ИММОБИЛИЗАЦИЯ МОДИФИЦИРОВАННОГО ОЛИГОНУКЛЕОТИДА НА ПОЛИМЕРНОМ СУБСТРАТЕ ПОСРЕДСТВОМ ФИЗИЧЕСКОЙ АДСОРБЦИИ
MODIFIED OLIGONUCLEOTIDE IMMOBILISATION ON A POLYMER SUBSTRATE BY PHYSICAL ADSORPTION

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Способ для иммобилизации меченого олигонуклеотида на немодифицированном субстрате, способ включает следующие стадии: a) получение смеси, включающей жидкость и меченый олигонуклеотид, b) нанесение смеси стадии a) на немодифицированный полимерный субстрат, где олигонуклеотид иммобилизуется на немодифицированном полимерном субстрате посредством физической адсорбции. Изобретение также относится к микрочипам, полученным таким способом. Изобретение дополнительно относится к применению метки, присоединенной к олигонуклеотиду, для иммобилизации меченого олигонуклеотида на немодифицированный полимерный субстрат путем физической адсорбции. Кроме того, изобретение относится к применению микрочипов, полученных способом, описанным в настоящем описании, для анализов и диагностических наборов, включающих такие микрочипы.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Биочипы или биологические микрочипы, в частности микрочипы ДНК, стали важным средством в современной молекулярной биологии и медицине. Обычно чипы состоят из упорядоченных серий большого количества микроскопических пятен олигонуклеотидов, каждое содержащее небольшие количества специфических последовательностей нуклеиновых кислот. Это может быть, например, короткий участок гена или другого элемента ДНК, которые используются как захватывающие зонды для гибридизации образца кДНК или кРНК (мишени) в условиях, которые допускают связывание между захватывающим зондом и соответствующей мишенью.
Пластики часто используют для получения одноразовых субстратов, так как они являются дешевыми и могут быть использованы для крупномасштабной продукции. Для биохимических анализов для определения нуклеиновых кислот, образцы олигонуклеотидов ДНК необходимо иммобилизовать на субстратах. Несколько методов было опубликовано для иммобилизации олигонуклеотидов ДНК на пластиковых (т.е., полимерных) субстратах, таких как циклические олефиновые сополимеры (COC). В большинстве случаев микрочипы на основе пластика имеют модифицированную/функционализированную поверхность для возможности присоединения олигонуклеотидов. Другие методы иммобилизации описывают связывание (линкер-)модифицированных олигонуклеотидов с немодифицированными полимерными субстратами. Коротко, воздействие УФ иммобилизует ДНК олигонуклеотиды, содержащие поли(T) и/или поли(C) метку, на различных немодифицированных полимерных субстратах. (Y. Sun et al, (2012); D. Sabourin et al (2010); N. Kimura, (2006))
Из-за необходимости модификации полимерного субстрата, такие методы являются затратными и требующими времени. Кроме того, они оказывают отрицательные эффекты на процесс анализа. В частности, облучение нуклеиновых кислот УФ светом обычно приводит к повреждению молекулы нуклеиновой кислоты, что может иметь последствия в отношении способности молекул гибридизоваться с комплементарными последовательностями и может таким образом влиять на их применимость в системах микрочипов. Следовательно, существует необходимость в разработке улучшенных методов со сниженными затратами и временем продукции микрочипов, которые не влияют на качество анализов, проводимых с указанными микрочипами.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение решает необходимость в методах, которые являются менее затратными по времени и дорогими для получения микрочипов, которые не влияют на качество проводимых анализов с использованием таких микрочипов.
Вышеуказанная задача достигается посредством метода иммобилизации меченого олигонуклеотида на немодифицированном полимерном субстрате, способ включает следующие стадии: a) получение смеси, включающей жидкость и меченый олигонуклеотид, и b) нанесение смеси стадии a) на немодифицированный субстрат; где олигонуклеотид иммобилизуют на немодифицированном субстрате посредством физической адсорбции.
В специфическом варианте осуществления изобретения полимерный субстрат выбирают из группы, состоящей из полиметилметакрилата (PMMA), поликарбоната (PC), полинорборнена, циклического олефинового сополимера (COC), фторированного полиимида, полистирола (PS), сополимера стирола бутадиена (SBC), акрилонитрил бутадиен стирола (ABS), стирола акрилонитрила (SAN) полиэтилена (PE), полипропилена (PP) и полисульфона.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения полимерным субстратом является циклический олефиновый сополимер (COC).
В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения меченым олигонуклеотидом является ДНК, РНК или LNA.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления изобретения меченым олигонуклеотидом является ДНК или LNA.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления изобретения меченым олигонуклеотидом является ssДНК или ssLNA
В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения меченый олигонуклеотид включает олигонуклеотид, к которому присоединена по меньшей мере одна химическая группа, где химическая группа является подходящей для иммобилизации меченого олигонуклеотида на немодифицированном субстрате.
В другом варианте осуществления изобретения меченый олигонуклеотид включает олигонуклеотид, к которому присоединена по меньшей мере одна химическая группа, где химическая группа имеет предпочтительно молекулярную массу от 0,1 до 1000 кДа, от 0,1 до 50 кДа, от 0,1 до 1,5 кДа, от 0,15 до 1 кДа, от 0,2 до 0,8 кДа.
В дополнительном варианте осуществления изобретения химической группой является химическая группа, предпочтительно выбираемая из группы, состоящей из биотина или сульфородамина 101 кислого хлорида (CAS номер 82354-19-6; Texas Red).
В другом варианте осуществления изобретения длина меченого олигонуклеотида составляет от около 2 до около 2000 нуклеотидов, от около 2 до 500, от около 2 до около 200 нуклеотидов, от около 2 до около 100, от около 2 до 50 нуклеотидов.
В дополнительном варианте осуществления изобретения способ не включает стадию УФ воздействия и олигонуклеотид ковалентно не связан с субстратом.
В еще одном варианте осуществления изобретения за стадией b) следует стадия инкубации субстрата.
В дополнительном варианте осуществления изобретения за вышеупомянутыми стадиями метода следует стадия сушки субстрата.
В следующем варианте осуществления изобретения за вышеупомянутой стадией метода следует стадия промывки субстрата, за которой необязательно следует стадия сушки субстрата.
Другой аспект изобретения относится к применению метки, присоединенной к олигонуклеотиду для иммобилизации меченого олигонуклеотида на немодифицированном полимерном субстрате путем физической адсорбции.
Дополнительный аспект изобретения относится к микрочипу, полученному способом, как описано выше.
Дополнительный аспект изобретения относится к микрочипу, включающему немодифицированный полимерный субстрат и меченый олигонуклеотид, который иммобилизован на субстрате; где не существует ковалентной связи между олигонуклеотидом и немодифицированным полимерным субстратом.
В одном варианте осуществления изобретения меченый олигонуклеотид дополнительно включает интересующую молекулу, которая присоединена к меченому олигонуклеотиду.
Дополнительный вариант осуществления изобретения относится к микрочипу, включающему немодифицированный полимерный субстрат, меченый олигонуклеотид, который иммобилизован на субстрате и олигонуклеотид, к которому присоединена интересующая молекула; где указанный олигонуклеотид гибридизован с меченым олигонуклеотидом, иммобилизованном на полимерном субстрате, и где не существует ковалентной связи между меченым олигонуклеотидом, иммобилизованном на субстрате, и немодифицированным полимерным субстратом.
В одном варианте осуществления изобретения меченый олигонуклеотид иммобилизован на немодифицированном субстрате посредством физической адсорбции.
Дополнительный аспект изобретения относится к диагностическому набору, включающему панель олигонуклеотидов, которые иммобилизованы в соответствии с методом, как описано в настоящему описании, и контрольный зонд, содержащий определенное количество известной, меченой нуклеиновой кислоты, комплементарной к по меньшей мере одному из указанных иммобилизованных олигонуклеотидов.
