КОМБИНИРОВАННАЯ ТЕРАПИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ИНФЕКЦИЙ ВГВ
COMBINED THERAPY FOR TREATING HEPATITIS B INFECTIONS

РОДСТВЕННАЯ ЗАЯВКА
В настоящей заявке заявлен приоритет согласно предварительной заявке на патент США № 61/936242, поданной 5 февраля 2014 года, полное содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Хроническая инфекция вируса гепатита В (ВГВ) представляет собой значительную глобальную медицинскую проблему, от которой страдает более 5% мирового населения (свыше 350 миллионов людей во всем мире и 1,25 миллиона людей в США).
Несмотря на доступность профилактической вакцины ВГВ, бремя хронической инфекции ВГВ продолжает быть существенной неудовлетворенной глобальной медицинской проблемой вследствие неоптимальных возможностей лечения и неизменных темпов возникновения новых инфекций в большинстве регионов развивающегося мира. Существующие средства лечения редко обеспечивают исцеление и ограничены лишь двумя классами агентов (аналоги интерферона и нуклеозидные аналоги/ингибиторы вирусной полимеразы); их действие ограничено лекарственной устойчивостью, низким показателем эффективности лечения и проблемами переносимости. Низкие показатели эффективности ВГВ могут быть связаны по меньшей мере отчасти с неполным подавлением репликации ВГВ и с наличием и стойкостью ковалентно замкнутой кольцевой ДНК (кзкДНК) в ядрах инфицированных гепатоцитов. Однако устойчивое подавление ДНК ВГВ замедляет прогрессирование болезни печени и способствует предотвращению гепатоклеточной карциномы. Таким образом, существующая терапия ориентирована на ВГВ-инфицированных пациентов и направлена на снижение ДНК ВГВ в сыворотке до низких или не обнаруживаемых уровней и, в конечном итоге, на уменьшение или предупреждение развития цирроза и гепатоклеточной карциномы.
Несмотря на то, что существует прецедент улучшенной эффективности применения комбинированных схем лечения других вирусных заболеваний, таких как ВИЧ и ВГС, комбинирование существующих лекарств против ВГВ оказалось неспособным продемонстрировать улучшенную эффективность. Ни комбинации интерферона α (IFN) с нуклеоз(т)идными ингибиторами полимеразы, ни комбинации нуклеоз(т)идных ингибиторов полимеразы не обеспечивают улучшенную эффективность лечения ВГВ в сравнении с монотерапией.
Таким образом, в данной области техники сохраняется потребность в улучшенных терапиях для лечения инфекции ВГВ.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В настоящем документе предложена комбинированная терапия, содержащая ингибитор сборки капсида и интерферон. Комбинированная терапия подходит для лечения инфекции ВГВ. Указанная комбинация неожиданно обеспечивает дополнительную эффективность подавления репликации вируса ВГВ в сравнении с монотерапией интерфероном, энтекавиром или соединением Формулы I.
Соответственно, в одном аспекте предложен способ лечения инфекции ВГВ у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение субъекту ингибитора сборки капсида и интерферона. В одном из вариантов реализации интерферон выбран из группы, состоящей из интерферона альфа, интерферона альфа-2a, рекомбинантного интерферона альфа-2а, пегинтерферона альфа-2а, интерферона альфа-2b, рекомбинантного интерферона альфа-2b, интерферона альфа-2b XL, пегинтерферона альфа-2b, гликозилированного интерферона альфа-2b, интерферона альфа-2с, рекомбинантного интерферона альфа-2с, интерферона бета, интерферона бета-1а, пегинтерферона бета-1а, интерферона дельта, интерферона лямбда, пегинтерферона лямбда-1, интерферона омега, интерферона тау, гамма-интерферона, интерферона альфакон-1, интерферона альфа-nl, интерферона альфа-n3, альбинтерферона альфа-2b, BLX-883, DA-3021, ПЭГ-инфергена и BELEROFON. В другом варианте реализации интерферон выбран из группы, состоящей из пегинтерферона альфа-2а, пегинтерферона альфа-2b, гликозилированного интерферона альфа-2b, пегинтерферона бета-1а и пегинтерферона лямбда-1. В конкретном варианте реализации интерферон представляет собой пегинтерферон альфа-2а.
В одном из вариантов реализации указанного способа ингибитор сборки капсида представляет собой соединение Формулы I:
или его фармацевтически приемлемую соль.
В другом аспекте предложен способ лечения инфекции ВГВ у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение субъекту пегинтерферона альфа-2а и соединения Формулы I:
или его фармацевтически приемлемой соли.
В одном из вариантов реализации пегинтерферон альфа-2а и соединение Формулы I находятся в одной композиции или единичной лекарственной форме. В другом варианте реализации указанный способ дополнительно включает фармацевтически приемлемый носитель. В другом варианте реализации пегинтерферон альфа-2а и соединение Формулы I вводят по отдельности. В другом варианте реализации указанный способ включает введение пегинтерферона альфа-2а и соединения Формулы I по существу одновременно.
В другом варианте реализации лечение включает введение пегинтерферона альфа-2а и соединения Формулы I в разное время. В одном из вариантов реализации субъекту вводят пегинтерферон альфа-2а, затем вводят соединение Формулы I. В другом варианте реализации субъекту вводят соединение Формулы I, затем вводят пегинтерферон альфа-2а. В другом варианте реализации пегинтерферон альфа-2а и соединение Формулы I находятся в разных композициях или единичных лекарственных формах.
В одном из вариантов реализации любых описанных выше способов субъектом является человек.
В одном аспекте предложена композиция, содержащая пегинтерферон альфа-2а и соединение Формулы I:
или его фармацевтически приемлемую соль.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
На фиг. 1 представлен линейный график снижения вирусной нагрузки относительно исходного значения (Log
; ордината) в зависимости от времени (дни; абсцисса) в гуманизированной мышиной модели uPa-SCID инфекции ВГВ. Мышиным субъектам вводили определенные количества: только ингибитора капсида; только энтекавира (ETV); только пегилированного интерферона α (IFN) (PEGASYS); смеси ингибитора капсида и энтекавира (ингибитор капсида+ETV); или смеси ингибитора капсида и интерферона (ингибитор капсида+ПЭГ-IFNα). Контрольным субъектам вводили только диметилсульфоксид (ДМСО). N=6
10
10
На фиг. 2 представлена линейная диаграмма ДНК ВГВ (Log копий/мл; ордината) в зависимости от времени (дни; абсцисса) в мышиной модели инфекции ВГВ генотипа С человеческой химерной печени.Мышиным субъектам вводили определенные количества: только ингибитора капсида; пегилированного интерферона α (ПЭГ-IFNα) (PEGASYS); или смеси ингибитора капсида и пегилированного интерферона α (ингибитор капсида+ПЭГ-IFNα).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Было обнаружено, что введение комбинации соединения Формулы I или его фармацевтически приемлемой соли и пегинтерферона альфа-2а (PEGASYS) или другого аналога интерферона обеспечивает неожиданный, улучшенный эффект лечения инфекции ВГВ у субъекта. Такой подход - комбинированное или совместное введение двух типов агентов - может быть подходящим для лечения индивидуумов, страдающих от инфекции ВГВ, которые не отвечают на современные терапии или являются устойчивыми к ним. Комбинированная терапия, содержащая соединение Формулы I и пегинтерферон альфа-2а или другой аналог интерферона, предложенная в настоящем документе, также подходит для улучшения эффективности и/или снижения побочных эффектов современных терапий ВГВ для индивидуумов, отвечающих на указанные терапии.
Некоторые термины, используемые в настоящем документе, описаны ниже. Соединения согласно настоящему изобретению описаны по стандартной номенклатуре. Если не определено иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют то же значение, которое обычно подразумевается специалистом в области, к которой относится настоящее изобретение.
Комбинированная терапия
В настоящем документе предложена комбинация терапевтических агентов и способы введения комбинации агентов для лечения инфекции ВГВ. В данном контексте «комбинация агентов» и аналогичные термины относятся к комбинации двух типов агентов: (1) соединения Формулы I или его фармацевтически приемлемой соли и (2) пегинтерферона альфа-2а или другого аналога интерферона.
Пегилированный интерферон альфа-2а или пегинтерферон альфа-2а представляет собой конъюгат поли(этиленгликоля) (ПЭГ) и интерферона альфа-2а. Одно из торговых названий пегилированного интерферона альфа-2а PEGASYS. Композиции пегилированного интерферона альфа-2а и/или способы получения пегилированного интерферона альфа-2а описаны, например, в US 5382657, US 5762923 и WO 08/145323, каждый из которых включен в настоящий документ посредством ссылки. Пегилированный интерферон альфа-2а может быть получен по способам, описанным в указанных ссылках.
Соединения Формулы I подходят для лечения и предупреждения ВГВ у людей. В одном аспекте соединения согласно настоящему изобретению подходят для лечения ВГВ посредством связывания с капсидным белком ВГВ, тем самым нарушая все или часть функций капсидного белка ВГВ, которые он выполняет в репликации и стойкости ВГВ, например, разрушая, ускоряя, сокращая отсрочку и/или подавляя нормальную сборку вирусного капсида и/или разборку незрелых или зрелых частиц, тем самым инициируя аберрантную морфологию капсида и приводя к противовирусному действию, такому как нарушение сборки вириона и/или разборки и/или созревания вириона, и/или выход вируса, и/или выработка, поддержание или транскрипция кзкДНК, и/или модулирование врожденного иммунного ответа хозяина.
