ДНК-ЧИП ДЛЯ КОМПЛЕКСНОЙ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИЙ, ПЕРЕДАВАЕМЫХ ПОЛОВЫМ ПУТЕМ

Область техники настоящего изобретения
Настоящее изобретение относится к области медицины, в частности, к диагностике инфекций, передаваемых половым путем.
Предшествующий уровень техники настоящего изобретения
Каждый день во всем мире около одного миллиона людей заболевают инфекциями, передаваемыми половым путем (ИППП). Принятие мер по борьбе с более чем 30 бактериальными, вирусными и паразитическими патогенами-возбудителями инфекций, передаваемых половым путем, стоит в ряду ведущих проблем общественного здравоохранения.
Среди ИППП выделяют «классические» инфекционные заболевания, вызываемые облигатными патогенами (такие как сифилис, гонорея, трихомоноз, урогенитальный хламидиоз), а также ряд других заболеваний, которые также могут передаваться при половых контактах: генитальный герпес, вирус папилломы человека, инфекции, вызываемые условно патогенной флорой (микоплазмы, уреаплазмы, грибы рода Candida и т.д.). Многими современными исследователями [Воронова О.А., Герасимова Н.М., Вишневская И.Ф., Кобенко Э.Г. Клинико-эпидемиологические особенности хронического аэробного вагинита. Актуальные вопросы терапии инфекций, передаваемых половым путем, и дерматозов. - Екатеринбург, 2002, 58-59; Кира Е.Ф. Бактериальный вагиноз. Спб.: ООО «Нева-Люкс», 2001, 364] отмечается, что патологические состояния мочеполового тракта чаще всего носят полимикробный характер и связаны с участием в воспалительном процессе ассоциаций патогенных и условно патогенных микроорганизмов.
Известно, что в настоящее время в диагностике ИППП ведущую роль играют микробиологические методы, такие как бактериоскопия и культуральное исследование. Данные методы позволяют с высокими показателями чувствительности и специфичности осуществлять прямое определение возбудителя, изучать фенотипические свойства микроорганизмов, а также чувствительность патогенов к антимикробным препаратам. Однако применение микробиологических методов идентификации микроорганизмов имеет ряд недостатков, таких как длительность анализа и трудоемкость в использовании, нестабильность качества диагностических наборов и питательных сред, связанная с отсутствием их стандартизации, субъективный фактор при оценке результатов исследований проведенных этими методами.
Получение несостоятельных результатов при исследовании клинических образцов микробиологическими методами, может быть обусловлено прихотливостью ряда микроорганизмов (гонококк, анаэробы, микроаэрофилы). Для проведения адекватного бактериологического исследования на анаэробы и микроаэрофилы необходимо наличие специальных питательных сред и создание определенных условий инкубации. Несмотря на достигнутые успехи в области культивирования Gardnerella vaginalis, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum и Mobiluncus spp., их идентификация в клиническом материале остается сложной процедурой, требующей длительного времени и опыта. Соблюдение всех требований, предъявляемых к условиям культивирования анаэробной и микроаэрофильной флоры, часто оказывается невозможным для рядовой бактериологической лаборатории, но даже и в хорошо оснащенных клинико-диагностических центрах процент высеваемости этих микроорганизмов составляет 12-60% [Keane FE, Maw R, Pritchard C, Ison CA. Methods employed by genitourinary medicine clinics in the United Kingdom to diagnose bacterial vaginosis. Sex Transm Infect. 2005 Apr; 81(2):155-7; Vagoras A, Butylkina R, Juseviciute V, Hallen A, Unemo M, Domeika M. Diagnosis of non-viral sexually transmitted infections in Lithuania and international recommendations. Euro Surveill. 2006 Jul; 11(7):161-4; Hallen A, Pahlson C, Forsum U.Bacterial vaginosis in women attending STD clinic: diagnostic criteria and prevalence of Mobiluncus spp.Genitourin Med. 1987 Dec;63(6):386-9; Amsel R, Totten PA, Spiegel CA, Chen KC, Eschenbach D, Holmes KK. Nonspecific vaginitis. Diagnostic criteria and microbial and epidemiologic associations. Am J Med. 1983 Jan;74(l): 14-22; Eschenbach DA, Hillier S, Critchlow C, Stevens C, DeRouen T, Holmes KK. Diagnosis and clinical manifestations of bacterial vaginosis. Am J Obstet Gynecol. 1988 Apr; 158(4):819-28; Forsum U, Jakobsson T, Larsson PG, Schmidt H, Beverly A, Bj0rnerem A, Carlsson B, Csango P, Donders G, Hay P, Ison C, Keane F, McDonald H, Moi H, Platz-Christensen JJ, Schwebke J. An international study of the interobserver variation between interpretations of vaginal smear criteria of bacterial vaginosis. APMIS. 2002 Nov; 110(11):811-8; Ferris MJ, Masztal A, Aldridge KE, Fortenberry JD, Fidel PL Jr, Martin DH. Association of Atopobium vaginae, a recently described metronidazole resistant anaerobe, with bacterial vaginosis. BMC Infect Dis. 2004 Feb 13; 4:5; redricks DN, Fiedler TL, Marrazzo JM. Molecular identification of bacteria associated with bacterial vaginosis. N Engl J Med. 2005 Nov 3; 353(18):1899-911].
