РЕЦЕПТОР ФОЛИЕВОЙ КИСЛОТЫ АЛЬФА В КАЧЕСТВЕ ДИАГНОСТИЧЕСКОГО И ПРОГНОСТИЧЕСКОГО МАРКЕРА ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ОПУХОЛЕЙ, ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ РЕЦЕПТОР ФОЛИЕВОЙ КИСЛОТЫ АЛЬФА
FOLATE RECEPTOR ALPHA AS A DIAGNOSTIC AND PROGNOSTIC MARKER OF MALIGNANT TUMOURS EXPRESSING FOLATE RECEPTOR ALPHA

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
По данной заявке испрашивается приоритет на дату подачи временной заявки США № 61/410497, поданной 5 ноября 2010 года, и временной заявки США № 61/508444, поданной 15 июля 2011 года, полное содержание которых включено в настоящее описание в качестве ссылок.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОМУ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
У человека высокоаффинный рецептор для фолатов имеет три изоформы: альфа, бета и гамма. Альфа- и бета-формы, как правило, связаны с мембранами клеток с помощью якоря - гликозилфосфатидилинозитола (GPI). Они рециркулируют между внеклеточными и эндоцитарными компартментами и способны транспортировать фолат в клетку. Растворимые формы FRα могут образовываться при действии протеаз или фосфолипаз на заякоренные на мембране рецепторы фолиевой кислоты.
Рецептор фолиевой кислоты альфа (также обозначаемый как FRα, FR-альфа, FOLR-1 или FOLR1) экспрессируется в различных эпителиальных тканях, включая ткани хориоидного сплетения, легкого, щитовидной железы, почки, матки, молочной железы, фаллопиевых труб, эпидидимиса и слюнных желез. Weitman, SD et al. Cancer Res 52: 3396-3401 (1992); Weitman SD et al, Cancer Res 52: 6708-6711. Сверхэкспрессию FRα наблюдали при различных злокачественных опухолях, включая рак легкого (например, бронхо-альвеолярные карциномы, карциноидные опухоли и немелкоклеточный рак легкого, такой как аденокарцинома); мезотелиому; рак яичника; рак почки; злокачественную опухоль головного мозга (например, анапластическую эпендимому, ювенильную мозжечковую пилоцитарную астроцитому и метастазы в головной мозга); рак шейки матки; рак носоглотки; происходящую из мезодермы опухоль; плоскоклеточную карциному головы и шеи; рак эндометрия; эндометриоидные аденокарциномы яичника, серозные цистаденокарциномы, рак молочной железы; рак мочевого пузыря; рак поджелудочной железы; рак кости (например, высокозлокачественная остеосаркома); рак гипофиза (например, аденомы гипофиза); рак ободочной и прямой кишки и медуллярный рак щитовидной железы. См. например, патент США № 7754698; патентную заявку США № 2005/0232919; WO 2009/132081; Bueno R et al. J of Thoracic and Cardiovascular Surgery, 121(2): 225-233 (2001); Elkanat H & Ratnam M. Frontiers in Bioscience, 11, 506-519 (2006); Fisher R.E. J Nucl Med, 49: 899-906 (2008); Franklin, WA et al. Int J Cancer, Suppl 8: 89-95 (1994); Hartman L.C. et al. Int J Cancer 121: 938-942 (2007); Iwakiri S et al. Annals of Surgical Oncology, 15(3): 889-899; Parker N. et al. Analytical Biochemistry, 338: 284-293 (2005); Weitman, SD et al. Cancer Res 52: 3396-3401 (1992); Saba N.F. et al. Head Neck, 31(4): 475-481 (2009); Yang R et al. Clin Cancer Res 13: 2557-2567 (2007). В некоторых типах злокачественных опухолей (например, плоскоклеточной карциноме головы и шеи) более высокий уровень экспрессии FRα ассоциирован с худшим прогнозом, в то время как в других типах злокачественных опухолей (например, немелкоклеточный рак легкого) более высокий уровень экспрессии FRα ассоциирован с лучшим прогнозом. См., например, Iwakiri S et al. Annals of Surgical Oncology, 15(3): 889-899; Saba N.F. et al. Head Neck, 31(4): 475-481 (2009).
Раннее выявление злокачественной опухоли повышает показатели выживаемости и качество жизни. Для повышения вероятности раннего выявления и лечения существует острая необходимость в неинвазивных способах диагностики злокачественной опухоли, определения уровня риска развития злокачественной опухоли и предсказания прогрессирования злокачественной опухоли. Настоящее изобретение удовлетворяет эти потребности для опухолей, экспрессирующих FRα.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к способам оценки того, страдает ли индивидуум злокачественной опухолью, экспрессирующей FRα, такой как рак легкого или рак яичника, к способам оценки прогрессирования злокачественных опухолей, экспрессирующих FRα, таких как рак легкого или рак яичника у индивидуума, страдающего злокачественной опухолью, экспрессирующей FRα, к способам распределения индивидуума, имеющего злокачественную опухоль, экспрессирующую FRα, в одну из по меньшей мере четырех групп терапии злокачественной опухоли, к способам оценки эффективности лечения с помощью MORAb-003 рака яичника или рака легкого и к наборам для оценки того, страдает ли индивидуум опухолью, экспрессирующей FRα, такой как рак легкого или рак яичника, или для оценки прогрессирования злокачественных опухолей, экспрессирующих FRα, таких как рак легкого или рак яичника у индивидуума.
Способы оценки того, страдает ли индивидуум злокачественной опухолью, экспрессирующей FRα
В первом аспекте настоящее изобретение относится к способу оценки того, страдает ли индивидуум злокачественной опухолью, экспрессирующей FRα, путем определения уровня рецептора фолиевой кислоты альфа (FRα), который не связан с клеткой, в образце, полученном от индивидуума; и сравнения уровня рецептора фолиевой кислоты альфа (FRα), который не связан с клеткой, с уровнем FRα в контрольном образце, где различие между уровнем FRα в образце, полученном от индивидуума, и уровнем FRα в контрольном образце указывает на то, что индивидуум страдает злокачественной опухолью, экспрессирующей FRα; где уровень FRα в образце, полученном от индивидуума, оценивают путем приведения образца в контакт с антителом, которое связывает FRα. В конкретном варианте осуществления образец представляет собой мочу, сыворотку, плазму или асцитную жидкость.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу оценки того, страдает ли индивидуум злокачественной опухолью, экспрессирующей FRα, путем определения уровня рецептора фолиевой кислоты альфа (FRα), который не связан с клеткой, в образце мочи, полученном от индивидуума; и сравнение уровня рецептора фолиевой кислоты альфа (FRα), который не связан с клеткой, в образце мочи, полученном от индивидуума, с уровнем FRα в контрольном образце, где различие между уровнем FRα в образце мочи, полученном от индивидуума, и уровнем FRα в контрольном образце указывает на то, что индивидуум страдает злокачественной опухолью, экспрессирующей FRα. В следующем аспекте настоящее изобретение относится к способу оценки того, страдает ли индивидуум злокачественной опухолью, которая экспрессирует FRα, путем определения уровня рецептора фолиевой кислоты альфа (FRα), который не связан с клеткой, в образце сыворотки, полученном от индивидуума; и сравнение уровня рецептора фолиевой кислоты альфа (FRα), который не связан с клеткой, в образце сыворотки, полученном от индивидуума, с уровнем FRα в контрольном образце, где различие между уровнем FRα в образце сыворотки, полученном от индивидуума, и уровнем FRα в контрольном образце указывает на то, что индивидуум страдает злокачественной опухолью, экспрессирующей FRα.
В различных вариантах осуществления указанных выше аспектов изобретения злокачественная опухоль, экспрессирующая FRα, выбрана из группы, состоящей из рака легкого, мезотелиомы, рака яичника, рака почки, злокачественной опухоли головного мозга, рака шейки матки, рака носоглотки, плоскоклеточной карциномы головы и шеи, рака эндометрия, рака молочной железы, рака мочевого пузыря, рака поджелудочной железы, рака кости, рака гипофиза, рака ободочной и прямой кишки и медуллярного рака щитовидной железы. В конкретном варианте осуществления злокачественная опухоль, экспрессирующая FRα, представляет собой рак яичника. В другом варианте осуществления злокачественная опухоль, экспрессирующая FRα, представляет собой немелкоклеточный рак легкого, такой как аденокарцинома.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способам оценки того, страдает ли индивидуум раком яичника, путем определения уровня рецептора фолиевой кислоты альфа (FRα), который не связан с клеткой, в образце мочи, полученном от индивидуума, где присутствие FRα, который не связан с клеткой, в образце мочи в концентрации более чем приблизительно 9100 пг/мл указывает на то, что индивидуум страдает раком яичника.
В различных аспектах указанных выше аспектов изобретения присутствие FRα в образце мочи в концентрации более чем приблизительно 9500 пг/мл, приблизительно 10000 пг/мл, приблизительно 11000 пг/мл, приблизительно 12000 пг/мл, приблизительно 13000 пг/мл, приблизительно 14000 пг/мл, приблизительно 15000 пг/мл, приблизительно 16000 пг/мл, приблизительно 17000 пг/мл, приблизительно 18000 пг/мл, приблизительно 19000 пг/мл или приблизительно 20000 пг/мл указывает на то, что индивидуум страдает раком яичника.
В различных аспектах уровень FRα определяют путем приведения образца в контакт с антителом, которое связывает FRα. Например, антитело выбрано из группы, состоящей из:
(a) антитело, которое связывает тот же эпитоп, что и антитело MORAb-003;
(b) антитело, содержащее SEQ ID NO: 1 (GFTFSGYGLS) в качестве CDRH1, SEQ ID NO: 2 (MISSGGSYTYYADSVKG) в качестве CDRH2, SEQ ID NO: 3 (HGDDPAWFAY) в качестве CDRH3, SEQ ID NO: 4 (SVSSSISSNNLH) в качестве CDRL1, SEQ ID NO: 5 (GTSNLAS) в качестве CDRL2 и SEQ ID NO: 6 (QQWSSYPYMYT) в качестве CDRL3;
(c) антитело MOV18;
(d) антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и антитело MOV18;
(e) антитело 548908;
(f) антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и антитело 548908;
(g) антитело 6D398;
(h) антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и антитело 6D398;
(i) антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и антитело 26B3;
(j) антитело, содержащее SEQ ID NO: 55 (GYFMN) в качестве CDRH1, SEQ ID NO: 56 (RIFPYNGDTFYNQKFKG) в качестве CDRH2, SEQ ID NO: 57 (GTHYFDY) в качестве CDRH3, SEQ ID NO: 51 (RTSENIFSYLA) в качестве CDRL1, SEQ ID NO: 52 (NAKTLAE) в качестве CDRL2 и SEQ ID NO: 53 (QHHYAFPWT) в качестве CDRL3;
(k) антитело 26B3;
(l) антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и антитело 19D4;
(m) антитело, содержащее SEQ ID NO: 39 (HPYMH) в качестве CDRH1, SEQ ID NO: 40 (RIDPANGNTKYDPKFQG) в качестве CDRH2, SEQ ID NO: 41 (EEVADYTMDY) в качестве CDRH3, SEQ ID NO: 35 (RASES VDTYGNNFIH) в качестве CDRL1, SEQ ID NO: 36 (LASNLES) в качестве CDRL2 и SEQ ID NO: 37 (QQNNGDPWT) в качестве CDRL3;
(n) антитело 19D4;
(o) антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и антитело 9F3;
(p) антитело, содержащее SEQ ID NO: 31 (SGYYWN) в качестве CDRH1, SEQ ID NO: 32 (YIKSDGSNNYNPSLKN) в качестве CDRH2, SEQ ID NO: 33 (EWKAMDY) в качестве CDRH3, SEQ ID NO: 27 (RASSTVSYSYLH) в качестве CDRL1, SEQ ID NO: 28 (GTSNLAS) в качестве CDRL2 и SEQ ID NO: 29 (QQYSGYPLT) в качестве CDRL3;
(q) антитело 9F3;
(r) антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и антитело 24F12;
(s) антитело, содержащее SEQ ID NO: 47 (SYAMS) в качестве CDRH1, SEQ ID NO: 48 (EIGSGGSYTYYPDTVTG) в качестве CDRH2, SEQ ID NO: 49 (ETTAGYFDY) в качестве CDRH3, SEQ ID NO: 43 (SASQGINNFLN) в качестве CDRL1, SEQ ID NO: 44 (YTSSLHS) в качестве CDRL2 и SEQ ID NO: 45 (QHFSKLPWT) в качестве CDRL3;
(t) антитело 24F12;
(u) антитело, которое содержит вариабельную область легкой цепи, выбранную из группы, состоящей из LK26HuVK (SEQ ID NO: 13); LK26HuVKY (SEQ ID NO: 14); LK26HuVKPW (SEQ ID NO: 15) и LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16);
(v) антитело, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из LK26HuVH (SEQ ID NO: 17); LK26HuVH FAIS,N (SEQ ID NO: 18); LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19); LK26HuVH I,I (SEQ ID NO: 20) и LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21);
(w) антитело, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21) и вариабельную область легкой цепи LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16);
(x) антитело, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19) и вариабельную область легкой цепи LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16); и
(y) антитело, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи LK26HuVH FAIS,N (SEQ ID NO: 18) и вариабельную область легкой цепи LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16).
В конкретном варианте осуществления антитело связывает тот же эпитоп, что и антитело MORAb-003. В другом варианте осуществления антитело включает SEQ ID NO: 1 (GFTFSGYGLS) в качестве CDRH1, SEQ ID NO: 2 (MISSGGSYTYYADSVKG) в качестве CDRH2, SEQ ID NO: 3 (HGDDPAWFAY) в качестве CDRH3, SEQ ID NO: 4 (SVSSSISSNNLH) в качестве CDRL1, SEQ ID NO: 5 (GTSNLAS) в качестве CDRL2 и SEQ ID NO: 6 (QQWSSYPYMYT) в качестве CDRL3. В другом варианте осуществления антитело представляет собой антитело MOV18. В другом варианте осуществления антитело связывает тот же эпитоп, что и антитело MOV18. В следующем варианте осуществления антитело содержит вариабельную область легкой цепи, выбранную из группы, состоящей из LK26HuVK (SEQ ID NO: 13); LK26HuVKY (SEQ ID NO: 14); LK26HuVKPW (SEQ ID NO: 15); и LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16).
Альтернативно или в комбинации, антитело включает вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из LK26HuVH (SEQ ID NO: 17); LK26HuVH FAIS,N (SEQ ID NO: 18); LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19); LK26HuVH I,I (SEQ ID NO: 20); и LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21). В определенных вариантах осуществления антитело включает (i) вариабельную область тяжелой цепи LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21) и вариабельную область легкой цепи LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16); вариабельную область тяжелой цепи LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19) и вариабельную область легкой цепи LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16); или вариабельную область тяжелой цепи LK26HuVH FAIS,N (SEQ ID NO: 18) и вариабельную область легкой цепи LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16).
В конкретном варианте осуществления уровень FRα в образце, полученном от указанного индивидуума, оценивают путем приведения образца в контакт с парой антител, выбранной из группы, состоящей из (a) антитела MOV18, иммобилизованного на твердой подложке, и меченого антитела MORAB-003; (b) антитела 9F3, иммобилизованного на твердой подложке, и меченого антитела 24F12; (c) антитела 26B3, иммобилизованного на твердой подложке, и меченого антитела 19D4; и (d) антитела 9F3, иммобилизованного на твердой подложке, и меченого антитела 26B3.
В определенных вариантах осуществления антитело выбрано из группы, состоящей антитела мыши, антитела человека, гуманизированного антитела, биспецифического антитела, химерного антитела, Fab, Fab’2, ScFv, SMIP, аффитела, авимера, версатела, наноантитела и доменного антитела. Альтернативно или в комбинации, антитело является меченным, например, меткой, выбранной из группы, состоящей из радиоактивной метки, биотиновой метки, хромофорной метки, флуорофорной метки или ферментной метки.
В определенных вариантах осуществления уровень FRα определяют с использованием способа, выбранного из группы, состоящей из анализа с использованием вестерн-блоттинга, радиоиммунного анализа, иммунофлуориметрии, иммунопреципитации, равновесного диализа, иммунодиффузии, анализа в жидкой фазе, электрохемилюминесцентного анализа (ECLIA) и анализа ELISA.
В различных вариантах осуществления указанных выше аспектов изобретения контрольным образцом является стандартизованный контрольный уровень FRα у здорового индивидуума.
В определенных вариантах осуществления образец обрабатывают гуанидином перед определением уровня FRα в образце. Альтернативно или в комбинации, образец разбавляют перед определением уровня FRα в образце. Альтернативно или в комбинации, образец центрифугируют, встряхивают или и центрифугируют, и встряхивают, перед определением уровня FRα в образце.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу оценки того, страдает ли индивидуум раком яичника, путем определения уровня рецептора фолиевой кислоты альфа (FRα), который не связан с клеткой, в образце, полученном от индивидуума; и сравнения уровня рецептора фолиевой кислоты альфа (FRα), который не связан с клеткой, в образце с уровнем FRα в контрольном образце, где различие между уровнями FRα в образце, полученном от индивидуума, и в контрольном образце указывает на то, что индивидуум страдает раком яичника; где уровень FRα в образце, полученном от индивидуума, оценивают путем приведения образца в контакт с (a) антителом MOV18, иммобилизованным на твердой подложке, и меченым антителом MORAB-003, (b) антителом 9F3, иммобилизованным на твердой подложке, и меченым антителом 24F12, (c) антителом 26B3, иммобилизованным на твердой подложке, и меченым антителом 19D4, и (d) антителом 9F3, иммобилизованным на твердой подложке, и меченым антителом 26B3. Например, образец может представлять собой мочу, сыворотку, плазму или асцитную жидкость.
Способы оценки прогрессирования злокачественной опухоли, экспрессирующей FRα, у индивидуума
В следующем аспекте настоящее изобретение относится к способу оценки прогрессирования злокачественной опухоли, экспрессирующей FRα, у индивидуума, страдающего злокачественной опухолью, экспрессирующей FRα, путем определения уровня рецептора фолиевой кислоты альфа (FRα), который не связан с клеткой, в образце, полученном от индивидуума; и сравнения уровня рецептора фолиевой кислоты альфа (FRα), который не связан с клеткой, с уровнем FRα в контрольном образце, где увеличение уровня FRα в образце, полученном от индивидуума, по сравнению с уровнем FRα в контрольном образце указывает на то, что злокачественная опухоль будет быстро прогрессировать; и где снижение уровня FRα в образце, полученном от индивидуума, по сравнению с уровнем FRα в контрольном образце указывает на то, что злокачественная опухоль будет прогрессировать медленно или будет регрессировать, тем самым оценивая прогрессирование злокачественной опухоли, экспрессирующей FRα, у индивидуума; где уровень FRα, который не связан с клеткой, в образце, полученном от индивидуума, оценивают путем приведения образца в контакт с антителом, которое связывает FRα. В конкретном варианте осуществления образец представляет собой мочу, сыворотку, плазму или асцитную жидкость.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу оценки прогрессирования злокачественной опухоли, экспрессирующей FRα, у индивидуума, страдающего злокачественной опухолью, экспрессирующей FRα, путем определения уровня рецептора фолиевой кислоты альфа (FRα), который не связан с клеткой, в образце мочи, полученном от индивидуума; и сравнения уровня рецептора фолиевой кислоты альфа (FRα), который не связан с клеткой, в образце мочи, полученном от индивидуума, с уровнем FRα в контрольном образце, где увеличение уровня FRα в образце мочи, полученном от индивидуума, по сравнению с уровнем FRα в контрольном образце указывает на то, что злокачественная опухоль будет быстро прогрессировать; и где снижение уровня FRα в образце мочи, полученном от индивидуума, по сравнению с уровнем FRα в контрольном образце указывает на то, что злокачественная опухоль будет прогрессировать медленно или будет регрессировать, тем самым оценивая прогрессирование злокачественной опухоли, экспрессирующей FRα, у индивидуума.
В следующем аспекте настоящее изобретение относится к способам оценки прогрессирования злокачественной опухоли, экспрессирующей FRα, у индивидуума, страдающего злокачественной опухолью, экспрессирующей FRα, путем определения уровня рецептора фолиевой кислоты альфа (FRα), который не связан с клеткой, в образце сыворотки, полученном от индивидуума; и сравнения уровня рецептора фолиевой кислоты альфа (FRα), который не связан с клеткой, в образце сыворотки, полученном от индивидуума, с уровнем FRα в контрольном образце, где увеличение уровня FRα в образце сыворотки, полученном от индивидуума, по сравнению с уровнем FRα в контрольном образце указывает на то, что злокачественная опухоль будет быстро прогрессировать; и где снижение уровня FRα в образце сыворотки, полученном от индивидуума, по сравнению с уровнем FRα в контрольном образце указывает на то, что злокачественная опухоль будет прогрессировать медленно или будет регрессировать, тем самым оценивая прогрессирование злокачественной опухоли, экспрессирующей FRα, у индивидуума.
В различных вариантах осуществления указанных выше аспектов изобретения злокачественная опухоль, экспрессирующая FRα, выбрана из группы, состоящей из рака легкого, мезотелиомы, рака яичника, рака почки, злокачественной опухоли головного мозга, рака шейки матки, рака носоглотки, плоскоклеточной карциномы головы и шеи, рака эндометрия, рака молочной железы, рака мочевого пузыря, рака поджелудочной железы, рака кости, рака гипофиза, рака ободочной и прямой кишки и медуллярного рака щитовидной железы. В конкретном варианте осуществления злокачественная опухоль, экспрессирующая FRα, представляет собой рак яичника. В другом варианте осуществления злокачественная опухоль, экспрессирующая FRα, представляет собой немелкоклеточный рак легкого, такой как аденокарцинома.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способам оценки того, страдает ли индивидуум раком яичника, путем определения уровня рецептора фолиевой кислоты альфа (FRα), который не связан с клеткой, в образце мочи, полученном от индивидуума, где присутствие FRα, который не связан с клеткой, в образце мочи в концентрации более чем приблизительно 9100 пг/мл указывает на то, что индивидуум страдает раком яичника.
В различных аспектах указанных выше аспектов изобретения присутствие FRα в образце мочи в концентрации более чем приблизительно 9500 пг/мл, приблизительно 10000 пг/мл, приблизительно 11000 пг/мл, приблизительно 12000 пг/мл, приблизительно 13000 пг/мл, приблизительно 14000 пг/мл, приблизительно 15000 пг/мл, приблизительно 16000 пг/мл, приблизительно 17000 пг/мл, приблизительно 18000 пг/мл, приблизительно 19000 пг/мл, или приблизительно 20000 пг/мл указывает на то, что индивидуум страдает раком яичника.
В различных аспектах уровень FRα определяют путем приведения образца в контакт с антителом, которое связывает FRα. Например, антитело выбрано из группы, состоящей из:
(a) антитело, которое связывает тот же эпитоп, что и антитело MORAb-003;
(b) антитело, содержащее SEQ ID NO: 1 (GFTFSGYGLS) в качестве CDRH1, SEQ ID NO: 2 (MISSGGSYTYYADSVKG) в качестве CDRH2, SEQ ID NO: 3 (HGDDPAWFAY) в качестве CDRH3, SEQ ID NO: 4 (SVSSSISSNNLH) в качестве CDRL1, SEQ ID NO: 5 (GTSNLAS) в качестве CDRL2 и SEQ ID NO: 6 (QQWSSYPYMYT) в качестве CDRL3;
(c) антитело MOV18; (d) антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и антитело MOV18;
(e) антитело 548908;
(f) антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и антитело 548908;
(g) антитело 6D398;
(h) антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и антитело 6D398;
(i) антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и антитело 26B3;
(j) антитело, содержащее SEQ ID NO: 55 (GYFMN) в качестве CDRH1, SEQ ID NO: 56 (RIFPYNGDTFYNQKFKG) в качестве CDRH2, SEQ ID NO: 57 (GTHYFDY) в качестве CDRH3, SEQ ID NO: 51 (RTSENIFSYLA) в качестве CDRL1, SEQ ID NO: 52 (NAKTLAE) в качестве CDRL2 и SEQ ID NO: 53 (QHHYAFPWT) в качестве CDRL3;
(k) антитело 26B3;
(l) антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и антитело 19D4;
(m) антитело, содержащее SEQ ID NO: 39 (HPYMH) в качестве CDRH1, SEQ ID NO: 40 (RIDPANGNTKYDPKFQG) в качестве CDRH2, SEQ ID NO: 41 (EEVADYTMDY) в качестве CDRH3, SEQ ID NO: 35 (RASES VDTYGNNFIH) в качестве CDRL1, SEQ ID NO: 36 (LASNLES) в качестве CDRL2 и SEQ ID NO: 37 (QQNNGDPWT) в качестве CDRL3;
(n) антитело 19D4;
(o) антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и антитело 9F3;
(p) антитело, содержащее SEQ ID NO: 31 (SGYYWN) в качестве CDRH1, SEQ ID NO: 32 (YIKSDGSNNYNPSLKN) в качестве CDRH2, SEQ ID NO: 33 (EWKAMDY) в качестве CDRH3, SEQ ID NO: 27 (RASSTVSYSYLH) в качестве CDRL1, SEQ ID NO: 28 (GTSNLAS) в качестве CDRL2 и SEQ ID NO: 29 (QQYSGYPLT) в качестве CDRL3;
(q) антитело 9F3;
(r) антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и антитело 24F12;
(s) антитело, содержащее SEQ ID NO: 47 (SYAMS) в качестве CDRH1, SEQ ID NO: 48 (EIGSGGSYTYYPDTVTG) в качестве CDRH2, SEQ ID NO: 49 (ETTAGYFDY) в качестве CDRH3, SEQ ID NO: 43 (SASQGINNFLN) в качестве CDRL1, SEQ ID NO: 44 (YTSSLHS) в качестве CDRL2 и SEQ ID NO: 45 (QHFSKLPWT) в качестве CDRL3;
(t) антитело 24F12;
(u) антитело, которое содержит вариабельную область легкой цепи, выбранную из группы, состоящей из LK26HuVK (SEQ ID NO: 13); LK26HuVKY (SEQ ID NO: 14); LK26HuVKPW (SEQ ID NO: 15); и LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16);
(v) антитело, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из LK26HuVH (SEQ ID NO: 17); LK26HuVH FAIS,N (SEQ ID NO: 18); LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19); LK26HuVH I,I (SEQ ID NO: 20); и LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21);
(w) антитело, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21) и вариабельную область легкой цепи LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16);
(x) антитело, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19) и вариабельную область легкой цепи LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16); и
(y) антитело, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи LK26HuVH FAIS,N (SEQ ID NO: 18) и вариабельную область легкой цепи LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16).
В конкретном варианте осуществления антитело связывает тот же эпитоп, что и антитело MORAb-003. В другом варианте осуществления антитело включает SEQ ID NO: 1 (GFTFSGYGLS) в качестве CDRH1, SEQ ID NO: 2 (MISSGGSYTYYADSVKG) в качестве CDRH2, SEQ ID NO: 3 (HGDDPAWFAY) в качестве CDRH3, SEQ ID NO: 4 (SVSSSISSNNLH) в качестве CDRL1, SEQ ID NO: 5 (GTSNLAS) в качестве CDRL2 и SEQ ID NO: 6 (QQWSSYPYMYT) в качестве CDRL3. В другом варианте осуществления антитело представляет собой антитело MOV18. В другом варианте осуществления антитело связывает тот же эпитоп, что и антитело MOV18. В следующем варианте осуществления антитело содержит вариабельную область легкой цепи, выбранную из группы, состоящей из LK26HuVK (SEQ ID NO: 13); LK26HuVKY (SEQ ID NO: 14); LK26HuVKPW (SEQ ID NO: 15); и LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16).
Альтернативно или в комбинации, антитело включает вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из LK26HuVH (SEQ ID NO: 17); LK26HuVH FAIS,N (SEQ ID NO: 18); LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19); LK26HuVH I,I (SEQ ID NO: 20); и LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21). В определенных вариантах осуществления антитело включает (i) вариабельную область тяжелой цепи LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21) и вариабельную область легкой цепи LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16); вариабельную область тяжелой цепи LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19) и вариабельную область легкой цепи LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16); или вариабельную область тяжелой цепи LK26HuVH FAIS,N (SEQ ID NO: 18) и вариабельную область легкой цепи LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16).
В конкретном варианте осуществления уровень FRα в образце, полученном от указанного индивидуума, оценивают путем приведения образца в контакт с парой антител, выбранной из группы, состоящей из (a) антитела MOV18, иммобилизованного на твердой подложке, и меченого антитела MORAB-003; (b) антитела 9F3, иммобилизованного на твердой подложке, и меченого антитела 24F12; (c) антитела 26B3, иммобилизованного на твердой подложке, и меченого антитела 19D4; и (d) антитела 9F3, иммобилизованного на твердой подложке, и меченого антитела 26B3.
В определенных вариантах осуществления антитело выбрано из группы, состоящей антитела мыши, антитела человека, гуманизированного антитела, биспецифического антитела, химерного антитела, Fab, Fab’2, ScFv, SMIP, аффитела, авимера, версатела, наноантитела и доменного антитела. Альтернативно или в комбинации, антитело является меченным, например, меткой, выбранной из группы, состоящей из радиоактивной метки, биотиновой метки, хромофорной метки, флуорофорной метки или ферментной метки.
В определенных вариантах осуществления уровень FRα определяют с использованием способа, выбранного из группы, состоящей из анализа с использованием вестерн-блоттинга, радиоиммунного анализа, иммунофлуориметрии, иммунопреципитации, равновесного диализа, иммунодиффузии, анализа в жидкой фазе, электрохемилюминесцентного анализа (ECLIA) и анализа ELISA.
В различных вариантах осуществления указанных выше аспектов изобретения контрольным образцом является стандартизованный контрольный уровень FRα у здорового индивидуума. В другом варианте осуществления контрольным образцом является образец, ранее полученный от индивидуума.
В определенных вариантах осуществления образец обрабатывают гуанидином перед определением уровня FRα в образце. Альтернативно или в комбинации, образец разбавляют перед определением уровня FRα в образце. Альтернативно или в комбинации, образец центрифугируют, встряхивают или и центрифугируют, и встряхивают, перед определением уровня FRα в образце.
В следующем аспекте настоящее изобретение относится к способам оценки прогрессирования рака яичника у индивидуума, страдающего раком яичника, путем определения уровня рецептора фолиевой кислоты альфа (FRα), который не связан с клеткой, в образце, полученном от индивидуума; и сравнения уровня рецептора фолиевой кислоты альфа (FRα), который не связан с клеткой, в образце с уровнем FRα в контрольном образце, где увеличение уровня FRα в образце, полученном от индивидуума, по сравнению с уровнем FRα в контрольном образце указывает на то, что рак яичника будет быстро прогрессировать; и где снижение уровня FRα в образце, полученном от индивидуума, по сравнению с уровнем FRα в контрольном образце указывает на то, что рак яичника будет прогрессировать медленно или будет регрессировать, тем самым, оценивая прогрессирование рака яичника у индивидуума; где уровень FRα в образце, полученном от индивидуума, оценивают путем приведения образца в контакт с (a) антителом MOV18, иммобилизованным на твердой подложке, и меченым антителом MORAB-003, (b) антителом 9F3, иммобилизованным на твердой подложке, и меченым антителом 24F12, (c) антителом 26B3, иммобилизованным на твердой подложке, и меченым антителом 19D4, и (d) антителом 9F3, иммобилизованным на твердой подложке, и меченым антителом 26B3. Например, образец может представлять собой мочу, сыворотку, плазму или асцитную жидкость.
Способы распределения злокачественных опухолей, экспрессирующих FRα, в группы лечения злокачественных опухолей
В следующем аспекте настоящее изобретение относится к способу распределения индивидуума, страдающего злокачественной опухолью, экспрессирующей FRα, в одну из по меньшей мере четырех групп лечения злокачественной опухоли путем определения уровня рецептора фолиевой кислоты альфа (FRα), который не связан с клеткой, в образце, полученном от индивидуума; и распределения индивидуума в одну из по меньшей мере четырех групп лечения злокачественной опухоли, исходя из уровня рецептора фолиевой кислоты альфа (FRα), который не связан с клеткой; где уровень FRα, который не связан с клеткой, в образце, полученном от индивидуума, оценивают путем приведения образца в контакт с антителом, которое связывает FRα. Например, образец выбран из группы, состоящей из мочи, сыворотки, плазмы или асцитной жидкости.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу распределения индивидуума, страдающего злокачественной опухолью, экспрессирующей FRα, в одну из по меньшей мере четырех групп лечения злокачественной опухоли путем определения уровня рецептора фолиевой кислоты альфа (FRα), который не связан с клеткой, в образце мочи, полученном от индивидуума; и распределения индивидуума в одну из по меньшей мере четырех групп лечения злокачественной опухоли, исходя из уровня рецептора фолиевой кислоты альфа (FRα), который не связан с клеткой, в образце. В следующем аспекте настоящее изобретение относится к способам распределения индивидуума, страдающего злокачественной опухолью, экспрессирующей FRα, в одну из по меньшей мере четырех групп лечения злокачественной опухоли путем определения уровня рецептора фолиевой кислоты альфа (FRα), который не связан с клеткой, в образце сыворотки, полученном от индивидуума; и распределения индивидуума в одну из по меньшей мере четырех групп лечения злокачественной опухоли, исходя из уровня рецептора фолиевой кислоты альфа (FRα), который не связан с клеткой, в образец сыворотки.
В различных вариантах осуществления указанных выше аспектов изобретения злокачественная опухоль, экспрессирующая FRα, выбрана из группы, состоящей из рака легкого, мезотелиомы, рака яичника, рака почки, злокачественной опухоли головного мозга, рака шейки матки, рака носоглотки, плоскоклеточной карциномы головы и шеи, рака эндометрия, рака молочной железы, рака мочевого пузыря, рака поджелудочной железы, рака кости, рака гипофиза, рака ободочной и прямой кишки и медуллярного рака щитовидной железы. В конкретном варианте осуществления злокачественная опухоль, экспрессирующая FRα, представляет собой рак яичника. В другом варианте осуществления злокачественная опухоль, экспрессирующая FRα, представляет собой немелкоклеточный рак легкого, такой как аденокарцинома.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способам оценки того, страдает ли индивидуум рак яичника, путем определения уровня рецептора фолиевой кислоты альфа (FRα), который не связан с клеткой, в образце мочи, полученном от индивидуума, где присутствие FRα, который не связан с клеткой, в образце мочи в концентрации более чем приблизительно 9100 пг/мл указывает на то, что индивидуум страдает раком яичника.
