СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ИЗ АМНИОТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЫ ПУПОВИНЫ С ПРИМЕНЕНИЕМ КЛЕТОЧНОЙ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ СРЕДЫ
METHOD FOR ISOLATION OF MESENCHYMAL STEM CELLS FROM AMNIOTIC MEMBRANE OF UMBILICAL CORD, USING CELL CULTURAL MEDIUM

Настоящая заявка испрашивает приоритет согласно предварительной заявке на патент США №62/404582, поданной 5 октября 2016 г., содержание которой полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки для всех целей.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к способу выделения мезенхимальных стволовых клеток (или такой популяции стволовых клеток) из амниотической мембраны пуповины, а также к популяции мезенхимальных стволовых клеток, выделенных из амниотической мембраны пуповины. Изобретение также относится к клеточной культуральной среде (среде для культивирования клеток) для выделения мезенхимальных стволовых клеток из амниотической мембраны пуповины. Изобретение также относится к фармацевтической композиции и применениям выделенной популяции мезенхимальных стволовых клеток. Изобретение также относится к способам лечения заболевания или нарушения, включающим введение популяции мезенхимальных стволовых клеток или фармацевтической композиции, содержащей такую популяцию мезенхимальных стволовых клеток по изобретению, субъекту, нуждающемуся в этом.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Мезенхимальные стволовые клетки, выделенные из амниотической мембраны пуповины, впервые были описаны в заявке на патент США 2006/0078993 (что привело к выдаче патентов США 9085755 и 9737568) и соответствующей международной заявке на патент WO 2006/019357. С тех пор ткань пуповины привлекала внимание как источник мультипотентных клеток; из-за своей широкой доступности пуповина и, в частности, стволовые клетки, выделенные из амниотической мембраны пуповины (также называемые "выстилающие стволовые клетки пуповины"), считаются отличным альтернативным источником клеток для регенеративной медицины. См. Jeschke et al. Umbilical Cord Lining Membrane and Wharton's Jelly-Derived Mesenchymal Stem Cells: the Similarities and Differences; The Open Tissue Engineering and Regenerative Medicine Journal, 2011, 4, 21-27.
В последующем исследовании сравнивали фенотип, скорость пролиферации, миграцию, иммуногенность и иммуномодулирующие способности мезенхимальных стволовых клеток (MSC, МСК) человека, полученных из амниотической мембраны пуповины (выстилки пуповины (CL-MSC)), пуповинной крови (СВ-MSC), плаценты (P-MSC) и вартонова студня (WJ-MSC) (Stubbendorf et al, Immunological Properties of Extraembryonic Human Mesenchymal Stromal Cells Derived from Gestational Tissue, STEM CELLS AND DEVELOPMENT Volume 22, Number 19, 2013, 2619-2629). Stubbendorf et al. пришли к выводу, что популяции MSC, полученных из внезародышевых гестационных тканей, демонстрируют варьирующийся потенциал, позволяющий избежать иммунного ответа, а также оказывать иммуномодулирующее действие. Авторы также обнаружили, что CL-MSC показали наиболее многообещающий потенциал для клеточной терапии, так как эти клетки показали низкую иммуногенность, но они также показали повышенный пролиферативный и миграционный потенциал, поэтому будущие исследования должны быть сосредоточены на наилучших моделях заболеваний, при которых могут быть применены CL-MSC.
Хотя мезенхимальные стволовые клетки амниотической мембраны могут быть легко получены с использованием протокола, описанного в заявке на патент США 2006/0078993 и международной заявке на патент WO 2006/019357, для клинических испытаний с этими MSC, полученных из выстилки пуповины, было бы полезно иметь в своем распоряжении метод, позволяющий выделить популяцию этих MSC из выстилки пуповины, которая являлась бы высоко однородной и, таким образом, могла быть применена для клинических испытаний.
Соответственно, задачей изобретения является создание способа выделения популяции мезенхимальных стволовых клеток из амниотической мембраны пуповины, которая удовлетворяет эту потребность. Таким образом, задачей изобретения является также создание высоко однородной популяции мезенхимальных стволовых клеток, выделенных из амниотической мембраны пуповины.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Эта задача решается с помощью способов, популяции мезенхимальных стволовых клеток, соответствующей фармацевтической композиции и клеточной культуральной среды, характеризующихся признаками независимых пунктов формулы изобретения.
В первом аспекте изобретение относится к способу выделения популяции мезенхимальных стволовых клеток из амниотической мембраны пуповины, способу, включающему культивирование ткани пуповины в культуральной среде, содержащей DMEM (среда Игла, модифицированная по Дульбекко), F12 (среда Хэма F-12), М171 (среда 171) и ФБС (фетальная бычья сыворотка).
Во втором аспекте изобретение относится к выделенной популяции мезенхимальных стволовых клеток амниотической мембраны пуповины, причем по меньшей мере приблизительно 90% или более клеток этой популяции стволовых клеток экспрессируют каждый из следующих маркеров: CD73, CD90 и CD105. Предпочтительно, эта выделенная популяция мезенхимальных стволовых клеток не экспрессирует следующие маркеры: CD34, CD45 и HLA-DR. В вариантах реализации этого второго аспекта по меньшей мере приблизительно 91% или более, приблизительно 92% или более, приблизительно 92% или более, приблизительно 93% или более, приблизительно 94% или более, приблизительно 95% или более, приблизительно 96% или более, приблизительно 97% или более, приблизительно 98% или более, приблизительно 99% или более клеток выделенной популяции мезенхимальных стволовых клеток экспрессируют каждый из CD73, CD90 и CD105. Кроме того, в этих вариантах реализации второго аспекта по меньшей мере приблизительно 91% или более, приблизительно 92% или более, приблизительно 92% или более, приблизительно 93% или более, приблизительно 94% или более, приблизительно 95% или более, приблизительно 96% или более, приблизительно 97% или более, приблизительно 98% или более, приблизительно 99% или более клеток выделенной популяции мезенхимальных стволовых клеток предпочтительно не экспрессирует маркеры CD34, CD45 и HLA-DR. Эта популяция мезенхимальных стволовых клеток может быть получена способом выделения популяции мезенхимальных стволовых клеток по первому аспекту.
В третьем аспекте изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей клетку млекопитающих (согласно второму аспекту) по изобретению.
В четвертом аспекте изобретение относится к способу изготовления культуральной среды для выделения, включающему смешивание следующих компонентов до получения конечного объема 500 мл культуральной среды:
i. 250 мл DMEM
ii. 118 мл М171
iii. 118 мл DMEM/F12
iv. 12,5 мл фетальной бычьей сыворотки (ФБС) для получения конечной концентрации 2,5% (об./об.).
В пятом аспекте изобретение относится к клеточной культуральной среде, получаемой способом по четвертому аспекту.
В шестом аспекте изобретение относится к способу выделения стволовых клеток из амниотической мембраны пуповины, включающему культивирование ткани амниотической мембраны в культуральной среде, приготовленной способом по четвертому аспекту.
В седьмом аспекте изобретение относится к клеточной культуральной среде, содержащей:
- DMEM в конечной концентрации приблизительно от 55 до 65% (об./об.),
- F12 в конечной концентрации приблизительно от 5 до 15% (об./об.),
- М171 в конечной концентрации приблизительно от 15 до 30% (об./об.) и
- ФБС в конечной концентрации приблизительно от 1 до 8% (об./об.).
В восьмом аспекте изобретение относится к применению клеточной культуральной среды согласно седьмому аспекту для выделения мезенхимальных стволовых клеток из амниотической мембраны пуповины.
В девятом аспекте изобретение относится к применению клеточной культуральной среды согласно седьмому аспекту для культивирования мезенхимальных стволовых клеток из амниотической мембраны пуповины.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Изобретение можно лучше понять, обратившись к подробному описанию, рассматриваемому в сочетании с неограничивающими примерами и чертежами, на которых:
На Фиг. 1 показана техническая спецификация Lonza для среды Игла, модифицированной по Дульбекко, включая номер по каталогу DMEM, использованной для создания иллюстративного примера среды по изобретению (РТТ-6) в разделе "Экспериментальные примеры";
На Фиг. 2 показана техническая спецификация Lonza для среды Хэма F-12;
На Фиг. 3 показана техническая спецификация Lonza для среды DMEM: F12 (1:1), включая номер по каталогу среды DMEM: F12 (1:1), использованной для создания иллюстративного примера среды по изобретению (РТТ- 6) в разделе "Экспериментальные примеры";
На Фиг. 4 показана техническая спецификация Life Technologies Corporation для среды М171, включая номер по каталогу среды М171, использованной для создания иллюстративного примера среды по изобретению (РТТ-6) в разделе "Экспериментальные примеры";
На Фиг. 5 показан список ингредиентов, включая коммерческих поставщиков и номер по каталогу, использованных в разделе "Экспериментальные примеры" для приготовления среды РТТ-6.
На Фиг. 6 показаны результаты экспериментов с проточной цитометрией, в которых мезенхимальные стволовые клетки, выделенные из пуповины, исследовали на экспрессию маркеров мезенхимальных стволовых клеток CD73, CD90 и CD105. Для этих экспериментов мезенхимальные стволовые клетки выделяли из ткани пуповины путем культивирования ткани пуповины в трех различных средах культивирования с последующим субкультивированием мезенхимальных стволовых клеток в соответствующей среде. В этих экспериментах использовали три следующие среды: а) 90% (об./(об./DMEM с добавлением 10% ФБС (об./(об.), b) культуральная среда РТТ-4, описанная в заявке на патент США 2006/0078993 и соответствующей международной заявке на патент WO 2006/019357, которая состоит из 90% (об./(об.) CMRL1066 и 10% (об./об.) ФБС (см. абзац [0183] в WO 2006/019357 и с), культуральная среда по настоящему изобретению РРТ-6, состав которой описан в настоящей заявке. В этом анализе проточной цитометрии исследовали два разных образца популяции мезенхимальных стволовых клеток выстилки пуповины (CLMC) для каждой из трех использованных культуральных сред. Результаты показаны на Фиг. 6а - Фиг. 6с. Более подробно, на Фиг. 6а показан процент выделенных мезенхимальных стволовых клеток выстилки пуповины, экспрессирующих маркеры стволовых клеток CD73, CD90 и CD105, после выделения из ткани пуповины и культивирования в DMEM/10% ФБС, на Фиг. 6b показан процент выделенных мезенхимальных стволовых клеток выстилки пуповины, экспрессирующих маркеры стволовых клеток CD73, CD90 и CD105, после выделения из ткани пуповины и культивирования в РТТ-4, и на Фиг. 6с показан процент выделенных мезенхимальных стволовых клеток выстилки пуповины, экспрессирующих маркеры стволовых клеток CD73, CD90 и CD 105 после выделения, из ткани пуповины и культивирования в РТТ-6.
