Культуры кроветворных клеток как тест-системы

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

УДК 611-018.46:576.8.093.33 © Ю.М.Захаров, 2009

Ю.М.Захаров

КУЛЬТУРЫ КРОВЕТВОРНЫХ КЛЕТОК КАК ТЕСТ-СИСТЕМЫ

Южно-Уральский научный центр РАМН

В статье изложены методы исследования пролиферации и созревания эритроидных клеток-предшественниц в различных культуральных системах. В статье описываются ответы эритроидных предшественников на действие различных биологически активных веществ.

Ключевые слова: долговременные жидкие культуры костного мозга; кроветворные клеточные клоны; эритроидные предшественники; жидкие культуры.

Yu.M. Zakharov HEMOPOIETIC CELL CULTURES AS TEST-SYSTEMS

The current methods of the study of proliferation and maturation of erythroid progenitors in different culture systems are presented in the paper. The review describes the response of erythroid progenitors to biologic active substances.

Key words: long-term bone marrow culture; hemopoietic cell clones; erythropoietic colony; erythrtoid progenitors; liquid culture.

Для оценки эффектов биологически активных соединений, наночастиц и наноматериалов, влияющих на ткани жизненно важных органов живых организмов и в частности на кроветворную ткань, поддерживающую развитие эритроидной линии гемопоэза, перспективным представляется использование в качестве биологических «мишеней» культуры клеток крови и кроветворных клеток-предшественниц in vitro. Техника исследования клонов мультипотентных и эритроидных кле-ток-предшественниц in vitro позволяет:

- количественно оценить способность к са-

моподдержанию и дифференциации эритроидных клеток-предшественниц, полученных у мыши и других лабораторных животных, а также у человека по представительству в культурах КОЕ-ГММЭ* (*Используемые сокращения: КОЕ - колониеобразующая единица; КОЕ-ГММЭ - грану-лоцитарно-макрофагально-мегакариоцитарно-эритроидная; ЭММ-эриттроцитарно-

макрофагально-мегакариоцитарная; ЭЭ-

эритроцитарно-эозинофильная; ГЭ - грануло-эритроцитарная; НЭоз-нейтрофильно-

эозинофильная; БОЕэ - бурстобразующая единица эритроидная; КОЕэ-КОЕ- эритроцитарная), бипо-тентных клеток (КОЕ-ЭММ, КОЕ-Э, КОЕ-ГЭ, КОЕ-ГМ и КОЕ-НЭоз), а также унипотентных БОЕэ ранних (мышиные - 8-10-й дни инкубации, у человека - 14-16-й дни), БОЕ-э поздних (мышиные

- 3-4-й дни, у человека - 8-9-й дни инкубации), КОЕэ (мышиные - 2-й день, у человека - 4-5-й дни инкубации) (часть колоний БОЕэ-ранних содержит мегакариоциты, что позволяет отнести их также к бипотентным клеткам);

- понять характер воздействуемых веществ на морфофункциональное состояние клеток, экспрессию рецепторов и антигенов на их мембранах, процессы регуляции эритропоэза на этапах диф-

ференцировки от КОЕ-ГММЭ до морфологически распознаваемых элементов красной линии);

- метаболическое обеспечение этих процессов, рецепцию и воздействие исследуемых соединений на пути внутриклеточной сигнализации, формирование вторичных мессенжеров и экспрессию генов;

- установить чувствительность различных КОЕ к регулирующему либо повреждающему действию испытуемых in vitro молекул [8,18,19].

Указанные свойства кроветворных клеток-предшественниц могут быть исследованы в культурах in vitro как с целью изучения эффектов различных воздействий, оказываемых на кроветворные клетки в целом организме, так и с целью изучения эффектов исследуемых соединений, воздействующих непосредственно на кроветворные клетки-предшественницы, культивируемые вне организма и добытые у здоровых животных или человека из костного мозга или периферической крови [40]. Методы исследования эритропоэза вне организма можно подразделить на 3 группы: клонирование кроветворных клеток-предшественниц эритроидной линии в полусолидном матриксе, культивирование в жидкой культуре выделенных из кроветворной ткани эритробластических островков или же и КОЕэ и БОЕэ, полученных из периферической крови, исследование эритропоэза в долговременных жидких культурах костного мозга (ДЖККМ) [8].

