ПРОБИОТИЧЕСКИЕ ШТАММЫ, ОБЛАДАЮЩИЕ СПОСОБНОСТЬЮ ПОГЛОЩАТЬ ХОЛЕСТЕРИН, СПОСОБЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
PROBIOTIC STRAINS HAVING THE ABILITY TO ABSORB CHOLESTEROL, METHODS AND USE THEREOF

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к области пробиотических штаммов, в частности, к области пробиотических штаммов, обладающих способностью поглощать (абсорбировать) холестерин, и к их применению в терапии. Настоящее изобретение также относится к лечению дислипидемий путем применения пробиотических штаммов.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Гиперхолестеринемия является наиболее важным фактором риска при развитии сердечно-сосудистых заболеваний, и ее считают одной из основных причин смерти и потери трудоспособности во многих странах. Было показано, что снижение концентрации холестерина в сыворотке на 1% может уменьшить риск возникновения ишемической болезни сердца на 2-3%. Лекарственная терапия гиперхолестеринемии обладает нежелательными побочными действиями, которые вызывают опасения относительно применения указанных лекарств в терапии. Следовательно, существует потребность в более естественном способе снижения концентрации холестерина в сыворотке у людей.
Лактобактерии и другие продуцирующие молочную кислоту бактерии играют важную роль в регуляции пищеварительных функций и способствовании удалению холестерина, хотя в исследованиях соотношение доза-эффект еще не было установлено. Так как молочнокислые бактерии способны деконъюгировать соли желчных кислот, в последние годы появился интерес к возможности применения указанных бактерий в качестве биологических гипохолестеринемических агентов. В нескольких исследованиях предположили существование взаимосвязи между потреблением молочнокислых бактерий и снижением концентраций холестерина в крови людей, крыс и цыплят. Присутствие гидролазы соли желчной кислоты (BSH) дает данным бактериям селективное преимущество в богатой солями желчных кислот среде. Активность BSH дает преимущество данной бактерии путем повышения ее устойчивости к конъюгированным солям желчных кислот и повышения ее выживаемости в желудочно-кишечном тракте и, следовательно, способности к колонизации последнего. Исследования по деконъюгированию лактобактериями солей желчных кислот и их способности снижать уровень холестерина по большей части проводили на штаммах, выделенных из людей, свиней и кисломолочных продуктов.
Сообщали, что штаммы Lactobacillus acidophilus и бифидобактерий поглощают холестерин из лабораторных сред. Таким образом, оба типа бактерий могут обладать способностью снижать уровень холестерина в сыворотке у человека. Было предпринято множество попыток объяснить механизм, участвующий в гипохолестеринемическом действии штаммов молочнокислых бактерий. Один предложенный механизм заключается в снижении уровня холестерина за счет клеточной стенки в процессе роста бактерий. Другой возможный механизм заключается в деконъюгировании солей желчных кислот бактериями, продуцирующими BSH. Тем не менее, согласно указанным механизмам для успешного снижения уровня холестерина в сыворотке необходимо, чтобы бактерии были жизнеспособны.
Таким образом, в данной области по-прежнему существует потребность в способах лечения на основе пробиотиков, которые обеспечивают эффективное лечение дислипидемии, особенно гиперхолестеринемии.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В первом аспекте настоящего изобретения предложен пробиотический штамм, выбранный из Lactobacillus reuteri V3401 с номером доступа СЕСТ 8605 и Bifidobacterium breve ВТ820 с номером доступа СЕСТ 8606, или вариант указанного пробиотического штамма, обладающий способностью поглощать холестерин.
В другом аспекте настоящего изобретения предложена биологически чистая культура, содержащая пробиотический штамм согласно настоящему изобретению.
В другом аспекте настоящего изобретения предложена композиция, содержащая пробиотический штамм согласно настоящему изобретению.
В другом аспекте настоящего изобретения предложен фармацевтический продукт, содержащий пробиотический штамм согласно настоящему изобретению.
В другом аспекте настоящего изобретения предложен продукт питания, содержащий пробиотический штамм согласно настоящему изобретению.
В другом аспекте настоящего изобретения предложен корм, содержащий пробиотический штамм согласно настоящему изобретению.
В другом аспекте настоящего изобретения предложена фракция, обогащенная клеточными мембранами или клеточными стенками пробиотического штамма согласно настоящему изобретению.
В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ получения пробиотического штамма согласно настоящему изобретению с повышенной способностью поглощать холестерин, включающий этап инактивации клеток.
В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ получения пробиотического штамма согласно настоящему изобретению с повышенной способностью поглощать холестерин, включающий этап культивирования клеток при рН от 6 до 9 во время экспоненциальной фазы роста указанных клеток.
В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ получения микроорганизма с повышенной способностью поглощать холестерин, включающий приведение в контакт микроорганизма, обладающего способностью поглощать холестерин, с композицией, обладающей активностью пептидогликангидролазы.
В другом аспекте настоящего изобретения предложена клетка, которая получена с помощью любого из способов получения микроорганизма с повышенной способностью поглощать холестерин согласно настоящему изобретению.
В другом аспекте настоящего изобретения предложен пробиотический штамм согласно настоящему изобретению для применения в качестве лекарственного средства.
В другом аспекте настоящего изобретения предложена клетка, которая получена с помощью любого из способов получения микроорганизма с повышенной способностью поглощать холестерин согласно настоящему изобретению, для применения в качестве лекарственного средства.
В другом аспекте настоящего изобретения предложен пробиотический штамм согласно настоящему изобретению для применения для лечения и/или профилактики заболевания или состояния, выбранного из группы, состоящей из дислипидемии, инсулинорезистентности и метаболического синдрома.
В другом аспекте настоящего изобретения предложена клетка, которая получена с помощью любого из способов получения микроорганизма с повышенной способностью поглощать холестерин согласно настоящему изобретению, для применения для лечения и/или профилактики заболевания или состояния, выбранного из группы, состоящей из дислипидемии, инсулинорезистентности и метаболического синдрома.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
Фигура 1. Средняя величина относительной флуоресценции клеток (%) для энтероцитов Н-Т29, которые инкубировали с флуорестеролом (флуорестерол) (отрицательный контроль), с эзетимибом (положительный контроль) и с суспензиями бактерий L. reuteri V3401 или В. breve ВТ820.
Фигура 2. Средняя величина относительной флуоресценции клеток (%) для энтероцитов Н-Т29, которые инкубировали с флуорестеролом (отрицательный контроль) и с эзетимибом (положительный контроль) или с суспензиями инактивированных бактерий. A: L. reuteri V3401. В: В. breve ВТ820.
Фигура 3. Паттерны случайным образом амплифицированной полиморфной ДНК (RAPD) штаммов L. reuteri получали с помощью праймеров (gtg)5 (слева) и OPL1 (справа). Слева: дорожки слева направо: дорожка 1 - маркер молекулярной массы 100 п. о.; дорожка 2 - L. reuteri V3401; дорожка 3 - LR35; дорожка 4 - LR20; дорожка 5 - LR01; дорожка 6 - СЕСТ925; дорожка 7 - DSM 19738; дорожка 8 - контроль без матрицы (NTC); дорожка 9 - маркер молекулярной массы 100 п. о. и дорожка 10 - маркер молекулярной массы 1 т.п.н. Справа: дорожка 1 - V3401; дорожка 2 - LR35; дорожка 3 - LR20; дорожка 4 - маркер молекулярной массы 100 п. о.
Фигура 4. Отпечаток RAPD (gtg)5 для В. breve ВТ820 и других штаммов В. breve и штамма Bifidobacterium longum. Дорожка 1 - маркер молекулярной массы 1 т.п.н. Дорожка 2 - маркер молекулярной массы 100 п. о. Дорожка 3 - В. breve ВТ820. Дорожка 4 - ВВ26. Дорожка 5 - DSM20091. Дорожка 6 - СЕСТ4839. Дорожка 7 - ВВ69. Дорожка 8 - В. longum АТСС15707.
8
Фигура 5. Относительная флуоресценция (среднее геометрическое) энтероцитов НТ-29, инкубированных с мицеллами флуорестерола (контроль), эзетимибом (300 мкМ), термоинактивированными суспензиями клеток (5⋅10 бактерий/мл) L. reuteri V3401, В. breve ВТ820, и энтероцитов, совместно инкубированных с эзетимибом и каждым микроорганизмом.
Фигура 6. Фактическая флуоресценция (условные единицы) образцов L. reuteri V3401, В. breve ВТ820 и отрицательного контроля (случайно выбранного), инкубированных с флуорестеролом, измеренная с помощью флуорофотометрии.
Фигура 7. Флуоресценция (среднее геометрическое) на бактерию в суспензиях L. reuteri V3401, В. breve ВТ820 и случайно выбранном отрицательном контроле, определенная с помощью проточной флуороцитометрии
Фигура 8. А: Концентрация жизнеспособных бактерий в культурах L. reuteri V3401, полученных в ростовых средах: среде А, рН 6, и среде В, рН 5. В: Средняя величина относительной флуоресценции клеток (%) для энтероцитов Н-Т29, которые инкубировали с флуорестеролом (отрицательный контроль), эзетимибом (положительный контроль) или суспензиями термоинактивированных L. reuteri V3401, выращенных при описанных условиях.
Фигура 9. Средняя величина относительной флуоресценции клеток (%) для энтероцитов Н-Т29, которые инкубировали с флуорестеролом (отрицательный контроль), эзетимибом (положительный контроль) или суспензиями термоинактивированных L. reuteri V3401, которые растили в различных средах и при различных рН. А: среда В, рН 5, плюс глюкоза. В: среда В, рН 5, плюс фосфат калия. С: среда В, рН 5, низкая концентрация дрожжевого экстракта. D: среда В, рН 5, плюс фосфат калия и низкая концентрация дрожжевого экстракта. Е: стандартная среда В, рН 5. F: среда В, рН 6. G: среда А, рН 6. Н: среда А, рН 5.
Фигура 10. Средняя величина относительной флуоресценции клеток (%) для энтероцитов Н-Т29, которые инкубировали с флуорестеролом (отрицательный контроль), эзетимибом (положительный контроль) или суспензиями термоинактивированных L. reuteri V3401, которые растили в среде В при различных значениях рН.
Фигура 11. Средняя величина относительной флуоресценции клеток (%) для энтероцитов Н-Т29, которые инкубировали с флуорестеролом и суспензиями термоинактивированных бактерий L. reuteri V3401, которые растили в среде В при рН 5 в течение 14 ч, инкубировали при рН 6 в течение 24 ч и собирали в различные моменты времени.
Фигура 12. Относительные значения экспрессии гена литического фермента в среде В и среде А, измеренные с помощью количественной ПЦР.
Фигура 13. Зимограмма (А) и ПААГ/ДСН (В) белковых экстрактов, полученных из L. reuteri V3401, которые растили в среде В при рН 4 (дорожки 1-2), рН 5 (3-4), рН 6 (5-6), рН 7 (7-8) и в среде А при рН 6 (9-10).
Фигура 14. Изображения просвечивающей электронной микроскопии L. reuteri V3401, которые растили в среде А при рН 6 (А, В) и в среде В при рН 5 (С, D).
Фигура 15. Средняя величина относительной флуоресценции клеток (%) для энтероцитов Н-Т29, которые инкубировали с флуорестеролом и термоинактивированными суспензиями бактерий, которые растили в среде А, рН 6, и в среде В, рН 5. A: L. reuteri LR01. В: В. breve ВВ16. С: L. fermentum СЕСТ5716. D: L. reuteri LR35. Е: L. reuteri LR20. F: Lactococcus lactis LL18. G: Leuconostoc mesenteroides LM37. H: Pediococcus pentosaceus PP02.
Фигура 16. Относительная экспрессия гена литического фермента в штаммах L. reuteri V3401 и LR20, которые растили в среде А, рН6, и в среде В, рН5, определенная с помощью количественной ПЦР.
Фигура 17. Относительная флуоресценция (%) на энтероцит НТ-29, инкубированный с мицеллами флуорестерола и без образца бактерий (отрицательный контроль), эзетимибом (положительный контроль) и суспензиями L. reuteri LR35, L plantarum LP18 и В. breve ВТ820, термоинактивированными (С) и инкубированными с белковым экстрактом из L. reuteri V3401 (Т).
Фигура 18. Интенсивность флуоресценции на клетку (среднее геометрическое) измеряли с помощью проточной флуороцитометрии. С: термоинактивированные образцы бактерий без флуорестерола (контроль аутофлуоресценции). F: термоинактивированные бактерии, инкубированные с флуорестеролом. TF: образцы бактерий, обработанных белковым экстрактом L. reuteri V3401, термоинактивированных и инкубированных с мицеллами флуорестерола.
Фигура 19. Холестерин в сыворотке измеряли в 6 группах животных через 57 дней. Планки погрешностей изображают стандартную ошибку среднего. А: здоровая контрольная группа; В: контрольная группа с гиперхолестеринемией; С: группа живых L. reuteri V3401; D: группа термоинактивированных L. reuteri V3401; Е: группа живых В. breve ВТ820; F: группа термоинактивированных В. breve ВТ820.
#
*
Фигура 20. ЛПВП-холестерин (А), ЛПНП-холестерин (В) и отношение ЛПНП-Х/ЛПВП-X (С) измеряли в указанных шести группах животных через 57 дней. Планки погрешностей изображают стандартную ошибку среднего. Указаны значимые различия (t-критерий Стьюдента α=0,05 и р<0,5) по сравнению с контрольной группой А () и по сравнению с группой с гиперхолестеринемией В ().
Фигура 21. Уровни триглицерида (А) и фосфолипида (В) в плазме в 6 группах животных через 57 дней. Планки погрешностей изображают стандартную ошибку среднего.
#
*
Фигура 22. Значения глюкозы в плазме в 6 группах животных через 57 дней. Планки погрешностей изображают стандартную ошибку среднего. Указаны значимые различия (t-критерий Стьюдента α=0,05 и р<0,5) по сравнению с контрольной группой А () и с группой с гиперхолестеринемией В ().
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Авторы настоящего изобретения идентифицировали два пробиотических штамма - Lactobacillus reuteri V3401 (номер доступа СЕСТ 8605) и Bifidobacterium breve ВТ820 (номер доступа СЕСТ 8606), - которые успешно снижают поглощение флуорестерола, флуоресцентного аналога холестерина, и холестерина эпителиальными клетками кишечника в анализах in vitro и in vivo. Механизм, посредством которого они оказывают свое действие, основан на способности данных бактерий поглощать холестерин, тем самым секвестрируя холестерин в кишечнике и снижая количество холестерина, доступного для поглощения эпителием кишечника. Более того, авторы настоящего изобретения определили, что, неожиданно, способность указанных штаммов поглощать холестерин можно индуцировать путем повышения литической активности, которая, вероятно, специфична для штамма L. reuteri V3401 (СЕСТ 8605). Данное неожиданное открытие позволяет активировать способность поглощать холестерин у микроорганизмов, у которых указанная функция существует.
Штаммы и культура
В первом аспекте настоящего изобретения предложен пробиотический штамм, выбранный из Lactobacillus reuteri V3401 с номером доступа СЕСТ 8605 и Bifidobacterium breve ВТ820 с номером доступа СЕСТ 8606, или вариант указанного штамма, обладающий способностью поглощать холестерин, называемый далее в данном тексте "пробиотический штамм согласно настоящему изобретению".
Термин "штамм" в данном тексте относится к генетическому варианту или подтипу вида микроорганизма, предпочтительно вида бактерий. Термин "пробиотический штамм" в данном тексте относится к живому штамму микроорганизмов, предпочтительно бактерий, который, при введении в достаточных количествах, приносит пользу здоровью хозяина. Хозяева, подходящие в контексте настоящего изобретения, включают любое млекопитающее, предпочтительно приматов, таких как люди и шимпанзе, свиней, лошадей, коров, коз, овец, собак, кошек, крыс и мышей; более предпочтительно людей. Другие подходящие хозяева включают птиц, предпочтительно цыплят, уток, гусей, лебедей, фазанов, голубей, горлиц и страусов.
В настоящем изобретении предложен пробиотический штамм, выбранный из:
- штамма Lactobacillus reuteri V3401, депонированного в Coleccion Espanola de Cultivos Tipo (СЕСТ) с номером доступа СЕСТ 8605, или его варианта, обладающего способностью поглощать холестерин, и
- Bifidobacterium breve ВТ820, депонированного в СЕСТ с номером доступа СЕСТ 8606, или его варианта, обладающего способностью поглощать холестерин.
