ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЕ СОЕДИНЕНИЯ
ANTITUMOUR COMPOUNDS

Уровень техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к новым противоопухолевым соединениям, содержащим их фармацевтическим композициям и их применению в качестве противоопухолевых агентов.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Theonella swinhoei
Было показано, что некоторые асимметричные димерные макролиды обладают противоопухолевыми, противовирусными и/или противогрибковыми свойствами. В частности, Kitagawa и др. (Chem. Pharm. Bull., 1994, 42(1), 19-26) выделили несколько асимметричных димерных макролидов из окинавской морской губки :
50
50
Показано, что Swinholide А (1), В (2) и С (3) проявляют цитотоксическую активность против L1210 и КВ клеток со значением IC 0,03, 0,30 и 0,14 мкг/мл (для L1210) и 0,04, 0,04 и 0,05 мкг/мл (для КВ), соответственно. Однако наблюдалось, что isoswinhokide A (4) показывал меньшую цитотоксичность [IC 1,35 мкг/мл (L1210) и 1,1 мкг/мл (КВ)] по сравнению с другими, ранее указанными аналогами.
Kitagawa и др. также проверили цитотоксичность некоторых димеров, полученных из Swinholide А (1):
наблюдая, что оба димера (8 и 9) показывают слабую способность ингибирования роста КВ клеток (51,1% ингибирования при 50 мкг/мл и 19,3% ингибирования при 10 мкг/мл, соответственно).
Другие димерные макролиды, которые были получены из Swinholide А (1), были следующими:
Цитотоксичность данных соединений (10-13) против L1210 и КВ клеток является меньшей, чем цитотоксичность, показанная Swinholide A (1).
Помимо этого, Kitagawa и др. проверили противоопухолевый эффект Swinholide A (1) и его изомеров против Р388 лейкемии у CDF1 мыши. Неожиданно было обнаружено, что Swinholide А (1), isoswinholide А (4) и изомер 11 были токсичны и не показали многообещающей противоопухолевой активности.
Theonella
Кроме этого, заявка на патент WO 88/00195 описывает следующие соединения (Misakinolide А (15) и производные (15)), которые были выделены из морской губки рода :
in vitro
50
В указанной заявке на патент описывается противоопухолевая активность Misakinolide А (14)  против Р388, НСТ-8, А549 и MDA-MB-231 раковых клеток. Также было описано, что кроме ярко выраженной цитотоксичности [IC 0,035 мкг/мл (L1210)], Misakinolide А также обладает противоопухолевой активностью [T/C 140% при дозе 0,1 мг/кг (мыши), против Р388 лейкемии] (Chem. Pharm. Bull., 1994, 42(1), 19-26).
Рак продолжает быть одной из главных причин смерти среди видов животных и человека. Были предприняты и продолжают предприниматься огромные усилия, направленные на поиск средств предохранения и новых эффективных противоопухолевых агентов, которые внесут вклад в увеличение терапевтического арсенала, необходимого для эффективного лечения пациентов с этим заболеванием. В этом смысле настоящее изобретение направлено на решение данной проблемы, предоставляя новые соединения, эффективные при лечении рака.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение направлено на асимметрические димерные макролиды с общей формулой I, а также на их соответствующие фармацевтически приемлемые соли, производные, пролекарства и стереоизомеры,
1-16
1
24
2
24
2
24
a
a
a
b
a
b
a
b
a
a
где R являются группами, независимо выбранными из водорода, защищенного или незащищенного гидроксила, замещенного или незамещенного С-С алкила, замещенного или незамещенного С-С алкенила, замещенного или незамещенного С-С алкинила, =О, OR, OCOR, NRR, NRCOR, CONRR, COR, COOR и галогена.
