Композиция ранозаживляющего действия
WOUND-HEALING COMPOSITION

I. Область применения
Изобретение относится к производству ветеринарных и фармацевтических препаратов, косметических и лечебно-косметических средств, а именно к производству кремов, мазей и гелей, включающих в свой состав липидный комплекс, сок алоэ и аллантоин, и может быть использовано в ветеринарии, медицине и косметологии.
"В производстве ветеринарных и медицинских препаратов, а также косметологии находят широкое применение различные биологически активные вещества, как животного, так и растительного или минерального происхождения. Активизируя обмен веществ, они улучшают физиологическое состояние кожных покровов при наружном применении.
На протяжении многих лет одной из важных проблем ветеринарной медицины является поиск эффективных методов лечения инфицированных раневых процессов в тканях [Крылова Л.С., Ремизов Е.К., Смирнова К.Ю., Ларионова О.С. Индикация пептидов из биомассы личинок насекомых и изучение их антимикробной активности // Актуальные вопросы ветеринарной биологии. - 2019. - №4 (44). - С. 3-6.]. Обусловлено это тем, что течение раневого процесса и наличие анаэробной, аэробной микрофлоры в очагах инфицированного воспаления приводят к нарушению тканевого дыхания в участках заживления, вызывая нарушения в окружающих тканях, которые в конечном итоге ведут к развитию ацидоза, гипоксии и метаболической интоксикации организма [Крылова Л.С., Ремизов Е.К., Смирнова К.Ю., Ларионова О.С. Индикация пептидов из биомассы личинок насекомых и изучение их антимикробной активности // Актуальные вопросы ветеринарной биологии. - 2019. - №4 (44). - С. 3-6.; Барсуков Н.А. Лечение инфицированных ран // Ветеринария. - 1986. - №8. - С. 68-69; Boateng, J.S.; Matthews, К.Н.; Stevens, H.N.; Eccleston, G.M. Wound healing dressings and drug delivery systems: a review. J Pharm Sci 2008, 97, 2892-923; Алексеева И.В. Разработка лекарственных форм для лечения ран // Фармация. - 2003. - №2. - С. 43-45; Bulik С.С., Wiskirchen D.E., Shepard A., et al. Tissue Penetration and Pharmacokinetics of Tigecycline in Diabetic Patients with Chronic Wound Infections Described by Using In vivo Microdialysis // Antimicrob. Agents Chemother. - 2010. - Vol. 54. - Р. 5209-5213].
Среди лекарственных средств наружного применения широко используются мази и гели на основах, которые не травмируют поврежденную поверхность при нанесении на рану, обеспечивают дренаж ран, а лекарственные вещества, входящие в их состав, обеспечивают необходимое лечебное действие [Барсуков Н.А. Лечение инфицированных ран // Ветеринария. - 1986. - №8. - С. 68-69; Boateng, J.S.; Matthews, K.Н.; Stevens, H.N.; Eccleston, G.M. Wound healing dressings and drug delivery systems: a review. J Pharm Sci 2008, 97, 2892-923; Алексеева И.В. Разработка лекарственных форм для лечения ран // Фармация. - 2003. - №2. - С. 43-45; Bulik С.С., Wiskirchen D.E., Shepard A., et al. Tissue Penetration and Pharmacokinetics of Tigecycline in Diabetic Patients with Chronic Wound Infections Described by Using In vivo Microdialysis // Antimicrob. Agents Chemother. - 2010. - Vol. 54. - P. 5209-5213]. Перспективным направлением является разработка и применение мазей разнонаправленного действия, которые сочетали бы в себе такие свойства, как антимикробная активность, высокая дегидратирующая способность, стимуляция регенерации тканей [Karami, А.; Tebyanian, Н.; Barkhordari, A.; Motavallian, Е.; Soufdoost, R.S.; Nourani, M.R. Healing effects of ointment drug on full-thickness wound. C.R. Acad. Bulg. Sci 2019, 72, 123-129; Блатун Л.А. Местное медикаментозное лечение ран. Проблемы и новые возможности их решения // Consilium medicum: хирургия (прилож.). - 2007. - №1. - С. 9-16; Ларионова О.С, Древко Я.Б., Банникова А.В., Ковтунова А.С., Мендубаев Д.В., Кармеева Ю.С., Крылова Л.С. Способ получения хитозана. Патент на изобретение RU 2615636 С, 06.04.2017. Заявка №2016110254 от 21.03.2016; Крылова Л.С., Амелькина А.А., Древко Я.Б., Ларионова О.С. Изучение некоторых биологических свойств антимикробных пептидов, полученных из гемолимфы личинок Galleria meilonella // В сборнике: Актуальные проблемы ветеринарной медицины, пищевых и биотехнологий. Материалы Международной научно-практической конференции. - 2017. - С. 263-267; Воленко А.В., Меньшиков А.Л., Титова Г.П., Куприков С.В. Профилактика раневой инфекции иммобилизованными антибактериальными препаратами // Хирургия. - 2004. - №10. - С. 54-58; Абаев, Ю.К. Справочник хирурга. Раны и раневая инфекция / Ю.К. Абаев. - Ростов-на-Дону: Феникс, 2006. - 427 с; Yang, F. Pathogenic alteration in severe burn wounds / F. Yang, X. Bing, D.B Feng [et al.] // J. Burns - 2012. - V. 38. - I.1. - P. 90-94].
