СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПРОТИВОТУБЕРКУЛЕЗНОГО ЛЕКАРСТВЕННОГО ПРЕПАРАТА
METHOD FOR PREPARING ANTI-TUBERCULOSIS DRUG

Изобретение относится к медицине, в частности к лекарственным противотуберкулезным средствам, и может быть использовано при получении препаратов на основе изониазида для лечения лекарственно-устойчивых форм туберкулеза.
К основным проблемам лечения туберкулеза относятся ограниченность арсенала противотуберкулезных средств, быстрое развитие устойчивых форм микобактерий туберкулеза (МБТ) на фоне лечения и, как следствие, рост числа больных, инфицированных первично устойчивыми МБТ к основным противотуберкулезным препаратам. Поэтому постоянно идет поиск новых противотуберкулезных препаратов, а также путей повышения эффективности известных.
Для устранения лекарственной устойчивости противотуберкулезные средства применяют в композиции с веществами потенцирующего действия.
Так, известен препарат RU 2003335 С1 («Способ лечения деструктивного туберкулеза легких с массивным бактериовыделением», ЯКУТСКИЙ ФИЛИАЛ НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКОГО ОБЪЕДИНЕНИЯ «ФТИЗИОПУЛЬМОНОЛОГИЯ»), заключающийся в растворении противотуберкулезных препаратов в серебряной воде. Серебряную воду для этого получают электролитическим путем. Следовательно, в процессе электролиза в воду переходят ионы металла, крайне нестабильные во времени, склонные к окислению и химическому взаимодействию с компонентами противотуберкулезной системы.
В CN 101225533 А описан способ получения наноразмерных частиц серебра электрохимическим путем с добавлением стабилизаторов, например цитрата аммония. Способ включает смешивание нитрата серебра с цитратом аммония, погружение в указанную смесь двух серебряных электродов.
При использовании нитрата серебра часть соли остается в продукте - растворе наночастиц серебра. Несмотря на стабильность наноразмерных частиц серебра, получаемых указанным способом, применение нитрата серебра делает невозможным использование таких частиц в составе противотуберкулезного лекарственного средства ввиду токсичности нитрата серебра. В отличие от данного метода предлагаемый нами способ получения противотуберкулезного препарата позволяет не только синтезировать коллоидный раствор наночастиц серебра, не содержащий посторонних примесей, но и добиться его совместимости с изониазидом. Кроме того применение противотуберкулезного препарата, полученного по заявляемому способу, позволяет добиться максимального терапевтического эффекта.
Из WO 2002085385 А2 известно добавление хитозана к антимикробным нанокристаллическим порошкам металла, в частности серебра, которые используются для лечения туберкулеза. В указанном семействе патентов рассматривается ингаляционное применение антимикробных нанокристаллических порошков. В отличие от указанного патента заявляемый способ приготовления противотуберкулезного лекарственного средства позволяет получать продукт, содержащий водный раствор стабилизированных наночастиц серебра и изониазид, допустимый к парентеральному введению (инъекции). Кроме того, как уже указывалось выше, заявляемый способ позволяет получать нетоксичный не содержащий солей металлов препарат.
Ближайшим к заявляемому изобретению является препарат RU 2008142461 А («Комбинированный лекарственный препарат противотуберкулезного действия, ООО «НПО «ЛИКОМ»), заключающийся в совместном применении изониазида и наночастиц серебра. Следует отметить, что для приготовления противотуберкулезного препарата используются наночастицы серебра, полученные из водного раствора путем вакуумирования, что нарушает не только оболочку, сформированную из стабилизатора, но и первоначальные свойства наночастиц серебра.
Целью предлагаемого изобретения является создание высокоэффективного препарата для лечения туберкулеза, содержащего помимо известных химиотерапевтических средств компоненты, оказывающие синергетический эффект и снижающие резистентность микобактерий туберкулеза к различным антибиотикам, а также расширение его спектра действия.
Поставленная цель достигается следующим образом.
В дистиллированной воде растворяются органические стабилизаторы (5-40% мас.), выбранные из желатина, полиэтиленгликолей, и неорганический стабилизатор (цитрат аммония однозамещенный, 0,1% мас.), хитозан (1-5% мас.), затем в полученном растворе проводится электрохимическое растворение серебряного анода. Изониазид в количестве 6-10% мас. вводится либо перед электролиза, либо после него.
