СПОСОБ ПОДГОТОВКИ ОБРАЗЦОВ ДЛЯ АНАЛИЗА И КАРТРИДЖ ДЛЯ НЕГО
METHOD OF PREPARATION OF SPECIMENS FOR ANALYSIS AND CARTRIDGE FOR IT

Настоящее изобретение относится к способу подготовки образцов для использования в аналитическом процессе и к картриджу для использования в таком способе подготовки. В частности, настоящее изобретение относится к подготовке образцов, содержащих водорастворимые определяемые вещества, экстрагируемые из продуктов питания, например, акриламид.
Известны способы экстракции соединений из продуктов питания. Например, известно применение твердофазной экстракции (ТФЭ) для удаления примесей из экстракта из продукта питания и анализ очищенного образца с помощью жидкостной хроматографии/тандемной масс-спектрометрии (ЖХ/МС/МС). ТФЭ использует аффинность веществ, растворенных или суспендированных в жидкости (известной как мобильная фаза) к твердому веществу, через который пропускают образец (твердое вещество известно как стационарная фаза, и содержит сорбирующий материал) для разделения смеси на необходимые и ненужные компоненты. Стационарная фаза обеспечивается в форме шприцеобразного картриджа с упакованным сорбирующим материалом. Сорбирующий материал можно выбрать для удерживания, посредством абсорбции, либо необходимого анализируемого вещества, либо ненужных примесей. Были разработаны некоторые системы ТФЭ, специфичные в отношении анализируемого вещества или растворителя, с применением конкретных ТФЭ сорбентов. Например, известно применение ТФЭ картриджа с многослойным сорбентом (известного как трубка Supelclean ENVI-Carb-II/PSE SPE, поставляемая Sigma-Aldrich Co., Беллефонте, Пенсильвания, США) для экстракции пестицидов из сельскохозяйственных продуктов с помощью органического растворителя, такого как ацетонитрил.
В последние годы появились вопросы, связанные со здоровьем и безопасностью, касающиеся наличия химического акриламида в некоторых продуктах питания, который, как считается, образует побочный продукт при некоторых процессах приготовления пищи. Управление по контролю за продуктами питания и лекарственными средствами (FDA) США разработало аналитический метод количественного определения акриламида в продуктах питания («Выявление и количественное определение акриламида в продуктах питания» опубликовано в виде проекта 20 июня 2002, обновлено 23 июля 2002 и 24 февраля 2003 Департаментом здравоохранения и соцобеспечения США, Управлением по контролю за продуктами питания и лекарственными средствами США, Центром по безопасности пищевых продуктов и практическим вопросам питания, Управлением по растительным и молочным продуктам питания и напиткам).
Этот способ, разработанный FDA, использует особую методику твердофазной экстракции (ТФЭ), вместе со связанным аппаратом, для удаления примесей из акриламид-содержащего экстракта из продукта питания в процессе очистки, для приготовления образца для последующего анализа с помощью жидкостной хроматографии/тандемной масс-спектрометрии (ЖХ/МС/МС).
В частности, предложенный FDA способ очистки образца для ЖХ/МС/МС применяет две последовательные и отдельные процедуры очистки, каждая из которых использует соответствующий ТФЭ картридж, где каждый картридж содержит соответствующую стационарную фазу. Первый ТФЭ картридж для применения на первом этапе ТФЭ использует полимерный сорбент, поставляемый под маркой Oasis HLB от Waters Corporation, Милфорд, Массачусетс, США, в виде стационарной фазы, а второй ТФЭ картридж для применения на втором этапе ТФЭ использует смешанный сорбент, проявляющий сильные катионообменные и сильные анионообменные свойства, и содержащий Cg активные группы, поставляемый под маркой Bond Elut Accucat от Varian, Inc., Харбор-Сити, Калифорния, США, в виде стационарной фазы.
