КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ ПРОБИОТИКИ И ПОЛИПЕПТИД, ОБЛАДАЮЩИЙ АФФИННОСТЬЮ СВЯЗЫВАНИЯ В ОТНОШЕНИИ IGE, И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ
COMPOSITION CONTAINING PROBIOTICS AND POLYPEPTIDE HAVING BINDING AFFINITY RELATIVELY TO IgE AND ITS USE

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к композиции для лечения или предупреждения аллергического заболевания.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Пищевая аллергия представляет собой заболевание, вызываемое сниженной иммунологической резистентностью к непатогенным пищевым антигенам (аллергенам). Заболевание может приводить к снижению качества жизни вследствие ограничений питания и может быть угрожающим жизни в случае развития острой и хронической анафилаксии. Число аллергических заболеваний, таких как аллергический ринит и атопический дерматит, а также пищевая аллергия, растет с высокой скоростью в индустриализированных и европизированных современных обществах. Кроме того, также возрастает число случаев развития анафилаксии, тяжелой аллергической реакции. Эти иммунные заболевания значительно ухудшают качество жизни и социально-экономические затраты растут соответствующим образом. Таким образом, существует острая потребность в мерах по преодолению таких заболеваний.
Хотя пищевые аллергические заболевания могут развиваться посредством IgE-опосредуемого или не IgE-опосредуемого иммунного ответа, IgE-опосредуемая пищевая аллергия является наиболее распространенной. При IgE-опосредуемой пищевой аллергии аллергены связываются с IgE, и связанный с аллергеном IgE связывает FcεRI, высокоаффинный Fc-рецептор для IgE, на эффекторных клетках, таких как тучные клетки и базофилы, тем самым индуцируя активацию эффекторных клеток. В случае, когда эффекторные клетки активируются, модуляторы высвобождаются, тем самым вызывая гиперчувствительность немедленного типа. В дополнение к пищевым аллергическим заболеваниям, большинство аллергических заболеваний вызываются чрезмерным иммунным ответом вследствие иммуноглобулина E (IgE). IgE представляет собой антитело, которое обычно присутствует в сыворотке в очень низкой концентрации. IgE также продуцируется в результате воздействия безопасных антигенов. В случае, когда уровень IgE возрастает без какого-либо конкретного стимула, может возникать аллергическое заболевание. Аномально увеличенное количество IgE может связываться с высокоаффинными Fc-рецепторами IgE (FcεRI), которые экспрессируются на поверхности тучных клеток, базофилов и т.п.
Такое связывание между IgE и Fc-рецептором IgE вызывает высвобождение тучными клетками или базофилами химических медиаторов, таких как гистамин, лейкотриен, простагландин, брадикинин и активирующие тромбоциты факторы. Высвобождение этих химических медиаторов тучными клетками или базофилами приводит к аллергическим симптомам. В частности, более тяжелые аллергические симптомы могут присутствовать, когда IgE и FcεRI связываются друг с другом. Известно, что уровень FcεRI-эспрессирующих клеток возрастает у пациентов с аллергией.
Для лечения аллергических заболеваний были предложены различные способы, такие как избегание аллергена, введение противоаллергических средств, модулирование синтеза IgE в организме и разработка антител против IgE. Однако такие способы имеют множество недостатков, таких как неспособность вылечить основную причину аллергии, недостаточную эффективность лекарственных средств и возникновение серьезных побочных эффектов.
in vitro
in vitro
Между тем, исследован способ использования микроорганизмов, таких как молочнокислые бактерии, для лечения или смягчения аллергических заболеваний. Такие здоровые микроорганизмы называют пробиотиками. Однако способы выявления и оценки пробиотиков для иммунного контроля, такого как ингибирование аллергии, еще не разработаны. В частности, исследований основного механизма действия пробиотиков недостаточно и большинство из исследований проведено . Иными словами, хотя пробиотики принимают перорально, большинство испытаний до настоящего времени было сфокусировано на экспериментах  с использованием клеточных линий, и эти экспериментальные способы имеют существенный недостаток, состоящий в том, что невозможно предоставить замену испытаниям функций, которые могут демонстрироваться, когда человека принимает пробиотики.
The Journal of Clinical Investigation
Кроме того, проводили исследования композиций иммуноглобулинов для лечения аллергических заболеваний. Описано, что такие композиции являются пригодными для лечения IgE-опосредуемых нарушений, включая аллергию и астму (KR10-1783272B1). В частности, омализумаб (торговое наименование: Xolair), который нацелен на Fc-часть IgE-антитела, разработан и используется в качестве терапевтического средства против не поддающейся лечению тяжелой астмы и не поддающейся лечению крапивницы. Однако для поддержания эффекта требуется введение высокой дозы омализумаба. Таким образом, было описано, что омализумаб имеет высокую стоимость и побочные эффекты, такие как ангионевротический отек и анафилактическая реакция (, Volume 99, Number 5, March 1997, 915-925).
Хотя основной механизм, посредством которого омализумаб вызывает побочные эффекты, еще не идентифицирован, можно ожидать, что он вызван тем, что омализумаб представляет собой IgG1-антитело. Исследование в модели на мышах показало, что большое количество антигенспецифических IgG1-антител могут индуцировать пассивную системную анафилаксию (PSA) через FcγRIII, низкоаффинный рецептор IgG, и активирующие тромбоциты факторы в богатой антигенами среде. Кроме того, такая IgG-опосредуемая анафилаксия возникает в чрезмерной степени вследствие отсутствия передачи сигнала FcεRI. Таким образом, пассивная системная анафилаксия может возникать в случае, когда значительное количество омализумаба инъецируют пациенту с аллергическим заболеванием, который демонстрирует высокий уровень IgE. Недавно было описано, что FcγRIIA, низкоаффинный рецептор IgG, экспрессируемый у человека, также ассоциирован с IgG-опосредуемой анафилаксией. Кроме того, постмаркетинговые исследования показали аномальные реакции, такие как аллергический гранулематозный васкулит и идиопатическая тяжелая тромбоцитопения.
Техническая проблема
Хотя было проведено множество исследований аллергических заболеваний, способ значительного смягчения аллергических заболеваний еще не разработан. Задачей настоящего изобретения является предоставление композиции для лечения или предупреждения таких аллергических заболеваний.
Решение проблемы
Согласно одному аспекту настоящего изобретения, предусматривается композиция, содержащая в качестве активных ингредиентов пробиотики и полипептид, обладающий способностью связываться с IgE.
В другом аспекте предусматривается фармацевтическая композиция для лечения или предупреждения аллергического заболевания, содержащая указанную композицию в качестве активного ингредиента. В другом аспекте предусматривается диетическая функциональная пищевая композиция для смягчения или облегчения симптома аллергии, содержащая указанную композицию в качестве активного ингредиента.
В другом аспекте предусматривается набор для лечения или предупреждения аллергического заболевания, содержащий первую композицию, которая содержит пробиотики, и вторую композицию, которая содержит полипептид, обладающий способностью связываться с IgE.
Преимущественные эффекты изобретения
in vivo
Композиция, содержащая в качестве активных ингредиентов пробиотики и полипептид, обладающий способностью связываться с IgE, в соответствии с настоящим изобретением, демонстрирует превосходный эффект смягчения аллергии . Таким образом, композицию можно использовать в качестве фармацевтической композиции для лечения или предупреждения тяжелого аллергического заболевания. Более того, с точки зрения того, что композицию по настоящему изобретению можно применять для пероральной иммунотерапии, композиция может быть не только более эффективной при пищевой аллергии при одновременном снижении побочных эффектов, но также может быть идеальной для лечения детей, страдающих от IgE-опосредуемой аллергии. Таким образом, композицию можно использовать в качестве диетического функционального продукта питания для смягчения или ослабления симптома аллергии.
Краткое описание чертежей
TRAP
TRAP
На фиг. 1 проиллюстрирована схематическая диаграмма строения мономера, являющегося вариантом осуществления (IgE) полипептидного димера по настоящему изобретению. Вариант осуществления IgEможет состоять из 425 аминокислот FcεRIα человека (область от 26-й аминокислоты до 205-й аминокислоты во внеклеточном домене FcεRIα, 180 а.к.) и гибридного Fc IgD/IgG4 (245 аминокислот). Гибридный Fc IgD/IgG4 имеет FcRn-связывающий участок (правая штриховая линия), но лишен участков связывания для FcγR и C1q (левая штриховая линия). Здесь, IgD может представлять собой область (38 а.к.) от 133-й аминокислоты до 170-йаминокислоты, и IgG4 может представлять собой область (207 а.к.) от 121-й аминокислоты до 327-й аминокислоты.
TRAP
На фиг. 2 проиллюстрирована трехмерная структурная модель гомодимера IgE. Структура демонстрирует внеклеточный домен FcεRIα (синий), шарнирную область IgD (желтый) и Fc IgG4 (зеленый).
На фиг. 3 проиллюстрированы результаты SDS-PAGE для полипептидов, обладающих способностью связываться с IgE, продуцированным в каждой клеточной линии (фиг.3A). Здесь можно видеть, что укороченная форма не образуется ни в восстанавливающих условиях, ни в не восстанавливающих условиях (фиг. 3A и 3B).
На фиг. 4 проиллюстрированы результаты экспериментов по изоэлектрическому фокусированию (GEL-IEF), проведенные для идентификации повышения содержания сиаловых кислот в полипептидах, обладающих способностью связываться с IgE, который продуцировался в каждой клеточной линии. Содержание белков с пониженной основной изоэлектрической точкой (pI) возрастает вследствие увеличения содержания отрицательно заряженной сиаловой кислоты, вызванного введением гена трансферазы сиаловых кислот. На основании этого, можно видеть, что содержание кислых белков возрастает посредством добавления трансферазы сиаловых кислот.
TRAP
На фиг. 5 проиллюстрированы результаты SDS-PAGE для не восстановленных и восстановленных форм полипептидного димерного белка (IgE) в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения. В частности, можно видеть, что полипептидный димер обладает высокой чистотой даже в культуральном супернатанте, который соответствует материалу на входе.
TRAP
На фиг. 6 проиллюстрированы результаты, полученные путем проведения анализа SDS-PAGE для IgE в условиях с восстановлением и без восстановления.
На фиг. 7 проиллюстрирован график, демонстрирующий способность связывания омализумаба с IgE. На графике показаны результаты, полученные путем иммобилизации омализумаба и анализа его связывающей способности в зависимости от использованных концентраций IgE. Взаимодействие между IgE человека и омализумабом анализировали с использованием поверхностного плазмонного резонанса (SPR) и вычисляли аффинность связывания каждой молекулы.
TRAP
TRAP
TRAP
На фиг. 8 проиллюстрирован график, демонстрирующий способность связывания с IgE полипептидного димерного белка (IgE) в соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения. На графике показаны результаты, полученные путем иммобилизации IgE и анализа его способности к связыванию в зависимости от используемых концентраций IgE. Взаимодействие между IgE и IgE анализировали с использованием поверхностного плазмонного резонанса (SPR) и вычисляли аффинность связывания каждой молекулы.
TRAP
На фиг. 9-13 проиллюстрированы результаты, полученные путем идентификации взаимодействий димерного белка (IgE), являющегося вариантом осуществления настоящего изобретения, и омализумаба с IgG-рецепторами FcγRI (фиг.9), FcγRIIA (фиг.10), FcγRIIB (фиг.11), FcγRIIIA (фиг.12) и FcγRIIIB (фиг.13) с использованием анализа на основе биослойной интерферометрии (BLI).
TRAP
На фиг. 14 проиллюстрирован график, полученный путем количественного определения связывающей способности между IgE и рецепторами IgG, и между омализумабом и рецепторами IgG.
TRAP
На фиг. 15A проиллюстрирован график, демонстрирующий ингибиторную способность в отношении активности происходящих из мыши тучных клеток полипептидного димерного белка (IgE) в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения в зависимости от его концентраций.
TRAP
На фиг. 15B проиллюстрирован график, демонстрирующий сравнение между ингибиторной способностью в отношении активности экспрессирующих FcεRI человека происходящих из мыши тучных клеток полипептидного димерного белка (IgE) согласно варианту осуществления настоящего изобретения и Xolair (омализумаб) в зависимости от их концентрации.
На фиг.16 проиллюстрирована эффективность полипептидного димерного белка в соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения в модели индуцированного пищевой аллергией заболевания.
TRAP
B. longum
На фиг. 17 проиллюстрирована схема эксперимента для индукции пищевой аллергии и терапии IgE,  и комбинированной терапии. в/б, внутрибрюшинный путь; в/ж, внутрижелудочный путь.
TRAP
TRAP
TRAP
B. longum
*P
B. longum
***P
На фиг. 18 проиллюстрирована эффективность IgE,  и комбинированной терапии в отношении ингибирования симптомов индуцированной аллергией диареи. n=16-18 мышей на группу, OVA против OVA+IgE:  < 0,05, OVA против OVA++IgE и OVA против PBS:  < 0,0001.
B. longum
B. longum
TRAP
TRAP
На фиг. 19A проиллюстрирован план эксперимента для идентификации того, что  улучшает терапевтические эффекты IgE. В частности, показан план эксперимента по индукции пищевой аллергии и однократному и комбинированному введению IgE и . в/б, внутрибрюшинный путь; в/ж, внутрижелудочный путь.
TRAP
TRAP
TRAP
TRAP
B. longum
B. longum
B. longum
**P
На фиг. 19B проиллюстрирован график, полученный путем идентификации эффектов комбинированного введения пробиотиков и полипептидного димерного белка (IgE), обладающего способностью связывания с IgE, в зависимости от увеличения доз в модели индуцированного пищевой аллергией заболевания. Показаны эффекты IgE,  и их комбинации в отношении ингибирования диареи, обусловленной пищевой аллергией. n=14 мышей на группу, OVA против OVA++IgE(20 мкг), OVA против OVA++IgE(200 мкг), и OVA против PBS:  < 0,001.
TRAP
B. longum
На фиг. 20 проиллюстрированы результаты, полученные путем анализа ELISA уровней протеазы-1 тучных клеток (MCPT-1) в сыворотках, полученных от соответствующих экспериментальных групп, при введении IgE,  и их комбинации в модели индуцированного пищевой аллергией заболевания.
TRAP
TRAP
TRAP
TRAP
B. longum
B. longum
***P
На фиг. 21 проиллюстрированы результаты, полученные путем измерения с использованием ELISA общих уровней IgE (свободный IgE и комплекс IgE-IgE) в сыворотке, полученной от соответствующих экспериментальных групп во время введения IgE,  и их комбинаций, в модели индуцированного пищевой аллергией заболевания. n=16-18 мышей на группу, OVA против OVA+IgE, OVA против OVA++IgE, и OVA против PBS:  < 0,0001.
TRAP
TRAP
TRAP
B. longum
B. longum
***P
На фиг. 22 проиллюстрированы результаты, полученные путем измерения с использованием ELISA уровней свободного IgE в сыворотке, полученной от соответствующих экспериментальных групп, при введении IgE,  и их комбинации в модели индуцированного пищевой аллергией заболевания. n=16-18 мышей на группу, OVA против OVA+IgE, OVA против OVA++IgE, и OVA против PBS:  < 0,0001.
TRAP
B. longum
На фиг. 23 проиллюстрированы результаты, полученные путем идентификации ингибиторных эффектов на пролиферацию тучных клеток и пролиферацию бокаловидных клеток в соответствующих экспериментальных группах при введении IgE,  и их комбинации в модели индуцированного пищевой аллергией заболевания. Представлены результаты, полученные путем окрашивания тучных клеток (красный) в соответствующих парафиновых срезах тощей кишки соответствующих экспериментальных групп (увеличение 400x). Увеличение тощей кишки явно демонстрирует тучные клетки (красный).
B. longum
**P
B. longum
***P
TRAP
TRAP
На фиг. 24 проиллюстрированы результаты, полученные путем увеличения тучных клеток в 400 раз на фиг.23 и идентификации тучных клеток. n=10-12 мышей на группу, OVA против , и OVA против IgE:  < 0,001, OVA против OVA++IgE, и OVA против PBS:  < 0,0001.
TRAP
B. longum
На фиг. 25 проиллюстрированы результаты, полученные путем идентификации ингибиторных эффектов на пролиферацию тучных клеток и пролиферацию бокаловидных клеток в соответствующих экспериментальных группах при введении IgE,  и их комбинаций в модели индуцированного пищевой аллергией заболевания. Представлены результаты, полученные путем окрашивания бокаловидных клеток для идентификации в соответствующих парафиновых срезах тощей кишки в соответствующих экспериментальных группах (фиолетовый, увеличение 400x).
B. longum
*P
B. longum
***P
TRAP
TRAP
На фиг. 26 проиллюстрированы результаты, полученные путем случайного отбора бокаловидных клеток из элементов ворсинка-крипта (VCU) на фиг.25 и подсчета для 10 VCU. n=5-6 мышей на группу, OVA против , и OVA против IgE:  < 0,05, OVA против OVA++IgE, и OVA против PBS:  < 0,0001.
B. longum
B. longum
B. longum
TRAP
TRAP
TRAP
На фиг. 27 проиллюстрирована схематическая диаграмма механизма ингибирования пищевой аллергии, вызванной посредством комбинированной терапии  и IgE. Проглоченные пищевые аллергены могут индуцировать активацию эффекторных клеток (тучные клетки и базофилы) путем связывания IgE с высокоаффинным рецептором Fc IgE (FcεRI) на эффекторных клетках. Активированные эффекторные клетки высвобождают модуляторы, тем самым вызывая реакцию немедленной гиперчувствительности. индуцирует апоптоз тучных клеток посредством секреции внеклеточных везикул (EV), который снижает количество тучных клеток. Между тем, IgE может блокировать связывание IgE с FcεRI на эффекторных клетках и, таким образом, ингибировать активацию и пролиферацию эффекторных клеток. Комбинированное введение и IgE сделало возможным эффективно смягчать симптомы пищевой аллергии и гиперплазии бокаловидных клеток.