На Фиг. 7 показаны результаты экспериментов проточной цитометриии, в которых мезенхимальные стволовые клетки, выделенные из пуповины, исследовали на предмет экспрессии маркеров стволовых клеток (CD73, CD90 и CD105, CD34, CD45 и HLA-DR (антиген лейкоцитов человека - D-родственный антиген), которые используют для определения пригодности мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток человека для клеточной терапии и сравнивают с экспрессией этих маркеров мезенхимальными стволовыми клетками костного мозга. Для этого эксперимента мезенхимальные стволовые клетки амниотической мембраны пуповины выделяли из ткани пуповины путем культивирования ткани пуповины в культуральной среде по настоящему изобретению РРТ-6, а мезенхимальные стволовые клетки костного мозга выделяли из костного мозга человека с использованием стандартного протокола. На Фиг. 7а показан процент выделенных мезенхимальных стволовых клеток выстилки пуповины, которые экспрессируют маркеры стволовых клеток CD73, CD90 и CD 105 и не экспрессируют CD34, CD45 и HLA-DR после выделения из ткани пуповины и культивирования в среде РТТ-6, в то время как на рис. 7b показан процент выделенных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга, которые экспрессируют CD73, CD90 и CD 105 и не экспрессируют CD34, CD45 и HLA-DR.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Как объяснено выше, в первом аспекте изобретение относится к способу выделения популяции мезенхимальных стволовых клеток из амниотической мембраны пуповины, включающему культивирование ткани пуповины в культуральной среде, содержащей DMEM (Среда Игла, модифицированная по Дульбекко), F12 (среда Хэма F-12), M171 (среда 171) и ФБС (фетальная бычья сыворотка). В настоящей заявке неожиданно было обнаружено, что применение такой среды обеспечивает выделение популяции мезенхимальных стволовых клеток из амниотической мембраны пуповины, из которых более 90% или даже 99% или более клеток являются положительными на наличие трех мезенхимальных маркеров стволовых клеток CD73, CD90 и, в то же время, в этих стволовых клетках отсутствует экспрессия CD34, CD45 и HLA-DR (см. раздел "Экспериментальные примеры"), что означает, что 99% или даже больше клеток этой популяции экспрессируют маркеры стволовых клеток CD73, CD90 и CD105 при этом не экспрессируя маркеры CD34, CD45 и HLA-DR. Такая чрезвычайно однородная и четко определенная клеточная популяция является идеальным кандидатом для клинических испытаний и клеточной терапии, поскольку эти клетки, например, полностью соответствуют критериям, общепринятым для мезенхимальных стволовых клеток человека, для применения в клеточной терапии, как определено, например, в работе Dominici et al, "Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement", Cytotherapy (2006) Vol. 8, No. 4, 315-317, Sensebe et al,. "Production of mesenchymal stromal/stem cells according to good manufacturing practices: a, review", Stem Cell Research & Therapy 2013, 4:66), Vonk et al., Stem Cell Research & Therapy (2015) 6:94, или Kundrotas Acta Medica Lituanica. 2012. Vol. 19. No. 2. P. 75-79. Кроме того, используя биореактор, такой как система Quantum Cell Expansion System, можно получить большое количество мезенхимальных стволовых клеток, например от 300 до 700 миллионов мезенхимальных стволовых клеток за один цикл (см. также раздел "Экспериментальные примеры"). Таким образом, настоящее изобретение позволяет обеспечить количества стволовых клеток, которые необходимы для терапевтического применения, например, их применения для заживления ран, экономически эффективным образом. Кроме того, все компоненты, используемые для приготовления культуральной среды по настоящему изобретению, коммерчески доступны в качестве, соответствующем GMP (стандартам надлежащей медицинской практики). Соответственно, настоящее изобретение открывает путь к производству этой высоко однородной популяции мезенхимальных стволовых клеток из амниотической мембраны пуповины в соответствии со стандартами GMP.
В этом контексте следует отметить, что культуральная среда по настоящему изобретению позволяет выделять популяцию мезенхимальных стволовых клеток (также называемую здесь "мезенхимальные стволовые клетки") из амниотической мембраны в условиях, которые допускают пролиферацию мезенхимальных стволовых/прогениторных клеток без дифференцировки мезенхимальных стволовых/прогениторных клеток. Таким образом, после выделения мезенхимальных стволовых клеток из амниотической мембраны, как описано в настоящей заявке, популяция выделенных мезенхимальных стволовых/прогениторных клеток может дифференцироваться в несколько типов клеток, как описано, например, в патентной заявке США 2006/0078993, патенте США 9085755, международной заявке на патент WO 2006/019357, патенте США 8287854 или WO 2007/046775. Как описано в заявке на патент США 2006/0078993, мезенхимальные стволовые клетки амниотической мембраны пуповины имеют форму веретена и экспрессируют следующие гены: POU5f1, Bmi-1, фактор, ингибирующий лейкоз (LIF), и секретируют активин А и фоллистатин. Мезенхимальные стволовые клетки, выделенные в настоящем изобретении, можно, например, дифференцировать в любой тип мезенхимальных клеток, таких как, среди прочего, адипоцит, фибробласты кожи, хондроциты, остеобласты, теноциты, фибробласты связок, кардиомиоциты, клетки гладких мышц, клетки скелетных мышц, адипоциты, клетки, продуцирующие муцин, клетки, происходящие из эндокринных желез, например, клетки, продуцирующие инсулин (например, β-островковые клетки) или нейроэктодермальные клетки. Стволовые клетки, выделенные в настоящем изобретении, можно дифференцировать in vitro, чтобы впоследствии применять дифференцированную клетку в медицинских целях. Наглядным примером такого подхода является дифференцировка мезенхимальных стволовых клеток в инсулин-продуцирующие β-островковые клетки, которые затем можно вводить, например, путем имплантации, пациенту, страдающему дефицитом инсулина, например сахарным диабетом (в этом контексте ср., также WO 2007/046775). В альтернативном варианте, мезенхимальные стволовые клетки по изобретению могут применяться в недифференцированном состоянии для клеточной терапии, например, для целей заживления ран, таких как лечение ожогов или хронических диабетических ран. В этих терапевтических применениях мезенхимальные стволовые клетки по изобретению могут либо способствовать заживлению ран, взаимодействуя с окружающей пораженной тканью, либо могут также дифференцироваться в соответствующие клетки кожи (ср., например, WO 2007/046775).
В этом контексте следует отметить, что популяция мезенхимальных стволовых клеток, описанная здесь, может быть выделена и культивирована (т.е. получена) из любой ткани пуповины, если ткань пуповины содержит амниотическую мембрану (которую также называют "выстилкой пуповины (пупочного канатика)"). Соответственно, популяция мезенхимальных стволовых клеток может быть выделена из (кусочков) всей пуповины, как описано в разделе "Экспериментальные примеры" настоящей заявки. Таким образом, эта ткань пуповины может содержать, помимо амниотической мембраны, любую другую ткань/компонент пуповины. Как показано, например, на Фиг. 16 заявки на патент США 2006/0078993 или международной заявки на патент WO 2006/019357, амниотическая мембрана пуповины является самой внешней частью пуповины, покрывающей пуповину. Кроме того, пуповина содержит одну вену (которая несет насыщенную кислородом кровь, богатую питательными веществами, к плоду) и две артерии (которые переносят бедную кислородом, истощенную кровь от плода). Для защиты и механической поддержки эти три кровеносных сосуда заключены в вартонов студень, желеобразное вещество, состоящее в основном из мукополисахаридов. Соответственно, ткань пуповины, используемая в настоящем изобретении, также может содержать одну вену, две артерии и вартонов студень. Применение такого целого (неповрежденного) участка пуповины имеет то преимущество, что амниотическую мембрану не нужно отделять от других компонентов пуповины. Это уменьшает количество этапов выделения и, таким образом, делает способ по настоящему изобретению более простым, быстрым, менее подверженным ошибкам и более экономичным - все это важные аспекты для GMP-производства, которое необходимо для терапевтического применения мезенхимальных стволовых клеток. Таким образом, выделение мезенхимальных стволовых клеток может начаться с эксплантации ткани, за которой может идти последующее субкультивирование (культивирование) выделенных мезенхимальных стволовых клеток, если требуется большее количество мезенхимальных стволовых клеток, например, для применения в клинических испытаниях. В альтернативном варианте, также возможно сначала отделить амниотическую мембрану от других компонентов пуповины и выделить мезенхимальные стволовые клетки выстилки из амниотической мембраны путем культивирования амниотической мембраны в культуральной среде по настоящему изобретению. Это культивирование также может быть осуществлено с помощью тканевого эксплантата, необязательно с последующим субкультивированием выделенных мезенхимальных стволовых клеток. В этом контексте термин "эксплантат ткани" или "метод эксплантации ткани" используется в его обычном значении в данной области техники для обозначения способа, при котором собранную ткань или кусочек такой ткани помещают чашку для культивирования клеток, содержащую культуральную (ростовую) среду, и благодаря которой стволовые клетки со временем мигрируют из ткани на поверхность чашки. Эти первичные стволовые клетки могут быть затем размножены и перенесены в свежие чашки посредством микроклонального размножения (субкультивирования), как также описано здесь. В этом контексте следует отметить, что с точки зрения производства клеток в терапевтических целях на первом этапе выделения мезенхимальных стволовых клеток амниотической мембраны из пуповины получают главный банк клеток из выделенных мезенхимальных стволовых клеток, в то время как при последующем субкультивировании может быть получен рабочий банк клеток. Если популяция мезенхимальных стволовых клеток по настоящему изобретению (в частности, популяция мезенхимальных стволовых клеток, из которых по меньшей мере приблизительно 98% или 99% или более экспрессируют каждый из маркеров CD73, CD90 и CD 105 и не экспрессируют каждый из маркеров: CD34, CD45 и HLA-DR) используется для клинических испытаний или в качестве одобренного терапевтического средства, для этой цели обычно будет применяться популяция клеток из рабочего банка. Как популяция стволовых клеток на стадии выделения (которая может составлять главный банк клеток), так и популяция стволовых клеток на стадии субкультивирования (которая может составлять рабочий банк клеток) может, например, храниться в криоконсервированной форме.
Как упоминалось выше, настоящий способ выделения мезенхимальных стволовых клеток из амниотической мембраны пуповины имеет то преимущество, что все компоненты, применяемые в культуральной среде по настоящему изобретению, доступны с качеством, соответствующем стандартам GMP и, таким образом, обеспечивают возможность выделения мезенхимальных стволовых клеток при условиях, соответствующих GMP, для последующего терапевтического применения.
Под "DMEM" подразумевается среда Игла, модифицированная по Дульбекко, которая была разработана в 1969 году и является модификацией базальной среды Игла (ВМЕ) (см. Фиг. 1, показывающий спецификацию DMEM, поставляемой Lonza). Первоначальная формула DMEM содержит 1000 мг/л глюкозы и впервые была предложена для культивирования эмбриональных клеток мыши. С тех пор DMEM стала стандартной средой для клеточной культуры, которая коммерчески доступна из различных источников, таких как ThermoFisher Scientific (номер по каталогу 11965-084), Sigma Aldrich (номер по каталогу D5546) или Lonza, и это лишь некоторые из поставщиков. Таким образом, в настоящем изобретении может быть применяться любая коммерчески доступная DMEM. В предпочтительных вариантах реализации DMEM, применяемая здесь, представляет собой среду DMEM, поставляемая Lonza под номером по каталогу 12-604F. Эта среда представляет собой DMEM с добавлением 4,5 г/л глюкозы и L-глютамина). В другом предпочтительном варианте реализации DMEM, используемая в настоящей заявке, представляет собой среду DMEM под каталожным номером Sigma Aldrich D5546, которая содержит 1000 мг/л глюкозы и бикарбонат натрия, но не содержит L-глютамин.