Клонирование кроветворных клеток в полутвердом матриксе

С целью исследования эритропоэтической функции кроветворных клеток человека, мыши и других животных в полутвердом матриксе используют агар, метилцеллюлозу, плазменный сгусток или коллагеный матрикс. В качестве источников бурстпромоторной активности (БПА) используют

кондиционную среду стимулированных селезеночных клеток, клеток WEHI-ЗВ, ФГА-стимулированных лейкоцитов человека, содержащую тромбопоэтин, фактор стволовой клетки, интерлейкины - ИЛ-3, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-9, ИЛ-11, колониестимулирующий фактор гранулоцитарный [41]. Применяют культуральные среды - Alpha-МЕМ или Искова, эритропоэтин, бычий сывороточный альбумин, сыворотку эмбриона теленка, 2-меркаптоэтанол. Воспроизводимые результаты, характеризующие количественно уровни содержания КОЕ-ГММЭ, БОЕэ и КОЕэ в исследуемых культурах гемопоэтической ткани, достигаются при строгом соблюдении подбора и доз ингради-ентов культивационной системы, выбранного

культурального матрикса, режимов температуры и газовой среды инкубатора, сроков культивирования. Указанные требования необходимо соблюдать, так как их изменение влияет на выходные параметры культуры. Например, при культивировании гемопоэтических клеток в плазменном сгустке число формирующихся эритроидных колоний оказывается намного большим, чем при выращивании в агаре [45]. Рост большего числа поздних эритроидных колоний может вызвать большая доза эритропоэтина (более 2 ед/мл) [38]. БОЕэ, формирующие 200 и более клеток, могут быть представлены в культуре в большем количестве при увеличении числа культивируемых клеток. В присутствии низких концентраций эритропоэтина ИЛ-3 вызывает уменьшение эритроидных колоний, происходящих из КОЕэ; в присутствии высоких концентраций эритропоэтина ИЛ-3 увеличивает формирование бурстов из БОЕэ, в присутствии ИЛ-3 потребность в бычьем сывороточном альбумине для формирования бурстов также снижается в несколько раз [37].

Наибольшее распространение в лабораториях экспериментальной гематологии получило культивирование эритроидных кроветворных кле-ток-предшественниц в агаре и метилцеллюлозе [8,38,43,46,56,54]. Агар легко готовить, хранить и использовать для работы. Он дает хорошую иммобилизацию клеток в матриксе. Распознавание колоний, как и в метилцеллюлозе, проводят по их морфологическим признакам. Отдельные колонии, культивируемые в метилцеллюлозе или агаре, могут быть аспирированы и исследованы на гемогло-бинизацию (по включению в них Fe59, аминокислот С14), синтез цепей глобина, цитохимические и ультраструктурные свойства, изозимные спектры, кариологический анализ, последовательности

ДНК, кодирующие различные эффекты генов, экспрессию последних. Однако агар и метилцеллюло-за не свободны от бактериальных продуктов (эндотоксин, пироген), микоплазмы, сульфатидов, полисахаридов, стимулирующих формирование колоний В-лимфоцитов, они могут содержать вещества, угнетающие развитие КОЕ-ГМ [44]. Конечное созревание в этих системах нарушено -гранулоциты часто лизируются на уровне метамиелоцитов, благодаря фагоцитозу агара наблюдается искусственная метахромозия моноцитарного

клона, часто бывает нарушена гемоглобинизация клеток, лизируется мембрана эритроцитов. Таким образом, необходимо учитывать, что при культивировании клеток в агаре, метилцеллюлозе, т.е. в системах, мало физиологичных, созревание эрит-роидных элементов БОЕэ идет не до конца, их терминальное созревание нарушено.

Более физиологические условия для созревания клеток создаются в плазменном сгустке или коллагеновом геле [44,45]. Двухэтапная окраска культуры в плазменном сгустке - вначале на хо-линэстразу мегакариоцитов, а затем ядер (по Фольгену) - дает надежные морфологические критерии для распознавания эритроидных, мегака-риоцитарных и грануло-моноцитарных колоний. Правда, плазменный сгусток также содержит биологические регуляторы, гормоны, ингибиторы клеточного деления в различных количествах, что необходимо учитывать при тестировании биологически активных соединений. Культивирование в коллагеновом геле дает возможность окраски препарат in situ по Май-Грюнвальду-Романовскому-Гимзе, чего нельзя сделать, используя клонирование в агаре и метилцеллюлозе. В данном матрисе сохранено созревание клеток всех линий (до сегментоядерных нейтрофилов, зрелых эритроцитов, формирования тромбоцитов), возможен дифференциальный подсчет лейкоцитарной формулы в больших КОЕ-ГМ колониях, in situ же возможны цитохимические и авторадиографические исследования, использование моноклональных антител, дифференциальный подсчет всех колоний. Использование более физиологичных культуральных систем - культивирование в коллагенном матриксе, долговременной жидкой культуре костного мозга культуры эритробластических островков -по сравнению с культурами, где используют агар и метилцеллюлозу в качестве матрикса, позволяет более полно оценить развитие эритроидной ткани из клеток-предшественниц, сохраняет терминальное созревание эритробластов, включающее де-нуклеацию нормобластов. Зрелые эритроциты в таких культурах переживают несколько дней, поскольку лизис мембран эритроцитов не наблюдается.

