АНТИ-TIGIT АНТИТЕЛА И СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ
ANTI-TIGIT ANTIBODIES AND METHODS OF USING

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
В данной заявке приложении содержится перечень последовательностей, который был подан в электронном виде в формате ASCII и таким образом включен посредством ссылки в полном объеме. Указанная копия ASCII, созданная 22 сентября 2016 года, носит название 50474-120WO3_Sequence_Listing_9_22_16_ST25, а ее размер составляет 209318 байт.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Данное изобретение относится к анти-TIGIT антителам (Т-клеточный иммунорецептор с доменами Ig и ITIM (иммунорецепторный ингибиторный мотив на основе тирозина)) и к способам их применения.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Связанные с иммунной системой заболевания (например, рак) представляют собой проявление или последствие сложных биологических путей, которые при нормальной физиологии имеют решающее значение для ответа на повреждение или травму, инициируя восстановление после повреждения или травмы и устанавливая врожденную и приобретенную защиту. Заболевание или патология возникает, если эти нормальные физиологические пути вызывают дополнительное повреждение или травму, которые непосредственно связаны с интенсивностью ответа (например, вследствие аномального регулирования или чрезмерной стимуляции) или в форме реакции организма на самого себя.
Хотя генезис этих заболеваний часто включает в себя многоступенчатые пути и часто несколько различных биологических систем/путей, вмешательство в критических точках в одном или нескольких из этих путей может оказывать смягчающее или терапевтическое влияние. Терапевтическое вмешательство может происходить посредством антагонизма вредоносному процессу/пути или стимуляции полезного процесса/пути.
Многие заболевания, связанные с иммунной системой, известны и широко изучались. К таким заболеваниям относятся рак (неоплазия), иммуно-опосредованные воспалительные заболевания, неиммунно-опосредованные воспалительные заболевания, инфекционные заболевания и иммунодефицитные заболевания.
Т-лимфоциты (Т-клетки) являются важным компонентом иммунного ответа млекопитающих. Т-клетки распознают антигены, которые связаны с собственной молекулой, кодируемой генами в основном комплексе гистосовместимости (ОКГ (MHC)). Антиген может отображаться вместе с молекулами ОКГ (MHC) на поверхности антигенпрезентующих клеток (АПК (APC)), инфицированных вирусом клеток, раковых клеток, трансплантатов и т.д. Система T-клеток устраняет такие модифицированные клетки, которые представляют угрозу здоровью млекопитающего-хозяина. Т-клетки включают в себя хелперные Т-клетки и цитотоксические Т-клетки. Хелперные Т-клетки интенсивно размножаются после распознавания комплекса антиген-ОКГ (MHC) на АПК (APC). Кроме того, хелперные Т-клетки секретируют различные цитокины (т.е., лимфокины), которые играют центральную роль в активации В-клеток, цитотоксических Т-клеток и различных других клеток, которые участвуют в иммунном ответе.
Регуляторные Т-клетки (Treg) представляют собой подмножество хелперных Т-клеток, которые играют критическую роль в подавлении иммунных реакций в отношении собственных структур организма, и часто встречаются на участках хронического воспаления, таких как опухолевая ткань. Фенотипически Treg определяются высокой экспрессией CD25, CLTA4, GITR (индуцируемый глюкокортикоидом рецептор опухолевого некротического фактора) и нейропилина-1 (NRP-1) на поверхности клетки и находятся под контролем фактора транскрипции FOXP3. Treg выполняют свою супрессивную функцию на активированных Т-клетках через зависящие от контакта механизмов и выработки цитокинов. Кроме того, Treg модулируют иммунные ответы путем непосредственного взаимодействия с лигандами на дендритных клетках (ДК (DC)), такого как лигирование CD40L и CTLA4 с молекулами B7 на ДК (DC), что вызывает индукцию индоламин-2,3-диоксигеназы (ИДО). ДК (DC) представляет собой профессиональные АПК (APC), способные индуцировать иммунитет или толерантность к собственным или чужеродным антигенам. Усиленные ДК (DC) Treg подавляют аллореактивные ответы in vitro, и при адоптивном переносе соответствующие Treg подавляют диабет у мышей NODscid или экспериментально индуцированную астму. Специфическое взаимодействие лигандов на ДК (DC) с Treg дополнительно может нейтрализовать их ингибиторную функцию, такую как вовлечение GITR у мышей, наводя на мысль о том, что, что ДК (DC) может играть множественные роли в модулировании функции Treg.
Молекулы CTLA4 и GITR представляют собой лиганды, определенные в суперсемействах костимулирующих/ингибирующих молекул CD28-B7 и TNF (опухолевый некротический фактор), соответственно. Эти молекулы в высокой степени экспрессируются на Treg, но обычно активизируются на активированных Т-клетках. Совсем недавно белок, обозначенный TIGIT (для Т-клеточного иммунорецептора с доменами Ig и ITIM), был идентифицирован как белок, связанный с клеточной поверхностью, который специфически экспрессируется на Т-клетках, содержащий домен IgV, трансмембранный домен и два предполагаемых иммунорецепторных ингибиторных мотива на основе тирозина (ITIM). Было показано, что TIGIT в особенности экспрессируется на подмножествах Treg и T-клетках памяти, а также на природных клетках-киллерах (ПК (NK)). Поскольку существует неудовлетворенная потребность в новых терапевтических средствах и способах лечения связанных с иммунной системой расстройств и, в частности, раковых заболеваний, в данном документе описан неожиданно эффективные терапевтические композиции, такие как анти-TIGIT антитела и их композиции, а также способы лечения связанных с иммунной системой расстройств и раковых заболеваний, которые включают модулирование взаимодействия TIGIT с его партнерами по связыванию.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В данном изобретении предложены анти-TIGIT (Т-клеточный иммунорецептор с доменами Ig и ITIM) антитела и их варианты с улучшенными свойствами, включая, например, аффинность связывания, перекрестную реактивность, фармакокинетику и/или экспрессию. В частности, данное изобретение относится к анти-TIGIT антителам и их вариантам, которые обладают, например, высокой аффинностью связывания с TIGIT человека; перекрестной реактивностью между TIGIT человека, TIGIT яванского макака (яванца) и/или TIGIT кролика; желаемыми параметрами клиренса у яванца; и биохимическими и биофизическими свойствами, которые обеспечивают антителам и их вариантам высокую стабильность.
В одном аспекте изобретение относится к антителу, которое специфически связывается с TIGIT человека, причем антитело связывается с эпитопом на TIGIT человека, содержащем один или большее количество из аминокислотных остатков Ser78, Ser80 и Lys82 TIGIT человека. В одном варианте осуществления изобретения эпитоп содержит аминокислотные остатки Ser80 и Lys82 TIGIT человека. В другом варианте осуществления изобретения эпитоп содержит аминокислотные остатки Ser78, Ser80 и Lys82 TIGIT человека. В другом варианте осуществления изобретения эпитоп дополнительно содержит аминокислотный остаток Ala67 TIGIT человека. В другом варианте осуществления изобретения эпитоп дополнительно содержит один или большее количество дополнительных аминокислотных остатков, выбранных из группы, состоящей из Glu60, Leu65 и Ile68 TIGIT человека. В другом варианте осуществления изобретения эпитоп дополнительно содержит один или большее количество дополнительных аминокислотных остатков, выбранных из группы, состоящей из Gln56, Asn70, Leu73 и His111 TIGIT человека. В другом варианте осуществления изобретения эпитоп дополнительно содержит один или большее количество дополнительных аминокислотных остатков, выбранных из группы, состоящей из Thr55, Asn58, Asp63, Gln64, His76, Ile77 и Pro79 TIGIT человека. В другом варианте осуществления изобретения эпитоп состоит из аминокислотных остатков Thr55, Gln56, Asn58, Glu60, Asp63, Gln64, Leu65, Ala67, Ile68, Asn70, Leu73, His76, Ile77, Ser78, Pro79, Ser80, Lys82 и His111 TIGIT человека.
В другом аспекте изобретение относится к антителу, которое специфически связывается с TIGIT человека, причем антитело связывается с эпитопом на TIGIT человека, содержащим один или большее количество аминокислотных остатков Thr55, Ser80 и Lys82 TIGIT человека. В одном варианте осуществления изобретения эпитоп содержит аминокислотный остаток Lys82 TIGIT человека. В другом варианте осуществления изобретения эпитоп содержит аминокислотные остатки Thr55, Ser80 и Lys82 TIGIT человека. В другом варианте осуществления изобретения эпитоп дополнительно содержит аминокислотный остаток Gln56 TIGIT человека. В другом варианте осуществления изобретения эпитоп дополнительно содержит аминокислотный остаток Ile77 или Pro79 TIGIT человека. В другом варианте осуществления изобретения эпитоп дополнительно содержит аминокислотные остатки Pro79 Ile77 и TIGIT человека. В другом варианте осуществления изобретения эпитоп дополнительно содержит аминокислотный остаток Asn58 или Glu60 TIGIT человека. В другом варианте осуществления изобретения эпитоп дополнительно содержит аминокислотные остатки Asn58 и Glu60 TIGIT человека. В другом варианте осуществления изобретения эпитоп дополнительно содержит один или большее количество дополнительных аминокислотных остатков, выбранных из группы, состоящей из Leu65, Ile68, Leu73, His76, Ser78 и His111 TIGIT человека. В другом варианте осуществления изобретения эпитоп дополнительно содержит аминокислотные остатки Leu65, Ile68, Leu73, His76, Ser78 и His111 TIGIT человека. В еще одном варианте осуществления изобретения эпитоп состоит из Thr55, Gln56, Asn58, Glu60, Leu65, Ile68, Leu73, His76, Ile77, Ser78, Pro79, Ser80, Lys82 и His111 TIGIT человека.
В другом аспекте изобретение относится к антителу, которое специфически связывается с TIGIT человека, причем антитело содержит паратоп, содержащий один или большее количество аминокислотных остатков, выбранных из группы, состоящей из аминокислотных остатков вариабельного участка тяжелой цепи Asn32, Tyr52, Arg52b, Phe53, Lys54, Tyr56, Asp58, Tyr99, Asp100, Leu100a, Leu100b и Ala100c и аминокислотных остатков вариабельного участка легкой цепи Tyr27d, Tyr92, Ser93, Thr94 и Phe96. В одном варианте осуществления изобретения паратоп состоит из аминокислотных остатков вариабельного участка тяжелой цепи Asn32, Tyr52, Arg52b, Phe53, Lys54, Tyr56, Asp58, Tyr99, Asp100, Leu100a, Leu100b и Ala100c и аминокислотных остатков вариабельного участка легкой цепи Tyr27d, Tyr92, Ser93, Thr94 и Phe96. В любом из вышеуказанных аспектов антитело может быть способно связываться с TIGIT кролика.
В другом аспекте изобретение относится к антителу, которое специфически связывается с TIGIT человека, причем антитело связывается с эпитопом на TIGIT человека, содержащем один или большее количество аминокислотных остатков, выбранных из группы, состоящей из Gln53, His111 и Tyr113 TIGIT человека. В некоторых вариантах осуществления эпитоп дополнительно содержит Gln56 TIGIT человека. В некоторых вариантах осуществления эпитоп дополнительно содержит Glu60, Leu65, Ile68, Asn70, Leu73 и His76 TIGIT человека.
1
1
В другом аспекте изобретение относится к антителу, которое специфически связывается с TIGIT человека, причем антитело содержит следующие шесть гипервариабельных участков (ГВУ (HVR)): HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SNSAAWN (SEQ ID NO: 1); HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность KTYYRFKWYSDYAVSVKG (SEQ ID NO: 2); HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность ESTTYDLLAGPFDY (SEQ ID NO: 3); HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность KSSQTVLYSSNNKKYLA (SEQ ID NO: 4); HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность WASTRES (SEQ ID NO: 5); и HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность QQYYSTPFT (SEQ ID NO: 6). В некоторых вариантах осуществления антитело дополнительно содержит следующие каркасные участки (КУ (FR)) вариабельного участка легкой цепи: FR-L1, содержащий аминокислотную последовательность DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC (SEQ ID NO: 7); FR-L2, содержащий аминокислотную последовательность WYQQKPGQPPNLLIY (SEQ ID NO: 8); FR-L3, содержащий аминокислотную последовательность GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC (SEQ ID NO: 9); и FR-L4, содержащий аминокислотную последовательность FGPGTKVEIK (SEQ ID NO: 10). В некоторых вариантах осуществления антитело дополнительно содержит следующие КУ вариабельного участка тяжелой цепи: FR-H1, содержащий аминокислотную последовательность XVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVS (SEQ ID NO: 11), где X представляет собой Q или E; FR-H2, содержащий аминокислотную последовательность WIRQSPSRGLEWLG (SEQ ID NO: 12); FR-H3, содержащий аминокислотную последовательность RITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVFYCTR (SEQ ID NO: 13); и FR-H4, содержащий аминокислотную последовательность WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 14). В некоторых вариантах осуществления антитело дополнительно содержит следующие КУ-области вариабельного участка тяжелой цепи: FR-H1, содержащий аминокислотную последовательность EVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVS (SEQ ID NO: 15); FR-H2, содержащий аминокислотную последовательность WIRQSPSRGLEWLG (SEQ ID NO: 12); FR-H3, содержащий аминокислотную последовательность RITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVFYCTR (SEQ ID NO: 13); и FR-H4, содержащий аминокислотную последовательность WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 14). В некоторых вариантах осуществления антитело дополнительно содержит следующие КУ вариабельного участка тяжелой цепи: FR-H1, содержащий аминокислотную последовательность QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVS (SEQ ID NO: 16); FR-H2, содержащий аминокислотную последовательность WIRQSPSRGLEWLG (SEQ ID NO: 12); FR-H3, содержащий аминокислотную последовательность RITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVFYCTR (SEQ ID NO: 13); и FR-H4, содержащий аминокислотную последовательность WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 14). В некоторых вариантах осуществления антитело способно связываться с TIGIT кролика.
1
1
В другом аспекте изобретение относится к антителу, которое специфически связывается с TIGIT человека, причем антитело содержит следующие шесть ГВУ (HVR): HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SYPMN (SEQ ID NO: 17); HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность WINTNTGNPTYVQGFTG (SEQ ID NO: 18); HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность TGGHTYDSYAFDV (SEQ ID NO: 19); HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность RASQVISSSLA (SEQ ID NO: 20); HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность AASTLQS (SEQ ID NO: 21); и HVR-L3, включающий аминокислотную последовательность QHLHGYPXN (SEQ ID NO: 22), где X представляет собой C или S. В некоторых вариантах осуществления антитело содержит следующие шесть ГВУ (HVR): HVR-H1, содержащий аминокислоту последовательность SYPMN (SEQ ID NO: 17); HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность WINTNTGNPTYVQGFTG (SEQ ID NO: 18); HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность TGGHTYDSYAFDV (SEQ ID NO: 19); HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность RASQVISSSLA (SEQ ID NO: 20); HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность AASTLQS (SEQ ID NO: 21); и HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность QHLHGYPSN (SEQ ID NO: 23). В некоторых вариантах осуществления антитело дополнительно содержит следующие КУ вариабельного участка тяжелой цепи: FR-H1, содержащий аминокислотную последовательность EVQLVQSGSDLKKPGASVRVSCKASGYTFT (SEQ ID NO: 24); FR-H2, содержащий аминокислотную последовательность WVRQAPGHGLEWMG (SEQ ID NO: 25); FR-H3, содержащий аминокислотную последовательность RFVFSLDTSVNTAYLQISSLKAEDTAVYFCAR (SEQ ID NO: 26); и FR-H4, содержащий аминокислотную последовательность WGQGTMVTVSS (SEQ ID NO: 27). В некоторых вариантах осуществления антитело содержит следующие шесть ГВУ (HVR): HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SYPMN (SEQ ID NO: 17); HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность WINTNTGNPTYVQGFTG (SEQ ID NO: 18); HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность TGGHTYDSYAFDV (SEQ ID NO: 19); HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность RASQVISSSLA (SEQ ID NO: 20); HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность AASTLQS (SEQ ID NO: 21); и HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность QHLHGYPCN (SEQ ID NO: 28). В некоторых вариантах осуществления антитело дополнительно содержит следующие КУ вариабельного участка тяжелой цепи: FR-H1, содержащий аминокислотную последовательность QVQLVQSGSDLKKPGASVRVSCKASGYTFT (SEQ ID NO: 29); FR-H2, содержащий аминокислотную последовательность WVRQAPGHGLEWMG (SEQ ID NO: 25); FR-H3, содержащий аминокислотную последовательность RFVFSLDTSVNTAYLQISSLKAEDTAVYFCAR (SEQ ID NO: 26); и FR-H4, содержащий аминокислотную последовательность WGQGTMVTVSS (SEQ ID NO: 27). В некоторых вариантах осуществления антитело дополнительно содержит следующие КУ вариабельного участка легкой цепи: FR-L1, содержащий аминокислотную последовательность DIQLTQSPTFLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 30); FR-L2, содержащий аминокислотную последовательность WYQQNPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 31); FR-L3, содержащий аминокислотную последовательность GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFVTYYC (SEQ ID NO: 32); и FR-L4, содержащий аминокислотную последовательность FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 33).
В другом аспекте изобретение относится к антителу, которое специфически связывается с TIGIT человека, причем антитело содержит (а) вариабельный участок тяжелой цепи (VH), обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 95 % относительно аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 34 или 35; (b) вариабельный участок легкой цепи (VL), обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 95 % относительно аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 36; или (c) вариабельный участок тяжелой цепи, как в (a), и вариабельный участок легкой цепи, как в (b). В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело содержит (а) вариабельный участок тяжелой цепи (VH), обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 95 % относительно аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 34; (b) вариабельный участок легкой цепи (VL), обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 95 % относительно аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 36; или (c) вариабельный участок тяжелой цепи, как в (a), и вариабельный участок легкой цепи, как в (b). В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело содержит (а) вариабельный участок тяжелой цепи (VH), обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 95 % относительно аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 35; (b) вариабельный участок легкой цепи (VL), обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 95 % относительно аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 36; или (c) вариабельный участок тяжелой цепи, как в (a), и вариабельный участок легкой цепи, как в (b). В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело способно связываться с TIGIT кролика.
В другом аспекте изобретение относится к антителу, которое специфически связывается с TIGIT человека, причем антитело содержит (а) вариабельный участок тяжелой цепи (VH), обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 95 % относительно аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 37; (b) вариабельный участок легкой цепи (VL), обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 95 % относительно аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 38; или (c) вариабельный участок тяжелой цепи, как в (a), и вариабельный участок легкой цепи, как в (b).
В еще одном аспекте изобретение относится к антителу, которое специфически связывается с TIGIT человека, причем антитело содержит (а) вариабельный участок тяжелой цепи (VH), обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 95 % относительно аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 39; (b) вариабельный участок легкой цепи (VL), обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 95 % относительно аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 40; или (c) вариабельный участок тяжелой цепи, как в (a), и вариабельный участок легкой цепи, как в (b).
В любом из аспектов, описанных выше, антитело может быть способно связываться как с TIGIT человека, так и с TIGIT яванского макака (яванца), но не с TIGIT мыши. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело связывается с TIGIT человека с Kd около 10 нМ или менее и с TIGIT яванца с Kd около 10 нМ или менее. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело связывается с TIGIT человека с Kd от около 0,1 нМ до около 1 нМ и с TIGIT яванца с Kd от около 0,5 нМ до около 1 нМ. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело связывается с TIGIT человека с Kd около 0,1 нМ или менее и с TIGIT яванца с Kd около 0,5 нМ или менее.
В любом из аспектов, описанных выше, антитело может быть антагонистическим антителом или агонистическим антителом.
В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонистическое антитело специфически связывается с TIGIT и ингибирует или блокирует взаимодействие TIGIT с рецептором полиовируса (ПВР (PVR)). В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонистическое антитело ингибирует внутриклеточное проведение сигнала, опосредуемое связыванием TIGIT с ПВР (PVR). В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонистическое антитело ингибирует или блокирует связывание TIGIT человека с ПВР (PVR) человека со значением IC50 10 нМ или менее. В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонистическое антитело ингибирует или блокирует связывание TIGIT человека с ПВР (PVR) человека со значением IC50 от 1 нМ до 10 нМ. В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонистическое антитело ингибирует или блокирует связывание TIGIT яванца с ПВР (PVR) яванца со значением IC50 50 нМ или менее. В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонистическое антитело ингибирует или блокирует связывание TIGIT яванца с ПВР (PVR) яванца со значением IC50 от 1 нМ до около 50 нМ. В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонистическое антитело ингибирует или блокирует связывание TIGIT яванца с ПВР (PVR) яванца со значением IC50 от 1 нМ до около 5 нМ.
В некоторых вариантах осуществления изобретения агонистическое антитело специфически связывается с TIGIT и стимулирует взаимодействие ПВР (PVR) с CD226 или CD96. В некоторых вариантах осуществления изобретения агонистическое антитело специфически связывается с TIGIT и стимулирует взаимодействие ПВР (PVR) с CD226 и CD96. В некоторых вариантах осуществления изобретения агонистическое антитело специфически связывается с TIGIT и стимулирует взаимодействие ПВР (PVR) человека с CD226 человека и CD96 человека. В некоторых вариантах осуществления изобретения агонистическое антитело специфически связывается с TIGIT и стимулирует взаимодействие ПВР (PVR) яванца с CD226 яванца и CD96 яванца.
В другом аспекте изобретение относится к выделенному антителу, которое конкурирует за связывание с TIGIT с антителом по любому из вышеуказанных аспектов.
В другом аспекте изобретение относится к выделенному антителу, которое связывается с тем же эпитопом, что и антитело по любому из вышеуказанных аспектов.
2
В некоторых вариантах осуществления любого из аспектов изобретения, описанных выше, антитело является моноклональным. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело является человеческим, гуманизированным или химерным. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело представляет собой полноразмерное антитело. В некоторых вариантах осуществления изобретения клиренс антитела после введения (например, инъекции, например, внутривенной инъекции) составляет менее чем около 10 мл/кг/день (например, от около 3 мл/кг/день до около 10 мл/кг/день), В некоторых вариантах осуществления изобретения клиренс антитела составляет около 3 мл/кг/день до около 8 мл/кг/день. В некоторых вариантах осуществления изобретения введение антитела проводят млекопитающему (например, обезьяне, такой как яванский макак, или человеку). В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело представляет собой фрагмент антитела, который связывается с TIGIT. В некоторых вариантах осуществления изобретения фрагмент антитела выбран из группы, состоящей из Fab, Fab', Fab'-SH, Fv, одноцепочечного вариабельного фрагмента (scFv) и фрагментов (Fab'). В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело представляет собой антитело класса IgG. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело класса IgG представляет собой антитело подкласса IgG1. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело, описанное в данном документе, может быть применено в качестве лекарственного средства. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело, описанное в данном документе, может быть применено для лечения или замедления прогрессирования рака у субъекта, нуждающегося в этом. В некоторых вариантах осуществления изобретения рак выбран из группы, включающей немелкоклеточного рака легкого, мелкоклеточного рака легкого, рака почки, колоректального рака, рака яичника, рака молочной железы, рака поджелудочной железы, карциномы желудка, рака мочевого пузыря, рака пищевода, мезотелиомы, меланомы, рак головы и шеи, рак щитовидной железы, саркому, рак предстательной железы, глиобластому, рак шейки матки, рак тимуса, лейкоз, лимфому, миелому, грибовидные микозы, рак клеток Меркель и злокачественные новообразование кроветворной системы. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело, описанное в данном документе, может быть применено для лечения или замедления прогрессирования множественной миеломы (ММ (MM)). В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело, описанное в данном документе, может быть применено для лечения или замедления прогрессирования связанного с иммунной системой заболевания у субъекта, нуждающегося в этом. В некоторых вариантах осуществления изобретения связанное с иммунной системой заболевание связано с дисфункциональным расстройством Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления изобретения дисфункциональное расстройство Т-клеток характеризуется истощением Т-клеток. В некоторых вариантах cвязанное с иммунной системой заболевание выбрано из группы, состоящей из неразрешенной острой инфекции, хронической инфекции и иммунитета опухолей. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело, описанное в данном документе, может быть применено для увеличения, усиления или стимуляции иммунного ответа или функции у субъекта, нуждающегося в этом.
E. coli
В другом аспекте изобретение относится к полинуклеотиду (например, выделенному полинуклеотиду), кодирующему любое из описанных в данном документе антител. В другом аспекте изобретение относится к вектору (например, вектор экспрессии), содержащему полинуклеотид для экспрессии антитела. В другом аспекте изобретение относится к клеткам-хозяевам, содержащим вышеуказанные полинуклеотиды и/или векторы. В некоторых вариантах осуществления изобретения клетка-хозяин является эукариотической (например, клетка млекопитающего). В некоторых вариантах осуществления изобретения эукариотическая клетка представляет собой клетку 293, клетку яичника китайского хомячка (ЯКХ (CHO)), дрожжевую клетку или растительную клетку. В некоторых вариантах осуществления изобретения клетка-хозяин представляет собой прокариотическую клетку. В некоторых вариантах осуществления изобретения прокариотическая клетка представляет собой .
E. coli
В другом аспекте изобретение относится к способу получения любого из описанных в данном документе антител, причем способ включает культивирование клетки-хозяина, которая содержит любой из вышеуказанных векторов (например, вектор экспрессии) в питательной среде. В некоторых вариантах осуществления изобретения способ дополнительно включает выделение антитела из клетки-хозяина или питательной среды. В некоторых вариантах осуществления изобретения клетка-хозяин представляет собой эукариотическую клетку, например клетку млекопитающего, например клетку 293, клетку яичника китайского хомячка (ЯКХ (CHO)), дрожжевую клетку или растительную клетку. В некоторых вариантах осуществления изобретения клетка-хозяин представляет собой прокариотическую клетку. В некоторых вариантах осуществления изобретения прокариотическая клетка представляет собой .
В другом аспекте изобретение относится к иммуноконъюгату, содержащему любое из описанных в данном документе антител и агент (например, терапевтический агент, например цитотоксический агент).
В другом аспекте изобретение относится к композиции, содержащей антитело, описанное в данном документе. В некоторых вариантах осуществления изобретения композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель, вспомогательное вещество или разбавитель. В некоторых вариантах осуществления изобретения композиция предназначена для диагностического применения (например, для определения уровней экспрессии TIGIT, например уровней экспрессии белка TIGIT). В некоторых вариантах осуществления изобретения композиция представляет собой фармацевтическую композицию. В некоторых вариантах осуществления изобретения композиция дополнительно содержит антагонист связывания оси PD-1 или дополнительный терапевтический агент.
В другом аспекте изобретение относится к применению антитела, описанного в данном документе, при производстве лекарственного средства для лечения или замедления прогрессирования рака у субъекта, нуждающегося в этом. В некоторых вариантах осуществления изобретения рак выбран из группы, состоящей из немелкоклеточного рака легкого, мелкоклеточного рака легкого, рака почки, колоректального рака, рака яичника, рака молочной железы, рака поджелудочной железы, карциномы желудка, рака мочевого пузыря, рака пищевода, мезотелиомы, меланомы, рака головы и шеи, рака щитовидной железы, саркомы, рака предстательной железы, глиобластомы, рака шейки матки, рака тимуса, лейкоза, лимфомы, миеломы, грибовидных микозов, рака клеток Меркель и злокачественных образований кроветворной системы. В некоторых вариантах осуществления изобретения миелома представляет собой ММ. В некоторых вариантах осуществления изобретения лекарственное средство составлено для подкожного, внутривенного, внутримышечного, местного применения, перорального, трансдермального, внутрибрюшинного, внутриорбитального, путем имплантации, ингаляционного, интратекального, интравентрикулярного или интраназального введения. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект является человеком.
В другом аспекте изобретение относится к применению антитела, описанного в данном документе, при производстве лекарственного средства для лечения или замедления прогрессирования связанного с иммунной системой заболевания у субъекта, нуждающегося в этом. В некоторых вариантах осуществления изобретения связанное с иммунной системой заболевание связано с дисфункциональным расстройством Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления изобретения дисфункциональное расстройство Т-клеток характеризуется истощением Т-клеток. В некоторых вариантах связанное с иммунной системой заболевание выбрано из группы, состоящей из неразрешенной острой инфекции, хронической инфекции и иммунитета опухолей. В некоторых вариантах осуществления изобретения лекарственное средство составлено для подкожного, внутривенного, внутримышечного, местного применения, перорального, трансдермального, внутрибрюшинного, внутриорбитального, путем имплантации, ингаляционного, интратекального, интравентрикулярного или интраназального введения. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект является человеком.
В другом аспекте изобретение относится к применению антитела, описанного в данном документе, в производстве лекарственного средства для увеличения, усиления или стимуляции иммунного ответа или функции у субъекта, нуждающегося в этом. В некоторых вариантах осуществления изобретения лекарственное средство составлено для подкожного, внутривенного, внутримышечного, местного применения, перорального, трансдермального, внутрибрюшинного, внутриорбитального, путем имплантации, ингаляционного, интратекального, интравентрикулярного или интраназального введения. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект является человеком.
В другом аспекте изобретение относится к способу лечения или замедления прогрессирования рака у субъекта, причем способ включает введение субъекту эффективного количества любого одного или большего количества (например, 1, 2, 3, 4, 5 или 6 или большее количество) антител, описанных в данном документе, с лечением или замедлением таким образом прогрессирования рака у субъекта. В некоторых вариантах осуществления изобретения рак выбран из группы, состоящей из немелкоклеточного рака легкого, мелкоклеточного рака легкого, рака почки, колоректального рака, рака яичника, рака молочной железы, рака поджелудочной железы, карциномы желудка, рака мочевого пузыря, рака пищевода, мезотелиомы, меланомы, рака головы и шеи, рака щитовидной железы, саркомы, рака предстательной железы, глиобластомы, рака шейки матки, рака тимуса, лейкоза, лимфомы, миеломы, грибовидных микозов, рака клеток Меркель и злокачественных образований кроветворной системы. В некоторых вариантах осуществления изобретения миелома представляет собой ММ.
В другом аспекте изобретение относится к способу лечения или замедления прогрессирования связанного с иммунной системой заболевания у субъекта, причем способ включает введение субъекту эффективного количества одного или большего количества (например, 1, 2, 3, 4, 5, или 6 или большее количество) антител, описанных в данном документе, с лечением или замедлением таким образом прогрессирования связанного с иммунной системой заболевания у субъекта. В некоторых вариантах осуществления изобретения связанное с иммунной системой заболевание связано с дисфункциональным расстройством Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления изобретения дисфункциональное расстройство Т-клеток характеризуется истощением Т-клеток. В некоторых вариантах связанное с иммунной системой заболевание выбрано из группы, состоящей из неразрешенной острой инфекции, хронической инфекции и иммунитета опухолей.
В другом аспекте изобретение включает способ увеличения, усиления или стимуляции иммунного ответа или функции у субъекта, включающий введение субъекту эффективного количества одного или большего количества (например, 1, 2, 3, 4, 5, или 6 или большее количество) антител, описанных в данном документе, таким образом увеличивая, усиливая или стимулируя иммунный ответ или функцию у субъекта. В некоторых вариантах осуществления изобретения способ дополнительно включает введение субъекту антагониста связывания оси PD-1. В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист связывания оси PD-1, вводят до или после введения антитела. В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист связывания оси с PD-1 вводят одновременно с антителом. В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист связывания PD-1 выбран из группы, состоящей из антагониста связывания PD-1, антагониста связывания PD-L1 и антагониста связывания PD-L2. В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист связывания оси PD-1 является антагонистом связывания PD-1. В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист связывания PD-1 ингибирует связывание PD-1 с его партнерами-лигандами по связыванию. В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист связывания PD-1 ингибирует связывание PD-1 с PD-L1. В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист связывания PD-1 ингибирует связывание PD-1 с PD-L2. В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист связывания PD-1 представляет собой антитело против PD-1. В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист связывания PD-1 выбран из группы, состоящей из MDX 1106 (ниволумаб), MK-3475 (пембролизумаб), CT-011 (пидилизумаб), MEDI-0680 (AMP-514), PDR001, REGN2810 и BGB-108. В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист связывания PD-1 является антагонистом PD-L1. В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист связывания PD-L1 ингибирует связывание PD-L1 с PD-1. В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист связывания PD-L1 ингибирует связывание PD-L1 с B7-1. В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист связывания PD-L1 ингибирует связывание PD-L1 как с PD-1, так и с B7-1. В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист связывания PD-L1 представляет собой анти-PD-L1 антитело. В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-PD-L1 антитело выбрано из группы, состоящей из: MPDL3280A (атезолизумаб), YW243.55.S70, MDX-1105, MEDI4736 (дурвалумаб) и MSB0010718C (авелумаб). В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело представляет собой MPDL3280A. В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист связывания оси PD-1 является антагонистом связывания PD-L2. В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист связывания PD-L2 представляет собой анти-PD-L2 антитело. В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист связывания PD-L2 является иммуноадгезином.
В некоторых вариантах осуществления изобретения любой из описанных выше способов лечения может дополнительно включать введение субъекту агониста связывания OX40. В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист связывания OX40, вводят до или после введения антитела и/или антагониста связывания оси PD-1. В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист связывания OX40, вводят одновременно с антителом и/или антагонистом связывания оси PD-1. В некоторых вариантах осуществления изобретения агонист связывания OX40 выбран из группы, состоящей из агониста OX40, фрагмента агониста OX40L, олигомерного рецептора OX40 и иммуноадгезина OX40. В некоторых вариантах осуществления изобретения агонистическое антитело OX40 истощает клетки, которые экспрессируют OX40 человека. В некоторых вариантах осуществления изобретения клетки, которые экспрессируют OX40 человека, представляют собой CD4+ эффекторные Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления изобретения клетки, которые экспрессируют OX40 человека, являются регуляторными T-клетками (Treg). В некоторых вариантах осуществления изобретения истощение происходит посредством антителозависимой клеточной цитотоксичности, AЗКЦ (ADCC) и/или фагоцитоза. В некоторых вариантах осуществления изобретения агонистическое антитело OX40 связывается с OX40 человека с аффинностью менее чем или равной около 1 нМ. В некоторых вариантах осуществления изобретения агонистическое антитело OX40 связывается с OX40 человека с аффинностью менее чем или равной около 0,45 нМ. В некоторых вариантах осуществления изобретения агонистическое антитело OX40 связывается с OX40 человека с аффинностью менее или равной около 0,4 нМ. В некоторых вариантах осуществления изобретения агонистическое антитело OX40 связывается с OX40 человека с EC50 менее чем или равно 0,3 мкг/мл. В некоторых вариантах осуществления изобретения агонистическое антитело OX40 связывается с OX40 человека с EC50 менее чем или равно 0,2 мкг/мл. В некоторых вариантах осуществления изобретения агонистическое антитело OX40 увеличивает пролиферацию CD4+ Т-клеток и/или увеличивает выработку цитокинов с помощью эффекторной CD4+ Т-клетки по сравнению с пролиферацией и/или выработкой цитокинов до обработки агонистом OX40. В некоторых вариантах осуществления изобретения агонистическое антитело OX40 увеличивает пролиферацию Т-клеток памяти и/или выработку цитокинов с помощью Т-клетки памяти. В некоторых вариантах осуществления изобретения выработка цитокинов представляет собой выработку IFN-γ (интерферона γ). В некоторых вариантах осуществления изобретения агонистическое антитело OX40 подавляет функцию Treg. В некоторых вариантах осуществления изобретения агонистическое антитело OX40 ингибирует подавление Treg эффекторной функции Т-клеток (например, пролиферации эффекторных Т-клеток и/или выработки цитокинов). В некоторых вариантах осуществления изобретения эффекторная Т-клетка представляет собой эффекторную CD4+ Т-клетку. В некоторых вариантах осуществления изобретения агонистическое антитело OX40 усиливает передачу сигнала OX40 в клетке-мишени, которая экспрессирует OX40. В некоторых вариантах осуществления изобретения передачу сигнала OX40 обнаруживают путем мониторинга передачи сигналов NFkB ниже в сигнальном пути. В некоторых вариантах осуществления изобретения агонистическое антитело OX40 содержит вариант полипептида IgG1 Fc, содержащий мутацию, которая устраняет связывание с эффекторными клетками человека и обладает сниженной активностью по отношению к агонисту OX40, содержащему часть нативной последовательности IgG1 Fc. В некоторых вариантах осуществления изобретения агонистическое антитело OX40 содержит вариант полипептида IgG1 Fc, содержащий мутацию DANA. В некоторых вариантах осуществления изобретения агонистическое антитело OX40 содержит (a) домен VH, содержащий (i) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 278, 279 или 280, (ii) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 281, 282, 283, 284, 285 или 286 и (iii) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 287, 288 или 289; и (b) домен VL, содержащий (i) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 290, (ii) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 291 и (iii) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298 или 299. В некоторых вариантах осуществления изобретения агонистическое антитело OX40 содержит (a) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 278; (b) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 281; (c) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 287; (d) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 290; (e) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 291; и (f) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 292. В некоторых вариантах осуществления изобретения агонистическое антитело OX40 содержит (a) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 278; (b) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 281; (c) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 287; (d) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 290; (e) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 291; и (f) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 297. В некоторых вариантах осуществления изобретения агонистическое антитело OX40 содержит (a) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 278; (b) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 281; (c) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 287; (d) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 290; (e) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 291; и (f) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 298. В некоторых вариантах осуществления изобретения агонистическое антитело OX40 содержит последовательность VH, обладающую по меньшей мере 90 % идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью любой из SEQ ID NO: 300-325. В некоторых вариантах осуществления изобретения агонистическое антитело OX40 содержит последовательность VH, обладающую по меньшей мере 90 % идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 300. В некоторых вариантах осуществления изобретения была произведена замена, инсерция и/или делеция в общей сложности от 1 до 10 аминокислот в SEQ ID NO: 300. В некоторых вариантах осуществления изобретения агонистическое антитело OX40 содержит VH, содержащий один, два или три ГВУ (HVR), выбранных из: (a) HVR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 278, (b) HVR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 281 и (c) HVR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 287. В некоторых вариантах осуществления изобретения агонистическое антитело OX40 содержит последовательность VL, обладающую по меньшей мере 90 % идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью любого из SEQ ID NO: 326-351. В некоторых вариантах осуществления изобретения агонистическое антитело OX40 содержит VL, обладающее по меньшей мере 90 % идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 326. В некоторых вариантах осуществления изобретения была произведена замена, вставка и/или делеция в общей сложности от 1 до 10 аминокислот в SEQ ID NO: 326. В некоторых вариантах осуществления изобретения агонистическое антитело OX40 содержит VL, содержащий один, два или три ГВУ (HVR), выбранных из (a) HVR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 290; (b) HVR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 291; и (c) HVR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 292. В некоторых вариантах осуществления изобретения агонистическое антитело OX40 содержит (а) последовательность VH SEQ ID NO: 300; (b) последовательность VL SEQ ID NO: 326; или (c) последовательность VH, как в (a), и последовательность VL, как в (b). В некоторых вариантах осуществления изобретения агонистическое антитело OX40 содержит (а) последовательность VH SEQ ID NO: 319; (b) последовательность VL SEQ ID NO: 345; или (c) последовательность VH, как в (a), и последовательность VL, как в (b). В некоторых вариантах осуществления изобретения агонистическое антитело OX40 содержит (а) последовательность VH SEQ ID NO: 320; (b) последовательность VL SEQ ID NO: 346; или (c) последовательность VH, как в (a), и последовательность VL, как в (b). В некоторых вариантах осуществления изобретения агонистическое антитело OX40 представляет собой антитело L106, антитело ACT35, MEDI6469 или MEDI0562. В некоторых вариантах осуществления изобретения агонистическое антитело OX40 представляет собой полноразмерное антитело IgG1. В некоторых вариантах осуществления изобретения иммуноадгезин OX40 представляет собой тримерный белок OX40-Fc.
В некоторых вариантах осуществления изобретения любой из описанных выше способов лечения может дополнительно включать введение субъекту агента, который уменьшает количество или ингибирует один или большее количество дополнительных иммунных коингибирующих рецепторов. В некоторых вариантах осуществления изобретения один или большее количество дополнительных иммунных коингибирующих рецепторов выбран из группы, состоящей из PD-1, CTLA-4, LAG3, TIM3, BTLA, VISTA, B7H4 и CD96. В некоторых вариантах осуществления изобретения любой из описанных выше способов лечения может дополнительно включать введение субъекту дополнительного терапевтического агента. В некоторых вариантах осуществления изобретения дополнительный терапевтический агент представляет собой химиотерапевтическое средство. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело вводят подкожно, внутривенно, внутримышечно, местно, перорально, трансдермально, внутрибрюшинно, внутриорбитально, путем имплантации, путем ингаляции, внутрипротекторно, интравентрикулярно или интраназально. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект является человеком.
В другом аспекте изобретение относится к набору, содержащему один или большее количество (например, 1, 2, 3, 4, 5 или 6 или большее количество) антител, описанных в данном документе, и листок-вкладыш в упаковку, содержащую инструкцию по применению антитела для лечения или замедления прогрессирования рака у субъекта. В некоторых вариантах осуществления изобретения рак выбран из группы, состоящей из немелкоклеточного рака легкого, мелкоклеточного рака легкого, рака почки, колоректального рака, рака яичника, рака молочной железы, рака поджелудочной железы, карциномы желудка, рака мочевого пузыря, рака пищевода, мезотелиомы, меланомы, рака головы и шеи, рака щитовидной железы, саркомы, рака предстательной железы, глиобластомы, рака шейки матки, рака тимуса, лейкоза, лимфомы, миеломы, грибовидных микозов, рака клеток Меркель и злокачественных образований кроветворной системы. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект является человеком. В некоторых вариантах осуществления изобретения миелома представляет собой ММ.
В другом аспекте изобретение относится к набору, содержащему один или большее количество (например, 1, 2, 3, 4, 5 или 6 или большее количество) антител, описанных в данном документе, и листок-вкладыш в упаковку, содержащий инструкцию по применению антитела для лечения или замедления прогрессирования связанного с иммунной системой заболевания у субъекта. В некоторых вариантах осуществления изобретения связанное с иммунной системой заболевание связано с дисфункциональным расстройством Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления изобретения дисфункциональное расстройство Т-клеток характеризуется истощением Т-клеток. В некоторых вариантах связанное с иммунной системой заболевание выбрано из группы, состоящей из неразрешенной острой инфекции, хронической инфекции и иммунитета опухолей. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект является человеком.
В другом аспекте изобретение относится к набору, содержащему один или большее количество (например, 1, 2, 3, 4, 5 или 6 или большее количество) антител, описанных в данном документе, и листок-вкладыш в упаковку, содержащий инструкцию по увеличению, усилению или стимуляции иммунного ответа или функции у субъекта. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект является человеком.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
Фиг. 1А представляет собой схематическую диаграмму анализа связывания ЯКХ (CHO)-TIGIT.
Фиг. 1В представляет собой график, иллюстрирующий результаты анализа связывания ЯКХ (CHO)-TIGIT, приведенного на Фиг. 1А, с применением экспрессирующих TIGIT человека клеток ЯКХ (CHO) и указанных анти-TIGIT антител, полученных из OMT, в различных концентрациях, по данным сортировки клеток с активированной флуоресценцией, СКАФ (FACS).
Фиг. 1С представляет собой график, иллюстрирующий результаты анализа связывания ЯКХ (CHO)-TIGIT, приведенного на Фиг. 1A, с применением экспрессирующих TIGIT яванского макака (яванца) клеток ЯКХ (CHO) и указанных OMT-анти-TIGIT антител в различных концентрациях, по данным СКАФ (FACS).
Фиг. 1D представляет собой график, иллюстрирующий результаты анализа связывания ЯКХ (CHO)-TIGIT, приведенного на Фиг. 1A, с применением экспрессирующих TIGIT человека клеток ЯКХ (CHO) и указанных SD-анти-TIGIT антител в различных концентрациях, по данным СКАФ (FACS).
Фиг. 1Е представляет собой график, иллюстрирующий результаты анализа связывания ЯКХ (CHO)-TIGIT, приведенного на Фиг. 1A, с применением экспрессирующих TIGIT яванца клеток ЯКХ (CHO) и указанных SD-анти-TIGIT антител в различных концентрациях, по данным СКАФ (FACS).
Фиг. 2A представляет собой график, иллюстрирующий зависимость связывания указанных анти-TIGIT антител, полученных из OMT, с CD4 T-клетками человека от концентрации антител.
Фиг. 2B представляет собой график, иллюстрирующий зависимость связывания указанных анти-TIGIT антител, полученных из OMT, с CD8 T-клетками человека от концентрации антител.
Фиг. 2С представляет собой график, иллюстрирующий зависимость связывания указанных SD-анти-TIGIT антител с CD4 T-клетками человека от концентрации антител.
Фиг. 2D представляет собой график, иллюстрирующий зависимость связывания указанных SD-анти-TIGIT антител с CD8 T-клетками человека от концентрации антител.
Фиг. 3А представляет собой график, иллюстрирующий зависимость результатов блокирующего твердофазного иммуноферментного анализа, ТИФА (ТИФА (ELISA)) с применением планшетов, покрытых химерным белком PVR-Fc человека, TIGIT человека и указанными анти-TIGIT антителами (10A7 и 4.1D3.Q1E в формате Fab или IgG) или контрольным анти-CSF1 Fab от концентрации антитела/Fab.
Фиг. 3В представляет собой график, иллюстрирующий зависимость результатов блокирующего анализа ТИФА (ELISA) с применением планшетов, покрытых химерным белком ПВР (PVR) яванца-Fc, TIGIT яванца и указанными анти-TIGIT антителами (10A7 и 4.1D3.Q1E в формате Fab или IgG) или контрольным анти-CSF1 Fab от концентрации антитела/Fab.
Фиг. 3С представляет собой график, иллюстрирующий зависимость результатов блокирующего анализа ТИФА (ELISA) с применением планшетов, покрытых химерным белком ПВР (PVR) мыши-Fc, TIGIT мыши и указанными анти-TIGIT антителами (10A7 и 4.1D3.Q1E в формате Fab или IgG) или контрольным анти-CSF1 Fab от концентрации антитела/Fab.
Фиг. 3D представляет собой таблицу, иллюстрирующую результаты блокирующих анализов ТИФА (ELISA), описанных на Фиг. 3А-3С.
Фиг. 4А представляет собой схематическую диаграмму блокирующего анализа ЯКХ (CHO)-TIGIT ПВР (PVR).
Фиг. 4B представляет собой график, иллюстрирующий результаты блокирующего анализа ЯКХ (CHO)-TIGIT ПВР (PVR), приведенного на Фиг. 4A, с применением экспрессирующих TIGIT человека клеток ЯКХ (CHO) и указанных анти-TIGIT антител, полученных из OMT, в различных концентрациях, по данным СКАФ (FACS).
Фиг. 4C представляет собой график, иллюстрирующий результаты блокирующего анализа ЯКХ (CHO)-TIGIT ПВР (PVR), приведенного на Фиг. 4А, с применением экспрессирующих TIGIT яванца клеток ЯКХ (CHO) и указанных анти-TIGIT антител, полученных из OMT, в различных концентрациях, по данным СКАФ (FACS).
Фиг. 4D представляет собой график, иллюстрирующий результаты блокирующего анализа ЯКХ (CHO)-TIGIT ПВР (PVR), приведенного на Фиг. 4А, с применением экспрессирующих TIGIT человека клеток ЯКХ (CHO) и указанных SD-анти-TIGIT антител в различных концентрациях, по данным СКАФ (FACS).
Фиг. 4Е представляет собой график, иллюстрирующий результаты блокирующего анализа ЯКХ (CHO)-TIGIT ПВР (PVR), приведенного на Фиг. 4А, с применением экспрессирующих TIGIT яванца клеток ЯКХ (CHO) и указанных SD-анти-TIGIT антител в различных концентрациях, по данным СКАФ (FACS).
Фиг. 5А представляет собой график, иллюстрирующий фармакокинетический клиренс указанных анти-TIGIT антител в организме яванца после внутривенного введения 10 мг/кг как зависимость концентрации в сыворотке (мкг/мл) от времени (дни).
Фиг. 5В представляет собой таблицу, иллюстрирующую расчетные значения клиренса для каждого антитела, протестированного в экспериментах с фармакокинетическим клиренсом на Фиг. 5А.
Фиг. 5С представляет собой график, иллюстрирующий фармакокинетический клиренс анти-TIGIT антител h10A7.K4G3 и 4.1D3 в организме яванца после внутривенного введения 10 мг/кг как зависимость концентрации в сыворотке (мкг/мл) от времени (дни, д0-д7).
Фиг. 5D представляет собой таблицу, иллюстрирующую расчетные значения клиренса для анти-TIGIT антител h10A7.K4G3 и 4.1D3, которые были протестированы в экспериментах с фармакокинетическим клиренсом на Фиг. 5C.
Фиг. 6А представляет собой интерпретацию кристаллической структуры 4.1D3 Fab, связанного с TIGIT человека, с обозначенными участками тяжелой цепи (HC) и легкой цепи (LC) 4.1D3 (LC), которые отличаются цветом.
Фиг. 6B представляет собой интерпретацию кристаллической структуры 4.1D3 Fab, связанного с TIGIT человека, наложенную на известную структуру PVR-TIGIT (PDB 3UDW), которая демонстрирует, что антитело 4.1D3 и ПВР (PVR) имеют перекрывающиеся сайты связывания с TIGIT.
Фиг. 6С представляет собой интерпретацию кристаллической структуры 4.1D3 Fab, связанного с TIGIT человека, с указанием относительного местоположения сайта связывания с ПВР (PVR). Также указано относительное местоположение петли 72-79 TIGIT.
Фиг. 6D и 6E представляют собой интерпретацию кристаллической структуры 4.1D3 Fab, связанного с TIGIT человека, с разных точек зрения, с идентификацией некоторых ключевых для контакта остатков 4.1D3 (остатки паратопа) и TIGIT (остатки эпитопа). Остатки в прямоугольнике, приведенном на Фиг. 6Е, были идентифицированы как важные с функциональной точки зрения остатки эпитопа, с помощью аланинсканирующего мутагенеза.
D
Фиг. 7A представляет собой график, иллюстрирующий значения K (нМ) для каждого из идентифицированных анти-TIGIT антител для указанного мутанта TIGIT человека, полученного аланиновым сканированием.
D
Фиг. 7В представляет собой график, иллюстрирующий значения K (нМ) для каждого из идентифицированных анти-TIGIT антител для указанного мутанта TIGIT человека, полученного аланиновым сканированием, нормализованное против мишени TIGIT человека дикого типа. Полученные аланиновым сканированием мутанты TIGIT, которые приводили к 1-10-кратному или более чем 10-кратному снижению аффинности связывания, обозначены светло-серой и темно-серой штриховкой, соответственно.
Фиг. 7C представляет собой интерпретацию в форме ленты структуры TIGIT человека, с остатками, которые были идентифицированы с помощью аланинсканирующего мутагенеза как важные для распознавания 10A7, обозначенными и представленными как сферы.
Фиг. 7D представляет собой интерпретацию в форме ленты структуры TIGIT человека, с остатками, которые были идентифицированы с помощью аланинсканирующего мутагенеза как важные для распознавания h1A5, обозначенными и представленными как сферы.
Фиг. 7Е представляет собой интерпретацию в форме ленты структуры TIGIT человека, с остатками, которые были идентифицированы с помощью аланинсканирующего мутагенеза как важные для распознавания 4.1D3, обозначенными и представленными как сферы.
Фиг. 7F представляет собой интерпретацию в форме ленты структуры TIGIT человека, с остатками, которые были идентифицированы с помощью аланинсканирующего мутагенеза как важные для распознавания 7.4A3, обозначенными и представленными как сферы.
Фиг. 7G представляет собой интерпретацию в форме ленты структуры TIGIT человека с остатками, которые были идентифицированы с помощью аланинсканирующего мутагенеза как важные для распознавания 4.1A3, обозначенными и представленными как сферы.
Фиг. 7H представляет собой интерпретацию в форме ленты структуры TIGIT человека, с остатками, которые были идентифицированы с помощью аланинсканирующего мутагенеза как важные для распознавания h6B2, обозначенными и представленными как сферы.
Фиг. 7I представляет собой интерпретацию в форме ленты структуры TIGIT человека, с остатками, которые были идентифицированы с помощью аланинсканирующего мутагенеза как важные для распознавания h7E7, обозначенными и представленными как сферы.
Фиг. 8 представляет собой интерпретацию кристаллической структуры 1A5 Fab, связанного с TIGIT человека, с указанными участками тяжелой цепи 1A5 (HC) и легкой цепи (LC), которые отличаются цветом.
Фиг. 9 представляет собой интерпретацию кристаллических структур комплексов 4.1D3-TIGIT, 1A5-TIGIT и 10A7-TIGIT, наложенных друг на друга по отношению к TIGIT, которая демонстрирует, что три анти-TIGIT антитела связываются с TIGIT человека в неидентичных эпитопах.
Фиг. 10А представляет собой интерпретацию кристаллической структуры 10А7 Fab, связанного с TIGIT человека, с указанными участками тяжелой цепи (HC) и легкой цепи (LC) 10А7, которые отличаются цветом.
Фиг. 10В представляет собой интерпретацию кристаллической структуры 10A7 Fab, связанного с TIGIT человека, с указанием относительного местоположения сайта связывания ПВР (PVR). Также указано относительное местоположение петли 72-79 TIGIT.
Фиг. 11 представляет собой серию интерпретаций антител 4.1D3 (верхнее слева), 10A7 (среднее по центру) и 1A5 (нижнее справа) и относительное местоположение остатков Ser78, Ser80 и Lys82 TIGIT человека. Структуры демонстрируют, что остатки Ser78, Ser80 и Lys82 TIGIT человека являются ключевыми остатками эпитопа для 4.1D3, но не для 10A7 или 1A5, в которых указанные три остатка расположены на некотором расстоянии от кармана связывания с антителом.
Фиг. 12 представляет собой серию графиков, иллюстрирующих экспрессию на Т-клетках CD45, PD-1, TIGIT и CD226 на CD4+ и CD8+, выделенных из костного мозга пациентов с множественной миеломой (ММ) (верхний ряд), и экспрессию PD-1, TIGIT и CD226 на CD4+ и CD8+ Т-клетках, выделенных из периферической крови здоровых пациентов (нижний ряд), по данным многоцветной проточной цитометрии.
Фиг. 13 представляет собой серию графиков проточной цитометрии (слева) и сопутствующих графиков (справа), демонстрирующих, что TIGIT и PD-1 совместно экспрессируются на CD4+ и CD8+ Т-клетках в костном мозге пациентов с ММ.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
I. Общие методы
Molecular Cloning: A Laboratory Manual
Current Protocols in Molecular Biology
Methods in Enzymology
PCR 2: A Practical Approach
Antibodies, A Laboratory Manual
Animal Cell Culture
Oligonucleotide Synthesis
Methods in Molecular Biology
Cell Biology: A Laboratory Notebook
Animal Cell Culture
Introduction to Cell and Tissue Culture
Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures
Handbook of Experimental Immunology
Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells
PCR: The Polymerase Chain Reaction
Current Protocols in Immunology
Short Protocols in Molecular Biology
Immunobiology
Antibodies
Antibodies: A Practical Approach
Monoclonal Antibodies: A Practical Approach
Using Antibodies: A Laboratory Manual
The Antibodies
Cancer: Principles and Practice of Oncology
Методики и процедуры, описанные или упоминаемые в данном документе, как правило, хорошо известны и обычно применяются при использовании специалистами в данной области техники общепринятой методологии, такие как, например, широко используемые методологии, описанные в Sambrook et al.,  3d edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.;  (F.M. Ausubel, et al. eds., (2003)); серия  (Academic Press, Inc.):  (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) , и  (R.I. Freshney, ed. (1987));  (M.J. Gait, ed., 1984); , Humana Press;  (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press;  (R.I. Freshney), ed., 1987);  (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press;  (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons;  (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.);  (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); , (Mullis et al., eds., 1994);  (J.E. Coligan et al., eds., 1991);  (Wiley and Sons, 1999);  (C.A. Janeway and P. Travers, 1997);  (P. Finch, 1997);  (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989);  (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000);  (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999);  (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); и  (V.T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993).
II. Определения
Термин «TIGIT» или «Т-клеточный иммунорецептор с доменами Ig и ITIM», используемый в данном документе, относится к любому нативному TIGIT из любого источника позвоночных, включая млекопитающих, таких как приматы (например, люди) и грызуны (например, мыши и крысы), если в тексте прямо не указано обратное. Дополнительно, TIGIT известен в данной области техники как DKFZp667A205, FLJ39873, V-набор и содержащий домен иммуноглобулина белок 9, V-набор и содержащий трансмембранный домен белок 3, VSIG9, VSTM3 и WUCAM. Термин охватывает «полноразмерный» непроцессированный TIGIT (например, полноразмерный TIGIT человека, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 352), а также любую форму TIGIT, которая является результатом процессинга в клетке (например, процессированный TIGIT человека без сигнальной последовательности, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 353). Кроме того, термин включает природные варианты TIGIT, например сплайсинговые варианты или аллельные варианты. Аминокислотная последовательность типичного TIGIT человека может быть найдена под учетным номером UniProt Q495A1.
-8
-8
-13
-9
-13
Термины «анти-TIGIT антитело» и «антитело, которое специфически связывается с TIGIT» относятся к антителу, которое способно связываться с TIGIT с достаточной аффинностью, таким образом, что антитело пригодно в качестве диагностического и/или терапевтического агента при нацеливании на TIGIT. В одном варианте осуществления изобретения степень связывания анти-TIGIT антитела с неродственным TIGIT белком составляет менее около 10 % от связывания антитела с TIGIT, по данным, например, радиоиммуноанализа (РИА (RIA)). В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело, которое связывается с TIGIT, имеет константу диссоциации (Kd) ≤ 1 мкМ, ≤ 100 нМ, ≤ 10 нМ ≤ 1 нМ, ≤ 0,1 нМ, ≤ 0,01 нМ или ≤ 0,001 нМ (например, 10 М или менее, например, от 10 до 10 М, например от 10 до 10 М). В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-TIGIT антитело связывается с эпитопом TIGIT, который является консервативным среди TIGIT разных видов или эпитопом на TIGIT, что позволяет проявлять перекрестно-видовую реактивность, таким как эпитоп, содержащий аминокислотные остатки Ser78, Ser80 и Lys82.
2
Термин «антитело» включает моноклональные антитела (включая полноразмерные антитела, которые содержат участок Fc иммуноглобулина), композиции антител с полиэпитопической специфичностью, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела, диатела и одноцепочечные молекулы, а также фрагменты антител (например, Fab, F(ab') и Fv). В данном документе термин «иммуноглобулин» (Ig) используется взаимозаменяемо с «антителом».
J. Chromatogr. B
in situ
Термин «выделенное антитело» при использовании для описания различных антител, описанных в данном документе, означает антитело, которое было идентифицировано и выделено и/или извлечено из клетки или клеточной культуры, в которой оно было экспрессировано. Загрязняющими компонентами его природной среды являются материалы, которые обычно препятствуют диагностическому или терапевтическому применению полипептида и могут включать ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые растворенные вещества. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело очищают до чистоты более чем 95 % или 99 %, по данным, например, электрофореза (например, электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия, ДНС-ПААГ (SDS-PAGE), изоэлектрического фокусирования (ИЭФ (IEF)), капиллярный электрофорез) или хроматографии (например, ионно-обменная или обращенно-фазовая ВЭЖХ). Обзора методов оценки чистоты антител см., например, в Flatman et al.,  848:79-87 (2007). В предпочтительных вариантах осуществления изобретения антитело будет очищено (1) до степени, достаточной для получения по меньшей мере 15 остатков N-концевой или внутренней аминокислотной последовательности с применением секвенатора с вращающимся стаканом или (2) до гомогенности с помощью ДНС-ПААГ (SDS-PAGE) в невосстанавливающих или восстановительных условия, с применением красителя Кумасси синего или, предпочтительно, серебрянки. Выделенное антитело включает антитела  в рекомбинантных клетках, поскольку по меньшей мере один компонент полипептидной природной среды будет отсутствовать. Однако обычно выделенный полипептид получают путем по меньшей мере одной стадии очистки.
H
H
H
L
L
H
L
H
H
L
Basic and Clinical Immunology
Основным 4-цепочечным модулем антитела является гетеротетрамерный гликопротеин, состоящий из двух идентичных легких (L) цепей и двух идентичных тяжелых (H) цепей. Антитело IgM состоит из 5 основных гетеротетрамерных единиц вместе с дополнительным полипептидом, называемым цепью J, и содержит 10 сайтов связывания с антигеном, тогда как антитела IgA состоят из 2-5 основных 4-цепочечных модулей, которые могут полимеризоваться с образованием многовалентных комплексов в сочетании с цепью J. В случае IgG 4-цепочечный модуль обычно составляет около 150 000 Да. Каждая цепь L связана с цепью H одной ковалентной дисульфидной связью, тогда как две цепи H связаны друг с другом одной или несколькими дисульфидными связями, в зависимости от изотипа цепи H. Каждая цепь H и L дополнительно содержит внутрицепочечные дисульфидные мостики с регулярными промежутками. Каждая Н-цепь содержит на N-конце вариабельный участок (V), за которым следуют три постоянных участка (C) для каждой из α- и γ-цепей и четыре домена C для изотипов μ и ε. Каждая цепь L содержит на N-конце, вариабельный домен (V), за которым следует постоянный домен на другом конце. V выровнен с V, а C выровнен с первым постоянным доменом тяжелой цепи (C1). Считается, что отдельные аминокислотные остатки образуют границу между вариабельными доменами легкой цепи и тяжелой цепи. Спаривание V и V образует один антигенсвязывающий сайт. Описание структуры и свойств различных классов антител см., например, , 8th Edition, Daniel P. Sties, Abba I. Terr and Tristram G. Parsolw (eds), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, 1994, стр. 71 и Глава 6. Цепь L любых видов позвоночных может быть отнесена к одному из двух четко различимых типов, называемых каппа и лямбда, на основе аминокислотных последовательностей их постоянных доменов. В зависимости от аминокислотной последовательности постоянного домена их тяжелых цепей (CH) иммуноглобулины могут быть отнесены к различным классам или изотипам. Существует пять классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, содержащих тяжелые цепи, обозначенные как α, δ, ε, γ и μ, соответственно. Классы γ и α далее подразделяются на подклассы на основе относительно небольших различий в последовательности и функции CH, например, у человека экспрессируются следующие подклассы: IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2.
«Вариабельный участок» или «вариабельный домен» антитела относится к аминоконцевым доменам тяжелой или легкой цепи антитела. Вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи могут называться «VH» и «VL», соответственно. Эти домены обычно являются наиболее вариабельными частями антитела (относительно других антител того же класса) и содержат антигенсвязывающие сайты.
et al., Sequences of Immunological Interest
Термин «вариабельный» относится к тому факту, что последовательность некоторых сегментов вариабельных доменов значительно различается среди антител. V-домен опосредует связывание с антигеном и определяет специфичность конкретного антитела в отношении его конкретного антигена. Однако изменчивость распределяется неравномерно по всему диапазону вариабельных доменов. Вместо этого она сосредоточена в трех сегментах, называемых гипервариабельными участками (ГВУ (HVR)), как в вариабельных доменах легкой цепи, так и в вариабельных доменах тяжелой цепи. В большей степени высококонсервативные части вариабельных доменов называются каркасными участками (КУ). Вариабельные домены нативных тяжелых и легких цепей содержат четыре КУ участка , в основном принимающих конфигурацию бета-листа, соединенного тремя ГВУ (HVR), которые образуют петли, соединяющие и в некоторых случаях составляющие часть структуры бета-листа. ГВУ (HVR) в каждой цепи удерживаются вместе в непосредственной близости КУ участками , причем ГВУ (HVR) из другой цепи способствуют образованию антигенсвязывающего сайта антител (см. Kabat , Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)). Константные домены не принимают непосредственного участия в связывании антитела с антигеном, но проявляют различные эффекторные функции, такие как участие антитела в антителозависимой клеточной токсичности.
«Блокирующим антителом» или «антагонистическим антителом» является такое, которое подавляет или снижает биологическую активность антигена, с которым оно связывается. В некоторых вариантах осуществления изобретения блокирующие антитела или антагонистические антитела в существенной мере или полностью подавляют биологическую активность антигена. Анти-TIGIT антитела по изобретению могут блокировать передачу сигналов через ПВР (PVR), PVRL2 и/или PVRL3, чтобы восстановить функциональный ответ Т-клеток (например, пролиферацию, выработку цитокинов, уничтожение клеток-мишеней) из дисфункционального состояния до стимуляции антигеном.
«Агонистическое антитело» или «активирующее антитело» представляет собой антитело, которое усиливает или инициирует передачу сигнала антигеном, с которым оно связывается. В некоторых вариантах осуществления изобретения агонистические антитела вызывают или активируют проведение сигнала в отсутствие природного лиганда. Агонистические антитела OX40 по изобретению могут усиливать пролиферацию Т-клеток памяти, повышать выработку цитокинов с помощью Т-клеток памяти, подавлять функцию клеток Treg и/или ингибировать подавление клетками Treg эффекторной функции Т-клеток, например, пролиферации эффекторных Т-клеток и/или выработки цитокинов.
«Эпитоп» представляет собой часть антигена, с которой специфически связывается антитело. В случае полипептидного антигена эпитоп обычно представляет собой пептидную часть размером около 4-15 аминокислотных остатков, которые могут быть смежными или несмежными.
«Антитело, которое связывается с тем же эпитопом» в качестве референтного антитела относится к антителу, которое блокирует связывание референтного антитела с его антигеном в конкурентном анализе на 50 % или более, и наоборот, контрольное антитело блокирует связывание антитела с его антигеном в конкурентном анализе на 50 % и более. Типичный конкурентный анализ представлен в данном документе.
Под «паратопом» подразумевается часть антитела, которое избирательно связывается с эпитопом антигена. Паратоп обычно содержит аминокислоты цепей VH и VL антитела и, в частности, участка(ов) ГВУ (HVR) антитела.
.
Nature
et al., Hybridoma,
et al.
Antibodies: A Laboratory Manual
et al.
Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas
например
например
et al
Nature
et al
J. Mol. Biol.
et al
J. Mol. Biol.
et al.
J. Mol. Biol.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
et al
J. Immunol. Methods
например
et al.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
et al
Nature
et al
Year in Immunol.
et al
Bio/Technology
et al
Nature
Nature
et al.
Nature Biotechnol.
Nature Biotechnol.
Intern. Rev. Immunol.
nd
Используемый в данном документе термин «моноклональное антитело» относится к антителу, полученному из популяции в существенной мере гомогенных антител, т.е., отдельные антитела, составляющие популяцию, идентичны, за исключением возможных естественных мутаций и/или посттрансляционных модификаций (например, изомеризации, амидирования), которые могут присутствовать в незначительных количествах. Моноклональные антитела являются высокоспецифичными и направлены против одного антигенного сайта. В противоположность препаратам поликлональных антител, которые обычно содержат различные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против одного детерминанта на антигене. В дополнение к их специфичности, моноклональные антитела выгодны тем, что они синтезируются гибридомной культурой, незагрязненной другими иммуноглобулинами. Модификатор «моноклональный» указывает на характер антитела, которое получают из в существенной мере гомогенной популяции антител, и его не следует истолковывать как требующий получения антитела каким-либо конкретным способом. Например, моноклональные антитела, которые будут применяться в соответствии с данным изобретением, могут быть получены различными способами, включая, например, метод гибридомы (например, Kohler and Milstein, , 256:495-97 (1975); Hongo 14 (3): 253-260 (1995), Harlow , , (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2 ed. 1988); Hammerling , в:  563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)), способы рекомбинантной ДНК (см., , патент США № 4816567), технологии фагового дисплея (см., , Clackson., , 352: 624-628 (1991); Marks .,  222: 581-597 (1992); Sidhu .,  338(2): 299-310 (2004); Lee ,  340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse,  101(34): 12467-12472 (2004); и Lee .,  284(1-2): 119-132 (2004), и технологии получения в организме животных человеческих или человекоподобных антител, которые содержат части или полноразмерные локусы или гены иммуноглобулина человека, кодирующие последовательности человеческого иммуноглобулина (см., , WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits ,  90: 2551 (1993); Jakobovits .,  362: 255-258 (1993); Bruggemann .,  7:33 (1993); патенты США №№ 5545807; 5545806; 5569825; 5625126; 5633425; и 5661016; Marks ., 10: 779-783 (1992); Lonberg .,  368: 856-859 (1994); Morrison,  368: 812-813 (1994); Fishwild ,  14: 845-851 (1996); Neuberger,  14: 826 (1996); и Lonberg and Huszar,  13: 65-93 (1995).
Термин «голое антитело» относится к антителу, которое не конъюгировано с цитотоксическим фрагментом или радиоактивной меткой.