1
24
2
24
2
24
a
a
a
b
a
b
a
b
a
a
X и Y являются группами, независимо выбранными из замещенного или незамещенного С-С алкила, замещенного или незамещенного С-С алкенила, замещенного или незамещенного С-С алкинила, =О, OR, OCOR, NRR, NRCOR, CONRR, COR, COOR и галогена;
a
b
1
12
2
12
2
12
R и R являются группами, независимо выбранными из водорода, галогена, замещенного или незамещенного С-С алкила, замещенного или незамещенного С-С алкенила, замещенного или незамещенного С-С алкинила, замещенного или незамещенного арила и замещенного или незамещенного гетероцикла; и пунктирная линия показывает необязательное присутствие двойной связи.
Theonella
Изобретение также относится к выделению соединений формулы I из губок семейства Theonellidae, рода  и вида swinhoei, и к образованию производных выделенных соединений.
Кроме этого, настоящее изобретение также относится к соединению общей формулы I или его фармацевтически приемлемой соли, производному, пролекарству или стереоизомеру, для его применения в качестве лекарственного средства.
Изобретение также направлено на применение соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли, производного, пролекарства или стереоизомера для получения лекарственного средства для лечения рака.
Также настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим соединение формулы I или его соответствующие фармацевтически приемлемые соли, производные, пролекарства или стереоизомеры в смеси с фармацевтически приемлемым эксципиентом или разбавителем.
Подробное описание изобретения
Соединения, являющиеся целью изобретения, относятся к асимметрическим димерным макролидам общей формулы I
1-16
1
24
2
24
2
24
a
a
a
b
a
b
a
b
a
a
где R являются группами, независимо выбранными из водорода, защищенного или незащищенного гидроксила, замещенного или незамещенного С-С алкила, замещенного или незамещенного С-С алкенила, замещенного или незамещенного С-С алкинила, =О, OR, OCOR, NRR, NRCOR, CONRR, COR, COOR и галогена.
1
24
2
24
2
24
a
a
a
b
a
b
a
b
a
a
X и Y являются группами, независимо выбранными из замещенного или незамещенного С-С алкила, замещенного или незамещенного С-С алкенила, замещенного или незамещенного С-С алкинила, =О, OR, OCOR, NRR, NRCOR, CONRR, COR, COOR и галогена;
a
b
1
24
2
24
2
24
R и R являются группами, независимо выбранными из водорода, галогена, замещенного или незамещенного С-С алкила, замещенного или незамещенного С-С алкенила, замещенного или незамещенного С-С алкинила, замещенного или незамещенного арила и замещенного или незамещенного гетероцикла; и пунктирная линия показывает необязательное присутствие двойной связи.
Группы или заместители в данных соединениях могут быть выбраны согласно следующим условиям.
Термин алкил обозначает линейную или разветвленную углеродную цепь, имеющую от 1 до 24 атомов углерода. Предпочтительными являются алкильные группы от 1 до 6 атомов углерода, и особенно предпочтительны те, которые состоят из 1, 2, 3 и 4 атомов углерода. В соединениях настоящего изобретения особенно предпочтительными алкильными группами являются метильная, этильная, пропильная, изопропильная, бутильная, втор-бутильная и трет-бутильная группы. Также термин алкил, используемый в настоящем изобретении, относится как к циклической, так и нециклической группе, принимая во внимание, что циклические группы будут содержать, по крайней мере, три атома углерода в кольце. Другими предпочтительными алкильными группами являются такие, которые имеют от 5 до 12 атомов углерода, причем особенно предпочтительны такие, которые состоят из 6, 7, 8, 9 и 10 атомов углерода. В соединениях настоящего изобретения особенно предпочтительными алкильными группами являются гексильная, гептильная, 1,3-диметилпентильная, октильная, 1,3-диметилгексильная и нонильная группы.
