ДНК-микрочип для молекулярно-генетического исследования предрасположенности к развитию тяжелого течения дистальной нейропатии и синдрома диабетической стопы у пациентов с сахарным диабетом 1 и 2 типа

Область техники
Полезная модель относится к медицине и биотехнологии, а именно к молекулярно-генетическим исследованиям человека в эндокринологии для диагностики и прогнозирования риска развития тяжелого течения дистальной нейропатии (далее - ДН) и синдрома диабетической стопы (далее – СДС) у пациентов с сахарным диабетом (далее – СД) 1 и 2 типа и коррекции тактики ведения этих больных.
Описание уровня техники
Однонуклеотидные зонды представляют собой короткие одноцепочечные олигонуклеотиды (ДНК или РНК), которые связываются с мишенями с высокой аффинностью и специфичностью путем сворачивания в третичные структуры [Xiao X. et al. Oligonucleotide aptamers: Recent advances in their screening, molecular conformation and therapeutic applications //Biomedicine & Pharmacotherapy. – 2021. – Т. 143. – С. 112232].
Исследование однонуклеотидных зондов явлется перспективным, так как наиболее распространенным типом генетической вариации у человека являются одиночные нуклеотидные полиморфизмы, которые возникают вследствие точечных мутаций [Степанова А.В., Кулебякин К.Ю., Кочегура Т.Н., Шестакова М.В., Ткачук В.А. Однонуклеотидные полиморфизмы в генетике сахарного диабета 2-го типа: подходы к их идентификации // Вестник РАМН. 2019. №1. URL: https://cyberleninka.ru/article/n/odnonukleotidnye-polimorfizmy-v-genetike-saharnogo-diabeta-2-go-tipa-podhody-k-ih-identifikatsii (дата обращения: 20.12.2022)].
Известен аналог «Набор олигонуклеотидных зондов, ДНК-микрочип, способ его получения, комплект для молекулярно-генетического исследования человека и их применение» по патенту РФ № 2 551 985, МПК C12Q 1/68 (2006.01), заявл. 02.08.2013, опубл. 10.02.2015, заключающийся в том, что изобретение относится к области биохимии, в частности к набору олигонуклеотидных зондов для диагностики популяции людей, проживающих на территории РФ, на наследственные моногенные заболевания, путем выявления мутаций и/или полиморфизмов. Также заявлены способ получения ДНК-микрочипа, набор для исследования популяции людей, а также способ детекции ассоциированных с наследственными моногенными заболеваниями мутаций и/или полиморфизмов, в которых используется указанный набор олигонуклеотидных зондов. Изобретение позволяет повысить информативность, точность и сократить сроки исследования.
Недостатками данного аналога являются:
детекция наследственных заболеваний, ассоциированных только с моногенным наследованием;
в перечне диагностики заболеваний отсутствуют ДН и СДС;
аналог позволяет диагностировать генетические заболевания, имеющие частоту выше одного случая на пятьдесят тысяч населения, в отличие от ДН и СДС, встречающихся гораздо чаще.
Известен ДНК-микрочип для скрининга новорожденных на такие наследственные заболевания, как муковисцидоз, врожденный гипотиреоз, галактоземия, фенилкетонурия за один анализ крови. Присутствие или отсутствие мутаций ДНК определяют с помощью гибридизации полученных фрагментов на специализированном олигонуклеотидном биочипе. Для этого используют амплификацию РАН, CFTR, РАХ8, GALT генов и получение одноцепочного флюоресцентно меченного продукта методом НИК-трансляции и рестрикции, приготавливают биочип для скрининга новорожденных на заболевания, содержащий набор иммобилизованных определенных олигонуклеотидов. Интерпретацию результатов гибридизации осуществляют путем сравнения интенсивности флюоресцентных сигналов, полученных при совершенной и несовершенной гибридизации. Несмотря на то, что такое исследование позволяет получить новый ускоренный метод массового скрининга новорожденных на наличие предрасположенности к моногенным заболеваниям, он обладает ограниченной информативностью.
