ВАРИАНТЫ СЕМЕЙСТВА, СОСТОЯЩЕГО ИЗ 44 КСИЛОГЛЮКАНАЗ
VERSIONS OF FAMILY CONSISTING OF 44 XYLOGLUCANASES

Ссылка на список последовательностей
Настоящая заявка содержит список последовательностей в машиночитаемой форме. Машиночитаемая форма этого списка включена в настоящее описание посредством ссылки.
Область, к которой относится изобретения
Настоящее изобретение относится к вариантам ксилоглюканазы, принадлежащей к семейству, состоящему из 44 гликозилгидролаз, а также к полинуклеотидам, кодирующим эти варианты, и к способам получения этих вариантов.
Предшествующий уровень техники
Ксилоглюкан представляет собой основной структурный полисахарид, присутствующий в стенке первичных (растущих) клеток растений. По своей структуре ксилоглюканы состоят из целлюлозоподобного бета-1,4-связанного глюкозного остова, который, в большинстве случаев, бывает замещен различными боковыми цепями. Очевидно, что ксилоглюкан функционирует в стенке первичных клеток растений посредством перекрестно связывающихся микроволокон целлюлозы, образуя целлюлозо-ксилоглюкановую сетчатую структуру.
Carbohydrate Research
Trichoderma viride
T. reesei
Aspergillus aculeatus
Bacillus licheniformis
Bacillus agaradhaerens
Ксилоглюканазы обладают способностью катализировать солюбилизацию ксилоглюкана с образованием ксилоглюкановых олигосахаридов. Некоторые ксилоглюканазы обладают только ксилоглюканазной активностью, а другие ксилоглюканазы обладают ксилоглюканазной и целлюлазной активностью. Ксилоглюканазам могут быть присвоены классификационные номера EC 3.2.1.4 или EC. 3.2.1.151. Ферменты с ксилоглюканазной активностью описаны, например, в работе Vincken et al. (1997)  298(4):299-310, в которой охарактеризованы три различных эндоглюканазы Endol, EndoV и EndoVI  (а также ). Эндоглюканазы Endol, EndoV и EndoVI принадлежат к семейству, состоящему из 5, 7 и 12 гликозилгидролаз соответственно, см. Henrissat B. (1991) Biochem. J. 280: 309-316, и Henrissat B. and Bairoch A. (1993) Biochem. J. 293: 781-788. В заявке WO 94/14953 описано семейство из 12 ксилоглюканаз (EG II), клонированных из грибов . В заявке WO 99/02663 описано семейство, состоящее из 12 ксилоглюканаз, и семейство, состоящее из 5 ксилоглюканаз, клонированных из  и  соответственно. В заявке WO 01/062903 описано семейство из 44 ксилоглюканаз.
В частности, в заявках WO 99/02663 и WO 01/062903 высказывается предположение, что ксилоглюканазы могут быть использованы в детергентах.
Целью настоящего изобретения является получение вариантов ксилоглюканаз, принадлежащих к семейству из 44 гликозилгидролаз, которые, по сравнению с родительским ферментом, обладают улучшенными свойствами.
Описание сущности изобретения
Настоящее изобретение относится к выделенным вариантам родительской ксилоглюканазы, включающим модификации в одном или нескольких положениях, выбранных из группы, состоящей из положений 68, 123, 156, 118, 200, 129, 137, 193, 92, 83, 149, 34, 340, 332, 9, 76, 331, 310, 324, 498, 395, 366, 1, 374, 7, 140, 8, 14, 21, 211, 37, 45, 13, 78, 87, 436, 101, 104, 111, 306, 117, 119, 414, 139, 268, 142, 159, 164, 102, 168, 176, 180, 482, 183, 202, 206, 217, 4, 222, 19, 224, 228, 232, 2, 240, 244, 5, 247, 249, 328, 252, 259, 406, 267, 269, 275, 179, 166, 278, 281, 288, 298, 301, 18, 302, 165, 80, 303, 316, 169, 322, 120, 146, 342, 348, 147, 353, 380, 468, 382, 383, 38, 384, 389, 391, 10, 392, 396, 177, 397, 399, 409, 237, 413, 253, 415, 418, 40, 443, 445, 148, 449, 225, 450, 454, 3, 455, 456, 299, 461, 470, 204, 476, 488, 347 и 507, которые соответствуют положениям в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:3, где указанная(ые) модификация(ии) независимо представляет(ют) собой
i) инсерцию аминокислоты, расположенной ниже аминокислоты, которая занимает указанное положение,
ii) делецию аминокислоты, которая занимает указанное положение, или
iii) замену аминокислоты, которая занимает указанное положение, другой аминокислотой; и
где родительская ксилоглюканаза принадлежит к семейству из 44 ксилоглюканаз, а указанный вариант обладает ксилоглюканазной активностью.
Настоящее изобретение также относится к выделенным полинуклеотидам, кодирующим варианты ксилоглюканаз или полипептидов, обладающих ксилоглюканазной активностью; к конструкциям нуклеиновых кислот; к векторам и к клеткам-хозяевам, содержащим указанные полинуклеотиды; а также к способам получения варианта родительской ксилоглюканазы или полипептида, обладающего ксилоглюканазной активностью.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к вариантам родительского фермента, принадлежащего к семейству из 44 ксилоглюканаз и содержащего модификацию, предпочтительно, в виде замены, и/или инсерции, и/или делеции в одном или нескольких положениях, где нумерация положения соответствует нумерации положений в SEQ ID NO: 3. Варианты согласно изобретению обладают ксилоглюканазной активностью и могут также обладать целлюлолитической активностью. Варианты согласно изобретению, в отличие от родительской ксилоглюканазы, обладают улучшенными свойствами. В одном из аспектов изобретения, указанные варианты обладают повышенной стабильностью в жидких детергентах, а, в частности в жидких моющих композициях для стирки.
Определения
Ксилоглюканазная активность
: Термин «ксилоглюканазная активность» определяется в настоящем документе как фермент, катализирующий гидролиз ксилоглюкана. Эта реакция включает эндогидролиз 1,4-бета-D-глюкозидных связей в ксилоглюкане. В соответствии с настоящим изобретением, ксилоглюканазную активность определяют с использованием AZCL-ксилоглюкана (от Megazyme), который служит в качестве субстрата в ферментативной реакции. Такой анализ может быть проведен несколькими способами, например, как описано в примере 2 настоящей заявки или как описано в заявке WO 01/62903. Одна единица ксилоглюканазной активности (XyloU) определена с помощью аналитического метода, описанного в заявке WO 01/62903, на странице 60, строки 3-17.
Целлюлазная активность
: Термин «целлюлазная активность» определяется в настоящем документе как фермент, катализирующий гидролиз 1,4-бета-D-глюкозидных связей в бета-1,4-глюкане (целлюлозе). В соответствии с настоящим изобретением, целлюлазную активность определяют с использованием AZCL-НЕ-целлюлозы (от Megazyme), которая служит в качестве субстрата в ферментативной реакции.
Вариант
: Термин «вариант» определен в настоящем документе как полипептид, обладающий ксилоглюканазной активностью и включающий модификацию, такую как замена, инсерция и/или делеция одного или нескольких аминокислотных остатков в одном или нескольких конкретных положениях, соответствующих положениям аминокислот в SEQ ID NO: 3. Варианты согласно изобретению могут также обладать целлюлазной активностью. Модифицированный полипептид (вариант) получают вмешательством человека путем модификации полинуклеотидной последовательности, кодирующей родительский фермент. Родительский фермент может кодироваться последовательностями SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 6, или последовательностью, которая по меньшей мере на 65%, более предпочтительно, по меньшей мере на 70%, еще более предпочтительно, по меньшей мере на 75%, еще более предпочтительно, по меньшей мере на 80%, еще более предпочтительно, по меньшей мере на 85%, еще более предпочтительно, по меньшей мере на 90%, а наиболее предпочтительно, по меньшей мере на 95% идентична одной из этих последовательностей, и которая кодирует активный полипептид. Последовательностью полипептидного варианта, предпочтительно, является последовательность, которая не была обнаружена в природе.
Фермент дикого типа
: Термин ксилоглюканаза «дикого типа» означает ксилоглюканазу, экспрессируемую природным микроорганизмом, таким как бактерии, дрожжи или нитчатые грибы, встречающиеся в природе. Термин «дикого типа» может употребляться как синоним термина «природный».
Родительский фермент
: Используемый здесь термин ксилоглюканаза-«родитель» или «родительская» ксилоглюканаза означает ксилоглюканазу, в которую были внесены модификации, например, замена(ы), инсерция(и), делеция(и) и/или усечение(я), с получением вариантов фермента согласно изобретению. Этот термин также означает полипептид, с которым сравнивают данный вариант, и сопоставляют этот вариант путем выравнивания. Указанным родителем может быть природный (дикого типа) полипептид, такой как фермент SEQ ID NO: 2, или SEQ ID NO: 3, или SEQ ID NO: 5, или SEQ ID NO: 7, или полипептид, имеющий последовательность, которая по меньшей мере на 65%, более предпочтительно, по меньшей мере на 70%, еще более предпочтительно, по меньшей мере на 75%, еще более предпочтительно, по меньшей мере на 80%, еще более предпочтительно, по меньшей мере на 85%, еще более предпочтительно, по меньшей мере на 90%, а наиболее предпочтительно, по меньшей мере на 95% идентична одной из этих последовательностей. Родительским полипептидом может быть также вариант природного полипептида, аминокислотная последовательность которого была модифицирована или изменена. Родительским полипептидом может быть также аллельный вариант, который представляет собой полипептид, кодируемый любой из двух или более альтернативных форм гена, занимающего тот же самый локус в хромосоме.
Выделенный вариант или полипептид
: Используемый здесь термин «выделенный вариант» или «выделенный полипептид» означает вариант или полипептид, который выделен из источника, например, из клетки-хозяина, в которой он экспрессируется, или из ферментного комплекса, который обычно присутствует в данной клетке. Предпочтительно, полипептид имеет чистоту, составляющую по меньшей мере 40%, более предпочтительно, по меньшей мере 60%, еще более предпочтительно, по меньшей мере 80%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере 90%, а еще более предпочтительно, по меньшей мере 95%, как было определено с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ.
По существу, чистый вариант или полипептид
: Используемый здесь термин «по существу, чистый вариант или по существу, чистый полипептид» означает полипептидный препарат, содержащий максимум 10 мас.%, предпочтительно, максимум 8 мас.%, более предпочтительно, максимум 6 мас.%, еще более предпочтительно, максимум 5 мас.%, еще более предпочтительно, максимум 4 мас.%, еще более предпочтительно, максимум 3 мас.%, еще более предпочтительно, максимум 2 мас.%, еще более предпочтительно, максимум 1 мас.%, а наиболее предпочтительно, максимум 0,5 мас.% другого полипептидного материала, с которым он ассоциируется в природе или в рекомбинантном препарате. Поэтому, по существу, чистый вариант или полипептид имеет чистоту, предпочтительно, составляющую по меньшей мере 92%, более предпочтительно, по меньшей мере 94%, еще более предпочтительно, по меньшей мере 95%, еще более предпочтительно, по меньшей мере 96%, еще более предпочтительно, по меньшей мере 97%, еще более предпочтительно, по меньшей мере 98%, еще более предпочтительно, по меньшей мере 99%, еще более предпочтительно, по меньшей мере 99,5%, а наиболее предпочтительно, 100% по массе всего полипептидного материала, присутствующего в данном препарате. Варианты и полипептиды согласно изобретению, предпочтительно, присутствуют, по существу, в чистой форме. Это может быть достигнуто, например, путем получения указанного варианта или полипептида хорошо известными рекомбинантными методами или классическими методами очистки.
Зрелый полипептид
Последовательность, кодирующая зрелый полипептид
: Термин «зрелый полипептид» определен здесь как полипептид, обладающий ксилоглюканазной активностью, конечная форма которого образуется после трансляции и любых посттрансляционных модификаций, таких как N-концевой процессинг, C-концевое усечение, гликозилирование, фосфорилирование и т.п. Для полипептида, определенного в SEQ ID NO: 2, зрелая ксилоглюканазная последовательность теоретически может начинаться в положении 28 последовательности SEQ ID NO: 2. Зрелая последовательность заканчивается в положении 551 SEQ ID NO: 2. Теоретическая зрелая последовательность ксилоглюканазы представлена в SEQ ID NO: 3. В зависимости от экспрессионной системы, фактическая длина зрелого полипептида может варьироваться от 1 до 10 аминокислот теоретической последовательности зрелого полипептида. Зрелый полипептид, например, может начинаться в положении 33 последовательности SEQ ID NO: 2 и заканчиваться в положении 551 последовательности SEQ ID NO: 2. : Термин «последовательность, кодирующая зрелый полипептид» определен здесь как нуклеотидная последовательность, кодирующая зрелый полипептид, обладающий ксилоглюканазной активностью. В одном из аспектов изобретения, последовательностью, кодирующей зрелый полипептид, является последовательность, состоящая из нуклеотидов 82-1653 SEQ ID NO: 1. Последовательность, кодирующая зрелый полипептид, может иметь длину, варьирующуюся от 3 до 30 нуклеотидов, в зависимости от экспрессионной системы. Последовательность, кодирующая зрелый полипептид, может, например, соответствовать нуклеотидам 97-1653 SEQ ID NO: 1.
Идентичность
: Сходство между двумя аминокислотными последовательностями или между двумя нуклеотидными последовательностями определяется параметром «идентичность».
J. Mol. Biol
Trends in Genetics
http://emboss.org
В соответствии с настоящим изобретением, степень идентичности двух аминокислотных последовательностей определяют с использованием алгоритма Нидлмана-Вюнша (Needleman and Wunsch, 1970, . 48: 443-453), включенного в программу Needle, входящую в пакет программ EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000,  16: 276-277; ), предпочтительно, версии 3.0.0 или более поздней. Необязательными используемыми параметрами являются штраф на пробел-пропуск 10, штраф на пробел-удлинение 0,5 и матрица замен EBLOSUM62 (EMBOSS версии BLOSUM62). Выходные данные программы Needle, обозначенные как «идентичность самых длинных последовательностей» (получаемые с использованием опции - nobrief), выражены как процент идентичности и вычисляются следующим образом:
(Идентичные остатки × 100)/(Длина выравниваемых последовательностей - Общее число пробелов, используемых при выравнивании).
http://emboss.org
В соответствии с настоящим изобретением, степень идентичности между двумя дезоксирибонуклеотидными последовательностями определяют с использованием алгоритма Нидлмана-Вюнша (Needleman and Wunsch, 1970, см. выше), включенного в программу Needle, входящую в пакет программ EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, см. выше; ), предпочтительно, версии 3.0.0 или более поздней. Необязательными используемыми параметрами являются штраф на пробел-пропуск 10, штраф на пробел-удлинение 0,5 и матрица замен EDNAFULL (EMBOSS версии NCBI NUC4.4). Выходные данные программы Needle, обозначенные как «идентичность самых длинных последовательностей» (получаемые с использованием опции - nobrief), выражены как процент идентичности и вычисляются следующим образом:
(Идентичные дезоксирибонуклеотиды × 100)/(Длина выравниваемых последовательностей - Общее число пробелов, используемых при выравнивании).
Функциональный фрагмент
: Термин «функциональный фрагмент полипептида» используется для описания полипептида, который происходит от более длинного полипептида, например зрелого полипептида, и имеет усечение либо в N-концевой области, либо в С-концевой области, либо в обеих областях, в результате чего образуется фрагмент родительского полипептида. Для того чтобы полипептид был функциональным, необходимо, чтобы его фрагмент сохранял по меньшей мере 20%, предпочтительно, по меньшей мере 40%, более предпочтительно, по меньшей мере 50%, еще более предпочтительно, по меньшей мере 60%, еще более предпочтительно, по меньшей мере 70%, еще более предпочтительно, по меньшей мере 80%, еще более предпочтительно, по меньшей мере 90%, еще более предпочтительно, по меньшей мере 95%, а наиболее предпочтительно, по меньшей мере 100% ксилоглюканазной активности полноразмерного/зрелого полипептида.
Аллельный вариант
: Используемый здесь термин «аллельный вариант» означает любые две или более альтернативных форм гена, занимающих тот же самый локус в хромосоме. Аллельные варианты обычно возникают в результате мутации и могут приводить к полиморфизму внутри популяций. Генные мутации могут быть молчащими (не изменяют кодируемый полипептид) или могут кодировать полипептиды, имеющие модифицированные аминокислотные последовательности. Аллельным вариантом полипептида является полипептид, кодируемый аллельным вариантом гена.
Выделенный полинуклеотид
: Используемый здесь термин «выделенный полинуклеотид» означает полинуклеотид, выделенный из источника. В одном из аспектов изобретения, выделенный полинуклеотид имеет чистоту, составляющую по меньшей мере 40%, более предпочтительно, по меньшей мере 60%, еще более предпочтительно, по меньшей мере 80%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере 90%, а еще более предпочтительно, по меньшей мере 95%, как было определено с помощью электрофореза в агарозном геле.
По существу, чистый полинуклеотид
: Используемый здесь термин «по существу, чистый полинуклеотид» означает полинуклеотидный препарат, не содержащий других чужеродных или нежелательных нуклеотидов и имеющий форму, подходящую для его использования в генетически сконструированных системах продуцирования полипептидов. Таким образом, по существу, чистый полинуклеотид содержит максимум 10 мас.%, предпочтительно, максимум 8 мас.%, более предпочтительно, максимум 6 мас.%, еще более предпочтительно, максимум 5 мас.%, еще более предпочтительно, максимум 4 мас.%, еще более предпочтительно, максимум 3 мас.%, еще более предпочтительно, максимум 2 мас.%, еще более предпочтительно, максимум 1 мас.%, а наиболее предпочтительно, максимум 0,5 мас.% другого полинуклеотидного материала, с которым он ассоциируется в природе или в рекомбинантном препарате. Однако, по существу, чистый полинуклеотид может включать природные 5'- и 3'-нетранслируемые области, такие как промоторы и терминаторы. По существу, чистый полинуклеотид имеет чистоту, предпочтительно, составляющую по меньшей мере 90%, более предпочтительно, по меньшей мере 92%, еще более предпочтительно, по меньшей мере 94%, еще более предпочтительно, по меньшей мере 95%, еще более предпочтительно, по меньшей мере 96%, еще более предпочтительно, по меньшей мере 97%, еще более предпочтительно, по меньшей мере 98%, еще более предпочтительно, по меньшей мере 99%, а наиболее предпочтительно, по меньшей мере 99,5% по массе. Полинуклеотиды согласно изобретению, предпочтительно, имеют, по существу, чистую форму, то есть указанный полинуклеотидный препарат, по существу, не содержит другого полинуклеотидного материала, с которым он ассоциируется в природе или в рекомбинантном препарате. Полинуклеотиды могут представлять собой геномные ДНК, кДНК, РНК, а также полусинтетические полинуклеотиды, синтетические полинуклеотиды или любые их комбинации.
Кодирующая последовательность
: Используемый здесь термин «кодирующая последовательность» означает полинуклеотид, который непосредственно определяет аминокислотную последовательность его полипептидного продукта. Границы кодирующей последовательности, в основном, определяются открытой рамкой считывания, которая обычно начинается со старт-кодона ATG или альтернативных старт-кодонов, таких как GTG и TTG, и заканчивается стоп-кодоном, таким как TAA, TAG и TGA. Кодирующей последовательностью может быть ДНК, кДНК, синтетический полинуклеотид или рекомбинантный полинуклеотид.
Функционально связанный
: Используемый здесь термин «функционально связанный» означает конфигурацию, в которой регуляторная последовательность находится в соответствующем положении по отношению к кодирующей последовательности полинуклеотидной последовательности, что позволяет указанной регуляторной последовательности управлять экспрессией кодирующей последовательности полипептида.
Клетка-хозяин
: Используемый здесь термин «клетка-хозяин» включает любую клетку, которая является компетентной в отношении переноса в нее конструкции нуклеиновой кислоты или вектора, содержащих полинуклеотид согласно изобретению, ее трансфекции такой конструкцией или вектором и трансдукции указанной конструкции или вектора и т.п. Термин «клетка-хозяин» включает любое потомство родительской клетки, которое не является идентичным родительской клетке, что обусловлено мутациями, происходящими в процессе репликации.
Повышенная химическая стабильность
в
детергенте
: Термин «повышенная химическая стабильность» определяют здесь как вариант фермента, сохраняющего ферментативную активность после инкубирования в присутствии химического вещества или химических веществ, либо природных, либо синтетических, которые снижают ферментативную активность родительского фермента. Повышенная химическая стабильность может также способствовать образованию вариантов, обладающих лучшей способностью катилизировать реакцию в присутствии таких химических веществ. В конкретном аспекте изобретения, повышенной химической стабильностью является повышенная стабильность , в частности в жидком детергенте. Повышенной стабильностью к детергенту является, в частности, повышенная стабильность ксилоглюканазной активности при смешивании ксилоглюканазного варианта согласно изобретению с получением жидкой композиции детергента и с ее последующим хранением при температуре от 15 до 50°С.
