СПОСОБ ИЗМЕРЕНИЯ ИНТЕНСИВНОСТИ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ ПОТЕНЦИАЛОЧУВСТВИТЕЛЬНОГО ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО КРАСИТЕЛЯ
MEASURING METHOD OF FLUORESCENCE INTENSITY OF VOLTAGE-SENSITIVE FLUORESCENT DYE

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[0001] Настоящее изобретение относится к способу, в котором используется витамин E и/или холестерин для увеличения чувствительности потенциалочувствительных флуорохромов, которые излучают флуоресценцию в ответ на изменение потенциала или ионной силы, (т.е. для сенсибилизации флуорохромов), или способу увеличения интенсивности флуоресценции потенциалочувствительных флуорохромов. Настоящее изобретение также относится к способу измерения потенциала действия культивируемых кардиомиоцитов, используя системы измерения, которые были сенсибилизированы или в которых была увеличена интенсивность посредством использования витамина E и/или холестерина. Настоящее изобретение, кроме того, относится к способу, в котором используется потенциалочувствительный флуорохром, образующий твердую фазу на поверхностях подложки, так что изменения потенциала или ионной силы согласно потенциалочувствительному флуорохрому можно измерить независимо от того, используется ли мембранный носитель, такой как клетки или липидные бислойные липосомы. Настоящее изобретение также относится к способу отбора вещества, которое увеличивает процент изменения потенциалозависимой или зависимой от изменения ионной силы интенсивности флуоресценции потенциалочувствительных флуорохромов, или которое увеличивает интенсивность флуоресценции.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0002] Аритмия является заболеванием, которое не только значительно понижает качество жизни пациентов, но которое также иногда угрожает их жизни. При разработке лекарственных средств от различных заболеваний необходимым является выявление и избегание любых побочных эффектов (например, аритмии), которые, бывает, влияют на электрические активности кардиомиоцитов. До сих пор животные и кардиомиоциты животного происхождения использовались с целью разработки антиаритмических средств и их проверки на любые действия, которые, бывает, влияют на электрические активности кардиомиоцитов. Однако вследствие вовлеченных межвидовых различий такой подход не был практически осуществимым способом, который можно использовать в случае людей (непатентный документ 1: Biochem. Biophys. Res. Commun., Vol. 385, p. 497-502, 2009).
[0003] Недавние разработки ES клеток человека и iPS клеток человека показали, что кардиомиоциты человека можно получить посредством дифференцировки этих клеток. Способ, с помощью которого можно легко получить информацию о потенциале действия кардиомиоцитов человека, используя эти клетки, будет играть важную роль в связанной с обнаружением лекарственных средств деятельности. В нынешних условиях использование потенциалочувствительных флуорохромов, как предполагают, обеспечит способ измерения потенциалов действий таких кардиомиоцитов, происходящих из ES клеток или iPS клеток человека; однако проблемой, связанной с анализом, используя потенциалочувствительные флуорохромы, является то, что, независимо от того, происходят ли кардиомиоциты от ES клеток человека или iPS клеток человека, было невозможным измерение потенциалов их действий вследствие недостаточности чувствительности потенциалочувствительных флуорохромов.
[0004] Дополнительной проблемой, связанной с ранее используемыми потенциалочувствительными флуорохромами, является то, что измерение потенциала возможно только, когда они связаны с мембранными носителями, такими как клетки или липидные бислойные липосомы. Если быть точнее, для измерения чувствительности потенциалочувствительных флуорохромов необходимо было выполнять эксперимент после обработки потенциалочувствительных флуорохромов в водном растворе для образования твердой фазы на мембранном носителе, таком как клетки или липидные бислойные липосомы, но это делало необходимым приготовление клеток или липидных бислойных липосом в качестве мембранного носителя. Поскольку в этом подходе требуется приготовление липидных бислойных липосом или использование клеток в качестве мембранного носителя, экспериментальная система станет не только сложной, но на нее будут также влиять различные мешающие артефакты.
СПИСОК ПРОТИВОПОСТАВЛЕННЫХ МАТЕРИАЛОВ
НЕПАТЕНТНЫЕ ДОКУМЕНТЫ
[0005] Непатентный документ 1: Biochem. Biophys. Res. Commun., Vol. 385, p. 497-502, 2009
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
ТЕХНИЧЕСКАЯ ПРОБЛЕМА
[0006] Целью настоящего изобретения является обеспечение способа увеличения изменения интенсивности флуоресценции, излучаемой потенциалочувствительным флуорохромом, в зависимости от изменения потенциала или ионной силы и/или способа увеличения интенсивности флуоресценции в зависимости от потенциала или ионной силы.
Другой целью настоящего изобретения является измерение изменений потенциалов действий происходящих из ES клеток или iPS клеток кардиомиоцитов, которые ранее было невозможно измерить.
Дальнейшей целью настоящего изобретения является обеспечение того, чтобы интенсивности флуоресценции потенциалочувствительных флуорохромов или потенциалозависимые количественные изменения интенсивности их флуоресценции можно было легко измерить без использования таких материалов (мембранных носителей), как клетки или липидные бислойные липосомы.
Еще одной целью настоящего изобретения является разработка способа скрининга для обнаружения вещества, которое увеличивает интенсивности флуоресценции потенциалочувствительных флуорохромов.
