КОМПОЗИЦИИ НА ОСНОВЕ БИОРЕСУРСОВ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ИЛИ ЛЕЧЕНИЯ СЕПСИСА И/ИЛИ СВЯЗАННЫХ С СЕПСИСОМ ОСЛОЖНЕНИЙ И СОСТОЯНИЙ, СПОСОБЫ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ СЕПСИСА
BASED ON BIORESOURCES COMPOSITIONS FOR PREVENTION OR TREATMENT OF SEPSIS AND/OR SEPSIS-RELATED COMPLICATIONS AND CONDITIONS, METHODS FOR SEPSIS PREVENTION AND TREATMENT

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к области ветеринарии и медицины. В частности, настоящее изобретение относится к применению композиции на основе гидролизата, полученного из одного или более природных биоресурсов, выбранных из группы, включающей двустворчатых моллюсков, кольчатых червей, пиявок, для профилактики или лечения сепсиса и/или связанных с сепсисом осложнений и состояний у нуждающегося в таком лечении или профилактике млекопитающего. Настоящее изобретение также относится к способам профилактики и лечения сепсиса и связанных с сепсисом состояний и осложнений с помощью вышеуказанной композиции.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Сепсис (бытовое непрофессиональное название - заражение крови) - труднообратимый инфекционно-токсический процесс, вызываемый попаданием в кровь и ткани животных, включая людей, возбудителей инфекции, в частности, патогенных и условно патогенных микроорганизмов и продуктов их жизнедеятельности и возможностью размножаться в кровеносной и лимфатической системах в условиях иммунодефицита и снижения бактерицидных свойств крови инфицированного субъекта. Сепсис сопровождается глубокими нервно-дистрофическими сдвигами и резким ухудшением всех функций организма, которые возникают вследствие интоксикации и генерализации возбудителя из первичного очага инфекции.
Сепсис не является достаточно изученным заболеванием. В связи с этим нет единых взглядов на этиологию, патогенез сепсиса и стратегию его лечения.
Специфического возбудителя сепсиса не установлено. Традиционно наиболее частыми возбудителями сепсиса считаются грамотрицательные микроорганизмы (E.coli, K.pneumoniae и Enterobacter cloacae, иногда и Neisseria Gonorrhoae и Meningitidis, Lysteria Monocytogenus, Salmonella, Bacillus Anthracis, Francisella Tularensis, Yersinia Enterocolitica), однако в последние десятилетия превалировать стали грамположительные: коагулазонегативные стафилококки, золотистый стафилококк и Enterococcus faecalis. Изменение возбудителя сепсиса связывают с селекцией резистентных грамположительных возбудителей в результате широкого применения эмпирической антибактериальной терапии, эффективной преимущественно в отношении грамотрицательной флоры, возросшего применения сосудистых катетеров и имплантатов, повышения вирулентности грамположительной флоры.
В целом, по характеру возбудителя различают стрептококковый, стафилококковый, анаэробный и смешанный сепсис. В частности, по данным Б.Р. Гельфанд, В.А. Гологорский, С.З. Бурневич, Е.Б. Гельфанд, В.Е. Гиткович "Абдоминальный сепсис: современный взгляд на нестареющую проблему. Стратегия и тактика лечения. Часть II / Вестник интенсивной терапии, 1997, №1-2, с. 73-79ʺ, при абдоминальном сепсисе, возникающем вследствие осложненного течения перитонита, среди возбудителей выделяют эшерихии (30%), клебсиеллы (14%), псевдомонады (13%), протей (10%), стрептококки (8%), стаффилококки (7%), энтеробактерии (7%), бактероиды (17%).
Развитию сепсиса способствуют условия, ухудшающие реактивность организма животного или человека, понижающие сопротивляемость и вызывающие его сенсибилизацию. Проникшие в кровь микробы частично погибают под влиянием ее бактерицидного действия, сохранившиеся заносятся в различные органы. При выраженном общем иммунитете, фагоцитарной активности физиологической системы соединительной ткани эти микробы уничтожаются, а при пониженной защитной реакции и сенсибилизации организма они «оседают» в органах и вызывают развитие метастатических абсцессов. Из этих абсцессов микробы периодически поступают в кровь. Обнаружение одного и того же микроба в крови при ряде исследований подтверждает наличие сепсиса, отрицательные же результаты не дают основания к его исключению.
Развитию сепсиса чаще всего предшествует местный септический очаг в виде абсцесса, карбункула, флегмоны, случайных и огнестрельных ран мягких тканей, остеомиелита, гнойных артритов, плевритов, пневмоний, перитонитов, гнойных и гнилостных метритов и др.. По локализации первичного септического очага он может быть послеродовый, отогенный, одонтогенный, миогенный, унгулярный (копытный), послеабортовый, послеродовый, перитонеальный, раневой, ожоговый, уросепсис, сепсис новорожденных, а также криптогенный сепсис.
Принято выделять хирургический сепсис. Большинство случаев диагностированного сепсиса относится именно к хирургическому сепсису, причинами которого являются осложнения различных хирургических гнойных заболеваний или повреждений: раны, ожоги и прочее. Зарегистрированы случаи возникновения сепсиса после проведения полостных и других хирургических операций без строгого соблюдения асептики и антисептики, вследствие неумело выполненной акушерской помощи, а также в результате нарушения послеоперационных лечебных процедур, условий ухода за животными/больными и условий их содержания.
Сепсис может возникать неожиданно, без клинического выявления местного инфекционного очага. Такой сепсис называется криптогенным. Он, как правило, бывает следствием вспышки дремлющей инфекции (кариесный зуб, зарубцевавшиеся раны, вжившийся ранящий предмет и пр.). Таким образом, для возникновения сепсиса необязательно наличие остро протекающего первичного септического очага, но совершенно необходимо проникновение в организм животного или человека через кожу или слизистые оболочки патогенных микробов. Однако решающим в его возникновении оказывается состояние организма животного или человека. Перегревание, переохлаждение, истощение, снижение иммунобиологических реакций организма, активности физиологической системы соединительной ткани, антитоксической функции печени, болевые и другие стрессы вегетативных центров и корковой структуры служат благоприятным фоном для возникновения сепсиса.
