КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАКА, ЭКСПРЕССИРУЮЩЕГО IGF-1R
COMPOSITION FOR TREATING IGF-1R EXPRESSING CANCER

Настоящее изобретение относится к способу лечения раковых заболеваний, экспрессирующих IGF-1R (рецептор инсулиноподобного фактора роста 1), а также к композициям и набору для указанного лечения. С одной стороны, данное изобретение относится к комбинированному применению первого антитела для определения статуса IGF-1R ракового заболевания и второго антитела, используемого в качестве ADC (конъюгат антитело-лекарственное средство) для лечения указанного ракового заболевания.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Рецептор инсулиноподобного фактора роста 1, именуемый IGF-1R (или иногда IGF1R или IGF-IR), представляет собой рецептор с тирозинкиназной активностью, имеющий 70%-ную гомологию с рецептором инсулина - IR. IGF-1R представляет собой гликопротеин с молекулярной массой приблизительно 350000. Он является гетеротетрамерным рецептором, у которого каждая половина, связанная дисульфидными мостиками, состоит из внеклеточной α-субъединицы и трансмембранной β-субъединицы. IGF-1R связывает IGF1 (инсулиноподобный фактор роста 1) и IGF2 с очень высокой аффинностью (Kd 1 нМ), но равным образом способен связываться с инсулином с аффинностью, меньшей в 100-1000 раз. Наоборот, IR связывает инсулин с очень высокой аффинностью, хотя IGF связываются с инсулиновым рецептором только с аффинностью, меньшей в 100 раз. Тирозинкиназный домен IGF-1R и IR имеет очень высокую гомологию последовательности, однако зоны с более слабой гомологией касаются, соответственно, цистеинбогатой области, расположенной на α-субъединице и С-концевой части β-субъединицы. Различия последовательности, наблюдаемые в α-субъединице, находятся в зоне связывания лигандов и, следовательно, лежат в основе относительных аффинностей IGF-1R и IR в отношении IGF и инсулина соответственно. Различия в С-концевой части β-субъединицы приводят к расхождению путей сигнализации двух рецепторов; причем IGF-1R опосредует митогенные, относящиеся к дифференциации и антиапоптозные эффекты, тогда как активация IR, в основном, включает эффекты на уровне метаболических путей.
Цитоплазматические тирозинкиназные белки активируются связыванием лиганда с внеклеточным доменом рецептора. Активация киназ, в свою очередь, включает стимуляцию разных внутриклеточных субстратов, включающих IRS-1 (субстрат инсулинового рецептора-1), IRS-2, Shc и Grb 10. Двумя главными субстратами IGF-1R являются IRS и Shc, которые опосредуют, путем активации ниже многочисленных эффекторов, большинство ростовых и относящихся дифференциации эффектов, связанных с присоединением IGF к данному рецептору. Доступность субстратов может, следовательно, диктовать конечный биологический эффект, связанный с активацией IGF-1R. При преобладании IRS-1 клетки имеют тенденцию к пролиферации и к трансформации. При доминировании Shc клетки имеют тенденцию к дифференциации. По-видимому, путем, главным образом участвующим в эффектах защиты против апоптоза, является путь фосфатидилинозитол-3-киназ (PI-3-киназы).
-
Роль системы IGF в онкогенезе стала темой интенсивных исследований в последние десять лет. Данный интерес последовал после открытия того факта, что, помимо его митогенных и антиапоптозных свойств, IGF-1R, по-видимому, требуется для установления и поддержания трансформированного фенотипа. На самом деле, было хорошо установлено то, что сверхэкспрессия или конститутивная активация IGF-1R приводит у огромного разнообразия клеток к независимому от поддержки росту клеток в средах, лишенных фетальной телячей сыворотки, и к образованию опухолей у голых мышей. Само по себе это не является уникальным свойством, так как огромное разнообразие продуктов сверхэкспрессируемых генов может трансформировать клетки, включая значительное число рецепторов факторов роста. Однако решающим открытием, которое явно продемонстрировало важную роль, которую IGF-1R играет в трансформации, была демонстрация того, что клетки IGF-1R, в которых был инактивирован ген, кодирующий IGF-1R, являются полностью не поддающимися трансформации разными агентами, которые обычно способны трансформировать клетки, такими как белок Е5 коровьего вируса папилломы, сверхэкспрессия EGFR (рецептор эпидермального фактора роста) или PDGFR (рецептор фактора роста тромбоцитов), Т-антиген SV40, активированный ras или комбинация этих двух последних факторов.
IGF-1R экспрессируется в широком спектре опухолей и линий опухолей, и IGF усиливают рост опухолей посредством их присоединения к IGF-1R. Другие аргументы в пользу роли IGF-1R в канцерогенезе приходят из исследований с использованием мышиных моноклональных антител, направленных против рецептора, или с использованием отрицательных доминантов IGF-1R. В самом деле, мышиные моноклональные антитела, направленные против IGF-1R, ингибируют пролиферацию многочисленных линий клеток в культуре и рост опухолевых клеток in vivo. Подобным образом было показано то, что отрицательный доминант IGF-1R способен ингибировать пролиферацию опухолей.
Инициировали большое число проектов для разработки голых антител против IGF-1R для лечения раковых заболеваний. Тем не менее, к настоящему времени ни один из данных проектов не был успешным, и на рынке нет антител против IGF-1R.
Кроме того, ряд клинических испытаний с участием антител против IGF-1R, объединенных с антителами против EGFR, для нацеливания и на EGFR, и на IGF-1R, потерпел неудачу, так как ни одно из этих антител не могло вылечить пациентов с мутацией KRAS.
Вследствие этого, IGF-1R теперь не рассматривается в качестве главной мишени, и в исследовании потенциальных терапевтических антител IGF-1R больше не считается имеющим особый интерес.
Предыдущие попытки разработать ценное антитело, которое может быть использовано в качестве релевантного диагностического или прогностического средства, были описаны, но не одна из них не дала удовлетворительного результата.
Как будет очевидно из следующих примеров, авторы изобретения были удивлены демонстрацией того, что имеющиеся в продаже антитела, обычно используемые в настоящее время для бальной оценки опухолей, экспрессирующих IGF-1R, по-видимому, не являются релевантными, так как они дают ложноположительные и/или ложноотрицательные результаты. Данная проблема возможно, отчасти, была ведущей в провале клинических испытаний с антителами против IGF-1R из-за неподходящего отбора пациентов.
Кроме того, первые исследования, проведенные с использованием имеющихся в продаже антител, продемонстрировали расхождение между бальной оценкой IGF-1R и противоопухолевой активностью таргетной терапии ADC.
Тем не менее, также необходимо отметить то, что попытки получения антител против IGF-1R были сосредоточены на голых антителах, т.е. антителах, полезных в силу их собственных свойств. В данном смысле IGF-1R считается мишенью, не подходящей для получения ADC, таких как конъюгат антитело-лекарственное средство (именуемых «ADC»), так как IGF-1R описывается в качестве мишени, также широко экспрессируемой нормальными клетками, включая кровеносные сосуды. В данном смысле можно отметить то, что самое последнее антитело против IGF-1R, т.е. AVE1642, разрабатывается в качестве голого антитела, не оснащенного лекарственным средством. То же самое относится к другим антителам против IGF-1R, разрабатываемым в настоящее время, и ко всем антителам, которые потерпели неудачу в клинических испытаниях.
Целью настоящего изобретения является устранение данной проблемы посредством предложения нового способа лечения раковых заболеваний, экспрессирующих IGF-1R, на основе применения первого антитела против IGF-1R в качестве диагностического антитела и второго антитела против IGF-1R в качестве терапевтического антитела, предпочтительно в виде ADC.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Данное изобретение относится к способу лечения ракового заболевания, включающему лечение субъекта, нуждающегося в этом, терапией, нацеленной на IGF-1R, если субъект демонстрирует статус IGF-1R(+), в котором:
статус субъекта в отношении IGF-1R был определен из биологического образца субъекта с использованием первого антитела против IGF-1R, являющегося:
i) антителом или его любым антигенсвязывающим фрагментом, содержащим тяжелую цепь с CDR-H1 SEQ ID No. 1, CDR-H2 SEQ ID No. 2 и CDR-H3 SEQ ID No. 3 и легкую цепь с CDR-L1 SEQ ID No. 4, CDR-L2 SEQ ID No. 5 и CDR-L3 SEQ ID No. 6; или
ii) антителом или его любым антигенсвязывающим фрагментом, содержащим тяжелую цепь с CDR-H1 SEQ ID No. 11, CDR-H2 последовательности SEQ ID No. 12 и CDR-H3 последовательности SEQ ID No. 13 и легкую цепь с CDR-L1 последовательности SEQ ID No. 14, CDR-L2 последовательности SEQ ID No. 15 и CDR-L3 последовательности SEQ ID No. 16;
и
в котором лечение осуществляется конъюгатом антитело-лекарственное средство следующей формулы (I):
n
Ab-(L-D)
или его фармацевтически приемлемой солью,
где
Ab представляет собой второе антитело против IGF-1R или его антигенсвязывающий фрагмент, которое связывается с человеческим IGF-1R, и которое интернализуется после его связывания с IGF-1R;
L представляет собой линкер;
D представляет собой лекарственную группировку; и
n составляет от 1 до 12.
Данное изобретение также относится к способу лечения IGF-1R(+) рака у субъекта с использованием конъюгата антитело-лекарственное средство следующей формулы (I):
n
Ab-(L-D)
или его фармацевтически приемлемой соли, где
Ab представляет собой второе антитело против IGF-1R или его антигенсвязывающий фрагмент, которое связывается с человеческим IGF-1R, и которое интернализуется после его связывания с IGF-1R;
L представляет собой линкер;
D представляет собой лекарственную группировку; и
n составляет от 1 до 12;
и в котором раковое заболевание субъекта до лечения было определено как IGF-1R(+) посредством способа с использованием первого антитела против IGF-1R, являющегося:
i) антителом или его любым антигенсвязывающим фрагментом, содержащим тяжелую цепь с CDR-H1 SEQ ID No. 1, CDR-H2 SEQ ID No. 2 и CDR-H3 SEQ ID No. 3 и легкую цепь с CDR-L1 SEQ ID No. 4, CDR-L2 SEQ ID No. 5 и CDR-L3 SEQ ID No. 6; или
ii) антителом или его любым антигенсвязывающим фрагментом, содержащим тяжелую цепь с CDR-H1 SEQ ID No. 11, CDR-H2 последовательности SEQ ID No. 12 и CDR-H3 последовательности SEQ ID No. 13 и легкую цепь с CDR-L1 последовательности SEQ ID No. 14, CDR-L2 последовательности SEQ ID No. 15 и CDR-L3 последовательности SEQ ID No. 16.
В другом альтернативном способе данное изобретение относится к способу диагностики и лечения рака у субъекта, где данный способ включает:
а) диагностику ракового заболевания субъекта как IGF-1R(+) с использованием первого антитела против IGF-1R, являющегося:
i) антителом или его любым антигенсвязывающим фрагментом, содержащим тяжелую цепь с CDR-H1 SEQ ID No. 1, CDR-H2 SEQ ID No. 2 и CDR-H3 SEQ ID No. 3 и легкую цепь с CDR-L1 SEQ ID No. 4, CDR-L2 SEQ ID No. 5 и CDR-L3 SEQ ID No. 6; или
ii) антителом или его любым антигенсвязывающим фрагментом, содержащим тяжелую цепь с CDR-H1 SEQ ID No. 11, CDR-H2 последовательности SEQ ID No. 12 и CDR-H3 последовательности SEQ ID No. 13 и легкую цепь с CDR-L1 последовательности SEQ ID No. 14, CDR-L2 последовательности SEQ ID No. 15 и CDR-L3 последовательности SEQ ID No. 16; и
б) лечение указанного субъекта, диагностированного на стадии а), конъюгатом антитело-лекарственное средство следующей формулы (I):
n
Ab-(L-D)
или его фармацевтически приемлемой солью, где
Ab представляет собой второе антитело против IGF-1R или его антигенсвязывающий фрагмент, которое связывается с человеческим IGF-1R, и которое интернализуется после его связывания с IGF-1R;
L представляет собой линкер;
D представляет собой лекарственную группировку; и
n составляет от 1 до 12.
Данное изобретение также относится к композиции для лечения рака или для применения для лечения рака у субъекта со статусом IGF-1R(+), отличающейся тем, что она содержит конъюгат антитело-лекарственное средство следующей формулы (I):
n
Ab-(L-D)
или его фармацевтически приемлемую соль, где
Ab представляет собой второе антитело против IGF-1R или его антигенсвязывающий фрагмент, которое связывается с человеческим IGF-1R, и которое интернализуется после его связывания с IGF-1R;
L представляет собой линкер;
D представляет собой лекарственную группировку; и
n составляет от 1 до 12;
и где IGF-1R(+) статус указанного субъекта был определен из биологического образца субъекта с использованием первого антитела против IGF-1R, являющегося:
i) антителом или его любым антигенсвязывающим фрагментом, содержащим тяжелую цепь с CDR-H1 SEQ ID No. 1, CDR-H2 SEQ ID No. 2 и CDR-H3 SEQ ID No. 3 и легкую цепь с CDR-L1 SEQ ID No. 4, CDR-L2 SEQ ID No. 5 и CDR-L3 SEQ ID No. 6; или
ii) антителом или его любым антигенсвязывающим фрагментом, содержащим тяжелую цепь с CDR-H1 SEQ ID No. 11, CDR-H2 последовательности SEQ ID No. 12 и CDR-H3 последовательности SEQ ID No. 13 и легкую цепь с CDR-L1 последовательности SEQ ID No. 14, CDR-L2 последовательности SEQ ID No. 15 и CDR-L3 последовательности SEQ ID No. 16.
Данное изобретение также относится к конъюгату антитело-лекарственное средство для применения в лечении рака, экспрессирующего IGF-1R, у субъекта, включающем следующие стадии:
А) определение IGF-1R(+) статуса указанного субъекта из биологического образца субъекта с использованием первого антитела против IGF-1R; и
Б) введение указанного конъюгата антитело-лекарственное средство пациенту, если данный субъект имеет статус IGF-1R(+), и где:
указанное первое антитело против IGF-1R является:
i) антителом или его любым антигенсвязывающим фрагментом, содержащим тяжелую цепь с CDR-H1 SEQ ID No. 1, CDR-H2 SEQ ID No. 2 и CDR-H3 SEQ ID No. 3 и легкую цепь с CDR-L1 SEQ ID No. 4, CDR-L2 SEQ ID No. 5 и CDR-L3 SEQ ID No. 6; или
ii) антителом или его любым антигенсвязывающим фрагментом, содержащим тяжелую цепь с CDR-H1 SEQ ID No. 11, CDR-H2 последовательности SEQ ID No. 12 и CDR-H3 последовательности SEQ ID No. 13 и легкую цепь с CDR-L1 последовательности SEQ ID No. 14, CDR-L2 последовательности SEQ ID No. 15 и CDR-L3 последовательности SEQ ID No. 16; и
указанный конъюгат антитело-лекарственное средство имеет следующую формулу (I):
n
Ab-(L-D)
или его фармацевтически приемлемой соли, где
Ab представляет собой второе антитело против IGF-1R или его антигенсвязывающий фрагмент, которое связывается с человеческим IGF-1R, и которое интернализуется после его связывания с IGF-1R;
L представляет собой линкер;
D представляет собой лекарственную группировку; и
n составляет от 1 до 12.
Согласно данному способу подразумевается то, что композия или набор, описанные в данном документе фразой «антитело или его любой антигенсвязывающий фрагмент», конкретно обозначают антитело против IGF-1R или его любой фрагмент, связывающий IGF-1R.
Согласно способу, композиции или набору, описанным в данном документе, первое и второе антитела не связываются с тем же самым эпитопом IGF-1R.
Согласно способу, композиции или набору, описанным в данном документе, первое антитело против IGF-1R представляет собой:
i) антитело, содержащее вариабельный домен тяжелой цепи последовательности SEQ ID No. 7 или любой последовательности с по меньшей мере 90%-ной гомологией с последовательностью SEQ ID No. 7; и/или вариабельный домен легкой цепи последовательности SEQ ID No. 8 или любой последовательности с по меньшей мере 90%-ной гомологией с последовательностью SEQ ID No. 8; или
ii) антитело, содержащее вариабельный домен тяжелой цепи последовательности SEQ ID No. 17 или любой последовательности с по меньшей мере 90%-ной гомологией с последовательностью SEQ ID No. 17; и/или вариабельный домен легкой цепи последовательности SEQ ID No. 18 или любой последовательности с по меньшей мере 90%-ной гомологией с последовательностью SEQ ID No. 18.
Согласно способу, композиции или набору, описанным в данном документе, первое антитело против IGF-1R представляет собой:
i) антитело 810D12, секретируемое гибридомой, депонированной в CNCM, Институт Пастера, Париж, 17 сентября 2014 г. под номером I-4893; или
ii) антитело 816С12, секретируемое гибридомой, депонированной в CNCM, Институт Пастера, Париж, 17 сентября 2014 г. под номером I-4894.
Согласно способу, композиции или набору, описанным в данном документе, Ab представляет собой антитело против IGF-1R или его антигенсвязывающий фрагмент, выбранное из i) антитела, которое содержит три CDR тяжелой цепи последовательности SEQ ID No. 21, 22 и 23, и три CDR легкой цепи последовательности SEQ ID No. 24, 25 и 26; или ii) антитела, которое конкурирует за связывание с IGF-1R с антителом i); или iii) антитела, которое связывается с тем же самым эпитопом IGF-1R, что и антитело i).
Согласно способу, композиции или набору, описанным в данном документе, Ab представляет собой:
а) антитело, содержащее три CDR тяжелой цепи последовательности SEQ ID No. 27, 22 и 23, и три CDR легкой цепи последовательности SEQ ID No. 29, 25 и 31;
б) антитело, содержащее три CDR тяжелой цепи последовательности SEQ ID No. 27, 22 и 23, и три CDR легкой цепи последовательности SEQ ID No. 30, 25 и 31;
в) антитело, содержащее три CDR тяжелой цепи последовательности SEQ ID No. 27, 22 и 23, и три CDR легкой цепи последовательности SEQ ID No. 29, 25 и 33; или
г) антитело, содержащее три CDR тяжелой цепи последовательности SEQ ID No. 28, 22 и 23, и три CDR легкой цепи последовательности SEQ ID No. 29, 25 и 31.
Согласно способу, композиции или набору, описанным в данном документе, Аb представляет собой:
а) антитело, содержащее вариабельный домен тяжелой цепи последовательности, выбранной из SEQ ID No. 33, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57 и 59, или любой последовательности с по меньшей мере 80%-ной идентичностью с SEQ ID No. 33, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57 и 59; и три CDR легкой цепи последовательности SEQ ID No. 29, 25 и 31;
б) антитело, содержащее вариабельный домен легкой цепи последовательности, выбранной из SEQ ID No. 34, 37 и 60, или любой последовательности с по меньшей мере 80%-ной идентичностью с SEQ ID No. 34, 37 или 60; и три CDR тяжелой цепи последовательностей SEQ ID No. 27, 22 и 23; или
в) антитело, содержащее вариабельный домен тяжелой цепи последовательности, выбранной из SEQ ID No. 33, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57 и 59, или любой последовательности с по меньшей мере 80%-ной идентичностью с SEQ ID No. 33, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57 и 59; и вариабельный домен легкой цепи последовательности, выбранной из SEQ ID No. 34, 37 и 60, или любой последовательности с по меньшей мере 80%-ной идентичностью с SEQ ID No. 34, 37 или 60.
Согласно способу, композиции или набору, описанным в данном документе, Аb содержит:
а) тяжелую цепь последовательности, выбранной из SEQ ID No. 35, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58 и 61 или любой последовательности с по меньшей мере 80%-ной идентичностью с SEQ ID No. 35, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58 или 61; и
б) легкую цепь последовательности, выбранной из SEQ ID No. 36, 38 и 62 или любой последовательности с по меньшей мере 80%-ной идентичностью с SEQ ID No. 36, 38 или 62.
Согласно способу, композиции или набору, описанным в данном документе, Ab представляет собой i) антитело, выбранное из антител 208F2, 212А11, 214F8, 219D6 и 213В10, ii) антитела, которые конкурируют за связывание с IGF-1R с антителами i); или iii) антитела, которые связываются с тем же самым эпитопом IGF-1R, что и антитела i).
Согласно способу, композиции или набору, описанным в данном документе, лекарственная группировка D выбрана из алкилирующих агентов, антиметаболитов, противоопухолевых антибиотиков, ингибиторов митоза, ингибиторов функции хроматина, антиангиогенных агентов, антиэстрогенов, антиандрогенов, хелаторов, стимулятора поглощения железа, ингибиторов циклооксигеназы, ингибиторов фосфодиэстеразы, ингибиторов ДНК, ингибиторов синтеза ДНК, стимуляторов апоптоза, тимидилатных ингибиторов, ингибиторов Т-клеток, агонистов интерферона, ингибиторов рибонуклеозидтрифосфатредуктазы, ингибиторов ароматазы, антагонистов рецептора эстрогена, ингибиторов тирозинкиназы, ингибиторов клеточного цикла, таксана, ингибиторов тубулина, ингибиторов ангиогенеза, стимуляторов макрофагов, антагонистов рецептора нейрокинина, агонистов каннабиноидного рецептора, агонистов рецептора дофамина, агонистов фактора, стимулирующего гранулоциты, агонистов рецептора эритропоэтина, агонистов рецептора соматостатина, агонистов LHRH (лютеинизирующий рилизинг-гормон), сенсибилизаторов кальция, антагонистов рецептора VEGF, антагонистов рецептора интерлейкина, ингибиторов остеокластов, стимуляторов образования радикалов, антагонистов рецептора эндотелина, алкалоида барвинка, противогормональных агентов или иммуномодуляторов, или любого другого лекарственного средства, которое выполняет критерии активности цитотоксического средства или токсина.
Согласно способу, композиции или набору, описанным в данном документе, лекарственная группировка D представляет собой ауристатин, долостатин 10 или их производное.
Согласно способу, композиции или набору, описанным в данном документе, лекарственная группировка D имеет следующую формулу (II):
в которой:
2
3
R представляет собой СООН, СООСН или тиазолил;
3
1
6
R представляет собой Н или (С-С)алкил;
9
1
6
R представляет собой Н или (С-С)алкил;
m представляет собой целое число от 1 до 8;
волнистая линия показывает точку присоединения к L.
Согласно способу, композиции или набору, описанным в данном документе, L представляет собой линкер следующей формулы (III):
в котором
2
4
10
2
6
2
6
L представляет собой (С-С)циклоалкил-карбонил, (С-С)алкил, (С-С)алкил-карбонил,
W представляет собой аминокислотное звено; w представляет собой целое число от 0 до 5;
Y представляет собой РАВ-карбонил, причем РАВ представляет собой
у равен 0 или 1;
звездочка показывает точку присоединения к D; и
волнистая линия показывает точку присоединения к Ab.
Согласно способу, композиции или набору, описанным в данном документе, конъюгат антитело-лекарственное средство представляет собой:
и их фармацевтически приемлемые соли,
где Ab представляет собой i) антитело, выбранное из антител 208F2, 212А11, 214F8, 219D6 и 213В10, или ii) антитело, выбранное из антител, которые конкурируют за связывание с IGF-1R с антителами i); или iii) антитело, выбранное из антител, которые связываются с тем же самым эпитопом IGF-1R, что и антитела i).
Данное изобретение также относится к набору для применения в лечении рака, экспрессирующего IGF-1R, включающему по меньшей мере: а) первое антитело против IGF-1R, состоящее из:
i) антитела или его любого антигенсвязывающего фрагмента, содержащего тяжелую цепь с CDR-H1 SEQ ID No. 1, CDR-H2 SEQ ID No. 2 и CDR-H3 SEQ ID No. 3 и легкую цепь с CDR-L1 SEQ ID No. 4, CDR-L2 SEQ ID No. 5 и CDR-L3 SEQ ID No. 6; или
ii) антитела или его любого антигенсвязывающего фрагмента, содержащего тяжелую цепь с CDR-H1 SEQ ID No. 11, CDR-H2 последовательности SEQ ID No. 12 и CDR-H3 последовательности SEQ ID No. 13 и легкую цепь с CDR-L1 последовательности SEQ ID No. 14, CDR-L2 последовательности SEQ ID No. 15 и CDR-L3 последовательности SEQ ID No. 16;
и
б) конъюгат антитело-лекарственное средство следующей формулы (I):
или его фармацевтически приемлемую соль,
в котором
Ab представляет собой второе антитело против IGF-1R или его антигенсвязывающий фрагмент, способное к связыванию с человеческим IGF-1R, выбранное из i) антитела, которое содержит три CDR тяжелой цепи последовательности SEQ ID No. 21, 22 и 23, и три CDR легкой цепи последовательности SEQ ID No. 24, 25 и 26; или ii) антитела, которое конкурирует за связывание с IGF-1R с антителом i); или iii) антитела, которое связывается с тем же самым эпитопом IGF-1R, что и антитело i);
L представляет собой линкер;
D представляет собой лекарственную группировку следующей формулы (II):
в которой:
2
3
R представляет собой СООН, СООСН или тиазолил;
3
1
6
R представляет собой Н или (С-С)алкил;
9
1
6
R представляет собой Н или (С-С)алкил;
m представляет собой целое число от 1 до 8;
волнистая линия показывает точку присоединения к L; и
n составляет от 1 до 12.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Данное изобретение относится к способу лечения рака, включающему лечение субъекта, нуждающегося в этом, с использованием терапии, нацеленной на IGF-1R, если субъект имеет IGF-1R(+) статус, где:
статус субъекта в отношении IGF-1R был определен из биологического образца субъекта с использованием первого антитела против IGF-1R, являющегося:
i) антителом или его любым антигенсвязывающим фрагментом, содержащим тяжелую цепь с CDR-H1 SEQ ID No. 1, CDR-H2 SEQ ID No. 2 и CDR-H3 SEQ ID No. 3 и легкую цепь с CDR-L1 SEQ ID No. 4, CDR-L2 SEQ ID No. 5 и CDR-L3 SEQ ID No. 6; или
ii) антителом или его любым антигенсвязывающим фрагментом, содержащим тяжелую цепь с CDR-H1 SEQ ID No. 11, CDR-H2 последовательности SEQ ID No. 12 и CDR-H3 последовательности SEQ ID No. 13 и легкую цепь с CDR-L1 последовательности SEQ ID No. 14, CDR-L2 последовательности SEQ ID No. 15 и CDR-L3 последовательности SEQ ID No. 16;
и
в котором лечение осуществляется конъюгатом антитело-лекарственное средство следующей формулы (I):
n
Ab-(L-D)
или его фармацевтически приемлемой солью,
в которой
Ab представляет собой второе антитело против IGF-1R или его антигенсвязывающий фрагмент, которое связывается с человеческим IGF-1R, и которое интернализуется после его связывания с IGF-1R;
L представляет собой линкер;
D представляет собой лекарственную группировку; и
n составляет от 1 до 12.
Данное изобретение также относится к композиции для лечения рака или для применения для лечения рака у субъекта со статусом IGF-1R(+), отличающейся тем, что она содержит конъюгат антитело-лекарственное средство следующей формулы (I):
n
Ab-(L-D)
или его фармацевтически приемлемую соль, в которой
Ab представляет собой второе антитело против IGF-1R или его антигенсвязывающий фрагмент, которое связывается с человеческим IGF-1R, и которое интернализуется после его связывания с IGF-1R;
L представляет собой линкер;
D представляет собой лекарственную группировку; и
n составляет от 1 до 12;
и где IGF-1R(+) статус указанного субъекта был определен из биологического образца субъекта с использованием первого антитела против IGF-1R, являющегося:
i) антителом или его любым антигенсвязывающим фрагментом, содержащим тяжелую цепь с CDR-H1 SEQ ID No. 1, CDR-H2 SEQ ID No. 2 и CDR-H3 SEQ ID No. 3 и легкую цепь с CDR-L1 SEQ ID No. 4, CDR-L2 SEQ ID No. 5 и CDR-L3 SEQ ID No. 6; или
ii) антителом или его любым антигенсвязывающим фрагментом, содержащим тяжелую цепь с CDR-H1 SEQ ID No. 11, CDR-H2 последовательности SEQ ID No. 12 и CDR-H3 последовательности SEQ ID No. 13 и легкую цепь с CDR-L1 последовательности SEQ ID No. 14, CDR-L2 последовательности SEQ ID No. 15 и CDR-L3 последовательности SEQ ID No. 16.
Данное изобретение также относится к конъюгату антитело-лекарственное средство для применения в лечении рака, экспрессирующего IGF-1R, у субъекта, включающем следующие стадии:
А) определение IGF-1R(+) статуса указанного субъекта из биологического образца субъекта с использованием первого антитела против IGF-1R; и
Б) введение указанного конъюгата антитело-лекарственное средство пациенту, если данный субъект имеет IGF-1R(+) статус, и где:
указанное первое антитело против IGF-1R является:
i) антителом или его любым антигенсвязывающим фрагментом, содержащим тяжелую цепь с CDR-H1 SEQ ID No. 1, CDR-H2 SEQ ID No. 2 и CDR-H3 SEQ ID No. 3 и легкую цепь с CDR-L1 SEQ ID No. 4, CDR-L2 SEQ ID No. 5 и CDR-L3 SEQ ID No. 6; или
ii) антителом или его любым антигенсвязывающим фрагментом, содержащим тяжелую цепь с CDR-H1 SEQ ID No. 11, CDR-H2 последовательности SEQ ID No. 12 и CDR-H3 последовательности SEQ ID No. 13 и легкую цепь с CDR-L1 последовательности SEQ ID No. 14, CDR-L2 последовательности SEQ ID No. 15 и CDR-L3 последовательности SEQ ID No. 16; и
указанный конъюгат антитело-лекарственное средство имеет следующую формулу (I):
n
Ab-(L-D)
или его фармацевтически приемлемая соль, где
Ab представляет собой второе антитело против IGF-1R или его антигенсвязывающий фрагмент, которое связывается с человеческим IGF-1R, и которое интернализуется после его связывания с IGF-1R;
L представляет собой линкер;
D представляет собой лекарственную группировку; и
n составляет от 1 до 12.
Данное изобретение также относится к набору для применения в лечении рака, экспрессирующего IGF-1R, содержащему по меньшей мере:
а) первое антитело против IGF-1R, состоящее из:
i) антитела или его любого антигенсвязывающего фрагмента, содержащего тяжелую цепь с CDR-H1 SEQ ID No. 1, CDR-H2 SEQ ID No. 2 и CDR-H3 SEQ ID No. 3 и легкую цепь с CDR-L1 SEQ ID No. 4, CDR-L2 SEQ ID No. 5 и CDR-L3 SEQ ID No. 6; или
ii) антитела или его любого антигенсвязывающего фрагмента, содержащего тяжелую цепь с CDR-H1 SEQ ID No. 11, CDR-H2 последовательности SEQ ID No. 12 и CDR-H3 последовательности SEQ ID No. 13 и легкую цепь с CDR-L1 последовательности SEQ ID No. 14, CDR-L2 последовательности SEQ ID No. 15 и CDR-L3 последовательности SEQ ID No. 16;
и
б) конъюгат антитело-лекарственное средство следующей формулы (I):
или его фармацевтически приемлемую соль,
где
Ab представляет собой второе антитело против IGF-1R или его антигенсвязывающий фрагмент, способное к связыванию с человеческим IGF-1R, выбранное из i) антитела, которое содержит три CDR тяжелой цепи последовательности SEQ ID No. 21, 22 и 23, и три CDR легкой цепи последовательности SEQ ID No. 24, 25 и 26; или ii) антитела, которое конкурирует за связывание с IGF-1R с антителом i); или iii) антитела, которое связывается с тем же самым эпитопом IGF-1R, что и антитело i);
L представляет собой линкер;
D представляет собой лекарственную группировку следующей формулы (II):
в которой:
2
3
R представляет собой СООН, СООСН или тиазолил;
3
1
6
R представляет собой Н или (С-С)алкил;
9
1
6
R представляет собой Н или (С-С)алкил;
m представляет собой целое число от 1 до 8;
волнистая линия показывает точку присоединения к L; и
n составляет от 1 до 12.
I - определения
Термины «антитело», «антитела», «ab», «Ab», «MAb» или «иммуноглобулин» используются взаимозаменяемо в самом широком смысле и включают моноклональные антитела, выделенные, генетически модифицированные или рекомбинантные антитела (например, полноразмерные или интактные моноклональные антитела), поликлональные антитела, многовалентные антитела или мультиспецифичные антитела (например, биспецифичные антитела) и также фрагменты антител, при условии, что они демонстрируют желательную биологическую активность. Более конкретно, такая молекула состоит из гликопротеина, содержащего по меньшей мере две тяжелые цепи (Н) и две легкие цепи (L), связанные между собой дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь содержит вариабельную область (или домен) тяжелой цепи (сокращенную в данном документе как HCVR или VH) и константную область тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи содержит три домена: СН1, СН2 и СН3. Каждая легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи (сокращенную в данном документе как LCVR или VL) и константную область легкой цепи. Константная область легкой цепи содержит один домен - CL. Области VH и VL могут быть дополнительно подразделены на области гипервариабельности, именуемые областями, определяющими комплементарность (CDR), перемежающиеся с областями, которые являются более консервативными, именуемыми каркасными областями (FR). Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, организованных от аминоконца до карбоксиконца в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с клетками хозяина или факторами, включающими разные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент (C1q) классической системы комплемента.
Выражение «антитело к IGF-1R» в том виде, в котором оно используется в настоящем описании изобретения, следует интерпретировать как аналогичное «антителу против IGF-1R», и оно означает антитело, способное к связыванию с IGF-1R.
Термин «моноклональное антитело» или «Mab» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к антителу, полученному из популяции по существу гомогенных антител, т.е. индивидуальные антитела популяции являются идентичными, за исключением возможных встречающихся в природе мутаций, которые могут присутствовать в минорных количествах. Будучи направленными против одного эпитопа, моноклональные антитела являются высокоспецифичными. Такие моноклональные антитела могут продуцироваться одним клоном В-клеток или гибридомы. Моноклональные антитела также могут быть рекомбинантными, т.е. продуцированными посредством белковой инженерии или химического синтеза. Моноклональные антитела также могут быть выделены из библиотек фагового дисплея. Кроме того, в отличие от препаратов поликлональных антител, которые типично включают разные антитела, направленные против разных детерминант или эпитопов, каждое моноклональное антитело направлено против одного эпитопа антигена. Моноклональное антитело в данном документе включает мышиное, химерное и гуманизированное антитело, такое, как описано далее.
Термин «рекомбинантное антитело» относится к антителу, которое возникает в результате экспрессии рекомбинантной ДНК в пределах живых клеток. Рекомбинантное антитело по изобретению получают посредством применения лабораторных способов генетической рекомбинации, хорошо известных специалисту в данной области, создавая последовательности ДНК, которые не обнаруживались бы в биологических организмах.
2
2
Подразумевается то, что термин «антигенсвязывающий фрагмент» или «фрагмент, связывающийся с IGF-IR» антитела ADC согласно изобретению указывает любой пептид, полипептид или белок, сохраняющий способность связываться с мишенью (также обычно именуемой «антиген») антитела. В одном воплощении такие «антигенсвязывающие фрагменты» выбраны в группе, состоящей из фрагментов Fv, scFv (sc - одноцепочечный), Fab, F(ab'), Fab', scFv-Fc или диател, или любого фрагмента, у которых период полувыведения был бы увеличен химической модификацией, такой как добавление поли(алкилен)гликоля, такого как поли(этилен)гликоль («ПЭГилирование») (ПЭГилированные фрагменты называются Fv-ПЭГ, scFV-ПЭГ, Fab-ПЭГ, F(ab')-ПЭГ или Fab'-ПЭГ) («ПЭГ» - поли(этилен)гликоль), или включением в липосому, причем указанные фрагменты имеют по меньшей мере одну характерную CDR антитела согласно изобретению. Предпочтительно указанные «антигенсвязывающие фрагменты» будут составлены или будут содержать частичную последовательность вариабельного домена тяжелой или легкой цепи, из которого они получены, причем указанная частичная последовательность является достаточной для сохранения такой же специфичности связывания, что и антитело, из которого она происходит, и достаточной аффинности, предпочтительно по меньшей мере равной 1/100, более предпочтительно - по меньшей мере 1/10 аффинности антитела, из которого она происходит, по отношению к мишени. Более предпочтительно указанные «антигенсвязывающие фрагменты» будут составлены из или будут содержать по меньшей мере три CDR: CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 вариабельного домена тяжелой цепи и три CDR: CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 вариабельного домена легкой цепи антитела, из которого они происходят.
-6
Под терминами «связывание», «связывается» или тому подобным подразумевается то, что антитело или его любой антигенсвязывающий фрагмент образует комплекс с антигеном, который является относительно стабильным при физиологических условиях. Специфическое связывание может характеризоваться равновесной константой диссоциации по меньшей мере примерно 1×10 М. Способы определения того, связываются ли две молекулы, хорошо известны в данной области и включают, например, равновесный диализ, поверхностный плазмонный резонанс, анализы с радиоактивным мечением и тому подобное. Во избежание сомнений это не означает то, что указанное антитело могло не связываться или препятствовать, на низком уровне, с другим антигеном. Тем не менее, в качестве одного воплощения, указанное антитело связывается только с указанным антигеном.
Подразумевается, что области CDR или CDR указывают гипервариабельные области тяжелой и легкой цепей иммуноглобулинов, как определено IMGT. Уникальная нумерация IMGT была определена для сравнения вариабельных доменов, независимо от того, каким является рецептор антигена, тип цепи или вид [Lefranc М.-Р., Immunology Today 18, 509 (1997) / Lefranc М.-Р., The Immunologist, 7, 132-136 (1999) / Lefranc, M.-P., Pommie, C, Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L, Thouvenin-Contet, V. and Lefranc, Dev. Соmр. Immunol., 27, 55-77 (2003)]. При уникальной нумерации IMGT консервативные аминокислоты всегда имеют одинаковое положение, например, цистеин 23 (1-ый CYS), триптофан 41 (КОНСЕРВАТИВНЫЙ-TRP), гидрофобная аминокислота 89, цистеин 104 (2-ой CYS), фенилаланин или триптофан 118 (J-PHE или J-TRP). Уникальная нумерация IMGT обеспечивает стандартизированное ограничение каркасных областей (FR1-IMGT: положения 1-26, FR2-IMGT: 39-55, FR3-IMGT: 66-104 и FR4-IMGT: 118-128) и областей, определяющих комплементарность: CDR1-IMGT: 27-38, CDR2-IMGT: 56-65 и CDR3-IMGT: 105-117. Поскольку пробелы представляют собой незанятые положения, длины CDR-IMGT (показанные между скобками и разделенные точками, например, [8.8.13]) становятся ключевой информацией. Уникальная нумерация IMGT используется в 2D (двумерный) графических представлениях, именуемых IMGT Colliers de Perles [Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002) / Kaas, Q. and Lefranc, M.-P., Current Bioinformatics, 2, 21-30 (2007)], и в 3D (трехмерных) структурах в IMGT/3Dstructure-DB [Kaas, Q., Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., T cell receptor and MHC structural data. Nucl. Acids. Res., 32, D208-D210 (2004)].
Следует понимать то, что без противоречивого описания в настоящем описании изобретения, области, определяющие комплементарность, или CDR означают гипервариабельные области тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов, как определено согласно системе нумерации IMGT. Тем не менее, CDR также могут быть определены согласно системе нумерации Kabat (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, NIH, 1991 и более поздние издания). Имеются три CDR тяжелой цепи и три CDR легкой цепи. В данном документе термин «CDR» используется для указания, в зависимости от ситуации, одной или более чем одной или даже всех областей, содержащих большинство аминокислотных остатков, ответственных за аффинность связывания антитела в отношении антигена или эпитопа, который оно распознает. Для того чтобы упростить прочтение настоящей заявки, CDR согласно Kabat не определяются. Тем не менее, для специалиста в данной области было бы очевидным, используя определение CDR согласно IMGT, определить CDR согласно Kabat.
50
50
50
Термин полумаксимальная эффективная концентрация (ЕС) соответствует концентрации лекарственного средства, антитела или токсина, которая индуцирует ответ, находящийся посередине между базовым уровнем и максимумом после некоторого определенного времени воздействия. Она обычно используется как мера эффективности лекарственного средства. ЕС кривой ответа в зависимости от возрастающей дозы, следовательно, представляет концентрацию соединения, при которой наблюдается 50% его максимального эффекта. ЕС кривой дискретного ответа в зависимости от дозы представляет собой концентрацию соединения, при которой 50% популяции демонстрирует ответ после определенной продолжительности воздействия. Измерения концентрации типично следуют сигмоидной кривой, быстро возрастая при относительно маленьком изменении концентрации. Это можно определять математически посредством выведения линии наилучшего соответствия.
Термин «эпитоп» обозначает область антигена, которая связывается антителом. Эпитопы могут быть определены как структурные или функциональные. Функциональные эпитопы обычно представляют собой поднабор структурных эпитопов, и имеют те остатки, которые непосредственно содействуют аффинности взаимодействия. Эпитопы также могут быть конформационными, т.е. состоящими из нелинейной последовательности аминокислот. В некоторых воплощениях эпитопы могут включать детерминанты, которые представляют собой химически активные поверхностные группировки молекул, таких как аминокислоты, боковые сахарные цепи, фосфорильные группы или сульфонильные группы и, в некоторых воплощениях, могут иметь специфические трехмерные структурные характеристики и/или специфические характеристики заряда.
В значении по настоящему изобретению «идентичность» или «процентная доля идентичности» между двумя последовательностями нуклеиновых кислот или аминокислот обозначает процентную долю идентичных нуклеотидов или аминокислотных остатков между двумя последовательностями, подлежащими сравнению, полученную после оптимального выравнивания, причем данная процентная доля является чисто статистической, и различия между двумя последовательностями случайным образом распределяются по их длине. Сравнение двух последовательностей нуклеиновых кислот или аминокислот традиционно проводится посредством сравнения последовательностей после их оптимального выравнивания, причем указанное сравнение можно проводить по отрезкам или с использованием «окна выравнивания». Может проводиться оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения, помимо сравнения вручную, посредством алгоритма местной гомологии Smith и Waterman (1981) [Ad. Арр. Math. 2:482], посредством алгоритма местной гомологии Neddleman и Wunsch (1970) [J. Mol. Biol. 48:443], посредством способа поиска сходства Pearson и Lipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444] или посредством компьютерной программы, использующей данные алгоритмы (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в пакете программ Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, или посредством программы сравнения BLAST NR или BLAST P). Процентная доля идентичности рассчитывается посредством определения числа положений, в которых аминокислота, нуклеотид или остаток являются идентичными между двумя последовательностями, предпочтительно между двумя полными последовательностями, деля число идентичных положений на общее число положений в окне выравнивания, и умножая результат на 100 с получением процентной доли идентичности между двумя последовательностями. Например, можно использовать программу BLAST - «BLAST 2 sequences» (Tatusova et al., "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol., 1999, Lett. 174:247-250), доступную на сайте http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html, с параметрами по умолчанию (а именно в отношении параметров «штраф за открытие пробела»: 5 и «штраф за удлинение пробела»: 2; причем выбранной матрицей является, например, матрица «BLOSUM 62», предложенная программой); процентная доля идентичности между двумя последовательностями для сравнения рассчитывается непосредственно программой. Для аминокислотной последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%-ную, предпочтительно 85%-ную, 90%-ную, 95%-ную и 98%-ную идентичность с эталонной аминокислотной последовательностью, предпочтительные примеры включают примеры, содержащие эталонную последовательность, определенные модификации, а именно делецию, присоединение или замену по меньшей мере одной аминокислоты, усечение или удлинение. В случае замены одной или более чем одной последовательной или непоследовательной аминокислоты, предпочтительными являются замены, при которых замененные аминокислоты заменяются «эквивалентными» аминокислотами. Здесь подразумевается то, что выражение «эквивалентные аминокислоты» указывает любые аминокислоты, вероятно заменяемые на одну из структурных аминокислот, однако, без модификации биологических активностей соответствующих антител, и из тех конкретных примеров, определенных ниже. Эквивалентные аминокислоты могут быть определены либо по их структурной гомологии с аминокислотами, которые ими заменяются, либо по результатам сравнительных анализов биологической активности между разными антителами, которые вероятно будут получены. В качестве неограничивающего примера, в Таблице 1 ниже обобщены возможные замены, которые, вероятно, проводятся, не приводя к значимой модификации биологической активности соответствующего модифицированного антитела; обратные замены, естественно, возможны при тех же самых условиях. В более предпочтительном воплощении для аминокислотной последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%-ную, предпочтительно 85%-ную, 90%-ную, 95%-ную и 98%-ную идентичность с эталонной аминокислотной последовательностью антитела, содержащего CDR, предпочтительные примеры включают по меньшей мере немодифицированные CDR, содержащиеся в контрольной последовательности.
Термины «нуклеиновая кислота», «нуклеиновая последовательность», «последовательность нуклеиновой кислоты», «полинуклеотид», «олигонуклеотид», «полинуклеотидная последовательность» и «нуклеотидная последовательность», используемые в настоящем описании взаимозаменяемо, означают точную последовательность нуклеотидов, модифицированную или нет, определяющую фрагмент или область нуклеиновой кислоты, содержащую неприродные нуклеотиды или не содержащую, и представляющую собой либо двухцепочечную ДНК, одноцепочечную ДНК, либо продукты транскрипции указанных ДНК.
Такие фразы, как «субъект, который получил бы пользу от введения терапии против IGF-1R» и «субъект, чувствительный к лечению терапией против IGF-1R» в том виде, в котором они используются в данном документе, включают субъектов, таких как субъекты-млекопитающие, которые получили бы пользу от введения терапии против IGF-1R, например, для выявления IGF-1R (например, для диагностической процедуры) и/или от лечения, т.е. временное облегчение или предупреждение заболевания, такого как рак, с использованием молекулы, связывающейся с IGF-1R, которая связывается с IGF-1R. Как более подробно описано в данном документе, молекула, связывающаяся с IGF-1R, может быть использована в неконъюгированной форме или может быть конъюгирована, например, с лекарственным средством, пролекарством или изотопом.
Под фразой «раковые заболевания, экспрессирующие IGF-1R» подразумевается любое раковое заболевание, при котором экспрессируется, сверхэкспрессируется или ненормально экспрессируется IGF-1R. В некоторых воплощениях она включает предраковое поражение, ненормальный рост клеток, доброкачественную опухоль, злокачественную опухоль, или «рак» содержит клетки, которые экспрессируют, сверхэкспрессируют или ненормально экспрессируют IGF-1R.
Термин «диагностирование» заболевания в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к способу идентификации или выявления присутствия патологического гиперпролиферативного онкогенного расстройства, ассоциированного с или опосредованного экспрессией IGF-1R, отслеживанию прогрессирования заболевания и идентификации или выявлению клеток или образцов, которые указывают на расстройство, ассоциированное с экспрессией IGF-1R.
Термин «прогноз» в том виде, в котором он используется в данном документе, означает вероятность выздоровления от заболевания или прогнозирование вероятного развития или исхода заболевания. Например, если образец от субъекта является негативным в отношении окрашивания антителом против IGF-1R, тогда «прогноз» для данного субъекта лучше, чем когда образец является позитивным в отношении окрашивания на IGF-1R. Образцы можно подвергать бальной оценке на уровни экспрессии IGF-1R в подходящем масштабе, как будет более подробно описано далее.
«Биологический образец» может представлять собой любой образец, который может быть отобран у субъекта. Такой образец должен обеспечивать определение уровней экспрессии биомаркера по изобретению. Природа образца, таким образом, будет зависеть от природы опухоли. Предпочтительные биологические образцы включают такие образцы, как образец крови, образец плазмы или образец лимфы, если раковое заболевание представляет собой опухоль жидких тканей. Предпочтительные биологические образцы включают такие образцы, как образец биопсии или образец, отобранный при хирургической резекционной терапии, если рак представляет собой солидную опухоль. Предпочтительно биологический образец представляет собой биологическую жидкость, такую как сыворотка, клетки цельной крови, образец ткани или биопсии человеческого происхождения. Данный образец, например, может включать подвергнувшуюся биопсии ткань, которую можно с удобством подвергнуть анализу на присутствие патологического онкогенного расстройства, ассоциированного с экспрессией IGF-1R.
«Статус IGF-1R» в пределах значения по изобретению относится к классификации опухоли в отношении класса IGF-1R положительной [IGF-1R (+)] или IGF-1R отрицательной [IGF-1R (-)] на основе определения уровня экспрессии IGF-1R при измерении любыми способами, такими как иммуногистохимия (IHC), флуоресцентная сортировка клеток (FACS) или другие способы, известные спецалисту в данной области.
II - первое антитело против IGF-1R
В одном воплощении изобретения первое антитело против IGF-1R или его любой антигенсвязывающий фрагмент содержит:
i) тяжелую цепь с CDR-H1 последовательности SEQ ID No. 1, CDR-H2 последовательности SEQ ID No. 2 и CDR-H3 последовательности SEQ ID No. 3; и
ii) легкую цепь с CDR-L1 последовательности SEQ ID No. 4, CDR-L2 последовательности SEQ ID No. 5 и CDR-L3 последовательности SEQ ID No. 6.
Первое антитело против IGF-1R характеризуется тем, что оно содержит вариабельный домен тяжелой цепи последовательности SEQ ID No. 7 или любой последовательности с по меньшей мере 90%-ной гомологией с последовательностью SEQ ID No. 7.
Первое антитело против IGF-1R характеризуется тем, что оно содержит вариабельный домен легкой цепи последовательности SEQ ID No. 8 или любой последовательности с по меньшей мере 90%-ной гомологией с последовательностью SEQ ID No. 8.
Согласно указанному воплощению первое антитело против IGF-1R, именуемое 810D12, характеризуется тем, что оно содержит вариабельный домен тяжелой цепи последовательности, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID No. 7, или последовательность с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной гомологией с последовательностью SEQ ID No. 7 после оптимального выравнивания; и/или что оно содержит вариабельный домен легкой цепи последовательности, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID No. 8 или последовательность с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной гомологией с последовательностью SEQ ID No. 8 после оптимального выравнивания.
В другом воплощении изобретения первое антитело против IGF-1R или его любой антигенсвязывающий фрагмент содержит:
i) тяжелую цепь с CDR-H1 последовательности SEQ ID No. 11, CDR-H2 последовательности SEQ ID No. 12 и CDR-H3 последовательности SEQ ID No. 13; и
ii) легкую цепь с CDR-L1 последовательности SEQ ID No. 14, CDR-L2 последовательности SEQ ID No. 15 и CDR-L3 последовательности SEQ ID No. 16.
Первое антитело против IGF-1R характеризуется тем, что оно содержит вариабельный домен тяжелой цепи последовательности SEQ ID No. 17 или любой последовательности с по меньшей мере 90%-ной гомологией с последовательностью SEQ ID No. 17.
Первое антитело против IGF-1R характеризуется тем, что оно содержит вариабельный домен легкой цепи последовательности SEQ ID No. 18 или любой последовательности с по меньшей мере 90%-ной гомологией с последовательностью SEQ ID No. 18.
Согласно указанному воплощению первое антитело против IGF-1R, именуемое 810D12, характеризуется тем, что оно содержит вариабельный домен тяжелой цепи последовательности, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID No. 17 или последовательность с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной гомологией с последовательностью SEQ ID No. 17 после оптимального выравнивания; и/или что оно содержит вариабельный домен легкой цепи последовательности, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID No. 18 или последовательность с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной гомологией с последовательностью SEQ ID No. 18 после оптимального выравнивания.
