Разработка технологии производства мягкой лекарственной формы с катиазином для коррекции нарушений сперматогенеза

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПРОИЗВОДСТВА МЯГКОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЫ С КАТИАЗИНОМ ДЛЯ КОРРЕКЦИИ НАРУШЕНИЙ СПЕРМАТОГЕНЕЗА

ИВАХНЕНКО Е.Л.*, СТРИЛЕЦ О.П.*, СТРЕЛЬНИКОВ Л.С.*, КУСТОВА С.П.**

Национальный фармацевтический университет, г. Харьков, Украина*

ГУ ««Институт проблем эндокринной патологии им. В.Я. Данилевского АМН Украины»,

г. Харьков, Украина**

Резюме. В данной статье отражены результаты исследования структурно-механических свойств и дисперсности масляной фазы разрабатываемого мягкого лекарственного средства с катиазином для стимуляции сперматогенеза. Доказано, что мазь эмульсионного типа «масло/вода» обладает термической и коллоидной стабильностью. Частицы масляной фазы имеют преимущественно размер от 3 до 4 мкм в диаметре. Также были изучены реологические свойства представленной эмульсионной системы в диапазоне температур от 10 до 50°С, что соответствует возможным границам использования и хранения, и при скоростях сдвига в диапазоне от 1,002 до 150,000 с-1. Согласно полученным кривым показатели динамической вязкости снижаются при увеличении температуры до 30°С, что может свидетельствовать об уменьшении затрачиваемых усилий при нанесении готового препарата на кожу, температура которой составляет 34°С. Показано, что эффективная концентрация действующего вещества составляет 0,5%. Разработана технология производства мягкой лекарственной формы с катиазином. Составлена технологическая схема производства мази с катиазином согласно требованиям ОМР.

Ключевые слова: мягкая лекарственная форма, технология, эмульсия, сперматогенез, вязкость, дисперсность.

Abstract. This article reflects the results of the study of structural and mechanical properties and the dispersity of the oil phase of the developed soft drug with katiazinum for the stimulation of spermatogenesis. The ointment of «oil/water» emulsion type proved to have thermal and colloidal stability. The particles of oil phase are predominantly from 3 to 4 microns in diameter. The rheological properties of the presented emulsion system have also been studied in the temperature range from 10 to 50°C, this corresponding to the possible bounds of use and storage, and at shear rates in the range from 1,002 to 150,000 s-1. According to the plotted curves the dynamic viscosity decreases with increasing temperature up to 30°C, that can testify to the reduction of efforts on the application of the ready-made preparation to the skin the temperature of which is 34°C. It has also been shown that the effective concentration of the active substance makes up 0,5%. The technology to produce soft medicinal form with katiazinum has been developed. The technological scheme of the production of this ointment with katiazinum according to GMP requirements has been devised.

Key words: soft medicinal form, technology, emulsion, spermatogenesis, viscosity, dispersity.

На сегодняшний день в медицинской практике все больше внимания уделяется проблеме сохранения

Адрес для корреспонденции: Украина, 61002, г. Харьков, ул. Мельникова, 12, Национальный фармацевтический университет, кафедра биотехнологии. E-mail: biotech_ukrfa@mail.ru, тел. раб.: +380 57 706 47 87

- Ивахненко Елена Леонидовна.

репродуктивного здоровья нации, в том числе мужчин, поскольку, по данным статистики, доля этого фактора в бесплодии семейных пар составляет от 30 до 50%. С одной стороны, сложность этиологии и несовершенство знаний причин возникновения нарушений сперматогенеза приводят порой к неадекватному и длительному симптоматическому лечению, с другой -

основное направление в медикаментозной терапии - применение препаратов гормональной природы может привести к побочным эффектам: гинекомастии, стимуляции очагов рака простаты, нарушению уровня половых гормонов и, как следствие, полной потере фертильности [1-5]. В связи с этим разработка новых лекарственных средств негормональной природы для коррекции сперматогенеза является актуальной задачей фармации.

