Возможность культивирования фибробластов дермы человека на искусственной пористой мембране из политетрафторэтилена, предназначенной для склеропластики

возможность культивирования фибробластов дермы человека на искусственной пористой мембране из политетрафторэтилена, предназначенной для склеропластики

М.И. Блинова 1, Н.М. Юдинцева 1, Е.А. Вершевская1, З. Н. Джанаева 2, Ю.С. Астахов 2, В.В. Томсон 2, ИЛ. Потокин 3, О.В. Галибин 2,

Г.П. Пинаев

1 Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург, Россия

2 Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова, Санкт-Петербург, Россия

3 Ггосударственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов, Санкт-Петербург, Россия

The human dermal fibroblasts cultivation on the porous polytetrafluoroethylene membrane for a scleroplastic

M.I. Blinova 1, N.M. Yudintceva 1, E.A. Vershevskaja 1, Z.N. Dghanaeva 2, YuS. Astakhov 2, V.V. Tomson 2, I.L. Potokoin 3, O.V. Galibin 2, G.P. Pinaev 1 11nstitut of Cytology of Russian Academy of Sciences, Saint-Petersburg, Russia

2 Pavlov State Medical University, Saint-Petersburg, Russia

3 State Research Institute of Highly Pure Biopreparations, Saint-Petersburg, Russia

Методы клеточных технологий все более активно начинают применяться в экспериментальной офтальмологии . Целью данного исследования была оценка возможности культивирования фибробластов дермы человека на пористой мембране из политетрафторэтилена с дальнейшим использованием такой композиции для склеропластики В результате выполненных экспериментов методом сканирующей электронной микроскопии установлено, что указанная пористая мембрана является приемлемым субстратом для культивирования фибробластов дермы . Также показано, что на такой мембране, заселенной культивируемыми фибробластами, в процессе имплантации её в глаз кролика гораздо раньше по сравнению с мембраной без клеток формируются тканевые структуры . Полученные результаты дают основания полагать, что фибробласты дермы, культивируемые на пористой мембране из политетрафторэтилена, могут быть использованы в офтальмологии для восстановления утраченных или поврежденных тканей . Об этом же свидетельствует и клинический случай, являющийся частью данного исследования

Ключевые слова: пористая мембрана из политетрафторэтилена (ПТФЭ), фибробласты дермы, сканирующая микроскопия, трансплантация, восстановление ткани, тканевые структуры

The cell technologies began to apply in ophthalmology actively . The aim of this investigation is to test the porous polytetraphtorethilen membrane as a substrate for the human dermal fibroblasts growth with further using for scleroplastik . It was shown by the scan electron microscopy that this membrane is a suitable substrate for a dermal fibroblast growth . Also it was shown, that the tissue-like structures are formed on the membrane previously seed with cells formerly than on membrane without cells in result of this membrane implantation into rabbit eye The obtained results suggest that dermal fibroblasts growing on porous polytetraphtorethilen membrane may be used in ophthalmology for the restoration of the damage or losed tissues . The clinical example mentioned in this work is evidence in this conclusion

Keywords: porous polytetrafluorineethylene membrane, dermal fibroblasts, electron scanning microscopy, transplantation, tissue structures, tissue regeneration

Введение

Активные исследования в области клеточных технологий позволили сформироваться новой области — «регенеративной медицине» . Эффективное использование культивируемых клеток кожи человека убедительно продемонстрировано при заживлении различных ран . Клеточные технологии интенсивно развиваются в области восстановления костной и хрящевой тканей, в лечении патологии нервной системы, заболеваний сосудов, при нарушении функций эндокринной системы и т . п . [1—7]. Ряд исследовательских коллективов занимаются культивированием клеток лимба, проблемами генной и клеточной терапии с использованием плюрипотентных стволовых клеток для восстановления активности утраченных функций органа зрения [8, 9]. Некоторые исследователи полагают, что трансплантация мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) костного мозга способствует восста-

e-mail: mira . blinova@mail . ru

новлению поврежденной роговицы глаза благодаря их пролиферации, дифференцировке и взаимодействию с гемопоэтическими клетками [10].

