СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ПЛАНКТОННОЙ ХЛОРЕЛЛЫ
METHOD OF CULTIVATION OF PLANKTON CHLORELLA

Область применения
Изобретение относится к биотехнологии, способу культивирования микроводорослей, преимущественно планктонной хлореллы, используемой в качестве корма для сельскохозяйственных животных.
Уровень техники
Известен способ культивирования микроводорослей с использованием целлюлозосодержащего вещества: соломы, камыша, рогоза, линтерной пыли и аэробных целлюлозоразрушающих бактерий Vibrio vulgaris с плотностью 1-3 млн/мл (а.с. SU 716541). Недостатки способа: длительный срок культивирования, который составляет шесть суток, и низкий выход биомассы - 0,5 г/л.
Известен способ культивирования микроводорослей на основе штамма Chlorella vulgaris ИФР № С-111, предусматривающий разлив питательной среды в емкости, инокуляцию суспензии штаммом, освещением культуральной емкости в процессе роста микроводорослей и поддержание необходимой температуры суспензии (патент RU 2176667). Недостатки способа: сравнительно длительный период культивирования, который составляет четверо суток, и продолжительное ежесуточное освещение, равное 20-22 часам.
Известен способ культивирования хлореллы на питательной среде, содержащей минеральные соли и жидкие отходы, образующиеся при варке и бланшировании картофеля на картофелеперерабатывающих предприятиях. Такой способ позволяет получить суспензию хлореллы с численностью 193,75 млн клеток/мл и сухой биомассой 4,52 г/л (а.с. SU 1373728). Недостаток способа заключается в трудоемкости приготовления питательной среды, что связано с трехкратной дробной стерилизацией в автоклаве.
Наиболее близким аналогом предлагаемого изобретения (прототип) является способ культивирования хлореллы на питательной среде, содержащей марганцовокислый калий, хлористый кобальт и зерно-картофельную барду, которая образуется при производстве спирта. Готовую питательную среду стерилизуют в течение 30 минут. В период светового выращивания водорослей культуру перемешивают воздухом (патент BY 6970). Недостаток способа: необходимость стерилизации питательной среды и барботирования культуры воздухом в светлый период выращивания.
Раскрытие изобретения
Цель данного изобретения состоит в разработке способа культивирования планктонной хлореллы с возможностью получения продукции, различающейся по содержанию биомассы для дифференцированного использования в качестве корма различным возрастным группам и категориям животных.
Техническим результатом настоящего изобретения является продукция, различающаяся по биомассе, получаемая за суточный период культивирования в режиме двух световых и одной темновой фазы фотосинтеза с использованием питательной среды из минеральных и органических компонентов.
Описание изобретения
Готовят питательную среду (1) на один литр водопроводной воды при следующем соотношении компонентов:
- минеральных
1. Аммиачная селитра 0,4 г;
2. Аммофос, 15% раствор 0,2 мл;
3. Железо хлорид, 1% раствор 0,15 мл;
4. Кобальт азотнокислый, 0,01% раствор 0,5 мл;
5. Медь сернокислая, 0,01% раствор 0,5 мл;
6. Магний сернокислый 0,3 г;
7. Калий сернокислый, 12% раствор 0,5 мл;
- органических
1. Фильтрат настоя голозерного овса (рН 3,5-5,0),
этап культивирования: I - 35,0 мл; II - 50,0 мл; III - 60,0 мл;
2. Фугат зерновой послеспиртовой барды (рН 4,2-4,5),
этап культивирования: I - 50,0 мл; II - 60,0 мл; III - 85,0 мл.
Фильтрат настоя голозерного овса. Зерно голозерного овса в соотношении 1:2 заливают минеральной питательной средой. Например, на 1 кг голозерного овса берут два литра минеральной питательной среды. Настаивают в течение одних суток при температуре 28-30°С. По истечении срока жидкую часть отцеживают через сетчатый фильтр и замеряют рН, который должен быть от 3,5 до 5,0. К голозерному овсу после сцеживания доливают минеральную питательную среду в количестве, равном слитой жидкой части. Срок использования голозерного овса для приготовления настоя составляет 1-2 месяца, причем за весь указанный срок рН не должен быть выше 5,0. По истечении срока использованный голозерный овес удаляют и заменяют на новый.