B. longum
B. longum
B. longum
*P
TRAP
TRAP
TRAP
На фиг. 28 проиллюстрирован график, полученный путем идентификации изменений экспрессии IL-33 в ткани кишечника после введения  и IgE. Введение  и IgE снижало экспрессию мРНК IL-33 в тощей кишке мышей в модели пищевой аллергии. n=16-18 мышей на группу, OVA против OVA++IgE:  < 0,05.
TRAP
L. casei
На фиг. 29 проиллюстрирован график, полученный путем идентификации частоты диареи после внутрибрюшинной инъекции IgE и . n=7-10 мышей на группу
TRAP
Lc. lactis
На фиг. 30 проиллюстрирован график, полученный путем идентификации частоты диареи после внутрибрюшинной инъекции IgE и . n=5 мышей на группу.
TRAP
S. thermophilus
На фиг. 31 проиллюстрирован график, полученный путем идентификации частоты диареи после внутрибрюшинной инъекции IgE и . n=6-10 мышей на группу.
TRAP
L. rhamnosus
На фиг. 32 проиллюстрирован график, полученный путем идентификации частоты диареи после внутрибрюшинной инъекции IgE и . n=5-10 мышей на группу.
TRAP
L. reuteri
На фиг. 33 проиллюстрирован график, полученный путем идентификации частоты диареи после внутрибрюшинной инъекции IgE и . n=5-10 мышей на группу.
TRAP
L. fermentum
На фиг. 34 проиллюстрирован график, полученный путем идентификации частоты диареи после внутрибрюшинной инъекции IgE и . n=7-10 мышей на группу.
TRAP
TRAP
На фиг. 35 проиллюстрирован график, полученный путем перорального введения IgE нормальным мышам, а затем идентификации IgE, адсорбированного в сыворотке мышей.
Подробное описание изобретения
В одном аспекте настоящего изобретения предусматривается композиция, содержащая в качестве активных ингредиентов пробиотики и полипептид, обладающий способностью связываться с IgE.
Как используют в рамках изобретения, термин "пробиотики" в обобщенном смысле относится к микроорганизмам, которые являются благоприятными для организма человека в случае их проглатывания в надлежащем количестве, указывая на бактерии, полезные для организма человека. Пробиотики могут представлять собой молочнокислые бактерии или бифидобактерии. Молочнокислые бактерии в общем относятся к бактериям, которые сбраживают сахар, продуцируя молочную кислоту. Большинство полезных бактерий кишечника классифицируют как молочнокислые бактерии, и молочнокислые бактерии могут деградировать сахара, из 50% или более которых продуцируется молочная кислота.
Lactobacillus
Lactococcus
Enterococcus
Streptococcus
Lactobacillus
L. acidophilus
L. casei
L. gasseri
L. delbrueckii ssp. bulgaricus
L. helveticus
L. fermentum
L. paracasei
L. plantarum
L. reuteri
L. rhamnosus
L. pentosus
L. salivarius
Lactococcus
Lc. lactis
Streptococcus
S. themophilus
B. bifidum
B. breve
B. longum
B. animalis ssp. lactis
Молочнокислые бактерии могут представлять собой любые бактерии, выбранные из группы, состоящей из , ,  и . В частности,  могут представлять собой любые бактерии, выбранные из группы, состоящей из ,,,,,,,,,, и . Кроме того,  могут представлять собой , и  могут представлять собой . Кроме того, бифидобактерии могут представлять собой любые бактерии, выбранные из группы, состоящей из ,, и .
Lactobacillus casei
Bifidobacterium longum
Bifidobacterium longum
Lactobacillus casei
Bifidobacterium longum
Bifidobacterium longum
Предпочтительно, пробиотики могут представлять собой  или . В частности,  могут иметь номер доступа № KACC 91563 (KR10-1778734B1). В частности, штамм KACC 91563 нацелен на тучные клетки, которые являются важными клетками в аллергических реакциях, и, таким образом, его можно использовать в качестве молочнокислых бактерий для лечения аллергии. Как правило, пробиотики можно использовать в форме живых бактерий, где живые бактерии могут использоваться в лиофилизированной форме. Кроме того, пробиотики можно использовать в форме убитых бактерий. Предпочтительно, пробиотики могут представлять собой  или . В частности,  могут иметь номер доступа № KACC 91563 (KR10-1778734B1). В частности, штамм KACC 91563 нацелен на тучные клетки, которые являются важными клетками в аллергических реакциях, и, таким образом, его можно использовать в качестве молочнокислых бактерий для лечения аллергии. Как правило, пробиотики можно использовать в форме живых бактерий, где живые бактерии могут использоваться в лиофилизированной форме. Кроме того, пробиотики можно использовать в форме убитых бактерий.
Как используют в рамках изобретения, термин "полипептид, обладающий способностью связывать IgE," означает полипептид, способный связываться с IgE. Как используют в рамках изобретения, термин "IgE" означает антительный белок, известный как иммуноглобулин E. IgE обладает аффинностью к тучным клеткам, базофилам крови и т.п. Кроме того, реакция между IgE-антителом и антигеном (аллергеном), соответствующим ему, вызывает воспалительную реакцию. Кроме того, известно, что IgE является антителом, которое вызывает анафилаксию.
В частности, полипептид, обладающий способностью связываться с IgE, может представлять собой любой из рекомбинантных белков, включающих антитело против IgE, Fc-рецептор IgE, внеклеточный домен альфа-субъединицы Fc-рецептора IgE, фрагмент внеклеточного домена альфа-субъединицы Fc-рецептора IgE, и внеклеточный домен альфа-субъединицы Fc-рецептора IgE или его фрагмент.
2
В рамках настоящей заявки антитело против IgE означает антитело, способное распознавать IgE в качестве антигена и связывать IgE. В рамках настоящей заявки, фрагмент антитела против IgE может представлять собой любой фрагмент, выбранный из группы, состоящей из Fab, scFv, F(ab) и Fv, при условии, что фрагмент может связываться с IgE. Фрагменты антител означают антигенсвязывающие домены, не включая кристаллизующуюся область (Fc-область), которая выполняет функцию (эффекторную функцию) переноса на клетку или комплемент стимула в результате связывания с антигеном. Вариантом осуществления антитела против IgE может быть омализумаб.
Как используют в рамках изобретения, термин "Fc-рецептор IgE" также называют Fcε-рецептором, и он связывается с Fc-частью IgE. Существует два типа этого рецептора. Рецептор, обладающий высокой аффинностью к Fc IgE, называют Fcε-рецептором I (FcεRI). Рецептор, обладающий низкой аффинностью к Fc IgE, называют Fcε-рецептором II (FcεRII). FcεRI экспрессируется в тучных клетках и базофилах. В случае, когда IgE-антитела, связанные с FcεRI, связываются поливалентными антигенами, происходит дегрануляция тучных клеток или базофилов, тем самым высвобождая различные химические вещества-переносчики, включая гистамин. Это высвобождение приводит к немедленной аллергической реакции.
FcεRI представляет собой мембранный белок, состоящий из одной α-цепи, одной β-цепи и двух γ-цепей, связанных дисульфидной связью. Среди этих цепей часть, с которой связывается IgE, представляет собой α-цепь (FcεRIα), и FcεRIα имеет размер приблизительно 60 кДа. FcεRIα состоит из гидрофобного домена, существующего внутри клеточной мембраны, и гидрофильного домена, существующего снаружи клеточной мембраны. В частности, IgE связывается с внеклеточным доменом α-цепи.
В частности, альфа-субъединица Fc-рецептора IgE может иметь аминокислотную последовательность, указанную в NP_001992.1. Кроме того, внеклеточный домен (FcεRIaECD) альфа-субъединицы Fc-рецептора IgE может иметь аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1. В настоящей заявке внеклеточный домен альфа-субъединицы Fc-рецептора IgE может представлять собой фрагмент или вариант внеклеточного домена альфа-субъединицы Fc-рецептора IgE при условии, что фрагмент или вариант способен связываться с IgE.
Получение варианта можно осуществлять способом замены, делеции или вставки одного или нескольких белков в FcεRIaECD дикого типа (внеклеточный домен) при условии, что способ не изменяет функцию α-цепи FcεRI. Такие различные белки или пептиды могут быть на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичными аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1. Кроме того, FcεRIaECD SEQ ID NO: 1 может кодироваться полинуклеотидом, имеющим последовательность SEQ ID NO: 5.
Таким образом, сам по себе внеклеточный домен альфа-субъединицы Fc-рецептора IgE или фрагмент внеклеточного домена альфа-субъединицы Fc-рецептора IgE можно использовать в качестве полипептида, обладающего способностью связываться с IgE. Вариант осуществления фрагмента внеклеточного домена может иметь форму, в которой некоторые из аминокислот на N-конце внеклеточного домена альфа-субъединицы Fc-рецептора IgE удалены. В некоторых вариантах осуществления фрагмент внеклеточного домена может представлять собой фрагмент, в котором удалено 1-30 аминокислот на N-конце. Кроме того, фрагмент внеклеточного домена может представлять собой фрагмент, в котором удалены 5-25 аминокислот на N-конце. Кроме того, фрагмент внеклеточного домена может иметь форму, в которой удалены 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот на N-конце. Кроме того, вариант осуществления фрагмента внеклеточного домена может быть в форме, в которой некоторые из аминокислот на C-конце внеклеточного домена альфа-субъединицы Fc-рецептора IgE удалены. В одном варианте осуществления фрагмент внеклеточного домена может представлять собой фрагмент, в котором удалены 1-30 аминокислот на C-конце. Кроме того, фрагмент внеклеточного домена может представлять собой фрагмент, в котором удалено 5-25 аминокислот на C-конце. Кроме того, фрагмент внеклеточного домена может иметь форму, в которой удалены 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот на C-конце. Кроме того, вариант осуществления фрагмента внеклеточного домена может иметь форму, в которой некоторые из аминокислот на N-конце и C-конце внеклеточного домена альфа-субъединицы Fc-рецептора IgE удалены. В одном варианте осуществления фрагмент внеклеточного домена может иметь форму, в которой удалены 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот, соответственно, на N-конце и C-конце.
Однако внеклеточный домен альфа-субъединицы рецептора IgE дикого типа или его фрагмент плохо удерживается в организме. Для улучшения этого удержания внеклеточный домен альфа-субъединицы рецептора IgE или его фрагмент можно модифицировать различными способами. В качестве одного варианта осуществления способа модификации с ним можно связывать полиэтиленгликоль (ПЭГ). В качестве другого варианта осуществления способа модификации с ним можно связывать Fc-область иммуноглобулина. В данном случае, в дополнение к нативной форме Fc иммуноглобулина можно использовать модифицированную Fc-область.
Кроме того, как используют в рамках изобретения, термин "модифицированная Fc-область" означает область, в которой часть Fc-области антитела модифицирована. В рамках настоящей заявки термин "Fc-область" относится к белку, который содержит константную область тяжелой цепи 2 (CH2) и константную область тяжелой цепи 3 (CH3) иммуноглобулина, и не содержит вариабельные области тяжелой и легкой цепей и константную область легкой цепи 1 (CH1) иммуноглобулина. В частности, модифицированная Fc-область означает область, полученную путем замены некоторых аминокислот в Fc-области или путем комбинирования различных типов Fc-областей. В частности, модифицированная Fc-область может иметь аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. Кроме того, модифицированная Fc-область SEQ ID NO: 2 может кодироваться полинуклеотидом, имеющим последовательность SEQ ID NO: 6.
Кроме того, модифицированная Fc-область по настоящему изобретению может иметь форму, имеющую цепи сахаров в нативной форме, увеличенное количество цепей сахаров относительно нативной формы или уменьшенное количество цепей сахаров относительно нативной форме, или она может быть в форме, из которой удалена цепь сахаров. Цепи сахаров Fc иммуноглобулинов можно модифицировать общепринятыми способами, такими как химические способы, ферментативные способы и способы генной инженерии с использованием микроорганизмов.
В рамках настоящей заявки модифицированная Fc-область по настоящему изобретению может представлять собой область, которая лишена функций антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) и комплементзависимой цитотоксичности (CDC) вследствие отсутствия участков связывания для FcγR или C1q.
Кроме того, FcεRIα-ECD или его фрагмент может быть связан с областью Fc дикого типа или модифицированной Fc-областью через линкер. Линкер может состоять из 20-60 последовательно расположенных аминокислот, 25-50 последовательно расположенных аминокислот или 30-40 аминокислот. В одном варианте осуществления линкер может состоять из 30 или 49 аминокислот, как показано ниже. Также линкер может содержать по меньшей мере один остаток цистеина. В частности, линкер может содержать один, два или три остатка цистеина. Предпочтительно, линкер содержит один остаток цистеина. В одном варианте осуществления линкер может представлять собой шарнирную область, происходящую из IgD-антитела. Кроме того, линкер может представлять собой вариант шарнирной области, полученный путем модификации шарнирной области IgD-антитела. Вариант шарнирной области может быть получен путем модификации некоторых остатков в последовательности шарнирной области IgD-антитела для минимизации образования укороченных форм в ходе процесса продуцирования белка.
В одном варианте осуществления шарнирная область может содержать следующую последовательность:
Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Xaa1 Xaa2 Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro (SEQ ID NO: 17), где Xaa1 может представлять собой Lys или Gly, и Xaa2 может представлять собой Glu, Gly или Ser. В частности, линкер может иметь аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 19, тем самым минимизируя образование укороченных форм в процессе продуцирования белка.
В другом варианте осуществления шарнирная область может содержать следующую последовательность:
Ala Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Xaa3 Xaa4 Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro (SEQ ID NO: 18), где Xaa3 может представлять собой Lys или Gly, и Xaa4 может представлять собой Glu, Gly или Ser. В частности, линкер может иметь аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, тем самым минимизируя образование укороченных форм в ходе продуцирования белка.
В частности, в линкере, имеющем аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, по меньшей мере один из Thr может быть гликозилирован. В частности, среди аминокислот SEQ ID NO: 18, 13-й, 14-й, 18-й и 19-й Thr могут быть гликозилированными. Предпочтительно, все четыре аминокислоты могут быть гликозилированными. В рамках настоящей заявки гликозилирование может представлять собой O-гликозилирование.
TRAP
TRAP
TRAP
TRAP
TRAP
IgE, который является вариантом осуществления полипептида, обладающего способностью связываться с IgE по настоящему изобретению, означает Fc-слитый белок из внеклеточного домена FcεRIα и гибридного Fc-домена IgD/IgG4. Fc-рецептор IgE FcεR состоит из α-цепи, β-цепи и двух идентичных связанных дисульфидной связью γ-цепей. FcεRIβ и FcεRIγ не имеют внеклеточного домена. Однако FcεRIα имеет два внеклеточных родственных иммуноглобулину домена и вовлечен в связывание IgE. Таким образом, для получения более безопасного и эффективного ингибитора IgE внеклеточный домен FcεRIα человека связывали с гибридным Fc-доменом IgD/IgG4 человека (фиг. 1 и 2) с получением IgE. В отличие от омализумаба, IgE не связывается с рецепторами IgG и, вероятно, будет снижать риск IgG-опосредуемой анафилаксии (фиг. 9-13). Кроме того, IgE обладает аффинностью к IgE, которая в 69 раз превышает аффинность омализумаба. Таким образом, IgE может быть более безопасным и эффективным, чем омализумаб, в качестве терапевтического средства против пищевой аллергии.
TRAP
Полипептид, обладающий способностью связываться с IgE, служит для блокирования связывания между FcεRIα на эффекторных клетках и IgE. Гибридный Fc IgD/IgG4 человека содержит верхний CH2-домен IgD и последние CH2- и CH3-домены IgG4, которые не имеют участка связывания для FcγR или C1q (фиг.1). Однако этот гибридный Fc может иметь участок связывания для неонатального Fc-рецептора (фиг.1). Кроме того, теоретическая молекулярная масса IgE в гомодимерной форме составляет приблизительно 97,6 кДа. Однако его истинная молекулярная масса составляет приблизительно 150 кДа вследствие гликозилирования (фиг.6).
Полипептидный димерный белок, обладающий способностью связываться с IgE, в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения, не только обладает превосходной безопасностью и удержанием в организме по сравнению с традиционно используемыми антителами против IgE, но также очень сильно связывается с IgE вследствие наличия способности связываться с IgE, которая приблизительно в 70 раз выше, чем у традиционно используемого антитела против IgE омализумаба, что позволяет более длительный курс введения. Кроме того, полипептидный димерный белок в соответствии с настоящим изобретением представляет собой вещество, полученное с использованием модифицированного Fc, который имеет только IgE в качестве единственной мишени и не связывается с рецептором Fc-гамма, и, таким образом, лишен функций антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) и комплементзависимой цитотоксичности (CDC). Таким образом, в отличие от общепринятых антител против IgE, содержащих Fc-область IgG1, полипептидный димерный белок не связывается с рецептором Fc-гамма и, таким образом, может ингибировать высвобождение медиаторов, вызываемое связыванием с рецептором Fc-гамма на поверхности тучных клеток. Таким образом, полипептид, обладающий способностью связываться с IgE по настоящему изобретению, может минимизировать тяжелые побочные эффекты, такие как возникновение анафилаксии, которое может быть вызвано связыванием между IgG1 и рецептором Fc-гамма III на тучных клетках. Таким образом, полипептидный димерный белок в соответствии с настоящим изобретением можно использовать в качестве новой фармацевтической композиции, которая может заменить терапевтические средства, содержащие общепринятое антитело против IgE.
