СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ЛЕЙКОЗА У ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ
METHOD OF TREATING LEUKOSIS IN LABORATORY ANIMALS

Предлагаемое изобретение относится к области лабораторных исследований и может быть использовано в экспериментальной медицине для лечения злокачественных образований.
В целом известны способы лечения лейкозов (хирургическое, химиотерапия, лучевая терапия), которые требуют проведения дополнительной терапии, направленной на повышение иммунитета.
Известен «Способ профилактики и лечения лейкоза крупного рогатого скота» по патенту РФ №2320357. Он предусматривает внутримышечное введение самопролонгированного лекарственного препарата лигфола. Действующим началом лигфола являются высокомолекулярные гуминовые вещества. В основе фармакологической активности препарата лежат иммуноантиоксидантные механизмы. Лигфол вводят 1 раз в месяц в дозах: коровам 5,0 мл; телятам в первый месяц жизни 0,1 мл, во второй 0,2 мл, в третий 0,3 мл, в четвертый 0,4 мл, в пятый и последующие 0,5 мл. Введение препарата продолжается до достижения положительного эффекта.
Недостаток способа заключается в ограничении его применения, поскольку препарат лигфол может использоваться только в ветеринарной практике.
Известен способ "Transcutaneous photodynamic treatment of targeted cells" по патенту US №2002087205 (A1). Способ предусматривает чрескожную терапию эндотелиальных тканей, злокачественных опухолей стенок сосудов, головы и шеи, желудочно-кишечного тракта, печени, молочной железы, предстательной железы, легких несолидных опухолей, кроветворной и лимфоидной тканей, других поражений сосудистой системы или костного мозга, тканей и клеток, связанных с аутоиммунными и воспалительными заболеваниями. ФДТ предполагает использовать сочетание целенаправленной доставки фотосенсибилизирующего вещества в ткани конкретного органа и источника света, мягко действующего локально через кожные покровы на место локализации опухоли.
Известен способ Novel rhodamine derivatives for photodynamic therapy of cancer and in vitro purqinq of the leukemias" по патенту WO №9607431 (A1) Способ предусматривает использование в качестве фотосенсибилизаторов производные из группы 4,5-дибромородамина 123 для терапии заболеваний лейкемии, миеломы и лимфомы. Сущность способа заключается в том, что родамин и его производные под действием подаваемого света соответствующей длины волны генерируют выход синглетного кислорода, действующего разрушительно на патологические клетки.
Недостатки обоих способов заключаются в дороговизне препаратов и источников излучения. Способ может быть реализован только в специализированных клиниках.
Прототипом предлагаемого изобретения является способ ФДТ, изложенный авторами Смирновой З.С., Мееровичем И.Г., Лукъянец Е.А. и др. // Российский биотерапевтический журнал, 2004 г. №.1, с.54-59. Он включает использование внутривенного введения липосомального фотосенсибилизатора «фенилтиозамещенного фталопианина» и локального чрескожного воздействия монохроматическим излучением.
2
В способе лимфолейкоз Р388 перевивали мышам-гибридам первого поколения BDF1 подкожно в область бедра асцитной жидкостью по 0,1 мл содержащей 500 тыс. опухолевых клеток. ФС в липосомальной форме вводили мышам однократно внутривенно в дозах 4 мг/кг и 10 мг/кг на 6-й день после перевивки. При проведении ФДТ опухоли через 17 часов после введения препарата облучали излучением от лампы накаливания LS5-PDT («Биоспек», Россия) с перестраиваемым интерференционным фильтром. Длина волны излучения составляла 720-800 нм, плотность мощности 250-600 мВт/см. Эффективность ФДТ оценивали по торможению роста опухоли бедра. В течение 1 суток после облучения на поверхности опухоли формировался некротический струп и на 5-7 сутки рост опухоли замедлялся на 74%, а на 8-10 сутки на 84%.