Под средой "F12" подразумевается среда Хэма F-12. Эта среда также является стандартной клеточной культуральной средой и представляет собой питательную смесь, изначально предназначенную для культивирования широкого спектра клеток млекопитающих и клеток гибридом при использовании с сывороткой в сочетании с гормонами и трансферрином (см. Фиг. 2, показывающий спецификацию среды Хэма F-12 от Lonza). В настоящем изобретении может применяться любая коммерчески доступная среда Хэма F-12 (например, от ThermoFisher Scientific (номер по каталогу 11765-054), Sigma Aldrich (номер по каталогу N4888) или Lonza, и это лишь некоторые из поставщиков). В предпочтительных вариантах применяют среду Хэма F-12 от Lonza.
Под "DMEM/F12" или "DMEM:F12" подразумевается смесь 1:1 DMEM с культуральной средой Хэма F12 (см. Фиг. 3, где показана спецификация для среды DMEM: F12 (1:1) от Lonza). Также среда DMEM/F12 (1:1) является широко используемой базальной средой для поддержки роста многих различных клеток млекопитающих и коммерчески доступна от различных поставщиков, таких как ThermoFisher Scientific (номер по каталогу 11330057), Sigma Aldrich (номер по каталогу D6421) или Lonza. В настоящем изобретении может быть применяться любая коммерчески доступная среда DMEM: F12. В предпочтительных вариантах реализации среда DMEM: F12, используемая в данной заявке, представляет собой среду DMEM/F12 (1:1), поставляемую Lonza под каталожным номером 12-719F (которая является представляет собой DMEM: F12 с L-глутамином, 15 мМ HEPES и 3,151 г/л глюкозы).
Под "М171" подразумевается культуральная среда 171, которая была разработана в качестве базальной среды для культивирования (культуральной среды) нормальных человеческих эпителиальных клеток молочной железы (см. Фиг. 4, показывающую спецификацию для среды М171 от Life Technologies Corporation). Также эта базальная среда широко используется и является коммерчески доступной, например, от такого поставщика, как ThermoFisher Scientific или Life Technologies Corporation (номер по каталогу M171500). В настоящем изобретении может быть применяться любая коммерчески доступная среда М171. В предпочтительных вариантах реализации применяемая здесь среда M171 представляет собой среду М171, поставляемую Life Technologies Corporation под каталожным номером М171500.
Под "ФБС" подразумевается фетальная бычья сыворотка (которая также называется "фетальная телячья сыворотка"), то есть фракция крови, которая остается после естественного свертывания крови с последующим центрифугированием для удаления любых оставшихся эритроцитов. Фетальная бычья сыворотка является наиболее широко используемой сывороточной добавкой для культивирования эукариотических клеток in vitro, поскольку она имеет очень низкий уровень антител и содержит больше факторов роста, что обеспечивает универсальность во многих различных применениях в клеточных культурах. ФБС предпочтительно получают от члена Международной ассоциации сывороточной промышленности (ISIA), основной задачей которого является безопасность и безопасное использование сыворотки и продуктов животного происхождения, благодаря надлежащему отслеживанию происхождения, достоверности маркировки, а также соответствующей стандартизации и надзору. Поставщики ФБС, являющиеся членами ISIA, включают Abattoir Basics Company, Animal Technologies Inc., Biomin Biotechnologia LTDA, GE Healthcare, Gibco от Thermo Fisher Scientific и Life Science Production, и это лишь некоторые из них. В предпочтительных в настоящее время вариантах реализации ФБС получают от GE Healthcare под каталожным номером А15-151.
Что касается к культуральной среды по настоящему изобретению, она может содержать для выделения или культивирования мезенхимальных стволовых клеток выстилки пуповины среду DMEM в конечной концентрации приблизительно от 55 до 65% (об./об.), F12 в конечной концентрации, приблизительно от 5 до 15% (об./об.), М171 в конечной концентрации от приблизительно 15 до 30% (об./об.) и ФБС в конечной концентрации от приблизительно 1 до 8% (об./об.). Используемое здесь значение "% (об./об.)" относится к объему отдельного компонента относительно конечного объема культуральной среды. Это означает, что, если DMEM, например, присутствует в культуральной среде, в конечной концентрации приблизительно от 55 до 65% (об./об.), 1 литр культуральной среды содержит приблизительно от 550 до 650 мл DMEM.
В других вариантах реализации культуральная среда может содержать DMEM в конечной концентрации приблизительно от 57,5 до 62,5% (об./об.), F12 в конечной концентрации приблизительно от 7,5 до 12,5% (об./об.), М171 в конечной концентрации приблизительно от 17,5 до 25,0% (об./об.) и ФБС в конечной концентрации от 1,75 до 3,5% (об./об.). В других вариантах реализации культуральная среда может содержать DMEM в конечной концентрации приблизительно 61,8% (об./об.), F12 в конечной концентрации приблизительно 11,8% (об./об.), М171 в конечной концентрации приблизительно 23,6% (об./об.) и ФБС в конечной концентрации приблизительно 2,5% (об./об.).
В дополнение к вышеупомянутым компонентам культуральная среда может содержать добавки, которые полезны для мезенхимальных стволовых клеток выстилки пуповины. Культуральная среда по настоящему изобретению может, например, содержать эпидермальный фактор роста (EGF). Если EGF присутствует в культуральной среде, он может быть в конечной концентрации от приблизительно 1 нг/мл до приблизительно 20 нг/мл. В некоторых из этих вариантов реализации культуральная среда может содержать EGF в конечной концентрации приблизительно 10 нг/мл.
Культуральная среда по настоящему изобретению также может содержать инсулин. Если инсулин присутствует, его конечная концентрация может быть приблизительно от 1 мкг/мл до 10 мкг/мл. В некоторых из этих вариантов реализации культуральная среда может содержать инсулин в конечной концентрации приблизительно 5 мкг/мл.
Культуральная среда может дополнительно содержать по меньшей мере одну из следующих добавок: аденин, гидрокортизон и натриевую соль 3,3',5-трийодо-L-тиронина (Т3). В таких вариантах реализации культуральная среда может содержать все три из этих добавок: аденин, гидрокортизон и натриевую соль 3,3',5-трийодо-L-тиронина (Т3). В этих вариантах реализации культуральная среда может содержать аденин в конечной концентрации от приблизительно 0,05 до приблизительно 0,1 мкг/мл, аденин, гидрокортизон в конечной концентрации от приблизительно 1 до приблизительно 10 мкг/мл, гидрокортизон и/или натриевую соль 3,3',5-трийодо-L-тиронина (Т3) в конечной концентрации от приблизительно 0,5 до приблизительно 5 нг/мл.
В способе по изобретению ткань пуповины можно культивировать до тех пор, пока из ткани не вырастет подходящее количество (первичных) мезенхимальных стволовых клеток выстилки. В типичных вариантах реализации ткань пуповины культивируют до тех пор, пока разрастание клеток мезенхимальных стволовых клеток амниотической мембраны не достигнет конфлюентности приблизительно 70-80%. Следует отметить, что термин "конфлюентность" используется в его обычном значении в области культивирования клеток и понимается как оценка/индикатор количества адгезивных клеток в культуральной чашке или колбе, которая обозначает долю поверхности, покрытую клетками. Например, 50-процентная конфлюентность означает, что покрыта приблизительно половина поверхности, и все еще есть место для роста клеток. 100-процентная конфлюентность означает, что поверхность полностью покрыта клетками, и клеткам больше не остается места для роста в виде монослоя.
После того как из ткани выстилки пуповины путем эксплантации ткани было получено требуемое количество первичных клеток (мезенхимальных стволовых клеток выстилки), мезенхимальные стволовые клетки извлекали из контейнера для культивирования, используемого для культивирования. Таким образом может быть получен главный клеточный банк, содержащий (первичные) выделенные мезенхимальные стволовые клетки амниотической мембраны. Как правило, поскольку мезенхимальные стволовые клетки представляют собой адгезивные клетки, извлечение проводят с применением стандартной ферментативной обработки. Например, ферментативная обработка может включать обработку трипсином, как описано в международной заявке на патент США 2006/0078993, международной заявке на патент WO 2006/019357 или международной заявке на патент WO 2007/046775, что означает, что отросшие клетки можно собирать путем трипсинизации (0,125% трипсина/0,05% ЭДТА) для дальнейшего размножения. Если собранные мезенхимальные стволовые клетки применяют, например, для создания главного клеточного банка, клетки также можно криоконсервировать и сохранять для дальнейшего использования, как объяснено ниже в настоящей заявке.
6
6
6
После сбора мезенхимальные стволовые клетки можно перенести в контейнер для культивирования для субкультивирования. Субкультивирование также можно начать из замороженных первичных клеток, то есть из главного клеточного банка. Для субкультивирования можно высевать любое подходящее количество клеток в контейнер для культивирования, например в планшет для культивирования клеток. Для этого мезенхимальные клетки можно суспендировать в подходящей среде (наиболее удобно, в культуральной среде по настоящему изобретению) для субкультивирования при концентрации, например, от приблизительно 0,5×10 клеток/мл до приблизительно 5,0×10 клеток./мл. В одном варианте реализации клетки суспендируют для субкультивирования в концентрации приблизительно 1,0×10 клеток/мл. Субкультивирование может осуществляться путем культивирования либо в простых культуральных колбах, но также, например, в многослойной системе, такой как Cell Stacks (Corning, Корнинг, Нью-Йорк, США) или Cellfactory (Nunc, филиал Thermo Fisher Scientific Inc., Уолтэм, Массачусетс, США), которые можно укладывать в стопку в инкубаторы. В альтернативном варианте субкультивирование также может проводить в замкнутой автономной системе, такой как биореактор. Специалистам в данной области известны различные конструкции биореакторов, например, биореакторы с параллельными пластинами, полыми волокнами или микрожидкостные биореакторы. См., например, Sensebe et al. "Production of mesenchymal stromal/stem cells according to good manufacturing practices: a review", выше. Наглядным примером коммерчески доступного биореактора с полыми волокнами является система Quantum Cell Expansion System (Terumo BCT, Inc), которая применялась, например, для размножения мезенхимальных стволовых клеток костного мозга для клинических испытаний (ср., Hanley et al, Efficient Manufacturing of Therapeutic Mesenchymal Stromal Cells Using the Quantum Cell Expansion System, Cytotherapy. 2014 August; 16(8): 1048-1058). Другим примером коммерчески доступных биореакторов, которые можно применять для субкультивирования популяции мезенхимальных стволовых клеток по настоящему изобретению, является система Xuri Cell Expansion System, производимая GE Heathcare. Культивирование популяции мезенхимальных стволовых клеток в автоматизированной системе, такой как Quantum Cell Expansion System, имеет особое преимущество, если рабочий банк клеток для терапевтического применения должен быть произведен в условиях GMP и требуется большое количество клеток.