Кроме того, вариант осуществления полипептида, обладающего способностью связываться с IgE, который предусматривается в рамках настоящего изобретения, может иметь форму мономера. В частности, в случае, когда не используют цистеин в линкере, полипептид может иметь мономерную форму.
Кроме того, вариант осуществления полипептида, обладающего способностью связываться с IgE, который предусматривается в рамках настоящего изобретения, может представлять собой полипептидный димер. Здесь, как описано выше, полипептидный димер может иметь форму, в которой два мономера связаны друг с другом и каждый мономер получен путем связывания между внеклеточным доменом альфа-субъединицы Fc-рецептора IgE и модифицированной Fc-областью. Полипептидный димер может иметь форму, в которой два одинаковых мономера связаны друг с другом посредством цистеина, находящегося в линкерной области. Кроме того, полипептидный димер может иметь форму, в которой два различных мономера связаны друг с другом. Например, в случае, когда два мономера отличаются друг от друга, полипептидный димер может иметь форму, в которой один мономер содержит внеклеточный домен альфа-субъединицы Fc-рецептора IgE, а другой мономер содержит фрагмент внеклеточного домена альфа-субъединицы Fc-рецептора IgE. В рамках настоящей заявки вариант осуществления мономера может иметь аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 или SEQ ID NO: 22.
В другом аспекте настоящего изобретения предусматривается фармацевтическая композиция для лечения или предупреждения аллергического заболевания, содержащая композицию, которая содержит в качестве активных ингредиентов пробиотики и полипептид, обладающий способностью связываться с IgE.
5
12
6
11
7
10
9
9
Пробиотики и полипептид, обладающий способностью связываться с IgE, являются такими, как описано выше. Смешиваемое количество пробиотиков и полипептида, обладающего способностью связываться с IgE, в композиции можно определять соответствующим образом. В одном варианте осуществления пробиотики в композиции могут содержаться в количестве от 1×10 к.о.е. до 1×10 к.о.е. Альтернативно пробиотики в композиции могут содержаться в количестве от 1×10 к.о.е. до 1×10 к.о.е., от 1×10 к.о.е. до 1×10 к.о.е., или от 1×10 к.о.е. до 5×10 к.о.е. Кроме того, полипептид, обладающий способностью связываться с IgE, может содержаться в количестве, но не ограничиваясь этим, от 0,1 мкг до 5 мг, от 0,5 мкг до 1 мг, от 1 мкг до 500 мкг, от 10 мкг до 400 мкг, или от 200 мкг до 300 мкг. Кроме того, соотношение смешения пробиотиков и полипептида, обладающего способностью связываться с IgE в композиции, можно надлежащим образом изменять.
В настоящем описании "аллергическое заболевание" означает патологический симптом, вызванный аллергической реакцией, опосредуемой активацией тучных клеток, такой как дегрануляция тучных клеток. Такие аллергические заболевания включают пищевую аллергию, атопический дерматит, астму, аллергический ринит, аллергический конъюнктивит, аллергический дерматит, аллергический контактный дерматит, анафилаксию, крапивницу, зуд, аллергию на укусы насекомых, хроническую идиопатическую крапивницу, аллергию на лекарственные средства и т.п. В частности, аллергические заболевания могут быть IgE-опосредуемыми.
TRAP
TRAP
TRAP
B. longum
В одном варианте осуществления настоящего изобретения полипептид, обладающий способностью связываться с IgE, который содержит внеклеточный домен FcεRIα, блокирует связывание IgE с FcεRI на эффекторных клетках через его связывание с IgE, и, таким образом, он может быть обозначен как IgE. Кроме того, было идентифицировано, что  могут улучшать терапевтический эффект IgE и значительно снижать дозу IgE, требуемую для лечения.
В композиции для лечения или предупреждения аллергического заболевания по настоящему изобретению, активный ингредиент может содержаться в любом количестве (эффективное количество) в зависимости от применения, состава, цели смешивания и т.п., при условии, что активный ингредиент может демонстрировать противоаллергическую активность. Типичное эффективное количество активного ингредиента может находиться в диапазоне от 0,001% по массе до 20,0% по массе в расчете на общую массу композиции. В настоящем описании "эффективное количество" относится к количеству активного ингредиента, которое способно индуцировать антиаллергический эффект. Такое эффективное количество может определить экспериментально специалист в данной области.
В рамках настоящего изобретения фармацевтическая композиция, кроме того, может содержать фармацевтически приемлемый носитель. В качестве фармацевтически приемлемого носителя может использоваться любой носитель при условии, что носитель представляет собой нетоксичное вещество, пригодное для доставки пациенту. В качестве носителей могут содержаться дистиллированная вода, спирт, жир, воск и инертное твердое вещество. Также в фармацевтической композиции могут содержаться фармакологически приемлемые адъюванты (буферы и диспергирующие вещества). В частности, можно использовать любой фармацевтически приемлемый состав при условии, что пробиотики и полипептид, обладающие способностью связываться с IgE, могут сохранять их стабильность в составе.
В частности, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению содержит, в дополнение к активным ингредиентам, фармацевтически приемлемый носитель, и она может быть изготовлена в форме перорального или парентерального состава в зависимости от пути введения общепринятым способом, известным в данной области. В рамках настоящей заявки, термин "фармацевтически приемлемый" означает имеющий не более высокую токсичность, чем может переноситься индивидуумом, который будет применять (которому будет назначено) средство, без ингибирования активности активного ингредиента.
В случае, когда фармацевтическую композицию по настоящему изобретению изготавливают в форме перорального состава, фармацевтическая композиция может быть изготовлена в форме составов, таких как порошки, гранулы, таблетки, пилюли, таблетки с сахарным покрытием, капсулы, жидкости, гели, сиропы, суспензии и вафли, вместе с подходящими носителями, в соответствии со способами, известными в данной области. В рамках настоящего изобретения, примеры подходящих фармацевтически приемлемых носителей могут включать сахара, такие как лактоза, глюкоза, сахароза, декстроза, сорбит, маннит и ксилит, крахмалы, такие как кукурузный крахмал, картофельный крахмал и пшеничный крахмал, целлюлозы, такие как целлюлоза, метилцеллюлоза, этилцеллюлоза, натрий карбоксиметилцеллюлоза, и гидроксипропилметилцеллюлоза, поливинилпирролидон, вода, метилгидроксибензоат, пропилгидроксибензоат, стеарат магния, минеральное масло, солод, желатин, тальк, полиол, растительное масло и т.п. В случае изготовления в виде препаратов, получение можно проводить, при необходимости, путем включения разбавителей и/или эксципиентов, таких как наполнитель, сухой разбавитель, связующее вещество, смачивающее вещество, разрыхлитель и поверхностно-активное вещество.
В случае, когда фармацевтическая композиция по настоящему изобретению изготовлена в виде парентерального состава, фармацевтическая композиция может быть изготовлена в виде препаратов в форме инъекций, трансдермальных лекарственных средств, назальных ингаляторов и суппозиториев, вместе с подходящими носителями, в соответствии со способами, известными в данной области. В случае получения в виде инъекций, в качестве подходящего носителя можно использовать стерилизованную воду, этанол, полиол, такой как глицерин и пропиленгликоль, или их смесь. В качестве носителя предпочтительно можно использовать изотонические растворы, такие как раствор Рингера, фосфатно-солевой буфер (PBS), содержащий триэтаноламин, стерильную воду для инъекций и 5% декстрозу, и т.п.
Получение фармацевтической композиции известно в данной области, и, в частности, может быть упомянут Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995) и т.п. Этот документ считается частью настоящего описания.
Предпочтительная суточная дозировка фармацевтической композиции по настоящему изобретению находится в диапазоне от 0,01 мкг/кг до 10 г/кг, и предпочтительно от 0,01 мг/кг до 1 г/кг, в зависимости от состояния пациента, массы тела, пола, возраста, тяжести заболевания или пути введения. Введение можно проводить один раз или несколько раз в сутки. Такую дозировку никоим образом не следует интерпретировать как ограничивающую объем настоящего изобретения.
Bifidobacterium longum
Индивидуумом, у которого может применяться (может быть назначена) композиция по настоящему изобретению, является млекопитающее и человек, причем особенно предпочтительным является человек. Композиция против аллергии по настоящему изобретению, кроме того, может содержать, в дополнение к активному ингредиенту, любое соединение или природный экстракт, для которого уже подтверждена безопасность и для которого известно, что оно обладает противоаллергической активностью, для повышения и усиления противоаллергической активности. В рамках настоящего изобретения фармацевтическая композиция, кроме того, может содержать внеклеточную эндоплазматическую сеть, выделенную из  KACC 91563.
Bifidobacterium longum
В другом аспекте настоящего изобретения предусматривается диетическая функциональная пищевая композиция для смягчения или облегчения симптома аллергии, содержащая композицию, которая содержит в качестве активных ингредиентов пробиотики и полипептид, обладающий аффинностью связывания в отношении IgE. В рамках настоящего изобретения пищевая композиция, кроме того, может содержать в качестве активного ингредиента внеклеточную эндоплазматическую сеть, выделенную из  KACC 91563.
Между тем, пищевая композиция по настоящему изобретению, кроме того, может содержать ситологически приемлемый носитель. Кроме того, пищевую композицию можно использовать вместе с другим продуктом питания или пищевым ингредиентом, и ее можно пригодным образом использовать в соответствии с общепринятыми способами. Количество активного ингредиента для смешения может быть подходящим образом определено в соответствии с его предполагаемым применением (профилактическое, оздоровительное или терапевтическое лечение).
Отсутствует конкретное ограничение типа продукта питания. Примеры продукта питания включают мясо, сосиски, хлеб, шоколад, конфеты, закуски, кондитерские изделия, молочные продукты, включающие мороженое, различные супы, напитки, чай, питьевую продукцию, алкогольные напитки и витаминные комплексы. Включаются все функциональные диетические продукты питания в общепринятом значении. Продукты питания, в которые можно добавлять описанные выше вещества, содержат ингредиенты, которые обычно добавляют в ходе производства, и примеры ингредиентов включают белки, углеводы, жиры, пищевые добавки, вкусовые добавки и специи. Вышеупомянутые углеводы представляют собой типичные сахара, например, моносахарид, такой как глюкоза и фруктоза, дисахарид, такой как мальтоза и сахароза, и полисахарид, такой как декстрин и циклодекстрин, и сахарный спирт, такой как ксилит, сорбит и эритрит. В качестве вкусовой добавки можно использовать природную вкусовую добавку, такую как тауматин и экстракт стевии, синтетическую вкусовую добавку, такую как сахарин и аспартам, и т.п.
Например, в случае, когда пищевую композицию по настоящему изобретению изготавливают в качестве напитка, в дополнение к композиции по настоящему изобретению она может содержать лимонную кислоту, жидкую фруктозу, сахар, глюкозу, уксусную кислоту, яблочную кислоту, сок, экстракт и т.п.
В дополнение к вышеуказанному, композиция по настоящему изобретению может содержать различные пищевые добавки, витамины, электролиты, вкусовые добавки, красители, пектиновую кислоту и ее соли, альгиновую кислоту и ее соли, органические кислоты, защитные коллоидные загустители, вещества для коррекции pH, стабилизаторы, консерванты, глицерин, спирт, карбонизирующее средство, используемое в газированных напитках, и т.п. Кроме того, композиция по настоящему изобретению может содержать мякоть для изготовления напитков на основе фруктового сока и овощных напитков. Эти ингредиенты могут использоваться независимо или в смеси.
Кроме того, пищевая композиция по настоящему изобретению может относиться к любой категории продуктов по официальной или функциональной классификации при условии, что пищевая композиция удовлетворяет предписаниям контролирующих органов на момент производства и распространения. Например, пищевая композиция может представлять собой диетический функциональный продукт питания в соответствии с Актом о функциональной диетической продукции, или может относиться к кондитерским изделиям, продуктам на основе бобовых, чаям, напиткам, продуктам питания специального назначения и т.п. в соответствии с каждым типом продуктов питания в Кодом продуктов питания Акта о пищевой санитарии (стандарты и спецификации для продуктов писания, зарегистрированные в Управление продовольствия и лекарственных препаратов). Что касается других пищевых добавок, которые могут содержаться в пищевой композиции по настоящему изобретению, может быть упомянут Код продуктов питания или Дополнительный код продуктов питания в соответствии с Актом о пищевой санитарии.
В другом аспекте настоящего изобретения предусматривается набор для лечения или предупреждения аллергического заболевания, содержащий первую композицию, которая содержит пробиотики; и вторую композицию, которая содержит полипептид, обладающий способностью связываться с IgE. В рамках настоящего изобретения вторая композиция может представлять собой композицию для подкожного или внутривенного введения.
В следующем аспекте изобретения предусматривается способ лечения или предупреждения аллергического заболевания, включающий стадию введения пробиотиков; и введения полипептида, обладающего способностью связываться с IgE.
TRAP
TRAP
TRAP
TRAP
TRAP
TRAP
B. longum
B. longum
B. longum
B. longum
Пробиотики являются такими, как описано выше, и их можно вводить пероральным путем. В рамках настоящей заявки полипептид, обладающий способностью связываться с IgE, можно вводить перорально и можно вводить парентерально. В рамках настоящего изобретения парентеральное введение можно проводить таким способом, как подкожное введение, внутривенное введение, введение через слизистую оболочку и т.п. В модели пищевой аллергии на мышах было показано, что IgE не только снижает уровень свободного IgE, но также снижает количество тучных клеток, тем самым облегчая симптомы пищевой аллергии (фиг.21-26). Считается, что снижение количества тучных клеток, вызываемое IgE, является следствием того факта, что IgE увеличивает количество тучных клеток путем увеличения выживаемости тучных клеток. Кроме того, избыточная пролиферация бокаловидных клеток в тонком кишечнике значительно ингибировалась путем введения IgE и  отдельно, и еще более ингибировалась при комбинированном введении (фиг. 23-26). Поскольку известно, что Th2-цитокины, такие как IL-13, индуцируют сверхпролиферацию бокаловидных клеток, можно ожидать, что IgE,  и их комбинация будут ослаблять условия для индукции Th2-цитокинов в тонком кишечнике. В подтверждение этого IgE и  продемонстрировали тенденцию к снижению экспрессии мРНК IL-33, который вовлечен в стимуляцию секреции IL-13, в тонком кишечнике путем активации врожденных лимфоидных клеток 2 типа (ILC2); и их комбинация значительно снижала экспрессию IL-33 более эффективным образом (фиг. 28). Кроме того, IL-33 не только секретируется в активируемых посредством IgE тучных клетках, но также вовлечен в стимуляцию дегрануляции тучных клеток. Таким образом, IL-33 имеет тесную корреляцию с тяжестью пищевой аллергии. Это указывает на то, что IgE и  могут смягчать симптомы пищевой аллергии посредством различных механизмов.
B. longum
B. longum
B. longum
B. longum,
B. longum
TRAP
TRAP
TRAP
TRAP
TRAP
TRAP
Ранее было описано, что  индуцирует апоптоз тучных клеток и улучшает симптомы пищевой аллергии, что согласуется с результатами, полученными авторами настоящего изобретения. Однако, ежедневное введение  для лечения пищевой аллергии было менее эффективным, чем введение только IgE. Однако  значительно улучшали терапевтический эффект IgE (фиг. 18), и IgE, использованный в комбинации с  демонстрировал терапевтический эффект, который является сходным с эффектом, которого достигают путем введения IgE отдельно в 10 раз более высокой дозе (фиг.19B). Кроме того, было описано, что некоторые кишечные бактерии могут смягчать аллергическое заболевание путем увеличения количества Treg-клеток или снижения уровней IgE и Th2-цитокинов. Таким образом, можно ожидать, что другие пробиотики в дополнение к  будут способны улучшать терапевтический эффект IgE. Действительно, было идентифицировано, что повышенный терапевтический эффект демонстрируется при комбинированном введении различных типов пробиотиков и IgE (фиг. 29-34).
В другом аспекте настоящего изобретения предусматривается способ лечения или предупреждения аллергического заболевания, включающий стадию введения индивидууму полипептида, обладающего способностью связываться с IgE, и пробиотиков в комбинации. Индивидуумом может быть млекопитающее, предпочтительно человека. В рамках настоящего изобретения введение можно проводить перорально или парентерально. В рамках настоящей заявки полипептид, обладающий способностью связываться с IgE, и пробиотики можно получать в виде составов, подходящих для перорального введения. Кроме того, парентеральное введение можно проводить такими способами, как подкожное введение, внутривенное введение, введение через слизистую оболочку и внутримышечное введение.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Далее настоящее изобретение описано более подробно с помощью следующих примеров. Однако следующие примеры предназначены только для иллюстрации настоящего изобретения и объем настоящего изобретения не ограничивается только ими.
Материалы и способы
Конструирование клеточной линии для IgETRAP и его очистка
TRAP
TRAP
Нуклеотидную последовательность IgE конструировали путем связывания C-конца (26-205) внеклеточного домена FcεRIα с N-концом гибридного Fc-домена IgD/IgG4 (IgD, 133-170; IgG4, 121-327). Белок экспрессировали в клетках яичника китайского хомячка с дефицитом дигидрофолатредуктазы DG44. IgE очищали с использованием колонки HiTrap rProtein A FF column (GE Healthcare), и его чистоту идентифицировали посредством SDS-PAGE в восстанавливающих и не восстанавливающих условиях.