Развитие сепсиса не находится в прямой зависимости от степени повреждения тканей и тяжести первичного септического процесса. Первичный септический очаг и вирулентность микробов играют главным образом роль пускового механизма. Именно поэтому нельзя исключать, что сепсис или болезненное состояние близкой природы может возникнуть как осложнение воспалительного процесса, вследствие чего предотвращение развития сепсиса и лечение широкого ряда воспалительных заболеваний тесно связаны.
Наряду с первичным очагом в организме затем образуется несколько вторичных очагов в виде метастазов либо весь организм превращается в общий септический очаг. Именно поэтому, если при гнойно-резорбтивной лихорадке тщательная хирургическая обработка первичного септического очага приводит к улучшению и последующему выздоровлению, при сепсисе даже полное оперативное удаление первичного септического очага из организма не улучшает его течения: тяжесть местного септического очага усугубляет септический процесс и, наоборот, септический процесс усиливает течение местного септического очага.
Клиническое течение сепсиса может быть молниеносным (бурное развитие проявлений в течение первых 2 суток), острым (до 5-7 суток), подострым и хроническим. Может наблюдаться стертость характерных симптомов, что вызвано значительным изменением свойств возбудителей в связи с массовым эмпирическим применением антибиотиков.
По тяжести протекания при диагностике сепсиса различают
- синдром системной воспалительной реакции (SIRS), характеризующийся отклонением температуры тела и количества лейкоцитов крови от нормы, учащенными сердцебиением и дыханием,
- сепсис, характеризующийся теми же симптомами, что и в случае синдрома системной воспалительной реакции, а также выявлением по меньшей мере одного из известных патогенных микроорганизмов в по меньшей мере одной из тканей, в норме являющихся стерильными, и проявлением местных воспалительных процессов, например, перитонита, пневмонии, пурпуры и т.д.,
- тяжелый сепсис (полиорганная недостаточность), характеризующийся теми же симптомами, что и сепсис, но с проявлениями гипотензии, гипоперфузии и дисфункции отдельных органов,
- септический шок - наиболее тяжелое септическое состояние, которое из-за нарушений кровоснабжения органов и тканей в подавляющем большинстве случаев приводит к смерти больного.
До настоящего времени не разработаны вполне эффективные методы лечения при сепсисе, поскольку смертность находится на уровне 30-40%, а в случае развития септического шока - на уровне 60-80%. Хорошо известно, что терапия должна быть ранней, комплексной, направленной на подавление микробного фактора, нейтрализацию и выведение из организма токсинов, а также на нормализацию всех функциональных нарушений организма.
Подавление микробного фактора осуществляют посредством антибактериальной терапии, которая не всегда выводит субъекта лечения из зоны риска из-за уже упоминавшейся ранее выработанной резистентности микроорганизмов к известным антибиотикам. Поэтому в комплекс мер по антисептической терапии, помимо прочего, обязательно входит повышение сопротивляемости самого организма за счет введения витаминных и иммуномодулирующих препаратов.
В указанной области техники существует определенный интерес к разработке противовоспалительных, противовирусных и иммуномодулирующих препаратов на основе биосырья, в котором могут содержаться компоненты, эффективные в борьбе с патогенными микроорганизмами.
Из уровня техники известно применение некоторых препаратов на основе биосырья, которые используются самостоятельно или в рамках традиционной комплексной терапии совместно с антибиотиками для лечения воспалительных заболеваний и для предотвращения и лечения сепсиса.
Применение неагрессивных и эффективных противовоспалительных средств особенно актуально при лечении детей младшей возрастной группы, которым мало подходят или не подходят в принципе известные радикальные методы, применяемые для лечения сепсиса у взрослых пациентов.
В частности, в патенте SU 1710060 показана эффективность применения акульего жира при лечении сепсиса у детей грудного возраста, вводимого перорально в дозировке 4,5-5,5 г 2 раза в сутки дополнительно к традиционной комплексной терапии, для сокращения сроков лечения.
В патенте РФ 2499604 показана эффективность первичной композиции, представляющей собой суспензию плодов заманихи (дерезы) в молоке или содержащем молочный белок носителе, не содержащей нерастворимые волокна, предназначенной, помимо прочего, для перорального и/или парентерального применения, для лечения или профилактики воспаления, в том числе, острого воспаления, включающего сепсис, инфекции, ожоги. Указанная композиция может предназначаться для младенцев, детей, подростков, взрослых и/или пожилых людей.
В патенте РФ 2295972 предложено применение препарата из активного вещества матрикса зубной эмали, источником которого могут являться развивающиеся зубы молодых сельскохозяйственных животных или кожа рыб, для производства фармацевтической композиции для профилактики или лечения системного воспаления и/или инфекции. Показано, что указанная композиция защищает от тяжелого септического шока и полиорганной недостаточности, вызванной токсином или тяжелой системной инфекцией.
В заявке WO 97/23235 описана фармацевтическая композиция из биосырья, полученного из меченосцев, содержащая, в частности, природные белки анти-LPS фактора, которая может применяться сама по себе или в сочетании с антибиотиками, для лечения ряда воспалительных заболеваний, включая септицемию, акне, токсический шок, бактериальные инфекции, вызванные патогенными микроорганизмами, пиогенный артрит, гонорею, пародонтит, менингит, инфекции амниотической жидкости, инфекции дрожжевыми и плесневыми грибами.
В заявке WO 2013/162135 описана композиция на основе экстракта, полученного из цветков японской жимолости, для предотвращения и лечения сепсиса и септического шока.
В заявке WO 2009/151236 раскрыта эффективность применения экстракта плодов и цветков магнолии или активных компонентов на его основе для предотвращения и лечения воспалительных заболеваний, в том числе, колитов и артритов.