Конкретным аспектом данного изобретения является то, что первое антитело против IGF-1R или его любой антигенсвязывающий фрагмент не связывается с инсулиновым рецептором (IR).
В другом воплощении первое антитело против IGF-1R по изобретению состоит из моноклонального антитела.
В другом воплощении первое антитело против IGF-1R по изобретению состоит из рекомбинантного антитела.
В другом воплощении антитело по изобретению состоит из химически синтезированного антитела.
«Антитело против IGF-1R» включает (без определения противоположного) мышиные, химерные и гуманизированные версии указанного антитела против IGF-1R.
Для большей ясности в следующей Таблице 2 проиллюстрированы последовательности антител 810D12 (Таблица 2а) и 816С12 (Таблица 2б), определенные согласно IMGT.
В одном воплощении моноклональное антитело в данном документе включает мышиное, химерное и гуманизированное антитело.
Первое антитело против IGF-1R может быть получено из гибридомы мышиного происхождения, депонированной во Французскую коллекцию культур микроорганизмов (CNCM, Институт Пастера, Париж, Франция), причем указанная гибридома получается слиянием спленоцитов/лимфоцитов иммунизированных мышей Balb/C и клеток миеломы клеточной линии Sp 2/O-Ag 14. Указанная гибридома может быть выбрана из i) гибридомы мышиного происхождения, депонированной в CNCM, Институт Пастера, Париж, Франция, 17 сентября 2014 г. под номером I-4893, или ii) гибридомы мышиного происхождения, депонированной в CNCM, Институт Пастера, Париж, Франция, 17 сентября 2014 г. под номером I-4894.
В настоящем изобретении очевидно может быть использовано первое моноклональное антитело против IGF-1R, именуемое здесь 810D12, или его любой антигенсвязывающий фрагмент, секретируемые указанной гибридомой I-4893.
В настоящем изобретении очевидно может быть использовано первое моноклональное антитело против IGF-1R, именуемое в данном документе 816С12, или его любой антигенсвязывающий фрагмент, секретируемые указанной гибридомой I-4894.
В другом воплощении указанное первое антитело против IGF-1R может кодироваться следующими нуклеотидными последовательностями:
i) SEQ ID No. 9 для вариабельного домена тяжелой цепи и/или SEQ ID No. 10 для вариабельного домена легкой цепи;
ii) SEQ ID No. 19 для вариабельного домена тяжелой цепи и/или SEQ ID No. 20 для вариабельного домена легкой цепи.
В Таблице 3 ниже обобщены разные нуклеотидные последовательности, касающиеся антитела 810D12 (Таблица 3а) и антитела 816С12 (Таблица 3б).
Также раскрывается применение первого антитела против IGF-1R по изобретению в качестве биомаркера. Могут использоваться способы выявления или диагностирования разных гиперпролиферативных онкогенных расстройств, ассоциированных с экспрессией IGF-1R, иллюстрируемых примерами рака предстательной железы, остеосаркомы, рака легкого, рака молочной железы, рака эндометрия, глиобластомы, рака толстого кишечника, рака желудка, рака почки, рака поджелудочной железы, рака головы и шеи или любого другого ракового заболевания, ассоциированного с экспрессией IGF-1R, но не ограничивающихся ими. Как было бы понятно обычному специалисту в данной области, уровень экспрессии антитела, ассоциированного с конкретным расстройством, будет варьировать, в зависимости от природы и/или тяжести предсуществующего состояния.
Определение статуса IGF-1R может осуществляться любым способом или методикой, известными или используемыми в настоящее время специалистом в данной области (обычно на основе определения уровня экспрессии IGF-1R). Тем не менее, некоторые неограничивающие примеры описываются ниже.
Определение стадии имеет потенциальное прогностическое значение и дает критерии для разработки оптимальной терапии. Simpson et al., J. Clin. Oncology 18:2059 (2000). Например, выбор лечения для солидных опухолей основывается на определении стадии опухоли, которое обычно осуществляется с использованием анализа опухоли/узелков/метастазов (TNM) от Американского объединенного комитета по раку (AJCC). Обычно признается то, что, хотя данный анализ и система определения стадии и дают некоторую ценную информацию относительно стадии, на которой у пациента был диагностирован солидный рак, они являются неточными и недостаточными. В частности, они не могут идентифицировать самые ранние стадии прогрессирования опухоли.
В одном воплощении способ определения бальной оценки IGF-1R опухолевых клеток у субъекта in vitro или ex vivo может включать следующие стадии:
(а) приведение в контакт биологического образца от указанного субъекта с первым антителом против IGF-1R или его антигенсвязывающим фрагментом, как описано выше;
(б) количественное измерение посредством флуоресцентной сортировки клеток (FACS) или иммуногистохимии (IHC) уровня связывания указанного первого антитела против IGF-1R или его антигенсвязывающего фрагмента с IGF-1R в указанном биологическом образце; и
(в) бальная оценка опухолевых клеток посредством сравнения количественно измеренного уровня, полученного на стадии (б), с подходящей шкалой на основе двух параметров, которыми являются интенсивность окрашивания и процентная доля позитивных клеток.
В одном воплощении первое антитело против IGF-1R способно связываться с IGF-1R, когда образцы ткани являются зафиксированными в формалине, замещенными-зафиксированными в формальдегиде, зафиксированными в Glyco-fixx, залитыми в парафин и/или замороженными.
Можно использовать любой традиционный способ анализа риска для оценки прогностического значения IGF-1R. Репрезентативные способы анализа включают регрессионный анализ Кокса, который представляет собой полупараметрический способ моделирования выживания или данных по времени до события в присутствии цензурируемых случаев (Hosmer and Lemeshow, 1999; Сох, 1972). В отличие от других анализов выживания, например, таблиц выживания или Каплана-Мейера, анализ Кокса обеспечивает включение предикторных переменных (ковариат) в модели. С использованием традиционного способа анализа, например, анализа Кокса, можно протестировать гипотезы в отношении корреляции статуса экспрессии IGF-1R в первичной опухоли со временем до начала либо рецидива заболевания (время выживания без заболевания или время до метастатического заболевания), либо временем до смерти от заболевания (общее время выживания). Регрессионный анализ Кокса также известен как модель пропорциональных рисков Кокса. Данный способ является стандартом для тестирования прогностического значения опухолевого маркера в отношении времени выживания пациента. При использовании в многомерном режиме эффект нескольких ковариат тестируется параллельно таким образом, что могут быть идентифицированы индивидуальные ковариаты, которые имеют независимое прогностическое значение, т.е. самые полезные маркеры. Термин отрицательный или положительный «статус IGF-1R» также может называться [IGF-1R(-)] или [IGF-1R(+)].
Образец может «подвергаться бальной оценке» во время постановки диагноза или мониторинга ракового заболевания. Бальная оценка в ее самой простой форме может быть категориальной отрицательной или положительной, судя по визуальной проверке образцов посредством иммуногистохимии. Более количественная бальная оценка включает суждение по двум параметрам: интенсивности окрашивания и доле окрашенных («позитивных») клеток, которые отобраны.
В одном воплощении для обеспечения стандартизации образцы могут подвергаться бальной оценке на уровни экспрессии IGF-1R в разных масштабах, большинство из них основывается на оценке интенсивности продукта реакции и процентной доли позитивных клеток (Payne et al., Predictive markers in breast cancer - the present, Histopathology 2008, 52, 82-90).
В другом воплощении указанная бальная оценка включает применение подходящей шкалы на основе интенсивности окрашивания и процентной доли позитивных клеток.
В качестве первого примера, по аналогии с быстрой бальной оценкой Оллреда для IHC оценки рецептора эстрогена и рецептора прогестерона, образцы могут подвергаться бальной оценке на уровни экспрессии IGF-1R по глобальной шкале от 0 до 8, объединяющей баллы в отношении интенсивности реакционной способности и в отношении доли окрашенных клеток (Harvey JM, Clarck GM, Osborne CK, Allred DC; J. Clin. Oncol. 1999; 17; 1474-1481). Более конкретно, первые критерии интенсивности реакционной способности подвергаются бальной оценке по шкале от 0 до 3, причем 0 соответствует «отсутствию реакционной способности», и 3 соответствует «сильной реакционной способности». Вторые критерии доли реакционноспособных подвергаются бальной оценке по шкале от 0 до 5, причем 0 соответствует «отсутствию реакционной способности», и 5 - «доле реакционноспособных 67-100%». Интенсивность балла реакционной способности и балла доли реакционноспособных затем суммируется с получением общего балла от 0 до 8. Общий балл 0-2 считается отрицательным, тогда как общий балл 3-8 считается положительным.
Согласно данной шкале термины отрицательный или положительный «статус IGF-1R» опухолей, используемые в настоящем описании, относятся к уровням экспрессии IGF-1R, которые соответствуют баллам 0-2 или 3-8 по шкале Оллреда соответственно.
В Таблице 4 ниже проиллюстрировано руководство для интерпретации результатов IHC согласно способу Оллреда.
Согласно изобретению указанная подходящая шкала может представлять собой шкалу от 0 до 8, где отсутствию реактивности дается бальная оценка 0, и сильной реактивности у доли реактивных 67-100% дается бальная оценка 8.
Другими словами описывается способ определения статуса опухоли от субъекта in vitro или ex vivo, где указанный способ включает следующие стадии: (а) бальная оценка опухоли от субъекта согласно шкале Оллреда; и (б) определение того, что статус опухоли является [IGF-1R(+)] с баллом Оллреда 3-8; или (в) определение того, что статус опухоли является [IGF-1R(-)] с баллом Оллреда 0-2.
В конкретном аспекте изобретения опухоль является [IGF-1R(+)] с баллом Оллреда 3.
В конкретном аспекте изобретения опухоль является [IGF-1R(+)] с баллом Оллреда 4.
В конкретном аспекте изобретения опухоль является [IGF-1R(+)] с баллом Оллреда 5.
В конкретном аспекте изобретения опухоль является [IGF-1R(+)] с баллом Оллреда 6.
В конкретном аспекте изобретения опухоль является [IGF-1R(+)] с баллом Оллреда 7.
В конкретном аспекте изобретения опухоль является [IGF-1R(+)] с баллом Оллреда 8.
В другом конкретном аспекте изобретения опухоль является [IGF-1R(+)] с баллом Оллреда от 3 до 8.
Другой конкретный способ определения статуса IGF-1R опухолевых клеток у субъекта in vitro или ex vivo, описанный в данном документе, отличается тем, что он включает следующие стадии:
(а) бальная оценка IGF-1R опухолевых клеток, как описано выше; и
(б) определение того, что статусом IGF-1R опухолевых клеток является [IGF-1R(+)] с баллом 3-8; или
(в) определение того, что статусом IGF-1R опухолевых клеток является [IGF-1R(-)] с баллом 0-2.
В качестве второго примера, по аналогии с традиционной бальной оценкой в отношении оценки IHC, например, рецептора HER-2, образцы могут подвергаться бальной оценке на уровни экспрессии IGF-1R в некотором отношении более простым способом бальной оценки, интегрирующим интенсивность окрашивания (предпочтительно мембранного окрашивания) и долю клеток, которые демонстрируют окрашивание, по объединенной шкале от 0 до 3+.
По данной шкале, именуемой упрощенная шкала, 0 и 1+ представляют собой отрицательное, тогда как 2+ и 3+ представляют собой положительное окрашивание. Тем не менее, баллы 1+ - 3+ могут быть записаны как положительные, так как каждый положительный балл может быть ассоциирован со значительно большим риском рецидива и смертельного заболевания по сравнению с баллом 0 (отрицательным), но увеличение интенсивности среди положительных баллов может давать дополнительное уменьшение риска.
В общем, термины отрицательный или положительный «статус IGF-1R» опухолей, используемые в настоящем описании, относятся к уровням экспрессии IGF-1R, которые соответствуют баллам 0-1+ или 2+ - 3+ по упрощенной шкале соответственно. Следует рассматривать только полную круговую мембранную реактивность инвазивной опухоли, и часто она имеет сходство с видом мелкоячеистой проволочной сетки. Согласно современным руководствам образцы с пограничной бальной оценкой (балл 2+ или 3+) в отношении IGF-1R требуют дополнительной оценки. Анализ IHC должен быть отброшен и либо повторен, либо должно быть проведено тестирование FISH (флуоресцентная гибридизация in situ) или любым другим способом, если, в качестве неограничивающего примера, контроли не являются такими, как ожидается, артефакты затрагивают большую часть образца, и образец имеет сильную мембранную позитивность в отношении нормальных протоков молочной железы (внутренние контроли), свидетельствуя об избыточной демаскировке антигена.
+
+
Подходящая шкала может представлять собой шкалу от 0 до 3, где отсутствующей мембранной реактивности опухолевых клеток дается бал 0, и сильной полной реактивности у более чем 10% опухолевых клеток дается бал 3.
+
+
+
Более подробно, как описано выше, указанной подходящей шкалой является шкала от 0 до 3, где отсутствующей мембранной реактивности опухолевых клеток дается бал 0, едва ощутимой мембранной реактивности у более чем 10% опухолевых клеток дается бал 1; полной мембранной реактивности от слабой до умеренной у более чем 10% опухолевых клеток дается бал 2; и сильной полной реактивности у более чем 10% опухолевых клеток дается бал 3.
Другими словами, описывается способ определения статуса опухоли от субъекта in vitro или ex vivo, где указанный способ включает следующие стадии: (а) бальная оценка опухоли от субъекта согласно упрощенной шкале, как описано выше; и (б) определение того, что статусом опухоли является [IGF-1R(+)] с баллом 2+ или 3+; или (в) определение того, что статусом опухоли является [IGF-1R(-)] с баллом 0 или 1+.
В конкретном аспекте изобретения опухоль представляет собой [IGF-1R(+)] с баллом 2+.
В конкретном аспекте изобретения опухоль представляет собой [IGF-1R(+)] с баллом 3+.
В другом конкретном аспекте изобретения опухоль представляет собой [IGF-1R(+)] с баллом 2+ или 3+.
В другом воплощении способ определения статуса IGF-1R опухолевых клеток у субъекта in vitro или ex vivo может включать следующие стадии:
(а) бальная оценка IGF-1R опухолевых клеток от указанного субъекта согласно способу, описанному выше; и
(б) определение того, что статусом IGF-1R опухолевых клеток является [IGF-1R(+)] с баллом 2+ или 3+; или
(в) определение того, что статусом IGF-1R опухолевых клеток является [IGF-1R(-)] с баллом 0 или 1+.
Обычно результаты теста или анализа могут быть представлены в любом из целого ряда форматов. Данные результаты могут быть представлены качественно. Например, в отчете анализа может быть указано только то, был ли выявлен или не выявлен конкретный полипептид, возможно также с указанием порогов выявления. Результаты могут быть продемонстрированы в виде полуколичественных. Например, могут быть определены разные интервалы, и данным интервалам может быть приписан балл (например, от 0 до 3+ или от 0 до 8, в зависимости от использованной шкалы), который дает определенную степень количественной информации. Такой балл может отражать разные факторы, например, число клеток, в которых выявляется IGF-1R, интенсивность сигнала (которая может указывать уровень экспрессии IGF-1R или клеток, несущих IGF-1R) и т.д. Результаты могут быть показаны количественным способом, например, в виде процентной доли клеток, в которых выявляется IGF-1R, в виде концентрации белка и т.д.
Как будет понятно обычному специалисту в данной области, тип вывода результатов, который дает анализ, будет варьировать, в зависимости от технических ограничений анализа и биологической значимости, ассоциированной с выявлением полипептида. Например, в случае определенных полипептидов чисто качественный вывод результатов (например, то, выявляется ли полипептид или не выявляется с определенным уровнем выявления) дает значимую информацию. В других случаях необходим более количественный вывод результатов (например, тестируется отношение уровня экспрессии полипептида в образце относительно нормального уровня).
В другом аспекте изобретения определение статуса IGF-1R может осуществляться для отслеживания экспрессии IGF-1R в ответ на введение терапии, нацеленной на путь IGF-1R. Такое отслеживание может быть очень полезным, когда указанная терапия запускает понижающую регуляцию и/или деградацию IGF-1R.
Целью данного изобретения также является описание способа определения того, является ли онкогенное расстройство чувствительным к лечению терапией, нацеленной на IGF-1R, причем указанный способ включает следующие стадии:
(а) определение статуса IGF-1R опухолевых клеток субъекта in vitro или ex vivo согласно способу, описанному выше, и
(б) определение того, что если статусом IGF-1R опухолевых клеток является IGF-1R(+), тогда онкогенное расстройство является чувствительным к лечению лекарственным средством на основе антитела, нацеленным на путь IGF-1R.
В частности, отслеживание экспрессии IGF-1R на поверхности клетки могло бы быть критически важным инструментом оценки эффективности лечения во время клинических испытаний и «персонализированных» терапий.
Увеличение или уменьшение уровня IGF-1R указывает на развитие ракового заболевания, ассоциированного с IGF-1R. Таким образом, посредством измерения увеличения числа клеток, экспрессирующих IGF-1R, или изменений концентрации IGF-1R, присутствующей в разных тканях или клетках, можно определять является ли эффективной конкретная терапевтическая схема, нацеленная на уменьшение интенсивности злокачественного заболевания, ассоциированного с IGF-1R.
Другой целью данного изобретения также является способ определения эффективности in vitro или ex vivo терапевтической схемы, разработанной для уменьшения интенсивности онкогенного расстройства, ассоциированного с IGF-1R, у субъекта, страдающего от указанного расстройства, причем указанный способ включает следующие стадии:
(а) определение первого уровня экспрессии IGF-1R, как описано выше, в первом биологическом образце, соответствующем первому моменту времени указанного лечения;
(б) определение второго уровня экспрессии IGF-1R, как описано выше, во втором биологическом образце, соответствующем второму, более позднему моменту времени указанного лечения;
(в) расчет отношения указанного первого уровня экспрессии, полученного на стадии (а), к указанному второму уровню экспрессии, полученному на стадии (б); и
(г) определение того, что эффективность указанной терапевтической схемы является высокой, когда отношение стадии (в) больше, чем 1; или определение того, что эффективность указанной терапевтической схемы является низкой, когда отношение стадии (в) меньше или равно 1.
В предпочтительном воплощении указанная терапевтическая схема, разработанная для уменьшения интенсивности онкогенного расстройства, ассоциированного с IGF-1R, у субъекта, страдающего от указанного расстройства, включает введение указанному субъекту терапии, нацеленной на путь IGF-1R.
Целью данного изобретения также является предложение способа визуализации in vivo онкогенного расстройства, ассоциированного с экспрессией IGF-1R. Такой способ является полезным для локализации опухолевых клеток in vivo, а также для отслеживания их инвазивности. Подобным образом, данный способ является полезным для отслеживания прогрессирования и/или ответа на лечение у пациентов, у которых ранее был диагностирован рак, опосредованный IGF-1R.
Одним воплощением является способ выявления локализации опухолевых клеток, экспрессирующих IGF-1R, у субъекта, причем указанный способ включает следующие стадии:
а) введение первого антитела против IGF-1R или его антигенсвязывающего фрагмента субъекту; и
б) выявление связывания указанного первого антитела против IGF-1R,
при этом указанное связывание указывает на присутствие опухолевых клеток.
Что касается выявления присутствия экспрессирующей опухоли, можно использовать многие методики, известные специалисту в данной области. Тем не менее, предпочтительными способами являются IHC и FACS.
III - конъюгат антитело-лекарственное средство (ADC)
III.1 - второе антитело против IGF-1R (Ab)
В одном воплощении второе антитело Ab против IGF-1R состоит из рекомбинантного антитела.
В другом воплощении второе антитело Ab против IGF-1R состоит из химически синтезированного антитела.
В одном воплощении настоящей заявки эпитоп второго антитела Ab против IGF-1R предпочтительно локализуется во внеклеточном домене человеческого IGF-1R (также именуемом ECD IGF-1R).
50
-10
-10
-10
-10
В конкретном воплощении второе антитело Ab против IGF-1R или его любой антигенсвязывающий фрагмент способно связываться с IGF-1R с ЕС, составляющей от 10×10 до 1×10, и, более предпочтительно - от 8×10 до 2×10.
50
50
50
50
В качестве предпочтительного воплощения ЕС, определенная в настоящем изобретении, характеризует способность антитела связываться на ECD IGF-1R, экспонированном на человеческих опухолевых клетках. Параметр ЕС определяется с использованием анализа FACS. Параметр ЕС отражает концентрацию антитела, для которой получается 50% от максимального связывания на человеческом IGF-1R, экспрессируемом на человеческих опухолевых клетках. Каждое значение ЕС было рассчитано как средняя точка кривой доза-ответ с использованием программы аппроксимации четырехпараметрической регрессионной кривой (программа Prism). Данный параметр был выбран так, чтобы быть репрезентативным для физиологических/патологических состояний.
Конкуренция за связывание с IGF-1R может быть определена любыми способами или методиками, известными специалисту в данной области, такими как, без ограничения, методики с использованием радиоактивности, Biacore, ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ), проточная цитометрия и т.д. Фраза «которое конкурирует за связывание с IGF-1R» означает конкуренцию по меньшей мере 20%, предпочтительно по меньшей мере 50% и более предпочтительно по меньшей мере 70%.
Определение связывания с тем же самым эпитопом может осуществляться любыми способами или методиками, известными специалисту в данной области, такими как, без ограничения, методики с использованием радиоактивности, Biacore, ELISA, проточная цитометрия и т.д. Фраза «которое связывается с тем же самым эпитопом IGF-1R» означает конкуренцию по меньшей мере 20%, предпочтительно по меньшей мере 50% и более предпочтительно по меньшей мере 70%.
Как упомянуто выше, и в отличие от известного уровня техники, настоящее изобретение сфокусировано на специфичных антителах против IGF-1R, демонстрирующих высокую способность интернализоваться после связывания с IGF-1R. Антитело, которое «является интернализованным» или которое «интернализуется» (два данных выражения являются аналогичными) в том виде, в котором выражения используется в данном документе, представляет собой антитело, которое поглощается (в значении «поступает в») клеткой при связывании с IGF-1R на клетке млекопитающего. Такое антитело является интересным как часть ADC, так как оно адресует или направляет связанное цитотоксическое средство в раковые клетки-мишени. Сразу после интернализации цитотоксическое средство запускает гибель раковых клеток.
Неожиданно то, что все вторые антитела Ab против IGF-1R по изобретению демонстрируют одинаковые последовательности CDR-H2, CDR-H3 и CDR-L2, причем другие 3 CDR отличаются. Данное наблюдение кажется логичным, так как частью известного уровня техники является то, что в отношении специфичности связывания антитела CDR-H3 описывается как самая важная и сильнее всего вовлеченная в распознавание эпитопа.
Полагают, что важным ключом к успеху терапии ADC являются специфичность в отношении антигена-мишени и интернализация комплексов антиген-антитело в раковые клетки. Очевидно то, что неинтернализующиеся антигены являются менее эффективными, чем интернализующиеся антигены для доставки цитотоксических агентов. Способы интернализации варьируют среди антигенов и зависят от многих параметров, на которые могут влиять антитела.
В ADC цитотоксический агент придает цитотоксическую активность, а используемое антитело отвечает за специфичность в отношении раковых клеток, а также служит в качестве вектора для входа в клетки для правильного адресования цитотоксического агента. Таким образом, для улучшения ADC антитело может демонстрировать высокую способность к интернализации в раковые клетки-мишени. Эффективность интернализации, опосредованной антителом, значительно отличается, в зависимости от эпитопа-мишени. Выбор мощных интернализующих антител против IGF-1R требует разных экспериментальных данных, не только из исследования понижающей регуляции IGF-1R, но также и после интернализации антитела против IGF-1R в клетки.
В одном воплощении интернализация второго Ab против IGF-1R может оцениваться посредством иммунофлуоресценции или FACS (проточная цитометрия) (как проиллюстрировано ниже в настоящей заявке) или любым способом или процессом, известным специалисту в данной области, специфичным в отношении механизма интернализации. В предпочтительном воплощении антитело или ADC согласно изобретению может индуцировать интернализацию после связывания с IGF-1R по меньшей мере 30%, предпочтительно 50% и более предпочтительно - 80%.
Комплекс IGF-1R/второе антитело Ab против IGF-1R интернализуется после связывания второго антитела Ab против IGF-1R с ECD указанного IGF-1R, и индуцируется уменьшение количества IGF-1R на поверхности клеток. Данное уменьшение можно количественно измерять любым способом, известным специалисту в данной области, таким как, в качестве неограничивающих примеров: вестерн-блоттинг, FACS и иммунофлуоресценция.
В одном воплощении данное уменьшение, отражающее, таким образом, интернализацию, предпочтительно можно измерять FACS и выражать как различие или дельту между средней интенсивностью флуоресценции (MFI), измеренной при 4°С и MFI, измеренной при 37°С после 4 часов инкубации со вторым антителом Ab против IGF-1R.
4°C
37°C
В качестве неограничивающего примера данная дельта определяется на основе MFI, полученных с необработанными клетками и клетками, обработанными вторым антителом Ab против IGF-1R, с использованием i) клеток рака молочной железы MCF7 после 4-часового инкубационного периода со вторым антителом Ab против IGF-1R и ii) вторичного антитела, меченного Alexa488. Данный параметр определяется как рассчитанный с использованием следующей формулы: Δ(MFI - MFI).
Данное различие между MFI отражает понижающую регуляцию IGF-1R, так как MFI пропорциональны IGF-1R, экспрессируемому на поверхности клетки.
4°C
37°C
В преимущественном аспекте антитела состоят из антител, запускающих Δ(MFI - MFI) на MCF-7, составляющее по меньшей мере 280, предпочтительно по меньшей мере 400.
Более подробно, вышеупомянутую дельту можно измерять согласно следующему способу, который необходимо рассматривать в качестве иллюстративного и неограничивающего примера:
а) обработка и инкубирование интересующих опухолевых клеток со вторым антителом Ab против IGF-1R либо в холодной (4°С), либо в теплой (37°С) полной культуральной среде;
б) обработка обработанных клеток стадии а) и, параллельно, необработанных клеток вторичным антителом;
в) измерение MFI (представляющей количество IGF-1R, присутствующего на поверхности) для обработанных и необработанных клеток вторичным меченым антителом, способным связываться с антителом по изобретению; и
г) расчет дельты как вычитание MFI, полученной с обработанными клетками, из MFI, полученной с необработанными клетками.
Из данной дельта MFI можно определять процентную долю интернализации как:
4°C
37°C
4°C
100×(MFI-MFI) / MFI.
Со вторыми антителами Ab против IGF-1R ADC на MCF7, предпочтительно, процентная доля интернализации составляет от 50% до 99%, от 70% до 90%, предпочтительно от 75% до 87%.
Конкретное преимущество вторых антител Ab против IGF-1R основывается на их скорости интернализации.
Общеизвестно то, что для ADC желательно, чтобы используемые антитела демонстрировали быструю скорость интернализации, предпочтительно в пределах 24 часов с момента введения антитела, более предпочтительно в пределах 12 часов и даже более предпочтительно - в пределах 6 часов.
В настоящем изобретении скорость интернализации, также именуемая уменьшение уровня антитела, связанного с поверхностью клетки, или падение уровня антитела на поверхности клетки, выражается как t1/2 (время полужизни) и соответствует необходимому времени для получения 50%-ного уменьшения ΔMFI (данный аспект будет совершенно понятным в отношении следующих примеров).
Конкретным преимуществом является то, что вторые антитела Ab против IGF-1R имеют t1/2, составляющее от 5 до 25 минут и, предпочтительно, от 10 до 20 минут.
Второе антитело Ab против IGF-1R или его любой антигенсвязывающий фрагмент может содержать три CDR тяжелой цепи с CDR-H2 последовательности SEQ ID No. 22 и CDR-H3 последовательности SEQ ID No. 23 и три CDR легкой цепи с CDR-L2 последовательности SEQ ID No. 25.
Второе антитело Ab против IGF-1R или его любой антигенсвязывающий фрагмент может содержать три CDR тяжелой цепи последовательностей SEQ ID No. 21, 22 и 23, и три CDR легкой цепи последовательностей SEQ ID No. 24, 25 и 26.
В одном воплощении второе антитело Ab против IGF-1R или его любой антигенсвязывающий фрагмент может содержать три CDR тяжелой цепи, содержащие или состоящие из последовательностей SEQ ID No. 21, 22 и 23 или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%-ную, предпочтительно 85%-ную, 90%-ную, 95%-ную и 98%-ную идентичность с SEQ ID No. 21, 22 и 23, и три CDR легкой цепи, содержащие или состоящие из последовательностей SEQ ID No. 24, 25 и 26 или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%-ную, предпочтительно 85%-ную, 90%-ную, 95%-ную и 98%-ную идентичность с SEQ ID No. 24, 25 или 26.
В другом воплощении второе антитело Ab против IGF-1R или его любой антигенсвязывающий фрагмент содержит три CDR тяжелой цепи, содержащие последовательности SEQ ID No. 21, 22 и 23; и три CDR легкой цепи, содержащие последовательности SEQ ID No. 24, 25 и 26.
Согласно конкретному аспекту второе антитело Ab против IGF-1R не связывается с инсулиновым рецептором (IR). Данный аспект интересен, так как антитело, описанное в данном документе, не будет иметь какого-либо отрицательного влияния на IR, имея в виду метаболизм инсулина.
В другом воплощении еще одного другого преимущественного аспекта второе антитело Ab против IGF-1R способно связываться не только с человеческим IGF-1R, но также и с IGF-1R обезьяны и, более конкретно, с IGF-1R яванского макака. Данный аспект также представляет интерес, так как он будет облегчать оценку токсичности, требующуюся для клинических испытаний.
В еще одном другом воплощении второе антитело Ab против IGF-1R состоит из моноклонального антитела.
Второе антитело Ab против IGF-1R предпочтительно происходит из гибридомы мышиного происхождения, депонированной во Французскую коллекцию культур микроорганизмов (CNCM, Институт Пастера, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, Франция), причем указанную гибридому получают слиянием спленоцитов/лимфоцитов иммунизированных мышей Balb/C и клеток миеломы линии клеток Sp 2/O-Ag 14.
Указанная мышиная гибридома может быть выбрана из гибридом I-4757, I-4773, I-4775, I-4736 и I-4774, депонированных в CNCM, Институт Пастера, Франция, 30 мая 2013 г., 26 июня 2013 г., 26 июня 2013 г., 24 апреля 2013 г. и 26 июня 2013 г. соответственно.
В конкретном аспекте второе антитело Ab против IGF-1R может представлять собой антитело, выбранное из: i) антитела, продуцированного гибридомами I-4757, I-4773, I-4775, I-4736 и I-4774, депонированными в CNCM, Институт Пастера, Франция, 30 мая 2013 г., 26 июня 2013 г., 26 июня 2013 г., 24 апреля 2013 г. и 26 июня 2013 г. соответственно, или и) антитела, которое конкурирует за связывание с IGF-1R с антителом i); или iii) антитела, которое связывается с тем же самым эпитопом IGF-1R, что и антитело i).
В одном воплощении второе антитело Ab против IGF-1R по изобретению состоит из мышиного антитела, именуемого ниже m[название антитела).
В одном воплощении второе антитело Ab против IGF-1R состоит из химерного антитела, именуемого ниже с[название антитела].
В одном воплощении второе антитело Ab против IGF-1R состоит из гуманизированного антитела, именуемого ниже hz[название антитела].
Во избежание сомнений в следующем описании изобретения выражения «антитело против IGF-1R» и «[название антитела]» являются аналогичными и включают (без описания противоположного) мышиные, химерные и гуманизированные версии указанного антитела против IGF-1R или указанного «[название антитела]». Когда это необходимо, используется префикс m- (мышиное), с- (химерное) или hz- (гуманизированное).
Для большей ясности в следующей Таблице 6а проиллюстрированы последовательности CDR, определенные согласно IMGT, для предпочтительных вторых антител Ab против IGF-1R. В объеме настоящего изобретения может содержаться любое другое антитело, демонстрирующее такие же характеристики.
Для специалиста в данной области будет очевидно то, что любая комбинация 6 CDR, как описано выше, должна рассматриваться как часть настоящего изобретения.
Как можно видеть из данной Таблицы 6а, все вторые антитела Ab против IGF-1R, описанные в данном документе, имеют одинаковые последовательности CDR-H2, CDR-H3 и CDR-L2, причем данное свойство представляет особый интерес, как описано выше.
В данном аспекте второе антитело Ab против IGF-1R представляет собой мышиное (m) антитело.
В другом аспекте второе антитело Ab против IGF-1R представляет собой химерное (с) антитело.
Химерное антитело представляет собой антитело, содержащее природную вариабельную область (легкой цепи и тяжелой цепи), происходящую из антитела данного вида, в комбинации с константными областями легкой цепи и тяжелой цепи антитела гетерологичного вида по отношению к указанному данному виду.
Химерные антитела можно получать с использованием методик генной инженерии. Например, химерное антитело могло бы быть получено клонированием рекомбинантной ДНК, содержащей промотор и последовательность, кодирующую вариабельную область моноклонального антитела, не являющегося человеческим, а именно мышиного, и последовательность, кодирующую константную область антитела гетерологичного вида, предпочтительно человека. Химерное антитело ADC согласно изобретению, кодируемое одним таким рекомбинантным геном, могло бы представлять собой, например, мышино-человеческую химеру, причем специфичность данного антитела определяется вариабельной областью, происходящей из мышиной ДНК, и его изотипом, определяемым константной областью, происходящей из человеческой ДНК.
Для большей ясности в следующей Таблице 66 проиллюстрированы неограничивающие примеры последовательностей VH и VL (вариабельного домена и полноразмерного) для разных вариантов химерных вторых антител против IGF-1R.
В еще одном другом аспекте второе антитело Ab против IGF-1R представляет собой гуманизированное антитело.
Термин «гуманизированные антитела» означает антитело, которое содержит области CDR, происходящие из антитела нечеловеческого происхождения, причем другие части молекулы антитела происходят из одного (или нескольких) человеческих антител. Кроме того, некоторые остатки отрезка скелета (именуемого FR - каркасная область) могут быть модифицированы для сохранения аффинности связывания.
Гуманизированные антитела или их фрагменты могут быть получены методиками, известными специалисту в данной области. Такие гуманизированные антитела являются предпочтительными для их применения в способах, включающих диагностику in vitro или предупредительное и/или терапевтическое лечение in vivo. Другие методики гуманизации, также известные специалисту в данной области, такие как, например, методика «пересадки CDR», описываются PDL в патентах ЕР 0 451 216, ЕР 0 682 040, ЕР 0 939 127, ЕР 0 566 647 или US 5530101, US 6180370, US 5585089 и US 5693761. Также можно процитировать патенты США 5639641 или 6054297, 5886152 и 5877293.
В качестве конкретного, но не ограничивающего воплощения изобретения в данном документе описывается второе антитело Ab против IGF-1R, состоящее из hz208F2. Такую гуманизацию также можно применять к другим антителам, являющимся частью настоящего изобретения.
В одном воплощении второе антитело Ab против IGF-1R содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH), имеющий:
i) CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 последовательностей SEQ ID No. 27, 22 и 23 соответственно и
ii) FR1, FR2 и FR3, происходящие из человеческой зародышевой линии IGHV1-46*01 (SEQ ID No. 86), и
iii) FR4, происходящую из человеческой зародышевой линии IGHJ4*01 (SEQ ID No. 88).
В предпочтительном воплощении второе антитело Ab против IGF-1R содержит вариабельный домен легкой цепи (VL), имеющий:
i) CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 последовательностей SEQ ID No. 29, 25 и 31 соответственно и
ii) FR1, FR2 и FR3, происходящие из человеческой зародышевой линии IGKV1-39*01 (SEQ ID No. 87), и
iii) FR4, происходящую из человеческой зародышевой линии IGKJ4*01 (SEQ ID No. 89).
В предпочтительном, но не ограничивающем воплощении изобретения второе антитело Ab против IGF-1R содержит:
а) тяжелую цепь, имеющую CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 последовательностей SEQ ID No. 27, 22 и 23 соответственно и FR1, FR2 и FR3, происходящие из человеческой зародышевой линии IGHV1-46*01 (SEQ ID No. 86), и FR4, происходящую из человеческой зародышевой линии IGHJ4*01 (SEQ ID No. 88); и
б) легкую цепь, имеющую CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 последовательностей SEQ ID No. 29, 25 и 31 соответственно и FR1, FR2 и FR3, происходящие из человеческой зародышевой линии IGKV1-39*01 (SEQ ID No. 87), и FR4, происходящую из человеческой зародышевой линии IGKJ4*01 (SEQ ID No. 89).
В другом воплощении второе антитело Ab против IGF-1R выбрано из:
а) антитела, содержащего вариабельный домен тяжелой цепи последовательности, выбранной из SEQ ID No. 33, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57 и 59, или любой последовательности с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью с SEQ ID No. 33, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57 или 59; и три CDR легкой цепи последовательностей SEQ ID No. 29, 25 и 31;
б) антитела, содержащего вариабельный домен легкой цепи последовательности, выбранной из SEQ ID No. 34, 37 и 60, или любой последовательности с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью с SEQ ID No. 34, 37 или 60; и три CDR тяжелой цепи последовательностей SEQ ID No. 27, 22 и 23; и
в) антитела, содержащего вариабельный домен тяжелой цепи последовательности, выбранной из SEQ ID No. 33, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57 и 59, или любой последовательности с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью с SEQ ID No. 33, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55 или 57; и вариабельный домен легкой цепи последовательности, выбранной из SEQ ID No. 34, 37 и 60, или любой последовательности с по меньшей мере 80%-ной, предпочтительно 85%-ной, 90%-ной, 95%-ной и 98%-ной идентичностью с SEQ ID No. 34, 37 или 60.
В другом воплощении второе антитело Ab против IGF-1R выбрано из:
а) антитела, содержащего тяжелую цепь последовательности, выбранной из SEQ ID No. 33, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55 и 57, или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%-ную идентичность с SEQ ID No. 33, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55 или 57, и легкую цепь последовательности SEQ ID No. 34 или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%-ную идентичность с SEQ ID No. 34;
б) антитела, содержащего тяжелую цепь последовательности, выбранной из SEQ ID No. 33, 41, 45 и 55, или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%-ную идентичность с SEQ ID No. 33, 41, 45 или 55, и легкую цепь последовательности SEQ ID No. 37 или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%-ную идентичность с SEQ ID No. 37; и
в) антитела, содержащего тяжелую цепь последовательности SEQ ID No. 59, или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%-ную идентичность с SEQ ID No. 59, и легкую цепь последовательности SEQ ID No. 60 или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%-ную идентичность с SEQ ID No. 60.
В еще одном другом воплощении второе антитело Ab против IGF-1R представляет собой антитело, выбранное из:
а) антитела, содержащего или состоящего из тяжелой цепи последовательности SEQ ID No. 35, или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%-ную идентичность с SEQ ID No. 35, и легкой цепи последовательности SEQ ID No. 36, или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%-ную идентичность с SEQ ID No. 36;
б) антитела, содержащего или состоящего из тяжелой цепи последовательности SEQ ID No. 35, или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%-ную идентичность с SEQ ID No. 35, и легкой цепи последовательности SEQ ID No. 38, или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%-ную идентичность с SEQ ID No. 38;
в) антитела, содержащего или состоящего из тяжелой цепи последовательности SEQ ID No. 40, или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%-ную идентичность с SEQ ID No. 40, и легкой цепи последовательности SEQ ID No. 36, или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%-ную идентичность с SEQ ID No. 36;
г) антитела, содержащего или состоящего из тяжелой цепи последовательности SEQ ID No. 42, или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%-ную идентичность с SEQ ID No. 42, и легкой цепи последовательности SEQ ID No. 36, или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%-ную идентичность с SEQ ID No. 36;
д) антитела, содержащего или состоящего из тяжелой цепи последовательности SEQ ID No. 42, или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%-ную идентичность с SEQ ID No. 42, и легкой цепи последовательности SEQ ID No. 38, или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%-ную идентичность с SEQ ID No. 38;
е) антитела, содержащего или состоящего из тяжелой цепи последовательности SEQ ID No. 44, или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%-ную идентичность с SEQ ID No. 44, и легкой цепи последовательности SEQ ID No. 36, или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%-ную идентичность с SEQ ID No. 36;
ж) антитела, содержащего или состоящего из тяжелой цепи последовательности SEQ ID No. 46, или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%-ную идентичность с SEQ ID No. 46, и легкой цепи последовательности SEQ ID No. 36, или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%-ную идентичность с SEQ ID No. 36;
з) антитела, содержащего или состоящего из тяжелой цепи последовательности SEQ ID No. 46, или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%-ную идентичность с SEQ ID No. 46, и легкой цепи последовательности SEQ ID No. 38, или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%-ную идентичность с SEQ ID No. 38;
и) антитела, содержащего или состоящего из тяжелой цепи последовательности SEQ ID No. 48, или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%-ную идентичность с SEQ ID No. 48, и легкой цепи последовательности SEQ ID No. 36, или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%-ную идентичность с SEQ ID No. 36;
й) антитела, содержащего или состоящего из тяжелой цепи последовательности SEQ ID No. 50, или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%-ную идентичность с SEQ ID No. 50, и легкой цепи последовательности SEQ ID No. 36, или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%-ную идентичность с SEQ ID No. 36;
к) антитела, содержащего или состоящего из тяжелой цепи последовательности SEQ ID No. 52, или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%-ную идентичность с SEQ ID No. 52, и легкой цепи последовательности SEQ ID No. 36, или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%-ную идентичность с SEQ ID No. 36;
л) антитела, содержащего или состоящего из тяжелой цепи последовательности SEQ ID No. 54, или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%-ную идентичность с SEQ ID No. 54, и легкой цепи последовательности SEQ ID No. 36, или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%-ную идентичность с SEQ ID No. 36;
м) антитела, содержащего или состоящего из тяжелой цепи последовательности SEQ ID No. 56, или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%-ную идентичность с SEQ ID No. 56, и легкой цепи последовательности SEQ ID No. 36, или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%-ную идентичность с SEQ ID No. 36;
н) антитела, содержащего или состоящего из тяжелой цепи последовательности SEQ ID No. 56, или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%-ную идентичность с SEQ ID No. 56, и легкой цепи последовательности SEQ ID No. 38, или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%-ную идентичность с SEQ ID No. 38;
о) антитела, содержащего или состоящего из тяжелой цепи последовательности SEQ ID No. 58, или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%-ную идентичность с SEQ ID No. 58, и легкой цепи последовательности SEQ ID No. 36, или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%-ную идентичность с SEQ ID No. 36; и
п) антитела, содержащего или состоящего из тяжелой цепи последовательности SEQ ID No. 61, или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%-ную идентичность с SEQ ID No. 61, и легкой цепи последовательности SEQ ID No. 62, или любой последовательности, демонстрирующей по меньшей мере 80%-ную идентичность с SEQ ID No. 62.
Другими словами данное изобретение относится к способу, в котором второе антитело Ab против IGF-1R представляет собой антитело, содержащее:
а) тяжелую цепь последовательности, выбранной из SEQ ID No. 35, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58 и 61, или любой последовательности с по меньшей мере 80%-ной идентичностью с SEQ ID No. 35, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58 или 61; и
б) легкую цепь последовательности, выбранной из SEQ ID No. 36, 38 и 62, или любой последовательности с по меньшей мере 80%-ной идентичностью с SEQ ID No. 36, 38 и 62.
Для большей ясности в следующей таблице 6в проиллюстрированы неограничивающие примеры последовательностей VH и VL (вариабельных доменов и полноразмерного) для разных вариантов гуманизированного антитела hz208F2.
III-2 - лекарственное средство (D)
Лекарственная группировка D может быть выбрана из алкилирующих агентов, антиметаболитов, противоопухолевых антибиотиков, ингибиторов митоза, ингибиторов функции хроматина, антиангиогенных агентов, антиэстрогенов, антиандрогенов, хелаторов, стимулятора поглощения железа, ингибиторов циклооксигеназы, ингибиторов фосфодиэстеразы, ингибиторов ДНК, ингибиторов синтеза ДНК, стимуляторов апоптоза, тимидилатных ингибиторов, ингибиторов Т-клеток, агонистов интерферона, ингибиторов рибонуклеозидтрифосфатредуктазы, ингибиторов ароматазы, антагонистов рецептора эстрогена, ингибиторов тирозинкиназы, ингибиторов клеточного цикла, таксана, ингибиторов тубулина, ингибиторов ангиогенеза, стимуляторов макрофагов, антагонистов рецептора нейрокинина, агонистов каннабиноидного рецептора, агонистов дофаминового рецептора, агонистов фактора, стимулирующего гранулоциты, агонистов рецептора эритропоэтина, агонистов рецептора соматостатина, агонистов LHRH (люлиберин), сенсибилизаторов кальция, антагонистов рецептора VEGF (фактор роста эндотелия сосудов), антагонистов рецептора интерлейкина, ингибиторов остеокластов, стимуляторов образования радикалов, антагонистов рецептора эндотелина, алкалоидов барвинка, антигормонов или иммуномодуляторов, или любого другого лекарственного средства, которое удовлетворяет критериям активности цитотоксического средства или токсина, и D предпочтительно представляет собой ауристатин, долостатин 10 или их производные.
В предпочтительном воплощении лекарственная группировка согласно способу и композиции По изобретению имеет следующую формулу (II)
где:
2
3
- R представляет собой СООН, СООСН или тиазолил (такой как тиазол-2-ил),
3
1
6
1
6
- R представляет собой Н или (С-С)алкил (такой как метил), в частности, (С-С)алкильную группу,
9
1
6
- R представляет собой Н или (С-С)алкил (такой как метил),
- m представляет собой целое число, составляющее от 1 до 8, и
- волнистая линия показывает точку присоединения к L.
Под «алкилом» в настоящем изобретении подразумевается насыщенная углеводородная цепь - прямая или разветвленная. Например, можно упомянуть метильную, этильную, пропильную, изопропильную, бутильную, изобутильную, втор-бутильную, трет-бутильную, пентильную или гексильную группы.
х
y
1
6
Под «(С-C)алкилом» в настоящем изобретении подразумевается такая алкильная цепь, как определено выше, содержащая от х до y атомов углерода. Следовательно, (С-С)алкильная группа представляет собой алкильную цепь, имеющую от 1 до 6 атомов углерода.
1
6
1
4
1
2
(С-С)алкил преимущественно представляет собой (С-С)алкил, предпочтительно (С-С)алкил.
2
Среди соединений по изобретению один особенно ценный класс лекарственных группировок соответствует лекарственным группировкам формулы (II), в которых R представляет собой группу СООН.
2
Другой особенно ценный класс группировок соответствует группировкам формулы (II), в которых R представляет собой тиазол (в частности, группу тиазол-2-ил).
2
Другой класс особенно ценных группировок соответствует группировкам формулы (II), в которых R представляет собой СООМе.
2
Согласно одному конкретному воплощению настоящего изобретения R более конкретно представляет собой СООН, СООМе или тиазол-2-ильную группу.
2
Согласно первому предпочтительному воплощению R представляет собой СООН.
2
Согласно второму предпочтительному воплощению R представляет собой СООМе.
3
1
6
R, в частности, представляет собой (С-С)алкильную, преимущественно метильную группу.
m представляет собой целое число, составляющее от 1 до 8, и, в частности, от 1 до 6, преимущественно от 1 до 4, предпочтительно составляет 1 или 2.
2
3
В предпочтительном воплощении R представляет собой СООН, R представляет собой метильную группу, и m составляет 1 или 2.
9
Среди лекарственных группировок по изобретению один особенно ценный класс лекарственных группировок соответствует лекарственным группировкам формулы (II), в которых R представляет собой метильную группу или водород.
В предпочтительном воплощении:
2
3
9
- R представляет собой СООН, R представляет собой метильную группу, R представляет собой метильную группу, и m составляет 1 или 2, или
2
3
9
- R представляет собой СООН, R представляет собой метильную группу, R представляет собой водород, и m составляет 1 или 2.
9
2
m
Согласно предпочтительному воплощению группа NR локализуется на фенильном кольце в пара положении по отношению к группе (СН).
Преимущественно лекарственная группировка выбрана среди следующих группировок:
Получение лекарственного средства (Формулы DH):
Лекарственное средство может быть получено с использованием общих способов, описанных на следующих схемах синтеза, при необходимости возможно дополненных любой стандартной операцией, которая описана в литературе или хорошо известна специалистам в данной области, или описана в примерах ее экспериментального раздела.
1
2
3
4
На Схеме 1 проиллюстрирован первый общий способ, который можно использовать для получения лекарственного средства. В приведенных выше общих формулах R представляет собой Н, R и R являются такими же, как определено ранее для формулы II, R представляет собой
4a
4
R представляет собой такую же группу R, как определено ранее, возможно в защищенной форме, и G представляет собой защитную группу.
3
2
2
3
2
3
Первая стадия состоит из конденсирования соединения (II), защищенного на его аминной функциональной группе посредством защитной группы G, с соединением (III). X может представлять собой уходящую группу, такую как хлор. В данном случае первая стадия состоит из реакции между хлорангидридом кислоты и амином. Данную реакцию можно проводить с использованием способов и методик, хорошо известных специалистам в данной области. В одном особенно ценном способе вызывают реакцию двух соединений в присутствии органического или неорганического основания, например, EtN, iPrNEt, пиридина, NaH, CsCO, KCO в таком растворителе, как THF (тетрагидрофуран), дихлорметан, DMF (диметилформамид), DMSO (диметилсульфоксид), а именно при температуре от -20°С до 100°С. X также может представлять собой гидроксил (ОН). В данном случае первой стадией является реакция конденсации между карбоновой кислотой (II) и амином (III). Данную реакцию можно проводить, следуя способам и методикам, хорошо известным специалистам. В одном особенно ценном способе вызывают реакцию двух данных соединений в присутствии связывающего агента, такого как 1-(3-диметиламинопропил)-3-этил-карбодиимид (EDC), 3-гидрокси-1,2,3-бензотриазин-4(3Н)-он, третичного амина, такого как диизопропилэтиламин, в полярном апротонном растворителе, таком как дихлорметан или DMF, а именно при температуре от -15°С до 40°С. В другом особенно ценном способе вызывают реакцию двух данных соединений в присутствии диэтилфосфороцианидата (DEPC), третичного амина, такого как триэтиламин, в полярном апротонном растворителе, таком как дихлорметан или DMF, при температуре от -15°С до 40°С. Другой особенно ценный способ заключается в вызове реакции данных двух соединений в присутствии O-(7-азабензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония гексафторфосфата (HATU), третичного амина, такого как диизопропилэтиламин, в полярном апротонном растворителе, таком как дихлорметан или DMF, при температуре от -15°С до 100°С.
3
3
3
3
3
После снятия защиты промежуточного соединения с использованием методик, хорошо известных специалистам в данной области («Protective Groups in Organic Synthesis», T.W. Greene, John Wiley & Sons, 2006 и «Protecting Groups», P.J. Kocienski, Thieme Verlag, 1994), соединение (IV) можно конденсировать с соединением (V), следуя способам и методикам, описанным выше, с получением соединения (VI) после снятия защиты. Данное соединение может затем, после конденсации с промежуточным соединением (VII) и возможного снятия защиты, приводить к образованию лекарственного средства. Соединение (VI) также можно связывать с соединением (VII'), в котором R' представляет собой предшественник R, в частности, группу R, защищенную защитной группой. Связывание, с последующим снятием защиты группы R' с образованием R можно проводить, следуя тем же самым методикам, как описано ранее.
