Определение остаточных количеств хлороталонила в персиках: проблемы газохроматографической идентификации с применением электронозахватного делектора

гиена и санитария. 2016; 95

DOI: http://dx.doi.org/10.1882/0016-9900-2016-95-11-1108-1112_

Original article

О КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016 УДК 613.6.02:543.064

Юдина Т.В., Федорова Н.Е., ЛарькинаМ.В., Егорченкова О.Е., Рогачева С.К.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ХЛОРОТАЛОНИЛА В ПЕРСИКАХ: ПРОБЛЕМЫ ГАЗОХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ С ПРИМЕНЕНИЕМ ЭЛЕКТРОНОЗАХВАТНОГО ДЕТЕКТОРА

ФБУН «Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана» Роспотребнадзора, 141014, Мытищи

В работе представлены результаты исследований по валидации газохроматографического метода определения остаточных количеств хлороталонила в персиках с применением электронозахватного детектора. Для аналитического контроля выбрана плодовая косточковая культура персика, относящаяся к одной из наиболее загрязненных остаточными количествами пестицидов культур. Обоснована необходимость включения в процедуру определения метода подтверждения, основанного на масс-спектрометрическом детектировании (тип ионизации электронный удар). Показано, что одним из существенных источников получения некорректных данных при идентификации с применением детектора электронного захвата ионов являются фталаты, проявляющиеся на хроматограмме в виде интенсивных и/или широких пиков. Масс-спектры соединений класса фталатов характеризуются доминирующим пиком иона с величиной масса/заряд 149 - именно по этому пику происходит детектирование низкомолекулярных фталатов в различных матрицах; на спектре также фиксируются характерные ионы, соответствующие фрагментам радикальных остатков. Сочетание применения различных видов детектирования позволяет доказать, что обнаруженная реакция (сигнал детектора) обусловлена именно аналитом, а не примесями, и при необходимости оптимизировать условиях хроматографирования в направлении получения надежных результатов. Нижний предел количественного определения хлороталонила в плодах персиков 0,01 мг/кг определен при соотношении сигнал/шум, равном 10. Диапазон измеряемых концентраций 0,01-0,1 мг/кг, полнота извлечения хлороталонила из образцов персиков, установленная по результатам анализа модельных проб с внесением вещества в четырех точках по определяемому диапазону, 84-102%, среднее квадратичное отклонение повторяемости в диапазоне 2,0-5,8%.

Ключевые слова: пестициды; хлороталонил; газожидкостная хроматография; фталаты; хромато-масс-спектрометрия.

Для цитирования: Юдина Т.В., Федорова Н.Е., Ларькина М.В., Егорченкова О.Е., Рогачева С.К. Определение остаточных количеств хлороталонила в персиках: проблемы газохроматографической идентификации с применением электронозахватного детектора. Гигиена и санитария. 2016; 95(11): 1108-1112. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0016-9900-2016-95-11-1108-1112

Yudina T.V., Fedorova N.E., Larkina M.V., Egorchenkova O.E., Rogacheva C.K.

DETERMINATION OF RESIDUAL AMOUNTS OF CHLOROTHALONIL IN PEACHES: PROBLEMS

OF GAS CHROMATOGRAPHIC IDENTIFICATION WITH THE USE OF ELECTRON CAPTURE DETECTOR

F.F. Erisman Federal Research Center of Hygiene, Mytischi, 141014, Russian Federation

