома на гибридизационных чипах Affymetrix Human Gene 1.0 ST Array.
2
2
Недифференцированные клетки Caco2 высевали на индивидуальные полиэфирные вставки с проницаемой мембраной с поверхностью 0,143 см и диаметром пор 1,0 мкм, вырезанные из HTS Transwell 96 well permeable supports (Corning, США), в количестве 54 000 клеток на лунку. Подсчет клеток осуществляли с помощью клеточного счетчика Countess (Invitrogen, США). Вставки с клетками помещали либо в микропланшет (статичные условия), либо в микробиореактор БАВР.422522.001 по ТУ 9443-001-89584548-2014 (ООО НТЦ «БиоКлиникум», Россия) с циркуляцией среды под вставками. Параметры микроциркуляции среды составляли от минус 9 кПа до 9 кПа и 5 Гц, скорость циркуляции среды в диапазоне от 0 до 0,9 мкл/с, средняя объемная скорость 5 мкл/мин. Клетки инкубировались в течение 7 дней, в культуральной среде Игла с 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 0,1 мМ заменимых аминокислот, 0,1% пенициллина-стрептомицина (все реагенты Gibco, США) при 37°C и 5% CO, среда менялась трижды за 7 дней. Для анализа использовалось по 3 биологических повтора в условиях микроциркуляции и в статических условиях.
По завершении инкубации к клеткам добавляли 130 мкл лизирующего буфера Qiazol Lysis Reagent (Qiagen, Германия), клеточный лизат переносили в пробирку 1,5 мл, объем лизата доводили с помощью Qiazol Lysis Reagent до 700 мкл. Выделение тотальной РНК осуществляли с помощью набора реагентов miRNeasy Mini Kit (Qiagen) согласно протоколу производителя. Качество выделенной РНК (RNA Integrity Number) оценивали на биоанализаторе (2100 Bioanalyzer, Agilent, Германия). Для всех образцов мРНК RIN превышал 7. Транскриптомный анализ проводили с использованием микрочипов HuGene 1.0 ST Array (Affymetrix, США) согласно методике производителя. Для анализа использовали 500 нг тотальной РНК.
TMPRSS2
Согласно результатам оценки транскриптома дифференцированных клеток Caсo2 в динамических и статических условиях экспрессия ACE2 составляла 6,3±0,07 и 6,5±0,14 соответственно. В свою очередь, экспрессия находилась на уровне 8,4±0,11 и 7,9±0,06 соответственно. Таким образом соотношение экспрессий составляло для статических условий 2^(7,9-6,5)=2,4, а для динамических – 2^(8,4-6,3)=4,28.
Пример 2.
ACE2
TMPRSS2
Изучение влияния культивирования монослоя клеток линии Caсo2 в условиях микроциркуляции с помощью анализа экспрессии мРНК  и методом полимеразной цепной реакции, сопряженной с обратной транскрипцией.
2
2
Недифференцированные клетки Caco2 высевали на индивидуальные полиэфирные вставки с проницаемой мембраной с поверхностью 0,143 см и диаметром пор 1,0 мкм, вырезанные из HTS Transwell 96 well permeable supports (Corning, США), в количестве 66000 клеток на лунку. Подсчет клеток осуществляли с помощью клеточного счетчика Countess (Invitrogen, США). Вставки с клетками помещали либо в микропланшет (статичные условия), либо в микробиореактор БАВР.422522.001 по ТУ 9443-001-89584548-2014 (ООО НТЦ «БиоКлиникум», Россия) с циркуляцией среды под вставками. Параметры микроциркуляции среды составляли от минус 15 кПа до 15 кПа и 4 Гц, скорость циркуляции среды в диапазоне от 0 до 1 мкл/с, средняя объемная скорость 5,2 мкл/мин. Клетки инкубировались в течение 7 дней, в культуральной среде Игла с 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 0,1 мМ заменимых аминокислот, 0,1% пенициллина-стрептомицина (все реагенты Gibco, США) при 37°C и 5% CO, среда менялась трижды за 7 дней. Для анализа использовалось по 3 биологических повтора в условиях микроциркуляции и в статических условиях.
ACE2
TMPRSS2
ACTB
GAPDH
ACE2
TMPRSS2
По завершении инкубации к клеткам добавляли 130 мкл лизирующего буфера Qiazol Lysis Reagent (Qiagen, Германия), клеточный лизат переносили в пробирку 1,5 мл, объем лизата доводили с помощью Qiazol Lysis Reagent до 700 мкл. Выделение тотальной РНК осуществляли с помощью набора реагентов miRNeasy Mini Kit (Qiagen) согласно протоколу производителя. Реакцию обратной транскрипции проводили для 1 мкг РНК с использованием коммерческого набора QuntiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen). На одну реакцию ПЦР-РВ брали 1 мкл разбавленной в 32 раза смеси после обратной транскрипции. Концентрации праймеров составляли 250 нМ, дНТФ («Синтол», Россия) - 0,25 мМ, Taq-полимеразы («Синтол», Россия) – 0,07 мМ в объеме 25 мкл. Оценивали экспрессию мРНК двух референсных генов и генов  и c помощью следующих праймеров:  (F: 5`-CCACGAAACTACCTTCAACTCC-3`, R: 5`-CTCGTCATACTCCTGCTTGCT-3`);  (F: 5`-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3`, R: 5`-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3`); (F: 5`-GTGGAGCACTGACTGGAGC-3`, R: 5`-GACAGGA GGCTCGTAAGGTG-3`); (5`-GTCCCCACTGTCTACGAGGT-3`, R: 5′-CAGACGACGGGGTTGGAAG-3′).
За накоплением продукта в процессе ПЦР-РВ следили по увеличению флуоресцентного сигнала интеркалирующего красителя SYBR Green I (Invitrogen) с помощью амплификатора ДТ-96 (ООО «НПО ДНК-Технология») c использованием программы RealTime PCR. Программа термоциклирования состояла из активации полимеразы при 94°С в течение 10 минут, 50 циклов плавления в течение 20 сек при 94°С с последующим отжигом праймеров при 64°С в течение 10 секунд и элонгацией при 72°С. Для каждой пары праймеров реакция проводилась параллельно в трех лунках.
ACE2
TMPRSS2
По результатам полимеразной цепной реакции, сопряженной с обратной транскрипцией, соотношение экспрессий  и в статических условиях составило 1 к 2,8, а в динамических 1 к 5,5.
ACE2
TMPRSS2
Таким образом, применение динамических условий культивирования позволяет получить дифференцированный монослой клеток линии эпителия кишечника человека Caсo2 с соотношением экспрессии мРНК  и в интервале от 1 к 4 до 1 к 5,5.