СПОСОБЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ШТАММОВ CRYPTOCOCCUS FLAVESCENS ДЛЯ БИОЛОГИЧЕСКОЙ БОРЬБЫ С ФУЗАРИОЗОМ КОЛОСА

1. Способ для подавления фузариоза колоса у злаков, включающий
а) определение генотипа штамма Cryptococcus flavescens в образце, собранном из злака; и
б) нанесение на злак эффективного количества одного или более микробных антагонистов по результатам со стадии (а) с целью подавления таким образом фузариоза колоса, причем один или более микробный антагонист представляет собой штамм Cryptococcus flavescens генотипа А или штамм Cryptococcus flavescens генотипа В, при этом один или более микробный антагонист не является Cryptococcus flavescens 3С, депонированным под номером доступа NRRL Y-50378, или Cryptococcus flavescens 4С, депонированным под номером доступа NRRL Y-50379.
2. Способ по п. 1, в котором образец собирают из одного или более злаковых травянистых растений перед нанесением одного или более микробных антагонистов на одно или более злаковых травянистых растений.
3. Способ по п. 1, в котором образец собирают из одного или более злаковых травянистых растений после нанесения одного или более микробных антагонистов на одно или более злаковых травянистых растений.
4. Способ по п. 1, в котором, по меньшей мере, один из одного или более микробных антагонистов выбран из группы штаммов С.flavescens, состоящей из: Y-7373; YB-601; YB-602; Y-7377; Y-7372; Y-7375; Y-7374; Y-7376; YB-328; Y-7379; и YB-744.
5. Способ по п. 1, в котором, по меньшей мере, один из одного или более микробных антагонистов толерантен к протиоконазолу.
6. Способ по п. 1, при котором в дополнение к одному или более микробных антагонистов, наносимых на семенную шапку злака, на злак наносят Cryptococcus flavescens 3С, депонированный под номером доступа NRRL Y-50378, и Cryptococcus flavescens 4С, депонированный под номером доступа NRRLY-50379.
7. Способ по п. 1, в котором один или более микробных антагонистов наносят на семенную шапку до стадии твердой спелости.
8. Способ по п. 1, в котором один или более микробных антагонистов наносят на семенную шапку во время цветения.
9. Способ по п. 1, в котором один или более микробных антагонистов наносят на семенную шапку перед цветением.
10. Способ по п. 1, в котором зерновое растение представляет собой пшеницу или ячмень.
11. Способ по п. 1, в котором эффективное количество, по меньшей мере, одного микробного антагониста представляет собой количество, достаточное для снижения уровня фузариоза колоса по сравнению с уровнем фузариоза в соответствующем необработанном контроле.
12. Способ по п. 1, в котором нанесение эффективного количества одного или более микробных антагонистов на семенную шапку злака включает опрыскивание злака одним или более микробными антагонистами.
13. Способ по п. 12, в котором опрыскивание выбирают из группы, состоящей из опрыскивания через систему орошения; распыления с воздуха; применения распыления с земли.
4
9
5
6
2
14. Способ по п. 1, в котором эффективное количество одного или более микробных антагонистов составляет примерно от 10 до 10 КОЕ/мл, нанесенных с нормой расхода примерно 10-10 КОЕ/см.
9
6
6
2
15. Способ по п. 11, в котором эффективное количество одного или более микробных антагонистов составляет примерно 1,5×10 КОЕ/мл, нанесенных с нормой расхода примерно от 2×10 до 6×10 КОЕ/см.
8
5
2
16. Способ по п. 11, в котором эффективное количество одного или более микробных антагонистов составляет примерно 2,3×10 КОЕ/мл, нанесенных с нормой расхода примерно 2×10 КОЕ/см.
8
6
2
17. Способ по п. 11, в котором эффективное количество одного или более микробных антагонистов составляет примерно 3×10 КОЕ/мл, нанесенных с нормой расхода примерно 10 КОЕ/см.
18. Способ по п. 1, в котором нанесение эффективного количества одного или более микробных антагонистов на семенную шапку злака происходит при температурах примерно от 5 до 35°С.
19. Способ по п. 1, в котором нанесение эффективного количества одного или более микробных антагонистов на семенную шапку злака происходит при температурах примерно от 15 до 30°С.
20. Способ по п. 1, в котором один или более микробных антагонистов являются, по существу, биологически чистыми.
21. Способ по п. 1, в котором два или более микробных антагониста наносят на семенную шапку злака.
22. Способ по п. 21, в котором два или более микробных антагониста наносят одновременно.
23. Способ по п. 21, в котором два или более микробных антагониста наносят раздельно.
24. Способ по п. 21, в котором, по меньшей мере, два микробных антагониста представляют собой штаммы Cryptococcus flavescens генотипа А.