На кафедре биотехнологии Национального фармацевтического университета (г. Харьков, Украина) совместно с ГУ «Институт проблем эндокринной патологии им. В.Я. Данилевского АМН Украины» (г. Харьков, Украина) проводятся исследования по разработке состава и технологии мягкой лекарственной формы, содержащей биологически активное соединение - катиазин, которое в малой дозе стимулирует сперматогенез за счет нормализации гормональной функции яичка и активизации серотонинер-гической системы мозга и ликвидации оксидативного стресса [6]. Предварительно проведенными исследованиями было установлено, что наиболее эффективной мягкой лекарственной формой для стимуляции сперматогенеза является мазь эмульсионного типа первого рода (масло в воде), в состав которой входят: катиа-зин (действующее вещество), комплексный эмульгатор №1, масло вазелиновое (масляная фаза основы), гидрофильный неводный растворитель глицерин, консерванты нипагин и нипазол, диметил-сульфоксид (ДМСО) в качестве растворителя для действующего вещества и вода. Однако широко известно то, что на терапевтическую эффективность и биологическую доступность любого лекарственного средства влияет не только выбор вида и соотношения компонентов, но и технология производства. Процесс получения эмульсии включает разнообразные технологические операции: нагревание, смешивание, гомогенизация, охлаждение, которые и определяют такие характеристики эмульсий, как: стабильность, степень дис-

персности, консистентные свойства, высвобождение действующего вещества. Немаловажную роль играет и порядок смешивания фаз [7]. Для получения мелкодисперсных эмульсионных систем в фармацевтической практике наиболее часто применяется метод инверсии фаз: добавление водной фазы к масляной частями через стадию образования эмульсии, которая обратна необходимой. Данный метод, согласно многолетней фармацевтической практике, позволяет обеспечить более высокую стабильность эмульсионной системы, чем метод прямого эмульгирования. Таким образом, целью данной работы была разработка технологии и исследование лекарственного средства с катиазином на основе эмульсионной системы первого рода.

Методы

Объектами исследования в данной работе были компоненты основ мягких лекарственных форм, вспомогательные вещества, мазь с катиазином. Эмульсии готовили методом инверсии фаз. Предварительно растворяли действующее вещество в ДМСО; на водяной бане сплавляли эмульгатор № 1 и вазелиновое масло при 55-60°С; отдельно смешивали глицерин и воду очищенную при 60°С, после чего добавляли смесь консервантов. Затем к масляной фазе добавляли около 10% гидрофильной фазы, перемешивали до образования эмульсии второго рода вода/ масло. Полученную массу смешивали с оставшейся частью гидрофильной фазы с целью образования эмульсии типа масло/ вода, далее смесь гомогенизировали и охлаждали. К готовой эмульсионной основе добавляли раствор катиазина в ДМСО и тщательно перемешивали. Для определения свойств полученных эмульсионных систем использовали следующие методы: определение дисперсности масляной фазы, термической и коллоидной стабильности, структурно-механических свойств и специфической активности лекарственного средства.

Дисперсный анализ эмульсионных систем проводился путем определения величины диаметра частиц дисперсной фазы методом световой микроскопии при увеличении х100 с последующей фиксацией изображения с помощью цифровой камеры-видеоокуляра ВСМ-320. Для установления размера частиц использовали пакет программного обеспечения ЛхюУ1зюп. Для облегчения проведения опыта концентрацию дисперсной фазы снижали путем разведения водой очищенной в соотношении 1:200, после чего добавляли 1-2 капли 1% раствора метилового оранжевого. Определение диаметра частиц и их расчет проводили по следующим группам: частицы с диаметром до 3, 3-5, 5-10, более 10 мкм. Дисперсность определяли на основании измерения не менее 1000 частиц. Содержание частиц каждой группы в процентах рассчитывали по формуле 1:

а * 100

а

где Хп - содержание частиц каждой группы в процентах;

ап - количество частиц каждой группы;

а - общее количество частиц всех групп.