In the work there are presented results of studies on the validation of the gas chromatographic (GC) methodfor the determination of chlorothalonil residue amounts in peaches with the use of electron capture detector (ECD). For the analytical control there was selected such stone fruit crop as the peach, referring to the crops, the most contaminated with residue amounts ofpesticides. There was justified the necessity of the inclusion in the procedure of the detection of the method of confirmation, based on mass spectrometry detection (MSD) (the type of ionization -electron impact). The significant source of the obtaining of incorrect data in the identification with the use of ECD of ions are shown to be phthalates, visualized in the chromatogram as intense and/or broad peaks. Mass spectra of compounds of the class ofphthalates are characterized by the dominant peak of the ion with the value of (mass/ charge) 149, just on this peak the detection of low molecular weight phthalates occurs in various matrices, on the spectrum there are also recorded typical ions corresponding to fragments of radical residues. The combination of the use of various types of the detection allows to prove that the revealed response (detector signal) is caused just by the analyte, but not the impurities, and optionally to optimize chromatographic conditions towards to the obtaining reliable results. The lower limit of the quantitation of chlorothalonil in peach fruits accounts for 0.01 mg/kg, determined with a signal/noise ratio of 10. The range of measured concentrations is volatile between 0.01-0.1 mg/kg, recovery rate of chlorothalonil from samples of peaches, established according to results of the analysis of model samples with the introduction of the substance in four points along the detection range, was 84-102%, the SD value of the repeatability varies in the range of 2.0-5.8%.

Keywords: pesticides; chlorothalonil; GC/ESD; GC/MS; phthalates; gas chromatography-mass - spectrometry.

For citation: Yudina T.V., Fedorova N.E., Larkina M.V., Egorchenkova O.E., Rogacheva C.K. Determination of residual amounts of chlorothalonil in peaches: problems of gas chromatographic identification with the use of electron capture detector. Gigiena i Sanitaria (Hygiene and Sanitation, Russian Journal) 2016; 95(11): 1108-1112. (In Russ.). DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0016-9900-2016-95-11-1108-1112

For correspondence: Natalia E. Fedorova, MD, PhD, DSci., Head of the Department of Analytical Control Methods of the F.F. Erisman Federal Research Center of Hygiene, Mytischi, 141014, Russian Federation. E-mail: analyt1@yandex.ru

Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest. Acknowledgment. The study had no sponsorship. Received: 10 March 2016 Accepted: 04 October 2016

Введение

Проблема обоснования гигиенических критериев безвредности производства и применения химических средств защиты растений связана с эффективной реализацией аналитического контроля, разработкой и применением надежных методов количественной идентификации как одной из основ сохранения здоровья населения, защиты прав потребителей в современных условиях. При этом в вопросах формирования общей химической нагрузки на население установление реальных концентраций веществ-загрязнителей в объектах среды обитания находится в ряду важнейших.

Поступление на продовольственный рынок Российской Федерации импортируемой сельскохозяйственной продукции предопределяет расширение перечня веществ для аналитического контроля остаточных количеств пестицидов, не зарегистрированных на территории России по сфере применения1.

Хлороталонил (химическое наименование - тетрахлоризоф-талонитрил), относится к группе хлорнитрилов и является несистемным фунгицидом широкого спектра действия, механизм которого заключается в предотвращении прорастания споры и борьбе против бурой, желтой стеблевой ржавчины, мучнистой росы, септориоза и фитофтороза [1].

Препараты на основе хлороталонила зарегистрированы на территории РФ для применения на пшенице (яровой и озимой), ячмене (яровом и озимом), картофеле, луке (семенники), томатах (семенные посевы) [2]. Применение указанного фунгицида обеспечено официальными методами измерения остаточных количеств действующего вещества, для отдельных матриц - с учетом основного метаболита.

Для контроля безопасности импортируемой сельскохозяйственной продукции установлен максимально допустимый уровень (МДУ) хлороталонила в персиках 0,2 мг/кг.2

Согласно международным данным, персики отнесены к одним из наиболее загрязненных остаточными количествами пестицидов плодам. Уровень загрязнения был установлен по 6 показателям количества и опасности обнаруженных в них пестицидов. По получении суммарного балла персик был отнесен к группе 12 пищевых продуктов, признанных опасными по содержанию пестицидов. [3].

Данные позиции обосновывают значимость метода аналитического определения хлороталонила в данной плодовой культуре для контроля соответствия сельскохозяйственной продукции при ее обращении на потребительском рынке показателям безопасности.

