МОНОКЛОНАЛЬНОЕ АНТИТЕЛО ПРОТИВ HCV В КАЧЕСТВЕ ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА ДЛЯ ТЕРАПЕВТИЧЕСКОГО ЛЕЧЕНИЯ И ПРОФИЛАКТИКИ ИНФЕКЦИЙ HCV
ANTI-HCV MONOCLONAL ANTIBODY AS THERAPEUTIC AGENT FOR MEDICAL TREATMENT AND PREVENTION OF HCV INFECTIONS

Настоящее изобретение относится к моноклональному антителу против гликопротеина E2 вируса гепатита C (HCV) в качестве лекарственного средства для терапевтического лечения и профилактики инфекцийHCV.
HCV представляет собой вирус, имеющий перикапсид и одноцепочечную РНК, который принадлежит к семейству Flavivirus. Основываясь на генетических различиях, наблюдаемых среди различных изолятов HCV, этот вид вируса разделяют на 6 различных генотипов, каждый из которых обозначен номером. В свою очередь, каждый генотип содержит несколько субтипов, каждый из которых обозначен буквой. Частота заболеваний и распространение различных генотипов HCV различны по всему миру. В Европе преобладающим генотипом является генотип 1b, тогда как в Северной Америке преобладает генотип 1a. Определение генотипа важно с клинической точки зрения, поскольку такой признак способствует определению возможного ответа на лечение, основанное на комбинации интерферона-α с рибавирином, которое является в настоящее время наиболее используемым лечением. Фактически генотипы 1 и 4 менее чувствительны, чем генотипы 2, 3, 5 и 6, к лечению, основанному на интерфероне.
До сих пор не существует вакцин и иммунотерапевтических средств, для которых действительно доказана эффективность против вируса гепатита C. Высокая вариабельность антигенной структуры HCV до сих пор является помехой для разработки антител, способных нейтрализовать вирус, которые при этом обеспечивают перекрестную реактивность с различными генотипами вируса. Таким образом, существует потребность в антителах против HCV, которые обладают такими признаками и, таким образом, действительно обладают эффективностью при лечении и профилактике инфекций HCV.
Антитела, направленные против HCV, описаны в предшествующем уровне техники. Например, Burioni et al., Hepatology Vol. 28, n. 3, 1998, описывают клонирование и определение характеристик последовательностей, кодирующих пять фрагментов рекомбинантных антитела человека (Fab), обладающих специфичностью к гликопротеину E2 HCV (HCV E2), которые способны связываться с гликопротеинами различных генотипов вируса (перекрестная реактивность). Среди описанных в данной статье Fab представлен фрагмент антитела, обозначенный e20. Burioni et al., 1998, cit. пишут, что e20 обладает высокой минимальной активностью по нейтрализации связывания HCV E2 (NOB-активность). Однако несмотря на высокую NOB-активность в международной патентной заявке WO 03/064473 указано, что фрагмент антитела e20 не способен нейтрализовать вирусную инфекцию при высокой концентрации (80 мкг/мл) (в частности, см. WO 03/064473, стр. 16, строки 8-10).
К настоящему времени авторы настоящего изобретения с удивлением обнаружили, что вопреки установленному в известном уровне техники и, в частности, в WO 03/064473, фрагмент e20 способен эффективно нейтрализовать инфицирование различными генотипами HCV in vitro. Это делает e20 особенно подходящим для нейтрализации HCV и элиминации HCV-инфицированных клеток и для применения в качестве лекарственного средства для иммунотерапии и иммунопрофилактики инфекций HCV.
Для достижения такого результата потребовалась длительная и сложная экспериментальная работа, которая подробно описана в нижеследующем экспериментальном разделе.
В сумме экспериментальная работа, проведенная авторами настоящего изобретения, позволила показать, что фрагмент антитела e20 проявляет следующие неожиданные свойства:
- он образуется в ходе естественной инфекции штаммом HCV, относящимся к генотипу 1b, но способен связываться с гликопротеинами всех известных генотипов HCV (в частности, генотипов 1a, 1b, 2a, 2b, 3, 4, 5 и 6) и по существу обладает высокой перекрестной реактивностью;
- он обладает чрезвычайно высокой способностью к нейтрализации генотипов 1a, 1b, 2a и 4 HCV, которую измеряли с помощью анализа нейтрализации, основанного на псевдочастицах HCV (HCVpp);
- определенные аминокислотные остатки, необходимые для связывания e20 с гликопротеином E2 HCV, также важны для инфекции HCV, что подсказывает, что мутанты, способные уходить от связывания с e20, в то же самое время обладают сниженной способностью к репликации.
