РЕКОМБИНАНТНЫЕ ВЕКТОРЫ НА ОСНОВЕ "ЖИВОГО" ВИРУСА ОСПЫ ДОМАШНЕЙ ПТИЦЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ В ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ КОМПОЗИЦИЯХ ПРОТИВ ВИРУСА ГЕПАТИТА С
RECOMBINANT VECTORS BASED ON 'LIVE' VIRUS OF FOWL POX AND THEIR APPLICATION IN PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS AGAINST VIRUS OF HEPATITIS C

Область, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к области иммунологии и вирусной вакцинации, а в частности вакцинации рекомбинантным вирусом оспы домашней птицы, экспрессирующим белки вируса гепатита С (HCV), и к фармацевтическим композициям, способным индуцировать клеточный иммунный ответ против HCV.
Предшествующий уровень техники
Вирус HCV впервые был идентифицирован в 1989 г. методами молекулярной биологии как главный этиологический фактор посттрансфузионного не-А, не-В гепатита (Choo Q. L., Kuo G. et al. (1989) Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome. Science. 244:359-62; EP0318216 Chiron Corp). В настоящее время во всем мире этим вирусом инфицированы более 170 миллионов человек. HCV-инфекция присутствует в организме человека в 85% случаев, и в большинстве случаев она вызывает цирроз и гепатоцеллюлярную карциному (Caselmann W. H., Alt M. (1996) Hepatitis C virus infection as a major risk factor for hepatocellular carcinoma. J. Hepatol. 24:61-66). Фактически в 25% случаев через 25 лет после инфицирования у индивидуумов-носителей хронической HCV-инфекции ежегодно регистрируется развитие цирроза, а в 1-4% случаев - развитие гепатоцеллюлярной карциномы (Prince A. M., Shata M. T. (2001) Immunoprophylaxis of hepatitis C virus infection. Clin. Liver Dis. 5:1091-103). Курс лечения HCV-инфекции основан на проведении интенсивной терапии путем введения комбинации ПЭГилированных интерферонов. Однако такое лечение является инвазивным и дорогостоящим и дает эффект только менее чем в 50% случаев (Prince A. M., Shata M. T. (2001) Immunoprophylaxis of hepatitis C virus infection. Clin. Liver. Dis. 5:1091-103).
+
Различные варианты субъединиц белка, вирусоподобные частицы, синтетические пептиды, рекомбинантные “живые” векторы и ДНК-конструкции для ДНК-иммунизации, основанной на антигенах HCV, оценивали как варианты, которые могут быть использованы в методах вакцинации (US6635257, US6387662, US6235888, US6685944, US2003021805, Lechmann M., Liang T. J. (2000) Vaciine development for hepatitis C. Semin. Liver. Dis. 20:211-26). Было продемонстрировано, что некоторые из этих вариантов обладают способностью вырабатывать специфический иммунный ответ против эпитопов HCV, хотя считается, что этот ответ все же является недостаточным. В настоящее время иммунологические параметры, коррелирующие с защитной функцией против HCV-инфекции, пока еще точно не определены. Тем не менее, несколько проведенных исследований дали основание предположить, что ранний сильный и мультиспецифический цитотоксический Т-клеточный ответ наряду с CD4-Th1-клеточным ответом благоприятствует развитию иммунитета против вируса и способствует эффективному лечению заболевания. В противоположность этому поздний Т-клеточный ответ ассоциируется с развитием хронической иммунопатологии печени (Cerny A., Chisari F.V. (1999) Pathogenesis of chronic hepatitis C: immunological features of hepatic injury and viral persistente. Hepatology. 30:595-601; Cooper S. et al. (1999) Analysis of a successful immune response against hepatitis C virus. Immunity 10:439-49; Lechner F. et al. (2000) Why do cytotoxic T lymphocytes fail to eliminate hepatitis C virus? Lessons from studies using major histocompatibility complex class I peptide tetramers. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 355:1085-92; Takaki A. et al. (2000). Cellular immune responses persist and humoral responses decrease two decades after recovery from single-source outbreak of hepatitis C. Nat. Med. 6:578-82).
