ВСПОМОГАТЕЛЬНЫЙ СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В ЛЕЧЕНИИ СИНДРОМА РАЗДРАЖЕННОГО КИШЕЧНИКА С ПРИМЕНЕНИЕМ КОРРЕКЦИОННОЙ ДИЕТЫ ИЛИ ТРАНСПЛАНТАЦИИ ФЕКАЛЬНОЙ МИКРОБИОТЫ
AUXILIARY DIAGNOSTIC METHOD FOR USE IN THE TREATMENT OF IRRITABLE BOWEL SYNDROME USING CORRECTIVE DIET OR FECAL MICROBIOTA TRANSPLANTATION

Настоящее изобретение обеспечивает способ диагностики, который можно применять для определения вероятности того, что субъект с синдромом раздраженного кишечника (СРК) будет реагировать на лечение с применением коррекционной диеты для СРК или трансплантации фекальной микробиоты (ТФМ). В частности, данный способ можно применять для прогнозирования или определения вероятности положительной реакции субъекта с СРТ на лечение с применением коррекционной диеты для СРК или ТФМ, в особенности для определения вероятности того, что коррекционная диета или ТФМ может оказать положительный (т.е. благоприятный) эффект на желудочно-кишечный тракт субъекта, конкретно, микробиоту желудочно-кишечного тракта, или другие симптомы или осложнения СРК (например, снизить их тяжесть). Таким образом, можно определить, произойдет ли улучшение СРК или осложнения или симптома СРК у субъекта с СРК, или возможно ли предотвращение или отсрочка развития СРК или указанного осложнения или симптома СРК после лечения с применением коррекционной диеты для СРК или ТФМ. Тем самым, способ согласно настоящему изобретению позволяет выявить пациентов с СРК, которые, вероятно, будут клинически реагировать на лечение с применением коррекционной диеты для СРК или ТФМ.
Неожиданно было обнаружено, что в образцах фекалий субъектов с СРК, демонстрирующих реакцию на лечение с применением коррекционной диеты для СРК или ТФМ, относительное содержание бактерий некоторых таксономических групп может быть повышено или понижено по сравнению с субъектами без симптомов СРК или субъектами с СРК, демонстрирующими отсутствие реакции на лечение с применением коррекционной диеты для СРК или ТФМ. Таким образом, посредством сравнения количества этих бактерий в образцах из желудочно-кишечного тракта субъектов с СРК с количеством в соответствующих образцах у субъектов без симптомов СРК можно выявить субъектов с СРК, которые, вероятно, будут реагировать на лечение с применением коррекционной диеты для СРК или ТФМ. Отсюда следует, что в качестве альтернативы или дополнения количество этих бактерий в образцах из желудочно-кишечного тракта субъектов с СРК можно сравнить с медианными значениями количества этих бактерий в образцах из желудочно-кишечного тракта субъектов, ранее демонстрировавших реакцию на указанное лечение, причем полученные значения, превышающие медианное пороговое значение для бактерий из таксономических групп, количество которых у реагировавших лиц было повышено по сравнению с количеством у не реагировавших лиц, либо полученные значения ниже медианного порогового значения для бактерий из таксономических групп, количество которых у реагировавших лиц было понижено по сравнению с количеством у не реагировавших лиц, являются показателем субъектов с СРК, которые, вероятно, будут реагировать на лечение с применением коррекционной диеты для СРК или ТФМ. Таким образом, способ согласно настоящему изобретению основан на анализе относительного содержания некоторых бактерий в образцах из желудочно-кишечного тракта, например, посредством анализа нуклеиновых кислот, включающего методики секвенирования нуклеиновых кислот или методики на основе гибридизации олигонуклеотидных зондов.
СРК представляет собой функциональное расстройство желудочно-кишечного тракта, определяемое по наличию комбинации симптомов, а именно, хронической боли или дискомфорта в животе и продолжительных диареи, запора или чередующихся периодов диареи и запора (СРК-диарея (диарейный подтип СРК), СРК-запор (запорный подтип СРК) или смешанный СРК (СРК смешанного подтипа). Широко принятый диагностический стандарт представляет собой критерии Rome III, т.е. рецидивирующая боль или дискомфорт в животе («дискомфорт» означает некомфортное ощущение, не описываемое как боль) по меньшей мере 3 дня в месяц за последние 3 месяца, ассоциированные с двумя или более из следующих явлений: улучшение при дефекации, начало симптомов ассоциировано с изменением частоты дефекации, начало симптомов ассоциировано с изменением формы (внешнего вида) фекалий. Некоторые пациенты также испытывают метеоризм, вздутие живота, спазм, скопление газов, тенезмы и императивные позывы к дефекации. В отличие от воспалительного заболевания кишечника (IBD), СРК является идиопатическим состоянием, и считается, что его возникновение не обусловлено патологическим механизмом, однако наблюдаемые при них симптомы часто одинаковы. СРК можно диагностировать по обнаружению характерных симптомов, однако для исключения альтернативных причин наблюдаемых симптомов могут потребоваться более инвазивные тесты, например, анализ крови и эндоскопические исследования. Тяжесть СРК можно измерить посредством принятого в настоящее время балльного показателя тяжести симптомов СРК (IBS-SSS; Francis C.Y., Aliment Pharmacol Ther. 1997 Apr; 11(2):395-402); установлено, что он является достоверным, обоснованным и воспроизводимым опросником, позволяющим осуществлять высокочувствительную оценку изменений тяжести симптомов, в особенности у пациентов с умеренными симптомами СРК (Betz, С., et al., Z Gastroenterol., 2013, 51 (10):1171-6).
Количество клинически эффективных способов лечения СРК ограничено, однако они включают введение антибиотиков (например, рифаксимина), коррекционную диету, в том числе диету, богатую пребиотиками (например, диеты с высоким содержанием сбраживаемых олигосахаридов (FOS) (Slavin J. Nutrients. 2013 Apr; 5(4): 1417-1435)), диеты с ограниченным содержанием пребиотиков (например, диеты с ограниченным содержанием FODMAP (сбраживаемых олигосахаридов, дисахаридов, моносахаридов и многоатомных спиртов) (Gearry R.B et al., JCC 2008.09.004 8-14)), и диеты, богатой пробиотиками, а также трансплантацию фекальной микробиоты (ТФМ; Kelly CR et al. Gastroenterology. 2015 Jul; 149(1): 223-237). Другие специфические лекарственные средства включают линаклотид, в частности, для симптоматического лечения умеренного и тяжелого синдрома раздраженного кишечника с запором (СРК-3) у взрослых; и элуксадолин, в частности, для лечения диареи и боли в животе у лиц с синдромом раздраженного кишечника с преобладанием диареи (СРК-Д). Кроме того, с учетом идиопатической природы СРК, часто оказывается, что лекарственное средство, эффективное для одного пациента, неэффективно для другого, даже если у каждого пациента наблюдаются практически одинаковые видимые симптомы. Даже у одного и того же пациента реакция на лечение может иметь место в определенное время и отсутствовать в другое время.
Желудочно-кишечный тракт, также называемый пищеварительным трактом или пищеварительной системой (эти термины можно использовать равнозначно с термином «желудочно-кишечный тракт» (ЖКТ)), представляет собой непрерывную последовательность органов, начинающихся с полости рта и заканчивающихся задним проходом. На всем своем протяжении желудочно-кишечный тракт населен микроорганизмами различных видов. Микроорганизмы, содержащиеся в ЖКТ, в целом называются микробиотой желудочно-кишечного тракта. Относительное количество микроорганизмов или их групп можно считать профилем микробиоты. Таким образом, профили микробиоты содержат информацию о микробиологическом разнообразии (т.е. количестве присутствующих таксономически различающихся микроорганизмов или различных таксономических групп) в ЖКТ, а также об относительном количестве присутствующих микроорганизмов или их групп.
Считается, что многие заболевания и состояния или их стадии ассоциированы с нарушениями в составе микробиоты желудочно-кишечного тракта или его областей. В некоторых случаях заболевание или состояние может вызываться или обостряться из-за сдвига профиля микробиоты желудочно-кишечного тракта или его областей (т.е. относительного количества микроорганизмов и их разнообразия). В других случаях заболевание или состояние вызывает или посредством некоторых механизмов приводит к изменению профиля микробиоты желудочно-кишечного тракта по сравнению с нормальным состоянием. В некотором смысле это даже может представлять собой адаптивный ответ, направленный на устранение патологического фенотипа заболевания или состояния
В настоящее время детектирование и даже количественная оценка относительного количества микроорганизмов в образцах из желудочно-кишечного тракта и применение таких профилей для диагностики заболевания по специфическим профилям, характерным для болезненного состояния, или для исключения диагноза по специфическим профилям, характерным для нормального состояния, является часто реализуемым подходом (например, WO 2012080754; WO 2011043654). Однако предположения о том, что относительное содержание бактерий некоторых таксономических групп может являться показателем вероятности того, что субъект с СРК будет реагировать на лечение с применением коррекционной диеты для СРК или трансплантации фекальной микробиоты (ТФМ), не высказывались.
Неожиданно мы обнаружили, что в образцах фекалий у субъектов с СРК, демонстрирующих реакцию на лечение с применением коррекционной диеты для СРК или ТФМ, относительное содержание бактерий некоторых таксономических групп может быть повышено или понижено по сравнению с субъектами без симптомов СРК или субъектами с СРК, демонстрирующими отсутствие реакции на лечение с применением коррекционной диеты для СРК или ТФМ. Таким образом, посредством сравнения количества этих бактерий в образцах из желудочно-кишечного тракта субъектов с СРК с количеством в соответствующих образцах у субъектов без симптомов СРК можно выявить субъектов с СРК, которые, вероятно, будут реагировать на лечение с применением коррекционной диеты для СРК или ТФМ, и отличать их от субъектов, у которых такая реакция маловероятна. Отсюда следует, что в качестве альтернативы или дополнения количество этих бактерий в образцах из желудочно-кишечного тракта субъектов с СРК можно сравнить с медианными значениями количества этих бактерий в образцах из желудочно-кишечного тракта субъектов, ранее демонстрировавших реакцию на указанное лечение, причем полученные значения, превышающие медианное пороговое значение для бактерий из таксономических групп, количество которых у реагировавших лиц было повышено по сравнению с количеством у не реагировавших лиц, либо полученные значения ниже медианного порогового значения для бактерий из таксономических групп, количество которых у реагировавших лиц было понижено по сравнению с количеством у не реагировавших лиц, являются показателем субъектов с СРК, которые, вероятно, будут реагировать на лечение с применением коррекционной диеты для СРК или ТФМ.
Таким образом, в первом аспекте настоящего изобретения предложен способ in vitro определения вероятности того, что субъект с синдромом раздраженного кишечника (СРК) будет реагировать на лечение с применением коррекционной диеты для СРК или трансплантации фекальной микробиоты (ТФМ), причем указанный способ включает:
(i)(a) определение в тестируемом образце из желудочно-кишечного тракта субъекта с СРК диарейного подтипа или СРК смешанного подтипа, которого предполагается лечить с применением коррекционной диеты для СРК, количества бактерий из по меньшей мере одной таксономической группы, выбранной из
- Acinetobacter junii
- Bacteroides stercosis
- Bacteroides zoogleoformans
- Dorea spp.
- Eubacterium siraeum
- Clostridium sp.
- Eubacterium hallii
- Bacteroides spp.
- Firmicutes
- Veillonella spp., Helicobacter spp. и Clostridia
- Shigella spp. и Escherichia spp. и
- Bacteroides spp. и Prevotella spp.; или
(i)(b) определение в тестируемом образце из желудочно-кишечного тракта субъекта с СРК запорного подтипа, которого предполагается лечить с применением коррекционной диеты для СРК, количества бактерий из по меньшей мере одной таксономической группы, выбранной из
- Clostridium methylpentosum
- Eubacterium siraeum
- Acinetobacter junii и
- Desulfitipora alkaliphila; или
(i) (c) определение в тестируемом образце из желудочно-кишечного тракта
субъекта с СРК диарейного подтипа или СРК смешанного подтипа, которого предполагается лечить посредством ТФМ, количества бактерий из по меньшей мере одной таксономической группы, выбранной из
- Clostridium sp.
- Eubacterium hallii
- Bacteroides spp. и Prevotella spp.; и
- Dialister invisus; и
(ii) (a) сравнение количества указанных бактерий из указанной по меньшей мере
одной таксономической группы с референтным значением, полученным из по меньшей мере одного образца из желудочно-кишечного тракта по меньшей мере одного субъекта без симптомов СРК, и определение отличия количества указанных бактерий из указанной по меньшей мере одной таксономической группы в указанном тестируемом образце от референтного значения или соответствия референтному значению; и/или (ii)(b) сравнение количества указанных бактерий из указанной по меньшей мере одной таксономической группы с пороговым значением, установленным как медианное количество указанных бактерий в по меньшей мере одном образце из желудочно-кишечного тракта по меньшей мере одного субъекта с СРК указанного подтипа, ранее демонстрировавшего реакцию на указанное лечение, и определение отличий количества указанных бактерий из указанной по меньшей мере одной таксономической группы в указанном тестируемом образце по сравнению с указанным медианным пороговым значением с большую или меньшую сторону.
На этапе (ii)(a) значимое различие между количеством бактерий из одной или более вышеупомянутых таксономических групп (т.е. целевых бактерий) в тестируемом образце и референтным значением (т.е. количеством указанных целевых бактерий в референтном образце) является показателем того, что указанный тестируемый субъект с синдромом раздраженного кишечника (СРК) будет реагировать на лечение с применением коррекционной диеты для СРК или ТФМ в соответствующих случаях. Другими словами, если у тестируемого субъекта с СРК имеет место дисбиоз по целевым бактериям, это является показателем того, что субъект будет реагировать на лечение с применением коррекционной диеты для СРК или ТФМ в соответствующих случаях. Безотносительно к теоретическим представлениям, выраженность различия в количестве указанных целевых бактерий (дисбиоза по отношению к указанным целевым бактериям) может являться показателем степени реакции.