Термины алкенил и алкинил обозначают линейную или разветвленную ненасыщенную алкильную цепь, содержащую от 2 до 24 атомов углерода, и включающую одно или несколько ненасыщенных положений. Предпочтительными являются алкенильные, алкинильные группы, имеющие от 2 до 6 атомов углерода, и особенно предпочтительны те, которые состоят из 2, 3 и 4 атомов углерода. Также термины алкенил и алкинил, используемые в настоящем изобретении, относятся как к циклическим, так и нециклическим группам, принимая во внимание, что циклические группы будут содержать, по крайней мере, три атома углерода в кольце. Другими предпочтительными алкенильными и алкинильными группами являются такие, которые имеют от 5 до 12 атомов углерода. В число арильных групп, которые могут присутствовать в соединениях изобретения, включены такие, которые содержат одно или несколько колец, включая множественные кольца с разделенными или конденсированными арильными или гетероарильными группами. Обычно арильные группы содержат от 1 до 3 колец и от 4 до 18 атом углерода в кольце(ах). Предпочтительными арильными группами являются фенил, нафтил, бифенил, фенантрил и антрацил, причем все они замещены или незамещены.
В число гетероциклических групп, которые могут присутствовать в соединениях изобретения, включены как гетероароматические, так и гетероалициклические группы. Гетероароматические группы содержат один, два или три гетероатома, выбранных из N, O и S, например, включая группы, такие как кумаринил, предпочтительно 8-кумаринил, хинолинил, предпочтительно 8-хинолинил, пиридил, пиразинил, пиримидил, фурил, пирролил, тиенил, тиазолил, оксазолил, имидазолил, индолил, бензофуранил и бензотиазолил. Гетероалициклические группы содержат один, два или три гетероатома, выбранных из N, O и, S, и, например, включая группы, такие как тетрагидрофуранил, тетрагидропиранил, пиперидинил, морфолин и пирролидинил. Гетероциклические группы могут быть как замещенными, так и незамещенными.
2
2
2
2
2
2
1
24
2
24
2
24
2
2
1
12
2
12
2
12
Ранее упомянутые группы, возможно, могут быть замещены по их одному или нескольким доступным положениям, независимо одним или несколькими подходящими заместителями, такими как OR`, =О, SR`, SOR`, SOR`, NO, NHR`, N(R`), =N-R`, NHCOR`, N(COR`), NHSOR`, NR`C(=NR`)NHR`, CN, галоген, С(=O)R`, COOR`, OC(=O)R`, CONHR`, CON(R`), замещенный или незамещенный С-С алкил, замещенный или незамещенный С-С алкенил, замещенный или незамещенный С-С алкинил, замещенный или незамещенный арил и замещенный или незамещенный гетероцикл, где каждая группа R` независимо выбрана из Н, ОН, NO, NH, SH, CN, галогена, =О, С(=O)Н, С(=O)алкила, СООН, замещенного или незамещенного С-С алкила, замещенного или незамещенного С-С алкенила, замещенного или незамещенного С-С алкинила, замещенного или незамещенного арила и замещенного или незамещенного гетероцикла. В число галогеновых заместителей, которые могут присутствовать в соединениях настоящего изобретения, включены F, Cl, Br и I. В случае таких групп, которые в свою очередь замещены, соответствующие заместители могут быть выбраны из указанного здесь списка заместителей.
Гидроксильная группа, возможно, может быть защищена. Существует огромное число гидроксильных защитных групп, и они хорошо известны специалисту в данной области техники. Для справки см. Protecting groups, Kocienski, 2004, 3-е изд.
Термин «фармацевтически приемлемые соли, производные, пролекарства» относится к любой фармацевтически приемлемой соли, сложному эфиру, сольвату, гидрату или какому-либо другому соединению, которое после его введения пациенту способно (напрямую или опосредованно) дать соединение формулы I. Однако следует принимать во внимание, что не фармацевтически приемлемые соли также находятся в рамках изобретения, так как они могут быть пригодными при получении фармацевтически приемлемых солей. Получение солей, пролекарств и производных может быть осуществлено с помощью способов, известных в области техники.