Сборка капсида играет ключевую роль в репликации генома ВГВ. ВГВ полимераза связывает прегеномную РНК ВГВ (пгРНК), и инкапсулирование пгРНК должно происходить до синтеза ДНК ВГВ. Кроме того, общепризнано, что скопление в ядре промежуточного соединения репликации кзкДНК, которое отвечает за сохранение постоянной репликации ВГВ в присутствии нуклеозидной подавляющей терапии, требует движения ДНК ВГВ в ядро капсида. Таким образом, ингибиторы ядра ВГВ или агенты, нарушающие сборку капсида, согласно настоящему изобретению могут увеличивать функциональные показатели эффективности лечения ВГВ за счет улучшенного подавления репликации вирусного генома и за счет подавления кзкДНК при использовании отдельно или в комбинации с существующими лекарствами против ВГВ, такими как интерфероны и нуклеоз(т)идные ингибиторы. Ингибиторы ядра или агенты, нарушающие сборку капсида, согласно настоящему изобретению, могут также изменять нормальное разрушение капсидного белка, потенциально приводя к изменению презентации антигена MHC-1, что, в свою очередь, может приводить к увеличению скорости сероконверсии/эрадикации посредством иммуностимулирующей активности, более эффективно выводя инфицированные клетки. Таким образом, соединения согласно настоящему изобретению могут связываться с капсидным белком ВГВ и изменять функцию белка посредством взаимодействия с ним, ускорения, замедления, нарушения или иного изменения функций, связанных с капсидным белком ВГВ.
Соединения, применимые с настоящим изобретением, могут быть синтезированы с помощью технологий, хорошо известных в области органического синтеза. Исходные материалы и промежуточные соединения, необходимые для синтеза, могут быть приобретены из коммерческих источников или синтезированы в соответствии со способами, известными специалистам в данной области техники.
В одном аспекте комбинированная терапия содержит соединение Формулы I:
или его фармацевтически приемлемую соль;
где
4
1
6
R представляет собой H или C-C алкил;
5
9
9
9
9
9
9
8
8
8
8
8
8
9
9
8
8
3
1
6
2
m
m
m
2
m
2
m
m
m
2
m
2
m
2
m
2
m
2
m
m
m
m
2
m
2
2
1
6
1
6
1
6
где каждый R в каждом случае независимо выбран из группы, состоящей из CH, C-C алкокси, галогена, -CN, -NO, -(L)-SR, -(L)-S(=O)R, -(L)-S(=O)R, -(L)-NHS(=O)R, -(L)-C(=O)R, -(L)-OC(=O)R, -(L)COR, -(L)-OCOR, -(L)-N(R), -(L)-C(=O)N(R), -(L)-OC(=O)N(R), -(L)-NHC(=O)NH(R), -(L)-NHC(=O)R, -(L)-NHC(=O)OR, -(L)-C(OH)(R), -(L)C(NH)(R), -C-C галогеналкила, -C-C дигалогеналкила и -C-C тригалогеналкила;
1
3
3
7
1
3
m
1
3
m
1
3
m
1
3
m
L в каждом случае независимо представляет собой двухвалентный радикал, выбранный из -(C-C алкилен)-, -(C-C циклоалкилен)-, -(C-C алкилен)-O-(C-C алкилен)- или -(C-C алкилен)-NH-(C-C алкилен)-;
8
2
1
6
1
6
1
6
1
6
1
6
3
10
3
10
1
4
3
10
1
4
3
10
1
4
1
4
каждый R в каждом случае независимо представляет собой H, C-C алкил, -C-C галогеналкил, -C-C дигалогеналкил, -C-C тригалогеналкил, C-C гетероалкил, C-C циклоалкил, C-C гетероциклоалкил, арил, гетероарил, -C-C алкил-(C-C циклоалкил), -C-C алкил-(C-C гетероциклоалкил), -C-C алкил-(арил) или -C-C алкил(гетероарил), и где алкил, гетероалкил, циклоалкил, гетероциклоалкил, арил и гетероарил необязательно замещен 1-5 заместителями, выбранными из R;
9
2
1
6
1
6
1
6
1
6
1
6
3
10
3
10
1
4
3
10
1
4
3
10
1
4
1
4
R представляет собой C-C алкил, -C-C галогеналкил, -C-C дигалогеналкил, -C-C тригалогеналкил, C-C гетероалкил, C-C циклоалкил, C-C гетероциклоалкил, арил, гетероарил, -C-C алкил-(C-C циклоалкил), -C-C алкил-(C-C гетероциклоалкил), -C-C алкил-(арил) или -C-C алкил-(гетероарил), и где алкил, гетероалкил, циклоалкил, гетероциклоалкил, арильное или гетероарильное кольцо необязательно замещено 0-5 заместителями, выбранными из R;
10
2
1
6
1
6
1
6
1
6
1
6
1
6
3
10
3
10
1
4
3
10
1
4
3
10
1
4
1
4
R представляет собой OH, C-C алкил, C-C алкил -OH, -C-C глогеналкил, -C-C дигалогеналкил, -C-C тригалогеналкил, C-C гетероалкил, C-C циклоалкил, C-C гетероциклоалкил, арил, гетероарил, -C-C алкил-(C-C циклоалкил), -C-C алкил-(C-C гетероциклоалкил), -C-C алкил-(арил) или -C-C алкил-(гетероарил), и где алкил, гетероалкил, циклоалкил, гетероциклоалкил, арильное или гетероарильное кольцо необязательно замещено 1-5 заместителями, выбранными из R;
11
2
1
3
1
3
R представляет собой связь или C-C алкилен, где C-C алкилен необязательно замещен 1-3 заместителями, выбранными из R;
2
2
1
6
1
6
1
6
1
6
1
6
1
6
1
6
R в каждом случае независимо выбран из группы, состоящей из OH, галогена, -CN, -NO, -C-C алкила, -C-C алкокси, -C-C галогеналкила, -C-C дигалогеналкила, -C-C тригалогеналкила, -C-C гетероалкила и C(O) -C-C алкила;
w равен 0, 1 или 2;
x в каждом случае независимо выбран из группы, состоящей из 0, 1, 2, 3 и 4;
y в каждом случае независимо выбран из группы, состоящей из 1, 2 и 3;
z в каждом случае независимо выбран из группы, состоящей из 0, 1, 2 и 3;
m в каждом случае независимо равен 0, 1 или 2.
2
2
1
6
1
6
1
6
1
6
1
6
1
6
1
6
В одном из вариантов реализации Формулы I R в каждом случае независимо выбран из группы, состоящей из галогена, -CN, -NO, -C-C алкила, -C-C алкокси, -C-C галогеналкила, -C-C дигалогеналкила, -C-C тригалогеналкила, -C-C гетероалкила и C(O) -C-C алкила;
В одном из вариантов реализации соединения Формулы I имеют Формулу IVa:
или его фармацевтически приемлемая соль.
В вариантах реализации Формул I или IVa
5
3
1
6
2
1
6
1
6
1
6
каждый R в каждом случае независимо выбран из группы, состоящей из CH, C-C алкокси, галогена, -CN, -NO, -C-C галогеналкила, -C-C дигалогеналкила, -C-C и тригалогеналкила;
10
2
1
6
1
6
1
6
1
6
1
6
1
6
1
6
1
6
1
6
3
10
3
10
1
4
3
10
1
4
3
10
1
4
1
4
R представляет собой OH, галоген, C-C алкил, C-C алкил-OH, -C-C хлоралкил, -C-C дихлоралкил, -C-C трихлоралкил, -C-C фторалкил, -C-C дифторалкил, -C-C трифторалкил, C-C гетероалкил, C-C циклоалкил, C-C гетероциклоалкил, арил, гетероарил, -C-C алкил-(C-C циклоалкил), -C-C алкил-(C-C гетероциклоалкил), -C-C алкил-(арил) или -C-C алкил-(гетероарил), и где алкил, гетероалкил, циклоалкил, гетероциклоалкил, арильное или гетероарильное кольцо необязательно замещено 1-5 заместителями, выбранными из R;
11
2
1
3
1
3
R представляет собой связь или C-C алкилен, где C-C алкилен необязательно замещен 1-3 заместителями, выбранными из R;
2
2
1
6
1
6
1
6
1
6
1
6
1
6
R в каждом случае независимо выбран из группы, состоящей из галогена, -CN, -NO, -C-C алкила, -C-C алкокси, -C-C фторалкила, -C-C гетероалкила, C(O)-C-C алкила и C(O)-C-C алкокси.
5
3
1
6
В других вариантах реализации Формул I или IVa каждый R в каждом случае независимо выбран из группы, состоящей из CH, C-C алкокси, галогена, фторметила, дифторметила, трифторметила, хлорметила, дихлорметила и трихлорметила;
10
2
1
6
1
6
1
6
1
6
1
6
1
6
3
10
3
10
1
4
3
10
1
4
3
10
1
4
1
4
R представляет собой OH, галоген, C-C алкил, C-C алкил-OH, C-C фторалкил, C-C дифторалкил, C-C трифторалкил, C-C гетероалкил, C-C циклоалкил, C-C гетероциклоалкил, арил, гетероарил, -C-C алкил-(C-C циклоалкил), -C-C алкил-(C-C гетероциклоалкил), -C-C алкил-(арил) или -C-C алкил-(гетероарил), и где алкил, гетероалкил, циклоалкил, гетероциклоалкил, арильное или гетероарильное кольцо необязательно замещено 1-5 заместителями, выбранными из R;
11
1
3
R представляет собой связь или C-C алкилен;
2
2
1
6
1
6
1
6
1
6
1
6
1
6
R в каждом случае независимо выбран из группы, состоящей из галогена, -CN, -NO, -C-C алкила, -C-C алкокси, -C-C фторалкила, -C-C гетероалкила и C(O)-C-C алкила, и C(O)-C-C алкокси.
