Способ оптимизации лабораторной диагностики тромбинемии у пациентов с инфекцией COVID-19
METHOD FOR OPTIMIZING LABORATORY DIAGNOSIS OF THROMBINEMIA IN PATIENTS WITH COVID-19 INFECTION

Изобретение относится к медицине, а точнее - к диагностике состояния тромбинемии на основе лабораторного метода кинетики тромбина и может быть использовано в клинической практике врачами клинической лабораторной диагностики, инфекционистами, реаниматологами с целью оптимизации диагностики протромботического состояния у пациентов с инфекцией COVID-19.
Диагностика патологии системы гемостаза определяет решающую роль в лечении инфекции COVID-19. Маркерами ковид-ассоциированной коагулопатии и воспаления являются показатели, рекомендованные специалистами ISTH для определения у пациентов с COVID-19 [Временные рекомендации Международного Общества специалистов по Тромбозу и Гемостазу (ISTH) по выявлению и коррекции коагулопатии у пациентов с COVID-19]. При этом следует учитывать, что рекомендуемые стандартные гемостазиологические тесты, такие как протромбиновое время, активированное частичное тромбопластиновое время, уровень D-димера, фибриногена не способны выявить состояние тромбинемии (гиперкоагуляции, протромботической готовности) при новой короновирусной инфекции. Возможным решением данной проблемы может стать использование глобальных (интегральных) методов исследования системы гемостаза, которым является тест генерации (кинетики) тромбина. Предлагаемый тест является чувствительным и специфичным методом диагностики образования и количества тромбина (тромбинемии) и одним из оптимальных методов, коррелирующих с риском развития кровотечения или тромботическими событиями, в том числе при проведении антитромботической терапии.
По данным научной литературы и реальной клинической практики в настоящее время не существует специфичного и чувствительного метода диагностики состояния тромбинемии (протромботической готовности, состояния гиперкоагуляции) у пациентов с острыми инфекционными заболеваниями, в том числе при инфекции Covid-19. Наиболее доступными тестами исследования гемостаза в реальной клинической практике до сих пор являются следующие: активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ), протромбиновое время (ПВ), определение плазменной активности антитромбина III (AT III), плазменная концентрация D-димера, уровень фибриногена И количество тромбоцитов [Raber M.N. Coagulation Tests / M.N. Raber - Butterworths, 1990]. Однако перечисленные выше лабораторные тесты не дают возможность оценить состояние тромбинемии и, как следствие, состояние протромботической готовности. Перечисленные скрининговые тесты коагуляции, отражая только 5% генерации (синтеза) тромбина, не решают полностью данную задачу, так как могут оставаться неизменными даже при развитии клинически значимого тромбоза, что не приемлемо для скрининга и, как следствие, выбора режима антитромботической терапии при патологии.
В отличие от широко используемых классических клоттинговых исследований, интегральные методы отображают кинетику всех стадий активации тромбина и формирования тромба, качество фибринового сгустка, функциональную активность тромбоцитов и фибринолиз [Röllig C. How I treat hyperleukocytosis in acute myeloid leukemia / C. Röllig, G. Ehninger // Blood - 2015. - T. 125 - №21 - 3246-3252 с.]. Данные тесты основаны на графической регистрации изменений вязкости и упруго-эластических свойств крови в процессе образования сгустка. Очень важно, что с помощью интегральных тестов исследуют не активность отдельных факторов свертывающей или противосвертывающей систем, а всю систему гемостаза в целом как результат взаимодействия данных факторов [Lang Т. Multi-centre investigation on reference ranges for ROTEM thromboelastometry. / T. Lang, A. Bauters, S.L. Braun, B. Pötzsch, K.-W. von Pape, H.-J. Kolde, M. Lakner // Blood Coagul. Fibrinolysis - 2005. - T. 16 - №4 - 301 - 10 с.].