На этапе (ii)(a) количество целевых бактерий в тестируемом образце, соответствующее референтному значению, является показателем того, что тестируемый субъект с СРК не будет реагировать на лечение с применением коррекционной диеты для СРК или ТФМ в соответствующих случаях. Другими словами, если у тестируемого субъекта с СРК имеет место нормобиоз по целевым бактериям, это является показателем того, что субъект не будет реагировать на лечение с применением коррекционной диеты для СРК или ТФМ. Безотносительно к теоретическим представлениям, чем больше соответствие полученного в тесте и референтного значения, тем больше вероятность отсутствия реакции у субъекта.
На этапе (ii)(b) количественный результат теста для указанного субъекта с СРК по количеству бактерий из вышеупомянутой таксономической группы, которые присутствуют в повышенных количествах у субъектов с СРК того же подтипа, ранее демонстрировавших реакцию на лечение с применением коррекционной диеты для СРК или ТФМ, по сравнению с субъектами с СРК того же подтипа, не реагирующими на лечение, превышающий медианное пороговое значение, является показателем того, что указанный тестируемый субъект будет реагировать на лечение с применением коррекционной диеты для СРК или ТФМ в соответствующих случаях.
И наоборот, на этапе (ii)(b) количественный результат теста для указанного субъекта с СРК по количеству бактерий из вышеупомянутой таксономической группы, которые присутствуют в повышенных количествах у субъектов с СРК того же подтипа, ранее демонстрировавших реакцию на лечение с применением коррекционной диеты для СРК или ТФМ, по сравнению с субъектами с СРК того же подтипа, не реагирующими на лечение, меньший медианного порогового значения, является показателем того, что тестируемый субъект не будет реагировать на лечение с применением коррекционной диеты для СРК или ТФМ в соответствующих случаях.
На этапе (ii)(b) количественный результат теста для указанного субъекта с СРК по количеству бактерий из вышеупомянутой таксономической группы, которые присутствуют в пониженных количествах у субъектов с СРК того же подтипа, ранее демонстрировавших реакцию на лечение с применением коррекционной диеты для СРК или ТФМ, по сравнению с субъектами с СРК того же подтипа, не реагирующими на лечение, меньший медианного порогового значения, является показателем того, что тестируемый субъект будет реагировать на лечение с применением коррекционной диеты для СРК или ТФМ в соответствующих случаях.
И наоборот, на этапе (ii)(b) количественный результат теста для указанного субъекта с СРК по количеству бактерий из вышеупомянутой таксономической группы, которые присутствуют в пониженных количествах у субъектов с СРК того же подтипа, ранее демонстрировавших реакцию на лечение с применением коррекционной диеты для СРК или ТФМ, по сравнению с субъектами с СРК того же подтипа, не реагирующими на лечение, превышающий медианное пороговое значение, является показателем того, что тестируемый субъект не будет реагировать на лечение с применением коррекционной диеты для СРК или ТФМ в соответствующих случаях.
Специалисту будет понятно, что этап (ii)(b), описанный выше, равносилен одностороннему анализу количественных результатов теста, при котором значимая (т.е. представляющая положительный результат) сторона соответствует направлению тенденции, наблюдаемой у субъектов с СРК того же подтипа, ранее демонстрировавших реакцию на лечение с применением коррекционной диеты для СРК или ТФМ в соответствующих случаях.
Сокращение «spp.» в настоящем документе используется для обозначения нескольких видов. В соответствии с настоящим изобретением, упоминание таксономической группы, содержащее сокращение «spp.», относится к группе, содержащей несколько видов. Ее можно считать группой, состоящей из бактерий одного рода. Сокращение «sp.» означает один вид.
Фразу «для определения вероятности» можно выразить как «для определения правдоподобия» или «для установления вероятности» или «для оценки вероятности». Как будет ясно из дальнейшего, результат указанной оценки может быть численным, графическим или описательным, и каждый из этих вариантов, в свою очередь, может быть качественным, полуколичественным или количественным.
Кроме того, очевидно, что указанный способ можно иначе описать как способ прогнозирования наличия или отсутствия реакции на лечение с применением коррекционной диеты для СРК или ТФМ у субъекта с СРК, например, наличия или отсутствия улучшения или вероятности улучшения СРК или его симптома или осложнения у субъекта с СРК, или наличия или отсутствия задержки или предотвращения или вероятности задержки или предотвращения развития СРК или указанного осложнения или симптома СРК после лечения с применением коррекционной диеты для СРК или ТФМ. Указанный способ также можно описать как способ выявления, обнаружения, диагностики, классификации или стратификации пациентов с СРК, которые, вероятно, будут реагировать на лечение с применением коррекционной диеты для СРК или ТФМ.
Кроме того, настоящее изобретение можно описать в более общем случае как способ получения информации, полезной для вышеупомянутых способов, имеющей значение для них или способной содействовать их реализации.
Термин «улучшение» по отношению к СРК или его осложнениям или симптомам используется в настоящем документе в широком смысле и включает любые положительные изменения или снижение тяжести СРК или его рассматриваемого осложнения или симптома или показателя. Сюда входят, например, улучшение любого признака СРК или его осложнения или симптома, или любого клинически принятого показателя СРК или его осложнения или симптома у субъекта (например, боли в животе, диареи, запора, метеоризма, вздутия живота, спазма, скопления газов, тенезмов и императивных позывов к дефекации). Улучшение не обязательно требует полного устранения осложнения или симптома. Тяжесть СРК и его симптомов и осложнений можно отслеживать по IBS-SSS. В некоторых вариантах реализации улучшением можно считать снижение показателя по шкале IBS-SSS у субъекта по меньшей мере приблизительно на 10%, например, по меньшей мере приблизительно на 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65% или 70%. В некоторых вариантах реализации улучшением можно считать снижение показателя по шкале IBS-SSS у субъекта по меньшей мере приблизительно на 50 баллов, например, по меньшей мере приблизительно на 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 130, 140 ил и 150 баллов.
Подразумевается, что термин «задержка» по отношению к СРК или его осложнениям или симптомам включает любую задержку, ограничение или ослабление проявления или развития любых эффектов СРК, его осложнения или симптома или одного или более из его показателей, или проявления или развития СРК, его осложнения или симптома или одного или более из его показателей, например, по сравнению с СРК, его осложнением, симптомом или показателем до лечения.
В противоположность этому, термин «предотвращение» относится к абсолютному предотвращению возникновения или развития осложнений или симптомов СРК у субъектов с СРК, у которых еще не наблюдается (или еще не развилось) рассматриваемое осложнение или симптом. Кроме того, можно считать, что предотвращение включает снижение риска приобретения или развития рассматриваемого осложнения или симптома СРК у субъекта с СРК.
В некоторых вариантах реализации «улучшение» или «задержка» в соответствии с настоящим изобретением или их клинические признаки могут наблюдаться в течение 14 дней, например, 10 дней, 7 дней, 5 дней, 3 дней, 2 дней, 1 дня 18 ч, 12 ч или 6 ч с момента начала лечения с применением коррекционной диеты для СРК или ТФМ.
Как вариант, статус субъекта с СРК как пациента, для которого вероятна реакция на лечение с применением коррекционной диеты для СРК или ТФМ, может измениться со временем. Например, субъекты с СРК, для которых установлена вероятность реакции, со временем могут перестать реагировать на лечение. Аналогичным образом, субъекты с СРК, для которых установлена вероятность отсутствия реакции, со временем могут начать реагировать на лечение. Эти изменения между состояниями наличия и отсутствия реакции могут происходить несколько раз. Соответственно, способы согласно настоящему изобретению можно выполнять повторно по отношению к одному и тому же субъекту по прошествии некоторого времени. Сюда может входить выполнение способов согласно настоящему изобретению во время или после лечения субъекта с применением коррекционной диеты для СРК или ТФМ, например, перед началом нового курса лечения с применением коррекционной диеты для СРК или ТФМ (в целях подтверждения вероятности реакции). В других случаях способы согласно настоящему изобретению можно выполнять по отношению к субъекту через соответствующий период времени после получения результата, указывающего на вероятное отсутствие реакции, и/или неудачного курса лечения с применением коррекционной диеты для СРК или ТФМ. Кроме того, в таких вариантах реализации вновь полученные результаты для пациента можно сравнивать (как указано в настоящем документе) с предыдущими результатами.
Так, в некоторых вариантах реализации субъект с СРК является субъектом, не получавшим лечения с применением коррекционной диеты для СРК или ТФМ. В других вариантах реализации субъект с СРК является субъектом, получающим или получившим лечение с применением коррекционной диеты для СРК или ТФМ. Субъект с СРК может являться субъектом, реагировавшим на указанное лечение, или субъектом, не реагировавшим на указанное лечение. В дополнительных вариантах реализации субъект с СРК является субъектом, для которого ранее установлена вероятность реакции на лечение с применением коррекционной диеты для СРК или ТФМ, или субъектом, для которого ранее установлено отсутствие вероятности реакции на указанное лечение.
В некоторых вариантах реализации определяют количество бактерий по меньшей мере 2, 3, 4 или всех вышеупомянутых таксономических групп, а на этапе (ii)(a) выполняют сравнение с референтными значениями для указанных таксономических групп, полученными из по меньшей мере одного образца из желудочно-кишечного тракта по меньшей мере одного субъекта без симптомов СРК.
В некоторых вариантах реализации определяют количество бактерий по меньшей мере 2, 3, 4 или всех вышеупомянутых таксономических групп, а на этапе (ii)(a) выполняют сравнение с пороговыми значениями для указанных таксономических групп, полученными из по меньшей мере одного образца из желудочно-кишечного тракта по меньшей мере одного субъекта с СРК указанного подтипа, ранее демонстрировавшего реакцию на указанное лечение.
В некоторых вариантах реализации на этапе (i)(a) указанную таксономическую группу выбирают из Acinetobacter junii, Eubacterium siraeum, Clostridium sp., Eubacterium hallii, Firmicutes и Bacteroides spp. и Prevotella spp.
В некоторых вариантах реализации на этапе (i)(b) указанную таксономическую группу выбирают из Acinetobacter junii и Eubacterium siraeum.
В некоторых вариантах реализации на этапе (i)(c) указанную таксономическую группу выбирают из Clostridium sp., Eubacterium hallii и Bacteroides spp. и Prevotella spp.
В некоторых вариантах реализации на этапе (i)(a) указанную таксономическую группу выбирают из любых двух или более из Acinetobacter junii, Firmicutes и Bacteroides spp. и Prevotella spp. или из любых двух или более из Dorea spp., Eubacterium siraeum и Shigella spp. и Escherichia spp. или из любых двух или более из Eubacterium siraeum, Firmicutes и Bacteroides spp. и Prevotella spp.
В некоторых вариантах реализации на этапе (i)(b) указанную таксономическую группу выбирают из любых двух или более из Acinetobacter junii, Clostridium methylpentosum и Desulfitipora alkaliphila.
В некоторых вариантах реализации на этапе (i)(c) указанную таксономическую группу выбирают из любых двух или более из Clostridium sp., Eubacterium hallii и Bacteroides spp. и Prevotella spp.
В некоторых вариантах реализации способ согласно настоящему изобретению включает этапы (i)(a) и (ii)(a), причем количество бактерий в таксономических группах Acinetobacter junii, Bacteroides stercosis, Bacteroides zoogleoformans, Dorea spp., Eubacterium siraeum, Clostridium sp., Eubacterium hallii или Firmicutes, превышающее референтные значения, или количество бактерий в таксономических группах Bacteroides spp., Firmicutes, Veillonella spp., Helicobacter spp. и Clostridia, Shigella spp. и Escherichia spp. или Bacteroides spp. и Prevotella spp., меньшее референтного значения, является показателем того, что субъект будет реагировать на коррекционную диету для СРК.
В некоторых вариантах реализации способ согласно настоящему изобретению включает этапы (i)(b) и (ii)(a), причем количество бактерий в таксономических группах Clostridium methyl реntosum или Eubacterium siraeum, превышающее референтные значения, или количество бактерий в таксономических группах Acinetobacter junii или Desulfitipora alkaliphila, меньшее референтного значения, является показателем того, что субъект будет реагировать на коррекционную диету для СРК.
В некоторых вариантах реализации способ согласно настоящему изобретению включает этапы (i)(c) и (ii)(a), причем количество бактерий в таксономических группах Clostridium sp.или Eubacterium hallii, превышающее референтные значения, или количество бактерий в таксономических группах Bacteroides spp. и Prevotella spp. или Dialister invisus, меньшее референтного значения, является показателем того, что субъект будет реагировать на ТФМ.
В некоторых вариантах реализации способ согласно настоящему изобретению включает этапы (i)(a) и (ii)(b), причем количество бактерий в таксономических группах Acinetobacter junii, Bacteroides stercosis, Bacteroides zoogleoformans, Dorea spp., Eubacterium siraeum, Clostridium sp., Eubacterium hallii или Firmicutes, превышающее указанное медианное пороговое значение для указанных бактерий, или количество бактерий в таксономических группах Bacteroides spp., Firmicutes, Veillonella spp., Helicobacter spp. и Clostridia, Shigella spp. и Escherichia spp. или Bacteroides spp. и Prevotella spp., меньшее указанного медианного порогового значения для указанных бактерий, является показателем того, что субъект будет реагировать на коррекционную диету для СРК.
В некоторых вариантах реализации способ согласно настоящему изобретению включает этапы (i)(b) и (ii)(b), причем количество бактерий в таксономических группах Clostridium methyl реntosum или Eubacterium siraeum, превышающее указанное медианное пороговое значение для указанных бактерий, или количество бактерий в таксономических группах Acinetobacter junii или Desulfitipora alkaliphila, меньшее указанного медианного порогового значения для указанных бактерий, является показателем того, что субъект будет реагировать на коррекционную диету для СРК.
В некоторых вариантах реализации способ согласно настоящему изобретению включает этапы (i)(c) и (ii)(b), причем количество бактерий в таксономических группах Clostridium sp.или Eubacterium hallii, превышающее указанное медианное пороговое значение для указанных бактерий, или количество бактерий в таксономических группах Bacteroides spp. и Prevotella spp. или Dialister invisus, указанного медианного порогового значения для указанных бактерий, является показателем того, что субъект будет реагировать на ТФМ.