Зачастую, для успешного применения клеток в регенеративной медицине требуются оптимальные носители — матриксы, на которых клетки могут расти и быть трансплантированными на пораженный объект . Серия исследований, выполненных разными группами, касается создания биосинтетических носителей, способствующих регенерации поврежденной роговицы, что представляет собой альтернативу пересадке донорской роговицы. Источниками материалов для подобных носителей являются, например, белки внеклеточного матрикса, в частности, коллаген I типа, сшитый с помощью различных химических агентов (N-(3-Dimethylaminoropyl)-N'ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC)/N-Hydroxysuccinimide (NHS), рибофлавин, глютаральдегид и др . ) для получения механической прочности, необходимой при выпол-

нении хирургических операций . Кроме того, разрабатываются матрицы на основе различных полимеров в комбинации с белками внеклеточного матрикса [11-15].

Учитывая, что гистологическая структура роговицы принципиально напоминает структуру тканей кожи [16], в некоторых исследованиях была продемонстрирована реконструкция роговицы в процессе культивирования на разделе воздушной и жидкой фаз эпителиальных клеток роговицы, растущих на тканеинженерной строме, образованной фибро-бластами роговицы, с адекватной эпителиальной дифференцировкой [17]. Исходя из этого, сделано предположение о возможности применения фибро-бластов дермы для восстановления роговицы при различных её нарушениях, что нашло подтверждение в клинической практике . А. В . Васильев с соавт . в 2005 г . вполне успешно применили для регенерации роговицы у 21 пациента выделенные из абортивного материала фибробласты человека в коллагено-вом геле, однако у некоторых пациентов не удалось добиться абсолютной прозрачности восстановленной роговицы [18]. Канадские исследователи провели эксперименты по созданию и оценке тканевых эквивалентов для этих же целей, используя различные комбинации: фибробласты роговицы + эпителиальные клетки роговицы; фибробласты роговицы + эпителиальные клетки кожи; фибробласты кожи + эпителиальные клетки роговицы; фибробласты кожи + эпителиальные клетки кожи Во всех вариантах было показано восстановление эпителия. Был сделан вывод, что такие конструкции могут служить удобными моделями для исследования эпителиально-стромальных взаимодействий и регуляции восстановления эпителия. В то же время отмечено, что конструкции с клетками стромы или роговицы по сравнению с клетками кожи отличались большей прозрачностью В этом сказывались специфические функциональные особенности роговицы глаза [19].

Цель работы: определение возможности культивирования фибробластов дермы человека на мембране из пористого политетрафторэтилена (ПТФЭ), оценка эффективности такой тканеинженерной конструкции для восстановления роговицы и склеры

Задачи исследования

1. Определение условий культивирования фибро-бластов дермы на мембране из ПТФЭ .

2 . Оценка пролиферации фибробластов, культивируемых на мембране из ПТФЭ;

3 . Определение состояния культивируемых на мембране клеток - прижизненное наблюдение под инвертированным микроскопом, сканирующая электронная микроскопии на 5 сут культивирования

4 . Оценка методом сканирующей электронной микроскопии состояния клеток на мембране после имплантации кролику

Материал и методы

Реактивы, использованные в работе

Среда DMEM (Dulbecco modified Eagle's medium; ПанЭко, Россия); фетальная сыворотка крупного рогатого скота — FBS (HyClone, США); гентамицин (40 мкг/мл); 0,125% раствор трипсина (Биолот,

Россия); 0,25% раствор версена (Биолот, Россия); 70% спирт; 0,1% генциан-фиолетовый; 10% уксусная кислота; 4% раствор формальдегида

Пористая мембрана из ПТФЭ используется в офтальмологии для склеропластики («Экофлон», СПб, Россия) . ПТФЭ относится к классу фторопластов, устойчив к различным вариантам биодеструкции полимерных материалов [20, 21]. Используемая в работе мембрана из ПТФЭ была гидрофобна и имела отрицательный заряд поверхности

Для экспериментов из мембраны нарезали диски площадью 0,5 см2 (далее мембранный диск) в соответствии с размером лунки 96-луночной платы. Материал стерилизовали автоклавированием .