2
Субкультивирование мезенхимальных стволовых клеток по изобретению осуществляется в культуральной среде по настоящему изобретению. Соответственно, культуральную среду по настоящему изобретению можно применять как для выделения мезенхимальных стволовых клеток из амниотической мембраны, так и для последующего культивирования выделенных первичных клеток путем субкультивирования. Также для субкультивирования мезенхимальные стволовые клетки можно культивировать до тех пор, пока не вырастет необходимое количество клеток. В иллюстративных вариантах реализации мезенхимальные стволовые клетки субкультивируют до тех пор, пока мезенхимальные стволовые клетки не достигнут конфлюентности от приблизительно 70 до приблизительно 80%. Выделение/культивирование популяции мезенхимальных стволовых клеток выстилки можно проводить в стандартных условиях для культивирования клеток млекопитающих. Как правило, способ выделения популяции мезенхимальных стволовых клеток выстилки согласно изобретению обычно осуществляют в условиях (температура, атмосфера), которые обычно применяют для культивирования клеток тех видов, из которых эти клетки получены. Например, ткани пуповины человека и мезенхимальные стволовые клетки выстилки, соответственно, обычно культивируют при 37°С в воздушной атмосфере с 5% СО. В этом контексте следует отметить, что в настоящем изобретении мезенхимальные клетки могут быть получены из любых видов млекопитающих, таких как мышь, крыса, морская свинка, кролик, коза, лошадь, собака, кошка, овца, обезьяна или человек, причем в одном варианте реализации предпочтительными являются мезенхимальные стволовые клетки человеческого происхождения.
После того как из субкультуры получено желаемое/достаточное количество мезенхимальных стволовых клеток выстилки, мезенхимальные стволовые клетки собирают, извлекая их из контейнера для культивирования, применяемого для субкультивирования. Сбор мезенхимальных стволовых клеток обычно проводят снова ферментативной обработкой, включая трипсинизацию клеток. Выделенные мезенхимальные стволовые клетки впоследствии собирают и либо непосредственно используют, либо сохраняют для дальнейшего использования. Как правило, сохранение осуществляется путем криоконсервации. Термин "криоконсервация" используется здесь в его обычном значении для описания процесса, при котором мезенхимальные стволовые клетки сохраняют путем охлаждения до низких минусовых температур, таких как (обычно) -80°С или -196°С (температура кипения жидкого азота). Криоконсервацию можно проводить, как известно специалисту в данной области, и она может включать применение криопротекторов, таких как диметилсульфоксид (ДМСО) или глицерин, которые замедляют образование кристаллов льда в клетках пуповины.
Выделенная популяция мезенхимальных стволовых клеток выстилки, полученная способом выделения по настоящему изобретению, является в хорошо определенной и однородной. В типичных вариантах реализации способа по меньшей мере приблизительно 90% или более, приблизительно 91% или более, приблизительно 92% или более, приблизительно 92% или более, приблизительно 93% или более, приблизительно 94% или более, приблизительно 95% или более, приблизительно 96% или более, приблизительно 97% или более, приблизительно 98% или более, приблизительно 99% или более выделенных мезенхимальных стволовых клеток экспрессируют следующие маркеры: CD73, CD90 и CD 105. Кроме того, в этих вариантах реализации по меньшей мере приблизительно 90% или более, приблизительно 91% или более, приблизительно 92% или более, приблизительно 92% или более, приблизительно 93% или более, приблизительно 94% или более, приблизительно 95% или более, приблизительно 96% или более, приблизительно 97% или более, приблизительно 98% или более, приблизительно 99% или более выделенных мезенхимальных стволовых клеток могут быть лишены экспрессии следующих маркеров: CD34, CD45 и HLA-DR. В конкретных вариантах реализации приблизительно 97% или более, приблизительно 98% или более или приблизительно 99% или более популяции выделенных мезенхимальных стволовых клеток экспрессируют CD73, CD90 и CD105, при этом лишены экспрессии CD34, CD45 и HLA-DR.
+
+
+
Таким образом, в соответствии с приведенным выше описанием настоящее изобретение также относится к популяции мезенхимальных стволовых клеток, выделенных из амниотической мембраны пуповины, причем по меньшей мере приблизительно 90% или более клеток этой популяции стволовых клеток экспрессируют каждый из следующих маркеров: CD73, CD90 и CD105. В предпочтительных вариантах реализации по меньшей мере приблизительно 91% или более, приблизительно 92% или более, приблизительно 92% или более, приблизительно 93% или более, приблизительно 94% или более, приблизительно 95% или более, приблизительно 96% или более, приблизительно 97% или более, приблизительно 98% или более, приблизительно 99% или более клеток выделенной популяции мезенхимальных стволовых клеток являются CD73, CD90 и CD105, то есть этот процент выделенной популяции клеток экспрессирует каждый из CD73, CD90 и CD105 (см. раздел "Экспериментальные примеры" настоящей заявки). Кроме того, по меньшей мере приблизительно 90% или более, приблизительно 91% или более, приблизительно 92% или более, приблизительно 92% или более, приблизительно 93% или более, приблизительно 94% или более, приблизительно 95% или более, приблизительно 96% или более, приблизительно 97% или более, приблизительно 98% или более, приблизительно 99% или более выделенных мезенхимальных стволовых клеток, могут быть лишены экспрессии следующих маркеров. В конкретных вариантах реализации приблизительно 97% или более, приблизительно 98% или более или приблизительно 99% или более из выделенной популяции мезенхимальных стволовых клеток экспрессируют CD73, CD90 и CD105, в то же время не экспрессируя CD34, CD45 и HLA-DR. Такая высоко однородная популяция мезенхимальных стволовых клеток, полученных из амниотической мембраны пуповины, описана здесь впервые, и она соответствует критериям для применения мезенхимальных стволовых клеток для клеточной терапии (также см. раздел "Экспериментальные примеры" и, например, Sensebe et al. "Production of mesenchymal stromal/stem cells according to good manufacturing practices: a review", см. выше). В этом контексте следует отметить, что эта популяция мезенхимальных стволовых клеток может быть получена способом выделения по настоящему изобретению, но также и другим способом, таким как сортировка клеток, при желании.
В соответствии с вышеизложенным настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей популяцию мезенхимальных стволовых клеток, выделенную из амниотической мембраны пуповины, в которой по меньшей мере приблизительно 90% или более клеток популяции стволовых клеток экспрессируют каждый из следующих маркеров: CD73, CD90 и CD105 и, необязательно, лишены экспрессии CD34, CD45 и HLA-DR. Фармацевтическая композиция может содержать любое фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество и может быть составлена для любого желаемого фармацевтического способа введения. Фармацевтическая композиция может, например, быть адаптирована для системного или местного применения.
В следующем аспекте изобретение относится к способу приготовления культуральной среды для выделения, включающему смешивание следующих компонентов до получения конечного объема 500 мл культуральной среды:
i. 250 мл DMEM
ii. 118 мл М171
iii. 118 мл DMEM/F12
iv. 12,5 мл фетальной бычьей сыворотки (ФБС) до получения конечной концентрации 2,5% (об./об.).
Как объяснялось выше, среда DMEM/F12 представляет собой смесь 1:1 среды DMEM и среды Хэма F-12. Таким образом, 118 мл среды DMEM/F12 содержат 59 мл DMEM и 59 мл F12. Соответственно, при применении этого способа приготовления культуральной среды конечные концентрации (об./об.) при общем объеме 500 мл являются следующими:
DMEM: 250 мл + 59 мл = 309 мл, соответствует 309/500=61,8% (об./об.)
М171: 118 мл, соответствует 118/500=23,6% (об./об.)
F12: 59 мл, соответствует 59/500=11,8% (об./об.).
Варианты реализации этого способа приготовления культуральной среды дополнительно включают добавление
v. 1 мл исходного раствора EGF (5 мкг/мл) для получения конечной концентрации EGF 10 нг/мл, и
vi. 0,175 мл исходного раствора инсулина (14,28 мг/мл) для получения конечной концентрации инсулина 5 мкг/мл.
Следует отметить, что в этих вариантах реализации вышеупомянутые объемы этих компонентов i.-vi, в результате дают конечный объем 499,675 мл культуральной среды. Если в культуральную среду не добавляются никакие дополнительные компоненты, оставшиеся 0,325 мл (для достижения суммарного объема 500 мл) могут, например, быть любым из компонентов i-iv, то есть DMEM, М171, DMEM/F12, либо ФБС. В альтернативном варианте, концентрацию исходного раствора EGF или инсулина, конечно, можно отрегулировать таким образом, чтобы общий объем культуральной среды составлял 500 мл. Кроме того, также следует отметить, что компоненты i.-iv. не обязательно добавлять в том порядке, в котором они перечислены, но, конечно, можно также применять любой порядок для смешивания этих компонентов, чтобы получить питательную среду по настоящему изобретению. Это означает, что, например, M171 и DMEM/F12 могут быть смешаны вместе и затем объединены с DMEM и ФБС для достижения конечных концентраций, как описано здесь, то есть конечной концентрации DMEM приблизительно от 55 до 65% (об./об.), конечной концентрации F12 приблизительно от 5 до 15% (об./об.), конечной концентрации М171 приблизительно от 15 до 30% (об./об.) и конечной концентрации ФБС приблизительно от 1 до 8% (об./об.).
В других вариантах реализации способ дополнительно включает добавление к DMEM объема 0,325 мл одной или нескольких следующих добавок: аденина, гидрокортизона, натриевой соли 3,3',5-трийодо-L-тиронина (Т3), тем самым получая общий объем 500 мл культуральной среды. В этих вариантах реализации конечная концентрация этих добавок в DMEM может быть следующей:
от приблизительно 0,05 до 0,1 мкг/мл аденина, например приблизительно 0,025 мкг/мл аденина,
от 1 до 10 мкг/мл гидрокортизона,
приблизительно от 0,5 до 5 нг/мл натриевой соли 3,3',5-трийодо-L-тиронина (Т3), например 1,36 нг/мл натриевой соли 3,3',5-трийодо-L-тиронина (Т3).
В соответствии с приведенным выше описанием изобретение также относится к клеточной культуральной среде, которая может быть получена или которую получают способом приготовления среды, описанным здесь.
Кроме того, изобретение также относится к способу выделения мезенхимальных стволовых клеток из амниотической мембраны пуповины, причем этот способ включает культивирование ткани амниотической мембраны в культуральной среде, полученной способом, описанным здесь.
Таким образом, настоящее изобретение также относится к клеточной культуральной среде, содержащей:
- DMEM в конечной концентрации приблизительно от 55 до 65% (об./об.),
- F12 в конечной концентрации приблизительно от 5 до 15% (об./об.),
- М171 в конечной концентрации приблизительно от 15 до 30% (об./об.) И
- ФБС в конечной концентрации приблизительно от 1 до 8% (об./Об).