25. Способ по п. 21, в котором, по меньшей мере, два микробных антагониста представляют собой штаммы Cryptococcus flavescens генотипа В.
26. Способ по п. 21, в котором первый микробный антагонист представляет собой штамм Cryptococcus flavescens генотипа А, а второй микробный антагонист представляет собой штамм Cryptococcus flavescens генотипа В.
27. Способ по п. 21, в котором, по меньшей мере, один микробный антагонист выбран из первой группы, состоящей из штаммов Cryptococcus flavescens генотипа А и штаммов Cryptococcus flavescens генотипа В; и, по меньшей мере, один микробный антагонист выбран из второй группы, состоящей из Cryptococcus flavescens 3С, депонированного под номером доступа NRRL Y-50378 и Cryptococcus flavescens 4С, депонированного под номером доступа NRRL Y-50379.
28. Способ по п. 1, дополнительно включающий нанесение на злак одного или более фунгицидов.
29. Способ по п. 28, в котором фунгицид представляет собой протиоконазол.
30. Способ по п. 28, в котором один или более фунгицидов, нанесенные на злак в конкретный момент времени, выбраны из группы, состоящей из фунгицидов, нанесенных: перед нанесением одного или более микробных антагонистов; одновременно с нанесением одного или более микробных антагонистов; и после нанесения одного или более микробных антагонистов.
31. Набор, содержащий одну или более пар праймеров, имеющих, по меньшей мере, 90%-ю идентичность последовательности с SEQ ID NO: 45 и 46; SEQ ID NOS: 47 и 48; SEQ ID NOS: 49 и 50; SEQ ID NOS: 51 и 52; SEQ ID NOS: 53 и 54; SEQ ID NOS: 55 и 56; SEQ ID NOS: 57 и 58; SEQ ID NOS: 59 и 60; SEQ ID NOS: 61 и 62; SEQ ID NOS: 63 и 64; SEQ ID NOS: 65 и 66; SEQ ID NOS: 67 и 68; SEQ ID NO: 69 и 70; и SEQ ID NOS: 71 и 72.
32. Способ идентификации генотипа штамма Cryptococcus flavescens включающий: выполнение ПЦР с использованием одной или более пар праймеров, имеющих, по меньшей мере, 90%-ю идентичность последовательности с SEQ ID NO: 45 и 46; SEQ ID NOS: 47 и 48; SEQ ID NOS: 49 и 50; SEQ ID NOS: 51 и 52; SEQ ID NOS: 53 и 54; SEQ ID NOS: 55 и 56; SEQ ID NOS: 57 и 58; SEQ ID NOS: 59 и 60; SEQ ID NOS: 61 и 62; SEQ ID NOS: 63 и 64; SEQ ID NOS: 65 и 66; SEQ ID NOS: 67 и 68; SEQ ID NO: 69 и 70; и SEQ ID NOS: 71 и 72.
33. Способ идентификации генотипа штамма Cryptococcus flavescens, включающий
а) секвенирование экстрагированной геномной ДНК целевого Cryptococcus flavescens;
б) сравнение последовательности, определенной на стадии а), с известными гомологичными последовательностями других штаммов Cryptococcus flavescens; и
в) идентификация штамма Cryptococcus flavescens как генотипа А или генотипа В.
34. Способ по п. 1, в котором генотип штамма Cryptococcus flavescens определен с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) или по идентичности последовательностей.
35. Способ по п. 34, в котором генотип штамма Cryptococcus flavescens определяется путем выполнения ПЦР с использованием одной или более пар праймеров, причем пары праймеров имеют, по меньшей мере, 90%-ю идентичность последовательности с SEQ ID NO: 45 и 46; SEQ ID NOS: 47 и 48; SEQ ID NOS: 49 и 50; SEQ ID NOS: 51 и 52; SEQ ID NOS: 53 и 54; SEQ ID NOS: 55 и 56; SEQ ID NOS: 57 и 58; SEQ ID NOS: 59 и 60; SEQ ID NOS: 61 и 62; SEQ ID NOS: 63 и 64; SEQ ID NOS: 65 и 66; SEQ ID NOS: 67 и 68; SEQ ID NO: 69 и 70; и SEQ ID NOS: 71 и 72, тем самым определяя штамм Cryptococcus flavescens.
36. Способ по п. 34, в котором генотип штамма Cryptococcus flavescens определяется по идентичности последовательности, включающий следующие стадии:
а) секвенирование экстрагированной геномной ДНК целевого Cryptococcus flavescens;
б) сравнение последовательности, определенной на стадии а), с известными гомологичными последовательностями других штаммов Cryptococcus flavescens; и
в) идентификацию штамма Cryptococcus flavescens.
37. Способ по п. 34, в котором ПЦР представляет собой количественную ПЦР (кПЦР).