1
4a
4b
Схема 2 иллюстрирует второй общий способ, который можно использовать для получения лекарственного средства. На приведенных выше общих формулах G представляет собой защитную группу, R представляет собой Н, R2, R3 и R являются такими, как определено ранее, и R представляет собой
3
2
2
3
2
3
На первой стадии соединение (IX), защищенное на его функциональной аминогруппе защитной группой G, конденсируется с соединением (VI). X может представлять собой уходящую группу, например, хлор. В данном случае первая стадия заключается в реакции между хлорангидридом кислоты и амином. Данную реакцию можно проводить с использованием способов и методик, хорошо известных специалистам в данной области. В одном особенно ценном способе вызывают реакцию двух соединений в присутствии органического или неорганического основания, такого как EtN, iPrNEt, пиридин, NaH, CsCO, KCO в таком растворителе, как THF, дихлорметан, DMF, DMSO, а именно при температуре от -20°С до 100°С. X также может представлять собой гидроксил. В данном случае первой стадией является реакция конденсации между карбоновой кислотой (IX) и амином (VI). Данную реакцию можно проводить, следуя способам и методикам, хорошо известным специалистам. В одном особенно ценном способе вызывают реакцию двух данных соединений в присутствии 1-(3-диметиламинопропил)-3-этил-карбодиимида (EDC), 3-гидрокси-1,2,3-бензотриазин-4(3Н)-она, третичного амина, такого как диизопропилэтиламин, в полярном апротонном растворителе, таком как дихлорметан или DMF, а именно при температуре от -15°С до 40°С. В другом особенно ценном способе вызывают реакцию двух данных соединений в присутствии диэтилфосфороцианидата (DEPC), третичного амина, такого как триэтиламин, в полярном апротонном растворителе, таком как дихлорметан или DMF, а именно при температуре от -15°С до 40°С.
4
2
3
2
3
3
2
2
3
2
3
4b
4b
4
4
3
3
После снятия защиты с промежуточного соединения, используя методики, хорошо известные специалистам, полученное соединение (VIII) может приводить к лекарственному средству после реакции с RY. В данном случае Y представляет собой уходящую группу, такую как Cl, Br, I, OSOCH, OSOCF или О-тозил. Реакция проводится в присутствии органического или неорганического основания, такого как EtN, iPrNEt, NaH, CsCO, KCO в полярном безводном растворителе, таком как дихлорметан, THF, DMF, DMSO, а именно при температуре от -20°С до 100°С. В другом особенно ценном способе вызывают реакцию соединения (VIII) с альдегидом формулы R-CHO, где R соответствует предшественнику R. В данном случае реакция представляет собой восстановительное аминирование в присутствии восстановителя, такого как NaBH, NaBHCN, NaBH(OAc), в полярном растворителе, таком как 1,2-дихлорэтан, дихлорметан, THF, DMF, МеОН, при возможном присутствии изопропоксида титана (IV), при рН, который может контролироваться добавлением кислоты, такой как уксусная кислота, а именно при температуре от -20°С до 100°С.
2
2
В приведенных выше схемах синтеза лекарственное средство может приводить к другому лекарственному средству после дополнительной стадии реакции, такой как омыление, например, с использованием способов, хорошо известных специалистам, при этом группа R, представляющая собой сложный эфир (СООМе), заменяется на группу R, представляющую собой карбоновую кислоту (СООН).
Если желательно выделить лекарственное средство, содержащее по меньшей мере одну основную функциональную группу в состоянии соли присоединения кислоты, это возможно осуществлять посредством обработки свободного основания лекарственного средства (содержащего по меньшей мере одну основную функциональную группу) подходящей кислотой, предпочтительно в эквивалентном количестве. Подходящая кислота может, в частности, представлять собой трифторуксусную кислоту.
III.3 - линкер (L)
Термин «линкер», «линкерное звено», «L» или «связка» в настоящем изобретении обозначает химическую группировку, содержащую ковалентную связь или цепь атомов, которая ковалентно присоединяет антитело к по меньшей мере одному лекарственному средству.
Линкеры могут быть получены с использованием целого ряда бифункциональных белковых связывающих агентов, таких как N-сукцинимидил-3-(2-пиридил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP), сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (SMCC), иминотиолан (IT), бифункциональные производные имидоэфиров (такие как диметиладипимидат HCI), активные сложные эфиры (такие как дисукцинимидилсуберат), альдегиды (такие как глутаральдегид), бис-азидосоединения (такие как бис-(п-азидобензоил)гександиамин), производные бис-диазония (такие как бис-(п-диазониябензоил)-этилендиамин), диизоцианаты (такие как толуол-2,6-диизоцианат) и бис-активные фторные соединения (такие как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). Меченная углеродом 14 1-изотиоцианатобензил-3-метилдиэтилентриаминпентауксусная кислота (MX-DTPA) представляет собой типичный хелатор для конъюгирования цитотоксических агентов с системой адресования. Другими поперечно связывающими реактивами могут быть BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, МРВН, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, сульфо-EMCS, сульфо-GMBS, сульфо-KMUS, сульфо-MBS, сульфо-SIAB, сульфо-SMCC, сульфо-SMPB и SVSB (сукцинимидил-(4-винилсульфон)бензоат), которые имеются в продаже (например, у Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, III., США).
Линкер может быть «нерасщепляемым» или «расщепляемым».
В предпочтительном воплощении он состоит из «расщепляемого линкера», облегчающего высвобождение лекарственного средства в клетке. Например, можно использовать кислотолабильный линкер, пептидазочувствительный линкер, фотолабильный линкер, диметильный линкер или дисульфидсодержащий линкер. В предпочтительном воплощении линкер расщепляется при внутриклеточных условиях, таким образом, что расщепление данного линкера высвобождает лекарственное средство от антитела во внутриклеточной среде.
Например, в некоторых воплощениях линкер расщепляется расщепляющим агентом, который присутствует во внутриклеточной среде (например, в пределах лизосомы или зндосомы или кавеол). Линкер может представлять собой, например, пептидильный линкер, который расщепляется внутриклеточным пептидазным или протеазным ферментом, включающим лизосомальную или эндосомальную протеазу, но не ограничивающимся ими. Типично пептидильный линкер содержит по меньшей мере две последовательные аминокислоты или по меньшей мере три последовательные аминокислоты, или имеет по меньшей мере две аминокислоты в длину, или по меньшей мере три аминокислоты в длину. Расщепляющие агенты могут включать катепсины В и D, и плазмин, для всех из которых известно то, что они гидролизуют дипептидные производные лекарственного средства, приводя к высвобождению активного лекарственного средства внутри клеток-мишеней. Например, можно использовать пептидильный линкер, который расщепляется тиолзависимой протеазой катепсином В, которая сильно экспрессируется в раковой ткани (например, линкер, содержащий или представляющий собой Phe-Leu или Gly-Phe-Leu-Gly). В конкретных воплощениях пептидильный линкер, расщепляемый внутриклеточной протеазой, содержит или представляет собой Val-Cit или Phe-Lys. Одним преимуществом применения внутриклеточного протеолитического высвобождения лекарственного средства является то, что действие данного лекарственного средства при конъюгировании типично ослаблено, и стабильности конъюгатов в сыворотке типично являются высокими.
В других воплощениях расщепляемый линкер является рН-чувствительным, т.е. чувствительным к гидролизу при определенных значениях рН. Типично рН-чувствительный линкер гидролизуется при кислотных условиях. Например, можно использовать кислотолабильный линкер, который гидролизуется в лизосоме (например, гидразон, семикарбазон, тиосемикарбазон, цис-аконитовый амид, ортоэфир, ацеталь, кеталь или тому подобное). Такие линкеры являются относительно стабильными при условиях нейтрального рН, таких как условия в крови, но являются нестабильными при рН ниже 5,5 или 5,0, приблизительном рН лизосомы. В некоторых воплощениях гидролизуемый линкер представляет собой тиоэфирный линкер (такой как, например, тиоэфир, присоединенный к лекарственному средству через ацилгидразоновую связь).
В еще одном другом воплощении линкер расщепляется при восстанавливающих условиях (например, дисульфидный линкер). В данной области известен целый ряд дисульфидных линкеров, включающих, например, линкеры, которые могут быть образованы с использованием SATA (N-сукцинимидил-S-ацетилтиоацетат), SPDP (N-сукцинимидил-3-(2-пиридилтио)пропионат), SPDB (N-сукцинимидил-3-(2-пиридилтио)бутират) и SMPT (N-сукцинимидил-оксикарбонил-альфа-метил-альфа-(2-пиридил-дитио)толуол).
В некоторых предпочтительных воплощениях линкерное звено может иметь следующую общую формулу:
a
w
y
-(T)-(W)-(Y)-
где:
Т представляет собой звено ширилки;
а составляет 0 или 1;
W представляет собой аминокислотное звено;
w представляет собой целое число, варьирующее от 0 до 12;
Y представляет собой спейсерное звено;
Y составляет 0, 1 или 2.
Звено ширилки (Т), при его наличии, связывает второе антитело Ab против IGF-1R с аминокислотным звеном (W), при его наличии, или со спейсерным звеном, при его наличии, или непосредственно с лекарственным средством.
Полезные функциональные группы, которые могут присутствовать на втором антителе Ab против IGF-1R либо в природе, либо посредством химической манипуляции, включают сульфгидрильную, амино, гидроксильную, аномерную гидроксильную группу углевода и карбоксил. Подходящими функциональными группами являются сульфгидрильная и аминогруппа. Сульфгидрильные группы могут быть получены восстановлением внутримолекулярных дисульфидных связей второго антитела Ab против IGF-1R, при его наличии. В качестве альтернативы, сульфгидрильные группы могут быть получены реакцией аминогруппы лизиновой группировки второго антитела Ab против IGF-1R с 2-иминотиоланом или другими реактивами, генерирующими сульфгидрил. В конкретных воплощениях второе антитело Ab против IGF-1R генетически модифицировано для того, чтобы нести один или более чем один лизин. Более предпочтительно, второе антитело Ab против IGF-1R может быть генетически модифицировано для того, чтобы нести один или более чем один цистеин (например, тио-Mab).
В некоторых конкретных воплощениях звено ширилки образует связь с атомом серы второго антитела Ab против IGF-1R. Данный атом серы может происходить из сульфгидрильной (-SH) группы восстановленного антитела.
В некоторых других конкретных воплощениях звено ширилки связано со вторым антителом Ab против IGF-1R посредством дисульфидной связи между атомом серы антитела и атомом серы звена ширилки.
В других конкретных воплощениях реакционноспособная группа ширилки содержит реакционноспособный сайт, который может реагировать с аминогруппой второго антитела Ab против IGF-1R. Данная аминогруппа может представлять собой аминогруппу аргинина или лизина. Подходящие аминные реакционноспособные сайты включают активированные сложные эфиры (например, сложные эфиры сукцинимида, сложные эфиры 4-нитрофенила, сложные эфиры пентафторфенила), ангидриды, хлорангидриды кислот, сульфонилхлориды, изоцианаты и изотиоцианаты, но не ограничиваются ими.
В еще одном другом аспекте реакционноспособная функциональная группа ширилки содержит реакционноспособный сайт, который реагирует с модифицированной группой углевода, которая может присутствовать на втором антителе Ab против IGF-1R. В конкретном воплощении второе антитело Ab против IGF-1R ферментативно гликозилируется с образованием углеводной группировки или является природно гликозилированным. Данный углевод может быть умеренно окисленным с использованием такого реактива, как перйодат натрия, и образующееся карбонильное звено окисленного углевода может быть конденсировано с ширилкой, которая содержит такую функциональную группу, как гидразид, оксим, реакционноспособный амин, гидразин, тиополукарбазид, карбоксилат гидразина или арилгидразид.
Согласно конкретному воплощению звено ширилки имеет следующую формулу:
в которой
2
4
10
2
6
2
6
L представляет собой (С-С)циклоалкил-карбонил, (С-С)алкил или (С-С)алкил-карбонил (причем циклоалкильная или алкильная группировки связываются с атомом азота малеимидной группировки),
звездочка показывает точку присоединения к аминокислотному звену, при его наличии, к спейсерному звену, при его наличии, или к лекарственному средству D, и
волнистая линия показывает точку присоединения к второму антителу Ab против IGF-1R.
4
10
Под «(С-С)циклоалкилом» в настоящем изобретении подразумевается углеводородный цикл, имеющий от 4 до 10 атомов углерода, включающий циклопентил, циклогексил и тому подобное, но не ограничивающийся ими.
2
2
6
L преимущественно может представлять собой (С-С)алкил-карбонил, такой как пентил-карбонил следующей формулы:
в которой
звездочка показывает точку присоединения к аминокислотному звену, при его наличии, к спейсерному звену, при его наличии, или к лекарственному средству D, и
волнистая линия показывает точку присоединения к атому азота малеимидной группировки.
Аминокислотное звено (W), при его наличии, связывает звено ширилки (Т), при его наличии, или, в ином случае, второе антитело Ab против IGF-1R, со спейсерным звеном (Y), при наличии спейсерного звена, или с лекарственным средством, если спейсерное звено отсутствует.
w
Как упомянуто выше, (W) отсутствует (w равно 0) или может представлять собой дипептидное, трипептидное, тетрапептидное, пентапептидное, гексапептидное, гептапептидное, октапептидное, нонапептидное, декапептидное, ундекапептидное или додекапептидное звено, где аминокислоты, образующие пептиды могут отличаться друг от друга.
w
w1
w2
w3
w4
w5
Таким образом, (W) может быть представлен следующей формулой: (W1)(W2)(W3)(W4)(W5), в которой каждый из W1-W5 представляет собой, независимо друг от друга, аминокислотное звено, и каждый w1-w5 равен 0 или 1.
w
В некоторых воплощениях аминокислотное звено (W) может содержать аминокислотные остатки, такие как аминокислотные остатки, встречающиеся в природе, а также минорные аминокислоты и аминокислотные аналоги, не встречающиеся в природе, такие как цитруллин.
w
Аминокислотные остатки аминокислотного звена (W) включают, без ограничения, аланин, валин, лейцин, изолейцин, метионин, фенилаланин, триптофан, пролин, лизин, защищенный или незащищенный ацетилом или формилом, аргинин, аргинин, защищенный или незащищенный тозильной или нитрогруппами, гистидин, орнитин, орнитин, защищенный ацетилом или формилом, и цитруллин. Типичные аминокислотные линкерные компоненты предпочтительно включают дипептид, трипептид, тетрапептид или пентапептид, а именно дипептид или трипептид.
9
9
Типичные дипептиды включают: Val-Cit, Ala-Val, Ala-Ala, Val-Ala, Lys-Lys, Cit-Cit, Val-Lys, Ala-Phe, Phe-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp-Cit, Phe-Ala, Phe-N-тозил-Arg, Phe-N-нитро-Arg.
Типичные трипептиды включают: Val-Ala-Val, Ala-Asn-Val, Val-Leu-Lys, Ala-Ala-Asn, Phe-Phe-Lys, Gly-Gly-Gly, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys.
Типичные тетрапептиды включают: Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO. 93), Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO. 94).
Типичный пентапептид включает: Pro-Val-Gly-Val-Val (SEQ ID NO. 95).
w
Согласно конкретному воплощению (W) может представлять собой дипептид (т.е. w равно 2), такой как Val-Cit, или у линкера отсутствует аминокислотное звено (w равно 0). При отсутствие у линкера аминокислотного звена, у него предпочтительно также отсутствует спейсерное звено.
w
w
w
Согласно предпочтительному воплощению w равен 0 (т.е. (W) представляет собой одинарную связь), или w равен 2 (т.е. (W) представляет собой дипептид), и (W) может быть, таким образом, выбран из:
и, в частности, представляет собой Val-Cit,
где
звездочка показывает точку присоединения к спейсерному звену, при его наличии, или к лекарственному средству D; и
2
волнистая линия показывает точку присоединения к L.
Компоненты аминокислотного линкера могут быть разработаны и оптимизированы по их селективности для ферментативного расщепления конкретным ферментом, например, протеазой, ассоциированной с опухолью, катепсином В, С и D или протеазой плазмином.
Аминокислотное звено линкера может ферментативно расщепляться ферментом, включающим ассоциированную с опухолью протеазу, но не ограничиваясь ей, с высвобождением лекарственного средства.
Аминокислотное звено может быть разработано и оптимизировано по его селективности для ферментативного расщепления конкретной протеазой, ассоциированной с опухолью. Подходящими звеньями являются звенья, расщепление которых катализируется протеазами, катепсином В, С и D и плазмином.
Спейсерное звено (Y), при его наличии, связывает аминокислотное звено, при его наличии, или звено ширилки, при его наличии, или, в ином случае, антитело, с лекарственным средством. Спейсерные звенья относятся к двум главным типам: саморасщепляющиеся и несаморасщепляющиеся. Несаморасщепляющееся спейсерное звено представляет собой спейсерное звено, в котором часть или все спейсерное звено остается связанным с лекарственным средством после ферментативного отщепления аминокислотного звена от конъюгата антитело-лекарственное средство. Примеры несаморасщепляющихся спейсерных звеньев включают (глицин-глициновое) спейсерное звено и глициновое спейсерное звено, но не ограничиваются ими. Для высвобождения лекарственного средства в клетке-мишени должна происходить независимая реакция гидролиза для расщепления связи глицин-звено лекарственного средства.
В конкретном воплощении несаморасщепляющееся спейсерное звено (Y) представляет собой Gly.
w
В качестве альтернативы, конъюгат антитело-лекарственное средство, содержащий саморасщепляющееся спейсерное звено, может высвобождать лекарственное средство без необходимости в отдельной стадии гидролиза. В данных воплощениях (Y) представляет собой остаток звена п-аминобензилового спирта (РАВ), который связан с (W) через атом азота группы РАВ и непосредственно связан с лекарственным средством через сложноэфирную, карбонатную, карбаматную группу или группу простого эфира.
Другие примеры саморасщепляющихся спейсеров включают ароматические соединения, которые являются электронно эквивалентными группе РАВ, такие как остатки 2-аминоимидазол-5-метанол производных и орто- или пара-аминобензилацетали, но не ограничиваются ими. Можно использовать спейсеры, которые подвергаются легкой циклизации при гидролизе амидной связи, такие как замещенные и незамещенные амиды 4-аминомасляной кислоты, подходящим образом замещенные бицикло[2.2.1] и бицикло[2.2.2] кольцевые системы и амиды 2-аминофенилпропионовой кислоты.
В альтернативном воплощении спейсерное звено представляет собой разветвленное бис(гидроксиметил)стирольное (BHMS) звено, которое можно использовать для включения дополнительных лекарственных средств.
В конкретном воплощении спейсерное звено (Y) представляет собой РАВ-карбонил, причем РАВ представляет собой
(причем кислород звена РАВ связывается с карбонилом), и у равен 1, или у линкера отсутствует спейсерное звено (у равен 0).
В конкретном воплощении линкер имеет следующую формулу (III):
в которой
2
4
10
2
6
2
6
w
L представляет собой (С-С)циклоалкил-карбонил, (С-С)алкил или (С-С)алкил-карбонил (причем карбонил данных группировок, при его наличии, связан с (W)),
W представляет собой аминокислотное звено, причем w представляет собой целое число составляющее от 0 до 5,
Y представляет собой РАВ-карбонил, причем РАВ представляет собой
(причем кислород звена РАВ связан с карбонилом), и y равен 0 или 1 (предпочтительно у равен 0, когда w равен 0, и у равен 0 или 1, когда w составляет от 1 до 5),
звездочка показывает точку присоединения к лекарственному средству D, и
волнистая линия показывает точку присоединения ко второму антителу Ab против IGF-1R.
2
2
6
Преимущественно L представляет собой (С-С)алкилкарбонил, такой как пентилкарбонил следующей формулы:
в которой
w
звездочка показывает точку присоединения к (W); и
волнистая линия показывает точку присоединения к атому азота малеимидной группировки.
Согласно предпочтительному воплощению линкер L выбран из:
где звездочка показывает точку присоединения к лекарственному средству D, и волнистая линия показывает точку присоединения ко второму антителу Ab против IGF-1R.
III. 4 - конъюгат антитело-лекарственное средство (ADC)
В предпочтительном воплощении конъюгат антитело-лекарственное средство (ADC), используемый в способе или композиции по изобретению, может быть получен любым способом, известным специалисту в данной области, таким как, без ограничения, i) реакция нуклеофильной группы второго антитела Ab против IGF-1R с двухвалентным линкерным реактивом, с последующей реакцией с нуклеофильной группой лекарственного средства, или ii) реакция нуклеофильной группы лекарственного средства с двухвалентным линкерным реактивом, с последующей реакцией с нуклеофильной группой второго антитела Ab против IGF-1R.
Нуклеофильные группы на втором антителе Ab против IGF-1R включают, без ограничения, N-концевые аминогруппы, аминогруппы боковых цепей (например, лизина), тиольные группы боковых цепей и гидроксил или аминогруппы сахара, когда второе антитело Ab против IGF-1R является гликозилированным.
Нуклеофильные группы на лекарственном средстве включают, без ограничения, амино-, тиольную и гидроксильную группы, и, предпочтительно - аминогруппы.
Амино-, тиольные и гидроксильные группы являются нуклеофильными и способными реагировать с образованием ковалентных связей с электрофильными группами на линкерных группировках и линкерных реактивах, включающих, без ограничения, активные сложные эфиры, такие как сложные эфиры NHS, сложные эфиры HOBt, галогенформиаты и галогенангидриды; алкил- и бензилгалогениды, такие как галогенацетамиды; альдегиды; кетоны; карбоксильные и малеимидные группы. Антитело может иметь восстанавливаемые межцепочечные дисульфиды, т.е. цистеиновые мостики. Антитело можно сделать реакционноспособным для конъюгирования с линкерными реактивами посредством обработки восстановителем, таким как DTT (дитиотрейтол). Каждый цистеиновый мостик, таким образом, теоретически будет образовать два реакционноспособных тиольных нуклеофила. Дополнительные нуклеофильные группы могут быть введены в антитело посредством любой реакции, известной специалисту в данной области. В качестве неограничивающего примера реакционноспособные тиольные группы могут вводиться во второе антитело Ab против IGF-1R посредством введения одного или более чем одного остатка цистеина.
ADC также может быть получен посредством модификации второго антитела Ab против IGF-1R для введения электрофильных группировок, которые могут реагировать с нуклеофильными заместителями на линкерном реактиве. Сахара гликозилированного антитела могут быть окислены с образованием альдегидных или кетоновых групп, которые могут реагировать с аминогруппой линкерных реактивов или лекарственного средства. Образующиеся иминные группы основания Шиффа могут образовать стабильную связь или могут быть восстановлены с образованием стабильных аминных связей. В одном воплощении реакция углеводной части гликозилированного второго антитела Ab против IGF-1R либо с галактозооксидазой, либо с мета-перйодатом натрия может давать карбонильные (альдегидные и кетоновые) группы в белке, которые могут реагировать с подходящими группами на лекарственном средстве. В другом воплощении белки, содержащие N-концевые остатки серина или треонина, могут реагировать с мета-перйодатом натрия, приводя к образованию альдегида вместо первой аминокислоты.
В предпочтительном воплощении ADC получают посредством получения группировки лекарственное средство-линкер, с последующим связыванием между нуклеофильной группой на втором антителе Ab против IGF-1R (например, группа SH цистеиновой группировки) и электрофильной группой группировки лекарственное средство-линкер (например, малеимид).
1. Лекарственное средство-линкер
Группировку лекарственное средство-линкер можно получать посредством связывания:
- линкера с лекарственным средством,
- части линкера с лекарственным средством до завершения синтеза линкера,
- линкера с частью или предшественником лекарственного средства до завершения синтеза лекарственного средства, или
- части линкера с частью или предшественником лекарственного средства до завершения синтеза линкера и лекарственного средства.
Реакции связывания между нуклеофильной группой и электрофильной группой являются хорошо известными реакциями для специалиста в данной области.
Нуклеофильная группа может представлять собой, в частности, амино-, тиольную или гидроксильную группу. В предпочтительном воплощении она представляет собой первичную или вторичную аминогруппу.
Электрофильная группа может представлять собой карбоксильную группу (СООН), возможно в активированной форме, или активированную группировку карбонатного сложного эфира.
Под «активированной формой» карбоновой кислоты подразумевается карбоновая кислота, в которой группировка ОН функциональной группы СООН была заменена активированной уходящей группой (LG), обеспечивая связывание активированной группы карбоновой кислоты с аминогруппой для того, чтобы образовать амидную связь и высвободить соединение LG-H. Активированными формами могут быть активированные сложные эфиры, активированные амиды, ангидриды или галоидангидриды, такие как хлорангидриды. Активированные сложные эфиры включают производные, образованные реакцией группы карбоновой кислоты с N-гидроксибензотриазолом или N-гидроксисукцинимидом.
Под «активированным карбонатным сложным эфиром» подразумевается карбонатный сложный эфир, содержащий группировку -OC(O)OR, в которой OR представляет собой хорошую уходящую группу, обеспечивающую связывание активированнго карбонатного сложного эфира с аминогруппой для того, чтобы образовать карбаматную группировку и высвободить соединение ROH. Группа R активированного карбонатного сложного эфира включает, без ограничения, п-нитро-фенильную, пентафторфенильную, 2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ильную и бензильную группы, предпочтительно п-нитро-фенильную и пентафторфенильную группы.
Когда линкер имеет следующую формулу (III):
группировка лекарственное средство-линкер имеет следующую формулу (IV):
и последней стадией синтеза группировки лекарственное средство-линкер обычно является связывание между соединением следующей формулы (V):
2
где L является таким, как определено ранее, и LG представляет собой уходящую группу, а именно галогенид, такой как хлорид, или группу, происходящую из N-гидроксисукцинимида,
и соединение следующей формулы (VI):
Когда у равен 1, и Y представляет собой РАВ-карбонил, соединение формулы (VI) можно получать связыванием между лекарственным средством (DH) и соединением следующей формулы (VII), предпочтительно его защищенной формой:
где W и w являются такими, как определено ранее, и R является таким, как определено в определении «активированного карбонатного сложного эфира», и G представляет собой Н или защищающую группу.
При нахождении соединения формулы (VII) в защищенной форме, необходима конечная стадия снятия защиты.
w
w
Когда у равен 0, соединение (VI) имеет формулу H-(W)-D, где (W) и, предпочтительно, D состоят из аминокислотных звеньев. Следовательно, соединение (VI) в данном случае может быть получено способом традиционного пептидного синтеза, хорошо известным специалисту в данной области.
2. Ab-линкер-лекарственное средство
Одно воплощение согласно данному изобретению заключается в связывании между остатком цистеина, присутствующим на втором антителе Ab против IGF-1R, и электрофильной группой группировки лекарственное средство-линкер, предпочтительно с малеимидной группировкой, присутствующей на группировке лекарственное средство-линкер.
Связывание малеимид-цистеин может осуществляться способами, хорошо известными специалисту в данной области.
В общем, антитела не содержат много или вообще не содержат свободных и реакционноспособных цистеиновых тиольных групп, которые могут быть связаны с группировкой лекарственного средства. Большинство цистеиновых тиольных остатков в антителах существует в виде дисульфидных мостиков, и они должны быть восстановлены восстановителем, таким как дитиотрейтол (DTT) или ТСЕР (трис-2-карбоксиэтилфосфин), при частичных или полных восстанавливающих условиях. Загрузка (отношение лекарственное средство/антитело) ADC может контролироваться несколькими разными способами, включающими: (i) ограничение молярного избытка промежуточного соединения лекарственное средство-линкер (D-L) или линкерного реактива по отношению к антителу, (ii) ограничение времени реакции или температуры конъюгирования и (iii) частичные или ограниченные восстанавливающие условия для модификации цистеинового тиола.
Структура дисульфидных связей человеческих IgG теперь хорошо установлена (обзор приводится в Liu and May, mAbs 4 (2012): 17-23). На самом деле существует много сходств и некоторые различия в отношении структур дисульфидных связей 4 человеческих подклассов IgG, а именно: IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Все подклассы IgG неизменно содержат 12 внутрицепочечных дисульфидных мостиков, и различия кроются в их межцепочечных дисульфидных связях, образованных между тяжелыми и легкими цепями. Каждая внутрицепочечная дисульфидная связь ассоциирована с индивидуальным доменом IgG, т.е. вариабельными (VL и VH) и константными (CL, СН1, СН2 и СН3) доменами. 2 тяжелые цепи связываются в их шарнирной области варьирующим числом дисульфидных мостиков: 2 для IgG1 и IgG4, 4 для IgG2 и 11 для IgG3. Тяжелая и легкая цепи IgG1 связываются дисульфидной связью между последним остатком цистеина легкой цепи и пятым остатком тяжелой цепи, тогда как для других подклассов - IgG2, IgG3 и IgG4 - легкая цепь связывается с тяжелой цепью дисульфидной связью между последним остатком цистеина легкой цепи и третьим остатком цистеина тяжелой цепи, который расположен на поверхности контакта доменов VH и СН1. Структуры дисульфидных связей, отличные от данных классических структур, были описаны для IgG2 и IgG4 (обзор приведен в Liu and May, mAbs 4 (2012): 17-23). Межцепочечные дисульфидные связи в значительной степени экспонированы растворителю и, следовательно, являются значительно более реакционноспособными, чем внутрицепочечные дисульфидные связи, которые скрыты в антипараллельных бета-складчатых слоях в пределах каждого домена и не экспонированы растворителю. По данным причинам, каким бы ни был изотип антитела, будет происходить связывание по межцепочечным экспонированным остаткам цистеина после восстановления в мягких условиях. Таким образом, каждый межцепочечный дисульфидный мостик теоретически может образовать два сайта конъюгирования.
В антитела могут быть введены дополнительные нуклеофильные группы посредством реакции лизинов с 2-иминотиоланом (реактив Траута), приводя к превращению амина в тиол. В антитело (или его фрагмент) также могут быть введены реакционноспособные тиольные группы посредством генетической модификации одного, двух, трех, четырех или более чем четырех цистеиновых остатков (например, получая мутантные антитела, содержащие один или более чем один неприродный аминокислотный остаток цистеина). В US 7521541 описаны генетически модифицированные антитела посредством введения реакционноспособных аминокислот цистеинов.
В антителе в реакционноспособных сайтах могут быть сконструированы аминокислоты цистеины, которые не образуют внутрицепочечных или межмолекулярных дисульфидных связей (Junutula, et al., 2008b Nature Biotech., 26(8):925-932; Dornan et al (2009) Blood 114(13): 2721-2729; US 7521541; US 7723485; WO 2009/052249). Тиолы сконструированных цистеинов могут реагировать с линкерными реактивами или с реактивами лекарственное средство-линкер по настоящему изобретению, которые имеют реагирующие с тиолом электрофильные группы, такие как малеимидные или альфа-галогеноамидные, с образованием ADC с антителами с генетически модифицированным цистеином и группировками лекарственных средств. Расположение лекарственной группировки, таким образом, можно конструировать, контролировать, и оно является известным. Можно контролировать загрузку лекарственного средства, так как сконструированные тиольные группы цистеина типично реагируют с линкерными реактивами, реакционноспособными в отношении тиола, или с реактивами лекарственное средство-линкер с высоким выходом. Генетическая модификация антитела IgG для введения аминокислоты цистеина посредством замены в одном сайте на тяжелой или легкой цепи дает два новых цистеина на симметричном антителе. Может достигаться загрузка лекарственного средства около 2 практически с гомогенностью продукта конъюгирования - ADC.
Когда более чем одна нуклеофильная или электрофильная группа антитела реагирует с промежуточным соединением лекарственное средство-линкер или с линкерным реактивом, с последующей реакцией с реактивом на основе лекарственной группировки, тогда образующийся продукт представляет собой смесь соединений ADC с распределением лекарственных группировок, присоединенных к антителу, например, 1, 2, 3 и т.д. Способы жидкостной хроматографии, как, например, на основе полимера с обращенной фазой (PLRP) и гидрофобного взаимодействия (HIC), могут разделять соединения в смеси по значению загрузки лекарственного средства. Могут быть выделены препараты ADC со значением загрузки одно лекарственное средство (р), однако, данные ADC со значением загрузки единица все еще могут представлять собой гетерогенные смеси, так как лекарственные группировки могут быть присоединены через линкер в разных сайтах на антителе.
Для некоторых ADC отношение лекарственного средства может ограничиваться числом сайтов присоединения на антителе. Высокая загрузка лекарственного средства, например, отношение лекарственного средства больше 5, может вызывать агрегацию, нерастворимость, токсичность или потерю клеточной проницаемости определенных ADC. Типично на протяжении реакции конъюгирования с антителом конъюгируется меньше лекарственных группировок, чем теоретический максимум.
Загрузка лекарственного средства, также именуемая отношение лекарственное средство-антитело (DAR), представляет собой среднее число группировок лекарственного средства на группировку агента, связывающегося с клеткой.
В случае антитела изотипов IgG1 и IgG4, где лекарственные средства связываются с цистеинами после частичного восстановления антитела, загрузка лекарственного средства может варьировать от 1 до 8 группировок лекарственного средства (D) на антитело, т.е. где 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8 группировок лекарственного средства ковалентно присоединяются к антителу.
В случае антитела изотипа IgG2, где лекарственные средства связываются с цистеинами после частичного восстановления антитела, загрузка лекарственного средства может варьировать от 1 до 12 группировок лекарственного средства (D) на антитело, т.е. где 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 и 12 группировок лекарственного средства ковалентно присоединяются к антителу.
Составы ADC включают наборы агентов, связывающихся с клеткой, например, антител, конъюгированных с целым рядом группировок лекарственных средств: от 1 до 8 или от 1 до 12.
Среднее число группировок лекарственного средства на антитело в препаратах ADC от реакций конъюгирования может характеризоваться традиционными способами, такими как УФ (ультрафилетовая область спектра) способы, ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография) с обращенной фазой, HIC, масс-спектрометрия, анализ ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ) и электрофорез.
В качестве неограничивающего воплощения в данном документе представлено конъюгирование с вторым антителом против IGF-1R hz208F2. В данном случае лекарственное средство связывается с по меньшей мере одним цистеином, выбранным из i) остатка Cys в положении 214 для легкой цепи последовательности SEQ ID No. 36, 38 или 62 и ii) остатков Cys в положении 223, 229 и 232 для тяжелой цепи последовательности SEQ ID No. 35, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58 или 61.
В качестве неограничивающего воплощения в данном документе представлено конъюгирование со вторым антителом против IGF-1R hz208F2. В данном случае лекарственное средство связывается с двумя, тремя или четырьмя цистеинами, выбранными из i) остатка Cys в положении 214 для легкой цепи последовательности SEQ ID No. 36, 38 или 62 и ii) остатков Cys в положении 223, 229 и 232 для тяжелой цепи последовательности SEQ ID No. 35, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58 и 61.
Альтернатива заключается в связывании с лизином. Антитело может содержать, например, много остатков лизина, которые не реагируют с промежуточным соединением лекарственное средство-линкер (D-L) или с линкерным реактивом. Только самые реакционноспособные лизиновые группы могут реагировать с линкерным реактивом, реагирующим с амином. Также только самые реакционноспособные тиольные группы цистеина могут реагировать с линкерным реактивом, реагирующим с тиолом.
Когда соединения по изобретению связываются с лизинами, загрузка лекарственного средства может варьировать от 1 до 80 группировок лекарственного средства (D) на антитело против клетки, хотя и может быть предпочтительной верхняя граница 40, 20, 10 или 8. Композиции ADC включают наборы агентов, связывающихся с клеткой, например, антител, конъюгированных с целым рядом лекарственных средств: от 1 до 80, от 1 до 40, от 1 до 20, от 1 до 10 или от 1 до 8.
ADC формулы (I) согласно изобретению может находиться в виде фармацевтически приемлемой соли.
В настоящем изобретении под «фармацевтически приемлемым» подразумевается то, что может использоваться в получении фармацевтической композиции, которая обычно является безопасной, нетоксичной и ни биологически, ни иным образом не желательной, и которая является приемлемой для ветеринарного применения, а также для фармацевтического применения у человека.
Под «фармацевтически приемлемой солью» соединения подразумевается соль, которая является фармацевтически приемлемой, как определено в данном документе, и которая имеет желательную фармакологическую активность родительского соединения.
Фармацевтически приемлемые соли в частности включают:
(1) соли присоединения фармацевтически приемлемой кислоты, образующиеся с фармацевтически приемлемыми неорганическими кислотами, такими как соляная, бромистоводородная, фосфорная, серная и аналогичные кислоты; или образующиеся с фармацевтически приемлемыми органическими кислотами, такими как уксусная, трифторуксусная, пропионовая, янтарная, фумаровая, яблочная, винная, лимонная, аскорбиновая, малеиновая, глутаминовая, бензойная, салициловая, толуолсульфоновая, метансульфоновая, стеариновая, молочная и аналогичные кислоты; и
(2) соли присоединения фармацевтически приемлемого основания, образующиеся либо при замене кислотного протона, присутствующего в родительском соединении, на ион металла, например, ион щелочного металла, ион щелочноземельного металла или ион алюминия; либо путем координации с фармацевтически приемлемым органическим основанием, таким как лизин, аргинин и аналогичные; или с фармацевтически приемлемым неорганическим основанием, таким как гидроксид натрия, поташ, гидроксид кальция и аналогичные.
Данные соли могут быть получены из соединений по изобретению, содержащих основную или кислотную функциональную группу, или соответствующих кислот или оснований с использованием традиционных химических способов.
IV - Лечение
Настоящее изобретение также касается способа лечения рака, включающего введение человеку, нуждающемуся в этом, эффективного количества соединения формулы (I), такого, как определено выше.
Раковые заболевания предпочтительно могут быть выбраны среди раковых заболеваний, экспрессирующих IGF-1R, включающих опухолевые клетки, экспрессирующие или сверхэкспрессирующие на их поверхности целый белок IGF-1R или его часть.
Более конкретно, указанные раковые заболевания представляют собой рак молочной железы, рак толстой кишки, карциному пищевода, печеночноклеточный рак, рак желудка, глиому, рак легкого, меланому, остеосаркому, рак яичника, рак предстательной железы, рабдомиосаркому, рак почки, рак щитовидной железы, рак эндометрия матки, шванному, нейробластому, плоскоклеточный рак полости рта, мезотелиому, лейомиосаркому и любые явления лекарственной устойчивости раковых заболеваний.
Способ согласно данному изобретению является полезным для лечения рака, в частности, устойчивых к лекарственным средствам или трудно поддающихся лечению раковых заболеваний у пациента. В некоторых воплощениях пациент имеет трудно поддающийся лечению или устойчивый к лекарственным средствам рак, где у пациента не имело успеха по меньшей мере одно предыдущее лечение химиотерапевтическим агентом.
Во избежание сомнений, под устойчивыми к лекарственным средствам или трудно поддающимися лечению раковыми заболеваниями подразумеваются любые устойчивые, экспрессирующие IGF-1R раковые заболевания, т.е. не только устойчивые раковые заболевания, которые исходно экспрессируют IGF-1R, но также и раковые заболевания, которые исходно не экспрессируют или сверхэкспрессируют IGF-1R, но которые экспрессируют IGF-1R, как только они стали устойчивыми к предыдущему лечению.
Другие конкретные типы раковых заболеваний, которые можно лечить, включают трудно поддающиеся лечению или устойчивые к лекарственным средствам формы карцином, лимфом, бластом, сарком, лейкозов, лимфоидных злокачественных образований и других раковых заболеваний, клеточных пролиферативных расстройств и опухолей, но не ограничиваются ими.
Другим предметом данного изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая ADC, как описано в описании изобретения.
Более конкретно, данное изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей ADC по изобретению с по меньшей мере одним эксципиентом и/или фармацевтически приемлемым носителем.
В настоящем описании подразумевается то, что выражение «фармацевтически приемлемый носитель» или «эксципиент» указывает соединение или комбинацию соединений, входящих в фармацевтическую композицию, не провоцирующих вторичных реакций, и которые обеспечивают, например, облегчение введения активного(ных) соединения(ний), увеличение его(их) времени жизни и/или его(их) эффективности в организме, увеличение его(их) растворимости в растворе или, кроме того, улучшение его(их) сохранности. Данные фармацевтически приемлемые носители и эксципиенты являются хорошо известными и будут адаптированы специалистом в данной области как функция природы и способа введения выбранного(ных) активного(ных) соединения(ний).
Активный ингредиент можно вводить в стандартных формах введения, в смеси с традиционными фармацевтическими носителями, животным или человеку. Подходящие стандартные формы введения включают формы, вводящиеся через пероральный путь, и формы для введения посредством парентерального пути (подкожного, внутрикожного, внутримышечного или внутривенного).
В качестве твердых композиций для перорального введения можно использовать таблетки, пилюли, порошки (твердые или мягкие желатиновые капсулы) или гранулы. В данных композициях активный ингредиент по изобретению смешивается с одним или более чем одним инертным разбавителем, таким как крахмал, целлюлоза, сахароза, лактоза или диоксид кремния, в струе аргона. Данные композиции также могут содержать вещества, отличные от разбавителей, например, одну или более чем одну смазку, такую как стеарат магния или тальк, краситель, покрытие (покрытые таблетки) или глянцующий агент.
Стерильные компзиции для парентерального введения предпочтительно могут быть водными или неводными растворами, суспензиями или эмульсиями. В качестве растворителя или носителя можно использовать воду, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, в частности оливковое масло, инъецируемые органические сложные эфиры, например, этилолеат, или другие подходящие органические растворители. Данные композиции также могут содержать адъюванты, в частности, увлажнители, изотонические, эмульгирующие, диспергирующие и стабилизирующие агенты. Стерилизация может проводиться несколькими способами, например, стерилизующей фильтрацией, посредством включения стерилизующих агентов в композицию, посредством облучения или посредством нагревания. Их также можно получать в виде твердых стерильных композиций, которые можно растворять во время применения в стерильной воде или любой другой инъецируемой стерильной среде.
Предпочтительно данные ADC будут вводиться системным путем, в частности, внутривенным путем, внутримышечным, внутрикожным, внутрибрюшинным или подкожным путем, или пероральным путем. В более предпочтительном способе композиция, содержащая ADC согласно изобретению, будет вводиться несколько раз последовательно.
Таким образом, данное изобретение также касается набора, содержащего по меньшей мере i) конъюгат антитело-лекарственное средство согласно изобретению и/или фармацевтическую композицию согласно изобретению и ii) шприц или сосуд, или ампулу, в которой размещается указанный конъюгат антитело-лекарственное средство и/или фармацевтическая композиция.
Их способы введения, дозировки и оптимальные фармацевтические формы могут быть определены согласно критериям, обычно принимаемым во внимание при установлении лечения, адаптированного к пациенту, таким как, например, возраст или масса тела пациента, серьезность его/ее общего состояния, переносимость лечения и отмеченные вторичные эффекты.
Другие характеристики и преимущества изобретения появятся в продолжении описания с примерами и графическими материалами, легенды которых представлены ниже.
ЛЕГЕНДЫ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
50
Фиг. 1А и 1Б: графическое представление значений ОП (оптическая плотность), полученных с первыми антителами против IGF-1R 816С12 (А) и 810D10 (Б) в ELISA на rhIGF-1 R. Аппроксимация данных и определение ЕС осуществляются с использованием приложения Prism.
Фиг. 2А-2Г: картины иммуногистохимии (IHC) распознавания залитой в парафин опухоли MCF-7 с использованием первого антитела против IGF-1R 816С12 (2А), первого антитела против IGF-1R 810D12 (2Б), антитела против IGF-1R G11 (Roche Ventana) (2В) или антитела против IGF-1R AF-305 (R&D System) (2Г).
Фиг. 3: активность in vivo ADC против IGF-1R в модели ксенотрансплантата MCF-7.
Фиг. 4А-4Г: картины иммуногистохимии (IHC) распознавания залитой в парафин опухоли SBC-5 с использованием первого антитела против IGF-1R 816С12 (4А), первого антитела против IGF-1R 810D12 (4Б), антитела против IGF-1R G11 (Roche Ventana) (4В) или антитела против IGF-1R AF-305 (R&D System) (4Г).
Фиг. 5: активность in vivo ADC против IGF-1R в модели ксенотрансплантата SBC-5.
50
max
Фиг. 6А-6В: связывание антитела с человеческим природным IGF-1R, определенное анализами FACS. На Фиг. 6А представлена кривая титрования на линии клеток MCF-7. MFI представляет собой среднее значение интенсивности флуоресценции. Фиг. 6Б представляет собой ЕС и мышиного, и химерного антител против IGF-1R на линии клеток MCF-7. На Фиг. 6В представлено B химерных антител против IGF-1R на линии клеток MCF-7.
+
-
Фиг. 7А-7Б: оценка распознавания hIGF-1R с использованием трансфицированных по сравнению с нетрансфицированными клетками. На Фиг. 7А представлены кривые титрования одного химерного Ab против IGF-1R на линии клеток IGF-1R. MFI представляет собой среднее значение интенсивности флуоресценции. На Фиг. 7Б представлено связывание химерных Ab против IGF-1R на линии человеческих клеток IGF-1R.
+
Фиг. 8А-8Б: оценка специфичности Ab к IGF-1R относительно hIR с использованием трансфицированных клеток. На Фиг. 8А представлено связывание мышиного Ab против IGF-1R на линии клеток, трансфицированной hIR. На Фиг. 8Б представлено связывание химерного Ab против IGF-1R на линии клеток IR+. MFI представляет собой среднее значение интенсивности флуоресценции. Mab против MR GRO5 (Calbiochem) вводили в качестве позитивного контроля.
Фиг. 9: связывание мышиного Ab против IGF-1R на линии клеток IM-9. MFI представляет собой среднее значение интенсивности флуоресценции. Mab против hIR GRO5 вводили в качестве позитивного контроля.
50
50
+
Фиг. 10А-10В: оценка распознавания IGF-1R обезьяны. На Фиг. 10А представлены кривые титрования химерного Ab против IGF-1R на линии клеток COS-7. MFI представляет собой среднее значение интенсивности флуоресценции. На Фиг. 10Б представлено ЕС и мышиного, и химерного антител против IGF-1R на линии клеток COS-7. На Фиг. 10В представлено ЕС химерных антител против IGF-1R как на трансфицированных клетках NIH 3Т3 IGF-1R, так и на линии клеток COS-7.
Фиг. 11: сенсограммы, полученные на Biacore Х100 на основе технологии SPR (поверхностный плазмонный резонанс) с использованием сенсорного чипа СМ5, активированного более чем 11000 RU (резонансные единицы) мышиного антитела против His метки, химически привитого на матрицу карбоксиметилдекстрана. Эксперимент проводили при скорости тока 30 мкл/мин при 25°С с использованием HBS-EP+в качестве подвижного буфера и буфера для разведения образцов. На Фиг. показано наложение 4 независимых сенсограмм, выровненных по абсциссе в начале первой инъекции аналитов и по ординате по исходному уровню, определенному непосредственно перед этой первой инъекцией. Сенсограммы, полученные с захватом основанного на человеческой последовательности рекомбинантного растворимого IGF-1R отмечены ромбами. Сенсограммы, полученные с захватом последовательности рекомбинантного растворимого IGF-1R, основанной на последовательности яванского макака, отмечены треугольниками. Белые символы соответствуют пустым циклам (5 инъекций подвижного буфера), и черные символы соответствуют инъекциям интервала возрастающих концентраций C208F2 (5, 10, 20, 40 и 80 нМ).
Фиг. 12: оценка собственного эффекта антител против hIGF-1R на фосфорилирование рецептора по сравнению с IGF1.
Фиг. 13: ингибирование фосфорилирования IGF-1R в ответ на IGF-1 посредством мышиного антитела против hIGF-1R.
Фиг. 14: интенсивность сигнала клеточной поверхности антител против IGF-1R подвергается понижающей регуляции после инкубации клеток при 37°С. Клетки MCF-7 инкубировали при 4°С или 37°С в течение 4 ч с 10 мкг/мл Ab. На Фиг. представлена ΔMFI.
Фиг. 15А-15Б: уменьшение уровня антитела на поверхности. Антитело, связанное с поверхностью клетки, оценивали после 10, 20, 30, 60 и 120 мин при 37°С. На Фиг. 15А представлен % остающегося IGF-1R по сравнению с интенсивностью сигнала, измеренной при 4°С. На Фиг. 15Б представлен расчет периода полужизни с использованием программы Prism и с использованием аппроксимации экспоненциального затухания.
Фиг. 16: Ab против hIGF-1R интернализуются. Клетки инкубировали с 10 мкг/мл мышиных Ab в течение 0, 30 или 60 мин при 37°С. Клетки делали или не делали проницаемыми и инкубировали с вторичным антителом против мышиного IgG, конъюгированным с Alexa 488. Мембрана соответствует интенсивности сигнала без пермеабилизации. Общая соответствует интенсивности сигнала после пермеабилизации клетки, и цитоплазматическая соответствует интернализованному Ab. Название каждого оцененного антитела показано наверху каждого графика.
Фиг. 17А-17Б: визуализация интернализации Ab. Фиг. 17А: клетки MCF-7 инкубировали с m208F2 в течение 20 мин при 4°С и промывали перед инкубацией (W) при 37°С в течение 15 (X), 30 (Y) и 60 (Z) мин. Клетки фиксировали и делали проницаемыми. Ab m208F2 выявляли с использованием антитела против мышиного IgG, конъюгированного с Alexa 488, a Lamp-1 - с использованием кроличьего антитела против Lamp-1 и с вторичным антителом против кроличьего IgG, конъюгированным с Alexa 555. Фиг. 17Б: клетки MCF-7 инкубировали в течение 30 минут при 37°С с мышиными антителами против hIGF-1R и окрашивали, как описано выше. Колокализацию идентифицировали с использованием программного модуля для выявления колокализации программы ImageJ.
Фиг. 18: участие лизосомного пути в деградации антитела.
Фиг. 19: кислотный рН уменьшает способность к связыванию пяти мышиных антител против IGF-1R.
Фиг. 20А-20Г: характеристика связывания первой гуманизированной формы Mab c208F2. Свойства связывания mAb hz208F2 оценивали на человеческой линии клеток MCF-7 (А), на линии клеток обезьяны COS-7 (Б) и на трансфицированной мышиной линии клеток, экспрессирующей человеческий инсулиновый рецептор (В). Связывание и мышиного, и химерного mAb 208F2 оценивали параллельно. Клон GRO5 антитела против hIR использовали для подтверждения экспрессии hIR на трансфицированной линии клеток (D).
Фиг. 21: уменьшение уровня антитела hz208F2 на поверхности.
Фиг. 22: наложение сенсограмм, полученных с использованием устройства Biacore Х100 на основе SPR при температуре 25°С с сенсорным чипом СМ5, активированным на обеих проточных ячейках примерно 12000 RU мышиных моноклональных антител против His метки, химически привитых на карбоксиметилдекстрановую матрицу, с использованием HBS-EP+ в качестве подвижного буфера при скорости тока 30 мкл/мин. Каждая сенсограмма (первая сенсограмма, отмеченная треугольниками, и вторая сенсограмма, отмеченная ромбами) соответствует полному циклу:
1 - инъекция раствора рекомбинантного h-IGF-1R (10 мкг/мл) на второй проточной ячейке на протяжении одной минуты.
2 - для первой сенсограммы: 5 инъекций подвижного буфера, каждая на протяжении 90 с.
Для второй сенсограммы: пять инъекций в интервале возрастающих концентраций растворов антитела против IGF-1R C208F2, каждая на протяжении 90 с.
3 - Задержка 300 с для определения кинетики скоростей диссоциации.