Один из показателей токсичности материала — выделение из него в питательную среду неблагоприятных компонентов в процессе культивирования клеток Для выявления этого факта мембранный диск инкубировали в течение 5 сут в среде DMEM в стандартных условиях культивирования клеток в С02-инкубаторе при температуре 37оС и 5% СО2 в атмосфере

Культивирование клеток

В экспериментах были использованы фибробласты дермы, выделенные из фрагмента кожи взрослого человека, полученной в результате косметической операции, после подписания им добровольного информированного согласия . Фибробласты культивировали в среде DMEM с добавлением 10% FBS и гентамицина (40 мкг/мл) Культивирование проводилось в 96-луночных планшетах (Nunc, Дания) с плотностью 2х103 клеток на лунку . Перед посевом клеток в лунки предварительно вкладывали приготовленные мембранные диски площадью 0,5 см2 .

Были выполнены 3 серии экспериментов:

1) культивирование фибробластов на мембранных дисках, предварительно инкубированных в питательной среде в течение 5 сут ;

2) культивирование фибробластов на мембранных дисках, не инкубированных в питательной среде;

3) культивирование фибробластов в питательной среде, в которой предварительно в течение 5 сут инкубировали мембранные диски В этом варианте посев клеток делали в обычной питательной среде (DMEM + 10% FBS), как и в других экспериментальных вариантах, то есть, при одинаковых исходных условиях . Через 1 ч . после посева клеток (после адгезии их к поверхности диска) питательную среду заменяли на среду, полученную после инкубирования в ней мембранных дисков В ней же продолжали культивировать клетки до окончания эксперимента Эта схема была предпринята для того, чтобы определить, не происходит ли экстракция каких-либо соединений из ПТФЭ мембраны, негативно влияющих на состояние культивируемых фибробластов

Контрольный вариант — культивирование фибро-бластов на пластике в стандартных условиях (среда DMEM с добавлением 10% фетальной сыворотки) .

На 5 сут . культивирования проводили прижизненное фотографирование клеток в каждой лунке каждого варианта Следует отметить, что в процессе посева некоторые клетки, не задерживаясь на мембране, «скатывались» на поверхность лунки, прикреплялись к ней и продолжали расти на ней, что было отчетливо видно при прижизненном наблюдении под инвертированным микроскопом между краем мем-

бранного диска и поверхностью лунки в течение всего срока культивирования

Критерии оценки культивируемых фибробластов

1. Количественная оценка: колориметрический метод определения количества клеток [22]

2 Качественная оценка: морфология клеток при прижизненном наблюдении под инвертированным микроскопом, фиксируемая фотографированием; сканирующая электронная микроскопия, трансмиссионная электронная микроскопия

Оценка пролиферации клеток методом колориметрии. Пролиферацию клеток по увеличению их количества в процессе культивирования определяли колориметрическим методом [22]. Клетки после удаления питательной среды и промывки их сбалансированным солевым раствором (PBS) фиксировали 70% этиловым спиртом в течение 10 мин , затем добавляли 0,1% раствор генциан-виолета для окрашивания клеточных белков (инкубация в течение 20 мин ) После удаления генциан-виолета лунки ополаскивали PBS для отмывания избытков красителя с поверхности субстрата. Платы с клетками высушивали на воздухе Далее клетки обрабатывали 10% уксусной кислотой, в результате чего клетки лизировались и из них выделялись окрашенные белки На иммуноферментном фотоэлектрическом анализаторе АИФ-Ц-01С при длине волны 570 нм (Е570) определяли оптическую плотность красителя в белках Для определения количества клеток была построена калибровочная кривая, где оптическая плотность окрашенных таким же образом клеток соответствовала известному числу клеток Сравнение оптической плотности клеток в разных экспериментальных вариантах с оптической плотностью на калибровочной кривой позволяло определить количество клеток в экспериментальных вариантах

