Изучение влияния наночастиц металлов на чувствительность к антибиотикам клинических штаммов микроорганизмов

волокна 1 во внутрь втулки 5. Последнее исключает риск травмирования стенки органа. Перед облучением выходной торец катетера подводится к участку облучения, а оптическое волокно 1 с чувствительным элементом 4 выдвигается из внеосевого канала 7 в окрестность зоны облучения до контакта с биотканью. После облучения оконечный участок оптического волокна с чувствительным элементом перемещается внутрь втулки 5, и катетер выводится из эндоскопа. Измерение температуры биоткани позволяет устранить перегрев биоткани при лазерном облучении. Дополнительное использование в катетере двух и более внеосевых каналов позволяет измерять температуру в нескольких участках биоткани, что исключает возможность перегрева близлежащей к зоне облучения биоткани. В конструкции могут использоваться трубка 2 из фторопласта марки «Tefzel» (наружный диаметр трубки около 5.8 мм), кварц-полимерное оптическое волокно 3 и кварц-кварцевые оптические волокна 1, соответственно, со световедущей жилой диаметром 0.4 мм и 0.1 мм. На оконечный участок торца оптических волокон 1 привариваются термочувствительные элементы 4 из монокристаллического кремния с поперечным размером до 0.12x0.12 мм2. Металлическая втулка 5 имеет осевой канал диаметром 0.75 мм (для размещения выходного участка оптического волокна 3) и внеосевые каналы, расположенные диаметрально противоположно, диаметром около 1.2 мм для размещения термочувствительного элемента 4 оконечного участка оптического волокна 1. Использование чувствительных элементов из кремния обеспечивает регистрацию температуры с точностью измерения ±0.2°С в диапазоне температур 40-110°С [4]. Предлагаемая конструкция катетера с ВОД может функционировать с гастрофиброскопом Olympus GIF-XT30, имеющем операционный канал с диаметром поперечного сечения 6.0. мм.

К настоящему времени ВОД положительно зарекомендовали себя в различных биомедицинских исследованиях. ВОД используются для локальной лазерной гипертермии в онкологии, радиочастотной (и микроволновой) термической абляции и термопластики биоткани, при томографических исследованиях внутренних органов тела человека. В медицинской эндоскопии предложен хирургический инструмент с ВОД давления, инструменты такого рода перспективны для задач микрохирургии. В кардиохирургии и других областях разрабатываются катетеры с ВОД давления, в флебологии возможна апробация ВОД для внутрисосудистого контроля температуры коагуляции вен при варикозе [10-12]. Отдельные разработки ВОД весьма миниатюрны, имеют внешний диаметр рабочей части менее 0.2 мм, что открывает возможность их применения в составе имплантируемых медицинских устройств и миниатюрного инструментария, например, для задач нейрохирургии. Кроме того исследователи могут использовать ряд коммерческих ВОД, как базовую основу для биомедицинского инструмента различного назначения. К клинической апробации ВОД предъявляются определенные требования по дезинфекции (или более жесткие условия по стерилизации инструмента). Например, ВОД температуры «Med FP» (см. табл.) выдерживает однократную 30 минутную стерилизацию (при температуре паров 121°C), следовательно, инструмент является для отдельных назначений одноразовым. Следует также учитывать, что законодательство ограничивает продажу, например, «Med FP» (и других представленных в таблице ВОД) по врачебным требованиям. Производители указывают на отсутствие разрешения на использование ВОД в качестве медицинского инструмента. Таким образом, сертифицирование инструмента и получение разрешения на клиническое применение, является обязанностью заказчика продукции.

Развитие коммерческого рынка и обзор научных публикаций свидетельствуют о росте интереса к применению достаточно миниатюрных ВОД температуры и давления в биомедицинских задачах. Успехи в создании малогабаритных волоконных лазеров и прогресс в новейших оптоволоконных технологиях послужат дальнейшему внедрению как лазеров, так и ВОД в медицинскую практику.