В настоящем изобретении жидкими детергентами являются детергенты, особенно подходящие для их использования в качестве жидких моющих средств для стирки.
Соглашения по обозначению вариантов
В соответствии с настоящим изобретением, аминокислотную последовательность ксилоглюканазы, описанную в SEQ ID NO: 3, используют для определения соответствующего аминокислотного остатка в другой ксилоглюканазе. Аминокислотную последовательность другой ксилоглюканазы выравнивают с аминокислотной последовательностью ксилоглюканазы, описанной в SEQ ID NO: 3, и исходя из такого выравнивания может быть определено число положений аминокислот, соответствующих любому аминокислотному остатку в аминокислотной последовательности ксилоглюканазы, описанной в SEQ ID NO: 3.
Nucleic Acids Research
Выравнивание полипептидных последовательностей может быть осуществлено, например, с использованием программы «ClustalW» (Thompson J.D., Higgins D.G. and Gibson T.J., 1994, CLUSTAL W: Improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap penalties and weight matrix choice,  22: 4673-4680). Выравнивание последовательностей ДНК может быть осуществлено с использованием ДНК данного полипептида в качестве матрицы, в которой была сделана замена кодона данных аминокислот соответствующим кодоном последовательности ДНК.
При описании различных вариантов ксилоглюканаз согласно изобретению, номенклатура, описанная ниже, была адаптирована для простоты ее идентификации. Во всех случаях, используется принятая ИЮПАК (IUPAC) однобуквенная или трехбуквенная аббревиатура аминокислот.
Замены
: Для замены аминокислот используется следующая номенклатура: исходная аминокислота/положение/замененная аминокислота. В соответствии с этим, замена треонина аланином в положении 226 обозначается «Thr226Ala» или «T226A». Множественные мутации разделены значком «плюс» («+»), так, например, «G205R + S411F» означает мутации в положениях 205 и 411, где глицин (G) заменен аргинином (R), а серин (S) заменен фенилаланином (F), соответственно. Если исходная аминокислота может быть заменена аминокислотой, выбранной из группы аминокислот, то такая замена обозначается «K129R,S,A,I,F,Q», где лизин (K) в положении 129 заменен аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из аргинина (R), серина (S), аланина (A), изолейцина (I), фенилаланина (F) и глутамина (Q). Альтернативно, «K129R,S,A,I,F,Q» может записываться как K129R, или K129S, или K129A, или K129I, или K129F, или K129Q.
Делеции
*
*
. Для делеции аминокислот используется следующая номенклатура: исходная аминокислота/положение/звездочка (*). В соответствии с этим, делеция глицина в положении 195 обозначается «Gly195» или «G195». Множественные делеции разделены значком «плюс» («+»), например, «G195* + S411*».
Инсерции
*
*
*
. Для инсерции аминокислот используется нижеследующая номенклатура: звездочка(*)/положение/строчная буква/встроенная аминокислота, где строчная буква означает добавление аминокислоты ниже данного положения. В соответствии с этим, инсерция глутаминовой кислоты (E) за положением 10 обозначается «10aE». Если ниже положения 10 за глутаминовой кислотой (E) встраивается вторая аминокислота, например, валин (V), то такая инсерция обозначается «*10аЕ + *10bV». Добавление полипептидов к N-концу обозначается 0 (ноль). Добавление глутаминовой кислоты (E) и валина (V) к N-концевой аминокислоте полипептида обозначается «*0aE+*0bV». Инсерция аминокислоты, «добавляемой ниже», может быть также определена как добавление одной или нескольких аминокислот между названным положением и положением, следующим непосредственно за названным положением, например, инсерция ниже положения 195 приводит к добавлению одной или нескольких аминокислот между положениями 195 и 196, в результате чего образуются новые положения, 195a, 195b и т.п.
Родительские ксилоглюканазы
В настоящем изобретении, родительской ксилоглюканазой является либо (a) ксилоглюканаза, принадлежащая к семейству из 44 гликозилгидролаз, также называемому семейством из 44 ксилоглюканаз; либо (b) полипептид, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO:3, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 7; либо (c) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 75% идентична последовательности зрелого полипептида SEQ ID NO: 3; либо (d) полипептид, кодируемый полинуклеотидом, который гибридизуется в условиях по меньшей мере умеренной жесткости с (i) последовательностью, кодирующей зрелый полипептид, SEQ ID NO: 1, или SEQ ID NO: 4, или SEQ ID NO: 6; (ii) геномной последовательностью ДНК, включающей последовательность, кодирующую зрелый полипептид, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 6; или (iii) полноразмерной комплементарной цепью (i) или (ii); либо (e) полипептид, кодируемый полинуклеотидом, включающим нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности, кодирующей зрелый полипептид, SEQ ID NO: 1.
В первом аспекте изобретения, родительская ксилоглюканаза содержит аминокислотную последовательность, которая имеет степень идентичности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 3, составляющую, предпочтительно, по меньшей мере 70%, более предпочтительно, по меньшей мере 75%, более предпочтительно, по меньшей мере 80%, еще более предпочтительно, по меньшей мере 85%, еще более предпочтительно, по меньшей мере 90%, еще более предпочтительно, по меньшей мере 95%, еще более предпочтительно, по меньшей мере 96%, еще более предпочтительно, по меньшей мере 97%, еще более предпочтительно, по меньшей мере 98%, а наиболее предпочтительно, по меньшей мере 99%, и которая обладает ксилоглюканазной активностью (далее называемая «гомологичными полипептидами»). В одном из аспектов изобретения, гомологичные полипептиды имеют аминокислотную последовательность, которая отличается от зрелого полипептида SEQ ID NO:3 на десять, предпочтительно, на девять, более предпочтительно, на восемь, еще более предпочтительно, на семь, еще более предпочтительно, на шесть, еще более предпочтительно, на пять аминокислот, еще более предпочтительно, на четыре, еще более предпочтительно, на три, еще более предпочтительно, на две аминокислоты, и наиболее предпочтительно, на одну аминокислоту.
EMBO J
Methods Enzymol
Protein Expression and Purification
По существу, гомологичные родительские ксилоглюканазы могут иметь одну или несколько аминокислотных модификаций, таких как замены, делеции и/или инсерции. Эти модификации, по своей природе, предпочтительно, играют незначительную роль, то есть представляют собой консервативные аминокислотные замены и другие замены, которые не оказывают заметного влияния на трехмерную укладку или активность белка или полипептида; небольшие делеции, обычно от одной до примерно 9 аминокислот, предпочтительно, от одной до примерно 15 аминокислот, а наиболее предпочтительно, от одной до примерно 30 аминокислот; и небольшие амино- или карбокси-концевые удлинения, такие как добавление амино-концевого метионинового остатка, небольшого линкерного пептида, имеющего примерно до 5-10 остатков, предпочтительно, от 10 до 15 остатков, а наиболее предпочтительно, от 20 до 25 остатков, или небольшое удлинение, облегчающее очистку (присоединение аффинной метки), такое как присоединение полигистидиновой метки или белка А (Nilsson et al., 1985, . 4: 1075; Nilsson et al., 1991, . 198: 3. В общих чертах, см. также Ford et al., 1991,  2: 95-107.
Хотя вышеописанные модификации, по своей природе, предпочтительно, не оказывают значительного влияния, однако, иногда они могут играть определенную роль, то есть могут приводить к образованию гибрида из более крупных полипептидов длиной до 300 аминокислот или более и могут представлять собой амино- или карбокси-концевые удлинения.
In, The Proteins
Примерами консервативных замен являются замены между аминокислотами группы основных аминокислот (аргинина, лизина и гистидина), кислотных аминокислот (глутаминовой кислоты и аспарагиновой кислоты), полярных аминокислот (глутамина и аспарагина), гидрофобных аминокислот (лейцина, изолейцина и валина), ароматических аминокислот (фенилаланина, триптофана и тирозина) и небольших аминокислот (глицина, аланина, серина, треонина и метионина). Аминокислотные замены, которые, по существу, не приводят к изменению удельной активности, известны специалистам и описаны, например, в публикации Neurath & Hill, 1979, , Academic Press, New York. Наиболее часто встречающимися заменами являются Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu и Asp/Gly.
J. Biol. Chem
Science
J. Biol. Chem. Vol.
in silico
+
+
Незаменимые аминокислоты в ксилоглюканазных полипептидах согласно изобретению могут быть идентифицированы в соответствии с процедурами, известными специалистам, такими как сайт-направленный мутагенез или аланин-сканирующий мутагенез (Cunningham and Wells, Science 244: 1081-1085, 1989). В последнем методе, одиночные аланиновые мутации вводят в каждый остаток молекулы, и полученные мутантные молекулы тестируют на биологическая активность (то есть ксилоглюканазную активность) для идентификации аминокислотных остатков, играющих важную роль в активности молекулы. См. также Hilton et al., . 271:4699-4708, 1996. Активный центр фермента или другие области, участвующие в биологических взаимодействиях, могут быть также определены с помощью физического анализа структуры, как было определено такими методами, как ядерный магнитный резонанс, кристаллография, электронная дифракция или фотоаффинное мечение, в комбинации с мутацией предполагаемого сайта контактирования аминокислот. См., например, de Vos et al.,  255:306-312, 1992; Smith et al., J. Mol. Biol. 224:899-904, 1992; Wlodaver et al., FEBS Lett. 309:59-64, 1992. Идентичность незаменимых аминокислот может быть также определена исходя из анализа их гомологии с полипептидами, которые являются родственными полипептиду согласно изобретению. Кристаллическая структура фермента, принадлежащего к семейству, состоящему из 44 гликозилгидролаз, была описана Kitago et al,  282:35703-35711, 2007. На основании этой структуры можно генерировать трехмерную структуру родительской ксилоглюканазы (SEQ ID NO: 3) . Путем сравнения с опубликованной структурой, нижеследующие остатки в SEQ ID NO: 3 были идентифицированы как остатки, осуществляющие важную ферментативную функцию, а именно остаток E187 (каталитическая аминокислота/каталитическое основание), остаток E358 (каталитический нуклеофил), остаток E56 (карбоксилатная группа, координирующая Ca2) и остаток D154 (карбоксилатная группа, координирующая Ca2). Поэтому, такие положения, предпочтительно, не должны быть мутированы в родительском ферменте.
Родительская ксилоглюканаза, предпочтительно, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 или ее аллельный вариант или фрагмент, обладающий ксилоглюканазной активностью. В одном из аспектов изобретения, родительская ксилоглюканаза содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. В другом аспекте изобретения, родительская ксилоглюканаза содержит зрелый полипептид SEQ ID NO: 2. В другом аспекте изобретения, родительская ксилоглюканаза состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3 или ее аллельного варианта или фрагмента, обладающего ксилоглюканазной активностью. В другом аспекте изобретения, родительская ксилоглюканаза содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5 или ее аллельный вариант или фрагмент, обладающий ксилоглюканазной активностью. В другом аспекте изобретения, родительская ксилоглюканаза содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7 или ее аллельный вариант или фрагмент, обладающий ксилоглюканазной активностью. В другом аспекте изобретения, родительская ксилоглюканаза содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 65%, более предпочтительно, по меньшей мере на 70%, еще более предпочтительно, по меньшей мере на 75%, еще более предпочтительно, по меньшей мере на 80%, еще более предпочтительно, по меньшей мере на 85%, еще более предпочтительно, по меньшей мере на 90%, а наиболее предпочтительно, по меньшей мере на 95% идентична последовательности SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3, или SEQ ID NO: 5. Фрагментом зрелого полипептида SEQ ID NO: 3 является полипептид, который имеет одну или несколько аминокислот, делетированных у амино- и/или карбоксиконца этой аминокислотной последовательности, и сохраняет ксилоглюканазную активность.
Molecular Cloning, A Laboratory Manual
Во втором аспекте изобретения, родительские ксилоглюканазы кодируются полинкулеотидами, которые гибридизуются в условиях очень низкой жесткости, предпочтительно, в условиях низкой жесткости, более предпочтительно, в условиях умеренной жесткости, более предпочтительно, в условиях умеренной-высокой жесткости, еще более предпочтительно, в условиях высокой жесткости, а наиболее предпочтительно, в условиях очень высокой жесткости, (i) с последовательностью, кодирующей зрелый полипептид, SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 4, или SEQ ID NO: 6, (ii) с последовательностью геномной ДНК, включаеющей последовательность, кодирующую зрелый полипептид, SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 4, или SEQ ID NO: 6, (iii) с подпоследовательностью (i) или (ii); или (iv) с полноразмерной комплементарной цепью (i), (ii) или (iii) (J. Sambrook, E.F. Fritsch and T. Maniatis, 1989, , 2d edition, Cold Spring Harbor, New York). Такая подпоследовательность может кодировать полипептидный фрагмент, обладающий ксилоглюканазной активностью. В одном из аспектов изобретения, комплементарной цепью является полноразмерная комплементарная цепь последовательности, кодирующей зрелый полипептид, SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 4, или SEQ ID NO: 6.
Подпоследовательностью последовательности, кодирующей зрелый полипептид, SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 4, или SEQ ID NO: 6, или ее гомологом является нуклеотидная последовательность, в которой один или несколько нуклеотидов делетированы у 5'- и/или 3'-конца, где указанный полипептид, кодируемый указанной подпоследовательностью, обладает ксилоглюканазной активностью.
Родительскими ферментами могут быть также аллельные варианты полипептидов, обладающих ксилоглюканазной активностью.
32
3
35
Полинуклеотид SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 4, или SEQ ID NO: 6 или его подпоследовательность, а также аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 5, или SEQ ID NO: 7, или ее фрагмент, могут быть использованы для конструирования зондов нуклеиновой кислоты, применяемых для идентификации и клонирования ДНК, кодирующей родительские ксилоглюканазы, происходящие от штаммов различного рода или вида, где такую идентификации и клонирование осуществляют методами, хорошо известными специалистам. В частности, такие зонды могут быть использованы для гибридизации с геномной ДНК или с кДНК представляющего интерес рода или вида после проведения стандартных процедур саузерн-блот-анализа, осуществляемого в целях идентификации и выделения соответствующего гена, описанного в настоящей заявке. Такие зонды могут быть значительно короче полноразмерной последовательности, но их длина должна составлять по меньшей мере 14, предпочтительно, по меньшей мере 25, более предпочтительно, по меньшей мере 35, а наиболее предпочтительно, по меньшей мере 70 нуклеотидов. Однако, предпочтительно, чтобы такой зонд нуклеиновой кислоты имел длину по меньшей мере 100 нуклеотидов. Так, например, зонд нуклеиновой кислоты может иметь длину по меньшей мере 200 нуклеотидов, предпочтительно, по меньшей мере 300 нуклеотидов, более предпочтительно, по меньшей мере 400 нуклеотидов, а наиболее предпочтительно, по меньшей мере 500 нуклеотидов. Могут быть использованы даже еще более длинные зонды, например, зонды нуклеиновой кислоты, которые, предпочтительно, имеют длину по меньшей мере 600 нуклеотидов, более предпочтительно, по меньшей мере 700 нуклеотидов, еще более предпочтительно, по меньшей мере 800 нуклеотидов, еще более предпочтительно, по меньшей мере 900 нуклеотидов, еще более предпочтительно, по меньшей мере 1000 нуклеотидов, еще более предпочтительно, по меньшей мере 1100 нуклеотидов, еще более предпочтительно, по меньшей мере 1200 нуклеотидов, еще более предпочтительно, по меньшей мере 1300 нуклеотидов, еще более предпочтительно, по меньшей мере 1400 нуклеотидов, еще более предпочтительно, по меньшей мере 1500 нуклеотидов, а наиболее предпочтительно, по меньшей мере 1600 нуклеотидов. Могут быть использованы как ДНК-, так и РНК-зонды. Эти зонды обычно метят для детектирования соответствующего гена (например, P, H, S, биотином или авидином). Такие зонды входят в объем настоящего изобретения.
Библиотека геномных ДНК, полученная от других организмов, может быть скринирована на ДНК, которая гибридизуется с описанными выше зондами и кодирует родительскую ксилоглюканазу. Геномная ДНК или другая ДНК от других организмов может быть разделена с помощью электрофореза в агарозном или полиакриламидном геле или другими методами разделения. ДНК из указанных библиотек или выделенная ДНК может быть перенесена на нитроцеллюлозу или другой подходящий материал-носитель и иммобилизована на этой нитроцеллюлозе или на этом материале-носителе. В саузерн-блот-анализе, для идентификации клона или ДНК, которые гомологичны последовательности SEQ ID NO: 1 или ее подпоследовательности, используют материал-носитель. В соответствии с настоящим изобретением, термин «гибридизация» означает, что данный полинуклеотид гибридизуется с меченным нуклеотидным зондом, соответствующим полинуклеотиду, представленному в SEQ ID NO: 1, его комплементарной цепи или подпоследовательности в условиях от низкой до очень высокой жесткости. Молекулы, с которыми гибридизуется данный зонд, могут быть детектированы с использованием, например, рентгеновской пленки или с применением любых других детектирующих средств, известных специалистам.
В одном из аспектов изобретения, зондом нуклеиновой кислоты является последовательность, кодирующая зрелый полипептид, SEQ ID NO:1. В другом аспекте изобретения, зондом нуклеиновой кислоты являются нуклеотиды 82-1653 SEQ ID NO: 1 или нуклеотиды 97-1653 SEQ ID NO:1. В другом аспекте изобретения, зондом нуклеиновой кислоты является полинуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид SEQ ID NO:2, или ее подпоследовательность. В другом аспекте изобретения, указанным зондом нуклеиновой кислоты является SEQ ID NO: 1.
Для длинных зондов, имеющих длину по меньшей мере 100 нуклеотидов, условия от очень низкой до очень высокой жесткости определены как предварительная гибридизация и гибридизация при 42°C в 5X SSPE, 0,3% ДСН, 200 микрограммов/мл фрагментированной и денатурированной ДНК спермы лосося, и либо 25% формамид, используемый в условиях очень низкой и низкой жесткости, либо 35% формамид, используемый в условиях умеренной и умеренно-высокой жесткости, либо 50% формамид, используемый в условиях высокой и очень высокой жесткости, где указанную предварительную гибридизацию и гибридизацию проводят в соответствии со стандартными процедурами саузерн-блот-анализа, оптимальное время которого составляет 12-24 часа.
Для длинных зондов длиной по меньшей мере в 100 нуклеотидов, материал-носитель подвергают конечной промывке три раза, каждую из которых проводят в течение 15 минут с использованием 2× SSC, 0,2% ДСН, предпочтительно, при 45°С (в условиях очень низкой жесткости), более предпочтительно, при 50°С (в условиях низкой жесткости), более предпочтительно, при 55°С (в условиях умеренной жесткости), еще более предпочтительно, при 60°С (в условиях умеренно-высокой жесткости), еще более предпочтительно, при 65°С (в условиях высокой жесткости), а наиболее предпочтительно, при 70°С (в условиях очень высокой жесткости).
m
Proceedings of the National Academy of Sciences USA
Для коротких зондов, длина которых составляет примерно от 15 до 70 нуклеотидов, условия жесткости определяют как предварительную гибридизацию, гибридизацию и промывку после гибридизации при температуре примерно на 5-10°С ниже T, вычисленной по Болтону и Маккарти (1962,  48:1390) в 0,9 M NaCl, 0,09 M трис-HCl, pH 7,6, 6 мМ EDTA, 0,5% NP-40, 1× растворе Денхардта, 1 мМ пирофосфата натрия, 1 мМ моноосновного фосфата натрия, 0,1 мМ ATP и 0,2 мг дрожжевой РНК на мл в соответствии со стандартными процедурами саузерн-блот-анализа, оптимальное время которого составляет 12-24 часа.
m
Для коротких зондов длиной примерно от 15 до 70 нуклеотидов, материал-носитель промывают один раз в 6× SCC плюс 0,1% ДСН в течение 15 минут и два раза (каждый) в течение 15 минут с использованием 6× SCC при температуре примерно на 5-10°С ниже вычисленной T.