Получение водного раствора наночастиц серебра электрохимическим методом в присутствии органических и неорганических стабилизаторов позволяет создать препарат с высокими противомикробными свойствами, оказывающий синергетическое действие при совместном применении с другими лекарственными средствами. Кроме того, наночастицы серебра имеют развитую поверхность массообмена, что дает максимальный эффект подавления микрофлоры. Оболочка из стабилизатора предотвращает окисление и химическое взаимодействие с другими компонентами системы, увеличивая тем самым срок полезного действия препарата.
Введение в систему природного полисахарида хитозана придает ей уникальные свойства. Хитозан - производное хитина, легко растворимое в воде, обладает противомикробными свойствами, значительно сокращает рост бактерий, что позволяет достичь наибольшего лечебного эффекта от применения заявляемой композиции. Кроме того, он и играет роль сорбента, значит, выполняет еще и транспортную функцию, обеспечивая быструю и точную доставку лекарственного средства к органу-мишени.
Пример 1.
В дистиллированной воде при перемешивании растворяют изониазид в количестве 6% мас. и природный полисахарид хитозан в количестве 3% мас. Затем при нагревании до 45-55°С вводят полиэтиленгликоль с молекулярной массой 4000 в количестве 10% и перемешивают до полного растворения. Потом охлаждают до температуры 20-25°С. В полученный раствор при перемешивании добавляют цитрат аммония из расчета 1,0 г на 1 л раствора при перемешивании. Затем в полученную среду помещают электродную систему, где анодом служит пластина из серебра (ГОСТ Р ИСО 9001-2001), а катодом - пластина из нержавеющей стали (ГОСТ 5582-95 марка 12Х18Н10Т). При перемешивании на электроды подают стабилизированный постоянный ток плотностью 10-20 А/кв. м и напряжением 10-20 В. Электрохимическое растворение серебра ведут в течение 10-30 мин из расчета выхода наночастиц серебра в водный раствор стабилизаторов 2-15 мг на 1 л раствора. Размер получаемых частиц составляет 5-60 нм, что подтверждают данные дисперсионного анализа, полученные с помощью анализатора размера частиц Nanotrac (рис.1).
Пример 2.
Способ приготовления противотуберкулезного лекарственного препарата по п.1, отличающийся тем, что изониазид берется в количестве 8% мас., хитозан в количестве 5% мас., а в качестве органического стабилизатора используется желатин в количестве 5% мас.
Пример 3.
Способ приготовления противотуберкулезного лекарственного препарата по п.1, отличающийся тем, что хитозан берется в количестве 2% мас., а изониазид в количестве 10% мас. добавляется по завершении процесса электролиза.
Пример 4.
Способ приготовления противотуберкулезного лекарственного препарата по п.1, отличающийся тем, что хитозан берется в количестве 1% мас., в качестве органического стабилизатора используется желатин в количестве 5% мас., а изониазид в количестве 7% мас. добавляется по завершении процесса электролиза.
Пример 5.
Способ приготовления противотуберкулезного лекарственного препарата по п.1, отличающийся тем, что изониазид берется в количестве 8% мас., хитозан в количестве 2% мас., а в качестве органического стабилизатора используется полиэтиленгликоль с молекулярной массой 400 в количестве 40% мас.
Пример 6.
Способ приготовления противотуберкулезного лекарственного препарата по п.5, отличающийся тем, что изониазид берется в количестве 6% мас., хитозан в количестве 1% мас., а полиэтиленгликоль в количестве 35% мас.
Пример 7. Прототип.
Изучение подавления роста лекарственно-устойчивых изолянтов МБТ проводили методом абсолютных концентраций с использованием плотной питательной среды Левенштейна-Йенсена. Материал для исследования был получен в лаборатории ГУЗ ЯО «Областная туберкулезная больница» от 50 больных различными формами туберкулеза легких. Все выделенные штаммы МБТ (740 шт.) имели лекарственную устойчивость к различным противотуберкулезным препаратам. МБТОценку результатов исследования проводили подсчетом колоний в экспериментальных пробах (примеры 1-4) в сравнении с контрольной (пример 5-прототип), где различали четыре степени подавления роста МБТ (полное, значительное, умеренное подавление и отсутствие подавления).
Результаты исследований приведены в табл.1.
Данные табл.1 подтверждают увеличение положительного эффекта от применения заявляемой композиции при лечении лекарственно устойчивых форм туберкулеза.
