ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ПЛОТНАЯ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ И СБОРА БИОМАССЫ ВАКЦИННОГО ШТАММА ЧУМНОГО МИКРОБА Y.pestis EV
DENSE NUTRIENT MEDIUM FOR CULTIVATION AND COLLECTION OF BIOMASS OF VACCINE STRAIN OF PLAGUE MICROBE YERSINIA PESTIS EV

Изобретение относится к микробиологии, именно к приготовлению микробиологических питательных сред для культивирования и сбора биомассы вакцинного штамма чумного микроба Y.pestis ЕУи может быть использовано в получении достаточного количества биомассы с определенным процентом живых микробных клеток.
Известна питательная среда для культивирования вакцинного штамма чумного микроба Y. pestis EV включающая, г/л: гидролизат говяжьего мяса, содержащего аминного азота 0,12%, натрий хлористый 4,0; натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12-водный 4,0; натрий сернистокислый 0,04; кислота соляная (1:1) 1,6; агар микробиологический 24,0; питьевая вода до 1 литра. (Промышленный регламент на производство вакцины чумной живой, лиофилизата для приготовления суспензии для инъекций, накожного скарификационного нанесения и ингаляций. ПР 01897080-09-09. Регистрационный №2134-09. 2009 г. 253 с).
Недостатком данной среды является ее дороговизна.
Наиболее близкой к предполагаемому изобретению относится питательная среда для культивирования вакцинного штамма чумного микроба Y. pestis EV, состоящая из смеси двух гидролизатов в соотношении 1:2: гидролизат кукурузного экстракта, содержащего аминного азота 0,45% -42,5 мл; гидролизат казеиновый, содержащего аминного азота 0,45% - 85 мл; натрий хлористый -3,0; натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12-водный -0,2; натрий сернистокислый- 0,4; молибденовый аммоний -0,5; агар микробиологический 30,0; рН 7,0±0,2, питьевая вода до 1 литра. Смесь тщательно перемешивают и выливают в загрузочный люк установки ферментативного гидролиза для сушки белковых гидролизатов. Высушивание ведут при температуре (80±2)° С, под вакуумом не мене 0,6 атм (НПО) «Аллерген» Г. Ставрополь). Высушенный агар измельчают керамическими шарами в сушильной камере в течение 2,5-3 ч, периодически (каждые 15-20 мин), меняя ее положение (от горизонтального до предельного наклона влево и право) для перемешивания. (Использование питательной среды на основе кукурузного экстракта в производстве чумной вакцины ЕВ: дис… кандидата биологических наук / К.С.Гюлушанян. - Ставрополь, 1994. - 148 с).
Недостатком данной среды является сложность в ее приготовлении.
Целью изобретения является разработка способа приготовления питательной среды плотной для культивирования и сбора биомассы вакцинного штамма чумного микроба Y. pestis EV, которая повышает накопительные свойства питательной среды.
Достигаемый технический результат заключается в том, что питательная среда в качестве питательной основы содержит ферментативный гидролизат кукурузной патоки (жидкой) и ферментативный гидролизат говяжьего мяса в соотношении 2:1, среда также включает: натрий хлористый; натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12 - водный; натрий сернистокислый; агар микробиологический; питьевую воду с добавлением в среду стимулирующей добавки - железо сернокислое закисное 7 водное, при следующем соотношении ингредиентов, г/л:
Ферментативный гидролизат кукурузной
патоки (жидкой) 100 - 177 - 254 мл
Ферментативный гидролизат
говяжьего мяса 60 - 89 - 118 мл
Натрий хлористый
4,0 - 5,0 - 6,0 г
Натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12 -водный
3,0 - 4,0 - 5,0 г
Натрий сернистокислый
0,3 - 0,4 - 0,5 г
Железо сернокислое закисное 7 водное
0,03 - 0,05 - 0,07 г
Агар микробиологический
16,0 - 19,0 - 22,0 г
Питьевая вода
до 1 л.
1
2
3
4
5
6
Кукурузная патока (жидкая), содержащая в среднем 9,4% белка. Благодаря высокому содержанию в сухом остатке азотистых веществ (до 45%) и углеводов (до 25%) как и экстракта, патока является хорошей питательной средой при производстве пенициллина и других антибиотиков и витаминов. Кроме того, она богат микроэлементами, мг/кг: цинк 22; марганец 5; медь 5; кобальт 0,02; йод 0,30, макроэлементами, в %: фосфора 0,25; натрия 0,04; кальция 0,59; калия 0,36; магния 0,12; серы 0,11; хлора 0,04; аминокислотами, в %: аргинина 90,0; гистидина 72,0; лейцина 72,0; изолейцина 89,0; фенилаланин 59,0; треонин 95,0; валин 12,7; лизина 0,96; метионина 0,56; триптофана 0,22; метионин+цистин 0,27 и витаминами, мг/кг: каротин (витамин А) 8,0; В 4,0; В1,0; В (пантотеновая кислота) 6,5; В (холин) 400; В 17; В 2,9. Как известно, кукурузные белки характеризуются повышенным содержанием треонина, гистидина, лейцина, валина, поставляющих макроэргические связи, кукурузные белки содержат также большое количество таких незаменимых аминокислот как изолейцин, лейцин, аргинин, фенилаланин. (М.Ф. Нестерин, И.М. Скурихин. Химический состав пищевых продуктов. Москва. «Пищевая промышленность». 1979. 247 с). Имеются также сведения о способности лейцина, как аминокислоты с разветвленной белковой цепью, инициировать синтез белка (Е.А. Газов, X.С.Морган, /США/ 1989).
