Способ прогнозирования риска тяжелого течения акне на основе экспрессии гена MEFV
METHOD FOR PREDICTING THE RISK OF SEVERE ACNE BASED ON MEFV GENE EXPRESSION

Изобретение относится к медицине, а именно к дерматовенерологии, иммунологии, и может быть использовано для прогнозирования риска тяжелого течения акне.
Известно, что акне - хронический рецидивирующий дерматоз с поражением сально-волосяных фолликулов, имеющий генетическую детерминированность, клинически проявляющийся комедонами, папулами, пустулами, узлами и кистами и обязательным сопровождением сопутствующей патологией (Демина О.М., Картелишев А.В. Параметры иммунного и цитокинового статуса при низкоинтенсивной фотодинамической терапии больных вульгарными угрями подростков // Педиатрия Ж. имени Г.Н. Сперанского. - 2014. - Т. 93. - №1. - С. 122-127; Shi V.Y., Leo Μ., Hassoun L., Chahal D.S., Maibach H.I., Sivamani R.K. Role of sebaceous glands in inflammatory dermatoses // J. Am. Acad. Dermatol. - 2015 Nov; 73(5):856-63. doi: 10.1016/j.jaad.2015.08.015. Epub 2015 Sep 18; Румянцев А.Г., Демина O.M., Райкина E.B. Патогенетический механизм воспаления при акне // Российский иммунологический журнал. - 2020. - Т.23. - №1. - С. 19-26).
Частота встречаемости акне варьирует и составляет от 60 до 90% в возрасте 12-24 лет и старше. Имеются данные, что тяжелые и очень тяжелые формы акне развиваются у 10% пациентов, при этом заболевание может иметь первично-тяжелое течение без предшествующих вариантов легкого или среднетяжелого поражения кожи (Демина О.М. Угревая болезнь: комбинированная лазерная и фотодинамическая терапия: руководство для врачей / Демина О.М., Картелишев А.В. // М.: БИНОМ, 2017. - 160 с; Karimkhani С., Dellavale R.P., Coffeng L.E., Flohr С., Hay R.J., Langan S.M., et al. Global skin disease morbidity and mortality: an update from the Global Burden of Disease Study 2013. JAMA Dermatology. -2017;153(5):406-12).
Одним из методов диагностики кожных болезней является молекулярно-генетическое исследование с анализом ДНК пациента.
Так, полногеномное исследование полиморфизмов, например, в китайской популяции хань выявили 3 однонуклеотидные замены, ассоцированные с тяжелым течением акне, среди которых было идентифицировано два новых локуса предрасположенности в 11р11.2 (DDB2, rs747650 и rs1060573) и 1q24.2 (SELL, rs7531806), которые регулируют метаболизм андрогенов, воспалительные процессы и развитие рубцов при тяжелом тячении акне (Не L., Wu W.J., Yang J.K. et al. Two new susceptibility loci 1q24.2 and 11p11.2 confer risk to severe acne. Nat Commun 2014; 5:2870). В результате метаанализа была подтвержденая ассоциация полиморфизма -308 G/A гена TNFa и акне (Yang J.K., Wu W.J., Qi J., He L., Zhang Y.P. TNF-308 G/A polymorphism and risk of acne vulgaris: a meta-analysis. PLoS One. 2014 Feb 3;9(2) e87806. doi: 10.1371/journal.pone.0087806. eCollection 2014). Среди провоспалительных цитокинов также исследовались полиморфизмы гена IL10 (IL10, 1082 A/G), IL4 (IL4, -590 Т/С), но достоверной связи с акне не отмечено. Хотя анализ полиморфизма IL4R (Q551R A/G) показал более высокую частоту встречаемости гомозиготы GG при акне (Al-Shobaili Н.А., Salem Т.А., Alzolibani А.А., Robaee A.A., Settin A.A. Tumor necrosis factor-α -308 G/A and interleukin 10 -1082 A/G gene polymorphisms in patients with acne vulgaris. J Dermatol Sci. 2012 Oct; 68(l):52-5).