Одним из перспективных интегральных тестов для внедрения в реальную клиническую практику является тест генерации (кинетики) тромбина (ТГТ), который отражает именно состояние тромбинемии - количество генерируемого тромбина, кинетику его образования, а также служит финальной характеристикой соотношения прокоагулянтных и антикоагулянтных факторов [Carlier L. Ex vivo thrombin generation patterns in septic patients with and without disseminated intravascular coagulation/ L. Carlier [et al.] // Thrombosis Research. - 2015. - Vol. 135, №1. - p. 192-197]. Тест генерации (кинетики) тромбина (ТГТ) - измеряет кинетику и количество тромбина, образующегося в плазме крови при стандартной величине активации системы свертывания. Регистрируется кинетика возникновения и последующего исчезновения тромбина в плазме крови после активации свертывания.
Генерация тромбина как глобальный коагуляционный анализ более точно отражает тромботический фенотип, чем измерение отдельных локальных параметров коагуляционного каскада. ТГТ является чувствительным и специфичным методом диагностики образования тромбина и одним из лучших методов, коррелирующих с кровотечениями или тромботическими событиями [Bagot C.N., Leishman E., Onyiaodike С.С. et al., 2019; Duarte R.C.F. et al., 2017; Joly B.S. et al., 2018]. Основное различие между ТГТ И клоттинговыми тестами на свертывание заключается в том, что вторые описывают начало и конец образования фибринового сгустка (около 5% потребления тромбина), а ТГТ предоставляет информацию об общем потенциале свертывания, так как генерация тромбина не прекращается даже после образования сгустков фибрина.
Наиболее близким к предлагаемому техническому решению проблемы является способ диагностики венозного тромбоза, основанный на методе определения D-димера [P.S. WELLS. Integrated strategies for the diagnosis of venous thromboembolism. - Jth. Volume 5, July 2007. - Pages 41-50 Issues 1 Special Issue: State of the Art]. Однако данный метод имеет низкую специфичность в виду того, что и фибриноген, и D-димер являются белками острофазового воспаления и закономерно увеличиваются при любом виде воспалении (инфекционном, асептическом, иммунным), беременности, старости, раке, и особенно при инфекции Covid-19 [Воробьева Н.А., Бедило Н.В., Сравнительная характеристика методов оценки тромбинемии у пациентов с внебольничной пневмонией Тромбоз, гемостаз, реология 2013 №2; Воробьева Н.А., Бедило Н.В. Оценка некоторых показателей гемостаза и эндотелиальной дисфункции у пациентов с внебольничной пневмонией Анестезиология и реаниматология, №1, 2014; Воробьева Н.А., Бедило Н.В. Способ прогнозирования неполного рентгенологического разрешения внебольничной пневмонии с использованием лабораторного мониторинга. Приоритет 2014134961 от 26.08.2014].
Другим близким методом является способ скринингового обследования для выявления групп риска развития гиперкоагуляционного состояния в условиях экспедиционной работы В Арктике [Воробьева Н.А., Воробьева А.И., Мельничук Е.Ю. Способ скринингового обследования для выявления групп риска развития гиперкоагуляционного состояния в условиях экспедиционной работы в Арктике. Патент на изобретение №2767891 от 22 марта 2022 г.], где тест кинетики тромбина используется у практически здоровых людей для диагностики гиперкоагуляционного состояния в условиях морского арктического рейса. Однако данный метод не предусматривал оценку состояния тромбинемии в условиях системного воспаления, закономерно присутствующего у пациентов с инфекцией Covid-19.
Таким образом в настоящее время используемые и доступные лабораторные тесты не позволяют объективно и достоверно оценить риск развития и выраженность состояния тромбинемии, протромботической готовности, и, как следствие, выбрать соответствующий оптимальный режим антитромботической терапии (назначение профилактических или терапевтических доз антикоагулянтов) применительно к скринингу данного состояния при тяжелом течении инфекции Covid-19.
Задачей настоящего изобретения является устранение существующих недостатков рутинных клоттинговых методов - объективизация (а именно измерение) анализируемого признака состояния тромбинемии и, как следствие, протромботической готовности на основе использования интегрального метода теста генерации (кинетики) тромбина, повышение диагностической значимости метода и упрощение интерпретации результатов, на основании которых выносят суждение о возможности наличия состояния протромботической готовности у пациентов с инфекцией Covid-19, на основе чего выбирается соответствующий режим антитромботической профилактики или терапии.
