Механизмы спонтанного и глюкокортикоид-индуцированного апоптоза лимфоцитов при атопической бронхиальной астме

Механизмы спонтанного и глюкокортикоид-индуцированного апоптоза лимфоцитов при атопической бронхиальной астме

С. В. БОЙЧУК1, И. Г МУСТАФИН2, И. Д. РЕШЕТНИКОВА3, П. Д. ДУНАЕВ1

1Кафедра патофизиологии

Казанского государственного медицинского университета.

Республиканский центр по борьбе со СПИДом МЗ РТ (главный врач — О. М. Романенко). 3Кафедра аллергологии и иммунологии (зав. кафедрой — проф. Р. С. Фассахов) Казанской государственной медицинской академии

Резюме

Изучали механизмы спонтанного и глюкокортикоид (ГК)-индуцированного апоптоза лимфоцитов (Лф) периферической крови доноров и больных атопической бронхиальной астмой (АБА). В качестве маркеров апоптоза Лф использовали динамику изменений величины митохондриального потенциала (МП), уровня экспрессии фосфатидилсерина (ФС), а также фрагментации ДНК. Вышеуказанные маркеры апоптоза Лф оценивали методом проточной цитофлюорометрии. Установлено, что Лф больных АБА обладают устойчивостью к спонтанному апопто-зу, но, в то же время, обладают повышенной чувствительностью к ГК-индуцированному апоптозу. Например, при инкубации Лф больных АБА уровень фрагментации их ДНК наблюдался в меньшей степени и на более поздних сроках по сравнению с контролем. Дексаметазон (Дн) индуцировал фрагментацию ДНК у Лф больных АБА на более ранних сроках и в большей степени по сравнению с Лф доноров (контроль). Инкубация Лф больных АБА с Дн приводила к значительному снижению величины их МП по сравнению с контролем, начиная с 48 часов инкубации. Дн-индуцированное снижение МП коррелировало с повышением уровня экспрессии ФС.

Таким образом, Дн-индуцированный апоптоз Лф является митохондрий-опосредованным, а чувствительность Лф больных АБА к Дн-индуцированному апоптозу может быть обусловлена значительными (по сравнению с контролем) изменениями величины их МП.

Ключевые слова: лимфоцит (Лф), апоптоз, митохондриальный потенциал (МП), фосфатидилсерин (ФС), фрагментация ДНК, атопическая бронхиальная астма (АБА), дексаметазон (Дн).

Введение

Известно, что одним из основных звеньев патогенеза атопической бронхиальной астмы (АБА), сопровождаются инфильтрацией бронхиального дерева клетками, мигрировавшими из кровяного русла. В первую очередь к таковым клеткам относятся лимфоциты (Лф) и эозинофилы (Эф) [7, 13]. Установлено, что клеткам, мигрировавшим в ткани, отведен строго определенный срок жизни, по истечении которого они подвергаются элиминации посредством запуска процесса их программированной клеточной гибели (ПКГ) или апоптоза. Длительный характер течения атопических заболеваний, в том числе, АБА, позволяет предположить, что одной из причин хронизации процесса является нарушение элиминации клеток из легких вследствие нарушений запуска и регулирования (как внеклеточного, так и внутриклеточного) процессов апоптоза.

Факторы, участвующие в регуляции процессов ПКГ, многочисленны и разнообразны. Немаловажная роль в регуляции механизмов спонтанного и индуцированного различными факторами апоптоза отводится митохондриям. Это обусловлено на-

