СПОСОБ ОЦЕНКИ ВЛИЯНИЯ АНТИТЕЛ IgG И IgM К ФОСФАТИДИЛСЕРИНУ В ПЛАЦЕНТЕ БЕРЕМЕННЫХ НА РАЗВИТИЕ АПОПТОЗА В СИНЦИТИОТРОФОБЛАСТЕ ВОРСИНОК ПЛАЦЕНТЫ ПРИ ОБОСТРЕНИИ ВО ВРЕМЯ БЕРЕМЕННОСТИ ГЕРПЕС-ВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ
METHOD OF ESTIMATING IMPACT OF IgG AND IgM ANTIBODIES TO PHOSPHATIDYLSERINE IN PLACENTA OF PREGNANT WOMEN AT DEVELOPMENT OF APOPTOSIS IN SYNCYOTROPHOBLAST OF PLACENTA PILI IN CASE OF EXACERBATION OF HERPES-VIRUS INFECTION DURING PREGNANCY

Цель исследования показать изменения содержания антител к фосфатидилсерину классов IgG и IgM в плаценте рожениц, перенесших в третьем триместре вспышку герпес-вирусной инфекции, сопровождающиеся увеличением числа ядер синцитиотрофобласта ворсинок плаценты, вступающих в апоптоз.
Клетку можно послать в апоптоз повреждающими факторами (продуктами перекисного окисления липидов, TNF α), действующими факторами извне. В этом случае важную роль играет фосфолипид фосфатидилсерин внешней поверхности мембраны. Транспортная АТФ-аза переносит фосфатидилсерин из наружного слоя плазматической мембраны во внутренний (Владимиров Ю.А., 1991; Князькин И.В., 2007; Скулачев В.П., 1999; 2001; Alareon-Segovia D., 1987).
В существующей литературе нет ссылок, указывающих на изменение содержания антител IgG и IgM к серину в плаценте при обострении во время беременности герпес-вирусной инфекции, приводящее к нарастанию ядер в синцитиотрофобласте ворсинок плаценты в состоянии апоптоза.
Заявленный способ имеет следующие приемы:
Исследовали гомогенат плаценты у 20 беременных, перенесших в третьем триместре вспышку герпес-вирусной инфекции, и 20 беременных, не болевших в течение всего периода гестации (контроль). Исследования проводились на базе стационара акушерского отделения клиники Дальневосточного научного центра физиологии и патологии дыхания СО РАМН. Все исследования были проведены с учетом требований Хельсинской декларации Всемирной ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с учетом человека» с поправками 2000 г. и «Правилами клинической практики в Российской Федерации», утвержденными Приказом Минздрава РФ от 19.06.2003 г. №266.
Морфологическая детекция апоптоза проводилась на парафиновых срезах плаценты по метке концов фрагментов ДНК in situ (ISEL - метод) [3]. Срезы после дегидратации в дистиллированной воде в течение 30 мин инкубируют в 3% растворе перекиси водорода и отмывают 0,15 M забуференным солевым раствором (PBS) (0,15 M NaCl на 0,1 М фосфатном буфере pH 7,5). Затем срезы инкубируют в смеси 0,3 М NaCl и 30 мМ цитрата натрия (pH 7,0; 80°C, 20 мин) и отмывают в 0,15 М PBS. После чего срезы инкубируют в растворе проназы при комнатной температуре в течение 30 мин (Calbiochem; 1 мг/мл на 0,15 M PBS). Отмывают в 0,15 М PBS и буфером A (50 мМ трис-гидрохлорид, 5 мМ хлорид магния, 10 мМ β-меркаптоэтанол и 0,005% раствор бычьего сывороточного альбумина (БСА), pH 7,5). Последовательно инкубируют (18°C, 2 час) в смеси из 4 нуклеотидов (0,01 мМ dATF, dCTF, dGTF; "Promega Madison WI", 0,001 мМ biotin-II-dUTP, "Sigma") и ДНК полимеразе-1 E coli (20 Ед/мл; "Promega"), до 2-3 см и толщиной 1 мм. Кусочки ткани помещали в химические стаканы, содержащие 200 мл физиологического раствора, отмывали приготовленной на буфере А. Затем отмывают буфером A, а вслед за ним 0,5 М PBS (0,5 М NaCl на 0,1 M фосфатном буфере pH 7,5). Окончательно срезы инкубируют с конъюгатом пероксидазы (Vectastam Elite ABC Kit-Vector, Burliname, CA), разведенным 1:25 0,5 M PBS, в который введены 1% БСА (бычьего сывороточного альбумина) и 0,5% твин-20, и в течение 10 мин окрашивают 0,04% раствором ДАБ (3,3-диаминобензидин тетрахлорид) на 0,05 M трис-буфере pH 7,5 и перекиси водорода в конечной концентрации 0,015% из 30% раствора. Промывают дистиллированной водой, обезвоживают и заключают в бальзам. Подсчет ядер, находившихся в состоянии апоптоза, проводился на 100 концевых ворсинках плаценты в каждом отдельно взятом случае. В подсчет на 100 ворсинок отбиралось 2000 ядер.
