Разработка и изучение стерически стабилизированной липосомальной формы лизомустина

УДК 616-006.446+616.24-006.6]-092.9:577.115

A. V. Lantsova, A. P. Polozkova, N. M. Peretolchina, Z. S. Shprakh, I.B. Showa, N. A. Oborotova,

A. Yu. Baryshnikov

LYSOMUSTINE STERICALLY STABILIZED LIPOSOMAL FORMS CREATION AND INVESTIGATION

N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center RAMS, Moscow

ABSTRACT

The purpose of this investigation was to carry out the PEG liposome-encapsulated form of lysomustine (PLEL) as well as to characterize its pharmaceutical properties and antitumor efficiency. At the technological stage of the investigation we have tested liposomal formulations of lysomustine using different PEG lipid compositions. The antitumor efficiency of new pharmaceutical formulation was investigated on two experimental tumor models - lymphoblastic leucosis L-1210 and Lewis lung carcinoma (LLC). On lymphoblastic leucosis L-1210 PEG 5000 LEL showed optimal therapeutic effect at doses from 125 to 225 mg/kg, resulting in 100% recovery of treated animals. In addition to PEG 2000 LEL 100% antitumor effect was in dose 175 mg/kg. On Lewis lung carcinoma antitumor effect of PEG 5000 LEL resulting in 71,4 % and 86 % recovery of treated animals, was maximally pronounced at doses 225 and 250 mg/kg. Comparative investigation of lysomustine different drug formulations has shown that theuse of PEGLEL 5000 allowed to widen the range of therapeutic doses from 100 to 250 mg/kg and to increase PEG LEL reparation antitumour efficiency on animals bearing leucosis or solid tumors, achieving up to 100% recovery of treated animals without LEL toxicity noticeable increase.

Key words: lysomustine, PEG liposome, lymphoblastic leucosis L-1210, Lewis lung carcinoma (LLC).

А. В. Ланцова, А. П. Полозкова, Н. М. Перетолчина, 3. С. Шпрах, И.Б. Шоуа,

Н. А. Оборотова, А. Ю. Барышников

РАЗРАБОТКА И ИЗУЧЕНИЕ СТЕРИЧЕСКИ СТАБИЛИЗИРОВАННОЙ ЛИПОСОМАЛЬНОЙ ФОРМЫ ЛИЗОМУСТИНА

ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва

РЕЗЮМЕ

Данная статья посвящена разработке новой лекарственной формы лизомустина в виде стерически стабилизированных липосом, определению ее химико-фармацевтических характеристик и оценке противоопухолевой активности. Созданы пегилированные липосомы лизомустина, в составы которых включили ПЭГ-5000- и ПЭГ-2000-липиды. Противоопухолевая активность новых лекарственных форм изучена на 2 моделях экспериментальных опухолей: лимфобластном лейкозе Ь-1210 и карциноме легкого Льюис (ЬЬС). Показано, что лизомустин в ПЭГ-5000 - липосомальной лекарственной форме (ЛЛФ-5000) в дозах от 125 до 225 мг/кг проявил максимальный противоопухолевый эффект в отношении лейкоза Ь-1210, излечивая 100 % животных. Лизомустин в ПЭГ-2000 - липосомальной лекарственной форме (ЛЛФ-2000) излечивает 100 % мышей с Ь-1210 лишь в дозе 175 мг/кг. При карциноме легкого Льюис лизомустин в ЛЛФ-5000 излечивает 71,4 и 86 % животных в дозах 225 и 250 мг/кг. Кроме того, показано, что применение лизомустина в ЛЛФ-5000 позволяет расширить диапазон терапевтических доз препарата (125-250мг/кг) и получить максимальный противоопухолевый эффект без проявления токсического действия как при лейкозе Ь-1210, так и ЬЬС.

Ключевые слова: лизомустин, пегилированные липосомы, лейкоз Ь-1210, карцинома легкого Льюис.

