Анализ ядрышек в интактных лимфоцитах периферической крови разных видов млекопитающих

УДК 636.4.082.12

анализ ядрышек в интактных лимфоцитах периферической крови разных видов млекопитающих

П.М. КЛЕНОВИЦКИЙ1, доктор биологических наук, главный научный сотрудник

Б.С. ИОЛЧИЕВ1, доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник

М.А. ЖИЛИНСКИЙ1, младший научный сотрудник

В.А. БАГИРОВ1, доктор биологических наук, главный научный сотрудник

Н.Т. ОНКОРОВА2, кандидат биологических наук, доцент

В.Н. ГРИШИН3, кандидат сельскохозяйственных наук, доцент

всероссийский научно-исследовательский институт животнововодства им. академика Л.К. Эрнста, пос. Дубровицы, 60, Подольский р-н, Московская обл., 142132, Российская Федерация

2Калмыцкий государственный университет, ул. Пушкина, 11, Элиста, Республика Калмыкия, 358000, Российская Федерация

3Российский университет дружбы народов, ул. Миклухо-Маклая, 8, Москва, 117198, Российская Федерация

Резюме. Анализ ЯОР (ядрышкообразующих районов) позволяет оценить уровень синтеза в клетках 18S и 28S субъединиц рибосомальной РНК, принимающих участие в биосинтезе белка. С целью разработки метода экспресс-анализа активности р-генов (генов рибосомальной РНК) представляет интерес изучение индекса ЯОР у видов домашних животных, различающихся по числу кластеров генов рибосомальной РНК (рРНК). Окраску лимфоцитов периферической крови проводили 50%-ным раствором азотнокислого серебра по методу Howell W., Black D. От каждого животного анализировали по 100 лимфоцитов, определяли долю клеток с окрашенными ЯОР и среднее число ЯОР в клетке. Исследовали домашних животных трех видов: нутрия, американская норка и домашняя овца. Число кластеров рибосомальных генов у этих видов равно 1, 2 и 5 соответственно. При окраске лимфоцитов в мазках крови раствором азотнокислого серебра выделены два типа клеток: покоящиеся лимфоциты и лимфоциты, содержащие Ag+ структуры. Доля последних из них оказалась пропорциональной числу кластеров рРНК-генов у изучаемых видов. У нутрии доля клеток, меченных серебром, составила 40%, норки - 68 и домашней овцы - 91%, что позволяет рассматривать Ag+ структуры лимфоцитов как интерфазные ядрышковые организаторы и использовать их как репортерную систему при изучении факторов, влияющих на обмен веществ у животных. Ключевые слова: биосинтез белка, ядрышко, лимфоциты, репортерная система, рибосомальная РНК (рРНК), ядрышковый организатор (ЯО), ядрышкообразующий район (ЯОР).

Для цитирования: Анализ ядрышек в интактных лимфоцитах периферической крови разных видов млекопитающих / П.М. Кленовицкий, Б.С. Иолчиев, М.А. Жилинский, В.А. Багиров, Н.Т. Онкорова, В.Н. Гришин // Достижения науки и техники АПК. 2015. Т.29. №12. С. 92-94.

В последние десятилетия в прикладной генетике животных, наряду с классическими подходами цитогенетического анализа, нашедшими широкое применение в систематике млекопитающих [1, 2] и при цитогенетическом мониторинге в селекции сельскохозяйственных животных [3-6] все большее внимание приобретает изучение функционального состояния отдельных систем генома [7-9].

Современные методы избирательного окрашивания хромосом позволяют выявлять и оценивать активность функционировавших в предшествующей интерфазе ядрышкообразующих районов (ЯОР), в которых локализованы гены одного из основных компонентов рибосом - рибосомальной РНК (рРНК). В ряде исследований [10] показано, что скорость биосинтеза белка зависит от количества рибосом в клетке, которое, в свою очередь, определяется содержанием в цитоплазме компонентов, необходимых для сборки этих органелл, в том числе рРНК. Очевидно, кластеры генов рРНК могут выступать в качестве репортерной системы, характеризующей параметры биосинтеза белка.

На сегодняшний день для большинства животных установлены лишь число и хромосомная локализация ядрышковых организаторов [11]. Из сельскохозяйственных животных наиболее детально исследованы ядрышковые организаторы свиньи, причем эти работы выполнены на митотических хромосомах [7-10,12]. Однако трудоемкость получения препаратов хромосом осложняет использование этого метода при оценке активности ядрышковых организаторов (ЯО). С другой стороны, для некоторых видов с множественной локализацией кластеров генов рРНК, в том числе овец и крупного рогатого скота, характерно окрашивание в большинстве клеток лишь части хромосом, несущих ЯО [13,14].