Таким образом, настоящее изобретение также относится к вариантам штамма L. reuteri V3401 и штамма В. breve ВТ820, обладающим способностью поглощать холестерин. В данном тексте термин "вариант" или "мутант" штамма относится к любому встречающемуся в природе или специально сконструированному штамму, полученному из исходного штамма X преимущественно путем мутации, которая сохраняет способность поглощать холестерин исходного штамма, т.е. штамма СЕСТ 8605 L. reuteri V3401 или штамма СЕСТ 8606 В. breve ВТ820.
Варианты могут иметь или не иметь такие же отличительные биологические признаки, как и у конкретных штаммов, приведенных в качестве примера в данной заявке, при условии, что они обладают сходными полезными свойствами в отношении способности поглощать холестерин, как и у исходного штамма. Например, последовательности генов 16S рРНК "варианта" штамма, предложенного в данной заявке, могут быть приблизительно на 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичны таковым у штамма, описанного в данной заявке.
В другом варианте реализации вариант штаммов согласно настоящему изобретению относится к любому штамму, геном которого гибридизуется при строгих условиях с геномом любого из штаммов СЕСТ 8605 L. reuteri V3401 или СЕСТ 8606 В. breve ВТ820. Обычно, реакцию гибридизации низкой строгости проводят при приблизительно 40 градусах Цельсия в 10×SSC или в растворе с эквивалентной ионной силой/температурой. Гибридизацию умеренной строгости обычно проводят при приблизительно 50 градусах Цельсия в 6×SSC, и реакцию гибридизации высокой строгости, как правило, проводят при приблизительно 60 градусах Цельсия в 1×SSC.
В другом варианте реализации степень родства между указанным вариантом штамма и исходным штаммом определяют как среднюю идентичность нуклеотидов (ANI), которая позволяет определить консервативность ДНК основного генома (Konstantinidis K и Tiedje JM, 2005, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 2567-2592). В некоторых вариантах реализации ANI между вариантом и исходным штаммом составляет приблизительно 95%, приблизительно 96%, приблизительно 97%, приблизительно 98%, приблизительно 99%, приблизительно 99,1%, приблизительно 99,5%, приблизительно 99,6%, приблизительно 99,7%, приблизительно 99,8%, приблизительно 99,9%, приблизительно 99,99%, приблизительно 99,999%, приблизительно 99,9999%, приблизительно 99,99999%, приблизительно 99,999999% или более, но менее чем 100%.
В другом варианте реализации степень родства между указанным вариантом штамма и исходным штаммом определяют как коэффициент корреляции частот тетрануклеотидного профиля (Tetranucleotide Signature Frequency Correlation Coefficient), который основан на частотах олигонуклеотидов (Bohlin J. и др. 2008, ВМС Genomics, 9:104). В некоторых вариантах реализации коэффициент корреляции частот тетрануклеотидного профиля между указанным вариантом и исходным штаммом составляет приблизительно 0,99, 0,999, 0,9999, 0,99999, 0,999999, 0,999999 или более, но менее 1.
В другом варианте реализации степень родства между указанным вариантом штамма и исходным штаммом определяют как степень подобия, полученную при анализе геномов исходного штамма и варианта штамма с помощью гель-электрофореза в градиенте пульсирующего поля (PFGE) с применением одной или более эндонуклеаз рестрикции. Степень подобия, полученную с помощью PFGE, можно измерить с помощью коэффициента подобия Дайса. В некоторых вариантах реализации коэффициент подобия Дайса между указанным вариантом и исходным штаммом составляет приблизительно 95%, приблизительно 96%, приблизительно 97%, приблизительно 98%, приблизительно 99%, приблизительно 99,1%, приблизительно 99,5%, приблизительно 99,6%, приблизительно 99,7%, приблизительно 99,8%, приблизительно 99,9%, приблизительно 99,99%, приблизительно 99,999%, приблизительно 99,9999%, приблизительно 99,99999%, приблизительно 99,999999% или более, но менее 100%.
В другом варианте реализации штамм считают вариантом данного исходного штамма, если оба штамма имеют одинаковый риботип, что определяют, применяя любой из способов, известных в данной области и описанных, например, в Bouchet и др. (Clin. Microbiol. Rev., 2008, 21:262-273).
В другом варианте реализации степень родства между указанным вариантом штамма и исходным штаммом представляет собой коэффициент корреляции Пирсона, полученный путем сравнения генетических профилей обоих штаммов, полученных с помощью ПЦР повторяющихся экстрагенных палиндромных элементов (ПЦР-ПЭПЭ) (см., например, Chou и Wang, Int J Food Microbiol. 2006, 110:135-48). В некоторых вариантах реализации коэффициент корреляции Пирсона, полученный путем сравнения профилей ПЦР-ПЭПЭ варианта штамма и исходного штамма, составляет приблизительно 0,99, 0,999, 0,9999, 0,99999, 0,999999, 0,999999 или более, но менее 1.
В другом варианте реализации степень родства между указанным вариантом штамма и исходным штаммом представляет собой генетическое расстояние между ними, полученное путем сравнения генетических профилей обоих штаммов, полученных с помощью мультилокусного секвенирования (МЛСТ) (см., например, Maiden, М.С., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:3140-3145). В некоторых вариантах реализации генетическое расстояние между вариантом штамма и исходным штаммом, полученное с помощью МЛСТ, составляет приблизительно 0,99, 0,999, 0,9999, 0,99999, 0,999999, 0,999999 или более, но менее 1.
В предпочтительном варианте реализации указанный вариант и исходный штамм относятся к одному роду. В еще более предпочтительном варианте реализации указанный вариант и исходный штамм относятся к одному виду или подвиду.
Термин "способность поглощать холестерин" в данном тексте относится к свойству, с помощью которого штамм способен захватывать холестерин и включать его в структуру бактериальной клетки. Для специалиста в данной области будет очевидно, что в данной области существует множество методик, подходящих для определения способности клетки поглощать холестерин. Они включают, без ограничения, способ, описанный в разделе Примеры настоящей заявки на патент, который основан на обнаружении с помощью флуориметрии или флуороцитометрии включения флуорестерола или NBD-холестерина, который представляет собой аналог холестерина формулы (I), из мицелл в бактерии.
Варианты, подходящие для применения в настоящем изобретении, включают такие варианты, которые обладают способностью поглощать холестерин, составляющей по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99%, по меньшей мере 100%, по меньшей мере 110%, по меньшей мере 120%, по меньшей мере 130%, по меньшей мере 140%, по меньшей мере 150% или более от способности поглощать холестерин штамма, из которого они получены.
В некотором варианте реализации пробиотический штамм согласно настоящему изобретению представлен в виде жизнеспособных клеток. В другом конкретном варианте реализации пробиотический штамм согласно настоящему изобретению представлен в виде нежизнеспособных клеток. Термин "жизнеспособность" в данном тексте относится к способности клетки поддерживать свое функционирование или восстанавливать свои потенциальные возможности и выживать до тех пор, пока она способна делиться. Таким образом клетка, которая является жизнеспособной, представляет собой клетку, которая способна выживать и делиться; и наоборот, клетка, которая является нежизнеспособной, представляет собой клетку, которая не способна выживать и делиться. Должно быть очевидно, что нежизнеспособные клетки включают погибшие клетки.
Жизнеспособность можно определить с помощью множества анализов, которые стандартны в данной области. Такие анализы включают анализы цитолиза или протечки мембраны, такие как анализ лактатдегидрогеназы, анализ с йодидом пропидия, анализ с трипановым синим и анализ с 7-аминоактиномицином D, а также геномные и протеомные анализы, которые позволяют протестировать активацию стрессорных путей, применяя ДНК-микрочипы и белковые чипы.
Пробиотический штамм согласно настоящему изобретению обладает жизнеспособностью, составляющей 0%, или по меньшей мере 5%, или по меньшей мере 10%, или по меньшей мере 15%, или по меньшей мере 20%, или по меньшей мере 25%, или по меньшей мере 30%, или по меньшей мере 35%, или по меньшей мере 40%, или по меньшей мере 45%, или по меньшей мере 50%, или по меньшей мере 55%, или по меньшей мере 60%, или по меньшей мере 65%, или по меньшей мере 70%, или по меньшей мере 75%, или по меньшей мере 80%, или по меньшей мере 85%, или по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 95% или 100%. Процент жизнеспособности клеток отражает процент клеток, которые способны поддерживать свое функционирование или восстанавливать свои потенциальные возможности и выживать до тех пор, пока они способны делиться. И наоборот, пробиотический штамм согласно настоящему изобретению обладает нежизнеспособностью, составляющей 100%, или по меньшей мере 95%, или по меньшей мере 90%, или по меньшей мере 85%, или по меньшей мере 80%, или по меньшей мере 75%, или по меньшей мере 70%, или по меньшей мере 65%, или по меньшей мере 60%, или по меньшей мере 55%, или по меньшей мере 50%, или по меньшей мере 45%, или по меньшей мере 40%, или по меньшей мере 35%, или по меньшей мере 30%, или по меньшей мере 25%, или по меньшей мере 20%, или по меньшей мере 15%, или по меньшей мере 10%, или по меньшей мере 5% или 0%. Процент нежизнеспособности клеток отражает процент клеток, которые неспособны поддерживать свое функционирование или восстанавливать свои потенциальные возможности и выживать до тех пор, пока они способны делиться.
В другом аспекте настоящего изобретения предложена биологически чистая культура пробиотического штамма согласно настоящему изобретению.
Термин "биологически чистая культура" в данном тексте относится к культуре, в которой бактерии согласно настоящему изобретению находятся в соотношении, равном 90% или более, например, 95% или более, 96% или более, 97% или более, 98% или более, 99% или более или 100%, по сравнению с другими организмами, присутствующими в данной культуре. Термин "культура" в данном тексте относится к популяции бактерий согласно настоящему изобретению. Культура может содержать другие элементы, отличные от бактерий согласно настоящему изобретению, такие как культуральная среда или любое другое вещество, которое можно добавить в культуральную среду, полезное для роста или поддержания культуры. Термин "культуральная среда" или "среда" известен в данной области и, как правило, относится к любому веществу или препарату, используемому для культивирования живых клеток. Термин "среда», если он используется по отношению к культуре клеток, включает компоненты среды, окружающей клетки. Среды могут быть твердыми, жидкими, газообразными или могут представлять собой смесь фаз и материалов. Среды включают жидкую ростовую среду, а также жидкие среды, которые не поддерживают рост клеток. Среды также включают гелеобразные среды, такие как матрицы из агара, агарозы, желатина и коллагена. Примеры газообразных сред включают газообразную фазу, воздействию которой подвергаются клетки, растущие на чашке Петри или другой твердой или полутвердой подложке. Термин "среда" также относится к материалу, который предназначен для применения в культуре клеток, даже если его еще не приводили в контакт с клетками. Другими словами, богатая питательными веществами жидкость, приготовленная для культивирования бактерий, является средой. Аналогично, порошкообразную смесь, которая после смешивания с водой или другой жидкостью становится подходящей для культивирования клеток, можно назвать "порошкообразной средой". "Среда определенного состава" относится к средам, которые получены из определенных (как правило, очищенных) химических компонентов. "Среда определенного состава" не содержит плохо охарактеризованные биологические экстракты, такие как дрожжевой экстракт и мясной бульон. "Обогащенная среда" включает среды, которые разработаны таким образом, чтобы они поддерживали рост большинства или всех жизнеспособных форм конкретного вида. Обогащенные среды часто содержат комбинированные биологические экстракты. В настоящем изобретении можно применять любую стандартную культуральную среду, подходящую для культур молочнокислых бактерий или бифидобактерий, известных в данной области, такую как, например, среда MRS, среда Хенкса, среда APT, среда RCM, среда LM17, среда BSM и среда Элликера.
В другом аспекте настоящего изобретения предложена фракция пробиотического штамма согласно настоящему изобретению, обогащенная клеточными мембранами или клеточными стенками.
Термин "обогащенная клеточными мембранами фракция" в данном тексте относится к препарату, полученному в результате процедур фракционирования клеток, в котором содержание клеточных мембран выше, чем в нефракционированных клетках. Аналогично, термин "обогащенная клеточными стенками фракция" в данном тексте относится к препарату, полученному в результате процедур фракционирования клеток, в котором содержание клеточных стенок выше, чем в нефракционированных клетках. Методики получения обогащенных клеточными мембранами фракций и обогащенных клеточными стенками фракций хорошо известны и стандартны в данной области и включают комбинацию методик гомогенизирования, таких как осмотическое гомогенизирование или физическое гомогенизирование с применением ступок, пестиков, измельчителей или ультразвука, и методик фракционирования, таких как центрифугирование.
Способы повышения способности микроорганизмов поглощать холестерин.
Авторы настоящего изобретения также определили, что, неожиданно, способность поглощать холестерин штамма СЕСТ 8605 L. reuteri V3401 и штамма СЕСТ 8606 В. breve ВТ820 можно вызвать или увеличить, подвергая клетки инактивации (пример 3). В качестве альтернативы, такой же эффект наблюдали, когда клетки растили при рН 6 или выше (пример 4).
Таким образом, в другом аспекте настоящего изобретения предложен способ получения пробиотического штамма, выбранного из L. reuteri V3401 с номером доступа СЕСТ 8605 и В. breve ВТ820 с номером доступа СЕСТ 8606, или варианта указанного штамма, обладающего способностью поглощать холестерин, с повышенной способностью поглощать холестерин, называемый далее в данном тексте "первым способом согласно настоящему изобретению", включающий этап инактивации указанных клеток или этап культивирования клеток при рН, равном 6 или выше.
Термины "способность поглощать холестерин", "пробиотический штамм", "L. reuteri V3401 с номером доступа СЕСТ 8605", "В. breve ВТ820 с номером доступа СЕСТ 8606" и "вариант" были подробно описаны в контексте пробиотического штамма согласно настоящему изобретению, и их определения и варианты реализации с ними включены в данную заявку посредством ссылки.
Первый способ согласно настоящему изобретению включает этап инактивации клеток. Для специалиста в данной области должно быть очевидно, что данный этап можно осуществить на культуре пробиотического штамма согласно настоящему изобретению или на выделенных клетках. Термин "инактивация клеток" в данном тексте относится к процессу превращения клетки из жизнеспособной в нежизнеспособную. Существуют различные способы определения того, является ли клетка жизнеспособной или нежизнеспособной, которые были описаны в контексте штамма согласно настоящему изобретению. Полученные в результате этого клетки состоят из 0% жизнеспособных клеток и 100% нежизнеспособных клеток, или по меньшей мере 1% жизнеспособных клеток и 99% нежизнеспособных клеток, или по меньшей мере 5% жизнеспособных клеток и 95% нежизнеспособных клеток, или по меньшей мере 10% жизнеспособных клеток и 90% нежизнеспособных клеток, или по меньшей мере 15% жизнеспособных клеток и 85% нежизнеспособных клеток, или по меньшей мере 20% жизнеспособных клеток и 80% нежизнеспособных клеток, или по меньшей мере 25% жизнеспособных клеток и 75% нежизнеспособных клеток, или по меньшей мере 30% жизнеспособных клеток и 70% нежизнеспособных клеток, или по меньшей мере 35% жизнеспособных клеток и 65% нежизнеспособных клеток, или по меньшей мере 40% жизнеспособных клеток и 60% нежизнеспособных клеток, или по меньшей мере 45% жизнеспособных клеток и 55% нежизнеспособных клеток, или по меньшей мере 50% жизнеспособных клеток и 50% нежизнеспособных клеток, или по меньшей мере 55% жизнеспособных клеток и 45% нежизнеспособных клеток, или по меньшей мере 60% жизнеспособных клеток и 40% нежизнеспособных клеток, или по меньшей мере 65% жизнеспособных клеток и 35% нежизнеспособных клеток, или по меньшей мере 70% жизнеспособных клеток и 30% нежизнеспособных клеток, или по меньшей мере 75% жизнеспособных клеток и 25% нежизнеспособных клеток, или по меньшей мере 80% жизнеспособных клеток и 20% нежизнеспособных клеток, или по меньшей мере 85% жизнеспособных клеток и 15% нежизнеспособных клеток, или по меньшей мере 90% жизнеспособных клеток и 10% нежизнеспособных клеток, или по меньшей мере 95% жизнеспособных клеток и 5% нежизнеспособных клеток, или по меньшей мере 99% жизнеспособных клеток и 1% нежизнеспособных клеток.