Дополнительный аспект изобретения относится к применению микрочипа, как определено выше, для анализов гибридизации, для поверхностной амплификации, для количественного и/или умноженного определения молекул ДНК или РНК, для анализа экспрессии, для сравнительной геномной гибридизации, для определения одиночного полиморфизма нуклеотидов или для секвенирования на основе геномной селекции.
Другой аспект изобретения относится к способу для иммобилизации интересующей молекулы на немодифицированном полимерном субстрате, способ включает стадии метода иммобилизации меченого олигонуклеотида, как описано в настоящем описании, где меченый олигонуклеотид, полученный на стадии a), дополнительно включает интересующую молекулу, которая присоединена к олигонуклеотиду.
Другой аспект изобретения относится к способу для иммобилизации интересующей молекулы на немодифицированном полимерном субстрате, способ включает стадии способа иммобилизации меченого олигонуклеотида, как описано в настоящем описании, и, кроме того, по меньшей мере стадии:
c) гибридизации олигонуклеотида, к которому присоединена интересующая молекула.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фиг. 1. Отражает результаты анализа с субстратом COC, отпечатанным с пятном немодифицированного олигонуклеотида, демонстрируя отсутствие видимого пятна при гибридизации с мишенью и меткой наночастицами.
На фиг. 2 показаны результаты субстрата COC, напечатанного с пятном TexasRed-модифицированного олигонуклеотида, с четко видимым пятном после гибридизации.
На фиг. 3 показан результат субстрата COC, отпечатанного с пятном биотин-модифицированного олигонуклеотида, с четко видимым пятном после гибридизации.
На фиг. 4 показан схематический обзор анализа гибридизации примера 2.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Хотя настоящее изобретение будет описано в отношении определенных вариантов осуществления изобретения, такое описание не рассматривается в ограничивающем смысле.
До описания в подробностях примерных вариантов осуществления настоящего изобретения даны определения, важные для понимания настоящего изобретения.
Как используется в настоящей спецификации и приложенной формуле изобретения, единственные формы ʺaʺ и ʺanʺ также включают соответствующее множественное число, если в контексте четко не указано иначе.
В контексте настоящего изобретения термины ʺоколоʺ и ʺприблизительноʺ обозначают интервал точности, который специалист в области техники понимает, как все еще обеспечивающий интересующие технические характеристики. Термин обычно показывает отклонение от указанного числового значения на ±20%, предпочтительно ±15%, более предпочтительно ±10%, и еще более предпочтительно ±5%.
Необходимо понимать, что термин ʺвключающийʺ не является ограничивающим. Для целей настоящего изобретения термин ʺсостоящий изʺ расценивается как предпочтительный вариант осуществления термина ʺвключающийʺ. Если далее группу определяют, как включающую по меньшей мере определенное количество вариантов осуществления изобретения, это означает также охват группы, которая предпочтительно состоит только из указанных вариантов осуществления изобретения.
Более того, термины ʺпервыйʺ, ʺвторойʺ, ʺтретийʺ или ʺ(a)ʺ, ʺ(b)ʺ, ʺ(c)ʺ, ʺ(d)ʺ и др. и подобные в описании и в формуле изобретения используют для различия между сходными элементами и не обязательно для описания последовательного или хронологического порядка. Необходимо понимать, что термины, используемые таким образом, являются взаимозаменяемыми в определенных обстоятельствах и что варианты осуществления изобретения, описанные в настоящем описании, возможно применять в других последовательностях, чем описано или проиллюстрировано в настоящем описании.
В случае терминов ʺпервыйʺ, ʺвторойʺ, ʺтретийʺ или ʺ(a)ʺ, ʺ(b)ʺ, ʺ(c)ʺ, ʺ(d)ʺ и др. относится к стадиям метода или применения, где не существует времени или временного интервала связки между стадиями, т.е. стадии могут осуществляться одновременно или могут быть временные интервалы секунды, минуты, часы, дни, недели, месяцы или даже года между указанными стадиями, если не указано иначе в применении, как указано далее.
Необходимо понимать, что настоящее изобретение не ограничивается определенной методологией, протоколами, реагентами и др., описанными в настоящем описании, так как они могут варьироваться. Также необходимо понимать, что терминология, используемая в настоящем описании, предназначена только для целей описания определенных вариантов осуществления изобретения, и не предназначена для ограничения рамок настоящего изобретения, которое ограничивается только приложенной формулой изобретения. Если не указано иначе, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют то же значение, как обычно понимает обычный специалист в области техники.
Один аспект изобретения относится к способу для иммобилизации меченого олигонуклеотида на немодифицированном полимерном субстрате, способ включает следующие стадии: получение смеси, включающей жидкость и меченый олигонуклеотид, нанесение смеси на немодифицированный полимерный субстрат, где олигонуклеотид иммобилизуют на немодифицированном полимерном субстрате посредством физической адсорбции.
2
2
2
Термины ʺнемодифицированныйʺ и ʺне модифицированныйʺ, как используется в настоящем описании, относится к полимерному субстрату, который не модифицирован или функционализирован, например, силановым слоем с функционализированными группами, как полиэтиленгликоль, амин, эпоксид, изотиоцианат, поли-L-лизин, авидин или стрептавидин. Это обозначает, между прочим, что полимерный субстрат не имеет модифицированной или функциональной поверхности, такой как гидрофобный монослой, образованный из алкильных цепей или гидрофильных слоев, состоящих из полиэтиленгликоля или цепей олигоэтиленгликоля, эпокси-содержащего полимерного слоя, аминосиланизированной поверхности и не покрыт оболочкой веществами, которые запускают связывание фосфатов, такими как амины, группы кванидина, группы амидина, группа имидазолина, незаряженный донор H-связи, такой как альдегид, спирт или формамид или незаряженный неорганический донор Н-связи, такой как SiO, TiO, AlO. Термин дополнительно обозначает, что полимерный субстрат, например, не контактирует с органической тонкой пленкой, покрывающей всю или некоторую часть поверхности полимерного субстрата. К полимерному субстрату не присоединяют реакционноспособных групп или функциональных групп. В частности, термины ʺнемодифицированныйʺ и ʺне модифицированныйʺ обозначают, что связывающие свойства субстрата не изменяются. Точнее, обозначают, что к полимерному субстрату не добавляют молекулы, в частности, молекулы, усиливающие связывание олигонуклеотидов, или что связывающие группы полимерного субстрата не активируются.
Термин ʺиммобилизация меченого олигонуклеотида на немодифицированном полимерном субстратеʺ относится к ассоциации меченых олигонуклеотидов с немодифицированным полимерным субстратом посредством молекулярных взаимодействий, которые затрудняют открепление олигонуклеотидов, например, во время отмывки, промывки или стадий химической гибридизации. В способе по изобретению такие молекулярные взаимодействия не основаны на ковалентных химических связях, но основаны на адсорбции, в частности адсорбции между субстратом и меченым олигонуклеотидом, который иммобилизуют. Адсорбционная сила связывания нуклеотида с субстратом может быть выбрана из группы, состоящей из водородной связи, электростатических взаимодействий, взаимодействия Ван дер Ваальса, гидрофобных взаимодействий или их комбинаций.
Адсорбция между субстратом и олигонуклеотидом передается меткой меченого олигонуклеотида. Это становится очевидным из фиг. 1-фиг. 3, которые показывают, что олигонуклеотид без метки не иммобилизуется на COC субстрате (фиг. 1), тогда как когда олигонуклеотид метят Texas Red (фиг. 2) или биотином (фиг. 3) может быть обнаружено четкое пятно, включающее несколько меченых олигонуклеотидов, демонстрируя, что меченый олигонуклеотид иммобилизуется на субстрате. Это четко демонстрирует, что только олигонуклеотиды с меткой, как определено в настоящем описании, иммобилизуются на полимерных субстратах, таких как COC.