Поставленная задача решается за счет того, что у пациентов с инфекцией Covid-19 проводиться лабораторная оценка состояния тромбинемии с использованием автоматического анализа параметров кинетики тромбина. Полученные результаты выражают в виде следующих показателей: время лаг-фазы (tLag), время образования пика тромбина (tPeak), пик тромбина (Peak) и эндогенный потенциал тромбина (AUC).
В доступных нам литературных источниках мы не обнаружили сведений по использованию метода Теста Генерации Тромбина для скрининга состояния тромботической готовности в условиях инфекции Covid-19 на основе которого выбирался режим антитромботической профилактики или терапии.
Способ осуществляют следующим образом.
У пациентов, госпитализированных в ковидное отделение с подтвержденной методом ПЦР-анализа инфекцией Covid-19, выполняется забор венозной крови объемом 5 мл в вакуумный вакутейнер с 3,2% цитратом натрия. Полученные образцы крови центрифугируют при скорости 3000 оборотов в минуту в течение 15 минут. Определение параметров кинетики тромбина выполняется на автоматическом анализаторе «Ceveronalpha» с TGA-модулем с использованием реагентов Ceveron TGA High (БиоХимМак). Анализируются следующие параметры кинетики тромбина: время лаг-фазы (tLag), время образования пика тромбина (tPeak), пик тромбина (Peak) и эндогенный потенциал тромбина (AUC). Программное обеспечение «Ceveronalpha» автоматически рассчитывает показатели генерации/кинетики тромбина в образце в течение 10-15 минут, результаты представляются в нМ тромбина, генерированного в образце для каждой точки времени в течение всего процесса свертывания.
Используя референтные показатели кинетики тромбина (см. таблицу 1) делается заключение о наличии или отсутствии состояния тромбинемии как фактора риска развития тромботических и сосудистых осложнений (венозные/артериальные тромбозы, ТЭЛА, инсульты, инфаркты, транзиторные ишемические атаки). Данный способ скринингового обследования пациентов с инфекцией Covid-19 для выявления групп риска развития состояния тромботической готовности, основан на интегральном анализе системы гемостаза с использованием количества генерируемого тромбина, кинетики его образования для финальной характеристики соотношения прокоагулянтных и антикоагулянтных факторов.
При необходимости возможно провести динамический контроль (мониторинг) показателей кинетики тромбина для контроля эффективности назначенного профилактического или терапевтического режима антитромботической терапии.
Основанием для использования теста кинетики тромбина при инфекции Covid-19 явились результаты анализа вышеперечисленных параметров у пациентов с индифицированным вирусом SARS-CoV-2, госпитализированных в ковидное отделение ГБУЗ АО «Первая городская клиническая больница им. Е.Е. Волосевич» г. Архангельска.
Объектом исследования являлись пациенты со среднетяжелым и тяжелым течением COVID-19, госпитализированные в ГБУЗ АО ПГКБ им. Е.Е. Волосевич г. Архангельска в период с марта 2020 года по май 2021 года. В проспективное клинико-лабораторное исследование были включены 100 пациентов с выделенным вирусом SARS-CoV-2, средний возраст обследуемых составил 63 [31;85] года, преобладали женщины - 60%.
Критериями включения в исследование явились: подтвержденная методом ПЦР анализа инфекция Covid-19; госпитализация в ковидное отделение; письменное добровольное информированное согласие на участие в исследовании; возраст старше 18 лет. Критерии не включения: отказ на участие в исследовании; возраст младше 18 лет.
Дизайн исследования был одобрен локальным этическим комитетом Северного государственного медицинского университета.
Забор образцов плазмы осуществлялся в двух точках: первая точка - при госпитализации пациента в стационар до назначения антитромботической терапии, вторая точка - на 3-5 сутки госпитализации на фоне антитромботической терапии низкомолекулярными гепаринами. Материалом для исследования явилась венозная кровь, полученная путем венепункции локтевой вены. Полученные образцы крови центрифугировали при скорости 3000 оборотов в минуту в течение 15 минут. Лабораторные исследования выполнены базе Регионального центра антитромботической терапии ГБУЗ Архангельской области «Первая городская клиническая больница им. Е.Е. Волосевич» г. Архангельска. Определение параметров кинетики тромбина проводилось на автоматическом анализаторе «Ceveronalpha» с TGA-модулем с использованием реагентов Ceveron TGA High (БиоХимМак). Проанализированы следующие параметры кинетики тромбина: время лаг-фазы (tLag), время образования пика тромбина (tPeak), пик тромбина (Peak), эндогенный потенциал тромбина (AUC).
