Оценка гемореологических нарушений при экспериментальном стрессе у крыс с помощью кластерного анализа

И.И. Дигурова, А.А. Шипов

ОЦЕНКА ГЕМОРЕОЛОГИЧЕСКИХ НАРУШЕНИЙ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ СТРЕССЕ У КРЫС С ПОМОЩЬЮ КЛАСТЕРНОГО АНАЛИЗА

Приведена оценка изменения гемореологических показателей в норме и при ортостатическом 45 минутном стрессе у крыс.

Оценка результатов с помощью кластерного анализа подтверждает стабильность гематок-ритного показателя, оптимизацию агрегации эритроцитов и ухудшение их деформируемости при ортостатическом стрессе у крыс.

Ключевые слова: гемореологические изменения, кластерный анализ, ортостатический стресс,

крысы.

I.I. Digurova, A.A. Shipov

HEMORHEOLOGICAL CHANGE ESTIMATION IN RAT EXPERIMENTAL STRESS BY MEANS OF THE CLUSTER ANALYSIS

Hemorheological indicator change estimation in norm and at rat orthostatic 45 minute stress is given.

The result estimation by means of the cluster analysis proves hematocrit index stability, erythrocyte aggregation optimization and degradation of their deformability in rat orthostatic stress.

Key words: hemorheological changes, cluster analysis, orthostatic stress, rats.

При действии стрессовых факторов различного генеза происходят гемореологические сдвиги [1-3]. Однако для объективной оценки полученных результатов необходима не только их обычная статистическая обработка, но и применение специальных математических методов. Одним из подходов, позволяющих классифицировать элементы совокупности, является кластерный анализ [4], широко применяющийся в современных биологических исследованиях [5-7].

Целью работы явилась оценка изменения гемореологических показателей в норме и при ортостатическом 45-минутном стрессе у крыс с помощью кластерного анализа.

Материалы и методы исследования

Кластерному анализу подверглись результаты исследования макро- и микрореологических показателей у крыс в норме и при остром 45-минутном ортостатическом стрессе. Животные содержались в стандартных условиях вивария. С ними работали в соответствии с «Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием лабораторных животных» [8]. Разброс по массе не превышал ±10%. Все исследования были синхронизированы по времени суток. Для создания модели ортостатического стресса неадаптированных и ненаркотизированных крыс помещали в клетках-футлярах объемом (0,4-0,6)*10-3м3 вниз головой под углом 900 к горизонтальной поверхности. Гемореологические показатели исследовали с помощью микрометодов [9]. Кровь для гемореологических исследований брали из хвостовой вены до стресса и сразу после окончания опыта. В качестве антикоагулянта использовали гепарин в микродозах. Все измерения были проведены в течение 2 ч после забора крови. Гематокритный показатель (Ж) определяли путем центрифугирования проб крови в микрокапиллярах при 3000 об/мин в течение 30 мин. Индекс деформируемости эритроцитов (ИДЭ) рассчитан по отношению времени фильтрации физиологического раствора ко времени фильтрации суспензии дважды отмытых эритроцитов (с гематокритным показателем, равным 0,02). Индекс агрегации эритроцитов (ИДЭ) рассчитывали как отношение числа агрегатов к числу неагрегированных клеток при микроскопировании в камере Горяева. Статистическая обработка

данных проведена с помощью пакетов OpenOffice.org, Ш SPSS 19. Различия считались значимыми при р<0,05.

Результаты исследований

Данные по исследованию макро- и микрореологических показателей представлены в таблице 1. При воздействии стрессового фактора не отмечено статистически значимых изменений гематокритного показателя по сравнению с исходными значениями. Индекс агрегации эритроцитов после стресса не изменялся статистически значимо по сравнению с соответствующим контролем. Исследование индекса деформируемости эритроцитов выявило статистически значимое уменьшение этого показателя в среднем по группе на 35% ф<0,001) по сравнению с исходным уровнем, что является негативным последствием стресса.

Таблица 1

Изменения гемореологических показателей при ортостатическом стрессе

Показатель До стресса После стресса

Ht, % 40,38±1,48 39,33±1,32

ИАЭ, отн. ед. 0,40±0,03 0,42±0,02

ИДЭ, отн.ед. 0,48±0,04 0,31±0,03*

* р <0,001.