В заявке WO 2010/137877 описаны способ получения и эффективность клеточной культуры, полученной из стволовых клеток камбия растений семейства Астровых Asteraceae, по подавлению образования NO при лечении состояний, индуцированных LPS, и по подавлению экспрессии генов СОХ-2 провоспалительного цитокина, вследствие чего может быть использована в качестве прекрасного противовоспалительного средства.
Однако в ветеринарии и медицине по-прежнему существует необходимость в создании новых, предпочтительно более эффективных средств и способов для профилактики или лечения сепсиса и/или связанных с сепсисом осложнений и состояний, а также средств, которые могли бы быть использованы совместно с традиционными средствами для профилактики или лечения сепсиса и/или связанных с сепсисом осложнений и состояний.
Задача настоящего изобретения заключалась в обеспечении такого средства.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ
Настоящее изобретение представляет собой результат продолжения разработки и исследования свойств композиции, описанной в патенте РФ 2526826, выданном на имя автора настоящего изобретения. В частности, из патента РФ 2526826 известна композиция для парентерального введения, содержащая гидролизат на основе биосырья, полученный с помощью кислотного и/или ферментативного гидролиза одного или более биоресурсов, выбранных из группы, включающей двустворчатых моллюсков, кольчатых червей, пиявок, и воду, обладающая широким спектром действия и свойств. В результате проведенных дополнительных исследований по эффективности лечения сепсиса, индуцированного в лабораторных условиях у мышей, а также снижению уровня оксидативного стресса в клетках крови человека in vitro, описанных ниже в настоящем описании, неожиданно было обнаружено, что указанная композиция является эффективным средством для лечения или профилактики сепсиса, а также связанных с сепсисом осложнений и состояний. Описание патента РФ 2526826 включено в настоящее описание во всей полноте посредством ссылки.
Таким образом, согласно настоящему описанию предложены применение композиции на основе гидролизата, полученного из одного или более биоресурсов, выбранных из группы ,включающей двустворчатых моллюсков, кольчатых червей, пиявок, для профилактики или лечения сепсиса и/или связанных с сепсисом осложнений и состояний у нуждающегося в такой профилактике или лечении млекопитающего, в частности гнойно-септических осложнений раневого и/или воспалительного процесса, вызванных патогенными микроорганизмами. Указанная композиция содержит широкий набор незаменимых аминокислот, меланоидины, выступающие в качестве антиоксидантов, регуляторные пептиды, насыщенные и ненасыщенные жирные кислоты, витамины, макро- и микроэлементы в сбалансированном естественном природном соотношении, помимо прочего обладает иммуномодулирующим свойством и применяется в лечебных и/или профилактических целях в ветеринарии и медицине.
Более конкретно, согласно первому аспекту предложено применение композиции, содержащей гидролизат, полученный с помощью кислотного и/или ферментативного гидролиза одного или более биоресурсов, выбранных из группы, включающей двустворчатых моллюсков, кольчатых червей, пиявок; и воду, для профилактики или лечения сепсиса и/или связанных с сепсисом осложнений и состояний.
Согласно второму аспекту изобретения предложен способ профилактики или лечения сепсиса и/или связанных с сепсисом осложнений и состояний у нуждающегося в таких лечении или профилактике млекопитающего, включающий введение указанному млекопитающему композиции, содержащей гидролизат, полученный с помощью кислотного и/или ферментативного гидролиза одного или более биоресурсов, выбранных из группы, включающей двустворчатых моллюсков, кольчатых червей, пиявок; и воду.
Согласно третьему аспекту настоящее изобретение относится к композиции для применения для профилактики или лечения сепсиса и/или связанных с сепсисом осложнений и состояний у нуждающегося в таких лечении или профилактике млекопитающего, причем указанная композиция содержит гидролизат, полученный с помощью кислотного и/или ферментативного гидролиза одного или более биоресурсов, выбранных из группы, включающей двустворчатых моллюсков, кольчатых червей, пиявок; и воду.
Согласно четвертому аспекту настоящее изобретение относится к композиции для получения лекарственного препарата для применения при профилактике или лечении сепсиса и/или связанных с сепсисом осложнений и состояний у нуждающегося в таких лечении или профилактике млекопитающего, причем указанная композиция содержит гидролизат, полученный с помощью кислотного и/или ферментативного гидролиза одного или более биоресурсов, выбранных из группы, включающей двустворчатых моллюсков, кольчатых червей, пиявок; и воду.
Ниже в разделе «Подробное описание» описаны различные варианты реализации настоящего изобретения. При этом следует понимать, что каждый из указанных конкретных вариантов реализации изобретения относится к любому из вышеуказанных аспектов изобретения.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
Фигура 1. На Фиг. 1 представлены данные по выживаемости подопытных животных в Опыте 2 Примера 2, описанном ниже. Данные соответствуют группе интактного контроля (LPS), группе активного контроля (LPS+PBS), опытной группе (LPS + Композиция) и группе положительного контроля (LPS + MIFab). Каждое животное опытной группы после индуцирования сепсиса получало по 0,1 мл композиции четыре раза в сутки.
Фигура 2. На Фиг. 2 представлены данные по выживаемости подопытных животных, полученные в Опытах 3 и 4 Примера 2, в сравнении с данными, полученными для Опыта 2 Примера 2. Данные соответствуют группе интактного контроля (LPS), группе активного контроля (LPS + PBS) для всех доз PBS, опытным группам (LPS + Композиция), получающим композицию четырежды в сутки по 0,1 мл, 0,2 мл и 0,4 мл соответственно, и группе положительного контроля (LPS + MIFab).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
Согласно первому аспекту предложено применение композиции, содержащей гидролизат, полученный с помощью кислотного и/или ферментативного гидролиза одного или более биоресурсов, выбранных из группы, включающей двустворчатых моллюсков, кольчатых червей, пиявок; и воду, для профилактики или лечения сепсиса и/или связанных с сепсисом осложнений и состояний у нуждающегося в таких лечении или профилактике млекопитающего.