Например, фармацевтически приемлемые соли соединений настоящего изобретения получаются из соответствующих соединений, имеющих кислотные или основные части, с помощью традиционных химических методов. В основном указанные соли образуются, например, посредством реакции соответствующей основной или свободнокислотной формы указанного соединения со стехиометрическим количеством подходящего основания или кислоты в воде, органическом растворителе или в их смеси. Обычно предпочтительными неводными средами являются эфир, этилацетат, этанол, изопропанол или ацетонитрил. В число солей, полученных добавлением кислоты, входят соли, полученные добавлением минеральных кислот, такие как гидрохлорид, гидробромид, гидроиодид, сульфат, нитрат и фосфат, и соли, полученные добавлением органических кислот, такие как ацетат, трифторацетат, малеат, фумарат, цитрат, оксалат, сукцинат, тартрат, соль яблочной кислоты, соль миндальной кислоты, метансульфанат и паратолуолсульфанат. В число солей, полученных добавлением основания, входят неорганические соли, такие как натриевые, калиевые, кальциевые и аммонийные соли, и органические соли, такие как соли этилендиамина, этаноламина, N,N-диалкиленэтаноламина, триэтаноламина и основные соли аминокислот.
Соединения настоящего изобретения могут быть в кристаллической форме как в виде свободных соединений, так и сольватов (например, гидратов), причем обе формы включены в объем настоящего изобретения. Способы сольватации в основном хорошо известны в области техники.
in vivo
Любое соединение, которое является пролекарством соединения общей формулы I, включено в объем настоящего изобретения. Термин «пролекарство» используется в широком смысле и включает все производные, которые могут быть превращены  в любые соединения изобретения. Специалист в области техники знает, какие это производные могут быть, и они включают, например, соединения, в которых свободная гидроксильная группа превращена в сложноэфирное производное, или сложный эфир модифицирован посредством переэтерификации или образования подходящего амида.
Соединения настоящего изобретения, представленные общей формулой I, имеют более чем один стереогенный центр, так что изобретение в равной степени относится к каждому и любому из возможных энантиомеров и диастериомеров, которые могут быть получены, а также к возможным Z и Е стереоизомерам, которые могут быть образованы при наличии в молекуле двойной связи. В рамках настоящего изобретения находятся как чистые изомеры, так и смеси изомеров указанных соединений.
1-16
a
a
a
b
a
b
1
24
а
1-7
9-15
1
6
а
8
16
Предпочтительными соединениями настоящего изобретения являются такие, у которых R являются группами, независимо выбранными из водорода, защищенного или незащищенного гидроксила, OR, OCOR, =О, NRR, NRCOR, галогена и замещенного или незамещенного С-С алкила, где R определен выше. Особенно предпочтительными являются такие соединения, в которых R и R являются группами, независимо выбранными из водорода, гидроксила, С-С алкила и OR; и среди них предпочтительными являются водород, гидроксил, метил и метокси. Также особенно предпочтительно, чтобы R и R группы были =О.
5
12
5
12
5
12
Предпочтительно Х и Y являются группами, независимо выбранными из замещенного или незамещенного С-С алкила и замещенного или незамещенного С-С алкенила. Особенно предпочтительно, чтобы они были независимо замещены одним или несколькими подходящими заместителями, и, в частности, замещены одним или несколькими следующими заместителями: ОН, OR`, NHCOR` и замещенным или незамещенным гетероциклом, где R` определен ранее. Более предпочтительно, чтобы X и Y были С-С алкильными группами, замещенными одной или несколькими гидроксильными группами и/или замещенными гетероциклами. Особенно предпочтительно, когда X и Y являются
В данных участках структуры предпочтительно наличие двойных связей, показанных пунктирной линией в общей формуле I.
Следующие соединения являются особенно предпочтительными соединениями настоящего изобретения:
Соединение А
Theonella
swinhoei
Соединение А является природным продуктом, выделенным из морской губки, а именно из губки вида  (Класс: Demosponhiae, Подкласс: Tetractinomorpha, Отряд: Lithistida, Подотряд: Triaenosina, Семейство: Theonellidae). Указанный организм был собран на Островах Глорьез (северо-запад Мадагаскара).
Данные виды губок обычны для запада Тихого Оокеана, в Индийском Океане и в Красном Море, причем располагаются по побережью на глубине до 48 метров. Образцы были найдены:
- Кения, Момбаса, Shelly Beach, на внешнем откосе рифа, на глубине 12-16 метров.