Анализ результатов показал, что изменения индекса агрегации эритроцитов зависели от исходных значений. У одних животных этот показатель увеличился после опыта, у других - снизился. По этому признаку были выделены две подгруппы. Результаты представлены в таблице 2. У половаины животных (первая подгруппа) произошло повышение индекса агрегации эритроцитов на 34% (р<0,001) по сравнению с результатами, полученными до стресса. Исходное среднее значение в этой подгруппе было равно 0,35 отн. ед. У остальной половины крыс (вторая подгруппа) индекс агрегации эритроцитов снизился на 18% ф<0,001). Средняя исходная цифра составляла при этом 0,45 отн. ед. Таким образом, при низком исходном значении индекс агрегации увеличился, а при более высоком - уменьшился. Такое деление, однако, недостаточно отражает происходящие изменения, несмотря на их статистическую значимость. В частности, если у некоторых животных показатель не изменится в результате воздействия, то этот результат невозможно будет включить в какую-либо из двух подгрупп.

Таблица 2

Индекс агрегации эритроцитов у крыс разных подгрупп

Показатель 1-я подгруппа 2-я подгруппа

До стресса После стресса До стресса После стресса

ИАЭ, отн.ед. 3 ,0 0, +1 5 ,3 0, * ,0 0, +1 7 ,4 0, 0,45 ± 0,03 0,37 ± 0,03*

* р <0,001.

При быстрой кластеризации (K-Means Cluster Analysis) получились следующие результаты: по исходным данным выделены два кластера (77 и 23% животных) с центрами 0,35 и 0,58 соответственно. Таким образом, можно предположить, что крысы от природы делятся на два класса. Аналогичная тенденция наблюдалась после опыта. При анализе данных, полученных после стрессового воздействия, выявлено два кластера (73 и 27% животных) с центрами 0,35 и 0,59 соответственно. Результаты указывают, что биологическая закономерность сохранялась на фоне стресса. Для подтверждения или опровержения этого вывода был проведен пошаговый кластерный анализ данных, полученных при исследовании индекса агрегации эритроцитов.

Результаты его проведения до стресса представлены в таблице 3. При разделении данных на 2, 3 и 4 кластера в каждом случае выявлена наиболее многочисленная группа: 0,39 отн.ед (96% крыс), 0,35 отн.ед. (77%), 0,38 отн.ед. (73%) соответственно. Деление на 5 кластеров позволили выделить три кластера, наиболее многочисленные, со средними значениями 0,28, 0,41 и 0,55 отн.ед. (количество животных 31, 42 и 19% соответственно).

Результаты пошагового кластерного анализа значений, полученных при исследовании индекса агрегации эритроцитов после стресса, представлены в таблице 3. При делении данных на 2, 3, 4 и 5 кластеров в каждом случае выявлена наиболее многочисленная группа: 0,39 отн.ед (92% крыс), 0,38 отн.ед. (88%), 0,36 отн.ед. (77%), 0,37 отн.ед. (73%) соответственно. В остальных кластерах было 1-3 животных.

Таблица 3

Результаты кластерного анализа индекса агрегации эритроцитов до и после стресса

Количество кластеров Среднее значение ИАЭ, отн. ед. Количество крыс, %

До стресса

2 G,39 96

G,73 4

G,35 77

3 G,55 19

G,73 4

G,18 4

4 G,38 73

G,55 19

G,73 4

G,18 4

0,28 31

5 0,41 42

0,55 19

G,73 4

После стресса

2 G,39 92

G,62 8

0,38 88

3 G,62 4

G,69 8

0,36 77

4 G,54 11

G,62 4

G,69 8

G,24 4

0,37 73

5 G,54 11

G,62 4

G,69 8

Таким образом, после воздействия стрессового фактора происходит «подравнивание» данных, направленное, вероятно, на оптимизацию кровотока в экстремальных условиях.

