СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
METHOD FOR ONCOLOGICAL DISEASES DIAGNOSTICS

Изобретение относится к области медицины, а именно к способам диагностики онкологических заболеваний.
Рак является одной из основных причин заболеваемости и смертности во всем мире; примерно 14 миллионов новых случаев заболевания и 8,2 миллиона случаев смерти, связанных с раком, зафиксировано в 2012 году (World Cancer Report, 2014). Ожидается, что число новых случаев онкологических заболеваний увеличится на 70% в течение следующих 2-х десятилетий (http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs297/en).
Эту ситуацию связывают с рядом причин: повышением общего радиационного фона Земли, ухудшением экологической обстановки и эндоэкологической среды, а также со многими поведенческими рисками, такими как табакокурение и употребление алкоголя. Все это вызывает снижение иммунитета организма и повышение способности трансформированных клеток к прогрессирующему росту.
Успех лечения онкологических больных во многом зависит от стадии, на которой выявлено заболевание. Диагностика рака на ранней бессимптомной стадии развития заболевания дает возможность эффективного лечения, менее травматичного и безопасного для всего организма, и позволяет предотвратить стадию метастазирования рака и добиться длительной ремиссии.
Современная онкологическая наука располагает рядом методов скрининговой диагностики злокачественных новообразований, позволяющих судить о наличии или отсутствии опухоли в момент обследования. В частности широкое распространение получило ежегодное флюорографическое обследование всех групп населения, а также профилактическая маммография, проводимая с целью ранней диагностики злокачественных новообразований молочной железы у женского населения (A.G. Holleb. Review of Breast Cancer Screening Guidelines. Cancer Supplement, 1992; 69, c. 1911-1912). Известен также метод цитологического скрининга злокачественных опухолей шейки матки (Guzick DS. Efficacy of screening for cervical cancer. A review. Am. J. Public Heath, 1978; 68, c. 125-134).
Однако большинство методов скрининговой диагностики направлено на выявление конкретного вида опухоли конкретного органа и не может быть использовано при общей диагностике онкологии.
Известен многопараметрический способ диагностики злокачественных новообразований (RU заявка №98112260, 2000), включающий определение времени продольной ядерной магнитной резонансной релаксации в сыворотке крови, а также проведение количественной оценки нарушения гомеостаза по данным биофизических, гематологических и биохимических анализов, по результатам которой судят о наличии злокачественного новообразования.
Недостатком этого способа является его техническая сложность, длительность, невозможность использования в клинических лабораториях больниц, трудность выявления ранней стадии злокачественного роста.
В настоящее время предполагают, что наиболее перспективными для общей диагностики онкологических заболеваний являются методы, основанные на определении опухолевых маркеров в биологических жидкостях организма, в частности в крови. Так, известен способ диагностики злокачественных опухолей человека, основанный на выявлении в крови обследуемого белков, специфичных для злокачественного роста (Короткоручко В.П. Осадочная реакция на рак при диагностике опухолевой болезни. Киев, "Наукова думка". 1967). Для этого сыворотку крови выдерживают в растворе соляной кислоты, после чего осаждают белок азотной кислотой и добавляют к нему дистиллированную воду. Образующийся осадок белков сыворотки крови онкологических больных в отличие от здоровых людей не растворяется. Результат реакции, получившей название осадочной реакции на рак (ОРР), фиксируют по визуальному показателю. Этот способ является достаточно универсальным, однако он не обладает достаточной специфичностью, т.к. ОРР часто бывает положительной при воспалительных и других неопухолевых заболеваниях.
В качестве опухолевых маркеров с целью диагностики солидных нелимфоидных опухолей и их метастазов использовали также рецептор  2 (патент RU №2144675, 2000), полинуклеотиды (RU патент №2174409, 2001) и некоторые другие вещества. В частности, перспективными являются методы диагностики онкологических заболеваний по присутствию в биологических жидкостях организма внеклеточных нуклеиновых кислот, специфических для клеток злокачественных новообразований (Y.M. Dennis Lo and Rossa W.K. Chiu The biology and diagnostic application of plasma RNA // Ann. N.Y. Acad. Sci., 2004, 1022: 135-139), или базирующиеся на обнаружении раковых клеток, экспрессирующих специфический ген (A.M. Gilbey, D. Burnett, R.E. Coleman, I. Holen. The detection of circulating breast cancer cells in blood // J. Clin. Pathol. 2004; 57: 903-911). В качестве одного из вариантов предлагается (патент RU №2251696, 2005) определять концентрацию нуклеиновых кислот (НК), связанных с клеточной поверхностью форменных элементов крови, и на основе данного показателя диагностировать наличие или отсутствие онкологического заболевания. Однако, как правило, большинство разработок ограничиваются диагностикой опухоли определенной локализации. В качестве примера можно привести группу маркеров на основе генов микроPHKmiR-129-2, miR-125b1, miR-137 и miR-375, для диагностики немелкоклеточного рака легкого, где диагностическим признаком является выявление метилирования хотя бы одной микроPHK (RU патент №2507268, 2012). Другим примером является количественное определение мРНК гена KIFC1 c помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени для диагностики рака мочевого пузыря (RU заявка №2011109883, 2011). Достоинство таких разработок состоит в их высокой чувствительности и специфичности к определенному виду опухоли, однако их использование для опухолей других локализаций, как правило, неэффективно из-за строгих требований к выбору тканеспецифического гена сравнения (референсного гена).
