Особенности микроядерного анализа эритроцитов крови в популяции сизого голубя в г. Казани

А.М.Басыйров, И.И.Рахимов

ОСОБЕННОСТИ МИКРОЯДЕРНОГО АНАЛИЗА ЭРИТРОЦИТОВ КРОВИ В ПОПУЛЯЦИИ СИЗОГО ГОЛУБЯ В

Г.КАЗАНИ

Данная работа отражает проблему влияния различных химических веществ - загрязнителей окружающей среды на организмы. Выявлены загрязняющие атмосферный воздух отрасли промышленности, определены преобладающие выбросы предприятий г.Казани. Особое внимание уделено микроядерному тесту как методу, позволяющему проследить влияние экологического состояния окружающей среды на генетический материал живых организмов. Изучено происхождение и суть микроядер в клеточном материале. Проведен микроядерный анализ эритроцитов крови в популяции Со1ишЪа 1ша в окрестностях г.Казани.

В настоящее время стало очевидным, что биосфера загрязняется самыми разнообразными техногенными соединениями, с которыми в своем историческом развитии человек не сталкивался. Антропогенное деятельность оказывает воздействие на различные стороны жизни, биологию и физиологию организмов.

Современный этап развития человечества характеризуется высокими темпами урбанизации; более половины населения планеты проживает в городах и доля городского населения неуклонно растет. Города стали центрами сосредоточения населения, промышленности и обусловленного этим интенсивного загрязнения окружающей среды, которые по площади аномалий токсикантов представляют собой техногенные геохимические и биогеохимиче-ские провинции. Особая роль в геохимическом мониторинге и оценке экологического состояния окружающей среды городов отводится изучению и анализу воздушной среды, выбросов в атмосферу как главного фактора создания экологической ситуации в городе.

Разнообразие предприятий химического, нефтехимического, машиностроительного и строительного профилей обуславливает широкий спектр вредных веществ, поступающих в воздушный бассейн г.Казани. Преобладают неблагоприятные для рассеивания параметры выбросов: Т<50оС, скорость <25 м/с, малые высоты (Н<10 м.). Доля горячих (>50оС) выбросов из высоких труб (Н>50м) с большой скоростью выхода газовоздушной смеси из трубы (>10 м/с) составляет всего 28% от общей массы выбросов. Исходя из характера расположения предприятий, формирующих техногенные поля атмосферных выбросов, на территории города было выделено 6 крупных промышленных агломераций [1] (Табл. 1).

В России основной вклад в загрязнение вносят предприятия энергетики, топливной промышленности, цветной и черной металлургии. В Республике Татарстан топливный комплекс и теплоэнергетика вносят существенный вклад в загрязнение атмосферного воздуха. Однако не менее важную роль играют предприятия химической и нефтехимической промышленности, а также машиностроение, что вполне естественно, учитывая промышленный потенциал теплоэнергетика вносят существенный вклад в загрязнение атмосферного воздуха. Однако не менее важную роль играют предприятия хими-

ческой и нефтехимической промышленности, а также машиностроение, что вполне естественно, учитывая промышленный потенциал [2, 3, 4].

Таблица 1

Промышленные зоны и предприятия г.Казани________________

ПРОМЫШЛЕННАЯ ЗОНА ПРЕДПРИЯТИЯ ПРОМЫШЛЕННОСТИ

Северо-западная ОАО "Оргсинтез", ТЭЦ-3

Центральная ОАО "Полимерфото", ОАО "Тасма-Холдинг", КГНПП им.Ленина, ОАО "Льнокомбинат", ОАО "Кожевенное объединение", ОАО завод "Сантехприбор", Вертолетный завод (филиал).

