СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РИСКА РАЗВИТИЯ ШИЗОФРЕНИИ
METHOD FOR PREDICTING RISK OF SCHIZOPHRENIA

Изобретение относится к области медицины, а именно к определению в образцах биологического материала человека генетических вариантов, связанных с повышенным риском развития шизофрении.
Шизофрения представляет собой заболевание с неясной этиологией и патогенезом, для которого характерны тяжелое клиническое течение и неблагоприятный прогноз. Распространенность ее в различных популяциях составляет 0,3-2%, причем число заболевших не зависит от социокультуральных условий. Заболевание, как правило, развивается в довольно раннем возрасте, и в случае несвоевременного лечения, может иметь неблагоприятный исход. Поэтому оценка риска шизофрении еще до проявления клинических симптомов является актуальной. Использование биологических показателей, в особенности генетических маркеров, может помочь в решении этой проблемы. Генетические факторы играют существенную роль в развитии шизофрении, что доказано многочисленными генеалогическими исследованиями. Согласно существующей в настоящее время модели наследования шизофрении предполагается, что в ее развитии участвует большое число генов, каждый из которых имеет небольшой эффект, причем генетические варианты (аллели), связанные с риском развития болезни, не являются результатом редких мутаций, а распространены в популяции. Поиск генов, связанных с заболеванием, основан на изучении вариаций (полиморфных локусов или полиморфизмов), имеющихся в структуре каждого гена. Для установления связи таких вариантов с болезнью используют анализ ассоциаций. Суть его заключается в том, что сравнивают распределение полиморфных вариантов гена в группе больных и контроле и выявляют статистически достоверные различия в частоте какого-либо варианта между группами. Затем оценивают риск развития заболевания у носителей того варианта, частота которого превалирует у больных по сравнению с контролем. Однако наличие одного варианта, предрасполагающего к заболеванию, связано с небольшой величиной риска (показатели отношения шансов, с помощью которых оценивают риск в анализе ассоциаций, составляют 1.2-2.0). Повысить точность расчета величин риска шизофрении можно при использовании нескольких генетических вариантов. Величина риска может быть увеличена за счет аддитивного (суммарного) эффекта или же за счет эпистатического эффекта, обусловленного взаимодействием генов.
В научной и патентной литературе предлагается использовать для оценки риска шизофрении разные гены.
Известен способ прогнозирования риска развития шизофрении, включающий забор биологического материала пациента, выделение и очистку ДНК, проведение полимеразной цепной реакции и определение генетических вариантов в гене, кодирующем пролиндегидрогеназу (Патент США №6395482). Согласно этому способу в последовательности генома определяют полиморфный локус, в котором нуклеотид тимин (Т) может быть заменен на нуклеотид цитозин (С) в кодоне 497. Присутствие варианта Т свидетельствует о генетической предрасположенности к шизофрении.
Известен способ прогнозирования риска развития шизофрении, включающий забор биологического материала пациента, выделение и очистку ДНК, проведение полимеразной цепной реакции и определение генетических вариантов в гене, кодирующем домен 3, содержащий множественные анкириновые повторы, (SHANK3) (Патент США №8318429). Согласно этому способу в гене SHANK3 определяют однонуклеотидные полиморфизмы rs9616816 и rs6010063, при этом у носителей комплексного генотипа, содержащего аллель А (rs9616816) и аллель А (rs6010063), прогнозируют риск развития шизофрении.
Известен способ прогнозирования риска развития шизофрении, включающий забор биологического материала пациента, выделение и очистку ДНК, проведение полимеразной цепной реакции и определение генетических вариантов в гене, кодирующем церамид-киназу (CERK) (Патент США № 8263337). Согласно этому способу в гене CERK определяют однонуклеотидные полиморфизмы rs135667 и rs1548977, при этом у носителей комплексного генотипа, содержащего аллель G (rs 135667) и аллель А (rs 1548977), прогнозируют риск развития шизофрении.