Наиболее близким по технической сути к заявляемому способу является способ диагностики рака желудка (патент RU №2204835, 2005), заключающийся в исследовании образца ткани пациента, содержащего клетки проблемной зоны, с целью определения в образце мРНК циклооксигеназы-2 или белка ЦОКС-2. Для этого общую РНК выделяли с помощью реагента RNAzol 1 (Tel-Test). Образец РНК денатурировали и переносили на нейлоновые мембраны, которые затем облучали УФ. Фрагменты очищенной к ДНК - циклооксигеназы-1 (ЦОКС-1), ЦОКС-2 и глицеральальдегид-3-фосфат дегидрогеназы (ГАФДГ) метили, после чего очищали на ник-колонках. Тотальную РНК превращали в кДНК, с помощью обратной транскриптазы SuperscriptII и олиго-dT или гексонуклеотидных праймеров (LifeTechnology), кДНК амплифицировали с помощью полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) с использованием специфических праймеров Цокс-2 в присутствии ДНК-полимеразы. Амплифицированную кДНК окрашивали бромистым этидием и количественно определяли по результатам электрофореза на 2% геле агарозы с помощью камеры CCD высокого разрешения. Полученные результаты сопоставляли с данными, полученными при аналогичном исследовании здоровых тканей и заведомо раковых клеток, и на базе такого сопоставления диагностировали наличие или отсутствие онкологического заболевания.
Недостатком данного способа является ограниченная область применения в связи с отсутствием достоверных данных о наличии ЦОКС в других тканях организма, а также длительность и сложность анализа.
Технической проблемой является создание метода диагностики онкологических заболеваний, пригодного для выявления рака различных органов организма человека.
Данная техническая проблема решается путем обнаружения в опухолевых тканях мРНК гена LINC00309 (Long intergenic non-protein coding RNA 309), отсутствующую в здоровых тканях организма человека. Это позволило создать способ диагностики онкологических заболеваний, сущность которого состоит в анализе тканей организма человека и диагностики онкологических заболеваний при обнаружении в тканях мРНК гена LINC00309.
Нуклеотидная последовательность мРНК гена LINC00309 (Long intergenic non-protein coding RNA 309) представлена на рис. 1.
На фиг. 1, на фиг. 2, на фиг. 3, на фиг. 4, на фиг. 5 приведены результаты ПЦР с праймерами специфическими к гену LINC00309 на панелях кДНК из нормальных, фетальных и опухолевых тканей человека.
Обнаружение мРНК гена LINC00309 осуществляется с помощью традиционных методов анализа мРНК, таких как дот-гибридизация, методы обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) и т.д. Лучшие результаты достигались при проведении детекции методами ОТ-ПЦР. В рамках ее осуществления полученную известными способами кДНК пациента амплифицировали в присутствии праймеров, специфических к фрагменту мРНК гена LINC00309, нуклеотидная последовательность которого представлена в SEQ ID NO 1. При этом в качестве прямого праймера использовали олигонуклеотид с последовательностью: 5'-CATGTCAGTCCCACCTTGAA-3', а в качестве обратного - 5'-GAGGCAGTATCCAGGGCTTA-3'.