Моделирование 3D-структуры
TRAP
Структурную модуль IgE моделировали с использованием WinCoot и конструировали с использованием программного обеспечения PyMOL на основе информации о FcεRIα (номер доступа PDB 1F6A) и Fc IgD/IgG4 (номер доступа PDB 1ADQ) в Protein Data Bank.
Анализ с использованием поверхностного плазмонного резонанса (SPR)
TRAP
TRAP
SPR-анализ проводили с использованием устройства ProteOn XPR36 (Bio-Rad). Степень связывания омализумаба и IgE с IgE человека (Calbiochem) идентифицировали с использованием кинетического анализа. 850 единиц ответа (RU) омализумаба в ацетатном буфере (pH 5,5) и 500 RU IgE в ацетатном буфере (pH 4,0) иммобилизовывали на сенсорном чипе ProteOn™ GLC (Bio-Rad). В качестве подвижного буфера использовали PBS, содержавший Tween-20, и скорость потока устанавливали на 30 мкл/мин. График каждого набора данных анализировали с использованием программного обеспечения ProteOn Manager (Bio-Rad).
Анализ с использованием биослойной интерферометрии (BLI)
TRAP
TRAP
Степень связывания IgE и омализумаба с рецепторами IgG определяли с использованием системы Octet RED384 (Pall ForteBio, CA, США). Рекомбинантные белки FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB, FcγRIIIA и FcγRIIIB (R & D Systems Inc., 5 мкг/мл), разбавленные в 300 мМ ацетатном буфере (pH 5), иммобилизовывали на биосенсоре Амин Reactive 2 Generation (AR2G), активированном посредством комбинации 400 мМ EDC и 10 мМ сульфо-NHS. Затем определяли ассоциацию с и диссоциацию от IgE и омализумаба при различных концентрациях, соответственно, в течение 300 секунд. В данном случае использованный кинетический буфер представлял собой PBS, содержавший 0,1% Tween-20 и 1% бычью сыворотку, и все эксперименты проводили при 30°C с устройством для встряхивания планшета со скоростью 1000 об/мин.
Анализ высвобождения
-гексозаминидазы
β
TRAP
TRAP
Тучные клетки костномозгового происхождения (BMMC) культивировали при 37°C в RPMI, содержавшей 10% инактивированную нагреванием FBS, 10 нг/мл IL-3 мыши (PeproTech, Inc.) и 50 нг/мл SCF мыши (PeproTech, Inc.). Перед анализом 1 мкг/мл IgE против динитрофенила (Sigma-Aldrich) и различные концентрации IgE инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут. Тучные клетки костномозгового происхождения инкубировали в смеси IgE против динитрофенила (Sigma-Aldrich) и IgE при 37°C в течение 30 минут, и к ним добавляли 0,1 мкг/мл IgE против динитрофенила. Полученный материал вновь инкубировали при 37°C в течение 30 минут. Культуральный супернатант собирали и инкубировали с 3 мМ п-нитрофенил-N-ацетил-β-D-глюкозаминидом при 37°C в течение 20 минут. Добавляли 0,1 M натрий-карбонатный буфер (pH 10) для остановки реакции и определяли поглощение при 405 нм. Долю высвободившейся β-гексозаминидазы вычисляли путем сравнения с общим внутриклеточным содержанием в BMMC после растворения посредством 0,1% Triton X-100.
Индукция пищевой аллергии и введение
B. longum
B. longum
B. longum,
9
На 0 и 14 сутки 50 мкг OVA (категория V; Sigma-Aldrich) и 1 мг адъюванта на основе сульфата калия-алюминия (Sigma-Aldrich) внутрибрюшинно вводили мышам. После 14 суток мышам перорально вводили 50 мг OVA (категория III; Sigma-Aldrich) 5 раз с интервалами 2 суток. Мышей подвергали голоданию в течение приблизительно 4-5 часов перед пероральным введением OVA. Возникновение диареи оценивали посредством мониторинга мышей в течение вплоть до 1 часа после инокуляции OVA. лиофилизировали и смешивали с порошковым кормом для мышей в количестве 3×10 к.о.е./г. Мышам обеспечивали доступ к корму без ограничений. Для поддержания свежести мышиный кром, смешанный с  заменяли каждые 2-3 суток.
Гистология
Тощую кишку фиксировали 4% параформальдегидом и заливали парафином с получением блока. Затем получали парафиновый срез на предметном стекле. Срез депарафинизировали и тучные клетки окрашивали с использование набора с нафтол AS-D хлорацетатэстеразой (Sigma-Aldrich). Для бокаловидных клеток срез окрашивали набором с перйодной кислотой-красителем Шиффа (ScyTek Laboratories, Inc.). Изображение окрашенного среза получали с использованием Pannoramic MIDI (3D HISTECH Ltd.).
ELISA
TRAP
Набор для ELISA на тотальный IgE мыши (BioLegend) и набор для ELISA на MCPT-1 (Invitrogen) использовали в соответствии с протоколом изготовителя для определения общих концентраций IgE и MCPT-1 в сыворотке мыши. Для определения свободного IgE планшет покрывали 1 мг/мл IgE и реакцию проводили в течение ночи при 4°C. Остальную часть анализа проводили в соответствии с протоколом изготовителя для набора для ELISA на тотальный IgE мыши.
Статистический анализ
Статистический анализ всех данных проводили с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 5 (GraphPad Software Inc.). Для вычисления частоты встречаемости диареи использовали анализ с использованием кривой выживаемости Каплана-Мейера с логарифмическим ранговым тестом (Ментеля-Кокса). Для идентификации значимых отличий в тесте использовали односторонний ANOVA с критерием множественных сравнений Ньюмана-Кеулса.
I. Получение и охарактеризация IgETRAP
Пример 1. Получение полипептида, содержащего Fc
RI
-ECD и модифицированную Fc-область
εα
C-концевой модифицированный полипептид внеклеточного домена (FcεRIα-ECD) альфа-субъединицы Fc-рецептора IgE получали способом, описанным в патенте IgE США № 7867491.
Сначала получали слитый белок, который содержит внеклеточный домен α-цепи FcεRI, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и модифицированный Fc иммуноглобулина SEQ ID NO: 2. В частности, для экспрессии белка (FcεRIαECD-Fc1), белка (FcεRIαECD-Fc2) и белка (FcεR1αECD-Fc3), которые были связаны, соответственно, через шарнирную область SEQ ID NO: 19, шарнирную область SEQ ID NO: 3 и шарнирную область SEQ ID NO: 4, кассеты, полученные путем связывания гена, кодирующего каждый белок, клонировали в векторы pAD15 (Genexin, Inc.), с конструкцией, экспрессирующей белок FcεRIαECD-Fc. Затем каждый из экспрессирующих векторов трансдуцировали в клетки CHO DG44 (от Dr. Chasin, Columbia University, США).
В данном случае, при трансдукции в клеточную линию экспрессирующий вектор, полученный посредством клонирования гена трансферазы α-2,6-сиаловой кислоты в вектор pCI Hygro (Invitrogen), одновременно трансдуцировали для получения отдельно клеточных линий, которые были способны экспрессировать белки FcεRIαECD-Fc2ST и FcεRIα ECD-Fc3ST, к которым была добавлена сиаловая кислота.
В качестве первичной скрининговой процедуры проводили селекцию с HT с использованием среды, свободной от 5-гидрокситриптамина (HT) с 10% dFBS (Gibco, США, 30067-334), среды MEMα (Gibco, 12561, США, каталожный номер № 12561-049) и среды HT+ (Gibco, США, 11067-030). Затем проводили амплификацию с метотрексатом (MTX) с использованием отобранных с помощью HT клонов для повышения продуктивности с использованием системы "дигидрофолатредуктаза (DHFR)-".
После завершения амплификации с MTX проводили субкультивирование приблизительно 1-5 раз для стабилизации клеток с целью оценки продуктивности. После этого проводили оценку продуктивности в единицах для амплифицированных с MTX клеток. Результаты представлены в таблице 1 ниже.
[Таблица 1]
Версия
Среда
Концентрация MTX
Продуктивность
Культивирование в течение 3 суток
Культура с подпиткой (мг/мл)
мкг/мл
мкг/10<sup>6</sup> клеток
FcεRIαECD-Fc2
Ex-cell DHFR
500 нМ
37,23
20,9
225
FcεRIαECD-Fc2+a2,6-ST
100 нМ
45,4
25,1
338,2
FcεRIαECD-Fc3
2 мкМ
27,0
16,9
180,4
FcεRIαECD-Fc3+a2,6-ST
1 мкМ
17,5
10,2
101,7
6
6
6
6
Как показано в таблице 1, клеточная линия FcεRIαECD-Fc3 демонстрировала продуктивность 16,9 мкг/10 клеток после амплификациии с метотрексатом в концентрации 2 мкМ. С другой стороны, клеточная линия FcεRIαECD-Fc3 (FcεRIαECD-Fc3ST), котрансдуцированная трансферазой 2,6-сиаловых кислот, демонстрировала продуктивность 17,5 мкг/10 клеток после амплификации с метотрексатом в концентрации 1 мкМ. Кроме того, клеточная линия FcεRIαECD-Fc2 демонстрировала продуктивность 20,9 мкг/10 клеток в условиях амплификации с метотрексатом в концентрации 0,5 мкМ. Кроме того, клеточная линия FcεRIαECD-Fc2 (FcεRIαECD-Fc2ST), котрансдуцированная трансферазой 2,6-сиаловых кислот, демонстрировала продуктивность 25,1 мкг/10 клеток после амплификации с метотрексатом в концентрации 0,1 мкМ. Следовательно, было идентифицировано, что клеточная линия FcεRIαECD-Fc2, котрансфицированная трансферазой 2,6-сиаловых кислот, которая была подвергнута селекции в условиях амплификации с метотрексатом в концентрации 0,1 мкМ, демонстрировала наилучшую продуктивность.
Пример 2. Очистка слитого белка FcεRIα ECD и определение его чистоты
Среди клеточных линий, отобранных согласно примеру 1 выше, i) FcεRIαECD-Fc3, ii) FcεRIαECD-Fc3ST и iii) FcεRIαECD-Fc2ST культивировали в масштабе 60 мл способом периодической культуры. Полученные культуры очищали с использованием аффинной колонки с белком A, а затем очищенные белки подвергали SDS-PAGE и эксклюзионной ВЭЖХ (SE-ВЭЖХ) для определения чистоты белков.
Как показано на фиг.3A и 3B, было идентифицировано, что все соответствующие белки, очищенные способом SE-ВЭЖХ, имели чистоту 93% или выше. Кроме того, в результате анализа SDS-PAGE было идентифицировано, что белки размером приблизительно 150 кДа и приблизительно 75 кДа, выявлялись, соответственно, в не восстанавливающих и восстанавливающих условиях (фиг. 3A, дорожки 1-6). Исходя из этого было обнаружено, что связанный с Fc FcεRIαECD образует димер. Кроме того, в результатах SDS-PAGE не наблюдалось примесей, таких как укороченная форма. В частности, даже после процесса оттаивания/замораживания (фиг. 3A, дорожки 7-9), было идентифицировано, что все белки имеют чистоту 93% или выше и не имеют примесей. В данном случае, гель-IEF проводили в приведенных ниже условиях тестирования для идентификации степени содержания сиаловых кислот в белках после введения трансферазы сиаловых кислот. Из этого было идентифицировано, что содержание кислых белков возрастало вследствие увеличения содержания сиаловых кислот.
[Таблица 2]
Условия тестирования
Гель
Гель IEF pH3-10 1,0 мм
Буфер для образца
Буфер для образца IEF (2X)
Условия загрузки
100 В 1 ч, 200 В 1 ч, 500 В 2 ч
Для определения воспроизводимости выхода очистки клеточную линию FcεRIαECD-Fc2ST подвергали периодическому культивированию в 1-л колбе в масштабе 250 мл и очищали с использованием аффинной колонки с белком A. Затем культуральный супернатант и очищенный продукт подвергали разделению на 4%-15% геле TGX™ (Bio-Rad Laboratories, Inc.) в течение 30 минут в условиях буфера Tris-глицин SDS (TGS) и 200 В, а затем подвергали анализу SDS PAGE. В результате было идентифицировано что белки с очень высокой чистотой (98% или выше) очищались даже посредством только первой стадии очистки, и белки экспрессировались с очень высокой чистотой даже в культуральном супернатанте. Это указывает на то, что стадии разработки процесса могут быть упрощены при разработке белка FcεRIαECD-Fc, который экспрессируется в рассматриваемой клеточной линии, в виде медицинского продукта, и в результате вероятно, что стоимость разработки медицинского продукта значительно снизится.
Экспериментальный пример 1. Определение способности связывания слитого белка FcεRIα ECD с IgE
Способность связывания с IgE подвергали сравнительному определению для четырех белков: i) FcεRIαECD-Fc2, ii) FcεRIαECD-Fc2ST, iii) FcεRIαECD-Fc3 и iv) FcεRIαECD-Fc3ST, которые были очищены способом согласно примеру 2 выше, и коммерчески доступного антитела против IgE омализумаба (торговое название: Xolair). В частности, способность связываться с IgE определяли путем нанесения IgE на канал сенсорного чипа Protein GLC (Bio-Rad Laboratories, Inc.) и позволения омализумабу или каждому белку FceR1αECD-Fc в различных концентрациях течь со скоростью 30 мкл в минуту.
TRAP
Эксперименты проводили путем идентификации нулевого фона с использованием 25 мМ NaOH в качестве регенерирующего буфера, а затем повторения описанных выше стадий. После этого кривую связывания идентифицировали с использованием анализатора связывания белков (ProteOn XPR36, Bio-Rad Laboratories, Inc., США). Результаты представлены в таблице 3, и на фиг.7 и 8. IgE на фиг. 8 означает FcεRIαECD-Fc2ST, который является вариантом осуществления полипептида, обладающего способностью связываться с IgE, по настоящему изобретению.
[Таблица 3]
ОбразцыПоложения
FcεRIa ECD-Fc
Омализумаб
Примечания
Тип лекарственного средства
слитый белок Fc
Ab против IgE
Аффинность связывания
ka (скорость ассоциации)
Fc2
2,14×10<sup>5</sup>
4,05×10<sup>5</sup>
В 1,9 раза слабее, чем омализумаб
Fc2ST
2,64×10<sup>5</sup>
В 1,5 раза слабее, чем омализумаб
Fc3
1,98×10<sup>5</sup>
В 2,0 раза слабее, чем омализумаб
Fc3ST
2,40×10<sup>5</sup>
В 1,7 раза слабее, чем омализумаб
kd (скорость диссоциации)
Fc2
8,2×10<sup>-5</sup>
6,02×10<sup>-3</sup>
В 73 раз лучше, чем омализумаб
Fc2ST
5,69×10<sup>-5</sup>
В 106 раз лучше, чем омализумаб
Fc3
1,33×10<sup>-4</sup>
В 45 раз лучше, чем омализумаб
Fc3ST
1,49×10<sup>-4</sup>
В 40 раз лучше, чем омализумаб
KD (kd/ka)
Fc2
3,88×10<sup>-10</sup>
1,49×10<sup>-8</sup>
В 38 раз лучше, чем омализумаб
Fc2ST
2,16×10<sup>-10</sup>
В 69 раз лучше, чем омализумаб
Fc3
6,72× 10<sup>-10</sup>
В 22 раза лучше, чем омализумаб
Fc3ST
6,21×10<sup>-10</sup>
В 24 раза лучше, чем омализумаб
Как показано в таблице 3, было определено, что величина скорости ассоциации (ka) полипептидного димера в соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения в 1,5-2,0 раза ниже, чем у омализумаба. Таким образом, было обнаружено, что его аффинность связывания с веществами, отличными от IgE, была в 1,5-2,0 ниже, чем у омализумаба. Кроме того, было определено, что величина скорости диссоциации (kd) полипептидного димера в соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения в 40-106 раз выше, чем у омализумаба. Кроме того, как показано на фиг.7 и 8, можно было идентифицировать, что омализумаб утрачивал свое связывание с IgE в случае, когда после связывания проходил определенный период времени, в то время как после связывания полипептидного димера слитого белка FcεRIαECD по настоящему изобретению с IgE полипептидный димер не отделялся от IgE. Таким образом, можно видеть, что полипептидный димер по настоящему изобретению не легко отделяется от IgE, и он обладает значительно лучшей способностью сохранять его связанное состояние, чем омализумаб. В результате, было обнаружено, что полипептидный димер в соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения имеет равновесную величину константы диссоциации (KD <kd/ka>), которая в 22-69 раз выше, чем у омализумаба.
TRAP
TRAP
TRAP
Исходя из этого, можно видеть, что слитый белок FcεRIαECD по настоящему изобретению обладает значительно увеличенной способностью связываться с IgE по сравнению с омализумабом. В частности, было идентифицировано, что FcεRIαECD -Fc2 (FcεRIαECD-Fc2ST), к которому добавлена сиаловая кислота, демонстрирует наивысшую способность связывания IgE, которая была в 69 раз выше, чем у омализумаба. В частности, для FcεR1αECD-Fc2ST, скорость ассоциации (Ka) и скорость диссоциации (Kd) IgE была приблизительно в 1,5 раза и в 94,5 раза ниже, чем у омализумаба, соответственно (фиг. 7 и 8, и таблица 4). Ранее было описано, что IgE диссоциировал от FcεRIα очень медленно. Было идентифицировано, что IgE также диссоциировал очень медленно (фиг. 8). В результате, способность IgE связываться с IgE была в 69 раз выше, чем у омализумаба (фиг. 8 и таблица 4).