Недостатками данного аналога являются:
использование аналога только у новорожденных и в специализированных лечебных учреждениях;
в перечне диагностики заболеваний отсутствуют ДН и СДС.
Наиболее близким техническим решением, принятым за прототип, является полезная модель «ДНК-микрочип для молекулярно-генетического исследования человека, принадлежащего к этнической группе, проживающей на территории Российской Федерации» по патенту РФ №137553, МПК C12Q1/68 (2006.01), заявл. 02.08.2013, опубл. 20.02.2014, заключающийся в том, что представляет собой стеклянную пластину с нанесенными на нее олигонуклеотидными зондами, содержащими участки ДНК, позволяющими диагностировать не менее 10 генетических заболеваний, имеющих частоту выше 1 случая 50 тысяч населения. Присутствие или отсутствие мутаций ДНК определяют с помощью гибридизации полученных фрагментов на специализированном олигонуклеотидном биочипе. ДНК-микрочип получают методом печати олигонуклеотидных зондов, содержащих участки ДНК, позволяющие детектировать выбранные мутации и/или полиморфизмы на стеклянной пластине, покрытой аминосиланом или другим адгезивом нуклеиновых кислот (см. WO 2004073988). Интерпретацию результатов гибридизации осуществляют путем сравнения интенсивности флюоресцентных сигналов, полученных при совершенной и несовершенной гибридизации.
Недостатками данного устройства являются:
отсутствие ретроспективного анализа пациентов с СД 1 и 2 типа, имеющих ДН и СДС;
не рассматриваются полиморфизмы генов, мутации которых приводят к тяжелому течению ДН и СДС.
Целью предлагаемой полезной модели является исследование предрасположенности к развитию тяжелого течения ДН и СДС у пациентов с СД 1 и 2 типа.
Описание сущности полезной модели
Задачей настоящей разработки является создание устройства ДНК-микрочипа для исследования ДНК человека на наличие мутаций и/или полиморфизмов, предрасполагающих к развитию тяжелого течения ДН и СДС.
Основной отличительной особенностью микрочипа является первый этап его разработки - определение мутаций и/или полиморфизмов, которые могут быть выявлены с его помощью. На данном этапе, исходят из генетических полиморфизмов, описанных в научной литературе, которые способствуют развитию тяжелого течения ДН и СДС. Микрочип позволяет детектировать наиболее частые мутации и полиморфизмы, ассоциированные с тяжелым течением ДН и СДС. Таким образом, эффективность и информативность диагностики людей с помощью микрочипа увеличивается по сравнению с прямыми аналогами, за счет способа подбора выявляемых мутаций, а не за счет увеличения их количества.
Состав мутаций, выявляемых с помощью микрочипа, оптимизирован и строго специфичен. Таким образом, повышается эффективность и информативность генетической диагностики наследственной предрасположенности к тяжелому течению ДН и СДС с применением данного ДНК-микрочипа.
ДНК-микрочип для молекулярно-генетического исследования человека представляет собой стеклянную пластину с нанесенными на нее олигонуклеотидными зондами, содержащими участки ДНК, позволяющими диагностировать наличие восьми полиморфизмов, предрасполагающих к развитию тяжелого течения ДН и СДС: G-1082A гена IL10, С-174G гена IL6, G681A(*2) гена CYP2C19, A-8202G гена MMP9, IIe105Val гена GSTP, T58C гена SOD2, G-1293C(c1/с2) гена CYP2E, -308А гена TNFα.
Полиморфизм G-1082A гена IL10 отвечает за экспрессию интерлейкина-10 (IL-10), который представляет собой противовоспалительный цитокин с более низкими уровнями циркуляции у пациентов с СД 2 типа.  IL-10 подавляет выработку провоспалительных цитокинов, которые нарушают правильную функцию инсулина. Таким образом, любая мутация в гене IL-10 приводит к увеличению выработки провоспалительных цитокинов, которые, в свою очередь, влияют на действие инсулина и вызывают СД 2 [Naz S., Shafiq N., Sharif S., Manzur F., Saifi S.Z., Firasat S., Kaul H. Association of the interleukin 10 (IL-10) gene with type 2 diabetes mellitus by the single-nucleotide polymorphism of its promoter region G/A 1082. Eukaryotic gene expression CritRev.2020. doi: 10.1615/ CritRevEukaryotGeneExpr. 2020030714].