- North Kenya Banks (02° 25,`ю.ш. - 40° 42,5` в.д., на глубине 48 метров)
- Tulear, область Ifaty (Мадагаскар)
- Острова Albadra (северо-запад Мадагаскара)
- Ternate, Celebes, Ambon, Manila, Formosa (Филиппины), Тайвань.
Angew. Chem. Int. Ed.
Кроме этого, аналоги указанных соединений могут быть синтезированы специалистом в данной области техники с помощью, например, кислотного или основного гидролиза, окисления, этерификации, альдолльной конденсации, озонолиза, реакции Виттига, реакции Хорнера-Эммонса, эпоксидирования по Шарплессу или реакции Пиктеда-Спенглера. Соединение А и его аналоги могут быть синтезированы, например, посредством описанных синтезов подходящим образом защищенных мономерных единиц Swinholide A и Misakinolide A, последующего проведения реакций макролактонизации, которые позволяют получить Соединение А и его аналоги (см. K-S. Yeung и I. Paterson.  2002, 41, 4632-4653).
Важным аспектом соединений настоящего изобретения является их биологическая активность и, в частности, их цитотоксическая активность. Следовательно, настоящее изобретение обеспечивает новые фармацевтические композиции соединений общей формулы I, имеющих цитотоксический эффект, а также их применение в качестве противоопухолевых агентов. Кроме этого, настоящее изобретение также обеспечивает фармацевтические композиции, содержащие соединение настоящего изобретения или фармацевтически приемлемую соль, производное, пролекарство или стереоизомер в смеси с фармацевтически приемлемым наполнителем или разбавителем.
Фармацевтические композиции, включенные в качестве примеров, являются любыми твердыми (таблетки, пилюли, капсулы, гранулы и т.п.) или жидкими (растворы, суспензии или эмульсии) композициями для орального, топического или парентерального введения. Фармацевтические композиции, содержащие соединения настоящего изобретения, также могут быть получены в форме липосом или наносфер, составов замедленного высвобождения или любых других традиционных систем высвобождения.
Введение соединений или композиций настоящего изобретения может быть осуществлено с помощью любых обычных способов, таких как внутривенное вливание, составы для орального введения и/или внутрибрюшинного и внутривенного введения. Предпочтительно, чтобы используемые времена вливания не превышали 24 часа, предпочтительно были от 1 до 12 часов и еще более предпочтительно от 1 до 6 часов. Короткие времена вливания особенно желаемы, так как это позволяет проводить лечение без необходимости проводить ночь в госпитале. Однако времена вливания от 12 до 24 часов и включая большие, при необходимости могут быть использованы. Вливание может быть проведено с подходящими интервалами, такими как от 1 до 4 недель.
Правильная доза соединений меняется в зависимости от типа используемого состава, формы применения и местоположения, хозяина и опухоли, которую необходимо лечить. Также должны приниматься во внимание другие факторы, такие как возраст, вес тела, пол, режим питания, время введения, скорость выведения, состояние здоровья хозяина, комбинация активных ингредиентов, чувствительность с точки зрения реакций и серьезности заболевания. Введение может быть проведено непрерывно или периодически с максимально переносимой дозой.
Соединения и композиции настоящего изобретения могут быть использованы вместе с другими активными ингредиентами в комбинированной терапии. Другие активные ингредиенты могут быть частью той же композиции или могут быть введены посредством другой композиции, причем одновременно или в различное время.
ПРИМЕРЫ
ПРИМЕР 1: ОПИСАНИЕ ОРГАНИЗМА И МЕСТО СБОРА
Несколько образцов губки Theonella swinhoei были собраны при погружении на Островах Глорьез (северо-запад Мадагаскара, запад Индийского Океана) на глубине 18 метров в ноябре 2003 г. Координаты места сбора образцов являются следующими: широта 11° 34` 995`` с.ш. и долгота 47° 16` 829`` в.д. Дно моря было скалистым и песчаным, и подложка образцов была скалистой.