Термическую и коллоидную стабильность определяли в соответствии с общепринятыми методиками [8, 9]. Образцы мази отбирали сразу после приготовления, через 6, 12, 18, 24 и 30 месяцев хранения при температуре от 8 до 15°С. Определение коллоидной стабильности проводили методом центрифугирования. Образцы мазей центрифугировали на лабораторной центрифуге ОПН-8 при 6000 об/мин в течение 5 минут. Для определения термостабильности 5-6 стеклянных пробирок диаметром 14 мм и высотой 120 мм наполняли на 2/3 объема образцом мази и помещали их в термостат марки ТС - 80 с температурой (42,5±2,5)°С на 24 часа. Стабильность определяли визуально: образец считали нестабильным, если при двух последовательно проведенных определениях одной серии образца эмульсии присутствовали признаки расслоения или выделения осадка.

Изучение намазываемости мази проводили сразу после приготовления. Образец мази помещали в мерный цилиндр вискозиметра «Реотест-2», который тер-мостатировали при температуре 34°С, и проводили определение напряжение сдвига при двух скоростях сдвига 145 и 243 с-1, при которых моделируется намазывае-мость мазей на кожный покров. Показания шкалы измерительного прибора регистрировали через 2-3 с после включения и через 15 с работы прибора. Также определяли структурно-механические свойства мази в диапазоне температур от 10 до 50°С и касательных напряжений при скоростях сдвига от 1,002 до 150,000 с-1.

Специфическую активность разрабатываемой мази с катиазином проводили в ГУ «Институт проблем эндокринной патологии им. В.Я. Данилевского АМН Украины» на модели кадмийиндуцированной патоспермии на крысах-самцах (популяция Вистар), которая используется для биологических исследований и считается наиболее изученной по механизму действия [10]. Исследования проводились в соответствии с национальными «Общими этическими принципами экспериментов на животных», которые согласуются с положениями «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» [11]. Нарушение сперматогенеза у крыс вызывали одноразовой подкожной инъекций 0,025% раствора хлорида кадмия в дозе 0,05 мг/кг массы тела. Далее через 2 суток 1 раз в день в течение 48 дней на мошонку наносили образцы мягкой лекарственной формы с катиазином и препарат сравнения - 1% гель тестостерона для наружного применения «Андрогель», который используется для лечения гипоандрогенных состояний у мужчин. По окончании эксперимента крыс умерщвляли посредством декапитации, далее с помощью камеры Горяева исследовали суспензию эпидимальных сперматозоидов и определяли их подвижность [11]. Полученные результаты сравнивали с данными интактных животных и крыс, не получивших лечения.

Рис. 1. Дисперсность масляной фазы мази с катиазином.

Таблица 1

Размер масляной фазы мази с катиазином

Наименование фракции, мкм Средний диаметр масляной фазы, мкм Содержание, %

до 3 (1,82±0,9) 6

3 - 5 (3,43±0,5) 80

о - 5 (6,33±1,4) 12

свыше 10 (13,1±2,7) 2

Примечания: Р<0,05, п=1000.

Результаты и обсуждение

Для всестороннего изучения разрабатываемого препарата необходимым условием является исследование определенных физико-химических и физических свойств мягких лекарственных средств на этапе их разработки и внедрения в производственный процесс, поскольку это позволяет разработать и при необходимости скорректировать рациональную технологию их производства. К таким свойствам следует отнести термическую и коллоидную стабильность, структурно-механические свойства и дисперсность масляной фазы.

Результаты проведенного эксперимента, представленные в таблице 1, по определению дисперсности показали (рис. 1), что мазь с катиазином имеет преимущественно частицы масляной фазы от 3 до 10 мкм, 80% которых представлены диаметром от 3 до 4 мкм. Это соответствует дан-

ным литературы, указывающим на то, что эмульсионные системы подобного рода редко бывают моно- и мелкодисперсными [12].