Более подробно, способ очистки FDA требует первой процедуры очистки с применением первого картриджа следующим образом: кондиционируют ТФЭ картридж OASIS с 3,5 мл метанола, далее с 3,5 мл воды. Отбрасывают порции метанола и воды, использованные для подготовки картриджа. Загружают ТФЭ картридж OASIS 1,5 мл анализируемой порции экстракта. Позволяют экстракту полностью пройти через сорбирующий материал. Элюируют колонку 0,5 мл воды и отбрасывают ее. Элюируют колонку дополнительно 1,5 мл воды и собирают для последующей очистки с ТФЭ картриджем.
Вторую последующую процедуру очистки с применением второго картриджа проводят следующим образом. Наносят отметку на внешней стороне ТФЭ картриджа Varian на высоте 1 мл над слоем сорбента. Кондиционируют ТФЭ картридж Varian 2,5 мл метанола, а затем 2,5 мл воды. Отбрасывают порции метанола и воды, использованные для подготовки картриджа. Загружают 1,5 мл порцию, собранную после первой процедуры очистки, и элюируют до 1 мл отметки перед сбором остатка элюированной порции. Переносят в 2 мл флакон из темного стекла для автоматического отбора пробы для ЖХ/МС/МС анализа.
Протокол анализа FDA указывает, что можно достичь высокой точности анализа, например, определения около 50 ч./млрд. Однако, такая точность достигается при выполнении протокола анализа, который занимает много времени и является строгим. Например, установлено, что исправленный способ анализа позволяет одному исполнителю подготовить 12 порций для анализа примерно за 1,5 часа. Проводимый вручную многоэтапный процесс занимает много времени и является трудоемким. Кроме того, FDA установило, что при разработке способа был протестирован ряд ТФЭ картриджей для первой процедуры очистки, и все они имели различные характеристики удерживания и элюции анализируемого вещества. Соответственно, протокол предписывает не заменять ТФЭ сорбент другим на данном этапе без тестирования. Другой протокол предписывает не применять вакуум для ускорения процесса элюции на каком-либо из этапов ТФЭ. Другими словами, на этапах ТФЭ необходимо прохождение мобильной жидкой фазы через стационарную фазу по каплям, под действием силы тяжести.
Хотя из литературы известно, что два картриджа можно установить вертикально, соединяя адаптером, авторы настоящего изобретения обнаружили, что такая установка механически неустойчива, а высокое обратное давление предотвращает прохождение жидкости через нее, и установка является непригодной для автоматизированной ТФЭ очистки. Таким образом, даже если техника автоматизированной ТФЭ очистки известна как таковая, до сих пор остается проблемой автоматизация очистки акриламида при операции в пределах протокола.
Другой проблемой протокола по данным авторов настоящего изобретения является многоэтапный способ, выполняемый вручную, который может вызывать вариабельность выявленного количества акриламида, явно обусловленную вариацией степени отделения необходимого анализируемого вещества, акриламида, от нежелательных примесей на твердой фазе. Полагают, что эта проблема является результатом чувствительности к вариациям степени упаковки сорбирующего материала в картридже.
В вышеприведенном изложении известная процедура очистки акриламида требует много времени, является трудоемкой и очень предрасположенной к ошибкам. Скорость потока образца и жидкости через картриджи значительно варьирует, в зависимости от природы экстрактов образца. Эта вариабельность может влиять на последующий анализ.
Настоящее изобретение нацелено, по меньшей мере частично, на преодоление этих проблем известного способа ТФЭ очистки акриламид-содержащих образцов и в более широком смысле, обеспечение способа и картриджа для использования в этом способе, для приготовления образцов, содержащих водорастворимые анализируемые вещества, экстрагируемые из продуктов питания, из которых акриламид является просто одним примером.
