Проблемы и перспективы развития суперпортативных микроаналитических устройств

УДК 543

Карташова А.А., Левин И.С., Танеева А.В., Новиков В.Ф.

ПРОБЛЕМЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ СУПЕРПОРТАТИВНЫХ

МИКРОАНАЛИТИЧЕСКИХ УСТРОЙСТВ

В представленной статье рассматриваются перспективы и возможности создания и использования в технике микрофлюидных аналитических систем. Даются основные понятия и принципы развития микроаналитических систем, а также описаны реальные практические приложения указанной концепции с использованием хроматографических методов анализа газовых и водных сред. Ключевые слова: микроаналитическая система, микрофлюидный чип, хроматография, аналитические исследования, миниатюризация.

1. Технология создания микроаналитических систем

В последнее время одним из важнейших направлений развития инструментальных методов контроля сырья промышленной и продовольственной продукции, а также объектов окружающей среды является миниатюризация приборов и технических средств химического анализа, включая пробоподготовку. Миниатюризация аппаратуры приводит к принципиальному уменьшению размеров приборов, что способствует их использованию в качестве мобильных или переносных устройств, позволяющих проводить научно-исследовательские работы и в полевых условиях [1]. При этом качество и надежность аналитической информации остаются достаточно высокими.

Второе важное направление развития инструментальных методов контроля заключается в автоматизации процесса, в результате которого происходит перевод особенно трудоемких и длительных этапов анализа в простую автоматизированную форму [2].

Третье направление связано с объединением как можно большего числа стадий анализа, к которым относится пробоотбор, пробоподготов-ка, разделение, концентрирование микропримесей, проведение химической реакции и измерение аналитического сигнала в одном приборе достаточно малого размера [3]. К этому направлению следует отнести и развитие различных тест-систем, например, индикаторных трубок, полунепроницаемых мембран и др.

Следует отметить, что в основном портативные приборы не расширяют возможности физико-химического метода, а только придают ему экспрессность. При этом можно выделить важное научное направление,

заключающееся в совершенно новой области инструментальных методов анализа. Это сверхпортативные микроаналитические устройства, в которых объединяются как миниатюризация и автоматизация приборов, так и возможность химического взаимодействия в микропространстве с получением новых производных [4]. Для изготовления миниатюрных аналитических систем наиболее часто используются тонкие пластины из различных материалов, которые имеют размер, близкий к электронным микросхемам, то есть микрочипам [5].

Перспективы использования таких систем заключаются в следующем [6]: объем дозируемой пробы снижается до 10-10 л, что способствует определению концентраций достаточно малых количеств веществ, вплоть до единичных молекул; за счет снижения расхода реагентов, растворителей и отходов удешевляется процесс анализа; по сравнению с обычными приборами существенно снижается время анализа в результате экспрессной диффузии, смешения реагентов, миграции веществ, нагрева системы и др.; в результате протекания ламинарных процессов при хроматографи-ческом разделении не происходит размывания зон веществ, при этом возрастает воспроизводимость аналитических измерений; для электромиграционных методов обеспечивается использование больших разностей потенциалов, что приводит к высокой скорости разделения компонентов без потери эффективности; небольшие размеры микрофлюидных систем позволяют одновременно применять несколько детекторов, что существенно расширяет диапазон гибридных методов анализа; отличающиеся от стандартных условия экстракционного и сорбционного разделения в микроканалах способствует разработке совершенно уникальных методик анализа и аналитических приборов малого размера.

В настоящее время основным направлением применения микрофлюидных аналитических систем являются иммуноферментные методы анализа, проточно-инжекционный анализ, капиллярный электрофорез, проточная экстракция, ферментативные каталитические методы, а также биохимические исследования. Портативные микрофлюидные системы достаточно часто используют в микрохимической технологии, синтетической химии, а также исследований в области биохимии клетки [7].

Для создания микрофлюидных чипов, как правило, используются современные материалы, которые можно разделить на три основные группы. К первой группе относятся кремний и пластические массы, ко второй - кварц и стекло, к третьей - металлические и керамические мик-

рофлюидные чипы. Кремний и пластмассы используются как стандартные материалы, которые находят практическое применение для решения большого числа микроаналитических задач. Кварц и стекло являются стандартными материалами для создания оптических систем. Наиболее важными являются металлические и керамические микрофлюидные чипы, которые имеют существенные преимущества перед другими материалами, используемыми для их создания [8].