Наиболее объективно стабильность эмульсионной системы характеризует их устойчивость к изменениям температуры и центрифугированию - термическая и коллоидная устойчивость соответственно. В ходе проведения экспериментальных исследований (табл. 2) было установлено, что все образцы разрабатываемой мази сохранили свою структуру без расслоения или выпадения осадка в течение 24 месяцев с момента производства. Следовательно, можно утверждать, что разрабатываемая мазь является коллоидно- и термостабильной в течение всего предлагаемого срока хранения.

Современные требования, предъявляемые к мягким лекарственным средствам, включают в себя необходимость

Рис. 2. Ограниченная реограмма течения мази с катиазином: І - через 2-3 с; 2 - через І5 с.

Таблица 2

Стабильность мягкой лекарственной формы с катиазином

Срок хранения, месяцы Коллоидная стабильность Термостабильность

визуально кремаж, мм визуально кремаж, мм

0 стабильна - стабильна -

6 стабильна - стабильна -

12 стабильна - стабильна -

18 стабильна - стабильна -

24 стабильна - стабильна -

30 нестабильна

иметь постоянные реологические (структурно-механические) свойства, поскольку они отражают их терапевтические и потребительские свойства, например легкость и удобство нанесения лекарственного средства на кожу [13, 14, 15]. Оценивали намазываемость по тем усилиям, которые прилагаются для распределения по поверхности кожи определенного количества мази. Данный процесс аналогичен тому, что происходит во время разрушения исследуемого образца в ротационном вискозиметре, а усилие, потраченное на намазывание, можно считать напряжением сдвига, поскольку оно характеризует сопротивление образца деформациям

сдвига при определенной скорости [І6]. На основании данных вискозиметра строили реограмму течения мази в координатах скорость сдвига - напряжение сдвига, которую наносили на графическое изображение оптимума реологии намазывания для гидрофильных систем типа масло/ вода, ограниченного точками А, Б, В, Г, Д, Е, К, Л, М, что представлено на рисунке 2.

Из рисунка 2 видно, что мазь с катиа-зином имеет удовлетворительную намазы-ваемость, поскольку кривые текучести не выходят за границы оптимума намазыва-емости.

Также были изучены реологические свойства представленных эмульсионных

систем в диапазоне температур от 10 до 50°С, что соответствует возможным границам использования и хранения, и при скоростях в диапазоне от 1,002 до 150,000 с-1. На основании полученных данных были построены зависимости динамической вязкости от скорости сдвига для мази с катиазином при различных температурах, что представлено на рисунке 3. Полученный градиент изменения динамической вязкости исследуемой мази при

скоростях деформации, близких к нулю (условия мануального использования), имеет тенденцию к снижению, а уменьшение показателей динамической вязкости при увеличении температуры до 30°С и выше свидетельствует об уменьшении затрачиваемых усилий при нанесении на кожу (температура 34°С) и удобстве применения.

Проведенные на базе ГУ «Институт проблем эндокринной патологии им. В.Я.

1,002 14,56 28,11 41,56 55,19 68,74 82,3 95,82 109,3 122,9 136,5 150

градиент скорости сдвига, с-1

Рис. 3. Зависимость динамической вязкости мази с катиазином от градиента скорости сдвига при температуре измерения: 1 - 10°C; 2 - 15°C; 3 - 20°C; 4 - 25°C; 5 - 30°C; б - 35°C; 7 - 40°C; 8 - 45°C; 9 - 50°C.

Таблица 3

Результаты определения подвижности сперматозоидов у крыс

Группа животных Подвижность сперматозоидов, %

Интактные

Животные, не получившие лечения

«Андрогель»

Мазь с катиазином

Примечания: n=6 для каждой группы, P<0,05.