Соответственно, настоящее изобретение обеспечивает способ подготовки водных образцов для применения в процессе анализа, где образец содержит по меньшей мере одно водорастворимое анализируемое вещество, полученное из продуктов питания; где способ включает этапы:
(a) обеспечения картриджа для твердофазной экстракции, содержащего первый и второй сорбирующие материалы, расположенные для абсорбции различных соответствующих химических компонентов, где картридж содержит камеру, включающую первый и второй сорбирующие материалы, и имеющую входное отверстие и выходное отверстие;
(b) введения через входное отверстие водного образца, содержащего по меньшей мере одно водорастворимое анализируемое вещество, полученное из продукта питания, и примеси, для диспергирования образца по меньшей мере в одном из первого и второго сорбирующих материалов;
(c) введения через входное отверстие промывающей жидкости так, чтобы по меньшей мере частично разделить по меньшей мере одно водорастворимое анализируемое вещество и примеси в первом и втором сорбирующих материалах; и
(d) элюции по меньшей мере одного водорастворимого анализируемого вещества из выходного отверстия картриджа путем введения элюирующей жидкости во входное отверстие.
Способ может дополнительно включать между этапами (a) и (b) этап кондиционирования сорбирующих материалов путем пропускания по меньшей мере одной кондиционирующей жидкости через входное отверстие в картридж.
Предпочтительно, первый и второй сорбирующие материалы располагаются в виде штабеля из двух слоев в картридже.
Обычно первый сорбирующий материал располагается как верхний слой на входной стороне картриджа и содержит полимерный сорбирующий материал, приспособленный для абсорбции гидрофобных органических молекул, и/или второй сорбирующий материал располагается в виде нижнего слоя на выходной стороне картриджа, и содержит смешанный сорбирующий материал на силикатной основе, приспособленный для абсорбции анионных и катионных компонентов.
Обычно в картридже находятся равные количества первого и второго сорбирующего материала.
Предпочтительно, на каждом из этапов (b), (c) и (d) соответствующую жидкость вводят в картридж при положительном давлении жидкости и при контролируемой скорости потока.
Более предпочтительно, контролируемая скорость потока является предварительно заданной.
Предпочтительно, равные контролируемые скорости потока применяются на каждом из этапов (b), (c) и (d).
Факультативно, равные количества жидкости вводят через входное отверстие на этапах (b), (c) и (d).
В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения, по меньшей мере одно водорастворимое анализируемое вещество содержит акриламид.
Способ может дополнительно включать этап размещения картриджа в аппарате, имеющем устройство для введения жидкости, приспособленное для сообщения с входным отверстием, источник промывающей жидкости и источник элюирующей жидкости; где образец устанавливается по отношению к аппарату и устройству для введения жидкости, приспособленному для приема порции образца для подготовки, где устройство для введения жидкости приспособлено избирательно и последовательно для введения соответствующей порции образца, промывающей жидкости и элюирующей жидкости в картридж.
Обычно элюированный образец, произведенный на этапе (d), переносится автоматически в аппарат для проведения процесса анализа.
Настоящее изобретение дополнительно обеспечивает картридж для твердофазной экстракции, содержащий первый второй сорбирующие материалы, расположенные для абсорбции различных соответствующих химических компонентов, где картридж содержит камеру, включающую первый и второй сорбирующие материалы, и имеющую входное отверстие и выходное отверстие, где первый и второй сорбирующие материалы располагаются в виде штабеля из двух слоев в картридже, где первый сорбирующий материал располагается в виде верхнего слоя на входной стороне картриджа и содержит полимерный сорбирующий материал, приспособленный для удерживания гидрофобных органических молекул, а второй сорбирующий материал располагается в виде нижнего слоя на выходной стороне картриджа и содержит смешанный сорбирующий материал на силикатной основе, приспособленный для удерживания анионных и катионных компонентов.
Предпочтительно, равные количества первого и второго сорбирующих материалов присутствуют в картридже.
