Анализ многолетнего опыта изучения инактивированных культуральных вакцин для профилактики f клещевого энцефалита отечественного и зарубежного производства по показателю качества -специфическая активность (иммуногенность)

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2015 УДК 615.371

Анализ многолетнего опыта изучения инактивированных культуральных вакцин для профилактики клещевого энцефалита отечественного и зарубежного производства по показателю качества - специфическая активность

М.С. Воробьёва, О.С. Афонина, О.А. Бархалева, М.С. Щербинина, К.А. Саркисян, А.В. Рукавишников, В.А. Шевцов, В.П. Бондарев

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Москва, Россия

The analysis of a long-term experience of studying inactivated cell-culture vaccines for preventing tick-borne encephalitis of domestic and foreign manufacture in terms of specific activity

M.S. Vorobieva, O.S. Afonina, O.A. Barhaleva, M.S. Shcherbinina, K.A. Sarkisyan, A.V. Rukavishnikov, V.A. Shevtsov, V.P. Bondarev

Federal State Budgetary Institution «Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products» of the Ministry of Health of the Russian Federation, Moscow, Russia

Проведен анализ применения метода оценки специфической (иммуногенной) активности современных вакцин клещевого энцефалита (вакцины КЭ) по протективному разведению (ПР50) и минимальной иммунизирующей дозе (МИД5Ю). Метод стандартизован и внесен в нормативные документы на зарегистрированные в Российской Федерации вакцины КЭ. При анализе результатов изучения специфической (иммуногенной) активности вакцин КЭ (исследовано 107 серий вакцин КЭ различных производителей) подтверждены: выбор показателя реальной летальной дозы (РЛД5Ю) вируса КЭ (тест-штамм «Абсеттаров») в пределах 100-3000 ЛД50, целесообразность применения линейных мышей ВАиВ/с, эффективность применения отечественного метода определения иммуногенности по показателю МИД5Ю для вакцин КЭ, зарегистрированных в Российской Федерации. Подтверждена целесообразность применения стандартного образца иммуногенности вакцины КЭ - ОСО 42-28-48для оценки сходимости результатов постановки экспериментов и однородности лабораторных животных по качеству. Метод определения имму-ногенности вакцин КЭ (показатель качества «Специфическая активность (иммуногенность)» по показателям ПР50 и МИД50 применим как для российских коммерческих вакцин КЭ, так и для вакцины ФСМЕ-Иммун, производства компании «Бакстер вакцины АГ», Австрия.

Ключевые слова: клещевой энцефалит; вакцинопрофилактика; качество вакцин клещевого энцефалита; иммуногенность; специфическая активность; лабораторный контроль; сертификация; стандартизация; линейные мыши. Библиографическое описание: Воробьёва МС, Афонина ОС, Бархалева ОА, Щербинина МС, Саркисян КА, Рукавишников АВ, Шевцов ВА, Бондарев ВП. Анализ многолетнего опыта изучения инактивированных культуральных вакцин для профилактики клещевого энцефалита отечественного и зарубежного производства по показателю качества - специфическая активность (иммуногенность). Биопрепараты 2015; (4): 4-10.

The analysis of the use of the method for the evaluation of specific (immunogenic) activity of vaccines for preventing tick-borne encephalitis (TBE vaccines) against protective dilution (PD50) and the minimum immunizing dose (MID50) has been performed. The method was standardized and submitted to the regulatory documents for TBE vaccines authorized in the Russian Federation. When analyzing the results of the study of specific (immunogenic) activity of TBE vaccines (107 TBE vaccine batches by different manufacturers have been studied) it was confirmed that the choice of real lethal

Э

( Обзор

dose (RLD50) indicator of TBE virus (test strain «Absettarov») in the range of 100-3000 LD50, the reasonability of using BALB /c cell-line mice, the effectiveness of the national method of determining immunogenicity in terms of MlD50 for TBE vaccines authorized in the Russian Federation. The reasonability of using immunogenicity reference standard for TBE-OSO 42-28-48 to assess the reproducibility of the experiments, and the homogeneity of laboratory animals in terms of quality. Methods for determining TBE vaccine immunogenicity («specific activity (immunogenicity)» in terms of PD50 and MIDI0) is applicable both for Russian commercial TBE vaccines and for FSME-Immun vaccine, manufactured by «Baxter Vaccine AG», Austria.

Key words: tick-borne encephalitis; vaccination; tick-borne encephalitis vaccine quality; immunogenicity; specific activity; laboratory testing; certification; standardization; linear mice.

Bibliographic description: Vorobieva MS, Afonina OS, Barhaleva OA, Shcherbinina MS, Sarkisyan KA, RukavishnikovAV, Shevtsov VA, Bondarev VP. The analysis of a long-term experience of studying inactivated cell-culture vaccines for preventing tick-borne encephalitis of domestic and foreign manufacture in terms of specific activity (immunogenicity). Biopreparation (Biopharmaceuticals) 2015; (4): 4-10.