38. Способ по п. 34, в котором ПЦР включает использование полимеразы.
39. Способ по п. 34, в котором ПЦР включает использование теплового циклирования.
40. Способ по п. 35, в котором штамм Cryptococcus flavescens идентифицируется как генотип А, если кПЦР дает в результате: значение порогового цикла, равное 17-21 при использовании одной или более пар праймеров, имеющих, по меньшей мере, 90%-ю идентичность последовательности с SEQ NOS: 45 и 46, SEQ ID NOS: 47 и 48 или SEQ ID NOS: 55 и 56; значение порогового цикла, равное 18-20 при использовании одной или более пар праймеров, имеющих, по меньшей мере, 90%-ю идентичность последовательности с SEQ ID NO: 57 и 58, SEQ ID NO: 65 и 66 или SEQ ID NO: 67 и 68; значение порогового цикла, равное 17-20 при использовании пары праймеров, имеющей, по меньшей мере, 90%-ю идентичность последовательности с SEQ ID NO: 69 и 70; или значение порогового цикла, равное 12-15 при использовании пары праймеров, имеющей, по меньшей мере, 90%-ю идентичность последовательности с SEQ ID NO: 73 и 74.
41. Способ по п. 35, в котором штамм Cryptococcus flavescens идентифицируется как генотип В, если кПЦР дает в результате: значение порогового цикла, равное 31-33 при использовании пары праймеров, имеющей, по меньшей мере, 90%-ю идентичность последовательности с SEQ NO: 45 и 46; значение порогового цикла, равное 32-35 при использовании пары праймеров, имеющей, по меньшей мере, 90%-ю идентичность последовательности с SEQ NO: 47 и 48; значение порогового цикла, равное 24-26 при использовании пары праймеров, имеющей, по меньшей мере, 90%-ю идентичность последовательности с SEQ NO: 55 и 56; значение порогового цикла, равное 22-24, при использовании одной или более пар праймеров, имеющих, по меньшей мере, 90%-ю идентичность последовательности с SEQ ID NO: 57 и 58 или SEQ ID NO: 67 и 68; значение порогового цикла, равное 22-23 при использовании пары праймеров, имеющей, по меньшей мере, 90%-ю идентичность последовательности с SEQ ID NO: 65 и 66; значение порогового цикла, равное 34-35 при использовании пары праймеров, имеющей, по меньшей мере, 90%-ю идентичность последовательности с SEQ ID NO: 69 и 70; или значение порогового цикла, равное 15-18 при использовании пары примеров, имеющей, по меньшей мере, 90%-ю идентичность последовательности с SEQ ID NO: 73 и 74.
42. Способ по п. 36, в котором штамм Cryptococcus flavescens идентифицируется как генотип А, если последовательность эстрагированной геномной ДНК целевого Cryptococcus flavescens имеет: 100%-ю идентичность последовательности по гену β-тубулина с SEQ ID NO: 1; идентичность последовательности между 95% и 100% по гену хитинсинтазы 1 с SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, или 6; идентичность последовательности между 99% и 100% по гену EF1 с SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10 или 11; идентичность последовательности между 99% и 100% по гену hsp70 с SEQ ID NO: 12, 13, 14, 15, или 16; или идентичность последовательности между 99% и 100% по локусу-мишени cs22 с SEQ ID. NO: 85, 86, 87, 88, или 89.
43. Способ по п. 36, в котором штамм Cryptococcus flavescens идентифицируется как генотип В, если последовательность экстрагированной геномной ДНК целевого Cryptococcus flavescens имеет: идентичность последовательности между 99% и 100% по гену β-тубулина с SEQ ID NO: 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23; идентичность последовательности между 97% и 100% по гену хитинсинтазы 1 с SEQ ID NO: 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30; идентичность последовательности между 99% и 100% по гену EF1 к гена с SEQ ID NO: 31, 32, 33, 34, 35, 36, или 37; идентичность последовательности между 99% и 100% по гену hsp70 с SEQ ID NO: 38, 39, 40, 41, 42, 43 или 44; или идентичность последовательности 100% по локусу-мишени cs22 с SEQ ID NO: 90.
44. Способ лечения фузариоза колоса, включающий
а) нанесение на злак одного или более микробных антагонистов, содержащих штамм Cryptococcus flavescens генотипа А или штамм Cryptococcus flavescens генотипа В, причем, один или более микробных антагонистов не являются Cryptococcus flavescens 3С, депонированным под номером доступа NRRL Y-50378, или Cryptococcus flavescens 4С, депонированным под номером доступа NRRL Y-50379; и
б) нанесение на это растение одного или более фунгицидов.
45. Способ по п. 44, в котором один фунгицид представляет собой протиоконазол.