Имплантация ПТФЭ мембраны, заселенной

клетками, кроликам

Для эксперимента были использованы кролики породы Шиншилла, массой 3,5—3,7 кг . Зоной для операции служил верхне-наружный квадрант глазного яблока Под общей и поверхностной анестезией в 3 мм от лимба выполнялась конъюнкти-вотомия с отсепаровкой подлежащей теноновой оболочки на протяжении 5 мм Шпателем формировался тоннель в субтеноновом пространстве, куда помещался заранее выкроенный имплантат из пористого политетрафторэтилена, предварительно заселенный фибробластами дермы Материал заводился в субтеноновое пространство таким образом, чтобы сторона с культивированным клеточным материалом была обращена в сторону склеры На рану накладывали два узловых шелковых шва (8/0), под конъюнктиву вводили раствор цефа-золина 0,05 г и раствор дексаметазона 0,002 г . В течение 10 сут . после операции закапывали глазные капли «Тобрадекс» (Alcon, США). После выведения животных из эксперимента глазное яблоко энуклеировали вместе с окружающими мягкими тканями Для гистологического анализа по методике Ван Гизона материал фиксировали в нейтральном растворе формалина, изготавливали парафиновые срезы, окрашивали гематоксилином и эозином

В контрольной группе 2 кроликам были имплантированы диски без культивируемых клеток

Содержание и использование лабораторных животных соответствовало правилам, принятым в Российской Федерации, национальным законам и рекомендациям локального этического комитета

Имплантация ПТФЭ мембраны, заселенной клетками, пациенту была выполнена с одобрения локального этического комитета СПбГМУ им . акад . И П Павлова Протокол операции представлен в разделе «Результаты»

Результаты

На 5 сут . культивирования (окончание эксперимента in vitro) клетки в лунках фотографировали под инвертированным микроскопом Поскольку сами мембранные диски непрозрачны и видеть под микроскопом состояние клеток на них невозможно, о морфологии клеток судили по тем, которые мигрировали с края диска на поверхность лунки и были хорошо видны в зазоре между диском и стенкой лунки после удаления диска из лунки Во всех экспериментальных вариантах и в контроле культивируемые клетки имели типичную морфологию фибробластов (рис . 1). Это в определенной степени служит свидетельством отсутствия токсического воздействия материала мембраны на клетки

Рис. 1. Фибробласты, культивируемые

на мембранных дисках:

А — предварительно инкубированных

в питательной среде;

Б — на нативных (не инкубированных

предварительно в питательной среде);

В — в питательной среде после инкубации в ней

мембранных дисков в течение 5 сут.;

Г — контроль (культивирование на пластике).

Прижизненная микроскопия после удаления дисков.

Ув. х100

Количествофибробластов

Построение калибровочной кривой по оптической плотности, соответствующей количеству фибробластов в контрольной популяции, представлено в табл . 1 и на рис . 2 .

Исходя из рассчитанных значений калибровочной кривой, было определено среднее количество фибробластов, культивируемых в питательной среде после инкубирования в ней мембранных дисков, и в контроле (табл . 2).

оригинальные ИССЛЕДОВАНИЯ 51

Таблица 1. Количество клеток и соответствующее значение оптической плотности в контрольной популяции фибробластов

Количество клеток (шт.) 50 000 25 000 12 500 6250 3125 1600 800

Оптическая плотность (у.е.) 0,821 0,350 0,191 0,086 0,046 0,033 0,019

50 000 25 000 12 500 6 250 3125 1 600 Количество клеток

800

400

Рис. 2. Калибровочная кривая — соотношение количества клеток и их оптической плотности в контрольной популяции фибробластов

Таблица 2. Количество клеток экспериментальных и контрольной групп после культивирования в течение 5 сут. Колориметрический метод

Этот вывод подтвержден и методом сканирующей электронной микроскопии фибробластов, культивируемых на мембранных дисках в тех же условиях (среда, срок культивирования) (рис. 3).