4 - Регенерация поверхности посредством инъекции 10 мМ буфера глицин-HCI, рН 1,5, на протяжении 45 с.
on
off
6
-1
-1
-5
-1
Фиг. 23: сенсограммы, соответствующие вычитанию пустой сенсограммы (5 инъекций HBS-EP+) из сенсограммы, полученной с интервалом возрастающих концентраций растворов антитела против IGF-1R C208F2, представлены серым цветом. Теоретическая сенсограмма, соответствующая модели 1:1 со следующими параметрами: k=(1,206±0,036)×10 М с, k=(7,81±0,18)×10 с, Rmax=307,6±0,3 RU, представлена тонкой черной линией. На графике приводятся расчетные концентрации c208F2: только наивысшая концентрация (24 нМ) рассматривается как константа).
off
on
12
Фиг. 24: константы диссоциации соответствуют среднему значению четырех экспериментальных прогонов для каждого антитела и соответствуют отношению: k/k × 10, подлежащему выражению в единицах пМ. Планки погрешностей соответствуют стандартной ошибке (n равно 4).
off
Фиг. 25: периоды полужизни соответствуют среднему значению четырех экспериментальных прогонов для каждого антитела и соответствуют отношению: Ln(2)/k/3600, подлежащему выражению в единицах ч. Планки погрешностей соответствуют стандартной ошибке (n равно 4).
Фиг. 26: клеточная цитотоксичность антитела против IGF-1R, связанного с тремя разными соединениями. Пять химерных антител против IGF-1R были связаны с одним из Е-13, G-13 или F-63. Иррелевантное антитело c9G4 также было связано с теми же самыми соединениями.
Фиг. 27А-27В: оценка in vivo C208F2-E-13 (Фиг. 27А), c208F2-G-13 (Фиг. 27Б) и c208F2-F-63 (Фиг. 27В) в модели ксенотрансплантатов MCF-7.
Фиг. 28А-28Б: оценка in vivo и c208F2-E-13 (Фиг. 28А), и c208F2-G-13 (Фиг. 28Б) по сравнению с контрольным ADC (c9G4-E13 и c9G4-G-13) в модели ксенотрансплантатов MCF-7.
Фиг. 29А-29Б: кислотный рН уменьшает способность к связыванию гуманизированных антител против IGF-1R hz208F2 H026/L024 (А) и hz208F2 H077/L018 (Б).
Фиг. 30: оценка цитотоксичности c208F2-G-13 на нормальных клетках.
Фиг. 31: клеточная цитотоксичность гуманизированных вариантов hz208F2, связанных с G-13. Иррелевантное антитело c9G4 также связывали с тем же самым соединением.
Фиг. 32: оценка in vivo гуманизированных форм 208F2-G-13 по сравнению с c208F2-G-13 в модели ксенотрансплантатов MCF-7.
Фиг. 33А и 33Б: оценка in vivo либо c208F2-G-13 (33А), либо hz208F2-4-G-13 (33Б), инъецированных 4 раза, по сравнению с одной инъекцией в модели ксенотрансплантатов MCF-7.
Фиг. 34А и 34Б: оценка in vivo c208F2-E-13 (34А) и c208F2-G-13 (34Б) в модели ксенотрансплантатов CaOV-3.
Фиг. 35А-35Г: 4 сенсограммы, соответствующие захвату растворимой формы h-IGF1R (30 мкг/мл), захваченной на СМ5, активированном более чем 12000 RU мышиного моноклонального антитела против полигистидина, химически связанного с карбоксиметилдекстрановой матрицей. После данной инъекции следовала инъекция в виде Ас1 либо подвижного буфера (HBS-EP+) (А и В), либо Hz208F2-4 (Б и В), использованного в концентрации 50 мкг/мл. После данной инъекции следовала инъекция Ас2 Hz208F2-4 в концентрации 50 мкг/мл (А и Б) или m810С12 также в концентрации 50 мкг/мл (В и Г). Данный эксперимент проводили на Biacore Х100 при 25°С при скорости тока 10 мкл/мин.
Фиг. 36: уровень связывания Ас2 в 20 с после завершения инъекции без Ас1 (белые столбики) или в присутствии Ас1 (черные столбики).
+
Фиг. 37: активность in vivo антитела 208F2, конъюгированного с соединениями G-13, в модели ксенотрансплантата 2 NCI-H2122.
Фиг. 38: уровни окрашивания IGF-1R и Ki67 в опухоли MCF7 перед инъекцией 208F2-G-13.
Фиг. 39: уровни окрашивания IGF-1R и Ki67 в опухоли MCF7 после инъекции 208F2-G-13.
ПРИМЕРЫ
Пример 1: получение и отбор первых антител против IGF-1R
Mab 816С12 и 810D12 продуцировали и отбирали, как описано ниже.
Самок мышей Balb/C иммунизировали подкожной инъекцией 10 мкг рекомбинантного человеческого белка IGF-1R (R&D Systems, 391-GR) с адъювантом Фрейнда. Иммунизацию повторяли 3 раза с 2-недельными интервалами. Четвертая инъекция была сделана внутрибрюшинной инъекцией в присутствии адъюванта.
Через трое суток клетки селезенки сливали с миеломными клетками SP2OAg14 с 50% PEG. После 14 суток метаболической селекции HAT (с гипоксантином, аминоптерином и тимидином) супернатанты гибридомы тестировали FACS с использованием человеческих клеток рака молочной железы MCF7. Сохраняли только антитела, связывающиеся с MCF7.
Интересующие антитела затем клонировали посредством ограниченного разведения. Через восемь суток после клонирования супернатанты еще один раз отбирали посредством FACS с использованием клеток MCF7. Для каждой гибридомы сохраняли три позитивных клона. Изотипирование секретированных антител определяется с использованием системы клонотипирования SBA (агглютинин из соевых бобов)-набора HRP (пероксидаза хрена) от Southern Biotechnologies (кат.: 5300-05). Наконец, один клон размножали и замораживали.
2
4
Затем проводили дополнительные характеризации 816С12 и 810D12 с использованием супернатанта гибридомы, как, например, посредством ELISA rhIGF-1R или rmIGF-1R, или rhIR. Во всех прямых ELISA интересующие белки иммобилизовали (1 мкг/мл) на дне каждой лунки. После насыщения супернатанты гибридомы добавляли в лунки. После 1-часового периода инкубации и стадии промывки использовали для выявления раствор поликлонального антитела козы против мышиного IgG, меченного HRP, до добавления субстрата ТМВ (тетраметилбензидин). Реакцию останавливали 1 М раствором HSO перед считыванием ОП (оптическая плотность) с использованием спектрофотометра при длине волны 450 нм. Данные представлены в Таблице 7.
50
Кривые доза ответ для вторых антител против IGF-1R на покрытии rhIGF-1R представлены на Фиг. 1 для 816С12 и на Фиг. 1Б для 810D12. Значения ЕС определяются с использованием приложения Prism.
50
50
Данные показали то, что антитело 816С12 распознает только rhIGF-1R с ЕС 0,41 нМ, и что антитело 810D12 распознает только rhIGF-1R с ЕС 0,51 нМ. Они оба не связываются ни с мышиной формой IGF-1R, ни с человеческим IR.
Пример 2: оценка корреляции определения стадии с первым антителом против IGF-1R по изобретению и активностью ADC, нацеленного на IGF-1R в модели ксенотрансплантата MCF-7
Для того чтобы связать стадию опухолей с фармакологией, определяли стадию опухолей (раздел 2.1), и затем осуществляли эксперименты in vivo на модели ксенотрансплантата MCF-7 с ADC, содержащим группировку второго антитела против IGF-1R, нацеленного на IGF-1R, для которого известно, что оно интернализуется, и лекарственную группировку, состоящую из ауристатина (раздел 2.2).
2.1: иммуногистохимическое выявление экспрессии IGF-1R на модели ксенотрансплантата MCF-7
Отрезки ткани из ксенотрансплантата MCF-7 депарафинизировали, регидратировали и помещали в буфер для демаскировки мишени 1× (Dako S1699) в кипящей бане, предварительно нагретой при 98°С для индуцированной нагреванием демаскировки эпитопа при 98°С в течение 40 мин, затем в течение еще 20 минут в буфере для демаскировки мишени. После 3 промывок в физиологическом растворе, буферизованном Tris - 0,05% Tween 20 (TBS-T) (Dako S3006), эндогенную пероксидазную активность блокировали с использованием реактива, блокирующего пероксидазу (Dako К4007), в течение пяти минут. Отрезки промывали TBS-T и инкубировали в блокирующем реактиве (Ultra V block-TA-125UB- LabVision) в течение 5 минут перед инкубацией либо с моноклональным антителом 816С12 (в концентрации 5 мкг/мл), либо с мышиным IgG1/каппа (5 мкг/мл, Х0931, Dako) в качестве негативного контроля в течение 1 часа при комнатной температуре. Отрезки промывали TBS-T и инкубировали с Envision (Dako) в течение 30 минут. Диаминобензидин использовали для проявления коричневого продукта реакции (Dako K3468). Предметные стекла помещали в гематоксилин на 2 минуты для контрастирующего окрашивания (Dako S3309).
Первое антитело против IGF-1R 816С12 и 810D12 дифференциально окрашивает клеточную мембрану MCF-7. В данной IHC (иммуногистохимической) методике коричневый продукт реакции коррелирует с позитивным окрашиванием клеточной мембраны, и отсутствие коричневого продукта реакции коррелирует с негативным окрашиванием и с отсутствием визуализации клеточной мембраны. С использованием мембранного алгоритма бальная оценка окрашивания опухолевых клеток MCF-7 составляла 3+ (Фиг. 2А для 816С12 и Фиг. 2Б для 810D12). С использованием антител против IGF-1R G11 (Roche Ventana) или AF-305 (R&D System) срезу той же самой опухоли была дана бальная оценка 2+ (Фиг. 2В и 2Г соответственно).
2.2: активность in vivo ADC против IGF-1R в модели ксенотрансплантата MCF-7
ADC против IGF-1R, содержащий вторую группировку против IGF-1R, оценивали in vivo в модели ксенотрансплантата MCF-7.
Все процедуры на животных проводили согласно руководству Директивы 2010/63/UE по защите животных, используемых в научных целях. Протокол был одобрен комитетом по этике обращения с животными Института Пьера Фабра. Пять миллионов клеток MCF-7 подкожно инъецировали 7-недельным швейцарским/голым мышам. Перед инъекцией клеток в левый бок мышей имплантировали эстрогеновые пеллеты (Innovative Research of America) для того, чтобы высвобождать эстрогены, необходимые для роста опухолей MCF-7 in vivo.
3
Через двадцать суток после имплантации клеток MCF-7, при достижении опухолями среднего размера 120-150 мм, животных делили на группы по 6 мышей согласно размеру и соотношению измерений опухоли. ADC против IGF-1R инокулировали посредством внутрибрюшинных инъекций в течение 6 инъекционных циклов каждые четверо суток (Q4d4). Состояние здоровья животных отслеживали ежесуточно. Объем опухоли измеряли дважды в неделю электронным штангенциркулем до завершения исследования. Объем опухоли рассчитывается с использованием следующей формулы: π/6 × длина × ширина × высота. Токсичность оценивали, отслеживая массу животных три раза в неделю. Статистические анализы проводили при каждом измерении с использованием критерия Манна-Уитни.
Инъекция ADC против IGF-1R значимо ингибировала и даже индуцировала полную регрессию роста опухоли (Фиг. 3), как ожидается для опухоли степени 3+, но не для опухоли степени 2+.
Пример 3: оценка корреляции определения стадии первым антителом против IGF-1R по изобретению и активности ADC, нацеленного на IGF-1R в модели ксенотрансплантата SBC-5
Для того чтобы связать стадию опухолей с фармакологией, определяли стадию опухолей (раздел 3.1), и затем осуществляли эксперименты in vivo на модели ксенотрансплантата SBC-5 с ADC, содержащим группировку антитела, нацеленного на IGF-1R, и лекарственную группировку, состоящую из ауристатина (раздел 3.2).
3.1: иммуногистохимическое выявление экспрессии IGF-1R на модели ксенотрансплантата SBC-5
Уровень IGF-1R анализировали с использованием того же самого протокола, который описан в разделе 2.1 Примера 2, приведенного ранее.
При выявлении IGF-1R с использованием 816С12 и 810D12 были выявлены низкие уровни (1+) (Фиг. 4А для 816С12 и 4Б для 810D12). При выявлении IGF-1R антителами против IGF-1R G11 (Roche Ventana) или AF-305 (R&D System) отрезкам из той же самой опухоли была дана бальная оценка 3+ (Фиг. 4В и 4Г соответственно).
3.2: активность in vivo ADC против IGF-1R в модели ксенотрансплантата SBC-5
ADC против IGF-1R оценивали in vivo в модели ксенотрансплантата SBC-5.
3
Все процедуры на животных проводили согласно руководству Директивы 2010/63/UE по защите животных, используемых в научных целях. Протокол был одобрен комитетом по этике обращения с животными Института Пьера Фабра. Пять миллионов клеток SBC-5 подкожно инъецировали 7-недельным бестимусным мышам. Через двенадцать суток после имплантации клеток, при достижении опухолями среднего размера 150 мм, животных делили на группы по 6 мышей согласно размеру и соотношению измерений опухоли. ADC против IGF-1R инокулировали посредством внутрибрюшинных инъекций в течение 6 инъекционных циклов каждые четверо суток (Q4d6). Состояние здоровья животных отслеживали ежесуточно. Объем опухоли измеряли дважды в неделю электронным штангенциркулем до завершения исследования. Объем опухоли рассчитывается с использованием следующей формулы: π/6 × длина × ширина × высота. Токсичность оценивали, отслеживая массу животных три раза в неделю. Статистические анализы проводили при каждом измерении с использованием критерия Манна-Уитни.
Прогрессирование опухоли опухолевых клеток SBC-5 не подвергалось влиянию инъекции ADC против IGF-1R, содержащего второе антитело против IGF-1R (Фиг. 5), как ожидалось для опухоли степени 1+, но не для опухоли степени 3+.
Пример 4: получение мышиных вторых антител Ab против IGF-1R, индуцированных против ECD IGF-1R
5
Для получения мышиных моноклональных антител (Mab) против человеческого внеклеточного домена (ECD) человеческого рецептора IGF-1 (hIGF-1R) 5 мышей BALB/c 3 раза п. к. (подкожно) иммунизировали 10 мкг белка rhIGF-1R (R&D Systems, кат. №391-GR). В качестве альтернативы, на некоторых животных проводили три дополнительные иммунизации 10 мкг мышиного внеклеточного домена (ECD) IGF-1R (R&D Systems, кат. №6630-GR / Fc). Первую иммунизацию проводили в присутствии полного адъюванта Фрейнда (Sigma, St Louis, MD, США). Неполный адъювант Фрейнда (Sigma) добавляли для следующих иммунизации. За трое суток до слияния иммунизированных мышей подвергали повторной иммунизации 10 мкг белка rhIGF-1R. Затем спленоциты и лимфоциты получали перфузией селезенки и измельчением проксимальных лимфатических узлов соответственно, отобранных от 1 из 5 иммунизированных мышей (отобранной после титрования сывороток всех мышей), и сливали с миеломными клетками SP2/0-Ag14 (АТСС (Американская коллекция типовых клеточных культур), Rockville, MD, США). Протокол слияния описывается Kohler and Milstein (Nature, 256: 495-497, 1975). Слитые клетки затем подвергаются отбору HAT. В общем, для получения моноклональных антител и их функциональных фрагментов, особенно мышиного происхождения, можно сослаться на методики, которые описываются, в частности, в руководстве "Antibodies" (Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, pp. 726, 1988). Приблизительно через 10 суток после слияния колонии гибридных клеток подвергали скринингу. Для первичного скрининга супернатанты гибридом оценивали на секрецию Mab, индуцированных против белка ECD IGF-1R, посредством анализа FACS с использованием человеческих клеток опухоли молочной железы MCF7 (АТСС) и/или клеток обезьяны COS7 (клетки почки африанской зеленой матрышки, трансформированные SV40), которые экспрессируют на их клеточной поверхности IGF-1R обезьяны. Более конкретно, для отбора проточной цитометрией в каждую лунку 96-луночного планшета высаживали 10 клеток (либо MCF7, либо COS7) в PBS (фосфатно-солевой буферный раствор), содержащем 1% BSA (бычий сывороточный альбумин) и 0,01% азида натрия (буфер FACS) при 4°С. После 2 мин центрифугирования при 2000 об./мин буфер удаляли, и добавляли супернатанты гибридомы, подлежащие тестированию. После 20 мин инкубации при 4° клетки дважды промывали и добавляли антитело козы против мышиного антитела, конъюгированное с Alexa 488, разведенное 1/500 в буфере FACS (#А11017, Molecular Probes Inc., Eugene, США), и инкубировали в течение 20 мин при 4°С. После конечной промывки буфером FACS клетки анализировали FACS (Facscalibur, Becton-Dickinson) после добавления в каждую пробирку пропидиум йодида в конечной концентрации 40 мкг/мл. Лунки, содержащие одни клетки и клетки, инкубированные с вторичным антителом, конъюгированным с Alexa 488, включали в качестве негативных контролей. В каждом эксперименте использовали изотипические контроли (Sigma, ref M90351MG). Оценивали по меньшей мере 5000 клеток для расчета среднего значения интенсивности флуоресценции (MFI).
5
Кроме того, проводили анализ интернализации для того, чтобы отобрать только интернализующиеся вторичные антитела Ab против IGF-1R. Для этого анализа линию клеток опухоли MCF7 культивировали в RPMI 1640 без фенолового красного с 1% L-глутамина и 10% FACS в течение 3 суток перед экспериментом. Клетки затем отсоединяли с использованием трипсина, и 100 мкл суспензии клеток в концентрации 4×10 клеток/мл высаживали в 96-многолуночные планшеты в RPMI1640 без фенолового красного, с 1% L-глутамина и 5% FBS. После 2 мин центрифугирования при 2000 об./мин клетки ресуспендировали в 50 мкл либо супернатантов гибридомы, либо контрольных растворов антитела (позитивный и изотипические контроли в концентрации 1 мкг/мл). После 20-мин времени инкубации при 4°С клетки центрифугировали 2 мин при 2000 об./мин и ресуспендировали либо в холодной (4°С), либо в теплой (37°С) полной культуральной среде. Клетки затем инкубировали в течение 2 часов либо при 37°С, либо при 4°С. Затем клетки три раза промывали буфером FACS. Антитело козы против мышиного антитела IgG, меченное Alexa 488, инкубировали в течение 20 мин, и клетки три раза промывали перед анализом FACS на популяции клеток, негативной в отношении пропидия йодида.
После анализа FACS определяли два параметра FACS: (i) различие флуоресцентного сигнала, выявленного на поверхности клеток, инкубированных при 4°С, с флуоресцентными сигналами, полученными с клетками, инкубированными при 37°С с одним супернатантом гибридомы, и (ii) процентную долю остающегося на поверхности клетки IGF-1R.
37°C
4°C
Процентная доля остающегося hIGF-1R рассчитывается следующим образом: % остающегося IGF-1R = (MFI Ab / MFI Ab )×100.
Кроме того, проводили три ELISA (либо до, либо после клонирования) для исследования связывания вторых антител Ab против IGF-1R на рекомбинантном человеческом (hIGF-1R) и мышином (mIGF-1R) белках, и на рекомбинантном белке человеческого инсулинового рецептора (hIR). Сохраняли гибридому, секретирующую антитело, демонстрирующую связывание на rh- и/или rm-IGF-1R и отсутствие связывания на rhIR. Вкратце, 96-луночные планшеты ELISA (Costar 3690, Corning, NY, США) покрывали 100 мкл/лунку либо белка rhIGF-1R (R&D Systems, кат. №391-GR) в концентрации 0,6 мкг/мл, либо белка rmIGF-1R (R&D Systems, кат. №6630-GR/Fc) в концентрации 1 мкг/мл, либо белка rhIR (R&D Systems, кат. №1544-IR/CF) в концентрации 1 мкг/мл в PBS в течение ночи при 4°С. Планшеты затем блокировали PBS, содержащим 0,5% желатина (#22151, Serva Electrophoresis GmbH, Гейдельберг, Германия) в течение 2 ч при 37°С. Как только насыщающий буфер был отброшен стряхиванием с чашек, в каждую лунку добавляли 100 мкл каждого разведения супернатанта (либо неразведенный супернатант гибридомы, либо серийные разведения супернатанта) и инкубировали в течение 1 ч при 37°С. После трех промывок добавляли 100 мкл поликлонального антитела козы против мышиного IgG, конъюгированного с пероксидазой хрена (#115-035-164, Jackson Immuno-Research Laboratories, Inc., West Grove, PA, США) в разведении 1/5000 в PBS, содержащем 0,1% желатина и 0,05% Tween 20 (масс. : масс.) в течение 1 ч при 37°С. Затем планшеты ELISA 3 раза промывали и добавляли субстрат ТМВ (#UP664782, Uptima, Interchim, Франция). После 10 мин времени инкубации при комнатной температуре реакцию останавливали с использованием 1 М серной кислоты, и измеряли оптическую плотность при 450 нм.
Гибридомы, секретирующие вторые интересующие антитела Ab против IGF-1R, размножали и клонировали посредством предельного разбавления. Сразу после изотипирования один клон каждого кода размножали и замораживали. Каждое второе интересующее антитело Ab против IGF-1R продуцировали в продукционных системах in vitro, именуемых CellLine (Intega Biosciences) для дальнейшей характеризации.
Дополнительные анализы, направленные на анализы специфичности связывания FACS, проводили на клетках IM9 (В-лимфобласты, экспрессирующие человеческий IR), а также на клетках, трансфицированных NGF-1R, относительно нетрансфицированных клеток.
Все данные, соответствующие отобранным вторым антителам Ab против IGF-1R, были обобщены в Таблице 8 и продемонстрировали то, что пять отобранных вторых антител Ab против IGF-1R сильно распознают природный человеческий IGF-1R, экспрессируемый либо на раковых клетках молочной железы MCF-7, либо на трансфицированных клетках. Они также распознают обезьяний IGF-1R на клетках COS-7. Данные вторые антитела Ab против IGF-1R не имеют перекрестной реактивности с человеческим инсулиновым рецептором, сильно экспрессируемым на клетках IM9. Необходимо отметить то, что данные вторые антитела Ab против IGF-1R плохо распознают ECD белка rhIGF-1R при непосредственном покрытии ими планшетов ELISA.
Пример 5: связывание второго антитела Ab против IGF-1R с человеческим нативным IGF-1R, определенное анализами FACS
6
3
max
50
Пять мышиных вторых антител Ab против IGF-1R делали химерными. Свойства связывания и мышиных, и химерных вторых антител Ab против IGF-1R оценивали анализами FACS на линии клеток человеческой аденокарциномы молочной железы MCF-7 (АТСС#НТВ-22), используя возрастающие концентрации антитела. С этой целью клетки (1×10 клеток/мл) инкубировали с антителами против IGF-1R в течение 20 мин при 4°С в буфере FACS (PBS, 0,1% BSA, 0,01% NaN). Их затем промывали 3 раза и инкубировали с подходящим вторичным антителом, связанным с Alexa 488, в течение 20 дополнительных минут при 4°С в темноте перед промывкой 3 раза в буфере FACS. Связывание вторых антител Ab против IGF-1R немедленно осуществляли на жизнеспособных клетках, которые были идентифицированы с использованием пропидиум йодида (который окрашивает мертвые клетки). Максимальная интенсивность сигнала, полученная с каждым антителом, была обозначена B и выражена в средней интенсивности флуоресценции (MFI). ЕС (полумаксимальная эффективная концентрация) связывания, выраженную в молярности (М), рассчитывали с использованием нелинейного регрессионного анализа (GraphPad Prism 4.0).
50
50
50
max
Кривая титрования каждого мышиного или химерного второго антитела Ab против IGF-1R продемонстрировала то, что все генерированные антитела способны распознавать нативную форму IGF-1R с типичным профилем насыщения (Фиг. 6А). Для того чтобы ранжировать вторые антитела Ab против IGF-1R и сравнить свойства связывания и мышиного, и химерного АЬ, ЕС связывания каждого соединения определяли с использованием нелинейного регрессионного анализа. Сравнение ЕС каждого мышиного Ab с соответствующей ему химерной формой показало то, что 2 данные формы демонстрировали одинаковые свойства связывания, демонстрируя то, что химеризация вторых антител Ab против IGF-1R не влияла на распознавание IGF-1R (Фиг. 6Б-В). Значения ЕС и B химерных антител обобщены в Таблице 9.
Пример 6: подтверждение специфичности второго антитела Ab против IGF-1R посредством применения клеток, трансфицированных либо IGF-1R, либо IR. или клеток IM9. которые экспрессируют значительные уровни IR
3
50
Для того чтобы подтвердить специфичность генерированных вторых антител Ab против IGF-1R в отношении IGF-1R относительно IR, оценивали стабильных трансфектантов, экспрессирующих либо hIGF-1R, либо hIR, посредством анализов FACS. Вкратце, возрастающие концентрации химерных вторых антител Ab против IGF-1R инкубировали с клетками в течение 20 мин при 4°С в буфере FACS (PBS, 0,1% BSA, 0,01% NaN). Клетки затем промывали 3 раза и инкубировали с подходящим вторичным антителом, связанным с Alexa 488, перед инкубированием в течение 20 дополнительных минут при 4°С в темноте и затем промывали 3 раза в буфере FACS. Связывание вторых антител Ab против IGF-1R немедленно осуществляли на жизнеспособных клетках, которые были идентифицированы с использованием пропидиум йодида (который окрашивает мертвые клетки). ЕС связывания, выраженную в молярности (М), рассчитывали с использованием нелинейного регрессионного анализа (GraphPad Prism 4.0).
50
max
Кривые титрования, полученные на линии клеток, трансфицированных hIGF-1R (Фиг. 7А), относительно нетрансфицированных клеток (Фиг. 7Б) подтвердили специфичность связывания химерных вторых антител Ab против IGF-1R в отношении человеческого IGF-1R. Значения ЕС и B обобщены в Таблице 10.
+
3
50
Для того чтобы подтвердить отсутствие связывания и мышиного, и химерного вторых антител Ab против IGF-1R на hIR, использовали стабильную линию клеток, экспрессирующую человеческий IR (hIR). Распознавание hIR поверхности человеческой клетки и мышиным, и химерным вторым антителом Ab против IGF-1R проводили посредством анализов FACS. Возрастающие концентрации либо мышиного, либо химерного Ab инкубировали на линии клеток, трансфицированной hIR, в течение 20 мин при 4°С в буфере FACS (PBS, 0,1% BSA, 0,01% NaN). Клетки затем 3 раза промывали и инкубировали с подходящим вторичным антителом, связанным с Alexa 488, перед инкубированием в течение 20 дополнительных минут при 4°С в темноте и затем промывали 3 раза в буфере FACS. Связывание вторых антител Ab против IGF-1R немедленно осуществляли на жизнеспособных клетках, которые были идентифицированы с использованием пропидиум йодида (который окрашивает мертвые клетки). ЕС связывания, выраженную в молярности (М), рассчитывали с использованием нелинейного регрессионного анализа (GraphPad Prism 4.0). Клон антитела против hIR GRO5 использовали в качестве позитивных контролей. Мышиное и химерное антитела 9G4 вводили в качестве иррелевантных антител.
+
Высокий уровень экспрессии hIR на клеточной поверхности трансфицированных клеток подтверждали с использованием имеющегося в продаже антитела против hIR GRO5 (Фиг. 8А и 8Б). Даже при использовании высоких концентраций либо мышиного (Фиг. 8А), либо химерного (Фиг. 8Б) вторых антител Ab против IGF-1R не наблюдали связывания на клеточной поверхности клеток, трансфицированных hIR. Данные результаты продемонстрировали то, что ни мышиное, ни химерное второе антитело Ab против IGF-1R не распознавало MR.
Данная специфичность распознавания hIGF-1R относительно IR также была продемонстрирована посредством анализов FACS с использованием клеток IM9 - линии клеток В-лимфомы, которая экспрессирует hIR (Фиг. 9). Для данных анализов FACS протокол был таким же, как и протокол, описанный выше, и мышиные вторые антитела Ab против IGF-1R использовали для того, чтобы предотвратить перекрестную реактивность вторичного антитела против человеческого Ab (клетки IM9 экспрессируют человеческий Ig на их клеточной поверхности). Результаты, представленные на Фиг. 9, опять продемонстрировали то, что с использованием антитела против hIR GRO5 наблюдался ожидаемый сигнал, тогда как ни одно из оцененных мышиных вторых антител Ab против IGF-1R не демонстрировало какого-либо значимого сигнала связывания на данной линии клеток.
Пример 7: связывание второго антитела Ab против IGF-1R с нативным обезьяньим IGF-1R, определенное анализами FACS и Biacore
Одной из первых предпосылок для надзорных исследований по токсикологии является нахождение релевантного вида животных для того, чтобы оценивать выбранное соединение. Поскольку ряд антител, описанных в данном документе, не способен распознавать мышиный IGF-1R, наиболее вероятный вид для токсикологической оценки представляет собой примата, не являющегося человеком (NHP).
6
3
50
Для того чтобы оценить связывание вторых антител Ab против IGF-1R на обезьяньем IGF-1R, сперва оценивали связывание и мышиных и химерных вторых антител Ab против IGF-1R посредством анализов FACS на линии клеток COS-7 с использованием возрастающих концентраций антител. Клетки (1×10 клеток/мл) инкубировали со вторыми антителами Ab против IGF-1R в течение 20 мин при 4°С в буфере FACS (PBS, 0,1% BSA, 0,01% NaN). Затем клетки промывали 3 раза и инкубировали с подходящим вторичным антителом, связанным с Alexa 488, перед инкубированием в течение 20 дополнительных минут при 4°С в темноте и, наконец, промывали 3 раза в буфере FACS. Связывание вторых антител Ab против IGF-1R немедленно оценивали на жизнеспособных клетках, идентифицированных с использованием пропидиум йодида (который окрашивает мертвые клетки). ЕС связывания, выраженную в молярности (М), рассчитывали с использованием нелинейного регрессионного анализа (GraphPad Prism 4.0).
50
Кривые титрования, полученные на линии клеток обезьяны COS-7, продемонстрировали то, что все вторые антитела Ab против IGF-1R специфично распознавали IGF-1R, экспрессируемый на поверхности линии клеток обезьяны (Фиг. 5А). Определение ЕС для каждого мышиного и химерного второго антитела Ab против IGF-1R продемонстрировало то, что 2 формы являются хорошо сравнимыми в отношении их свойств связывания на обезьяньем IGF-1R (Фиг. 10Б). Данные результаты продемонстрировали то, что все генерированные вторые антитела Ab против IGF-1R распознавали обезьяний IGF-1R.
50
Сравнение ЕС связывания на клетках COS-7 относительно клеток, трансфицированных IGF-1R, проводили для того, чтобы подтвердить величину распознавания химерным антителом на человеческом IGF-1R относительно обезьяньего. Результаты, показанные на Фиг. 10В, продемонстрировали аналогичное распознавание человеческого и обезьяньего IGF-1R всеми вторыми антителами Ab против IGF-1R.
Для того чтобы подтвердить распознавание на другом типе обезьяньего IGF-1R, клетки трансфицировали IGF-1R от яванского макака с получением растворимого ECD обезьяньего IGF-1R, и проводили эксперименты Biacore с одним из химерных вторых антител против IGF-1R (c208F2) для того, чтобы сравнить его свойства связывания либо на hIGF-1R, либо на IGF-1R яванского макака.
Эксперименты по распознаванию прогоняли на устройстве Biacore Х100 с использованием сенсорного чипа СМ5, активированного антителом против His метки (набор для захвата His, каталожный номер GE Healthcare 28-9950-56). Более чем 11000 RU антител химически прививали на карбоксиметилдекстрановую матрицу с использованием набора для аминной химии. Эксперименты проводили при 25°С со скоростью тока 30 мкл/мин с использованием буфера HBS-EP (GE Healthcare) в качестве подвижного буфера и буфера для разведения образца. Кинетическую схему одного цикла использовали для определения кинетических параметров связывания химерной формы 208F2 второго антитела против IGF-1R (c208F2) на hIGF-1R по сравнению с IGF-1R макака.
Раствор растворимой рекомбинантной версии гетеротетрамера IGF-1R, состоящего из 2 α-цепей и внеклеточных доменов 2 β-цепей, экспрессируемых с дополнительной С-концевой 10-His меткой, основанного либо на последовательности человеческого (каталожный номер R&D Systems 305-GR-50), либо одного из IGF-1R яванского макака (полученого самостоятельно авторами изобретения), инъецировали 1 минуту на второй проточной ячейке при разведении, определенном для захвата примерно 160 RU антигена. После фазы захвата 5 раз инъецировали (каждая инъекция 90 с) либо подвижный буфер, либо интервал 5 возрастающих концентраций c208F2 (каждая инъекция 90 с) на обеих проточных ячейках. В конце пятой инъекции пропускали подвижный буфер для того, чтобы определить скорость диссоциации.
Затем регенерировали поверхность инъекцией 10 мМ глицин-HCl буфера, рН 1,5, на протяжении 30 с.
Расчетный сигнал соответствует различию между ответом проточной ячейки 2 (с захваченным IGF-1R) и ответом проточной ячейки 1 (без каких-либо молекул IGF-1R) (Фиг. 11).
2
Для каждой молекулы IGF-1R (человека или яванского макака) сигнал, обусловленный инъекциями интервала возрастающих концентраций c208F2, корректировали вычитанием сигнала, полученного с 5 инъекциями буфера (двойной контроль). Полученные в результате сенсограммы анализировали с использованием программы Biaevaluation с моделью 1:1. Кинетические скорости оцениваются либо независимо (2 кинетические скорости связывания c208F2 на каждом IGF-1R), либо обобщенно (те же самые кинетические скорости связывания c208F2 на IGF-1R человека и яванского макака). Качество аппроксимации оценивали по отношению Хи/Rmax, меньшему, чем 0,05 RU.
Кинетические скорости связывания (см. Таблицу 11), определенные раздельно для каждого IGF-1R, являются близкими, и аппроксимация обеих сенсограмм с теми же кинетическими скоростями имеет хорошее качество.
Антитело c208F2 также распознает рекомбинантный человеческий IGF-1R и IGF-1R яванского макака с константой диссоциации (KD) примерно 0,2 нМ. Аффинности, определенные в данном исследовании, соответствуют функциональным аффинностям (авидностям) антител для уровня захваченного человеческого IGF-1R и IGF-1R яванского макака около 160 RU.
Пример 8: собственный эффект полученных вторых антител Ab против IGF-1R на фосфорилирование IGF-1R
Хорошо известно то, что антитела могли индуцировать агонистический эффект при их связывании с тирозинкиназными рецепторами. Поскольку авторы изобретения не хотели бы отбирать такие агонистические антитела, оценка фосфорилирования hIGF-1R была исследована с использованием химерных вторых антител Ab против IGF-1R.
С этой целью клетки MCF-7 инкубировали в бессывороточной среде в течение ночи. Затем добавляли либо IGF-1 (100 нМ), либо вторые антитела Ab против IGF-1R, подлежащие тестированию (10 мкг/мл) на 10 минут при 37°С. Среду отбрасывали, и клетки соскабливали в лизисный буфер (рН 7,5), содержащий 10 мМ буфер Tris-HCl (рН 7,5), 15% NaCl (1 М), 10% смеси детергентов (10 мМ Tris-HCl, 10% лизисного буфера Igepal) (Sigma Chemical Co.), 5% дезоксихолата натрия (Sigma Chemical Co.), 1 полную TM таблетку смеси ингибиторов протеаз (Roche), 1% набора II смеси ингибиторов фосфатаз (Calbiochem) в течение 90 мин при 4°С. Лизаты осветляли центрифугированием при 4°С, нагревали в течение 5 мин при 100°С и выдерживали при -20°С или непосредственно загружали на 4-12%-ные гели SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия). Инкубацию первичных антител проводили в течение 2 ч при комнатной температуре, и затем осуществляли инкубацию с вторичными антителами, связанными с HRP, в течение 1 ч при комнатной температуре. Мембраны промывали в TBST перед визуализацией белков с использованием ECL (электрохемилюминисценция). Блоты количественно измеряли с использованием программы Image J. Значения фосфобелка нормировали с использованием GAPDH (глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа). Фосфорилирование hIGF-1R в ответ на IGF-1 считали 100%-ной стимуляцией. Эффект вторых антител Ab против IGF-1R на фосфорилирование hIGF-1R определяли как % фосфорилирования, индуцированного IGF-1.
Результаты, описанные на Фиг. 12, представляют среднее значение % pIGF-1R в ответ на химерные вторые антитела IGF-1R 3 независимых экспериментов плюс/минус S.D. (стандартное отклонение) по сравнению с IGF-1. Как проиллюстрировано, при инкубации клеток MCF-7 с 10 мкг Ab против IGF-1R было выявлено не значимое или слабое (меньше 10%) фосфорилирование hIGF-1R.
Пример 9: ингибирование фосфорилирования IGF-1R в ответ на IGF-1 посредством мышиных вторых антител Ab против IGF-1R
Для того чтобы охарактеризовать отобранные вторые антитела Ab против IGF-1R, исследовали их способность ингибировать фосфорилирование, индуцированное IGF1. С этой целью клетки MCF-7 инкубировали в бессывороточной среде в течение ночи. Затем клетки инкубировали в течение 5 минут с мышиными вторыми антителами против IGF-1R перед добавлением IGF-1 на 2 минуты при 37°С. Среду отбрасывали, и клетки соскабливали в лизисный буфер (рН 7,5), содержащий 10 мМ буфер Tris-HCl (рН 7,5), 15% NaCl (1 М), 10% смеси детергентов (10 мМ Tris-HCl, 10% лизисного буфера Igepal) (Sigma Chemical Co.), 5% дезоксихолата натрия (Sigma Chemical Co.), 1 полную TM таблетку смеси ингибиторов протеаз (Roche), 1% набора II смеси ингибиторов фосфатаз (Calbiochem) в течение 90 мин при 4°С. Лизаты осветляли центрифугированием при 4°С, нагревали в течение 5 мин при 100°С и выдерживали при -20°С или непосредственно загружали на 4-12%-ные гели SDS-PAGE. Инкубацию первичных антител проводили в течение 2 ч при комнатной температуре, и затем осуществляли инкубацию с вторичными антителами, связанными с HRP, в течение 1 ч при комнатной температуре. Мембраны промывали в TBST перед визуализацией белков с использованием ECL. Блоты количественно измеряли с использованием программы Image J. Значения уровня фосфобелка нормировали с использованием GAPDH. Фосфорилирование hIGF-1R в ответ на IGF-1 считали 100%-ной стимуляцией. Эффект Ab против hIGF-1R на фосфорилирование hIGF-1R определяли как % фосфорилирования, индуцированного IGF-1.
Все вторые антитела Ab против IGF-1R сильно ингибировали фосфорилирование hIGF-1R в ответ на IGF-1 (уменьшение больше 80%) (Фиг. 13). Наилучшими ингибиторами индуцированного IGF-1 фосфорилирования hIGF-1R являются Mab m208F2, m212A11 и m214F8.
Пример 10: исследование интернализации IGF-1R после связывания полученными вторыми антителами против IGF-1R, определенной анализами FACS
Клетки MCF-7 инкубировали с 10 мкг/мл химерных антител при 4°С в течение 20 мин. Затем клетки промывали и инкубировали при 4°С или при 37°С в течение 4 ч. Количество антитела, связанного с поверхностью клетки, определяли с использованием вторичного антитела. ΔMFI, определенная как различие между MFI, измеренной при 4°С, и MFI, измеренной при 37°С, после 4-часового времени инкубации, соответствовала количеству интернализованных вторых антител Ab против IGF-1R. ΔMFI была представлена на Фиг. 14 и в Таблице 12. Процентную долю интернализации при концентрации Ab 10 мкг/мл рассчитывали следующим образом: 100%*(MFI при 4°С - MFI при 37°C)/MFI при 4°С и представляли в Таблице 12.
Для того чтобы определить, были ли способны вторые антитела против IGF-1R, которые также распознавали IGF-1R обезьяны, интернализовать данный рецептор, проводили такой же эксперимент по интернализации. Результаты, обобщенные в Таблице 13, продемонстрировали то, что все протестированные антитела могли опосредовать интернализацию IGF-1R обезьяны.
Дополнительно оценивали кинетику уменьшения уровня антитела, связанного с поверхностью клетки. С этой целью клетки MCF-7 высевали в 96-луночные планшеты и инкубировали с 10 мкг/мл мышиного антитела в течение 20 мин при 4°С. Клетки затем промывали с удалением несвязавшегося антитела и в средах при 37°С в течение 10, 20, 30, 60 или 120 мин. В каждый момент времени клетки центрифугировали и затем метили поверхность на льду с использованием вторичного антитела против мышиного IgG, конъюшированного с Alexa488, для определения количества антитела, остающегося на поверхности клетки. Интенсивность флуоресценции для каждого мышиного Ab и для каждого момента времени нормировали к сигналу при 4°С (% остающегося IGF-1R) и аппроксимировали к экспоненциальному уменьшению сигнала для определения периода полужизни (t1/2). t1/2 рассматривали как время, необходимое для получения 50%-ного уменьшения сигнала. Как проиллюстрировано на Фиг. 15, поверхностный уровень всех мышиных Ab быстро падал на протяжении первых 30 мин, и снижение было почти максимальным после 60 мин инкубации (Фиг. 15А). Расчетный период полувыведения составлял от 10 до 18 мин согласно мышиному Ab (Фиг. 15Б).
Для того чтобы подтвердить то, что уменьшение уровня сигнала поверхности клетки было обусловлено интернализацией вторых антител Ab против IGF-1R и не было обусловлено отделением рецептора, клетки инкубировали с мышиными Ab в течение 0, 30 и 60 мин при 37°С (Фиг. 16). Клетки затем фиксировали и пермеабилизировали или не пермеабилизировали для определения антитела, связанного с поверхностью клетки (без пермеабилизации), и общего сигнала антитела, соответствующего связанным с поверхностью клетки плюс интернализованным вторым антителам Ab против IGF-1R (с пермеабилизацией). Количество интернализованных вторых антител Ab против IGF-1R (цитоплазматических) определяли следующим образом: MFI после пермеабилизации минус MFI без пермеабилизации. Данный эксперимент продемонстрировал то, что уменьшение связанных с поверхностью клетки вторых антител Ab против IGF-1R было обусловлено увеличением цитоплазматических Ab, демонстрируя то, что Ab интернализовались (Фиг. 16). Кроме того, после 1 ч инкубации начиналась деградация Ab, на что указывает уменьшение сигнала после пермеабилизации (общее).
Пример 11: исследование интернализации IGF-1R после связывания полученных вторых антител против IGF-1R посредством конфокальных анализов
Для дальнейшего подтверждения интернализации вторых антител Ab против IGF-1R осуществляли конфокальную микроскопию для оценки субклеточного распределения антител после клеточного транспорта. Клетки инкубировали с Ab против hIGF-1R при 37°С, фиксировали и пермеабилизировали. Следовательно, клетки окрашивали с использованием вторичного антитела, конъюгированного с Alexa-488, и антителом кролика против Lamp-1, которое было выявлено с использованием вторичного антитела против IgG кролика, конъюгированного с Alexa 555. Перед инкубацией при 37°С мышиное Ab 208F2 было локализовано на мембране клеток MCF-7 (Фиг. 17А). Не было отмечено колокализации с лизосомальным маркером - lamp-1 - с использованием программного модуля для выявления колокализации программы Image J. Уровень антитела, связанного с поверхностью клетки, кардинально уменьшался после 15 мин инкубации при 37°С. Параллельно уменьшению уровня антитела, связанного с поверхностью клетки, было выявлено внутриклеточное антитело в везикулах. Можно было наблюдать редкую колокализацию с lamp-1. После 30 мин инкубации антитело, связанное с поверхностью клетки, было едва выявляемым. Однако возрастала колокализация Ab в лизосоме. После 1 ч инкубации окрашивание на внутриклеточное Ab уменьшалось, также как и уровень колокализации с lamp-1. Данная кинетика антитела, связанного с поверхностью клетки, и его внутриклеточное накопление коррелировали с кинетикой измерения спада уровня антитела на поверхности посредством FACS. Кроме того, как уже описано с исследованиями FACS, деградация мышиных Ab начиналась после 1 ч инкубации при определении конфокальной микроскопией.
Также оценивали интернализацию всех других вторых мышиных антител Ab против IGF-1R и их колокализацию с Lamp-1 (Фиг. 17Б). После 30 мин инкубации при 37°С выявляли внутриклеточное антитело и могли наблюдать колокализацию с lamp-1, указывающую на то, что все отобранные антитела против IGF-1R эффективно интернализовались в лизосомы.
Пример 12: ингибирование деградации вторых антител Ab против IGF-1R с использованием лизосомального ингибитора - бафиломицина А1
Для того чтобы подтвердить то, что вторые антитела Ab против IGF-1R достигали лизосомы, где они деградировали, клетки обрабатывали или не обрабатывали бафиломицином А1 - мощным ингибитором функций лизосом. Клетки затем инкубировали с 10 мкг/мл Ab, подлежащего тестированию, при 4°С, промывали и инкубировали в течение 2 ч при 37°С. Интернализованные Ab выявляли после пермеабилизации клеток с использованием вторичного Ab против мышиного IgG, конъюгированного с Alexa 488. Добавление бафиломицина А1 предотвращало деградацию внутриклеточного Ab (Фиг. 18), указывая то, что Ab эффективно интернализовались и деградировали в лизосомах.
Пример 13: влияние рН на связывание второго антитела Ab против IGF-1R с IGF-1R
Так как вторые антитела Ab против IGF-1R были отобраны на основе их потенциала к интернализации, и, как показано выше, колокализуются с ранними эндосомами перед поступлением в лизосомальный компартмент, интересный подход заключался в отборе антител, для которых стабильность связывания Ab/hIGF-1R модулировалась в отношении рН среды, и предпочтительно антител, которые предпочтительно диссоциировали от IGF-1R, когда рН среды становился кислотным. В самом деле, важнейшим различием между ранними эндосомами и лизосомами является рН их полости: в эндосомальном компартменте рН составляет приблизительно 6, тогда как в лизосомальном компартменте рН составляет примерно 4,5.
Хорошо известно то, что сразу после интернализации после связывания лиганда (IGF1) hIGF-1R возвращается обратно к поверхности клетки посредством пути рециклирования.
Не будучи связанными теорией, в данном документе описывается гипотеза о том, что антитела, более склонные к раннему высвобождению от их мишени при кислотном рН, вероятно будут способствовать рециклированию мишени к мембране и, следовательно, могли бы рассматриваться как лучшие кандидаты для подходов ADC.
50
Для того чтобы исследовать, демонстрируют ли некоторые из полученных вторых антител Ab против IGF-1R такое свойство, и для связывания данного свойства с цитотоксической активностью, связывание мышиных вторых антител Ab против IGF-1R на линии клеток MCF-7 осуществляли в буферах при разных рН. Возрастающие концентрации мышиных mAb инкубировали на линии клеток MCF-7 в течение 20 мин при 4°С при разных рН, варьирующих от 5 до 8. Затем клетки 3 раза промывали и инкубировали с подходящим вторичным антителом, связанным с Alexa 488, в буфере FACS. Клетки инкубировали в течение еще 20 мин при 4°С в темноте и затем 3 раза промывали в буфере FACS. Связывание антител против hIGF-1R осуществляли немедленно на жизнеспособных клетках, которые идентифицировали с использованием пропидиум йодида, который окрашивал мертвые клетки. ЕС связывания, выраженную в молярности (М), рассчитывали с использованием нелинейного регрессионного анализа (GraphPad Prism 4.0). Все отобранные мышиные вторые антитела Ab против IGF-1R демонстрировали меньшую способность к связыванию при кислотном рН, как проиллюстрировано на Фиг. 19.
50
Связывание гуманизированных вторых антител Ab против IGF-1R на линии клеток MCF-7 осуществляли в буферах при разных рН. Возрастающие концентрации гуманизированных mAb инкубировали на линии клеток MCF-7 в течение 20 мин при 4°С при разных рН, варьирующих от 5 до 8. Затем клетки 3 раза промывали и инкубировали с подходящим вторичным антителом, связанным с Alexa 488, в буфере FACS. Клетки инкубировали в течение еще 20 мин при 4°С в темноте и затем 3 раза промывали в буфере FACS. Связывание гуманизированных вторых антител Ab против IGF-1R осуществляли немедленно на жизнеспособных клетках, которые идентифицировали с использованием пропидиум йодида, который окрашивал мертвые клетки. ЕС связывания, выраженную в молярности (М), рассчитывали с использованием нелинейного регрессионного анализа (GraphPad Prism 4.0). Гуманизированные вторые антитела против IGF-1R демонстрировали меньшую способность к связыванию при кислотном рН, как проиллюстрировано на Фиг. 29.
Пример 14: оценка гуманизированной формы Mab 208F2
14.1 Оценка связывания и интернализации гуманизированной формы hz208F2 H026/L024 (также иногда именуемой VH3/VL3 или вариант 3)
+
Связывание гуманизированной формы mAb c208F2 оценивали на линиях клеток MCF-7, COS-7 и NIH 3Т3 IR. На каждой линии клеток добавляли возрастающие концентрации m208F2, c208F2 или hz208F2 VH3VL3 в течение 20 мин при 4°С. Затем клетки промывали, и связывание тестируемых mAb выявляли с использованием соответствующего вторичного антитела. Для того чтобы подтвердить экспрессию человеческого IR на линии трансфицированных клеток, использовали имеющийся в продаже клон GRO5 антитела против hIR, и его профиль распознавания проиллюстрирован примером на Фиг. 20Г.
Сравнение гуманизированной формы либо с мышиными, либо с химерными антителами на клетках MCF-7 (Фиг. 20А) или COS-7 обезьяны (Фиг. 20Б) продемонстрировало близкие профили для 3 протестированных форм. Процесс гуманизации не модифицировал специфичность распознавания антитела, которая является вполне сравнимой с мышиной и химерной формами в отношении отсутствия перекрестной реактивности на человеческом инсулиновом рецепторе (Фиг. 20В).
50s
Расчетные EC первой гуманизированной формы 208F2 на человеческой линии клеток MCF-7 и мышиной линии клеток COS-7 были аналогичными значению, определенному с использованием либо мышиной, либо химерной формы mAb 208F2.
Способность mAb hz208F2 H026/L024 к интернализации оценивали проточной цитометрией. Клетки MCF-7 инкубировали с 10 мкг/мл антител при 4°С в течение 20 мин. Затем клетки промывали и инкубировали при 4°С или 37°С в течение 4 ч. Количество антитела, связанного с поверхностью клеток, опредедяли с использованием вторичного антитела. ΔMFI, определенная как различие между MFI, измеренной при при 4°С, и MFI, измеренной при 37°С, после 4-часового времени инкубации, соответствовала количеству интернализованного Ab. ΔMFI была представлена на Фиг. 21 и в Таблице 14а. Процентную долю интернализации при 10 мкг/мл Ab рассчитывали следующим образом: 100*(MFI при 4°С - MFI при 37°C)/MFI при 4°С, и она представлена в Таблице 14а. Следовательно, гуманизированное hz208F2 H026/L024 (именуемое в следующей таблице VH3/VL3) имело аналогичные свойства связывания и интернализации, что и свойства, измеренные с соответствующим мышиным и химерным антителами 208F2.
14.2 Оценка связывания последующих гуманизированных форм hz208F2
6
3
50
Гуманизировали второе антитело против IGF-1R 208F2, и оценивали свойства связывания шестнадцати гуманизированных вариантов (включающих первую форму, описанную в 12.1). Свойства связывания гуманизированных вариантов оценивали анализами FACS на человеческой линии клеток аденокарциномы молочной железы MCF-7 и обезьяньей линии клеток Cos-7 с использованием возрастающих концентраций антитела. С этой целью клетки (1×10 клеток/мл) инкубировали с антителами против IGF-1R в течение 20 мин при 4°С в буфере FACS (PBS, 0,1% BSA, 0,01% NaN). Их затем 3 раза промывали и инкубировали с подходящим вторичным антителом, связанным с Alexa 488, в течение еще 20 минут при 4°С в темноте перед промывкой 3 раза в буфере FACS. Связывание антител против IGF-1R немедленно осуществляли на жизнеспособных клетках, которые были идентифицированы с использованием пропидиум йодида (который окрашивает мертвые клетки). ЕС связывания, выраженную в молярности (М), рассчитывали с использованием нелинейного регрессионного анализа (GraphPad Prism 4.0).