Для определения активности вирусов, вызывающих патологию урогенитальной сферы и передаваемых половым путем (вирус герпеса, вирус папилломы человека), используются сложные методы диагностики вирусов, включающие выявление вируса с помощью моноклональных антител, обнаружение специфичного противовирусного иммунного ответа. В последние годы для определения активности вирусов, вызывающих патологию урогенитальной сферы, часто используют иммуноферментный анализ (ИФА). С целью идентификации вируса герпеса проводят выделение вируса из крови, ликвора, содержимого везикул и других локусов (носоглотки, конъюнктивы) в культуре тканей. Чувствительность метода составляет 80-100%, специфичность - 100%. Длительность исследования составляет не менее 5 дней. Идентификацию вирусов семейства Herpesviridae проводят иммунологическими методами (метод мечения моноклональными антителами, иммуноблоттинг, иммуноферментный анализ). «Золотым стандартом» диагностики вирусных инфекций являются вирусологические исследования с определением цитопатического эффекта. Однако, вследствие трудоемкости и длительности подобных исследований, классическое вирусологическое исследование все реже используется в практическом здравоохранении [Moseley RC, Corey L, Benjamin D, Winter C, Remington ML. Comparison of viral isolation, direct immunofluorescence, and indirect immunoperoxidase techniques for detection of genital herpes simplex virus infection. J Clin Microbiol. 1981 May; 13 (5): 913-8; Corey L, Holmes KK. Genital herpes simplex virus infections: current concepts in diagnosis, therapy, and prevention. Ann Intern Med. 1983b Jun; 98(6):973-83. Review; Lafferty WE, Krofft S, Remington M, Giddings R, Winter C, Cent A, Corey L. Diagnosis of herpes simplex virus by direct immunofluorescence and viral isolation from samples of external genital lesions in a high-prevalence population. J Clin Microbiol. 1987 Feb; 25(2):323-6; Koutsky LA, Stevens CE, Holmes KK, Ashley RL, Kiviat NB, Critchlow CW, Corey L. Underdiagnosis of genital herpes by current clinical and viral-isolation procedures. N Engl J Med. 1992 Jun 4;326(23): 1533-9; Cone RW, Swenson PD, Hobson AC, Remington M, Corey L. Herpes simplex virus detection from genital lesions: a comparative study using antigen detection (HerpChek) and culture. J Clin Microbiol. 1993 Jul;31(7): 1774-6; Slomka MJ, Emery L, Munday PE, Moulsdale M, Brown DW. A comparison of PCR with virus isolation and direct antigen detection for diagnosis and typing of genital herpes. J Med Virol. 1998 Jun; 55(2):177-83; Langenberg AG, Corey L, Ashley RL, Leong WP, Straus SE. A prospective study of new infections with herpes simplex virus type 1 and type 2. Chiron HSV Vaccine Study Group.N Engl J Med. 1999; 341(19):1432-8; Koenig M, Reynolds KS, Aldous W, Hickman M.Comparison of Light-Cycler PCR, enzyme immunoassay, and tissue culture for detection of herpes simplex virus. Diagn Microbiol Infect Dis. 2001 Jul; 40(3):107-10; Leach CT, Ashley RL, Baillargeon J, Jenson HB. Performance of two commercial glycoprotein G-based enzyme immunoassays for detecting antibodies to herpes simplex viruses 1 and 2 in children and young adolescents. Clin Diagn Lab Immunol. 2002 Sep; 9(5):l 124-5; Scoular A. Using the evidence base on genital herpes: optimising the use of diagnostic tests and information provision. Sex Transm Infect. 2002 Jun; 78(3): 160-5. Review; Subhan S, Jose RJ, Duggirala A, Hari R, Krishna P, Reddy S, Sharma S. Diagnosis of herpes simplex virus-1 keratitis: comparison of Giemsa stain, immunofluorescence assay and polymerase chain reaction. Curr Eye Res. 2004 Aug-Sep; 29(2-3):209-13].