В некоторых вариантах реализации культуральной среды, описанной здесь, среда содержит DMEM в конечной концентрации приблизительно от 57,5 до 62,5% (об./об.), F12 в конечной концентрации приблизительно от 7,5 до 12,5% (об./об.), М171 в конечной концентрации приблизительно от 17,5 до 25,0% (об./об.) и ФБС в конечной концентрации от приблизительно 1,75 до 3,5% (об./об.). В других вариантах реализации культуральная среда может содержать DMEM в конечной концентрации приблизительно 61,8% (об./об.), F12 в конечной концентрации приблизительно 11,8% (об./об.), М171 в конечной концентрации приблизительно 23,6% (об./об.) v) и ФБС в конечной концентрации приблизительно 2,5% (об./об.).
Кроме того, культуральная среда может дополнительно содержать эпидермальный фактор роста (EGF) в конечной концентрации от приблизительно 1 нг/мл до приблизительно 20 нг/мл. В определенных вариантах реализации культуральная среда содержит EGF в конечной концентрации приблизительно 10 нг/мл. Культуральная среда, описанная в настоящей заявке, может дополнительно содержать инсулин в конечной концентрации от приблизительно 1 мкг/мл до 10 мкг/мл. В таких вариантах реализации культуральная среда может содержать инсулин в конечной концентрации приблизительно 5 мкг/мл.
Клеточная культуральная среда по настоящему изобретению может дополнительно содержать по меньшей мере одну из следующих добавок: аденин, гидрокортизон и натриевую соль 3,3',5-трийодо-L-тиронина (Т3). В некоторых вариантах реализации культуральная среда включает все три из из следующих добавок: аденин, гидрокортизон и натриевую соль 3,3',5-трийодо-L-тиронина (Т3). При наличии этих добавок культуральная среда может содержать аденин в конечной концентрации от приблизительно 0,01 до приблизительно 0,1 мкг/мл аденина или от приблизительно 0,05 до приблизительно 0,1 мкг/мл аденина, гидрокортизон в конечной концентрации от приблизительно 0,1 до приблизительно 10 мкг/мл гидрокортизона или от приблизительно 1 до приблизительно 10 мкг/мл гидрокортизона и/или натриевую соль 3,3',5-трийодо-L-тиронина (Т3) в конечной концентрации от приблизительно 0,5 до приблизительно 5 нг/мл/мл.
В вариантах реализации клеточной культуральной среды 500 мл клеточной культуральной среды по настоящему изобретению содержат:
i. 250 мл DMEM
ii. 118 мл М171
iii. 118 мл DMEM/F12
iv. 12,5 мл фетальной бычьей сыворотки (ФБС) до получения конечной концентрации 2,5%
В других вариантах реализации клеточная культуральная среда может дополнительно содержать
v. EGF в конечной концентрации 10 нг/мл, и
vi. инсулин в конечной концентрации 5 мг/мл.
Как инсулин, так и EGF могут быть добавлены к культуральной среде с применением исходного раствора по выбору, так чтобы общий объем культуральной среды не превышал 500 мл.
В конкретном примере компоненты i.-vi. культуральной среды по настоящему изобретению представляют собой компоненты, указанные на Фиг. 5, то есть они получены от соответствующих производителей с использованием номера по каталогу, указанного на Фиг. 5. Среда, полученная в результате смешивания компонентов i. vi., как указано на Фиг. 5, также обозначается здесь как "РТТ-6". В этом контексте снова следует отметить, что при изготовлении среды по настоящему изобретению могут быть использованы компоненты i.-vi., а также любой другой ингредиент, такой как антибиотик, от любого другого коммерческого поставщика,.
Кроме того, клеточная культуральная среда по изобретению может содержать аденин в конечной концентрации от приблизительно 0,01 до приблизительно 0,1 мкг/мл аденина или от приблизительно 0,05 до приблизительно 0,1 мкг/мл аденина, гидрокортизон в конечной концентрации от приблизительно 0,1 до 10 мкг./мл, от приблизительно 0,5 до приблизительно 10 мкг/мл или от приблизительно 1 до приблизительно 10 мкг/мл гидрокортизона и/или натриевую соль 3,3',5-трийодо-L-тиронина (Т3) в конечной концентрации приблизительно 0,1 до приблизительно 5 нг/мл или от приблизительно 0,5 до приблизительно 5 нг/мл.
Наконец, изобретение также относится к способу лечения пациента с заболеванием, включающему введение пациенту мезенхимальных стволовых клеток выстилки или фармацевтической композиции, содержащей стволовые клетки, описанные здесь. Это заболевание может представлять собой любое заболевание, описанное выше. Для лечения субъекта популяцию мезенхимальных стволовых клеток по изобретению можно вводить любым подходящим способом, например, включая, среди прочего, местное введение, введение путем имплантации или инъекции. Такая популяция стволовых клеток, например, может быть помещена непосредственно на рану, например на ожоговую или диабетическую рану (см. международную заявку на патент WO 2007/046775). В альтернативном варианте, популяция стволовых клеток также может быть имплантирована подкожно, например, непосредственно под кожу, в жировые отложения или брюшину.
Изобретение будет далее проиллюстрировано следующими неограничивающими экспериментальными примерами.
Экспериментальные примеры
1. Криоконсервация ткани пуповины до выделения мезенхимальных стволовых клеток
Ткань пуповины (пуповина была предоставлена с информированным согласием матери-донора) обрабатывали для последующего выделения мезенхимальных стволовых клеток из амниотической мембраны пуповины следующим образом.
1.1 Промывка образца ткани пуповины:
a. Извлекают скальпели из защитного чехла.
b. Надежно удерживают пуповину с помощью щипцов и вырезают из нее кусок длиной 10 см с помощью скальпеля. Помещают неиспользуемую пуповину обратно в исходную чашку для тканей.
c. Помещают кусок пуповины длиной 10 см в новую 150-миллиметровую культуральную чашку. Вместо чашек может быть использована 150-миллиметровая чашка для культивирования.
d. В качестве места для временного хранения для щипцов и скальпеля используют крышку 150 мм чашки для культивирования.
e. Извлекают 25 мл Плазмалита A (Baxter, № по каталогу 2B2543Q) с помощью шприца на 30 мл. Удерживая шприц одной рукой под углом 45°, наносят Плазмалит А непосредственно на ткань пуповины.
f. Удерживая чашку для культивирования под небольшим углом, удаляют Плазмалит А с помощью шприца на 30 мл и тупой иглы.
g. Собирают использованный Плазмалит А в пакет для переноса объемом 300 мл, который служит контейнером для отходов, и утилизируют е его в контейнере биологической опасности.
h. Повторяют процедуру промывки, при необходимости используя новую чашку для культивирования для каждой промывки. Обеспечивают удаление всех сгустков крови на поверхности. При необходимости можно использовать больше Плазмалита А для очистки тканей.
i. Помещают ткань в новую маркированную чашку для культивирования ткани, чтобы продолжить разрезание ткани. Помещают 20 мл Плазмалита А в чашку, чтобы ткань не высохла во время разрезания.
j. Разрезают пуповину на равные приблизительно 1-сантиметровые сегменты, в результате чего получают 10 сегментов.
k. Далее разрезают каждый 1-сантиметровый сегмент на более мелкие кусочки размером приблизительно от 0,3 см × 0,3 см до 0,5 см × 0,5 см на сегмент.
l. Удаляют весь Плазмалит А, которые был в чашке.
m. Извлекают 25 мл Плазмалита А с помощью шприца на 30 мл из оригинального пакета с Плазмалитом А и распределяют его непосредственно по кусочкам ткани пуповины.
n. Удерживают чашку для культивирования под углом, чтобы собрать весь Плазмалит А, используемый для промывки ткани, на одной стороне, и удаляют его ее с помощью шприца и тупой иглы.
о. Повторяют промывку еще раз. Не должно оставаться никаких сгустков крови.
ПРИМЕЧАНИЕ. Если пуповину не замораживают сразу, ткань пуповины хранят в Плазмалите А до готовности к замораживанию.
1.2 Криоконсервация ткани пуповины:
a. Готовят криоконсервационный раствор::
i. Готовят 50 мл раствора для замораживания, состоящего из 60% Плазмалита А, 30% 5%-го человеческого сывороточного альбумина и 10% диметилсульфоксида (ДМСО).
ii. Маркируют 150 мл пакет для переноса "Раствор для замораживания ткани" и подсоединяют набор для переноса плазмы к порту, используя асептический метод.
iii Извлекают 30 мл Плазмалита А с помощью шприца 30 мл из оригинального пакета Плазмалита А и переносят его в пакет для переноса с меткой "Раствор для замораживания ткани" с указанием времени и даты приготовления.
iv. Извлекают 15 мл 5% человеческого сывороточного альбумина с помощью 20 мл шприца и переносят его в помеченный пакет для переноса.
v. Добавляют в пакет для переноса 5 мл ДМСО.
vi. Тщательно перемешивают и записывают смешивание раствора для замораживания
b. Удаляют Плазмалит А из ткани перед добавлением раствора для замораживания.
c. Используя 60 мл шприц, забирают все 50 мл раствора для замораживания в шприц и добавляют приблизительно 30 мл раствора для замораживания в 150-миллиметровую чашку для культивирования клеток, содержащую ткань пуповины. Устанавливают тупую иглу на шприц, чтобы он был стерильным.
d. Взбалтывают чашку для культивирования, содержащую ткань и замораживающий раствор, раз в минуту в течение 10 минут.
e. Используя щипцы, выбирают 8 случайно выбранных отрезанных сегментов и поместите их в каждую из четырех криопробирок на 4 мл. Выбирают 4 случайно выбранных сегмента и помещают их в одну 1,8 мл криопробирку. На этих сегментах не должно быть сгустков крови.
f. Заполняют каждую криопробирку, содержащую ткань пуповины, оставшимся раствором для замораживания до линии наполнения 3,6 мл для пробирок объемом 4 мл и линии 1,8 мл для флакона Nunc объемом 1,8 мл.
g. Маркируют одну бутылку Bactec Lytic/10 - Anaerobic/F и одну бутылку Bactec Plus Aerobic/F идентификатором ткани.
h. Удаляют 20 мл раствора для замораживания из чашки для культивирования с помощью шприца и тупой иглы, после этого протирают флаконы Bactec спиртовым тампоном, заменяют тупую иглу на иглу калибра 18g и инокулируют аэробные и анаэробные флаконы Bactec по 10 мл каждый.
i. Запускают морозильную камеру с регулируемой скоростью.
j. После завершения заморозки с регулируемой скоростью помещают пробирки в морозильную камеру с жидким азотом с непрерывным контролем температуры до дальнейшего использования.