Полиморфизм С-174G гена IL6 отвечает за экспрессию интерлейкина-6 (IL-6). Генотип (G;G) IL-6 имеют люди с более высоким риском впервые возникшего СД и более высокий уровень С-реактивного белка по сравнению с генотипом (C;C). Соответственно, выявление аллеля G повышает риск развития СД, однако исследование европеоидов с СД 2 типа показало, что носители (C) имеют чувствительный к IL-6 фенотип резистентности к инсулину, поэтому методы контроля и лечения инсулинорезистентности должны отличаться у носителей (C) и (G;G). Кроме того, есть взаимосвязь полиморфизма IL-6 с микрососудистыми осложнениями при СД [Cui Jia, Zhang X, Guo S, Zhang L. Relationship of interieukin-6 polymorphism (rs1800795) with microvascular complications in type 2 diabetes mellitus. Biosci Rep. 2020 Oct 30;40(10):BSR20201105. doi: 10.1042/BSR20201105].
Полиморфизм G681A(*2) гена CYP2C19 отвечает за экспрессию фермента CYP2C19. Существует взаимосвязь мутации CYP2C19 с наиболее вероятным развитием СД 2 типа  его осложнений [Chang K. et al. Association of cytochrome P450 2C19* 2 and* 3 variants with type 2 diabetes mellitus in Chinese population. – 2019].
Полиморфизм A-8202G гена MMP9 отвечает за транскрипционную активность и концентрацию MMП-9. Матриксные металлопротеиназы (ММР) представляют собой внеклеточные протеазы, продуцируемые различными типами клеток, такими как фибробласты, кератиноциты, эндотелиальные клетки, нейтрофилы, макрофаги и эозинофилы. Основной функцией MMP-9 является разрушение белков эндоплазматического ретикулума. Они расщепляют декорин, эластин, фибриллин, ламинин, желатин, коллагены IV, V, XI и XVI типов, а также активируют различные факторы роста. Кроме того, установлено, что высокий уровень ММР-9 в раневой жидкости свидетельствует об активности воспаления и является маркером плохого заживления ран при СД [Токмакова А.Ю., Зайцева Е.Л., Воронкова И.А., Шестакова М.В. Клинико-морфологическое исследование тканевой репарации при синдроме диабетической стопы // Сахарный диабет. 2018. №6. URL: https://cyberleninka.ru/article/n/kliniko-morfologicheskoe-issledovanie-tkanevoy-reparatsii-pri-sindrome-diabeticheskoy-stopy (дата обращения: 16.06.2022)].
Анализ полиморфизма IIe105Val гена GSTP может помочь выявить людей, подверженных риску развития СД и его осложнений, и обеспечить надлежащее медицинское лечение. Генотипирование GSTP является полезным биомаркером для ранней диагностики развития СД. Дополнительные исследования, посвященные ассоциации полиморфизма GSTP у пациентов с СД, помогут  лучше определить патофизиологию СД [Oliveri L. M. et al. Diabetes and Pi Class Glutathione S-Transferase //New Innovations in Chemistry and Biochemistry Vol. 7. – 2022. – С. 137-153].
Изучение мутаций полиморфизма T58C гена SOD2 является значимым, так как супероксиддисмутаза 2 (СОД 2) – важный  антиоксидантный фермент для устранения супероксида в митохондриях. Кроме того, СОД 2 может детоксифицировать нитрующий агент пероксинитрит и катализировать супероксид в перекись водорода, что уменьшает окислительный стресс и, соответственно, улучшает заживление ран при СДС [Ghareghomi S. et al. The potential role of curcumin in modulating the master antioxidant pathway in diabetic hypoxia-induced complications //Molecules. – 2021. – Т. 26. – №. 24. – С. 7658].