260
280
Диагностику проводили следующим образом. Суммарную РНК выделяли из замороженных образцов с помощью TRI Reagent (Sigma). Для этого 100-500 мг замороженной в жидком азоте ткани разрушали с использованием микродесмембратора («Sartorius», Германия) и затем разрушенный образец лизировали в растворе TRI Reagent (Sigma), содержащем гуанидинизотиоцианат и фенол. Смесь оставляли при комнатной температуре на 5 минут, после чего в нее добавляли хлороформ для разделения фаз и затем центрифугировали 10 минут при  12000×g при температуре 4°С. После центрифугированиия отбирали водную (верхнюю) фазу, содержащую суммарную РНК. Из водной фазы РНК осаждали путем добавления изопропилового спирта и затем повторно центрифугировали в течение 10 минутпри 12000×g при температуре 4°C. Надосадочную жидкость сливали, осадок промывали 70% этанолом и подсушивали при -20°C, после чего осадок растворяли в воде, обработанной диметилпирокарбонатом (ДПК). Концентрацию и чистоту выделенной РНК определяли на спектрофотометре Ultrospec 3100 pro. Чистоту РНК считали пригодной для работы при соотношении A/А≥1,7 (водный раствор). Далее проводили анализ качества РНК гель-электрофорезом, по соотношению 28s и 18s рРНК в 1% агарозном геле. Перед проведением электрофореза к препаратам РНК, содержащим 1-2 мкг тотальной РНК (в объеме 5-10 мкл), добавляли додецил-сульфат натрия (SDS) до концентрации 0,3%. После чего пробы РНК денатурировали при 65°C в течение 10 минут, быстро охлаждали на льду, добавляли 0,1 объема от объема пробы 10-кратного буферного раствора, содержащего 50%-ный глицерин и 0,4%-ный бромфеноловый синий, и наносили на гель.
Электрофорез проводили в горизонтальных аппаратах в буфере TAE (40 мМ Трис-ацетат; 2 мМ ЭДТА, pH 8,0; 0,5 мкг/мл бромистого этидия) при напряжении 5-14 В/см длины геля. Результат разделения РНК регистрировали в проходящем ультрафиолетовом свете трансиллюминатора (Macrovue, LKB, Швеция).
Синтез кДНК проводили с помощью набора Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas). Для этого на льду смешивали 5 мкг тотальной РНК, 0,2 мкг гексануклеотидных праймеров и доводили объем смеси до 12 мкл водой. Для денатурации РНК смесь инкубировали 5 минут при 70°C и переносили на лед. Затем добавляли 4 мкл 5-кратного буфера, 1 мкл (20 ед.) ингибитора рибонуклеаз RiboLock, 2 мкл смеси10 мМ dNTP. После этого смесь инкубировали при 25°C в течение 5 минут и добавляли 1 мкл (200 ед.) Revert Aid M-MuLV обратной транскриптазы. Объем полученной смеси составлял 20 мкл. Реакционную смесь инкубировали 10 минут при 25°C, а затем 60 минут при 42°C. Далее реакцию останавливали прогреванием до 70°C в течение 10 минут и ставили на лед. Полученную кДНК хранили при -20°С до использования.
Для выявления самостоятельных транскриптов гена LINC00309 в тканях человека была проведена серия ПЦР-экспериментов на панелях кДНК из различных нормальных и опухолевых тканей.
2
Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в растворе, содержащем 2,5 мкл кДНК, 1-кратный ПЦР-буфер, MgCl(4 mM), dNTP (200 μМ каждого), 0,4 μМ каждого праймера и 1 единицу Taq ДНК-полимеразы в общем объеме 25 мкл, при следующих условиях: 1 мин при 95°С, 35 циклов, включавших 20 сек при 95°С, 20 сек при 60°С и 40 сек при 72°С. В конце проводили достройку фрагментов в течение 5 мин при 72°С. Продукты ПЦР разделяли электрофорезом в 2% агарозе и прокрашивали бромистым этидием. Присутствие искомой мРНК в образце определяли по наличию продукта амплификации с размером 221 п.н.
Для проверки качества панелей кДНК ставили ПЦР с использованием праймеров к гену G3PDH (прямой 5'-TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT-3', обратный 5'-CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC-3', Tm 68°С, 30 циклов, размер амплифицируемого фрагмента 983 п.о.).
На фиг. 1 показаны результаты ПЦР с праймерами, специфическими к гену LINC00309, на панели кДНК нормальных тканей (Human МТС Panel I и Human МТС Panel II, Clontech).
1 - мозг, 2 - сердце, 3 - почка, 4 - печень, 5 - легкое, 6 - поджелудочная железа, 7 - плацента, 8 - скелетная мышца, 9 - толстая кишка, 10 - яичник, 11 - лейкоциты периферической крови, 12 - предстательная железа, 13 - тонкий кишечник, 14 - селезенка, 15 - яичко, 16 - тимус, -К - отрицательный контроль, +К - положительный контроль.