Существуют различные способы инактивации клеток, которые доступны в данной области, включая термическую инактивацию (инактивацию температурой), инактивацию микроволнами, инактивацию давлением, инактивацию кислотой, инактивацию основанием, инактивацию спиртом и инактивацию перекисью.
В некотором варианте реализации первого способа согласно настоящему изобретению инактивацию выбирают из группы, состоящей из термической инактивации, инактивации микроволнами, инактивации давлением, инактивации кислотой, инактивации основанием, инактивации спиртом и инактивации перекисью.
Термин "термическая инактивация" в данном тексте относится к инактивации клеток с применением высоких температур. Обычно этого добиваются путем повышения температуры клеток или среды, содержащей их, выше 50°С. Способы, подходящие для термической инактивации, хорошо известны в данной области и включают, без ограничения, способ, описанный в разделе Примеры, который состоит в инкубации культуры, содержащей пробиотический штамм согласно настоящему изобретению, при 120°С в течение 20 мин и предоставлении возможности культуре охладиться до комнатной температуры.
Термин "инактивация микроволнами (микроволновая инактивация)" в данном тексте относится к инактивации клеток с применением микроволн. Способы, подходящие для инактивации микроволнами, хорошо известны в данной области и включают, без ограничения, воздействие на клетки или среду, содержащую пробиотический штамм согласно настоящему изобретению, микроволнами с применением лабораторного микроволнового устройства. Например, инактивации можно добиться путем постепенного повышения в течение 3 мин мощности указанного устройства до 300 Вт и поддержания данных условий в течение дополнительных 5 мин.
Термин "инактивация давлением" в данном тексте относится к инактивации клеток с применением давления. Способы, подходящие для инактивации давлением, хорошо известны в данной области и включают, без ограничения, гомогенизирование, например, применяя гомогенизатор или френч-пресс. Например, инактивации клеток можно добиться, применяя гомогенизатор высокого давления при давлении 1500-2000 бар и 15-20 толчках/мин в течение 10 мин.
4
3
2
4
2
4
Термин "инактивация кислотой" в данном тексте относится к инактивации клеток путем снижения рН. Этого обычно добиваются путем добавления кислоты к клеткам или в среду, содержащую их, с последующей нейтрализацией клеток или среды. Для целей инактивации клетки предпочтительны сильные кислоты, которые включают без ограничения соляную кислоту (HCl), йодоводородную кислоту (HI), бромистоводородную кислоту (HBr), перхлорную кислоту (HClO), азотную кислоту (HNO) и серную кислоту (HSO). Сила кислоты относится к ее способности или склонности отдавать протон. Например, инактивации можно добиться путем добавления HSO к клеткам до достижения концентрации 80 мМ, инкубации клеток при 55°С в течение 4 ч и нейтрализации путем добавления 10 М NaOH до достижения рН, равного 7.
2
2
2
2
4
Аналогично термин "инактивация основанием" в данном тексте относится к инактивации клеток путем увеличения рН. Этого обычно добиваются путем добавления основания к клеткам или в среду, содержащую их, с последующей нейтрализацией клеток или среды. Для целей инактивации клетки предпочтительны сильные основания, которые включают, без ограничения, гидроксид калия (КОН), гидроксид бария [Ва(ОН)], гидроксид цезия (CsOH), гидроксид натрия (NaOH), гидроксид стронция [Sr(OH)], гидроксид кальция [Са(ОН)], гидроксид лития (LiOH) и гидроксид рубидия (RbOH). Сила основания относится к его способности депротонировать кислоту. Например, инактивации можно добиться путем добавления NaOH к клеткам до достижения концентрации 80 мМ, инкубации клеток при 55°С в течение 4 ч и нейтрализации путем добавления 96% HSO до достижения рН, равного 7.
2
2
2
2
2
2
2
2-
Термин "инактивация перекисью" в данном тексте относится к инактивации клеток с применением перекиси. Перекись представляет собой соединение, содержащее одинарную связь кислород-кислород или пероксидный анион О, и включает перекись водорода (HO), супероксиды, диоксигенилы, озоны и озониды. Например, инактивации клеток можно добиться путем инкубации клеток в 1,5% (в объемном отношении) НО при 37°С в течение 1 ч. Затем НО расщепляют путем обработки клеток каталазой.
Термин "инактивация спиртом" в данном тексте относится к инактивации клеток с применением спирта. Спирт представляет собой органическое гидроксильное соединение с функциональной группой -ОН, связанной с насыщенным атомом углерода, и включает этанол, метанол, изопропанол, бутанол. Например, инактивации клеток можно добиться путем получения разведения 1:1 культуры клеток в 96% этаноле и инкубации при 37°С в течение 1 ч. Затем этанол удаляют путем выпаривания в роторном испарителе, или Rotavap.
В предпочтительном варианте реализации инактивация представляет собой термическую инактивацию.
В результате этапа инактивации клетки пробиотического штамма согласно настоящему изобретению становятся нежизнеспособными или даже погибают.
В качестве альтернативы первый способ согласно настоящему изобретению включает этап культивирования клеток при рН между 6 и 9 во время фазы их активного роста.
Для того, чтобы растить клетки согласно данному альтернативному варианту реализации первого способа согласно настоящему изобретению, необходимо, чтобы рН культуральной среды находился между 6 и 9, предпочтительно между 6 и 8,5, более предпочтительно между 6 и 8, еще более предпочтительно между 6 и 7,5, еще более предпочтительно между 6 и 7, или еще более предпочтительно между 6 и 6,5. В некотором варианте реализации рН равен 6.
Специалист в данной области, используя известный уровень техники, сразу же поймет, что рН между 6 и 9 можно получить, применяя среду с таким рН. Среды с рН внутри данного диапазона хорошо известны в данной области, но рН между 6 и 9 также можно получить в любой среде путем подведения рН с помощью подходящей кислоты, такой как HCl, или основания, такого как NaOH.
В другом конкретном варианте реализации первый способ согласно настоящему изобретению включает этап культивирования клеток при рН, равном от 6 до 9, и дополнительно включает этап инактивации указанных клеток.
Термин "фаза активного роста" в данном тексте относится к стадии роста бактерий, характеризуемой увеличением общей биомассы или количества клеток. Бактериальный рост можно представить в виде кривой роста, которая обычно изображает log количества клеток в зависимости от времени. Рост бактерий в культуре, выращиваемой в замкнутом объеме, можно смоделировать с четырьмя различными фазами:
- Лаг-фаза, во время которой бактерии адаптируются к условиям роста, и скорость увеличения количества клеток минимальна.
- Log-фаза или экспоненциальная фаза, характеризуемая скоростью роста, которая постепенно увеличивается (ранняя log/экспоненциальная фаза) до тех пор, пока не станет постоянной и максимальной для конкретных условий роста.
- Стационарная фаза, характеризуемая скоростью роста, которая снижается (ранняя стационарная фаза) и в конечном счете достигает нуля.
- Фаза гибели, во время которой количество жизнеспособных клеток в культуре снижается.
Таким образом специалист в данной области сразу же поймет, что фаза активного роста начинается с ранней log/экспоненциальной фазы и заканчивается ранней стационарной фазой.
Бактериальный рост можно измерить путем отслеживания количества клеток, путем измерения увеличения сухого веса биомассы, образованной в данный промежуток времени, путем отслеживания поглощения и метаболизма (или высвобождения) определенных веществ и путем измерения количества радиоактивного метаболита, внедренного в биомассу, в заданный момент времени. Обычно, количество клеток измеряют путем определения концентрации бактерий в суспензии путем измерения оптической плотности с помощью спектрофотометра; как правило для данной цели используют OD600.
Клетки, полученные в результате первого способа согласно настоящему изобретению, обладают способностью поглощать холестерин, которая повышена по сравнению с таковой у клеток, которые не подвергали инактивации.
Термин "повышенная способность поглощать холестерин" в данном тексте относится к способности поглощать холестерин, которая составляет по меньшей мере 101%, по меньшей мере 105%, по меньшей мере 110%, по меньшей мере 120%, по меньшей мере 130%, по меньшей мере 140%, по меньшей мере 150%, по меньшей мере 160%, по меньшей мере 170%, по меньшей мере 180%, по меньшей мере 190%, по меньшей мере 200%, по меньшей мере 250%, по меньшей мере 300%, по меньшей мере 500%, по меньшей мере 1000% или более от таковой, проявляемой клеткой, которая не была подвергнута инактивации. Способы, подходящие для определения способности клетки поглощать холестерин, включают способ, описанный в разделе Примеры настоящей заявки на патент, который основан на обнаружении с помощью флуориметрии или флуороцитометрии включения флуорестерола из мицелл в бактерии.
В настоящем изобретении также предложена клетка, полученная с помощью первого способа согласно настоящему изобретению.
Таким образом в другом аспекте настоящего изобретения предложена клетка, которая получена с помощью способа повышения способности поглощать холестерин пробиотического штамма, выбранного из L. reuteri V3401 с номером доступа СЕСТ 8605 и В. breve ВТ820 с номером доступа СЕСТ 8606, или варианта указанного штамма, обладающего способностью поглощать холестерин, включающего этап инактивации указанных клеток.
В другом аспекте настоящего изобретения предложена клетка, которая получена с помощью способа повышения способности поглощать холестерин пробиотического штамма, выбранного из L. reuteri V3401 с номером доступа СЕСТ 8605 и В. breve ВТ820 с номером доступа СЕСТ 8606, или варианта указанного штамма, обладающего способностью поглощать холестерин, включающего этап культивирования указанных клеток при рН, равном 6 или выше.
Неожиданно, авторы настоящего изобретения также наблюдали, что клетки с существующей способностью поглощать холестерин можно модифицировать для того, чтобы повысить их способность поглощать холестерин. Указанную модификацию осуществляют путем инкубации клеток с экстрактом клеток, полученным из штамма СЕСТ 8605 L. reuteri V3401, как показано в примере 7. Обнаружили, что агент, вызывающий такую повышенную способность поглощать холестерин, представляет собой фермент с активностью муреингидролазы. Без привязки к какой-либо конкретной теории, предполагают, что пептидогликангидролаза играет роль в пермеабилизации клеточной стенки микроорганизма, обладающего способностью поглощать холестерин, или в повышении аффинности его клеточной стенки к содержащим холестерин мицеллам. Это приведет к тому, что микроорганизм поглощает повышенное количество холестерина. Более того, данный эффект, похоже, специфичен для пептидогликангидролазы, экспрессируемой штаммом СЕСТ 8605 L. reuteri V3401.
Таким образом, в другом аспекте настоящего изобретения предложен способ получения микроорганизма с повышенной способностью поглощать холестерин, называемый далее в данном тексте "второй способ согласно настоящему изобретению", включающий осуществление контакта микроорганизма, обладающего способностью поглощать холестерин, с композицией, содержащей фермент с активностью пептидогликангидролазы.
Термины "способность поглощать холестерин" и "повышенная способность поглощать холестерин" были подробно описаны в контексте пробиотического штамма согласно настоящему изобретению и первого способа согласно настоящему изобретению, и их определения и варианты реализации с ними включены в данную заявку посредством ссылки.
Второй способ согласно настоящему изобретению включает этап осуществления контакта микроорганизма, обладающего способностью поглощать холестерин, с композицией, содержащей пептидогликангидролазу.
Термин "микроорганизм" в данном тексте относится к микроскопическому организму, который может представлять собой отдельную клетку или многоклеточный организм, а также может представлять собой прокариотический или эукариотический организм со способностью поглощать холестерин. Способы определения того, обладает ли микроорганизм способностью поглощать холестерин, были подробно описаны в контексте пробиотического штамма согласно настоящему изобретению и включены в данную заявку посредством ссылки.
В конкретном варианте реализации микроорганизм, обладающий способностью поглощать холестерин, является прокариотическим. В другом конкретном варианте реализации микроорганизм, обладающий способностью поглощать холестерин, является эукариотическим.
В предпочтительном варианте реализации микроорганизм, обладающий способностью поглощать холестерин, представляет собой бактерию штамма СЕСТ 8605 L. reuteri V3401. В другом предпочтительном варианте реализации микроорганизм, обладающий способностью поглощать холестерин, представляет собой бактерию СЕСТ 8606 штамма В. breve ВТ820.
Для целей настоящего изобретения композиция, контактирующая с микроорганизмом, обладающим способностью поглощать холестерин, содержит пептидогликангидролазу. Термин "пептидогликангидролаза" или "муреингидролаза" в данном тексте относится к ферменту, который катализирует гидролиз пептидогликанов, т.е. к ферменту, способному расщеплять ковалентные связи в пептидогликановых каркасах или их фрагментах. Физиологические функции данных ферментов включают регуляцию роста клеточной стенки, разделение дочерних клеток в процессе деления клеток и автолиза и метаболизм пептидогликанов в процессе роста, при этом продукты метаболизма служат в качестве сигнальных молекул для распознавания бактерий другими организмами и, в некоторых бактериях, для индукции β-лактамазы. Специальные гидролазы расширяют поры в пептидогликане для сборки больших комплексов, проходящих через оболочку (ресничек, жгутиков, систем секреции), или они специфично расщепляют пептидогликан в процессе споруляции или прорастания спор. Более того, пептидогликангидролазы участвуют в явлении лизиса, таком как фратрицид или лизис в процессе развития, происходящем в популяциях бактерий.
Активность пептидогликангидролазы относится к гидролизу амидной, пептидной и гликозидной связей в пептидогликане. Различные пептидогликангидролазы, а также соответствующие сайты расщепления, описаны у Vollmer и др., 2008 (Vollmer и др., 2008, FEMS Microbiol Rev 32:259-86). Вкратце, пептидогликангидролазы включают следующие ферменты:
- N-ацетилмурамил-L-аланинамидазы, которые гидролизуют амидную связь между MurNAc и N-концевым остатком L-аланина основного пептида. Они включают некоторые амидазы (anhAmi), специфично расщепляющие остатки 1,6-ангидро-MurNAc.
- Карбоксипептидазы, которые гидролизуют пептидные связи, чтобы удалить С-концевые D- или L-аминокислоты. Они включают DD-карбоксипептидазу, LD-карбоксипептидазу и DL-карбоксипептидазу.
- Эндопептидазы, которые расщепляют амидные связи в указанных пептидах. Они включают DD-эндопептидазу, LD-эндопептидазу и DL-эндопептидазу.
- Гликозидазы, которые расщепляют цепи гликана. Существует три типа гликозидаз:
a) N-ацетил-глюкозаминидазы, которые гидролизуют гликозидную связь между остатками N-ацетил-β-D-глюкозамина и примыкающими моносахаридами,
b) лизоцимы, и
c) литические трансгликозилазы,
Лизоцимы и литические трансгликозилазы также в совокупности известны как N-ацетил-β-D-мурамидазы (мурамидазы) и расщепляют ту же гликозидную связь, т.е. β-1,4-гликозидную связь между остатками MurNAc и GlcNAc в пептидогликане (фиг. 1В).
Активность пептидогликангидролазы зачастую специфична для определенного типа пептидогликана, для присутствия или отсутствия вторичных модификаций или для высокомолекулярного пептидогликана или малых фрагментов. Таким образом, пептидогликангидролазу выбирают из группы, состоящей из N-ацетилмурамил-L-аланинамидазы, карбоксипептидазы, эндопептидазы или гликозидазы.
В некотором варианте реализации пептидогликангидролаза представляет собой N-ацетилмурамил-L-аланинамидазу. В другом конкретном варианте реализации пептидогликангидролаза представляет собой карбоксипептидазу. В другом конкретном варианте реализации пептидогликангидролаза представляет собой эндопептидазу. В другом конкретном варианте реализации пептидогликангидролаза представляет собой гликозидазу, выбранную из группы, состоящей из N-ацетил-глюкозаминидазы, лизоцима и литической трансгликозилазы.