РЕШЕНИЕ ПРОБЛЕМЫ
[0007] Авторы настоящего изобретения скринировали ряд веществ и установили, что витамин E выполняет функцию увеличения чувствительности потенциалочувствительных флуорохромов, тогда как и витамин E, и холестерин выполняют функцию увеличения интенсивности флуоресценции потенциалочувствительных флуорохромов. Кроме того, стало ясно, что эти вещества можно скомбинировать таким образом, чтобы витамин E увеличивал чувствительность потенциалочувствительного флуорохрома при увеличении в то же самое время абсолютной величины интенсивности его флуоресценции с помощью и холестерина, и витамина E (или комбинации холестерина и витамина E). На основе этих обнаружений авторы настоящего изобретения осуществили настоящее изобретение, которым обеспечивается способ измерения изменений интенсивности флуоресценции потенциалочувствительного флуорохрома в зависимости от изменения потенциала или ионной силы, в котором к потенциалочувствительному флуорохрому добавляют ионизирующееся соединение для вызова изменения потенциала или ионной силы, а также добавляют витамин E и/или холестерин для увеличения изменения потенциала или ионной силы согласно потенциалочувствительному флуорохрому.
[0008] Авторы настоящего изобретения также показали, что в результате использования описанного выше действия для сенсибилизации потенциалочувствительных флуорохромов, чтобы увеличить интенсивность их флуоресценции, можно было выполнить ранее невозможное измерение потенциалов действий единичных клеток, таких как происходящие из ES клеток или iPS клеток кардиомиоциты, при этом дополнительным преимуществом являлось предоставление возможности измерений изменений потенциала действия в специфических областях клеток. На основе этих обнаружений авторы настоящего изобретения предоставляют способ измерения потенциала действия культивируемых кардиомиоцитов, в котором потенциалочувствительный флуорохром приводят в контакт с кардиомиоцитами, культивируемыми в культуральной среде, в культуральную среду добавляют витамин E и/или холестерин и измеряют изменения интенсивности флуоресценции потенциалочувствительного флуорохрома в зависимости от изменения потенциала или ионной силы.
[0009] Авторами настоящего изобретения было, кроме того, сделано новое открытие, что потенциалочувствительные флуорохромы можно адсорбировать с образованием твердой фазы на поверхностях подложек, таких как пластмассовые или стеклянные поверхности. Это открытие основано на обнаружении того, что потенциалочувствительные флуорохромы являются веществами, которые можно легко адсорбировать на поверхностях подложек, таких как пластмассовые или стеклянные поверхности. Используя образованную таким образом твердую фазу потенциалочувствительных флуорохромов, авторы настоящего изобретения с успехом разработали систему, с помощью которой изменения потенциала или ионной силы можно измерить очень легко и последовательным и высоко-воспроизводимым образом даже в отсутствие мембранного носителя, такого как клетки или липидные бислойные липосомы. На основе этого обнаружения авторы настоящего изобретения предоставляют способ измерения изменений потенциала или ионной силы согласно потенциалочувствительному флуорохрому в отсутствие мембранного носителя, такого как клетки или липидные бислойные липосомы, в котором потенциалочувствительный флуорохром иммобилизуют на поверхности подложки в растворе, к раствору добавляют ионизирующееся соединение для придания потенциала или вызова изменения ионной силы и измеряют изменения интенсивности флуоресценции потенциалочувствительного флуорохрома в зависимости от изменения потенциала или ионной силы.
[0010] В еще одном варианте настоящего изобретения его авторы, основываясь на обнаружении того, что при использовании специфических веществ можно увеличить чувствительность флуоресценции от потенциалочувствительных флуорохромов или абсолютную величину интенсивности их флуоресценции, и что изменения потенциала или ионной силы согласно потенциалочувствительным флуорохромам можно также измерить независимо от того, используется ли мембранный носитель, такой как клетки или липидные бислойные липосомы, продемонстрировали возможность скрининга на вещества, способные увеличивать чувствительности потенциалочувствительных флуорохромов, или вещества, способные увеличивать абсолютные величины интенсивности их флуоресценции. На основе этих данных наблюдений авторы настоящего изобретения предоставляют способ отбора вещества, которое увеличивает процент изменения интенсивности флуоресценции потенциалочувствительного флуорохрома в зависимости от потенциала или ионной силы, включающий:
(i) иммобилизацию потенциалочувствительного флуорохрома на поверхности подложки в растворе, добавление в раствор ионизирующегося соединения и измерение изменений интенсивности флуоресценции потенциалочувствительного флуорохрома в зависимости от изменения потенциала или ионной силы, чтобы таким образом измерить опорное значение для потенциала или ионной силы согласно потенциалочувствительному флуорохрому в отсутствие мембранного носителя, такого как клетки или липидные бислойные липосомы;
(ii) иммобилизацию потенциалочувствительного флуорохрома на поверхности подложки в растворе, добавление в раствор ионизирующегося соединения и испытываемого вещества и измерение изменений интенсивности флуоресценции потенциалочувствительного флуорохрома в зависимости от изменения потенциала или ионной силы, чтобы таким образом измерить испытательное значение потенциала или ионной силы согласно потенциалочувствительному флуорохрому в отсутствие мембранного носителя, такого как клетки или липидные бислойные липосомы;
(iii) сравнение опорного значения, полученного в (i), с испытательным значением, полученным в (ii), и, если при одной и той же концентрации ионизирующегося соединения интенсивность флуоресценции потенциалочувствительного флуорохрома, полученная в (ii), выше интенсивности флуоресценции, полученной в (i), или если в случае по меньшей мере двух различных концентраций добавляемого ионизирующегося соединения процент увеличения интенсивности флуоресценции, полученный в (ii), выше процента увеличения, полученного в (i), отбор испытываемого вещества в качестве вещества, которое увеличивает процент изменения интенсивности флуоресценции потенциалочувствительного флуорохрома в зависимости от потенциала или ионной силы.