Анализ (K-Means Cluster Analysis) изменений деформируемости эритроцитов показал, что исходная популяция разделилась на два кластера (44 и 56% животных) с центрами 0,32 и 0,59, опытная группа - (32 и 68% крыс) с центрами 0,13 и 0,39 соответственно.

Результаты пошагового кластерного анализа индексов деформируемости эритроцитов до стресса представлены в таблице 4. При делении данных на две кластера наиболее многочисленная группа крыс имела среднее значение 0,49 отн.ед. (96% крыс), а при делении на 3, 4 и 5 кластеров - 0,42 отн.ед. (72%). Таким образом, исходные значения индекса деформируемости эритроцитов являлись более стабильными по сравнению с индексом агрегации.

Таблица 4

Результаты кластерного анализа индекса деформируемости эритроцитов до и после стресса

Количество кластеров Среднее значение ИДЭ, отн. ед. Количество крыс, %

До стресса

2 0,04 4

0,49 96

0,04 4

3 0,42 72

0,71 24

0,04 4

4 0,42 72

0,66 12

0,75 12

0,04 4

0,42 72

5 0,62 4

0,69 8

0,75 12

После стресса

2 0,04 8

0,33 92

0,04 8

3 0,15 20

0,38 72

0,04 8

4 0,15 20

0,31 36

0,46 36

0,04 8

0,11 8

5 0,17 12

0,31 36

0,46 36

Результаты пошагового кластерного анализа, полученные после воздействия стрессового фактора (см. табл. 4), показали, что наибольшее среднее значение (0, 46 отн.ед.) наблюдалось в группе, включающей 36% крыс. У остальных животных этот показатель был значительно ниже. Таким образом, кластерный анализ подтверждает ухудшение деформируемости эритроцитов в результате действия стрессового фактора.

Проведение быстрой кластеризации (K-Means Cluster Analysis) данных по исследованию гематокрит-ного показателя привело к следующим результатам. Контрольная популяция животных разделилась на два кластера с центрами 26,67 и 42,67% (14 и 86% крыс). После опыта также выделены две группы (57 и 43% животных) с центрами 43,33 и 34, 0% соответственно.

Анализ результатов пошаговой кластеризации гематокритного показателя до стресса представлен в таблице 5. При делении на 2, 3 и 4 кластера выявлено, что исследуемый показатель у 85% крыс принадлежал к кластеру, где среднее значение составляло 42,67%. Таким образом, у большинства крыс гематокрит-ный показатель до воздействия стрессового фактора находился в пределах нормы.

Таблица 5

Результаты кластерного анализа значений гематокритного показателя до и после стресса

Количество кластеров Среднее значение Ж, % Количество крыс, %

До стресса

2 42,67 85

26,67 15

42,67 85

3 29,0 10

22,0 5

42,67 85

4 31,0 5

27,0 5

22,0 5

48,50 20

41,0 65

5 31,0 5

27,0 5

22,0 5

После стресса

2 41,06 86

29,0 14

48,0 19

3 39,07 67

29,0 14

48,0 19

4 44,0 5

38,69 62

29,0 14

50,0 5

47,33 14

5 44,0 5

38,69 62

29,0 14

Результаты пошагового кластерного анализа гематокритного показателя после ортостатического стресса представлены в таблице 5. При делении данных на два кластера выявлено, что у 86% крыс среднее значение составило 41,06%. Деление на 3, 4 и 5 кластеров показало, что более чем у 60% крыс значение исследуемого показателя было равно примерно 40%. Сравнение результатов кластерного анализа данных, полученных до и после стрессового воздействия, подтверждает стабильность гематокритного показателя.

Заключение

Кластерный анализ подтверждает стабильность гематокритного показателя, оптимизацию агрегации эритроцитов и ухудшение их деформируемости после ортостатического 45-минутного стресса. Для объективной оценки гемореологического статуса целесообразно использовать пошаговый кластерный анализ.

Литература

1. Федоров Б.М. Стресс и система кровообращения. - М.:Медицина, 1991. -320 с.

2. Смирнов И.Ю. Гемореологическая выносливость в спорте. - Кострома: Изд-во КГТУ, 2006.