Цель настоящего исследования состояла в валидации процедуры определения остаточных количеств хлороталонила в яблоках, включенной в МУК 4.1.1445-033, с целью оценки ее пригодности для контроля остаточных количеств действующего вещества в персиках, относящихся к одной группе культур (с высоким содержанием воды) [4].

Материал и методы

Материалы

Использованы аналитический стандартный образец хлороталонила (содержание основного компонента 99,1%, CAS № 189745-6); ацетонитрил, н-гексан, метилен хлористый, этилацетат, вода градиентная для ВЭЖХ, натрий сернокислый безводный, флорисил для препаративной хроматографии (60-100 меш) фирмы «Panreac»; ацетон особо чистый фирмы «J.T. Baker».

1 Решение Комиссии Таможенного союза №721 от 22.06.2009 о применении международных стандартов, рекомендаций и руководств.

2 Гигиенические нормативы содержания в объектах окружающей среды (перечень), ГН1.2.3111-13

3 МУК 4.1.1445-03 «Определение остаточных количеств хлоротало-нила в зерне и соломе зерновых колосовых культур, винограде, яблоках, хлороталонила и его метаболита - SDS 3701 ^ 182281) - в клубнях картофеля методом газожидкостной хроматографии».

Для корреспонденции: Федорова Наталия Евгеньевна, д-р биол. наук, зав. отд. аналитических методов контроля ФБУН «Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана» Роспотребнадзора, 141014, Мытищи. E-mail: analyt1@yandex.ru

Hygiene & Sanitation

_DOI: http://dx.doi.org/10.1882/0016-9900-2016-95-11-1108-1112

Original article

В аналитическом исследовании использованы образцы персиков, реализуемые на потребительском рынке (Московская область).

Подготовка проб персиков для анализа

Измельченные образцы персиков массой 20 г экстрагировали 100 см3 ацетонитрила (30 мин механическое встряхивание, затем выдержка на ультразвуковой бане 3 мин).

Надосадочную жидкость фильтровали на воронке Бюхнера, остаток повторно экстрагировали 80 см3 ацетонитрила (15 мин встряхивание, затем выдержка на ультразвуковой бане в течение 5 мин). Отфильтрованные экстракты объединяли в делительной воронке, промывали двумя порциями н-гексана по 30 см3 (гек-сан отбрасывали). Концентрировали на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30°C до водного остатка (около 5 см3). Добавляли 100 см3 дистиллированной воды и экстрагировали трижды дихлорметаном (порциями 40, 50 и 50 см3). Объединенный экстракт упаривали досуха при температуре не выше 30°C.

Остаток растворяли в 3 см3 гексана и очищали на колонке (25 см • 10 мм) с флорисилом (5 г), промывая колонку 20 см3 гек-сана, 20 см3 смеси гексан-этилацетат в объемном соотношении 95:5, элюаты отбрасывали. Хлороталонил элюировали 20 см3 смеси гексан-этилацетат в объемном соотношении 9:1, собирая элюат в колбу для упаривания. Пробы упаривали досуха, сухой остаток растворяли в 2 см3 гексана.

Условия хроматографирования

Идентификацию и количественное определение хлорота-лонила выполняли методом капиллярной газожидкостной хроматографии с использованием газовых хроматографов серии «Кристалл 2000М» (Россия, «Хроматэк») с электронозахватным (ЭЗД) детектором, программным обеспечением Хроматэк-Ана-литик 2.5 и «Agilent 6890N», (США, «Agilent Technologies») с масс-селективным детектором (MSD) 5975С (ионизация электронным ударом) и программным обеспечением Agilent MSD ChemStation.