II. Предшествующий уровень техники
Известна фармацевтическая композиция для местного введения на основе липида, описанная в WO 2010/036947 А2, которая содержит один или несколько липидов и одно или несколько других биологически активных соединений, выбранных из группы, состоящей из финастерида, дутастерида, миноксидила, амфотерицина В и такролимуса. В патенте RU 2715103 С2, 27.02.2020 (конвенционный приоритет 03.05.2013 SE 1300318-1) используется от 3 до 60% фосфолипида в качестве фармацевтического или косметического носителя. Так же жиры широко распространены в качестве компонентов ранозаживляющих мазей и гелей: на основе медвежьего жира РФ №2246310, МПК А61К 35/78, 2002; бараньего и барсучьего жира RU 2571487 С9, 20.12.2015; свиного жира РФ №2042357, МПК А61К 35/78, 1993. Широко в мазях и гелях для рано- заживления используются и растительные масла: алоэ RU 2697255 С1, 13.08.2019, касторовое и шиповника RU 2040252 С1, 25.07.1995, пихтового (RU 2284809, 10.10.2006), в композиции с жирорастворимыми витаминами А и Е (патент №2128500, 10.04.1999). Известны так же мази, имеющие в своем составе как растительные, так и животные компоненты: масло алоэ, масла корня мандрагоры и медвежий жир (RU 2002108231 А 27.01.2004). Данные рецептуры показывают эффективность применения жировых фракций в качестве одного из компонентов ранозаживляющих мазей и гелей.
Известна методика выделения меланина со смесью жирных кислот из личинок Hermetia illucens, данный комплекс можно использовать для получения ранозаживляющих препаратов и биологически активных добавок в косметологии, биоинженерии, а также в промышленности для создания водоотталкивающих покровов (RU 2692260, 24.06.2019). К недостаткам данного изобретения можно отнести отсутствие готовой терапевтической рецептуры.
Аллантоин так же находит свое применение в качестве действующего вещества в ранозаживляющих гелях и мазях (RU 2611400 С2, 21.02.2017, RU 2162318 С1, 27.01.2001, RU 2545691 С2, 27.08.2013, ЕР №2384741 05.05.2011, RU 2567730 С1, 10.11.2015).
III. Сущность изобретения
Данное изобретение относится к производству ветеринарных и фармацевтических препаратов, косметических и лечебно-косметических средств с использованием в качестве основных компонентов липидной фракции, выделенной из личинок Hermetia illucens (комплекса сложных эфиров жирных кислот), сока Aloe arborescens, аллантоина и сопутствующих компонентов: диметилсульфоксида, альгината натрия или карбоксиметилатцеллюлозы, глицерина, ТВИН-80 и талька.
Использование липидной фракции, выделенной из личинок Hermetia illucens (комплекса сложных эфиров жирных кислот), будет способствовать более эффективному восстановлению эпителия, а терапевтическая эффективность сока Aloe arborescens, который относится к биогенным стимуляторам, будет заключаться в стимулирующем влиянии на процессы обмена: улучшении клеточного метаболизма, трофики и регенерации тканей. Это подтверждено клиническими испытаниями и находит применение в качестве лекарственных препаратов (Алоэ линимент № ЛСР-002881/09). Аллантоин оказывает противовоспалительное действие, стимулирует обменные процессы в тканях и способствует пролиферации клеток (Гепатромбин № П N013949/01, 2007-12-13). Диметилсульфоксид являясь фармокопейным растворителем усиливает всасываемость действующих веществ, что позволяет повысить эффективность данной рецептуры.