Основной недостаток метода заключается в невозможности получения полного 100% излечения от названной патологии.
По нашему мнению более эффективный технический результат можно получить посредством совмещения локальной ФДТ и системной с использованием известных фотосенсибилизаторов и источников лазерного облучения.
Технический результат изобретения - повышение эффективности лечения лейкоза у лабораторных животных (в частности, у мышей) методом фотодинамической терапии. Более того, полученный результат позволит в последующем перенести его в экспериментальную медицину.
Обозначенный результат обусловлен, прежде всего, искусственным созданием в опухоли определенной концентрации фотосенсибилизатора. Из бинарной природы ФДТ следует, что в схеме фотодинамических эффектов необходимо учитывать взаимодействие фотосенсибилизатора (ФС) как химического вещества с биологической тканью, так и с действием самого света. Синергический (суммарный) эффект терапии при этом складывается из фотодинамических эффектов - фотосенсибилизации синглетного кислорода и его действия на опухоль. Учитывая, что среднее время синглетного кислорода в жидком растворе составляет 2 мкс, нетрудно понять важность способа доставки и места локализации ФС.
Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что опухоль бедра лабораторного животного вначале обкалывают под углом 25°-35° к плоскости фотосенсибилизатором «Димегин» (аналог препарата «Фотогем») в дозе 45-55 мг/кг и через 50-60 мин с помощью стекловолоконного световода, подведенного под опухоль, проводят облучение монохроматическим излучением с длиной волны 630 нм в течение 10-15 мин. Затем, для предотвращения гематогенного метастазирования, фотосенсибилизатор (в дозе 10-15 мг/кг) вводят внутривенно и через 50-60 мин проводят внутривенное облучение монохроматическим излучением такой же длиной волны продолжительностью 10-15 мин. Для проведения внутривенного облучения использовали стент, изготовленный из материала, обладающего информационной памятью.
Все необходимые манипуляции на животных проводились с использованием приспособления, позволяющего увеличивать свободу проводимых операций без травм и стресса.
Перечень чертежей
Фиг.1 - макет схемы проведения эксперимента, где 1 - автономный световой облучатель, 2 - световод, 3 - место введения стента и световода, 4 - опухоль на 3-и сутки после ФДТ, 5 - опухоль на 9-е сутки после ФДТ.
Фиг.2 - стент.
Порядок реализации способа
Заболевание лейкоза, а наиболее распространен лимфолейкоз, связано с кровью, поэтому одной из главных задач и условий проводимого эксперимента являлось исследование влияния отечественного фотосенсибилизатора «Димегин», аналога «Фотогема» на поведение клеток стволовой фракции кроветворения в селезенке биологического контроля.
Таблица 1Влияние «Димегина» на образование селезеночных эндоколоний
Группы
Доза обл. Гр
Кол-во мышей в группе
Кол-во эндоколоний в селезенке на мышь
Контроль
8
6
11,5±1,9
Препарат «Димегин»
8
6
13,8±3,2
Контроль
6
8
22,8±5,9
Препарат «Димегин»
6
6
23,2±5,2
Анализ результатов, полученных общепринятым методом на эндогенных селезеночных колониях с целью определения биологической направленности препарата, показал, что «Димегин» не влиял на выход селезеночных колоний у биологически чистых мышей и указывал на отсутствие у препарата протекторных - защитных свойств.
6
На следующем этапе проводимых исследований лабораторные животные (мыши линии DBA) распределены на опытные группы и контроль, которым перевивали под кожу верхней трети бедра 0,1 мл взвеси, содержащей около 10 клеток опухоли Р388. Штамм отличается повышенной химио- и радиорезистентностью и обширным метастазированием в брюшную полость с 100% летальным исходом на 8-10 сутки после перевивки опухоли. В основу исследований положен метод направленной доставки препарата для повышения селективности ФДТ. Фотосенсибилизатор в виде водного раствора однократно в дозах 5, 10, 50 мг/кг вводили внутривенно, внутрибрюшинно и проводили обкалывание опухоли. При этом во всех случаях облучение проводили через 50-60 мин монохроматическим излучением в течение 10-15 мин.