Фугат зерновой послеспиртовой барды. Фугат является отходом спиртового производства. Послеспиртовая барда представлена твердой и жидкой фазами. Жидкая фаза - фугат - прозрачный окрашенный в светло-коричневый цвет фильтрат. Он состоит из водного раствора минеральных и органических веществ (г/л): минеральные соли 1,24-1,52, сырой протеин 8,6-8,8, жиры 0,4-0,6. Химический состав минеральных солей (мг/л): общий азот 283. фосфаты 80, сульфаты 366. хлориды 454, железо общее 68. Органические вещества представлены пептидами, аминокислотами, неутилизированными сахарами и органическими кислотами. Фугат имеет рН в пределах 4,2-4,5. Срок хранения фугата до трех лет при температуре от 2 до 7°С.
Приготовленную таким образом питательную среду и исходный посевной материал культуры заливают в стеклянный сосуд в соотношении по 50% каждого и замеряют рН, при необходимости доводят до 7,0. Далее включают освещение лампами ДРИ-250 или ДНаТ-250, при этом температуру суспензии выдерживают в пределах 28-30°С. В процессе культивирования используются световой и темновой периоды фотосинтеза, которые состоят из двух световых и одной темновой фазы, при этом каждый световой период составляет 10 часов, а между ними темновая фаза равняется 4 часам. Таким образом, на культивирование затрачивается 24 часа. Последующие этапы культивирования проводятся в таком же режиме освещения.
По предлагаемому способу предусмотрено три этапа культивирования (таблица 1), которые отличаются внесением в питательную среду органических компонентов: на этапе I добавляют 35 мл/л фильтрата голозерного овса (рН 3,5-5,0) и 50 мл/л фугата зернового послеспиртовой барды (рН 4,2-4,7) соответственно, на этапе II - 50 и 60 мл/л и на этапе III - 60 и 85 мл/л соответственно.
Для каждого этапа исходным материалом является суспензия хлореллы, полученная в предыдущем этапе культивирования. После выхода на конечную продукцию любого из этапов для его продолжения используется полученная суспензия. Различающаяся по содержанию биомассы продукция предназначена для дифференцированного использования в качестве корма различным возрастным группам и категориям животных (грамм сухой биомассы в 1 литре суспензии хлореллы):
- птица - 1,5;
- свиньи - 2,0;
- крупный рогатый скот - 2,3.
Культивирование планктонной хлореллы приспособлено к освещению лампами или использованию солнечного света. При использовании солнечного света культивирование ведется так же в две световых и одну темновую фезу. Каждая световая фаза равна по длительности периоду дневного солнечного освещения. Темновая фаза длится с периода наступления темноты до рассвета. Таким образом, при использовании солнечного освещения на культивирование тратится 2 световых дня и 1 ночь. При этом необходимо следить за температурой суспензии, не допуская превышения 30°С.
Предлагаемый способ не требует подачи углекислого газа и барботирования культуры воздухом, а также исключает постоянное перемешивание суспензии.
Органический комплекс питательной среды, состоящий из фугата и фильтрата настоя голозерного овса, является основой для образования бактериально-альгологического микробиоценоза, что в значительной мере ускоряет биологические процессы в высокопродуктивной экосистеме аквакультуры [Богданов Н.И., Эгамов М.С., 1993 (стр. 26)].