Для специфической диагностики урогенитального хламидиоза доступны цитологические и серологические методы. Цитологический метод позволяет при иммунофлуоресценции выявить цитопатические включения хламидий в клетках эпителия соскобов, однако характеризуется низкой чувствительностью. Из серологических методов наиболее информативным является ИФА. Однако выявление антител к хламидиям связано с рядом проблем. Воспроизводимость методов, таких как микроиммунофлюоресцентный тест, низка и нет никаких согласованных стандартов. У некоторых людей иммунный ответ на урогенитальную хламидийную инфекцию может быть отсрочен или даже отсутствовать после перенесенной хламидийной инфекции. В случаях, где ответ есть, антитела часто сохраняются в течение длительного времени после выздоровления. По этим причинам, несмотря на ряд очевидных достоинств иммунологических методов для выявления антител к возбудителю урогенитального хламидиоза (относительная дешевизна и простота постановки, возможность автоматизации), серологическое исследование для диагностики отдельных случаев урогенитальной хламидийной инфекции не может быть рекомендован. Диагноз урогенитального хламидиоза должен быть основан на прямом выявлении этиологического агента. Определение антител к хламидиям может быть использовано в эпидемиологических исследованиях как совокупный показатель контакта исследуемой популяции с возбудителем [M Domeika, A Hallen (Eds). Chlamydia trachomatis infections in Eastern Europe. KATA, Kaunas, 2002, 112 p; Kohl KS, Markowitz LE, Koumans EH. Developments in the screening for Chlamydia trachomatis: a review. Obstet Gynecol Clin North Am. 2003 Dec; 30(4):637-58. Review; Naaber P, Uusktila A, Naaber J, Poder A, Hjelm E, Hallen A, Unemo M, Domeika M. Laboratory diagnosis of sexually transmitted infections in Estonia in 2001-2002: shortcomings with impact on diagnostic quality and surveillance. Sex Transm Dis. 2005 Dec; 32(12):759-64; CDC. Sexually transmitted diseases treatment guidelines, 2006. MMWR, 2006, Vol.55. 100 p.; Banoo S, Bell D, Bossuyt P, Herring A, Mabey D, Poole F, Smith PG, Sriram N, Wongsrichanalai C, Linke R, O'Brien R, Perkins M, Cunningham J, Matsoso P, Nathanson CM, Olliaro P, Peeling RW, Ramsay A; TDR Diagnostics Evaluation Expert Panel. Evaluation of diagnostic tests for infectious diseases: general principles. Nat Rev Microbiol. 2006 Dec;4(12 Suppl):S20-32; Peeling RW., Smith PG., Bossuyt PMM. A guide for diagnostic evaluations. Nat Rev Microbiol. 2006 Dec; 4(12 Suppl):S52-56].
Для экспресс-диагностики урогенитальных заболеваний, вызываемых микоплазмами, используют реакцию иммунофлюоресценции, из серологических реакций наиболее часто используют ИФА.
Стандартным методом для идентификации M.hominis и U.urealyticum считается культуральный метод. Однако метод культивирования требует высокой профессиональной подготовки персонала клинической лаборатории, больших затрат денежных средств и, что не менее важно, занимает от 2 до 5 дней. Еще одним недостатком культурального метода является то, что уреаплазмы очень требовательны к условиям среды. Все это привело к тому, что многие лаборатории отказались от использования культурального метода для идентификации уреаплазм [Cassell G.Н., Waites K.B., Watson H.L., Crouse D.T., and Harasawa R., Ureaplasma urealyticum Intrauterine Infection: Role in Prematurity and Disease in Newborns, Clinical Microbiology Reviews, 1993, Vol.6, p.69-87].
Указанные недостатки микробиологических методов идентификации возбудителей ИППП потребовали поиска новых подходов, которые позволили бы исключить из анализа стадию культивирования и, таким образом, сократить время идентификации патогенов.