50
ЕС гуманизированных вариантов показала то, что все гуманизированные варианты демонстрировали эквивалентные свойства связывания как на человеческих, так и на обезьяньих линиях клеток.
50
ЕС гуманизированных антител были обобщены в Таблице 14б.
14.3 Оценка интернализации другой гуманизированной формы hz208F2
Клетки MCF-7 инкубировали с 10 мкг/мл гуманизированных антител при 4°С в течение 20 мин. Затем клетки промывали и инкубировали при 4°С или 37°С в течение 4 ч. Количество антитела, связанного с поверхностью клетки, определяли с использованием вторичного антитела на проточном цитометре FacsCalibur (Becton Dickinson). ΔMFI, определенная как различие между MFI, измеренной при при 4°С, и MFI, измеренной при 37°С, после 4-часового времени инкубации, соответствовала количеству интернализованного Ab. ΔMFI была представлена в Таблице 14в. Процентную долю интернализации при 10 мкг/мл Ab рассчитывали следующим образом: 100*(MFI при 4°С - MFI при 37°C)/MFI при 4°С. Гуманизированное второе антитело против IGF-1R hz208F2 H077/L018 способно индуцировать значительную интернализацию IGF-1R.
D
Пример 15: определение константы диссоциации (K) связывания пяти химерных антител против IGF-1R (c208F2, c213B10, с212А11, c214F8 и C219D6) и гуманизированной версии (H026/L024) антитела 208F2 на растворимом рекомбинантном человеческом IGF-1R
D
off
on
Константы диссоциации (K) связывания антител на рекомбинантном растворимом человеческом IGF-1R определяли по отношению между скоростью диссоциации (k) и скоростью ассоциации (k). Эксперименты по кинетике проводили на приборе Biacore Х100 с использованием сенсорного чипа СМ5, активированного мышиным моноклональным антителом против His метки. Около 12000 RU антител химически прививали на карбоксиметилдекстрановую матрицу с использованием набора для аминной химии.
Эксперименты проводили при 25°С со скоростью тока 30 мкл/мин с использованием буфера HBS-EP+ (GE Healthcare) в качестве подвижного буфера и буфера для разведения образца.
Для определения кинетических параметров связывания антител против IGF-1R на растворимом рекомбинантном человеческом IGF-1R, захваченном посредством его двух С-концевых 10-гистидиновых меток, использовали кинетическую схему одного цикла.
1 - раствор растворимой рекомбинантной версии гетеротетрамера человеческого IGF-1R: 2 α-цепи и внеклеточные домены 2 β-цепей, экспрессируемых с дополнительной С-концевой 10-His меткой (R&D Systems, каталожный номер 305-GR-50), инъецировали на протяжении одной минуты на второй проточной ячейке в концентрации 10 мкг/мл. В среднем 587 RU (со стандартным отклонением 24 RU) растворимого рецептора захватывали в каждом из 24 циклов, осуществленных для данного исследования.
2 - после фазы захвата на обоих проточных ячейках инъецировали либо подвижный буфер 5 раз (каждая инъекция - 90 с), либо интервал возрастающих 5 концентраций одного из шести антител (каждая инъекция - 90 с). В конце пятой инъекции пропускали подвижный буфер на протяжении 5 минут для того, чтобы определить скорость диссоциации.
3 - затем регенерировали поверхность инъекцией 10 мМ буфера глицин-HCl, рН 1,5, на протяжении 45 с.
Расчетный сигнал соответствует различию между ответом проточной ячейки 2 (с захваченным IGF-1R) и ответом проточной ячейки 1 (без каких-либо молекул IGF-1R).
Для каждого IGF-1R сигнал, обусловленный инъекциями интервала возрастающих концентраций одного антитела, корректировали вычитанием сигнала, полученного с 5 инъекциями буфера (двойной контроль) (см. Фиг. 22).
Полученные в результате сенсограммы анализировали посредством программы Biaevaluation с использованием модели 1:1.
Для каждого антитела провели четыре эксперимента с использованием двух разных интервалов концентраций: 40, 20, 10, 5 и 2,5 нМ для двух первых экспериментов и 24, 12, 6, 3 и 1,5 нМ для двух последних экспериментов, проведенных для каждого второго антитела против IGF-1R.
off
Для 6 вторых антител против IGF-1R, протестированных в данном эксперименте, экспериментальные данные хорошо аппроксимировались к модели 1:1 со значимыми значениями k, когда более высокая концентрация была определена как константа, а другие четыре концентрации рассчитываются (см. Фиг. 23).
D
off
on
off
Константы диссоциации (K), рассчитанные как отношение: k/k, и период полужизни комплексов, рассчитанный как отношение: Ln(2)/k, представлены на Фиг. 24 и 25. Они соответствуют среднему значению четырех независимых экспериментальных прогонов для каждого из вторых антител против IGF-1R. Планки погрешностей соответствуют стандартным ошибкам (n равно 4) значений.
D
D
D
Константы диссоциации находятся в интервале от 10 до 100 пМ. Антитело c208F2 демонстрирует более слабую аффинность (более высокое значение константы диссоциации) в отношении h-IGF-1R (с K около 75 пМ), и его гуманизированная версия по меньшей мере так же хороша, как и химерная версия (с K около 60 пМ). Четыре других вторых химерных антитела против IGF-1R демонстрируют весьма сходную аффинность в отношении hIGF-1R (с K около 30 пМ). Различие аффинностей, главным образом, связано со скоростью диссоциации или с полученным в результате временем полужизни комплексов. При использовании 208F2 время полужизни комплекса составляет от 2 до 3 часов с химерной и гуманизированной версиями второго антитела против IGF-1R. Для четырех других вторых химерных антител против IGF-1R средние периоды полужизни составляют от 7,0 до 9,4 ч.
D
Эта очень медленная кинетика диссоциации явно связана с двухвалентной структурой антител, которые способны одновременно связываться обеими из их Fab-рук с двумя смежными молекулами h-IGF-1R. В данном случае уровень захваченных молекул IGF-1R может иметь влияние на скорость диссоциации. Аффинности, определенные в данном исследовании, соответствуют функциональным аффинностям (или авидностям) антител для уровня захваченного hIGF-1R около 600 RU. Трехкратное различие K, наблюдаемое между данными, показанными выше (Таблица 11), и значениями, представленными в Примере 13, связано с изменением уровня захвата hIGF-1R (600 RU по сравнению со 160 RU в Примере 7).
Пример 16: синтез лекарственных средств по изобретению
В следующих примерах используются следующие сокращения:
водн. водный
ее энантиомерный избыток
экв. эквивалент
ЭРИ электрораспылительная ионизация
ЖХ/МС жидкостная хроматография, сопряженная с масс-спектрометрией
ВЭЖХ высокоэффективная жидкостная хроматография
ЯМР ядерный магнитный резонанс
насыщ. насыщенный
УФ ультрафиолетовое излучение
Эталонное соединение 1
(S)-2-((S)-2-((3-аминопропил)(метил)амино)-3-метилбутанамидо)-N-(3R,4S,5S)-3-метокси-1-((S)-2-((1R,2R)-1-метокси-2-метил-3-оксо-3-(((S)-2-фенил-1-(тиазол-2-ил)этил)амино)пропил)пирролидин-1-ил)-5-метил-1-оксогептан-4-ил)-N,3-диметилбутанамида бис-трифторуксусная кислота
Соединение 1A: (4R,5S)-4-метил-5-фенил-3-пропаноил-1,3-оксазолидин-2-он
(4R,5S)-4-метил-5-фенил-1,3-оксазолидин-2-он (5,8 г, 32,7 ммоль, 1,00 экв.) растворяли в тетрагидрофуране (THF, 120 мл) в инертной атмосфере. Данную смесь охлаждали до -78°С и добавляли по каплям н-бутиллитий (14,4 мл). После встряхивания в течение 30 минут при -78°С добавляли пропаноилхлорид (5,7 мл). Встряхивание продолжали в течение 30 минут при -78°С, затем в течение ночи при температуре окружающей среды. Реакционную смесь концентрировали, затем повторно растворяли в 200 мл воды. рН раствора доводили до 7 насыщенным водным раствором бикарбоната натрия. Эту водную фазу 3 раза экстрагировали 100 мл этилацетата (EtOAc). Органические фазы объединяли, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали с получением 6,8 г (89%) соединения 1А в виде желтого масла.
Соединение 1В: трет-бутил-(2S)-2-[(1R,2R)-1-гидрокси-2-метил-3-[(4R,5S)-4-метил-2-оксо-5-фенил-1,3-оксазолидин-3-ил]-3-оксопропил]пирролидин-1-карбоксилат
2
Соединение 1А (17,6 г, 75,45 ммоль, 1,00 экв.) растворяли в дихлорметане (DCM, 286 мл) в инертной атмосфере. Данный раствор охлаждали с использованием бани со льдом. Добавляли по каплям триэтиламин (TEA, 12,1 мл, 1,15 экв.) и BuBOTf (78,3 мл, 1,04 экв.), поддерживая температуру реакционной смеси меньше 2°С. Встряхивание продолжали при 0°С в течение 45 мин, после чего реакционную смесь охлаждали до -78°С. Добавляли по каплям раствор трет-бутил-(2S)-2-формилпирролидин-1-карбоксилата (8,5 г, 42,66 ммоль, 0,57 экв.) в DCM (42 мл). Встряхивание продолжали в течение 2 часов при -78°С, затем в течение 1 часа при 0°С и, наконец, в течение 1 часа при температуре окружающей среды. Реакционную смесь нейтрализовали 72 мл фосфатного буфера (рН 7,2-7,4) и 214 мл метанола, и охлаждали до 0°С. Добавляли по каплям раствор 30%-ного пероксида водорода в метаноле (257 мл), поддерживая температуру ниже 10°С. Встряхивание продолжали в течение 1 часа при 0°С. Реакционную смесь нейтрализовали 142 мл воды, затем концентрировали при пониженном давлении. Образующийся водный раствор 3 раза экстрагировали 200 мл EtOAc. Органические фазы объединяли, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали на колонке с диоксидом кремния с использованием смеси EtOAc и петролейного эфира (EtOAc : PE - 1:8) с получением 13,16 г (40%) соединения 1В в виде бесцветного масла.
Соединение 1С: (2R,3R)-3-[(2S)-1-[(трет-бутокси)карбонил]пирролидин-2-ил]-3-гидрокси-2-метилпропановая кислота
2
3
4
Соединение 1В (13,16 г, 30,43 ммоль, 1,00 экв.) растворяли в THF (460 мл) в присутствии пероксида водорода (30% в воде, 15,7 мл), затем охлаждали с использованием бани со льдом. Добавляли по каплям водный раствор гидроксида лития (0,4 моль/л, 152,1 мл), поддерживая температуру реакционной смеси ниже 4°С. Реакционную смесь встряхивали 2,5 часа при 0°С. Добавляли по каплям водный раствор NaSO (1 моль/л, 167,3 мл), поддерживая температуру 0°С. Реакционную смесь встряхивали 14 часов при температуре окружающей среды, затем нейтрализовали 150 мл холодного насыщенного раствора бикарбоната натрия и 3 раза промывали 50 мл DCM. рН водного раствора доводили до 2-3 1 М водным раствором KHSO. Этот водный раствор 3 раза экстрагировали 100 мл EtOAc. Органические фазы объединяли, один раз промывали насыщенным раствором NaCl, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали с получением 7,31 г (88%) соединения 1С в виде бесцветного масла.
Соединение 1D: (2R,3R)-3-[(2S)-1-[(трет-бутокси)карбонил]пирролидин-2-ил]-3-метокси-2-метилпропановая кислота
4
2
2
3
Соединение 1С (7,31 г, 26,74 ммоль, 1,00 экв.) растворяли в инертной атмосфере в THF (135 мл) в присутствии йодметана (25,3 мл). Реакционную смесь охлаждали с использованием бани со льдом, после чего добавляли порциями NaH (60% в масле, 4,28 г). Реакционную смесь оставляли при встряхивании в течение 3 суток при 0°С и затем нейтрализовали 100 мл насыщенного водного раствора бикарбоната натрия, и 3 раза промывали 50 мл эфира. рН водного раствора доводили до 3 1 М водным раствором KHSO. Этот водный раствор 3 раза экстрагировали 100 мл EtOAc. Органические фазы объединяли, один раз промывали 100 мл NaSO (5% в воде), один раз - насыщенным раствором NaCl, затем сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали с получением 5,5 г (72%) соединения 1D в виде бесцветного масла.
Соединение 1Е: N-метокси-N-метил-2-фенилацетамид
3
2-Фенилуксусную кислоту (16,2 г, 118,99 ммоль, 1,00 экв.) растворяли в диметилформамиде (DMF, 130 мл), затем охлаждали до -10°С. Добавляли диэтилфосфороцианидат (DEPC, 19,2 мл), метокси(метил)амина гидрохлорид (12,92 г, 133,20 ммоль, 1,12 экв.) и триэтиламин (33,6 мл). Реакционную смесь встряхивали 30 минут при -10°С, затем 2,5 часа при температуре окружающей среды. Затем ее дважды экстрагировали 1 литром EtOAc. Органические фазы объединяли, дважды промывали 500 мл NaHCO (насыщ.), один раз - 400 мл воды, затем сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали на колонке с диоксидом кремния с использованием смеси EtOAc и РЕ (от 1:100 до 1:3) с получением 20,2 г (95%) соединения 1Е в виде желтого масла.
Соединение 1F: 2-фенил-1-(1,3-тиазол-2-ил)этан-1-он
4
Тетраметилэтилендиамин (TMEDA, 27,2 мл) растворяли в THF (300 мл) в инертной атмосфере, затем охлаждали до -78°С перед добавлением по каплям н-BuLi (67,6 мл, 2,5 М). Добавляли по каплям 2-бром-1,3-тиазол (15,2 мл) и продолжали встряхивание 30 минут при -78°С. Добавляли по каплям соединение 1Е (25 г, 139,50 ммоль, 1,00 экв.), растворенное в THF (100 мл). Встряхивание продолжали 30 минут при -78°С, затем 2 часа при -10°С. Реакционную смесь нейтрализовали 500 мл KHSO (насыщ.), затем 3 раза экстрагировали 1 литром EtOAc. Органические фазы объединяли, дважды промывали 400 мл воды и дважды - 700 мл NaCl (насыщ.), затем сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали на колонке с диокидом кремния с использованием смеси EtOAc и РЕ (от 1:100 до 1:10) с получением 25 г (88%) соединения 1F в виде желтого масла.
Соединение 1G: (1R)-2-фенил-1-(1,3-тиазол-2-ил)этан-1-ол
2
2
2
2
3
Раствор соединения 1F (15 г, 73,8 ммоль, 1,00 экв.) в эфире (300 мл) в инертной атмосфере добавляли по каплям к (+)-В-хлордиизопинокамфеилборану ((+)-IpcBCl, 110,8 мл). Реакционную смесь встряхтвали 24 часа при 0°С, затем нейтрализовали 300 мл смеси (1:1) NaOH (10% в воде) и HO (30% в воде) и, наконец, три раза экстрагировали 500 мл EtOAc. Органические фазы объединяли, дважды промывали 300 мл KCO (насыщ.) и один раз - 500 мл NaCl (насыщ.), затем сущили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали на колонке с диоксидом кремния с использованием смеси EtOAc и РЕ (от 1:20 до 1:2) с получением 6,3 г (42%) соединения 1G в виде белого твердого вещества.
Соединение 1Н: 2-[(1S)-1-азидо-2-фенилэтил]-1,3-тиазол
Соединение 1G (6 г, 29,23 ммоль, 1,00 экв.) растворяли в инертной атмосфере в THF (150 мл) в присутствии трифенилфосфина (13 г, 49,56 ммоль, 1,70 экв.), затем охлаждали до 0°С. Добавляли по каплям диэтилазодикарбоксилат (DEAD, 7,6 мл), с последующим добавлением дифенилфосфорилазида (DPPA, 11 мл), затем удаляли холодную баню, и раствор отставляли на 48 часов со встряхиванием при температуре окружающей среды. Среду концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали на колонке с диоксидом кремния с использованием смеси EtOAc и РЕ (от 1:100 до 1:30) с получением 8 г частично очищеннго соединения 1Н в виде желтого масла. Соединение 1Н использовали как таковое на следующей стадии.
Соединение 1I: трет-бутил-N-[(1S)-2-фенил-1-(1,3-тиазол-2-ил)этил]карбамат
2
Соединение 1H (6,5 г, 28,2 ммоль, 1,00 экв.) растворяли в THF (100 мл) в инертной атмосфере в присутствии трифенилфосфина (6,5 г, 33,9 ммоль, 1,20 экв.) и нагревали до 50°С в течение 2 часов. Затем добавляли аммиак (70 мл) и продолжали нагревание в течение 3 часов. Реакционную смесь охлаждали, нейтрализовали 500 мл воды, затем 3 раза экстрагировали 500 мл EtOAc. Органические фазы объединяли и дважды экстрагировали 500 мл 1 н. HCl. Водные фазы объединяли, доводили до рН 8-9 добавлением раствора гидроксида натрия (10% в воде), затем 3 раза экстрагировали 500 мл DCM. Органические фазы объединяли, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали с получением 4,8 г (83%) (1S)-2-фенил-1-(1,3-тиазол-2-ил)этан-1-амина в виде желтого масла. Данное соединение затем защищали группой Вос ((трет-бутокси)карбонил) таким образом, что оно могло быть очищено. Его растворяли в 1,4-диоксане (40 мл) в инертной атмосфере, затем охлаждали до 0°С. Добавляли по каплям (Вос)O (10,26 г, 47,01 ммоль, 2,00 экв.), разведенный в 20 мл 1,4-диоксана. Холодную баню удаляли, и раствор оставляли при встряхивании в течение ночи при температуре окружающей среды перед нейтрализацией 300 мл воды и экстракцией два раза 500 мл EtOAc. Органические фазы объединяли, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали на колонке с диоксидом кремния с использованием смеси EtOAc и РЕ (от 1:100 до 1:20, ее составляет 93%). Его затем перекристаллизовывали в смеси гексан/ацетон (~5-10/1, 1 г/10 мл) с получением 6 г (84%) соединения 1I в виде белого твердого вещества (ее больше 99%).
Соединение 1J: трет-бутил-(2S)-2-[(1R,2R)-1-метокси-2-метил-2-[[(1S)-2-фенил-1-(1,3-тиазол-2-ил)этил]карбамоил]этил]пирролидин-1-карбоксилат
Соединение 1I (3 г, 9,86 ммоль, 1,00 экв.) растворяли в 10 мл DCM в инертной атмосфере. Добавляли трифторуксусную кислоту (TFA, 10 мл), и раствор оставляли при встряхивании в течение ночи при температуре окружающей среды, затем концентрировали при пониженном давлении с получением 2,0 г (64%) (1S)-2-фенил-1-(1,3-тиазол-2-ил)этан-1-амина; трифторуксусной кислоты в виде желтого масла. Данное промежуточное соединение повторно растворяли в 20 мл DCM, после чего добавляли соединение 1D (1,8 г, 6,26 ммоль, 1,05 экв.), DEPC (1,1 г, 6,75 ммоль, 1,13 экв.) и диизопропилэтиламин (DIEA, 1,64 г, 12,71 ммоль, 2,13 экв.). Реакционную смесь оставляли при встряхивании в течение ночи при температуре окружающей среды, затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали на колонке с диоксидом кремния с использованием смеси EtOAc и РЕ (от 1:100 до 1:3) с получением 2,3 г (81%) соединения 1J в виде бледно-желтого твердого вещества.
Соединение 1K: (2R,3R)-3-метокси-2-метил-N-[(1S)-2-фенил-1-(1,3-тиазол-2-ил)этил]-3-[(2S)-пирролидин-2-ил]пропанамид; трифторуксусная кислота
Соединение 1J (2,25 г, 4,75 ммоль, 1,00 экв.) растворяли в 10 мл DCM в инертной атмосфере. Добавляли TFA (10 мл), и раствор оставляли при встряхивании в течение ночи при температуре окружающей среды, затем концентрировали при пониженном давлении с получением 2,18 г (94%) соединения 1K в виде желтого масла.
Соединение 1L: (2S,3S)-2-(бензиламино)-3-метилпентановая кислота
(2S,3S)-2-амино-3-метилпентановую кислоту (98,4 г, 750 ммоль, 1,00 экв.) добавляли порциями при температуре окружающей среды в 2 н. раствор гидроксида натрия (375 мл). Быстро добавляли бензальдегид (79,7 г, 751,02 ммоль, 1,00 экв.), и образующийся раствор встряхивали 30 минут. Добавляли маленькими порциями боргидрид натрия (10,9 г, 288,17 ммоль, 0,38 экв.), поддерживая температуру от 5 до 15°С. Встряхивание продолжали в течение 4 часов при температуре окружающей среды. Реакционную смесь разводили 200 мл воды, затем дважды промывали 200 мл EtOAc. рН водного раствора доводили до 7 2 н. раствором соляной кислоты. Образовавшийся осадок собирали фильтрованием, с получением 149,2 г (90%) соединения 1L в виде белого твердого вещества.
Соединение 1М: (2S,3S)-2-[бензил(метил)амино]-3-метилпентановая кислота
Соединение 1L (25 г, 112,97 ммоль, 1,00 экв.) растворяли в муравьиной кислоте (31,2 г) в инертной атмосфере в присутствии формальдегида (36,5% в воде, 22,3 г). Данный раствор встряхивали 3 часа при 90°С, затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток растирали в 250 мл ацетона, затем концентрировали. Данную операцию растирания/упаривания повторяли дважды с 500 мл ацетона с получением 21,6 г (81%) соеднения 1М в виде белого твердого вещества.
Соединение 1N: (2S,3S)-2-[бензил(метил)амино]-3-метилпентан-1-ол
4
LiAlH (0,36 г) суспендировали в 10 мл THF в инертной атмосфере при 0°С. Соединение 1М (1,5 г, 6,37 ммоль, 1,00 экв.) добавляли маленькими порциями, поддерживая температуру от 0 до 10°С. Данную реакционную смесь встряхивали 2 часа при 65°С, затем вновь охлаждали до 0°С перед нейтрализацией с использованием последовательных добавлений 360 мкл воды, 1 мл 15%-ного гидроксида натрия и 360 мкл воды. Соли алюминия, которые выпадали в осадок, удаляли фильтрованием. Фильтрат сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали на колонке с диоксидом кремния с использованием смеси EtOAc и РЕ (1:50) с получением 820 мг (58%) соединения 1N в виде бледно-желтого масла.
Соединение 1O: (2S,3S)-2-[бензил(метил)амино]-3-метилпентанал
Оксалилхлорид (0,4 мл) растворяли в DCM (15 мл) в инертной атмосфере. Данный раствор охлаждали до -70°С, и добавляли по каплям раствор диметилсульфоксида (DMSO (0,5 мл) в DCM (10 мл)) в течение 15 минут. Реакционную смесь встряхивали 30 минут, после чего добавляли по каплям раствор соединения 1N (820 мг, 3,70 ммоль, 1,00 экв.) в DCM (10 мл) в течение 15 минут. Данную реакционную смесь встряхивали еще 30 минут при низкой температуре, затем медленно добавляли триэтиламин (2,5 мл). Реакционную смесь встряхивали 1 час при -50°С, затем удаляли холодную баню, и реакционную смесь нейтрализовали 25 мл воды, обеспечивая возвращение температуры к нормальному значению. Раствор один раз промывали 30 мл насыщенного водного раствора NaCl, затем сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали на колонке с диоксидом кремния с использованием смеси EtOAc и РЕ (1:200) с получением 0,42 г (52%) соединения 10 в виде желтого масла.
Соединение 1Р: (2S,3S)-N-бензил-1,1-диметокси-N,3-диметилпентан-2-амин
2
3
Соединение 1O (4,7 г, 21,43 ммоль, 1,00 экв.) растворяли в 20 мл метанола при 0°С. Добавляли по каплям концентрированную серную кислоту (4,3 мл), и продолжали встряхивание в течение 30 минут при 0°С. Добавляли триметилортоформиат (21,4 мл), холодную баню удаляли, и реакционную среду оставляли при встряхивании в течение 3 часов при температуре окружающей среды. Реакционную среду разводили 200 мл EtOAc, последовательно промывали 100 мл 10% NaCO и 200 мл насыщенного NaCl, затем сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением 3,4 г (60%) соединения 1Р в виде бледно-желтого масла.
Соединение 1Q: [[1-(трет-бутокси)этенил]окси](трет-бутил)диметилсилан
Диизопропиламин (20 г, 186,71 ммоль, 1,08 экв.) растворяли в 170 мл THF в инертной атмосфере и охлаждали до -78°С. Добавляли по каплям nBuLi (2,4 М, 78,8 мл), и раствор встряхивали 30 минут при низкой температуре (с получением LDA-литий диизопропиламида) перед добавлением трет-бутилацетата (20 г, 172,18 ммоль, 1,00 экв.). Реакционную смесь встряхивали 20 минут при -78°С перед добавлением гексаметилфосфорамида (НМРА, 25,8 мл) и раствора трет-бутилдиметилхлорсилана (TBDMSCl, 28 г, 185,80 ммоль, 1,08 экв.) в 35 мл THF. Встряхивание продолжали в течение еще 20 мин при низкой температуре, и затем удаляли холодную баню. Раствор концентрировали при пониженном давлении. Остаток повторно растворяли в 100 мл воды и 3 раза экстрагировали 100 мл РЕ. Органические фазы объединяли, один раз промывали 500 мл насыщенного водного раствора NaCl, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали перегонкой с получением 16,6 г (83%) соединения 1Q в виде бесцветного масла.
Соединение 1R: трет-бутил-(3R,4S,5S)-4-[бензил(метил)амино]-3-метокси-5-метилгептаноат
3
2
Соединение 1Р (2,0 г, 7,54 ммоль, 1,00 экв.) и соединение 1Q (2,6 г, 11,28 ммоль, 1,50 экв.) растворяли в 33 мл DCM в инертной атмосфере. Данный раствор охлаждали до 0°С. Добавляли по каплям DMF (1,2 г) вместе с раствором BF⋅EtO (2,1 г) в 7,5 мл DCM. Встряхивание продолжали в течение 24 часов при 0°С. Реакционную среду один раз промывали 30 мл карбоната натрия (10%) и дважды 50 мл насыщенного водного раствора NaCl, затем сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали на колонке с диоксидом кремния с использованием смеси EtOAc и РЕ (1:100) с получением 1,82 г (91%) соединения 1R в виде желтого масла.
Соединение 1S: (3R,4S,5S)-3-метокси-5-метил-4-(метиламино)гептаноата гидрохлорид
Соединение 1R (2,4 г, 6,87 ммоль, 1,00 экв.) растворяли в 35 мл этанола в инертной атмосфере в присутствии Pd/C (0,12 г) и концентрированной соляной кислоты (0,63 мл). Атмосферу азота заменяли на атмосферу водорода, и реакционную среду оставляли при встряхивании 18 часов при температуре окружающей среды. Реакционную среду фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток растирали в 50 мл гексана, и удаляли супернатант, что, после сушки при пониженном давлении, давало 1,66 г (82%) соединения 1S в виде белого твердого вещества.
Соединение 1T: трет-бутил-(3R,4S,5S)-4-[(2S)-2-[[(бензилокси)карбонил]амино]-N,3-диметилбутанамидо]-3-метокси-5-метилгептаноат
(2S)-2-[[(бензилокси)карбонил]амино]-3-метилбутановую кислоту (15 г, 0,40 ммоль, 1,00 экв.) растворяли в 300 мл DCM в присутствии DIEA (38,3 мл) и бромтрипирролидинофосфония гексафторфосфата (PyBrOP, 32,2 г). Данный раствор встряхивали 30 минут при температуре окружающей среды перед добавлением соединения 1S (15,99 г, 0,42 ммоль, 1,07 экв.). Реакционную среду встряхивали 2 часа и затем концентрировали. Остаток очищали в обращенной фазе (С18) с использованием смеси ацетонитрила (ACN) и воды (от 30:70 до 100:0 за 40 мин) с получением 17 г (58%) соединения 1Т в виде бесцветного масла.
Соединение 1U: трет-бутил-(3R,4S,5S)-4-[(2S)-2-амино-N,3-диметилбутанамидо]-3-метокси-5-метилгептаноат
Соединение 1Т (76 мг, 0,15 ммоль, 1,00 экв.) растворяли в 10 мл этанола в инертной атмосфере в присутствии Pd/C (0,05 г). Атмосферу азота заменяли на атмосферу водорода, и реакционную смесь встряхивали 2 часа при температуре окружающей среды. Реакционную среду фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением 64 мг соединения 1U в виде бесцветного масла.
Соединение 1V: (3R,4S,5S)-4-[(2S)-2-[[(9H-флюорен-9-илметокси)карбонил]амино]-N,3-диметилбутанамидо]-3-метокси-5-метилгептаноат
Соедиение 1U (18,19 г, 50,74 ммоль, 1,00 экв.) растворяли в 400 мл смеси 1,4-диоксан/вода (1:1) в присутствии бикарбоната натрия (12,78 г, 152 ммоль, 3,00 экв.) и 9Н-флюорен-9-илметилхлорформиата (Fmoc-Cl, 19,69 г, 76 ммоль, 1,50 экв.), затем встряхивали 2 часа при температуре окружающей среды. Реакционную среду затем разводили 500 мл воды и 3 раза экстрагировали 200 мл EtOAc. Органические фазы объединяли, один раз промывали 200 мл насыщенного водного раствора NaCl, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали с получением 40 г частично очищенного соединения 1V в виде бледно-желтого масла.
Соединение 1W: (3R,4S,5S)-4-[(2S)-2-[[(9H-флюорен-9-илметокси)карбонил]амино]-N,3-диметилбутанамидо]-3-метокси-5-метилгептановая кислота
Соединение 1V (40 г, 68,88 ммоль, 1,00 экв.) растворяли в нейтральной атмосфере в 600 мл DCM. Добавляли TFA (300 мл). Данный раствор встряхивали 2 часа при температуре окружающей среды, затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали на колонке с диоксидом кремния с использованием смеси метанола и DCM (1:10) с получением 23,6 г (65%) соединения 1W в виде бесцветного масла.
Соединение 1Х: 9Н-флюорен-9-илметил-N-[(1S)-1-[[(3R,4S,5S)-3-метокси-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-1-метокси-2-метил-2-[[(1S)-2-фенил-1-(1,3-тиазол-2-ил)этил]карбамоил]этил]пирролидин-1-ил]-5-метил-1-оксогептан-4-ил](метил)карбамоил]-2-метилпропил]карбамат
4
Соединение 1W (2,53 г, 4,82 ммоль, 1,08 экв.) растворяли в 20 мл DCM в присутствии соединения 1K (2,18 г, 4,47 ммоль, 1,00 экв.), DEPC (875 мг, 5,37 ммоль, 1,20 экв.) и DIEA (1,25 г, 9,67 ммоль, 2,16 экв.). Реакционную смесь оставляли при встряхивании в течение ночи при температуре окружающей среды, затем последовательно промывали 50 мл насыщенного KHSO и 100 мл воды, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали на колонке с диоксидом кремния с использованием смеси метанола и DCM (от 1:200 до 1:40) с получением 2,8 г (71%) соединения 1Х в виде бледно-желтого твердого вещества.
Соединение 1Y: (2S)-2-амино-N-[(3R,5S)-3-метокси-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-1-метокси-2-метил-2-[[(1S)-2-фенил-1-(1,3-тиазол-2-ил)этил]карбамоил]этил]пирролидин-1-ил]-5-метил-1-оксогептан-4-ил]-N,3-диметилбутанамид
Соединение 1Х (2,8 г, 3,18 ммоль, 1,00 экв.) растворяли в ацетонитриле (ACN, 12 мл) в присутствии пиперидина (3 мл) и оставляли при встряхивании на 18 часов при температуре окружающей среды. Реакционную смесь нейтрализовали 50 мл воды, затем дважды экстагировали 100 мл DCM. Органические фазы объединяли, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали на колонке с диоксидом кремния с использованием смеси метанола и DCM (от 1:100 до 1:40) с получением 1,2 г (57%) соединения 1Y в виде желтого твердого вещества.
Соединение 1ZA: (2S)-2-[[(трет-бутокси)карбонил](метил)амино]-3-метилбутановая кислота
(2S)-2-[[(трет-бутокси)карбонил]амино]-3-метилбутановую кислоту (63 г, 289,97 ммоль, 1,00 экв.) растворяли в THF (1000 мл) в инертной атмосфере в присутствии йодметана (181 мл). Данный раствор охлаждали до 0°С перед добавлением гидрида натрия (116 г, 4,83 моль, 16,67 экв.) маленькими порциями. Реакционную смесь встряхивали в течение 1,5 часов при 0°С, холодную баню затем удаляли, и встряхивание продолжали в течение 18 часов. Реакционную смесь нейтрализовали 200 мл воды и затем концентрировали при пониженном давлении. Остаточную водную фазу разводили 4 литрами воды, один раз промывали 200 мл EtOAc, и ее рН доводили до значения от 3 до 4 1 н. раствором соляной кислоты. Полученную смесь 3 раза экстрагировали 1,2 л EtOAc. Органические фазы объединяли, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали с получением 60 г (89%) соединения 1ZA в виде желтого масла.
Соединение 1ZB: бензил-(2S)-2-[[(трет-бутокси)карбонил](метил)амино]-3-метилбутаноат
2
3
Соединение 1ZA (47 г, 203,21 ммоль, 1,00 экв.) растворяли в DMF (600 мл) в присутствии LiCO (15,8 г, 213,83 ммоль, 1,05 экв.). Данный раствор охлаждали до 0°С, затем добавляли по каплям бензилбромид (BnBr - 57,9 г, 338,53 ммоль, 1,67 экв.). Данную реакционную смесь оставляли при встряхивании в течение ночи перед нейтрализацией 400 мл воды и фильтровали. Полученный раствор дважды экстрагировали 500 мл EtOAc. Органические фазы объединяли, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали на колонке с диоксидом кремния с использованием смеси EtOAc и РЕ (от 1:100 до 1:20) с получением 22,5 г (34%) соединения 1ZB в виде желтого масла.
Соединение 1ZC: бензил-(2S)-3-метил-2-(метиламино)бутаноата гидрохлорид
Соединение 1ZB (22,5 г, 70,00 ммоль, 1,00 экв.) растворяли в 150 мл DCM. Пропускали в виде пузырьков газообразную соляную кислоту. Реакционную смесь встряхивали 1 час при температуре окружающей среды и затем концентрировали при пониженном давлении с получением 17 г (94%) соединения 1ZC в виде желтого твердого вещества.
Соединение 1ZD: трет-бутил-N-(3,3-диэтоксипропил)карбамат
2
3,3-диэтоксипропан-1-амин (6 г, 40,76 ммоль, 1,00 экв.) растворяли в 1,4-диоксане (30 мл) в присутствии TEA (4,45 г, 43,98 ммоль, 1,08 экв.), затем охлаждали до 0°С. Добавляли по каплям (Вос)O (9,6 г, 43,99 ммоль, 1,08 экв.), разведенный в 20 мл 1,4-диоксана. Данный раствор встряхивали 2 часа при 0°С, затем в течение ночи при температуре окружающей среды перед нейтрализацией 10 мл воды. рН доводили до 5 с использованием HCl (1%). Раствор экстрагировали 3 раза 50 мл EtOAc. Органические фазы объединяли, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали с получением 8,21 г (81%) соединения 1ZD в виде бледно-желтого масла.
Соединение 1ZE: трет-бутил-N-(3-оксопропил)карбамат
Соединение 1ZD (8,20 г, 33,15 ммоль, 1,00 экв.) растворяли в 18,75 мл уксусной кислоты и оставляли при встряхивании в течение ночи при температуре окружающей среды. Реакционную среду затем 3 раза экстрагировали 30 мл EtOAc. Органические фазы объединяли, 3 раза промывали 30 мл насыщенного раствора NaCl, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали с получением 5 г (87%) соединения 1ZE в виде темно-красного масла.
Соединение 1ZF: (2S)-2-[(3-[[(трет-бутокси)карбонил]амино]пропил)(метил)амино]-3-метилбутановая кислота
Соединение 1ZE (2,4 г, 13,86 ммоль, 1,00 экв.) растворяли в 50 мл THF в присутствии соединения 1ZC (3,56 г, 13,81 ммоль, 1,00 экв.) и DIEA (9,16 мл, 4,00 экв.). Реакционную смесь встряхивали 30 минут при температуре окружающей среды перед добавлением триацетоксиборгидрида натрия (5,87 г, 27,70 ммоль, 2,00 экв.). Встряхивание продолжали в течение ночи, затем реакционную смесь нейтрализовали 100 мл воды и 3 раза экстранировали 50 мл EtOAc. Органические фазы объединяли, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Остаток частично очищали на колонке с диоксидом кремния с использованием смеси EtOAc и РЕ (1:4). Полученный неочищенный продукт повторно растворяли в 20 мл метанола в присутствии Pd/C (1,2 г) и гидрогенизировали в течение 20 минут при нормальной температуре и давлении. Реакционную смесь фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением 200 мг (5%) соединения 1ZF в виде белого твердого вещества.
Соединение 1ZG: трет-бутил-N-(3-[[(1S)-1-[[(1S)-1-[[(3R,4S,5S)-3-метокси-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-1-метокси-2-метил-2-[[(1S)-2-фенил-1-(1,3-тиазол-2-ил)этил]карбамоил]тил]пирролидин-1-ил]-5-метил-1-оксогептан-4ил](метил)карбамоил]-2-метилпропил]карбамоил]-2-метилпропил](метил)амино]пропил)карбамат
Соединение 1Y (50 мг, 0,08 ммоль, 1,00 экв.) растворяли в 2 мл DMF в присутствии соединения 1ZF (26,2 мг, 0,09 ммоль, 1,20 экв.), DIEA (37,7 мл) и O-(7-азабензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилурония гексафторфосфата (HATU, 43,3 мг, 0,11 ммоль, 1,50 экв.). Реакционную смесь оставляли при встряхивании в течение ночи при температуре окружающей среды, затем разводили 10 мл воды и 3 раза экстрагировали 5 мл EtOAc. Органические фазы объединяли, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали с получением 100 мг соединения 1ZG в виде частично очищенного бесцветного масла.
Соединение 1ZG (90 мг, 0,10 ммоль, 1,00 экв.) растворяли в нейтральной атмосфере в 2 мл DCM, и данный раствор охлаждали с использованием бани со льдом. Добавляли TFA (1 мл), и реакционную смесь встряхивали в течение 2 часов при температуре окружающей среды, затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали препаративной ВЭЖХ (Pre-HPLC-001 SHIMADZU, колонка SunFire Prep С18 OBD, 5 мкм, 19×150 мм; элюирующая фаза: вода/ACN, буферизованная 0,05% TFA; градиент от 18% до 31% ACN за 7 минут, затем от 31% до 100% ACN за 2 минуты; УФ детектор Waters 2489 при 254 нм и 220 нм). Соединение 1 получали с выходом 25% (23 мг) в виде белого твердого вещества.
44
73
7
6
+
ЖХ/МС/УФ (колонка Atlantis Т3, 3 мкм, 4,6×100 мм; 35°С; 1 мл/мин, от 30% до 60% ACN в воде (20 мМ ацетат аммония за 6 минут); ЭРИ (CHNOS, точная масса 827,53) m/z: 829 (МН), 5,84 мин (93,7%, 254 нм).
1
-1
3
Н ЯМР (300 МГц, CDOD, млн): δ (присутствие ротамеров) 7.85-7.80 (m, 1Н); 7.69-7.66 (m, 1Н), 7.40-7.10 (m, 5Н), 5.80-5.63 (m, 1Н), 4.80-4.65 (m, 2Н), 4.22-4.00 (m, 1Н), 3.89-0.74 (m, 58Н).
Эталонное соединение 2
(S)-2-((S)-2-(((2-аминопиридин-4-ил)метил)(метил)амино)-3-метилбутанамидо)-N-((3R,4S,5S)-1-(S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-гидрокси-1-фенилпропан-2-ил)амино)-1-метокси-2-метил-3-оксопропил)пирролидин-1-ил)-3-метокси-5-метил-1-оксогептан-4-ил)-N,3-диметилбутанамид, трифторуксусная кислота
Соединение 2А: трет-бутил-(S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-гидрокси-1-фенилпропан-2-ил)амино)-1-метокси-2-метил-3-оксопропил)пирролидин-1-карбоксилат
4
3
Соединение 1D (2,5 г, 8,70 ммоль, 1,00 экв.) и (1S,2R)-2-амино-1-фенилпропан-1-ол (1,315 г, 8,70 ммоль, 1,00 экв.) растворяли в DMF (35 мл) в инертной атмосфере. Данный раствор охлаждали до 0°С, затем добавляли по каплям DEPC (1,39 мл) и TEA (1,82 мл). Реакционную смесь встряхивали 2 часа при 0°С, затем 4 часа при температуре окружающей среды. Реакционную смесь разводили 200 мл воды и три раза экстрагировали 50 мл EtOAc. Органические фазы объединяли, один раз промывали 50 мл KHSO (1 моль/л), один раз - 50 мл NaHCO (насыщ.), один раз - 50 мл NaCl (насыщ.), затем сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением 3,6 г (98%) соединения 2А в виде желтого твердого вещества.
Соединение 2В: (2R,3R)-N-((1S,2R)-1-гидрокси-1-фенилпропан-2-ил)-3-метокси-2-метил-3-((S)-пирролидин-2-ил)пропанамид-2,2,2-трифторацетат
Соединение 2А (2,7 г, 6,42 ммоль, 1,00 экв.) растворяли в DCM (40 мл) в инертной атмосфере, затем охлаждали до 0°С. Добавляли TFA (25 мл), и раствор встряхивали в течение 2 часов при 0°С. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении с получением 4,4 г соединения 2В в виде желтого масла.
Соединение 2С: (9Н-флюорен-9-ил)метил-((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-гидрокси-1-фенилпропан-2-ил)амино)-1-метокси-2-метил-3-оксопропил)пирролидин-1-ил)-3-метокси-5-метил-1-оксогептан-4-ил)(метил)амино)-3-метил-1-оксобутан-2-ил)карбамат
4
3
Соединение 2В (4,4 г, 10,13 ммоль, 1,00 экв.) и 1W (5,31 г, 10,12 ммоль, 1 экв.) растворяли в DCM (45 мл) в инертной атмосфере. Раствор охлаждали до 0°С, затем добавляли по каплям DEPC (1,62 мл) и DIEA (8,4 мл). Данную реакционную смесь встряхивали в течение 2 часов при 0°С, затем при температуре окружающей среды в течение ночи. Реакционную смесь разводили 100 мл воды и три раза экстрагировали 50 мл DCM. Органические фазы объединяли, один раз промывали 50 мл KHSO (1 моль/л), один раз 50 мл NaHCO (насыщ.), один раз 50 мл NaCl (насыщ.), затем сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением 3,3 г (39%) соединения 2С в виде желтого твердого вещества.
Соединение 2D: (S)-2-амино-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-гидрокси-1-фенилпропан-2-ил)амино)-1-метокси-2-метил-3-оксопропил)пирролидин-1-ил)-3-метокси-5-метил-1-оксогептан-4-ил)-N,3-диметилбутанамид
Соединение 2С (300 мг, 0,36 ммоль, 1,00 экв.) растворяли в ACN (2 мл) и пиперидине (0,5 мл) в инертной атмосфере. Данный раствор оставляли при встряхивании при температуре окружающей среды в течение ночи, затем упаривали досуха при пониженном давлении. Остаток очищали на колонке с диоксидом кремния с использованием смеси DCM и МеОН (1:100) с получением 150 мг (68%) соединения 2D в виде белого твердого вещества.
Соединение 2Е: метил-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)изоникотинат
3
Метил-2-аминопиридин-4-карбоксилат (2 г, 13,14 ммоль, 1,00 экв.) растворяли в трет-бутаноле (20 мл), после чего добавляли ди-трет-бутилдикарбонат (4,02 г, 18,42 ммоль, 1,40 экв.). Данную реакционную смесь встряхивали при 60°С в течение ночи, затем реакцию останавливали посредством добавления водного раствора 1 М NaHCO (50 мл). Твердое вещество выделяли фильтрованием, промывали 50 мл EtOH, затем сушили под вакуумом с получением 2,5 г (75%) соединения 2Е в виде белого твердого вещества.
Соединение 2F: трет-бутил-(4-(гидроксиметил)пиридин-2-ил)карбамат
2
4
Соединение 2Е (2,5 г, 9,91 ммоль, 1,00 экв.) и CaCl (1,65 г) растворяли в EtOH (30 мл). Данный раствор охлаждали до 0°С, затем постепенно добавляли NaBH (1,13 г, 29,87 ммоль, 3,01 экв.). Раствор оставляли при встряхивании в течение ночи при температуре окружающей среды, затем реакцию останавливали добавлением воды (50 мл). Данную смесь три раза экстрагировали 20 мл EtOAc. Органические фазы объединяли, два раза промывали 20 мл NaCl (насыщ.), затем сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением 2,0 г (90%) соединения 2F в виде бесцветного твердого вещества.
Соединение 2G: трет-бутил-(4-формилпиридин-2-ил)карбамат
2
Соединение 2F (2,5 г, 11,15 ммоль, 1,00 экв.) растворяли в DCE (25 мл), затем добавляли 19,4 г (223,14 ммоль, 20,02 экв.) MnO. Данную смесь оставляли при встряхивании в течение ночи при 70°С, затем твердые вещества удаляли фильтрованием. Фильтрат упаривали досуха с получением 1,4 г (57%) соединения 2G в виде белого твердого вещества.
Соединение 2Н: бензил-(S)-2-(((2-((трет-бутоксикарбонил)амино)пиридин-4-ил)метил)(метил)амино)-3-метилбутаноат
3
3
Соединение 2G (2,3 г, 10,35 ммоль, 1,00 экв.) растворяли в 25 мл THF в присутствии соединения 1ZC (2,93 г, 11,37 ммоль, 1,10 экв.), DIEA (5,39 г, 41,71 ммоль, 4,03 экв.) и NaBH(OAc) (4,39 г, 20,71 ммоль, 2,00 экв.). Данную реакционную смесь встряхивали в течение 6 часов при температуре окружающей среды, затем нейтрализовали 60 мл NaHCO (насыщ.) и 3 раза экстрагировали 20 мл AcOEt. Органические фазы объединяли, дважды промывали 20 мл NaCl (насыщ.), сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали на колонке с диоксидом кремния с использованием смеси EtOAc и РЕ (1:15) с получением 2,7 г (61%) соединения 2Н в виде белого твердого вещества.
Соединение 2I: (S)-2-(((2-((трет-бутоксикарбонил)амино)пиридин-4-ил)метил)(метил)амино)-3-метилбутановая кислота
Соединение 2Н (500 мг, 1,17 ммоль, 1,00 экв.) растворяли в 10 мл AcOEt и 2 мл метанола в присутствии Pd/C (250 мг) и гидрогенизировали в течение 3 часов при температуре окружающей среды и атмосферном давлении. Реакционную среду фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением 254 мг (64%) соединения 2I в виде бесцветного твердого вещества.
Соединение 2J: трет-бутил-(4-((3S,6S,9S,10R)-9-((S)-втор-бутил)-10-(2-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-гидрокси-1-фенилпропан-2-ил)амино)-1-метокси-2-метил-3-оксопропил)пирролидин-1-ил)-2-оксоэтил)-3,6-диизопропил-2,8-диметил-4,7-диоксо-11-окса-2,5,8-триазадодецил)пиридин-2-ил)карбамат
Соединение 2J получали аналогично соединению 1ZG из амина 2D (85,2 мг, 0,14 ммоль, 1,50 экв.), кислоты 21 (31,7 мг, 0,09 ммоль, 1,00 экв.), HATU (42,9 мг, 0,11 ммоль, 1,20 экв.) и DIEA (36,7 мг, 0,28 ммоль, 3,02 экв.) в DMF (3 мл). После упаривания досуха получали 100 мг неочищенного продукта получали в виде белого твердого вещества.
Соединение 2J (100 мг, 0,11 ммоль, 1,00 экв.) растворяли в 2 мл DCM и 1 мл TFA. Реакционную смесь встряхивали в течение 1 часа при температуре окружающей среды, затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток (80 мг) очищали препаративной ВЭЖХ (Pre-HPLC-001 SHIMADZU, колонка SunFire Prep С18 OBD, 5 мкм, 19×150 мм; элюирующая фаза: вода/ACN, буферизованная 0,05% TFA; градиент от 20% до 40% ACN за 10 минут, затем от 40% до 100% ACN за 2 минуты; УФ детектор Waters 2489 при 254 нм и 220 нм). Соединение 2 получали с выходом 6% (6,3 мг) в виде белого твердого вещества.
45
73
7
7
+
+
ЖХ/МС/УФ (колонка Ascentis Express С18, 2,7 мкм, 4,6×100 мм; 40°С; 1,8 мл/мин, от 10% до 95% ACN в воде (0,05% TFA) за 6 минут); ЭРИ (CHNO, точная масса 823,56) m/z: 824,5 (МН) и 412,9 (М.2Н/2, 100%), 3,21 мин (99,2%, 210 нм).
1
-1
3
Н ЯМР (400 МГц, CDOD, млн): δ (присутствие ротамеров) 7.81-7.79 (m, 1Н); 7.39-7.29 (m, 5Н); 6.61-6.59 (m, 2Н); 4.84-4.52 (m, 1Н); 4.32-4.02 (m, 1Н); 3.90-2.98 (m, 10Н); 2.90-2.78 (m, 1Н); 2.55-0.81 (m, 39Н).
Эталонное соединение 3
Метил-((S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метил(пиридин-4-илметил)амино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропаноат, трифторуксусная кислота
Соединение 3А: трет-бутил-(S)-2-((1R,2R)-1-метокси-3-(((S)-1-метокси-1-оксо-3-фенилпропан-2-ил)амино)-2-метил-3-оксоропил)пирролидин-1-карбоксилат
4
3
Соединение 1D (3 г, 10,44 ммоль, 1,00 экв.) и метил-(S)-2-амино-3-фенилпропаноат (2,25 г, 12,55 ммоль, 1,20 экв.) растворяли в DMF (40 мл) в инертной атмосфере. Данный раствор охлаждали до 0°С, затем добавляли по каплям DEPC (1,67 мл, 1,05 экв.) и TEA (3,64 мл, 2,50 экв.). Реакционную смесь встряхивали 2 часа при 0°С, затем при температуре окружающей среды в течение ночи. Реакционную смесь разводили 100 мл воды и три раза экстрагировали 50 мл EtOAc. Органические фазы объединяли, один раз промывали 100 мл KHSO (1 моль/л), один раз 100 мл NaHCO (насыщ.), один раз 100 мл NaCl (насыщ.), затем сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением 4 г (85%) соединения 3А в виде бесцветного масла.
Соединение 3В: 2,2,2-трифторацетат метил-(S)-2-((2R,3R)-3-метокси-2-метил-3-((S)-пирролидин-2-ил)пропанамидо)-3-фенилпропаноата
Соединение 3А (5 г, 11,15 ммоль, 1,00 экв.) растворяли в DCM (40 мл) в инертной атмосфере. Добавляли TFA (25 мл), и раствор встряхивали в течение 2 часов. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении с получением 8 г соединения 3B в виде желтого масла.