Показано, что профилирование экспрессии генов в коже больных акне может служит показателем генетической предрасположенности к акне, а также являться основой для создания терапевтических средств, модулирующих экспрессию выявленных генов.
Описан метод диагностики угрей с использованием биомаркеров поражений и метод скрининга in vitro для выявления его модуляторов (ЕР2124058 (A1), GALDERMA RES & DEV, 25.11.2009). Данный способ осуществляется путем профилирования экспрессии генов в коже in vitro, полученной из области пораженной кожи при акне и области нормальной кожи, с использованием микросхем Affymetrix U133A. Образцы кожи подвергали быстрой заморозке и подвергали индивидуальному криосекционированию для облегчения выделения РНК.
В вышеупомянутом способе гены с наибольшим кратным увеличением экспрессии в очагах поряжения акне включали матричные металлопротеиназы ММР-1 и ММР-3, которые имели 92 и 64-кратные более высокие паттерны экспрессии соответственно. Другие гены, значительно повышающие активность, включали провоспалительные цитокины IL-8 (в 52 раза) и CXCL-2 (в 16 раз). Также было отмечено значительное увеличение экспрессии хемокинового рецептора 1 (CCR1), рецептора IL-7, рецептора IL-13 и членов семейства IL-1 5 и 9. Экспрессия нескольких антимикробных пептидов была также значительно увеличена в очагах поражения акне по сравнению с нормальной кожей у этих же пациентов. К ним относятся HBD-4 и гранулизин, которые были активированы более чем в 33 раза и в 2 раза соответственно. Также были активированы гранзим, в более чем в 10 раз при поражениях угрей по сравнению с нормальной кожей, в то время как уровень GPR65 был увеличен примерно в 2,7 раза.
Недостатком описанного способа является определение уровня предполагаемых биомаркеров экспрессии генов, т.е. происходит оценка результата работы гена и/или группы генов, которые предположительно вовлечены в патогенез акне. При этом не учитывается, во-первых, что данные биомаркеры могут кодироваться совокупностью различных генов, не участвующих в патогенезе акне. Во-вторых, на синтез продуктов экспрессии генов оказывают влияние внешние (средовые) и внутренние (сопутствующая патология) факторы, что в целом не может служить достоверным критерием диагностики собственно заболевания кожи, в частности акне. Также метод является трудоемким из-за необходимости проводить биопсию кожи с последующим поэтапным многокомпонентым анализом экспрессии генов, что ограничивает применение данного способа у пациентов с акне, локализация высыпания при котором в более чем 90% случаев на коже лица.
Ближайшим аналогом является способ диагностики акне путем мониторинга увеличения эпителиальной адгезии за счет повышения уровня экспрессии LAMC2 как фактора риска среднетяжелого и тяжелого течения акне и скрининга эффективности терапии акне (WO 2018046999 (A1), GALDERMA RES&[GB] [FR]; KINGS COLLEGE DEV, 15.03.2018).
В качестве биологического образца используются образец жидкости (кровь, лимфа, интерстециальная жидкость) или образец ткани (биоптат кожи). ДНК генотипировали с использованием массива генотипирования Illumina Human OmniExpressExome. В результате был идентифицирован ген, который находится в непосредственно близости к геномному локусу 1 q25.3 SNP 1: 183167051_A_G аллель. Этот маркер представляет собой ген ламинина гамма 2 (γ2) (LAMC2) и его генный продукт, гамма-субъединица ламинина 2 (γ2) (LAMC2). Показано, что аллель SNP 1: 183167051_A_G, модулирует и предпочтительно увеличивает и/или усиливает экспрессию и/или активность LAMC2 и/или LAMC2, что свидетельствует о диагнозе и прогнозе акне среднетяжелого и тяжелого течения. В некоторых вариантах осуществления маркер, предпочтительно другой аллель в SNP 1: 183167051, модулирует и предпочтительно уменьшает и/или ингибирует экспрессию и/или активность LAMC2 и/или LAMC2, что свидетельствует об эффективном лечении и успешном скрининге эффективного кандидата для лечения акне среднетяжелого и тяжелого течения.