Термины «полноразмерное антитело», «интактное антитело» или «цельное антитело» используются взаимозаменяемым образом для обозначения антитела в его практически немодифицированной форме, в отличие от фрагмента антитела. Конкретно, цельные антитела включают такие, в которых тяжелые и легкие цепи содержат участок Fc. Константные домены могут быть константными доменами с нативной последовательности (например, константными доменами с нативной последовательностью человека) или вариантами их аминокислотной последовательности. В некоторых случаях интактное антитело может обладать одной или большим количеством эффекторных функций.
2
H
H
2
H
2
et al., Protein Eng.
8(10)
«Фрагмент антитела» содержит часть интактного антитела, предпочтительно антигенсвязывающий и/или вариабельный участок интактного антитела. Примеры фрагментов антител включают фрагменты Fab, Fab', F(ab') и Fv; димеры; линейные антитела (см. патент США 5641870, Пример 2, Zapata : 1057-1062 [1995]); молекулы одноцепочечных антител и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител. Расщепление антител папаином давало два идентичных антигенсвязывающих фрагмента, называемых фрагментами Fab, и остаточный фрагмент «Fc», обозначение которого указывает на его способность с легкостью кристаллизоваться. Фрагмент Fab состоит из полноразмерной цепи L, вместе с доменом вариабельного участка цепи H (V) и первым константным доменом одной из тяжелых цепей (C1). Каждый фрагмент Fab является одновалентным с точки зрения связывания с антигеном, т.е., содержит один антигенсвязывающий сайт. Обработка антитела пепсином дает один большой фрагмент F(ab'), который приблизительно соответствует двум связанным дисульфидной связью фрагментам Fab, проявляющим различную антигенсвязывающую активность и по-прежнему способным к образованию перекрестных связей с антигеном. Фрагменты Fab' отличаются от фрагментов Fab наличием нескольких дополнительных остатков на карбоксильном конце домена C1, включая один или большее количество остатков цистеина шарнирного участка антитела. В данном документе Fab'-SH является обозначением для Fab', в котором остаток(ки) цистеина константных доменов несут свободную тиольную группу. Фрагменты F(ab') первоначально были получены в виде пар Fab'-фрагментов, между которыми находятся имеют шарнирные остатки цистеина. Кроме того, известны другие виды химических связей для соединения фрагментов антител.
Фрагмент Fc содержит карбокси-концевые части обеих цепей Н, удерживаемых вместе дисульфидными связями. Эффекторные функции антител определяются последовательностью участка Fc, участка, который также распознается Fc-рецепторами (FcR), найденными на некоторых видах клеток.
«Fv» представляет собой минимальный фрагмент антитела, который содержит полноразмерный сайт распознавания и связывания с антигеном. Этот фрагмент состоит из димера домена вариабельного участка одной тяжелой и одной легкой цепей в плотной, нековалентной ассоциации. Сворачивание этих двух доменов приводит к образованию шести гипервариабельных петель (по 3 петли из цепей H и L), которые дают аминокислотные остатки для связывания с антигеном и обеспечивают антителу антигенсвязывающую специфичность. Однако даже один вариабельный домен (или половина Fv, содержащая только три ГВУ (HVR), специфичных в отношении антигена), обладает способностью распознавать и связываться с антигеном, хотя и с более низкой аффинностью, чем весь сайт связывания.
H
L
H
L
The Pharmacology of Monoclonal Antibodies
«Одноцепочечные Fv», также сокращенно «sFv» или «scFv», представляют собой фрагменты антител, которые содержат домены антитела V и V, соединенные в одну полипептидную цепь. Предпочтительно полипептид sFv дополнительно содержит полипептидный линкер между доменами V и V, который позволяет sFv формировать желаемую структуру для связывания с антигеном. Обзор sFv см. в Pluckthun в , vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994).
«Функциональные фрагменты» антител по изобретению содержат часть интактного антитела, обычно содержащую антигенсвязывающий или вариабельный участок интактного антитела или участок Fc антитела, который сохраняет или обладает модифицированной способностью к связыванию с FcR. Примеры фрагментов антител включают линейные антитела, молекулы одноцепочечных антител и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител.
H
L
H
L
т.е.
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
90
Термин «диатела» относится к небольшим фрагментам антител, полученным путем инжиниринга фрагментов sFv (см. предыдущий абзац) с помощью коротких линкеров (около 5-10 остатков) между доменами V и V, таким образом, что достигается межцепочечное, но не внутрицепочечное спаривание V-доменов, приводя к образованию двухвалентного фрагмента, , фрагмента, содержащего два антигенсвязывающих сайта. Биспецифические диатела являются гетеродимерами двух «кроссоверных» фрагментов sFv, в которых домены V и V двух антител присутствуют в разных полипептидных цепях. Диатела описаны более подробно, например, в ЕР 404097; WO 93/11161; Hollinger : 6444-6448 (1993).
et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
например
81

Моноклональные антитела в данном документе конкретно включают «химерные» антитела (иммуноглобулины), в которых часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, полученных из определенного вида или принадлежащих к определенному классу или подклассу антител, в то время как остальная(ые) цепь(и) идентична(ы) или гомологична(ы) соответствующим последовательностям в антителах, полученных из другого вида или принадлежащих к другому классу или подклассу антител, а также фрагментам таких антител, при условии, что они проявляют желаемую биологическую активность (патент США № 4816567, Morrison , :6851-6855 (1984)). Предлагаемые в данном документе химерные антитела включают антитела PRIMATIZED, в которых антигенсвязывающий участок антитела получен из антитела, вырабатываемого, , иммунизированными обезьянами макаками, с представляющим интерес антигеном. Используемый в данном документе термин «гуманизированное антитело» используется как подмножество «химерных антител».
et al., Nature
et al., Nature
Curr. Op. Struct. Biol.
Ann. Allergy, Asthma & Immunol
Biochem. Soc. Transactions
Curr. Op. Biotech
«Гуманизированные» формы нечеловеческих (например, мышиных) антител представляют собой химерные антитела, которые содержат минимальную последовательность, полученную из иммуноглобулина, отличного от человека. В одном варианте осуществления изобретения гуманизированное антитело представляет собой иммуноглобулин человека (антитело-реципиент), в котором остатки из ГВУ (HVR) (определяемые ниже) реципиента заменены остатками из ГВУ (HVR) не относящихся к человеку видов (донорные антитела), таких как мышь, крыса, кролик или не относящийся к человеку примат, обладающими желаемой специфичностью, аффинностью и/или функциональной возможностью. В некоторых случаях каркасные («КУ») остатки человеческого иммуноглобулина заменены соответствующими не имеющими отношения к человеку остатками. Кроме того, гуманизированные антитела могут содержать остатки, которые не обнаружены в антителе-реципиенте или в донорском антителе. Такие модификации могут быть осуществлены для дальнейшего совершенствования характеристик антител, таких как аффинность связывания. В общем, гуманизированное антитело будет содержать в существенной мере все из по меньшей мере одного и, как правило, двух вариабельных доменов, в которых все или в существенной мере все гипервариабельные петли соответствуют таковым из последовательности иммуноглобулина, не относящейся к человеку, а все или практически все КУ участки являются участками последовательности человеческого иммуноглобулина, хотя КУ участки могут включать в себя одну или большее количество индивидуальных замен фрагментов КУ, которые улучшают характеристики антител, такие как аффинность связывания, изомеризация, иммуногенность и т.д. Количество таких аминокислотных замен в КУ обычно не превышает 6 в цепи H, и не более 3 в цепи L. Кроме того, гуманизированное антитело необязательно будет содержать по меньшей мере часть константного участка иммуноглобулина (Fc), как правило, из человеческого иммуноглобулина. Более подробную информацию см., например, в Jones  321:522-525 (1986); Riechmann  332:323-329 (1988); и Presta,  2:593-596 (1992). Дополнительно см., например, Vaswani and Hamilton, . 1:105-115 (1998); Harris,  23:1035-1038 (1995); Hurle and Gross, . 5:428-433 (1994); и патенты США №№ 6982321 и 7087409.
J. Mol. Biol
et al.
J. Mol. Biol
et al.
Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy
et al.
J. Immunol.
Curr. Opin. Pharmacol.,
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
5
103
«Человеческое антитело» представляет собой антитело, имеющее аминокислотную последовательность, которая соответствует последовательности антитела, образованного человеком, и/или которое было получено с применением любого из способов получения человеческих антител, как описано в данном документе. Это определение человеческого антитела конкретно исключает гуманизированное антитело, содержащее антигенсвязывающиеся остатки, не относящиеся к человеку. Человеческие антитела могут быть получены с применением различных методов, известных в данной области техники, включая библиотеки фагового дисплея. Hoogenboom and Winter, ., 227:381 (1991); Marks , ., 222:581 (1991). Кроме того, для получения человеческих моноклональных антител доступны способы, описанные в Cole , , Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner , , 147(1):86-95 (1991). См. также van Dijk and van de Winkel, : 368-74 (2001). Антитела человека могут быть получены путем введения антигена трансгенному животному, организм которого был модифицирован для получения таких антител в ответ на антигенную стимуляцию, но чьи эндогенные локусы были отключены, например, иммунизированные ксеномыши (см., например, патенты США №№ 6075181 и 6150584 относительно технологии XENOMOUSE™). Также, см., например, Li , :3557-3562 (2006) в отношении человеческих антител, полученных с помощью технологии гибридомы В-клеток человека.
et al., Immunity
Methods in Molecular Biology
например
Hamers-Casterman et al., Nature
et al., Nature Struct. Biol.
13
248
363
3
Термин «гипервариабельный участок», «ГВУ (HVR)» или «HV (ГВ)» при использовании в данном документе относится к участкам вариабельного домена антитела, которые являются гипервариабельными в последовательности и/или образуют структурно определенные петли. Как правило, антитела содержат шесть ГВУ (HVR); три в VH (H1, H2, H3) и три в VL (L1, L2, L3). В нативных антителах H3 и L3 проявляют наибольшее разнообразие шести ГВУ (HVR), и считается, что H3 играет уникальную роль в придании тонкой специфичности антителам. См., например, Xu :37-45 (2000); Johnson and Wu, в :1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003). Действительно, встречающиеся в природе антитела верблюдовых, состоящие только из тяжелой цепи, являются функциональными и стабильными в отсутствие легкой цепи. См., , :446-448 (1993); Sheriff:733-736 (1996).
t al., Sequences of Proteins of Immunological Interest
J. Mol. Biol.
196
Ряд разграничений ГВУ (HVR) применяется и охватывается данным документом. Участки определения комплементарности Kabat (УОК (CDR)) основаны на вариабельности последовательности и являются наиболее часто применяемыми (Kabat e, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Вместо этого Chothia ссылается на расположение структурных петель (Chothia and Lesk, :901-917 (1987)). AbM ГВУ (HVR) представляют собой компромисс между ГВУ (HVR) Kabat и структурными петлями Chothia и используются для моделирования антител AbM в программном обеспечении Oxford Molecular. «Контактные» ГВУ (HVR) основаны на анализе имеющихся сложных кристаллических структур. Остатки каждого из этих ГВУ (HVR) отмечены ниже.
Петля  Kabat   AbM   Chothia   Контактные
L1   L24-L34   L24-L34   L26-L32   L30-L36
L2   L50-L56   L50-L56   L50-L52   L46-L55
L3   L89-L97   L89-L97   L91-L96   L89-L96
H1   H31-H35B   H26-H35B   H26-H32   H30-H35B (нумерация Kabat)
H1   H31-H35   H26-H35   H26-H32   H30-H35 (нумерация Chothia)
H2   H50-H65   H50-H58   H53-H55   H47-H58
H3   H95-H102   H95-H102   H96-H101 H93-H101
выше
ГВУ (HVR) могут содержать «расширенные ГВУ (HVR)» следующим образом: 24-36 или 24-34 (L1), 46-56 или 50-56 (L2) и 89-97 или 89-96 (L3) в VL и 26-35 (H1), 50-65 или 49-65 (H2) и 93-102, 94-102 или 95-102 (H3) в VH. Для каждого из этих определений остатки вариабельного участка нумеруются в соответствии с Kabat et al., .
выше
Выражения «нумерация остатков вариабельных доменов по Kabat» или «нумерация положений аминокислот по Kabat» и их вариации относятся к системе нумерации, применяемой для вариабельных доменов тяжелой цепи или вариабельных доменов легкой цепи компиляции антител в Kabat et al., . С применением этой системы нумерации, фактическая линейная аминокислотная последовательность может содержать меньше или дополнительные аминокислоты, соответствующие сокращению или введению в КУ или ГВУ (HVR) вариабельного домена. Например, вариабельный домен тяжелой цепи может содержать инсерцию одной аминокислоты (остаток 52а согласно Kabat) после остатка 52 Н2 и инсерцию остатков (например, остатки 82а, 82b и 82с и т.д. согласно Kabat) после остатка 82 КУ тяжелой цепи. Нумерация остатков по Kabat может быть определена для данного антитела путем выравнивания на участках гомологии последовательности антитела со «стандартной» последовательностью, пронумерованной по Kabat.
«Каркасные» или «КУ» остатки представляют собой остатки вариабельного участка, отличные от остатков ГВУ (HVR), как определено в данном документе.
et al.
Sequences of Proteins of Immunological Interest
et al.,
выше
et al
выше
th
«Консенсусный каркас человека» или «акцепторный каркас человека» представляет собой структуру, которая представляет наиболее часто встречающиеся аминокислотные остатки в выборке последовательностей каркаса VL или VH человеческого иммуноглобулина. Как правило, выбор последовательности VL или VH человеческого иммуноглобулина осуществляется из подгруппы последовательностей вариабельных доменов. Как правило, подгруппа последовательностей является подгруппой, как в Kabat ,, 5 Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). Примеры включают, в случае VL, подгруппу, которая может быть подгруппой каппа I, каппа II, каппа III или каппа IV, как в Kabat . Кроме того, в случае VH, подгруппа может быть подгруппой I, подгруппой II или подгруппой III, как в Kabat ., . В качестве альтернативы, консенсусная структура человека может быть выведена из вышеизложенного, в которой конкретные остатки, такие как в случае, если каркасный остаток человека выбирают на основе его гомологии с донорной каркасной структурой, выравнивая последовательность донорного каркаса с набором различных последовательностей каркаса человека. Акцепторный каркас человека, «выведенный из» каркаса иммуноглобулина человека или консенсусного каркаса человека, может содержать ту же аминокислотную последовательность, или он может содержать ранее существовавшие модификации аминокислотной последовательности. В некоторых вариантах количество ранее существовавших модификаций аминокислот составляет 10 или менее, 9 или менее, 8 или менее, 7 или менее, 6 или менее, 5 или менее, 4 или менее, 3 или менее или 2 или менее.
et al
выше
«Консенсусный каркас VH подгруппа III» содержит консенсусную последовательность, полученную из аминокислотных последовательностей в вариабельной тяжелой подгруппе III Kabat ., . В одном варианте осуществления изобретения аминокислотная последовательность подгруппы VH III консенсусного каркаса содержит по меньшей мере часть или все из каждой из следующих последовательностей: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (HC-FR1) (SEQ ID NO: 229); WVRQAPGKGLEWV (HC-FR2) (SEQ ID NO: 230); RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (HC-FR3) (SEQ ID NO: 232); и WGQGTLVTVSA (HC-FR4) (SEQ ID NO: 232).
et al
выше
«Консенсусный каркас VL каппа I» содержит консенсусную последовательность, полученную из аминокислотных последовательностей в подгруппе I легкой каппа Kabat ., . В одном варианте осуществления изобретения аминокислотная последовательность консенсусного каркаса VH подгруппы I содержит по меньшей мере часть или все из каждой из следующих последовательностей: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (LC-FR1) (SEQ ID NO: 233); WYQQKPGKAPKLLIY (LC-FR2) (SEQ ID NO: 234); GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (LC-FR3) (SEQ ID NO: 235); и FGQGTKVEIKR (LC-FR4) (SEQ ID NO: 236).
«Модификация аминокислоты» в указанном положении, например, участка Fc, относится к замене или делеции указанного остатка или инсерции по меньшей мере одного аминокислотного остатка, смежного с указанным остатком. Инсерция «примыкает» к указанному остатку означает инсерцию в пределах одного-двух остатков от него. Инсерция может быть N-концевой или С-концевой относительно указанного остатка. В данном документе предпочтительная модификация аминокислоты представляет собой замену.
«Аффинность» относится к активности суммарного количества нековалентных взаимодействий между одним сайтом связывания молекулы (например, антитела) и его партнером по связыванию (например, антигеном, например, TIGIT). Если в тексте прямо не указано обратное, то, как используется в данном документе, «аффинность связывания» относится к аффинности собственного связывания, отражающей взаимодействие 1:1 между членами пары связывания (например, антителом и антигеном). Аффинность молекулы X в отношении ее партнера Y обычно может быть представлена константой диссоциации (Kd). Аффинность может быть измерена обычными способами, известными в данной области техники, включая описанные в данном документе. Конкретные иллюстративные и типичные варианты осуществления изобретения для измерения аффинности связывания описаны ниже.
et al., Bio/Technology
et al. Proc Nat. Acad. Sci. USA
et al. Gene
et al. J. Immunol.
et al., J. Immunol.
et al, J. Mol. Biol.
Антитело «с созревшей аффинностью» представляет собой такое, которое содержит одну или большее количество модификаций в одном или нескольких ГВУ (HVR), приводящие к улучшению аффинности антитела к антигену по сравнению с исходным антителом, которое не содержит этих модификаций. В одном варианте осуществления изобретения антитело с созревшей аффинностью обладает аффинностью к целевому антигену в наномолярном или даже пикомолярном диапазоне. Антитела с созревшей аффинностью получают способами, известными в данной области техники. Например, в Marks  10:779-783 (1992) описано созревание аффинности путем перетасовки VH- и VL-домена. Случайный мутагенез ГВУ (HVR) и/или каркасных остатков описан, например, в Barbas 91:3809-3813 (1994); Schier 169:147-155 (1995); Yelton 155:1994-2004 (1995); Jackson 154(7):3310-9 (1995); и Hawkins 226:889-896 (1992).
-4
-5
-6
-7
-8
-9
-10
-11
-12
-4
-6
-6
-10
-7
-9
Используемый в данном документе термин «связывается», «специфически связывается с» или «специфичный в отношении» относится к измеримому и воспроизводимому взаимодействию, такому как связывание между мишенью и антителом, которое является определяющим для присутствия мишени в присутствии гетерогенной популяции молекул, включая биологические молекулы. Например, антитело, которое специфически связывается с мишенью (которая может быть эпитопом), представляет собой антитело, которое связывается с этой мишень с большей аффинностью, авидностью, с большей легкостью и/или на более продолжительное время, чем оно связывается с другими мишенями. В одном варианте осуществления изобретения степень связывания антитела с неродственной мишенью составляет менее чем около 10 % от связывания антитела с мишенью, по данным, например, радиоиммуноанализа (РИА (RIA)). В некоторых вариантах осуществления изобретения константа диссоциации (Kd) антитело, которое специфически связывается с мишенью, составляет ≤ 1 мкМ, ≤ 100 нМ, ≤ 10 нМ, ≤ 1 нМ или ≤ 0,1 нМ. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело специфически связывается с эпитопом на белке, который является консервативным для белка разных видов. В другом варианте осуществления изобретения специфическое связывание может включать эксклюзивное связывание, но не требует его. Используемый в данном документе термин может быть представлен, например, молекулой с Kd в отношении мишени 10 М или менее, в качестве альтернативы, 10 М или менее, в качестве альтернативы, 10 М или менее, в качестве альтернативы, 10 М или менее, в качестве альтернативы, 10 М или менее, в качестве альтернативы, 10 М или менее, в качестве альтернативы, 10 М или менее, в качестве альтернативы, 10 М или менее, в качестве альтернативы, 10 М или менее или Kd в диапазоне от 10 М до 10 М или от 10 М до 10 М или от 10 М до 10 М. Как будет понятно специалисту в данной области техники, аффинность и значения Kd являются обратно пропорциональными. Высокая аффинность к антигену отображается низким значением Kd. В одном варианте осуществления изобретения термин «специфическое связывание» относится к связыванию, при котором молекула связывается с конкретным полипептидом или эпитопом на конкретном полипептиде без существенного связывания с любым другим полипептидом или полипептидным эпитопом.
Используемый в данном документе термин «иммуноадгезин» обозначает антителоподобные молекулы, которые сочетают специфичность связывания гетерологичного белка («адгезин») с эффекторными функциями константных доменов иммуноглобулина. С точки зрения структуры иммуноадгезины содержат химеру аминокислотной последовательности с желаемой специфичностью связывания, которая отличается от сайта распознавания и связывания антитела с антигеном (т.е., является «гетерологичной») и последовательности константного домена иммуноглобулина. Адгезиновая часть молекулы иммуноадгезина обычно представляет собой непрерывную аминокислотную последовательность, содержащую по меньшей мере сайт связывания с рецептором или лигандом. Последовательность константного домена иммуноглобулина в иммуноадгезине может быть получена из любого иммуноглобулина, такого как IgG-1, IgG-2 (включая IgG2A и IgG2B), IgG-3 или IgG-4 подтипы IgA (включая IgA-1 и IgA-2), IgE, IgD или IgM. Химерные Ig предпочтительно содержат замену домена полипептида или антитела, описанного в данном документе, в месте по меньшей мере одного вариабельного участка в молекуле Ig. В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретения химерный иммуноглобулин содержит участки шарнира, CH2 и CH3, или шарнира, CH1, CH2 и CH3 молекулы IgG1. Относительно получения химерного иммуноглобулина дополнительно см. патент США № 5428130, выданный 27 июня 1995 года. Например, иммуноадгезины, пригодные для комбинированной терапии, в данном случае включают полипептиды, которые содержат внеклеточные или связывающиеся с OX40 части OX40L или внеклеточные или связывающиеся с OX40L части OX40, слитые с константным доменом последовательности иммуноглобулина, такие как ECD-Fc OX40 или FCD OX40L. Иммуноадгезиновые комбинации Ig Fc и внеклеточные домены, ВКД (ECD) рецепторов клеточной поверхности иногда называют растворимыми рецепторами.
in vitro
in vivo
«Химерный белок» и «химерный полипептид» относятся к полипептиду, содержащему две части, ковалентно связанные друг с другом, причем каждая из частей представляет собой полипептид с иным свойством. Свойство может быть биологическим свойством, таким как активность  или . Кроме того, свойство может быть простым химическим или физическим свойством, таким как связывание с молекулой-мишенью, катализ реакции и т.д. Две части могут быть соединены напрямую одинарной пептидной связью или посредством пептидного линкера, но находятся в рамке считывания друг с другом.
Термин «участок Fc» в данном документе используется для определения С-концевого участка тяжелой цепи иммуноглобулина, включая участки Fc нативной последовательности и варианты участков Fc. Хотя границы участка Fc тяжелой цепи иммуноглобулина могут варьироваться, участок Fc тяжелой цепи человека обычно определяется как продолжающийся от аминокислотного остатка в положении Cys226 или от Pro230 до его карбоксильного конца. С-концевой лизин (остаток 447 в соответствии с системой нумерации ЕС) участка Fc может быть удален, например, во время выработки или очистки антитела или путем рекомбинантной инженерии нуклеиновой кислоты, кодирующей тяжелую цепь антитела. Соответственно, композиция интактных антител может содержать популяции антител с удаленными остатками K447, популяции антител без удаленных остатков K447 и популяции антител, содержащие смесь антител с остатком K447 и без него. Подходящие природные последовательности участков Fc для применения в антителах по изобретению включают IgG1 человека, IgG2 (IgG2A, IgG2B), IgG3 и IgG4.
Annu. Rev. Immunol.
Annu. Rev. Immunol.
et al.
Immunomethods
et al., J. Lab. Clin. Med.
15
9
4
126
«Рецептор Fc» или «FcR» описывает рецептор, который связывается с участком Fc антитела. Предпочтительный FcR представляет собой FcR нативной последовательности человека. Кроме того, предпочтительным FcR является такой, который связывается с антителом IgG (гамма-рецептор), что включает рецепторы подклассов FcγRI, FcγRII и FcγRIII, включая аллельные варианты и, в качестве альтернативы, сплайсинговые формы этих рецепторов, рецепторы FcγRII включают FcγRIIA («активирующий рецептор»«) И FcγRIIB («ингибирующий рецептор»), которые имеют сходные аминокислотные последовательности, в основном содержащие отличия в их цитоплазматических доменах. Активирующий рецептор FcγRIIA содержит в цитоплазматическом домене иммунорецепторный мотив активации на основе тирозина (ИМАТ (ITAM)). Ингибирующий рецептор FcγRIIB содержит в цитоплазматическом домене иммунорецепторный мотив ингибирования на основе тирозина (ИМИТ (ITIM)). (см. M. Daëron, :203-234 (1997). Обзор FcR приведен в Ravetch and Kinet, : 457-92 (1991); Capel , : 25-34 (1994); и de Haas : 330-41 (1995). Другие FcR, включая те, которые будут идентифицированы в будущем, охватываются термином «FcR».
«Эффекторные клетки человека» относятся к лейкоцитам, которые экспрессируют один или большее количество FcR и выполняют эффекторные функции. В некоторых вариантах осуществления изобретения клетки экспрессируют по меньшей мере FcγRIII и выполняют эффекторную(ые) функцию(и) АЗКЦ (ADCC). Примеры лейкоцитов человека, которые опосредуют АЗКЦ (ADCC), включают мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК (PBMC)), природные клетки-киллеры (ПК (NK)), моноциты, цитотоксические Т-клетки и нейтрофилы. Эффекторные клетки могут быть выделены из природного источника, например, из крови.
«Эффекторные функции» относятся к биологической активности, которую относят на счет участка Fc антитела и которая варьируется в зависимости от изотипа антитела. Примеры эффекторных функций антитела включают в себя: связывание с C1q и комплементзависимую цитотоксичность (КЗЦ (CDC)); связывание с рецептором Fc; антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (АЗКЦ (ADCC)); фагоцитоз; подавление рецепторов клеточной поверхности (например, рецептора В-клеток); и активации В-клеток.
Выражение «в существенной мере сниженный» или «в существенной мере отличающийся», как используется в данном документе, обозначает достаточно высокую степень разницы между двумя числовыми значениями (как правило, одно связано с молекулой, а другое связано с референтной/молекулой компаратором), таким образом, что специалист в данной области техники будет рассматривать разницу между этими двумя значениями как статистически значимую в контексте биологической характеристики, измеренной указанными значениями (например, значениями Kd). Разница между указанными двумя значениями составляет, например, более чем около 10 %, более чем около 20 %, более чем около 30 %, более чем около 40 % и/или более чем около 50 % от значения референтной молекулы/компаратора.
Термин «в существенной мере подобный» или «в существенной мере такой же», как используется в данном документе, обозначает достаточно высокую степень сходства между двумя числовыми значениями (например, одно, связанное с антителом по изобретению, а другое, связанное с референтным антителом/компаратором), таким образом, что специалист в данной области техники будет рассматривать разницу между этими двумя значениями, как имеющую небольшую или вообще не имеющую биологической и/или статистической значимости в контексте биологической характеристики, измеренной указанными значениями (например, значениями Kd). Разница между указанными двумя значениями составляет, например, менее чем около 50 %, менее чем около 40 %, менее чем около 30 %, менее чем около 20 % и/или менее чем около 10 % от значения референтной молекулы/компаратора.
Термин «антагонист» используется в самом широком смысле и включает в себя любую молекулу, которая частично или полностью блокирует, ингибирует или нейтрализует биологическую активность нативного полипептида, описанную в данном документе. Аналогичным образом термин «агонист» используется в самом широком смысле и включает в себя любую молекулу, которая имитирует биологическую активность нативного полипептида, описанную в данном документе. Подходящие молекулы агонистов или антагонистов конкретно включают агонистические или антагонистические антитела или фрагменты антител, фрагменты или варианты аминокислотных последовательностей нативных полипептидов, пептидов, антисмысловые олигонуклеотиды, органические молекулы небольшого размера и т.д. Способы идентификации агонистов или антагонистов полипептида могут включать в себя приведение полипептида в контакт с потенциальной молекулой-агонистом или антагонистом и измерение обнаружимого изменения в одном или большем количестве видов биологической активности, обычно ассоциируемых с полипептидом.
Используемый в данном документе термин «антагонистическое антитело» молекулы-мишени относится к антителу, которое препятствует нормальному функционированию молекулы-мишени путем уменьшения транскрипции или трансляции нуклеиновой кислоты, кодирующей молекулу-мишень, или путем подавления или блокирования активности молекулы-мишени, или и того, и другого. Например, антагонистическое антитело против TIGIT можно рассматривать как антитело или его связывающий анти-TIGIT фрагмент, который препятствует нормальному функционированию TIGIT путем уменьшения транскрипции или трансляции нуклеиновой кислоты, кодирующей TIGIT, или путем подавления или блокирования активности полипептида TIGIT, или и того, и другого. Специалисту в данной области техники будет понятно, что в некоторых случаях антагонистическое антитело против TIGIT может противодействовать одному виду активности TIGIT, не влияя на другой вид активности TIGIT. Например, желаемое антагонистическое антитело против TIGIT для применения в определенных способах согласно данному документу представляет собой антагонистическое антитело TIGIT, которое противодействует активности TIGIT в ответ на один из видов взаимодействия с ПВР (PVR), взаимодействия с PVRL3 или взаимодействие с PVRL2, например, не затрагивая или минимально затрагивая любой из других видов взаимодействия TIGIT.
Термины «антагонист TIGIT» и «антагонист активности TIGIT или экспрессии TIGIT» используются взаимозаменяемым образом и относятся к соединению, которое препятствует нормальному функционированию TIGIT путем уменьшения транскрипции или трансляции нуклеиновой кислоты, кодирующей TIGIT, или путем подавления или блокирования активность полипептида TIGIT или и того, и другого. Примеры антагонистов TIGIT включают, но не ограничиваясь этим, антисмысловые полинуклеотиды, интерферирующие РНК, каталитические РНК, химеры РНК-ДНК, специфичные в отношении TIGIT аптамеры, анти-TIGIT антитела, TIGIT-связывающие фрагменты анти-TIGIT антител, связывающиеся с TIGIT молекулы небольшого размера, связывающиеся с TIGIT пептиды и другие полипептиды, которые специфически связываются с TIGIT (включая, но не ограничиваясь этим, связывающие с TIGIT фрагменты одного или большего количества лигандов TIGIT, необязательно слитые с одним или большим количеством дополнительными доменами), таким образом, что взаимодействие между антагонистом TIGIT и TIGIT приводит к уменьшению или прекращению проявления активности или экспрессии TIGIT. Специалисту в данной области техники будет понятно, что в некоторых случаях антагонист TIGIT может противодействовать одному виду активности TIGIT, не влияя на другой вид активности TIGIT. Например, желаемым антагонистом TIGIT для применения в некоторых из предложенных в данном документе способов является антагонист TIGIT, который противодействует активности TIGIT в ответ на один из видов взаимодействия с ПВР (PVR), взаимодействия с PVRL3 или взаимодействия с PVRL2, например, не затрагивая или минимально затрагивая на любой другой вид взаимодействия TIGIT.
Термины «антагонист ПВР (PVR)» и «антагонист активности ПВР (PVR) или экспрессии ПВР (PVR)» используются взаимозаменяемым образом и относятся к соединению, которое препятствует нормальному функционированию ПВР (PVR), путем уменьшения транскрипции или трансляции нуклеиновой кислоты, кодирующей ПВР (PVR), или путем подавления или блокирования активности полипептида ПВР (PVR) или и того, и другого. Примеры антагонистов ПВР (PVR) включают, но не ограничиваясь этим, антисмысловые полинуклеотиды, интерферирующие РНК, каталитические РНК, химеры РНК-ДНК, специфические в отношении ПВР (PVR) аптамеры, анти-ПВР (PVR) антитела, связывающиеся с ПВР (PVR) фрагменты антител против ПВР (PVR), связывающиеся с ПВР (PVR) молекулы небольшого размера, связывающиеся с ПВР (PVR) пептиды и другие полипептиды, которые специфически связываются с ПВР (PVR) (включая, но не ограничиваясь этим, связывающиеся с ПВР (PVR) фрагменты одного или большего количества лигандов ПВР (PVR), необязательно слитые с одним или большим количеством дополнительных доменов), таким образом, что взаимодействие между антагонистом ПВР (PVR) и ПВР (PVR) приводит к уменьшению или прекращению проявления активности или экспрессии ПВР (PVR). Специалисту в данной области техники будет понятно, что в некоторых случаях антагонист ПВР (PVR) может противодействовать одному виду активности ПВР (PVR), не влияя на другой вид активности ПВР (PVR). Например, желаемым антагонистом ПВР (PVR) для применения в некоторых способах согласно данному документу является антагонист ПВР (PVR), который противодействует активности ПВР (PVR) в ответ на взаимодействие с TIGIT, не затрагивая взаимодействия с PVR-CD96 и/или PVR-CD226.
Термин «антагонист связывания оси PD-1» относится к молекуле, которая подавляет взаимодействие партнера по связыванию оси PD-1 с одним или большим количеством из его партнеров по связыванию, чтобы устранить дисфункцию Т-клеток, возникающую в результате проведения сигнала в PD-1 — с целью восстановления или усиления функции Т-клеток (например, пролиферации, выработки цитокинов, уничтожения клеток-мишеней). Как используется в данном документе, антагонист связывания оси PD-1 включает антагониста связывания PD-1, антагониста связывания PD-L1 и антагониста связывания PD-L2.
Термин «антагонист связывания PD-1» относится к молекуле, которая уменьшает, блокирует, ингибирует, устраняет или препятствует трансдукции сигнала в результате взаимодействия PD-1 с одним или большим количеством из его партнеров по связыванию, таких как PD-L1, PD-L2. В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист связывания PD-1 представляет собой молекулу, которая ингибирует связывание PD-1 с одним или большим количеством его партнеров по связыванию. В конкретном аспекте антагонист связывания PD-1 ингибирует связывание PD-1 с PD-L1 и/или PD-L2. Например, антагонисты связывания PD-1 включают антитела против PD-1, их антигенсвязывающие фрагменты, иммуноадгезины, химерные белки, олигопептиды и другие молекулы, которые уменьшают, блокируют, ингибируют, устраняют или препятствуют передаче сигнала, возникающей в результате взаимодействия PD-1 с PD-L1 и/или PD-L2. В одном варианте осуществления изобретения антагонист связывания PD-1 уменьшает отрицательный костимулирующий сигнал, опосредуемый или передаваемый белками клеточной поверхности, экспрессируемыми на Т-лимфоцитах, опосредующих передачу сигнала через PD-1, таким образом, что дисфункциональная Т-клетка становится менее дисфункциональной (например, усиливает эффекторные ответы на распознавание антигена). В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист связывания PD-1 представляет собой антитело против PD-1. В конкретном аспекте антагонист связывания PD-1 представляет собой MDX-1106 (ниволумаб), описанный в данном документе. В другом конкретном аспекте антагонист связывания PD-1 представляет собой MK-3475 (ламбролизумаб), описанный в данном документе. В другом конкретном аспекте антагонист связывания PD-1 представляет собой CT-011 (пидилизумаб), описанный в данном документе. В другом конкретном аспекте антагонист связывания PD-1 представляет собой MEDI-0680 (AMP-514), описанный в данном документе. В другом конкретном аспекте антагонист связывания PD-1 представляет собой PDR001, описанный в данном документе. В другом конкретном аспекте антагонист связывания PD-1 представляет собой REGN2810, описанный в данном документе. В другом конкретном аспекте антагонист связывания PD-1 представляет собой BGB-108, описанный в данном документе.
Термин «антагонист связывания PD-L1» относится к молекуле, которая уменьшает, блокирует, ингибирует, устраняет или препятствует трансдукции сигнала, возникающей в результате взаимодействия PD-L1 с одним или большим количеством его партнеров по связыванию, таких как PD-1, В7-1. В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист связывания PD-L1 представляет собой молекулу, которая ингибирует связывание PD-L1 с его партнерами по связыванию. В конкретном аспекте антагонист связывания PD-L1 ингибирует связывание PD-L1 с PD-1 и/или B7-1. В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонисты связывания PD-L1 включают антитела против PD-L1, их антигенсвязывающие фрагменты, иммуноадгезины, химерные белки, олигопептиды и другие молекулы, которые уменьшают, блокируют, ингибируют, устраняют или препятствуют передаче сигнала, возникающей в результате взаимодействия PD-L1 с одним или большим количеством его партнеров по связыванию, таких как PD-1, B7-1. В одном варианте осуществления изобретения антагонист связывания PD-L1 уменьшает отрицательный костимулирующий сигнал, опосредуемый или передаваемый белками клеточной поверхности на Т-лимфоцитах, опосредующих передачу сигнала через PD-L1, таким образом, что дисфункциональная Т-клетка становится менее дисфункциональной (например, усиливает эффекторные ответы на распознавание антигена). В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист связывания PD-L1 представляет собой антитело против PD-L1. В конкретном аспекте анти-PD-L1 антитело представляет собой YW243.55.S70, описанный в данном документе. В другом конкретном аспекте анти-PD-L1 антитело представляет собой MDX-1105, описанный в данном документе. В еще одном конкретном аспекте анти-PD-L1 антитело представляет собой MPDL3280A (атезолизумаб), описанный в данном документе. В еще одном конкретном аспекте анти-PD-L1 антитело представляет собой MEDI4736 (дурвалумаб), описанный в данном документе. В еще одном конкретном аспекте анти-PD-L1 антитело представляет собой YW243.55.S70, описанный в данном документе. В еще одном конкретном аспекте анти-PD-L1 антитело представляет собой MSB0010718C (авелумаб), описанный в данном документе.
Термин «антагонист связывания PD-L2» относится к молекуле, которая уменьшает, блокирует, ингибирует, устраняет или препятствует трансдукции сигнала в результате взаимодействия PD-L2 с одним или большим количеством из его партнеров по связыванию, таких как PD-1. В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист связывания PD-L2 представляет собой молекулу, которая ингибирует связывание PD-L2 с одним или большим количеством его партнеров по связыванию. В конкретном аспекте антагонист связывания PD-L2 ингибирует связывание PD-L2 с PD-1. В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонисты связывания PD-L2 включают антитела против PD-L2, их антигенсвязывающие фрагменты, иммуноадгезины, химерные белки, олигопептиды и другие молекулы, которые уменьшают, блокируют, ингибируют, устраняют или препятствуют передаче сигнала, возникающей в результате взаимодействия PD-L2 с одним или большим количеством его партнеров по связыванию, таких как PD-1. В одном варианте осуществления изобретения антагонист связывания PD-L2 уменьшает отрицательный костимулирующий сигнал, опосредуемый или передаваемый белками клеточной поверхности, экспрессируемыми на Т-лимфоцитах, опосредующих передачу сигнала через PD-1, таким образом, что дисфункциональная Т-клетка становится менее дисфункциональной (например, усиливает эффекторные ответы на распознавание антигена). В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист связывания PD-L2 является иммуноадгезином.
Используемый в данном документе термин «OX40» относится к любому природному OX40 из любого источника позвоночных, включая млекопитающих, таких как приматы (например, человек) и грызунов (например, мыши и крысы), если в тексте прямо не указано обратное. Термин включает «полноразмерный», непроцессированный OX40, а также любую форму OX40, которая возникает в результате процессирования в клетке. Дополнительно, термин включает природные варианты OX40, например, сплайсинговые варианты или аллельные варианты. Аминокислотная последовательность типичного OX40 человека представлена в SEQ ID NO: 354.
«Активация OX40» относится к активации рецептора OX40. Как правило, активация OX40 приводит к передаче сигнала.
Термин «аптамер» относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая способна связываться с молекулой-мишенью, такой как полипептид. Например, аптамер по изобретению может специфически связываться с полипептидом TIGIT или с молекулой в сигнальном пути, который модулирует экспрессию TIGIT. В данной области техники хорошо известны генерация и терапевтическое применение аптамеров. См., например, патент США № 5475096, и терапевтическая эффективность MACUGEN (Eyetech, Нью-Йорк) для лечения возрастной дегенерации желтого пятна.
Термин «дисфункция» в контексте иммунной дисфункции относится к состоянию сниженного иммунного ответа на антигенную стимуляцию.
например
Используемый в данном документе термин «дисфункциональный» дополнительно включает резистентный или невосприимчивый к распознаванию антигена, в частности, нарушенную способность трансформировать распознавание антигена в эффекторные функции Т-клеток ниже в сигнальном пути, такие как пролиферация, выработка цитокинов (, гамма-интерферона) и/или уничтожение клетки-мишени.
Annu. Rev. Immunol
in vitro
in vivo
et al. PNAS
(USA)
«Антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность» или «АЗКЦ (ADCC)» относится к форме цитотоксичности, при которой секретируемый иммуноглобулин, связанный с рецепторами Fc (FcR), присутствующими на определенных цитотоксических клетках (например, ПК (NK)-клетках, нейтрофилах и макрофагах), позволяет этим цитотоксическим эффекторам специфически связываться с антигенсодержащей клеткой-мишенью и впоследствии вызывать гибель клетки-мишени при помощи цитотоксинов. Первичные клетки для опосредования АЗКЦ (ADCC), ПК (NK)-клетки, экспрессируют только FcγRIII, тогда как моноциты экспрессируют FcγRI, FcγRII и FcγRIII. Экспрессия FcR на гемопоэтических клетках приведена в Табл. 3 на стр. 464 Ravetch and Kinet,  9: 457-92 (1991). Для оценки активности АЗКЦ (ADCC) представляющей интерес молекулы может быть проведен анализ АЗКЦ (ADCC) , такой как описан в патенте США №№ 5500362 или 5821337 или в патенте США № 6737056 (Presta). Пригодные для таких анализов эффекторные клетки включают клетки МКПК (PMBC) и ПК (NK). В качестве альтернативы или дополнительно, активность АЗКЦ (ADCC) представляющей интерес молекулы может быть оценена , например, на животной модели, такой как описана в Clynes  95:652-656 (1998). Типичный анализ для оценки активности АЗКЦ (ADCC) представлен в приведенных в данном документе примерах.
2+
Термин «анергия» относится к состоянию нечувствительности к антигенной стимуляции, вызванному неполными или недостаточными сигналами, передаваемыми через рецептор Т-клеток (например, повышение внутриклеточного уровня Ca в отсутствие активации ras). Кроме того, анергия Т-клеток может быть результатом стимуляции антигеном в отсутствие костимуляции, в результате чего клетки становятся невосприимчивыми к последующей активации антигеном даже в контексте костимуляции. Невосприимчивое состояние часто может быть устранено присутствием интерлейкина-2 (IL-2). Анергические Т-клетки не клонируются и/или не приобретают эффекторных функций.
+
например
«Усиление функции Т-клеток» означает индуцировать, вызывать или стимулировать эффекторную Т-клетку или Т-клетку памяти для получения обновленной, устойчивой или усиленной биологической функции. Примеры усиления функции Т-клеток включают в себя: повышенную секрецию γ-интерферона эффекторными CD8 Т-клетками, усиление секреции γ-интерферона CD4+ Т-клетками памяти и/или эффекторными Т-клетками, увеличение пролиферации CD4+ эффекторных Т-клеток и/или Т-клеток памяти, увеличение пролиферации CD8+ эффекторных Т-клеток, повышение чувствительности к антигенам (, клиренс) по сравнению с уровнями таких показателей до вмешательства. В одном варианте осуществления изобретения степень улучшения составляет по меньшей мере 50 %, в качестве альтернативы, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 120 %, 150 %, 200 %. Способ измерения такого улучшения известен специалисту в данной области техники.
Термин «истощение» относится к истощению Т-клеток как к состоянию дисфункции Т-клеток, которая возникает из-за продолжительной передачи сигналов Т-клеточным рецептором (ТКР (TCR)), которая возникает во время многих хронических инфекций и рака. Это состояние отличается от анергии тем, что он возникает не из-за неполной или недостаточной передачи сигнала, а из-за продолжительной передачи сигнала. Оно определяется слабой эффекторной функцией, устойчивой экспрессией ингибирующих рецепторов и транскрипциональным состоянием, отличным от состояния функциональных эффекторных Т-клеток или Т-клеток памяти. Истощение препятствует оптимальному контролю инфекции и опухолей. Истощение может быть результатом как внешних отрицательных регуляторных путей (например, иммунорегуляторных цитокинов), так и внутренних отрицательных регуляторных путей (костимулирующих) в клетке (PD-1, B7-H3, B7-H4 и т.д.).
+
например
«Усиление функции Т-клеток» означает индуцировать, вызывать или стимулировать Т-клетку для получения устойчивой или усиленной биологической функции или возобновлять или реактивировать истощенные или неактивные Т-клетки. Примеры усиления функции Т-клеток включают: повышенную секрецию γ-интерферона CD8 Т-клетками, повышенную пролиферацию, повышенную чувствительность к антигенам (, клиренс вируса, патогена или опухоли) по сравнению с уровнями таких показателей до вмешательства. В одном варианте осуществления изобретения степень улучшения составляет по меньшей мере 50 %, в качестве альтернативы, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 120 %, 150 %, 200 %. Способ измерения такого улучшения известен специалисту в данной области техники.
«Дисфункциональное расстройство Т-клеток» представляет собой расстройство или состояние Т-клеток, характеризующееся снижением чувствительности к антигенной стимуляции. В конкретном варианте осуществления изобретения дисфункциональное нарушение Т-клеток представляет собой расстройство, которое специфически связано с ненадлежащим образом сниженной передачей сигнала через OX40 и/или OX40L. В другом варианте осуществления изобретения дисфункциональное расстройство Т-клеток является таким, при котором Т-клетки являются анергическими или снижена их способность секретировать цитокины, пролиферировать или проявлять цитолитическую активность. В конкретном аспекте снижение чувствительности приводит к неэффективному контролю патогена или опухоли, экспрессирующих иммуноген. Примеры дисфункциональных нарушений Т-клеток, характеризующихся дисфункцией Т-клеток, включают неразрешенную острую инфекцию, хроническую инфекцию и опухолевый иммунитет.
«Опухолевый иммунитет» относится к процессу, в котором опухоли уклоняются от иммунного распознавания и клиренса. Таким образом, в качестве терапевтической концепции опухолевый иммунитет «излечен», когда такое уклонение ослабляется, а опухоли распознаются и атакуются иммунной системой. Примеры распознавания опухоли включают связывание с опухолью, уменьшение размера опухоли и клиренс опухоли.
«Иммуногенность» относится к способности конкретного вещества провоцировать иммунный ответ. Опухоли являются иммуногенными и усиление иммуногенности опухолей способствует клиренсу опухолевых клеток иммунным ответом. Примеры усиления иммуногенности опухоли включают, но не ограничиваясь этим, обработку агонистом связывания OX40 (например, агонистическими анти-OX40 антителами) и ингибитором TIGIT (например, блокирующие анти-TIGIT антитела).
«Устойчивый ответ» относится к устойчивому влиянию в форме уменьшения роста опухоли после прекращения лечения. Например, размер опухоли может оставаться таким же или меньшим по сравнению с размером в начале фазы введения. В некоторых вариантах осуществления изобретения длительность устойчивого ответа является по меньшей мере такой же, как продолжительность лечения, по меньшей мере 1,5X, 2,0X, 2,5X или 3,0X продолжительности лечения.
«Носители», как используется в данном изобретении, включают фармацевтически приемлемые носители, наполнители или стабилизаторы, которые являются нетоксичными для клетки или млекопитающего, воздействуя на него в применяемых дозах и концентрациях. Часто физиологически приемлемый носитель представляет собой водный раствор c буферизованным рН. Примеры физиологически приемлемых носителей включают буферы, такие как фосфатный, цитратный и другие органические кислоты; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту; низкомолекулярный полипептид (менее 10 остатков); белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как ЭДТА; сахарные спирты, такие как маннит или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN™, полиэтиленгликоль (ПЭГ (PEG)) и PLURONICS™.
«Листок-вкладыш» относится к инструкции, обычно содержащейся в коммерческие упаковки лекарственных средств, которые содержат информацию о показаниях, обычно содержащиеся в коммерческие упаковках лекарственных средств, которые содержат информацию о показаниях, применении, дозировке, способах введения, противопоказаниях, других лекарственных средствах для комбинирования с содержащимся в упаковке продуктом и/или предупреждения относительно применения таких лекарственных средств.
Используемый в данном документе термин «лечение» относится к клиническому вмешательству, предназначенному для модификации естественного протекания у индивидуума или клетки, которую лечат в ходе клинической патологии. Желаемые эффекты лечения включают снижение скорости прогрессирования заболевания, улучшение или облегчение патологического состояния, ремиссии или улучшение прогноза. Например, лечение индивидуума проходит успешно, если один или большее количество симптомов, связанных с раком, смягчаются или устраняются, включая, но не ограничиваясь этим, уменьшение пролиферации (или разрушение) раковых клеток, уменьшение симптомов, возникающих в результате заболевания, повышение качество жизни тех, кто страдает от заболевания, снижение дозы других лекарственных средств, необходимых для лечения заболевания, замедление прогрессирование заболевания и/или увеличение продолжительности жизни индивидуумов.
Используемый в данном документе термин «задержка прогрессирования заболевания» означает отсрочку, затруднение, уменьшение скорости, замедление, стабилизацию и/или отодвигание во времени развития заболевания (например, рака). Такая задержка может быть разной продолжительности, в зависимости от истории заболевания и/или индивидуума, который проходит лечение. Как очевидно для специалиста в данной области техники, достаточная или значительная задержка может, по сути, включать профилактику, при которой заболевание у индивидуума не развивается. Например, поздняя стадия рака, такая как развитие метастазов, может быть отодвинута во времени.
Используемый в данном документе термин «уменьшение или подавление рецидива рака» означает уменьшение или ингибирование рецидива опухоли или рака, опухоли или прогрессирования рака.
Как используется в данном документе, «рак» и «раковый» относятся к или описывают физиологическое состояние у млекопитающих, которое обычно характеризуется нерегулируемым ростом клеток. В это определение включены доброкачественные и злокачественные раковые образования, а также латентные опухоли или микрометастазы. Примеры рака включают, но не ограничиваясь этим, карциному, миелому, лимфому, бластому, саркому и лейкоз. Более конкретные примеры таких видов рака включают множественную миелому (MM), плоскоклеточный рак, рак легкого (включая мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, аденокарциному легкого и плоскоклеточный рак легкого), перитонеальный рак, печеночно-клеточный рак, рак желудка (включая рак желудочно-кишечного тракта), рак поджелудочной железы, глиобластому, рак шейки матки, рак яичника, рак печени, рак мочевого пузыря, гепатому, рак молочной железы, рак толстой кишки, колоректальный рак, карциному эндометрия или матки, карциному слюнной железы, рак почки или почечный рак, рак печени, рак предстательной железы, рак вульвы, рак щитовидной железы, карциному печени, различные виды рака головы и шеи, а также лимфому В-клеток (включая высокодифференцированную/фолликулярную неходжкинскую лимфому (НХЛ (NHL)), мелкоклеточную лимфоцитарную (МЛ (SL)) НХЛ (NHL), НХЛ (NHL) промежуточной степени дифференциации/фолликулярную НХЛ (NHL), диффузную НХЛ (NHL) промежуточной степени дифференциации, низкодифференцированную иммунобластную НХЛ (NHL), низкодифференцированную лимфобластную НХЛ (NHL), низкодифференцированную мелкоклеточную НКЛ (NHL) с нерасщепленными клетками, НХЛ (NHL) с массивным поражением; мантийно-клеточную лимфому; связанную со СПИДом лимфому; и макроглобулинемию Вальденстрема), хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ (CLL)), острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ (ALL)), волосатоклеточный лейкоз, хронический миелобластный лейкоз и посттрансплантационное лимфопролиферативное расстройство (ПТЛР (PTLD)), а также аномальную сосудистую пролиферацию, связанную с факоматозами, отек (такой как связанный с опухолями головного мозга) и синдром Мейгса.
Термин «опухоль» относится к любому росту и пролиферации опухолевых клеток, злокачественные или доброкачественные, и всех предраковых и раковых клеток и тканей. Термины «рак», «раковое», «клеточное пролиферативное расстройство», «пролиферативное расстройство» и «опухоль» не являются взаимоисключающими, как указано в данном документе.
Используемый в данном документе термин «метастаз» означает распространение рака из его основного месторасположения в другие участки организма. Раковые клетки могут отрываться от первичной опухоли, проникать в лимфатические и кровеносные сосуды, циркулировать в кровотоке и расти в отдаленном очаге (образовывать метастазы) в нормальных тканях в любом другом месте организма. Метастазы могут быть локальными или отдаленными. Метастазирование представляет собой последовательный процесс, зависящий от отрыва опухолевых клеток от первичной опухоли, перемещения с кровотоком и остановки на удаленном участке. В новом месте клетки организуют кровоснабжение и могут вырасти с образованием опасной для жизни массы. Как стимулирующие, так и ингибирующие молекулярные пути внутри опухолевой клетки регулируют это поведение, причем значимым является также взаимодействие между опухолевой клеткой и клетками-хозяевами на удаленном участке.
«Эффективное количество» представляет собой по меньшей мере минимальную концентрацию, необходимую для достижения измеримого улучшения или профилактики определенного расстройства. Эффективное количество в данном документе может варьироваться в зависимости от таких факторов, как степень развития заболевания, возраст, пол и масса тела пациента, а также способность антитела вызывать желаемый ответ у индивидуума. Кроме того, эффективным количеством является количество, при котором любые токсичные или вредные эффекты лечения перевешиваются благоприятными с терапевтической точки зрения эффектами. Для профилактического применения полезные или желаемые результаты включают такие результаты, как устранение или снижение риска, уменьшение тяжести или отодвигание во времени начала заболевания, включая биохимические, гистологические и/или поведенческие симптомы заболевания, его осложнения и промежуточные патологические фенотипы, презентуемые во время развития заболевания. Для терапевтического применения полезные или желаемые результаты включают клинические результаты, такие как уменьшение одного или большего количества симптомов, возникающих в результате заболевания, повышение качества жизни людей, страдающих этим заболеванием, уменьшение дозы других лекарственных средств, необходимых для лечения заболевания, повышение эффекта другого лекарственное средство, например, посредством нацеливания, замедление прогрессирования заболевания и/или увеличение продолжительности жизни. В случае рака или опухоли эффективное количество лекарственного средства может оказывать эффект в виде уменьшения количества раковых клеток; уменьшения размера опухоли; подавления (т.е., замедления до некоторой степени или, желательно, прекращения) инфильтрации раковых клеток в периферические органы; подавления (т.е., замедления развития до некоторой степени и, желательно, прекращения) метастазов опухолей; подавление до некоторой степени роста опухоли; и/или облегчение до некоторой степени одного или большего количества симптомов, связанных с расстройством. Эффективное количество можно вводить в один или большее количество приемов. Для целей данного изобретения эффективное количество лекарственного средства, соединения или фармацевтической композиции представляет собой количество, достаточное для проведения профилактического или терапевтического лечения, прямо или косвенно. Как будет понятно в клиническом контексте, эффективное количество лекарственного средства, соединения или фармацевтической композиции может быть достигнуто или может не быть достигнуто в сочетании с другим лекарственным средством, соединением или фармацевтической композицией. Таким образом, «эффективное количество» может рассматриваться в контексте введения одного или большего количества терапевтических агентов, причем один агент может считаться указанным в эффективном количестве, если в сочетании с одним или большим количеством других агентов желаемый результат может быть достигнут или достигается.
Используемый в данном документе термин «в сочетании с» относится к применению одного метода лечения в дополнение к другому методу лечения. Таким образом, «в сочетании с» относится к применению одного метода лечения до, во время или после применения другого метода лечения у индивидуума.
Используемый в данном документе термин «субъект» или «индивидуум» означает млекопитающее, включая, но не ограничиваясь этим, человека или млекопитающее, не относящееся к человеку, такое как жвачные животные, лошадиные, собачьи, овечьи или кошачьи. Предпочтительно, субъект является человеком. Согласно данному описанию, пациенты также являются субъектами.
«Химиотерапевтический агент» включает химические соединения, пригодные для лечения рака. Примеры химиотерапевтических агентов включают эрлотиниб (TARCEVA, Genentech/OSI Pharm.), бортезомиб (VELCADE, Millennium Pharm.), дисульфирам, эпигаллокатехина гидрат, салиноспорамид A, карфилзомиб, 17-AAG (гелданамицин), радицикол, лактатдегидрогеназа A (LDH-A), фулвестрант (FASLODEX, AstraZeneca), сунитиб (SUTENT, Pfizer/Sugen), летрозол (FEMARA, Novartis), иматиниба мезилат (GLEEVEC, Novartis), финасунат (VATALANIB, Novartis), оксалиплатин (ELOXATIN, Sanofi), 5-ФУ (5-FU) (5-фторурацил), лейковорин, рапамицин (Sirolimus, RAPAMUNE, Wyeth), лапатиниб (TYKERB, GSK572016, Glaxo Smith Kline), лонафамиб (SCH 66336), сорафениб (NEXAVAR, Bayer Labs), гефитиниб (IRESSA, AstraZeneca), AG1478, алкилирующие агенты, такие как тиотепа и циклофосфамид CYTOXAN; алкилсульфонаты, такие как бусульфан, имсульфан и пиросульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбоквон, метидопа и уредопа; этиленимины и метиламеламины, включая альтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметиломеламин; ацетогенины (особенно буллатацин и буллатацинон); камптотецин (включая топотекан и иринотекан); бриостатин; каллистатин; CC-1065 (включая синтетические аналоги адозелезина, карцелезина и бизелезина); криптофицины (в частности, криптофицин 1 и криптофицин 8); адренокортикостероиды (включая преднизон и преднизолон); ципротерона ацетат; 5α-редуктазы, включая финастерид и дутастерид); вориностат, ромадипсин, панобиностат, вальпроевая кислота, моцитиностат доластатин; алдеслейкин, тальк дуокармицин (включая синтетические аналоги, KW-2189 и CB1-TM1); элейтеробин; панкратистатин; саркодиктин; спонгистатин; соединения ипритного азота, такие как хлорамбуцил, хломафазин, хлорфосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлорэтамин, мехлорэтамина оксида гидрохлорид, мелфалан, новэмбихин, фенстерин, преднимустин, трофосфамид, урациловый иприт; производные нитрозомочевины, такие как кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин и ранимустин; антибиотики, такие как энедииновые антибиотики (например, калихеамицин, особенно калихеамицин γ1I и калихеамицин ω1I (Angew Chem. Int., Ed., 1994, 33: 183-186), динемицин, включая динемицин A, бисфосфонаты, такие как клодронат, эсперамицин; а также неокарциностатиновый хромофор и родственные хромофоры хромопротеиновых энедииновых антибиотиков), аклациномизины, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицины, кактиномицин, карабицин, каминомицин, карцинофилин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, ADRIAMYCIN (доксорубицин), морфолино-доксорубицин, цианоморфолино-доксорубицин, 2-пирролино-доксорубицин и дезоксидоксорубицин), эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марцелломицин, митомицины, такие как митомицин С, микофенольная кислота, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, порфиромицин, пуромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, циностатин, зорубицин; антиметаболиты, такие как метотрексат и 5-фторурацил (5-ФУ); аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; пуриновые аналоги, такие как флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин; пиримидиновые аналоги, такие как анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксфлуридин, эноцитабин, флоксуридин; андрогены, такие как калустерон, дромоностанола пропионат, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон; средства, угнетающие функцию надпочечников, такие как аминоглутетимид, митотан, трилостан; добавку для восполнения дефицита фолиевой кислоты, такую как фролиновая кислота; ацеглатон; альдофосфамидгликозид; аминолевулиновую кислоту; энилурацил; амсакрин; бестрабуцил; бисантрен; эдатраксат; дефофамин; демеколцин; диазиквон; элфомитин; эллиптиния ацетат; эпотилон; этоглюцид; нитрат галлия; гидроксимочевину; лентинан; лонидайнин; майтансиноиды, такие как майтансин и ансамитоцины; митогуазон; митоксантрон; мопидамнол; нитраэрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; лозоксантрон; подофиллиновую кислоту; 2-этилгидразид; прокарбазин; полисахаридный комплекс PSK (JHS Natural Products, Юджин, Орегон); разоксан; ризоксин; сизофуран; спирогерманий; тенуазоновую кислоту; триазиквон; 2,2',2''-трихлортриэтиламин; трихотецены (особенно токсин Т-2, верракурин А, роридин А и ангидин); уретан; виндезин; дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабинозид («Ара-С»); циклофосфамид; тиотепа; таксаны, например, TAXOL (паклитаксел, Bristol-Myers Squibb Oncology, Принстон, штат Нью-Джерси), ABRAXANE (без кремофора), композиций наночастиц паклитаксела с альбумином (American Pharmaceutical Partners, Шомберг, штат Иллинойс) и TAXOTERE (доцетаксел, доксетаксел, Sanofi-Aventis); хлорамбуцил; GEMZAR (гемцитабин); 6-тиогуанин; меркаптопурин; метотрексат; платиновые аналоги, такие как цисплатин и карбоплатин; винбластин; этопозид (VP-16); ифосфамид; митоксантрон; винкристин; NAVELBINE (винорелбин); новантрон; тенипозид; эдатрексат; дауномицин; аминоптерин; капецитабин (XELODA); ибандронат; СРТ-11; ингибитор топоизомеразы RFS 2000; дифторметилорнитин (DMFO); ретиноиды, такие как ретиноевая кислота; и фармацевтически приемлемые соли, кислоты и производные любого из вышеуказанных.
Кроме того, химиотерапевтическое средство включает (i) антигормональные агенты, действие которых направлено на регулирование или подавление действия гормонов на опухоли, такие как антиэстрогены и селективные модуляторы рецепторов эстрогенов (СМРЭ (SERM)), включая, например, тамоксифен (в том числе NOLVADEX, тамоксифена цитрат) ралоксифен, дролоксифен, йодоксифен, 4-гидрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, LY117018, онпристон и FARESTON (торемифина цитрат); (ii) ингибиторы ароматазы, которые ингибируют фермент ароматазу, регулирующую образование эстрогенов в надпочечниках, такие как, например, 4 (5)-имидазолы, аминоглутетимид, MEGASE (мегестрола ацетат), AROMASIN (экземестан, Pfizer) форместан, фадрозол, RIVISOR (ворозол), FEMARA (летрозол, Novartis) и ARIMIDEX (анастрозол, AstraZeneca); (iii) антиандрогены, такие как флутамид, нилутамид, бикалутамид, лейпролид и гозерелин; бусерелин, триптерелин, медроксипрогестерона ацетат, диэтилстильбэстрол, премарин, флуоксиместерон, полностью транс-ретиноновая кислота, фенретинид, а также трокацитабин (1,3-диоксоланнуклеозидный аналог цитозина); (iv) ингибиторы протеинкиназы; (v) ингибиторы липидкиназы; (vi) антисмысловые олигонуклеотиды, особенно те, которые подавляют экспрессию генов в сигнальных путях, участвующих в аберрантной пролиферации клеток, таких как, например, PKC-альфа, Ralf и H-Ras; (vii) рибозимы, такие как ингибиторы экспрессии фактора роста эндотелия сосудов, ФРЭС (VEGF) (например, ANGIOZYME) и ингибиторы экспрессии HER2; (viii) вакцины, такие как вакцины против генной терапии, например, ALLOVECTIN, LEUVECTIN и VAXID; PROLEUKIN, rIL-2; ингибитор топоизомеразы 1, такой как LURTOTECAN; ABARELIX rmRH; и (ix) фармацевтически приемлемые соли, кислоты и производные любого из вышеуказанных.
Химиотерапевтический агент также включает антитела, такие как алемтузумаб (Campath), бевацизумаб (AVASTIN, Genentech); цетуксимаб (ERBITUX, Imclone); панитумумаб (VECTIBIX, Amgen), ритуксимаб (RITUXAN, Genentech/Biogen Idec), пертузумаб (OMNITARG, 2C4, Genentech), трастузумаб (HERCEPTIN, Genentech), тозитумомаб (Bexxar, Corixia) и конъюгат антитела с лекарственным средством гемтузумаб озогамицин (MYLOTARG, Wyeth). Дополнительные гуманизированные моноклональные антитела с терапевтическим потенциалом в качестве агентов в сочетании с соединениями по изобретению включают: аполизумаб, азелизумаб, атлизумаб, бапинейзумаб, битазузумаб мертансин, кантузумаб мертансин, седелизумаб, сертолизумаб пегол, цидфузитузумаб, цидтузумаб, даклизумаб, экулизумаб, эфализумаб, эпратузумаб, эклизумаб, фелвизумаб, фонтолизумаб, гемтузумаб озогамицин, инотузумаб озогамицин, имилимумаб, лабетузумаб, линтузумаб, матузумаб, меполизумаб, мотавизумаб, мотовизумаб, натализумаб, нимотузумаб, ноловизумаб, нумавизумаб, окрелизумаб, омализумаб, паливизумаб, пасколизумаб, пекфузитузумаб, пектузумаб, пекселизумаб, раливизумаб, ранибизумаб, резливизуаб, резлизумаб, резивизуаб, ровелизумаб. Руплизумаб, сибротузумаб, сиплизумаб, сонтузумаб, такатузумаб тетраксетан, тадоцизумаб, тализумаб, тефибазумаб, тоцилизумаб, торализумаб, тукотузумаб целмолейкин, туцуситузумаб, умавизуаб, уртоксазумаб, устекинумаб, визилизумаб и анти-интерлейкин 12 (AB T-874/J695, Wyeth Research и Abbott Laboratories), который представляет собой рекомбинантное полноразмерное IgG1 λ антитело с исключительно человеческой последовательностью, генетически модифицированное для распознавания белка интерлейкин-12 ple40.
Дополнительно, химиотерапевтический агент включает «ингибиторы рецептора эпидермального фактора роста, РЭФР (EGFR)», которые относятся к соединениям, связывающимся с или иным образом взаимодействующим непосредственно с РЭФР (EGFR) и предотвращают или уменьшают его сигнальную активность и, в качестве альтернативы, упоминаются как «антагонист РЭФР (EGFR)». Примеры таких агентов включают антитела и молекулы небольшого размера, которые связываются с РЭФР (EGFR). Примеры антител, которые связываются с РЭФР (EGFR), включают MAb 579 (ATCC CRL HB 8506), MAb 455 (ATCC CRL HB8507), MAb 225 (ATCC CRL 8508), MAb 528 (ATCC CRL 8509) (см. патент США № 4943533, Mendelsohn et al.) и его варианты, такие как химеризованное 225 (C225 или Cetuximab, ERBUTIX) и реконструированное человеческое 225 (H225) (см. WO 96/40210, Imclone Systems Inc.); IMC-11F8, полностью человеческое, нацеленное на РЭФР (EGFR) антитело (Imclone); антитела, которые связываются с мутантным РЭФР (EGFR) типа II (патент США № 5212290); гуманизированные и химерные антитела, которые связываются с РЭФР (EGFR), как описано в патенте США № 5891996; и человеческие антитела, которые связываются с РЭФР (EGFR), такие как ABX-EGF или панитумумаб (см. WO98/50433, Abgenix/Amgen); EMD 55900 (Stragliotto et al., Eur. J. Cancer 32A: 636-640 (1996)); EMD7200 (матузумаб) гуманизированное антитело против РЭФР (EGFR), направленное против РЭФР (EGFR), которое конкурирует как с эпидермальным фактором роста, ЭФР (EGF), так и с трансформирующим фактором роста, ТФР (TGF)-альфа за связывание с РЭФР (EGFR) (EMD/Merck); человеческое антитело против РЭФР (EGFR), HuMax-EGFR (GenМab); полностью человеческие антитела, известные как E1.1, E2.4, E2.5, E6.2, E6.4, E2.11, E6.3 и Е7.6.3 и описанные в патенте США 6235883; MDX-447 (Medarex Inc); и mAb 806 или гуманизированное mAb 806 (Johns et al., J. Biol., Chem., 279 (29): 30375-30384 (2004)). Антитело против РЭФР (EGFR) можно конъюгировать с цитотоксическим агентом, создавая таким образом иммуноконъюгат (см., например, EP659439A2, Merck Patent GmbH). Антагонисты РЭФР (EGFR) включают в себя небольшие молекулы, такие как соединения, описанные в патентах США №№ 5616582, 5457105, 5475001, 5654307, 5679683, 6084095, 6265410, 6455534, 6521620, 6596726, 6713484, 5770599, 6133332, 5866572, 6399602, 6344459, 6602863, 6391874, 6344455, 5760041, 6002008 и 5747498, а также следующие публикации РСТ: WO 98/14451, WO98/50038, WO99/09016 и WO 99/24037. Конкретные низкомолекулярные антагонисты РЭФР (EGFR) включают OSI-774 (CP-358774, эрлотиниб, TARCEVA Genentech/OSI Pharmaceuticals); PD 183805 (CI 1033, 2-пропенамид, N-[4-[(3-хлор-4-фторфенил)амино]-7-[3-(4-морфолинил)пропокси]-6-хиназолинил]-, дигидрохлорид, Pfizer Inc.); ZD1839, гефитиниб (IRESSA) 4-(3'-хлор-4'-фторанилино)-7-метокси-6-(3-морфолинопропокси)хиназолин, AstraZeneca); ZM 105180 ((6-амино-4-(3-метилфениламино)-хиназолин, Zeneca), BIBX-1382 (N8-(3-хлор-4-фторфенил)-N2-(1-метилпиперидин-4-ил)пиримидо[5,4-d]пиримидин-2,8-диамин, Boehringer Ingelheim), PKI-166 ((R)-4-[4-[(1-фенилэтил)амино]-1H-пирроло[2,3-d]пиримидин-6-ил]фенола), (R)-6-(4-гидроксифенил)-4-[(1-фенилэтил)амино]-7H-пирроло[2,3-d]пиримидин); CL-387785 (N-[4-[(3-бромфенил)амино]-6-хиназолинил]-2-бутинамид); EKB-569 (N- [4-[(3-хлор-4-фторфенил)амино]-3-циано-7-этокси-6-хинолинил]-4-(диметиламино)-2-бутенамид) (Wyeth); AG1478 (Pfizer); AG1571 (SU 5271, Pfizer); двойные ингибиторы тирозинкиназы РЭФР (EGFR)/HER2, такие как лапатиниб (TYKERB, GSK572016 или N-[3-хлор-4-[(3-фторфенил)метокси]фенил]-6[5[[[2-метилсульфонил]этил]амино]метил]-2-фуранил]-4-хиназолинамин).