Цель изобретения достигается путем применения комплекса сложных эфиров жирных кислот, аллантоина, сока алоэ с органическим растворителем (диметилсульфоксид), поверхностноактивного вещества ТВИН-80, альгината натрия или карбокисметилатцеллюлозы, глицерина, талька и воды. Как бактериостатик вводится бензиловый спирт.
При температуре 50°C и постоянном перемешивании к диметилсульфоксиду добавляют аллантоин, комплекс сложных эфиров жирных кислот, твин-80 и бензиловый спирт, далее после гомогенизации добавляют раствор воды с соком алоэ, альгинатом натрия или карбокисметилатцеллюлозы, бензилового спирта и талька. Полученную смесь перемешивают до полной гомогенизации и оставляют остывать до комнатной температуры.
На основе проведенных исследований можно сделать вывод о том, что при помощи приведенного способа можно получать стабильные композиции с содержанием аллантоина 9-14%, комплексов сложных эфиров жирных кислот 8-36%, сока алоэ 6-12%, с использованием сопутствующих веществ: диметилсульфоксида 9-25%, ТВИН-80 4-7%, глицерина 4-7%, талька 0-35%, бензилового спирта 1%, карбоксиметилатцеллюлозы или альгината натрия 0-1%, талька 0-35% - остальное вода.
Нами был разработан прототип ранозаживляющего препарата на основе комплекса сложных эфиров жирных кислот. Данный образец получали методом прессования из биомассы личинок Hermetia illucens. При разработке прототипа препарата нами было получено 34 образца, наиболее оптимальным был образец 6, состоящий из комплекса сложных эфиров жирных кислот 13%, аллантоина 10%, бензилового спитра 1%, ДМСО 10%, карбоксиметилатцеллюлозы 1%, глицерина 5%, талька 33%, сока алоэ 10%, ТВИН-80 5% и воды.
Объектами исследования при испытании на местно-раздражающее действие препарата послужили лабораторные животные - морские свинки. Для подготовки животных к испытанию на местно-раздражающее действие препарата шерсть на подопытных участках кожи тщательно выстригали до начала исследования. Доза, вводимая подкожно в каждый исследуемый участок, составляет 0,1 мл.
2
Для аппликаций пропитывали испытуемой пробой фильтровальную бумагу или гигроскопичную марлевую подушечку (4-8 см), которые прикладывали на выстриженные участки кожи и фиксировали окклюзионной повязкой вокруг тела животного.
Предварительные испытания проводили для того, чтобы определить концентрацию испытуемой пробы, которая будет использоваться в основном исследовании.
Неразведенные экстракты при использовании известных растворителей не нуждаются в предварительном испытании.
Должно быть рассмотрено возможное влияние введения полного адъюванта Фрейнда (FCA) в сочетании с испытуемым материалом во время основного теста и, таким образом, возможное искажение результатов.
Согласно применению, испытывали крайние разведения на трех животных.
Через 24 ч снимали повязку, образцы и оценивали состояние опытных участков на наличие эритемы и отека.
Для индукционной фазы в основном тесте выбирали самую высокую концентрацию, которая не вызывает более, чем очень слабую эритему, и не оказывает общего отрицательного воздействия на животных.
Результаты исследования
Подкожная индукционная фаза
Каждому животному в выстриженные участки кожи (А, В и С) в соответствии с фиг. 1 проводили парные подкожные инъекции в объеме 0,1 мл.
Местная индукционная фаза
2
Через семь дней (±1 день) после подкожной индукционной фазы начинали накожные аппликации исследуемого материала на участки инъекций, на внутрилопаточную область каждого животного, используя для этого пропитанные кусочки марли площадью 8 см.
При этом использовали максимальную концентрацию для участка В. Если максимальная концентрация, которая может быть достигнута, не вызывает раздражения, предварительно обрабатывали область аппликации 10%-ным раствором натрия додецилсульфата, вмассировав в кожу за (24±2) ч до аппликации. Накладывали окклюзионную повязку. Удаляли повязку через (48±2) ч.