Соединение 3С: метил-(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((((9Н-флюорен-9-ил)метокси)карбонил)амино)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропаноат
4
3
Соединения 3В (8,03 г, 17,36 ммоль, 1,00 экв.) и 1W (9,1 г, 17,34 ммоль, 1,00 экв.) растеряли в DCM (80 мл) в инертной атмосфере. Данный раствор охлаждали до 0°С, затем добавляли по каплям DEPC (2,8 мл) и DIEA (12 мл). Реакционную смесь встряхивали в течение 2 часов при 0°С, затем при температуре окружающей среды в течение ночи. Реакционную смесь разводили 200 мл воды и три раза экстрагировали 50 мл DCM. Органические фазы объединяли, один раз промывали 50 мл KHSO (1 моль/л), один раз 50 мл NaHCO (насыщ.), один раз 50 мл NaCl (насыщ.), затем сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением 5 г (34%) соединения 3С в виде желтого твердого вещества.
Соединение 3D: метил-(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-амино-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропаноат
Соединение 3С (5,5 г, 6,43 ммоль, 1,00 экв.) растворяли в растворе тетрабутиламмония фторида (TBAF, 2,61 г, 9,98 ммоль, 1,55 экв.) в DMF (100 мл) в инертной атмосфере. Данный раствор встряхивали при температуре окружающей среды в течение 2 часов, затем разводили 100 мл воды и три раза экстрагировали 50 мл EtOAc. Органические фазы объединяли, затем сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением 3,3 г (81%) соединения 3D в виде желтого твердого вещества.
Соединение 3Е: бензил-(S)-3-метил-2-(метил(пиридин-4-илметил)амино)бутаноат
3
Пиридин-4-карбальдегид (1 г, 9,34 ммоль, 1,00 экв.) растворяли в 10 мл 1,2-дихлорэтана (DCE) в присутствии соединения 1ZC (2,9 г, 11,25 ммоль, 1,21 экв.) и изопропоксида титана(IV) (4,19 мл, 1,40 экв.). Данную смесь встряхивали при температуре окружающей среды в течение 30 минут, затем добавляли 2,77 г NaBH(OAc) (13,07 ммоль, 1,40 экв.). Реакционную среду оставляли при встряхивании в течение ночи, затем нейтрализовали 100 мл воды, и смесь 3 раза экстрагировали 50 мл AcOEt. Органические фазы объединяли и упаривали досуха. Остаток очищали на колонке с диокисидом кремния с использованием смеси EtOAc и РЕ (1:20) с получением 1,3 г (45%) соединения 3Е в виде бесцветного масла.
Соединение 3F (S)-3-метил-2-(метил(пиридин-4-илметил)амино)бутановая кислота
Соединение 3Е (800 мг, 2,56 ммоль, 1,00 экв.) растворяли в 30 мл AcOEt в присутствии Pd/C (300 мг) и гидрогенизировали в течение 3 часов при температуре окружающей среды и атмосферном давлении. Реакционную среду фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали на колонке с диокисидом кремния со смесью DCM и МеОН (от 100:1 до 5:1) с получением 100 мг (18%) соединения 3F в виде белого твердого вещества.
Соединения 3D (50 мг, 0,08 ммоль, 1,00 экв.) и 3F (26,34 мг, 0,12 ммоль, 1,50 экв.) растворяли в 3 мл DCM. Данный раствор охлаждали до 0°С, затем добавляли 0,018 мл DEPC и 0,0392 мл DIEA. Реакционную смесь встряхивали при 0°С в течение 2 часов, затем при температуре окружающей среды в течение ночи. Реакционную среду концентрировали при пониженном давлении, и остаток (70 мг) очищали препаративной ВЭЖХ (Pre-HPLC-001 SHIMADZU, колонка SunFire Prep С18 OBD, 5 мкм, 19×150 мм; элюирующая фаза: вода/ACN, буферизованная 0,05% TFA; градиент от 20% до 40% ACN за 10 минут, затем от 40% до 100% ACN за 2 минуты; УФ детектор Waters 2545 при 254 нм и 220 нм). Соединение 3 получали с выходом 27% (20 мг) в виде белого твердого вещества.
46
72
6
8
+
+
ЖК/МС/УФ (колонка Ascentis Express С18, 2,7 мкм, 4,6×100 мм; 40°С; 1,5 мл/мин, от 10% до 95% ACN в воде (0,05% TFA) за 8 минут); ЭРИ (CHNO, точная маса 836,5) m/z: 837,5 (МН) и 419,4 (М.2Н/2 (100%)), 7,04 мин (90,0%, 210 нм)
1
-1
3
Н ЯМР (400 МГц, CDOD, млн): δ (присутствие ротамеров) 8.76-8.74 (m, 2Н); 8.53-8.48 (m, 0,4Н, NHCO неполный обмен); 8.29-8.15 (m, 0,8Н, NHCO неполный обмен); 8.01 (s, 2Н), 7.31-7.22 (m, 5Н), 4.88-4.68 (m, 3Н); 4.31-4.07 (m, 2Н); 3.94-2.90 (m, 18Н); 2.55-0.86 (m, 38Н).
Эталонное соединение 4
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-(S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метил(пиридин-4-илметил)амино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропановая кислота, трифторуксусная кислота
Соединение 3 (100 мг, 0,11 моль, 1,00 экв.) растворяли в смеси воды (5 мл), ACN (5 мл) и пиперидина (2,5 мл). Данную реакционную смесь оставляли при встряхивании в течение ночи, затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали препаративной ВЭЖХ (Pre-HPLC-001 SHIMADZU, колонка SunFire Prep С18 OBD, 5 мкм, 19×150 мм; элюирующая фаза: вода/ACN, буферизованная 0,05% TFA; градиент от 20% до 40% ACN за 10 минут, затем от 40% до 100% ACN за 2 минуты; УФ детектор Waters 2545 при 254 нм и 220 нм), с получением 20 мг (20%) соединения 4 в виде белого твердого вещества.
45
70
6
8
+
+
ЖК/МС/УФ (колонка Ascentis Express С18, 2,7 мкм, 4,6×100 мм; 40°С; 1,5 мл/мин, от 10% до 95% ACN в воде (0,05% TFA) за 8 минут); ЭРИ (CHNO, точная масса 822,5) m/z: 823,5 (МН) и 412,4 (М.2Н/2, 100%), 6,84 мин (89,1%, 210 нм).
1
-1
3
Н ЯМР (400 МГц, CDOD, млн): δ (присутствие ротамеров) 8.79-8.78 (m, 2Н); 8.09 (m, 2Н); 7.30-7.21 (m, 5Н); 4.80-4.80 (m, 1Н), 4.36-0.87 (m, 58Н).
Эталонное соединение 6
Метил-(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-(3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((3-аминопропил)(метил)амино)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропаноат, бис-трифторуксусная кислота
Соединение 6А: метил-(2S)-2-[(2R)-2-[(R)-[(2S)-1-[(3R,4S,5S)-4-(2S)-2-[(2S)-2-[(3-[[(трет-бутокси)карбонил]амино]пропил)(метил)амино]-3-метилбутанамидо]-N,3-диметилбутанамидо]-3-метокси-5-метилгептаноил]пирролидин-2-ил](метокси)метил]пропанамидо]-3-фенилпропаноат
Соединение 3D (157,5 мг, 0,25 ммоль, 1,00 экв.) растворяли в 3 мл DCM при 0°С в инертной атмосфере в присутствии карбоновой кислоты 1ZF (78,7 мг, 0,27 ммоль, 1,10 экв.), DEPC (46 мкл) и DIEA (124 мкл). Реакционную смесь встряхивали 2 часа при низкой температуре, затем удаляли холодную баню, и встряхивание продолжали в течение 4 часов. Ее затем концентрировали при пониженном давлении с получением 200 мг соединения 6А в виде неочищенного желтого масла. Ее использовали как таковую на следующей стадии.
Соединение 6А (200 мг, 0,22 ммоль, 1,00 экв.) растворяли в 2 мл DCM в инертной атмосфере при 0°С. Добавляли по каплям TFA (1 мл), и удаляли холодную баню. Реакционную смесь встряхивали 1 час при температуре окружающей среды, затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали препаративной ВЭЖХ (Pre-HPLC-001 SHIMADZU, колонка SunFire Prep С18 OBD, 5 мкм, 19×150 мм; элюирующая фаза: вода/ACN, буферизованная 0,05% TFA; градиент от 20% до 40% ACN за 10 минут, затем от 40% до 100% ACN за 2 минуты; УФ детектор Waters 2489 при 254 нм и 220 нм), с получением 60 мг (26%, выход за 2 этапа) соединения 6 в виде белого твердого вещества.
3
4
43
74
6
8
+
ЖХ/МС/УФ (Zorbax Eclipse Plus С8, 3,5 мкм, 4,6×150 мм; 1 мл/мин, 40°С, от 30 до 80% метанола в воде (0,1% HPO) за 18 минут); ЭРИ (CHNO, точная масса 802,56) m/z: 804 (МН); 11,50 мин (91,5%, 210 нм).
1
-1
3
Н ЯМР (300 МГц, CDOD, млн): δ (присутствие ротамеров) 8.52 (d, 0,3Н, NHCO неполный обмен); 8.25 (d, 0,5Н, NHCO неполный обмен); 7.30-7.22 (m, 5Н); 4.9-4.6 (m, 3Н); 4.2-4.0 (m, 1Н); 4.0-0.86 (m, 61Н).
Эталонное соединение 7
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((3-аминопропил)(метил)амино)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропановая кислота, бис-трифторуксусная кислота
Соединение 6 (70 мг, 0,08 ммоль, 1,00 экв.) растворяли в смеси воды (5 мл), ACN (2,5 мл) и пиперидина (5 мл). Реакционную смесь оставляли при встряхивании в течение ночи при температуре окружающей среды, затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали препаративной ВЭЖХ (Pre-HPLC-001 SHIMADZU, колонка SunFire Prep С18 OBD, 5 мкм, 19×150 мм; элюирующая фаза: вода/ACN, буферизованная 0,05% TFA; градиент от 20% до 40% ACN за 10 минут, затем от 40% до 100% ACN за 2 минуты; УФ детектор Waters 2489 при 254 нм и 220 нм), с получением 14,6 мг (21%) соединения 7 в виде белого твердого вещества.
42
72
6
8
+
ЖХ/МС/УФ (Ascentis Express С18, 2,7 мкм, 4,6×100 мм; 1,5 мл/мин, 40°С, от 0 до 80% метанола в воде (0,05% TFA) за 8 минут); ЭРИ (CHNO, точная масса 788,54) m/z: 790 (МН), 5,71 мин (96,83%, 210 нм).
1
-1
3
Н ЯМР (300 МГц, CDOD, млн): δ (присутствие ротамеров) 8.42 (d, 0,3Н, NHCO неполный обмен); 8.15 (d, 0,2Н, NHCO неполный обмен); 7.31-7.21 (m, 5Н); 4.9-4.6 (m, 3Н); 4.25-4.0 (m, 1Н); 4.0-0.86 (m, 59Н).
Соединение 11
(S)-N-((3R,4S,5S)-3-метокси-1-((S)-2-(1R,2R)-1-метокси-2-метил-3-оксо-3-(((S)-2-фенил-1-(тиазол-2-ил)этил)амино)пропил)пирролидин-1-ил)-5-метил-1-оксогептан-4-ил)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метил(4-(метиламино)фенэтил)амино)бутанамидо)бутанамид, трифторуксусная кислота
Соединение 11А: трет-бутил-N-[4-(2-гидроксиэтил)фенил]карбамат
3
4
Ди-трет-бутил-дикарбонат (16,7 г, 77 ммоль, 1,05 экв.) добавляли в раствор 2-(4-аминофенил)этанола (10 г, 72,9 ммоль, 1 экв.) в THF (200 мл), и реакционную смесь перемешивали в течение ночи при температуре окружающей среды. Данную смесь разводили EtOAc (200 мл), промывали водой (200 мл), затем 1 М HCl (100 мл), затем насыщенным водным раствором NaHCO (100 мл), затем рассолом (100 мл). Органическую фазу сушили над MgSO, затем упаривали досуха при пониженном давлении. Неочищенный продукт дважды растирали с гептаном (150 мл) и сушили под вакуумом с получением соединения 11А в виде белого твердого вещества (14,7 г, 84%).
Соединение 11В: трет-бутил-N-[4-(2-оксоэтил)фенил]карбамат
2
2
3
Соединение 11А (2,5 г, 10,5 ммоль, 1,00 экв.) растворяли в 25 мл DCM, затем охлаждали до -78°С. Добавляли по каплям раствор перйодинана Десса-Мартина (DMP, 6,71 г, 15,8 ммоль, 1,5 экв.) в DCM (10 мл). Холодную баню удаляли, и встряхивание продолжали в течение 1 часа при температуре окружающей среды. Реакционную смесь нейтрализовали 60 мл смеси 50/50 бикарбоната натрия - насыщенного водного раствора и NaSO - насыщенного водного раствора. Образующийся раствор 3 раза экстрагировали 30 мл EtOAc. Органические фазы объединяли, два раза промывали NaCl - насыщенным водным раствором, сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали на силикагеле (EtOAc/PE 1/15) с получением 1,0 г (40%) соединения 11B в виде бледно-желтого твердого вещества.
Соединение 11С: бензил-(2S)-2-[[2-(4-[[(трет-бутокси)карбонил]амино]фенил)этил](метил)амино]-3-метилбутаноат
Соединение 1ZC (3,5 г, 13,6 ммоль, 1,1 экв.) растворяли в THF (30 мл) в присутствии DIEA (6,4 г, 49,7 ммоль, 4,0 экв.), альдегида 11В (2,9 г, 12,3 ммоль, 1,0 экв.) и триацетоксиборгидрида натрия (5,23 г, 49,7 ммоль, 2,0 экв.). Данную реакционную смесь оставляли при встряхивании в течение ночи при температуре окружающей среды, затем нейтрализовали 60 мл насыщенного раствора бикарбоната натрия. Образующийся раствор 3 раза экстрагировали 30 мл EtOAc. Органические фазы объединяли, дважды промывали насыщенным водным раствором NaCl, сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали на силикагеле (EtOAc/РЕ 1:20) с получением 3,7 г (68%) соединения 11С в виде желтого масла.
Соединение 11D: (2S)-2-[[2-(4-[[(трет-бутокси)карбонил]амино]фенил)этил](метил)амино]-3-метилбутановая кислота
Соединение 11С (2 г, 4,5 ммоль, 1 экв.) растворяли в 10 мл метанола в присутствии Pd/C (2 г) и гидрогенизировали в течение 2 часов при нормальной температуре и давлении. Реакционную среду фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением 1,2 г (75%) соединения 11D в виде желтого масла.
Соединение 11Е: (2S)-2-[[2-(4-[[(трет-бутокси)карбонил](метил)амино]фенил)этил](метил)амино]-3-метилбутановая кислота
Соединение 11D (1,2 г, 3,4 ммоль, 1,00 экв.) растворяли в THF (20 мл) в инертной атмосфере. Данную реакционную смесь охлаждали с использованием бани со льдом, после чего порциями добавляли NaH (60% в масле, 549 мг, 13,7 ммоль, 4,0 экв.), с последующим добавлением йодметана (4,9 г, 34 ммоль, 10 экв.). Реакционную смесь оставляли при встряхивании в течение ночи при температуре окружающей среды, затем нейтрализовали водой и промывали 100 мл EtOAc. рН водного раствора доводили до 6-7 с использованием 1 н. HCl. Данный водный раствор 3 раза экстрагировали 100 мл EtOAc. Органические фазы объединяли, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали с получением 800 мг (64%) соединения 11Е в виде желтого твердого вещества.
Соединение 11F: трет-бутил-N-[4-(2-[[(1S)-1-[[(1S)-1-[[(3R,4S,5S)-3-метокси-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-1-метокси-2-метил-2-[[(1S)-2-фенил-1-(1,3-тиазол-2-ил)этил]карбамоил]этил]пирролидин-1-ил]-5-метил-1-оксогептан-4-ил](метил)карбамоил]-2-метилпропил]карбамоил]-2-метилпропил](метил)амино]этил)фенил]-N-метилкарбамат
Соединение 11F получали аналогично соединению 6А из амина 1Y (150 мг, 0,22 ммоль, 1,2 экв.) и кислоты 11Е (70 мг, 0,19 ммоль, 1,0 экв.). После очистки на силикагеле (EtOAc/PE 1:1) 100 мг (52%) желательного продукта получали в виде бледно-желтого твердого вещества.
Соединение 11 получали таким же способом, что и соединение 1, из промежуточного соединения 11F (100 мг, 0,1 ммоль). Остаток очищали препаративной ВЭЖХ (Pre-HPLC-001 SHIMADZU, колонка SunFire Prep С18 OBD, 5 мкм, 19×150 мм; элюирующая фаза: вода/ACN, буферизованная 0,05% TFA; градиент от 20% до 40% ACN за 10 минут, затем от 40% до 100% ACN за 2 минуты; УФ детектор Waters 2489 при 254 нм и 220 нм). Соединение 11 получали с выходом 39% (39,7 мг) в виде белого твердого вещества.
50
77
7
6
+
ЖХ/МС/УФ (Eclipse Plus С8, 3,5 мкм, 4,6×150 мм; 1 мл/мин, 40°С, от 50 до 95% метанола в воде (0,05% TFA) за 18 минут); ЭРИ (CHNOS, точная масса 903,57) m/z: 904,5 (МН), 7,53 мин (93,68%, 254 нм).
1
-1
3
Н ЯМР (300 МГц, CDOD, млн): δ (присутствие ротамеров) 8.84 (d, 0,5Н, NHCO неполный обмен); 8.7-8.5 (m, 0,9Н, NHCO неполный обмен); 7.76-7.73 (m, 1Н); 7.55-7.4 (m, 1Н); 7.28-7.22 (m, 7Н); 7.08-7.05 (m, 2Н); 5.51-5.72 (m, 1Н); 4.9-4.80 (m, 2Н); 4.3-0.7 (m, 60Н).
Соединение 12
Метил-(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метил(4-(метиламино)фенэтил)амино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропаноат, трифторуксусная кислота
Тем же самым способом, что и для конечных фаз в синтезе соединения 1, соединение 12 получали в два этапа из амина 3D (118 мг, 0,19 ммоль) и кислоты 11Е (82 мг, 0,22 ммоль). Конечный остаток очищали препаративной ВЭЖХ (Pre-HPLC-001 SHIMADZU, колонка SunFire Prep С18 OBD, 5 мкм, 19×150 мм; элюирующая фаза: вода/ACN, буферизованная 0,05% TFA; градиент от 20% до 40% ACN за 10 минут, затем от 40% до 100% ACN за 2 минуты; УФ детектор Waters 2489 при 254 нм и 220 нм). Соединение 12 получали с выходом 7% (13,7 мг) в виде белого твердого вещества.
49
78
6
8
+
ЖХ/МС/УФ (Eclipse Plus С8, 3,5 мкм, 4,6×150 мм; 1 мл/мин, 40°С, от 40 до 95% метанола в воде (0,05% TFA) за 18 минут); ЭРИ (CHNO, точная масса 878,59) m/z: 879,7 (МН), 10,07 мин (90,6%, 254 нм).
1
-1
3
Н ЯМР (300 МГц, CDOD, млн): δ (присутствие ротамеров) 7.40 (se, 2Н); 7.38-7.22 (m, 7Н); 4.95-4.7 (m, 3Н); 4.2-4.0 (m, 1Н); 3.9-0.86 (m, 62Н).
Соединение 13
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-N,3-диметил-2-((S)-3-метил-2-(метил(4-(метиламино)фенэтил)амино)бутанамидо)бутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропановая кислота, трифторуксусная кислота
Соединение 13 получали таким же способом, что и соединение 7, из соединения 12 (100 мг, 0,10 ммоль). Остаток очищали препаративной ВЭЖХ (Pre-HPLC-001 SHIMADZU, колонка SunFire Prep С18 OBD, 5 мкм, 19×150 мм; элюирующая фаза: вода/ACN, буферизованная 0,05% TFA; градиент от 20% до 40% ACN за 10 минут, затем от 40% до 100% ACN за 2 минуты; УФ детектор Waters 2489 при 254 нм и 220 нм). Соединение 13 получали с выходом 20% (20 мг) в виде белого твердого вещества.
48
76
6
8
+
ЖХ/МС/УФ (Ascentis Express С18, 2,7 мкм, 4,6×100 мм; 1,5 мл/мин, 40°С, от 10 до 95% метанола в воде (0,05% TFA) за 8 минут); ЭРИ (CHNO, точная масса 864,57) m/z: 865,6 (МН), 6,05 мин (90,9%, 210 нм).
1
-1
3
Н ЯМР: (300 МГц, CDOD, млн): δ (присутствие ротамеров) 7.32-7.19 (m, 9Н); 4.9-4.65 (m, 3Н); 4.2-4.0 (m, 1Н); 3.9-0.86 (m, 59Н).
Соединение 14
(S)-2-((S)-2-((3-аминобензил)(метил)амино)-3-метилбутанамидо)-N-((3R,4S,5S)-3-метокси-1-((8S)-2-((1R,2R)-1-метокси-2-метил-3-оксо-3-(((S)-2-фенил-1-(тиазол-2-ил)этил)амино)пропил)пирролидин-1-ил)-5-метил-1-оксогептан-4-ил)-N,3-диметилбутанамид, трифторуксусная кислота
Соединение 14А: трет-бутил-(3-(гидроксиметил)карбамат
(3-Аминофенил)метанол (3 г, 24,36 ммоль, 1,00 экв.) растворяли в THF (60 мл), после чего добавляли ди-трет-бутил-дикарбонат (6,38 г, 29,23 ммоль, 1,20 экв.). Данную реакционную смесь оставляли при встряхивании в течение ночи при температуре окружающей среды, и реакционную смесь затем разводили добавлением 200 мл воды. Продукт экстрагировали 3 раза 100 мл AcOEt, и органические фазы затем повторно объединяли, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением неочищенного продукта (13,85 г соединения 14А) в виде желтого масла.
Соединение 14В: трет-бутил-(3-формилфенил)карбамат
2
Соединение 14А (13,8 г, 61,81 ммоль, 1,00 экв.) растворяли в DCE (400 мл), и затем добавляли MnO (54 г, 621,14 ммоль, 10,05 экв.). Данную смесь оставляли при встряхивании при температуре окружающей среды в течение 3 суток, после чего твердые вещества удаляли посредством фильтрования. Фильтрат упаривали досуха, и остаток очищали на колонке с диоксидом кремния с использованием смеси EtOAc и РЕ (1:30) с получением 3 г (22%) соединения 14В в виде белого твердого вещества.
Соединение 14С: бензил-(S)-2-((3-((трет-бутоксикарбонил)амино)бензил)(метил)амино)-3-метилбутаноат
3
Соединение 14В (1 г, 4,52 ммоль, 1,00 экв.) растворяли в 20 мл THF в присутствии соединения 1ZC (1,16 г, 4,50 ммоль, 1,00 экв.), DIEA (3 мл) и NaBH(OAc) (1,92 г, 9,06 ммоль, 2,01 экв.). Реакционную смесь оставляли при встряхивании в течение ночи при температуре окружающей среды, затем нейтрализовали 100 мл воды и 3 раза экстрагировали 50 мл AcOEt. Органические фазы объединяли, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали. Остаток очищали на колонке с диоксидом кремния с использованием смеси EtOAc и РЕ (1:50) с получением 1,9 г (99%) соединения 14С в виде белого твердого вещества.
Соединение 14D: (S)-2-((3-((трет-бутоксикарбонил)амино)бензил)(метил)амино)-3-метилбутановая кислота
Соединение 14С (1 г, 2,34 ммоль, 1,00 экв.) растворяли в 30 мл AcOEt и 4 мл метанола в присутствии Pd/C (400 мг) и гидрогенизировали в течение 1 часа при температуре окужающей среды и атмосферном давлении. Реакционную среду фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением 680 мг (86%) соединения 14D в виде белого твердого вещества.
Соединение 14Е: трет-бутил-(3-((3S,6S,9S,10R)-9-((S)-втор-бутил)-3,6-диизопропил-10-(2-((S)-2-((1R,2R)-1-метокси-2-метил-3-оксо-3-(((S)-2-фенил-1-(тиазол-2-ил)этил)амино)пропил)пирролидин-1-ил)-2-оксоэтил)-2,8-диметил-4,7-диоксо-11-окса-2,5,8-триазадодецил)фенил)карбамат
Соединение 14Е синтезировали таким же способом, что и соединение 3, из амина 1Y (100 мг, 0,15 ммоль, 1,00 экв.), кислоты 14D (102,27 мг, 0,30 ммоль, 2,00 экв.), DEPC (0,053 мл) и DIEA (0,046 мл) в DCM (3 мл). Неочищенный продукт (80 мг) очищали на колонке с диоксидом кремния с использованем смеси. EtOAc и РЕ (1:1) с получением 100 мг (67%) соединения 14Е в виде бледно-желтого твердого вещества.
Соединение 14 синтезировали таким же способом, что и соединение 2, из промежуточного соединения 14Е (100 мг, 0,10 ммоль, 1,00 экв.). Неочищенный продукт (80 мг) очищали препаративной ВЭЖХ (Pre-HPLC-001 SHIMADZU, колонка SunFire Prep С18 OBD, 5 мкм, 19×150 мм; элюирующая фаза: вода/ACN, буферизованная 0,05% TFA; градиент от 20% до 40% ACN за 10 минут, затем от 40% до 100% ACN за 2 минуты; УФ детектор Waters 2545 при 254 нм и 220 нм). Соединение 14 получали с выходом 10% (10 мг) в виде белого твердого вещества.
48
73
7
6
+
+
ЖХ/МС/УФ (колонка Eclipse plus С8, 3,5 мкм, 4,6×100 мм; 40°С, 1,0 мл/мин, от 40 до 95% МеОН в воде (0,05% TFA) за 18 минут); ЭРИ (CHNOS, точная масса 875,5) m/z: 876,5 (МН) и 438,9 (М.2Н/2, 100%), 11,35 мин (95,6%, 210 нм).
1
-1
3
Н ЯМР (400 МГц, CDOD, млн): δ (присутствие ротамеров) 8.92-8.86 (гл, 0,4Н, NH неполный обмен); 8.70-8.54 (m, 0,6Н, NH неполный обмен); 7.88-7.78 (m, 1Н); 7.60-7.50 (m, 1Н); 7.45-6.97 (m, 9Н); 5.80-5.65 (m, 1Н); 4.85-4.70 (m, 1Н); 4.40-0.80 (m, 56Н).
Соединение 15
Метил-(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-(3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((3-аминобензил)(метил)амино)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропаноат, трифторуксусная кислота
Соединение 15А: метил-(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-(S)-2-((S)-2-((3-((трет-бутоксикарбонил)амино)бензил)(метил)амино)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропаноат
Соединение 15А синтезировали таким же способом, что и соединение 3, из амина 3D (200 мг, 0,32 ммоль, 1,00 экв.), кислоты 14D (212,6 мг, 0,63 ммоль, 2,00 экв.), DEPC (0,1103 мл) и DIEA (0,157 мл, 3,00 экв.) в DCM (5 мл). Неочищенный продукт очищали на колонке с диоксидом кремния с использованием смеси EtOAc и РЕ (1:1) с получением 200 мг (67%) соединения 15А в виде желтого твердого вещества.
Соединение 15: Соединение 15 синтезировали таким же способом, что и соединение 2, из промежуточного соединения 15А (200 мг, 0,21 ммоль, 1,00 экв.). Неочищенный продукт очищали препаративной ВЭЖХ (Pre-HPLC-001 SHIMADZU, колонка SunFire Prep С18 OBD, 5 мкм, 19×150 мм; элюирующая фаза: вода/ACN, буферизованная 0,05% TFA; градиент от 20% до 40% ACN за 10 минут, затем от 40% до 100% ACN за 2 минуты; УФ детектор Waters 2545 при 254 нм и 220 нм). Соединение 15 получали с выходом 19% (38,6 мг) в виде белого твердого вещества.
47
74
6
8
+
+
ЖХ/МС/УФ (колонка Ascentis Express С18, 2,7 мкм, 4,6×100 мм; 40°С; 1,5 мл/мин, от 10% до 95% МеОН в воде (0,05% TFA) за 8 минут); ЭРИ (CHNO, точная масса 850,5) m/z: 851,5 (МН) и 426,4 (М.2Н/2, 100%), 6,61 мин (91,1%, 210 нм).
1
-1
3
Н ЯМР (400 МГц, CDOD, млн): δ (присутствие ротамеров) 7.53-7.42 (m, 1Н); 7.35-7.18 (m, 8Н); 4.88-4.79 (m, 2Н); 4.42-4.00 (m, 3Н); 3.93-2.71 (m, 22Н); 2.61-0.81 (m, 33Н).
Соединение 20
(S)-2-((S)-2-((4-аминобензил)(метил)амино)-3-метилбутанамидо)-N-((3R,4S,5S)-3-метокси-1-((S)-2-((1R,2R)-1-метокси-2-метил-3-оксо-3-(((S)-2-фенил-1-(тиазол-2-ил)этил)амино)пропил)пирролидин-1-ил)-5-метил-1-оксогептан-4-ил)-N,3-диметилбутанамид, трифторуксусная кислота
Соединение 20 получали таким же способом, что и соединение 1, из амина 1ZC и соответствующего альдегида.
4-Нитробензальдегид, участвующий в получении соединения 20, имелся в продаже.
Синтез соединения 20 завершали восстановлением нитрогруппы. Это осуществляли следующим образом: (2S)-N-[(3R,4S,5S)-1-[(2S)-2-[(1R,2R)-2-[[(1S,2R)-1-гидрокси-1-фенилпропан-2-ил]карбамоил]-1-метокси-2-метилэтил]пирролидин-1-ил]-3-метокси-5-метил-1-оксогептан-4-ил]-N,3-диметил-2-[(2S)-3-метил-2-[метил[(4-нитрофенил)метил]амино]бутанамидо]бутанамид (40 мг, 0,05 ммоль, 1,0 экв.) растворяли в 15 мл этанола. Добавляли дигидратированный хлорид олова(II) (317 мг, 1,4 ммоль, 30 экв.), и раствор оставляли при встряхивании в течение 3 суток при температуре окружающей среды. Реакцию нейтрализовали 50 мл воды, затем три раза экстрагировали 50 мл EtOAc. Органические фазы объединяли, сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением соединения 20 в неочищенном состоянии (чистота: 93,2%; количество: 21,6 мг).
Соединение очищали препаративной ВЭЖХ (Pre-HPLC-001 SHIMADZU, колонка SunFire Prep С18 OBD, 5 мкм, 19×150 мм; элюирующая фаза: вода/ACN, буферизованная 0,05% TFA; градиент от 20% до 40% ACN за 10 минут, затем от 40% до 100% ACN за 2 минуты; УФ детектор Waters 2489 при 254 нм и 220 нм), с получением соответствующих солей TFA в виде белых твердых веществ.
1
-
+
+)
1
-1
3
48
73
7
7
3
Н ЯМР: (400 МГц, CDOD, млн1): δ (присутствие ротамеров) 7.85-7.80 (m, 1Н); 7.6-7.5 (m, 1Н); 7.4-7.15 (m, 5Н); 7.1-7.05 (m, 2Н); 6.73-6.70 (m, 2Н); 5.8-5.55 (m, 1Н); 5.0-4.7 (m, 2Н); 4.25-4.05 (m, 1Н); 4.0-0.8 (m, 54Н). ЖХ/МС/УФ ЭРИ: (CHNOS, точная масса 875,53) m/z: 876 (МН), 439 [75%, (М.2Н/2]; УФ: RT (время удерживания) равно 4,83 мин (96,8%, 254 нм). Н ЯМР: (400 МГц, CDOD, млн): δ (присутствие ротамеров) 7.85-7.80 (m, 1Н); 7.6-7.5 (m, 1Н); 7.4-7.1 (m, 7Н); 6.76-6.72 (m, 2Н); 5.8-5.55 (m, 1Н); 4.9-4.65 (m, 2Н); 4.25-4.05 (m, 1Н); 4.0-0.8 (m, 54Н).
Соединение 29
(S)-2-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((3-аминобензил)(метил)амино)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропанамидо)-3-фенилпропановая кислота, трифторуксусная кислота
Соединение 15 (100 мг, 0,10 ммоль, 1,00 экв.) растворяли в смеси воды (5 мл), ACN (5 мл) и пиперидина (2,5 мл). Реакционную смесь оставляли при встряхивании в течение ночи при температуре окружающей среды и затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали препаративной ВЭЖХ (Pre-HPLC-001 SHIMADZU, колонка SunFire Prep С18 OBD, 5 мкм, 19×150 мм; элюирующая фаза: вода/ACN, буферизованная 0,05% TFA; градиент от 20% до 40% ACN за 10 минут, затем от 40% до 100% ACN за 2 минуты; УФ детектор Waters 2545 при 254 нм и 220 нм), с получением 20 мг (20%) соединения 29 в виде белого твердого вещества.
46
72
6
8
+
+
ЖХ/МС/УФ (колонка Eclipse Plus С8, 3,5 мкм, 4,6×150 мм; 40°С, 1,0 мл/мин, от 40% до 95% МеОН в воде (0,05% TFA) за 18 минут); ЭРИ (CHNO, точная масса 836,54) m/z: 837,5 (МН) и 419,4 (М.2Н/2, 100%), 10,61 мин (92,5%, 210 нм).
1
-1
3
Н ЯМР: (400 МГц, CDOD, млн): δ (присутствие ротамеров) 7.38-7.15 (m, 6Н); 7.00-6.99 (m, 3Н); 4.85-4.68 (m, 2Н); 4.37-3.38 (m, 11Н); 3.31-2.70 (m, 8Н); 2.60-0.82 (m, 35Н).
Соединение 61
(S)-2-((S)-2-((4-аминофенэтил)(метил)амино)-3-метилбутанамидо)-N-((3R,4S,5S)-3-метокси-1-((S)-2-((1R,2R)-1-метокси-2-метил-3-оксо-3-(((S)-2-фенил-1-(тиазол-2-ил)этил)амино)пропил)пирролидин-1-ил)-5-метил-1-оксогептан-4-ил)-N,3-диметилбутанамид
Соединение 61 А: N-(4-аминофенэтил)-N-метил-L-валина дигидрохлорид
2
Соединение 11D (962 мг, 2,75 ммоль) растворяли в 10 мл имеющегося в продаже раствора HCl в пропан-2-оле (5-6 М) и перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Анализ TLC (тонкослойная хроматография) показал полное потребление исходного вещества. Растворитель выпаривали при пониженном давлении, и образующееся желтое твердое вещество растирали с EtO (2×10 мл). Продукт сушили под вакуумом с получением соединения 61A в виде желтого твердого вещества (322 мг, 47%).
Соединение 61: карбоновую кислоту 61A (73 мг, 0,23 ммоль, 1 экв.) и амин 1Y (150 мг, 0,23 ммоль, 1 экв.) растворяли в сухом DMF (2 мл). Добавляли DIEA (158 мкл, 0,90 ммоль, 4 экв.) и DECP (также именуемый DEPC) (51 мкл, 0,34 ммоль, 1,5 экв.), и реакционную смесь перемешивали в течение 4 часов при комнатной температуре. Анализ посредством ЖХ-МС показал полное потребление исходного вещества. Растворитель выпаривали при пониженном давлении, и остаток очищали флэш-хроматографией на силикагеле (DCM/MeOH) с получением соединения 61 в виде светло-желтого твердого вещества (83 мг, 40%).
1
-1
2
H ЯМР (500 МГц, DMSO-d6, млн): δ (присутствие ротамеров), 8.86 (d, 0,5H, NHCO); 8.65 (d, 0,5H, NHCO), 8.11-8.05 (m, 1H, NHCO), 7.80 (d, 0,5H, тиазол), 7.78 (d, 0,5H, тиазол), 7.65 (d, 0,5H, тиазол), 7.63 (d, 0,5H, тиазол), 7.32-7.12 (m, 5H), 6.83 (d, J=8,3 Гц, 2H), 6.45 (d, J=8,3 Гц, 2H), 5.56-5.49 (m, 0.5H), 5.42-5.35 (m, 0.5H), 4.78 (s, 2H, NH), 4.74-4.46 (m, 2H), 4.01-0.66 (m, 57H).
ВЭЖХ (Xbridge Shield С18, 3,5 мкм, 4,6×50 мм; 3,5 мл/мин, 40°C, от 0 до 95% MeCN в воде (0,1% TFA) за 2,25 минут, затем 95% MeCN за 0,5 минуты, Tr равно 1,31 мин (96,5%, 220 нм).
+
+
2+
49
76
7
6
2
49
77
7
6
m/z (К-ВП (квадрупольная-времяпролетная) ЭРИ) 890,5558 (2%, MH, CHNOS требует 890,5572), 445,7834 (100%, (MH), CHNOS требует 445,7823).
Соединение 62
Метил-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-аминофенэтил)(метил)амино)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропаноил)-L-фенилаланинат
Соединение 62 получали таким же способом, что и соединение 61, с использованием карбоновой кислоты 61A (69 мг, 0,21 ммоль, 1 экв.), амина 3D (135 мг, 0,21 ммоль, 1 экв.), DIEA (75 мкл, 0,43 ммоль, 2 экв.) и DECP (49 мкл, 0,32 ммоль, 1,5 экв.). Неочищенный продукт очищали флэш-хроматографией на силикагеле (DCM/MeOH) с получением соединения 62 в виде желтоватого твердого вещества (82 мг, 45%).
1
-1
2
2
2
H ЯМР: (500 МГц, DMSO-d6, млн): δ (присутствие ротамеров), 8.50 (d, J=8,3, 0,5H, NHCO); 8.27 (d, J=8,0, 0,5H, NHCO), 8.15-8.04 (m, 1H, NHCO), 7.27-7.13 (m, 5H), 6.86-6.79 (m, 2H), 6.48-6.42 (m, 2H), 4.78 (s, 2H, NH), 4.74-4.44 (m, 3H), 4.01-3.72 (m, 1,5H), 3.66 (s, 1,5H, COMe), 3.63 (s, 1,5H, COMe), 3.57-0.65 (m, 55.5H).
ВЭЖХ (Xbridge Shield C18, 3,5 мкм, 4,6×50 мм; 3,5 мл/мин, 40°C, от 0 до 95% MeCN в воде (0,1% TFA) за 2,25 минуты, затем 95% MeCN за 0,5 минуты, Tr равно 1,29 мин (95,3%, 220 нм).
+
+
2+
48
77
6
8
2
48
78
6
8
m/z (К-ВП ЭРИ) 865,5800 (2%, MH, CHNO требует 865,5797), 433,2937 (100%, (MH), CHNO требует 433,2935).
Соединение 63
((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-аминофенэтил)(метил)амино)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропаноил)-L-фенилаланин-2,2,2-трифторацетат
Соединение 62 (23 мг, 0,03 ммоль) растворяли в смеси воды (1 мл) и ацетонитрила (1 мл). Добавляли пиперидин (0,75 мл), и данную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 5 часов. Анализ TLC показал полное потребление исходного вещества. Растворитель выпаривали при пониженном давлении, и остаток очищали препаративной ВЭЖХ (колонка SunFire Prep С18 OBD, 5 мкм, 19×150 мм; подвижная фаза: вода/MeCN, буферизованная 0,1% TFA; градиент от 20% до 40% MeCN за 10 минут, затем от 40% до 100% MeCN за 2 минуты; УФ детектор Waters 2545 при 254 нм и 220 нм). Соединение 63 получали в виде белого твердого вещества (14 мг, 66%).
1
-1
2
H ЯМР: (500 МГц, DMSO-d6, млн): δ (присутствие ротамеров), 12.7 (s(br), 1H, COH), 9.58 (m(br), 1H); 9.04-8.89 (m, 1H), 8.41 (d, 0,6H, NHCO), 8.15 (d, 0,4H, NHCO), 7.27-7.13 (m, 5H), 7.13-6.99 (m(br), 2H), 6.90-6.64 (s(br), 2H), 4.77-3.40 (m, 10H), 3.34-2.75 (m, 20H), 2.34-1.94 (m, 4H), 1.90-0.7 (m, 25H).
ВЭЖХ (Xbridge Shield С18, 3,5 мкм, 4,6×50 мм; 3,5 мл/мин, 40°C, от 0 до 95% MeCN в воде (0,1% TFA) за 2,25 минут, затем 95% MeCN за 0,5 минут, Tr равно 1,24 мин (100%, 220 нм).
+
+
2+
47
75
6
8
2
47
76
6
8
m/z (К-ВП ЭРИ) 851,5641 (6%, MH, CHNO требует 851,5641), 426,2854 (100%, (MH), CHNO требует 426,2857).
Пример 17: антипролиферативная активность лекарственных средств
Способ:
2
Культура клеток. Клетки A549 (немелкоклеточного рака легкого - АТСС CCL-185) и MDA-MB-231 (аденокарциномы молочной железы - АТСС НТВ-26) культивировали в минимальной питательной среде Игла (MEM) с 5% телячьей коровьей сыворотки (FCS) и среде Игла, модифицированной по Дульбекко (DMEM) с 10% FCS соответственно. Клетки MCF7 (карциномы протоков молочной железы - АТСС НТВ-22) и SN-12C (карциномы почки - АТСС) поддерживали в среде RPMI1640 (без фенолового красного для клеток MCF7), содержащей 10% FCS. Все среды дополняли фунгизоном (1,25 мкг/мл) и пенициллином-стрептомицином (100 U / 100 мкг/мл). Клетки культивировали при стандартных условиях в инкубаторе при 37°C, 5% CO и 95%-ной атмосферной влажности.
3
3
2
50
Антипролиферативная активность на 4 линиях опухолевых клеток. Выбранные лекарственные средства исследовали на их антипролиферативную активность с использованием анализа пролиферации ATPlite (Perkin Elmer, Villebon sur Yvette, Франция) на всеохватывающем наборе из 4 линий клеток. Клетки высевали в 96-луночные планшеты (10 клеток/лунку для А549, 2×10 для MCF7, MDA-MB-231 и SN12C) в сутки 0 в концентрации, обеспечиващей то, что клетки останутся в логарифмической фазе роста клеток на протяжении всего 72 ч периода обработки лекарственным средством. После 24 ч периода инкубации все клетки обрабатывали серийными разведениями тестируемых соединений (11 мкл 10× раствора в 1% DMSO - 6 лунок/условие). Для того чтобы избежать прилипания соединений на наконечниках пипеток, наконечники заменяли между двумя последовательными разведениями. Клетки затем помещали в инкубатор при 37°C, 5% CO. В сутки 4 оценивали жизнеспособность клеток посредством дозирования АТФ, высвобождаемой жизнеспособными клетками. Число жизнеспособных клеток анализировали по сравнению с числом клеток, обработанных растворитем. Значения EC определяли с использованием анализа аппроксимации кривых (модель нелинейной регрессии с сигмоидной кривой доза-ответ, варьирующий коэффициент наклона), проведенного алгоритмом, предоставленным программой GraphPad (GraphPad Software Inc., CA, США).
Результаты:
Разные лекарственные средства:
50
Тестировали разные лекарственные средства для определения их антипролиферативной активности на линии клеток MDA-MB-231, следуя вышеописанному способу. Измеренные активности давали значения EC меньше 0,1 мкМ.
Несколько следующих примеров, выбранных среди лекарственных средств, проиллюстрированных выше примерами, иллюстрируют их совершенно примечательные антипролиферативные свойства:
50
50
50
50
-10
-8
-10
-10
Пример 12: EC равна 5,80×10 М; Пример 13: EC равна 7,95×10 М; Пример 15: EC равна 1,70×10 М; Пример 27: EC равна 1,20×10 М.
Разные линии клеток:
50
Соединение 15 тестировали на разных линиях клеток (А549, MDA-MB-231, MCF-7, SN12C), следуя вышеописанному способу. Измеренные активности давали значения EC меньше 0,1 мкМ на всех протестированных линиях клеток.
Сравнительные примеры:
В сравнительных примерах, приведенных ниже, исследовали замену на фенильном кольце (аминогруппы относительно карбоксила), демонстрируя улучшенную антипролиферативную активность лекарственных средств согласно изобретению, содержащих амино заеститель.
Пример 18: синтез группировки лекарственное средство-линкер
Соединение E-11
4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанамидо)-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил(4-((3R,4S,7S,10S)-4-((S)-втор-бутил)-7,10-диизопропил-3-(2-((S)-2-((1R,2R)-1-метокси-2-метил-3-оксо-3-(((S)-2-фенил-1-(тиазол-2-ил)этил)амино)пропил)пирролидин-1-ил)-2-оксоэтил)-5,11-диметил-6,9-диоксо-2-окса-5,8,11-триазатридекан-13-ил)фенил)(метил)карбамата 2,2,2-трифторацетат
Соединение Е-11-1: метил-(S)-2-амино-5-уреидопентаноата гидрохлорид
Ацетилхлорид (10 мл) добавляли по каплям к MeOH (120 мл) при 0°C с перемешиванием. Через 20 минут добавляли L-цитруллин (10 г, 57 ммоль, 1,00 экв.), и данную смесь нагревали с обратным холодильником в течение ночи. Растворитель выпаривали при пониженном давлении с получением 15 г (116%) соединения E-11-1 в виде белого твердого вещества. Данный продукт использовали на следующей стадии без дальнейшей сушки.
Соединение E-11-2: метил-(S)-2-((S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентаноат
2
4
Соединение Е-11-1 (13 г, 57,6 ммоль, 1,1 экв.) растворяли в DMF (140 мл) при 0°C в инетной атмосфере. Добавляли DIEA (30 мл, 173 ммоль, 3,0 экв.), гидроксибензотриазол (HOBt - 10,59 г, 69,1 ммоль, 1,2 экв.) и сложный гидроксисукцинимидиловый эфир Boc-L-валина (Boc-Val-OSu - 18,1 г, 57,6 ммоль, 1,0 экв.). Реакционную смесь встряхивали в течение ночи при температуре окружающей среды, затем выпаривали растворитель при пониженном давлении. Остаток растворяли в воде (100 мл) и дважды экстрагировали DCM (150 мл). Органические фазы объединяли, сушили над NaSO и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали на силикагеле (DCM/MeOH) с получением 18,8 г (84%) соединения Е-11-2 в виде белого твердого вещества.
Соединение Е-11-3: (S)-2-((S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентановая кислота
Соединение Е-11-2 (18,8 г, 48,4 ммоль, 1 экв.) растворяли в MeOH (200 мл) при 0°C. Добавляли 1 М раствор NaOH (72 мл, 72 ммоль, 1,5 экв.), и данную смесь перемешивали в течение 2 часов при комнатной температуре. MeOH удаляли при пониженном давлении, и оставшийся водный раствор подкисляли 1 М HCl. Водную фазу упаривали досуха, и остаток очищали на силикагеле (DCM/MeOH) с получением 18 г (99%) соединения Е-11-3 в виде белого твердого вещества.
Соединение Е-11-4: трет-бутил-((S)-1-(((S)-1-((4-(гидроксиметил)фенил)амино)-1-оксо-5-уреидопентан-2-ил)амино)-3-метил-1-оксобутан-2-ил)карбамат
Соединение Е-11-3 (5 г, 13,4 ммоль, 1 экв.) растворяли в смеси сухого DCM (65 мл) и сухого MeOH (35 мл). Добавляли (4-аминофенил)метанол (1,81 г, 14,7 ммоль, 1,1 экв.) и N-этоксикарбонил-2-этокси-1,2-дигидрохинолин (EEDQ - 6,60 г, 26,7 ммоль, 2 экв.), и данную смесь перемешивали в темноте в течение ночи. Растворители выпаривали при пониженном давлении, и остаток очищали на силикагеле (DCM/MeOH) с получением 5,2 г (73%) соединения Е-11-4 в виде беловатого твердого вещества.
Соединение Е-11-5: трет-бутил-((S)-3-метил-1-(((S)-1-((4-((((4-нитрофенокси)карбонил)окси)метил)фенил)амино)-1-оксо-5-уреидопентан-2-ил)амино)-1-оксобутан-2-ил)карбамат
Соединение Е-11-4 (1,1 г, 2,29 ммоль, 1 экв.) растворяли в сухом DMF (5 мл) при температуре окружающей среды в инертной атмосфере. Добавляли бис(4-нитрофенил)карбонат (1,40 г, 4,59 ммоль, 2 экв.), с последующим добавлением DIEA (600 мкл, 3,44 ммоль, 1,5 экв.), и образующийся желтый раствор перемешивали в течение ночи. DMF выпаривали при пониженном давлении, и остаток очищали на силикагеле (DCM/MeOH) с получением 1,27 г (84%) соединения Е-11-5 в виде беловатого твердого вещества.
Соединение Е-11-6: 4-((S)-2-((S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил(4-((3R,4S,7S,10S)-4-((S)-втор-бутил)-7,10-диизопропил-3-(2-((S)-2-((1R,2R)-1-метокси-2-метил-3-оксо-3-(((S)-2-фенил-1-(тиазол-2-ил)этил)амино)пропил)пирролидин-1-ил)-2-оксоэтил)-5,11-диметил-6,9-диоксо-2-окса-5,8,11-триазатридекан-13-ил)фенил)(метил)карбамата 2,2,2-трифторацетат
Карбонат Е-11-5 (114 мг, 0,177 ммоль, 1,2 экв.) и анилин 11F (150 мг, 0,147 ммоль, 1 экв.) растворяли в сухом DMF (4 мл). Добавляли HOBt (38 мг, 0,295 ммоль, 2 экв.) и DIEA (54 мкл, 0,295 ммоль, 2 экв.), и данную смесь перемешивали в течение выходных при комнатной температуре. DMF выпаривали при пониженном давлении, и остаток очищали флэш-хроматографией на диоксиде кремния, элюируя DCM. Продукт повторно очищали препаративной ВЭЖХ (Waters 600Е, колонка SunFire Prep С18 OBD, 5 мкм, 19×100 мм; элюирующая фаза: вода/MeCN, буферизованная 0,1 % TFA; градиент от 5% до 100% MeCN за 15 минут; УФ детектор Waters 2487 при 220 нм). Выбранные фракции объединяли и лиофилизировали с получением соединения Е-11-6 в виде белого твердого вещества (89 мг, 39%).
Соединение Е-11:
Соединение Е-11-6 (21 мг, 0,014 ммоль, 1,0 экв.) растворяли в DCM (0,25 мл), и добавляли TFA (40 мкл). Раствор перемешивали в течение 2 часов при комнатной температуре, после чего анализ ЖХ-МС показал полное потребление исходного вещества. Данную смесь быстро охлаждали (баня с жидким азотом) при одновременном добавлении DMF (0,5 мл), затем DIEA (100 мкл) для того, чтобы нейтрализовать TFA. Затем удаляли охлаждающую баню и добавляли 2,5-диоксопирролидин-1-ил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноат (4 мг, 0,012 ммоль, 1 экв.). Данную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 48 часов, и продукт очищали препаративной ВЭЖХ (Waters 600Е, колонка SunFire Prep С18 OBD, 5 мкм, 19×100 мм; элюирующая фаза: вода/MeCN, буферизованная 0,1 % TFA; градиент от 5% до 100% MeCN за 15 минут; УФ детектор Waters 2487 при 220 нм). Выбранные фракции объединяли и лиофилизировали с получением соединения Е-11 в виде белого твердого вещества (11 мг, 54%).
+
2+
79
115
13
14
2
79
117
13
14
m/z (К-ВП МС ЭРИ+) 1524,8282 (2%, MNa, CHNNaOS требует 1524,8299), 751,9283 (100%, (MH), CHNOS требует 751,9276).