Разработаны различные способы выделения КОЕ-ГММЭ, БОЕэ и КОЕэ из кроветворной ткани и крови с последующим их исследованием в культуре. Из костного мозга или периферической крови человека БОЕэ получают после предварительного выделения мононуклеаров на градиенте плотности (например Ficoll-Histopaque). Ранние гемопоэтические клетки-предшественницы

(CD34+) выделяют, используя специальный набор

- сортинг для CD34+ клеток (иммуномагнитная сепарация CD34+ клеток.). Выделенные клетки культивируют в присутствии эритропоэтина и фактора стволовой клетки, получая к 12-му дню инкубации значительный выход колоний [55]. При более коротком периоде культивирования (7 дней) данные культуры служат источником для выделения КОЕэ уже через день нового культивирования

выделенной фракции таких клеток число КОЕэ в ней достигает 97% [57].

Более полному исследованию эффектов различных соединений на функции КОЕэ в культурах способствовало развитие эффективных приемов выделения КОЕэ из гемопоэтической ткани мыши, получение фракции, содержащей до 80-100% этих клеток [47,48]. В значительном количестве (до 3х107) КОЕэ in vitro в жидкой культуре получают из спленоцитов селезенки мышей, предварительно получавших тиамфеникол [61]. Стимулирующие пролиферацию КОЕэ эффекты эритропоэтина в данной культуре исследуются по включению метил-Н3-тимидина, выделенная РНК клеток подвергается Northern blot анализам, клетки исследуются с помощью проточной цитометрии. Разработаны и способы выделения ранних эритроидных клеток-проэритробластов (гликофо-рин А-позитивных эритрокариоцитов) из костного мозга здоровых доноров [7]. КОЕэ из содержащихся в периферической крови человека БОЕэ получают после последовательных операций: центрифугирования клеток крови в градиентах плотности, удаления лимфоцитов, ^+-клеток, адгези-рующихся клеток и CDHb+, CD2+, CD45R+,

CD16+-клеток и последующего накопления КОЕэ в культуре на 6-8-й дни инкубации в присутствии фактора стволовой клетки, эритропоэтина, ИЛ-3 и инсулина [52]. Поздние эритроидные клетки-предшественницы из костного мозга, плацентарной или периферической крови человека могут быть получены в ходе предварительного культивирования (2-3 недели) выделенных из исходного материала мононуклеаров в присутствии в культуральной среде дексаметазона и p-эстрадиола, а также фактора стволовой клетки, эритропоэтина, инсулиноподобного фактора роста-1 [49]. Использование вышеуказанных приемов клонирования кроветворных клеток-предшественниц позволило оценить эффекты на БОЕэ и КОЕэ ряда биологически активных соединений - эритропоэтина, естественных регуляторов гемопоэза - гемопоэтиче-ских цитокинов, различных серий простагланди-нов, трансферина, цистеина, фосфолипидов, циклических нуклеотидов, гормонов, адренэргических агонистов, селенитов, ионов кальция - и на основании полученных данных, развить представления о механизмах их действия на данные клетки-предшественницы [5,8,13], оценивать эффективность гемостимуляторов (синтетических производных глюкозаминогликанов - D-глюкуроновая кислота, байкалинат-лизин и др.), средств естественного происхождения - экстракта шлемника байкальского кропанола и др. [6]. Эритроидные культуры используют для испытания чувствительности, оценки особенности пролиферации и дифференциации БОЕэ и КОЕэ после воздействия на них различных концентраций соединений, вызывающих аплазию кроветворной ткани, например хлоралфеникола, тиаминфеникола, амфотерацина и др.[56], фенотипии после трансформации этих клеток онкогенными вирусными продуктами [56], воздействия активных форм кислорода, свободно-

радикальных реакций на данные клетки-

предшественницы. Эритроидные культуры были успешно использованы для выяснения чувствительности и переживания БОЕэ и КОЕэ при лучевых воздействиях (у-излучение) in vitro [56], цито-токсических соединений, например цитостатиче-ских эффектов гидроксимочевины на синтез ДНК в БОЕэ культуры [50].