По-видимому, указанные выше признаки полезны в отношении использования фрагмента антитела e20 в качестве лекарственного средства для иммунотерапии и иммунопрофилактики инфекций HCV.
Таким образом, первой целью изобретения является моноклональное антитело или его фрагмент, способные связывать гликопротеин E2 HCV, полученный из нескольких различных генотипов HCV, выполняющие функцию лекарственного средства для терапевтического лечения или профилактики инфекций HCV, которые отличаются тем, что моноклональное антитело или его фрагмент содержат по меньшей мере одну вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID No: 1 или последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID No: 1, и по меньшей мере одну вариабельную область легкой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID No: 2 или последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID No: 2.
Более предпочтительное процентное значение идентичности последовательностей составляет по меньшей мере 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, где выражение «по меньшей мере» относится к каждому перечисленному процентному значению.
В одном из вариантов осуществления изобретения вариабельную область тяжелой цепи кодирует нуклеотидная последовательность SEQ ID No: 3, а вариабельную область легкой цепи кодирует SEQ ID No: 4.
Термин «антитело» предназначен для обозначения любого класса полноразмерного иммуноглобулина и любого его фрагмента, содержащего вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи, такого как, например, Fab, F(ab')2, CDR (определяющая комплементарность область) или одноцепочечное антитело, содержащее вариабельную область как тяжелой, так и легкой цепи, или области CDR или каркас, содержащий одну или несколько копий фрагментов CDR из вариабельной области тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина. Он включает функциональные фрагменты антител, обозначаемые ScFv, диатела, VHH или выделенные легкие или тяжелые цепи. Кроме того, выражение «антитело» охватывает антитела, которые можно создать, используя последовательности вариабельной области фрагмента антитела e20 в процессе перетасовки для вариабельной области легкой цепи, для того, чтобы установить комбинации VH/VL с усовершенствованной аффинностью, стабильностью и/или свойствами рекомбинантного получения. Выражение «антитело» также включает полноразмерные иммуноглобулины любого типа или фрагменты иммуноглобулинов, слитые с обладающими специфичностью полноразмерными иммуноглобулинами или фрагментами иммуноглобулинов, которые могут нацелить фрагмент антитела e20 или иммуноглобулин на конкретные ткани, клетки или растворимые белковые структуры. Моноклональное антитело по изобретению предпочтительно представляет собой моноклональное антитело человека.
Антитело, использованное в изобретении, может находиться в свободной форме или в форме конъюгата. Антитело в форме конъюгата представляет собой антитело, как определено выше, конъюгированное с молекулой, которая способна модулировать персистентность in vivo, содействовать распределению в организме или ограничивать его, снижать чувствительность к протеолитическим средствам, снижать антигенность, повышать цитотоксическую способность и/или облегчать определение в жидкостях и тканях организма. Неограничивающие примеры молекул, подходящих для получения конъюгата, включают сывороточный альбумин человека, мальтоза-связывающий белок, глутатион-S-трансферазу, белки p3 или p8 оболочки фага, пептиды, сахара, ПЭГ или ПЭГ-подобные молекулы, токсины животного, растительного или микробиологического происхождения, цитокины, ферменты, хемилюминесцентные соединения, биолюминесцентные соединения, атомы металлов, радиоизотопы, флуоресцентные соединения, метящие группы или субстраты для фосфорилирования, гликозилирования, убиквитинилирования, сумоилирования или эндопротеолитического расщепления. Для того чтобы облегчить образование конъюгата, C-конец или N-конец антитела можно модифицировать, например, посредством вставки дополнительных аминокислотных остатков, например, одного или нескольких остатков цистеина, которые способны образовывать дисульфидные связи. Антитело, использованное в изобретении, также можно связать с эритроцитами человека или другими клеточными носителями, с конкретными составами или с системами с замедленным высвобождением, такими как, но без ограничения, липосомы, дендримеры, микросомы, наночастицы, микрокапсулы, вирусные векторы и т. п.