Настоящее изобретение дополнительно обеспечивает способ автоматической подготовки водного образца, содержащего акриламид, полученный из продукта питания, где образец предназначен для применения в аналитическом процессе количественного определения акриламида в образце, где способ включает этапы:
(a) обеспечения картриджа для твердофазной экстракции, содержащего первый и второй сорбирующие материалы, расположенные для абсорбции различных соответствующих химических компонентов, где картридж содержит камеру, включающую первый и второй сорбирующие материалы, и имеющую входное отверстие и выходное отверстие, и размещения картриджа в аппарате, снабженном устройством для введения жидкости, приспособленным для сообщения с входным отверстием, источником промывающей жидкости и источником элюирующей жидкости;
(b) введения через входное отверстие, с помощью устройства для введения жидкости, при положительном давлении жидкости и при контролируемой скорости потока, водного образца, содержащего акриламид, полученный из продукта питания, и примеси, для диспергирования образца по меньшей мере в одном из первого и второго сорбирующих материалов;
(c) введения через входное отверстие, с помощью устройства для введения жидкости, при положительном давлении жидкости и при контролируемой скорости потока, порции промывающей жидкости от ее источника так, чтобы по меньшей мере частично разделить акриламид и примеси в первом и втором сорбирующих материалах;
и
(d) элюции (извлечение) акриламида из выходного отверстия картриджа путем введения через входное отверстие, с помощью устройства для введения, при положительном давлении жидкости и при контролируемой скорости потока, порции элюирующей жидкости от ее источника.
Варианты осуществления настоящего изобретения далее описаны только в качестве примера, со ссылкой на сопроводительные чертежи, на которых:
На Фигуре 1 схематически показан картридж для твердофазной экстракции (ТФЭ) для применения на этапе очистки с применением способа подготовки образцов для анализа в соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения;
На Фигурах 2a-2d показаны последовательные этапы применения картриджа с Фигуры 1 на этапе очистки; и
На Фигуре 3 схематически, показан аппарат для осуществления способа, иллюстрированного на Фигуре 2.
Что касается Фигуры 1, картридж для твердофазной экстракции (ТФЭ) 2 содержит корпус 4, определяющий внутреннюю камеру 6, где корпус 4 имеет входное отверстие 8 и выходное отверстие 10 для камеры 6, при этом входное отверстие 8 и выходное отверстие 10 выровнены по оси. Выходное отверстие 10 соединяется с полой иглой 12 с образованием шприцеобразной структуры для картриджа 2. Камера 6 содержит два слоя из первого и второго сорбирующего материала 14, 16, разделенные фриттой 18. Каждый слой из первого и второго сорбирующих материалов 14, 16 соответственно, содержит упакованный объем дисперсного материала.
Первый сорбирующий материал 14, расположенный в качестве верхнего слоя на входной стороне, содержит полимерный сорбирующий материал, приспособленный для удерживания гидрофобных органических молекул. В частности, первый сорбирующий материал 14 может содержать увлажняемый водой обращенно-фазовый полимерный сорбирующий материал, такой как Oasis HLB, поставляемый Waters Corporation, Милфорд, Массачусетс, США.
Второй сорбирующий материал 16, расположенный в качестве нижнего слоя на выходной стороне, содержит смешанный сорбирующий материал на силикатной основе, приспособленный для удерживания анионных и катионных компонентов и компонентов с высокой полярностью. В частности, второй сорбирующий материал 16 может содержать увлажняемый водой смешанный сорбирующий материал, включающий сульфоновую кислоту и четвертичный амин на силикатной основе, такого как Bond Elut Accucat, поставляемый Varian, Inc., Харбор-Сити, Калифорния, США.
Хотя многослойный картридж 2 раскрыт в иллюстрированном варианте осуществления изобретения, может применяться смешанный картридж, содержащий физическую смесь из двух дисперсных сорбирующих материалов.
Обычно количество, например, измеренное по массе, для первого и второго сорбирующих материалов 14, 16 является одинаковым, хотя эти количества могут варьировать.