Использовали свежеприготовленные образцы. Если образцы приготовлены ранее чем за 24 ч, то проверяли их стабильность при хранении.
Процедуру с контрольными животными повторяли в том же режиме, используя только контрольный раствор.
Провокационная фаза
Через 14 дней (±1 день) после завершения местной индукционной фазы провоцировали всех опытных и контрольных животных испытуемым материалом. Для этого проводили аппликации исследуемого материала на интактные участки кожи бока каждого животного, используя гигроскопичную марлевую подушечку. Накладывали фиксирующую окклюзионную повязку. Удаляли повязку и аппликации через (24±2) ч.
Обследование животных
Осматривали поверхность участков, где проводили провокационную пробу подопытных и контрольных животных, через 24; 48 ч после снятия повязки. Для визуализации реакций кожи использовали освещение с полным спектром.
Описывали и оценивали степень кожной реакции, включая эритему и отек для каждого участка и в каждый интервал времени наблюдения.
Описание делали без учета предварительного воздействия, чтобы минимизировать погрешность в оценке результатов.
Исследование ранозаживляющего действия препарата проводили на лабораторных животных.
Объектами исследования на терапевтическую эффективность при ожогах послужили лабораторные животные - крысы. Была проведена работа по формированию опытных и контрольной групп животных по принципу аналогов. На момент исследований лабораторные животные (крысы) были клинически здоровы.
Исследования выполнялись согласно «Правилам лабораторной практики в Российской Федерации» (Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации №708н от 23.08.2010 г.). Эксперименты на животных проводились в соответствии с правилами, принятыми Европейской Конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (European Convention for the Protection of Vertebrate Animals Used for Experimental and other Scientific Purposes (ETS 123) Strasbourg, 1986).
Исследования осуществлялись согласно утвержденному письменному протоколу и в соответствии со Стандартными операционными процедурами исследователя (СОП). Все животные подвергались обследованию, которое включало в себя клиническое исследование.
Исходя из полученных данных в ходе выше указанных исследований, проводили формирование групп по сходным физиологическим показателям.
В исследование были включены 30 клинически здоровых крыс. Экспериментальные животные содержались в одинаковых условиях, оптимальных для данного вида. Животные содержались в клетках по 10 голов. Перед началом опыта все клетки были промаркированы.
2
За сутки до нанесения ожога, у подопытных животных удаляли шерстный покров в области спины, площадью 10 см. В день эксперимента проводили наркотизирование крыс изофлураном.
2
2
После введения животным наркоза, их помещали на столик для фиксации лабораторных животных. Экспериментальные ожоговые раны моделировали, используя металлический стержень с диаметром поверхности 1 см, который разогревали до 100 С°. Стержень прикладывали к коже животного на 20 сек., в результате получали ожог IIIA степени, общей площадью 100-130 мм.
После включения в исследование животных распределили в одну из трех групп:
- 1 опытная группа (n=10) - на ожоговую рану животным наносили опытный образец крема «Образец №6», в течение 20 дней;
- 2 опытная группа (n=10) - на ожоговую рану животным наносили Пантенол крем универсальный, в течение 20 дней;
- Третья группа (n=10) животных была контрольной, ожоговая рана оставалась без лечения.
Экспериментальным группам животных непосредственно после нанесения ожога и затем ежесуточно наносили испытуемые образцы в дозе 0,5 г.
Ежедневно с начала эксперимента фиксировали общее состояние крыс.
2
Площадь экспериментальных ожогов измеряли планиметрическим способом с использованием щтангенциркуля. Измеряли диаметр ожога, затем высчитывали его площадь по формуле: S=2π.
Измерение площади раны производили на 1-й, 5-й, 10-й и 20-й день после нанесения ожоговой раны.
Общее состояние животных контролировали на основании поведенческих реакций.
При изучении местно-раздражающего действия после парного внутрикожного введения в соответствующие участки кожи веществ в объеме 0,1 мл каждому животному через 24 часа проводили учет результатов.
У контрольной группы в месте введения наблюдалась небольшая припухлость в месте введения, которая проходила спустя 6-8 часов, состояние животных стабильное, эритема не наблюдалась (фиг. 2).