Гарантией качества вакцин является биологическая стандартизация, регламентирующая комплекс требований к иммунобиологическому лекарственному препарату на всех этапах производства, начиная с сырья, субстрата репродукции возбудителя и заканчивая методами контроля серий готового препарата. Качество вакцин клещевого энцефалита (КЭ) тесно связано с совершенствованием и унификацией технологии производства препаратов. Одним из основных показателей качества является специфическая активность (иммуно-генность) препарата.

До 1984 г. для контроля защитных свойств неконцентрированной культуральной инактивированной вакцины КЭ использовали метод иммунизации мышей линии ВА1_В/с испытуемой серией неразведенной вакцины КЭ с последующим заражением иммунизированных и мышей контрольной группы тест-штаммом вирулентного вируса КЭ и определением индекса резистентности (113), представляющий собой разность показателей инфекционной активности вирулентного тест-штамма вируса КЭ при титровании на группах контрольных и иммунизированных испытуемой серией вакцины КЭ мышей. Метод применялся при контроле вакцин КЭ в ОБТК предприятий-производителей и в ГИСК им. Л.А. Тара-севича [1-3].

Совершенствование производства вакцин КЭ, оптимизация технологии культивирования вируса КЭ, современные методы концентрации и очистки вакцинного антигена потребовали разработки современных, более чувствительных методов испытания специфической (иммуногенной) активности препарата на животных.

В 1982-1984 годах с целью оценки активности концентрированной очищенной инактивированной культуральной вакцины КЭ на предприятии по производству бактерийных и вирусных препаратов института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова был разработан и аттестован метод определения иммуногенной активности по минимальной иммунизирующей дозе (МИД50). Метод основан на соблюдении ряда требований: использовании инбредных мышей ВА_В/с определенной весовой категории и возраста, иммунизации опытных групп животных различными разведениями испытуемой серии вакцины, приготовленными на одном и том же растворителе, с последующим проведением разрешения на иммунизированных мышах определенной дозой вирулентного тест-штамма вируса КЭ. Параллельно, в идентичных условиях, провели иммунизацию мышей линии ВА_В/с и все перечисленные выше процедуры постановки опыта для препарата сравнения - отраслевого стандартного образца вакцины КЭ - ОСО иммуногенности с регламентированными и стабильными показателями активности для

подтверждения правильности сходимости результатов постановки теста иммуногенной активности испытуемой серии вакцины [4, 5].

С 2001 г. метод определения иммуногенной активности на мышах ВА_В/с по МИД50 с применением ОСО иммуноген-ности вакцины КЭ был использован для первичной аттестации в рамках доклинических испытаний и последующего контроля серий вакцины КЭ культуральной инактивированной концентрированной очищенной сорбированной «ЭнцеВир», разработанной и производимой в ФГУП «НПО «Микроген» Минздрава РФ, в филиале НПО «Вирион», г. Томск.

Метод определения иммуногенной активности вакцин КЭ, с применением ОСО иммуногенности в качестве препарата сравнения, применяется до настоящего времени, регламентирован действующими нормативными документами (ФСП) на отечественные вакцины КЭ [7].

Схема иммунизации мышей, определение показателей РЛД50 (реальная 50% летальная доза тест-штамма вируса КЭ) и ПР50 (протективное разведение вакцины) сопоставимы с методом определения иммуногенности вакцин КЭ, изложенным в Европейской фармакопее [8]. Для отечественных вакцин КЭ, на основании показателя ПР50 с учетом прививочной дозы вакцины дополнительно рассчитывается относительный показатель МИД50, предложенный профессором Л.Б. Эльбертом с соавт. в 1982 г. [6, 11]. Отечественный метод определения специфической активности вакцин КЭ имеет некоторые отличия от зарубежного: кратность разведений вакцины для иммунизации животных, характеристика линии инбредных мышей, метод учета и обработки результатов опыта, характеристика применяемого в эксперименте тест-штамма вируса КЭ.

За рубежом при оценке иммуногенности вакцин КЭ (Энцепур, Германия; ФСМЕ-Иммун, Австрия), в качестве препаратов сравнения используют соответствующие референс-препараты. В сравнении с лиофилизи-рованным образцом отечественного препарата сравнения - ОСО иммуногенности (срок годности 5 лет), зарубежные референс-препараты выпускаются в жидкой форме и имеют короткий срок годности. Лимит активности зарубежных вакцин рассчитывается с помощью пробит-анализа по коэффициенту протективности (отношение ПР50 для серии вакцины КЭ к ПР50 референс-препарата). Для зарубежных вакцин КЭ компании-производители указывают лимиты протективности - не менее 0,82 относительно референс-препарата (вакцина Энцепур) и не менее 65% относительно референс-препарата (вакцина ФСМЕ-Иммун). Для вакцины Энцепур показатели коэффициента протективности по результатам лабораторных исследований составляют

1,87-5,98; а для серий вакцины КЭ ФСМЕ-Иммун показатели активности составляют 69-102% и более по отношению к референс-препарату [10].