личием в данных органеллах большого количества биологически активных веществ (БАВ), необходимых для перехода апоптоза в конечную и необратимую стадию, сопровождающуюся упорядоченной деградацией ДНК [9]. К ним относятся апоптоз-инду-цирующий фактор, цитохром с, каспазы 2 и 9 и др. Считается, что высвобождение большинства данных факторов из митохондрий происходит в результате повышения проницаемости митохондриальной мембраны, что, в свою очередь, находит отражение в изменении (а именно, снижении) величины МП. Следовательно, изменение данного маркера программированной клеточной гибели свидетельствует о высвобождении из митохондрий в цитозоль вышеуказанных БАВ. Участие данных органелл в процессах ПКГ обусловлено также наличием в них разнообразных белков (Ьс1-х, Ьс1-2 и др.), являющихся внутриклеточными регуляторами апоптоза. Тем не менее, несмотря на большое количество исследований, посвященных участию митохондрий в апоптозе, до настоящего времени не существует однозначного мнения, касающегося обязательного их участия в процессах апоптоза [2, 4, 5, 6, 10, 18, 22].

Нарушение элиминации клеток из органов-мишеней может быть обусловлено также ослаблением экспрессии на их клеточной поверхности молекул (фосфатидилсерин, тромбосподин и др.), сигнализирующих об апоптозе клеток и обеспечивающих их распознавание и последующее переваривание макрофагами. В частности, небезосновательным представляется существующее мнение о том, что причиной длительного воспаления в легких при АБА является не нарушение процессов регуляции апоптоза вышеуказанных клеток, а нарушение их распознавания. В результате этого, «апоптотирующие» Эф не фагоцитируются макрофагами, а агрессивные БАВ (в частности, основной щелочной белок и др.) высвобождаются во внеклеточное пространство и сущест-венно усиливают повреждение бронхиального дерева [25].

Очевидно, что в настоящее время глюкокортикоиды (ГК) являются средствами базисной терапии больных АБА средней и тяжелой степени тяжести. Долгое время считалось, что традиционной мишенью ГК как индукторов апоптоза являются незрелые Лф. В последнее время было показано, что некоторые субпопуляции зрелых Т-лимфоцитов (ЫК-клетки, цитотоксические Лф, Т-хел-перы) также подвергаются апоптозу под влиянием ГК. В противоположность этому считается, что В-Лф резистентны к действию ГК. Также убедительно доказана способность ГК индуцировать апоптоз Эф [13]. Следовательно, способность ГК индуцировать апоптоз клеток, инфильтрирующих бронхиальное дерево при АБА, может являться одним из факторов, обуславливающих их клиническую эффективность. Проведенные исследования показали, что применение ГК приводило к уменьшению количества клеток, мигрировавших в легкие после ингаляции специфического аллергена [20].

Несмотря на достаточно давно установленный факт возможности индукции апоптоза лимфоидных клеток под влиянием ГК, механизмы ГК-индуцированного апоптоза Лф по-прежнему являются предметом дискуссий.

Исходя из вышеизложенного, целью настоящего исследования явилось изучение некоторых механизмов спонтанного и Дн-индуцированного апоптоза Лф доноров и больных АБА.

Материалы и методы исследования

Объектом исследований явились Лф периферической крови 34 больных АБА и 16 здоровых доноров. Группу больных АБА составляли лица с легкой и средней степенью тяжести заболевания, на момент забора крови не получавшие ГК. Лф выделяли из периферической крови путем центрифугирования крови на градиенте плотности Ficoll-Hypaque (Amersham). Клетки, выделенные с интерфазы градиента плотности, культивировали в 24-луноч-ных пластиковых плоскодонных планшетах (Nun^ в среде RPMI 1640 (Sigma) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Sigma), 200 мкг/мл L-глутамина (Flow) и антибиотиков (пенициллин + стрептомицин (Sigma). В культуру клеток вносили дексаментазон (Дн) (Sigma) (10-4-10-6 М) и инкубировали в СО2-инкубаторе (5% СО2) при температуре 37 °С.

Оценку апоптоза Лф осуществляли методом проточной ци-тофлуорометрии на приборе Fa^alibur (Вєсйп Dickinson) по следующим параметрам:

1. По уровню фрагментации ДНК с помощью ее окрашивания гипотоническим раствором пропидия йодида (PI) (Sigma), содержащего 0,1% тритона Х-100 и 0,1% цитрата натрия. Подсчитывали процент клеток, обнаруживаемых в гиподиплоидной зоне гистограммы. Регистрацию результатов проводили на втором (FL2) детекторе флюоресценции [16].