ВВЕДЕНИЕ

Лизомустин — 2-хлорэтилнитрозоуреидопроиз-водное аминокислоты лизин относится к группе ни-трозоалкилмочевин (НАМ) и представляет собой смесь 2 изомеров (активного и малоактивного). Препарат синтезирован в Институте органического синтеза Уральского отделения РАН, лиофилизированная лекарственная форма для внутривенного введения разработана в ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН. Механизм противоопухолевого действия лизомустина, как и других производных НАМ, заключается в глубоком нарушении синтеза ДНК опухолевых клеток. При изучении лизомустина в эксперименте in vitro и in vivo показано, что препарат в однократной терапевтической дозе через 48-96 ч после введения ингибирует синтез ДНК в опухолевых клетках на 80 % [2].

Клиническое изучение лизомустина показало эффективность препарата при мелкоклеточном раке легкого и меланоме кожи. Для расширения возможности клинического изучения высокоэффективного препарата предпринята попытка создания новой лекарственной формы с более высокой избирательностью действия на опухолевые клетки и низкой токсичностью. Для достижения этой цели использовали липосомы — липидные везикулы, обладающие рядом достоинств. Благодаря своим коллоидным свойствам, контролируемым размерам, поверхностным характеристикам, мембранотропности и биосовместимости липосомы рассматриваются как перспективные системы доставки препаратов в кровеносное русло. Универсальность свойств липосомального носителя обеспечивает широкие возможности его применения, особенно в химиотерапии рака, т. к. липосомы позволяют предотвратить быструю деградацию высокореактивных противоопухолевых препаратов в биологических субстратах организма [1].

Наряду с разработкой обычных липосом («con-ventional») в последние годы ученых привлекают различные способы модификации поверхности липидных везикул с целью замедления захвата их клетками ретикулоэндотелиальной системы и пролонгирования времени циркуляции в кровотоке. Разработан способ видоизменения липосомальной поверхности полимерами с гибкой гидрофильной цепью. Для этого использовали синтетические липиды, конъюгированные с полиэтиленгликолем (ПЭГ). Стерически стабилизированные молекулы ПЭГ способны создавать на мембране избыточное осмотическое давление, защищая тем самым липо-сомальные везикулы от опсонинов. Подобное покрытие позволяет липосомам дольше находиться в кровотоке, что повышает их противоопухолевую активность [3].

В настоящей работе предложена новая лекарственная форма лизомустина в виде пегилированных (ПЭГ) липосом. Проведена первичная химико-фармацевтическая и биологическая стандартизация липосомаль-ной дисперсии.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалы

Лизомустин — ФСП 42-0494451903 ООО «Ака-демфарм».

Лизомустин лиофилизат — ФСП 42-0105086701 ООО Фирма «Глес».

При проведении исследований использованы вспомогательные вещества, которые соответствовали требованиям соответствующей нормативной документации: ГФ XI издания, USP 24 NF 19, отдельных Фармакопейных статей и ГОСТов:

1. Лецитин (фосфотидилхолин) — Е-80 (Lipoid, Германия).

2. Холестерин (Lipoid, Германия).

3. Кардиолипин (Lipoid, Германия).

4. Фосфотидилэтаноламинполиэтиленгликоль-2000 (Lipoid, Германия).

5. Дистеароилфосфотидилэтаноламинполиэтилен-гликоль-5000 (Avanti Polar Lipids, США).

6. Спирт этиловый 95%, ФС 42-3072-94.

7. Антиоксидант — а-токоферол.

8. Раствор глюкозы 5% для инъекций.

9. Вода дистиллированная для инъекций, ФС 422620-98.

Упаковочный материал

Для упаковки липосомальных дисперсий использовали флаконы из дрота (стекло НС-1) вместимостью 20 мл (ТУ 64-2-10-87), которые укупоривали силико-нированными резиновыми пробками по ИСО 8362-2 под обкатку алюминиевыми колпачками по ОСТ 64009-86.

Приборы и аппаратура

В работе использовали вакуумный насос «ВН-464А», испаритель ротационный «ИР-1М», оборудование фирмы «Миллипор», «Nuclepore», измеряющий размер наночастиц прибор «Наносайзер» (Submicron Particale Sizzer Nicomp 380 (США), мини-экструдер (Avanti Mini-Extruder set № 610000), спектрофотометр СФ-46, диализные мешки диаметром 1 см.