Известен способ прогнозирования риска развития шизофрении, включающий забор биологического материала пациента, выделение и очистку ДНК, проведение полимеразной цепной реакции и определение генетических вариантов в гене, кодирующем рецептор бета 2 гамма-аминомасляной кислоты (GABRB2). (Патент № WO 02004087948). Согласно этому способу, в гене GABRB2 определяют 6 полиморфизмов и выявляют комбинацию аллелей, предрасполагающих к шизофрении. Наличие аллелей риска указывает на повышение вероятности развития шизофрении у пациента.
К недостаткам перечисленных способов относится низкая эффективность, поскольку для прогнозирования риска шизфорении используются лишь один ген.
Наиболее близким к предлагаемому является способ прогнозирования риска развития шизофрении, включающий забор биологического материала пациента, выделение и очистку ДНК, проведение полимеразной цепной реакции и определение генетических вариантов в генах, кодирующих альфа рецептор интерлейкина-3 (IL3RA), фактор стимуляции роста колоний гранулоцитов (CSF3), рецептор серотонина типа 2А (HTR2A), плацентарный костный морфогенетический белкок (PLAB), тирозин-киназу онкогена MET, рецептор 2 фактора, стимулирующего рост колоний гранулоцитов (CSF2RA) (патент № WO 2008070074 A3).
Согласно этому способу для прогнозирования риска используют 6 генов, общим для которых является то, что они относятся к системе гематологического ответа. Выбор полиморфизмов в этих генах был проведен авторами патента на основании данных об их ассоциации с шизофренией, представленных в литературе. Риск шизофрении прогнозируют, если присутствуют варианты риска в каждом из генов.
К недостаткам способа относится то, что выбраны гены, связанные с системой гематологического ответа, которая не имеет прямого отношения к биохимическим путям, играющим существенную роль в патогенезе шизофрении. Исходя из этого, выявленные варианты риска обладают недостаточной специфичностью, что сказывается на точности прогноза.
Целью предлагаемого способа прогнозирования риска развития шизофрении является повышение его точности, а также расширение арсенала полиморфизмов для оценки риска шизофрении. Поставленная цель достигается использованием комплексного генотипа, включающего в себя полиморфные локусы rs16944 и rs1143634 в гене интерлейкина - 1β, полиморфные локусы VNTR и rs9657182 в гене индоламин-2,3-диоксигеназы, полиморфные локусы rs2275163 и rs1053230 в гене кинуренин -3-монооксигеназы (КМО). При этом при наличии варианта, содержащего аллель С (rs16944), аллель Т (rs1143634), аллель V1 (VNTR), аллель С (rs9657182), аллель Т (rs2275163) и два аллеля G (rs1053230) прогнозируют риск развития шизофрении.
Таким образом, комплексный генотип содержит аллели по 6 полиморфным локусам трех генов. Выбор генов обусловлен тем фактом, что они участвуют в так называемом кинурениновом пути метаболизма триптофана. Предполагается, что этот путь играет существенную роль в патогенезе шизофрении. Прямых доказательств этому не получено, но в ряде исследований показано, что в спинномозговой жидкости и посмертно взятых образцах головного мозга больных шизофренией по сравнению с контролем содержатся повышенные концентрации продуктов метаболизма (Schwarcz et al. Biol Psychiatry. 