Недостатком данного способа является вариативность выбора биологического образца, что не позволяет оценить валидность и дать сравнительную характеристику полученным результатам у разных пациентов.
Противоречивые данные результатов молекулярно-генетических методов исследования свидетельствует о необходимости поиска надежных и значимых генетических маркеров тяжелого течения акне, что является актуальной проблемой ранней диагностики и превентивной медицины.
Известно, что Cutibacterium acnes (С.acnes), играющие важную роль в патогенезе акне, инициируют врожденный иммунитет через toll-подобные рецепторы (TLR2) и на ранних, и на поздних стадиях течения акне. Индукция TLR ведет к экспрессии генов иммунного ответа, включая кодирующие цитокины и хемокины, обеспечивающих хемотаксис клеток иммунной системы (Lee S.E., Kim J.M., Jeong S.K., Choi E.H., Zouboulis C.C., Lee S.H.. Expression of Protease-Activated Receptor-2 in SZ95 Sebocytes and its Role in Sebaceous Lipogenesis, Inflammation, and Innate Immunity. J. Invest. Dermatol., 2015, Vol.135, no.9, pp. 2219-2227).
Ген MEFV картирован в области 16p13.3. Этот ген кодирует белок, также известный как пирин или маренострин, который является важным модулятором врожденного иммунитета. Кроме того, продукт регуляции гена MEFV оказывает ингибирующее влияние на воспалительный ответ за счет подавления секреции IL1 β, IL12, INF-γ.
Мутации в этом гене связаны со средиземноморской лихорадкой, синдромом наследственной периодической лихорадки. Так, было показано, что гомозиготность по мутации M694V MEFV связана с наиболее тяжелым фенотипом в клиническом спектре средиземноморской лихорадки (Grossman С., Kassel Υ., Livneh A., Ben-Zvi I. Familial Mediterranean Fever (FMF) Phenotype in Patients Homozygous to the MEFV M694V Mutation Eur J Med Genet. 2019 Jun; 62(6):103532. doi: 10.1016/j.ejmg.2018.08.013).
Однако данные о значении полиморфизма гена MEFV при других заболеваниях единичны. Показано, что идиопатический рецидивирующий периодический артрит у детей с поражением тазобедренного сустава представляет собой артропатию, ассоциированную с 3 мутациями гена MEFV: V726A, R761H, A744S (Salehzadeh F., Barak Μ., Nematdoust Haghi R. Relapsing Periodic Arthritis, Palindromic Rheumatism and MEFV Gene-Related Variants Alleles in Children/ Pediatr Rheumatol Online J. 2019 Jun 6; 17(1):28. doi: 10.1186/s12969-019-0329-2).
Задачей настоящего изобретения является повышение достоверности выявления генетической предрасположенности к тяжелому течению акне, что и является техническим результатом изобретения.
Патентуемый способ прогнозирования риска тяжелого течения акне включает отбор цельной венозной крови больного, выделение ДНК и проведение молекулярно-генетического исследования.
Отличие состоит в том, что молекулярно-генетическое исследование ДНК проводят методом высокопроизводительного секвенирования, и при выявлении полиморфизма гена MEFV rs104895094 прогнозируют риск развития тяжелого течения акне.
Способ осуществляют следующим образом.
У больного акне утром натощак производят забор венозной крови из кубитальной вены в стандартных условиях в пластиковые пробирки системы «Vacutainer » с консервантом этилендиаминтетраацетат (ЭДТА) (0,5М раствор, рН=8,0) в объеме 5 мл.
Для молекулярно-генетического исследования производят выделение ДНК из цельной венозной крови больного с использованием стандартного набора CellSep Advanced Kit. (DiaSorin Ireland Ltd., Ирландия) и автоматической станции Arrow NorDiag Arrow (DiaSorin) («NorDiag Asa», Норвегия).
Молекулярно-генетическое исследование проводится методом NGS высокопроизводительного секвенирования ДНК. Основные этапы NGS секвенирования:
1. Выделение ДНК;
2. Приготовление библиотеки ДНК;
3. Гибридизационное обогащение смесью праймеров с последующей полимеразной цепной реакцией;
4. Секвенирование на секвенаторе MiSeq («Illumina», США);
5. Автоматический анализ исходных данных;
6. Фильтрация полученных вариантов с помощью программ-аннотаторов, анализ отфильтрованных вариантов.