Вместе с тем, в работах [15-17] показано, что в качестве теста, характеризующего состояние интактных клеток лимфоцитарного ряда, можно использовать окраску азотнокислым серебром. Прошин С.Н с соавт. [15] обнаружили связь индекса ядрышковых организаторов с жизнеспособностью лимфоцитов периферической крови.

Рис. 1. Окраска лимфоцитов перефирической крови нутрии (М. coypus) азотнокислым серебром: а) интактный лимфоцит; б), в) лимфоциты с разной степенью окраски ЯО.

рис. 2. Лимфоцит периферической крови домашней овцы (О. aries), окрашенный азотнокислым серебром, содержащий 8 ЯО.

Однако число подобных исследований невелико. Кроме того, в этих работах нет прямых доказательств связи индекса ЯО с ЯОР, подтверждение которой можно получить на основании анализа особенностей окраски азотнокислым серебром интактных лимфоцитов у животных, принадлежащих к видам, различающимся по числу кластеров р-генов.

Таблица. характеристика активности яо в лимфоцитах исследованных видов

Вид животных Число кластеров рибосомальных генов Доля клеток с активными ядрышками Среднее число ядрышек на клетку

Нутрия (M. coypus) Американская норка (M. vison) Домашняя овца (O. aries) 1 [19] 2 [11] б [11] 0,40+0,02 0,68+0,01 0,91+0,01 0,63+0,03 0,84+0,01 2,40+0,03

С целью выявления этой связи для обоснования метода экспресс-анализа активности р-генов была поставлена задача изучить связь индекса ЯО, определяемого как доля клеток, с окрашенными серебром ядрышками (или ядрышком), от общего числа лимфоцитов [15], с числом выявляемых серебром меток на клетку и с числом кластеров р-генов.

Условия, материалы и методы. Для исследования видовой специфичности индекса ЯО были выбраны виды животных, различающиеся по их числу: нутрия (Myocastor coypus Molina,) - 30 гол., американская норка (Mustela vison Schreber) -40 гол. и домашняя овца (Ovis aries L.) - 30 гол. Анализ ЯО проводили на мазках периферической крови, фиксированных при комнатной температуре метиловым спиртом. Окраску интактных лимфоцитов осуществляли азотнокислым серебром по методу Хавелла-Блейка [17]. От каждого животного анализировали по 100 лимфоцитов. Учитывали долю клеток,

несущих серебряную метку (в процентах), и среднее число меток на клетку.

Результаты исследования документировали с помощью цифровой видеокамеры КС-583С (Digital, Tawan) и пакета программ, совместимых с Widows. Статистическую обработку осуществляли с использованием программных средств Microsoft Exel.

результаты и обсуждение. В популяции циркулирующих лимфоцитов после окраски серебром выделяются два типа клеток: покоящиеся лимфоциты и лимфоциты с активными ядрышками. При этом у последних отмечено наличие вариаций, как по интенсивности окраски ЯО, так и по числу окрашенных центров. Причем различия по указанным признакам наблюдаются, как в пределах вида (рис. 1), так и между видами.

По данным наших исследований у нутрий число ядрышек в окрашенных лимфоцитах колебалось от 1 до 2 на клетку, у норок - от 1 до 4 шт. Следует отметить, что у овец практически все клетки несли окрашенную серебром метку. Число активных ЯО у них достигало 8 (рис. 2) при минимальном значении равном 1.

Исследованные виды животных достоверно с высоким уровнем значимости различались между собой

(см. табл.), как по доле клеток с активными ядрышками (p<0,001), так и по среднему числу ядрышек на клетку (p<0,001). Существует высокая корреляция между установленным ранее [11, 19] числом кластеров рибосомальных генов и долей лимфоцитов с активными ядрышками (r=0,94; p<0,01), а также со средним числом ядрышек на лимфоцит (r=0,99; p<0,01).