Рекомбинантные “живые” векторы являются привлекательными кандидатами на вырабатывание клеточного иммунного ответа против HCV. В результате иммунизации мышей рекомбинантным аденовирусом, полученным на основе сердцевины HCV и Е1, вырабатывается специфический цитотоксический Т-клеточный ответ против этих антигенов (Bruna-Romero O. et al. (1997) Induction of cytotoxic T-cell response against hepatitis C virus structural antigens using a defective recombinant adenovirus. Hepatology 25:470-7). Хотя эти результаты являются многообещающими, однако возникшие в настоящее время проблемы, связанные с использованием рекомбинантного аденовируса в генотерапии, вызывают сомнение в возможности их использования для лечения человека. Применение рекомбинантных вирусов коровьей оспы и оспы канареек, содержащих различные гены HCV, как показал анализ антигена, приводит к индуцированию цитотоксических Т-клеточных ответов у мышей в том случае, если они были объединены с вакцинами-кандидатами, полученными на основе ДНК-конструкций (Pancholi P. et al. (2000) DNA prime-canarypox boost with polycistronic hepatitis C virus (HCV) genes generates potent immune responses to HCV structural and nonstructural proteins. J. Infect. Dis. 182:18-27; Pancholi P. et al. (2003) DNA immunization with hepatitis C virus (HCV) polycistronic genes or immunization by HCV DNA priming-recombinant canarypox virus boosting induces immune response and protection from recombinant HCV-vaccinia virus infection in HLA-A2.1-transgenic mice. J. Virol. 77:382-90). Фактически нет никаких свидетельств о том, что in vivo индуцирование клеточного иммунного ответа после введения индивидууму рекомбинантных вирусов оспы канареек, полученных на основе структурных антигенов HCV, будет эффективным, например, у модели, инфицированной рекомбинантным вирусом коровьей оспы. К этой группе вирусов также принадлежит вирус оспы домашней птицы, который до настоящего времени не использовался для индуцирования иммунного ответа против антигенов HCV. Вирус оспы домашней птицы не реплицируется в клетках млекопитающих, но он может проникать в цитоплазму клетки-хозяина и эффективно экспрессировать в этой цитоплазме белки, кодируемые своим геномом. Исходя из этих свойств было высказано предположение о том, что риск, ассоциированный с использованием вектора, полученного на основе рекомбинантного вируса оспы домашней птицы, для лечения человека будет снижаться при использовании векторов, полученных на основе других “живых” вирусов.
В настоящее время на фармацевтическом рынке отсутствует вакцина против HCV-инфекции. Действительно, большинство исследований пока еще находятся на предклиническом этапе. Таким образом, разработка профилактических и/или терапевтических средств, эффективных для лечения HCV-инфекции, все еще остается крайне актуальной.
Описание сущности изобретения
Настоящее изобретение несмотря на все ограничения и предшествующий уровень техники позволяет решить вышеупомянутую проблему путем конструирования рекомбинантного вируса оспы домашней птицы, содержащего фрагменты ДНК, происходящие от HCV, в неосновной области генома вируса оспы домашней птицы и способного индуцировать специфический клеточный иммунный ответ против HCV, где указанными областями являются аминокислотные области, соответствующие антигенам HCV, экспрессируемым вирусом оспы домашней птицы.
+
+
В соответствии с настоящим изобретением вирус FPCoEl содержит фрагмент ДНК, определенный последовательностью SEQ ID NO:1, кодирующий белок, содержащий аминокислоты 79-338, включая часть корового белка и Е1, а вирус FPBS содержит фрагмент ДНК, определенный последовательностью SEQ ID NO:2, кодирующий химерный белок, включая эпитопы, к которым специфичны CD4- и CD8-T-лимфоциты, соответствующие различным антигенам HCV. В этих вирусах последовательность, кодирующая антигены HCV, происходит от кДНК кубинского изолята HCV (Morales J. et al., WO 98/25960).
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, индуцирующей специфический клеточный иммунный ответ против HCV и содержащей эффективное количество рекомбинантного вируса оспы домашней птицы и фармацевтически приемлемый наполнитель.
Рекомбинантные вирусы оспы домашней птицы согласно изобретению обладают способностью проникать в человеческие клетки и экспрессировать антигены HCV в цитоплазме. Экспрессия в человеческих клетках регулируется транскрипционной единицей, полученной на основе раннего/позднего синтетического промотора вируса оспы домашней птицы. Эти вирусы также содержат ген ксантин-гуанозин-фосфорибозилтрансферазы, находящийся под контролем промотора 7.5К, происходящего от вируса коровьей оспы. Эти вирусы не способны реплицироваться у человека.
