СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ХИТИНА ИЗ ЛИЧИНОК ЧЕРНОЙ ЛЬВИНКИ HERMETIA ILLUCENS
METHOD OF OBTAINING CHITIN FROM HERMETIA ILLUCENS BLACK SOLDIER FLY LAVRAE

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения высокомолекулярного хитина.
На сегодняшний день в мире активно развивается технология по переработке пищевых отходов и органических отходов сельского хозяйства с помощью личинок мух черная львинка Hermetia illucens. Лидерами в этом направлении являются Китай, США, Канада, Нидерланды, ЮАР, причем количество ежегодно перерабатываемых отходов уже составляет сотни тысяч тонн. В последние несколько лет в мировой практике освоено крупнотоннажное промышленное получение личинок с соответствующим масштабным получением продуктов переработки биомассы личинок. В настоящее время эта технология стала развиваться и в России. Помимо кормового белка и биоудобрения насекомые (в различных стадиях онтогенеза) являются источником сырья для получения хитина и хитин-меланинового комплекса.
Известен способ получения хитина из личинок насекомых [Р.В. Уланова и И.К. Кравченко «Способ получения хитина», Патент РФ №2526936, 27.11.2012]. Согласно данному способу измельченную биомассу личинок насекомых заливают 0,01-1,0% раствором щелочи в соотношении 1:1-1:8 и перемешивают в течение 5-30 минут при температуре 25-100°С. После инокуляции молочнокислыми бактериями ферментируют от 1,5 до 7,0 часов в стационарных условиях при температуре 25-45°С. Затем хитин отделяют, промывают водой и проводят дополнительную деминерализацию раствором кислоты. В конце, раствор кислоты удаляют, а хитин промывают и высушивают.
Существует способ получения хитина [С.И. Шыш и Г.В. Винокурова «Способ получения хитина и способ получения хитозана», Патент РФ №2139887, 15.03.1999], включающий культивацию синантропных мух с последующим использованием мух и/или форм их постадийного развития в качестве хитинсодержащего сырья. Данный способ отличается тем, что из вышеуказанного хитинсодержащего сырья выделяют хитинсодержащую фракцию и обрабатывают ее 1,5-5,0% раствором сильной неорганической кислоты в течение 1,5-2,0 ч при перемешивании, температуре 18-30°С и в соотношении твердой и жидкой фаз 1: (3-4). Твердую фазу отмывают водой, проводят последующую обработку отмытой твердой фазы 2,0-5,0% раствором щелочи в течение 1,5-3,0 ч при перемешивании, температуре 90-100°С, в соотношении твердой и жидкой фаз 1: (3-5) и исключении контакта реакционной среды с воздухом. Затем осадок последовательно отмывают гидрофильным и гидрофобным растворителем и сушат при температуре 18-30°С.
Наиболее близким к заявляемому является способ получения хитина из куколок и имаго черной львинки [A. Wasko et al. The first report of the physicochemical structure of chitin isolated from Hermetia illucens, International Journal of Biological Macromolecules, 92, 2016, 316-320]. В данной работе стадия деминерализации была проведена на измельченном сырье с использованием 1М раствора HCl в течение 1 часа. Последующее депротеинирование проводили в 1М растворе NaOH при 80°С в течение 24 часов.
4
Используемое в данной работе хитин-содержащее сырье является сильно пигментированным и часть меланинов ковалентно связано с хитином. Поэтому была добавлена стадия обесцвечивания, которая проводилась в присутствии 1%-го раствора KMnO. Однако такая обработка не позволяет удалить весь меланин. Кроме того в работе не проводилось обезжиривание и не определялись возможные примеси в полученном хитине (белок, липиды, меланин). Степень ацетилирования полученных образцов хитина, рассчитанная по эмпирической формуле на основе данных элементного анализа составляла 250 и 179%% при теоретически максимально возможных 100%, что говорит о наличии в них примесей нехитиновой природы.
Таким образом, все известные способы получения хитина из личинок черной львинки Hermetia illucens направлены на последовательное удаление примесных компонентов из хитин-содержащего сырья. Такой подход является многостадийным и не гарантирует получения чистого продукта.
С целью преодоления перечисленных недостатков предлагается для получения хитина использование непосредственной экстракции целевого продукта.