Следовательно, в настоящем изобретении иммобилизация меченого олигонуклеотида опосредуется путем адсорбции метки меченого олигонуклеотида к немодифицированному полимерному субстрату.
ʺЦельюʺ или ʺцелевой молекулойʺ, как используется в настоящем описании, может быть любая подходящая молекула, которая допускает специфическое взаимодействие, как описано в настоящем описании выше. Примеры целевых молекул представляют собой нуклеиновые кислоты, белки, пептиды, лиганды любой формы и формата, антитела, антигены, мелкие молекулы, как органические, неорганические или смеси органических и неорганических структур, например, углеводы или сахара, полимеры, структуры, как клетки или фрагменты клеток или части клеток, например, бактериальные клетки или их фрагменты, клетки эукариот или их фрагменты, вирусные частицы или вирусы или любые производные или комбинации вышеупомянутого.
Термин ʺнанесениеʺ, как используется в настоящем описании, относится к любому методу отложения жидкости, такому как контактная печать или неконтактная печать. В предпочтительном варианте осуществления изобретения неконтактная печать используется для нанесения смеси стадии a) на немодифицированный субстрат.
Термин ʺнеконтактная печатьʺ, как используется в настоящем описании, относится к любому методу неконтактной печати в области техники, подходящему для печатных смесей, включающих олигонуклеотиды на полимерных субстратах, таких как чернильная печать, маркировка или подача. Для неконтактной печати может быть использован аппликатор, такой как sciFLEXARRAYER S11 (Scienion).
Специфический вариант осуществления изобретения относится к способу для иммобилизации меченого олигонуклеотида на немодифицированном полимерном субстрате, способ включает следующие стадии: получение смеси, включающей жидкость и меченый олигонуклеотид, неконтактная печать смеси на немодифицированном полимерном субстрате, где олигонуклеотид иммобилизуют на немодифицированном полимерном субстрате посредством физической адсорбции.
Термин "субстрат", как используется в настоящем описании, относится к любому подходящему субстрату, известному специалисту в области техники. Субстрат может иметь любую подходящую форму или формат, например, он может быть плоским, изогнутым, например, выпукло или вогнуто изогнут, он может быть закручен или иметь волноподобную форму. Чип может дополнительно включать магнитные частицы, включающие захватывающие молекулы. Термин субстрат, как используется в настоящем описании, может включать твердые объекты, такие как твердые предметные стекла или твердые микроструйные устройства, а также покровные слои, например, покровные слои стекол, покровные слои камер или покровные слои микроструйных устройств. В одном варианте осуществления изобретения субстрат относится к твердым объектам. В специфических вариантах осуществления изобретения субстрат относится к твердым стеклам или твердым камерам.
В одном варианте осуществления изобретения полимерный субстрат выбирают из группы, состоящей из полиметилметакрилата (PMMA), поликарбоната (PC), полинорборнена, циклического олефинового сополимера (COC), фторированного полиимида, полистирола (PS), сополимера стирола и бутадиена (SBC), акрилонитрил бутадиен стирола (ABS), стирол акрилонитрила (SAN), полиэтилена (PE), полипропилена (PP) и полисульфона.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения полимерный субстрат выбирают из группы, состоящей из полиметилметакрилата (PMMA), поликарбоната (PC), полинорборнена, циклического олефинового сополимера (COC), фторированного полиимида, сополимера стирола и бутадиена (SBC), акрилонитрил бутадиен стирола (ABS), стирол акрилонитрила (SAN), полиэтилена (PE), полипропилена (PP) и полисульфона.
В более предпочтительном варианте осуществления изобретения полимерный субстрат выбирают из группы, состоящей из полинорборнена, циклического олефинового сополимера (COC), фторированного полиимида, сополимера стирола и бутадиена (SBC), акрилонитрил бутадиен стирола (ABS), стирол акрилонитрила (SAN), полиэтилена (PE) и полисульфона. В еще более предпочтительном варианте осуществления изобретения полимерным субстратом является циклический олефиновый сополимер (COC).
В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения меченый олигонуклеотид включает олигонуклеотид, к которому присоединена по меньшей мере одна химическая группа, где химическая группа подходит для иммобилизации меченого олигонуклеотида на немодифицированном субстрате.
Термин ʺприсоединенныйʺ относится к ковалентной и нековалентной связи. Предпочтительно, ʺприсоединенныйʺ обозначает, что метка для иммобилизации ковалентно связана с олигонуклеотидом. Предпочтительно, ʺприсоединенныйʺ обозначает, что интересующая молекула ковалентно связана с олигонуклеотидом.
ʺПодходящий для иммобилизации меченого олигонуклеотидаʺ понимают, что между по меньшей мере одной химической группой и немодифицированным субстратом устанавливаются адсорбтивные силы, в частности физические адсорбтивные силы, так что меченый олигонуклеотид иммобилизуется на субстрате. Это может быть, между прочим, исследовано в соответствии с протоколом примеров 1-3 с использованием олигонуклеотидов, которые мечены химической группой, которую тестируют. Образование пятна, например, как показано на фиг. 2 и фиг. 3, демонстрирует, что химическая группа подходит для иммобилизации меченого олигонуклеотида на субстрате. Наоборот, отсутствие пятна, например, как показано на фиг. 1, демонстрирует, что химическая группа не подходит для иммобилизации меченого олигонуклеотида на субстрате. Следовательно, посредством гибридизующих зондов с магнитными шариками с образцом и исследованием шариков посредством изменяемого полного внутреннего отражения (f-TIR) может быть исследовано соответствие иммобизированного олигонуклеотида. Однако, также другие матрицы, меченые различными метками, могут быть использованы для определения в комбинации с методом определения, подходящим для определения метки матрицы.
В другом варианте осуществления изобретения меченый олигонуклеотид включает олигонуклеотид, к которому присоединена по меньшей мере одна химическая группа, где химическая группа имеет предпочтительно молекулярную массу от 0,1 до 1000 кДа, от 0,1 до 50 кДа, от 0,1 до 1,5 кДа, от 0,15 до 1 кДа, от 0,2 до 0,8 кДа.
В дополнительном варианте осуществления изобретения по меньшей мере одной химической группой является гидрофобная химическая группа. В специфическом варианте осуществления изобретения, например, гидрофобной химической группой может быть гидрофобный хромофор, длинная гидрофобная цепь, холестерил, PEG или биотин.
Термин ʺгидрофобный,ʺ как используется в настоящем описании, относится к тенденции легко не растворяться (т.е. ассоциировать) в воде. Фрагмент может быть гидрофобным, предпочтительно связываясь или ассоциируясь с другими гидрофобными фрагментами или молекулами, таким образом исключая молекулы воды.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения химической группой является белковый или небелковый органический фторофор, такой как производные цианина, производные нафталана, производные оксадиазола, производные антрацена, производные пирена, производные оксазина, производные акридина, производные арилметина или производные тетрапиррола, предпочтительно производное ксантена, такие как флуоресцеин или его производные или родамин или его производные.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения химической группой является родамин или его производные, такие как карбокситетраметилродамин (TAMRA), тетраметилродамин (TMR) и его изотиоцианатное производное (TRITC) и сульфородамин 101 и сульфородамин 101 хлорид (Texas Red).
В предпочтительном варианте осуществления изобретения химическую группу выбирают из группы, состоящей из биотина или сульфородамина 101 кислого хлорида (CAS номер 82354-19-6; Texas Red).