[Таблица 4]
Ka (M<sup>-1</sup> с<sup>-1</sup>)
Kd (с<sup>-1</sup>)
KD (M)
IgE<sub>TRAP</sub>
2,64×10<sup>5</sup>
5,69×10<sup>-5</sup>
2,15×10<sup>-10</sup>
Омализумаб
4,05×10<sup>5</sup>
6,02×10<sup>-3</sup>
1,49×10<sup>-8</sup>
Сравнение KD [Омализумаб/IgE<sub>TRAP</sub>]
Приблизительно в 69 раз
Экспериментальный пример 2. Определение способности IgETRAP связываться с IgG-опосредуемыми рецепторами IgG
TRAP
TRAP
TRAP
IgE не связывается с низкоаффинными рецепторами IgG, ассоциированными с IgG-опосредуемой анафилаксией. Поскольку считается, что анафилаксия, основной побочный эффект омализумаба, вызывается возможным связыванием низкоаффинного рецептора IgG, анализ BLI использовали для проверки способности IgE связываться с рецепторами IgG при использовании омализумаба в качестве контроля. В частности, степень связывания IgE и омализумаба с рецептором IgG идентифицировали с использованием системы Octet RED384 (Pall ForteBio, CA, США).
TRAP
Рекомбинантные белки FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB, FcγRIIIA и FcγRIIIB (R & D Systems Inc., 5 мкг/мл), которые были разбавлены в 300 мМ ацетатном буфере (pH 5), иммобилизовывали на биосенсоре Amine Reactive 2 Generation (AR2G), активированном посредством комбинации 400 мМ EDC и 10 мМ сульфо-NHS. Затем определяли ассоциацию с и диссоциацию от IgE и омализумаба при различных концентрациях, соответственно, в течение 300 секунд. В данном случае, использованный кинетический буфер представлял собой PBS, содержавший 0,1% Tween-20 и 1% бычью сыворотку, и все эксперименты проводили при 30°C с использованием устройства для встряхивания планшетов со скоростью 1000 об/мин.
TRAP
TRAP
Как и ожидалось, омализумаб продемонстрировал значительную способность связывать FcγRI, высокоаффинным рецептором IgG, а также с низкоаффинными рецепторами IgG, такими как FcγRIIA, FcγRIIB, FcγRIIIA и FcγRIIIB (фиг. 9-14). Это означает, что, в отличие от омализумаба, IgE не может связывать рецепторы IgG, такие как FcγRIIA и FcγRIII, и, таким образом, имеет очень низкий риск индукции IgG-опосредуемой анафилаксии (фиг.9-14). Способность связывания омализумаба и IgE с рецепторами IgG количественно определяли, и она показана на фиг.14.
Экспериментальный пример 3. Определение активности слитого белка FcεRIα ECD с использованием анализа с бета-гексозаминидазой в тучных клетках костномозгового происхождения мыши
in vitro
5
Анализ с бета-гексозаминидазой проводили для исследования активности  слитого бека FcεRIαECD по настоящему изобретению. В частности, белок FcεRIαECD-Fc2 в соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения смешивали в каждой концентрации с IgE мыши (1 мкг/мл) и инкубировали при комнатной температуре (20°C) в течение 30 минут с получением образцов. Тучные клетки костномозгового происхождения в культуре для активации тучных клеток промывали буфером на основе сбалансированного солевого раствора Хэнка (HBSS) для удаления среды, и определяли количество клеток. Затем проводили доведение таким образом, чтобы 5×10 клеток инжектировали в 40 мкл буфера HBSS.
2
2
2
Затем к активированным тучным клеткам добавляли 50 мкл раствора образца, полученного посредством предварительной инкубации. Затем полученный материал инкубировали в инкубаторе с 5% CO при 37°C в течение 30 минут. Затем после добавления в каждом случае по 10 мкл DNP (2,4-динитрофенол, 100 нг/мл), который является посторонним антигеном, вновь проводили инкубацию при 37°C в течение 30 минут в 5% CO, а затем отделяли 30 мкл супернатанта. 30 мкл отделенного супернатанта и 30 мкл субстрата (4-нитрофенил N-ацетил-β-D-глюкозаминид, 5,84 мМ) хорошо перемешивали, а затем инкубировали при 37°C в течение 20 минут в 5% CO. Затем добавляли 140 мкл 0,1 M натрий-карбонатного буфера (pH 10) в качестве стоп-раствора для завершения реакции. После этого определяли поглощение при 405 нм для идентификации секретируемого количества β-гексозаминидазы, секретируемой посредством постороннего антигена, в активированных тучных клетках. Результаты показаны на фиг. 15A.
TRAP
50
TRAP
TRAP
IgE ингибировал дегрануляцию тучных клеток дозозависимым образом с 0,45 мкг/мл IC (концентрация лекарственного средства, необходимая для демонстрации ингибиторного эффекта 50%) в присутствии 1 мкг/мл IgE мыши (фиг. 15A). IgE полностью ингибировал дегрануляцию тучных клеток костномозгового происхождения в молекулярном соотношении IgE:IgE 0,79 (таблица 5).
[Таблица 5]
IgE против DNP
1 мкг/мл (= 5,26 нМ)
IgE<sub>TRAP </sub>(мкг/мл)
0
0,016
0,063
0,25
0,5
1
2
4
IgE<sub>TRAP </sub>(нМ)
0
0,11
0,42
1,67
3,33
6,67
13,3
26,7
Молярное соотношение [IgE/IgE<sub>TRAP</sub>]
0
47,8
12,5
3,15
1,58
0,79
0,40
0,20
Средняя доля ингибирования (%)
0
2,12
12,4
13,8
49,4
99,3
99,4
99,8
В частности, как показано на фиг. 15A, полипептидный димер согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения демонстрировал долю ингибирования тучных клеток приблизительно 49,4% в случае половинной (0,5 мкг/мл) концентрации IgE мыши, и демонстрировал долю ингибирования тучных клеток приблизительно 99,4% в случае той же концентрации (1 мкг/мл) IgE мыши. Таким образом, можно видеть, что индуцируемая IgE активность происходящих из костного мозга тучных клеток значительно подавляется полипептидным димером FcεRIα-ECD по настоящему изобретению.
Экспериментальный пример 4. Сравнение активности слитого белка FcεRIα ECD и антитела против IgE человека с использованием анализа с β-гексозаминидазой в экспрессирующих FcεRI человека тучных клетках костномозгового происхождения
in vitro
TRAP
2
5
Анализ с β-гексозаминидазой проводили для идентификации превосходства слитого белка FcεRIα ECD над Xolair посредством анализа активности . Соответствующие лекарственные средства, FcεRIαECD -Fc2ST (IgE) и Xolair, получали в каждой концентрации, а затем смешивали с IgE человека (1 мкг/мл). Затем проводили инкубацию при комнатной температуре в течение 30 минут. В ходе предварительной инкубации с лекарственным средством вводили ген FcεRI человека и получали тучные клетки, происходящие и дифференцированные из костного мозга мыши, в которых ген FcεRI мыши удален. Полученные тучные клетки промывали буфером HBSS, а затем 5×10 клеток инжектировали в 60 мкл буфера HBSS. К полученным тучным клеткам добавляли 20 мкл предварительно инкубированного образца, а затем инкубировали в инкубаторе с 5% CO при 37°C в течение 30 минут.
2
2
Затем добавляли 20 мкл антитела против IgE человека (BioLegend, каталожный номер № 325502, 0,5 мкг/мл) для индукции сходной реакции с чужеродным антигеном, а затем полученный материал вновь инкубировали в инкубаторе с 5% CO при 37°C в течение 30 минут. Затем после центрифугирования при 1500 об/мин при 4°C отделяли 30 мкл супернатанта. 30 мкл отделенного супернатанта и 30 мкл субстрата (4-нитрофенил N-ацетил-β-глюкозаминида, 5,84 мМ) хорошо перемешивали, а затем инкубировали в инкубаторе с 5% CO при 37°C в течение 25 минут. Затем добавляли 140 мкл 0,1 M натрий-карбонатного буфера (pH 10) для завершения реакции.
50
50
Затем определяли поглощение при 405 нм для сравнения относительных количеств секретируемой β-гексозаминидазы и идентифицировали эффект ингибирования тучных клеток в зависимости от каждой концентрации лекарственного средства. Результаты представлены на фиг.15B. Как показано на фиг.15B, было определено, что IC слитого белка FcεRIα ECD составляет приблизительно 11,16 нг/мл, и IC белка Xolair составляет приблизительно 649,8 нг/мл. Таким образом, было идентифицировано, что слитый белок FcεRIα ECD обладает в 58 раз более высокой ингибиторной активностью в отношении активности тучных клеток, чем Xolair.
Экспериментальный пример 5. Анализ
in vivo
слитого белка FcεRIα ECD: модель пищевой аллергии
50 мкг овальбумина (OVA) и 1 мг квасцов внутрибрюшинно вводили мышам Balb/c (Orientbio Inc.) два раза с интервалом 14 суток для индукции сенсибилизации. После этого 50 мг OVA перорально вводили пять раз всего на 28, 30, 32, 34 и 36 сутки для индукции пищевой аллергии в кишечнике.
После перорального введения OVA два раза, т.е. на 31 сутки, мышей разделяли на три группы, каждая из которых содержала 7 мышей. Три разделенных группы были следующими: в первой группе вводили слитый белок FcεRIαECD -Fc2ST в высокой концентрации (200 мкг), во второй группе вводили слитый белок FcεRIαECD -Fc2ST в низкой концентрации (20 мкг), и в третьей группе ничего не вводили. При пероральном введении OVA определяли, происходит ли диарея в результате индукции пищевой аллергии. Мышей умерщвляли на 37 сутки и анализировали количество тучных клеток в тонком кишечнике, концентрацию IgE в крови и концентрацию фермента (протеаза-1 тучных клеток (MCPT-1)) дегрануляции тучных клеток в крови для мышей, относящихся к каждой группе.
Как показано на фиг.16, было идентифицировано, что мыши, относящиеся к группе, в которой вводили FcεRIαECD -Fc2ST, который представляет собой полипептидный димер, в высокой концентрации демонстрирует эффект смягчения пищевой аллергии зависимым от концентрации образом по сравнению с мышами, относящимися к группе, в которой ничего не вводили.
II. Получение комбинации полипептида, обладающего способностью связываться с IgE, и пробиотиков, и определение ее эффекта
Пример 3: Культивирование и введение пробиотиков
L. casei
Lactobacillus casei
Lc. lactis
Lactococcus lactis
L. fermentum
Lactobacillus fermentum
L. rhamnosus
Lactobacillus rhamnosus
L. reuteri
Lactobacillus reuteri
S. thermophiles
Streptococcus thermophiles
(; KACC 12413),(; KACC 13877),(; KACC 11441) и(; KACC 11953) инокулировали на бульон MRS илисредус сердечно-мозговым экстрактом (BHI) и культивировали в инкубаторе при 37°C (N-Biotek, каталожный номер № NB201L) в течение 24 часов.  (; KACC 11452)и (; KACC 11857)культивировали в инкубаторе со встряхиванием (N-biotek) при 37°C и 50 об/мин в течение 24 часов ввиду их аэробной природы.
Культивированные пробиотики растворяли в среде для лиофилизации, содержавшей 10% снятое молоко и 10% сахарозу, и лиофилизировали с использованием лиофилизатора (Labcono). Затем полученный материал преобразовывали в порошок. Для полученных пробиотиков определяли количество колониеобразующих единиц (к.о.е.) на грамм посредством серийного разведения.
9
9
Лиофилизированные пробиотики непрерывно вводили с пищей в количестве от 1×10 до 2,5×10 к.о.е. на мышь с использованием орального зонда с интервалами 2-3 суток в ходе эксперимента. Отрицательных контрольных мышей кормили равным количеством лиофилизированной среды.
Пример 4: Получение композиции, содержащей пробиотики и полипептид, обладающий способностью связываться с IgE
Полипептид, обладающий способностью связываться с IgE, полученный согласно примеру 1, и пробиотики, полученные согласно примеру 3, смешивали с получением композиции для лечения аллергии.
Экспериментальный пример 6. Определение эффекта слитого белка FcεRIα-Fc на смягчение аллергии
B. longum
B. longum
50 мкг овальбумина (OVA) и 1 мг квасцов внутрибрюшинно вводили мышам Balb/c (Orientbio Inc.) два раза с интервалом 14 суток для индукции сенсибилизации. После этого 50 мг OVA перорально вводили пять раз всего на 28, 30, 32, 34 и 36 сутки для индукции пищевой аллергии в кишечнике. Мышей, у которых была индуцирована пищевая аллергия, распределяли на пять групп, каждая из которых содержала 7 мышей. Эти пять групп были следующими: в первой группе вводили рекомбинантный белок FcεRIαECD в высокой концентрации (200 мкг), во второй группе вводили рекомбинантный белок FcεRIαECD в низкой концентрации (20 мкг), в третьей группе вводили рекомбинантный белок FcεRIαECD в высокой концентрации (200 мкг) плюс , в четвертой группе вводили рекомбинантный белок FcεRIαECD в низкой концентрации (20 мкг) плюс , и в пятой группе ничего не вводили.
B. longum,
При пероральном введении OVA определяли происходит ли диарея в результате индукции пищевой аллергии. Мышей умерщвляли на 37 сутки и анализировали количество тучных клеток в тонком кишечнике, концентрацию IgE в крови и концентрацию фермента (протеаза-1 тучных клеток (MCPT-1)) дегрануляции тучных клеток в крови для мышей, относящихся к каждой группе. Как показано на фиг.19B, было обнаружено, что мыши, относившиеся к группе, в которой вводили комбинацию полипептидного димера FcεRIαECD и  демонстрируют эффект смягчения пищевой аллергии по сравнению с мышами, относящимися к группе, в которой ничего не вводили.
Экспериментальный пример 7. Определение эффекта комбинированного введения IgETRAP и пробиотиков на смягчение аллергии
TRAP
TRAP
TRAP
B. longum
B. longum,
B. longum
9
Для оценки эффекта IgE на пищевую аллергию дозозависимую острую диарею индуцировали у мышей BALB/c для получения модели на мышах индуцированной аллергеном пищевой аллергии. В частности, эксперименты проводили аналогично тому, как в экспериментальном примере 6, за исключением того, что IgE, рекомбинантный белок FcεRIαECD, вводили в количестве 100 мкг/мышь. Кроме того, пробиотики лиофилизировали и смешивали с порошкованным кормом для мышей в количестве 3×10 к.о.е./г. Мышам обеспечивали доступ к корму без ограничений. Для поддержания свежести мышиный корм, смешанный с  заменяли каждые 2-3 суток. В результате, как показано в приведенной ниже таблице 6 и на фиг. 18, было обнаружено, что в экспериментальной группе, в которой одновременно вводили пробиотики  и IgE, полипептидный димер FcεRIαECD, наблюдали превосходный эффект смягчения аллергии.
[Таблица 6]
Группа
Конечное количество мышей
Характерный признак
1-ая нагрузка OVA
2-я нагрузка OVA
3-я нагрузка OVA
4-я нагрузка OVA
5-я нагрузка OVA
1
17
Контроль заболевания
0/17(0,00%)
0/17(0,00%)
2/17(11,76%)
14/17(82,35%)
15/17(88,24%)
2
17
Только B.longum
0/17(0,00%)
0/17(0,00%)
2/17(11,11%)
11/17(61,11%)
11/17(64,71%)
3
18
IgE-ловушка+B.longum
0/18(0,00%)
0/18(0,00%)
1/18(5,56%)
2/18(11,11%)
4/18(22,22%)
4
17
Только IgE-ловушка
0/17(0,00%)
0/17(0,00%)
3/17(17,65%)
6/17(35,29%)
9/17(52,94%)
5
16
Нормальный контроль
0/16(0,00%)
0/16(0,00%)
0/16(0,00%)
0/16(0,00%)
0/16(0,00%)
TRAP
TRAP
TRAP
TRAP
TRAP
TRAP
TRAP
B. longum
B. longum
B. longum
B. longum
С использованием этой модели авторы настоящего изобретения обнаружили, что введение IgE отдельно эффективно снижало частоту возникновения диареи и идентифицировали, что введение IgE в комбинации с  значительно снижали частоту возникновения диареи по сравнению с введением IgE отдельно (фиг. 18). Было описано, что  снижали количество тучных клеток и смягчали симптомы пищевой аллергии посредством апоптоза. Однако группа, в которой проводили внутрибрюшинную инъекцию IgE, демонстрировала лучший терапевтический эффект, чем группа, в которой ежедневно вводили  (фиг. 18). Интересно, что даже в случае, когда использовали IgE с 10-кратно сниженной концентрацией, комбинированная терапия IgE и  демонстрировала сходный эффект с терапией IgE отдельно (фиг. 19B).