2. Выделение мезенхимальных стволовых клеток выстилки из ткани пуповины
2.1. Приготовление среды для обработки MSC из ткани пуповины:
а. Для приготовления 500 мл РТТ6 (культуральной/ростовой среды) добавляют следующие компоненты в указанном порядке:
i. DMEM, 250 мл
ii. М171, 118 мл
iii. DMEM F12, 118 мл
iv. ФБС, 12,5 мл (конечная концентрация 2,5%)
v. EGF, 1 мл (конечная концентрация 10 нг/мл)
vi. Инсулин, 0,175 мл (конечная концентрация 5 мкг/мл))
Вышеупомянутые объемы компонентов i.- vi в результате дают суммарный конечный объем 499,675 мл культуральной среды. Если в культуральную среду не добавляются никакие дополнительные компоненты, оставшиеся 0,325 мл (для достижения суммарного объема 500 мл) могут, например, быть любым из компонентов i-iv, то есть DMEM, М171, DMEM/F12, либо ФБС. В альтернативном варианте, концентрацию исходного раствора EGF или инсулина, конечно, можно отрегулировать таким образом, чтобы общий объем культуральной среды составлял 500 мл. В альтернативном варианте, можно добавить исходный раствор антибиотика, такого как пенициллин-стрептомицин-амфотерицин, чтобы получить конечный объем 500 мл. Также можно добавить в культуральную среду 0,325 мл одной или нескольких следующих добавок: аденин, гидрокортизон, натриевая соль 3,3',5-трийодо-L-тиронина (Т3), тем самым получая общий объем культуральной среды 500 мл.
vii. Маркируют бутылку "РТТ6" с датой приготовления среды, инициалом оператора, фразой "срок годности истекает" и датой истечения срока годности. Дата истечения срока действия - это наиболее ранняя дата истечения срока действия любого компонента или 1 месяц с даты приготовления, в зависимости от того, что наступит раньше.
b. Чтобы приготовить среду для промывки (забуференный солевой раствор Хэнка (HBSS) без кальция или магния и с 5% ФБС), добавляют 2,5 мл ФБС к 47,5 мл HBSS в центрифужной пробирке на 50 мл. Маркируют пробирку "Среда для промывки" с инициалами оператора и датой приготовления среды.
c. Все среды будут протестированы на стерильность с использованием бутылок Bactec Lytic/10 - Anaerobic/F (Becton Dickinson & Company) и Bactec Pluc+Aerobic/F (Becton Dickinson & Company). Вводят 20 мл приготовленной среды в каждую бутылку.
2.2 Размораживание ткани пуповины для сбора MSC:
a. Размораживание начинают, После того как оператор будет готов обработать образец в чистой комнате. Не допускается размораживать более 1 флакона за раз, кроме случаев, когда флаконы происходят от одного и того же донора.
b. Протирают водяную баню дезинфицирующим средством, а затем 70%-ным изопропанолом и заполняют ее 1 л стерильной воды. Нагревают водяную баню до 36-38°С.
c. Готовят 10 мл среды для промывки, состоящей из 70-90% Плазмалита А, в чистой комнате в боксе биологической безопасности. Стерильно отфильтровывают раствор с помощью шприцевого фильтра 0,2 мкм, прикрепленного к 10 мл шприцу, и хранят раствор в холодильнике до использования.
d. Помещают этикетку для обработки на 50 мл коническую пробирку.
e. Следят, чтобы температура водяной бани составляла 36-38°С.
f. Берут пробирку с тканями из хранилища с жидким азотом и быстро размораживают в водяной бане при 37°С, наполненной 1 л стерильной воды. Держатель флаконов для морозильного контейнера Mr. Frosty Nalgene Cryo 1°C плавает с установленными флаконами и может использоваться в качестве плавающего держателя при размораживании образцов.
g. Извлекают флакон из водяной бани и опрыскивают 70% раствором изопропанола. Рекомендуется вынимать флакон из водяной бани, когда в нем видно немного плавающего льда в качестве подтверждения, что внутренняя температура флакона составляет менее 37°С.
h. Помещают флакон в передаточное окно и предупреждают техника по обработке чистой комнаты.
2.3 Подготовка к обработке ткани:
a. Обработка ткани пуповины должна проводиться в чистой комнате с контролем окружающей среды (ЕМ). В конце каждой смены проводят полную очистку помещения и вытяжки.
b. Готовят/очищают бокс биологической безопасности.
c. Выполняют подсчет жизнеспособных частиц, работая в боксе биобезопасности.
d. Собирают все необходимые материалы в боксе биобезопасности, проверяя каждый на предмет повреждений упаковки и срока годности. При работе со шприцами, серологическими пипетками, стерильными щипцами, скальпелями, тканевыми планшетами и иглами следят за тем, чтобы не прикасаться ни к какой поверхности, которая соприкасается со стерильным продуктом. Безопасно может прикасаться к только к внешней стороне цилиндра шприца, трубки, наконечника плунжера и/или колпачка или канюли иглы. Использование материалов, если к поверхности прикасались, или они коснулись нестерильной поверхности, не допускается.
e. Записывают номера партий и сроки годности (если применимо) всех используемых реагентов и расходных материалов.
f. Получают оттаявшую пробирку, перед переносом в бокс биологической безопасности очистив ее безворсовой салфеткой, смоченной 70% спиртом.
g. Используя аспирационную иглу со шприцем, извлекают как можно больше жидкости из флакона. Избегают засасывания ткани.
h. Используя стерильные щипцы, переносят ткань в стерильную чашку Петри размером 100 мм.
i. Добавляют аликвоту 5 мл промывочной среды на фрагменты ткани.
j. Взбалтывают содержимое в течение 15-30 секунд, затем удаляют промывочную среду пипеткой или шприцем с помощью аспирационной иглы. Повторяют этот процесс промывания дважды.
k. Добавляют к ткани 2 мл промывочной среды, чтобы избежать высыхания ткани.
2.4. Инициирование разрастания MSC из ткани:
a. Маркируют дно 6-луночного планшета "Разрастание 1" номером партии MSC или идентификатором ткани пуповины и датой начала роста. Если используется 60 мм чашка для культивирования ткани, планшет делят на 4 квадранта, нарисовав сетку на дне чашки.
b. Используя стерильные одноразовые щипцы, помещают по одному кусочку ткани размером от 3 × 3 мм до 5 × 5 мм в каждую лунку. Если используется 60 мм чашка для культивирования ткани, помещают ткань в середину каждого квадранта, чтобы отделить ткани друг от друга (на расстоянии более 1 см друг от друга).
c. Заполняют каждую лунку 3 мл РТТ6.
d. Используя аспирационную иглу, присоединенную к шприцу на 30 мл, извлекают достаточное количество среды, чтобы едва покрыть ткань. Не наклоняйте планшет. Не прикасайтесь к дну лунки аспирационной иглой.
e. Используя инвертированный световой микроскоп, ежедневно наблюдают за ростом клеток (24±6 часов). Вместо светового микроскопа можно использовать систему визуализации культуры клеток в реальном времени.
f. Меняют среду каждый день. Перед использованием среду обязательно уравновешивают до комнатной температуры.
i. Аспирируют среду.
ii. Добавляют 3 мл РТТ6.
iii. Аспирируют, пока ткань не будет едва погруженной в среду.
g. Когда наблюдается клеточный рост из ткани, пересаживают ткань в новый 6-луночный планшет, используя ту же процедуру, что и в пунктах 4.а-4.е выше, за исключением того, что планшет маркируют " Разрастание 2". Поддерживают разрастание клеток в планшете "Разрастание 1", добавив 2 мл РТТ6 в каждую лунку. Отслеживают конфлюентность каждый день. Заменяют среду каждые 2-3 дня (перед использованием обязательно уравновешивают среду до комнатной температуры).
h. Когда на планшете "Разрастание 2" наблюдается рост клеток, повторяют шаги 4.а-4.е, за исключением того, что планшет маркируют "Разрастание 3.". Поддерживают рост клеток на планшете "Разрастание 2", добавив 2 мл РТТ6 в каждую лунку. Отслеживают конфлюентность каждый день. Заменяют среду каждые 2-3 дня (перед использованием обязательно уравновешивают среду до комнатной температуры).
i. Когда на планшете "Разрастание 3" наблюдается рост, ткань выбрасывают. Если кусочки ткани очень маленькие и, по-видимому, не мешают росту клеток, ткань утилизируют при субкультивировании.
j. Когда клетки достигают конфлюентности 40-50%, контролируют клетки каждый день, чтобы предотвратить чрезмерное размножение.
k. Когда клетки достигают конфлюентности 70-80%, клетки пересевают.Не позволяют клеткам расширяться за пределы 80% конфлюентности.
2
2
При размере эксплантов ткани приблизительно 1-3 мм, и выполнении эксплантации ткани/клеточной культуры в чашке для культивирования размером 175 мм, среднее количество мезенхимальных стволовых клеток, собранных из эксплантата, обычно составляет приблизительно 4000-6000 клеток/эксплантат. Соответственно, когда мезенхимальные стволовые клетки выращиваются одновременно из 48 эксплантов, при сборе можно получить приблизительно 300000 клеток. Эти 300000 мезенхимальных стволовых клеток, собранных из эксплантов, можно затем использовать для субкультивирования путем засева колбы для культивирования клеток объемом 175 см этими 300000 клеток, как описано в следующем примере 2.5 (это можно назвать "Пассаж 1!). Мезенхимальные стволовые клетки, полученные из этого пассажа 1, затем можно использовать для повторного засева колб объемом 175 см (Пассаж 2) и размножения клеток, как описано в следующем примере 2.5. Клетки, полученные как в Пассаже 1, так и в Пассаже 2, могут быть "занесены в банк" путем криоконсервации, при этом считается, что мезенхимальные стволовые клетки, полученные после Пассажа 2, представляют Главный клеточный банк, который будет использоваться для дальнейшего размножения мезенхимальных стволовых клеток, например, в биореакторе, как описано ниже в примере 2.7.
2.5. Субкультура MSC в чашках для культивирования клеток
a. Получают жизнеспособные частицы работая в боксе биобезопасности. Перед использованием все среды уравновешивают до комнатной температуры.
b. Когда разрастание клеток достигает конфлюентности приблизительно 70-80%, субкультивируют клетки.
i. Удаляют РТТ6 из чашки Петри.
ii. Промывают средой HBSS без кальция или магния.
iii. Добавляют 0,2 мл IX TrypLE-ЭДТА и перемешивают в течение 1-2 минут.
iv. Наклоняют чашку на 30-45°, чтобы позволить клеткам сместиться под действием силы тяжести. Легкое постукивание по боку планшета ускоряет отрыв.
v. Добавляют 1 мл РТТ6. Осторожно пипетируют вверх и вниз, затем переносят клетки в центрифужную пробирку на 15 мл. Используют чистый наконечник пипетки для каждой лунки. Клетки из всех 6 лунок можно объединить в одну пробирку объемом 15 мл.
vi. Центрифугируют в течение 10 минут на 1200 об/мин.
vii. Удаляют супернатант и ресуспендируют клетки с 5 мл РТТ6.
c. Субкультивируют MSC
i. Аликвотируют 50 мкл клеточной суспензии и анализируют на TNC и жизнеспособность методом вытеснения трипанового синего.
ii. Подсчитывают клетки с использованием гемоцитометра. Ожидается результат 20-100 клеток/кв. Если этот количество выше 100, разводят исходный образец 1:5 и повторяют метод с трипановым синим, используя гемоцитометр.
iii. Подсчитывают количество жизнеспособных клеток/мл и общее количество жизнеспособных клеток:
4
1. Количество жизнеспособных клеток/мл = количество жизнеспособных клеток × коэффициент разведения × 10
4
2. Общее количество жизнеспособных клеток = количество жизнеспособных клеток × коэффициент разведения × общий объем × 10
iv. Рассчитывают % жизнеспособности:
1. % жизнеспособности = количество жизнеспособных клеток × 100/(количество жизнеспособных клеток + количество мертвых клеток)
6
v. Разводят клеточную суспензию до 1,0×10 клеток/мл.:
6
1. "X" объем = общее количество жизнеспособных клеток/10 клеток/мл
7
2. Например, если общее количество жизнеспособных клеток составляет 1,0×10;
7
6
3. "X" = 10/10 клеток/мл или 10 мл, следовательно, можно довести общий объем клеток до 10 мл, добавив 5 мл к суспензии клеток (то есть 5 мл).