5
5
y
3
2
2
3
В других вариантах реализации Формул I и IVa, R (т.е. (R)) представляет собой 3-F, 3-Cl, 3-CH, 3-CHF, 3-CHF, 4-F, 3-CH-4-F, 3-Cl-4-F, 3-Br-4-F, 3,4,5-трифтор, 3,4,5-трихлор или 3-хлор-4,5-дифтор. В другом варианте реализации w равен 1 или 2.
В других вариантах реализации Формул I и IVa
11
1
3
R представляет собой связь или C-C алкилен;
10
1
6
1
6
1
6
1
6
1
6
1
6
1
6
1
6
3
10
3
10
3
10
3
10
1
6
1
6
R представляет собой OH, галоген, C-C алкил, C-C алкил-OH, -C-C хлоралкил, -C-C дихлоралкил, -C-C трихлоралкил, -C-C фторалкил, -C-C дифторалкил, -C-C трифторалкил, C-C циклоалкил, C-C гетероциклоалкил или фенил, где C-C циклоалкильные, C-C гетероциклоалкильные или фенильные группы необязательно замещены 1-5 заместителями, выбранными из галогена, -C-C алкила и -C-C алкокси; и
z равен 0 или 1.
В другом варианте реализации соединения Формулы I имеют Формулу IVb:
или их фармацевтически приемлемые соли;
1
3
3
3
3
2
2
2
2
3
где G в каждом случае независимо выбран из CH, OCH, галогена, CF, CCl, CHCl, CClH, CFH, CHF и CF;
2
1
4
Gпредставляет собой H, C-C алкил или галоген;
3
2
2
2
G представляет собой OH, CHOH или CHCHOH;
4
1
6
1
6
1
6
1
6
1
6
1
6
1
6
1
6
1
6
1
6
G представляет собой H, OH, галоген, C-C алкил, C-C алкил-OH, -C-C хлоралкил, -C-C дихлоралкил, -C-C трихлоралкил, -C-C фторалкил, -C-C дифторалкил, -C-C трифторалкил или фенил, где фенильная группа необязательно замещена 1-5 заместителями, выбранными из галогена, -C-C алкила и -C-C алкокси; и
y равен 1, 2 или 3.
1
3
3
2
2
2
2
3
В одном из вариантов реализации Формулы IVb, G в каждом случае независимо выбран из галогена, CF, CCl, CHCl, CClH, CFH, CHF и CF.
В другом варианте реализации соединения Формулы I имеют Формулу IVc:
или их фармацевтически приемлемые соли;
где X представляет собой галоген;
1
G представляет собой водород или галоген;
2
1
4
Gпредставляет собой H, C-C алкил или галоген; и
4
1
4
G представляет собой H, галоген, C-C алкил или OH.
2
2
1
4
В одном из вариантов реализации Формулы IVc, Gпредставляет собой C-C алкил или галоген, и при этом G находится в 2, 3 или 4 положении фенильного кольца.
В конкретном варианте реализации соединение Формулы I представляет собой соединение, представленное в следующей таблице, или его фармацевтически приемлемую соль:
<b>Структура МС (M+H)</b><sup><b>+</b></sup>
<b>ID соединения</b>
<b>Структура МС (M+H)</b><sup><b>+</b></sup>
<b>ID соединения</b>
<img file="00000008.jpg" he="52" wi="38" img-content="undefined" img-format="jpg" />
960_D1
<img file="00000009.jpg" he="51" wi="33" img-content="undefined" img-format="jpg" />
960_D2
<img file="00000010.jpg" he="43" wi="33" img-content="undefined" img-format="jpg" />433
890
<img file="00000011.jpg" he="44" wi="34" img-content="undefined" img-format="jpg" />449/451
893
<img file="00000012.jpg" he="51" wi="35" img-content="undefined" img-format="jpg" />
946_D1
<img file="00000013.jpg" he="46" wi="32" img-content="undefined" img-format="jpg" />
946_D2
<img file="00000014.jpg" he="49" wi="32" img-content="undefined" img-format="jpg" />
925
<img file="00000015.jpg" he="46" wi="33" img-content="undefined" img-format="jpg" />
1080
<img file="00000016.jpg" he="45" wi="33" img-content="undefined" img-format="jpg" />
1084_D1
<img file="00000017.jpg" he="45" wi="30" img-content="undefined" img-format="jpg" />
1084_D2
<img file="00000018.jpg" he="54" wi="33" img-content="undefined" img-format="jpg" />
1085
<img file="00000019.jpg" he="53" wi="33" img-content="undefined" img-format="jpg" />
1088
<img file="00000020.jpg" he="52" wi="34" img-content="undefined" img-format="jpg" />
1100
<img file="00000021.jpg" he="49" wi="32" img-content="undefined" img-format="jpg" />
1161
<img file="00000022.jpg" he="56" wi="38" img-content="undefined" img-format="jpg" />
916
<img file="00000023.jpg" he="50" wi="33" img-content="undefined" img-format="jpg" />
1057
<img file="00000024.jpg" he="47" wi="31" img-content="undefined" img-format="jpg" />
1060
<img file="00000025.jpg" he="49" wi="34" img-content="undefined" img-format="jpg" />
1081_D1
<img file="00000026.jpg" he="47" wi="33" img-content="undefined" img-format="jpg" />
1081_D2
<img file="00000027.jpg" he="50" wi="34" img-content="undefined" img-format="jpg" />
1130
<img file="00000028.jpg" he="48" wi="32" img-content="undefined" img-format="jpg" />
1135_D1
<img file="00000029.jpg" he="49" wi="31" img-content="undefined" img-format="jpg" />
1135_D2
<img file="00000030.jpg" he="46" wi="33" img-content="undefined" img-format="jpg" />
1073
<img file="00000031.jpg" he="48" wi="30" img-content="undefined" img-format="jpg" />
1077_D1
<img file="00000032.jpg" he="48" wi="31" img-content="undefined" img-format="jpg" />
1077_D2
<img file="00000033.jpg" he="41" wi="32" img-content="undefined" img-format="jpg" />461/463
1076
Примеры соединений Формулы I включают соединения, описанные в патенте США № 8629274, полное содержание которого включено в настоящий документ посредством ссылки. Способы получения соединений Формулы I, включая соединения из показанной выше таблицы, представлены в патенте США № 8629274.
Соединения Формулы I могут быть получены по последовательности реакций, изображенной на Схеме 1.
6
6
6
6
Соединение Формулы (IV) на Схеме 1 может быть приведено в реакцию с хлорсульфоновой кислотой с получением сульфонилхлорида формулы (V). Соединение Формулы (V) может быть приведено в реакцию со вторичным или первичным амином формулы HNRR в растворителе, таком как, но не ограничиваясь ими, тетрагидрофуран, дихлорметан, этиловый эфир или их смесь, предпочтительно в присутствии третичного основания, такого как, но не ограничиваясь ими, триэтиламин, диизопропилэтиламин или пиридин, с получением соединения Формулы (VI), которое может быть связано с амином посредством амидной связи с образованием соединения Формулы (II). Амидное связывание может быть проведено в присутствии связывающего агента, такого как, но не ограничиваясь ими, DCC (N,N'-дициклогексилкарбодиимид), DIC (N,N'-диизопропилкарбодиимид), EDC (1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид),HBTU (O-бензотриазол-N,N,N',N'-тетраметилурония гексафторфосфат), HATU (2-(1H-7-азабензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония гексафторфосфат метаминия), HCTU ((2-(6-хлор-1H-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметиламиния гексафторфосфат), TBTU (O-(бензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилурония тетрафторборат) или PyBOP (бензотриазол-1-ил-окситрипирролидинофосфония гексафторфосфат), в растворителе, таком как, но не ограничиваясь ими, тетрагидрофуран, дихлорметан или их смесь, и в необязательном присутствии третичного основания, такого как, но не ограничиваясь ими, триэтиламин, диизопропилэтиламин или пиридин. В альтернативном варианте, сульфонихлорид Формулы (V) может быть приведен в реакцию с хлорирующим агентом, таким как, но не ограничиваясь ими, тионилхлорид, фосген, дифосген или трифосген, с получением ацилхлорида Формулы (VII). Соединение Формулы (VII) может быть затем приведено в реакцию с амином в растворителе, таком как, но не ограничиваясь ими, тетрагидрофуран, дихлорметан, этиловый эфир или их смесь, в условиях, которые не ускоряют взаимодействие сульфонилхлоридной группы с амином, с получением соединения Формулы (VIII), которое может быть затем приведено в реакцию с амином HNRR в растворителе, таком как, но не ограничиваясь ими, тетрагидрофуран, толуол, дихлорметан или их смесь, и в присутствии третичного основания, такого как, но не ограничиваясь ими, триэтиламин, диизопропилэтиламин или пиридин, с получением соединения Формулы (II).
x
y
1
4
В данном контексте выражение «C-C-алкил», где x равен 1-5, и y равен 2-10, означает определенную алкильную группу (неразветвленную или разветвленную) с определенным диапазоном атомов углерода. Например, выражение C-C-алкил включает, но не ограничивается ими, метил, этил, пропил, бутил, изопропил, трет-бутил и изобутил.
3-6
В данном контексте термин «C циклоалкил» относится к насыщенным или ненасыщенным моноциклическим или бициклическим углеводородным группам из 3-6 атомов углерода, предпочтительно 5 атомов углерода. Иллюстративные моноциклические углеводородные группы включают, но не ограничиваются ими, циклопропил, циклобутил и циклопентил.
Термин«галоген» или «гало» относится к группам хлора, брома, фтора и йода.
