Влияние мезенхимальных стромальных клеток на раннее восстановление Т-лимфоцитов у больных злокачественными лимфомами с аутологичной трансплантацией гемопоэтических стволовых клеток

ИММУНОЛОГИЯ № 4, 2013

молярной концентрации в 3 раза выше, чем у полноразмерных АТ, что, вероятно, обусловлено их более низкой константой связывания с ганглиозидом GD2. Во-вторых, как описано выше, время полужизни Fab-фрагментов значительно ниже, чем у АТ. Для более эффективного использования свойства GD2-специфичных АТ индуцировать апоптоз в опухолевых клетках представляется перспективным использование модифицированных Fab-фрагментов, имеющих увеличенную молекулярную массу (например, за счет пегилирования) и, как следствие, увеличенное времени полужизни в организме. Другим подходом может служить создание рекомбинантных бивалентных фрагментов АТ, имеющих аффинность связывания, сравнимую с полноразмерными АТ,и массу более 60 кД, но лишенных Fc-фрагментов, которые вызывают ряд побочных эффектов терапевтических АТ, направленных на GD2-позитивные опухоли.

Работа выполнена при поддержке федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг., государственные контракты № П1065 и № 8165.

ЛИТЕРАТУРА

1. Холоденко Р.В. Апоптозиндуцирующая активность моноклональных антител 14G2a к опухолевому ганглиозиду GD2 в Т-клеточной лимфоме EL-4. Современные проблемы венерологии, иммунологии и врачебной косметологии. 2010; 8(1): 17-23.

2. Доронин И.И., Холоденко И.В., Молотковская И.М., Холоденко Р.В. Получение Fab-фрагментов GD2-специфичных антител (GD2-mAb) и анализ их противоопухолевой активности in vitro. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2012; 154(11): 616-23.

3. Холоденко И.В., Доронин И.И., Холоденко Р.В. Клинические испытания антител к ганглиозиду GD2 для терапии онкологических заболеваний: перспективы и ограничения. Современные проблемы венерологии, иммунологии и врачебной косметологии. 2010; 13(6): 79-83.

REFERENCES

1. Kholodenko R.V Sovremennye problemy venerologii, immu-nologii i vrachebnoy kosmetologii. 2010; 8(1): 17-23 (in Russian).

2. Doronin I.I., Kholodenko I.V., Molotkovskaya I.M., Kholodenko R.V. Byulleten’ eksperimental’noy biologii i meditsiny. 2012; 154(11): 616-23 (in Russian).

3. Kholodenko I.V., Doronin I.I., Kholodenko R.V. Sovremennye problemy venerologii, immunologii i vrachebnoy kosmetologii. 2010; 13(6): 79-83 (in Russian).

4. Alvarez-Rueda N., Leprieur S., Clemenceau B., et al. Binding activities and antitumor properties of a new mouse/human chimeric antibody specific for GD2 ganglioside antigen. Clin Cancer Res. 2007; 13: 5613-20.

5. Barker E., Reisfeld R. Mechanism for neutrophil-mediated lysis of human neuroblastoma cells. Cancer Res. 1993; 53(2): 362-67.

6. Aixinjueluo W., Furukawa K., Zhang Q., et al. Mechanisms for the apoptosis of small cell lung cancer cells induced by anti-GD2 monoclonal antibodies. Journal of biological chemistry. 2005; 280(33): 29828-36.

7. Kowalczyk A., Gila M., Horwacika I., Odrowa Z., Kozborb D., Rokitaa H. The GD2-specific 14G2a monoclonal antibody induces apoptosis and enhances cytotoxicity of chemotherapeutic drugs in IMR-32 human neuroblastoma cells. Cancer Letters. 2009; 281: 171-82.

8. Zhang Z., Knoepp S.M., Ku H., Sansbury H.M., Xie Y., Chahal M.S., Tomlinson S., Meier K.E. Differential expression of FAK and Pyk2 in metastatic and non-metastatic EL4 lymphoma cell lines. Clin Exp Metastasis. 2011; 28: 551-65.

9. KurokiM., Hachimine K., Huang J., Shibaguchi H., Kinugasa T., Maekawa S.-I., Kuroki M. Re-targeting of cytotoxic T lymphocytes and/or Natural killer cells to CEA-expressing tumor cells with anti-CEA antibody activity. Anticancer Research. 2005; 25: 3725-32.