Описание организма: массивная губка. Верхняя поверхность покрыта несколькими округлыми отверстиями (поры). Поверхность является гладкой и консистенция твердая, однако выдержанные образцы являются хрупкими. Цвет живой губки коричневый и ее внутренность светло-бежевого цвета. Дермальная мембрана равномерно пористая. Данные образцы легко характеризуются посредством скелетных элементов. Скелет образован неправильными узлами стронгилидов, направленных по касательным к поверхности, и помощью малоразветвленных спикул (кремнистая спикула губок неправильной формы). Внутренний скелет состоит из тетразоновых спикул, которые могут быть гладко или слабо покрыты бугорками.
ПРИМЕР 2: ВЫДЕЛЕНИЕ СОЕДИНЕНИЯ А
2
2
2
2
2
2
2
3
2
3
Замороженный образец (604 г) губки Примера 1 нарезают на кусочки и экстрагируют НО (3×500 мл) и затем смесью МеОН:CHCl (50:50, 3×500 мл). Объединенные органические экстракты концентрируют, получая остаток (7,48 г), который разделяют вакуумной жидкостной хроматографией на Lichroprep RP-18 с градиентом от НО:МеОН до CHCl. Соединение А (5,8 мг) выделяют из фракции, элюированной с МеОН, которую очищают с помощью полупрепаративной ВЭЖХ (SymmetryPrep C-18, 7 мкм, 7,8 мм×150 мм, градиент НО:CHCN, УФ-детектирование), получая фракцию, содержащую Соединение А, и которую снова очищают с помощью полупрепаративной ВЭЖХ (SymmetryPrep C-18, 7 мкм, 19 мм×150 мм, градиент НО:CHCN, УФ-детектирование).
2
1
13
Соединение А: MS (ESI)=1362 (M+). MS (APCI)=1345(M+1-HO)+. Н и С ЯМР см. Таблицу 1.
Соединение А
Таблица 1Данные <sup>1</sup>Н и <sup>13</sup>С ЯМР (CD<sub>3</sub>OD) соединения А
<sup>1</sup><b>Н, мультиплетность, <i>J</i>=Гц </b>
<sup>13</sup><b>C</b>
<b>COSY</b>
<b>HMBC</b>
<b>1/32</b>
-
170,7/171,1
-
-
<b>2</b>
5,91, д, 16,0
116,1
H-3
C-1, C-4
<b>3</b>
7,50, д, 16, 0
152,4
H-2
C-1, C-2, C-4, 4-Мe, C-5
<b>4/33</b>
-
135,6/129,9
-
-
<b>4-Мe/33-Мe</b>
1,86, с/1,89, с
12,7/13,22
H-5/H-34
C-3, 4-Мe, C-5/C-32, C-33, C-34
<b>5/34</b>
6,16, т, 7,0/6,99, т, 6,0
140,9/142,1
4-Мe, H-6/33-Мe, H-35
C-3, C-4, C-6, C-7/C-32, 33-Мe, C-35, C-36
<b>6/35</b>
2,44, м/2,38, м
38,8/38,6
H-5, H-7/H-34, H-36
C-4, C-5, C-7/C-33, C-34, C-36
<b>7/36</b>
4,02, м/4,08, м
68,4/67,8
H-6, H-8/H-35, H-37
C-8/C-37
<b>8/37</b>
1,38, м/1,80, м<sup>a</sup>
41,58/41,63<sup>b</sup>
H-7, H-9/H-36, H-38
-
<b>9/38</b>
4,49, д, 10,5
70,60/70,64<sup>с</sup>
H-8/H-37, H-40
C-10/C-39
<b>10/39</b>