В предпочтительном варианте реализации гликозидаза представляет собой N-ацетил-глюкозаминидазу. В другом предпочтительном варианте реализации гликозидаза представляет собой лизоцим. В другом предпочтительном варианте реализации гликозидаза представляет собой литическую трансгликозилазу.
В другом конкретном варианте реализации пептидогликангидролаза представляет собой пептидогликангидролазу, специфичную для штамма СЕСТ 8605 L. reuteri V3401.
Для того, чтобы пептидогликангидролаза оказала свое действие в отношении повышения способности поглощать холестерин у микроорганизма, обладающего способностью поглощать холестерин, необходимо привести в контакт пептидогликангидролазу с указанным организмом. Для специалиста в данной области сразу будет очевидно, что этап приведения в контакт можно осуществить различными путями. Один из таких путей представляет собой рекомбинантную экспрессию пептидогликангидролазы в указанном организме.
Таким образом, в некотором варианте реализации композиция, содержащая пептидогликангидролазу, представляет собой экстракт из организма, который экспрессирует указанную пептидогликангидролазу.
Рекомбинантную экспрессию пептидогликангидролазы можно осуществить, применяя способы, которые стандартны в данной области. Предпочтительно, последовательность нуклеотидов, кодирующая пептидогликангидролазу, также кодирует любой встречающийся в природе сигнальный пептид, который может содержать данный фермент. Например, последовательность нуклеотидов может быть функционально связана с последовательностями, регулирующими экспрессию, таким образом образуя генетическую конструкцию или кассету экспрессии. В данном тексте термин "функционально связанный" означает, что пептидогликангидролаза, кодируемая указанной последовательностью нуклеотидов, экспрессируется в правильной рамке считывания под контролем контролирующей последовательности или регулирующей экспрессию последовательности. Кассету экспрессии согласно настоящему изобретению можно получить с помощью методик молекулярной биологии, которые хорошо известны в данной области. Контролирующие последовательности представляют собой последовательности, которые контролируют и регулируют транскрипцию и, когда это применимо, трансляцию указанной пептидогликангидролазы, и включают последовательности промотора, последовательности, кодирующие регуляторы транскрипции, связывающие рибосому последовательности (RBS) и/или последовательности терминаторов транскрипции. Промоторы, подходящие в контексте настоящего изобретения, включают, без ограничения, индуцируемые и конститутивные промоторы. Кассета экспрессии может дополнительно содержать энхансер, который может примыкать к последовательности промотора или находиться на некотором расстоянии от нее и может осуществлять свою функцию повышения уровня транскрипции. В некотором варианте реализации указанная контролирующая экспрессию последовательность функциональна в прокариотических клетках. В другом конкретном варианте реализации указанная контролирующая экспрессию последовательность функциональна в эукариотических клетках.
Предпочтительно, кассета экспрессии дополнительно содержит маркер или ген, кодирующий мотив или фенотип, который позволяет осуществить селекцию клетки-хозяина, трансформированной указанной кассетой экспрессии. Наглядные примеры указанных маркеров, которые могут присутствовать в кассете экспрессии согласно настоящему изобретению, включают гены устойчивости к антибиотику, гены устойчивости к токсичным соединениям и вообще все гены, которые позволяют осуществить селекцию генетически трансформированных клеток.
Кассету экспрессии можно встроить в подходящий вектор. Выбор вектора будет зависеть от клетки-хозяина, в которую его впоследствии будут внедрять, т.е. от микроорганизма, обладающего способностью поглощать холестерин. Для наглядности, вектор, в который внедрена указанная последовательность нуклеиновой кислоты, может представлять собой плазмиду или вектор, который после внедрения в клетку-хозяина встраивается или не встраивается в геном указанной клетки. Получение указанного вектора экспрессии можно осуществить с помощью обычных способов, известных специалистам в данной области. В некотором варианте реализации указанный рекомбинантный вектор представляет собой вектор, полезный для трансформации прокариотических клеток. В некотором варианте реализации указанный рекомбинантный вектор представляет собой вектор, полезный для трансформации эукариотических клеток.
Вектор, содержащий последовательность, кодирующую пептидогликангидролазу, можно применять для трансформации, трансфекции или инфекции клеток микроорганизма, обладающего способностью поглощать холестерин. Трансформированные, трансфицированные или инфицированные клетки можно получить с помощью обычных способов, известных специалистам в данной области. Такие клетки могут быть прокариотическими или эукариотическими. Следовательно, полученная в результате этого трансформированная, трансфицированная или инфицированная клетка содержит последовательность, кодирующую пептидогликангидролазу.
Генетическая конструкция, кассета и вектор экспрессии, содержащие последовательность, кодирующую пептидогликангидролазу, также представляют собой аспекты настоящего изобретения.
Как только в микроорганизм, обладающий способностью поглощать холестерин, внедрили вектор экспрессии, содержащий последовательность пептидогликангидролазы, указанную пептидогликангидролазу можно рекомбинантно экспрессировать с помощью обычных способов, известных специалисту в данной области. Например, рекомбинантная экспрессия пептидогликангидролазы может быть индуцируемая или конститутивная. Предпочтительно, полученная путем рекомбинантной экспрессии пептидогликангидролаза секретируется.
Таким образом, полученная путем рекомбинантной экспрессии пептидогликангидролаза образует часть композиции, предпочтительно внеклеточной, которая находится в контакте с микроорганизмом, обладающим способностью поглощать холестерин, тем самым проявляя свою функцию повышения указанной способности поглощать холестерин.
Поскольку пептидогликангидролаза, отвечающая за повышение способности поглощать холестерин микроорганизма, обладающего способностью поглощать холестерин, похоже, специфично экспрессируется в штамме СЕСТ 8605 L. reuteri V3401, второй способ согласно настоящему изобретению также можно осуществить путем применения белкового экстракта, полученного из указанного штамма.
Таким образом, в другом конкретном варианте реализации композиция, содержащая пептидогликангидролазу, представляет собой белковый экстракт штамма СЕСТ 8605 L. reuteri V3401. Предпочтительно, клетки штамма СЕСТ 8605 L. reuteri V3401 культивируют при рН, равном 6 или выше.
Термин "белковый экстракт" в данном тексте относится к белковому содержимому клетки. В некоторых вариантах реализации белковый экстракт относится к "тотальному белковому экстракту" или "неочищенному белковому экстракту", который относится к совокупности белков, происходящих из штаммов согласно настоящему изобретению, и практически полному отсутствию фрагментов или обломков клеточных стенок и больших органелл. Согласно одному типичному варианту реализации тотальный белковый экстракт ткани можно получить путем добавления бактерий в лизирующий буфер, но настоящее изобретение не ограничено данным вариантом реализации. Тем не менее, тотальный белковый экстракт можно экстрагировать, применяя любой способ экстрагирования, известный в данной области.
Способы получения белкового экстракта стандартны и хорошо известны специалисту в данной области. Обычно белки переводят в раствор путем разрушения клеток, содержащих их. Существует несколько способов достижения этого, таких как повторное замораживание и оттаивание, разрушение ультразвуком, гомогенизация высоким давлением, фильтрация или пермеабилизация органическими растворителями.
В некоторых вариантах реализации белковый экстракт по меньшей мере частично фракционируют для того, чтобы обогатить активностью пептидогликангидролазы, тем самым получая "обогащенный пептидогликангидролазой экстракт". Для получения обогащенного пептидогликангидролазой экстракта можно применять любой подходящий способ, известный в данной области, такой как аффинная хроматография, ионообменная хроматография, фильтрация, ультрафильтрация, гель-фильтрация, электрофорез, солевая преципитация, диализ и т.д., которые подходящим образом выбирают и комбинируют, чтобы позволить разделение и очистку пептида. Степень обогащения активностью пептидогликангидролазы можно определить путем измерения специфичной активности пептидогликангидролазы в обогащенном экстракте (т.е. единиц активности пептидогликангидролазы на мг белка), при этом повышение активности по сравнению с активностью в неочищенном экстракте свидетельствует о том, что экстракт был обогащен активностью пептидогликангидролазы. В предпочтительном варианте реализации обогащенный пептидогликангидролазой экстракт содержит активность пептидогликангидролазы, которая составляет по меньшей мере 5%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 100% от активности, обнаруженной в неочищенном экстракте. В другом варианте реализации обогащенный пептидогликангидролазой экстракт содержит активность пептидогликангидролазы, которая по меньшей мере в 2 раза, в 3 раза, в 4 раза, в 5 раз, в 6 раз, в 7 раз, в 8 раз, в 9 раз, в 10 раз, в 100 раз, в 1000 раз, в 10000 раз или более больше, чем активность в неочищенном экстракте.
На этапе приведения в контакт второго способа согласно настоящему изобретению требуется, чтобы композиция, содержащая пептидогликангидролазу, контактировала с микроорганизмом, обладающим способностью поглощать холестерин, в течение количества времени, достаточного, чтобы позволить пептидогликану расщепиться. Этап приведения в контакт длится по меньшей мере 1 с, по меньшей мере 10 с, по меньшей мере 30 с, по меньшей мере 1 мин, по меньшей мере 5 мин, по меньшей мере 10 мин, по меньшей мере 30 мин, по меньшей мере 1 ч, по меньшей мере 2 ч, по меньшей мере 4 ч, по меньшей мере 6 ч, по меньшей мере 8 ч, по меньшей мере 10 ч, по меньшей мере 12 ч, по меньшей мере 24 ч или дольше.
Для того, чтобы определить, была ли повышена способность микроорганизма поглощать холестерин, для специалиста в данной области будет очевидно, что способность поглощать холестерин необходимо будет определить и сравнить со способностью поглощать холестерин того же микроорганизма, который не был подвергнут второму способу согласно настоящему изобретению. Способы определения способности клетки поглощать холестерин были описаны в контексте пробиотического штамма согласно настоящему изобретению и включены в данную заявку посредством ссылки.
В настоящем изобретении также предложена клетка, полученная с помощью второго способа согласно настоящему изобретению.
Таким образом, клетка, которая получена с помощью способа повышения способности поглощать холестерин микроорганизма, обладающего способностью поглощать холестерин, включающего осуществление контакта указанного микроорганизма с композицией, содержащей пептидогликангидролазу, представляет собой другой аспект настоящего изобретения.
Композиции и корма или продукты питания
Для специалиста в данной области сразу будет очевидно, что пробиотический штамм согласно настоящему изобретению особенно полезен как часть композиции, корма или продукта питания.
Таким образом, в другом аспекте настоящего изобретения предложена композиция, содержащая пробиотический штамм, выбранный из Lactobacillus reuteri V3401 с номером доступа СЕСТ 8605 и Bifidobacterium breve ВТ820 с номером доступа СЕСТ 8606, или вариант указанного штамма, обладающий способностью поглощать холестерин.
Термины "пробиотический штамм", "L. reuteri V3401 с номером доступа СЕСТ 8605", "В. breve ВТ820 с номером доступа СЕСТ 8606", "вариант" и "способность поглощать холестерин" были подробно описаны в контексте пробиотического штамма согласно настоящему изобретению, и их определения и варианты реализации с ними включены в данную заявку посредством ссылки.
В некотором варианте реализации композиция содержит смесь пробиотических штаммов согласно настоящему изобретению.
Предпочтительно указанная композиция содержит по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4 или более штаммов согласно настоящему изобретению, и при этом каждый из штаммов представлен в композиции в соотношении от 0,1% до 99,9%, предпочтительно от 1% до 99%, более предпочтительно от 10% до 90%. В другом варианте реализации композиция содержит любой из бактериальных штаммов согласно настоящему изобретению вместе с другим штаммом или смесью штаммов, при этом каждый из штаммов представлен в композиции в соотношении от 0,1% до 99,9%, предпочтительно от 1% до 99%, более предпочтительно от 10% до 90%. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложена композиция, которая содержит супернатант из культуры одного или более штаммов согласно настоящему изобретению. Предпочтительно супернатант представлен в композиции в соотношении от 0,1% до 99,9%, более предпочтительно от 1% до 99% и еще более предпочтительно от 10% до 90%.
В другом конкретном варианте реализации настоящее изобретение также относится к композиции из штаммов согласно настоящему изобретению в лиофилизированной, высушенной сублимацией или высушенной форме, которую можно получить с помощью любого обычного способа, известного в данной области.
В другом конкретном варианте реализации пробиотический штамм или смесь штаммов представлены в виде нежизнеспособных клеток.
В другом аспекте настоящего изобретения предложен корм или продукт питания, содержащий пробиотический штамм, выбранный из Lactobacillus reuteri V3401 с номером доступа СЕСТ 8605 и Bifidobacterium breve ВТ820 с номером доступа СЕСТ 8606, или вариант указанного штамма, обладающий способностью поглощать холестерин.
Термины "пробиотический штамм", "L. reuteri V3401 с номером доступа СЕСТ 8605", "в. breve ВТ820 с номером доступа СЕСТ 8606", "вариант" и "способность поглощать холестерин" были подробно описаны в контексте пробиотического штамма согласно настоящему изобретению, и их определения и варианты реализации с ними включены в данную заявку посредством ссылки.
В некотором варианте реализации корм или продукт питания содержит смесь пробиотических штаммов согласно настоящему изобретению.
Предпочтительно корм или продукт питания содержит по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4 или более штаммов согласно настоящему изобретению, и при этом каждый из штаммов представлен в композиции в соотношении от 0,1% до 99,9%, предпочтительно от 1% до 99%, более предпочтительно от 10% до 90%. В другом варианте реализации корм или продукт питания содержит любой из бактериальных штаммов согласно настоящему изобретению вместе с другим штаммом или смесью штаммов, при этом каждый из штаммов представлен в композиции в соотношении от 0,1% до 99,9%, предпочтительно от 1% до 99%, более предпочтительно от 10% до 90%. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен корм или продукт питания, который содержит супернатант из культуры одного или более штаммов согласно настоящему изобретению. Предпочтительно супернатант представлен в указанном корме или продукте питания в соотношении от 0,1% до 99,9%, более предпочтительно от 1% до 99% и еще более предпочтительно от 10% до 90%.
Лишь некоторые из примеров подходящих продуктов, которые можно применять в настоящем изобретении, представляют собой молоко, йогурт, сыр, творог, кисломолочные продукты, ферментированные продукты на молочной основе, ферментированные продукты на основе злаков, ферментированные мясные продукты, другие порошки на молочной основе или на основе злаков, составы для лечебного питания, мороженое, соки, хлеб, пироги или конфеты, составы кормов для животных, полусинтетические или синтетические диетические составы, составы для младенцев, составы для клинического питания, мороженое, соки, муку, хлеб, пироги, конфеты или жевательные резинки.
В другом варианте реализации корм или продукт питания, содержащий пробиотический штамм согласно настоящему изобретению, находится в лиофилизированной, высушенной сублимацией или высушенной форме, которую можно получить с помощью любого обычного способа, известного в данной области.
В другом варианте реализации корма или продукта питания пробиотический штамм или смесь штаммов представлены в виде нежизнеспособных клеток.
Применения в терапии
Авторы настоящего изобретения показали, что пробиотические штаммы согласно настоящему изобретению способны снижать поглощение флуорестерола клетками НТ-29, линией клеток энтероцитов, когда их культивируют совместно с содержащими флуорестерол мицеллами, как показано в Примере 1. Это происходило в результате конкурирования пробиотических клеток с клетками НТ-29 за захват мицелл (см. Пример 2). Данный эффект можно использовать для лечения заболеваний, в которых играет роль уровень холестерина в плазме, таких как дислипидемии. Авторы настоящего изобретения продемонстрировали, что прием пробиотических штаммов согласно настоящему изобретению снижает общий холестерин в плазме, показатель ЛПНП/ЛПВП и уровень гликемии в модели гиперхолестеринемии in vivo (см. Пример 8).
Таким образом, в другом аспекте настоящего изобретения предложен пробиотический штамм, выбранный из Lactobacillus reuteri V3401 с номером доступа СЕСТ 8605 и Bifidobacterium breve ВТ820 с номером доступа СЕСТ 8606, или вариант указанного штамма, обладающий способностью поглощать холестерин, для применения в качестве лекарственного средства.
В другом аспекте настоящего изобретения предложен пробиотический штамм, выбранный из Lactobacillus reuteri V3401 с номером доступа СЕСТ 8605 и Bifidobacterium breve ВТ820 с номером доступа СЕСТ 8606, или вариант указанного штамма, обладающий способностью поглощать холестерин, для применения для лечения и/или профилактики дислипидемии.