Экспериментальный пример 8. Определение эффектов при комбинированном введении IgETRAP и
B. longum
: уровни MCPT-1 и IgE
TRAP
TRAP
TRAP
TRAP
TRAP
TRAP
TRAP
TRAP
B. longum
B. longum
B. longum
B. longum,
B. longum,
B. longum
B. longum
Кроме того, определяли уровень MCPT-1 в сыворотке для идентификации дегрануляции тучных клеток. Введение IgE и  отдельно не снижало уровень MCPT-1, однако комбинация IgE и  значительно снижала уровень MCPT-1 (фиг. 20). Таким образом, можно видеть, что  и IgE кооперируют, ингибируя дегрануляцию тучных клеток. В модели пищевой аллергии на мышах для исследования эффективности терапевтического средства, которое снижает уровень IgE, использовали ELISA для анализа уровней тотального IgE и свободного IgE в сыворотке. IgE, и комбинация IgE и  слабо повышали уровень тотального IgE (фиг. 21). Однако IgE, и комбинация IgE и значительно снижали уровень свободного IgE (фиг. 22). Напротив, введение  отдельно не влияло на уровни тотального IgE и свободного IgE (фиг. 21 и 22). Таким образом, IgE и  смягчают симптомы пищевой аллергии несколькими путями, указывая на то, что эта комбинация может демонстрировать эффективный терапевтический эффект на пищевую аллергию.
Экспериментальный пример 9. Определение ингибиторного эффекта комбинации IgETRAP и
B. longum
на количество тучных клеток и гиперплазию бокаловидных клеток
TRAP
TRAP
TRAP
B. longum
B. longum
B. longum
B. longum
Для исследования того, снижают ли IgE и , и их комбинация количество тучных клеток, использовали активность хлорацетатэстеразы для окрашивания тучных клеток. Результаты показали, что введение IgE и  отдельно значительно снижало количество тучных клеток, и комбинация этих двух средств была значительно более эффективной (фиг. 23 и 24). Можно видеть, что результаты для  согласуются с результатами, описанными ранее. Проводили исследование того, может ли гиперплазия бокаловидных клеток, индуцированная средой с Th2-цитокинами, ингибироваться посредством IgE,  и их комбинированной терапии. Как и ожидалось, было идентифицировано, что размер бокаловидных клеток в тонком кишечнике мышей с пищевой аллергией увеличивался, и возникала гиперплазия, поскольку увеличивалось количество клеток (фиг.25 и 26).
TRAP
TRAP
TRAP
TRAP
B. longum
B. longum
B. longum
B. longum
Было идентифицировано, что введение IgE и  значительно уменьшало размер и количество бокаловидных клеток, и этот эффект становился более выраженным в случае, когда IgE и  вводили в комбинации (фиг. 25 и 26). Кроме того, наблюдалось, что экспрессия мРНК IL-33 имела тенденцию к снижению посредством IgE и , и этот эффект становился значительно более выраженным в случае введения в комбинации (фиг. 28). Эти результаты указывают на то, что IgE и  значительно ингибируют количество кишечных тучных клеток и гиперплазию бокаловидных клеток, и демонстрируют дополнительно улучшенный эффект в случае введения в комбинации.
Экспериментальный пример 10. Определение присутствия IgETRAP в сыворотке после перорального введения IgETRAP мышам
TRAP
2
4
TRAP
TRAP
TRAP
IgE (300 мкг) перорально вводили мышам и через 2 часа проводили взятие сыворотки посредством ретроорбитального взятия крови. После обеспечения возможности реагировать при комнатной температуре в течение 30 минут получали супернатант (сыворотку) посредством центрифугирования при 4°C и 1300 об/мин в течение 15 минут. 96-луночный планшет Immuno покрывали антителом против FcεRI (Abcam, ab54411) и позволяли ему реагировать в течение ночи при 4°C. Планшет промывали промывочным буфером (PBS, содержащий 0,05% Tween-20), а затем добавляли блокирующий буфер (PBS, содержащий 1% бычий сывороточный альбумин). Реакции в планшете позволяли протекать в течение 1 часа. Планшет вновь промывали промывочным буфером, и в планшет добавляли стандартный образец и образец разбавленной сыворотки мыши. Планшету позволяли реагировать в течение 2 часов и вновь промывали промывочным буфером. В него добавляли антитело против Fc IgG4 человека (Abcam, ab99823), и реакции в планшете позволяли протекать в течение 1 часа. Планшет вновь промывали промывочным буфером и в него добавляли субстрат TMB (Supmodics). После реакции в течение 20 минут при блокировании света добавляли стоп-реагент (1 M HSO) для остановки реакции. Величину концентрации определяли с использованием устройства для считывания микропланшетов (спектрометров для микропланшетов Epoch) путем выбора длины волны 450 нм. В результате, IgE обнаруживался в сыворотке нормальных мышей (фиг. 35). Из этих результатов можно видеть, что в случае, когда перорально вводили белок IgE, белок IgE доставлялся в сыворотку посредством связывания с FcRn в слизистой оболочке и, таким образом, может быть достигнут терапевтический эффект.
Экспериментальный пример 11. Определение эффекта, полученного посредством комбинированного введения IgETRAP и различных пробиотиков в модели пищевой аллергии
TRAP
TRAP
9
9
Для оценкиэффекта IgE и пробиотиков на пищевую аллергию индуцировали дозозависимую острую диарею у мышей BALB/c с получением модели на мышах индуцированной аллергеном пищевой аллергии. В частности, эксперименты проводили аналогично тому, как описано в экспериментальном примере 7, за исключением того, что IgE, рекомбинантный белок FcεRIαECD, внутрибрюшинно вводили мышам в дозе 100 мкг/мышь, как на схеме эксперимента на фиг.17. Кроме того, лиофилизированными пробиотиками непрерывно кормили мышей в количестве от 1×10 до 2,5×10 к.о.е. на мышь с использованием орального зонда с интервалами 2-3 суток в ходе эксперимента, и отрицательных контрольных мышей кормили равным количеством лиофилизированной среды.
TRAP
TRAP
TRAP
TRAP
TRAP
TRAP
L. casei,
Lc. lactis,
S. thermophilus,
L. rhamnosus,
L. reuteri,
L. fermentum,
Результаты, полученные путем определения частоты диареи после введения IgE и  проиллюстрированы на фиг.29. Результаты, полученные посредством определения частоты диареи после введения IgE и  проиллюстрированы на фиг.30. Результаты, полученные посредством определения частоты диареи после введения IgE и  проиллюстрированы на фиг.31. Результаты, полученные посредством определения частоты диареи после введения IgE и  проиллюстрированы на фиг.32. Результаты, полученные путем определения частоты диареи после введения IgE и  проиллюстрированы на фиг.33. Результаты, полученные путем определения частоты диареи после введения IgE и  проиллюстрированы на фиг.34.
Список сокращений:
B. longum: Bifidobacterium longum
OIT: пероральная иммунотерапия
PSA: пассивная системная анафилаксия
SPR: Поверхностный плазмонный резонанс
BLI: биослойная интерферометрия
BMMC: тучная клетка костномозгового происхождения
к.о.е.: колониеобразующие единицы
MCPT-1: протеаза-1 тучных клеток
OVA: овальбумин
Treg-клетки: регуляторные T-клетки
Th2-клетки: хелперные T-клетки 2 типа
ILC2: врожденная лимфоидная клетка 2 группы
[Список последовательностей]
SEQ ID NO: 1
VPQKPKVSLN PPWNRIFKGE NVTLTCNGNN FFEVSSTKWF HNGSLSEETN SSLNIVNAKF EDSGEYKCQH QQVNESEPVY LEVFSDWLLL QASAEVVMEG QPLFLRCHGW RNWDVYKVIY YKDGEALKYW YENHNISITN ATVEDSGTYY CTGKVWQLDY ESEPLNITVI KAPREKYWLQ
SEQ ID NO: 2
SHTQPLGVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSQEDPE VQFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQFNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKGLPSSI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSQEEMTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSRLTV DKSRWQEGNV FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSLGK
SEQ ID NO: 3
RNTGRGGEEK KGSKEKEEQE ERETKTPECP
SEQ ID NO: 4
AQPQAEGSLA KATTAPATTR NTGRGGEEKK GSKEKEEQEE RETKTPECP
SEQ ID NO: 5
gtgccccaga agcccaaggt gagcctgaac cctccctgga acagaatctt caagggcgag aacgtgaccc tgacctgcaa cggcaacaac ttcttcgagg tgagcagcac caagtggttc cacaatggca gcctgagcga ggagaccaac agctccctga acatcgtgaa cgccaagttc gaggacagcg gcgagtacaa gtgccagcac cagcaggtga acgagagcga gcccgtgtac ctggaggtgt tcagcgactg gctgctgctg caggccagcg ccgaggtggt gatggagggc cagcccctgt tcctgagatg ccacggctgg agaaactggg acgtgtacaa ggtgatctac tacaaggatg gcgaggccct gaagtactgg tacgagaacc acaacatctc catcaccaac gccaccgtgg aggacagcgg cacctactac tgcacaggca aggtgtggca gctggactac gagagcgagc ccctgaacat caccgtgatc aaggctccca gagagaagta ctggctgcag
SEQ ID NO: 6
tgcgtggtcg tggatgtgag ccaggaagat cccgaagtgc agttcaactg gtacgtggat ggcgtggaag tgcacaacgc caagaccaag cccagagaag agcagttcaa ctccacctac agagtggtga gcgtgctgac cgtgctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag tgcaaggtgt ccaacaaagg cctgcccagc tccatcgaga agaccatcag caaagccaaa ggccagccca gagaacccca ggtgtacacc ctgcctccca gccaggaaga gatgaccaag aaccaggtgt ccctgacctg cctggtgaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag tgggaaagca acggccagcc cgagaacaat tacaagacaa cccctcccgt gctggatagc gatggcagct tctttctgta cagcagactg accgtggaca agagcagatg gcaggaaggc aacgtgttca gctgcagcgt gatgcacgaa gccctgcaca accactacac ccagaagagc ctgtccctga gcctgggcaa g
SEQ ID NO: 7
aggaacaccg gcagaggagg cgaggaaaag aaaggaagca aggagaagga ggagcaggag gaaagagaaa ccaagacccc cgagtgcccc agccacaccc agcccctggg cgtgttcctg ttccccccca agcccaagga caccctgatg atcagcagaa cccccgaggt gacc
SEQ ID NO: 8
gcccagcccc aggccgaggg cagcctggct aaggccacca cagctcccgc caccaccagg aacaccggca gaggaggcga ggaaaagaaa ggaagcaagg agaaggagga gcaggaggaa agagaaacca agacccccga gtgccccagc cacacccagc ccctgggcgt gttcctgttc ccccccaagc ccaaggacac cctgatgatc agcagaaccc ccgaggtgac c
SEQ ID NO: 9
MDAMLRGLCC VLLLCGAVFV SPSHA
SEQ ID NO: 10
atggacgcca tgctgagagg cctgtgctgt gtgctgctgc tgtgcggcgc cgtgttcgtg tcccctagcc acgcc
SEQ ID NO: 11
MDAMLRGLCC VLLLCGAVFV SPSHAVPQKP KVSLNPPWNR IFKGENVTLT CNGNNFFEVS STKWFHNGSL SEETNSSLNI VNAKFEDSGE YKCQHQQVNE SEPVYLEVFS DWLLLQASAE VVMEGQPLFL RCHGWRNWDV YKVIYYKDGE ALKYWYENHN ISITNATVED SGTYYCTGKV WQLDYESEPL NITVIKAPRE KYWLQRNTGR GGEEKKGSKE KEEQEERETK TPECPSHTQP LGVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS QEDPEVQFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQFN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKG LPSSIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSQEE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SRLTVDKSRW QEGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSLGK
SEQ ID NO: 12
atggacgcca tgctgagagg cctgtgctgt gtgctgctgc tgtgcggcgc cgtgttcgtg tcccctagcc acgccgtgcc ccagaagccc aaggtgagcc tgaaccctcc ctggaacaga atcttcaagg gcgagaacgt gaccctgacc tgcaacggca acaacttctt cgaggtgagc agcaccaagt ggttccacaa tggcagcctg agcgaggaga ccaacagctc cctgaacatc gtgaacgcca agttcgagga cagcggcgag tacaagtgcc agcaccagca ggtgaacgag agcgagcccg tgtacctgga ggtgttcagc gactggctgc tgctgcaggc cagcgccgag gtggtgatgg agggccagcc cctgttcctg agatgccacg gctggagaaa ctgggacgtg tacaaggtga tctactacaa ggatggcgag gccctgaagt actggtacga gaaccacaac atctccatca ccaacgccac cgtggaggac agcggcacct actactgcac aggcaaggtg tggcagctgg actacgagag cgagcccctg aacatcaccg tgatcaaggc tcccagagag aagtactggc tgcagaggaa caccggcaga ggaggcgagg aaaagaaagg aagcaaggag aaggaggagc aggaggaaag agaaaccaag acccccgagt gccccagcca cacccagccc ctgggcgtgt tcctgttccc ccccaagccc aaggacaccc tgatgatcag cagaaccccc gaggtgacct gcgtggtcgt ggatgtgagc caggaagatc ccgaagtgca gttcaactgg tacgtggatg gcgtggaagt gcacaacgcc aagaccaagc ccagagaaga gcagttcaac tccacctaca gagtggtgag cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaag gagtacaagt gcaaggtgtc caacaaaggc ctgcccagct ccatcgagaa gaccatcagc aaagccaaag gccagcccag agaaccccag gtgtacaccc tgcctcccag ccaggaagag atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgc ctggtgaaag gcttctaccc cagcgacatc gccgtggagt gggaaagcaa cggccagccc gagaacaatt acaagacaac ccctcccgtg ctggatagcg atggcagctt ctttctgtac agcagactga ccgtggacaa gagcagatgg caggaaggca acgtgttcag ctgcagcgtg atgcacgaag ccctgcacaa ccactacacc cagaagagcc tgtccctgag cctgggcaag
SEQ ID NO: 13
MDAMLRGLCC VLLLCGAVFV SPSHAVPQKP KVSLNPPWNR IFKGENVTLT CNGNNFFEVS STKWFHNGSL SEETNSSLNI VNAKFEDSGE YKCQHQQVNE SEPVYLEVFS DWLLLQASAE VVMEGQPLFL RCHGWRNWDV YKVIYYKDGE ALKYWYENHN ISITNATVED SGTYYCTGKV WQLDYESEPL NITVIKAPRE KYWLQAQPQA EGSLAKATTA PATTRNTGRG GEEKKGSKEK EEQEERETKT PECPSHTQPL GVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSQ EDPEVQFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQFNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKGL PSSIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSQEEM TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS RLTVDKSRWQ EGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSLGK
SEQ ID NO: 14
atggacgcca tgctgagagg cctgtgctgt gtgctgctgc tgtgcggcgc cgtgttcgtg tcccctagcc acgccgtgcc ccagaagccc aaggtgagcc tgaaccctcc ctggaacaga atcttcaagg gcgagaacgt gaccctgacc tgcaacggca acaacttctt cgaggtgagc agcaccaagt ggttccacaa tggcagcctg agcgaggaga ccaacagctc cctgaacatc gtgaacgcca agttcgagga cagcggcgag tacaagtgcc agcaccagca ggtgaacgag agcgagcccg tgtacctgga ggtgttcagc gactggctgc tgctgcaggc cagcgccgag gtggtgatgg agggccagcc cctgttcctg agatgccacg gctggagaaa ctgggacgtg tacaaggtga tctactacaa ggatggcgag gccctgaagt actggtacga gaaccacaac atctccatca ccaacgccac cgtggaggac agcggcacct actactgcac aggcaaggtg tggcagctgg actacgagag cgagcccctg aacatcaccg tgatcaaggc tcccagagag aagtactggc tgcaggccca gccccaggcc gagggcagcc tggctaaggc caccacagct cccgccacca ccaggaacac cggcagagga ggcgaggaaa agaaaggaag caaggagaag gaggagcagg aggaaagaga aaccaagacc cccgagtgcc ccagccacac ccagcccctg ggcgtgttcc tgttcccccc caagcccaag gacaccctga tgatcagcag aacccccgag gtgacctgcg tggtcgtgga tgtgagccag gaagatcccg aagtgcagtt caactggtac gtggatggcg tggaagtgca caacgccaag accaagccca gagaagagca gttcaactcc acctacagag tggtgagcgt gctgaccgtg ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag tacaagtgca aggtgtccaa caaaggcctg cccagctcca tcgagaagac catcagcaaa gccaaaggcc agcccagaga accccaggtg tacaccctgc ctcccagcca ggaagagatg accaagaacc aggtgtccct gacctgcctg gtgaaaggct tctaccccag cgacatcgcc gtggagtggg aaagcaacgg ccagcccgag aacaattaca agacaacccc tcccgtgctg gatagcgatg gcagcttctt tctgtacagc agactgaccg tggacaagag cagatggcag gaaggcaacg tgttcagctg cagcgtgatg cacgaagccc tgcacaacca ctacacccag aagagcctgt ccctgagcct gggcaag
SEQ ID NO: 15
MIHTNLKKKF SCCVLVFLLF AVICVWKEKK KGSYYDSFKL QTKEFQVLKS LGKLAMGSDS QSVSSSSTQD PHRGRQTLGS LRGLAKAKPE ASFQVWNKDS SSKNLIPRLQ KIWKNYLSMN KYKVSYKGPG PGIKFSAEAL RCHLRDHVNV SMVEVTDFPF NTSEWEGYLP KESIRTKAGP WGRCAVVSSA GSLKSSQLGR EIDDHDAVLR FNGAPTANFQ QDVGTKTTIR LMNSQLVTTE KRFLKDSLYN EGILIVWDPS VYHSDIPKWY QNPDYNFFNN YKTYRKLHPN QPFYILKPQM PWELWDILQE ISPEEIQPNP PSSGMLGIII MMTLCDQVDI YEFLPSKRKT DVCYYYQKFF DSACTMGAYH PLLYEKNLVK HLNQGTDEDI YLLGKATLPG FRTIHC
SEQ ID NO: 16
atgatccaca ccaacctgaa gaagaagttc agctgctgcg tgctggtgtt cctgctgttc gccgtgatct gcgtgtggaa ggagaagaag aaaggcagct actacgacag cttcaagctg cagaccaagg agttccaggt gctgaagagc ctgggcaagc tggccatggg cagcgacagc cagagcgtgt ccagctcctc cacccaggat ccccacagag gcagacagac cctgggcagc ctgagaggcc tggccaaggc caagcccgag gccagcttcc aggtgtggaa caaggacagc agcagcaaga acctgatccc cagactgcag aagatctgga agaactacct gagcatgaac aagtacaagg tgagctacaa aggacccgga cccggcatca agttcagcgc cgaggccctg aggtgccacc tgagagacca cgtgaacgtg agcatggtgg aagtgaccga cttccccttc aacaccagcg agtgggaagg ctacctgccc aaggagagca tcaggaccaa ggctggcccc tggggcagat gcgccgtggt gagcagcgct ggcagcctga agagctccca gctgggcaga gagatcgacg accacgatgc cgtgctgagg ttcaatggcg ctcccaccgc caacttccag caggacgtgg gcaccaagac cacaatccgg ctgatgaaca gccagctggt gacaaccgag aagcggttcc tgaaggacag cctgtacaac gagggcatcc tgatcgtgtg ggatcccagc gtgtaccaca gcgacatccc caagtggtac cagaatcccg actacaactt cttcaacaac tacaagacct atagaaagct gcaccccaac cagcccttct acatcctgaa gccccagatg ccctgggagc tgtgggacat cctgcaggag atcagccctg aagagatcca gcccaaccct ccctccagcg gcatgctggg cattatcatc atgatgaccc tgtgcgacca ggtggacatc tacgagttcc tgcccagcaa gagaaagacc gacgtgtgct actactatca gaagttcttc gacagcgcct gcaccatggg cgcctaccac cccctgctgt acgagaagaa cctggtgaag cacctgaacc agggcaccga cgaggacatc tacctgctgg gcaaagccac cctgcccggc ttcagaacca tccactgc
SEQ ID NO: 17
RNTGRGGEEK KXXKEKEEQE ERETKTPECP
SEQ ID NO: 18
AQPQAEGSLA KATTAPATTR NTGRGGEEKK XXKEKEEQEE RETKTPECP
SEQ ID NO: 19
RNTGRGGEEK KKEKEKEEQE ERETKTPECP
SEQ ID NO: 20
VPQKPKVSLN PPWNRIFKGE NVTLTCNGNN FFEVSSTKWF HNGSLSEETN SSLNIVNAKF EDSGEYKCQH QQVNESEPVY LEVFSDWLLL QASAEVVMEG QPLFLRCHGW RNWDVYKVIY YKDGEALKYW YENHNISITN ATVEDSGTYY CTGKVWQLDY ESEPLNITVI KAPREKYWLQ RNTGRGGEEK KKEKEKEEQE ERETKTPECP SHTQPLGVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSQEDPE VQFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQFNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKGLPSSI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSQEEMTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSRLTV DKSRWQEGNV FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSLGK
SEQ ID NO: 21
VPQKPKVSLN PPWNRIFKGE NVTLTCNGNN FFEVSSTKWF HNGSLSEETN SSLNIVNAKF EDSGEYKCQH QQVNESEPVY LEVFSDWLLL QASAEVVMEG QPLFLRCHGW RNWDVYKVIY YKDGEALKYW YENHNISITN ATVEDSGTYY CTGKVWQLDY ESEPLNITVI KAPREKYWLQ RNTGRGGEEK KGSKEKEEQE ERETKTPECP SHTQPLGVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSQEDPE VQFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQFNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKGLPSSI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSQEEMTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSRLTV DKSRWQEGNV FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSLGK
SEQ ID NO: 22
VPQKPKVSLN PPWNRIFKGE NVTLTCNGNN FFEVSSTKWF HNGSLSEETN SSLNIVNAKF EDSGEYKCQH QQVNESEPVY LEVFSDWLLL QASAEVVMEG QPLFLRCHGW RNWDVYKVIY YKDGEALKYW YENHNISITN ATVEDSGTYY CTGKVWQLDY ESEPLNITVI KAPREKYWLQ AQPQAEGSLA KATTAPATTR NTGRGGEEKK GSKEKEEQEE RETKTPECPS HTQPLGVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSQEDPEV QFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQFNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKGLPSSIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SQEEMTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSRLTVD KSRWQEGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SLGK
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>    PROGEN CO., LTD.