2. По изменению величины митохондриального потенциала (МП) измеряли с помощью флюорохромов CM-x-ROS (Molecular Probes) [11] и DiOC6 (Sigma) [4]. Оценку величины МП по флюоресценции CMX-ROS и DiOC6 проводили на втором (FL2) и первом (FL1) детекторах флюоресценции, соответственно. В качестве контроля уровня флюоресценции флюорохромов, используемых для оценки величины МП, в отдельных экспериментах клетки инкубировали 15 минут с m-CLCCP (Sigma) (150 цМ). Данное вещество является специфическим индуктором, снижающим величину МП.

3. По экспрессии фосфатидилсерина определяли с помощью флюорохрома MC540 (Sigma). Регистрацию результатов проводили на втором детекторе (FL2) флюоресценции [15].

4. По оценке параметров прямого (FSC) и бокового (SSC) светорассеивания. Об изменении данных показателей судили по смещению основного «гейта» свежевыделенных Лф периферической крови.

Результаты исследований

Культивирование Лф доноров и больных АБА индуцировало с течением времени их гибель. Часть клеток погибала по типу некроза, часть - посредством апоптоза. Показано, что снижение величины МП Лф происходило после 48 часов инкубации, экспрессия молекул ФС на поверхности происходила на 3-и сутки культивирования. Показатели FSC и SSC у основной популяции Лф изменялись после 4-е сутки культивирования, в то время как процессы фрагментации ДНК начинались только на 5-6 сутки культивирования.

Таким образом, у Лф доноров и АБА снижение величины МП являлось самым ранним признаком спонтанного апоптоза.

Вышеуказанные признаки ПКГ наблюдались как у Лф доноров, так и больных АБА. Было показано, что фрагментация Лф больных АБА была выражена в меньшей степени по сравнению с контролем (р<0,001). Аналогичная закономерность обнаружена и при сравнительном изучении других параметров апоптоза Лф доноров и больных АБА. Процесс фрагментации ДНК коррелировал с изменением параметров светорассеивания в течение всего периода инкубации.

Инкубация Лф с Дн индуцировала в них вышеперечисленные изменения. Однако их динамика существенно отличалась между Лф исследуемых групп лиц.

Показано, что инкубация Лф с Дн дозозависимо приводила к снижению величины МП. Дн в одинаковой степени инициировал снижение величины МП у Лф доноров и больных АБА только при 24-часовой инкубации. На 2-е сутки культивирования Лф с Дн количество клеток со сниженным МП среди Лф больных АБА было выше по сравнению с Лф доноров (р<0,01). Аналогичная тенденция сохранялась и в дальнейшем. Следует также отметить тот факт, что при инкубации Лф как доноров, так и больных АБА с Дн происходило снижение величины МП только у определенной части клеток, в то время как у остальных Лф величина МП не изменялась.

Инкубация Лф с Дн также приводила к достоверному повышению уровня экспрессии ФС на их поверхности после 48 часов инкубации (р<0,01). Также было выявлено, что количество ФС+-Лф после их инкубации с Дн было существенно выше среди Лф больных АБА по сравнению с контролем (р<0,001).

Таким образом, выявлена обратная зависимость между спонтанным и Дн-индуцированным изменением МП и появлением молекул ФС на поверхности Лф. Полученный факт позволил сделать предположение, что экспрессия ФС на клеточной поверхности Лф происходит только у клеток со сниженным МП. Для подтверждения данной гипотезы было проведено одновременное измерение вышеуказанных показателей. Для этого вместо флюорохрома СМ-х-РОБ, использованного для оценки величины МП, было произведено одновременное окрашивание Лф с помощью флюорохрома РЮС6 (для оценки МП) и МС540 (для оценки уровня экспрессии ФС). В предварительных экспериментах было показано, что инкубация Лф с т-С1_ССР приводит в одинаковой степени к снижению величины МП Лф, оцениваемой по снижению уровня флюоресценции СМ-х-РОБ и РЮС6.