Культура эритробластических островков костного мозга

Эритропоэз у млекопитающих и человека протекает в эритробластических островках костного мозга, представляющих собой ассоциацию клеток двух гемопоэтических линий - эритроид-ной и моноцитарной [30-33]. На основании накопленного нами опыта исследования эритропоэза в эритробластических островках in vivo [14,16,15,18] мы сформулировали характерные черты количественных и качественных изменений в эритробла-стических островках при стимуляции и угнетении эритропоэза, последовательность амплификации и дифференциации эритроидных клеток - от про-эритробласта до ретикулоцита в «короне», окружающей центральный макрофаг, при данных состояниях.

Метод культивирования эритробластиче-ских островков был разработан Ю.Захаровым и М.Прена в лаборатории М.Бессиса в 1981г. [60]. Культивирование выделенных из костного мозга крысы островков проводится с использованием среды Альфа-МЕМ или Искова, бычьей фетальной сыворотки, 2-меркаптоэтанола в присутствии разных доз эритропоэтина. Инкубация проводится в культивационном шкафу при температуре 37оС и содержании СО2, равном 4,5%. Для анализа эри-тропоэза в эритробластических островках нами предложены коэффициенты, характеризующие интенсивность формирования эритроидной «короны» островков: показатель общего количества КОЕэ, вступивших в дифференциацию, показатель интенсивного вовлечения КОЕэ в дифференциацию, показатель созревания эритроидных клеток в островках, показатель повторного вовлечения макрофагов в эритропоэз в эритробластические островки, разработаны методы функциональной оценки центральных макрофагов эритробластиче-ских островков по интенсивности и активности их фагоцитарной реакции, методы исследования биосинтетических процессов, происходящих в макрофагах эритробластических островков, определения кислой фосфатаза, неспецифической эстеразы, кислых и нейтрофильных глюкозаминогликанов [16,18,42], метаболизма простагландинов [42]. Непрерывно производимая видеосъемка культуры эритробластических островков позволяет наблюдать и регистрировать во времени удвоение эрит-роидных клеток в «короне» островка, контакт центральных макрофагов с эритроидными клетками, развитие пролиферативной и дифференцировоч-ной волн в эритробластических островках. Видеосъемка, а также фазово-контрастная микроскопия позволяют также оценить локомоторные ответы со стороны центральных макрофагов и эритроидных

клеток при добавлении в культуральную среду эритропоэтина и других биологически активных веществ. Накопленные нами данные позволяют предложить культуру ЭО в качестве тест-системы для определения биологической активности различных субстанций

[2,16,23,24,20,27,6], хлорорганических соединений, применяемых в промышленности и сельском хозяйстве (аминная соль 2,4-

дихлорфеноксиуксусной кислоты [22,25], полихлорированные бифенилы [1,21,3]) для оценки воздействия солей тяжелых металлов - N1, Со [26], микрочастиц 8Ю2 [51] с регистрацией следующих параметров:

- темп дифференциации КОЕэ в проэрит-робласты;

- амплификация и продолжительность клеточного цикла эритроидных клеток в островках;

- темп созревания эритроидных клеток - от проэритробластов до ретикулоцитов;

- синтез и секреция в культуральную среду клеточными компонентами островка - эритропо-этина, плацентарного росткового фактора, сосудистого эндотелиального ростового фактора, глико-заминогликанов (последние поддерживают эри-тропоэтическое микроокружение в островке) и др.;

- активность нуклеолярной транскрипции по активности ядрышковых организаторов в эрит-роидных клетках и макрофагах ЭО (гистохимически);

- апоптоз клеточных элементов островков;

- -экспрессия иРНК эритропоэтина и иРНК рецепторов эритропоэтина в клетках ЭО;

- фагоцитарная и секреторная активность центральных макрофагов эритробластических островков;

- состояние межклеточных взаимодействий в островке;

- адгезивные свойства островков;

- взаимодействие наноструктур с клеткой и ее органеллами, районов их возможного избирательного накопления в клетке, кинетика выхода из клетки [19].

