Эффективность применения лизата тромбоцитов в качестве ростового фактора мезенхимальных стволовых клеток

второго поколения. «Незащищенные» аминопенициллины следует назначать детям, впервые получающим антибактериальные препараты, а также пациентам, не имеющим очагов хронической инфекции и в течение длительного времени не использующих никаких антибактериальных препаратов [2, 7].

3. Принимая во внимание тот факт, что полирезистентные возбудители (Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa и др.) у детей, не имеющих очагов хронической инфекции, на амбулаторном этапе встречаются крайне редко (до 2%), назначение цефалоспоринов третьего поколения парентеральных и пероральных форм должно быть существенно ограничено. У детей с доказанной аллергической реакцией к пенициллинам и цефалоспори-нам препаратами выбора (но не препаратами эмпирической терапии первого ряда) являются макролиды. Следует учитывать довольно быстрое развитие резистентности к ним, поэтому курс лечения макролидами в виде монотерапии не должен превышать 5-7 дней [3].

Эффективность стартовой антибактериальной терапии во многом зависит от учета врачом индивидуальных особенностей ребенка, его возраста, эпидемиологической ситуации и характера инфекционного заболевания. Учет сведений о потенциальных возбудителях, наиболее часто вызывающих инфекционные процессы определенной локализации, а также их чувствительность к антибактериальным препаратам позволит целенаправленно сузить круг выбираемых лекарственных средств. Все это способствует современной стратегии антибактериального лечения -уже на ранних сроках заболевания проводить рациональную этиотропную терапию, чтобы уменьшить риск развития серьезных осложнений и повысить успех лечения респираторных инфекций в целом [2, 5, 6, 9].

Л И Т Е Р А Т У Р А

1. Василевский И.В. // Медицина. - 2008. - №1. -С.92-97.

2. Василевский И.В. Клиническая фармакология в таблицах и схемах (основы рациональной антибиотикотерапии в педиатрии). - Минск, 2012. - 56 с.

3. Захаров Н.В., Карпов О.И. // Рос. мед. журн. -2007. - №18. - С.32-40.

4. Зубков М.Н. // Рос. мед. журн. - 2009. - № 2.-С. 123-131.

5. Коровина Н.А., Заплатников А.Л., Захарова И.Н. Антибактериальная терапия респираторных заболеваний в амбулаторной практике врача-педиатра: рук-во для врачей. - М., 1998. - 62 с.

6. Практическое руководство по антиинфекционной химиотерапии /под ред. Л.С. Стра-чунского, Ю.Б. Белоусова, С.Н. Козлова. - М., 2007. - 464 с.

7. Скепьян Е.Н, Василевский И.В. Мониторинг возбудителей бактериальных заболеваний дыхательных путей у детей // М-лы 9-го съезда педиатров Республики Беларусь (17-18 ноября 2011 г.). - Минск, 2011. - С.252-253.

8. Скепьян Е.Н, Василевский И.В. Анализ спектра возбудителей бактериальных заболеваний верхних дыхательных путей у детей в практике врача-педиатра // М-лы 9-го Рос. конгр. «Инновационные технологии в педиатрии и детской хирургии» и 2-го конгр. детских врачей Союзного гос-ва (Москва, 18-20 окт. 2011г.). - М., 2011. -С.259-260.

9. Чучалин А.Г., Синопальников А.И., Козлов Р.С. и др. Внебольничная пневмония у взрослых: практ. рекоменд. по диагностике, лечению и профилактике. - М., 2010. - 106 с.

10. Leibovitz E., Jacobs M.R., Dagan R. // Pediatr. Infect. Dis. J. - 2004. - Vol.23(12). -P.1142-1152.

Поступила 26.02.2013 г.

Эффективность применения лизата тромбоцитов в качестве ростового фактора мезенхимальных стволовых клеток

Кривенко С.И., Назарова Е.А., Коритко А.А., Примакова Е.А., Петровская Е.Г., Шустовская А.А.

Республиканский центр трансплантации органов и тканей на базе 9-й городской клинической больницы, Минск

Krivenko S.I., Nazarova E.A., Koritko A.A., Primakova E.A., Petrovskaya E.G., Shustovskaya A.A.