Полиморфизм G-1293C(c1/с2) гена CYP2E отвечает за экспрессию фермента CYP2E, увеличение которого наблюдалось в периферической крови у лиц с СД 1 и 2 типа, а именно, в условиях длительной гипергликемии [Howe C. G. et al. Maternal gestational diabetes mellitus and newborn DNA methylation: findings from the pregnancy and childhood epigenetics consortium //Diabetes Care. – 2020. – Т. 43. – №. 1. – С. 98-105].
Полиморфизм -308А гена TNFα также требует изучения, так как TNFα играет важную роль в воспалительной реакции эндотелиальных клеток сосудов посредством индукции адгезии нейтрофилов к ним и связан с большим количеством микрососудистых осложнений у пациентов с СД 2 типа, включая пациентов с ДН [Nádró B. et al. Effects of alpha-lipoic acid treatment on serum progranulin levels and inflammatory markers in diabetic neuropathy //Journal of International Medical Research. – 2021. – Т. 49. – №. 5. – С. 03000605211012213].
ДНК-микрочип получают методом печати олигонуклеотидных зондов, содержащих участки ДНК, позволяющие детектировать выбранные мутации и/или полиморфизмы на стеклянной пластине, покрытой аминосиланом или другим адгезивом нуклеиновых кислот (см. WO 2004073988).
Отличительной особенностью разработанного способа является этап предварительного отбора мутаций. Способ позволяет получить уникальный микрочип для молекулярно-генетической диагностики предрасположенности к тяжелому течению ДН и СДС и повысить точность и информативность исследования.
Способ получения ДНК-микрочипа для молекулярно-генетического исследования предрасположенности к тяжелому течению ДН и СДС включает:
1) формирование перечня полиморфизмов генов, мутации которых приводят к развитию тяжелого течения ДН и СДС;
2) получение олигонуклеотидных зондов, содержащих ДНК-участки позволяющие детектировать мутации отобранных полиморфизмов генов;
3) нанесение олигонуклеотидных зондов на стеклянную пластину, покрытую аминосиланом или другим адгезивом нуклеиновых кислот, при этом одна из сторон пластины обработана таким образом, что распространение в ней лазерного луча происходит за счет эффекта полного внутреннего отражения.
Предпочтительно, чтобы зонды были подобраны таким образом, чтобы точно детектировать мутацию или полиморфизм, указанный, как по смысловой, так и по антисмысловой цепи ДНК.
Для детекции мутаций и полиморфизмов зонды отбирают согласно следующим критериям:
отсутствие внутренней вторичной структуры;
способность участвовать в специфичной элонгации фрагментов генов, содержащих участки, позволяющие в дальнейшем идентифицировать мутации и полиморфные варианты генов.
Настоящее устройство микрочип может использоваться в составе комплекта для молекулярно-генетической диагностики на основе реакции элонгации праймеров на ДНК-микроматрицах.
Разработанный ДНК-микрочип в составе комплекта позволяет единовременно выявлять носительство мутаций и/или полиморфизмов, ассоциированных с тяжелым течением ДН и СДС и применяется для молекулярно-генетической диагностики предрасположенности к тяжелому течению ДН и СДС.
Комплект для молекулярно-генетического исследования человека, включает:
набор ферментов и реактивов для подготовки матрицы реакции элонгации праймеров на микрочипе (англ. Arrayed Primer Extention – APEX), состоящий из ДНК-полимеразы, раствора магния, растворов дизоксинуклеотидов, урацил-М-гликозилазы, щелочной фосфатазы креветки;
праймеры для реакции ПЦР мультиплексные;
набор для очистки продуктов ПЦР;
набор для реакции АРЕХ: ДНК-полимеразы, раствора магния, растворов флуоресцентно-меченных дидезоксинуклеотидов для элонгации цепи;
ДНК-микрочип, адаптированный для молекулярно-генетического исследования людей.
Применение наборов на основе технологии АРЕХ описано в US 20070134691.
В качестве метода анализа ДНК-микрочипа был выбран способ, описанный в EP 1088214, что позволяет повысить точность, упростить методику генетической диагностики и сделать ее экономически выгодной.