ПОЛЕЗНЫЕ ЭФФЕКТЫ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0011] Стало ясно, что независимо от того, выполняется ли эксперимент в системе, в которой не используется мембранный носитель, такой как клетки или липидные бислойные липосомы, или в традиционной системе, в которой используется мембранный носитель, такой как клетки или липидные бислойные липосомы, чувствительность флуоресценции в зависимости от изменения потенциала или ионной силы от потенциалочувствительных флуорохромов можно увеличить с помощью витамина E, и что интенсивность флуоресценции потенциалочувствительных флуорохромов в зависимости от изменения потенциала или ионной силы можно увеличить с помощью и витамина E, и холестерина.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0012] Фиг.1 представляет собой набор фотографий, на которых показано, что потенциалочувствительные флуорохромы, образующие твердую фазу на поверхности подложки, излучали флуоресценцию с интенсивностями, пропорциональными ионной силе, в таких условиях, в которых не было клеток, выполняющих функцию мембранного носителя; очевидно, что независимо от материала подложки (стекла или пластмассы) или типа потенциалочувствительного флуорохрома интенсивность флуоресценции увеличивалась пропорционально концентрации добавленного ионизирующегося соединения (хлорида калия).
Фиг.2 представляет собой набор фотографий, на которых показано, что потенциалочувствительные флуорохромы, образующие твердую фазу на поверхности подложки, излучали флуоресценцию с интенсивностями, пропорциональными ионной силе, в таких условиях, в которых не было клеток, выполняющих функцию мембранного носителя; в случае Di8-ANEPPS (Фиг.2a) и RH237 (Фиг.2b) изменения интенсивности флуоресценции возникали пропорционально концентрации добавленного ионизирующегося соединения (хлорида калия).
Фиг.3 представляет собой набор фотографий, на которых показано, что витамин Е действует как вещество, способное увеличить процент потенциалозависимого изменения интенсивности флуоресценции потенциалочувствительного флуорохрома (т.е. как вещество, обладающее сенсибилизирующим действием), и что и холестерин, и витамин E действуют как усилитель потенциалозависимой интенсивности флуоресценции потенциалочувствительного флуорохрома.
Фиг.4 представляет собой набор фотографий, на которых показано, что витамин E действует как вещество, способное увеличить процент потенциалозависимого изменения интенсивности флуоресценции потенциалочувствительного флуорохрома (т.е. как вещество, обладающее сенсибилизирующим действием), и что и холестерин, и витамин E действуют как усилитель потенциалозависимой интенсивности флуоресценции потенциалочувствительного флуорохрома.
Фиг.5 представляет собой набор фотографий, на которых показано, что витамин E и холестерин могут также проявлять сенсибилизирующее или усиливающее действие в отношении потенциалочувствительного флуорохрома в таких условиях, когда в качестве мембранного носителя использовались клетки.
ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
[0013] Потенциалочувствительные флуорохромы являются веществами, применимыми для измерения потенциала действия кардиомиоцитов или нейронов. Ранее сообщалось о различных веществах в качестве потенциалочувствительных флуорохромов. Традиционные способы, в которых используются потенциалочувствительные флуорохромы для анализа характеристик потенциала действия по показателю интенсивности флуоресценции, включают измерение разности потенциалов между внутренней стороной и внешней стороной клеточной мембраны, используя мембранную структуру (мембранный носитель), такую как клетки или липидные бислойные липосомы. В этих традиционных способах не используются клетки, обладающие автономной электрической активностью; а предпочтительнее используется мембранный носитель, такой как клетки или липидные бислойные липосомы, не обладающий электрической активностью, и с внешней стороны клетки добавляют ионизирующееся соединение для создания трансмембранной разности потенциалов; основанный на этом подходе метод обычно использовался в качестве количественного аналитического способа.
[0014] Для выполнения измерения потенциала согласно потенциалочувствительным флуорохромам используют клетки, поскольку потенциалочувствительные флуорохромы, которые первоначально предназначались для измерения трансмембранной разности потенциалов, специально разрабатывались для приобретения ими большей способности к перемещению к клеточной мембране, чтобы достичь этой цели.
[0015] Для поиска добавок, которые могли бы дать возможность выявлять изменения потенциала действия с большей чувствительностью, авторы настоящего изобретения сначала выполняли измерения в соответствии с традиционным способом, используя клетки в качестве мембранного носителя. Когда с целью увеличения интенсивности флуоресценции от потенциалочувствительного флуорохрома было добавлено большее количество потенциалочувствительного флуорохрома, увеличилась интенсивность флуоресценции на чашке для культивирования клеток, а не на клетках, а именно увеличилась интенсивность флуоресценции фона. Это необычное явление говорит об иммобилизации потенциалочувствительного флуорохрома на поверхности чашки для культивирования клеток в качестве подложки. Поскольку ранее считалось необходимым подвергание потенциалочувствительного флуорохрома экспериментированию после его обработки для образования твердой фазы на мембранном носителе, таком как клетки или липидные бислойные липосомы, возможность иммобилизации потенциалочувствительного флуорохрома на поверхности подложки, такой как пластмасса, стекло и т.д., была совершенно неожиданным явлением.
[0016] Основываясь на этом обнаружении, авторы настоящего изобретения измерили изменения интенсивности флуоресценции в зависимости от концентрации добавленного ионизирующегося соединения (т.е. ионной силы) в соответствии с традиционным способом за исключением того, что потенциалочувствительный флуорохром не обрабатывали для образования твердой фазы на мембранном носителе, такой как клетки или липидные бислойные липосомы, а допускали адгезию к поверхности подложки, к которой прилипают клетки, такой как пластмасса или стекло. В результате авторы настоящего изобретения установили, что даже без использования мембранного носителя, таком как клетки или липидные бислойные липосомы, интенсивность флуоресценции увеличивается зависимым от концентрации ионизирующегося соединения (т.е. ионной силы) образом. Это дало возможность легко измерять интенсивность флуоресценции потенциалочувствительного флуорохрома и потенциалозависимое количественное изменение интенсивности флуоресценции.