В различных аспектах указанных выше аспектов изобретения присутствие FRα в образце мочи в концентрации более чем приблизительно 9500 пг/мл, приблизительно 10000 пг/мл, приблизительно 11000 пг/мл, приблизительно 12000 пг/мл, приблизительно 13000 пг/мл, приблизительно 14000 пг/мл, приблизительно 15000 пг/мл, приблизительно 16000 пг/мл, приблизительно 17000 пг/мл, приблизительно 18000 пг/мл, приблизительно 19000 пг/мл, или приблизительно 20000 пг/мл указывает на то, что индивидуум страдает раком яичника.
В различных аспектах, уровень FRα определяют путем приведения образца в контакт с антителом, которое связывает FRα. Например, антитело выбрано из группы, состоящей из:
(a) антитело, которое связывает тот же эпитоп, что и антитело MORAb-003;
(b) антитело, содержащее SEQ ID NO: 1 (GFTFSGYGLS) в качестве CDRH1, SEQ ID NO: 2 (MISSGGSYTYYADSVKG) в качестве CDRH2, SEQ ID NO: 3 (HGDDPAWFAY) в качестве CDRH3, SEQ ID NO: 4 (SVSSSISSNNLH) в качестве CDRL1, SEQ ID NO: 5 (GTSNLAS) в качестве CDRL2 и SEQ ID NO: 6 (QQWSSYPYMYT) в качестве CDRL3;
(c) антитело MOV18;
(d) антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и антитело MOV18;
(e) антитело 548908;
(f) антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и антитело 548908;
(g) антитело 6D398;
(h) антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и антитело 6D398;
(i) антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и антитело 26B3;
(j) антитело, содержащее SEQ ID NO: 55 (GYFMN) в качестве CDRH1, SEQ ID NO: 56 (RIFPYNGDTFYNQKFKG) в качестве CDRH2, SEQ ID NO: 57 (GTHYFDY) в качестве CDRH3, SEQ ID NO: 51 (RTSENIFSYLA) в качестве CDRL1, SEQ ID NO: 52 (NAKTLAE) в качестве CDRL2 и SEQ ID NO: 53 (QHHYAFPWT) в качестве CDRL3;
(k) антитело 26B3;
(l) антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и антитело 19D4;
(m) антитело, содержащее SEQ ID NO: 39 (HPYMH) в качестве CDRH1, SEQ ID NO: 40 (RIDPANGNTKYDPKFQG) в качестве CDRH2, SEQ ID NO: 41 (EEVADYTMDY) в качестве CDRH3, SEQ ID NO: 35 (RASES VDTYGNNFIH) в качестве CDRL1, SEQ ID NO: 36
(LASNLES) в качестве CDRL2 и SEQ ID NO: 37 (QQNNGDPWT) в качестве CDRL3;
(n) антитело 19D4;
(o) антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и антитело 9F3;
(p) антитело, содержащее SEQ ID NO: 31 (SGYYWN) в качестве CDRH1, SEQ ID NO: 32 (YIKSDGSNNYNPSLKN) в качестве CDRH2, SEQ ID NO: 33 (EWKAMDY) в качестве CDRH3, SEQ ID NO: 27 (RASSTVSYSYLH) в качестве CDRL1, SEQ ID NO: 28 (GTSNLAS) в качестве CDRL2 и SEQ ID NO: 29 (QQYSGYPLT) в качестве CDRL3;
(q) антитело 9F3;
(r) антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и антитело 24F12;
(s) антитело, содержащее SEQ ID NO: 47 (SYAMS) в качестве CDRH1, SEQ ID NO: 48 (EIGSGGSYTYYPDTVTG) в качестве CDRH2, SEQ ID NO: 49 (ETTAGYFDY) в качестве CDRH3, SEQ ID NO: 43 (SASQGINNFLN) в качестве CDRL1, SEQ ID NO: 44 (YTSSLHS) в качестве CDRL2 и SEQ ID NO: 45 (QHFSKLPWT) в качестве CDRL3;
(t) антитело 24F12;
(u) антитело, которое содержит вариабельную область легкой цепи, выбранную из группы, состоящей из LK26HuVK (SEQ ID NO: 13); LK26HuVKY (SEQ ID NO: 14); LK26HuVKPW (SEQ ID NO: 15); и LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16);
(v) антитело, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из LK26HuVH (SEQ ID NO: 17); LK26HuVH FAIS,N (SEQ ID NO: 18); LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19); LK26HuVH I,I (SEQ ID NO: 20); и LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21);
(w) антитело, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21) и вариабельную область легкой цепи LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16);
(x) антитело, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19) и вариабельную область легкой цепи LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16); и
(y) антитело, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи LK26HuVH FAIS,N (SEQ ID NO: 18) и вариабельную область легкой цепи LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16).
В конкретном варианте осуществления антитело связывает тот же эпитоп, что и антитело MORAb-003. В другом варианте осуществления антитело включает SEQ ID NO: 1 (GFTFSGYGLS) в качестве CDRH1, SEQ ID NO: 2 (MISSGGSYTYYADSVKG) в качестве CDRH2, SEQ ID NO: 3 (HGDDPAWFAY) в качестве CDRH3, SEQ ID NO: 4 (SVSSSISSNNLH) в качестве CDRL1, SEQ ID NO: 5 (GTSNLAS) в качестве CDRL2 и SEQ ID NO: 6 (QQWSSYPYMYT) в качестве CDRL3. В другом варианте осуществления антитело представляет собой антитело MOV18. В другом варианте осуществления антитело связывает тот же эпитоп, что и антитело MOV18. В следующем варианте осуществления антитело содержит вариабельную область легкой цепи, выбранную из группы, состоящей из LK26HuVK (SEQ ID NO: 13); LK26HuVKY (SEQ ID NO: 14); LK26HuVKPW (SEQ ID NO: 15); и LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16).
Альтернативно или в комбинации, антитело включает вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из LK26HuVH (SEQ ID NO: 17); LK26HuVH FAIS,N (SEQ ID NO: 18); LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19); LK26HuVH I,I (SEQ ID NO: 20); и LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21). В определенных вариантах осуществления антитело включает (i) вариабельную область тяжелой цепи LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21) и вариабельную область легкой цепи LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16); вариабельную область тяжелой цепи LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19) и вариабельную область легкой цепи LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16); или вариабельную область тяжелой цепи LK26HuVH FAIS,N (SEQ ID NO: 18) и вариабельную область легкой цепи LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16).
В конкретном варианте осуществления уровень FRα в образце, полученном от указанного индивидуума оценивают путем приведения образца в контакт с парой антител, выбранной из группы, состоящей из (a) антитела MOV18, иммобилизованного на твердой подложке, и меченого антитела MORAB-003; (b) антитела 9F3, иммобилизованного на твердой подложке, и меченого антитела 24F12; (c) антитела 26B3, иммобилизованного на твердой подложке, и меченого антитела 19D4; и (d) антитела 9F3, иммобилизованного на твердой подложке, и меченого антитела 26B3.
В определенных вариантах осуществления антитело выбрано из группы, состоящей антитела мыши, антитела человека, гуманизированного антитела, биспецифического антитела, химерного антитела, Fab, Fab’2, ScFv, SMIP, аффитела, авимера, версатела, наноантитела и доменного антитела. Альтернативно или в комбинации, антитело является меченным, например, меткой, выбранной из группы, состоящей из радиоактивной метки, биотиновой метки, хромофорной метки, флуорофорной метки или ферментной метки.
В определенных вариантах осуществления уровень FRα определяют с использованием способа, выбранного из группы, состоящей из анализа с использованием вестерн-блоттинга, радиоиммунного анализа, иммунофлуориметрии, иммунопреципитации, равновесного диализа, иммунодиффузии, анализа в жидкой фазе, электрохемилюминесцентного анализа (ECLIA) и анализа ELISA.
В различных вариантах осуществления указанных выше аспектов изобретения контрольным образцом является стандартизованный контрольный уровень FRα у здорового индивидуума.
В определенных вариантах осуществления образец обрабатывают гуанидином перед определением уровня FRα в образце. Альтернативно или в комбинации, образец разбавляют перед определением уровня FRα в образце. Альтернативно или в комбинации, образец центрифугируют, встряхивают или и центрифугируют, и встряхивают, перед определением уровня FRα в образце.
В конкретном варианте осуществления индивидуума распределяют на стадии I, стадии II, стадии III или стадии IV рака яичника.
В следующем аспекте настоящее изобретение относится к способу распределения индивидуума с раком яичника в одну из по меньшей мере четырех групп лечения злокачественной опухоли путем определения уровня рецептора фолиевой кислоты альфа (FRα), который не связан с клеткой, в образце, полученном от индивидуума; и распределения индивидуума в одну из по меньшей мере четырех групп лечения злокачественной опухоли, исходя из уровня рецептора фолиевой кислоты альфа (FRα), который не связан с клеткой, в образце; где уровень FRα в образце, полученном от индивидуума, оценивают путем приведения образца в контакт с (a) антителом MOV18, иммобилизованным на твердой подложке, и меченым антителом MORAB-003, (b) антителом 9F3, иммобилизованным на твердой подложке, и меченым антителом 24F12, (c) антителом 26B3, иммобилизованным на твердой подложке, и меченым антителом 19D4, и (d) антителом 9F3, иммобилизованным на твердой подложке, и меченым антителом 26B3. Например, образец может представлять собой мочу, сыворотку, плазму или асцитную жидкость.
Способы мониторинга эффективности лечения с помощью MORAb-003 рака яичника или рака легкого
В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу мониторинга эффективности лечения с помощью MORAb-003 рака яичника или рака легкого у индивидуума, страдающего раком яичника или раком легкого, путем определения уровня рецептора фолиевой кислоты альфа (FRα), который не связан с клеткой, в образце, полученном от индивидуума, где индивидууму ранее вводили MORAb-003; и сравнение уровня рецептора фолиевой кислоты альфа (FRα), который не связан с клеткой, с уровнем FRα в контрольном образце, где увеличение уровня FRα в образце, полученном от индивидуума, по сравнению с уровнем FRα в контрольном образце указывает на то, что лечение с помощью MORAb-003 не является эффективным; и где снижение уровня FRα в образце, полученном от индивидуума, по сравнению с уровнем FRα в контрольном образце указывает на то, что лечение с помощью MORAb-003 является эффективным. В конкретных вариантах осуществления уровень FRα, который не связан с клеткой, в образце, полученном от индивидуума, оценивают путем приведения образца в контакт с антителом, которое связывает FRα. Например, образец может представлять собой мочу, сыворотку, плазму или асцитную жидкость.
В следующем аспекте настоящее изобретение относится к способу мониторинга эффективности лечения с помощью MORAb-003 рака яичника или рака легкого у индивидуума, страдающего раком яичника или раком легкого, путем определения уровня рецептора фолиевой кислоты альфа (FRα), который не связан с клеткой, в образце мочи, полученном от индивидуума, где индивидууму ранее вводили MORAb-003; и сравнение уровня рецептора фолиевой кислоты альфа (FRα), который не связан с клеткой, в образце мочи, полученном от индивидуума, с уровнем FRα в контрольном образце, где увеличение уровня FRα в образце мочи, полученном от индивидуума, по сравнению с уровнем FRα в контрольном образце указывает на то, что лечение с помощью MORAb-003 не является эффективным; и где снижение уровня FRα в образце мочи, полученном от индивидуума, по сравнению с уровнем FRα в контрольном образце указывает на то, что лечение с помощью MORAb-003 является эффективным.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу мониторинга эффективности лечения с помощью MORAb-003 рака яичника или рака легкого у индивидуума, страдающего раком яичника или раком легкого, путем определения уровня рецептора фолиевой кислоты альфа (FRα), который не связан с клеткой, в образце сыворотки, полученном от индивидуума, где индивидууму ранее вводили MORAb-003; и сравнения уровня рецептора фолиевой кислоты альфа (FRα), который не связан с клеткой, в образце сыворотки, полученном от индивидуума, с уровнем FRα в контрольном образце, где увеличение уровня FRα в образце сыворотки, полученном от индивидуума, по сравнению с уровнем FRα в контрольном образце указывает на то, что лечение с помощью MORAb-003 не является эффективным; и где снижение уровня FRα в образце сыворотки, полученном от индивидуума, по сравнению с уровнем FRα в контрольном образце указывает на то, что лечение с помощью MORAb-003 является эффективным.
В различных аспектах, уровень FRα определяют путем приведения образца в контакт с антителом, которое связывает FRα. Например, антитело выбрано из группы, состоящей из:
(a) антитело, которое связывает тот же эпитоп, что и антитело MORAb-003;
(b) антитело, содержащее SEQ ID NO: 1 (GFTFSGYGLS) в качестве CDRH1, SEQ ID NO: 2 (MISSGGSYTYYADSVKG) в качестве CDRH2, SEQ ID NO: 3 (HGDDPAWFAY) в качестве CDRH3, SEQ ID NO: 4 (SVSSSISSNNLH) в качестве CDRL1, SEQ ID NO: 5 (GTSNLAS) в качестве CDRL2 и SEQ ID NO: 6 (QQWSSYPYMYT) в качестве CDRL3;
(c) антитело MOV18;
(d) антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и антитело MOV18;
(e) антитело 548908;
(f) антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и антитело 548908;
(g) антитело 6D398;
(h) антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и антитело 6D398;
(i) антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и антитело 26B3;
(j) антитело, содержащее SEQ ID NO: 55 (GYFMN) в качестве CDRH1, SEQ ID NO: 56 (RIFPYNGDTFYNQKFKG) в качестве CDRH2, SEQ ID NO: 57 (GTHYFDY) в качестве CDRH3, SEQ ID NO: 51 (RTSENIFSYLA) в качестве CDRL1, SEQ ID NO: 52 (NAKTLAE) в качестве CDRL2 и SEQ ID NO: 53 (QHHYAFPWT) в качестве CDRL3;
(k) антитело 26B3;
(l) антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и антитело 19D4;
(m) антитело, содержащее SEQ ID NO: 39 (HPYMH) в качестве CDRH1, SEQ ID NO: 40 (RIDPANGNTKYDPKFQG) в качестве CDRH2, SEQ ID NO: 41 (EEVADYTMDY) в качестве CDRH3, SEQ ID NO: 35 (RASES VDTYGNNFIH) в качестве CDRL1, SEQ ID NO: 36 (LASNLES) в качестве CDRL2 и SEQ ID NO: 37 (QQNNGDPWT) в качестве CDRL3;
(n) антитело 19D4;
(o) антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и антитело 9F3;
(p) антитело, содержащее SEQ ID NO: 31 (SGYYWN) в качестве CDRH1, SEQ ID NO: 32 (YIKSDGSNNYNPSLKN) в качестве CDRH2, SEQ ID NO: 33 (EWKAMDY) в качестве CDRH3, SEQ ID NO: 27 (RASSTVSYSYLH) в качестве CDRL1, SEQ ID NO: 28 (GTSNLAS) в качестве CDRL2 и SEQ ID NO: 29 (QQYSGYPLT) в качестве CDRL3;
(q) антитело 9F3;
(r) антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и антитело 24F12;
(s) антитело, содержащее SEQ ID NO: 47 (SYAMS) в качестве CDRH1, SEQ ID NO: 48 (EIGSGGSYTYYPDTVTG) в качестве CDRH2, SEQ ID NO: 49 (ETTAGYFDY) в качестве CDRH3, SEQ ID NO: 43 (SASQGINNFLN) в качестве CDRL1, SEQ ID NO: 44 (YTSSLHS) в качестве CDRL2 и SEQ ID NO: 45 (QHFSKLPWT) в качестве CDRL3;
(t) антитело 24F12;
(u) антитело, которое содержит вариабельную область легкой цепи, выбранную из группы, состоящей из LK26HuVK (SEQ ID NO: 13); LK26HuVKY (SEQ ID NO: 14); LK26HuVKPW (SEQ ID NO: 15); и LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16);
(v) антитело, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из LK26HuVH (SEQ ID NO: 17); LK26HuVH FAIS,N (SEQ ID NO: 18); LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19); LK26HuVH I,I (SEQ ID NO: 20); и LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21);
(w) антитело, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21) и вариабельную область легкой цепи LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16);
(x) антитело, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19) и вариабельную область легкой цепи LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16); и
(y) антитело, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи LK26HuVH FAIS,N (SEQ ID NO: 18) и вариабельную область легкой цепи LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16).
В конкретном варианте осуществления антитело связывает тот же эпитоп, что и антитело MORAb-003. В другом варианте осуществления антитело включает SEQ ID NO: 1 (GFTFSGYGLS) в качестве CDRH1, SEQ ID NO: 2 (MISSGGSYTYYADSVKG) в качестве CDRH2, SEQ ID NO: 3 (HGDDPAWFAY) в качестве CDRH3, SEQ ID NO: 4 (SVSSSISSNNLH) в качестве CDRL1, SEQ ID NO: 5 (GTSNLAS) в качестве CDRL2 и SEQ ID NO: 6 (QQWSSYPYMYT) в качестве CDRL3. В другом варианте осуществления антитело представляет собой антитело MOV18. В другом варианте осуществления антитело связывает тот же эпитоп, что и антитело MOV18. В следующем варианте осуществления антитело содержит вариабельную область легкой цепи, выбранную из группы, состоящей из LK26HuVK (SEQ ID NO: 13); LK26HuVKY (SEQ ID NO: 14); LK26HuVKPW (SEQ ID NO: 15); и LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16).
Альтернативно или в комбинации, антитело включает вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из LK26HuVH (SEQ ID NO: 17); LK26HuVH FAIS,N (SEQ ID NO: 18); LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19); LK26HuVH I,I (SEQ ID NO: 20); и LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21). В определенных вариантах осуществления антитело включает (i) вариабельную область тяжелой цепи LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21) и вариабельную область легкой цепи LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16); вариабельную область тяжелой цепи LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19) и вариабельную область легкой цепи LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16); или вариабельную область тяжелой цепи LK26HuVH FAIS,N (SEQ ID NO: 18) и вариабельную область легкой цепи LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16).
В конкретном варианте осуществления уровень FRα в образце, полученном от указанного индивидуума, оценивают путем приведения образца в контакт с парой антител, выбранной из группы, состоящей из (a) антитела MOV18, иммобилизованного на твердой подложке, и меченого антитела MORAB-003; (b) антитела 9F3, иммобилизованного на твердой подложке, и меченого антитела 24F12; (c) антитела 26B3, иммобилизованного на твердой подложке, и меченого антитела 19D4; и (d) антитела 9F3, иммобилизованного на твердой подложке, и меченого антитела 26B3.
В определенных вариантах осуществления антитело выбрано из группы, состоящей антитела мыши, антитела человека, гуманизированного антитела, биспецифического антитела, химерного антитела, Fab, Fab’2, ScFv, SMIP, аффитела, авимера, версатела, наноантитела и доменного антитела. Альтернативно или в комбинации, антитело является меченным, например, меткой, выбранной из группы, состоящей из радиоактивной метки, биотиновой метки, хромофорной метки, флуорофорной метки или ферментной метки.
В определенных вариантах осуществления уровень FRα определяют с использованием способа, выбранного из группы, состоящей из анализа с использованием вестерн-блоттинга, радиоиммунного анализа, иммунофлуориметрии, иммунопреципитации, равновесного диализа, иммунодиффузии, анализа в жидкой фазе, электрохемилюминесцентного анализа (ECLIA) и анализа ELISA.
В различных вариантах осуществления указанных выше аспектов изобретения контрольным образцом является стандартизованный контрольный уровень FRα у здорового индивидуума. В другом варианте осуществления контрольным образцом является образец, ранее полученный от индивидуума.
В определенных вариантах осуществления образец обрабатывают гуанидином перед определением уровня FRα в образце. Альтернативно или в комбинации, образец разбавляют перед определением уровня FRα в образце. Альтернативно или в комбинации, образец центрифугируют, встряхивают или и центрифугируют, и встряхивают, перед определением уровня FRα в образце.
Способы прогнозирования того, будет ли индивидуум отвечать на лечение с помощью MORAb-003
В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу прогнозирования того, будет ли индивидуум, страдающий злокачественной опухолью, экспрессирующей FRα, такой как рак яичника или рак легкого, отвечать на лечение MORAb-003, путем определения уровня рецептора фолиевой кислоты альфа (FRα), который не связан с клеткой, в образце, полученном от индивидуума; и сравнения уровня рецептора фолиевой кислоты альфа (FRα), который не связан с клеткой, в образце, полученном от индивидуума, с уровнем FRα в контрольном образце, где различие между уровнем FRα в образце, полученном от индивидуума, и уровнем FRα в контрольном образце указывает на то, что индивидуум будет отвечать на лечение MORAb-003.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу прогнозирования того, будет ли индивидуум, страдающий злокачественной опухолью, экспрессирующей FRα, такой как рак яичника или рак легкого, отвечать на лечение MORAb-003, путем определения уровня рецептора фолиевой кислоты альфа (FRα), который не связан с клеткой, в образце мочи, полученном от индивидуума; и сравнение уровня рецептора фолиевой кислоты альфа (FRα), который не связан с клеткой, в образце мочи, полученном от индивидуума, с уровнем FRα в контрольном образце, где различие между уровнем FRα в образце мочи, полученном от индивидуума, и уровнем FRα в контрольном образце указывает на то, что индивидуум будет отвечать на лечение MORAb-003.
В следующем аспекте настоящее изобретение относится к способу прогнозирования того, будет ли индивидуум, страдающий злокачественной опухолью, экспрессирующей FRα, такой как рак яичника или рак легкого, отвечать на лечение MORAb-003, путем определения уровня рецептора фолиевой кислоты альфа (FRα), который не связан с клеткой, в образце сыворотки, полученном от индивидуума; и сравнения уровня рецептора фолиевой кислоты альфа (FRα), который не связан с клеткой, в образце сыворотки, полученном от индивидуума, с уровнем FRα в контрольном образце, где различие между уровнем FRα в образце сыворотки, полученном от индивидуума, и уровнем FRα в контрольном образце указывает на то, что индивидуум будет отвечать на лечение MORAb-003.
В следующих вариантах осуществления злокачественная опухоль, экспрессирующая FRα, выбрана из группы, состоящей из рака легкого, мезотелиомы, рака яичника, рака почки, злокачественной опухоли головного мозга, рака шейки матки, рака носоглотки, плоскоклеточной карциномы головы и шеи, рака эндометрия, рака молочной железы, рака мочевого пузыря, рака поджелудочной железы, рака кости, рака гипофиза, рака ободочной и прямой кишки и медуллярного рака щитовидной железы. В конкретном варианте осуществления злокачественная опухоль, экспрессирующая FRα, представляет собой рак яичника. В другом варианте осуществления рак легкого, экспрессирующий FRα, представляет собой немелкоклеточный рак легкого, такой как аденокарцинома.
В следующем аспекте настоящее изобретение относится к способам прогнозирования того, будет ли индивидуум, страдающий раком яичника будет отвечать на лечение MORAb-003, путем определения уровня рецептора фолиевой кислоты альфа (FRα), который не связан с клеткой, в образце мочи, полученном от индивидуума, где присутствие FRα, который не связан с клеткой, в образце мочи в концентрации более чем приблизительно 9100 пг/мл указывает на то, что индивидуум будет отвечать на лечение MORAb-003.
В различных вариантах осуществления указанных выше аспектов изобретения присутствие FRα в образце мочи в концентрации более чем приблизительно 9500 пг/мл, приблизительно 10000 пг/мл, приблизительно 11000 пг/мл, приблизительно 12000 пг/мл, приблизительно 13000 пг/мл, приблизительно 14000 пг/мл, приблизительно 15000 пг/мл, приблизительно 16000 пг/мл, приблизительно 17000 пг/мл, приблизительно 18000 пг/мл, приблизительно 19000 пг/мл, или приблизительно 20000 пг/мл указывает на то, что индивидуум страдает раком яичника.
В различных вариантах осуществления указанных выше аспектов изобретения уровень FRα определяют путем приведения образца в контакт с антителом, которое связывает FRα. Например, антитело выбрано из группы, состоящей из:
(a) антитело, которое связывает тот же эпитоп, что и антитело MORAb-003;
(b) антитело, содержащее SEQ ID NO: 1 (GFTFSGYGLS) в качестве CDRH1, SEQ ID NO: 2 (MISSGGSYTYYADSVKG) в качестве CDRH2, SEQ ID NO: 3 (HGDDPAWFAY) в качестве CDRH3, SEQ ID NO: 4 (SVSSSISSNNLH) в качестве CDRL1, SEQ ID NO: 5 (GTSNLAS) в качестве CDRL2 и SEQ ID NO: 6 (QQWSSYPYMYT) в качестве CDRL3;
(c) антитело MOV18;
(d) антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и антитело MOV18;
(e) антитело 548908;
(f) антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и антитело 548908;
(g) антитело 6D398;
(h) антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и антитело 6D398;
(i) антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и антитело 26B3;
(j) антитело, содержащее SEQ ID NO: 55 (GYFMN) в качестве CDRH1, SEQ ID NO: 56 (RIFPYNGDTFYNQKFKG) в качестве CDRH2, SEQ ID NO: 57 (GTHYFDY) в качестве CDRH3, SEQ ID NO: 51 (RTSENIFSYLA) в качестве CDRL1, SEQ ID NO: 52 (NAKTLAE) в качестве CDRL2 и SEQ ID NO: 53 (QHHYAFPWT) в качестве CDRL3;
(k) антитело 26B3;
(l) антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и антитело 19D4;
(m) антитело, содержащее SEQ ID NO: 39 (HPYMH) в качестве CDRH1, SEQ ID NO: 40 (RIDPANGNTKYDPKFQG) в качестве CDRH2, SEQ ID NO: 41 (EEVADYTMDY) в качестве CDRH3, SEQ ID NO: 35 (RASES VDTYGNNFIH) в качестве CDRL1, SEQ ID NO: 36 (LASNLES) в качестве CDRL2 и SEQ ID NO: 37 (QQNNGDPWT) в качестве CDRL3;
(n) антитело 19D4;
(o) антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и антитело 9F3;
(p) антитело, содержащее SEQ ID NO: 31 (SGYYWN) в качестве CDRH1, SEQ ID NO: 32 (YIKSDGSNNYNPSLKN) в качестве CDRH2, SEQ ID NO: 33 (EWKAMDY) в качестве CDRH3, SEQ ID NO: 27 (RASSTVSYSYLH) в качестве CDRL1, SEQ ID NO: 28 (GTSNLAS) в качестве CDRL2 и SEQ ID NO: 29 (QQYSGYPLT) в качестве CDRL3;
(q) антитело 9F3;
(r) антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и антитело 24F12;
(s) антитело, содержащее SEQ ID NO: 47 (SYAMS) в качестве CDRH1, SEQ ID NO: 48 (EIGSGGSYTYYPDTVTG) в качестве CDRH2, SEQ ID NO: 49 (ETTAGYFDY) в качестве CDRH3, SEQ ID NO: 43 (SASQGINNFLN) в качестве CDRL1, SEQ ID NO: 44 (YTSSLHS) в качестве CDRL2 и SEQ ID NO: 45 (QHFSKLPWT) в качестве CDRL3;
(t) антитело 24F12;
(u) антитело, которое содержит вариабельную область легкой цепи, выбранную из группы, состоящей из LK26HuVK (SEQ ID NO: 13); LK26HuVKY (SEQ ID NO: 14); LK26HuVKPW (SEQ ID NO: 15); и LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16);
(v) антитело, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из LK26HuVH (SEQ ID NO: 17); LK26HuVH FAIS,N (SEQ ID NO: 18); LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19); LK26HuVH I,I (SEQ ID NO: 20); и LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21);
(w) антитело, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21) и вариабельную область легкой цепи LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16);
(x) антитело, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19) и вариабельную область легкой цепи LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16); и
(y) антитело, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи LK26HuVH FAIS,N (SEQ ID NO: 18) и вариабельную область легкой цепи LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16).
В конкретном варианте осуществления антитело связывает тот же эпитоп, что и антитело MORAb-003. В другом варианте осуществления антитело включает SEQ ID NO: 1 (GFTFSGYGLS) в качестве CDRH1, SEQ ID NO: 2 (MISSGGSYTYYADSVKG) в качестве CDRH2, SEQ ID NO: 3 (HGDDPAWFAY) в качестве CDRH3, SEQ ID NO: 4 (SVSSSISSNNLH) в качестве CDRL1, SEQ ID NO: 5 (GTSNLAS) в качестве CDRL2 и SEQ ID NO: 6 (QQWSSYPYMYT) в качестве CDRL3. В другом варианте осуществления антитело представляет собой антитело MOV18. В другом варианте осуществления антитело связывает тот же эпитоп, что и антитело MOV18. В следующем варианте осуществления антитело содержит вариабельную область легкой цепи, выбранную из группы, состоящей из LK26HuVK (SEQ ID NO: 13); LK26HuVKY (SEQ ID NO: 14); LK26HuVKPW (SEQ ID NO: 15) и LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16).
Альтернативно или в комбинации, антитело включает вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из LK26HuVH (SEQ ID NO: 17); LK26HuVH FAIS,N (SEQ ID NO: 18); LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19); LK26HuVH I,I (SEQ ID NO: 20); и LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21). В определенных вариантах осуществления антитело включает (i) вариабельную область тяжелой цепи LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21) и вариабельную область легкой цепи LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16); вариабельную область тяжелой цепи LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19) и вариабельную область легкой цепи LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16); или вариабельную область тяжелой цепи LK26HuVH FAIS,N (SEQ ID NO: 18) и вариабельную область легкой цепи LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16).
В конкретном варианте осуществления уровень FRα в образце, полученном от указанного индивидуума, оценивают путем приведения образца в контакт с парой антител, выбранной из группы, состоящей из (a) антитела MOV18, иммобилизованного на твердой подложке, и меченого антитела MORAB-003; (b) антитела 9F3, иммобилизованного на твердой подложке, и меченого антитела 24F12; (c) антитела 26B3, иммобилизованного на твердой подложке, и меченого антитела 19D4; и (d) антитела 9F3, иммобилизованного на твердой подложке, и меченого антитела 26B3.
В определенных вариантах осуществления антитело выбрано из группы, состоящей антитела мыши, антитела человека, гуманизированного антитела, биспецифического антитела, химерного антитела, Fab, Fab’2, ScFv, SMIP, аффитела, авимера, версатела, наноантитела и доменного антитела. Альтернативно или в комбинации, антитело является меченным, например, меткой, выбранной из группы, состоящей из радиоактивной метки, биотиновой метки, хромофорной метки, флуорофорной метки или ферментной метки.
В определенных вариантах осуществления уровень FRα определяют с использованием способа, выбранного из группы, состоящей из анализа с использованием вестерн-блоттинга, радиоиммунного анализа, иммунофлуориметрии, иммунопреципитации, равновесного диализа, иммунодиффузии, анализа в жидкой фазе, электрохемилюминесцентного анализа (ECLIA) и анализа ELISA.
В различных вариантах осуществления указанных выше аспектов изобретения контрольным образцом является стандартизованный контрольный уровень FRα у здорового индивидуума.
В определенных вариантах осуществления образец обрабатывают гуанидином перед определением уровня FRα в образце. Альтернативно или в комбинации, образец разбавляют перед определением уровня FRα в образце. Альтернативно или в комбинации, образец центрифугируют, встряхивают или и центрифугируют, и встряхивают, перед определением уровня FRα в образце.
В следующем аспекте настоящее изобретение относится к способу прогнозирования того, будет ли индивидуум, страдающий злокачественной опухолью, экспрессирующей FRα, такой как рак яичника или рак легкого, отвечать на лечение MORAb-003, путем определения уровня рецептора фолиевой кислоты альфа (FRα), который не связан с клеткой, в образце, полученном от индивидуума; и сравнения уровня рецептора фолиевой кислоты альфа (FRα), который не связан с клеткой, в образце с уровнем FRα в контрольном образце, где различие между уровнями FRα в образце, полученном от индивидуума, и в контрольном образце указывает на то, что индивидуум будет отвечать на лечение MORAb-003; где уровень FRα в образце, полученном от индивидуума, оценивают путем приведения образца в контакт с (a) антителом MOV18, иммобилизованным на твердой подложке, и меченым антителом MORAB-003, (b) антителом 9F3, иммобилизованным на твердой подложке, и меченым антителом 24F12, (c) антителом 26B3, иммобилизованным на твердой подложке, и меченым антителом 19D4, и (d) антителом 9F3, иммобилизованным на твердой подложке, и меченым антителом 26B3. Например, образец может представлять собой мочу, сыворотку, плазму или асцитную жидкость.
В различных вариантах осуществления указанных выше аспектов изобретения MORAb-003 для лечения представляет собой (a) антитело, которое содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи, указанную в SEQ ID NO: 7, и аминокислотную последовательность легкой цепи, указанную в SEQ ID NO: 8; (b) антитело, которое связывает тот же эпитоп, что и антитело MORAb-003; или (c) антитело, содержащее SEQ ID NO: 1 (GFTFSGYGLS) в качестве CDRH1, SEQ ID NO: 2 (MISSGGSYTYYADSVKG) в качестве CDRH2, SEQ ID NO: 3 (HGDDPAWFAY) в качестве CDRH3, SEQ ID NO: 4 (SVSSSISSNNLH) в качестве CDRL1, SEQ ID NO: 5 (GTSNLAS) в качестве CDRL2 и SEQ ID NO: 6 (QQWSSYPYMYT) в качестве CDRL3.
Способы лечения индивидуума, имеющего рак яичника или рак легкого
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способам лечения индивидуума, имеющего рак яичника или рак легкого путем определения уровня рецептора фолиевой кислоты альфа (FRα), который не связан с клеткой, в образце, полученном от указанного индивидуума (например, моча, сыворотка, плазма или асцитная жидкость); и сравнения уровня рецептора фолиевой кислоты альфа (FRα), который не связан с клеткой, с уровнем FRα в контрольном образце, где различие между уровнем FRα в образце, полученном от указанного индивидуума, и уровнем FRα в контрольном образце указывает на то, что индивидуум страдает раком яичника или рак легкого; и введения терапевтически эффективного количества MORAb-003 указанному индивидууму.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способам лечения индивидуума, имеющего рак яичника или рак легкого, путем определения уровня рецептора фолиевой кислоты альфа (FRα), который не связан с клеткой, в образце мочи, полученном от указанного индивидуума; и сравнения уровня рецептора фолиевой кислоты альфа (FRα), который не связан с клеткой, с уровнем FRα в контрольном образце, где различие между уровнем FRα в образце мочи, полученном от указанного индивидуума, и уровнем FRα в контрольном образце указывает на то, что индивидуум страдает раком яичника или раком легкого; и введения терапевтически эффективного количества MORAb-003 указанному индивидууму.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способам лечения индивидуума, имеющего рак яичника или рак легкого, путем определения уровня рецептора фолиевой кислоты альфа (FRα), который не связан с клеткой, в образце сыворотки, полученном от указанного индивидуума; и сравнения уровня рецептора фолиевой кислоты альфа (FRα), который не связан с клеткой, с уровнем FRα в контрольном образце, где различие между уровнем FRα в образце сыворотки, полученном от указанного индивидуума, и уровнем FRα в контрольном образце указывает на то, что индивидуум страдает раком яичника или раком легкого; и введения терапевтически эффективного количества MORAb-003 указанному индивидууму.