Сущность получения хитина из личинок черной львинки Hermetia illucens заключается в том, что берут 200-300 г личинок черной львинки 5/6-го возраста, заливают 0,7-1,0 л кипящей воды на 2-3 мин. Затем обездвиженные личинки подвергают обработке на маслопрессе и получают твердый остаток. К 30 - 50 г твердого остатка добавляют 150-200 мл (в соотношении 4-5 мл/г) 85% фосфорной кислоты, тщательно перемешивают и оставляют на 16-20 ч при комнатной температуре. Полученную суспензию фильтруют под вакуумом через стеклянный пористый фильтр №1 и промывают 70 - 100 мл 40% фосфорной кислоты. Объединенный фильтрат разбавляют 2,5-3,0 л воды при интенсивном перемешивании. Выпавший осадок хитина в фильтрате отмывают водой методом декантации до рН 5,5-6,0 и лиофильно высушивается. Получают аморфный хитин.
Технический результат достигается путем исключения многочисленных стадий очистки при получении хитина, таких как обезжиривание, депротеинирование, деминерализация, обесцвечивание, а кроме того в снижении степени кристалличности получаемого продукта, что увеличивает его стерическую доступность, и, как следствие, повышает биологическую активность хитина.
Известно, что хитин растворим в концентрированных минеральных кислотах, таких как: соляная, серная, фосфорная и т.п. Однако это свойство биополимера ранее не применялось для его выделения. Для получения хитина использовали фосфорную кислоту, т.к. она, в отличие от соляной и серной, практически не гидролизует хитин в процессе его получения. Предлагаемый способ получения хитина не требует стадии обезжиривания, которая осуществляется обработкой сырья органическими растворителями или раствором щелочи при высокой температуре. Кроме того, хитин, получаемый через стадию растворения, является не кристаллическим, а аморфным. На основе такого хитина можно получать коллоидные растворы, используемые, например, в качестве субстрата при определении хитиназной активности ферментов.
Полученный продукт представляет собой белый или светло-кремовый порошок, нерастворимый в воде, нетоксичный. Оставшиеся после экстракции хитина фрагменты оболочек личинок после отмывки или нейтрализации фосфорной кислоты могут быть использованы в качестве кормовой добавки, а нейтрализованная фосфорная кислота в качестве удобрения.
Чистота получаемого хитина подтверждается данными элементного анализа, ИК-спектроскопии и титрованием свободных аминогрупп в сравнении с аналогичными параметрами, определенными у «эталонного» хитина из панциря креветок («Sigma», США).
Пример 1.
300 г личинок черной львинки Hermetia illucens 5/6-го возраста заливают 1 л кипящей воды на 2-3 мин. Затем обездвиженные личинки подвергают обработке на маслопрессе. Получают 50 г твердого остатка с влажностью 55%, содержащего 5% жира, 4% золы, 7% хитина. К твердому остатку добавляю 200 мл 85% фосфорной кислоты, тщательно перемешивают и оставляли на 16 часов при комнатной температуре. Полученную суспензию фильтруют под вакуумом через стеклянный пористый фильтр №1 и промывают 100 мл 40% фосфорной кислоты. Объединенный фильтрат разбавляют 3,0 л воды при интенсивном перемешивании. Выпавший осадок хитина в фильтрате отмывают водой методом декантации до рН 5,5-6,0 и лиофильно высушивали. Получают 2,75 г аморфного хитина. Пример 2.
Аналогично примеру 1. К 50 г твердого остатка добавляют 150 мл 85% фосфорной кислоты, тщательно перемешивают и оставляют на 16 часов при комнатной температуре. Затем полученную суспензию фильтруют под вакуумом через стеклянный пористый фильтр №1 и промывают 100 мл 40% фосфорной кислоты. Объединенный фильтрат разбавляют 2,5 л воды при интенсивном перемешивании. Выпавший осадок хитина в фильтрате отмывают водой методом декантации до рН 5,5-6,0 и лиофильно высушивают. Получают 2,45 г аморфного хитина.
Пример 3.
200 г личинок черной львинки Hermetia illucens 5/6-го возраста заливают 0,7 л кипящей воды на 2- мин. Затем обездвиженные личинки подвергают обработке на маслопрессе. Получают 30 г твердого остатка с влажностью 55%, содержащего 5% жира, 4% золы, 7% хитина. К твердому остатку добавляю 150 мл 85% фосфорной кислоты, тщательно перемешивают и оставляют на 16 часов при комнатной температуре. Полученную суспензию фильтруют под вакуумом через стеклянный пористый фильтр №1 и промывают 70 мл 40% фосфорной кислоты. Объединенный фильтрат разбавляют 2,5 л воды при интенсивном перемешивании. Выпавший осадок хитина в фильтрате отмывают водой методом декантации до рН 5,5-6,0 и лиофильно высушивают. Получают 1,75 г аморфного хитина.