Устройство для оценки состава иммунокомпетентных клеток в опухолевой ткани спектрально-флуоресцентными методами с применением фотосенсибилизатора на основе хлорина е6
DEVICE FOR ASSESSING THE COMPOSITION OF IMMUNOCOMPETENT CELLS IN TUMOR TISSUE BY SPECTRAL FLUORESCENCE METHODS USING A PHOTOSENSITIZER BASED ON CHLORIN E6

Изобретение относится к области медицинской техники, а более конкретно к лазерно-спектроскопической технике для контроля состояния биологических тканей и может быть использовано, в частности, при диагностике и лечении онкологических заболеваний ghb при оценке стадии степени заболевания и вероятном направлении его развития в процессе терапевтического воздействия.
Известно, что любая первичная опухоль состоит не только из неопластических клеток, но и из поддерживающей стромы, основными элементами которой являются клетки гемопоэтической системы (в особенности нейтрофилы и макрофаги). Изменение фенотипа клеток опухолевого микроокружения дает опухоли возможность роста и инвазии. Макрофаги способны изменять свой фенотип в зависимости от микроокружения и тем самым влиять на развитие опухолевого процесса. Макрофаги способны накапливать фотосенсибилизаторы на основе хлорина е6 в несколько раз больше, чем опухолевые клетки (до 9 раз), что влияет на накопление фотосенсибилизаторов и на время жизни их флуоресценции. Таким образом, в сенсибилизированной фотосенсибилизатором хлорином е6 биологической ткани макрофаги более всего подвержены фотодинамическому воздействию.
Известны устройства, позволяющее измерять время жизни флуоресценции методами коррелированного по времени подсчета одиночных фотонов (TCSPC) или многоканального масштабирования (MCS) от нескольких пикосекунд до нескольких секунд. Системы включают в себя пикосекундные импульсные диодные лазеры, светодиоды или ксеноновые лампы (непрерывные и импульсные) и предназначены для изучения различных образцов и выполнения нескольких приложений, в том числе регистрации: флуоресценции с временным разрешением; синглетного кислорода, ап-конверсной фотолюминесценции, анизотропии флуоресценции (поляризации), и измерений квантового выхода фотолюминесценции [https://www.picoquant.com/products/category/fluorescence-spectrometers/fluotime-300-high-performance-fluorescence-lifetime-spectrometer#papers; https:www.hamamatsu.com/resources/pdf/sys/SHSS0006E_STREAK.pdf]
Недостатками данных устройств является ограниченные размеры исследуемого образца и отсутствие возможности интраоперационных измерений из-за используемой геометрии измерений. Известно устройство для флуоресцентной корреляционной спектроскопии времени жизни (Fluorescence Lifetime Correlation Spectroscopy, FLCS), которое использует флуоресцентные методы с временным разрешением для разделения вкладов различных хромофоров. [https://www.picoquant.com/applications/category/life-science/fluorescence-lifetime-correlation-spectroscopy-flcs#description]. Недостатком данного устройства при измерении кинетических характеристик флуоресценции является необходимость использования конфокального микроскопа для проведения измерений времени жизни флуоресценции исследуемого образца/объекта.
Известны устройства для разрешенной по времени флуоресцентной микроскопии (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy, FLIM) методами стробирования. Технология FLIM создает изображение на основе различий в скорости затухания возбужденного состояния от флуоресцентного образца. С помощью настраиваемого генератора задержки можно собирать излучение флуоресценции после определенного времени задержки, охватывающих временной диапазон затухания флуоресценции образца.
Известны диагностические устройства на основе интегрированных ПЗС-камер, включающих усилитель изображения, ПЗС-матрицу и встроенный генератор задержки. Камеры с самым коротким временем стробирования до 200 пс и шагом задержки 10 пс позволяют использовать FLIM с субнаносекундным разрешением. В сочетании с эндоскопом эти устройства используются для интраоперационной диагностики опухолей головного мозга [Sun Y. Н. et al. Fluorescence lifetime imaging microscopy for brain tumor image-guided surgery //Journal of biomedical optics. - 2010. - T. 15. - №. 5. - C. 056022]. Недостатком этих устройств является отсутствие возможности дифференциации сигнала по длине волны, что не позволяет разделять собственную флуоресценцию тканей и флуоресценцию фотосенсибилизатора, что может привести к получению недостоверных результатов.