GI INNOVATION, INC.
<120> КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ ПРОБИОТИКИ И ПОЛИПЕПТИД, ОБЛАДАЮЩИЙ
АФФИННОСТЬЮ СВЯЗЫВАНИЯ В ОТНШОЕНИИ IGE, И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ
<130>    PCB812127GEE/PCT
<150>    KR 10-2018-0004421
<151>    2018-01-12
<160>    22
<170>    KopatentIn 2.0
<210>    1
<211>    180
<212>    БЕЛОК
<213>    Искусственный белок
<220>
<223>    FCeRI1 ECD
<400>    1
Val Pro Gln Lys Pro Lys Val Ser Leu Asn Pro Pro Trp Asn Arg Ile
1               5                  10                  15
Phe Lys Gly Glu Asn Val Thr Leu Thr Cys Asn Gly Asn Asn Phe Phe
20                  25                  30
Glu Val Ser Ser Thr Lys Trp Phe His Asn Gly Ser Leu Ser Glu Glu
35                  40                  45
Thr Asn Ser Ser Leu Asn Ile Val Asn Ala Lys Phe Glu Asp Ser Gly
50                  55                  60
Glu Tyr Lys Cys Gln His Gln Gln Val Asn Glu Ser Glu Pro Val Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Glu Val Phe Ser Asp Trp Leu Leu Leu Gln Ala Ser Ala Glu Val
85                  90                  95
Val Met Glu Gly Gln Pro Leu Phe Leu Arg Cys His Gly Trp Arg Asn
100                 105                 110
Trp Asp Val Tyr Lys Val Ile Tyr Tyr Lys Asp Gly Glu Ala Leu Lys
115                 120                 125
Tyr Trp Tyr Glu Asn His Asn Ile Ser Ile Thr Asn Ala Thr Val Glu
130                 135                 140
Asp Ser Gly Thr Tyr Tyr Cys Thr Gly Lys Val Trp Gln Leu Asp Tyr
145                 150                 155                 160
Glu Ser Glu Pro Leu Asn Ile Thr Val Ile Lys Ala Pro Arg Glu Lys
165                 170                 175
Tyr Trp Leu Gln
180
<210>    2
<211>    215
<212>    БЕЛОК
<213>    Искусственный белок
<220>
<223>    Модифицированный Fc
<400>    2
Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
1               5                  10                  15
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
20                  25                  30
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
35                  40                  45
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
50                  55                  60
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
65                  70                  75                  80
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
85                  90                  95
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
100                 105                 110
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
115                 120                 125
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
130                 135                 140
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
145                 150                 155                 160
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
165                 170                 175
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
180                 185                 190
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
195                 200                 205
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
210                 215
<210>    3
<211>    30
<212>    БЕЛОК
<213>    Искусственный белок
<220>
<223>   вариант шарнирной области IgD
<400>    3
Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Gly Ser Lys Glu Lys
1               5                  10                  15
Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro
20                  25                  30
<210>    4
<211>    49
<212>    БЕЛОК
<213>    Искусственный белок
<220>
<223>    вариант шарнирной области IgD
<400>    4
Ala Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro
1               5                  10                  15
Ala Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Gly Ser
20                  25                  30
Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys
35                  40                  45
Pro
<210>    5
<211>    540
<212>    ДНК
<213>    Искусственный белок
<220>
<223>    нуклеотидная последовательность FCeRI1 ECD
<400>    5
gtgccccaga agcccaaggt gagcctgaac cctccctgga acagaatctt caagggcgag         60
aacgtgaccc tgacctgcaa cggcaacaac ttcttcgagg tgagcagcac caagtggttc        120
cacaatggca gcctgagcga ggagaccaac agctccctga acatcgtgaa cgccaagttc        180
gaggacagcg gcgagtacaa gtgccagcac cagcaggtga acgagagcga gcccgtgtac        240
ctggaggtgt tcagcgactg gctgctgctg caggccagcg ccgaggtggt gatggagggc        300
cagcccctgt tcctgagatg ccacggctgg agaaactggg acgtgtacaa ggtgatctac        360
tacaaggatg gcgaggccct gaagtactgg tacgagaacc acaacatctc catcaccaac        420
gccaccgtgg aggacagcgg cacctactac tgcacaggca aggtgtggca gctggactac        480
gagagcgagc ccctgaacat caccgtgatc aaggctccca gagagaagta ctggctgcag        540
540
<210>    6
<211>    561
<212>    ДНК
<213>    Искусственный белок
<220>
<223>    нуклеотидная последовательность модифицированного Fc
<400>    6
tgcgtggtcg tggatgtgag ccaggaagat cccgaagtgc agttcaactg gtacgtggat         60
ggcgtggaag tgcacaacgc caagaccaag cccagagaag agcagttcaa ctccacctac        120
agagtggtga gcgtgctgac cgtgctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag        180
tgcaaggtgt ccaacaaagg cctgcccagc tccatcgaga agaccatcag caaagccaaa        240
ggccagccca gagaacccca ggtgtacacc ctgcctccca gccaggaaga gatgaccaag        300
aaccaggtgt ccctgacctg cctggtgaaa ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag        360
tgggaaagca acggccagcc cgagaacaat tacaagacaa cccctcccgt gctggatagc        420
gatggcagct tctttctgta cagcagactg accgtggaca agagcagatg gcaggaaggc        480
aacgtgttca gctgcagcgt gatgcacgaa gccctgcaca accactacac ccagaagagc        540
ctgtccctga gcctgggcaa g                                                  561
<210>    7
<211>    174
<212>    ДНК
<213>    Искусственный белок
<220>
<223>    нуклеотидная последовательность варианта шарнирной области IgD
<400>    7
aggaacaccg gcagaggagg cgaggaaaag aaaggaagca aggagaagga ggagcaggag         60
gaaagagaaa ccaagacccc cgagtgcccc agccacaccc agcccctggg cgtgttcctg        120
ttccccccca agcccaagga caccctgatg atcagcagaa cccccgaggt gacc              174
<210>    8
<211>    231
<212>    ДНК
<213>    Искусственный белок
<220>
<223>    нуклеотидная последовательность варианта шарнирной области IgD
<400>    8
gcccagcccc aggccgaggg cagcctggct aaggccacca cagctcccgc caccaccagg         60
aacaccggca gaggaggcga ggaaaagaaa ggaagcaagg agaaggagga gcaggaggaa        120
agagaaacca agacccccga gtgccccagc cacacccagc ccctgggcgt gttcctgttc        180
ccccccaagc ccaaggacac cctgatgatc agcagaaccc ccgaggtgac c                 231
<210>    9
<211>    25
<212>    БЕЛОК
<213>    Искусственный белок
<220>
<223>    сигнальный пептид
<400>    9
Met Asp Ala Met Leu Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
1               5                  10                  15
Ala Val Phe Val Ser Pro Ser His Ala
20                  25
<210>    10
<211>    75
<212>    ДНК
<213>    Искусственный белок
<220>
<223>    нуклеотидная последовательность сигнального пептида
<400>    10
atggacgcca tgctgagagg cctgtgctgt gtgctgctgc tgtgcggcgc cgtgttcgtg         60
tcccctagcc acgcc                                                          75
<210>    11
<211>    450
<212>    БЕЛОК
<213>    Искусственный белок
<220>
<223>    FceRIa ECD-шарнирная область-Fc2
<400>    11
Met Asp Ala Met Leu Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
1               5                  10                  15
Ala Val Phe Val Ser Pro Ser His Ala Val Pro Gln Lys Pro Lys Val
20                  25                  30
Ser Leu Asn Pro Pro Trp Asn Arg Ile Phe Lys Gly Glu Asn Val Thr
35                  40                  45
Leu Thr Cys Asn Gly Asn Asn Phe Phe Glu Val Ser Ser Thr Lys Trp
50                  55                  60
Phe His Asn Gly Ser Leu Ser Glu Glu Thr Asn Ser Ser Leu Asn Ile
65                  70                  75                  80
Val Asn Ala Lys Phe Glu Asp Ser Gly Glu Tyr Lys Cys Gln His Gln
85                  90                  95
Gln Val Asn Glu Ser Glu Pro Val Tyr Leu Glu Val Phe Ser Asp Trp
100                 105                 110
Leu Leu Leu Gln Ala Ser Ala Glu Val Val Met Glu Gly Gln Pro Leu
115                 120                 125
Phe Leu Arg Cys His Gly Trp Arg Asn Trp Asp Val Tyr Lys Val Ile
130                 135                 140
Tyr Tyr Lys Asp Gly Glu Ala Leu Lys Tyr Trp Tyr Glu Asn His Asn
145                 150                 155                 160
Ile Ser Ile Thr Asn Ala Thr Val Glu Asp Ser Gly Thr Tyr Tyr Cys
165                 170                 175
Thr Gly Lys Val Trp Gln Leu Asp Tyr Glu Ser Glu Pro Leu Asn Ile
180                 185                 190
Thr Val Ile Lys Ala Pro Arg Glu Lys Tyr Trp Leu Gln Arg Asn Thr
195                 200                 205
Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Gly Ser Lys Glu Lys Glu Glu Gln
210                 215                 220
Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr Gln Pro
225                 230                 235                 240
Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245                 250                 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu
260                 265                 270
Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275                 280                 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg
290                 295                 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305                 310                 315                 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu
325                 330                 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340                 345                 350
Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355                 360                 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370                 375                 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385                 390                 395                 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp
405                 410                 415
Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420                 425                 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu
435                 440                 445
Gly Lys
450
<210>    12
<211>    1350
<212>    ДНК
<213>    Искусственный белок
<220>
<223>    нуклеотидная последовательность FceRIa ECD-шарнирная область-Fc2
<400>    12
atggacgcca tgctgagagg cctgtgctgt gtgctgctgc tgtgcggcgc cgtgttcgtg         60
tcccctagcc acgccgtgcc ccagaagccc aaggtgagcc tgaaccctcc ctggaacaga        120
atcttcaagg gcgagaacgt gaccctgacc tgcaacggca acaacttctt cgaggtgagc        180
agcaccaagt ggttccacaa tggcagcctg agcgaggaga ccaacagctc cctgaacatc        240
gtgaacgcca agttcgagga cagcggcgag tacaagtgcc agcaccagca ggtgaacgag        300
agcgagcccg tgtacctgga ggtgttcagc gactggctgc tgctgcaggc cagcgccgag        360
gtggtgatgg agggccagcc cctgttcctg agatgccacg gctggagaaa ctgggacgtg        420
tacaaggtga tctactacaa ggatggcgag gccctgaagt actggtacga gaaccacaac        480
atctccatca ccaacgccac cgtggaggac agcggcacct actactgcac aggcaaggtg        540
tggcagctgg actacgagag cgagcccctg aacatcaccg tgatcaaggc tcccagagag        600
aagtactggc tgcagaggaa caccggcaga ggaggcgagg aaaagaaagg aagcaaggag        660
aaggaggagc aggaggaaag agaaaccaag acccccgagt gccccagcca cacccagccc        720
ctgggcgtgt tcctgttccc ccccaagccc aaggacaccc tgatgatcag cagaaccccc        780
gaggtgacct gcgtggtcgt ggatgtgagc caggaagatc ccgaagtgca gttcaactgg        840
tacgtggatg gcgtggaagt gcacaacgcc aagaccaagc ccagagaaga gcagttcaac        900
tccacctaca gagtggtgag cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaag        960
gagtacaagt gcaaggtgtc caacaaaggc ctgcccagct ccatcgagaa gaccatcagc       1020
aaagccaaag gccagcccag agaaccccag gtgtacaccc tgcctcccag ccaggaagag       1080
atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgc ctggtgaaag gcttctaccc cagcgacatc       1140
gccgtggagt gggaaagcaa cggccagccc gagaacaatt acaagacaac ccctcccgtg       1200
ctggatagcg atggcagctt ctttctgtac agcagactga ccgtggacaa gagcagatgg       1260
caggaaggca acgtgttcag ctgcagcgtg atgcacgaag ccctgcacaa ccactacacc       1320
cagaagagcc tgtccctgag cctgggcaag                                        1350
<210>    13
<211>    469
<212>    БЕЛОК
<213>    Искусственный белок
<220>
<223>    FceRIa ECD-шарнирная область-Fc3
<400>    13
Met Asp Ala Met Leu Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
1               5                  10                  15
Ala Val Phe Val Ser Pro Ser His Ala Val Pro Gln Lys Pro Lys Val
20                  25                  30
Ser Leu Asn Pro Pro Trp Asn Arg Ile Phe Lys Gly Glu Asn Val Thr
35                  40                  45
Leu Thr Cys Asn Gly Asn Asn Phe Phe Glu Val Ser Ser Thr Lys Trp
50                  55                  60
Phe His Asn Gly Ser Leu Ser Glu Glu Thr Asn Ser Ser Leu Asn Ile
65                  70                  75                  80
Val Asn Ala Lys Phe Glu Asp Ser Gly Glu Tyr Lys Cys Gln His Gln
85                  90                  95
Gln Val Asn Glu Ser Glu Pro Val Tyr Leu Glu Val Phe Ser Asp Trp
100                 105                 110
Leu Leu Leu Gln Ala Ser Ala Glu Val Val Met Glu Gly Gln Pro Leu
115                 120                 125
Phe Leu Arg Cys His Gly Trp Arg Asn Trp Asp Val Tyr Lys Val Ile
130                 135                 140
Tyr Tyr Lys Asp Gly Glu Ala Leu Lys Tyr Trp Tyr Glu Asn His Asn
145                 150                 155                 160
Ile Ser Ile Thr Asn Ala Thr Val Glu Asp Ser Gly Thr Tyr Tyr Cys
165                 170                 175
Thr Gly Lys Val Trp Gln Leu Asp Tyr Glu Ser Glu Pro Leu Asn Ile
180                 185                 190
Thr Val Ile Lys Ala Pro Arg Glu Lys Tyr Trp Leu Gln Ala Gln Pro
195                 200                 205
Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala Thr Thr
210                 215                 220
Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Gly Ser Lys Glu Lys
225                 230                 235                 240
Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His
245                 250                 255
Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
260                 265                 270
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
275                 280                 285
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
290                 295                 300
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
305                 310                 315                 320
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
325                 330                 335
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
340                 345                 350
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
355                 360                 365
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
370                 375                 380
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
385                 390                 395                 400
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
405                 410                 415
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
420                 425                 430
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
435                 440                 445
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
450                 455                 460
Leu Ser Leu Gly Lys
465
<210>    14
<211>    1407
<212>    ДНК
<213>    Искусственный белок
<220>
<223>    нуклеотидная последовательность FceRIa ECD-шарнирная область-Fc3
<400>    14
atggacgcca tgctgagagg cctgtgctgt gtgctgctgc tgtgcggcgc cgtgttcgtg         60
tcccctagcc acgccgtgcc ccagaagccc aaggtgagcc tgaaccctcc ctggaacaga        120
atcttcaagg gcgagaacgt gaccctgacc tgcaacggca acaacttctt cgaggtgagc        180
agcaccaagt ggttccacaa tggcagcctg agcgaggaga ccaacagctc cctgaacatc        240
gtgaacgcca agttcgagga cagcggcgag tacaagtgcc agcaccagca ggtgaacgag        300
agcgagcccg tgtacctgga ggtgttcagc gactggctgc tgctgcaggc cagcgccgag        360
gtggtgatgg agggccagcc cctgttcctg agatgccacg gctggagaaa ctgggacgtg        420
