Экспрессия матриксной металлопротеиназы-9 в аденокарциноме предстательной железы

Экспрессия матриксной металлопротеиназы-9 в аденокарциноме предстательной железы

М.И. Андрюхин1, С.А. Пульбере1, А.В. Локтев1, И.И. Бабиченко2

1Кафедра урологии и оперативной нефрологии; 2кафедра патологической анатомии РУДН, Москва

Контакты: Артем Валерьевич Локтев doklok@mail.ru

В статье представлены результаты сравнительного иммуногистохимического исследования пролиферативной активности клеток, оцениваемой по экспрессии белка Ш-67, и локализации белка матриксной металлопротеиназы-9 (ММР-9) при доброкачественной гиперплазии предстательной железы и аденокарциноме различной градации по шкале Глисона. Выявлено достоверное снижение уровня ММР-9 в аденокарциноме различной градации. Установлена умеренная положительная корреляция между градацией по шкале Глисона и индексом пролиферации клеток по показателю Ш-67 (г = 0,674) и умеренная отрицательная корреляция градации по шкале Глисона с уровнем экспрессии ММР-9 (г = —0,660).

Ключевые слова: аденокарцинома предстательной железы, доброкачественная гиперплазия предстательной железы, пролифе-ративная активность, матриксная металлопротеиназа-9, Ш-67

Expression of matrix metalloproteinase-9 in adenocarcinoma of prostate M.I. Andruchin1, S.A. Pulbere1, A.V. Loktev1, I.I. Babichenko2

IDepartment of Urology and Operative Nephrology;

2Department of Pathological Anatomy, Peoples' Friendship University of Russia, Moscow

Iimmunohistochemical study of cells proliferative activity by Ki-67 protein and localization of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) has been carried out at benign prostatic hyperplasia and adenocarcinoma of different gradations by the Gleason score. A significant decrease of the MMP-9 levels in the adenocarcinoma of different gradations have been found. A moderate positive correlation between the Gleason score and cell proliferation Ki-67 index (rs = 0.674) and a moderate negative correlation with the level of such score and expression of MMP-9 (rs = —0.660) were detected.

Key words: adenocarcinoma of the prostate, benign prostatic hyperplasia, proliferative activity, matrix metalloproteinase-9, Ki-67

Введение

Рак предстательной железы (РПЖ) является 5-й из наиболее часто встречающихся раковых опухолей в мире и занимает 2-е место по заболеваемости у мужчин. Основными критериями аденокарциномы предстательной железы (ПЖ) считаются наличие инфильтративного роста железистых структур в строму органа, отсутствие базального клеточного слоя и атипия клеточных ядер [1].

Матриксные металлопротеиназы (ММР) — ферменты, разрушающие внеклеточный матрикс, играют ведущую роль в эмбриогенезе, восстановлении тканей после повреждения при воспалении и ангиогенезе [2]. В условиях онкопатологии ММР обеспечивают инвазию раковых клеток и процессы метастазирования [3, 4].

ММР-9 разрушает основные компоненты внеклеточного матрикса: коллаген IV, фибронектин и лами-нин, и обычно используется как маркер злокачественного фенотипа опухолей [5, 6].

Цель исследования — изучение экспрессии маркера пролиферации К1-67 и ММР-9 в неизмененных клетках секреторного эпителия при доброкачествен-

ной гиперплазии ПЖ (ДГПЖ) и атипических клетках аденокарциномы ПЖ различных градаций по шкале Глисона для определения молекулярных механизмов инвазивного роста опухолевых клеток в ПЖ.

Материалы и методы

В работе был использован операционный материал от 53 пациентов с аденокарциномой ПЖ. Средний возраст больных составил 67 (от 52 до 83) лет. В качестве контроля изучали биопсийный материал от 10 пациентов той же возрастной группы с диагнозом ДГПЖ.

Гистологическая оценка новообразований выполнена с использованием суммы баллов по шкале Глисо-на [7], которые соответствовали наиболее выраженным анапластическим изменениям клеток опухолевых желез, выявленным при биопсии у данного пациента. У всех пациентов также определяли уровень общего простатспецифического антигена (ПСА) в сыворотке крови. Были выделены 4 группы пациентов по градациям шкалы Глисона: 2-я градация — средний уровень ПСА 9,2 ± 8,4 нг/мл (п = 10), 3-я градация - 13,3 ± 12,0

нг/мл (n = 18), 4-я градация — 10,7 ± 5,3 нг/мл (n = 20) и 5-я градация — 16,3 ± 6,2 нг/мл (n = 5).

