Способ диагностики меланомы хориоидеи
METHOD FOR DIAGNOSIS OF CHOROIDAL MELANOMA

Изобретение относится к области офтальмоонкологии и молекулярной биологии.
Меланома хориоидеи - злокачественная опухоль, встречается в 92% среди всех случаев меланом сосудистой оболочки глаза [Shields C.L. et al, 2000; Damato E.M., 2012; Бровкина А.Ф., 2018;Singh N., 2019], характеризуется гематогенным метастазированием: таргетный орган - печень (93-95%) [Diener-West М. et al, 2001; Singh A.D. et al., 2011]. K факторам риска метастазирования относят: старший возраст пациента; большие размеры меланомы хориоидеи (толщина более 5 мм, диаметр более 15 мм); распространение на цилиарное тело или первичную локализацию в нем; морфологически - эпителиоидный тип опухоли. Лучший витальный прогнозв течении 5 лет наблюдают при начальных меланомах толщиной до 3 мм., максимальным диаметром до 10 мм [Shields C.L. et al, 2009; Бровкина А.Ф. и соавторы, 2016]. Существующие методы клинического и инструментального цифрового исследования не являются абсолютными. Дифференциальная диагностика, особенно начальных меланом, затруднена. По-прежнему актуален вопрос раннего уточнения истинного характера патологического процесса и раннего выявления возможного (скрытого) метастазирования.
МикроРНК-малые некодирующие молекулы РНК выявлены в плазме крови больного колоректальным раком в 2009 году [Gillotin S. et al]. В 2012 году обнаружены микроРНК в плазме крови больных меланомой хориоидеи с метастазами в печень [Triozzi P.L. et al]. На апрель 2021 года в зарубежной литературе опубликовано 5 работ (одна из них имеет повторение в разных журналах) [Triozzi P.L. et al, 2012, 2016; Achberger S. et al, 2014; Ragusa M.et al, 2015; Russo A. et al, 2016].
К настоящему времени BmiRbase зарегистрировано 2654 микроРНК у человека [Kozomara A., 2019], а исследованы в плазме крови больных меланомой сосудистой оболочки глаза всего 12 микроРНК. Необходимо отметить, что в опубликованных работах отсутствуют сведения об изменения уровня экспрессии микроРНК с учетом размеров опухоли. Выводы авторов опубликованных работ основаны на небольшом клиническом материале (6-16 больных). Больных находящихся в четвертой стадии опухолевого процесса (гематогенные метастазы в печень) [Triozzi P.L. et al, 2012, 2016; Achberger S. et al, 2014; Ragusa M. et al, 2015; Russo A. et al, 2016].
Что касается исследования плазмы крови больных одиночным узлом меланомы хориоидеи без метастазов, то к настоящему времени имеется только 2 публикации [Ragusa M. et al, 2015; Russo A. et al, 2016], основанных на результатах исследования 14 больных. В качестве биомаркера использованы микроРНК-146а, микроРНК-155, микроРНК-223.
В общей онкологии утверждены патенты на диагностическую ценность выявления микроРНК в плазме крови больных раком молочной железы, немелкоклеточным раком легкого, колоректальным раком [Поспехова Н.И. с соавт. 2012; Запорожченко И.А., 2018; Шевченко О.П. с соавт., 2020].
Задача настоящего изобретения - определить уровень экспрессии микроРНК-27b, циркулирующих в плазме крови больных меланомой хориоидеи, без признаков метастазирования в таргетный и другие органы, что подтверждено цифровыми методами исследования (КТ, МРТ и ПЭТ).
Поставленная задача решается благодаря тому, что в способе диагностики микроРНК, как биомаркера при хориоидальной меланоме, включающем определение экспрессии микроРНК методом ПНР в режиме реального времени, предусмотрены следующие отличия:проведено исследование микроРНК-27b в плазме крови 84 больных одиночным узлом меланомы хориоидеи при инструментально доказанном отсутствии гематогенного метастазирования. Положительные результаты по микроРНК-27b, циркулирующих в плазме крови больных меланомой хориоидеи, подтверждены одномоментными исследованиями по микроРНК-146а, микроРНК-155, микроРНК-223, микроРНК-126, известных своим свойством увеличивать свою экспрессию по сравнению с контролем у больных аналогичной группы,
- предложен способ определения уровня экспрессии микроРНК-27b в плазме крови по сравнению с контролем в процентном отношении. За 100% принимали уровень экспрессии у здоровых лиц (контроль). На основании данных расчетов установлена активность исследованных микроРНК. Показаны преимущества микроРНК-27b.