Для получения гомогената плодовая часть плаценты (ворсинчатый хорион) срезалась скальпелем небольшими пластинками площадью от клеток крови, перемешивая на магнитной мешалке в течение 15 мин и подсушивали на фильтрованной бумаге. Затем ткань растирали пестиком в фарфоровой ступке и гомогенизировали до однородной массы. К полеченному гомогенату добавляли ФР в объеме, равном изначальному весу ткани (на 1 г - 1 мл ФР). Взвесь помещали в пластиковые пробирки «Falcon» и подвергали замораживанию при -20°C в течение суток. Затем гомогенат размораживали и ультрацентрифугировали при 4000 об/мин при температуре +4°C. Недостаточную жидкость разливали мелкими аликвотами и хранили при -20°C до проведения иммуноферментного анализа.
Содержание антител к фосфатидилсерину классов IgG и IgM определяли с помощью твердофазного иммуноферментного анализа с использованием наборов компании «Bender MedSystems» (Austria). Верификацию вируса простого герпеса (ВПГ-1) и выраженность заболевания оценивали по динамике титров антител IgG с помощью стандартных тест-систем фирмы ЗАО «Вектор Бест», (Новосибирск). Анализ проводили на микропланшетном ридере «Stat-Fax-2100» (USA).
Статистическая обработка данных проводилась с использованием t-критерия Стьюдента.
Исследования показали, что обострение герпес-вирусной инфекции в третьем триместре беременности сопровождалось нарастанием в гомогенате плацент антител IgG и IgM к фосфатидилсерину. При титре антител к ВПГ-1 1:6400 отмечалось нарастание антител IgG и IgM к PS до 4,70±0,08 Ед/мл. Такие же высокие показатели антител IgG и IgM к PS определялись при титре антител к ВПГ-1 1:12800 - 5,60±0,06 Ед/мл (контроль - 2,50±0,07 Ед/мл).
Исследуя срезы плаценты после реакции ISEL, отмечено, что на 2000 ядер в ворсинках плаценты рожениц, перенесших герпес-вирусную инфекцию в третьем триместре при титре антител к вирусу герпеса - 1:6400, определяли 2,30±0,015% (контроль - 1,50±0,02%; p<0,001) ядер синцитиотрофобласта в состоянии апоптоза, а при титре 1:12800 количество ядер в состоянии апоптоза в синцитиотрофобласте увеличивалось до 4,50±0,20%.
Таким образом, вспышка герпес-вирусной инфекции во время беременности стимулирует выработку антител IgG и IgM к фосфатидилсерину (PS), что приводит к увеличению преждевременно вступающих в апоптоз ядер фетоплацентарного барьера.
Литература
1. Владимиров Ю.А. Свободные радикалы в живых системах / Ю.А.Владимиров, О.А.Азизова, А.И.Деев и др. // Итоги науки и техники. Сер. Биофизика. - 1991. - 29 т.
2. Князькин И.В. Апоптоз в онкоурологии / И.В.Князькин, В.Н.Цыган - Санк. Петерб.: «Наука». - 2007. - 240 с.
3. Погорелов В.М. Морфология апоптоза при нормальном и злокачественном гемопоэзе / В.М.Погорелов, Г.И.Козинец // Гематология и трансфузиология. - 1995. - т.43. - №5. - с.21-24.
4. Скулачев В.П. Феноптоз: запрограммированная смерть организма / В.П.Скулачев // Биохимия. - 1999. - 64 т. - Вып.12. - с.1679-1688.
5. Скулачев В.П. Явления запрограммированной смерти. Митохондрии, клетки и органы: роль активных форм кислорода / В.П.Скулачев // Соросовский образовательный журнал. 2001. №7. с.4-10.
6. Alareon-Segovia D. Antiphospholipid antibodies and the antiphospholipid syndrome in systemic lupus erythematosus. A perspective analysis of 500 consecutive patients, D. Alareon-Segovia, M. Debze // Medicine, 1987 v.68, p.353-365.