МЕТОДЫ

1. Технологический метод получения ПЭГ-липо-сом лизомустина.

Малые однослойные пегилированные липосомы получали гидратацией липидной пленки 1%-м водным раствором субстанции лизомустина, образующейся после упаривания в вакууме спиртовых растворов липидов с последующей экструзией липосомальной дисперсии через поликарбонатные мембраны. В качестве липидной основы использовали лецитин (фосфоти-дилхолин), для стабилизации липидного бислоя и уменьшения «вытекания» включенного в липосомы препарата в липидную оболочку вводили холестерин и кардиолипин. Для создания липосом с пролонгированным временем циркуляции в кровяном русле в состав липидной оболочки включали ПЭГ-5000 или ПЭГ-2000.

2. Химико-фармацевтические методы.

Количественное определение эффективности включения препарата в ПЭГ-липосомы проводили методом прямой УФ-спектрофотометрии.

Метод очистки липосом. Не включенный в ПЭГ-липосомы лизомустин отделяли методом равновесного диализа. Для этого использовали диализные мешки. Липосомальную дисперсию лизомустина погружали в диализный мешок диаметром 1см. Мешок помещали в емкость, содержащую 30 мл 5%-го раствора глюкозы. Диализ проводили при температуре +10 °С до тех пор, пока концентрация лизомустина во внешнем растворе не переставала изменяться. Далее определяли концентрацию лизомустина в липосомах (в диализном мешке) на спектрофотометре СФ-46.

Определение окисления липидов. Продукт перекис-ного окисления липидов — малоновый диальдегид (МДА) определяли пробой с тиобарбитуровой кислотой (ТБК). Для этого 0,5 мл анализируемого образца (липосомальной дисперсии) и 3,0 мл свежеприготовленного раствора сравнения перемешивали в пробирке и нагревали на кипящей бане в течение 30 мин. Далее измеряли оптическую плотность образца относительно раствора сравнения при длине волны 532±2 и 580±2 нм. Содержание в пробе МДА рассчитывали по формуле:

С = (Д532 - Д580)х6х 1000/155 (нмоль МДА/мл).

Приготовление раствора сравнения. 15 г трихлор-уксусной кислоты (ТХУ) и 0,67 г тиобарбитуровой кислоты (ТБК) растворяют в 100 мл дистиллированной воды и нагревают на водяной бане до полного растворения.

Определение размера липосом. Размер липосом определяли на спектрометре Nano-Sizer (Cultronics, США). Принцип работы прибора: определяется отраженный свет (под фиксированным углом) от совокупности частиц, суспензированных в растворителе. Интенсивность этого света колеблется во времени благодаря диффузии частиц. Существует четко определяемое характеристическое время жизни этих колебаний, которое обратно пропорционально диффузивнос-ти частиц. Далее, просчитывается автокорреляционная функция флуктуирующей интенсивности и строится убывающая экспоненциальная кривая (зависимость от времени). Получив константу времени затухания ф, рассчитывают диффузивность частиц. Наконец, с помощью уравнения Стокса—Энштейна рассчитывается радиус частиц:

Д = кТ/6п^К,

где к — кинетическая константа Больцмана (1,38-10-16 ед. к-1);

Т — температура (к = °С+273);

П — вязкость раствора (1,002-10-2 для воды при 20 °С).

Все математические операции проводили на компьютере с помощью специальной программы. На экране автокорреляционного спектрометра наблюдали кривую распределения липосом по размерам частиц. Результат оценивали с помощью гауссовского анализа

(обработка полученных данных методом наименьших квадратов — анализ по двум параметрам). Гауссовы популяции имели четко определяемый средний диаметр частиц. Однако этот подход используют только для простых распределений — симметричных унимодальных популяций. Асимметричные унимодальные и бимодальные распределения невозможно интерпретировать с помощью гауссовского анализа. Единственным признаком наличия более сложного распределения является высокое и растущее значение квадратичного отклонения (X2). Эти распределения оценивают с помощью никомповского анализа, который дает в результате 3 или 4 параметра, по которым можно судить о распределении липосом в образце (сколько (в %) в данной пробе содержится липосом определенного размера).

3. Биологический метод.