Обнаружена четкая обратная зависимость между величиной МП и уровнем экспрессии ФС. Показано, что Лф с нормальной величиной МП не экспрессируют ФС на своей поверхности. Спонтанное снижение величины МП Лф предшествует появлению ФС на клеточной поверхности. Более того, экспрессия ФС появляется исключительно на клетках со сниженным МП. Аналогичные изменения наблюдались и в случае Дн-индуцирован-ного апоптоза Лф.

Дн также индуцировал фрагментацию ДНК Лф уже на 4-е сутки культивирования. Количество клеток, в которых наблюдалась упорядоченная фрагментация ДНК, было достоверно выше среди Лф больных АБА по сравнению с Лф доноров (р<0,01).

Обсуждение

Полученные нами данные свидетельствуют о том, что изменение величины МП Лф является самым ранним и обязательным признаком спонтанного и ГК-индуцированного апоптоза Лф доноров и больных АБА. Инкубация Лф с Дн приводила, в первую очередь, к снижению величины МП и к последующей экспрессии ФС и фрагментации ДНК. Более того, целенаправленное снижение МП с помощью С1_ССР также дозозависимо индуцировало последующую экспрессию ФС на поверхности Лф. Следовательно, логично предположить, что БАВ, выделяющиеся из митохондрий после снижения из МП, могут участвовать как в деградации ДНК (см. выше), так и создавать предпосылки для последующей элиминации клеток, подвергающихся апоптотической гибели посредством усиления экспрессии специфических молекул (см. выше) на их поверхности. В частности, можно предположить, что вышеуказанные БАВ могут активировать ФС-транслоказы или оказывать протеолиз компонентов цитоскелета (например, фо-дрина), удерживающих ФС на внутренней поверхности мембраны. Известно, что протеолиз фодрина инициирует транслокацию ФС на наружную поверхность клетки [12]. Участие митохондрий в апоптозе и последующей элиминации апоптотирующих клеток подтверждают и другие исследователи. Например, показано, что блокада митохондриальной АТФ-азы индуцирует экспрессию ФС на поверхности Лф [4]. Так как высвобождение из митохондрий большинства БАВ, участвующих в регуляции ПКГ, сопряжено со снижением величины их МП, блокирование этого процесса способно предотвратить большинство характерных признаков апоптоза. Например, показано, что преинкубация тимоцитов

с веществами, препятствующими снижению величины их МП, одновременно предотвращает появление на поверхности клеток молекул ФС [4] и фрагментацию ДНК в ответ на различные стимулы [22]. К сожалению, использование веществ, предотвращающих снижение величины МП, при изучении индуцированного апоптоза Лф периферической крови является неприемлемым из-за кратковременности их действия (30-60 мин.) [23].

Известно, что в митохондриях содержатся белки (Ьс1-2, Ьс1-х, Ьс!-хь и др.), регулирующие процессы ПКГ. Одной из точек приложения в функционировании данных белков является контроль за высвобождением вышеперечисленных БАВ из митохондрий. Обнаружено, что высвобождение из митохондрий ряда апоп-тогенных факторов, в частности, цитохрома с блокируется гиперэкспрессией белка Ьс!-2 [21]. Также показано, что уровень экспрессии в клетках этих белков при различных патологических состояниях может изменяться и оказывать существенное влияние на их течение. Например, показано, что экспрессия белка Ьс!-2, являющегося продуктом одноименного протоонкогена, в Лф, полученных из бронхоальвеолярного лаважа больных АБА со средней и тяжелой степенью тяжести заболевания, оказывается повышенной, в то время как у Лф доноров и больных АБА с легкой степенью тяжести заболевания не отличается друг от друга [17].