Другой целью изобретения является фармацевтическая композиция для терапевтического лечения или профилактики инфекций HCV, которая содержит фармацевтически эффективное количество моноклонального антитела или его фрагмента, как определено выше.
Композицию по изобретению можно вводить субъекту, инфицированному HCV или подверженному риску инфицирования HCV. Можно использовать любой подходящий путь введения, включая парентеральный, пероральный, окулярный, местный, локорегионарный путь, клизму или аэрозольное введение. Парентеральное введение включает внутримышечную инъекцию, внутривенную инъекцию, внутрилимфатическую инъекцию, подкожную или внутрикожную инъекцию и инфузию.
Композицию по изобретению можно получать в любой фармацевтической форме, которая подходит для выбранного пути введения, например, в форме инъецируемого раствора или суспензии, инфузии, таблетки, капсулы, крема, мази, лосьона или суппозитория.
Композиция по изобретению содержит антитело или его фрагмент, как определено выше, в качестве активного начала, а также подходящие фармацевтические эксципиенты, носители или разбавители, известные специалистам в данной области.
Дополнительной целью изобретения является антиидиотипическое антитело, способное специфически связываться с идиотипом антитела или его фрагмента, как определено выше. Антиидиотипическое антитело по изобретению можно получить стандартными способами для получения антиидиотипических антител, которые известны специалистам в данной области per se.
Дополнительно настоящее изобретение подробно описано в следующем экспериментальном разделе, который предоставлен исключительно в качестве иллюстрации со ссылкой на прилагаемые чертежи, где на фиг. 1 показано связывание e20 с гликопротеинами E2 HCV из различных генотипов. Данные приведены в виде процентных значений для положительных флуоресцентных клеток. На фиг. 2 показана нейтрализующая активность Fab e20 при использовании вирусных псевдочастиц, которые экспонируют гликопротеины E1-E2 генотипа 1a: UKN1A20.8 (a); E1E2 генотипа 1b: UKN1B5.23 (b); E1E2 генотипа 2a: UKN2A1.2 (c); E1E2 генотипа 2b: UKN2B1.1 (d); E1E2 генотипа 4: UKN4.21.16 (e). (f) Нейтрализующая активность Fab e20 в концентрации 15 мкг/мл при использовании вирусных псевдочастиц, которые экспонируют E1-E2 из различных генотипов (UKN1A20.8, UKN1B5.23, UKN2A1.2, UKN2B1.1; UKN3A13.6, UKN4.21.16, UKN5.15.11, UKN6.5.8).
На фиг. 3 показана нейтрализующая активность e20 и других антител против HCV (e137, AP33) при использовании системы HCVcc (генотип 2a). JFH-1 инфекционность в присутствии e20 и отрицательного контроля Fab (c33-3) показаны в виде количества вирусной РНК, нормализованного к РНК глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, как определяли посредством количественной ПЦР с обратной транскрипцией.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ РАЗДЕЛ
Стратегия клонирования
Получение случайных комбинаторных библиотек, представленных на поверхностях нитевидных фагов дает инструмент с широкими возможностями для отбора моноклональных антител человека с высокой аффинностью. Фактически процедура отбора, основанная на фаговом дисплее, является чрезвычайно гибкой, и ее можно оптимизировать с тем, чтобы отбирать антитела с перекрестной реактивностью. В частности, e20 клонировали в виде Fab фрагмента IgG1 B-лимфоцитарного репертуара женщины в возрасте 58 лет с персистирующей инфекцией штаммом HCV, относящимся к генотипу 1b. Для того чтобы отобрать клоны с перекрестной реактивностью, библиотеку, полученную от пациента, подвергали пэннингу с рекомбинантным гликопротеином E2 HCV, полученным из изолята вируса, принадлежащего к генотипу, отличному от 1a. В кратком изложении, при таком подходе можно получить антитела, образуемые в ходе естественной инфекции, которые к тому же одинаково способны связываться с различными гликопротеинами, с которыми никогда не сталкивалась иммунная система пациента, выбранного для исследования.