При регистрации зарубежных вакцин КЭ в Российской Федерации воспроизведение методов оценки иммуно-генной активности этих препаратов (при отсутствии используемых иностранными компаниями вирулентных тест-штаммов вируса КЭ и референс-препаратов) было затруднительным и не обеспечивало возможность в доклиническом лабораторном испытании оценить и сопоставить активность зарубежных вакцин КЭ в сравнении с отечественными препаратами [2].

Целями данного исследования являлись:

- определение целесообразности, доступности и перспективности применения разработанного в России метода определения специфической (иммуногенной) активности вакцин КЭ по показателю МИД50 для лабораторной оценки защитных свойств вакцин КЭ отечественного и зарубежного производства.

- определение преимущества использования линии ин-бредных мышей ВА1_В/с для метода оценки иммуногенной активности вакцин КЭ;

- определение пригодности применения РЛД50 (реальной 50% летальной дозы вируса КЭ тест-штамма при лимите, указанном в НД - 100-3500 ЛД50).

Материалы и методы

Материалы

1. Животные

- инбредные мыши линий: СВА, масса тела 14-16 г;

- ВА_В/с, масса тела 14-16 г.

Животные поступали из Центрального питомника лабораторных животных РАМН. Рацион питания стандартный, с достаточным количеством воды.

2. Вакцины КЭ:

- серии вакцины КЭ культуральной инактивированной сорбированной жидкой (неконцентрированной) производства Томского НИИВС, прививочная доза 1,0 мл, поступавшие на контроль в ГИСК им. Л.А. Тарасевича в период с 1975 г. по 1983 г. (архивные материалы по результатам контроля 16 серий);

- серии вакцины КЭ культуральной инактивированной концентрированной очищенной сухой производства ФГУП ПИПВЭ им. М.П. Чумакова, прививочная доза 0,5 мл, поступавшие на контроль в ГИСК им. Л.А. Тарасевича за период с 1992 г. по 2010 г. (архивные материалы по результатам контроля 24 серий);

- серии вакцины КЭ культуральной инактивированной концентрированной очищенной сорбированной ЭнцеВир, производства ФГУП «НПО «Микроген», прививочная доза 0,5 мл, поступавшие на контроль с 2001 г. по 2010 г. (архивные материалы по результатам контроля 33 серий).

3. Серии стандартного образца вакцины: ОСО 42-28-48 соответствующего года выпуска.

4. Вирулентный штамм вируса КЭ «Абсеттаров» (европейский подтип), хранящийся в Государственной коллекции вирусов в Институте вирусологии им. Д.И. Ивановского.

Методы

1. Оценка вакцин КЭ по показателю «Специфическая активность» по индексу резистентности

Мышей линии ВА_В/с иммунизировали серией вакцины КЭ (неконцентрированный препарат производства НПО «Вири-

он», г. Томск) двукратно, с интервалом 1 сут, внутрибрюшин-но, дозой по 1,0 мл неразведенной вакцины. Одновременно формировали контрольную группу мышей BALB/c для последующего титрования вируса тест-штамма на иммунизированных мышах и животных контрольной группы. Разрешающий опыт титрования тест-штамма проводили через 7-8 сут после второй иммунизации мышей вакциной КЭ: суспензию вируса КЭ, тест-штамм «Абсеттаров» в объеме 0,25 мл вводили внутрибрюшинно в разведениях 10-2-10-7 иммунизированным мышам, и в разведениях 10-4-10-9 мышам контрольной группы, по 6 особей на каждое разведение. Наблюдение за животными после введения вируса КЭ проводили в течение 14 сут с ежедневным учетом количества выживших и заболевших (павших) мышей. Титры вируса тест-штамма «Абсеттаров» в lg ЛД50/мл определяли по методу Рида и Менча [9].

2. Определение иммуногенной активности вакцин КЭ по показателю МИД50

Мышей линии BALB/c или СВА трехкратно иммунизировали подкожно разведениями вакцины (1:10, 1:32, 1:100, 1:320) в дозе 0,5 мл, с интервалами 1-2 сут, с последующим внутри-брюшинным введением через 7-9 сут после последней иммунизации вирулентного вируса КЭ (тест-штамма «Абсеттаров») в расчетной дозе вируса 100-3500 ЛД50 в объеме 0,25 мл при титре вируса не менее 8,5 lg ЛД50/мл. Животных наблюдали в течение 14 сут. По количеству выживших и заболевших (павших) мышей с помощью метода Рида и Менча рассчитывали три показателя:

- РЛД50 (реальная летальная доза вируса тест-штамма, введенная внутрибрюшинно иммунизированным вакциной КЭ мышам);

- ПР50 (протективное разведение вакцины, обеспечивающее защиту 50% иммунизированных мышей от заражения вирулентным тест-штаммом вируса КЭ в дозе, равной

РЛД50);

- МИД50 (относительный показатель) - минимальное иммунизирующее количество (в мл) вакцины КЭ, которое защищает иммунизированных испытуемой вакциной КЭ мышей от заражения реальной летальной дозой вируса КЭ (РЛД50).