[0017] Таким образом, в одном варианте настоящего изобретения его авторы показали, что в соответствии с процедурой, включающей стадии иммобилизации потенциалочувствительного флуорохрома на поверхности подложки в растворе, добавления в раствор ионизирующегося соединения и измерения изменений интенсивности флуоресценции потенциалочувствительного флуорохрома в зависимости от изменения потенциала или ионной силы, был обеспечен способ измерения изменений потенциала или ионной силы согласно потенциалочувствительному флуорохрому даже в отсутствие мембранного носителя, такого как клетки или липидные бислойные липосомы.
[0018] Используемый здесь потенциалочувствительный флуорохром может быть любого из типов, которые вообще имеются в распоряжении в соответствующей области техники, и подходящий потенциалочувствительный флуорохром может быть выбран из числа следующих: потенциалочувствительных флуорохромов на основе стирила, включающих ANEPPS, ANRPEQ и RH; потенциалочувствительных флуорохромов на основе цианина или оксонола, включающих DiSC, DiOC, DiIC, DiBAC и DiSBAC; и происходящего от родамина потенциалочувствительного флуорохрома, такого как Rh 123, TMRM и TMRE. В настоящем изобретении более предпочтительно использовать потенциалочувствительные флуорохромы на основе стирила, включающие ANEPPS, ANRPEQ и RH, конкретными примерами которых служат di-8-ANEPPS, di-4-ANEPPS, RH-237, RH-1691, di-5-ASP, RH-160, RH-421, RH-795, di-4-ANEPPDHQ, ANNINE-5 и ANNINE-6, и предпочтительный потенциалочувствительный флуорохром можно выбрать из их числа.
[0019] Ионизирующееся соединение, добавляемое к потенциалочувствительному флуорохрому, иммобилизованному на поверхности подложки в растворе, может быть любым веществом, которое ионизируется (превращается в йоны) в растворе. Выражаясь точнее, оно может быть ионизирующимся соединением, которое состоит только из йонов, содержащихся в биологической тканевой жидкости или внутриклеточной жидкости, таких как йон калия, натрия, кальция, бикарбонат-йон, хлорид-йон, гидроксильный йон и йон аммония. В настоящем изобретении хлорид калия, хлорид кальция или хлорид натрия могут обычно использоваться в качестве предпочтительного ионизирующегося соединения.
[0020] Поверхность подложки, такой как пластмасса или стекло, не нужно подвергать какой-либо специальной обработке; в альтернативном случае ее поверхность может быть подвергнута обработке, которая делает возможной легкую адгезию клеток. В каком угодно случае поверхность подложки впоследствии обрабатывают при подходящей концентрации потенциалочувствительного флуорохрома (скажем, 100 мкМ или менее в случае ANEPPS) в течение подходящего периода времени (скажем, 15 минут в случае ANEPPS) при подходящей температуре (скажем, 20°С в случае ANEPPS). Подвергнутую обработке поверхность подложки промывают подходящим водным раствором по меньшей мере три раза для удаления таким образом потенциалочувствительного флуорохрома, который не был иммобилизован на поверхности.
[0021] В качестве дальнейшего преимущества настоящего изобретения, используя описанный выше способ, в котором измеряются изменения потенциала или ионной силы согласно потенциалочувствительному флуорохрому в отсутствие мембранного носителя, такого как клетки или липидные бислойные липосомы, измерение изменений потенциала или ионной силы согласно потенциалочувствительному флуорохрому, которое традиционно выполнялось с использованием мембранного носителя, такого как клетки или липидные бислойные липосомы, стало весьма поддающимся осуществлению in vitro. Поэтому авторы настоящего изобретения применили этот способ для конкретной цели - скрининга на вещества, которые могли бы увеличить изменение интенсивности флуоресценции потенциалочувствительного флуорохрома, а также на вещества, которые могли бы облегчить выявление этого изменения интенсивности флуоресценции. Итак, в другом варианте настоящего изобретения его авторы показали, что, используя описанный выше способ, может быть обеспечен способ скрининга на вещество, которое изменяет интенсивность флуоресценции потенциалочувствительного флуорохрома (а именно, на вещество, которое увеличивает интенсивность флуоресценции, или вещество, которое уменьшает ее), а также на вещество, которое облегчает выявление изменения интенсивности флуоресценции (а именно, вещество, которое облегчает выявление изменения в сторону увеличения интенсивности флуоресценции, или вещество, которое облегчает изменение в сторону уменьшения интенсивности флуоресценции).