В третьем аспекте изобретения, родительская ксилоглюканаза кодируется полинуклеотидом, включающим нуклеотидную последовательность, или состоящим из нее, где указанная последовательность, предпочтительно, по меньшей мере на 65%, более предпочтительно, по меньшей мере на 70%, более предпочтительно, по меньшей мере на 75%, еще более предпочтительно, по меньшей мере на 80%, еще более предпочтительно, по меньшей мере на 85%, еще более предпочтительно, по меньшей мере на 90%, еще более предпочтительно, по меньшей мере на 95%, а наиболее предпочтительно на 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности, кодирующей зрелый полипептид, SEQ ID NO: 1, и которая кодирует активный полипептид. В одном из аспектов изобретения, последовательностью, кодирующей зрелый полипептид, является последовательность нуклеотидов 82-1653 SEQ ID NO:1 или последовательность нуклеотидов 97-1653 SEQ ID NO:1.
Родительская ксилоглюканаза может быть получена из микроорганизмов любого рода. В одном из аспектов изобретения, родительская ксилоглюканаза секретируется во внеклеточное пространство.
Bacillus
Bacillus/Lactobacillus
Paenibacillus
Paenibacillus polymyxa
Paenibacillus polymyxa
В другом аспекте изобретения, родительской ксилоглюканазой может быть бактериальная ксилоглюканаза. Так, например, ксилоглюканазой может быть полипептид грамположительных бактерий, таких как , предпочтительно, бактерий подразделения , более предпочтительно, бактерий видов, происходящих от рода , а в частности, , например, , ATCC 832, а предпочтительной ксилоглюканазой является ксилоглюканаза, принадлежащая к семейству из 44 ксилоглюканаз, например, описанных в WO 01/62903, более предпочтительно, ксилоглюканаза SEQ ID NO: 5, еще более предпочтительно, ксилоглюканаза SEQ ID NO: 7, а наиболее предпочтительно, ксилоглюканаза SEQ ID NO: 2 или ее зрелый полипептид.
Получение вариантов
Варианты родительской ксилоглюканазы могут быть получены любым методом мутагенеза, известным специалистам, таким как неспецифический и/или сайт-направленный мутагенез, конструирование синтетических генов, конструирование полусинтетических генов, неспецифический мутагенез, перестановка генов и т.п.
in vitr
Nature
Конструирование синтетического гена включает o синтез нужной полинуклеотидной молекулы, которая кодирует представляющую интерес полипептидную молекулу. Синтез гена может быть осуществлен с применением ряда методов, таких как технология на основе мультиплексных микрочипов, описанная Tian, et al. (Tian et al.,  432:1050-1054), и аналогичные технологии, в которых олигонуклеотиды подвергают синтезу и сборке на фотопрограммируемых микрофлюидизационных чипах.
de novo
Конструирование полусинтетического гена осуществляют путем комбинирования технологий конструирования синтетического гена, и/или сайт-направленного мутагенеза, и/или неспецифического мутагенеза, и/или перестановки генов. Конструирование полусинтетического гена осуществляют с использованием полинуклеотидных фрагментов, которые синтезируют в комбинации с ПЦР-технологиями. Таким образом, определенные области генов могут быть синтезированы , некоторые области могут быть амплифицированы с использованием праймеров, мутированных методом сайт-направленного мутагенеза, а другие области могут быть подвергнуты ПЦР с вероятностью ошибки или точной ПЦР-амплификации. Затем полинуклеотидные фрагменты могут быть подвергнуты перестановке.
in vitr
in vivo
Сайт-направленный мутагенез представляет собой метод, который позволяет вносить одну или несколько мутаций в определенном сайте полинуклеотидной молекулы, кодирующей родительскую ксилоглюканазу. Этот способ может быть осуществлен o или .
in vitr
in vitr
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
Nucleic Acids Research
Сайт-направленный мутагенез может быть осуществлен o с помощью реакции ПЦР, предусматривающей использование олигонуклеотидных праймеров, содержащих желаемую мутацию. Сайт-направленный мутагенез может быть также осуществлен o с помощью кластерного мутагенеза, заключающегося в расщеплении рестриктирующим ферментом в сайте плазмиды, содержащей полинуклеотид, кодирующий родительскую ксилоглюканазу, с последующим лигированием олигонуклеотида, имеющего мутацию, в данный полинуклеотид. Обычно, рестриктирующим ферментом, который расщепляет и плазмиду, и олигонуклеотид, является один и тот же фермент, что позволяет создавать у плазмиды и у вставки липкие концы и лигировать их друг с другом. Дополнительное описание подходящих методов можно найти в руководствах Sambrook et al. (1989), Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY; Ausubel F.M. et al. (eds.) «Current protocols in Molecular Biology». John Wiley and Sons, 1995; Harwood C.R. and Cutting S.M. (eds.) «Molecular Biological Methods for Bacillus». John Wiley and Sons, 1990), в заявке WO 96/34946; и в публикации Scherer and Davis, 1979,  76: 4949-4955; и Barton et al., 1990,  18: 7349-4966.
E.coli,
E.coli
B. subtilis
Bacillus,
E.coli
Bacillus
in vitr
После лигазной реакции смесь для лигирования может быть использована для трансформации клеток-хозяев, а в целях клонирования часто используют клетки  как описано в руководстве Ausubel F. M. et al. Трансформированные клетки  могут быть размножены в планшетах с жидкой средой или с твердым агаром, а плазмиды могут быть выделены из трансформированных клеток и использованы для трансформации клеток . Подходящие компетентные клетки  такие как MB1510, 168-производное (например, поставляемое фирмой BGSC с регистрационным номером № 1A1 168 trpC2), могут быть трансформированы как описано в WO 03/095658. Кластер для интеграции плазмиды в , используемый для конструирования библиотеки, может быть применен для трансформации . Этот метод подробно описан в заявке WO 03/095658. Альтернативно, может быть использован o амплифицированный ПЦР-SOE-продукт (Melnikov and Youngman, Nucleic Acid Research 27, 1056).
in vivo
Nature Biotechnology
Nat. Med
Fungal Genet. Newslett
Сайт-направленный мутагенез может быть осуществлен  методами, известными специалистам. См., например, публикацию заявки на патент США 2004/0171154; Storici et al., 2001,  19: 773-776; Kren et al., 1998, . 4: 285-290; и Calissano and Macino, 1996, . 43: 15-16.
В настоящем изобретении может быть использован любой метод сайт-направленного мутагенеза. Существует множество коммерчески доступных наборов, которые могут быть использованы для получения вариантов родительских ксилоглюканаз.
Science
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
Biochem
Gene
Одна или множество аминокислотных замен, делеций и/или инсерций могут быть введены и протестированы известными методами мутагенеза, рекомбинации и/или перестановки с последующим проведением соответствующей процедуры скрининга, например, описанной в публикации Reidhaar-Olson and Sauer, 1988,  241 : 53-57; Bowie and Sauer, 1989,  86: 2152-2156; в заявке WO 95/17413; или в заявке WO 95/22625. Другими методами, которые могут быть применены, являются ПЦР с вероятностью ошибки, фаговое представление (например, Lowman et al., 1991, . 30:10832-10837; патент США №5223409; заявка WO 92/06204) и область-направленный мутагенез (Derbyshire et al., 1986,  46:145; Ner et al., 1988, DNA 7:127).
Bacillus
Описанные выше методы мутагенеза/перестановки могут быть объединены с высокоэффективными методами автоматического скрининга для детектирования активности клонированных мутагенных полипептидов, экспрессируемых клетками-хозяевами, например , как описано выше. Мутагенные молекулы ДНК, кодирующие полипептиды, обладающие ксилоглюканазной активностью, могут быть выделены из клеток-хозяев и быстро секвенированы стандартными методами, известными специалистам.
Варианты
В настоящем изобретении, выделенные варианты родительской ксилоглюканазы содержат модификацию в одном или нескольких положениях, выбранных из группы, состоящей из положений 68, 123, 156, 118, 200, 129, 137, 193, 92, 83, 149, 34, 340, 332, 9, 76, 331, 310, 324, 498, 395, 366, 1, 374, 7, 140, 8, 14, 21, 211, 37, 45, 13, 78, 87, 436, 101, 104, 111, 306, 117, 119, 414, 139, 268, 142, 159, 164, 102, 168, 176, 180, 482, 183, 202, 206, 217, 4, 222, 19, 224, 228, 232, 2, 240, 244, 5, 247, 249, 328, 252, 259, 406, 267, 269, 275, 179, 166, 278, 281, 288, 298, 301, 18, 302, 165, 80, 303, 316, 169, 322, 120, 146, 342, 348, 147, 353, 380, 468, 382, 383, 38, 384, 389, 391, 10, 392, 396, 177, 397, 399, 409, 237, 413, 253, 415, 418, 40, 443, 445, 148, 449, 225, 450, 454, 3, 455, 456, 299, 461, 470, 204, 476, 488, 347 и 507, где указанный вариант, обладающий ксилоглюканазной активностью, содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, более предпочтительно, по меньшей мере на 75%, еще более предпочтительно, по меньшей мере на 80%, еще более предпочтительно, по меньшей мере на 85%, еще более предпочтительно, по меньшей мере на 90%, еще более предпочтительно, по меньшей мере на 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 97%, еще более предпочтительно, по меньшей мере на 98%, а наиболее предпочтительно, на 99% идентична аминокислотной последовательности родительской ксилоглюканазы. Нумерация положений соответствует нумерации аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3. Предпочтительно, указанные варианты, содержащие модификации в одном или нескольких положениях, идентифицированных выше, обладают повышенной стабильностью к детергенту, а предпочтительно, в жидком детергенте, по сравнению с активностью родительской ксилоглюканазы.
В предпочтительном варианте изобретения, указанный вариант содержит одну или несколько нижеследующих комбинаций модификаций:
V1*+V2*+H3*;
V1Q+*1aE+*1bV;
H3A;
H3A+H436A;
K8A,Q,S;
T9D;
T9D+L34F+A83E+Q149E+H193T+S332P+R340T;
I10V+D33E+M40L+A41T+Q67M+Y73F+S76D+G78A+Q82K+T92A+L102Q+Q137E+I222V+V228I+D249N+S269N+V272A+E333A+I337L+M356L+T374A+S416A+D444Y+A469E+K470T+I473G+T517A+S522*;
I10V+F17S+D33E+M40L+A41T+Q67M+N72S+S76D+G78A+Q82K+Q137E+V219A+D249N+V272A+I337L+M356L+V397A+S416A+T421I+S424N+N441D+D444Y+V450I+K470T+I473S+V477I;
I10V+F17S+D33E+M40L+Q67M+N72S+S76D+G78A+Q82K+T92A+L102Q+Q137E+H164N+N168K+T172A+V219A+I222V+V228I+D249N+S269N+V272A+E333A+I337L+M356L+N415S+T421I+S424H+N441D+D444Y+S522P+P523V+V524E;
I10V+F17S+D33E+M40L+Q67M+N72S+S76D+G78A+Q82K+T92A+L102Q+Q137E+I222V+V228I+D249N+V272A+I337L+M356L+T374A+V397A+S416A+T421I+S424N+N441D+D444Y+V450I+A469E+K470T+I473G+T517A+S522P+P523V+V524E;
I10V+F17S+D33E+Q67M+N72S+S76D+G78A+Q82K+T92A+L102Q+Q137E+N168K+T172A+I222V+V228I+D249N+V272A+E333A+I337L+M356L+V397A+S416A+T421I+S424H+N441D+D444Y+A469E+K470T+I473S+V477I+E489A+A490V+T517A+S522*;
I10V+F17S+M40L+Q67M+N72S+S76D+G78A+Q82K+T92A+L102Q+Q137E+I222V+V228I+D249N+S269N+V272A+T320A+I337L+M356L+T374A+V397A+N415S+T421I+S424H+N441D+D444Y+A469E+K470T+I473S+V477I+T517A+S522P+P523V+V524E;
I10V+F17S+Q67M+N72S+S76D+G78A+Q82K+T104A+Q137E+N153K+R156Q+V219A+I222V+V228I+D249N+S269N+V272A+E333A+I337L+M356L+V397A+N415S+D420G+T421I+S424H+N441D+D444Y+V450I+A469E+K470T+I473G+T517A+S522*;
I10V+F17S+Q67M+N72S+S76D+G78A+Q82K+T92A+T104A+Q137E+R156Q+V159A+H164N+N168K+T172A+I222V+V228I+D249N+V272A;
I10V+F17S+Y53H+Q67M+N72S+S76D+G78A+Q82K+T92A+L102Q+Q137E+T172V+A177T+I222V+V228I+D249N+S269N+I337L+M356L+V397A+S416A+T421I+S424H+N441D+D444Y+A469E+K470T+I473G+T517A+S522*;
K13A+K129A;
K13A+Q68H+T92V+K118A+Q137E+R156Y+G200P;
K13A,R;
K18R;
R20A;
K21Q+K129A;
K21Q,R,T;
Q32H+M40L+R49G+D65E+Q67M+N72S+S76D+G78A+Q82K+T92A+L102Q+T104A+Q137E+H164N+K202E+I222V+V228I+D249N+M356L+T374A;
D33V+Q68H+N168H+V450I;
L34F,I,M,V;
L34I+K129A;
D37G,N+K129A+R156Y;
E38I,V;
M40L+A41T+Q67M+N72S+S76D+G78A+Q82K+Q137E+N153K+H164N+D249N+V272A+I337L+M356L+V397A+N415S+T421I+S424N+N441D+V450I+E489A+A490V+T517A+S522*;
M40V;
L45I;
Q68H,M,N;
Q68H+G200P+N331F;
Q68H+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F;
Q68H+K118A+R156V+G200P+N331F;
Q68H+K118A+R156Y+H193T+D366H;
Q68H+K118R+R156F,Y;
Q68H+K118R+R156Y+G200P;
Q68H+K118S+R156F+G200P+G274D+N331F;
Q68H+K129A,T+R156K+G200P+N331F;
Q68H+R156F,V,Y+G200P+N331F;
Q68H+R156Y;
Q68H+R156Y+H193T;
Q68H+R156Y+H193T+D366H;
Q68H+R156Y+H193T+G200P+M310V;
Q68H+S76W+T92V+K118A+Q137E+R156Y+G200P+N331F;
Q68H+T92A,D,I,S,V,Y+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F;
Q68H+T92N+D97N+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F;
Q68H+T92S+K118A+K129A+R156Y+G200P+G274D+N331F;
Q68H+T92V+G200P+M310V;
Q68H+T92V+G200P+M310V+N331F;
Q68H+T92V+K118A+K129A+Q137E+R156Y+G200P+A224P+N331F;
Q68H+T92V+K118A+K129A+Q137E+R156Y+G200P+N331F;
Q68H+T92V+K118A+K129A+Q137E+R156Y+H193T;
Q68H+T92V+K118A+K129A+Q137E+R156Y+H193T+D366H;
Q68H+T92V+K118A+K129A+Q137E+R156Y+H193T+G200P+M310V+E446K;
Q68H+T92V+K118A+K129A+Q137E+R156Y+H193T+N331H,K,Q;
Q68H+T92V+K118A+K129A+R156Y+H193T;
Q68H+T92V+K118A+K129A+R156Y+H193T+D366H;
Q68H+T92V+K118A+K129A+R156Y+H193T+G200P+M310V;
Q68H+T92V+K118A+Q137E+N140F+R156Y+G200P+K470T;
Q68H+T92V+K118A+Q137E+R156Y+G200P+D324N;
Q68H+T92V+K118A+Q137E+R156Y+G200P+K470T;
Q68H+T92V+K118A+Q137E+R156Y+G200P+M310L;
Q68H+T92V+K118A+Q137E+R156Y+G200P+N331F;
Q68H+T92V+K118A,R+R156Y,F;
Q68H+T92V+K118A+S123P,T+K129A+Q137E+R156Y+G200P+N331F;
Q68H+T92V+K118R+R156Y+H193T+D366H;
Q68H+T92V+R156F+G200P+M310V+S484C;
Q68H+T92V+R156F,V,Y+G200P+M310V;
Q68H+T92V+R156F,V,Y+G200P+M310V+N331F;
Q68H+T92V+R156F,Y+H193T;
Q68H+T92V+R156F,Y+H193T+D366H;
Q68H+T92V+R156F,Y+H193T+G200P+M310V;
Q68H+T92V+R156Y;
S76E,I,K,M,R,T,V,W;
S76W+G200P;
S76W+G200P+A224P;
G78A+K118A++K129A+R156Y;
G78A+K118A+K129A+R156Y;
G78A+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F;
G78A+K118A+K129A+R156Y+K169A;
G78A,N,S;
G78A+T92V+K118A+K129A+R156Y;
G78A+T92V+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F;
G78A+T92V+K118A+K129A+R156Y+K169A;
L80V;
A83D,E,H,I,L,N,R,S,T,Y;
K87Q;
K87V+K129A+K169A;
T92I,V;
T92V+K118A+K129A+Q137E+R156Y+G200P+N331F;
T92V+K118A+K129A+R156Y;
T92V+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F;
T92V+K118A+K129A+R156Y+H164N+G200P+N331F;
T92V+K129A+R156Y;
K101A+K129A;
K101R;
K101R+L102I;
T104A+P111Q+A117S+K129A+R156Y;
P111Q;
K118A+K129A;
K118A+K129A+F146L+R156Y+G200P+N331F;
K118A+K129A+Q137E+R156Y+G200P+N331F;
K118A+K129A+R156Y;
K118A+K129A+R156Y+A224P;
K118A+K129A+R156Y+G200P;
K118A+K129A+R156Y+G200P+M310V+N331F;
K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F;
K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F+N399I;
K118A+K129A+R156Y+K169A+G200P+N331F;
K118A+K129A+R156Y+K470T;
K118A,R;
K118A+R156Y;
K118A+R156Y+G200P;
D119L;
G120A;
S123P,T;
S123T+K129A+R156Y;
K129A,F,I,K,R,S,T;
K129A+K169A;
K129A+K176P;
K129A+K275Q;
K129A+K445S;
K129A+K470T;
K129A+Q137E+R156Y;
K129A+Q137E+R156Y+G200P;
K129A+Q137E+R156Y+K470T;
K129A+Q137E+V139K+N140F+Q147S+R156Y;
K129A+R156Y;
K129A+R156Y+A177T+V179I+A183S;
K129A+R156Y+A328G;
K129A+R156Y+D247G;
K129A+R156Y+D249G,N,S;
K129A+R156Y+D303I,K,S,V;
K129A+R156Y+D324N;
K129A+R156Y+D366H+T374A;
K129A+R156Y+D461N,Q,T;
K129A+R156Y+E288Q;
K129A+R156Y+G200P;
K129A+R156Y+G200P+G204T+R211K;
K129A+R156Y+H164N;
K129A+R156Y+H436Y;
K129A+R156Y+I10V+V14I+D19E;
K129A+R156Y+I222V+A224P+V228I+V232A;
K129A+R156Y+K176P,S;
K129A+R156Y+K275T;
K129A+R156Y+K322I+K454Q;
K129A+R156Y+K406N+N415G;
K129A+R156Y+K454Q;
K129A+R156Y+L380F+N383Y+D384G+N389T;
K129A+R156Y+N298F+E299N+G301T;
K129A+R156Y+N302K+D303L,S;
K129A+R156Y+N331F;
K129A+R156Y+P507A;
K129A+R156Y+R267H;
K129A+R156Y+R409L,T;
K129A+R156Y+S443D+K445S+L449I+V450I+S455N+M456Y;
K129A+R156Y+T244D;
K129A+R156Y+V159M+H164N+F165Y;
K129A+R156Y+V259I+R267K+L268K+S269A;
Q137D,E;
N140F;
K142A,Q,R;
F146C+H164C;
F146K,L;
F146L+K322I;
L148K+N168D;
Q149E;
R156A,D,E,F,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y;
R156Y+N331F;
V159M;
H164A,N;
L166I;
N168D;
K169A,Q,R;
K176P;
A177E,T;
K180R;
H193A,D,S,T;
R197A,L;
H199A;
G200A,C,D,E,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y;
G200P+A224P;
K202N,Q,R;
S214E;
K217A;
A221K;
G225S;
V232A;
G237A,S,V;
K240A,Q,R;
K252A,Q,R;
G253A;
R267A;
L268I;
K275A,Q,R;
L278I;
F281L;
M290R;
R295A;
K306A,R;
K307Q;
M310I,L,V;
M310V+N399I;
R314A;
G316I;
K322A,R;
D324N;
N331A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,P,Q,R,S,T,V,W,Y;
S332M,P;
S332P+V397I;
R340A,N,T;
K342A;
V345I;
K347A,Q,R;
D348G;
K353Q,R;
D366H;
M373Q;
T374A;
L380F;
K382A;
N383Y;
N389A,F,N,V;
W391V;
K392G,Q;
D395G;
G396P;
V397S;
N399I;
K406N;
G413A,S;
K414A;
N415S;
T417K;
F418I;
V431E;
H436A;
N441G+A442E+S443D;
S443E,K,Q;
K445A,R,S;
K445C+K470C;
H448A;
K454R;
S467R+G468S+A469T;
G468S,Y;
K470P,R,T;
I473T;
K476Q;
K482A,Q,R;
K488A,Q,R,T;
A490R;
G498A,D,S;
R500A,T,V;
H512A;
T517A+G518D; или
G518D;
В одном из аспектов изобретения, общее число аминокислотных модификаций в вариантах согласно изобретению составляет, предпочтительно, 55, более предпочтительно, 52, еще более предпочтительно, 50, еще более предпочтительно, 40, еще более предпочтительно, 30, еще более предпочтительно, 20, еще более предпочтительно, 15, еще более предпочтительно, десять, еще более предпочтительно, девять, еще более предпочтительно, восемь, еще более предпочтительно, семь, еще более предпочтительно, шесть, еще более предпочтительно, пять, еще более предпочтительно, четыре, еще более предпочтительно, три, еще более предпочтительно две модификации, а наиболее предпочтительно, одну модификацию. В другом аспекте изобретения, общее число модификаций составляет одну, предпочтительно, две, более предпочтительно, три, еще более предпочтительно, четыре, еще более предпочтительно, пять, еще более предпочтительно, шесть, еще более предпочтительно, семь, еще более предпочтительно, восемь, еще более предпочтительно, девять, а наиболее предпочтительно, десять модификаций. Модификация может присутствовать в форме i) инсерции аминокислоты, которую вводят ниже аминокислоты, занимающей данное положение; ii) делеции аминокислоты, занимающей данное положение, или iii) замены аминокислоты, занимащей данное положение, другой аминокислотой. Эти модификации могут быть внесены независимо друг от друга; так, например, в отличие от родительской ксилоглюканазы, в этих вариантах, в одном положении может присутствовать инсерция, во втором положении - замена, а в третьем положении - делеция. В предпочтительном варианте изобретения, указанный вариант содержит только замены.