3. Статистические методы

Определение суммарных средних показателей (M ± m) для РЛД50, ПР50 и МИД50 проводили на основании значений этих показателей для каждой исследованной серии (п) вакцин КЭ при использовании компьютерной программы расчета Microsoft Office Excel: M (среднеарифметическое значение определяемого показателя) и m (стандартное отклонение) [12].

Результаты и обсуждение

1. Сравнение методов оценки иммуногенной активности вакцин КЭ

Оценку иммуногенной активности вакцин КЭ проводили двумя методами: определения IR и МИД50 для 6 серий неконцентрированной вакцины КЭ и двух вариантов (по 5 серий) концентрированной очищенной вакцины КЭ, результаты представлены в таблице 1.

Метод определения значения индексов резистентности (IR): установлены близкие (средние) IR: от 6,0 до 7,8 независимо от технологии производства испытуемых серий вакцины КЭ.

Метод определения МИД50: выявлено различие в показателях МИД50 - средний показатель МИД50 для концентрированной вакцины КЭ был меньше (в 2-4 раза по отношению к

э

Review

Таблица 1. Сравнительный анализ иммуногенной активности по 1Я и МИД50 серий вакцин КЭ разной технологии при оценке с применением двух методов определения

Вакцина КЭ/ количество серий (п)* Средний показатель индекса резистентности (1Р) Р** Средний показатель иммуногенности по МИД50 Р**

Неконцентрированная культуральная инактивированная сорбированная вакцина КЭ (штамм «Софьин») п*= б 7,б1±0,5 >0,1 0,022+0,006 <0,001

Концентрированная очищенная культуральная инактивированная сухая вакцина КЭ (штамм «Софьин»), вариант технологии очистки и концентрации вакцинного антигена: ультрацентрифугирование в градиенте плотности сахарозы - п* = 5 7,88±0,4б >0,1 0,005+0,002

Концентрированная очищенная культуральная инактивированная сухая вакцина КЭ (штамм «Софьин»), вариант технологии очистки и концентрации вакцинного антигена: адсорбционная хроматография с гель-фильтрацией -п* = 5. б,0±0,5 0,008+0,001

Примечание. п* - количество исследованных серий вакцин; Р**- критерий Р, характеризующий достоверность различия ( по таблице Стьюдента-Фишера) между средними геометрическими величинами М ± т [12].

Таблица 2. Иммуногенная активность по методу МИД50 концентрированной вакцины КЭ (штамм «Софьин») при сравнительном исследовании на мышах линии ВАЬВ/с и линии СВА

Линия мышей Показатели МИД,70,5 мл для 6 серий концентрированной вакцины КЭ производства НИИ полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР М±т P**

БМБ/с 0,0089 0,012 0,01 0,0078 0,0070 0,0078 0,0086+0,00084 <0,01

СВА 0,021 0,02 0,03 0,016 0,009 0,015 0,016+0,0023

Примечание. Р** - см. примечание к таблице 1.

лимиту МИД50). Для неконцентрированной вакцины КЭ - показатель МИД50 составил от 0,016 до 0,028 мл (с учетом значения «т») и превышал значение лимита иммуногенной активности.

Метод МИД50 дифференцирует по активности вакцины КЭ различной технологии и подтверждает более высокую имму-ногенную активность отечественной концентрированной очищенной вакцины КЭ в сравнении с ранее выпускавшейся неконцентрированной вакциной КЭ.

На основании проведенного анализа была подтверждена более высокая чувствительность метода определения специфической активности (иммуногенности) вакцин КЭ по показателю МИД50 в сравнении с методом определения !И.

2. Анализ результатов исследования активности вакцин КЭ на двух линиях инбредных мышей

Представлены результаты оценки показателей МИД50 для 6 серий концентрированной вакцины КЭ при использовании для иммунизации двух различных линий мышей - СВА и ВА_В/с. Животные не различались по массе тела, возрасту, были аналогичными и другие условия экспериментов - использовали равнозначную стандартную регламентированную нормативной документацией на вакцину КЭ методику определения показателя «Специфической активности» по МИД50 (табл. 2).