Юго-западная ОАО "Нэфис", ЗАО "Кварт" (Резинотехника), ЗАО завод "Искож", ГУП "Теплоконтроль", ОАО "Казанский завод СК", АО завод "Вакууммаш", ГУП "Мед-инструмент", ТЭЦ-1, ОАО завод "Радиоприбор", ОАО "Мехкомбинат"

Восточная ОАО "Казанькомпрессормаш", ПО "Терминал", АО "Завод газовой аппаратуры"

Северо-восточная НПП "КОМЗ", ОАО "Хитон"

Северная ОАО "КМПО", ФГУП "КАПО им. Горбунова", ООО завод "Элекон"

Воздействие электроэнергетики на окружающую среду выражается в загрязнении атмосферного воздуха продуктами сгорания и тепловом загрязнении. В процессе получения электрической и тепловой энергии образуются диоксид азота, диоксид серы, углеводороды, зола, зола мазута, пятиокись ванадия и др.

На предприятиях нефтеперерабатывающей и нефтехимической промышленности выбросы отличаются чрезвычайным разнообразием, но основными среди них являются углеводороды и их производные. Кроме углеводородов, сероводорода, оксида углерода, диоксида серы, в атмосферный воздух поступают фенол, бензол, много других соединений. Среди них особо следует отметить возможность выпадения полициклических ароматических углеводородов, обладающих канцерогенными свойствами. Особого внимания заслуживает бенз(а)пирен - соединение, иногда содержащееся в сырых нефтях некоторых месторождений, еще в больших количествах появляющееся во многих продуктах нефтепереработки и нефтехимии за счет применения высоких температур в технологии их получения, при пиролизе углеводородного сырья, а также вследствие сжигания топлива в печах техногенных установок. В Казани имеет место многокомпонентное загрязнение атмосферного воздуха. Например, в районе ОАО "Оргсинтез" в выбросах присутствуют углеводороды, оксид этилена, ацетон, фенол, бензол, этилен и другие вещества. От ОАО "Тасма-Холдинг" в воздух с выбросами поступают ацетон, аммиак, ксилол, этилацетат, уксусная кислота и др. [3, 5].

Для предприятий машиностроения и приборостроения характерны выбросы пыли разного химического и гранулометрического состава, дымы -

диоксид серы, оксид углерода, оксиды азота, сероводород и др. Наряду с этими можно упомянуть также сварочный и масляный аэрозоли, бензол, толуол, ксилол, ацетон, углеводороды, бензин, испарения гальванических ванн.

В отработавших газах автотранспорта идентифицировано более 200 различных химических веществ. Это продукты неполного сгорания (оксид углерода, альдегиды, кетоны, углеводороды, в том числе канцерогенные, водород, перекисные соединения, сажа), продукты термических реакций азота с кислородом (оксиды азота), соединения неорганических веществ, которые входят в состав топлива (соединения свинца, диоксид серы и др.) и избыточный кислород [3].

Все эти выбросы, попав в окружающую среду, депонируются в почве, вовлекаются в биогеохимические круговороты веществ в природе, перенося различного рода трансформации и, в конечном счете, попадают в организм животных и человека, аккумулируются в различных органах и системах, претерпевают многочисленные биотрансформации. Вредные вещества, попав в организм при дыхании, вместе с пищей или через кожные покровы, могут стать причиной многочисленных заболеваний, новообразований и злокачественных опухолей.

Тревогу вызывает то, что многие выбросы могут привести к нарушениям генетических структур клеток организма. В этой связи первоочередной задачей гематологии, радиобиологии, радиационной медицины, экологии и цитогенетики стал поиск и разработка методов, с помощью которых возможно достаточно четко и быстро определить мутагенность и канцерогенность как вновь синтезируемых соединений, так и веществ, широко применяемых в быту, промышленности, сельском хозяйстве и медицине с тем, чтобы обезопасить человека от возможного контакта с источниками мутаций.

Целью является исследование влияния состояния окружающей среды на показатели системы крови. Сизые голуби (Columba livia) как объект исследования выбраны потому, что являются синантропными птицами; в любое время года имеют высокий уровень обмена веществ и их отлов в больших количествах не вызывает особых затруднений. Голуби отлавливаются в различных по экологической ситуации 7 точках, что позволяет прослеживать изменения в кровеносной системе птиц в зависимости от степени техногенного загрязнения окружающей среды. Результаты исследований могут использоваться при комплексной оценке влияния совокупности повреждающих факторов на клетки крови и на организм в целом, при разработке профилактических мероприятий.