Агенты могут содержать один или более асимметричных элементов, таких как стереогенные центры или стереогенные оси, например, асимметричных атомов углерода, поэтому соединения могут существовать в различных стереоизомерных формах. Указанные соединения могут быть, например, рацематами или оптически активными формами. Для соединений с двумя или более асимметричными элементами указанные соединения могут дополнительно представлять собой смеси диастереомеров. Для соединений, имеющих асимметричные центры, следует понимать, что подразумеваются все оптические изомеры и их смеси. Кроме того, соединения с двойными углерод-углеродными связями могут существовать в Z- и E-формах; в настоящее изобретение включены все изомерные формы соединений. В таких ситуациях отдельные энантиомеры (оптически активные формы) могут быть получены посредством асимметричного синтеза, синтеза из оптически чистых предшественников, или посредством разделения рацематов. Разделение рацематов также может быть проведено, например, обычными способами, такими как кристаллизация в присутствии разделительного агента, или хроматография с применением, например, хиральной ВЭЖХ колонки.
Если не указано иное или если очевидно не следует из контекста, то упоминание соединений, подходящих в комбинированной терапии согласно настоящему изобретению, включает свободные основания указанных соединений, а также все фармацевтически приемлемые соли соединений.
В данном контексте термин «фармацевтически приемлемые соли» относится к производным описанных соединений, в которых исходное соединение модифицировано превращением существующего кислотного или основного фрагмента в его солевую форму. Примеры фармацевтически приемлемых солей включают, но не ограничиваются ими, соли неорганических или органических кислот с основными остатками, такими как амины; щелочные или органические соли кислотных остатков, таких как карбоновые кислоты; и т.п. Фармацевтически приемлемые соли согласно настоящему изобретению включают обычные нетоксичные соли исходного соединения, полученные, например, из нетоксичных неорганических или органических кислот. Фармацевтически приемлемые соли согласно настоящему изобретению могут быть синтезированы из исходного соединения, которое содержит основной или кислотный фрагмент, обычными химическими способами. В целом, такие соли могут быть получены посредством взаимодействия свободных кислотных или основных форм указанных соединений со стехиометрическим количеством соответствующего основания или кислоты в воде или в органическом растворителе, или в смеси таких растворителей; как правило, предпочтительна неводная среда, такая как эфир, этилацетат, этанол, изопропанол или ацетонитрил. Списки подходящих солей представлены в публикациях Remington, Pharmaceutical Sciences, 17ое изд., Mack Publishing Company, Истон, штат Пенсильвания, 1985, с. 1418, и Journal of Pharmaceutical Science, 66, 2 (1977), полное содержание каждой из которых включено в настоящий документ посредством ссылки.
В настоящем документе предложена комбинированная терапия, содержащая соединение Формулы I или его фармацевтически приемлемую соль и PEGASYS. Введение комбинации включает введение комбинации в виде одной композиции или единичной лекарственной формы, введение отдельных агентов комбинации совместно, но по отдельности, или введение отдельных агентов комбинации последовательно любым подходящим способом. Доза отдельных агентов комбинации может потребовать более частого введения одного агента(-ов) в сравнении с другим агентом(-ами) в комбинации. Следовательно, для обеспечения возможности надлежащего дозирования, упакованные фармацевтические продукты могут содержать одну или более лекарственных форм, которые содержат комбинацию агентов, и одну или более лекарственных форм, которые содержат один из агентов комбинации, но не содержат другой агент(-ы) комбинации.
Термин «единая композиция» в данном контексте относится к одному носителю или среде, составленной в композицию для доставки эффективного количества обоих терапевтических агентов пациенту. Единая среда предназначена для доставки эффективного количества каждого из агентов вместе с любыми фармацевтически приемлемыми носителями или вспомогательными веществами. В некоторых вариантах реализации носитель представляет собой таблетку, капсулу, пилюлю или пластырь. В других вариантах реализации носитель представляет собой раствор или суспензию.
Термин «единичная доза» в данном контексте означает одновременное введение пациенту, подлежащему лечению, обоих агентов вместе, в одной лекарственной форме. В некоторых вариантах реализации единичная доза представляет собой единую композицию. В некоторых вариантах реализации единичная доза содержит одну или более сред, так что каждая среда содержит эффективное количество по меньшей мере одного из агентов вместе с фармацевтически приемлемыми носителями и вспомогательными веществами. В некоторых вариантах реализации единичная доза представляет собой одну или более таблеток, капсул, пилюль или пластырей, вводимых пациенту одновременно.
Термин «лечить» в данном контексте означает облегчение, уменьшение или ослабление по меньшей мере одного симптома заболевания у субъекта. В контексте настоящего изобретения термин «лечить» означает также остановку, отсрочку возникновения (т.е. период до клинического проявления заболевания или симптома заболевания) и/или снижение риска развития или ухудшения симптома заболевания.
Термин «субъект» включает животных. Примеры субъектов включают млекопитающих, например, людей, собак, коров, лошадей, свиней, овец, коз, кошек, мышей, кроликов, крыс и трансгенных животных, не являющихся человеком. В некоторых вариантах реализации субъектом является человек, например, человек, страдающий или имеющий риск возникновения или потенциально склонный к возникновению инфекции ВГВ.
Термин «около» или «приблизительно» обычно означает в пределах 20%, более предпочтительно в пределах 10% и наиболее предпочтительно в пределах 5% от указанного значения или диапазона. В альтернативном варианте, особенно в биологических системах, термин «около» означает в пределах около log (т.е. порядка отклонения), предпочтительно в пределах множителя «два» относительно данного значения.
Термины «ингибитор сборки капсида», «ингибитор капсида», «агент, нарушающий сборку капсида» и «ингибитор ядра» относятся к одному и тому же образу действия. Не ограничиваясь каким-либо теоретическим объяснением, указанный образ действия может быть инициирован связыванием соединений согласно настоящему изобретению с капсидным белком ВГВ и изменением функции указанного белка за счет взаимодействия с ним, ускорения, замедления, нарушения или иного изменения функций, связанных с капсидным белком ВГВ.
Термин «комбинированная терапия» означает введение двух или более терапевтических агентов для лечения терапевтического состояния или расстройства, описанного в настоящем описании. Такое введение включает совместное введение этих терапевтических агентов практически одновременно, как, например, в единой капсуле, имеющей определенное соотношение активных компонентов, или в виде нескольких, или в виде отдельных контейнеров (например, капсул) для каждого активного компонента. Кроме того, такое введение включает также применение каждого типа терапевтического агента последовательным образом, приблизительно в одно время или в разное время. В любом случае, режим лечения обеспечивает благотворное влияние комбинации лекарств при лечении состояний или расстройств, описанных в настоящем документе.
Комбинация агентов, описанных в настоящем документе, обеспечивает улучшенное подавление ВГВ или эффективность лечения ВГВ в сравнении с соответствующими монотерапиями. В некоторых вариантах реализации комбинация агентов, описанных в настоящем документе, демонстрирует синергетический эффект. Термин «синергетический эффект» в данном контексте относится к действию двух агентов, таких как, например, соединение Формулы I или его фармацевтически приемлемая соль и Pegasys, вызывающему эффект, например, замедление симптоматического прогрессирования рака или его симптомов, который превосходит простой аддитивный эффект каждого лекарства, введенного в отдельности. Синергетический эффект может быть рассчитан, например, с помощью подходящих способов, таких как уравнение сигмоидальной Emax (Holford, N. H. G. и Scheiner, L. B., Clin. Pharmacokinet. 6: 429-453 (1981)), уравнение аддитивности Лоу (Loewe, S. и Muischnek, H., Arch. Exp. Pathol Pharmacol. 114: 313-326 (1926)) и уравнение медианного эффекта (Chou, T. C. и Talalay, P., Adv. Enzyme Regul. 22: 27-55 (1984)). Каждое уравнение, указанное выше, может быть применено в отношении экспериментальных данных для построения соответствующей диаграммы для облегчения оценки эффекта лекарственной комбинации. Соответствующие диаграммы, связанные с указанными уравнениями, представленными выше, представляют собой кривую зависимости эффекта от концентрации, изоболограмму и кривую показателя аддитивности, соответсвенно.
В одном из вариантов реализации предложена комбинированная терапия, содержащая эффективное количество соединения Формулы I или его фармацевтически приемлемой соли и PEGASYS. «Эффективное количество» комбинации агентов представляет собой количество, достаточное для обеспечения видимого улучшения относительно исходных клинически наблюдаемых признаков и симптомов расстройств, подлежащих лечению указанной комбинацией.
«Пероральная лекарственная форма» включает единичную лекарственную форму, предписанную или предназначенную для перорального введения.
Способы лечения
В одном аспекте настоящего изобретения предложен способ лечения инфекции ВГВ у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение субъекту ингибитора сборки капсида и интерферона.
В одном из вариантов реализации интерферон выбран из группы, состоящей из интерферона альфа, интерферона альфа-2a, рекомбинантного интерферона альфа-2а, пегинтерферона альфа-2а, интерферона альфа-2b, рекомбинантного интерферона альфа-2b, интерферона альфа-2b XL, пегинтерферона альфа-2b, гликозилированного интерферона альфа-2b, интерферона альфа-2с, рекомбинантного интерферона альфа-2с, интерферона бета, интерферона бета-1а, пегинтерферона бета-1а, интерферона дельта, интерферона лямбда, пегинтерферона лямбда-1, интерферона омега, интерферона тау, гамма-интерферона, интерферона альфакон-1, интерферона альфа-n1, интерферона альфа-n3, альбинтерферона альфа-2b, BLX-883, DA-3021, ПЭГ-инфергена и BELEROFON. В конкретном варианте реализации интерферон выбран из группы, состоящей из пегинтерферона альфа-2а, пегинтерферона альфа-2b, гликозилированного интерферона альфа-2b, пегинтерферона бета-1а и пегинтерферона лямбда-1. В конкретном варианте реализации интерферон представляет собой пегинтерферон альфа-2а.