Исследование последовательностей тяжелой и легкой цепи
Секвенирование генов тяжелой и легкой цепи e20 и исследование их мутационных паттернов (таблица 1) показали, что это антитело получено в результате соматического мутационного процесса, который представляет собой процесс, вызванный в клоне антитела посредством непрерывного контакта с конкретным антигеном, для того, чтобы усовершенствовать аффинность самого антитела к антигену.
Что касается тяжелой цепи, e20 проявляет гомологию нуклеотидной последовательности с геном зародышевой линии ниже 85%. Мутационный паттерн показывает типичное распределение для соматически мутировавшего клона, со специфической поляризацией в определяющих комплементарность областях (CDR). Исследование соединительной области e20 (которая представляет собой соединительную область, которая дает начало CDR3) показывает, что она состоит из гена V, принадлежащего к подсемейству VH 1-69 (широко представленный ген в гуморальном ответе человека против HCV), ген D, принадлежащий к подсемейству D2-21, и ген JH, принадлежащий к подсемейству JH4.
Аналогичным образом легкая цепь e20 (изотип κ) проявляет процентное значение мутации, согласующееся с соматическим мутационным процессом, как показано посредством поляризации в CDR. Исследование соединительной области показывает, что CDR3 легкой цепи e20 происходит из соединения гена κV, принадлежащего подсемейству κV3-15, и гена κJ, принадлежащего подсемейству κJ5.
Данные о последовательностях позволяют сделать заключение о том, что e20 не является искусственным антителом, но напротив на самом деле присутствует в репертуаре антител пациента, выбранного для исследования.
Таблица 1
a)
Ген V
Ген D
Ген J
Длина CDR3
% мутировавших нуклеотидов
% мутировавших аминокислот
Мутации R:S
FR
CDR
FR
CDR
FR
CDR
V1-69
D2-21
J4
18
9,4
16,9
19
38
13:2
5:1
b)
Ген V
Ген J
Длина CDR3
% мутировавших нуклеотидов
% мутировавших аминокислот
Мутации R:S
FR
CDR
FR
CDR
FR
CDR
KV3-15
KJ5
9
1,5
10,4
1,5
11,5
1:2
3:5
В приведенной выше таблице 1 показаны мутационные паттерны для зародышевых линий и гена V в тяжелой цепи a) и легкой цепи b) e20. Процентные значения мутаций аминокислот и нуклеотидов вычисляли в соответствии со способом выравнивания авторов Kabat и Wu с учетом FR1, FR2 и FR3 для легких и тяжелых цепей, CDR1 и CDR2 для тяжелых цепей и CDR1, CDR2 и CDR3 для легких цепей. Также приведено отношение заместительных мутаций (R) к молчащим мутациям (S).
Оценка связывания e20 с E2, полученными из различных генотипов HCV
Фрагмент e20 в форме Fab исследовали на способность к распознаванию гликопротеина E2 из генотипов HCV, отличных от 1b (т. е. от генотипа штамма, которым был инфицирован пациент, от которого получили e20) и 1a (т. е. от генотипа, использованного для клонирования Fab). Сложности, проявившиеся при получении растворимых форм E2 из различных генотипов HCV, потребовали использования альтернативного подхода, основанного на FACS.
6
В кратком изложении, эпителиальные клетки почки человека 293T (HEK) растили в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (DMEM) с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки, 5% заменимых аминокислот, 200 мМ глутамина, стрептомицина (100 мкг/мл) и пенициллина (100 Ед/мл). После достижения 80% конфлюентности 2×10 клеток HEK высевали в 10 см чашки и через 24 часа трансфицировали с использованием 3 мкг phCMV-7, экспрессирующего вектора, который кодирует гликопротеины E1E2 из различных генотипов HCV, используя протокол трансфекции с фосфатом кальция. Среду заменяли через 16 часов после трансфекции, а затем клетки инкубировали при температуре 37°C в течение 24 часов. Среду удаляли, монослой клеток дважды промывали в PBS. Добавляли 5 мл буфера для диссоциации и инкубировали клетки при температуре 37°C в течение 5 минут. Клетки промывали дважды в PBS и центрифугировали на скорости 1000 об/мин в течение 5 минут; в осадок, полученный из каждой чашки, добавляли 1,2 мл фиксирующего реактива. Клетки инкубировали в течение 15 минут при комнатной температуре. Образцы промывали в 5 мл PBS с добавлением 2% фетальной телячьей сыворотки (FPBS), затем центрифугировали на скорости 1000 об/мин в течение 5 минут.