Для проведения ФДТ использовали источник монохроматического излучения АСО-1 (г.Москва) с длиной волны 630 нм, мощностью на выходе световода 50 мВт (см. фиг.1-(1). При внутривенном облучении крови использовали стент (⌀ 0,1 мм), изготовленный из материала, обладающего информационной памятью (фиг.2). Перед проведением опыта стенту задавали форму спирали заданного размера. Во время проведения опыта стент расправляли и через иглу вводили в хвостовую вену (2). После небольшого нагрева (срабатывает разность температур) он сворачивается в пружину заданного диаметра. При этом чем меньше шаги между витками, тем равномернее оказывается давление на стенки сосуда. Световод беспрепятственно входил в расширенный стентом сосуд, не нарушая кровотока (3).
t
0
0
1
2
3
Противоопухолевый эффект оценивали по интегральным показателям: коэффициенту прироста опухоли (К), рассчитываемому по формуле К=(V-V)/V. Перемножением показателей трех взаимно перпендикулярных замеров опухоли (4, 5) определяли ее объем V=d·d·d·0.52. В ходе эксперимента на животных с солидной и асцитной опухолями наблюдали изменение массы тела, рассматриваемое как ответную реакцию организма на препарат и воздействие. Поэтому ввели дополнительное взвешивание животных, а также и их органов после естественной гибели (печень, селезенка), также обращали внимание на выживаемость и увеличение продолжительности жизни.
Животных содержали на овсяной каше и очищенной питьевой воде. В небольших количествах в рацион добавляли морковь и творог.
Примеры реализации способа
Пример 1
Действие препарата в различных дозах в сочетании с монохроматическим генерализованным воздействием на мышей исследовали в следующей серии эксперимента (табл.2). За 1 час до проведения ФДТ лейкозным животным, у которых повышено тромбообразование, вводили внутривенно гепарин в дозе 15 мг/кг для снижения активности системы свертывания крови (Птушкин В.В. Онкогематология №1, 2007 г., с.57-60).
Тестирование внутренних органов у животных с солидной опухолью бедра и внутрибрюшинным асцитом, а также оценка эффективности ФДТ проводились на 7-14 сутки. Дополнительным контролем служили органы биологически чистых мышей, умерщвленных на 7-е сутки от начала проведения эксперимента.
Таблица 2Влияние внутривенной ФДТ на изменение веса селезенки и печени мышей DBA
Группа
Кол-воживотных
Сроки исследования
Вес органов, %
селезенка
печень
1
6
7
100±14,9
100,0±9,1
2
8
9
112,5±33,1
57,5±7,4***
3
8
13-14
287,4±96,9*
117,8±33,9
4
6
7
245,2±11,9
107,8±6,1
5
7
9-10
120,9±59,1**
73,3±19,3
Примечание к таблице 2:
1 - группа - биологический контроль
2 - группа-контроль, мыши с перевитой опухолью Р388 в бедро
3 - группа - внутривенная ФДТ в сочетании с локальной ФДТ солидной опухоли бедра («Димегин» 10 мг/кг)
4 - группа-контроль, мыши с перевитым асцитом Р388 внутрибрюшинно (асцитная опухоль)
5 - группа - внутривенная ФДТ мышей с асцитной опухолью («Димегин» 50 мг/кг)
*Р≤0,05 относительно группы 2
**Р≤0,05 относительно группы 4
***Р≤0,05 относительно группы 1
При вскрытии и осмотре животных, погибших на 9-е сутки с перевитой опухолью в бедро (гр. 2), установлено, что вес селезенки на 12,5% превышает в сопоставимые сроки вес селезенки у мышей биологического контроля. У всех мышей наблюдается достоверное снижение веса печени до 57,5%. Тем не менее, печень увеличена в размерах и занимает большую часть брюшной полости.