Указанный гидролизат представляет собой продукт гидролиза биосырья. Согласно одному варианту реализации биоресурсы выбраны из группы, включающей двустворчатых моллюсков, ракообразных, кольчатых червей, пиявок. Указанные биоресурсы позволяют получить гидролизат, обладающий сбалансированным химическим составом, включающим помимо прочего широкий набор аминокислот, в том числе незаменимых аминокислот, насыщенные и ненасыщенные жирные кислоты, меланоидины, углеводы, микро- и макроэлементы, на основе которого может быть получена композиция, позволяющая достигнуть желаемый лечебно-профилактический эффект при ее парентеральном введении нуждающемуся в таких лечении или профилактике млекопитающему.
Предпочтительно указанное биосырье представляет собой двухстворчатых моллюсков, включая беззубки (Anodonta), перловицы (Unio), устрицы (Ostreidae), мидии (Mytilidae), тридакны (Tridacna), жемчужницы (Pinctada), морские гребешки (Pectinidae), корабельные черви (Teredinidae), гуидак (Panopea abrupta), исландскую циприну (Arctica Islandica) и другие промысловые виды моллюсков.
Под термином «гидролизат, полученный из биоресурсов» в контексте настоящего описания следует понимать жидкий раствор, полученный при ферментативном и/или кислотном гидролизе вышеуказанных биоресурсов. Из уровня техники известны различные способы проведения гидролиза биоресурсов, которые могут быть выбраны специалистом в данной области техники при реализации настоящего изобретения. В частности, в патентах РФ 2134523, РФ 2374892, РФ 5042669, РФ 2090084, РФ 2066105, РФ 2134523, РФ 2319409 описаны различные условия осуществления гидролиза белкового сырья, пригодные согласно настоящему изобретению.
Согласно одному варианту реализации в качестве исходного гидролизата для получения композиции могут быть использованы коммерчески доступные гидролизаты из мидий, включая помимо прочего такие как «МИДЭЛ» и «МИГИ-К».
Степень разбавления раствора, полученного непосредственного после гидролиза водой, определяется эмпирическим путем специалистом в данной области техники таким образом, чтобы количество минеральных солей, в частности хлорида натрия, в конечном продукте (композиции) не превышала общую соленость крови млекопитающего, которому планируется осуществлять введение композиции. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения количество гидролизата в композиции составляет от 2 до 8 масс. %, предпочтительно от 3 до 7 масс. %, более предпочтительно от 4 до 6%, наиболее предпочтительно около 5 масс. %. Согласно еще одному варианту реализации количество гидролизата может составлять от 1 до 4 масс. %, от 1 до 3 масс. %, от 1 до 2 масс. %, от 6 до 9 масс. %, от 7 до 9 масс. % и от 8 до 9 масс. %. Остаток составляет вода, а также, факультативно, вспомогательные ингредиенты, например глюкоза.
Как правило, количество гидролизата не превышает 10 масс. % композиции, поскольку в противном случае композиция не будет пригодна для отдельных видов парентерального введения, в частности, инъекционного введения, из-за присутствия содержащейся в ней соли в высокой концентрации. С другой стороны, массовая доля гидролизата, как правило, составляет не менее 1 масс. % для обеспечения композиции с достаточным количеством компонентов для наступления желательного эффекта при лечении и/или профилактике сепсиса и связанных с сепсисом состояний и осложнений.
Однако конечная степень разбавления гидролизата, как будет понятно специалисту в данной области техники, будет определяться конкретными условиями проведения гидролиза начального биосырья и необходимостью разбавления в целом в зависимости от способа введения композиции, вида млекопитающего и прочих условий.
Согласно еще одному варианту реализации указанная композиция характеризуется массовой долей аминного азота, составляющей по меньшей мере 0,01 масс. %. Предпочтительно массовая доля аминного азота составляет от 0,01 до 0, 5 масс. %. Более предпочтительно массовая доля аминного азота составляет от 0,05 до 0,5 масс. %, наиболее предпочтительно от 0,02 до 0,1 масс. %. Величина массовой доли аминного азота характеризует степень прохождения гидролиза биоресурсов и является фактором, позволяющим оценить завершенность указанного процесса. Указанная характеристика служит косвенным показателем наличия необходимых компонентов в составе конечной композиции для парентерального введения при использовании биоресурсов в соответствии с настоящим описанием.
Согласно другому варианту реализации предложенная композиция имеет величину рН от 4 до 7, предпочтительно от 5 до 7, наиболее предпочтительно от 5,5 до 6,5. Величина рН в вышеуказанном диапазоне указывает на достаточную степень нейтрализации гидролизата, а также на возможность применения указанной композиции в лечебных и/или профилактических целях для млекопитающих.
Согласно другому варианту реализации предложенная композиция имеет массовую долю сухих веществ от 0,5 до 5 масс. %, предпочтительно от 1 до 3 масс. %, наиболее предпочтительно от 1,2 до 1,8 масс. %.
Под термином «связанное с сепсисом осложнение или состояние» следует понимать любое состояние или осложнение, развившееся в результате сепсиса, включая гнойно-септические осложнения раневого и/или воспалительного процесса, вызванные патогенными микроорганизмами. В частности, такими состояниями могут быть заболевания, указанные в международной классификации болезней (МКБ 10) в разделах А40 (стрептококковая септицемия), А41 (Другая септицемия) и Р36 (Бактериальный сепсис новорожденного), а также иные заболевания, раскрытые в настоящем описании.
Согласно одному из вариантов реализации указанную композицию вводят «парентерально», что подразумевает любые способы введения, исключающие попадание предложенной композиции в организм нуждающегося млекопитающего через желудочно-кишечный тракт. В частности, парентеральное введение может представлять инъекционное, интраназальное, субконъюнктивальное введение композиции в виде растворов, применение растворов в виде полосканий, промываний, примочек, обертываний, а также наложение композиции на пораженную поверхность в виде кремов, мазей, гелей на гидрофильной основе.