Материал фиксировали в 10 % нейтральном формалине (pH 7,4), после проводки на гистопроцессоре заливали в парафин с температурой плавления +54 °С. Для гистологического и иммуногистохимического (ИГХ) исследования серийные срезы толщиной 5 мкм монтировали на стекла, покрытые поли-Ь-лизином. Выявление тканевых антигенов осуществляли с помощью очищенных антител кроличьей антисыворотки к ММР-9 (Thermoscientific) 1:400 и Ki-67 (MM1, Diagnostic Biosystems) 1:100. Выявление иммунных комплексов проводили при помощи безбиотиновой системы детекции на основе пероксидазы хрена (N-Histofine, Япония), срезы докрашивали гематоксилином Майера.

Оценку интенсивности ИГХ-реакции с MMP-9 осуществляли по следующим параметрам: 0 — отсутствие коричневых гранул в цитоплазме клеток, 1 — наличие отдельных мелких гранул в цитоплазме, 2 — распределение в отдельных клетках крупных гранул, 3 — наличие крупных гранул в цитоплазме большинства клеток. Индекс пролиферации (ИП) Ki-67 определяли отношением количества иммунореактивных ядер клеток к общему числу ядер в процентах. Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью программы Statistica 10.0 стандартными методами с определением средней арифметической (М) и среднего квадратического отклонения (с). Учитывая ненормальное распределение отдельных статистических показателей, сравнение 2 независимых групп осуществляли непараметрическим методом при помощи U-критерия Манна—Уитни. Достоверными считали различия средних при уровне статистической значимостиp < 0,05. Корреляционные взаимосвязи между градациями опухоли по шкале Глисона, ИП клеток, выраженностью экспрессии MMP-9 оценивали с помощью коэффициента корреляции Спир-мена (rs).

Результаты и обсуждение

ИГХ-исследование ткани ПЖ выявило особенности экспрессии белков, характеризующих пролифера-тивные процессы ММР-9, в зависимости от градации опухолей по шкале Глисона.

При изучении пролиферативной активности клеток в контрольном материале — ДГПЖ — отдельные клетки, окрашенные антителами к белку Ю-67, располагались только в базальном клеточном слое, про-лиферативная активность клеток секреторного клеточного слоя не отмечалась. В аденокарциноме различных градаций выявлен широкий спектр проли-феративной активности секреторных железистых клеток (табл. 1). В высокоинвазивных аденокарциномах 4-й и 5-й градаций нами отмечено увеличение пролиферативной активности атипических клеток.

Таким образом, пролиферативная активность ана-пластических клеток аденокарциномы различных градаций по шкале Глисона является чувствительным тестом для дифференциальной диагностики этих новообразований.

Экспрессия ММР-9 выявлялась в цитоплазме опухолевых клеток в виде мелких или крупных гранул, при этом отмечалась различная интенсивность окрашивания продуктами диаминобензидиновой реакции. При ДГПЖ отмечается выраженная ИГХ-реакция, в секреторных клетках в большом количестве видны крупные, средние и мелкие гранулы ММР-9.

При изучении аденокарциномы мы выявили снижение интенсивности ИГХ-окрашивания ММР-9. При исследовании ИГХ-реакции в аденокарциноме ПЖ (2-й и 4-й градаций по шкале Глисона) в цитоплазме секреторных клеток отмечаются отдельные мелкие гранулы ММР-9. Следует отметить, что в аденокарциномах различных градаций интенсивность окрашивания была ниже, чем при ДГПЖ.

Как видно из представленных данных, уровень экспрессии ММР-9 снижается в опухолевых клетках по мере нарастания в них анапластических изменений,

Таблица 1. Характеристика экспрессии ИП Ki-67 и ММР-9 в ПЖ при ДГПЖ и аденокарциноме различных градаций по шкале Глисона

ДГПЖ/аденокарцинома, шкала Глисона Число пациентов ИП Ki-67, М ± S, % MMP-9, М ± S, у. е.

ДГПЖ (контроль) 10 0 3,0

2-я градация (2 балла) 10 5,3 ± 1,1 1,8 ± 0,4

3-я градация (3 балла) 18 7,2 ± 1,4* 1,8 ± 0,5

4-я градация (4 балла) 20 10,0 ± 3,9*' ** 0,9 ± 0,4# ##

5-я градация (5 баллов) 5 17 2 + 9 4*, ** 0,8 ± 0,4# ##

Всего 63 - -

* Достоверные различия между 2-й и 3-й, 2-й и 4-й, 2-й и 5-й градациями; ** достоверные различия между 3-й и 4-й, 3-й и 5-й градациями;

# достоверные различия между 2-й и 4-й, 2-й и 5-й градациями; ## достоверные различия между 3-й и 4-й, 3-й и 5-й градациями.

