СПОСОБ ХРАНЕНИЯ РАСТЕНИЙ РОДА RUBUS В УСЛОВИЯХ IN VITRO
METHOD OF STORING RUBUS PLANTS IN VITRO

Изобретение относится к области биотехнологии растений и сельскому хозяйству, и может быть использовано для длительного беспересадочного хранения особо ценных сортов малины и ежевики в условиях in vitro.
В современной биотехнологии сохранение in vitro культур растений используется для снижения затрат на пересадку и для сохранения особо ценных генотипов. Наиболее приемлемым способом депонирования является хранение in vitro культур при положительных температурах (+4°С).
Для выращивания высококачественного садового материала малины, ежевики и их гибридов крупные специализированные рассадники используют оздоровленный материал, который продуцируется in vitro в биотехнологических лабораториях. Это позволяет получать безвирусные растения с максимально возможным, для соответствующего сорта, потенциалом урожайности. В настоящий момент микрорастения рассматривается как посадочный материал нового поколения. Однако использование технологии микроклонального размножения сопряжено с появлением целого комплекса проблем: вырождение сортовых признаков при длительном культивировании, самоклональная изменчивость, а следовательно постоянное введение в культуру in vitro одного и того же сорта; это дорогостоящее ведение культуры не пользующейся постоянным спросом и короткий срок хранения товарной продукции. Решением сложившихся проблем может являться длительное беспересадочное сохранение ценной культуры растений, при которой не происходит потери сортовых свойств. В мире технологии длительного хранения растений in vitro с сохранением необходимых признаков активно разрабатываются.
Известно несколько способов хранения растений при положительных температурах, в частности известен способ депонирования растений винограда. Известен патент на изобретение №2564565 «Способ сохранения in vitro растений земляники (Fragaria L.)», патентообладатель Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук (ФГБУН ИФР РАН). Изобретение представляет собой способ сохранения in vitro растений земляники (Fragaria L.), заключающийся в том, что растения помещают в пробирки на питательную среду Мурасиге-Скуга, модифицированную 6% сахарозы, 10-12 г/л агар-агара, 0,2 мг/л 6-бензиламинопурина, 0,1-0,5 мг/л паклобутразола, 6 мМ глюконата кальция, а на ее поверхность выкладывают гранулы альгината кальция с тиосульфатом серебра, закрывают пробирки и переносят их в условия при температуре от 1 до 10°С, 6-часовом световом дне и освещенности 0,5-0,8 клк. Заявленное изобретение обеспечивает долговременное сохранение in vitro коллекций растений земляники в состоянии ингибированного роста без смены питательной среды в течение двух и более и позволяет увеличить продолжительность хранения в жизнеспособном состоянии 65-69% растений земляники, а также 100% клонов этой культуры до двух и более лет и использовать его для научных и промышленных целей.
Известен также состав питательной среды для длительного хранения растений in vitro (патент России №94011805). Новым в питательной среде является совместное введение в ее состав сорбита в концентрации 1-10 г/л и 6-бензиламинопурина в концентрации 0,1-1,0 мг/л. Влияние на культуру малины или ежевики, не оценивалось.
Наиболее близким техническим решением из описанных является патент на изобретение №2522823 «Способ длительного хранения in vitro растений осины», патентообладатель Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН). Изобретение представляет собой способ длительного беспересадочного хранения in vitro растений осины, в основе метода лежит культивирование микропобегов осины на питательной среде WPM с добавлением сахарозы 10-20 г/л, агар-агара 9 г/л и витаминов MS 1 мл/л, сорбитола 5-10 г/л и маннитола 5-10 г/л, причем хранение растений осуществляют при температуре +4°С в режиме освещения 8 ч день/16 ч ночь с интенсивностью 2000 люкс. Представленный патент интересен длительностью сохранения без пересадки и при низких положительных температурах, однако разработан только для растений осины.
Целью предлагаемого изобретения является повышение сохранности микрорастений малины, ежевики и малино-ежевичных гибридов в условиях in vitro при хранении на +4°С, без пересадок культур в течение 12 месяцев.
