Биосинтетическая активность и антимикробные свойства Eremothecium ashbyi Guill

УДК 579.61:616-092.7

Е. Ф. Семенова

БИОСИНТЕТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ И АНТИМИКРОБНЫЕ СВОЙСТВА EREMOTHECIUM ASHBYI GUILL.

С использованием световой и электронной микроскопии изучены цито-морфологические изменения мицелия Eremothecium ashbyi в связи с накоплением эфирного масла. Проведена сравнительная оценка комплекса водорастворимых веществ цветков розы на уровень биосинтетической активности Eremothecium ashbyi, Esherichia coli, Staphylococcus epidermidis при глубинном культивировании в условиях аэрации. Исследованы антимикробные свойства эремотецевого масла в сравнении с розовым эфирным маслом в отношении Candida albicans, S.aureus и E.coli.

Длительное время господствовало мнение, что эфирные масла продуцируются только высшими растениями. Однако известна способность микроорганизмов различной таксономической принадлежности синтезировать ароматообразующие соединения. В последние десятилетия активно изучаются летучие продукты микробного метаболизма для выяснения их роли в аллело-патических взаимодействиях микро- и макроорганизмов. Прикладной аспект проблемы биосинтеза и накопления летучих метаболитов позволяет рассматривать микроорганизмы в качестве нетрадиционных источников получения натуральных душистых веществ, применяемых в медицине, парфюмернокосметической и пищевой промышленности.

Анализ биосинтетической способности более 50 культур мицелиаль-ных грибов, относящихся к видам Ceratocystis paradoxa, C.pilifera, Eremothecium ashbyi, Ashbyi gossypii, Aspergillus awamori, Asp. foetidus, Penicillium canescens, Trichoderma viride и др., показал, что они могут продуцировать эфирные масла, содержащие ценные компоненты [1-3]. Качественный состав и количественное содержание (22,3-424,1 мг/л культуральной жидкости) синтезируемых летучих соединений весьма разнообразны и обусловлены как генетическими факторами, так и условиями культивирования. В составе эфирных масел изученных штаммов идентифицированы ароматообразующие вещества, относящиеся в основном к следующим классам органических соединений: лактоны, терпеновые и ароматические спирты, альдегиды, кетоны.

Наибольшее количество эфирного масла синтезировали коллекционные штаммы E^shbyi - до 180 мг/л культуральной жидкости в течение первых двух суток роста на ферментационной среде, что может быть сопоставлено с содержанием эфирного масла в 500-600 г цветков розы. Основными компонентами являются гераниол (69,5-84,9% ) и р-фенилэтанол (12,7-27,7%), а также идентифицированы нерол, цитронеллол, нераль и гераниаль, что свидетельствует о сходстве изучаемого масла с эфирным маслом из свежих цветков розы. Наряду с ароматообразующими соединениями штаммы E^sh-byi продуцируют витамин В2 (рибофлавин) до 137 мг/л культуральной жидкости и при этом различаются уровнем флавиногенеза [4, 5].

Проведенный нами скрининг по накоплению монотерпеновых спиртов, рибофлавина, интенсивности роста 9 штаммов позволил выделить для дальнейшей селекции штамм № 124 из Всесоюзной коллекции микроорганизмов (ВКМ) как наиболее продуктивный. Однако популяция этого штамма была

гетерогенна по степени выраженности некоторых морфофизиологических признаков отдельных колоний (диаметру, пигментации, интенсивности маслообразовательного процесса). Это позволило получить путем многократного ступенчатого отбора на основе естественной изменчивости новый штамм E^shbyi ВКМ Б-3009Д, превосходящий по биосинтетической активности исходный ВКМ 124 в 1,4 раза и производственный из Центральной коллекции промышленных микроорганизмов (ЦКПМ) 340 - в 1,6 раза [6, 7]. Следует отметить, что представляет интерес выяснение эндогенных механизмов и экзогенных факторов, влияющих на образование и накопление душистых веществ у микроскопических грибов как модельных объектов.

В связи с этим целью данного исследования является изучение микро-морфологических изменений мицелия и динамики маслонакопления в процессе культивирования E^shbyi ВКМ Б-3009Д, а также сравнение антимикробного действия эремотецевого и розового эфирных масел.