6
6
2
vi. Если клеточная суспензия менее 10/мл, определяют объем, необходимый для посева 2×10 клеток на каждую 150 мм чашку Петри или колбу объемом 175 см.
6
6
1. Объем для 2×10 клеток=2×10 клеток ÷ количество жизнеспособных клеток/мл
5
6
5
2. Например, если количество жизнеспособных клеток/мл составляет 8×10 клеток/мл, необходимо 2×10 клеток ÷ 8×10 клеток/мл или 2,5 мл.
vii. Откладывают 0,5 мл для анализа маркеров MSC.
6
2
viii. Высевают 2×10 клеток в каждую 150 мм чашку Петри или колбу 175 см с 30 мл РТТ6.
ix. Наблюдают за клетками на предмет прикрепления, образования колоний и конфлюентности каждые три дня. Когда клетки достигают 40-50% конфлюентности, наблюдают клетки каждые один-два дня, чтобы предотвратить чрезмерное расширение. НЕ позволяют клеткам расширяться за пределы 80% конфлюентности. Вместо светового микроскопа можно использовать систему мониторинга культивирования клеток в реальном времени.
x. Заменяют среду каждые 2-3 дня.
2.6 Криоконсервация клеток MSC
a. Получают жизнеспособные частицы работая в боксе биобезопасности.
2
b. Когда клетки достигают 70-80% конфлюентности, отделяют клетки, используя 2 мл 1X TrypLE-ЭДТА на каждую 150 мм чашку Петри или колбу объемом 175 см.
i. Удаляют РТТ6 из чашки Петри.
ii. Промывают 5 мл HBSS или ФСБ без кальция или магния.
iii. Добавляют 2 мл 1X TrypLE-ЭДТА и взбалтывают в течение 1-2 минут.
iv. Наклоняют чашку на 30-45°, чтобы позволить клеткам сместиться под действием силы тяжести. Легкое постукивание по боку планшета ускоряет отрыв.
v. Добавляют 10 мл РТТ6 для инактивации TrypLE. Хорошо перемешивают, чтобы разделить комки клеток.
vi. Переносят клетки в центрифужную пробирку на 15 мл, используя пипетку Пастера.
vii. Центрифугируют в течение 10 минут на 1200 об/мин.
viii. Аспирируют среду и ресуспендируют с 10 мл РТТ6.
ix. Аликвотируют 50 мкл и определяют общее количество жизнеспособных клеток и % жизнеспособности, как указано выше. Подсчет клеток необходимо выполнить в течение 15 минут, так как клетки могут начать комковаться.
с. Приготовление клеток к криоконсервации
i. Готовят среду для суспензии клеток и криоконсервационную среду и замораживают клетки
2.7. Субкультивирование (размножение) MSC в биореакторе Quantum (Terumo ВТС, Inc.)
Для размножения MSC также можно использовать биореактор Quantum. Начальное число клеток для расширения в биореакторе Quantum должно составлять от 20 до 30 миллионов клеток на цикл. Типичная урожайность за цикл составляет от 300 до 700 миллионов MSC при сборе. Биореактор эксплуатируют в соответствии с протоколом производителя. Полученные таким образом мезенхимальные стволовые клетки обычно криоконсервируют (см. ниже) и используют в качестве рабочего банка клеток.
МАТЕРИАЛЫ/РЕАГЕНТЫ:
1. Набор для размножения Quantum
2. Пакет для отходов Quantum
3. Пакет для среды Quantum
4. Пакет для введения Quantum
5. РТТ6
6. ФСБ
7. Фибронектин
8. TrypLE
9. 3 мл шприц
10. Тест-полоски на глюкозу
11. Тест-полоски на лактат
12. 60 мл планшет для культивирования клеток или эквивалент
2
13. Газовая смесь 5% СО медицинского класса
14. Комбинированный наконечник 50 мл
ОБОРУДОВАНИЕ:
1. Бокс биобезопасности
2. Глюкометр (Bayer Healthcare/Ascensia Contour Blood Glucose Meter)
3. Лактат Плюс (Nova Biomedical)
4. Перистальтический насос с выходным патрубком
5. Центрифуга, Eppendorf 5810
6. Стерильный соединитель
7. М4 пипеточный дозатор
8. RF приспособление для заклеивания планшетов приспособление для заклеивания планшетов
ПРОЦЕДУРА:
1. Подготовка биореактора Quantum
a) Заправка биореактора Quantum
b) Покрытие биореактора:
1) Готовят раствор фибронектина в боксе биобезопасности.
1) Дают лиофилизированному фибронектину акклиматизироваться до комнатной температуры (≥15 мин при комнатной температуре)
2) Добавляют 5 мл стерильной дистиллированной воды; не взбалтывая и не перемешивая
3) Дают фибронектину перейти в раствор в течение 30 мин.
4) Используя 10 мл шприц с прикрепленный иглой 18g, переносят раствор фибронектина в пакет для ведения Ccell, содержащий 95 мл ФСБ.
2) Прикрепляют пакет к линии "реагента"
3) Проверяют наличие пузырьков (пузырьки можно удалить, используя режимы "Удалить воздух IC" или "Удалить воздух ЕС" и используя "Промывку" в качестве источника на входе.
4) Открывают или настраивают программу для нанесения покрытия на биореактор (Фиг. 1. Шаги 3-5)).
5) Запускают программу
6) Пока выполняется программа для нанесения покрытия на биореактор, готовят пакет с 4 л среды РТТ6.
7) Подсоединяют пакет со средой к линии IC Media с помощью стерильной соединительной трубки.
8) Когда стадии нанесения покрытия на биореактор завершены, отсоединяют мешок для введения клеток, используемый для раствора фибронектина, с помощью герметизирующего устройства RF.
c) Смывание избытка фибронектина
d) Кондиционирование биореактора средой
2. Культивирование клеток в биореакторе Quantum
a) Загрузка и прикрепление клеток с помощью унифицированной суспензии:
b) Питание и культивирование клеток
1) Выбирают расход среды для питания клеток.
2) Отбирают пробы на лактат и глюкозу каждый день.
3) Регулируют расход среды по мере увеличения уровня лактата. Фактическая максимальная переносимая концентрация лактата будет определяться культурой в колбе, из которой происходят клетки. Определяют, находится ли в пакете достаточное количество среды РТТ6. При необходимости заменяют пакет для среды РТТ6 на новый пакет для среды РТТ6.
4) Когда расход достигнет желаемого значения, измеряют уровень лактата каждые 8-12 часов. Если уровень лактата не снижается или уровень лактата продолжает увеличиваться, собирают клетки.
3. Сбор клеток из биореактора Quantum
a) Когда концентрация лактата не уменьшается, собирают клетки после отбора проб на лактат и глюкозу в последний раз.
b) Сбор клеток:
1) Подсоединяют пакет для введения клеток, заполненный 100 мл TrypLE, к линии "Реагент", с помощью стерильной соединительной трубки.
2) Убеждаются, что в пакете ФСБ достаточно ФСБ. Если нет, подсоединяют новый пакет с не менее 1,7 литра ФСБ к линии "Промывка" с помощью стерильной соединительной трубки.
3) Запускают программу сбора
4. Криоконсервация клеток
1) После сбора клетки переносят в центрифужную пробирку объемом 50 мл для осаждения клеток.
2) Ресуспендируют, используя 25 мл холодного раствора для суспендирования клеток. Подсчитывают количество клеток с помощью счетчика клеток Sysmex или Biorad. Прикрепляют отчет о количестве клеток к соответствующему протоколу на переработку серии Quantum.
7
3) Доводят концентрацию клеток до 2×10/мл
4) Добавляют раствор для криоконсервации в равном объеме и хорошо перемешивают (не встряхивайте и не перемешивайте на вортексе)
5) Используя микродозатор, добавляют 1 мл суспензии клеток в криоконсерванте в каждый флакон объемом 1,8 мл. Криоконсервируют с использованием программы CRF, как описано в SOP D6.100 СВ "Криоконсервация с использованием морозильных камер с контролируемой скоростью"
6) Хранят флаконы в специально отведенном хранилище с жидким азотом.
7) Прикрепляют отчет о запуске CRF к форме, соответствующей записи партии обработки MSC Р3-Quantum.
3. Анализ экспрессии маркеров стволовых клеток в популяциях мезенхимальных стволовых клеток выстилки, выделенных из ткани пуповины с использованием различных питательных сред
Были проведены эксперименты с проточной цитометрией для анализа мезенхимальных стволовых клеток, выделенных из пуповины, на экспрессию маркеров мезенхимальных стволовых клеток CD73, CD90 и CD 105.
Для этих экспериментов выделяли мезенхимальные стволовые клетки из ткани пуповины путем культивирования ткани пуповины в трех различных средах культивирования с последующим субкультивированием мезенхимальных стволовых клеток в соответствующей среде, как указано в примере 2.
В этих экспериментах использовали три следующие питательные среды: а) 90% (об./об.) DMEM с добавлением 10% ФБС (об./об.), b) культуральная среда РТТ-4, описанная в заявке на патент США 2006/0078993 и соответствующая международная заявка на патент WO 2006/019357, которая состоит из 90% (по объему) CMRL1066 и 10% (об./об.) ФБС (см. параграф [0183] WO 2006/019357 и с) культуральная среда по настоящему изобретению РРТ- 6, состав которой описан здесь. В этом анализе проточной цитометрии анализировали два разных образца популяции пуповинной оболочки мезенхимальных стволовых клеток (CLMC) для каждой из трех использованных питательных сред.
Для анализа проточной цитометрии использовали следующий протокол.
Материалы и методы
Процедура
a) Выделение и культивирование клеток из оболочки пуповины
2
1. Образцы ткани эксплантатов инкубировали в планшете для культивирования клеток и погружали в соответствующую среду, затем хранили в инкубаторе с СО при 37°С, как описано в примере 2.
2. Среду меняли каждые 3 дня.
3. Рост клеток из эксплантов тканевых культур контролировали с помощью световой микроскопии.
4. При конфлюентности приблизительно 70% клетки отделяли от чашки трипсинизацией (0,0125% трипсина/0,05% ЭДТА) и использовали для экспериментов с проточной цитометрией.
b) Трипсинизация клеток для экспериментов
1. Удаляют среду из планшета для культивирования клеток
2. Аккуратно промывают стерильным 1X ФСБ, чтобы удалить следы ФБС, так как ФБС будет мешать ферментативному действию трипсина.
3. Добавляют 1X трипсин в планшет для культивирования клеток и инкубирую в течение 3-5 минут при 37°С.