Оценка противоопухолевой активности новой ли-посомальной лекарственной формы лизомустина проводили на экспериментальных моделях опухолей мышей — лейкозе Ь-1210 и эпидермоидной карциноме легкого Льюис, которые перевивали на самцов-гибри-дов ВББ1, в сравнении со стандартной лиофильно высушенной лекарственной формой.

Методика трансплантации лейкоза Ь-1210

Лейкоз прививали внутрибрюшинно по

1,0—1,2х106 клеток/мышь в 0,3 мл среды 199 (подсчет клеток проводили в камере Горяева). Лечение начинали через 48 ч после трансплантации опухоли. Препарат вводили внутрибрюшинно, однократно. ЛЛФ-5000, ЛЛФ-2000 и лиофилизированную лекарственные формы лизомустина вводили животным в дозах 100; 125; 150; 175; 200 и 225 мг/кг (концентрация 10 мг/мл).

Терапевтический эффект оценивали по 2 критериям: увеличению продолжительности жизни леченных животных (УПЖ, %) и излечению животных.

1. УПЖ вычисляли по формуле:

УПЖ(%) =

спж0-спжк спж

хЮО,

где СПЖ0 и СПЖк — средняя продолжительность жизни мышей в опытных и контрольных группах соответственно.

2. Излечение животных: п/п1, где п/п1 — число излеченных мышей к общему числу животных в группе. Излеченными считали животных, не имеющих рецидивов заболевания после окончания лечения в течение 2 мес. и более.

Методика трансплантации карциномы легких ЬЬС В асептических условиях у животного-донора выделяли растущую внутримышечно опухоль. Опухолевую ткань тщательно промывали средой 199 (струйно из шприца), разрезали на несколько кусочков, удаляя при этом остатки неопухолевых тканей (мышцы, кости, сухожилия, капсулу, сгустки крови) и участки с некрозом. Затем опухоль взвешивали, измельчали ножницами до гомогенной консистенции и разводили питательной средой 199 в соотношении 1:10. Полученную

взвесь тщательно перемешивали шприцем с последовательно уменьшающимся диаметром иглы. После этого взвесь опухолевых клеток инокулировали по

1,0—1,5-106 клеток в 0,5 мл среды 199 мышам-реципи-ентам подкожно в область подмышечной впадины.

Лечение начинали через 48 ч после трансплантации опухоли. Препарат вводили внутрибрюшинно, однократно. ЛЛФ-5000 и лиофилизированную лекарственную форму лизомустина вводили животным в дозах 125; 150; 175; 200; 225 и 250 мг/кг (концентрация 10 мг/мл).

Противоопухолевый эффект препарата оценивали по трем критериям: торможению роста опухоли (ТРО, %); УПЖ (см. выше) и излечению (см. выше). ТРО вычисляли по формуле:

ТРО (%) = У°'У- х100,

У, ’

где У0 и Ук — средний объем опухоли в опытной и контрольных группах соответственно.

Объем первичного подкожного узла контрольных и леченных животных измеряли начиная с 7-х суток опыта, а затем в динамике с интервалом 5-7 дней вплоть до окончания эксперимента.

Статистическую обработку полученных результатов проводили по критериям Стьюдента (параметрический) и Колмогорова-Смирнова (непараметрический).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Для создания липосом с пролонгированным временем циркуляции в кровяном русле в составы липидных оболочек включили ПЭГ-липиды. Тот факт, что лизомустин является водорастворимым препаратом, позволил включить его во внутреннее водное пространство липосом. Не включенный в липосомы лизомустин отделяли методом равновесного диализа.

В результате проведенных технологических исследований установлено оптимальное молярное соотношение компонентов, входящих в модельные дисперсии липосомального лизомустина.

Состав 1

Лизомустин

Лецитин

Холестерин

Кардиолипин

Дистеароилфосфотидилэтаноламинполиэтиленг-

ликоль-5000

а-токоферол

Состав-2

Лизомустин

Лецитин

Холестерин

Кардиолипин

Фосфотидилэтаноламинполиэтиленгликоль-2000

а-токоферол

Первичную стандартизацию липосомальных дисперсий провели по следующим критериям качества: внешний вид, размер липидных везикул, количественное содержание лизомустина в единице объема дисперсии, концентрация МДА и противоопухолевая активность.