2001; Linderholm et al. Schizophr Bull. 2012). Эти продукты, в число которых входят кинуреновая кислота (KYNU), 3-гидроксикинуренин и хинолиновая кислота, являются токсичными для головного мозга. В кинурениновом пути принимают участие многие гены, кодирующие различные ферменты и цитокины. Взаимодействия между ними и их совместный вклад в развитие болезни до сих пор до конца не изучены. Проведенные нами эмпирические исследования показали, что с риском шизофрении оказались связаны три гена. Это ген интерлейкина-1B, который индуцирует секрецию нескольких воспалительных факторов с помощью различных типов клеток, связывается на их поверхности с соответствующими рецепторами, и инициирует каскад событий, в результате чего происходит мобилизация и активация макрофагов и нейтрофилов. Ген IL-1B расположен на хромосоме 2q14, в его промоторе обнаружены полиморфные локусы -511Т>С (rs16944) и С3954Т (rs1143634). Оба полиморфизма являются функциональными, т.е. при замене нуклеотидов имеет место изменение экспрессии соответствующего белка. Минорные аллели, т.е. аллели с более низкой популяционной частотой, связывают с более высокой продукцией белка, т.е. высокая активность характерна для аллелей Т. Ранее обнаружена ассоциация полиморфизма rs16944 с шизофренией, с риском шизофрении был связан аллель С (Shirts et al. Schizophr Res. 2006. 88(1-3):235-244). IDO является ферментом, с помощью которого триптофан превращается в кинуренин. Ген находится на хромосомном участке 8р12-р11. Полиморфные локусы VNTR и rs9657182 расположены в области промотора гена. Полиморфизм VNTR обусловлен разным числом повторов, состоящих из 24 п.о., а полиморфизм rs9657182 - заменой тимина (Т) на цитозин (С). Ранее ген IDO у больных шизофренией не изучали. КМО превращает KYNU в токсический продукт 3-гидроксикинуренин. На возможную роль КМО в патогенезе шизофрении указывают данные о том, что активность этого фермента в значительной степени снижена в префронтальной коре больных шизофренией по сравнению с контролем. Ген КМО находится на хромосомном участке 1q42-44. Полиморфный локус rs1053230, локализованный в экзоне 15, является несинонимичным и ведет к замещению аминокислот Arg452Cys в соответствующем белке, полиморфный локус rs2275163 расположен в интронной области. Ранее было обнаружено, что полиморфизмы генетических вариантов rs2275163 и rs1053230 ассоциированы с шизофренией (Aoyama et al. Genes Brain Behav. 2006. V. 5(4). P. 364-368).
Способ осуществляется следующим образом
Из пробы биологического материала (слюна или кровь) пациента выделяют ДНК любым из известных методов. Для генотипирования полиморфизмов генов используют стандартные олигонуклеотидные праймеры, последовательность которых определяют с помощью соответствующих программ. После этого осуществляют полимеразную цепную реакцию (ПЦР) для определения генотипов по полиморфным локусам rs16944 и rs1143634 в гене IL-β, VNTR и rs9657182 в гене IDO, rs2275163 и rs1053230 в гене КМО. Условия генотипирования для каждого полиморфизма описаны ниже. Для определения аллельного полиморфизма -511Т>С гена IL-1B проводят ПЦР с использованием олигонуклеотидных праймеров: прямой - 5'-TGGCATTGATCTGGTTCATC-3', обратный - 5'-GTTTAGGAATCTTCCCACTT-3'. Реакционная смесь объемом 15 мкл содержит 2.5 мМ хлорида магния, 0.2 мМ каждого dNTP, 0.5 ед. полимеразы Taq, 100 нг геномной ДНК, 10 пкмол каждого из праймеров, 10× буфер для Taq-полимеразы (Helicon). ПЦР проводят по следующей схеме: денатурация в течение 2 минут при 94°С, далее - 30 циклов амплификации (94°С - 20 с; 58°С - 20 с; 72°С - 20 с). На заключительной стадии образцы прогревают при 72°С 4 мин. Рестрикцию проводят с помощью фермента Ama87I (фирма «Сибэнзим») в условиях, рекомендованных производителем. Разделение полученных фрагментов осуществляют в 8%-ном полиакриламидном геле в течение 1 часа при 240V. Размер фрагмента, полученного в результате амплификации, составляет 305 пары оснований (п.