Материал и методы исследования

Объектами исследования служили селектированный нами штамм Eremothecium ashbyi Guill. ВКМ Б-3009Д (таксономическое положение согласно современной классификации, предложенной Алексопулосом и др. [8]: царство Fungi, тип Ascomycota, класс Endomycetes, порядок Saccharomy-cetales, семейство Spermophthoraceae) и коллекционные культуры кафедры микробиологии Крымского мединститута, относящиеся к видам бактерий по [9]: Esherichia coli (царство Bacteria, класс Gracilicutes, семейство Enterobacte-riaceae), Staphylococcus epidermidis, S.aureus (царство Bacteria, класс Fir-micutes, семейство Micrococcaceae) и дрожжей Candida albicans (царство Fungi, тип Fungi imperfecti, класс Blastomycetes - по [10]).

Штамм гриба хранили при 4°C на скошенной агаризованной среде, содержащей соевую муку (4%) и сахарозу (1%), бактериальные культуры - на мясо-пептонном агаре (МПА), дрожжи - на кукурузном агаре. Культивирование осуществляли в течение 18-84 ч в жидкой питательной среде (10 мл) в микробиологических пробирках на качалках (150 об./мин). Культуральную жидкость (КЖ) в трехкратной повторности отбирали каждые 12 ч, начиная с

24 ч культивирования. Мицелий отфильтровывали, биомассу определяли после высушивания при 100°C до постоянной массы, фильтрат культуральной жидкости экстрагировали диэтиловым эфиром или липиды извлекали трехкратной экстракцией гексаном. Растворитель удаляли на роторном испарителе под вакуумом, остаток липидов взвешивали. Навеску липидов растворяли в гексановом растворе внутреннего стандарта (2 мг ментола в 1 мл гексана) и анализировали содержание ароматообразующих соединений (АОС) методом газожидкостной хроматографии (ГЖХ). Содержание рибофлавина определяли cпектрофотометрически при 445 нм после предварительного гидролиза культуральной жидкости при 100°C в течение 30 мин в присутствии 6 н раствора соляной кислоты. В качестве экзогенного стимулятора биосинтетической активности использовали (из расчета 0,05-3,0 г СВ/л среды) комплекс водорастворимых веществ цветков розы (ВВЦР), представляющий жидкую фазу, отделенную от отходов после гидродистилляции эфиромасличной розы. Определение антимикробных свойств E.ashbyi проводили методами перпендикулярных штрихов и агаровых блочков [11], основанных на диффузии в агар, а антимикробное действие эфирного масла - методом серийных разведений [12, 13].

Образцы для электронной микроскопии готовили, как было описано ранее [7]. Морфологию культуры Е.а8ЬЪу1 исследовали под микроскопами МБС-1 (кратность увеличения 10-40) и 1ЕМ-100 С (при увеличении в 15-40 тыс. раз). Результаты обрабатывали статистически, уровень значимости р = 0,95 [14, 15].

Результаты и их обсуждение

Морфологические и физиолого-биохимические исследования. Мак-ро- и микроморфологические исследования штамма Е.а8ЬЪу1 ВКМ Б-3009Д позволили выявить его отличительные признаки. Дихотомически ветвящийся мицелий состоит из многоядерных клеток. Диаметр гиф варьирует в пределах 2,5-16,5 мкм (рис. 1,а1,б1,в1,г1). Спорангии продолговатые многоспоровые, конидии веретеновидные. Размеры аскоспор составляют: длина -20,2-26,7 мкм, диаметр - 2,5-2,8 мкм. На агаризованной среде образует плоские матовые (позднее глянцевые) колонии желтого цвета, легко снимающиеся с агара. Форма колоний округлая, диаметром 8-12 мм (на сусло-агаре через 3 сут. роста при 28°С).

Физиолого-биохимические особенности штамма, изученные в основном на модификациях среды Чапека [16], заключаются в следующем: Е.а8ЬЪу1 ВКМ Б-3009Д в качестве источников углерода использует глюкозу, фруктозу, рафинозу, сахарозу, глицерин, ацетат и цитрат, не усваивает крахмал, целлюлозу, этанол, инозит, коагулирует молоко, слабо разжижает желатину.