Для оценки этапов развития из эритроидных клеток-предшественниц проэритробластов, формирования в культурах эритробластических островков используют также двухфазные жидкие культуры, формирующиеся из эритроидных кле-ток-предшественниц периферической крови человека [36,59,39,40]. С этой целью после культивирования мононуклеарных клеток, выделенных из периферической крови человека (клетки культивируют в модифицированной среде Би1Ъессо, содержащей фетальную сыворотку, кондиционную среду с БПА), получают отделенную от фагоцитирующих клеток фракцию нефагоцитирующих клеток и вновь культивируют ее в жидкой среде (среда Би1Ъессо, сыворотка эмбриона теленка, бычий альбумин, 2-меркаптоэтанол, насыщенный Бе

трансферрин, эритропоэтин). При данном повторном культивировании через 4-5 дней в культуре

начинается формирование проэритробластов. Данная 2-я фаза жидкой культуры позволяет изучать как начало формирования эритробластических островков, так и характер взаимодействий центральных макрофагов с эритроидными клетками «короны» островков, влияния на эти процессы вносимых в культуру различных соединений -глюкозаминогликанов (гепарина и др.).

Долговременные жидкие культуры костного мозга

ДЖККМ оказались удачной моделью, позволяющей исследовать роль различных клеток костного мозга и их взаимодействий со стромаль-ными элементами костного мозга в формировании активных гемопоэтических участков - «булыжни-ковой мостовой» (cobblaston regions), последовательность развития данных гемопоэтических очагов эритроидной серии клеток - от ранних БОЕэ до зрелых эритроцитов [28,29,35,53]. Эритропоэз в ДЖККМ идет подобно таковому в костном мозге живого организма при стимуляции его эритропо-этином и БПА, т.е. через формирование эритроб-ластических островков с созреванием эритробла-стов в ЭО, включая энуклеацию нормобластов. ЭО начинают появляться в ДЖККМ через 2-3 недели после внесения в нее сыворотки анемичных мышей (содержащей БПА и эритропоэтин), что во времени соответствует созреванию БОЕэ-ранней до морфологически распознаваемых эритроидных клеток. ЭО содержат от 2 до 32 эритробластов [53], т. е. эритробласты в них совершают 5 делений, как и in vivo [33]. Исследуя «неприлипающие» клетки в культуральной среде ДЖККМ, можно одновременно определить в ней содержание и свойства КОЕ-ГММЭ, БОЕэ и КОЕэ. Благодаря подвижности клеток в ДЖККМ, процессы кроветворения регистрируются с помощью телевидеосъемки, позволяющей вносить кинетические оценки формирования гемопоэтически активных участков в культуре (cobblaston regions). Помимо развития эритроидной линии клеток - от БОЕэ до эритроцитов - ДЖККМ позволяют проследить развитие гранулоцитарной линии клеток, конечное созревание которых в костном мозге оканчивается формированием гранулоцитарных и смешанных островков.

Гранулоцитарные островки костного

мозга

Исследования, выполненные в разных лабораториях мира в 80-90-е гг. ХХ века с использованием приемов, щадящих хрупкие межклеточные контакты в гранулоцитарных островках при их выделении из костно-мозговой ткани, подтвердили реальность данной формы межклеточных взаимодействий в костном мозге [4,34]. Гранулоцитарные островки, выделенные из костного мозга мышей, представляют собой макрофагальные клетки, окруженные разными формами развития клеток гра-нулоцитарного ряда [53]. Доказана возможность формирования гранулоцитарных островков в ДЖККМ под воздействием сыворотки анемичных мышей, содержащей активаторы гранулоцитопоэза [53]. После добавления в культуру данного актива-

тора количество гранулоцитарных островков возрастало в 10 раз. В гранулоцитарных островках наблюдались митозы преметамиелоцитов, в зрелых гранулоцитарных островках отмечается высокая степень синхронизации этапов созревания клеток нейтрофильного ряда до стадий метамиелоцитов, палочко- и сегментоядерных нейтрофи-лов. Общее число гранулоцитов, контактирующих с макрофагом, составляет в среднем 16 клеток. Непрерывная телевидеосъемка ДЖККМ показала, что время жизни гранулоцитарного островка составляет 24 часа, время освобождения зрелых гра-нулоцитов из островков занимает от 4 до 6 часов.

