Экспериментальные и клинические исследования стафилокиназы и Фортелизина®

ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальные и клинические исследования стафилокиназы и Фортелизина

Вышлов Е.В.1' 2, Алексеева Я.В.1, Герасимец Е.А.3, Марков В.А.1 2

1 НИИ кардиологии ФГБНУ «Томский национальный исследовательский медицинский центр» РАН

2 ФГБОУ ВО «Сибирский государственный медицинский университет» Минздрава России, Томск

3 ФГАОУ ВО «Российский университет дружбы народов», Москва

В статье представлены экспериментальные и пилотные клинические исследования стафилокиназы - наиболее фибринселективного тромболитика. Показаны высокая эффективность и безопасность болюсно-инфузи-онного применения стафилокиназы по сравнению с Актилизе у больных с инфарктом миокарда с подъемом сегмента ST (ОИМпST). Вместе с тем авторы наблюдали появление нейтрализующих антистафилокиназных антител в высоких титрах, что не позволяло вводить препарат повторно. Представлены результаты клинического применения генно-модифицированной неимуногенной стафилокиназы - препарата Фортелизин. Как и стафилоки-наза, Фортелизин обладает самой высокой фибринселективностью среди всех тромболитиков, что позволило применять меньшие дозы препарата (15 мг) и достичь высоких значений коронарной реперфузии. При введении Фортелизина не образовывались нейтрализующие антитела. Результаты 4-летнего мониторинга применения препарата Фортелизин, охватившего 4123 пациентов с ОИМпST, показали его высокую эффективность, безопасность и удобство применения.

Ключевые слова:

инфаркт миокарда, острый коронарный синдром с подъемом сегмента БТ, тромболизис, Фортелизин

Experimental and clinical studies of staphylokinase and Fortelyzin

Vishlov E.V.1 2, Alekseeva Ya.V.1, Gerasimets Е.А.3, Markov V.A.1 2

1 Cardiology Research Institute, Tomsk National Research Medical Center of the Russian Academy of Sciences

2 Siberian State Medical University, Tomsk

3 Peoples Friendship University of Russia, Moscow

The article presents experimental and pilot clinical studies of staphylokinase as the most fibrin-selective thrombolytic. It was shown a high efficacy and safety of bolus-infusion usage of staphylokinase compared to Actilyse in patients with myocardial infarction with S7~-segment elevation (5TEMI). However, the authors observed the appearance of anti-staphylokinase neutralizing antibodies in high titers, which was not allowed to use the thrombolytic agent again. The article presents the results of the clinical application of genetically modified nonimmunogenic staphylokinase - thrombolytic agent Fortelyzin. As a staphylokinase, Fortelyzin has the highest fibrin-selectivity among all the thrombolytics, which allowes to use the smaller doses of the agent (15 mg) and to obtain high values of coronary reperfusion. After the usage of Fortelyzin the neutralizing antistaphylokinase antibodies didn»t appear. The results of the 4-year monitoring of the Fortelyzin, covering 4123 patients with STEMI showed its high efficacy, safety and a simple way of usage.

Keywords:

myocardial infarction, acute coronary syndrome with ST segment elevation, thrombolysis, Fortelyzin

Тромболитический потенциал стафилокиназы был выявлен в 1964 г.: этот тромболитик сначала испытывали в двух сериях экспериментов на собаках [1]. Собакам вводили стафилокиназу в бедренную артерию системно и внутриартериально. Результаты проведенных экспериментов обескуражили, так как препарат показал себя как тромболитик, вызывающий полную деградацию фибриногена и сильные кровотечения.

При ретроспективном анализе результатов исследования было обнаружено, что фибринолитическая система собак и человека по-разному реагирует на введение стафилокиназы. Оказалось, что низкая фибринселектив-ность тромболитика у собак обусловлена замедленным ингибированием а2-антиплазмином плазмин-стафило-киназного комплекса. Таким образом, выбор плазмы собак для первоначальной оценки стафилокиназы in vivo

привел к ошибочному выводу о неперспективности этого тромболитика [2].