В дополнительных вариантах реализации способ согласно настоящему изобретению включает этапы (ii)(a) и (ii)(b) и вышеуказанное обсуждение диагностического результата сравнения между количественными результатами теста и референтными значениями или медианными пороговыми значениями, который можно получить на этих этапах, применяется с соответствующими поправками.
Как подробно обсуждается ниже, в предпочтительных вариантах реализации коррекционная диета для СРК, представляет собой диету с низким (ограниченным) содержанием FODMAP (ферментируемых олиго-, ди-, моно- сахаридов и пололов) или диету с высоким содержанием FOS (фруктоолигосахаридов).
Так, в некоторых вариантах реализации способ согласно настоящему изобретению включает этапы (i)(a) и (ii)(a) и/или (ii)(b), причем указанная коррекционная диета для СРК, представляет собой диету с низким содержанием FODMAP, а указанную таксономическую группу выбирают из Acinetobacter junii, Bacteroides stercosis, Bacteroides zoogleoformans, Dorea spp., Eubacterium siraeum, Clostridium sp., Eubacterium halli, Bacteroides spp., Firmicutes, Veillonella spp., Helicobacter spp. и Clostridia и Shigella spp. и Escherichia spp..
В указанных вариантах реализации на любом этапе (ii)(a) количество бактерий в таксономических группах Acinetobacter junii, Bacteroides stercosis, Bacteroides zoogleoformans, Dorea spp., Eubacterium siraeum, Clostridium sp. или Eubacterium hallii, превышающее референтные значения, или количество бактерий в таксономических группах Bacteroides spp., Firmicutes, Veillonella spp., Helicobacter spp. и Clostridia или Shigella spp. и Escherichia spp., меньшее референтного значения, предпочтительно является показателем того, что субъект будет реагировать на диету с низким содержанием FODMAP.
В указанных вариантах реализации на любом этапе (ii)(b) количество бактерий в таксономических группах Acinetobacter junii, Bacteroides stercosis, Bacteroides zoogleoformans, Dorea spp., Eubacterium siraeum, Clostridium sp. или Eubacterium hallii, превышающее указанное медианное пороговое значение для указанных бактерий, или количество бактерий в таксономических группах Bacteroides spp., Firmicutes, Veillonella spp., Helicobacter spp. и Clostridia или Shigella spp. и Escherichia spp., меньшее указанного медианного порогового значения для указанных бактерий, предпочтительно является показателем того, что субъект будет реагировать на диету с низким содержанием FODMAP.
В других вариантах реализации способ согласно настоящему изобретению включает этапы (i)(a) и (ii)(a) и/или (ii)(b), причем указанная коррекционная диета для СРК, представляет собой диету с высоким содержанием FOS, а указанную таксономическую группу выбирают из Eubacterium siraeum, Firmicutes и Bacteroides spp. и Prevotella spp.
В указанных вариантах реализации на любом этапе (ii)(a) количество бактерий в таксономических группах Eubacterium siraeum, Firmicutes или Bacteroides spp. и Prevotella spp., превышающее референтные значения, предпочтительно является показателем того, что субъект будет реагировать на диету с высоким содержанием FOS.
В указанных вариантах реализации на любом этапе (ii)(b) количество бактерий в таксономических группах Eubacterium siraeum, Firmicutes или Bacteroides spp. и Prevotella spp., превышающее указанное медианное пороговое значение для указанных бактерий, предпочтительно является показателем того, что субъект будет реагировать на диету с высоким содержанием FOS.
В других вариантах реализации способ согласно настоящему изобретению включает этапы (i)(b) и (ii)(a) и/или (ii)(b), причем указанная коррекционная диета для СРК, представляет собой диету с низким содержанием FODMAP, а указанную таксономическую группу выбирают из Clostridium methylpentosum, Eubacterium siraeum, Acinetobacter junii и Desulfitipora alkaliphila.
В указанных вариантах реализации на любом этапе (ii)(a) количество бактерий в таксономических группах Clostridium methylpentosum или Eubacterium siraeum, превышающее референтные значения, или количество бактерий в таксономических группах Acinetobacter junii или Desulfitipora alkaliphila, меньшее референтного значения, предпочтительно является показателем того, что субъект будет реагировать на диету с низким содержанием FODMAP.
В указанных вариантах реализации на любом этапе (ii)(b) количество бактерий в таксономических группах Clostridium methylpentosum или Eubacterium siraeum, превышающее указанное медианное пороговое значение для указанных бактерий, или количество бактерий в таксономических группах Acinetobacter junii или Desulfitipora alkaliphila, меньшее указанного медианного порогового значения для указанных бактерий, предпочтительно является показателем того, что субъект будет реагировать на диету с низким содержанием FODMAP.
В дополнительных вариантах реализации способ согласно настоящему изобретению включает этап (i)(c) и (ii)(a) или (ii)(b), причем у указанного субъекта имеет место СРК диарейного подтипа, а указанную таксономическую группу выбирают из Clostridium sp., Eubacterium hallii и Bacteroides spp. и Prevotella spp.
В указанных вариантах реализации на любом этапе (ii)(a) количество бактерий в таксономических группах Clostridium sp.или Eubacterium hallii, превышающее референтные значения, или количество бактерий в таксономических группах Bacteroides spp. и Prevotella spp., меньшее референтного значения, предпочтительно является показателем того, что субъект будет реагировать на ТФМ.
В указанных вариантах реализации на любом этапе (ii)(b) количество бактерий в таксономических группах Clostridium sp.или Eubacterium hallii, превышающее указанное медианное пороговое значение для указанных бактерий, или количество бактерий в таксономических группах Bacteroides spp. и Prevotella spp., меньшее указанного медианного порогового значения для указанных бактерий, предпочтительно является показателем того, что субъект будет реагировать на ТФМ.
В дополнительных вариантах реализации способ согласно настоящему изобретению включает этап (i)(c) и (ii)(a) или (ii)(b), причем у указанного субъекта имеет место СРК смешанного подтипа, а указанную таксономическую группу выбирают из Clostridium sp., Bacteroides spp. и Prevotella spp. и Dialister invisus
В указанных вариантах реализации на любом этапе (ii)(a) количество бактерий в таксономической группе Clostridium sp., превышающее референтные значения, или количество бактерий в таксономических группах Bacteroides spp. и Prevotella spp. и Dialister invisus, меньшее референтного значения, предпочтительно является показателем того, что субъект будет реагировать на ТФМ.
В указанных вариантах реализации на любом этапе (ii)(b) количество бактерий в таксономической группе Clostridium sp., превышающее указанное медианное пороговое значение для указанных бактерий, или количество бактерий в таксономических группах Bacteroides spp. и Prevotella spp. и Dialister invisus, меньшее указанного медианного порогового значения для указанных бактерий, предпочтительно является показателем того, что субъект будет реагировать на ТФМ.
В соответствии с настоящим изобретением термин «количество» бактерий также можно выразить как «уровень», «относительное содержание» и т.п. Указанные термины используются в настоящем документе взаимозаменяемо.
В вариантах реализации этапа (ii)(a), где определяют количество бактерий из более чем одной из вышеуказанных таксономических групп, полученные данные/информацию можно считать диаграммой или профилем выбранных групп, и в этих вариантах реализации можно выполнить сравнение с соответствующей референтной диаграммой (профилем), полученным из по меньшей мере одного образца из желудочно-кишечного тракта по меньшей мере одного субъекта без симптомов СРК. Значимое различие (отсутствие корреляции) между диаграммой в тестируемом образце и референтной диаграммой является показателем того, что субъект с СРК будет реагировать на лечение с применением коррекционной диеты для СРК или ТФМ. Безотносительно к теоретическим представлениям, выраженность различий может являться показателем степени реакции. Аналогичным образом, чем выше корреляция, тем меньше вероятность того, что субъект будет реагировать на лечение.
В вариантах реализации этапа (ii)(b), где определяют количество бактерий из более чем одной из вышеуказанных таксономических групп, полученные данные/информацию можно считать диаграммой или профилем выбранных групп, и в этих вариантах реализации можно выполнить сравнение с соответствующей референтной диаграммой (профилем), полученной из медианных пороговых значений для каждой таксономической группы и определенной из по меньшей мере одного образца из желудочно-кишечного тракта по меньшей мере одного субъекта с СРК того же подтипа, ранее демонстрировавшего реакцию на указанное лечение. В указанных вариантах реализации сравнение может включать для одной или более из тестируемых таксономических групп определение того, является ли количество бактерий из указанной тестируемой таксономической группы в указанном тестируемом образце большим или меньшим, чем указанное медианное пороговое значение.
В некоторых более специфических вариантах реализации вышеописанного с полученным в тесте профилем можно связать балльный показатель на основе (i) количества случаев, в которых количественные результаты теста количества бактерий вышеупомянутых таксономических групп, присутствующих в повышенном количестве у субъектов с СРК того же подтипа, ранее демонстрировавших реакцию на лечение с применением коррекционной диеты для СРК или ТФМ (в соответствующих случаях), по сравнению с субъектами с СРК того же подтипа, не реагирующими на лечение, превышают медианные пороговые значения для указанных бактерий у указанных субъектов с СРК, реагирующих на лечение, и (ii) количества случаев, в которых количественные результаты теста количества бактерий вышеупомянутых таксономических групп, присутствующих в пониженном количестве у субъектов с СРК того же подтипа, ранее демонстрировавших реакцию на лечение с применением коррекционной диеты для СРК или ТФМ (в соответствующих случаях), по сравнению с субъектами с СРК того же подтипа, не реагирующими на лечение, являются меньшими, чем медианные пороговые значения для указанных бактерий у указанных субъектов с СРК, реагирующих на лечение. Затем данный балльный показатель сравнивают с общим количеством протестированных таксономических групп, и если балльный показатель равен или превышает 30%, например, равен или превышает 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% или 90% количества протестированных таксономических групп, это является показателем того, что субъект с СРК будет реагировать на лечение с применением коррекционной диеты для СРК или ТФМ.
В других более специфических вариантах реализации вышеописанного с полученным в тесте профилем можно связать балльный показатель на основе (i) количества случаев, в которых количественные результаты теста количества бактерий вышеупомянутых таксономических групп, присутствующих в повышенном количестве у субъектов с СРК того же подтипа, ранее демонстрировавших реакцию на лечение с применением коррекционной диеты для СРК или ТФМ (в соответствующих случаях), по сравнению с субъектами с СРК того же подтипа, не реагирующими на лечение, являются меньшими, чем медианные пороговые значения для указанных бактерий у указанных субъектов с СРК, реагирующих на лечение, и (ii) количества случаев, в которых количественные результаты теста количества бактерий вышеупомянутых таксономических групп, присутствующих в пониженном количестве у субъектов с СРК того же подтипа, ранее демонстрировавших реакцию на лечение с применением коррекционной диеты для СРК или ТФМ (в соответствующих случаях), по сравнению с субъектами с СРК того же подтипа, не реагирующими на лечение, превышают медианные пороговые значения для указанных бактерий у указанных субъектов с СРК, реагирующих на лечение. Затем данный балльный показатель сравнивают с общим количеством протестированных таксономических групп, и если балльный показатель равен или превышает 30%, например, равен или превышает 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% или 90% количества протестированных таксономических групп, это является показателем того, что субъект с СРК не будет реагировать на лечение с применением коррекционной диеты для СРК или ТФМ.
Вышеприведенное описание, в котором приведена подробная информация о том, какие таксономические группы являются индикаторами реакции на коррекционную диету для СРК или ТФМ при их наличии в тестируемом образце в количествах, равных, больших или меньших по сравнению с медианными пороговыми значениями, действует с соответствующими поправками в отношении указанных вариантов реализации.
В соответствии с настоящим изобретением, количество бактерий выбранных таксономических групп можно определить наряду (вместе с) количеством нецелевых бактерий или других бактерий, для которых позже может быть установлено, что они являются аналогичными индикаторами реакции субъекта с СРК на коррекционную диету для СРК или ТФМ. Другими словами, данные, имеющие отношение к относительному содержанию вышеупомянутых целевых бактерий в образце из желудочно-кишечного тракта, можно получить или представить с данными, имеющими отношение к относительному содержанию других бактерий.
В связи с этим можно дополнительно определить количество бактерий следующих таксономических групп и сравнить его с референтными значениями для образцов из желудочно-кишечного тракта субъектов с нормобиозом или медианными пороговыми значениями для образцов из желудочно-кишечного тракта субъектов с СРК, ранее демонстрировавших реакцию на лечение с применением коррекционной диеты для СРК или ТФМ (в соответствующих случаях): Acinetobacter junii, Firmicutes, Shigella spp. и Escherichia spp., Bacteroides fragilis, Ruminiclostridium, Streptococcus, Actinomycetales, Anaerotruncus, Clostridiales и Eubacterium.
В некоторых вариантах реализации данной части настоящего изобретения количественные результаты теста для Acinetobacter junii, Firmicutes, Shigella spp. и Escherichia spp., Bacteroides fragilis, Ruminiclostridium, Streptococcus, Actinomycetales, Anaerotruncus, Clostridiales и Eubacterium, отличающиеся от референтных значений при нормобиозе, являются показателем того, что субъект с СРК будет реагировать на лечение посредством диеты с низким содержанием FODMAP. И наоборот, количественные результаты теста для Acinetobacter junii, Firmicutes, Shigella spp. и Escherichia spp., Bacteroides fragilis, Ruminiclostridium, Streptococcus, Actinomycetales, Anaerotruncus, Clostridiales и Eubacterium, соответствующие референтным значениям при нормобиозе, являются показателем того, что субъект с СРК не будет реагировать на лечение посредством диеты с низким содержанием FODMAP.