3. Оценка микроциркуляторных изменений при воздействии некоторых экстремальных факторов / И.И.Дигурова, А.Д. Ноздрачев, В.В. Гагарин [и др.] // Вестн. СПбГУ. - Сер. 3. - 2007. - С. 65-73.

4. Boslaugh S., Watters P.A. Statistics in a nutshell. - Sebastopol, 2008. - P. 298-314.

5. Bazelot M., Dinocourt C., Cohen I., Miles R. Unitary inhibitory field potentials in the CA3 region of rat hippocampus J. Physiol.2010 Jun 15; 588(pt 12):2077-90 Epub 2010 Apr 19

6. Pearson K.A., Stephen A., Beck S.G., Valentino R.J. Identifying genes in monoamine nuclei that may determine stress vulnerability and depressive behavior in Wistar - Kyoto rats // Neuropsychopharmacology. - 2006. 31(11):2449-61. Epub 2006. May 17.

7. Wozny C., Williams SR. Specificity of Synaptic Connectivity between layer 1 Inhibitory Interneurons and Layer 2/3 pyramidal Neurons in the rat Neocortex // Ceribcortex. - 2011. - Jan. 10.

8. Международные рекомендации по проведению медико-биологических исследований с использованием лабораторных животных // Хроника ВОЗ. - 1985. - №3. - С. 3-9.

9. Дигурова И.И., Гущин А.Г. Исследования макрореологических показателей крови при разных стрессах у крыс с помощью микрометодов // Вестн. КГУ. - 2006. - №6. - С. 6-8.

УДК 619:616:661.833.322.2:678.048 Л.А. Набока, А.Н. Чубин, А.В. Корнилова

ВЛИЯНИЕ ОДНОВРЕМЕННОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ АКТИВНОГО ГИПОХЛОРИТА НАТРИЯ И МЕКСИДОЛА

НА СЕКРЕТОРНУЮ ФУНКЦИЮ ЖЕЛУДКА СОБАК

В хронических опытах на фистулированных собаках было изучено влияние одновременного воздействия гипохлорита натрия и мексидола на секреторную функцию желудка. Анализ результатов показывает угнетающее действие испытуемых препаратов.

Ключевые слова: гипохлорит натрия, мексидол, фистулированные собаки, секреторная функция желудка.

L.A. Naboka, A.N. Chubin, A.V. ^тЫа EFFECT OF SIMULTANEOUS EXPOSURE OF ACTIVE SODIUM HYPOCHLORITE AND MEXIDOL ON DOG GASTRIC SECRETORY FUNCTION

The effect of simultaneous exposure of sodium hypochlorite and mexidol on the gastric secretory function is studied in chronic experiments on the fistula dogs. The result analysis shows the inhibitory effect of the tested medications.

Key words: sodium hypochlorite, mexidol, fistula dogs, gastric secretory function.

В ветеринарной и медицинской практике большое внимание уделяется применению электроактиви-рованных растворов, в частности, раствора активного гипохлорита натрия (РАГН). Данный раствор является сильным окислителем за счет содержания в молекуле легко отщепляемого атомарного кислорода, это обеспечивает его бактерицидное, противовирусное, противогрибковое, иммуномодулирующее свойства [1]. В чистых физиологических экспериментах изучены механизмы его воздействия на секрецию желудочных желез при различных способах введения: внутривенно, перорально, ректально, интраперитонеально [2].

На основе соединения гетероароматических фенолов разработан и внедрен в клиническую практику лекарственный препарат мексидол, эффект которого определяется следующим механизмом действия: он ингибирует свободнорадикальное окисление липидов биомембран, сохраняя их упорядоченность. Мексидол активно реагирует с перекисными радикалами липидов, первичными и гидроксильными радикалами пептидов, повышает активность супероксиддисмутазы и других антиоксидантных ферментов [3,4].

Нами выдвинуто предположение, что одновременное введение РАГН и мексидола может вызвать качественно новую реакцию желудочных желез. Выявленные особенности реакции желудочных желез при действии перечисленных факторов в сочетании могут служить экспериментальной базой для применения в клинической практике.

Целью данного исследования явилось изучение секреторной, кислотообразующей и ферментовы-