Republican Centre for Organs and Tissues Transplantation (City Hospital №9), Minsk, Belarus Efficiency of platelet lysates' application as a growth factor

of mesenchymal stem cells

Резюме. Проведена оценка эффективности использования лизата тромбоцитов в качестве добавки к культуральной среде наряду с эмбриональной телячьей сывороткой (ЭТС) при наращивании трансплантатов мезенхимальных стволовых клеток (МСК). Установлено, что внесение тромболизата в специализированную питательную среду для культивирования МСК обеспечивает получение качественного клеточного трансплантата в более короткие сроки, что позволяет рекомендовать использование данного продукта в качестве альтернативы ЭТС в клинических протоколах.

Ключевые слова: мезенхимальные стволовые клетки, лизат тромбоцитов, клеточный трансплантат.

Медицинские новости. — 2014. — №4. — С. 48-50. Summary. The efficiency of platelet lysate has been estimated as a supplement to the culture medium along with fetal bovine serum (FBS) at expansion of MSCs transplants. It is established that the addition of platelet lysate into a specialized medium for culturing MSCs provides quality cell transplants in a short time. This fact gets the opportunity for application of this product as an alternative to FBS in clinical protocols. Keywords: mesenchymal stem cells, platelet lysate, cell transplant. Meditsinskie novosti. - 2014. - N4. - P. 48-50.

Эмбриональная телячья сыворотка (ЭТС) представляет собой реагент, предназначенный для лабораторного применения. При получении клеточных трансплантатов для терапии в большинстве опубликованных международных клинических исследований данный реагент также применяется в со-

ставе культуральной среды. ЭТС содержит низкомолекулярные биоактивные факторы, обладающие нейропротек-тивными свойствами и играющие критическую роль в ослаблении эффекта цитотоксичности, вызванного некротическими и апоптическими сигналами (деполяризация митохондриальной

мембраны и активация каспазы-3) [3]. Несмотря на имеющиеся данные об отсутствии у пациентов побочных эффектов, связанных с использование ЭТС [1], в последнее время все активнее ведется поиск питательных добавок со сходными свойствами не животного происхождения. Человеческая сыво-

* Примечание к рис. 1 и 2: КМ РС - образцы костного мозга от пациентов с рассеянным склерозом, КМ доноры - образцы костного мозга от здоровых доноров, ЖТ доноры - образцы жировой ткани, полученные от умерших доноров

Рисунок 1

Сравнительный анализ длительности культивирования МСК с использованием ЭТС и лизата тромбоцитов*

Рисунок 2

| Сравнительный анализ клеточности образцов МСК, полученных при культивировании с использованием ЭТС и лизата тромбоцитов*

ротка и лизат тромбоцитов становятся такой альтернативой [2, 5].

Лизат тромбоцитов содержит 7 фундаментальных факторов роста, активно секретируемых тромбоцитами: PDGFaa (platelet derived growth factor), -ßß, -aß, TGFß1 (transforming growth factor) и -ß VEGF (vascular endothelial growth factor), EGF (epidermal growth factor). Ростовые факторы PDGF TGF EGF и FGF (fibroblast growth factor) являются митогенами для мезенхимальных стволовых клеток (МСК). Культивирование МСК с использованием лизата тромбоцитов позволяет получить большое количество клеток за короткое время. Клетки, выращенные в этих условиях, соответствуют всем критериям МСК [4].

Цель исследования - оценить эффективность использования лизата тромбоцитов в качестве добавки к культу-ральной среде наряду с эмбриональной телячьей сывороткой при наращивании трансплантатов МСК.

Материалы и методы

Материалом исследования являлись мезенхимальные стволовые клетки, полученные из костного мозга (КМ) от здоровых доноров, пациентов с рассеянным склерозом (РС), а также из жировой ткани (ЖТ) параумбиликальной и паранеф-ральной анатомической локализации от умерших доноров в процессе операции мультиорганного забора.

В исследование было включено 16 образцов костного мозга, полученных от пациентов с рассеянным склерозом, 16 образцов костного мозга, полученных от здоровых доноров, 14 образцов жировой ткани, полученных от умерших доноров в процессе операции мультиорганного забора.