Рис. 3. Мембрана из ПТФЭ в разных группах: А — контроль;

Б — фибробласты, культивированные 5 сут. на мембранных дисках, предварительно инкубированных в питательной среде до посева на них клеток;

В — фибробласты, культивированные 5 сут. на не инкубированных в питательной среде мембранных дисках; Г — фибробласты, культивированные на мембранных дисках в кондиционированной (в течение 5 сут.) ПТФЭ среде. Сканирующая электронная микроскопия

Параметры Клетки в кондиционированной ПТФЭ мембраной среде Контроль

Оптическая 0,280 0,320

плотность

растворов

красителя

Среднее количество клеток за 5 сут. культивирования

По результатам колориметрического метода оценки количества клеток не было обнаружено статистически значимых различий между вариантом культивирования в кондиционированной среде и контролем Таким образом, материал мембраны не содержит компонентов, токсичных для клеток, что соответствует результатам морфологического анализа

Результаты эксперимента in vivo

Через 3 нед . после операции материалы были извлечены и проанализированы методом сканирующей электронной микроскопии. В контроле (диски без клеток) на мембранах выявлялись участки, заселенные клетками, которые могли мигрировать только из окружающих тканей . На мембранах, предварительно заселенных фибробластами, активно формировались тканевые структуры (рис . 4) .

Рис. 4.

Состояние мембраны через 3 нед. после имплантации кролику: формирование тканевых структур на мембране, заселенной фибробластами до имплантации (А — кролик № 1, Б — кролик № 2); В — состояние мембраны после имплантации без предварительного заселения клетками - отдельные клетки могли мигрировать из ткани глаза

Кроме того, была выполнена трансмиссионная электронная микроскопия на полутонких срезах исследуемых материалов . Поры мембраны, до имплантации заселенной фибробластами, были заполнены клетками (рис . 5).

Рис. 5. Мембрана из ПТФЭ, заселенная клетками,

через 3 нед. после трансплантации.

Полутонкий срез. Окраска: толуидиновый синий.

Ув. х40

Клинический случай

Больная С . , 67 лет, оперирована по поводу катаракты с имплантацией интраокулярной линзы (ИОЛ) посредством транссклеральной шовной фиксации . Нередко швы прорезаются через истонченную склеру и конъюнктиву и служат «входными воротами» для внутриглазной инфекции . В случае пациентки С транссклеральные швы из полипропилена обнажились через 8 лет . В дальнейшем трижды за год были выполнены пластические операции с использованием аутосклеры и лиофилизированной донорской роговицы. Приняв во внимание безуспешность предпринятых ранее мероприятий, было решено покрыть участок склеры с прорезавшимися швами пористой мембраной из ПТФЭ, предварительно заселенной фибробластами . Материал был фиксирован таким образом, чтобы сторона с клеточным субстратом плотно прилегала к склере . Учитывая лимбаль-ную локализацию, рубцово-измененную конъюнктиву вследствие ранее проведенных вмешательств, слизистый лоскут над материалом был натянут . В дальнейшем, несмотря на соскальзывание натянутой конъюнктивы с поверхности тканеинженерной конструкции, отмечалась хорошая ее фиксация к склере . При контрольном осмотре было отмечено полное покрытие клетками прорезавшихся швов

Обсуждение

Как известно, существуют ситуации, когда для более успешного процесса заживления становится необходимым использование культивируемого кле-

точного материала В выполненном исследовании была осуществлена попытка использования в офтальмологии фибробластов дермы человека, культивируемых на мембране ПТФЭ . Клинический опыт различных исследователей показал допустимость применения аллогенных клеток кожи (фибробластов и кератиноцитов) для заживления ран [23—26].