Литература

1. Миков А. А., Свирин В. Н. // Медицинская техника. 2009.-№4.- С. 26

2. Pat. 20080139897 USA. Catheter with optical fiber sensor / Ainsworth R. D. et al.

3. Kesler G. et al. // Journal of Clinical Laser Medicine & Sur-

gery.- 2003.- Vol.21, №4.- P.209-217.

4. Егоров Ф.А. и др. //ВНМТ.- 2005.- №3-4.- С.112.

5. Проспект Opsens. 2010.

6. Проспект Fiso Technologies. Inc. 2010.

7. Проспект LumaSense Technologies. 2010.

8. Пат. РФ 2241211. Датчик температуры и устройство для измерения температуры./ Садовский П.И. и др. //Изобретения. Полезные модели.- 2004.- №12.

9. Пат. на полезную модель 87081. Лазерный катетер с волоконно-оптическим датчиком/ Королев В.А., Потапов В.Т. //Изобретения. Полезные модели.- 2009.- №27.

10. Pat. 20090287092 USA. Temperature compensated strain sensing catheter/ Leo G. et al.

11. Pat. 20020072680 USA. Intra-aortic balloon catheter having a fiberoptic sensor/ Schock R.B. et al.

12. Королев В.А., Потапов В.Т. //ВНМТ.- 2007.- №2.-

С. 140.

FIBER-OPTIC SENSORS TEMPERATURE AND PRESSURE IN BIOMEDICINE

V.A.KOROLYOV, V.T.POTAPOV

Fryazino Branch of Russian Academy of Sciences,

Institute of Radio Engineering and Electronics after V.A. Kotelnikov

The article presents the review of modern commercial fiberoptic sensors of temperature and pressure for possible use in surgery and oncology. r The development of a catheter with a temperature sensor for rapid endoscopy is consided .

Key words: fiber-optic sensors, laser surgery, laser hyper-thermia, endoscopic catheter.

УДК 615. 281 [6:539] - 022.532

ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ НАНОЧАСТИЦ МЕТАЛЛОВ НА

ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ К АНТИБИОТИКАМ КЛИНИЧЕСКИХ ШТАММОВ МИКРООРГАНИЗМОВ

И.В. БАБУШКИНА*, Е.Г.ЧЕБОТАРЕВА**, Е.В. БОРОДУЛИНА**, И.А. МАМОНОВА*, М. САККАЛА**, М. ЭЛЬБУБУ**

В работе изучено влияние наночастиц металлов на антибиотикоре-зистентность и плазмидную ДНК клинических штаммов Pscudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus, выделенных от больных с гнойными осложнениями травматолого-ортопедического стационара. Выявлено восстановление чувствительности к цефтази-диму и влияние на плазмидную ДНК у части штаммов Pscudomonas aeruginosa после воздействия наночастиц меди. Изменений чувствительности ко всем исследуемым антибиотикам у штаммов Staphylo-coccus aureus после воздействия наночастиц меди, железа, цинка и их сплава не выявлено.

Ключевые слова: наночастицы, железо, медь, плазмидная ДНК

Проблема устойчивости микроорганизмов к антибиотикам требует новых подходов к лечению вызванных ими заболеваний. Существуют внутрибольничные штаммы Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus, устойчивые ко всем известным антибиотикам. Вследствие наличия у Ps. aeruginosa многочисленных факторов вирулентности, инфекции, вызываемые этим микроорганизмом, потенциально более опасны, чем вызванные другими условно-патогенными микроорганизмами [1].

В связи с постоянно возрастающим числом гнойных осложнений создание высокоэффективных антибактериальных препаратов является актуальной проблемой современной медицины. Высокий процент инфекционных осложнений у больных, развитие резистентности у микроорганизмов к используемым лекарственным препаратам требуют дальнейшего изучения, разработки и совершенствования методов лечения. Известно также, что мощная антибиотикотерапия способствует снижению специфических и неспецифических факторов резистентности организма, что в свою очередь, может значительно ухудшить течение заболевания [2].

Исследование свойств наночастиц металлов показало их ра-нозаживляющую активность, регенерирующие и бактерицидные свойства, что делает перспективным их использование для лечения гнойно-воспалительных осложнений [3]. Наночастицы меди обладают многосторонним действием на бактериальную клетку.