Наши эксперименты [9,10,11] с ДЖККМ здоровых мышей (воспроизведенные по методу Т.Декстера) показали возможность стимуляции в культуре добавлением сыворотки анемичных мышей дифференциации КОЕгммэ и БОЕэ, увеличения воспроизводства эритробластов, мегакариоб-ластов, нейтрофилов, моноцитов-макрофагов,

формирования и роста количества вначале грану-лоцитарных, а затем и эритробластических островков. Внесение сыворотки анемичных мышей в ДЖККМ мышей-мутантов 81/81а и 81ёьп/81соп,

имеющих мутацию в локусе, контролирующем

синтез фактора стволовой клетки, не стимулировало или недостаточно стимулировало эритропоэз и мегакариоцитопоэз, угнетало формирование гра-нулоцитарных и эритробластических островков в ДЖККМ. Этот же вывод подтвердило наблюдение культуры с помощью непрерывной телевидеосъемки: в ДЖККМ здоровых мышей добавление сыворотки анемичных мышей закономерно вызывало вначале волну формирования гранулоцитар-ных, а затем и эритробластических островков, а в ДЖККМ 81-мутантов, имевших недостаточную секрецию фактора стволовой клетки, обнаруживалось резкое снижение контакта макрофагов с кроветворными клетками, подавлялось формирование эритробластических и гранулоцитарных островков.

Таким образом, разработанные и применяемые ныне в экспериментальной гематологии методы культур тканей могут быть использованы для изучения возможного действия различных биоактивных соединений и наноматериалов разного назначения на развитие эритроидной линии клеток, включая определение характера их повреждающих эффектов на кроветворную ткань.

Литература

1. Богданова А.В. Изменения в эритроне в восстановительном периоде после подострого воздействия различных доз полихлорированных бифенилов: дис. ...канд.мед.наук. - Екатеринбург, 2006. - 181с.

2. Волков А. В. Влияние нейтрофилов и их секреторных продуктов на эритропоэз в эритробластических островках костного мозга: дис.. канд.мед.наук. - Челябинск, 1991. -137с.

3. Гайсина А.Ф.Изменения в эритроне при сочетанном воздействии различных доз полихлорированных бифенилов и оксиметилурацила: дис..канд.мед.наук. - Казань, 2002. -184с.

4. Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Захаров Ю.М. К вопросу о специфичности механизмов регуляции кроветворения при различных экстремальных воздействиях //Патологическая физиология и экспериментальная терапия. - 1991.- Т.3, №3.-С.7-10.

5. Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Провалова Н.А. и др. Роль нервной системы в регуляции кроветворения.- Томск, 2004. - 143с.

6. Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Жданов В.В. с соавт. Фармакологическая регуляция системы крови при экспериментальных невротических воздействиях. - Томск: Изд-во Томского университета, 2007.- 151с.

7. Денисова В.В., Кулагин А.Д., Лисуков И.А. и др. Цитокинсинтезирующая активность эритрокарио-цитов костного мозга и ее регуляция в норме //БЭБМ. - 2007.- Т. 143.- № 2.- С.179-182.

8. Захаров Ю.М. Прогресс в изучении эритропоэза ин витро //Гематология и трансфузиология.- 1988.-№ 12.-С. 25-33

9. Захаров Ю.М. О гуморальных посредниках, мобилизирующих эритропоэз, в условиях гипоксии //Актуальные вопросы патологии дыхания. - Куйбышев, 1989.- С.257-258.

10. Захаров Ю.М. О содержании КОЕгммэ, БОЕэ и КОЕф в гемопоэтической ткани 81-мутантов: Тезисы докладов 2-го съезда физиологов Уральского региона. - Свердловск, 1990.-С.13-14.

11. Захаров Ю.М. О переживании стволовых кроветворных клеток в долговременных жидких культурах костного мозга 81-мутантов: Тезисы докладов конференции патофизиологов Урала. - Челябинск, 1991.-С.4-45.

12. Захаров Ю. М. О роли нервной системы и ингибиторов кроветворения в его регуляции //Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова.- 2004.- Т.90.- №8.- С.987-1000.

13. Захаров Ю. М. Реакция эритропоэза на стрессорные нагрузки: Рук-во по реабилитации лиц, подвергшихся стрессовым нагрузкам. -М.: Медицина, 2004.-С. 182-193.

14. Захаров Ю.М., Мельников И.Ю., Рассохин А.Г. Классификация эритробластических островков костного мозга с учетом изменения их клеточного состава //Архив анат., гистол. и эмбриол.- 1990.- №5.-С.38-42.

15. Захаров Ю.М., Тишевская Н.В. О взаимосвязи функциональной активности макрофагов с кинетикой эритропоэза в эритробластических островках //Вопр. эксперим. физиол.-М.-Екатеринбург, 1997.- С. 95103.