В одном из аспектов изобретения, мутируемые положения идентифицируют с помощью анализа консенсусной последовательности. Этот анализ осуществляют путем выравнивания последовательности SEQ ID NO: 3 с SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 7, а также с другими последовательностями, взятыми из базы данных Uniprot, которые на 30% идентичны области последовательностей SEQ ID NO: 3 ферментов, принадлежащих к семейству, состоящему из 44 гликозилгидролаз. Полученные консенсусные последовательности представлены на фиг.1. Консенсусной последовательностью 1 является последовательность, включающая аминокислоту, наиболее часто встречающуюся в данном положении, как было определено путем выравнивания, а консенсусной последовательностью 2 является последовательность, включающая 2-ю аминокислоту, наиболее часто встречающуюся в данном положении, и т.п. В одном из аспектов изобретения, один или более (несколько) остатков SEQ ID NO: 3 заменены соответствующим остатком консенсусной последовательности 1 или консенсусной последовательности 2, или консенсусной последовательности 3, или консенсусной последовательности 4. В одном из аспектов изобретения, указанные варианты содержат модификацию в одном или более (нескольких) положениях, выбранных из группы, состоящей из 52 положений, идентифицированных с помощью анализа консенсусной последовательности и состоящих из положений 10, 19, 68, 80, 89, 104, 111, 117, 123, 129, 137, 139, 140, 147, 156, 159, 164, 165, 177, 179, 183, 200, 204, 211, 222, 224, 225, 228, 232, 259, 267, 268, 269, 281, 328, 345, 366, 374, 380, 383, 384, 406, 415, 436, 443, 445, 449, 450, 455, 456, 488 и 507. В предпочтительном варианте изобретения, указанной модификацией является замена или несколько замен, выбранных из группы, состоящей из: I10V, D19E, Q68H, L80V, G89A, T104A, P111Q, A117S, S123P, K129T, Q137E, V139K, N140F, Q147S, R156Y, V159M, H164N, F165Y, A177T, V179I, A183S, G200P, G204T, R211K, I222V, A224P, G225S, V228I, V232A, V259I, R267K, L268K, S269A, F281L, A328G, V345I, D366H, T374A, L380F, N383Y, D384G, K406N, N415G, H436Y, S443D, K445S, L449I, V450I, S455N, M456Y, K488T и P507A.
В другом аспекте изобретения, указанный вариант получают из родительского пептида путем замены аминокислот, имеющих положительные заряды и расположенных в пределах 20 Å от иона кальция, на нейтрально заряженные или отрицательно заряженные аминокислоты. Предпочтительными вариантами согласно изобретению являются варианты, в которых суммарный заряд в пределах 20 Å от иона кальция имеет высокое отрицательное значение. В таких вариантах, положительно заряженные аминокислоты могут быть заменены аминокислотами с нейтральным или отрицательным зарядом в зависимости от условий их применения. В соответствии с этим, предпочтительные варианты могут иметь аминокислотный остаток, который является частично или полностью положительно заряженным в зависимости от «химической стабильности» или от условий их применения, то есть остаток Lys, Arg или His может быть заменен отрицательно заряженной или нейтральной аминокислотой. Предпочтительными замененными аминокислотами могут быть отрицательно заряженные аминокислоты, такие как Asp и Glu, или нейтральные аминокислоты, такие как Ala, Asn, Gln, Tyr, Trp и Phe. Предпочтительный вариант согласно изобретению содержит модификацию в одном или нескольких положениях, выбранных из группы, состоящей из положений 49, 87, 118, 129, 134, 142, 156, 169 и 197. В предпочтительном варианте изобретения указанными модификациями являются замены в одном или нескольких положениях, выбранных из группы, состоящей из положений 87, 118, 129, 134, 142, 156 и 169. В предпочтительном варианте изобретения, указанная замена выбрана из группы, состоящей из K87A; K129A,S,F,I; K118A; K142A,Q, R156Y,F,V,I,K,W,L,M и K169Q,A.
В одном из аспектов изобретения, вариант родительской ксилоглюканазы содержит модификацию в одном или более (нескольких) положениях, соответствующих положениям 68, или 123, или 156, или 118, или 200, или 129, или 137, или 193, или 92, или 76, или 331. Предпочтительный вариант имеет замену в положении 68 и одну или несколько замен в одном или нескольких дополнительных положениях, выбранных из группы, состоящей из положений 123, 156, 118, 200, 129, 137, 193, 92, 83, 149, 34, 340, 332, 9, 76, 331, 310, 324, 498, 395 и 366.
В другом аспекте изобретения, вариант имеет замену в положении 156 и одну или несколько замен в одном или нескольких дополнительных положениях, выбранных из группы, состоящей из положений 10, 13, 14, 19, 37, 68, 78, 92, 118, 123, 129, 137, 139, 140, 147, 159, 164, 165, 169, 176, 177, 179, 183, 200, 204, 211, 222, 224, 244, 247, 249, 259, 267, 268, 269, 275, 288, 299, 301, 302, 303, 310, 324, 328, 331, 366, 380, 383, 384, 389, 406, 409, 415, 436, 443, 445, 449, 450, 454, 455, 456, 461, 470 и 507.
В другом аспекте изобретения, вариант родительской ксилоглюканазы включает модификации в двух или более (нескольких) положениях, соответствующих положениям 68, или 123, или 156, или 118, или 200, или 129, или 137, или 193, или 92, или 76, или 331. Предпочтительный вариант имеет замену в положении 68, или 123, или 156, или 118, или 200, или 129. Еще более предпочтительный вариант имеет замены в положениях 129 и 156.
В другом аспекте изобретения, вариант родительской ксилоглюканазы имеет модификации в трех или более (нескольких) положениях, соответствующих положениям 68, или 123, или 156, или 118, или 200, или 129, или 137, или 193, или 92, или 76, или 331.
В другом аспекте изобретения, вариант родительской ксилоглюканазы имеет модификации в четырех или более (нескольких) положениях, соответствующих положениям 68, или 123, или 156, или 118, или 200, или 129, или 137, или 193, или 92, или 76, или 331.
В другом аспекте изобретения, вариант родительской ксилоглюканазы имеет модификации в пяти или более (нескольких) положениях, соответствующих положениям 68 или 123, или 156, или 118, или 200, или 129, или 137, или 193, или 92, или 76, или 331.
В другом аспекте изобретения, вариант родительской ксилоглюканазы имеет модификации в шести или более (нескольких) положениях, соответствующих положениям 68, или 123, или 156, или 118, или 200, или 129, или 137, или 193, или 92. или 76, или 331.
В другом аспекте изобретения, вариант родительской ксилоглюканазы имеет модификации в семи или более (нескольких) положениях, соответствующих положениям 68 или 123, или 156, или 118, или 200, или 129, или 137, или 193, или 92, или 76, или 331.
В другом аспекте изобретения, вариант родительской ксилоглюканазы имеет модификации в положениях, соответствующих положениям 129, и 156, и 331, и 200, и 118.
В другом аспекте изобретения, вариант родительской ксилоглюканазы имеет модификации в положениях, соответствующих положениям 68, и 129, и 156, и 331, и 200, и 118.
В другом аспекте изобретения, вариант родительской ксилоглюканазы имеет модификации в положениях, соответствующих положениям 68, и 92, и 129, и 156, и 331, и 200, и 118.
В другом аспекте изобретения, вариант содержит одну или более (несколько) замен, выбранных из группы, состоящей из Q68H,N,L; S123P,T; R156Y,F,V,I,K,W,L,M; K118A,R; G200P,E,S,D; K129T,A,S; Q137E; H193T,S,D; T92V,I,A,S; A83E; Q149E; L34F,I,V; R340T,N; S332P; T9D; S76W,V,I,K,R,T; N331F,C; M310I,V,L; D324N; G498A,D; D395G и D366H. Предпочтительные замены выбраны из группы, состоящей из Q68H; S123P; R156Y,F; K118A; G200P,E; K129T,A; Q137E; H193T; T92V и N331F. Более предпочтительные замены выбраны из группы, состоящей из Q68H; S123P; R156Y,F; K118A; G200P,E; K129T,A; Q137E; T92V и N331F. Более предпочтительно, указанный вариант содержит замену в девяти или восьми, в семи, или в шести, или в пяти, или в четырех, или в трех, или в двух, или в одном положении, где указанные замены выбраны из группы, состоящей из Q68H; S123P; R156Y,F; K118A; G200P,E; K129T,A; Q137E; T92V и N331F.
В другом аспекте изобретения, вариант содержит одну или более (несколько) нижеследующих комбинаций замен:
Q68H;
S123P;
R156Y;
Q68H+R156Y;
K129A+R156Y;
S123T+K129A+R156Y;
K129A+R156Y+G200P;
Q68H+K118R+R156F;
Q68H+R156Y+H193T;
Q68H+R156F+G200P+N331F;
Q68H+T92V+K118A+R156Y;
K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F;
G78A+T92V+K118A+K129A+R156Y;
Q68H+K129T+R156K+G200P+N331F;
K118A+K129A+R156Y+K169A+G200P+N331F;
T92V+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F;
G78A+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F;
G78A+T92V+K118A+K129A+R156Y+K169A;
Q68H+T92V+Q137E+R156Y+G200P+N331F;
Q68H+T92V+K118A+Q137E+R156Y+N331F;
Q68H+T92V+R156Y+G200P+M310V+N331F;
Q68H+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F;
Q68H+T92V+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F;
Q68H+T92V+K118A+Q137E+R156Y+G200P+N331F;
Q68H+T92V+K118A+K129A+R156Y+H193T+D366H;
Q68H+T92V+K118A+K129A+Q137E+R156Y+H193T+D366H;
Q68H+T92V+K118A+K129A+Q137E+R156Y+G200P+N331F;
Q68H+T92V+K118A+S123P,T+K129A+Q137E+R156Y+G200P+N331F; или
Q68H+T92V+K118A+K129A+Q137E+R156Y+G200P+A224P+N331F;
В предпочтительном варианте изобретения, все варианты, описанные выше, представляют собой варианты родительской ксилоглюканазы, принадлежащей к семейству из 44 гликозилгидролаз, где более предпочтительная родительская ксилоглюканаза выбрана из ксилоглюканазы, имеющей последовательность, которая по меньшей мере на 65%, более предпочтительно, по меньшей мере на 70%, более предпочтительно, по меньшей мере на 75%, еще более предпочтительно, по меньшей мере на 80%, еще более предпочтительно, по меньшей мере на 85%, еще более предпочтительно, по меньшей мере на 90%, а наиболее предпочтительно, по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:3, при этом более предпочтительная родительская ксилоглюканаза выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 7, а наиболее предпочтительная родительская ксилоглюканаза состоит из SEQ ID NO: 3.
Полинуклеотиды
Настоящее изобретение также относится к выделенным полинуклеотидам, кодирующим варианты родительской ксилоглюканазы согласно изобретению. В частности, полинуклеотиды, кодирующие вариант ксилоглюканазы, описаны выше в разделе «Вариант» и входят в объем настоящего изобретения. Полинуклеотиды согласно изобретению гибридизуются с денатурированным двухцепочечным ДНК-зондом, содержащим полноразмерную последовательность варианта, соответствующую положениям 82-1653 SEQ ID NO: 1 или положениям 97-1653 SEQ ID NO: 1, где нужные модификации последовательности соответствуют фактическим аминокислотным модификациям в данном варианте или в любом зонде, включающем подпоследовательность варианта, имеющую длину по меньшей мере примерно 100 пар оснований, по меньшей мере в условиях умеренной жесткости, а предпочтительно, в условиях высокой жесткости. Вариант полинуклеотидов согласно изобретению может также содержать молчащие мутации, а также мутации, приводящие к образованию аминокислотных модификаций, описанных выше в разделе «Вариант». Молчащими мутациями являются мутации в кодоне, которые не приводят к замене аминокислоты, например, при замене кодона GTT на кодон GAT, которые оба кодируют валин.
Полинуклеотиды, кодирующие варианты ксилоглюканазы согласно изобретению, включают ДНК и РНК. Методы выделения ДНК и РНК хорошо известны специалистам. ДНК и РНК, имеющие представляющие интерес гены, могут быть клонированы в банках генов или в библиотеках ДНК методами, известными специалистам. Затем полинуклеотиды, кодирующие полипептиды, обладающие ксилоглюканазной активностью согласно изобретению, идентифицируют и выделяют, например, путем гибридизации или с помощью ПЦР.
Экспрессионные векторы
Настоящее изобретение также относится к экспрессионным векторам, а, в частности к рекомбинантным экспрессионным векторам, содержащим конструкцию нуклеиновой кислоты согласно изобретению. Конструкции нуклеиновой кислоты согласно изобретению включают выделенный полинуклеотид, кодирующий вариант ксилоглюканазы согласно изобретению, предпочтительно, функционально связанный с одной или несколькими регуляторными последовательностями, которые регулируют экспрессию кодирующей последовательности в подходящей клетке-хозяине в условиях, подходящих для таких регуляторных последовательностей. При создании экспрессионного вектора кодирующая последовательность должна быть расположена в векторе так, чтобы она была функционально связана с соответствующими регуляторными последовательностями для экспрессии. Регуляторные последовательности могут присутствовать либо в векторах, либо в конструкциях нуклеиновой кислоты, встроенных в данный вектор.
Регуляторной последовательностью может быть соответствующая промоторная последовательность, то есть нуклеотидная последовательность, распознаваемая клеткой-хозяином, экспрессирующей полинуклеотид, кодирующий полипептид согласно изобретению. Промотором может быть любая нуклеотидная последовательность, обладающая транскрипционной активностью в выбранной клетке-хозяине, включая мутантные, усеченные и гибридные промоторы, и такой промотор может быть получен из генов, кодирующих внеклеточные или внутриклеточные полипептиды, которые являются либо гомологичными, либо гетерологичными для данной клетки-хозяина. Такие промоторы хорошо известны специалистам. Регуляторной последовательностью может быть также подходящая последовательность терминации транскрипции, то есть последовательность, распознаваемая клеткой-хозяином для терминации транскрипции. Последовательность терминации транскрипции функционально связана с 3'-концом нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид. В настоящем изобретении может быть использован любой терминатор, который является функциональным в выбранной клетке-хозяине, и такие терминаторы хорошо известны специалистам. Регуляторной последовательностью может быть также подходящая лидерная последовательность, то есть нетранслируемая область мРНК, которая играет важную роль в трансляции последовательности в клетке-хозяине. Лидерная последовательность функционально связана с 5'-концом нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид. В настоящем изобретении может быть использована любая лидерная последовательность, которая является функциональной в выбранной клетке-хозяине, и такие лидерные последовательности хорошо известны специалистам. Регуляторной последовательностью может быть также область, кодирующая сигнальный пептид, где указанная область кодирует аминокислотную последовательность, присоединенную к аминоконцу полипептида, и направляет кодируемый полипептид по клеточному секреторному пути. 5'-конец кодирующей нуклеотидной последовательности, по своей природе, может содержать область, кодирующую сигнальный пептид и обычно присоединенную, в транслируемой открытой рамке считывания, к сегменту области, кодирующей секретируемый полипептид. Альтернативно, 5'-конец кодирующей последовательности может содержать область, кодирующую сигнальный пептид, которая является чужеродной для кодирующей последовательности. Такая чужеродная область, кодирующая сигнальный пептид, может быть необходимой в том случае, когда кодирующая последовательность, по своей природе, не содержит область, кодирующую сигнальный пептид. Альтернативно, чужеродная область, кодирующая сигнальный пептид, может быть просто заменена природной областью, кодирующей сигнальный пептид, что будет приводить к повышению уровня секреции полипептида. Однако в настоящем изобретении может быть использована любая область, кодирующая сигнальный пептид, которая будет направлять экспрессируемый полипептид по секреторному пути выбранной клетки-хозяина. Регуляторной последовательностью может быть также последовательность полиаденилирования, которая функционально связана с 3'-концом нуклеотидной последовательности, и которая, при ее транскрипции, будет распознаваться клеткой-хозяином как сигнал к присоединению полиаденозиновых остатков к транскрибируемой мРНК. В настоящем изобретении может быть использована любая последовательность полиаденилирования, которая является функциональной в выбранной клетке-хозяине. Может также оказаться желательным присоединение регуляторных последовательностей, которые осуществляют регуляцию экспрессии полипептида, ассоциированного с ростом клетки-хозяина. Примерами регуляторных систем являются системы, индуцирующие экспрессию гена, включающегося или выключающегося в ответ на действие химических или физических факторов, включая присутствие регуляторного соединения.
Выделенный полинуклеотид, кодирующий вариант ксилоглюканазы согласно изобретению, может быть модифицирован различными способами для сообщения ему способности экспрессировать данный полипептид. Модификация полинуклеотидной последовательности перед ее встраиванием в вектор может оказаться желательной или необходимой в зависимости от экспрессионного вектора. Методы модификации полинуклеотидных последовательностей с применением техники рекомбинантных ДНК хорошо известны специалистам. Кроме того, к данному полипептиду могут быть присоединены метки, которые могут облегчать очистку или иммобилизацию полипептида. Такой меткой может быть, например, полигистидиновая метка (His-метка). Предпочтительно, эта метка расположена у N- или C-конца полипептида и может кодироваться вектором. Альтернативно, данная метка может быть расположена внутри полипептида при условии, что она не будет влиять на функциональные свойства полипептида.
Рекомбинантным экспрессионным вектором может быть любой вектор (например, плазмида, фагмида, фаг или вирус), который может быть подвергнут стандартным процедурам в соответствии с техникой рекомбинантных ДНК и может индуцировать экспрессию нуклеотидной последовательности. Выбор вектора обычно зависит от совместимости данного вектора с клеткой-хозяином, в которую встраивают данный вектор.
Векторами могут быть линейные или замкнутые кольцевые плазмиды. Таким вектором может быть автономно реплицирующийся вектор, то есть вектор, присутствующий во внехромосомной молекуле, репликация которой не зависит от хромосомной репликации, например, в плазмиде, во внехромосомном элементе, в минихромосоме или в искусственной хромосоме.