Химическая группа может быть присоединена к 3ʹ-концу или к 5ʹ-концу олигонуклеотида.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения меченым олигонуклеотидом является меченая РНК, меченая LNA или меченая DNA. В еще одном более предпочтительном варианте осуществления изобретения олигонуклеотидом является меченая ДНК или меченая LNA.
Меченый олигонуклеотид также может включать аптамеры нуклеотидов, такие как ДНК аптамеры, РНК аптамеры или LNA аптамеры.
Олигонуклеотидами для иммобилизации в соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения могут быть ДНК, РНК, PNA, CNA, HNA, LNA или ANA. ДНК может находиться в форме, например, A-DNA, B-DNA или Z-DNA. РНК может находиться в форме, например, п-РНК, т.е. пиранозил-РНК или структурно модифицированных форм, как шпилечная РНК или РНК типа петля на стебле.
Термин ʺPNAʺ относится к нуклеиновой кислоте пептида, т.е. искусственно синтезированному полимеру, сходному с ДНК или РНК, которые используют в биологических исследованиях и медицинском лечении, но которые не существуют в естественных условиях. Основа PNA обычно состоит из повторяющихся единиц N-(2-аминоэтил)глицина, связанных пептидными связями. Различные пуриновые и пиримидиновые основания связаны с основой метиленкарбонильными связями. PNA обычно изображены как пептиды, с N-концом в первом (левом) положении и C-концом справа.
Термин ʺCNAʺ относится к нуклеиновой кислоте аминоциклогексилэтановой кислоты. Более того, термин относится к циклопентановой нуклеиновой кислоте, т.е. молекуле нуклеиновой кислоты, включающей, например, 2'-деоксикарбакванозин.
Термин ʺHNAʺ относится к гекситол нуклеиновой кислоте, т.е. аналогам ДНК, которые построены из стандартных пар оснований и фосфорилированной 1,5-ангидрогекситоловой основы.
Термин ʺLNAʺ относится к блокированным нуклеиновым кислотам. Обычно, блокированная нуклеиновая кислота представляет собой модифицированные и, следовательно, недоступные РНК нуклеотиды. Рибозный фрагмент нуклеотида LNA может быть модифицирован экстра-мостиком, соединяющим 2' и 4' углероды. Такой мостик блокирует рибозу в 3'-эндо структурной конформации. Блокированная рибозная конформация усиливает стэкинг взаимодействие и предварительную организацию основы. Это может достоверно увеличивать термическую стабильность, т.е. температуру плавления олигонуклеотида.
Термин ʺANAʺ относится к арабиноевым нуклеиновым кислотам или их производным. Предпочтительным ANA производным в контексте настоящего изобретения является 2'-деокси-2'-фтор-бета-D-арабинонуклеозид (2'F-ANA).
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления изобретения олигонуклеотиды могут включать комбинацию любого из ДНК, РНК, PNA, CNA, HNA, LNA и ANA. Особенно предпочтительными являются смеси LNA нуклеотидов с ДНК или РНК основаниями.
В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения олигонуклеотидом, как определено в настоящем описании выше, может быть одноцепочечный, двухцепочечный или может состоять из одноцепочечных и двухцепочечных промежутков. Термин ʺодноцепочечная нуклеиновая кислотаʺ относится к олигонуклеотидам, которые включают одиночную сахар-фосфатную основу и/или не организованы в спиральную форму. Предпочтительно такие олигонуклеотиды не демонстрируют вторичных структур или межмолекулярных ассоциаций. Термин ʺдвухцепочечная нуклеиновая кислотаʺ относится к молекулам нуклеиновой кислоты, которые включают две сахар-фосфатных основы. В предпочтительном варианте осуществления изобретения двухцепочечная нуклеиновая кислота организована в двухспиральной форме. В дополнительном предпочтительном варианте осуществления изобретения двухцепочечные нуклеиновые кислоты в соответствии с настоящим изобретением могут состоять из различных типов молекул нуклеиновой кислоты, например, ДНК и РНК, ДНК и PNA, ДНК и CNA, ДНК и HNA, ДНК и LNA, ДНК и ANA, или РНК и CNA, РНК и PNA, РНК и CNA, РНК и HNA, РНК и LNA, РНК и ANA, или PNA и CNA, PNA и HNA, PNA и LNA, PNA и ANA или CNA и HNA, CNA и LNA, CNA и ANA, или HNA и LNA, HNA и ANA, или LNA и ANA. Они могут альтернативно также состоять из комбинаций промежутков любого из вышеупомянутых вариантов нуклеотидов. Наиболее предпочтительной является одноцепочечная ДНК (ssDNA) или одноцепочечная LNA (ssLNA).
Олигонуклеотид может иметь афинность связывания с целевой молекулой.
Олигонуклеотид может включать спейсер, который не имеет афинности связывания с целевой молекулой. Спейсером может быть олигонуклеотид или другой полимер, например, углеводная цепь. Спейсером может быть олигонуклеотид, имеющий длину, например, по меньшей мере 15 нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере 20 нуклеотидов или по меньшей мере 50 нуклеотидов. Спейсером может быть полимер, такой как углеводная цепь, имеющая длину по меньшей мере 4 нм, 6 нм или 15 нм. Спейсер может быть на конце олигонуклеотида, который помечен химической группой, подходящей для иммобилизации меченого олигонуклеотида к субстрату, и, следовательно, спейсер может находиться на конце олигонуклеотида, который близок к субстрату.
Один специфический вариант осуществления изобретения относится к способу иммобилизации меченого олигонуклеотида на немодифицированном полимерном субстрате, способ включает следующие стадии: получение смеси, включающей жидкость и меченый олигонуклеотид, нанесение смеси на немодифицированный полимерный субстрат, где олигонуклеотид иммобилизуют на немодифицированном полимерном субстрате посредством физической адсорбции и где меченым олигонуклеотидом является меченый ssDNA.
Один специфический вариант осуществления изобретения относится к способу иммобилизации меченого олигонуклеотида на немодифицированном полимерном субстрате, способ включает следующие стадии: получение смеси, включающей жидкость и меченый олигонуклеотид, нанесение смеси на немодифицированный полимерный субстрат, где олигонуклеотид иммобилизуют на немодифицированном полимерном субстрате посредством физической адсорбции, и где меченым олигонуклеотидом является меченый ssLNA.
Олигонуклеотиды могут происходить из естественных или искусственно полученных молекул нуклеиновой кислоты. Они могут включать кодирующие и/или некодирующие участки. В соответствии с изобретением олигонуклеотиды могут иметь длину от около 2 до около 2000 нуклеотидов, более предпочтительно от около 2 до около 500 нуклеотидов, или от около 2 до 200 особенно предпочтительно от около 2 до около 100 нуклеотидов. Также предпочтительной является длина 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40 нуклеотидов.
В частности, настоящее изобретение решает проблему, что для присоединенных олигонуклеотидов, в частности 100 нуклеотидов или менее, адсорбционные силы являются не очень эффективными. Субстраты и методы, увеличивающие адсорбционные силы между нуклеотидом и субстратом, влияют на способность олигонуклеотида образовывать дуплекс или запускать неспецифическое связывание мишени на микрочипе. Посредством использования олигонуклеотидов, к которым присоединена по меньшей мере одна химическая группа, которая является подходящей для связывания олигонуклеотидов с полимерным субстратом посредством адсорбции, в частности, физической адсорбции, указанная проблема была преодолена
Способ по изобретению не включает стадию фотохимических перекрестных сшивок, таких как УФ воздействие. Способ по изобретению также не использует стадию химических перекрестных сшивок. Способ не включает модификацию заряда полимерного субстрата, так что поверхность полимерного субстрата имеет специфический заряд.