tacaaggtga tctactacaa ggatggcgag gccctgaagt actggtacga gaaccacaac        480
atctccatca ccaacgccac cgtggaggac agcggcacct actactgcac aggcaaggtg        540
tggcagctgg actacgagag cgagcccctg aacatcaccg tgatcaaggc tcccagagag        600
aagtactggc tgcaggccca gccccaggcc gagggcagcc tggctaaggc caccacagct        660
cccgccacca ccaggaacac cggcagagga ggcgaggaaa agaaaggaag caaggagaag        720
gaggagcagg aggaaagaga aaccaagacc cccgagtgcc ccagccacac ccagcccctg        780
ggcgtgttcc tgttcccccc caagcccaag gacaccctga tgatcagcag aacccccgag        840
gtgacctgcg tggtcgtgga tgtgagccag gaagatcccg aagtgcagtt caactggtac        900
gtggatggcg tggaagtgca caacgccaag accaagccca gagaagagca gttcaactcc        960
acctacagag tggtgagcgt gctgaccgtg ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag       1020
tacaagtgca aggtgtccaa caaaggcctg cccagctcca tcgagaagac catcagcaaa       1080
gccaaaggcc agcccagaga accccaggtg tacaccctgc ctcccagcca ggaagagatg       1140
accaagaacc aggtgtccct gacctgcctg gtgaaaggct tctaccccag cgacatcgcc       1200
gtggagtggg aaagcaacgg ccagcccgag aacaattaca agacaacccc tcccgtgctg       1260
gatagcgatg gcagcttctt tctgtacagc agactgaccg tggacaagag cagatggcag       1320
gaaggcaacg tgttcagctg cagcgtgatg cacgaagccc tgcacaacca ctacacccag       1380
aagagcctgt ccctgagcct gggcaag                                           1407
<210>    15
<211>    406
<212>    БЕЛОК
<213>    Искусственный белок
<220>
<223>    трансфераза a-2,6 сиаловой кислоты человека
<400>    15
Met Ile His Thr Asn Leu Lys Lys Lys Phe Ser Cys Cys Val Leu Val
1               5                  10                  15
Phe Leu Leu Phe Ala Val Ile Cys Val Trp Lys Glu Lys Lys Lys Gly
20                  25                  30
Ser Tyr Tyr Asp Ser Phe Lys Leu Gln Thr Lys Glu Phe Gln Val Leu
35                  40                  45
Lys Ser Leu Gly Lys Leu Ala Met Gly Ser Asp Ser Gln Ser Val Ser
50                  55                  60
Ser Ser Ser Thr Gln Asp Pro His Arg Gly Arg Gln Thr Leu Gly Ser
65                  70                  75                  80
Leu Arg Gly Leu Ala Lys Ala Lys Pro Glu Ala Ser Phe Gln Val Trp
85                  90                  95
Asn Lys Asp Ser Ser Ser Lys Asn Leu Ile Pro Arg Leu Gln Lys Ile
100                 105                 110
Trp Lys Asn Tyr Leu Ser Met Asn Lys Tyr Lys Val Ser Tyr Lys Gly
115                 120                 125
Pro Gly Pro Gly Ile Lys Phe Ser Ala Glu Ala Leu Arg Cys His Leu
130                 135                 140
Arg Asp His Val Asn Val Ser Met Val Glu Val Thr Asp Phe Pro Phe
145                 150                 155                 160
Asn Thr Ser Glu Trp Glu Gly Tyr Leu Pro Lys Glu Ser Ile Arg Thr
165                 170                 175
Lys Ala Gly Pro Trp Gly Arg Cys Ala Val Val Ser Ser Ala Gly Ser
180                 185                 190
Leu Lys Ser Ser Gln Leu Gly Arg Glu Ile Asp Asp His Asp Ala Val
195                 200                 205
Leu Arg Phe Asn Gly Ala Pro Thr Ala Asn Phe Gln Gln Asp Val Gly
210                 215                 220
Thr Lys Thr Thr Ile Arg Leu Met Asn Ser Gln Leu Val Thr Thr Glu
225                 230                 235                 240
Lys Arg Phe Leu Lys Asp Ser Leu Tyr Asn Glu Gly Ile Leu Ile Val
245                 250                 255
Trp Asp Pro Ser Val Tyr His Ser Asp Ile Pro Lys Trp Tyr Gln Asn
260                 265                 270
Pro Asp Tyr Asn Phe Phe Asn Asn Tyr Lys Thr Tyr Arg Lys Leu His
275                 280                 285
Pro Asn Gln Pro Phe Tyr Ile Leu Lys Pro Gln Met Pro Trp Glu Leu
290                 295                 300
Trp Asp Ile Leu Gln Glu Ile Ser Pro Glu Glu Ile Gln Pro Asn Pro
305                 310                 315                 320
Pro Ser Ser Gly Met Leu Gly Ile Ile Ile Met Met Thr Leu Cys Asp
325                 330                 335
Gln Val Asp Ile Tyr Glu Phe Leu Pro Ser Lys Arg Lys Thr Asp Val
340                 345                 350
Cys Tyr Tyr Tyr Gln Lys Phe Phe Asp Ser Ala Cys Thr Met Gly Ala
355                 360                 365
Tyr His Pro Leu Leu Tyr Glu Lys Asn Leu Val Lys His Leu Asn Gln
370                 375                 380
Gly Thr Asp Glu Asp Ile Tyr Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Pro Gly
385                 390                 395                 400
Phe Arg Thr Ile His Cys
405
<210>    16
<211>    1218
<212>    ДНК
<213>    Искусственный белок
<220>
<223>    нуклеотидная последовательность трансферазы a-2,6-сиаловой
кислоты человека
<400>    16
atgatccaca ccaacctgaa gaagaagttc agctgctgcg tgctggtgtt cctgctgttc         60
gccgtgatct gcgtgtggaa ggagaagaag aaaggcagct actacgacag cttcaagctg        120
cagaccaagg agttccaggt gctgaagagc ctgggcaagc tggccatggg cagcgacagc        180
cagagcgtgt ccagctcctc cacccaggat ccccacagag gcagacagac cctgggcagc        240
ctgagaggcc tggccaaggc caagcccgag gccagcttcc aggtgtggaa caaggacagc        300
agcagcaaga acctgatccc cagactgcag aagatctgga agaactacct gagcatgaac        360
aagtacaagg tgagctacaa aggacccgga cccggcatca agttcagcgc cgaggccctg        420
aggtgccacc tgagagacca cgtgaacgtg agcatggtgg aagtgaccga cttccccttc        480
aacaccagcg agtgggaagg ctacctgccc aaggagagca tcaggaccaa ggctggcccc        540
tggggcagat gcgccgtggt gagcagcgct ggcagcctga agagctccca gctgggcaga        600
gagatcgacg accacgatgc cgtgctgagg ttcaatggcg ctcccaccgc caacttccag        660
caggacgtgg gcaccaagac cacaatccgg ctgatgaaca gccagctggt gacaaccgag        720
aagcggttcc tgaaggacag cctgtacaac gagggcatcc tgatcgtgtg ggatcccagc        780
gtgtaccaca gcgacatccc caagtggtac cagaatcccg actacaactt cttcaacaac        840
tacaagacct atagaaagct gcaccccaac cagcccttct acatcctgaa gccccagatg        900
ccctgggagc tgtgggacat cctgcaggag atcagccctg aagagatcca gcccaaccct        960
ccctccagcg gcatgctggg cattatcatc atgatgaccc tgtgcgacca ggtggacatc       1020
tacgagttcc tgcccagcaa gagaaagacc gacgtgtgct actactatca gaagttcttc       1080
gacagcgcct gcaccatggg cgcctaccac cccctgctgt acgagaagaa cctggtgaag       1140
cacctgaacc agggcaccga cgaggacatc tacctgctgg gcaaagccac cctgcccggc       1200
ttcagaacca tccactgc                                                     1218
<210>    17
<211>    30
<212>    БЕЛОК
<213>    Искусственный белок
<220>
<223>    вариант шарнирной области IgD
<400>    17
Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Xaa Xaa Lys Glu Lys
1               5                  10                  15
Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro
20                  25                  30
<210>    18
<211>    49
<212>    БЕЛОК
<213>    Искусственный белок
<220>
<223>    вариант шарнирной области IgD
<400>    18
Ala Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro
1               5                  10                  15
Ala Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Xaa Xaa
20                  25                  30
Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys
35                  40                  45
Pro
<210>    19
<211>    30
<212>    БЕЛОК
<213>    Искусственный белок
<220>
<223>    шарнирная область IgD
<400>    19
Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys
1               5                  10                  15
Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro
20                  25                  30
<210>    20
<211>    425
<212>    БЕЛОК
<213>    Искусственный белок
<220>
<223>    FceRIa ECD-шарнирная область-Fc1
<400>    20
Val Pro Gln Lys Pro Lys Val Ser Leu Asn Pro Pro Trp Asn Arg Ile
1               5                  10                  15
Phe Lys Gly Glu Asn Val Thr Leu Thr Cys Asn Gly Asn Asn Phe Phe
20                  25                  30
Glu Val Ser Ser Thr Lys Trp Phe His Asn Gly Ser Leu Ser Glu Glu
35                  40                  45
Thr Asn Ser Ser Leu Asn Ile Val Asn Ala Lys Phe Glu Asp Ser Gly
50                  55                  60
Glu Tyr Lys Cys Gln His Gln Gln Val Asn Glu Ser Glu Pro Val Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Glu Val Phe Ser Asp Trp Leu Leu Leu Gln Ala Ser Ala Glu Val
85                  90                  95
Val Met Glu Gly Gln Pro Leu Phe Leu Arg Cys His Gly Trp Arg Asn
100                 105                 110
Trp Asp Val Tyr Lys Val Ile Tyr Tyr Lys Asp Gly Glu Ala Leu Lys
115                 120                 125
Tyr Trp Tyr Glu Asn His Asn Ile Ser Ile Thr Asn Ala Thr Val Glu
130                 135                 140
Asp Ser Gly Thr Tyr Tyr Cys Thr Gly Lys Val Trp Gln Leu Asp Tyr
145                 150                 155                 160
Glu Ser Glu Pro Leu Asn Ile Thr Val Ile Lys Ala Pro Arg Glu Lys
165                 170                 175
Tyr Trp Leu Gln Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys
180                 185                 190
Glu Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu
195                 200                 205
Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
210                 215                 220
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
225                 230                 235                 240
Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
245                 250                 255
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
260                 265                 270
Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
275                 280                 285
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
290                 295                 300
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
305                 310                 315                 320
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met
325                 330                 335
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
340                 345                 350
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
355                 360                 365
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
370                 375                 380
Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val
385                 390                 395                 400
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
405                 410                 415
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
420                 425
<210>    21
<211>    425
<212>    БЕЛОК
<213>    Искусственный белок
<220>
<223>    FceRIa ECD-шарнирная область-Fc2
<400>    21
Val Pro Gln Lys Pro Lys Val Ser Leu Asn Pro Pro Trp Asn Arg Ile
1               5                  10                  15
Phe Lys Gly Glu Asn Val Thr Leu Thr Cys Asn Gly Asn Asn Phe Phe
20                  25                  30
Glu Val Ser Ser Thr Lys Trp Phe His Asn Gly Ser Leu Ser Glu Glu
35                  40                  45
Thr Asn Ser Ser Leu Asn Ile Val Asn Ala Lys Phe Glu Asp Ser Gly
50                  55                  60
Glu Tyr Lys Cys Gln His Gln Gln Val Asn Glu Ser Glu Pro Val Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Glu Val Phe Ser Asp Trp Leu Leu Leu Gln Ala Ser Ala Glu Val
85                  90                  95
Val Met Glu Gly Gln Pro Leu Phe Leu Arg Cys His Gly Trp Arg Asn
100                 105                 110
Trp Asp Val Tyr Lys Val Ile Tyr Tyr Lys Asp Gly Glu Ala Leu Lys
115                 120                 125
Tyr Trp Tyr Glu Asn His Asn Ile Ser Ile Thr Asn Ala Thr Val Glu
130                 135                 140
Asp Ser Gly Thr Tyr Tyr Cys Thr Gly Lys Val Trp Gln Leu Asp Tyr
145                 150                 155                 160
Glu Ser Glu Pro Leu Asn Ile Thr Val Ile Lys Ala Pro Arg Glu Lys
165                 170                 175
Tyr Trp Leu Gln Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Gly
180                 185                 190
Ser Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu
195                 200                 205
Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
210                 215                 220
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
225                 230                 235                 240
Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
245                 250                 255
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
260                 265                 270
Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
275                 280                 285
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
290                 295                 300
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
305                 310                 315                 320
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met
325                 330                 335
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
340                 345                 350
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
355                 360                 365
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
370                 375                 380
Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val
385                 390                 395                 400
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
405                 410                 415
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
420                 425
<210>    22
<211>    444
<212>    БЕЛОК
<213>    Искусственный белок
<220>
<223>    FceRIa ECD-шарнирная область-Fc3
<400>    22
Val Pro Gln Lys Pro Lys Val Ser Leu Asn Pro Pro Trp Asn Arg Ile
1               5                  10                  15
Phe Lys Gly Glu Asn Val Thr Leu Thr Cys Asn Gly Asn Asn Phe Phe
20                  25                  30
Glu Val Ser Ser Thr Lys Trp Phe His Asn Gly Ser Leu Ser Glu Glu
35                  40                  45
Thr Asn Ser Ser Leu Asn Ile Val Asn Ala Lys Phe Glu Asp Ser Gly
50                  55                  60
Glu Tyr Lys Cys Gln His Gln Gln Val Asn Glu Ser Glu Pro Val Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Glu Val Phe Ser Asp Trp Leu Leu Leu Gln Ala Ser Ala Glu Val
85                  90                  95
Val Met Glu Gly Gln Pro Leu Phe Leu Arg Cys His Gly Trp Arg Asn
100                 105                 110
Trp Asp Val Tyr Lys Val Ile Tyr Tyr Lys Asp Gly Glu Ala Leu Lys
115                 120                 125
Tyr Trp Tyr Glu Asn His Asn Ile Ser Ile Thr Asn Ala Thr Val Glu
130                 135                 140
Asp Ser Gly Thr Tyr Tyr Cys Thr Gly Lys Val Trp Gln Leu Asp Tyr
145                 150                 155                 160
Glu Ser Glu Pro Leu Asn Ile Thr Val Ile Lys Ala Pro Arg Glu Lys
165                 170                 175
Tyr Trp Leu Gln Ala Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala
180                 185                 190
Thr Thr Ala Pro Ala Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu
195                 200                 205
Lys Lys Gly Ser Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys
210                 215                 220
Thr Pro Glu Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe
225                 230                 235                 240
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
245                 250                 255
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe
260                 265                 270
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
275                 280                 285
Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
290                 295                 300
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
305                 310                 315                 320
Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
325                 330                 335
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln
340                 345                 350
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
355                 360                 365
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
370                 375                 380
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
385                 390                 395                 400
Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu
405                 410                 415
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
420                 425                 430
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435                 440
<---