выводы. Результаты наших исследований свидетельствуют о том, что число активных ядрыш-ковых организаторов в лимфоцитах и индекс ЯО видоспецифичны и тесно коррелируют с числом кластеров р-генов у исследуемых видов. Известно также, что активность ядрышковых организаторов достоверно коррелирует с количеством зрелой рРНК [20], следовательно, в качестве экспресс-метода оценки функционирования генов 18S/28S -рРНК у домашних животных можно использовать окраску ядрышковых организаторов интактных лимфоцитов азотнокислым серебром. Окрашенные азотнокислым серебром интерфазные клетки могут служить в качестве репортерной системы при изучении факторов, влияющих на обмен веществ у животных.

Литература.

1. Орлов В.Н., Булатова Н.Ш. Сравнительная цитогенетика и кариосистематика млекопитающих. М.: Наука. 1983. 405 с.

2. Дзуев Р.И. Хромосомные наборы млекопитающих Кавказа.- Нальчик: Эльбрус. 1998. 256 с.

3. Эрнст Л.К., Жигачев А.И. Мониторинг генетических болезней в системе крупномасштабной селекции. М.: РАСХН. 2006. 382 с.

4. Яковлев А.Ф. Цитогенетическая оценка племенных животных. М.: Агропромиздат. 1985. 256 с.

5. Вопросы прикладной цитогенетики сельскохозяйственных животных / П.М. Кленовицкий, В.А. Багиров, Б.С. Иолчиев, А.В. Доцев //Достижения науки и техники АПК. 2003. № 10. С. 17.

6. Цитогенетический анализ при отдаленной гибридизации полорогих/B.A. Багиров, П.М. Кленовицкий, Ш.Н. Насибов, Б.С. Иолчиев, Н.А. Зиновьева, Л.К. Эрнст //Достижения науки и техники АПК. 2009. №8. С. 41-43.

7. Выявление ядрышковых организаторов и активность рибосомных генов у свиней, трансгенных по MMT1/RHGH (ген соматолиберина человека) /Л.К. Эрнст, П.М. Кленовицкий, И.В. Гусев, Н.В. Костерева, С.С. Данч // Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук. 2003. № 2. С. 36-38.

8. ЭрнстЛ.К., Волкова Н.А., Кленовицкий П.М. Цитогенетическая характеристика свиней, трансгенных по гену релизинг-фактора гормона роста человека MMT1/RHGH// Сельскохозяйственная биология. 2008. № 2. С. 40-46.

9. Состояние хромосомного аппарата у свиней, трансгенных по гену соматолиберина человека MT1/RHGH /Л.К. Эрнст, П.М. Кленовицкий, В.А. Багиров, Н.А. Волкова, Н.А. Зиновьева, И.В. Гусев, С.С. Данч, Г. Брем//Сельскохозяйственная биология. 2009. №2. С. 31-36.

10. СтентГ., Кэлидер Р. Молекулярная генетика. М.: Мир, 1986. 415 с.

11. Графодатский А.С., Раджабли С.И. Хромосомы сельскохозяйственных и лабораторных млекопитающих: атлас. Новосибирск: Наука, 1988. 127 с.

12. Кленовицкий П.М., Завада А.Н., Гусев Д.И. Анализ ядрышковых организаторов (ЯОР) у свиней цивильской породы // Проблемы увеличения производства продуктов животноводства и пути их решения: материалы международной научно-практической конференции. ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии; РУЭЦ МГАВМиБ, 2008. С. 452-455.

13. Киселева Т.Ю., Яковлев А.Ф., Смирнов А.Ф. О полиморфизме активности районов ядрышкового организатора хромосом у различных пород крупного рогатого скота // Сельскохозяйственная биология. 1985. № 4. С. 100-103.

14. Цитогенетика животных/ П.М. Кленовицкий, В.А. Багиров, Н.А. Зиновьева, Ш.Н. Насибов, Б.С. Иолчиев. М.: РАСХН, 2007. 82 с.

15. Прошин С.Н., Косякова Г.П., Смирнова Т.А., Яковлев А.Ф. Связь функциональной активности и апоптоза клеток периферической крови крупного рогатого скота // Актуальные проблемы биотехнологии в животноводстве: тез. докл. третьей международной конференции. Боровск: ВНИИБиПЖ, 2000. С. 421.

16. Косякова Г.П., Яковлев А.Ф. Спонтанная дестабилизация генома свиней // Зоотехническая наука в условиях современных вызовов. Сборник статей научно-практической конференции с международным участием, посвященной 85-летию со дня рождения академика Л.К.Эрнста и 85-летию подготовки зоотехников в ВГСХА. Киров: ВГСХА, 2015. С. 172-176.