На фиг. 2 показаны результаты ПЦР с праймерами, специфическими к гену LINC00309, на панелях кДНК из тканей пищеварительной системы и тканей иммунной системы (Human Digestive System МТС Panel и Human Immune System МТС Panel, Clontech).
1 - слепая кишка, 2 - восходящая ободочная кишка, 3 - нисходящая ободочная кишка, 4 - поперечная ободочная кишка, 5 - двенадцатиперстная кишка, 6 - пищевод, 7 - подвздошно-слепая кишка, 8 - подвздошная кишка, 9 - тощая кишка, 10 - печень, 11 - прямая кишка, 12 - желудок, 13 - костный мозг, 14 - фетальная печень, 15 - лимфатический узел, 16 - лейкоциты периферической крови, 17 - селезенка, 18 - тимус, 19 - миндалевидная железа, -К - отрицательный контроль, +К - положительный контроль.
На фиг. 3 показаны результаты ПЦР с праймерами, специфическими к гену LINC00309, на панели кДНК из фетальных тканей (Human Fetal МТС Panel, Clontech).
1 - фетальный мозг, 2 - фетальное сердце, 3 - фетальная почка, 4 - фетальная печень, 5 - фетальное легкое, 6 - фетальная скелетная мышца, 7 - фетальная селезенка, 8 - фетальный тимус, -К - отрицательный контроль, +К - положительный контроль.
На фиг. 4 показаны результаты ПЦР с праймерами, специфическими к гену LINC00309, на панели кДНК опухолевых тканей (BioChain).
1 - медуллобластома мозга, 2 - плоскоклеточный рак легкого, 3 - зернистоклеточный рак почки, 4 - светлоклеточный рак почки, 5 - холангиоцеллюлярный рак печени, 6 - гепатоцеллюлярный рак печени, 7 - аденокарцинома желчного пузыря, 8 - плоскоклеточный рак пищевода, 9 - перстневидноклеточный рак желудка, 10 - аденокарцинома тонкого кишечника, 11 - папиллярная аденокарцинома ободочной кишки, 12 - аденокарцинома прямой кишки, 13 - фиброаденома молочной железы, 14 - серозная цистоаденокарцинома яичника, 15 - медуллярный рак фаллопиевых труб, 16 - аденокарцинома матки, 17 - папиллярный переходноклеточный рак мочеточника, 18 - переходноклеточный рак мочевого пузыря, 19 -семиномаяичка, 20 - аденокарцинома предстательной железы, 21 - меланома кожи, 22 - злокачественная фиброзная гистоцитома мышц, 23 - феохромоцитома надпочечника, 24 - неходжкинская лимфома, 25 - папиллярная аденокарцинома щитовидной железы, 26 - смешанная опухоль околоушной железы, 27 - аденокарцинома поджелудочной железы, 28 - семинома тимуса, 29 - аденокарцинома селезенки, 30 - неходжкинская лимфома, 31 - T-клеточная ходжкинская лимфома, 32 - злокачественная лимфома, -K - отрицательный контроль, +K - положительный контроль.
На фиг. 5 показаны результаты ПЦР с праймерами, специфическими к гену LINC00309, на панели кДНК из клинических образцов опухолевых тканей (Биомедицинский центр).
Коды пациентов и соответствующий им гистологический диагноз: 3, 246, 250, 251 - рак молочной железы; 19 - аденокарцинома молочной железы; 9 - киста молочной железы с предраковой пролиферацией; 156, 270 - аденокарцинома эндометрия; 12, 14 - плоскоклеточный рак легкого; 7 - семинома яичка; 45, 63 - менингиома; 140 - аденома гипофиза; 2 - рак шейки матки, 2а-1, 2а-3, 2а-4 - метастазы опухоли №2 в тело матки, большой сальник, левый и правый яичник соответственно; 13 - миосаркома шейки матки; 1-2 - бластома яичника; 6 - рак яичника; 30 - хронический лимфолейкоз; 31 - неходжкинская T-клеточная лимфома; 67 - лимфоаденопатия неясного генеза, 82 - неходжкинская лимфома, 87, 108 - рак желудка; 92 - лимфогрануломатоз, рецидив; 94 - гемолитическая анемия неясного генеза, 102, 113 - неходжкинская лимфома; 27 - эмбрион 6-7 недель, -K - отрицательный контроль.
