СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РАЗМЕРОВ НАНОЧАСТИЦ, ДОБАВЛЕННЫХ В ИСХОДНЫЙ КОЛЛОИДНЫЙ РАСТВОР
METHOD FOR DETERMINING SIZES OF NANOPARTICLES ADDED TO INITIAL COLLOIDAL SOLUTION

Изобретение относится к области исследования и анализа материалов, а именно к способам измерения параметров наночастиц, взвешенных в жидкости, оптическими методами, и может быть использовано для определения размеров и распределений по размерам наночастиц, добавляемых в исходный коллоидный раствор, в котором уже присутствуют наночастицы, отличные от добавляемых.
Предлагаемый способ может быть использован в биомедицинских технологиях, в случаях, когда в биосистему, содержащую естественные компоненты нанометрового диапазона (например, белковые молекулы в плазме крови), вводят биосовместимые нанообъекты с лекарственными препаратами. Возникает задача отслеживания поведения добавляемых наночастиц в многокомпонентной дисперсии, а именно - изменения размеров вводимых частиц, например, из-за образования оболочек или агрегации частиц.
Для получения информации о размере и распределении по размерам наночастиц используются такие оптические методы, как статическое рассеяние, лазерная дифракция и динамическое рассеяние света (метод фотонно-корреляционной спектроскопии). Лазерная дифракция и статическое рассеяние света основаны на измерении зависимости интенсивности рассеянного излучения от угла рассеяния и вычислении из полученной зависимости размеров и распределений по размерам рассеивающих частиц, для расчетов применяются теория Фраунгофера (лазерная дифракции) и теория Ми (статическое рассеяние света).
Метод динамического рассеяния света (ДРС) основан на измерении флуктуаций интенсивности лазерного излучения, рассеянного частицами. Для зарегистрированных зависимостей интенсивности рассеянного излучения от времени определяют автокорреляционные функции (АКФ). Вычисление по измеренной АКФ размеров анализируемых частиц осуществляют с помощью математических алгоритмов, простейшим из которых является метод кумулянтов, рекомендуемый стандартами (ISO 22412-2008. Particle size analysis - Dynamic light scattering (DLS), 2011). Этот метод заключается в разложении АКФ в ряд и использовании коэффициентов этого ряда (кумулянтов) для определения среднего гидродинамического диаметра. Для восстановления распределений по размерам используют алгоритмы обратного преобразования Лапласа, например, CONTIN или NNLS (ASTM Е2490-09. Standard Guide for Measurement of Particle Size Distribution of Nanomaterials in Suspension by Photon Correlation Spectroscopy (PCS), 2015). Вычисляемая таким образом, функция распределения показывает относительный вклад частиц с определенным диаметром в интенсивность рассеянного излучения и называется распределением по размерам. В современных приборах расчет распределения по размерам производится автоматически.
Скорость счета фотонов (число импульсов в секунду) является показателем реальной интенсивности рассеянного света и в современных приборах ДРС используется как дополнительная оптическая характеристика, вспомогательный параметр при подборе оптического фильтра, и в расчетах не участвует. Использование в вычислениях скорости счета фотонов известно, однако, для решения другой задачи - для определения относительной концентрации наночастиц в одном из образцов по отношению к другому методом ДРС (В.В. Высоцкий, О.Я. Урюпина, А.В. Гусельникова, В.И. Ролдугин. О возможности определения концентрации частиц методом динамического светорассеяния, Коллоидный журнал, 2009, том 71, №6, с. 728-733).
обр
Из уровня техники известен способ определения размеров наночастиц, включающий облучение раствора с наночастицами лазерным излучением, измерение для него текущей интенсивности рассеянного излучения в течение заданного периода времени и расчет распределения по размерам наночастиц в указанном растворе I(d) методом динамического рассеяния (см. патент US 2016169878, кл. G01N 33/543, опубл. 16.06.2016). Основным недостатком этого способа является то, что при вычислении размеров наночастиц, добавленных в исходный коллоидный раствор, требуется, чтобы рассеяние на вводимых частицах не менее чем на порядок, превышало рассеяние от наночастиц, изначально находившихся в растворе. Приходится либо разбавлять исходную коллоидную систему, либо увеличивать концентрацию добавляемых частиц, что в некоторых случаях крайне нежелательно, например в плазме крови и других биологических средах.