7
8
Эта композиция может быть введена внутримышечно, внутрибрюшинно или подкожно. Такое введение может быть осуществлено с помощью шприцов, “дробовика” для выстеливания генов, ингалятора, или с помощью других устройств для иммунизации. Каждому индивидууму вводят дозу, составляющую 2,5×10-1×10 б.о.е./дозу, в определенном объеме. В настоящем изобретении также описаны способы введения рекомбинантных вирусов оспы домашней птицы с применением стратегии первичной иммунизации/бустер-иммунизации ДНК-конструкциями. Рекомбинантные вирусы оспы домашней птицы могут быть также введены с применением стратегий первичной иммунизации/бустер-иммунизации белками или другими вирусами, рекомбинантными по антигенам HCV, или одновременно цитокинами и другими иммуностимулирующими молекулами. Эти комбинации позволяют продуцировать новые специфичные к эпитопам молекулы или усиливать специфический иммунный ответ. Фармацевтические композиции, полученные на основе вирусов оспы домашней птицы, рекомбинантных по антигенам HCV, могут иметь следующие преимущества, а именно:
- они могут индуцировать эффективный специфический клеточный иммунный ответ;
- для достижения нужного эффекта требуется меньшее число процедур иммунизации;
- эти композиции могут быть использованы в качестве основы для получения комбинированных вакцин;
- не требуется введение адъюванта;
- эти композиции могут быть использованы в комбинации с противовирусными средствами.
В некоторых случаях указанные фармацевтические композиции для индуцирования иммунного ответа против HCV могут быть введены до проведения другой терапии или вакцинации либо одновременно с их проведением, либо после их проведения. Указанные фармацевтические композиции могут быть введены для индуцирования профилактического иммунного ответа против HCV-инфекции, а также для индуцирования иммунного ответа у пациентов с хроническим гепатитом С, циррозом и раком печени.
Краткое описание графического материала
Фиг.1: Схематически представлены области, соответствующие антигенам HCV в рекомбинантных вирусах оспы домашней птицы.
Фиг.2: Схема иммунизации различными рекомбинантными вирусами оспы домашней птицы. (А): Вырабатывание антител. (В): Вырабатывание секреторного интерферона гамма. (С): Ответ на инфицирование вирусом коровьей оспы, рекомбинантным по структурным антигенам HCV.
Фиг.3: Схема иммунизации вирусами FPCoE1 и FPBS с применением различных методов инокуляции. Ответ на инфицирование вирусом коровьей оспы, рекомбинантным по структурным антигенам HCV.
Фиг.4: Схема иммунизации различными количествами FPCoE1 и FPBS. Ответ на инфицирование вирусом коровьей оспы, рекомбинантным по структурным антигенам HCV.
Фиг.5: Схема иммунизации на основе комбинаций FPCoE1 и препарата ДНК-вакцины. (А): Вырабатывание антител против сердцевины, Е1 и Е2. (В): Ответ на инфицирование вирусом коровьей оспы, рекомбинантным по структурным антигенам HCV.
Примеры осуществления настоящего изобретения
Используемые в настоящем изобретении термины “вирус гепатита С” или “HCV” означают общее родовое название вируса и не ограничиваются конкретной вирусной последовательностью или конкретным изолятом HCV.
Аналогичным образом следует отметить, что термин “кодирующая последовательность” означает молекулу нуклеиновой кислоты, которая транслируется в полипептид обычно посредством мРНК, если она находится под контролем “правильной” регуляторной последовательности. В данном случае термин “кодирующая последовательность” может включать, но не ограничивается ими, кДНК и рекомбинантные нуклеотидные последовательности.
Настоящее изобретение более подробно описано в нижеследующих примерах, которые приводятся лишь в иллюстративных целях и не должны рассматриваться как ограничение изобретения.
Пример 1: Оценка FPCoE1c, FPCoE1 и FPBS
Для оценки способности вирусов оспы домашней птицы, рекомбинантных по антигенам HCV, индуцировали специфическийклеточный иммунный ответ, получали вирусы FPCoE1c, FPCoE1 и FPBS. На фиг.1 схематически представлена последовательность, соответствующая антигенам HCV. Указанные вирусы получали следующим образом: фибробласты куриных эмбрионов инфицировали вирусом оспы домашней птицы и трансфецировали плазмидами pFPCoE1c, pFPCoE1 или pFPBS с использованием липофектамина (Invitrogen, USA). Эти плазмиды происходили от плазмиды pFP67xgpt (Vazquez-Blomquist D., Gonzalez S., Duarte C.A. (2002) Effect of promoters on cellular immune response induced by recombinant fowlpox virus expressing multi-epitope polypeptides from HIV-1. Biotechnol. Appl. Biochem. 36:171-9) и содержали последовательность (SEQ ID NO:1), кодирующую области, включающие аминокислоты 1-338 и 79-338, или последовательность (SEQ ID NO:2), кодирующую химерный белок, сконструированный на основе эпитопов, к которым специфичны Т-лимфоциты (плазмиды pFPCoE1c, pFPCoE1 и pFPBS соответственно). Затем проводили несколько циклов очистки вируса в селективной среде, содержащей ксантин, гипоксантин и микофеноловую кислоту. После этого вирусный продукт, находящийся в планшете для инфицирования, амплифицировали и присутствие вставки, соответствующей последовательности HCV, подтверждали с помощью полимеразной цепной реакции.
