СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ЛЕЙЦИНА, L-ВАЛИНА, L-ИЗОЛЕЙЦИНА, АЛЬФА-КЕТОИЗОВАЛЕРАТА, АЛЬФА-КЕТО-БЕТА-МЕТИЛВАЛЕРАТА ИЛИ АЛЬФА-КЕТОИЗОКАПРОАТА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ РЕКОМБИНАНТНЫХ КОРИНЕБАКТЕРИЙ, СОДЕРЖАЩИХ ОПЕРОН ILVBN, КОТОРЫЙ МОЖНО ИНДУЦИРОВАТЬ ПРОПИОНАТОМ

1. Способ получения L-аминокислоты, выбранной из L-лейцина, L-валина и L-изолейцина, или α-кетокислоты, выбранной из α-кетоизовалерата, α-кетометилвалерата и α-кетоизокапроата, путем ферментации микроорганизмов из рода Corynebacterium, содержащих в реплицируемой форме полинуклеотид с операторной активностью, последовательность которого по меньшей мере на 85% идентична последовательности от положения 1 до 121 согласно SEQ ID NO: 1, 2 или 3, с которым связывается активатор PrpR, и функционально ниже которого на 3′-конце находится второй полинуклеотид, характеризующийся промоторной активностью, а также гены ilvB и ilvN, кодирующие субъединицы ацетолактатсинтазы, и который регулирует транскрипцию генов ilvBN в зависимости от добавления активатора PrpR в среду, к которой после первой фазы (фазы роста), проходящей без индуктора, во второй фазе в качестве индуктора добавляют пропионат или 2-метилцитрат, после чего синтезируют желаемую L-аминокислоту или α-кетокислоту в условиях, при которых увеличивается содержание желаемой L-аминокислоты или α-кетокислоты в среде и/или в клетках.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что полинуклеотид с операторной активностью предусматривает полинуклеотид (“IR 1”), последовательность которого по меньшей мере на 90%, предпочтительно по меньшей мере на 92, 94 или 96%, особенно предпочтительно на 100% идентична последовательности от положения 22 до положения 49 согласно SEQ ID NO: 1, 2 или 3, а также полинуклеотид (“IR 2”), последовательность которого по меньшей мере на 90%, предпочтительно по меньшей мере на 92, 94 или 96%, особенно предпочтительно на 100% идентична последовательности от положения 77 до положения 105 согласно SEQ ID NO: 1, 2 или 3, при этом полинуклеотид с операторной активностью предпочтительно представляет собой полинуклеотид с последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 92, 94 или 96%, особенно предпочтительно на 100% идентична последовательности от положения 1 до 121 согласно SEQ ID NO: 1, 2 или 3.
3. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что полинуклеотид с промоторной активностью представляет собой полинуклеотид, характеризующийся последовательностью, которая по меньшей мере на 90, 92, 94 или 96%, в частности, по меньшей мере на 97, 98 или 99%, особенно предпочтительно на 100% идентична последовательности от положения 122 до 206 согласно SEQ ID NO: 4.
4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что ген ilvB является полинуклеотидом, который кодирует полипептид, последовательность которого по меньшей мере на 90, 92, 94 или 96%, в частности, по меньшей мере на 97, 98 или 99%, особенно предпочтительно на 100% идентична последовательности согласно SEQ ID NO: 9, и ген ilvN является полинуклеотидом, который кодирует полипептид, последовательность которого по меньшей мере на 90, 92, 94 или 96%, в частности, по меньшей мере на 97, 98 или 99%, особенно предпочтительно на 100% идентична последовательности согласно SEQ ID NO: 10.
5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что используют микроорганизмы, в которых присутствующие дополнительные ферменты биосинтетического пути желаемой L-аминокислоты или α-кетокислоты дополнительно амплифицированы, в частности, сверхэкспрессированы, и/или в которых по меньшей мере частично ослаблены метаболические пути, которые снижают образование желаемой L-аминокислоты или α-кетокислоты.
6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что синтезируют L-валин.
7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что коринебактерии, используемые в фазе культивирования, проходят по меньшей мере 16, предпочтительно по меньшей мере 24 поколения, и ферментация предпочтительно включает по меньшей мере четыре стадии, предпочтительно предусматривающие встряхиваемый сосуд, предпосевной ферментер, посевной ферментер и ферментер для получения продукта.
8. Применение полинуклеотида, характеризующегося операторной активностью, последовательность которого по меньшей мере на 85% идентична последовательности от положения 1 до 121 согласно SEQ ID NO: 1, 2 или 3, для регуляции экспрессии генов ilvBN, кодирующих ацетолактатсинтазу, предпочтительно в комбинации с промотором, расположенным выше генов.
9. Кассета экспрессии, содержащая полинуклеотид, характеризующийся операторной активностью, последовательность которого по меньшей мере на 85% идентична последовательности от положения 1 до 121 согласно SEQ ID NO: 1, 2 или 3, расположенный ниже промотор, который предпочтительно характеризуется последовательностью, по меньшей мере на 90% идентичной последовательности от положения 122 до 206 согласно SEQ ID NO: 4, а также гены ilvBN, кодирующие ацетолактатсинтазу.
10. Вектор, содержащий кассету экспрессии по предыдущему пункту.
11. Применение кассеты экспрессии по п. 9 для экспрессии генов ilvBN в микроорганизмах, предпочтительно из рода Corynebacterium.
12. Применение вектора по п. 10 для экспрессии генов ilvBN в микроорганизмах, предпочтительно из рода Corynebacterium.
13. Микроорганизм, предпочтительно из рода Corynebacterium, особенно предпочтительно из вида Corynebacterium glutamicum, содержащий в реплицируемой форме кассету экспрессии по п. 9 или вектор по п. 10.
14. Микроорганизм по п. 13, отличающийся тем, что кассета экспрессии была интегрирована в хромосому микроорганизма.
15. Микроорганизм по любому из пп. 13 и 14, отличающийся тем, что он производит L-аминокислоту, выбранную из L-лейцина, L-валина и L-изолейцина, предпочтительно L-валин, или α-кетокислоту, выбранную из кетоизовалерата, кетометилвалерата и кетоизокапроата.
16. Микроорганизм по п. 15, отличающийся тем, что он производит L-валин, и в котором предпочтительно в повышенном содержании дополнительно присутствуют дополнительные ферменты биосинтетического пути L-валина, в частности, сверхэкспрессированые, и/или в котором метаболические пути, которые снижают образование L-валина, по меньшей мере частично ослаблены.