Следовательно, функциональное состояние митохондрий и их способность реагировать на апоптотические сигналы выделением различных БАВ, способно определять характер воспаления, а следовательно, и повреждения бронхиального дерева при АБА.

Учитывая высокую эффективность ГК, используемых в терапии АБА, было проведено изучение их влияния на ПКГ Лф доноров и АБА.

Показано, что несмотря на «устойчивость» Лф больных АБА к процессам спонтанного апоптоза, проявляющегося в замедлении фрагментации их ДНК, данные клетки являются более «чувствительными» к Дн-индуцированному апоптозу, что проявляется в увеличении количества клеток с признаками упорядоченной фрагментации ДНК по сравнению с контролем. Аналогичным образом Дн-индуцированное снижение величины МП наблюдается в большей степени среди Лф больных АБА. Эти данные свидетельствуют о том, что процессы ГК-индуцированного апоптоза Лф являются митохондрий-опосредованными и не связаны исключительно со способностью препаратов данной группы активировать эндонуклеазы, как это указывают литературные данные (см. выше).

Нельзя исключить тот факт, что повышенная чувствительность Лф больных АБА по сравнению с контролем к Дн-индуцирован-ному апоптозу может быть обусловлена их предварительной активацией. Известно, что предварительно активированные клетки, в том числе и Лф, способны подвергаться апоптозу при повторном действии активационного стимула [1, 24]. Этому способствует, например, одновременное появление на поверхности Т-Лф РаБ-рецептора и его лиганда (Ра$1_), запускающих программу их клеточной гибели [8]. Активация Лф при АБА, возможно, делает их более чувствительными к Дн-индуцированному пути запуска программированной клеточной гибели.

ЛИТЕРАТУРА

1. Ярилин А. А., Никонова М. Ф., Ярилина А. А., Варфоломеева М. И., Григорьева Т. Ю. Апоптоз, роль в патологии и значимость его оценки в клинико-иммунологическом обследовании больных // Медицинская иммунология. — 2000. — Т. 2. — № 1. — С. 7-16.

2. Banki K., Hutter E., Gonchoroff N., Perl A. Elevation of mitochondrial transmembrane potential and reactive oxygen intermediate levels are early events and occur independently from activation of caspases in Fas signaling // J. Exp. Med. — 1995. — Vol. 182. — P. 367-377.

3. Caron-Leslie L.-A., Evans R. B., Cidlowski J. A. Bcl-2 inhibits glucocorticoid-induced apoptosis but only partially blocks calcium ionophore or cyclohemide-regulated apoptosis in S49 cells // FASEB J. — 1994. — Vol. 8. — P. 639-645.

4. Castedo M., Hirsch T., Susin S. eta. Sequential acquisition of mitochon-

drial and plasma membrane alterations during early lymphocyte apoptosis // J. Immunology. — 1996. — Vol. 157. — P. 512-521.

5. Cossarizza A., Kalashnikova G., Grassilli E., etc. Mitochondrial modifications during rat thymocyte apoptosis: a study at the single cell level // Exp. Cell Research. — 1994. — Vol. 214. — P. 323-330.

6. Jacobson M. D., Burne M. P., King T. et al. Bcl-2 blocks apoptosis in cells lacking mitochondrial DNA // Nature. 1993. — Vol. 361. — P. 365-369.

7. Kodama T., Matsuyama T., Miuata S., etc. Late and prolonged induction of eosinophil apoptosis in sensitized mouse lung after ovalbumin challange // Clin. Exp. Allergy. — 1998. — Vol. 28. — P. 1435-1443.

8. Krammer P. H. CD95(APO-1/Fas)-mediated apoptosis: live and let die // Adv. Immunol. — 1999. — Vol. 71. — P. 163-210.

9. Kroemer G., Zamzani N., Susin S. Mithochondrial control of apoptosis // Immunology Today. — 1997. — Vol. 18 (1). — P. 44-51.