Использованы аналитические капиллярные кварцевые колонки: НР-50 (30 м*0,25 мм*0,25 мкм), температура детектора (ЭЗД) 320 °C, испарителя 250 °C. Температура термостата колонки программированная. Начальная температура 120 °C, выдержка 1 мин, нагрев по 5° в минуту до 200 °C, выдержка 4 мин, нагрев по 25° в минуту до 270 °C. Газ-носитель азот, поток 1,5 см3/мин, деление потока 1:3, сброс 6,9 см3/мин, средняя линейная скорость 36 см/с, давление 75 кПа; а также HP-5ms (30 м*0,25 мм*0,25 мкм). Температура детектора (МСД): квадруполя 150 °C, источника 230 °C, переходной камеры 280 °C, испарителя 250 °C. Температура термостата колонки программированная. Начальная температура 100 °C, выдержка 2 мин, нагрев по 8° в минуту до 200 °C, выдержка 4 мин, нагрев по 20° в минуту до 250 °C. Газ 1 (гелий): поток в колонке 1,3 см3/мин., температура испарителя 250 °C, давление 96,9 кПа, средняя линейная скорость 43 см/с. Сбор данных: в режиме сканирования (по полному ионному току) и в режиме регистрации индивидуальных ионов. Хроматографируемый объем 1 мм3. Ионы с m/z (отношение: масса/заряд): 266 (количественный расчет), 109, 231. Идентификацию вещества на хроматографе с масс-селективным детектором осуществляли в помощью поиска в библиотеке NIST.

Основной раствор хлороталонила с концентрацией 500 мкг/ см3 приготовлен в ацетоне. Рабочие растворы для калибровки и внесения в модельные образцы с концентрациями 0,05; 0,1; 0,2; 0,5; 5,0 мкг/см3 готовили разбавлением основного раствора ацетоном. Все растворы хранили при температуре 4 ± 2 °C.

Статистический анализ включал определение средней величины и среднего квадратичного отклонения по результатам исследования модельных проб персиков с внесением веществ с использованием стандартной программы Microsoft Excel в среде Windows 2010.

Результаты

Основными критериями (характеристиками) валидации методов определения остаточных количеств пестицидов являются: калибровочная характеристика (линейная в определенном диапазоне), эффект матрицы, установленный нижний предел

Original article

Время, мин

Рис. 1. Хроматограмма образца персиков с внесением 0,1 мг/кг хлороталонила, зарегистрированная по полному ионному току.

120 140 160 180 200 220 Отношение массы к заряду Рис. 2. Спектр пика, соответствующий времени удерживания хлороталонила.

количественного определения, селективность и специфичность, полнота извлечения (открываемость), прецизионность.

При разработке и валидации метода, а также определении аналитов, которые являются новыми для лаборатории, необходимо прежде всего показать, что обнаруженная реакция (сигнал детектора) обусловлена именно аналитом, а не примесями или артефактом.

Важным моментом является оценка вероятности проявления эффектов матрицы в избранных условиях пробоподготовки и хроматографирования с применением ДЭЗ. Результаты исследования аналитического стандарта хлороталонила с минимальной концентрацией, приготовленного на основе растворителя и экстракта холостой матрицы, показали существенное увеличение площади пика в растворе на основе матрицы. На хроматограмме контрольной пробы персиков при времени удерживания хлоро-талонила был констатирован широкий пик с нечетким максимумом, обусловленный наложением неизвестного вещества.

С

II

О

m/z 149

Рис. 3. Механизм фрагментации фталатов в режиме электронного удара.

Идентификацию вещества, соответствующего пику проинтегрированной хроматограммы, зарегистрированной по полному ионному току, осуществляли на хроматографе с масс-селективным детектором в режиме автоматизированного библиотечного поиска (рис. 1).

Полученный масс-спектр включал интенсивный пик иона с отношением массы к заряду (m/z) 149 (рис. 2).

Экспериментальные спектры совпали со спектрами дибу-тилфталата из библиотеки NIST.

Следует отметить, что одной из проблем в анализе пестицидов с использованием электронно-захватного детектора является мешающее влияние фталатов. Эти соединения обычно проявляются на хроматограмме в виде очень интенсивных и/или широких хроматографических пиков [5-6].

Для соединений этого класса, за исключением диметило-вого эфира, важнейшей характеристикой спектра электронного удара является доминирующий пик иона с m/z 149, именно по этому пику осуществляют детектирование низкомолекулярных фталатов в различных матрицах, на спектре также фиксируются характерные ионы, соответствующие фрагментам радикальных остатков [7]

Образование этого иона идет по механизму, представленному на рис. 3.