В следующем аспекте настоящее изобретение относится к способам лечения индивидуума, страдающего раком яичника, путем определения уровня рецептора фолиевой кислоты альфа (FRα), который не связан с клеткой, в образце мочи, полученном от индивидуума, где присутствие FRα, который не связан с клеткой, в образце мочи в концентрации более чем приблизительно 9100 пг/мл указывает на то, что индивидуум будет отвечать на лечение MORAb-003; и введения терапевтически эффективного количества MORAb-003 указанному индивидууму.
В конкретных вариантах осуществления уровень FRα, который не связан с клеткой, в образце, полученном от указанного индивидуума, оценивают путем приведения образца в контакт с антителом, которое связывает FRα.
В различных вариантах осуществления указанных выше аспектов изобретения присутствие FRα в образце мочи в концентрации более чем приблизительно 9500 пг/мл, приблизительно 10000 пг/мл, приблизительно 11000 пг/мл, приблизительно 12000 пг/мл, приблизительно 13000 пг/мл, приблизительно 14000 пг/мл, приблизительно 15000 пг/мл, приблизительно 16000 пг/мл, приблизительно 17000 пг/мл, приблизительно 18000 пг/мл, приблизительно 19000 пг/мл, или приблизительно 20000 пг/мл указывает на то, что индивидуум страдает раком яичника.
В различных вариантах осуществления указанных выше аспектов изобретения уровень FRα определяют путем приведения образца в контакт с антителом, которое связывает FRα. Например, антитело выбрано из группы, состоящей из:
(a) антитело, которое связывает тот же эпитоп, что и антитело MORAb-003;
(b) антитело, содержащее SEQ ID NO: 1 (GFTFSGYGLS) в качестве CDRH1, SEQ ID NO: 2 (MISSGGSYTYYADSVKG) в качестве CDRH2, SEQ ID NO: 3 (HGDDPAWFAY) в качестве CDRH3, SEQ ID NO: 4 (SVSSSISSNNLH) в качестве CDRL1, SEQ ID NO: 5 (GTSNLAS) в качестве CDRL2 и SEQ ID NO: 6 (QQWSSYPYMYT) в качестве CDRL3;
(c) антитело MOV18;
(d) антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и антитело MOV18;
(e) антитело 548908;
(f) антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и антитело 548908;
(g) антитело 6D398;
(h) антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и антитело 6D398;
(i) антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и антитело 26B3;
(j) антитело, содержащее SEQ ID NO: 55 (GYFMN) в качестве CDRH1, SEQ ID NO: 56 (RIFPYNGDTFYNQKFKG) в качестве CDRH2, SEQ ID NO: 57 (GTHYFDY) в качестве CDRH3, SEQ ID NO: 51 (RTSENIFSYLA) в качестве CDRL1, SEQ ID NO: 52 (NAKTLAE) в качестве CDRL2 и SEQ ID NO: 53 (QHHYAFPWT) в качестве CDRL3;
(k) антитело 26B3;
(l) антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и антитело 19D4;
(m) антитело, содержащее SEQ ID NO: 39 (HPYMH) в качестве CDRH1, SEQ ID NO: 40 (RIDPANGNTKYDPKFQG) в качестве CDRH2, SEQ ID NO: 41 (EEVADYTMDY) в качестве CDRH3, SEQ ID NO: 35 (RASES VDTYGNNFIH) в качестве CDRL1, SEQ ID NO: 36 (LASNLES) в качестве CDRL2 и SEQ ID NO: 37 (QQNNGDPWT) в качестве CDRL3;
(n) антитело 19D4;
(o) антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и антитело 9F3;
(p) антитело, содержащее SEQ ID NO: 31 (SGYYWN) в качестве CDRH1, SEQ ID NO: 32 (YIKSDGSNNYNPSLKN) в качестве CDRH2, SEQ ID NO: 33 (EWKAMDY) в качестве CDRH3, SEQ ID NO: 27 (RASSTVSYSYLH) в качестве CDRL1, SEQ ID NO: 28 (GTSNLAS) в качестве CDRL2 и SEQ ID NO: 29 (QQYSGYPLT) в качестве CDRL3;
(q) антитело 9F3;
(r) антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и антитело 24F12;
(s) антитело, содержащее SEQ ID NO: 47 (SYAMS) в качестве CDRH1, SEQ ID NO: 48 (EIGSGGSYTYYPDTVTG) в качестве CDRH2, SEQ ID NO: 49 (ETTAGYFDY) в качестве CDRH3, SEQ ID NO: 43 (SASQGINNFLN) в качестве CDRL1, SEQ ID NO: 44 (YTSSLHS) в качестве CDRL2 и SEQ ID NO: 45 (QHFSKLPWT) в качестве CDRL3;
(t) антитело 24F12;
(u) антитело, которое содержит вариабельную область легкой цепи, выбранную из группы, состоящей из LK26HuVK (SEQ ID NO: 13); LK26HuVKY (SEQ ID NO: 14); LK26HuVKPW (SEQ ID NO: 15); и LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16);
(v) антитело, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из LK26HuVH (SEQ ID NO: 17); LK26HuVH FAIS,N (SEQ ID NO: 18); LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19); LK26HuVH I,I (SEQ ID NO: 20); и LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21);
(w) антитело, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21) и вариабельную область легкой цепи LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16);
(x) антитело, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19) и вариабельную область легкой цепи LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16); и
(y) антитело, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи LK26HuVH FAIS,N (SEQ ID NO: 18) и вариабельную область легкой цепи LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16).
В конкретном варианте осуществления антитело связывает тот же эпитоп, что и антитело MORAb-003. В другом варианте осуществления антитело включает SEQ ID NO: 1 (GFTFSGYGLS) в качестве CDRH1, SEQ ID NO: 2 (MISSGGSYTYYADSVKG) в качестве CDRH2, SEQ ID NO: 3 (HGDDPAWFAY) в качестве CDRH3, SEQ ID NO: 4 (SVSSSISSNNLH) в качестве CDRL1, SEQ ID NO: 5 (GTSNLAS) в качестве CDRL2 и SEQ ID NO: 6 (QQWSSYPYMYT) в качестве CDRL3. В другом варианте осуществления антитело представляет собой антитело MOV18. В другом варианте осуществления антитело связывает тот же эпитоп, что и антитело MOV18. В следующем варианте осуществления антитело содержит вариабельную область легкой цепи, выбранную из группы, состоящей из LK26HuVK (SEQ ID NO: 13); LK26HuVKY (SEQ ID NO: 14); LK26HuVKPW (SEQ ID NO: 15); и LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16).
Альтернативно или в комбинации, антитело включает вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из LK26HuVH (SEQ ID NO: 17); LK26HuVH FAIS,N (SEQ ID NO: 18); LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19); LK26HuVH I,I (SEQ ID NO: 20); и LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21). В определенных вариантах осуществления антитело включает (i) вариабельную область тяжелой цепи LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21) и вариабельную область легкой цепи LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16); вариабельную область тяжелой цепи LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19) и вариабельную область легкой цепи LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16); или вариабельную область тяжелой цепи LK26HuVH FAIS,N (SEQ ID NO: 18) и вариабельную область легкой цепи LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16).
В конкретном варианте осуществления уровень FRα в образце, полученном от указанного индивидуума, оценивают путем приведения образца в контакт с парой антител, выбранной из группы, состоящей из (a) антитела MOV18, иммобилизованного на твердой подложке, и меченого антитела MORAB-003; (b) антитела 9F3, иммобилизованного на твердой подложке, и меченого антитела 24F12; (c) антитела 26B3, иммобилизованного на твердой подложке, и меченого антитела 19D4; и (d) антитела 9F3, иммобилизованного на твердой подложке, и меченого антитела 26B3.
В определенных вариантах осуществления антитело выбрано из группы, состоящей антитела мыши, антитела человека, гуманизированного антитела, биспецифического антитела, химерного антитела, Fab, Fab’2, ScFv, SMIP, аффитела, авимера, версатела, наноантитела и доменного антитела. Альтернативно или в комбинации, антитело является меченным, например, меткой, выбранной из группы, состоящей из радиоактивной метки, биотиновой метки, хромофорной метки, флуорофорной метки или ферментной метки.
В определенных вариантах осуществления уровень FRα определяют с использованием способа, выбранного из группы, состоящей из анализа с использованием вестерн-блоттинга, радиоиммунного анализа, иммунофлуориметрии, иммунопреципитации, равновесного диализа, иммунодиффузии, анализа в жидкой фазе, электрохемилюминесцентного анализа (ECLIA) и анализа ELISA.
В различных вариантах осуществления указанных выше аспектов изобретения контрольным образцом является стандартизованный контрольный уровень FRα у здорового индивидуума.
В определенных вариантах осуществления образец обрабатывают гуанидином перед определением уровня FRα в образце. Альтернативно или в комбинации, образец разбавляют перед определением уровня FRα в образце. Альтернативно или в комбинации, образец центрифугируют, встряхивают или и центрифугируют, и встряхивают, перед определением уровня FRα в образце.
В следующем аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения индивидуума, страдающего раком яичника или раком легкого, путем определения уровня рецептора фолиевой кислоты альфа (FRα), который не связан с клеткой, в образце, полученном от индивидуума; и сравнения уровня рецептора фолиевой кислоты альфа (FRα), который не связан с клеткой, в образце с уровнем FRα в контрольном образце, где различие между уровнями FRα в образце, полученном от индивидуума, и в контрольном образце указывает на то, что индивидуум будет отвечать на лечение MORAb-003; где уровень FRα в образце, полученном от индивидуума, оценивают путем приведения образца в контакт с (a) антителом MOV18, иммобилизованным на твердой подложке, и меченым антителом MORAB-003, (b) антителом 9F3, иммобилизованным на твердой подложке, и меченым антителом 24F12, (c) антителом 26B3, иммобилизованным на твердой подложке, и меченым антителом 19D4, и (d) антителом 9F3, иммобилизованным на твердой подложке, и меченым антителом 26B3. Например, образец может представлять собой мочу, сыворотку, плазму или асцитную жидкость.
В различных вариантах осуществления указанных выше аспектов изобретения MORAb-003 для лечения представляет собой (a) антитело, которое содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи, указанную в SEQ ID NO: 7 и аминокислотную последовательность легкой цепи, указанную в SEQ ID NO: 8; (b) антитело, которое связывает тот же эпитоп, что и антитело MORAb-003; или (c) антитело, содержащее SEQ ID NO: 1 (GFTFSGYGLS) в качестве CDRH1, SEQ ID NO: 2 (MISSGGSYTYYADSVKG) в качестве CDRH2, SEQ ID NO: 3 (HGDDPAWFAY) в качестве CDRH3, SEQ ID NO: 4 (SVSSSISSNNLH) в качестве CDRL1, SEQ ID NO: 5 (GTSNLAS) в качестве CDRL2 и SEQ ID NO: 6 (QQWSSYPYMYT) в качестве CDRL3.
Наборы по изобретению
В одном аспекте настоящее изобретение относится к набору для оценки того, страдает ли индивидуум злокачественной опухолью, экспрессирующей FRα, или для оценки прогрессирования злокачественной опухоли, экспрессирующей FRα, у индивидуума, причем набор включает средства для определения уровня рецептора фолиевой кислоты альфа (FRα), который не связан с клеткой, в образце, полученном от индивидуума; и инструкции по применению набора для оценки того, страдает ли индивидуум злокачественной опухолью, экспрессирующей FRα, или для оценки прогрессирования злокачественной опухоли, экспрессирующей FRα. Например, злокачественная опухоль, экспрессирующая FRα, выбрана из группы, состоящей из рака легкого, мезотелиомы, рака яичника, рака почки, злокачественной опухоли головного мозга, рака шейки матки, рака носоглотки, плоскоклеточной карциномы головы и шеи, рака эндометрия, рака молочной железы, рака мочевого пузыря, рака поджелудочной железы, рака кости, рака гипофиза, рака ободочной и прямой кишки и медуллярного рака щитовидной железы. В конкретном варианте осуществления злокачественная опухоль, экспрессирующая FRα, представляет собой рак яичника. В другом варианте осуществления злокачественная опухоль, экспрессирующая FRα, представляет собой немелкоклеточный рак легкого, например, аденокарциному. В следующем варианте осуществления образец представляет собой мочу, сыворотку, плазму или асцитную жидкость.
В следующем варианте осуществления средства включают агент, связывающий рецептор фолиевой кислоты альфа (FRα), например, антитело. В следующем варианте осуществления антитело выбрано из группы, состоящей из
(a) антитело, которое связывает тот же эпитоп, что и антитело MORAb-003;
(b) антитело, содержащее SEQ ID NO: 1 (GFTFSGYGLS) в качестве CDRH1, SEQ ID NO: 2 (MISSGGSYTYYADSVKG) в качестве CDRH2, SEQ ID NO: 3 (HGDDPAWFAY) в качестве CDRH3, SEQ ID NO: 4 (SVSSSISSNNLH) в качестве CDRL1, SEQ ID NO: 5 (GTSNLAS) в качестве CDRL2 и SEQ ID NO: 6 (QQWSSYPYMYT) в качестве CDRL3;
(c) антитело MOV18;
(d) антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и антитело MOV18;
(e) антитело 548908;
(f) антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и антитело 548908;
(g) антитело 6D398;
(h) антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и антитело 6D398;
(i) антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и антитело 26B3;
(j) антитело, содержащее SEQ ID NO: 55 (GYFMN) в качестве CDRH1, SEQ ID NO: 56 (RIFPYNGDTFYNQKFKG) в качестве CDRH2, SEQ ID NO: 57 (GTHYFDY) в качестве CDRH3, SEQ ID NO: 51 (RTSENIFSYLA) в качестве CDRL1, SEQ ID NO: 52 (NAKTLAE) в качестве CDRL2 и SEQ ID NO: 53 (QHHYAFPWT) в качестве CDRL3;
(k) антитело 26B3;
(l) антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и антитело 19D4;
(m) антитело, содержащее SEQ ID NO: 39 (HPYMH) в качестве CDRH1, SEQ ID NO: 40 (RIDPANGNTKYDPKFQG) в качестве CDRH2, SEQ ID NO: 41 (EEVADYTMDY) в качестве CDRH3, SEQ ID NO: 35 (RASES VDTYGNNFIH) в качестве CDRL1, SEQ ID NO: 36 (LASNLES) в качестве CDRL2 и SEQ ID NO: 37 (QQNNGDPWT) в качестве CDRL3;
(n) антитело 19D4;
(o) антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и антитело 9F3;
(p) антитело, содержащее SEQ ID NO: 31 (SGYYWN) в качестве CDRH1, SEQ ID NO: 32 (YIKSDGSNNYNPSLKN) в качестве CDRH2, SEQ ID NO: 33 (EWKAMDY) в качестве CDRH3, SEQ ID NO: 27 (RASSTVSYSYLH) в качестве CDRL1, SEQ ID NO: 28 (GTSNLAS) в качестве CDRL2 и SEQ ID NO: 29 (QQYSGYPLT) в качестве CDRL3;
(q) антитело 9F3;
(r) антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и антитело 24F12;
(s) антитело, содержащее SEQ ID NO: 47 (SYAMS) в качестве CDRH1, SEQ ID NO: 48 (EIGSGGSYTYYPDTVTG) в качестве CDRH2, SEQ ID NO: 49 (ETTAGYFDY) в качестве CDRH3, SEQ ID NO: 43 (SASQGINNFLN) в качестве CDRL1, SEQ ID NO: 44 (YTSSLHS) в качестве CDRL2 и SEQ ID NO: 45 (QHFSKLPWT) в качестве CDRL3;
(t) антитело 24F12;
(u) антитело, которое содержит вариабельную область легкой цепи, выбранную из группы, состоящей из LK26HuVK (SEQ ID NO: 13); LK26HuVKY (SEQ ID NO: 14); LK26HuVKPW (SEQ ID NO: 15); и LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16);
(v) антитело, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из LK26HuVH (SEQ ID NO: 17); LK26HuVH FAIS,N (SEQ ID NO: 18); LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19); LK26HuVH I,I (SEQ ID NO: 20); и LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21);
(w) антитело, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21) и вариабельную область легкой цепи LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16);
(x) антитело, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19) и вариабельную область легкой цепи LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16); и
(y) антитело, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи LK26HuVH FAIS,N (SEQ ID NO: 18) и вариабельную область легкой цепи LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16).
В определенных вариантах осуществления антитело является меченным, включая, но не ограничиваясь ими, радиоактивную метку, биотиновую метку, хромофорную метку, флуорофорную метку или ферментную метку.
В другом варианте осуществления набор включает средства для получения образца от индивидуума.
Настоящее изобретение далее иллюстрируется с помощью представленного ниже подробного описания и чертежей.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На фиг.1 представлено схематическое изображение способа электролюминесцентного иммуноанализа (ECLIA) для оценки FRα в моче, как описано в примерах. Антитело MOV18, связанное с твердыми подложками, связывало FRα в моче. Затем FRα выявляли путем связывания с меченным Ru антителом MORAb-003.
На фиг.2 представлено распределение уровней FRα в моче индивидуумов с раком яичника и здоровых контрольных индивидуумов при измерении способом ECLIA (см. пример 1).
На фиг.3 представлено выявление FRα в моче пациентов с раком яичника (бледная полоса на дорожке 1, отчетливая полоса на дорожке 2) с использованием иммуноблоттинга (см. пример 5).
На фиг.4 представлено распределение уровней FRα в моче индивидуумов с раком яичника и здоровых контрольных индивидуумов при измерении способом ECLIA после обработки мочи гуанидином, как описано в примере 7.
На фиг.5 представлена ROC-кривая, демонстрирующая чувствительность и специфичность измерения способом ECLIA уровней FRα в моче после обработки мочи гуанидином, как описано в примере 7. Площадь под кривой (AUC) является мерой точности испытания в отношении отделения индивидуумов с раком яичника от контрольных индивидуумов. Использовали предельную величину (выше которой результаты испытания считали аномальными) 9100 пг/мл.
На фиг.6 представлено распределение уровней FRα у индивидуумов с раком яичника (OC) и здоровых контрольных индивидуумов после поправки на уровни креатинина. Существует статистически значимое отличие между пациентами с раком яичника и контролями в уровнях FRα после поправки на креатинин (p=0,007) (см. пример 8).
На фиг.7 представлен анализа ROC уровней FRα с поправкой на креатинин, определенных с использованием электрохемилюминесцентного анализа (ECLIA) обработанных гуанидином образцов мочи (см. пример 8).
На фиг.8 представлено схематическое изображение способа ферментного иммуноанализа (EIA) для оценки уровня FRα (т.е. FRα) в образцах, как описано в примере 9. MOV-18 служил в качестве улавливающего антитела, которое связывало FRα из биологических жидкостей. FRα было выявлено по связыванию с биотинилированным MORAb-003, которое выявляли с использованием авидина, конъюгированного с пероксидазой хрена (авидин-HRP).
На фиг.9 представлены результаты, полученные для измерения FRα в сыворотке с использованием методик одностадийной и двухстадийной инкубации, как описано в примере 9.
На фиг.10 представлено схематическое изображение трех различных комбинаций улавливающих и детекторных антител, которые использовали в способе ферментного иммуноанализа (EIA) для оценки уровня FRα в плазме человека, как описано в примере 11.
На фиг.11 представлены концентрации FRα в плазме (пг/мл) для отдельных индивидуумов, определенные с использованием EIA с тремя комбинациями улавливающих и детекторных антител, как описано в примере 11.
На фиг.12 представлена взаимосвязь между величинами OD и концентрациями FRα (см. пример 11).
На фиг.13 представлено распределение концентраций FRα в плазме у индивидуумов с раком яичника и нормальных здоровых индивидуумов при определении с использованием EIA (см. пример 12).
На фиг.14 представлена корреляция между концентрациями FRα в плазме, определенными с использованием EIA и ECLIA (см. пример 12).
На фиг.15 представлена корреляция между показателями в ECLIA уровней FRα в сыворотке и моче. Корреляция для пациентов с раком легкого составила r=0,24 (верхняя панель) и корреляция для пациентов с раком яичника составила r=-0,76 (нижняя панель) (см. пример 13).
На фиг.16 представлена корреляция уровней FRα в сыворотке относительно плазмы для анализов, проведенных с использованием пары 1 (см. пример 16).
На фиг.17 представлена корреляция уровней FRα в сыворотке относительно плазмы для анализов, проведенных с использованием пары 2 (см. пример 16).
На фиг.18 представлена корреляция уровней FRα в сыворотке для анализов, проведенных с использованием пары 1 относительно пары 2 (см. пример 16).
На фиг.19 представлена корреляция уровней FRα в плазме для анализов, проведенных с использованием пары 1 относительно пары 2 (см. пример 16).
На фиг.20 представлена корреляция в течение суток уровней FRα в сыворотке для анализов, проведенных с использованием пары 2 (пример 16).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение основано, по меньшей мере частично, на неожиданном открытии, что рецептор фолиевой кислоты альфа (FRα), не связанный с клеткой, встречается на повышенных уровнях в жидкостях организма, например, моче или сыворотке, индивидуума, имеющего злокачественную опухоль, экспрессирующую FRα, такую как рак легкого или рак яичника, по сравнению с контрольным образцом. Более того, настоящее изобретение основано, по меньшей мере частично, на разработке иммунологического анализа, который проявляет требуемую чувствительность для оценки уровней FRα в образцах, в то время как предшествующие попытки сделать это неоднократно провалились. В результате настоящее изобретение относится к способам диагностики злокачественной опухоли, экспрессирующей FRα, путем оценки уровней FRα, не связанного с клеткой, в образцах, полученных от индивидуума. Действительно, настоящее изобретение преодолевает проблемы, наблюдавшиеся в ходе предшествующих попыток разработать диагностический анализ на основе FRα для злокачественных опухолей, экспрессирующих FRα, таких как рак яичника, путем предоставления иммунологического анализа, способного точно оценить уровни FRα, не связанного с клеткой, в образцах.
Таким образом, предусмотрены способы и наборы для оценки того, имеет ли индивидуум злокачественную опухоль, экспрессирующую FRα, или имеет ли индивидуум риск ее развития, и, кроме ого, для оценки прогрессирования злокачественной опухоли, экспрессирующей FRα. В различных вариантах осуществления способы вовлекают сравнение уровней FRα, не связанного с клеткой, в образцах, например, моче или сыворотке, по сравнению с контрольными уровнями, при оценке присутствия, степени или риска развития рака яичника у индивидуума. В конкретных вариантах осуществления способы вовлекают применение антитела MORAb-003, антител, которые связывают тот же эпитоп, что и антитело MORAb-003, или антител, имеющих SEQ ID NO: 1 (GFTFSGYGLS) в качестве CDRH1, SEQ ID NO: 2 (MISSGGSYTYYADSVKG) в качестве CDRH2, SEQ ID NO: 3 (HGDDPAWFAY) в качестве CDRH3, SEQ ID NO: 4 (SVSSSISSNNLH) в качестве CDRL1, SEQ ID NO: 5 (GTSNLAS) в качестве CDRL2 и SEQ ID NO: 6 (QQWSSYPYMYT) в качестве CDRL3, для оценки уровней FRα, не связавшегося с клеткой в образце, например, моче или сыворотке.
Альтернативно или дополнительно, антитело MOV18 или антитело, которое связывает тот же эпитоп, что и антитело MOV18, антитело 548908, антитело, которое связывает тот же эпитоп, что и антитело 548908, антитело 6D398 или антитело, которое связывает тот же эпитоп, что и антитело 548908, можно использовать в соответствии со способами по настоящему изобретению.
Различные аспекты изобретения описаны более подробно в представленных ниже подразделах:
I. Определения
Как используют в рамках изобретения, каждый из следующих терминов имеет значение, соответствующее ему в этом разделе.
Форму единственного числа используют для обозначения одного или более одного (т.е. по меньшей мере одного) грамматического объекта. В качестве примера, "элемент" означает один элемент или более одного элемента.
Как используют в рамках изобретения, термин "индивидуум" относится к человеку и не являющимся человеком животным, включая ветеринарных индивидуумов. Термин "не являющееся человеком животное" включает всех позвоночных, например, млекопитающих и немлекопитающих, таких как не являющиеся человеком приматы, мыши, кролики, овцы, собаки, кошки, лошади, коровы, куры, земноводные и пресмыкающиеся. В предпочтительном варианте осуществления индивидуум является человек.
Термины "злокачественная опухоль" или "опухоль" хорошо известны в данной области и относятся к наличию, например, у индивидуума, клеток, обладающих характеристиками, типичными для клеток, вызывающих злокачественную опухоль, такими как неконтролируемая пролиферация, бессмертие, метастатический потенциал, быстрый рост и скорость пролиферации, и определенные характерные морфологические признаки. Злокачественные клетки часто находятся в форме опухоли, однако такие клетки могут существовать отдельно у индивидуума, или могут быть не образующими опухоль злокачественными клетками, такими как лейкозные клетки. Как используют в рамках изобретения, термин "злокачественная опухоль" включает предзлокачественные, а также злокачественные опухоли.
Как используют в рамках изобретения, "злокачественная опухоль, экспрессирующая FRα," включает любой тип злокачественной опухоли, характеризующийся тем, что злокачественные клетки экспрессируют FRα. В конкретных вариантах осуществления экспрессирующая FRα злокачественная опухоль включает злокачественные состояния, характеризующиеся тем, что злокачественные клетки способны секретировать, сбрасывать, экспортировать или высвобождать FRα таким образом, что повышенные уровни FRα поддаются выявлению в биологическом образце индивидуума. Злокачественные опухоли, экспрессирующие FRα, включают, но не ограничиваются ими, рак легкого (например, бронхоальвеолярные карциномы, карциноидные опухоли и немелкоклеточный рак легкого, такой как аденокарциномы); мезотелиому; рак яичника; рак почки; злокачественную опухоль головного мозга (например, анапластическая эпендимома и ювенильная мозжечковая пилоцитарная астроцитома); рак шейки матки; рак носоглотки; происходящую из мезодермы опухоль; плоскоклеточную карциному головы и шеи; рак эндометрия; эндометриоидные аденокарциномы яичника, серозные цистаденокарциномы, рак молочной железы; рак мочевого пузыря; рак поджелудочной железы; рак кости (например, высокозлокачественная остеосаркома); рак гипофиза (например, аденома гипофиза). См. например, патент США № 7754698; патентную заявку США № 2005/0232919; WO 2009/132081; Bueno R et al. J of Thoracic и Cardiovascular Surgery, 121(2): 225-233 (2001); Elkanat H & Ratnam M. Frontiers in Bioscience, 11, 506-519 (2006); Franklin, WA et al. Int J Cancer, Suppl 8: 89-95 (1994); Hartman L.C. et al. Int J Cancer 121: 938-942 (2007); Iwakiri S et al. Annals of Surgical Oncology, 15(3): 889-899; Weitman, SD et al. Cancer Res 52: 3396-3401 (1992); Saba N.F. et al. Head Neck, 31(4): 475-481 (2009); Yang R et al. Clin Cancer Res 13: 2557-2567 (2007). В конкретном варианте осуществления злокачественная опухоль, экспрессирующая FRα, представляет собой рак яичника. В другом варианте осуществления злокачественная опухоль, экспрессирующая FRα, представляет собой рак легкого, такой как немелкоклеточный рак легкого. В других вариантах осуществления злокачественная опухоль, экспрессирующая FRα, представляет собой рак ободочной и прямой кишки и медуллярный рак щитовидной железы.
Как используют в рамках изобретения, индивидуум, который "страдает злокачественной опухолью, экспрессирующей FRα," представляет собой индивидуума, у которого клинически диагностирована такая злокачественная опухоль квалифицированным клиницистом (например, способами по настоящему изобретению), или индивидуума, у которого проявляется один или несколько признаков или симптомов (например, повышенные уровни FRα в биологических жидкостях) такой злокачественной опухоли, а впоследствии клинически диагностирована такая злокачественная опухоль квалифицированным клиницистом (например, способами по настоящему изобретению). Также в объем термина индивидуум "страдающий злокачественной опухолью, экспрессирующей FRα" входит не являющийся человеком индивидуум, который служит в качестве модели на животных для злокачественной опухоли, экспрессирующей FRα.
Термин "рак яичника" относится к известному в данной области заболеванию и включает каждый эпителиальный рак яичника (EOC; >90% случаев рака яичника в западных странах), герминомы (приблизительно 2-3% рака яичника) и стромальный рак яичника. Рак яичника подразделяют на различные группы на основе дифференцировки опухолевой ткани. В случае степени I опухолевая ткань высоко дифференцирована. В случае степени II опухолевая ткань умеренно дифференцирована. В случае степени III опухолевая ткань является низко дифференцированной. Эта степень коррелирует с менее благоприятным прогнозом, чем степени I и II.
Рак яичника подразделяют на различные стадии на основе распределения злокачественной опухоли. Стадия I, как правило, ограничена капсулой, окружающей один (стадия IA) или оба (стадия IB) яичника, хотя при некоторых злокачественных опухолях стадии I (т.е. стадия IC), злокачественные клетки могут выявляться в асцитной жидкости, в жидкости перитонеального смыва, или на поверхности яичников. Стадия II вовлекает распространение или метастазирование опухоли из одного или обоих яичников в другие структуры таза. На стадии IIA опухоль распространяется или метастазирует в матку, фаллопиевы трубы или и в матку, и в фаллопиевы трубы. Стадия IIB вовлекает распространение опухоли в таз. Стадия IIC представляет собой стадию IIA или IIB, при которой злокачественные клетки могут выявляться в асцитной жидкости, в жидкости перитонеального смыва или на поверхности яичников. На стадии III опухоль имеет по меньшей мере одно злокачественное распространение в тонкий кишечник или сальник, образует внетазовые перитониальные имплантаты микроскопического (стадия IIIA) или макроскопического (диаметр < 2 сантиметров, стадия IIIB; диаметр > 2 сантиметров, стадия IIIC), или метастазирует в ретроперитонеальный или паховый лимфатический узел (альтернативный признак стадии IIIC). На стадии IV могут выявляться отдаленные (т.е. неперитонеальные) метастазы опухоли.
Длительность различных стадий рака яичника в настоящее время неизвестна, однако полагают, что каждая из них составляет по меньшей мере приблизительно год (Richart et al., 1969, Am. J. Obstet. Gynecol. 105:386). Прогноз ухудшается при увеличении номера стадии. Например, показатели 5-летней выживаемости для людей, у которых диагностирован рак яичника стадии I, II, III и IV, составляют 80%, 57%, 25% и 8%, соответственно.
Каждый из указанных выше типов, групп и стадий рака яичника охватываются термином "рак яичника", как используют в рамках изобретения.
Как используют в рамках изобретения, термин "рак легкого" относится к заболеванию в тканях легкого, вовлекающему неконтролируемый рост клеток, который, в некоторых случаях, приводит к метастазам. Рак легкого является наиболее распространенной причиной обусловленной злокачественной опухолью смерти у мужчин и индивидуумов. Большинство случаев первичного рака легкого представляют собой карциномы легкого, происходящие из эпителиальных клеток. Основными типами рака легкого являются мелкоклеточная карцинома легкого (SCLC) и немелкоклеточная карцинома легкого (NSCLC). В конкретном варианте осуществления злокачественная опухоль, экспрессирующая FRα, представляет собой немелкоклеточный рак легкого.
Мелкоклеточный рак легкого или мелкоклеточная карцинома легкого (SCLC) представляет собой злокачественную опухоль легкого, где злокачественные клетки имеют плоскую форму и скудную цитоплазму; таким образом, SCLC иногда называют "овсяно-клеточной карциномой". SCLC, как правило, в большей степени метастазирует, чем NSCLC и иногда выявляется в комбинации с плоскоклеточным раком.
Как используют в рамках изобретения, термин "немелкоклеточный рак легкого", также известный как немелкоклеточная карцинома легкого (NSCLC), относится к эпителиальному раку легкого, отличному от мелкоклеточной карциномы легкого (SCLC). Существует три главных подтипа: аденокарцинома, плоскоклеточная карцинома легкого и крупноклеточная карцинома легкого. Другие менее распространенные типы немелкоклеточного рака легкого включают плейоморфную карциноидную опухоль, карциному слюнной железы и неклассифицируемую карциному. Аденокарциномы составляют приблизительно 40% случаев рака легкого, и являются наиболее распространенным типом рака легкого у людей, которые никогда не курили. Плоскоклеточный рак составляет приблизительно 25% случаев рака легкого. Плоскоклеточная карцинома легкого является более распространенной у мужчин, чем у индивидуумов, и даже более высоко коррелирует с анамнезом курения табака, чем другие типы карциномы легкого. Существует по меньшей мере четыре варианта (папиллярная, мелкоклеточная, светлоклеточная и базалоидная) плоскоклеточной карциномы легкого. Крупноклеточные карциномы легкого представляют собой гетерогенную группу злокачественных новообразований, происходящих из трансформированных эпителиальных клеток в легком. Крупноклеточные карциномы легкого представляют собой карциномы, которые лишены выявляемых с помощью световой микроскопии характеристик мелкоклеточной карциномы, плоскоклеточной карциномы или аденокарциномы.
Для SCLC и NSCLC используют различные системы присвоения стадий. SCLC относят к категории ограниченного заболевания, заключенного в пределах ипсилатеральной половины грудной клетки, или к категории распространенного заболевания с метастазами за пределами ипсилатеральной половины грудной клетки.
NSCLC может быть подразделен на категории с использованием системы присвоения стадий опухоль-узлы-метастазы (TNM). См. Spira J & Ettinger, D.S. Multidisciplinary management of lung cancer, N Engl J Med, 350:382- (2004) (далее Spira); Greene FL, Page DL, Fleming ID, Fritz AG, Balch CM, Haller DG, et al (eds). AJCC Cancer Staging Manual. 6th edition. New York: Springer-Verlag, 2002: 167-77 (далее Greene); Sobin LH, Wittekind CH (eds). International Union Against Cancer. TNM classification of malignant tumours. 6th edition. New York: Wiley-Liss (2002) (далее Sobin). Кроме того, NSCLC, как правило, лечат в соответствии со стадией злокачественной опухоли, определенной по следующей схеме классификации (см. http://www.cancer.gov/cancertopics/pdq/treatment/non-small-cell-lung/Patient/page2#Keypoint10).
На латентной (скрытой) стадии, злокачественные клетки выявляются в мокроте (слизь, откашливаемая из легких), однако при визуализации или бронхоскопии опухоль не выявляется, или опухоль является слишком маленькой, чтобы ее отследить.
in situ
in situ
На стадии 0 (карцинома ) аномальные клетки встречаются на выстилке дыхательных путей. Эти аномальные клетки могут стать злокачественными и распространиться в близлежащие нормальные ткани. Стадию 0 также называют карциномой .