В качестве альтернативы данный аспект можно переформулировать как применение пробиотического штамма, выбранного из Lactobacillus reuteri V3401 с номером доступа СЕСТ 8605 и Bifidobacterium breve ВТ820 с номером доступа СЕСТ 8606, или варианта указанного штамма, обладающего способностью поглощать холестерин для производства лекарственного средства для лечения и/или профилактики дислипидемии. В качестве альтернативы данный аспект можно переформулировать как способ лечения и/или профилактики дислипидемии у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение пробиотического штамма, выбранного из Lactobacillus reuteri V3401 с номером доступа СЕСТ 8605 и Bifidobacterium breve ВТ820 с номером доступа СЕСТ 8606, или варианта указанного штамма, обладающего способностью поглощать холестерин.
The термины "пробиотический штамм", "L. reuteri V3401 с номером доступа СЕСТ 8605", "В. breve ВТ820 с номером доступа СЕСТ 8606", "вариант" и "способность поглощать холестерин" были подробно описаны в контексте пробиотического штамма согласно настоящему изобретению, и их определения и варианты реализации с ними включены в данную заявку посредством ссылки.
Термин "лечение" или "терапия" в данном тексте включает любой процесс, действие, применение, терапию или тому подобное, при которых субъекту (или пациенту), включая человека, предоставляют медицинскую помощь с целью улучшения состояния субъекта, непосредственно или опосредованно, или замедления прогрессирования состояния или расстройства у субъекта, или облегчения по меньшей мере одного симптома заболевания или расстройства, от которого лечат. В частности, термин лечение относится к введению пробиотического штамма, выбранного из Lactobacillus reuteri V3401 с номером доступа СЕСТ 8605 и Bifidobacterium breve ВТ820 с номером доступа СЕСТ 8606, или варианта указанного штамма, обладающего способностью поглощать холестерин, субъекту, у которого была диагностирована дислипидемия.
Термин "предотвращение", "предотвращать" или "предотвратить" в данном тексте относится к введению пробиотического штамма, выбранного из Lactobacillus reuteri V3401 с номером доступа СЕСТ 8605 и Bifidobacterium breve ВТ820 с номером доступа СЕСТ 8606, или варианта указанного штамма, обладающего способностью поглощать холестерин, субъекту, у которого не была диагностирована дислипидемия, но у которого обычно будут ожидать развитие указанного заболевания или повышенный риск указанного заболевания. Предупреждение состоит в предотвращении возникновения дислипидемии. Предупреждение может быть полным (например, полное отсутствие заболевания). Предупреждение также может быть частичным, таким что, например, проявление заболевания у субъекта меньше, чем таковое, которое могло бы произойти без введения ингибитора согласно настоящему изобретению. Предупреждение также относится к пониженной подверженности клиническому состоянию.
Термин "субъект" в данном тексте относится ко всем животным, классифицированным как млекопитающие и птицы, и включает, но не ограничен перечисленными: домашних и сельскохозяйственных животных, приматов и людей, например, людей, не относящихся к человеку приматов, коров, лошадей, свиней, овец, коз, собак, кошек, грызунов, цыплят, уток, гусей, лебедей, фазанов, голубей, горлиц или страусов. Предпочтительно пациент представляет собой мужчину или женщину любого возраста или расы.
Термин "дислипидемия" в данном тексте относится к аномальному количеству липидов и липопротеинов в крови, то есть, к количеству липидов, которое повышено или понижено по сравнению с нормальными значениями. Указанные липиды и липопротеины могут представлять собой:
- Холестерин, который в аномальных количествах может вызывать гиперхолестеринемию, включая семейную гиперхолестеринемию вследствие дефекта в хромосоме 19 (19р13.1 - 13.3), и гипохолестеринемию.
- Глицериды, такие как триглицериды, которые в аномальных количествах могут вызывать гипертриглицеридемию и гипотриглицеридемию.
- Липопротеины, такие как ЛПНП и ЛПВП, которые в аномальных количествах могут вызывать гиперлипопротеинемию и гиполипопротеинемию.
Пробиотический штамм согласно настоящему изобретению благодаря его способности поглощать холестерин особенно подходит для лечения дислипидемии, характеризуемой повышенными уровнями липидов или липопротеинов.
Таким образом, в конкретном варианте реализации дислипидемия представляет собой гиперхолестеринемию. Термин "гиперхолестеринемия" в данном тексте относится к любому патологическому состоянию, при котором уровни холестерина в крови повышены относительно клинически рекомендованных уровней. Например, если холестерин измеряют в виде липопротеинов низкой плотности (ЛПНП), то гиперхолестеринемия возможно присутствует, если измеренные уровни ЛПНП выше, например, чем приблизительно 70 мг/дл. В качестве альтернативы, если холестерин измеряют в виде свободного холестерина в плазме, то гиперхолестеринемия возможно присутствует, если измеренные уровни свободного холестерина выше, например, чем приблизительно 200-220 мг/дл.
В другом конкретном варианте реализации дислипидемия представляет собой гипертриглицеридемию. Термин "гипертриглицеридемия" в данном тексте относится к высоким уровням триглицеридов в крови. На основании уровней натощак диагностируют легкую и умеренную гипертриглицеридемию при уровнях триглицеридов, равных 150-999 мг/дл, и диагностируют тяжелую и очень тяжелую гипертриглицеридемию при уровнях триглицеридов свыше 1000 мг/дл.
В другом конкретном варианте реализации дислипидемия представляет собой гиперлипопротеинемию. Термин "гиперлипопротеинемия" в данном тексте относится к аномально повышенным уровням любого липопротеина в крови. Липопротеины включают хиломикроны, липопротеины очень низкой плотности (ЛПОНП), ЛПНП и липопротеины промежуточной плотности (ЛППП). Высокие уровни липопротеинов ассоциированы с атеросклерозом. Гиперлипопротеинемию подразделяют на пять следующих типов:
- Тип I: вызванная жиром гиперлипидемия или идиопатическая семейная гиперлипидемия, которая представляет собой редкое состояние, вызванное недостаточностью или аномальностью липазы, характеризуемое уровнем триглицеридов, равным 1000-10000 мг/дл и более.
- Тип II: семейная гипербеталипопротеинемия и эссенциальная семейная гиперхолестеринемия вследствие недостаточности рецепторов на поверхности клеток, характеризуемая повышенным холестерином и триглицеридами, повышенными липопротеинами низкой плотности (ЛПНП) и липопротеинами очень низкой плотности (ЛПОНП).
- Тип III: семейная гипербеталипопротеинемия туберозная ксантома, вызванная недостаточностью рецептора липопротеинов низкой плотности, характеризуемая повышенным холестерином и триглицеридами; повышенными липопротеинами промежуточной плотности.
- Тип IV: эндогенная гипертриглицеридемия и гипербеталипопротеинемия с идиопатической причиной, характеризуемая уровнями триглицеридов ниже, чем 1000 мг/дл, нормальным холестерином, повышенными ЛПОНП.
Тип V: смешанная гипертриглицеридемия, возникающая вследствие нарушенного клиренса триглицеридов, характеризуемая уровнями триглицеридов выше, чем 1000 мг/дл, повышенным холестерином, нормальными ЛПНП.
Поскольку различные дислипидемии вовлечены в инсулинорезистентность, вероятно вследствие низких уровней ЛПВП в крови, пробиотический штамм согласно настоящему изобретению также полезен для лечения инсулинорезистентности или метаболического синдрома.
Таким образом, в другом аспекте настоящего изобретения предложен пробиотический штамм, выбранный из Lactobacillus reuteri V3401 с номером доступа СЕСТ 8605 и Bifidobacterium breve ВТ820 с номером доступа СЕСТ 8606, или вариант указанного штамма, обладающий способностью поглощать холестерин, для применения для лечения и/или профилактики метаболического синдрома. В качестве альтернативы данный аспект можно переформулировать как применение пробиотического штамма, выбранного из Lactobacillus reuteri V3401 с номером доступа СЕСТ 8605 и Bifidobacterium breve ВТ820 с номером доступа СЕСТ 8606, или варианта указанного штамма, обладающего способностью поглощать холестерин, для производства лекарственного средства для лечения и/или профилактики метаболического синдрома. В качестве альтернативы данный аспект можно переформулировать как способ лечения и/или профилактики метаболического синдрома у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение ему пробиотического штамма, выбранного из Lactobacillus reuteri V3401 с номером доступа СЕСТ 8605 и Bifidobacterium breve ВТ820 с номером доступа СЕСТ 8606, или варианта указанного штамма, обладающего способностью поглощать холестерин.
Термин "метаболический синдром", или "синдром инсулинорезистентности", или "метаболический синдром X", или "кардиометаболический синдром", или "синдром X" в данном тексте относится к расстройству использования и запасания энергии, диагностированному по одновременному присутствию трех из пяти следующих патологических состояний: абдоминальное (центральное) ожирение, повышенное кровяное давление, повышенные уровни глюкозы в плазме натощак, гипертриглицеридемия и низкие уровни холестерина высокой плотности (ЛПВП). Метаболический синдром повышает риск развития сердечно-сосудистого заболевания, особенно сердечной недостаточности, и диабета.
В другом аспекте настоящего изобретения предложено применение пробиотического штамма, выбранного из Lactobacillus reuteri V3401 с номером доступа СЕСТ 8605 и Bifidobacterium breve ВТ820 с номером доступа СЕСТ 8606, или варианта указанного штамма, обладающего способностью поглощать холестерин, в качестве гипохолестеринемического агента.
Термин "гипохолестеринемический агент" в данном тексте относится к агенту, который вызывает снижение уровней холестерина в крови.
В другом аспекте настоящего изобретения предложена композиция, содержащая пробиотический штамм, выбранный из Lactobacillus reuteri V3401 с номером доступа СЕСТ 8605 и Bifidobacterium breve ВТ820 с номером доступа СЕСТ 8606, или вариант указанного штамма, обладающий способностью поглощать холестерин, для применения в качестве лекарственного средства.
В другом аспекте настоящего изобретения предложена композиция, содержащая пробиотический штамм, выбранный из Lactobacillus reuteri V3401 с номером доступа СЕСТ 8605 и Bifidobacterium breve ВТ820 с номером доступа СЕСТ 8606, или вариант указанного штамма, обладающий способностью поглощать холестерин, для применения для лечения и/или профилактики дислипидемии.
В качестве альтернативы данный аспект можно переформулировать как применение композиции, содержащей пробиотический штамм, выбранный из Lactobacillus reuteriV3401 с номером доступа СЕСТ 8605 и Bifidobacterium breve ВТ820 с номером доступа СЕСТ 8606, или вариант указанного штамма, обладающий способностью поглощать холестерин, для производства лекарственного средства для лечения и/или профилактики дислипидемии. В качестве альтернативы данный аспект можно переформулировать как способ лечения и/или профилактики дислипидемии у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение композиции, содержащей пробиотический штамм, выбранный из Lactobacillus reuteri V3401 с номером доступа СЕСТ 8605 и Bifidobacterium breve ВТ820 с номером доступа СЕСТ 8606, или вариант указанного штамма, обладающий способностью поглощать холестерин.
В другом аспекте настоящего изобретения предложена композиция, содержащая пробиотический штамм, выбранный из Lactobacillus reuteriV3401 с номером доступа СЕСТ 8605 и Bifidobacterium breve ВТ820 с номером доступа СЕСТ 8606, или вариант указанного штамма, обладающий способностью поглощать холестерин, для применения для лечения и/или профилактики метаболического синдрома. В качестве альтернативы данный аспект можно переформулировать как применение композиции, содержащей пробиотический штамм, выбранный из Lactobacillus reuteri V3401 с номером доступа СЕСТ 8605 и Bifidobacterium breve ВТ820 с номером доступа СЕСТ 8606, или вариант указанного штамма, обладающий способностью поглощать холестерин, для производства лекарственного средства для лечения и/или профилактики метаболического синдрома. В качестве альтернативы данный аспект можно переформулировать как способ лечения и/или профилактики метаболического синдрома у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение композиции, содержащей пробиотический штамм, выбранный из Lactobacillus reuteri V3401 с номером доступа СЕСТ 8605 и Bifidobacterium breve ВТ820 с номером доступа СЕСТ 8606, или вариант указанного штамма, обладающий способностью поглощать холестерин.
В другом аспекте настоящего изобретения предложено применение композиции, содержащей пробиотический штамм, выбранный из Lactobacillus reuteri V3401 с номером доступа СЕСТ 8605 и Bifidobacterium breve ВТ820 с номером доступа СЕСТ 8606, или вариант указанного штамма, обладающий способностью поглощать холестерин, в качестве гипохолестеринемического агента.
Термины "пробиотический штамм", "L. reuteri V3401 с номером доступа СЕСТ 8605", "В. breve ВТ820 с номером доступа СЕСТ 8606", "вариант", "способность поглощать холестерин", "дислипидемия", "метаболический синдром" и "гипохолестеринемический агент" были подробно описаны ранее, и их определения и варианты реализации с ними включены в данную заявку посредством ссылки.
В другом аспекте настоящего изобретения предложен корм или продукт питания, содержащий пробиотический штамм, выбранный из Lactobacillus reuteri V3401 с номером доступа СЕСТ 8605 и Bifidobacterium breve ВТ820 с номером доступа СЕСТ 8606, или вариант указанного штамма, обладающий способностью поглощать холестерин, для применения в качестве лекарственного средства.
В другом аспекте настоящего изобретения предложен корм или продукт питания, содержащий пробиотический штамм, выбранный из Lactobacillus reuteri V3401 с номером доступа СЕСТ 8605 и Bifidobacterium breve ВТ820 с номером доступа СЕСТ 8606, или вариант указанного штамма, обладающий способностью поглощать холестерин, для применения для лечения и/или профилактики дислипидемии.
В качестве альтернативы данный аспект можно переформулировать как применение корма или продукта питания, содержащего пробиотический штамм, выбранный из Lactobacillus reuteri V3401 с номером доступа СЕСТ 8605 и Bifidobacterium breve ВТ820 с номером доступа СЕСТ 8606, или вариант указанного штамма, обладающий способностью поглощать холестерин, для производства лекарственного средства для лечения и/или профилактики дислипидемии. В качестве альтернативы данный аспект можно переформулировать как способ лечения и/или профилактики дислипидемии у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение корма или продукта питания, содержащего пробиотический штамм, выбранный из Lactobacillus reuteriV3401 с номером доступа СЕСТ 8605 и Bifidobacterium breve ВТ820 с номером доступа СЕСТ 8606, или вариант указанного штамма, обладающий способностью поглощать холестерин.
В другом аспекте настоящего изобретения предложен корм или продукт питания, содержащий пробиотический штамм, выбранный из Lactobacillus reuteri V3401 с номером доступа СЕСТ 8605 и Bifidobacterium breve ВТ820 с номером доступа СЕСТ 8606, или вариант указанного штамма, обладающий способностью поглощать холестерин, для применения для лечения и/или профилактики метаболического синдрома. В качестве альтернативы данный аспект можно переформулировать как применение корма или продукта питания, содержащего пробиотический штамм, выбранный из Lactobacillus reuteri V3401 с номером доступа СЕСТ 8605 и Bifidobacterium breve ВТ820 с номером доступа СЕСТ 8606, или вариант указанного штамма, обладающий способностью поглощать холестерин, для производства лекарственного средства для лечения и/или профилактики метаболического синдрома. В качестве альтернативы данный аспект можно переформулировать как способ лечения и/или профилактики метаболического синдрома у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение корма или продукта питания, содержащего пробиотический штамм, выбранный из Lactobacillus reuteri V3401 с номером доступа СЕСТ 8605 и Bifidobacterium breve ВТ820 с номером доступа СЕСТ 8606, или вариант указанного штамма, обладающий способностью поглощать холестерин.
В другом аспекте настоящего изобретения предложено применение корма или продукта питания, содержащего пробиотический штамм, выбранный из Lactobacillus reuteri V3401 с номером доступа СЕСТ 8605 и Bifidobacterium breve ВТ820 с номером доступа СЕСТ 8606, или вариант указанного штамма, обладающий способностью поглощать холестерин, в качестве гипохолестеринемического агента.