В специфическом варианте осуществления изобретения смесь, наносимая на немодифицированный полимерный субстрат, включает жидкость и меченый олигонуклеотид. Жидкостью может быть любая жидкость, подходящая для растворения олигонуклеотидов для нанесения и иммобилизации на субстрате, такая как вода или буферный раствор, такой как PBS, карбонатные буферы, ацетатные буферы и цитратные буферы. Буферный раствор может включать, например, сахарозу, триметилглицин (бетаин), трегалозу, глицерин, Tween, Саркозил, PVA и/или PEG. В предпочтительном варианте осуществления изобретения буфер включает сахарозу и бетаин.
В специфическом варианте осуществления изобретения жидкость может не включать катионные детергент-подобные соединения, такие как бромид цетилтриметиламмония (CTAB), 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида гидрохлорид (EDC), октилдиметиламин (ODA). В другом специфическом варианте осуществления изобретения жидкость может не включать CTAB, EDC или ODA.
Концентрация сахарозы может составлять от 1% до 50%, от 5% до 40%, от 10% до 30%, предпочтительно 20%. Концентрация триметилглицина может составлять от 1 мM до 50 мM, от 5 мM до 30 мM, от 10 мM до 20 мM, предпочтительно 15 мM.
В специфическом варианте осуществления изобретения буфер включает PBS, сахарозу и триметилглицин.
Специфический вариант осуществления изобретения относится к способу иммобилизации меченого олигонуклеотида на немеченом полимерном субстрате, способ включает следующие стадии: получение смеси, включающей буфер и меченый олигонуклеотид, нанесение смеси на немодифицированный полимерный субстрат, где олигонуклеотид иммобилизуют на немодифицированном полимерном субстрате посредством физической адсорбции.
Специфический вариант осуществления изобретения относится к способу для иммобилизации меченого олигонуклеотида на немодифицированном полимерном субстрате, способ включает следующие стадии: получение смеси, включающей буфер и меченый олигонуклеотид, неконтактная печать смеси, включающей буфер, и меченый олигонуклеотид, неконтактная печать смеси на немодифицированном полимерном субстрате, где олигонуклеотид иммобилизуют на немодифицированном полимерном субстрате посредством физической адсорбции.
Другой вариант осуществления изобретения относится к способу для иммобилизации меченого олигонуклеотида на немодифицированном полимерном субстрате, способ включает следующие стадии: получение смеси, включающей жидкость и меченый олигонуклеотид, нанесение смеси на немодифицированный полимерный субстрат, где олигонуклеотид иммобилизуют на немодифицированном полимерном субстрате посредством физической адсорбции, и где способ не включает стадию УФ воздействия и олигонуклеотид ковалентно не связан с субстратом.
Другой вариант осуществления изобретения относится к способу для иммобилизации меченого олигонуклеотида на немодифицированном полимерном субстрате, способ включает следующие стадии: получение смеси, включающей буфер, и меченый олигонуклеотид, неконтактная печать смеси на немодифицированном полимерном субстрате, где олигонуклеотид иммобилизуют на немодифицированном полимерном субстрате посредством физической адсорбции, и где способ не включает стадию УФ воздействия и олигонуклеотид ковалентно не связан с субстратом.
Другой вариант осуществления изобретения относится к способу иммобилизации меченого олигонуклеотида на немодифицированном полимерном субстрате, способ включает следующие стадии: получение смеси, включающей жидкость и меченый олигонуклеотид, нанесение смеси на немодифицированный полимерный субстрат, где олигонуклеотид иммобилизуют на немодифицированном полимерном субстрате посредством физической адсорбции, где немодифицированным полимерным субстратом является COC, где меченый олигонуклеотид включает химическую группу, которая является биотином или органическим небелковым фторофором, таким как сульфородамин 101 кислый хлорид (CAS номер 82354-19-6; Texas Red), и где способ не включает стадии УФ воздействия и олигонуклеотид ковалентно не связан с субстратом.
Другой вариант осуществления изобретения относится к способу для иммобилизации меченого олигонуклеотида на немодифицированном полимерном субстрате, способ включает следующие стадии: получение смеси, включающей буфер и меченый олигонуклеотид, неконтактную печать смеси на немодифицированном полимерном субстрате, где олигонуклеотид иммобилизуют на немодифицированном полимерном субстрате посредством физической адсорбции, где немодифицированным полимерным субстратом является COC, где меченый олигонуклеотид включает химическую группу, которой является биотин или органический небелковый фторофор, такой как сульфородамин 101 кислый хлорид (CAS номер 82354-19-6; Texas Red), и где способ не включает стадию УФ воздействия и олигонуклеотид ковалентно не связан с субстратом.
Другой вариант осуществления изобретения относится к способу иммобилизации меченого олигонуклеотида на немодифицированном полимерном субстрате: получение смеси, включающей жидкость и меченый олигонуклеотид, нанесение смеси на немодифицированный полимерный субстрат, где олигонуклеотид иммобилизуют на немодифицированном полимерном субстрате посредством физической адсорбции, где меченым олигонуклеотидом является ssDNA, где немодифицированным полимерным субстратом является COC, где меченый олигонуклеотид включает химическую группу, которая является биотином или органическим небелковым фторофором, таким как сульфородамин 101 кислый хлорид (CAS номер 82354-19-6; Texas Red), и где метод не включает стадию УФ воздействия и олигонуклеотид ковалентно не связан с субстратом.
Другой вариант осуществления изобретения относится к способу для иммобилизации меченого олигонуклеотида на немодифицированном полимерном субстрате, способ включает следующие стадии: получение смеси, включающей буфер и меченый олигонуклеотид, неконтактная печать смеси на немодифицированном полимерном субстрате, где олигонуклеотид иммобилизуют на немодифицированном полимерном субстрате посредствомфизической адсорбции, где меченым олигонуклеотидом является ssDNA, где немодифицированным полимерным субстратом является COC, где меченый олигонуклеотид включает химическую группу, такую как биотин или неорганический небелковый фторофор, такой как сульфородамин 101 кислый хлорид (CAS номер 82354-19-6; Texas Red), и где способ не включает стадии УФ воздействия и олигонуклеотид ковалентно не связан с субстратом.
Другой вариант осуществления изобретения относится к способу для иммобилизации меченого олигонуклеотида на немодифицированном полимерном субстрате, способ включает следующие стадии: получение смеси, включающей жидкость и меченый олигонуклеотид, нанесение смеси на немодифицированный полимерный субстрат и инкубация полимерного субстрата, где олигонуклеотид иммобилизуют на немодифицированном полимерном субстрате посредством физической адсорбции.
Инкубация полимерного субстрата может проводиться при комнатной температуре, например, от 18°C до 25°C, предпочтительно от 20°C до 22°C в течение от 30 секунд до 5 часов, в течение 5 минут до 4 часов, в течение от 10 минут до 3 часов в течение от 15 минут до 1 часа, предпочтительно в течение 30 минут.
Инкубация может происходить с относительной влажностью от 10% до 90%, от 20% до 80%, от 30% до 70%, от 40% до 60%, предпочтительно 50%.
Другой вариант осуществления изобретения относится к способу иммобилизации меченого олигонуклеотида на немодифицированном полимерном субстрате, способ включает следующие стадии: получение смеси, включающей жидкость и меченый олигонуклеотид, нанесение смеси на немодифицированный полимерный субстрат, и сушку субстрата, где олигонуклеотид иммобилизуют на немодифицированном полимерном субстрате посредством физической адсорбции.
Другой вариант осуществления изобретения относится к способу иммобилизации меченого олигонуклеотида на немодифицированном полимерном субстрате, способ включает следующие стадии: получение смеси, включающей жидкость и меченый олигонуклеотид, нанесение смеси на немодифицированный полимерный субстрат, инкубация субстрата и сушка субстрата, где олигонуклеотид иммобилизуют на немодифицированном полимерном субстрате посредством физический адсорбции.