В другом варианте реализации ингибитор сборки капсида представляет собой соединение Формулы (I).
Настоящее изобретение включает способ лечения инфекции ВГВ у индивидуума, нуждающегося в этом, включающий введение индивидууму комбинированной терапии согласно настоящему изобретению (т.е. соединения Формулы I в комбинации с пегинтерфероном альфа-2а).
Настоящее изобретение включает также способ снижения вирусной нагрузки, связанной с инфекцией ВГВ у индивидуума, нуждающегося в этом, включающий введение индивидууму комбинированной терапии согласно настоящему изобретению.
Настоящее изобретение дополнительно включает способ снижения рецидива инфекции ВГВ у индивидуума, нуждающегося в этом, включающий введение индивидууму комбинированной терапии согласно настоящему изобретению.
Настоящее изобретение включает также способ снижения физиологического воздействия инфекции ВГВ у индивидуума, нуждающегося в этом, включающий введение индивидууму комбинированной терапии согласно настоящему изобретению.
Настоящее изобретение дополнительно включает способ снижения, замедления или подавления инфекции ВГВ у индивидуума, нуждающегося в этом, включающий введение индивидууму комбинированной терапии согласно настоящему изобретению.
Настоящее изобретение включает также способ инициации ремиссии повреждения печени в результате инфекции ВГВ у индивидуума, нуждающегося в этом, включающий введение индивидууму комбинированной терапии согласно настоящему изобретению.
Настоящее изобретение дополнительно включает способ снижения физиологического воздействия долговременной противовирусной терапии инфекции ВГВ у индивидуума, нуждающегося в этом, включающий введение индивидууму комбинированной терапии согласно настоящему изобретению.
Настоящее изобретение включает также способ эрадикации инфекции ВГВ у индивидуума, нуждающегося в этом, включающий введение индивидууму комбинированной терапии согласно настоящему изобретению.
Настоящее изобретение дополнительно включает способ профилактического лечения инфекции ВГВ у индивидуума, нуждающегося в этом, где индивидуум поражен латентной инфекцией ВГВ, включающий введение индивидууму комбинированной терапии согласно настоящему изобретению.
В одном из вариантов реализации индивидуум является не поддающимся лечению или невосприимчивым к другим терапевтическим классам лекарств против ВГВ (например, ингибиторы полимеразы ВГВ, интерфероны, ингибиторы проникновения вируса в клетку, ингибиторы созревания вируса, описанные в литературе модуляторы сборки капсида, противовирусные соединения другого или неизвестного механизма действия и т.п., или их комбинации). В другом варианте реализации способ согласно настоящему изобретению обеспечивает снижение вирусной нагрузки у индивидуума, страдающего от инфекции ВГВ, до более высокой степени, чем степень, до которой вирусную нагрузку у индивидуума снижают другие терапевтические классы лекарств против ВГВ.
В одном из вариантов реализации способ согласно настоящему изобретению обеспечивает снижение вирусной нагрузки у индивидуума, страдающего от инфекции ВГВ, обеспечивая тем самым возможность снижения доз или изменения схемы комбинированной терапии.
В одном из вариантов реализации способ согласно настоящему изобретению обеспечивает снижение числа случаев мутации вируса и/или вирусной резистентности по сравнению с другими классами лекарств против ВГВ, тем самым обеспечивая возможность продолжительной терапии и минимизации необходимости в изменении схемы лечения.
В одном из вариантов реализации способ согласно настоящему изобретению обеспечивает увеличение скорости сероконверсии больше, чем известные схемы лечения.
В одном из вариантов реализации способ согласно настоящему изобретению увеличивает и/или нормализует, и/или восстанавливает нормальное здоровье, вызывает полный возврат нормального здоровья, восстанавливает прогнозируемую продолжительность жизни и/или устраняет вирусную инфекцию у индивидуума, нуждающегося в этом.
В одном из вариантов реализации способ согласно настоящему изобретению обеспечивает эрадикацию ВГВ из организма индивидуума, инфицированного ВГВ, тем самым исключая необходимость в долговременном и/или пожизненном лечении, или сокращая продолжительность лечения, и/или обеспечивая возможность снижения дозы других противовирусных агентов.
Соответственно, в одном из вариантов реализации в настоящем документе предложен способ лечения инфекции ВГВ у индивидуума, нуждающегося в этом, включающий введение индивидууму терапевтически эффективного количества соединения Формулы I или его фармацевтически приемлемой соли и PEGASYS.
В другом варианте реализации в настоящем документе предложен способ лечения инфекции ВГВ у индивидуума, нуждающегося в этом, включающий введение индивидууму терапевтически эффективного количества соединения Формулы IVa или его фармацевтически приемлемой соли и PEGASYS.
В другом варианте реализации в настоящем документе предложен способ лечения инфекции ВГВ у индивидуума, нуждающегося в этом, включающий введение индивидууму терапевтически эффективного количества соединения Формулы IVb или его фармацевтически приемлемой соли и PEGASYS.
В другом варианте реализации в настоящем документе предложен способ лечения инфекции ВГВ у индивидуума, нуждающегося в этом, включающий введение индивидууму терапевтически эффективного количества соединения Формулы IVc или его фармацевтически приемлемой соли и PEGASYS.
В другом варианте реализации в настоящем документе предложен способ лечения инфекции ВГВ у индивидуума, нуждающегося в этом, включающий введение индивидууму терапевтически эффективного количества соединения 960 или его фармацевтически приемлемой соли и PEGASYS.
В другом варианте реализации в настоящем документе предложен способ лечения инфекции ВГВ у индивидуума, нуждающегося в этом, включающий введение индивидууму терапевтически эффективного количества соединения 890 или его фармацевтически приемлемой соли и PEGASYS.
В другом варианте реализации в настоящем документе предложен способ лечения инфекции ВГВ у индивидуума, нуждающегося в этом, включающий введение индивидууму терапевтически эффективного количества соединения 893 или его фармацевтически приемлемой соли и PEGASYS.
В другом варианте реализации в настоящем документе предложен способ лечения инфекции ВГВ у индивидуума, нуждающегося в этом, включающий введение индивидууму терапевтически эффективного количества соединения 946 или его фармацевтически приемлемой соли и PEGASYS.
В другом варианте реализации в настоящем документе предложен способ лечения инфекции ВГВ у индивидуума, нуждающегося в этом, включающий введение индивидууму терапевтически эффективного количества соединения 925 или его фармацевтически приемлемой соли и PEGASYS.
В другом варианте реализации в настоящем документе предложен способ лечения инфекции ВГВ у индивидуума, нуждающегося в этом, включающий введение индивидууму терапевтически эффективного количества соединения 1080 или его фармацевтически приемлемой соли и PEGASYS.
В другом варианте реализации в настоящем документе предложен способ лечения инфекции ВГВ у индивидуума, нуждающегося в этом, включающий введение индивидууму терапевтически эффективного количества соединения 1084 или его фармацевтически приемлемой соли и PEGASYS.
В другом варианте реализации в настоящем документе предложен способ лечения инфекции ВГВ у индивидуума, нуждающегося в этом, включающий введение индивидууму терапевтически эффективного количества соединения 1085 или его фармацевтически приемлемой соли и PEGASYS.
В другом варианте реализации в настоящем документе предложен способ лечения инфекции ВГВ у индивидуума, нуждающегося в этом, включающий введение индивидууму терапевтически эффективного количества соединения 1088 или его фармацевтически приемлемой соли и PEGASYS.
В другом варианте реализации в настоящем документе предложен способ лечения инфекции ВГВ у индивидуума, нуждающегося в этом, включающий введение индивидууму терапевтически эффективного количества соединения 1100 или его фармацевтически приемлемой соли и PEGASYS.
В другом варианте реализации в настоящем документе предложен способ лечения инфекции ВГВ у индивидуума, нуждающегося в этом, включающий введение индивидууму терапевтически эффективного количества соединения 1161 или его фармацевтически приемлемой соли и PEGASYS.
В другом варианте реализации в настоящем документе предложен способ лечения инфекции ВГВ у индивидуума, нуждающегося в этом, включающий введение индивидууму терапевтически эффективного количества соединения 916 или его фармацевтически приемлемой соли и PEGASYS.
В другом варианте реализации в настоящем документе предложен способ лечения инфекции ВГВ у индивидуума, нуждающегося в этом, включающий введение индивидууму терапевтически эффективного количества соединения 1057 или его фармацевтически приемлемой соли и PEGASYS.
В другом варианте реализации в настоящем документе предложен способ лечения инфекции ВГВ у индивидуума, нуждающегося в этом, включающий введение индивидууму терапевтически эффективного количества соединения 1060 или его фармацевтически приемлемой соли и PEGASYS.
В другом варианте реализации в настоящем документе предложен способ лечения инфекции ВГВ у индивидуума, нуждающегося в этом, включающий введение индивидууму терапевтически эффективного количества соединения 1081 или его фармацевтически приемлемой соли и PEGASYS.
В другом варианте реализации в настоящем документе предложен способ лечения инфекции ВГВ у индивидуума, нуждающегося в этом, включающий введение индивидууму терапевтически эффективного количества соединения 1130 или его фармацевтически приемлемой соли и PEGASYS.
В другом варианте реализации в настоящем документе предложен способ лечения инфекции ВГВ у индивидуума, нуждающегося в этом, включающий введение индивидууму терапевтически эффективного количества соединения 1135 или его фармацевтически приемлемой соли и PEGASYS.