Согласно данным, представленным в таблице 2, при анализе значений МИД50 для каждой серии, средних значений и среднего отклонения (М±т) МИД50 было установлено преимущество линии мышей ВА_В/с. Значения МИД50 для серий концентрированной вакцины КЭ при испытании на мышах линии ВА_В/с - 0,0078-0,0094 мл были меньше по сравнению с результатами оценки МИД50 на мышах линии СВА -0,014-0,018 мл, т.е. минимальная доза вакцины для мышей ВА_В/с, необходимая для создания защиты от вируса КЭ в пересчете на введенную дозу вакцины (0,5 мл), в 2 раза меньше, чем минимальная доза вакцины КЭ для мышей СВА. В настоящее время применение более чувствительной

и иммунологически более реактивной линии мышей ВА_В/с включено в общую фармакопейную статью (ФСП) на отечественные вакцины КЭ для определения иммуногенной активности вакцин КЭ [7].

3. Анализ результатов испытаний специфической активности серий вакцин КЭ отечественного и зарубежного производства с применением показателя МИД50, с определением пригодности применения РЛД50

Проведен анализ иммуногенной активности (по средним значениям показателей ПР50 и МИД50) 57 серий двух отечественных концентрированных очищенных культуральных инактивированных вакцин КЭ. Значения МИД50 для каждой испытуемой серии вакцин КЭ были распределены в зависимости от величины РЛД50 вируса тест-штамма «Абсеттаров» (в пределах от 100-3500 ЛД50). Правильность постановки экспериментов и достоверность полученных результатов подтверждались параллельной оценкой иммуногенности ОСО вакцины КЭ (табл. 3).

Показано, что средние значения реальной летальной дозы вируса тест-штамма по отношению к расчетной летальной дозе (от 100 ЛД50 до 1000 ЛД50) составляют (с учетом стандартного отклонения «т»): 484,5 ЛД50/486,25 ЛД50 - 2456,2 ЛД50/2321,3 ЛД50. Установлены средние значения («М») для ПР50 и МИД50 по 33 сериям вакцины КЭ ЭнцеВир и по 24 сериям вакцины КЭ ПИПВЭ-Москва. Показано отсутствие зависимости этих показателей активности от величины реальной летальной дозы вируса КЭ, тест-штамм «Абсеттаров», введенной иммунизированным мышам: значения «т»: для вакцины КЭ ЭнцеВир МИД50 - 0,006/0,010-0,004/0,005 мл, а для вакцины КЭ ПИПВЭ-Москва - от 0,004/0,005 до 0,005/0,007 мл при значении лимита иммуногенности по ФСП = 0,0125 и показателях МИД50 для ОСО иммуногенности: 0,004/0,0060,002/0,004 мл соответственно. Проведенный анализ показал, что значения РЛД50 допустимы в пределах от 100 до 3500 ЛД50, современные отечественные вакцины КЭ обладают значительным запасом иммуногенной активности по МИД50 на мышах линии ВА_В/с.

Таблица 3. Иммуногенная активность вакцин КЭ культуральных инактивированных концентрированных очищенных: лиофилизированной вакцины производства «ФГУП «ПИПВЭ им. М.П. Чумакова», Москва, сорбированной ЭнцеВир производства ФГУП «НПО «Микроген», г. Томск

Средние показатели иммуногенности

Название вакцины/ количество серий

РЛД50 ПР50 МИД50 ПР50 МИД50

ЭнцеВир / 19 серий

484,5 ± 248,6 1: 64,4 ± 13,3 0,008±0,0021 1:154,4 ± 11,1 0,007 ± 0,001

ЭнцеВир / 14 серий

2456,2 ± 476,7 1:157,4 ± 26,1 0,0041±0,0006 1:167,4 ± 38,1 0,004 ± 0,0007

ПИПВЭ-Москва / 18 серий

486,25 ± 212,4 1:159,6 ± 31,1 0,004±0,0005 1:100,7 ± 18,4 0,005 ± 0,0008

ПИПВЭ-Москва / 6 серий

2321,3 ± 208,7 1:90,9 ± 15,7 0,006±0,0009 1:170,9 ± 55,1 0,003 ± 0,001

Таблица 4. Иммуногенная активность вакцин КЭ культуральных инактивированных концентрированных очищенных сорбированных: ФСМЕ-Иммун компания «Бакстер вакцины АГ», Австрия и Энцепур взрослый, компания «Новартис вакцины АГ», Германия

Средние показатели иммуногенности ^±m) ОСО иммуногенности России ^±m)