17. Жиденова А.Н. Межполовые различия по уровню активности интерфазных ядрышкообразующих районов хромосом у крупного рогатого скота // Вестник Новосибирского государственного аграрного университета. 2011. Т.3. №19. С. 62-65.

18. Howell W., Black D. Controlled silver staining of nucleolus organizer regions with a protective colloidal developer: in a one step method//Experientia. 1980. V. 36. Pp. 1014-1015.

19. Кленовицкий П.М., Гришин В.Н., Нгбодо Ж.В. Кариотип нутрии (Myocastor Coypus Molina)//Ветеринарная патология. 2007. Т.20. №1. С. 91-94.

20. Morton C.C., Brown J.A., Holmes W.A., Nance W.E., Wolf B. Stain intensity of human nucleolus organizer region reflects incorporation of uridine in to mature ribosomal RNA //Expl Cell Res. 1983. V. 145. P. 405-413.

ANALYSIS OF NuCLEOLI IN INTACT PERIPHERAL BLOOD LYMPHOCYTES IN DIFFERENT SPECIES OF MAMMALS

P.M. Klenovitsky, B.S. Iolchiev, M.A. Zhilinskiy, V.A. Bagirov, N.T. Onkorova, V.N. Grishin

1L.K. Ernst All-Russian Research Institute of Animal Husbandry, pos. Dubrovitsy, 60, Podolskiy r-n, Moskovskaya obl., 142132, Russian Federation

2Kalmyk State University, ul. Pushkina, 11, Elista, Respublica Kalmykia, 358000, Russian Federation 3Peoples' Friendship University of Russia, ul. Miklukho-Maklaya, 8, Moskva, 117198, Russian Federation

Summary. Analysis of NOR (nucleolar organizer regions) allows assessing the level of synthesis of 18S and 28S ribosomal RNA subunits, involved in protein biosynthesis, in cells. In order to develop a method of an express analysis of r-gene activity (ribosomal RNA genes) the NOR index study in species of domestic animals, differing in the number of genes clusters of ribosomal RNA (rRNA), is of interest. The coloring of peripheral blood lymphocytes was carried out with 50% solution of silver nitrate by the method of W. Howell, D. Black. From each animal 100 lymphocytes were analyzed, the proportion of cells with dyed NOR and the average number of NOR in the cell were determined. We studied three types of animals: nutria, American mink and domestic sheep. The number of ribosomal genes clusters in these species is 1, 2, and 5, respectively. When stained lymphocytes in blood smears with a solution of silver nitrate it was allocated two types of cells: resting lymphocytes and lymphocytes containing structure Ag+. The share of the latter was proportional to the number of rRNA genes clusters in the studied species. The proportion of cells, labeled by silver, in nutria was 40%, in mink-68% and in domestic sheep-91%. This allows considering the Ag+ structures of lymphocytes as the interphase nucleolus organizers and using them as a reporter system in the study of factors affecting the metabolism in animals.

Keywords: protein biosynthesis, nucleolus, lymphocytes, reporter system, ribosomal RNA (rRNA), nucleolus organizer (NO), nucleolus organizer region (NOR).

Author Details: P.M. Klenovitsky, D. Sc. (Biol.), chief research fellow (e-mail: klenpm@mail.ru); B.S. Iolchiev, , D. Sc. (Biol.), leading research fellow; M.A. Zhilinskiy, junior research fellow, V.A. Bagirov, D. Sc. (Biol.), Chief Research fellow; N.T. Onkorova, Cand. Sc. (Biol.), assoc. prof.; V.N. Grishin, Cand. Sc. (Agr.), assoc. prof.

For citation: Klenovitsky P.M., Iolchiev B.S., Zhilinskiy M.A., BagirovV.A., Onkorova N.T., Grishin V.N. Analysis of Nucleoli in Intact Peripheral Blood Lymphocytes in Different Species of Mammals. Dostizheniya nauki i tekhnikiAPK. 2015. V.29. No 12. Pp. 92-94 (In Russ.).

вниманию соискателей ученых степеней и других заинтересованных лиЦ!

Редакция журнала «Достижения науки и техники АПК» издает монографии и другую книжную продукцию с редактированием и всеми выходными данными.

Цены договорные. Заявки отправлять по адресу: 101000, г Москва, Моспочтамт, а/я 166. Тел.: (495) 557-13-01, (916) 241-63-43. E-mail: agroapk@mail.ru

J