Поступила 28.10.12

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013

УДК 616-006.441.04-08:615.361.4-013.3]-07

Е.Р. Черных, Е.В. Баторов, Е.Я. Шевела, Н.В. Пронкина, И.В. Крючкова, В.В. Сергеевичева, А.В. гилевич, Д.С. Баранова, В.С. Кожевников, А.А. йстани

ВЛИЯНИЕ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК НА РАННЕЕ

восстановление т-лимфоцитов у больных злокачественными лимфомами с аутологичной трансплантацией гемопоэтических стволовых клеток

НИИ клинической иммунологии СО РАМН, 630099, г. Новосибирск

В работе проанализировано влияние котрансплантации мезенхимальных стромальных клеток (МСК) на раннее восстановление содержания лимфоцитов и особенности реконституции Т-клеток у больных злокачественными лимфомами с аутологичной трансплантацией гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК). Котрансплантацию МСК в средней дозе 0,17106/кг провели у 22 больных. Группу сравнения составили пациенты (n = 31) со стандартной аутологичной ТГСК, сопоставимые по возрасту, полу, предлеченности, режимам мобилизации, исходному содержанию и субпопуляционному составу лимфоцитов и количеству трансплантированных гемопоэтических стволовых клеток. Пациенты с котрансплантацией МСК характеризовались более эффективным ранним восстановлением содержания лимфоцитов (х2 = 0,004), более интенсивным восстановлением относительного и абсолютного количества наивных CD4+ Т-клеток (ри = 0,047 и ри = 0,022) и тенденцией к более активной реконституции CD4+-лимфоцитов в целом (pU= 0,058). При этом котрансплантация МСК не влияла на восстановление пула CD8+T-клеток. Обсуждаются возможные механизмы влияния МСК на восстановление субпопуляций Т-лимфоцитов.

Ключевые слова: реконституция лимфоцитов, мезенхимальные стромальные клетки, гемопоэтические стволовые клетки, трансплантация

- 202 -

ИММУНООНКОЛОГИЯ

E.R. Chernykh, E. V Batorov, E.Ya. Shevela, N. V. Pronkina, I. V. Kryuchkova, VV Sergeevicheva, A. V Gilevich, D.S. Baranova, VS. Kozhevnikov, A.A. Ostanin

EFFECT OF MESENCHYMAL STROMAL CELLS ON THE EARLY RECONSTITUTION OF T-LYMPHOCYTES IN MALIGNANT LYMPHOMA PATIENTS WITH AUTOLOGOUS HEMATOPOIETIC STEM CELL TRANSPLANTATION

Scientific research Institute of clinical immunology SB RAMS, Novosibirsk

The effect of mesenchymal stromal cells (MSC) co-transplantation on the early lymphocyte recovery and T-cell reconstitution in malignant lymphoma patients with autologous hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) has been investigated. Co-transplantation of MSC in an average dose of 0,17106/kg was conducted in a group of 22 patients. The control group consisted of 31 patients with a standard autologous HSCT, comparable in age, gender, pretreatment, mobilization regimens, initial amount and subpopulation structure of lymphocytes and the number of transplanted HSCs. Patients with MSC co-transplantation were characterized by more effective early lymphocyte recovery (x2 = 0,004), more intensive reconstitution of relative and absolute number of naive CD4+T-cells (pU = 0,047 and pU = 0,022) and a trend towards more active reconstitution of total CD4+T-cell (pU = 0,058). However, MSC co-transplantation did not affect early reconstitution of CD8+T-cells. In conclusion, we discuss possible mechanisms mediating effects of MSC on T-lymphocyte recovery.

Keywords: reconstitution of lymphocytes, mesenchymal stromal cells, hematopoietic stem cells, transplantation

Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК) является одним из эффективных методов лечения ряда гематологических, онкологических и аутоиммунных заболеваний. Однако развитие рецидива заболевания является причиной смерти в 73% случаев аутологичной и 35-43% случаев аллогенной ТГСК [1]. Поэтому остается актуальным поиск методов оптимизации существующих трансплантационных технологий. Определенный интерес в этом направлении вызывает котрансплантация мезенхимальных стромальных клеток (МСК). Использование МСК обосновано в первую очередь способностью этих клеток к поддержанию гемопоэза [2, 3]. МСК входят в состав микроокружения стволовых кроветворных клеток, усиливают пролиферацию и диффе-ренцировку гемопоэтических предшественников и способны стимулировать регенерацию клеток стромы после повреждающих воздействий [4]. Проведение химио-, радиотерапии у больных c гемобластозами и солидными опухолями приводит к выраженным нарушениям гемопоэзподдерживаю-щей функции стромальных клеток костного мозга. Поэтому одновременное введение МСК при ТГСК может способствовать улучшению приживления гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) и сокращению сроков критической цитопении [4-6].

Однако поскольку МСК обладают иммуносупрессорной активностью [6, 8, 9], широкое применение этих клеток в клинической практике требует более детального изучения возможных побочных эффектов. Например, в одном из исследований было показано, что котрансплантация донорских МСК наряду со снижением частоты развития острой и хронической РТПХ приводила к увеличению количества рецидивов [10], что могло быть связано с ингибирующим действием МСК на реконституцию иммунной системы. Действительно, в литературе имеются данные о важной роли раннего восстановления содержания лимфоцитов в исходах ТГСК. Данный показатель является независимым фактором увеличения общей выживаемости и времени до прогрессии заболевания после аутологичной ТГСК при неходжкинских лимфомах (НХЛ), лимфомах Ходжкина (ЛХ) и миеломной болезни [11, 12].