* ФГУ «СарНИИТО» Минздравсоцразвития РФ

ГОУ ВПО «СГМУ им. В.И.Разумовского» Минздравсоцразвития РФ

В частности установлено, что после обработки клеток медью происходит утечка из них катионов K+. Эти данные свидетельствуют о том, что барьерные свойства мембраны нарушаются при взаимодействии с ионами меди, концентрация которых определяется совокупностью окислительно-восстановительных процессов в примембранном пространстве [4].

Роль R-плазмид в формировании госпитальных штаммов складывается из сообщения им резистентности к антибактериальным препаратам, а также способности повышать резистентность микробной клетки к бактерицидному действию сыворотки крови, что наделяет клетку дополнительными селективными преимуществами [5]. Наночастицы, вследствие своих небольших размеров, могут связываться с нуклеиновыми кислотами, что может быть использовано для целей метаболической и генной инженерии, но и несет в себе риски изменения экспрессии генов, мутагенного и канцерогенного эффектов [6,7]. Воздействие атомов меди на плазмидную ДНК связано с тем, что ионы меди имеют в своей структуре положительно заряженный атом. Возможно возникновение электростатических сил притяжения между отрицательно заряженным сахарофосфатным остовом ДНК и положительным атомом меди. Также вероятно образование хе-латных связей между атомами азота, входящими в имидазольные кольца пуриновых нуклеотидов, расположенных друг под другом в цепи ДНК.

Цель исследования - изучение влияния наночастиц металлов на антибиотикорезистентность и плазмидную ДНК клинических штаммов Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus.

Материалы и методы исследования. В работе использовались нанопорошки железа, меди, цинка и их сплава, полученные плазмохимическим методом (ТУ 173305600209013 - 2008), питательные и транспортные среды, центрифуга лабораторная Eppendorf 5 модели, набор для идентификации неферментирую-щей флоры «NEFERMtest24» и стафилококка «STAPHYtest16» «LACHEMA»; набор для выделения плазмидной ДНК ООО «Ци-токин», диски индикаторные картонные с противомикробными лекарственными средствами ДИ-ПЛС-50-01 для определения чувствительности микроорганизмов (ЗАО «Научно-исследовательский центр фармакотерапии», Санкт-Петербург), микроскоп лабораторный Микрос МС-300. Нанопорошки предоставлены Саратовским плазмохимическим комплексом ФГУП РФ ГНЦ ГНИИ химической технологии элементо-органического синтеза (г. Москва).

Исследования научно-исследовательского института проводились на 30 штаммах Pseudomonas aeruginosa и 30 штаммах Staphylococcus aureus, выделенных от больных, находящимися на лечении в травматолого-ортопедическом стационаре Саратовского травматологии и ортопедии (СарНИИТО).

Определяли чувствительность к профильным антибиотикам диско-диффузионным методом до и после обработки суспензии бактериальных клеток наночастицами железа, меди, цинка и их сплава в концентрации 0, 01 мг/мл в течение 30 минут.

30 изучаемых штаммов Pseudomonas aeruginosa были использованы для экспериментов по выделению плазмидных ДНК по модифицированному методу Бирнбойма-Доли и с использованием набора для выделения плазмидной ДНК ООО «Цитокин». Штаммы, обладающие плазмидной ДНК, обработаны взвесью наночастиц железа, меди, цинка и их сплава в концентрациях, вызывающих бактериостатический эффект, после чего из них повторно была выделена плазмидная ДНК. В контрольной группе была выделена плазмидная ДНК из штаммов, не подвергавшихся воздействию наночастиц.

Электрофорез проводился в горизонтальной камере (в 0,8% агарозном геле). В качестве маркеров молекулярных масс были использованы следующие плазмиды: pUC-19 (1,8МДа), pBR-325 (4МДа), р8А (23МДа), pR-386 (78МДа), pRTSl (120МДа).

Полученный цифровой материал обработан с использованием коэффициента х2-критерия, с помощью которого оценивали различия между эффектами нанопорошков металлов в различных сериях исследования, определяя достоверность полученных результатов по значению р - критического уровня значимости при проверке статистических гипотез.