В другом варианте реализации в настоящем документе предложен способ лечения инфекции ВГВ у индивидуума, нуждающегося в этом, включающий введение индивидууму терапевтически эффективного количества соединения 1073 или его фармацевтически приемлемой соли и PEGASYS.
В другом варианте реализации в настоящем документе предложен способ лечения инфекции ВГВ у индивидуума, нуждающегося в этом, включающий введение индивидууму терапевтически эффективного количества соединения 1077 или его фармацевтически приемлемой соли и PEGASYS.
В другом варианте реализации в настоящем документе предложен способ лечения инфекции ВГВ у индивидуума, нуждающегося в этом, включающий введение индивидууму терапевтически эффективного количества соединения 1076 или его фармацевтически приемлемой соли и PEGASYS.
Дозы
Оптимальная доза комбинации агентов для лечения заболевания может быть определена эмпирически для каждого индивидуума с помощью известных способов, и она зависит от различных факторов, включая, но не ограничиваясь ими, степень развития заболевания; возраст, массу тела, общее состояние здоровья, пол и рацион индивидуума; время и способ введения; и другие лекарства, принимаемые индивидуумом. Оптимальные дозы могут быть установлены с помощью обычного тестирования и процедур, общеизвестных в данной области техники.
Количество комбинации агентов, которые могут быть смешаны с материалами носителя с получением единичной лекарственной формы, варьируется в зависимости от индивидуума, подлежащего лечению, и конкретного способа введения. В некоторых вариантах реализации единичные лекарственные формы, содержащие комбинацию агентов, описанную в настоящем документе, содержат такое количество каждого агента комбинации, которое обычно вводят при введении агентов по отдельности.
В одном из вариантов реализации комбинации, предложенной в настоящем документе, каждый агент вводят в дозах, которые не являются эффективными при введении одного или обоих агентов по отдельности, но такие количества являются эффективными в комбинации. Например, в одном из вариантов реализации пегинтерферон альфа-2а и соединение Формулы I вводят в дозах, которые не являются эффективными при введении одного или обоих из пегинтерферона альфа-2а и соединения Формулы I по отдельности, но такие количества являются эффективными в комбинации.
Частота введения доз может варьироваться в зависимости от используемого соединения и конкретного состояния, подлежащего лечению или предупреждению. В целом, предпочтительно применение минимальной дозы, которая является достаточной для обеспечения эффективной терапии. Пациенты могут быть подвержены мониторингу на терапевтическую эффективность с применением анализов, подходящих для состояния, подлежащего лечению или предупреждению, которые известны специалистам в данной области техники.
В одном из вариантов реализации комбинации, предложенной в настоящем документе, один или более агентов вводят в течение времени, которое меньше, чем время, используемое при введении любого из агентов в отдельности. Например, современные руководства по лечению рекомендуют лечение интерфероном в течение 12 месяцев. В одном из вариантов реализации комбинации, предложенной в настоящем документе (например, соединения Формулы I и интерферона), продолжительность лечения интерфероном составляет 12 месяцев или менее, например, 11 месяцев или менее, например, 10 месяцев или менее, например, 9 месяцев или менее, например, 8 месяцев или менее, например, 7 месяцев или менее, например, 6 месяцев или менее, например, 5 месяцев или менее, например, 4 месяца или менее, например, 3 месяца или менее, например, 2 месяца или менее, например, 1 месяц или менее. В другом варианте реализации лечение пегинтерфероном альфа-2а и соединением Формулы I осуществляют в течение 12 месяцев или менее, например, 11 месяцев или менее, например, 10 месяцев или менее, например, 9 месяцев или менее, например, 8 месяцев или менее, например, 7 месяцев или менее, например, 6 месяцев или менее, например, 5 месяцев или менее, например, 4 месяца или менее, например, 3 месяца или менее, например, 2 месяца или менее, например, 1 месяц или менее.
Лекарственная форма может быть получена различными стандартными технологиями смешивания, измельчения и обработки, известными специалистам в области химии лекарственных препаратов.
Пероральная лекарственная форма, содержащая комбинацию агентов или индивидуальные агенты комбинации агентов, может быть в форме микротаблеток, помещенных в капсулу, например, желатиновую капсулу. Для этого может быть использована желатиновая капсула, используемая в фармацевтических композициях, такая как твердая желатиновая капсула, известная как CAPSUGEL производства компании Pfizer.
Многие пероральные лекарственные формы, подходящие согласно настоящему изобретению, содержат комбинацию агентов или отдельные агенты комбинации агентов в форме частиц. Такие частицы могут быть спрессованы в таблетку, представлены в виде центрального элемента лекарственной формы с покрытием, такой как лекарственная форма с маскированным вкусом, в виде лекарственной формы с прессованным покрытием или в виде лекарственной формы с энтеросолюбильным покрытием, или могут быть помещены в капсулу, лекарственную форму осмотического насоса или другую лекарственную форму.
Лекарственные соединения согласно настоящему изобретению присутствуют в комбинациях, лекарственных формах, фармацевтических композициях и фармацевтических составах, описанных в настоящем документе, в соотношении в диапазоне от 100:1 до 1:100. Например, соотношение соединения Формулы I: пегинтерферона альфа-2а (или другого аналога интерферона) может находиться в диапазоне от 1:100 до 1:1, например, 1:100, 1:90, 1:80, 1:70, 1:60, 1:50, 1:40, 1:30, 1:20, 1:10, 1:5, 1:2 или 1:1 соединения Формулы I: пегинтерферона альфа-2а. В другом примере соотношение пегинтерферона альфа-2а: соединения Формулы I может находиться в диапазоне от 1:100 до 1:1, например, 1:100, 1:90, 1:80, 1:70, 1:60, 1:50, 1:40, 1:30, 1:20, 1:10, 1:5, 1:2 или 1:1 пегинтерферона альфа-2а: соединения Формулы I.
Оптимальные соотношения, индивидуальные и комбинированные дозы, а также концентрации лекарственных соединений, которые обеспечивают эффективность без токсичности, основаны на кинетике доступности активных ингредиентов в целевых участках, и их определяют с помощью способов, известных специалистам в данной области техники.
Фармацевтические композиции или комбинации, предложенные в настоящем документе, могут быть испытаны в клинических испытаниях. Подходящие клинические испытания могут быть, например, открытыми испытаниями повышения дозы у пациентов с пролиферативными заболеваниями. Такие испытания подтверждают, в частности, улучшение эффективности активных ингредиентов комбинации согласно настоящему изобретению. Благоприятное действие на пролиферативные заболевания может быть определено непосредственно по результатам указанных испытаний, которые известны специалистам в данной области техники. Такие испытания могут быть, в частности, подходящими для сравнения эффекта монотерапии с применением активных ингредиентов и комбинации согласно настоящему изобретению.
Введение комбинированной терапии согласно настоящему изобретению может приводить не только к благоприятному эффекту, например, улучшенному терапевтическому эффекту, например, в отношении облегчения, отсрочки прогрессирования или подавления симптомов, но и к дополнительным неожиданным благоприятным эффектам, например, к уменьшению побочных эффектов, улучшению качества жизни или снижению смертности, по сравнению с монотерапией с применением только одного из фармацевтически активных ингредиентов, используемых в комбинации согласно настоящему изобретению.
Дополнительное преимущество может заключаться в том, что могут быть использованы более низкие дозы активных ингредиентов комбинации согласно настоящему изобретению, например, что дозы зачастую могут быть не только ниже, но и могут быть использованы реже, что может снижать частоту возникновения или тяжесть побочных эффектов. Это соответствует пожеланиям и требованиям пациентов, подлежащих лечению.
Задача настоящего изобретения заключается в обеспечении фармацевтической композиции, содержащей такое количество, которое может быть совместно терапевтически эффективным при направленном воздействии или предупреждении инфекции ВГВ. В такой композиции соединение Формулы I и пегинтерферон альфа-2а (или другой аналог интерферона) могут быть введены вместе, один за другим или по отдельности, в одной комбинированной единичной лекарственной форме или в двух отдельных единичных лекарственных формах. Единичная лекарственная форма также может быть фиксированной комбинацией.
per se
Фармацевтические композиции для раздельного введения обоих соединений или для введения в виде фиксированной комбинации, т.е. одной лечебной композиции, содержащей оба соединения согласно настоящему изобретению, могут быть получены по способам, известным , и представляют собой композиции, подходящие для энтерального, такого как пероральное или ректальное, и парентерального введения млекопитающим (теплокровным животным), включая людей, содержащие терапевтически эффективное количество по меньшей мере одного компонента фармакологически активной комбинации в отдельности, например, как указано выше, или в комбинации с одним или более фармацевтически приемлемыми носителями или разбавителями, особенно подходящими для энтерального или парентерального применения.