Название вакцины/ количество серий

рлД50 ПР50 МИД50 ПР50 МИД50

ФСМЕ-Иммун /10 серий

625±338,7 1:172,2±29,3 0,003±0,0005 1:260,7±94,6 0,004±0,001

ФСМЕ-Иммун / 4 серии

3203,5±723,3 1:151,1±28,5 0,002±0,0009 1:224,4±135,2 0,002±0,001

Энцепур взрослый / 4 серии

758,3±407,8 1:118,1±118,5 0,02 ±0,01 1:248,6± 116,5 0,003± 0,002

Энцепур взрослый / 10 серий

2085,03±582,5 1:26,7 ±4,5 0,022 ±0,004 1:234,08±54,7 0,002± 0,0004

Таким образом, анализ многолетнего опыта применения метода расчета иммуногенной активности серий вакцин КЭ по МИД50 подтвердил возможность стандартного определения активности вакцин КЭ как по каждой серии, так и по средним показателям. Параллельное применение стандартного образца - ОСО иммуногенности вакцин КЭ в опытах на мышах BALB/c подтверждает правильность и сходимость полученных результатов.

Проведены сравнительные исследования оценки им-муногенной активности с применением российского метода определения по МИД50 в рамках регистрации в Российской Федерации вакцины ФСМЕ-Иммун, Австрия. В ранее опубликованных нами предварительных испытаниях (до регистрации препарата в России), были использованы в сравнительном тесте по три серии вакцин КЭ австрийского и отечественного производства. Исследования по оценке иммуногенности проводились на мышах линии BALB/с и линии Swiss при применении следующей схемы иммунизации мышей: двукратно, подкожно, животные были иммунизированы дозами вакцины КЭ в разведениях от 1:5 до 1:125 в объеме по 0,2 мл, с последующим разрешением вирулентными тест-штаммами вируса КЭ: «Абсет-таров», «Hypr» (европейский подтип) и штаммами № 205, № 139 (дальневосточный подтип) в дозах от 100 ЛД50 до 3000 ЛД50. Не было выявлено статистически значимых различий в показателях иммуногенности (по ПР50) для обеих вакцин КЭ при инфицировании иммунизированных животных различными штаммами вируса КЭ, принадлежащими к

различным подтипам вируса во всех использованных дозах вируса [13, 14]. Проведенные предварительные сравнительные исследования вакцин КЭ с применением различных тест-штаммов, в том числе и тест-штамма «Абсет-таров», в дозе от 100 до 3000 ЛД50 и различных линий мышей подтвердили возможность применения регламентированного отечественного метода определения активности для вакцины ФСМЕ-Иммун.

Как видно из данных, представленных в таблице 4, для вакцины КЭ ФСМЕ-Иммун были выявлены те же закономерности при оценке показателей ПР50 и МИД50 (по средним значениям оценки активности 14 серий вакцины) с параллельной постановкой российского ОСО иммуногенности, значения ПР50 и МИД50 не зависели от величины реальной летальной дозы вируса (штамм «Абсеттаров»).

МИД50 (средние значения) для вакцины КЭ ФСМЕ-Иммун составляла, с учетом значения стандартного отклонения «т», 0,0035-0,0029 мл, при этом для ОСО этот показатель составил 0,003-0,005 мл, при лимите иммуногенности 0,0125 мл.

Таким образом, значения ПР50 и МИД50 для вакцины КЭ ФСМЕ-Иммун, Австрия и ОСО соответствовали российским требованиям по показателю «Специфическая активность» (иммуногенность). Отечественный метод определения имму-ногенной активности вакцин КЭ оказался пригоден для аттестации вакцины КЭ ФСМЕ-Иммун, Австрия. При регистрации препарата в Российской Федерации данный метод был внесен в нормативную документацию на вакцину ФСМЕ-Иммун и

э

( Обзор

Review

до настоящего времени применяется для сертификации серий этого препарата.

Также в таблице 4 представлены результаты анализа им-муногенной активности вакцины КЭ Энцепур взрослый, Германия. Данный препарат в настоящее время в своем составе не содержит альбумина крови человека или других белковых стабилизаторов активности вакцины КЭ. Анализ результатов по определению возможности использования для вакцины КЭ Энцепур взрослый отечественной методики оценки иммуно-генной активности по МИД50 показал, что при значениях РЛД50 758,3-2085,03 ЛД50 (т.е. в пределах 100-3500 ЛД50) были выявлены более низкие значения ПР50 - от 1:118 до 1:2б,7; среднее значение МИД50 для вакцины Энцепур взрослый было, независимо от дозы РЛД50, 0,02-0,22 мл, т.е. более допустимого лимита МИД50 - 0,0125 мл.

Выводы

Отечественный метод определения иммуногенной активности вакцин КЭ - МИД50 обладает достаточной чувствительностью и позволяет проводить сравнение между препаратами, изготовленными по различным технологиям, как отечественных, так и зарубежных производителей.

Доказано преимущество использования для метода оценки иммуногенной активности вакцин КЭ линии инбредных мышей ВАLB/c.

Определена пригодность применения реальной 50% летальной дозы вируса КЭ тест-штамма «Абсеттаров» (РЛД50) при ее содержании в пределах 100-3500 ЛД50.