Одним из перспективных подходов является идентификация возбудителей ИППП на ДНК-чипе, содержащем иммобилизованные на поверхности олигонуклеотидные зонды, специфичные к определяемым микроорганизмам [MB Miller and Y.-W.Tang. Basic Concepts of Microarrays and Potential Applications in Clinical Microbiology. Clinical Microbiology Reviews, Oct. 2009, p.611-633]. Основными преимуществами использования ДНК-чипов для идентификации возбудителей ИППП является возможность одновременной идентификации большого числа патогенов в биологическом материале за короткое время. При этом себестоимость исследования с использованием ДНК-чипов значительно ниже себестоимости комплексной идентификации возбудителей ИППП с применением микробиологических методов. Полученные результаты позволяют предположить, что применение ДНК-чипа может быть полезным и оправданным в лабораториях, применяющих для идентификации возбудителей ИППП только рутинные микробиологические методы, в особенности при отсутствии в этих учреждениях хорошо налаженной культуральной диагностики.
Однако, существующие способы диагностики ИППП в формате ДНК-чипа предусматривают определение лишь патогенных и условно патогенных микроорганизмов, что недостаточно для оценки состояния микробиоценоза мочеполовой сферы пациентов с подозрением на ИППП в целом.
Микробиоценоз - это единая микроэкологическая система, сохраняющаяся за счет непрерывного динамического баланса между микро- и макроорганизмом. С микробиологической точки зрения здоровье мочеполовой сферы человека определяется не только (или даже не столько) отсутствием в составе флоры облигатно или условно патогенных микроорганизмов, сколько подавляющим преимуществом в ее составе непатогенных микроорганизмов.
Следовательно, оценить состояния микробиоценозд мочеполовой сферы человека и, в частности, пациента с подозрением на ИППП возможно, лишь комплексно изучив состав микрофлоры его мочеполовых путей, что достижимо только при условии определения в составе флоры и облигатно или условно патогенных, и непатогенных микроорганизмов.
Таким образом, в данной области техники существует потребность в разработке способа и чипа для быстрой и относительно недорогой диагностики ИППП путем комплексной оценки состояния микробиоценоза мочеполовой сферы пациентов с подозрением на ИППП.
Раскрытие настоящего изобретения
Сущностью настоящего изобретения являются способ и ДНК-чип, с помощью которого в едином формате исследования в короткие сроки в полученном от пациента биологическом материале возможно одновременно идентифицировать ряд наиболее распространенных облигатно патогенных микроорганизмов-возбудителей ИППП, условно патогенных и непатогенных микроорганизмов.
Итак, настоящее изобретение относится к ДНК-чипу для комплексной диагностики ИППП путем оценки состояния микробиоценоза мочеполовой сферы пациента, содержащему поверхность с иммобилизованными на нем олигонуклеотидными зондами, специфичными к каждому из определяемых облигатно патогенных микроорганизмов-возбудителей ИППП, условно патогенных и непатогенных микроорганизмов.
В соответствии с одним из вариантов осуществления настоящего изобретения ДНК-чип представляет собой микроскопный слайд с эпокси-модифицированной поверхностью.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения облигатно патогенные микроорганизмы-возбудители ИППП выбраны из группы, состоящей из Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Treponema pallidum, Trichomonas vaginalis, вируса герпеса I и II типа; условно патогенные микроорганизмы выбраны из группы, состоящей из Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis, Gardnerella vaginalis, Bacteroides vulgatus, Bacteroides fragilis, Mobiluncus mulieris, Mobiluncus curtisii, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Prevotella melanogenica, Prevotella oralis, Fusobacterium nucleatum, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus sanguinis, Corynebacterium spp., Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Proteus mirabilis, Enterococcus faecium, Peptostreptococcus anaerobius, Anaerobius prevotii; а непатогенные микроорганизмы представляют собой Lactobacillus spp.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способу комплексной диагностики ИППП путем оценки состояния микробиоценоза мочеполовой сферы пациента, осуществляемому путем параллельной идентификации микроорганизмов-возбудителей ИППП в полученном от пациента биоматериале, и предусматривающему, кроме идентификации облигатно патогенных микроорганизмов-возбудителей ИППП, идентификацию ряда условно патогенных и непатогенных микроорганизмов, причем способ предусматривает следующие стадии:
а) получение испытуемого образца биоматериала от пациента с подозрением на наличие ИППП,
б) выделение ДНК из испытуемого образца биоматериала стандартным способом,
в) амплификация испытуемого образца ДНК, полученного на стадии б), методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с одновременным введением в состав продуктов амплификации меченого олигонуклеотида,
г) проведение реакции гибридизации путем инкубации меченых продуктов амплификации, полученных на стадии в), на ДНК-чипе, охарактеризованном в любом из пп.1-5,
д) отмывка ДНК-чипа после окончания реакции гибридизации, проведенной на стадии г), и высушивание чипа,
е) регистрация результатов гибридизации и анализ полученных результатов сканирования с помощью программ, позволяющих интерпретировать полученные сигналы.