Пример 1
Проводят I этап культивирования микроводорослей (таблица 1) с использованием установки для непрерывного выращивания планктонных водорослей (патент RU 2571939). В качестве маточной культуры используют штамм Chlorella vulgaris ИФР № С-111 (патент RU 1751981) с исходной плотностью суспензии 1,0 г/л сухой биомассы. Используется питательная среда (1), в состав которой входят минеральные и органические компоненты. Соотношение питательной среды и маточной культуры 1:1. Замеряют рН суспензии и при необходимости доводят до 7,0. Включают освещение, при этом температуру суспензии выдерживают в пределах 28-30°C. Первый световой период составляет 10 часов. Для исполнения темнового периода освещение выключают на 4 часа. Второй световой период, так же, как и первый, составляет 10 часов. Срок культивирования равен 24 часам. Готовую культуру сливают в приемную емкость. Выход сухой биомассы составляет 1,5 г/л. Клетки в культуре на I этапе образуют по 2-4 автоспоры. Полученная продукция может использоваться в качестве корма для сельскохозяйственных животных, преимущественно птицы.
Пример 2
Проводят II этап культивирования микроводорослей (таблица 1). Исходным материалом для засева является продукция, полученная на I этапе. Культивирование осуществляется по примеру 1. Клетки в культуре на II этапе образуют по 4-8 автоспоры. Выход сухой биомассы составляет 2 г/л. Полученная продукция может использоваться в качестве корма для сельскохозяйственных животных, преимущественно свиней.
Культивирование осуществляется по примеру 1. Клетки в культуре на III этапе образуют по 8-16 автоспор. Выход сухой биомассы составляет 2,3 г/л. Полученная продукция может использоваться в качестве корма для сельскохозяйственных животных, преимущественно крупного рогатого скота.
Пример 4
Культивирование хлореллы с использованием солнечного освещения выполняется в соответствии с таблицей 1 для каждого этапа в двух вариантах. Первый вариант при использовании солнечного освещения состоит из двух дней и одной ночи. По второму варианту днем используется солнечный свет в течение 10 часов, далее 4 часа темновая фаза, и для второй световой фазы используются лампы. Второй вариант позволяет сократить выращивание хлореллы на 12 часов по сравнению с первым.
По предлагаемому способу планктонная хлорелла растет в условиях монокультуры, устойчива и невосприимчива к фагам, агглютинация клеток отсутствует, автолиз не наблюдается.
Таким образом, предложенный способ культивирования планктонной хлореллы позволяет получить продукцию, различающуюся по содержанию биомассы для дифференцированного использования в качестве корма различным возрастным группам и категориям животных. Питательная среда, включающая в состав минеральные и органические компоненты, за суточный срок с использованием двух световых и одного темнового периода, дает возможность сократить срок выращивания хлореллы в 4-6 раз.
Источники информации
1. Авторское свидетельство СССР 716541 от 31 июля 1978 г., кл. C12N 1/12. Способ выращивания микроводорослей. Богданов Н.И., Елсуков И.Е. 25.02.80. Бюл. №7.
2. Патент РФ 2176667 от 21 апреля 2000 г., кл. C12N 1/12. Культивирование микроводорослей на основе штамма «Chlorella vulgaris ИФР № С-111». Богданов Н.И., Куницын М.В. 1012.2001. Бюл. №34.
3. Авторское свидетельство СССР 1373728 от 26 июня 1986 г., кл. C12N 1/12. Способ культивирования хлореллы. Грищенко Т.П. и др. 15.02.88. Бюл. №6.
4. Патент РБ 6970 от 29 декабря 2001 г., кл. C12N 1/12. Способ культивирования хлореллы. Сенникова В.Д. и др. 30.03.2005 (прототип).
5. Патент РФ 2571939 от 15 апреля 2015 г, кл. С12М 1/00. Установка для непрерывного выращивания планктонных водорослей. Богданов Н.И. 27.12.2015. Бюл. №36.
6. Патент РФ 1751981 от 14 декабря 1987 г. кл. 6 C12N 1/12. Штамм микроводоросли Chlorella vulgaris - продуцент биомассы. Богданов Н.И. 10.02.1997. Бюл. №4.
7. Богданов Н.И., Эгамов М.С. Микробиологические процессы и рыбоводные результаты интенсивно эксплуатируемых прудов Таджикистана. Деп. ВИНИТИ №197-В93, 1993. - С. 80.