Натрий хлористый, хч, ГОСТ 4233-77 партия 24, срок годности 12.2015. Бактерии нуждаются в минимальном количестве солей. Будучи растворены в питательной среде и находясь в состоянии электролитического распада, ионизируемые минеральные соединения являются одновременно катализаторами различных химических процессов, происходящих в микробной клетке.
Включение в состав среды натрия фосфорнокислого 2- замещенного 12 - водного обосновано широким использованием фосфатов при приготовлении питательных сред, т.к. это единственные неорганические соединения, обладающие буферным действием в физиологически важном диапазоне рН, они малотоксичны (Методические рекомендации по изготовлению и использованию питательных сред и растворов для микробиологических целей, культивирования клеток и вирусов-М.,1989). (М.С.Поляк; В.И. Сухаревич; М.Э. Сухаревич. Питательные среды для медицинской и санитарной микробиологии. СПб.: ЭЛБИ-СП6.-2008. - С. 37 - 38).
Натрий сернистокислый ГОСТ- 195-77 ЧДА, дата поступления 19.12.17 г., партия №15, порошок белого цвета, растворим в воде. Выдерживает испытание п. 3.4. ГОСТ 197-77. Определение щелочности, %, не более 0,048. Массовая доля основного вещества, %, не менее 99,1. Дата контроля 26.01.16 г. Срок хранения 6 месяцев. Изготовитель АО «Химический завод им. Л.Я. Карпова. Натрий сернистокислый является стимулятором роста микроорганизмов, источником серы и восстановителем окислительно-восстановительного потенциала питательной среды. Сера присутствующая в натрии сернистокислом необходима для белка клеток микроорганизмов в количестве 1%. Для подавляющего числа микроорганизмов, в том числе и патогенных, благоприятной средой для роста и размножения является нейтральная реакция среды (рН 7,0±0,5), поэтому уровень рН среды до нужного значения необходимо контролировать, этот фактор доводят до нужного использованием сернистых солей или кислот. Этим фактором и является натрий сернистокислый. При добавлении натрия сернистокислого среда становится прозрачнее.
4
2
Железо сернокислое закисное 7 водное Ч. ГОСТ - 4168-48, партия 118. Дата изготовления 0.2-2017 г. Изготовитель « Донецкий завод химических реактивов». В своем составе содержит: 99% железа FeSo - 7 НO, меди -0,02%, хлориды - 0,0005%. Железо как макроэлемент микроорганизмы получают в виде катионов неорганических веществ.
Агар микробиологический - агар бактериологический (европейский тип). Производитель: «Pronadisa» Испания. Партия LF 15130184. Срок годности до 09.2020 г. Дата изготовления: август 2017 г. Порошок светло-кремового цвета сероватого оттенка, запах без постороннего, свойственный студню с массовой долей сухого агара 0,85%. Температура плавления студня с массовой долей сухого агара 0.85% не ниже 80°С, температура застудневания - 30-37°С, прочность студня не менее - 350±40 г. Главная особенность агара - его желирующая способность.
Питьевая вода - ГОСТ 8-51-232-98 отвечает всем гигиеническим требованиям.
Приготовление ферментативного гидролизата из кукурузной патоки (жидкой)
Способ приготовления питательной среды плотной для культивирования и сбора биомассы вакцинного штамма чумного микроба Y. pestis EV заключается в следующем: кукурузную патоку (жидкую) в количестве 12,0 кг помещают в варочный котел, затем добавляют 36,0 л питьевой воды кипятят в течение 15 минут, устанавливают до рН 8,2-8,5 ед 40% раствором натрия гидроокиси в количестве 529 мл, затем настой сливают в 10 л баллоны, охлаждают до 42°С. В остуженный настой добавляют поджелудочную железу крупного рогатого скота (КРС) из расчета 100,0 на 1 л, добавляют 1,5% хлороформа. Гидролиз ведут в термокамере при температуре 42°С в течение 10 сут. В первый день смесь перемешивают через каждые 15 мин, в последующем смесь перемешивают через каждые 2 ч. Ежедневно измеряют уровень аминного азота. На 10 сутки аминный азот составил 660 мг%, а сухой остаток соответственно 16,6%. С прекращением нарастания аминного азота, что бывает на 7-10 сутки, прекращают перемешивать и подогревать. Дают отстояться в течение 2 суток, затем жидкость отфильтровывают от осадка на пресс-фильтре, разливают по бутылям с добавлением 1% хлороформа, пробкуют стерильными резиновыми пробками и хранят при температуре 4-6°С.