[0022] Выражаясь точнее, обеспечен способ отбора вещества, которое изменяет процент изменения интенсивности флуоресценции потенциалочувствительного флуорохрома в зависимости от потенциала или ионной силы, включающий:
[0023] (i) иммобилизацию потенциалочувствительного флуорохрома на поверхности подложки в растворе, добавление в раствор ионизирующегося соединения и измерение изменений интенсивности флуоресценции потенциалочувствительного флуорохрома в зависимости от изменения потенциала или ионной силы, чтобы таким образом измерить опорное значение для потенциала или ионной силы согласно потенциалочувствительному флуорохрому в отсутствие мембранного носителя, такого как клетки или липидные бислойные липосомы;
[0024] (ii) иммобилизацию потенциалочувствительного флуорохрома на поверхности подложки в растворе, добавление в раствор ионизирующегося соединения и испытываемого вещества и измерение изменений интенсивности флуоресценции потенциалочувствительного флуорохрома в зависимости от изменения потенциала или ионной силы, чтобы таким образом измерить испытательное значение потенциала или ионной силы по потенциалочувствительному флуорохрому в отсутствие мембранного носителя, такого как клетки или липидные бислойные липосомы;
[0025] (iii) сравнение опорного значения, полученного в (i), с испытательным значением, полученным в (ii), и, если при одной и той же концентрации ионизирующегося соединения интенсивность флуоресценции потенциалочувствительного флуорохрома, полученная в (ii), выше интенсивности флуоресценции, полученной в (i), или если в случае по меньшей мере двух различных концентраций добавляемого ионизирующегося соединения процент увеличения интенсивности флуоресценции, полученный в (ii), выше процента увеличения, полученного в (i), отбор испытываемого вещества в качестве вещества, которое изменяет процент изменения интенсивности флуоресценции потенциалочувствительного флуорохрома в зависимости от потенциала или ионной силы.
[0026] Термин «изменяют [изменяет]», используемый здесь в отношении процента изменения интенсивности флуоресценции потенциалочувствительного флуорохрома в зависимости от потенциала или ионной силы, может относиться либо к увеличению, либо к уменьшению процента представляющего интерес изменения. В настоящем изобретении как вещество, которое увеличивает интенсивность флуоресценции потенциалочувствительного флуорохрома, так и вещество, которое облегчает выявление увеличения интенсивности флуоресценции, являются предпочтительными.
[0027] В традиционном способе скрининга, в котором использовались клетки в качестве мембранного носителя, было трудно определить, действует ли вещество при скрининге на белки, такие как ионные каналы в клетках, или оно вызывает непосредственное взаимодействие с потенциалочувствительным флуорохромом. В отличие от этого традиционного способа, в описанном выше способе скрининга по настоящему изобретению не используется мембранный носитель, такой как клетки или липидные бислойные липосомы, поэтому можно отобрать вещество, которое непосредственно взаимодействует с потенциалочувствительным флуорохромом.
[0028] Авторы настоящего изобретения добавляли ряд веществ в качестве примеров испытываемого вещества, на которое делается ссылка на стадии (ii) описанного выше способа, и выясняли, увеличивает ли каждое вещество интенсивность флуоресценции потенциалочувствительных флуорохромов, или облегчает ли оно выявление изменения интенсивности их флуоресценции. В результате, они установили, что два вещества - витамин E и холестерин, обладающие различными характеристиками, увеличивают интенсивность флуоресценции потенциалочувствительных флуорохромов. С помощью детального исследования этого действия выявлено, что витамин E выполняет функцию увеличения чувствительности потенциалочувствительных флуорохромов, тогда как и витамин E, и холестерин выполняют функцию увеличения интенсивности флуоресценции потенциалозависимых флуорохромов.
[0029] С помощью этого способа скрининга, в котором используется экспериментальная система, в которой не используется мембранный носитель, такой как клетки или липидные бислойные липосомы, можно выбрать изменение интенсивности флуоресценции, которое основано на непосредственном взаимодействии потенциалочувствительного флуорохрома с испытываемым веществом. Поэтому стало ясно, что витамин E и холестерин, которым до некоторой степени оказывает помощь действие мембраны или мембранного потенциала, действуют непосредственно на потенциалочувствительный флуорохром с увеличением тем самым его чувствительности к окружающим йонам, а также интенсивности его флуоресценции.
[0030] Кроме того, ввиду свойств витамина E и холестерина нетрудно ожидать схожие функции не только от производных витамина E и производных холестерина, но также от жирорастворимых антиоксидантов, в том числе производных, таких как бутилированный гидрокситолуол, тролокс, катехин и астаксантин, соединения, описанные в известных документах (например, Advances in Drug Research, Vol. 28, 1996, pp. 65-138 and Toxicology, Vol. 180, 2002, pp. 151-167), и их производные.
[0031] В случае скрининга на вещество, которое влияет на интенсивность флуоресценции и потенциалозависимое изменение интенсивности флуоресценции, в раствор можно добавить потенциалочувствительный флуорохром, который должен образовать твердую фазу, который затем подвергают обработке описанным выше способом. Авторы настоящего изобретения произвели проверку этого способа скрининга на наличие связи между концентрацией витамина Е или холестерина и их сенсибилизирующим или усиливающим действием применительно к интенсивности флуоресценции. В результате, они установили, что витамин E, при использовании в концентрациях от 500 мкМ до 5 мкМ, может увеличить чувствительность потенциалочувствительных флуорохромов при увеличении в то же самое время интенсивности их флуоресценции. Авторы настоящего изобретения также установили, что холестерин, при использовании в концентрациях от 500 мкМ до 5 мкМ, может увеличить интенсивность флуоресценции потенциалочувствительных флуорохромов.
[0032] Используя увеличивающие чувствительность или интенсивность флуоресценции вещества, полученные таким образом с помощью описанного выше способа скрининга, авторы настоящего изобретения, кроме того, показали, что изменения потенциала действия, которые возникают в популяции происходящих из ES клеток или iPS клеток кардиомиоцитов или в единичном происходящем из ES клетки или iPS клетки кардиомиоците, или в определенных областях таких кардиомиоцитов, можно измерить с большими чувствительностями, чем можно в традиционном способе. В частности, авторы настоящего изобретения показали, что потенциал действия культивируемых кардиомиоцитов можно измерить с большей чувствительностью, чем можно в традиционном способе, с помощью процедуры приведения потенциалочувствительного флуорохрома в контакт с кардиомиоцитами, культивируемыми в культуральной среде, добавления в культуральную среду витамина E и/или холестерина и измерения изменений интенсивности флуоресценции потенциалочувствительного флуорохрома в зависимости от изменения потенциала или ионной силы.