Результаты и их обсуждение. Изучена чувствительность к профильным антибиотикам у 30 клинических штаммов Pseudomonas aeruginosa. Практически все изученные штаммы были выделены от больных, ранее получавших длительную анти-

биотикотерапию.

Следует отметить низкую чувствительность к антибиотикам штаммов Ps. aeruginosa. Это особенно важно, так как среди всех изученных грамотрицательных микроорганизмов штаммы Ps.aeruginosa составили подавляющее большинство. Кроме того, Ps.aeruginosa является признанным доминирующим возбудителем при госпитальных хирургических инфекциях (гнойные раны, инфекционные осложнения ожоговой травмы и др.). Штаммы отличались полирезистентностью к антибактериальным препаратам: 100% штаммов были устойчивы к гентамицину и цефопера-зону; к амикацину, цефипиму, карбенициллину были чувствительны только 10-30% штаммов, имипенем и меропенем были активны в отношении 50-53% штаммов, к ципрофлоксациму была выявлена чувствительность у 60% штаммов.

Обнаружено изменение чувствительности изучаемых штаммов к цефтазидиму под влиянием наночастиц меди: после обработки наночастицами в концентрации 0, 01 мг/мл в течение 30 минут вдвое увеличилось количество штаммов, чувствительных к этому антибиотику, что является статистически достоверным (p=0,01). После воздействия наночастиц железа, цинка и сплава изменений антибиотикорезистентности у изучаемых штаммов Pseudomonas aeruginosa не выявлено.

Результаты изучения чувствительности к профильным антибиотикам у изучаемых штаммов Pseudomonas aeruginosa представлены в табл. 1.

Таблица 1

Изучение изменения устойчивости к антибиотикам клинических штаммов Ps. aeruginosa после воздействия наночастиц металлов

Антибиотик Количество штаммов, устойчивых к антибиотику

контроль n =30 медь n =30 железо n =30 цинк n =30 сплав n =30

Карбенициллин 21 20 21 19 21

Гентамицин 30 29 30 30 29

Ципрофлоксацин 12 15 12 13 14

Цефтазидим 20 8** 16 20 20

Цефоперазон 30 29 29 30 30

Имипенем 14 12 13 14 14

Меропенем 15 15 14 15 18

Амикацин 27 27 25 27 27

Цефипим 24 23 23 24 22

Примечание: **- уровень достоверности различий показателей по отношению к первой группе (р).

Для всех случаев определено значение коэффициента х2 , показывающего серию разностей между контрольной и опытными группами. Для группы штаммов после воздействия наночастиц меди в случае определения чувствительности к цефтазидиму величина х2 составила 11,7, что соответствует уровню достоверности различий показателей по отношению к контрольной группе р=0,01. Для других групп статистически достоверных изменений чувствительности ко всем исследуемым антибиотикам не выявлено.

Изучена чувствительность к профильным антибиотикам у 30 клинических штаммов Staphylococcus aureus. Все штаммы были выделены от больных с гнойно-воспалительными осложнениями, ранее получавших длительную антибиотикотерапию и были оксациллинрезистентными. Ванкомицин и фузидин были наиболее активными препаратами в отношении стафилококков -77-97% штаммов были чувствительны. Умеренная чувствительность была обнаружена в отношении ко-тримоксазола (47% штаммов) и эритромицина (36% штаммов).

Также было изучено изменение чувствительности к антибиотикам клинических штаммов Staphylococcus aureus после воздействия суспензии наночастиц меди, железа, цинка и их сплава в концентрации 0, 01 мг/мл в течение 30 минут. Для всех случаев определено значение коэффициента х2, показывающего серию разностей между контрольной и опытными группами. Для группы штаммов Staphylococcus aureus после воздействия нано-частиц меди, железа, цинка и их сплава в случае определения чувствительности ко всем антибиотикам уровень достоверности различий показателей по отношению к контрольной группе р>0,05, это свидетельствует о том, что статистически достоверных изменений чувствительности ко всем исследуемым антибиотикам не выявлено.