Соединение Е-12
Метил-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((((4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанамидо)-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил)окси)карбонил)(метил)амино)фенэтил)(метил)амино)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропаноил)-L-фенилаланината 2,2,2-трифторацетат
Соединение Е-12-1: трет-бутил-((S)-3-метил-1-оксо-1-(((S)-1-оксо-1-((4-((((перфторфенокси)карбонил)окси)метил)фенил)амино)-5-уреидопентан-2-ил)амино)бутан-2-ил)карбамат
Соединение Е-11-4 (670 мг, 1,26 ммоль, 1 экв.) растворяли в сухом DMF (6 мл) при 0°C в инертной атмосфере. Добавляли бис(перфторфенил)карбонат (991 мг, 2,51 ммоль, 2 экв.), с последующим добавлением DIEA (329 мкл, 1,89 ммоль, 1,5 экв.), и образующийся бесцветный раствор перешивали в течение 30 минут при комнатной температуре. DMF выпаривали при пониженном давлении, и остаток очищали на силикагеле (DCM/MeOH) с получением 836 мг (96%) соединения Е-12-1 в виде беловатого твердого вещества.
Соединение Е-12-2: метил-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((((4-((S)-2-((S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил)окси)карбонил)(метил)амино)фенэтил)(метил)амино)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропаноил)-L-фенилаланината 2,2,2-трифторацетат
Анилин 12 (165 мг, 0,189 ммоль, 1,0 экв.) растворяли в DMF (5 мл) при 0°C в инертной атмосфере. Добавляли карбонат Е-12-1 (194 мг, 0,282 ммоль, 1,5 экв.), HOBt (51 мг, 0,375 ммоль, 2 экв.) и DIEA (66 мкл, 0,375 ммоль, 2 экв.), и данную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 8 часов. Растворитель выпаривали при пониженном давлении, и остаток очищали препаративной ВЭЖХ (Waters 600Е, колонка SunFire Prep С18 OBD, 5 мкм, 19×100 мм; элюирующая фаза: вода/MeCN, буферизованная 0,1% TFA; градиент от 5% до 100% MeCN за 15 минут; УФ детектор Waters 2487 при 220 нм). Выбранные фракции объединяли и лиофилизировали с получением соединения Е12-7 в виде белого твердого вещества (247 мг, 77%).
Соединение Е-12-3: метил-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((((4-((S)-2-((S)-2-амино-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил)окси)карбонил)(метил)амино)фенэтил)(метил)амино)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропаноил)-L-фенилаланината бис(2,2,2-трифторацетат)
Соединение Е-12-2 (5,6 мг, 4,04 мкмоль, 1,0 экв.) растворяли в TFA (100 мкл). Через 5 минут добавляли 2 мл воды, и смесь лиофилизировали в течение ночи с получением соединения Е-12-3 в виде беловатого твердого вещества (5,6 мг, 98%).
Соединение Е-12:
Соединение Е-12-3 (5,6 мг, 4 мкмоль, 1,0 экв.) растворяли в ацетонитриле (0,5 мл), и добавляли DIEA (5 мкл, 7 экв.), с последующим добавлением 2,5-диоксопирролидин-1-ил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноата (2,5 мг, 8 мкмоль, 2 экв.). Данную смесь перемешивали в течение 6 часов при комнатной температуре. После осуществления контроля реакции посредством ЖХ-МС добавляли 200 мкл воды, и образующийся раствор очищали препаративной ВЭЖХ (Waters 600Е, колонка SunFire Prep С18 OBD, 5 мкм, 19×100 мм; элюирующая фаза: вода/MeCN, буферизованная 0,1 % TFA; градиент от 5% до 100% MeCN за 15 минут; УФ детектор Waters 2487 при 220 нм). Отобранные фракции объединяли и лиофилизировали с получением соединения Е12 в виде белого твердого вещества (4,6 мг, 70%).
2
78
118
12
16
2+
m/z (К-ВП МС ЭРИ+) 739,4389 (100%, (MH), CHNO требует 739,4389).
Соединение Е-13
((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((((4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанамидо)-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил)окси)карбонил)(метил)амино)фенэтил)(метил)амино)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропаноил)-L-фенилаланина 2,2,2-трифторацетат
Соединение Е-13-1: ((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((((4-((S)-2-((S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил)окси)карбонил)(метил)амино)фенэтил)(метил)амино)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропаноил)-L-фенилаланин
2
2
Соединение Е-12-2 (185 мг, 0,123 ммоль, 1,0 экв.) растворяли в смеси воды (5 мл) и ацетонитрила (5 мл) при комнатной температуре. Добавляли пиперидин (3,67 мл, 300 экв.), и данную смесь перемешивали в течение 6 часов при комнатной температуре. Растворители выпаривали досуха при пониженном давлении, и остаток растирали с EtO (60 мл). Твердое вещество дважды промывали EtO (20 мл) и сушили под вакуумом с получением соединения Е-13-1 в виде беловатого твердого вещества (175 мг, 95%).
Соединение Е-13-2: ((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((((4-((S)-2-((S)-2-амино-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил)окси)карбонил)(метил)амино)фенэтил)(метил)амино)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропаноил)-L-фенилаланина бис-(2,2,2-трифторацетат)
Соединение Е-13-1 (175 мг, 0,128 ммоль, 1,0 экв.) растворяли в TFA (200 мл). Через 5 минут добавляли воду (1 мл) и ацетонитрил (1 мл), и раствор лиофилизировали в течение ночи с получением соединения Е-13-2 в виде беловатого твердого вещества (180 мг, 87%).
Соединение Е-13: ((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((((4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанамидо)-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил)окси)карбонил)(метил)амино)фенэтил)(метил)амино)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил) пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропаноил)-L-фенилаланин, 2,2,2-трифторацетат
Соединение Е-13-2 (80 мг, 0,058 ммоль, 1,0 экв.) растворяли в смеси ацетонитрила (1,5 мл) и DMF (0,4 мл). Добавляли DIEA (50 мкл, 0,289 ммоль, 5 экв.), с последующим добавлением 2,5-диоксопирролидин-1-ил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноата (36 мг, 0,116 ммоль, 2 экв.). Данную смесь перемешивали в течение 3 часов при комнатной температуре. После осуществления контроля реакции посредством ЖХ-МС растворитель выпаривали при пониженном давлении, и остаток очищали препаративной ВЭЖХ (Waters 600Е, колонка SunFire Prep С18 OBD, 5 мкм, 19×100 мм; элюирующая фаза: вода/MeCN, буферизованная 0,1 % TFA; градиент от 5% до 100% MeCN за 15 минут; УФ детектор Waters 2487 при 220 нм). Выбранные фракции объединяли и лиофилизировали с получением соединения Е-13 в виде белого твердого вещества (32 мг, 35%).
-
+
2+
77
113
12
16
77
115
12
16
2
77
116
12
16
m/z (К-ВП МС ЭРИ-) 1461,8336 (100%, (М-H), CHNO требует 1461,8403). m/z (К-ВП МС ЭРИ+) 1463,8565 (2%, MH, CHNO требует 1463,8549), 732,4317 (100%, (MH), CHNO требует 732,4311).
Соединение Е-15
Метил-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((3-((((4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанамидо)-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил)окси)карбонил)амино)бензил)(метил)амино)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропаноил)-L-фенилаланината 2,2,2-трифторацетат
Соединение Е-15-1: метил-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((3-((((4-((S)-2-((S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил)окси)карбонил)амино)бензил)(метил)амино)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропаноил)-L-фенилаланината 2,2,2-трифторацетат
Соединение Е-15-1 получали согласно тому же самому способу, что и соединение Е-11-6, с использованием карбоната Е-11-5 (28 мг, 0,044 ммоль, 1 экв.), анилина 15 (42 мг, 0,044 ммоль, 1 экв.), HOBt (3 мг, 0,022 ммоль, 0,5 экв.) и DIEA (15 мкл, 0,087 ммоль, 2 экв.) в DMF (2 мл). Соединение Е-15-1 выделяли в виде белого твердого вещества (8,2 мг, 13%).
Соединение Е-15-2: метил-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((3-((((4-((S)-2-((S)-2-амино-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил)окси)карбонил)амино)бензил)(метил)амино)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропаноил)-L-фенилаланината бис(2,2,2-трифторацетат)
Соединение Е-15-1 (8,2 мг, 5,58 мкмоль, 1,0 экв.) растворяли в TFA (200 мкл). Через 5 минут добавляли воду (1 мл), и раствор лиофилизировали в течение ночи с получением соединения Е-15-8 в виде белого твердого вещества (7,6 мг, 99%).
Соединение Е-15:
Соединение Е-15 получали согласно тому же самому способу, что и соединение Е-12, с использованием амина Е-15-2 (7,6 мг, 5,55 мкмоль, 1 экв.), 2,5-диоксопирролидин-1-ил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноата (2 мг, 6,65 мкмоль, 1,2 экв.) и DIEA (5 мкл, 0,028 ммоль, 5 экв.) в ацетонитриле (0,5 мл). Соединение Е-15 выделяли в виде белого твердого вещества (4,2 мг, 48%).
+
2+
3+
76
112
12
16
2
76
114
12
16
3
76
115
12
16
m/z (К-ВМ МС ЭРИ+) 1471,8169 (2%, MNa, CHNNaO требует 1471,8211), 725,4223 (100%, (MH), CHNO требует 725,4232), 483,9482 (10%, (MH), CHNO требует 483,9513).
Соединение F-13
((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанамидо)-3-метилбутанамидо)-N-метил-5-уреидопентанамидо)фенэтил)(метил)амино)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропаноил)-L-фенилаланина 2,2,2-трифторацетат
Соединение F-13-1: бензил-N-(4-((трет-бутоксикарбонил)(метил)амино)фенэтил)-N-метил-L-валинат
4
Соединение 11C (250 мг, 0,567 ммоль, 1 экв.) растворяли в THF (10 мл), с последующим добавлением NaH (60%-ная суспензия в минеральном масле, 68 мг, 1,702 ммоль, 3 экв.). Данную смесь перемешивали в течение 5 минут перед добавлением йодметана (106 мкл, 1,702 ммоль, 3 экв.). Реакционную смесь перемешивали в течение 2 часов при комнатной температуре перед гашением водой и разделением между EtOAc (100 мл) и водой (50 мл). Органическую фазу сушили над MgSO и упаривали досуха с получением соединения F-13-1 в виде желтого масла (250 мг, 97%), которое использовали без дальнейшей очистки.
Соединение F-13-2: бензил-N-метил-N-(4-(метиламино)фенэтил)-L-валинат
i
2
Анилин F-13-1, защищенный Boc (250 мг, 0,550 ммоль, 1 экв.), растворяли в MeOH (5 мл), с последующим добавлением 1 мл имеющегося в продаже раствора HCl в PrOH (5-6 М). Раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов перед упариванием досуха при пониженном давлении. Образующееся желтое масло растирали с EtO с получением соединения F-13-2 в виде желтого твердого вещества (202 мг, 94%).
Соединение F-13-3: бензил-N-(4-((S)-2-((S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-метилбутанамидо)-N-метил-5-уреидопентанамидо)фенэтил)-N-метил-L-валинат
Кислоту Е-11-3 (190 мг, 0,508 ммоль, 1,5 экв.) растворяли в сухом DMF (1 мл), с последующим добавлением DIEA (118 мкл, 0,677 ммоль, 2 экв.), бензотриазол-1-ил-окситрипирролидинофосфония гексафторфосфата (PyBOP - 264 мг, 0,508 ммоль, 1,5 экв.) и анилина F-13-2 (120 мг, 0,339 ммоль, 1 экв.). Данную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи, и растворители выпаривали при пониженном давлении. Остаток очищали препаративной ВЭЖХ (Waters 600Е, колонка SunFire Prep С18 OBD, 5 мкм, 19×100 мм; элюирующая фаза: вода/MeCN, буферизованная 0,1% TFA; градиент от 5% до 100% MeCN за 15 минут; УФ детектор Waters 2487 при 220 нм). Выбранные фракции объединяли и лиофилизировали с получением соединения F-13-3 в виде белого твердого вещества (140 мг, 45%).
Соединение F-13-4: N-(4-((S)-2-((S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-метилбутанамидо)-N-метил-5-уреидопентанамидо)фенэтил)-N-метил-L-валин
Соединение F-13-3 (116 мг, 0,163 ммоль, 1 экв.) растворяли в MeOH (5 мл) в присутствии 10% Pd/C (30 мг) и гидрогенизировали в течение 2 часов при температуре окружающей среды и атмосферном давлении. Реакционную среду фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением 110 мг (99%) соединения F-13-4 в виде бежевого твердого вещества.
Соединение F-13-5: метил-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((S)-2-((S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-метилбутанамидо)-N-метил-5-уреидопентанамидо)фенэтил)(метил)амино)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-мл)-3-метокси-2-метилпропаноил)-L-фенилаланината 2,2,2-трифторацетат
4
Амин 3D (89 мг, 0,140 ммоль, 1 экв.) и кислоту F-13-4 (145 мг, 0,210 ммоль, 1,5 экв.) растворяли в сухом DMF (4 мл) и добавляли PyBOP (109 мг, 0,210 ммоль, 1,5 экв.) и DIEA (73 мкл, 0,420 ммоль, 3 экв.). Данную смесь перемешивали в течение 1 часа при комнатной температуре и выпаривали растворитель. Остаток разделяли между EtOAc и водой, и органическую фазу сушили над MgSO, фильтровали и упаривали при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищали препаративной ВЭЖХ (Waters 600Е, колонка SunFire Prep С18 OBD, 5 мкм, 19×100 мм; элюирующая фаза: вода/MeCN, буферизованная 0,1% TFA; градиент от 5% до 100% MeCN за 15 минут; УФ детектор Waters 2487 при 220 нм). Отобранные фракции объединяли и лиофилизировали с получением соединения F-13-5 в виде белого твердого вещества (140 мг, 73%).
Соединение F-13-6: ((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((S)-2-((S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-метилбутанамидо)-N-метил-5-уреидопентанамидо)фенэтил)(метил)амино)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропаноил)-L-фенилаланина 2,2,2-трифторацетат
Соединение F-13-5 (140 мг, 0,104 ммоль, 1 экв.) растворяли в смеси воды (4 мл), ацетонитрила (4 мл) и пиперидина (2 мл), и перемешивали при комнатной температуре в течение 4 часов. Растворитель выпаривали при пониженном давлении, и остаток очищали препаративной ВЭЖХ (Waters 600Е, колонка SunFire Prep С18 OBD, 5 мкм, 19×100 мм; элюирующая фаза: вода/MeCN, буферизованная 0,1% TFA; градиент от 5% до 100% MeCN за 15 минут; УФ детектор Waters 2487 при 220 нм). Отобранные фракции объединяли и лиофилизировали с получением соединения F-13-6 в виде белого твердого вещества (115 мг, 83%).
Соединение F-13:
Соединение F-13 получали согласно тому же самому способу, что и соединение Е-11, с использованием амина F-13-6, защищенного Вое (55 мг, 0,041 ммоль, 1,0 экв.), в DCM (0,5 мл) и TFA (100 мкл, 30 экв.), с последующим разведением DMF (1 мл), осуществляя гашение DIEA (320 мкл, 45 экв.), затем проводя реакцию с 2,5-диоксопирролидин-1-ил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноатом (15 мг, 0,049 ммоль, 1,2 экв.). После очистки препаративной ВЭЖХ и лиофилизации получали соединение F-13 в виде белого твердого вещества (14 мг, 24%).
+
2+
69
108
11
14
2
69
109
11
14
m/z (К-ВП МС ЭРИ+) 1314,8067 (2%, MH, CHNO требует 1314,8072), 657,9067 (100%, (MH), CHNO требует 657,9072).
Соединение F-61
N-((S)-1-(((S)-1-((4-((3R,4S,7S,10S)-4-((S)-втор-бутил)-7,10-диизопропил-3-(2-((S)-2-((1R,2R)-1-метокси-2-метил-3-оксо-3-(((S)-2-фенил-1-(тиазол-2-ил)этил)амино)пропил)пирролидин-1-ил)-2-оксоэтил)-5,11-диметил-6,9-диоксо-2-окса-5,8,11-триазатридекан-13-ил)фенил)амино)-1-оксо-5-уреидопентан-2-ил)амино)-3-метил-1-оксобутан-2-ил)-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанамида 2,2,2-трифторацетат
Соединение F-61-1: бензил-N-(4-аминофенэтил)-N-метил-L-валината дигидрохлорид
i
2
Соединение 11С (1,0 г, 2,27 ммоль, 1 экв.) растворяли в 8 мл имеющегося в продаже раствора HCl в PrOH (5-6 М). Данную смесь перемешивали в течение 2 часов при комнатной температуре перед упариванием досуха при пониженном давлении. Остаток дважды растирали с EtO (30 мл) и сушили под вакуумом с получением соединения F-61-1 в виде белого твердого вещества (916 мг, 98%).
Соединение F-61-2: бензил-N-(4-((S)-2-((S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)фенэтил)-N-метил-L-валинат
Кислоту Е-11-3 (769 мг, 2,05 ммоль, 1,5 экв.) растворяли в сухом DMF (2,5 мл), с последующим доавлением DIEA (957 мкл, 5,48 ммоль, 4 экв.) и PyBOP (1,07 г, 2,05 ммоль, 1,5 экв.). Добавляли анилин F-61-1 (566 мг, 1,369 ммоль, 1 экв.), и данную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Растворители выпаривали при пониженном давлении, и остаток очищали на силикагеле (DCM/MeOH) с получением 969 мг (102%) соединения F-61-2 в виде белого твердого вещества.
Соединение F-61-3: N-(4-((S)-2-((S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)фенэтил)-N-метил-L-валин
Соединение F-61-2 (969 мг, 1,28 ммоль, 1 экв.) растворяли в MeOH (20 мл) в присутствии 10% Pd/C (270 мг) и гидрогенизировали в течение 3 часов при температуре окружающей среды и атмосферном давлении. Реакционную среду фильтровали и концентрировали при пониженном давлении, и остаток очищали на силикагеле (DCM/MeOH/AcOH) с получением 520 мг (67%) соединения F-61-3 в виде белого твердого вещества.
Соединение F-61-4: трет-бутил-((S)-1-(((S)-1-((4-((3R,4S,7S,10S)-4-((S)-втор-бутил)-7,10-диизопропил-3-(2-((S)-2-((1R,2R)-1-метокси-2-метил-3-оксо-3-(((S)-2-фенил-1-(тиазол-2-ил)этил)амино)пропил)пирролидин-1-ил)-2-оксоэтил)-5,11-диметил-6,9-диоксо-2-окса-5,8,11-триазатридекан-13-ил)фенил)амино)-1-оксо-5-уреидопентан-2-ил)амино)-3-метил-1-оксобутан-2-ил)карбамата 2,2,2-трифторацетат
Кислоту F-61-3 (67,5 мг, 0,111 ммоль, 1,5 экв.) растворяли в сухом DMF (2 мл), и добавляли DECP (17 мкл, 0,111 ммоль, 1,5 экв.) и DIEA (39 мкл, 0,223 ммоль, 3 экв.). После перемешивания в течение 15 минут при комнатной температуре добавляли амин 1Y (50 мг, 0,074 ммоль, 1 экв.), и раствор перемешивали в течение ночи. Растворитель выпаривали при пониженном давлении, и остаток очищали препаративной ВЭЖХ (Waters 600Е, колонка SunFire Prep С18 OBD, 5 мкм, 19×100 мм; элюирующая фаза: вода/MeCN, буферизованная 0,1% TFA; градиент от 5% до 100% MeCN за 15 минут; УФ детектор Waters 2487 при 220 нм). Выбранные фракции объединяли и лиофилизировали с получением соединения F61-4 в виде белого твердого вещества (28 мг, 28%).
Соединение F-61-5: (S)-2-((S)-2-амино-3-метилбутанамидо)-N-(4-((3R,4S,7S,10S)-4-((S)-втор-бутил)-7,10-диизопропил-3-(2-((S)-2-((1R,2R)-1-метокси-2-метил-3-оксо-3-(((S)-2-фенил-1-(тиазол-2-ил)этил)амино)пропил)пирролидин-1-ил)-2-оксоэтил)-5,11-диметил-6,9-диоксо-2-окса-5,8,11-триазатридекан-13-ил)фенил)-5-уреидопентанамида бис(2,2,2-трифторацетат)
Соединение F-61-4 (28 мг, 0,021 ммоль, 1,0 экв.) растворяли в TFA (200 мкл). Через 5 минут добавляли воду (2 мл) и ацетонитрил (0,5 мл), и данный раствор лиофилизировали в течение ночи с получением соединения F-61-5 в виде бесцветного масла (38 мг, 134%).
Соединение F-61:
2
Соединение F-61-5 (28,3 мг, 0,020 ммоль, 1 экв.) растворяли в ацетонитриле (0,5 мл), с последующим добавлением 2,5-диоксопирролидин-1-ил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноата (9 мг, 0,029 мкмоль, 1,4 экв.) и DIEA (25 мкл, 0,143 ммоль, 7 экв.). Данную смесь перемешивали в течение 4,5 часов, после чего анализ ВЭЖХ показал присутствие исходного вещества, но и полное потребление сукцинимида. Следовательно, добавляли дополнительный 2,5-диоксопирролидин-1-ил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноат (3 мг, 0,01 мкмоль, 0,5 экв.), и реакционную смесь перемешивали в течение 1,5 часов. Анализ ВЭЖХ показал полное потребление исходного вещества. Растворитель выпаривали досуха, и остаток дважды растирали со смесью EtOAc/EtO (80/20) с получением соединения F-61 в виде беловатого твердого вещества (19,4 мг, 70%).
+
2+
70
106
12
12
2
70
108
12
12
m/z (К-ВП МС ЭРИ+) 1361,7725 (2%, MNa, CHNNaOS требует 1361,7666), 670,3961 (100%, (MH), CHNOS требует 670,3960).
Соединение F-62:
Метил-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанамидо)-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)фенэтил)(метил)амино)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропаноил)-L-фенилаланината 2,2,2-трифторацетат
Соединение F-62-1: метил-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((S)-2-((S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)фенэтил)(метил)амино)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропаноил)-L-фенилаланината 2,2,2-трифторацетат
Соединение F-62-1 получали аналогично соединению F-61-4 из амина 3D (100 мг, 0,158 ммоль, 0,9 экв.), кислоты F-61-3 (108 мг, 0,178 ммоль, 1 экв.), DECP (41 мкл, 0,267 ммоль, 1,5 экв.) и DIEA (93 мкл, 0,534 ммоль, 3 экв.) в DMF (2 мл). После очистки препаративной ВЭЖХ получали соединение F-62-1 в виде белого твердого вещества (93 мг, 39%).
Соединение F-62-2: метил-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((S)-2-((S)-2-амино-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)фенэтил)(метил)амино)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропаноил)-L-фенилаланината бис(2,2,2-трифторацетат)
Соединение F-62-1 (35 мг, 0,026 ммоль, 1,0 экв.) растворяли в TFA (200 мкл). Через 10 минут добавляли воду (2 мл) и ацетонитрил (0,5 мл), и раствор лиофилизировали в течение ночи с получением соединения F-62-2 в виде белого твердого вещества (34 мг, 105%).
Соединение F-62:
2
Амин F-62-2 (34 мг, 5,55 мкмоль, 1 экв.) растворяли в ацетонитриле (3 мл). Добавляли DIEA (5 мкл, 0,028 ммоль, 5 экв.) и 2,5-диоксопирролидин-1-ил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноат (2 мг, 6,65 мкмоль, 1,2 экв.). Анализ ВЭЖХ показал полное потребление исходного вещества. Растворитель выпаривали досуха, и остаток растирали со смесью EtOAc/EtO (80/20). Неочищенный продукт очищали препаративной ВЭЖХ (Waters 600Е, колонка SunFire Prep С18 OBD, 5 мкм, 19×100 мм; элюирующая фаза: вода/MeCN, буферизованная 0,1% TFA; градиент от 5% до 100% MeCN за 15 минут; УФ детектор Waters 2487 при 220 нм). Выбранные фракции объединяли и лиофилизировали с получением соединения F-62 в виде белого твердого вещества (5,5 мг, 13%).
+
2+
69
107
11
14
2
69
109
11
14
m/z (К-ВМ МС ЭРИ+) 1336,7859 (2%, MNa, CHNNaO требует 1336,7891), 657,9073 (100%, (MH), CHNO требует 657,9072).
Соединение F-63:
((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанамидо)-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)фенэтил)(метил)амино)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропаноил)-L-фенилаланина 2,2,2-трифторацетат
Соединение F-63-1: ((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((S)-2-((S)-2-((трет-бутоксикарбонил)амино)-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)фенэтил)(метил)амино)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропаноил)-L-фенилаланин
2
2
Соединение F-62-1 (157 мг, 0,118 ммоль, 1 экв.) растворяли в смеси воды (4,5 мл), ацетонитрила (4,5 мл) и пиперидина (3,5 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение 5 часов. Растворитель выпаривали при пониженном давлении, и остаток растирали с EtO (60 мл). Твердое вещество собирали фильтрованием и дважды промывали EtO (10 мл) с получением соединения F-63-1 в виде беловатого твердого вещества (153 мг, 100%).
Соединение F-63-2: ((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-((S)-2-((S)-2-амино-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)фенэтил)(метил)амино)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропаноил)-L-фенилаланина бис-2,2,2-трифторацетат
Соединение F-63-1 (153 мг, 0,127 ммоль, 1,0 экв.) растворяли в TFA (200 мкл). Через 10 минут добавляли воду (2 мл) и ацетонитрил (0,5 мл), и данный раствор лиофилизировали в течение ночи с получением соединения F-63-2 в виде белого твердого вещества (34 мг, 105%).
Соединение F-63:
Амин F-63-2 (100 мг, 0,082 ммоль, 1 экв.) растворяли в смеси ацетонитрила (2 мл) и DMF (0,5 мл), и добавляли 2,5-диоксопирролидин-1-ил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноат (45 мг, 0,147 ммоль, 1,8 экв.) и DIEA (71 мкл, 0,409 ммоль, 5 экв.). После перемешивания при комнатной температуре в течение 4,5 часов выпаривали растворитель при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищали препаративной ВЭЖХ (Waters 600Е, колонка SunFire Prep С18 OBD, 5 мкм, 19×100 мм; элюирующая фаза: вода/MeCN, буферизованная 0,1% TFA; градиент от 5% до 100% MeCN за 15 минут; УФ детектор Waters 2487 при 220 нм). Отобранные фракции объединяли и лиофилизировали с получением соединения F-63 в виде белого твердого вещества (42 мг, 36%).
+
2+
68
106
11
14
2
68
107
11
14
m/z (К-ВП МС ЭРИ+) 1300,7901 (2%, MH, CHNO требует 1300,7915), 650,8990 (100%, (MH), CHNO требует 650,8994).
Соединение G-12
Метил-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4((S)-2-((S)-2-((4-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-N-метилгексанамидо)фенэтил)(метил)амино)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропаноил)-L-фенилаланината 2,2,2-трифторацетат
Соединение G-12-1: бензил-N-(4-аминофенэтил)-N-метил-L-валината дигидрохлорид
В оксалилхлориде (3 мл) растворяли 6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексановую кислоту (200 мг, 0,947 ммоль, 1 экв.). Данный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 5 часов перед упариванием досуха при пониженном давлении. Соединение G-12-1 получали в виде бежевого твердого вещества (217 мг, 100%) и использовали на следующей стадии без очистки.
Соединение G-12:
2
4
Анилин 12 (40 мг, 0,045 ммоль, 1 экв.) растворяли в сухом DCM (1 мл) при 0°C, и добавляли DIEA (8 мкл, 0,045 ммоль, 1 экв.). После перемешивания в течение 30 минут вводили раствор соединения G-12-1 (10 мг, 0,45 ммоль, 1 экв.) в сухом DCM (1 мл), и реакционную смесь перемешивали в течение 1 часа при 0°C. Данную смесь разводили DCM (25 мл) и дважды промывали водой (20 мл), один раз рассолом (10 мл). Органическую фазу сушили над NaSO, фильтровали и упаривали при пониженном давлении с получением неочищенного продукта в виде светло-коричневого твердого вещества (54 мг). Его очищали флэш-хроматографией на силикагеле (DCM/MeOH), с последующей препаративной ВЭЖХ (Waters 600Е, колонка SunFire Prep С18 OBD, 5 мкм, 19×100 мм; элюирующая фаза: вода/MeCN, буферизованная 0,1% TFA; градиент от 5% до 100% MeCN за 15 минут; УФ детектор Waters 2487 при 220 нм). Выделенный продукт лиофилизировали с получением белого твердого вещества (23 мг), которое повторно очищали препаративной ВЭЖХ, и отобранные фракции объединяли и лиофилизировали с получением соединения G-12 в виде белого твердого вещества (9 мг, 16%).
+
+
2+
59
89
7
11
59
90
7
11
2
59
91
7
11
m/z (К-ВП МС ЭРИ+) 1094,6543 (20%, MNa, CHNNaO требует 1094,6512), 1072,6722 (16 %, MH, CHNO требует 1072,6693), 536,8358 (100%, (MH), CHNO требует 536,8383).
Соединение G-13
((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((4-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-N-метилгексанамидо)фенэтил)(метил)амино)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропаноил)-L-фенилаланина 2,2,2-трифторацетат
Соединение G-13:
Анилин 13 (15 мг, 0,015 ммоль, 1 экв.) растворяли в сухом DCM (1,5 мл) при 0°C и добавляли DIEA (8 мкл, 0,046 ммоль, 3 экв.). Вводили раствор соединения G-12-1 (3,5 мг, 0,046 ммоль, 1 экв.) в сухом DCM (0,5 мл), и данную реакционную смесь перемешивали в течение 1,5 часов при 0°C. Растворитель выпаривали при пониженном давлении, и неочищенный продукт очищали препаративной ВЭЖХ (Waters 600Е, колонка SunFire Prep С18 OBD, 5 мкм, 19×100 мм; элюирующая фаза: вода/MeCN, буферизованная 0,1% TFA; градиент от 5% до 100% MeCN за 15 минут; УФ детектор Waters 2487 при 220 нм). Выделенные фракции объединяли и лиофилизировали с получением соединения G-13 в виде белого твердого вещества (11,4 мг, 62%).
+
2+
58
88
7
11
2
58
89
7
11
m/z (К-ВП МС ЭРИ+) 1058,6510 (30%, MH, CHNO требует 1058,6536), 529,8285 (100%, (MH), CHNO требует 529,8305).
Соединение G-15
Метил-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-((3-(6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексанамидо)бензил)(метил)амино)-3-метилбутанамидо)-N,3-диметилбутанамидо)-3-метокси-5-метилгептаноил)пирролидин-2-ил)-3-метокси-2-метилпропаноил)-L-фенилаланината 2,2,2-трифторацетат
Соединение G-15:
4
Анилин 15 (40 мг, 0,047 ммоль, 1 экв.) растворяли в сухом DCM (2 мл) при 0°C, и добавляли DIEA (10 мкл, 0,056 ммоль, 1,2 экв.). Вводили раствор соединения G-12-1 (108 мг, 0,47 ммоль, 10 экв.) в сухом DCM (1 мл), и данную реакционную смесь перемешивали в течение 1,5 часов при 0°C. Смесь разводили DCM (10 мл), и дважды промывали водой (5 мл). Органическую фазу сушили над MgSO, фильтровали и упаривали при пониженном давлении с получением неочищенного продукта в виде бежевого твердого вещества. Его очищали препаративной ВЭЖХ (Waters 600Е, колонка SunFire Prep С18 OBD, 5 мкм, 19×100 мм; элюирующая фаза: вода/MeCN, буферизованная 0,1% TFA; градиент от 5% до 100% MeCN за 15 минут; УФ детектор Waters 2487 при 220 нм). Отобранные фракции объединяли и лиофилизировали с получением соединения G15 в виде белого твердого вещества (27 мг, 50%).
+
2+
57
85
7
11
2
57
87
7
11
m/z (К-ВП МС ЭРИ+) 1066,6517 (2%, MNa, CHNNaO требует 1066,6199), 522,8224 (100%, (MH), CHNO требует 522,8226).
Пример 19: синтез, очистка и характеризация ADC
Описанная ниже методика применяется к химерным и гуманизированным формам IgG1. Следует понимать, что для любых других форм, таких как IgG2, IgG4 и т.д., специалист в данной области мог бы адаптировать данную методику с использованием общих знаний.
Вторые антитела против IGF-1R (1-5 мг/мл) частично восстанавливали Tris(2-карбоксиэтил)фосфина гидрохлоридом (ТСЕР) в 10 мМ боратном буфере, pH 8,4, содержащем 150 мМ NaCl и 2 мМ EDTA, в течение 2 ч при 37°C. Типично использовали 2,5-3 мольных эквивалента ТСЕР для целевых отношений лекарственного средства к антителу (DAR) приблизительно 4 соответственно. Частичное восстановление антитела подтверждали анализом SDS-PAGE при невосстанавливающих условиях. Перед связыванием линкера-лекарственного средства с высвобожденными межцепочечными остатками цистеина давали восстанавливающей смеси охладиться до комнатной температуры. Концентрацию антитела затем доводили до 1 мг/мл 10 мМ боратным буфером, pH 8,4, содержащим 150 мМ NaCl и 2 мМ EDTA, и добавляли 5-молярный избыток лекарственного средства к антителу из 10 мМ раствора в диметилсульфоксиде (DMSO). Конечная концентрация DMSO была доведена до 10% для поддержания растворимости лекарственного средства в водной среде на протяжении связывания. Реакцию проводили в течение 1 ч при комнатной температуре. Избыток лекарственного средства гасили добавлением 1,5 моль N-ацетилцистеина на моль лекарственного средства и инкубированием в течение 1 ч при комнатной температуре. После диализа против 25 мМ His буфера, pH 6,5, содержащего 150 мМ NaCl, в течение ночи при 4°C конъюгаты антитело-лекарственное средство очищали с использованием способов, известных специалистам в данной области, на основе имеющихся в продаже хроматографических колонок и ультрафильтрационных блоков. Сначала несвязавшееся лекарственное средство и агрегаты ADC устраняли гель-фильтрацией (SEC) на колонке S200 (GE Life Sciences) или TSK G3000 SW (Tosoh). Очищенные мономеры ADC затем концентрировали до 2-3 мг/мл посредством ультрафильтрации на фильтрационных блоках с MWCO (порог отсечения молекулярной массы) 30 или 50 кДа или посредством аффинной хроматографии на белке А. Очищенные ADC хранили при 4°C после стерилизующей фильтрации на 0,2 мкм фильтре. Далее их анализировали посредством SDS-PAGE при восстанавливающих и невосстанавливающих условиях для подтверждения конъюгирования лекарственного средства и посредством SEC на аналитических колонках S200 или TSK G3000 SWXL для подтверждения содержания мономеров и агрегированных форм. Концентрации белка были определены с использованием анализа на основе бицинхониновой кислоты (ВСА) с IgG в качестве стандарта. DAR оценивали для каждого очищенного ADC посредством HIC и ЖХ-МС. Типично содержание агрегированных форм были ниже, чем 5%, и DAR составляло от 3,5 до 5.
Пример 20: оценка цитотоксичности антител против IGF-1R. связанных с разными лекарственными средствами
20.1 Оценка химерных вторых антител против IGF-1R на клетках MCF-7
Было показано то, что пять вторых антител против IGF-1R быстро интернализуются в лизосомы и имеют меньшую способность к связыванию в кислотных средах. В данном отношении эти вторые Ab против IGF-1R имели все свойсва для использования в виде ADC. Таким образом, пять химерных антител против IGF-1R связывали с тремя разными соединениями (G-13; Е-13 и F-63). Отношение лекарственного средства к антителу данных ADC составляло примерно 4. Для того чтобы оценить неспецифичную цитотоксичность с данными соединениями при таком же DAR было также связано нерелевантное химерное антитело c9G4. Клетки MCF-7 инкубировали с возрастающими концентрациями каждого ADC в течение 6 суток при 37°C в полной культуральной среде. Жизнеспособность клеток оценивали с использованием люминисцентного анализа жизнеспособности клеток (CellTiter-Glo, Promega). Люминисцентный сигнал считывали с использованием планшет-ридера Mithras (Berthold Technologies). Нерелевантное химерное антитело c9G4, связанное с одним из Е-13, G-13 или F-63, не демонстрировало или демонстрировало умеренную цитотоксическую активность на клетках MCF-7 (Фиг. 26). С другой стороны, добавление всех других ADC, полученных после связывания вторых антител против IGF-1R с одним из Е-13, G-13 или F-63 кардинально снижало жизнеспособность клеток MCF-7.
20.2 Оценка химерных вторых антител против IGF-1R на нормальных клетках
6
3
Уровни экспрессии IGF-1R оценивали на первичных нормальных клетках (PromoCell GmbH) с использованием mAb c208F2. С этой целью клетки (0,5×10 клеток/мл) инкубировали с 10 мкг/мл антитела c208F2 в течение 20 мин при 4°C в буфере FACS (PBS, 0,1% BSA, 0,01% NaN). Затем их 3 раза промывали и инкубировали с подходящим вторичным антителом, связанным с Alexa 488, в течение еще 20 минут при 4°C в темноте перед промывкой 3 раза в буфере FACS. Связывание второго антитела против IGF-1R немедленно осуществляли на жизнеспособных клетках, которые были идентифицированы с использованием пропидиум йодида (который окрашивает мертвые клетки). Уровень экспрессии (Bmax) был низким на нормальных клетках (Таблица 15) по сравнению с экспрессией IGF-1R на клетках MCF-7 (см. Пример 5, Таблицу 9).
Цитотоксичность ADC c208F2-G-13 оценивали на нормальных клетках. Клетки инкубировали с возрастающими концентрациями c208F2-G-13 в течение 6 суток при 37°C в полной культуральной среде. Жизнеспособность клеток оценивали с использованием люминисцентного анализа жизнеспособности клеток (CellTiter-Glo, Promega). Люминисцентный сигнал считывали с использованием планшет-ридера Mithras (Berthold Technologies). На HBSMC, HPMEC, НАоЕС и HREpC не наблюдали значительной цитотоксичности (Фиг. 30). Небольшую клеточную токсичность измеряли только на HUC при высоких концентрациях c208F2-G-13.
20.3 Оценка гуманизированных вариантов hz208F2
Шестнадцать гуманизированных вариантов 208F2 связывали с соединением G-13. Отношение лекарственного средства к антителу данных ADC составляло примерно 4. Для того чтобы оценить неспецифичную цитотоксичность с данными соединениями при таком же DAR связывали нерелевантное химерное антитело c9G4. С G-13 также связывали химерное антитело c208F2. Клетки MCF-7 инкубировали с возрастающими концентрациями каждого ADC в течение 6 суток при 37°C в полной культуральной среде. Жизнеспособность клеток оценивали с использованием люминисцентного анализа жизнеспособности клеток (CellTiter-Glo, Promega). Люминисцентный сигнал считывали с использованием планшет-ридера Mithras (Berthold Technologies). Нерелевантное химерное антитело c9G4, связанное с G-13, не демонстрировало или демонстрировало умеренную цитотоксическую активность на клетках MCF-7 (Фиг. 31). С другой стороны, добавление всех других ADC, полученных после связывания антител против IGF-1R с G-13, кардинально снижало жизнеспособность клеток MCF-7. Способность шестнадцати гуманизированных вариантов индуцировать клеточную цитотоксичность была по меньшей мере эквивалентной или даже лучшей по отношению к цитотоксичности, измеренной с химерной формой c208F2-G-13, как показано в Таблице 16 и проиллюстрировано с одним гуманизированным вариантом на Фиг. 31.
Пример 21: активность in vivo антитела c208F2. конъюгированного с одним из соединений Е-13, G-13 или F-63, в модели ксенотрансплантата MCF-7
Для того чтобы подтвердить то, что эффективность in vitro c208F2, связанного с соединениями G-13, Е-13 или F-63, могла бы переноситься на условия in vivo, их протестировали в модели ксенотрансплантатов MCF-7.
Все процедуры на животных поводили согласно руководствам 2010/63/UE Директивы по защите животных, используемых в научных целях. Протокол был одобрен комитетом по этике обращения с животными Института Пьера Фабра. Пять миллионов клеток MCF-7 подкожно инъецировали 7-недельным швейцарским/голым мышам. Перед инъекцией клеток в левый бок мышей имплантировали эстрогеновые пеллеты (Innovative Research of America) для того, чтобы высвобождать эстрогены, необходимые для роста опухолей MCF-7 in vivo.
3
Через двадцать суток после имплантации клеток MCF-7, при достижении опухолями среднего размера 120-150 мм, животных делили на группы по 5 мышей согласно размеру и соотношению измерений опухоли. Разные обработки инокулировали посредством внутрибрюшинных инъекций. Состояние здоровья животных отслеживали ежесуточно. Объем опухоли измеряли дважды в неделю электронным штангенциркулем до завершения исследования. Объем опухоли рассчитывается с использованием следующей формулы: π/6 × длина × ширина × высота. Токсичность оценивали, отслеживая массу животных три раза в неделю. Статистические анализы проводили при каждом измерении с использованием критерия Манна-Уитни. Все соединения инъецировали внутрибрюшинно (в.б.). В данном примере противоопухолевую активность mAb c208F2, связанного с одним из Е-13, F-13 или F-63 при DAR примерно 4, оценивали после 2 инъекций 7 мг/кг дозы в D20 (сутки 20) и D27 (Фиг. 27А, 27Б и 27В). Параллельно инъецировали кэппированные лекарственные группировки Е-13, F-13 и F-63 в эквивалентной дозе по отношению к дозе, соответствующей 7 мг/кг c208F2-E-13, c208F2-F-13 и c208F2-F-63 с DAR примерно 4.
Инъекция одного из c208F2-E-13 (Фиг. 22А), c208F2-G-13 (Фиг. 22Б) или c208F2-F-63 (Фиг. 27В) значимо ингибировала или даже индуцировала полную регрессию роста опухоли (p<0,05 относительно соответствующего кэппированного лекарственного средства). Не могли заметить статистического различия активности между c208-E-13, c208F2-G-13 и c208F2-F-63. Кэппированные лекарственные средства не имели влияния на рост опухоли MCF-7 (p больше 0,05 относительно контрольной группы).
Второй набор экспериментов проводили с c208F2, связанным либо с Е-13, либо с G-13, и с нерелевантным антителом c9G4, связанным либо с Е-13, либо с G-13, в моделях ксенотрансплантатов MCF-7, как описано ранее. Мышам в.б. инъецировали 7 мг/кг каждого ADC в D20 и D27 (Фиг. 28А и 28Б).
Инъекция как c9G4-E-13, так и c9G4-F-13 умеренно и кратковременно влияла на рост ксенотрансплантатов опухолей MCF-7. Однако этот второй эксперимент подтвердил то, что инъекции одного из c208-Е-13 или c208F2-G-13 индуцировали полную регрессию опухоли, так как в D43 проявлялась высокая противоопухолевая активность данных ADC.
+
Пример 22: активность in vivo антитела hz208F2. конъюгированного с соединением G-13. в модели ксенотрансплантата 3 MCF-7
Гуманизированные формы 208F2, связанные с соединением G-13, оценивали in vivo в модели ксенотрансплантатов MCF-7.
Все процедуры на животных поводили согласно руководствам 2010/63/UE Директивы по защите животных, используемых в научных целях. Протокол был одобрен комитетом по этике обращения с животными Института Пьера Фабра. Пять миллионов клеток MCF-7 подкожно инъецировали 7-недельным швейцарским/голым мышам. Перед инъекцией клеток в левый бок мышей имплантировали эстрогеновые пеллеты (Innovative Research of America) для того, чтобы высвобождать эстрогены, необходимые для роста опухолей MCF-7 in vivo.
3
Через двадцать суток после имплантации клеток MCF-7, при достижении опухолями среднего размера 120-150 мм, животных делили на группы по 6 мышей согласно размеру и соотношению измерений опухоли. Разные обработки инокулировали посредством внутрибрюшинных инъекций в виде протокола, включающего 4 инъекции: одну инъекцию каждые четверо суток (Q4d4). Состояние здоровья животных отслеживали ежесуточно. Объем опухоли измеряли дважды в неделю электронным штангенциркулем до завершения исследования. Объем опухоли рассчитывается с использованием следующей формулы: π/6 × длина × ширина × высота. Токсичность оценивали, отслеживая массу животных три раза в неделю. Статистические анализы проводили при каждом измерении с использованием критерия Манна-Уитни. Все соединения инъецировали внутрибрюшинно (в.б.). В данном примере противоопухолевую активность mAb c208F2, связанного с соединением G-13, сравнивали с разными гуманизированными формами, также связанными с G-13 (Фиг. 32). Протестированные гуманизированные формы были описаны в Таблице 17 ниже:
Инъекция одной из гуманизированных форм c208-G-13 или 208F2 значимо ингибировала и даже индуцировала полную регрессию опухоли (р меньше 0,05 относительно соответствующего контроля). Не наблюдали статистического различия активности между c208F2-G-13 и протестированными гуманизированными формами.
Второй набор экспериментов проводили либо с c208F2, либо с hz208F2-4, связанными с G-13, в моделях ксенотрансплантатов MCF-7, как описано ранее (Фиг. 33А и 33Б соответственно). Мышам в.б. инъецировали 3 мг/кг каждого ADC каждые четверо суток для 4 инъекций (Q4d4) или только один раз.
Наблюдали одинаковую сильную противоопухолевую активность при инъекции ADC четыре раза или только один раз в модели ксенотрансплантатов MCF-7.
+
Пример 23: активность in vivo антитела 208F2, конъюгированного с соединниями G-13 или Е-13 в модели ксенотрансплантатов 2 CaOV-3
+
6
3
Противоопухолевую активность также исследовали в опухоли, экспрессирующей 2 - модели ксенотрансплантата CaOV-3, которая представляет собой линию клеток карциномы яичника. С этой целью мышам подкожно инъецировали 7×10 клеток в D0. При достижении опухолями приблизительно 120 мм (19 суток после инъекции опухолевых клеток) животных делили на 5 групп по 5 мышей со сравнимым размером опухоли и внутрибрюшинно обрабатывали c208F2, связанным либо с Е-13, либо с G-13, и нерелевантным антителом c9G4, связанным либо с Е-13, либо с G-13. Мышам в.б. инъецировали 3 мг/кг каждого ADC в течение 6 циклов инъекций - одну инъекцию каждые четверо суток. Мышей отслеживали для наблюдения скорости роста ксенотрансплантата. Объем опухоли рассчитывается по формуле: π/6 × длина × ширина × высота.
По сравнению с c9G4-E-13, которое индуцировало умеренное и кратковременное замедление роста, инъекция c9G4-G-13 не влияла на рост ксенотрансплантатов опухолей CaOV-3. Тем временем инъекции либо c208F2-E-13, либо c208F2-G-13 индуцировали, соответственно, 95%-ное и 77%-ное ингибирование роста опухоли в сутки 50 (Фиг. 34А и 34Б).
Пример 24: оценка конкуренции за связывание между первым (810D12 или 816С12) и вторым (208F2) антителами против IGF-1R
Целью данного эксперимента является определение того, связываются ли оба мышиных моноклональных антитела m810D12 и m816C12 с областью растворимой формы h-IGF1R, расположенной вне и на расстоянии от сайта связывания гуманизированного антитела 208F2 (вариант Hz208F2-4).
Данный эксперимент проводили на приборе Biacore Х100 на основе технологии поверхностного плазмонного резонанса. Сенсорный чип СМ5 активировали мышиным моноклональным антителом IgG1 против полигистидина, химически связанным с карбоксиметилдекстрановой матрицей с использованием химии аминного связывания. Типично 12451 RU и 12257 RU антител прививали на проточную ячейку 1 (FC1) и проточную ячейку 2 (FC2) соответственно. Классический буфер HBS-EP+ использовали в качестве подвижного буфера. Данный буфер также использовали для приготовления растворов белков. Эксперимент проводили при 25°C и при скорости тока 10 мкл/мин.
Растворимая форма IGF-1R, полученная самими авторами изобретения, представляет собой гетеротетрамер, составленный двумя альфа-цепями и двумя внеклеточными доменами бета-цепей, завершающихся последовательностью из 6 гистидинов на их С-конце. Данный белок инъецируется на протяжении одной минуты на FC2 в концентрации 30 мкг/мл (примерно 80 нМ). Антитела инъецируются в концентрации 50 мкг/мл (примерно 330 нМ). На обоих проточных ячейках на протяжении 90 с инъецируется либо раствор первого антитела (Фиг. 35Б и 35Г), либо подвижный буфер (Фиг. 35А и 35В). Затем на обе проточные ячейки инъецируется раствор второго антитела. Отсутствие связывания второго антитела после связывания первого антитела является доказательством того, что оба антитела связываются с ближележащими сайтами на антигене (Фиг. 35Б). Напротив, связывание второго антитела после связывания первого антитела является доказательством того, что сайт связывания второго антитела находится вне и на расстоянии от сайта связывания первого антитела (Фиг. 35Г). В конце каждого цикла поверхность сенсорного чипа регенерируют инъекцией 10 мМ буфера глицин-HCl, pH 1,5, на протяжении 30 с.
Уровни связывания Ас2 (стрелки) без (Фиг. 35А и 35Б) или с Ac1 (Фиг. 35В и 35Г) записывали через 20 с после завершения инъецирования. Данные представлены на гистограмме на Фиг. 36.
При использовании в качестве Ас1 Hz208F2-4 полностью блокирует собственное связывание, но практически не имеет влияния на связывание обоих мышиных моноклональных антител (m810D12 и m816C12) при использовании трех данных антител в качестве Ac2.
Заключение: сайты связывания каждого мышиного моноклонального антитела m810D12 и m816C12 находятся вне и достаточно далеко от сайта связывания антитела Hz208F2-4 для обеспечения связывания каждого мышиного моноклонального антитела на h-IGF-1R, связанном с антителом Hz208F2-4.
+
Пример 25: активность in vivo антитела 208F2. конъюгированного с соединениями G-13, в модели ксенотрансплантата 2 NCl-H2122
+
6
3
Противоопухолевую активность также исследовали во второй опухоли, экспрессирующей 2 - модели ксенотрансплантата NCl-H2122, которая представляет собой линию клеток немелкоклеточного рака легкого. С этой целью мышам подкожно инъецировали 7×10 клеток в D0. При достижении опухолями примерно 170 мм (через 13 суток после инъекции опухолевых клеток) животных делили на 3 группы из 6 мышей с сопоставимым размером опухоли и внутрибрюшинно обрабатывали 208F2, связанным с G-13. Мышам в.б. инъецировали 5 или 10 мг/кг ADC в течение 4 циклов инъекции: по одной инъекции каждые семь суток. Мышей отслеживали для наблюдения скорости роста ксенотрансплантатов. Объем опухоли рассчитывали по формуле: π/6 × длина × ширина × высота.
Инъекции 208F2-G-13 индуцировали стагнацию роста опухоли на протяжении более чем 30 суток (Фиг. 37).
+
Пример 26: активность in vivo и анализ ex vivo антитела hz208F2, конъюгированного с соединением G-13, в модели ксенотрансплантата 3 MCF-7 (пролиферация и коммитирование в отношении мишени с использованием либо m810D12, либо m816C12)
Гуманизированные формы 208F2, связанные с соединением G-13, оценивали in vivo в модели ксенотрансплантатов MCF-7 для подтверждения его активности и коммитирования в отношении мишени.