Стадию I, на которой опухоль сформировалась, подразделяют на стадии IA и IB.
На стадии IA, опухоль расположена только в легком и составляет 3 сантиметра или менее.
На стадии IB злокачественная опухоль не распространяется в лимфатические узлы и справедливо одно или несколько из следующих: (i) опухоль больше 3 сантиметров, но меньше 5 сантиметров; (ii) злокачественная опухоль распространяется в главный бронх и находится по меньшей мере на 2 сантиметра ниже места, где трахея соединяется с бронхами; (iii) злокачественная опухоль распространяется на самый внутренний слой оболочки, которая покрывает легкое; (iv) часть легкого спалась или развился пневмонит (воспаление легкого) в области, где трахея соединяется с бронхом.
На стадии IIA злокачественная опухоль распространяется в определенные лимфатические узлы на той же стороне грудной клетки, что и первичная опухоль; опухоль (a) составляет 5 см или менее, (b) распространяется в главный бронх, и/или (c) распространяется в самый внутренний слой выстилки легких. В ином случае, злокачественная опухоль не распространяется в лимфатические узлы; злокачественная опухоль (d) составляет более 5 см, но не более 7 см, (e) распространяется в главный бронх, и/или (f) распространяется в самый внутренний слой выстилки легкого. Часть легкого может быть спавшейся или воспалиться. Стадию IIA подразделяют на две группы, в зависимости от размера опухоли, места расположения опухоли и наличия злокачественной опухоли в лимфатических узлах. В первой группе злокачественная опухоль распространяется в лимфатические узлы на той же стороне грудной клетки, что и опухоль. Лимфатические узлы со злокачественной опухолью располагаются в легком или вблизи бронхов. Также справедливо одно или несколько из следующих: (i) опухоль не больше 5 сантиметров, (ii) злокачественная опухоль распространяется в главный бронх и располагается по меньшей мере на 2 сантиметра ниже места, где трахея соединяется с бронхами, (iii) злокачественная опухоль распространяется на самый внутренний слой оболочки, которая покрывает легкое, (iv) часть легкого спалась или развился пневмонит (воспаление легкого) в области, где трахея соединяется с бронхами. Во второй группе злокачественная опухоль не распространяется в лимфатические узлы и является справедливым одно или несколько из следующих: (i) опухоль больше 5 сантиметров, но не больше 7 сантиметров, (ii) злокачественная опухоль распространяется в главный бронх и располагается по меньшей мере на 2 сантиметра ниже места, где трахея соединяется с бронхом, (iii) злокачественная опухоль распространяется на самый внутренний слой оболочки, которая покрывает легкое, (iv) часть легкого спалась или развился пневмонит (воспаление легкого) в области, где трахея соединяется с бронхами.
На стадии IIB злокачественная опухоль распространяется в определенные лимфатические узлы на той же стороне грудной клетки, что и первичная опухоль; злокачественная опухоль (a) составляет больше 5 см, но меньше 7 см, (b) распространяется в главный бронх, и/или (c) распространяется в самый внутренний слой выстилки легкого. Часть легкого может быть спавшейся или воспалиться. Альтернативно (d) злокачественная опухоль составляет более 7 см; (e) распространяется в главный бронх, (f) диафрагму, (g) грудную стенку или выстилку грудной стенки; и/или (h) распространяется в оболочку сердца. Может быть одна или несколько отдельных опухолей в одной доле легкого; злокачественная опухоль может распространяться на нерв, который контролирует диафрагму; целое легкое может быть спавшимся или воспаленным. Стадию IIB подразделяют на две группы, в зависимости от размера опухоли, места расположения опухоли и наличия злокачественной опухоли в лимфатических узлах. В первой группе злокачественная опухоль распространяется в близлежащие лимфатические узлы на той же стороне грудной клетки, что и опухоль. Лимфатические узлы со злокачественной опухолью находятся в легком или вблизи бронхов. Также справедливо одно или несколько из следующих: (i) опухоль составляет более 5 сантиметров, но не более 7 сантиметров, (ii) злокачественная опухоль распространяется в главный бронх и находится по меньшей мере на 2 сантиметра ниже места, где трахея соединяется с бронхом, (iii) злокачественная опухоль распространяется на самый внутренний слой оболочки, которая покрывает легкое, (iv) часть легкого спалась или развился пневмонит (воспаление легкого) в области, где трахея соединяется с бронхами. Во второй группе злокачественная опухоль не распространяется в лимфатические узлы, и справедливо одно или несколько из следующих: (i) опухоль превышает 7 сантиметров, (ii) злокачественная опухоль распространяется в главный бронх (и находится менее чем на 2 сантиметра ниже, где трахея соединяется с бронхом), грудную стенку, диафрагму или нерв, который контролирует диафрагму, (iii) злокачественная опухоль распространяется на оболочку сердца или выстилку грудной клетки, (iv) целое легкое спалось или развился пневмонит (воспаление легкого), (v) имеется одна или несколько отдельных опухолей в одной и той же доле легкого.
Стадию IIIA подразделяют на три группы, в зависимости от размера опухоли, места расположения опухоли и того, какие лимфатические узлы имеют злокачественную опухоль (если имеют). В первой группе стадии IIIA, злокачественная опухоль распространяется в лимфатические узлы на той же стороне грудной клетки, что и опухоль. Лимфатические узлы со злокачественной опухолью расположены вблизи грудины (грудная кость) или места, где бронх входит в легкое. Также опухоль может быть любого размера; часть легкого (где трахея соединяется с бронхом) или все легкое могут быть спавшимися или в них развивается пневмонит (воспаление легкого); может быть одна или несколько отдельных опухолей в одной и той же доле легкого; и злокачественная опухоль может распространяться в любое из следующих: (i) главный бронх, но не в область, где трахея соединяется с бронхом, (ii) грудная стенка, (iii) диафрагма и нерв, который ее контролирует, (iv) оболочка легкого или выстилка грудной стенки, (iv) оболочка сердца. Во второй группе стадии IIIA, злокачественная опухоль распространяется в лимфатические узлы на той же стороне грудной клетки, что и опухоль. Лимфатические узлы со злокачественной опухолью располагаются в легком или вблизи бронхов. Также опухоль может быть любого размера; все легкое может быть спавшимся или может развиться пневмонит (воспаление легкого); может быть одна или несколько опухолей в любой из долей легкого со злокачественной опухолью; и злокачественная опухоль может распространяться в любое из следующих: (i) главный бронх, но не в область, где трахея соединяется с бронхом, (ii) грудная стенка, (iii) диафрагма и нерв, который ее контролирует, (iv) оболочка легкого или выстилка грудной стенки, (v) сердце или его оболочка, (vi) главные кровеносные сосуды, которые идут к сердцу или от сердца, (vi) трахея, (vii) пищевод, (viii) нерв, который контролирует гортань (голосовой аппарат), (ix) грудина (грудная кость) или позвоночник, (x) киль (где трахея соединяется с бронхами). В третьей группе стадии IIIA, злокачественная опухоль не распространяется в лимфатические узлы и опухоль может быть любого размера и злокачественная опухоль распространяется в любое из следующих: (i) сердце, (ii) главные кровеносные сосуды, которые идут к сердцу или от сердца, (iii) трахея, (iv) пищевод, (v) нерв, который контролирует гортань (голосовой аппарат), (vi) грудина (грудная кость) или позвоночник, (vi) киль (где трахея соединяется с бронхами).
Стадию IIIB подразделяют на две группы, в зависимости от размера опухоли, места расположения опухоли и того, какие лимфатические узлы имеют злокачественную опухоль. В первой группе злокачественная опухоль распространяется в лимфатические узлы выше ключицы или в лимфатические узлы на противоположной стороне грудной клетки относительно опухоли; опухоль может иметь любой размер; часть легкого (где трахея соединяется с бронхом) или целое легкое могут быть спавшимися или в них развивается пневмонит (воспаление легкого); может быть одна или несколько отдельных опухолей в любой из долей легкого со злокачественной опухолью; и злокачественная опухоль может распространяться на любое из следующих: (i) главный бронх, (ii) грудная стенка, (iii) диафрагма и нерв, который ее контролирует, (iv) оболочка легкого или выстилка грудной стенки, (iv) сердце или его оболочка, (v) главные кровеносные сосуды, которые идут к сердцу или от сердца, (vi) трахея, (vii) пищевод, (viii) нерв, который контролирует глотку (голосовой аппарат), (ix) грудина (грудная кость) или позвоночник, (x) киль (где трахея соединяется с бронхами). Во второй группе стадии IIIB, злокачественная опухоль распространяется в лимфатические узлы на той же стороне грудной клетки, что и опухоль; лимфатические узлы со злокачественной опухолью располагаются вблизи грудины (грудная клетка) или где бронх входит в легкое; опухоль может иметь любой размер; могут быть отдельные опухоли в различных долях одного легкого; и злокачественная опухоль может распространяться в любое из следующих: (i) сердце, (ii) главные кровеносные сосуды, которые идут к сердцу или от сердца, (iii) трахея, (iv) пищевод, (v) нерв, который контролирует глотку (голосовой аппарат), (vi) грудина (грудная кость) или позвоночник, (vii) киль (где трахея соединяется с бронхами).
На стадии IV опухоль может иметь любой размер и злокачественная опухоль распространяется в лимфатические узлы. Справедливо одно или несколько из следующих: имеется одна или несколько опухолей в обоих легких; злокачественная опухоль встречается в жидкости вокруг легких или сердца; злокачественная опухоль распространяется на другие части тела, такие как головной мозг, печень, надпочечники, почки или кость.
Таким образом, в различных вариантах осуществления вышеуказанного изобретения, рак легкого может быть отнесен к любой из предшествующих стадий (например, скрытая, стадия 0, стадия IA, стадия IB, стадия IIA, стадия IIB, стадия IIIA, стадия IIIB или стадия IV), исходя из оценки уровней FRα, не связанного с клеткой, такими как нормальная или злокачественная клетка, в образце (например, моча или сыворотка) индивидуума.
Как используют в рамках изобретения, термин "рецептор фолиевой кислоты альфа" (также обозначаемый как FRα, FR-альфа, FOLR-1 или FOLR1) относится к альфа-изоформе высокоаффинного рецептора для фолатов. Связанный с мембраной FRα связан с клеточной поверхностью с помощью якоря -гликозилфосфатидилинозитола (GPI)), рециркулирует между внеклеточным и эндоцитарным компартментами и способен транспортировать фолаты в клетку. FRα экспрессируется в различных эпителиальных тканях, включая ткани женских половых путей, плаценты, молочной железы, проксимальные канальцы почек, хориоидное сплетение, легкое и слюнные железы. Растворимые формы FRα могут образовываться при действии протеаз или фосфолипаз на заякоренные на мембране рецепторы фолиевой кислоты.
Консенсусные нуклеотидные и аминокислотные последовательности FRα человека указаны в качестве SEQ ID NO: 24 и 25, соответственно. Термины, используемые в рамках изобретения, охватывают варианты, например, встречающиеся в природе аллельные варианты или последовательности, содержащие по меньшей мере одну аминокислотную замену.
Как используют в рамках изобретения, термин "не связанный с клеткой" относится к FRα, который не связан с клеточной мембраной клетки, такой как злокачественная клетка. В конкретном варианте осуществления FRα, не связанный с клеткой, не связан ни с какой клеткой и свободно перемещается или растворен в биологических жидкостях, например, моче или сыворотке. Например, FRα может сбрасываться, секретироваться или экспортироваться нормальными или злокачественными клетками, например, с поверхности злокачественных клеток, в биологические жидкости.
"Уровень" рецептора фолиевой кислоты альфа, не связанного с клеткой, как используют в рамках изобретения, относится к уровню белка рецептора фолиевой кислоты альфа, как определяют с использованием любого способа, известного в данной области для измерения уровней белка. Такие способы включают, например, электрофорез, капиллярный электрофорез, высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ), тонкослойную хроматографию (TLC), гипердиффузионную хроматографию, реакции преципитации в жидкости или геле, абсорбционную спектроскопию, колориметрические анализы, спектрофотометричские анализы, проточную цитометрию, иммунодиффузию (одинарную или двойную), анализ в жидкой фазе, иммуноэлектрофорез, вестер-блоттинг, радиоиммунный анализ (RIA), твердофазные иммуноферментные анализы (ELISAs), иммунофлуоресцентные анализы и электрохемилюминесцентный иммуноанализ (проиллюстрированный ниже) и т.п. В предпочтительном варианте осуществления уровень определяют с использованием способов на основе антител, как более подробно описано в настоящем описании.
Как правило, предпочтительно иммобилизовывать либо антитело, либо связывающий белок, специфичный к FRα, не связанному с клеткой, на твердой подложке для вестерн-блоттинга и способов иммунофлуоресценции. подходящие твердофазные подложки или носители включают любую подложку, способную связывать антиген или антитело. Хорошо известные подложки или носители включают стекло, полистирол, полипропилен, полиэтилен, декстран, нейлон, амилазы, природные и модифицированные целлюлозы, полиакриламиды, габбро и магнетит.
Специалисту в данной области известно множество других подходящих носителей для связывания антитела или антигена, и он способен адаптировать такую подложку для применения с настоящим изобретением. Например, белок, выделенный из образца от индивидуума (например, мочи или сыворотки), можно разделять на полиакриламидном гель-электрофорезе и иммобилизовывать на твердофазной подложке, такой как нитроцеллюлоза. Затем подложку можно промывать подходящими буферами с последующей обработкой меченым антителом. Затем твердофазную подложку можно промывать буфером второй раз для удаления не связавшегося антитела. Затем количество связавшейся метки на твердой подложке можно выявлять общепринятыми способами. Способы выявления белков с использованием технологий электрофореза хорошо известны специалистам в данной области (см., главным образом, R. Scopes (1982) Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y.; Deutscher, (1990) Methods in Enzymology Vol. 182: Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc., N.Y.).
Другие стандартные способы включают способы иммуноанализа, которые хорошо известны специалисту в данной области и могут быть найдены в Principles And Practice Of Immunoassay, 2nd Edition, Price и Newman, eds., MacMillan (1997) и Antibodies, A Laboratory Manual, Harlow and Lane, eds., Cold Spring Harbor Laboratory, Ch. 9 (1988), каждый из которых включен в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
Антитела, используемые в иммуноанализах для определения уровня экспрессии рецептора фолиевой кислоты альфа, могут быть меченными поддающейся детекции меткой. Термин "меченый" в отношении связывающего агента или антитела, охватывает прямое мечение связывающего агента или антитела путем присоединения (т.е. физического связывания) поддающегося детекции вещества со связывающим агентом или антителом, а также непрямое мечение связывающегося агента или антитела посредством реакционной способности с другим реагентом, который является прямо меченным. Пример непрямого мечения включает детекцию первичного антитела с использованием меченного флуоресцентной меткой вторичного антитела. В одном варианте осуществления антитело является меченным, например, радиоактивно меченным, меченным хромофором, меченным флуорофором или меченным ферментом. В другом варианте осуществления антитело представляет собой производное антитела (например, антитело, конъюгированное с субстратом или с белком или лигандом пары белок-лиганд (например, биотин-стрептавидин)), или фрагмент антитела (например, одноцепочечное антитело, выделенный гипервариабельный домен антитела), который специфично связывается с FRα, не связанным с клеткой.
В одном варианте осуществления изобретения используют протеомные способы, например, масс-спектрометрию. Масс-спектрометрия представляет собой аналитическую технологию, которая состоит в ионизации химических соединений для образования заряженных молекул (или их фрагментов) и измерении их отношений массы к заряду. В типичной методике масс-спектрометрии получают образец от индивидуума, помещают в масс-спектрометр, и его компоненты (например, FRα) ионизируют различными способами (например, воздействием на них электронным пучком), что приводит к образованию заряженных частиц (ионов). Затем вычисляют отношение массы к заряду частиц из движения ионов, по мере того, как они проходят через электромагнитные поля.
Например, для определения уровня FRα можно использовать времяпролетную масс-спектрометрию с лазерной десорбцией и ионизацией из жидкой матрицы масс (MALDI-TOF MS) или времяпролетную масс-спектрометрию с лазерной десорбцией и ионизацией с усиленной поверхностью (SELDI-TOF MS), которая вовлекает нанесение образца, такого как моча или сыворотка, на связывающий белок чип (Wright, G.L., Jr., et al. (2002) Expert Rev Mol Diagn 2:549; Li, J., et al. (2002) Clin Chem 48: 1296; Laronga, C, et al. (2003) Dis Markers 19:229; Petricoin, E.F., et al. (2002) 359:572; Adam, B.L., et al. (2002) Cancer Res 62:3609; Tolson, J., et al. (2004) Lab Invest 84:845; Xiao, Z., et al. (2001) Cancer Res 61:6029).
in vivo
Более того, способы определения  уровня FRα, не связанного с клеткой, включают введение индивидууму меченого антитела, направленного против FRα, которое связывается с FRα и преобразует его в поддающуюся детекции молекулу. Присутствие, уровень или положение поддающегося детекции FRα, не связанного с клеткой, у индивидуума можно определять с использованием стандартных способов визуализации.
Термин "образец", как используют в рамках изобретения, относится к коллекции сходных жидкостей, клеток или тканей, выделенных от индивидуума, а также жидкостей, клеток или тканей, присутствующих у индивидуума. В предпочтительных вариантах осуществления образец представляет собой биологическую жидкость, содержащую FRα, не связанный со злокачественной клеткой. Биологические жидкости, как правило, представляют собой жидкости при физиологических температурах и могут включать встречающиеся в природе жидкости, присутствующие в, взятые из, экспрессированные или иным образом экстрагированные из индивидуума или биологического источника. Определенные биологические жидкости происходят из конкретных тканей, органов или локализованных областей, и некоторые другие биологические жидкости могут более широко или системно располагаться в индивидууме или биологическом источнике.
Примеры биологических жидкостей включают кровь, сыворотку и серозные жидкости, плазму, лимфу, мочу, цереброспинальную жидкость, слюну, внутриглазную жидкость, жидкость кисты, слезу, фекалии, мокроту, слизистые секреты секреторных тканей и органов, вагинальные секреты, гинекологические жидкости, асцитные жидкости, такие как жидкости, ассоциированные с несолидными опухолями, жидкости плевральной, перикардиальной, перитонеальной, абдоминальной и других полостей организма, жидкости, взятые с помощью бронхиального лаважа и т.п. В конкретном варианте осуществления образец представляет собой мочу или сыворотку. В другом варианте осуществления образец не включает асцитную жидкость или не является образцом асцитной жидкости. В другом варианте осуществления образец не включает перитонеальную жидкость или не является перитонеальной жидкостью.
В одном варианте осуществления образец извлекают из индивидуума. В другом варианте осуществления образец находится в индивидууме. Биологические жидкости также могут включать жидкие растворы, приведенные в контакт с индивидуумом или биологическим источником, например, средой для культивирования клеток и органов, включающей среду, кондиционированную клетками или органом, жидкость лаважа и т.п.
В некоторых вариантах осуществления только часть образца подвергают анализу для определения уровня FRα, не связанного с клеткой, или различные части образца подвергают различным анализам для определения уровня FRα, не связанного с клеткой. Также во многих вариантах осуществления образец можно предварительно обрабатывать с помощью физических или химических средств перед анализом. Например, в вариантах осуществления, более подробно рассмотренных в разделе “Примеры”, образцы, например, образцы мочи, подвергали центрифугированию, разведению и/или обработке солюбилизирующим веществом (например, обработке гуанидином) перед оценкой образцов на FRα, не связанный с клеткой. Такие способы служат для повышения точности, надежности и воспроизводимости анализов по настоящему изобретению.
Термин "контрольный образец", как используют в рамках изобретения, относится к любому клинически значимому контрольному образцу, включая, например, образец от здорового индивидуума, не страдающего раком яичника, образец от индивидуума, имеющего менее тяжелый или медленнее прогрессирующий рак яичника, чем оцениваемый индивидуум, образец от индивидуума, имеющего некоторый другой тип злокачественной опухоли или заболевания, и т.п. Контрольный образец может включать образец, полученный от одного или нескольких индивидуумов. Контрольный образец также может представлять собой образец, полученный ранее от индивидуума, подвергаемого оценке. Например, контрольный образец может представлять собой образец, взятый от индивидуума, подвергаемого оценке, до возникновения злокачественной опухоли, экспрессирующей FRα, такой как рак легкого или рак яичника, на более ранней стадии заболевания, или до проведения лечения или части лечения. Контрольный образец также может представлять собой образец, полученный из модели на животных для злокачественной опухоли, экспрессирующей FRα, такой как рак легкого или рак яичника, или из ткани или клеточных линий, полученных из модели на животных для злокачественной опухоли, экспрессирующей FRα, такой как рак легкого или рак яичника. Уровень FRα, не связанного с клеткой, в контрольном образце, который состоит из группы показателей, можно определять, исходя из соответствующего статистического показателя, например, такого как показатели, характеризующие положение центра распределения, включая среднее значение, медиану или модальные величины.
Термин "контрольный уровень" относится к принятому или предварительно определенному уровню FRα, который используют для сравнения с уровнем FRα в образце, полученном от индивидуума. В одном варианте осуществления контрольный уровень FRα основан на уровне FRα, не связанного с клеткой, в образце(ах) от субъекта(ов), имеющего медленное прогрессирование заболевания. В другом варианте осуществления контрольный уровень FRα, не связанного с клеткой, основан на уровне в образце от индивидуума(ов), имеющего быстрое прогрессирование заболевания. В другом варианте осуществления контрольный уровень FRα основан на уровне FRα, не связанного с клеткой, в образце(ах) от не страдающего, т.е. не имеющего заболевания, индивидуума(ов), т.е. индивидуума, который не имеет злокачественной опухоли, экспрессирующей FRα, такой как рак легкого или рак яичника. В другом варианте осуществления контрольный уровень FRα основан на уровне FRα, не связанного с клеткой. в образце от индивидуума(ов) перед проведением терапии от рака яичника. В другом варианте осуществления контрольный уровень FRα основан на уровне FRα, не связанного с клеткой, в образце(ах) от индивидуума(ов), имеющего злокачественную опухоль, экспрессирующую FRα, такую как рак легкого или рак яичника, который не приводят в контакт с исследуемым соединением. В другом варианте осуществления контрольный уровень FRα основан на уровне FRα, не связанного с клеткой, в образце(ах) от индивидуума(ов), не имеющего злокачественную опухоль, экспрессирующую FRα, такую как рак легкого или рак яичника, который приводят в контакт с исследуемым соединением. В одном варианте осуществления контрольный уровень FRα основан на уровне FRα, не связанного с клеткой, в образце(ах), полученном из модели на животных для злокачественной опухоли, экспрессирующей FRα, такой как рак легкого или рак яичника, клетке или клеточной линии, полученной из модели на животных для злокачественной опухоли, экспрессирующей FRα, такой как рак легкого или рак яичника.
В одном варианте осуществления контроль представляет собой стандартизованный контроль, например, такой как контроль, который заранее установлен с использованием среднего значения уровней FRα, не связанного с клеткой, в популяции индивидуумов, не имеющих злокачественной опухоли, экспрессирующей FRα, такой как рак легкого или рак яичника. В других вариантах осуществления изобретения контрольный уровень FRα основан на уровне FRα, не связанного с клеткой, в не являющемся злокачественным образце(ах), полученном от индивидуума, имеющего злокачественную опухоль, экспрессирующую FRα, такую как рак легкого или рак яичника. Например, когда лапаротомия или другая медицинская процедура выявляет присутствие рака яичника в одной части яичников, контрольный уровень FRα можно определять с использованием не пораженной части яичников, и этот контрольный уровень можно сравнивать с уровнем FRα в пораженной части яичников. Аналогично, когда биопсия или другая медицинская процедура выявляет присутствие рака легкого в одной части легких, контрольный уровень FRα можно определять с использованием непораженной части легких, и этот контрольный уровень можно сравнивать с уровнем FRα в пораженной части легких.
Как используют в рамках изобретения, "различие" между уровнем рецептора фолиевой кислоты альфа, не связанного с клеткой, в образце от индивидуума (т.е. исследуемом образце) и уровнем рецептора фолиевой кислоты альфа, не связанного с клеткой, в контрольном образце, относится, в общем, любому клинически значимому и/или статистически значимому различию уровней рецептора фолиевой кислоты альфа в двух образцах. В иллюстративном варианте осуществления различие выбирают, исходя из предельной величины, определенной с использованием анализа зависимости чувствительности от частоты ложно положительных заключений (ROC), пример которого представлен в примере 6.
В других вариантах осуществления различие может превышать пределы выявления способа определения уровня FRα, не связанного с клеткой. Предпочтительно, чтобы различие превышало по меньшей мере стандартную ошибку способа оценки, и предпочтительно различие по меньшей мере приблизительно в 2, приблизительно в 3, приблизительно в 4, приблизительно в 5, приблизительно в 6, приблизительно в 7, приблизительно в 8, приблизительно в 9, приблизительно в 10, приблизительно в 15, приблизительно в 20, приблизительно в 25, приблизительно в 100, приблизительно в 500, приблизительно в 1000 раз или более превышает стандартную ошибку способа оценки. Различие можно оценивать путем подходящего сравнения, включая любую подходящую параметрическую или непараметрическую статистику или сравнение. Например, "увеличение" уровня FRα, не связанного с клеткой, может относиться к уровне в исследуемом образце, который приблизительно в два, и более предпочтительно приблизительно в три, приблизительно в четыре, приблизительно в пять, приблизительно в шесть, приблизительно в семь, приблизительно в восемь, приблизительно в девять, приблизительно в десять или более раз превышает уровень FRα в контрольном образце. Увеличение также может относиться к уровню в исследуемом образце, который предпочтительно по меньшей мере приблизительно в 1,5, и более предпочтительно приблизительно на два, приблизительно на три, приблизительно на четыре, приблизительно на пять или более стандартных отклонений превышает стандартный уровень FRα в контрольном образце.
Аналогично, "снижение" уровня FRα, не связанного с клеткой, может относиться к уровню в исследуемом образце, который предпочтительно по меньшей мере приблизительно в два, и более предпочтительно приблизительно в три, приблизительно в четыре, приблизительно в пять, приблизительно в шесть, приблизительно в семь, приблизительно в восемь, приблизительно в девять, приблизительно в десять или более раз меньше, чем уровень FRα в контрольном образце. Снижение также может относиться к уровню в исследуемом образце, который предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 1,5, и более предпочтительно приблизительно на два, приблизительно на три, приблизительно на четыре, приблизительно на пять или более стандартных отклонений ниже среднего уровня FRα в контрольном образце.
Как используют в рамках изобретения, термин "приведение образца в контакт" со связывающим FRα агентом, например, антителом против FRα, включает воздействие на образец или любую его часть агента или антитела, так чтобы по меньшей мере часть образца приходила в контакт с агентом или антителом. Образец или его часть можно изменять некоторым образом, например, подвергая его физической или химической обработке (например, разведение или обработка гуанидином), перед приведением его в контакт с агентом или антителом.
2
Термин "антитело", как используют в рамках изобретения, включает четыре полипептидных цепи: две тяжелых (H) цепи и две легких (L) цепи, соединенных друг с другом дисульфидными связями, а также их функциональный (т.е. антигенсвязывающий) фрагмент, мутант, вариант или производное, которые сохраняют основные признаки связывания эпитопа в молекуле Ig. Такие форматы антитела, как мутант, вариант или производное, известны в данной области, и включают молекулы, такие как Fab-фрагменты, Fab'-фрагменты, F(ab')-фрагменты, Fd-фрагменты, Fabc-фрагменты, Sc-антитела (одноцепочечные антитела), диантитела, отдельные легкие цепи антител, отдельные тяжелые цепи антител, химерные слитые конструкции из цепей антител и т.п. Молекулы иммуноглобулинов могут быть любого типа (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY), класса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или подкласса.
Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (сокращенно обозначаемой в настоящем описании как HCVR или VH) и константной области тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов: CH1, CH2 и CH3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (сокращенно обозначаемой в настоящем описании как LCVR или VL) и константной области легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена CL. VH- и VL-области могут быть далее подразделены на области гипервариабельности, называемые определяющими комплементарность областями (CDR), между которыми встроены области, которые являются более консервативными, называемые каркасными областями (FR). Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от N-конца к С-концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Легкие цепи классифицируют либо как каппа, либо как лямбда. Тяжелые цепи классифицируют как гамма, мю, альфа, дельта или эпсилон, и они определяют изотип антитела как IgG, IgM, IgA, IgD и IgE, соответственно.
Вариабельные области тяжелой и легкой цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями хозяина или факторами, включающими различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент (C1q) классической системы комплемента.
L
H
Термин "антигенсвязывающая часть" антитела, как используют в рамках изобретения, относится к одному или нескольким фрагментам антитела, которые сохраняют способность специфично связываться с антигеном (например, FRα, не связанным с клеткой). Было показано, что функцию антитела, состоящую в связывании антигена, могут выполнять фрагменты полноразмерного антитела. Примеры связывающих фрагментов, охватываемых термином "антигенсвязывающая часть" антитела, включают (i) Fab-фрагмент, одновалентный фрагмент состоящий из VL-, VH-, CL- и CH1-доменов; (ii) F(ab')2-фрагмент, двухвалентный фрагмент, содержащий два Fab-фрагмента, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) Fd-фрагмент, состоящий из VH- и CH1-доменов; (iv) Fv-фрагмент, состоящий из VL- и VH-доменов одного плеча антитела, (v) dAb, включающий VH- и VL-домены; (vi) dAb-фрагмент (Ward et al. (1989) Nature 341, 544-546), который состоит из VH-домена; (vii) dAb-который состоит из VH- или VL-домена; и (viii) выделенная определяющая комплементарность область (CDR) или (ix) комбинация двух или более выделенных CDR, которые необязательно могут быть связаны синтетическим линкером. Более того, хотя два домена Fv-фрагмента, VL и VH, кодируются отдельными генами, они могут быть соединены с использованием рекомбинантных способов с помощью синтетического линкера, который позволяет получение их в качестве единой белковой цепи, в которой V и V-области образуют пары, формируя одновалентные молекулы (известные как одноцепочечный Fv (scFv); см. например, Bird et al. (1988) Science 242, 423-426; и Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5879-5883). Такие одноцепочечные антитела также охватываются термином "антигенсвязывающая часть" антитела. Эти фрагменты антител получают с использованием общепринятых способов, известных специалистам в данной области, и фрагменты подвергают скринингу в отношении применимости аналогично тому, как и целые антитела. Антигенсвязывающие части можно получать способами рекомбинантных ДНК, или путем ферментативного или химического расщепления целых иммуноглобулинов.
Термин "антитело", как используют в рамках изобретения, включает поликлональные антитела, моноклональные антитела, антитела мыши, химерные антитела, гуманизированные антитела и антитела человека, и антитела которые встречаются в природе или рекомбинантно продуцированы в соответствии со способами, хорошо известными в данной области.
В одном варианте осуществления антитело для применения в способах по изобретению представляет собой биспецифическое антитело. "Биспецифическое антитело" представляет собой искусственное гибридное антитело, имеющее две различных пары тяжелая/легкая цепь и два различных участка связывания. Биспецифические антитела можно получать различными способами, включая слияние гибридом или связывание Fab'-фрагментов. См., например, Songsivilai & Lachmann, (1990) Clin. Exp. Immunol. 79, 315-321; Kostelny et al. (1992) J. Immunol. 148, 1547-1553.
В другом варианте осуществления антитело для применения в способах по изобретению представляет собой камелидное антитело, как описано, например, в публикации PCT WO 94/04678, полное содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки.
HH
Область камелидного антитела, которая представляет собой небольшой единичный вариабельный домен, идентифицированный как V,можно получать способами генетической инженерии, получая небольшой белок, имеющий высокую аффинность к мишени, что приводит к низкомолекулярному происходящему из антитела белку, известному как "камелидное наноантитело". См. патент США № 5759808; также см. Stijlemans et al., 2004 J. Biol. Chem. 279: 1256-1261; Dumoulin et al, 2003 Nature 424: 783-788; Pleschberger et al., 2003 Bioconjugate Chem. 14: 440-448; Cortez-Retamozo et al., 2002 Int. J. Cancer 89: 456-62; и Lauwereys et al, 1998 EMBO J. 17: 3512-3520. Полученные способами инженерии библиотеки антител животных семейства верблюдовых и фрагменты антител коммерчески доступны, например, от Ablynx, Ghent, Бельгия. Таким образом, признаком настоящего изобретения является наноантитело животного семейства верблюдовых, имеющее высокую аффинность к FRα.
в других вариантах осуществления изобретения антитело для применения в способах по изобретению представляет собой диантитело, одноцепочечное диантитело или ди-диантитело.
H
L
H
L
HA
LB
HB
LA
H
L
LA
HB
LB
HA
L
H
Диантитела представляют собой двухвалентные биспецифические молекулы, в которых V- и V-домены экспрессируются на одной полипептидной цепи, соединенные линкером, который является слишком коротким, чтобы позволить образование пары между двумя доменами на одной цепи. Домены V и V образуют пары с комплементарными доменами другой цепи, тем самым, создавая участки связывания антигена (см. например, Holliger et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak et al., 1994 Structure 2: 1121-1123). Диантитела можно получать путем экспрессии двух полипептидных цепей со структурой либо V-V и V-V (конфигурация V-V), либо V-V и V-V (конфигурация V-V) в одной и той же клетке. Большинство из них могут экспрессироваться в растворимой форме в бактериях.
Одноцепочечные диантитела (scDb) получают путем связывания двух образующих диантитело полипептидных цепей с помощью линкера размером приблизительно 15 аминокислотных остатков (см. Holliger and Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45(3-4): 128-30; Wu et al., 1996 Immunotechnology, 2(1):21-36). scDb могут экспрессироваться в бактериях в растворимой, активной мономерной форме (см. Holliger and Winter, 1997 Cancer Immunol. Immunother., 45(34): 128-30; Wu et al, 1996 Immunotechnology, 2(l):21-36; Pluckthun и Pack, 1997 Immunotechnology, 3(2): 83-105; Ridgway et al., 1996 Protein Eng., 9(7):617-21).