7
6
+
Иммуногенность вирусов FPCoEic, FPCoEl и FPBS исследовали на 8-недельных самках мышей BALB/c после двух внутрибрюшинных введений (с интервалами в 3 недели) 2,5×10 б.о.е. Каждая группа иммунизации включала десять животных. На фиг.2А показано, что только FPCoE1-иммунизация способна индуцировать детектируемые уровни антител против сердцевины и Е1. Однако на фиг.2В показано, что позитивный ответ, заключающийся в секреции IFN-гамма лимфоцитами животных, иммунизованных вирусами FPCoE1 и FPBS соответственно, является статистически значимым по сравнению с ответом, детектируемым у животных, иммунизованных вирусом, используемым в качестве негативного контроля, FP9 (т-критерий Стьюдента, р<0,05). Иммунизация вирусом FPCoE1c не индуцировала позитивного ответа, заключающегося в секреции лимфоцитами IFN-гамма. Кроме того, как показано на фиг.2С, у группы животных, иммунизованных вирусами FPCoE1 и FPBS, наблюдалось значимое снижение (т-критерий Стьюдента, р<0,05) вирусной нагрузки в яичниках после их инфицирования 10 б.о.е. вируса коровьей оспы (vvRE), рекомбинантного по структурным антигенам HCV (аминокислоты 1-650 полипротеина HCV) по сравнению с вирусной нагрузкой, наблюдаемой после инфицирования контрольным вирусом коровьей оспы (WR), не являющимся рекомбинантным по антигенам HCV. Кроме того, vvRE-вирусная нагрузка у животных, иммунизованных вирусами FPCoE1 и FPBS, была статистически ниже по сравнению с вирусной нагрузкой, детектируемой у животных, иммунизованных вирусом оспы домашней птицы FP9, используемым в качестве негативного контроля (т-критерий Стьюдента, р<0,05). Иммунизация вирусом FPCoE1c не приводила к значимому снижению вирусной нагрузки в яичниках. Инфицирование вирусом коровьей оспы осуществляли путем его внутрибрюшинного введения через 2 недели после последней иммунизации вирусами оспы домашней птицы. Через 5 дней после инокуляции вирусом коровьей оспы извлекали яичники. Инфицирование рекомбинантными вирусами коровьей оспы широко применяется в целях иллюстрации способности вакцины-кандидата вырабатывать сильный клеточный иммунный ответ in vivo. В частности, снижение клеточного титра в яичниках ассоциируется, главным образом, с индуцированием сильного CD8-Т-лимфоцитарного ответа.
Пример 2: Способы введения вирусов оспы домашней птицы (внутрибрюшинное, подкожное и внутримышечное)
7
6
Для оценки влияния способа инокуляции на иммунный ответ, продуцируемый рекомбинантными вирусами оспы домашней птицы, была проведена иммунизация 8-недельных самок мышей BALB/c. Каждая группа иммунизации включала десять животных. Вирусы (2,5×10 б.о.е.) вводили внутрибрюшинно, внутримышечно или подкожно за две стадии иммунизации с интервалами в 3 недели. На фиг.3 показано, что между этими способами иммунизации не существует какого-либо значимого различия с точки зрения способности рекомбинантных вирусов оспы домашней птицы FPCoE1 и FPBS снижать вирусную нагрузку в яичниках после инфицирования вирусом коровьей оспы vvRE. Эти 2 рекомбинантных вируса индуцировали позитивный ответ, заключающийся в снижении вирусной нагрузки, по сравнению с вирусом оспы домашней птицы, FP9, используемым в качестве негативного контроля (т-критерий Стьюдента, р<0,05). Инфицирование вирусом коровьей оспы осуществляли путем внутрибрюшинного введения 10 б.о.е. вируса коровьей оспы vvRE через 2 недели после последней иммунизации вирусами оспы домашней птицы. Через 5 дней после инфицирования вирусом коровьей оспы извлекали яичники.
7
7
7
8
Пример 3: Сравнение доз (0,9×10, 2,5×10, 5×10 и 1×10 б.о.е.)