Метафазный анализ, который используется при учете хромосомных аберраций в соматических клетках животных и человека, требует много времени и высокой квалификации исследователя. Поиск же новых принципов учета структурных нарушений хромосом был направлен на упрощение метода. Разработку микроядерного анализа обычно связывают с именем Schmid, хотя в 1973 г. J.A.Heddle и W.Schmid независимо друг от друга предложили микроядерный тест, основанный на учете микроядер в полихромных эритроцитах костного мозга. Первоначально он был разработан для эритроидных

клеток костного мозга, а позже тест стал применяться для учета микроядер в ранних сперматидах, печени плода при изучении трансплацентарной активности химических соединений, в клетках слизистой рта, лимфоцитах человека, в клетках печени и толстой кишки животных. К настоящему времени учет микроядер стал возможен в большинстве популяций делящихся клеток [6].

Микроядерный тест в силу своей простоты и возможности быстрого анализа стал методом скрининга химических соединений на цитогенетическую активность in vitro. Микроядра возникают из фрагментов хромосом, которые лишены центромер и поэтому исключаются из клеточных ядер в момент деления клеток. Иными словами, они являются ацентрическими фрагментами, возникшими в результате структурных нарушений хромосом и не попавшими во вновь формирующееся ядро при делении клеток. Кроме того, они могут образовываться из хромосом, оставшихся в анафазе. Тем самым результаты учета микроядер отражают результаты кластогенного действия на хромосомы изучаемого соединения.

Наиболее распространенным методом является учет микроядер в поли-хромных эритроцитах и испытано этим большое количество соединений. Это связано с тем, что полихромные эритроциты легко распознаются, имеют короткий жизненный цикл и любое содержащееся в них микроядро является следствием хромосомных аберраций в эритробластных клетках, возникших спонтанно или индуцированных исследуемыми агентами. Метод быстро получил распространение. В США в рамках токсикологической программы агентства по охране окружающей среды создана рабочая группа из наиболее видных специалистов по микорядерному анализу, которая подготовила соответствующие методические рекомендации [7, 8]. В настоящее время микро-ядерный тест включен как обязательный при токсикологических исследованиях в странах Европейского экономического сообщества и Японии. Широко используют микроядерный тест и в других странах, так как по сравнению с уже имеющимися на вооружении генетиков методами, данный является наименее трудоемким и наиболее производительным, хотя и не лишен некоторых недостатков.

Цитогенетический анализ (микроядерный тест) - одно из перспективнейших направлений в изучении влияния факторов окружающей среды на генетический аппарат клеток организма. Он основан на способности эритроцитов и лимфоцитов крови под воздействием мутагенов, то есть факторов, способных вызывать наследственные изменения (мутации), образовывать внутри себя особые ядерные структуры, которые называются микроядрами. К их числу относятся загрязняющие факторы химической, физической и биологической природы, ультрафиолетовое излучение, многочисленные химические соединения, в том числе некоторые лекарственные препараты, продукты бытовой химии и т.п. На основании проведенных исследований Н.Н.Ильинских впервые показал, что не только радиация и химические вещества способны вызывать генетические изменения в клетках человека, таким действием обладают и инфекционные агенты - вирусы, бактерии, простейшие и гельминты. При этом было доказано, что к таким же последствиям

приводят и прививки живыми вакцинами [9]. Проблемой влияния мутагенных факторов окружающей среды на генетический аппарат клеток человека занимаются целые медико-биологические и исследовательские институты по всему миру.

Микроядра - это ядерные структуры, которые впервые были обнаружены в эритроцитах и чаще всего, обозначаемые как тельца Жолли. В конце XIX и в начале XX многие гематологи констатировали, что некоторые вещества, вводимые в организм, могут вызвать резкое повышение числа эритроцитов с тельцами Жолли. Кроме того, было установлено, что помимо телец Жолли, ядерный материал мог выглядеть в виде зернистости, колец и т.д., что зависело как от способа фиксации и окраски эритроцитов, так и от видов заболевания или воздействия на организм.