Вместе с тем, десятиминутное воздействие локального излучения на солидную опухоль бедра мышей, проведенное через 1 час после внутривенного введения препарата в дозе 10 мг/кг, вызывает увеличение селезенки до 287,4%, что в 2,9 и 2,5 раза выше значений контроля (100 и 112,5% соответственно). ФДТ в таком режиме восстанавливает вес печени до уровня биологического контроля. Следует учесть, что ФДТ начинали с 6-х суток после перевивки лейкоза (группа 3). На 13-14 сутки животные погибали, пережив мышей, не получавших ФДТ, на 4-5 суток.
Таким образом, вскрытие животных с перевитой внутрибрюшинно асцитной опухолью (системный лейкоз) выявило следующие закономерности:
1 - селезенка в 2,5 раза тяжелее селезенки животных биологического контроля;
2 - печень животных 4 группы увеличена и на 7% превышает вес печени биологического контроля.
3 - все животные погибали на 7 сутки.
ФДТ с использованием внутривенного введения «Димегина» в дозе 50 мг/кг оказывает противоопухолевое действие на мышей с асцитной опухолью (группа 5), снижая массу селезенки в 2 (t=1,9; Р≤0,05), а вес печени в 1,5 раза. Гибель животных после ФДТ отсрочена на 3 суток. Можно предположить, что усиление противоопухолевого эффекта произошло вследствие действия ФДТ на лейкемическую составляющую, приводящую к ранней гибели мышей контрольной группы.
Как следует из представленных данных таблицы 3, введение препарата в дозах 5, 10 и 50 мг/кг с последующим монохроматическим воздействием приводит к проявлению закономерных тенденций в ответной реакции животных на воздействие. Во-первых, это снижение, либо увеличение массы тела по сравнению с исходным весом экспериментальных мышей
Таблица 3Влияние ФДТ на массу тела животного и выживаемость в различные сроки наблюдения
Группа
Кол-во животных
Сроки наблюдения (сутки)
4
6
7
8
10
11
12
13
1
5
16,0±0,8
15,8±0,8
15,9±0,8
15,9±0,8
15,8±0,5
2
4
19,3±1,1
19,3±2,0
21,5±3,0
21,6±3,0
3
4
24,6±0,6
24,6±1,3
25,3±1,8
24,3±1,7
24,3±1,7
24,3±1,7
24,3±1,7
4
4
24,5±2,1
25,3±1,0
25,3±0,5
24,5±2,0
25,0
5
9
22,1±1,6
21,2±2,0
21,2±2,0
25,0
6
3
16,6±0,6
16,3±1,2
16,0
гибель
7
7
24,0±1,3
27,2±2,9
25,4±3,1
23,0±1,4
гибель
Примечание к таблице 3:
1 - группа - внутривенная ФТД, через 1 час после внутривенного введения «Димегина» (солидная опухоль) 10 мг/кг.
2 - группа - внутривенная ФТД, через 1 час после внутритканевого обкалывания опухоли под углом 25-30° к плоскости «Димегином» - 5 мг/кг.
3 - группа - внутривенная ФТД, через 24 часа после внутривенного введения «Димегина» 50 мг/кг.
4 - группа - внутрибрюшинная ФТД, через 1 час после внутривенного введения «Димегина» (асцитная опухоль) 10 мг/кг.
5 - группа - внутривенная ФТД, через 1 час после внутрибрюшинного введения «Димегина» (асцитная опухоль) 10 мг/кг.
6 - группа-контроль.
7 - группа-контроль.