Ошибочность изначальных заключений об эффективности и безопасности стафилокиназы в последующем подтвердили эксперименты, проведенные на хомяках и бабуинах [1, 2]. В опыте на хомяках проводилось сравнительное исследование стафилокиназы и стрептоки-назы на модели легочной тромбоэмболии. Животные были поделены на 3 группы: 1-й группе вводили тромбы из человеческой плазмы, обедненной тромбоцитами, 2-й группе - тромбы, богатые тромбоцитами (3х105 тромбо-цитов/ммоль), 3-й группе - тромбы, насыщенные тромбоцитами (1,5х106 тромбоцитов/ммоль). При определении тромболитической активности стафилокиназа и стреп-токиназа показали относительно сопоставимые результаты в группах с тромбами с обедненными и богатыми тромбоцитами. Однако в 3-й группе хомяков, где тромбы состояли из человеческой плазмы, насыщенной тромбоцитами, эффективность стафилокиназы оказалась в 5 раз выше по сравнению со стрептокиназой. У бабуинов внутривенное введение как стрептокиназы, так и стафилокиназы вызывало одинаковый дозозависимый фибрин-селективный лизис фибрина, меченного аутологическими тромбоцитами, но при применении стафилокиназы река-нализация на модели богатого тромбоцитами артериального тромба достигалась чаще и более продолжительное время, чем при стрептокиназе.

Среди тромболитиков III поколения (алтеплаза, тенек-теплаза, стафилокиназа), по мнению одного из ведущих

кардиологов Европы M. Verstraete, наиболее фибринсе-лективным является стафилокиназа [3]. Этого же мнения придерживаются и другие исследователи [4], а D. Collen называет стафилокиназу уникальным фибринселектив-ным тромболитиком [1]. Механизм действия фибрин-селективного тромболитика основано на связывании только с тем фибрин-фибриногеном, который находится на тромбе, и игнорировании фибриногена, находящегося в системном кровотоке, что не приводит к массивным кровотечениям. В противоположность этому фибрин-неселективный тромболитик, например стрептокиназа, связывается как с фибрин-фибриногеном, находящимся на тромбе, так и с циркулирующим фибриногеном, приводя к массивным кровотечениям. Фибринселектив-ность тромболитика обусловливает и его дозозависимый клинический эффект. По данным M. Verstraete, доза умеренно селективного тромболитика алтеплазы равна 100 мг, селективного тромболитика тенектеплаза - 50 мг, а наиболее селективного тромболитика стафилокиназы -15-20 мг [3]. В рандомизированных сравнительных исследованиях стафилокиназа vs алтеплаза в виде болюс-но-инфузионного способа введения у больных острым инфарктом миокарда с подъемом сегмента ST (ИМп5Г) было показано преимущество стафилокиназы по эффективности (частота коронарной реперфузии) и безопасности (наличие кровотечений и минимальное снижение фибриногена крови, плазминогена, а2-антиплазмина) (см. рисунок) [5, 6]. Основным недостатком стафилокиназы, применявшейся в этих исследованиях, было обра-

6 -

4 -

2 -

10

100 log, мин

1000 10000

10

100 log, мин

1000 10000

120 ^ 100 £ 80 мин 60

СО

100

СО

о 60 о

СО

о

Л 40 м

О

5 20 1=

0

10

100 log, мин

1000 10000

10

100 log, мин

1000 10000

Сравнение показателей фибринолиза и коагуляции (фибриноген, плазминоген, а2-антиплазмин и протромбиновое время) у пациентов, получавших стафилокиназу (о) и алтеплазу (); * - р<0,000001

0

зование нейтрализующих антистафилокиназных антител, что не позволяло вводить ее повторно.

Появление нейтрализующих антистафилокиназных антител было ожидаемо. Ген стафилокиназы был клонирован из бактериофагов sakéC и sak42D [7], a также из геномной ДНК (sakSTAR) лизогенного штамма Staphylococcus aureus. Экспрессию гена проводили под контролем промотора ÀPR и его трансляционных сигналов в Escherichia coli. Стафилокиназный ген кодирует белок из 163 аминокислот с аминокислотой 28, соответствующей NН2-концевому остатку зрелой стафилокиназы полной длины [2, 8]. Таким образом, применение стафилокиназы, подобно стрепто-киназе, необходимо ограничивать единственным введением. С учетом того, что уровни уже сформированных антистафилокиназных антител в общей популяции ниже, чем антистрептокиназных, в проведенных исследованиях введение стафилокиназы не вызывало развития аллергических реакций. Однако у большинства пациентов через

2 нед после введения препарата выявляли нейтрализующие антистафилокиназные IgG, которые сохранялись на протяжении 2 мес. В связи с этим следует избегать повторного применения стафилокиназы со 2-й недели после первого введения. Пациенты с высокими титрами антител не только невосприимчивы к тромболитическому действию препарата, но и подвержены высокому риску развития аллергических реакций, в том числе анафилактического шока.