7
6
7
7
8
Самок мышей BALB/C иммунизовали путем внутримышечного введения различных количеств рекомбинантных вирусов оспы домашней птицы на недели 0 и 3. Каждая группа иммунизации включала 10 животных. На фиг.4 показано, что у мышей, иммунизованных 0,9×10 б.о.е., не наблюдалось каких-либо значимых различий в отношении вирусной нагрузки, детектируемой в яичниках после инфицирования 10 б.о.е. vvRE, через 2 недели после последней иммунизации вирусами оспы домашней птицы. В противоположность этому введение 2,5×10, 5×10 и 1×10 б.о.е. FPCoE1 и FPBS приводило к значимому снижению vvRE-вирусной нагрузки в яичниках по сравнению с вирусной нагрузкой, детектируемой у животных, инокулированных аналогичными количествами вируса оспы домашней птицы, FP9, используемого в качестве негативного контроля (т-критерий Стьюдента, р<0,05). Во всех случаях через 5 дней после инокуляции vvRE извлекали яичники.
Пример 4: Первичная иммунизация/бустер-иммунизация ДНК и вирусами оспы домашней птицы
7
6
Для оценки иммунного ответа, индуцированного первичной иммунизацией/бустер-иммунизацией, включающей введение комбинации из полученной на основе ДНК вакцины-кандидата и вируса оспы домашней птицы, рекомбинантного по антигенам HCV, проводили иммунизацию 8-недельных самок мышей BALB/c. Каждая группа иммунизации включала 10 животных. Животных одной группы (Со-pIDKE2) иммунизовали на недели 0, 3, 7 и 12 путем внутримышечного введения смеси 100 мкг плазмиды, экспрессирующей первые 650 аминокислот полипротеина HCV, pIDKE2 (Duenas-Carrera S. et al. (2004). Immunization with a DNA vaccine encoding the hepatitis C virus structural antigens elicits a specific immune response against the capsid and envelope proteins in rabbits and Macaca irus (crab-eating macaque monkeys). Biotechnol. Appl. Biochem. 39:249-55) и 10 мкг рекомбинантного белка сердцевины HCV, Со.120 (Alvarez-Obregon J.C. et al. (2001). A truncated HCV core protein elicits a potent immune response with a strong participation of cellular immunity components in mice. Vaccine 19:3940-46). Животных другой группы (pAEC-K6) иммунизовали в аналогичных условиях плазмидой рАЕС-К6, используемой в качестве негативного контроля (Herrera A.M. et al. (2000) A family of compact plasmid vectors for DNA immunization in human. Biochem. Biophys. Res. Commun. 279:548-51). Животных другой группы иммунизовали на недели 0 и 3 путем внутримышечного введения 2,5×10 б.о.е. вируса FPCoE1. Кроме того, животных этой группы иммунизовали в тех же самых условиях вирусом оспы домашней птицы, FP9, используемым в качестве негативного контроля. Затем животных одной из групп (Co-pIDKE2/FPCoE1) иммунизовали на недели 0 и 3 путем внутримышечного введения смеси Co-pIDKE2, а на недели 9 и 12, их иммунизовали вирусом FPCoE1. Животных другой группы (Co-pIDKE2/FP9) иммунизовали аналогичным образом за исключением того, что этим животным на 6-ю и на 9-ю недели вводили FP9. На фиг.5 показано, что самые высокие уровни антител индуцировались у группы, которой вводили Co-pIDKE2 (т-критерий Стьюдента, р<0,05). Кроме того, в результате первичной иммунизации/бустер-иммунизации, предусматривающей введение комбинации Co-pIDKE2 и FPCoE1, индуцировались более высокие уровни антител по сравнению с уровнями, наблюдаемыми у группы, которой вводили только FPCoE1 (т-критерий Стьюдента, р<0,05). На фиг.5В можно видеть, что у животных обеих групп, иммунизованных вирусами FPCoE1 или Co-pIDKE2, а также у группы, иммунизованной вирусом Co-pIDKE2 в первых 2 дозах и вирусом FPCoE1 в других 2 дозах, наблюдалось значимое снижение (т-критерий Стьюдента, р<0,05) vvRE-вирусной нагрузки после их инфицирования по сравнению с вирусной нагрузкой у животных, иммунизованных вирусами, используемыми в качестве негативного контроля. Самая низкая вирусная нагрузка наблюдалась у животных, иммунизованных вирусом Co-pIDKE2 в первых 2 дозах и вирусом FPCoE1 в других 2 дозах. Инфицирование вирусом коровьей оспы осуществляли путем внутрибрюшинного введения 10 б.о.е. вируса коровьей оспы vvRE через 2 недели после последней иммунизации. Через 5 дней после инокуляции вирусом коровьей оспы vvRE извлекали яичники.