Сырье, промежуточная продукция и материалы

Раствор катиазина в ДМСО со стадии I

Производство мази с катиазином

Контроль в процессе производства

ДМСО, катиазин Стадия 1 Приготовление раствора катиазина в ДМСО Реактор Масса компонентов,

полнота растворения, время перемешивания

Масло вазелиновое, эмульгатор № 1 Стадия 2 Приготовление масляной фазы Реактор Масса компонентов, температура, время перемешивания, однородность смеси

1

Вода очищенная, Стадия 3 Приготовление водной фазы Реактор Температура, время

глицерин, нипагин, нипачол перемешивания^ масса компонентов. : однородность

-9

Стали Получен

іульеии

Тем!

>емя іемешивания, юдность массы

Стадия 5 Охлаждение мази

Реактор______

Время перемешиваний! однородность массы, _____температура______

Упаковка мази

Нсрасфасованная мазь со стадии 5, тубы, бушоны Фасовка мази в тубы Тубонаполняющий автомат ^ . Качество туб, маркировка

1

Пачки, листки- > Стадия 7 Упаковка туб в пачки Комплектность, печать,

*!

вкладыши Автомат для упаковки туб в пачки маркировка

V

Коробки, N Стадия 8 ^наковка пачек в коробки Упаковочный стол Количество пачек в

групповые этикетки У коробке, качество печати

Готовая продукция Контроль готовой продукции

Рис. 4. Cхема технологического процесса производства мази с катиазином.

Данилевского АМН Украины» исследования специфической активности мягкой лекарственной формы с катиазином 0,5% на модели кадмийиндуцированной пато-

спермии у крыс подтвердили улучшение показателей сперматогенеза относительно интактного контроля, в частности подвижность сперматозоидов повысилась на

18% (табл. 3). При этом терапевтическое действие исследуемой мази не уступало действию гормонального препарата сравнения «Андрогель».

Результаты проведенных исследований были учтены при разработке технологии получения мази в промышленных условиях, схема которой представлена на рисунке 4. Данная технология состоит из следующих стадий: растворение действующего вещества в ДМСО, приготовление масляной фазы (сплавление эмульгатора и масла вазелинового, приготовление водной фазы (смешивание воды, глицерина и консервантов), получение эмульсии (получение эмульсии масло/вода, добавление раствора катиазина в ДМСО, гомогенизация), охлаждение мази, фасовка ее в тубы, упаковка туб в пачки и упаковка последних в коробки.

Заключение

Таким образом, на основании полученных результатов можно сделать следующие выводы.

Разработана технология получения мягкой лекарственной формы эмульсионного типа масло/вода для коррекции показателей сперматогенеза.

Исследуемая мазь имеет удовлетворительные значения однородности и дисперсности масляной фазы с преимущественным содержанием частиц от 3 до 4 мкм. Мазь с катиазином является термо- и коллоидноустойчивой.

Ограниченные реограммы течения мягкой лекарственной формы и зависимости динамической вязкости от скорости сдвига в диапазоне температур от 10 до 50°С подтвердили хорошие показатели консистенции, обуславливающие потребительские (намазываемость, удобство применения и способность разжижаться при нанесении на кожу) и технологические (фасовка) свойства. Проведены исследования специфической активности мази с катиазином и определена эффективная концентрация действующего вещества - 0,5%. Разрабо-

тана промышленная технология производства мази с катиазином, составлена технологическая схема в соответствии с требованиями GMP.

Литература

1. Male infertility: lifestyle and oriental remedies / R.K. Mishra [et al.] // Journal of Scientific Research. - 2012. - Vol. 5б. - P. 93-101.

2. Brezina, P.R. Effects of Pharmaceutical Medications on Male Fertility / P.R. Brezina, F.N. Yunus, Z. Yulian // Journal Reproductive Infertility. - 2012. - Vol. 13, N 1. - P. 3-11.

3. Нікіткін О.Д. Aпдрологiчпi аспекти безплідного шлюбу: стап проблеми, епідеміологія (огляд літератури) / О.Д. Нікітін // Здоровье мужчины.

- 2010. - №3. - C. 108-1б.