Химиотерапевтические агенты также включают «ингибиторы тирозинкиназы», включая препараты, нацеленные на РЭФР (EGFR), отмеченные в предыдущем абзаце; низкомолекулярный ингибитор тирозинкиназы HER2, такой как TAK165, доступный от Takeda; CP-724,714, селективный ингибитор рецепторной тирозинкиназы ErbB2 для перорального применения (Pfizer и OSI); ингибиторы двойного HER, такие как EKB-569 (доступный от Wyeth), которые предпочтительно связываются с РЭФР (EGFR), но подавляют клетки, чрезмерно экспрессирующие как HER2, так и РЭФР (EGFR); лапатиниб (GSK572016, доступный от Glaxo-SmithKline), ингибитор тирозинкиназы РЭФР (EGFR) и HER2 для перорального применения; PKI-166 (доступен от Novartis); ингибиторы pan-HER, такие как канертиниб (CI-1033; Pharmacia); ингибиторы Raf-1, такие как антисмысловой агент ISIS-5132, доступный от ISIS Pharmaceuticals, которые ингибируют передачу сигналов Raf-1; не нацеленные на HER ингибиторы TK, такие как мезилат иматиниба (GLEEVEC, доступный от Glaxo SmithKline); мультиспецифические ингибиторы тирозинкиназы, такие как сунитиниб (SUTENT, доступный от Pfizer); ингибиторы рецепторной тирозинкиназы ФРЭС (VEGF), такие как ваталаниб (PTK787/ZK222584, доступный от Novartis/Schering AG); MAPK ингибитор внеклеточной регулируемой киназы I CI-1040 (доступен от Pharmacia); хиназолины, такие как PD 153035,4-(3-хлоранилино)хиназолин; пиридопиримидины; пиримидопиримидины; пирролпиримидины, такие как CGP 59326, CGP 60261 и CGP 62706; пиразолпиримидины, 4-(фениламино)-7H-пирроло[2,3-d]пиримидины; куркумин (диферулоилметан, 4,5-бис(4-фторанилино)фталимид); тирфостины, содержащие нитротиофеновые фрагменты; PD-0183805 (Warner-Lamber); антисмысловые молекулы (например, такие, которые связываются с кодирующей HER нуклеиновой кислотой); хиноксалины (патент США № 5804396); трифостины (патент США № 5804396); ZD6474 (Astra Zeneca); PTK-787 (Novartis/Schering AG); ингибиторы pan-HER, такие как CI-1033 (Pfizer); аффинитак (ISIS 3521; Isis/Lilly); иматиниба мезилат (GLEEVEC); PKI 166 (Novartis); GW2016 (Glaxo SmithKline); CI-1033 (Pfizer); EKB-569 (Wyeth); семаксиниб (Pfizer); ZD6474 (AstraZeneca); PTK-787 (Novartis/Schering AG); INC-1C11 (Imclone), рапамицин (сиролимус, RAPAMUNE); или описанные в любой из следующих патентных публикаций: патент США № 5804396; WO 1999/09016 (American Cyanamid); WO 1998/43960 (American Cyanamid); WO 1997/38983 (Warner Lambert); WO 1999/06378 (Warner Lambert); WO 1999/06396 (Warner Lambert); WO 1996/30347 (Pfizer, Inc); WO 1996/33978 (Zeneca); WO 1996/3397 (Zeneca) и WO 1996/33980 (Zeneca).
Кроме того, химиотерапевтические агенты включают дексаметазон, интерфероны, колхицин, метоприн, циклоспорин, амфотерицин, метронидазол, алемтузумаб, алитретиноин, аллопуринол, амифостин, триоксид мышьяка, аспарагиназу, живую БЦЖ (BCG), бевацузимаб, бексаротин, кладрибин, клофарабин, дарбепоэтин альфа, денилейкин, дексазоксан, эпоэтин альфа, элотиниб, филграстим, гистерелина ацетат, ибритумомаб, интерферон альфа-2а, интерферон альфа-2b, леналидомид, левамизол, месна, метоксазален, нандролон, неларабин, нофетумомаб, опрелвекин, палифермин, памидронат, пегадемазу, пегаспаргазу, пегфилграстим, пеметрексед динатрий, пликамицин, порфимер натрий, хинакрин, расбуриказу, сарграмостим, темозоломид, VM-26, 6-TG, торемифен, третиноин, полностью транс-ретиноевую кислоту, ПТРК (ATRA), валрубицин, золедронат и золедроновую кислоту и их фармацевтически приемлемые соли.
Дополнительно, химиотерапевтические агенты включают гидрокортизон, гидрокортизона ацетат, кортизона ацетат, тиксокотола пивалат, триамцинолона ацетамид, мометазон, амцинонид, будесонид, десонид, флуоцинонид, флуоцинолон ацетонид, бетаметазон, бетаметазона натрия фосфат, дексаметазон, дексаметазона натрия фосфат, флуокортолон, гидрокортизон-17-бутират, гидрокортизон-17-валерат, аклометазона дипропионат, бетаметазона валерат, бетаметазона дипропионат, предникарбат, клобетазон-17-бутират, клобетазол-17-пропионат, флуокортолона капроат, флуокортолона пивалат и флупреднидена ацетат; иммунные селективные противовоспалительные пептиды (ИмСПВП (ImSAID)), такие как фенилаланин-глутамин-глицин (ФГГ (FEG)) и его D-изомерная форма (feG) (IMULAN BioTherapeutics, LLC); противоревматические препараты, такие как азатиоприн, циклоспорин (циклоспорин A), D-пеницилламин, соли золота, гидроксихлорохин, лефлуномид, миноциклин, сульфасалазин, блокаторы опухолевого некротического фактора альфа (TNFα), такие как этанерсепт (Enbrel), инфликсимаб (Remicade), адалимумаб (Humira), сертолизумаб пегол (Cimzia), голимумаб (Simponi), блокаторы интерлейкина 1 (IL-1), такие как анакинра (Kineret), блокаторы костимуляции Т-клеток, такие как абатасепт (Orencia), блокаторы интерлейкина 6 (IL-6), такие как тоцилизумаб (ACTEMERA); блокаторы интерлейкина 13 (IL-13), такие как лебрикизумаб; блокаторы интерферона альфа (IFN), такие как ронтализумаб; блокаторы бета-7-интегрина, такие как rhuMAb Beta7; блокаторы путей IgE, такие как анти-M1 прайм; секретируемый гомотримерный LTa3 и мембраносвязанные гетеротример LTa1/β2-блокаторы, такие как анти-лимфотоксин альфа (LTa); радиоактивные изотопы (например, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 и радиоактивные изотопы Lu); различные исследуемые агенты, такие как тиоплатин, PS-341, фенилбутират, ET-18-OCH3 или ингибиторы фарнезилтрансферазы (L-739749, L-744832); полифенолы, такие как кверцетин, ресвератрол, пицатаннол, эпигаллокатехина галлат, теафлавины, флаванолы, процианидины, бетулиновая кислота и их производные; ингибиторы аутофагии, такие как хлорохин; дельта-9-тетрагидроканнабинол (дронабинол, MARINOL); бета-лапахон; лапахол; колхицины; бетулиновую кислоту; ацетилкамптотецин, скополектин и 9-аминокамптотецин); подофиллотоксин; тегафур (UFTORAL); бексаротин (TARGRETIN); бисфосфонаты, такие как клодронат (например, BONEFOS или OSTAC), этидронат (DIDROCAL), NE-58095, золедроновая кислота/золедронат (ZOMETA), алендронат (FOSAMAX), памидронат (AREDIA), тилудронат (SKELID) или ризедронат (ACTONEL); и рецептор эпидермального фактора роста (EGF-R); вакцины, такие как вакцина THERATOPE; перифозин, ингибитор ЦОГ-2 (например, целекоксиб или эторикоксиб), ингибитор протеосомы (например, PS341); CCI-779; типифарниб (R11577); орафениб, ABT510; ингибитор Bcl-2, такой как облимерсен натрий (GENASENSE); пиксантрон; ингибиторы фарнезилтрансферазы, такие как лонафарниб (SCH 6636, SARASARTM); и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из вышеуказанных; а также комбинации двух или более из вышеуказанных, таких как CHOP, сокращенное обозначение комбинированной терапии циклофосфамидом, доксорубицином, винкристином и преднизолоном; и FOLFOX, сокращенное обозначение схемы лечения оксалиплатином (ELOXATINTM) в сочетании с 5-ФУ (5-FU) и лейковорином.
Химиотерапевтические агенты также включают нестероидные противовоспалительные препараты с болеутоляющим, жаропонижающим и противовоспалительным действием. НПВП включают неселективные ингибиторы фермента циклооксигеназы. Конкретные примеры НПВП включают аспирин, производные пропионовой кислоты, такие как ибупрофен, фенопрофен, кетопрофен, флурбипрофен, оксапрозин и напроксен, производные уксусной кислоты, такие как индометацин, сулиндак, этодолак, диклофенак, производные енольной кислоты, такие как пироксикам, мелоксикам, теноксикам, дроксикам, лорноксикам и изоксикам, производные фенаминовой кислоты, такие как мефенамовая кислота, меклофенамовая кислота, флуфенамовая кислота, тофенамовая кислота и ингибиторы СОХ-2, такие как целекоксиб, эторикоксиб, люмиракоксиб, парекоксиб, рофекоксиб, рофекоксиб и вальдекоксиб. НПВС могут быть показаны для симптоматического облегчения таких состояний, как ревматоидный артрит, остеоартрит, воспалительные артропатии, анкилозирующий спондилоартрит, псориатический артрит, синдром Рейтера, острая подагра, дисменорея, метастатическая боль в костях, головная боль и мигрень, послеоперационная боль, легкая и умеренная боль вследствие воспаления и повреждения тканей, повышенная температура, кишечная непроходимость и почечная колика.

Используемый в данном документе термин «цитокин» в общем случае относится к белкам, высвобождаемым одной клеточной популяцией, которые действуют на другую клетку в качестве межклеточных медиаторов или оказывают аутокринное действие на клетки, вырабатывающие белки. Примеры таких цитокинов включают лимфокины, монокины; интерлейкины (ИЛ (IL)), такие как IL-1, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17A-F, с IL-18 по IL-29 (например, IL-23), IL-31, в том числе PROLEUKIN rIL-2; опухолевый некротический фактор, такой как TNF-α или TNF-β, TGF-β1-3; и другие полипептидные факторы, включая фактор, ингибирующий лейкоз (ФИЛ («LIF»)), цилиарный нейротрофический фактор (ЦНТФ («CNTF»)), ЦНТФ (CNTF)-подобный цитокин (ЦПЦ («CLC»)), кардиотрофин (КТ («CT»)) и kit лиганд (КЛ («KL»)).
Используемый в данном документе термин «хемокин» относится к растворимым факторам (например, цитокинам), которые обладают способностью избирательно индуцировать хемотаксис и активацию лейкоцитов. Кроме того, они запускают процессы ангиогенеза, воспаления, заживления ран и образования опухолей. Примеры хемокинов включают IL-8, человеческий гомолог хемоаттрактанта кератиноцитов (ХК (KC)) мыши.
«Процент идентичности аминокислотных последовательностей ( %)» относительно референтной полипептидной последовательности определяется как процент аминокислотных остатков в потенциальной последовательности, которые идентичны аминокислотным остаткам в референтной полипептидной последовательности после выравнивания последовательностей и введения гэпов, если это необходимо, для достижения максимального процента идентичности последовательности и без учета каких-либо консервативных замен как части идентичности последовательностей. Выравнивание для целей определения процента идентичности аминокислотных последовательностей может быть достигнуто различными способами, которые входят в компетенцию специалиста в данной области техники, например, с применением общедоступного компьютерного программного обеспечения, такого как программное обеспечение BLAST, BLAST-2, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области техники могут определить соответствующие параметры для выравнивания последовательностей, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей. Однако для целей данного изобретения значения идентичности последовательностей аминокислот генерируются с применением компьютерной программы сравнения последовательностей ALIGN-2. Компьютерная программа сравнения последовательностей ALIGN-2 была создана Genentech, Inc., а исходный код был подан с пользовательской документацией в Бюро регистрации авторских прав США, Вашингтон, округ Колумбия, 20559, где он зарегистрирован под регистрационным № авторских прав США TXU510087. Программа ALIGN-2 общедоступна в Genentech, Inc., Южный Сан-Франциско, штат Калифорния, или может быть скомпилирована из исходного кода. Программа ALIGN-2 должна быть скомпилирована для применения в операционной системе UNIX, включая цифровой UNIX V4.0D. Все параметры сравнения последовательностей задаются программой ALIGN-2 и не меняются.
В ситуациях, когда ALIGN-2 используется для сравнения аминокислотных последовательностей, идентичность аминокислотных последовательностей для данной аминокислотной последовательности A относительно или против данной аминокислотной последовательности B (которая может, в качестве альтернативы, быть выражена как данная аминокислота последовательность А, которая имеет или содержит определенную аминокислотную последовательность, идентичную относительно или против данной аминокислотной последовательности В), вычисляют следующим образом:
100 умножить на дробь X/Y
где X  количество аминокислотных остатков, отмеченных как идентичные совпадения программой выравнивания последовательностей ALIGN-2 в выравнивании этой программой A и B, а Y  общее количество аминокислотных остатков в B. Необходимо понимать, что если длина аминокислотной последовательности А не равна длине аминокислотной последовательности В, то % идентичности аминокислотной последовательности А относительно В не будет равен % идентичности аминокислотной последовательности В относительно А. Если в тексте прямо не указано обратное, то все % значения идентичности аминокислотных последовательностей, используемые в данном документе, получают, как описано в предыдущем абзаце, с применением компьютерной программы ALIGN-2.
Выражение «фармацевтически приемлемый» указывает на то, что вещество или композиция должны быть совместимы, с химической и/или токсикологической точки зрения, с другими ингредиентами, составляющими препарат, и/или с организмом млекопитающего, подлежащего лечению им.
Используемый в данном документе термин «введение» означает способ введения дозы соединения (например, анти-TIGIT антитела по изобретению или нуклеиновой кислоты, кодирующей анти-TIGIT антитело по изобретению) или композиции (например, фармацевтической композиции, например фармацевтической композиции, содержащей анти-TIGIT антитело по изобретению) субъекту. Композиции, применяемые в описанных в данном документе способах, можно вводить, например, внутривенно, внутримышечно, интравитреально (например, путем интравитреальной инъекции), в виде глазных капель, внутрикожно, трансдермально, внутриартериально, внутрибрюшинно, внутриочагово, интракраниально, внутрисуставно, в предстательную железу, интратрахеально, интратекально, интраназально, интравагинально, интраректально, применять местно, в опухоль, в брюшную полость, подкожно, субконъюнктивально, интравезикулярно, на слизистую, интраперикардеально, в пупочную вену, в глаз, интраорбитально, перорально, местно, трансдермально, путем ингаляции, путем инъекции, путем имплантации, путем инфузии, путем непрерывной инфузии, путем локализованной перфузии, непосредственно омывающей целевые клетки, с помощью катетера, с помощью лаважа, в виде кремов или липидных композиций. Кроме того, композиции, применяемые в описанных в данном документе способах, можно вводить системно или применять местно. Способ введения может варьироваться в зависимости от различных факторов (например, вводимого соединения или композиции и тяжести состояния, заболевания или расстройства, подлежащего лечению).
Используемый в данном документе термин «вектор» предназначен для обозначения молекулы нуклеиновой кислоты, способной переносить другую нуклеиновую кислоту, с которой она связана. Один тип вектора представляет собой «плазмиду», которая относится к циклической двухцепочечной петле ДНК, в которую могут быть лигированы дополнительные сегменты ДНК. Другим типом вектора является фаговый вектор. Другим типом вектора является вирусный вектор, в котором дополнительные сегменты ДНК могут быть лигированы в вирусный геном. Некоторые векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую их вводят (например, бактериальные векторы, содержащие бактериальный источник репликации и эписомальные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомальные векторы млекопитающих) могут быть интегрированы в геном клетки-хозяина при введении в клетку-хозяина и, таким образом, реплицируются вместе с геномом хозяина. Более того, некоторые векторы способны направлять экспрессию генов, с которыми они функционально связаны. Такие векторы упоминаются в данном документе как «рекомбинантные векторы экспрессии» (или просто «рекомбинантные векторы» или «векторы экспрессии»). В общем, векторы экспрессии, пригодные для способов рекомбинантной ДНК, часто находятся в форме плазмид. В данном описании «плазмида» и «вектор» могут использоваться взаимозаменяемо.
Используемый в данном документе термин «около» относится к обычному диапазону ошибок для соответствующего значения, хорошо известному специалисту в данной области техники. Ссылка на «около» значения или параметра в данном документе включает (и описывает) варианты осуществления изобретения, которые направлены на это значение или параметр как таковой.
III. Типичные анти-TIGIT антитела
Изобретение относится к анти-TIGIT антителам, пригодным для лечения или замедления прогрессирования рака или заболевания, связанного с иммунной системой (например, дисфункциональные расстройства Т-клеток) у субъекта (например, человека).
В одном примере анти-TIGIT антитела связываются с эпитопом на TIGIT человека, содержащим один или большее количество аминокислотных остатков (например, 1, 2 или 3 аминокислотных остатка), выбранных из группы, состоящей из Ser78, Ser80 и Lys82 TIGIT человека. Например, в некоторых случаях анти-TIGIT антитела связываются с эпитопом на TIGIT человека, содержащим аминокислотные остатки Ser80 и Lys82. В некоторых случаях анти-TIGIT антитела связываются с эпитопом на TIGIT человека, содержащим аминокислотные остатки Ser78 и Ser80. В некоторых случаях анти-TIGIT антитела связываются с эпитопом на TIGIT человека, содержащим аминокислотные остатки Ser78 и Lys82. В некоторых случаях анти-TIGIT антитела связываются с эпитопом на TIGIT человека, содержащим аминокислотные остатки Ser78, Ser80 и Lys82.
В некоторых случаях анти-TIGIT антитела связываются с эпитопом на TIGIT человека, который содержит, помимо Ser78, Ser80 и/или Lys82, остаток Ala67 TIGIT человека. В некоторых случаях анти-TIGIT антитела связываются с эпитопом на TIGIT человека, содержащим Ser78 и Ala67; Ser80 и Ala67; Lys82 и Ala67; Ser78, Ser80 и Ala67; Ser78, Lys82 и Ala67; Ser80, Lys82 и Ala67; или Ser78, Ser80, Lys82 и Ala67.
В некоторых случаях анти-TIGIT антитела связываются с эпитопом на TIGIT человека, который содержит, помимо Ser78, Ser80 и/или Lys82, один или большее количество дополнительных аминокислотных остатков (например, 1, 2 или 3 аминокислотных остатка), выбранных из группы, состоящей из Glu60, Leu65 и Ile68 TIGIT человека. В некоторых случаях анти-TIGIT антитела связываются с эпитопом на TIGIT человека, который содержит Ser78 и Glu60; Ser80 и Glu60; Lys82 и Glu60; Ser78 и Leu65; Ser80 и Leu65; Lys82 и Leu65; Ser78 и Ile68; Ser80 и Ile68; Lys82 и Ile68. В некоторых случаях анти-TIGIT антитела связываются с эпитопом на TIGIT человека, который содержит Ser78, Ser80 и Glu60; Ser78, Ser80 и Leu65; Ser78, Ser80 и Ile68; Ser80, Lys82 и Glu60; Ser80, Lys82 и Leu65; Ser80, Lys82 и Ile68; Ser78, Lys82 и Glu60; Ser78, Lys82 и Leu65; Ser78, Lys82 и Ile68. В некоторых случаях анти-TIGIT антитела связываются с эпитопом на TIGIT человека, который содержит Ser78, Ser80, Lys82 и Glu60; Ser78, Ser80, Lys82 и Leu65; Ser78, Ser80, Lys82 и Ile68. В некоторых случаях анти-TIGIT антитела связываются с эпитопом на TIGIT человека, который содержит Glu60, Leu65 и Ser78; Glu60, Leu65 и Ser80; Glu60, Leu65 и Lys82; Leu65, Ile68 и Ser78; Leu65, Ile68 и Ser80; Leu65, Ile68 и Lys82; Glu60, Ile68 и Ser78; Glu60, Ile68 и Ser80; Glu60, Ile68 и Lys82. В некоторых случаях анти-TIGIT антитела связываются с эпитопом на TIGIT человека, который содержит Glu60, Leu65, Ile68 и Ser78; Glu60, Leu65, Ile68 и Ser80; Glu60, Leu65, Ile68 и Lys82. В некоторых случаях анти-TIGIT антитела связываются с эпитопом на TIGIT человека, который содержит Glu60, Leu65, Ser78 и Ser80; Glu60, Leu65, Ser78 и Lys82; Glu60, Leu65, Ser80 и Lys82; Leu65, Ile68, Ser78 и Ser80; Leu65, Ile68, Ser78 и Lys82; Leu65, Ile68, Ser80 и Lys82; Leu65, Glu60, Ser78 и Ser80; Leu65, Glu60, Ser78 и Lys82; Leu65, Glu60, Ser80 и Lys82. В некоторых случаях анти-TIGIT антитела связываются с эпитопом на TIGIT человека, который содержит Glu60, Leu65, Ser78, Ser80 и Lys82; Leu65, Ile68, Ser78, Ser80 и Lys82; Glu60, Leu65, Ser78, Ser80 и Lys82. В некоторых случаях анти-TIGIT антитела связываются с эпитопом на TIGIT человека, который содержит Ser78, Ser80, Glu60, Leu65 и Ile68; Ser78, Lys82, Glu60, Leu65 и Ile68; Ser80 и Lys82, Glu60, Leu65 и Ile68. В некоторых случаях анти-TIGIT антитела связываются с эпитопом на TIGIT человека, который содержит Ser78, Ser80, Lys82, Glu60, Leu65 и Ile68.
В некоторых случаях анти-TIGIT антитела связываются с эпитопом на TIGIT человека, который содержит, помимо Ser78, Ser80 и Lys82, один или большее количество дополнительных аминокислотных остатков (например, 1, 2, 3 или 4 аминокислотных остатка), выбранных из группы, состоящей из Gln56, Asn70, Leu73 и His111 TIGIT человека. В некоторых случаях анти-TIGIT антитела связываются с эпитопом на TIGIT человека, который содержит Ser78, Ser80, Lys82 и Gln56; Ser78, Ser80, Lys82 и Asn70; Ser78, Ser80, Lys82 и Leu73; Ser78, Ser80, Lys82 и His111. В некоторых случаях анти-TIGIT антитела связываются с эпитопом на TIGIT человека, который содержит Ser78, Ser80, Lys82, Gln56 и Asn70; Ser78, Ser80, Lys82, Gln56 и Leu73; Ser78, Ser80, Lys82, Gln56 и His111; Ser78, Ser80, Lys82, Asn70 и Leu73; Ser78, Ser80, Lys82, Asn70 и His111; Ser78, Ser80, Lys82, Leu73 и His111. В некоторых случаях анти-TIGIT антитела связываются с эпитопом на TIGIT человека, который содержит Ser78, Ser80, Lys82, Gln56, Asn70 и Leu73; Ser78, Ser80, Lys82, Gln56, Asn70 и His111; Ser78, Ser80, Lys82, Gln56, Leu73 и His111; Ser78, Ser80, Lys82, Asn70, Leu73 и His111. В некоторых случаях анти-TIGIT антитела связываются с эпитопом на TIGIT человека, который содержит Ser78, Ser80, Lys82, Gln56, Asn70, Leu73 и His111. В некоторых случаях анти-TIGIT антитела связываются с эпитопом на TIGIT человека, который содержит, кроме Ser78, Ser80 и/или Lys82, один или большее количество дополнительных аминокислотных остатков (например, 1, 2 или 3 аминокислотных остатка), выбранных из группы, состоящей из Thr55, Asn58, Asp63, Gln64, His76, Ile77 и Pro79 TIGIT человека.
В некоторых случаях анти-TIGIT антитела связываются с эпитопом на TIGIT человека, который содержит аминокислотные остатки Thr55, Gln56, Asn58, Glu60, Asp63, Gln64, Leu65, Ala67, Ile68, Asn70, Leu73, His76, Ile77, Ser78, Pro79, Ser80, Lys82 и His111 TIGIT человека. В некоторых случаях анти-TIGIT антитела связываются с эпитопом на TIGIT человека, который состоит из аминокислотных остатков Thr55, Gln56, Asn58, Glu60, Asp63, Gln64, Leu65, Ala67, Ile68, Asn70, Leu73, His76, Ile77, Ser78, Pro79, Ser80, Lys82 и His111 TIGIT человека.
В другом примере анти-TIGIT антитела связываются с эпитопом на TIGIT человека, содержащим один или большее количество аминокислотных остатков (например, 1, 2 или 3 аминокислотных остатка), выбранных из группы, состоящей из Thr55, Ser80 и Lys82 TIGIT человека. Например, в некоторых случаях анти-TIGIT антитела связываются с эпитопом на TIGIT человека, содержащим аминокислотный остаток Lys82. В некоторых случаях анти-TIGIT антитела связываются с эпитопом на TIGIT человека, содержащим аминокислотные остатки Ser80 и Lys82. В некоторых случаях анти-TIGIT антитела связываются с эпитопом на TIGIT человека, содержащим аминокислотные остатки Thr55 и Ser80. В некоторых случаях анти-TIGIT антитела связываются с эпитопом на TIGIT человека, содержащим аминокислотные остатки Thr55 и Lys82. В некоторых случаях анти-TIGIT антитела связываются с эпитопом на TIGIT человека, содержащим аминокислотные остатки Thr55, Ser80 и Lys82.
В некоторых случаях анти-TIGIT антитела связываются с эпитопом на TIGIT человека, который содержит, помимо Thr55, Ser80 и/или Lys82, остаток Gln56 TIGIT человека. В некоторых случаях анти-TIGIT антитела связываются с эпитопом на TIGIT человека, содержащим Thr55 и Gln56; Ser80 и Gln56; Lys82 и Gln56; Thr55, Ser80 и Gln56; Thr55, Lys82 и Gln56; Ser80, Lys82 и Gln56; или Thr55, Ser80, Lys82 и Gln56.
В некоторых случаях анти-TIGIT антитела связываются с эпитопом на TIGIT человека, который содержит, помимо Thr55, Ser80 и/или Lys82, один или большее количество дополнительных аминокислотных остатков (например, 1, 2 или 3 аминокислотных остатка), выбранных из группы, состоящей из Asn58, Glu60, Ile77 и Pro79 TIGIT человека. В некоторых случаях анти-TIGIT антитела связываются с эпитопом на TIGIT человека, который содержит Thr55 и Asn58; Thr55 и Glu60; Ser80 и Asn58; Ser80 и Glu60; Lys82 и Asn58; Lys82 и Glu60; Thr55 и Ile77; Ser80 и Ile77; Lys82 и Ile77; Thr55 и Pro79; Ser80 и Pro79; Lys82 и Pro79. В некоторых случаях анти-TIGIT антитела связываются с эпитопом на TIGIT человека, который содержит Thr55, Ser80 и Asn58; Thr55, Ser80 и Glu60; Thr55, Ser80 и Ile77; Thr55, Ser80 и Pro79; Ser80, Lys82 и Asn58; Ser80, Lys82 и Glu60; Ser80, Lys82 и Ile77; Ser80, Lys82 и Pro79; Thr55, Lys82 и Asn58; Thr55, Lys82 и Glu60; Thr55, Lys82 и Ile77; Thr55, Lys82 и Pro79. В некоторых случаях анти-TIGIT антитела связываются с эпитопом на TIGIT человека, который содержит Thr55, Ser80, Lys82 и Asn58; Thr55, Ser80, Lys82 и Glu60; Thr55, Ser80, Lys82 и Ile77; Thr55, Ser80, Lys82 и Pro79. В некоторых случаях анти-TIGIT антитела связываются с эпитопом на TIGIT человека, который содержит Asn58, Ile77 и Thr55; Glu60, Ile77 и Thr55; Asn58, Ile77 и Ser80; Glu60, Ile77 и Ser80; Asn58, Ile77 и Lys82; Glu60, Ile77 и Lys82; Ile77, Pro79 и Thr55; Ile77, Pro79 и Ser80; Ile77, Pro79 и Lys82; Glu60, Pro79 и Thr55; Asn58, Pro79 и Ser80; Glu60, Pro79 и Ser80; Asn58, Pro79 и Lys82; Glu60, Pro79 и Lys82. В некоторых случаях анти-TIGIT антитела связываются с эпитопом на TIGIT человека, который содержит Asn58, Ile77, Pro79 и Thr55; Glu60, Ile77, Pro79 и Thr55; Asn58, Ile77, Pro79 и Ser80; Glu60, Ile77, Pro79 и Ser80; Asn58, Ile77, Pro79 и Lys82; Glu60, Ile77, Pro79 и Lys82. В некоторых случаях анти-TIGIT антитела связываются с эпитопом на TIGIT человека, который содержит Asn58, Ile77, Thr55 и Ser80; Glu60, Ile77, Thr55 и Ser80; Asn58, Ile77, Thr55 и Lys82; Glu60, Ile77, Thr55 и Lys82; Asn58, Ile77, Ser80 и Lys82; Glu60, Ile77, Ser80 и Lys82; Ile77, Pro79, Thr55 и Ser80; Ile77, Pro79, Thr55 и Lys82; Ile77, Pro79, Ser80 и Lys82; Ile77, Asn58, Thr55 и Ser80; Ile77, Glu60, Thr55 и Ser80; Ile77, Asn58, Thr55 и Lys82; Ile77, Asn58, Thr55 и Lys82; Ile77, Glu60, Thr55 и Lys82; Ile77, Asn58, Ser80 и Lys82; Ile77, Glu60, Ser80 и Lys82. В некоторых случаях анти-TIGIT антитела связываются с эпитопом на TIGIT человека, который содержит Asn58, Ile77, Thr55, Ser80 и Lys82; Glu60, Ile77, Thr55, Ser80 и Lys82; Ile77, Pro79, Thr55, Ser80 и Lys82; Asn58, Ile77, Thr55, Ser80 и Lys82; Glu60, Ile77, Thr55, Ser80 и Lys82. В некоторых случаях анти-TIGIT антитела связываются с эпитопом на TIGIT человека, который содержит Thr55, Ser80, Asn58, Ile77 и Pro79; Thr55, Ser80, Glu60, Ile77 и Pro79; Thr55, Lys82, Asn58, Ile77 и Pro79; Thr55, Lys82, Glu60, Ile77 и Pro79; Ser80, Lys82, Asn58, Ile77 и Pro79; и Ser80, Lys82, Glu60, Ile77 и Pro79. В некоторых случаях анти-TIGIT антитела связываются с эпитопом на TIGIT человека, который содержит Thr55, Ser80, Lys82, Glu60, Ile77 и Pro79. В некоторых случаях анти-TIGIT антитела связываются с эпитопом на TIGIT человека, который содержит Thr55, Ser80, Lys82, Asn58, Ile77 и Pro79. В некоторых случаях анти-TIGIT антитела связываются с эпитопом на TIGIT человека, который содержит Thr55, Asn58, Glu60, Ile77, Pro79, Ser80 и Lys82.
В некоторых случаях анти-TIGIT антитела связываются с эпитопом на TIGIT человека, который содержит, помимо Thr55, Ser80 и Lys82, один или большее количество дополнительных аминокислотных остатков (например, 1, 2, 3, 4, 5 или 6 аминокислотных остатков), выбранных из группы, включающей Leu65, Ile68, Leu73, His76, Ser78 и His111, дополнительно содержит аминокислотные остатки Leu65, Ile68, Leu73, His76, Ser78 и His111 TIGIT человека.
В некоторых случаях анти-TIGIT антитела связываются с эпитопом на TIGIT человека, который содержит аминокислотные остатки Thr55, Gln56, Asn58, Glu60, Leu65, Ile68, Leu73, His76, Ile77, Ser78, Pro79, Ser80, Lys82 и His111 TIGIT человека. В некоторых случаях анти-TIGIT антитела связываются с эпитопом на TIGIT человека, который состоит из аминокислотных остатков Thr55, Gln56, Asn58, Glu60, Leu65, Ile68, Leu73, His76, Ile77, Ser78, Pro79, Ser80, Lys82 и His111 TIGIT человека.
В некоторых случаях любое из анти-TIGIT антител, описанных выше, может содержать паратоп, который содержит один или большее количество аминокислотных остатков (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, или 12 аминокислотных остатков), выбранных из группы, состоящей из аминокислотных остатков вариабельного участка тяжелой цепи Asn32, Tyr52, Arg52b, Phe53, Lys54, Tyr56, Asp58, Tyr99, Asp100, Leu100a, Leu100b и Ala100c и/или одной или нескольких аминогрупп (например, 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотных остатков), выбранных из группы, состоящей из аминокислотных остатков вариабельного участка легкой цепи Tyr27d, Tyr92, Ser93, Thr94 и Phe96.
В некоторых случаях анти-TIGIT антитела могут содержать паратоп, который состоит из аминокислотных остатков вариабельного участка тяжелой цепи Asn32, Tyr52, Arg52b, Phe53, Lys54, Tyr56, Asp58, Tyr99, Asp100, Leu100a, Leu100b и Ala100c и аминокислотных остатков вариабельного участка легкой цепи Tyr27d, Tyr92, Ser93, Thr94 и Phe96.
В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-TIGIT антитело по изобретению обеспечивает уникальные контакты с аминокислотами TIGIT человека на расстоянии 4,5 ангстрема, 3,7 ангстрема, 3,5 ангстрема, 3,25 ангстрема, 3,00 ангстрема, 2,75 ангстрема или менее. В некоторых вариантах осуществления изобретения предлагается антитело, которое связывается с эпитопом, состоящим из одной, двух, трех, четырех или пяти аминокислот TIGIT человека на расстоянии 4,5 ангстрема, 3,7 ангстрема, 3,5 ангстрема, 3,25 ангстрема, 3,00 ангстрема, 2,75 ангстрема или меньше. В одном варианте осуществления изобретения анти-TIGIT антитело по изобретению обеспечивает уникальные контакты с аминокислотами TIGIT человека на расстоянии 3,7 ангстрема или менее. В некоторых вариантах осуществления изобретения предлагается антитело, которое связывается с эпитопом, состоящим из одной, двух, трех, четырех или пяти аминокислот TIGIT человека на расстоянии 3,7 ангстрема или менее.
В некоторых случаях любое из вышеуказанных анти-TIGIT антител содержит по меньшей мере один, два, три, четыре, пять или шесть ГВУ (HVR), выбранных из (a) HVR-H1, содержащего аминокислотную последовательность SNSAAWN (SEQ ID NO: 1); (b) HVR-H2, содержащего аминокислотную последовательность KTYYRFKWYSDYAVSVKG (SEQ ID NO: 2); (c) HVR-H3, содержащего аминокислотную последовательность ESTTYDLLAGPFDY (SEQ ID NO: 3); (d) HVR-L1, содержащего аминокислотную последовательность KSSQTVLYSSNNKKYLA (SEQ ID NO: 4); (e) HVR-L2, содержащего аминокислотную последовательность WASTRES (SEQ ID NO: 5); и/или (f) HVR-L3, содержащего аминокислотную последовательность QQYYSTPFT (SEQ ID NO: 6), или комбинацию одного или большего количества вышеуказанных ГВУ (HVR) и одного или большего количества их вариантов, обладающих по меньшей мере около 90 % идентичности последовательности (например, идентичностью 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) любой из SEQ ID NO: 1-6. В некоторых случаях любое из вышеуказанных анти-TIGIT антител содержит (a) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SNSAAWN (SEQ ID NO: 1); (b) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность KTYYRFKWYSDYAVSVKG (SEQ ID NO: 2); (c) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность ESTTYDLLAGPFDY (SEQ ID NO: 3); (d) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность KSSQTVLYSSNNKKYLA (SEQ ID NO: 4); (e) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность WASTRES (SEQ ID NO: 5); и (f) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность QQYYSTPFT (SEQ ID NO: 6), такую как содержится в анти-TIGIT антителе 4.1D3 и его производных (например, 4.1D3.Q1E). В некоторых случаях анти-TIGIT антитело может содержать домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, идентичностью последовательности по меньшей мере 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно последовательности SEQ ID NO: 34 или 35 и/или VL-домена, содержащего аминокислотную последовательность, обладающую идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, идентичностью последовательности по меньшей мере 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно последовательности SEQ ID NO: 36. В некоторых случаях антитело анти-TIGIT может содержать домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, идентичностью последовательности по меньшей мере 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно последовательности SEQ ID NO: 34 и/или VL-домена, содержащего аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 90 % идентичностью последовательности (например, идентичностью последовательности по меньшей мере 91 %, 92 %, 93 % 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно последовательности SEQ ID NO: 36. В конкретном случае анти-TIGIT антитело может представлять собой 4.1D3.Q1E или его производное или родственный клон. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело может содержать домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, идентичностью последовательности по меньшей мере 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно последовательности SEQ ID NO: 35 и/или VL-домена, содержащего аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 90 % идентичностью последовательности (например, идентичностью последовательности по меньшей мере 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно последовательности SEQ ID NO: 36. В конкретном случае анти-TIGIT антитело может представлять собой 4.1D3 или его производное или родственный клон.
В некоторых случаях антитело дополнительно содержит по меньшей мере один, два, три или четыре из следующих каркасных участков (КУ ) вариабельного участка легкой цепи: FR-L1, содержащий аминокислотную последовательность DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC (SEQ ID NO: 7); FR-L2, содержащий аминокислотную последовательность WYQQKPGQPPNLLIY (SEQ ID NO: 8); FR-L3, содержащий аминокислотную последовательность GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC (SEQ ID NO: 9); и/или FR-L4, содержащий аминокислотную последовательность FGPGTKVEIK (SEQ ID NO: 10), или комбинацию одного или большего количества из вышеуказанных КУ и одного или большего количества их вариантов, обладающих идентичностью последовательности по меньшей мере около 90 % (например, идентичностью 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно любой из SEQ ID NO: 7-10. В некоторых случаях, например, антитело дополнительно содержит FR-L1, содержащий аминокислотную последовательность DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC (SEQ ID NO: 7); FR-L2, содержащий аминокислотную последовательность WYQQKPGQPPNLLIY (SEQ ID NO: 8); FR-L3, содержащий аминокислотную последовательность GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC (SEQ ID NO: 9); и FR-L4, содержащий аминокислотную последовательность FGPGTKVEIK (SEQ ID NO: 10), такую как анти-TIGIT антитела 4.1D3.Q1E и 4.1D3.
1
1
В некоторых случаях антитело дополнительно содержит по меньшей мере один, два, три или четыре из следующих КУ участков вариабельного участка тяжелой цепи: FR-H1, содержащий аминокислотную последовательность XVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVS (SEQ ID NO: 11), где X представляет собой Q или E; FR-H2, содержащий аминокислотную последовательность WIRQSPSRGLEWLG (SEQ ID NO: 12); FR-H3, содержащий аминокислотную последовательность RITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVFYCTR (SEQ ID NO: 13); и/или FR-H4, содержащий аминокислотную последовательность WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 14), или комбинацию одного или большего количества из вышеуказанных КУ и одного или большего количества его вариантов, обладающих идентичностью последовательности по меньшей мере около 90 % (например, идентичностью 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно любой из SEQ ID NO: 11-14. Анти-TIGIT антитело может дополнительно содержать, например, по меньшей мере один, два, три или четыре из следующих КУ участков вариабельного участка тяжелой цепи: FR-H1, содержащий аминокислотную последовательность EVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVS (SEQ ID NO: 15); FR-H2, содержащий аминокислотную последовательность WIRQSPSRGLEWLG (SEQ ID NO: 12); FR-H3, содержащий аминокислотную последовательность RITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVFYCTR (SEQ ID NO: 13); и/или FR-H4, содержащий аминокислотную последовательность WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 14), или комбинацию одного или большего количества из вышеуказанных КУ и одного или большего количества их вариантов, обладающих идентичностью последовательности по меньшей мере около 90 % (например, идентичностью 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно любой из SEQ ID NO: 12-15. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит FR-H1, содержащий аминокислотную последовательность EVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVS (SEQ ID NO: 15); FR-H2, содержащий аминокислотную последовательность WIRQSPSRGLEWLG (SEQ ID NO: 12); FR-H3, содержащий аминокислотную последовательность RITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVFYCTR (SEQ ID NO: 13); и FR-H4, содержащий аминокислотную последовательность WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 14), такую как антитело 4.1D3.Q1E. В другом случае, например, анти-TIGIT антитело может дополнительно содержать по меньшей мере один, два, три или четыре из следующих КУ FR-H1 вариабельного участка тяжелой цепи: FR-H1, содержащий аминокислотную последовательность QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVS (SEQ ID NO: 16); FR-H2, содержащий аминокислотную последовательность WIRQSPSRGLEWLG (SEQ ID NO: 12); FR-H3, содержащий аминокислотную последовательность RITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVFYCTR (SEQ ID NO: 13); и/или FR-H4, содержащий аминокислотную последовательность WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 14), или комбинацию одного или большего количества из вышеуказанных КУ и одного или большего количества их вариантов, обладающих идентичностью последовательности по меньшей мере около 90 % (например, идентичностью 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно любой из SEQ ID NO: 12-14 и 16. В некоторых случаях, анти-TIGIT антитело содержит FR-H1, содержащий аминокислотную последовательность QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVS (SEQ ID NO: 16); FR-H2, содержащий аминокислотную последовательность WIRQSPSRGLEWLG (SEQ ID NO: 12); FR-H3, содержащий аминокислотную последовательность RITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVFYCTR (SEQ ID NO: 13); и FR-H4, содержащий аминокислотную последовательность WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 14), такую как содержится в антителе 4.1D3.
В другом примере, в изобретении предлагаются анти-TIGIT антитела, которые связываются с эпитопом на TIGIT человека, содержащим один или большее количество аминокислотных остатков (например, 1, 2 или 3 аминокислотных остатка), выбранных из группы, состоящей из Gln53, His111 и Tyr113 TIGIT человека. Например, в некоторых случаях анти-TIGIT антитела связываются с эпитопом на TIGIT человека, содержащим аминокислотные остатки His111 и Tyr113. В некоторых случаях анти-TIGIT антитела связываются с эпитопом на TIGIT человека, содержащим аминокислотные остатки Gln53 и His111. В некоторых случаях анти-TIGIT антитела связываются с эпитопом на TIGIT человека, содержащим аминокислотные остатки Gln53 и Tyr113. В некоторых случаях анти-TIGIT антитела связываются с эпитопом на TIGIT человека, содержащим аминокислотные остатки Gln53, His111 и Tyr113.
В некоторых случаях анти-TIGIT антитела связываются с эпитопом на TIGIT человека, который содержит, помимо Gln53, His111 и/или Tyr113, остаток Gln56 TIGIT человека. В некоторых случаях анти-TIGIT антитела связываются с эпитопом на TIGIT человека, содержащим Gln53 и Gln56; His111 и Gln56; Tyr113 и Gln56; Gln53, His111 и Gln56; Gln53, Tyr113 и Gln56; His111, Tyr113 и Gln56; или Gln53, His111, Tyr113 и Gln56.
В некоторых случаях анти-TIGIT антитела связываются с эпитопом на TIGIT человека, который дополнительно содержит Gln53, His111, Tyr113 и/или Gln56 и один или большее количество дополнительных аминокислотных остатков (например, 1, 2, 3, 4, 5 или 6 аминокислотных остатков), выбранных из группы, состоящей из Glu60, Leu65, Ile68, Asn70, Leu73 и His76 TIGIT человека. Например, в некоторых случаях анти-TIGIT антитела связываются с эпитопом на TIGIT человека, содержащим Gln53, His111, Tyr113, Gln56 и Glu60; Gln53, His111, Tyr113, Gln56 и Leu65; Gln53, His111, Tyr113, Gln56 и Ile68; Gln53, His111, Tyr113, Gln56 и Asn70; Gln53, His111, Tyr113, Gln56 и Leu73; Gln53, His111, Tyr113, Gln56 и His76. В некоторых случаях анти-TIGIT антитела связываются с эпитопом на TIGIT человека, содержащим Gln53, His111, Tyr113, Gln56, Glu60 и Leu65; Gln53, His111, Tyr113, Gln56, Glu60 и Ile68; Gln53, His111, Tyr113, Gln56, Glu60 и Asn70; Gln53, His111, Tyr113, Gln56, Glu60 и Leu73; Gln53, His111, Tyr113, Gln56, Glu60 и His76. В некоторых случаях анти-TIGIT антитела связываются с эпитопом на TIGIT человека, содержащим Gln53, His111, Tyr113, Gln56, Glu60, Leu65 и Ile68; Gln53, His111, Tyr113, Gln56, Glu60, Leu65 и Asn70; Gln53, His111, Tyr113, Gln56, Glu60, Leu65 и Leu73; Gln53, His111, Tyr113, Gln56, Glu60, Leu65 и His76. В некоторых случаях анти-TIGIT антитела связываются с эпитопом на TIGIT человека, содержащим Gln53, His111, Tyr113, Gln56, Glu60, Ile68 и Asn70; Gln53, His111, Tyr113, Gln56, Glu60, Ile68 и Leu73; Gln53, His111, Tyr113, Gln56, Glu60, Ile68 и His76. В некоторых случаях анти-TIGIT антитела связываются с эпитопом на TIGIT человека, содержащим Gln53, His111, Tyr113, Gln56, Glu60, Asn70 и Leu73; Gln53, His111, Tyr113, Gln56, Glu60, Asn70 и His76. В некоторых случаях анти-TIGIT антитела связываются с эпитопом на TIGIT человека, содержащим Gln53, His111, Tyr113, Gln56, Glu60, Leu73 и His76. В некоторых случаях анти-TIGIT антитела связываются с эпитопом на TIGIT человека, содержащим Gln53, His111, Tyr113, Gln56, Glu60, Leu65, Ile68 и Asn70; Gln53, His111, Tyr113, Gln56, Glu60, Leu65, Ile68 и Leu73; Gln53, His111, Tyr113, Gln56, Glu60, Leu65, Ile68 и His76. В некоторых случаях анти-TIGIT антитела связываются с эпитопом на TIGIT человека, содержащим Gln53, His111, Tyr113, Gln56, Glu60, Ile68, Asn70 и Leu73; Gln53, His111, Tyr113, Gln56, Glu60, Ile68, Asn70 и His76. В некоторых случаях анти-TIGIT антитела связываются с эпитопом на TIGIT человека, содержащим Gln53, His111, Tyr113, Gln56, Glu60, Leu65, Ile68, Asn70 и Leu73; Gln53, His111, Tyr113, Gln56, Glu60, Leu65, Ile68, Asn70 и His76; Gln53, His111, Tyr113, Gln56, Glu60, Ile68, Asn70, Leu73 и His76. В некоторых случаях анти-TIGIT антитела связываются с эпитопом на TIGIT человека, содержащим Gln53, His111, Tyr113, Gln56, Glu60, Leu65, Ile68, Asn70, Leu73 и His76.
В некоторых случаях анти-TIGIT антитела связываются с эпитопом на TIGIT человека, содержащим Gln53, His111, Tyr113, Gln56, Leu65 и Ile68; Gln53, His111, Tyr113, Gln56, Leu65 и Asn70; Gln53, His111, Tyr113, Gln56, Leu65 и Leu73; Gln53, His111, Tyr113, Gln56, Leu65 и His76. В некоторых случаях анти-TIGIT антитела связываются с эпитопом на TIGIT человека, содержащим Gln53, His111, Tyr113, Gln56, Leu65, Ile68 и Asn70; Gln53, His111, Tyr113, Gln56, Leu65, Ile68 и Leu73; Gln53, His111, Tyr113, Gln56, Leu65, Ile68 и Asn70; Gln53, His111, Tyr113, Gln56, Leu65, Ile68 и His76. В некоторых случаях анти-TIGIT антитела связываются с эпитопом на TIGIT человека, содержащим Gln53, His111, Tyr113, Gln56, Leu65, Asn70 и Leu73; Gln53, His111, Tyr113, Gln56, Leu65, Asn70 и His76. В некоторых случаях анти-TIGIT антитела связываются с эпитопом на TIGIT человека, содержащим Gln53, His111, Tyr113, Gln56, Leu65, Leu73 и His76. В некоторых случаях анти-TIGIT антитела связываются с эпитопом на TIGIT человека, содержащим Gln53, His111, Tyr113, Gln56, Leu65, Ile68, Asn70 и Leu73; Gln53, His111, Tyr113, Gln56, Leu65, Ile68, Asn70 и His76. В некоторых случаях анти-TIGIT антитела связываются с эпитопом на TIGIT человека, содержащим Gln53, His111, Tyr113, Gln56, Leu65, Asn70, Leu73 и His76. В некоторых случаях анти-TIGIT антитела связываются с эпитопом на TIGIT человека, содержащим Gln53, His111, Tyr113, Gln56, Leu65, Ile68, Asn70, Leu73 и His76.
В некоторых случаях анти-TIGIT антитела связываются с эпитопом на TIGIT человека, содержащим Gln53, His111, Tyr113, Gln56, Ile68 и Asn70; Gln53, His111, Tyr113, Gln56, Ile68 и Leu73; Gln53, His111, Tyr113, Gln56, Ile68 и His76. В некоторых случаях анти-TIGIT антитела связываются с эпитопом на TIGIT человека, содержащим Gln53, His111, Tyr113, Gln56, Ile68, Asn70 и Leu73; Gln53, His111, Tyr113, Gln56, Ile68, Asn70 и His76; Gln53, His111, Tyr113, Gln56, Ile68, Leu73 и His76. В некоторых случаях анти-TIGIT антитела связываются с эпитопом на TIGIT человека, содержащим Gln53, His111, Tyr113, Gln56, Ile68, Asn70, Leu73 и His76.
В некоторых случаях анти-TIGIT антитела связываются с эпитопом на TIGIT человека, содержащим Gln53, His111, Tyr113, Gln56, Asn70 и Leu73; Gln53, His111, Tyr113, Gln56, Asn70 и His76. В некоторых случаях анти-TIGIT антитела связываются с эпитопом на TIGIT человека, содержащим Gln53, His111, Tyr113, Gln56, Asn70, Leu73 и His76. В некоторых случаях анти-TIGIT антитела связываются с эпитопом на TIGIT человека, содержащим Gln53, His111, Tyr113, Gln56, Leu73 и His76.
1
1
1
В некоторых случаях любое из анти-TIGIT антител предыдущего примера содержит по меньшей мере один, два, три, четыре, пять или шесть ГВУ (HVR), выбранных из (a) HVR-H1, содержащего аминокислотную последовательность SYPMN (SEQ ID NO: 17); (b) HVR-H2, содержащего аминокислотную последовательность WINTNTGNPTYVQGFTG (SEQ ID NO: 18); (c) HVR-H3, содержащего аминокислотную последовательность TGGHTYDSYAFDV (SEQ ID NO: 19); (d) HVR-L1, содержащего аминокислотную последовательность RASQVISSSLA (SEQ ID NO: 20); (e) HVR-L2, содержащего аминокислотную последовательность AASTLQS (SEQ ID NO: 21); и/или (f) HVR-L3, содержащего аминокислотную последовательность QHLHGYPXN (SEQ ID NO: 22), где X представляет собой C или S, или комбинацию одного или большего количества вышеуказанных ГВУ (HVR) и одного или большего количества их вариантов, обладающих идентичностью последовательности по меньшей мере около 90 % (например, идентичностью 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно любой из SEQ ID NO: 17-22. В некоторых случаях любое из вышеуказанных анти-TIGIT антител из предшествующего примера может содержать, например, (а) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SYPMN (SEQ ID NO: 17); (b) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность WINTNTGNPTYVQGFTG (SEQ ID NO: 18); (c) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность TGGHTYDSYAFDV (SEQ ID NO: 19); (d) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность RASQVISSSLA (SEQ ID NO: 20); (e) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность AASTLQS (SEQ ID NO: 21); и (f) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность QHLHGYPXN (SEQ ID NO: 22), такую как содержится в анти-TIGIT антителе 7.4A3 и его производных (например, 7.4A3.C96S.Q1E). В некоторых случаях анти-TIGIT антитело может содержать (a) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SYPMN (SEQ ID NO: 17); (b) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность WINTNTGNPTYVQGFTG (SEQ ID NO: 18); (c) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность TGGHTYDSYAFDV (SEQ ID NO: 19); (d) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность RASQVISSSLA (SEQ ID NO: 20); (e) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность AASTLQS (SEQ ID NO: 21); и (f) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность QHLHGYPSN (SEQ ID NO: 23), такую как содержится в анти-TIGIT антителе 7.4A3.C96S.Q1E. В других случаях анти-TIGIT антитело может содержать (a) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SYPMN (SEQ ID NO: 17); (b) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность WINTNTGNPTYVQGFTG (SEQ ID NO: 18); (c) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность TGGHTYDSYAFDV (SEQ ID NO: 19); (d) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность RASQVISSSLA (SEQ ID NO: 20); (e) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность AASTLQS (SEQ ID NO: 21); и (f) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность QHLHGYPCN (SEQ ID NO: 28), такую как содержится в анти-TIGIT антителе 7.4A3.
В некоторых случаях анти-TIGIT антитело может содержать домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, идентичностью последовательности по меньшей мере 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно последовательности SEQ ID NO: 37 и/или VL-домена, содержащего аминокислотную последовательность, обладающую идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, идентичностью последовательности по меньшей мере 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно последовательности SEQ ID NO: 38. В конкретном случае анти-TIGIT антитело может представлять собой 7.4A3.C96S.Q1E или его производное или родственный клон. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело может содержать домен VH, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, идентичностью последовательности по меньшей мере 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно последовательности SEQ ID NO: 39 и/или VL-домена, содержащего аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 90 % идентичностью последовательности (например, идентичностью последовательности по меньшей мере 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно последовательности SEQ ID NO: 40. В конкретном случае анти-TIGIT антитело может представлять собой 7.4A3 или его производное или родственный клон.
В некоторых случаях антитело дополнительно содержит по меньшей мере один, два, три или четыре из следующих каркасных участков (КУ) вариабельного участка легкой цепи: DIQLTQSPTFLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 30); FR-L2, содержащий аминокислотную последовательность WYQQNPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 31); FR-L3, содержащий аминокислотную последовательность GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFVTYYC (SEQ ID NO: 32); и/или FR-L4, содержащий аминокислотную последовательность FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 33), или комбинацию одного или большего количества из вышеуказанных КУ и одного или большего количества их вариантов, обладающих идентичностью последовательности по меньшей мере около 90 % (например, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно любой из SEQ ID NO: 30-33, такую как содержатся в анти-TIGIT антителе 7.4A3 и его производных (например, 7.4A3.C96S.Q1E).
В некоторых случаях антитело дополнительно содержит по меньшей мере один, два, три или четыре из следующих КУ участков вариабельного участка тяжелой цепи: FR-H1, содержащий аминокислотную последовательность EVQLVQSGSDLKKPGASVRVSCKASGYTFT (SEQ ID NO: 24) или аминокислотную последовательность QVQLVQSGSDLKKPGASVRVSCKASGYTFT (SEQ ID NO: 29); FR-H2, содержащий аминокислотную последовательность WVRQAPGHGLEWMG (SEQ ID NO: 25); FR-H3, содержащий аминокислотную последовательность RFVFSLDTSVNTAYLQISSLKAEDTAVYFCAR (SEQ ID NO: 26); и/или FR-H4, содержащий аминокислотную последовательность WGQGTMVTVSS (SEQ ID NO: 27), или комбинацию одного или большего количества из вышеуказанных КУ и одного или большего количества его вариантов, обладающих идентичностью последовательности по меньшей мере около 90 % (например, идентичностью 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно любой из SEQ ID NO: 24-27 и 29. Анти-TIGIT антитело может дополнительно содержать, например, по меньшей мере один, два, три или четыре из следующих КУ участков вариабельного участка тяжелой цепи: FR-H1, содержащий аминокислотную последовательность EVQLVQSGSDLKKPGASVRVSCKASGYTFT (SEQ ID NO: 24); FR-H2, содержащий аминокислотную последовательность WVRQAPGHGLEWMG (SEQ ID NO: 25); FR-H3, содержащий аминокислотную последовательность RFVFSLDTSVNTAYLQISSLKAEDTAVYFCAR (SEQ ID NO: 26); и/или FR-H4, содержащий аминокислотную последовательность WGQGTMVTVSS (SEQ ID NO: 27), или комбинацию одного или большего количества из вышеуказанных КУ и одного или большего количества их вариантов, обладающих идентичностью последовательности по меньшей мере около 90 % (например, идентичностью 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно любой из SEQ ID NO: 24-27. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит FR-H1, содержащий аминокислотную последовательность EVQLVQSGSDLKKPGASVRVSCKASGYTFT (SEQ ID NO: 24); FR-H2, содержащий аминокислотную последовательность WVRQAPGHGLEWMG (SEQ ID NO: 25); FR-H3, содержащий аминокислотную последовательность RFVFSLDTSVNTAYLQISSLKAEDTAVYFCAR (SEQ ID NO: 26); и FR-H4, содержащий аминокислотную последовательность WGQGTMVTVSS (SEQ ID NO: 27), такой как содержится в антителе 7,4A3.C96S.Q1E. В другом случае, например, анти-TIGIT антитело может дополнительно содержать по меньшей мере один, два, три или четыре из следующих КУ участков вариабельного участка тяжелой цепи: FR-H1, содержащий аминокислотную последовательность QVQLVQSGSDLKKPGASVRVSCKASGYTFT (SEQ ID NO: 29); FR-H2, содержащий аминокислотную последовательность WVRQAPGHGLEWMG (SEQ ID NO: 25); FR-H3, содержащий аминокислотную последовательность RFVFSLDTSVNTAYLQISSLKAEDTAVYFCAR (SEQ ID NO: 26); и/или FR-H4, содержащий аминокислотную последовательность WGQGTMVTVSS (SEQ ID NO: 27), или комбинацию одного или большего количества из вышеуказанных КУ и одного или большего количества их вариантов, обладающих идентичностью последовательности по меньшей мере около 90 % (например, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно любой из SEQ ID NO: 25-27 и 29. В некоторых случаях, анти-TIGIT антитело содержит FR-H1, содержащий аминокислотную последовательность QVQLVQSGSDLKKPGASVRVSCKASGYTFT (SEQ ID NO: 29); FR-H2, содержащий аминокислотную последовательность WVRQAPGHGLEWMG (SEQ ID NO: 25); FR-H3, содержащий аминокислотную последовательность RFVFSLDTSVNTAYLQISSLKAEDTAVYFCAR (SEQ ID NO: 26); и FR-H4, содержащий аминокислотную последовательность WGQGTMVTVSS (SEQ ID NO: 27), такую как содержится в анти-TIGIT антителе против 7.4А3.
1
1
1
1
В другом примере, в изобретении предлагаются анти-TIGIT антитела, которые содержат по меньшей мере один, два, три, четыре, пять или шесть ГВУ (HVR), выбранных из (a) HVR-H1, содержащего аминокислотную последовательность NYPMN (SEQ ID NO: 41); (b) HVR-H2, содержащего аминокислотную последовательность WINTNTGSPAYAQDFTE (SEQ ID NO: 42); (c) HVR-H3, содержащего аминокислотную последовательность TAITSVYHFDY (SEQ ID NO: 43); (d) HVR-L1, содержащего аминокислотную последовательность RASQGISSYLA (SEQ ID NO: 44); (e) HVR-L2, содержащего аминокислотную последовательность GATTLQS (SEQ ID NO: 45); и/или (f) HVR-L3, содержащего аминокислотную последовательность QKLNSHPXS (SEQ ID NO: 46), где X представляет собой C, S или Y или комбинацию одного или большего количества из вышеуказанных ГВУ (HVR) и одного или большего количества их вариантов, обладающих по меньшей мере около 90 % идентичностью последовательностей (например, идентичностью 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно одной из SEQ ID NO: 41-46. В некоторых случаях любое из вышеуказанных анти-TIGIT-антител из предшествующего примера может содержать, например, (а) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность NYPMN (SEQ ID NO: 41); (b) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность WINTNTGSPAYAQDFTE (SEQ ID NO: 42); (c) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность TAITSVYHFDY (SEQ ID NO: 43); (d) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность RASQGISSYLA (SEQ ID NO: 44); (e) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность GATTLQS (SEQ ID NO: 45); и (f) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность QKLNSHPXS (SEQ ID NO: 46), где X представляет собой C, S или Y, такой как содержится в анти-TIGIT антителе 4.1A4 и его производных (например, 4.1A4.C96S.Q1E и 4.1A4.C96Y.Q1E). В некоторых случаях анти-TIGIT антитело может содержать (a) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность NYPMN (SEQ ID NO: 41); (b) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность WINTNTGSPAYAQDFTE (SEQ ID NO: 42); (c) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность TAITSVYHFDY (SEQ ID NO: 43); (d) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность RASQGISSYLA (SEQ ID NO: 44); (e) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность GATTLQS (SEQ ID NO: 45); и (f) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность QKLNSHPCS (SEQ ID NO: 47), такой как содержится в анти-TIGIT антителе 4.1A4. В других случаях анти-TIGIT антитело может содержать (a) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность NYPMN (SEQ ID NO: 41); (b) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность WINTNTGSPAYAQDFTE (SEQ ID NO: 42); (c) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность TAITSVYHFDY (SEQ ID NO: 43); (d) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность RASQGISSYLA (SEQ ID NO: 44); (e) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность GATTLQS (SEQ ID NO: 45); и (f) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность QKLNSHPSS (SEQ ID NO: 48), такой содержится в анти-TIGIT антителе 4.1A4.C96S.Q1E. В других случаях анти-TIGIT антитело может содержать (a) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность NYPMN (SEQ ID NO: 41); (b) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность WINTNTGSPAYAQDFTE (SEQ ID NO: 42); (c) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность TAITSVYHFDY (SEQ ID NO: 43); (d) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность RASQGISSYLA (SEQ ID NO: 44); (e) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность GATTLQS (SEQ ID NO: 45); и (f) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность QKLNSHPYS (SEQ ID NO: 49), такой как содержится в анти-TIGIT антителе 4.1A4.C96Y.Q1E.
В некоторых случаях антитело дополнительно содержит по меньшей мере одну, две, три или четыре из следующих каркасных участков (КУ) вариабельного участка легкой цепи: FR-L1, содержащий аминокислотную последовательность DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 56); FR-L2, содержащий аминокислотную последовательность WYQQKPGKAPRVLIY (SEQ ID NO: 57); FR-L3, содержащий аминокислотную последовательность GVPSRFSGSESGTEFTLTISSLQPEDLATYYC (SEQ ID NO: 58); и/или FR-L4, содержащий аминокислотную последовательность FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 59), или комбинацию одного или большего количества из вышеуказанных КУ и одного или большего количества их вариантов, обладающих идентичностью последовательности по меньшей мере около 90 % (например, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно любой из SEQ ID NO: 56-59, такой, как содержится в анти-TIGIT антителе 4.1A4 и его производных (например, 1A4.C96S.Q1E и 1A4.C96Y.Q1E).
1
1
В некоторых случаях антитело дополнительно содержит по меньшей мере один, два, три или четыре из следующих КУ участков вариабельного участка тяжелой цепи: FR-H1, содержащий аминокислотную последовательность XVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTLT (SEQ ID NO: 50), где X представляет собой E или Q; FR-H2, содержащий аминокислотную последовательность WVRQAPGRGLEWMG (SEQ ID NO: 51); FR-H3, содержащий аминокислотную последовательность RFVFSLDTSVTTAYLQISSLKAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 52); и/или FR-H4, содержащий аминокислотную последовательность WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 53), или комбинацию одного или большего количества из вышеуказанных КУ и одного или большего количества их вариантов, обладающих идентичностью последовательности по меньшей мере около 90 % (например, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно любой из SEQ ID NO: 50-53. Анти-TIGIT антитело может дополнительно содержать, например, по меньшей мере один, два, три или четыре из следующих КУ участков вариабельного участка тяжелой цепи: FR-H1, содержащий аминокислотную последовательность QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTLT (SEQ ID NO: 54); FR-H2, содержащий аминокислотную последовательность WVRQAPGRGLEWMG (SEQ ID NO: 51); FR-H3, содержащий аминокислотную последовательность RFVFSLDTSVTTAYLQISSLKAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 52); и/или FR-H4, содержащий аминокислотную последовательность WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 53), или комбинацию одного или большего количества из вышеуказанных КУ и одного или большего количества их вариантов, обладающих идентичностью последовательности по меньшей мере около 90 % (например, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно любой из SEQ ID NO: 51-54, -TIGIT антитело 4.1A4. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит FR-H1, содержащее аминокислотную последовательность EVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTLT (SEQ ID NO: 55); FR-H2, содержащий аминокислотную последовательность WVRQAPGRGLEWMG (SEQ ID NO: 51); FR-H3, содержащий аминокислотную последовательность RFVFSLDTSVTTAYLQISSLKAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 52); и/или FR-H4, содержащий аминокислотную последовательность WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 53), или комбинацию одного или большего количества из вышеуказанных КУ и одного или большего количества его вариантов, обладающих идентичностью последовательности по меньшей мере около 90 % (например, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно любой из SEQ ID NO: 51-53 и 55, такой, как содержится в анти-TIGIT антителе 1A4.C96S.Q1E или 1A4.C96Y.Q1E.
В другом примере изобретение предусматривает анти-TIGIT антитела, которые содержат по меньшей мере один, два, три, четыре, пять или шесть ГВУ (HVR), выбранных из (a) HVR-H1, содержащего аминокислотную последовательность TYGMGVS (SEQ ID NO: 68); (b) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SIWWNGNTYYNPSLKS (SEQ ID NO: 69); (c) HVR-H3, содержащего аминокислотную последовательность TGGAVITWFAY (SEQ ID NO: 70); (d) HVR-L1, содержащего аминокислотную последовательность KASQSVGKNIA (SEQ ID NO: 71); (e) HVR-L2, содержащего аминокислотную последовательность YASNRYT (SEQ ID NO: 72); и/или (f) HVR-L3, содержащего аминокислотную последовательность QHIYNSPYP (SEQ ID NO: 73), или комбинацию одного или большего количества из вышеуказанных ГВУ (HVR) и одного или большего количества их вариантов, обладающих идентичностью последовательности по меньшей мере около 90 % (например, идентичностью 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно любой из SEQ ID NO: 68-73. В некоторых случаях любое из вышеуказанных анти-TIGIT антител из предыдущего примера может содержать, например, (a) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность TYGMGVS (SEQ ID NO: 68); (b) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SIWWNGNTYYNPSLKS (SEQ ID NO: 69); (c) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность TGGAVITWFAY (SEQ ID NO: 70); (d) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность KASQSVGKNIA (SEQ ID NO: 71); (e) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность YASNRYT (SEQ ID NO: 72); и (f) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность QHIYNSPYP (SEQ ID NO: 73), такой как содержащийся в анти-TIGIT антителе rat6B2 и его производных (например, h6B2.L1H1, h6B2.L2H1, h6B2.L1H2, h6B2.L1H3, h6B2.L1H4, h6B2.L1H5 и h6B2.L2H5).