В осадок добавляли 100 мкл пермеабилизирующего реактива с 50 мкл Fab e20 в конечной концентрации 10 мкг/мл. Аналогичный протокол повторяли для нетрансфицированных клеток, которые использовали в качестве контроля. После инкубации в течение 40 минут при комнатной температуре образцы промывали в 5 мл FPBS и добавляли в осадок 50 мкл ФИТЦ-конъюгированного вторичного антитела. Клетки инкубировали в течение 20 минут при комнатной температуре и промывали дважды в 5 мл FPBS. Наконец, супернатант удаляли, осадок ресуспендировали в 300 мкл FPBS и проводили анализ клеток с помощью FACS. Связывающую активность выражали в виде процентного значения положительных флуоресцентных клеток, полученного из процентного значения клеток, обладающих более высоким уровнем флуоресценции, чем клетки без Fab e20. В каждый эксперимент включали рекомбинантный Fab человека (c33-3), обладающий специфичностью к неструктурному антигену HCV (NS3) в качестве отрицательного контроля.
Этот подход показал, что Fab e20 способен распознавать экспрессируемые E2 HCV из всех генотипов (1a; 1b; 2a; 2b; 3; 4; 5; 6) при более высоком процентном значении флуоресцентных клеток, чем тот, что получен при использовании контрольного Fab. Результаты приведены на фиг. 1.
Оценка связывания e20 с гликопротеинами E2 из HCV 1a, мутировавшими в CD81-связывающих областях
Fab e20 также тестировали на панели E1E2, полученных из H77 (генотип 1a), которые мутировали в консервативных областях, которые, как описано, играют ключевую роль в связывании CD81 и в инфекционности псевдочастиц HCV (HCVpp). Каждое консервативное положение в этой области мутировали в аланин. Все эти замены привели к потере инфекционности в описанном ниже анализе HCVpp. Связывание Fab e20 с гликопротеином E2 HCV устраняли посредством некоторых из этих ключевых мутаций (таблица 2).
Данные, описанные в таблице 2, указывают на то, что e20 связывается с областью E2, необходимой для вирусной инфекции. Эти данные также подтверждают, что e20 связывается с областью, критичной для связывания AP33, нейтрализующим антителом против HCV с большей перекрестной реактивностью, но менее подходящим в качестве шаблона для конструирования вакцинного лекарственного средства и для использования в качестве иммунотерапевтического средства, принимая во внимание, что иммунотерапия гетерологичными антителами не оправдана и что присутствие похожих антител в репертуаре человека встречается чрезвычайно редко (Tarr et al. J Gen Virol. 88:2991. 2007). Еще более примечательно, что данный анализ ясно показал, что все мутанты, которые не распознавал e20, не допускают инфекцию клеток-мишеней в псевдовирусной модели.
В приведенной выше таблице 2 показано связывание e20 с E1E2, полученными из мутантов H77 (генотип 1a). Связывающая активность выражена в виде процентного значения от того, что измерено для белка H77 дикого типа.
Оценка нейтрализующей активности e20 на псевдочастицах HCV, полученных из различных генотипов
Затем подтверждали нейтрализующую активность Fab e20 в анализе нейтрализации, основанном на псевдочастицах HCV (HCVpp).