Композиции
Лекарственные комбинации, предложенные в настоящем документе, могут быть составлены в композиции различными способами, известными специалистам в области составления фармацевтических препаратов. Различные свойства высвобождения, описанные выше, могут быть достигнуты многочисленными способами. Подходящие композиции включают, например, таблетки, капсулы, композиции с прессованным покрытием и другие композиции для простого введения.
per se
Подходящие фармацевтические композиции могут содержать, например, от около 0,1% до около 99,9%, предпочтительно от около 1% до около 60% активного ингредиента(-ов). Фармацевтические композиции для комбинированной терапии для энтерального или парентерального введения представляют собой, например, композиции в единичных лекарственных формах, таких как таблетки с сахарным покрытием, таблетки, капсулы или суппозитории, или ампулы. Если не указано иное, их получают по способам, известным , например, способами обычного смешивания, гранулирования, нанесения сахарного покрытия, растворения или лиофилизации. Следует понимать, что единичное содержание компонента комбинации, содержащегося в отдельной дозе каждой лекарственной формы, не обязательно должно составлять эффективную дозу, поскольку необходимое эффективное количество может быть достигнуто введением нескольких единичных доз.
in vivo
В частности, терапевтически эффективное количество каждого компонента комбинации согласно настоящему изобретению может быть введено одновременно или последовательно и в любом порядке, и компоненты могут быть введены по отдельности или в виде фиксированной комбинации. Например, способ лечения заболевания согласно настоящему изобретению может включать (i) введение первого агента в свободной форме или в форме фармацевтически приемлемой соли и (ii) введение второго агента в свободной форме или в форме фармацевтически приемлемой соли, одновременно или последовательно в любом порядке, в совместно терапевтически эффективных количествах, предпочтительно в улучшенных терапевтически эффективных количествах, например, ежедневными или периодическими дозами, соответствующими описанным количествам. Отдельные компоненты комбинации согласно настоящему изобретению могут быть введены по отдельности в разное время в течение курса терапии или одновременно в виде отдельных или единых комбинированных форм. Кроме того, термин «введение» включает также применение пролекарства компонента комбинации, которое может превращаться  в указанный компонент комбинации. Следовательно, настоящее изобретение следует понимать как охватывающее все такие схемы одновременного или чередующегося лечения, и термин «введение» следует понимать соответствующим образом.
Эффективная доза каждого из компонентов комбинации, используемых в комбинации согласно настоящему изобретению, может варьироваться в зависимости от конкретного используемого соединения или фармацевтической композиции, способа введения, состояния, подлежащего лечению, тяжести состояния, подлежащего лечению. Таким образом, схему лечения комбинацией согласно настоящему изобретения выбирают в соответствии с различными факторами, включая способ введения и функцию почек и печени пациента. Опытный клиницист или врач может легко определить и предписать эффективное количество отдельных активных ингредиентов, необходимое для облегчения, противодействия или остановки развития патологического состояния.
Предпочтительные подходящие дозы для соединений, используемых при лечении, описанном в настоящем документе, представляют собой дозы порядка от около 1 мг до около 600 мг, предпочтительно от около 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 95, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 420, 440, 460, 480, 500, 520, 540, 560, 580 до около 600 мг в сумме.
Соответственно, в одном из вариантов реализации в настоящем документе предложена композиция, содержащая интерферон и соединение Формулы I. В другом варианте реализации предложена композиция, содержащая пегинтерферон альфа-2а и соединение Формулы I. В одном из вариантов реализации соединение Формулы I представляет собой соединение 960, соединение 890, соединение 893, соединение 946, соединение 925, соединение 1080, соединение 1084, соединение 1085, соединение 1088, соединение 1100, соединение 1161, соединение 916, соединение 1057, соединение 1060, соединение 1081, соединение 1130, соединение 1135, соединение 1073, соединение 1077 или соединение 1076. В другом варианте реализации композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
На фиг. 1 представлен линейный график снижения вирусной нагрузки относительно исходного значения (Log
; ордината) в зависимости от времени (дни; абсцисса) в гуманизированной мышиной модели uPa-SCID инфекции ВГВ. Мышиным субъектам вводили определенные количества: только ингибитора капсида; только энтекавира (ETV); только интерферона α (IFN) (PEGASYS); смеси ингибитора капсида и энтекавира (ингибитор капсида+ETV); или смеси ингибитора капсида и интерферона (ингибитор капсида
+
IFN
)
. Контрольным субъектам вводили только диметилсульфоксид (ДМСО).
N=6. Неожиданно было обнаружено, что комбинация PEGASYS с ингибитором капсида демонстрирует улучшенную эффективность в сравнении с лечением либо PEGASYS, либо ингибитором капсида ETV, либо ETV в комбинации с PEGASYS.
10
На фиг. 2 представлена линейная диаграмма ДНК ВГВ (log10 копий/мл; ордината) в зависимости от времени (дни; абсцисса) в мышиной модели инфекции ВГВ генотипа С человеческой химерной печени. Мышиным субъектам вводили определенные количества: только ингибитора капсида; пегилированного интерферона α (ПЭГ-IFN) (PEGASYS); или смеси ингибитора капсида и пегилированного интерферона α (ингибитор капсида+ПЭГ-IFN).
Проткол исследования на мышах
Название исследования
Исследование ФК/переносимости ингибитора капсида у мышей не- PXB и мышей PXB (4 недели)
Предполагаемый график исследования
Отбор образца крови до введения дозы: 21 июняРаспределение по группам: 27 июняПериод введения: С 28 июня (пп) до 26 июля (дп)Некропсия: 26 июля (пп)Окончание исследования: 30 августа
(день -7)(день -1)(с дня 0 до дня 27) (день 28)
Задачи
Задача настоящего исследования заключается в оценке переносимости и печеночной токсичности ингибитора капсида у мышей не-PXB и мышей PXB.
Исследуемые соединения
Идентификация: Ингибитор капсидаПартия: PCV-CRA1.113-6Внешний вид: твердыйПриобретенное количество: 35 гУсловия хранения: хранить при < 25 градусов CИсточник: Спонсор исследования
Животные
Вид: МышиЛиния:PXB-мыши [генотип: eDNA-uPA<sup>+/+</sup>/SCID, uPA<sup>+/+</sup>: B6;129SvEv-Plau, SCID:C.B-1711cr-scid <i>lscid </i>Jcl, мыши, содержащие человеческие гепатоциты с предполагаемым индексом замещения 70% или более, рассчитанным на основании концентрации человеческого альбумина (h-Alb) в крови]Мыши не-PXB [генотип: eDNAuPA<sup>+/+</sup>/SC1D,uPA<sup>+/+</sup>: B6;129SvEv-Plau, SCID: C.B-17/1cr-scid <i>/scid </i>Jcl, мыши, содержащие человеческие гепатоциты с предполагаемым индексом замещения менее 70%, рассчитанным на основании концентрации h-Alb в крови]Количество: 16 (PXB-мыши: 2, мыши не-PXB: 14)Идентификация: Прокол уха
Акклиматизация
Всех потенциальных животных взвесили и у каждого проверили состояние здоровья. После этого мышей акклиматизировали к экспериментальному помещению в течение по меньшей мере 7 дней до начала введения. В течение периода акклиматизации один раз в день проводили наблюдения состояния здоровья и измерения массы тела каждого потенциального животного.
Распределение по группам и критерии отбора животных
На -7 день у всех потенциальных животных взяли образцы крови до введения дозы, чтобы измерить концентрацию h-Alb в крови и активность ALT/AST в сыворотке. Указанные анализы проводили с использованием процедур, описанных в разделе «Наблюдения, измерения, отбор образцов и другие способы». Оставшуюся сыворотку хранили при -80 °С до передачи спонсору.На -1 день животных, имеющих здоровый внешний вид и соответствующих всем критериям, указанным ниже, распределяли по группам. Для минимизации вариабельности между группами состав группы рандомизировали на основании арифметических средних значений массы тела и геометрических средних значений концентрации h-Alb в крови.
Возраст: 12-16 недель на 0 день
Масса: 15,6 г или более на -1 день
Уровень h-Alb в крови: 7,0 мг/мл или более на -7 день (для PXB-мышей), менее 7,0 мг/мл на -7 день (для не-PXB мышей) Донор гепатоцитов:
Введение доз
1. Состав групп
Группа
Линия
№ мыши (ID)
Исследуемое соединение
Доза
Уровень (<sup>111</sup>8/k8)
Конц. (мг/мл)
Объем (мл/k8)
Способ
Частота
1
не-PXB
4(101-104)
Ингибитор капсида
45
4.5
10
p.o.
BID, 28 дней Дни 0-27
2
не-PXB
4(201-204)
Ингибитор капсида
135
13.5
10
p.o.
BID, 28 днейДни 0-27
3
PXB
2(301-302)
Ингибитор капсида
405
40.5
10
p.o.
BID, 28 дней Дни 0-27
не-PXB
2(303-304)
Ингибитор капсида
405
40.5
10
p.o.
BID, 28 дней Дни 0-27
4
не-PXB
4(401-404)
Носитель
0
0
10
p.o.
BID, 28 дней Дни 0-27
2. Получение 0,5% масс./об. дисперсии Methocel E50
1) 1 г Tween 80 взвесили в стакан (емкость 1) и добавили в емкость 1 40 мл очищенной воды, предварительно нагретой до диапазона 70°C ± 5 °C, и выдерживали емкость при указанной температуре.
2) Tween 80 в емкости 1 растворяли при температуре в диапазоне 70°C ± 5°C за 3 минуты с получением прозрачного раствора.
3) 0,5 г Methocel E50 взвесили и в течение 1 минуты добавляли к раствору Tween 80 в емкости 1, перемешивая с образованием вихревой воронки. Содержимое емкости 1 перемешивали в течение 5 минут в диапазоне 70°C ± 5°C с получением однородной дисперсии Methocel E50.
4) В емкость 1 добавили 50 мл очищенной воды при комнатной температуре. Содержимое перемешивали, избегая избыточного пенообразования, с получением прозрачной дисперсии Methocel E50. Затем дисперсию Methocel E50 охладили до диапазона 20°C ± 3°C при перемешивании. Для ускорения охлаждения может быть использована баня с холодной водой.
5) Содержимое емкости 1 перенесли в градуированный мерный цилиндр и довели объем водой до 100 мл. Цилиндр закрыли и перемешивали содержимое в течение 1 минуты, несколько раз переворачивая мерный цилиндр.