16. Захаров Ю.М., Рассохин А.Г. Эритробластический островок. -М.: Медицина, 2002.-280с.

17. Захаров Ю.М., Тишевская Н.В. Динамика клеточного состава эритробластических островков при культивировании in vitro //Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова.-2001.- Т.87.-№ 1.-С.84-89.

18. Захаров Ю.М., Тишевская Н.В. Об особенностях ассоциации клеток моноцитарной, эритроидной и гранулоцитарной линий в кроветворной ткани // Медицинский академический журнал.-2003.- Т.3.-№2.-С. 11-18.

19. Захаров Ю.М., Тишевская Н.В., Шевяков С.А. и др. Метод тестирования биологической активности различных веществ in vitro //Клеточные нанотехнологии в биологии и медицине. - Курган, 2007.-С. 3436.

20. Калайджиева В.Ц. Хуморални и междуклетьчни взаимодействия в регулацията на еритропоезата: дис. .д-ра мед. наук.- Стара Загора, 1996. - 169с.

21. Каримов Р. Р. Исследование механизмов развития анемии при подострой интоксикации полихлорированными бифенилами: автореф. дис.. канд. мед. наук. -Тюмень, 2007.

22. Каюмова А.Ф. Нарушения в системе крови, вызванные гербицидом - аминной солью 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты: дис.. д-ра мед. наук. - Челябинск, 1996 - 290с.

23. Крестьянинова О.Г. О характере эритропоэза в эритробластических островках костного мозга при экспериментальных анемиях: дис.. канд. биол.наук.- Челябинск, 1994. - 123с.

24. Тишевская Н.В. Экспериментальные исследования регуляции эритропоэза в культуре эритробласти-ческих островков: - Дис.. д-ра мед. наук.- Челябинск, 2005 - 286с.

25. Фазлыахметова М.Я. Коррекция токоферолом изменений в эритроне и внутренних органах, вызванных действием гербицида аминной соли 2,4- дихлорфеноксиуксусной кислоты: дис. канд.мед. наук.-Уфа, 2004.-200с.

26. Шакиров Н.Н. К оценке нестабильности цитогенетического аппарата эритроидных клеток у жителей Южного Урала: дис.. канд. мед. наук. - Челябинск, 2001. -153с.

27. Шевяков С. А. Влияние эритроцитов разной степени зрелости на эритропоэз в культуре эритробласти-ческих островков: дис.. канд. мед. наук. - Челябинск, 2005. -130с.

28. Allen T., Dexter T. Ultrastructural aspects of erytrhropoietic differentiation in long-term bone marrow culture //Differentiation. 1982. Vol.21. P.87-94.

29. Allen T., Testa N. Cellular interactions in erythroblastic islads in long-term bone marrow culture, as studied by time-lapse video // Blood cells.1991. Vol.213 (6). P.29-43.

30. Bessis M. L'ilot erythroblastique. Unite' functionelle de la moelle osseuse. Rev. Hematol , 1958;13:8.

31. Bessis M.et Breton-Gorins J. J. L'ilot erythroblastique et la rhopheocytose dans l'anemie ferriprive. Rev.Hematol. 1960; 15:233-240.

32. Bessis M. Living Blood Cell and their ultrastructure. NY, Springer, 1973;870p.

33. Bessis M., Mize C., Prenant M. Erythropoiesis: Comparison of in vivo and amplification// Blood cells.1978. Vol.4. P.155-168.

34. Crocker P., Gordon S., Isolation and characterization of resident stromal macrophages and hematopoietic cell clasters from mouse bone marrow // J.Exp. Med. 1985. Vol.162 (9). P.993-1014.

35. Dexter T., Spooncer E., Simmons P. Long-term marrow culture: an overview of techniques and experience. -New York, 1984. P.57-96.

36. Fibach E., Manor D., Oppenheim A et al., Proliferation and maturation of human erythroid progenitors in liquid culture // Blood 73:100: 1989.

37. Goldwasser E. Hematopoietic stem cell physioljgy: progress in clinical and biological research. New.York: Alan R. Liss. 1985.

38. Gregory C.J.// Erythropoietin sensitivity as a differentiation marker in the hemopoietic system: studies of three erythropoietic colony responses in culture. // J. Cell.Physiol.- 1976/ Vol.89. P.289-302.

39. Hauspal By M. and Hanspal J.S. The association of erythroblasts with macrophages promotes erythroid proliferation and maturation: // Bioll. Vol.84, 10, 1994. p. 3494-3505.