5,68, м
131,1
H-11, H-13/H-40, H-41
C-9, C-11, C-12/C-38, C-40, C-41
<b>11/40</b>
5,83, м
125,05/125,20<sup>d</sup>
H-10, H-12/H-38, H-39
C-10/C-39
<b>12/41</b>
2,00, м
32,37/32,44<sup>е</sup>
H-11, H-13/H-39, H-42
C-10, C-11/C-39, C-40
<b>13/42</b>
3,57, м
65,5/65,7<sup>f</sup>
H-10, H-12, H-14/H-41, H-43
-
<b>14/43</b>
1,58, м/1,82, м<sup>g</sup>
37,1/37,4<sup>h</sup>
H-13, H-15/H-42, H-44
C-13/C-42
<b>15/44</b>
3,78, м
79,04/79,05<sup>i</sup>
H-14/H-43
-/C-45
<b>15-ОМе/44-ОМе</b>
3,33, с
57,1/57,2<sup>j</sup>
-
C-15/-
<b>16/45</b>
1,58, м
43,6/43,8<sup>k</sup>
16-Мe/45-Мe
C-15, C-18, C-19/C-47, C-48
<b>1б-Ме/45-Ме</b>
0,84, д, 5,5/0,86, д, 5,5<sup>l</sup>
9,05/9,40<sup>m</sup>
H-16/H-45
C-15, C-16, C-17/C-46, C-44, C-45
<b>17/46</b>
3,65, м/3,66, м<sup>11</sup>
73,8/74,2°
H-18/H-47
-
<b>18/47</b>
1,62, м/1,68, м<sup>p</sup>
39,0/39,2<sup>кв.</sup>
H-17, H-19/H-46, H-48
C-19/C-48
<b>19/48</b>
3,94, м
70,9/70,8<sup>r</sup>
H-18/H-47
-
<b>20/49</b>
1,90, м
40,2/40,5
H-21, 20-Мe/H-50, 49-Мe
C-21/C-50
<b>20-Ме/49-Ме</b>
0,92, д, 7,5/0,95, д, 7,5<sup>с</sup>
9,4/9,5<sup>t</sup>
H-20/H-49
С-19, С-20, С-21/С-48, С-49, С-50
<b>21/50</b>
5,41, м
76,5/76,0
H-20/H-49
С-19, С-20, С-22, 22-Ме, С-23, С-32/С-1, С-48, С-49, 51-Мe, C-51, С-52
<b>22/51</b>
2,03, м
38,5/38,3
22-Мe/51-Мe
22-Ме, С-23/51-Ме, С-52
<b>22-Ме/51-Ме</b>
0,97, м
10,1/9,9
H-22/H-51
С-22, С-23/С-51, С-52
<b>23/52</b>
3,13, дд, 2,0, 8,0
77,7/77,6<sup>U</sup>
-
-
<b>24/53</b>
1,73, м
34,7
24-Мe/53-Мe
-
<b>24-Ме/53-Ме</b>
0,98, д, 7,0/0,99, д, 7,0<sup>v</sup>
18, 0/18,1<sup>w</sup>
H-24/H-<b>53</b>
С-24, С-25/С-53, С-<b>54</b>
<b>25/54</b>
1,23, м/1,43, м<sup>x</sup>
25,30/25,35
H-26/H-<b>55</b>
С-24, С-26/С-53, С-55
<b>26/55</b>
1,94, м
30,0
H-25, H-27/Н-54, Н-56
С-24, С-29/С-53, С-58
<b>27/56</b>
4,01, м
73,03/73,06<sup>y</sup>
Н-26, Н-28/Н-57, Н-55
-
<b>28/57</b>
1,52, м/1,88, м<sup>z</sup>
36,1
Н-27, Н-29/Н-56, Н-58
С-26, С-27, С-29, С-ЗО/С-55, С-56, С-58, С-<b>59</b>
<b>29/58</b>
3,62, м
74,5
Н-28, Н-ЗО/Н-57, Н-59
-
<b>29-ОМе/58-ОМе</b>
3,36, с
55,6
-
С-29/С-58
<b>30/59</b>
1,11, кв., 12,5/2,03, м<sup>az</sup>
40,0
Н-29, Н-31/Н-58, Н-60
С-28, С-29, С-31/С-57, С-58, С-60
<b>31/60</b>
3,76, м
66,0
Н-30/Н-59
-
<b>31-Ме/О-Ме</b>
1,21, д, 6,5
22,1
-
С-29, С-30, С-31/С-58, С-59, С-60
<sup>a-az</sup> верхний индекс в ячейке означает, что значения химического сдвига могут быть взаимозаменяемыми.