У опытной группы животных в месте введения смеси полного адъюванта Фрейнда с выбранным растворителем в соотношении 50/50 наблюдалась небольшая припухлость в месте введения, которая проходила спустя 6-8 часов, состояние животных стабильное, наблюдалась небольшая эритема.
В месте введения испытуемого образца с растворителем наблюдалась небольшая припухлость, которая проходила спустя 4-5 часов, состояние животных немного угнетенное, но спустя 1-2 часа - стабильное, эритема не наблюдалась (фиг. 3).
После введения испытуемого образца, эмульгированного с полным адъювантом Фрейнда в соотношении 50/50 и растворителем (50%) наблюдалась небольшая припухлость в месте введения, которая проходила спустя 6-8 часов, состояние животных немного угнетенное, но спустя 2-3 часа - стабильное, эритема не наблюдалась (фиг. 4).
2
Через семь дней (±1 день) после внутрикожной индукционной фазы начинали накожные аппликации исследуемого материала на участки инъекций, на внутрилопаточную область каждого животного, используя для этого пропитанные кусочки марли площадью 8 см.
Осматривали поверхность участков кожи животных в течение 14 дней после нанесения накожных аппликаций исследуемого материала у подопытных и контрольных животных.
Через 24 часа после снятия повязки наблюдали умеренную эритему у всех животных, включая контроль (фиг. 5, 6, 7).
Спустя 48 часов наблюдалась небольшая дискретная или очаговая эритема у первой и второй опытных групп животных (фиг. 8, 9).
Через 7 суток отмечалась незначительная припухлость вместе введения у всех групп животных (фиг. 10, 11, 12). По истечении 14 суток у всех животных контрольной и опытной групп никаких изменений не наблюдалось.
В этой связи, проведенные исследования позволяют заключить, что препарат при накожных апликациях, согласно межгосударственному стандарту ГОСТ ISO 10993-10-2011, обладает слабой степенью ответной реакции на раздражение у морских свинок. Нанесение разрешающей дозы препарата сенсибилизированным морским свинкам не вызывает ответную реакцию со стороны кожного покрова, что говорит об отсутствии аллергизирующих свойств у данной композиции.
При изучении терапевтической эффективности испытуемых образцов при ожогах, нагноения ран не наблюдалось. Отмечено 4 случая смертельного исхода в контрольной группе и осложненного течения раневого процесса. На вторые сутки после нанесения ожоговой травмы во всех группах животных отмечается гиперемия кожи по периферии ожога. В области ожога отмечаются некрозы, в некоторых местах поражается только поверхностный слой собственно кожи, в других ожог распространяется на всю ее толщу, сопровождаясь полным некрозом сосочкового слоя. Образуется поверхностный сухой белесовато-серый струп. На вторые сутки после нанесения ожоговой травмы, внешне разницы между животными разных групп не наблюдается. К седьмым суткам эксперимента в первой опытной группе животных происходит формирование грануляционной ткани и начало эпителизации со стороны здоровой кожи. На 14 день эксперимента, отмечается ярко выраженная положительная динамика у животных первой опытной группы, на грануляциях заметны островки эпителизации, происходит заметное отторжение струпа. К 20 дню эксперимента в первой опытной группе крыс происходит полное восстановление эпителиальной ткани, разрастание волосяного покрова со стороны здоровой кожи.
К 20 дню эксперимента в первой и второй опытной группе крыс отмечается полное заживление раневой поверхности (фиг. 13, 14).
В контрольной группе животных к 20 суткам эксперимента отмечаются физиологические процессы купирования ожоговой раны. Интенсивная эпителизация со стороны здоровой кожи. Заметное уменьшение в объеме раневой поверхности. У 4 животных - летальный исход.
Таким образом, на основании вышеизложенного можно заключить, что полученный опытный образец препарата «Образец №6», обладает ярко выраженными ранозаживляющими свойствами. О чем свидетельствует сокращение сроков полного восстановления кожного покрова после нанесения ожоговой травмы крысам по сравнению с контрольными животными. Опытный образец крема «Образец №6» обладает ранозаживляющим действием наравне с общепринятым средством «Пантенол», а также обладает низким местно-раздражающим действием, о чем свидетельствуют результаты внутрикожного введения образца и наложением накожных аппликаций.