Таблица 2. Корреляционные взаимосвязи между клиническими, морфологическими и ИГХ-характеристиками аденокарциномы ПЖ

Параметр Показатели Возраст ПСА Градация по шкале Глисона ИП Ki-67 Экспрессия ММР-9

Возраст rs p - 0,290* 0,034 0,164 0,239 0,065 0,642 -0,009 0,948

ПСА rs p - - 0,276* 0,046 0,1313 0,348 0,022 0,875

Градация по шкале Глисона rs p - - - 0,674* 0,0001 -0,660* 0,0001

ИП Ki-67 rs p - - - - -0,369* 0,006

Экспрессия ММР-9 rs p - - - - -

* Достоверные показатели.

при этом в аденокарциномах 2-й и 3-й градаций уровень экспрессии этого фермента достоверно в 2 раза превышает этот показатель в аденокарциномах 4-й и 5-й градаций. Нами не выявлено достоверных различий в экспрессии ММР-9 между аденокарциномами 2-й и 3-й градаций, а также 4-й и 5-й градаций. По уровню экспрессии ММР-9 эти группы опухолей оказались идентичны.

Изучение молекулярных особенностей онкогене-за открывает новые возможности диагностики и лечения опухолей ПЖ, помогает раскрыть механизмы их биологического потенциала и инвазивных свойств. В настоящее время показано прогностическое значение при аденокарциномах ПЖ таких показателей, как градация по шкале Глисона, уровень общего ПСА в сыворотке крови; многие авторы указывают, что важным показателем является уровень пролиферативной активности опухолевых клеток. В табл. 2 представлены взаимосвязи между клиническими, морфологическими характеристиками опухолей ПЖ, пролиферацией клеток и экспрессией ММР-9. Как видно из представленных данных, наблюдается умеренная положитель-

ная корреляционная связь между градацией по шкале Глисона и ИП клеток по показателю Ю-67 (г8 = 0,674) и умеренная отрицательная корреляционная связь градации опухолей с уровнем экспрессии ММР-9 (г8= —0,660). Слабая достоверная отрицательная корреляция существует между уровнем пролиферативной активности клеток и экспрессией секреторными опухолевыми клетками ММР-9 (г = —0,369).

Заключение

Таким образом, проведенные исследования свидетельствуют о том, что по мере увеличения градации по шкале Глисона и повышения пролиферативной активности секреторных клеток аденокарциномы ПЖ происходит снижение выработки ММР-9. При этом инвазивные свойства опухолевых клеток можно объяснить нарушением структуры желез при аденокарцино-ме, в результате чего фермент не выводится из ацинусов по протокам, а накапливается в них и разрушает базаль-ную мембрану и окружающую соединительнотканную строму, характеризуя инфильтрирующий рост опухоли и развитие отдаленных метастазов.

ЛИТЕРАТУРА

1. Humphrey P.A. Diagnosis of adenocarcinoma in prostate needle biopsy tissue. J Clin Pathol 2007;60:35-42.

2. Castellano G., Malaponte G., Mazzarino M.C. et al. Activation of the osteopontine/matrix metalloproteinase-9 pathway correlates with prostate cancer progression. Clin Cancer Res 2008;14: 7470-80.

3. Авдошин В.П., Бабиченко И.И., Котельникова Е.В. Прогностическое значение экспрессии иммуногистохимических маркеров Ki-67, MMP-9 и коллагена IV

у больных папиллярным уротелиальным раком мочевого пузыря. Онкоурология 2011;(3):66—70.

4. Vargas R., Jacobus S., Leitzel K. et al. Elevated plasma tissue inhibitor of metalloproteinase-1 levels predict decreased survival in castration-resistant prostate cancer patients. Cancer 2011;117:517-25.

5. Авдошин В.П., Котельникова Е.В., Бабиченко И.И. Диагностическая и прогностическая значимость экспрессии им-муногистохимических маркеров Ki-67, MMP-9 и коллагена IV у больных папил-

лярным уротелиальным раком мочевого пузыря. Вестник РУДН. Серия «Медицина» 2011;4:80-6.

6. Roy R., Louis G., Loughlin K.R. et al. Tumor-specific urinary MMP fingerprinting: identification of high molecular weight urinary MMP species. Clin Cancer Res 2008;14:6610-7.

7. Murphy G.P., Busch C., Abrahamsson P.A. et al. Histopathology of localized prostate cancer. Consensus Conference on Diagnosis and Prognostic Parameters in Localized Prostate Cancer. Scand J Urol Nephrol Suppl 1993;162:7-42.