Все процедуры на животных поводили согласно руководствам 2010/63/UE Директивы по защите животных, используемых в научных целях. Протокол был одобрен комитетом по этике обращения с животными Института Пьера Фабра. Пять миллионов клеток MCF-7 подкожно инъецировали 7-недельным швейцарским/голым мышам. Перед инъекцией клеток в левый бок мышей имплантировали эстрогеновые пеллеты (Innovative Research of America) для того, чтобы высвобождать эстрогены, необходимые для роста опухолей MCF-7 in vivo.
3
Через двадцать суток после имплантации клеток MCF-7, при достижении опухолями среднего размера 120-150 мм, животных делили на i) 2 группы из 6 мышей согласно размеру и соотношению измерений опухоли для отслеживания противоопухолевой активности и ii) 15 групп из 3 мышей для IHC исследований (1 группа для Т0 и 2×7 групп для контроля и 208F2-G-13). Разные обработки инокулировали посредством внутрибрюшинных инъекций в виде одного протокола инъекции: 3 мг/кг 208F2-G-13. Состояние здоровья животных отслеживали ежесуточно. Объем опухоли измеряли дважды в неделю электронным штангенциркулем до завершения исследования. Объем опухоли рассчитывается с использованием следующей формулы: π/6 × длина × ширина × высота. Токсичность оценивали, отслеживая массу животных три раза в неделю. Статистические анализы проводили при каждом измерении с использованием критерия Манна-Уитни. Удаление опухоли для IHC анализа проводили в Т0 (соответствующее суткам рандомизации, перед инъекциями соединения), затем 3 опухоли из каждой партии - 208F2-G-13 и контроля - удаляли в 6 ч, 4 суток, 7 суток, 14 суток и 26 суток после инъекции. Опухоли фиксировали в формалине и заливали в парафин, затем окрашивали с использованием антитела против Ki67 для отслеживания пролиферации и антител m810D12 или m816C12 для отслеживания экспрессии IGF-1R.
Экспрессию IGF-1R и Ki67 в контрольной группе подтверждали от Т0 до 14 суток после рандомизации для подтверждаения влияния роста опухоли либо на экспрессию IGF-1R, либо на пролиферацию. Каким бы ни было время тестирования, уровни окрашивания на IGF-1R и Ki67 в опухоли оставались стабильными (Фиг. 38). IGF-1R давали бальную оценку 3+ с суток Т0 до 14 суток после рандомизации и пролиферативный индекс (Ki67) больше 80%.
Затем опухоли анализировали после одной инъекции 208F2-G-13 (Фиг. 39). Ингибирование роста опухолей, наблюдаемое у мышей, сопровождалось сильным уеньшением экспрессии Ki67 в опухоли: от 83% в Т0 до 13% через 26 суток после одной инъекции (Фиг. 39, панель А). Экспрессию IGF-1R отслеживали через 26 суток после одной инъекции 208F2-G-13 с использованием либо m816C12, либо m810D12 (Фиг. 39Б). Через 4 суток и до суток 26 уровень IGF-1R в опухоли кардинально снижается, что i) ухудшает коммитирование в отношении мишени после 208F2-G-13 и ii) способность m816C12 и m810D12 отслеживать активность 208F2-G-13.
Пример 27: исследование распространения IGF-1R с использованием m810D12 и m816C12
Распространение IGF-1R при человеческом раковом заболевании с использованием либо m810D12, либо m816C12 исследовали на опухолевом микрочипе (ТМА) от Superbiochips. Предметные стекла окрашивали, как описано ранее, и центральные зоны анализировали на экспрессию мембранного IGF-1R с использованием алгоритма Roche Ventana (Таблица 18). IGF-1R не был выявлен на нормальных тканях (молочной железы и легкого), тогда как высокие уровни (3+) IGF-1R были обнаружены в 60% раковых заболеваний молочной железы, в более чем 50% плоскоклеточных карцином легкого и в 30% карцином головы и шеи (гортани, плоскоклеточная карцинома).
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  ПЬЕР ФАБР МЕДИКАМЕНТ
<120>  КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАКА, ЭКСПРЕССИРУЮЩЕГО IGF-1R
<130>  D35463
<140> PCT/EP2016/075858
<141> 2016-10-26
<150>  EP 15306707.9
<151>  2015-10-26
<160>  95
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  8
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  810D12 I-4893, тяжелая цепь, CDR-H1
<400>  1
Gly His Thr Phe Thr Ser Tyr Met
1               5
<210>  2
<211>  8
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  810D12 I-4893, тяжелая цепь, CDR-H2
<400>  2
Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Val Thr
1               5
<210>  3
<211>  14
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  810D12 I-4893, тяжелая цепь, CDR-H3
<400>  3
Val Thr Thr Ala Tyr Tyr Gly Asn Gly Arg Tyr Phe Asp Val
1               5                   10
<210>  4
<211>  6
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  810D12 I-4893, легкая цепь, CDR-L1
<400>  4
Gln Asp Ile Thr Asn Tyr
1               5
<210>  5
<211>  3
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  810D12 I-4893, легкая цепь, CDR-L2
<400>  5
Tyr Thr Ser
1
<210>  6
<211>  9
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  810D12 I-4893, легкая цепь, CDR-L3
<400>  6
Gln Gln Gly Tyr Ser Leu Pro Trp Thr
1               5
<210>  7
<211>  121
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  810D12 I-4893, тяжелая цепь, вариабельный домен
<400>  7
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly His Thr Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Met Leu His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Leu
35                  40                  45
Gly Phe Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Val Thr Lys Tyr Asn Glu Asn Phe
50                  55                  60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Val Thr Thr Ala Tyr Tyr Gly Asn Gly Arg Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100                 105                 110
Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  8
<211>  107
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  810D12 I-4893, легкая цепь,  вариабельный домен
<400>  8
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Thr Asn Tyr
20                  25                  30
Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Val Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Asn Asn Leu Glu Gln
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Tyr Ser Leu Pro Trp
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105
<210>  9
<211>  363
<212>  ДНК
<213>  искусственная
<220>
<223>  810D12 I-4893, тяжелая цепь, вариабельный домен
<400>  9
gaggtccagc tgcagcagtc tggacctgaa ctggtaaagc ctggggcttc agtgaagatg       60
tcctgcaagg cttctggaca cacattcact agctatatgc tgcactgggt gaagcagaag      120
cctgggcagg gccttgagtg gcttggattt attaatcctt acaatgatgt tactaagtac      180
aatgagaact tcaaaggcaa ggccacactg acttcagaca aatcctccag cacagcctac      240
atggagctca acagcctgac ctctgaggac tctgcggtct atttctgtgt aactaccgcc      300
tactatggta acggccggta cttcgatgtc tggggcgcag ggaccacggt caccgtctcc      360
tca                                                                    363
<210>  10
<211>  321
<212>  ДНК
<213>  искусственная
<220>
<223>  810D12 I-4893, легкая цепь,  вариабельный домен
<400>  10
gatatccaga tgacacagac tacatcttcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc       60
atcagttgca gggcaagtca ggacattacc aattatttaa cctggtatca gcagaaacca      120
gatggaactg ttaaagttct gatctactac acatcaagat tatactcagg agtcccatca      180
aggttcagtg gcagtgggtc tggatcagat tattctctca ccattaacaa cctggagcaa      240
gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggttattcgc ttccgtggac gttcggtgga      300
ggcaccaagc tggaaatcaa a                                                321
<210>  11
<211>  8
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  816C12 I-4894, тяжелая цепь, CDR-H1
<400>  11
Gly His Thr Phe Thr Ser Tyr Val
1               5
<210>  12
<211>  8
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  816C12 I-4894, тяжелая цепь, CDR-H2
<400>  12
Ile Asn Pro His Asn Asp Val Thr
1               5
<210>  13
<211>  14
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  816C12 I-4894, тяжелая цепь, CDR-H3
<400>  13
Val Ser Thr Ala Tyr Tyr Gly Asn Gly Arg Tyr Phe Asp Val
1               5                   10
<210>  14
<211>  6
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  816C12 I-4894, легкая цепь, CDR-L1
<400>  14
Gln Asp Ile Asn Asn Tyr
1               5
<210>  15
<211>  3
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  816C12 I-4894, легкая цепь, CDR-L2
<400>  15
Tyr Thr Ser
1
<210>  16
<211>  9
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  816C12 I-4894, легкая цепь, CDR-L3
<400>  16
Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr
1               5
<210>  17
<211>  121
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  816C12 I-4894, тяжелая цепь, вариабельный домен
<400>  17
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly His Thr Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Val Leu His Trp Met Lys Arg Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Tyr Ile Asn Pro His Asn Asp Val Thr Lys Tyr Asn Glu Asn Phe
50                  55                  60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Tyr Ser Ser Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Val Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Val Ser Thr Ala Tyr Tyr Gly Asn Gly Arg Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100                 105                 110
Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  18
<211>  107
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  816C12 I-4894, легкая цепь,  вариабельный домен
<400>  18
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105
<210>  19
<211>  363
<212>  ДНК
<213>  искусственная
<220>
<223>  816C12 I-4894, тяжелая цепь, вариабельный домен
<400>  19
gaggtccagc tgcagcagtc tggacctgag ctggtaaagc ctggggcttc agtgaagatg       60
tcctgcaagg cttctggaca cacattcact agctatgttt tgcactggat gaagcggaag      120
cctgggcagg gccttgagtg gattggatat attaatcctc acaatgatgt tactaagtac      180
aatgagaatt tcaaaggcaa ggccacactg acttcagaca aatactccag cacagtctac      240
atggaggtca gcagcctgac ctctgaggac tctgcggtgt attactgtgt aagtaccgcc      300
tactatggta acggccggta cttcgatgtc tggggcgcag ggaccacggt caccgtctcc      360
tca                                                                    363
<210>  20
<211>  321
<212>  ДНК
<213>  искусственная
<220>
<223>  816C12 I-4894, легкая цепь,  вариабельный домен
<400>  20
gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc       60
atcagttgca gggcaagtca ggacattaac aattatttaa actggtatca gcagaaacca      120
gatggaactg ttaaactcct gatctactac acatcaagat tacactcagg agtctcatca      180
aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa      240
gaagatattg ccacttattt ttgccaacag ggtaatacgc ttccgtggac gttcggtgga      300
ggcaccaagc tggaaatcaa a                                                321
<210>  21
<211>  8
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  Консенсусная, тяжелая цепь, CDR-H1
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (3)..(3)
<223>  Thr может быть заменен на Ser
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (8)..(8)
<223>  Tyr может быть заменен на Phe
<400>  21
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr
1               5
<210>  22
<211>  8
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  Консенсусная, тяжелая цепь, CDR-H2
<400>  22
Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr
1               5
<210>  23
<211>  13
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  Консенсусная, тяжелая цепь, CDR-H3
<400>  23
Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr
1               5                   10
<210>  24
<211>  6
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  Консенсусная, легкая цепь, CDR-L1
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (4)..(4)
<223>  Ser может быть заменен на Asn
<400>  24
Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
1               5
<210>  25
<211>  3
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  Консенсусная, легкая цепь, CDR-L2
<400>  25
Tyr Thr Ser
1
<210>  26
<211>  9
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  Консенсусная, легкая цепь, CDR-L3
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (5)..(5)
<223>  Thr может быть заменен на Ala
<400>  26
Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Tyr Thr
1               5
<210>  27
<211>  8
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  тяжелая цепь, CDR-H1
<400>  27
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr
1               5
<210>  28
<211>  8
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  тяжелая цепь, CDR-H1
<400>  28
Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Phe
1               5
<210>  29
<211>  6
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  легкая цепь, CDR-L1
<400>  29
Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
1               5
<210>  30
<211>  6
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  легкая цепь, CDR-L1
<400>  30
Gln Asp Ile Asn Lys Tyr
1               5
<210>  31
<211>  9
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  легкая цепь, CDR-L3
<400>  31
Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Tyr Thr
1               5
<210>  32
<211>  9
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  легкая цепь, CDR-L3
<400>  32
Gln Gln Gly Ser Ala Leu Pro Tyr Thr
1               5
<210>  33
<211>  120
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  hz208F2 тяжелая цепь H037, VH
<400>  33
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  34
<211>  107
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  hz208F2 легкая цепь L018, VL
<400>  34
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Arg Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Tyr
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  35
<211>  449
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  hz208F2 тяжелая цепь H037, полноразмерная
<400>  35
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115                 120                 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130                 135                 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145                 150                 155                 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165                 170                 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180                 185                 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195                 200                 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210                 215                 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225                 230                 235                 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245                 250                 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260                 265                 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275                 280                 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290                 295                 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305                 310                 315                 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325                 330                 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340                 345                 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355                 360                 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370                 375                 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385                 390                 395                 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405                 410                 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420                 425                 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435                 440                 445
Gly
<210>  36
<211>  214
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  hz208F2 легкая цепь L018, полноразмерная
<400>  36
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Arg Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Tyr
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210>  37
<211>  107
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  hz208F2 легкая цепь L021, VL
<400>  37
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Tyr
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  38
<211>  214
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  hz208F2 легкая цепь L021, полноразмерная
<400>  38
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Tyr
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210>  39
<211>  120
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  hz208F2 тяжелая цепь H047, VH
<400>  39
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ser Asn Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  40
<211>  449
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  hz208F2 тяжелая цепь H047, полноразмерная
<400>  40
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ser Asn Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115                 120                 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130                 135                 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145                 150                 155                 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165                 170                 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180                 185                 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195                 200                 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210                 215                 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225                 230                 235                 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245                 250                 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260                 265                 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275                 280                 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290                 295                 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305                 310                 315                 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325                 330                 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340                 345                 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355                 360                 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370                 375                 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385                 390                 395                 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405                 410                 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420                 425                 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435                 440                 445
Gly
<210>  41
<211>  120
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  hz208F2 тяжелая цепь H049, VH
<400>  41
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  42
<211>  449
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  hz208F2 тяжелая цепь H049, полноразмерная
<400>  42
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115                 120                 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130                 135                 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145                 150                 155                 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165                 170                 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180                 185                 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195                 200                 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210                 215                 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225                 230                 235                 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245                 250                 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260                 265                 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275                 280                 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290                 295                 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305                 310                 315                 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325                 330                 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340                 345                 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355                 360                 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370                 375                 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385                 390                 395                 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405                 410                 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420                 425                 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435                 440                 445
Gly
<210>  43
<211>  120
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  hz208F2 тяжелая цепь H051, VH
<400>  43
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ser Asn Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  44
<211>  449
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  hz208F2 тяжелая цепь H051, полноразмерная
<400>  44
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ser Asn Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115                 120                 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130                 135                 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145                 150                 155                 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165                 170                 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180                 185                 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195                 200                 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210                 215                 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225                 230                 235                 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245                 250                 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260                 265                 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275                 280                 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290                 295                 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305                 310                 315                 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325                 330                 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340                 345                 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355                 360                 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370                 375                 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385                 390                 395                 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405                 410                 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420                 425                 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435                 440                 445
Gly
<210>  45
<211>  120
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  hz208F2 тяжелая цепь H052, VH
<400>  45
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  46
<211>  449
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  hz208F2 тяжелая цепь H052, полноразмерная
<400>  46
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115                 120                 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130                 135                 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145                 150                 155                 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165                 170                 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180                 185                 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195                 200                 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210                 215                 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225                 230                 235                 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245                 250                 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260                 265                 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275                 280                 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290                 295                 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305                 310                 315                 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325                 330                 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340                 345                 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355                 360                 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370                 375                 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385                 390                 395                 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405                 410                 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420                 425                 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435                 440                 445
Gly
<210>  47
<211>  120
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  hz208F2 тяжелая цепь H057, VH
<400>  47
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Lys Ser Thr Asn Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  48
<211>  449
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  hz208F2 тяжелая цепь H057, полноразмерная
<400>  48
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Lys Ser Thr Asn Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115                 120                 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130                 135                 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145                 150                 155                 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165                 170                 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180                 185                 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195                 200                 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210                 215                 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225                 230                 235                 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245                 250                 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260                 265                 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275                 280                 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290                 295                 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305                 310                 315                 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325                 330                 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340                 345                 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355                 360                 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370                 375                 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385                 390                 395                 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405                 410                 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420                 425                 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435                 440                 445
Gly
<210>  49
<211>  120
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  hz208F2 тяжелая цепь H068, VH
<400>  49
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Asn Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  50
<211>  449
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  hz208F2 тяжелая цепь H068, полноразмерная
<400>  50
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Asn Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115                 120                 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130                 135                 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145                 150                 155                 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165                 170                 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180                 185                 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195                 200                 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210                 215                 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225                 230                 235                 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245                 250                 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260                 265                 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275                 280                 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290                 295                 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305                 310                 315                 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325                 330                 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340                 345                 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355                 360                 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370                 375                 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385                 390                 395                 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405                 410                 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420                 425                 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435                 440                 445
Gly
<210>  51
<211>  120
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  hz208F2 тяжелая цепь H070, VH
<400>  51
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  52
<211>  449
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  hz208F2 тяжелая цепь H070, полноразмерная
<400>  52
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115                 120                 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130                 135                 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145                 150                 155                 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165                 170                 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180                 185                 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195                 200                 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210                 215                 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225                 230                 235                 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245                 250                 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260                 265                 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275                 280                 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290                 295                 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305                 310                 315                 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325                 330                 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340                 345                 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355                 360                 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370                 375                 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385                 390                 395                 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405                 410                 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420                 425                 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435                 440                 445
Gly
<210>  53
<211>  120
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  hz208F2 тяжелая цепь H071, VH
<400>  53
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Asn Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  54
<211>  449
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  hz208F2 тяжелая цепь H071, полноразмерная
<400>  54
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Asn Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115                 120                 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130                 135                 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145                 150                 155                 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165                 170                 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180                 185                 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195                 200                 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210                 215                 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225                 230                 235                 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245                 250                 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260                 265                 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275                 280                 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290                 295                 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305                 310                 315                 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325                 330                 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340                 345                 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355                 360                 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370                 375                 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385                 390                 395                 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405                 410                 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420                 425                 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435                 440                 445
Gly
<210>  55
<211>  120
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  hz208F2 тяжелая цепь H076, VH
<400>  55
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  56
<211>  449
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  hz208F2 тяжелая цепь H076, полноразмерная
<400>  56
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115                 120                 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130                 135                 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145                 150                 155                 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165                 170                 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180                 185                 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195                 200                 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210                 215                 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225                 230                 235                 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245                 250                 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260                 265                 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275                 280                 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290                 295                 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305                 310                 315                 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325                 330                 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340                 345                 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355                 360                 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370                 375                 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385                 390                 395                 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405                 410                 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420                 425                 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435                 440                 445
Gly
<210>  57
<211>  120
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  hz208F2 тяжелая цепь H077, VH
<400>  57
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  58
<211>  449
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  hz208F2 тяжелая цепь H077, полноразмерная
<400>  58
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115                 120                 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130                 135                 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145                 150                 155                 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165                 170                 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180                 185                 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195                 200                 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210                 215                 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225                 230                 235                 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245                 250                 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260                 265                 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275                 280                 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290                 295                 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305                 310                 315                 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325                 330                 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340                 345                 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355                 360                 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370                 375                 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385                 390                 395                 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405                 410                 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420                 425                 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435                 440                 445
Gly
<210>  59
<211>  120
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  hz208F2 тяжелая цепь H026, VH
<400>  59
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Tyr Ile Tyr Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Leu
35                  40                  45
Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Phe Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  60
<211>  107
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  hz208F2 легкая цепь L024, VL
<400>  60
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Arg Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Tyr
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  61
<211>  449
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  hz208F2 тяжелая цепь H026, полноразмерная
<400>  61
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Tyr Ile Tyr Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Leu
35                  40                  45
Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Phe Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115                 120                 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130                 135                 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145                 150                 155                 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165                 170                 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180                 185                 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195                 200                 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210                 215                 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225                 230                 235                 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245                 250                 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260                 265                 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275                 280                 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290                 295                 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305                 310                 315                 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325                 330                 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340                 345                 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355                 360                 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370                 375                 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385                 390                 395                 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405                 410                 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420                 425                 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435                 440                 445
Gly
<210>  62
<211>  214
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  hz208F2 легкая цепь L024, полноразмерная
<400>  62
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Arg Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Tyr
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210>  63
<211>  120
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  c208F2 тяжелая цепь, VH
<400>  63
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Tyr Ile Tyr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Leu
35                  40                  45
Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50                  55                  60
Lys Asp Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Phe Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  64
<211>  120
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  c212A11 тяжелая цепь, VH
<400>  64
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50                  55                  60
Lys Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Phe Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  65
<211>  120
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  c214F8 тяжелая цепь, VH
<400>  65
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ser Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Arg Phe
50                  55                  60
Lys Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Phe Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  66
<211>  120
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  c219D6 тяжелая цепь, VH
<400>  66
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Asp
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Phe Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50                  55                  60
Lys Gly Lys Thr Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Phe Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  67
<211>  120
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  c213B10 тяжелая цепь, VH
<400>  67
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ser Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Arg Phe
50                  55                  60
Lys Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Phe Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  68
<211>  107
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  c208F2 легкая цепь, VL
<400>  68
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Asp Gly Thr Ile Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Arg Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Val Glu Gln
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Tyr
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105
<210>  69
<211>  107
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  c212A11 легкая цепь, VL
<400>  69
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Arg Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Tyr
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105
<210>  70
<211>  107
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  c214F8 легкая цепь, VL
<400>  70
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Asp Gly Thr Ile Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Arg Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Thr Asn Leu Glu Gln
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ser Ala Leu Pro Tyr
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105
<210>  71
<211>  107
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  c219D6 легкая цепь, VL
<400>  71
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Arg Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Tyr
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105
<210>  72
<211>  107
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  c213B10 легкая цепь, VL
<400>  72
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Asp Gly Thr Ile Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Arg Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Thr Asn Leu Glu Gln
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ser Ala Leu Pro Tyr
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105
<210>  73
<211>  449
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  c208F2 тяжелая цепь, полноразмерная
<400>  73
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Tyr Ile Tyr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Leu
35                  40                  45
Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50                  55                  60
Lys Asp Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Phe Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115                 120                 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130                 135                 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145                 150                 155                 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165                 170                 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180                 185                 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195                 200                 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210                 215                 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225                 230                 235                 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245                 250                 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260                 265                 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275                 280                 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290                 295                 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305                 310                 315                 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325                 330                 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340                 345                 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355                 360                 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370                 375                 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385                 390                 395                 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405                 410                 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420                 425                 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435                 440                 445
Gly
<210>  74
<211>  449
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  c212A11 тяжелая цепь, полноразмерная
<400>  74
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50                  55                  60
Lys Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Phe Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115                 120                 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130                 135                 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145                 150                 155                 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165                 170                 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180                 185                 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195                 200                 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210                 215                 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225                 230                 235                 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245                 250                 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260                 265                 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275                 280                 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290                 295                 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305                 310                 315                 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325                 330                 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340                 345                 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355                 360                 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370                 375                 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385                 390                 395                 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405                 410                 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420                 425                 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435                 440                 445
Gly
<210>  75
<211>  449
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  c214F8 тяжелая цепь, полноразмерная
<400>  75
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ser Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Arg Phe
50                  55                  60
Lys Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Phe Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115                 120                 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130                 135                 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145                 150                 155                 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165                 170                 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180                 185                 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195                 200                 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210                 215                 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225                 230                 235                 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245                 250                 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260                 265                 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275                 280                 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290                 295                 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305                 310                 315                 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325                 330                 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340                 345                 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355                 360                 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370                 375                 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385                 390                 395                 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405                 410                 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420                 425                 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435                 440                 445
Gly
<210>  76
<211>  449
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  c219D6 тяжелая цепь, полноразмерная
<400>  76
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Asp
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Phe Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50                  55                  60
Lys Gly Lys Thr Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Phe Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115                 120                 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130                 135                 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145                 150                 155                 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165                 170                 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180                 185                 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195                 200                 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210                 215                 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225                 230                 235                 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245                 250                 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260                 265                 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275                 280                 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290                 295                 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305                 310                 315                 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325                 330                 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340                 345                 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355                 360                 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370                 375                 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385                 390                 395                 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405                 410                 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420                 425                 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435                 440                 445
Gly
<210>  77
<211>  449
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  c213B10 тяжелая цепь, полноразмерная
<400>  77
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ser Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Trp Ile Trp Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Arg Phe
50                  55                  60
Lys Gly Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Phe Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Ala Ser Pro Met Ile Thr Pro Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115                 120                 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130                 135                 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145                 150                 155                 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165                 170                 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180                 185                 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195                 200                 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210                 215                 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225                 230                 235                 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245                 250                 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260                 265                 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275                 280                 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290                 295                 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305                 310                 315                 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325                 330                 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340                 345                 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355                 360                 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370                 375                 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385                 390                 395                 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405                 410                 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420                 425                 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435                 440                 445
Gly
<210>  78
<211>  214
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  c208F2 легкая цепь, полноразмерная
<400>  78
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Asp Gly Thr Ile Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Arg Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Val Glu Gln
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Tyr
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210>  79
<211>  214
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  c212A11 легкая цепь, полноразмерная
<400>  79
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Arg Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Tyr
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210>  80
<211>  214
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  c214F8 легкая цепь, полноразмерная
<400>  80
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Asp Gly Thr Ile Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Arg Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Thr Asn Leu Glu Gln
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ser Ala Leu Pro Tyr
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210>  81
<211>  214
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  c219D6 легкая цепь, полноразмерная
<400>  81
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Arg Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Tyr
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210>  82
<211>  214
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  c213B10 легкая цепь, полноразмерная
<400>  82
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Asp Gly Thr Ile Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Arg Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Thr Asn Leu Glu Gln
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ser Ala Leu Pro Tyr
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210>  83
<211>  329
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  константный домен (VH) IgG1
<400>  83
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85                  90                  95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100                 105                 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115                 120                 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130                 135                 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145                 150                 155                 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165                 170                 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180                 185                 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195                 200                 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210                 215                 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225                 230                 235                 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245                 250                 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260                 265                 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275                 280                 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290                 295                 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305                 310                 315                 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210>  84
<211>  326
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  константный домен (VH) IgG4 (S228P)
<400>  84
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85                  90                  95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100                 105                 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115                 120                 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130                 135                 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145                 150                 155                 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165                 170                 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180                 185                 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195                 200                 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210                 215                 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225                 230                 235                 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245                 250                 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260                 265                 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275                 280                 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290                 295                 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305                 310                 315                 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly
325
<210>  85
<211>  107
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  Домен каппа (VL)
<400>  85
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1               5                   10                  15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20                  25                  30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35                  40                  45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50                  55                  60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65                  70                  75                  80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85                  90                  95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100                 105
<210>  86
<211>  98
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  человеческая зародышевая линия IGHV1-46*01
<400>  86
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg
<210>  87
<211>  95
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  человеческая зародышевая линия IGKV1-39*01
<400>  87
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro
85                  90                  95
<210>  88
<211>  15
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  человеческая зародышевая линия IGHJ4*01
<400>  88
Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1               5                   10                  15
<210>  89
<211>  12
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  человеческая зародышевая линия IGKJ4*01
<400>  89
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1               5                   10
<210>  90
<211>  1367
<212>  ПРТ
<213>  Homo sapiens
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<223>  IGF-1R
<400>  90
Met Lys Ser Gly Ser Gly Gly Gly Ser Pro Thr Ser Leu Trp Gly Leu
1               5                   10                  15
Leu Phe Leu Ser Ala Ala Leu Ser Leu Trp Pro Thr Ser Gly Glu Ile
20                  25                  30
Cys Gly Pro Gly Ile Asp Ile Arg Asn Asp Tyr Gln Gln Leu Lys Arg
35                  40                  45
Leu Glu Asn Cys Thr Val Ile Glu Gly Tyr Leu His Ile Leu Leu Ile
50                  55                  60
Ser Lys Ala Glu Asp Tyr Arg Ser Tyr Arg Phe Pro Lys Leu Thr Val
65                  70                  75                  80
Ile Thr Glu Tyr Leu Leu Leu Phe Arg Val Ala Gly Leu Glu Ser Leu
85                  90                  95
Gly Asp Leu Phe Pro Asn Leu Thr Val Ile Arg Gly Trp Lys Leu Phe
100                 105                 110
Tyr Asn Tyr Ala Leu Val Ile Phe Glu Met Thr Asn Leu Lys Asp Ile
115                 120                 125
Gly Leu Tyr Asn Leu Arg Asn Ile Thr Arg Gly Ala Ile Arg Ile Glu
130                 135                 140
Lys Asn Ala Asp Leu Cys Tyr Leu Ser Thr Val Asp Trp Ser Leu Ile
145                 150                 155                 160
Leu Asp Ala Val Ser Asn Asn Tyr Ile Val Gly Asn Lys Pro Pro Lys
165                 170                 175
Glu Cys Gly Asp Leu Cys Pro Gly Thr Met Glu Glu Lys Pro Met Cys
180                 185                 190
Glu Lys Thr Thr Ile Asn Asn Glu Tyr Asn Tyr Arg Cys Trp Thr Thr
195                 200                 205
Asn Arg Cys Gln Lys Met Cys Pro Ser Thr Cys Gly Lys Arg Ala Cys
210                 215                 220
Thr Glu Asn Asn Glu Cys Cys His Pro Glu Cys Leu Gly Ser Cys Ser
225                 230                 235                 240
Ala Pro Asp Asn Asp Thr Ala Cys Val Ala Cys Arg His Tyr Tyr Tyr
245                 250                 255
Ala Gly Val Cys Val Pro Ala Cys Pro Pro Asn Thr Tyr Arg Phe Glu
260                 265                 270
Gly Trp Arg Cys Val Asp Arg Asp Phe Cys Ala Asn Ile Leu Ser Ala
275                 280                 285
Glu Ser Ser Asp Ser Glu Gly Phe Val Ile His Asp Gly Glu Cys Met
290                 295                 300
Gln Glu Cys Pro Ser Gly Phe Ile Arg Asn Gly Ser Gln Ser Met Tyr
305                 310                 315                 320
Cys Ile Pro Cys Glu Gly Pro Cys Pro Lys Val Cys Glu Glu Glu Lys
325                 330                 335
Lys Thr Lys Thr Ile Asp Ser Val Thr Ser Ala Gln Met Leu Gln Gly
340                 345                 350
Cys Thr Ile Phe Lys Gly Asn Leu Leu Ile Asn Ile Arg Arg Gly Asn
355                 360                 365
Asn Ile Ala Ser Glu Leu Glu Asn Phe Met Gly Leu Ile Glu Val Val
370                 375                 380
Thr Gly Tyr Val Lys Ile Arg His Ser His Ala Leu Val Ser Leu Ser
385                 390                 395                 400
Phe Leu Lys Asn Leu Arg Leu Ile Leu Gly Glu Glu Gln Leu Glu Gly
405                 410                 415
Asn Tyr Ser Phe Tyr Val Leu Asp Asn Gln Asn Leu Gln Gln Leu Trp
420                 425                 430
Asp Trp Asp His Arg Asn Leu Thr Ile Lys Ala Gly Lys Met Tyr Phe
435                 440                 445
Ala Phe Asn Pro Lys Leu Cys Val Ser Glu Ile Tyr Arg Met Glu Glu
450                 455                 460
Val Thr Gly Thr Lys Gly Arg Gln Ser Lys Gly Asp Ile Asn Thr Arg
465                 470                 475                 480
Asn Asn Gly Glu Arg Ala Ser Cys Glu Ser Asp Val Leu His Phe Thr
485                 490                 495
Ser Thr Thr Thr Ser Lys Asn Arg Ile Ile Ile Thr Trp His Arg Tyr
500                 505                 510
Arg Pro Pro Asp Tyr Arg Asp Leu Ile Ser Phe Thr Val Tyr Tyr Lys
515                 520                 525
Glu Ala Pro Phe Lys Asn Val Thr Glu Tyr Asp Gly Gln Asp Ala Cys
530                 535                 540
Gly Ser Asn Ser Trp Asn Met Val Asp Val Asp Leu Pro Pro Asn Lys
545                 550                 555                 560
Asp Val Glu Pro Gly Ile Leu Leu His Gly Leu Lys Pro Trp Thr Gln
565                 570                 575
Tyr Ala Val Tyr Val Lys Ala Val Thr Leu Thr Met Val Glu Asn Asp
580                 585                 590
His Ile Arg Gly Ala Lys Ser Glu Ile Leu Tyr Ile Arg Thr Asn Ala
595                 600                 605
Ser Val Pro Ser Ile Pro Leu Asp Val Leu Ser Ala Ser Asn Ser Ser
610                 615                 620
Ser Gln Leu Ile Val Lys Trp Asn Pro Pro Ser Leu Pro Asn Gly Asn
625                 630                 635                 640
Leu Ser Tyr Tyr Ile Val Arg Trp Gln Arg Gln Pro Gln Asp Gly Tyr
645                 650                 655
Leu Tyr Arg His Asn Tyr Cys Ser Lys Asp Lys Ile Pro Ile Arg Lys
660                 665                 670
Tyr Ala Asp Gly Thr Ile Asp Ile Glu Glu Val Thr Glu Asn Pro Lys
675                 680                 685
Thr Glu Val Cys Gly Gly Glu Lys Gly Pro Cys Cys Ala Cys Pro Lys
690                 695                 700
Thr Glu Ala Glu Lys Gln Ala Glu Lys Glu Glu Ala Glu Tyr Arg Lys
705                 710                 715                 720
Val Phe Glu Asn Phe Leu His Asn Ser Ile Phe Val Pro Arg Pro Glu
725                 730                 735
Arg Lys Arg Arg Asp Val Met Gln Val Ala Asn Thr Thr Met Ser Ser
740                 745                 750
Arg Ser Arg Asn Thr Thr Ala Ala Asp Thr Tyr Asn Ile Thr Asp Pro
755                 760                 765
Glu Glu Leu Glu Thr Glu Tyr Pro Phe Phe Glu Ser Arg Val Asp Asn
770                 775                 780
Lys Glu Arg Thr Val Ile Ser Asn Leu Arg Pro Phe Thr Leu Tyr Arg
785                 790                 795                 800
Ile Asp Ile His Ser Cys Asn His Glu Ala Glu Lys Leu Gly Cys Ser
805                 810                 815
Ala Ser Asn Phe Val Phe Ala Arg Thr Met Pro Ala Glu Gly Ala Asp
820                 825                 830
Asp Ile Pro Gly Pro Val Thr Trp Glu Pro Arg Pro Glu Asn Ser Ile
835                 840                 845
Phe Leu Lys Trp Pro Glu Pro Glu Asn Pro Asn Gly Leu Ile Leu Met
850                 855                 860
Tyr Glu Ile Lys Tyr Gly Ser Gln Val Glu Asp Gln Arg Glu Cys Val
865                 870                 875                 880
Ser Arg Gln Glu Tyr Arg Lys Tyr Gly Gly Ala Lys Leu Asn Arg Leu
885                 890                 895
Asn Pro Gly Asn Tyr Thr Ala Arg Ile Gln Ala Thr Ser Leu Ser Gly
900                 905                 910
Asn Gly Ser Trp Thr Asp Pro Val Phe Phe Tyr Val Gln Ala Lys Thr
915                 920                 925
Gly Tyr Glu Asn Phe Ile His Leu Ile Ile Ala Leu Pro Val Ala Val
930                 935                 940
Leu Leu Ile Val Gly Gly Leu Val Ile Met Leu Tyr Val Phe His Arg
945                 950                 955                 960
Lys Arg Asn Asn Ser Arg Leu Gly Asn Gly Val Leu Tyr Ala Ser Val
965                 970                 975
Asn Pro Glu Tyr Phe Ser Ala Ala Asp Val Tyr Val Pro Asp Glu Trp
980                 985                 990
Glu Val Ala Arg Glu Lys Ile Thr  Met Ser Arg Glu Leu  Gly Gln Gly
995                 1000                 1005
Ser Phe  Gly Met Val Tyr Glu  Gly Val Ala Lys Gly  Val Val Lys
1010                 1015                 1020
Asp Glu  Pro Glu Thr Arg Val  Ala Ile Lys Thr Val  Asn Glu Ala
1025                 1030                 1035
Ala Ser  Met Arg Glu Arg Ile  Glu Phe Leu Asn Glu  Ala Ser Val
1040                 1045                 1050
Met Lys  Glu Phe Asn Cys His  His Val Val Arg Leu  Leu Gly Val
1055                 1060                 1065
Val Ser  Gln Gly Gln Pro Thr  Leu Val Ile Met Glu  Leu Met Thr
1070                 1075                 1080
Arg Gly  Asp Leu Lys Ser Tyr  Leu Arg Ser Leu Arg  Pro Glu Met
1085                 1090                 1095
Glu Asn  Asn Pro Val Leu Ala  Pro Pro Ser Leu Ser  Lys Met Ile
1100                 1105                 1110
Gln Met  Ala Gly Glu Ile Ala  Asp Gly Met Ala Tyr  Leu Asn Ala
1115                 1120                 1125
Asn Lys  Phe Val His Arg Asp  Leu Ala Ala Arg Asn  Cys Met Val
1130                 1135                 1140
Ala Glu  Asp Phe Thr Val Lys  Ile Gly Asp Phe Gly  Met Thr Arg
1145                 1150                 1155
Asp Ile  Tyr Glu Thr Asp Tyr  Tyr Arg Lys Gly Gly  Lys Gly Leu
1160                 1165                 1170
Leu Pro  Val Arg Trp Met Ser  Pro Glu Ser Leu Lys  Asp Gly Val
1175                 1180                 1185
Phe Thr  Thr Tyr Ser Asp Val  Trp Ser Phe Gly Val  Val Leu Trp
1190                 1195                 1200
Glu Ile  Ala Thr Leu Ala Glu  Gln Pro Tyr Gln Gly  Leu Ser Asn
1205                 1210                 1215
Glu Gln  Val Leu Arg Phe Val  Met Glu Gly Gly Leu  Leu Asp Lys
1220                 1225                 1230
Pro Asp  Asn Cys Pro Asp Met  Leu Phe Glu Leu Met  Arg Met Cys
1235                 1240                 1245
Trp Gln  Tyr Asn Pro Lys Met  Arg Pro Ser Phe Leu  Glu Ile Ile
1250                 1255                 1260
Ser Ser  Ile Lys Glu Glu Met  Glu Pro Gly Phe Arg  Glu Val Ser
1265                 1270                 1275
Phe Tyr  Tyr Ser Glu Glu Asn  Lys Leu Pro Glu Pro  Glu Glu Leu
1280                 1285                 1290
Asp Leu  Glu Pro Glu Asn Met  Glu Ser Val Pro Leu  Asp Pro Ser
1295                 1300                 1305
Ala Ser  Ser Ser Ser Leu Pro  Leu Pro Asp Arg His  Ser Gly His
1310                 1315                 1320
Lys Ala  Glu Asn Gly Pro Gly  Pro Gly Val Leu Val  Leu Arg Ala
1325                 1330                 1335
Ser Phe  Asp Glu Arg Gln Pro  Tyr Ala His Met Asn  Gly Gly Arg
1340                 1345                 1350
Lys Asn  Glu Arg Ala Leu Pro  Leu Pro Gln Ser Ser  Thr Cys
1355                 1360                 1365
<210>  91
<211>  932
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  ECD IGF-1R
<400>  91
Met Lys Ser Gly Ser Gly Gly Gly Ser Pro Thr Ser Leu Trp Gly Leu
1               5                   10                  15
Leu Phe Leu Ser Ala Ala Leu Ser Leu Trp Pro Thr Ser Gly Glu Ile
20                  25                  30
Cys Gly Pro Gly Ile Asp Ile Arg Asn Asp Tyr Gln Gln Leu Lys Arg
35                  40                  45
Leu Glu Asn Cys Thr Val Ile Glu Gly Tyr Leu His Ile Leu Leu Ile
50                  55                  60
Ser Lys Ala Glu Asp Tyr Arg Ser Tyr Arg Phe Pro Lys Leu Thr Val
65                  70                  75                  80
Ile Thr Glu Tyr Leu Leu Leu Phe Arg Val Ala Gly Leu Glu Ser Leu
85                  90                  95
Gly Asp Leu Phe Pro Asn Leu Thr Val Ile Arg Gly Trp Lys Leu Phe
100                 105                 110
Tyr Asn Tyr Ala Leu Val Ile Phe Glu Met Thr Asn Leu Lys Asp Ile
115                 120                 125
Gly Leu Tyr Asn Leu Arg Asn Ile Thr Arg Gly Ala Ile Arg Ile Glu
130                 135                 140
Lys Asn Ala Asp Leu Cys Tyr Leu Ser Thr Val Asp Trp Ser Leu Ile
145                 150                 155                 160
Leu Asp Ala Val Ser Asn Asn Tyr Ile Val Gly Asn Lys Pro Pro Lys
165                 170                 175
Glu Cys Gly Asp Leu Cys Pro Gly Thr Met Glu Glu Lys Pro Met Cys
180                 185                 190
Glu Lys Thr Thr Ile Asn Asn Glu Tyr Asn Tyr Arg Cys Trp Thr Thr
195                 200                 205
Asn Arg Cys Gln Lys Met Cys Pro Ser Thr Cys Gly Lys Arg Ala Cys
210                 215                 220
Thr Glu Asn Asn Glu Cys Cys His Pro Glu Cys Leu Gly Ser Cys Ser
225                 230                 235                 240
Ala Pro Asp Asn Asp Thr Ala Cys Val Ala Cys Arg His Tyr Tyr Tyr
245                 250                 255
Ala Gly Val Cys Val Pro Ala Cys Pro Pro Asn Thr Tyr Arg Phe Glu
260                 265                 270
Gly Trp Arg Cys Val Asp Arg Asp Phe Cys Ala Asn Ile Leu Ser Ala
275                 280                 285
Glu Ser Ser Asp Ser Glu Gly Phe Val Ile His Asp Gly Glu Cys Met
290                 295                 300
Gln Glu Cys Pro Ser Gly Phe Ile Arg Asn Gly Ser Gln Ser Met Tyr
305                 310                 315                 320
Cys Ile Pro Cys Glu Gly Pro Cys Pro Lys Val Cys Glu Glu Glu Lys
325                 330                 335
Lys Thr Lys Thr Ile Asp Ser Val Thr Ser Ala Gln Met Leu Gln Gly
340                 345                 350
Cys Thr Ile Phe Lys Gly Asn Leu Leu Ile Asn Ile Arg Arg Gly Asn
355                 360                 365
Asn Ile Ala Ser Glu Leu Glu Asn Phe Met Gly Leu Ile Glu Val Val
370                 375                 380
Thr Gly Tyr Val Lys Ile Arg His Ser His Ala Leu Val Ser Leu Ser
385                 390                 395                 400
Phe Leu Lys Asn Leu Arg Leu Ile Leu Gly Glu Glu Gln Leu Glu Gly
405                 410                 415
Asn Tyr Ser Phe Tyr Val Leu Asp Asn Gln Asn Leu Gln Gln Leu Trp
420                 425                 430
Asp Trp Asp His Arg Asn Leu Thr Ile Lys Ala Gly Lys Met Tyr Phe
435                 440                 445
Ala Phe Asn Pro Lys Leu Cys Val Ser Glu Ile Tyr Arg Met Glu Glu
450                 455                 460
Val Thr Gly Thr Lys Gly Arg Gln Ser Lys Gly Asp Ile Asn Thr Arg
465                 470                 475                 480
Asn Asn Gly Glu Arg Ala Ser Cys Glu Ser Asp Val Leu His Phe Thr
485                 490                 495
Ser Thr Thr Thr Ser Lys Asn Arg Ile Ile Ile Thr Trp His Arg Tyr
500                 505                 510
Arg Pro Pro Asp Tyr Arg Asp Leu Ile Ser Phe Thr Val Tyr Tyr Lys
515                 520                 525
Glu Ala Pro Phe Lys Asn Val Thr Glu Tyr Asp Gly Gln Asp Ala Cys
530                 535                 540
Gly Ser Asn Ser Trp Asn Met Val Asp Val Asp Leu Pro Pro Asn Lys
545                 550                 555                 560
Asp Val Glu Pro Gly Ile Leu Leu His Gly Leu Lys Pro Trp Thr Gln
565                 570                 575
Tyr Ala Val Tyr Val Lys Ala Val Thr Leu Thr Met Val Glu Asn Asp
580                 585                 590
His Ile Arg Gly Ala Lys Ser Glu Ile Leu Tyr Ile Arg Thr Asn Ala
595                 600                 605
Ser Val Pro Ser Ile Pro Leu Asp Val Leu Ser Ala Ser Asn Ser Ser
610                 615                 620
Ser Gln Leu Ile Val Lys Trp Asn Pro Pro Ser Leu Pro Asn Gly Asn
625                 630                 635                 640
Leu Ser Tyr Tyr Ile Val Arg Trp Gln Arg Gln Pro Gln Asp Gly Tyr
645                 650                 655
Leu Tyr Arg His Asn Tyr Cys Ser Lys Asp Lys Ile Pro Ile Arg Lys
660                 665                 670
Tyr Ala Asp Gly Thr Ile Asp Ile Glu Glu Val Thr Glu Asn Pro Lys
675                 680                 685
Thr Glu Val Cys Gly Gly Glu Lys Gly Pro Cys Cys Ala Cys Pro Lys
690                 695                 700
Thr Glu Ala Glu Lys Gln Ala Glu Lys Glu Glu Ala Glu Tyr Arg Lys
705                 710                 715                 720
Val Phe Glu Asn Phe Leu His Asn Ser Ile Phe Val Pro Arg Pro Glu
725                 730                 735
Arg Lys Arg Arg Asp Val Met Gln Val Ala Asn Thr Thr Met Ser Ser
740                 745                 750
Arg Ser Arg Asn Thr Thr Ala Ala Asp Thr Tyr Asn Ile Thr Asp Pro
755                 760                 765
Glu Glu Leu Glu Thr Glu Tyr Pro Phe Phe Glu Ser Arg Val Asp Asn
770                 775                 780
Lys Glu Arg Thr Val Ile Ser Asn Leu Arg Pro Phe Thr Leu Tyr Arg
785                 790                 795                 800
Ile Asp Ile His Ser Cys Asn His Glu Ala Glu Lys Leu Gly Cys Ser
805                 810                 815
Ala Ser Asn Phe Val Phe Ala Arg Thr Met Pro Ala Glu Gly Ala Asp
820                 825                 830
Asp Ile Pro Gly Pro Val Thr Trp Glu Pro Arg Pro Glu Asn Ser Ile
835                 840                 845
Phe Leu Lys Trp Pro Glu Pro Glu Asn Pro Asn Gly Leu Ile Leu Met
850                 855                 860
Tyr Glu Ile Lys Tyr Gly Ser Gln Val Glu Asp Gln Arg Glu Cys Val
865                 870                 875                 880
Ser Arg Gln Glu Tyr Arg Lys Tyr Gly Gly Ala Lys Leu Asn Arg Leu
885                 890                 895
Asn Pro Gly Asn Tyr Thr Ala Arg Ile Gln Ala Thr Ser Leu Ser Gly
900                 905                 910
Asn Gly Ser Trp Thr Asp Pro Val Phe Phe Tyr Val Gln Ala Lys Thr
915                 920                 925
Gly Tyr Glu Asn
930
<210>  92
<211>  512
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  N-концевая ECD IGF-1R
<400>  92
Met Lys Ser Gly Ser Gly Gly Gly Ser Pro Thr Ser Leu Trp Gly Leu
1               5                   10                  15
Leu Phe Leu Ser Ala Ala Leu Ser Leu Trp Pro Thr Ser Gly Glu Ile
20                  25                  30
Cys Gly Pro Gly Ile Asp Ile Arg Asn Asp Tyr Gln Gln Leu Lys Arg
35                  40                  45
Leu Glu Asn Cys Thr Val Ile Glu Gly Tyr Leu His Ile Leu Leu Ile
50                  55                  60
Ser Lys Ala Glu Asp Tyr Arg Ser Tyr Arg Phe Pro Lys Leu Thr Val
65                  70                  75                  80
Ile Thr Glu Tyr Leu Leu Leu Phe Arg Val Ala Gly Leu Glu Ser Leu
85                  90                  95
Gly Asp Leu Phe Pro Asn Leu Thr Val Ile Arg Gly Trp Lys Leu Phe
100                 105                 110
Tyr Asn Tyr Ala Leu Val Ile Phe Glu Met Thr Asn Leu Lys Asp Ile
115                 120                 125
Gly Leu Tyr Asn Leu Arg Asn Ile Thr Arg Gly Ala Ile Arg Ile Glu
130                 135                 140
Lys Asn Ala Asp Leu Cys Tyr Leu Ser Thr Val Asp Trp Ser Leu Ile
145                 150                 155                 160
Leu Asp Ala Val Ser Asn Asn Tyr Ile Val Gly Asn Lys Pro Pro Lys
165                 170                 175
Glu Cys Gly Asp Leu Cys Pro Gly Thr Met Glu Glu Lys Pro Met Cys
180                 185                 190
Glu Lys Thr Thr Ile Asn Asn Glu Tyr Asn Tyr Arg Cys Trp Thr Thr
195                 200                 205
Asn Arg Cys Gln Lys Met Cys Pro Ser Thr Cys Gly Lys Arg Ala Cys
210                 215                 220
Thr Glu Asn Asn Glu Cys Cys His Pro Glu Cys Leu Gly Ser Cys Ser
225                 230                 235                 240
Ala Pro Asp Asn Asp Thr Ala Cys Val Ala Cys Arg His Tyr Tyr Tyr
245                 250                 255
Ala Gly Val Cys Val Pro Ala Cys Pro Pro Asn Thr Tyr Arg Phe Glu
260                 265                 270
Gly Trp Arg Cys Val Asp Arg Asp Phe Cys Ala Asn Ile Leu Ser Ala
275                 280                 285
Glu Ser Ser Asp Ser Glu Gly Phe Val Ile His Asp Gly Glu Cys Met
290                 295                 300
Gln Glu Cys Pro Ser Gly Phe Ile Arg Asn Gly Ser Gln Ser Met Tyr
305                 310                 315                 320
Cys Ile Pro Cys Glu Gly Pro Cys Pro Lys Val Cys Glu Glu Glu Lys
325                 330                 335
Lys Thr Lys Thr Ile Asp Ser Val Thr Ser Ala Gln Met Leu Gln Gly
340                 345                 350
Cys Thr Ile Phe Lys Gly Asn Leu Leu Ile Asn Ile Arg Arg Gly Asn
355                 360                 365
Asn Ile Ala Ser Glu Leu Glu Asn Phe Met Gly Leu Ile Glu Val Val
370                 375                 380
Thr Gly Tyr Val Lys Ile Arg His Ser His Ala Leu Val Ser Leu Ser
385                 390                 395                 400
Phe Leu Lys Asn Leu Arg Leu Ile Leu Gly Glu Glu Gln Leu Glu Gly
405                 410                 415
Asn Tyr Ser Phe Tyr Val Leu Asp Asn Gln Asn Leu Gln Gln Leu Trp
420                 425                 430
Asp Trp Asp His Arg Asn Leu Thr Ile Lys Ala Gly Lys Met Tyr Phe
435                 440                 445
Ala Phe Asn Pro Lys Leu Cys Val Ser Glu Ile Tyr Arg Met Glu Glu
450                 455                 460
Val Thr Gly Thr Lys Gly Arg Gln Ser Lys Gly Asp Ile Asn Thr Arg
465                 470                 475                 480
Asn Asn Gly Glu Arg Ala Ser Cys Glu Ser Asp Val Leu His Phe Thr
485                 490                 495
Ser Thr Thr Thr Ser Lys Asn Arg Ile Ile Ile Thr Trp His Arg Tyr
500                 505                 510
<210>  93
<211>  4
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  тетрапептид (линкер)
<400>  93
Gly Phe Leu Gly
1
<210>  94
<211>  4
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  тетрапептид (линкер)
<400>  94
Ala Leu Ala Leu
1
<210>  95
<211>  5
<212>  ПРТ
<213>  искусственная
<220>
<223>  пентапептид (линкер)
<400>  95
Pro Val Gly Val Val
1               5
<---