Каждый из вышеперечисленных параметров имеет диагностическое значение. Lag time представляет собой эквивалент времени свертывания в традиционном тесте на коагуляцию. Peak thrombin представляет наибольшую концентрацию тромбина, которая может быть получена. Time to peak представляет скорость генерации тромбина. Исследуемая плазма может достигать time to peak быстрее или медленнее, что отражает гипер- или гипокоагуляционные состояния. Наконец, эндогенный тромбиновый потенциал AUC представляет собой общее количество тромбина, которое может генерировать образец плазмы под действием двух противоположных (про- и антикоагулянтных) активаторов, действующих в плазме (фиг. 1).
Используемые референтные показатели ТГТ представлены в таблице 1 [Полеводова О.А. Диагностика и мониторинг терапии жизнеугрожающих геморрагических и тромботических осложнений у пациентов с заболеваниями системы крови - канд. дис. Москва 2019].
Исходя из временных методических рекомендаций определяли коагулологические показатели (протромбиновое время, D-димер, АЧТВ, фибриноген) - с использованием реактивов «Diagnostica Stago» на автоматическом коагулометре «StaCompact», Roshe (Швейцария) в течение 30 минут с момента забора крови в вакутейнер [Временные методические рекомендации «Профилактика, диагностика и лечение новой коронавирусной инфекции (COVID-19)». Версия 11 от 07.05.2021 http://nasci.ru/?id=40123&download=1, дата обращения 30 марта 2022].
Статистический анализ выполнен с использованием программы SPSS версия 20,0 и калькулятор MedCalc. Количественные переменные представлены как М (mean) ± SD в случае нормального распределения и Me (median) и 25, 75 percentile при иных распределениях. Количественные переменные сравнивались с использованием параметрических и непараметрических тестов. Достоверными считались различия при р<0,05. Использованы методы корреляционного анализа (коэффициенты линейной корреляции Пирсона и ранговой корреляции Спирмена), регрессионного анализа (множественная линейная регрессия и множественная логистическая регрессия) и ROC.
Обследуемые пациенты были в возрасте 63 [31; 85] года, в основном преобладали женщины - 60%. Динамика рутинных лабораторных показателей системы гемостаза у пациентов с Covid-19 представлена в таблице 2.
Было выявлено, что уровень D-димера статистически значимо повышается к 4-м суткам госпитализации, не смотря на проводимую антикоагулянтную терапию с использованием низкомолекулярных гепаринов, при этом уровень фибриногена и ферритина снижались только к 10-м суткам терапии. При этом важно отметить, что указанные маркеры относятся к лабораторным маркерам как гиперкоагуляции, так и системного воспаления (фиг. 1). Важно отметить, что рутинные клотинговые тесты (АЧТВ, MHO (ПВ) не показали диагностической значимости для выявления состояния тромбинемии.
Результаты теста кинетики тромбина в нашем исследовании указывают на повышение прокоагулянтного потенциала крови у пациентов с Covid-19 при госпитализации в стационар. Так, было установлено, что статистически значимо укорачивалось время инициации свертывания, время достижения пиковой концентрации тромбина и время увеличения пиковой концентрации тромбина у пациентов в 1-е сутки госпитализации, что свидетельствовало о значимой активации тромбина и состоянии тромбинемии - протромботической активности (таблица 3).
Следующим этапом явился анализ показателей теста кинетики тромбина на фоне антитромботической терапии низкомолекулярными гепаринами, где была отмечена динамика снижения активности тромбинемии по всем анализируемым показателям теста кинетики тромбина (таблица 4).
Проведен анализ возможной связи отдельных показателей теста кинетики тромбина с рекомендуемыми BMP (версия 11.0) лабораторными маркерами острофазового воспаления и дисбаланса в системе гемостаза (фиг. 2-6).