Термин ʺсушка субстратаʺ, как используется в настоящем описании, относится к инкубации субстрата при температуре от около 25°C до 70°C, от около 30°C до 45°C, предпочтительно от около 35°C до 39°C, более предпочтительно около 37°C. Вследствие этого жидкость смеси выпаривается. В течение этой стадии не возникает перекрестных сшивок между мечеными нуклеиновыми кислотами и субстратом.
Стадию сушки субстрата можно осуществлять в течение любого подходящего периода времени, известного специалисту в области техники, например, от 30 мин до 36 ч, в течение от 1 ч до 30 ч, в течение от 10 до 22 ч. Сушку субстрата можно проводить посредством любых подходящих средств, известных специалисту в области техники, например, сушильной камеры или печи или инкубатора. В добавление к температуре, также другие параметры, как влажность, аэрация или вентиляция, могут быть отрегулированы специалистом до подходящих значений в области техники.
Немодифицированный субстрат может быть стерилизован, например, обычной стерилизацией паром (автоклавированием) или гамма излучением. Предпочтительно немодифицированный субстрат является обработанным гамма излучением.
Другой вариант осуществления изобретения относится к способу иммобилизации меченого олигонуклеотида на немодифицированном полимерном субстрате, способ включает следующие стадии: получение смеси, включающей жидкость и меченый олигонуклеотид, нанесение смеси на немодифицированный субстрат, инкубация субстрата, сушка субстрата и промывка субстрата, где олигонуклеотид иммобилизуют на немодифицированном субстрате посредством физической адсорбции.
Другой вариант осуществления изобретения относится к способу иммобилизации меченого олигонуклеотида на немодифицированном субстрате, способ включает следующие стадии: получение смеси, включающей жидкость и меченый олигонуклеотид, нанесение смеси на немодифицированный субстрат, сушка субстрата и промывка субстрата, где олигонуклеотид иммобилизуют на немодифицированном субстрате посредством физической адсорбции.
Другой вариант осуществления изобретения относится к способу иммобилизации меченого олигонуклеотида на немодифицированном субстрате, способ включает следующие стадии: получение смеси, включающей жидкость и меченый олигонуклеотид, нанесение смеси на немодифицированный субстрат, инкубация субстрата и промывка субстрата, где олигонуклеотид иммобилизуют на немодифицированном субстрате посредством физической адсорбции.
Другой вариант осуществления изобретения относится к способу иммобилизации меченого олигонуклеотида на немодифицированном субстрате, способ включает следующие стадии: получение смеси, включающей жидкость и меченый олигонуклеотид, нанесение смеси на немодифицированный субстрат и промывка субстрата, где олигонуклеотид иммобилизуют на немодифицированном субстрате посредством физической адсорбции.
Для промывки субстрата может быть использован промывочный буфер, содержащий PBS и Tween20. Буфером может быть, например, 0,5xPBS и 0,01% Tween20.
Субстрат может быть помещен в промывочный буфер в течение от 1 секунды до 1 часа, в течение от 10 секунд до 30 минут, в течение от 30 секунд до 10 минут, в течение от 45 секунд до 5 минут, предпочтительно в течение 1 минуты.
Промывочный буфер может быть удален из субстрата способами, известными специалисту в области техники, такими как помещение субстрата в сухой шкаф.
Другой вариант осуществления изобретения относится к способу иммобилизации меченого олигонуклеотида на немодифицированном субстрате, способ включает следующие стадии: получение смеси, включающей жидкость и меченый олигонуклеотид, нанесение смеси на немодифицированный субстрат, инкубация субстрата, сушка субстрата, промывка субстрата и удаление промывочного буфера из субстрата, где олигонуклеотид иммобилизован на немодифицированном субстрате посредством физической адсорбции.
Другой вариант осуществления изобретения относится к способу иммобилизации меченого олигонуклеотида на немодифицированном субстрате, способ включает следующие стадии: получение смеси, включающей жидкость и меченый олигонуклеотид, нанесение смеси на немодифицированный субстрат, инкубация субстрата, сушка субстрата, промывка субстрата и удаление промывочного буфера из субстрата, где олигонуклеотид иммобилизован на немодифицированном субстрате посредством физической адсорбции.
Другой аспект изобретения относится к применению метки, присоединенной к олигонуклеотиду, для иммобилизации меченого олигонуклеотида на немодифицированном полимерном субстрате посредством физической адсорбции.
Адсорбция между субстратом и олигонуклеотидом передается меткой меченого олигонуклеотида. Это становится очевидным из фиг. 1-3, которые показывают, что олигонуклеотид без метки не иммобилизуется на COC субстрате (фиг. 1), тогда как когда олигонуклеотид помечен Texas Red (фиг. 2) или биотином (фиг.3) может быть обнаружено четкое пятно, включающее несколько олигонуклеотидов, демонстрирующее, что меченый олигонуклеотид иммобилизуется на субстрате. Это четко демонстрирует, что только олигонуклеотид с меткой, как определено в настоящем описании, иммобилизуется на полимерных субстратах, таких как COC.
Следовательно, в настоящем изобретении иммобилизация меченого олигонуклеотида опосредуется адсорбцией метки меченого олигонуклеотида к немодифицированному полимерному субстрату.
Дополнительный аспект изобретения относится к микрочипу, полученному способом, как описано в настоящем описании.
2
2
2
2
2
2
Термин "микрочип", как используется в настоящем описании, относится к упорядоченному или случайному чипу, представленному для взаимодействия между захватывающими молекулами в чипе и потенциальными взаимодействующими веществами в окружающей среде, например, среде, реакционном растворе, предпочтительно растворе для гибридизации. Микрочип может включать двух- или трехмерное расположение адресуемых участков, предпочтительно двухмерное расположение. Типичный микрочип может содержать множество пятен, характеристик, областей индивидуальной иммобилизации или областей индивидуальной молекулярной идентичности. Например, панель может содержать более чем 2, 5, 10, 50, 100, 500, 750, 1000, 1500, 3000, 5000, 10000, 20000, 40000, 50000, 70000, 100000, 200000, 300000, 400000, 500000, 750000, 800000, 1000000, 1200000, 1500000, 1750000, 2000000 или 2100000 пятен, характеристик, захватывающих молекул или областей индивидуальной иммобилизации или областей индивидуальной молекулярной идентичности. Такие области могут находиться в области менее чем около 20 см, менее чем около 10 см, менее чем около 5 см, менее чем около 1 см, менее чем около 1 мм, менее чем около 100 мкм. В дополнительных вариантах осуществления изобретения размер пятна в микрочипе может находиться в диапазоне от около 1 до 300 мкм, например, имеют размер 10, 50, 100, 150, 200, или 250 мкм, или иметь любое подходящее значение между упомянутыми значениями. В дополнительных вариантах осуществления изобретения плотность матриц (олигонуклеотида) может варьироваться в соответствии с необходимостью. Примерами плотностей матрицы являются плотности от 1000 до 5000000 матриц на квадратный мкм, например, плотность матриц 2000, 10000, 50000, 75000 или 1000000 матриц на квадратный мкм.
В специфических вариантах осуществления изобретения такие пятна, характеристики или площади индивидуальной иммобилизации могут включать подходящее покрытие, например, покрытие 1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более из одной или более специфических последовательностей или геномов или частей геномов. Следовательно, микрочип может, например, включать 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более копий той же захватывающей молекулы. Альтернативно или дополнительно она может включать вариации захватывающей молекулы, например, несогласованные варианты, варианты с единственным или множественным полиморфизмами нуклеотидов, различные версии единственного или множественных полиморфизмов нуклеотидов, захватывающие молекулы с различными стартовыми или терминальными последовательностями, например, хвостами, сайтами связывания праймеров, сайтами распознавания эндонуклеазами, однако с идентичными ядерными частями и др.