6) 0,5% масс./об. дисперсию Methocel E50 хранили при 4 °С в течение до 1 недели.
3. Получение составов доз
1) Лекарственное вещество CMP взвесили и перенесли в ступку.
2) По каплям добавляли 1 мл 0,5% дисперсии Methocel E50 и перемешивали порошок ингибитора капсида с помощью пестика с получением пасты ингибитора капсида.
3) По каплям добавили еще 4 мл 0,5% дисперсии Methocel E50 при перемешивании пестиком с получением суспензии ингибитора капсида, способной к переливанию. Суспензию перенесли в тарированную стеклянную пробирку.
4) Ступку и пестик промывали 3,0 мл объемами 0,5% дисперсии Methocel E50 и добавляли промывочные растворы к суспензии ингибитора капсида.
5) Конечную массу довели 0,5% дисперсией Methocel E50 до 9,33 г в тарированной стеклянной пробирке.
6) Используя гомогенизатор (MH-1000, As One Corporation, Осака, Япония), белую суспензию ингибитора капсида перемешивали в течение 2 минут при 8000 об./мин.
7) Составы доз хранили при комнатной температуре в течение 24 часов и перемешивали при введении дозы для обеспечения гомогенности суспензии.
4. Введение доз
Все дозы рассчитывали на основании индивидуальной массы тела мышей, которые измеряли до 1 (первого) введения в указанные дни введения доз. Объемный коэффициент дозы составил 10 мл/кг. Всем экспериментальным мышам вводили пероральную дозу композиции через зонд два раза в сутки (около 8 пп и 8 дп; время введения доз записывали) в течение 28 дней с 0 дня по 27 день, используя одноразовые пластиковые зонды (Fuchigami Kikai Co., Киото, Япония) и одноразовые пластиковые шприцы объемом 1,0 мл (Terumo Corporation, Токио, Япония).
5. Условия хранения для оставшегося состава доз
Составы доз получали ежедневно. После введения дозы образец объемом ~100 мкл оставшегося состава дозы хранили при <25 градусов Цельсия до завершения анализов данных исследования для обеспечения возможности количественного определения введенной дозы ингибитора капсида, при необходимости. Все дополнительные неиспользованные составы доз утилизировали в соответствии с требованиями утилизации химических отходов в PhoenixBio.
Наблюдения, измерения, отбор образцов и другие способы
Первый день введения обозначили как день 0. Проводили следующие наблюдения, измерения и отбор образцов:
1. Наблюдение общего состояния
Подробное наблюдение общего состояния проводили один раз за день до отбора образца крови перед первым введением дозы, во время первого введения в дни введения дозы и при последнем отборе образца крови.
2. Измерение массы тела
Индивидуальную массу тела измеряли один раз за день до отбора образца крови перед первым введением дозы, во время первого введения в дни введения дозы и при последнем отборе образца крови.
3. Сбор образцов при жизни
Подробный график сбора образцов крови представлен ниже:
День
Временная точка
Экспериментальное животное
Объем крови(мкл)
h-Alb (мкл)
Объем сыворотки(мкл)
ALT/AST
ФК
0
До 1 дозы
Все животные
100
2
40
7
До 1 дозы
Животные №1 и №3
150
2
20
40
Через 3 часа после 1 дозы
Животные №2 и №4
150
2
20
40
14
До 1 дозы
Животные №1 и №3
150
2
20
40
Через 3 часа после I дозы
Животные №2 и №4
150
2
20
40
21
До 1 дозы
Животные №1 и №3
100
2
40
Через 3 часа после 1 дозы
Животные №2 и №4
100
2
40
27
Через 1 час после 2 дозы
Животное №1
≥400
2
20
≥140
Через 3 часа после 2 дозы
Животное №2
≥400
2
20
≥140
Через 6 часов после 2 дозы
Животное №3
≥400
2
20
≥I40
28
Через 12 часов после 2 дозы
Животное №4
≥400
2
20
≥140
В каждой временной точке в дни 0, 7, 14 и 21 собирали требуемые объемы крови под изофлурановой анестезией (Escain, Mylan, Осака, Япония) у всех животных через ретроорбитальное сплетение/пазуху, используя калиброванные пипетки (Drummond Scientific Company, штат Пенсилвания, США). Для указанных измерений использовали два микролитра (2 мкл) собранной крови. Остальную кровь центрифугировали для отделения сыворотки.
Через 1 час, 3 часа и 6 часов после введения 2 дозы на 27 день и через 12 часов после введения 2 дозы на 27 день (день 28) всех животных анестезировали изофлураном и у каждого животного собирали минимум 400 мкл крови из сердца в шприц, после чего животных усыпляли пункцией сердца и обескровливанием. Два микролитра (2 мкл) из каждого собранного образца крови центрифугировали для отделения сыворотки.
После сбора при усыплении всей крови проводили некропсию. Собирали индивидуальные цельные печени, высушивали промоканием, разделяли на 6 частей примерно равного размера, взвешивали, затем переносили в пробирку и проводили мгновенную заморозку жидким азотом. Замороженные образцы печени хранили при -80 °С до передачи спонсору.
4. Отделение сыворотки
Индивидуальные образцы крови животных переносили в маркированные пробирки для сбора крови и оставляли коагулироваться при комнатной температуре в течение по меньшей мере 5 минут, а затем центрифугировали при 13200 x g, 4 °С в течение 3 минут с получением сыворотки.
Требуемый объем сыворотки каждого выделенного образца сыворотки переносили в отдельную маркированную микропробирку.
Указанные образцы сыворотки хранили при -80 °С до использования и передачи спонсору.
5. Лабораторные исследования
Концентрацию h-Alb в крови измеряли с помощью PhoenixBio, используя иммунонефелометрию латекс-агглютинации (I.X реагент ʺEikenʺ Alb II, Eiken Chemical Co., Ltd., Токио, Япония). Активность ALT/AST в сыворотке определяли с помощью 7000 (Fujifilm, Токио, Япония).
6. Нежелательные явления
При возникновении при жизни неожиданных патологий, таких как потеря массы более 20% от исходной массы тела, агония или гибель, компания PhoenixBio проводила запись подробностей инцидента.
Приложение
Приложение 1: График проведения исследования
День
Временная точка
График
Экспериментальное животное
Объем крови (мкл)
Список образцов (пробирки)
h-Alb (мкл)
Объем сыворотки (мкл)
ALT/AST
ФК
Сыворотка
Печень
-7
Отбор образца крови до введения дозы
Все потенциальные животные
150
2
60
20
40
16
-1
Распределение по группам
Все потенциальные животные
0
До 1 дозы
Серийный отбор образцов крови
Все животные
100
2
40
40
16
1 введение
Все животные
2 введение
Все животные
1 введение
Все животные
2 введение
Все животные
2
1 введение
Все животные
2 введение
Все животные
3
1 введение
Все животные
2 введение
Все животные
4
1 введение
Все животные
2 введение
Все животные
5
1 введение
Все животные
2 введение
Все животные
1 введение
Все животные
2 введение
Все животные
До 1 дозы
Серийный отбор образцов крови
Животные №1 и №3
150
2
60
20
40
1 введение
Все животные
Через 3 часа после 1 дозы
Серийный отбор образцов крови
Животные №2 и №4
150
2
60
20
40
8
2 введение
Все животные
1 введение
Все животные
2 введение
Все животные
9
1 введение
Все животные
2 введение
Все животные
10
1 введение
Все животные
2 введение
Все животные
11
1 введение
Все животные
2 введение
Все животные
12
1 введение
Все животные
2 введение
Все животные
13
1 введение
Все животные
2 введение
Все животные
Приложение 1: График проведения исследования (продолжение)
День
Временная точка
График
Экспериментальное животное
Объем крови (мкл)
Список образцов (пробирки)
h-Alb (мкл)
Объем сыворотки (мкл)
ALT/AST
ФК
Сыворотка
Печень
14
До 1 дозы
Серийный отбор образцов крови
Животные №1 и №3
150
2
60
20
40
8
1 введение
Все животные
Через 3 часа после 1 дозы
Серийный отбор образцов крови
Животные №2 и №4
150
2
60
20
40
2 введение
Все животные
15
1 введение
Все животные
2 введение
Все животные
16
1 введение
Все животные
2 введение
Все животные
17
1 введение
Все животные
2 введение
Все животные
18
1 введение
Все животные
2 введение
Все животные
19
1 введение
Все животные
2 введение
Все животные
20
1 введение
Все животные
2 введение
Все животные
21
До 1 дозы
Серийный отбор образцов крови
Животные №1 и 43
100
2
40
40
1 введение
Все животные
Через три часа после 1 дозы
Серийный отбор образцов крови
Животные №2 и №4
100
2
40
40
8
2 введение
Все животные
22
1 введение
Все животные
2 введение
Все животные
23
1 введение
Все животные
2 введение
Все животные
24
1 введение
Все животные
2 введение
Все животные
25
1 введение
Все животные
2 введение
Все животные
26
1 введение
Все животные
2 введение
Все животные
27
1 введение
Все животные
2 введение
Все животные
Через 1 час после 2 дозы
Последний отбор образцов крови
Животное №1
≥400
2
≥160
20
≥140
Некропсия
Животное 4I
24
Через 3 часа после 2 дозы
Последний отбор образцов крови
Животное №2
≥400
2
≥160
20
≥140
Некропсия
Животное №2
24
Через 6 часов после 2 дозы
Последний отбор образцов крови
Животное №3
≥400
2
≥160
20
≥140
Некропсия
Животное №3
24
28
Через 12 часов после 2 дозы
Последний отбор образцов крови
Животное №4
≥400
2
≥160
20
≥140
Некропсия
Животное №4
24