В некоторых вариантах реализации данной части настоящего изобретения количественные результаты теста для Acinetobacter junii, Bacteroides fragilis, Ruminiclostridium. Streptococcus и Eubacterium, превышающие референтные значения при нормобиозе или превышающие медианные пороговые значения у субъектов с СРК, ранее демонстрировавших реакцию на лечение посредством диеты с низким содержанием FODMAP, являются показателем того, что субъект с СРК будет реагировать на лечение посредством диеты с низким содержанием FODMAP.
В некоторых вариантах реализации данной части настоящего изобретения количественные результаты теста для Firmicutes, Shigella spp.and Escherichia spp., Actinomycetales, Anaerotruncus и Clostridiales, меньшие референтных значений при нормобиозе или меньшие медианных пороговых значений у субъектов с СРК, ранее демонстрировавших реакцию на лечение посредством диеты с низким содержанием FODMAP, являются показателем того, что субъект с СРК будет реагировать на лечение посредством диеты с низким содержанием FODMAP.
В некоторых вариантах реализации данной части настоящего изобретения количественные результаты теста для Acinetobacter junii, Bacteroides fragilis, Ruminiclostridium. Streptococcus и Eubacterium, меньшие медианных пороговых значений у субъектов с СРК, ранее демонстрировавших реакцию на лечение посредством диеты с низким содержанием FODMAP, являются показателем того, что субъект с СРК не будет реагировать на лечение посредством диеты с низким содержанием FODMAP.
В некоторых вариантах реализации количественные результаты теста для Firmicutes, Shigella spp.and Escherichia spp., Actinomycetales, Anaerotruncus и Clostridiales, превышающие медианные пороговые значения у субъектов с СРК, ранее демонстрировавших реакцию на лечение посредством диеты с низким содержанием FODMAP, являются показателем того, что субъект с СРК не будет реагировать на лечение посредством диеты с низким содержанием FODMAP.
Желудочно-кишечный тракт, также называемый пищеварительным трактом или пищеварительной системой (эти термины можно использовать на равных основаниях с термином «желудочно-кишечный тракт» (ЖКТ)), представляет собой непрерывную последовательность органов, начинающихся с полости рта и заканчивающихся задним проходом. Конкретно, эта последовательность состоит из полости рта, глотки, пищевода, желудка, двенадцатиперстной кишки, тонкого кишечника, толстого кишечника и заднего прохода. Эти органы можно разделить на верхний ЖКТ, состоящий из полости рта, глотки, пищевода, желудка и двенадцатиперстной кишки, и нижний ЖКТ, состоящий из тощей кишки, подвздошной кишки (совместно называемых тонким кишечником), слепой кишки, ободочной кишки, прямой кишки (совместно называемых толстым кишечником) и заднего прохода.
Образец из желудочно-кишечного тракта в соответствии с настоящим изобретением может включать любую жидкость или твердое вещество, взятое из просвета или поверхности желудочно-кишечного тракта, или любой образец любой ткани, образующей органы желудочно-кишечного тракта, но не ограничивается ими. Таким образом, образец может представлять собой любое содержимое просвета желудочно-кишечного тракта (например, содержимое желудка, содержимое кишечника, слизь и фекалии или их комбинации), а также образцы, полученные механически из желудочно-кишечного тракта, например, путем взятия мазка, смыва, аспирации или соскоба из полости или с поверхности желудочно-кишечного тракта или путем биопсии ткани/органа желудочно-кишечного тракта. Предпочтительными являются образцы фекалий. Кроме того, образец можно получить из части хирургически удаленной ткани/органа желудочно-кишечного тракта. Образец может представлять собой фрагмент ампутированной ткани/органа. В вариантах реализации, где образец представляет собой образец ткани/органа желудочно-кишечного тракта, указанный образец может содержать фрагмент слизистой оболочки, подслизистого слоя, наружного мышечного слоя, адвентициальной оболочки и/или серозной оболочки ткани/органа желудочно-кишечного тракта. Такие образцы ткани можно получить путем биопсии во время эндоскопической процедуры. Образец предпочтительно получают из нижнего желудочно-кишечного тракта, т.е. из тощей кишки, подвздошной кишки, слепой кишки, ободочной кишки, прямой кишки или заднего прохода. Более предпочтительно, образец представляет собой образец слизистой или содержимого просвета. Образцы фекалий можно собрать путем получения мазка, смыва, аспирации или соскоба из прямой кишки или заднего прохода, или, проще всего, путем сбора фекалий во время или после дефекации.
Образец можно использовать в соответствии с настоящим изобретением в исходной форме. Кроме того, образец перед использованием в способах согласно настоящему изобретению можно подвергать некоторым манипуляциям, обогащению или очистке. Таким образом, термин «образец» также включает препараты образцов, например, относительно чистые или частично очищенные исходные материалы, например, полуочищенные препараты вышеупомянутых образцов. Термин «образец» также включает препараты вышеупомянутых образцов, в которых РНК, в том числе 16S рРНК, подвергают обратной транскрипции. Кроме того, данный термин включает продукт культивирования микроорганизмов указанного образца.
Очистка может быть грубой, например, означать не более чем концентрирование твердых веществ или клеток образца в меньшем объеме или отделение клеток от некоторых или всех остальных компонентов образца. Типичные методики выделения клеток описаны в WO 98/51693 и WO 01/53525.
В некоторых вариантах реализации в соответствии с настоящим изобретением используют препарат нуклеиновой кислоты из вышеупомянутых образцов, предпочтительно препарат, в котором нуклеиновые кислоты являются мечеными. Такие препараты включают продукты обратной транскрипции и/или продукты амплификации таких образцов или препараты их нуклеиновых кислот. В предпочтительном случае нуклеиновой кислотой, преобладающей в препарате нуклеиновых кислот, является ДНК. Указанные препараты включают препараты относительно чистых или частично очищенных нуклеиновых кислот.
Существует большое количество методик выделения нуклеиновых кислот из образцов, в том числе образцов сложного состава, хорошо известных в данной области техники и подробно описанных в литературе. Кроме того, для получения нуклеиновых кислот из вышеупомянутых образцов можно использовать методики, описанные в WO 98/51693 и WO 01/53525.
Способ согласно настоящему изобретению может включать этап сбора образца и/или обработки образца и/или культивирования, в частности, этап амплификации нуклеиновой кислоты, например, амплификации геномной нуклеиновой кислоты, в частности, амплификации нуклеиновой кислоты, несущей нуклеотидные последовательности, характерные для микроорганизма или группы микроорганизмов.
Если иное не следует из контекста, термин «соответствующий образец» в настоящем документе относится к образцам одного типа, полученным от различных субъектов и/или в разное время практически одинаковым способом, которые подвергали практически одинаковой фактической обработке или обращению.
Способы определения количества бактерий из целевой таксономической группы в образце из желудочно-кишечного тракта включают анализ нуклеиновых кислот (например, подходы на основе секвенирования нуклеиновых кислот, подходы на основе гибридизации олигонуклеотидных зондов, подходы на основе амплификации нуклеиновых кислот с использованием праймеров), подходы на основе антител или других лигандов со специфическим сродством, протеомные или метаболомные подходы, но не ограничиваются ими Анализ образца предпочтительно представляет собой анализ последовательности нуклеиновой кислоты и может принимать вид методики секвенирования. Способ секвенирования с использованием дидезоксинуклеотидов по Сэнгеру представляет собой хорошо известную и широко используемую методику секвенирования нуклеиновых кислот. Вместе с тем, в последнее время получили широкое распространение так называемые подходы на основе секвенирования «следующего поколения» или «второго поколения» (по отношению к способу с использованием дидезоксинуклеотидов по Сэнгеру как подходу «первого поколения»). Эти новые методики характеризуются высокой пропускной способностью, например, вследствие использования параллельных, например, массовых параллельных реакций секвенирования, или за счет использования менее длительных этапов. Различные высокопроизводительные способы секвенирования обеспечивают секвенирование единственной молекулы и используют такие методики, как пиросеквенирование, секвенирование с обратимым терминатором, секвенирование лигированием с использованием отщепляемых зондов, секвенирование лигированием с использованием неотщепляемых зондов, наногранулы ДНК и секвенирование одиночной молекулы в реальном времени, например, секвенирование на основе нанопор.
Кроме того, анализ последовательности нуклеиновых кислот предпочтительно может принимать вид подхода на основе гибридизации олигонуклеотидных зондов, при котором наличие нуклеотидной последовательности-мишени подтверждают путем обнаружения события специфической гибридизации между зондом и его мишенью. В этих подходах олигонуклеотидные зонды часто представлены в составе расширенной матрицы, например, микрочипа с иммобилизованными нуклеиновыми кислотами. Для получения профилей микробиоты в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно можно использовать наборы олигонуклеотидных зондов и связанные с ними способы, описанные в WO 2012/080754, WO 2011/043654, Veb∅ et al., Clin Vaccine Immunol, 2011, Vol; 18(8): 1326-35, и Casén, C., et al., Alimentary Pharmacology and Therapeutics, 42(1):71-83) и/или GAmap™ (Genetic Analysis AS, Норвегия).
Данные, полученные с использованием вышеупомянутых способов, можно анализировать с использованием различных методик, от простейшего визуального представления (например, по интенсивности сигнала) до более сложных манипуляций с данными, которые можно количественно оценить и выразить в математической форме, в целях определения количества бактерий целевой таксономической группы в образце из желудочно-кишечного тракта и/или в целях сравнения данных, полученных в исходный момент или после некоторой обработки данных тестируемого образца, с референтными значениями у субъекта без симптомов заболевания и/или пороговыми значениями у субъектов с СРК, демонстрировавших отсутствие реакции на лечение с применением коррекционной диеты для СРК или ТФМ (в соответствующих случаях) Необработанные данные, полученные таким образом, целесообразно подвергать манипуляциям путем обработки данных и статистических расчетов, в частности, нормировки и стандартизации данных. Специалист будет знать подходящие для использования статистические методики. Статистическая методика предпочтительно позволяет получить «значение Р» в качестве показателя того, что наблюдаемая тенденция не является случайной. Статистически значимый результат, т.е. результат, не связанный со случайными изменениями при сравнении с контролем, должен характеризоваться значением Р<0,05, предпочтительно <0,01, <0,005 или <0,001. Исключительно ради примера, подходящие способы измерения статистической значимости в способах согласно настоящему изобретению представляют собой дисперсионный анализ, критерий Манна-Уитни-Уилкоксона (MWW), критерий Краскала-Уоллиса и критерий достоверно значимых различий (HSD) Тьюки. Способы прогнозирования включают способы дискриминантного анализа, логистическую регрессию, программно-независимое моделирование аналогии классов на основе анализа основных компонентов, дискриминантный анализ с использованием частных наименьших квадратов и т.д. Специалист будет знаком с большим количество других подходов. В некоторых вариантах реализации может быть уместным использование критерия перестановки, например, описанного в работах Langsrud (2002, Journal of the Royal Statistical Society Series D 51, 305-317) и Veb∅ et al. (supra) и Casén, et al (supra). Параллельный анализ количества бактерий в образце можно описать как дифференциальный анализ относительного содержания или дифференциальное обнаружение особенностей относительного содержания. В соответствии с настоящим изобретением можно использовать любую подходящую методику. Общедоступно большое количество программных инструментов для такого анализа и сравнения результатов такого анализа для референтных и тестируемых образцов. Исключительно ради примера, можно упомянуть DESeq, MEGAN, STAMP, metagenomeSeq, Myrna, RADs, metaDprof, mcaGUI и METAGENassist. В других вариантах реализации по отношению к данным можно применять методики контролируемого обучения. Исключительно ради примера, можно упомянуть способ опорных векторов (SVM), искусственные нейронные сети, наивный байесовский классификатор, обучение дерева принятия решений, алгоритмы наименьших квадратов (kNN), классификаторы «случайный лес», байесовскую статистику и байесовское машинное обучение.
В соответствии с настоящим изобретением указанное референтное значение (или диаграммы или профили), полученное по меньшей мере для одного образца из желудочно-кишечного тракта по меньшей мере одного субъекта без симптомов СРК, представляет собой значения (диаграммы/профили), полученные по существу так же, как и количественные результаты теста/диаграммы/профили (количество бактерий целевой таксономической группы или их диаграммы/профили), предпочтительно с использованием того же оборудования с теми же настройками и в тех же условиях тестирования, для образца практически из той же части желудочно-кишечного тракта, что и образец тестируемого пациента (или наоборот). Другими словами - для соответствующего образца. В подходящих вариантах реализации тестируемый и референтный образцы представляют собой образцы фекалий. В дополнительных вариантах реализации референтные образцы получают таким же образом и обрабатывают и хранят практически так же, как и тестируемые образцы (или наоборот). В предпочтительных вариантах реализации референтное значение (диаграмму/профиль) можно получить при анализе более чем одного (обычно группы) субъектов без симптомов СРК, и указанное значение представляют как среднее (например, среднеарифметическое) значение или модельную диаграмму/профиль. Особенности получения указанных медианных пороговых значений (или диаграмм или профилей) из по меньшей мере одного образца из желудочно-кишечного тракта по меньшей мере одного субъекта с СРК того же подтипа, что и у тестируемого субъекта, ранее демонстрировавшего реакцию на лечение с применением коррекционной диеты для СРК или ТФМ, следует интерпретировать аналогичным образом.
Субъект без симптомов СРК является субъектом, у которого не диагностирован СРК, в частности, в соответствии с критериями Rome III. У такого субъекта может проявляться один или более из симптомов СРК, однако вероятность, что они вызваны СРК, исключена. В идеале субъект без симптомов СРК является субъектом с практически «нормальной/здоровой» функцией желудочно-кишечного тракта, т.е. не страдающим дисфункцией или какими-либо признаками дисфункции ЖКТ. В некоторых вариантах реализации у указанного субъекта отсутствует дисбиоз желудочно-кишечного тракта, например, согласно анализу GAmap™. В более общем случае указанный субъект может являться «нормальным» или «здоровым» субъектом, практически не страдающим серьезными болезнями, заболеваниями или другими патологическими состояниями, или по меньшей мере субъектом, у которого отсутствуют наблюдаемые или обнаружимые симптомы любого известного серьезного заболевания. В других вариантах реализации нормальный или здоровый субъект не страдает никакими болезнями, заболеваниями или другими патологическими состояниями, или по меньшей мере не демонстрирует наблюдаемых или обнаружимых симптомов любого известного серьезного заболевания. Предпочтительно указанные упоминания болезни, заболевания или патологического состояния представляют собой упоминания болезни, заболевания или патологического состояния желудочно-кишечного тракта.