Результаты изучения чувствительности к профильным антибиотикам у изучаемых штаммов Staphylococcus aureus представлены в табл. 2.

Таблица 2

Изучение изменения устойчивости к антибиотикам клинических штаммов Staphylococcus aureus после воздействия наночастиц металлов

Количество штаммов устойчивых к антибиотику

Антибиотик контроль медь железо цинк сплав

n =30 n =30 n =30 n =30 n =30

Оксациллин 30 30 30 29 30

Ко-тримоксазол 16 15 16 16 16

Эритромицин 19 19 19 18 19

Фузидин 7 8 7 7 7

Клиндамицин 21 20 20 21 20

Ванкомицин 1 2 1 2 2

Для изучения механизма восстановления чувствительности к антибиотикам была изучена плазмидная ДНК штаммов Р.чеы-domonas aeruginosa, которая может нести детерминанты анти-биотикорезистентности. Всего для выделения плазмидной ДНК были взяты 30 штаммов, у 24 из них при электрофоретическом исследовании обнаружены плазмиды различных молекулярных масс. Использовались классический метод щелочного лизиса Бирнбойма-Доли и набор для выделения плазмидной ДНК ООО «Цитокин».

Экспериментальным путем были подобраны концентрации наночастиц, вызывающие снижение КОЕ после высева на плотные питательные среды на 50% для каждого типа наночастиц.

Штаммы, обладающие плазмидной ДНК, обработаны взвесью наночастиц металлов в концентрации 0,01мг/мл, после чего из них повторно была выделена плазмидная ДНК, а также выделение плазмид проведено в контрольной группе, подвергавшейся воздействию изотонического раствора NaCl без наночастиц.

При воздействии наночастицами на штаммы Psеudomonas aeruginosa, содержащие плазмиду массой 40 мДа, у 10 штаммов после обработки наночастицами меди произошла элиминация плазмиды (р=0,01), влияние наночастиц железа и цинка не выявило статистически достоверных изменений в копийности и количестве плазмид, что представлено в табл. 3.

Таблица 3

Элиминация плазмиды 40 мДа под влиянием наночастиц металлов

Плазмида 40 мДа

Штаммы с плазмидой Бесплазмидные штаммы Сумма Элиминация плазмиды в % Статистические показатели

р

1 Изотонический раствор NaCl 18 0 18 0

2 Наночастицы меди 8 10 18 53,0 11,8 0,01

3 Наночастицы железа 16 2 18 10,6 0,04 0,50

4 Наночастицы цинка 17 1 18 5,3 0,02 0,90

Примечание: р — уровень достоверности различий показателей 2, 3, 4 групп по отношению к первой группе.

При воздействии наночастицами меди, железа, цинка на штаммы Psеudomonas aeruginosa, содержащие плазмиду величиной 120 мДа, не было выявлено статистически достоверных изменений в копийности и количестве плазмид.

Выводы.

1. Исследованы изменения чувствительности к антибиотикам клинических штаммов Ps. aeruginosa и St.aureus после воздействия нанопорошков металлов, выявлено восстановление чувствительности к цефтазидиму после воздействия наночастиц меди.

2. В результате проведенных исследований установлено, что среди изученных клинических штаммов распространены штаммы Ps.aeruginosa, обладающие R-плазмидами. Исследование плазмидной ДНК штаммов Pseudomonas aeruginosa, подвергавшихся воздействию наночастиц меди, показало снижение копийности и полную элиминацию плазмид у части штаммов, что может быть причиной восстановления чувствительности к цефа-лоспоринам.

Литература

1. Сидоренко, С.В. Госпитальные инфекции, вызванные Ps. аeruginosa. Распространенность и клиническое значение анти-

биотикорезистентности // Сидоренко С.В., Резван С.П., Стерхова Г.А., Грудинина С.А.// Антибиотики и химиотерапия. .— 1999.-№3.- С. 13-15.

2. Белобородов, В.Б. Актуальные аспекты антимикробной терапии хирургических инфекций / В.Б.Белобородов // Инфекции в хирургии. - 2003.- №1. - С. 28-30.