Поставленная цель достигается за счет того, что используются оптимальные концентрации минеральных и органических компонентов питательной среды и изменяется режим освещения (длительность и интенсивность).
3
3
Суть изобретения заключается в том, что для пассажа на укоренение и последующее хранение используют среду MS (Murashige Т., Skoog F. А revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture // Physiol. Plant, 1962. - Vol. 15, №2. - P. 473-497) с добавлением сахарозы (25-30 г/л), AgNO (1-5 мг/л), 6-Бензиламинопурина 0,5-0,8 мг/л. В результате использование AgNO и 6-Бензиламинопурина в составе питательной среды MS и подбор правильного освещения во время хранения, способствует замедлению старения культур, а также постепенному переходу растений в состояние покоя, что повышает до 70% их сохранность в течение года.
Анализ известных способов хранения микрорастений малины, ежевики и малино-ежевичных гибридов при температуре +4°С в условиях in vitro, проведенный по научно-технической и патентной документации, показал, что совокупность существенных признаков заявляемого способа неизвестна из уровня техники, следовательно, он соответствует такому условию патентоспособности изобретения как «новизна».
Предлагаемый способ реализуется следующим образом.
3
1. В нестерильных условиях готовится питательная среда для последующего хранения. В нее добавляются необходимые количества макро-, микроэлементов, хелата железа, мио-инозита, объем доводится дистиллированной водой, рН 5,6-5,8. Растворяются необходимые количества сахарозы. После этого добавляется навеска агара. Среда разливается по колбам; автоклавирование проводится при 1 атм. (=1 изб. атм.) в течение 25 минут. В охлажденную до 55°С среду в ламинар-боксе добавляются стерильные растворы витаминов, 6-Бензиламинопурин и AgNO. Полученный раствор разливается по стерильным культуральным сосудам объемом 330 мл в количестве 50 мл. Все манипуляции с растительным материалом производятся в ламинар-боксе в условиях стерильного воздуха. Число эксплантов в одном сосуде составляет 12 штук.
2. После переноса растительного материала на среду для укоренения и последующего хранения, инкубацию побегов проводят 2 недели при интенсивном (5000 люкс) длиннодневном (16 ч день/8 ч ночь) режиме освещения, при температуре +22°С.
3. Укорененные микрорастения затем переносят в условия хранения. Режим освещения на протяжении всего периода хранения короткодневный - 8 часов «день», 16 часов «ночь», интенсивность освещения должна не превышать 2000 люкс. Температура хранения +4°С. Инкубация в подобных условиях достигала 12 месяцев. Процент выживания оценивается после 12 месяцев инкубации на среде для восстановления.
4. Пересадку верхушечной почки растений на среду для восстановления (MS с добавлением сахарозы 30 г/л, агар-агара 9 г/л, гиббереллиновой кислоты 0,5 мг/л, 6-Бензиламинопурин 0,5 мг/л) необходимо провести через год депонирования. Восстановление осуществляется при длиннодневном режиме освещения 16 часов «день», 8 часов «ночь» интенсивностью 5000 люкс, при температуре +22°С.
3
3
В таблице 1 представлены детальные результаты выживаемости растений малины, ежевики и малино-ежевичных гибридов через разные временные промежутки при культивировании в условиях с добавлением в среду MS сахарозы (25-30 г/л), AgNO (1-5 мг/л), 6-Бензиламинопурина 0,5-0,8 мг/л (патентуемые условия), а также агар-агара (9 г/л) и витаминов MS 1 мл/л и в условиях без добавления в среду AgNO (1-5 мг/л), 6-Бензиламинопурина 0,5-0,8 мг/л (контрольные условия).
Предложенный способ хранения при температуре +4°С не является затратным, поэтому способ может быть успешно использован для сохранения ценных сортов малины, ежевики и малино-ежевичных гибридов, а также при производстве посадочного материала растений.