В соответствии с одним из вариантов осуществления настоящего изобретения олигонуклеотид помечен флуорофором Cy5 (Cy5-dCTP).
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения регистрацию результатов гибридизации проводят с помощью многоканального сканера биочипов, а анализ полученных результатов сканирования - с помощью программ, осуществляющих перевод флуоресцентных сигналов в цифровые показатели коэффициента позитивности.
Таким образом, в соответствии с одним из конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения способ позволяет с помощью заявленного ДНК-чипа одновременно идентифицировать 29 микроорганизмов, включая облигатные возбудители ИППП (Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Treponema pallidum, Trichomonas vaginalis, вирус герпеса I и II типов); условно патогенные (Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis, Gardnerella vaginalis, Bacteroides vulgatus, Bacteroides fragilis, Mobiluncus mulieris, Mobiluncus curtisii, Enterococcus faecium, Escherichia coli, Prevotella melanogenica, Prevotella oralis, Fusobacterium nucleatum, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus sanguinis, Corynebacterium spp., Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Proteus mirabilis, Enterococcus faecalis, Peptostreptococcus anaerobius, Anaerobius prevotii) и непатогенные микроорганизмы (Lactobacillus spp.).
Только такой подход позволяет адекватно оценить состояние микробиоценоза мочеполовой сферы пациентов с подозрением на ИППП и повысить точность диагностики ИППП за счет расширения спектра определяемых патогенных и условно патогенных возбудителей и непатогенных микроорганизмов.
В соответствии с одним из конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения способ предусматривает следующие стадии:
а) получение испытуемого образца биоматериала от пациента с подозрением на наличие ИППП,
б) выделение ДНК из испытуемого образца биоматериала стандартным способом,
в) амплификация испытуемого образца ДНК, полученного на стадии б), методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с одновременным введением в состав продуктов амплификации олигонуклеотида, меченого флуорофором Cy5 (Cy5-dCTP),
г) проведение реакции гибридизации путем инкубации меченных флуорофором Cy5 продуктов амплификации, полученных на стадии в), на ДНК-чипе, представляющем собой микроскопный слайд с эпокси-модифицированной поверхностью с иммобилизованными на нем олигонуклеотидными зондами, специфичными к каждому из определяемых микроорганизмов,
д) отмывка ДНК-чипа после окончания реакции гибридизации, проведенной на стадии г), и высушивание чипа,
е) регистрация результатов гибридизации с помощью многоканального сканера биочипов и анализ полученных результатов сканирования с помощью программ, осуществляющих перевод флуоресцентных сигналов в цифровые показатели коэффициента позитивности.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения в качестве генов-мишеней для амплификации используют ген 16S pPHK Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Treponema pallidum, Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis, Gardnerella vaginalis, Bacteroides vulgatus, Bacteroides fragilis, Mobiluncus mulieris, Mobiluncus curtisii, Enterococcus faecium, Escherichia coli, Prevotella melanogenica, Prevotella oralis, Fusobacterium nucleatum, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus sanguinis, Corynebacterium spp., Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Proteus mirabilis, Enterococcus faecalis, Peptostreptococcus anaerobius, Anaerobius prevotii; Lactobacillus spp., фрагмент геномной ДНК Trichomonas vaginalis и ген тимидинкиназы для вируса герпеса I и II типов, а для постановки контроля проводят амплификацию гена 16S pPHK фага λ.
Характеристика генов-мишеней микроорганизмов, праймеров для их амплификации и условий постановки ПЦР, представлены в таблице 1.
Таблица 1.