Для получения микрочипов из кремния, кварца и стекла используют химическое травление, глубокое реактивно-ионное травление, электрохимическое травление и микромеханическую обработку поверхности. Наиболее широко применяется метод химического травления, который заключается в обработке не зачищенных областей пластины предполагаемого микрочипа химическими реагентами, обычно в сочетании с термической обработкой. Обработку пластин из кремния осуществляют горячими растворами щелочей. В результате такой обработки монокристалл кремния сохраняет свою кристаллическую решетку, а такой чип травления называется анизотропным [9]. В этом случае наблюдаются совершенно четкие углы образующихся каналов.

Травление аморфных материалов смесью концентрированных кислот обуславливает равномерное вытравливание материала пластины, что приводит к закруглению ее углов и профили каналов становятся полуэллиптическими. Такая обработка материалов называется изотропной. Как правило, перед травлением материала наносят маску, которая соответствует будущим каналам микрофлюидных чипов, а также защищает поверхность. Последняя не должна подвергаться химическому травлению.

При обработке поверхности ионным травлением ее бомбардируют ионами, которые уносят материал пластины. В этом случае формируются каналы любой конфигурации, что способствует созданию капиллярных колонок для газовой хроматографии. При получении готового микрочипа основную пластину спекают и склеивают с покровной. Для получения микрочипов на основе пластмасс применяют формовку, литье в формы, фото полимеризацию под действием ультрафиолетовых источников света, лазерную абляцию. Такая технология изготовления является достаточно простой, что позволяет получать на ее основе одноразовые пластмассовые микрочипы.

Микрочипы, как правило, объединяют определенные стадии химического анализа, реализуемые в микротоке растворителя или газа. Поэто-

му он должен содержать микроаналоги устройств, которые используются в стационарной лаборатории физико-химических методов анализа. Принципиальная схема микрочипа должна включать емкости для реагентов, микрососуды или реакционные спирали, микроколонки или капилляры, а также коммуникации для их соединения с линейными размерами 10-9-10-4 м. Кроме того, в структуру микрочипа могут входить источники напряжения, микроэлектроды, микронасосы и другие устройства [10].

Таким образом, микрофлюидная система объединяет все аналитические стадии анализа, включая пробоподготовку, разделение и детектирование анализируемых компонентов. Эта система включает микрочип с микроканалами, блок создания потоков жидкости или газа, а также управления этими потоками, блок детектирования, интерфейс микрочипа с внешним миром, программное обеспечение.

«Строительные блоки» микрофлюидной системы, их взаимное расположение, размеры и проточные параметры называются топологией микрочипа. Топология микрофлюидных чипов зависит от метода разделения, физико-химических свойств растворителей и их потоков, связи микрочипов с детекторами и внешними устройствами. Обычно микроканалы соединяют основные функциональные блоки системы и, как правило, служат такими блоками. Для уменьшения времени диффузии и снижения объемов жидкости каналы необходимо изготавливать как можно меньших размеров. Существенное снижение размеров каналов может привести к ухудшению параметров электрофоретического разделения и снижению чувствительности детектирования. Поэтому наиболее оптимальные размеры каналовна-ходятся в интервале от 20 до 100 мкм. Обычно прямые каналы в микрочипах служат разделительными системами в проточно-инжекционном анализе или в капиллярном электрофорезе. При заполнении каналов сорбентами можно создать хроматографические колонки или адсорбционные патроны для пробоподготовки анализируемых объектов. Модифицирование поверхности каналов органическими веществами способствует проведению электрофоретического разделения или газохроматографического анализа. Для увеличения длины каналов микрочипов их часто делают в виде плоских спиралей и зигзагов. Достоинство каналов в микрофлюидных системах заключается в том, что сравнительно большие участки их могут служить для оптического детектирования. Поэтому детектирование в микрофлюидных системах возможно по всему разделительному каналу, хромато-графической колонке или реактору.

Так как температурный фактор является определяющим при осуществлении процесса разделения компонентов, то в микрофлюидных системах монтируют различные нагревательные элементы, где в качестве источников теплоты обычно применяют электротермические нагревательные элементы Пельтье, радиаторы и микровентиляторы. В микрофлюидных системах часто используют встроенные электроды, которые представляют собой нити или пластины из инертных или благородных металлов. Кроме того, в микрочипы часто встраивают дозировочные насосы и клапаны. Микрофлюидные чипы должны обладать малой инертностью, так как в случае большой инертности могут образоваться участки развития и постепенной остановки потока, вследствие чего возникают затруднения при контроле аналитических параметров процесса разделения [11].