Восстановление количества Т-клеток после ТГСК происходит за счет тимопоэза и гомеостатической пролиферации периферических Т-лимфоцитов. Согласно данным литературы, МСК способны ингибировать пролиферацию наивных Т-клеток и Т-клеток памяти [13, 14], а также пролиферацию лимфоцитов, стимулированных интерлейкином (ИЛ)-2, ИЛ-7 и ИЛ-15, т.е. отражающую гомеостатическую пролиферацию Т-клеток [15]. Однако супрессорный эффект МСК in vitro проявляется только при высоких дозах МСК [16] и не всегда подтверждается in vivo [17]. При этом влияние МСК на гомеостатическую пролиферацию лимфоцитов и эффективность тимопоэза in vivo остается до сих пор не исследованным.

Ранее нами была разработана медицинская технология

совместной трансплантации ГСК и МСК с целью улучшения приживления стволовых кроветворных клеток и ускорения восстановления гемопоэза [18]. Апробация данного подхода показала хорошую переносимость котрансплантации МСК, отсутствие токсических эффектов и раннее восстановление гемопоэза после трансплантации аутологичных ГСК [19]. Однако влияние МСК на раннее восстановление уровня лимфоцитов и Т-клеток оставалось неисследованным. С учетом этого цель работы состояла в изучении влияния ко-трансплантации МСК на особенности ранней реконституции Т-лимфоцитов при проведении аутологичной ТГСК у больных злокачественными лимфомами.

Материалы и методы. Пациенты. В исследование включили 53 больных, в том числе 38 мужчин и 15 женщин, в возрасте от 17 до 58 лет (средний возраст 35 лет), которым проводили аутологичную ТГСК в отделении гематологии и трансплантации костного мозга Клиники иммунопатологии НИИ клинической иммунологии СО РАМН с 2003 по 2010 г. У 22 пациентов диагностировали НХЛ, у 17 - ЛХ, у 14 - множественную миелому (ММ). В качестве контрольной группы обследовали 15 совместимых по полу и возрасту здоровых лиц. Забор крови и все иммунологические исследования проводили после получения письменного информированного согласия пациентов.

Мобилизация, режимы кондиционирования и получение периферических ГСК. Мобилизацию ГСК у большинства (50) больных проводили с использованием различных режимов химиотерапии (ХТ) с последующим введением гранулоци-тарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ, 10 мкг/ кг/день). Мобилизацию ГСК в режиме монотерапии Г-КСФ применяли только у 3 больных. 42 пациента получили высо-кодозную ХТ циклофосфамидом (4 г/м2), 8 - другие режимы ХТ (2 - DexaBEAM, 2 - ESHAP, 2 - ICE, по 1 - CAV, DCEP). 36 пациентов с лимфомами получали режим кондиционирования BEAM, 14 с ММ и 3 с лимфомами - высокодозный мел-фалан. Процедуру афереза проводили на сепараторах клеток крови AS TEC 204 (Fresenius) и Spectra LRS 07 (COBE) после достижения в периферической крови концентрации ГСК 1 • 104 CD34+-клеток/мл и продолжали до получения более чем 2-106 CD34+-клеток/кг.

Получение и введение МСК. Аспират костного мозга получали из крыла подвздошной кости. Фракцию монону-клеарных клеток (МНК) выделяли стандартно путем центрифугирования клеток аспирата в градиенте плотности фиколла-верографина (1,078 г/л). Для получения МСК костномозговые МНК инкубировали в пластиковых флаконах («Nunclon», Дания) в питательной среде aMEM («БиолоТ», Санкт-Петербург), дополненной 100 мкг/мл гентамицина и 5% пулированного лизата человеческих тромбоцитов, при 37°C в С02-инкубаторе Через 48 ч неприкрепленные к пластику клетки удаляли, а прилипающую фракцию клеток культивировали до получения конфлюентного монослоя. Отделе-

- 203 -

ИММУНОЛОГИЯ № 4, 2013

Характеристика больных с онкологическими заболеваниями

Группа больных Досто-

Параметр верность

МСК- (n = 31) МСК+ (n = 22) различий

Возраст, годы

Половой состав:

мужчины

женщины

Статус:

полная ремиссия частичная ремиссия Количество курсов ХТ:

1- й линии

2- й линии cD34+ ГСК

(медиана; min—max), •106/кг

Абсолютное количество лимфоцитов в продукте сепарации

(медиана; min-max), •lO9

Лимфоцитоз периферической крови до ТГСК

Субпопуляция Т-клеток в периферической крови до ТГСК, %:

CD4+CD45RA+

CD4+CD45RO+

CD8+CD45RA+

CD8+CD45RO+

Раннее восстановление лимфоцитов (количество/процент больных)*

35 (18-58) 26(17-55) Ри = 0,23

22

9 (29%) 6 (27%) X2 = 0,88

7

24 (77,4%) 13 (59%) X2 = 0,15

6,2 ± 0,5 6,3 ± 0,4 Ри = 0,54

1,4 ± 0,3 1,9 ± 0,4 Ри = 0,44

6,7 ± 1,2 5,0 ± 0,5

(4,7; 2-34) (4,4; 1-9,6) Ри = 0,25

11,9 ± 1,9 15,0 ± 3,0

(10,7; 1,8-36) (9,95; 3,8-50,8) Ри = 0,82

1,49 ± 0,17 (1,2) 1,13 ± 0,1 (1,19) Ри = 0,24

11,2 ± 1,9 13,4 ± 1,8 ри = 0,36

19,6 ± 1,7 22,2 ± 1,8 Ри = 0,21

21,7 ± 2,3 21,4 ± 2,5 Ри = 0,94

14,3 ± 2,5 11,9 ± 0,9 Ри = 0,86

14/30 (46,7%) 18/21 (85,7%) X2 = 0,004

Примечание. Данные представлены в виде M ± S.E. * - у 2 пациентов (по одному больному в каждой группе) не удалось оценить точные сроки восстановления уровня лимфоцитов в посттрансплантационном периоде.

ние МСК от поверхности флакона осуществляли с использованием 0,25% раствора трипсина и 0,02% раствора ЭДТА. МСК криоконсервировали в растворе человеческого альбумина («Микроген», Россия), содержащем 10% DMSO (Sigma-Aldrich). Размораживание клеток проводили непосредственно перед введением на водяной бане при 37°С. Далее клетки двукратно отмывали, ресуспендировали в 20 мл физиологического раствора и вводили внутривенно после трансплантации ГСК. Количество трансплантированных МСК варьировало от 0,01 до 1,1-10б клеток на 1 кг массы тела больного (медиана 0,17-106 клеток/кг).

Диагностика раннего восстановления содержания лимфоцитов. Общий анализ крови оценивали на автоматическом гематологическом анализаторе Hema-Screen 18 (Hospitex Diagnostics,

Италия). Ранее восстановление уровня лимфоцитов считали наступившим, если выход из цитопении (лейкоциты более 1 • 109/л) наступал не позднее 15-х суток после ТГСК, а количество лимфоцитов в периферической крови при этом составляло 500 клеток/мкл и более.

Оценка количества субпопуляций

Т-лимфоцитов. Относительное содержание CD4+CD45RO+-, CD4+CD45RA+-, CD8+CD45RO+-и CD8+CD45RA+ -Т-лимфоцитов оценивали в лейковзвеси методом проточной цитофлюориметрии, используя FITC-меченные анти-CD4 и анти-CD8 моноклональные антитела (АТ) («Сорбент», Россия) и РЕ-меченные анти-CD45RO и аши-СD45RA моноклональные АТ («Becton Dickinson», США). Цитометрию проводили с использованием параметров светорассеяния для определения лимфоцитарного гейта, из которого строили график каналов флюоресценции FL-1 (FITC) против FL-2 (РЕ). С помощью квадрантной статистики определяли относительное содержание двойных позитивных CD4+CD45RO+-, CD4+CD45RA+-, CD8+CD45RO+-и CD8+CD45RA+-Т-лимфоцитов. Исследование содержания Т-клеточных субпопуляций проводили двукратно: до ТГСК (перед началом кондиционирования) и после ТГСК на момент выписки из стационара (в среднем на 23-е сутки).

Данные статистически обрабатывали при помощи пакета программ Statistica 6.0 для Windows (StatSoft). Для оценки значимости различий между группами больных использовали критерий %2 для дискретных переменных и непараметрический критерий Вилкоксона—Манна-Уитни для непрерывных переменных. Различия считали достоверными при p < 0,05.

Результаты и обсуждение. Особенности ранней реконституции лимфоцитов оценивали в двух группах больных лимфомами. В 1-ю группу вошли 22 пациента, которым выполнили аутологичную ТГСК в режиме котранспланта-ции с МСК (группа МСК+). Во 2-ю группу включили 31 пациента, которому проводили стандартную ТГСК (группа МСК-). Значимых различий по возрасту, полу, статусу заболевания, предлеченности больных и режимам мобили-зации/кондиционирования ГСК не выявили (см. таблицу). Абсолютное количество лимфоцитов в продукте сепарации и количество трансплантированных CD34+ ГСК в группах также было сопоставимыми. Пациенты обеих групп также не различались по абсолютному содержанию лимфоцитов и структуре Т-клеточных субпопуляций в периферической крови, что свидетельствовало об исходной однородности больных в сравниваемых группах. В то же время феномен РВЛ данного восстановления содержания лимфоцитов у больных, которым выполнили аутологичную ТГСК в комбинации с МСК, выявляли достоверно чаще, чем у пациен-

тов со стандартной ТГСК (у 85,7 и 46,7% соответственно; X2 = 0,004).