По классическому (являющемуся в настоящее время общепризнанным) описанию тельца Жолли имеют ядерное (хроматиновое) происхождение и представляют собой обычно небольшое образование округлой формы, окрашивающиеся в тон хроматина, большей частью единичные, расположенные эксцентрично или в центре эритроцитов (оксифильного, полихроматофильно-го), реже встречающиеся в количестве 2-3 в клетке. Тельца Жолли могут быть обнаружены в мегало-, макро-, нормо- и микроцитах. Эритроциты с тельцами Жолли относятся к группе регенеративных форм клеток, появление которых свидетельствует либо о компенсаторных изменениях эритропоэза, либо о нарушении созревания клеток эритроидного ряда в костном мозге. Появление эритроцитов с тельцами Жолли, равным образом как и других регенеративных форм этих клеток ядерной (нормобласты и мегалобласты, эритроциты с кольцами Кабо, азурофильной зернистостью, азурофильной штриховатостью) и цитоплазматической природы (полихроматофильные эри-торциты с базофильной зернистостью, увеличение числа ретикулоцитов при суправитальной окраске), наблюдается при пернициозной анемии, других тяжелых формах малокровия (при отравлении свинцом и фенилгидразином, при острых лейкоза), а также после операции спленэктомии и при болезни Якша-Гайема [10, 11, 12, 13, 14, 15]. Таким образом, приведенные данные свидетельствуют о том, что в предыстории возникновения микроядерного теста большую роль сыграли многочисленные гематологические исследования [16].

Ранее проведенные исследования [16, 17, 18, 19, 20] убеждают нас в том, что сизые голуби (Со1ишЬа 1ша) могут служить прекрасным объектом для генотоксической оценки состояния окружающей среды. К главным достоинствам этого объекта следует отнести то, что голубь является естественным компонентом среды обитания городов и поселков, он является коменса-лом (т.е. голубь, в основном, питается "со стола" человека), его легко ловить и содержать в неволе, можно брать кровь, не причиняя особого вреда особи и, кроме того, поскольку у птиц эритроциты крупные и содержат ядра, то микроядра видны на обычном (стандартном) гематологическом препарате гораздо отчетливей, чем в крови человека или мышей [16].

Учитывая эти данные, мы проводили серии экспериментов с отловом, последующими измерениями и взятием проб крови у Сизых голубей. После каждой серии отловов птиц идет процесс изготовления микропрепаратов и мазков крови для просмотра под световым микроскопом и дальнейшего многоаспектного анализа. Кровь на микроядерный анализ брали из подкрыльцо-вой вены птицы непосредственно после ее отлова. Для получения стандартных гематологических мазков достаточно капли крови, после получения которой птиц сразу же отпускали на волю. Мазки крови готовили, помещая каплю крови животного на сухое обезжиренное предметное стекло. Препараты высушивали над спиртовкой, фиксировали в 96% этиловом спирте 3 минуты. Окрашивали фиксированный мазок крови 20 мин в растворе Гимзы (10 капель (глазной пипеткой) концентрированного раствора Гимзы в 10 мл. дистиллированной воды). Промывали окрашенные мазки дистиллированной водой. Просмотр окрашенных мазков крови производится на световом микроскопе под эмирсионным маслом при увеличении 10х90. Для получения достоверных данных с каждого мазка необходимо просмотреть 3 тыс. эритроцитов [12, 13, 14, 15, 20, 21]. Результаты всех тестов подлежат обработке с помощью статистических методов с учетом коэффициента достоверности, рассчитанного по Стьюденту при сравнении показателей, характеризирующих эффекты мутагена при его раздельном и совместном применении с антимутагеном. В настоящее время нами подготовлено 130 микропрепаратов (Табл. 2).