Для интегрирования в микрочип широко применяют и оптические элементы, т.е. внедрение активной оптики, к которой относятся встроенные источники света и детекторы небольших размеров, а также пассивных оптических систем, представляющих собой планарные волноводы, встроенные микролинзы и различные светофильтры. Начинают широко применяться многоканальные матричные детекторы на основе приборов с зарядовой связью, которые обладают высокой чувствительностью и селективностью.

2. Процессы разделения в микрофлюидных системах

Основные процессы разделения в микрофлюидных системах заключаются в разделении исходных смесей на стадии пробоподготовки, а также с использованием проточных вариантов адсорбции, хроматографии или электромиграционных методов.

Одним из первых аналитических методов, который был реализован на микрочипах, является капиллярный электрофорез, т.е. электрофорети-ческое разделение веществ в капиллярах. Одна из важнейших причин развития этого метода заключается в природе электроосмотического потока, когда реализуется плоский профиль потока жидкости, а также получение небольших объемов инжекции благодаря технологиям производства микрочипов. При этом основное преимущество электрофоретического разделения на микрофлюидных чипах заключается в следующем: сравнительно высокая эффективность разделения компонентов в результате получения плоского профиля жидкостного потока в микроканале; за счет высокого соотношения площади сечения канала разделения к тепловой массе микрочипа - эффективный отвод джоулевой теплоты; высокая вос-

производимость дозировки малых объемов анализируемых проб за счет достаточно точно изготовленных и геометрически выдержанных параметров каналов; за счет малых объемов инжектирования существенное уменьшение времени разделения анализируемых веществ;низкая стоимость микрофлюидного электрофоретического разделения обусловлено возможностью регулирования потоков в микрофлюидной системе без дозировочных насосов.

Современные микрочипы для электрофоретического разделения состоят из каналов ввода пробы в виде инжекционного креста. На микрочипе имеются четыре жидкостных порта или резервуара. К ним относится порт пробы, порт сброса пробы и два порта для разделительного буферного раствора. В этих портах располагаются внешние платиновые микроэлектроды, которые встраивают в микрочип в процессе его изготовления. Управление скоростью потоков и их направлением производится путем приложения разности потенциалов между резервуарами микроканалов рис.1.

Рис.1. Схема микрочипа для проведения электрофоретического разделения

Для управления скоростью потоков можно использовать также и изменение заряда поверхности микроканала под действием потенциала, который приложен поперек него. Такой способ управления потоками характеризуется компактностью и низкой потребляемой мощностью блока питания, малой инерционностью подачи жидкости и высокой точностью

получаемых результатов. С целью параллельного анализа большого числа проб изготавливают мультиканальные микрочипы [12].

Существенное преимущество микрочипового электрофореза от капиллярного заключается в том, что в микрофлюидных устройствах применяют многоканальные системы оптического детектирования, в большинстве случаев используют флюидные матрицы. В этом случае появляется возможность осуществлять непрерывное измерение аналитического сигнала по всей длине разделительного канала в течение всего процесса разделения, что позволяет визуально видеть динамическое развитие элек-трофорограмм и контролировать его стадии.

При дозировке пробы в микрофлюидных чипах большое значение имеет электрокинетическая инжекция анализируемого раствора, т.е. вначале заполняется начальный участок капилляра. При этом электрокинетическое дозирование защищает каналы от проникновения раствора пробы в результате правильного подбора геометрии каналов микрочипа и напряжений на электродах. На микрочипах разработаны разновидности капиллярного электрофореза: капиллярный зонный электрофорез; мицел-лярная электрокинетическая хроматография и изотахофорез.

Большое значение для развития микрофлюидной технологии имеет также проточный анализ, который подразделяется на непрерывный проточный анализ, сегментированный проточный анализ и проточно-инжекционный анализ. Наиболее широкое распространение получил про-точно-инжекционный анализ, который заключается в непрерывной подаче дозировочным насосом реагента и растворителя, в поток которого периодически инжектируют небольшой объем анализируемой жидкой пробы. Для определения примесей пробу концентрируют в проточном реакторе. В потоке после смешивания реагента и определяемого компонента протекает аналитическая реакция. При проточно-инжекционном анализе детектирование разделенных компонентов осуществляется фотометрически. Окрашенные продукты фотометрической реакции пропускают через проточную спектрофотометрическую кювету для детектирования. Реализация такого разделения позволяет проводить большое количество аналитических измерений за сравнительно короткое время, как правило, до 80 анализов в час.

Специфичность проточно-инжекционного анализа заключается также в том, что при постоянной скорости потока время, затрачиваемое на смешение реагентов до детектора, строго фиксировано. Поэтому доста-

точно важной является скорость и эффективность каждой из стадий проточного анализа, смешивания реагентов и аналитической реакции. Как правило, проточный реактор термостатируют при высокой температуре, оптимизируют стадию концентрирования, соотношения скоростей потоков анализируемой пробы, реагентов, детектирующих устройств и др.