Вектор может содержать любые элементы, обеспечивающие саморепликацию. Альтернативно, вектором может быть такой вектор, который, при его встраивании в клетку-хозяина, интегрируется в геном клетки-хозяина и реплицируется вместе с хромосомой(ами), в которую(ые) он интегрирован. Кроме того, могут быть использованы один вектор или одна плазмида, либо два или более векторов, или две или более плазмид, которые имеют общую ДНК, встраиваемую в геном клетки-хозяина или транспозон.
dal
Bacillus subtilis
Bacillus licheniformis
amdS
argB
bar
hygB
niaD
pyrG
sC
trpC
Aspergillus
amdS
pyrG
Aspergillus nidulans
Aspergillus oryzae
bar
Streptomyces hygroscopicus
Векторы согласно изобретению, предпочтительно, содержат один или несколько селективных маркеров, облегчающих отбор трансформированных клеток. Селективный маркер представляет собой ген, продукт которого сообщает резистентность к биоцидам или вирусам, резистентность к тяжелым металлам, прототрофам или ауксотрофам и т.п. Примерами бактериальных селективных маркеров являются гены , происходящие от  или , или маркеры, сообщающие резистентность к антибиотикам, таким как ампициллин, канамицин, хлорамфеникол или тетрациклин. Подходящими маркерами для дрожжевых клеток-хозяев являются ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1 и URA3. Селективными маркерами, используемыми в клетках-хозяевах нитчатых грибов, являются, но не ограничиваются ими,  (ацетамидаза),  (орнитин-карбамоилтрансфераза),  (фосфинотрицин-ацетилтрансфераза),  (гигромицинфосфотрансфераза),  (нитратредуктаза),  (оротидин-5'-фосфатдекарбоксилаза),  (сульфат-аденилтрансфераза),  (антранилатсинтаза), а также их эквиваленты. Генами, предпочтительными для использования в клетках , являются гены  и  или , и ген .
Векторы согласно изобретению могут содержать элемент(ы), позволяющий(ие) осуществлять стабильную интеграцию вектора в геном клетки-хозяина или автономную репликацию вектора в клетке независимо от генома.
Для повышения уровня продуцирования генного продукта, в клетку-хозяина могут быть встроены более чем одна копия нуклеотидной последовательности согласно изобретению. Увеличение числа копий нуклеотидной последовательности может быть достигнуто путем интергации по меньшей мере одной дополнительной копии последовательности в геном клетки-хозяина или путем включения амплифицируемого селективного маркерного гена с указанной нуклеотидной последовательностью, где клетки, содержащие амплифицированные копии селективного маркерного гена и, тем самым, дополнительные копии нуклеотидной последовательности, могут быть отобраны путем их культивирования в присутствии соответствующего селективного агента.
Методы, применяемые для лигирования описанных выше элементов в целях конструирования рекомбинантных экспрессионных векторов согласно изобретению, хорошо известны специалистам в данной области (см., например, Sambrook et al., 1989, см. выше).
В одном из вариантов изобретения, плазмидный вектор может содержать следующие элементы:
Bacillus
Bacillus stearothermophilus
Bacillus licheniformis
Bacillus licheniformis
Bacillus stearothermophilus
Bacillus subtilis
i) область, кодирующую сигнальный пептид (например, область, полученную от генов мальтогенной амилазы штамма NCIB 11837 , альфа-амилазы , субтилизина , альфа-амилазы , нейтральной протеазы  (nprT, nprS, nprM), и prsA ), за которой следует полинуклеотидная последовательность, кодирующая зрелый вариант ксилоглюканазы. За указанной последовательностью могут следовать функционально связанные с ней элементы:
Cryllla
ii) последовательность ДНК, включающую мРНК-стабилизирующй сегмент (например, происходящий от гена , как указано в заявке WO 99/043835);
iii) маркерный ген (например, ген резистентности к хлорамфениколу); и
Bacillus subtilis
Bacillus
iv) геномная ДНК от  в виде 5'- и 3'-фланкирующих сегментов, расположенных выше и ниже указанного полинуклеотида соответственно, что позволяет осуществлять геномную интеграцию посредством гомологичной рекомбинации между фланкирующими сегментами и геномом .
Описанные выше векторы могут быть использованы для получения и скрининга вариантов с применением вышеописанных методов мутагенеза.
Клетки-хозяева
Настоящее изобретение также относится к рекомбинантным клеткам-хозяевам, содержащим полинуклеотид, кодирующий вариант ксилоглюканазы согласно изобретению, который преимущественно используется при рекомбинантном продуцировании полипептидов. Вектор, включающий полинуклеотидную последовательность согласно изобретению, вводят в клетки-хозяева так, чтобы указанный вектор присутствовал в виде хромосомного интегранта, либо в виде самореплицирующегося внехромосомного вектора, описанного выше.
Указанной клеткой-хозяином могут быть прокариотические клетки, такие как бактериальные клетки, архебактерии или эукариотические клетки, такие как клетки грибов, клетки растений, клетки насекомых или клетки млекопитающих.
Bacillus
Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus halodurans, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis
Bacillus thuringiensis;
Streptomyces
Streptomyces lividans
Streptomyces murinus
E.coli
Pseudomonas
Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus
Bacillus subtilis
Bacillus
Bacillus
Используемыми прокариотами являются клетки бактерий, такие как клетки грамположительных бактерий, включая, но не ограничиваясь ими, клетки , например,  и или клетки , например  или , либо клетки грамотрицательных бактерий, такие как клетки  и  sp. В предпочтительном варианте изобретения, бактериальной клеткой-хозяином является клетка или. В другом предпочтительном варианте изобретения, клеткой  является клетка алкалофильной .
Molecular General Genetics
Journal of Bacteriology
, Journal of Molecular Biology
Biotechniques
Journal of Bacteriology
Введение вектора в бактериальную клетку-хозяина может быть осуществлено, например, путем трансформации протопластов (см., например, Chang and Cohen, 1979,  168: 111-115), с использованием компетентных клеток (см., например, Young and Spizizin, 1961,  81: 823-829, или Dubnau and Davidoff-Abelson, 1971 56: 209-221), путем электропорации (см., например, Shigekawa and Dower, 1988,  6: 742-751), или путем конъюгирования (см., например, Koehler and Thome, 1987,  169: 5771-5278).
Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota
Zygomycota
Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi
Oomycota
Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi
Biology and Activities of Yeast
Soc. App. Bacteriol. Symposium Series
В предпочтительном варианте изобретения, клеткой-хозяином является клетка грибов. Используемый здесь термин «грибы» включает грибы типа и (определенные в публикации Hawksworth et al., , 8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK), а также  (упоминаемые в публикации Hawksworth et al., , 8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK, page 171) и все митоспоровые грибы (Hawksworth et al., In, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK). В более предпочтительном варианте изобретения, грибковой клеткой-хозяином является дрожжевая клетка. Используемый здесь термин «дрожжи» включает аскоспорогенные дрожжи (Endomycetales), базидиоспорогенные дрожжи и дрожжи, принадлежащие к несовершенным грибам (Blastomycetes). Поскольку в будущем классификация дрожжей может изменяться, то в соответствии с настоящим изобретением, дрожжи должны быть определены как описано в публикации  (Skinner, Passmore and Davenport, eds,  N9, 1980).
Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces
Yarrowia
Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis
Saccharomyces oviformis
Kluyveromyces lactis
Yarrowia lipolytica
В еще более предпочтительном варианте изобретения, дрожжевой клеткой-хозяином является клетка или. В наиболее предпочтительном варианте изобретения, дрожжевой клеткой-хозяином является клетка  или . В другом наиболее предпочтительном варианте изобретения, дрожжевой клеткой-хозяином является клетка . В другом наиболее предпочтительном варианте изобретения, дрожжевой клеткой-хозяином является клетка .
Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi
Saccharomyces cerevisiae
Acremonium, Aspergillus, Fusarium, Humicola, Mucor, Myceliophthora, Neurospora, Penicillium, Thielavia, Tolypocladium
Trichoderma.
Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger
Aspergillus oryzae
Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides
Fusarium venenatum
Fusarium venenatum
Nirenberg
Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Thielavia terrestris, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei
Trichoderma viride
В другом более предпочтительном варианте изобретения, грибковой клеткой-хозяином является клетка нитчатых грибов. Термин «нитчатые грибы» включает все формы нитчатых грибов подразделения Eumycota и Oomycota (определенного Hawksworth et ai, в , 8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK). Нитчатые грибы характеризуются тем, что стенки их мицелия состоят из хитина, целлюлозы, глюкана, хитозана, маннана и других комплексных полисахаридов. Вегетативный рост происходит за счет удлинения гифов, а катаболизм углерода является облигатно аэробным. В противоположность этому, вегетативный рост дрожжей, таких как , происходит за счет почкования одноклеточного таллома, а катаболизм углерода может быть ферментативным. В еще более предпочтительном варианте изобретения, клеткой-хозяином нитчатых грибов является клетка грибов, принадлежащих к виду, который включает, но не ограничивается ими, илиВ наиболее предпочтительном варианте изобретения, клеткой-хозяином нитчатых грибов является клетка  или . В другом наиболее предпочтительном варианте изобретения, клеткой-хозяином нитчатых грибов является клетка  или . В наиболее предпочтительном варианте изобретения, родительской клеткой нитчатых грибов является клетка  ( sp. nov.). В другом наиболее предпочтительном варианте изобретения, клеткой-хозяином нитчатых грибов является клетка  или .
per se
Aspergillus
Proceedings of the National Academy of Sciences USA
Fusarium
Gene
Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology
Journal of Bacteriology
Proceedings of the National Academy of Sciences USA
Клетки грибов могут быть трансформированы способом, включающим образование протопластов, трансформацию протопластов и регенерацию клеточной стенки по механизму, известному . Подходящие способы трансформации клеток-хозяев  описаны в EP 238023 и в публикации Yelton et al., 1984,  81:1470-1474. Подходящие методы трансформации вида  описаны в публикации Malardier et al., 1989,  78: 147-156 и в WO 96/00787. Дрожжи могут быть трансформированы методами, описанными Becker and Guarente в издании Abelson and Simon,  194: 182-187, Academic Press, Inc., New York; Ito et al., 1983,  153:163; и Hinnen et ai, 1978,  75: 1920.
Конкретным вариантом настоящего изобретения является рекомбинантная клетка-хозяин, трансформированная полинуклеотидом, кодирующим вариант ксилоглюканазы согласно изобретению. Предпочтительно, такая клетка-хозяин не содержит природного гена, кодирующего ксилоглюканазу, либо такой ген является дезинтегрированным. Поэтому рекомбинантный вариант ксилоглюканазы представляет собой лишь ксилоглюканазу, продуцированную рекомбинантной клеткой-хозяином согласно изобретению.
Способы получения
Настоящее изобретение также относится к способам получения варианта ксилоглюканазы, включающим: (a) культивирование клетки-хозяина согласно изобретению в условиях, подходящих для экспрессии данного варианта; и (b) выделение данного варианта из культуральной среды.
В способах получения согласно изобретению, клетки-хозяева культивируют в питательной среде, подходящей для продуцирования варианта ксилоглюканазы с применением методов, известных специалистам. Так, например, клетки могут быть выращены путем культивирования в шейкерных колбах или путем лабораторной или крупномасштабной ферментации (включая, непрерывную ферментацию, периодическую ферментацию, периодическую ферментацию с подпиткой или объемную ферментацию) в лабораторных или в промышленных ферментерах, осуществляемой в подходящей среде и в условиях, обеспечивающих экспрессию и/или выделение данного полипептида. Культивирование проводят в подходящей питательной среде, содержащей углерод, источники азота и неорганические соли, в соответствии с процедурами, известными специалистам. Подходящие среды закупают у коммерческих поставщиков, либо они могут быть получены в соответствии с известной рецептурой (имеющейся, например, в каталогах Американской коллекции типовых культур). Если полипептид секретируется в питательную среду, то такой полипептид может быть непосредственно выделен из этой среды. Если данный полипептид не секретируется в среду, то он может быть выделен из клеточных лизатов.
Одним из вариантов настоящего изобретения является способ получения варианта родительской ксилоглюканазы, где указанный вариант обладает ксилоглюканазной активностью, и где указанный способ включает: a) культивирование клеток в условиях, подходящих для экспрессии данного варианта, где указанные клетки содержат полинуклеотидную последовательность, кодирующую вариант родительской ксилоглюканазы, где указанный вариант модифицирован в одном или более (нескольких) положениях аминокислот, выбранных из группы, состоящей из положений 68, 123, 156, 118, 200, 129, 137, 193, 92, 83, 149, 34, 340, 332, 9, 76, 331, 310, 324, 498, 395, 366, 1, 374, 7, 140, 8, 14, 21, 211, 37, 45, 13, 78, 87, 436, 101, 104, 111, 306, 117, 119, 414, 139, 268, 142, 159, 164, 102, 168, 176, 180, 482, 183, 202, 206, 217, 4, 222, 19, 224, 228, 232, 2, 240, 244, 5, 247, 249, 328, 252, 259, 406, 267, 269, 275, 179, 166, 278, 281, 288, 298, 301, 18, 302, 165, 80, 303, 316, 169, 322, 120, 146, 342, 348, 147, 353, 380, 468, 382, 383, 38, 384, 389, 391, 10, 392, 396, 177, 397, 399, 409, 237, 413, 253, 415, 418, 40, 443, 445, 148, 449, 225, 450, 454, 3, 455, 456, 299, 461, 470, 204, 476, 488, 347 и 507, и где указанную полинуклеотидную последовательность получают путем мутагенеза родительской полинуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 6, или родительской полинуклеотидной последовательности, которая по меньшей мере на 65%, более предпочтительно, по меньшей мере на 70%, более предпочтительно, по меньшей мере на 75%, еще более предпочтительно, по меньшей мере на 80%, еще более предпочтительно, по меньшей мере на 85%, еще более предпочтительно, по меньшей мере на 90%, а наиболее предпочтительно, по меньшей мере на 95% идентична нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1; и b) выделение указанного варианта ксилоглюканазы из культуральной среды.
В альтернативном аспекте изобретения, вариант ксилоглюканазы не выделяют, а в качестве источника данного варианта используют клетку-хозяина согласно изобретению, экспрессирующую такой вариант.
Вариант ксилоглюканазы может быть детектирован известными методами, которые являются специфичными для экспрессируемых полипептидов. Такие методы детектирования могут включать использование специфических антител, оценку образования ферментного продукта или определение исчезновения субстрата фермента. Так, например, ферментный анализ может быть использован для определения активности варианта ксилоглюканазы, описанного в примерах, представленных в настоящей заявке.
Полученный вариант ксилоглюканазы может быть выделен методами, известными специалистам. Так, например, полипептид может быть выделен из питательной среды стандартными методами, включая, но не ограничиваясь ими, сбор, центрифугирование, фильтрацию, экстракцию, сушку распылением, выпаривание или осаждение.
Protein Purification
Вариант ксилоглюканазы согласно изобретению может быть очищен различными методами, известными специалистам, включая, но не ограничиваясь ими, хроматографию (например, ионообменную хроматографию, аффинную хроматографию, гидрофобную хроматографию, хроматофокусирование и эксклюзионную хроматографию), электрофорез (например, препаративное изоэлектрическое фокусирование), дифференциальное растворение (например, преципитацию сульфатом аммония), электрофорез в ДСН-ПААГ или экстракцию (см., например, , J.-C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989) с получением, по существу, чистых вариантов ксилоглюканазы.
Композиции
Настоящее изобретение также относится к композициям, включающим вариант ксилоглюканазы или полипептид, обладающие ксилоглюканазной активностью согласно изобретению. Указанные композиции, предпочтительно, обогащены таким вариантом или полипептидом. Термин «обогащенный» означает, что ксилоглюканазная активность композиции повышается, например, в 1,1 или более раз. Указанные композиции, предпочтительно, приготавливают так, чтобы они обладали желаемыми свойствами, то есть почти не имели окраску, почти не имели запаха и обладали приемлемой стабильностью при хранении.
Указанная композиция может содержать вариант или полипептид согласно изобретению в качестве основного ферментного компонента; так, например, данная композиция может состоять из одного компонента. Альтернативно, такая композиция может обладать ферментативной активностью, например, она может включать аминопептидазу, амилазу, карбогидразу, карбоксипептидазу, каталазу, целлюлазу, хитиназу, кутиназу, циклодекстрин-гликозилтрансферазу, дезоксирибонуклеазу, эстеразу, альфа-галактозидазу, бета-галактозидазу, глюкоамилазу, альфа-глюкозидазу, бета-глюкозидазу, галопероксидазу, инвертазу, лакказу, липазу, маннозидазу, оксидазу, пектинолитический фермент, пептидоглутаминазу, пероксидазу, фитазу, полифенолоксидазу, протеолитический фермент, рибонуклеазу, трансглутаминазу или ксиланазу.
Полипептидные композиции могут быть получены методами, известными специалистам, и могут представлять собой жидкий или сухой препарат. Так, например, полипептид может быть получен в форме гранулята или микрогранулята. Вариант или полипептид, включенные в данную композицию, могут быть стабилизированы методами, известными специалистам. В предпочтительном варианте изобретения вариант ксилоглюканазы получают в виде жидкой композиции.
Применение
Настоящее изобретение также относится к способам применения вариантов ксилоглюканазы.
Варианты ксилоглюканазы, предпочтительно, вводят в моющие композиции и/или используют вместе с моющими композициями, такими как, например, моющие композиции для стирки, например, моющие композиции для стирки в домашних условиях, а, в частности, жидкие моющие композиции для стирки. Моющая композиция обычно содержит стандартные ингредиенты детергентов, такие как поверхностно-активные вещества (анионные, катионные, неионные, цвиттерионные, амфотерные), модифицирующие добавки, отбеливатели, полимеры и другие ферменты и другие ингредиенты, описанные, например, в заявках WO 2007/130562 и WO 2007/149806, которые во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки.
Моющая композиция может быть получена в любой форме, такой как твердое вещество, жидкость, гель или любая их комбинация, при этом предпочтительной композицией является жидкая композиция, а более предпочтительно, жидкая моющая композиция для стирки.
Одним из аспектов изобретения является применение варианта ксилоглюканазы или композиции варианта ксилоглюканазы согласно изобретению вместе с моющей композицией для предотвращения пиллинга ткани, и/или для придания ткани мягкости, и/или для сохранения ее окраски, и/или для удаления пятен, и/или для предупреждения переосаждения загрязнений на ткань, и/или для ингибирования переноса красителя на ткань в целях улучшения качества ткани или одежды.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способу стирки тканей, включающему обработку тканей моющим раствором, содержащим моющую композицию и вариант ксилоглюканазы или композицию варианта ксилоглюканазы согласно изобретению. Такая стирка может быть осуществлена, например, на стиральной машине или вручную. Моющим раствором может быть, например, водный моющий раствор, содержащий моющую композицию и имеющий рН в пределах 3-12.
В процессе стирки и носки, поверхность тканей или одежды загрязняется фрагментами разорванных или разрыхленных волокон, которые придают ткани линялый и изношенный вид. Удаление этих волокон с поверхности ткани позволяет частично сохранить ее первоначальный цвет и вид, придает ей более яркую окраску и улучшает ее внешний вид. Вариант ксилоглюканазы или композиция варианта ксилоглюканазы могут быть использованы для сохранения цвета ткани и/или для улучшения ее внешнего вида при проведении одного цикла или нескольких (повторных) циклов полоскания.
Кроме того, микроволокна, выступающие на поверхность текстильного изделия, могут собираться в небольшие комочки, так называемые пилли или ворсинки, которые прилипают к поверхности ткани и портят ее внешний вид. Вариант ксилоглюканазы или композиция варианта ксилоглюканазы согласно изобретению могут быть использованы для удаления таких комочков (пиллей), то есть для достижения эффекта, который называется предотвращением пиллинга.
Enzymes in Detergency
Сохранение окраски и предотвращение пиллинга могут быть оценены визуально группой специалистов. Эти эффекты могут быть измерены по отражению света или путем определения ворсистости хлопчатобумажной ткани методом оптических измерений. Эти методы, в основном, известны специалистам и кратко описаны в публикации , 1997, опубликованной Marcel Dekker, стр. 139-140.
В частности, с увеличением циклов полоскания, на поверхности текстильного волокна образуется осадок, который может включать пятна грязи, содержащие крупные частицы; растворимые пятна грязи; красители; пигменты и нерастворимые соли. Это может приводить к видимому ухудшению кажущейся чистоты изделия после стирки, например, придавать ткани сероватый или желтоватый оттенок. Для предупреждения этого, в циклах полоскания может быть использован вариант ксилоглюканазы или композиция варианта ксилоглюканазы. Этот эффект называется «предотвращение переосаждения загрязнений на ткань» или «ингибированием переноса красителя на ткань» или «удалением пятен» и может быть оценен методами оптических измерений.
Частички грязи или нерастворимой соли, захватываемые на поверхности ткани и застревающие между волокнами, могут сообщать ткани жесткость. При использовании в циклах стирки вариантов ксилоглюканазы или композиции варианта ксилоглюканазы согласно изобретению можно придать данной ткани большую мягкость.