Согласно одному конкретному варианту реализации композиция дополнительно стерилизована и представляет собой композицию для инъекционного введения. Указанное инъекционное введение может быть осуществлено внутривенно (в/в), внутрикожно, подкожно (п/к), внутримышечно (в/м) или внутрикостно (в/к), причем указанное введение может быть осуществлено в непрерывном (перманентном) режиме с помощью капельницы, различных дозаторов лекарственных препаратов, включая осмотические насосы, помпы (аналогичные инсулиновым помпам) или иного подходящего дозирующего устройства.
Под термином «нуждающееся в таких лечении или профилактике млекопитающее» следует понимать любое животное из класса «млекопитающие», включая человека, нуждающихся в лечении и профилактике сепсиса и связанных с сепсисом состояний и осложнений.
Согласно одному из вариантов реализации млекопитающее может представлять собой животное или человека. Например, животное может представлять собой сельскохозяйственное животное, выбранное из группы, включающей корову, буйвола, яка, оленя, свинью, козу, овцу, кролика, лошадь, осла, верблюда, ламу, соболя, лису, норку, хорька и др., либо животное может представлять собой домашнего питомца, например, такого как собака, кошка, крыса, хомяк, морская свинка и др., либо животное может представлять собой животное, обитающее в диких условиях. В конкретном варианте реализации животное представляет собой мышь.
Под термином «патогенные микроорганизмы» следует понимать любые микроорганизмы, способные паразитировать на других организмах, включая условно-патогенные, которые в норме являются безопасными, но при определенных условиях, как, например, нарушение иммунитета или общее ослабление организма млекопитающего становятся патогенными. Приведенное в описании к настоящему изобретению деление на грамотрицательные и грамположительные микроорганизмы соответствует фенотипической классификации бактерий, основанной на строении их клеточной стенки. При этом подразумевается, что клеточные стенки грамотрицательных микроорганизмов содержат липополисахаридный слой (LPS), также называемый эндотоксическим слоем или эндотоксином, который способен вызвать в организме животного иммунный ответ, характеризующийся синтезом цитокинов и активацией иммунной системы, выражающейся в воспалительной реакции.
Согласно одному из вариантов реализации возбудителем сепсиса или связанных с сепсисом осложнений и состояний являются патогенные грамотрицательные микроорганизмы, выбранные из группы, включающей E.coli, K.pneumoniae и Enterobacter cloacae, Neisseria Gonorrhoae и Meningitidis, Lysteria Monocytogenus, Salmonella, Bacillus Anthracis, Francisella Tularensis, Yersinia Enterocolitica.
Согласно другому варианту реализации возбудителем сепсиса или связанных с сепсисом осложнений и состояний являются патогенные грамположительные микроорганизмы, выбранные из группы, включающей грамположительные: коагулазонегативные стафилококки, золотистый стафилококк и Enterococcus faecalis.
Согласно одному из вариантов реализации композиция применяется для предотвращения и лечения диагностированного сепсиса различной этиологии, который может быть выбран из группы, включающей сепсис послеродовый, отогенный, одонтогенный, миогенный, унгулярный (копытный), послеабортовый, послеродовый, перитонеальный, раневой, ожоговый, уросепсис, сепсис новорожденных, а также криптогенный сепсис.
Согласно еще одному варианту реализации указанный диагностированный сепсис может представлять собой септицемию, септикопиемию и бактериемию (бактериальный эндокардит).
Согласно другому варианту реализации диагностированный сепсис может представлять собой сепсис перитонеальной этиологии.
Сепсис возникает как осложнение воспалительного или раневого процесса, провоцируемого действием патогенных микроорганизмов. Согласно одному из вариантов реализации возможные связанные с сепсисом осложнения и состояния, вызванные патогенными микроорганизмами, выбраны из группы, включающей гайморит, гнойный блефарит, конъюнктивит, тонзиллит, остеомиелит, фурункулез, перитонит. Согласно другому варианту реализации возможные осложнения возникают в результате поражений, выбранных из группы, включающей травмы, раны, ожоги, обморожения, пролежни, роды, выкидыши, аборты и иные хирургические вмешательства.
Для профилактики развития хирургического сепсиса при проведении хирургических вмешательств любого характера необходимо проводить адекватную асептическую и антисептическую обработку раневой поверхности, полости и т.п. Согласно одному из вариантов реализации профилактика указанных осложнений включает профилактику развития хирургического сепсиса при проведении плановых и экстренных хирургических вмешательств, включая эндоскопические. Согласно еще одному варианту реализации предотвращение развития сепсиса включает профилактику любых состояний, которые потенциально могут привести к возникновению сепсиса, септического шока, а также синдрому системного воспалительного ответа (ССВО) и полиорганной недостаточности.
Согласно одному варианту реализации указанную композицию вводят указанному млекопитающему в течение 1-5 суток в дозировке от 0,2 до 6,0 мкл*кг/ч. В частности, данное введение может быть осуществлено путем непрерывного парентерального введения, в частности подкожной, внутривенной или внутримышечной инъекции с помощью подходящего дозирующего устройства, например капельницы, помпы (аналогичной инсульновой помпе), осмотического насоса. Было установлено, что указанная дозировка является эффективной при лечении сепсиса и связанных с сепсисом осложнений и заболеваний. При этом специалист в медицине или ветеринарии сможет опытным путем подобрать необходимую конкретную дозировку с учетом особенностей организма больного, тяжести заболевания и прочих условий.
Согласно еще одному варианту реализации указанную композицию вводят указанному млекопитающему в дозировке 10-400 мкл/ч в течение 1-5 суток. В частности, указанное введение может быть осуществлено путем возможно непрерывного парентерального введения, в частности подкожной, внутривенной или внутримышечной инъекции с помощью подходящего дозирующего устройства, например капельницы, помпы, или осмотического насоса.
В соответствии с одним из наиболее предпочтительных вариантов реализации композицию вводят непрерывно (перманентно) в организм нуждающегося млекопитающего с помощью осмотического насоса, помпы или капельницы.
Согласно дополнительному варианту реализации указанную композицию вводят указанному млекопитающему в течение 7-10 суток.