Сравнение определенного в тесте количества бактерий целевой таксономической группы (или, в соответствующих случаях, их диаграммы/профиля) с референтным значением (или диаграммой/профилем) и оценка различий (или отсутствия соответствия) или соответствия между этими двумя значениями может быть качественным, полуколичественным или количественным процессом. В контексте настоящего изобретения, соответствовать референтному значению (или диаграмме/профилю) -означает быть в значительной степени, например, по существу таким же (или аналогичным), как референтное значение (или диаграмма/профиль). Сообразно этому следует интерпретировать и понятие различия. Так, полученное в тесте значение (или диаграмма/профиль) соответствует эталону, если оно является в значительной степени таким же, как эталон, или аналогично или эквивалентно ему, или совпадает или согласуется с ним, например, статистически аналогично или статистически эквивалентно ему. Так, полученное в тесте значение (или диаграмма/профиль) отличается от референтного значения, если оно не является в значительной степени таким же, как референтное значения, или не близко или не эквивалентно ему, или не совпадает или не соответствует ему, например, не является статистически близким или статистически эквивалентным ему. Таким образом, этапы сравнения полученного в тесте и референтного значений (или диаграммы/профиля) и определения их соответствия (или различия) можно выполнить с использованием математических или статистических методик (например, с помощью прогностических моделей и алгоритмов, подготовленных на основе ранее полученных референтных значений), и в общем случае эти процедуры выполняются программным обеспечением (т.е. с использованием компьютера, т.е. виртуально). Статистические и математические способы выполнения такого сравнения и определения соответствия хорошо известны и общедоступны в данной области техники. Таким образом, следует четко понимать, что необходимость получения референтного значения или диаграммы или модели в каждом случае (т.е. для каждого теста) отсутствует.
В одном варианте реализации количество бактерий целевой таксономической группы (или, в соответствующих случаях, их диаграмму/профиль) в тестируемом и референтном образцах можно выразить в виде визуального представления (в этом случае возможно визуальное сравнение полученного в тесте и референтного значений) или с использованием аналогичных технических средств и выполнить оценку соответствия (или различия) между полученным в тесте и референтным значениями.
В еще одном варианте реализации соответствие (или различие) между полученным в тесте и референтным значением (или диаграммой/профилем) можно анализировать, подставив указанное полученное в тесте значение (или диаграмму/профиль) в математическую модель, полученную с использованием референтного(ых) значения(й) (или диаграмм/профилей). Такую математическую модель можно использовать для определения согласования или совпадения полученного в тесте и референтного значений. Математические способы получения такой модели хорошо известны; ее можно получить, например, с использованием методик линейной регрессии. Соответственно, такой анализ можно выполнить с использованием прогностической модели на основе линейной регрессии, полученной из множества референтных значений (или диаграмм/профилей).
В вариантах реализации, где определяют количество бактерий двух таксономических групп, соответствие между полученным в тесте и референтными диаграммами/профилями анализируют посредством представления полученной в тесте и референтной диаграмм как одиночных точек в двумерной прямоугольной системе координат, причем координаты указанных точек представляли собой значения количества бактерий двух целевых таксономических групп, например, в виде 2D-графика разброса, но это несущественно. Совпадающее расположение точек данных указывает, что субъект не будет реагировать на лечение. Несовпадающее расположение указывает, что субъект будет реагировать на лечение.
Можно считать, что совпадающее расположение точек данных теста и референтных данных имеет место, если точка данных теста располагается в заданной области, в центре которой находится точка референтных данных, а длина и ширина которой (размеры по осям х и у), проходящие через указанную центральную точку, равны или составляют менее 50% от значения соответствующей координаты точки референтных данных (т.е. количество бактерий целевой таксономической группы, величина которого соответствует длине или ширине данной области). В дополнительных вариантах реализации указанная длина или ширина данной области равны или составляют менее 40%, например, равны или составляют менее 30%, 20%, 10% или 2% от значения соответствующей координаты.
В других вариантах реализации, где определяют количество бактерий трех таксономических групп, соответствие между полученными в тесте и референтными диаграммами/профилями анализируют посредством представления полученной в тесте и референтной диаграмм как одиночных точек в эвклидовом пространстве, причем координаты указанных точек представляли собой значения количества бактерий трех целевых таксономических групп, например, в виде 3D-графика разброса, но это несущественно. Совпадающее расположение точек данных указывает, что субъект не будет реагировать на лечение. Несовпадающее расположение указывает, что субъект будет реагировать на лечение.
Можно считать, что совпадающее расположение точек полученных в тесте данных и референтных данных имеет место, если точка полученных в тесте располагается в заданном эвклидовом объеме, в центре которого находится точка референтных данных, а края (или границы) которого проходят через три проекции, соответствующие трем координатам указанной центральной точки, причем протяженность указанных границ равна или составляет менее 50% от значения соответствующей координаты точки референтных данных (т.е. количество бактерий целевой таксономической группы, величина которого соответствует рассматриваемым границам). В дополнительных вариантах реализации указанная протяженность границ равна или составляет менее 40%, например, равна или составляет менее 30%, 20%, 10% или 2% от значения соответствующей координаты.
В некоторых вариантах реализации единственную точку полученных в тесте сравнивают со множеством точек референтных данных, и можно считать, что совпадающее расположение имеет место, если точка полученных в тесте находится в значительной степени, например, практически на или в пределах внешней границы, образованной кластером референтных точек. Это можно определить с использованием любой удобной методики или алгоритма кластерного анализа (которую также можно называть кластерным алгоритмом), которая может соответствовать 2D или 3D данным, например, с помощью иерархического кластерного анализа с использованием эвклидова расстояния в качестве показателя расстояния, и способа построения «усредненного» дерева
Можно считать, что соответствие между одиночным полученным в тесте и одиночным референтным значением имеет место, если полученное в тесте значение равно или составляет менее 25% от положительного или отрицательного отклонения от референтного значения. В дополнительных вариантах реализации указанное положительное или отрицательное отклонение равно или составляет менее 20%, например, равно или составляет менее 15%, 10%, 5% или 1%.
Субъект с СРК (субъект, страдающий СРК) является субъектом, у которого диагностирован СРК, в частности, в соответствии с критериями Rome III. Субъектов с СРК можно разделить на диарейный, запорный и смешанный подтипы на основе преобладающего симптома со стороны пищеварительной системы. Тяжесть симптомов СРКу субъекта можно выразить в виде балльного показателя тяжести симптомов СРК (IBS-SSS, установленного в работе Francis C.Y., Aliment Pharmacol Ther. 1997 Apr; 11(2):395-402). Максимальный достижимый показатель по этому опроснику составляет 500 баллов, что позволяет установить степени тяжести симптомов следующим образом: легкие (75-175 баллов), умеренные (175-300 баллов) и тяжелые (>300 баллов). В соответствии с настоящим изобретением субъекта с СРК, реагирующего на вмешательство (например, коррекционная диета или ТФМ), можно идентивицировать как субъекта, у которого после вмешательства наблюдается по меньшей мере 30%, например, по меньшей мере 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65% или 70%, в частности, более чем 50% снижение общего показателя IBS-SSS по сравнению с исходным уровнем. В качестве альтернативы, в соответствии с настоящим изобретением субъекта с СРК, реагирующего на вмешательство (например, коррекционную диету или ТФМ), можно идентифицировать как субъекта, у которого после вмешательства наблюдается снижение общего показателя IBS-SSS по меньшей мере на 50, например, по меньшей мере на 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140 или 150, в частности, по меньшей мере на 100 баллов по сравнению с исходным уровнем.
Медианные пороговые значения получают из множества значений количества бактерий выбранной таксономической группе согласно настоящему изобретению, указанной выше, по меньшей мере в одном образце из желудочно-кишечного тракта по меньшей мере одного субъекта с СРК (в соответствующих случаях, того же подтипа, что и у тестируемого субъекта), заведомо реагирующего на лечения с применением коррекционной диеты для СРК или ТФМ (в соответствующих случаях), как указано в настоящем документе. Медианные пороговые значения предпочтительно получают из значений, полученных для множества образцов по меньшей мере одного субъекта с СРК (в соответствующих случаях, того же подтипа, что и у тестируемого субъекта), заведомо реагирующего на лечение с применением коррекционной диеты для СРК или ТФМ (в соответствующих случаях), как указано в настоящем документе. Медианные пороговые значения предпочтительно получают из значений, полученных для по меньшей мере одного образца множества субъектов с СРК (в соответствующих случаях, того же подтипа, что и у тестируемого субъекта), заведомо реагирующих на лечение с применением коррекционной диеты для СРК или ТФМ (в соответствующих случаях), как указано в настоящем документе Медианные пороговые значения наиболее предпочтительно получают из значений, полученных для множества образцов множества субъектов с СРК (в соответствующих случаях, того же подтипа, что и у тестируемого субъекта), заведомо реагирующих на лечения с применением коррекционной диеты для СРК или ТФМ (в соответствующих случаях), как указано в настоящем документе.
Сравнение между количественными результатами теста и медианными пороговыми значениями можно выполнить с помощью любых подходящих средств. В некоторых вариантах реализации указанное сравнение включает этапы определения статистической значимости того, что полученное в тесте значение больше (или меньше) медианного порогового значения. Таким образом, указанное сравнение должно включать математические (статистические) методики, и в общем случае выполняется программным обеспечением (т.е. с помощью компьютера, т.е. виртуально). Статистические и математические способы выполнения такого сравнения и определения хорошо известны и общедоступны в данной области техники, например, такие способы описаны выше. Таким образом, следует четко понимать, что необходимость получения медианного порогового значения или диаграммы или модели в каждом случае (т.е. для каждого теста) отсутствует.
В других вариантах реализации, где определяют количество бактерий более чем одной таксономической группы, можно считать, что полученная в тесте диаграмма/профиль соответствует референтной диаграмме/профилю, если 2 или более, например, все из полученных в тесте значений равны или составляют менее 25% от положительного или отрицательного отклонения от соответствующих референтных значений. В дополнительных вариантах реализации указанное положительное или отрицательное отклонение равно или составляет менее 20%, например, равно или составляет менее 15%, 10%, 5% или 1%.
Диета для СРК может представлять собой любую диету, возможно или заведомо (i) оказывающую лечебное (улучшающее) действие на СРК или его симптом или осложнение у субъекта с СРК, т.е. оказывающую положительное (благоприятное) действие на желудочно-кишечный тракт субъекта с СРК, конкретно, на микробиоту желудочно-кишечного тракта или другие симптомы или осложнения СРК (например, снижающую их тяжесть), или (ii) предотвращающую или задерживающую развитие СРК или его осложнения или симптома у субъекта. В это определение должны входить диеты, богатые пребиотиками, диеты с ограниченным содержанием пребиотиков и диеты, богатые пробиотиками. Важные примеры таких диет характеризуются низким содержанием FODMAP (они также называются в настоящем документе диетами с ограниченным содержанием FODMAP) и высоким содержанием FOS (они также называются диетами, богатыми FOS). Эти диеты описаны и установлен в публикациях Slavin J. Nutrients. 2013 Apr; 5(4): 1417-1435 и Gearry R.B et al., JCC 2008.09.004 8-14). Специалистам непосредственно известны такие диеты, и они легко могут разработать такие диеты за счет своих знаний или с использованием литературных источников, например, Slavin and Gearry, supra.
Трансплантация фекальной микробиоты (также называемая введением пробиотика человеческого происхождения, фекальной бактериотерапией, восстановлением микробиоты за счет пересадки фекалий, трансплантацией кала, пересадкой кала и фекальной клизмой) относится к процедуре, при которой собирают материал фекалий выбранного донора и вводят реципиенту после некоторой обработки образца. В некоторых методиках материал фекалий смешивают с физиологическим раствором или другим фармацевтически приемлемым раствором, отфильтровывают и вводят пациенту посредством колоноскопии, эндоскопии, сигмоидоскопии или клизмы. В других методиках твердый материал отделяют от материала фекалий и лиофилизируют перед введением посредством колоноскопии, эндоскопии, сигмоидоскопии, клизмы, ректального катетера или перорального введения. Предпочтительно ТФМ осуществляют в соответствии с описанием в работах Francis C.Y., Aliment Pharmacol Ther. 1997 Apr; 11 (2):395-402 или Betz, C., et al., Z Gastroenterol., 2013, 51 (10): 1171-6).
Субъект может представлять собой человека или любое животное, не являющееся человеком, однако в более конкретном случае может представлять собой позвоночное, например, млекопитающее, в том числе домашний скот и домашних животных. Субъект предпочтительно является человеком, и в этом случае на равных основаниях с термином «субъект» можно использовать термин «пациент». Субъект может быть любого возраста, например, младенцем, ребенком, несовершеннолетним, подростком или взрослым, предпочтительно взрослым. Люди считаются взрослыми по меньшей мере с 16 лет, а младенцами - до 2 лет. В некоторых вариантах реализации субъект является младенцем, а в других - ребенком или взрослым. Субъект (или пациент) с СРК равнозначен субъекту (или пациенту), страдающему СРК, и эти термины можно использовать в настоящем документе на равных основаниях. У субъекта можно определить наличие (поставить диагноз) СРК или его подтипа, используя критерии Rome III, описанные выше. Таким образом, способ согласно настоящему изобретению может включать этап, во время которого у тестируемого субъекта определяют наличие (ставят диагноз) СРК.