Для оптически анизотропных частиц используют метод деполяризованного ДРС (ДДРС), который предусматривает измерение АКФ интенсивности при двух положениях поляризационного анализатора в системе сбора рассеянного излучения: одно из них обеспечивает поляризацию VV, совпадающую с поляризацией падающего излучения, другое - поляризацию VH, перпендикулярную ей (с помощью поворота поляризационного анализатора на угол 90°). Измеряют АКФ интенсивности рассеянного света при двух положениях поляризационного анализатора: VV и VH. По измеренным АКФ вычисляют коэффициенты трансляционной и ротационной диффузии, по коэффициентам диффузии - размеры исследуемых частиц.
обр
Наиболее близким к заявляемому является способ определения размеров наночастиц, добавленных в исходный коллоидный раствор, включающий облучение раствора с добавленными наночастицами лазерным излучением, измерение для него текущей интенсивности рассеянного излучения в течение заданного периода времени и расчет распределения по размерам наночастиц в указанном растворе I(d) методом динамического рассеяния (S. Balog et al. Characterizing nanoparticles in complex biological media and physiological fluids with depolarized dynamic light scattering // Nanoscale, 2015, V. 7, PP. 5991-5997). Этот способ позволяет определять размеры анизотропных золотых наночастиц, добавляемых в жидкую среду, содержащую различные рассеивающие нанообъекты, методом деполяризованного ДРС. Подход основан на том, что нанообъекты в исходном растворе оптически изотропны, а добавляемые наночастицы - оптически анизотропны, при этом вклад в деполяризованную компоненту рассеянного излучения вносят только анизотропные частицы. Основным недостатком такого способа является невозможность его применения в случае, если добавляемые частицы оптически изотропны (например, липосомы). Кроме того, этот способ требует наличия дорогого прибора деполяризованного ДРС, который имеется далеко не во всякой исследовательской лаборатории.
обр
ф
ф
обр
ф
обр
Задачей изобретения является устранение указанных недостатков и разработка способа, который может быть реализован с помощью стандартного оборудования. Технической результат заключается в упрощении определения размеров наночастиц, добавленных в исходный коллоидный раствор. Поставленная задача решается, а технический результат достигается тем, что в способе определения размеров наночастиц, добавленных в исходный коллоидный раствор, включающем облучение раствора с добавленными наночастицами лазерным излучением, измерение для него текущей интенсивности рассеянного излучения в течение заданного периода времени и расчет распределения по размерам наночастиц в указанном растворе I(d) методом динамического рассеяния, предварительно аналогичным образом получают распределение по размерам наночастиц в исходном растворе I(d), измеряют среднюю скорость счета фотонов в течение указанного периода времени для исходного раствора Р и раствора с добавленными наночастицами Р, измеряют коэффициенты пропускания на длине волны лазерного излучения для исходного раствора Т и раствора с добавленными наночастицами Т, после чего рассчитывают распределение по размерам добавленных наночастиц как
, где , а .
ф
На фиг. 1 представлено распределение по размерам наночастиц в исходном растворе (плазме крови) I(d), в относительных единицах;
обр
на фиг. 2 - в растворе с добавленными наночастицами (липосомы в плазме крови) I(d), в относительных единицах;
р
на фиг. 3 - распределение I(d) для липосом, в единицах скорости счета фотонов.
В современных приборах ДРС интенсивность рассеянного излучения измеряется в относительных единицах, разных для каждого образца. Суть предлагаемого способа заключается в переходе от относительных единиц к единицам скорости счета фотонов, которые будут одинаковы для всех образцов, измеренных на одном приборе ДРС. Таким образом, предлагаемый способ не будет зависеть от поляризационных свойств исследуемых частиц и не потребует переоборудования стандартного прибора ДРС.
Предлагаемый способ подразумевает реализацию следующей последовательности действий.
1) В кювету с прозрачными стенками, предназначенную для измерений размеров наночастиц методом ДРС, помещают исходный коллоидный раствор (фон), содержащий наночастицы не известного заранее размера.
ф
ф
2) Кювету устанавливают в измерительный отсек анализатора размеров частиц, реализующего метод ДРС (например, прибора АРН-2, Malvern Zetasizer). Исходный раствора облучают лазерным излучением и в течение 2-3 минут измеряют текущую интенсивность рассеянного излучения, на основе которой прибор автоматически рассчитывает распределение по размерам фоновых наночастиц в указанном исходном растворе I(d). Существующие анализаторы размеров частиц выдают результат измерения в относительных единицах, которые различны для разных образцов. Параллельно измеряют среднюю скорость счета фотонов в течение указанного периода времени для исходного раствора Р.