Способ молекулярно-генетического исследования предрасположенности к развитию тяжелого течения ДН и СДС у пациентов с СД 1 и 2 типа предусматривает использование нового комплекта для диагностики и регистрацию результатов анализа путем сравнения интенсивности флуоресцентных сигналов, при облучении ДНК-микрочипа лазерами различной длины волны.
Осуществление полезной модели
Микрочип отличается нуклеотидной последовательностью зондов, закрепленных на ДНК-микрочипе для прохождения реакции элонгации праймеров на чипе (англ. Arrayed Primer Extention – APEX). В ходе реакции амплифицированные и фрагментированные участки генома, содержащие анализируемые мутации, денатурируются и наносятся на ДНК-микрочип (фигура).
На фигуре 1 показана схема работы ДНК-микрочипа. ДНК-микрочип представляет собой стеклянную пластину с закрепленными на ней одноцепочечными зондами ДНК. В ходе проведения генетической диагностики ДНК пациента амплифицируется, фрагментируется и наносится на микрочип. Затем зонд достраивается на один флуоресцентно меченный нуклеотид, причем в качестве матрицы используется ДНК пациента, которая в дальнейшем отмывается.
Заявленный ДНК-микрочип используется в составе комплекта (таблица 1) для диагностики предрасположенности к развитию тяжелого течения ДН и СДС осуществляемой в несколько этапов (фиг.):
получение геномной ДНК человека непосредственно из клинического образца (цельной периферической крови);
амплификация участков ДНК, содержащих мутации и полиморфизмы с использованием специфично подобранных праймеров;
очистка продуктов полимеразной цепной реакции (ПЦР);
фрагментация продуктов ПЦР;
гибридизация полученных одноцепочечных фрагментов на ДНК-микрочипе, с последующим достраиванием зондов на один специфично-меченный флуоресцентным маркером нуклеотид в месте мутации, при этом в качестве матрицы используются образцы анализируемой ДНК;
регистрация результатов анализа путем сравнения интенсивности свечения флюоресцентных сигналов, при облучении ДНК-микрочипа лазерами различной длины волны.
Проведение ПЦР и фрагментация ДНК
ПЦР используется для амплификации (увеличения копийности) участков геномной ДНК, несущих целевые мутации или однонуклеотидные полиморфизмы (SNP).
Часть дезокситимидин трифосфата (дТТФ) заменяется в ПЦР-миксе на дезоксиуридин трифосфат (дУТФ), что обеспечивает возможность дальнейшей фрагментации с помощью урацил N-гликозилазы (UNG). Продукты ПЦР объединяют, концентрируют и очищают от невстроившихся дезоксинуклеотид трифосфатов (дНТФ) с помощью щелочной фосфатазы креветок (SAP). После обработки SAP и UNG образцы нагревают для инактивации ферментов и расщепления ДНК в месте встройки урацила. Фрагментация длинных продуктов ПЦР обеспечивает лучшую гибридизацию с комплементарными олигонуклеотидами, иммобилизованными на стекле.
Проведение реакции APEX
Непосредственно перед реакцией элонгации праймеров на чипе APEX фрагментированные продукты ПЦР денатурируют и переносят в реакционной смеси на разработанный чип (массив олигонуклеотидов на стекле). Реакционная смесь содержит буфер, одноцепочечные ДНК, термостабильную ДНК-полимеразу и 4 различных, индивидуально меченных флуорофорами терминаторных нуклеотидов.
Матрице-зависимая ДНК полимеразная реакция проводится при постепенно увеличивающейся температуре для того, чтобы минимизировать образования олигонуклеотидами нежелательных вторичных структур, кроме того, обеспечить эффективную гибридизацию с целевыми фрагментами ДНК и поддержать на высоком уровне активность полимеразы. После инкубации, свободный и неприсоединенный ковалентными связями материал отмывается, что обеспечивает наилучшее соотношение сигнал-шум.
Детекция
Обработанные слайды, несущие на себе массив олигонуклеотидов, прошедших реакцию APEX, сканируют в микрочиповом сканере Genorama QuattroImager™ (см. EP 1088214). 4 лазера (поодиночке) используют для возбуждения разных красителей. 4 хорошо спектрально разделенных красителя возбуждают с помощью полного внутреннего отражения лазерного луча в толще стеклянного слайда, работающего как световод. Свет, излучаемый флуорофорами в ответ на возбуждение, регистрируют с помощью ПЗС-камеры.