Упомянутая в настоящем описании микрочип может включать "один или более видов" молекул олигонуклеотидов или "один или более видов" интересующих молекул, присоединенных к молекуле олигонуклеотида, т.е. один или более различных типов молекул могут присутствовать в микрочипе. Альтернативно, термин "один или более видов" также относится к олигонуклеотидам той же категории или имеющим ту же форму или формат, например, ДНК, но которые не являются идентичными или сходными по молекулярной идентичности, например, последовательности. Следовательно, реакционная зона или захватывающая зона в соответствии с настоящем изобретением может включать различные олигонуклеотиды. Если олигонуклеотиды различной молекулярной идентичности, в частности, нуклеиновые кислоты, присутствуют в реакционной зоне или захватывающей зоне в соответствии с настоящим изобретением, такие олигонуклеотиды могут быть частично идентичными или частично сходными, т.е., иметь, в частности в случае нуклеиновых кислот, пересечения в отношении последовательности или могут не иметь пересечения. Олигонуклеотиды в соответствии с настоящим изобретением могут, например, включать, покрывать или представлять последовательность любой подходящей области или процента генома, например, от около 0,00001% до около 30% генома, например, по меньшей мере около 0,00001, 0,00005, 0,0001, 0,0005, 0,001, 0,005, 0,01, 0,02, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,11, 0,12, 0,13, 0,14, 0,15, 0,16, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,75, 0,8, 0,9, 1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, или 30% генома организма, предпочтительно генома млекопитающего, более предпочтительно генома человека и/или может быть комплементарным к таким участкам. Такая область или процент может включать, например, группу от около 2 до 5000 генов, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 50, 100, 150, 200, 350, 500, 750, 1000, 1200, 1500, 2000, 2500, 3000, 4000, 5000 или более чем 5000 генов. Такие гены могут быть или локализованы в соседних областях генома или могут альтернативно быть распределены по всему геному. Также предусматриваются подгруппы, комбинации, варианты, например, варианты, получающиеся из данных экспрессии генов и др.
Дополнительный аспект изобретения относится к микрочипу, включающему немодифицированный полимерный субстрат и меченый олигонуклеотид, который иммобилизован на субстрате; где не существует ковалентной связи между олигонуклеотидом и немодифицированным полимерным субстратом.
В одном варианте осуществления изобретения полимерный субстрат выбирают из группы, состоящей из полиметилметакрилата (PMMA), поликарбоната (PC), полинорборнена, циклического олефинового сополимера (COC), фторированного полиимида, полистирола (PS), сополимера стирола и бутадиена (SBC), акрилонитрил бутадиен стирола (ABS), стирола акрилонитрила (SAN), полиэтилена (PE), полипропилена (PP) и полисульфона.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения полимерным субстратом является циклический олефиновый сополимер (COC).
В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения меченый олигонуклеотид включает олигонуклеотид, к которому присоединена по меньшей мере одна химическая группа, где химическая группа подходит для иммобилизации меченого олигонуклеотида на немодифицированном субстрате.
В специфическом варианте осуществления изобретения меченый олигонуклеотид включает олигонуклеотид, к которому присоединена по меньшей мере одна химическая группа, где химическая группа имеет предпочтительно молекулярную массу от 0,1 до 1000 кДа, от 0,1 до 50 кДа, от 0,1 до 1,5 кДа, от 0,15 до 1 кДа, от 0,2 до 0,8 кДа.
В дополнительном варианте осуществления изобретения химической группой является химическая группа, предпочтительно выбираемая из группы, состоящей из биотина или сульфородамина 101 кислого хлорида (CAS номер 82354-19-6; Texas Red).
В другом варианте осуществления изобретения длина меченого олигонуклеотида составляет от около 2 до около 2000, от около 2 до 500, от около 2 до около 200 нуклеотидов, от около 2 до около 100 нуклеотидов, от около 2 до около 50 нуклеотидов.
Специфический аспект изобретения относится к микрочипу, включающему немодифицированный полимерный субстрат и меченый олигонуклеотид, который иммобилизован на немодифицированном полимерном субстрате; где не существует ковалентной связи между олигонуклеотидом и немодифицированным полимерным субстратом и где олигонуклеотид иммобилизуется на немодифицированном полимерном субстрате посредством адсорбции, в частности физической адсорбции.
Специфический аспект изобретения относится к микрочипу, включающему немодифицированный полимерный субстрат и меченый олигонуклеотид, который иммобилизован на немодифицированном полимерном субстрате; где не существует ковалентной связи между олигонуклеотидом и немодифицированным полимерным субстратом и где меченый олигонуклеотид иммобилизуется на немодифицированном полимерном субстрате посредством его метки путем адсорбции, в частности, физической адсорбции.
Специфический аспект изобретения относится к микрочипу, включающему немодифицированный COC субстрат и меченый олигонуклеотид, который иммобилизован на немодифицированном COC субстрате; где не существует ковалентной связи между олигонуклеотидом и немодифцированным COC субстратом.
Специфический аспект изобретения относится к микрочипу, включающему немодифицированный COC субстрат и меченый олигонуклеотид, который иммобилизован на немодифицированном COC субстрате; где не существует ковалентной связи между олигонуклеотидом и немодифицированным COC субстратом и где меченым олигонуклеотидом является меченая ssDNA.
Специфически аспект изобретения относится к микрочипу, включающему немодифицированный COC субстрат и меченый олигонуклеотид, который иммобилизован на немодифицированном COC субстрате; где не существует ковалентной связи между олигонуклеотидом и немодифицированным COC субстратом, и где олигонуклеотид иммобилизован на немодифицированном COC субстрате посредством адсорбции, в частности, физической адсорбции.
Специфический аспект изобретения относится к микрочипу, включающему немодифицированный COC субстрат и меченый олигонуклеотид, который иммобилизован на немодифицированном COC субстрате; где не существует ковалентной связи между олигонуклеотидом и немодифицированным COC субстратом, и где меченый олигонуклеотид иммобилизован на немодифицированном COC субстрате посредством его метки путем адсорбции, в частности, физической адсорбции.
Специфический аспект изобретения относится к микрочипу, включающему немодифицированный COC субстрат и меченый олигонуклеотид, который иммобилизован на немодифицированном COC субстрате; где не существует ковалентной связи между олигонуклеотидом и немодифицированным COC субстратом, и где олигонуклеотид является меченым по меньшей мере одной химической группой, которая подходит для иммобилизации меченого олигонуклеотида на немодифицированном субстрате COC.
Специфический аспект изобретения относится к микрочипу, включающему немодифицированный COC субстрат и меченый олигонуклеотид, который иммобилизован на немодифицированном COC субстрате; где не существует ковалентной связи между олигонуклеотидом и немодифицированным COC субстратом, и где олигонуклеотид является меченым по меньшей мере одной химической группой, выбираемой из по меньшей мере одной химической группы, состоящей из хромофора или биотина.
Специфический аспект изобретения относится к микрочипу, включающему немодифицированный COC субстрат и меченый олигонуклеотид, который иммобилизован на немодифицированном COC субстрате; где не существует ковалентной связи между олигонуклеотидом и немодифицированным COC субстратом, и где олигонуклеотид является меченым по меньшей мере одной химической группой, выбираемой из группы, состоящей из сульфородамина 101 кислого хлорида (CAS номер 82354-19-6; Texas Red) или биотина.