Помимо исследования подавляющей способности заявляемого препарата были оценены его противовирусные свойства, в частности его влияние на показатели течения ВИЧ-инфекции. На базе «Ярославского областного центра по профилактике и борьбе со СПИДом» были проведены исследования in vitro, в ходе которых взят анализ крови у 8 больных, состоящих на учете. У 6 из них - сопутствующее заболевание гепатит С. Проба I была взята вначале исследования, пробы II и III - после 2-месячного и 6-месячного применения заявляемого препарата, соответственно.
Результаты исследований отражены в табл.2 и 3.
Согласно табл.2 и 3 после 2 месяцев исследований наблюдается снижение вирусной нагрузки и увеличение количества клеток CD-4-лимфоцитов в крови.
Важно отметить, что применение заявляемого препарата не оказало никаких побочных эффектов на формулу крови и биохимические показатели.
Таблица 1
Результаты испытания подавляющей способности противотуберкулезных препаратов на рост ЛУ МБТ
Степень подавления роста ЛУ штаммов МБТ
Пример 1
Пример 2
Пример 3
Пример 4
Пример 5
Пример 6
Пример 7
Полное, %
82,5
73,8
77,5
81,4
79,4
77,1
37,4
Значительное, %
15
21,2
18,8
15,6
16,8
20,0
30,4
Умеренное, %
2,5
3,7
3,7
2,7
3,3
2,9
9,7
Отсутствие. %
0
1,3
0
0,3
0,5
0
2,5
Всего
100
100
100
100
100
100
100
Таблица 2
Вирусная нагрузка до и после применения препарата
№ пациента
№ пробы
Вирусная нагрузка
пример 1
пример 2
пример 3
пример 4
пример 5
пример 6
пример 7
1
I
16754
16760
16757
16723
16754
16755
16750
II
15643
14233
15782
16007
15290
15673
16774
III
14712
12651
12227
13514
13741
14111
16723
2
I
5417
5403
5521
5629
5424
5479
5428
II
5128
5200
5478
5015
5138
5003
5410
III
4380
4456
4901
4781
4500
4289
5400
3
I
10982
10927
10956
10783
10789
10892
10990
II
9891
10113
9903
9567
9561
9800
10993
III
7562
8251
8560
8014
8001
8236
10981
4
I
8814
8725
8898
8856
8821
8867
8913
II
8712
8400
8361
8224
8367
8009
8874
III
6065
5814
7511
6996
7006
7159
8870
5
I
50873
50096
51114
50527
50078
51001
50548
II
45620
42790
46573
43561
46081
47207
50500
III
32081
30098
34219
35800
34200
35692
50481
6
I
21863
21513
21744
21762
21901
21872
21007
II
18034
18001
19540
18992
18650
18900
20984
III
16590
15300
17016
16003
16520
17007
20900
7
I
30025
30112
30277
30671
31009
30810
30019
II
28549
29310
28780
29006
28379
27964
29921
III
25800
26755
25555
27953
26300
25019
29956
8
I
78923
78214
79900
78160
79042
78231
78615
II
73005
65060
72187
71923
73116
72000
78593
III
61290
58116
64253
67500
60067
63214
78550
Таблица 3
Количество CD-4-лейкоцитов до и после применения препарата
№ пациента
№ пробы
Количество CD-4-клеток
пример 1
пример 2
пример 3
пример 4
пример 5
пример 6
пример 7
1
I
321
314
330
319
328
334
315
II
367
360
378
353
369
357
320
III
450
423
440
468
455
441
324
2
I
532
541
529
538
542
550
533
II
580
613
687
592
590
601
537
III
670
668
690
667
681
684
550
3
I
333
337
341
346
350
332
337
II
384
390
378
384
392
379
343
III
449
432
456
449
461
448
351
4
I
478
463
444
435
459
442
430
II
521
512
498
470
507
515
447
III
584
567
558
555
572
564
479
5
I
200
205
207
221
237
216
214
II
267
254
267
281
265
254
226
III
312
353
300
378
362
320
250
6
I
316
323
317
311
320
327
315
II
347
378
389
376
383
367
327
III
479
456
428
420
431
448
349
7
I
298
301
274
293
311
281
285
II
349
370
338
328
338
348
299
III
401
427
390
411
420
420
307
8
I
187
190
188
191
205
183
201
II
253
215
227
249
254
240
215
III
302
284
300
305
308
300
229