Авторы выражают благодарность Марине Николаевне Рас-щепкиной за непосредственное участие в работе.

Литература:

1. Дзагуров СГ, Быченко БД. Биологическая стандартизация. Вопросы вирусологии 1984; (3): 264-70.

2. Воробьёва MC. Принципы стандартизации и совершенствование методов контроля вакцин клещевого энцефалита: дис. . д-ра мед. наук. M.; 1985.

3. Воробьёва MC. Вакцины для специфической профилактики клещевого энцефалита. Дезинфекционное дело 2007; (1): 45-7.

4. Расщепкина MH. Разработка и изучение стандартного образца для оценки иммуногенной активности вакцины клещевого энцефалита. В сб.: Стандарты, штаммы, и методы контроля бактерийных и вирусных препаратов. M.; 1982. С. 154-8.

5. Воробьёва MC, Mеркyлов ВА, Ладыженская ИП, Рукавишников АВ, Шевцов ВА. История создания и оценки качества современных вакцин КЭ отечественного и зарубежного производства. Ведомости Научного центра экспертизы средств медицинского применения 2013; (3): 40-4.

6. Эльберт ЛБ, Ворович MФ, Тимофеев АВ. Сравнительный анализ in vitro и in vivo количественной оценки иммуногенности вакцин клещевого энцефалита. Вопросы вирусологии 1998; (5): 235-8.

7. Вакцина клещевого энцефалита культуральная очищенная концентрированная инактивированная сорбированная жидкая или сухая с в комплекте с растворителем - алюминия гидроксидом. Фармакопейная статья. Государственный стандарт качества лекарственного средства. Available from: http://www.rosminzdrav.ru/ministry/61/11/ materialy-po-deyatelnosti-departamenta/stranitsa-856/spisok-obschih-farmakopeynyh-statey.

8. Красильников ИВ. Вакцины против клещевого энцефалита, бешенства и гепатита В. Разработка высокоэффективной технологии получения препаратов, иммунобиологические и клинические испытания: дис.... д-ра биол. наук. M.; 1998.

9. Reed LJ, Muench H. A simple method for estimating fifty percent endpoints. Amer J Hyg. 1938; 27:493.

10. Kunz Ch, Heinz F, Hofmann H. Immunogenity and reactogenity of a highly purified vaccine against tick-borne encephalitis. Med Virol. 1980; 2: 1039.

11. Эльберт ЛБ, Гагарина АВ, Ханина MK. Концентрированная очищенная вакцина против клещевого энцефалита, приготовленная методом зонального центрифугирования. Разработка препарата. Вопросы вирусологии 1980; (3): 341.

12. Ашмарин ИП, Воробьев АА. Статистические методы в микробиологических исследованиях. M; 1962.

13. Воробьёва МС, Расщепкина МН, Ладыженская ИП, Горбунов МА, Павлова ЛИ, Бектимиров ТА. Сравнительное изучение инактивиро-ванных культуральных вакцин против клещевого энцефалита отечественного производства и производства фирмы «Иммуно» (Австрия). Вопросы вирусологии 1996; 41(5): 221-4.

14. Holzmann H, Vorobyova MS, Ladeshenskaya IP, Ferenzi E, Kundi M, Kunz C, Heinz FX. Molecular epidemiology of tick-borne virus: cross-protection between European and Far Eastern subtypes. Vaccine 1992, 10:345-9.

References

1. Dzagurov SG, Bychenko BD. Biological Standardization. Voprosy virusologii 1984; (3): 264-70 (in Russian).

2. Vorobieva MS. The principles of standardization and improvement of methods for control of tick-borne encephalitis vaccine. Dr.Med.Sci [dissertation]. Moscow; 1985 (in Russian).

3. Vorobieva MS. Vaccines for the prevention of specific tick-borne encephalitis. Dezinfektsionnoe delo 2007; (1): 45-7 (in Russian).

4. Rasschepkina MN. The development and study of a standard sample to evaluate immunogenicity vaccine encephalitis. In: Standards, strains and control methods for bacterial and viral preparations. Moscow; 1982. P. 154-8 (in Russian).

5. Vorobieva MS, Merkulov VA Ladyzhenskaya IP, Rukavishnikov AV, Shevtsov VA. History and assess of the quality of modern vaccines KE of domestic and foreign production. Vedomosti Nauchnogo tsentra ekspertizy sredstv meditsinskogo primeneniya 2013; (3): 40-4 (in Russian).

6. Elbert LB, Vorovich MF, Timofeev AV. Comparative analysis of the quantitative evaluation of the immunogenicity of encephalitis vaccines in vitro and in vivo. Voprosy virusologii 1998; (5): 235-8 (in Russian).