Согласно одному из вариантов реализации применение указанной композиции может включать совместное введение указанной композиции и средств традиционной комплексной терапии для профилактики или лечения сепсиса у нуждающегося пациента.
Согласно второму аспекту настоящего изобретения предложен способ лечения сепсиса и/или связанных с сепсисом осложнений и состояний у нуждающегося в таких лечении или профилактике млекопитающего, включающий парентеральное введение указанному млекопитающему композиции, содержащей гидролизат, полученный с помощью кислотного и/или ферментативного гидролиза одного или более биоресурсов, выбранных из группы, включающей двустворчатых моллюсков, кольчатых червей, пиявок; и воду.
Согласно одному из вариантов реализации указанные связанные с сепсисом осложнения и состояния выбраны из группы, включающей гайморит, гнойный блефарит, конъюнктивит, экзему, тонзиллит, остеомиелит, гнойный артрит, фурункулез, перитонит.
Согласно одному из вариантов реализации композицию применяют для профилактики или лечения диагностированного сепсиса различной этиологии, выбранного из группы, включающей сепсис послеродовый, отогенный, одонтогенный, миогенный, унгулярный (копытный), послеабортовый, перитонеальный, раневой, ожоговый, уросепсис, сепсис новорожденных, а также криптогенный сепсис.
Согласно еще одному варианту реализации указанный диагностированный сепсис включает септицемию, септикопиемию или бактериемию (бактериальный септический эндокардит).
Согласно другому варианту реализации диагностированный сепсис представляет собой сепсис перитонеальной этиологии.
Согласно конкретному варианту реализации возбудителем сепсиса или связанных с сепсисом осложнений и состояний являются патогенные грамотрицательные микроорганизмы, выбранные из группы, включающей E.coli, K.pneumoniae и Enterobacter cloacae, Neisseria Gonorrhoae и Meningitidis, Lysteria Monocytogenus, Salmonella, Bacillus Anthracis, Francisella Tularensis, Yersinia Enterocolitica.
Согласно еще одному варианту реализации возбудителем сепсиса или связанных с сепсисом осложнений и состояний являются патогенные грамположительные микроорганизмы, выбранные из группы, включающей грамположительные: коагулазонегативные стафилококки, золотистый стафилококк и Enterococcus faecalis.
Согласно одному варианту реализации указанную композицию вводят указанному млекопитающему в течение 1-5 суток в дозировке от 0,2 до 6,0 мкл*кг/ч. В частности, данное введение может быть осуществлено путем непрерывного парентерального введения, в частности подкожной, внутривенной или внутримышечной инъекции с помощью подходящего дозирующего устройства, например капельницы, помпы или осмотического насоса.
Согласно еще одному варианту реализации указанную композицию вводят указанному млекопитающему в дозировке 10-400 мкл/ч в течение 1-5 суток. В частности, указанное введение может быть осуществлено путем возможно непрерывного парентерального введения, в частности подкожной, внутривенной или внутримышечной инъекции с помощью подходящего дозирующего устройства, например капельницы, помпы, или осмотического насоса.
Согласно дополнительному варианту реализации предложенный способ лечения включает применение композиции, предназначенной для инъекционного введения, которую вводят указанному млекопитающему в течение 7-10 суток.
Согласно еще одному дополнительному варианту реализации предложенный способ лечения включает применение композиции, предназначенной для инъекционного введения, и может дополнительно включать повторный курс, который проводят через 1-2 суток после завершения первого.
Согласно одному из вариантов реализации предложенный способ лечения включает применение композиции, предназначенной для инъекционного введения, и может включать совместное применение указанной композиции и средств традиционной комплексной терапии для профилактики или лечения сепсиса и связанных с сепсисом осложнений и состояний у нуждающегося пациента.
Эффективность применения композиции для лечения и профилактики сепсиса, а также связанных с сепсисом состояний и осложнений будет подробнее рассмотрена далее на конкретных примерах его реализации.
ПРИМЕР 1. ИЗУЧЕНИЕ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ КОМПОЗИЦИИ
Материалы и методы
Культуры клеток
2
Эндотелиальные линии EA.hy926 культивировали в среде DMEM/F12 («Биолот», СПб, РФ), с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки («Sigma», США), 50 мкг/мл сульфата гентамицина, 2 ммоль глутамина. Для дезинтеграции монослоя клетки инкубировали в растворе Версена («Биолот», СПб, РФ) в течение 5-10 минут. Пересев производили 1 раз в 3-4 дня. Клетки культивировали при 37°С во влажной атмосфере с 5% СO в пластиковых флаконах объемом 50-250 мл производства «Sarstedt», Австрия.
Выделение мононуклеарных лейкоцитов периферической крови человека
Для выделения мононуклеарных лейкоцитов периферической крови человека использовали донорскую кровь, взятую из локтевой вены здоровых доноров обоих полов в возрасте от 20 до 54 лет (Отделение переливания крови, Санкт-Петербургский Государственный Медицинский Университет им. акад. И.П. Павлова). В качестве антикоагулянта использовали препарат гепарина, 20-25 ЕД на 1 мл крови. Разделение фракции гранулоцитов и фракции мононуклеарных лейкоцитов проводили с помощью осаждения клеток в градиенте плотности фиколл-верографина 1,077 г/см3 («Биолот», СПб., РФ). Цельную кровь разводили в 2 раза забуференным физиологическим раствором PBS (Phosphate-buffered saline) (рН 7,2), 8 мл разведенной крови наслаивали на 4 мл раствора фиколл-верографина и центрифугировали в горизонтальном роторе при 400 g в течение 30 минут. Мононуклеарные лейкоциты отбирали из интерфазного кольца, образовавшегося на границе смеси фиколл-верографина и разведенной крови, и отмывали 3 раза PBS. Клетки ресуспендировали в среде RPMI-1640 («Биолот», СПб, РФ), содержащей 10% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки («ICN», США), 50 мкг/мл сульфата гентамицина (АО «Самсон», СПб., РФ) и 2 ммоль L-глутамина («ICN», США).
Анализ влияния препарата на жизнеспособность эндотелиальных клеток линии EA.hy.