С целью изучения влияния МСК на особенности реконституции Т-клеток провели сравнительный анализ относительного и абсолютного количества различных субпопуляций Т-лимфоцитов у больных до и после проведения ТГСК. Оказалось, что у пациентов, которым проводили стандартную ТГСК (группа МСК-; n = 22), абсолютное количество лимфоцитов через 1 мес после ТГСК не восстанавливалось и было достоверно ниже, чем до ТГСК (0,9 ± 0,08-109/л против 1,41 ± 0,18Л09/л; ри=0,02). При этом регистрировали более низкое относительное содержание наивных CD4+CD45RA+-и CD8+CD45RA+-Т-лимфоцитов и более высокое содержание CD8+СD45RО+-Т-клеток памяти (рис. 1, а). В результате этого индексы соотношения наивных Т-клеток и Т-клеток памяти в субпопуляциях CD4+- и CD8+-лимфоцитов были ниже, чем до ТГСК (соответственно 0,18 ± 0,04 против 0,55 ± 0,07; ри < 0,001 и 0,95 ± 0,1 против 1,93 ± 0,3; ри < 0,001). Учитывая лимфопению, установили, что изменения субпопуляционной структуры Т-клеток посттрансплантационном периоде проявлялись более низким абсолютным количеством CD4+ Т-клеток, особенно субпопуляции наивных Т-клеток, и меньшим количеством наивных CD8+ Т-лимфоцитов по сравнению с таковыми до ТГСК (рис. 1, а). Таким образом, реконституция Т-клеток после стандартной ТГСК происходила преимущественно за счет Т-клеток памяти, причем в боль-

- 204 -

ИММУНООНКОЛОГИЯ

%

н

До АТГСК

После АТГСК

Рис. 1. Относительное и абсолютное содержание субпопуляций лимфоцитов в периферической крови у больных лимфомами до и после ТГСК. а - стандартная ТГСК

Рис. 2. Относительное и абсолютное содержание субпопуляций лимфоцитов в периферической крови у больных после ТГСК в группах МСК+ и МСК-.

Данные представлены в виде индивидуальных значений, медианы и интерквартильных диапазонов.

шей степени CD8+СD45RО+-Т-лимфоцитов, на фоне снижения интенсивности восстановления уровня наивных Т-клеток, и в первую очередь CD4+СD45RA+-лимфоцитов.

В оппозитной группе (группа МСК+, 16 больных) с котрансплантацией МСК абсолютное количество лимфоцитов через 1 мес после трансплантации полностью восстановилось (до 1,49 ± 1,1-109/л против исходного уровня 1,1 ± 0,1109/л). Изменения в структуре Т-клеточных субпопуляций во многом были схожи с таковыми в группе МСК- (рис. 1, б). После ТГСК у больных с котрансплантаци-ей МСК отметили более низкое процентное содержание наивных CD4+Т-клеток и соответственно более низкий индекс соотношения CD4+CD45RA-+/CD4+CD45RO+-клеток (0,29 ± 0,05 против 0,66 ± 0,1; рц = 0,007), а также меньшее содержание наивных и увеличение доли CD8+ Т-клеток памяти и, как следствие, более низкий индекс соотношения CD8+CD45RA+-/CD8+CD45RO+ Т-клеток (0,85 ± 0,2 против 1,95 ± 0,1; рц < 0,001). В то же время с учетом полного восстановления абсолютного лимфоцитоза, сниженное (по сравнению с исходным) абсолютное количество клеток регистрировали только в субпопуляциях наивных CD4+ и CD8+ Т-клеток (рц = 0,017% и pv > 0,05 соответственно).

Несмотря на сходный характер изменений структуры Т-клеточного пула после ТГСК, больные в группе МСК+ отличались от пациентов группы МСК- более высоким относительным содержанием наивных CD4+Т-клеток (5,1 ± 0,7% против 3,5 ± 0,7%; pv= 0,047) и индексом соотношения CD4+CD45RA+-/CD4+CD45RO+-клеток (0,29 ± 0,05 против 0,18 ± 0,04; рц = 0,049) (рис. 2). Учитывая также более эффективное восстановление уровня лимфоцитов у больных с котрансплантацией МСК, отметили, что эти пациенты характеризовались более высоким абсолютным количеством наивных CD4+-клеток (рц = 0,022) и выраженной тенденцией к более высокому содержанию CD4+CD45RO+-клеток памяти (pu = 0,086) и общей популяции CD4+ лимфоцитов (pv = 0,058) (см. рис. 2). Полученные данные свидетельствуют о более эффективном восстановлении уровня наивных Т-клеток и Т-клеток памяти на фоне котрансплантации МСК. При этом, судя по отсутствию различий в относительном и абсолютном содержании CD8+ наивных клеток и CD8+Т-клеток памяти в анализируемых подгруппах, полагаем, что трансплантация МСК значимо не влияла на восстановление пула CD8+ Т-клеток.

Наличие гемопоэзстимулирующей активности сделало МСК потенциально привлекательными кандидатами для улучшения восстановления гемопоэза после трансплантации стволовых кроветворных клеток [3]. Однако иммуносупрессивные свойства этих клеток вызывают опасение, что котрансплан-тация МСК может негативным образом сказываться на реконституции лимфоцитов и Т-клеток и соответственно повышать частоту рецидивов после ТГСК [14]. Поэтому в настоящей работе мы исследовали эффект котрансплантации МСК на восстановление

- 205 -

ИММУНОЛОГИЯ № 4, 2013

уровня лимфоцитов и Т-клеток после ТГСК у больных лимфомами.