Гены-мишени, использованные для амплификации выбранного спектра микроорганизмов, праймеры для их амплификации и условия постановки ПЦР
№№
Ген-мишень
Название праймера
Последовательность
Условия амплификации
1
BAC-F
gactcctacgggaggcagcagt
2
BAC-R
cgtattaccgcggctgctggca
29 циклов
3
16S pPHK
BAC2-F
gtgccagcagccgcggtaatacg
95°C - 15 сек
4
BAC2-R
tcacaacacgagctgacgac
68°C - 8 сек
5
lambda-F
ggtgaaattgccagtattct
72°C - 15 сек
6
lambda-R
cgggagatagtaattagcat
7
фрагмент геномной ДНК
T.V.-F
attgtcgaacattggtcttacc
29 циклов
8
T.V.-R
tctgtgccgtcttcaagtatgc
95°C - 15 сек
68°C - 8 сек
72°C - 15 сек
9
ген тимидинкиназы
Ger-F
ctgcgggtttatatagacg
30 циклов
10
Ger-R
cattgttatctgggcgct
95°C - 10 сек
56°C - 10 сек
72°C - 15 сек
Примечание: праймеры BAC-F и BAC-R для Bacteroides merdae, Bacteroides ovatus Mycoplasma genitalium, Clostridium ramosum, Staphylococcus aureus, Moraxella catarrhalis Prevotella disiens, Streptococcus anginosus, Lactobacillus fermentus, Lactobacillus brevis Lactobacillus spp., Lactobacillus plantarum, Lactobacillus salvarius, Gardnerella vaginalis, Mycoplasma hominis, Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealyticum, Neisseria gonorrhoeae, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Bacteroides distasonis, Escherichia coli, Bacteroides vulgatus, Mobiluncus mulieris, Mobiluncus curtisii; праймеры BAC2-F и BAC2-R для Actinobacillus actinomycetemcomitans, Peptostreptococcus anaerobius, Streptococcus spp., Bacteroides thetaiotaomicron, Veillonella parvula, Prevotella bivia, Prevotella melanogenica, Bacteroides stercoris, Porphyromonas asaccharolytica, Fusobacterium nucleatum, Bacteroides uniformis, Bacteroides eggerthii, Lactobacillus vaginalis, Lactobacillus gasseri, Bacteroides fragilis, Bacteroides caccae; праймеры T.V.-F и T.V.-R для Trichomonas vaginalis; праймеры Ger-F и Ger-K для вируса герпеса I и II типа.
В соответствии с одним из конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения микрочип, на котором на стадии г) проводят реакцию гибридизации, содержит 12 ограниченных областей, каждая из которых включает 64 спота (29 иммобилизованных зондов, соответствующих выбранным микроорганизмам, 1 зонд для ДНК фага X и 2 маркерных спота (Cy5) в 2-х повторах по вертикали). Одна ограниченная область предназначается для постановки одного анализируемого образца ДНК-пробы.
Схема расположения олигонуклеотидных зондов на одной ограниченной области ДНК-чипа представлена в таблице 2.
Таблица 2.
Схема расположения олигонуклеотидных зондов на одном ограниченной области ДНК-чипа
PR.MIR
LAMB
FUS.NUC
M.MUL
B. FRAG
UR.UR
PEPT. AN
Cy5
PR.MIR
LAMB
FUS.NUC
M.MUL
B. FRAG
UR.UR
PEPT. AN
Cy5
В. VULG
М.НОМ
ST.EPID
G.VAG
T.VAG
PREV.OR
E.COLI
N.GON
В. VULG
М.НОМ
ST.EPID
G.VAG
T.VAG
PREV.OR
E.COLI
N.GON
KL.OXYT
Т. PAL
CORYN SPP
M.CUR
KL.PNEU
CHL.TR
M.GEN
ENT.FAE
KL.OXYT
Т. PAL
CORYN SPP
M.CUR
KL.PNEU
CHL.TR
M.GEN
ENT.FAE
Cy5
ENT.FAEC
AN.PRE
GER I
PR.MEL
L.SPP
STR.SANG
GER II
Cy5
ENT.FAEC
AN.PRE
GER I
PR.MEL
L.SPP
STR.SANG
GER II
Примечание: PR.MIR - Proteus mirabilis, B.VULG - Bacteroides vulgatus, KL.OXYT -Klebsiella oxytoca, LAMB - ДНК фага λ, M.HOM - Mycoplasma hominis, T.PAL - Treponema pallidum, ENT.FAEC - Enterococcus faecium, FUS.NUC - Fusobacterium nucleatum, ST.EPID - Staphylococcus epidermidis, CORYN SPP - Corynebacterium spp., AN.PRE - Anaerobius prevotii, M.MUL - Mobiluncus mulieris, G.VAG -Gardnerella vaginalis, M.CUR - Mobiluncus curtisii, GER I- герпес вирус I типа, B.FRAG - Bacteroides fragilis, T.VAG - Trichomonas vaginalis, KL.PNEU - Klebsiella pneumoniae, PR.MEL -Prevotella melanogenica, UR.UR - Ureaplasma urealyticum, PREV.OR - Prevotella oralis, CHL.TR - Chlamydia trachomatis, L.SPP -Lactobacillus spp., PEPT.AN - Peptostreptococcus anaerobius, E.COLI - Escherichia coli, M.GEN - Mycoplasma genitalium, STR.SANG - Streptococcus sanguinis, N. GON - Neisseria gonorrhoeae, ENT.FAE - Enterococcus faecalis, GER II - герпесвирус II типа, Cy5 - маркер границ чипа.