Технической задачей, решаемой данной изобретением, является создание диагностического устройства для оценки состава иммунокомпетентных клеток в опухолевой ткани спектрально-флуоресцентными методами с применением фотосенсибилизатора на основе хлорина е6, позволяющего проводить исследования различных органов и тканей как in vitro, так и in vivo, в том числе интраоперационно, и характеризовать состояния биологических тканей, отличающихся по фенотипу присутствующих в них макрофагов и степени их активности, с учетом различий между моноцитами (ТНР-1), неполяризованными «наивными» макрофагами (М0), провоспалительными макрофагами (M1), противовоспалительными макрофагами (М2), опухолевыми клетками, фибробластами кожи и сосудистой частью стромы опухоли для определения направления развития опухолевого процесса.
Поставленная задача решается тем, что устройство для оценки состава иммунокомпетентных клеток в опухолевой ткани спектрально-флуоресцентными методами с применением фотосенсибилизатора на основе хлорина еб, включающее импульсный лазер, возбуждающий флуоресценцию накопившегося в биологической ткани фотосенсибнлизатора, систему определения и анализа кинетических характеристик флуоресцентного излучения и систему отображения информации, систему приема флуоресцентного излучения, которая дополнительно содержит многоволоконный оптический зонд для доставки возбуждающего лазерного излучения к исследуемому образцу и передачи обратно рассеянного лазерного и флуоресцентного излучения на вход системы регистрации излучения флуоресценции, систему регистрации излучения флуоресценции, которая дополнительно содержит систему оптических фильтров и полихроматор для спектрального разложения регистрируемых лазерного и флуоресцентного излучения, поступающих через оптоволоконный кабель на вход полихроматора, в спектрально разложенную полосу на оптическом выходе полихроматора, электронно-оптический преобразователь с фотокатодом, системой временной развертки в направлении, перпендикулярном спектрально разложенной полосе флуоресцентного сигнала, и люминесцентным экраном на выходе, CCD-камеру для регистрации картины, отображаемой на люминесцентным экране на выходе ЭОП, выход CCD-камеры связан со входом системы определения и анализа кинетических характеристик флуоресцентного излучения, устройство дополнительно содержит последовательно соединенные блок для суммирования экспоненциальных характеристических функций кинетики флуоресценции хлорина е6 в моноцитах ТНР-1, макрофагах М0, M1, М2 с регулируемыми весовыми коэффициентами и итерационной подгонки суммы к кинетическим характеристикам излучения фотосенсибилизатора путем вариации весовых коэффициентов, блок анализа и обработки весовых коэффициентов для получения из их соотношения информации о количественном содержании моноцитов ТНР-1, макрофагов М0, M1, М2, выход которого соединен со входом блока отображения информации персонального компьютера.
Предлагаемое устройство поясняется Фиг. 1 где:
1 - сенсибилизированная биологическая ткань,
2 - импульсный лазер,
3 - система приема флуоресцентного излучения,
4 - система регистрации флуоресцентного излучения,
5 - система определения и анализа кинетических характеристик флуоресцентного излучения,
6 - система отображения информации,
7 - многоволоконный оптический зонд для доставки возбуждающего лазерного излучения импульсного лазера к исследуемому образцу и передачи обратно рассеянного лазерного и флуоресцентного излучения на вход системы регистрации излучения,
8 - система оптических фильтров,
9 - полихроматор для спектрального разложения лазерного и флуоресцентного излучения,
10 - электронно-оптический преобразователь,
11 - CCD-камера,
12 - блок для суммирования экспоненциальных характеристических функций кинетики флуоресценции хлорина е6 в моноцитах ТНР-1, макрофагах М0, M1, М2 с регулируемыми весовыми коэффициентами и итерационной подгонки суммы к кинетическим характеристик излучения фотосенсибилизатора,
13 - блок анализа и обработки весовых коэффициентов для получения из их соотношения информации о количественном содержании моноцитов ТНР-1, макрофагов М0, M1, М2.