о.). После проведения рестрикции наличие фрагмента величиной 305 п.о. свидетельствует о присутствии гомозиготных аллелей ТТ, наличие фрагментов величиной 190 и 115 п.о. соответствует гомозиготным аллелям СС. Наличие трех фрагментов величиной 305, 190 и 115 п.о. свидетельствует о гетерозиготном генотипе ТС. Для определения полиморфизма С3954Т гена IL-1B проводят ПНР с использованием олигонуклеотидных праймеров: прямой - 5'-СТС AGG ТОТ ССТ CGA AGA ААТ СААА и обратный -5'-GCT TTT TTG CTG TGA GTC CCG. Реакционная смесь объемом 15 мкл содержит 2.5 мМ хлорида магния, 0.2 мМ каждого dNTP, 0.5 ед. полимеразы Taq, 100 нг геномной ДНК, 10 пкмол каждого из праймеров, 10× буфер для Taq-полимеразы (Helicon) и (формамид или DMSO). Денатурацию проводят в течение 4 мин при 96°С, далее - 35 циклов амплификации (95°С - 30 с; 58°С - 40 с; 72°С - 25 с). На заключительной стадии образцы прогревают при 72°С 2 мин. Для рестрикции использую фермент Taq (Fermentas или Сибэнзим) в условиях, рекомендованных производителем. Разделение фрагментов осуществляют в 3,5% агарозном геле в присутствии бромистого этидия в течение 1 часа при 240 В. После рестрикции фрагментов получают фрагмент длиной 164 п.о. (генотип ТТ) и фрагменты 52 и 112 п.о., которые соответствуют генотипу СС. На наличие гетерозиготного генотипа ТС указывает наличие трех фрагментов величиной 305, 190 и 115 п.о. Для определения полиморфизма IDO VNTR используют олигонуклеотидные праймеры: прямой - 5'-ААТ ССТ GGG АСА GAA ТСА ТС и обратный - 5' ATG AGG СТА АТА СТТ TGG G. Реакционная смесь объемом 15 мкл содержит 2.5 мМ хлорида магния, 0.2 мМ каждого dNTP, 0.5 ед. полимеразы Taq, 100 нг геномной ДНК, 10 пкмол каждого из праймеров, 10х буфер для Taq-полимеразы (Helicon) и 0.8М бетаина. Денатурацию проводят в течение 4 мин при 94°С, далее - 30 циклов амплификации (94°С - 30 с; 53°С - 30 с; 72°С - 30 с). На заключительной стадии образцы прогревают при 72°С 2 мин. Разделение полученных фрагментов осуществляют в 8%-ном полиакриламидном геле в течение 1 часа при 240 В. Размеры фрагментов составляют: 208 п.о. (аллель V1) и 232 п.о. (аллель V2). Для полиморфизма IDO rs9657182 используют олигонуклеотидные праймеры: прямой - 5'-TGC ТСС ААА АТТ АТА TGA GAT ТСС и обратный - 5' GAC АСА АСА СТТ TAG GAT TTG СА. Состав реакционной смеси тот же, что и для полиморфизма IDO VNTR.
Денатурацию проводят в течение 4 мин при 94°С, далее - 30 циклов амплификации (94°С - 30 с; 61°С - 30 с; 72°С - 30 с). На заключительной стадии образцы прогревают при 72°С 2 мин. Рестрикцию проводят ферментом Bsp19I (Сибэнзим) в условиях, рекомендованных производителем. Разделение фрагментов осуществляют в 8%-ном полиакриламидном геле в течение 1 часа при 240 В. После рестрикции получают фрагмент длиной 232 п.о. (генотип СС) и фрагменты 90 и 142 п.о., которые соответствовуют генотипу ТТ. На наличие гетерозиготного генотипа ТС указывает наличие трех фрагментов величиной 232, 90 и 142 п.