7. Tick-borne encephalitis vaccine culture purified inactivated adsorbed concentrated liquid or dry with together with the solvent - aluminum hydroxide. Pharmacopeial article. State quality standard of medicine. Available from: http://www.rosminzdrav.ru/ministry/61y11/materialy-po-deyatelnosti-departamenta/stranitsa-856/spisok-obschih-farmakopeynyh-statey (in Russian).

8. Krasilnikov iV. The vaccines against tick-borne encephalitis, rabies and hepatitis B. The development of technology for high-performance products, immunobiological and clinical trials. Dr.Biol.Sci [dissertation]. Moscow; 1998 (in Russian).

9. Reed LJ, Muench H. A simple method for estimating fifty percent endpoints. Amer J Hyg. 1938; 27:493.

10. Kunz Ch, Heinz F, Hofmann H. Immunogenity and reactogenity of a highly purified vaccine against tick-borne encephalitis. Med Virol. 1980; 2: 103-9.

11. Elbert LB, Gagarina AB, Hanina MK. The concentrated purified vaccine against tick-borne encephalitis, prepared by zonal centrifugation. Development of the drug. Voprosy virusologii 1980; (3): 341 (in Russian).

12. Ashmarin IP, Vorobiev AA. Statistical methods in microbiological studies. Moscow; 1962 (in Russian).

13. Vorobieva MS, Rasschepkina MN, Ladyzhenskaya IP, Gorbunov MA, Pavlova LI, Bektimirov TA. A comparative study of cultural inactivated vaccine against tick-borne encephalitis, domestic production and production of company "Immuno" (Austria). Voprosy virusologii 1996; 41(5): 221-4 (in Russian).

14. Holzmann H, Vorobyova MS, Ladeshenskaya IP, Ferenzi E, Kundi M, Kunz C, Heinz FX. Molecular epidemiology of tick-borne virus: cross-protection between European and Far Eastern subtypes. Vaccine 1992, 10: 345-9.

Authors:

Federal State Budgetary Institution «Scientific Centre on Expert Evaluation of Medical Application Products» of the Ministry of Health of the Russian Federation, 8 Petrovsky Boulevard, Moscow, 127051, Russian Federation.

Vorobieva MS. Chief expert of Office of expertise of antiviral medical immunobiological preparations of Center for examination and control of medical immunobiological preparations. Doctor of Medical Sciences, professor.

Afonina OS. Microbiologist of Laboratory of viral vaccines of Test Center of Quality Expertise of medical immunobiological preparations.

Barhaleva OA. Leading expert of Laboratory of viral vaccines of Test Center of Quality Expertise of medical immunobiological preparations. Candidate of Biological Sciences.

Shсherbinina MS. 2nd category expert of Laboratory of viral vaccines of Test Center of Quality Expertise of medical immunobiological preparations.

Sarkisyan KA. Head of Laboratory of viral vaccines of Test Center of Quality Expertise of medical immunobiological preparations. Candidate of Medical Sciences.

Rukavishnikov AV. Deputy head of Office of expertise of antiviral medical immunobiological preparations. Candidate of Biological Sciences.

Shevtsov VA. Head of Office of expertise of antiviral medical immunobiological preparations of Center for examination and control of medical immunobiological preparations. Candidate of Medical Sciences.

Bondarev VP. Director of Center for examination and control of medical immunobiological preparations. Doctor of Medical Sciences, professor.

БИО

ПРЕПАРАТЫ

Об авторах

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Российская Федерация, 127051, Москва, Петровский бульвар, 8.

Воробьева Мая Сергеевна. Главный эксперт Управления экспертизы противовирусных МИБП Центра экспертизы и контроля МИБП, д-р мед. наук, профессор.

Афонина Ольга Сергеевна. Микробиолог Лаборатории вирусных вакцин Испытательного центра экспертизы качества МИБП.

Бархалева Оксана Александровна. Ведущий эксперт Лаборатории вирусных вакцин Испытательного центра экспертизы качества МибП, канд. биол. наук.

Щербинина Мария Сергеевна. Эксперт 2-й категории Лаборатории вирусных вакцин Испытательного центра экспертизы качества МИБП.

Саркисян Каринэ Арташесовна. Начальник Лаборатории вирусных вакцин Испытательного центра экспертизы качества МИБП, канд. мед. наук.

Рукавишников Андрей Владимирович. Заместитель начальника Управления экспертизы противовирусных МИБП Центра экспертизы и контроля МИБП, канд. биол. наук.

Шевцов Владимир Александрович. Начальник Управления экспертизы противовирусных МИБП Центра экспертизы и контроля МИБП, канд. мед. наук.

Бондарев Владимир Петрович. Директор Центра экспертизы и контроля МИБП, д-р мед. наук, профессор.

Адрес для переписки: Воробьева Мая Сергеевна; Vorobiova@expmed.ru

Поступила 30.07.2015 г.

Принята 06.1 1.2015 г.