Предлагаемое устройство включает в себя импульсный лазер 2, к которому подсоединен входным концом одного из световодов многоволоконный оптический зонд 7 системы приема флуоресцентного излучения 3, дистальный конец зонда подведен к сенсибилизированной биологической ткани 1, систему регистрации флуоресцентного излучения 4, включающую приемные световоды многоволоконного оптического зонда, 7 систему оптических фильтров 8, полихроматор 9 для спектрального разложения лазерного и флуоресцентного излучения, электронно-оптический преобразователь 10, CCD-камеру 11, выход которой связан со входом системы 5 определения и анализа кинетических характеристик флуоресцентного излучения. Информация с выхода системы 5 через последовательно соединенные блок 12 для суммирования экспоненциальных характеристических функций кинетики флуоресценции хлорина е6 в моноцитах ТНР-1, макрофагах М0, M1, М2 с регулируемыми весовыми коэффициентами и итерационной подгонки суммы к кинетическим характеристик излучения фотосенсибилизатора и блок 13 анализа и обработки весовых коэффициентов для получения из их соотношения информации о количественном содержании моноцитов ТНР-1, макрофагов М0, M1, М2 поступает на вход системы отображения информации 6.
Устройство для оценки поляризации макрофагов спектрально-флуоресцентными методами с применением фотосенсибилизатора хлорина е6 работает следующим образом.
Пациенту (или в эксперименте - лабораторному животному) предварительно вводят фотосенсибилизатор на основе хлорина е6. К сенсибилизированным биологическим тканям 1 подводят дистальный конец оптоволоконного многоволоконного зонда 7 системы приема флуоресцентного излучения 3, в одно из волокон которого из импульсного лазера 2 поступает импульсное излучение (длина волны 637 им, длительность импульса 67 пс), возбуждающее фотосенсибилизатор в биологической ткани.
Излучение флуоресценции, возбуждаемой излучением импульсного лазера 2, собирают на входе дистальных концов оптических волокон многоволоконного оптического зонда 7 системы приема флуоресцентного излучения 3. Из противоположных концов оптических волокон это излучение поступает в систему регистрации флуоресцентного излучения 4 сначала в систему оптических фильтров 8, затем в полихроматор 9 для разложения лазерного и флуоресцентного излучения в спектрально-разложенную (разрешенную) полосу. Система оптических фильтров снижает интенсивность рассеянного назад лазерного излучения от 3 до 6 порядков, но не снижает интенсивности флуоресценции хлорина е6. Изображение спектрально-разложенной полосы поступает на фотокатод электронно-оптического преобразователя 10. В электронно-оптическом преобразователе осуществляется быстрая развертка изображения спектрально-разложенной полосы в направлении, перпендикулярном изображению полосы. Двумерная картина распределения электронов в электронно-оптическом преобразователе несет информацию о кинетических характеристиках каждого из участков спектра, эта картина в электронно-оптическом преобразователе усиливается. При попадании электронов на люминесцентный экран электронно-оптического преобразователя на его выходном экране формируется двумерная люминесцентная картина, пространственное распределение интенсивности в которой соответствует распределению сигнала флуоресценции фотосенсибилизатора в конкретной точке биологической ткани по спектру и времени (локальная кинетическая характеристика). Эта картина считывается CCD-камерой 11, информация с которой поступает на вход системы 5 определения и анализа кинетических характеристик флуоресцентного излучения фотосенсибилизатора в конкретной точке биологической ткани.
Авторами экспериментально установлены эталонные времена жизни флуоресценции хлорина е6 в моноцитах ТНР-1, макрофагах М0, M1, М2. Полученные из конкретной точки биологической ткани данные о кинетических характеристиках излучения фотосенсибилизатора поступают в блок 12 для суммирования экспоненциальных характеристических функций кинетики флуоресценции хлорина е6 в моноцитах ТНР-1, макрофагах М0, M1, М2 с регулируемыми весовыми коэффициентами и итерационной подгонки суммы к кинетическим характеристикам излучения фотосенсибилизатора. Соотношение весовых коэффициентов кинетик является оценкой количественного содержания моноцитов ТНР-1, макрофагов М0, M1, М2.
Таким образом, устройство для оценки состава иммунокомпетентных клеток в опухолевой ткани спектрально-флуоресцентными методами с применением фотосенсибилизатора хлорина е6 позволяет реализовать неинвазивный способ оценки направления развития опухолевого процесса. Данное устройство позволяет быстро получить комплексную оценку состояния ткани во время проведения хирургической операции или сеанса лазерно-индуцированной терапии для своевременной коррекции терапевтического или хирургического лечения.