ПРИМЕР 3: БИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТИ
Анализ противоопухолевой активности позволяет обнаруживать выделения или соединения с цитотоксической активностью (клеточной гибелью) или цитостатической активностью (ингибирование роста) в in vitro культурах опухолевых клеток человеческого происхождения.
ЛИНИИ КЛЕТОК
Название
№ В Американской коллекции типовых культур
Виды
Ткани
Характеристики
А549
CCL-185
Человек
Легкое
“NSCL” рак легкого
НТ29
НТВ-38
Человек
Толстая кишка
Аденокарцинома толстой кишки, аденокарцинома молочной железы
MDA-MB-231
HTB-26
Человек
Молочная железа
Her2/neu+ (плевральный выпот)
ИССЛЕДОВАНИЯ ИНГИБИРОВАНИЯ КЛЕТОЧНОГО РОСТА С ПОМОЩЬЮ КОЛОРИМЕТРИЧЕСКОГО АНАЛИЗА
in vitro
Измерение клеточного роста  проводилось с помощью колориметрического анализа с сульфородомином В (SRB) (следуя адаптации, ранее описанного способа Philip Skehan и др. 1990, J. Natl. Cancer Inst., 82:1107-1112).
В данном типе анализа используется 96-луночные микроплашки культур (Mosmann, 1983, Faircloth, 1988). Большинство использованных линий клеток получено из Американской коллекции типовых культур (АТСС) и от различных типов человеческих опухолей.
2
Культуры клеток поддерживались в культурной среде DMEM (с добавлением 10% эмбриональной бычий сыворотки (FBS), 1% пенициллин/стрептомицин 1% глутамин) при 37°С, 5% СО и 98% влажности.
Для анализов, клетки трипсинизируются и высеваются в 96-луночные микроплашки при различной концентрации в зависимости от линии клеток и инкубируются в течение 24 часов в активной среде без ингредиента с целью их стабилизации. Затем культуры обрабатываются (конечная концентрация изменяется в зависимости от типа анализа) носителем (DMSO:DMEM, 1:1) или активным ингредиентом. После 48 часов экспонирования активному ингредиенту противоопухолевый эффект измеряют посредством указанного ранее SRB способа, который по существу состоит из: фиксации клеток 1% раствором глутарового альдегида (30 минут, комнатная температура), промывки фиксированных клеток фосфатно-буферным солевым раствором (3 промывки, комнатная температура), окрашивания культур 0,4% раствором SRB (30 минут, комнатная температура), промывки красящего агента в 1% уксусной кислоте (3 промывки, комнатная температура), сушки планшетов на воздухе и окончательной экстракции красящего агента Трис-буфером. Количественное измерение анализа проводят с помощью показаний оптической плотности планшетов в спектрофотометрическом планшет-ридере при одной длине волны 490 нм.
50
50
Для определения клеточного роста из полученных значений оптической плотности применялся алгоритм (эквивалентный алгоритму, применяемому в программе противоопухолевого скрининга NCI), который позволяет рассчитывать проценты роста по отношению к нулевому времени (начало эксперимента) как в отсутствии, так и в присутствии активного ингредиента в исследовании. Рассчитанные параметры клеточного ответа по отношению к активному ингридиенту являются следующими: GI=концентрация, вызывающая 50% ингибирования роста, TGI=концентрация, вызывающая полное ингибирование роста (цитостатический эффект) и LC=концентрация, вызывающая 50% клеточной гибели (цитотоксический эффект).
В Таблице 2 представлены данные биологической активности Соединения А.
Таблица 2Данные противоопухолевой активности (Молярные)
<b>Толстая кишка</b>
<b>Молочная железа</b>
<b>NSCL (легкое)</b>
<b>HT29</b>
<b>MDA-MB-231</b>
<b>A549</b>
Соединение А
GI<sub>50</sub>
3,38E-7
8,08E-7
2,28E-7
TGI
8,81E-7
2,35E-6
2,28E-7
LC<sub>50</sub>
2,20E-6
4,77E-6
5,29E-7