Приготовление ферментативного гидролизата из говяжьего мяса в реакторе
2
3
Наливают в котел питьевую воду, погружают обработанное мясо из расчета (на 1 кг мяса 1,5 литра воды). Мясо без жира, сухожилий и пленок режут на кусочки размером 2,5×2,5 см. Варят мясо 15-20 мин, затем вынимают, охлаждают и пропускают через мясорубку. Бульон остывший до 50°С подщелачивают NaСО из расчета 3,0 г соды на 1 л взятой в реактор воды. Добавляют поджелудочную железу дважды пропущенную через мясорубку из расчета 80,0 - 100,0 г железы на 1 л воды в зависимости от активности ее. Активность должна быть не менее 5 тыс единиц по Фульд -_Гроссу. Проверяют рН, которое должно быть 8,5±0,2. Добавляют хлороформ 2% к общему объему жидкости. Первые сутки гидролизат перемешивают механической мешалкой через каждые 15 мин по 5 мин. В дальнейшем переводят на автоматическую мешалку, которая включается через каждые 2 ч на 5 мин. Ежедневно определяют аминный азот в гидролизате. С прекращением нарастания аминного азота, что бывает на 7-9-10 сутки, мешалку и подогрев отключают.Об окончании гидролиза судят по достижению аминного азота 0,7% - 0,9%. Дают отстояться 2 суток, затем отфильтровывают от осадка на пресс-фильтре, разливают в 10 литровые бутыли, добавляют хлороформ 2%, пробкуют резиновыми пробками, хранят в холодовой при температуре 6±2°С.
Способ приготовления питательной среды плотной
Питательную среду на основе ферментативного гидролизата кукурузной патоки (жидкой) и ферментативного гидролизата говяжьего мяса в соотношении 2:1 для культивирования и сбора биомассы вакцинного штамма чумного микроба Y.pestis EV готовят следующим способом: г/л, ферментативный гидролизат кукурузной патоки, разбавленный питьевой водой до показания аминного азота 0,12% 177 мл, смешивают с ферментативным гидролизатом говяжьего мяса, разбавленный питьевой водой до показания аминного азота 0,12% в количестве 89 мл, натрий хлористый 5,0 г; натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12-водного 4,0 г; агар микробиологический 19,0 г; натрий сернистокислый 0,4 г, дистиллированная вода до 1 литра. Среду кипятят до полого растворения, затем устанавливают рН 7,2±0,1 с помощью 20% раствора натрия гидроокиси, фильтруют через ватно - марлевый фильтр добавляют стимулирующую добавку железо сернокислое закисное 7 водное 0,05 г, разливают в градуированные флаконы (матрацы) по 50,0 мл, затем стерилизуют при 0,5 атм. в течение 30 мин. После стерилизации, охлаждают до 56°С, затем скашивают.
9
9
Перед приготовлением производственной культуры проводят анимализацию вакцинного штамма чумного микроба Y.pestis EV путем пассажа через организм морской свинки. Все стерильные бактериологические пипетки перед работой хранят в условиях холодильника при (4±1) °С. Ампулу с сухой культурой штамма EV вскрывают с соблюдением правил асептики, разводят ее содержимое 0,9% раствором натрия хлорида и засевают микробной взвесью ряд пробирок со скошенным агаром Хоттингера рН 7,1±0,1 (исходная культура или культура I генерации). Одновременно контролируют ее культурально -морфологические и ферментативные свойства, высевают по 2 пробирки со средами Гисса с сахарозой, лактозой, рамнозой и глицерином, к которым добавляют индикатор Андреде, и высевают на 3 чашки Петри с агаром Хоттингера рН 7,3±0,1. Также культуру высевают на 3 чашки Петри с агаром Хоттингера рН 7,1±0,1, которые в дальнейшем используют последовательного рассева с целью получения изолированных колоний. Все чашки Петри с посевами помещают на (48±2) ч для выращивания в термостат при температуре (27±1) °С. В том случае, если культура без диссоциации т.е. морфология колоний типична для чумного микроба и вакцинный штамм стойко удерживает свой биохимический тип, исходную культуру I генерации пересевают в бактериологические пробирки (культура II генерации). Посевы инкубируют (24±1) ч при (27±1) °С. Через сутки пробирки с культурой II генерации используют для культивирования вакцинного штамма чумного микроба на скошенные поверхности во флаконы (матрацы). В качестве примера испытывают культуру вакцинного штамма чумного микроба EV выращенную на пластинках 2% агара Хоттингера, рН 7,2±0,1 при температуре (27±1) °С.Затем готовят взвесь I суточной культуры тест-штамма, соответствующую 10 ед по оптическому стандартному образцу ОСО мутности бактериальных взвесей 42-28-85 (ЮМЕ) 2017 года выпуска ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России, эквивалентную 1,0×10 м.к./мл в стерильном 0,9% растворе натрия хлорида, затем разведением взвеси 1×1 из 1,0×10 доводят содержания в 1 мл 500 млн. м.к. из данного разведения взвеси культуры высевают по 1,0 мл в 3 флакона (матраца), затем покачиванием распределяют взвесь по скошенной поверхности агара, оставляют на специально смонтированных подставках в скошенном состоянии, помещают в термостат.Выращивают в течение (48±2) ч при (27±1) °С.