Термины "пробиотический штамм", "L. reuteri V3401 с номером доступа СЕСТ 8605", "B. breve ВТ820 с номером доступа СЕСТ 8606", "вариант", "способность поглощать холестерин", "дислипидемия", "метаболический синдром" и "гипохолестеринемический агент" были подробно описаны ранее, и их определения и варианты реализации с ними включены в данную заявку посредством ссылки.
Фармацевтические продукты.
Для специалиста в данной области сразу будет очевидно, что пробиотический штамм согласно настоящему изобретению особенно полезен как компонент фармацевтического продукта.
Таким образом, в другом аспекте настоящего изобретения предложен фармацевтический продукт, содержащий терапевтически эффективное количество пробиотического штамма, выбранного из Lactobacillus reuteri V3401 с номером доступа СЕСТ 8605 и Bifidobacterium breve ВТ820 с номером доступа СЕСТ 8606, или варианта указанного штамма, обладающего способностью поглощать холестерин.
Термины "пробиотический штамм", "L. reuteri V3401 с номером доступа СЕСТ 8605", "B. breve ВТ820 с номером доступа СЕСТ 8606", "вариант" и "способность поглощать холестерин" были подробно описаны в контексте пробиотического штамма согласно настоящему изобретению, и их определения и варианты реализации с ними включены в данную заявку посредством ссылки.
Термин "терапевтически эффективное количество" в данном тексте относится к количеству пробиотического штамма согласно настоящему изобретению, необходимому для того, чтобы добиться профилактики, излечения, замедления, уменьшения тяжести или снижения выраженности одного или более заметных симптомов дислипидемии, инсулинорезистентности или метаболического синдрома. Термины дислипидемия, инсулинорезистентность и метаболический синдром были подробно описаны в контексте применений в терапии согласно настоящему изобретению, и их определения и особенности также включены в данную заявку посредством ссылки. Терапевтически эффективное количество пробиотического штамма согласно настоящему изобретению можно определить с помощью способов, которые стандартны в данной области.
В некотором варианте реализации фармацевтическая композиция содержит смесь пробиотических штаммов согласно настоящему изобретению.
Предпочтительно фармацевтическая композиция содержит по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4 или более штаммов согласно настоящему изобретению, и при этом каждый из штаммов представлен в композиции в соотношении от 0,1% до 99,9%, предпочтительно от 1% до 99%, более предпочтительно от 10% до 90%. В другом варианте реализации композиция содержит любой из бактериальных штаммов согласно настоящему изобретению вместе с другим штаммом или смесью штаммов, при этом каждый из штаммов представлен в композиции в соотношении от 0,1% до 99,9%, предпочтительно от 1% до 99%, более предпочтительно от 10% до 90%. В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению предложен фармацевтический продукт, который содержит супернатант из культуры одного или более штаммов согласно настоящему изобретению. Предпочтительно указанный супернатант представлен в фармацевтическом продукте в соотношении от 0,1% до 99,9%, более предпочтительно от 1% до 99% и еще более предпочтительно от 10% до 90%.
В некотором варианте реализации фармацевтический продукт содержит смесь пробиотических штаммов согласно настоящему изобретению.
Фармацевтические продукты или композиции, предложенные в настоящем изобретении, можно вводить субъекту для лечения дислипидемии, инсулинорезистентности или метаболического синдрома. Термины дислипидемия, инсулинорезистентность и метаболический синдром были подробно описаны в контексте применений в терапии согласно настоящему изобретению, и их определения и особенности также включены в данную заявку посредством ссылки.
В другом конкретном варианте реализации фармацевтический продукт или композиция дополнительно содержит один или более носителей, вспомогательных веществ или фармацевтически приемлемых растворителей.
Предполагают, что в контексте настоящего изобретения термины "фармацевтически приемлемый носитель", или "фармацевтически приемлемый растворитель", или "фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество" включают любые и все растворители, дисперсионные среды, покрытия, противогрибковые агенты и тому подобные агенты, подходящие для фармацевтического введения. Применение таких носителей и сред для фармацевтически активных веществ хорошо известно в данной области, за исключением случаев, когда какой-либо обычный носитель несовместим с пробиотическим штаммом согласно настоящему изобретению. Стабилизаторы представляют собой приемлемые носители, вспомогательные вещества или растворители, которые нетоксичны для субъекта в используемых дозировках и при используемых концентрациях, и включают буферы, такие как фосфат, цитрат и другие органические кислоты; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как октадецилдиметилбензилхлорид аммония, хлорид гексаметония, хлорид бензалкония, хлорид бензэтония, фенол, бутиловый или бензиловый спирт, алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен, катехол, резорцинол, циклогексанол, 3-пентанол и м-крезол); низкомолекулярные полипептиды (длиной менее чем приблизительно 10 аминокислот); белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как ЭДТА; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противойоны, такие как натрий; комплексы металлов (например, комплексы Zn-белок) и/или неионогенные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN™, плюроники (PLURONICS™) или полиэтиленгликоль (ПЭГ).
Фармацевтические продукты или композиции, предложенные в настоящем изобретении, можно поместить в контейнер, упаковку или дозирующее устройство вместе с инструкциями по введению.
Фармацевтические составы можно заключить в форму таблеток, капсул, жидких суспензий бактерий, высушенных добавок для перорального применения, влажных добавок для перорального применения, сухого зондового питания или влажного зондового питания. Предпочтительно пробиотик, содержащая пробиотик или содержащая супернатант композиция и фармацевтический продукт направлены на поверхность слизистой рта, желудка и/или кишечника; тем не менее, они также могут быть направлены на слизистую носоглотки, дыхательных путей, репродуктивной системы или железистую слизистую оболочку, и их можно вводить субъекту пероральным, назальным, глазным, ректальным, топическим и/или вагинальным путем.
Необходимый размер дозировки указанных пробиотических штаммов в указанных композиции, корме или продукте питания или в фармацевтическом продукте, описанном ранее, будет изменяться в соответствии с природой расстройства или предполагаемым применением указанной композиции, и типом используемого организма.
5
12
6
11
6
10
Любую подходящую дозировку пробиотиков или их комбинаций можно применять в настоящем изобретении при условии, что токсичное действие не превышает терапевтическое действие. Терапевтическую эффективность и токсичность можно определить с помощью стандартных фармацевтических процедур с использованием экспериментальных животных, таких как вычисление статистики ED (доза, терапевтически эффективная для 50% популяции) или LD (доза, летальная для 50% популяции). Отношение доз токсичного к терапевтическому действию представляет собой терапевтический индекс, который можно выразить в виде отношения LD/ED. Тем не менее, активность новых штаммов в индивиде по природе зависит от дозы. То есть, чем больше новых штаммов внедряют посредством проглатывания или введения описанного выше питательного вещества или фармацевтической композиции, тем выше защитная и/или терапевтическая активность указанных штаммов. Поскольку штаммы согласно настоящему изобретению не наносят вреда людям и животным, то можно вводить большое их количество таким образом, что по существу большая часть слизистой индивида будет колонизирована указанными новыми штаммами. Предпочтительны композиции, для которых выявили большие терапевтические индексы. Результаты, полученные в исследованиях на животных, используют для разработки диапазона дозировок для применения у человека или животного. Дозировка, которая содержится в таких композициях, предпочтительно находится в диапазоне концентраций в крови, который содержит ED, при незначительной токсичности или отсутствии токсичности. Конкретная дозировка изменяется внутри данного диапазона в зависимости от используемой лекарственной формы, восприимчивости пациента и пути введения. Точную дозировку будет определять практикующий врач в свете факторов, относящихся к субъекту, которому требуется лечение. Например, для получения питательной композиции согласно настоящему изобретению пробиотический штамм согласно настоящему изобретению заключают в подходящую основу в количестве от 10 КОЕ/г до приблизительно 10 КОЕ/г материала основы, предпочтительно от приблизительно 10 КОЕ/г до приблизительно 10 КОЕ/г материала основы, более предпочтительно от приблизительно 10 КОЕ/г до приблизительно 10 КОЕ/г материала основы.
5
14
6
13
7
12
В случае фармацевтического продукта или композиции дозировка пробиотического штамма должна составлять от приблизительно 10 КОЕ/г до приблизительно 10 КОЕ/г материала основы, предпочтительно от приблизительно 10 КОЕ/г до приблизительно 10 КОЕ/г материала основы, более предпочтительно от приблизительно 10 КОЕ/г до приблизительно 10 КОЕ/г материала основы. Для целей настоящего изобретения аббревиатура КОЕ обозначает "колониеобразующая единица", то есть ее определяют как количество бактериальных клеток, подсчитанное микробиологическим способом на чашках с агаром.
Дозировку и путь введения можно корректировать, чтобы обеспечить достаточные уровни активной молекулы, или для поддержания желательного эффекта. Факторы, которые можно учитывать, включают тяжесть болезненного состояния, общее состояние здоровья субъекта, возраст, массу тела и пол субъекта, период и частоту введения, комбинацию(-и) лекарственных средств, аллергические реакции и ответ на терапию. Композиции пролонгированного действия можно вводить каждый день, раз в 3-4 дня, раз в неделю или раз в две недели в зависимости от времени полувыведения и скорости клиренса конкретной лекарственной формы.
В другом варианте реализации в настоящем изобретении также предложен фармацевтический продукт или композиция из штаммов согласно настоящему изобретению в лиофилизированной, высушенной сублимацией или высушенной форме, которую можно получить с помощью любого обычного способа, известного в данной области.
В другом варианте реализации фармацевтического продукта или композиции указанный пробиотический штамм или смесь штаммов представлены в виде нежизнеспособных клеток.
ДЕПОНИРОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
Lactobacillus reuteri V3401 депонировали в  de Cultivos Tipo (Испанская коллекция типовых культур, СЕСТ) (Edificio 3 CUE, Pare Cientlfic Universitat de Valencia, Catedratico Agustin Escardino 9, 46980, Патерна, Испания) при условиях, предусмотренных в Будапештском договоре. Данный штамм был депонирован 25ого сентября 2014 г., и ему был присвоен депозитный номер СЕСТ 8605.
ого
Bifidobacterium breve ВТ820 депонировали в  de Cultivos Tipo (Испанская коллекция типовых культур, СЕСТ) (Edificio 3 CUE, Pare Cientlfic Universitat de Valencia,  Agustin Escardino 9, 46980, Патерна, Испания) при условиях, предусмотренных в Будапештском договоре. Данный штамм был депонирован 25 сентября 2014 г., и ему был присвоен депозитный номер СЕСТ 8606.
Следующие примеры служат для пояснения настоящего изобретения и не должны рассматриваться как ограничивающие объем настоящего изобретения.
ПРИМЕРЫ
Материалы и методы.
Бактериальные штаммы и условия выращивания.
Lactobacillus reuteri V3401 и другие виды Lactobacillus культивировали стандартным способом в среде MRS (Oxoid) при 37°С в анаэробных условиях. Bifidobacterium breve ВТ820 и другие бифидобактерии растили в среде MRS, дополненной цистеином (0,1% p/v (0,1 г/100 мл)), также при 37°С в анаэробных условиях. Суспензии клеток для процедур инактивации и для анализа активности растили в стандартных ростовых средах в биореакторах емкостью 5 л Biostat В (В. Braun) в течение 8-24 ч. В частности, использовали среду А и среду В при различных рН. Биомассу концентрировали (10х) путем центрифугирования при 8000 g и хранили при -20°С до момента применения.
Способность L. reuteri V3401 расти с использованием различных источников углерода исследовали, применяя тест API 50 СН (Biomerieux), следуя инструкциям производителя. Ферментационные тестовые пластинки (стрипы) анализировали после 24 и 48 ч инкубации.
Процедуры инактивации бактерий.
2
4
2
4
2
2
Для получения образцов инактивированных бактерий проводили следующие процедуры: термическую инактивацию осуществляли в стандартном лабораторном автоклаве при 120°С в течение 20 мин. Инактивацию микроволнами осуществляли, применяя устройство Milestone Ethos One, в котором образцы бактерий подвергали воздействию нарастающей до 300 Вт мощности в течение 3 мин и конечной инкубации в течение 5 мин при данном значении мощности. Инактивацию давлением осуществляли в гомогенизаторе Microfluidics М-110Р при 15-20 импульсах/мин в течение 10 мин при 1500-2000 бар. Инкубация в 80 мМ HSO в течение 4 ч при 55°С и последующая нейтрализация (до достижения рН 7) с помощью 10 М NaOH представляли собой условия для инактивации кислотой. Такой же процедуры, но с применением сначала 80 мМ NaOH, а затем 96% HSO для нейтрализации щелочи, придерживались для инактивации основанием. Химическую инактивацию осуществляли путем инкубации образцов бактерий с 1,5% (в объемном отношении) НО или 50% (в объемном отношении) этанолом в течение 1 ч при 37°С. Химические агенты удаляли путем обработки ферментом каталазой или путем выпаривания, соответственно.
Культуры энтероцитов.
2
8
Энтероциты НТ-29 получили из CIC университета Гранады (Испания) и культивировали в среде DMEM, дополненной 10% (в объемном отношении) FBS, заменимых аминокислот и 2 мМ L-глутамина; при 37°С и 5% (в объемном отношении) СО. Культуры для поглощения флуорестерола растили в течение 14 дней, используя 96-луночные планшеты, инкубировали в течение 3-4 ч с мицеллами флуорестерола и суспензиями бактерий при концентрации 5⋅10 бактерий/мл, или 150 мкМ эзетимиба (MSD-SP Ltd) в качестве положительного контроля. Перед проведением флуороцитометрических анализов культуры НТ-29 отделяли от планшетов путем обработки трипсином, среду и свободные мицеллы флуорестерола удаляли путем центрифугирования и энтероциты суспендировали в буфере ФБР.
Анализ поглощения флуорестерола.
8
возб
исп
Мицеллы флуорестерола, содержащие 10 мМ таурохолат натрия, 6 мМ фосфатидилхолин и 0,2 мМ флуорестерол, получали, как описано у Sparrow и др. (Sparrow и др., 1999, J Lipid Res 40:1747-57). Поглощение флуорестерола бактериями анализировали путем инкубации суспензий бактерий (5⋅10 бактерий/мл) с мицеллами (0,1 мг/мл флуорестерола) в буфере ФБР при 37°С. После 2 ч инкубации смесь центрифугировали при 5000 g в течение 5 мин, супернатант отбрасывали и бактериальный осадок ресуспендировали в 0,1 мл ФБР. Данную процедуру повторяли трижды, чтобы удалить мицеллы свободного флуорестерола. Наконец, связанную с бактериями флуоресценцию определяли на микроспектрофотометре для прочтения планшетов Tecan Genius (фильтр возбуждения 485 нм, фильтр испускания 535 нм) или на проточном цитометре FACScalibur Beckton Dickinson. Если использовали методику проточной цитометрии, то бактерии также окрашивали бромистым этидием (10 мкг/мл) в боратном буфере (20 мМ борат натрия; 12 мМ ЭДТА; 0,01% формальдегид и 0,01 Triton Х-100) для того, чтобы, чтобы определить их популяцию (считывали флуоресценцию при длинах волн возбуждения и испускания 488 нм и 661 нм, соответственно). Проводили количественный анализ поглощенного флуорестерола на основании количества флуоресценции (λ: 488 нм; λ: 530 нм) на клетку, полученного для 2000 событий в каждом образце.
Количественный анализ флуорестерола, поглощенного энтероцитами НТ-29, проводили только с помощью проточной цитометрии, применяя упомянутое оборудование и такие же установочные параметры лазера, но окрашивание бромистым этидием не было необходимым для идентификации популяции эукариотических клеток. В каждом анализе результаты для отрицательных контролей (энтероцитов, инкубированных с мицеллами флуорестерола) использовали в качестве эталона для расчета относительного (%) поглощения для спорных образцов.
Микроскопия.
Изображения L. reuteri V3401, которые растили в среде А, рН 6, и среде В, рН 5, получали с помощью просвечивающей электронной микроскопии на микроскопе Libra 120 Plus Carl Zeiss.
Белковые экстракты L. reuteri V3401 и электрофорез белков.