Специфический аспект изобретения относится к микрочипу, включающему немодифицированный COC субстрат и меченый олигонуклеотид, который иммобилизован на немодифицированном COC субстрате; где не существует ковалентной связи между олигонуклеотидом и немодифицированным COC субстратом, где олигонуклеотид меченый по меньшей мере одной химической группой, выбираемой из группы, состоящей из сульфородамина 101 кислого хлорида (CAS номер 82354-19-6; Texas Red) или биотина и где меченым олигонуклеотидом является меченый ssDNA.
В одном варианте осуществления изобретения меченый олигонуклеотид иммобилизован на немодифицированном субстрате посредством физической адсорбции.
Дополнительный аспект изобретения относится к диагностическому набору, включающему чип олигонуклеотидов, которые иммобилизованы в соответствии со способом, как описано в настоящем описании, и контрольную матрицу, содержащую определенное количество известной меченой нуклеиновой кислоты, комплементарной по меньшей мере одному из указанных иммобилизованных олигонуклеотидов.
Дополнительный аспект изобретения относится к диагностическому набору, включающему микрочип, включающий олигонуклеотиды, которые иммобилизованы в соответствии с методом, как описано в настоящем описании, и контрольную матрицу, содержащую определенное количество известной меченой нуклеиновой кислоты, комплементарной по меньшей мере одному из указанных иммобилизованных олигонуклеотидов.
Термин ʺконтрольная матрица, содержащая определенное количество известной меченой комплементарной нуклеиновой кислотыʺ относится к хорошо определенному олигонуклеотиду, который содержит метку, предпочтительно флуоресцентную метку, и который используется для калибровки и/или исследования или проверки качества по меньшей мере одного из иммобилизованных олигонуклеотидов, присутствующих в форме чипа.
Дополнительный вариант осуществления изобретения относится к применению микрочипа, как определено выше, для анализа гибридизации, для поверхностной амплификации, для количественного и/или умноженного определения молекул ДНК или РНК, для анализа экспрессии, для сравнительной геномной гибридизации, для определения одиночного полиморфизма нуклеотида или для секвенирования на основе геномной селекции.
Микрочип по изобретению является особенно подходящей для определения нуклеиновой кислоты, такого как на основе анализа микрочипов, анализов гибридизации, такие как анализ сендвич гибридизации, поверхностной амплификации. Субстраты по изобретению могут быть использованы в комбинации с магнитными шариками.
Следующие примеры и чертежи представлены с целью иллюстрации. Следовательно, понимают, что пример и чертежи не должны рассматриваться как ограничивающие. Специалист в области техники четко способен осуществить дополнительные модификации принципов, изложенных в настоящем описании.
Другой аспект изобретения относится к способу иммобилизации интересующей молекулы на немодифицированном полимерном субстрате, способ включает стадии способа для иммобилизации меченого олигонуклеотида, как описано в настоящем описании, где меченый олигонуклеотид, полученный на стадии a), дополнительно включает интересующую молекулу, которая присоединена к олигонуклеотиду.
Интересующая молекула может быть присоединена к противоположной стороне олигонуклеотида, к которому присоединена метка для иммобилизации. Это означает, если метка для иммобилизации присоединена к 3ʹ-концу олигонуклеотида, интересующая молекула может быть присоединена к 5ʹ-концу олигонуклеотида. Наоборот, если метка для иммобилизации присоединена к 5ʹ-концу олигонуклеотида, интересующая молекула может быть присоединена к 3ʹ-концу олигонуклеотида.
В специфическом варианте осуществления изобретения, если интересующая молекула присоединена к олигонуклеотиду, к которому присоединена метка для иммобилизации, олигонуклеотид может не иметь афинность связывания в отношении целевой молекулы. В таком случае, олигонуклеотид действует, как линкер для иммобилизации интересующей молекулы на полимерном субстрате и не участвует в связывании интересующей молекулы и целевой молекулы.
Дополнительный аспект изобретения относится к способу для иммобилизации интересующей молекулы на немодифицированном полимерном субстрате, способ включает стадии способа иммобилизации меченого олигонуклеотида, как описано в настоящем описании, и в добавление по меньшей мере стадию: c) гибридизации олигонуклеотида, к которому присоединена интересующая молекула.
Термин ʺинтересующая молекулаʺ, как используется в настоящем описании, относится, например, к белкам, пептидам или антителам, мелким молекулам, полимерам с впечатанными молекулами, аптамерам белков или аптамерам пептидов. ʺИнтересующая молекулаʺ может обладать афинностью связывания к целевой молекуле.
ПРИМЕРЫ
Пример 1 - Иммобилизация ssDNA на субстрате COC
Буфер печати, содержащий TexasRed-меченый или биотин-меченый ssDNA олигонуклеотид (40 нуклеотидов) или биотин-меченый, 1X PBS с 20% сахарозой и 15 мM бетаин, впечатывают на гамма-обработанный COC субстрат с помощью Scienion sciFLEXARRAYER S11 струйного принтера в закрытом окружении при комнатной температуре (21°C), и с относительной влажностью приблизительно 50%. После печати, субстраты держат в таком окружении в течение получаса, до того, как их переносят в инкубатор с температурой 37°C в течение ночи для сушки. На следующий день такие субстраты аккуратно промывают путем помещения их верхней стороной вниз в промывочную баню, содержащую промывочный буфер, в течение 1 минуты (0,5xPBS с 0,01% Tween20). Избыток жидкости удаляют путем аккуратного промакивания субстрата тканью, и субстрат помещают в сухую камеру в течение часа (комнатная температура, относительная влажность ~10%). Далее субстраты готовы для дальнейшего объединения и хранятся в герметичных упаковках при 4°C, с добавлением шариков диоксида кремния для поддержания влажности ниже 10% для минимизации конденсации.
Пример 2 - Анализ сандвич-гибридизации
Для исследования качества пятна, анализ сандвич-гибридизации проводили на субстрате с иммобилизованным меченым олигонуклеотидом. Вместе с магнитными частицами, мечеными матрицей, и с целевым олиго (растворенным в буферном растворе), проводили гибридизацию. Сандвич-гибридизацию облегчали путем воздействия на магнитные частицы магнитных импульсов в буферном растворе при определенной температуре (между 40°C и 60°C). Несвязанные магнитные частицы отмывали с помощью магнита. На фиг. 4 показано схематическое перекрестное сечение посредством субстрата с иммобилизованным TexasRed меченым олигонуклеотидом, с которым магнитные частицы гибридизованы посредством матрицы. В таком специфическом варианте осуществления изобретения олигонуклеотид включает спейсерный участок длиной 20 нт на 3ʹ-конце и участок длиной 20 нт, имеющий связывающую активность, на его 5ʹ-конце в отношении матрицы. Следовательно, зонд гибридизуется с иммобилизованным олигонуклеотидом и с магнитными частицами.
Пример 3 - Определение магнитных частиц
Связанные магнитные частицы визуализировали посредством нарушенного общего внутреннего отражения (f-TIR) с использованием CCD камеры. Направленный луч света из светоизлучающего диода (λ=625 нм) облучает сенсорную поверхность в состоянии внутреннего отражения. Так называемое преходящее оптическое поле создается на границе фаз субстрата/жидкости, которая разрушается экспоненциально и проникает в жидкость на расстояние субдлины волны. В отсутствие магнитных частиц свет не экстрагируется из рассеянного оптического поля (фиг. 1). Когда магнитные наночастицы присутствуют на поверхности сенсора, частицы абсорбируют и рассеивают часть света, таким образом нарушая общее внутреннее отражение и таким образом снижая интенсивность отраженного света (фиг. 2, фиг. 3). Поверхность субстрата визуализировали на камеру CCD.
СПИСОК ССЫЛОК:
Y. Sun et al, Anal. Bioanal. Chem. (2012) 402:741-748.
D. Sabourin et al, Biomed. Microdevices. (2010) 12:673-681.
N. Kimura, BBRC 347 (2006) 477-484.