Учет результатов проводят через (48±2) ч. После чего производят смыв выращенной культуры 5 мл 0,9% раствором натрия хлористого из каждого флакона (матраца) путем отсасывания биомассы в градуированную пробирку объемом 25 мл стерильной бактериологической пипеткой объемом 5 мл и устанавливают концентрацию микробов в 1 мл суспензии по ОСО мутности.
Методика подсчета количества микробных клеток
7
8
Для подсчета количества (%) живых микробных клеток в суспензии собранной при выращивании чумного микроба и сбора биомассы вакцинного штамма чумного микроба на матрацах с питательной средой приготовленной на основе ферментативного гидролизата патоки кукурузной (жидкой) (растительное сырье) и ферментативного гидролизата говяжьего мяса (животное сырье), в соотношении 2:1, необходимо брать 0,5 мл взвеси титровать в 0,9% физиологическом растворе до разведений 10 и 10 с последующем посевом по 0,1 мл в 2 чашки Петри. Учет производят через 48±2 ч путем подсчета количества выросших колоний, где вырастает не менее 150 и 25 колоний соответственно. При этом оценивается характер роста культуры на плотной среде.
Пример 1. Тест-штамм выращивали на скошенной поверхности питательной среды содержащей, г/л: ферментативный гидролизат кукурузной патоки (жидкой) 100 мл; гидролизат говяжьего мяса 60,0 мл; натрий хлористый 4,0 г; натрий фосфорнокислый 2 - замещенный 12 - водный 3,0 г; натрий сернистокислый 0,3 г; железо сернокислое закисное 0,03 г, агар микробиологический 16,0 г; питьевая вода до 1 л. При таком соотношении ингредиентов сбор биомассы Y. pestis EV составляет 12 мл взвеси, в 1 мл, которой получают 45 млрд.м.к., процент живых м.к. через (48±1) ч соответственно 40,0.
Пример 2. Тест-штамм выращивали на скошенной поверхности питательной среды, содержащей, г/л: ферментативный гидролизат кукурузной патоки (жидкой) 177 мл; гидролизат говяжьего мяса 89 мл; натрий хлористый 5,0 г; натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12 - водный 4,0 г; натрия сернистокислого 0.4 г; железо сернокислое закисное 7 водное 0,05 г, агар микробиологический 19,0 г; питьевая вода до 1 л. При таком соотношении ингредиентов сбор биомассы Y. pestis EV составил 13 мл взвеси, в 1 мл, которой получают 65 млрд. м.к., процент живых м. к. через (48±1) ч соответственно 70,7.
Пример 3. Тест-штамм выращивали на скошенной поверхности питательной среды, содержащей, г/л; ферментативный гидролизат кукурузной патоки (жидкой) 254 мл; гидролизат говяжьего мяса 118 мл; натрий хлористый 6,0 г; натрий фосфорнокислый 2 - замещенный 12 - водный 5,0 г; натрий сернистокислый 0,5 г; железо сернокислое закисное 7 водное 0,07 г, агар микробиологический 22,0 г; питьевая вода до 1 л. При таком соотношении ингредиентов сбор биомассы Y. pestis EV составил 12,1 мл взвеси, в 1 мл, которой получено 37 млрд. м.к., процент живых микробных клеток через (48±1) ч соответственно 35.
Y
Таким образом, заявленный способ приготовления питательной среды плотной для культивирования и сбора биомассы вакцинного штамма чумного микроба  pestis EV (пример 2), приготовленная на основе ферментативного гидролизата кукурузной патоки (жидкой) и гидролизата говяжьего мяса в соотношении 2:1 может применяться для культивирования и сбора биомассы вакцинного штамма чумного микроба Y. pestis EV, которая обеспечивает достаточное количество биомассы с определенным процентом живых микробных клеток.