В данной работе проверена реакция модельного объекта (ткань глаза кролика) на трансплантацию ксеногенных клеток — фибробластов дермы человека, способствующих формированию новообразованной ткани (рис . 3, 4) . Прежде всего, была установлена возможность культивирования клеток на материале из пористой мембраны ПТФЭ, применяемой для склеропластики и активно используемой в офталь-мохирургии для лечения таких заболеваний, как злокачественное новообразование сосудистой оболочки, отслойка сетчатки, перфорирующая склеромаляция, разъедающая язва склеры, прогрессирующий птери-гиум и т д , а также тяжелые повреждения глазного яблока [26]. Проведенные исследования как по культивированию клеток, непосредственно посеянных на мембрану, так и культивируемых в питательной среде после инкубирования в ней ПТФЭ мембраны в течение 5 сут . в обычных для культивирования условиях, показали, что материал мембраны не содержит компонентов, токсичных для клеток . Об этом свидетельствовали результаты прижизненного наблюдения за состоянием культивируемых фибробластов (частично мигрировавших с мембраны на поверхность лунки и оставшихся на ней после удаления мембраны) и данные колориметрического определения пролиферации клеток, культивируемых в питательной среде после инкубирования в ней мембранных дисков, и в стандартных условиях (рис . 1, 2) .

Методом сканирующей электронной микроскопии было подтверждено, что фибробласты, посеянные на мембрану, адгезируются к ее поверхности, и в течение 5 сут . культивирования хорошо распластываются по этому субстрату, сохраняя нормальную морфологию, несмотря на гидрофобность мембраны ПТФЭ (см рис 3) Этот кажущийся парадокс может быть объяснен тем, что гидрофобная поверхность мембраны ПТФЭ имеет отрицательный заряд, а заряд внешней оболочки клетки является положительным. Разница зарядов способствует адгезии клеток Полученные данные, на наш взгляд, свидетельствуют о том, что ПТФЭ мембрана является пригодным субстратом для культивирования клеток Такой вывод подтверждается также и многочисленными случаями применения имплантатов из пористой ПТФЭ мембраны в клинике для профилактики и лечения анофтальмологического синдрома, в лечении переломов глазницы, для кератотезиро-вания, для закрытия дефектов склеры и в лечении глаукомы [27, 28]

Кроме того, о возможности адгезии и пролиферации ММСК жировой ткани на подложке из пористого ПТФЭ, наноструктурированного многофункциональным биосовместимым нерезорбируемым покрытием (МБНП) состава ТнСа-Р-С-О^ сообщается в работе по получению тканеинженерной конструкции для регенерации костной ткани [29].

Исходя из вышесказанного, представлялось логичным имплантировать мембраны с культивируемыми на них в течение 5 сут фибробластами в склеру кролика Обнаружено, что на имплантированных мембранах, предварительно заселенных фибробластами,

развиваются многослойные тканеподобные структуры (рис . 4) . Материал был имплантирован двум кроликам и в каждом случае образовался плотный клеточный слой . Морфологические различия в состоянии образовавшихся структур могут определяться индивидуальными особенностями реципиентов (кроликов) . Изготовленные из имплантированного материала полутонкие и ультратонкие срезы для электронной микроскопии четко свидетельствуют о заполнении пор мембраны клетками, растущими на поверхности мембран (рис . 5) .

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о допустимости использования в офтальмологии фибробластов дермы, культивируемых на пористой ПТФЭ мембране .

Что касается источников материала для клеточных технологий с целью устранения повреждений роговицы, в обзоре Е . В . Киселевой (2011) упоминается целый ряд исследований [8]. Среди предполагаемых источников рассматривались, например, эпителиальные клетки слизистой оболочки ротовой полости . При этом роговица восстанавливается, становится прозрачной, но в дальнейшем выясняется, что отсутствие экспрессии цитокератина 12 не позволяет дифференцироваться эпителиальным клеткам слизистой оболочки в эпителий роговицы При использовании кератиноцитов из волосяных фолликулов восстанавливается пул стволовых клеток роговицы, но наблюдается подавление васкуляризации и врастание коньюктивы в роговицу . ММСК жировой ткани способны стимулировать заживление роговицы и дифференцироваться в кератоциты и эпителиальные клетки роговицы . Также показано восстановление эпителия роговицы при трансплантации кроликам стволовых клеток из пульпы молочных зубов В эксперименте доказано, что фибробласты дермы способствуют усилению миграции и пролиферации собственных кератоцитов Если до лечения отсутствовало помутнение роговицы, то после при-