В процессе реализации проточно-инжекционного анализа определяют концентрацию одного из компонентов анализируемой смеси с помощью селективной реакции. Для определения нескольких компонентов анализируемой смеси проводят параллельные или последовательные селективные реакции или применяют индикаторные системы, в которых несколько веществ, представителей гомологического ряда, отличаются скоростями химических реакций.

Таким образом, проточно-инжекционный анализ характеризуется автоматизацией большого числа стадий аналитического цикла, стабильностью по времени проведения исследований, взаимосвязью химической составляющей анализа, к которой относится аналитическая система, и ее системой детектирования. При этом практически все элементы проточно-инжекционного анализа достаточно легко изготавливаются на микрофлюидном чипе. В этом случае на микрофлюидном чипе реакция протекает более полно, т.е. возрастает чувствительность определения анализируемых компонентов. Как правило, степень завершения аналитической реакции для проточно-инжекционного анализа в микрофлюидных системах достигается за 20 мс.

Микропроточно-инжекционный анализ позволяет решать самые сложные аналитические задачи, включая определение концентраций тяжелых металлов, сложных органических веществ, лекарственных и допинговых препаратов, наркотиков, пищевых и синтетических красителей, алкогольной продукции, глюкозы, белков, пептидов, сахаридов. Наиболее существенные результаты получены при иммуноферментном анализе, когда применяют прямой анализ крови с определением следовых концентраций компонентов. Другим важным направлением является анализ микроорганизмов. В этом случае реализуется селективная реакция на молекулы определенного вещества с фотометрическим реагентом, а микроорганизмы или их продукты распада - с реагентом, который дает характеристическую окраску. Специальные микрочипы используются также для проведения послеколоночных реакций в жидкостной хроматографии, а также концентрирования примесей и проведении пробоподготовки.

На микрочипах можно реализовать также варианты микрогазовой хроматографии, что оказалось возможным после внедрения технологии сублимации монослоев и плазменного нанесения на поверхность колонок тонких слоев. Начали изготавливать капиллярные колонки на кремниевых пластинах при помощи глубокого реактивного ионного травления кварцевого стекла. Такие капиллярные хроматографические колонки имеют длину 300-800 мкм при диаметре 5-10 мкм. В этом случае процесс хрома-тографического разделения составляет от 0,4 до 1,0 сек.

Таким образом, в результате уменьшения как вихревой, так и продольной диффузии при реализации метода газовой хроматографии на микрочип на несколько порядков уменьшается время анализа, повышается эффективность разделения и воспроизводимость получаемых результатов. Для реализации такой методики анализа необходимо также изготовить детекторы на основе микрочипов. В этом отношении небольшой размер детекторов позволяет изготавливать мультидетекторные системы, а для идентификации анализируемых компонентов подключать микро-хроматографическую систему к масс-спектрометру.

Для реализации системы пробоподготовки на микрочипах можно создать микродозаторы газовых проб. С этой целью используют микромембранные клапаны или импульсные генераторы плазмы, когда при включении источника ионизации генератор плазмы работает как детектор, а при выключении источника ионизации газовый образец попадает в газохроматографическую колонку и детектор. Таким образом, при создании микрочипового газового хроматографа можно проводить полный микроанализ различных сложных органических и неорганических смесей.

Варианты микрочиповой хроматографии можно реализовать также при использовании поликапиллярныххроматографических колонок, представляющих собой монолитные стеклянные стержни, пронизанные тонкими параллельными капиллярами, упакованными в гексагональную структуру, внутренняя поверхность которых изнутри покрыта тонкой пленкой неподвижной фазы. Большое количество капилляров в поликапиллярной колонке способствует разделению сравнительно большого объема анализируемой пробы, а малый диаметр капилляров и небольшая длина колонки дают возможность проводить экспрессное разделение и, кроме всего прочего, обеспечивает высокую чувствительность газохрома-тографического анализа. Коммерческие поликапиллярные колонки позволяют проводить аналитическое разделение широкой фракции органи-

ческих смесей за время, не превышающее 20 секунд, с эффективностью до 15000 теоретических тарелок на метр колонки.