3. Глущенко, Н.Н. Физико-химические закономерности биологического действия высокодисперсных порошков металлов // Н.Н Глущенко, О.А Богословская, И.П.Ольховская // Химическая физика. - 2002. - Т.21(4). - С.79-85.

4. К механизму токсического действия наночастиц меди на бактерии Escherichia coli // Володина Л.А., Ольховская И.П. // Биофизика. - № 6.- 2009.- С. 1060-1065.

5. Шагинян, И.А. Роль и место молекулярно-генетических методов в эпидемиологическом анализе внутрибольничной инфекции // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия - 2000.-Т.2 - №3.- С.82-95.

6. Сергеев, Г.Б. Нанохимия. Изд-во Московского Университета, 2003, 305 с.

7. Арсентьева, И.П. Аттестация и применение наночастиц металлов в качестве биологически активных препаратов / И. П. Арсентьева, Е.С. Зотова, Г.Э Фолманис [и др.] // Нанотехника. Спец. выпуск «Нанотехнологии-медицине». - 2007. - № 2 (10). -С. 72-77.

STUDYING THE EFFECT OF METAL NANOPARTICLES ON THE

ANTIBIOTIC SUSCEPTIBILITY OF MICROORGANISM CLINICAL CULTURES

I.V.BABUSHKINA, YE.G.CHEBOTAREVA, YE.V.BORODULINA, I.A.MAMONOVA, M. SAKKALA, V.ELBUBU

Saratov Research Institute of Traumatology and Orthopaedy" Saratov State Medical University after V.I. Razumovsky"

The article concerns the effect of metal nanoparticles on the antibiotic resistance and plasmid DNA of such clinical cultures as Psеu-domonas aeruginosa and Staphylococcus aureus, exuded from patients with suppurative complications in a trauma-orthopedic hospital. Restoration of ceftazidime susceptibility and effect on plasmid DNA are detected in some of Psеudomonas aeruginosa cultures after the action of copper nanoparticles.

Susceptibility changes to all the antibiotics under study in Sta-phylococcus aureus cultures after the effect of nanoparticles of copper, iron, zinc and their alloy have not been discovered.

Key words: nanoparticles, iron, copper, plasmid DNA.

УДК 616-009.11-031.4-085:616-009.2

ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА БИОЛОГИЧЕСКОЙ ОБРАТНОЙ СВЯЗИ У БОЛЬНЫХ С СИНДРОМОМ ЦЕНТРАЛЬНОГО ГЕМИПАРЕЗА ПОСТИНСУЛЬТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ С ЦЕЛЬЮ ВОССТАНОВЛЕНИЯ ФУНКЦИИ РАВНОВЕСИЯ И ХОДЬБЫ

В.С. ОНДАР, В.В. НАРОДОВА, А.В. ЛЯПИН*

В статье представлены результаты исследования, посвященного оценке состояния равновесия у больных, перенесших острое нарушение мозгового кровообращения, с синдромом центрального геми-пареза. Оценивалось влияние традиционных методов реабилитации и программ на основе принципа биологической обратной связи на состояние равновесия и функцию ходьбы. Исследование функции ходьбы проводилось с использованием нового диагностического метода анализа ходьбы с использованием лазерного дальномера. Получены данные, подтверждающие необходимость восстановления равновесия при синдроме центрального гемипареза, а так же подтверждают данные о влиянии смещения центра тяжести на основные параметры ходьбы, такие как длина, длительность, асимметрия и равномерность ходьбы.

Ключевые слова: центральный гемипарез, смещение центра тяжести, ходьба, лазерный дальномер, асимметрия шага, вариабельность шага.

В настоящее время в крупных мегаполисах в России за сутки происходит до 120 случаев острого нарушения мозгового кровообращения (ОНМК). Инсульт среди причин смертности в развитых странах находится на втором-третьем месте. В России смерть по причине ОНМК занимает второе место после кардиоваскулярной

* Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Красноярский государственный медицинский университет имени профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации», 660022, г. Красноярск, ул. Партизана Железняка, дом 1.