2
2
2
Для анализа влияния препарата на жизнеспособность клетки вносили в лунки 24-луночного плоскодонного планшета в концентрации 250 тыс. клеток в 500 мкл полной культуральной среды. В каждую вносили NaOCl или НО в концентрациях 12,5 мкмоль, 25 мкмоль, 50 мкмоль, 100 мкмоль, а также исследуемый препарат в разведении 1/5. После 24 ч инкубации при 37°С во влажной атмосфере с 5% СО производили дезинтеграцию монослоя с помощью раствора аккутазы («Sigma», США) с последующей отмывкой в полной культуральной среде. Клетки переносили в пробирки для анализа и производили окрашивание клеточной суспензии. Для этого YO-PRO (Invitrogen, США) (флуоресцентный краситель, который свободно проникает в клетки, находящиеся в состоянии апоптоза, и связывается с нуклеиновыми кислотами) вносили в конечной концентрации 100 нмоль. Одновременно вносили Propidium Iodide («Sigma», США) (флуоресцентный краситель свободно проникает в клетки, находящиеся в состоянии некроза, и связывается с нуклеиновыми кислотами) в конечной концентрации 2 мкг/мл. Клеточную суспензию ресуспендировали и после 5 мин инкубации с красителями проводили анализ образцов на проточном цитометре Navios (Beckman Coulter, США).
Анализ влияния композиции на спонтанную и индуцированную форболмиристатацетатом (ФМА) генерацию активных Форм кислорода лейкоцитами крови человека.
2
2
Для анализа влияния композиции на продукцию активных форм кислорода клетки вносили в лунки 96-луночного плоскодонного планшета в концентрации 400 тыс. клеток в 200 мкл полной культуральной среды. Для индукции респираторного взрыва одновременно вносили РМА («Sigma», США) в концентрациях 10 нг/мл, 20 нг/мл, а также исследуемую композицию в разведениях 1:5. Для детекции активных форм кислорода в каждую лунку вносили 2',7'-дихлордигидрофлуоресцеина диацетата (HDCFDA) (Invitrogen, США) в концентрации 0.1 мкмоль. После 10 мин инкубации при 37°С во влажной атмосфере с 5% СО производили анализ проб с помощью флюороскана каждые 10 мин в течение 40 мин.
Дополнительно проводили анализ проб с помощью проточной цитометрии. В этом случае после инкубации 30 мин клеток с исследуемыми веществами в лунки планшета вносили раствор аккутазы («Sigma», США), для дезинтеграции адгезировавших лейкоцитов. Клетки инкубировали 10 мин при 37°С, после чего переносили в пробирки для анализа и производили отмывку в полной культуральной среде. Анализ образцов проводили на проточном цитометре Navios (Beckman Coulter, США).
2
2
Выводы: Полученные данные свидетельствуют об антиоксидантной активности композиции и демонстрируют способность композиции снижать негативное воздействие гипохлорита натрия и перекиси водорода на клетки крови человека в in vitro исследованиях. Снижение оксидативного стресса, вызванного наличием НО и NaOCl, с помощью исследованной композиции позволило предполагать о ее эффективности в отношении сепсиса и связанных с сепсисом состояний. Для подтверждения данной гипотезы были проведены исследования на моделях сепсиса у мышей, описанных в Примере 2 ниже.
ПРИМЕР 2. ИЗУЧЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ СЕПСИСА НА МЫШИНЫХ МОДЕЛЯХ
Приготовление смеси для индуцирования сепсиса
LPS растворяли в забуференном физиологическим раствором PBS (Phosphate-buffered saline) до концентрации 1 мг/мл и хранили аликвотами по 50 мкл в пробирках объемом 500 мл при температуре -70°С до момента использования. При приготовлении раствора LPS препарат гомогенизировали под действием ультразвука в ультразвуковой бане в течение 5 минут до исчезновения взвеси. После размораживания смесь также подвергали действию ультразвука в течение 5 минут. Далее смесь разводили растворителем до концентрации LPS в PBS 800 нг/мл в пробирках объемом 10 мл.
Галактозамин в количестве 100 мг растворяли в 5 мл PBS до концентрации 20 мг/мл и смешивали с равным объемом разбавленной гомогенизированной взвеси LPS в PBS.
Свежеприготовленные смеси LPS-галактозамин (LPS-Gal) готовили описанным выше способом непосредственно перед использованием для внутрибрюшинного введения мышам. Каждой мыши индуцирующая сепсис смесь вводилась в количестве 500 мкл внутрибрюшинно, так чтобы каждая мышь получала 200 нг LPS и 5 мг Gal.
Состав применявшейся композиции: 5% гидролизат, 95% вода для инъекций.
Для доказательства эффективности композиции для лечения сепсиса было проведено несколько раундов in vivo исследований на мышиных моделях.
∧
Индуцирование сепсиса во всех группах проводили с помощью разработанной Galanos (Galanos С, М.А. Freudenberg, and W. Reutter. 1979. Galactosamine-induced sensitization to the lethal effects of endotoxin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 5939-5943) LPS-GalN-модели индуцирования сепсиса у мышей с использованием низких доз LPS.
Опыт 1
Для первого опыта было взято три группы животных по 12 мышей в каждой: группа интактного контроля, группа активного контроля и опытная группа. Индуцирование сепсиса во всех трех группах проводилось посредством инъекции препарата, содержащего 250 нг LPS Е. coli и 5 мг N-галактозамина.
С животными из группы интактного контроля после индуцирования сепсиса никаких манипуляций не производилось. Каждому животному опытной группы после индуцирования сепсиса одноразово вводилось по 0,4 мл композиции во внутрибрюшинную область. Каждому животному из группы активного контроля внутрибрюшинно вводилось такое же количество стерильного физиологического раствора (PBS).
По итогам эксперимента через пять суток в каждой группе выжило по 5 животных.
Следовательно, композиция, применяемая после индуцирования сепсиса одноразово внутрибрюшинно в количестве 0,4 мл каждой мыши, не оказывает влияния на выживаемость мышей и не является антидотом к индуцирующей сепсис смеси LPS-галактозамин.