1
2
3
4
5
6
7
1
2
3
4
5
6
7
1
2
1
2
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
1
2
1
2
В некоторых случаях антитело дополнительно содержит по меньшей мере один, два, три или четыре из следующих каркасных участков (КУ) вариабельного участка легкой цепи: FR-L1, содержащий аминокислотную последовательность XIXMTQSPXSXSXSVGDRVTXXC (SEQ ID NO: 88), где X представляет собой D или N; X представляет собой Q или V; X представляет собой K или S; X представляет собой L или M; X представляет собой A или I; X представляет собой I или M; и X представляет собой N или T; FR-L2, содержащий аминокислотную последовательность WYQQKPGXX PKLLIY (SEQ ID NO: 89), где X представляет собой K или Q, а X представляет собой A или S; FR-L3, содержащий аминокислотную последовательность GVPXRFXGXGSGTDFTXTIXXXQXEDXAXXYC (SEQ ID NO: 90), где X представляет собой D или S; X представляет собой S или T; X представляет собой G или S; X представляет собой F или L; X представляет собой N или S; X представляет собой S или T; X представляет собой L или V; X представляет собой A или P; X представляет собой A или I; X представляет собой F или T; и X представляет собой F или Y; и/или FR-L4, содержащий аминокислотную последовательность FGXGTKXEIK (SEQ ID NO: 91), где X представляет собой Q или T и X представляет собой L или V или комбинацию одного или большего количества из вышеуказанных КУ и один или большее количество их вариантов, обладающих идентичностью последовательности по меньшей мере около 90 % (например, идентичностью 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно любой из SEQ ID NO: 88-91, такой как обладает анти-TIGIT антитело rat6B2 и его производных (например, h6B2.L1H1, h6B2.L2H1, h6B2.L1H2, h6B2.L1H3, h6B2.L1H4, h6B2.L1H5 и h6B2.L2H5). Анти-TIGIT антитело может дополнительно содержать, например, по меньшей мере один, два, три или четыре из следующих КУ участков вариабельного участка легкой цепи: FR-L1, содержащий аминокислотную последовательность NIVMTQSPKSMSISVGDRVTMNC (SEQ ID NO: 92); FR-L2, содержащий аминокислотную последовательность WYQQKPGQSPKLLIY (SEQ ID NO: 93); FR-L3, содержащий аминокислотную последовательность GVPDRFTGGGSGTDFTLTINTVQAEDAAFFYC (SEQ ID NO: 94); и/или FR-L4, содержащий аминокислотную последовательность FGTGTKLEIK (SEQ ID NO: 95), или комбинацию одного или большего количества из вышеуказанных КУ и одного или большего количества их вариантов, обладающих идентичностью последовательности по меньшей мере около 90 % (например, идентичностью 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно любой из SEQ ID NO: 92-65, такой как содержащийся в анти-TIGIT антителе rat6B2 и его производных. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит FR-L1, содержащий аминокислотную последовательность DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 96); FR-L2, содержащий аминокислотную последовательность WYQQKPGKSPKLLIY (SEQ ID NO: 97); FR-L3, содержащий аминокислотную последовательность GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYC (SEQ ID NO: 99); и/или FR-L4, содержащий аминокислотную последовательность FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 100), или комбинацию одного или большего количества из вышеуказанных КУ и одного или большего количества их вариантов, обладающих идентичностью последовательности по меньшей мере около 90 % (например, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно любой из SEQ ID NO: 96-97 и 99-100, такой как обладают анти-TIGIT антитела h6B2.L1H1, h6B2.L1H2, h6B2.L1H3, h6B2.L1H4 и h6B2.L1H5. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит FR-L1, содержащий аминокислотную последовательность DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 96); FR-L2, содержащий аминокислотную последовательность WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 98); FR-L3, содержащий аминокислотную последовательность GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYC (SEQ ID NO: 99); и/или FR-L4, содержащий аминокислотную последовательность FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 100), или комбинацию одного или большего количества из вышеуказанных КУ и одного или большего количества их вариантов, обладающих идентичностью последовательности по меньшей мере около 90 % (например, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно любой из SEQ ID NO: 96 и 98-100, такой как содержится в анти-TIGIT антителе h6B2.L2H1 и h6B2.L2H5.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1
2
3
1
2
3
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
В некоторых случаях антитело дополнительно содержит по меньшей мере один, два, три или четыре из следующих КУ участков вариабельного участка тяжелой цепи: FR-H1, содержащий аминокислотную последовательность XVXLKESGPXXXXPXXTLXLTCXFSGFSLS (SEQ ID NO: 74), где X представляет собой E или Q; X представляет собой S или T; X представляет собой A или G; X представляет собой I или L; X представляет собой L или V; X представляет собой K или Q; X представляет собой S или T; X представляет собой Н или Q; X представляет собой S или T; и X представляет собой S или T; FR-H2, содержащий аминокислотную последовательность WIRQPXXKXLEWLA (SEQ ID NO: 75), где X представляет собой P или S; X представляет собой E или G; и X представляет собой A или G; FR-H3, содержащий аминокислотную последовательность RLTXXKDXSXXQXXLXXTXXDXXDTATYYCAH (SEQ ID NO: 76), где X представляет собой I или V; X представляет собой S или T; X представляет собой A или T; X представляет собой K или N; X представляет собой D или N; X представляет собой A или V; X представляет собой F или V; X представляет собой N или T; X представляет собой M или V; X представляет собой N или S; X представляет собой M или V; X представляет собой P или T; и X представляет собой T или V; и/или FR-H4, содержащий аминокислотную последовательность WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 77), или комбинацию одного или большего количества из вышеуказанных КУ и одного или большего количества их вариантов, обладающих идентичностью последовательности по меньшей мере около 90 % (например, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно любой из SEQ ID NO: 74-77, такой как обладает анти-TIGIT антитело rat6B2 и его производные (например, h6B2.L1H1, h6B2.L2H1, h6B2.L1H2, h6B2.L1H3, h6B2.L1H4, h6B2.L1H5 и h6B2.L2H5). Анти-TIGIT антитело может дополнительно содержать, например, по меньшей мере один, два, три или четыре из следующих КУ участков вариабельного участка тяжелой цепи: FR-H1, содержащий аминокислотную последовательность QVSLKESGPGILQPSHTLSLTCSFSGFSLS (SEQ ID NO: 78); FR-H2, содержащий аминокислотную последовательность WIRQPSEKGLEWLA (SEQ ID NO: 79); FR-H3, содержащий аминокислотную последовательность RLTVSKDASNDQAFLNVTSVDTTDTATYYCAH (SEQ ID NO: 80); и/или FR-H4, содержащий аминокислотную последовательность WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 77), или комбинацию одного или большего количества из вышеуказанных КУ и одного или большего количества его вариантов, обладающих идентичностью последовательности по меньшей мере около 90 % (например, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно любой из SEQ ID NO: 77-80, такой как обладает анти-TIGIT антитело rat6B2. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит FR-H1, содержащий аминокислотную последовательность EVTLKESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLS (SEQ ID NO: 81); FR-H2, содержащий аминокислотную последовательность WIRQPPGKALEWLA (SEQ ID NO: 82); FR-H3, содержащий аминокислотную последовательность RLTVTKDASKNQAVLTMTNMDPVDTATYYCAH (SEQ ID NO: 83); и/или FR-H4, содержащий аминокислотную последовательность WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 77), или комбинацию одного или большего количества из вышеуказанных КУ и одного или большего количества его вариантов, обладающих идентичностью последовательности по меньшей мере около 90 % (например, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно любой из SEQ ID NO: 77 и 81-83, анти-TIGIT антитела h6B2.L1H1 и h6B2.L2H1. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит FR-H1, содержащий аминокислотную последовательность EVTLKESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLS (SEQ ID NO: 81); FR-H2, содержащий аминокислотную последовательность WIRQPPGKALEWLA (SEQ ID NO: 82); FR-H3, содержащий аминокислотную последовательность RLTITKDASKNQAVLTMTNMDPVDTATYYCAH (SEQ ID NO: 84); и/или FR-H4, содержащий аминокислотную последовательность WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 77), или комбинацию одного или большего количества из вышеуказанных КУ и одного или большего количества его вариантов, обладающих идентичностью последовательности по меньшей мере около 90 % (например, идентичностью 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно любой из SEQ ID NO: 77, 81-82 и 84, такой как обладает анти-TIGIT антитело h6B2.L1H2. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит FR-H1, содержащий аминокислотную последовательность EVTLKESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLS (SEQ ID NO: 81); FR-H2, содержащий аминокислотную последовательность WIRQPPGKALEWLA (SEQ ID NO: 82); FR-H3, содержащий аминокислотную последовательность RLTVTKDTSKNQAVLTMTNMDPVDTATYYCAH (SEQ ID NO: 85); и/или FR-H4, содержащий аминокислотную последовательность WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 77), или комбинацию одного или большего количества из вышеуказанных КУ и одного или большего количества их вариантов, обладающих идентичностью последовательности по меньшей мере около 90 % (например, идентичностью 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно любой из SEQ ID NO: 77, 81-82 и 85, такой как обладает анти-TIGIT антитело h6B2.L1H3. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит FR-H1, содержащий аминокислотную последовательность EVTLKESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLS (SEQ ID NO: 81); FR-H2, содержащий аминокислотную последовательность WIRQPPGKALEWLA (SEQ ID NO: 82); FR-H3, содержащий аминокислотную последовательность RLTVTKDASKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCAH (SEQ ID NO: 86); и/или FR-H4, содержащий аминокислотную последовательность WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 77), или комбинацию одного или большего количества из вышеуказанных КУ и одного или большего количества их вариантов, обладающих идентичностью последовательности по меньшей мере около 90 % (например, идентичностью 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно любой из SEQ ID NO: 77, 81-82 и 85, такой как обладает анти-TIGIT антитело h6B2.L1H4. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит FR-H1, содержащий аминокислотную последовательность EVTLKESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLS (SEQ ID NO: 81); FR-H2, содержащий аминокислотную последовательность WIRQPPGKALEWLA (SEQ ID NO: 82); FR-H3, содержащий аминокислотную последовательность RLTITKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCAH (SEQ ID NO: 87); и/или FR-H4, содержащий аминокислотную последовательность WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 77), или комбинацию одного или большего количества из вышеуказанных КУ и одного или большего количества их вариантов, обладающих идентичностью последовательности по меньшей мере около 90 % (например, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно любой из SEQ ID NO: 77, 81-82 и 87, такой как обладают анти-TIGIT антитела h6B2.L1H5 и h6B2.L2H5.
В другом примере, в изобретении предлагаются анти-TIGIT антитела, которые содержат по меньшей мере один, два, три, четыре, пять или шесть ГВУ (HVR), выбранных из (а) HVR-H1, содержащего аминокислотную последовательность TYGMGVS (SEQ ID NO: 110); (b) HVR-H2, содержащего аминокислотную последовательность SIWWNGNTYYNPSLRS (SEQ ID NO: 111); (c) HVR-H3, содержащего аминокислотную последовательность TGGAVITWFAY (SEQ ID NO: 112); (d) HVR-L1, содержащего аминокислотную последовательность KASQSVGKNIA (SEQ ID NO: 113); (e) HVR-L2, содержащего аминокислотную последовательность YASNRYT (SEQ ID NO: 114); и/или (f) HVR-L3, содержащего аминокислотную последовательность QHIYNSPYP (SEQ ID NO: 115), или комбинацию одного или большего количества вышеуказанных ГВУ (HVR) и одного или большего количества их вариантов, обладающих идентичностью последовательности по меньшей мере около 90 % (например, идентичностью 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно любой из SEQ ID NO: 110-115. В некоторых случаях любое из вышеуказанных анти-TIGIT антител из предыдущего примера может содержать, например, (a) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность TYGMGVS (SEQ ID NO: 110); (b) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SIWWNGNTYYNPSLRS (SEQ ID NO: 111); (c) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность TGGAVITWFAY (SEQ ID NO: 112); (d) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность KASQSVGKNIA (SEQ ID NO: 113); (e) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность YASNRYT (SEQ ID NO: 114); и (f) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность QHIYNSPYP (SEQ ID NO: 115), такой как обладает анти-TIGIT антитело rat10A5 и его производные (например, h10A5.L1H1; h10A5.L2H1; h10A5.L3H1 h10A5.L4H1; h10A5.L1H2; h10A5.L1H3; h10A5.L1H4 и h10A5.L4H4).
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1
2
3
1
2
3
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
1
2
В некоторых случаях антитело дополнительно содержит по меньшей мере один, два, три или четыре из следующих каркасных участков (КУ) вариабельного участка легкой цепи: FR-L1, содержащий аминокислотную последовательность XIVMTQSPXXXSXSXGXRXTXXC (SEQ ID NO: 129), где X представляет собой E или N; X представляет собой A или K; X представляет собой S или T; X представляет собой L или M; X представляет собой I или V; X представляет собой I или P; X представляет собой D или E; X представляет собой A или V; X представляет собой L или M; и X представляет собой N или S; FR-L2, содержащий аминокислотную последовательность WYQQKXGQXPXLLIY (SEQ ID NO: 130), где X представляет собой P или T; X представляет собой A или S; и X представляет собой Q или R; FR-L3, содержащий аминокислотную последовательность GXPXRFXGXGSGTXFTLTIXSXQXEDXAXXYC (SEQ ID NO: 131), где X представляет собой I или V; X представляет собой A или D; X представляет собой S или T; X представляет собой G или S; X представляет собой D или E; X представляет собой N или S; X представляет собой L или V; X представляет собой A или S; X представляет собой A или F; X представляет собой F или V; и X представляет собой F или Y; и/или FR-L4, содержащий аминокислотную последовательность FGXGTKXEIK (SEQ ID NO: 132), или комбинацию одного или большего количества из вышеуказанных КУ и одного или большего количества их вариантов, обладающих идентичностью последовательности по меньшей мере около 90 % (например, идентичностью 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно любой из SEQ ID NO: 129-132, такой как обладает анти-TIGIT антитело rat10A5 и его производные (например, h10A5.L1H1; h10A5.L2H1; h10A5.L3H1; h10A5.L4H1; h10A5.L1H2; h10A5.L1H3; h10A5.L1H4 и h10A5.L4H4). Анти-TIGIT антитело может дополнительно содержать, например, по меньшей мере один, два, три или четыре из следующих КУ участков вариабельного участка легкой цепи: FR-L1, содержащий аминокислотную последовательность NIVMTQSPKSMSISIGDRVTMNC (SEQ ID NO: 133); FR-L2, содержащий аминокислотную последовательность WYQQKTGQSPQLLIY (SEQ ID NO: 134); FR-L3, содержащий аминокислотную последовательность GVPDRFTGGGSGTDFTLTINSVQAEDAAFFYC (SEQ ID NO: 135); и/или FR-L4, содержащий аминокислотную последовательность FGTGTKLEIK (SEQ ID NO: 136), или комбинацию одного или большего количества из вышеуказанных КУ и одного или большего количества их вариантов, обладающих идентичностью последовательности по меньшей мере около 90 % (например, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно любой из SEQ ID NO: 133-136, такой как обладает анти-TIGIT антитело rat10A5. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит FR-L1, содержащий аминокислотную последовательность EIVMTQSPATLSVSPGERATLSC (SEQ ID NO: 137); FR-L2, содержащий аминокислотную последовательность WYQQKPGQSPRLLIY (SEQ ID NO: 138); FR-L3, содержащий аминокислотную последовательность GVPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYC (SEQ ID NO: 140); и/или FR-L4, содержащий аминокислотную последовательность FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 142), или комбинацию одного или большего количества из вышеуказанных КУ и одного или большего количества их вариантов, обладающих идентичностью последовательности по меньшей мере около 90 % (например, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно любой из SEQ ID NO: 137-138, 140 и 142, такой как обладают анти-TIGIT антитела h10A5.L1H1, h10A5.L1H2, h10A5.L1H3 и h10A5.L1H4. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит FR-L1, содержащий аминокислотную последовательность EIVMTQSPATLSVSPGERATLSC (SEQ ID NO: 137); FR-L2, содержащий аминокислотную последовательность WYQQKPGQAPRLLIY (SEQ ID NO: 139); FR-L3, содержащий аминокислотную последовательность GVPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYC (SEQ ID NO: 140); и/или FR-L4, содержащий аминокислотную последовательность FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 142), или комбинацию одного или большего количества из вышеуказанных КУ и одного или большего количества их вариантов, обладающих идентичностью последовательности по меньшей мере около 90 % (например, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно любой из SEQ ID NO: 137, 139-140 и 142, такой как обладает анти-TIGIT антитело h10A5.L2H1. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит FR-L1, содержащий аминокислотную последовательность EIVMTQSPATLSVSPGERATLSC (SEQ ID NO: 137); FR-L2, содержащий аминокислотную последовательность WYQQKPGQSPRLLIY (SEQ ID NO: 138); FR-L3, содержащий аминокислотную последовательность GIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYC (SEQ ID NO: 141); и/или FR-L4, содержащий аминокислотную последовательность FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 142), или комбинацию одного или большего количества из вышеуказанных КУ и одного или большего количества их вариантов, обладающих идентичностью последовательности по меньшей мере около 90 % (например, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно любой из SEQ ID NO: 137-138 и 141-142, такой как обладают анти-TIGIT антитела h10A5.L3H1. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит FR-L1, содержащий аминокислотную последовательность EIVMTQSPATLSVSPGERATLSC (SEQ ID NO: 137); FR-L2, содержащий аминокислотную последовательность WYQQKPGQAPRLLIY (SEQ ID NO: 139); FR-L3, содержащий аминокислотную последовательность GIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYC (SEQ ID NO: 141); и/или FR-L4, содержащий аминокислотную последовательность FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 142), или комбинацию одного или большего количества из вышеуказанных КУ и одного или большего количества их вариантов, обладающих идентичностью последовательности по меньшей мере около 90 % (например, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно любой из SEQ ID NO: 137, 139 и 141-142, такой как обладают анти-TIGIT антитела h10A5.L4H1 и h10A5.L4H4.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1
2
3
1
2
3
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
В некоторых случаях антитело дополнительно содержит по меньшей мере один, два, три или четыре из следующих КУ участков вариабельного участка тяжелой цепи: FR-H1, содержащий аминокислотную последовательность XVXLKESGPXXXXPXXTLXLTCXFSGFSLT (SEQ ID NO: 116), где X представляет собой E или Q; X представляет собой S или T; X представляет собой A или G; X представляет собой I или L; X представляет собой L или V; X представляет собой K или Q; X представляет собой S или T; X представляет собой Н или Q; X представляет собой S или T; и X представляет собой S или T; FR-H2, содержащий аминокислотную последовательность WIRQPXX KX LEWLA (SEQ ID NO: 117), где X представляет собой P или S; X представляет собой E или G; и X представляет собой A или G; FR-H3, содержащий аминокислотную последовательность RLTXX KDTSX X QX X LX X TX X DX X DTATYYCAH (SEQ ID NO: 118), где X представляет собой I или V; X представляет собой S или T; X представляет собой K или N; X представляет собой D или N; X представляет собой A или V; X представляет собой F или V; X представляет собой N или T; X представляет собой M или V; X представляет собой N или S; X представляет собой M или V; X представляет собой P или T; и X представляет собой T или V; и/или FR-H4, содержащий аминокислотную последовательность WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 119), или комбинацию одного или большего количества из вышеуказанных КУ и одного или большего количества их вариантов, обладающих идентичностью последовательности по меньшей мере около 90 % (например, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно любой из SEQ ID NO: 116-119, такой как обладает анти-TIGIT антитело rat10A5 и его производные (например, h10A5.L1H1; h10A5.L2H1; h10A5.L3H1; h10A5.L4H1; h10A5.L1H2; h10A5.L1H3; h10A5.L1H4 и h10A5.L4H4). Анти-TIGIT антитело может дополнительно содержать, например, по меньшей мере один, два, три или четыре из следующих КУ участков вариабельного участка тяжелой цепи: FR-H1, содержащий аминокислотную последовательность QVSLKESGPGILQPSHTLSLTCSFSGFSLT (SEQ ID NO: 120); FR-H2, содержащий аминокислотную последовательность WIRQPSEKGLEWLA (SEQ ID NO: 121); FR-H3, содержащий аминокислотную последовательность RLTVSKDTSNDQAFLNVTSVDTTDTATYYCAH (SEQ ID NO: 122); и/или FR-H4, содержащий аминокислотную последовательность WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 119), или комбинацию одного или большего количества из вышеуказанных КУ и одного или большего количества их вариантов, обладающих идентичностью последовательности по меньшей мере около 90 % (например, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно любой из SEQ ID NO: 119-122, например, такой как обладает анти-TIGIT антитело rat10A5. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит FR-H1, содержащий аминокислотную последовательность EVTLKESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLT (SEQ ID NO: 123); FR-H2, содержащий аминокислотную последовательность WIRQPPGKALEWLA (SEQ ID NO: 124); FR-H3, содержащий аминокислотную последовательность RLTVTKDTSKNQAVLTMTNMDPVDTATYYCAH (SEQ ID NO: 125); и/или FR-H4, содержащий аминокислотную последовательность WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 119), или комбинацию одного или большего количества из вышеуказанных КУ и одного или большего количества их вариантов, обладающих идентичностью последовательности по меньшей мере около 90 % (например, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно любой из SEQ ID NO: 119 и 123-125, такой как обладают анти-TIGIT антитела h10A5.L1H1, h10A5.L2H1, h10A5.L3H1 и h10A5.L4H1. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит FR-H1, содержащий аминокислотную последовательность EVTLKESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLT (SEQ ID NO: 123); FR-H2, содержащий аминокислотную последовательность WIRQPPGKALEWLA (SEQ ID NO: 124); FR-H3, содержащий аминокислотную последовательность RLTITKDTSKNQAVLTMTNMDPVDTATYYCAH (SEQ ID NO: 126); и/или FR-H4, содержащий аминокислотную последовательность WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 119), или комбинацию одного или большего количества из вышеуказанных КУ и одного или большего количества его вариантов, обладающих идентичностью последовательности по меньшей мере около 90 % (например, идентичностью 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно любой из SEQ ID NO: 119, 123-124 и 126, такой как обладает анти-TIGIT антитело h10A5.L1H2. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит FR-H1, содержащий аминокислотную последовательность EVTLKESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLT (SEQ ID NO: 123); FR-H2, содержащий аминокислотную последовательность WIRQPPGKALEWLA (SEQ ID NO: 124); FR-H3, содержащий аминокислотную последовательность RLTVTKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCAH (SEQ ID NO: 127); и/или FR-H4, содержащий аминокислотную последовательность WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 119), или комбинацию одного или большего количества из вышеуказанных КУ и одного или большего количества их вариантов, обладающих идентичностью последовательности по меньшей мере около 90 % (например, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно любой из SEQ ID NO: 119, 123-124 и 127, такой как обладает анти-TIGIT антитело h10A5.L1H3. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит FR-H1, содержащий аминокислотную последовательность EVTLKESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLT (SEQ ID NO: 123); FR-H2, содержащий аминокислотную последовательность WIRQPPGKALEWLA (SEQ ID NO: 124); FR-H3, содержащий аминокислотную последовательность RLTITKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCAH (SEQ ID NO: 128); и/или FR-H4, содержащий аминокислотную последовательность WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 119), или комбинацию одного или большего количества из вышеуказанных КУ и одного или большего количества их вариантов, обладающих идентичностью последовательности по меньшей мере около 90 % (например, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно любой из SEQ ID NO: 119, 123-124 и 128, такой как обладают анти-TIGIT антитела h10A5.L1H4 и h10A5.L4H4.
В другом примере, в изобретении предлагаются анти-TIGIT антитела, которые содержат по меньшей мере один, два, три, четыре, пять или шесть ГВУ (HVR), выбранных из (a) HVR-H1, содержащего аминокислотную последовательность EYSIY (SEQ ID NO: 153); (b) HVR-H2, содержащего аминокислотную последовательность RIDPKNGRTYYVDKFKN (SEQ ID NO: 154); (c) HVR-H3, содержащего аминокислотную последовательность IYGFYFDF (SEQ ID NO: 155); (d) HVR-L1, содержащего аминокислотную последовательность KGSQNVПК (NK)YLV (SEQ ID NO: 156); (e) HVR-L2, содержащего аминокислотную последовательность NTDNLQS (SEQ ID NO: 157); и/или (f) HVR-L3, содержащего аминокислотную последовательность YQYNNGFT (SEQ ID NO: 158), или комбинацию одного или большего количества из вышеуказанных ГВУ (HVR) и одного или большего количества их вариантов, обладающих идентичностью последовательности по меньшей мере около 90 % (например, идентичностью 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно любой из SEQ ID NO: 153-158. В некоторых случаях любое из вышеуказанных анти-TIGIT антител из предыдущего примера может содержать, например, (a) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность EYSIY (SEQ ID NO: 153); (b) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность RIDPKNGRTYYVDKFKN (SEQ ID NO: 154); (c) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность IYGFYFDF (SEQ ID NO: 155); (d) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность KGSQNVПК (NK)YLV (SEQ ID NO: 156); (e) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность NTDNLQS (SEQ ID NO: 157); и (f) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность YQYNNGFT (SEQ ID NO: 158), такой как содержится в анти-TIGIT антителе rat7E7 и его производных (например, h7E7.L1H1, h7E7.L2H1, h7E7.L3H1, h7E7.L4H1, h7E7.L5H1, h7E7.L1H2, h7E7.L1H3, h7E7.L1H4, h7E7.L1H5, h7E7.L1H6, h7E7.L1H7, h7E7.L1H8, h7E7.L1H9, h7E7.L5H9 и 7E7.L5aH9a).
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
1
2
1
2
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
1
2
1
2
В некоторых случаях антитело дополнительно содержит по меньшей мере один, два, три или четыре из следующих каркасных участков (КУ) вариабельного участка легкой цепи: FR-L1, содержащий аминокислотную последовательность XIXLTQSPSXLSASVGDRVTXXC (SEQ ID NO: 180), где X представляет собой D или N; X представляет собой Н или Q; X представляет собой F или L; X представляет собой I или L; и X представляет собой S или T; FR-L2, содержащий аминокислотную последовательность WYQQKXGXAPKLLIY (SEQ ID NO: 181), где X представляет собой L или P; и X представляет собой E или K; FR-L3, содержащий аминокислотную последовательность GXPSRFSGSGSGTXXTLTISSLQPEDXATYXC (SEQ ID NO: 182), где X представляет собой I или V; X представляет собой D или E; X представляет собой F или Y; X обозначает A или F; и X представляет собой F или Y; и/или FR-L4, содержащий аминокислотную последовательность FGX GTKX EIK (SEQ ID NO: 183), где X представляет собой Q или S; и X представляет собой L или V или комбинацию одного или большего количества из вышеуказанных КУ и одного или большего количества их вариантов, обладающих идентичностью последовательности по меньшей мере около 90 % (например, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 % 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 % идентичности) относительно любой из SEQ ID NO: 180-183, например, такой как обладает анти-TIGIT антитело rat7E7 и его производные (например, h7E7.L1H1, h7E7.L2H1, h7E7.L3H1, h7E7.L4H1, h7E7.L5H1, h7E7.L1H2, h7E7.L1H3, h7E7.L1H4, h7E7.L1H5, h7E7.L1H6, h7E7.L1H7, h7E7.L1H8, h7E7.L1H9, h7E7.L5H9, и 7E7.L5aH9a). Анти-TIGIT антитело может дополнительно содержать, например, по меньшей мере один, два, три или четыре из следующих КУ участков вариабельного участка легкой цепи: FR-L1, содержащий аминокислотную последовательность NIHLTQSPSLLSASVGDRVTLSC (SEQ ID NO: 184); FR-L2, содержащий аминокислотную последовательность WYQQKLGEAPKLLIY (SEQ ID NO: 185); FR-L3, содержащий аминокислотную последовательность GIPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDAATYFC (SEQ ID NO: 186); и/или FR-L4, содержащий аминокислотную последовательность FGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 187), или комбинацию одного или большего количества из вышеуказанных КУ и одного или большего количества их вариантов, обладающих идентичностью последовательности по меньшей мере около 90 % (например, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно любой из SEQ ID NO: 184-187, такой как обладает анти-TIGIT антитело rat7E7. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит FR-L1, содержащий аминокислотную последовательность DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 188); FR-L2, содержащий аминокислотную последовательность WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 189); FR-L3, содержащий аминокислотную последовательность GIPSRFSGSGSGTEYTLTISSLQPEDFATYFC (SEQ ID NO: 190); и/или FR-L4, содержащий аминокислотную последовательность FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 196), или комбинацию одного или большего количества из вышеуказанных КУ и одного или большего количества их вариантов, обладающих идентичностью последовательности по меньшей мере около 90 % (например, идентичностью 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно любой из SEQ ID NO: 188-190 и 196, такой как обладают анти-TIGIT антитела h7E7.L1H1, h7E7.L1H2, h7E7.L1H3, h7E7.L1H4, h7E7.L1H5, h7E7.L1H6, h7E7.L1H7, h7E7.L1H8 и h7E7.L1H9. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит FR-L1, содержащий аминокислотную последовательность DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 188); FR-L2, содержащий аминокислотную последовательность WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 189); FR-L3, содержащий аминокислотную последовательность GVPSRFSGSGSGTEYTLTISSLQPEDFATYFC (SEQ ID NO: 191); и/или FR-L4, содержащий аминокислотную последовательность FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 196), или комбинацию одного или большего количества из вышеуказанных КУ и одного или большего количества их вариантов, обладающих идентичностью последовательности по меньшей мере около 90 % (например, идентичностью 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно любой из SEQ ID NO: 188-189, 191 и 196, например, такой как обладает анти-TIGIT антитело h7E7.L2H1. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит FR-L1, содержащий аминокислотную последовательность DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 188); FR-L2, содержащий аминокислотную последовательность WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 189); FR-L3, содержащий аминокислотную последовательность GIPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYFC (SEQ ID NO: 192); и/или FR-L4, содержащий аминокислотную последовательность FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 196), или комбинацию одного или большего количества из вышеуказанных КУ и одного или большего количества их вариантов, обладающих идентичностью последовательности по меньшей мере около 90 % (например, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно любой из SEQ ID NO: 188-189, 192 и 196, такой как обладают анти-TIGIT антитела h7E7.L3H1. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит FR-L1, содержащий аминокислотную последовательность DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 188); FR-L2, содержащий аминокислотную последовательность WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 189); FR-L3, содержащий аминокислотную последовательность GIPSRFSGSGSGTEYTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 193); и/или FR-L4, содержащий аминокислотную последовательность FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 196), или комбинацию одного или большего количества из вышеуказанных КУ и одного или большего количества его вариантов, обладающих идентичностью последовательности по меньшей мере около 90 % (например, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно любой из SEQ ID NO: 188-189, 193 и 196, например, такой как обладают анти-TIGIT антитела h7E7.L4H1. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит FR-L1, содержащий аминокислотную последовательность DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 188); FR-L2, содержащий аминокислотную последовательность WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 189); FR-L3, содержащий аминокислотную последовательность GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 194); и/или FR-L4, содержащий аминокислотную последовательность FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 196), или комбинацию одного или большего количества из вышеуказанных КУ и одного или большего количества их вариантов, обладающих идентичностью последовательности по меньшей мере около 90 % (например, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно любой из SEQ ID NO: 188-189, 194 и 196, такой как обладают анти-TIGIT антитела h7E7.L5H1 и h7E7.L5H9. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит FR-L1, содержащий аминокислотную последовательность DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 188); FR-L2, содержащий аминокислотную последовательность WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 189); FR-L3, содержащий аминокислотную последовательность GVPSRFSGSGSGTEYTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 195); и/или FR-L4, содержащий аминокислотную последовательность FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 196), или комбинацию одного или большего количества из вышеуказанных КУ и одного или большего количества их вариантов, обладающих идентичностью последовательности по меньшей мере около 90 % (например, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно любой из SEQ ID NO: 188-189 и 195-196, такой как обладают анти-TIGIT антитела 7E7.L5aH9a.
1
2
3
4
5
6
7
1
2
3
4
5
6
7
1
2
3
4
5
6
1
2
3
4
5
6
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1
2
3
1
2
3
В некоторых случаях антитело дополнительно содержит по меньшей мере один, два, три или четыре из следующих КУ участков вариабельного участка тяжелой цепи: FR-H1, содержащий аминокислотную последовательность EVQLXQSGXEXXX PGASVKXSCKAXGYTFT (SEQ ID NO: 159), где X представляет собой Q или V; X представляет собой A или P; X представляет собой L или V; X представляет собой K или Q; X представляет собой K или R; X представляет собой L или V; и X представляет собой S или T; FR-H2, содержащий аминокислотную последовательность WVXQXPXQXLEXXG (SEQ ID NO: 160), где X представляет собой K или R; X представляет собой A или R; X представляет собой G или K; X представляет собой R или S; X представляет собой I или W; и X представляет собой I или M; FR-H3, содержащий аминокислотную последовательность RXTXTXDTSXXTAYMXLSSLXSEDTAXYXCXR (SEQ ID NO: 161), где X представляет собой A или V; X представляет собой I или L; X представляет собой A или R; X представляет собой A или S; X представляет собой N или S; X представляет собой E или Q; X представляет собой R или T; X представляет собой T или V; X представляет собой F или Y; и X представляет собой A или T; и/или FR-H4, содержащий аминокислотную последовательность WGQGXXVTXSS (SEQ ID NO: 162), где X представляет собой T или V; X представляет собой L или M; и X представляет собой A или V или комбинацию одного или большего количества из вышеуказанных КУ и одного или большего количества их вариантов, обладающих идентичностью последовательности по меньшей мере около 90 % (например, идентичностью 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно любой из SEQ ID NO: 159-162, например, такой как обладает анти-TIGIT антитело rat7E7 и его производные (например, h7E7.L1H1, h7E7.L2H1, h7E7.L3H1, h7E7.L4H1, h7E7.L5H1, h7E7.L1H2, h7E7.L1H3, h7E7.L1H4, h7E7.L1H5, h7E7.L1H6, h7E7.L1H7, h7E7.L1H8, h7E7.L1H9, h7E7. L5H9 и 7E7.L5aH9a). Анти-TIGIT антитело может дополнительно содержать, например, по меньшей мере один, два, три или четыре из следующих КУ участков вариабельного участка тяжелой цепи: FR-H1, содержащий аминокислотную последовательность EVQLQQSGPELQRPGASVKLSCKATGYTFT (SEQ ID NO: 163); FR-H2, содержащий аминокислотную последовательность WVKQRPKQSLEIIG (SEQ ID NO: 164); FR-H3, содержащий аминокислотную последовательность RATLTADTSSNTAYMQLSSLTSEDTATYFCTR (SEQ ID NO: 165); и/или FR-H4, содержащий аминокислотную последовательность WGQGVMVTASS (SEQ ID NO: 166), или комбинацию одного или большего количества из вышеуказанных КУ и одного или большего количества их вариантов, обладающих идентичностью последовательности по меньшей мере около 90 % (например, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно любой из SEQ ID NO: 163-166, такой как обладает анти-TIGIT антитело rat7E7. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит FR-H1, содержащий аминокислотную последовательность EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT (SEQ ID NO: 167); FR-H2, содержащий аминокислотную последовательность WVRQAPGQRLEIIG (SEQ ID NO: 168); FR-H3, содержащий аминокислотную последовательность RATLTADTSASTAMELSSLRSEDTAVYFCTR (SEQ ID NO: 172); и/или FR-H4, содержащий аминокислотную последовательность WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 179), или комбинацию одного или большего количества из вышеуказанных КУ и одного или большего количества их вариантов, обладающих идентичностью последовательности по меньшей мере около 90 % (например, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно любой из SEQ ID NO: 167-138, 172 и 179, такой как обладают анти-TIGIT антитела h7E7.L1H1, h7E7.L2H1, h7E7.L3H1, h7E7.L4H1 и h7E7.L5H1. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит FR-H1, содержащий аминокислотную последовательность EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT (SEQ ID NO: 167); FR-H2, содержащий аминокислотную последовательность WVRQAPGQRLEWIG (SEQ ID NO: 169); FR-H3, содержащий аминокислотную последовательность RATLTADTSASTAMELSSLRSEDTAVYFCTR (SEQ ID NO: 172); и/или FR-H4, содержащий аминокислотную последовательность WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 179), или комбинацию одного или большего количества из вышеуказанных КУ и одного или большего количества его вариантов, обладающих идентичностью последовательности по меньшей мере около 90 % (например, идентичностью 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно любой из SEQ ID NO: 167, 169, 172 и 179, такой как обладает анти-TIGIT антитело h7E7.L1H2. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит FR-H1, содержащий аминокислотную последовательность EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT (SEQ ID NO: 167); FR-H2, содержащий аминокислотную последовательность WVRQAPGQRLEIMG (SEQ ID NO: 170); FR-H3, содержащий аминокислотную последовательность RATLTADTSASTAMELSSLRSEDTAVYFCTR (SEQ ID NO: 172); и/или FR-H4, содержащий аминокислотную последовательность WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 179), или комбинацию одного или большего количества из вышеуказанных КУ и одного или большего количества их вариантов, обладающих идентичностью последовательности по меньшей мере около 90 % (например, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно любой из SEQ ID NO: 167, 170, 172 и 179, такой как обладает анти-TIGIT антитело h7E7.L1H3. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит FR-H1, содержащий аминокислотную последовательность EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT (SEQ ID NO: 167); FR-H2, содержащий аминокислотную последовательность WVRQAPGQRLEIIG (SEQ ID NO: 168); FR-H3, содержащий аминокислотную последовательность RVTLTADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYFCTR (SEQ ID NO: 173); и/или FR-H4, содержащий аминокислотную последовательность WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 179), или комбинацию одного или большего количества из вышеуказанных КУ и одного или большего количества их вариантов, обладающих идентичностью последовательности по меньшей мере около 90 % (например, идентичностью 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно любой из SEQ ID NO: 167-168, 173 и 179, такой как обладает анти-TIGIT антитело h7E7.L1H4. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит FR-H1, содержащий аминокислотную последовательность EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT (SEQ ID NO: 167); FR-H2, содержащий аминокислотную последовательность WVRQAPGQRLEIIG (SEQ ID NO: 168); FR-H3, содержащий аминокислотную последовательность RATITADTSASTAMELSSLRSEDTAVYFCTR (SEQ ID NO: 174); и/или FR-H4, содержащий аминокислотную последовательность WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 179), или комбинацию одного или большего количества из вышеуказанных КУ и одного или большего количества их вариантов, обладающих идентичностью последовательности по меньшей мере около 90 % (например, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно любой из SEQ ID NO: 167-168, 174 и 179, такой как обладает анти-TIGIT антитело h7E7.L1H5. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит FR-H1, содержащий аминокислотную последовательность EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT (SEQ ID NO: 167); FR-H2, содержащий аминокислотную последовательность WVRQAPGQRLEIIG (SEQ ID NO: 168); FR-H3, содержащий аминокислотную последовательность RATLTRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYFCTR (SEQ ID NO: 175); и/или FR-H4, содержащий аминокислотную последовательность WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 179), или комбинацию одного или большего количества из вышеуказанных КУ и одного или большего количества их вариантов, обладающих идентичностью последовательности по меньшей мере около 90 % (например, идентичностью 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно любой из SEQ ID NO: 167-168, 175 и 179, такой как обладает анти-TIGIT антитело h7E7.L1H6. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит FR-H1, содержащий аминокислотную последовательность EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT (SEQ ID NO: 167); FR-H2, содержащий аминокислотную последовательность WVRQAPGQRLEIIG (SEQ ID NO: 168); FR-H3, содержащий аминокислотную последовательность RATLTADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCTR (SEQ ID NO: 176); и/или FR-H4, содержащий аминокислотную последовательность WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 179), или комбинацию одного или большего количества из вышеуказанных КУ и одного или большего количества их вариантов, обладающих идентичностью последовательности по меньшей мере около 90 % (например, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно любой из SEQ ID NO: 167-168, 176 и 179, такой как обладает анти-TIGIT антитело h7E7.L1H7. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит FR-H1, содержащий аминокислотную последовательность EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT (SEQ ID NO: 167); FR-H2, содержащий аминокислотную последовательность WVRQAPGQRLEIIG (SEQ ID NO: 168); FR-H3, содержащий аминокислотную последовательность RATLTADTSASTAMELSSLRSEDTAVYFCAR (SEQ ID NO: 177); и/или FR-H4, содержащий аминокислотную последовательность WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 179), или комбинацию одного или большего количества из вышеуказанных КУ и одного или большего количества их вариантов, обладающих идентичностью последовательности по меньшей мере около 90 % (например, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно любой из SEQ ID NO: 167-168, 177 и 179, такой как обладает анти-TIGIT антитело h7E7.L1H8. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит FR-H1, содержащий аминокислотную последовательность EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT (SEQ ID NO: 167); FR-H2, содержащий аминокислотную последовательность WVRQAPGQRLEWMG (SEQ ID NO: 171); FR-H3, содержащий аминокислотную последовательность RVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 178); и/или FR-H4, содержащий аминокислотную последовательность WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 179), или комбинацию одного или большего количества из вышеуказанных КУ и одного или большего количества их вариантов, обладающих идентичностью последовательности по меньшей мере около 90 % (например, идентичностью 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно любой из SEQ ID NO: 167, 171 и 178-179, такой как обладают анти-TIGIT антитела h7E7.L1H9 и h7E7.L5H9. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит FR-H1, содержащий аминокислотную последовательность EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT (SEQ ID NO: 167); FR-H2, содержащий аминокислотную последовательность WVRQAPGQRLEIMG (SEQ ID NO: 170); FR-H3, содержащий аминокислотную последовательность RVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 178); и/или FR-H4, содержащий аминокислотную последовательность WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 179), или комбинацию одного или большего количества из вышеуказанных КУ и одного или большего количества их вариантов, обладающих идентичностью последовательности по меньшей мере около 90 % (например, идентичностью 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно любой из SEQ ID NO: 167, 170 и 178-179, такой как обладает анти-TIGIT антитело 7E7.L5aH9a.
В другом примере изобретение предусматривает анти-TIGIT антитела, которые содержат по меньшей мере один, два, три, четыре, пять или шесть ГВУ (HVR), выбранных из (a) HVR-H1, содержащего аминокислотную последовательность EHSIY (SEQ ID NO: 215); (b) HVR-H2, содержащего аминокислотную последовательность RIDPKNGRTYFVDKFKN (SEQ ID NO: 216); (c) HVR-H3, содержащего аминокислотную последовательность IDGFYFDF (SEQ ID NO: 217); (d) HVR-L1, содержащего аминокислотную последовательность KGSQNVПК (NK)YLV (SEQ ID NO: 218); (e) HVR-L2, содержащего аминокислотную последовательность STDNLQS (SEQ ID NO: 219); и/или (f) HVR-L3, содержащего аминокислотную последовательность YQYNNGFT (SEQ ID NO: 220), или комбинацию одного или большего количества из вышеуказанных ГВУ (HVR) и одного или большего количества их вариантов, обладающих идентичностью последовательности по меньшей мере около 90 % (например, идентичностью 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно любой из SEQ ID NO: 215-220. В некоторых случаях любое из вышеуказанных анти-TIGIT антител предыдущего примера может содержать, например, (а) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность EHSIY (SEQ ID NO: 215); (b) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность RIDPKNGRTYFVDKFKN (SEQ ID NO: 216); (c) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность IDGFYFDF (SEQ ID NO: 217); (d) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность KGSQNVПК (NK)YLV (SEQ ID NO: 218); (e) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность STDNLQS (SEQ ID NO: 219); и (f) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность YQYNNGFT (SEQ ID NO: 220), такой как содержится в анти-TIGIT антителе rat15C8 и его производных (например, h15C8.L1H1, h15C8.L2H1, h15C8.L3H1, h15C8.L4H1, h15C8.L5H1, h15C8.L1H2, h15C8.L1H3, h15C8.L1H4, h15C8.L1H5, h15C8.L1H6, h15C8.L1H7, h15C8.L1H8, h15C8.L1H9, h15C8.L5H9 и 5C8.L5aH9a).
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
1
2
1
2
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
1
2
1
2
В некоторых случаях антитело дополнительно содержит по меньшей мере один, два, три или четыре из следующих каркасных участков (КУ) вариабельного участка легкой цепи: FR-L1, содержащий аминокислотную последовательность XIXLTQSPSXLSASVGDRVTXXC (SEQ ID NO: 243), где X представляет собой D или N; X представляет собой Н или Q; X представляет собой F или L; X представляет собой I или L; и X представляет собой S или T; FR-L2, содержащий аминокислотную последовательность WYQQKXGXAPKLLIY (SEQ ID NO: 244), где X представляет собой L или P и X представляет собой E или K; FR-L3, содержащий аминокислотную последовательность GXPSRFSGSGSGTXXTLTISSLQPEDXATYXC (SEQ ID NO: 245), где X представляет собой I или V; X представляет собой D или E; X представляет собой F или Y; X обозначает A или F; и X представляет собой F или Y; и/или FR-L4, содержащий аминокислотную последовательность FGX GTKX EIK (SEQ ID NO: 246), где X представляет собой Q или S и X представляет собой L или V, или комбинацию одного или большего количества из выше КУ и один или большее количество его вариантов, обладающих идентичностью последовательности по меньшей мере около 90 % (например, идентичностью 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) до любого из SEQ ID NO: 243-246, такой как обладает анти-TIGIT антитело rat15C8 и его производные (например, h15C8.L1H1, h15C8.L2H1, h15C8.L3H1, h15C8.L4H1, h15C8.L5H1, h15C8.L1H2, h15C8.L1H3, h15C8.L1H4, h15C8.L1H5, h15C8.L1H6, h15C8.L1H7, h15C8.L1H8, h15C8.L1H9, h15C8.L5H9 и 5C8.L5aH9a). Анти-TIGIT антитело может дополнительно содержать, например, по меньшей мере один, два, три или четыре из следующих КУ участков вариабельного участка легкой цепи: FR-L1, содержащий аминокислотную последовательность NIHLTQSPSLLSASVGDRVTLSC (SEQ ID NO: 247); FR-L2, содержащий аминокислотную последовательность WYQQKLGEAPKLLIY (SEQ ID NO: 248); FR-L3, содержащий аминокислотную последовательность GIPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDAATYFC (SEQ ID NO: 249); и/или FR-L4, содержащий аминокислотную последовательность FGSGTKLEIK (SEQ ID NO: 250), или комбинацию одного или большего количества из вышеуказанных КУ и одного или большего количества их вариантов, обладающих идентичностью последовательности по меньшей мере около 90 % (например, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно любой из SEQ ID NO: 247-250, такой как обладает анти-TIGIT антитело rat15C8. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит FR-L1, содержащий аминокислотную последовательность DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 251); FR-L2, содержащий аминокислотную последовательность WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 252); FR-L3, содержащий аминокислотную последовательность GIPSRFSGSGSGTEYTLTISSLQPEDFATYFC (SEQ ID NO: 253); и/или FR-L4, содержащий аминокислотную последовательность FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 259), или комбинацию одного или большего количества из вышеуказанных КУ и одного или большего количества их вариантов, обладающих идентичностью последовательности по меньшей мере около 90 % (например, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно любой из SEQ ID NO: 251-253 и 259, такой как обладают анти-TIGIT антитела h15C8.L1H1, h15C8.L1H2, h15C8.L1H3, h15C8.L1H4, h15C8.L1H5, h15C8.L1H6, h15C8.L1H7, h15C8.L1H8 и h15C8.L1H9. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит FR-L1, содержащий аминокислотную последовательность DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 251); FR-L2, содержащий аминокислотную последовательность WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 252); FR-L3, содержащий аминокислотную последовательность GVPSRFSGSGSGTEYTLTISSLQPEDFATYFC (SEQ ID NO: 254); и/или FR-L4, содержащий аминокислотную последовательность FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 259), или комбинацию одного или большего количества из вышеуказанных КУ и одного или большего количества их вариантов, обладающих идентичностью последовательности по меньшей мере около 90 % (например, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно любой из SEQ ID NO: 251-252, 254 и 259, такой как обладает анти-TIGIT антитело h15C8.L2H1. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит FR-L1, содержащий аминокислотную последовательность DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 251); FR-L2, содержащий аминокислотную последовательность WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 252); FR-L3, содержащий аминокислотную последовательность GIPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYFC (SEQ ID NO: 255); и/или FR-L4, содержащий аминокислотную последовательность FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 259), или комбинацию одного или большего количества из вышеуказанных КУ и одного или большего количества его вариантов, обладающих идентичностью последовательности по меньшей мере около 90 % (например, идентичностью 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно любой из SEQ ID NO: 251-252, 255 и 259, такой как обладают анти-TIGIT антитела h15C8.L3H1. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит FR-L1, содержащий аминокислотную последовательность DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 251); FR-L2, содержащий аминокислотную последовательность WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 252); FR-L3, содержащий аминокислотную последовательность GIPSRFSGSGSGTEYTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 256); и/или FR-L4, содержащий аминокислотную последовательность FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 259), или комбинацию одного или большего количества из вышеуказанных КУ и одного или большего количества их вариантов, обладающих идентичностью последовательности по меньшей мере около 90 % (например, идентичностью 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно любой из SEQ ID NO: 251-252, 256 и 259, такой как обладают анти-TIGIT антитела h15C8.L4H1. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит FR-L1, содержащий аминокислотную последовательность DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 251); FR-L2, содержащий аминокислотную последовательность WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 252); FR-L3, содержащий аминокислотную последовательность GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 257); и/или FR-L4, содержащий аминокислотную последовательность FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 259), или комбинацию одного или большего количества из вышеуказанных КУ и одного или большего количества их вариантов, обладающих идентичностью последовательности по меньшей мере около 90 % (например, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно любой из SEQ ID NO: 251-252, 257 и 259, такой как обладают анти-TIGIT антитела h15C8.L5H1 и h15C8.L5H9. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит FR-L1, содержащий аминокислотную последовательность DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO: 251); FR-L2, содержащий аминокислотную последовательность WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 252); FR-L3, содержащий аминокислотную последовательность GVPSRFSGSGSGTEYTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO: 258); и/или FR-L4, содержащий аминокислотную последовательность FGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 259), или комбинацию одного или большего количества из вышеуказанных КУ и одного или большего количества их вариантов, обладающих идентичностью последовательности по меньшей мере около 90 % (например, идентичностью 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно любой из SEQ ID NO: 251-252 и 258-259, такой как обладают анти-TIGIT антитела 5C8.L5aH9a.
1
2
3
4
5
6
1
2
3
4
5
6
1
2
3
4
5
6
7
1
2
3
4
5
6
7
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1
2
3
В некоторых случаях антитело дополнительно содержит по меньшей мере один, два, три или четыре из следующих КУ вариабельного участка тяжелой цепи: FR-H1, содержащий аминокислотную последовательность EVQLXQSGXEXXXPGASVKXSCKASGYTFT (SEQ ID NO: 221), где X представляет собой Q или V; X представляет собой A или P; X представляет собой L или V; X представляет собой K или Q; X представляет собой K или R; и X представляет собой L или V; FR-H2, содержащий аминокислотную последовательность WXXQXPXQXLEXXG (SEQ ID NO: 222), где X представляет собой L или V; X представляет собой K или R; X представляет собой A или R; X представляет собой G или K; X представляет собой R или S; X представляет собой I или W; и X представляет собой I или M; FR-H3, содержащий аминокислотную последовательность RXTXTXXTSXXTAYMXLSSLXSEDTAXYXCAR (SEQ ID NO: 223), где X представляет собой A или V; X представляет собой I или L; X представляет собой R или T; X представляет собой D или N; X представляет собой A или S; X представляет собой N или S; X представляет собой E или Q; X представляет собой R или T; X представляет собой I или V; и X представляет собой F или Y; и/или FR-H4, содержащий аминокислотную последовательность WGQGXXVTXSS (SEQ ID NO: 224), или комбинацию одного или большего количества из вышеуказанных КУ и одного или большего количества их вариантов, обладающих идентичностью последовательности по меньшей мере около 90 % (например, идентичностью 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) до любого из SEQ ID NO: 221-224, такой как обладает анти-TIGIT антитело rat15C8 и его производные (например, h15C8.L1H1, h15C8.L2H1, h15C8.L3H1, h15C8.L4H1, h15C8.L5H1, h15C8.L1H2, h15C8.L1H3, h15C8.L1H4, h15C8. L1H5, h15C8.L1H6, h15C8.L1H7, h15C8.L1H8, h15C8.L1H9, h15C8.L5H9 и 5C8.L5aH9a). Анти-TIGIT антитело может дополнительно содержать, например, по меньшей мере один, два, три или четыре из следующих КУ участков вариабельного участка тяжелой цепи: FR-H1, содержащий аминокислотную последовательность EVQLQQSGPELQRPGASVKLSCKASGYTFT (SEQ ID NO: 225); FR-H2, содержащий аминокислотную последовательность WLKQRPKQSLEIIG (SEQ ID NO: 226); FR-H3, содержащий аминокислотную последовательность RATLTTNTSSNTAYMQLSSLTSEDTAIYFCAR (SEQ ID NO: 227); и/или FR-H4, содержащий аминокислотную последовательность WGQGVMVTASS (SEQ ID NO: 228), или комбинацию одного или большего количества из вышеуказанных КУ и одного или большего количества их вариантов, обладающих идентичностью последовательности по меньшей мере около 90 % (например, идентичностью 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) до любого из SEQ ID NO: 225-228, такой как обладает анти-TIGIT антитело rat15C8. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит FR-H1, содержащий аминокислотную последовательность EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT (SEQ ID NO: 229); FR-H2, содержащий аминокислотную последовательность WLRQAPGQRLEIIG (SEQ ID NO: 230); FR-H3, содержащий аминокислотную последовательность RATLTTDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYFCAR (SEQ ID NO: 235); и/или FR-H4, содержащий аминокислотную последовательность WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 242), или комбинацию одного или большего количества из вышеуказанных КУ и одного или большего количества его вариантов, обладающих идентичностью последовательности по меньшей мере около 90 % (например, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно любой из SEQ ID NO: 229-230, 235 и 242, такой как обладают анти-TIGIT антитела h15C8.L1H1, h15C8.L2H1, h15C8.L3H1, h15C8.L4H1 и h15C8.L5H1. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит FR-H1, содержащий аминокислотную последовательность EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT (SEQ ID NO: 229); FR-H2, содержащий аминокислотную последовательность WVRQAPGQRLEIIG (SEQ ID NO: 231); FR-H3, содержащий аминокислотную последовательность RATLTTDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYFCAR (SEQ ID NO: 235); и/или FR-H4, содержащий аминокислотную последовательность WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 242), или комбинацию одного или большего количества из вышеуказанных КУ и одного или большего количества их вариантов, обладающих идентичностью последовательности по меньшей мере около 90 % (например, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно любой из SEQ ID NO: 229, 231, 235 и 242, такой как обладает анти-TIGIT антитело h15C8.L1H2. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит FR-H1, содержащий аминокислотную последовательность EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT (SEQ ID NO: 229); FR-H2, содержащий аминокислотную последовательность WLRQAPGQRLEWIG (SEQ ID NO: 232); FR-H3, содержащий аминокислотную последовательность RATLTTDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYFCAR (SEQ ID NO: 235); и/или FR-H4, содержащий аминокислотную последовательность WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 242), или комбинацию одного или большего количества из вышеуказанных КУ и одного или большего количества их вариантов, обладающих идентичностью последовательности по меньшей мере около 90 % (например, идентичностью 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно любой из SEQ ID NO: 229, 232, 235 и 242, такой как обладает анти-TIGIT антитело h15C8.L1H3. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит FR-H1, содержащий аминокислотную последовательность EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT (SEQ ID NO: 229); FR-H2, содержащий аминокислотную последовательность WLRQAPGQRLEIMG (SEQ ID NO: 233); FR-H3, содержащий аминокислотную последовательность RATLTTDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYFCAR (SEQ ID NO: 235); и/или FR-H4, содержащий аминокислотную последовательность WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 242), или комбинацию одного или большего количества из вышеуказанных КУ и одного или большего количества их вариантов, обладающих идентичностью последовательности по меньшей мере около 90 % (например, идентичностью 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно любой из SEQ ID NO: 229, 233, 235 и 242, такой как обладает анти-TIGIT антитело h15C8.L1H4. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит FR-H1, содержащий аминокислотную последовательность EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT (SEQ ID NO: 229); FR-H2, содержащий аминокислотную последовательность WLRQAPGQRLEIIG (SEQ ID NO: 230); FR-H3, содержащий аминокислотную последовательность RVTLTTDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYFCAR (SEQ ID NO: 236); и/или FR-H4, содержащий аминокислотную последовательность WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 242), или комбинацию одного или большего количества из вышеуказанных КУ и одного или большего количества их вариантов, обладающих идентичностью последовательности по меньшей мере около 90 % (например, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно любой из SEQ ID NO: 229-230, 236 и 242, такой как обладает анти-TIGIT антитело h15C8.L1H5. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит FR-H1, содержащий аминокислотную последовательность EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT (SEQ ID NO: 229); FR-H2, содержащий аминокислотную последовательность WLRQAPGQRLEIIG (SEQ ID NO: 230); FR-H3, содержащий аминокислотную последовательность RATITTDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYFCAR (SEQ ID NO: 237); и/или FR-H4, содержащий аминокислотную последовательность WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 242), или комбинацию одного или большего количества из вышеуказанных КУ и одного или большего количества их вариантов, обладающих идентичностью последовательности по меньшей мере около 90 % (например, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно любой из SEQ ID NO: 229-230, 237 и 242, такой как обладает анти-TIGIT антитело h15C8.L1H6. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит FR-H1, содержащий аминокислотную последовательность EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT (SEQ ID NO: 229); FR-H2, содержащий аминокислотную последовательность WLRQAPGQRLEIIG (SEQ ID NO: 230); FR-H3, содержащий аминокислотную последовательность RATLTRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYFCAR (SEQ ID NO: 238); и/или FR-H4, содержащий аминокислотную последовательность WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 242), или комбинацию одного или большего количества из вышеуказанных КУ и одного или большего количества их вариантов, обладающих идентичностью последовательности по меньшей мере около 90 % (например, идентичностью 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно любой из SEQ ID NO: 229-230, 238 и 242, такой как обладает анти-TIGIT антитело h15C8.L1H7. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит FR-H1, содержащий аминокислотную последовательность EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT (SEQ ID NO: 229); FR-H2, содержащий аминокислотную последовательность WLRQAPGQRLEIIG (SEQ ID NO: 230); FR-H3, содержащий аминокислотную последовательность RATLTTDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 239); и/или FR-H4, содержащий аминокислотную последовательность WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 242), или комбинацию одного или большего количества из вышеуказанных КУ и одного или большего количества их вариантов, обладающих идентичностью последовательности по меньшей мере около 90 % (например, идентичностью 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно любой из SEQ ID NO: 229-230, 239 и 242, такой как обладает анти-TIGIT антитело h15C8.L1H8. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит FR-H1, содержащий аминокислотную последовательность EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT (SEQ ID NO: 229); FR-H2, содержащий аминокислотную последовательность WVRQAPGQRLEWMG (SEQ ID NO: 234); FR-H3, содержащий аминокислотную последовательность RVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 240); и/или FR-H4, содержащий аминокислотную последовательность WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 242), или комбинацию одного или большего количества из вышеуказанных КУ и одного или большего количества их вариантов, обладающих идентичностью последовательности по меньшей мере около 90 % (например, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно любой из SEQ ID NO: 229, 234, 240 и 242, такой как обладают анти-TIGIT антитела h15C8.L1H9 и h15C8.L5H9. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит FR-H1, содержащий аминокислотную последовательность EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT (SEQ ID NO: 229); FR-H2, содержащий аминокислотную последовательность WLRQAPGQRLEIMG (SEQ ID NO: 233); FR-H3, содержащий аминокислотную последовательность RATITTDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 241); и/или FR-H4, содержащий аминокислотную последовательность WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 242), или комбинацию одного или большего количества из вышеуказанных КУ и одного или большего количества их вариантов, обладающих идентичностью последовательности по меньшей мере около 90 % (например, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) относительно любой из SEQ ID NO: 229, 233 и 241-242, такой как обладает анти-TIGIT антитело 5C8.L5aH9a.
Кроме того, предлагаются анти-TIGIT антитела, которые содержат вариабельный участок тяжелой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 % 98 % или 99 %) или имеющий последовательность любой из SEQ ID NO: 60, 62, 66, 101, 103, 104, 105, 106, 107, 145, 146, 147, 148, 197, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 213, 260, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270 или 276. Кроме того, представлены анти-TIGIT антитела, которые содержат вариабельный участок легкой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность любой из SEQ ID NO: 61, 63, 64, 67, 102, 108, 109, 144, 149, 150, 151, 152, 198, 208, 209, 210, 211, 212, 214, 261, 271, 272, 273, 274, 275 или 277.
В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит вариабельный участок тяжелой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 60, и вариабельного участка легкой цепи, обладающего идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %), или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 61. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит вариабельный участок тяжелой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 62, и вариабельный участок легкой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 63. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит вариабельный участок тяжелой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 62, и вариабельный участка легкой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 64. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит вариабельный участок тяжелой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 66, и вариабельный участок легкой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 %, или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 67. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит вариабельный участок тяжелой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 101, и вариабельный участок легкой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 102. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит вариабельный участок тяжелой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 103, и вариабельный участок легкой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 108. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит вариабельный участок тяжелой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 104, и вариабельный участок легкой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 108. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит вариабельный участок тяжелой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 105, и вариабельный участок легкой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 % 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 108. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит вариабельный участок тяжелой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 106, и вариабельный участок легкой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 108. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит вариабельный участок тяжелой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 107, и вариабельный участок легкой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 109. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит вариабельный участок тяжелой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или в по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 143, и вариабельный участок легкой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 144. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит вариабельный участок тяжелой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или последовательности SEQ ID NO: 145, и вариабельный участок легкой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 149. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит вариабельный участок тяжелой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 145, и вариабельный участок легкой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 150. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит вариабельный участок тяжелой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 145, и вариабельный участок легкой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 151. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит вариабельный участок тяжелой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 145, и вариабельный участок легкой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 152. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит вариабельный участок тяжелой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 147, и вариабельный участок легкой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 149. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит вариабельный участок тяжелой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 148, и вариабельный участок легкой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 149. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит вариабельный участок тяжелой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 148, и вариабельный участок легкой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 % 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 152. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит вариабельный участок тяжелой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 197, и вариабельный участок легкой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 198. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит вариабельный участок тяжелой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 199, и вариабельный участок легкой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 208. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит вариабельный участок тяжелой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 200, и вариабельный участок легкой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %), или имеющий последовательность SEQ ID NO: 208. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит вариабельный участок тяжелой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 201, и вариабельный участок легкой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 208. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит вариабельный участок тяжелой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 202, и вариабельный участок легкой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 208. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит вариабельный участок тяжелой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 203, и вариабельный участок легкой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 208. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит вариабельный участок тяжелой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 204, и вариабельный участок легкой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 208. В некоторых случаях, анти-TIGIT антитело содержит вариабельный участок тяжелой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 205, и вариабельный участок легкой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 208. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит вариабельный участок тяжелой цепи, обладающий по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) идентичностью последовательности или имеющий последовательность SEQ ID NO: 206, и вариабельный участок легкой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 208. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит вариабельный участок тяжелой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 207, и вариабельный участок легкой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %), или по меньшей мере, 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 208. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит вариабельный участок тяжелой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 207, и вариабельный участок легкой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 212. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит вариабельный участок тяжелой цепи, обладающий по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) последовательности или имеющий последовательность SEQ ID NO: 199, и вариабельный участок легкой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 209. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит вариабельный участок тяжелой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 199, и вариабельный участок легкой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 210. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит вариабельный участок тяжелой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 199, и вариабельный участок легкой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 211. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит вариабельный участок тяжелой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 199, и вариабельный участок легкой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 212. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит вариабельный участок тяжелой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %), или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 213, и вариабельный участок легкой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 % 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 214. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит вариабельный участок тяжелой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 260, и вариабельный участок легкой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 261. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит вариабельный участок тяжелой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 262, и вариабельный участок легкой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 271. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит вариабельный участок тяжелой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %), или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 263, и вариабельный участок легкой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 271. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит вариабельный участок тяжелой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 264, и вариабельный участок легкой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %), или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 271. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит вариабельный участок тяжелой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 265, и вариабельный участок легкой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 271. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит вариабельный участок тяжелой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 266, и вариабельный участок легкой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 271. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит вариабельный участок тяжелой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 267, и вариабельный участок легкой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 271. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит вариабельный участок тяжелой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 % 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 268, и вариабельный участок легкой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 271. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит вариабельный участок тяжелой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 269, и вариабельный участок легкой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 271. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит вариабельный участок тяжелой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 270, и вариабельный участок легкой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 271. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит вариабельный участок тяжелой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 270, и вариабельный участок легкой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 275. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит вариабельный участок тяжелой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 262, и вариабельный участок легкой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 % 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 272. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит вариабельный участок тяжелой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 262, и вариабельный участок легкой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 273. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит вариабельный участок тяжелой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 262, и вариабельный участок легкой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 274. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит вариабельный участок тяжелой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 262, и вариабельный участок легкой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 275. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело содержит вариабельный участок тяжелой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 276, и вариабельный участок легкой цепи, обладающий идентичностью последовательности по меньшей мере 90 % (например, 91 %, 92 %, 93 % или 94 %) или по меньшей мере 95 % (например, 96 %, 97 %, 98 % или 99 %) или имеющий последовательность SEQ ID NO: 277.
В другом аспекте предлагается анти-TIGIT антитело, в котором антитело содержит VH, как в любом из вышеописанных вариантов осуществления изобретения, и VL, как в любом из вышеописанных вариантов осуществления изобретения, причем одна или обе последовательности вариабельного домена содержит посттрансляционные модификации.
В некоторых случаях любое из анти-TIGIT антител, описанных выше, может быть способно связываться с TIGIT кролика, в дополнение к TIGIT человека. В некоторых случаях любое из анти-TIGIT антител, описанных выше, может быть способно связываться как с TIGIT человека, так и с TIGIT яванского макака (яванца). В некоторых случаях любое из анти-TIGIT антител, описанных выше, может быть способно связываться с TIGIT человека, TIGIT яванца и TIGIT кролика. В некоторых случаях любое из анти-TIGIT антител, описанных выше (например, 4.1D3 или его производное), может быть способно связываться с TIGIT человека, TIGIT яванца и TIGIT кролика, но не с TIGIT мыши.
В некоторых случаях анти-TIGIT антитело связывается с TIGIT человека с Kd около 10 нМ или менее и с TIGIT яванца с Kd около 10 нМ или менее (например, связывается с TIGIT человека с Kd от около 0,1 нМ до около 1 нМ и с TIGIT яванца с Kd от около 0,5 нМ до около 1 нМ, например, связывается с TIGIT человека с Kd около 0,1 нМ или менее и с TIGIT яванца с Kd около 0,5 нМ или менее).
В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-TIGIT антитело является антагонистическим антителом. Антагонистическое антитело может специфически связываться с TIGIT и ингибировать или блокировать взаимодействие TIGIT с рецептором полиовируса (ПВР (PVR)) (например, антагонистическое антитело ингибирует внутриклеточное проведение сигнала, опосредуемое связыванием TIGIT с ПВР (PVR)). В некоторых случаях антагонистическое антитело ингибирует или блокирует связывание TIGIT человека с ПВР (PVR) человека со значением IC50 10 нМ или менее (например, от 1 нМ до 10 нМ). В некоторых случаях антагонистическое антитело ингибирует или блокирует связывание TIGIT яванца с ПВР (PVR) яванца со значением IC50 50 нМ или менее (например, от 1 нМ до около 50 нМ, например от 1 нМ до около 5 нМ).
В других вариантах осуществления изобретения анти-TIGIT антитело может быть агонистическим антителом. Агонистическое антитело может специфически связываться с TIGIT и стимулировать взаимодействие ПВР (PVR) с CD226 или CD96. Например, агонистическое антитело может специфически связываться с TIGIT и стимулировать взаимодействие ПВР (PVR) с CD226 и CD96 (например, связывается с TIGIT человека и стимулирует взаимодействие ПВР (PVR) человека с человеческим CD226 и человеческим CD96 и/или связывается с TIGIT яванца и стимулирует взаимодействие ПВР (PVR) яванца с CD226 яванца и CD96 яванца).
В следующем аспекте изобретение относится к выделенному антителу, которое конкурирует за связывание с TIGIT с любым из анти-TIGIT антител, описанных выше. Еще в одном аспекте изобретение относится к выделенному антителу, которое связывается с тем же эпитопом, что и анти-TIGIT антитело, описанное выше.
2
Анти-TIGIT антитело по любому из вышеуказанных вариантов осуществления изобретения представляет собой моноклональное антитело, включая химерное, гуманизированное или человеческое антитело. В одном варианте осуществления изобретения анти-TIGIT антитело представляет собой фрагмент антитела, например фрагмент Fv, Fab, Fab ', scFv, диатело или F(ab'). В другом варианте осуществления изобретения антитело представляет собой полноразмерное антитело, например, интактное IgG антитело (например, интактное IgG1антитело) или другой класс или изотип антитела, как определено в данном документе.
В еще одном аспекте анти-TIGIT антитело в соответствии с любым из вышеприведенных вариантов осуществления изобретения может обладать любым из признаков, отдельно или в комбинации, как описано в разделах 1-7 ниже.
Аффинность антител
1.
-8
-8
-13
-9
-13
В некоторых вариантах осуществления изобретения константа диссоциации антитела (например, анти-TIGIT антитело), представленного в данном документе, составляет (Kd) ≤ 1 мкМ, ≤ 100 нМ, ≤ 10 нМ, ≤ 1 нМ, ≤ 0,1 нМ, ≤ 0,01 нМ или ≤ 0,001 нМ (например, 10 М или менее, например, от 10 М до 10 М, например, от 10 М до 10 М).