Способ в соответствии с данным аспектом настоящего изобретения представляет собой способ in vitro в том смысле, что его выполняют в образце, полученном или выделенном из желудочно-кишечного тракта субъекта. Другими словами, способ не выполняется in vivo или в организме субъекта. В то же время, в более специфических аспектах способ может дополнительно включать этап получения или выделения образца из организма субъекта, предпочтительно нехирургическим или неинвазивным путем. Таким образом, в данном аспекте лечение пациента (т.е. этап лечения субъекта с применением коррекционной диеты или ТФМ) не входит в состав способа. Таким образом, например, упоминание исхода лечения представляет собой умозрительное упоминание возможных вариантов исхода, и этап лечения субъекта с применением коррекционной диеты или выполнения ТФМ не входит в состав способа согласно данному аспекту настоящего изобретения. В то же время возможен вариант, когда такие лекарственные средства вводят пациенту после выполнения способа, описанного в данном аспекте.
Таким образом, в дополнительном конкретном аспекте способ согласно настоящему изобретению может дополнительно включать коррекционную диету для СРК или ТФМ у субъекта, если установлено, что субъект, вероятно, будет реагировать на них (и наоборот, отсутствие соблюдения диеты для СРК или ТФМ у субъекта, если установлено, что субъект, вероятно, не будет реагировать на них).
Таким образом, согласно настоящему аспекту в настоящем изобретении может быть предложен способ лечения субъекта с СРК, причем вначале с помощью способа, описанного выше, определяют, что субъект может реагировать (т.е. вероятно, будет реагировать) на коррекционную диету для СРК или ТФМ, и указанный способ дополнительно (или впоследствии) включает соблюдение диеты для СРК или ТФМ с альгинатным олигомером в эффективном количестве для субъекта, который, вероятно, будет реагировать на такое лечение, т.е. лечение указанного субъекта с применением коррекционной диеты для СРК или ТФМ.
В данном аспекте настоящего изобретения также предложен способ лечения субъекта с СРК, причем указанный способ включает коррекционную диету для СРК или ТФМ для указанного субъекта в эффективном количестве (или лечение указанного субъекта с применением коррекционной диеты для СРК или ТФМ), причем с помощью вышеописанного способа определения вероятности реакции установлено, что указанный субъект, вероятно, будет реагировать на лечение с применением коррекционной диеты для СРК или ТФМ.
Слово «соответствующий» используется для передачи представления о том, что субъект, к которому относится этот термин, является таким же, как и другой пример такого субъекта. Таким образом, важнейшие свойства, определяющие указанного субъекта, являются общими для него и другого субъекта, даже если точные детали могут быть уникальными для них. Альтернативными терминами могут являться «совпадающий», «аналогичный», «согласующийся», «эквивалентный» или «такой же».
В некоторых вариантах реализации «улучшение» или «задержка» в соответствии с настоящим изобретением или их клинические признаки могут наблюдаться в течение 14 дней, например, 10 дней, 7 дней, 5 дней, 3 дней, 2 дней, 1 дня 18 ч, 12 ч или 6 ч с момента начала лечения с применением коррекционной диеты для СРК или ТФМ (в соответствующих случаях).
В некоторых вариантах реализации профилактические эффекты лечения с применением коррекционной диеты для СРК или ТФМ (в соответствующих случаях) в соответствии с настоящим изобретением поддерживаются в течение лечения субъекта.
Хотя настоящее изобретение описано в настоящем документе в контексте субъектов с СРК и их реакции на коррекционную диету для СРК или ТФМ, следует принимать во внимание, что основные понятия настоящего изобретения можно применять в более широком смысле как с точки зрения медицинских показаний у целевого субъекта, так и с точки зрения рассматриваемых способов лечения.
В связи с этим и как указано выше, считается, что многие заболевания и состояния или их стадии ассоциированы с нарушениями в составе микробиоты желудочно-кишечного тракта или его областей. Весьма вероятно, что заболевания и состояния, влияющие на ЖКТ, например, воспалительное заболевание кишечника (IBD), болезнь Крона (БК), язвенный колит (ЯК), синдром раздраженного кишечника (СРК), синдром избыточного роста бактерий в тонком кишечнике и рак желудочно-кишечного тракта (например, рак ротовой полости, глотки, пищевода, желудка, двенадцатиперстной кишки, тощей кишки, подвздошной кишки, слепой кишки, ободочной кишки, прямой кишки или заднего прохода), приводят к появлению профилей микробиоты, отличающихся от нормального состояния, и существуют доказательства связи между профилями микробиоты желудочно-кишечного тракта и заболеваниями и состояниями, которые считаются не имеющими отношения к ЖКТ, например, раком молочной железы, анкилозирующим спондилитом, неалкогольным стеатогепатитом; атопическими заболеваниями, например, экземой, астмой, атопическим дерматитом, аллергическим конъюнктивитом, аллергическим ринитом и пищевыми аллергическими реакциями; метаболическими расстройствами, например, сахарным диабетом (1 или 2 типа), ожирением и метаболическим синдромом; неврологическими расстройствами, например, депрессией, рассеянным склерозом, деменцией и болезнью Альцгеймера; аутоиммунными заболеваниями (например, артритом); неправильным питанием; синдромом хронической усталости и аутизмом. Считается, что такие нарушения профиля микробиоты желудочно-кишечного тракта (с точки зрения относительного количества и/или разнообразия), которые можно считать направленными на исправление дисбаланса микробиоты желудочно-кишечного тракта, вносят вклад в указанные заболевания, вызывая эти заболевания или внося вклад в их прогрессирование. Кроме того, считается, что многие другие заболевания могут характеризоваться причинно-следственной связью с нарушениями профиля микробиоты желудочно-кишечного тракта. Точный механизм, лежащий в основе этой причинно-следственной связи, не до конца изучен. Ясно, что нарушения микробиоты желудочно-кишечного тракта приводят к недостаточной численности некоторых микроорганизмов и/или избыточной численности других микроорганизмов, и/или снижению разнообразия, что приводит к сдвигу или дисбалансу относительной активности популяции каждого микроорганизма. Считается, что указанный сдвиг активности микроорганизмов приводит к снижению благоприятных эффектов (например, синтеза витаминов, короткоцепочечных жирных кислот и полиаминов, поглощения питательных веществ, ингибирования патогенных организмов, метаболизма растительных соединений) и повышению вредоносных эффектов (секреции эндотоксинов и других токсичных продуктов) с последующим общим негативным влиянием на физиологию хозяина в целом. Эти эффекты могут проявляться в виде болезни или заболевания, например, указанных выше.
Существует огромное количество средств лечения указанных заболеваний и состояний, мишенью некоторых из которых является желудочно-кишечный тракт и его микробиота, например, введение антибиотиков, лекарственных средств на основе антител, противовоспалительных средств, иммуномодуляторов (иммунодепрессантов или иммуностимуляторов), пробиотиков или пребиотиков и т.д. Конкретно в контексте СРК и его подтипов, лекарственные средства могут включать антибиотики (например, рифаксимин), линаклотид и элуксадолин. Таким образом, в свете настоящего изобретения можно ожидать, что количество бактерий некоторых таксономических групп может быть показателем реакции или отсутствия реакции на такие лекарственные средства. Таким образом, понятия настоящего изобретения можно использовать с соответствующими поправками в таком контексте.
Настоящее изобретение дополнительно описано со ссылками на следующие неограничивающие примеры, в которых
На фигуре 1 показан 3D-график классификации с использованием результатов для Bacteroides spp.., Acinetobacter junii и Firmicutes из примера 1 исследования 1 (реакция на диету с низким содержанием FODMAP в подгруппе диарейного СРК). Светло-серый цвет -наличие реакции, темно-серый цвет - отсутствие реакции.
На фигуре 2 показан 2D-график классификации с использованием результатов для Acinetobacter junii и Firmicutes из примера 1 исследования 1 (реакция на диету с низким содержанием FODMAP в подгруппе диарейного СРК). Светло-серый цвет - наличие реакции, темно-серый цвет - отсутствие реакции.
На фигуре 3 показан 2D-график классификации с использованием результатов для Acinetobacter junii и 2D Bacteroides spp. из примера 1 исследования 1 (реакция на диету с низким содержанием FODMAP в подгруппе диарейного СРК). Светло-серый цвет - наличие реакции, темно-серый цвет - отсутствие реакции.
На Фигуре 4 показан 2D-график классификации с использованием результатов для Firmicutes и Bacteroides spp. из примера 1 исследования 1 (реакция на диету с низким содержанием FODMAP в подгруппе диарейного СРК). Светло-серый цвет - наличие реакции, темно-серый цвет - отсутствие реакции.
На фигуре 5 показан 3D-график классификации с использованием результатов для Acinetobacter junii, Costridium methylpentosum и Desulfitipora alkaliphila из примера 1 исследования 1 (реакция на диету с низким содержанием FODMAP в подгруппе СРК). Светло-серый цвет - наличие реакции, темно-серый цвет - отсутствие реакции (точность 80%).
На фигуре 6 показан 2D-график классификации с использованием результатов для Acinetobacter junii и Desulfitipora alkaliphila из примера 1 исследования 1 (реакция на диету с низким содержанием FODMAP в подгруппе запорного СРК). Светло-серый цвет - наличие реакции, темно-серый цвет - отсутствие реакции.
На фигуре 7 показан 2D-график классификации с использованием результатов для Acinetobacter junii и Clostridium methylpentosum. из примера 1 исследования 1 (реакция на диету с низким содержанием FODMAP в подгруппе запорного СРК). Светло-серый цвет -наличие реакции, темно-серый цвет - отсутствие реакции.
На фигуре 8 показан 2D-график классификации с использованием результатов для Desulfitipora alkaliphila и Clostridium methylpentosum из примера 1 исследования 1 (реакция на диету с низким содержанием FODMAP в подгруппе запорного СРК). Светло-серый цвет
- наличие реакции, темно-серый цвет - отсутствие реакции.
На фигуре 9 показан 3D-график классификации с использованием результатов для Shigella spp. и Escherichia spp., Dorea spp. и Eubacterium siraeum из примера 1 исследования 2 (реакция на диету с низким содержанием FODMAP в подгруппе диарейного СРК). Светло-серый цвет - наличие реакции, темно-серый цвет - отсутствие реакции (точность 90,9%).
На фигуре 10 показан 2D-график классификации с использованием результатов для Dorea spp. и Shigella spp. и Escherichia spp. из примера 1 исследования 2 (реакция на диету с низким содержанием FODMAP в подгруппе диарейного СРК). Светло-серый цвет -наличие реакции, темно-серый цвет - отсутствие реакции.
На Фигуре 11 показан 2D-график классификации с использованием результатов для Eubacterium siraeum и Shigella spp. и Escherichia spp. из примера 1 исследования 2 (реакция на диету с низким содержанием FODMAP в подгруппе диарейного СРК). Светло-серый цвет
- наличие реакции, темно-серый цвет - отсутствие реакции.
На фигуре 12 показан 2D-график классификации с использованием результатов для Eubacterium siraeum и Dorea spp. из примера 1 исследования 2 (реакция на FODMAP в подгруппе диарейного СРК). Светло-серый цвет - наличие реакции, темно-серый цвет -отсутствие реакции.
На фигуре 13 показан 3D-график классификации с использованием результатов для Eubacterium siraeum, Firmicutes и Bacteroides spp. и Prevotella spp. из примера 1 исследования 2 (реакция на диету с высоким содержанием FOS в подгруппе диарейного СРК). Светло-серый цвет - наличие реакции, темно-серый цвет - отсутствие реакции (точность 100%).
На фигуре 14 показан 20-график классификации с использованием результатов для Firmicutes и Bacteroides spp. и Prevotella spp. из примера 1 исследования 2 (реакция на диету с высоким содержанием FOS в подгруппе диарейного СРК). Светло-серый цвет - наличие реакции, темно-серый цвет - отсутствие реакции.
На фигуре 15 показан 2D-график классификации с использованием результатов для Eubacterium siraeum и Bacteroides spp. и Prevotella spp. из примера 1 исследования 2 (реакция на диету с высоким содержанием FOS в подгруппе диарейного СРК). Светлосерый цвет - наличие реакции, темно-серый цвет - отсутствие реакции.
На фигуре 16 показан 2D-график классификации с использованием результатов для Eubacterium siraeum и Firmicutes из примера 1 исследования 1 (реакция на диету с высоким содержанием FOS в подгруппе диарейного СРК). Светло-серый цвет - наличие реакции, темно-серый цвет - отсутствие реакции. Подгруппа диареи
На фигуре 17 показан 3D-график классификации с использованием результатов для Bacteroides spp. и Prevotella spp., Eubacterium hallii и Clostridium sp.из примера 1 исследования 3 (реакция на ТФМ в подгруппе диарейного СРК). Светло-серый цвет - наличие реакции, темно-серый цвет - отсутствие реакции (точность 100%).
На фигуре 18 показан 2D-график классификации с использованием результатов для Bacteroides spp. и Prevotella spp. и Eubacterium hallii из примера 1 исследования 3 (реакция на ТФМ в подгруппе диарейного СРК). Светло-серый цвет - наличие реакции, темно-серый цвет - отсутствие реакции.
На фигуре 19 показан 2D-график классификации с использованием результатов для Bacteroides spp. и Prevotella и Clostridium sp.из примера 1 исследования 3 (реакция на ТФМ в подгруппе диарейного СРК). Светло-серый цвет - наличие реакции, темно-серый цвет -отсутствие реакции.
На фигуре 20 показан 2D-график классификации с использованием результатов для Eubacterium hallii и Clostridium sp.из примера 1 исследования 3 (реакция на ТФМ в подгруппе диарейного СРК). Светло-серый цвет - наличие реакции, темно-серый цвет -отсутствие реакции.
На фигуре 21 показан трехфакторный РСА состава кишечной микробиоты согласно оценке посредством анализа дисбиоза GA-map™ у пациентов с СРК, классифицированных как субъектов, реагирующих на лечение (кружки; n=32) и как субъектов, не реагирующих на лечение (треугольники; n=29) с применением коррекционной диеты с ограниченным содержанием FODMAP в течение 4 недель, как описано в примере 2.
На фигуре 22 показана связь между показателем реакции на основе результатов оценки состава кишечной микробиоты и симптоматической реакции, оцениваемой как процентное снижение IBS-SSS по сравнению с исходными значениями, как описано в примере 2 (субъекты, реагирующие на лечение (кружки; n=32); субъекты, не реагирующие на лечение (треугольники; n=29)) Переменные значимым образом коррелировали (ро=0,39, р<0,001).