Ткани, обрабатываемые способами согласно изобретению, могут быть подвергнуты обычной стирке, например стирке в домашних условиях. При этом большинство вещей, пригодных для стирки, представляет собой одежду и ткани, включая вязанные изделия, тканые изделия, изделия из хлопчато-бумажной ткани «деним», изделия из пряжи и полотенечной ткани, изделия, изготовленные из хлопка, из смешанной ткани, включающей хлопковое волокно, или натуральное, или синтетическое целлюлозное волокно (например, полученное из древесной целлюлозы), или их смеси. Примерами смешанных тканей являются смеси хлопчато-бумажной ткани или исскуственного шелка/вискозы с одним или несколькими сопутствующими материалами, такими как шерсть, синтетическое волокно (например, полиамидное волокно, акриловое волокно, полиэфирное волокно, волокно из поливинилового спирта, поливинилхлоридное волокно, полиуретановое волокно, волокно из полимочевины, арамидное волокно) и волокно, содержащее целлюлозу (например, искусственный шелк/вискоза, волокно рами, лен/льняное полотно, джут, волокно из ацетата целлюлозы, лиоцель).
Известно, что обработка тканей или одежды моющим раствором, содержащим вариант ксилоглюканазы или композицию варианта ксилоглюканазы согласно изобретению может быть особенно полезной, например, при изготовлении нового волокна, и/или новой ткани, и/или новой одежды, а также при стирке используемой ткани и/или одежды, например, в домашних или в промышленных условиях.
Доза варианта ксилоглюканазы или композиции варианта ксилоглюканазы согласно изобретению и другие условия, в которых используется такая композиция, включая состав и концентрацию моющего раствора, могут быть определены методами, известными специалистам.
Настоящее изобретение более подробно описано в нижеследующих примерах, которые не должны рассматриваться как ограничение объема изобретения.
ТМ
Ксилоглюканазы могут быть использованы в композициях согласно изобретению для эффективного удаления пятен, содержащих производные целлюлозы или гемицеллюлозы, для более эффективного ингибирования переосаждения загрязнений на ткань и для облегчения удаления пятен. Ксилоглюканазы могут быть также использованы в данных композициях для облегчения удаления пятен из хлопчато-бумажной ткани в процессе последующей стирки. Такой эффект удаления пятен может наблюдаться на хлопчато-бумажной ткани и на тканях всех типов, имеющих высокое содержание хлопка, таких как ткани, изготовленные из смеси хлопкового и синтетического волокна (например, полиэстера, полиамида, такого как найлон, и эластана).
Примеры
Пример 1 - Получение и очистка вариантов ксилоглюканазы
Bacillus subtilis
Bacillus subtilis
Варианты ксилоглюканазы согласно изобретению были получены стандартными методами, а именно, путем введения неспецифических и/или сайт-направленных мутаций в ген; трансформации клеток-хозяев  мутированными генами; ферментации трансформированных клеток-хозяев и получения варианта ксилоглюканазы из ферментационного бульона. Эталонную ксилоглюканазу (SEQ ID NO: 3) продуцировали в рекомбинантной  аналогичным образом.
3
2
4
2
Ферментацию осуществляли в культурах в шейкерных колбах при 37°C и при встряхивании в течение 4 дней со 100 мл среды PS-1, содержащей одну таблетку CaCO (0,5 г), в 500-миллилитровой колбе Эрленмейера с перегородкой. Среда PS-1 содержит 100 г/л сахарозы, 40 г/л соевой муки, 10 г/л NaHPO·12HO, 0,1 мл/л Dowfax 63N10 и 6 мкг/мл антибиотика хлорамфеникола.
После ферментации бульон с культурой собирали путем центрифугирования (26000 × g, 20 минут). Небольшой объем супернатанта подвергали стерильной фильтрации через фильтр 0,45 мкм и хранили в замороженном виде. Непосредственно перед проведением анализов на стабильность, описанных ниже, образцы сразу оттаивали.
В некоторых случаях, образцы ферментов очищали непосредственно перед их использованием в тесте на стабильность.
3
2
Для очистки ферментов супернатанты фильтровали через фильтр NALGENE 0,2 мкм (номер по каталогу № 569-0020) в целях удаления остатка клеток-хозяев. 0,2 мкм-фильтрата доводили до pH 5,0 добавлением 20% CHCOOH и фильтрат наносили на колонку с белком А (ProA) XpressLine (UpFront chromatography A/S), уравновешенную в 50 мМ янтарной кислоты/NaOH, 1 мМ CaCl, pH 5,0. После интенсивной промывки колонки XpressLine ProA уравновешивающим буфером, ксилоглюканазу постадийно элюировали 50 мМ триса/HCl, pH 9,0. Фракции собирали в процессе элюирования. Фракции с колонки анализировали на ксилоглюканазную активность (пример 2) и фракции, обладающие такой активностью, объединяли. pH данного пула доводили до 9,0 с использованием 3M основания Трис, и этот пул разводили деминерализованной водой до достижения такой же проводимости, которой обладает 50 мМ Трис/HCl, pH 9,0 (или более низкой проводимости). Скорректированный по рН раствор наносили на колонку SOURCE Q (GE Healthcare), уравновешенную в 50 мМ Трис/HCl, pH 9,0. После интенсивной промывки колонки SOURCE Q уравновешивающим буфером, фермент элюировали линейным градиентом NaCl (0 → 0,5M) в том же самом буфере в объеме выше пяти колоночных объемов. Фракции с колонки снова анализировали на ксилоглюканазную активность, и активные фракции дополнительно анализировали с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ. Фракции, которые давали только одну полосу, обнаруживаемую на окрашенном кумасси ПААГ с ДСН, объединяли и получали очищенный препарат.
Пример 2 - Анализ на ксилоглюканазу
Ксилоглюканазную активность ферментных образцов, например, взятых после очистки, оценивали с помощью анализа на AZCL-ксилоглюкан.
AZCL-ксилоглюкан (Megazyme) инкубировали с ксилоглюканазой, и спонтанное появление синей окраски оценивали на длине волны 650 нм. Ксилоглюканазную активность вычисляли как увеличение интенсивности синей окраски в процессе инкубирования после вычитания собственного фонового значения.
Субстрат AZCL-ксилоглюкан: 4 мг/мл AZCL-ксилоглюкана (Megazyme), гомогенно суспендированного в 0,01% тритоне X-100 путем перемешивания.
Температура при проведении анализа: 37°C.
Аналитический буфер: 50 мМ янтарной кислоты/NaOH, 0,01% тритона X-100, pH 5,0.
650
650
500 мкл суспензии субстрата AZCL-ксилоглюкана помещали на лед в пробирку Эппендорфа. Затем добавляли 500 мкл аналитического буфера, и смесь оставляли для охлаждения на льду. После этого добавляли 20 мкл образца фермента (разведенного в 0,01% тритона X-100). Анализ начинали путем переноса пробирки Эппендорфа в термомиксер Эппендорфа, который был установлен на температуру проведения анализа. Эту пробирку инкубировали в течение 15 минут на термомиксере Эппендорфа при самой высокой скорости встряхивания (1400 об/мин). Инкубирование завершали путем переноса пробирки обратно на ледяную баню. После охлаждения пробирки на льду, ее быстро центрифугировали в охлажденной льдом центрифуге для осаждения непрореагировавшего субстрата. 200 мкл супернатанта переносили в микротитрационный планшет и считывали величину оптической плотности A. В этот анализ был включен контрольный буфер (20 мкл 0,01% тритона X-100, вместо фермента), и различия в A для образца фермента и контрольного буфера оценивали как показатель ксилоглюканазной активности.
Пример 3 - Стабильность вариантов ксилоглюканазы
Стабильность к детергенту, содержащему варианты ксилоглюканазы согласно изобретению, оценивали путем измерения активности вариантов после их инкубирования в жидком детергенте.
Тест на стабильность осуществляли путем добавления образца фермента в жидкий детергент и хранения при повышенной температуре, например, при 35°C или 40°C. После хранения в течение заранее определенного периода времени определяли ферментативную активность и эту активность сравнивали с активностью эквивалентного образца, который хранили приблизительно при -18°C в течение того же самого периода времени. Результатом теста на стабильность является активность образца, который хранили при повышенной температуре, где указанную активность выражали как % от активности, обнаруживаемой в образце, который хранили в условиях холода.
Результаты для вариантов ксилоглюканазы сравнивали с результатами для родительской ксилоглюканазы (SEQ ID NO:3), протестированной в тех же самых условиях. Отношение результатов этих двух стабильностей представляет собой коэффицинт повышения стабильности (SIF).
Варианты, имеющие SIF>1, являются более стабильными в тестируемых условиях, чем родительская ксилоглюканаза. Предпочтительными вариантами являются варианты, имеющие высокие значения SIF в данном тесте.
Детергент
Жидкий детергент, используемый в тестах на стабильность, имеет следующий состав:
алкилэтоксисульфат
20,1%
алкилбензолсульфонат
2,7%
алкилсульфат
6,5%
алкилэтоксилат
0,8%
лимонная кислота
3,8%
жирная кислота
2,0%
бура
3,0%
формиат Na и Ca
0,2%
полимеры этоксилата амина
3,4%
диэтилентриаминпентауксусная кислота
0,4%
Тинопал AMS-GX
0,2%
этанол
2,6%
пропиленгликоль
4,6%
диэтиленгликоль
3,0%
полиэтиленгликоль
0,2%
моноэтаноламин
2,7%
NaOH
до pH 8,3
вспомогательные ингредиенты (протеаза, амилаза, отдушка, краситель)
2,3%
вода
остальное
Тест на хранение
Перед проведением теста на стабильность при хранении, образцы фермента, полученные как описано в примере 1, сразу оттаивали.
Образцы фермента разводили до концентрации приблизительно 0,25 мг раствора фермента на мл.
Жидкий детергент закапывали в стеклянные бутыли объемом приблизительно 12 мл, в результате чего в каждой стеклянной бутыли содержалось 1,0±0,05 грамма детергента.
Для каждого образца фермента приготавливали две бутыли с двумя дубликатами. В эти бутыли добавляли 50 мкл разведенного фермента и помещали небольшую магнитную стержневую мешалку, а затем их плотно закрывали (для предотвращения выпаривания во время хранения). Содержимое перемешивали стержневой магнитной мешалкой в течение примерно 5 минут. Одну бутыль из этой пары помещали в морозильную камеру при температуре приблизительно -18°C. Другую бутыль помещали в подходящую печь-инкубатор при заранее определенной повышенной температуре тестирования, например, при 35°C или 40°C. После хранения в течение предварительно определенного периода времени бутыли, находящиеся в печи-инкубаторе, переносили в морозильную камеру.
Анализ на активность
Активность образцов фермента после их хранения в детергенте оценивали методами, описанными ниже.
Материалы и реагенты
:
1 M фосфатный буфер, pH 7:
2
4
2
138 граммов NaHPO·HO растворяли примерно в 750 мл воды. Затем добавляли 4 н. NaOH для доведения pH до 7,0. После этого конечный объем доводили до 1000 мл.
Аналитический буфер (50 мМ фосфат, pH 7):
Смешивали 950 мл воды, 50 мл 1 M фосфатного буфера, pH 7 и 5 мл Berol 537 (неионного поверхностно-активного вещества, поставляемого Akzo Nobel). Конечный pH доводили до 7,00±0,02.
Субстрат:
Таблетки целлазима C поставлялись компанией Megazyme International Ireland Ltd, номер по каталогу T-CCZ. Эти таблетки содержали структурированную HE-целлюлозу, окрашенную красителем.
Процедура
Примерно за 30 минут до начала анализа бутыли, находящиеся в морозильной камере, переносили в холодильник, приблизительно при 4°С. Непосредственно перед началом анализа бутыли вынимали из холодильника, помещали на лабораторный столик и открывали.
В каждую открытую бутыль добавляли 10 мл аналитического буфера (при комнатной температуре). Затем бутыли переносили в водяную баню при 30°C, снабженную многофункциональной магнитной мешалкой, погруженной вовнутрь бани. Содержимое осторожно помешивали примерно 5 мин.
В каждую бутыль добавляли одну таблетку целлазима C. Затем содержимое перемешивали мешалкой, скорость которой была достаточной лишь для поддержания частиц субстрата в движении и для предотвращения осаждения. Через 30 минут после добавления таблетки бутыли вынимали из водяной бани и оставляли на 15 минут при комнатной температуре без перемешивания.
Из верхней части каждой бутыли пипеткой брали приблизительно 1 мл практически прозрачного супернатанта и переносили в кювету полумикроспектрофотометра. Затем измеряли оптическую плотность на 590 нм на подходящем спектрофотометре. Все измерения завершали через 15 минут.
В анализ были включены контрольные образцы, то есть эквивалентные образцы детергента, в которые не добавляли фермент ксилоглюканазу.
Вычисление
Для каждого образца фермента проводили два измерения A590:
- A590f, представляющего собой величину оптической плотности (А) A590 для образца, который хранили при -18°C,
- A590w, представляющего собой величину A590 для образца, который хранили при повышенной температуре.
Величину, полученную для контроля, (A590b) вычитали из A590f (с получением A590f-A590b) и из A590w (с получением A590w-A590b).
Стабильность вычисляли по формуле:
% стабильности=((A590w-A590b)/(A590f-A590b))×100%.
Результаты (A590f - A590b) для каждого фермента должны составлять в пределах величин 0,1-1,2. Если эти величины выходят за пределы данного интервала, то результаты для этого фермента должны быть интерпретированы как недостоверные, и тест необходимо повторить с использованием другого разведения указанного образца фермента.
И наконец, коэффициент повышения стабильности (SIF) для каждого варианта фермента вычисляли следующим образом:
SIF = % стабильности образца фермента/% стабильности родительского фермента (SEQ ID NO: 3).
Результаты
Ниже представлены результаты стабильности вариантов ксилоглюканазы, тестируемых в различных условиях.
<b>Таблица 1</b>Стерильно отфильтрованные образцы фермента, которые хранили в течение 18 часов при 40°C
<b>Мутации</b>
<b>SIF</b>
K8Q
1,1
K8A
1,2
K13A
1,1
K18R
1,1
K87Q
1,1
K129A
1,7
K169Q
1,3
K169R
1,4
K169A
1,3
N140F
1,2
G316I
1,1
F418I
1,1
L34I
1,1
L166I
1,1
L268I
1,1
L278I
1,3
V1*+ V2*+H3*
1,2
*0aE+*0bV
1,3
F146L
1,2
Q137E
1,6
R156Y
2,2
R156Q
1,5
K8S
1,2
K21T
1,4
K176P
1,1
K445S
1,4
K470T
1,2
<b>Таблица 2</b>Очищенные образцы фермента, которые хранили в течение 18 часов при 40°C
<b>Мутации</b>
<b>SIF</b>
K87Q
1,1
K129A
1,8
K169A
1,1
A7T+G200P+A224P+G225K+R267K+L268K+S269A
1,3
H164N+V179I+G200A+R267K
1,2
H164N+V179I+G200A+R211K+G225D+F281L
1,5
H164N+G200A+G225N+R267K
1,2
<b>Таблица 3</b>Стерильно отфильтрованные образцы фермента, которые хранили в течение 24 часов при 40°C
<b>Мутации</b>
<b>SIF</b>
K101R+L102I
1,1
K217A
1,1
L380F
1,1
N383Y
1,2
G78A
1,2
M310V
1,2
N399I
1,1
G498S
1,1
F146L
1,1
Q137E
1,4
R156Y
2,0
V1*+V2*+H3*+G4*+Q5*
1,1
N331F
1,2
K8S
1,1
T92V
1,3
K176P
1,2
G253A
1,1
K445S
1,3
K470T
1,2
<b>Таблица 4</b>Очищенные образцы фермента, которые хранили в течение 24 часов при 40°C
<b>Мутации</b>
<b>SIF</b>
T92V
1,2
Q137E
1,5
R156Y
1,7
R156Q
1,2
<b>Таблица 5</b>Стерильно отфильтрованные образцы фермента, которые хранили в течение 30 часов при 40°C
<b>Мутации</b>
<b>SIF</b>
K118R
1,1
K118A
1,7
K129A+K169A
1,6
G200P
1,5
K129A+R156Y
2,0
K129A+Q137E+R156Y
2,2
K129A+R156Y+H164N
2,1
<b>Таблица 6</b>Очищенные образцы фермента, которые хранили в течение 30 часов при 40°C
<b>Мутации</b>
<b>SIF</b>
T92V
1,3
R156Y
1,9
K129A+R156Y
2,1
<b>Таблица 7</b>Стерильно отфильтрованные образцы фермента, которые хранили в течение 48 часов при 40°C
<b>Мутации</b>
<b>SIF</b>
K118A
3,0
K252Q
1,1
K252R
1,2
K252A
1,1
K275Q
1,1
K275R
1,2
K275A
1,1
K306R
1,1
K306A
1,1
K347Q
1,1
K347R
1,1
K347A
1,1
K382A
1,1
K414A
1,2
K445R
1,3
K454R
1,1
K476Q
1,1
K482Q
1,1
K482A
1,1
K488Q
1,1
K488R
1,1
K488A
1,1
M40V
1,4
R156Y
2,9
G200P
1,8
K129A+R156Y
3,5
K129A+Q137E+R156Y+K470T
3,7
K406N
1,1
K445S
1,2
K488T
1,2
T92V+K129A+R156Y
3,7
K118A+K129A+R156Y
3,8
T92V+K118A+K129A+R156Y
3,9
K129A+R156Y+P507A
3,2
K129A+R156Y+S443D+K445S+L449I+V450I+S455N+M456Y
3,8
K129A+R156Y+H436Y
3,9
K129A+R156Y+K406N+N415G
3,5
K129A+R156Y+L380F+N383Y+D384G+N389T
3,5
K129A+R156Y+D366H+T374A
3,4
K129A+R156Y+A328G
3,5
K129A+R156Y+V259I+R267K+L268K+S269A
3,5
K129A+R156Y+T244D
3,4
K129A+R156Y+I222V+A224P+V228I+V232A
2,0
K129A+R156Y+G200P+G204T+R211K
3,6
K129A+R156Y+A177T+V179I+A183S
2,9
K129A+R156Y+V159M+H164N+F165Y
2,8
K129A+R156Y+I10V+V14I+D19E
4,0
T104A+P111Q+A117S+K129A+R156Y
2,1
S123T+K129A+R156Y
3,8
K129A+Q137E+V139K+N140F+Q147S+R156Y
2,9
K129A+R156Y+D324N
3,4
K129A+R156Y+K176P
3,2
K129A+R156Y+D249N
3,2
K129A+R156Y+D249G
3,3
K129A+R156Y+D249S
3,1
K129A+R156Y+D461N
3,6
K129A+R156Y+D461T
3,9
K129A+R156Y+D461Q
4,0
K129A+R156Y+R409T
3,8
K129A+R156Y+R409L
3,6
K129A+R156Y+D247G
1,4
K129A+R156Y+E288Q
2,7
D37G+K129A+R156Y
3,9
D37N+K129A+R156Y
3,6
K129A+R156Y+R267H
3,8
K129A+R156Y+D303I
4,1
K129A+R156Y+D303K
3,7
K129A+R156Y+K275T
3,5
K129A+R156Y+G200P
3,9
K129A+R156Y+N331F
3,8
R156Y+N331F
3,2
K118A+K129A+R156Y+K470T
4,4
K470R
1,1
K470P
1,2
G413A
1,1
K118A+K129A+R156Y+A224P
3,9
D119L
1,3
K87V+K129A+K169A
1,9
K129A+K445S
1,8
K118A+K129A+R156Y+G200P
3,8
K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F
4,2
G78A+K118A+K129A+R156Y
3,8
G78A+T92V+K118A+K129A+R156Y
3,8
T92V+K118A+K129A+R156Y
3,7
M310V+N399I
1,7
L34I+K129A
1,9
K101A+K129A
1,8
K13A+K129A
2,0
K129A+K470T
1,8
K129A+K176P
1,9
G78A+T92V+K118A+K129A+R156Y+K169A
4,8
K118A+K129A+R156Y+K169A+G200P+N331F
4,7
K118A+K129A+R156Y+G200P+M310V+N331F
4,7
K129A+R156Y+K454Q
3,8
G78A+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F
4,2
T92V+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F
4,3
K129A+R156Y+N302K+D303S
2,9
K129A+R156Y+N302K+D303L
2,7
S332P+V397I
1,1
K129A+R156Y+K322I+K454Q
2,3
Q68H+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F
4,1
Q68H+T92S+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F
5,2
Q68H+T92A+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F
4,7
Q68H+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F
5,0
Q68H+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F
5,7
Q68H+T92D+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F
3,3
Q68H+T92I+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F
4,4
Q68H+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F
4,4
Q68H+T92V+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F
4,2
K129S
1,1
K129A
1,5
R156M
1,3
R156F
2,3
R156W
1,6
R156L
1,4
R156V
2,2
G396P
1,3
G413S
1,1
A177T
1,1
E38I
1,1
E38V
1,2
G36V+D37A+E38*+N39*
1,2
T104A
1,2
L102A+T104V+*104P
1,3
Q68L
1,3
Q68H
3,6
N389A
1,1
G468Y
1,1
G237V
1,1
<b>Таблица 8</b>Очищенные образцы фермента, которые хранили в течение 48 часов при 40°C
<b>Мутации</b>
<b>SIF</b>
K118A
2,3
R156Y
2,5
K129A+K169A
1,7
G200P
1,5
K129A+R156Y
1,7
K129A+Q137E+R156Y
3,7
K129A+R156Y+H164N
3,5
K129A+Q137E+R156Y+K470T
4,2
T92V+K129A+R156Y
4,5
K118A+K129A+R156Y
3,8
K129A+R156Y+G200P
4,8
K129A+R156Y+N331F
4,1
R156Y+N331F
3,5
K118A+K129A+R156Y+G200P,
4,2
K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F
4,5
G78A+K118A,+K129A+R156Y
4,0
G78A+T92V+K118A+K129A+R156Y
4,3
Q68H
3,7
<b>Таблица 9</b>Стерильно отфильтрованные образцы фермента, которые хранили в течение 72 часов при 40°C
<b>Мутации</b>
<b>SIF</b>
K13R
1,3
K206Q
1,1
K129A+R156Y
5,1
K129A+Q137E+R156Y+K470T
6,4
T92V+K129A+R156Y
6,6
K118A+K129A+R156Y
7,2
K129A+R156Y+G200P
7,7
K129A+R156Y+N331F
5,9
R156Y+N331F
5,3
<b>Таблица 10</b>Стерильно отфильтрованные образцы фермента, которые хранили в течение одной недели при 35°C
<b>Мутации</b>
<b>SIF</b>
K8Q
1,4
K8A
1,1
K13Q
1,1
K18Q
1,1
K18A
1,4
K21Q
1,4
K21R
1,4
K21A
1,4
K87Q
1,3
K101R
1,3
K101A
1,6
K118R
1,4
K118A
2,3
K101R+L102I
1,1
K129A
2,1
K169Q
1,4
K169R
1,5
K169A
1,5
K220Q
1,3
K220A
1,2
K252Q
1,1
K252R
1,1
K275Q
1,1
K275R
1,1
K275A
1,1
K306R
1,1
K306A
1,1
K307Q
1,2
K307R
1,1
K454Q
1,6
K454R
1,2
K476Q
1,3
K476R
1,3
K476A
1,2
K482Q
1,2
K482A
1,2
K488Q
1,2
K488R
1,2
K488A
1,1
N140F
1,7
G78A
1,2
M310V
1,3
G316I
1,1
W391V
1,1
N399I
1,4
L34I
1,3
L268I
1,1
L278I
1,2
G498S
1,2
*0aE+*0bV
1,4
F146L
2,3
Q137E
2,0
R156Y
3,2
R156Q
1,7
N331F
1,5
K8S
1,3
K21T
1,5
K176P
1,2
G253A
1,1
K445S
1,5
K470T
1,6
F146C
1,3
K129A+K169A
1,8
G200P
1,7
A224P
1,1
K129A+R156Y
2,6
K129A+Q137E+R156Y
2,6
K129A+R156Y+H164N
2,6
K406N
1,3
K445S
1,2
K488T
1,2
K129R
1,1
R156F
2,0
<b>Таблица 11</b>Очищенные образцы фермента, которые хранили в течение одной недели при 35°C
<b>Мутации</b>
<b>SIF</b>
K101R
1,1
K101A
1,1
K118A
2,3
K129A
1,8
K169R
1,2
K169A
1,1
T92V
2,0
F418I
1,1
V1*+V2*+H3*+G4*+Q5*;
1,2
Q137E
1,6
R156Y
2,5
R156Q
1,2
K21T
1,1
G200P
1,7
K129A+R156Y
2,7
K129A+Q137E+R156Y
3,0
K129A+R156Y+H164N
3,1
A7T+G200P+A224P+G225K+R267K+L268K+S269A
1,3
H164N+V179I+G200A+R267K
1,3
H164N+V179I+G200A+R211K+G225D+F281L
1,8
H164N+G200A+G225N+R267K
1,6
<b>Таблица 12</b>Очищенные образцы фермента, которые хранили в течение 16 часов при 44°C
<b>Мутации</b>
<b>SIF</b>
Q68H
5,8
S123P
4,4
R156Y
4,0
K118A
2,9
G200P
2,6
K129A
2,4
Q137E
2,4
H193T
2,1
T92V
2,0
S76W
1,7
Пример 4 - Стабильность вариантов ксилоглюканазы
Стабильность к детергенту, содержащему варианты ксилоглюканазы согласно изобретению, оценивали путем измерения активности вариантов после их инкубирования в жидком детергенте.