- проведенная корреляция размеров меланомы хориоидеи (от маленьких до больших) показала четкое увеличение уровня экспрессии микроРНК-27b.
Сущность предложенного способа заключается в следующем - определение уровня экспрессии микроРНК-27b, циркулирующих в плазме крови больных меланомой хориоидеи с помощью метода - ПЦР в режиме реального времени (методика описана ниже).
Изобретение позволяет на основании полученных данных не только подтвердить диагноз меланомы хориоидеи, но и предположить возможность скрытого метастазирования по мере увеличения размеров опухоли.
Характеристика пациентов.
Обследованы 84 больных меланомой хориоидеи, средний возраст 63,4±1,2 (35-86 лет). Толщина MX варьировала в пределах 0,77-17,19 мм (средн. 7,21±0,43 мм).До лечения всем пациентам проведено плановое офтальмологическое обследование по общепринятой схеме с обязательным ультразвуковым сканированием, эхобиометрией, оптической-когерентной томографией, цифровым фотографированием глазного дна. С целью исключения метастазов всем проведено обследование органов грудной клетки (компьютерная томография) и печени (магнитно-резонансная томография). Контрольную группу составили 28 волонтеров, средний возраст 62,9±1,42 (45-78 лет), не имеющих опухолевых или хронических аутоиммунных заболеваний.
ПЦР в режиме реального времени
-ΔCt
Образцы периферической крови пациентов объемом 4 мл собирались в одноразовые пробирки с антикоагулянтом этилендиаминуксусной кислотой (ЭДТА), затем центрифугировали в течение 10 минут при 2000 оборотов в минуту. По окончании центрифугирования плазму объемом 2 мл отделяли от клеточного осадка и переносили в стерильные пробирки. Выделение суммарной РНК, включая микроРНК, проводили с использование реагента Qiazol и набора miRNeasyMiniKit (Qiagen, Хильден, Германия). Концентрацию и чистоту полученной РНК оценивали на спектрофотометре для микрообъемов NanoDrop 2000 (ThermoFisherScientific, Нью-Йорк, США). Обратную транскрипцию проводили с использованием набора MiScript II RTKit (Qiagen) в соответствии с рекомендованным протоколом. ПЦР в реальном времени ставилась на приборе CFX96 Real-Time PCR DetectionSystem (Bio-Rad, Геркулес, США) Экспрессия микроРНК была нормализована относительно экзогенного контроля cel-miR-39-3р и выражалась в относительных единицах, равных 2, где ΔCt - рабочие значения изменения цикла получения продукта относительно внутреннего контроля экспрессии микроРНК cel-miR-39-3р. Статистический анализ результатов оценивали с помощью стандартных методов статистической обработки, используя программное обеспечение MicrosoftOfficeExcel и пакет прикладных программ «Statistica» v. 13.0, StatSoftlnc (США). Критический уровень значимости принимали равным 5%, отвергая нулевую гипотезу при р<0,05. Уровень экспрессии каждой микроРНК рассчитывали в процентах по отношению к контролю для каждой микроРНК.
По степени проминенции меланомы, с учетом метрической классификации предложенной J.A. Shields в 1983 году больных разделили на традиционные 3 группы: начальные MX - проминенция до 3 мм (16 глаз); средние проминенция более 3 мм до 5 мм (13 глаз) и большие проминенция более 5 мм (55 глаз).
При начальных MX экспрессия микроРНК-27b повышается по сравнению с контрольной группой на 90%. При средних меланомах хориоидеи резкий рост уровня микроРНК-27b до 318% и самый большой уровень при больших MX - 362%.
Таким образом, подтверждено увеличение экспрессии микроРНК-27b в плазме крови больных меланомой хориоидеи по сравнению с контролем. Доказан прогрессирующий рост экспрессии микроРНК-27b по мере увеличения размеров меланомы хориоидеи.