ф
3) С помощью спектрофотометра измеряют коэффициент пропускания исходного коллоидного раствора Т на длине волны лазерного излучения.
4) Затем в исходный коллоидный раствор добавляют исследуемые наночастицы также не известного заранее размера.
обр
обр
5) Полученный образец раствора вновь облучают лазерным излучением и в течение 2-3 минут измеряют текущую интенсивность рассеянного излучения, на основе которой прибор автоматически рассчитывает распределение по размерам в растворе с добавленными наночастицами I(d), выраженное в относительных единицах. Параллельно измеряют среднюю скорость счета фотонов в течение указанного периода времени Р.
обр
6) С помощью спектрофотометра измеряют коэффициент пропускания полученного образца раствора с добавленными наночастицами Т на длине волны лазерного излучения.
ф
обр
7) В обоих полученных распределениях I(d) и I(d) осуществляют переход от относительной шкалы интенсивности к шкале, выраженной в единицах скорости счета фотонов (имп/с), скорректированной с учетом эффекта внутреннего фильтра (поглощения падающего и рассеянного излучения при прохождении внутри кюветы).
p
8) Приведенное распределение для исходного раствора вычитают из аналогично приведенного распределения для раствора с добавленными наночастицами и получают искомое распределение по размерам добавленных наночастиц I(d).
Упомянутый переход от относительной шкалы интенсивности к шкале, выраженной в единицах скорости счета фотонов (имп/с), осуществляют путем использования интегрального значения распределения в относительных единицах и средней скорости счета фотонов, которую измеряет анализатор размеров частиц. Интегральное значение распределения рассчитывают следующим образом.
k
Пусть I(d) - относительная интенсивность рассеянного излучения. Если весь диапазон распределения по размерам разделить на N интервалов (k - номер интервала, а I(d) - относительная интенсивность рассеянного излучения на k-том интервале), то
,
где  - интенсивность в единицах скорости счета на k-м интервале (имп/с), F - коэффициент пропорциональности. При этом
,
где Р - средняя скорость счета (имп/с). Тогда
.
При уменьшении величины интервалов .
Определив таким образом коэффициент F, можно от интенсивностей в относительных единицах перейти к интенсивностям, выраженным в единицах скорости счета.
обр
ф
Однако для корректного перехода необходимо дополнительно учесть коэффициенты пропускания Т и Т, т.к. в некоторых анализаторах размеров частиц оптическая схема построена таким образом, что рассеивающий объем находится в центре поперечного сечения кюветы и имеет место эффект внутреннего фильтра. Корректировка, учитывающая эффект внутреннего фильтра, основана на том, что для указанных оптических схем искомая средняя скорость счета фотонов Р* зависит от пропускания кюветы Т и полученной средней скорости счета фотонов Р как
.
обр
ф
Исходя из предложенного алгоритма, I(d) и I(d), разбивают на интервалы и получают соответствующие интегральные значения. После чего искомое распределение по размерам добавленных наночастиц рассчитывают по формуле
, где  , а .
Пример.
Для проверки предложенного способа были исследованы изменения размеров липосом при их попадании в плазму крови человека. В настоящее время липосомы рассматриваются как перспективные носители для адресной доставки лекарств, поэтому их поведение в плазме, особенно неразбавленной, представляет значительный интерес. Всего были исследованы образцы плазмы от 5 доноров, предоставленные РНИМУ им. Н.И. Пирогова.
ф
обр
Вначале измерили распределения I(d) для исходных образцов плазмы, далее в плазму ввели концентрированную суспензию липосом (80 мкл на 1 мл плазмы) и измерили распределение I(d) для полученного таким образом раствора. Измерения проводили на ДРС анализаторе АРН-2 при угле рассеяния 90°, коэффициенты пропускания измерили на спектрофотометре СФФ-2 «ФЛУОРАН» (оба прибора разработаны ФГУП «ВНИИОФИ»). Затем произвели обработку полученных данных согласно предлагаемому способу. Результаты измерений и их обработки приведены на фиг. 1-3. Полученное распределение по размерам добавленных наночастиц соответствует теоретическим расчетам.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет быстро и просто определять размеры наночастиц, добавленных в исходный коллоидный раствор, используя при этом стандартное лабораторное оборудование.