125

125

J. Mol. Biol.
Cancer Res
В одном варианте осуществления изобретения Kd измеряют с помощью анализа связывания радиоактивно меченного антигена (РИА (RIA)). В одном варианте осуществления изобретения РИА (RIA) выполняют с Fab-версией представляющего интерес антитела и его антигена. Например, аффинность, связывание в растворе для Fab в отношении измеряют путем уравновешивания Fab с минимальной концентрацией (I)-меченого антигена в присутствии титрационной серии немеченого антигена, с последующим захватом связанного на планшете, покрытым антителом против Fab (см., например, Chen et al.,  293:865-881(1999)). Для проведения анализа многослойные планшеты MICROTITER (Thermo Scientific) покрывают в течение ночи 5 мкг/мл улавливающего антитела против Fab (Cappel Labs) в 50 мМ карбоната натрия (pH 9,6), и затем блокируют 2 % (мас./об.) бычьего сывороточного альбумина в фосфатно-солевом буфере, ФСБ (PBS) в течение двух-пяти часов при комнатной температуре (около 23 °C). На неадсорбирующем планшете (Nunc № 269620) 100 пМ или 26 пМ [I]-антигена смешивают с серийными разведениями Fab, представляющего интерес (например, при оценке антитела против ФРЭС (VEGF), Fab-12, в Presta et al., ., 57: 4593-4599 (1997)). Затем Fab, представляющий интерес, инкубируют в течение ночи; однако инкубация может продолжаться в течение более длительного периода (например, около 65 часов), чтобы обеспечить достижение равновесия. После этого смеси переносят на адсорбирующий планшет для инкубации при комнатной температуре (например, в течение одного часа). Затем раствор удаляют и планшет промывают восемь раз 0,1 % полисорбатом 20 (TWEEN-20) в ФСБ (PBS). После высушивания планшетов добавляют 150 мкл/лунку сцинтилляционной жидкости (MicroScint-20™; Packard), и планшеты считывают на гамма-счетчике TopCount™ (Packard) в течение десяти минут. Концентрации каждого Fab, которые дают значения менее чем или равные 20 % максимального связывания, выбирают для применения в анализах конкурентного связывания.

6
-1
-1
on
off
off
on
J. Mol. Biol.
Согласно другому варианту осуществления Kd измеряется с применением анализа методом поверхностного плазмонного резонанса BIACORE. Например, анализ с применением BIACORE-2000 или BIACORE-3000 (BIAcore, Inc., Пискатауэй, штат Нью-Джерси) проводится при 25 °C с помощью иммобилизованных антигенов CM5 в ~ 10 единиц ответа (ЕО (RU)). В одном варианте осуществления изобретения карбоксиметилированные биосенсорные декстрановые чипы (CM5, BIACORE, Inc.) активируют с помощью N-метил-N'-(3-диметиламинопропил)карбодиимида гидрохлорида (ЭДК (EDC)) и N- гидроксисукцинимида (NHS) в соответствии с инструкциями поставщика. Антиген разбавляют 10 мМ раствором ацетата натрия, рН 4,8, до 5 мкг/мл (~ 0,2 мкМ) перед инжекцией при скорости потока 5 мкл/мин до достижения около 10 единиц отклика (RU) связанного белка. После инъекции антигена вводят 1 М этаноламина для блокирования непрореагировавших групп. Для измерений кинетики осуществляют инжекции двукратных серийных разведений Fab (от 0,78 нМ до 500 нМ) в ФСБ (PBS) с 0,05 % поверхностно-активного вещества полисорбата 20 (Tween-20™) (ПБПА (PBST)) при 25 °С со скоростью потока около 25 мкл/мин. Скорость ассоциации (k) и скорость диссоциации (k) вычисляют с применением простой модели связывания Лэнгмюра один к одному (программное обеспечение BIACORE Evaluation, версия 3.2) путем одновременной аппроксимации сенсорных диаграмм ассоциации и диссоциации. Константу равновесной диссоциации (Kd) вычисляют как отношение k/k. См., например, Chen et al.,  293:865-881(1999). Если скорость ассоциации превышает 10 М с по данным метода поверхностного плазмонного резонанса, описанного выше, то скорость ассоциации может быть определена с применением методики гашения флуоресценции, в которой измеряют увеличение или уменьшение интенсивности флуоресцентного излучения (возбуждение = 295 нм, излучение = 340 нм, полоса пропускания 16 нм) при 25 °C для 20 нМ антитела против антигена (форма Fab) в ФСБ (PBS), pH 7,2, в присутствии возрастающих концентраций антигена, с измерением на спектрометре, таком как спектрофотометр со стоп-потоком (Aviv Instruments) или спектрофотометр SLM-AMINCO™ серии 8000 (ThermoSpectronic) с перемешиваемой кюветой.
Фрагменты антител
2.
2
2
Nat. Med.
The Pharmacology of Monoclonal Antibodies
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело, представленное в данном документе, представляет собой фрагмент антитела. Фрагменты антитела включают, но не ограничиваясь этим, фрагменты Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab'), Fv и scFv и другие фрагменты, описанные ниже. Обзор некоторых фрагментов антител см. в Hudson et al.  9:129-134 (2003). Обзор фрагментов scFv см., например, Pluckthün, в , vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994); см. также WO 93/16185; и патенты США № 5571894 и 5587458. Обсуждение фрагментов Fab и F (ab'), содержащих остатки эпитопов, связывающихся с рецептором реутилизации, и обладающих увеличенным периодом полувыведения in vivo, см. в патенте США № 5869046.
Nat. Med.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
Nat. Med.
Диатела являются фрагментами антител с двумя антигенсвязывающими сайтами, которые могут быть двухвалентными или биспецифическими. См., например, ЕР 404097; WO 1993/01161; Hudson et al.  9:129-134 (2003); и Hollinger et al.  90: 6444-6448 (1993). Триатела и тетратела также описаны в Hudson et al.  9:129-134 (2003).
Однодоменные антитела представляют собой фрагменты антител, содержащие весь или часть вариабельного домена тяжелой цепи или весь или часть вариабельного домена легкой цепи антитела. В некоторых вариантах осуществления изобретения однодоменное антитело представляет собой однодоменное антитело человека (Domantis, Inc., Уолтхэм, штат Массачусетс, см., например, патент США № 6248516 B1).
E. coli
Фрагменты антител могут быть получены различными способами, включая, но не ограничиваясь этим, протеолитическое расщепление интактного антитела, а также выработку рекомбинантными клетками-хозяевами (например,  или фаг), как описано в данном документе.
Химерные и гуманизированные антитела
3.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело, представленное в данном документе, представляет собой химерное антитело. Некоторые химерные антитела описаны, например, в патенте США № 4816567; и Morrison et al. , 81:6851-6855 (1984)). В одном примере химерное антитело содержит вариабельную участок, не относящийся к человеку (например, вариабельный участок, полученный от мыши, крысы, хомяка, кролика или приматов, не относящихся к человеку, таких как обезьяна) и константный участок человека. В другом примере химерное антитело представляет собой «класс-свич» антитело, в котором класс или подкласс был модифицирован по сравнению с классом исходного антитела. Химерные антитела включают антигенсвязывающие фрагменты.
В некоторых вариантах осуществления изобретения химерное антитело представляет собой гуманизированное антитело. Как правило, антитело, не относящееся к человеку, гуманизируют для снижения иммуногенности у человека, сохраняя при этом специфичность и аффинность исходного антитела, не относящегося к человека. Как правило, гуманизированное антитело содержит один или большее количество вариабельных доменов, в которых ГВУ (HVR), например УОК (CDR) (или их части), получают из антитела, не относящегося к человеку, а КУ (или их части) получают из последовательностей антител человека. Гуманизированное антитело необязательно будет дополнительно содержать по меньшей мере часть константного участка человека. В некоторых вариантах осуществления изобретения некоторые остатки КУ в гуманизированном антителе замещены соответствующими остатками антитела, не относящегося к человеку (например, антитело, из которого получены остатки ГВУ (HVR)), например, для восстановления или улучшения специфичности или аффинности антитела.
Front. Biosci.
, Nature
Proc. Nat’l Acad. Sci. USA
et al
Methods
Mol. Immunol.
Methods
Methods
Br. J. Cancer
Гуманизированные антитела и способы их получения рассматриваются, например, в Almagro and Fransson,  13:1619-1633 (2008), и далее описаны, например, в Riechmann et al. 332:323-329 (1988); Queen et al.,  86:10029-10033 (1989); патентах США №№ 5821337, 7527791, 6982321 и 7087409; Kashmiri .,  36:25-34 (2005) (описана пересадка определяющего специфичность участка, ОСУ (SDR)); Padlan,  28:489-498 (1991) (описана «модификация поверхности»); Dall’Acqua et al.,  36:43-60 (2005) (описана «перетасовка КУ»); and Osbourn et al.,  36:61-68 (2005) и Klimka et al., , 83:252-260 (2000) (описан подход «направленного отбора» к перетасовке КУ).
J. Immunol.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
J. Immunol.
Front. Biosci.
J. Biol. Chem.
J. Biol. Chem.
Каркасные участки человека, которые могут быть применены для гуманизации, включают, но не ограничиваясь этим: каркасные участки, выбранные с применением метода «наилучшего соответствия» (см., например, Sims et al. 151:2296 (1993)); каркасные участки, полученные из консенсусной последовательности человеческих антител конкретной подгруппы вариабельных участков легкой или тяжелой цепи (см., например, Carter et al. , 89:4285 (1992); и Presta et al. , 151:2623 (1993)); зрелые (соматически мутировавшие) каркасные участки человека или каркасные участки зародышевой линии человека (см., например, Almagro and Fransson,  13:1619-1633 (2008)); и каркасные участки, полученные в результате скрининга библиотек RE (FR) (см., например, Baca et al.,  272:10678-10684 (1997) и Rosok et al.,  271:22611-22618 (1996)).
Человеческие антитела
4.
Curr. Opin. Pharmacol.
Curr. Opin. Immunol.
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело, представленное в данном документе, представляет собой человеческое антитело. Человеческие антитела могут быть получены с применением различных методов, известных в данной области техники. Человеческие антитела в общем описаны в van Dijk and van de Winkel, 5: 368-74 (2001) и Lonberg,  20:450-459 (2008).
Nat. Biotech.
Человеческие антитела могут быть получены путем введения иммуногена трансгенному животному, организм которого был модифицирован для получения интактных человеческих антител или интактных антител с вариабельными участками человека в ответ на антигенный вызов. Такие животные обычно несут все или часть локусов иммуноглобулина человека, которые заменяют эндогенные локусы иммуноглобулина или которые присутствуют внехромосомно или интегрированы случайным образом в хромосомы животного. У таких трансгенных мышей эндогенные локусы иммуноглобулина обычно инактивированы. Обзора методов получения антител человека от трансгенных животных см. в Lonberg,  23:1117-1125 (2005). См. также, например, патенты США №№ 6075181 и 6150584, в которых описана технологию XENOMOUSE™; патент США № 5770429, в котором описана технология HuMab; патент США № 7041870, в котором описана технология K-M MOUSE, и публикацию патентной заявки США № US 2007/0061900, в которой описана технология VelociMouse). Вариабельные участки человека из интактных антител, вырабатываемых такими животными, могут быть дополнительно модифицированы, например, путем комбинирования с другим константным участком человека.
J. Immunol.
Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications
J. Immunol
, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
Xiandai Mianyixue
Histology and Histopathology
Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology
Человеческие антитела также могут быть получены с помощью гибридомных методов. Описаны клеточные линии человеческой миеломы и мышино-человеческой гетеромиеломы для выработки человеческих моноклональных антител. (См., например, Kozbor , 133: 3001 (1984); Brodeur et al.,, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); и Boerner et al.,., 147: 86 (1991).) Человеческие антитела, полученные с помощью технологии гибридомы B-клеток человека, также описаны в Li et al., 103:3557-3562 (2006). Дополнительные способы включают описанные, например, в патенте США № 7189826 (в котором описано получение моноклональных антител человека IgM из клеточных линий гибридомы) и Ni, , 26(4):265-268 (2006) (описаны гибридомы человека-человека). Кроме того, технология гибридомы человека (технология Trioma) описана в работах Vollmers and Brandlein, , 20(3):927-937 (2005) и Vollmers and Brandlein, , 27(3):185-91 (2005).
Человеческие антитела также могут быть получены путем выделения последовательностей вариабельного домена клона Fv, выбранного из библиотек фагового дисплея, полученных от человека. Такие последовательности вариабельных доменов затем могут быть объединены с желаемым константным доменом человека. Методы отбора человеческих антител из библиотек антител описаны ниже.
Полученные из библиотеки антитела
5.
Methods in Molecular Biology
Nature
Nature
J. Mol. Biol.
Methods in Molecular Biology
J. Mol. Biol.
J. Mol. Biol.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
J. Immunol. Methods
Антитела по изобретению могут быть выделены путем скрининга комбинаторных библиотек для антител с желаемой активностью или видами активности. Например, в данной области техники известны различные способы создания библиотек фагового дисплея и скрининга таких библиотек на предмет антител, обладающих желаемыми характеристиками связывания. Такие способы рассматриваются, например, в Hoogenboom et al. in  178:1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001), и дополнительно описаны, например, в McCafferty et al., 348:552-554; Clackson et al.,  352: 624-628 (1991); Marks et al.,  222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, в  248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al.,  338(2): 299-310 (2004); Lee et al.,  340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse,  101(34): 12467-12472 (2004); и Lee et al.,  284(1-2): 119-132(2004).
Ann. Rev. Immunol.
EMBO J,
in vitro
J. Mol. Biol.
В некоторых способах фагового дисплея репертуары генов VH и VL отдельно клонируются с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и рекомбинируются случайным образом в фаговых библиотеках, для которых затем может быть проведен скрининг на предмет антигенсвязывающего фага, как описано в Winter et al., , 12: 433-455 (1994). Фаг обычно отображает фрагменты антител в виде одноцепочечных фрагментов Fv (scFv), или в виде фрагментов Fab. Библиотеки из иммунизированных источников обеспечивают высокоаффинные антитела к иммуногену без необходимости создания гибридом. В качестве альтернативы, наивный репертуар может быть клонирован (например, от человека), чтобы обеспечить единый источник антител к широкому спектру неауто-, а также ауто-антигенов без какой-либо иммунизации, как описано Griffiths et al.,  12: 725-734 (1993). Наконец, наивные библиотеки дополнительно могут быть синтезированы путем клонирования неарранжированных сегментов V-гена из стволовых клеток и с применением праймеров ПЦР, содержащих случайную последовательность, для кодирования высоко вариабельных областей CDR3 и для осуществления перегруппировки , как описано Hoogenboom and Winter, , 227: 381-388 (1992). Патентные публикации, описывающие библиотеки фаговых антител человека, включают, например: патент США № 5750373 и патентные публикации США №№ 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 и 2009/0002360.
Антитела или фрагменты антител, выделенные из библиотек человеческих антител, считаются в данном контексте человеческими антителами или фрагментами человеческого антитела.
Мультиспецифические антитела
6.
В любом из вышеуказанных аспектов анти-TIGIT антитела (например, 4.1D3 или его вариант, например, 4.1D3.Q1E), представленные в данном документе, могут быть мультиспецифическими антителами, например биспецифическими антителами. Мультиспецифические антитела могут быть моноклональными антителами, которые обладают специфичностью связывания по меньшей мере в отношении двух разных сайтов. В некоторых вариантах осуществления изобретения биспецифические антитела могут связываться с двумя разными эпитопами на TIGIT. В некоторых вариантах осуществления изобретения одна из специфических характеристик связывания направлена на TIGIT, а другая на любой другой антиген (например, вторая биологическая молекула, например, антиген клеточной поверхности, например, опухолевый антиген). Соответственно, биспецифическое анти-TIGIT антитело может обладать специфичностью связывания в отношении TIGIT и второй биологической молекулы, такой как PD-1, PD-L1, PD-L2, OX40, PD-1, CTLA-4, LAG3, TIM3, BTLA, VISTA, B7H4 или CD96. Биспецифические антитела дополнительно могут быть получены как полноразмерные антитела или фрагменты антител.
В других вариантах осуществления изобретения биспецифические антитела могут связываться с двумя разными эпитопами TIGIT, OX40, PD-1, PD-L1, PD-L2. В некоторых вариантах осуществления изобретения одна из специфических характеристик связывания направлена на TIGIT, а другая на любой другой антиген (например, вторая биологическая молекула, такая как OX40). В других вариантах осуществления изобретения биспецифическое антитело может иметь обладать специфичностью связывания в отношении TIGIT и PD-L1; TIGIT и PD-L2; TIGIT и PD-1; TIGIT и CTLA-4; TIGIT и LAG3; TIGIT и TIM3; TIGIT и BTLA; TIGIT и VISTA; TIGIT и B7H4; или TIGIT и CD96, причем биспецифическое антитело предпочтительно представляет собой антагонистическое антитело против TIGIT и антагонистическое антитело против его второй мишени. В других вариантах осуществления изобретения биспецифическое антитело может обладать специфичностью связывания в отношении TIGIT и CD226; TIGIT и CD28; TIGIT и CD27; TIGIT и CD137; TIGIT и HVEM; TIGIT и GITR; TIGIT и MICA; TIGIT и ICOS; TIGIT и ПК (NK)G2D; или TIGIT и 2B4, причем биспецифическое антитело предпочтительно представляет собой антагонистическое антитело против TIGIT и его второй мишени. В других вариантах осуществления изобретения биспецифическое антитело может обладать специфичностью связывания в отношении TIGIT, которая не является антагонистической по своей природе (т.е. биспецифическое антитело не действует как антагонист TIGIT).
Nature
EMBO J.
,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
, Science
J. Immunol.
,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
,
J. Immunol.
J. Immunol.
Методы получения мультиспецифических антител включают, но не ограничиваясь этим, рекомбинантную коэкспрессию двух пар тяжелой цепи-легкой цепи иммуноглобулина, обладающих разной специфичностью (см. Milstein and Cuello,  305: 537 (1983)), WO 93/08829, и Traunecker et al.,  10: 3655 (1991)) и инжиниринг «выступ-во-впадине» (см., например, патент США № 5731168). Технология «выступ-во-впадине» для мультиспецифических антител может быть применена для создания первого плеча, содержащего выступ, и второго плеча, содержащего впадину, с которой может связываться выступ первого плеча. В одном варианте осуществления изобретения выступ мультиспецифических антител по изобретению может представлять собой анти-TIGIT плечо. В качестве альтернативы, в одном варианте осуществления изобретения выступ мультиспецифических антител по изобретению может быть представлять собой анти-TIGIT плечо. Кроме того, мультиспецифические антитела могут быть сконструированы с применением технологии иммуноглобулинового кроссовера (также известного как обмена доменов Fab или формат CrossMab) (см., например, WO2009/080253, Schaefer et al., 108:11187-11192 (2011)). Мультиспецифические антитела дополнительно могут быть получены с помощью инжиниринга электростатических управляющих эффектов для получения Fc-гетеродимерных молекул антител (WO 2009/089004A1); поперечного сшивания двух или более антител или фрагментов (см., например, патент США № 4676980 и Brennan et al., 229: 81 (1985)); с применением лейциновых зипперов для получения биспецифических антител (см., например, Kostelnyet al., , 148(5):1547-1553 (1992)); с применением технологии «диатела» для получения биспецифических фрагментов антител (см., например, Hollinger et al., 90:6444-6448 (1993)); и с применением одноцепочечных димеров Fv (sFv) (см., например, Gruber et al.,152:5368 (1994)); и получения триспецифических антител, как описано, например, в Tutt et al.  147: 60 (1991).
Дополнительно, в данное изобретение включены инженерные антитела с тремя или более функциональными сайтами связывания с антигеном, включая «осминожьи антитела» (см., например, US 2006/0025576A1).
Кроме того, антитела или фрагменты антител могут содержать «FAb двойного действия» или «DAF», содержащий сайт связывания с антигеном, который связывается с TIGIT, а также с другим, отличным антигеном (например, вторая биологическая молекула) (см., например, US 2008/0069820).
Варианты антител
7.
В некоторых вариантах осуществления изобретения предлагаются варианты аминокислотной последовательности анти-TIGIT антител по изобретению. Как подробно описано в данном документе, анти-TIGIT антитела могут быть оптимизированы на основе желаемых структурных и функциональных свойств. Например, может быть желаемым улучшить аффинность связывания и/или другие биологические свойства антитела. Варианты аминокислотной последовательности антитела могут быть получены путем введения соответствующих модификаций в нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело, или путем синтеза пептидов. Такие модификации включают, например, делеции и/или инсерции и/или замены остатков в аминокислотных последовательностях антитела. Любая комбинация делеции, инсерции и замены может быть получена для конечной конструкции, при условии, что конечная конструкция обладает требуемыми характеристиками, например связывания с антигеном.
Варианты замены, вставки и удаления
I.
В некоторых вариантах осуществления изобретения предлагаются варианты антител, содержащие одну или несколько аминокислотных замен. Сайты, представляющие интерес для мутагенеза с заменой, включают ГВУ (HVR) и КУ. Консервативные замены приведены в Табл. 1 под заголовком «Предпочтительные замены». Более существенные модификации приведены в Табл. 1 под заголовком «типичные замены» и дополнительно описаны ниже в отношении классов боковой цепи аминокислот. Аминокислотные замены могут быть введены в представляющее интерес антитело, а продукты подвергнуты скринингу на предмет желаемой активности, например, сохранения/улучшения связывания с антигеном, снижения иммуногенности или улучшения антителозависимой цитотоксичности, АЗКЦ (ADCC) или комплементзависимой цитотоксичности, КЗЦ (CDC).
Таблица 1. Типичные и предпочтительные замены аминокислот
<b>Исходный остаток</b>
<b>Типичные замены</b>
<b>Предпочтительные замены</b>
Ala (A)
Val; Leu; Ile
Val
Arg (R)
Lys; Gln; Asn
Lys
Asn (N)
Gln; His; Asp, Lys; Arg
Gln
Asp (D)
Glu; Asn
Glu
Cys (C)
Ser; Ala
Ser
Gln (Q)
Asn; Glu
Asn
Glu (E)
Asp; Gln
Asp
Gly (G)
Ala
Ala
His (H)
Asn; Gln; Lys; Arg
Arg
Ile (I)
Leu; Val; Met; Ala; Phe; норлейцин
Leu
Leu (L)
норлейцин; Ile; Val; Met; Ala; Phe
Ile
Lys (K)
Arg; Gln; Asn
Arg
Met (M)
Leu; Phe; Ile
Leu
Phe (F)
Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr
Tyr
Pro (P)
Ala
Ala
Ser (S)
Thr
Thr
Thr (T)
Val; Ser
Ser
Trp (W)
Tyr; Phe
Tyr
Tyr (Y)
Trp; Phe; Thr; Ser
Phe
Val (V)
Ile; Leu; Met; Phe; Ala; норлейцин
Leu
Аминокислоты могут быть сгруппированы в соответствии с общими свойствами боковой цепи:
(1) гидрофобные: норлейцин, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) нейтральные гидрофильные: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) кислые: Asp, Glu;
(4) основные: His, Lys, Arg;
(5) остатки, которые влияют на ориентацию цепей: Gly, Pro;
(6) ароматические: Trp, Tyr, Phe.
Неконсервативные замены влекут за собой обмен членом одного из этих классов на другой класс.
Один тип варианта замены включает замену одного или большего количества остатков гипервариабельных участков исходного антитела (например, гуманизированного или человеческого антитела). Как правило, результирующий вариант (варианты), выбранный для дальнейшего изучения, будет содержать модификации (например, улучшение) определенных биологических свойств (например, повышенная аффинность, сниженная иммуногенность) относительно исходного антитела и/или будет в существенной мере сохранять определенные биологические свойства исходного антитела. Типичным вариантом замещения является антитело с созревшей аффинностью, которое может быть традиционно сгенерировано, например, с применением методов созревания аффинности на основе фагового дисплея, таких как описанные в данном документе. Вкратце, один или большее количество остатков ГВУ (HVR) мутируют, а варианты антител отображаются на фаге и подвергаются скринингу на предмет конкретной биологической активности (например, аффинность связывания).
Methods Mol. Biol.
Methods in Molecular Biology
Модификации (например, замены) могут быть осуществлены в ГВУ (HVR), например, для улучшения аффинности к антителу. Такие модификации могут быть осуществлены в «горячих точках» ГВУ (HVR), т.е., в остатках, кодируемых кодонами, которые с высокой частотой подвергаются мутации во время процесса соматического созревания (см., например, Chowdhury,  207:179-196 (2008)), и/или остатках, которые контактируют с антигеном, причем полученный вариант VH или VL тестируют предмет аффинности связывания. Созревание аффинности путем инжиниринга и повторной селекции из вторичных библиотек было описано, например, в Hoogenboom et al. в  178:1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)). В некоторых вариантах созревания аффинности в вариабельные гены, выбранные для созревания, вносят генетическое разнообразие с помощью любого из множества способов (например, ПЦР с применением ошибающейся полимеразы, перетасовки цепей или олигонуклеотид-направленного мутагенеза). Затем создается вторичная библиотека. Далее библиотеку подвергают скринингу для идентификации любых вариантов антител с желаемой аффинностью. Другой способ внесения разнообразия включает в себя ГВУ (HVR) ориентированные подходы, в которых рандомизируют несколько ГВУ (HVR) остатков (например, 4-6 остатков за раз). Остатки ГВУ (HVR), принимающие участие в связывании с антигеном, могут быть специфически идентифицированы, например, с применением аланинсканирующего мутагенеза или моделирования. В частности, мишенью часто выступают CDR-H3 и CDR-L3.
В некоторых вариантах осуществления изобретения замены, инсерции или делеции могут происходить в пределах одного или большего количества ГВУ (HVR), до тех пор, пока такие изменения не уменьшают в существенной мере способность антитела связываться с антигеном. Например, в ГВУ (HVR) могут быть осуществлены консервативные модификации (например, консервативные замены, как указано в данном документе), которые не уменьшают в существенной мере аффинность связывания. Такие модификации могут, например, располагаться за пределами вступающих в контакт с антигеном остатков ГВУ (HVR). В некоторых вариантах VH и VL, представленных выше, каждый ГВУ (HVR) либо является немодифицированным, либо содержит не более одной, двух или трех замен аминокислот.
Science
Пригодным способом идентификации остатков или участков антитела, которые могут быть нацелены на мутагенез, называется «аланинсканирующий мутагенез», как описано в статье Cunningham and Wells (1989) , 244:1081-1085. В этом способе остаток или группу целевых остатков (например, заряженные остатки, такие как arg, asp, his, lys и glu) идентифицируют и заменяют нейтральной или отрицательно заряженной аминокислотой (например, аланином или полиаланином), чтобы определить, затронет ли это взаимодействие антитела с антигеном. Дальнейшие замены могут быть введены в местах аминокислот, демонстрирующих функциональную чувствительность к исходным заменам. В качестве альтернативы или дополнительно, кристаллическая структура комплекса антигена-антитела для идентификации точек контакта между антителом и антигеном. Такие вступающие в контакт остатки и соседние остатки могут служить мишенями или быть исключены в качестве кандидатов для замены. Варианты могут быть подвергнуты скринингу, чтобы определить, обладают ли они требуемыми свойствами.
Инсерции аминокислотной последовательности включают амино- и/или карбокси-концевые слияния длиной от одного остатка до полипептидов, содержащих сто или более остатков, а также инсерции одного или большего количества аминокислотных остатков внутри последовательности. Примеры концевых инсерций включают антитело с N-концевым метионильным остатком. Другие инсерционные варианты молекулы антитела включают слияние с N- или С-концом антитела с ферментом (например, для антитело-опосредованной терапии с применением ферментов и пролекарств, АОТФП (ADEPT)) или полипептид, который увеличивает период полувыведения антитела из сыворотки.
II. Варианты гликозилирования
В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-TIGIT антитела по изобретению (например, 4.1D3 или его вариант, например, 4.1D3.Q1E) могут быть модифицированы для увеличения или уменьшения степени гликозилирования антитела. Добавление или удаление сайтов гликозилирования из анти-TIGIT антитела по изобретению может быть с легкостью осуществлено путем модификации аминокислотной последовательности таким образом, что создается или удаляется один или большее количество сайтов гликозилирования.
TIBTECH
Если антитело содержит участок Fc, то углевод, присоединенный к нему, может быть модифицирован. Нативные антитела, вырабатываемые клетками млекопитающих, обычно содержат разветвленный двухантенный олигосахарид, который обычно присоединен N-связью к Asn297 домена CH2 участка Fc. См., например, Wright et al.  15:26-32 (1997). Олигосахарид может включать различные углеводы, например маннозу, N-ацетилглюкозамин (GlcNAc), галактозу и сиаловую кислоту, а также фукозу, присоединенную к GlcNAc в «стебле» двухантенной олигосахаридной структуры. В некоторых вариантах осуществления изобретения могут быть осуществлены модификации олигосахарида в антителе по изобретению с целью создания вариантов антител с некоторыми улучшенными свойствами.
J. Mol. Biol.
Biotech. Bioeng.
Arch. Biochem. Biophys.
FUT8
Biotech. Bioeng.
, Biotechnol. Bioeng
В одном варианте осуществления изобретения предлагаются варианты анти-TIGIT антитела, содержащие углеводную структуру, в которой отсутствует фукоза, присоединенная (прямо или непрямо) к участку Fc. Например, количество фукозы в таком антителе может составлять от 1 % до 80 %, от 1 % до 65 %, от 5 % до 65 % или от 20 % до 40 %. Количество фукозы определяют путем вычисления среднего количества фукозы в сахарной цепи при Asn297 по отношению к сумме всех гликоструктур, присоединенных к Asn 297 (например, комплексной, гибридной и высокоманнозной структуры), по данным масс-спектрометрии времяпролетной ионизации лазерной десорбцией с применением матрицы, ВП-ИЛДПМ (MALDI-TOF), как описано, например, в WO 2008/077546. Asn297 относится к остатку аспарагина, расположенному примерно в положении 297 на участке Fc (нумерация ЕС остатков участка Fc); однако из-за незначительных вариаций последовательности антител Asn297 также может быть расположен на около ± 3 аминокислоты в направлении против ходе транскрипции или по ходу транскрипции относительно положения 297, т.е., между положениями 294 и 300. Такие варианты фукозилирования могут обладать улучшенной функцией АЗКЦ (ADCC). См., например, патентные публикации США №№ US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Примеры публикаций, относящихся к «дефукозилированным» или «фукозо-дефицитным» вариантам антитела, включают: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki et al. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. 87: 614 (2004). Примеры клеточных линий, способных вырабатывать дефукозилированные антитела, включают в себя клетки Lec13 ЯКХ (CHO), с дефицитом фукозилирования белка (Ripka et al.249:533-545 (1986), патентную заявку США № US 2003/0157108 A1, Presta, L и WO 2004/056312 A1, Adams et al., особенно в Примере 11), и содержащие «нокаут» клеточные линии, такие как ген альфа-1,6-фукозилтрансферазы, , содержащие «нокаут» клетки ЯКХ (СНО) (см., например, Yamane-Ohnuki et al. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al.., 94(4):680-688 (2006); и WO2003/085107).
Варианты анти-TIGIT антител дополнительно снабжены двухантенными олигосахаридами, например, в которых двухантенный олигосахарид, присоединенный к участку Fc антитела, делится GlcNAc пополам. Таким вариантам антител может быть присуща сниженная степень фукозилирования и/или улучшенная функция АЗКЦ (ADCC). Примеры таких вариантов антител описаны, например, в WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); патент США № 6602684 (Umana et al.); и US 2005/0123546 (Umana et al.). Кроме того, предусмотрены варианты антител с по меньшей мере одним галактозным остатком в олигосахариде, присоединенном к участку Fc. Такие варианты антител могут обладать улучшенной функцией КЗЦ (CDC). Такие варианты антител описаны, например, в WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); и WO 1999/22764 (Raju, S.).
III. Варианты участка Fc
В некоторых вариантах осуществления изобретения одна или несколько модификаций аминокислот могут быть введены на участке Fc анти-TIGIT антитела по изобретению (например, 4.1D3 или его вариант, например, 4.1D3.Q1E), с генерацией тем самым варианта участка Fc (см., например, US 2012/0251531). Вариант участка Fc может содержать последовательность участка Fc человека (например, участок Fc человека IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4), содержащую модификацию аминокислоты (например, замену) в одном или нескольких положениях аминокислот.
in vivo
in vitro
in vivo
Annu. Rev. Immunol.
in vitro
Proc. Nat’l Acad. Sci. USA
Proc. Nat’l Acad. Sci. USA
J. Exp. Med.
in vivo
Proc. Nat’l Acad. Sci. USA
et al
J. Immunol. Methods
Blood.
Blood.
in vivo
Int’l. Immunol.

В некоторых вариантах осуществления изобретение включает вариант анти-TIGIT антитела, который обладает некоторыми, но не всеми эффекторными функциями, что делает его желательным кандидатом для сфер применения, в которых период полувыведения антитела  является существенным, а некоторые эффекторные функции (такие как комплемент и АЗКЦ (ADCC)) являются ненужными или вредными. Анализы цитотоксичности  и/или  можно проводить для подтверждения снижения/истощения активности КЗЦ (CDC) и/или АЗКЦ (ADCC). Например, могут быть проведены анализы связывания с рецептором Fc (FcR), чтобы гарантировать, что антитело не связывается FcγR (а следовательно, вероятно, не обладает активностью АЗКЦ (ADCC)), но сохраняет способность к связыванию с FcRn. Основные клетки для опосредования АЗКЦ (ADCC), ПК (NK)-клетки, экспрессирующие только FcγRIII, тогда как моноциты экспрессируют FcγRI, FcγRII и FcγRIII. Экспрессия FcR на кроветворных клетках кратко суммирована в Табл. 3 на стр. 464 Ravetch and Kinet,  9:457-492 (1991). Неограничивающие примеры анализов  для оценки активности АЗКЦ (ADCC) представляющей интерес молекулы описаны в патенте США № 5500362 (см., например, Hellstrom, I. et al.  83:7059-7063 (1986)) и Hellstrom, I et al.,  82:1499-1502 (1985); 5821337 (см. Bruggemann, M. et al.,  166:1351-1361 (1987)). В качестве альтернативы могут быть применены методы нерадиоактивного анализа (см., например, нерадиоактивный анализ цитотоксичности ACTI™ для проточной цитометрии (CellTechnology, Inc. Маунтин-Вью, штат Калифорния, и нерадиоактивный анализ цитотоксичности CytoTox 96 (Promega, Мэдисон, штат Висконсин). Пригодными эффекторными клетками для таких анализов являются мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК (PBMC)) и природные клетки-киллеры (ПК (NK)). В качестве альтернативы или дополнительно, активность АЗКЦ (ADCC) представляющей интерес молекулы может быть оценена , например, на животной модели, как, например, раскрыто в Clynes et al.  95:652-656 (1998). Кроме того, анализы связывания с C1q могут быть проведены для подтверждения того, что антитело неспособно связываться с C1q и,, следовательно, не обладает активностью КЗЦ (CDC). См., например, ТИФА (ELISA) связывания с C1q и C3c в WO 2006/029879 и WO 2005/100402. Для оценки активации комплемента может быть проведен анализ КЗЦ (CDC) (см., например, Gazzano-Santoro .  202:163 (1996); Cragg, M.S. et al.  101:1045-1052 (2003); и Cragg, M.S. and M.J. Glennie  103:2738-2743 (2004)). Кроме того, связывание с FcRn и определение клиренса/периода полувыведения  могут быть выполнены с применением методов, известных в данной области техники (см., например, Petkova, S.B. et al.  18(12):1759-1769 (2006)).
Антитела со сниженной эффекторной функцией включают антитела с заменой одного или большего количества остатков на участке Fc 238, 265, 269, 270, 297, 327 и 329 (патенты США №№ 6737056 и 8219149). Такие мутанты Fc включают мутанты Fc с заменой в двух или большем количестве положений аминокислот 265, 269, 270, 297 и 327, включая так называемый мутант Fc «DANA» с заменой остатков 265 и 297 на аланин (патенты США №№ 7332581 и 8219149).
В некоторых вариантах осуществления изобретения пролин в положении 329 участка Fc человека дикого типа в антителе замещен глицином или аргинином или аминокислотным остатком, достаточно большим для разрушения пролинного сэндвича в пределах поверхности рецептора Fc/Fc.гамма, который образуется между пролином 329 Fc и остатками триптофана Trp 87 и Trp 110 FcγRIII (Sondermann et al.: Nature 406, 267-273 (20 Jul. 2000)). В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело содержит по меньшей мере еще одну замену аминокислоты. В одном варианте осуществления изобретения дополнительная замена аминокислоты представляет собой S228P, E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D или P331S, а еще в другом варианте осуществления изобретения по меньшей мере одна дополнительная замена аминокислоты представляет собой L234A и L235A участка Fc IgG1 человека или S228P и L235E участка Fc IgG4 человека (см., например, US 2012/0251531), и все еще в другом варианте осуществления изобретения по меньшей мере одна дополнительная замена аминокислоты представляет собой L234A и L235A и P329G участка Fc IgG1 человека.
, J. Biol. Chem.
Описаны некоторые варианты антител с улучшенным или сниженным связыванием с FcR. (См., например, патент США № 6737056, WO 2004/056312 и Shields et al. 9(2): 6591-6604 (2001)).
В некоторых вариантах осуществления изобретения вариант антитела содержит участок Fc с одной или большим количеством замен аминокислот, которые улучшают АЗКЦ (ADCC), например, замены в положениях 298, 333 и/или 334 участка Fc (нумерация ЕС остатков).
J. Immunol.
В некоторых вариантах осуществления изобретения на участке Fc осуществляют модификации, которые приводят к изменению (например, улучшению или снижению) связывания C1q и/или комплементзависимой цитотоксичности (КЗЦ (CDC)), например, как описано в патенте США № 6194551, WO 99/51642, и Idusogie et al. 164: 4178-4184 (2000).
J. Immunol.
J. Immunol.
Антитела с увеличенным периодом полувыведения и улучшенным связыванием с рецептором Fc новорожденных (FcRn), который ответственен за передачу материнских IgG плоду (Guyer et al.,  117:587 (1976) и Kim et al.,  24:249 (1994)), описаны в US2005/0014934A1 (Hinton et al.). Такие антитела содержат участок Fc с одной или несколькими заменами, которые улучшают связывание участка Fc с FcRn. Такие варианты Fc включают в себя содержащие замены одного или нескольких остатков на участке Fc: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 или 434, например замена остатка 434 на участке Fc (патент США № 7371826).
Nature
См. также Duncan & Winter,  322:738-40 (1988); патент США № 5648260; патент США № 5624821; и WO 94/29351 относительно других примеров вариантов участка Fc.
В некоторых аспектах анти-TIGIT антитело (например, 4.1D3 или его вариант, например, 4.1D3.Q1E) содержит участок Fc, содержащий мутацию N297G.
1
1
1
2
2
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-TIGIT антитело (например, 4.1D3 или его вариант, например, 4.1D3.Q1E) содержит один или большее количество константных доменов тяжелой цепи, причем один или большее количество константных доменов тяжелой цепи выбраны из первого домена CH1 (СН1 ), первого домена СН2 (СН2 ), первого домена СН3 (СН3 ), второго домена СН1 (СН1 ), второго домена СН2 (СН2 ), и второго домена СН3 (СН3 ), В некоторых случаях по меньшей мере один из одного или большего количества константных доменов тяжелой цепи соединен с другим константным доменом тяжелой цепи. В некоторых случаях каждый из доменов CH3  и CH3  содержит выступ или полость, причем выступ или полость в домене CH3  расположена в полости или выступе, соответственно, в домене CH3 . В некоторых случаях домены CH3  и CH3  встречаются на границе раздела между выступом и полостью. В некоторых случаях каждый из доменов CH2  и CH2  содержит выступ или полость, причем выступ или полость в домене CH2  расположена соответственно в полости или выступе в домене CH2 . В других случаях домены CH2  и CH2  встречаются на границе раздела между выступом и полостью. В некоторых случаях анти-TIGIT антитело представляет собой антитело IgG1.
IV. Модифицированные цистеином варианты антител
В некоторых вариантах осуществления изобретения может быть желаемым создать модифицированные цистеином антитела, например «тиоMAb», в которых один или большее количество остатков антитела замещены остатками цистеина. В конкретных вариантах осуществления изобретения замещенные остатки находятся в доступных участках антитела. При замене этих остатков цистеином, реакционноспособные тиольные группы, таким образом, помещаются в доступные сайты антитела и могут быть использованы для конъюгации антитела с другими фрагментами, такими как фрагменты лекарственного средства или фрагменты линкера-лекарственного средства, для создания иммуноконъюгата, как описано в данном документе ниже, В некоторых вариантах осуществления изобретения любой один или большее количество из следующих остатков могут быть замещены цистеином: V205 (нумерация Kabat) легкой цепи; A118 (нумерация ЕС) тяжелой цепи; и S400 (нумерация ЕС) участка Fc тяжелой цепи. Модифицированные цистеином антитела могут быть получены, как описано, например, в патенте США 7521541.
V. Производные антител
В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-TIGIT антитело по изобретению (например, 4.1D3 или его вариант, например, 4.1D3.Q1E), предложенное в данном изобретении, может быть дополнительно модифицировано с целью введения дополнительных небелковых фрагментов, которые известны в данной области техники и являются легко доступными. Группы, подходящие для дериватизации антитела, включают, но не ограничиваясь этим, водорастворимые полимеры. Неограничивающие примеры водорастворимых полимеров включают, но не ограничиваясь этим, полиэтиленгликоль (ПЭГ), сополимеры этиленгликоля/пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлозу, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, поли-1,3-диоксолан, поли-1,3,6-триоксан, сополимер этилена и малеинового ангидрида, полиаминокислоты (гомополимеры или статистические сополимеры) и декстрана или поли(н-винилпирролидон)полиэтиленгликоль, гомополимеры пропропиленгликоля, сополимеры пролипропиленоксида/этиленоксида, полиоксиэтилированные полиолы (например, глицерин), поливиниловый спирт и их смеси. Полиэтиленгликоль пропиональдегид может иметь преимущества в производстве благодаря его стабильности в воде. Полимер может иметь любую молекулярную массу и может быть разветвленным или неразветвленным. Количество полимеров, присоединенных к антителу, может варьировать, и если к нему прикреплено более одного полимера, они могут быть одинаковыми или разными молекулами. В общем, количество и/или тип полимеров, применяемых для дериватизации, могут быть определены на основе соображений, включающих (но не ограничиваясь этим) конкретные свойства или функции улучшаемого антитела, независимо от того, будет ли производное антитела применяться при терапии определенных состояний, и т. д.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
В другом варианте осуществления изобретения предусмотрены конъюгаты антитела и небелкового фрагмента, которые могут избирательно нагреваться под воздействием излучения. В одном варианте осуществления изобретения небелковая часть представляет собой углеродную нанотрубку (Kam et al.,  102: 11600-11605 (2005)). Излучение может иметь любую длину волны и включает в себя, но не ограничиваясь этим, длины волн, которые не вредят обычным клеткам, но которые нагревают небелковый остаток до температуры, при которой погибают клетки, расположенные проксимально относительно небелковой части антитела.
IV. Рекомбинантные способы и композиции
Анти-TIGIT антитела по изобретению (например, 4.1D3 или его вариант, например, 4.1D3.Q1E) могут быть получены с применением рекомбинантных способов и композиций, например, как описано в патенте США № 4816567, который включен в данный документ посредством ссылки в полном объеме. В одном варианте осуществления изобретения предлагается выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая анти-TIGIT антитело, описанное в данном документе. Такая нуклеиновая кислота может кодировать аминокислотную последовательность, содержащую VL, и/или аминокислотную последовательность, содержащую VH антитела (например, легкие и/или тяжелые цепи антитела). В следующем варианте осуществления изобретения предлагается один или большее количество векторов (например, векторов экспрессии), содержащих такую нуклеиновую кислоту. В следующем варианте осуществления изобретения предлагается клетка-хозяин, содержащая такую нуклеиновую кислоту. В одном из таких вариантов осуществления изобретения клетка-хозяин содержит (например, была трансформирована): (1) вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, которая кодирует аминокислотную последовательность, содержащую VL антитела, и аминокислотную последовательность, содержащую VH антитела, или (2) первый вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, которая кодирует аминокислотную последовательность, содержащую VL антитела, и второй вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, которая кодирует аминокислотную последовательность, содержащую VH антитела. В одном варианте осуществления изобретения клетка-хозяин является эукариотической, например клеткой яичника китайского хомяка (ЯКХ (CHO)) или лимфоидной клеткой (например, Y0, NS0, клеткой Sp20). В одном варианте осуществления изобретения предлагается способ получения анти-TIGIT антитела, причем способ включает культивирование клетки-хозяина, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, как указано выше, в условиях, подходящих для экспрессии антитела, и, необязательно, выделение антитела из клетки-хозяина (или среды культивирования клеток-хозяев).
Для рекомбинантного продуцирования анти-TIGIT антитела нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, например, как описано выше, выделяют и вставляют в один или большее количество векторов для дальнейшего клонирования и/или экспрессии в клетке-хозяине. Такая нуклеиновая кислота может быть легко выделена и секвенирована с применением обычных методов (например, с применением олигонуклеотидных зондов, которые способны специфически связываться с генами, кодирующими тяжелую и легкую цепи антитела).
Methods in Molecular Biology, Vol. 248
E. coli
Подходящие клетки-хозяева для клонирования или экспрессии векторов, кодирующих антитело, включают прокариотические или эукариотические клетки, описанные в данном документе. Например, антитела могут быть получены в бактериях, в частности, если гликозилирование и эффекторная функция Fc не нужны. Для экспрессии фрагментов антител и полипептидов в бактериях см., например, патенты США №№ 5648237, 5789199 и 5840523. (См. также Charlton,  (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254, где описана экспрессию фрагментов антител в ). После экспрессии, антитело может быть выделено из пасты бактериальных клеток в растворимой фракции и может быть дополнительно очищено.
Nat. Biotech.
Nat. Biotech.
В дополнение к прокариотам, эукариотические микробы, такие как нитчатые грибы или дрожжи, являются подходящими хозяевами клонирования или экспрессии для векторов, кодирующих антитела, включая грибы и дрожжевые штаммы, пути гликозилирования которых были «гуманизированы», что приводит к выработке антитела с частично или полностью человеческим характером гликозилирования. См. Gerngross,  22:1409-1414 (2004), and Li et al.,  24:210-215 (2006).
Spodoptera frugiperda
Дополнительно, подходящие клетки-хозяева для экспрессии гликозилированного антитела получают из многоклеточных организмов (беспозвоночных и позвоночных). Примеры клеток беспозвоночных включают клетки растений и насекомых. Были идентифицированы многочисленные бакуловирусные штаммы, которые можно применять в сочетании с клетками насекомых, особенно для трансфекции клеток .
Кроме того, культуры растительных клеток могут быть применены в качестве хозяев. См., например, патенты США №№ 5959177, 6040498, 6420548, 7125978 и 6417429 (описывающие технологию PLANTIBODIES™ для получения антител в трансгенных растениях).
, J. Gen Virol.
Biol. Reprod.
, Annals N.Y. Acad. Sci
, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
Methods in Molecular Biology, Vol. 248
-
-
Клетки позвоночных также можно применять в качестве хозяев. Например, подходящими могут быть клеточные линии млекопитающих, адаптированные для роста в суспензии. Другими примерами подходящих клеточных линий млекопитающих являются линия CV1 почки обезьяны, трансформированная SV40 (COS-7); (293 или клетки 293, как описано, например, в Graham et al. 36:59 (1977)); клетки почки детеныша хомяка (ПДК (BHK)); клетки Сертоли мыши (клетки TM4, как описано, например, в Mather,  23:243-251 (1980)); клетки почки обезьяны (CV1); клетки почки африканской зеленой мартышки (VERO-76); клетки карциномы шейки матки человека (HELA); клетки почки собаки (MDCK), клетки печени крысы линии Buffalo (BRL 3A), клетки легкого человека (W138), клетки печени человека (Hep G2), опухоль молочной железы мыши (MMT 060562), клетки TRI, как описано, например, в Mather et al.. 383:44-68 (1982); клетки MRC 5, а также клетки FS4. Другие подходящие линии клеток-хозяев млекопитающих включают клетки яичника китайского хомяка (ЯКХ (СНО)), в том числе дигидрофолатредуктаза-отрицательные, ДГФР (DHFR) клетки ЯКХ (СНО) (Urlaub et al. 77:4216 (1980)) и клеточные линии миеломы, такие как Y0, NS0 и Sp2/0. Обзор некоторых линий клеток-хозяев млекопитающих, подходящих для продуцирования антител, см., например, в Yazaki and Wu,  (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003).
V. Иммуноконъюгаты
Изобретение дополнительно относится к иммуноконъюгатам, содержащим анти-TIGIT антитело по изобретению (например, 4.1D3 или его вариант, например, 4.1D3.Q1E), конъюгированное с одним или большим количеством цитотоксических агентов, таких как химиотерапевтические агенты или лекарственные средства, ингибиторы роста, токсины (например, белковые токсины, обладающие ферментативной активностью токсины бактериального, грибного, растительного или животного происхождения или их фрагменты) или радиоактивные изотопы.
Cancer Res.
Cancer Res.
Current Med. Chem.
Bioorganic & Med. Chem. Letters
Bioconj. Chem.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
Bioorg. & Med. Chem. Letters
J. Med. Chem.
В одном варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат представляет собой конъюгат антитела-лекарственного средства (КАЛС (ADC)), в котором антитело конъюгировано с одним или большим количеством лекарственных средств, включая, но не ограничиваясь этим, майтансиноид (см. патенты США №№ 5208020, 5416064 и европейский патент EP 0425235 В1); ауристатин, такой как фрагменты лекарственного средства монометилауристатина DE и DF (MMAE и MMAF) (см. патенты США №№ 5635483 и 5780588 и 7498298); доластатин; калихеамицин или его производное (см. патенты США №№ 5712374, 5714586, 5739116, 5767285, 5770701, 5770710, 5773001 и 5877296; Hinman et al.,  53:3336-3342 (1993); и Lode et al.,  58:2925-2928 (1998)); антрациклин, такой как дауномицин или доксорубицин (см. Kratz et al., 13:477-523 (2006); Jeffrey et al., 16:358-362 (2006); Torgov et al.,  16:717-721 (2005); Nagy et al.,  97:829-834 (2000); Dubowchik et al.,  12:1529-1532 (2002); King et al.,  45:4336-4343 (2002) и патент США № 6630579); метотрексат; виндезин; таксан, такой как доцетаксел, паклитаксел, ларотаксел, тезетаксел и ортатаксел; трихотецен; и CC1065.
Pseudomonas aeruginosa
Aleurites fordii
Phytolaca americana
Momordica charantia
Sapanaria officinalis
В другом варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат содержит анти-TIGIT антитело, как описано в данном документе (например, 4.1D3 или его вариант, например, 4.1D3.Q1E), конъюгированный с обладающим ферментативной активностью токсином или его фрагментом, включая, но не ограничиваясь этим, цепь дифтерии A, несвязывающиеся активные фрагменты дифтерийного токсина, цепь экзотоксина A (из ), цепь рицина A, цепь абрина A, цепь модессина A, альфа-сарцин, белки , диантиновые белки, белки  (PAPI, PAPII и PAP-S), ингибитор , курцин, кротин, ингибитор , гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин и трикотецены.
211
131
125
90
186
188
153
212
32
212
В другом варианте осуществления изобретения иммуноконъюгат содержит анти-TIGIT антитело, как описано в данном документе (например, 4.1D3 или его вариант, например, 4.1D3.Q1E), конъюгированный с радиоактивным атомом с образованием радиоконъюгата. Множество радиоактивных изотопов доступно для получения радиоконъюгатов. Примеры включают At, I, I, Y, Re, Re, Sm, Bi, P, Pb и радиоактивные изотопы Lu. Если для обнаружения применяется радиоконъюгат, он может содержать радиоактивный атом для сцинтиграфических исследований, например tc99m или I123, или спин-метку для визуализации методом ядерного магнитного резонанса (ЯМР) (также известный как магнитно-резонансная томография, МРТ), такую как снова йод-123, йод-131, индий-111, фтор-19, углерод-13, азот-15, кислород-17, гадолиний, марганец или железо.
Science
Cancer Res.
Конъюгаты антитела и цитотоксического агента могут быть получены с применением множества бифункциональных, связывающихся с белком агентов, таких как N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (СПДП (SPDP)), сукцинимидил-4-(N-малеинмидометил)циклогексан-1-карбоксилат (СМЦК (SMCC)), иминотиолан (ИТ (IT)), бифункциональные производные имидоэфиров (таких как диметиладипимидат HCl), активные сложные эфиры (такие как дисукцинимидилсуберат), альдегиды (такие как глутаровый альдегид), бис-азидосоединения (такие как бис(п-азидобензоил)гександиамин), производные бис-диазония (такие как бис-(п-диазонийбензоил)-этилендиамин), диизоцианаты (такие как толуол-2,6-диизоцианат) и бис-активные соединения фтора (такие как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). Например, иммунотоксин клещевины может быть получен, как описано в Vitetta et al.,  238:1098 (1987). Меченная углеродом-14 1-изотиоцианатобензил-3-метилдиэтилентриаминпентауксусная кислота (МТ-ДТПУ (MX-DTPA)) представляет собой типичный хелатирующий агент для конъюгации радионуклеотида с антителом. См. WO94/11026. Линкер может быть «расщепляемым линкером», облегчающим высвобождение цитотоксического лекарственного средства в клетке. Например, можно применять кислотолабильный линкер, чувствительный к пептидазе линкер, фотолабильный линкер, диметиловый линкер или дисульфидсодержащий линкер (Chari et al.,  52:127-131 (1992), патент США № 5208020).
Иммуноконъюгаты или КАЛС (ADC) в данном документе явно включают, но не ограничиваясь этим, такие конъюгаты, полученные с помощью поперечно-сшивающих реагентов, включая, но не ограничиваясь этим, (N-[β-малеинимидопропилокси]сукцинимидный эфир), БМПС (BMPS), (N-(ε-малеинимидокапроилокси)-сукцинимидный эфир), ИМКС (EMCS), 4-малеинимидомасляной кислоты N-гидрокисукцинимидный эфир, ММГС (GMBS), 1,6-гексан-бис-винилсульфон, ГБВС (HBVS), сукцинимидил-4-(N-малеинимидометил)циклогексан-1-карбокси-(6-амидокапроат), АК-СМЦК (LC-SMCC), 3-малеинимидобензойной кислоты N-гидроксисукцинимидный эфир, МБС (MBS), 4-(4-N-малеинимидофенил)масляной кислоты гидразида гидрохлорид + 1/2 диоксана, МФМГ (MPBH), сукцинимидил-3-(бромацетамидо)пропионат, СБАП (SBAP), NS-сукцинимидилйодацетат, СЙА (SIA), N-сукцинимидил-(4-йодацетил)аминобензоат, СЙАБ (SIAB), N-сукцинимидил-4-(N-малеинимидометил)циклогексан-1-карбоксилат, СМЦК (SMCC), сукцинимидил-4-(N-малеинимидофенил)бутират, СМФБ (SMPB), сукцинимидил-6-((b-малеинимидопропионамидо)гексаноат, СМПГ (SMPH), сульфо-ИМКС (EMCS), сульфо-ММГС (GMBS), N-(κ-малеинимидоундеканоилокси)сульфосукцинимидный эфир, сульфо-КМУС (KMUS), сульфо-МБС (MBS), сульфо-СЙАБ (SIAB), сульфо-СМЦК (SMCC) и сульфо-СМФБ (SMPB) и (сукцинимидил-(4-винилсульфон)бензоат), СВСБ (SVSB) которые являются коммерчески доступными (например, от Pierce Biotechnology, Inc., Рокфорд, штат Иллинойс, США).
VI. Способы и композиции для диагностики и обнаружения
В некоторых вариантах осуществления изобретения любое из анти-TIGIT антител по изобретению (например, 4.1D3 или его вариант, например, 4.1D3.Q1E) пригодно для обнаружения присутствия TIGIT в биологическом образце. Используемый в данном документе термин «обнаружение» включает количественное или качественное обнаружение. В некоторых вариантах осуществления изобретения биологический образец содержит клетку или ткань.
in vitro
in vivo
В одном варианте осуществления изобретения предлагается анти-TIGIT антитело для применения в способе диагностики или обнаружения. В еще одном аспекте представлен способ обнаружения присутствия TIGIT в биологическом образце. В некоторых вариантах осуществления изобретения способ включает приведение биологического образца в контакт с анти-TIGIT антителом, как описано в данном документе, в условиях, позволяющих связывание анти-TIGIT антитела с TIGIT, и определение того, образуется ли комплекс между анти-TIGIT антителом и TIGIT. Такой способ может быть способом  или .
32
14
125
3
131
В некоторых вариантах осуществления изобретения предлагаются меченые анти-TIGIT антитела. Метки включают, но не ограничиваясь этим, метки или фрагменты, которые обнаруживаются непосредственно (например, флуоресцентные, хромофорные, электронно-плотные, хемилюминесцентные и радиоактивные метки), а также такие фрагменты, как ферменты или лиганды, которые обнаруживаются косвенно, например, посредством ферментативной реакции или молекулярного взаимодействия. Типичные метки включают в себя, но не ограничиваясь этим, радиоизотопы P, C, I, H и I, флуорофоры, такие как редкоземельные хелаты или флуоресцеин, и его производные, родамин и его производные, дансил, умбеллиферон, люцериферазы, например, люцифераза светлячков и люцифераза бактерий (патент США № 4737456), люциферин, 2,3-дигидрофталазиндионы, пероксидаза хрена (ПХ (HRP)), щелочная фосфатаза, β-галактозидаза, глюкоамилаза, лизоцим, сахаридоксидазы, например, глюкозооксидаза, галактозооксидаза и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, гетероциклические оксидазы, такие как уриказа и ксантиноксидаза, в сочетании с ферментом, который использует пероксид водорода для окисления прекурсора красителя, такого как ПХ (HRP), лактопероксидаза или микропероксидаза, биотин/авидин, спин-метки, метки бактериофага, стабильные свободные радикалы и т.п.
VII. Фармацевтические композиции
Remington’s Pharmaceutical Sciences

Фармацевтические композиции анти-TIGIT антитела по изобретению (например, 4.1D3 или его варианта, например, 4.1D3.Q1E) получают смешиванием такого антитела, обладающего желаемой степенью чистоты, с одним или большим количеством необязательных фармацевтически приемлемых носителей ( 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), в виде лиофилизированных композиций или водных растворов. Фармацевтически приемлемые носители, как правило, нетоксичны для реципиентов в применяемых дозах и концентрациях и включают, но не ограничиваясь этим: буферные вещества, такие как фосфат, цитрат и другие органические кислоты; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как октадецилдиметилбензиламмония хлорид, гексаметония хлорид, бензалкония хлорид, бензэтония хлорид, фенол, бутиловый или бензиловый спирт, алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен, катехол, резорцин, циклогексанол, 3-пентанол и м-крезол); низкомолекулярные (менее 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как ЭДТА; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы металлов (например, Zn-белковые комплексы); и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как полиэтиленгликоль (ПЭГ). Типичные фармацевтически приемлемые носители в данном изобретении дополнительно включают дисперсионные агенты для вводимых инстерстициально лекарственных средств, такие как растворимые нейтрально-активные гиалуронидазные гликопротеины (рНАГГП (sHASEGP)), например, растворимые PH-20 гиалуронидазные гликопротеины человека, такие как rHuPH20 (HYLENEX, Baxter International, Inc.). Некоторые типичные рНАГГП (sHASEGP) и способы их применения, включая rHuPH20, описаны в патентных публикациях США №№ 2005/0260186 и 2006/0104968. В одном аспекте рНАГГП (sHASEGP) объединяют с одним или большим количеством дополнительных гликозаминогликанов, таких как хондроитиназы.
В некоторых случаях фармацевтическая композиция, содержащая анти-TIGIT антитело, представленное в данном документе, может дополнительно содержать антагонист связывания оси PD-1, такой как антагонист связывания PD-1 антагонист связывания PD-L1 и антагонист связывания PD-L2.
В некоторых случаях фармацевтическая композиция, содержащая анти-TIGIT антитело, представленное в данном документе, может дополнительно включать агонист связывания OX40, такой как агонистическое антитело к OX40, фрагмент агониста OX40L, олигомерный рецептор OX40 и иммуноадгезин OX40.
В некоторых случаях фармацевтическая композиция, содержащая анти-TIGIT антитело, представленное в данном документе, может дополнительно содержать дополнительный терапевтический агент, такой как химиотерапевтический агент или агент, который уменьшает или подавляет один или большее количество дополнительных иммунных коингибирующих рецепторов (например, PD-1, CTLA-4, LAG3, TIM3, BTLA, VISTA, B7H4 и/или CD96).
В других вариантах осуществления изобретения фармацевтическая композиция, содержащая анти-TIGIT антитело, может дополнительно содержать (a) антагонист связывания оси PD-1 и агонист связывания OX40; (b) антагонист связывания PD-1 и дополнительный терапевтический агент (например, химиотерапевтический агент); (c) антагонист связывания PD-1 и агент, который уменьшает или подавляет один или большее количество дополнительных иммунных коингибирующих рецепторов (например, PD-1, CTLA-4, LAG3, TIM3, BTLA, VISTA, B7H4 и/или CD96); (d) агонист связывания OX40 и дополнительный терапевтический агент (например, химиотерапевтический агент); (e) агонист связывания OX40 и агент, который уменьшает или подавляет один или большее количество дополнительных иммунных коингибирующих рецепторов (например, PD-1, CTLA-4, LAG3, TIM3, BTLA, VISTA, B7H4 и/или CD96); (f) дополнительный терапевтический агент (например, химиотерапевтический агент) и агент, который уменьшает или подавляет один или большее количество дополнительных иммунных коингибирующих рецепторов (например, PD-1, CTLA-4, LAG3, TIM3, BTLA, VISTA, B7H4, и/или CD96); или (g) антагонист связывания оси PD-1, антагонист связывания OX40 и агент, который уменьшает или подавляет один или большее количество дополнительных иммунных коингибирующих рецепторов (например, PD-1, CTLA-4, LAG3, TIM3, BTLA, VISTA, B7H4 и/или CD96). Необязательно, фармацевтическая композиция будет содержать один или большее количество фармацевтически приемлемых носителей, вспомогательных веществ или разбавитель.
Типичные лиофилизированные композиции антител описаны в патенте США № 6267958. Водные композиции антител включают композиции, описанные в патенте США № 6171586 и WO2006/044908, причем последние композиции содержат гистидин-ацетатный буфер.
При необходимости, композиция в данном документе может дополнительно содержать более одного активного ингредиента для конкретного показания, которое подлежит лечению, предпочтительно такие, которые обладают дополнительными видами активности, не оказывающими неблагоприятного влияния друг на друга. Например, может быть желаемым дополнительно предложить дополнительный терапевтический агент (например, химиотерапевтический агент, цитотоксический агент, подавляющий рост агент и/или антигормональный агент, такой как перечисленные выше). Такие активные ингредиенты подходящим образом присутствуют в комбинации в количествах, которые являются эффективными для достижения намеченной цели.
Remington’s Pharmaceutical Sciences
Активные ингредиенты могут быть захвачены в микрокапсулы, полученные, например, методами коацервации или межфазной полимеризации, например, гидроксиметилцеллюлозные или желатиновые микрокапсулы и поли-(метилметакрилатные) микрокапсулы, соответственно, в коллоидных системах доставки лекарственных средств (например, липосомы, микросферы альбумина, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в макроэмульсии. Такие методы раскрыты в  16th edition, Osol, A. Ed. (1980).
Можно изготовить препараты с замедленным высвобождением. Подходящие примеры препаратов с замедленным высвобождением включают полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, содержащие антитело, причем матрицы находятся в форме формованных изделий, например пленок или микрокапсул.
in vivo
Композиции, которые должны применяться для введения, обычно являются стерильными. Стерильность может быть с легкостью достигнута, например, путем фильтрации через мембраны для стерильной фильтрации.
VIII. Терапевтические способы
Любое анти-TIGIT антитело по изобретению (например, 4.1D3 или его вариант, например, 4.1D3.Q1E) можно применять в терапевтических способах.
В одном аспекте предлагается анти-TIGIT антитело для применения в качестве лекарственного средства. В других аспектах предлагается анти-TIGIT антитело, описанное в данном документе (например, 4.1D3 или его вариант, например, 4.1D3.Q1E) для применения при лечении или замедлении прогрессирования связанного с иммунной системой заболевания у субъекта. В некоторых вариантах осуществления изобретения предлагается анти-TIGIT антитело для применения в способе лечения субъекта, имеющего связанное с иммунной системой заболевание, которое связано с дисфункциональным расстройством Т-клеток. В других вариантах связанное с иммунной системой заболевание представляет собой вирусную инфекцию. В некоторых вариантах осуществления изобретения вирусная инфекция представляет собой хроническую вирусную инфекцию. В некоторых вариантах осуществления изобретения дисфункциональное расстройство Т-клеток характеризуется снижением чувствительности к антигенной стимуляции. В некоторых вариантах осуществления изобретения дисфункциональное расстройство Т-клеток характеризуется анергией Т-клеток или сниженной способностью к секреции цитокинов, пролиферации или осуществлению цитолитической активности. В некоторых вариантах осуществления изобретения дисфункциональное расстройство Т-клеток характеризуется истощением Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления изобретения Т-клетки представляют собой CD4+ и CD8+ Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления изобретения дисфункциональное расстройство Т-клеток включает неразрешенную острую инфекцию, хроническую инфекцию и опухолевый иммунитет.
В другом аспекте предлагается анти-TIGIT антитело, описанное в данном документе (например, 4.1D3 или его вариант, например, 4.1D3.Q1E) для лечения или замедления прогрессирования рака у субъекта. В некоторых вариантах осуществления изобретения рак выбран из группы, включающей немелкоклеточный рак легкого, мелкоклеточный рак легкого, рак почки, колоректальный рак, рак яичника, рак молочной железы, рак поджелудочной железы, желудочную карциному, рак мочевого пузыря, рак пищевода, мезотелиому, меланому, рак головы и шеи, рак щитовидной железы, саркому, рак предстательной железы, глиобластому, рак шейки матки, карциному тимуса, лейкоз, лимфому, миелому (например, множественную миелому (ММ)), грибовидные микозы, рак клеток Меркель и злокачественные новообразования кроветворной системы. Таким образом, можно лечить различные виды рака, или их прогрессирование может быть отодвинуто во времени. В некоторых вариантах осуществления изобретения у индивидуума может присутствовать рак молочной железы (например, тройной отрицательный рак молочной железы). В других вариантах осуществления изобретения у индивидуума может присутствовать рак поджелудочной железы (например, аденокарцинома поджелудочной железы (АКПЖ (PDAC)). В некоторых вариантах осуществления изобретения у индивидуума присутствует немелкоклеточный рак легкого. Немелкоклеточный рак легкого может быть ранней стадии или поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления изобретения у индивидуума присутствует мелкоклеточный рак легкого. Мелкоклеточный рак легкого может быть ранней стадии или поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления изобретения у индивидуума присутствует почечно-клеточный рак. Рак почки может быть ранней стадии или поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления изобретения у индивидуума присутствует колоректальный рак. Колоректальный рак может быть ранней стадии или поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления изобретения у индивидуума присутствует рак яичника. Рак яичника может быть ранней стадии или поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления изобретения у индивидуума присутствует рак молочной железы. Рак молочной железы может быть ранней стадии или поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления изобретения у индивидуума присутствует рак поджелудочной железы. Рак поджелудочной железы может быть ранней стадии или поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления изобретения у индивидуума присутствует карцинома желудка. Карцинома желудка может быть ранней стадии или поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления изобретения у индивидуума присутствует рак мочевого пузыря. Рак мочевого пузыря может быть ранней стадии или поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления изобретения у индивидуума присутствует рак пищевода. Рак пищевода может быть ранней стадии или поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления изобретения у индивидуума присутствует мезотелиома. Мезотелиома может быть ранней стадии или поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления изобретения у индивидуума присутствует меланома. Меланома может быть ранней стадии или поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления изобретения у индивидуума присутствует рак головы и шеи. Рак головы и шеи может быть ранней стадии или поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления изобретения у индивидуума присутствует рак щитовидной железы. Рак щитовидной железы может быть ранней стадии или поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления изобретения у индивидуума присутствует саркома. Саркома может быть ранней стадии или поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления изобретения у индивидуума присутствует рак предстательной железы. Рак предстательной железы может быть ранней стадии или поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления изобретения у индивидуума присутствует глиобластома. Глиобластома может быть ранней стадии или поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления изобретения у индивидуума присутствует рак шейки матки. Рак шейки матки может быть ранней стадии или поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления изобретения у индивидуума присутствует карцинома тимуса. Карцинома тимуса может быть ранней стадии или поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления изобретения у индивидуума присутствует лейкоз. Лейкоз может быть ранней стадии или поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления изобретения у индивидуума присутствуют лимфомы. Лимфома может быть ранней стадии или поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления изобретения у индивидуума присутствует миелома (например, ММ). Миелома (например, ММ) может быть ранней стадии или поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления изобретения у индивидуума присутствует грибовидные микозы. Грибовидные микозы могут быть ранней стадии или поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления изобретения у индивидуума присутствует рак клеток Меркель. Рак клеток Меркель может быть ранней стадии или поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления изобретения у индивидуума присутствуют злокачественные новообразования кроветворной системы. Злокачественные новообразования кроветворной системы могут быть ранней стадии или поздней стадии.