40. Hauspal By M., Smockova Y and Uong Q. Molecular identification and functional characterization of a novel protein that mediates the attachment of erythroblasts to macrophages // Blood, Vol.92, No.8, 1998/ -p.2940-2950.

41. Hermine O., Romeo P-H. Regulation of erythropoiesis. Disoders of ironhomeostasis, erythrocytes, erythro-poieses. Genoa. Italy. 2006. p 38-71.

42. Kalaidjieva V. Modulation of erythropoiesis in rat bone marrow etythroblastic islands by cyclooxygenase inhibition. // Gen Pharmac. 1999. 32 (4): 423-8.

43. Konwalinka G., Peschel C., Boyd J. Miniaturized agar culture system for cloning human erythropoietic progenitor cell // Ibid. Vol.12. P. 75-79. - 1984.

44. Lannote M. Terminal differentiation on Hemopoietic cell clones cultured in Tridimentional collagen matrix: in citu cell morphology and enzyme histochemistry analysis // Biol. Cell. 1984. Vol.50. P. 107-120.

45. Mc Leod D, Shreeve M., Axelrad A. // In vitro aspects of erythropoiesis. - New York, 1978. P. 31-36.

46. Metcalf D. Hemopoietic colonies, in vitro cloning of normal and leukemic Cell. Heidelberg: Springer-Verlag; 1977.

47. Nicola N., Metcalf D., von Melchner H. Isolation of murine fetal hemopoietic progenitor cells and selective fraction. // Blood.- 1981.-Vol.58.- P.376-386.

48. Nijhof W., Wierenga P.K. Isolation and characterization of the erythroid progenitor cell CFU-E // J. Cell biology. - 1983.-Vol.96, 2.

49. Panzenbock B., Bartunek P., Mapara M.Y., Zenke M. Growth and differentiation of human stem cell factor/erythropoietin-dependent erythroid progenitor cell in vitro // Blood, 1998. 92:3658.

50. Pluthero F.G., Shreeve M., Eskinazi D. et al. Purification of an inhibitor of erithroid progenitor cell cycling and antagonist to interleukin 3 from mouse marrow cell supernatant and its identification as cytosolic superoxide dismutase. // J. Cell Biology. Vol 111. 1990. 1217-1223.

51. Rich I.N., W.Heit, and Kubanek B. An erythropoietic stimulating factor similar to erythropoietin released by macrophages after treatment with silica // Blut 1980, 40, 297-303.

52. Sawada K., Krantz S.B., Kans J.S. et al., Purification of human erythroid colony-forming units and demonstration of binding of erythropoietin. // J.Clin Invest 80 (2): 1987, 357.

53. Simmons P. Cellular interactions in vitro haemopoiesis. Thesis of Doctor of Phylosophy. Manchester, 1984. P.230.

54. Sadahira Y., Yasuda T. Impaired splenic erythropoiesis in phlebotomized mice injected with CL2MDP-liposome: an exptrimental model for studying the role of stromal macrophages in erythropoiesis // J. of leukocyte biology. 2000; 68; 464-470.

55. Stopka By T.,Zivnu J.H.,Stopkova P.et al.Human hematopoietic progenitors express erythropoietin // Blood, , 1998, Vol, 91, No.19, p 3766-3772.

56. Testa N. Clonal assays for haemopoietic and lymphoid cell in vitro // In: Cell clones: manual of cell techni-gues. - Churchill Livingstone. - Edinburgh. - 1985.- P.27-43.

57. Tordjman R., Delaire S., Plouet J. et al. Erythroblasts are a source of angiogenic factors //Blood, 2001, vol.97, 1968-1974.

58. Watt S.M. and Vissert J.W.M. Resent advances in the growth and isolation of primitive human haemopoietic progenitor cell. // Cell. Prolif.1992, 25, 263-297.

59. Wada H., Suda T., Miura Y. Expression of major blood antigens on human erythroid cells in a two phase liquid culture system. Blood 75:505, 1990.

60. Zakharov Yu.M., M. Ptenant. Nouvelle technique d'isolement et culture des macrophages centraux des ilots erythroblastiques //Nouv. Rev. Fr. Hematol., 1982, 24, 6, 363-367.

61. Zhang D., Johnson M.M., Miller C.P. et al. An optimized system for studies of EPO-dependent murine proerythroblast development. // Exper. Hematology. 2001; 29, 1278-1288.