Типичный картридж для применения в соответствии с предпочтительными вариантами осуществления настоящего изобретения имеет объем 3 мл и содержит 100 мг каждого из первого и второго сорбирующих материалов 14, 16. Однако, различный объем картриджа и/или количества сорбирующих материалов можно применять в соответствии с настоящим изобретением.
При использовании картриджа 2 выполняют последовательность этапов с методом промывания единого картриджа с применением сорбирующих материалов 14, 16 в общем картридже 2.
С картриджем 2 выполняют описанные ниже последовательные этапы:
1. Этап кондиционирования, на котором сорбирующий материал уравновешивают слабо-полярным или полярным растворителем, таким как метанол, а затем промывают водой для увлажнения поверхностей сорбента. Растворитель и воду последовательно вводят через входное отверстие с предварительно установленной контролируемой скоростью потока;
2. Этап добавления, на котором водный образец, содержащий вещество, подлежащее анализу, где вещество является водорастворимым анализируемым веществом, полученным из продукта питания, таким как акриламид, вводят через входное отверстие с предварительно установленной скоростью потока, что приводит к некоторому разделению компонентов образца в сорбирующих материалах, как подробно описано ниже;
3. Этап промывания, на котором воду вводят через входное отверстие с предварительно установленной контролируемой скоростью потока для дополнительного разделения компонентов образца внутри сорбирующих материалов, как подробно описано ниже; и
4. Этап элюции (извлечения) на котором воду вводят через входное отверстие с предварительно установленной контролируемой скоростью потока для получения потока элюируемого экстракта из выходного отверстия. Этот элюируемый экстракт собирают для последующего анализа.
На каждом этапе соответствующую жидкость пропускают через картридж при положительном давлении жидкости и контролируемой скорости потока.
Элюируемый экстракт затем пропускают через аппарат ЖХ/МС/МС для анализа.
Вместо воды можно применять буферную композицию для образца и/или для способа очистки.
Что касается Фигуры 2а, на этапе кондиционирования первый и второй сорбирующие материалы 14, 16 уравновешивают растворителем, таким как метанол, а затем промывают водой для увлажнения поверхностей сорбента. При этом сорбирующие материалы 14, 16 остаются увлажненными водой, ведение воды вытесняет ранее введенный метанол через выходное отверстие. Для картриджа емкостью 3 мл, содержащего 100 мг каждого из первого и второго сорбирующих материалов 14 и 16, можно ввести 0,5 мл метанола и 0,5 мл воды в картридж, при контролируемой скорости потока 40 мкл/сек.
Что касается Фигуры 2b, на этапе добавления образца введенный образец вытесняет часть воды из выходного отверстия, и образец распределяется в верхнем сорбирующем материале 14. Для вышеуказанного картриджа емкостью 3 мл можно ввести 0,5 мл экстракта в картридж при контролируемой скорости потока 20 мкл/сек.
Что касается Фигуры 2 с, на этапе промывания с применением картриджа, указанного выше, 0,5 мл воды вводят в картридж с контролируемой скоростью потока 20 мкл/сек. Это вызывает разделение компонентов в экстракте между сорбирующими материалами 14, 16. Гидрофобные органические материалы, схематически представленные бензольным кольцом на Фигуре 2, имеют тенденцию удерживаться на полимерном первом сорбирующем материале 14. Ионные (анионные и катионные) компоненты, и любые высоко полярные соединения, схематически представленные +/- на Фигуре 2, имеют тенденцию к вымыванию и удерживанию на смешанном втором сорбирующем материале 16. Водорастворимые анализируемые вещества, такие как акриламид, схематически представленные как AA на Фигуре 2, имеют тенденцию к удерживанию по существу в виде полоски, распространяющейся между нижней частью полимерного первого сорбирующего материала 14 и верхней частью смешанного второго сорбирующего материала 16. Другими словами, двойной сорбирующий материал обеспечивает, с помощью этапов добавления экстракта и промывания, подобное хроматографическому разделение компонентов экстракта.