ПРИМЕР 1 - Выявление бактериальных таксономических групп, по которым можно различать пациентов с СРК, реагирующих на диету с низким содержанием FODMAP, диету с высоким содержанием FOS или ТФМ, от субъектов, не реагирующих на лечение
Способы
Выполнены клинические исследования с целью выявления таксономических групп в составе микробиоты желудочно-кишечного тракта, которые могут служить маркерами для пациентов с СРК, реагирующих на диету с низким содержанием FODMAP (описанную в работе Gearry R.B et al., JCC 2008.09.004 8-14), на диету с высоким содержанием FOS (описанную в работе Slavin J. Nutrients. 2013 Apr; 5(4): 1417-1435), ТФМ (описанную в работе Francis C.Y., Aliment Pharmacol Ther. 1997 Apr; 11(2):395-402).
Пациентов набирали в соответствии с критериями ROME III для диагностики СРК. Пациентов распределили на следующие подтипы СРК на основании с преобладающим у них симптомов: диарейный, запорный или смешанный. Профили микробиоты из образцов фекалий каждого пациента получили с использованием анализа дисбиоза GAmap™ (Genetic Analysis AS, Соло, Норвегия) до лечения и через 3-6 недель коррекционной диеты в исследованиях с использованием диеты или через 1 и 3 недели в исследованиях ТФМ. В эти моменты у субъектов регистрировали балльный показатель тяжести симптомов СРК (IBS-SSS, установленный в работе Francis C.Y., Aliment Pharmacol Ther. 1997 Apr; 11(2):395-402), и этот показатель использовали для определения субъектов, реагирующих/не реагирующих на лечение, на основании изменений показателя.
Анализ GAmap™ основан на общепринятых молекулярно-биологических методиках, включающих гомогенизацию образца фекалий человека и механическое разрушение бактериальных клеток; автоматизированное выделение общей бактериальной геномной ДНК с использованием магнитных гранул; ПЦР-амплификацию ДНК 16S рРНК с охватом V3-V9; мечение зонда путем удлинения на один нуклеотид; гибридизацию с комплементарными зондами, присоединенными к магнитным гранулам; и обнаружение сигнала с помощью анализатора BioCode 1000А 128-Plex Analyzer (Applied BioCode, Санта-Фе-Спрингс, штат Калифорния, США). GAmapTM состоит из 54 ДНК-зондов, мишенью которых являются ≥300 бактерий различных таксономических уровней, выбранных на основе возможности отличать пациентов с СРК от здоровых пациентов (т.е. пациентов без симптомов СРК). Эта модель позволяла выполнить алгоритмическую оценку относительного содержания целевых таксономических групп бактерий в образцах фекалий и тем самым получить профиль микробиоты в образце и определить потенциальные клинически значимые отклонения микробиома от нормобиоза, т.е. дисбиоз (Casén, С., et al., Alimentary Pharmacology and Therapeutics, 42(1):71-83).
Результаты GAmap™ подвергли поэтапному дискриминантному анализу с использованием значений для зондов бактерий перед вмешательством (в исходный момент) в качестве факторов-кандидатов для определения субъектов, реагирующих и не реагирующих на вмешательство (диету с низким содержанием FODMAP, диету с высоким содержанием FOS, ТФМ). Данная процедура позволяла отобрать бактерий-кандидатов, позволявших наилучшим образом отделить субъектов, реагировавших на лечение, от субъектов, не реагировавших на лечение. Субъекта, реагировавшего на лечение, определяли по снижению по меньшей мере на 50% (при использовании диеты) или снижению по меньшей мере на 100 баллов (ТФМ) общего балльного показателя СРК по сравнению с исходным уровнем. Затем выбранные факторы использовали в линейной дискриминантной функции Фишера в целях количественной оценки влияния выбранных факторов и оценки точности, в том числе чувствительности и специфичности правила классификации.
Коэффициенты дискриминантной функции выбрали с целью максимального увеличения различий балльной оценки дискриминантной функции в двух группах (т.е. положительный дискриминантный балльный показатель указывал, что субъект реагировал на лечение, в то время как отрицательный балльный показатель указывал, что субъект не реагировал на лечение). Интерпретация «высокого» или «низкого» значения линейной дискриминантной функции для бактерии представляло собой относительный показатель между группами. Высокое значение для бактерии должно было вносить вклад в классификацию пациента как субъекта, реагирующего на лечение, в то время как низкое значение должно было оказывать обратное действие, если принять, что у субъекта, реагирующего на лечение, значение функции являлось положительным.
Результаты
Исследование 1 (IBS01-1302) - пациенты с диарейным СРК на коррекционной диете с ограниченным содержанием FODMAP
Дискриминантный анализ при 1 визите в целях разделения диарейной подгруппы (n=32, 16+16) на группы субъектов, реагировавших/не реагировавших на лечение, по 54 бактериальным зондам (субъектов, реагировавших на лечение, классифицировали по снижению общего показателя СРК по меньшей мере на 50% на 4 неделе коррекционной диеты с ограниченным содержанием FODMAP по сравнению с исходным уровнем):
Следующие 6 бактериальных зондов отобрали в поэтапном дискриминантном процессе отбора * из 54 кандидатов:
- Bacteroides spp.
- Bacteroides stercosis
- Bacteroides zoogleoformans
- Acinetobacter junii
- Firmicutes
- Veillonella spp., Helicobacter spp. и Clostridia
* Применяли поэтапный отбор факторов с использованием уровня значимости 0,10 в качестве порогового значения для включения и исключения
У субъектов, реагировавших на лечение, имелась тенденция к наличию следующих исходных характеристик:
- Пониженные значения Bacteroides spp.
- Повышенные значения Bacteroides stercosis
- Повышенные значения Bacteroides zoogleoformans
- Повышенные значения Acinetobacter junii
- Пониженные значения Firmicutes.
- Пониженные значения Veillonella spp., Helicobacter spp. и Clostridia
31 из 32 (97%) пациентов с диарейным СРК правильно классифицировали на основании вышеприведенного: 16/16 субъектов, реагировавших на лечение (100%), и 31/32 субъектов, не реагировавших на лечение (94%)
Исследование 1 (IBS01-1302) - пациенты с запорным СРК не диете с ограниченным содержанием FODMAP
Дискриминантный анализ при 1 визите в целях разделения запорной подгруппы (n=10, 5+5) на группы субъектов, реагировавших/не реагировавших на лечение, по 54 бактериальным зондам (субъектов, реагировавших на лечение, классифицировали по снижению общего показателя СРК по меньшей мере на 50% на 4 неделе коррекционной диеты с ограниченным содержанием FODMAP по сравнению с исходным уровнем):
Следующие 4 бактериальных зонда отобрали в поэтапном дискриминантном процессе отбора * из 54 кандидатов:
- Eubacterium siraeum
- Acinetobacter junii
- Clostridium methylpentosum
- Desulfitipora alkaliphila
* Применяли поэтапный отбор факторов с использованием уровня значимости 0,10 в качестве порогового значения для включения и исключения
У субъектов, реагировавших на лечение, имелась тенденция к наличию следующих исходных характеристик:
- Повышенные значения Eubacterium siraeum
- Пониженные значения Acinetobacter junii
- Повышенные значения Clostridium methylpentosum
- Пониженные значения Desulfitipora alkaliphila
Всех 10 из 10 (100%) пациентов с запорным СРК правильно классифицировали на основании вышеприведенного.
Исследование 2 (СОР1602) - пациенты с диарейным СРК на диете с ограниченным содержанием FODMAP
Дискриминантный анализ с использованием исходных значений бактерий для разделения подгруппы диарейного СРК на группы субъектов, реагировавших/не реагировавших на лечение (n=11, 7/4), по 54 бактериальным зондам. (Субъектов, реагировавших на лечение, классифицировали по снижению общего показателя СРК по меньшей мере на 50% на 3 неделе коррекционной диеты с ограниченным содержанием FODMAP по сравнению с исходным уровнем):
Следующие 3 бактериальных зонда отобрали при дискриминантном процессе прямого отбора * из 54 кандидатов:
- Dorea spp.
- Eubacterium siraeum
- Shigella spp. и Escherichia spp.
* Применяли прямой отбор факторов с использованием уровня значимости 0,10 в качестве порогового значения для включения
У субъектов, реагировавших на лечение, имелась тенденция к наличию следующих исходных характеристик:
- Повышенные значения Dorea spp.
- Повышенные значения Eubacterium siraeum
- Пониженные значения Shigella spp. и Escherichia spp.
10 из 11 (90,9%) пациентов с диарейным СРК правильно классифицировали на основании вышеприведенного: 6/7 субъектов, реагировавших на лечение (85,7%), и 4/7 субъектов, не реагировавших на лечение (100%)
Исследование 2 (СОР1602) - пациенты с диарейным СРК на диете с высоким содержанием FOS
Дискриминантный анализ в целях разделения на группы субъектов, реагировавших/не реагировавших на диету с высоким содержанием FOS, по 54 бактериальным зондам (субъектов, реагировавших на лечение, классифицировали по снижению общего показателя СРК по меньшей мере на 50% на 6 неделе коррекционной диеты FOS по сравнению с исходным уровнем)
Следующие 3 бактериальных зонда отобрали в поэтапном дискриминантном процессе отбора * из 54 кандидатов:
- Eubacterium siraeum
- Firmicutes
- Bacteroides spp. и Prevotella spp.
* Применяли поэтапный отбор факторов с использованием уровня значимости 0,10 в качестве порогового значения для включения и исключения
У субъектов, реагировавших на лечение, имелась тенденция к наличию следующих исходных характеристик:
- Повышенные значения Eubacterium siraeum
- Повышенные значения Firmicutes
- Повышенные значения Bacteroides spp. и Prevotella spp.
Всех 11 из 11 (100%) пациентов с диарейным СРК правильно классифицировали на основании вышеприведенного.
Исследоеание 3 (СОР1609) - пациенты с диарейным СРК, получившие лечение посредством трансплантации фекальной микрофлоры
Дискриминантный анализ с использованием исходного количества бактерий в целях разделения подгруппы диарейного СРК на группы субъектов, реагировавших/не реагировавших на лечение (n=8, 4/4), по 54 бактериальным зондам (субъектов, реагировавших на лечение, классифицировали по снижению общего показателя СРК по меньшей мере на 100 баллов на 3 неделе после трансплантации фекалий по сравнению с исходным уровнем) (3 пациента использовали W1 в качестве исходного уровня):
Следующие 3 бактериальных зонда отобрали при дискриминантном процессе прямого отбора * из 54 кандидатов:
- Clostridium sp.
- Eubacterium hallii
- Bacteroides / Prevotella
* Применяли прямой отбор факторов с использованием уровня значимости 0,10 в качестве порогового значения для включения
У субъектов, реагировавших на лечение, имелась тенденция к наличию следующих исходных характеристик:
- Повышенные значения Clostridium sp.
- Повышенные значения Eubacterium hallii
- Пониженные значения Bacteroides / Prevotella
Всех 8 пациентов с диарейным СРК правильно классифицировали на основании вышеприведенного
Исследование 3 (СОР1609) - БИ- пациенты с диарейным СРК и смешанным СРК, получившие лечение посредством трансплантации фекальной микрофлоры
Дискриминантный анализ с использованием исходного количества бактерий в целях разделения подгруппы диарейного/смешанного СРК на группы субъектов, реагировавших/не реагировавших на лечение (n=13, 5/8), по 54 бактериальным зондам (субъектов, реагировавших на лечение, классифицировали по снижению общего показателя СРК по меньшей мере на 100 баллов на 3 неделе после трансплантации фекалий по сравнению с исходным уровнем) (3 пациента использовали W1 в качестве исходного уровня):
У субъектов, реагировавших на лечение, имелась тенденция к наличию следующих исходных характеристик:
- Повышенные значения Clostridium sp.
- Пониженные значения Dialister invisus
- Пониженные значения Bacteroides / Prevotella
Всех 13 пациентов с диарейным/смешанным СРК правильно классифицировали на основании вышеприведенного
ПРИМЕР 2 - Исследование состава кишечной микробиоты как индикатора клинической реакции на ограничение FODMAP в диете у пациентов с синдромом раздраженного кишечника
Материалы и способы
Пациенты
13
13
13
2
Пациентов с СРК последовательно набрали в специализированной поликлинике (Ловизенбергская дьяконская больница, Осло, Норвегия) с апреля 2013 г. по октябрь 2014 г. Вкратце, все пациенты соответствовали критериям Rome III для СРК и прошли тщательное обследование у одного и того же опытного гастроэнтеролога для исключения органических заболеваний. Следует отметить, что все пациенты прошли дыхательный тест с С-D-ксилозой для исключения нарушения всасывания в тонком кишечнике, и в исследование включили только пациентов с высоким уровнем выделения СО после приема С-D-ксилозы.
Ограничение FODMAP в диете
Всех пациентов отправляли на консультацию к опытному клиническому диетологу, прошедшему обучение представлениям о диете с низким содержанием FODMA. Исходную диету подвергали тщательной оценке с целью убедиться, что ни у одного из пациентов до вступления в исследование не было частично ограниченной диеты по сравнению с усредненной норвежской диетой. Следует отметить, что диета с низким содержанием FODMAP не была широко известна в Норвегии на момент включения. Затем пациентов инструктировали полностью исключить все продукты питания, содержащие избыточное количество FODMAP, в соответствии с принципами, установленными в университете Монаша (Мельбурн, Австралия). Так, пациентов инструктировали избегать продуктов питания, содержащих галактоолигосахариды (например, бобов, чечевицы, гороха и т.д.), фруктаны (например, пшеницы, капусты, лука и т.д.), лактозу (например, молока, йогурта, молочных продуктов и т.д.) и многоатомные спирты (например, грибов, цветной капусты, абрикосов и т.д., в том числе продуктов, подслащенных многоатомными спиртами), а также продуктов питания, содержащих фруктозу или избыточное количество глюкозы (например, яблок, груш, сухофруктов и т.д.). В качестве альтернативы продуктам с высоким содержанием FODMAP предлагали продукты с низким содержанием FODMAP, например, апельсины, бананы, рис, овес, мясо, рыбу, яйца и молочные продукты, не содержащие лактозы. Продолжительность коррекционной диеты составляла 4 недели. В течение всего исследования соблюдение диеты обеспечивали путем пристального наблюдения клинического диетолога, включавшего личные консультации, связь по телефону и электронной почте, а соответствие диеты оценивали путем проверки дневников питания, которые требовалось вести пациентам.