Так, была выявлена связь времени инициации свертывания (Tlag) с уровнем фибриногена (rS=-0,7(р=0,001) и СРБ (rS=-0,1(p=0,01); времени достижения пика генерации тромбина (tPeak) со всеми маркерами воспаления (D-димером (rS=-0,4 (р=0,001), ферритином (rS=-0,2(p=0,01), СРБ (rS=-0,3(p=0,05), фибриногеном (rS=-0,5(p=0,001)); пиковой концентрации тромбина (Peak thrombin) с уровнем фибриногена (rS=0,3 р=0,001); индекса скорости (VI) с уровнем фибриногена (rS=0,2, р<0,001); эндогенного тромбинового потенциала (ЕТР, AUC) с уровнем фибриногена (rS=0,4, р=0,001) и СРБ (rS=0,1, р=0,001) (фиг. 2-6).
Полученные результаты свидетельствуют о значимом повышении уровня эндогенного тромбинового потенциала и наличии тромбинемии по всем тестам кинетики тромбина в зависимости от острофазового воспаления при новой короновирусной инфекции.
Таким образом, тест генерации (кинетики) тромбина может рассматриваться в качестве маркера развития тромбинемии - протромботической готовности у пациентов с среднетяжелым и тяжелым течением новой короновирусной инфекцией.
Данные результаты нашего исследования согласуются с отдельными данными, что многие провоспалительные эффекты тромбина имеют важную роль в развития сосудистых событий как на уровне макро- так и микроциркуляции [Favaretto Е. Thrombin generation and intracranial atherosclerotic disease in patients with a transient ischaemic attack /Е. Favaretto [et al.] // Thrombosis Research. - 2017. - Vol. 155. - P. 72-77].
Апробирование скринингового метода мониторинга тромбинемии на проспективной выборке пациентов с новой короновирусной инфекцией показало, что в 100% случаев данный метод выявляет состояние тромбинемии в отличие от клоттинговых методов, которые не показали свою диагностическую ценность в плане диагностики состояния тромбинемии.
Представляем несколько клинических примеров, демонстрирующих значимость данного скринингового метода для лабораторной диагностики состояния тромбинемии в условиях инфекции Covid-19. Хронометрические и структурные показатели системы гемостаза (фибриноген, АЧТВ и MHO), включая широко используемый и рекомендуемый тест определения уровня D-димера, во всех случаях не показали состояния тромбинемии в отличии от теста генерации тромбина.
Клинические примеры
2
1. Пациент Р., мужчина 69 года. Сопутствующие заболевания (коморбитность) - гипертоническая болезнь III ст., риск 3, сахарный диабет 2 типа, ИМТ 38 кг/м, курит. КТ-3 - среднетяжелая пневмония, поражено 50-75% легких.
Уровень D-димера - без динамики. Показатели теста генерации тромбина в динамике - состояние тромбинемии при поступлении и регрессия тромбинемии при назначении антитромботической терапии надропарином в терапевтической дозе. Выздоровление.
2
2. Пациентка С., женщина 82 года. Сопутствующие заболевания (коморбитность) - гипертоническая болезнь III ст., риск 4, сахарный диабет 2 типа, ИМТ 29 кг/м, не курит. КТ-4 - тяжелая пневмония, поражено более 75% легких.
Уровень D-димера - без динамики. Показатели теста генерации тромбина в динамике - состояние тромбинемии при поступлении и регрессия тромбинемии при назначении антитромботической терапии надропарином в терапевтической дозе. Выздоровление через тяжелый постковидный синдром.
2
3. Пациентка П., женщина 78 года. Сопутствующие заболевания (коморбитность) - ОНМК 4 года назад, гипертоническая болезнь III ст., риск 4, сахарный диабет 2 типа, ИМТ 34 кг/м, не курит. КТ-3 - среднетяжелая пневмония, поражено 50-75% легких.