менения стромального эквивалента роговица сохраняла свою прозрачность

В клинической практике для закрытия дефектов тканей глаза используют различные аутоматериалы, в частности, донорскую склеру (проблема дефицита материала), васкуляризованный лоскут на ножке, выкроенный из надкостницы и височной фасции пациента; широкую фасцию бедра и хрящ, также обладающий хорошей опорной функцией, но эти ткани плохо приживаются к бессосудистому ложу Как наиболее эффективные аутогенные материалы зарекомендовали себя расщепленные лоскуты кожи бедра [29]. Дерма является слабо антигенным материалом, приживается к аваскулярной поверхности, обладает способностью к самостоятельной эпителизации и поэтому не требует конъюнктивального покрытия . Из алломатериалов применяют либо ацеллюлярный дермальный аллотрансплантат «Аллодерм», или бычий перикард [25]

Группой исследователей рассматривается также возможность создания ЗД-клеточных конструкций из разных типов клеток — эндотелиальных и эпителиальных, выращенных на реконструированной строме. Разрабатываемые технологии касаются не только восстановления роговицы, но и лечения других заболеваний, например, сетчатки глаза [9].

В заключение можно констатировать, что в настоящее время не разработаны оптимальные клеточные конструкции при данных медицинских показаниях Применение фибробластов дермы в комплексе с пористой мембраной ПТФЭ может помочь в ряде случаев восстановлению структуры и функции склеры

Благодарности

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 14-50-00068) и при финансовой поддержке ФАНО России.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Деев Р . В . Гистогенетические основы клеточных технологий в восстановлении скелетных тканей [спорные вопросы экспериментальной и клинической остеологии) . В: Пинаев Г . П ., Богданова М . С . , Кольцова А. М ., редакторы . Клеточные технологии для регенеративной медицины . СПб: Изд-во Политехнического университета; 2011. с . 145-61.

2 . Блинова М . И . Клеточные технологии восстановления поврежденного кожного покрова . В: Пинаев Г. П ., Богданова М . С ., Кольцова А М , редакторы Клеточные технологии для регенеративной медицины . СПб: Изд-во Политехнического университета; 2011. с . 178-93 .

3 . Николаенко Н . С . Восстановление хрящевой ткани с помощью клеточных технологий В: Пинаев Г П , Богданова М С , Кольцова А М , редакторы Клеточные технологии для регенеративной медицины . СПб: Изд-во Политехнического университета; 2011. с . 162-77 .

4 . Александрова М .А . Клеточные технологии в лечении патологий нервной системы В: Пинаев Г П , Богданова М С , Кольцова А М , редакторы Клеточные технологии для регенеративной медицины . СПб: Изд-во Политехнического университета; 2011. с . 210-23 .

5 Давыденко В В Использование клеточных технологий в лечении заболеваний сосудов . В: Пинаев Г . П ., Богданова М . С ., Кольцова А М , редакторы Клеточные технологии для регенеративной медицины . СПб: Изд-во Политехнического университета; 2011. с . 239-51

6 . Галибин О . В . Клеточные технологии в лечении эндокринных желез В: Пинаев Г П , Богданова М С , Кольцова А М , редакторы Клеточные технологии для регенеративной медицины СПб: Изд-во Политехнического университета; 2011. с . 252-75 .

7 . Зорин В .Л ., Степанова И.И. , Зорина А. И. и др . Устранение рецессий и дефицита десны методом трансплантации аутогенных фибробластов слизистой оболочки полости рта человека.

В: Пинаев Г . П . , Богданова М . С . , Кольцова А . М . , редакторы . Клеточные технологии для регенеративной медицины . СПб: Изд-во Политехнического университета; 2011. с . 276-88 .

8 . Киселева Е . В ., Дашинимаев Э . Б ., Шипунова А. В . и др . Клеточные технологии для восстановления роговицы В: Пинаев г П , Богданова М С , Кольцова А М , редакторы Клеточные технологии для регенеративной медицины СПб: Изд-во Политехнического университета; 2011. с . 224-38 .