Поскольку для каждой реакции используют 4 различных красителя, для каждого микрочипа снимают 4 различных изображения излученного света. Каждый снимок соответствует своему красителю, соответственно отражает паттерн встраивания на чипе одного из 4 терминаторных нуклеотидов.
Анализ изображений и информации.
Сканирование сопровождается анализом с помощью Genorama Genotyping Software™ («лазерный диск для генотипирования») для перевода информации о паттерне флуоресценции в нуклеотидную последовательность. Сначала нормируются интенсивности сигналов соответствующих красителей нуклеотидов-терминаторов. Сравниваются интенсивности сигналов в каждой точке расположения олигонуклеотидов во всех четырех изображениях и наиболее интенсивный сигнал интерпретируется как соответствующий нуклеотид. В зависимости от того, встраивание какого нуклеотида произошло в точке мутации, делают вывод о статусе ее носительства у конкретного пациента.
Таким образом, уникальный набор мутаций и полиморфизмов, может быть генотипирован с помощью разработанного микрочипа.
Обеспечена высокая специфичность и чувствительность при использовании в составе комплекта данного микрочипа для генетической диагностики при помощи реакции элонгации праймеров на ДНК-микроматрицах.
Данный микрочип позволяет детектировать мутации и полиморфизмы, предрасполагающие к развитию тяжелого течения ДН и СДС. ДНК-микрочип предназначен для диагностики наиболее частых мутаций, ассоциированных с предрасположенностью к развитию тяжелого течения ДН и СДС.
Клинические примеры
Клинический пример 1. Больная Н.
Материалом для скринингового исследования служил образец периферической крови.
Было проведено молекулярно-генетическое типирование с помощью заявляемого ДНК-микрочипа на восемь мутаций.
С помощью предлагаемого ДНК-микрочипа у больной Н. была выявлена ассоциированная с тяжелым течением ДН мутация в гомозиготной форме G-1293C(c1/с2) гена CYP2E.
Клинический пример 2. Больная Р.
Материалом для скринингового исследования служил образец периферической крови.
Было проведено молекулярно-генетическое типирование с помощью заявляемого ДНК-микрочипа на восемь мутаций.
С помощью предлагаемого ДНК-микрочипа у больной Р. была выявлена ассоциированная с тяжелым течением ДН и СДС мутация в G681A(*2) гена CYP2C19, A-8202G гена MMP9, IIe105Val гена GSTP, T58C гена SOD2.
ДНК-микрочип может применяться для молекулярно-генетической диагностики в больницах, клинико-диагностических лабораториях и научно-исследовательских институтах. Данные исследования позволят здоровым людям получить информацию о своих генетических особенностях для поддержания собственного здоровья, а также предупредить развитие тяжелого течения ДН и СДС у пациентов с СД 1 и 2 типа.
Таблица 1
Комплект для диагностики
№ Наименование
1. Набор для подготовки матрицы APEX:
1.1. ДНК-полимераза с «горячим стартом» (10 ед/мкл)
1.2. 10Х Буфер для реакции ПЦР с (NH4)2SO4
1.3. 25 mM MgCl2
1.4. 2,5 mM смесь dNTP (20% dUTP)
1.5. Урацил-^Гликозилаза (UNG) (1 ед./мкл.)
1.6. 10* UNG реакционный буфер
1.7. Щелочная фосфатаза креветки (sAP) 1 ед./мкл.
2. Набор для реакции APEX
2.1. Смесь для реакции APEX
2.2. Антифэйд
3. Набор для очистки продуктов ПЦР
3.1. Колонки для очистки и пробирки для сбора
3.2. Связывающий буфер
3.3. Отмывочный буфер
3.4. Элюирующий буфер
4. ДНК-чипы для диагностики ДН и СДС
5. Покровное стекло «Лифтэр Слипе»
6. Порошок «Alcanox»
7. Покровное стекло
8. Праймеры для реакции ПНР мультиплексные