Полученные результаты показали, что заявляемый способ обладает большей широтой применения, занимает меньше времени и позволяет получать достаточно надежные и селективные результаты, что иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Диагностику проводили по вышеописанной методике. При постановке ПЦР на наборе кДНК из нормальных тканей человека Human MTC Panel I и Human МТС Panel II, LINС00309-специфический фрагмент не образовывался ни в одном образце (фиг. 1). Амплификация LINC00309-специфического фрагмента не наблюдалась ни в одном образце тканей пищеварительной и иммунной системы (фиг. 2) и фетальных тканей (фиг. 3).
Вместе с тем, анализ образцов кДНК из опухолей показал наличие сильного генспецифического сигнала мРНК LINC00309 в образцах злокачественных опухолей самого различного происхождения. На панели кДНК опухолевых тканей производства фирмы Biochain Institute (CШA) сигналы наблюдаются на дорожках, соответствующих опухолям легкого, желчного пузыря, желудка, тонкого кишечника, предстательной железы, надпочечника, а также в образце из неходжкинской лимфомы (фиг. 4). Экспрессия гена LINC00309 была также выявлена в опухолевых образцах панели кДНК, производства Биомедицинского центра (Санкт-Петербург) (фиг. 5). ПЦР-фрагменты гена были выявлены в некоторых образцах рака молочной железы, рака легкого и рака шейки матки, семиномы яичка, а также во всех образцах лимфом и рака желудка. Таким образом, экспрессия гена LINC00309 отсутствовала в нормальных тканях и детектировалась только в опухолевых тканях человека, и данный способ может быть использован для выявления опухолей различных органов, как, например, опухолей легкого, желудка, молочной железы, шейки матки, предстательной железы и других.
Пример 2. Детекция мРНК гена LINC00309 методом дот-гибридизации. В качестве пробы использовали двуцепочечный фрагмент кДНК гена LINC00309, полученный с помощью ОТ-ПЦР. Мечение зонда для гибридизации радиоактивным фосфором [α-32P] проводили с помощью набора HexaLabel™ DNA Labeling Kit (Fermentas, Литва) согласно протоколу производителя. Полученный зонд хранили при -70°C до использования, но не более 3 дней. Выделение и оценку качества РНК проводили с использованием технологии, описанной в примере 1. Для переноса РНК на мембрану брали по 10 мкг каждого образца РНК, разведенного в 10 мкл воды, и смешивали с 30 мкл денатурирующего раствора (660 мкл формамида, 210 мкл формальдегида, 130 мкл 10-кратного электрофорезного буфера MOPS pH=7,0), затем смесь инкубировали при 65°C в течение 5 минут и охлаждали на льду. Далее к смеси добавляли равный объем 20-кратного раствора SSC (3M NaCl, 0,3M цитрат натрия) и осуществляли точечный перенос РНК на смоченную в 10-кратном растворе SSC нейлоновую мембрану с помощью устройства для вакуумного переноса. После этого дважды промывали все точки 10-кратным раствором SSC и фиксировали РНК на мембране, облучая ее УФ-лучами на трансиллюминаторе в течение 3 минут. Мембрану помещали на 2 часа в 15 мл прегибридизационного раствора (0,5 М фосфат натрия pH=7,2, 7% SDS, 1 мМ ЭДТА pH=7,0) при температуре 68°C. Непосредственно перед использованием денатурировали гибридизационный зонд кипячением в течение 10 минут и последующим быстрым охлаждением на льду. Денатурированный зонд добавляли в прегибридизационный раствор и инкубировали 14 часов при температуре 68°C. Затем проводили следующие отмывки: один раз в 150 мл первого отмывочного раствора (1-кратный SSC и 1% SDS) в течение 10 минут при комнатной температуре и 3 раза в 150 мл второго отмывочного раствора (0,5-кратный SSC, 0,1% SDS), в течение 10 минут при 68°C. Далее мембрану сушили и экспонировали с рентгеновской пленкой в течение 48 часов при -70°C, после чего пленку проявляли по стандартной процедуре. По результатам гибридизации визуально анализировали силу сигнала в точках, соответствующих здоровым тканям и в точках, соответствующих опухолевым тканям. Для анализа были взяты клинические образцы опухолей, описанные в примере 1. При их изучении были обнаружены сигналы гибридизации в образцах 7 (семинома яичка), 30, 31, 92 (лимфомы), 87, 108 (рак желудка). Сопоставление результатов детекции мРНК LINC00309 обоими методами показало их сходство, однако данный метод менее чувствителен и более длителен.
Приведенные выше экспериментальные данные свидетельствуют о том, что заявляемый способ может быть с высокой степенью надежности использован для выявления онкологических заболеваний различных органов.