9 . Максимов В . В ., Лагарькова М .А . , Киселев С .Л . Генная и клеточная терапия заболеваний сетчатки глаза Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2012; VIIC3): 12-20 .

10 . Ye J . , Yao K ., Kim J . С . Mesenchymal stem cell transplantation in a rabbit corneal alkali burn model: engraftment and involvement in wound healing . Eye 2006; 20: 482-90 .

11. Zhang Xu, Nakahara Jukiko, Xuan Dwight et al . Study on the optical property and biocompatibility of a tissue engineering cornea Int . J . Ophtalmol . 2012; 5(1): 45-9 .

12 . Grobe G . M ., Reichl S . Examining the suitability of riboflavin/ UVA treatment for strengthening the stromal bioequivalent of a human cornea constract. Curr. Eye Res . 2011; 36(3): 217-31.

13 . Li F ., Carlsson D ., Lohmann Ch . et al . Cellular and nerve regeneration within a biosynthetic extracellular matrix for corneal transplantation . PNAS USA 2003; 100: 15346-51.

14 . Deng Ch ., Li F ., Hackett J . M . et al . Collagen and glycopolymer based hydrogel for potential corneal application . Acta Biomater. 2010; 6(1):187-94 .

15 Bentley E , Murphy Ch J , Li F et al Biosynthetic corneal substitute implantation in dogs . Cornea 2010; 29: 910-6 .

16 . Хэм А . , Кормак Д . Глаз и ухо . В: Афанасьев Ю . И . , Чен-цов Ю . С . , редакторы . Гистология, Т . 5 . Москва: Мир; 1983 . с 223-56

17 . Paquet C ., Larouche D ., Bisson F . et al . Tissue engineering of skin and cornea: development of new models for in vitro studies. Ann . N .Y . Acad . Sci . 2010; 1197: 166-77 .

18 . Васильев А. В ., Макаров П . В ., Роговая О . С . и др . Восстановление дефектов роговицы с помощью тканевой инженерии . Известия РАН . Серия биологическая 2005; 1: 5-8 .

19 . Carrier P . , Deschambeault A ., Audet С . et al . Impact of cell source on human cornea reconstructed by tissue engineering . Invest . Ophtalmol . Vis . Sci . 2009; 50(6): 2645-52 .

20 . Липатова Т . Э ., Пхакадзе Г .А . Применение полимеров в хирургии . Киев: Наука думка; 1977 .

21. Розанова И . Б . Биодеструкция имплантатов . В: Севастьянов В . И ., редактор . Биосовместимость . Москва: ИЦ ВНИИ; 1999 . с . 212-45 .

22 . Mossman T . Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxity assays . J . Immunological Methods 1983; 65: 55-83 .

23 . Генин А. М ., Капланский А. С . Биоэтические правила проведения исследований на человеке и животных в авиационной, космической и морской медицине Авиационная и экологическая медицина 2001; 4: 14-20 .

24 . Stingl G ., Katz S . L ., Clement L . et al . Immunological functions of Ia-bearing epidermal Langerhans cells . Immunology 1978; 121(5): 2005-13 .

25 . Brain A., Purkis P . , Coates P . et al . Survival of cultured allogenic keratinocytes transplanted to deep dermal bed absessed with probe specific for "Y" chromosomes . Br . Med . J . 1989; 248: 917-9 .

26 . Mauriello J . A . Jr . , Pokorny К . Use of split-thickness dermal grafts to repair corneal and scleral defects — a study of 10 patients . Brit . J . Ophtalmol . 1993; 77(6): 327-31.

27 . Сомов Е . Е . Склеропластика . СПб: ППМИ; 1995 .

28 . Астахов Ю . С ., Николаенко В . П . , Дьяков В . Е . Использование политетрафторэтиленовых имплантатов в офтальмохирургии . СПб: Фолиант; 2007 .

29 . Григорьян А . С ., Киселёва Е . В ., Штанский Д . В . и др ., Новый тип тканеинженерной конструкции на основе политетрафторэтилена с наноструктурированным многофункциональным биосовместимым нерезорбируемым покрытием Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2010; V(3):71-6 .

Поступила: 15.01.2015