В заключение выдают качественный результат исследования: положительный - в случае наличия соответствующих микроорганизмов в испытуемом биообразце, отрицательный - в случае отсутствия соответствующих микроорганизмов в испытуемом биообразце.
Варианты осуществления настоящего изобретения
Пример №1. У пациентки А. с подозрением на наличие ИППП и с наличием соответствующих жалоб (выделения из половых путей с неприятным запахом, дизурия), стандартным способом получали образец биоматериала (соскобы со слизистых оболочек урогенитального тракта).
Идентификацию 29 патогенных, условно патогенных и непатогенных микроорганизмов в исследуемом биообразце проводили в соответствии с предлагаемым способом.
Исследование включало следующие стадии:
- выделение тотальной ДНК из образца биоматериала (с использованием набора для выделения «ДНК-экспресс» (НПФ «Литех», Россия, №ФС 032а2002/0923-05));
- проведение полимеразной цепной реакции с целью получения меченых флуорофором Cy5 продуктов амплификации фрагментов геномов выбранных микроорганизмов в соответствии с условиями проведения реакции, изложенными в таблице 1;
- проведение реакции гибридизации путем инкубации меченных флуорофором Cy5 продуктов амплификации геномов идентифицируемых микроорганизмов на ДНК-чипе;
- отмывка ДНК-чипа после окончания гибридизации и высушивание чипа;
- регистрация результатов гибридизации с помощью многоканального сканера биочипов и анализ полученных флуоресцентных сигналов на предмет наличия или отсутствия определяемых микроорганизмов в испытуемом биообразце.
Проведение полимеразной цепной реакции
Подготавливали 4 стерильные пробирки объемом 0,2 мл для приготовления проб для амплификации ДНК. Каждая пробирка содержала следующие реагенты: водный раствор трех нуклеозидтрифосфатов (dATP, dTTP, dGTP) в концентрации 100 мкМ каждый (фирма «Силекс», Россия, кат №1310); нуклеозидтрифосфат dCTP в концентрации 90 мкМ (фирма «Силекс», Россия, кат №1310); нуклеозидтрифосфат dCTP, модифицированный Cy5, в концентрации 10 мкМ (фирма «Синтол», Россия); два специфичных праймера, в концентрации 10 пмоль каждый (фирма «Синтол», Россия); 1×ПЦР-буфер [раствор 0,66 M трис-HCl; 25 мМ MgCl2 (кат. №Т 6791, фирма «Sigma», США)]; 0.05 ед./мкл Taq-полимераза (фирма «Promega», США); 3 мкг испытуемой ДНК-пробы. В каждую пробирку добавляли деионизованную воду до конечного объема смеси 25 мкл. Пробирки закрывали и устанавливали в ПЦР-амплификатор. На амплификаторе запускали установленную программу (таблица 1). После окончания реакции амплификации пробирку вынимали из амплификатора.
Проведение реакции гибридизации
ДНК-чип вставляли в рамку-держатель для чипов. Сверху на чип надевали рамку-трафарет.
2
4
2
В одной стерильной пробирке объемом 0,5 мл смешивали содержимое четырех пробирок, содержащих продукты амплификации фрагментов геномов идентифицируемых микроорганизмов и добавляли равный объем гибридизационного буфера (20×SSPE буфер: 3 М NaCl, 20 мМ NaHPO×HO, 20 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты динатриевая соль, pH 7,4). Полученную смесь подвергали инкубации при 95°C в течение 3 мин с последующим быстрым замораживанием смеси при -20°C в течение 2 мин для денатурации ДНК.
На поверхность одной ограниченной области ДНК-чипа вносили 40 мкл смеси денатурированных продуктов амплификации ДНК идентифицируемых микроорганизмов. Рамку-держатель закрывали крышкой. Чип инкубировали в термошейкере при температуре 37°C при вращении платформы 300 об/мин в течение 2 ч.