Штамм синтезирует эфирное масло, в состав которого входит гераниол (65,5-80,9%), цитронеллол (6,0-11,4%), нерол (1,8-3,4%), р-фенилэтанол (9,1-20,1%).

Динамика накопления биомассы Е.а8ЬЪу1 при культивировании в жидкой питательной среде подчиняется известным закономерностям для простых периодических культур: до 36 ч рост идет экспоненциально и достигает 2,0 г сухой биомассы на 1 л культуральной жидкости, затем наблюдается замедление скорости роста, характерное при переходе к стационарной фазе, и к концу ферментации - начало автолиза культуры. При этом происходил сдвиг рН: закисление культуральной жидкости в период активного роста до 5,5 и увеличение рН до 6,2 в стационарную фазу и фазу лизиса. Синтез и накопление рибофлавина начинался в фазе стационарного роста и увеличивался по мере лизирования культуры до 30 мг/г сухой биомассы. Максимум накопления основного монотерпенового спирта в составе эфирного масла гриба - гераниола наступал в период между 36 и 48 ч культивирования (рис. 1) и составил

25 мг/г сухой биомассы.

С указанными особенностями биосинтетической активности коррелирует формирование и развитие некоторых клеточных структур (рис. 1,а2,б2,в2,г2). В гифах мицелия суточной глубинной культуры присутствовали относительно электронно-светлые полосатые липидные тела. Количество их в динамике изменялось параллельно с уровнем накопления компонентов эфирного масла в культуральной среде. Следует также отметить наличие (на всех фазах роста) липидных тел другого типа - электронно-плотных (осмиефильных), округлых, причем мелкие тела сливались в более крупные образования неправильной формы («потоки»). Их морфологические параметры (количество, размеры, местоположение) характеризовали функциональную активность мицелия: возрастание степени общей осмиефильности протоплазмы с увеличением суммарной биосинтетической активности штамма. При этом распо-

ложение округлых липидных тел привязано к основным клеточным мембранам: плазмалемме и тонопласту. После выделения липидов в среду осмие-фильность клеток значительно снижалась. Липидные тела практически исчезали. В вакуолях не обнаруживали электронно-плотного содержимого. Можно предположить, что выделение микроорганизмами душистых веществ в среду служит одной из регуляторных функций их синтеза («механизм переполнения», или экскреции избыточных метаболитов).

_ Уровень _

Световая микроскопия Электронная микроскопия

гераниола

Рис. 1 Цитоморфологические особенности мицелия ЕгешоШеаип а8№у1 и изменение уровня гераниола в процессе накопления душистых веществ: а1, а2 - 24 ч; б1, б2 - 36 ч; в1, в2 - 48 ч; г1, г2 - 60 ч культивирования в жидкой питательной среде

Для повышения биосинтетической активности микроорганизмов в наших опытах использовали экзогенный фактор - комплекс ВВЦР (таблица 1). Контролем служили среды культивирования без добавления ВВЦР.

Таблица 1

Эффективность применения комплекса ВВЦР для экзогенной стимуляции микробного синтеза в условиях in vitro

Название микроорганизма Вариант опыта Накопление в 1 л КЖ % к контролю

биомассы, г АОС, мг биомассы АОС

Е^йуі Контроль - 138,0 - 100,0

Соевая среда + 3,0 г /л ВВЦР - 212,2 - 153,8

Контроль 1,63 124,0 100,0 100,0

Солодовое сусло + 0,05 г/л ВВЦР 2,21 150,7 135,6 121,5

E.coli Контроль 1,13 - 100,0 -

Пептонно-сахарозная среда + 0,05 г/л ВВЦР 1,43 - 126,6 -

S.epidermidis Контроль 2,37 - 100,0 -

Пептонно-сахарозная среда + 0,5 г/л ВВЦР 2,92 - 123,1 -

Как видно из представленных данных, введение комплекса ВВЦР в состав жидких сред культивирования микроорганизмов различных таксонов позволяет интенсифицировать биосинтетические процессы, что приводит к увеличению накопления биомассы на 23,1-35,6% и эфирного масла (арома-тобразующих соединений) на 21,5-53,8%.