Опыт 2
Для второго опыта было взято три группы животных по 12 мышей в каждой: группа интактного контроля, группа активного контроля и опытная группа. Индуцирование сепсиса во всех трех группах проводилось посредством инъекции препарата, содержащего 250 нг LPS Е. coli и 5 мг N-галактозамина.
Группе положительного контроля совместно с LPS вводили 5 мг аффинных антител против фактора ингибирующего миграцию макрофагов (MIFab).
Группа интактного контроля после индуцирования сепсиса не подвергалась воздействию.
Каждому животному опытной группы после индуцирования сепсиса внутрибрюшинно вводили по 0,1 мл композиции четыре раза в сутки: в 8:00, в 12:00, в 16:00 и в 20:00 (суммарно 0,4 мл композиции в сутки).
Каждому животному из группы активного контроля после индуцирования сепсиса вместо композиции вводили стерильный физиологический раствор (PBS) в том же объеме и в то же время.
Было проведено 3 раунда опыта для получения достоверных результатов.
Выживаемость подопытных животных отмечали в течение 5 суток. Результаты представлены в Таблице 5 и на Фигуре 1.
Из приведенных данных видно, что выживаемость в группах интактного и активного контроля была сравнимой и составляла около 40%, тогда как выживаемость животных в опытной группе возросла до 72%.
Опыт 3
Третий опыт проводился параллельно с проведением третьего раунда первого опыта. Было взято 2 группы животных: опытная группа и группа активного контроля по 12 мышей в каждой. В каждой группе индуцирование сепсиса проводили указанным выше способом.
Каждому животному опытной группы после индуцирования сепсиса внутрибрюшинно вводилось по 0,2 мл композиции четыре раза в сутки: в 8:00, в 12:00, в 16:00 и в 20:00 (суммарно 0,8 мл композиции в сутки).
Каждому животному из группы активного контроля после индуцирования сепсиса внутрибрюшинно вводили стерильный физиологический раствор (PBS) вместо композиции в том же объеме и в то же время.
Для получения достоверных результатов было проведено 3 раунда опыта. Выживаемость подопытных животных отмечали в течение 5 суток. Результаты представлены в Таблице 6 и на Фигуре 2.
Опыт 4
Четвертый опыт проводили параллельно с проведением третьего раунда первого опыта. Было взято 2 группы животных: опытная группа и группа активного контроля по 12 мышей в каждой. В каждой группе индуцирование сепсиса проводили указанным выше способом.
Каждому животному опытной группы после индуцирования сепсиса внутрибрюшинно вводилось по 0,4 мл композиции четыре раза в сутки: в 8:00, в 12:00, в 16:00 и в 20:00 (суммарно 1,6 мл композиции в сутки).
Каждому животному из группы активного контроля после индуцирования сепсиса внутрибрюшинно вводили стерильный физиологический раствор (PBS) вместо композиции в том же объеме и в то же время.
Выживаемость подопытных животных отмечали в течение 5 суток. Результаты представлены в Таблице 7 и на Фигуре 2.
Сравнение данных, представленных в Таблицах 2 и 3, позволяет сделать вывод, что увеличение дозировки вводимой композиции не ведет к снижению смертности от индуцированного сепсиса, которая остается на уровне 25%.
Опыт 5
Анализ экспериментальных данных позволил предположить, что процент выживаемости животных при лечении индуцированного сепсиса у мышей с помощью композиции нужно увеличить не дозировку, а количество инъекций в сутки, то есть "время присутствия" композиции в организме животного.
Для этого в опыте использовались осмотические насосы фирмы ALZET серии 1003D. Было взято 2 группы животных: опытная группа и группа активного контроля по 12 мышей в каждой. В каждой группе индуцирование сепсиса проводили указанным выше способом.
Указанные насосы вживлялись всем животным подкожно после стандартной процедуры индуцирования сепсиса. Для этого мыши вводились в состояние наркоза с помощью следующей процедуры.
Содержимое флакона Золетил 100, состоящее из 250 мг тилетамина гидрохлорида и 250 мг золазепама гидрохлорида, растворяли в 5 мл воды для инъекций и замораживали порциями по 0.2 мл. Такие пробирки хранили при -20°С. Для наркоза порцию 0.2 мл однократно размораживали и добавляли к ней 1,8 мл стерильного физраствора, полученные 2 мл использовали в течение 3-4 часов. Разбавленный раствор повторно не замораживали. На мышь массой 20 г вводили 0,2 мл полученного раствора внутрибрюшинно. Таким образом, дозировка наркоза составляла по 50 мг тилетамина и 50 мг золазепама на 1 кг массы тела. Длительность наркоза при такой дозе составляла 30-40 минут.
После этого мышь брили в области холки, делали небольшой кожный надрез, в который помещали осмотический насос, содержащий 0,1 мл композиции в опытной группе и такое же количество физиологического раствора в группе активного контроля. Наложение швов производилось стандартным образом с помощью шовного материала ПГА (рассасывающийся плетеный хирургический шовный материал с покрытием, изготавливаемый из полигликолидной кислоты).
Содержимое насоса равномерно доставлялось в организм животного в течение 72 часов - 3 суток. Скорость подачи содержимого составляла 1,0 мкл/ч. Дозировка: суммарно 0,024 мл в сутки при массе мыши около 20 г или 1,2 мл на кг веса животного в сутки.
В результате проведенного опыта выживаемость в группе активного контроля составила 25%, в опытной группе - 100%.
Указанная более низкая выживаемость в группе активного контроля по сравнению с выживаемостью в предыдущих опытах объясняется тем, что в данном опыте мыши дополнительно подвергались действию наркоза и следующей за ним достаточно травматичной операции по подкожному вживлению осмотического насоса.
На основании проведенных исследований было показано, что исследованная композиция может быть применена для снижения смертности от сепсиса различной этиологии, а также связанных с сепсисом состояний и осложнений у млекопитающих.