6
4
В кратком изложении эпителиальные клетки почки человека 293T (HEK) и клетки гепатомы человека Huh-7 растили в DMEM с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки, 5% заменимых аминокислот, 200 мМ глутамина, стрептомицина (100 мкг/мл) и пенициллина (100 Ед/мл). После достижения 80% конфлюентности 2×10 клеток HEK высевали в 10 см чашки и через 24 часа совместно трансфицировали с использованием 8 мкг вектора вируса лейкемии мыши (MLV) Gag-Pol, 8 мкг MLV вектора для переноса, который кодирует люциферазу, и 3 мкг полноразмерного экспрессирующего вектора phCMV-7a, который кодирует гликопротеины E1E2 из различных генотипов HCV. Днем позже среду для трансфекции заменяли на 5 мл свежей среды, содержащей 10 мМ HEPES. Клетки инкубировали в течение 24 часов при температуре 37°C. Клетки-мишени (Huh-7) высевали в 24-луночные планшеты в количестве 2,5×10 на лунку и инкубировали в течение ночи при температуре 37°C. Псевдочастицы HCV (HCVpp) собирали через 24 часа после замены среды, центрифугировали на скорости 2000 об/мин в течение 10 минут и фильтровали через мембраны с размером пор 0,45 мкм и использовали в анализе нейтрализации.
В частности, 60 мкл содержащей HCVpp среды смешивали с 90 мкл Fab e20 с другими концентрациями и инкубировали в течение 1 часа при температуре 37°C. Такую смесь добавляли в клетки-мишени Huh-7 и клетки инкубировали в течение 3 часов при температуре 37°C. В конце удаляли инокулят, в каждую лунку добавляли 1 мл свежей среды и клетки инкубировали при температуре 37°C в течение 4 дней. Клетки промывали дважды в PBS и затем лизировали с использованием 100 мкл лизисного буфера (Promega), по инструкциям производителя. Клеточный лизат переносили в 96-луночные планшеты и в каждую лунку добавляли 100 мкл субстрата/буфера (Promega). Инфекцию клеток анализировали посредством измерения люминесцентной активности (считыватель планшетов Chameleon, Hidex), которая приведена в относительных световых единицах (ОСЕ). Нейтрализующую активность определяли в виде процентного значения инфекции посредством сравнения полученной люминесценции с тем, что определяли в лунках с HCVpp в отсутствие антител, способных к конкуренции (отр.). В каждый эксперимент в качестве отрицательного контроля включали рекомбинантный Fab человека (c33-3) со специфичностью к неструктурному антигену HCV (NS3).
Этот подход показал, что e20 способен резко нейтрализовать генотипы HCV 1a и 4. e20 проявляет 50% нейтрализующую активность в отношении генотипа 1a в концентрации 7,5 мкг/мл и 75% ингибирование в отношении генотипа 4 в концентрации 15 мкг/мл (фиг. 2a, 2e и 2f). Однако это антитело также способно резко нейтрализовать генотипы HCV 1b и 2a. Более подробно, в концентрации 15 мкг/мл e20 показывает 40% нейтрализацию и 75% инфекционность в отношении генотипов 1b и 2a соответственно (фиг. 2b, 2c и 2f). Наконец, e20 способен нейтрализовать в меньшей степени HCVpp, содержащие гликопротеины E1E2 генотипа 2b, проявляя 20% ингибирование в концентрации 15 мкг/мл (фиг. 2d и 2f).
Нейтрализующая активность e20 в отношении штамма HCV, выращенного в культуре клеток (генотип 2a, штамм JFH1)
Также тестировали нейтрализующую активность e20 в отношении HCV, используя модельную систему HCVcc (HCV культура клеток), посредством использования стабильной клеточной линии гепатомы человека, которая содержит кДНК, встроенную в хромосому, из HCV генотипа 2a (JFH1) и высоко продуцирующих контагиозных вирусов (фиг. 3). Такая система позволяет оценить нейтрализующую активность посредством использования контагиозного штамма вируса гепатита C. В этой группе экспериментов Fab e20 в различных концентрациях инкубировали со средой, содержащей вирус, созданный в анализе HCVcc. Через 3 часа смесь добавляли к клеткам-мишеням (Huh7.5). Инфекционность оценивали посредством измерения уровней плюс-цепей РНК HCV. Fab e20 показал сильную нейтрализующую активность, поскольку в концентрации 1 мкг/мл, которая является очень низкой, он способен полностью устранять инфекционность HCV генотипа 2a. Нейтрализующая активность Fab e20 сравнима с моноклональным антителом IgG AP33 мыши, одним из наиболее сильных нейтрализующих антител с перекрестной реактивностью, описанных на сегодняшний день.