Именно иммуногенность стафилокиназы препятствовала ее широкому применению. В связи с этим стали использовать генную инженерию для снижение иммунно-генности препарата. Было выявлено, что стафилокиназа дикого типа (sakSTAR) состоит из 3 иммунодоминантных эпитопов, и с помощью специфичного сайт-направленного мутагенеза две антигенных детерминанты могут быть убраны без снижения фибринолитической активности.

В ходе проведенных экспериментов было получено несколько модификаций стафилокиназы дикого типа. Так, D. Collen с группой ученых создали 21 производную молекулы нативной стафилокиназы. Некоторые из них были неактивными, другие реагировали с панелью моно-клональных антител, как и нативная стафилокиназа. Все

3 производных оказывали тромболитический эффект, но слабо реагировали с панелью антител [9].

Параллельно этим исследованиям L. Moons создал мутантную полиэтиленгликолевую молекулу с заменой аминокислоты цистеина на серин в кластере 3, сокращенное название молекулы - SY 161-P5 [10]. Таким образом, исследователям удалось увеличить период полувыведения молекулы, чтобы можно было назначать исследуемый препарат однократным болюсом. Но при испытаниях этого препарата на крысах, мышах, хомяках и кроликах был обнаружен кардиотоксический эффект. При секционном исследовании у животных выявляли миокардит с умеренной или минимальной активностью. Хотя в выводах исследователи указали, что мутантная стафилокиназа по кардиотоксичности аналогична нативной стафилоки-назе и стрептокиназе, больше в литературе не найдено описаний последующих исследований SY 161-P5.

Фортелизин - отечественный фибринселективный тромболитик. В 2012 г. Минздрав РФ зарегистрировал оригинальный тромболитический препарат Фортелизин (ЛП-001941 от 18.12.2012) для лечения больных ИМп57\ Фортелизин - это рекомбинантный белок E. coli, полученный по генно-инженерной технологии и содержащий аминокислотную последовательность неиммуногенной стафилокиназы. Для его создания был сконструирован ген Sak7-457, получена сначала рекомбинантная плаз-мида pZT11, несущая этот ген под контролем промотора бактериофага Т5, а затем синтезирован штамм-продуцент неиммуногенной стафилокиназы Sak7-457 (E. coli MZ09) с заменой аминокислот в иммунодоминантном эпитопе белка.

Были разработаны инновационные способы хрома-тографической очистки лекарственной субстанции Фор-теплазе на СМ- и DEAE-сефарозах и на G-25-сефадексе. Создан оригинальный состав вспомогательных веществ для получения готовой лекарственной формы, отработаны промышленные технологии лиофильной сушки, позволяющие сохранять фибринолитическую активность препарата Фортелизин на протяжении всего 3-летнего срока годности.

Проект создания инновационного отечественного лекарственного препарата Фортелизин осуществлялся с участием ведущих медицинских и научных центров (МГУ им. М.В. Ломоносова, Первого МГМУ им. И.М. Сеченова, РУДН, НИИ кардиологии СО РАМН и др.) и занял более 12 лет [11, 12]. При разработке субстанции и лекарственной формы препарата Фортелизин были учтены требования Российской, Британской, Европейской и Американской фармакопей.

Доклинические и клинические исследования препарата Фортелизин проходили в ведущих кардиологических клиниках и региональных сосудистых центрах России и показали, что восстановление коронарного кровотока, по данным ангиографии, происходит не менее чем в 80% (критерии TIMI 2-3), по данным электрокардиографии (снижение сегмента ST) - не менее чем в 85% случаев. Отмечена незначительная доля малых кровотечений из мест пункций, геморрагических инсультов не было, что, по-видимому, обусловлено минимальным снижением циркулирующего фибриногена (7%). Такое незначительное снижение фибриногена при введении Фортелизина подтверждает предыдущие исследования стафилокиназы как самого фибринселективного среди всех существующих тромболитиков. Подробно результаты доклинического и клинических исследований Фортелизина были опубликованы ранее [13, 14].