4. Осматривают клетки под микроскопом, чтобы убедиться, что они сдвинуты с места. Нейтрализуют трипсин, добавляя полную среду, содержащую ФБС (DMEM с 10% ФБС).
5. Используют пипетку, чтобы разбить комки клеток, пипетируя клетки в среде против стенки планшета. Собирают и переносят клеточную суспензию в центрифужные пробирки емкостью 50 мл.
6. Добавляют стерильный 1X ФСБ в планшет и промывают его. Собирают клеточную суспензию в ту же центрифужную пробирку.
7. Центрифугируют на 1800 об/мин в течение 10 минут.
8. Удаляют супернатант и ресуспендируют осадок клеток средой РВА.
с) Подсчет клеток
1. Убеждаются, что гемоцитометр и его покровное стекло чистые и сухие, предпочтительно, промыв их 70% этанолом и высушив перед тем, как вытереть их салфетками Kim (безворсовая бумага).
2. Аликвотируют небольшое количество клеток в суспензии в микроцентрифужную пробирку и извлекают из бокса биологической безопасности.
3. Окрашивают клетки в суспензии равным объемом трипанового синего, например, к 500 мкл суспензии добавляют 500 мкл трипанового синего (коэффициент разбавления = 2Х, в результате чего получается 0,2% раствор трипанового синего).
4. Избегают воздействия трипанового синего на клетки в течение более 30 минут, поскольку трипановый синий токсичен и приведет к увеличению числа нежизнеспособных клеток, что приведет к неверному количеству клеток.
5. Добавляют 20 мкл смеси клеточной суспензии в каждую камеру гемоцитометра и просматривают под световым микроскопом.
Подсчитывают количество жизнеспособных клеток (светлые клетки; нежизнеспособные клетки легко поглощают трипановый синий и, следовательно, темнеют) в каждом квадранте гемоцитометра, чтобы получить в общей сложности 8 квадрантов в верхней и нижней камере.
4
Общее количество клеток представляют в виде (Среднее количество клеток/квадрант) × 10 клеток/мл.
d) Окрашивание клеток
i. Подготовка перед окрашиванием клеток
• Клеточную суспензию аликвотируют в 3 пробирки (CD73, CD90, CD 105) в двух экземплярах и 2 пробирки (отрицательный контроль), каждая из которых содержит 50000 клеток.
ii. Окрашивание первичным антителом (Ab)
• Добавляют 1 мкл [0,5 мг/мл Ab] первичного антитела к 100 мкл клеточной суспензии. Инкубируют при 4°С в течение 45 мин.
• Доводят объем РВА до 1 мл.
• Центрифугируют на 8000 об/мин при 4°С в течение 5 минут.
• Удаляют супернатант.
• Добавляют 1 мл РВА и повторно ресуспендируют осадок
• Центрифугируют на 8000 об/мин при 4°С в течение 5 минут.
• Удаляют супернатант.
• Ресуспендируют в 100 мкл РВА.
iii. Окрашивание вторичным Ab - в темноте
• Добавляют 1 мкл [0,5 мг/мл антитела] вторичного антитела к 100 мкл клеточной суспензии. Инкубируют при 4°С в течение 30 мин.
• Доводят объем РВА до 1 мл.
• Центрифугируют на 8000 об/мин при 4°С в течение 5 минут.
• Удаляют супернатант.
• Добавляют 1 мл РВА и ресуспендируют осадок
• Центрифугируют на 8000 об/мин при 4°С в течение 5 минут.
• Удаляют супернатант
• Ресуспендируют в 200-300 мкл РВА для анализа проточной цитометрией
• Переносят клетки в пробирку для FACS для считывания результата проточной цитометрии в цитофлуориметре BD FACS CANDO.
+
+
+
+
+
+
Результаты анализа методом проточной цитометрии показаны на Фиг. 6а-6с. На Фиг. 6а показан процент выделенных мезенхимальных стволовых клеток выстилки, экспрессирующих маркеры стволовых клеток CD73, CD90 и CD105 после выделения из ткани пуповины и культивирования в DMEM/10% ФБС, на Фиг. 6b показан процент выделенных мезенхимальных стволовых клеток выстилки, экспрессирующих маркеры стволовых клеток CD73, CD90 и CD105 после выделения из ткани пуповины и культивирования в РТТ-4, и на Фиг. 6 с показан процент выделенных мезенхимальных стволовых клеток выстилки, экспрессирующих маркеры стволовых клеток CD73, CD90 и CD105 после выделения из ткани пуповины и культивирования в РРТ-6. Как видно из Фиг. 6а, популяция, выделенная с применением DMEM/10% ФБС в качестве культуральной среды, содержит приблизительно 75% CD73 клеток, 78% CD 90 клеток и 80% CD105 клеток (среднее из двух экспериментов), тогда как после выделения/культивирования ткани пуповины с использованием культуральной среды РРТ-4 (см. Фиг. 6b), количество мезенхимальных стволовых клеток, которые являются CD73-позитивными, CD90-позитивными и CD105-позитивными, составляет приблизительно 87% (CD73 клетки), 93%/CD90 клетки) и 86% (CD105 клетки) в среднем из двух экспериментов. Чистота популяции мезенхимальных стволовых клеток, полученных путем культивирования в среде РТТ-6 по настоящему изобретению, составляет по меньшей мере 99,0% по отношению ко всем трем маркерам (CD73, CD90, CD105), что означает чистоту этой популяции клеток, значительно выше, чем при культивировании с использованием среды РРТ-4 или DMEM/10% ФБС. Кроме того, и что еще более важно, популяция мезенхимальных стволовых клеток, полученная путем культивирования в РТТ-6, по существу представляет собой 100% чистую и определенную популяцию стволовых клеток. Это делает популяцию стволовых клеток по настоящему изобретению идеальным кандидатом для лечения на основе стволовых клеток. Таким образом, эта популяция стволовых мезенхимальных стволовых клеток выстилки может стать золотым стандартом для таких терапевтических подходов на основе стволовых клеток.
Результаты, показанные на Фиг. 6, дополнительно подтверждаются результатами анализа проточной цитометрией, которые показаны на Фиг. 7а и Фиг. 7b. На Фиг. 7а показан процент выделенных мезенхимальных стволовых клеток выстилки (мезенхимальные стволовые клетки амниотической мембраны пуповины), которые экспрессируют маркеры стволовых клеток CD73, CD90 и CD 105 и не экспрессируют CD34, CD45 и HLA-DR после выделения из ткани пуповины и разведения в среде РТТ-6. Как показано на Фиг. 7а, популяция мезенхимальных стволовых клеток содержала 97,5% жизнеспособных клеток, из которых 100% экспрессировали каждый из CD73, CD90 и CD105 (см. строки "CD73+ CD90+" и "CD73+ CD105+"), в то время как 99,2% популяции стволовых клеток не экспрессировала CD45, и 100% популяции стволовых клеток не экспрессировали CD34 и HLA-DR (см. строки "CD34-CD45-" и " CD34-HLA-DR-"). Таким образом, популяция мезенхимальных стволовых клеток, полученная путем культивирования в среде РТТ-6, по существу представляет собой 100% чистую и определенную популяцию стволовых клеток, которая соответствует критериям, которым должны соответствовать мезенхимальные стволовые клетки для применения в клеточной терапии (95% или более популяции стволовых клеток экспрессирует CD73, CD90 и CD105, в то время как у 98% или более популяции стволовых клеток не экспрессирует CD34, CD45 и HLA-DR, см. Sensebe et al. "Production of mesenchymal stromal/stem cells according to good manufacturing practices: a review", см. выше). Следует отметить, что настоящие мезенхимальные стволовые клетки амниотической мембраны в стандартных условиях культивирования прилипают к пластику и дифференцируются in vitro в остеобласты, адипоциты и хондробласты, см. патент США 9085755, патент США 8287854 или WO 2007/046775 и, таким образом, соответствуют в целом принятым критериям для применения мезенхимальных стволовых клеток в клеточной терапии.
На Фиг. 7b показан процент выделенных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга, которые экспрессируют CD73, CD90 и CD105 и не экспрессируют CD34, CD45 и HLA-DR. Как показано на Фиг. 7b, популяция мезенхимальных стволовых клеток костного мозга содержала 94,3% жизнеспособных клеток, из которых 100% экспрессировали каждый из CD73, CD90 и CD105 (см. строки "CD73+ CD90+" и "CD73+ CD105+"), в то время После того как в 62,8% популяции стволовых клеток костного мозга отсутствовала экспрессия CD45, и в 99,9% популяции стволовых клеток отсутствовала экспрессия CD34 и HLA-DR (см. строки "CD34-CD45-" и "CD34-HLA-DR-"). Таким образом, мезенхимальные стволовые клетки костного мозга, которые считаются золотым стандартом мезенхимальных стволовых клеток, являются гораздо менее однородными/чистыми с точки зрения маркеров стволовых клеток, чем популяция мезенхимальных стволовых клеток (амниотической мембраны пуповины) по настоящей заявке Это открытие также показывает, что популяция стволовых клеток по настоящему изобретению может быть идеальным кандидатом для лечения на основе стволовых клеток и может стать золотым стандартом для терапевтических подходов на основе стволовых клеток.
Специалисту в данной области будет очевидно, что могут быть сделаны различные замены и модификации изобретения, раскрытого в данной заявке, без отступления от объема и сущности изобретения.
Все патенты и публикации, упомянутые в описании изобретения, являются показательными на уровне среднего специалиста в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Все патенты и публикации включены в настоящий документ посредством ссылки в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация была специально и индивидуально указана для включения в качестве ссылки.
Изобретение, иллюстративно описанное в данной заявке, может быть соответствующим образом осуществлено на практике в отсутствие какого-либо элемента или элементов, какого-либо ограничения или ограничений, конкретно не раскрытых в данной заявке. Так, например, термины "содержащий", "включающий" и т.д. следует читать в широком смысле и без ограничений. Кроме того, используемые здесь термины и выражения использовались в качестве терминов описания, а не ограничения, и при использовании таких терминов и выражений нет намерения исключать какие-либо эквиваленты показанных и описанных признаков или их частей, но признается, что возможны различные модификации в пределах объема заявленного изобретения. Таким образом, следует понимать, что хотя настоящее изобретение было конкретно раскрыто посредством предпочтительных вариантов реализации и необязательных признаков, модификации и вариации изобретений, воплощенных в них, раскрытых в данной заявке, могут быть использованы специалистами в данной области техники, и что такие модификации и варианты подпадают под объем настоящего изобретения. Изобретение было описано здесь широко и в общих чертах. Каждый из более узких видов и подродовых групп, попадающих в общее раскрытие, также составляет часть изобретения. Это включает общее описание изобретения с условием или отрицательным ограничением, удаляющим любой предмет из рода, независимо от того, был ли специально процитирован здесь исключенный материал. Кроме того, если признаки или аспекты изобретения описаны в терминах групп Маркуша, специалисты в данной области техники поймут, что изобретение также таким образом описано в терминах любого отдельного члена или подгруппы членов группы Маркуша. Другие варианты реализации изобретения станут очевидными из следующей формулы изобретения.