Результаты проведенных нами исследований показали, что внутривенное введение небольших количеств аутологичных МСК (в среднем 0,17-106 клеток/кг) не оказывало ингибирующего действия на характер восстановления лимфоцитов, более того, оно повышало частоту раннего восстановления уровня лимфоцитов и давало позитивный эффект на реконституцию СD4+Т-клеток. Известно, что восстановление уровня лимфоцитов в условиях лимфопении происходит за счет двух механизмов - тимопоэза, пополняющего пул наивных Т-клеток, и гомеостатической пролиферации наивных Т-клеток и Т-клеток памяти. Проводимая программная ХТ оказывает выраженное повреждающее действие на тимопоэз, поэтому раннее восстановление уровня лимфоцитов происходит преимущественно за счет пролиферации Т-клеток памяти. Причем, поскольку СD4+Т-клетки более чувствительны к апоптозу, восстановление пула Т-клеток происходит в большей степени за счет экспансии CD8+Т-клеток памяти, сохранившихся после ХТ или содержащихся в трансплантате [20, 21]. Действительно результаты анализа количественных показателей Т-клеток у пациентов со стандартной ТГСК (МСК-) продемонстрировали, что к исходу 1-го месяца после ТГСК у больных происходит только частичное восстановление уровня лимфоцитов, что составляет лишь 43% исходного уровня. При этом количество Т-клеток наиболее интенсивно восстанавливается за счет CD8+Т-клеток памяти (CD8+CD45RO+) и в меньшей степени - за счет CD4+r-клеток памяти. В то же время восстановление абсолютного количества наивных CD8+Т-клеток и особенно наивных CD4+Т-клеток подавлено. Изменения в структуре Т-клеток в этот период особенно ярко проявляются 3- и 2-кратным снижением индексов соотношения наивных Т-клеток и Т-клеток памяти в популяциях CD4+- и CD8+-лимфоцитов. Таким образом, полученные нами данные полностью согласуются с данными литературы.

При анализе реконституции Т-лимфоцитов в группе с котрансплантацией МСК установили, что восстановление лимфоцитов в этом случае происходит более интенсивно и имеет свои особенности. Абсолютное количество лимфоцитов в течение 1-го месяца в этой группе восстанавливалось до исходного уровня (до ТГСК), причем это было сопряжено с более высокой частотой раннего восстановления содержания лимфоцитов. Так же, как и в группе МСК-, восстановление лимфоцитов осуществлялось преимущественно за счет CD8+Т-клеток памяти. Однако наряду с этим отметили более интенсивное восстановление количества CD4+Т-клеток, причем за счет не только CD4+ Т-клеток памяти, но и наивных CD4+ Т-клеток.

Нарушение раннего восстановления содержания наивных Т-клеток, предопределяющих разнообразие Т-клеточного репертуара и соответственно эффективность иммунного надзора, рассматривается в качестве одного из факторов, способствующих развитию инфекционных осложнений и рецидиву заболевания. Действительно, по данным D. Mitra и соавт. [13], реконституция наивных Т-клеток и у-интерферон продуцирующих Т-клеток памяти была существенно ниже у пациентов с рецидивом заболевания в течение 1 года после ТГСК, чем у больных, находящихся в течение 2 лет в ремиссии. С этой точки зрения выявленная нами способность МСК повышать эффективность раннего восстановления уровня Т-клеток за счет CD4+Т-клеток, в том числе наивных Т-клеток, считает благоприятным эффектом.

Механизмы позитивного влияния МСК на реконституцию CD4+r-клеток остаются во многом не ясными. Несмотря на выраженную иммуносупрессорную активность, МСК в определенных условиях могут стимулировать пролиферацию лимфоцитов. Так, при низком уроне базальной пролиферации лимфоцитов и низком количестве МСК мезенхимальные клетки способны усиливать пролиферативный ответ лимфоцитов на

аллоантигены и стимуляцию гомеостатическими цитокинами [15, 16]. Поскольку в наших исследованиях мы использовали относительно низкие дозы МСК, вводимые клетки могли оказывать стимулирующее действие на гомеостатическую пролиферацию лимфоцитов. Не исключено также, что МСК могут повышать эффективность тимопоэза. Например, известно, что МСК необходимы для создания тимического микроокружения и поддержания функций эпителиальных клеток, играющих важную роль в развитии тимоцитов [23, 24]. ХТ оказывает повреждающее действие на эпителиальные клетки тимуса и тимопоэз, что проявляется длительным восстановлением количества Т-лимфоцитов преимущественно за счет пролиферации Т-клеток памяти. Поэтому восстановление тимического микроокружения может способствовать более эффективной реконституции Т-клеток за счет мигрантов из тимуса. В этом плане дальнейшие исследования соотношения количества недавних мигрантов из тимуса и центральных наивных Т-клеток в условиях котрансплантации МСК могли бы прояснить, посредством какого механизма МСК стимулируют реконституцию наивных CD4+ Т-клеток.