Бактериальные клетки из L. reuteri V3401 ресуспендировали при концентрации 0,2 г/мл (сырой массы) в охлажденном до температуры льда буфере 50 мМ фосфата калия, 1 мМ ЭДТА при рН 6, содержащем 0,1-0,2 г/мл промытых кислотой стеклянных гранул (0,25-0,5 мм). Физическое разрушение клеток осуществляли путем взбалтывания на вихревом встряхивателе в течение десяти периодов времени по 20 сек с интервалами по 20 сек для охлаждения на льду. После центрифугирования при 14000 g в течение 15 мин при 4°С обломки клеток отбрасывали и проводили количественный анализ богатого белками супернатанта с помощью метода Бредфорд.
9
В. breve ВТ820 и другие бактерии инкубировали (5⋅10 бактерий/мл) с 0,1-0,2 мг/мл белковых экстрактов L. reuteri V3401 в 50 мМ калий-фосфатном буфере, рН 6, в течение 8-12 ч при 37°С в экспериментах по "активации". После инкубации белковый экстракт удаляли путем центрифугирования и промывки буфером ФБР.
Осуществляли ЭФ в ПААГ/ДСН при условиях денатурации, используя 8% (p/v) гели, и электрофоретические полосы визуализировали путем окрашивания кумасси. Зимограммы для обнаружения литических ферментов получали с помощью ЭФ в 8% полунативных ПААГ/ДСН, содержащих 10 мг/мл автоклавированных клеток Micrococcus luteus. После электрофореза белковых образцов (15-20 мкг) гели инкубировали в течение ночи при 37°С в 50 мМ калий-фосфатном буфере, рН 6, с 0,1% (в объемном отношении) Triton Х-100. Полосы белков с литической активностью детектировали путем окрашивания метиленовым синим (0,1% p/v в 0,01% p/v КОН) в течение 1-2 мин и тщательной промывки водой.
Анализ гидролиза солей желчных кислот.
8
возб
исп
Гидролиз солей желчных кислот образцами бактерий анализировали, как описано далее: 5⋅10 КОЕ/мл бактерий (живых) инкубировали с 1 мг/мл солей желчных кислот из свиньи в 1 М боратном буфере, рН 10, в течение 2 ч при 37°С: осуществляли количественный анализ таурина, высвобожденного гидролазами, путем смешивания 10 мкл ферментативной реакции со 100 мкл реагента орто-фталальдегида (ОРА). Наконец, добавляли 2 мл 0,5 М NaOH и анализировали флуоресценцию (λ 340 нм/λ 465 нм) на спектрофотометре для прочтения микропланшетов Tecan Genius. Концентрацию таурина рассчитывали с помощью калибровочной кривой, полученной для известных концентраций данной органической кислоты.
Активность холестеринэстеразы.
8
415нм
Кинетику холестеринэстеразы анализировали спектрофотометрически при 415 нм в течение 10 мин при 37°С на спектрофотометре для прочтения микропланшетов Tecan Genius для того, чтобы исследовать, смогли ли L. reuteri V3401 или В. breve ВТ820 ингибировать данный фермент. 4-нитрофенилбутират (2,5 мМ) ипользовали в качестве хромогенного субстрата, растворенного в 100 мМ натрий-фосфатном буфере рН 7 со 100 мМ NaCl, 0,5 мМ таурохолатом натрия. Образцы бактерий (5⋅10 бактерий/мл) совместно инкубировали в реакционной смеси с 0,04 ед./мл фермента, и для определения и сравнения ферментативных активностей использовали уклон прямой линии (А в зависимости от времени).
Очистка, амплификация и секвенирование ДНК.

Геномную ДНК из образцов бактерий очищали, применяя набор QIAamp DNA Mini (QIAgen), следуя инструкциям для грамположительных бактерий. ДНК использовали в качестве матрицы в анализах амплификации методом ПЦР для очистки гена 16S (набор QIAquick Gel Extraction, QIAgen) и последующего секвенирования (Sistemas Genomicos, S.L., Испания), получения профилей RAPD и обнаружения специфичных последовательностей ДНК. Реакции ПЦР осуществляли в термоциклере Mastercyler Eppendorf, используя в качестве праймеров олигонуклеотиды (Eurofins Genomics), представленные в таблице 1, и компоненты реакции, входящие в состав набора для проведения ПЦР MasterTaq (5 Prime GmbH). Фрагменты ДНК разделяли и визуализировали с помощью методик стандартного электрофореза в агарозном геле.
Выделение РНК и анализ экспрессии генов.
Образцы РНК прокариот и энтероцитов НТ-29 выделяли, следуя способу TRIzol (Chomczynski и Sacchi, 1987, Anal Biochem 162:156-159). Исходные образцы биомассы были получены из 10 мл культур на поздней Log-фазе роста для лактобактерий и из 24-луночных планшетов (одна лунка на образец), инкубированных в течение 14 дней, для энтероцитов. Образцы тотальной РНК инкубировали с ДНКазой I и выделение с помощью TRIzol повторяли, чтобы удалить нуклеазу. Концентрацию, целостность и чистоту РНК подтверждали путем электрофореза в агарозном геле и спектрофотометрии в УФ области.
Для исследований экспрессии генов с помощью количественной ПЦР осуществляли двухэтапный синтез «ДНК путем ретротранскрипции. Сначала синтезировали кДНК, применяя олиго d(T)15 и произвольные гексамеры в качестве праймеров ретротранскрипции для эукариотических и прокариотических образцов РНК, соответственно, и набор для синтеза кДНК AffinityScript QPCR (Agilent), следуя инструкциям производителя. На втором этапе специфические фрагменты кДНК амплифицировали в термоциклере МХ3005Р Stratagene, применяя SYBR green (Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green, Agilent) в качестве флуорофора. Значения Ct для реакций с контрольным геном (GADPH) и анализируемыми генами (NPC1L1 или генами литических ферментов) использовали для расчета экспрессии генов, следуя способу ΔΔCt и рекоммендациям Willems и др. (Willems и др., 2008; Anal Biochem 379:127-9) для нормировки результатов.
Вычитающая гибридизация.
Бактериальную супрессионную вычитающую гибридизацию (SSH) осуществляли, следуя руководствам пользователя из набора для вычитания кДНК PCR-Select™ (Clontech Laboratories, Inc., США), за исключением того, что применяли произвольные праймеры для синтеза первой цепи кДНК. В эксперименте по супрессионной вычитающей гибридизации L. reuteri V3401, который растили в среде А, использовали в качестве «тестера» (tester) и L. reuteri V3401, который растили в среде В, использовали в качестве «драйвера» (driver).
Вычтенные фрагменты кДНК клонировали в вектор pGEM-T (Promega), амплифицированный с применением олигонуклеотидов Т7 и SP6 в качестве праймеров, и секвенировали в Sistemas , S. L (Испания). Полученные последовательности нуклеотидов идентифицировали в базе данных нуклеотидных последовательностей, применяя программу Blastn на главной странице NCBI.
Группы животных и режимы питания
Шестьдесят самок крыс Wistar, имеющих массу приблизительно 200 г, приобретали у Janvier Labs (France). Крыс расселяли в отдельные клетки и держали при постоянной температуре (23±2°С) и влажности (55±5%) при 12-часовом цикле света/темноты.
9
После 2-недельного адаптационного периода на нормальном рационе (2014 Teklad Global 14% Protein Rodent Maintenance Diet, Harlan) 60 крыс подразделяли на 6 групп по 10 крыс в каждой. Шести указанным группам назначали рационы, описанные далее: (А) контрольная группа с нормальным рационом не получала ни образцы бактерий, ни рацион с высоким содержанием холестерина; (В) положительный контроль с рационом с высоким содержанием холестерина. Остальным группам давали ежедневно, дополнительно к рациону с высоким содержанием холестерина, дозу образца бактерий (2×10 бактерий на животное в день) в питьевой воде: (С) L. reuteri V3401, живые; (D) L. reuteri V3401, термоинактивированные; (Е) В. breve ВТ820, живые; (F) В. breve ВТ820, термоинактивированные. Рацион с высоким содержанием холестерина включал 1% (по массе) холестерина в стандартном рационе (2014 Teklad Global 14% Protein Rodent Maintenance Diet, Harlan). Крыс кормили в течение 57 дней и массу тела регистрировали. По прошествии данного периода указанных крыс умерщвляли.
Анализ показателей сыворотки крови.
Образцы крови собирали из хвостовой вены каждые 7-10 дней, чтобы определить холестерин в сыворотке, применяя набор Cholesterol от Biosystems. По окончании экспериментального периода (57 дней), после лишения пищи в течение 12 часов, собирали приблизительно по 5 мл образцов крови из каждой крысы путем пункции сердца. Общий сывороточный холестерин (OCX), липопротеиды высокой плотности-холестерин (ЛПВП-Х), липопротеиды низкой плотности-холестерин (ЛПНП-Х), триглицериды, фосфолипиды и глюкозу измеряли с помощью автоматического химического анализатора Mindray BS200.
Пример 1. Скрининг для выявления штаммов бактерий со способностью ингибировать поглощение холестерина энтероцитами человека.
Для осуществления данной задачи разработали способ на основе культур энтероцитов человека НТ-29 и флуоресцентного аналога холестерина - флуорестерола.
Можно осуществить количественный анализ поглощения флуорестерола, растворенного в мицеллах фосфатидилхолина и таурохолата натрия, энтероцитами НТ-29 с помощью проточной цитометрии. Культуры клеток НТ-29 инкубировали в присутствии мицелл флуорестерола в течение по меньшей мере 3 ч и после дезагрегации культуры определяли флуоресценцию популяции клеток с помощью упомянутой методики. Флуоресценция клеток пропорциональна количеству поглощенного флуорестерола. Указанный способ подтверждали путем анализа со снижающим холестерин лекарственным средством эзетимибом (при концентрации 150 мкМ) в описанной модели in vitro.
8
Применяя данный способ выявили способность снижать поглощение флуорестерола у коллекции бактерий из более чем 400 образцов. Культуры клеток инкубировали с мицеллами флуорестерола и суспензиями (5⋅10 КОЕ/мл) жизнеспособных или инактивированных бактерий. Библиотеку нежизнеспособных образцов получали, применяя различные способы инактивации: термическую инактивацию, инактивацию высоким давлением, инактивацию микроволнами и инкубацию с кислотой, основанием, спиртом и перекисью водорода.
Сравнение результатов усредненной флуоресценции клеток культур отрицательного контроля (без образцов бактерий) с аналогичными значениями, полученными для культур, инкубированных с суспензиями бактерий, позволили нам определить два вида бактерий, способных снижать поглощение флуорестерола более чем на 25%: Lactobacillus reuteri V3401 и Bifidobacterium breve ВТ820 (фиг. 1).
У обоих штаммов бактерий выявили активность при анализе как живых бактерий, так и инактивированных с помощью различных способов (фиг. 2).
Пример 2. Описание штаммов бактерий.
2.1 Lactobacillus reuteri V3401
Lactobacillus reuteri V3401 выделяли из сырого коровьего молока на среде MRS. Его идентификацию осуществляли путем амплификации и секвенирования рибосомного гена 16S. У полученной частичной последовательности рибосомного гена 16S (SEQ ID NO: 1) выявили 100% подобие с последовательностями генов 16S из нескольких записей EMBL, соответствующих штаммам L. reuteri (I5007, BCS159, NM94-6 и ТВ-В11).
Дифференциацию L. reuteri V3401 проводили с помощью теста отпечатков RAPD (случайная амплификация полиморфной ДНК), применяя в качестве матрицы геномную ДНК из L. reuteri V3401 и пяти других штаммов L. reuteri (фиг. 3). Олигонуклеотиды (gtg)5 и OPL1 использовали в качестве праймеров (таблица 1).
Профили RAPD с (gtg)5 и OPL-1 позволили нам отличить L. reuteri V3401 от других 5 исследованных штаммов. Праймер с паттерном полос (gtg)5 был специфичен к штаммам L. reuteri V3401 и LR20, что привело к необходимости дополнительного анализа RAPD с праймером OPL-1, чтобы различить штаммы L. reuteri V3401 и LR20.
Кроме того, определяли свойства L. reuteri V3401 на основании его биохимического профиля, применяя ферментационный анализ углеводов API СН50 (BioMerieux). Результаты показаны в таблице 2.
2.2. Bifidobacterium breve BT820.
Данный микроорганизм выделяли из грудного молока человека, культивированного на агарозной среде MRS-цистеин. Bifidobacterium breve ВТ820 идентифицировали на уровне вида путем амплификации и секвенирования рибосомного гена 16S. Полученная частичная последовательность рибосомного гена 16S (SEQ ID NO: 14) выявила значительное подобие (между 98,6-100%) с последовательностями генов 16S из нескольких штаммов В. breve (BR2, BGM6, 689b, 875 и JCM1273), находящихся в базе данных ДНК EMBL.
Проводили дополнительный анализ таким же способом, как и для L. reuteri V3401, чтобы отличить В. breve ВТ820 от штаммов бактерий, принадлежащих тому же виду или роду. Тест с получением отпечатков RAPD проводили, используя геномную ДНК из В. breve ВТ820, четырех штаммов В. breve и штамма В. longum, используя олигонуклеотид (gtg)5 в качестве праймера. Полученные результаты, показанные на фигуре 4 и в таблице 3, продемонстрировали, что В. breve ВТ820 можно отличить от других штаммов бифидобактерий на основании его специфичного профиля RAPD для (gtg)5.
Пример 3. Механизм действия.
Для того, чтобы выяснить, как оба штамма бактерий снижают поглощение флуорестерола энтероцитами НТ-29, проводили несколько анализов. Во-первых, было выдвинуто предположение, что деконъюгирование солей желчных кислот может способствовать более низким уровням флуорестерола. Гидролазы желчных кислот представляют собой ферменты, отвечающие за данную реакцию, а глицин и таурин представляют собой продукты такого гидролиза. Для того, чтобы оценить ферментативную активность гидролазы в L. reuteri V3401 и В. breve ВТ820, оба штамма инкубировали с солью желчной кислоты (10 мг/мл) в течение 2 ч и определяли высвобожденный таурин. Результаты показали, что ни L. reuteri V3401, ни В. breve ВТ820 не вызывали гидролиз солей желчных кислот при наших условиях эксперимента.
Другой возможный механизм может состоять в том, что флуорестерол метаболизируется или разрушается штаммами бактерий, вызывая разрушение флуорофора и объясняя то, что флуоресценция, ассоциированная с клетками НТ-29, снижается. L. reuteri V3401 и В. breve ВТ820 инкубировали с мицеллами флуорестерола в течение 24 ч и измеряли флуоресценцию в различные моменты времени. Полученные результаты продемонстрировали, что общая флуоресценция спадала не сильнее, чем для отрицательного контроля флуорестерола без образцов бактерий, и, следовательно, гипотезу разрушения и/или метаболизма флуорестерола можно отвергнуть.
L. reuteri V3401 и В. breve ВТ820, возможно, ингибируют поглощение флуорестерола энтероцитами НТ-29 путем взаимодействия с эукариотическим рецептором на мембране - NPC1L1. Похоже, что данный рецептор участвует в транспорте холестерина через мембрану энтероцита у млекопитающих, и он представляет собой молекулярную мишень эзетимиба. Мы разработали непрямой анализ, чтобы попытаться увидеть, ингибируют ли L. reuteri V3401 и В. breve ВТ820 транспорт холестерина путем блокирования мембранного белка NPC1L1. Энтероциты НТ-29 инкубировали с флуорестеролом, указанными образцами бактерий и с эзетимибом при максимально эффективной концентрации (300 мкМ), наблюдаемой в нашей модели in vitro, которая вызывала ингибирование поглощения флуорестерола на 40%. Мы предположили, что при данных условиях эзетимиб будет полностью ингибировать рецептор NPC1L1 и скроет возможное действие бактерий, если их мишенью является тот же транспортер холестерина. Напротив, адитивный эффект лекарственного средства и образцов бактерий можно интерпретировать, как доказательство того, что они действуют с помощью различных механизмов. Результаты наших экспериментов показали повышение ингибирования поглощения флуорестерола в культурах НТ-29, которые инкубировали с эзетимибом и L. reuteri V3401 или В. breve ВТ820 (фиг. 5). Следовательно, мы думаем, что оба микроорганизма не снижают поглощения флуорестерола путем блокирования рецептора NPC1L1.