Диантитело можно подвергать слиянию с Fc с образованием "дидиантитела" (см. Lu et al., 2004 J. Biol. Chem., 279(4):2856-65).
in vivo
Также в способах по настоящему изобретению можно использовать связывающие FRα молекулы, которые проявляют функциональные свойства антител, но лишены их каркасных областей и антигенсвязывающих областей из других полипептидов (например, полипептиды, отличные от кодируемых генами антител или полученных путем рекомбинации генов антител ). Антигенсвязывающие домены (например, связывающие FRα домены) этих связывающих молекул получают способом направленных изменений. См. патент США № 7115396. Молекулы, которые имеют общую укладку, сходную с укладкой вариабельного домена антитела ("иммуноглобулин-подобная" укладка) являются подходящими каркасными белками. Каркасные белки, подходящие для получения антигенсвязывающих молекул, включают фибронектин или димер фибронектина, тенасцин, N-кадгерин, E-кадгерин, ICAM, титин, GCSF-рецептор, рецептор цитокинов, ингибитор гликозидазы, антибиотический хромопротеин, молекулу адгезии к миелиновой оболочке P0, CD8, CD4, CD2, MHC класса I, T-клеточный рецептор антигенов, CD1, C2 и I-set домены VCAM-1, I-set иммуноглобулиновый домен миозин-связывающего белка C, I-set иммуноглобулиновый домен миозин-связывающего белка H, I-set иммуноглобулиновый домен телокина, NCAM, твитчин, нейроглиан, рецептор гормона роста, рецептор эритропоэтина, рецептор пролактина, рецептор интерферона-гамма, β-галактозидазу/глюкуронидазу, β-глюкуронидазу, трансглутаминазу, T-клеточный рецептор антигенов, супероксиддисмутазу, домен тканевого фактора, цитохром F, зеленый флуоресцентный белок, GroEL и тауматин.
-8
"Специфическое связывание", используемое в контексте антител или фрагментов антител, представляет собой связывание через домены, кодируемые генами иммуноглобулинов или фрагментами генов иммуноглобулинов, с одним или несколькими эпитопами представляющего интерес белка, но которые по существу не распознают и не связывают другие молекулы в образце, содержащем смешанную популяцию антигенных молекул. Как правило, антитело связывается с распознаваемым им антигеном с Kd менее чем приблизительно 1×10 M, при измерении с помощью анализа с использованием поверхностного плазмонного резонанса или клеточного анализа связывания.
Как используют в рамках изобретения, "связывающий агент" для рецептора фолиевой кислоты альфа включает антитело, которое связывает FRα, не связанный с клеткой, а также не являющиеся антителами связывающие агенты. Для получения не являющихся антителами связывающих агентов или связывающих молекул можно создавать библиотеку клонов, в которой последовательности в областях каркасного белка, который формирует антигенсвязывающие поверхности (например, области, аналогичные по положению и структуре CDR в вариабельном домене антитела укладки иммуноглобулина), являются рандомизированными. Клоны библиотек исследуют на специфическое связывание с представляющим интерес антигеном (например, FRα) и на другие функции (например, ингибирование биологической активности FRα). Отдельные клоны можно использовать в качестве основы для дальнейшей рандомизации и селекции для получения производных с более высокой аффинностью к антигену.
10
Молекулы с высокоаффинным связыванием получают, например, с использованием десятого модуля фибронектина III (Fn3) в качестве каркаса, описанного в патентах США № 6818418 и 7115396; Roberts and Szostak, 1997 Proc. Natl. Acad. Sci USA 94: 12297; патент США № 6261804; патент США № 6258558; и Szostak et al. WO98/31700, полное содержание каждого из которых включено в настоящее описание в качестве ссылки.
Не являющиеся антителами связывающие молекулы можно получать в качестве димеров или мультимеров для повышения авидности к антигену-мишени. Например, антигенсвязывающий домен экспрессируют в качестве слитой конструкции с константной областью (Fc) антитела, которая образует димеры Fc-Fc. См., например, патент США № 7115396, полное содержание которого включено в настоящее описание в качестве ссылки.
"Антиген" представляет собой молекулу, распознаваемую иммунной системой; термин берет свое начало от "генератора антител" и включает молекулу, которая специфично связывается с антителом. На молекулярном уровне антиген характеризуется его способностью быть связанным антигенсвязывающим центром антитела. В настоящем изобретении антиген представляет собой FRα, такой как FRα, который не связан с клеткой, FRα или его часть.
Как используют в рамках изобретения, термин "эпитоп" относится к элементам молекулярной поверхности антигена, например FRα, способным быть связанными антителом. Антигенные молекулы, обычно являющиеся "большими" биологическими полимерами, обычно представляют несколько поверхностных элементов, которые могут действовать в качестве точек взаимодействия для специфических антител. Любой такой отдельный молекулярный элемент представляет собой эпитоп. Таким образом, большинство антигенов обладают потенциалом к тому, чтобы быть связанными несколькими различными антителами, каждое из которых, как правило, является специфичным к конкретному эпитопу. В одном варианте осуществления настоящего изобретения связывающий агент, например антитело, связывается с эпитопом на FRα, который доступен в форме рецептора, который не связан с клеткой, но не на связанной с мембраной форме рецептора. Например, антитело может связываться с тем же эпитопом на FRα, с которым связывается MORAB-003.
Как используют в рамках изобретения, выражение "прогрессирование злокачественной опухоли, экспрессирующей FRα, у индивидуума, страдающего злокачественной опухолью, экспрессирующей FRα," включает прогрессирование такой злокачественной опухоли от менее тяжелой в более тяжелую стадию. Оно может включать увеличение количества и тяжести опухолей, степени метастазирования, скорости, с которой злокачественная опухоль растет и распространяется, и т.п. Например, "прогрессирование рака яичника" включает прогрессирование такой злокачественной опухоли от менее тяжелой в более тяжелую стадию, такое как прогрессирование от стадии I до стадии II, от стадии II до стадии III и т.д. Альтернативно выражение "прогрессирование злокачественной опухоли, экспрессирующей FRα, у индивидуума, страдающего злокачественной опухолью, экспрессирующей FRα," может относиться к регрессии злокачественной опухоли, экспрессирующей FRα, от более тяжелой стадии в менее тяжелую стадию. Например, в одном варианте осуществления "прогрессирование рака яичника" относится к регрессии от стадии IV до стадии III, от стадии III до стадии II и т.д. В других вариантах осуществления "прогрессирование злокачественной опухоли, экспрессирующей FRα, у индивидуума, страдающего злокачественной опухолью, экспрессирующей FRα," может относиться к уровню выживаемости, определяемому от возникновения симптомов злокачественной опухоли, экспрессирующей FRα, или к уровню выживаемости от времени постановки диагноза злокачественной опухоли, экспрессирующей FRα.
Как используют в рамках изобретения, термин "распределение" относится к охарактеризации злокачественной опухоли, экспрессирующей FRα, например, рака яичника или рака легкого, в отношении соответствующей стадии на основе, например, степени распространения злокачественной опухоли, а также к общепринятым распределениям в данной области. Например, распределение включает охарактеризацию злокачественной опухоли, экспрессирующей FRα, как стадия I, стадия II, стадия III или стадия IV. В определенных вариантах осуществления стадия I относится к злокачественным опухолям, которые расположены в одной части организма. В определенных вариантах осуществления стадии II и III относятся к злокачественным опухолям, которые являются локально развернутыми, где отличие между стадиями часто является специфическим для конкретной злокачественной опухоли. Наконец, стадия IV относится к злокачественным опухолям, которые часто метастазируют, или распространяются в другие органы или по организму.
Как используют в рамках изобретения, термин "выживание" относится к продолжительности жизни индивидуума, которого лечили от злокачественной опухоли. В одном варианте осуществления выживание относится отсутствию рецидива опухоли. Как используют в рамках изобретения, термин "рецидив" относится к повторному росту опухоли или злокачественных клеток у индивидуума, которому проводили первичное лечение опухоли. Опухоль может рецидивировать в первоначальной области или в другой части организма. В одном варианте осуществления опухоль, которая рецидивирует, представляет собой опухоль того же типа, что и исходная опухоль, от которой индивидуума лечили. Например, если индивидуум имел опухоль рака яичника, его лечили, а затем у него развилась другая опухоль рака яичника, то опухоль рецидивировала. Кроме того, злокачественная опухоль может рецидивировать в орган или ткань, отличные от органа или ткани, где они первоначально возникли.
II. Способы и наборы по изобретению
Настоящее изобретение основано, по меньшей мере частично, на неожиданном открытии, что рецептор фолиевой кислоты альфа (FRα), не связанный с клеткой, выявляется на повышенных уровнях в жидкостях организма, например, моче или сыворотке, индивидуума, имеющего злокачественную опухоль, экспрессирующую FRα, по сравнению с контрольным образцом. Более того, настоящее изобретение основано, по меньшей мере частично, на идентификации иммунологического анализа, который проявляет необходимую чувствительность, для оценки уровней FRα, не связанного с клетками, в образцах, в то время как предшествующие попытки сделать это неоднократно проваливались. Действительно, настоящее изобретение преодолевает проблемы, наблюдаемые в ходе предшествующих попыток разработать диагностический анализ на основе FRα для злокачественной опухоли, экспрессирующей FRα, такой как рак легкого или рак яичника, путем предоставления иммунологического анализа, способного точно оценивать уровни FRα, не связанного с клеткой, в образце, например, моче или сыворотке.
Таким образом, предусмотрены способы и наборы для оценки того, имеет ли индивидуум злокачественную опухоль, экспрессирующую FRα, или имеет ли индивидуум риск ее развития, и, кроме того, для оценки прогрессирования злокачественной опухоли, экспрессирующей FRα. В различных вариантах осуществления способы вовлекают сравнение уровней FRα, не связанного с клеткой, в образцах, например, моче и сыворотке, по сравнению с контрольными уровнями, при оценке присутствия, степени или риска развития рак яичника у индивидуума.
A. Диагностические способы, прогностические способы, способы оценки риска и способы распределения
В частности, настоящее изобретение относится к диагностическим способам для оценки того, страдает ли индивидуум злокачественной опухолью, экспрессирующей FRα, такой как рак легкого или рак яичника, к прогностическим способам для предсказания прогрессирования злокачественной опухоли, экспрессирующей FRα, такой как рак легкого или рак яичника, и к способам оценки риска для оценки уровня риска того, что у индивидуума разовьется злокачественная опухоль, экспрессирующая FRα. Более того, изобретение относится к способам распределения злокачественной опухоли, экспрессирующей FRα, такой как рак легкого или рак яичника у индивидуума на группы терапии злокачественной опухоли. Различные аспекты и варианты осуществления изобретения, обсуждаемые в настоящем описании, не являются ограничивающими и охватывают все возможные комбинации конкретных упомянутых вариантов осуществления, которые могут применяться к любым способам и наборам, обсуждаемым в настоящем описании и заявленным ниже.
Способы по настоящему изобретению можно применять на практике совместно с любым другим способом, используемым квалифицированным специалистом для диагностики злокачественной опухоли, экспрессирующей FRα, прогнозирования прогрессирования злокачественной опухоли, экспрессирующей FRα, или для оценки уровня риска того, что у индивидуума разовьется злокачественная опухоль, экспрессирующая FRα.
В одном аспекте изобретение относится к способу оценки того, страдает ли индивидуум злокачественной опухолью, экспрессирующей FRα, путем определения уровня рецептора фолиевой кислоты альфа (FRα), который не связан с клеткой, в образце (таком как моча или сыворотка), полученном от индивидуума; и сравнения уровня рецептора фолиевой кислоты альфа (FRα), который не связан с клеткой, с уровнем FRα в контрольном образце, где различие между уровнем FRα в образце, полученном от индивидуума, и уровнем FRα в контрольном образце указывает на то, что индивидуум страдает злокачественной опухолью, экспрессирующей FRα. В конкретном варианте осуществления уровень FRα в образце, полученном от индивидуума, оценивают путем приведения образца в контакт с антителом, которое связывает FRα, не связанный с клеткой, и выбрано из группы, состоящей из (a) антитела, которое связывает тот же эпитоп, что и антитело MORAb-003; и (b) антитела, содержащего SEQ ID NO: 1 (GFTFSGYGLS) в качестве CDRH1, SEQ ID NO: 2 (MISSGGSYTYYADSVKG) в качестве CDRH2, SEQ ID NO: 3 (HGDDPAWFAY) в качестве CDRH3, SEQ ID NO: 4 (SVSSSISSNNLH) в качестве CDRL1, SEQ ID NO: 5 (GTSNLAS) в качестве CDRL2 и SEQ ID NO: 6 (QQWSSYPYMYT) в качестве CDRL3. В одном варианте осуществления образец выбран из группы, состоящей из мочи и сыворотки.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу оценки того, страдает ли индивидуум злокачественной опухолью, экспрессирующей FRα, такой как рак легкого или рак яичника, причем способ включает определение уровня рецептора фолиевой кислоты альфа (FRα), не связанного с клеткой, в образце мочи, полученном от индивидуума; и сравнение уровня рецептора фолиевой кислоты альфа (FRα) в образце мочи, полученном от индивидуума, с уровнем FRα в контрольном образце, где различие между уровнем FRα в образце мочи, полученном от индивидуума, и уровнем FRα в контрольном образце указывает на то, что индивидуум страдает злокачественной опухолью, экспрессирующей FRα.
В другом аспекте изобретение относится к способу оценки того, страдает ли индивидуум злокачественной опухолью, экспрессирующей FRα, путем определения уровня рецептора фолиевой кислоты альфа (FRα), не связанного с клеткой, в образце сыворотки, полученном от индивидуума; и сравнение уровня рецептора фолиевой кислоты альфа (FRα) в образце сыворотки, полученном от индивидуума, с уровнем FRα в контрольном образце, где различие между уровнем FRα в образце сыворотки, полученном от индивидуума, и уровнем FRα в контрольном образце указывает на то, что индивидуум страдает злокачественной опухолью, экспрессирующей FRα. В конкретных вариантах осуществления индивидуума не лечили средством, таким как стероид, которое усиливает уровни FRα в сыворотке. В конкретном варианте осуществления злокачественная опухоль, экспрессирующая FRα, представляет собой рак яичника и индивидуума не лечили средством, таким как стероид, которое повышает уровни FRα в сыворотке.
В способах и наборах по настоящему изобретению злокачественные опухоли, экспрессирующие FRα, включают злокачественные опухоли, характеризующиеся тем, что злокачественные клетки экспрессируют FRα. В конкретных вариантах осуществления FRα высвобождается из злокачественных клеток, например, с поверхности злокачественной клетки, и в биологические жидкости индивидуума. Злокачественные опухоли, экспрессирующие FRα, включают рак легкого (например, бронхоальвеолярные карциномы, карциноидные опухоли и немелкоклеточный рак легкого, такой как аденокарциномы); мезотелиому; рак яичника; рак почки; злокачественную опухоль головного мозга (например, анапластическая эпендимома и ювенильная мозжечковая пилоцитарная астроцитома); рак шейки матки; рак носоглотки; происходящую из мезодермы опухоль; плоскоклеточную карциному головы и шеи; рак эндометрия; эндометриоидные аденокарциномы яичника, серозные цистаденокарциномы, рак молочной железы; рак мочевого пузыря; рак поджелудочной железы; рак кости (например, высокозлокачественная остеосаркома); и рак гипофиза (например, аденома гипофиза). В конкретном варианте осуществления злокачественная опухоль, экспрессирующая FRα, представляет собой рак яичника.
В определенных вариантах осуществления способов и наборов по настоящему изобретению злокачественная опухоль, экспрессирующая FRα, представляет собой рак легкого. В более конкретных вариантах осуществления рак легкого представляет собой немелкоклеточную карциному легкого (NSCLC). В одном таком варианте осуществления NSCLC выбрана из группы, состоящей из аденокарциномы, плоскоклеточной карциномы легкого, крупноклеточной карциномы легкого, плейоморфной NSCLC, карциноидной опухоли, карциномы слюнной железы и неклассифицируемой карциномы. В предпочтительном варианте осуществления NSCLC представляет собой аденокарциному. В альтернативных вариантах осуществления рак легкого представляет собой мелкоклеточную карциному легкого (SCLC). В другом варианте осуществления рак легкого представляет собой бронхоальвеолярную карциному. В другом варианте осуществления рак легкого представляет собой карциноидную опухоль легкого.
Настоящее изобретение также относится к способам оценки того, страдает ли индивидуум раком яичника, путем определения уровня рецептора фолиевой кислоты альфа (FRα), не связанного с клеткой, в образце мочи, полученном от индивидуума, где присутствие FRα в образце мочи в концентрации более чем приблизительно 3000 произвольных единиц/мл указывает на то, что индивидуум страдает раком яичника. В конкретных вариантах осуществления присутствие FRα в образце мочи в концентрации более чем приблизительно 4000 произвольных единиц/мл, приблизительно 5000 произвольных единиц/мл, приблизительно 6000 произвольных единиц/мл, приблизительно 7000 произвольных единиц/мл, приблизительно 8000 произвольных единиц/мл, приблизительно 9000 произвольных единиц/мл, приблизительно 10000 произвольных единиц/мл, приблизительно 11000 произвольных единиц/мл, приблизительно 12000 произвольных единиц/мл, приблизительно 13000 произвольных единиц/мл, приблизительно 14000 произвольных единиц/мл, приблизительно 15000 произвольных единиц/мл, приблизительно 16000 произвольных единиц/мл, приблизительно 17000 произвольных единиц/мл, приблизительно 18000 произвольных единиц/мл, приблизительно 19000 произвольных единиц/мл, приблизительно 20000 произвольных единиц/мл, приблизительно 21000 произвольных единиц/мл, приблизительно 22000 произвольных единиц/мл, приблизительно 23000 произвольных единиц/мл, приблизительно 24000 произвольных единиц/мл, приблизительно 25000 произвольных единиц/мл, приблизительно 26000 произвольных единиц/мл, приблизительно 27000 произвольных единиц/мл, приблизительно 28000 произвольных единиц/мл, приблизительно 29000 произвольных единиц/мл или приблизительно 30000 произвольных единиц/мл указывает на то, что индивидуум страдает раком яичника.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу оценки того, страдает ли индивидуум раком яичника, путем определения уровня рецептора фолиевой кислоты альфа (FRα) в образце мочи, полученном от индивидуума, где присутствие FRα в образце мочи в концентрации более чем приблизительно 9100 пг/мл указывает на то, что индивидуум страдает раком яичника или где концентрация менее чем приблизительно 9100 пг/мл указывает на то, что индивидуум не страдает раком яичника. Например, присутствие FRα в образце мочи в концентрации более чем приблизительно 9500 пг/мл, приблизительно 10000 пг/мл, приблизительно 11000 пг/мл, приблизительно 12000 пг/мл, приблизительно 13000 пг/мл, приблизительно 14000 пг/мл, приблизительно 15000 пг/мл, приблизительно 16000 пг/мл, приблизительно 17000 пг/мл, приблизительно 18000 пг/мл, приблизительно 19000 пг/мл, приблизительно 20000 пг/мл, приблизительно 21000 пг/мл, приблизительно 22000 пг/мл, приблизительно 23000 пг/мл, приблизительно 24000 пг/мл, приблизительно 25000 пг/мл, приблизительно 26000 пг/мл, приблизительно 27000 пг/мл, приблизительно 28000 пг/мл, приблизительно 29000 пг/мл, приблизительно 30000 пг/мл, приблизительно 40000 пг/мл, приблизительно 50000 пг/мл, приблизительно 60000 пг/мл, приблизительно 70000 пг/мл, приблизительно 80000 пг/мл, приблизительно 90000 пг/мл, приблизительно 100000 пг/мл или приблизительно 150000 пг/мл указывает на то, что индивидуум страдает раком яичника.
В определенных вариантах осуществления указанных выше аспектов изобретения уровни FRα, не связанного с клеткой, в образце (например, таком образце, как образец мочи или образец сыворотки), полученном от индивидуума, сравнивают с уровнями FRα в контрольном образце, где различие между уровнями указывает на то, что индивидуум страдает злокачественной опухолью, экспрессирующей FRα, такой как рак легкого или рак яичника. В конкретном варианте осуществления различие представляет собой увеличение уровня FRα, не связанного с клеткой, в образце, полученном от индивидуума, по сравнению с уровнем FRα в контрольном образце, где это увеличение указывает на присутствие или рост злокачественной опухоли, экспрессирующей FRα. Альтернативно различие представляет собой снижение уровня FRα, где снижение указывает на отсутствие или регрессию злокачественной опухоли, экспрессирующей FRα. Как используют в рамках изобретения, "различие" между уровнем рецептора фолиевой кислоты альфа, не связанного с клеткой, в образце от индивидуума (т.е. исследуемом образце) и уровнем рецептора фолиевой кислоты альфа в контрольном образце относится, в общем, к любому клинически значимому изменению (включая увеличение или снижение) и/или статистически значимому различию уровней рецептора фолиевой кислоты альфа в двух образцах. В иллюстративном варианте осуществления различие выбирают на основе пороговой величины, определяемой с использованием анализа зависимости чувствительности от частоты ложно положительных заключений (ROC), пример которого представлен в примере 6. Оптимальная пороговая величина может варьировать, в зависимости от используемых способов анализа и условий. В других вариантах осуществления различие может превышать пределы детекции способа определения уровня FRα, не связанного с клеткой. Предпочтительно, чтобы различие превышало по меньшей мере стандартную ошибку способа оценки, и предпочтительно различие по меньшей мере приблизительно в 2, приблизительно в 3, приблизительно в 4, приблизительно в 5, приблизительно в 6, приблизительно в 7, приблизительно в 8, приблизительно в 9, приблизительно в 10, приблизительно в 15, приблизительно в 20, приблизительно в 25, приблизительно в 100, приблизительно в 500, приблизительно в 1000 раз или более превышает стандартную ошибку способа оценки. Различие можно оценивать путем подходящего сравнения, включая любую подходящую параметрическую или непараметрическую статистику или сравнение. Например, "увеличение" уровня FRα может относиться к уровню, который превышает пороговую величину, определенную с использованием анализа ROC. Также оно может относиться к уровню в исследуемом образце, который на два, и более предпочтительно приблизительно на 5%, приблизительно на 10%, приблизительно на 15%, приблизительно на 20%, приблизительно на 25%, приблизительно на 30%, приблизительно на 40%, приблизительно на 50%, приблизительно на 60%, приблизительно на 70%, приблизительно на 80%, приблизительно на 90%, приблизительно на 100%, приблизительно на 150%, приблизительно на 200%, приблизительно на 300%, приблизительно на 400%, приблизительно на 500%, приблизительно на 600%, приблизительно на 700%, приблизительно на 800%, приблизительно на 900% или приблизительно на 1000% превышает уровень FRα в контрольном образце. Увеличение также может относиться к уровню в исследуемом образце, который предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 1,5, и более предпочтительно приблизительно на два, приблизительно на три, приблизительно на четыре, приблизительно на пять или более стандартных отклонений превышает средний уровень FRα в контрольном образце. Аналогично, "снижение" уровня FRα, не связанного с клеткой, может относиться к уровню в исследуемом образце, который не превышает пороговой величины, определенной с использованием анализа ROC. Также оно может относиться к уровню в исследуемом образце, который приблизительно на 5%, приблизительно на 10%, приблизительно на 15%, приблизительно на 20%, приблизительно на 25%, приблизительно на 30%, приблизительно на 40%, приблизительно на 50%, приблизительно на 60%, приблизительно на 70%, приблизительно на 80% или приблизительно на 90% меньше, чем уровень FRα в контрольном образце. Снижение также может относиться к уровню в исследуемом образце, который предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 1,5, и более предпочтительно приблизительно на два, приблизительно на три, приблизительно на четыре, приблизительно на пять или более стандартных отклонений ниже среднего уровня FRα в контрольном образце.
Образцы, пригодные в способах и наборах по изобретению, включают любую ткань, клетку, биоптат или жидкость организма, которые могут содержать поддающиеся детекции уровни FRα, не связанного с клеткой. В одном варианте осуществления образец может представлять собой ткань, клетку, цельную кровь, плазму, соскоб с щеки, слюну, цереброспинальную жидкость, стул или бронхоальвеолярный лаваж. В некоторых вариантах осуществления образец представляет собой образец опухоли, экспрессирующей FRα, или образец тканей или клеток, в которых может быть найдена злокачественная опухоль, экспрессирующая FRα. В предпочтительных вариантах осуществления образец представляет собой образец мочи или сыворотки.
Образцы организма можно получать от индивидуума различными способами, известными в данной области, в том числе, например, с использованием биопсии или соскобов или мазков с области или с использованием иглы для аспирирования жидкостей организма. Способы взятия образцов различных жидкостей организма хорошо известны в данной области.
Образцы, подходящие для выявления и количественного определения уровня белка FRα, могут быть свежими, замороженными или фиксированными в соответствии со способами, известными специалисту в данной области. Подходящие образцы тканей предпочтительно разрезают и помещают на предметное стекло микроскопа для дальнейшего анализа. Твердые образцы, т.е. образцы тканей, можно солюбилизировать и/или гомогенизировать, а затем анализировать в качестве растворимых экстрактов. Жидкие образцы также можно подвергать физической или химической обработке. В некоторых вариантах осуществления образцы мочи обрабатывают центрифугированием, встряхиванием, разбавлением и/или обработкой солюбилизирующим веществом (как, например, обработка гуанидином).
В одном варианте осуществления свежеполученный образец биоптата замораживают с использованием, например, жидкого азота или дифтордихлорметана. Из замороженного образца приготавливают препарат для проведения срезов с использованием, например, OCT, и его серийно нарезают в криостате. Серийные срезы собирают на предметное стекло микроскопа. Для иммуногистохимического окрашивания предметные стекла можно покрывать, например, хромовыми квасцами, желатином или поли-L-лизином для обеспечения того, чтобы срезы приклеивались к предметным стеклам. В другом варианте осуществления образцы фиксируют и погружают перед проведением срезов. Например, образец ткани можно фиксировать, например, в формалине, дегидратировать сериями и погружать, например, в парафин.
После получения образца можно использовать любой способ, известный в данной области, пригодный для выявления и количественного определения FRα, не связанного с клеткой, (либо на уровне нуклеиновой кислоты, либо, предпочтительно, на белковом уровне), как описано в разделе (B) ниже. Иллюстративные способы хорошо известны в данной области и включают, но не ограничиваются ими, вестерн-блоттинг, нозерн-блоттинг, саузерн-блоттинг, иммуногистохимию, анализ в жидкой фазе, ELISA, например, усиленный ELISA, иммунопреципитацию, иммунофлуоресценцию, проточную цитометрию, иммуноцитохимию, масс-спектрометрические анализы, например, MALDI-TOF и SELDI-TOF, способы гибридизации нуклеиновых кислот, способы обратной транскрипции нуклеиновых кислот и способы амплификации нуклеиновых кислот.
Во многих вариантах осуществления уровень FRα, не связанного с клеткой, в образце (например, таком как моча или сыворотка) оценивают путем приведения образца в контакт с антителом, которое связывает FRα. Антитела, которые связывают FRα, известны в данной области и включают (i) моноклональное антитело мыши LK26 (его тяжелая и легкая цепи представлены в настоящем описании в качестве SEQ ID NO: 22 и 23), как описано в патентной заявке Европы № 86104170.5 (Rettig) (полное содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки); (ii) антитело MORAB-003, как описано в международной публикации № WO2004/113388 и патенте США № 5646253, полное содержание которых включено в настоящее описание в качестве ссылки. Моноклональные антитела MOV18 и MOV19 также связывают различные эпитопы на молекуле FRα (ранее известной как gp38/FBP). Miotti, S. et al. Int J Cancer, 38: 297-303 (1987). Например, антитело MOV18 связывает эпитоп, указанный в настоящем описании в качестве SEQ ID NO: 26 (TELLNVXMNAK*XKEKPXPX*KLXXQX) (следует отметить, что в положении 12 возможен остаток триптофана или гистидина, и в положении 21 возможен остаток аспарагиновой кислоты или глутаминовой кислоты), как описано в Coney et al. Cancer Res, 51: 6125-6132 (1991).
Как используют в рамках изобретения, термин "MORAb-003" относится к антителу, которое специфично связывает FRα и которое содержит аминокислотную последовательность зрелой тяжелой цепи, как указано в SEQ ID NO: 7, и последовательность зрелой легкой цепи SEQ ID NO: 8. Соответствующие аминокислотные последовательности пребелков для MORAb-003 указаны в SEQ ID NO: 9 (тяжелая цепь) и 10 (легкая цепь). Антитело MORAb-003 содержит следующие CDR: SEQ ID NO: 1 в качестве CDRH1, SEQ ID NO: 2 в качестве CDRH2, SEQ ID NO: 3 в качестве CDRH3, SEQ ID NO: 4 в качестве CDRL1, SEQ ID NO: 5 в качестве CDRL2, и SEQ ID NO: 6 в качестве CDRL3. Клетки, продуцирующие антитело MORAb-003, были депонированы в American Type Culture Collection (10801 University Blvd., Manassas, Virginia 20110-2209) 24 апреля 2006 года и им был присвоен номер доступа № PTA-7552.
Другие антитела, которые связывают FRα и пригодны в способах по настоящему изобретению, включают 9F3.H9.H3.H3.B5.G2 (также обозначаемое как 9F3), 19D4.B7 (также обозначаемое как 19D4), 24F12.B1 (также обозначаемое как 24F12) и 26B3.F2 (также обозначаемое как 26B3). Аминокислотные последовательности этих антител, их CDR и их вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей, а также полинуклеотидные последовательности, которые могут кодировать их, представлены в таблице 33. В некоторых вариантах осуществления эти антитела представляют собой IgG мыши или его производные. В других вариантах осуществления антитела являются человеческими, гуманизированными или химерными.
9F3
В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывает FRα, представляет собой антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые включают аминокислотную последовательность CDR1, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 27. В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывает FRα, включает аминокислотную последовательность CDR2 легкой цепи, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 28. В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывает FRα, включает аминокислотную последовательность CDR3 легкой цепи, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO 29. В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывает FRα, включает аминокислотную последовательность CDR1 тяжелой цепи, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO 31. В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывает FRα, аминокислотную последовательность CDR2 тяжелой цепи, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 32. В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывает FRα, включает аминокислотную последовательность CDR3 тяжелой цепи, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 33. Антитело, которое связывает FRα, может включать легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность CDR1, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 27; аминокислотную последовательность CDR2, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 28; и аминокислотную последовательность CDR3, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 29. Антитело, которое связывает FRα, может включать тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность CDR1, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 31; аминокислотную последовательность CDR2, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 32; и аминокислотную последовательность CDR3, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 33. Антитело, которое связывает FRα, может включать легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность CDR1, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 27; аминокислотную последовательность CDR2, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 28; и аминокислотную последовательность CDR3, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 29, и также имеет тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность CDR1, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 31; аминокислотную последовательность CDR2, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 32; и аминокислотную последовательность CDR3, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 33.
Антитело, которое связывает FRα, может включать вариабельный домен легкой цепи, который включает аминокислотную последовательность, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 30. Антитело, которое связывает FRα, может включать вариабельный домен тяжелой цепи, который включает аминокислотную последовательность, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 34. Антитело, которое связывает FRα, может включать вариабельные домены легкой и тяжелой цепи, где вариабельный домен легкой цепи включает аминокислотную последовательность, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 30, и вариабельный домен тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 34. В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывает FRα, представляет собой антитело 9F3.H9.H3.H3.B5.G2 (9F3) или его антигенсвязывающий фрагмент, способные связываться либо с нативной, либо с невосстановленной формой FRα. В некоторых вариантах осуществления антитело имеет константную область IgG2a мыши.
В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывает FRα, представляет собой антитело, которое продуцируется антителопродуцирующими клетками, депонированными в American Type Culture Collection (10801 University Blvd., Manassas, Virginia 20110-2209) 19 мая 2011 года и которым был присвоен номер доступа № PTA-11887. В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывает FRα, содержит одну или несколько из CDR легкой или тяжелой цепей антител, продуцированных депонированными антителопродуцирующими клетками. В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывает FRα, содержит вариабельные области легкой и тяжелой цепей антител, продуцированные депонированными антителпродуцирующими клетками.
19D4
В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывает FRα, представляет собой антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые включают аминокислотную последовательность CDR1, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 35. В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывает FRα, включает аминокислотную последовательность CDR2 легкой цепи, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 36. В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывает FRα, включает аминокислотную последовательность CDR3 легкой цепи, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 37. В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывает FRα, включает аминокислотную последовательность CDR1 тяжелой цепи, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 39. В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывает FRα, аминокислотную последовательность CDR2 тяжелой цепи, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 40. В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывает FRα, включает аминокислотную последовательность CDR3 тяжелой цепи, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 41. Антитело, которое связывает FRα, может включать легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность CDR1, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 35; аминокислотную последовательность CDR2, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 36; и аминокислотную последовательность CDR3, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 37. Антитело, которое связывает FRα, может включать тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность CDR1, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 39; аминокислотную последовательность CDR2, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 40; и аминокислотную последовательность CDR3, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 41. Антитело, которое связывает FRα, может включать легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность CDR1, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 35; аминокислотную последовательность CDR2, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 36; и аминокислотную последовательность CDR3, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 37, и также имеет тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность CDR1, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 39; аминокислотную CDR2 последовательность, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 40; и аминокислотную последовательность CDR3, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 41.
Антитело, которое связывает FRα, может включать вариабельный домен легкой цепи, который включает аминокислотную последовательность, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 38. Антитело, которое связывает FRα, может включать вариабельный домен тяжелой цепи, который включает аминокислотную последовательность, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 42. Антитело, которое связывает FRα, может включать вариабельные домены легкой и тяжелой цепи, где вариабельный домен легкой цепи включает аминокислотную последовательность, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 38, и вариабельный домен тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 42. В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывает FRα, представляет собой антитело 19D4.B7 (19D4) или его антигенсвязывающий фрагмент, способные связываться либо с нативной, либо с невосстановленной формой FRα. В некоторых вариантах осуществления антитело имеет константную область IgG2a мыши.
В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывает FRα, представляет собой антитело, которое продуцируется антителопродуцирующими клетками, депонированными в American Type Culture Collection (10801 University Blvd., Manassas, Virginia 20110-2209) 19 мая 2011 года и которым был присвоен номер доступа № PTA-11884. В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывает FRα, содержит одну или несколько из CDR легкой или тяжелой цепей антител, продуцированных депонированными антителопродуцирующими клетками. В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывает FRα, содержит вариабельные области легкой и тяжелой цепей антител, продуцированные депонированными антителпродуцирующими клетками.
24F12
В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывает FRα, представляет собой антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые включают аминокислотную последовательность CDR1, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 43. В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывает FRα, включает аминокислотную последовательность CDR2 легкой цепи, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 44. В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывает FRα, включает аминокислотную последовательность CDR3 легкой цепи, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 45. В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывает FRα, включает аминокислотную последовательность CDR1 тяжелой цепи, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 47. В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывает FRα, аминокислотную последовательность CDR2 тяжелой цепи, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 48. В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывает FRα, включает аминокислотную последовательность CDR3 тяжелой цепи, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 49. Антитело, которое связывает FRα, может включать легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность CDR1, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 43; аминокислотную последовательность CDR2, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 44; и аминокислотную последовательность CDR3, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 45. Антитело, которое связывает FRα, может включать тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность CDR1, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 47; аминокислотную последовательность CDR2, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 48; и аминокислотную последовательность CDR3, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 49. Антитело, которое связывает FRα, может включать легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность CDR1, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 43; аминокислотную последовательность CDR2, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 44; и аминокислотную последовательность CDR3, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 45, и также имеет тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность CDR1, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 47; аминокислотную последовательность CDR2, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 48; и аминокислотную последовательность CDR3, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 49.