+
+
high
low
В другом аспекте представлено анти-TIGIT антитело, описанное в данном документе (например, 4.1D3 или его вариант, например, 4.1D3.Q1E) для применения при повышении, усилении или стимулировании иммунного ответа или функции у субъекта, нуждающегося в этом. В некоторых вариантах осуществления изобретения иммунный ответ или функция повышается, усиливается и/или стимулируется активирующими эффекторными клетками (например, Т-клетки, например, CD8+ и/или CD4+ Т-клетки), расширением (увеличения) популяции эффекторных клеток и/или уничтожением клеток-мишеней (например, опухолевых клеток-мишеней) у субъекта. В некоторых вариантах осуществления изобретения CD4 и/или CD8 Т-клеткам у индивидуума присуще увеличенное или усиленное праймирование, активация, пролиферация, высвобождение цитокинов и/или цитолитическая активность по сравнению с уровнем, предшествующим введению комбинации. В некоторых вариантах осуществления изобретения количество CD4 и/или CD8 Т-клеток повышается относительно уровня до введения комбинации. В некоторых вариантах количество активированных CD4 и/или CD8 Т-клеток повышается относительно уровня до введения комбинации. В некоторых вариантах осуществления изобретения активированные CD4 и/или CD8 Т-клетки характеризуются вырабатывающими γ-IFN CD4 и/или CD8 Т-клетками и/или повышенной цитолитической активностью относительно уровня до введения комбинации. В некоторых вариантах осуществления изобретения CD4 и/или CD8 Т-клетки демонстрируют повышенное высвобождение цитокинов, выбранных из группы, состоящей из IFN-γ, TNF-α и интерлейкинов. В некоторых вариантах осуществления способов по данному изобретению CD4 и/или CD8 Т-клетка представляет собой Т-клетку эффекторной памяти. В некоторых вариантах осуществления изобретения CD4 и/или CD8 Т-клетка эффекторной памяти характеризуется вырабатывающими γ-IFN CD4 и/или CD8-T-клетками и/или усиленной цитолитической активностью. В некоторых вариантах осуществления изобретения CD4 и/или CD8 Т-клетка с эффекторной памяти характеризуется экспрессией CD44 CD62L. В некоторых вариантах осуществления изобретения раку свойственны повышенные уровни инфильтрации Т-клеток.
В любом из вышеуказанных аспектов анти-TIGIT антитело может быть применено в комбинации с другим антагонистом TIGIT, антагонистом связывания оси PD-1, агонистом связывания OX40, агентом, который уменьшает или ингибирует один или большее количество дополнительных иммунных коингибирующих рецепторов, и/или дополнительным терапевтическим агентом, таким как химиотерапевтический агент, как подробно описано в данном документе.
В другом аспекте изобретения предлагается применение описанного в данном документе анти-TIGIT антитела (например, 4.1D3 или его варианта, например, 4.1D3.Q1E) в производстве или приготовлении лекарственного средства. В одном варианте осуществления изобретения лекарственное средство предназначено для лечения или замедления прогрессирования рака. В другом варианте осуществления изобретения лекарственное средство предназначено для лечения или замедления прогрессирования немелкоклеточного рака легкого, мелкоклеточного рака легкого, рака почки, колоректального рака, рака яичника, рака молочной железы, рака поджелудочной железы, карциномы желудка, рака мочевого пузыря, рака пищевода, мезотелиомы, меланомы, рака головы и шеи, рака щитовидной железы, саркомы, рака предстательной железы, глиобластомы, рака шейки матки, рака тимуса, лейкоза, лимфомы, миеломы, грибовидных микозов, рака клеток Меркель и злокачественных образований кроветворной системы. Таким образом, можно лечить различные виды рака, или их прогрессирование может быть отодвинуто во времени. В некоторых вариантах осуществления изобретения у индивидуума может присутствовать рак молочной железы (например, тройной отрицательный рак молочной железы). В других вариантах осуществления изобретения у индивидуума может присутствовать рак поджелудочной железы (например, аденокарцинома поджелудочной железы, АКПЖ (PDAC)). В некоторых вариантах осуществления изобретения у индивидуума присутствует немелкоклеточный рак легкого. Немелкоклеточный рак легкого может быть ранней стадии или поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления изобретения у индивидуума присутствует мелкоклеточный рак легкого. Мелкоклеточный рак легкого может быть ранней стадии или поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления изобретения у индивидуума присутствует почечно-клеточный рак. Рак почки может быть ранней стадии или поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления изобретения у индивидуума присутствует колоректальный рак. Колоректальный рак может быть ранней стадии или поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления изобретения у индивидуума присутствует рак яичника. Рак яичника может быть ранней стадии или поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления изобретения у индивидуума присутствует рак молочной железы. Рак молочной железы может быть ранней стадии или поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления изобретения у индивидуума присутствует рак поджелудочной железы. Рак поджелудочной железы может быть ранней стадии или поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления изобретения у индивидуума присутствует карцинома желудка. Карцинома желудка может быть ранней стадии или поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления изобретения у индивидуума присутствует рак мочевого пузыря. Рак мочевого пузыря может быть ранней стадии или поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления изобретения у индивидуума присутствует рак пищевода. Рак пищевода может быть ранней стадии или поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления изобретения у индивидуума присутствует мезотелиома. Мезотелиома может быть ранней стадии или поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления изобретения у индивидуума присутствует меланома. Меланома может быть ранней стадии или поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления изобретения у индивидуума присутствует рак головы и шеи. Рак головы и шеи может быть ранней стадии или поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления изобретения у индивидуума присутствует рак щитовидной железы. Рак щитовидной железы может быть ранней стадии или поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления изобретения у индивидуума присутствует саркома. Саркома может быть ранней стадии или поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления изобретения у индивидуума присутствует рак предстательной железы. Рак предстательной железы может быть ранней стадии или поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления изобретения у индивидуума присутствует глиобластома. Глиобластома может быть ранней стадии или поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления изобретения у индивидуума присутствует рак шейки матки. Рак шейки матки может быть ранней стадии или поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления изобретения у индивидуума присутствует карцинома тимуса. Карцинома тимуса может быть ранней стадии или поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления изобретения у индивидуума присутствует лейкоз. Лейкоз может быть ранней стадии или поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления изобретения у индивидуума присутствуют лимфомы. Лимфома может быть ранней стадии или поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления изобретения у индивидуума присутствует миелома (например, ММ). Миелома (например, ММ) может быть ранней стадии или поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления изобретения у индивидуума присутствует грибовидные микозы. Грибовидные микозы могут быть ранней стадии или поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления изобретения у индивидуума присутствует рак клеток Меркель. Рак клеток Меркель может быть ранней стадии или поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления изобретения у индивидуума присутствуют злокачественные новообразования кроветворной системы. Злокачественные новообразования кроветворной системы могут быть ранней стадии или поздней стадии.
В другом аспекте изобретение предусматривает применение описанного в данном документе анти-TIGIT антитела (например, 4.1D3 или его варианта, например, 4.1D3.Q1E), в производстве лекарственного средства для лечения или замедления прогрессирования связанного с иммунной системой заболевания. В некоторых вариантах осуществления изобретения связанное с иммунной системой заболевание связано с дисфункциональным расстройством Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления изобретения связанное с иммунной системой заболевание представляет собой вирусную инфекцию. В некоторых вариантах осуществления изобретения вирусная инфекция представляет собой хроническую вирусную инфекцию. В некоторых вариантах осуществления изобретения дисфункциональное расстройство Т-клеток характеризуется снижением чувствительности к антигенной стимуляции. В некоторых вариантах осуществления изобретения дисфункциональное расстройство Т-клеток характеризуется аритмией Т-клеток или сниженной способностью секретировать цитокины, пролиферировать или осуществлять цитолитическую активность. В некоторых вариантах осуществления изобретения дисфункциональное расстройство Т-клеток характеризуется истощением Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления изобретения Т-клетки представляют собой CD4+ и CD8+ Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления изобретения дисфункциональное расстройство Т-клеток включает неразрешенную острую инфекцию, хроническую инфекцию и опухолевый иммунитет.
+
+
high
low
В другом аспекте описанное в данном документе предлагается анти-TIGIT антитело (например, 4.1D3 или его вариант, например, 4.1D3.Q1E) в производстве лекарственного средства для применения при повышении, усилении или стимулировании иммунного ответа или функции у субъекта, нуждающегося в этом. В некоторых вариантах осуществления изобретения иммунный ответ или функцию повышают, усиливают и/или стимулируют путем активации эффекторных клеток (например, Т-клеток, например CD8+ и/или CD4+ Т-клеток), расширения (увеличения) популяции эффекторных клеток и/или уничтожения клеток-мишеней (например, опухолевых клеток-мишеней) у субъекта. В некоторых вариантах осуществления изобретения CD4 и/или CD8 Т-клеткам у индивидуума свойственно увеличенное или усиленное праймирование, активация, пролиферация, высвобождение цитокинов и/или цитолитическая активность по сравнению с уровнем до введения комбинации. В некоторых вариантах осуществления изобретения количество CD4 и/или CD8 Т-клеток увеличивается относительно уровня до введения комбинации. В некоторых вариантах количество активированных CD4 и/или CD8 Т-клеток увеличивается относительно уровня до введения комбинации. В некоторых вариантах осуществления изобретения активированные CD4 и/или CD8 Т-клетки характеризуются вырабатывающими γ-IFN CD4 и/или CD8 Т-клетками и/или повышенной цитолитической активностью относительно уровня до введения комбинации. В некоторых вариантах осуществления изобретения CD4 и/или CD8 Т-клетки демонстрируют повышенное выделение цитокинов, выбранных из группы, состоящей из IFN-γ, TNF-α и интерлейкинов. В некоторых вариантах осуществления способов по данному изобретению CD4 и/или CD8 Т-клетка представляет собой Т-клетку эффекторной памяти. В некоторых вариантах осуществления изобретения CD4 и/или CD8 Т-клетка эффекторной памяти характеризуется вырабатывающими γ-IFN CD4 и/или CD8 T-клетками и/или усиленной цитолитической активностью. В некоторых вариантах осуществления изобретения CD4 и/или CD8 Т-клетка эффекторной памяти характеризуется экспрессией CD44 CD62L. В некоторых вариантах осуществления изобретения раку свойственны повышенные уровни инфильтрации Т-клеток.
В любом из вышеуказанных аспектов анти-TIGIT антитело может быть применено в комбинации с другим антагонистом TIGIT, антагонистом связывания оси PD-1, агонистом связывания OX40, агентом, который уменьшает или ингибирует один или большее количество дополнительных иммунных коингибирующих рецепторов, и/или дополнительным терапевтическим агентом, таким как химиотерапевтический агент, как подробно описано в данном документе.
В другом аспекте изобретение относится к способу лечения или замедления прогрессирования рака у субъекта, причем способ включает введение субъекту эффективного количества анти-TIGIT антитела, описанного в данном документе (например, 4.1D3 или его вариант, например, 4.1D3.Q1E), лечением или замедлением таким образом прогрессирования рака у субъекта. В некоторых вариантах осуществления изобретения рак выбран из группы, включающей немелкоклеточный рак легкого, мелкоклеточный рак легкого, рак почки, колоректальный рак, рак яичника, рак молочной железы, рак поджелудочной железы, желудочную карциному, рак мочевого пузыря, рак пищевода, мезотелиому, меланому, рак головы и шеи, рак щитовидной железы, саркому, рак предстательной железы, глиобластому, рак шейки матки, карциному тимуса, лейкоз, лимфому, миелому (например, множественную миелому (ММ)), грибовидные микозы, рак клеток Меркель и злокачественные новообразования кроветворной системы. Таким образом, можно лечить различные виды рака, или их прогрессирование может быть отодвинуто во времени. В некоторых вариантах осуществления изобретения у индивидуума может присутствовать рак молочной железы (например, тройной отрицательный рак молочной железы). В других вариантах осуществления изобретения у индивидуума может присутствовать рак поджелудочной железы (например, аденокарцинома поджелудочной железы (АКПЖ (PDAC)). В некоторых вариантах осуществления изобретения у индивидуума присутствует немелкоклеточный рак легкого. Немелкоклеточный рак легкого может быть ранней стадии или поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления изобретения у индивидуума присутствует мелкоклеточный рак легкого. Мелкоклеточный рак легкого может быть ранней стадии или поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления изобретения у индивидуума присутствует почечно-клеточный рак. Рак почки может быть ранней стадии или поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления изобретения у индивидуума присутствует колоректальный рак. Колоректальный рак может быть ранней стадии или поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления изобретения у индивидуума присутствует рак яичника. Рак яичника может быть ранней стадии или поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления изобретения у индивидуума присутствует рак молочной железы. Рак молочной железы может быть ранней стадии или поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления изобретения у индивидуума присутствует рак поджелудочной железы. Рак поджелудочной железы может быть ранней стадии или поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления изобретения у индивидуума присутствует карцинома желудка. Карцинома желудка может быть ранней стадии или поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления изобретения у индивидуума присутствует рак мочевого пузыря. Рак мочевого пузыря может быть ранней стадии или поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления изобретения у индивидуума присутствует рак пищевода. Рак пищевода может быть ранней стадии или поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления изобретения у индивидуума присутствует мезотелиома. Мезотелиома может быть ранней стадии или поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления изобретения у индивидуума присутствует меланома. Меланома может быть ранней стадии или поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления изобретения у индивидуума присутствует рак головы и шеи. Рак головы и шеи может быть ранней стадии или поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления изобретения у индивидуума присутствует рак щитовидной железы. Рак щитовидной железы может быть ранней стадии или поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления изобретения у индивидуума присутствует саркома. Саркома может быть ранней стадии или поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления изобретения у индивидуума присутствует рак предстательной железы. Рак предстательной железы может быть ранней стадии или поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления изобретения у индивидуума присутствует глиобластома. Глиобластома может быть ранней стадии или поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления изобретения у индивидуума присутствует рак шейки матки. Рак шейки матки может быть ранней стадии или поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления изобретения у индивидуума присутствует карцинома тимуса. Карцинома тимуса может быть ранней стадии или поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления изобретения у индивидуума присутствует лейкоз. Лейкоз может быть ранней стадии или поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления изобретения у индивидуума присутствуют лимфомы. Лимфома может быть ранней стадии или поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления изобретения у индивидуума присутствует миелома (например, ММ). Миелома (например, ММ) может быть ранней стадии или поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления изобретения у индивидуума присутствует грибовидные микозы. Грибовидные микозы могут быть ранней стадии или поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления изобретения у индивидуума присутствует рак клеток Меркель. Рак клеток Меркель может быть ранней стадии или поздней стадии. В некоторых вариантах осуществления изобретения у индивидуума присутствуют злокачественные новообразования кроветворной системы. Злокачественные новообразования кроветворной системы могут быть ранней стадии или поздней стадии.
В другом аспекте изобретения предлагается способ лечения или замедления прогрессирования связанного с иммунной системой заболевания у субъекта, причем способ включает введение субъекту эффективного количества анти-TIGIT антитела, описанного в данном документе (например, 4.1D3 или его вариант, например, 4.1D3.Q1E), с лечением или замедлением таким образом прогрессирования связанного с иммунной системой заболевания у субъекта. В некоторых вариантах осуществления изобретения связанное с иммунной системой заболевание связано с дисфункциональным расстройством Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления изобретения связанное с иммунной системой заболевание представляет собой вирусную инфекцию. В некоторых вариантах осуществления изобретения вирусная инфекция представляет собой хроническую вирусную инфекцию. В некоторых вариантах осуществления изобретения дисфункциональное расстройство Т-клеток характеризуется снижением чувствительности к антигенной стимуляции. В некоторых вариантах осуществления изобретения дисфункциональное расстройство Т-клеток характеризуется анергией Т-клеток или сниженной способностью секретировать цитокины, пролиферировать или осуществлять цитолитическую активность. В некоторых вариантах осуществления изобретения дисфункциональное расстройство Т-клеток характеризуется истощением Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления изобретения Т-клетки представляют собой CD4+ и CD8+ Т-клетки. В некоторых вариантах осуществления изобретения дисфункциональное расстройство Т-клеток включает неразрешенную острую инфекцию, хроническую инфекцию и опухолевый иммунитет.
+
+
high
low
В другом аспекте изобретения предлагается способ повышения, усиления или стимуляции иммунного ответа или функции у субъекта, включающий введение субъекту эффективного количества анти-TIGIT антитела, описанного в данном документе (например, 4.1D3 или его варианта, например, 4.1D3.Q1E), тем самым повышая, усиливая или стимулируя иммунный ответ или функцию у субъекта. В некоторых вариантах осуществления изобретения иммунный ответ или функцию повышают, усиливают и/или стимулируют путем активации эффекторных клеток (например, Т-клеток, например CD8+ и/или CD4+ Т-клеток), расширения (увеличения) популяции эффекторных клеток и/или уничтожения клеток-мишеней (например, опухолевых клеток-мишеней) у субъекта. В некоторых вариантах осуществления способов по данному изобретению CD4 и/или CD8 Т-клеткам индивидуума свойственно увеличенное или усиленное праймирование, активация, пролиферация, высвобождение цитокинов и/или цитолитическая активность по сравнению с уровнем до введения комбинации. В некоторых вариантах осуществления способов по данному изобретению количество CD4 и/или CD8 Т-клеток увеличивается по сравнению с уровнем до введения комбинации. В некоторых вариантах осуществления способов по данному изобретению количество активированных CD4 и/или CD8 Т-клеток увеличивается относительно уровня до введения комбинации. В некоторых вариантах осуществления способов по данному изобретению Т-клетки CD4 и/или CD8 активированные характеризуются вырабатывающими γ-IFN CD4 и/или CD8-Т-клетками и/или повышенной цитолитической активностью по сравнению с уровнем до введения комбинации. В некоторых вариантах осуществления способов по данному изобретению CD4 и/или CD8 Т-клетки демонстрируют повышенное выделение цитокинов, выбранных из группы, состоящей из IFN-γ, TNF-α и интерлейкинов. В некоторых вариантах осуществления способов по данному изобретению CD4 и/или CD8 Т-клетка представляет собой Т-клетку эффекторной памяти. В некоторых вариантах осуществления способов по данному изобретению CD4 и/или CD8 Т-клетка эффекторной памяти характеризуется вырабатывающими γ-IFN CD4 и/или CD8 Т-клетками и/или усиленной цитолитической активностью. В некоторых вариантах осуществления способов по данному изобретению CD4 и/или CD8 эффекторная Т-клетка памяти характеризуется экспрессией CD44 CD62L. В некоторых вариантах осуществления изобретения раку свойственны повышенные уровни инфильтрации Т-клеток.
В любом из вышеуказанных аспектов анти-TIGIT антитело может быть введено в комбинации с другим антагонистом TIGIT, антагонистом связывания PD-1, агонистом связывания OX40, агентом, который уменьшает или ингибирует один или большее количество дополнительных иммунных коингибирующих рецепторов и/или дополнительным терапевтическим агентом, таким как химиотерапевтический агент, как подробно описано в данном документе.
В некоторых вариантах осуществления изобретения другой (второй) антагонист TIGIT может быть антагонистом экспрессии и/или активности TIGIT, таким как низкомолекулярный ингибитор, ингибирующее антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, аптамер, ингибирующая нуклеиновая кислота и ингибирующий полипептид. В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист TIGIT представляет собой другое анти-TIGIT антитело или его антигенсвязывающий фрагмент (например, связывающийся с другим эпитопом на TIGIT, который не перекрывается или частично перекрывается с эпитопом, который распознается применяемым анти-TIGIT антителом по изобретению). В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист TIGIT представляет собой ингибирующую нуклеиновую кислоту, выбранную из антисмыслового полинуклеотида, интерферирующей РНК, каталитической РНК и химеры РНК-ДНК.
В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист TIGIT может быть агентом, который модулирует экспрессию и/или активность CD226. Например, агент, который модулирует экспрессию и/или активность CD226, способный увеличивать и/или стимулировать экспрессию и/или активность CD226; увеличивать и/или стимулировать взаимодействие CD226 с ПВР (PVR), PVRL2 и/или PVRL3; и увеличивать и/или стимулировать внутриклеточное проведение сигнала, опосредуемое связыванием CD226 с ПВР (PVR), PVRL2 и/или PVRL3. Как используется в данном документе, агент, который способен увеличивать и/или стимулировать экспрессию и/или активность CD226, включает, но не ограничиваясь этим, агенты, которые увеличивают и/или стимулируют экспрессию и/или активность CD226. Как используется в данном документе, агент, способный увеличивать и/или стимулировать взаимодействие CD226 с ПВР (PVR), PVRL2 и/или PVRL3, включает, но не ограничиваясь этим, агенты, которые увеличивают и/или стимулируют взаимодействие CD226 с ПВР (PVR), PVRL2 и/или PVRL3. Как используется в данном документе агент, способный увеличивать и/или стимулировать внутриклеточную проведение сигнала, опосредованную связыванием CD226 с ПВР (PVR), PVRL2 и/или PVRL3, включает, но не ограничиваясь этим, агенты, которые увеличивают и/или стимулируют внутриклеточную проведение сигнала, опосредованную связыванием CD226 к ПВР (PVR), PVRL2 и/или PVRL3.
В некоторых вариантах осуществления изобретения агент, который модулирует экспрессию и/или активность CD226, выбран из агента, который ингибирует и/или блокирует взаимодействие CD226 с TIGIT, антагониста экспрессии и/или активности ПВР (PVR), агента, который ингибирует и/или блокирует взаимодействие TIGIT с ПВР (PVR), агента, который ингибирует и/или блокирует взаимодействие TIGIT с PVRL2, агента, который ингибирует и/или блокирует взаимодействие TIGIT с PVRL3, агента, который ингибирует и/или блокирует внутриклеточное проведение сигнала, опосредованное связыванием TIGIT с ПВР (PVR), агента, который ингибирует и/или блокирует внутриклеточное проведение сигнала, опосредованное связыванием TIGIT с PVRL2, агента, который ингибирует и/или блокирует внутриклеточное проведение сигнала, опосредованное связыванием TIGIT с PVRL3, и их комбинаций.
В некоторых вариантах осуществления изобретения агент, который ингибирует и/или блокирует взаимодействие CD226 с TIGIT, представляет собой низкомолекулярный ингибитор, ингибирующее антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, аптамер, ингибирующую нуклеиновую кислоту и ингибирующий полипептид. В некоторых вариантах осуществления изобретения агент, который ингибирует и/или блокирует взаимодействие CD226 с TIGIT, представляет собой анти-TIGIT антитело или его антигенсвязывающий фрагмент (например, связывающийся с другим эпитопом на TIGIT, не перекрывающимся или только частично перекрывающимся с эпитопом, который распознается применяемым анти-TIGIT антителом по изобретению). В некоторых вариантах осуществления изобретения агент, который ингибирует и/или блокирует взаимодействие CD226 с TIGIT, представляет собой ингибирующую нуклеиновую кислоту, выбранную из антисмыслового полинуклеотида, интерферирующей РНК, каталитической РНК и химеры РНК-ДНК.
В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист экспрессии и/или активности ПВР (PVR) представляет собой низкомолекулярный ингибитор, ингибирующее антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, аптамер, ингибирующую нуклеиновую кислоту и ингибирующий полипептид. В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист экспрессии и/или активности ПВР (PVR) выбран из низкомолекулярного ингибитора, ингибирующего антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, аптамера, ингибирующей нуклеиновой кислоты и ингибирующего полипептида.
В некоторых вариантах осуществления изобретения агент, который ингибирует и/или блокирует взаимодействие TIGIT с ПВР (PVR), представляет собой низкомолекулярный ингибитор, ингибирующее антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, аптамер, ингибирующую нуклеиновую кислоту и ингибирующий полипептид. В некоторых вариантах осуществления изобретения агент, который ингибирует и/или блокирует взаимодействие TIGIT с ПВР (PVR), выбран из низкомолекулярного ингибитора, ингибирующего антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, аптамера, ингибирующей нуклеиновой кислоты и ингибирующего полипептида. В некоторых вариантах осуществления изобретения агент, который ингибирует и/или блокирует взаимодействие TIGIT с PVRL2, выбран из низкомолекулярного ингибитора, ингибирующего антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, аптамера, ингибирующей нуклеиновой кислоты и ингибирующего полипептида. В некоторых вариантах осуществления изобретения агент, который ингибирует и/или блокирует взаимодействие TIGIT с PVRL3, выбран из низкомолекулярного ингибитора, ингибирующего антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, аптамера, ингибирующей нуклеиновой кислоты и ингибирующего полипептида.
В некоторых вариантах осуществления изобретения агент, который ингибирует и/или блокирует внутриклеточное проведение сигнала, опосредуемое связыванием TIGIT с ПВР (PVR), представляет собой низкомолекулярный ингибитор, ингибирующее антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, аптамер, ингибирующую нуклеиновую кислоту и ингибирующий полипептид. В некоторых вариантах осуществления изобретения агент, который ингибирует и/или блокирует внутриклеточное проведение сигнала, опосредуемое связыванием TIGIT с ПВР (PVR), выбран из низкомолекулярного ингибитора, ингибирующего антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, аптамера, ингибирующей нуклеиновой кислоты и ингибирующего полипептида. В некоторых вариантах осуществления изобретения агент, который ингибирует и/или блокирует внутриклеточное проведение сигнала, опосредуемое связыванием TIGIT с PVRL2, выбран из низкомолекулярного ингибитора, ингибирующего антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, аптамера, ингибирующей нуклеиновой кислоты и ингибирующего полипептид. В некоторых вариантах осуществления изобретения агент, который ингибирует и/или блокирует внутриклеточное проведение сигнала, опосредуемое связыванием TIGIT с PVRL3, выбран из низкомолекулярного ингибитора, ингибирующего антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, аптамера, ингибирующей нуклеиновой кислоты и ингибирующего полипептид.
Другие антагонисты TIGIT, которые могут быть применены в комбинации с антителами анти-TIGIT по изобретению, включают анти-TIGIT антитела и композиции, содержащие такие антитела, описанные в WO 2009/126688, которые включены в данный документ посредством ссылки в полном объеме.
В некоторых случаях предлагаемые в данном документе способы включают введение эффективного количества антагониста связывания оси PD-1 до, после или одновременно с антителом анти-TIGIT по изобретению (и, необязательно, одним или несколькими дополнительными агентами, такими как второй, другой антагонист TIGIT, агонист связывания OX40, химиотерапевтический агент и т. д.). Антагонист связывания оси PD-1 может быть выбран из группы, состоящей из антагониста связывания PD-1, антагониста связывания PD-L1 и антагониста связывания PD-L2.
В некоторых вариантах осуществления изобретения вышеуказанного аспекта антагонист связывания PD-1 является антагонистом связывания PD-1. В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист связывания PD-1 ингибирует связывание PD-1 с его партнерами-лигандами по связыванию. В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист связывания PD-1 ингибирует связывание PD-1 с PD-L1. В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист связывания PD-1 ингибирует связывание PD-1 с PD-L2. В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист связывания PD-1 ингибирует связывание PD-1 с PD-L1 и PD-L2. В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист связывания PD-1 представляет собой антитело. В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист связывания PD-1 выбран из группы, состоящей из MDX1106 (ниволумаб), MK-3475 (пембролизумаб), CT-011 (пидилизумаб), MEDI-0680 (AMP-514), PDR001, REGN2810 и BGB-108.
В других вариантах осуществления вышеуказанного аспекта изобретения антагонист связывания оси PD-1 является антагонистом связывания PD-L1. В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист связывания PD-L1 ингибирует связывание PD-L1 с PD-1. В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист связывания PD-L1 ингибирует связывание PD-L1-B7-1. В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист связывания PD-L1 ингибирует связывание PD-L1 как с PD-1, так и с B7-1. В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист связывания PD-L1 представляет собой антитело. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело выбрано из группы, состоящей из: MPDL3280A (атезолизумаб), YW243.55.S70, MDX-1105, MEDI4736 (дурвалумаб) и MSB0010718C (авелумаб).
В других вариантах осуществления вышеуказанного аспекта изобретения антагонист связывания PD-1 является антагонистом связывания PD-L2. В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист связывания PD-L2 представляет собой антитело. В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист связывания PD-L2 является иммуноадгезином.
В качестве общего предложения терапевтически эффективное количество антагониста связывания оси PD-1 (например, антитело против PD-L1) может быть введено человеку в диапазоне от около 0,01 до около 50 мг/кг массы тела пациента тела в одним или несколько приемов. В некоторых вариантах осуществления изобретения, например, антагонист (например, анти-PD-L1 антитело) вводят в дозе от около 0,01 до около 45 мг/кг, от около 0,01 до около 40 мг/кг, от около 0,01 до около 35 мг/кг, от около 0,01 до около 30 мг/кг, от около 0,01 до около 25 мг/кг, от около 0,01 до около 20 мг/кг, от около 0,01 до около 15 мг/кг, от около 0,01 до около 10 мг/кг, от около 0,01 до около 5 мг/кг или около от 0,01 до около 1 мг/кг, например, ежедневно. В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист (например, анти-PD-L1 антитело) вводят в концентрации 15 мг/кг. Однако подходящими могут быть и другие схемы введения. В одном варианте осуществления изобретения антагонист связывания оси PD-1 (например, антитело против PD-L1), вводят человеку в дозе около 100 мг, около 200 мг, около 300 мг, около 400 мг, около 500 мг, около 600 мг, около 700 мг, около 800 мг, около 900 мг, около 1000 мг, около 1100 мг, около 1200 мг, около 1300 мг, около 1400 мг или около 1500 мг. В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист связывания оси PD-1 (например, антитело против PD-L1), вводят в дозе от около 800 до около 850 мг каждые две недели. В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист связывания PD-1 (например, антитело против PD-L1) вводят в дозе около 840 мг каждые две недели. Дозу можно вводить за один прием или в несколько приемов (например, 2 или 3 дозы), например, в виде инфузий. Доза антитела, вводимого в комбинированном лечении, может быть снижена по сравнению с монотерапией. В некоторых вариантах осуществления изобретения, например, способ лечения или замедления прогрессирования локально прогрессировавшего или метастатического рака молочной железы у индивидуума включает схему введения, включающую циклы лечения, в которых индивидууму вводят в дни 1 и 15 каждого цикла антагонист связывания оси PD-1 человека (например, анти-PD-L1 антитело) в дозе около 840 мг, причем каждый цикл составляет 28 дней (т.е., каждый цикл повторяется каждые 28 дней). Прогресс такой терапии с легкостью контролируется обычными методами.
В некоторых вариантах осуществления изобретения агонист связывания OX40 включает, например, агонистическое антитело к OX40 (например, антитело против агониста OX40 человека), фрагмент агониста OX40L, олигомерный рецептор OX40 и иммуноадгезин OX40.
В некоторых вариантах осуществления изобретения агонистическое антитело OX40 истощает клетки, которые экспрессируют OX40 человека (например, CD4+ эффекторные Т-клетки, CD8+ Т-клетки и/или клетки Treg), например, путем АЗКЦ (ADCC) и/или фагоцитоза. В некоторых вариантах осуществления изобретения агонистическое антитело OX40 связывается с OX40 человека с аффинностью менее чем или равной около 1 нМ (например, менее чем или равно около 0,5 нМ, например, менее чем или равно около 0,45 нМ, например, менее чем, чем или равно около 0,4 нМ, например, менее чем или равно около 0,3 нМ). В некоторых вариантах осуществления изобретения аффинность связывания агонистического антитела к OX40 определяют с применением радиоиммунологического анализа.
В некоторых вариантах осуществления изобретения агонистическое антитело OX40 связывается с OX40 человека и OX40 яванского макака. В других вариантах осуществления изобретения связывание с OX40 человека и OX40 яванского макака определяют с применением анализа СКАФ (FACS). В некоторых вариантах осуществления изобретения EC50 для связывания OX40 человека составляет менее чем или равно около 1 мкг/мл (например, менее чем или равно около 0,7 мкг/мл, например, менее чем или равно около 0,5 мкг/мл, например, менее чем или равно около 0,4 мкг/мл, например, менее чем или равно около 0,3 мкг/мл, например, менее чем или равно около 0,2 мкг/мл, например, менее чем или равно около 0,1 мкг/мл). В некоторых вариантах осуществления изобретения EC50 для связывания OX40 яванца составляет менее чем или равно 3 мкг/мл (например, менее чем или равно около 2 мкг/мл, например, менее чем или равно около 1,7 мкг/мл, например, менее чем или равно около 1,5 мкг/мл, например, менее чем или равно около 1,4 мкг/мл, например, менее чем или равно около 1,3 мкг/мл, например, менее чем или равно около 1,2 мкг/мл, например, менее чем или равно около 1,1 мкг/мл, например, менее чем или равно около 1,0 мкг/мл).
В некоторых вариантах осуществления изобретения агонистическое антитело OX40 увеличивает пролиферацию CD4+ Т-клеток и/или увеличивает выработку цитокинов с помощью CD4+ эффекторных Т-клеток по сравнению с пролиферацией и/или выработкой цитокинов до обработки агонистическим антителом к OX40. В некоторых вариантах осуществления изобретения цитокин представляет собой IFN-γ.
В некоторых вариантах осуществления изобретения агонистическое антитело OX40 увеличивает пролиферацию Т-клеток памяти и/или повышает выработку цитокинов клеткой памяти. В некоторых вариантах осуществления изобретения цитокин представляет собой IFN-γ.
В некоторых вариантах осуществления изобретения агонистическое антитело OX40 ингибирует подавление Treg эффекторной функции Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления изобретения эффекторная функция Т-клеток представляет собой пролиферацию эффекторных Т-клеток и/или выработку цитокинов. В некоторых вариантах осуществления изобретения эффекторная Т-клетка представляет собой CD4+эффекторную Т-клетку.
В некоторых вариантах осуществления изобретения агонистическое антитело к OX40 усиливает передачу сигнала OX40 в клетке-мишени, которая экспрессирует OX40. В некоторых вариантах осуществления изобретения передачу сигнала OX40 обнаруживают путем мониторинга передачи сигнала NFkB ниже в сигнальном пути.
В некоторых вариантах осуществления изобретения агонистическое антитело к OX40 остается стабильным после обработки при 40 °C в течение от одной до четырех недель, например, одна неделя, две недели, три недели или четыре недели. В некоторых вариантах осуществления изобретения агонистическое антитело OX40 остается стабильным после обработки при 40 °С в течение двух недель.
В некоторых вариантах осуществления изобретения агонистическое антитело к OX40 содержит вариант полипептида IgG1 Fc, содержащий мутацию, которая устраняет связывание с эффекторными клетками человека, и обладает сниженной активностью по отношению к агонистическому антителу к OX40, содержащему часть Fc IgG1 с нативной последовательностью. В некоторых вариантах осуществления изобретения агонистическое антитело к OX40 содержит вариант Fc, содержащий мутацию DANA.
В некоторых вариантах осуществления изобретения поперечное сшивание антител требуется для выполнения функции антагонистического антитела против OX40 человека.
В некоторых вариантах осуществления изобретения агонистическое антитело к OX40 содержит (a) домен VH, который содержит (i) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 278, 279 или 280, (ii) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 281, 282, 283, 284, 285 или 286 и (iii) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 287, 288 или 289; и (b) домен VL, который содержит (i) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 290, (ii) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 291 и (iii) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298 или 299. Например, в некоторых вариантах осуществления изобретения агонистическое антитело OX40 содержит (a) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 278; (b) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 281; (c) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 287; (d) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 290; (e) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 291; и (f) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 292. В некоторых вариантах осуществления изобретения агонистическое антитело к OX40 содержит (a) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 278; (b) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 281; (c) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 287; (d) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 290; (e) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 291; и (f) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 297. В некоторых вариантах осуществления изобретения агонистическое антитело к OX40 содержит (a) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 278; (b) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 281; (c) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 287; (d) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 290; (e) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 291; и (f) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 298.
В других вариантах осуществления изобретения агонистическое антитело к OX40 содержит последовательность VH, обладающую по меньшей мере 90 % идентичностью последовательности относительно аминокислотной последовательности любой из SEQ ID NO: 300-325. Например, агонистическое антитело OX40 содержит последовательность VH, обладающую по меньшей мере 90 % идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 300 (например, в которой от 1 до 10 аминокислот были заменены, вставлены и/или удалены в SEQ ID NO: 300). Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретения агонистическое антитело к OX40 содержит VH, содержащий один, два или три ГВУ (HVR), выбранных из: (a) HVR-H1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 278, (b) HVR-H2, аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 281 и (c) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 287.
В других вариантах осуществления изобретения агонистическое антитело к OX40 содержит последовательность VL, обладающую по меньшей мере 90 % идентичностью последовательности относительно аминокислотной последовательности любой из SEQ ID NO: 326-351. Например, агонистическое антитело OX40 содержит VL, обладающий по меньшей мере 90 % идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 326 (например, в которой от 1 до 10 аминокислот были заменены, вставлены и/или удалены в SEQ ID NO: 326). Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретения агонистическое антитело к OX40 содержит VL, содержащий один, два или три ГВУ (HVR), выбранных из (a) HVR-L1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 290; (b) HVR-L2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 291; и (c) HVR-L3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 292.
В некоторых вариантах осуществления изобретения агонистическое антитело к OX40 содержит (а) последовательность VH SEQ ID NO: 300; (b) последовательность VL SEQ ID NO: 326; или (c) последовательность VH, как в (a), и последовательность VL, как в (b).
В некоторых вариантах осуществления изобретения агонистическое антитело к OX40 содержит (а) последовательность VH SEQ ID NO: 319; (b) последовательность VL SEQ ID NO: 345; или (c) последовательность VH, как в (a), и последовательность VL, как в (b).
В некоторых вариантах осуществления изобретения агонистическое антитело к OX40 содержит (а) последовательность VH SEQ ID NO: 320; (b) последовательность VL SEQ ID NO: 346; или (c) последовательность VH, как в (a), и последовательность VL, как в (b).
Кроме того, конкретно включено агонистическое антитело к OX40, такое как антитело, разделяющее те же или в существенной мере те же последовательности ГВУ (HVR) и/или последовательности VH и VL антител против OX40, раскрытых в патенте США 7550140 и Международных публикациях №№ WO 2014/148895 и WO 2013/038191, которые включены в данный документ посредством ссылки в полном объеме.
В некоторых вариантах осуществления изобретения агонистическое антитело OX40 представляет собой L106 BD (продукт Pharmingen № 340420). В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело содержит по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять или шесть последовательностей гипервариабельного участка (ГВУ (HVR)) антитела L106 (продукт BD Pharmingen № 340420). В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело содержит последовательность вариабельного участка тяжелой цепи и/или последовательность вариабельного участка легкой цепи антитела L106 (продукт BD Pharmingen № 340420).
В некоторых вариантах осуществления изобретения агонистическое антитело к OX40 представляет собой ACT35 (Santa Cruz Biotechnology, номер по каталогу 20073). В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело содержит по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять или шесть последовательностей гипервариабельного участка (ГВУ (HVR)) антитела ACT35 (Santa Cruz Biotechnology, номер по каталогу 20073). В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело содержит последовательность вариабельного участка тяжелой цепи и/или последовательность вариабельного участка легкой цепи антитела ACT35 (Santa Cruz Biotechnology, номер по каталогу 20073).
В некоторых вариантах осуществления изобретения агонистическое антитело OX40 представляет собой MEDI6469. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело содержит по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять или шесть последовательностей гипервариабельного участка (ГВУ (HVR)) антитела MEDI6469. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело содержит последовательность вариабельного участка тяжелой цепи и/или последовательность вариабельного участка легкой цепи антитела MEDI6469.
В некоторых вариантах осуществления изобретения агонистическое антитело OX40 представляет собой MEDI0562. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело содержит по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять или шесть последовательностей гипервариабельного участка (ГВУ (HVR)) антитела MEDI0562. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело содержит последовательность вариабельного участка тяжелой цепи и/или последовательность вариабельного участка легкой цепи антитела MEDI0562.
В некоторых вариантах осуществления изобретения агонистическое антитело OX40 представляет собой агонистическое антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и любое из указанных выше агонистов OX40.
В любом из вышеприведенных вариантов осуществления агонистическое антитело к OX40 может представлять собой полноразмерное антитело (например, антитело IgG1) или фрагмент антитела.
Агонисты OX40, полезные для описанных в данном документе способов, никоим образом не ограничиваются антителами. Агонисты OX40, не являющиеся антителами, включены и хорошо известны в данной области техники.
Как описано выше, OX40L (также известный как CD134L) служит в качестве лиганда для OX40. Таким образом, агонисты, которые представляют часть или все из OX40L, могут служить агонистами OX40. В некоторых вариантах осуществления изобретения агонист OX40 может содержать один или большее количество внеклеточных доменов OX40L. Примеры внеклеточных доменов OX40L могут включать OX40-связывающие домены. В некоторых вариантах осуществления изобретения агонист OX40 может быть растворимой формой OX40L, которая содержит один или большее количество внеклеточных доменов OX40L, но не содержит других нерастворимых доменов белка, например трансмембранных доменов. В некоторых вариантах осуществления изобретения агонист OX40 представляет собой растворимый белок, который содержит один или большее количество внеклеточных доменов OX40L, способных связываться с OX40L. В некоторых вариантах осуществления изобретения агонист OX40 может быть связан с другим белковым доменом, например, для увеличения его эффективности, периода полувыведения или других желаемых характеристик. В некоторых вариантах осуществления изобретения агонист OX40 может содержать один или большее количество внеклеточных доменов OX40L, связанных с доменом Fc иммуноглобулина.
В некоторых вариантах осуществления изобретения агонист OX40 может быть олигомерной или полимерной молекулой. Например, агонист OX40 может содержать один или большее количество доменов (например, домен лейцинового зиппера), что позволяет олигомеризовать белки. В некоторых вариантах осуществления изобретения агонист OX40 может содержать один или большее количество внеклеточных доменов OX40L, связанных с одним или большим количеством доменов лейцинового зиппера.
В некоторых вариантах осуществления изобретения агонистом OX40 может быть любой из агонистов OX40, описанный в Европейском патенте № EP0672141 B1.
В некоторых вариантах осуществления изобретения агонист OX40 может представлять собой тримерный химерный белок OX40L. Например, агонист OX40 может содержать один или большее количество внеклеточных доменов OX40L, связанных с доменом Fc иммуноглобулина и доменом тримеризации (включая, но не ограничиваясь этим, домен изолейцинового зиппера).
В некоторых вариантах осуществления изобретения агонистом OX40 может быть любой из агонистов OX40, описанных в Международной публикации № WO2006/121810, такой как иммуноадгезин OX40. В некоторых вариантах осуществления изобретения иммуноадгезин OX40 может представлять собой тримерный белок OX40-Fc. В некоторых вариантах осуществления изобретения агонистом OX40 является MEDI6383.
Такая комбинированная терапия, отмеченная выше, включает в себя комбинированное введение, в результате чего анти-TIGIT антитело и один или большее количество агентов (например, антагонист связывания PD-1, агонист связывания OX40, агент, который уменьшает или ингибирует один или большее количество дополнительных иммунных коингибирующих рецепторов, и/или дополнительный терапевтический агент) введены в одни и те же или отдельные препараты и раздельное введение, при котором введение анти-TIGIT антитела по изобретению может происходить до, одновременно и/или после введения одного или большего количества агентов (например, антагониста связывания PD-1, агониста связывания OX40, агента, который уменьшает или ингибирует один или большее количество дополнительных иммунных коингибирующих рецепторов и/или дополнительного терапевтического агента). В одном варианте введение анти-TIGIT антитела и введение одного или большего количества агентов происходит в пределах около одного месяца или в течение около одной, двух или трех недель или в пределах около одного, двух, трех, четырех, пяти или шести дней друг от друга. Кроме того, анти-TIGIT антитела по изобретению (например, 4.1D3 или его вариант, например, 4.1D3.Q1E) могут применяться в сочетании с лучевой терапией.
Анти-TIGIT антитело по изобретению (и/или любое дополнительное терапевтическое средство) можно вводить любым подходящим способом, включая парентеральное, внутрилегочное и интраназальное, и, при желании проведения местного лечения, внутриочаговое введение. Парентеральные инфузии включают внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное или подкожное введение. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело вводят путем подкожного введения. В некоторых вариантах осуществления изобретения анти-TIGIT антитело, вводимое подкожной инъекцией, проявляет менее токсичный ответ у пациента, чем то же самое анти-TIGIT антитело, вводимое внутривенной инъекцией. Дозирование может быть осуществлено любым подходящим путем, например, путем инъекций, таких как внутривенные или подкожные инъекции, в зависимости от того, является ли введение кратковременным или хроническим. В данном документе рассматриваются различные схемы введения, включая, но не ограничиваясь этим, однократное или многократное введение в различные моменты времени, введение болюса и пульсирующую инфузию.
Анти-TIGIT антитела по изобретению будут составляться, дозироваться и вводиться в соответствии с надлежащей медицинской практикой. Факторы для рассмотрения в этом контексте включают конкретное расстройство, которое подлежит лечению, конкретное млекопитающее, которое подлежит лечению, клиническое состояние отдельного пациента, причину расстройства, место доставки агента, способ введения, расписание введения и другие факторы, известные врачам. Антитело не обязательно должно быть, но может быть составлено с одним или большим количеством агентов, которые в настоящее время применяются для предотвращения или лечения подлежащего лечению расстройства. Эффективное количество таких других агентов зависит от количества антитела, присутствующего в препарате, вида расстройства или лечения и других факторов, рассмотренных выше. Они обычно применяются в тех же дозах и теми же способами введения, как описано в данном документе, или около от 1 до 99 % доз, описанных в данном документе, или в любых дозах и любым способом введения, который эмпирически/клинически определяется как подходящий.
Для профилактики или лечения заболевания подходящая доза анти-TIGIT антитела по изобретению (например, 4.1D3 или его вариант, например, 4.1D3.Q1E), при применении в отдельности или в сочетании с одним или большим количеством дополнительных агентов (например, антагонист связывания PD-1, агонист связывания OX40, агент, который уменьшает или ингибирует один или большее количество дополнительных иммунных коингибирующих рецепторов и/или дополнительный терапевтический агент), будет зависеть от вида заболевания, подлежащего лечению, вида применяемого антитела, тяжести и течение заболевания, независимо от того, вводят ли антитело в профилактических или терапевтических целях, предшествующего лечения, клинического анамнеза пациента и ответа на антитело, а также по усмотрению лечащего врача. Антитело подходящим образом вводят пациенту однократно или на протяжении ряда процедур.
В качестве общего предложения терапевтически эффективное количество анти-TIGIT антитела, вводимого человеку, будет находиться в диапазоне от около 0,01 до около 100 мг/кг массы тела пациента, за один или несколько приемов. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело применяют, например, в дозе от около 0,01 до около 45 мг/кг, от около 0,01 до около 40 мг/кг, от около 0,01 до около 35 мг/кг, от около 0,01 до около 30 мг/кг, от около 0,01 до около 25 мг/кг, от около 0,01 до около 20 мг/кг, от около 0,01 до около 15 мг/кг, от около 0,01 до около 10 мг/кг, от около 0,01 до около 5 мг/кг или от около 0,01 до около 1 мг/кг. В одном варианте осуществления изобретения анти-TIGIT антитело, описанное в данном документе, вводят человеку в дозе около 100 мг, около 200 мг, около 300 мг, около 400 мг, около 500 мг, около 600 мг, около 700 мг, около 800 мг, около 900 мг, около 1000 мг, около 1100 мг, около 1200 мг, около 1300 мг или около 1400 мг в 1 день 21-дневного цикла. Дозу можно вводить однократно или несколько приемов (например, 2 или 3 приема), например, в виде инфузии. При повторном введении на протяжении нескольких дней или дольше, в зависимости от состояния, лечение, как правило, следует продолжать до тех пор, пока не произойдет желаемое подавление симптомов заболевания. Одна типичная доза антитела будет находиться в диапазоне от около 0,05 мг/кг до около 10 мг/кг. Таким образом, пациенту может вводиться одна или несколько доз около 0,5 мг/кг, 2,0 мг/кг, 4,0 мг/кг или 10 мг/кг (или любая их комбинация). Такие дозы можно вводить периодически, например, каждую неделю или каждые три недели (например, так, чтобы пациент получал от около двух до около двадцати или, например, около шести доз анти-TIGIT антитела). Можно вводить начальную более высокую нагрузочную дозу, за которой следует одна или несколько более низких доз. Прогресс такого лечения с легкостью контролируется при помощи обычных способов и анализов.
В некоторых вариантах осуществления изобретения способы могут дополнительно включать дополнительные терапевтические средства. Дополнительным терапевтическим средством может быть лучевая терапия, хирургия, химиотерапия, генная терапия, ДНК-терапия, вирусная терапия, РНК-терапия, иммунотерапия, трансплантация костного мозга, нанотерапия, терапия моноклональными антителами или комбинация вышеуказанного. Дополнительное терапевтическое средство может принимать форму адъювантной или неоадъювантной терапии. В некоторых вариантах осуществления изобретения дополнительное терапевтическое средство представляет собой введение низкомолекулярного ферментативного ингибитора или антиметастатического агента. В некоторых вариантах осуществления изобретения дополнительное терапевтическое средство представляет собой введение ограничивающих побочные эффекты агентов (например, агентов, предназначенных для уменьшения возникновения и/или тяжести побочных эффектов лечения, таких как средства против тошноты и т.д.). В некоторых вариантах осуществления изобретения дополнительное терапевтическое средство представляет собой лучевую терапию. В некоторых вариантах осуществления изобретения дополнительное терапевтическое средство представляет собой хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах осуществления изобретения дополнительное терапевтическое средство представляет собой комбинацию лучевой терапии и хирургического вмешательства. В некоторых вариантах осуществления изобретения дополнительное терапевтическое средство представляет собой гамма-облучение. В некоторых вариантах осуществления изобретения дополнительное терапевтическое средство может представлять собой отдельное введение одного или большего количества терапевтических агентов, описанных выше.
IX. Промышленные изделия
В другом аспекте изобретения предлагается изделие или набор, содержащий материалы, подходящие для лечения, профилактики и/или диагностики расстройств, описанных выше. Промышленное изделие изготовления включает емкость и этикетку или листок-вкладыш в упаковку на или в сочетании с емкостью. Подходящие емкости включают, например, бутыли, флаконы, шприцы, пакеты для в/в раствора и т.д. Емкости могут быть изготовлены из множества материалов, таких как стекло или пластический материал. Емкость содержит композицию, которая сама по себе или в сочетании с другой композицией эффективна для лечения, профилактики и/или диагностики состояния, и может быть снабжена стерильным портом доступа (например, емкость может представлять собой пакет для внутривенного раствора или флакон с пробкой, прокалываемой иглой для подкожной инъекции). По меньшей мере один активный агент в композиции представляет собой анти-TIGIT антитело по изобретению. Этикетка или листок-вкладыш в упаковку указывает на то, что композиция применяется для лечения выбранного состояния. Кроме того, изделие может включать (а) первую емкость с композицией, содержащейся в ней, причем композиция содержит антитело по изобретению; и (b) вторую емкость с композицией, содержащейся в ней, причем композиция содержит дополнительный цитотоксический или иной терапевтический агент. Промышленное изделие в этом варианте осуществления изобретения может дополнительно содержать листок-вкладыш в упаковку, на котором указано, что композиции могут применяться для лечения конкретного состояния. В качестве альтернативы или дополнительно изделие может дополнительно включать вторую (или третью) емкость, содержащую фармацевтически приемлемый буфер, такой как бактериостатическая вода для инъекций (БВИ (BWFI)), буферизованный фосфатом физиологический раствор, раствор Рингера и раствор декстрозы. Кроме того, оно может включать другие материалы, желаемые с коммерческой и пользовательской точек зрения, включая другие буферные вещества, разбавители, фильтры, иглы и шприцы.
В одном варианте осуществления изобретения представлен набор, включающий анти-TIGIT антитело по изобретению (например, 4.1D3 или его вариант, например, 4.1D3.Q1E), и листок-вкладыш в упаковку, содержащий инструкции по применению анти-TIGIT антитела для лечения или замедления прогрессирования рака у субъекта или для лечения или замедления прогрессирования связанного с иммунной системой заболевания у субъекта. В соответствующем варианте осуществления изобретение относится к набору, включающему анти-TIGIT антитело по изобретению (например, 4.1D3 или его вариант, например, 4.1D3.Q1E), антагонист связывания оси PD-1 (например, антагонист связывания PD-1, антагонист связывания PD-L1 и антагонист связывания PD-L2) и листок-вкладыш в упаковку, содержащий инструкцию по применению анти-TIGIT антитела для лечения или замедления прогрессирования рака у субъекта или для лечения или замедления прогрессирования связанного с иммунной системой заболевания у субъекта. В соответствующем варианте осуществления изобретение относится к набору, включающему анти-TIGIT антитело по изобретению (например, 4.1D3 или его вариант, например, 4.1D3.Q1E), агонист связывания OX40 (например, агонистическое антитело к OX40, фрагмент агониста OX40L, олигомерный рецептор OX40 и иммуноадгезин OX40) и листок-вкладыш в упаковку, содержащий инструкцию по применению анти-TIGIT антитела для лечения или замедления прогрессирования рака у субъекта или для лечения или замедления прогрессирования связанного с иммунной системой заболевания у субъекта. В соответствующем варианте осуществления изобретение относится к набору, включающему анти-TIGIT антитело по изобретению (например, 4.1D3 или его вариант, например, 4.1D3.Q1E), антагонист связывания оси PD-1 (например, антагонист связывания PD-1, антагонист связывания PD-L1 и антагонист связывания PD-L2), агонист связывания OX40 (например, агонистическое антитело к OX40, фрагмент агониста OX40L, олигомерный рецептор OX40 и иммуноадгезин OX40), и содержащему инструкцию по применения анти-TIGIT антитела для лечения или замедления прогрессирования рака у субъекта или для лечения или замедления прогрессирования связанного с иммунной системой заболевания у субъекта. В любом из вышеприведенных вариантов осуществления субъект может быть, например, человеком. В частности, предполагается, что любые анти-TIGIT антитела, агонисты связывания OX40 и антагонисты связывания оси PD-1, описанные в данном документе, могут быть включены в набор.
В еще одном варианте осуществления изобретения предлагается набор, включающий анти-TIGIT антитело по изобретению (например, 4.1D3 или его вариант, например, 4.1D3.Q1E), и листок-вкладыш в упаковку, содержащий инструкции по повышению, усилению или стимуляции ответа или функции иммунной системы у субъекта. В соответствующем варианте осуществления изобретения предлагается набор, включающий анти-TIGIT антитело по изобретению (например, 4.1D3 или его вариант, например, 4.1D3.Q1E), антагонист связывания оси PD-1 (например, антагонист связывания PD-1, антагонист связывания PD-L1 и антагонист связывания PD-L2) и листок вкладыш в упаковку, содержащий инструкцию по повышению, усилению или стимуляции иммунного ответа или функции у субъекта. В соответствующем варианте осуществления изобретения предлагается набор, включающий анти-TIGIT антитело по изобретению (например, 4.1D3 или его вариант, например, 4.1D3.Q1E), агонист связывания OX40 (например, агонистическое антитело к OX40, фрагмент агониста OX40L, олигомерный рецептор OX40 и иммуноадгезин OX40) и листок-вкладыш в упаковку, содержащий инструкцию по применению анти-TIGIT антитела для повышения, усиления или стимуляции иммунного ответа или функции у субъекта. В соответствующем варианте осуществления изобретения предлагается набор, включающий анти-TIGIT антитело по изобретению (например, 4.1D3 или его вариант, например, 4.1D3.Q1E), антагонист связывания оси PD-1 (например, антагонист связывания PD-1, антагонист связывания PD-L1 и антагонист связывания PD-L2), агонист связывания OX40 (например, агонистическое антитело к OX40, фрагмент агониста OX40L, олигомерный рецептор OX40 и иммуноадгезин OX40) и листок-вкладыш в упаковку, содержащий инструкции по применению анти-TIGIT антитела для повышения, усиления или стимуляции иммунного ответа или функции у субъекта. В любом из вышеприведенных вариантов осуществления изобретения субъект может быть, например, человеком. В частности, предполагается, что любые анти-TIGIT антитела, агонисты связывания OX40 и антагонисты связывания оси PD-1, описанные в данном документе, могут быть включены в набор.
ПРИМЕРЫ
Изобретение может быть лучше понято со ссылкой на следующие примеры, которые приведены в качестве иллюстрации и не предназначены для ограничения.
Пример 1. Генерация анти-TIGIT антител
Крыс Спрег-Доули или трансгенных крыс OMT (Open Monoclonal Technology, Пало-Альто, штат Калифорния) совместно иммунизируют подкожно начальной дозой 50 мкг белка TIGIT человека (Genentech, Inc.) и 50 мкг белка TIGIT яванского макака (яванца) (Genentech, Inc.), смешанных с полным адъювантом Фрейнда (BD, Франклин-Лейкс, штат Нью-Джерси), а затем 25 мкг белка TIGIT человека и 25 мкг белка TIGIT яванца, разведенных в ФСБ (PBS) на нескольких участках подкожно и внутрибрюшинно каждые две недели.
2
Несколько лимфатических узлов извлекают через три дня после последней иммунизации. В-клетки указанных крыс обогащают с применением отрицательной селекции при помощи биотинилированных антител, нацеленных на не-В-клетки крысы (BD; eBioscience, Сан-Диего, штат Калифорния) и магнитных гранул, покрытых стрептавидином (Miltenyi, Сан-Диего, штат Калифорния). Осуществляют слияние полученной популяции B-клеток с клетками миеломы мыши P3X63-Ag8U.1 (Американская Коллекция Типовых Культур, Роквилль, штат Мэриленд) с помощью электрослияния (Harvard Apparatus, Холлистон, штат Массачусетс). Слитые клетки инкубируют при 37 °C, 7 % CO, в течение ночи в Среде C (StemCell Technologies, Ванкувер, Британская Колумбия, Канада) перед ресуспендированием в полутвердой Среде D (StemCell Technologies) с анти-крысиным IgG-флуоресцеин изотиоцианатом, ФИТЦ (FITC) (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, штат Миссури) и наносят на лотки Omniwell (Thermo Fisher Scientific, Рочестер, штат Нью-Йорк). Через семь дней после нанесения на лотки флуоресцентные колонии отбирают и переносят на 96-луночные планшеты для культивирования (BD), содержащие Среду E (StemCell Technologies), с применением Clonepix FL (Molecular Devices, Саннивейл, штат Калифорния). Проводят скрининг супернатантов с помощью ТИФА (ELISA) против белка TIGIT человека через семь дней после сбора колоний. 384-луночные планшеты (Greiner Microlon, Greiner Bio-One, Монро, штат Северная Каролина) покрывают 1 мкг/мл белка, разведенного в 0,05 М буферном растворе карбоната натрия, pH 9,6, и инкубируют в течение ночи при 4 °C. Затем лунки блокируют 100 мкл ФСБ (PBS), содержащего 0,5 % бычьего сывороточного альбумина, БСА (BSA) и 0,5 % Tween-20, в течение одного часа при комнатной температуре. После промывания добавляют супернатанты и/или сыворотки в количестве 50 мкл и встряхивают в течение 30 минут при комнатной температуре. Для обнаружения специфических антител, конъюгированные с пероксидазой хрена антитела против IgG крысы (Bethyl Laboratories, Монтгомери, штат Техас) разбавляют до оптимальной концентрации ФСБ (PBS), содержащим 0,5 % БСА (BSA) и 0,5 % Tween-20, и после промывания добавляют в количестве 50 мкл на лунку, а планшеты встряхивают в течение 30 минут при комнатной температуре. Планшеты трижды промывают 100 мкл ФСБ (PBS), содержащим 0,05 % Tween-20. Добавляют 50 мкл субстрата тетраметилбензидина, ТМБ (TMB) (BioFX, Овингс Миллс, штат Мэриленд) и планшеты инкубируют в течение пяти минут при комнатной температуре с последующим добавлением 50 мкл стоп-раствора (BioFX), а затем считывают при 630 нм. Клеточные линии гибридомы, связывающиеся с TIGIT человека, разводят и культивируют в течение двух-четырех дней, а затем проводят скрининг с помощью ТИФА (ELISA) против белков TIGIT человека, TIGIT яванца и TIGIT мыши (Genentech, Inc.). Супернатант клеточных линий, перекрестно-реагирующих с белками человека и яванца, собирают и очищают при помощи белка G (Protein G Sepharose 4 Fast Flow, GE Healthcare, Питтсбург, штат Пенсильвания). Около 500 клонов были подвергнуты скринингу. При помощи скрининга идентифицированы клоны 4.1D3, 7.4A3 и 4.1A4, полученные в результате иммунизации крыс OMT, и клоны 1.6B2, 1.10A5, 1.7E7 и 1.15C8, идентифицированные после иммунизации крыс Спрег-Доули.
Пример 2. Оптимизация анти-TIGIT антител
A. Доводка полученного от крыс OMT моноклонального антитела против TIGIT человека
Чтобы предотвратить нежелательное образование пироглутамата для клонов 4.1A4, 4.1D3 и 7.4A3 (также называются 1A4, 1D3 и 4A3, соответственно) и для решения проблемы неспаренных остатков цистеина для клонов 4.1A4 и 7.4A3, были сгенерированы следующие оптимизированные варианты анти-TIGIT антител: 4.1A4.C96S.Q1E, 4.1A4.C96Y.Q1E, 4.1D3.Q1E, 7.4A3.C96S.Q1E и 7.4A3.C96Y.Q1E (также называются 1A4.C96S. Q1E, 1A4.C96Y.Q1E, 1D3.Q1E, 4A3.C96S.Q1E и 4A3.C96Y.Q1E, соответственно). Как описано в Табл. 2 ниже, аффинность этих пяти оптимизированных вариантов для TIGIT человека и яванского макака (яванца) затем определяли с помощью поверхностного плазмонного резонанса (ППР (SRP)) (анализ BIACORE™) и сравнивали с аффинностью соответствующих родительских клонов.
N
N'
Вкратце, биосенсорный чип серии S CM5 активируют с помощью реагентов -метил--(3-диметиламинопропил)карбодиимида (ЭДК (EDC)) и N- гидроксисукцинимида (NHS) в соответствии с инструкциями поставщика (GE Healthcare Biosciences, Пискатауэй, штат Нью-Джерси) и набор для захвата антител человека использовали для сочетания с козьими антителами против Fc IgG человека, чтобы получить около 10 000 единиц ответа (ЕО (RU)) на каждой проточной кювете, а затем блокировать непрореагировавшие группы с помощью 1 М этаноламина.
on
off
D
off
on
Для определения показателей кинетики каждый клон захватывают до достижения около 250 ЕО (RU) и осуществляют инжекцию 5-кратных серийных разведений антигена TIGIT (от 1,23 до 300 нМ) в буфере ГСБ-П (HBS-P) (0,01 М 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновой кислоты, ГЭПЭС (HEPES), рН 7,4, 0,15 М NaCl, 0,005 % поверхностно-активного вещества P20) при 25 °C (скорость потока: 30 мл/мин) без регенерации между инжекциями. Сенсограммы были записаны и оценены при помощи программного обеспечения BIAcore™ T200 Evaluation (версия 2.0) после вычитания сигнала референтной кюветы. Скорость ассоциации (k) и скорость диссоциации (k) вычисляют с применением простой модели связывания один к одному Ленгмюра. Константу равновесной диссоциации (K) вычисляют как соотношение k/k.
Таблица 2. Показатели аффинности BIACORE™ для вариантов полученного от крысы OMT антитела против TIGIT человека и яванца 1A4, 1D3 и 4A3
<b>xTIGIT mAb</b>
<b>TIGIT человека</b>
<b>TIGIT яванца</b>
<b>Kon (10</b><sup><b>5</b></sup><b>М</b><sup><b>-1</b></sup><b>с</b><sup><b>-1</b></sup><b>)</b>
<b>Koff (10</b><sup><b>-4</b></sup><b>с</b><sup><b>-1</b></sup><b>)</b>
<b>KD (нМ)</b>
<b>Kon (10</b><sup><b>5</b></sup><b>М</b><sup><b>-1</b></sup><b>с</b><sup><b>-1</b></sup><b>)</b>
<b>Koff (10</b><sup><b>-4</b></sup><b>с</b><sup><b>-1</b></sup><b>)</b>
<b>KD (нМ)</b>
<b>1A4</b>
3,42
12,2
3,57
2,66
6,43
2,42
<b>1A4.C96S.Q1E</b>
12,5
367,9
29,4
13,4
169,1
12,6
<b>1A4.C96Y.Q1E</b>
-
-
>100
-
-
>100
<b>1D3</b>
38,4
16,4
0,43
6,21
20,7
3,33
<b>1D3.Q1E</b>
17,2
9,7
0,56
4,78
15,4
3,22
<b>4A3</b>
3,02
10,4
3,44
3,34
6,99
2,09
<b>4A3.C96S.Q1E</b>
2,88
8,56
2,97
2,76
5,56
2,01
<b>4A3.C96Y.Q1E</b>
3,72
364,7
98,0
3,95
140,5
35,6
Клоны 4.1A4.C96S.Q1E, 7.4A3.C96S.Q1E и 4.1D3.Q1E рассматривались как конечные молекулы с аналогичной и приемлемой аффинностью связывания с TIGIT человека и яванца по сравнению с родительскими клонами. Дополнительные анализы BIACORE™ показали, что клон 4.1D3.Q1E, в частности, способен перекрестно реагировать и связываться с TIGIT кролика с аффинностью в диапазоне низких наномолярных значений (Табл. 3).
Таблица 3. 4.1D3.Q1E способно перекрестно реагировать с TIGIT человека, яванца и кролика
<b>Источник</b>
<b>Клон</b>
<b>Анализ кинетики BIAcore</b>
<b>TIGIT человека</b>
<b>TIGIT яванца</b>
<b>TIGIT кролика</b>
<b>Одновалентная аффинность (нМ)</b>
<b>OMT</b>
<b>4.1D3.Q1E</b>
0,56
3,2
4,9
<b>7.4A3.Q1E.C96S</b>
2,97
2,01
> 500
<b>Мышь</b>
<b>h1A5.L2H8</b>
5,76
> 500
> 500
B. Гуманизация моноклональных анти-TIGIT антител, полученных от крыс СД (SD)
Sequences of Proteins of Immunological Interest
th
Моноклональные антитела 1.6B2, 1.10A5, 1.7E7 и 1.15C8 (данном документе носят название 6B2, 10A5, 7E7 и 15C8, соответственно) были гуманизированы, как описано ниже. Номера остатков соответствуют Kabat et al. (. 5 Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)).
J. Mol. Biol.
et al
J. Mol. Biol.
.
:
Для гуманизации антител 6B2 гипервариабельные участки крысиного антитела 6B2 (rat6B2) были сконструированы в ближайших акцепторных человеческих каркасах для генерации гуманизированного 6B2 (h6B2.L1H1). В частности, положения 24-34 (L1), 50-56 (L2) и 89-97 (L3) домена VL rat6B2 были пересажены на IGKV1-33*01 зародышевой линии человека. Положения 26-35 (H1), 50-65 (H2) и 95-102 (H3) из домена VH rat6B2 были пересажены на зародышевую линию человека IGHV2-5*08. Кроме того, положение 43 в каркасе II VL и положения 69, 73, 78 в каркасе III VH были сохранены из последовательности крысы в h6B2.L1H1. Было обнаружено, что эти остатки являются частью каркасных остатков, действующих как зона «верньера», которые могут регулировать структуру УОК (CDR)/ГВУ (HVR) и точно настраивать соответствие антигену. См., например, Foote and Winter,  224: 487-499 (1992). Эти определения УОК (CDR)/ГВУ (HVR) включают положения, определяемые гипервариабельностью их последовательности (Wu, TT & Kabat, EA (1970)), их структурным расположением (Chothia, C. & Lesk, AM (1987)) и их участием в контактах антиген антитело (MacCallum 262732-745 (1996)).
Дополнительные гуманизированные варианты 6B2 были получены путем инжиниринга каждого остатка крысы h6B2.L1H1 в зоне верньера обратно к остатку зародышевой линии человека, причем эти варианты представляют собой h6B2.L2H1 (VL: S43A), h6B2.L1H2 (VH: V69I), h6B2.L1H3 (VH: A73T), h6B2.L1H4 (VH: A78V), h6B2.L1H5 (VH: V69I, A73T, A78V) и h6B2.L2H5 (VL: S43A, VH: V69I, A73T, A78V, полностью гуманизированная версия).