Другой возможный механизм состоит в том, что L. reuteri V3401 и В. breve ВТ820 подавляют синтез NPC1L1 на генетическом уровне. Данную гипотезу исследовали, определяя относительную концентрацию мРНК в энтероцитах НТ-29, инкубированных или не инкубированных с бактериями. После очистки и ретротранскрипции РНК определяли экспрессию гена NPC1L1 путем количественной ПЦР, используя ген GAPDH в качестве эталона для нормировки результатов. Полученные результаты не выявили изменений в уровне экспрессии NCP1L1 в НТ-29 после инкубации в присутствии L. reuteri V3401 или В. breve ВТ820.
Холестеринэстераза поджелудочной железы представляет собой фермент, участвующий в гидролизе эфиров холестерина в пищеварительном тракте. Такой гидролиз играет важную роль в регуляции процесса поглощения холестерина. Хотя данный физиологический этап не может быть причиной ингибирования поглощения флуорестерола в нашей модели in vitro на основе энтероцитов НТ-29, мы решили оценить, способны ли L. reuteri V3401 и В. breve ВТ820 ингибировать данный фермент, поскольку такое действие может быть вовлечено в гипохолестеринемическую активность указанных штаммов in vivo. Активность холестеринэстеразы поджелудочной железы измеряли спектрофотометрически в присутствии образцов бактерий, и полученные результаты показали, что кинетика фермента не изменялась при сравнении с контрольными реакциями без образцов бактерий.
Провели три различных эксперимента, чтобы исследовать, способны ли L. reuteri V3401 и В. breve ВТ820 поглощать флуорестерол. Сначала оба штамма (термоинактивированных) инкубировали с мицеллами флуорестерола в течение 3 ч и, после тщательной промывки, определяли флуоресценцию, асоциированную с бактериальными клетками, с помощью флуороспектрофотометрии. Результаты данных анализов показаны на фигуре 6.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что L. reuteri V3401 и В. breve ВТ820 поглощают флуорестерол. Образцы бактерий из упомянутых штаммов, обработанные таким же способом, который был описан ранее, анализировали с помощью проточной цитометрии и получили аналогичные результаты. Данная методика позволяет отличить флуоресценцию, ассоциированную с бактериальными клетками, и флуоресценцию, соответствующую остаточным мицеллам флуорестерола, и таким образом, является более точной методикой. Опять же, оба штамма бактерий были способны поглощать флуорестерол (фиг. 7).
Для того, чтобы подтвердить результаты, полученные в предыдущих анализах, образцы L. reuteri V3401 и В. breve ВТ820, термоинактивированные и инкубированные с мицеллами флуорестерола, анализировали с помощью конфокальной лазерной микроскопии. Полученные результаты показали, что клеточные структуры L. reuteri V3401 и В. breve ВТ820 были окрашены флуорестеролом. Изображения подтвердили, что оба штамма способны поглощать флуорестерол и могут конкурировать с энтероцитами НТ-29 в клеточных анализах, снижая уровень флуорестерола, доступный для поглощения клетками человека.
Пример 4. Lactobacillus reuteri V3401 можно культивировать при определенных условиях выращивания, чтобы повысить их способность снижать поглощение флуорестерола энтероцитами человека.
В процессе оптимизации условий выращивания L. reuteri V3401 проанализировали несколько ростовых сред и физико-химических параметров, чтобы увеличить концентрацию бактерий. Образцы L. reuteri V3401, результаты для которых показаны, получили в ростовой среде, названной средой А, с рН, подведенным до 6. Результаты экспериментов по оптимизации позволили разработать более эффективный процесс получения (фиг. 8А), в котором использовали ростовую среду, названную средой В, со значением рН, равным 5. Тем не менее, после термической инактивации образцов бактерий, полученных в указанном процессе выращивания, L. reuteri V3401 оказались неспособны снижать поглощение флуорестерола культурами энтероцитов НТ-29 на таком же уровне, как и образцы, полученные в среде А при рН 6 (фиг. 8В).
Для того, чтобы определить фактор, отвечающий за такое изменение активности L. reuteri V3401, исследовали влияние состава культуральной среды и рН выращивания. Образцы бактерий, термоинактивированные, полученные при различных условиях выращивания, исследовали на энтероцитах НТ-29, и определяли их способность снижать поглощение флуорестерола. Результаты данных тестов показаны на фигуре 9.
Полученные результаты, похоже, свидетельствовали о том, что внеклеточный рН может быть ключевым фактором в процессе активации способности L. reuteri V3401 снижать поглощение флуорестерола энтероцитами человека. Для того, чтобы подтвердить данную гипотезу, L. reuteri V3401 растили в среде В при различных значениях внеклеточного рН. И снова, после получения и термоинактивации суспензий бактерий анализировали их способность снижать поглощение флуорестерола энтероцитами НТ-29. Результаты данного эксперимента продемонстрировали, что значения рН выращивания, равные или большие, чем 6, повышали способность L. reuteri V3401 ингибировать поглощение флуорестерола энтероцитами человека НТ-29 (фиг. 10).
Провели новый анализ, чтобы выяснить, может ли внеклеточный рН активировать L. reuteri V3401 за короткий период времени. Для этого указанный микроорганизм культивировали в среде В при рН 5 в течение 14 ч. Затем внеклеточный рН изменили на 6 и культивировали в течение 24 ч. Образцы бактерий собирали в различные моменты времени, термоинактивировали и исследовали их биологическую активность на культурах энтероцитов НТ-29. На фигуре 11 показано, что L. reuteri V3401, которые растили при описанных условиях, были неспособны снижать поглощение флуорестерола клетками НТ-29. Полученные результаты, похоже, свидетельствуют о том, что для процесса активации L. reuteri V3401 требуется, чтобы инкубацию при рН 6 осуществляли в фазе активного роста.
Пример 5. Описание процесса активации.
Для того, чтобы исследовать молекулярные события, ответственные за активацию L. reuteri V3401 при выращивании при рН 6 по сравнению с рН 5, проводили анализ вычитающей гибридизации, применяя библиотеки кДНК, выделенные из L. reuteri V3401, которые растили в среде А при рН 6 (образец тестера), и из того же штамма, который растили в среде В при рН 5 (образец драйвера). Данный эксперимент был разработан таким образом, чтобы определить гены с повышенной экспрессией при первом условии роста.
Результаты данного эксперимента позволили выявить несколько генов с повышенным уровнем экспрессии в среде А при рН 6. Один из данных генов представлял собой ген, кодирующий литический фермент (определили на основании подобия последовательностей), который, возможно, вовлечен в процесс модификации клеточной стенки L. reuteri V3401, повышая аффинность данных бактерий и/или их проницаемость для мицелл флуорестерола. Повышенную экспрессию данного гена в среде А при рН 6 подтвердили с помощью количественной ПЦР, применяя специфические праймеры (таблица 1) и gadph в качестве контроля для нормировки результатов экспрессии генов (фиг. 12).
С другой стороны, электрофоретическую полосу белка обнаружили на биохимическом уровне в полунативных гелях ПААГ/ДСН (зимограммах). Белковые экстракты очищали из L. reuteri V3401, которые растили в среде В при различных рН, и разделяли на содержащих Micrococcus luteus гелях ПААГ/ДСН. После окрашивания метиленовым синим можно было обнаружить литический фермент в образцах, которые получили из L. reuteri V3401, выращенных при более высоких значениях рН (фиг. 13).
Нельзя прийти к заключению, что литический фермент, обнаруженный биохимическим способом, кодируется геном, обнаруженным в анализах вычитающей гибридизации, хотя присутствует взаимосвязь между экспрессией указанного гена и ферментативной активностью, обнаруженной на зимограммах.
Полученные результаты, похоже, свидетельствуют о том, что культивирование L reuteri V3401 в среде А или среде В при рН 6 индуцирует активность литического фермента, которая может быть вовлечена в пермеабилизацию бактериальной оболочки. Для того, чтобы исследовать целостность клеточной стенки, образцы L. reuteri V3401, которые растили в среде А при рН 6 и в среде В при рН 5, анализировали с помощью просвечивающей электронной микроскопии (фиг. 14). На полученных изображениях видны бактерии с диффузной клеточной оболочкой в образцах L. reuteri V3401, которые растили в среде А при рН 6 (фиг. 14А и В), и это можно объяснить частичным гидролизом клеточной стенки. Напротив, в образцах L. reuteri V3401, которые растили в среде В при рН 5 (фиг. 14С и D), выявили более электроплотные бактерии с определенной формой.
Пример 6. Специфичность механизма активации.
Влияние культуральной среды на активность поглощения флуорестерола проанализировали для других штаммов бактерий, чтобы попытаться выяснить, насколько специфичным может быть эффект, наблюдаемый для L. reuteri V3401. Сначала проанализировали активность нескольких видов бактерий, которые растили в среде А при рН 6 и в среде В при рН 5, в анализе с энтероцитами Н-Т29 (фиг. 15).
Полученные результаты показали, что ни одна из проанализированных бактерий не снижала поглощение флуорестерола энтероцитами НТ-29, независимо от используемой ростовой среды.
Ранее упоминали, что активация L. reuteri V3401, похоже, опосредована, по меньшей мере отчасти, повышением экспрессии литического фермента. Более того, ген, кодирующий литический фермент, был обнаружен в проведенных нами экспериментах по вычитающей гибридизации и присутствует в других штаммах L. reuteri, геном которых опубликован в научной литературе. Было решено исследовать, присутствует ли данный ген в других штаммах L. reuteri, доступных в нашей компании, применяя специфические праймеры (таблица 1) для осуществления эксперимента ПЦР с применением геномной ДНК упомянутых штаммов L. reuteri. Полученные результаты свидетельствуют о том, что данный ген присутствует в L. reuteri LR20, но не в LR35. Для данных штаммов не выявили способности снижать поглощение флуорестерола в проведенных анализах с энтероцитами. Было решено проверить активность экспрессии гена литического фермента, присутствующего в L. reuteri LR20. Экспрессию гена определяли с помощью количественной ПЦР и фермент выявляли с помощью зимограмм, используя образцы РНК и белковые экстракты, очищенные из биомассы, которую растили в среде А при рН 6 и среде В при рН 5.
Полученные результаты показали, что, в отличие от L. reuteri V3401, в L. reuteri LR20 ген литического фермента не изменяет свой уровень экспрессии в зависимости от культуральной среды, и его уровень был ниже, чем определенный в L. reuteri V3401 (фиг. 16).
В заключение, полученные результаты, похоже, свидетельствуют о том, что хотя ген, кодирующий литический фермент, присутствует в других штаммах L. reuteri, механизм активации, который улучшает поглощение флуорестерола штаммом L. reuteri V3401 посредством индукции литического фермента, специфичен для данного штамма.
Пример 7. Активация других штаммов бактерий.
Выше упоминалось, что оптимальные условия выращивания, которые позволяют поглощение флуорестерола штаммом L. reuteri V3401, похоже, специфичны для данного штамма. Частично молекулярный механизм данного процесса основан на активации литического фермента, который, вероятно, расщепляет клеточную стенку и повышает проницаемость клетки. Исследовали активацию данным ферментом других бактерий и проанализировали их способность поглощать флуорестерол.
Белковый экстракт L. reuteri V3401 получали путем выращивания данного микроорганизма в среде А при рН 6, и инкубировали его со следующими штаммами бактерий: L. reuteri LR35, L. plantarum LP18 и В. breve ВТ820. После инкубации суспензии данных микроорганизмов подвергали термической инактивации и исследовали в анализе поглощения флуорестерола клетками НТ-29 (фиг. 17). Полученные результаты показали, что ни L. reuteri LR35, ни L plantarum LP18 не снижали поглощение флуорестерола энтероцитами; как в необработанном виде, так и инкубированные с указанным белковым экстрактом. Напротив, для В. breve ВТ820 подтвердили способность снижать уровень флуорестерола, обнаруженную в предыдущих анализах, и данная активность была выше у образцов бактерий, инкубированных с белковым экстрактом L. reuteri V3401 (фиг. 17).
Поглощение флуорестерола суспензиями бактерий подтвердили результаты, наблюдаемые для клеток НТ-29. Ни для L. reuteri LR35, ни для L. plantarum LP18 не выявили способности поглощать флуорестерол. Оба штамма исследовали после инкубации и без инкубации с белковым экстрактом L. reuteri V3401. Напротив, для В. breve ВТ820 выявили более высокие значения флуоресценции на клетку в образцах, инкубированных с белковым экстрактом L. reuteri V3401, по сравнению с необработанными образцами бактерий (фиг. 18).
Пример 8. Активность in vivo в модели гиперхолестеринемии у животных.
9
Решили проверить, можно ли продемонстрировать in vivo влияние L. reuteri V3401 и В. breve ВТ820 на поглощение флуорестерола энтероцитами человека in vitro. С этой целью проводили анализ, используя модель гиперхолестеринемии у животных. В указанном анализе исследовали шесть групп (n=10) самок крыс Wistar, имеющих массу приблизительно 200 г, которых кормили рационом с высоким содержанием холестерина, включающего 1% (по массе) холестерина. Образцы бактерий вводили (2⋅10 бактерий на животное в день) в питьевой воде (таблица 5).
Образцы крови собирали из хвостовой вены каждые 7-10 дней, чтобы определить концентрацию холестерина в сыворотке. Через 57 дней у контрольной группы с гиперхолестеринемией (группы В) выявили значительно более высокие значения холестерина в сыворотке по сравнению с группой, которую кормили стандартным рационом (контрольной группой А). В указанный момент времени крыс умерщвляли и измеряли общий холестерин в сыворотке (OCX), липопротеиды высокой плотности-холестерин (ЛПВП-Х), липопротеиды низкой плотности-холестерин (ЛПНП-Х), триглицериды, фосфолипиды и глюкозу.
Полученные результаты показали более низкие значения OCX в четырех группах животных, которые получали пробиотические образцы (фиг. 19). Дополнение рациона любым из четырех образцов эффективно снижало холестерин в сыворотке по сравнению с группой, которую кормили, придерживаясь того же рациона с высоким содержанием холестерина (контрольной группой В).
Более того, у крыс, которых кормили рационом с высоким содержанием холестерина и пробиотическими образцами (группы С - F), выявили уровни ЛПВП-Х, аналогичные таковым у контрольной группы (группы А), в противоположность контрольной группе с гиперхолестеринемией (группе В), в которой выявили значительно пониженные уровни ЛПВП-Х (фиг. 20А). Отношение ЛПНП-Х/ЛПВП-Х используют для прогнозирования риска сердечно-сосудистых заболеваний, считая его более пригодным, чем абсолютные значения уровня холестерина и/или ЛПНП-Х в сыворотке. Когда для расчета данного отношения (фиг. 20С) использовали значения ЛПНП-Х (фиг. 20В), подтвердили, что употребление пробиотиков в пищу снижает отношение ЛПНП-Х/ЛПВП-Х до значений, аналогичных таковым для здоровой группы (группы А).
Другие исследованные параметры представляли собой уровни триглицеридов и фосфолипидов в плазме. У контрольных животных, которых кормили рационом с высоким содержанием холестерина (группа В), выявили более высокие значения, чем в контрольной группе (группе А), в противоположность крысам, которых кормили рационом с высоким содержанием холестерина и образцами пробиотиков (группы С - F), у которых выявили уровни триглицеридов, аналогичные таковым в здоровой контрольной группе А. Тем не менее, данные различия не были статистически значимыми (фиг. 21А). Также не было обнаружено различий между уровнями фосфолипидов в плазме, полученными для указанных 6 экспериментальных групп (фиг. 21В).
Также наблюдали различия между разными группами животных в отличных от липидов параметрах. Средний уровень глюкозы в плазме крыс, которых кормили рационом с высоким содержанием холестерина (группе В), был выше, чем таковой в здоровой контрольной группе (группе А). Возможно, такое повышение уровня глюкозы связано с инсулинорезистентностью, которая, как правило, ассоциирована с гиперхолестеринемией и низкими уровнями ЛПВП-Х. В 4 группах животных, которых кормили образцами пробиотиков, выявили гликемические значения, аналогичные таковым в здоровой контрольной группе (группе А). Данный результат можно объяснить возвращением инсулинорезистентности к исходному уровню, вероятно вызванным высокими уровнями ЛПВП-Х, обнаруженными в контрольной группе с гиперхолестеринемией В, и не наблюдаемой в группах, которых кормили пробиотиками (фиг. 22).