о. Генотипирование по полиморфному локусу rs2275163 проводят с использованием олигонуклеотидных праймеров - 5'-ССТ ТТС ACT CTG TTT СТС ТТС ТТС ТС-3' (прямой) и 5'-GCA CGC CAA GCC ССА AGG AGC-3' (обратный). Реакционная смесь объемом 20 мкл содержит 0.2 мМ каждого dNTP, 0.5 ед. полимеразы Taq, 50-100 нг геномной ДНК, 10 пкмол каждого из праймеров, 10х буфер для Taq-полимеразы с 1.5 мМ хлорида магния и 1М бетаина. Начальную денатурацию проводят в течение 4 минут при 96°С, далее - 35 циклов амплификации (96°С - 25 с; 61°С - 35 с; 72°С - 25 с). На заключительной стадии образцы прогревают при 72°С 2 мин. Рестрикцию проводят с помощью эндонуклеазы рестрикции BstDEI (Сибэнзим) в условиях, рекомендованных производителем. Продукты рестрикции разделяют в 3,5% агарозном геле в присутствии бромистого этидия в течение 1 часа при 240V. Аллелю Т соответствует фрагмент длиной 411 пар нуклеотидов (п.о.), а аллелю С - фрагменты длиной 294 и 117 п.о. На наличие гетерозиготного генотипа ТС указывает наличие трех фрагментов величиной 411, 294 и 117 и.о. Для полиморфного локуса rs1053230 (A/G) используют олигонуклеотидные праймеры 5'- ААС АТА CAG AGA ТАС ТСТ АСА ТТС AG -3' (прямой) и 5'- GCT CCC AAT CCT TGA CTT TAT CTT GA -3' (обратный). Состав реакционной смеси и параметры ПНР те же, что и при генотипировании по rs2275163. Рестрикцию проводят с помощью эндонуклеазы рестрикции BspACI (Сибэнзим) в условиях, рекомендованных производителем. После разделения продуктов в 3,5% агарозном геле аллелю А соответствуют фрагменты длиной 334 п.н. и 198 п.о., а аллелю G - фрагменты 198 п.н., 279 п.н. и 56 п.о. На наличие гетерозиготного генотипа AG указывает наличие трех фрагментов величиной 411, 294 и 117 п.о.
При наличии комплексного генотипа, содержащего аллель С (rs16944), аллель Т (rs1143634), аллель VI (VNTR), аллель С (rs9657182), аллель Т (rs2275163) и два аллеля G (rs1053230) у пациента прогнозируют риск развития шизофрении.
2
Возможность использования предлагаемого способа прогнозирования риска развития шизофрении подтверждается результатами исследования группы больных шизофренией, включающей в себя 103 человека, и контрольной группы, состоящей из 206 психически здоровых человек. Больные были обследованы в процессе лечения их в клинических отделениях ФГБУ «НЦПЗ» РАМН. Диагноз шизофрении был поставлен на основе диагностических критериев Международной классификации болезней 10-ого пересмотра. Контрольную группу составили жители Москвы и Московской области, не имеющие клинического диагноза эндогенного психоза, а также не имеющие родственников первой степени родства с таким диагнозом. У всех участников исследования были отобраны образцы слюны или крови. Проведено генотипирование по 6 полиморфным локусам: rs16944 и rs1143634 в гене интерлейкина - 1β, VNTR и rs9657182 в гене индоламин-2,3 -диоксигеназы, rs2275163 и rs1053230 в гене кинуренин -3-монооксигеназы (КМО). Данные о генотипах для каждого человека внесены в таблицу для последующего статистического анализа. Сравнение частоты всех возможных комбинаций генотипов в группах больных и контроля проводили с помощью статистической программы MDR (Multiple Dimensionality Reduction). Значимость различий устанавливали с помощью критерия X. Для расчета риска использовали показатель отношение шансов (ОШ) с приведением доверительного интервала при вероятности 95% (95% ДИ).