ЛИТЕРАТУРА

18. Сергеевичева В.В., Шевела Е.Я., Крючкова И.В., и др. Использование совместной трансплантации мезенхимальных стволовых стромальных клеток и стволовых кроветворных клеток при гемобластозах и аутоиммунных заболеваниях // Разрешение Росздравнадзора на применение новой медицинской технологии ФС № 2008/014 от 30.01.2008 г.

REFERENCES

1. PasquiniM.C., WangZ. Current use and outcome of hematopoietic stem cell transplantation: CIBMTR summary slides, 2010. http:// www.cibmtr.org.

2. AngelopoulouM., NovelliE., Grove J.E., et al. Co-transplantation of human mesenchymal stem cells enhances human myelopoiesis and megakaryocytopoiesis in NOD/SCID mice. Exp. Hematol. 2003; 31(5): 413-20.

3. Majumdar M.K., Thiede M.A., Haynesworth S.E., Bruder S.P., Gerson S.L. Human marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) express hematopoietic cytokines and support long-term hematopoiesis when differentiated toward stromal and osteogenic lineages. J. Hematother. Stem Cell Res. 2000; 9(6): 841-8.

4. BattiwallaM., HemattiP. Mesenchymal stem cells in hematopoietic

stem cell transplantation. Cytotherapy. 2009; 11(5): 503-15.

5. O’FlahertyE., SparrowR., Szer J. Bone marrow stromal function from patients after bone marrow transplantation. Bone Marrow Transplant. 1995; 15: 207-12.

6. Uhlman D.L., Verfaillie C., Jones R.B., et al. BCNU treatment of marrow stromal monolayers reversibly alters haematopoiesis. Br.

J. Haematol. 1991; 78: 3304-9.

7. Ghannam S., Bouffi C., Djouad F., Jorgensen F., Noel D. Immunosuppression by mesenchymal stem cells: mechanisms and clinical applications. Stem Cell Research & Therapy. 2010; 1:2 doi:10.1186/scrt2

8. Kuci S., Kuci Z., Kreyenberg H., et al. CD271 antigen defines a subset of multipotent stromal cells with immunosuppressive and lymphohematopoietic engraftment-promoting properties. Haematologica. 2010; 95(4): 651-9.

9. Uccelli A., Pistoia V., Moretta L. Mesenchymal stem cells: a new strategy for immunosuppression? Trends in immunology. 2007; 28(5): 219-26

10. Ning H., Yang F., Jiang M., et al. The correlation between cotransplantation of mesenchymal stem cells and higher recurrence rate in hematologic malignancy patients: outcome of a pilot clinical study. Leukemia. 2008; 22: 593-9.

11. Gordan L.N., Sugrue M.W., Lynch J.W., et al. Correlation of early lymphocyte recovery and progression-free survival after autologous stem-cell transplant in patients with Hodgkin’s and non-Hodgkin’s lymphoma. Bone Marrow Transplant. 2003; 31: 1009-13.

12. Porrata L.F., Litzow M.R., Inwards D.J., et al. Infused peripheral blood autograft absolute lymphocyte count correlates with day 15

- 206 -

ИММУНООНКОЛОГИЯ

absolute lymphocyte count and clinical outcome after autologous peripheral hematopoietic stem cell transplantation in non-Hodgkin’s lymphoma. Bone Marrow Transplant. 2004; 33: 291-8.

13. Di Nicola M., Carlo-Stella C., Magni M.., et al. Human bone marrow stromal cells suppress T-lymphocyte proliferation induced by cellular or nonspecific mitogenic stimuli. Blood. 2002; 99: 3838-43.

14. Krampera M., Glennie S., Dyson J., et al. Bone marrow mesenchymal stem cells inhibit the response of naive and memory antigen-specific T cells to their cognate peptide. Blood. 2003; 101(9): 3722-9.

15. Bocelli-Tyndall С., Bracci L., Schaeren S., et al. Human bone marrow mesenchymal stem cells and chondrocytes promote and/ or suppress the in vitro proliferation of lymphocytes stimulated by interleukins 2, 7 and 15. Ann. Rheum. Dis. 2009; 68: 1352-9.

16. Le Blanc K., Tammik L., Sundberg B., Haynesworth S.E., Ringden O. Mesenchymal stem cells inhibit and stimulate mixed lymphocyte cultures and mitogenic responses independently of the major histocompatibility complex. Scand. J. Immunol. 2003; 57: 11-20.

17. SudresM., NorolF., TrenadoA., et al. Bone marrow mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro but fail to prevent graft-versus-host disease in mice. J. Immunol. 2006; 176(12): 7761-7.

18. Sergeevicheva V.V., Shevela E.Ya., Kruchkova I.V et al. Use of

combined transplantation of mesenchymal stromal stem cells and hematopoietic stem cells in patients, and autoimmune diseases. Resolution Roszdravnadzor on the application of new medical technologies FS №2008/014 30.01.2008 (in Russian).