Поликапиллярные колонки выпускаются прямыми, длиной от 40 до 250 мм, и спиральными. Диаметр колонок составляет 2 мм, диаметр капилляров от 20 до 80 мкм, число капилляров достигает 1500. Достоинства поликапиллярных колонок заключаются в следующем: газохроматогра-фический анализ протекает в десятки раз быстрее в режиме скоростной хроматографии; высокая эффективность хроматографического разделения в широком диапазоне скоростей газа-носителя; хорошая совместимость со стандартной газохроматографической аппаратурой; разделение анализируемой пробы, возможно, проводить при более низких температурных условиях; повышенная чувствительность хроматографического анализа при разделении микропримесей; возможность работы при большом расходе газа-носителя при умеренном давлении на входе в поликапиллярную хроматографическую колонку.

На микрочипах можно создавать также и варианты микрожидкостной хроматографии. В отличии от газовой хроматографии, жидкостная предъявляет повышенные требования к плотности и воспроизводимости набивной колонки. Поэтому наиболее широко применяется жидкостная хроматография на микрочипах в открытых колонках, которые используют в режиме обращено-фазовой хроматографии или для микропрепаративной хроматографии.

Интересным вариантом реализации хроматографического анализа на микрофлюидных чипах является создание монолитных колонок, в которых неподвижная фаза является частью самой колонки. В этом случае достигается равномерность «элементов» неподвижной фазы, а также одинаковость капилляров между ними, по которым протекает подвижная фаза. Это позволяет разделять с очень высокой экспрессностью и высокой эффективностью смеси сложных органических соединений, таких как аминокислоты, пептиды, белки и др.

Можно также использовать различные электромиграционные хро-матографические методы, например, электрохроматография, мицеллярная электрокинетическая хроматография и др. Такие варианты хроматогра-фического анализа применяются для определения наркотиков, например, амфетаминов, кокаина, героина. В этом случае используется мицеллярная электрохроматография на микрофлюидных чипах с монолитными колонками и флуоресцентным детектированием.

Таким образом, с использованием чипов представляет возможным реализовать микросистемы полного химического анализа в аналитической химии. Проведение полного цикла химического анализа в микроаналитических системах можно рассматривать как одно из наиболее важных преимуществ, так как эта система представляет собой полностью функциональный аналитический прибор размером в несколько сантиметров или микрофлюидную систему, в которой реализованы все основные ступени химического анализа, включая отбор пробы, ее концентрирование и разделение, проведение аналитической реакции и детектирование. Применение системы полого химического анализа, реализованного на микрофлюидных чипах, способствует интегрированию аналитических методик в компактный прибор, который способен анализировать большое количество образцов за сравнительно короткое время.

Источники

1. Львов Н.В., Василенко И.А., Гольдштрах М.А. и др. Аналитическая химия и физико-химические методы анализа (Химические технологии). Т.2. Под. ред. А.А.Ищенко. М.: Издательский центр «Академия», 2010. 416 с.

2. Li P.C.H. Microfluidic Lab-on-a-Chip for chemical and biological analysis and discovery / P.C.H. Li-London: CRC. 2006.

3. Chakzabarty K. F.S. Digital microfluidic biochips: synthesis, testing and reconfiguration techniques. London: CRC, 2006.

4. Буляница А.Л. Математическое моделирование в микрофлюидике: основные положения // Научное приборостроение. 2005. Т.15. №2. С. 51-66.

5. Проскурин М.А. и др. Демонстрация возможности определения низкомолекулярных веществ на приборе для электрофореза на микрочипах ShimadzuMCE-2010 // Научное приборостроение. 2005. Т.15. №2. С.5-10.

6. Сляднев и др. Микрочиповаямультиреакторная система для биохимического анализа // Научное приборостроение. 2005. Т.15. №3. 42 с.

7. Kutter I.P., Fintschenko Y. Separation methods in microanalytical systems // London: CRC. 2005.

8. Поздняков А.О., Евстрапов А.А., Лишевич И.В. Микрофлюидные устройства с точки зрения технологии полимерных композитов // Научное приборостроение. 2005. Т.15. №1.С.67-71.

9. Проскурин М.А. и др. Сравнение возможностей термолинзового детектирования в капиллярах и микрофлюидных чипах // Журнал аналитической химии. 2004. Т.59. №9.С.923-928.

10. Mogensen K.B., Klan K.H., Kutter I.P. Recent developments in detection for microfluide systems // Electrophoresis. 2004. V.25. №21-22.Р.3498-3512.

11. Vilkher T., Janasek D., Manz A. Micro total analysis systems. Recentdevelopments // Anal. Chem. 2004. V.76.№12.P.3373-3386.

12. Лучинин В.В., Крапивина Е.В. Конструкторско-технологические основы жидкостных аналити-ко-технологических микросистем // Датчики и системы. 2002. Т.9.С.17-23.

Зарегистрирована 14.10.2011 г.