2
В результате генотипирования и сравнения всех возможных комбинаций генетических вариантов по 6-ти полиморфным локусам в группе больных и контрольной группе был установлен комплексный генотип, содержащий аллель С (rs16944), аллель Т (rs1143634), аллель VI (VNTR), аллель С (rs9657182), аллель Т (rs2275163) и два аллеля G (rs1053230). Этот генотип был выявлен у 6 (2.9%) человек из контрольной группы и у 12 (11.7%) больных. Различия между частотой этого генотипа в указанных группах были статистически значимы (X=9.6; р=0.002; ОШ 4.4 95% ДИ 1.6-12.1). Таким образом, риск развития шизофрении у носителей указанного комплексного генотипа возрастал по сравнению с носителями любой другой комбинации вариантов более, чем в 4 раза. По сравнению с носителями генотипа, содержащего 0-2 вариантов из состава комплексного генотипа, риск был еще выше (ОШ 5.1; 95% ДИ 1.6-15.9). Нужно отметить, что высокий риск развития шизофрении отмечен только для носителей предложенного комплексного генотипа. Другие комбинации, включающие в себя, например, 4 или 5 вариантов из этого генотипа, не представляли риска - ОШ составляло величину, близкую к 1.
Ниже приводятся примеры осуществления способа.
Пример 1
Пациент В-ий, возраст 22 года. Проведено генотипирование по полиморфным локусам rs16944 и rs1143634 в гене интерлейкина - 1β, VNTR и rs9657182 в гене индоламин-2,3-диоксигеназы, rs2275163 и rs1053230 в гене кинуренин-3-монооксигеназы (КМО). В результате выявлены генотип ТС (rs16944), генотип СТ, (rs1143634), генотип VI V2 (VNTR), генотип СТ (rs9657182), генотип ТТ (rs2275163) и генотип GG (rs1053230). Анализ генотипов показал, что у испытуемого присутствуют все аллели, входящие в комплексный генотип, связанный с риском развития шизофрении. Наличие этого генотипа увеличивает риск шизофрении в 5 раз.
Пример 2
Пациент П-ова, 25 лет. Проведено генотипирование по полиморфным локусам rs16944 и rs1143634 в гене интерлейкина - 1β, VNTR и rs9657182 в гене индоламин-2,3-диоксигеназы, rs2275163 и rs1053230 в гене кинуренин-3-монооксигеназы (КМО). В результате выявлены генотип СС (rs16944), генотип СС, (rs1143634), генотип V2V2 (VNTR), генотип ТТ (rs9657182), генотип СС (rs2275163) и генотип GA (rs1053230). Анализ генотипов показал, что пациентка имеет всего один генотип (СС по полиморфизму rs16944), входящий в состав комплексного генотипа риска. Таким образом, предрасположенность к шизофрении не установлена.
Пример 3
Пациент А-ев, 20 лет. Проведено генотипирование по полиморфным локусам rs16944 и rs1143634 в гене интерлейкина - 1β, VNTR и rs9657182 в гене индоламин-2,3-диоксигеназы, rs2275163 и rs1053230 в гене кинуренин-3-монооксигеназы (КМО). В результате выявлены генотип СС (rs16944), генотип ТТ, (rs1143634), генотип V1V2 (VNTR), генотип СТ (rs9657182), генотип СС (rs2275163) и генотип GG (rs1053230). Анализ генотипов показал, что у испытуемого присутствуют 5 вариантов из 6, составляющих комплексный генотип. Расчет риска показал, что ОШ составляет 1.2 раза, т.е. риск является небольшим.
Таким образом, точность способа повышается за счет использования комплексного генотипа, включающего в себя гены кинуренинового пути метаболизма триптофана. Это связано с тем, что используют гены, которые участвуют в биохимическом пути, имеющем важное значение для патогенеза шизофрении, в частности, гены, связанные с образованием токсических для головного мозга продуктов. Кроме того, в способе предлагается использовать гены и полиморфизмы, ранее не исследованные у больных шизофренией. В отличие от известного способа, в котором для установления риска суммируют варианты риска по каждому гену, нами предложен комплексный генотип. Он подобран путем анализа различных моделей риска, и полученная комбинация аллелей не является очевидной в рамках известного уровня науки и техники. Наличие этого генотипа у испытуемого указывает на предрасположенность к шизофрении на генетическом уровне. Предлагаемый способ может быть использован в практике медико-генетического консультирования для выявления лиц с высоким генетическим предрасположением к шизофрении.