Анализ ДНК пациента проводится на платформе NextSeq Illumina методом парно-концевого чтения. Для оценки популяционных частот выявленных вариантов используются данные международного проекта gnomAD Exomes (ЕхАС) для экзонных варинатов и базы gnomAD Genomes для интронных вариантов. Для компьютерной оценки патогенности найденных миссенс-вариантов применяются программы предсказания патогенности замен аминокислот (SIFT, PolyPhen-2, PROVEAN, UMD Predictor). Для компьютерного предсказания эффекта изменений в сайтах сплайсинга или прилежащих к сайту сплайсинга участках используются программы Human Splicing Finder и NNSplice.
Для оценки клинической релевантности выявленных вариантов использовали базы данных Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM), Human Gene Mutation Database (HGMD), Leiden Open Variation Database (LOVD), Catalogue of Somatic Mutations in Cancer (COSMIC), специализированные базы данных по отдельным заболеваниям.
Для подтверждения возможности реализации заявленного назначения и достижения указанного технического результата приводим следующие данные.
Клинический пример.
Пациентка Б., 32 лет.
Поступила с жалобами на высыпания на коже лица и спины. Предварительный диагноз: акне, среднетяжелое течение. Проведено исследование по заявленному способу.
Данные объективного осмотра: патологический кожный процесс распространенный симметричный островоспалительный, локализован на коже лица, груди и спины, представлен множественными открытыми и закрытыми комедонами, воспалительным папулами, пустулами и единичными поствоспалительными застойно-синюшного цвета пятнами.
При молекулярно-генетическом исследовании в соответствии с предлагаемым способом выявлен полиморфизм гена MEFV rs104895094 (с.2084А>Т; р.(К695М), прогнозировано тяжелое течение акне. Рекомендована комплексная терапия с применением системных антибактериальных препаратов: доксициклин (Юнидокс солютаб) по 100 мг 2 раза в сутки утром и вечером per os 14 дней, местно: адапален (Дифферин крем) 1 раз в сут (на ночь) наружно на чистую сухую кожу пораженной области, избегая попадания в глаза и на губы в сочетании с бензоил пероксидом (Базирон АС, гель 2,5%), 1 раз в сут (утром) на чистую сухую кожу. Отмечалось незначительное улучшение течения кожного процесса. После окончания курса терапии отмечались неоднократные обострения течения кожного процесса и в течение 6 месяцев отмечено появление глубоких пустул и единичных узлов, которые разрешались с образованием атрофических рубцов, что свидетельствует о тяжелом течении акне, прогноз подтвердился.
Таким образом, проведенное молекулярно-генетическое исследование методом NGS с определением полиморфизма гена MEFV rs104895094 (с.2084А>Т; р.(К695М) свидетельствует о прогнозе ассоциации с риском развития тяжелого течения акне.
Предлагаемый способ был использован у 50 неродственных больных с акне тяжелой степени тяжести и 20 условно здоровых лиц, 42 - мужчины и 28 женщин в возрасте от 15 до 46 лет (медиана - 22,1 год).
При молекулярно-генетическом исследовании с помощью предлагаемого способа методом NGS у всех 50 больных акне выявлен полиморфизм гена MEFV rs104895094 (OR=1,52; р<0,05). Обнаружены достоверные различия в частотах генотипов по полиморфизму гена MEFV rs104895094 (р<0,05) между группой пациентов с акне и контрольной группой, что позволяет диагностировать ассоциацию с тяжелым течением акне.
Представленные данные свидетельствуют о возможности использования заявленного способа для выявления генетической предрасположенности человека к развитию тяжелой формы акне, а именно для прогнозирования риска тяжелого течения акне.
Таким образом, способ информативен, расширяет арсенал способов диагностики акне, отвечает современным требованиям к методам лабораторной диагностики и может быть рекомендован для клинической практики.