[0033] Для измерения потенциала действия кардиомиоцитов поверхность подложки, такой как пластмасса или стекло, подвергают какой-либо подходящей для усиления адгезии клеток обработке, и кардиомиоциты подвергают адгезионному культивированию. В среду для адгезионного культивирования добавляют потенциалочувствительный флуорохром для окрашивания культивируемых клеток, а также добавляют витамин E и/или холестерин в концентрациях, составляющих от 500 мкМ до 5 мкМ. В этом случае витамин E или холестерин может использоваться независимо, или они могут использоваться в комбинации.
[0034] Для флуоресцентного анализа в настоящем изобретении может применяться любой тип флуоресцентного микроскопа, который может использоваться в соответствующей области техники, и типичным примером является IX71 (OLYMPUS Corporation). В следующих примерах IX71 (OLYMPUS Corporation) был использован в качестве флуоресцентного микроскопа и сочетан с подходящим единичным источником света, таким как ртутная лампа (OLYMPUS Corporation), или компоновкой LED (OLYMPUS Corporation). С целью фиксации флуоресцентных изображений, обработки изображений и численных расчетов в настоящем изобретении могут применяться любые модели аналитических программных средств для обработки изображений и численных расчетов, которые могут использоваться в соответствующей области техники. В следующих примерах была использована система MiCAM02 (Brainvision Inc.).
[0035] Вышеприведенные результаты, в своей совокупности, показали, что не только в экспериментальной системе, которая не включает применение мембранного носителя, такого как клетки или липидные бислойные липосомы, но также в традиционной экспериментальной системе, в которой используется мембранный носитель, такой как клетки или липидные бислойные липосомы, витамин E способен увеличить чувствительность потенциалочувствительных флуорохромов, тогда как и витамин E, и холестерин способны увеличить интенсивность флуоресценции потенциалочувствительных флуорохромов в зависимости от изменения потенциала или ионной силы. Таким образом, было показано, что настоящим изобретением может быть обеспечен новый способ измерения изменений интенсивности флуоресценции потенциалочувствительного флуорохрома в зависимости от изменения потенциала или ионной силы, который включает добавление к потенциалочувствительному флуорохрому ионизирующегося соединения для вызова изменения потенциала или ионной силы, а также добавление витамина E и/или холестерина для увеличения изменения потенциала или ионной силы согласно потенциалочувствительному флуорохрому.
ПРИМЕРЫ
[0036] Настоящее изобретение описывается подробнее посредством ссылки на следующие примеры. Однако следует отметить, что эти примеры представляют собой иллюстрации настоящего изобретения и, как предполагается, никоим образом не ограничивают его.
Пример 1
Создание способа измерения интенсивности флуоресценции и потенциалозависимого изменения интенсивности флуоресценции, используя потенциалочувствительные флуорохромы, образующие твердую фазу на поверхности подложки
[0037] В примере 1 описаны способ образования твердой фазы потенциалочувствительных флуорохромов на поверхностях подложек, таких как прозрачная пластмасса или стекло, и способ измерения интенсивностей флуоресценции потенциалочувствительных флуорохромов и потенциалозависимых изменений интенсивности их флуоресценции.
[0038] Потенциалочувствительный флуорохром (Di8-ANEPPS или Di4-ANEPPS, оба имеющиеся в продаже от Invitrogen), смешивали в количестве, равном 50 мкМ, в среде MEM-BASE (Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, Missouri, США), содержащей фетальную телячью сыворотку (SAFC Biosciences, Lenexa, Kansas, США) в конечной концентрации, равной 10%, и смесь пропускали через 0,22 мкм шприцевой фильтр (Millipore, Massachusetts, США) для приготовления раствора потенциалочувствительного флуорохрома.
[0039] Равную 1 мл часть этого флуорохрома добавляли в каждую 3,5-см пластмассовую чашку для культивирования (BD, New Jersey, США) и 3,5-см чашку со стеклянным дном (IWAKI, Asahi Glass Co., Ltd., Tokyo, Япония), с последующей обработкой поверхности при 20°С в течение 15 минут. Подвергнутые обработке поверхности промывали по меньшей мере три раза тем же раствором, что и описанный выше раствор, за исключением того, что он не содержал какого-либо потенциалочувствительного флуорохрома, и что он был нагрет до 37°С, удаляя тем самым любую часть потенциалочувствительного флуорохрома, которая не образовала твердую фазу.
[0040] Среду заменяли содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки средой MEM-BASE, дополненной 50 мкМ Mn-TBAP (Calbiochem, Merck KGaA, Darmstadt, Германия) и 992 мкМ Trolox (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Япония), и флуоресцентные сигналы фиксировали, используя флуоресцентную микроскопическую систему IX71 (Olympus Corporation, Tokyo, Япония) и ртутную лампу (Olympus Corporation, Tokyo, Япония) или источник света LED (Olympus Corporation, Tokyo, Япония), с последующей обработкой изображений и численными расчетами, используя систему MiCAM02 (Brainvision Inc., Tokyo, Япония).
[0041] Для обеспечения изменений потенциала в растворе потенциалочувствительного флуорохрома к раствору флуорохрома добавляли раствор хлорида калия с получением конечных концентраций, равных 0, 5, 10, 15 и 20 мМ. После выдерживания в течение 1 мин после добавления хлорида калия измеряли интенсивность флуоресценции от поверхности каждой чашки (в которой присутствовал потенциалочувствительный флуорохром). Интенсивность флуоресценции для каждой концентрации флуорохрома замеряли в трех различных точках на чашке и определяли среднеквадратическое отклонение от среднего значения замеренных интенсивностей. Данные наносили на графики с построением графиков для интенсивности флуоресценции и изменения интенсивности флуоресценции (Фиг.1).