Изучение антимикробных свойств. Оценка антимикробного действия E.ashbyi проводилась с использованием в качестве тест-культур Candida albicans, S.aureus, E.coli. Методами перпендикулярных штрихов и агаровых блочков, основанных на диффузии в агар, предварительно выявляли антагонистические свойства E.ashbyi. В первом случае гриб и тест-организмы выращивали на одной среде МПА или сусло-агаре, причем посев тест-организмов проводили перпендикулярно к штриху E.ashbyi, инкубированного в течение двух-трех суток при 28°С. Во втором случае микроорганизмы культивировали на разных средах: E.ashbyi - на пептонно-дрожжевой среде и среде Чапека-Докса предварительно в течение 60 ч, C.elbicans - на декстроз-ном агаре Сабуро, S.aureus, E.coli - на МПА. Антимикробная активность изучаемого гриба, чувствительность тест-культур учитывалась визуально спустя одни-двое суток и была выражена недостаточно четко, зоны отсутствия роста составляли 1-5 мм. Поэтому для количественной оценки антимикробного действия был использован метод серийных разведений двух образцов эфирного масла гриба (экстрактового и гидродистилляционного) в сравнении с розовым маслом, обладающим спазмолитическим и антисептическим действием [17]. Состав эремотецевого масла образца № 1 включал до 65% парафинов, 8,3% цитраля, 6,2% фенилэтанола и около 20% монотерпеновых спиртов (гераниола, нерола, цитронеллола). Содержание данных компонентов в об-

4S

разце № 2 соответственно равнялось: 6,7; 9,3; 53,6 и 22,9%. В образце розового масла массовая доля р-фенилэтилового спирта составила 75,5%, а моно-терпеновых спиртов - 8,0%.

Результаты определения антимикробных свойств эремотецевого масла по сравнению с маслом из цветков розы эфиромасличной представлены в таблице 2. У образцов № 1 и № 2 антимикробная активность наблюдалась в отношении С.а1Ысаш при разведении 1:2048, к Б.аигеш - в разведении 1:1024 и к Е.соН - от 1:512 до 1:1024. Антимикробное действие образца № 3 на Е.соН было аналогично образцу № 2, а в отношении С.а1Ысаш и Б.аигеш - значительно ниже (от 1:256 до 1:512). Отмеченные свойства эфирного масла из гриба (качественный состав, количественное содержание, антимикробная активность, аромат) сходны с эфирным маслом из цветков розы. Полученные данные являются предпосылкой для применения эремотецевого масла в медицине и косметике.

Таблица 2

Эффективность действия эремотецевого и розового эфирных масел в отношении некоторых видов микроорганизмов

Разведение эфирного масла

Экстрактовое

Рост тест-культур на мясо-пентонном бульоне + 6°Б сусло (1:1) при 30°С

С.аіЬіеап 8 сл £ 00 Е.соїі С.аІЬісап 8 сл £ 00 Е.соїі С.аїЬі- саш Б.аигеш Е.соїі

1:128 - - - - - - - - -

1:256 - - - - - - - - -

1:512 - - - - - - + - -

1:1024 - - + - - - + + -

1:2048 - + + - + + + + +

1:4096 + + + + + + + + +

Контроль (среда без ЭМ ) + + + + + + + + +

Выводы

1. У штамма Е.а8ЬЪу1 ВКМ Б-3009Д в ходе культивирования повышение интенсивности синтеза эфирного масла к началу стационарной фазы сопровождается увеличением числа, размеров липидных капель и общей ос-миефильности вакуолизированной протоплазмы. Максимум накопления культурой эфирного масла совпадает с мощными «потоками» электронноплотного вещества в области клеточной оболочки.

2. Повышение активности микробиологического синтеза в 1,2—1,5 раза у изученных бактериальных и грибных культур (Е.соН, 8.ер1ёетйШ8, Е^Ь-Ъу1) наблюдается при внесении в ферментационную среду 0,05-3,0 г/л сухих водорастворимых веществ цветков эфиромасличной розы.