Оценка симптомов и определение реакции на диету
Тяжесть симптомов в области живота оценивали до и после диеты с помощью системы балльной оценки тяжести синдрома раздраженного кишечника (IBS-SSS) в соответствии с Francis et al. (supra). Максимальный достижимый показатель по этому опроснику составляет 500 баллов, что позволяет установить степени тяжести симптомов следующим образом: легкие (75-175 баллов), умеренные (175-300 баллов) и тяжелые (>300 баллов). В соответствии с рекомендациями по дизайну Rome комитета по исследованиям лекарственных средств, субъектов, реагировавших на лечение, определяли как пациентов, сообщавших о ≥50% снижении показателя IBS-SSS. Соответственно, субъектов, не реагировавших на лечение, определяли как пациентов, сообщавших о<50% снижении показателя IBS-SSS.
Кроме оценки симптомов, связанных с областью живота, в исходный момент выполняли оценку внекишечных симптомов по больничной шкале тревожности и депрессии (HADS) с целью оценки тревожности и депрессии, а также по шкале влияния утомляемости (FIS) с целью оценки хронической утомляемости.
Анализ состава кишечной микробиоты
Пациенты собирали образцы фекалий до и после лечения посредством диеты с использованием специальных контейнеров (Genetic Analysis, Осло, Норвегия). Их инструктировали немедленно замораживать фекалии при температуре минус 20°С на дому и как можно быстрее доставлять замороженные контейнеры в больницу. Затем образцы хранили при минус 80°С, не размораживая до анализа. Для оценки состава кишечной микрофлоры использовали анализ дисбиоза GA-map™ (supra). Результаты представляли как в виде относительного содержания бактерий в соответствии с 54 специфическими бактериальными маркерами, измеренного как «интенсивность флуоресцентного сигнала», так и в качестве показателя дисбиоза (DI, диапазон 0-5, где DI>2 обозначали как «дисбиоз».
Статистический анализ
Вследствие ограниченного размера выборки все непрерывные переменные сравнивали между субъектами, реагировавшими и не реагировавшими на лечение, с использованием непараметрических критериев; критерия Манна-Уитни-Уилкоксона при сравнении независимых переменных и критерия знаковых рангов Уилкоксона при сравнении измерений до и после лечения. Положительную связь между парами категориальных переменных оценивали с использованием критерия хи-квадрат или критерия Мак-Немара при сравнении долей до и после лечения. Корреляцию рассчитывали с использованием показателя ро по Спирмену. Для исследования дискриминационной способности всех измеренных бактериальных маркеров по отношению к различению субъектов, реагировавших и не реагировавших на лечение, выполнили анализ основных компонентов (РСА) с использованием ковариационной матрицы. Вероятность того, что субъект будет реагировать на лечение, рассчитывали с использованием логистической регрессии, а результаты выражали в виде коэффициентов несогласия (КН) с 95% доверительными интервалами (ДИ). Кроме того, рассчитывали вероятности с учетом выбранных независимых переменных. Прогностическую ценность положительного результата (PPV) рассчитывали, как описано в книге Altman (Altman DG, et al., Statistics with confidence. 2nd ed. New York: BMJ Books; 2000). Вследствие ограниченного размера выборки не удалось разделить данные на наборы для обучения и тестирования, поэтому оценку модели выполняли с использованием 5-кратной перекрестной валидации (CV) (James G, et al., An introduction to statistical learning. New York: Springer; 2013). Точность рассчитывали в виде среднего показателя от CV с 95% ДИ. Поскольку эти анализы считались эксплоративными, поправку на множественное тестирование не вносили и значения р<0,05 считали статистически значимыми. Все анализы выполняли с помощью SPSS версии 22 и R (языка программирования) версии 3.3.2.
Результаты
Характеристики субъектов: наличие и отсутствие реакции на лечение
Изначально в исследование зачислили 63 пациента; однако образцы фекалий 2 пациентов для анализа состава кишечной микробиоты отсутствовали, что снизило общее количество участников до 61. На основании определения субъекта, реагировавшего на лечение (>50% снижение показателя IBS-SSS (13)), 32 пациентов классифицировали как субъектов, реагировавших на лечение, а 29 пациентов - как субъектов, не реагировавших на лечение с применением коррекционной диеты. У субъектов, реагировавших и не реагировавших на лечение, отсутствовали значимые различия с точки зрения исходных клинических характеристик (таблица 1).
Распределение по полу было аналогичным в обеих группах, причем подавляющее большинство составляли женщины. Индекс массы тела (ИМТ) и распределение по подтипам СРК также было аналогичным; однако среди субъектов, реагировавших на лечение, имела место легкая тенденция в сторону меньшего возраста по сравнению с субъектами, не реагировавшими на лечение.
Различия по отношению к измерениям IBS-SSS между субъектами, реагировавшими и не реагировавшими на лечение, отсутствовали. Распределение категорий IBS-SSS также было очень похожим в обеих группах; ни один пациент не попал в категорию легкого заболевания по IBS-SSS до лечения. Однако после лечения у 13 из 32 субъектов, реагировавших на лечение, была зарегистрирована легкая категория IBS-SSS, в то время как среди субъектов, не реагировавших на лечение, после лечения в эту категорию попал только один пациент. После лечения в обеих группах регистрировали статистически значимое снижение показателей IBS-SSS по сравнению с исходным уровнем (р<0,01 в обеих группах).
Профилирование кишечной микробиоты
Бактериальные профили у субъектов, реагировавших и не реагировавших на лечение, сравнивали на основе данных по 54 бактериальным маркерам. Общую способность всех измеренных бактериальных маркеров по отношению к различению субъектов, реагировавших и не реагировавших на лечение, оценивали с использованием методики РСА. Трехфакторное решение представлено на фигуре 21. У субъектов, реагировавших на лечение, имели место значительно повышенные уровни следующих бактериальных маркеров (таблица 2): Bacteroides fragilis, Acinetobacter junii, Ruminiclostridium, Streptococcus и Eubacterium (p<0,05 во всех случаях). Кроме того, у субъектов, реагировавших на лечение, имели место значительно пониженные уровни следующих бактериальных маркеров (таблица 2): Clostridia/Negativicutes/Bacilii (Firmicutes), Actinomycetales, Anaerotruncus, Clostridiales и Shigella spp, и Escherichia spp, (p<0,05 во всех случаях).
Данные для остальных 44 бактериальных маркеров не выявили различий между субъектами, реагировавшими и не реагировавшими на лечение. Различия между субъектами, реагировавшими и не реагировавшими на лечение, также оставались статистически значимыми после лечения для 8 из вышеописанных 10 бактериальных маркеров. Мишенями двух бактериальных маркеров, которые не являлись статистически значимыми после диеты, являлись Bacteroides fragilis и Acinetobacter junii, поскольку их уровни несколько снизились после лечения в группе субъектов, реагировавших на лечение (медианное значение от 27,4 до 24,2, р=0,16 и медианное значение от 188,9 до 183,6, р=0, 19, для Bacteroides fragilis и Acinetobacter junii, соответственно).
У приблизительно половины протестированных индивидов перед лечением был классифицирован «дисбиоз» (DI>2), причем доля субъектов, реагировавших и не реагировавших на лечение, была аналогичной и составляла 50% (16/32) и 48% (14/29), соответственно. После лечения эти доли увеличились численно, но статистически не значимо и оставались очень близкими для субъектов, реагировавших и не реагировавших на лечение, - 56% (18/32) и 59% (17/29), соответственно. В то же время у многих пациентов среди субъектов, как реагировавших, так и не реагировавших на лечение, после лечения изменилась DI-классификация. Среди субъектов, не реагировавших на лечение, у 7 пациентов был «дисбиоз», а у 5 - «отсутствие дисбиоза». Количество таких пациентов было несколько меньшим в группе субъектов, реагировавших на лечение, где у 5 пациентов после лечения был «дисбиоз», а у 3 - нормальное значение DI. При измерении по шкале от 1 до 5 балльные оценки DI оставались неизменными после лечения для субъектов, как реагировавших, так и не реагировавших на лечение. Медианное значение (диапазон) как до, так и после лечения составляло 3 (1-4) для субъектов, реагировавших на лечение, и 3 (1-5) для субъектов, не реагировавших на лечение.
Показатель реакции (RI)
10 из 54 бактериальных маркеров, использованных для оценки состава кишечной микрофлоры до лечения, статистически значимо различались между субъектами, реагировавшими или не реагировавшими на лечение (как описано выше). На основании медианных значений этих маркеров у субъектов, реагировавших на лечение, показатель ответа (RI) определяли следующим образом:
1. Медианные значения по 10 выбранным бактериальным маркерам у субъектов, реагировавших на лечение, использовали в качестве пороговых уровней.
2. Каждому пациенту присваивали точку, когда его/ее значение каждого выбранного маркера отличалось от порогового уровня. Для каждого маркера, реже встречавшегося у субъектов, реагировавших на лечение, по сравнению с субъектами, не реагировавшими на лечение, пациенту присваивали точку, где уровень указанного маркера в его/ее образце был ниже порогового уровня. Для каждого маркера, чаще встречавшегося у субъектов, реагировавших на лечение, по сравнению с субъектами, не реагировавшими на лечение, пациенту присваивали точку, где уровень указанного маркера был выше порогового уровня.
3. Эти точки суммировали, присваивая число от 0 до 10 (суммарный балльный показатель RI). Затем эту сумму разделяли на 2 категории: пациентам, набравшим 3 балла и менее, присваивали значение 0 (отрицательная реакция), а пациентам, набравши 4 или более баллов, присваивали значение 1 (положительная реакция).
4. Наконец, выполняли валидацию характеристики RI и рассчитывали точность в виде среднего балльного показателя: 0,72, 95% ДИ [0,63; 0,81].
Несмотря на значительное разнообразие результатов до лечения, субъекты, реагировавшие на лечение, достигали более высоких суммарных показателей RI, чем субъекты, не реагировавшие на лечение (медианное значение 4,9 для субъектов, реагировавших на лечение, и 2,6 для субъектов, не реагировавших на лечение, при диапазоне от 0 до 9 для обеих групп). Кроме того, между суммарным показателем RI и процентным снижением IBS-SSS имела место статистически значимая корреляция (ро=0,39, р<0,001; фигура 22). Большинство субъектов, реагировавших на лечение, также достигали высоких суммарных показателей RI после лечения.
RI до лечения
В общей сложности 60% (19/32) субъектов, реагировавших на лечение, набрали 4 балла и более по суммарному показателю RI, в то время как лишь у 21% (6/29) субъектов, не реагировавших на лечение, было положительное значение RI. Субъекты, реагировавшие на лечение, характеризовались более молодым возрастом и слегка более высоким ИМТ, и поэтому в дальнейшие анализы вносили поправку на эти возможные искажающие факторы. При внесении поправки на возраст и ИМТ статистически значимая связь с положительным RI (р<0,004) сохранялась только для субъектов, реагировавших на лечение. В то же время в окончательной модели учитывался возраст. У пациентов с положительным RI вероятность реакции на лечение была в 5 раз выше, чем у субъектов с более низкими балльными показателями (OR=5,05, 95% ДИ [1,58; 16,10]). Более молодые пациенты с большей вероятностью реагировали на лечение (р=0,04). Вероятность реакции для пациентов с положительным RI составляла 83,4%, 95% ДИ [61,2 - 94%]. Кроме того, рассчитали вероятность того, что пациент будет реагировать на диету FODMAP, с учетом положительного RI, т.е. прогностическую ценность положительного значения: PPV=76,0, 95% ДИ [61,1-86,9].
RI после лечения
У большинства субъектов, реагировавших на лечение, был положительный RI и после лечения. Положительная оценка имела место у в общей сложности 56% (18/32) субъектов, реагировавших на лечение, по сравнению с 14% (4/29) субъектов, не реагировавших на лечение. При внесении поправки на возраст и ИМТ вероятность положительного RI у субъектов, реагировавших на лечение, была повышена более чем в 7 раз по сравнению с субъектами, не реагировавшими на лечение (OR=7,31, 95% ДИ [1,90-28,23], р=0,004).
Обсуждение
В течение последнего десятилетия растет количество доказательств того, что кишечная микробиота играет важную роль в патогенезе СРК. В то время как микробиота, ассоциированная со слизистыми, по-видимому, в основном влияет на хозяина за счет регуляторной контрольной системы, расположенной в стенке кишечника, микробиота просвета, по-видимому, в основном оказывает свое действие за счет сбраживания, образования газа и других метаболитов. У пациентов с СРК, по-видимому, возникают нарушения в этих обоих компартментах, и эти изменения могут участвовать в развитии симптомов. В настоящем исследовании выполнена оценка состава кишечной микробиоты путем оценки бактериальных ДНК-маркеров.
Представленные данные указывают, что уровень выбранных ДНК-маркеров кишечной микрофлоры может быть ассоциирован с повышенной вероятностью благоприятной реакции на диету с ограниченным содержанием FODMAP. Хотя настоящее исследование не смогло установить наличие механистической взаимосвязи между составом кишечной микробиоты и развитием симптомов СРК, результаты показывают, что такие ДНК-маркеры микроорганизмов можно использовать до лечения в качестве индикатора вероятной реакции на лечение и, таким образом, они могут иметь важное значение в клинических условиях. Включение информации о таких маркерах в систему балльной оценки, например, RI, описанный в настоящем документе, может обеспечить непосредственное, унифицированное и воспроизводимое применение этой оценки в клинических условиях.