Производство лекарственного препарата Фортелизин осуществляется в соответствии с действующими в РФ нормативными актами и правилами Good Manufactured Practice (Лицензия № 00204-ЛС от 08.06.2016).

Мониторинг эффективности и безопасности препарата Фортелизин осуществляется постоянно, с июня 2013 по март 2017 г. он охватил 4123 больных с ИМпST. Средний возраст больных, которым вводился Фортелизин, составил 64 года, старше 75 лет было 610 человек, мужчины со-

ставили 72% от общего числа больных. По локализации патологии преобладал передний инфаркт миокарда (табл. 1).

Время от начала симптомов инфаркта миокарда до введения препарата Фортелизин составило 206 мин. Признаки реперфузии миокарда, по данным ЭКГ, к 90-й минуте при неинвазивной стратегии отмечались у 2542 из 3139 больных, что составило 81%, при фармакоинва-зивной стратегии - у 826 из 984 больных (83%).

При фармакоинвазивной стратегии (ТЛТ + ЧКВ), по данным коронарной ангиографии восстановление коронарного кровотока по критериям TIMI 3 наблюдалось у 403 из 984 больных (41%), по критерию TIMI 2 - у 305

больных (31%), всего по сумме Т1М1 2-3 - у 708 из 984 больных (72%).

Геморрагический инсульт был у 9 (0,3%) больных при неинвазивной стратегии (ТЛТ) и у 3 (0,3%) больных -при фармакоинвазивной.

Смертность за время госпитализации была несколько выше в неивазивной группе по сравнению с фармакоинвазивной - 4,5 и 3,2% соответственно.

Количество кровотечений, потребовавших переливания крови, и малых кровотечений в течение 7 сут было одинаково в обеих группах и составило соответственно 0,7 и 2,5% (табл. 2, 3).

Таблица 1. Основные характеристики пациентов, участвующих в мониторинге эффективности и безопасности медицинского применения препарата Фортелизин

Количество Пол (м/ж) Возраст Количество Локализация инфаркта Время «боль - игла»

больных mediana, minmax, лет пациентов >75 лет передний задний mediana, min-max, мин

4123 2981/1142 64 32-93 610 (15%) 2300 1823 206 40-720

Таблица 2. Мониторинг эффективности и безопасности применения препарата Фортелизин при фармакоинвазивной стратегии

Признаки TIMI Геморрагический Госпитальная Кровотечения, Малые

реперфузии инсульт за время летальность потребовавшие кровотечения

(снижение подъема госпитализации переливания в течение

ST 3 2 крови за время первых суток

на 50%) на 90-й В3Ы госпитализации

минуте

826 403 305 708 3 31 7 24

Примечание. ТЛТ - тромболитическая терапия; ЧКВ - чрескожное вмешательство.

Таблица 3. Мониторинг эффективности и безопасности применения препарата Фортелизин при неинвазивной стратегии

Признаки реперфузии Геморрагический инсульт Госпитальная Кровотечения, потребовавшие Малые кровотечения

(снижение подъема ST за время госпитализации летальность переливания крови за время в течение 1 суток

на 50%) на 90-й минуте госпитализации

2542 9 141 22 72

Приведенные данные эффективности и безопасности препарата Фортелизин, основанные на мониторинге 4123 больных с ИМп5Г, говорят о результатах, сопоставимых с применением зарубежных тромболитиков алте-плазы и тенектеплазы. В настоящее время в инструкции по медицинскому применению препарата Фортелизин разрешены болюсный (двойной болюс) и болюсно-инфу-зионный (30 мин) способы введения.

В целях изменения Инструкции по медицинскому применению препарата Фортелизин в части однократного болюсного введения в соответствии с разрешением Министерства здравоохранения РФ № 261 от 16.05.014 закончено многоцентровое рандомизированное открытое сравнительное исследование эффективности и безопасности однократного болюсного введения препаратов

Фортелизин и Метализе у больных с ИМп5Г, которое позволит расширить применение Фортелизина, особенно на догоспитальном этапе, в скорой медицинской помощи.

В рамках стратегии импортозамещения, а также учитывая актуальность вопроса проведения тромболитиче-ской терапии на догоспитальном и раннем госпитальном этапах больным с острым инфарктом миокарда, Правительство РФ включило оригинальный отечественный лекарственный препарат Фортелизин (рекомбинантный белок, содержащий аминокислотную последовательность стафилокиназы) в обновленный Перечень жизненно необходимых и важнейших лекарственных препаратов для медицинского применения на 2017 г. (Распоряжение Правительства РФ от 28.21.2016 № 2885-р) [15].

СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ

Вышлов Евгений Викторович - доктор медицинских наук, ведущий научный сотрудник отделения неотложной кардиологии НИИ кардиологии ФГБНУ «Томский национальный исследовательский медицинский центр» РАН, доцент кафедры кардиологии ФГБОУ ВО «Сибирский государственный медицинский университет» Минздрава России E-mail: evv@cardio-tomsk.ru

Алексеева Яна Валерьевна - аспирант НИИ кардиологии ФГБНУ «Томский национальный исследовательский медицинский центр» РАН

E-mail: Marckova.Yanochka@yandex.ru

Герасимец Евгений Алексеевич - аспирант кафедры кардиологии, рентгенэндоваскулярных и гибридных методов диагностики и лечения факультета повышения квалификации медицинских работников ФГАОУ ВО «Российский университет дружбы народов», Москва E-mail: j.hydro@yandex.ru

Марков Валентин Алексеевич - доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой кардиологии ФГБОУ ВО «Сибирский государственный медицинский университет» Минздрава России, ведущий научный сотрудник отделения неотложной кардиологии НИИ кардиологии ФГБНУ «Томский национальный исследовательский медицинский центр» РАН

E-mail: markov@cardio.tsu.ru

ЛИТЕРАТУРА

1. Collen D. Staphylokinase: a potent, uniquely fibrin-selective thrombolytic agent // Nat. Med. 1998. Vol. 4, N 3. P. 279-284.

2. Collen D., Lijnen H.R. Staphylokinase, a fibrin-specific plasminogen activator with therapeutic potential? // Blood. 1994. Vol. 84, N 3 P. 680-686.

3. Vestraete M. Third-generation thrombolytic drugs // Am. J. Med. 2000. Vol. 109. P. 52-58.

4. Kunadian V., Gibson C.M. Trombolytics and myocardial infarction // Cadriovasc. Ther. 2012. Vol. 30. P. 81-88.

5. Vanderschueren S., Dens J., Kerdsinchai P. et al. Randomized coronary patency trial of double-bolus recombinant staphylokinase versus front-loaded alteplase in acute myocardial infarction. Acute Ischemic Heart Disease // Am. Heart J. 1997. Vol. 134, N 2. Pt 1. P. 213-219.

6. A randomized multicenter trial comparing recombinant staphylokinase with recombinant tissue-type plasminogen activator in patients with acute myocardial infarction / Department of Cardiology, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032. China // Zhonghua Xin Xue Guan Bing Za Zhi. 2007. Vol. 35, N 8. P. 691-696.

7. Szarka S.J., Sihota E.G., Habibi H.R. et al. Staphylokinase as a plasminogen activator component in recombinant fusion

proteins // Appl. Environ. Microbiol. 1999. Vol. 65, N 2. P. 506513.

8. Sazonova I.Y.,. Houng A.K et al. The mechanism of a bacterial plasminogen activator intermediate between streptokinase and staphylokinase // J. Biol. Chem. 2001. Vol. 276, N 16. P. 1260912613.

9. Collen D. Пат. ЕАПО № 000121 от 30.06.1998 г. Новые производные стафилокиназы.

10. Moons L., Vanlinthout I., Roelants I. Toxicology studies with recombinant Staphylokinase and with SY 161-P5, a polyethylene glycol-derivatized cysteine-substitution mutant // Toxicol. Pathol. 2001. Vol. 29, N 3. P. 285-291.

11. Маркин С.С. и др. Пат. РФ 2156299 от 20.09.2000. Рекомби-нантная плазмидная ДНК, кодирующая полную последовательность стафилокиназы, штамм Escherichia coli SA 9325 -продуцент рекомбинантного белка.

12. Вилькин Я.Ф., Маркин С.С., Семенов А.М. и др. Пат. РФ 2483750 от 10.06.2013 г. Способ лечения больных с острым инфарктом миокарда с подъемом сегмента ST.

13. Маркин С.С., Семенов А.М., Арзамасцев Е.В. и др. Доклинические и клиническое исследование фибринселективного тромболитического препарата Фортелизин // Мед. академ. журн. 2012. Т. 12, № 1. С. 80-86.