Таблица 2

Количество исследованных птиц по сезонам года, (шт)______________

ПУНКТ ОТЛОВА ЗИМА ВЕСНА ЛЕТО ВСЕГО

Колхозный рынок 5 9 11 25

Дербышки 5 3 9 17

Азино 5 - 11 16

Пос. Левченко 10 10 14 34

Ново-Савиновский р-н - 7 - 7

Кировский р-н - 8 11 19

Космонавтов - - 12 12

Итого 25 37 68 130

На данном этапе наших исследований аномального содержания микроядер в эритроцитах голубей не обнаружено.

Литература

[1] Фасхутдинов М.Г. Формирование и динамика геохимических полей тяжелых металлов в условиях крупного промышленного центра: Автореф. дисс. ... канд. геогр. наук. Ярославль, 2004.

[2] Гайсин, И. Т., Хусаинов, З.А., Галимов Ш.Ш., География и экология Республики Татарстан. Казань, 2003.

[3] Гимадеев, М.М.,Щеповских, А.И. Современные проблемы охраны атмосферного воздуха. Казань, 1997.

[4] Города и районы Республики Татарстан в цифрах. Статистический сборник. Издательский Центр Комгосстата РТ, 2003.

[5] Государственный доклад о состоянии природных ресурсов и об охране окружающей среды Республики Татарстан/ научный редактор Торсуев Н.П. Казань, 2006.

[6] Микроядерный тест. [Электронный ресурс]. - Режим доступа:

http://adilev.narod.ru/factor.htm, свободный.

[7] Mac Gregor J. T., Heddle J.A., Hite F., Tice R.R. Guidelines for the conduct of micronucleus assays in mammalian bone marrow erytrocytes // Mutat. Res. Genet. Toxicol. Test. 1987. Vol.189, №2. P.103-112.

[8] Sex difference in the micronucleus test. The collaborative study group for the micronucleus test// Mutat. Res. Genet. Toxicol. Test. 1986. Vol.172, №2. P.151-163.

[9] Биография профессора Ильинских Николая Николаевича. [Электронный ресурс], http://ilyinskikhnic.narod.ru/, свободный

[10] Воробьев А.И., Лорие Ю.И. Руководство по гематологии. М., 1985. Т.1.

[11] Гольдберг Д.И., Гольдберг Е.Д. Справочник по гематологии. Томск, 1980.

[12] Кассирский И.А., Алексеев Г. А. Клиническая гематология. М., 1970.

[13] Кост Е. А. Справочник по клиническим лабораторным методам исследования. М., 1977.

[14] Файнштейн Ф.З., Козинец Г.И., Бахрамов С.М., Хохлова М.П. Болезни системы крови. Ташкент, 1987.

[15] Grafe R., Patzelt O. Einfuhrung in die Hamatologie. Dresden-Leipzig. 1965.

[16] Ильинских Н.Н., Новицкий В.В., Ванчугова Н.Н., и др. Микроядерный анализ и цитогенетическая нестабильность. Томск, 1992.

[17] Ильинских Н.Н., Ксенз А.С., Ксенз Г.Х., Плотникова Н.Н., Новикова Н.А., Качушкина Г.Г., Микроядерный анализ эритроцитов сизых голубей из населенных пунктов западносибирского и среднеазиатского регионов СССР, Методические и методологические вопросы генетики. Томск, 1990. С.166-172.

[18] Ильинских Н.Н, Ильинских Е.Н., Юркин А.Ю. Микроядерный анализ эритроцитов у голубей, обитающих в населенных пунктах, расположенных в зоне влияния Сибирского химического комбината // Генетические последствия чрезвычайных радиационных ситуаций. М., 2002. С.56-57.

[19] Ильинских Н.Н., Ксенз А.С., Юркин А.Ю., Даниленко И.И. Оценка частоты эритроцитов с микроядрами в крови голубей в радиоактивно загрязненной зоне вокруг Сибирского химического комбината // Актуальные проблемы экологии. Тюмень, 1998. С.126-128.

[20] Юркин А. Ю. Методические особенности анализа микроядер в клетках человека и животных при скрининге и мониторинге кластогенных факторов в окружающей среде: Автореф. дисс. ... канд. мед. наук. Томск, 2002.

[21] Лакин Г.Ф. Биометрия. М., 1990.