Причин появления фталатов несколько: посторонние ингредиенты матричной основы образца; растворители - экстрагенты, используемые для пробоподготовки и экстракции; пластифицированный поливинилхлорид, полисилоксан или сополимеры ви-нилацетата, являющиеся составными элементами в уплотнении

Hygiene & Sanitation

DOI: http://dx.doi.org/10.1882/0016-9900-2016-95-11-1108-1112

Original article

Время, мин

Рис. 4. Хроматограмма образца персиков с внесением 0,1 мг/кг хлороталонила (режим регистрации индивидуальных ионов).

для крышек виал; иглы в микрошприцах (приклеены с использованием эпоксидной смолы, содержащей пластификаторы); септы испарителя газового хроматографа, в состав которых входят дибутилфталат и бис-(2-этилгексил) фталат [8]. Влияние фта-латов может быть минимизировано путем исключения использования пластиковой посуды для хранения и пробоподготовки образцов, а также глубокой очистки реагентов и стекловаты [9].

Модификация режима хроматографирования позволила разделить пики хлороталонила и дибутилфталатата (рис. 4).

На основе полученных результатов были оптимизированы условия хроматографирования с примененим ДЭЗ. Показана линейная зависимость интенсивности сигнала от содержания хлороталонила в растворе в диапазоне концентраций 0,05-0,5 мкг/см3. Формула графика зависимости площади хроматографического пика (Б) от концентрации вещества мкг/см3) имеет вид: C = 8,761 • 10-4 • Б + 3,011 • 10-2 (коэффициент корреляции более 0,99).

Нижний предел детектирования хлороталонила в плодах персиков установлен на уровне 0,003 мг/кг (соотношение сигнал/шум 3). Нижний предел количественного определения 0,01 мг/кг, определен для концентрации аналита, при которой соотношение сигнал-шум превышает 10.

Для определения полноты извлечения подготовлены модельные пробы персиков с внесением хлороталонила на четырех концентрационных уровнях (0,05; 0,1; 0,2 и 0,5 мкг/см3). Полноту извлечения оценивали как отношение интенсивности пика аналита в модельном образце к площади пика соответствующего стандарта в растворителе. Установленная полнота извлечения находилась в диапазоне 84-102%, средняя величина 93%.

Воспроизводимость результатов, характеризуемая величиной относительного стандартного отклонения 2,0-5,8% по всему диапазону измерений 0,01-0,1 мг/кг.

На основании проведенных исследований, обобщения и статистической обработки результатов сформированы методические указания по определению остаточных количеств хло-роталонила в персиках методом капиллярной газожидкостной хроматографии, включенные в МУК 4.1.3122-13, утвержденные в установленном порядке по разделу «4.1. Методы контроля. Химические факторы».

Обсуждение

Важным аспектом количественной идентификации хлорор-ганических пестицидов с применением специфичных детекторов является необходимость исключения влияния матричной основы аналитических образцов и присутствия иных компонентов, проявляющихся во время развития хроматограммы [10].

Валидация метода определения хлороталонила в персиках продемонстрировала, что к интерпретации хроматографических данных, полученных с применением ДЭЗ, следует относится с достаточной степенью осторожности. В этой связи особое внимание следует обратить на то, что большинство эластичных пластиков содержит разнообразные фталаты, которые легко экстрагируются или выщелачиваются в процессе лабораторных операций. Перекрестное загрязнение стекловаты часто наблю-

дается при работе с пластиками во время экстракции, особенно когда их поверхность смачивается растворителем.

Положительные находки аналитических измерений с применением электронозахватного детектора могут быть связаны с присутствием посторонних ингредиентов матричной основы образца, растворителей, материалов, используемых в ходе анализа. При идентификации неожиданно высоких уровней веществ в пробе целесообразно обратиться к альтернативному методу количественной идентификации. В этой связи в разработанную методику измерений для обеспечения достоверности результатов включен масс-селективный детектор (метод подтверждения).