По внешнему виду дисперсии липосом не различались — молочно-белые, однородные, без расслоения. При использовании ЛЛФ-5000 лизомустина получены сразу мелкие липосомы — 155 ± 23 нм, поэтому в дальнейшем данные липосомы не измельчали экструзионным методом. Для состава 2 первоначальный размер липосом составил 980 ± 34 нм, после экструзии — 105 ± 30 нм. Количественное содержание действующего вещества (лизомустина) в единице объема дисперсии для ЛЛФ-5000 составило 90,4 ± 0,3 %, тогда как для состава 2 — 79 ± 0,5 %. Концентрация МДА оказалась равной 1,30 и 2,20 нмоль/мл, для состава 1 и 2 соответственно.

В табл. 1 представлены результаты изучения противоопухолевой активности липосомального лизомустина в отношении лимфобластного лейкоза мышей Ь-1210.

Из представленных данных видно, что лизомустин в ЛЛФ-5000 на мышах с лейкозом Ь-1210 в дозах от 125 до 225 мг/кг проявил высокий терапевтический эффект при однократном внутрибрюшинном применении с излечением 100 % животных.

В дозе 100 мг/кг одна мышь погибла от лейкоза, и увеличение продолжительности жизни составило 357 %. При применении этого состава липосом лизо-мустина в изученных дозах гибели животных от токсичности не выявлено.

Таблица 1

Противоопухолевая активность лииосомального лизомустина на лейкозе Ь-1210

Группа опыта Доза мг/кг, в/б х 1 раз УПЖ, % животных, погибших от лейкоза Гибель животных от ТОКСИЧНОСТИ, п/«1

Лиофилизированная 100 105,2 (2/6)’ — 4/6 (67)*

лекарственная форма 125 585 (1/5)* — 4/5 (80)*

лизомустина 150 — — 5/5 (100)’

175 — 5/5 (100)*

200 — 2/5(40) 3/5 (60)*

225 2/5(40) 3/5 (60)*

ПЭГ-5000 100 357(1/5)* - 4/5 (80)*

липосомальная 125 — — 6/6(100)*

лекарственная форма 150 - - 5/5(100)*

лизомустина 175 — — 5/5 (100)*

200 — — 5/5 (100)*

225 - - 5/5(100)*

ПЭГ-2000 100 178,5 (2/5)* — 3/5 (60)*

липосомальная 125 385,5 (2/5)* — 3/5 (60)*

лекарственная форма 150 386 (1/5)* — 4/5 (80)*

лизомустина 175 — — 5/5(100)*

200 — 1/5 (20) 4/5 (80)*

225 614(1/5)* 1/5 (20) 3/5 (60)*

250 - 2/5(40) 3/5 (60)’

Примечание. Контроль 1 — нелеченные мыши, средняя продолжительность жизни мышей 7,3 дня; контроль 2 — мышам вводили пустые липосомы, средняя продолжительность жизни 7 дней. р < 0,05 по отношению к контролю.

В то время как лизомустин в ЛЛФ-2000 излечивал 100 % животных лишь в дозе 175 мг/кг, в дозах 100 и 125 мг/кг он излечивал 60 % животных. Доза 250 мг/кг была токсичной для 40 % мышей, дозы 200 и 225 мг/кг — для 20 % животных.

Для лиофилизированной лекарственной формы ли-зомустина терапевтические дозы составляли 150 и 175 мг/кг, а дозы 100 и 125 мг/кг вызывали излечение 67 и 80 % животных соответственно. Дозы 200 и 225 мг/кг вызвали гибель 40 % мышей от токсичности.

В табл. 2 представлены результаты изучения противоопухолевой активности ЛЛФ-5000 в отношении карциномы легкого Льюис.

Таблица 2

Противоопухолевая активность липосомального лизомустина на карциноме легкого Льюис ЬЬС

1 Контроль 1 — нелеченные мыши.

2 Контроль 2 — мыши, которым вводили пустые липосомы; для контрольных мышей дан средний объем опухоли в мм3.

р < 0,05 по отношению к кошролю.