Для гуманизации антитела 10A5 был осуществлен инжиниринг гипервариабельных участков крысиного антитела 10A5 (rat10A5) в ближайшие к нему акцепторные человеческие каркасы для генерации гуманизированного 10A5 (h10A5.L1H1). В частности, положения 24-34 (L1), 50-56 (L2) и 89-97 (L3) из домена VL rat10А5 были пересажены на IGKV3-15*01 зародышевой линии человека. Положения 26-35 (H1), 50-65 (H2) и 95-102 (H3) из домена VH rat10A5 были пересажены на IGHV2-5*08 зародышевой линии человека. Кроме того, положение 43 в каркасе II и положении 58 в каркасе III VL и положения 69 и 78 в каркасе III VH были сохранены из последовательности крыс в h10A5.L1H1. Было обнаружено, что эти остатки являются частью каркасных остатков, действующих как зона «верньера», как описано выше.
Дополнительные гуманизированные варианты 10А5 были получены путем инжиниринга каждого остатка крысы h10A5.L1H1 в области верньера обратно к остатку зародышевой линии человека, и эти варианты представляют собой h10A5.L2H1 (VL: S43A), h10A5.L3H1 (VL: V58I), h10A5.L4H1 (VL: S43A, V58I), h10A5.L1H2 (VH: V69I), h10A5.L1H3 (VH: A78V), h10A5.L1H4 (VH: V69I, A78V) и h10A5.L4H4 (VL: S43A, V58I, VH: V69I, A78V, полностью гуманизированная версия).
Для гуманизации антитела 7E7 был осуществлен инжиниринг гипервариабельных участков крысиного антитела 7E7 (rat7E7) в ближайшие к нему акцепторные человеческие каркасы для генерации гуманизированного 7E7 (h7E7.L1H1). В частности, положения 24-34 (L1), 50-56 (L2) и 89-97 (L3) из домена VL rat7E7 были пересажены на IGKV1-9*01 зародышевой линии человека. Положения 26-35 (H1), 50-65 (H2) и 95-102 (H3) из домена V7 rat7E7 были пересажены на IGHV1-3*01 зародышевой линии человека. Кроме того, в h7E7.L1H1 положения 58, 71 и 87 в каркасе III VL, положения 47, 48 в каркасе II VH и положения 67, 69, 71, 91 и 93 в каркасе III VH были сохранены из последовательности крысы. Было обнаружено, что эти остатки являются частью каркасных остатков, действующих как зона «верньера», как описано выше.
Дополнительные гуманизированные варианты 7E7 были получены путем инжиниринга каждого остатка крысы h7E7.L1H1 в зоне верньера обратно к остатку зародышевой линии человека, и эти варианты представляют собой h7E7.L2H1 (VL: I58V), h7E7.L3H1 (VL: Y71F), h7E7.L4H1 (VL : F87Y), h7E7.L5H1 (VL: I58V, Y71F, F87Y), h7E7.L1H2 (VH: I47W), h7E7.L1H3 (VH: I48M), h7E7.L1H4 (VH: A67V), h7E7.L1H5 (VH: L69I), h7E7.L1H6 (VH: A71R), h7E7.L1H7 (VH: F91Y), h7E7.L1H8 (VH: T93A), h7E7.L1H9 (VH: I47W, I48M, A67V, L69I, A71R, F91Y, T93A), и h7E7.L5H9 (VL: I58V, Y71F, F87Y, VH: I47W, I48M, A67V, L69I, A71R, F91Y, T93A, полностью гуманизированная версия).
Для гуманизации антитела 15C8 был осуществлен инжиниринг гипервариабельных участков крысиного антитела 15C8 (rat15C8) в ближайшие к нему акцепторные каркасы человека для получения гуманизированного 15C8 (h15C8.L1H1). В частности, положения 24-34 (L1), 50-56 (L2) и 89-97 (L3) из домена VL rat15C были пересажены на IGKV1-9*01 зародышевой линии человека. Положения 26-35 (H1), 50-65 (H2) и 95-102 (H3) из домена VH rat15C8 были пересажены на IGHV1-3*01 зародышевой линии человека. Кроме того, в h15C8.L1H1 были сохранены положения 58, 71 и 87 в каркасе III VL, положения 37, 47 и 48 в каркасе II VH и положения 67, 69, 71 и 91 в каркасе III VH из последовательности крысы. Было обнаружено, что эти остатки являются частью каркасных остатков, действующих как зона «верньера», как описано выше.
Дополнительные гуманизированные варианты 15C8 были получены путем инжиниринга каждого остатка крысы h15C8.L1H1 в зоне верньера обратно к остатку зародышей человека, и эти варианты представляют собой h15C8.L2H1 (VL: I58V), h15C8.L3H1 (VL: Y71F), h15C8.L4H1 (VL: F87Y), h15C8.L5H1 (VL: I58V, Y71F, F87Y), h15C8.L1H2 (VH: L37V), h15C8.L1H3 (VH: I47W), h15C8.L1H4 (VH: I48M), h15C8.L1H5 (VH: A67V), h15C8.L1H6 (VH: L69I), h15C8.L1H7 (VH: T71R), h15C8.L1H8 (VH: F91Y), h15C8.L1H9 (VH: L37V, I47W, I48M, A67V, L69I, T71R, F91Y), и h7E7.L5H9 (VL: I58V, Y71F, F87Y, VH: L37V, I47W, I48M, A67V, L69I, T71R, F91Y, полностью очеловеченная версия).
D
Для первых гуманизированных версий h6B2, L1H1, h10A5.L1H1, h7E7, L1H1 и h15C8.L1H1, которые содержат как УОК (CDR) крысы, так и каркасные остатки в зоне верньера, а также полностью гуманизированных версий h6B2.L2H5, h10A5.L4H4, h7E7. L5H9 и h15C8.L5H9, которые содержат только УОК (CDR) крысы, проводили измерение аффинности BIAcore по сравнению с исходными антителами крысы, rat6B2, rat10A5, rat7E7 и rat15C8. Для определения аффинности связывания антител TIGIT против TIGIT человека, TIGIT яванского макака и аланинсканированных мутантов TIGIT человека с помощью однотактной кинетики, проводили измерение методом поверхностного плазмонного резонанса (ППР) с помощью прибора BIACORE™-T200, как описано выше. Результаты BIACORE™ в Табл. 4 ниже показывают, что все гуманизированные варианты демонстрируют снижение аффинности связывания (т.е., повышение K) приблизительно в 5-10 раз по сравнению с TIGIT человека и яванского макака. Полностью гуманизированные версии h6B2.L2H5 и h10A5.L4H4 неожиданно демонстрируют сходную аффинность связывания с первыми гуманизированными версиями h6B2.L1H1 и h10A5.L1H1, и это свидетельствует о том, что каркасные остатки rat6B2 и rat10A5 в зоне верньера не вносят вклада в связывание с TIGIT человека и яванца. Поэтому оба h6B2.L2H5 и h10A5.L4H4 представляют собой окончательную гуманизированную версию для rat6B2 и rat10A5 соответственно. Напротив, полностью гуманизированные версии h7E7.L5H9 и h15C8.L5H9 потеряли способность связываться с TIGIT человека и яванца.
Для дальнейшего выяснения того, какие остатки каркаса крысы в положениях верньера для первых гуманизированных антител h7E7, L1H1 и h15C8.L1H1 имеют решающее значение для связывания, измеряли аффинность методом BIAcore для всех вариантов доводки каркаса. В случае доводки каркаса 7E7 варианты h7E7.L1H2, h7E7.L1H9 и h7E7.L5H9, содержащие замену VH: I47W, продемонстрировали снижение аффинности связывания с TIGIT человека и яванца более чем в 100 раз, а варианты h7E7.L3H1 и h7E7.L5H1, содержащие замену VL: Y71F, продемонстрировали снижение аффинности связывания с TIGIT яванца приблизительно в 2-3 раза. Таким образом, остатки каркаса VH: I47 и VL: Y71 были сохранены в окончательной гуманизированной версии 7E7 под названием h7E7.L5aH9a, для сохранения связывания с TIGIT человека и яванца. В целях доводки каркаса, варианты 15C8 h15C8.L1H3, h15C8.L1H9 и h15C8.L5H9, содержащие замены VH: I47W, продемонстрировали снижение аффинности связывания с TIGIT человека и яванца более чем в 100 раз, а варианты h15C8.L3H1 и h15C8.L5H1, содержащие замену VL: Y71F, продемонстрировали снижение аффинности связывания с TIGIT человека и яванца приблизительно в 2-3 раза. Кроме того, другие варианты, h15C8.L1H2, h15C8.L1H5 и h15C8.L1H7, содержащие замены VH: L37V, A67V и T71R соответственно, продемонстрировали снижение аффинности связывания с TIGIT человека приблизительно в 2-3 раза. Таким образом, все пять остатков каркаса VH: I47, L37, A67, T71 и VL: Y71 были сохранены в окончательной гуманизированной версии 15C8 под названием h15C8.L5aH9a, чтобы сохранить связывание человека и TIGIT яванца.
Таблица 4. Краткая характеристика полученных методом BIACORE™ показателей аффинности гуманизированных вариантов антител 6B2, 10A5, 7E7 и 15C8, полученных от крыс СД (SD), в отношении TIGIT человека и яванца
xTIGIT mAb
TIGIT человека
TIGIT яванца
Kon (10<sup>5</sup>М<sup>-1</sup>с<sup>-1</sup>)
Koff (10<sup>-4</sup>с<sup>-1</sup>)
KD (нМ)
Kon (10<sup>5</sup>М<sup>-1</sup>с<sup>-1</sup>)
Koff (10<sup>-4</sup>с<sup>-1</sup>)
KD (нМ)
rat6B2
9,97
0,35
0,04
6,88
2,02
0,29
h6B2.L1H1
46,7
25,3
0,54
12,3
11,8
0,96
h6B2.L2H5
46,5
22,2
0,48
12,8
12,4
0,97
rat10A5
9,05
0,84
0,09
6,78
2,81
0,41
h10A5.L1H1
45,7
23,8
0,52
14,7
12,7
0,86
h10A5.L4H4
52,1
22,7
0,44
15,2
12,9
0,85
rat7E7
5,68
0,18
0,03
3,99
0,27
0,07
h7E7.L1H1
20,6
4,76
0,23
4,18
1,52
0,36
h7E7.L2H1
20,6
5,04
0,24
4,93
1,79
0,36
h7E7.L3H1
9,2
2,18
0,24
12,8
12,2
0,95
h7E7.L4H1
29,5
7,96
0,27
6,29
2,74
0,44
h7E7.L5H1
32,1
10,4
0,32
5,75
3,24
0,56
h7E7.L1H2
-
-
> 100
-
-
> 100
h7E7.L1H3
28,2
10,7
0,38
9,08
3,81
0,42
h7E7.L1H4
27,9
7,49
0,27
6,01
2,43
0,40
h7E7.L1H5
32,4
12,9
0,40
8,98
3,59
0,40
h7E7.L1H6
18,5
6,48
0,35
6,41
2,84
0,44
h7E7.L1H7
27,4
8,49
0,31
6,64
2,86
0,43
h7E7.L1H8
27,8
10,1
0,36
8,45
3,31
0,39
h7E7.L1H9
-
-
> 100
-
-
> 100
h7E7.L5H9
-
-
> 100
-
-
> 100
h7E7.L5aH9a
12,8
3,63
0,28
5,91
1,82
0,31
rat15C8
5,22
0,18
0,03
3,81
0,96
0,25
h15C8.L1H1
9,22
3,57
0,39
4,93
4,64
0,94
h15C8.L2H1
7,71
5,06
0,66
5,02
5,02
1,00
h15C8.L3H1
6,31
5,33
0,84
3,36
5,88
1,75
h15C8.L4H1
9,55
6,11
0,64
4,85
5,59
1,15
h15C8.L5H1
6,74
5,62
0,83
2,81
7,52
2,68
h15C8.L1H2
10,4
10,7
1,03
3,82
8,06
2,1
h15C8.L1H3
-
-
> 100
-
-
> 100
h15C8.L1H4
8,41
4,98
0,59
5,32
5,58
1,05
h15C8.L1H5
7,98
5,67
0,71
4,84
5,58
1,15
h15C8.L1H6
13,8
7,56
0,55
6,63
5,56
0,84
h15C8.L1H7
6,1
5,97
0,98
2,19
2,06
0,94
h15C8.L1H8
6,2
3,81
0,61
2,91
1,19
0,41
h15C8.L1H9
-
-
> 100
-
-
> 100
h15C8.L5H9
-
-
> 100
-
-
> 100
h15C8.L5aH9a
11,2
4,21
0,38
5,96
6,13
1,03
Пример 3. Исследования связывания и блокирования анти-TIGIT антителами
in vitro
A. Характеристика связывания анти-TIGIT антител in vitro
in vitro
Полученные от OMT и СД (SD) анти-TIGIT антитела охарактеризованы  на предмет их способности связываться с TIGIT и блокировать связывание рецептора полиовируса (ПВР (PVR)) с TIGIT. Связывание с TIGIT человека и яванца исследовали методом BIACORE™, как описано выше, в контексте как одновалентной, так и двухвалентной аффинности и в условиях сравнения с анти-TIGIT антителом, полученным от мыши (1A5), и химерным анти-TIGIT антителом, полученным от хомяка (10А7, см., например, патент США 2009/0258013, который включен в данное описание посредством ссылки в полном объеме). Результаты анализа BIACORE™, приведенные в Табл. 5, демонстрируют, что многочисленные варианты анти-TIGIT клонов, полученные от OMT, такие как 4.1D3.Q1E и 7.4A3.C96S.Q1E, и полученные от СД (SD) варианты анти-TIGIT клонов способны связываться как с TIGIT человека, так и с TIGIT яванца, в каждом случае с высокой и сходной степенью аффинности. Такие свойства являются желательными для терапевтических анти-TIGIT антител, поскольку они позволяют с легкостью проводить тестирование на токсичность с использованием яванского макака (Macaca fascicularis) в качестве неклинического вида для изучения токсичности. Дополнительная перекрестная реактивность клона 4.1D3.Q1E с кроликом может обеспечить дополнительный вид для изучения токсичности.
Таблица 5. Анализ методом BIACORE™ оптимизированных анти-TIGIT клонов, полученных от OMT и СД (SD)
<b>Источник</b>
<b>Клон</b>
<b>Анализ кинетики методом BIAcore</b>
<b>TIGIT человека</b>
<b>TIGIT яванца</b>
<b>TIGIT человека</b>
<b>TIGIT яванца</b>
<b>Одновалентная аффинность (нМ)</b>
<b>Двухвалентная аффинность (нМ)</b>
<b>Крыса OMT </b>
4.1A4.Q1.C96
4,9
2,6
0,31
0,035
4.1A4.Q1E.C96
3,6
2,4
4.1A4.Q1E.C96S
29,4
12,6
4.1A4.Q1E.C96Y
>100
>100
4.1D3.Q1
0,61
3,4
≤ 0,019
0,36
<b>4.1D3.Q1E</b>
<b>0,57</b>
<b>3,2</b>
7.4A3.Q1.C96
3,60
1,6
0,098
≤ 0,05
7.4A3.Q1E.C96
3,45
2,09
<b>7.4A3.Q1E.C96S</b>
<b>2,97</b>
<b>2,02</b>
7.4A3.Q1E.C96Y
98,1
35,5
<b>Крыса СД (SD)</b>
Химерное 1.6B2
0,035
0,29
≤ 0,027
0,091
h1.6B2.L1H1
0,54
0,96
Химерное 1.10A5
0,093
0,41
≤ 0,003
0,013
h1.10A5.L1H1
0,52
0,86
Химерное 1.7E7
≤ 0,018
0,067
≤ 0,004
≤ 0,009
h1.7E7.L1H1
0,33
0,51
Химерное 1.15C8
0,034
0,25
≤ 0,007
≤ 0,013
h1.15C8.L1H1
0,58
1,39
<b>Мышь</b>
h1A5.L2H8
5,76
> 500
0,26
7,77
<b>Хомяк</b>
c10A7 (к человеческому)
24
0,54
8,22
c10A7 (к мышиному)
0,24
in vitro
Были проведены дополнительные исследования  связывания клонов анти-TIGIT антител, полученных от OMT и СД (SD). Полученные от OMT и СД (SD) анти-TIGIT клоны тестируют на предмет связывание с TIGIT человека и яванца, экспрессируемым на поверхности клеток ЯКХ (CHO), при помощи анализа СКАФ (FACS). Клетки ЯКХ (CHO) трансфицируют полноразмерным TIGIT человека (CHO-hTIGIT) или TIGIT яванского макака (CHO-cyTIGIT). Экспрессирующие TIGIT клетки ЯКХ (CHO) инкубируют с каждым анти-TIGIT антителом в указанных концентрациях, а затем проводят обнаружение с помощью ФИТЦ (FITC)-меченого анти-hIgG антитела (см. Фиг. 1A) с применением стандартных способов. Результаты, приведенные в Табл. 6 и на Фиг. 1B-1E, подтверждают результаты анализа методом BIACORE™, описанные выше.
Nature Immunology.
BD bioscience
Полученные от OMT и СД (SD) анти-TIGIT клоны дополнительно тестировали на предмет связывания с первичными Т-клетками человека при помощи анализа СКАФ (FACS). МКПК (PMBC) человека активируют с помощью связанного с планшетом анти-CD3 (5 мкг/мл) и растворимого анти-CD28 (2 мкг/мл) в течение 2 дней, как описано в Yu et al. 10: 48-57, 2009, который включен в данный документ посредством ссылки в полном объеме. Затем клетки промывают и инкубируют с каждым анти-TIGIT антителом в указанных концентрациях, после чего проводят обнаружение с помощью ФИТЦ (FITC)-меченого антитела против hIgG. Дополнительно, клетки окрашивают анти-CD4, анти-CD8 и анти-CD25 (). CD4+ (CD25+ CD4+) человека и CD8+ (CD25+ CD8+) Т-клетки человека оценивают на предмет связывания с ними анти-TIGIT клонов при помощи СКАФ (FACS). Все образцы считаны на приборах LSR-II или LSR-Fortessa (BD Biosciences) и проанализированы с применением программного обеспечения FlowJo (Treestar). Как приведено в Табл. 6 и на Фиг. 2A-2D, клоны продемонстрировали приблизительно эквивалентное связывание с их целевым TIGIT.
Таблица 6. Краткая характеристика связывания оптимизированных анти-TIGIT клонов, полученных от OMT и СД (SD), с CHO-TIGIT и Т-клетками человека
<b>Анализ</b>
<b>10A7 </b><b>(mu TIGIT) </b><b>& 1A5 </b><b>(hu TIGIT)</b>
<b>Клоны OMT (hu TIGIT)</b>
<b>Клоны </b><b>СД (SD) </b><b>(hu TIGIT)</b>
<b>Связывание с CHO-TIGIT (EC50)</b>
10A7 0,54 нМ1A5 0,14 нМ
4.1A4.C96S.Q1E 0,90 нМ4.1D3.Q1E    1,04 нМ7.4A3.C96S.Q1E 3,04 нМ
1,6B2 0,52 нМ1,7E7 0,10 нМ
<b>Связывание с T-клетками человека (EC50)</b>
10A7 0,63 нМ1A5 0,14 нМ
4.1A4.C96S.Q1E 0,38 нМ4.1D3.Q1E    1,36 нМ7.4A3.C96S.Q1E 2,63 нМ
1,6B2 0,09 нМ1,7E7 0,11 нМ
B. Характеристика блокирования анти-TIGIT антителами in vitro
Полученные от OMT и СД (SD) клоны анти-TIGIT антител дополнительно тестировали на предмет их способности блокировать взаимодействие TIGIT-PVR и TIGIT-CD226.
Для проверки способности клонов блокировать взаимодействие TIGIT-PVR применяли блокирующий анализ ТИФА (ELISA). Вкратце, рекомбинантным химерным белком PVR человека-Fc, химерным белком PVR яванского макака-Fc или гибридным белком PVR мыши-Fc в концентрации 4 мкг/мл в фосфатно-солевом буфере, ФСБ (PBS, pH 7,0) в количестве 25 мкл/лунку покрывают 384-луночные микротитровальные планшеты Maxisorp (NUNC, Дания) и инкубируют на протяжении ночи при 4 °C. Затем раствор для покрытия отбрасывают, планшет блокируют с применением 0,5 % бычьего сывороточного альбумина (БСА (BSA)) в ФСБ (PBS) в количестве 80 мкл/лунку и инкубируют с осторожным перемешиванием в течение 1 часа. Образцы для кривых титрования анти-TIGIT антител и контрольного изотипа Fab разбавляют буфером анализа (ФСБ (PBS), 0,5 % БСА (BSA), 0,05 % Tween 20) с применением 12 серийных 2,5-кратных разведений (40000-1,7 нг/мл). К этим образцам для кривых титрования добавляют равные объемы TIGIT человека-AviFlag-биотина (1 мкг/мл), TIGIT яванца-AviFlag-биотина (150 нг/мл) или TIGIT мыши-His (1 мкг/мл) и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 часа с осторожным перемешиванием. Блокированный планшет промывают 3х промывочным буфером (ФСБ (PBS), 0,05 % Tween 20, pH 7,4) с применением автоматического устройства для промывания микропланшетов ELx405 (BioTek Instruments, Вермонт), добавляют смесь антитело/лиганд-биотин или лиганд-His в количестве 25 мкл/лунку и инкубируют в течение 1 часа при комнатной температуре с осторожным перемешиванием. Затем планшет промывают 6х промывочным буфером и связанный TIGIT человека-AviFlag-биотин, TIGIT яванца-AviFlag-биотин или TIGIT мыши-His обнаруживают путем добавления 25 мкл/лунку конъюгированного с пероксидазой хрена стрептавидина (1:10000, Amersham, Великобритания) или конъюгированного с пероксидазой хрена мышиного анти-His (1:2500, Qiagen, Германия), разведенных в буфере анализа. После инкубации в течение 30 минут или 1 часа планшет промывают 6х промывочным буфером и добавляют 100 мкл/лунку субстрата 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (ТМБ (TMB)) (KPL, Inc., Гайтерсберг, штат Мэриленд, США), чтобы позволить проявиться цвету. Реакцию гасят добавлением 1 М фосфорной кислоты. Оптическое поглощение регистрируют на длине волны 450 нм на считывающем устройстве для микротитровальных планшетов MULTISKAN ASCENT (Thermo Labsystems, Хельсинки, Финляндия). На основе полученных значений оптической плотности на планшетах ТИФА (ELISA) получают кривые зависимости, а значения IC50 вычисляют с применением программного обеспечения Genedata Screener (Genedata, Швейцария). Как проиллюстрировано на Фиг. 3А-3D ниже, указанные анализы демонстрируют способность 4.1D3.Q1E перекрестно реагировать и блокировать в отношении TIGIT человека и TIGIT яванца, что отличает 4.1D3.Q1E от анти-TIGIT антитела, полученного от хомяка, 10A7, которое перекрестно реагирует с TIGIT мыши, но не с TIGIT яванца. Данные указывают на то, что 4.1D3.Q1E более активно блокирует связывание TIGIT яванца с ПВР (PVR) яванца. Кроме того, данные указывают на то, что 4.1D3.Q1E является более активным блокатором связывания TIGIT человека с ПВР (PVR) человека, чем клон анти-TIGIT антитела 10A7, полученный от хомяка.
Данные исследования были дополнительно валидированы в экспериментах по блокированию CHO-TIGIT ПВР (PVR), в которых экспрессирующие TIGIT клетки ЯКХ (CHO) инкубируют с меченым PVR-Fc химерным белком в присутствии анти-TIGIT антитела или контрольного IgG1 человека (Фиг. 4A). Как приведено в Табл. 7 и на Фиг. 4B-4E, инкубация с 10 мкг/мл полученного от OMT анти-TIGIT антитела (Фиг. 4B и 4C) или полученного от СД (SD) анти-TIGIT антитела (Фиг. 4D и 4E) приводила к блокированию связывания TIGIT-PVR как в случае huTIGIT-huPVR, так и в случае cyTIGIT-cyPVR, со значениями IC50 в наномолярном и субнаномолярном диапазоне.
6
Для проверки способность клонов блокировать взаимодействие TIGIT-CD226 применяли резонансный перенос энергии флуоресценции с временным разрешением, ВР-РПЭФ (TR-FRET). Вначале, меченый модифицированной формой восстановительного белка человека O-алкилгуанин-ДНК-алкилтрансферазы, SNAP-tag (ST) CD226 с непереносимыми донорным и акцепторным флуорофорами был экспрессируют с введением метки при помощи клеток СНО. ST-CD226 человека совместно экспрессируют с меченым гемагглютинином, ГА (HA), TIGIT, в присутствии клонов полученных от OMT и СД (SD) анти-TIGIT антител. Добавление каждого из тестируемых клонов к культурам клеток значительно снижает способность TIGIT и CD226 к связыванию (Табл. 7). Полученные данные свидетельствуют о том, что лечение идентифицированными анти-TIGIT антителами может ограничивать взаимодействие TIGIT с CD226, указывая на то, что эти антитела могут быть благоприятными терапевтическими средствами на основе их способности активировать активность Т-клеток, путем высвобождая опосредованного TIGIT подавления активности CD226 и предотвращения последующего истощения CD8+ Т-клеток.
Таблица 7. Краткая характеристика блокирования TIGIT-ПВР (PVR) и блокирования TIGIT-CD226 полученными от OMT и СД (SD) оптимизированными анти-TIGIT клонами
<b>Анализ</b>
<b>10A7 </b><b>(mu TIGIT) </b><b>& 1A5 </b><b>(hu TIGIT)</b>
<b>Клоны OMT (hu TIGIT)</b>
<b>Клоны SD </b><b>(hu TIGIT)</b>
<b>Блокирование TIGIT-PVR (IC50)</b>
10A7 0,07 нМ1A5 0,18 нМ
4.1A4.C96S.Q1E 0,14 нМ4.1D3.Q1E    0,29 нМ7.4A3.C96S.Q1E 0,38 нМ
1,6B2 0,08 нМ1,7E7 0,04 нМ
<b>Блокирование TIGIT-CD226 РПЭФ (IC50)</b>
10A7 17,6 нМ1A5 13,7 нМ
4.1A4.C96S.Q1E 25,2 нМ4.1D3.Q1E    45,0 нМ7.4A3.C96S.Q1E 19,3 нМ
Пример 4. Фармакокинетическая характеристика анти-TIGIT антител
Далее, фармакокинетические (ФК (PK)) свойства полученных от OMT и СД (SD) клонов анти-TIGIT антител были протестированы у яванского макака по сравнению с полученным от мыши анти-TIGIT антителом, несущим мутацию агликозилирования N297G (1A5 N297G) и контрольным анти-gD антителом. В этих экспериментах концентрацию антител в сыворотке яванского макака измеряют на протяжении 28 дней после внутривенного введения 10 мг/кг. Исследования ФК (PK) показали, что полученный от СД (SD) вариант h1.6B2 демонстрирует самый быстрый клиренс, около 20 мл/сутки/кг (Фиг. 5A и 5B). Исследуемый вариант 1А5 также демонстрирует быстрый клиренс, около 15 мл/сутки/кг (Фиг. 5А и 5В). В отличие от этих анти-TIGIT вариантов, исследуемые варианты OMT (4.1D3.Q1E, 7.4A3.C96S.Q1E и 4.1A4.C96S.Q1E) демонстрируют клиренс около 8-10 мл/сутки/кг (Фиг. 5A и 5B), который находится на верхнем конце исторически принятого диапазона для яванца около 4-8 мл/сутки/кг. ФК (PK) профили вариантов OMT сходны с контрольным анти-gD антителом до д10, и в это время опосредованное мишенью распределение лекарственного средства (ОПРЛС (TMDD)) и/или эффекты антитерапевтического антитела (АТА (ATA)) соответствуют теоретически оцененным.
Полученное от OMT анти-TIGIT антитело 4.1D3, которое проявило благоприятные ФК (PK) свойства, дополнительно сравнивали с гуманизированным 10A7 (h10A7.K4G3) в 7-дневном исследовании ФК (PK). В этом эксперименте восемь самок яванского макака делят на две группы по четыре макака, причем первая группа получает h10A7.K4G3, а вторая группа получает 4.1D3. Оба анти-TIGIT антитела вводят в дозе 10 мг/кг (объем дозы 5 мл/кг, концентрация 2 мг/мл) путем медленной внутривенной инъекции болюса. Образцы крови (0,5 мл) отбирают через 0 ч (до введения дозы), 0,25 часа, 2 часа, 8 часов, 1 день, 3 дня и 7 дней после введения в соответствии со следующими «окнами» сбора:
Временная точка после введения дозы
«Окно» отбора
от 0 до 15 минут
+/- 1 минута
от 16 до 30 минут
+/- 2 минуты
от 31 до 45 минут
+/- 3 минуты
от 46 до 60 минут
+/- 4 минуты
от 61 минут до 2 часов
+/- 5 минуты
от > 2 до 8 часов
+/-10 минут
от > 8 до 24 часов
+/- 20 минут
с применением сепараторных пробирок для разделения геля-сыворотки. Кровь хранят при температуре окружающей среды и позволяют сворачиваться в течение по меньшей мере 20 минут до центрифугирования. Образцы центрифугируют (приблизительно от 10 до 15 минут при около 1500-2000 × g [сила], от 2 °C до 8 °C) в пределах 1 часа после отбора. Сыворотку собирают в пределах 30 минут после начала центрифугирования и переносят в маркированные штрих-кодом пробирки с верхней навинчивающейся крышкой емкостью 0,5 мл (каталог Thermofisher Scientific № 3744 или аналогичные). Образец сыворотки маркируют номером животного, видом, группой дозы, днем отбора, видом образца (т.е., ФК (PK) сыворотка) и номерами исследований. Затем образцы сыворотки анализируют на предмет концентрации h10A7.K4G3 или 4.1D3. Как проиллюстрировано на Фиг. 5C и 5D, данное исследование ФК (PK) показало, что h10A7.K4G3 демонстрирует более быстрый клиренс (более низкую площадь под кривой, AUC), чем 4,1D3, и что клиренс h10A7.K4G3 (> 9 мл/сутки/кг) выше рекомендованного для выбора моноклональных антител у яванского макака. Оценочный клиренс был основан на данных с 0 по 7 день и вычислен Winnonlin с применением некомпартментального анализа, НКА (NCA).
Пример 5. Молекулярный анализ анти-TIGIT антител
Клоны полученных от OMT (4.1D3, 7.4A3.C96S и 4.1A4.C96S) и полученных от СД (SD) (h1.6B2.L1H1, h1.10A5.L1H1, h1.7E7.L1H1 и h1.15C8.L1H1) антител TIGIT дополнительно тестировали в анализах молекулярной оценки (МО (MA)) на предмет стабильных свойств клеточной линии. Вкратце, анти-TIGIT антитела (1 мг/мл) испытывают на предмет стресса в химических условиях с 2,2-азобис-(2-амидинопропан)-дигидрохлоридом, ААРГ (AAPH), молекулой небольшого размера, которая, как известно, генерирует свободные радикалы, а также в условиях термического стресса при различных рН (двухнедельный тест термического стресса при 40° С и рН 5,5 или рН 7,4). Как приведено в Табл. 8 и 9 ниже, 4.1A4.C96S было определено как нестабильное, поскольку демонстрировало неприемлемое снижение интенсивности основного пика и повышенное дезамидирование в исследованиях МО (МА). Аналогично, h1.7E7.L1H1 и h1.15C8.L1H1 показали высокое начальное дезамидирование (> 30 %). С другой стороны, анти-TIGIT антитела 4.1D3, 7.4A3.C96S, h1.6B2.L1H1 и h1.10A5.L1H1, как было обнаружено, проявляют приемлемые свойства стабильности в исследованиях МА.
Таблица 8. Краткая характеристика стабильности МО (MA) клонов анти-TIGIT антител, полученных от OMT
<b>4.1A4.C96S</b>
<b>4.1D3</b>
<b>7.4A3.C96S</b>
Стресс ААФГ
<b>M</b> в CDR-H1 стабилен
<b>W</b> в CDR-H2 стабилен
<b>W</b> в CDR-H1 стабилен
<b>W</b> в CDR-H2 стабилен
<b>W</b> в CDR-L2 стабилен
<b>M</b> в CDR-H1 стабилен
<b>W</b> в CDR-H2 стабилен
Термический стрессpH 5,5(2 недели)Анализ пептидной картыОбъемный зарядЖХ/МС
<b>NY</b> в CDR-H1 стабилен
<b>N(52)T </b>в CDR-H2 стабильны
<b>N(54)T</b> в CDR-H2 стабильны
<b>DY</b> в CDR-H3 стабилен
<b>NS</b> в CDR-L3 нестабилен - увеличение степени дезамидирования на 15,7 %
<b>DS</b> в CDR-H1 стабилен<b></b><b>NS</b> в CDR-H1 стабилен
<b>DY</b> в CDR-H2 стабилен
<b>DY</b> в CDR-H3 стабилен
<b>NN</b> в CDR-L1 стабилен
<b>N(52)T</b> в CDR-H2 стабилен
<b>N(54)T</b> в CDR-H2 стабилен
<b>NP</b> в CDR-H2 стабилен
<b>DS</b> в CDR-H3 стабилен
Потеря мономера (<b>0,5 %</b>)<b></b>приемлемаСнижение основного пика (<b>16,7 %</b>)<b></b><u>неприемлемо</u>Значения массы соответствуют ожидаемым
Потеря мономера (<b>0,6 %</b>)<b></b>приемлемаСнижение основного пика (<b>11,1 %</b>)<b></b>приемлемаЗначения массы соответствуют ожидаемым
Потеря мономера (<b>1,1 %</b>)<b></b>приемлемаСнижение основного пика (<b>7,3 %</b>)<b></b>приемлемаЗначения массы соответствуют ожидаемым
Термический стрессpH 7,4(2 недели)Анализ пептидной картыОбъемный зарядЖХ/МС
<b>NY</b> в CDR-H1 без изменений
<b>N(52)T</b> & <b>N(54)T</b> в CDR-H2 без изменений
<b>DY</b> в CDR-H3 без изменений
<b>NS</b> в CDR-L3 увеличение степени дезамидирования на 9,4 %
<b>DS </b>CDR-H1 увеличение степени изомеризации на 2,8 %
<b>NS </b>CDR-H1 без изменений
<b>DY</b> в CDR-H2 без изменений
<b>DY</b> в CDR-H3 увеличение степени изомеризации на 2,7 %
<b>NN</b> в CDR-L1 без изменений
<b>N(52)T</b> в CDR-H2 без изменений
<b>N(54)T</b> в CDR-H2 без изменений
<b>NP</b> в CDR-H2 без изменений
<b>DS</b> в CDR-H3 без изменений
Потеря мономера (<b>2,7 %</b>)Снижение основного пика (<b>21,9 %</b>)Значения массы соответствуют ожидаемым
Потеря мономера (<b>0,9 %</b>)Снижение основного пика (<b>27,7 %</b>)Значения массы соответствуют ожидаемым
Потеря мономера (<b>2,3 %</b>)Снижение основного пика (<b>15,7 %</b>)Значения массы соответствуют ожидаемым
Таблица 9-1. Краткая характеристика стабильности МО (MA) клонов анти-TIGIT антител, полученных от СД (SD)
<b>h7E7.L1H1 </b>
<b>h15C8.L1H1 </b>
Стресс ААФГ
«Горячие точки» окисления отсутствуют
«Горячие точки» окисления отсутствуют
Термический стрессpH 5,5(2 недели)Анализ пептидной картыОбъемный заряд ЖХ/МС
<b>DP</b> в CDR-H2 стабилен
<b>NG</b> в CDR-H2 стабилен
<b>NT</b> в CDR-L2 стабилен
<b>NL</b> в CDR-L2 стабилен
<b>N(92)N(93)G</b> в CDR-L3 стабилен - высокий начальный уровень дезамидирования 31,5 %
<b>DP</b> в CDR-H2 стабилен
<b>NG</b> в CDR-H2 стабилен
<b>DG</b> в CDR-H3 нестабилен (повышение степени изомеризации на 14,7 % (от 3,8 % до 18,5 %)
<b>N(92)N(93)G</b> в CDR-L3 стабилен - высокий начальный уровень дезамидирования 39,2 %
Потеря мономера (<b>0,8 %</b>)<b></b>приемлемаСнижение основного пика (<b>6,2 %</b>)<b></b>приемлемоЗначения массы соответствуют ожидаемым
Потеря мономера (<b>0,9 %</b>)<b></b>приемлемаСнижение основного пика (<b>10,3 %</b>)<b></b>приемлемаЗначения массы соответствуют ожидаемым
Термический стрессpH 7.4(2 недели)Анализ пептидной картыОбъемный заряд ЖХ/МС
<b>DP</b> в CDR-H2 без изменений
<b>NG</b> в CDR-H2 повышение степени дезамидирования на 1,9 %
<b>NT</b> в CDR-L2 без изменений
<b>NL</b> в CDR-L2 без изменений
<b>N(92)N(93)G </b>в CDR<b>-L3 - </b>повышение степени дезамидирования на 24,3 %
<b>DP</b> в CDR-H2 без изменений
<b>NG</b> в CDR-H2 повышение степени дезамидирования на 3,3 %
<b>DG</b> в CDR-H3 повышение степени изомеризации на 7,0 %
<b>N(92)N(93)G </b>в CDR<b>-L3 - </b>повышение степени дезамидирования на 15,5 %
Потеря мономера (<b>0,5 %</b>)Снижение основного пика (<b>16,7 %</b>)Значения массы соответствуют ожидаемым
Потеря мономера (<b>1,5 %</b>)Снижение основного пика (<b>25,2 %</b>)Значения массы соответствуют ожидаемым
Таблица 9-2. Краткая характеристика стабильности МО (MA) клонов анти-TIGIT антител, полученных от СД (SD)
<b>h6B2.L1H1 </b>
<b>h10A5.L1H1 </b>
Стресс ААФГ
<b>M</b> в CDR-H1 стабилен
<b>W(52)</b> и <b>W(53)</b> в CDR-H2 стабильны
<b>W</b> в CDR-H3 стабилен
<b>M</b> в CDR-H1 стабилен
<b>W(52)</b> и <b>W(53)</b> в CDR-H2 стабильны
<b>W</b> в CDR-H3 стабилен
Термический стрессpH 5.5 (2 недели)Анализ пептидной картыОбъемный заряд ЖХ/МС
<b>NG</b> в CDR-H2 стабилен
<b>NT</b> в CDR-H2 стабилен
<b>NP</b> в CDR-H2 стабилен
<b>NS</b> в CDR-L3 стабилен
<b>NG</b> в CDR-H2 стабилен
<b>NT</b> в CDR-H2 стабилен
<b>NP</b> в CDR-H2 стабилен
<b>NS</b> в CDR-L3 стабилен
Потеря мономера (<b>0,2 %</b>)<b></b>приемлемаСнижение основного пика (<b>2,4 %</b>)<b></b>приемлемоЗначения массы соответствуют ожидаемым
Потеря мономера (<b>0,1 %</b>)<b></b>приемлемаСнижение основного пика (<b>6,3 %</b>)<b></b>приемлемоЗначения массы соответствуют ожидаемым
Термический стрессpH 7.4 (2 недели)Анализ пептидной картыОбъемный заряд ЖХ/МС
<b>NG</b> в CDR-H2 повышение степени дезамидирования на 5,6 %
<b>NT</b> в CDR-H2 без изменений
<b>NP</b> в CDR-H2 без изменений
<b>NS</b> в CDR-L3 без изменений
<b>NG</b> в CDR-H2 повышение степени дезамидирования на 4,8 %
<b>NT</b> в CDR-H2 без изменений
<b>NP</b> в CDR-H2 без изменений
<b>NS</b> в CDR-L3 без изменений
Потеря мономера (<b>0,0 %</b>)Снижение основного пика (<b>9,9 %</b>)Значения массы соответствуют ожидаемым
Потеря мономера (<b>0,2 %</b>)Снижение основного пика (<b>14,5 %</b>)Значения массы соответствуют ожидаемым
Пример 6. Структурное и функциональное отображение эпитопов TIGIT
Для лучшего понимания того, каким образом анти-TIGIT антитело 4.1D3 и его оптимизированные варианты (например, 4.1D3.Q1E), в частности, способны к типичной перекрестной реактивности (например, перекрестной реактивности между TIGIT человека, яванца и кролика) с высокой аффинностью к TIGIT и надежной блокировкой взаимодействия/функции TIGIT-PVR и TIGIT-CD226 при проявлении свойств фармакокинетики и молекулярной оценки, определяли кристаллическую структуру 4.1D3 в комплексе с TIGIT и сравнивалась с кристаллической структурой мышиного анти-TIGIT антитела 1A5, связанного с TIGIT, и полученного от хомяка анти-TIGIT антитела 10A7, связанного с TIGIT, как подробно описано ниже. Кроме того, для идентификации функциональных эпитопных остатков выполняли эксперименты по анализу интерфейса TIGIT методом аланинсканирующего мутагенеза.
A. Экспрессия, очистка и кристаллизация TIGIT и Fab
PNAS
Nat. Biotech.
Остатки TIGIT человека 23-128 экспрессируют и очищают, как описано (см., например, Stengel et al. . 109(14): 5399-5404, 2012). Фрагменты Fab, включая тяжелые и легкие цепи, экспрессируют и очищают, как описано (см., например, Carter et al.  1992). Очищенный TIGIT смешивают с избытком очищенного фрагмента Fab для получения комплекса TIGIT/Fab. Затем комплекс дополнительно очищают на эксклюзионной колонке, уравновешенной буферизованным ГЭПЭС (HEPES) физиологическим раствором (10 мМ ГЭПЭС (HEPES), pH 7,5 и 100 мМ NaCl), чтобы получить образец, содержащий только комплексы TIGIT и Fab 1:1. Затем каждый из комплексов TIGIT/Fab концентрируют для кристаллизации и обрабатывают стандартными методиками высокопроизводительного скрининга кристаллизацией с диффузией паров. Для комплекса TIGIT/10A7 образец концентрируют до около 25 мг/мл, причем было обнаружено, что он кристаллизуется в 0,1 М ГЭПЭС (HEPES), pH 7,5, 20 % ПЭГ (PEG) 4000 и 10 % изопропанола. Для комплекса TIGIT/1A5 образец концентрируют до около 25 мг/мл, причем было обнаружено, что он кристаллизуется в 0,05 М ГЭПЭС (HEPES), рН 7,0, 12 % ПЭГ (PEG) 3350 и 1 % Tryptone. Для комплекса TIGIT/4.1D3 образец концентрируют до около 25 мг/мл, и было обнаружено, что он кристаллизуется в 0,1 М ГЭПЭС (HEPES), pH 7,5, 10 % ПЭГ (PEG) 6000 и 5 % (+/-)-2-метил-2,4-пентандиола, МПД (MPD). Кристаллы подвергают криозащите глицерином и мгновенно замораживают в жидком азоте в соответствии со стандартными методами сбора данных.
B. Сбор данных и отнесение структуры
Acta Cryst. D. Biol. Crystl.
Данные рентгеноструктурного анализа получают в условиях криоохлаждения при 100 Кельвинах с применением различных рентгеновских лучей синхротронного излучения на Advanced Light Source (Беркли, штат Калифорния) или Advanced Photon Source (Аргонн, штат Иллинойс) в соответствии со стандартными способами. Дифракционные изображения обрабатывают и уменьшают с применением программного обеспечения для обработки данных XDS (Kabsch W. 66: 125-132, 2010). Модели генерируют с применением метода молекулярной замены с помощью программы PHASER. В качестве поисковых моделей применяют структуру TIGIT человека (Stengel et al PNAS 2012) и модель антитела Fab (Nakamura et al Cell Host Microbe 2013). Структуры проходят итеративные раунды настройки модели с применением программы COOT и уточнения с применением программ Phenix.refine или BUSTER. Модели уточнены до приемлемых значений R и свободного R и статистики Рамачандрана (вычислены по Molprobity). Статистические данные обработки и уточнения приведены в Табл. 10.
Таблица 10. Статистика сбора и уточнения данных
<b>Статистика сбора и уточнения данных</b>
TIGIT/10A7
TIGIT/1A5
TIGIT/1D3
<b>Сбор данных</b>
ALS 5.0.2
APS LS-CAT 21ID-G
APS 22ID-D
Пространственная группа
P21
P1
I4
Размеры ячейки
<i>a, b, c (Å)</i>
53,02, 76,99, 136,91
74,60, 88,78, 101,10
212,39, 212,39, 66,52
<i>α, β, γ (Υ)</i>
90, 90,6, 90
101,1, 101,5, 110,5
90, 90, 90
Разрешение (Å)
136,90-1,84 (1,94-1,84)*
81,11-2,77(2,92-2,77)*
106,19-1,91(2,01-1,91)*
<i>R</i><sub><i>sym</i></sub> или <i>R</i><sub><i>merge</i></sub>
0,063 (0,512)
0,062 (0,558)
0,089 (0,973)
<i>I/σI</i>
12,7 (2,4)
12,1 (2,3)
12,8 (1,8)
Полнота (%)
96,4 (95,7)
97,8 (97,1)
93,8 (69,3)
Избыток
3,8 (3,8)
2,2 (2,1)
7,4 (6,6)
<b>Уточнение</b>
Разрешение (Å)
136,9-1,85
81,11-2,77
27,96-1,91
Кол-во изображений
90418
58936
107910
<i>R</i><sub><i>work</i></sub><i>/</i><i>R</i><sub><i>tree</i></sub>
17,8/21,8 %
19,9/27,1 %
18,6/21,6 %
Отклонение ср. квадр.
Длины связей (Å)
0,010
0,010
0,010
Углы связей (Å)
1,16
1,26
1,13
Рамачандран
Наиболее благоприятный
97,0 %
91,2 %
97,4 %
Отклоненный
0,3 %
1,4 %
0,1 %
*Значения в скобках относятся к оболочке с самым высоким разрешением.
C. Структура 4.1D3, связанного с TIGIT человека
2
Комплексе 4.1D3 Fab с TIGIT кристаллизовался в пространственной группе I4 с двумя комплексами в асимметричном блоке и диффракцией до 1,91 Å. Наложение двух отдельных комплексов в асимметричном блоке показывает лишь незначительные вариации размещения основной цепи между отдельными копиями. Структура 4.1D3, связанного с TIGIT человека (Фиг. 6A), показывает, что 4.1D3 стерически препятствует связыванию с ПВР (PVR) (Фиг. 6B и 6C). Площадь скрытой поверхности между 4.1D3 и TIGIT составляет около 1630Å. Взаимодействие с легкими цепями 4.1D3 группируется вокруг остатков TIGIT 77-82, причем CDR L1 Tyr27d и CDR L3 Tyr92, Ser93, Thr94 и Phe96, вступают в контакт с остатками TIGIT Ile77, Pro79, Ser80 и Lys82. CDR L2 не вступает в контакт с TIGIT. Взаимодействие с тяжелыми цепями 4.1D3 в основном опосредуется CDR H2 и H3 и обеспечивает более широкий контакт с TIGIT. 4.1D3 CDR H1 Asn32 вступает в контакт с TIGIT Leu73. 4.1D3 CDR H2 Tyr52, Arg52b, Phe53, Lys54, Tyr56 и Asp58 вступают в контакт с остатками TIGIT Thr55, Gln56, Asn58, Glu60, Asp63, Gln64, Leu65, Ile68, Asn70, Ser80 и His111. Остатки 4.1D3 CDR H3 Tyr99, Asp100, Leu100a Leu100b и Ala100c вступают в контакт с остатками TIGIT Leu65, Ala67, Ile68, Leu73, His76, Ile77, Ser78, Pro79 и Lys82. 4.1D3 взаимодействует с TIGIT, используя комбинацию неполярных и полярных взаимодействий. Остаток легкой цепи CDR L3 Thr94 образует полярные контакты с TIGIT Pro79 и Ser80. Остатки тяжелой цепи CDR H2 Arg52b и Tyr56 образуют водородные связи с остатками TIGIT Asn58 и Glu60. Остаток тяжелой цеп CDR H3 Leu100a образует водородную связь с TIGIT His76. Остаток CDR H2 Lys54 и остаток CDR H3 Asp100 тяжелой цепи образуют солевые мостики с остатками TIGIT Glu60 и Lys82, соответственно. Дополнительно см. Фиг. 6D и 6E.
Основываясь на кристаллической структуре комплекса 4.1D3/TIGIT, определены остатки TIGIT, с которыми контактирует 4.1D3 (т.е., остатки эпитопа TIGIT, с которыми связывается 4.1D3) и остатки 4.1D3, с которыми вступает в контакт TIGIT (т.е., были определены остатки паратопа 4.1D3, вступающие в контакт с TIGIT). В Табл. 11 и 12 ниже приведены остатки TIGIT и остатки легкой или тяжелой цепи 4.1D3, с которыми они вступают в контакт, согласно оценке с применением жесткости контактного расстояния 3,7 Å, точки, в которой силы ван-дер-ваальсовских (неполярных) взаимодействий являются максимальными.
Таблица 11. Эпитопные остатки TIGIT и соответствующие паратопные остатки на легкой цепи 4.1D3
<u>TIGIT</u>
<u>Легкая цепь 4.1D3</u>
Ile
77
Tyr
27d
Pro
79
Tyr
92
Ser
93
Thr
94
Ser
80
Thr
94
Lys
82
Tyr
27d
Таблица 12. Эпитопные остатки TIGIT и соответствующих паратопные остатки на тяжелой цепи 4.1D3
<u>TIGIT</u>
<u>Тяжелая цепь 4.1D3</u>
Thr
55
Phe
53
Gln
56
Phe
53
Asn
58
Arg
52b
Tyr
56
Glu
60
Lys
54
Tyr
56
Leu
65
Leu
100b
Ile
68
Leu
100a
Leu
73
Leu
100a
His
76
Tyr
99
Asp
100
Leu
100a
Leu
100b
Ser
78
Leu
100b
Pro
79
Leu
100b
Ser
80
Asp
58
Lys
82
Asp
100
His
111
Phe
53
Дополнительно проведено аланиновое сканирование интерфейса TIGIT человека с аланиновыми мутациями остатков TIGIT, осуществленными для Gln53, Gln56, Glu60, Leu65, Ile68, Asn70, Leu73, His76, His111, Tyr113 и Thr117. Указанные мутанты, наряду с диким типом, тестировали на предмет связывания с Fab фрагментом 4.1D3. В этом эксперименте мутация остатков TIGIT Glu60, Leu65 и Ile68 уменьшала связывание с 4.1D3 более чем в 10 раз (Фиг. 7A, 7B и 7E). Мутация остатков TIGIT Gln56, Asn70, Leu73, His111 и Tyr113 уменьшала связывание с 4.1D3 в пределах от 1 до 10 раз (Фиг. 7A, 7B и 7E). Мутация TIGIT Gln53, His76 и Thr117 не влияла на связывание с 4.1D3 (Фиг. 7A, 7B и 7E). Проведенный анализ согласуется с анализом кристаллической структуры, причем обнаружено, что остатки TIGIT, которые наиболее подвержены связыванию с 4.1D3, взаимодействуют с 4.1D3 в структуре.
D. Структура 1A5, связанного с TIGIT человека
2
Комплекс 1A5 Fab с TIGIT кристаллизовался в пространственной группе P1 с четырьмя комплексами в асимметричном блоке и диффракцией до 2,77 Å. Наложение четырех отдельных комплексов в асимметричном блоке показывает лишь незначительные вариации расположения основных цепей между отдельными копиями. Структура 1A5, связанного с TIGIT человека (Фиг. 8), показывает, что 1A5 стерически препятствует связыванию с ПВР (PVR), но эпитоп на TIGIT человека, с которым связывается 1A5, не идентичен эпитопу 4.1D3 (Фиг. 9). Площадь скрытой поверхности между 1A5 и TIGIT составляет около 1715 Å. Взаимодействие легкой цепи 1A5 с TIGIT в основном группируется между остатками 109 и 119 с одним внешним контактом с Glu60. Легкая цепь 1A5 CDR L1 содержит единственный вступающий в контакт остаток Trp32, который вступает в контакт с остатками TIGIT Ile109, Thr117 и Thr119. Остаток 1A5 CDR L2 Lys50 вступает в контакт с TIGIT Glu60. Остатки 1A5 CDR L3 Gly91, Gln92, Ser93 и Tyr94 вступают в контакт с остатками TIGIT Thr112, Tyr113, Pro114, Asp115, Gly116 и Thr117. В случае тяжелой цепи 10А7 остатки CDR H1 Thr30 и Asp31 вступают в контакт с остатком TIGIT Leu73. Остатки 10A7 CDR H2 Tyr52, Val53, Ser54, Tyr58 и Tyr59 вступают в контакт с остатками TIGIT Gln53, Thr55, Asp72, Leu73 и Tyr113. 10A7 CDR H3 Phe97, Arg98, Pro100 и Trp100a вступают в контакт с остатками TIGIT Gln56, Asn58, Glu60, Asp63, Gln64, Leu65, Ile68, Leu73, His76 и His111. Контакты между 1A5 и TIGIT носят в основном неполярный характер, причем два исключения представляют собой водородную связь между остатком 1A5 CDR H2 Ser54 и остатком TIGIT Asp72 и солевой мостик между остатком 1A5 CDR H3 ArgA и остатком TIGIT Glu60.
На основе кристаллической структуры комплекса 1A5/TIGIT определены остатки TIGIT, с которыми вступает в контакт 1A5 (т.е., эпитопные остатки TIGIT, с которыми связывается 1A5), и остатки 1A5, с которыми вступает в контакт TIGIT (т.е., паратопные остатки 1A5, с которыми связывается TIGIT). В Табл. 13 и 14 ниже приведены остатки TIGIT и остатки легкой или тяжелой цепи 1A5, с которыми они вступают в контакт, согласно оценке с применением жесткости контактного расстояния 3,7 Å, в точке, в которой силы ван-дер-ваальсовских взаимодействий (неполярных) максимальные.
Таблица 13. Эпитопные остатки TIGIT и соответствующие паратопные остатки на легкой цепи 1A5
<u>TIGIT</u>
<u>Легкая цепь 1A5</u>
Thr
112
Tyr
94
Tyr
113
Tyr
94
Pro
114
Tyr
94
Gly
116
Gln
92
Thr
117
Trp
32
Gly
91
Gln
92
Таблица 14. Эпитопные остатки TIGIT и соответствующие паратопные остатки на тяжелой цепи 1A5
<u>TIGIT</u>
<u>Тяжелая цепь 1A5</u>
Gln
53
Tyr
58
Thr
55
Tyr
52
Tyr
58
Gln
56
Phe
97
Arg
98
Pro
100
Asn
58
Arg
98
Glu
60
Arg
98
Leu
65
Arg
98
Asp
72
Tyr
52
Val
53
Ser
54
Leu
73
Thr
30
Asp
31
Tyr
113
Tyr
58
Tyr
59
Дополнительно проведено аланиновое сканирование интерфейса TIGIT с аланиновыми мутациями остатков TIGIT для Gln53, Gln56, Glu60, Leu65, Ile68, Asn70, Leu73, His76, His111, Tyr113 и Thr117. Указанные мутанты наряду с диким типом были протестированы на предмет связывания с Fab фрагментом 1A5. В этом эксперименте мутация остатков TIGIT Gln56, Glu60, Leu65, Ile68 и Tyr113 уменьшала связывание с1A5 более чем в 10 раз (Фиг. 7A, 7B и 7D). Мутация остатков TIGIT Leu73, His76, Asn70, His111 и Thr117 уменьшала связывание с 1A5 в пределах от 1 до 10 раз (Фиг. 7A, 7B и 7D). Только мутация TIGIT Gln53 не влияла на связывание с1A5 (Фиг. 7A, 7B и 7D). Проведенный анализ согласуется с анализом кристаллической структуры, причем обнаружено, что остатки TIGIT, которые наиболее подвержены связыванию с 1A5, взаимодействуют с 1A5 в структуре.
E. Структура 10A7, связанного с TIGIT человека
2
Комплекс 10A7 Fab/TIGIT кристаллизовался в пространственной группе P21 с двумя комплексами 10A7/TIGIT в асимметричном блоке и диффракцией до 1,85 Å. Наложение двух комплексов показывает лишь незначительные вариации размещения основной цепи как для TIGIT, так и для 10A7. Структура 10A7, связанного с TIGIT человека (Фиг. 10A), показывает, что 10A7 стерически препятствует связыванию с ПВР (PVR) (Фиг. 10B), но эпитоп на TIGIT человека, с которым связывается 10A7, не идентичен эпитопу для 4.1D3 или 1A5 (Фиг. 9). Площадь скрытой поверхности между 10A7 и TIGIT составляет около 1420 Å. Вступающие в контакты остатки TIGIT сгруппированы между Leu65 и Ile77, с двумя внешними контактами 10A7 CDR с TIGIT Gln56 и Pro87. Легкая цепь CDR L1 содержит инсерцию размером шесть аминокислот и использует остатки Tyr27d, Gly27f, Val28, Lys29 и Leu32 для установления контактов с остатками TIGIT Gln56, Leu65, Ile68, Asn70, Leu73, His76, Ser78, Ile77 и Pro79. CDR L2 устанавливает только два контакта через Tyr50 и Ile53 с TIGIT His76, Ile77 и Pro79. CDR L3 Gly91, Ile92, Asn93 и Asn94 вступают в контакт с остатками TIGIT Asp72, Leu73 и His76. В случае CDR тяжелой цепи остатки H1 не связываются с TIGIT. В случае CDR H2, Phe50 и Arg52 вступают в контакт с Asn70, Ala71, Asp72, Leu73 и Gly74. В случае CDR H3 остатки Arg95, Leu97, Gly98, His99 и Asn100 вступают в контакт с остатками TIGIT Leu73, Gly74, Trp75, His76, Ile77 и Pro87. В целом, взаимодействие между легкой цепью 10А7 и TIGIT было в основном гидрофобными по своей природе, с одним контактом в виде водородной связи между гидроксильной группой CDR L2 Tyr50 и карбонилом основной цепи Ile77. В случае тяжелой цепи 10А7 полярные контакты найдены между Arg52 и карбонильными группами основной цепи TIGIT Ala71 и Asp72, а также между Arg95 и карбонильными группами основной цепи Gly74 и Trp75.
Основываясь на кристаллической структуре комплекса 10А7/TIGIT, определены остатки TIGIT, с которыми вступают в контакт 10A7 (т.е., эпитопные остатки TIGIT, с которыми связывается 10A7), и остатки 10A7, с которыми вступает в контакт TIGIT (т.е., паратопные остатки 10A7, с которыми связывается TIGIT). В Табл. 15 и 16 ниже приведены остатки TIGIT и остатки легкой или тяжелой цепи 10A7, с которыми они вступают в контакт, согласно оценке с применением жесткости контактного расстояния 3,7 Å, в точке, в которой силы ван-дер-ваальсовских взаимодействий (неполярных) максимальные.
Таблица 15. Эпитопные остатки TIGIT и соответствующие паратопные остатки на легкой цепи 10A7
<u>TIGIT</u>
<u>Легкая цепь 10A7</u>
Asp
72
Asn
94
Leu
73
Gly
91
Ile
92
His
76
Tyr
27d
Leu
32
Tyr
50
Ile
77
Tyr
50
Pro
79
Glu
30
Tyr
50
Ile
53
Таблица 16. Эпитопные остатки TIGIT и соответствующие паратопные остатки на тяжелой цепи 10A7
<u>TIGIT</u>
<u>Тяжелая цепь 10A7</u>
Ala
71
Arg
52
Phe
58
Asp
72
Arg
52
Leu
73
Arg
52
Arg
95
Asn
100
Gly
74
Arg
52
Trp
75
Arg
95
Leu
97
Gly
98
His
99
His
76
Gly
98
Asn
100
Ile
77
Gly
98
Pro
87
Leu
97
Дополнительно проведено выполнялось аланиновое сканирование интерфейса TIGIT с аланиновыми мутациями остатков TIGIT для Gln53, Gln56, Glu60, Leu65, Ile68, Asn70, Leu73, His76, His111, Tyr113 и Thr117. Указанные мутанты, наряду с диким типом, тестировали на предмет связывания с Fab фрагментом 10A7. В этом эксперименте только мутации Leu73Ala и His76Ala влияли на связывание с 10A7 более чем в 10 раз (Фиг. 7A-7C). Мутация других перечисленных остатков существенно не влияла на связывание с 10А7 (Фиг. 7А-7С). Это согласуется с кристаллической структурой 10A7, связанного с TIGIT, в которой Leu73 и His76 были обнаружены непосредственно в эпитопе, с которым связывается 10A7.
F. Анти-TIGIT антитела 4.1D3, 1A5 и 10A7 распознают TIGIT на уникальных эпитопах
Структурные исследования, описанные выше, показывают, что три анти-TIGIT антитела 4.1D3, 1A5 и 10A7 распознают TIGIT на уникальных эпитопах, что может объяснить их различные функциональные свойства и характеристики. Как показано в Табл. 17 ниже, например, 4.1D3 связывается с TIGIT на остатках Ser78, Ser80 и Lys82, которые не связываются ни с 1A5, ни с 10A7 антителами. На Фиг. 11 приведена структурная интерпретация, иллюстрирующая, что остатки Ser78, Ser80 и Lys82 TIGIT вступают в тесный контакт с 4.1D3, но не с 1A5 или 10A7.
Таблица 17. Эпитопные остатки TIGIT в пределах 3,7 Å для анти-TIGIT антител 4,1D3, 1A5 и 10A7
<b>4.1D3</b>
<b>1A5</b>
<b>10A7</b>
53
55
55
56
56
58
58
60
60
65
65
68
71
72
72
73
73
73
74
75
76
76
77
77
78
79
79
80
82
87
111
112
113
114
116
117
Пример 7. Характеристика экспрессии TIGIT, PD-1 и CD226 на иммунных клетках
Далее мы охарактеризовали экспрессию
TIGIT, PD-1 и CD226 на CD4+ и CD8+ Т-клетках из образцов костного мозга множественной миеломы (MM) с применением многоцветной проточной цитометрии. Клетки были выделены из замороженного костного мозга, извлеченного у пациентов с ММ (n = 10). От двух пациентов с ММ были получены образцы при постановке диагноза, и снова после ремиссии. Замороженный костный мозг здоровых доноров использовали в качестве контроля (n = 8). В этих экспериментах образцы костного мозга окрашивали следующими флуоресцентно конъюгированными моноклональными антителами: BV605 (PD-1), Alexa Fluor 488 (FoxP3), PE-DNAM-1 (CD226), PE-Cy7 (CD45), BUV737 (CD8), PerCP-eF710 (CD4), АПК (APC) (TIGIT), Бриллиантовый фиолетовый 421 (NKp46), Бриллиантовый фиолетовый 421 (CD56), Бриллиантовый фиолетовый 510 (CD3), Бриллиантовый фиолетовый 510 (CD38), PE-Cy7 (CD319), PE (CD19) и LIVE/DEAD FixableNear-IR краситель мертвых клеток (Life Technologies, ThermoFisher).
Было показано, что TIGIT, PD-1 и CD226 в высокой степени экспрессируются на CD4+ и CD8+ Т-клетках, полученных из костного мозга пациентов с ММ, по сравнению с CD4+ и CD8+ Т-клетками, полученными из периферической крови здоровых пациентов (Фиг. 12). CD4+ и CD8+ Т-клетки, полученные из костного мозга пациентов с ММ, также были определены как совместно экспрессирующие TIGIT и PD-1 (Фиг. 13). Учитывая эту картину экспрессии, анти-TIGIT антитела по изобретению пригодны для лечения пациентов со связанным с иммунной системой заболеванием или раком (например, миеломой, например MM), в виде монотерапии или в сочетании с дополнительным терапевтическим агентом, таким как антагонист связывания оси PD-1 (например, антагонист связывания PD-L1, например, антитело против PD-L1, например MPDL3280A (атезолизумаб)).
Другие варианты осуществления изобретения
Хотя вышеизложенное изобретение было описано более подробно путем иллюстрации и примера для ясности понимания, описания и примеры не следует интерпретировать как ограничивающие объем изобретения. Необходимо понимать, что различные другие варианты реализации изобретения могут быть осуществлены на практике с учетом общего описания, приведенного выше. Содержимое всей патентной и научной литературы, процитированной в данном документе, включено посредством ссылки в полном объеме.
--->
SEQUENCE LISTING
<110>  Genentech, Inc.