Данная позиция полностью согласуется с международными требованиями к аналитическому контролю остаточных количеств пестицидов [4], определяющими, что масс-спектрометрия в сочетании с хроматографическим разделением является наиболее оптимальным подходом для идентификации аналитов в экстракте, поскольку одновременно обеспечено заданными параметрами времени удерживания, а также соотношения масс ионов к заряду.

Выводы

При лабораторном контроле остаточных количеств действующего вещества фунгицида хлороталонила (химический класс хлорнитрилов) в образцах персиков надежная интерпретация хроматографических данных обеспечивается применением альтернативного метода, дающего подтверждение полученных аналитических результатов.

Минимизация риска влияния фталатов на результаты анализа может быть достигнута исключением пластиковой посуды для хранения и пробоподготовки образцов, а также путем глубокой очистки растворителей и реагентов.

Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки. Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Литер атур а

2. Справочник пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории Российской Федерации. Москва: Агрорус; 2015.

3. RuPest.ru. Available at: http://mpest.ru/news-pesticides/49-samih-opas-nih-po-soderzhaniu-pestitsidov-fruktov-i-ovoschei.html

7. Турнаев В.А., Третьяков П.Ю., Турнаева Е.А. Хроматографические методы определения фталатов в поверхностных и питьевых водах. Вестник Тюменского государственного университета. Экология и природопользование. 2007; (3): 139-46. 10. Ракитский В.Н., Юдина Т.В., Федорова Н.Е. Значимость алгоритма химико-аналитического контроля пестицидов в безвредности объектов среды обитания. Международный научно-исследовательский журнал. 2015; (3-4): 103-5.

References

1. MacBean C., ed. The Pesticide Manual. (14th Ed.). Alton: BCPC; 2012. Available at: http://bcpcdata.com/_assets/files/PM16-supplementary-BCPC.pdf

Оригинальная статья

2. Directory of pesticides and agrochemicals permitted for use in the Russian Federation. Moscow: Agrorus; 2015.

3. RuPest.ru Available at: http://rupest.ru/news-pesticides/49-samih-opas-nih-po-soderzhaniu-pestitsidov-fruktov-i-ovoschei.html

4. SANC0/12571/2013. Guidance document on analytical quality control and validation procedures for pesticide residues analysis in food and feed). Available at: http://www.eurl-pesticides.eu/library/docs/allcrl/ AqcGuidance_Sanco_2013_12571.pdf

5. Gian S.S., Chan H.S., Neff G.S. Sensitive method for determination of phthalate ester plasticizers in open-ocean biota samples. Anal. Chem. 1975; 47(13): 22259.

6. Gian S.S., Chan H.S. Control actuators of blanks in analysis of phthal-ates in air and ocean biota samples. U.S. National Bureau of standards, special publication. 1976; 442: 701-8.

7. Turnaev V.A., Tret'yakov P.Yu., Turnaeva E.A. Chromatographic methods for the determination of phthalates in surface and drinking water. Ekologiya i prirodopol'zovanie. 2007; (3): 139-46. (in Russian).

8. Agilent Premium Septa for Contamination-Free Inlet and Reduced Bleed. USA: Agilent Technologies; 2006. 6. Available at: https://www. agilent.com/cs/library/technicaloverviews/public/5989-5347EN.pdf

9. Earls A.O., Axford I.P., Braybrook J.H. Gas chromatography-mass spec-trometry determination of the migration of phthalate plasticisers from polyvinyl chloride toys and childcare articles. J. Chromatogr. A. 2003; 983(1-2): 237-46.

10. Rakitskiy V.N., Yudina T.V., Fedorova N.E. The significance of the algorithm chemical and analytical control of pesticides in safety facilities habitats. Mezhdunarodnyy nauchno-issledovatel'skiy zhurnal. 2015; (34): 103-5. (in Russian).

Поступила 10.03.16 Принята к печати 04.10.16