10. MacDonald G., Shi L., Vande Velde C., etc. Mitochondria-dependent and independent regulation of granzyme B-induced apoptosis // J. Exp. Med. — 1999. — Vol. 189. — P. 131-143.

11. Macho A., Decandin D., Cartedo M., etc. Chloromethyl-X-Rosamine is an aldehyde-fixable potencial-sensitive fluorochrome for the detection of early apoptosis // Cytometry. — 1996. — V. 25. — P. 333-340.

12. Martin S. J., Brein C. A., Nishioka W. K., etc. Proteolysis of fodrin (non-erythroid spectrin) during apoptosis // J. Biol. Chem. — 1995. — Vol. 270. — P. 6425.

13. Meaher L., Cousin J., Seckl J., Haslett C. Opposing effects of glucocorticoids on the rate of apoptosis in neutrophilic and eosinophilic granulocytes // J. Immunology. — 1996. — Vol. 156. — P. 4422-4428.

14. Metzger W. J., Zavala D., Richerson H., etc. Local allergen challenge and bronchoalveolar lavage of allergic asthmatics lung: description of model and local inflammation // J. Allergy Clin. Immunol. — 1987. — Vol. 135. — P. 433-440.

15. Mower D. A. Jr., Peckhman D. W., Illera V. A., etc. Decreased membrane phospholipid packing and decreased cell size precede DNA cleavage in mature mouse B cell apoptosis // J. Immunol. — 1994. — V. 152. — P. 4832-4842.

16. Nicoletti I., Migliorati G. Rapid and simple method of measurement of nuclear apoptosis // J. Immunol. Methods. — 1991. — Vol. 139. — P. 271-279.

17. Panagou P., Karameris S., Tspira S., etc. BCL-2 expression in asthma: Analysis of sputum induction samples // Abstr. Of Europ. Respir. Society. Annual Congress, Berlin, 1997. — P. 2066.

18. Petit P. X., LeCocuer H., Zorn E., etc. Alterations in mithochondrial structure and function are early events of dexametasone-induced thymocyte apoptosis // J. Cell Biol. — 1995. — Vol. 130. — P. 157-167.

19. Susin S., Lorenzo H., Zamzani N., etc. Mithochondrial release of caspa-se-2 and caspase-9 during the apoptotic process // J. Exp. Med. — 1999. — Vol. 189. — P. 381-393.

20. Xin-le Cui, Yuan-Jue Zhu, Zi-Jian Guo, etc. Aerosol administration of dexamethasone and methotrexate attenuated the reaction of eosinophil infiltration of the lung in ovalbumin sensitized mice. // Abstr. Of Europ. Respir. Society. Annual Congress, Berlin, 1997. — P. 0430.

21. Yang J., Bhalla K., Kim C. N., etc. Prevention of apoptosis by BcL-2: release of cytochrome c from mitochondria blocked // Science. — 1997. — Vol. 275. — P. 1129.

22. Zamzani N., Marchetti P., Castedo M., etc. Reduction in mithochondrial potential constitutes an early irreversible step of programmed lymphocyte death in vivo // J. Exp. Med. — 1995. — Vol. 18. — P. 1661-1672.

23. Zamzani N., Susin P., Marchetti P., etc. Mitochondrial control of nuclear apoptosis // J. Exp. Med. — 1996. — Vol. 183. — P. 1533-1547.

24. Wesselborg S., Janssen O., Kabelitz D. Induction of activation-driven death (apoptosis) in activated but not resting blood cells // J. Immunol. — 1993. — Vol. 150. — P. 4338-4345.

25. Walsh G. H., Dewson G., Wardlaw A. J., etc. A comparative study of different methods for the assessment of apoptosis and necrosis in human eosinophils // J. Immunol. Methods. — 1998. — Vol. 217 (1-2). — P. 153-163.