[0042] Фиг.1(a) относится к случаю, когда Di8-ANEPPS образовывал твердую фазу на поверхности пластмассовой чашки, (b) - к случаю, когда Di4-ANEPPS образовывал твердую фазу на поверхности пластмассовой чашки, а (c) - к случаю, когда Di8-ANEPPS образовывал твердую фазу на поверхности стеклянной чашки. На основе этих результатов стало ясно, что интенсивность флуоресценции увеличивается пропорционально концентрации добавленного ионизирующегося соединения (хлорида калия) независимо от того, из какого материала (стекла или пластмассы) была изготовлена подложка, или типа используемого потенциалочувствительного флуорохрома.
[0043] Кроме того, для определения диапазона концентраций, в котором потенциалочувствительный флуорохром эффективно работает, на поверхность 3,5-см пластмассовой чашки для культивирования наносили 10 мкМ или 100 мкМ Di8-ANEPPS или RH237 (оба имеются в продаже от Invitrogen) и осуществляли обработку, как описано выше, для приготовления раствора потенциалочувствительного флуорохрома; после этого к этому раствору флуорохрома добавляли раствор хлорида калия с получением конечных концентраций, равных 0, 5, 10, 15 и 20 мМ. Данные, полученные в результате выполнения последующих обработок, измерений и обработок данных, описанных выше, наносили на графики (Фиг. 2).
[0044] На Фиг.2(a) представлены данные для случая, когда Di8-ANEPPS использовали в количествах, равных 10 мкМ и 100 мкМ, а на фиг 2(b) - данные для случая, когда RH237 использовали в количествах, равных 10 мкМ и 100 мкМ. На основе этих результатов стало ясно, что изменения интенсивности флуоресценции возникают пропорционально концентрации добавленного ионизирующегося соединения (хлорида калия).
Пример 2
Скрининг на усилители интенсивности флуоресценции и процента потенциалозависимого изменения интенсивности флуоресценции (чувствительности), используя потенциалочувствительный флуорохром, образующий твердую фазу на поверхности подложки
[0045] В этом примере описаны способ скрининга для обнаружения веществ, которые могли бы увеличить интенсивность флуоресценции потенциалочувствительного флуорохрома, отмеченного в примере 1, и процента потенциалозависимого изменения интенсивности его флуоресценции (т.е. его чувствительности), а также к способам идентификации веществ, имеющих соответствующие действия.
[0046] В соответствии с процедурой, описанной в примере 1, в качестве раствора потенциалочувствительного флуорохрома готовили раствор Di8-ANEPPS (100 мкМ), в который добавляли 75 мкМ витамин E (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) или 75 мкМ холестерин (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), или их комбинацию. Потенциалозависимое количествественное изменение интенсивности флуоресценции и потенциалозависимую интенсивность флуоресценции анализировали, как описано в примере 1, используя способ добавления раствора хлорида калия с получением конечных концентраций, равных 0, 5, 10, 15 и 20 мМ; результаты представлены графически на Фиг.3 для группы с добавлением витамина E («VE 18,75 мкМ»), группы с добавлением холестерина («Cho 18,75 мкМ»), группы с добавлением витамина E + холестерина («двойной») и контрольной группы («di-8»).
[0047] На Фиг.3(a) представлены определенные значения процента изменения интенсивности флуоресценции, а на Фиг.3(b) представлены измеренные значения интенсивности флуоресценции; на каждом графике ◆ относится к контрольной группе (только Di8-ANEPPS был добавлен),  - к группе с добавлением витамина E,  - к группе с добавлением холестерина, и ● - к группе с добавлением витамина E + холестерина.
[0048] Процент изменения интенсивности флуоресценции, графически нанесенный на Фиг. 3(a), в сравнении со случаем, когда хлорид калия не был добавлен, ясно показывает, что витамин E обладает сенсибилизирующим действием в отношении потенциалочувствительного флуорохрома (т.е. усиливающим чувствительность его флуоресценции).
[0049] Увеличение интенсивности флуоресценции, сравнение которого при различных концентрациях KCl представлено на Фиг. 3(b), показало, что и витамин E, и холестерин выполняют функцию увеличения интенсивности флуоресценции потенциалочувствительного флуорохрома. Кроме того, комбинированное применение витамина E и холестерина не только имело аддитивный эффект на увеличение интенсивности флуоресценции, но также проявило принесенное витамином E сенсибилизирующее действие в отношении потенциалочувствительного флуорохрома (т.е. усиливающее чувствительность его флуоресценции или увеличивающее процент потенциалозависимого изменения интенсивности флуоресценции). Эти результаты демонстрируют громадное преимущество раскрытого здесь способа в качестве способа скрининга на вещества, которые могли бы увеличить интенсивности флуоресценции потенциалочувствительных флуорохромов, и/или веществ, которые могли бы увеличить процент потенциалозависимого изменения интенсивности флуоресценции.
[0050] Кроме того, для определения диапазона эффективных на практике концентраций холестерина и витамина E, к 100 мкМ Di8-ANEPPS в растворе добавляли 5 мкМ, 18,7 мкМ или 500 мкМ витамина E или 18,8 мкМ или 238 мкМ холестерина; каждый из растворов наносили на поверхность 3,5-см пластмассовой чашки для культивирования, и затем к растворам флуорохрома добавляли раствор KCl с получением конечных концентраций, равных 0, 10, 20, 30, 40 и 50 мМ; результаты последующих обработок и обработки данных нанесены на графики (Фиг. 4).