Выделение клеток из костного мозга и жировой ткани проводили согласно технологическим протоколам получения и паспортизации стандартизованного трансплантата мезенхимальных стволовых клеток из КМ и ЖТ.

Лизат тромбоцитов получали по общепринятой методике из пула тромбоцитов не менее чем от 10 доноров.

Культивирование проводили в специализированной среде для мезенхимальных стволовых клеток (среда Игла в модификации Дульбекко (DMEM), содержащей 5% лизата тромбоцитов или 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 1% антибиотика, 1% Ьглутамина), замена которой выполнялась каждые 3-4 суток (1/2 объема). Визуальный контроль скорости пролиферации осуществлялся методом микроскопирования с использованием универсального инвертированного микроскопа с применением фазового контраста. По достижении культурами 70-80% монослоя клетки снимали с поверхности культурального флакона с помощью раствора трипсина/ЭДТА. Полученные клетки подсчитывали и пересевали на последующие пассажи (плотность от 5х 103 на см2 поверхности) с целью достижения необходимой клеточности трансплантата МСК.

Контроль качества МСК включал морфологический анализ культур клеток с применением универсального инвертированного микроскопа («Micros», Австрия и «Nikon», Япония) методом фазового контраста; определение жизнеспособности клеток общепринятым методом по исключению трипанового синего; иммунофенотипический анализ мезен-химальных клеток методом проточной

цитофлюориметрии с использованием следующей панели моноклональных антител (МКАТ): CD 90, CD 105, CD 13, CD 44, CD 73, CD 54, CD 29, CD 9, CD 34, CD 45, HLA-DR; контроль стерильности на автоматическом анализаторе «Бакт/ Алерт» (Франция).

Результаты и обсуждение

Для оценки эффективности использования пулированного тромболизата был проведен сравнительный анализ клеточности трансплантатов МСК на конечном этапе их культивирования при использовании в качестве добавки к среде 5 % тромболизата или 10% ЭТС, а также оценка длительности пребывания клеток в культуре. Установлено, что культивирование клеток в присутствии 5% тромболизата способствует сохранению характерной для ранних пассажей морфологии. Добавление тромболизата позволило ускорить процесс образования монослоя в культуре и сократить сроки культивирования по сравнению с таковым показателем при использовании ЭТС (рис. 1).

Необходимое для терапии количество МСК КМ от пациентов с рассеянным склерозом при использовании тромбо-лизата в качестве добавки к среде получали за (18; 30) дней, с медианным значением 26 дней (п=8). Аналогичный показатель в присутствии 10% сыворотки - (41; 84), с медианным значением 57 дней (п=8). При культивировании МСК КМ от здоровых доноров сроки пребывания клеток в культуре составили (20; 31) день, с медианным значением 22 дня, для лизата тромбоцитов (п=8) и (26; 69) дней, с медианным значением 35,5 дня, для ЭТС (п=8) соответственно. Для МСК ЖТ требуемая клеточность достигалась

№4^ 2014

¡медицинские новости" |49

за (11; 32) дня, с медианным значением 22 дня, при использовании тромболизата (п=9). Длительность культивирования клеток в присутствии 10% ЭТС составила (34; 75) дней, с медианой 54 дня (п=5).

Таким образом, использование 5% тромболизата в качестве добавки к куль-туральной среде позволяет сократить сроки культивирования в 1,6-2,4 раза по сравнению с применением 10% ЭТС.

При анализе клеточности образцов было установлено, что сокращение сроков их культивирования не приводило к уменьшению количества клеток в трансплантатах, получаемых с использованием тромболизата. Напротив, использование 5% тромболизата в качестве добавки к культуральной среде способствовало увеличению клеточности образцов на всех этапах получения трансплантатов МСК по сравнению с использованием 10% ЭТС (рис. 2).

Как видно из гистограммы

х106, с медианой 209х106, на конечном этапе культивирования при использовании тромболизата (п=8). Аналогичный показатель при добавлении ЭТС - (12; 89,3) х106, с медианой 64,3х106 клеток, (п=8). При культивировании МСК КМ от здоровых доноров количество клеток в анализируемых образцах составило (112; 774,35) х106, с медианой 192,63 х106, для лизата тромбоцитов (п=8), и (66,7; 244,35) х106, с медианой 84,94 х106, - для ЭТС (п=8). При культивировании МСК ЖТ данный показатель составил (91;328,24) х106, с медианой 172 х106, при использовании тромболизата (п=9). Длительность культивирования клеток в присутствии 10% ЭТС - (20,5; 69,5) х106, с медианным значением 30х106 (п=5).