19. Sergeevicheva V.V., Shevela E.Ya., Sizikova S.A., et al. Autologous mesenchymal stromal cells of hemoblastosis patients efficiently support hematopoietic recovery after stem cell transplantation. Cellular Therapy & Transplantation. 2010; 1(4): 98-105.

20 Peggs K.S., Verfuerth S., Pizzey A., et al. Reconstitution of T-cell repertoire after autologous stem cell transplantation: Influence of CD34 selection and cytomegalovirus infection. Biol. Blood Marrow Transplant. 2003; 9(3): 198-205.

21. Williams K., Hakim F.T., Gress R.E. T cell immune reconstitution following lymphodepletion. Semin. Immunol. 2007; 19(5): 318-30.

22. Mitra D.K., Singh H.P., Singh M., et al. Reconstitution of naive T cells and type 1 function after autologous peripheral stem cell transplantation: impact on the relapse of original cancer. Transplantation. 2002; 73(8): 1336-9.

23. ItoiM., Tsukamoto N., Yoshida H., Amagai T. Mesenchymal cells are required for functional development of thymic epithelial cells. Int. Immunol. 2007; 19: 953-64.

24. Suniara R.K., Jenkinson E.J., Owen J.J.T. An essential role for thymic mesenchyme in early T cell development. J. Exp. Med. 2000; 191(6): 1051-6.

Поступила 13.09.12

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 УДК 615.276.4.03:618.19-006.04].015.46

Ф.А. Шамилов1, ГА. Ельшина2, Д.А.Буров3, Я.В. Вишневская3, Н.В. Чхиквадзе3, Д.И. Зернов3, В.В. Тимошенко3., В.Ю. Сельчук1, Н.Н. Тупицын3

ВЛИЯНИЕ ПОЛИОКСИДОНИЯ НА СУБПОПУЛЯЦИИ ИНТРАТУМОРАЛЬНЫХ ЛИМФОЦИТОВ у больных РАКОМ МОЛОЧНОЙ железы

1Кафедра онкологии Московского государственного медицинского стоматологического университета, 127473, г Москва; 2ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России; Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский онкологический научный центр имени Н.Н. Блохина» РАМН, 115478, г Москва

В работе представлены результаты изучения влияния полиоксидония, применяемого у 20 больных раком молочной железы в неоадъювантном режиме, на субпопуляции интратуморальных лимфоцитов. Лимфоидные клетки изучали в гейте CD45 на материале кор-биопсии (до применения полиоксидония) и затем на материале удаленной опухоли (после применения полиоксидония). Для окраски клеток использовали две 4-цветные пробы моноклональных антител: CD45/CD3/CD4/CD25 и CD45/CD3/CD8/CD56, последующий анализ проводили методом проточной цитометрии. Среднее количество большинства субпопуляций интратуморальных лимфоцитов не изменялось после иммунотерапии, достоверно снижались только NK-клетки (CD3-CD56+), однако их содержание было крайне низким: 1,68 ± 0,3 и 1,16 ± 0,3% (р < 0,05). Субпопуляционный состав интратуморальных лимфоцитов 6 больных с наличием патоморфоза опухолевой ткани после применения полиоксидония отличался достоверно более высокими уровнями CD4+ лимфоцитов: 50,9 ± 2,0 и 42,1 ± 2,0%, р = 0,009.

Ключевые слова: рак молочной железы, неоадъювантная иммунотерапия, интратуморальные лимфоциты

F.A. Shamilov1, G.A. Elshina2, D.A. Burov3, Ya.V Vishnevskaya3, N.V Chkhikvadze3, D.I. Zernov3, V.V Timoshenko3, V.Yu. Selchuk1, N.N. Tupitsyn3

department of oncology Moscow State Stomatology University, Moscow; 2Federal State Budgetary Enterprise «Scientific Centrum of Medical Expertise of Facilities of Medical Use» Ministry of Health, Russia; 3 Federal State Budgetary Institute «N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center» RAMS, Moscow

The work presents the results of studying the impact of polyoxidonium, used in 20 patients with breast cancer in neoadjuvant mode, on a subpopulation intratumoral lymphocytes. The lymphoma cells studied in the gate CD45 on the material of the core-biopsy (before application of polyoxidonium) and then on the material of the removed tumor (after the application of polyoxidonium). For the painting of the cells used two 4-color samples monoclonal antibodies: CD45/CD3/CD4/CD25 and CD45/CD3/CD8/CD56, the following analysis was performed by flow cytometry. The average number of subpopulations most intratumoral lymphocytes did not change after immunotherapy, authentically decreased only NK-cells (CD3-CD56+), but their content was extremely low: 1,68±0.3% and 1.16 ^ 0,3% (p<0.05). Subpopulation structure of intratumoral lymphocytes 6 patients with the presence of disease variability of tumor tissue after application of polyoxidonium differed significantly higher levels of CD4+ lymphocytes: 50,9±2,0% and 42.1±2,0%, p=0.009.

Key words: breast cancer, adjuvant immunotherapy, intratumoral lymphocyte

- 207 -