Как видно из табл. 2, при карциноме легкого Льюис максимальный противоопухолевый эффект лизомустина в ЛЛФ-5000 проявлялся при дозах 225 и 250 мг/кг, излечивая 71 и 86 % животных соответственно. Токсичность препарата не выявлена в этих дозах.

При применении лизомустина в лиофилизирован-ной форме в аналогичных дозах наблюдали излечение 57 и 29 % животных, при этом в дозе 225 мг/кг — 15 %, а в дозе 250 мг/кг 57 % животных погибли от токсичности. Максимальный противоопухолевый эффект отмечен в более низких дозах — 175 и 200 мг/кг и проявлялся излечением 86 % животных, тогда как

лизомустин в этих дозах в ЛЛФ-5000 вызывал излечение 29 и 57 % мышей соответственно. Лизомустин в дозах 125 и 150 мг/кг в обеих лекарственных формах проявил практически равный эффект как по излечению животных, так и по УПЖ мышей, погибших от опухоли (УПЖ=31 %).

Таким образом, проведенные исследования показали, что лизомустин в новой форме ЛЛФ-5000 при лейкозе Ь-1210 оказался наиболее эффективным. В отношении карциномы легкого Льюис противоопухолевая активность лизомустина в ЛЛФ-5000 превысила эффект, полученный при использовании препарата в лиофилизированной лекарственной форме. При этом следует отметить увеличение диапазона терапевтических доз лизомустина в ЛЛФ-5000 до 250 мг/кг без проявления токсичности.

ВЫВОДЫ

1. Разработана новая лекарственная форма лизо-мустина в виде пегилированных липосом.

2. По технологическим критериям отобрана для дальнейших исследований ЛЛФ-5000, содержащая 90,4 ± 0,3 % лизомустина; со средним диаметром липо-сом 155 ± 23 нм и с концентрацией МДА 1,30 нмоль/мл.

3. Показан высокий противоопухолевый эффект и отсутствие токсичности лизомустина в ЛЛФ-5000 при лейкозе Ь-1210 во всех тестируемых дозах (125-225 мг/кг).

4. Установлены эффективные терапевтические дозы лизомустина — 225 и 250 мг/кг в ЛЛФ-5000, которые вызывали излечение 71 и 86 % животных с карциномой легкого Льюис.

5. Показано, что ЛЛФ-5000 лизомустина более эффективная лекарственная форма, позволяющая расширить диапазон терапевтических доз препарата и снизить его токсичность по сравнению с лиофилизирован-ной лекарственной формой.

ЛИТЕРАТУРА

1. Грегориадис Г., Аллисон Л. Липосомы в биологических системах. — М.: Медицина, 1983. — 256 с.

2. Давыдов М. И., Барышников А. Ю. Экспериментальная онкология на рубеже веков. — М.: Издательская группа РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, 2003. — С. 147-159.

3. Торчилин В. П., Смирнов В. Н., Чазов Е. И. Проблемы и перспективы использования липосом для направленного транспорта лекарств (обзор) // Вопросы медицинской химии. — 1982. — Т. 28, № 1. — С. 3-12.

Доза мг/кг, в/бх 1 ТРО,%* Гибель Излечение

Группа опыта Дни после перевивки опыта токсичности, животных, п!п\ (%)*

раз 5-й 19-й 26-й я/яі

Контроль I1 477±163 12324±93 4 22005±19 05 — —

Лиофилизирован- 125 90,5 79,2 54,7 - -

ная лекарственная 150 92,3 82,3 78,8 — 2/7

форма 175 93,9 98,0 95,8 — 6/7

лизомустина 200 95,0 99,9 99,8 — 6/7

225 97,2 97,8 95,6 1/7

250 95,8 93,0 90,1 4/7

Контроль 22 332±195 11501±17 71 22763±17 93 — —

ПЭГ-5000 125 82,0 76,9 69,1 — —

липосомальная 150 89,5 80,7 74,4 — 2/6

лекарственная 175 88,6 82,3 68,5 — 2/7

форма 200 89,0 95,1 92,0 4/7

лизомустина 225 92,2 98,9 98,5 — 5/7

250 93,0 99,9 99,9 6/7