Что касается Фигуры 2d, на окончательном этапе элюирования вводят воду, например, 0,5 мл, с применением вышеописанного картриджа, через входное отверстие при предварительно установленной скорости потока, например, 20 мкл/сек, для получения потока водного элюируемого экстракта из выходного отверстия, где экстракт обогащен водорастворимыми анализируемыми веществами, оставляя гидрофобные органические материалы и ионные (анионные и катионные) и высоко полярные соединения удерживающимися в картридже.
Что касается Фигуры 3, в способе из предпочтительного варианта осуществления изобретения картридж 2 располагается в аппарате 20, содержащем устройство для введения жидкости 22 в форме шприца, приспособленное для сообщения с входным отверстием 8. Аппарат 20 обеспечивается источником кондиционирующего растворителя 24 (например, метанола) и источником промывающей жидкости и/или элюирующей жидкости 26, которая обычно может быть водой, и факультативно может отличаться. Образец 28 водного жидкого экстракта продукта питания, содержащий анализируемое вещество, подлежащее очистке, например, флакон 30, устанавливают в аппарат 20. Флакон 30 может иметь герметичный эластомерный колпачок 32, через который можно провести иглу шприца 34 устройства для введения жидкости 22 для извлечения порции образца экстракта продукта питания. Устройство для введения жидкости 22 избирательно и последовательно контролирует и выполняет введение соответствующей части каждого из образца 28, кондиционирующего растворителя, промывающей жидкости и элюирующей жидкости в картридж 2. Окончательный элюируемый образец собирают в другой флакон 36, который автоматически переносится в аппарат 38 для проведения аналитического процесса.
С применением последовательности этапов в способе очистки и использования картриджа, имеющего два сорбирующих материала, обеспечивается ряд существенных преимуществ по сравнению со способами очистки из предшествующего уровня техники для водорастворимых анализируемых веществ из продуктов питания, таких как акриламид, и в частности по сравнению со способом PDA для акриламида, обсуждаемым выше.
Применение единого картриджа, содержащего два сорбирующихся материала, обеспечивает возможность автоматизации процесса очистки, поскольку имеется только один этап добавления образца и один этап элюции, и можно избежать обработки вручную. Продолжительность цикла можно уменьшить от 1,5 часов в способе FDA до менее 10 минут.
Можно применять коммерчески доступные автоматизированные аппараты для очистки ТФЭ образца для подготовки образцов для анализа ЖХ/МС/МС, такие как поставляемые Gerstel GmbH & Со. KG, D-45473, Мюлхейм-ан-дер-Рур, Германия. Автоматизированный аппарат для очистки ТФЭ образцов может сообщаться с ЖХ/МС/МС спектрометром, обеспечивая 24-часовую очистку и анализ образцов.
Применение на каждом этапе положительного давления жидкости и контролируемой скорости потока для введения соответствующей жидкости в картридж устраняет необходимость в капельной подаче под действием силы тяжести, и преодолевает проблемы обратного давления в способе FDA, вызванные заблокированным картриджем. Кроме того, эти этапы должны обеспечивать точность и воспроизводимость, и снижение вариабельности количественного определения анализируемого вещества в результате вариабельности плотности упаковки сорбирующих материалов в картридже. Можно уменьшить погрешность результатов анализа.
Хотя варианты осуществления настоящего изобретения конкретно описаны со ссылкой на количественное определение акриламида в экстракте продукта питания, тем не менее настоящее изобретение можно применять для количественного определения других водорастворимых анализируемых веществ, как части пути разработки вкусового букета, который может присутствовать в продуктах питания.
Другие модификации и варианты осуществления настоящего изобретения, раскрытые здесь, легко понятны специалистам в данной области техники.