Тест на стабильность осуществляли путем добавления образца фермента в жидкий детергент и хранения при повышенной температуре, например, при 35°C или 46°C. После хранения в течение предварительно установленного периода времени определяли ферментативную активность, и эту активность сравнивали с активностью идентичного образца, который хранили на холоде приблизительно при +5°C в течение того же самого периода времени. Результатом теста на стабильность является активность образца, который хранили при повышенной температуре (образец в условиях стресса), где указанную активность выражали как % активности, обнаруживаемой в эквивалентном образце, который хранили в условиях холода (образец, не подвергаемый стрессу).
Результаты для вариантов ксилоглюканазы сравнивали с результатами для родительской ксилоглюканазы (SEQ ID NO:3), протестированной в тех же самых условиях.
Детергент
Жидкий детергент, используемый в тестах на стабильность, имеет следующий состав:
алкилэтоксисульфат
20,1%
алкилбензолсульфонат
2,7%
алкилсульфат
6,5%
алкилэтоксилат
0,8%
лимонная кислота
3,8%
жирная кислота
2,0%
бура
3,0%
формиат Na и Ca
0,2%
полимеры этоксилата амина
3,4%
диэтилентриаминпентауксусная кислота
0,4%
Тинопал AMS-GX
0,2%
этанол
2,6%
пропиленгликоль
4,6%
диэтиленгликоль
3,0%
полиэтиленгликоль
0,2%
моноэтаноламин
2,7%
NaOH
pH 8,3
вспомогательные ингредиенты (протеаза,амилаза, отдушка, краситель)
2,3%
вода
остальное
Тест на хранение
Перед проведением теста на стабильность при хранении, образцы фермента, полученные как описано в примере 1, сразу оттаивали.
Образцы фермента использовали без дополнительного разведения.
Жидкий детергент закапывали в полистироловый микротитрационный 96-луночный планшет с круглодонными лунками (планшет 1) с получением 190 мкл детергента на лунку.
В каждую лунку добавляли десять микролитров образца фермента и вставляли небольшую магнитную стержневую мешалку, а затем планшет плотно закрывали (для предотвращения выпаривания) крышкой из адгезивной алюминиевой фольги (Beckman Coulter). Содержимое перемешивали магнитной стержневой мешалкой в течение примерно 30 минут.
Из каждой лунки планшета 1 брали 20 мкл смеси детергента-фермента, а затем переносили в новый пустой идентичный планшет (планшет 2). После этого оба планшета герметично закрывали.
Исходный планшет (планшет 1) помещали в подходящую печь-инкубатор при заранее определенной повышенной температуре тестирования, например, при 35°C или 46°C. Другой планшет (планшет 2) помещали в холодильник приблизительно при 5°С.
После инкубирования в течение предварительно определенного периода времени планшеты вынимали из холодильника и из печи-инкубатора. Планшеты оставляли на лабораторном столике по меньшей мере на 0,5 часа для охлаждения всех лунок до комнатной температуры.
Затем 20 мкл образца, взятого из каждой лунки планшета 1, переносили в новый пустой 96-луночный планшет с круглодонными лунками (планшет 1а).
Итак, планшет 1а содержал 20 мкл образцов в условиях стресса, а планшет 2 содержал 20 мкл образцов, не подвергнутых стрессу.
Анализ на активность
Активность образцов фермента после хранения их в детергенте оценивали описанными ниже методами при комнатной температуре.
Схема проведения анализа:
Пара-нитрофенол-1-бета-D-целлотетраозид (pNP-бета-D-целлотетраозид) представляет собой синтетический субстрат, который гидролизуется благодаря каталитическому действию некоторых ксилоглюканазных ферментов.
Сам субстрат является бесцветным, однако, после гидролиза гликозидной связи по восстанавливающим концам, высвобождается паранитрофенол, который имеет желтую окраску в буфере при рН 8, что обусловлено выской оптической плотностью при 405 нм.
Сам pNP-бета-D-целлотетраозид является в высокой степени стабильным в условиях проведения данного анализа. Таким образом, увеличение оптической плотности при длине волны 405 нм является показателем ферментативной активности.
Авторами настоящего изобретения было обнаружено, что родительская ксилоглюканаза (SEQ ID NO:3) присоединяет pNP-бета-D-целлотетраозид в качестве субстрата, о чем свидетельствует значительное увеличение оптической плотности при 405 нм.
Материалы и реагенты:
Аналитический буфер: 100 мМ EPPS; 0,01% твина-20; pH 8,0.
pNP-бета-D-целлотетраозид (CAS-#: 129411-62-7; Toronto Research Chemicals; Canada)
Раствор субстрата: 1 мМ pNP-бета-D-целлотетраозида в аналитическом буфере.
Процедура
:
Планшет 1а содержит 20 мкл образцов в условиях стресса, а планшет 2 содержит 20 мкл образцов, не подвергнутых стрессу.
Образцы разводили путем добавления 50 мкл аналитического буфера во все лунки в планшете 1a и в планшете 2, и перемешивали в течение одного часа с помощью шейкера, встроенного в микротитрационный планшет. Затем во все лунки добавляли еще 50 мкл аналитического буфера, и встряхивание продолжали еще 10 минут.
20 мкл 6-кратно разведенных образцов переносили в 384-луночный полистироловый микротитрационный планшет с прозрачными лунками, и во все лунки добавляли 20 мкл раствора субстрата. Образцы смешивали путем быстрого встряхивания микротитрационного планшета. Измерение кинетики ферментативной активности инициировали сразу после наблюдения скорости увеличения оптической плотности при 405 нм на 384-луночном спектрофотометрическом планшет-ридере.
Была определена начальная скорость (оптическая плотность (А)/мин) реакции. Начальная скорость реакции является показателем ферментативной активности в образце, как было подтверждено путем построения линейной страндартной кривой при соответствующих концентрациях фермента.
Вычисления
:
% остаточной активности вычисляли как ферментативную активность образца в условиях стресса, деленную на ферментативную активность в идентичном образце, не подвергнутом стрессу.
% остаточной активности = «A/мин (образца в условиях стресса)»/«A/мин (образца, не подвергнутого стрессу)» ×100%.
Результаты
Ниже представлены результаты стабильности вариантов ксилоглюканазы, тестируемых в различных условиях.
<b>Таблица 13</b>Стерильно отфильтрованные образцы фермента, которые хранили в течение 16 часов при +44°С
<b>Мутации</b>
<b>% остаточной активности</b>
SEQ ID NO: 3
7
K118A
24
R156Y
36
K129A+K169A
19
G200P
26
K129A+R156Y
51
K129A+Q137E+R156Y
72
K129A+R156Y+H164N
63
<b>Таблица 14</b>Стерильно отфильтрованные образцы фермента, которые хранили в течение 16 часов при +47°С
<b>Мутации</b>
<b>% остаточной активности</b>
SEQ ID NO: 3
<5
Q68H+T92S+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F
77
Q68H+T92A+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F
83
Q68H+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F
91
Q68H+T92D+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F
49
Q68H+T92Y+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F
78
Q68H+T92I+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F
89
Q68H+T92V+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F
95
Q68H+T92S+K118A+K129A+R156Y+G200P+G274D+N331F
67
Q68H+T92N+D97N+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F
81
Q68H
52
K118A+K129A+R156Y
52
T92V+K118A+K129A+R156Y
88
K129A+R156Y+G200P+G204T+R211K
68
S123T+K129A+R156Y
65
K129A+R156Y+G200P
73
K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F
90
G78A+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F
98
T92V+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F
95
<b>Таблица 15</b>Стерильно отфильтрованные образцы фермента, которые хранили в течение 16 часов при +44°С
<b>Мутации</b>
<b>% остаточной активности</b>
SEQ ID NO: 3
22
R156Y
59
K13R
34
K307Q
31
K414A
34
G253A
33
G498S
31
M310V
38
N399I
30
V1*+V2*+H3*+G4*+Q5*
31
F146L
34
K445S
30
K470T
30
<b>Таблица 16</b>Стерильно отфильтрованные образцы фермента,которые хранили в течение 16 часов при +45°С
<b>Мутации</b>
<b>% остаточной активности</b>
SEQ ID NO: 3
6
R156Y
34
K129A+R156Y
55
K101R+L102I
12
K118A+K129A+R156Y
72
K129A+R156Y+P507A
57
K129A+R156Y+D366H+T374A
44
K129A+R156Y+V259I+R267K+L268K+S269A
40
K129A+R156Y+G200P+G204T+R211K
49
K129A+R156Y+V159M+H164N+F165Y
30
T104A+P111Q+A117S+K129A+R156Y
39
S123T+K129A+R156Y
70
K129A+R156Y+D324N
60
K129A+R156Y+D461N
59
K129A+R156Y+D461T
61
K129A+R156Y+D461Q
59
D37G+K129A+R156Y
60
D37N+K129A+R156Y
64
K129A+R156Y+R267H
64
K129A+R156Y+D303I
62
K129A+R156Y+D303K
65
K129A+R156Y+K275T
68
K129A+R156Y+G200P
92
K118A+K129A+R156Y+K470T
80
H164N
<5
K129A+R156Y+N302K+D303S
66
K129A+R156Y+N302K+D303L
64
<b>Таблица 17</b>Стерильно отфильтрованные образцы фермента, которые хранили в течение 16 часов при +44°С
<b>Мутации</b>
<b>% остаточной активности</b>
SEQ ID NO: 3
26
R156Y
58
K118A+R156Y+G200P
84
K118A+K129A+Q137E+R156Y+G200P+N331F
92
K445C+K470C
32
F281L
32
D366H
35
K392G
26
D395G
35
S76W
47
G498D
32
G498A
36
D324N
39
S123T
36
Q68Y
6
Q68C
13
K129A+R156Y
89
K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F
100
<b>Таблица 18</b>Стерильно отфильтрованные образцы фермента, которые хранили в течение 16 часов при +44°С
<b>Мутации</b>
<b>% остаточной активности</b>
SEQ ID NO: 3
34
R156Y
66
R156M
39
R156F
63
R156W
44
R156L
34
R156P
<5
R156V
50
R156T
35
R156S
27
R156A
36
R156D
34
R156K
52
R156N
29
R156I
50
T92I
39
R156Q
34
<b>Таблица 19</b>Стерильно отфильтрованные образцы фермента, которые хранили в течение 16 часов при +44°С
<b>Мутации</b>
<b>% остаточной активности</b>
SEQ ID NO: 3
25
R156Y
70
R156E
66
R156F
65
T92V
43
R156P
<5
R156V
53
R156K
38
R156I
31
<b>Таблица 20</b>Стерильно отфильтрованные образцы фермента, которые хранили в течение 16 часов при +44°С
<b>Мутации</b>
<b>% остаточной активности</b>
SEQ ID NO: 3
31
R156Y
65
N415S
34
S443E
33
S443K
32
S443Q
35
K129T
46
K129A
50
G468Y
32
G237A
34
G237S
34
G237V
25
G468S
32
<b>Таблица 21</b>Стерильно отфильтрованные образцы фермента, которые хранили в течение 16 часов при +44°С
<b>Мутации</b>
<b>% остаточной активности</b>
SEQ ID NO: 3
21
R156Y
45
S332P
41
K129A+R156Y+K176S
73
K129A+R156Y+D303V
77
K129A+R156Y+D303S
81
R197L
20
R340N
41
R340T
43
H193S
51
H193D
49
H193T
66
L34F
43
Q137D
24
Q149E
48
T9D
40
A83E
49
S214E
25
K129A+R156Y
98
T92V
49
T92I
36
<b>Таблица 22</b>Стерильно отфильтрованные образцы фермента, которые хранили в течение 16 часов при +47°С
<b>Мутации</b>
<b>% остаточной активности</b>
SEQ ID NO: 3
<5
R156Y
29
Q68H+R156V+G200P+N331F
93
Q68H+R156F+G200P+N331F
Прибл. 100
Q68H+G200P+N331F
Прибл. 100
Q68H+T92V+R156V+G200P+M310V
86
Q68H+T92V+R156Y+G200P+M310V
86
Q68H+T92V+R156F+G200P+M310V
91
Q68H+T92V+R156F+G200P+M310V+S484C
82
Q68H+T92V+G200P+M310V
82
Q68H+T92V+R156V+G200P+M310V+N331F
Прибл. 100
Q68H+T92V+R156Y+G200P+M310V+N331F
Прибл. 100
Q68H+T92V+R156F+G200P+M310V+N331F
86
Q68H+T92V+G200P+M310V+N331F
80
D366H
<5
K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F
81
Q68H+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F
87
Q68H+T92V+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F
80
M40L+A41T+Q67M+N72S+S76D+G78A+Q82K+Q137E+N153K+ H164N+D249N+V272A+I337L+M356L+V397A+N415S+T421I+ S424N+N441D+V450I+E489A+A490V+T517A+S522*
41
I10V+F17S+D33E+M40L+Q67M+N72S+S76D+G78A+Q82K+ T92A+L102Q+Q137E+I222V+V228I+D249N+V272A+I337L+M356L+T374A+V397A+S416A+T421I+S424N+N441D+D444Y+V450I+ A469E+K470T+I473G+T517A+S522P+P523V+V524E
52
Q32H+M40L+R49G+D65E+Q67M+N72S+S76D+G78A+Q82K+92A+L102Q+T104A+Q137E+H164N+K202E+I222V+V228I+D249N+M356L+T374A
41
I10V+F17S+Y53H+Q67M+N72S+S76D+G78A+Q82K+T92A+L102Q+Q137E+T172V+A177T+I222V+V228I+D249N+S269N+I337L+M356LV397A+S416A+T421I+S424H+N441D+D444Y+A469E+K470T+I473G+T517A+S522*
26
<b>Таблица 23</b>Стерильно отфильтрованные образцы фермента, которые хранили в течение 64 часов при +46°С
<b>Мутации</b>
<b>% остаточной активности</b>
SEQ ID NO: 3
<5
R156Y
<5
Q68H+R156V+G200P+N331F
80
Q68H+R156F+G200P+N331F
84
Q68H+G200P+N331F
63
Q68H+T92V+R156V+G200P+M310V
52
Q68H+T92V+R156Y+G200P+M310V
67
Q68H+T92V+R156F+G200P+M310V
63
Q68H+T92V+R156F+G200P+M310V+S484C
68
Q68H+T92V+G200P+M310V
48
Q68H+T92V+R156V+G200P+M310V+N331F
93
Q68H+T92V+R156Y+G200P+M310V+N331F
100
Q68H+T92V+R156F+G200P+M310V+N331F
91
Q68H+T92V+G200P+M310V+N331F
80
K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F
56
Q68H+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F
86
Q68H+T92V+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F
88
<b>Таблица 24</b>Стерильно отфильтрованные образцы фермента, которые хранили в течение 16 часов при +44°С
<b>Мутации</b>
<b>% остаточной активности</b>
SEQ ID NO: 3
16
R156Y
52
T374A
27
F146L+K322I
24
K129A+Q137E+R156Y+G200P
87
Q68S
14
Q68T
<5
K129A+R156Y
71
F146L
26
K129A+R156Y+G200P
82
Q68H
77
<b>Таблица 25</b>Стерильно отфильтрованные образцы фермента, которые хранили в течение 16 часов при +44°С
<b>Мутации</b>
<b>% остаточной активности</b>
SEQ ID NO: 3
19
R156Y
53
K101A+K129A
47
K129A+K470T
46
S332P
29
G413A
30
K118A+K129A+R156Y+A224P
81
K129A+K176P
50
K118A+K129A+R156Y+K169A+G200P+N331F
89
K118A+K129A+R156Y+G200P+M310V+N331F
86
K129A+R156Y+K454Q
86
K13A+K129A
49
G78A+T92V+K118A+K129A+R156Y+K169A
93
K129A+R156Y+K322I+K454Q
76
K129A
47
K129A+R156Y
74
K118A+K129A+R156Y
77
K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F
Прибл. 100
G78A+T92V+K118A+K129A+R156Y
93
<b>Таблица 26</b>Стерильно отфильтрованные образцы фермента, которые хранили в течение 6 дней при +46°С
<b>Мутации</b>
<b>% остаточной активности</b>
SEQ ID NO: 3
<5
R156Y
<5
Q68H+R156V+G200P+N331F
50
Q68H+R156Y+G200P+N331F
60
Q68H+R156F+G200P+N331F
64
Q68H+G200P+N331F
40
Q68H+T92V+R156V+G200P+M310V
32
Q68H+T92V+R156Y+G200P+M310V
42
Q68H+T92V+R156F+G200P+M310V
43
Q68H+T92V+R156F+G200P+M310V+S484C
34
Q68H+T92V+G200P+M310V
27
Q68H+T92V+R156F+G200P+M310V+N331F
93
Q68H+T92V+G200P+M310V+N331F