Антитело, которое связывает FRα, может включать вариабельный домен легкой цепи, который включает аминокислотную последовательность, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 46. Антитело, которое связывает FRα, может включать вариабельный домен тяжелой цепи, который включает аминокислотную последовательность, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 50. Антитело, которое связывает FRα, может включать вариабельные домены легкой и тяжелой цепи, где вариабельный домен легкой цепи включает аминокислотную последовательность, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 46, и вариабельный домен тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 50. В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывает FRα, представляет собой антитело 24F12.B1 (24F12) или его антигенсвязывающий фрагмент, способные связываться либо с нативной, либо с невосстановленной формой FRα. В некоторых вариантах осуществления антитело имеет константную область IgG1 мыши.
В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывает FRα, представляет собой антитело, которое продуцируется антителопродуцирующими клетками, депонированными в American Type Culture Collection (10801 University Blvd., Manassas, Virginia 20110-2209) 19 мая 2011 года и которым был присвоен номер доступа № PTA-11886. В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывает FRα, содержит одну или несколько из CDR легкой или тяжелой цепей антител, продуцированных депонированными антителопродуцирующими клетками. В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывает FRα, содержит вариабельные области легкой и тяжелой цепей антител, продуцированные депонированными антителпродуцирующими клетками.
26B3
В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывает FRα, представляет собой антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые включают аминокислотную последовательность CDR1, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 51. В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывает FRα, включает аминокислотную последовательность CDR2 легкой цепи, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 52. В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывает FRα, включает аминокислотную последовательность CDR3 легкой цепи, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 53. В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывает FRα, включает аминокислотную последовательность CDR1 тяжелой цепи, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 55. В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывает FRα, аминокислотную последовательность CDR2 тяжелой цепи, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 56. В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывает FRα, включает аминокислотную последовательность CDR3 тяжелой цепи, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 57. Антитело, которое связывает FRα, может включать легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность CDR1, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 51; аминокислотную последовательность CDR2, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 52; и аминокислотную последовательность CDR3, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 53. Антитело, которое связывает FRα, может включать тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность CDR1, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 55; аминокислотную последовательность CDR2, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 56; и аминокислотную последовательность CDR3, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 57. Антитело, которое связывает FRα, может включать легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность CDR1, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 51; аминокислотную последовательность CDR2, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 52; и аминокислотную последовательность CDR3, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 53, и также имеет тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность CDR1, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 55; аминокислотную последовательность CDR2, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 56; и аминокислотную последовательность CDR3, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 57.
Антитело, которое связывает FRα, может включать вариабельный домен легкой цепи, который включает аминокислотную последовательность, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 54. Антитело, которое связывает FRα, может включать вариабельный домен тяжелой цепи, который включает аминокислотную последовательность, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 58. Антитело, которое связывает FRα, может включать вариабельные домены легкой и тяжелой цепи, где вариабельный домен легкой цепи включает аминокислотную последовательность, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 54, и вариабельный домен тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, по существу такую же как, или идентичную, SEQ ID NO: 58. В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывает FRα, представляет собой антитело 26B3.F2 (26B3) или его антигенсвязывающий фрагмент, способные связываться либо с нативной, либо с невосстановленной формой FRα. В некоторых вариантах осуществления антитело имеет константную область IgG1 мыши.
В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывает FRα, представляет собой антитело, которое продуцируется антителопродуцирующими клетками, депонированными в American Type Culture Collection (10801 University Blvd., Manassas, Virginia 20110-2209) 19 мая 2011 года и которым был присвоен номер доступа № PTA-11885. В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывает FRα, содержит одну или несколько из CDR легкой или тяжелой цепей антител, продуцированных депонированными антителопродуцирующими клетками. В некоторых вариантах осуществления антитело, которое связывает FRα, содержит вариабельные области легкой и тяжелой цепей антител, продуцированные депонированными антителпродуцирующими клетками.
Организацию CDR для связывания антигена можно модифицировать способами инженерии с использованием антитело-подобных белков в качестве каркаса для CDR. Полученные способами инженерии антигенсвязывающие белки включены в объем антител, которые связывают FRα.
Другие антитела-реагенты, которые связывают FRα, известны в данной области, и в настоящее время, множество таких антител-реагентов является коммерчески доступным (исходя из поиска антител против FRα на http://www.biocompare.com), как приведено в таблице ниже.
Продукт
Компания
Количество
Применения
Реактивность
Поликлональное антитело мыши против FRα человека MaxPab, очищенное, неконъюги-рованное
Abnova Corporation
50 мкг
Антитело для детекции, вестерн-блоттинг (лизат трансфици-рованных клеток)
Человек
Поликлональное антитело мыши против FRα человека MaxPab, очищенное, неконъюги-рованное
Abnova Corporation
50 мкг
Антитело для детекции, вестерн-блоттинг (лизат трансфици-рованных клеток)
Человек
Поликлональное антитело кролика против FRα человека MaxPab, очищенное, неконъюги-рованное
Abnova Corporation
100 мкг
Антитело для детекции, вестерн-блоттинг (лизат трансфици-рованных клеток)
Человек
Поликлональное антитело кролика против FRα, очищенное, неконъюги-рованное
Aviva Systems Biology
50 мкг
Вестерн-блоттинг
Человек, мышь, крыса
Поликлональное антитело кролика против FRα человека, очищенное, неконъюги-рованное
GenTex
100 мл
Вестерн-блоттинг. пригодность этого продукта в других способах применения не определялась
Человек
Поликлональное антитело козы против бычьего рецептора фолиевой кислоты альфа (FRα), конъюгированное с биотином
LifeSpan BioSciences
10 мг
ELISA (1:4000 - 1:20000), иммунофлу-оресценция, иммуногис-тохимия, вестерн-блоттинг
Животное семейства бычьих
Поликлональное антитело козы против бычьего рецептора фолиевой кислоты альфа (FRα), конъюгированное с биотином
LifeSpan BioSciences
не предостав-лено
ELISA (1:5000 - 1:25000), вестерн-блоттинг
Животное семейства бычьих
Поликлональное антитело козы против бычьего рецептора фолиевой кислоты альфа (FRα), конъюгированное с Hrp
LifeSpan BioSciences
20 мг
ELISA (1:2000 - 1:10000), иммуноги-стохимия, вестерн-блоттинг
Животное семейства бычьих
Поликлональное антитело козы против бычьего рецептора фолиевой кислоты альфа (FRα), конъюгированное с Hrp
LifeSpan BioSciences
1000 мкг
ELISA (1:2000 - 1:12000), сдвиг в геле, иммуно-гистохимия, (1:100 - 1:200), иммуно-гистохимия
Животное семейства бычьих
Поликлональное антитело козы против бычьего рецептора фолиевой кислоты альфа (FRα), конъюгированное с Hrp
LifeSpan BioSciences
2000 мкг (200 мкл)
ELISA, вестерн-блоттинг
Животное семейства бычьих
Поликлональное антитело козы против бычьего рецептора фолиевой кислоты альфа (FRα), конъюгированное с Hrp
LifeSpan BioSciences
не предостав-лено
ELISA, иммуногис-тохимия (замороженные срезы), иммуногис-тохимия (парафин), вестерн-блоттинг
Животное семейства бычьих
Поликлональное антитело козы против бычьего рецептора фолиевой кислоты альфа (FRα), неконъюги-рованное
LifeSpan BioSciences
50 мг
ELISA (1:10000 - 1:40000), иммунопреци-питация, вестерн-блоттинг
Животное семейства бычьих
Поликлональное антитело козы против бычьего рецептора фолиевой кислоты альфа (FRα), неконъюги-рованное
LifeSpan BioSciences
10000 мкг
ELISA (1:10000 - 1:40000), иммунопреци-питация, вестерн-блоттинг
Животное семейства бычьих
Поликлональное антитело козы против бычьего рецептора фолиевой кислоты альфа (FRα), неконъюги-рованное
LifeSpan BioSciences
1 мл
ELISA (1:3000 - 1:9000), иммунопреци-питация, вестерн-блоттинг
Животное семейства бычьих
Поликлональное антитело козы против бычьего рецептора фолиевой кислоты альфа (FRα), неконъюги-рованное, рецептор фолиевой кислоты альфа (FRα)
LifeSpan BioSciences
не предостав-лено
ELISA (1:3000 - 1:9000), иммунопреци-питация, вестерн-блоттинг
Животное семейства бычьих
Моноклональное антитело мыши против бычьего рецептора фолиевой кислоты альфа (FRα), неконъюги-рованное
LifeSpan BioSciences
200 мкг
ELISA
Животное семейства бычьих
Моноклональное антитело мыши против бычьего рецептора фолиевой кислоты альфа (FRα), неконъюги-рованное
LifeSpan BioSciences, рецептор фолиевой кислоты альфа (FRα)
200 мкг
ELISA
Человек
Моноклональное антитело мыши против бычьего рецептора фолиевой кислоты альфа (FRα), неконъюги-рованное
LifeSpan BioSciences
200 мкг
ELISA
Человек
Моноклональное антитело мыши против бычьего рецептора фолиевой кислоты альфа (FRα), неконъюги-рованное
LifeSpan BioSciences
200 мкг
ELISA
Не предоставлено
Моноклональное антитело мыши против рецептора фолиевой кислоты альфа (FRα) человека, неконъюги-рованное, клон 6d398
LifeSpan BioSciences
100 мкл
ELISA (1-10 мкг/мл), проточная цитометрия, иммуноцито-химия, иммуноги-стохимия (замороженные срезы)
Обезьяна
Поликлональное антитело кролика против бычьего рецептора фолиевой кислоты альфа (FRα), неконъюги-рованное
LifeSpan BioSciences
1 мл
ELISA
Животное семейства бычьих
Поликлональное антитело кролика против бычьего рецептора фолиевой кислоты альфа (FRα), неконъюги-рованное
LifeSpan BioSciences
не предостав-лено
не предоставлено
Животное семейства бычьих
Поликлональное антитело мыши против FRα человека, неконъюги-рованное, клон рецептора фолиевой кислоты 1 (взрослые)
Novus Biologicals
0,05 мл
Вестерн-блоттинг, ELISA
Поликлональное антитело мыши против FRα человека, неконъюги-рованное
Novus Biologicals
0,05 мг
ELISA, вестерн-блоттинг
Человек
Поликлональное антитело козы против FRα человека, подвергнутое аффинной очистке, конъюгированное с биотином
R&D Systems
50 мкг
Вестерн-блоттинг
Человек
Поликлональное антитело козы против FRα человека, подвергнутое аффинной очистке, конъюгированное с биотином
R&D Systems
100 мкг
Проточная цитометрия, вестерн-блоттинг
Человек
Моноклоналное антитело мыши против FRα человека, конъюгированное с аллофикоцианином, клон 548908
R&D Systems
100 исследо-ваний
Проточная цитометрия
Человек
Моноклоналное антитело мыши против FRα человека, конъюгированное с фикоэритрином, клон 548908
R&D Systems
100 исследо-ваний
Проточная цитометрия
Человек
Моноклональное антитело мыши против FRα человека, неконъюги-рованное, клон 548908
R&D Systems
100 мкг
Проточная цитометрия, иммуноцито-химия, вестерн-блоттинг
Человек
Моноклональное антитело мыши против FRα человека, неконъюги-рованное
United States Biological
100 мкг
ELISA, проточная цитометрия, иммуноцито-химия, вестерн-блоттинг
Человек
В предпочтительном варианте осуществления антитело, которое связывает FRα, содержит по меньшей мере одну из следующих CDR, происходящую из тяжелой и легкой цепей LK26 мыши: SEQ ID NO: 1 (GFTFSGYGLS) в качестве CDRH1, SEQ ID NO: 2 (MISSGGSYTYYADSVKG) в качестве CDRH2, SEQ ID NO: 3 (HGDDPAWFAY) в качестве CDRH3, SEQ ID NO: 4 (SVSSSISSNNLH) в качестве CDR11, SEQ ID NO: 5 (GTSNLAS) в качестве CDR12 и SEQ ID NO: 6 (QQWSSYPYMYT) в качестве CDR13. См. патент США № 5646253, содержание которого, поскольку оно относится к антителам против FRα, можно использовать в настоящем изобретении, включено в настоящее описание в качестве ссылки. Дополнительные мутации можно вносить в каркасные области, как описано в патенте США № 5646253, содержание которого включено в настоящее описание в качестве ссылки.
В другом предпочтительном варианте осуществления антитело включает вариабельную область легкой цепи, выбранную из группы, состоящей из LK26HuVK (SEQ ID NO: 13), LK26HuVKY (SEQ ID NO: 14), LK26HuVKPW (SEQ ID NO: 15) и LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16); и вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из LK26HuVH (SEQ ID NO: 17); LK26HuVH FAIS,N (SEQ ID NO: 18); LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19); LK26HuVH I,I (SEQ ID NO: 20); и LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21). См. патент США № 5646253 и патент США № 6124106. В другом варианте осуществления антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи LK26KOLHuVH (SEQ ID NO: 21) и вариабельную область легкой цепи LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16). В другом варианте осуществления антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи LK26HuVH SLF (SEQ ID NO: 19) и вариабельную область легкой цепи LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16). В следующем варианте осуществления антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи LK26HuVH FAIS,N (SEQ ID NO: 18) и вариабельную область легкой цепи LK26HuVKPW,Y (SEQ ID NO: 16).
В некоторых вариантах осуществления может быть необходимо модифицировать образцы для получения FRα, доступного для связывания антитела. В конкретном аспекте способов иммуноцитохимии или иммуногистохимии предметные стекла можно переносить в буфер для предварительной обработки и необязательно нагревать для повышения доступности антигена. Нагревание образца в буфере для предварительной обработки быстро разрушает липидный бислой клеток и делает антигены (возможно в свежих образцах, но, как правило, не происходит в фиксированных образцах) (т.е. белок FRα) более доступными для связывания антителом. Термин "буфер для предварительной обработки" используют в настоящем описании для обозначения буфера, который используют для подготовки цитологических или гистологических образцов для иммунного окрашивания, в частности, путем повышения доступности белка FRα для связывания антителом. Буфер для предварительной обработки может содержать раствор соли с определенным pH, полимер, детергент или неонное или анионное поверхностно-активное вещество, например, такое как этоксилированное анионное или неионное поверхностно-активное вещество, алканоат или алкоксилат или даже смеси этих поверхностно-активных веществ или в нем даже может использоваться желчная соль. Буфер для предварительной обработки может представлять собой, например, 0,1%-1% раствор дезоксихолевой кислоты, соль натрия, или раствор лаурет-13-карбоксилата натрия (например, Sandopan LS) или/и этоксилированный анионный комплекс. В некоторых вариантах осуществления буфер для предварительной обработки также можно использовать в качестве буфера для хранения предметных стекол. В конкретном варианте осуществления образец, например, образец мочи, центрифугируют, встряхивают, разбавляют и/или подвергают обработки гуанидином.
Любой способ повышения доступности белка FRα для связывания антителом можно использовать при осуществлении настоящего изобретения на практике, включая способы извлечения антигена, известные в данной области. См., например, Bibbo, et al. (2002) Acta. Cytol. 46:25-29; Saqi, et al. (2003) Diagn. Cytopathol. 27:365-370; Bibbo, et al. (2003) Anal. Quant. Cytol. Histol. 25:8-11, полное содержание каждого из которых включено в настоящее описание в качестве ссылок.
После предварительной обработки для повышения доступности белка FRα, образцы можно блокировать с использованием подходящего блокирующего агента, например, блокирующего пероксидазу реагента, такого как пероксид водорода. В некоторых вариантах осуществления образцы можно блокировать с использованием блокирующего белок реагента для предотвращения неспецифического связывания антитела. Блокирующий белок реагент может содержать, например, очищенный казеин. Затем с образцом инкубируют антитело, в частности, моноклональное или поликлональное антитело, которое специфично связывается с FRα.
Способы выявления связывания антитела хорошо известны в данной области. Связывание антитела с FRα можно выявлять с использованием химических реагентов, которые генерируют поддающийся детекции сигнал, который соответствуют уровню связывания антитела и, таким образом, уровню экспрессии белка FRα. В одном из способов иммуногистохимии или иммуноцитохимии по изобретению, связывание антитела выявляют с использованием вторичного антитела, которое конъюгировано с меченым полимером. Примеры меченых полимеров включают, но не ограничиваются ими, конъюгаты полимер-фермент. Ферменты в этих комплексах, как правило, используют для катализа отложения хромогена в участке связывания антиген-антитело, что, тем самым, приводит к окрашиванию клеток, которое соответствует уровню экспрессии представляющего интерес биомаркера. Ферменты включают, но не ограничиваются ими, пероксидазу хрена (HRP) и щелочную фосфатазу (AP).
В одном способе иммуногистохимии или иммуноцитохимии по изобретению, связывание антитела с белком FRα выявляют с использованием меченого HRP полимера, который конъюгирован с вторичным антителом. Связывание антитела также можно выявлять с использованием реагента видоспецифического зонда, который связывается с моноклональными или поликлональными антителами, и полимера, конъюгированного с HRP, который связывается с реагентом видоспецифического зонда. Предметные стекла окрашивают для связывания антитела с использованием любого хромогена, например, хромогена 3,3-диаминобензидина (DAB), а затем контрастно окрашивают гематоксилином и, необязательно, окрашивающим синим цветом агентом, таким как гидроксид аммония или TBS/Tween-20. Другие подходящие хромогены включают, например, 3-амино-9-этилкарбазол (AEC). В некоторых аспектах изобретения, предметные стекла рассматривает под микроскопом цитотехнолог и/или патолог для оценки окрашивания клеток, например, флуоресцентного окрашивания (т.е. экспрессии FRα). Альтернативно образцы могут быть исследованы с помощью автоматизированной микроскопии или специалистами с помощью компьютерного программного обеспечения, которое облегчает идентификацию положительно окрашенных клеток.
125
131
35
14
3
В предпочтительном варианте осуществления изобретения антитело является меченным. Например, выявление связывания антитела может облегчаться путем связывания антитела против FRα с поддающимся детекции веществом. Примеры поддающихся детекции веществ включают различные ферменты, простетические группы, флуоресцентные материалы, люминесцентные материалы, биолюминесцентные материалы и радиоактивные материалы. Примеры подходящих ферментов включают пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, β-галактозидазу или ацетилхолинэстеразу; примеры подходящих комплексов простетических групп включают стрептавидин/биотин и авидин/биотин; примеры подходящих флуоресцентных материалов включают умбеллиферон, флуоресцеин, флуоресцеин изотиоцианат, родамин, дихлортриазиниламин флуоресцеин, дансилхлорид или фикоэритрин; пример люминесцентного материала включает люминол; примеры биолюминесцентных материалов включают люциферазу, люциферин и экворин; и примеры подходящего радиоактивного материала включают I, I, S, C или H. В конкретном варианте осуществления антитело является меченным радиоактивной меткой, хромофорной меткой, флуорофорной меткой или ферментной меткой.
В одном варианте осуществления изобретения получают замороженные образцы, как описано выше, а затем окрашивают их антителами против FRα, разбавленного до соответствующей концентрации с использованием, например, забуференного Tris солевого раствора (TBS). Первичные антитела можно выявлять путем инкубации предметных стекол с биотинилированным антителом против иммуноглобулинов. Этот сигнал необязательно можно усиливать и визуализировать с использованием осаждения антигена с диаминобензидином. Более того, предметные стекла необязательно можно контрастно окрашивать, например, гематоксилином, для визуализации клеток.
В другом варианте осуществления фиксированные и залитые образцы окрашивают антителами против FRα и контрастно окрашивают, как описано выше для замороженных срезов. Кроме того, образцы необязательно можно обрабатывать агентами, усиливающими сигнал, для визуализации связывания антитела. Например, можно использовать катализируемое пероксидазой отложение биотинил-тирамида, который в свою очередь подвергают реакции с конъюгированным с пероксидазой стрептавидином (Catalyzed Signal Amplification (CSA) System, DAKO, Carpinteria, CA).
Специалисту в данной области понятно, что концентрация конкретного антитела, используемого для осуществления на практике способов по изобретению, варьирует, в зависимости от таких факторов, как время связывания, уровень специфичности антитела к FRα, и способ приготовления образца. Более того, когда используют множество антител, на требуемую концентрацию может влиять порядок, в котором антитела наносят на образец, например, одновременно в качестве коктейля или последовательно в качестве индивидуальных антительных реагентов. Более того, химию детекции, используемую для визуализации связывания антител с FRα, необходимо оптимизировать для получения желаемого отношения сигнала к шуму. В одном варианте осуществления изобретения для детекции и количественного определения белка FRα используют протеомные способы, например, масс-спектрометрию. Например, для детекции и количественного определения белка FRα можно использовать времяпролетную масс-спектрометрию с лазерной десорбцией и ионизацией из жидкой матрицы масс (MALDI-TOF MS) или времяпролетную масс-спектрометрию с лазерной десорбцией и ионизацией с усиленной поверхностью (SELDI-TOF MS), которая вовлекает нанесение образца, такого как сыворотка, на связывающий белок чип (Wright, G.L., Jr., et al. (2002) Expert Rev Mol Diagn 2:549; Li, J., et al. (2002) Clin Chem 48: 1296; Laronga, C, et al. (2003) Dis Markers 19:229; Petricoin, E.F., et al. (2002) 359:572; Adam, B.L., et al. (2002) Cancer Res 62:3609; Tolson, J., et al. (2004) Lab Invest 84:845; Xiao, Z., et al. (2001) Cancer Res 61:6029). Масс-спектрометрические способы описаны, например, в патентах США № 5622824, 5605798 и 5547835, полное содержание каждого из которых включено в настоящее описание в качестве ссылки.
Кроме того, настоящее изобретение основывается, по меньшей мере частично, на идентификации FRα в качестве прогностического биомаркера, т.е. в качестве биомаркера прогрессирования и/или тяжести злокачественной опухоли, экспрессирующей FRα, такой как рак яичника или немелкоклеточный рак легкого. Таким образом, настоящее изобретение относится к способам оценки прогрессирования злокачественной опухоли, экспрессирующей FRα, у индивидуума, страдающего раком яичника, путем сравнения уровня FRα в образце, полученном от индивидуума, с уровнем FRα в контрольном образце, где отличие в уровне FRα в образце (таком как образец мочи или сыворотке), полученном от индивидуума, по сравнению с контрольным образцом указывает на то, что злокачественная опухоль будет быстро прогрессировать. Аналогично, способы оценки уровня риска того, что у индивидуума разовьется злокачественная опухоль, экспрессирующая FRα, вовлекают сравнение уровня FRα в образце, полученном от индивидуума, с уровнем FRα в контрольном образце, где отличие уровня FRα в образце (таком как образец мочи или сыворотки), полученном от индивидуума, по сравнению с контрольным образцом указывает на то, что индивидуум имеет более высокий уровень риска развития злокачественной опухоли, экспрессирующей FRα, по сравнению с нормальным риском у здорового индивидуума.
В одном варианте осуществления отличием является увеличение. В другом варианте осуществления отличием является снижение. В некоторых типах злокачественных опухолей (например, плоскоклеточная карцинома головы и шеи, рак яичника), более высокий уровень экспрессии FRα ассоциирован с худшим прогнозом, в то время как при других типах злокачественных опухолей (например, немелкоклеточный рак легкого), более высокий уровень экспрессии FRα ассоциирован с лучшим прогнозом. Таким образом, в одном конкретном варианте осуществления злокачественная опухоль, экспрессирующая FRα, представляет собой рак яичника или плоскоклеточную карциному головы и шеи и отличием является увеличение. В другом конкретном варианте осуществления злокачественная опухоль, экспрессирующая FRα, представляет собой немелкоклеточный рак легкого, и отличием является снижение.
В некоторых аспектах изобретение относится к способам оценки прогрессирования злокачественной опухоли, экспрессирующей FRα, у индивидуума, страдающего злокачественной опухолью, экспрессирующей FRα, путем сравнения уровня FRα в образце, полученном от индивидуума, с уровнем FRα в контрольном образце, где увеличение уровня FRα в образце (таком как образец мочи или сыворотки), полученном от индивидуума, по сравнению с контрольным образцом указывает на то, что злокачественная опухоль будет быстро прогрессировать, или снижение уровня FRα в образце, полученном от индивидуума, по сравнению с уровнем FRα в контрольном образце указывает на то, что злокачественная опухоль будет прогрессировать медленно или будет регрессировать. Аналогично, способы оценки уровня риска того, что у индивидуума разовьется злокачественная опухоль, экспрессирующая FRα, вовлекают сравнение уровня FRα в образце, полученном от индивидуума, с уровнем FRα в контрольном образце, где увеличение уровня FRα в образце (таком как образец мочи или сыворотки), полученном от индивидуума, по сравнению с контрольным образцом указывает на то, что индивидуум имеет более высокий риск развития злокачественной опухоли, экспрессирующей FRα, по сравнению с нормальным риском у здорового индивидуума или снижение уровня FRα в образце, полученном от индивидуума, по сравнению с уровнем FRα в контрольном образце, указывает на то, что индивидуум имеет более низкий риск развития злокачественной опухоли, экспрессирующей FRα, по сравнению с нормальным риском у здорового индивидуума.
Любое клинически значимое или статистически значимое увеличение или снижение, при использовании любого аналитического способа, известного в данной области, можно использовать в способах прогнозирования, оценки риска и других способах по изобретению. В одном варианте осуществления увеличение уровня FRα относится к уровню, который превышает пороговую величину, определенную с использованием ROC-анализа, как проиллюстрировано в примере 6. В другом варианте осуществления снижение уровня FRα относится к уровню в исследуемом образце, который не превышает пороговой величины, определенной с использованием ROC-анализа.
В других вариантах осуществления увеличение или снижение должно превышать пределы детекции способа определения уровня FRα. В следующих вариантах осуществления увеличение или снижение превышает по меньшей мере стандартную ошибку способа оценки, и предпочтительно по меньшей мере приблизительно в 2, приблизительно в 3, приблизительно в 4, приблизительно в 5, приблизительно в 6, приблизительно в 7, приблизительно в 8, приблизительно в 9, приблизительно в 10, приблизительно в 15, приблизительно в 20, приблизительно в 25, приблизительно в 100, приблизительно в 500, приблизительно в 1000 раз или более превышает стандартную ошибку способа оценки. В некоторых вариантах осуществления увеличение или снижение оценивают с использованием параметрической или непараметрической описательной статистики, сравнений, регрессионного анализа и т.п.
В других вариантах осуществления увеличение или снижение представляет собой уровень в образце, полученном от индивидуума, который приблизительно на 5%, приблизительно на 10%, приблизительно на 15%, приблизительно на 20%, приблизительно на 25%, приблизительно на 30%, приблизительно на 40%, приблизительно на 50%, приблизительно на 60%, приблизительно на 70%, приблизительно на 80%, приблизительно на 90%, приблизительно на 100%, приблизительно на 150%, приблизительно на 200%, приблизительно на 300%, приблизительно на 400%, приблизительно на 500%, приблизительно на 600%, приблизительно на 700%, приблизительно на 800%, приблизительно на 900% или приблизительно на 1000% выше или ниже уровня FRα в контрольном образце. В альтернативных вариантах осуществления увеличение или снижение уровня представляет собой уровень в образце, полученном от индивидуума, который по меньшей мере приблизительно на 1,5, и более предпочтительно приблизительно на два, приблизительно на три, приблизительно на четыре, приблизительно на пять или более стандартных отклонений выше или ниже среднего уровня FRα в контрольном образце. Как используют в рамках изобретения, выражение "прогрессирование злокачественной опухоли, экспрессирующей FRα, у индивидуума, страдающего злокачественной опухолью, экспрессирующей FRα," может относиться к прогрессированию злокачественной опухоли, экспрессирующей FRα, от менее тяжелого в менее тяжелое состояние злокачественной опухоли. Оно может включать увеличение количества или тяжести опухолей, степень метастазирования, скорость, с которой злокачественная опухоль растет и распространяется, и т.п. В определенных вариантах осуществления прогрессирование представляет собой прогрессирование от менее тяжелой стадии в более тяжелую стадию, где стадию оценивают в соответствии со схемой присвоения стадий, известной в данной области. В одном варианте осуществления, где злокачественная опухоль, экспрессирующая FRα, представляет собой рак яичника, прогрессирование относится к прогрессированию от стадии I в стадию II, от стадии II в стадию III, и т.д. В другом варианте осуществления, где злокачественная опухоль, экспрессирующая FRα, представляет собой немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), прогрессирование относится к прогрессированию от стадии 0 в стадию IA, от стадии IA в стадию IB, от стадии IB в стадию IIA, от стадии IIA в стадию IIB, от стадии IIB в стадию IIC и т.д. В другом варианте осуществления, где злокачественная опухоль, экспрессирующая FRα, представляет собой немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), прогрессирование относится к прогрессированию от менее тяжелой стадии в более тяжелую стадию при определении согласно системе классификации TNM. См. Spira; Greene; Sobin.
Альтернативно выражение "прогрессирование злокачественной опухоли, экспрессирующей FRα, у индивидуума, страдающего злокачественной опухолью, экспрессирующей FRα," может относиться к регрессии злокачественной опухоли, экспрессирующей FRα, от более тяжелой стадии в менее тяжелую стадию, такой как снижение количества и тяжести опухолей, степени метастазирования, скорости, с которой злокачественная опухоль растет и распространяется и т.п. В определенных вариантах осуществления прогрессирование представляет собой прогрессирование от более тяжелой стадии в менее тяжелую стадию, где стадию оценивают в соответствии со схемой присвоения стадий, известной в данной области. В одном варианте осуществления, где злокачественная опухоль, экспрессирующая FRα, представляет собой рак яичника, прогрессирование относится к регрессии от стадии IV до стадии III, от стадии III до стадии II и т.д. В другом варианте осуществления, где злокачественная опухоль, экспрессирующая FRα, представляет собой немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), прогрессирование относится к прогрессированию от стадии IV в стадию IIIB, от стадии IIIB в стадию IIIA, от стадии IIIA в стадию IIB, и т.д. В другом варианте осуществления, где злокачественная опухоль, экспрессирующая FRα, представляет собой немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), прогрессирование относится к прогрессированию от более тяжелой стадии в менее тяжелую стадию при определении согласно системе классификации TNM. См. Spira; Greene; Sobin.
В следующих вариантах осуществления уровень FRα можно использовать для вычисления вероятности того, что инидивидуум страдает злокачественной опухолью, экспрессирующаей FRα, прогрессирования злокачественной опухоли, экспрессирующей FRα, у индивидуума, уровня риска развития злокачественной опухоли, экспрессирующей FRα, риска рецидива злокачественной опухоли у индивидуума, подвергаемого лечению от злокачественной опухоли, экспрессирующей FRα, выживаемости индивидуума, подвергаемого лечению от злокачественной опухоли, экспрессирующей FRα, эффективности режима лечения злокачественной опухоли, экспрессирующей FRα, и т.п., с использованием способов по изобретению, которые могут включать способы регрессионного анализа, известные специалисту в данной области. Например, подходящие регрессионные модели включают, но не ограничиваются ими, CART (например, Hill, T, и Lewicki, P. (2006) "STATISTICS Methods and Applications" StatSoft, Tulsa, OK), Cox (например, www.evidence-based-medicine.co.uk), экспоненциальные, нормальные и логарифмические нормальные (например, www.obgyn.cam.ac.uk/mrg/statsbook/stsurvan.html), логистические (например, www.en.wikipedia.org/wiki/Logistic_regression), парметрические, непараметрические, полупараметрические (например, www.socserv.mcmaster.ca/jfox/Books/Companion), линейные (например, www.en.wikipedia.org/wiki/Linear_regression), или аддитивные (например, www.en.wikipedia.org/wiki/Generalized_additive_model).
В одном варианте осуществления регрессионный анализ включает уровень FRα. В следующих вариантах осуществления регрессионный анализ может включать дополнительные клинические и/или молекулярные ковариаты. Такие клинические ковариаты включают, но не ограничиваются ими, возраст индивидуума, стадию опухоли, степень опухоли, размер опухоли, режим лечения, например, химиотерапия и/или лучевая терапия, клинический исход (например, рецидив, обусловленная заболеванием выживаемость, неуспех терапии), и/или клинический исход в качестве функции времени после постановки диагноза, времени после начала терапии и/или времени после завершения лечения. Молекулярные ковариаты могут включать, но не ограничиваться ими, уровни дополнительных молекулярных маркеров. Например, в вариантах осуществления, где злокачественная опухоль, экспрессирующая FRα, представляет собой рак яичника, такие маркеры могут включать, например, уровни CA125 в сыворотке, уровни DF3 в сыворотке и/или уровни LPA в сыворотке.
В других аспектах изобретение относится к способам мониторинга эффективности терапии или режима лечения. Например, настоящее изобретение относится к способам мониторинга эффективности лечения с помощью MORAb-003 рака яичника или рака легкого у индивидуума, страдающего раком яичника или раком легкого. В частности, способы вовлекают определение уровня рецептора фолиевой кислоты альфа (FRα), который не связан с клеткой, в образце, полученном от указанного индивидуума, где указанному индивидууму ранее вводили MORAb-003; и сравнение уровня рецептора фолиевой кислоты альфа (FRα), который не связан с клеткой, с уровнем FRα в контрольном образце, где увеличение или отсутствие изменений уровня FRα в образце, полученном от указанного индивидуума, по сравнению с уровнем FRα в контрольном образце указывает на то, что лечение с помощью MORAb-003 не является эффективным; и где снижение уровня FRα в образце, полученном от указанного индивидуума, по сравнению с уровнем FRα в контрольном образце указывает на то, что лечение с помощью MORAb-003 является эффективным.