4. Cухих, Г.Т. Мужское бесплодие / Г.Т. Cухих, B.A. Божедомов. - М.: Эксмо, 2009. - 240 с.

5. Юшко, Е.И. Мужская инфертильность в бесплодных браках / Е.И. Юшко, A.B. Бондарев, A.B. Огроцкий // Репродуктив. здоровье. -2011. - № 4. - C. 108-14.

6. МПК 7 A61K 31/1б, C07C б1/0б, C07D 277/00.

3-(4,5-Дигідротіазол-3-іл)-амід цис-1,2,2-

триметилциклопентан-1,3-дикарбонової кислоти, що стимулює сперматогенез : пат. 38130A UA / Ф.Яременко, І. Cвидло, B. Bакула [та ін.].

- № 20000б3139 ; заявл. ОІ.Об.ОО ; опубл. 15.05.01 // Бюл. - № 4.

7. Допоміжні речовини в технології ліків: вплив па технологічні, споживчі, економічні характеристики і терапевтичну ефективність : павч. посіб. для студ. вищ. фармац. павч. закл. / І.М. Перцев, Д.І. Дмитрієвський, B^. Рибачук [та ін.] ; за ред. І.М. Перцева. - Х. : Золоті сторінки, 2G10. - б00 с.

8. ГОСТ 29188.3-91. Изделия косметические. Методы определения стабильности эмульсии. -М. : Изд-во стандартов, 1992. - 3 с.

9. Дмитриєвський, Д.І. Обгрунтування складу емульсії за допомогою фізико-хімічних та структурно-механічних досліджень / Д.І. Дмитрієвський, A.A. Котвіцька // Bira. фармації. - 2001. - № 4(28). - C. 49-51.

10. Ермишкин, A.B. Фармакобиохимическая коррекция нарушений сперматогенеза при интоксикации хлоридом кадмия в эксперименте : ав-тореф. дис. ... капд. мед. паук: G3.GG.G4 / A.B. Ермишкин; Ряз. гос. мед. ун-т. - Рязань, 2004.

- 20 с.

11. Загальні етичні принципи експериментів па тваринах // Ендокринологія. - 2003. - Т. 8, № 1. -C. 142-45.

12. Інтегральна оцінка репродуктивної функції самців лабораторних тварин / Н.О. Карпенко[та

ін.] // Укр. біофарм. журн. - 2011. - № 2 (13). - С. 64-68.

13. Гладух, Є.В. Вплив параметрів гомогенізації на дисперсність емульсій першого роду / Є.В. Гладух // Фарм. журн. - 2003. - № 4. - С. 76-78.

14. Jaganath, N. The Application of Rheological Techniques in the Characterization of Semisolids in the Pharmaceutical Industry / J. Nelesh. -Washington, 2004. - 228 р.

15. Jilao, J. Rheology and stability of water-in-oil-in-water multiple emulsions containing Span 83 and

Tween 80 / J. Jilao, D. Burgess // The American Association of Pharmaceutical Science J. - 2003. -Vol. 5, № 1. - P. б2-73.

16. Державна фармакопея України / Державне підприємство наук.-експерт. фарм. центр. - 1-е вид. - Доп. 4. - Харків: Укр. паук. фарм. центр якості лік. засобів, 2011. - 540 с.

17. Фармацевтичні та медико-біологічні аспекти ліків / І.М. Перцев [та ін.] ; за ред. І.М. Перцева. - 2-е вид., перероб. та доп. - Biпппця: Нова кн., 2007. - 728 с.

Поступила 18.02.2013 г. Принята в печать 07.06.2013 г.

Сведения об авторах:

Ивахненко Е.Л. - ст. лаборант кафедры биотехнолгии НФаУ, г.Харьков,

Стрилец О.П. - к.ф.н., доцент кафедры биотехнологии НФаУ, г.Харьков,

Стрельников Л.С. - д.ф.н., профессор, заведующий кафедрой биотехнологии НФаУ, г.Харьков, Кустова С.П. - к.ф.н., ст. научный сотрудник ГУ «Институт проблем эндокринной патологии им. В. Я. Данилевского АМН Украины», г.Харьков.