58
K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F
27
Q68H+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F
75
Q68H+T92V+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F
70
<b>Таблица 27</b>Стерильно отфильтрованные образцы фермента, которые хранили в течение 64 часов при +44°С
<b>Мутации</b>
<b>% остаточной активности</b>
SEQ ID NO: 3
<5
R156Y
9
K101A+K129A
6
K129A+K470T
4
S332P
<5
G413A
<5
K118A+K129A+R156Y+A224P
51
K129A+K176P
6
K118A+K129A+R156Y+K169A+G200P+N331F
67
K118A+K129A+R156Y+G200P+M310V+N331F
63
K129A+R156Y+K454Q
52
K13A+K129A
5
G78A+T92V+K118A+K129A+R156Y+K169A
72
K129A
5
K129A+R156Y
32
K118A+K129A+R156Y
30
K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F
63
G78A+T92V+K118A+K129A+R156Y
72
<b>Таблица 28</b>Стерильно отфильтрованные образцы фермента, которые хранили в течение 64 часов при +46°С
<b>Мутации</b>
<b>% остаточной активности</b>
SEQ ID NO: 3
<5
R156Y
4
G78A+T92V+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F
71
K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F+N399I
59
K118A+K129A+F146L+R156Y+G200P+N331F
62
T92V+K118A+K129A+Q137E+R156Y+G200P+N331F
74
T92V+K118A+K129A+R156Y+H164N+G200P+N331F
70
Q68H+T92V+K118A+K129A+Q137E+R156Y+G200P+N331F
87
Q68H+T92V+K118A+S123T+K129A+Q137E+R156Y+G200P+ N331F
90
T92V+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F
66
K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F
68
Q68H T92V K118A K129A R156Y G200P N331F
83
<b>Таблица 29</b>Стерильно отфильтрованные образцы фермента, которые хранили в течение 16 часов при +44°С
<b>Мутации</b>
<b>% остаточной активности</b>
SEQ ID NO: 3
19
R156Y
51
S123P
69
V159M
21
V345I
34
G225S
30
V232A
<10
<b>Таблица 31</b>Стерильно отфильтрованные образцы фермента, которые хранили в течение 16 часов при +44°С
<b>Мутации</b>
<b>% остаточной активности</b>
SEQ ID NO: 3
15
R156Y
51
Q68F
<5
Q68N
69
Q68Y
<5
Q68D
<10
Q68C
<10
Q68G
<10
Q68S
<10
Q68E
<5
Q68A
<5
Q68M
27
Q68W
<10
Q68H
82
<b>Таблица 32</b>Стерильно отфильтрованные образцы фермента, которые хранили в течение 7 дней при +46°С
<b>Мутации</b>
<b>% остаточной активности</b>
SEQ ID NO: 3
<5
R156Y
<5
Q68H+T92V+K118A+K129A+Q137E+R156Y+G200P+A224P+ N331F
81
Q68H+T92V+K118A+Q137E+R156Y+G200P+N331F
74
Q68H+T92V+Q137E+R156Y+G200P+N331F
80
Q68H+T92V+K118A+Q137E+G200P+N331F
65
Q68H+T92V+K118A+Q137E+R156Y+N331F
80
Q68H+T92V+K118A+Q137E+R156Y+G200P
67
G78A+K118A+K129A+R156Y+K169A
14
Q68H+T92V+K118A+K129A+Q137E+R156Y+G200P+N331F
73
K129A+R156Y
<5
G78A+K118A+K129A+R156Y
7
<b>Таблица 33</b>Стерильно отфильтрованные образцы фермента, которые хранили в течение 48 часов при +46°С
<b>Мутации</b>
<b>% остаточной активности</b>
SEQ ID NO: 3
<5
R156Y
9
K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F
67
Q68H+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F
79
Q68H+T92V+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F
85
Q68H+T92V+K118A+K129A+R156Y+H193T+D366H
73
Q68H+T92V+K118A+K129A+Q137E+R156Y+H193T+D366H
72
Q68H+T92V+R156Y+H193T+D366H
78
Q68H+T92V+R156F+H193T+D366H
78
Q68H+R156Y+H193T+D366H
68
Q68H+T92V+K118A+K129A+R156Y+H193T
67
Q68H+T92V+K118A+K129A+Q137E+R156Y+H193T
80
Q68H+T92V+R156Y+H193T
84
Q68H+T92V+R156F+H193T
66
Q68H+R156Y+H193T
66
Q68H+R156Y+H193T+G200P+M310V
93
Q68H+T92V+R156F+H193T+G200P+M310V
82
Q68H+T92V+K118A+K129A+Q137E+R156Y+H193T+G200P+M310V+E446K
76
Q68H+T92V+R156Y+H193T+G200P+M310V
73
Q68H+T92V+K118A+K129A+R156Y+H193T+G200P+M310V
89
Q68H+K129T+R156K+G200P+N331F
95
Q68H+K129A+R156K+G200P+N331F
86
Q68H+K118A+R156V+G200P+N331F
81
Q68H+K118S+R156F+G200P+G274D+N331F
68
<b>Таблица 34</b>Стерильно отфильтрованные образцы фермента, которые хранили в течение 16 часов при +44°С
<b>Мутации</b>
<b>% остаточной активности</b>
SEQ ID NO: 3
22
R156Y
61
S123T+K129A+R156Y
83
H193T
44
G78A+T92V+K118A+K129A+R156Y
91
S123T
55
S123P
73
V232A
<10
K129A+R156Y
64
K118A+K129A+R156Y
68
<b>Таблица 35</b>Стерильно отфильтрованные образцы фермента, которые хранили в течение 16 часов при +44°С
<b>Мутации</b>
<b>% остаточной активности</b>
SEQ ID NO: 3
17
R156Y
60
N140F
25
H164A
7
H193A
23
R500T
30
R500A
33
R500V
29
H199A
<10
H3A
26
H436A
26
H448A
<10
H512A
25
H96A
14
H3A+H436A
27
<b>Таблица 36</b>Стерильно отфильтрованные образцы фермента, которые хранили в течение 16 часов при +44°С
<b>Мутации</b>
<b>% остаточной активности</b>
SEQ ID NO: 3
27
R156Y
66
N399I
33
L34F
35
Q149E
35
S332P
36
K129A
50
K21Q+K129A
54
K129A+K275Q
56
Q68F
6
T9D+L34F+A83E+Q149E+H193T+S332P+R340T
53
<b>Таблица 37</b>Стерильно отфильтрованные образцы фермента, которые хранили в течение 12 дней при +37°С
<b>Мутации</b>
<b>% остаточной активности</b>
SEQ ID NO: 3
<5
R156Y
8
K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F
52
Q68H+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F
47
Q68H+T92V+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F
67
Q68H+R156Y+G200P+N331F
47
Q68H+R156F+G200P+N331F
66
Q68H+T92V+R156Y+G200P+M310V
41
Q68H+T92V+K118A+K129A+R156Y+H193T+D366H
54
Q68H+T92V+K118A+K129A+Q137E+R156Y+H193T+D366H
44
Q68H+T92V+R156Y+H193T+D366H
44
Q68H+T92V+R156F+H193T+D366H
37
Q68H+R156Y+H193T+D366H
36
Q68H+T92V+K118A+K129A+R156Y+H193T
50
Q68H+T92V+K118A+K129A+Q137E+R156Y+H193T
56
Q68H+T92V+R156Y+H193T
37
Q68H+T92V+R156F+H193T
37
Q68H+R156Y+H193T
44
Q68H+R156Y+H193T+G200P+M310V
34
Q68H+T92V+R156F+H193T+G200P+M310V
28
Q68H+T92V+K118A+K129A+Q137E+R156Y+H193T+G200P+M310V+E446K
47
Q68H+T92V+R156Y+H193T+G200P+M310V
47
Q68H+T92V+K118A+K129A+R156Y+H193T+G200P+M310V
56
<b>Таблица 38</b>Стерильно отфильтрованные образцы фермента, которые хранили в течение 16 часов при +44°С
<b>Мутации</b>
<b>% остаточной активности</b>
SEQ ID NO: 3
19
R156Y
49
G200S
28
G200D
25
G200Y
12
G200L
<5
G200P
37
G200W
<5
G200I
<5
G200N
9
G200F
<5
G200V
9
G200H
12
G200Q
19
G200C
17
G200A
24
G200M
6
G200K
11
G200E
48
G200R
<5
G200T
5
<b>Таблица 39</b>Стерильно отфильтрованные образцы фермента, которые хранили в течение 16 часов при +44°С
<b>Мутации</b>
<b>% остаточной активности</b>
SEQ ID NO: 3
13
R156Y
45
K21Q+K129A
34
K129A+K275Q
39
T9D+L34F+A83E+Q149E+H193T+S332P+R340T
43
N399I
24
L34F
22
Q149E
23
S332P
24
K129A
58
G518D
19
K118A+K129A
73
K118A
48
K129A+K169A
40
<b>Таблица 40</b>Очищенные образцы фермента, которые хранили в течение 5 дней при +46°С
<b>Мутации</b>
<b>% остаточной активности</b>
SEQ ID NO: 3
<5
R156Y
<5
Q68H+T92V+K118A+K129A+Q137E+R156Y+H193T+D366H
73
Q68H+R156Y+H193T
63
Q68H
13
Q68H+T92V+K118A+Q137E+R156Y+N331F
70
G78A+T92V+K118A+K129A+R156Y
44
K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F
46
Q68H+T92V+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F
83
Q68H+K129T+R156K+G200P+N331F
77
Q68H+T92V+K118A+K129A+R156Y+H193T+D366H
85
<b>Таблица 41</b>Стерильно отфильтрованные образцы фермента, которые хранили в течение 5 дней при +46°С
<b>Мутации</b>
<b>% остаточной активности</b>
SEQ ID NO: 3
<5
R156Y
<5
Q68H+T92V+K118A+K129A+Q137E+R156Y+H193T+N331K
70
Q68H+T92V+K118A+K129A+Q137E+R156Y+H193T+N331H
42
Q68H+T92V+K118A+K129A+Q137E+R156Y+H193T+N331Q
24
Q68H+T92V+K118A+K129A+Q137E+R156Y+H193T
33
Q68H+K118A+Q137E+R156Y+G200P+N331F
74
Q68H+S76W+T92V+K118A+Q137E+R156Y+G200P+N331F
87
K13A+Q68H+T92V+K118A+Q137E+R156Y+G200P
54
Q68H+T92V+K118A+Q137E+R156Y+G200P+D324N
53
Q68H+T92V+K118A+Q137E+R156Y+G200P+K470T
69
Q68H+T92V+K118A+Q137E+R156Y+G200P+N331F
75
Q68H+T92V+K118A+Q137E+R156Y+G200P
52
<b>Таблица 42</b>Стерильно отфильтрованные образцы фермента, которые хранили в течение 16 часов при +44°С
<b>Мутации</b>
<b>% остаточной активности</b>
SEQ ID NO: 3
13
R156Y
43
S76M
21
S76I
36
S76E
19
S76R
26
S76K
27
S76V
39
S76R
24
<b>Таблица 43</b>Стерильно отфильтрованные образцы фермента, которые хранили в течение 16 часов при +44°С
<b>Мутации</b>
<b>% остаточной активности</b>
SEQ ID NO: 3
20
R156Y
51
K118A+R156Y
62
R197A
<5
R20A
26
R267A
26
R295A
23
R314A
<10
R340A
23
A221K
25
M290R
23
M373Q
25
V397S
25
T417K
27
N441G+A442E+S443D
30
S467R+G468S+A469T
29
I473T
24
A490R
32
T517A+G518D
31
V431E
29
S76W+G200P+A224P
58
S76W+G200P
59
G200P+A224P
56
S76T
42
M310V
31
G200P
47
G200E
59
M310V+N399I
<10
Q68W
<5
<b>Таблица 44</b>Стерильно отфильтрованные образцы фермента, которые хранили в течение 16 часов при +46°С
<b>Мутации</b>
<b>% остаточной активности</b>
SEQ ID NO: 3
8
R156Y
40
Q68H+T92V+K118A+Q137E+N140F+R156Y+G200P+K470T
89
Q68H+T92V+K118A+S123P+K129A+Q137E+R156Y+G200P+ N331F
88
T92V+K118A+Q137E+R156Y+G200P+N331F
88
S76W+G200P+A224P
44
S76W+G200P
45
G200P+A224P
48
S76T
26
Q68H+T92V+K118A+Q137E+R156Y+G200P+M310L
91
Q68H+T92V+K118A+K129A+Q137E+R156Y+G200P+N331F
95
G200P
39
<b>Таблица 45</b>Стерильно отфильтрованные образцы фермента, которые хранили в течение 9 дней при +46°С
<b>Мутации</b>
<b>% остаточной активности</b>
SEQ ID NO: 3
<5
R156Y
<5
Q68H+T92V+K118A+K129A+Q137E+R156Y+H193T+N331K
46
Q68H+T92V+K118A+K129A+Q137E+R156Y+H193T+N331H
19
Q68H+T92V+K118A+K129A+Q137E+R156Y+H193T+N331Q
9
Q68H+T92V+K118A+K129A+Q137E+R156Y+H193T
17
Q68H+K118A+Q137E+R156Y+G200P+N331F
48
Q68H+S76W+T92V+K118A+Q137E+R156Y+G200P+N331F
65
K13A+Q68H+T92V+K118A+Q137E+R156Y+G200P
31
Q68H+T92V+K118A+Q137E+R156Y+G200P+D324N
30
Q68H+T92V+K118A+Q137E+R156Y+G200P+K470T
41
Q68H+T92V+K118A+Q137E+R156Y+G200P+N331F
50
Q68H+T92V+K118A+Q137E+R156Y+G200P
30
<b>Таблица 46</b>Очищенные образцы фермента, которые хранили в течение 9 дней при +46°С
<b>Мутации</b>
<b>% остаточной активности</b>
SEQ ID NO: 3
<5
R156Y
<5
Q68H+T92V+K118A+K129A+Q137E+R156Y+H193T+ D366H
52
Q68H+R156Y+H193T
34
Q68H+T92V+K118A+Q137E+R156Y+N331F
45
G78A+T92V+K118A+K129A+R156Y
14
K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F
18
Q68H+T92V+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F
56
Q68H+K129T+R156K+G200P+N331F
47
Q68H+T92V+K118A+K129A+R156Y+H193T+D366H
52
Q68H+R156Y+H193T
31
<b>Таблица 47</b>Стерильно отфильтрованные образцы фермента, которые хранили в течение 30 дней при +37°С
<b>Мутации</b>
<b>% остаточной активности</b>
SEQ ID NO: 3
<5
R156Y
<5
K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F
33
Q68H+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F
42
Q68H+T92V+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F
52
Q68H+R156Y+G200P+N331F
41
Q68H+R156F+G200P+N331F
58
Q68H+T92V+R156Y+G200P+M310V
41
Q68H+T92V+R156F+G200P+M310V
42
Q68H+T92V+K118A+K129A+R156Y+H193T+D366H
50
Q68H+T92V+K118A+K129A+Q137E+R156Y+H193T+D366H
32
Q68H+T92V+R156Y+H193T+D366H
33
Q68H+T92V+R156F+H193T+D366H
28
Q68H+R156Y+H193T+D366H
25
Q68H+T92V+K118A+K129A+R156Y+H193T
41
Q68H+T92V+K118A+K129A+Q137E+R156Y+H193T
43
Q68H+T92V+R156Y+H193T
27
Q68H+T92V+R156F+H193T
23
Q68H+R156Y+H193T
33
Q68H+R156Y+H193T+G200P+M310V
28
Q68H+T92V+R156F+H193T+G200P+M310V
21
Q68H+T92V+K118A+K129A+Q137E+R156Y+H193T+G200P+ M310V+E446K
35
Q68H+T92V+R156Y+H193T+G200P+M310V
35
Q68H+T92V+K118A+K129A+R156Y+H193T+G200P+M310V
46
<b>Таблица 48</b>Стерильно отфильтрованные образцы фермента, которые хранили в течение 16 часов при +44°С
<b>Мутации</b>
<b>% остаточной активности</b>
SEQ ID NO: 3
15
R156Y
49
A83S
15
A83N
9
A83Y
10
A83H
14
A83I
8
A83L
10
A83R
16
A83D
17
A83T
12
A83E
31
L34V
22
L34M
19
L34I
24
M310I
21
M310V
20
M310L
18
<b>Таблица 49</b>Стерильно отфильтрованные образцы фермента, которые хранили в течение 3 дней при +35°С
<b>Мутации</b>
<b>% остаточной активности</b>
SEQ ID NO: 3
61
R156Y
89
N331K
57
N331R
54
N331L
39
N331H
62
N331G
59
N331M
70
N331W
55
N331S
58
N331V
57
N331T
46
N331Y
55
N331I
47
N331A
87
N331Q
82
N331C
70
N331E
58
N331D
63
N331P
26
N331F
51
<b>Таблица 50</b>Стерильно отфильтрованные образцы фермента, которые хранили в течение 16 часов при +44°С
<b>Мутации</b>
<b>% остаточной активности</b>
SEQ ID NO: 3
20
R156Y
58
I10V+F17S+Q67M+N72S+S76D+G78A+Q82K+T104A+Q137E+ N153K+R156Q+V219A+I222V+V228I+D249N+S269N+V272A+ E333A+I337L+M356L+V397A+N415S+D420G+T421I+S424H+ N441D+D444Y+V450I+A469E+K470T+I473G+T517A+S522*
72
I10V+D33E+M40L+A41T+Q67M+Y73F+S76D+G78A+Q82K+ T92A+L102Q+Q137E+I222V+V228I+D249N+S269N+V272A+ E333A+I337L+M356L+T374A+S416A+D444Y+A469E+K470T+ I473G+T517A+S522*
71
I10V+F17S+D33E+M40L+Q67M+N72S+S76D+G78A+Q82K+ T92A+L102Q+Q137E+H164N+N168K+T172A+V219A+I222V+ V228I+D249N+S269N+V272A+E333A+I337L+M356L+N415S+ T421I+S424H+N441D+D444Y+S522P+P523V+V524E
78
I10V+F17S+D33E+Q67M+N72S+S76D+G78A+Q82K+T92A+ L102Q+Q137E+N168K+T172A+I222V+V228I+D249N+V272A+ E333A+I337L+M356L+V397A+S416A+T421I+S424H+N441D+ D444Y+A469E+K470T+I473S+V477I+E489A+A490V+T517A+ S522*
74
I10V+F17S+M40L+Q67M+N72S+S76D+G78A+Q82K+T92A+ L102Q+Q137E+I222V+V228I+D249N+S269N+V272A+T320A+ I337L+M356L+T374A+V397A+N415S+T421I+S424H+N441D+ D444Y+A469E+K470T+I473S+V477I+T517A+S522P+P523V+ V524E
73
I10V+F17S+D33E+M40L+A41T+Q67M+N72S+S76D+G78A+ Q82K+Q137E+V219A+D249N+V272A+I337L+M356L+V397A+ S416A+T421I+S424N+N441D+D444Y+V450I+K470T+I473S+ V477I
64
I10V+F17S+Q67M+N72S+S76D+G78A+Q82K+T92A+T104A+ Q137E+R156Q+V159A+H164N+N168K+T172A+I222V+V228I+ D249N+V272A
66
K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F
98
Q68H+T92V+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F
Прибл. 100
<b>Таблица 51</b>Стерильно отфильтрованные образцы фермента, которые хранили в течение 2 дней при +44°С
<b>Мутации</b>
<b>% остаточной активности</b>
SEQ ID NO: 3
<5
R156Y
20
Q68H+R156Y
61
Q68H+T92V+K118A+R156Y
66
Q68H+T92V+R156Y
68
Q68H+K118A+R156Y+H193T+D366H
74
Q68H+T92V+K118R+R156Y+H193T+D366H
65
Q68H+T92V+K118R+R156F
63
Q68H+K118R+R156Y
68
Q68H+T92V+R156Y+H193T+D366H
69
Q68H+K118R+R156Y+G200P
74
Q68H+K118R+R156F
66
K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F
79
Q68H+T92V+K118A+K129A+R156Y+G200P+N331F
91
Q68H
55
D33V+Q68H+N168H+V450I
70
S123T
10
K129A
10