[0051] Как оказалось, холестерин увеличивал интенсивность флуоресценции дозозависимым образом, тогда как витамин E, не являющийся зависимым от дозы по показателю либо интенсивности флуоресценции, либо процента изменения интенсивности флуоресценции, увеличивал интенсивность флуоресценции приблизительно в 1,5 раза, а процент изменения интенсивности флуоресценции приблизительно в 3 раза при условии нахождения его концентрации в пределах диапазона от 18,7 мкМ до 500 мкМ. Также стало ясно, что витамин E выполнял функцию увеличения процента изменения интенсивности флуоресценции, даже когда его концентрация составляла всего 5 мкМ.
Пример 3
Измерения потенциалов действий кардиомиоцитов, происходящих из ES клеток человека и iPS клеток человека
[0052] В этом примере были исследованы действия витамина E и холестерина на получение информации о потенциале действия от кардиомиоцитов; кардиомиоциты были получены в результате подвергания дифференцировке ES клеток человека и iPS клеток человека и подвергнуты культивированию с ферментативным разъединением.
[0053] Эмбриональные стволовые клетки человека (ES клетки) были получены из Stem Cell Research Center, Institute for Frontier Medical Sciences, Kyoto University (Центра эмбриональных стволовых клеток, финансируемого Национальной программой по биоресурсам). Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека (iPS клетки) были получены из Center for iPS Cell Research and Application, Institute for Integrated Cell-Material Sciences, Kyoto University.
[0054] Для этих стволовых клеток человека создавали возможность оставаться недифференцированными посредством культивирования при поддержке мышиных эмбриональных фибробластов (MEF), которые были превращены в неактивные в отношении пролиферации в результате обработки митомицином C. Для приготовления клеток MEF плод мыши ICR в день 14 беременности (CLEA Japan, Inc.) обезглавливали и подвергали эвисцерации, и впоследствии разделяли на отдельные клетки способом, описанным в WO 2006/022377.
[0055] Культуральной средой была F12/DMEM (1:1) (Sigma-Aldrich Corporation; № продукта D6421), которая была дополнена 20% KO-SERUM (GIBCO, Life Technologies Foundation, Maryland, США), 1,6 мМ L-глютамином, 0,1 мМ заменимыми аминокислотами (MEM), 0,1 мМ β-меркаптоэтанолом (2ME; Sigma-Aldrich Corporation), 100 МЕ/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина сульфата и 10 нг/мл рекомбинантного основного фактора роста фибробластов человека (bFGF; PeproTech Inc., New Jersey, США). Для субкультивирования колонии эмбриональных стволовых клеток разъединяли при 37°С посредством 10-минутной обработки 0,1% коллагеназы типа III (Worthington Biochemical Corporation, New Jersey, США).
[0056] Впоследствии, для отделения MEF от эмбриональных стволовых клеток, клеточные массы (эмбриоидные тельца, EB) собирали на сетке с размером пор, равным 40 мкм. Они представляли собой очищенные массы эмбриональных стволовых клеток. Для дифференцировки 50-1000 эмбриональных стволовых клеток в EB подвергали культивированию в виде эмбриоидных телец на бактериальной чашке для неадгезионного культивирования (AGC TECHNO GLASS CO., LTD., Chiba, Япония; стерилизованной чашке Петри) в течение всего 15-30 дней до их дифференцировки в эмбриоидные тельца, содержащие кардиомиоциты.
[0057] Кардиомиоциты разделяли способом, описанным в WO 2006/022377. Конкретно, эмбриоидное тельце подвергали обработке коллагеназой и трипсином для создания отдельных единичных клеток. Эти клетки суспендировали в содержащей 10% сыворотке αMEM (Sigma-Aldrich Corporation) и засевали в 3,5-см пластмассовую чашку для культивирования (BD) и 3,5-см чашку со стеклянным дном (IWAKI, Asahi Glass Co., Ltd.), при этом поверхность каждой чашки была покрыта 0,001% фибронектином (Sigma-Aldrich Corporation) при 37°С в течение часа. Прилипающие кардиомиоциты были автономно ритмически сокращающимися.
[0058] Измерения потенциала действия на этих кардиомиоцитах осуществляли в отсутствие витамина E и холестерина. В других экспериментах культивируемые клетки подвергали обработке потенциалочувствительным флуорохромом и 18,75 мкМ витамина E и/или 18,75 мкМ холестерина, а затем измеряли преходящее изменение интенсивности флуоресценции. Эта обработка давала возможность получать информацию о потенциалах действий от единичных клеток, а также части единичной клетки (Фиг.5).
[0059] На Фиг.5(a) представлен результат измерений на изолированных кардиомиоцитах, происходящих из ES клеток человека, в отсутствие витамина E и холестерина; на Фиг.5(b) представлен потенциал действия, полученный от изолированного кардиомиоцита, происходящего из ES клетки; и на Фиг.5(c) представлен потенциал действия, полученный от изолированного кардиомиоцита, происходящего из iPS клетки человека.
[0060] Как оказалось, колебания потенциала действия, которые невозможно было выявить от единичных кардиомиоцитов, происходящих из ES клеток, в отсутствие витамина E или холестерина, стали заметными после добавления этих веществ. Также стало ясно, что витамин E и холестерин, которые выполняли функцию сенсибилизации или усиления потенциалочувствительного флуорохрома в отсутствие клеток в качестве мембранного носителя, могут также проявлять такое же действие даже при использовании клеток в качестве мембранного носителя.