Таким образом, использование 5% тромболизата в качестве добавки к культу-ральной среде способствует увеличению клеточности трансплантатов от 2,3 раза для МСК, выделенных из костного мозга, до 5,7 раза для МСК, выделенных из жировой ткани, по сравнению с клетками, культивированными в присутствии 10% ЭТС.

Выводы:

1. Установлено, что использование 5% тромболизата в качестве добавки к культуральной среде обеспечивает получение качественного клеточного трансплантата в более короткие сроки по сравнению с применением 10% ЭТС.

2. Использование 5% тромболизата в качестве добавки к культуральной среде способствует увеличению клеточности трансплантатов МСК.

3. Полученные данные позволяют рекомендовать использование лизата тромбоцитов в качестве альтернативы ЭТС в клинических протоколах.

Л И Т Е Р А Т У Р А

1. BergerM.G. [et al.] // Stem. Cells. - 2006. - Vol.24. -Р.2888-2890.

2. Doucet C. [et alj // J. Cell. Physiol. - 2005. -Vol.205. - Р.228-236.

3. Kume T [et al.] // Eur. J. Pharmacol. - 2006. -Vol.542. - Р.69-76.

4. Lange^ C. [et al.] // Cell. Ther. Transplant. - 2008. -

5. Stute N. [et al.] // Exp. Hematol. - 2004. - Vol.32. -Р.1212-1225.

Поступила 19.07.2013 г.

Экспрессия вт-тубулина в клетках колоректального рака

Портянко А.С.1, Ковалев П.А.2, Межеевский А.Б.1, Горгун Ю.В.3, Черствый Е.Д.1

Белорусский государственный медицинский университет, Минск 21ородское клиническое патологоанатомичекое бюро, Минск 3Белорусская медицинская академия последипломного образования, Минск

Portyanko A.S.1, Kovalev P.A.2, Mezheyeuski A.B.1, Gorgun J.V.3, Cherstvoy E.D.1

1 Belarusian State Medical University, Minsk 2 City Clinical Pathological Bureau, Minsk 3 Belarusian Medical Academy of Post-Graduate Education, Minsk

Expression of pm-tubulin in colorectal cancer cells

Резюме. Известно, что инвазивный рост опухоли связан с динамикой структур цитоскелета, в том числе и микротрубочек. Состав микротрубочек влияет на их свойства, включая динамику и чувствительность к химиотерапевтическим препаратам. Цель данного исследования -установление изменений в экспрессии fi-тубулина в клетках колоректального рака. В основу исследования легло определение оптической плотности хромогена в гистологических препаратах, окрашенных методом иммуногистохимии. Было установлено статистически значимое повышение оптической плотности в инвазивном крае.

Ключевые слова: колоректальный рак, тубулин, цитоскелет, опухолевое почкование, инвазия. Медицинские новости. — 2014. — №4. — С. 50-53.

Summary. It is known that cancer cell invasion is associated wtth the dynamics of cytoskeletal structures including microtubules. Composition of microtubules affects their properties, including dynamics and sensitivity to anticancer agents. Hence, we investigated the expression of ftiirtubulin in colorectal cancer cells. The study was based on the determination of optical density of chromogen on histological slides stained by immunohistochemistry. A significantly higher optical density was found at the invasive front. Keywords: colorectal cancer, tubuiin, microtubules, cytoskeleton, tumor budding, invasion. Meditsinskie novosti. - 2014. - N4. - P. 50-53.

Несмотря на определенные успехи, смертность от злокачественных новообразований остается актуальной проблемой здравоохранения во всем мире. Во многом это связано

с ограниченным эффектом используемых химиотерапевтических средств. Для обеспечения значительного прорыва в данной области требуются новые подходы к созданию противоопухоле-

вых препаратов. Одним из таких подходов может стать подавление миграционной активности опухолевых клеток, поскольку именно метастазирование как следствие инвазивного роста и со-