Пример 2
У животных в группе 1 с перевитым в бедро лейкозом Р-388, после внутривенно проведенной ФДТ (доза препарата «Димегин»10 мг/кг) масса тела уменьшается на 0,2 г по сравнению с исходным весом и продолжительность жизни увеличивается на 3 суток (УПЖ=37,5%) относительно контрольной группы 6. Мыши без лечения в контроле теряли в весе 0,6 г и погибали в течение 8 суток.
Пример 3
Внутривенное монохроматическое облучение светом (группа 2), проведенное через 1 час после внутритканевого обкалывания опухоли (под углом 25-30° к плоскости) «Димегин» в дозе 5 мг/кг, способствует повышению массы тела на 2,3 г. Если в контроле животные погибали на 8 сутки, то после ФДТ мыши доживали до 10 суток. Сроки жизни животных в этой группе были увеличены на 2 суток (УПЖ=25%)
Пример 4
Увеличение дозы введенного внутривенно препарата «Димегин» до 50 мг/кг и интервала перед внутривенным монохроматическим воздействия до 24 часов снижает массу тела опытных животных в 3 группе на 0,3 г, а сроки жизни увеличивает на 5 суток (УПЖ=63%). После ФДТ мыши выживали до 13 суток и общая реакция организма на течение перевитого в бедро лейкоза менее выражена, чем у животных в контроле 6 группы без лечения.
В контрольной группе 7 с привитым асцитом лейкоза внутрибрюшинно на момент начала гибели - с 7-х суток, вес тела увеличивался на 1,3 г, а само животное увеличивалось в размерах. В последующие 8-е сутки животные теряли в весе за счет разрушения мышечной и костной ткани и погибали. Средняя продолжительность жизни мышей-опухоленосителей составляла 7,3 суток. Все животные с асцитной опухолью имели симптомы, характерные для поздней стадии заболевания - одышка, малая подвижность, отказ от приема пищи.
Пример 5
ФДТ мышей на 4 сутки развития у них асцитной опухоли (группа 4) способствовала увеличению веса тела на 0,5 г. Монохроматическое воздействие осуществлялось внутрибрюшинно через 1 час после внутривенного введения препарата «Димегин» в дозе 10 мг/кг.
Пример 6
В более поздние сроки развития асцитной опухоли (6 сутки) у мышей 5-й группы внутривенное монохроматическое воздействие, следующее за внутрибрюшинным введением препарата, вызывало увеличение веса тела животных на 2,9 г.
Сроки жизни мышей, прошедших ФДТ, отличались от контроля. Начиная с 8-х суток, отмечены единичные случаи гибели в группах 4 и 5. При этом отмечается увеличение продолжительности жизни (УПЖ) в каждой группе на 25%. При анализе представленных данных таблицы 3 видно, что увеличение веса тела животных в группах 2 и 5 (после внутривенного монохроматического облучения, следующего за локальным внутриопухолевым или внутрибрюшинным введением препарата) приблизительно одинаковое. Суть данного эксперимента заключалась в отдельной оценке эффективности локального действия самого препарата и внутривенного облучения. Так, введенный локально «Димегин» в небольших дозах (5 мг/кг) в солидную опухоль бедра стимулирует развитие опухоли. На этом фоне вес тела мышей за короткий срок увеличивается. К концу срока наблюдения (10 сут) агрессивная солидная опухоль бедра достигает 1/8 часть размера животного. Можно предположить, что окончательный вес животного будет состоять из веса самого животного и веса опухоли. Непосредственное внутривенное монохроматическое воздействие, стимулируя общую резистентность организма, способствовало увеличению сроков жизни животных на 3 или 2 суток.
Пример 7
Для подтверждения и сравнения эффективности локальных подведений препарата и оптического воздействия с внутривенно проводимой ФДТ, исходя из полученных результатов, «Димегин» в дозе 50 мг/кг вводили под углом 30° в основание опухоли бедра мыши на 7 сутки после перевивки (табл.4). Объем введенного препарата составил 1/2 объема опухоли. Через час в место прокола вводился световод. Время облучения 10 минут. При таком сочетании ФДТ способствовала сдерживанию роста опухолевого узла вплоть до 9 суток наблюдения, но на 10 сутки животные все же погибали.