Отмывка и высушивание ДНК-чипа
3
6
5
7
2
3
6
6
7
2
После инкубации содержимое из лунок рамок-трафаретов аккуратно убирали, не повреждая центральное поле лунки, с помощью вакуумного медицинского отсасывавателя. В каждую ограниченную область чипа вносили по 100 мкл раствора для отмывки №1 (5×раствор SSC: 0,75 М NaCl, 75 мМ NaCHO×5,5 HO; содержащий 0,1%-ый раствор твин-20), инкубировали в термошейкере 15 мин при комнатной температуре при вращении платформы 300 об/мин. После инкубации содержимое из лунок рамок-трафаретов снова аккуратно убирали с помощью вакуумного медицинского отсасывавателя. В каждую ограниченную область чипа вносили по 100 мкл раствора для отмывки №2 (2×раствор SSC: 0,3 М NaCl, 0,03 М NaCHO×5,5 HO; содержащий 0,1%-ый раствор твин-20), инкубировали в термошейкере 15 мин при комнатной температуре при вращении платформы 300 об/мин. Чип аккуратно вынимали из рамки-держателя, ополаскивали дистиллированной водой и высушивали с помощью центрифугирования в течение 1 мин при 1000 об/мин.
Регистрация и анализ результатов
После проведения анализа чип сканировали на многоканальном сканере для биочипов, активируя канал Cy5. Сканированные изображения сохраняли в формате tif. Сканированные образы в формате tif открывали в специальной программе для последующей интерпретации изображения. Процедуру проводили согласно Инструкции (описанию) к конкретному программному обеспечению. В данной программе вносили все необходимые параметры для точного наложения «сетки» по центру локализации слотов. Полученные результаты сохраняли в формате Excel.
Результат анализа считали валидным, если на чипе при сканировании на канале Cy5 визуально наблюдались ярко флуоресцирующие споты в положениях, соответствующих внесенным маркерам печати.
За положительный результат принимали положительный сигнал, превышающий фон на 12% в трех из четырех точках, соответствующих одному зонду.
В результате исследования биологического материала, полученного от пациентки, с помощью ДНК-чипа идентифицированы микроорганизмы: Bacteroides vulgatus, Fusobacterium nucleatum, Mycoplasma hominis, Gardnerella vaginalis, Mobiluncus mulieris, Mobiluncus curtisii, Anaerobius prevotii, Bacteroides fragilis, Prevotella melanogenica, Prevotella oralis, Peptostreptococcus anaerobius.
В результате проведенного клинико-лабораторного обследования поставлен диагноз: Бактериальный вагиноз.
Пример №2. У пациента Б. с подозрением на наличие ИППП (жалобы на выделения гнойного характера из уретры, учащение и боли при мочеиспускании) стандартным способом получали образец биоматериала (соскобы (мазки) со слизистых оболочек урогенитального тракта).
Идентификацию 29 патогенных, условно патогенных и непатогенных микроорганизмов в исследуемом биообразце проводили в соответствии с предлагаемым способом.
Исследование включало те же стадии, осуществленные в соответствии с методиками, описанными в примере 1.
В результате исследования биологического материала, полученного от пациента, с помощью ДНК-чипа идентифицированы микроорганизмы: Trichomonas vaginalis, Mycoplasma genitalium, Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma hominis, Proteus mirabilis, Bacteroides vulgatus, Klebsiella oxytoca, Enterococcus faecium, Fusobacterium nucleatum, Staphylococcus epidermidis, Anaerobius prevotii, Mobiluncus mulieris, Mobiluncus curtisii, Bacteroides fragilis, Klebsiella pneumoniae, Prevotella melanogenica, Prevotella oralis, Peptostreptococcus anaerobius, Escherichia coli, Streptococcus sanguinis, Enterococcus faecalis, герпес вирус I типа, герпес вирус II типа.
На основании проведенного клинико-лабораторного обследования установлен диагноз: Негонококковый уретрит.
Пример №3. - У пациентки К., проходившей медицинское обследование в связи с прохождением медицинского осмотра, стандартным способом получали образец биоматериала (соскобы (мазки) со слизистых оболочек урогенитального тракта).
Идентификацию 29 патогенных, условно патогенных и непатогенных микроорганизмов в исследуемом биообразце проводили в соответствии с предлагаемым способом.
Исследование включало те же стадии, осуществленные в соответствии с методиками, описанными в примере 1.
В результате исследования биологического материала, полученного от пациентки, с помощью ДНК-чипа идентифицированы микроорганизмы: Lactobacillus spp., Escherichia coli, Proteus mirabilis.
Заключение: В результате проведенного клинико-лабораторного обследования установлено: Пациентка здорова.