3. Установлено наличие антимикробной активности у образцов эфирного масла гриба E.ashbyi, соответствующей пределам активности эфирного масла из лепестков розы в отношении C.albicans, S.aureus, E.coli. Антимикробное действие в значительной мере обусловлено не только количественным содержанием отдельных ароматобразующих соединений, но и их сочетанием, дающим дополнительный ингибирующий эффект.

Список литературы

1. Бугорский, П. С. Получение и анализ эфирных масел при культивировании некоторых мицелиальных грибов / П. С. Бугорский, Е. Ф. Семенова, В. С. Родов [и др.] // Основные направления исследований по интенсификации эфиромасличного производства : тезисы докладов Всесоюзного совещания. - Симферополь, 1985. - Ч. 2. - С. 51-52.

2. Семенова, Е. Ф. Некоторые итоги поиска биотехнологически перспективных ароматообразующих культур / Е. Ф. Семенова, П. С. Бугорский // Труды ВНИИ эфиромасличных культур. - Симферополь, 1989. - Т. 20. - С. 14-16.

3. Семенова, Е. Ф. Мицелиальные грибы - перспективные культуры для биотехнологического получения ароматических продуктов / Е. Ф. Семенова, П. С. Бу-горский // V симпозиум «Основные направления научных исследований по интенсификации эфиромасличного производства» : тезисы докладов. - Кишинев, 1990. -С. 88-89.

4. Семенова, Е. Ф. Eremothecium ashbyi - перспективный продуцент для биотехнологии эфирных масел / Е. Ф. Семенова // VII съезд Украинского микробиологического общества (тезисы докладов). - Черновцы, 1989. - Ч. 1. - С. 126.

5. Бугорский, П. С. Влияние ионов водорода, калия и натрия на продуктивность гриба Eremothecium ashbyi / П. С. Бугорский, Е. Ф. Семенова, В. С. Родов // Микробиологический журнал. - 1990. - Т. 52. - № 3. - С. 44-47.

6. А. С. 1454845 СССР. Штамм гриба Eremothecium ashbyi - продуцент эфирного масла / Е. Ф. Семенова, В. С. Родов, П. С. Бугорский ; опубл. 30.01.89, Бюл. № 4.

7. Погорельская, А. Н. О биосинтезе компонентов эфирного масла гриба Eremothecium ashbyi (структурно-функциональные особенности) / А. Н. Погорельская, П. С. Бугорский, Е. Ф. Семенова [и др.] // Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. - 2003. - № 1. - С. 83-85.

8. Alexopoulus, C. J. Introductory mycology / C. J. Alexopoulus, C. W. Mims, M. Blackwell. - Ed. 4. - New York : John Wiley & Sons, inc., 1996.

9. Bergey’s manual of systematic bacteriology : 4 v. - Ed. 9. - Baltimore : Williams & Wilkins co, 1994.

10. Саттон, Д. Определитель патогенных и условно патогенных грибов / Д. Саттон,

A. Фотергилл, М. Ринальди . - М. : Мир, 2001. - 486 с.

11. Практикум по микробиологии / под ред. Н. С. Егорова. - М. : Изд-во Моск. ун-та, 1976. - 307 с.

12. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования / под ред. М. О. Биргера. - М. : Медицина, 1982. - 464 с.

13. Руководство к практическим занятиям по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии / под ред. В. В. Теца. - М. : Медицина, 2002. - 352 с.

14. Платонов, А. Е. Статистический анализ в медицине и биологии: задачи, терминология, логика, компьютерные методы / А. Е. Платонов. - М. : Изд-во РАМН, 2000. - 52 с.

15. Сергиенко, В. И. Математическая статистика в клинических исследованиях /

B. И. Сергиенко, И. Б. Бондарева. - М. : Гэотар-Медиа, 2006. - 304 с.

16. Практикум по микробиологии / под ред. А. И. Нетрусова. - М. : Академия, 2005. -608 с.

17. Лекарственное сырье растительного и животного происхождения. Фармакогнозия : учеб. пособие / под ред. Г. П. Яковлева. - СПб. : Спецлит, 2006. - 845 с.