Например, контрольный образец можно получать от индивидуума, не подвергавшегося режиму лечения, и исследуемый образец можно получать от индивидуума, подвергнутого по меньшей мере части режима лечения. Альтернативно исследуемый образец и контрольный образец могут быть получены от одного и того же индивидуума. Например, исследуемый образец может представлять собой образец, полученный от индивидуума после введения терапевтического средства, такого как MORAb-003. Контрольный образец может представлять собой образец, полученный от индивидуума перед введением терапевтического вещества или на ранней стадии терапевтического режима. Таким образом, снижение уровня экспрессии FRα в исследуемом образце относительно контрольного образца, указывает на то, терапия снизила прогрессирование злокачественной опухоли, экспрессирующей FRα, например, рака яичника. Для злокачественных опухолей, экспрессирующих FRα, где более высокий уровень FRα ассоциирован с худшим прогнозом, например, таких как рак яичника или плоскоклеточная карцинома головы и шеи, снижение уровня экспрессии FRα в исследуемом образце относительно контрольного образца указывает на то, что терапия является эффективной в отношении замедления прогрессирования злокачественной опухоли, экспрессирующей FRα, или в отношении обеспечения регрессии злокачественной опухоли у индивидуума, страдающего злокачественной опухолью, экспрессирующей FRα. В предпочтительном варианте осуществления злокачественная опухоль, экспрессирующая FRα, представляет собой рак яичника.
В различных вариантах осуществления этого аспекта изобретения образец может представлять собой мочу, сыворотку, плазму или асцитную жидкость. В конкретных вариантах осуществления образец представляет собой мочу или сыворотку. Более того, FRα можно определять путем приведения образца в контакт с антителом, которое связывает FRα, необязательно с использованием антител, как описано в настоящем описании, и способов анализа, как описано в настоящем описании.
В различных вариантах осуществления антитело MORAb-003 для лечения представляет собой (a) антитело, которое содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи, указанную в SEQ ID NO: 7 и аминокислотную последовательность легкой цепи, указанную в SEQ ID NO: 8; (b) антитело, которое связывает тот же эпитоп, что и антитело MORAb-003; или (c) антитело, содержащее SEQ ID NO: 1 (GFTFSGYGLS) в качестве CDRH1, SEQ ID NO: 2 (MISSGGSYTYYADSVKG) в качестве CDRH2, SEQ ID NO: 3 (HGDDPAWFAY) в качестве CDRH3, SEQ ID NO: 4 (SVSSSISSNNLH) в качестве CDR11, SEQ ID NO: 5 (GTSNLAS) в качестве CDR12 и SEQ ID NO: 6 (QQWSSYPYMYT) в качестве CDR13.
В конкретном варианте осуществления злокачественная опухоль, экспрессирующая FRα, представляет собой рак яичника. В других вариантах осуществления злокачественная опухоль, экспрессирующая FRα, представляет собой рак легкого. В более конкретных вариантах осуществления рак легкого представляет собой немелкоклеточный рак легкого (NSCLC). В одном таком варианте осуществления NSCLC выбран из группы, состоящей из аденокарциномы легкого, плоскоклеточной карциномы легкого, крупноклеточной карциномы легкого, плейоморфной NSCLC, карциноидной опухоли, карциномы слюнной железы и неклассифицируемой карциномы. В предпочтительном варианте осуществления NSCLC представляет собой аденокарциному. В альтернативнах вариантах осуществления рак легкого представляет собой мелкоклеточную карциному легкого (SCLC). В другом варианте осуществления рак легкого представляет собой бронхоальвеолярную карциному. В другом варианте осуществления рак легкого представляет собой карциноидную опухоль легкого.
В другом аспекте изобретение относится к способам распределения индивидуума со злокачественной опухолью, экспрессирующей FRα, в группы терапии злокачественной опухоли на основе установленного уровня FRα в образце. В предпочтительном варианте осуществления способ вовлекает распределение индивидуума со злокачественной опухолью, экспрессирующей FRα, в одну из по меньшей мере четырех групп лечения злокачественной опухоли. В других вариантах осуществления способ вовлекает распределение индивидуума со злокачественной опухолью, экспрессирующей FRα, в одну из по меньшей мере приблизительно двух, приблизительно трех, приблизительно четырех, приблизительно пяти, приблизительно шести, приблизительно семи, приблизительно восьми, приблизительно девяти или приблизительно десяти групп терапии злокачественной опухоли.
В соответствии с настоящим изобретением уровни FRα могут быть ассоциированы с тяжестью, т.е. стадией, злокачественной опухоли, экспрессирующей FRα. Например, рак яичника подразделяют на различные стадии, исходя из тяжести злокачественной опухоли, как указано в настоящем описании. Таким образом, настоящее изобретение относится к способам отнесения рака яичника к стадии I, например, стадии IA, стадии IB или стадии IC; стадии II, например, стадии IIA, стадии IIB или стадии IIC; стадии III, например, стадии IIIA, стадии IIIB или стадии IIIC; или стадии IV рака яичника.
SCLS или NSCLC можно распределять на различные стадии, исходя из тяжести злокачественной опухоли, как указано в настоящем описании. Таким образом, настоящее изобретение относится к способам отнесения рака легкого, например, SCLS или NSCLC, к латентной (скрытой) стадии; стадии 0; стадии I, например, стадиям IA и IB; стадии II, например, стадиям IIA и IIB; стадии III, например, стадиям IIIA и IIIB; или стадии IV рака легкого.
В другом аспекте настоящее изобретение основано, по меньшей мере частично, на обнаружении того, что FRα может служить в качестве предсказывающего биомаркера для лечения злокачественных опухолей, экспрессирующих FRα. В частности, способы по настоящему изобретению обеспечивают оценку того, будет ли индивидуум отвечать на лечение, например, MORAb-003, и того, начинать ли лечение и когда начинать лечение, например, MORAb-003, путем оценки уровней FRα у индивидуума.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу прогнозирования того, будет ли индивидуум, страдающий злокачественной опухолью, экспрессирующей FRα, например, раком яичника или раком легкого, отвечать на лечение MORAb-003, путем определения уровня рецептора фолиевой кислоты альфа (FRα), который не связан с клеткой, в образце, полученном от указанного индивидуума; и сравнения уровня рецептора фолиевой кислоты альфа (FRα), который не связан с клеткой, в образце, полученном от указанного индивидуума, с уровнем FRα в контрольном образце, где различие между уровнем FRα в образце, полученном от указанного индивидуума и уровень FRα в контрольном образце указывает на то, что индивидуум будет отвечать на лечение MORAb-003.
В определенных вариантах осуществления степень отличия между уровнями FRα, не связанного со злокачественной клеткой, в исследуемом образце по сравнению с контрольным образцом указывает на то, что индивидуум будет отвечать на лечение MORAb-003. Например, различие, по меньшей мере приблизительно в 2, приблизительно в 3, приблизительно в 4, приблизительно в 5, приблизительно в 6, приблизительно в 7, приблизительно в 8, приблизительно в 9, приблизительно в 10, приблизительно в 15, приблизительно в 20, приблизительно в 25, приблизительно в 100, приблизительно в 500, приблизительно в 1000 раз или более превышающее стандартную ошибку способа оценки указывает на то, что индивидуум будет отвечать на лечение MORAb-003. Альтернативно или в комбинации, различие по меньшей мере приблизительно на 5%, приблизительно на 10%, приблизительно на 15%, приблизительно на 20%, приблизительно на 25%, приблизительно на 30%, приблизительно на 40%, приблизительно на 50%, приблизительно на 60%, приблизительно на 70%, приблизительно на 80%, приблизительно на 90%, приблизительно на 100%, приблизительно на 150%, приблизительно на 200%, приблизительно на 300%, приблизительно на 400%, приблизительно на 500%, приблизительно на 600%, приблизительно на 700%, приблизительно на 800%, приблизительно на 900% или приблизительно на 1000% указывает на то, что индивидуум будет отвечать на лечение MORAb-003. Альтернативно или в комбинации, различие по меньшей мере приблизительно на 1,5, и более предпочтительно приблизительно на два, приблизительно на три, приблизительно на четыре, приблизительно на пять или более стандартных отклонений указывает на то, что индивидуум будет отвечать на лечение MORAb-003.
В различных вариантах осуществления антитело для лечения MORAb-003 представляет собой (a) антитело, которое связывает тот же эпитоп, что и антитело MORAb-003; или (b) антитело, содержащее SEQ ID NO: 1 (GFTFSGYGLS) в качестве CDRH1, SEQ ID NO: 2 (MISSGGSYTYYADSVKG) в качестве CDRH2, SEQ ID NO: 3 (HGDDPAWFAY) в качестве CDRH3, SEQ ID NO: 4 (SVSSSISSNNLH) в качестве CDR11, SEQ ID NO: 5 (GTSNLAS) в качестве CDR12 и SEQ ID NO: 6 (QQWSSYPYMYT) в качестве CDR13.
В различных вариантах осуществления образец представляет собой мочу, плазму, сыворотку или асцитную жидкость. В конкретных вариантах осуществления образец представляет собой мочу или сыворотку. В следующих вариантах осуществления злокачественная опухоль, экспрессирующая FRα, выбрана из группы, состоящей из рака легкого, мезотелиомы, рака яичника, рака почки, злокачественной опухоли головного мозга, рака шейки матки, рака носоглотки, плоскоклеточной карциномы головы и шеи, рака эндометрия, рака молочной железы, рака мочевого пузыря, рака поджелудочной железы, рака кости, рака гипофиза, рака ободочной и прямой кишки и медуллярного рака щитовидной железы. В конкретном варианте осуществления злокачественная опухоль, экспрессирующая FRα, представляет собой рак яичника. В другом варианте осуществления злокачественная опухоль, экспрессирующая FRα, представляет собой немелкоклеточный рак легкого, такой как аденокарцинома.
B. Анализы на основе антитела против FRα для выявления злокачественных опухолей, экспрессирующих FRα
Существуют различные формы анализов, известные средним специалистам в данной области, для использования антитела для выявления полипептида в образце, включая, но не ограничиваясь ими, твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), радиоиммунный анализ (RIA), иммунофлуориметрию, иммунопреципитацию, анализ в жидкой фазе, равновесный диализ, иммунодиффузию и другие способы. См., например, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; Weir, D. M., Handbook of Experimental Immunology, 1986, Blackwell Scientific, Boston. Например, анализ можно проводить в формате вестерн-блоттинга, где белковый препарат из биологического образца подвергают гель-электрофорезу, переносят на подходящую мембрану и позволяют реагировать с антителом. Затем присутствие антитела на мембране можно выявлять с использованием подходящего реагента для детекции, как хорошо известно в данной области и описано ниже.
В другом варианте осуществления анализ вовлекает применение антитела, иммобилизованного на твердой подложке, для связывания полипептида FRα-мишени и отделения его от остального образца. Затем связанный полипептид FRα можно выявлять с использованием второго антитела, реакционно-способного в отношении другой антигенной детерминанты полипептида FRα, например, реагента, который содержит поддающуюся детекции репортерную часть. В качестве неограничивающего примера, в соответствии с этим вариантом осуществления иммобилизованное антитело и второе антитело, которые распознают различные антигенные детерминанты, могут представлять собой любые два из моноклональных антител, описанных в настоящем описании, выбранных из MORAb-003, MOV18, 548908, 6D398 или их вариантов, как описано в настоящем описании. Альтернативно можно использовать конкурентный анализ, в котором FRα метят поддающейся детекции репортерной частью и позволяют связываться с иммобилизованным антителом против FRα после инкубации иммобилизованного антитела с образцом. Степень, с которой компоненты образца ингибируют связывание меченого полипептида с антителом, указывает на реакционную способность образца в отношении иммобилизованного антитела, и в результате указывает на уровень FRα в образце.
Твердая подложка может представлять собой любой материал, известный средним специалистам в данной области, с которым антитело может быть связано, такой как лунка для исследования в микропланшете для титрования, нитроцеллюлозный фильтр или другая подходящая мембрана. Альтернативно подложка может представлять собой гранулы или диск, такие как из стекла, стекловолокна, латекса или пластмассы, такой как полистирол или поливинилхлорид. Антитело может быть иммобилизовано на твердой подложке с использованием различных способов, известных специалистам в данной области, которые широко описаны в патентной и научной литературе.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления анализ для выявления FRα в образце представляет собой сэндвич-анализ с двумя антителами. Этот анализ можно проводить, сначала приводя в контакт специфичное к FRα антитело (например, MORAb-003, MOV18, 548908, 6D398 или их варианты, как описано в настоящем описании), иммобилизованное на твердой подложке, обычно на лунке микропланшета для титрования, с биологическим образцом, так чтобы обеспечить связывание растворимой молекулы, естественным образом встречающейся в образце и имеющей антигенную детерминанту, реагирующую с антителом, с иммобилизованным антителом (например, обычно достаточно времени инкубации 30 минут при комнатной температуре), с образованием комплекса антиген-антитело или иммунного комплекса. Затем не связавшиеся компоненты образца удаляют из иммобилизованных иммунных комплексов. Затем добавляют второе антитело, специфичное к FRα, где антигенсвязывающий центр вторичного антитела не ингибирует конкурентно связывание антигенсвязывающего центра иммобилизованного первого антитела с FRα (например, MORAb-003, MOV18, 548908, 6D398 или их варианты, как описано в настоящем описании, которое не является таким же, как моноклональное антитело, иммобилизованное на твердой подложке). Второе антитело может быть меченным поддающейся детекции меткой, как описано в настоящем описании, так что его можно прямо выявлять. Альтернативно второе антитело можно непрямо выявлять с использованием меченного поддающейся детекции меткой вторичного анти-антитела (или "второго этапа"), или с использованием специфического реагента для детекции, как описано в настоящем описании. Способ по настоящему изобретению не ограничивается какой-либо конкретной методикой детекции, поскольку тем, кто знаком с иммуноанализом, понятно, что существует множество реагентов и конфигураций для иммунологической детекции конкретного антигена (например, FRα) в сэндвич-иммуноанализе с двумя антителами.
2
В определенных предпочтительных вариантах осуществления изобретения, в которых используется сэндвич-анализ с двумя антителами, описанный выше, первым иммобилизованным антителом, специфичным к FRα, является поликлональное антитело, а вторым антителом, специфичным к FRα, является поликлональное антитело. В определенных других вариантах осуществления изобретения первым иммобилизованным антителом, специфичным к FRα, является моноклональное антитело, а вторым антителом, специфичным к FRα, является поликлональное антитело. В определенных других вариантах осуществления изобретения первое иммобилизованное антитело, специфичное к FRα, представляет собой поликлональное антитело, и второе антитело, специфичное к FRα, представляет собой моноклональное антитело. В определенных других вариантах осуществления изобретения первое иммобилизованное антитело, специфичное к FRα, представляет собой моноклональное антитело, и второе антитело, специфичное к FRα представляет собой моноклональное антитело. Например, следует отметить, что в этих вариантах осуществления моноклональные антитела MORAb-003, MOV18, 548908, 6D398 или их варианты, как описано в настоящем описании, описанные в настоящем описании, распознают различные и не конкурирующие антигенные детерминанты (например, эпитопы) на полипептидах FRα, так чтобы можно было использовать любую парную комбинацию этих моноклональных антител. В других предпочтительных вариантах осуществления изобретения первое иммобилизованное антитело, специфичное к FRα, и/или второе антитело, специфичное к FRα, может представлять собой любой из типов антител, известных в данной области и упоминаемых в настоящем описании, например, в качестве иллюстрации, а не для ограничения, Fab-фрагменты, F(ab')-фрагменты, слитые белки V-области иммуноглобулина или одноцепочечные антитела. Специалистам в данной области понятно, что настоящее изобретение охватывает применение других форм антител, фрагментов, производных и т.п. в способах, описанных и заявленных в настоящем описании.
В определенных особенно предпочтительных вариантах осуществления второе антитело может содержать поддающуюся детекции репортерную часть или метку, такую как фермент, краситель, радионуклид, люминесцентная группа, флуоресцентная группа, или сходные с ними. Затем определяют количество второго антитела, которое остается связанным с твердой подложкой, с использованием способа, подходящего для конкретной поддающейся детекции репортерной части или метки. Для радиоактивных групп, обычно является пригодным сцинтилляционный подсчет или способы радиоавтографии. Конъюгаты антитело-фермент можно получать с использованием различных способов присоединения (для обзора см., например, Scouten, W. H., Methods in Enzymology 135:30-65, 1987). Для выявления красителей (включая, например, колориметрические продукты ферментативных реакций) можно использовать спектроскопические способы, люминесцентные группы и флуоресцентные группы. Детекцию биотина можно проводить с использованием авидина или стрептавидина, связанного с отличающейся репортерной группой (обычно радиоактивной или флуоресцентной группой или ферментом). Ферментные репортерные группы, как правило, можно выявлять путем добавления субстрата (как правило, в течение определенного периода времени), с последующим спектроскопическим, спектрофотометрическим или другим анализом продуктов реакции. Для определения уровня полипептида мезотелина в образце можно использовать стандарты и стандартные добавки с использованием хорошо известных способов.
Способ скрининга наличия злокачественной опухоли, экспрессирующей FRα, в соответствии с настоящим изобретением можно далее усиливать путем определения более одного ассоциированного с опухолью маркера в биологическом образце от индивидуума. Таким образом, в определенных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу скрининга, который, в дополнение к выявлению реактивности FRα, не связанного с клеткой, также включает определение по меньшей мере одного дополнительного растворимого маркера злокачественного состояния с использованием общепринятых способов, известных в данной области и представленных в настоящем описании. Как отмечалось выше, в настоящее время существует ряд растворимых ассоциированных с опухолью антигенов, которые поддаются детекции в образцах легко получаемых биологических жидкостей.
C. Наборы по изобретению
Изобретение также относится к наборам для оценки того, страдает ли индивидуум злокачественной опухолью, экспрессирующей FRα, для оценки прогрессирования злокачественной опухоли, экспрессирующей FRα, для оценки уровня риска того, что у индивидуума разовьется злокачественная опухоль, экспрессирующая FRα, или для мониторинга эффективности терапии или режима лечения злокачественной опухоли, экспрессирующей FRα. Эти наборы включают средства для определения уровня экспрессии FRα и инструкции по применению набора для оценки прогрессирования злокачественной опухоли, экспрессирующей FRα, для оценки уровня риска того, что у индивидуума разовьется злокачественная опухоль, экспрессирующая FRα, или для мониторинга эффективности терапии или режима лечения злокачественной опухоли, экспрессирующей FRα.
Наборы по изобретению необязательно могут содержать дополнительные компоненты, пригодные для проведения способов по изобретению. В качестве примера наборы могут содержать средства для получения образца от индивидуума, контрольного образца, например, образца от индивидуума, имеющего медленно прогрессирующую злокачественную опухоль и/или индивидуума, не имеющего злокачественной опухоли, одно или несколько отделений для образца, и инструкции, в которых описано проведение способа по изобретению, и тканеспецифические контроли/стандарты.
Средства для определения уровня FRα включают известные в данной области способы оценки уровней белков, как рассмотрено выше, и, в конкретных предпочтительных вариантах осуществления, например, с использованием антитела MORAb-003, как описано в настоящем описании. Таким образом, например, в одном варианте осуществления уровень FRα оценивают путем приведения в контакт образца, полученного от индивидуума, (такого как моча или сыворотка) со связывающим рецептор фолиевой кислоты альфа (FRα) агентом. В предпочтительном варианте осуществления связывающий агент представляет собой антитело. Многие из типов антител, которые связывают FRα, рассмотрены выше и их также можно использовать в наборах по изобретению.
Средства для определения уровня FRα, кроме того, могут включать, например, буферы или другие реагенты для применения в анализе для определения уровня FRα. Инструкции могут представлять собой, например, напечатанные инструкции для проведения анализа и/или инструкции для оценки уровня экспрессии FRα.
Наборы по изобретению также могут включать средства для взятия образца от индивидуума. Эти средства могут включать один или несколько приспособлений или реагентов, которые можно использовать для получения жидкости или ткани от индивидуума. Средства для получения образца от индивидуума также могут включать средства для выделения компонентов крови, таких как сыворотка, из образца крови. Предпочтительно, набор предназначен для применения у человека.
III. Скрининговые анализы
В следующих вариантах осуществления изобретение также относится к способам (также называемым в настоящем описании "скрининговыми анализами") для идентификации модуляторов, т.е. являющихся кандидатами или исследуемых соединений или агентов (например, белков, пептидов, пептидомиметиков, пептоидов, низкомолекулярных или других лекарственных средств), которые модулируют рост, прогрессирование и/или агрессивность злокачественной опухоли, например, злокачественной опухоли, экспрессирующей FRα, или злокачественной клетки, например, клетки рака яичника, путем мониторинга и сравнения уровней FRα в образце. Такие анализы, как правило, включают исследуемое соединение или комбинацию исследуемых соединений, активность которых против злокачественной опухоли или злокачественной клетки предстоит оценивать. Соединения, идентифицированные с помощью анализов, таких как анализы, описанные в настоящем описании, могут быть пригодны, например, для модулирования, например, ингибирования, смягчения, лечения или предупреждения агрессивности злокачественной опухоли, экспрессирующей FRα, или злокачественной клетки, например, клетки рака яичника. Путем мониторинга уровня FRα в образце можно определить, является ли злокачественная опухоль, экспрессирующая FRα, прогрессирующей или регрессирующей, и имеет ли исследуемое соединение желаемый эффект. Например, в вариантах осуществления, где злокачественная опухоль, экспрессирующая FRα, представляет собой злокачественную опухоль, для которой более высокие уровни FRα ассоциированы с худшим прогнозом, снижение уровня FRα после введения исследуемого соединения(ий) указывает на эффективность исследуемого соединения. Напротив, увеличение уровня FRα после введения исследуемого соединения(ий) указывает на то, что исследуемое соединение не является эффективным для лечения рака яичника. В противоположность этому, в вариантах осуществления, где злокачественная опухоль, экспрессирующая FRα, представляет собой злокачественную опухоль, для которой более высокие уровни FRα ассоциированы с лучшим прогнозом, увеличение уровня FRα после введения исследуемого соединения(ий) указывало бы на эффективность исследуемого соединения. Напротив, снижение уровня FRα после введения исследуемого соединения(ий) указывает на то, что исследуемое соединение не является эффективным при лечении рака яичника.
Исследуемые соединения, используемые в скрининговых анализах по настоящему изобретению, можно получать из любого доступного источника, включая систематические библиотеки природных и/или синтетических соединений. Исследуемые соединения также можно получать с помощью любого из многочисленных подходов в способах комбинаторных библиотек, известных в данной области, включая биологические библиотеки; пептоидные библиотеки (библиотеки молекул, имеющих функциональность пептидов, но с новым непептидным каркасом, которые являются устойчивыми к ферментативной деградации, но которые, тем не менее, остаются биологически активными; см., например, Zuckermann et al., 1994, J. Med. Chem. 37:2678-85); пространственно-адресуемые параллельные твердофазные или жидкофазные библиотеки; способы синтетических библиотек, требующие обратной свертки; способ библиотеки “одна гранула - одно соединение”; и способы синтетических библиотек с использованием селекции с помощью аффинной хроматографии. Подходы биологических библиотек и пептоидных библиотек ограничены пептидными библиотеками, в то время как другие четыре подхода применимы к пептидным, непептидным олигомерным или низкомолекулярным библиотекам соединений (Lam, 1997, Anticancer Drug Des. 12: 145).
Примеры способов синтез молекулярных библиотек могут быть найдены в материалах уровня техники, например в: DeWitt et al. (1993) Pwc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6909; Erb et al. (1994) Pwc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11422; Zuckermann et al. (1994). J. Med. Chem. 37:2678; Cho et al. (1993) Science 261: 1303; Carrell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061; и in Gallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37: 1233.
Библиотеки соединений могут быть представлены в растворе (например, Houghten, 1992, Biotechniques 13:412-421), или на гранулах (Lam, 1991, Nature 354:82-84), чипах (Fodor, 1993, Nature 364:555-556), бактериях и/или спорах, (Ladner, USP 5223409), плазмидах (Cull et al, 1992, Pwc Natl Acad Sci USA 89: 1865-1869) или на фаге (Scott и Smith, 1990, Science 249:386-390; Devlin, 1990, Science 249:404-406; Cwirla et al, 1990, Pwc. Natl. Acad. Sci. 87:6378-6382; Felici, 1991, J. Mol. Biol. 222:301-310; Ladner, выше.).
Настоящее изобретение далее иллюстрируются с помощью следующих примеров, которые не следует истолковывать как дополнительно ограничивающие. Содержание всех ссылок, патентов и опубликованных патентных заявок, цитированных на протяжении настоящей заявки, а также фигур, включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
ПРИМЕРЫ
ПРИМЕР 1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ УРОВНЕЙ FRα В ОБРАЗЦАХ МОЧИ ЛЮДЕЙ С РАКОМ ЯИЧНИКА И БЕЗ НЕГО ПРИ ИЗМЕРЕНИИ С ПОМОЩЬЮ ЭЛЕКТРОХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНТНОГО ИММУНОАНАЛИЗА (ECLIA)
Материалы и способы
Образцы мочи получали от людей, включавших индивидуумов, страдающих раком яичника, и нормальных контрольных индивидуумов, не страдающих раком яичника. Уровни FRα в образцах мочи определяли с использованием электрохемилюминесцентного иммунанализа (ECLIA) по следующей методике (см. Namba et al. (1999) Analytical Science 15: 1087-1093):
i. Покрытие антителом микрогранул
Моноклональным антителом против рецептора фолиевой кислоты альфа покрывали поверхность микрогранул (Dynabeads M-450 Epoxy, Dynal). Тридцать шесть миллиграмм микрогранул смешивали с 1,2 мл антитела MOV18 (0,36 мг/мл, Enzo Life Science) в 0,15 моль/л фосфатно-солевого буфера, pH 7,8 (PBS), с последующим осторожным перемешиванием в течение 16 часов при комнатной температуре. Затем микрогранулы промывали 5 раз 50 мМ буфером HEPES, содержавшим 0,1% нормальную сыворотку кролика (NRS), 150 моль/л NaCl, 0,01% Tween 20 pH 7,5 (промывочный буфер). После этого покрытые микрогранулы суспендировали в 1,2 мл 50 мМ буфера HEPES, содержавшего 20% NRS, 150 ммоль/л NaCl и 0,01% Tween 20 pH 7,5 (реакционный буфер) для блокирования несвязанной поверхности, а затем осторожно перемешивали в течение 3,5 часов при комнатной температуре. Наконец, микрогранулы промывали 5 раз промывочным буфером и ресуспендировали в 1,2 мл 50 мМ буфера HEPES, содержавшего 10% NRS, 150 ммоль/л NaCl, 10 ммоль/л EDTA-2Na и 0,01% Tween 20 pH 7,5 (реакционный буфер) так, чтобы концентрация микрогранул составляла 30 мг/мл. Микрогранулы хранили при 4°C до применения.
ii. Антитело с помощью хелата рутения с NHS (Ru)
Один миллилитр MORAB-003 (1 мг/мл) в PBS смешивали с 14 мкл Ru (10 мг/мл), исходное молярное соотношение антитела и Ru составляло 1:20, с последующим встряхиванием в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте. Реакцию завершали добавлением 25 мкл 2 моль/л раствора глицина с последующей инкубацией в течение 20 минут. Меченое антитело очищали гель-фильтрацией с использованием Sephadex G-25 (GE Healthcare), элюируя PBS. Первую элюированную желтую фракцию собирали и определяли концентрацию антитела и Ru с помощью набора для анализа белков Pierce BCA (Thermo Scientific), и поглощение при 455 нм соответственно. Конечное молярное отношение вычисляли по формуле: конечное молярное отношение = [(поглощение при 455)/13700]/[Ab(мг/мл/150000)]. Меченое антитело хранили при 4°C до применения.
iii. Одностадийный иммуноанализ
Покрытые антителом микрогранулы помещали на столик для реагентов Picolumi 8220 (Sanko, Tokyo, Япония) после доведения концентрации гранул до 1,5 мг/мл (рабочий раствор) в реакционном буфере. Меченное Ru антитело помещали на столик для реагентов Picolumi 8220 после доведения концентрации антитела до 2 мкг/мл (рабочий раствор) в реакционном буфере.
Десять микролитров мочи (разбавленных 1:51 в реакционном буфере) или стандартный FRα (приготовленный в реакционном буфере) и 100 мкл реакционного буфера добавляли в реакционную пробирку (Sanko, Tokyo, Япония) и помещали в Picolumi 8220.
Следующие стадии автоматически проводили на Picolumi 8220. Распределяли двадцать пять микролитров гранул (рабочий раствор) и 180 мкл меченного Ru антитела (рабочий раствор). После инкубации в течение 26 минут при 30 +/-2°C, гранулы промывали и суспендировали с 300 мкл раствора электролитов (Sanko, Tokyo, Япония). Промытые гранулы затем переносили на электрод и измеряли испускание электрохемилюминесценции (ECL).
Все измерения ECL проводили в двух экземплярах.
Результаты
В таблице 1 представлены уровни в моче FRα у отдельных индивидуумов с раком яичника и здоровых контрольных женщин.
На фиг.2 представлено распределение уровней FRα в моче у индивидуумов с раком яичника и у здоровых контрольных женщин, как указано в таблице 1.
В таблице 2 обобщенно представлено количество индивидуумов (n), среднее значение, стандартное отклонение (SD), максимальные (Max.) и минимальные (Мин.) величины уровней FRα в группе рака яичника и контрольной группе здоровых женщин.
Обсуждение
В моче индивидуумов с раком яичника был выявлен высокий уровень FRα. Более того, уровни FRα значимо отличались между группами рака яичника и здоровых контрольных женщин (p=0,03, односторонний).
ПРИМЕР 2. ЛИНЕЙНОСТЬ РАЗВЕДЕНИЯ - ОПРЕДЕЛЕНИЕ УРОВНЕЙ FRα В СЕРИЙНО РАЗБАВЛЕННЫХ ОБРАЗЦАХ МОЧИ, ИЗМЕРЕННЫХ С ПОМОЩЬЮ АНАЛИЗА ЭЛЕКТРОХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ (ECLIA)
Линейность разведения является показателем точности анализа. Два образца мочи подвергали серийным разведением с коэффициентом 10 и 100. Уровни FRα каждого образца измеряли, как указано в примере 1, и сравнивали для оценки процентной ошибки. процентную ошибку вычисляли следующим образом:
Результаты представлены в таблице 3:
<b>Таблица 3</b>
<b>Линейность разведения для мочи</b>
<b>Образец</b>
<b>Фактор разведения</b>
<b>FRα (пг/мл)</b>
<b>Ошибка (%)</b>
1
1
25037
-
10
2601
4
100
279
11
2
1
16649
-
10
1696
2
100
173
4
Указанные выше результаты демонстрируют линейность разведения при оценке уровней FRα в образцах мочи человека и то, что, в пределах приемлемых ошибок, мочу можно разбавлять вплоть до меньшей мере 100 раз при сохранении точных уровней FRα. Таким образом, перед определением уровней FRα можно предусмотреть разведение образцов мочи.
ПРИМЕР 3: ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ ОБРАЗЦОВ МОЧИ - РЕШЕНИЕ ПРОБЛЕМЫ ВОСПРОИЗВОДИМОСТИ
Также исследовали воспроизводимость анализа ECLIA для конкретного образца мочи. Например, как представлено в таблице 4, анализы ECLIA одного и того же образца приводили к варьирующим результатам.
<b>Таблица 4</b>
<b>Воспроизводимость без центрифугирования образца</b>
<b>Количество импульсов ECL</b>
<b>Образец</b>
<b>Исследование 1</b>
<b>Исследование 2</b>
1
29380
15046
2
20912
17227
Было предположено, что присутствие нерастворимого материала (преципитатов) в образцах мочи является ответственным за вариабельность, наблюдаемую измерении уровней FRα. В результате в качестве возможности повышения точности и воспроизводимости анализа рассматривали центрифугирование образцов для удаления осадка в моче, перед измерением уровней FRα.
В таблице 5 представлены результаты, полученные, когда три образца центрифугировали перед проведением анализа ECLIA.
<b>Таблица 5</b>
<b>Воспроизводимость при центрифугировании образца</b>
<b>Концентрация FRα (нг/мл)</b>
<b>Исследование</b>
<b>Образец 1</b>
<b>Образец 2</b>
<b>Образец 3</b>
<b>1</b>
10,4
9,2
13,3
<b>2</b>
10,5
8,9
14,0
<b>3</b>
10,3
9,2
13,4
<b>Среднее значение</b>
10,4
9,1
13,6
<b>SD</b>
0,1
0,1
0,3
<b>CV (%)</b>
1,0
1,1
2,2
Как указано выше, результаты указывают на то, что центрифугирование обеспечило более единообразные показатели концентрации FRα.
Кроме того, два образца подвергали (i) центрифугированию (при 2000×g в течение 2 мин) и супернатант извлекали для измерения FRα (представлено как образец "A" ниже в таблице 6) и (ii) центрифугированию с последующим встряхиванием (представлено как образец "B" ниже в таблице 6), перед измерением уровней FRα с помощью анализа ECLIA, описанного в примере 1. Результаты представлены в таблице 6 ниже.
<b>Таблица 6</b>
<b>Эффект центрифугирования на уровни FRα в моче</b>
<b>Образец</b>
<b>Осадок после центрифугирования</b>
<b>A/B</b>
<b>FRα (пг/мл)</b>
<b>Отличие (%)</b>
1
Да (++)
A
13678
-
B
16559
21
2
Да (+)
A
12271
-
B
13206
8
Отличие (%) определяли следующим образом:
Как представлено в таблице 6, уровни FRα при определении с помощью анализа ECLIA варьируют, в зависимости от того, очищали ли мочу центрифугированием для удаления осадка или встряхивали ли мочу для суспендирования или диспергирования осадка. Таким образом, в определенных вариантах осуществления перед определением уровней FRα можно проводить центрифугирование или встряхивание образцов мочи.
ПРИМЕР 4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ УРОВНЕЙ FRα В ЦЕНТРИФУГИРОВАННЫХ ОБРАЗЦАХ МОЧИ ОТ ЛЮДЕЙ С РАКОМ ЯИЧНИКА И БЕЗ НЕГО, ИЗМЕРЕННЫХ С ПОМОЩЬЮ АНАЛИЗА ЭЛЕКТРОХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ (ECLIA).
Основываясь на результатах примера 3, анализ для оценки уровней FRα у индивидуумов модифицировали добавлением стадии центрифугирования. Уровни FRα определяли в тех же образцах, что использовали в примере 1, включая группу индивидуумов с раком яичника и группу контрольных здоровых женщин.
Материалы и способы
Использованная методология была такой, как описано в примере 1, за исключением того, что образцы мочи центрифугировали в течение 10000×g в течение 1 минуты и полученный супернатант затем разбавляли 1:51 в реакционном буфере.
Результаты
В таблице 7 представлены уровни FRα в центрифугированных и нецентрифугированных образцах мочи от индивидуумов, страдающих раком яичника, и здоровых контрольных женщин.
В соответствии с результатами, представленными в таблице 7, центрифугирование приводило к снижению показателей уровней FRα в некоторых образцах, как ранее было продемонстрировано в таблице 6.
ПРИМЕР 5: ВЫЯВЛЕНИЕ FRα В ОСАДКЕ МОЧИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИММУНОБЛОТТИНГА
Исходя из результатов, представленных в примерах 3 и 4, присутствие или отсутствие FRα в осадке/преципитате мочи оценивали с использованием вестерн-блоттинга.