Уровень D-димера - без динамики. Показатели теста генерации тромбина в динамике - состояние тромбинемии при поступлении и регрессия тромбинемии при назначении антитромботической терапии надропарином в терапевтической дозе. Выздоровление
2
4. Пациент М., мужчина 58 года. Сопутствующие заболевания (коморбитность) - сахарный диабет 2 типа, ИМТ 28 кг/м, ХОБЛ, курит. КТ-3 - среднетяжелая пневмония, поражено 50-75% легких.
Уровень D-димера - без динамики. Показатели теста генерации тромбина в динамике - состояние тромбинемии при поступлении и регрессия тромбинемии при назначении антитромботической терапии надропарином в терапевтической дозе. Выздоровление через фиброз легкого.
2
5. Пациент О., мужчина 47 года. Сопутствующие заболевания (коморбитность) - гипертоническая болезнь III ст., риск 4, ИМТ 32 кг/м, не курит. КТ-3 - среднетяжелая пневмония, поражено 50-75% легких.
Уровень D-димера - без динамики. Показатели теста генерации тромбина в динамике - состояние тромбинемии при поступлении и регрессия тромбинемии при назначении антитромботической терапии надропарином в терапевтической дозе. Выздоровление.
Данные настоящего проспективного клинического исследования демонстрируют простоту и полезность предложенного лабораторного метода способа скрининга состояния тромбинемии. Кроме того, разработанный и апробированный метод значительно оптимизирует лабораторную диагностику состояния именно тромбинемии на фоне острого воспаления в отличии от базовых хронометрических и структурных тестов (фибриноген, АЧТВ, ПВ, D-димер), которые в данных условиях не показали свою диагностическую ценность. Немаловажно, что врач-клиницист «красной» зоны ковидного госпиталя получает объективный показатель, указывающий на возможность присутствия состояния тромбинемии на фоне острого воспаления при инфекции Covid-19, что невозможно при использовании лабораторного теста уровня Д-димера.
Сведения об известных аналогах
1. Воробьева Н.А., Бедило Н.В., Сравнительная характеристика методов оценки тромбинемии у пациентов с внебольничной пневмонией Тромбоз, гемостаз, реология 2013 №2.
2. Воробьева Н.А., Бедило Н.В. Оценка некоторых показателей гемостаза и эндотелиальной дисфункции у пациентов с внебольничной пневмонией Анестезиология и реаниматология, №1, 2014.
3. Воробьева Н.А., Бедило Н.В. Способ прогнозирования неполного рентгенологического разрешения внебольничной пневмонии с использованием лабораторного мониторинга. Приоритет 2014134961 от 26.08.2014.
4. Воробьева Н.А., Воробьева А.И., Мельничук Е.Ю. Способ скринингового обследования для выявления групп риска развития гиперкоагуляционного состояния в условиях экспедиционной работы в Арктике. Патент на изобретение №2767891 от 22 марта 2022 г.
5. А.А. Мельник Тест генерации тромбина - уникальный метод интегральной оценки системы гемостаза Медична газета «Здоров'я Украïи 21 сторiччя» №2 (375), сiчень 2016 p.; Hemker Н.С., Аl Dieri R., De Smedt E. et al. // Thromb. Haemost. 2006; 96: 553-561.
6. Armando Tripodi. Thrombin Generation Assay and Its Application in the Clinical Laboratory // Clinical Chemistry. - 2016. - No. 5. - S. 699-707.
7. Eichinger S. Prediction of recurrent venous thromboembolism by endogenous thrombin potential and D-dimer / S. Eichinger [et al.] // Clin Chem. - 2008. - Vol. 54, №12. - P. 2042-2048
8. Hemker H.C., Beguin S. Thrombin generation in plasma: its assessment via the endogenous thrombin potential. Throm. Haemost. 1995; 74(5): 134-138.
9. Hemker H.C., Al Dieri R., De Smedt E. et al. Thrombin generation, a function test of the haemostatic-thrombotic system // Thromb Haemost.. - 2006. - Вып. 96, №5. - С. 553-561
10. Raber M.N. Coagulation Tests / M.N. Raber - Butterworths, 1990.
11. Wells P.S. Integrated strategies for the diagnosis of venous thromboembolism. - Jth. Volume 5, July 2007. - Pages 41-50 Issues1 Special Issue: State of the Art.