Таблица 4Влияние внутривенной и внутриопухолевой ФДТ на динамику роста опухоли.
Группа
Кол-воживотных
Сроки наблюдения (сутки)/объем опухоли/см<sup>3</sup>
7
8
9
10
11
12
13
1
4
0,8±0,5
0,9±0,4
0,8±0,4
1,2±0,4
2
8
0,28±0,1
0,27±0,1
0,43±0,05
0,37±0,1
0,37±0,01
0,37±0,01
0,86
3
3
0,5±0,5
0,6±0,4
1,2±0,6
Примечание к таблице 4
1 - группа - внутриопухолевая (внутритканевая) ФДТ через 1 час после внутриопухолевого (внутритканевого) введения препарата «Димегин» в дозе 50 мг/кг
2 - группа - внутривенная ФДТ через 1 час после внутривенного введения препарата «Димегин» в дозе 50 мг/кг
3 - группа-контроль
Кроме этого внутривенное введение фотосенсибилизатора в дозе 50 мг/кг с последующим через час внутривенным 10-минутным световьм воздействием (группа 2) не только влияло на динамику опухоли бедра, но и продлевало сроки жизни животным на 44,4%.
Пример 8
Анализ результатов примера 7 позволил изменить подход к локальной терапии солидной опухоли бедра мышей. Для этого опухоль сначала обкалывали препаратом «Димегин», а затем для предотвращения гематогенного метастазирования вводили «Димегин» в дозе 10 мг/кг внутривенно. Монохроматическое воздействие через час
Проводилось аналогичным образом.
Таблица 5Влияние внутривенной и внутриопухолевой (внутритканевой)_ ФДТ на коэффициент прироста опухоли бедра у мышей DBA
Группа
Кол-воживотных
Сроки наблюдения (сутки) /прирост опухоли (коэффициент)
6
8
9
10
13
15
1
15
0,18±0,34
-0,5±0,65
-0,65±0,13
-0,7±0,15
0,87±0,07
-0,99±0,01
2
7
0,77±0,27
2,26±0,59
2,41±0,88
4,64±1,50
Примечание к таблице 5:
1 - группа - внутриопухолевое (внутритканевое) облучение с последующим внутривенным облучением, проведенным через час после аналогичных введений препарата «Димегин» в дозах 50 и 10 мг/кг.
2 - группа-контроль.
Как видно из данных таблицы, уже на первые сутки после воздействия рост опухолей бедра в опытной группе замедляется. Коэффициент прироста опухолей у животных, прошедших ФДТ, составляет -0,99+0,04, что влияет на продолжительность жизни. В контроле к 10 суткам этот показатель составляет 4,64+1,5 и животные погибают.
В результате проведения ФДТ по предлагаемой схеме продолжительность жизни животных увеличивается, опухоли уменьшаются в размерах.
Положительный эффект от достижения технического результата
В настоящее время ФДТ накопила огромный фактический материал, располагает большими потенциальными возможностями применительно к системным заболеваниям, таким как лейкоз. Имеющиеся сведения по данному вопросу требуют систематизации и разработки новых подходов. Проблема приобретает практическую значимость в связи с возросшим бесконтрольным и непрофессиональным применением различных излучений в быту, что может привести к неблагоприятным экологическим последствиям. Комплексное решение этих вопросов значительно дополнит существующие представления о механизмах биологического действия оптического излучения и вводимых препаратов, что даст ценную научную информацию по проблемам оптимизации и повышения эффективности ФДТ.
Представленные нами данные свидетельствуют о возможности достижения намеченного технического результата по изобретению, направленного на повышение эффективности лечения лейкоза у лабораторных животных. Предложенный способ может быть перенесен в экспериментальную медицину.