Материалы и способы
Образцы мочи от 2 пациентов с раком яичника, для которых концентрации FRα были измерены как 18,747 пг/мл и 145,564 пг/мл, соответственно (см таблицу 10 выше), подвергали следующим процедурам. Контрольные образцы состояли из 10 мкг лизата клеток HeLa, 20 мкг лизата ткани печени и 20 мкг лизата ткани рака яичника.
- 900 мкл мочи центрифугировали в течение 2 минут при 10000g
- супернатант удаляли
- оставшийся осадок растворяли в 15 мкл буфера для образца PAGE (содержавшего 292 мМ LDS), а затем кипятили при 70°C в течение 10 мин
- Весь образец (приблизительно 20 мкл) наносили на бис-трис гель NuPAGE (Invitrogen)
- После электрофореза, белки переносили на мембрану PVDF
- Добавляли 1% обезжиренное молоко/0,05% Tween 20/PBS для блокирования
- Мембрану промывали 0,05% Tween 20/PBS
- Добавляли 0,5 мл моноклонального антитела 548908 (R&D Systems) при 2 мкг/мл и инкубировали в течение 60 минут при комнатной температуре
- Мембрану промывали 0,05% Tween 20/PBS
- Добавляли 10 мл антитела против IgG мыши-HRP (DAKO p0447, 1:2000) и позволяли инкубироваться в течение 60 минут
- Мембрану промывали 0,05% Tween 20/PBS
- К мембране добавляли субстрат Pierce ECL Substrate
- Мембрану извлекали из субстрата, а затем визуализировали с использованием системы LAS-3000 (FUJIFILM)
Результаты
Полученный иммуноблот представлен на фиг.3. На этой фигуре дорожки 1-5 соответствуют выявленному FRα из следующих источников:
(1) моча от пациента с раком яичника с измеренным уровнем FRα 18,747 пг/мл
(2) моча пациента с раком яичника с измеренным уровнем FRα 145,564 пг/мл
(3) Лизат клеток HeLa: 10 мкг
(4) Лизат ткани печени: 20 мкг
(5) Лизат ткани рака яичника: 20 мкг
На дорожке 6 на вестерн-блоте представлены маркеры молекулярной массы и показано, что наблюдаемая полоса на дорожках 1, 2, 3 и 5 располагается на уровне ожидаемой молекулярной массы для FRα.
Дорожки 3 и 5 представляют собой образцы положительного контроля, и дорожка 4 представляет собой образец отрицательного контроля. Слабая полоса на дорожке 1 и четкая полоса на дорожке 2 демонстрируют, что FRα может быть выявлен в осадке мочи пациентов с раком яичника с использованием вестерн-блоттинга.
ПРИМЕР 6. ОПРЕДЕЛЕНИЕ УРОВНЕЙ FRα В ОБРАБОТАННЫХ ГУАНИДИНОМ ОБРАЗЦАХ НОРМАЛЬНОЙ МОЧИ ЧЕЛОВЕКА С ПОМОЩЬЮ ЭЛЕКТРОХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНТНОГО ИММУНОАНАЛИЗА (ECLIA)
Основываясь на результатах примера 4, в котором центрифугирование приводило к сниженным уровням FRα, и результатам примера 5, где показано, что осадок мочи, полученный после центрифугирования, содержит иммунореактивный FRα, проводили поиск способов для солюбилизации осадка в моче для получения более количественных и точных показателей FRα.
В этом отношении проводили обработку образцов мочи здоровых женщин гуанидином перед оценкой уровней FRα.
Использованная методология была такой, как описано в примере 1, за исключением того, что образцы мочи в соотношении 1:1 либо с 6 M гуанидином в буфере (PBS), либо с буфером отдельно. Затем образцы мочи разбавляли 1:51 в реакционном буфере.
Результаты этого анализа представлены в таблице 8.
<b>Таблица 8</b>
<b>Уровень FRα в нормальной моче с обработкой гуанидином или без нее</b>
<b>Образец</b>
<b>Обработка гуанидином</b>
<b>FRα (пг/мл)</b>
Std Ag
Да
83964
Нет
82512
Нормальная моча
1
Да
9431
Нет
7796
2
Да
5713
Нет
4066
3
Да
9687
Нет
9428
Результаты этого эксперимента указывают на то, что гуанидин не препятствует измерению FRα. Как можно видеть для контроля в виде чистого антигена (Std Ag), эта методология обработки гуанидином и последующего разведения не оказывала эффекта на измерение FRα. Кроме того, следует отметить, что во всех трех (3) оцененных образцах мочи уровни FRα были более высокими в образцах, обработанных (солюбилизированных) гуанидином, относительно образцов, не обработанных гуанидином.
Надежность предварительной обработки гуанидином образцов мочи далее оценивали путем воздействия на три образца гуанидина и измерения концентрации FRα в каждом образце, обработанном гуанидином, 3 раза с использованием анализа ECLIA. Результаты представлены в таблице 9 ниже:
<b>Таблица 9</b>
<b>Воспроизводимость для мочи, обработанной гуанидином, внутри одного анализа</b>
<b>Концентрация FRα (нг/мл)</b>
<b>Исследование</b>
<b>Образец 1</b>
<b>Образец 2</b>
<b>Образец 3</b>
<b>1</b>
9210
5477
9889
<b>2</b>
9638
5405
10047
<b>3</b>
10192
5812
10944
<b>Среднее значение</b>
9680
5565
10293
<b>SD</b>
492
217
569
<b>CV (%)</b>
5,1
3,9
5,5
Как указано выше, результаты указывают, что обработка мочи гуанидином перед анализом FRα обеспечила единообразные показатели концентрации FRα с очень низкими CV.
ПРИМЕР 7. ОПРЕДЕЛЕНИЕ УРОВНЕЙ FRα В ОБРАБОТАННЫХ ГУАНИДИНОМ ОБРАЗЦАХ МОЧИ ОТ ЛЮДЕЙ С РАКОМ ЯИЧНИКА И БЕЗ НЕГО, ИЗМЕРЕННЫХ С ПОМОЩЬЮ ЭЛЕКТРОХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНТНОГО ИММУНОАНАЛИЗА (ECLIA).
Основываясь на результатах примера 6, в котором было показано, что обработка гуанидином не препятствует анализам FRα, использовали модифицированный протокол анализа для измерения FRα в образцах мочи от индивидуумов с раком яичника и без него из примера 1.
Использовали следующий протокол анализа:
Материалы и способы
Использованная методология была такой, как описано в примере 1, за исключением того, что образцы мочи смешивали в соотношении 1:1 с 6M гуанидиновым буфером, а затем разбавляли 1:26 в реакционном буфере.
Результаты
В таблице 10 представлены уровни FRα в обработанных гуанидином образцах мочи от индивидуумов, страдающих раком яичника, и здоровых контрольных женщин.
На фиг.4 представлено распределение уровней FRα в моче индивидуумов, страдающих раком яичника, и здоровых контрольных женщин с использованием модифицированного протокола с обработкой гуанидином. Наблюдали статистически значимое отличие между группами. В таблице 11 обобщенно представлены эти результаты.
<b>Таблица 11</b>
<b>Обобщение показателей FRα в моче</b>
<b>FRα (пг/мл)</b>
<b>Рак яичника</b>
<b>Нормальный контроль</b>
n
19
10
Среднее значение
28557
7749
SD
34990
5850
Max.
145564
20976
Min.
285
2617
С использованием данных из этого эксперимента проводили анализ зависимости чувствительности от частоты ложноположительных заключений (ROC). На фиг.5 представлена ROC-кривая чувствительности и специфичности измерения с помощью ECLIA уровней FRα в моче после обработки мочи гуанидином. AUC представляет собой площадь под кривой, которая является мерой точности исследования при отделении индивидуумов с раком яичника от контрольных индивидуумов.
При использовании произвольной пороговой величины 9100 пг FRα/мл, AUC составляла 0,70 с положительной предсказательной величиной 70% и отрицательной предсказательной величиной 80%, как представлено в таблице 12. При использовании этой пороговой величины 15/19 пациентов с раком яичника имели концентрацию FRα выше 9100 пг/мл и 8/10 нормальных индивидуумов имели концентрацию FRα менее 9100 пг/мл.
<b>Таблица 12</b>
<b>Обработка гуанидином для измерения в моче</b>
<b>Рак яичника</b>
<b>Контроль</b>
Количество образцов
19
10
Положительные
15
2
Предсказательная величина (%)
78,9
80,0
ПРИМЕР 8: ПОПРАВКА НА КРЕАТИНИН КОНЦЕНТРАЦИЙ FRα, ОПРЕДЕЛЕННЫХ В ОБРАБОТАННЫХ ГУАНИДИНОМ ОБРАЗЦАХ МОЧИ С ПОМОЩЬЮ ЭЛЕКТРОХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНТНОГО АНАЛИЗА (ECLIA)
Концентрации FRα предварительно определяли с использованием ECLIA для обработанных гуанидином образцов мочи от пациентов с раком яичника и здоровых контрольных женщин (см. пример 7, таблица 10). В этом примере, эти в концентрации FRα вносили поправку на уровни креатинина в моче для нормализации по уровню гломерулярной фильтрации. Полученные величины подвергали ROC-анализу.
Способы
Уровень креатинина в моче определяли с помощью тест-набора, одобренного Ministry of Health, Labour and Welfare, Determiner L CRE (Kyowa Medex, Япония). Скорректированную величину для концентрации FRα в моче вычисляли следующим образом:
Поправка FRα на креатинин в моче (нг/г)
= (FRα в моче (нг/л) × 1000)/(креатинин в моче (мг/дл)×10)
= (FRα в моче (нг/л) × 1000)/креатинин в моче (мг/л)
= FRα в моче (нг/л)/креатинин в моче (г/л)
= FRα в моче (нг)/креатинин в моче (г)
или
= 1/1000×FRα (мкг) в моче/креатинин (г) в моче
Результаты
В таблице 13 представлены полученные уровни FRα с поправкой на креатинин.
На фиг.6 представлено распределение уровней FRα у индивидуумов с раком яичника (OC) и здоровых контрольных женщин после поправки на уровни креатинина в моче. Существует статистически значимое отличие между пациентами с раком яичника и контролями в уровнях FRα с поправкой на креатинин (p=0,007).
Обобщенные данные для индивидуумов с раком яичника и здоровых контрольных индивидуумов представлены в таблице 14.
<b>Таблица 14</b>
<b>Обобщенная статистика для уровней FRα с поправкой на креатинин</b>
<b>FRα (пг/мл)</b>
<b>Рак яичника</b>
<b>Нормальный контроль</b>
n
18
9
Среднее значение
18,9
6,9
SD
17,9
3,9
Max.
66,0
13,8
Min.
0,6
1,9
Уровни FRα с поправкой на креатинин далее подвергали ROC-анализу. ROC-кривая представлена на фиг.7. В таблице 15 представлена чувствительность, специфичность и площадь под кривой (AUC) для различных пороговых величин в исследовании с поправкой на креатинин.
<b>Таблица 15</b><b>Чувствительность, специфичность и AUC для различных пороговых величин в исследовании FRα с поправкой на креатинин</b>
<b>Пороговое значение</b>
<b>Чувствительность</b>
<b>Специфичность</b>
<b>AUC</b>
3,0
94,4%
11,1%
0,67
4,0
94,4%
22,2%
0,70
5,0
94,4%
44,4%
0,78
6,0
88,9%
44,4%
0,74
9,0
66,7%
77,8%
0,70
Как отмечалось выше, существует четкое отличие между мочой пациентов с раком яичников и мочой от здоровых контрольных женщин.
ПРИМЕР 9: ФЕРМЕНТНЫЙ ИММУНОАНАЛИЗ (EIA) И ЕГО ОПТИМИЗАЦИЯ
1. Ферментный иммуноанализ (EIA)
Покрытие антителом микропланшетов для титрования
Моноклональным антителом против рецептора фолиевой кислоты альфа покрывали поверхность микропланшетов для титрования (Nunc-immunoplate, Thermo Scientific) следующим образом. Сто микролитров антитела (поглощение 0,02 при 280 нм) в 50 ммоль/л карбонатного буфера, pH 9,4, распределяли в лунки с последующим их покрытием в течение 16 часов при 4°C. Затем микропланшеты промывали 2 раза PBS, содержащим 0,05% Tween20 (PBS-T). После этого 0,15 мл PBS, содержавшего 20% нормальную сыворотку кролика, pH 7,8, распределяли в лунки для блокирования несвязанной поверхности, а затем блокировали в течение 1 часа при комнатной температуре. Наконец, микропланшеты промывали 2 раза PBS-T. Покрытые антителом планшеты сушили и хранили при 4°C в алюминиевых мешках до применения.
Мечение биотином
Мечение биотином проводили в соответствии с рекомендациями изготовителей для сульфо-NHS-LC-LC-биотина EZ-Link (продукт № 21338, Thermo Scientific). В кратком изложении, 1 мг антитела в 0,4 мл PBS смешивали с 0,013 мл 10 мМ сульфо-NHS-LC-LC-биотина, с исходным молярным соотношением антитела и биотина 1:20, а затем инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. Связанное с биотином антитело очищали гель-фильтрацией с использованием колонки PD-10 (GE Healthcare), элюируя PBS для удаления не вступившего в реакцию биотина. Для определения уровня включения биотина использовали набор для количественного определения биотина EZ Biotin quantitation kit (продукт № 28005, Thermo Scientific). Антитело, меченное биотином, хранили при -80°C до применения.
Двухстадийный иммуноанализ
Для первой реакции 40 мкл плазмы или стандартного антигена и 60 мкл 50 мМ буфера HEPES, содержавшего 10% NRS, 150 ммоль/л NaCl, 10 ммоль/л EDTA-2Na, 0,01% Tween 20 pH 7,5 (реакционный буфер) распределяли в покрытые антителом лунки. Планшет инкубировали в течение 18 часов при 4°C, а затем промывали 5 раз PBS-T. Для второй реакции распределяли 100 мкл меченного биотином антитела в концентрации 10 мкг/мл в реакционном буфере. Планшет инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре, а затем промывали 5 раз PBS-T. Распределяли 100 мкл меченного пероксидазой хрена стрептавидина (Pierce). После инкубации в течение 30 минут при комнатной температуре планшеты промывали 5 раз PBS-T. Наконец, для проявления цвета 100 мкл раствора TMB (KPL) распределяли и оставляли на 15 минут в темноте. После остановки проявления цвета путем добавления 100 мкл 1 Н HCl, проводили считывание поглощения при 450 нм с использованием устройства для считывания планшетов. Все стадии промывания проводили автоматические с помощью автоматического устройства для промывания планшетов (AMW-8, BioTec, Япония), и все измерения EIA проводили в двух экземплярах.
На фиг.8 представлен анализ EIA с использованием MOV18 в качестве улавливающего антитела и биотинилированного MORAb-003 в качестве детекторного антитела.
2. Оптимизация методик EIA
Описанные выше методики EIA частично были установлены, основываясь на следующих экспериментах, предназначенных для оптимизации методики.
Во-первых, сравнивали авидин-HRP, меченное биотином антитело и меченное HRP антитело. По сравнению с меченным HRP антителом, меченное биотином антитело и авидин-HRP обеспечивали более высокий сигнал; таким образом, использовали меченное биотином антитело и авидин-HRP.
Во-вторых, сравнивали одностадийную и двухстадийную методики инкубации. Как представлено на фиг.9, двухстадийная методика инкубации обеспечивала более высокий сигнал, и таким образом, использовали ее.
В-третьих, для оптимизации второго времени инкубации, сравнивали время инкубации от одного до четырех часов. Результаты показали, что время инкубации один час обеспечивало наиболее высокое отношение сигнала к шуму, и, таким образом, использовали время инкубации один час.
В-четвертых, для оптимизации рабочей концентрации меченного биотином антитела, меченного HRP антитела и объема образца, использовали различные концентрации, как указано в представленном выше описании анализа EIA. Оптимальные величины концентраций описаны выше.
ПРИМЕР 10: СРАВНЕНИЕ FRα В ПЛАЗМЕ ЧЕЛОВЕКА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЭЛЕКТРОХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНТНОГО ИММУНОАНАЛИЗА (ECLIA) И ФЕРМЕНТНОГО ИММУНОАНАЛИЗА (EIA)
Уровни FRα измеряли в образцах плазмы человека, взятых от пациентов с раком яичника и здоровых контрольных женщин с использованием электрохемилюминесцентного анализа (ECLIA), описанного в примере 1 и на фиг.1 (с использованием MORAb-003 в качестве улавливающего антитела и меченного рутением (Ru) MOV-18 в качестве меченого детекторного антитела) и ферментного иммуноанализа (EIA), описанного в примере 9 и на фиг.8. В обоих анализах анализировали 40 мкл плазмы.
В таблице 16 представлены уровни FRα в плазме у индивидуумов с раком яичника и нормальных контрольных индивидуумов при определении с использованием EIA и ECLIA.
<b>Таблица 16</b>
<b>Концентрации FRα в плазме, определенные с использованием способов EIA и ECLIA</b>
<b>Группа</b>
<b># образца</b>
<b>Концентрация FRα (пг/мл)</b>
<b>EIA</b>
<b>ECLIA</b>
Рак яичника
1
10
73
2
<10
200
3
56
286
4
44
286
5
353
1606
6
83
494
Здоровый контроль
7
110
127
8
162
112
9
88
252
10
180
254
11
262
471
12
206
396
Результаты для всех, только с одним исключением, индивидуумов показали, что концентрации FRα, выявленные в сыворотке с использованием EIA, являются более низкими, чем уровни, выявленные с использованием ECLIA, демонстрируя, что анализ EIA, после изменения формата, не является настолько же чувствительным, как и анализ ECLIA, когда используют эту конкретную комбинацию улавливающего (MOV-18) и детекторного (MORAb-003) антител. Таким образом, проводили дальнейшие эксперименты с другими типами антител для разработки более чувствительной методики EIA.
ПРИМЕР 11: ПРИМЕНИМОСТЬ РАЗЛИЧНЫХ ТИПОВ АНТИТЕЛ ДЛЯ ИЗМЕРЕНИЯ С ПОМОЩЬЮ EIA FRα В СЫВОРОТКЕ ЧЕЛОВЕКА
1. Предварительное экспериментирование с комбинациями антител
Рассматривали различные комбинации улавливающих/детекторных антител.
Предварительное экспериментирование дало результаты, указанные в таблице 17.
2. Сравнение анализов EIA с использованием различных комбинаций антител и сравнение с анализом ECLIA
Уровни FRα в плазме пациентов с раком яичника и нормальных здоровых контрольных женщин измеряли с использованием твердофазного иммуноферментного анализа (EIA) с различными комбинациями улавливающих и меченных биотином антител и сравнивали с уровнями FRα, измеренными с использованием анализа ECLIA.
Материалы и способы
Способ ECLIA был таким, как описано в примере 1 и представлено на фиг.1 (с использованием антитела MORAb-003 в качестве улавливающего антитела и антитела Mov-18 в качестве меченного детекторного антитела). Способ EIA был таким, как описано в примере 9, за исключением того, что использовали три различных комбинации улавливающих/детекторных антител, как представлено на фиг.10: MOV18/MORAb-003, 548908/MORAb-003 и 6D398/MORAb-003. Антитела 548908 и 6D398 являются коммерчески доступными. Антитело 548908 было получено от R&D Systems (North Las Vegas, NV) и антитело 6D398 было получено от US Biological (Swampscott, MA 01907).
Результаты
Концентрации FRα (пг/мл), определенные с использованием способов EIA и ECLIA, представлены в таблице 18. Кроме того, концентрации FRα (пг/мл), определенные с помощью EIA с использованием различных комбинаций улавливающих/детекторных антител, графически представлены на фиг.11.
Данные в таблице 18 указывают на то, что измерение уровней FRα с помощью EIA с использованием комбинации 54908-MORAb-003, дает результаты, которые наиболее сходны с результатами, полученными с использованием анализа ECLIA. Проводили количественные анализы, подтвердившие это наблюдение. Кроме того, эти данные демонстрируют, что детекция FRα в высокой степени зависит от используемых антител и комбинаций антител. Таким образом, для определения FRα в биологических жидкостях можно использовать различные комбинации антител. Кроме того, поскольку данные, полученные в форматах анализа EIA и ECLIA, являются сходными, для определения FRα можно использовать различные форматы анализов.
Для каждой из трех комбинаций улавливающих и детекторных антител, использованных для способа EIA, проводили регрессионный анализ и концентрации FRα (пг/мл), определенные с помощью EIA, коррелировали с концентрациями, определенными с помощью анализа ECLIA. Результаты этого анализа представлены в таблице 19 и на фиг.12.
<b>Таблица 19</b>
<b>Корреляция концентраций в плазме FRα, измеренных с помощью ECLIA, с концентрациями, измеренными с помощью EIA, с использованием трех комбинаций улавливающих и детекторных антител</b>
Улавливающее антитело - детекторное антитело
548098-MORAb-003
6D398-MORAb-003
MOV18-MORAb-003
r
0,960
0,781
0,715
Наклон
1,595
0,285
0,223
Пересечение
-87,06
-0,64
58,62
Результаты для EIA с использованием комбинации улавливающего-детекторного антител 548098-MORAb-003 высоко коррелировали (r=0,96) с результатами ECLIA.
ПРИМЕР 12: УРОВНИ В ПЛАЗМЕ FRα, ОПРЕДЕЛЕННЫЕ С ПОМОЩЬЮ EIA И ECLIA В ОБРАЗЦАХ ОТ ПАЦИЕНТОВ С РАКОМ ЯИЧНИКА
Измерение уровней FRα в сыворотке проводили в группе пациентов с раком яичника (n=17) и нормальных контролей (n=35) с использованием ECLIA и EIA. Для измерения с помощью EIA использовали комбинацию улавливающее антитело 548908/детекторное антитело MORAb-003. Методика EIA в остальном была такой, описано в примере 9. Методика ECLIA была такой, как описано в примере 1. Результаты представлены в таблице 20.
На фиг.13 представлено распределение концентраций FRα в плазме у индивидуумов с раком рак яичника и здоровых контрольных женщин при определении с использованием EIA.
В таблице 21 представлена обобщенная описательная статистика для концентраций FRα в плазме у индивидуумов с раком яичника и здоровых контрольных женщин при определении с использованием EIA.
<b>Таблица 21</b>
<b>Обобщение концентраций FRα в плазме у индивидуумов с раком яичника и здоровых контрольных женщин при определении с использованием EIA</b>
<b>FRα (пг/мл)</b>
<b>Рак яичника</b>
<b>Нормальный контроль</b>
n
17
35
Среднее значение
967
389
SD
1438
126
Max.
4768
806
Min.
154
215
На фиг.14, кроме того, представлена корреляция между концентрациями FRα в плазме, определенными с использованием EIA и ECLIA. Корреляция является высокой (r=0,95).
ПРИМЕР 13. ОПРЕДЕЛЕНИЕ УРОВНЕЙ FRα В СООТВЕТСТВУЮЩИХ ДРУГ ДРУГУ ОБРАЗЦАХ МОЧИ И СЫВОРОТКИ ОТ ПАЦИЕНТОВ С РАКОМ ЛЕГКОГО И РАКОМ ЯИЧНИКА ПРИ ИЗМЕРЕНИИ С ПОМОЩЬЮ ЭЛЕКТРОХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНТНОГО ИММУНОАНАЛИЗА (ECLIA)
Уровни FRα определяли в соответствующих друг другу образцах мочи и сыворотки от пациентов с раком легкого и раком яичника с использованием ECLIA, где образцы были взяты от одного и того же пациента. Также определяли корреляцию между уровнями FRα в сыворотке и моче.
Материалы и способы
Использованная методология ECLIA является такой, как описано в примере 1. Для растворения осадков в моче использовали гуанидин, как описано в примере 6.
Результаты
Результаты анализов ECLIA сыворотки и мочи от пациентов с раком легкого и раком яичника представлены в таблице 22.
Обобщенные данные для уровней FRα в сыворотке и моче пациентов с раком легкого представлены в таблице 23.
<b>Таблица 23</b>
<b>Обобщенная статистика для концентраций FRα в соответствующих друг другу образцах сыворотки и мочи от пациентов с раком легкого, при определении с помощью ECLIA</b>
<b>Рак легких</b>
<b>FRα (пг/мл)</b>
<b>Сыворотка</b>
<b>Моча</b>
n
25
23
Среднее значение
191
8700
SD
75
6291
Max.
421
24448
Min.
70
822
Обобщенные данные для уровней FRα в сыворотке и моче пациентов с раком яичника представлены в таблице 24.
<b>Таблица 24</b>
<b>Обобщенная статистика для концентраций FRα в соответствующих друг другу образцах сыворотки и мочи от пациентов с раком яичника, при определении с помощью ECLIA</b>
<b>Рак яичника</b>
<b>FRα (пг/мл)</b>
<b>Сыворотка</b>
<b>Моча</b>
n
4
4
Среднее значение
705
10168
SD
634
2266
Max.
1605
13059
Min.
240
7651
На фиг.15 представлены корреляции между показателями ECLIA для уровней FRα в соответствующих друг другу образцах сыворотки и мочи, взятых от одного и того же пациента. Корреляция для пациентов с раком легкого составляла r=0,24 (верхняя панель) и корреляция для пациентов с раком яичника составляла r=-0,76 (нижняя панель).
Эти данные демонстрируют относительное отсутствие корреляции между концентрациями FRα, измеренными в моче относительно сыворотки, особенно, как показано для пациентов с раком легкого. Кроме того, эти данные демонстрируют, что FRα, в основном, не выявляется выше фоновых уровней в сыворотке пациентов с раком легкого против нормальных контролей, в то время как FRα выявляется в моче этих пациентов.
ПРИМЕР 14. ОЦЕНКА УРОВНЕЙ FRα В ОБРАЗЦАХ СЫВОРОТКИ ОТ ПАЦИЕНТОВ С РАКОМ ЯИЧНИКА, ПАЦИЕНТОВ С РАКОМ ЛЕГКОГО И НОРМАЛЬНЫХ КОНТРОЛЕЙ
Оценивали уровни FRα в сыворотке пациентов с раком яичника, пациентов с раком легкого, и нормальных контролей. Уровни FRα в сыворотке оценивали с использованием ECLIA с двумя различными парами улавливающих-детекторных антител: пара 1, в которой 9F3 представляло собой улавливающее антитело и 24F12 представляло собой детекторное антитело, и пара 2, в которой 26B3 представляло собой улавливающее антитело и 19D4 представляло собой детекторное антитело.
Пары FRα исследовали с помощью полных калибровочных кривых и 196 индивидуальных сывороток, разбавленных 1:4. В одном эксперименте 26B3 использовали в качестве улавливающего антитела после обработки CR на партии планшетов (75 мкг/мл, +B, +T) и 19D4 использовали в качестве детекторного антитела в концентрации 1,0 мкг/мл. В другом эксперименте 9F3 использовали в качестве улавливающего антитела и 24F12 использовали в качестве детекторного антитела в концентрации 1,0 мкг/мл. Каждое антитело обрабатывали CR (партия 10070) с соотношением метки и белка (L/P) 13,3. Разбавитель 100 (Meso Scale Discovery, Gakbersburg, Maryland) + антитело человека против антител мышей (HAMA) +i-mIgG использовали для образцов и калибратора. Для детекции использовали разбавитель 3 (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, Maryland).

Для ECLIA использовали следующий протокол. Образцы добавляли в количестве 50 мкл/лунка. Образцы встряхивали в течение 2 часов, а затем промывали фосфатно-солевым буфером (PBS) с детергентом Tween 20 (PBST). Добавляли детекторное антитело в количестве 25 мкл/лунка. Образцы встряхивали в течение 2 часов, а затем промывали PBST. Наконец, проводили считывание испускания электрохемилюминесценции (ECL) образцов с 2X буфером T MSD.
Результаты представлены в таблице 25 ниже.
Основываясь на указанных выше данных, очевидно, что антитела 9F3, 2412, 26B3 и 19D4 были пригодны для выявления уровней FRα в биологических образцах, например, сыворотке, полученной от индивидуума. Более того, конкретные комбинации (i) 9F3 в качестве улавливающего антитела и 24F12 в качестве детекторного антитела и (ii) 26B3 в качестве улавливающего антитела и 19D4 в качестве детекторного антитела были способны к оценке уровней FRα и особенно эффективны при оценке уровней FRα в биологических образцах.
ПРИМЕР 15. ОЦЕНКА УРОВНЕЙ FRα В МОЧЕ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ТРЕХ РАЗЛИЧНЫХ ПАР ДЕТЕКТОРНЫХ И УЛАВЛИВАЮЩИХ АНТИТЕЛ
Оценивали способность трех пар антител FRα определять уровни FRα в образцах мочи. Использованные пары антител были следующими: (1) 26B3 в качестве детекторного антитела и 9F3 в качестве улавливающего антитела, и (2) 24F12 в качестве детекторного антитела и 9F3 в качестве улавливающего антитела.
Способ
Две пары антител исследовали с полными калибровочными кривыми и мочой, предварительно обработанной разведением 1:1 в течение 2 минут в 6 M гуанидине, 3 M гуанидине или контроле в виде PBS. Исследовали следующие образцы мочи: три объединенных образца мочи человека, разбавленных 1:80, и пять индивидуальных образцов мочи человека, разбавленных 1:80 (один мужской, четыре женских).
Планшеты подвергали способу Biodot при 150 мкг/мл, +B, +T, на STD с 4 точками ((Meso Scale Discovery, Gaithersburg, Maryland)), по одному улавливающему антителу на лунку. Детекцию проводили при 1 мкг/мл. Для образцов и калибратора использовали разбавитель 100 + HAMA + mIgG. Для детекции использовали разбавитель 3. Разбавители представляли собой коммерчески доступные разбавители, полученные от Meso Scale Discovery.
Для ECLIA использовали следующий протокол. Образцы добавляли в количестве 50 мкл/лунка. Образцы встряхивали в течение 2 часов. Образцы промывали фосфатно-солевым буфером (PBS) с детергентом Tween 20 (PBST). Детекторное антитело добавляли в количестве 25 мкл/лунка. Образцы встряхивали в течение 2 часов, а затем промывали PBST. Считывание испускания электрохемилюминесценции (ECL) образцов проводили с 2X буфером T MSD.
Результаты этих экспериментов представлены в таблицах 26-27.
Исходя из вышеуказанных данных, было очевидно, что антитела 9F3, 24F12, 26B3 и 19D4 были пригодны для определения уровней FRα в биологических образцах, полученных от индивидуума. Более того, комбинации (1) 26B3 в качестве детекторного антитела и 9F3 в качестве улавливающего антитела и (2) 24F12 в качестве детекторного антитела и 9F3 в качестве улавливающего антитела были способны к оценке уровней FRα и особенно эффективны для оценки уровней FRα в биологических образцах.
Вторую группу экспериментов в соответствии с протоколом, описанным выше, и использованием тех же двух пар антител, проводили с использованием четырех индивидуальных образцов мочи индивидуумов, разбавленных 1:80. Мочу предварительно обрабатывали путем разведения 1:1 в течение 2 минут либо в 3 M гуанидине, либо в контроле в виде PBS. Результаты представлены в таблицах 28-29.
Результаты этой второй группы экспериментов дополнительно подтверждают результаты первой группы экспериментов и демонстрируют, что уровень FRα, который не связан с клеткой, можно надежно оценивать, например, в моче, с использованием анализов, таких как анализ ECLIA, и с использованием антител 26B3, 9F3, 24F12. Кроме того, результаты демонстрируют, что такие анализы могут эффективно выявлять FRα с использованием пар детекторных и улавливающих антител, которые связывают FRα (таких как, например, 26B3 в качестве детекторного антитела и 9F3 в качестве улавливающего антитела, и 24F12 в качестве детекторного антитела и 9F3 в качестве улавливающего антитела).
ПРИМЕР 16. ОЦЕНКА УРОВНЕЙ FRα В СЫВОРОТКЕ И ПЛАЗМЕ
Уровни FRα оценивали в образцах сыворотки и плазмы в два отдельных дня. Индивидуумы, от которых были получены образцы, представляли собой либо нормальных индивидуумов, либо пациентов с раком яичника или раком легкого.
Протокол оценки уровней FRα был таким же, как указано в примере 14 выше. Пары антител, использованные для оценки уровней FRα, также были такими же, как в примере 14, т.е. пара 1, в которой 9F3 было улавливающим антителом и 24F12 было детекторным антителом, и пара 2, в которой 26B3 было улавливающим антителом и 19D4 было детекторным антителом.
Результаты представлены в таблице 30.
Исходя из вышеуказанных данных, очевидно, что антитела 9F3, 2412, 26B3 и 19D4 были пригодны для определения уровней FRα в биологических образцах, например, сыворотке или плазме, полученных от индивидуума. Более того, конкретные комбинации (i) 9F3 в качестве улавливающего антитела и 24F12 в качестве детекторного антитела и (ii) 26B3 в качестве улавливающего антитела и 19D4 в качестве детекторного антитела были способны к оценке уровней FRα и особенно эффективны для оценки уровней FRα в биологических образцах.
Для анализов, проведенных с использованием как пары 1, так и пары 2, существовала высокая корреляция между уровнями FRα в сыворотке и плазме. На фиг.16 представлена корреляция в сыворотке против уровней FRα в плазме для анализов, проведенных с использованием пары 1 (см. пример 16). Величина R составляла 0,8604. На фиг.17 представлена корреляция уровней FRα в сыворотке против плазмы для анализов, проведенных с использованием пары 2 (см. пример 16). Величина R составляла 0,9766.
Для образцов как сыворотки, так и плазмы, существовала высокая корреляция между уровнями FRα, измеренными с использованием пары 1 и пары 2. На фиг.18 представлена корреляция уровней FRα в сыворотке для анализов, проведенных с использованием пары 1 против пары 2 (см. пример 16). Величина R составляла 0,9028. На фиг.19 представлена корреляция уровней FRα в плазме для анализов, проведенных с использованием пары 1 против пары 2 (см. пример 16). Величина R составляла 0,8773.
Результаты также показали, что существует высокая корреляция между уровнями FRα, измеренными в различные дни. На фиг.20 представлена корреляция уровней FRα в сыворотке в разные дни для анализов, проведенных с использованием пары 2. Величина R составляла 0,9839.
ЭКВИВАЛЕНТЫ
Специалисты в данной области поймут, или способны установить с использованием не более чем общепринятого экспериментирования, многие эквиваленты конкретных вариантов осуществления изобретения, описанных в настоящем описании. Такие эквиваленты охватываются следующей формулой изобретения. Любая комбинация вариантов осуществления, описанных в зависимых пунктах формулы изобретения, считается входящей в объем изобретения.