46. Способ по п. 44, в котором один или более фунгицидов, нанесенных на злак в конкретный момент времени, выбраны из группы, состоящей из фунгицидов, нанесенных: перед нанесением одного или более микробных антагонистов; одновременно с нанесением одного или более микробных антагонистов; и после нанесения одного или более микробных антагонистов.
47. Набор по п. 31, в котором идентичность последовательностей определяется для каждого отдельного прямого или обратного праймера.
48. Набор по п. 31, который содержит также один или более фунгицидов.
49. Набор по п. 48, в котором фунгицид представляет собой протиоконазол.
50. Набор по п. 48, который дополнительно содержит компоненты амплификации.
51. Набор по п. 50, в котором компоненты амплификации содержат один или более нуклеотидов, полимеразы, реакционного буфера или других реакционных реагентов.
52. Способ по п. 32, в котором штамм Cryptococcus flavescens идентифицируется как генотип А, если кПЦР дает в результате: значение порогового цикла, равное 17-21 при использовании одной или более пар праймеров, имеющих, по меньшей мере, 90%-ю идентичность последовательности с SEQ NOS: 45 и 46, SEQ ID NOS: 47 и 48 или SEQ ID NOS: 55 и 56; значение порогового цикла, равное 18-20 при использовании одной или более пар праймеров, имеющих, по меньшей мере, 90%-ю идентичность последовательности с SEQ ID NO: 57 и 58, SEQ ID NO: 65 и 66 или SEQ ID NO: 67 и 68; значение порогового цикла, равное 17-20 при использовании пары праймеров, имеющей, по меньшей мере, 90%-ю идентичность последовательности с SEQ ID NO: 69 и 70; или значение порогового цикла, равное 12-15 при использовании пары праймеров, имеющей, по меньшей мере, 90%-ю идентичность последовательности с SEQ ID NO: 73 и 74.
53. Способ по п. 32, в котором штамм Cryptococcus flavescens идентифицируется как генотип В, если кПЦР дает в результате: значение порогового цикла, равное 31-33 при использовании пары праймеров, имеющей, по меньшей мере, 90%-ю идентичность последовательности с SEQ NO: 45 и 46; значение порогового цикла, равное 32-35 при использовании пары праймеров, имеющей, по меньшей мере, 90%-ю идентичность последовательности с SEQ NO: 47 и 48; значение порогового цикла, равное 24-26 при использовании пары праймеров, имеющей, по меньшей мере, 90%-ю идентичность последовательности с SEQ NO: 55 и 56; значение порогового цикла, равное 22-24, при использовании одной или более пар праймеров, имеющих, по меньшей мере, 90%-ю идентичность последовательности с SEQ ID NO: 57 и 58 или SEQ ID NO: 67 и 68; значение порогового цикла, равное 22-23 при использовании пары праймеров, имеющей, по меньшей мере, 90%-ю идентичность последовательности с SEQ ID NO: 65 и 66; значение порогового цикла, равное 34-35 при использовании пары праймеров, имеющей, по меньшей мере, 90%-ю идентичность последовательности с SEQ ID NO: 69 и 70; или значение порогового цикла, равное 15-18 при использовании пары примеров, имеющей, по меньшей мере, 90%-ю идентичность последовательности с SEQ ID NO: 73 и 74.
54. Способ по п. 33, где штамм Cryptococcus flavescens идентифицируется как генотип А, если последовательность эстрагированной геномной ДНК целевого Cryptococcus flavescens имеет: 100%-ю идентичность последовательности по гену β-тубулина с SEQ ID NO: 1; идентичность последовательности между 95% и 100% по гену хитинсинтазы 1 с SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, или 6; идентичность последовательности между 99% и 100% по гену EF1 с SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10 или 11; идентичность последовательности между 99% и 100% по гену hsp70 с SEQ ID NO: 12, 13, 14, 15, или 16; или идентичность последовательности между 99% и 100% по локусу-мишени cs22 с SEQ ID. NO: 85, 86, 87, 88, или 89.
55. Способ по п. 33, где штамм Cryptococcus flavescens идентифицируется как генотип В, если последовательность экстрагированной геномной ДНК целевого Cryptococcus flavescens имеет: идентичность последовательности между 99% и 100% по гену β-тубулина с SEQ ID NO: 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23; идентичность последовательности между 97% и 100% по гену хитинсинтазы 1 с SEQ ID NO: 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30; идентичность последовательности между 99% и 100% по гену EF1 к гена с SEQ ID NO: 31, 32, 33, 34, 35, 36, или 37; идентичность последовательности между 99% и 100% по гену hsp70 с SEQ ID NO: 38, 39, 40, 41, 42, 43 или 44; или идентичность последовательности 100% по локусу-мишени cs22 с SEQ ID NO: 90.