F. Hoffmann-La Roche AG
<120>  ANTI-TIGIT ANTIBODIES AND METHODS OF USE
<130>  50474-120WO3
<150>  US 62/369,299
<151>  2016-08-01
<150>  US 62/233,230
<151>  2015-09-25
<160>  354
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  7
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  1
Ser Asn Ser Ala Ala Trp Asn
1               5
<210>  2
<211>  18
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  2
Lys Thr Tyr Tyr Arg Phe Lys Trp Tyr Ser Asp Tyr Ala Val Ser Val
1               5                   10                  15
Lys Gly
<210>  3
<211>  14
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  3
Glu Ser Thr Thr Tyr Asp Leu Leu Ala Gly Pro Phe Asp Tyr
1               5                   10
<210>  4
<211>  17
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  4
Lys Ser Ser Gln Thr Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Lys Tyr Leu
1               5                   10                  15
Ala
<210>  5
<211>  7
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  5
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1               5
<210>  6
<211>  9
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  6
Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Phe Thr
1               5
<210>  7
<211>  23
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  7
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys
20
<210>  8
<211>  15
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  8
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Asn Leu Leu Ile Tyr
1               5                   10                  15
<210>  9
<211>  32
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  9
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1               5                   10                  15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys
20                  25                  30
<210>  10
<211>  10
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  10
Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1               5                   10
<210>  11
<211>  30
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (1)..(1)
<223>  Xaa is Gln or Glu
<400>  11
Xaa Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser
20                  25                  30
<210>  12
<211>  14
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  12
Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu Trp Leu Gly
1               5                   10
<210>  13
<211>  32
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  13
Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Gln
1               5                   10                  15
Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val Phe Tyr Cys Thr Arg
20                  25                  30
<210>  14
<211>  11
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  14
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1               5                   10
<210>  15
<211>  30
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  15
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser
20                  25                  30
<210>  16
<211>  30
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  16
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser
20                  25                  30
<210>  17
<211>  5
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  17
Ser Tyr Pro Met Asn
1               5
<210>  18
<211>  17
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  18
Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Asn Pro Thr Tyr Val Gln Gly Phe Thr
1               5                   10                  15
Gly
<210>  19
<211>  13
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  19
Thr Gly Gly His Thr Tyr Asp Ser Tyr Ala Phe Asp Val
1               5                   10
<210>  20
<211>  11
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  20
Arg Ala Ser Gln Val Ile Ser Ser Ser Leu Ala
1               5                   10
<210>  21
<211>  7
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  21
Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser
1               5
<210>  22
<211>  9
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (8)..(8)
<223>  Xaa is Cys, Ser, or Tyr
<400>  22
Gln His Leu His Gly Tyr Pro Xaa Asn
1               5
<210>  23
<211>  9
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  23
Gln His Leu His Gly Tyr Pro Ser Asn
1               5
<210>  24
<211>  30
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  24
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Asp Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Arg Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
20                  25                  30
<210>  25
<211>  14
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  25
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Met Gly
1               5                   10
<210>  26
<211>  32
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  26
Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Asn Thr Ala Tyr Leu Gln
1               5                   10                  15
Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg
20                  25                  30
<210>  27
<211>  11
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  27
Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
1               5                   10
<210>  28
<211>  9
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  28
Gln His Leu His Gly Tyr Pro Cys Asn
1               5
<210>  29
<211>  30
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  29
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Asp Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Arg Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
20                  25                  30
<210>  30
<211>  23
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  30
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Thr Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
20
<210>  31
<211>  15
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  31
Trp Tyr Gln Gln Asn Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1               5                   10                  15
<210>  32
<211>  32
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  32
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr
1               5                   10                  15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Val Thr Tyr Tyr Cys
20                  25                  30
<210>  33
<211>  10
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  33
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1               5                   10
<210>  34
<211>  126
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  34
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn
20                  25                  30
Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
35                  40                  45
Trp Leu Gly Lys Thr Tyr Tyr Arg Phe Lys Trp Tyr Ser Asp Tyr Ala
50                  55                  60
Val Ser Val Lys Gly Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn
65                  70                  75                  80
Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
85                  90                  95
Phe Tyr Cys Thr Arg Glu Ser Thr Thr Tyr Asp Leu Leu Ala Gly Pro
100                 105                 110
Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120                 125
<210>  35
<211>  126
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  35
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn
20                  25                  30
Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
35                  40                  45
Trp Leu Gly Lys Thr Tyr Tyr Arg Phe Lys Trp Tyr Ser Asp Tyr Ala
50                  55                  60
Val Ser Val Lys Gly Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn
65                  70                  75                  80
Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
85                  90                  95
Phe Tyr Cys Thr Arg Glu Ser Thr Thr Tyr Asp Leu Leu Ala Gly Pro
100                 105                 110
Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120                 125
<210>  36
<211>  113
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  36
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Thr Val Leu Tyr Ser
20                  25                  30
Ser Asn Asn Lys Lys Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35                  40                  45
Pro Pro Asn Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50                  55                  60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65                  70                  75                  80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85                  90                  95
Tyr Tyr Ser Thr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile
100                 105                 110
Lys
<210>  37
<211>  122
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  37
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Asp Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Arg Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Pro Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Asn Pro Thr Tyr Val Gln Gly Phe
50                  55                  60
Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Asn Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Ala Arg Thr Gly Gly His Thr Tyr Asp Ser Tyr Ala Phe Asp Val Trp
100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  38
<211>  107
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  38
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Thr Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Val Ile Ser Ser Ser
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Asn Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Val Thr Tyr Tyr Cys Gln His Leu His Gly Tyr Pro Ser
85                  90                  95
Asn Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  39
<211>  122
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  39
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Asp Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Arg Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Pro Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Asn Pro Thr Tyr Val Gln Gly Phe
50                  55                  60
Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Asn Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Ala Arg Thr Gly Gly His Thr Tyr Asp Ser Tyr Ala Phe Asp Val Trp
100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  40
<211>  107
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  40
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Thr Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Val Ile Ser Ser Ser
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Asn Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Val Thr Tyr Tyr Cys Gln His Leu His Gly Tyr Pro Cys
85                  90                  95
Asn Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  41
<211>  5
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  41
Asn Tyr Pro Met Asn
1               5
<210>  42
<211>  17
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  42
Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Ser Pro Ala Tyr Ala Gln Asp Phe Thr
1               5                   10                  15
Glu
<210>  43
<211>  11
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  43
Thr Ala Ile Thr Ser Val Tyr His Phe Asp Tyr
1               5                   10
<210>  44
<211>  11
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  44
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr Leu Ala
1               5                   10
<210>  45
<211>  7
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  45
Gly Ala Thr Thr Leu Gln Ser
1               5
<210>  46
<211>  9
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (8)..(8)
<223>  Xaa is Cys, Ser, or Tyr
<400>  46
Gln Lys Leu Asn Ser His Pro Xaa Ser
1               5
<210>  47
<211>  9
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  47
Gln Lys Leu Asn Ser His Pro Cys Ser
1               5
<210>  48
<211>  9
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  48
Gln Lys Leu Asn Ser His Pro Ser Ser
1               5
<210>  49
<211>  9
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  49
Gln Lys Leu Asn Ser His Pro Tyr Ser
1               5
<210>  50
<211>  30
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (1)..(1)
<223>  Xaa is Glu or Gln
<400>  50
Xaa Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Thr
20                  25                  30
<210>  51
<211>  14
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  51
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Met Gly
1               5                   10
<210>  52
<211>  32
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  52
Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Thr Thr Ala Tyr Leu Gln
1               5                   10                  15
Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20                  25                  30
<210>  53
<211>  11
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  53
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1               5                   10
<210>  54
<211>  30
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  54
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Thr
20                  25                  30
<210>  55
<211>  30
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  55
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Thr
20                  25                  30
<210>  56
<211>  23
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  56
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
20
<210>  57
<211>  15
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  57
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Val Leu Ile Tyr
1               5                   10                  15
<210>  58
<211>  32
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  58
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Glu Ser Gly Thr Glu Phe Thr
1               5                   10                  15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Tyr Cys
20                  25                  30
<210>  59
<211>  10
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  59
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1               5                   10
<210>  60
<211>  120
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  60
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Asn Tyr
20                  25                  30
Pro Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Ser Pro Ala Tyr Ala Gln Asp Phe
50                  55                  60
Thr Glu Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Thr Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Thr Ala Ile Thr Ser Val Tyr His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  61
<211>  107
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  61
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Val Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Gly Ala Thr Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Glu Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Lys Leu Asn Ser His Pro Cys
85                  90                  95
Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  62
<211>  120
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  62
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Asn Tyr
20                  25                  30
Pro Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Ser Pro Ala Tyr Ala Gln Asp Phe
50                  55                  60
Thr Glu Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Thr Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Thr Ala Ile Thr Ser Val Tyr His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  63
<211>  107
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  63
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Val Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Gly Ala Thr Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Glu Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Lys Leu Asn Ser His Pro Ser
85                  90                  95
Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  64
<211>  107
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  64
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Val Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Gly Ala Thr Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Glu Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Lys Leu Asn Ser His Pro Tyr
85                  90                  95
Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  65
<211>  9
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  65
Gln His Leu His Gly Tyr Pro Tyr Asn
1               5
<210>  66
<211>  122
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  66
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Asp Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Arg Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Pro Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Asn Pro Thr Tyr Val Gln Gly Phe
50                  55                  60
Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Asn Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Ala Arg Thr Gly Gly His Thr Tyr Asp Ser Tyr Ala Phe Asp Val Trp
100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  67
<211>  107
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  67
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Thr Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Val Ile Ser Ser Ser
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Asn Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Val Thr Tyr Tyr Cys Gln His Leu His Gly Tyr Pro Tyr
85                  90                  95
Asn Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  68
<211>  7
<212>  PRT
<213>  Rattus norvegicus
<400>  68
Thr Tyr Gly Met Gly Val Ser
1               5
<210>  69
<211>  16
<212>  PRT
<213>  Rattus norvegicus
<400>  69
Ser Ile Trp Trp Asn Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1               5                   10                  15
<210>  70
<211>  11
<212>  PRT
<213>  Rattus norvegicus
<400>  70
Thr Gly Gly Ala Val Ile Thr Trp Phe Ala Tyr
1               5                   10
<210>  71
<211>  11
<212>  PRT
<213>  Rattus norvegicus
<400>  71
Lys Ala Ser Gln Ser Val Gly Lys Asn Ile Ala
1               5                   10
<210>  72
<211>  7
<212>  PRT
<213>  Rattus norvegicus
<400>  72
Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr
1               5
<210>  73
<211>  9
<212>  PRT
<213>  Rattus norvegicus
<400>  73
Gln His Ile Tyr Asn Ser Pro Tyr Pro
1               5
<210>  74
<211>  30
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (1)..(1)
<223>  Xaa is Glu or Gln
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (3)..(3)
<223>  Xaa is Ser or Thr
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (10)..(10)
<223>  Xaa is Ala or Gly
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (11)..(11)
<223>  Xaa is Ile or Leu
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (12)..(12)
<223>  Xaa is Leu or Val
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (13)..(13)
<223>  Xaa is Lys or Gln
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (15)..(15)
<223>  Xaa is Ser or Thr
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (16)..(16)
<223>  Xaa is His or Gln
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (19)..(19)
<223>  Xaa is Ser or Thr
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (23)..(23)
<223>  Xaa is Ser or Thr
<400>  74
Xaa Val Xaa Leu Lys Glu Ser Gly Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Xaa
1               5                   10                  15
Thr Leu Xaa Leu Thr Cys Xaa Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser
20                  25                  30
<210>  75
<211>  14
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (6)..(6)
<223>  Xaa is Pro or Ser
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (7)..(7)
<223>  Xaa is Glu or Gly
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (9)..(9)
<223>  Xaa is Ala or Gly
<400>  75
Trp Ile Arg Gln Pro Xaa Xaa Lys Xaa Leu Glu Trp Leu Ala
1               5                   10
<210>  76
<211>  32
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (4)..(4)
<223>  Xaa is Ile or Val
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (5)..(5)
<223>  Xaa is Ser or Thr
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (8)..(8)
<223>  Xaa is Ala or Thr
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (10)..(10)
<223>  Xaa is Lys or Asn
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (11)..(11)
<223>  Xaa is Asp or Asn
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (13)..(13)
<223>  Xaa is Ala or Val
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (14)..(14)
<223>  Xaa is Phe or Val
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (16)..(16)
<223>  Xaa is Asn or Thr
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (17)..(17)
<223>  Xaa is Met or Val
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (19)..(19)
<223>  Xaa is Asn or Ser
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (20)..(20)
<223>  Xaa is Met or Val
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (22)..(22)
<223>  Xaa is Pro or Thr
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (23)..(23)
<223>  Xaa is Thr or Val
<400>  76
Arg Leu Thr Xaa Xaa Lys Asp Xaa Ser Xaa Xaa Gln Xaa Xaa Leu Xaa
1               5                   10                  15
Xaa Thr Xaa Xaa Asp Xaa Xaa Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala His
20                  25                  30
<210>  77
<211>  11
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  77
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1               5                   10
<210>  78
<211>  30
<212>  PRT
<213>  Rattus norvegicus
<400>  78
Gln Val Ser Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser His
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser
20                  25                  30
<210>  79
<211>  14
<212>  PRT
<213>  Rattus norvegicus
<400>  79
Trp Ile Arg Gln Pro Ser Glu Lys Gly Leu Glu Trp Leu Ala
1               5                   10
<210>  80
<211>  32
<212>  PRT
<213>  Rattus norvegicus
<400>  80
Arg Leu Thr Val Ser Lys Asp Ala Ser Asn Asp Gln Ala Phe Leu Asn
1               5                   10                  15
Val Thr Ser Val Asp Thr Thr Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala His
20                  25                  30
<210>  81
<211>  30
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  81
Glu Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser
20                  25                  30
<210>  82
<211>  14
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  82
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Ala
1               5                   10
<210>  83
<211>  32
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  83
Arg Leu Thr Val Thr Lys Asp Ala Ser Lys Asn Gln Ala Val Leu Thr
1               5                   10                  15
Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala His
20                  25                  30
<210>  84
<211>  32
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  84
Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Ala Ser Lys Asn Gln Ala Val Leu Thr
1               5                   10                  15
Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala His
20                  25                  30
<210>  85
<211>  32
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  85
Arg Leu Thr Val Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Ala Val Leu Thr
1               5                   10                  15
Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala His
20                  25                  30
<210>  86
<211>  32
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  86
Arg Leu Thr Val Thr Lys Asp Ala Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Thr
1               5                   10                  15
Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala His
20                  25                  30
<210>  87
<211>  32
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  87
Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Thr
1               5                   10                  15
Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala His
20                  25                  30
<210>  88
<211>  23
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (1)..(1)
<223>  Xaa is Asp or Asn
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (3)..(3)
<223>  Xaa is Gln or Val
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (9)..(9)
<223>  Xaa is Lys or Ser
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (11)..(11)
<223>  Xaa is Leu or Met
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (13)..(13)
<223>  Xaa is Ala or Ile
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (21)..(21)
<223>  Xaa is Ile or Met
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (22)..(22)
<223>  Xaa is Asn or Thr
<400>  88
Xaa Ile Xaa Met Thr Gln Ser Pro Xaa Ser Xaa Ser Xaa Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Xaa Xaa Cys
20
<210>  89
<211>  15
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (8)..(8)
<223>  Xaa is Lys or Gln
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (9)..(9)
<223>  Xaa is Ala or Ser
<400>  89
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Xaa Xaa Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1               5                   10                  15
<210>  90
<211>  32
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (4)..(4)
<223>  Xaa is Asp or Ser
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (7)..(7)
<223>  Xaa is Ser or Thr
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (9)..(9)
<223>  Xaa is Gly or Ser
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (17)..(17)
<223>  Xaa is Phe or Leu
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (20)..(20)
<223>  Xaa is Asn or Ser
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (21)..(21)
<223>  Xaa is Ser or Thr
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (22)..(22)
<223>  Xaa is Leu or Val
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (24)..(24)
<223>  Xaa is Ala or Pro
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (27)..(27)
<223>  Xaa is Ala or Ile
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (29)..(29)
<223>  Xaa is Phe or Thr
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (30)..(30)
<223>  Xaa is Phe or Tyr
<400>  90
Gly Val Pro Xaa Arg Phe Xaa Gly Xaa Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1               5                   10                  15
Xaa Thr Ile Xaa Xaa Xaa Gln Xaa Glu Asp Xaa Ala Xaa Xaa Tyr Cys
20                  25                  30
<210>  91
<211>  10
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (3)..(3)
<223>  Xaa is Gln or Thr
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (7)..(7)
<223>  Xaa is Leu or Val
<400>  91
Phe Gly Xaa Gly Thr Lys Xaa Glu Ile Lys
1               5                   10
<210>  92
<211>  23
<212>  PRT
<213>  Rattus norvegicus
<400>  92
Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser Ile Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Met Asn Cys
20
<210>  93
<211>  15
<212>  PRT
<213>  Rattus norvegicus
<400>  93
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1               5                   10                  15
<210>  94
<211>  32
<212>  PRT
<213>  Rattus norvegicus
<400>  94
Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1               5                   10                  15
Leu Thr Ile Asn Thr Val Gln Ala Glu Asp Ala Ala Phe Phe Tyr Cys
20                  25                  30
<210>  95
<211>  10
<212>  PRT
<213>  Rattus norvegicus
<400>  95
Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1               5                   10
<210>  96
<211>  23
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  96
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
20
<210>  97
<211>  15
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  97
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1               5                   10                  15
<210>  98
<211>  15
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  98
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1               5                   10                  15
<210>  99
<211>  32
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  99
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1               5                   10                  15
Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys
20                  25                  30
<210>  100
<211>  10
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  100
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1               5                   10
<210>  101
<211>  121
<212>  PRT
<213>  Rattus norvegicus
<400>  101
Gln Val Ser Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser His
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr
20                  25                  30
Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ser Glu Lys Gly Leu Glu
35                  40                  45
Trp Leu Ala Ser Ile Trp Trp Asn Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50                  55                  60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Val Ser Lys Asp Ala Ser Asn Asp Gln Ala
65                  70                  75                  80
Phe Leu Asn Val Thr Ser Val Asp Thr Thr Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85                  90                  95
Cys Ala His Thr Gly Gly Ala Val Ile Thr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly
100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  102
<211>  107
<212>  PRT
<213>  Rattus norvegicus
<400>  102
Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser Ile Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Met Asn Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Gly Lys Asn
20                  25                  30
Ile Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50                  55                  60
Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Thr Val Gln Ala
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ala Ala Phe Phe Tyr Cys Gln His Ile Tyr Asn Ser Pro Tyr
85                  90                  95
Pro Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105
<210>  103
<211>  121
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  103
Glu Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr
20                  25                  30
Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35                  40                  45
Trp Leu Ala Ser Ile Trp Trp Asn Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50                  55                  60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Val Thr Lys Asp Ala Ser Lys Asn Gln Ala
65                  70                  75                  80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85                  90                  95
Cys Ala His Thr Gly Gly Ala Val Ile Thr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly
100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  104
<211>  121
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  104
Glu Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr
20                  25                  30
Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35                  40                  45
Trp Leu Ala Ser Ile Trp Trp Asn Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50                  55                  60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Ala Ser Lys Asn Gln Ala
65                  70                  75                  80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85                  90                  95
Cys Ala His Thr Gly Gly Ala Val Ile Thr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly
100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  105
<211>  121
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  105
Glu Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr
20                  25                  30
Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35                  40                  45
Trp Leu Ala Ser Ile Trp Trp Asn Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50                  55                  60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Val Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Ala
65                  70                  75                  80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85                  90                  95
Cys Ala His Thr Gly Gly Ala Val Ile Thr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly
100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  106
<211>  121
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  106
Glu Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr
20                  25                  30
Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35                  40                  45
Trp Leu Ala Ser Ile Trp Trp Asn Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50                  55                  60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Val Thr Lys Asp Ala Ser Lys Asn Gln Val
65                  70                  75                  80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85                  90                  95
Cys Ala His Thr Gly Gly Ala Val Ile Thr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly
100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  107
<211>  121
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  107
Glu Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr
20                  25                  30
Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35                  40                  45
Trp Leu Ala Ser Ile Trp Trp Asn Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50                  55                  60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65                  70                  75                  80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85                  90                  95
Cys Ala His Thr Gly Gly Ala Val Ile Thr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly
100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  108
<211>  107
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  108
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Gly Lys Asn
20                  25                  30
Ile Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Tyr Asn Ser Pro Tyr
85                  90                  95
Pro Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  109
<211>  107
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  109
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Gly Lys Asn
20                  25                  30
Ile Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Tyr Asn Ser Pro Tyr
85                  90                  95
Pro Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  110
<211>  7
<212>  PRT
<213>  Rattus norvegicus
<400>  110
Thr Tyr Gly Met Gly Val Ser
1               5
<210>  111
<211>  16
<212>  PRT
<213>  Rattus norvegicus
<400>  111
Ser Ile Trp Trp Asn Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Arg Ser
1               5                   10                  15
<210>  112
<211>  11
<212>  PRT
<213>  Rattus norvegicus
<400>  112
Thr Gly Gly Ala Val Ile Thr Trp Phe Ala Tyr
1               5                   10
<210>  113
<211>  11
<212>  PRT
<213>  Rattus norvegicus
<400>  113
Lys Ala Ser Gln Ser Val Gly Lys Asn Ile Ala
1               5                   10
<210>  114
<211>  7
<212>  PRT
<213>  Rattus norvegicus
<400>  114
Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr
1               5
<210>  115
<211>  9
<212>  PRT
<213>  Rattus norvegicus
<400>  115
Gln His Ile Tyr Asn Ser Pro Tyr Pro
1               5
<210>  116
<211>  30
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (1)..(1)
<223>  Xaa is Glu or Gln
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (3)..(3)
<223>  Xaa is Ser or Thr
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (10)..(10)
<223>  Xaa is Ala or Gly
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (11)..(11)
<223>  Xaa is Ile or Leu
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (12)..(12)
<223>  Xaa is Leu or Val
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (13)..(13)
<223>  Xaa is Lys or Gln
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (15)..(15)
<223>  Xaa is Ser or Thr
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (16)..(16)
<223>  Xaa is His or Gln
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (19)..(19)
<223>  Xaa is Ser or Thr
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (23)..(23)
<223>  Xaa is Ser or Thr
<400>  116
Xaa Val Xaa Leu Lys Glu Ser Gly Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Xaa
1               5                   10                  15
Thr Leu Xaa Leu Thr Cys Xaa Phe Ser Gly Phe Ser Leu Thr
20                  25                  30
<210>  117
<211>  14
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (6)..(6)
<223>  Xaa is Pro or Ser
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (7)..(7)
<223>  Xaa is Glu or Gly
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (9)..(9)
<223>  Xaa is Ala or Gly
<400>  117
Trp Ile Arg Gln Pro Xaa Xaa Lys Xaa Leu Glu Trp Leu Ala
1               5                   10
<210>  118
<211>  32
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (4)..(4)
<223>  Xaa is Ile or Val
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (5)..(5)
<223>  Xaa is Ser or Thr
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (10)..(10)
<223>  Xaa is Lys or Asn
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (11)..(11)
<223>  Xaa is Asp or Asn
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (13)..(13)
<223>  Xaa is Ala or Val
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (14)..(14)
<223>  Xaa is Phe or Val
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (16)..(16)
<223>  Xaa is Asn or Thr
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (17)..(17)
<223>  Xaa is Met or Val
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (19)..(19)
<223>  Xaa is Asn or Ser
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (20)..(20)
<223>  Xaa is Met or Val
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (22)..(22)
<223>  Xaa is Pro or Thr
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (23)..(23)
<223>  Xaa is Thr or Val
<400>  118
Arg Leu Thr Xaa Xaa Lys Asp Thr Ser Xaa Xaa Gln Xaa Xaa Leu Xaa
1               5                   10                  15
Xaa Thr Xaa Xaa Asp Xaa Xaa Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala His
20                  25                  30
<210>  119
<211>  11
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  119
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1               5                   10
<210>  120
<211>  30
<212>  PRT
<213>  Rattus norvegicus
<400>  120
Gln Val Ser Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser His
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Thr
20                  25                  30
<210>  121
<211>  14
<212>  PRT
<213>  Rattus norvegicus
<400>  121
Trp Ile Arg Gln Pro Ser Glu Lys Gly Leu Glu Trp Leu Ala
1               5                   10
<210>  122
<211>  32
<212>  PRT
<213>  Rattus norvegicus
<400>  122
Arg Leu Thr Val Ser Lys Asp Thr Ser Asn Asp Gln Ala Phe Leu Asn
1               5                   10                  15
Val Thr Ser Val Asp Thr Thr Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala His
20                  25                  30
<210>  123
<211>  30
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  123
Glu Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Thr
20                  25                  30
<210>  124
<211>  14
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  124
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Ala
1               5                   10
<210>  125
<211>  32
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  125
Arg Leu Thr Val Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Ala Val Leu Thr
1               5                   10                  15
Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala His
20                  25                  30
<210>  126
<211>  32
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  126
Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Ala Val Leu Thr
1               5                   10                  15
Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala His
20                  25                  30
<210>  127
<211>  32
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  127
Arg Leu Thr Val Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Thr
1               5                   10                  15
Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala His
20                  25                  30
<210>  128
<211>  32
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  128
Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Thr
1               5                   10                  15
Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala His
20                  25                  30
<210>  129
<211>  23
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (1)..(1)
<223>  Xaa is Glu or Asn
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (9)..(9)
<223>  Xaa is Ala or Lys
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (10)..(10)
<223>  Xaa is Ser or Thr
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (11)..(11)
<223>  Xaa is Leu or Met
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (13)..(13)
<223>  Xaa is Ile or Val
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (15)..(15)
<223>  Xaa is Ile or Pro
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (17)..(17)
<223>  Xaa is Asp or Glu
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (19)..(19)
<223>  Xaa is Ala or Val
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (21)..(21)
<223>  Xaa is Leu or Met
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (22)..(22)
<223>  Xaa is Asn or Ser
<400>  129
Xaa Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Ser Xaa Gly
1               5                   10                  15
Xaa Arg Xaa Thr Xaa Xaa Cys
20
<210>  130
<211>  15
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (6)..(6)
<223>  Xaa is Pro or Thr
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (9)..(9)
<223>  Xaa is Ala or Ser
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (11)..(11)
<223>  Xaa is Gln or Arg
<400>  130
Trp Tyr Gln Gln Lys Xaa Gly Gln Xaa Pro Xaa Leu Leu Ile Tyr
1               5                   10                  15
<210>  131
<211>  32
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (2)..(2)
<223>  Xaa is Ile or Val
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (4)..(4)
<223>  Xaa is Ala or Asp
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (7)..(7)
<223>  Xaa is Ser or Thr
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (9)..(9)
<223>  Xaa is Gly or Ser
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (14)..(14)
<223>  Xaa is Asp or Glu
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (20)..(20)
<223>  Xaa is Asn or Ser
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (22)..(22)
<223>  Xaa is Leu or Val
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (24)..(24)
<223>  Xaa is Ala or Ser
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (27)..(27)
<223>  Xaa is Ala or Phe
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (29)..(29)
<223>  Xaa is Phe or Val
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (30)..(30)
<223>  Xaa is Phe or Tyr
<400>  131
Gly Xaa Pro Xaa Arg Phe Xaa Gly Xaa Gly Ser Gly Thr Xaa Phe Thr
1               5                   10                  15
Leu Thr Ile Xaa Ser Xaa Gln Xaa Glu Asp Xaa Ala Xaa Xaa Tyr Cys
20                  25                  30
<210>  132
<211>  10
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (3)..(3)
<223>  Xaa is Gln or Thr
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (7)..(7)
<223>  Xaa is Leu or Val
<400>  132
Phe Gly Xaa Gly Thr Lys Xaa Glu Ile Lys
1               5                   10
<210>  133
<211>  23
<212>  PRT
<213>  Rattus norvegicus
<400>  133
Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser Ile Ser Ile Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Met Asn Cys
20
<210>  134
<211>  15
<212>  PRT
<213>  Rattus norvegicus
<400>  134
Trp Tyr Gln Gln Lys Thr Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr
1               5                   10                  15
<210>  135
<211>  32
<212>  PRT
<213>  Rattus norvegicus
<400>  135
Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1               5                   10                  15
Leu Thr Ile Asn Ser Val Gln Ala Glu Asp Ala Ala Phe Phe Tyr Cys
20                  25                  30
<210>  136
<211>  10
<212>  PRT
<213>  Rattus norvegicus
<400>  136
Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1               5                   10
<210>  137
<211>  23
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  137
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys
20
<210>  138
<211>  15
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  138
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
1               5                   10                  15
<210>  139
<211>  15
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  139
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
1               5                   10                  15
<210>  140
<211>  32
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  140
Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr
1               5                   10                  15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys
20                  25                  30
<210>  141
<211>  32
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  141
Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr
1               5                   10                  15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys
20                  25                  30
<210>  142
<211>  10
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  142
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1               5                   10
<210>  143
<211>  121
<212>  PRT
<213>  Rattus norvegicus
<400>  143
Gln Val Ser Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser His
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Tyr
20                  25                  30
Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ser Glu Lys Gly Leu Glu
35                  40                  45
Trp Leu Ala Ser Ile Trp Trp Asn Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50                  55                  60
Leu Arg Ser Arg Leu Thr Val Ser Lys Asp Thr Ser Asn Asp Gln Ala
65                  70                  75                  80
Phe Leu Asn Val Thr Ser Val Asp Thr Thr Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85                  90                  95
Cys Ala His Thr Gly Gly Ala Val Ile Thr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly
100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  144
<211>  107
<212>  PRT
<213>  Rattus norvegicus
<400>  144
Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser Ile Ser Ile Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Met Asn Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Gly Lys Asn
20                  25                  30
Ile Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Thr Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50                  55                  60
Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Val Gln Ala
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ala Ala Phe Phe Tyr Cys Gln His Ile Tyr Asn Ser Pro Tyr
85                  90                  95
Pro Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105
<210>  145
<211>  121
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  145
Glu Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Tyr
20                  25                  30
Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35                  40                  45
Trp Leu Ala Ser Ile Trp Trp Asn Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50                  55                  60
Leu Arg Ser Arg Leu Thr Val Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Ala
65                  70                  75                  80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85                  90                  95
Cys Ala His Thr Gly Gly Ala Val Ile Thr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly
100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  146
<211>  121
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  146
Glu Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Tyr
20                  25                  30
Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35                  40                  45
Trp Leu Ala Ser Ile Trp Trp Asn Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50                  55                  60
Leu Arg Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Ala
65                  70                  75                  80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85                  90                  95
Cys Ala His Thr Gly Gly Ala Val Ile Thr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly
100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  147
<211>  121
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  147
Glu Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Tyr
20                  25                  30
Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35                  40                  45
Trp Leu Ala Ser Ile Trp Trp Asn Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50                  55                  60
Leu Arg Ser Arg Leu Thr Val Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65                  70                  75                  80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85                  90                  95
Cys Ala His Thr Gly Gly Ala Val Ile Thr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly
100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  148
<211>  121
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  148
Glu Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Tyr
20                  25                  30
Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35                  40                  45
Trp Leu Ala Ser Ile Trp Trp Asn Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50                  55                  60
Leu Arg Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65                  70                  75                  80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85                  90                  95
Cys Ala His Thr Gly Gly Ala Val Ile Thr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly
100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  149
<211>  107
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  149
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Gly Lys Asn
20                  25                  30
Ile Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ile Tyr Asn Ser Pro Tyr
85                  90                  95
Pro Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  150
<211>  107
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  150
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Gly Lys Asn
20                  25                  30
Ile Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ile Tyr Asn Ser Pro Tyr
85                  90                  95
Pro Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  151
<211>  107
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  151
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Gly Lys Asn
20                  25                  30
Ile Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ile Tyr Asn Ser Pro Tyr
85                  90                  95
Pro Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  152
<211>  107
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  152
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Gly Lys Asn
20                  25                  30
Ile Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ile Tyr Asn Ser Pro Tyr
85                  90                  95
Pro Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  153
<211>  5
<212>  PRT
<213>  Rattus norvegicus
<400>  153
Glu Tyr Ser Ile Tyr
1               5
<210>  154
<211>  17
<212>  PRT
<213>  Rattus norvegicus
<400>  154
Arg Ile Asp Pro Lys Asn Gly Arg Thr Tyr Tyr Val Asp Lys Phe Lys
1               5                   10                  15
Asn
<210>  155
<211>  8
<212>  PRT
<213>  Rattus norvegicus
<400>  155
Ile Tyr Gly Phe Tyr Phe Asp Phe
1               5
<210>  156
<211>  11
<212>  PRT
<213>  Rattus norvegicus
<400>  156
Lys Gly Ser Gln Asn Val Asn Lys Tyr Leu Val
1               5                   10
<210>  157
<211>  7
<212>  PRT
<213>  Rattus norvegicus
<400>  157
Asn Thr Asp Asn Leu Gln Ser
1               5
<210>  158
<211>  8
<212>  PRT
<213>  Rattus norvegicus
<400>  158
Tyr Gln Tyr Asn Asn Gly Phe Thr
1               5
<210>  159
<211>  30
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (5)..(5)
<223>  Xaa is Gln or Val
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (9)..(9)
<223>  Xaa is Ala or Pro
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (11)..(11)
<223>  Xaa is Leu or Val
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (12)..(12)
<223>  Xaa is Lys or Gln
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (13)..(13)
<223>  Xaa is Lys or Arg
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (20)..(20)
<223>  Xaa is Leu or Val
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (25)..(25)
<223>  Xaa is Ser or Thr
<400>  159
Glu Val Gln Leu Xaa Gln Ser Gly Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Xaa Ser Cys Lys Ala Xaa Gly Tyr Thr Phe Thr
20                  25                  30
<210>  160
<211>  14
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (3)..(3)
<223>  Xaa is Lys or Arg
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (5)..(5)
<223>  Xaa is Ala or Arg
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (7)..(7)
<223>  Xaa is Gly or Lys
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (9)..(9)
<223>  Xaa is Arg or Ser
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (12)..(12)
<223>  Xaa is Ile or Trp
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (13)..(13)
<223>  Xaa is Ile or Met
<400>  160
Trp Val Xaa Gln Xaa Pro Xaa Gln Xaa Leu Glu Xaa Xaa Gly
1               5                   10
<210>  161
<211>  32
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (2)..(2)
<223>  Xaa is Ala or Val
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (4)..(4)
<223>  Xaa is Ile or Leu
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (6)..(6)
<223>  Xaa is Ala or Arg
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (10)..(10)
<223>  Xaa is Ala or Ser
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (11)..(11)
<223>  Xaa is Asn or Ser
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (16)..(16)
<223>  Xaa is Glu or Gln
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (21)..(21)
<223>  Xaa is Arg or Thr
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (27)..(27)
<223>  Xaa is Thr or Val
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (29)..(29)
<223>  Xaa is Phe or Tyr
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (31)..(31)
<223>  Xaa is Ala or Thr
<400>  161
Arg Xaa Thr Xaa Thr Xaa Asp Thr Ser Xaa Xaa Thr Ala Tyr Met Xaa
1               5                   10                  15
Leu Ser Ser Leu Xaa Ser Glu Asp Thr Ala Xaa Tyr Xaa Cys Xaa Arg
20                  25                  30
<210>  162
<211>  11
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (5)..(5)
<223>  Xaa is Thr or Val
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (6)..(6)
<223>  Xaa is Leu or Met
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (9)..(9)
<223>  Xaa is Ala or Val
<400>  162
Trp Gly Gln Gly Xaa Xaa Val Thr Xaa Ser Ser
1               5                   10
<210>  163
<211>  30
<212>  PRT
<213>  Rattus norvegicus
<400>  163
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Gln Arg Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Thr
20                  25                  30
<210>  164
<211>  14
<212>  PRT
<213>  Rattus norvegicus
<400>  164
Trp Val Lys Gln Arg Pro Lys Gln Ser Leu Glu Ile Ile Gly
1               5                   10
<210>  165
<211>  32
<212>  PRT
<213>  Rattus norvegicus
<400>  165
Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Met Gln
1               5                   10                  15
Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Thr Arg
20                  25                  30
<210>  166
<211>  11
<212>  PRT
<213>  Rattus norvegicus
<400>  166
Trp Gly Gln Gly Val Met Val Thr Ala Ser Ser
1               5                   10
<210>  167
<211>  30
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  167
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
20                  25                  30
<210>  168
<211>  14
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  168
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Ile Ile Gly
1               5                   10
<210>  169
<211>  14
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  169
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile Gly
1               5                   10
<210>  170
<211>  14
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  170
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Ile Met Gly
1               5                   10
<210>  171
<211>  14
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  171
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met Gly
1               5                   10
<210>  172
<211>  32
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  172
Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu
1               5                   10                  15
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Thr Arg
20                  25                  30
<210>  173
<211>  32
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  173
Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu
1               5                   10                  15
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Thr Arg
20                  25                  30
<210>  174
<211>  32
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  174
Arg Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu
1               5                   10                  15
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Thr Arg
20                  25                  30
<210>  175
<211>  32
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  175
Arg Ala Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu
1               5                   10                  15
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Thr Arg
20                  25                  30
<210>  176
<211>  32
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  176
Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu
1               5                   10                  15
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg
20                  25                  30
<210>  177
<211>  32
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  177
Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu
1               5                   10                  15
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg
20                  25                  30
<210>  178
<211>  32
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  178
Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu
1               5                   10                  15
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20                  25                  30
<210>  179
<211>  11
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  179
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1               5                   10
<210>  180
<211>  23
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (1)..(1)
<223>  Xaa is Asp or Asn
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (3)..(3)
<223>  Xaa is His or Gln
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (10)..(10)
<223>  Xaa is Phe or Leu
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (21)..(21)
<223>  Xaa is Ile or Leu
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (22)..(22)
<223>  Xaa is Ser or Thr
<400>  180
Xaa Ile Xaa Leu Thr Gln Ser Pro Ser Xaa Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Xaa Xaa Cys
20
<210>  181
<211>  15
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (6)..(6)
<223>  Xaa is Leu or Pro
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (8)..(8)
<223>  Xaa is Glu or Lys
<400>  181
Trp Tyr Gln Gln Lys Xaa Gly Xaa Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1               5                   10                  15
<210>  182
<211>  32
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (2)..(2)
<223>  Xaa is Ile or Val
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (14)..(14)
<223>  Xaa is Asp or Glu
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (15)..(15)
<223>  Xaa is Phe or Tyr
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (27)..(27)
<223>  Xaa is Ala or Phe
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (31)..(31)
<223>  Xaa is Phe or Tyr
<400>  182
Gly Xaa Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Xaa Xaa Thr
1               5                   10                  15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Xaa Ala Thr Tyr Xaa Cys
20                  25                  30
<210>  183
<211>  10
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (3)..(3)
<223>  Xaa is Gln or Ser
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (7)..(7)
<223>  Xaa is Leu or Val
<400>  183
Phe Gly Xaa Gly Thr Lys Xaa Glu Ile Lys
1               5                   10
<210>  184
<211>  23
<212>  PRT
<213>  Rattus norvegicus
<400>  184
Asn Ile His Leu Thr Gln Ser Pro Ser Leu Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Leu Ser Cys
20
<210>  185
<211>  15
<212>  PRT
<213>  Rattus norvegicus
<400>  185
Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1               5                   10                  15
<210>  186
<211>  32
<212>  PRT
<213>  Rattus norvegicus
<400>  186
Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr
1               5                   10                  15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys
20                  25                  30
<210>  187
<211>  10
<212>  PRT
<213>  Rattus norvegicus
<400>  187
Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1               5                   10
<210>  188
<211>  23
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  188
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
20
<210>  189
<211>  15
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  189
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1               5                   10                  15
<210>  190
<211>  32
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  190
Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr
1               5                   10                  15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys
20                  25                  30
<210>  191
<211>  32
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  191
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr
1               5                   10                  15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys
20                  25                  30
<210>  192
<211>  32
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Seq_193
<400>  192
Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr
1               5                   10                  15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys
20                  25                  30
<210>  193
<211>  32
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  193
Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr
1               5                   10                  15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20                  25                  30
<210>  194
<211>  32
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  194
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr
1               5                   10                  15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20                  25                  30
<210>  195
<211>  32
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  195
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr
1               5                   10                  15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20                  25                  30
<210>  196
<211>  10
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  196
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1               5                   10
<210>  197
<211>  117
<212>  PRT
<213>  Rattus norvegicus
<400>  197
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Gln Arg Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr
20                  25                  30
Ser Ile Tyr Trp Val Lys Gln Arg Pro Lys Gln Ser Leu Glu Ile Ile
35                  40                  45
Gly Arg Ile Asp Pro Lys Asn Gly Arg Thr Tyr Tyr Val Asp Lys Phe
50                  55                  60
Lys Asn Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Thr Arg Ile Tyr Gly Phe Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Val Met
100                 105                 110
Val Thr Ala Ser Ser
115
<210>  198
<211>  106
<212>  PRT
<213>  Rattus norvegicus
<400>  198
Asn Ile His Leu Thr Gln Ser Pro Ser Leu Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Gly Ser Gln Asn Val Asn Lys Tyr
20                  25                  30
Leu Val Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Asn Thr Asp Asn Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys Tyr Gln Tyr Asn Asn Gly Phe Thr
85                  90                  95
Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105
<210>  199
<211>  117
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  199
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr
20                  25                  30
Ser Ile Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Ile Ile
35                  40                  45
Gly Arg Ile Asp Pro Lys Asn Gly Arg Thr Tyr Tyr Val Asp Lys Phe
50                  55                  60
Lys Asn Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Thr Arg Ile Tyr Gly Phe Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  200
<211>  117
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  200
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr
20                  25                  30
Ser Ile Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Arg Ile Asp Pro Lys Asn Gly Arg Thr Tyr Tyr Val Asp Lys Phe
50                  55                  60
Lys Asn Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Thr Arg Ile Tyr Gly Phe Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  201
<211>  117
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  201
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr
20                  25                  30
Ser Ile Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Ile Met
35                  40                  45
Gly Arg Ile Asp Pro Lys Asn Gly Arg Thr Tyr Tyr Val Asp Lys Phe
50                  55                  60
Lys Asn Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Thr Arg Ile Tyr Gly Phe Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  202
<211>  117
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  202
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr
20                  25                  30
Ser Ile Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Ile Ile
35                  40                  45
Gly Arg Ile Asp Pro Lys Asn Gly Arg Thr Tyr Tyr Val Asp Lys Phe
50                  55                  60
Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Thr Arg Ile Tyr Gly Phe Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  203
<211>  117
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  203
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr
20                  25                  30
Ser Ile Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Ile Ile
35                  40                  45
Gly Arg Ile Asp Pro Lys Asn Gly Arg Thr Tyr Tyr Val Asp Lys Phe
50                  55                  60
Lys Asn Arg Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Thr Arg Ile Tyr Gly Phe Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  204
<211>  117
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  204
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr
20                  25                  30
Ser Ile Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Ile Ile
35                  40                  45
Gly Arg Ile Asp Pro Lys Asn Gly Arg Thr Tyr Tyr Val Asp Lys Phe
50                  55                  60
Lys Asn Arg Ala Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Thr Arg Ile Tyr Gly Phe Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  205
<211>  117
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  205
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr
20                  25                  30
Ser Ile Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Ile Ile
35                  40                  45
Gly Arg Ile Asp Pro Lys Asn Gly Arg Thr Tyr Tyr Val Asp Lys Phe
50                  55                  60
Lys Asn Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Thr Arg Ile Tyr Gly Phe Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  206
<211>  117
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  206
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr
20                  25                  30
Ser Ile Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Ile Ile
35                  40                  45
Gly Arg Ile Asp Pro Lys Asn Gly Arg Thr Tyr Tyr Val Asp Lys Phe
50                  55                  60
Lys Asn Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ile Tyr Gly Phe Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  207
<211>  117
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  207
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr
20                  25                  30
Ser Ile Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Arg Ile Asp Pro Lys Asn Gly Arg Thr Tyr Tyr Val Asp Lys Phe
50                  55                  60
Lys Asn Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ile Tyr Gly Phe Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  208
<211>  106
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  208
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Gly Ser Gln Asn Val Asn Lys Tyr
20                  25                  30
Leu Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Asn Thr Asp Asn Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Tyr Gln Tyr Asn Asn Gly Phe Thr
85                  90                  95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  209
<211>  106
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  209
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Gly Ser Gln Asn Val Asn Lys Tyr
20                  25                  30
Leu Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Asn Thr Asp Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Tyr Gln Tyr Asn Asn Gly Phe Thr
85                  90                  95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  210
<211>  106
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  210
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Gly Ser Gln Asn Val Asn Lys Tyr
20                  25                  30
Leu Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Asn Thr Asp Asn Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Tyr Gln Tyr Asn Asn Gly Phe Thr
85                  90                  95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  211
<211>  106
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  211
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Gly Ser Gln Asn Val Asn Lys Tyr
20                  25                  30
Leu Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Asn Thr Asp Asn Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Tyr Gln Tyr Asn Asn Gly Phe Thr
85                  90                  95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  212
<211>  106
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  212
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Gly Ser Gln Asn Val Asn Lys Tyr
20                  25                  30
Leu Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Asn Thr Asp Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Tyr Gln Tyr Asn Asn Gly Phe Thr
85                  90                  95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  213
<211>  117
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  213
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr
20                  25                  30
Ser Ile Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Ile Met
35                  40                  45
Gly Arg Ile Asp Pro Lys Asn Gly Arg Thr Tyr Tyr Val Asp Lys Phe
50                  55                  60
Lys Asn Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ile Tyr Gly Phe Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  214
<211>  106
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  214
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Gly Ser Gln Asn Val Asn Lys Tyr
20                  25                  30
Leu Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Asn Thr Asp Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Tyr Gln Tyr Asn Asn Gly Phe Thr
85                  90                  95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  215
<211>  5
<212>  PRT
<213>  Rattus norvegicus
<400>  215
Glu His Ser Ile Tyr
1               5
<210>  216
<211>  17
<212>  PRT
<213>  Rattus norvegicus
<400>  216
Arg Ile Asp Pro Lys Asn Gly Arg Thr Tyr Phe Val Asp Lys Phe Lys
1               5                   10                  15
Asn
<210>  217
<211>  8
<212>  PRT
<213>  Rattus norvegicus
<400>  217
Ile Asp Gly Phe Tyr Phe Asp Phe
1               5
<210>  218
<211>  11
<212>  PRT
<213>  Rattus norvegicus
<400>  218
Lys Gly Ser Gln Asn Val Asn Lys Tyr Leu Val
1               5                   10
<210>  219
<211>  7
<212>  PRT
<213>  Rattus norvegicus
<400>  219
Ser Thr Asp Asn Leu Gln Ser
1               5
<210>  220
<211>  8
<212>  PRT
<213>  Rattus norvegicus
<400>  220
Tyr Gln Tyr Asn Asn Gly Phe Thr
1               5
<210>  221
<211>  30
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (5)..(5)
<223>  Xaa is Gln or Val
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (9)..(9)
<223>  Xaa is Ala or Pro
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (11)..(11)
<223>  Xaa is Leu or Val
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (12)..(12)
<223>  Xaa is Lys or Gln
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (13)..(13)
<223>  Xaa is Lys or Arg
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (20)..(20)
<223>  Xaa is Leu or Val
<400>  221
Glu Val Gln Leu Xaa Gln Ser Gly Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Xaa Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
20                  25                  30
<210>  222
<211>  14
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (2)..(2)
<223>  Xaa is Leu or Val
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (3)..(3)
<223>  Xaa is Lys or Arg
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (5)..(5)
<223>  Xaa is Ala or Arg
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (7)..(7)
<223>  Xaa is Gly or Lys
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (9)..(9)
<223>  Xaa is Arg or Ser
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (12)..(12)
<223>  Xaa is Ile or Trp
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (13)..(13)
<223>  Xaa is Ile or Met
<400>  222
Trp Xaa Xaa Gln Xaa Pro Xaa Gln Xaa Leu Glu Xaa Xaa Gly
1               5                   10
<210>  223
<211>  32
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (2)..(2)
<223>  Xaa is Ala or Val
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (4)..(4)
<223>  Xaa is Ile or Leu
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (6)..(6)
<223>  Xaa is Arg or Thr
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (7)..(7)
<223>  Xaa is Asp or Asn
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (10)..(10)
<223>  Xaa is Ala or Ser
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (11)..(11)
<223>  Xaa is Asn or Ser
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (16)..(16)
<223>  Xaa is Glu or Gln
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (21)..(21)
<223>  Xaa is Arg or Thr
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (27)..(27)
<223>  Xaa is Ile or Val
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (29)..(29)
<223>  Xaa is Phe or Tyr
<400>  223
Arg Xaa Thr Xaa Thr Xaa Xaa Thr Ser Xaa Xaa Thr Ala Tyr Met Xaa
1               5                   10                  15
Leu Ser Ser Leu Xaa Ser Glu Asp Thr Ala Xaa Tyr Xaa Cys Ala Arg
20                  25                  30
<210>  224
<211>  11
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (5)..(5)
<223>  Xaa is Thr or Val
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (6)..(6)
<223>  Xaa is Leu or Met
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (9)..(9)
<223>  Xaa is Ala or Val
<400>  224
Trp Gly Gln Gly Xaa Xaa Val Thr Xaa Ser Ser
1               5                   10
<210>  225
<211>  30
<212>  PRT
<213>  Rattus norvegicus
<400>  225
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Gln Arg Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
20                  25                  30
<210>  226
<211>  14
<212>  PRT
<213>  Rattus norvegicus
<400>  226
Trp Leu Lys Gln Arg Pro Lys Gln Ser Leu Glu Ile Ile Gly
1               5                   10
<210>  227
<211>  32
<212>  PRT
<213>  Rattus norvegicus
<400>  227
Arg Ala Thr Leu Thr Thr Asn Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Met Gln
1               5                   10                  15
Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Arg
20                  25                  30
<210>  228
<211>  11
<212>  PRT
<213>  Rattus norvegicus
<400>  228
Trp Gly Gln Gly Val Met Val Thr Ala Ser Ser
1               5                   10
<210>  229
<211>  30
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  229
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
20                  25                  30
<210>  230
<211>  14
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  230
Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Ile Ile Gly
1               5                   10
<210>  231
<211>  14
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  231
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Ile Ile Gly
1               5                   10
<210>  232
<211>  14
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  232
Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile Gly
1               5                   10
<210>  233
<211>  14
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  233
Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Ile Met Gly
1               5                   10
<210>  234
<211>  14
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  234
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met Gly
1               5                   10
<210>  235
<211>  32
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  235
Arg Ala Thr Leu Thr Thr Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu
1               5                   10                  15
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg
20                  25                  30
<210>  236
<211>  32
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  236
Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu
1               5                   10                  15
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg
20                  25                  30
<210>  237
<211>  32
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  237
Arg Ala Thr Ile Thr Thr Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu
1               5                   10                  15
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg
20                  25                  30
<210>  238
<211>  32
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  238
Arg Ala Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu
1               5                   10                  15
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg
20                  25                  30
<210>  239
<211>  32
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  239
Arg Ala Thr Leu Thr Thr Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu
1               5                   10                  15
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20                  25                  30
<210>  240
<211>  32
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  240
Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu
1               5                   10                  15
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20                  25                  30
<210>  241
<211>  32
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  241
Arg Ala Thr Ile Thr Thr Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu
1               5                   10                  15
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20                  25                  30
<210>  242
<211>  11
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  242
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1               5                   10
<210>  243
<211>  23
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (1)..(1)
<223>  Xaa is Asp or Asn
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (3)..(3)
<223>  Xaa is His or Gln
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (10)..(10)
<223>  Xaa is Phe or Leu
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (21)..(21)
<223>  Xaa is Ile or Leu
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (22)..(22)
<223>  Xaa is Ser or Thr
<400>  243
Xaa Ile Xaa Leu Thr Gln Ser Pro Ser Xaa Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Xaa Xaa Cys
20
<210>  244
<211>  15
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (6)..(6)
<223>  Xaa is Leu or Pro
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (8)..(8)
<223>  Xaa is Glu or Lys
<400>  244
Trp Tyr Gln Gln Lys Xaa Gly Xaa Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1               5                   10                  15
<210>  245
<211>  32
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (2)..(2)
<223>  Xaa is Ile or Val
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (14)..(14)
<223>  Xaa is Asp or Glu
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (15)..(15)
<223>  Xaa is Phe or Tyr
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (27)..(27)
<223>  Xaa is Ala or Phe
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (31)..(31)
<223>  Xaa is Phe or Tyr
<400>  245
Gly Xaa Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Xaa Xaa Thr
1               5                   10                  15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Xaa Ala Thr Tyr Xaa Cys
20                  25                  30
<210>  246
<211>  10
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (3)..(3)
<223>  Xaa is Gln or Ser
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (7)..(7)
<223>  Xaa is Leu or Val
<400>  246
Phe Gly Xaa Gly Thr Lys Xaa Glu Ile Lys
1               5                   10
<210>  247
<211>  23
<212>  PRT
<213>  Rattus norvegicus
<400>  247
Asn Ile His Leu Thr Gln Ser Pro Ser Leu Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Leu Ser Cys
20
<210>  248
<211>  15
<212>  PRT
<213>  Rattus norvegicus
<400>  248
Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1               5                   10                  15
<210>  249
<211>  32
<212>  PRT
<213>  Rattus norvegicus
<400>  249
Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr
1               5                   10                  15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys
20                  25                  30
<210>  250
<211>  10
<212>  PRT
<213>  Rattus norvegicus
<400>  250
Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1               5                   10
<210>  251
<211>  23
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  251
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
20
<210>  252
<211>  15
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  252
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1               5                   10                  15
<210>  253
<211>  32
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  253
Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr
1               5                   10                  15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys
20                  25                  30
<210>  254
<211>  32
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  254
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr
1               5                   10                  15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys
20                  25                  30
<210>  255
<211>  32
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  255
Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr
1               5                   10                  15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys
20                  25                  30
<210>  256
<211>  32
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  256
Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr
1               5                   10                  15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20                  25                  30
<210>  257
<211>  32
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  257
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr
1               5                   10                  15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20                  25                  30
<210>  258
<211>  32
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  258
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr
1               5                   10                  15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20                  25                  30
<210>  259
<211>  10
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  259
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1               5                   10
<210>  260
<211>  117
<212>  PRT
<213>  Rattus norvegicus
<400>  260
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Gln Arg Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu His
20                  25                  30
Ser Ile Tyr Trp Leu Lys Gln Arg Pro Lys Gln Ser Leu Glu Ile Ile
35                  40                  45
Gly Arg Ile Asp Pro Lys Asn Gly Arg Thr Tyr Phe Val Asp Lys Phe
50                  55                  60
Lys Asn Arg Ala Thr Leu Thr Thr Asn Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ile Asp Gly Phe Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Val Met
100                 105                 110
Val Thr Ala Ser Ser
115
<210>  261
<211>  106
<212>  PRT
<213>  Rattus norvegicus
<400>  261
Asn Ile His Leu Thr Gln Ser Pro Ser Leu Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Gly Ser Gln Asn Val Asn Lys Tyr
20                  25                  30
Leu Val Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Ser Thr Asp Asn Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys Tyr Gln Tyr Asn Asn Gly Phe Thr
85                  90                  95
Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105
<210>  262
<211>  117
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  262
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu His
20                  25                  30
Ser Ile Tyr Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Ile Ile
35                  40                  45
Gly Arg Ile Asp Pro Lys Asn Gly Arg Thr Tyr Phe Val Asp Lys Phe
50                  55                  60
Lys Asn Arg Ala Thr Leu Thr Thr Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ile Asp Gly Phe Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  263
<211>  117
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  263
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu His
20                  25                  30
Ser Ile Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Ile Ile
35                  40                  45
Gly Arg Ile Asp Pro Lys Asn Gly Arg Thr Tyr Phe Val Asp Lys Phe
50                  55                  60
Lys Asn Arg Ala Thr Leu Thr Thr Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ile Asp Gly Phe Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  264
<211>  117
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  264
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu His
20                  25                  30
Ser Ile Tyr Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Arg Ile Asp Pro Lys Asn Gly Arg Thr Tyr Phe Val Asp Lys Phe
50                  55                  60
Lys Asn Arg Ala Thr Leu Thr Thr Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ile Asp Gly Phe Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  265
<211>  117
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  265
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu His
20                  25                  30
Ser Ile Tyr Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Ile Met
35                  40                  45
Gly Arg Ile Asp Pro Lys Asn Gly Arg Thr Tyr Phe Val Asp Lys Phe
50                  55                  60
Lys Asn Arg Ala Thr Leu Thr Thr Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ile Asp Gly Phe Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  266
<211>  117
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  266
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu His
20                  25                  30
Ser Ile Tyr Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Ile Ile
35                  40                  45
Gly Arg Ile Asp Pro Lys Asn Gly Arg Thr Tyr Phe Val Asp Lys Phe
50                  55                  60
Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ile Asp Gly Phe Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  267
<211>  117
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  267
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu His
20                  25                  30
Ser Ile Tyr Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Ile Ile
35                  40                  45
Gly Arg Ile Asp Pro Lys Asn Gly Arg Thr Tyr Phe Val Asp Lys Phe
50                  55                  60
Lys Asn Arg Ala Thr Ile Thr Thr Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ile Asp Gly Phe Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  268
<211>  117
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  268
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu His
20                  25                  30
Ser Ile Tyr Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Ile Ile
35                  40                  45
Gly Arg Ile Asp Pro Lys Asn Gly Arg Thr Tyr Phe Val Asp Lys Phe
50                  55                  60
Lys Asn Arg Ala Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ile Asp Gly Phe Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  269
<211>  117
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  269
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu His
20                  25                  30
Ser Ile Tyr Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Ile Ile
35                  40                  45
Gly Arg Ile Asp Pro Lys Asn Gly Arg Thr Tyr Phe Val Asp Lys Phe
50                  55                  60
Lys Asn Arg Ala Thr Leu Thr Thr Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ile Asp Gly Phe Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  270
<211>  117
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  270
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu His
20                  25                  30
Ser Ile Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Arg Ile Asp Pro Lys Asn Gly Arg Thr Tyr Phe Val Asp Lys Phe
50                  55                  60
Lys Asn Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ile Asp Gly Phe Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  271
<211>  106
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  271
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Gly Ser Gln Asn Val Asn Lys Tyr
20                  25                  30
Leu Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Ser Thr Asp Asn Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Tyr Gln Tyr Asn Asn Gly Phe Thr
85                  90                  95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  272
<211>  106
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  272
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Gly Ser Gln Asn Val Asn Lys Tyr
20                  25                  30
Leu Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Ser Thr Asp Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Tyr Gln Tyr Asn Asn Gly Phe Thr
85                  90                  95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  273
<211>  106
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  273
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Gly Ser Gln Asn Val Asn Lys Tyr
20                  25                  30
Leu Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Ser Thr Asp Asn Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Tyr Gln Tyr Asn Asn Gly Phe Thr
85                  90                  95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  274
<211>  106
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  274
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Gly Ser Gln Asn Val Asn Lys Tyr
20                  25                  30
Leu Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Ser Thr Asp Asn Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Tyr Gln Tyr Asn Asn Gly Phe Thr
85                  90                  95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  275
<211>  106
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  275
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Gly Ser Gln Asn Val Asn Lys Tyr
20                  25                  30
Leu Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Ser Thr Asp Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Tyr Gln Tyr Asn Asn Gly Phe Thr
85                  90                  95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  276
<211>  117
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  276
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu His
20                  25                  30
Ser Ile Tyr Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Ile Met
35                  40                  45
Gly Arg Ile Asp Pro Lys Asn Gly Arg Thr Tyr Phe Val Asp Lys Phe
50                  55                  60
Lys Asn Arg Ala Thr Ile Thr Thr Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ile Asp Gly Phe Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  277
<211>  106
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  277
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Gly Ser Gln Asn Val Asn Lys Tyr
20                  25                  30
Leu Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Ser Thr Asp Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Tyr Gln Tyr Asn Asn Gly Phe Thr
85                  90                  95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  278
<211>  5
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  278
Asp Ser Tyr Met Ser
1               5
<210>  279
<211>  5
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  279
Asp Ala Tyr Met Ser
1               5
<210>  280
<211>  5
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  280
Glu Ser Tyr Met Ser
1               5
<210>  281
<211>  17
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  281
Asp Met Tyr Pro Asp Asn Gly Asp Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Arg
1               5                   10                  15
Glu
<210>  282
<211>  17
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  282
Asp Met Tyr Pro Asp Asn Ala Asp Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Arg
1               5                   10                  15
Glu
<210>  283
<211>  17
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  283
Asp Met Tyr Pro Asp Asn Ala Asp Ala Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Arg
1               5                   10                  15
Glu
<210>  284
<211>  17
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  284
Asp Met Tyr Pro Asp Asn Gly Asp Ala Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Arg
1               5                   10                  15
Glu
<210>  285
<211>  17
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  285
Asp Met Tyr Pro Asp Ser Gly Asp Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Arg
1               5                   10                  15
Glu
<210>  286
<211>  17
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  286
Asp Met Tyr Pro Asp Asn Gly Ser Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Arg
1               5                   10                  15
Glu
<210>  287
<211>  8
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  287
Ala Pro Arg Trp Tyr Phe Ser Val
1               5
<210>  288
<211>  8
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  288
Ala Pro Arg Trp Tyr Phe Ser Ala
1               5
<210>  289
<211>  8
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  289
Ala Pro Arg Trp Tyr Phe Ala Val
1               5
<210>  290
<211>  11
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  290
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn
1               5                   10
<210>  291
<211>  7
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  291
Tyr Thr Ser Arg Leu Arg Ser
1               5
<210>  292
<211>  9
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  292
Gln Gln Gly His Thr Leu Pro Pro Thr
1               5
<210>  293
<211>  9
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  293
Gln Gln Gly His Thr Leu Pro Ala Thr
1               5
<210>  294
<211>  9
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  294
Gln Gln Gly His Thr Ala Pro Pro Thr
1               5
<210>  295
<211>  9
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  295
Gln Gln Gly Ala Thr Leu Pro Pro Thr
1               5
<210>  296
<211>  9
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  296
Gln Gln Gly His Ala Leu Pro Pro Thr
1               5
<210>  297
<211>  9
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  297
Gln Gln Ala His Thr Leu Pro Pro Thr
1               5
<210>  298
<211>  9
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  298
Gln Gln Gly His Thr Leu Ala Pro Thr
1               5
<210>  299
<211>  9
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  299
Gln Ala Gly His Thr Leu Pro Pro Thr
1               5
<210>  300
<211>  117
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  300
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Ser
20                  25                  30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Asp Met Tyr Pro Asp Asn Gly Asp Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50                  55                  60
Arg Glu Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Val Leu Ala Pro Arg Trp Tyr Phe Ser Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  301
<211>  117
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  301
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Ser
20                  25                  30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Asp Met Tyr Pro Asp Asn Gly Asp Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50                  55                  60
Arg Glu Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Val Leu Ala Pro Arg Trp Tyr Phe Ser Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  302
<211>  117
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  302
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Ser
20                  25                  30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Asp Met Tyr Pro Asp Asn Gly Asp Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50                  55                  60
Arg Glu Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Val Leu Ala Pro Arg Trp Tyr Phe Ser Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  303
<211>  117
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  303
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Ser
20                  25                  30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Asp Met Tyr Pro Asp Asn Gly Asp Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50                  55                  60
Arg Glu Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Val Leu Ala Pro Arg Trp Tyr Phe Ser Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  304
<211>  117
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  304
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Ser
20                  25                  30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Asp Met Tyr Pro Asp Asn Gly Asp Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50                  55                  60
Arg Glu Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Val Leu Ala Pro Arg Trp Tyr Phe Ser Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  305
<211>  117
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  305
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Ser
20                  25                  30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Asp Met Tyr Pro Asp Asn Gly Asp Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50                  55                  60
Arg Glu Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Val Leu Ala Pro Arg Trp Tyr Phe Ser Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  306
<211>  117
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  306
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Ser
20                  25                  30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Asp Met Tyr Pro Asp Asn Gly Asp Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50                  55                  60
Arg Glu Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Val Leu Ala Pro Arg Trp Tyr Phe Ser Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  307
<211>  117
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  307
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Ala
20                  25                  30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Asp Met Tyr Pro Asp Asn Gly Asp Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50                  55                  60
Arg Glu Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Val Leu Ala Pro Arg Trp Tyr Phe Ser Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  308
<211>  117
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  308
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Ser
20                  25                  30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Asp Met Tyr Pro Asp Asn Gly Asp Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50                  55                  60
Arg Glu Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Val Leu Ala Pro Arg Trp Tyr Phe Ser Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  309
<211>  117
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  309
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Ser
20                  25                  30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Asp Met Tyr Pro Asp Asn Ala Asp Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50                  55                  60
Arg Glu Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Val Leu Ala Pro Arg Trp Tyr Phe Ser Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  310
<211>  117
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  310
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Ser
20                  25                  30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Asp Met Tyr Pro Asp Asn Ala Asp Ala Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50                  55                  60
Arg Glu Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Val Leu Ala Pro Arg Trp Tyr Phe Ser Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  311
<211>  117
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  311
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Ser
20                  25                  30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Asp Met Tyr Pro Asp Asn Gly Asp Ala Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50                  55                  60
Arg Glu Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Val Leu Ala Pro Arg Trp Tyr Phe Ser Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  312
<211>  117
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  312
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Ser
20                  25                  30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Asp Met Tyr Pro Asp Ser Gly Asp Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50                  55                  60
Arg Glu Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Val Leu Ala Pro Arg Trp Tyr Phe Ser Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  313
<211>  117
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  313
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Ser
20                  25                  30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Asp Met Tyr Pro Asp Asn Gly Ser Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50                  55                  60
Arg Glu Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Val Leu Ala Pro Arg Trp Tyr Phe Ser Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  314
<211>  117
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  314
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Ala
20                  25                  30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Asp Met Tyr Pro Asp Asn Ala Asp Ala Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50                  55                  60
Arg Glu Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Val Leu Ala Pro Arg Trp Tyr Phe Ser Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  315
<211>  117
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  315
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Ser
20                  25                  30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Asp Met Tyr Pro Asp Asn Gly Asp Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50                  55                  60
Arg Glu Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Val Leu Ala Pro Arg Trp Tyr Phe Ser Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  316
<211>  117
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  316
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Ser
20                  25                  30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Asp Met Tyr Pro Asp Asn Gly Asp Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50                  55                  60
Arg Glu Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Val Leu Ala Pro Arg Trp Tyr Phe Ser Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  317
<211>  117
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  317
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Ser
20                  25                  30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Asp Met Tyr Pro Asp Asn Gly Asp Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50                  55                  60
Arg Glu Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Val Leu Ala Pro Arg Trp Tyr Phe Ser Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  318
<211>  117
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  318
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Ser
20                  25                  30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Asp Met Tyr Pro Asp Asn Gly Asp Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50                  55                  60
Arg Glu Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Val Leu Ala Pro Arg Trp Tyr Phe Ser Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  319
<211>  117
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  319
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Ser
20                  25                  30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Asp Met Tyr Pro Asp Asn Gly Asp Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50                  55                  60
Arg Glu Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Val Leu Ala Pro Arg Trp Tyr Phe Ser Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  320
<211>  117
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  320
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Ser
20                  25                  30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Asp Met Tyr Pro Asp Asn Gly Asp Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50                  55                  60
Arg Glu Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Val Leu Ala Pro Arg Trp Tyr Phe Ser Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  321
<211>  117
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  321
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Ser
20                  25                  30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Asp Met Tyr Pro Asp Asn Gly Asp Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50                  55                  60
Arg Glu Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Val Leu Ala Pro Arg Trp Tyr Phe Ser Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  322
<211>  117
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  322
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Ser
20                  25                  30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Asp Met Tyr Pro Asp Asn Gly Asp Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50                  55                  60
Arg Glu Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Val Leu Ala Pro Arg Trp Tyr Phe Ser Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  323
<211>  117
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  323
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Ser
20                  25                  30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Asp Met Tyr Pro Asp Asn Gly Asp Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50                  55                  60
Arg Glu Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Val Leu Ala Pro Arg Trp Tyr Phe Ala Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  324
<211>  117
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  324
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Ser
20                  25                  30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Asp Met Tyr Pro Asp Asn Gly Asp Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50                  55                  60
Arg Glu Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Leu Ala Pro Arg Trp Tyr Phe Ser Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  325
<211>  117
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  325
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Ser
20                  25                  30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Asp Met Tyr Pro Asp Asn Gly Asp Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50                  55                  60
Arg Glu Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Val Ala Ala Pro Arg Trp Tyr Phe Ser Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  326
<211>  107
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  326
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Arg Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly His Thr Leu Pro Pro
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  327
<211>  107
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  327
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Arg Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly His Thr Leu Pro Pro
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  328
<211>  107
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  328
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Arg Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly His Thr Leu Pro Pro
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  329
<211>  107
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  329
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Thr Val Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Arg Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly His Thr Leu Pro Pro
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  330
<211>  107
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  330
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Thr Val Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Arg Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly His Thr Leu Pro Pro
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  331
<211>  107
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  331
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Thr Val Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Arg Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Lys Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly His Thr Leu Pro Pro
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  332
<211>  107
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  332
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Thr Val Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Arg Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Lys Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly His Thr Leu Pro Pro
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  333
<211>  107
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  333
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Arg Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly His Thr Leu Pro Pro
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  334
<211>  107
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  334
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Arg Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly His Thr Leu Pro Pro
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  335
<211>  107
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  335
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Arg Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly His Thr Leu Pro Pro
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  336
<211>  107
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  336
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Arg Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly His Thr Leu Pro Pro
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  337
<211>  107
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  337
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Arg Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly His Thr Leu Pro Pro
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  338
<211>  107
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  338
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Arg Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly His Thr Leu Pro Pro
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  339
<211>  107
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  339
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Arg Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly His Thr Leu Pro Pro
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  340
<211>  107
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  340
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Arg Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly His Thr Leu Pro Pro
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  341
<211>  107
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  341
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Arg Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly His Thr Leu Pro Ala
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  342
<211>  107
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  342
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Arg Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly His Thr Ala Pro Pro
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  343
<211>  107
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  343
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Arg Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ala Thr Leu Pro Pro
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  344
<211>  107
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  344
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Arg Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly His Ala Leu Pro Pro
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  345
<211>  107
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  345
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Arg Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala His Thr Leu Pro Pro
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  346
<211>  107
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  346
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Arg Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly His Thr Leu Ala Pro
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  347
<211>  107
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  347
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Arg Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ala Gly His Thr Leu Pro Pro
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  348
<211>  107
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  348
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Arg Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly His Thr Leu Pro Pro
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  349
<211>  107
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  349
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Arg Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly His Thr Leu Pro Pro
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  350
<211>  107
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  350
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Arg Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly His Thr Leu Pro Pro
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  351
<211>  107
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Synthetic Construct
<400>  351
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Arg Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly His Thr Leu Pro Pro
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  352
<211>  244
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  352
Met Arg Trp Cys Leu Leu Leu Ile Trp Ala Gln Gly Leu Arg Gln Ala
1               5                   10                  15
Pro Leu Ala Ser Gly Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn
20                  25                  30
Ile Ser Ala Glu Lys Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser
35                  40                  45
Ser Thr Thr Ala Gln Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln
50                  55                  60
Leu Leu Ala Ile Cys Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser
65                  70                  75                  80
Phe Lys Asp Arg Val Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln
85                  90                  95
Ser Leu Thr Val Asn Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr
100                 105                 110
Tyr Pro Asp Gly Thr Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu
115                 120                 125
Ser Ser Val Ala Glu His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro Leu Leu Gly
130                 135                 140
Ala Met Ala Ala Thr Leu Val Val Ile Cys Thr Ala Val Ile Val Val
145                 150                 155                 160
Val Ala Leu Thr Arg Lys Lys Lys Ala Leu Arg Ile His Ser Val Glu
165                 170                 175
Gly Asp Leu Arg Arg Lys Ser Ala Gly Gln Glu Glu Trp Ser Pro Ser
180                 185                 190
Ala Pro Ser Pro Pro Gly Ser Cys Val Gln Ala Glu Ala Ala Pro Ala
195                 200                 205
Gly Leu Cys Gly Glu Gln Arg Gly Glu Asp Cys Ala Glu Leu His Asp
210                 215                 220
Tyr Phe Asn Val Leu Ser Tyr Arg Ser Leu Gly Asn Cys Ser Phe Phe
225                 230                 235                 240
Thr Glu Thr Gly
<210>  353
<211>  223
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  353
Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn Ile Ser Ala Glu Lys
1               5                   10                  15
Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser Ser Thr Thr Ala Gln
20                  25                  30
Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln Leu Leu Ala Ile Cys
35                  40                  45
Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser Phe Lys Asp Arg Val
50                  55                  60
Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln Ser Leu Thr Val Asn
65                  70                  75                  80
Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr Tyr Pro Asp Gly Thr
85                  90                  95
Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu Ser Ser Val Ala Glu
100                 105                 110
His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro Leu Leu Gly Ala Met Ala Ala Thr
115                 120                 125
Leu Val Val Ile Cys Thr Ala Val Ile Val Val Val Ala Leu Thr Arg
130                 135                 140
Lys Lys Lys Ala Leu Arg Ile His Ser Val Glu Gly Asp Leu Arg Arg
145                 150                 155                 160
Lys Ser Ala Gly Gln Glu Glu Trp Ser Pro Ser Ala Pro Ser Pro Pro
165                 170                 175
Gly Ser Cys Val Gln Ala Glu Ala Ala Pro Ala Gly Leu Cys Gly Glu
180                 185                 190
Gln Arg Gly Glu Asp Cys Ala Glu Leu His Asp Tyr Phe Asn Val Leu
195                 200                 205
Ser Tyr Arg Ser Leu Gly Asn Cys Ser Phe Phe Thr Glu Thr Gly
210                 215                 220
<210>  354
<211>  249
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  354
Leu His Cys Val Gly Asp Thr Tyr Pro Ser Asn Asp Arg Cys Cys His
1               5                   10                  15
Glu Cys Arg Pro Gly Asn Gly Met Val Ser Arg Cys Ser Arg Ser Gln
20                  25                  30
Asn Thr Val Cys Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val
35                  40                  45
Ser Ser Lys Pro Cys Lys Pro Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly
50                  55                  60
Ser Glu Arg Lys Gln Leu Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg
65                  70                  75                  80
Cys Arg Ala Gly Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val Asp
85                  90                  95
Cys Ala Pro Cys Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala
100                 105                 110
Cys Lys Pro Trp Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln
115                 120                 125
Pro Ala Ser Asn Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro
130                 135                 140
Ala Thr Gln Pro Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile Thr
145                 150                 155                 160
Val Gln Pro Thr Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Gly Pro Ser Thr
165                 170                 175
Arg Pro Val Glu Val Pro Gly Gly Arg Ala Val Ala Ala Ile Leu Gly
180                 185                 190
Leu Gly Leu Val Leu Gly Leu Leu Gly Pro Leu Ala Ile Leu Leu Ala
195                 200                 205
Leu Tyr Leu Leu Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys
210                 215                 220
Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala
225                 230                 235                 240
Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys Ile
245
<---