СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОРОШКОВЫХ ПРЕПАРАТОВ, СОДЕРЖАЩИХ СЕРОТОНИН, ИЗ НЕПЛОДОВЫХ ЧАСТЕЙ ОБЛЕПИХИ
METHOD FOR PRODUCTION OF POWDERED PREPARATIONS CONTAINING SEROTONIN FROM NON-FRUIT SEA-BUCKTHORN PARTS

зобретение относится к фармацевтической и пищевой промышленности, в частности, к производству композиций биологически активных веществ, которые могут быть использованы как биологически активные добавки. Более конкретно новый способ получения порошковых препаратов на основе серотонина из растительного сырья - неплодовых частей облепихи.
Нейромедиатор серотонин участвует в различных физиологических аспектах жизнедеятельности человека и животных. Серотонин является стимулятором гладкой мускулатуры, перистальтики и секреторной активности желудочно-кишечного тракта; увеличивает капиллярную стабильность, участвует в регуляции цикла сон - бодрствование и других значимых процессах [Mohammad-Zadeh L.F., Moses L., Gwaltney-Brant S.M. Serotonin: a review. // Journal of veterinary pharmacology and therapeutics. 2008. Vol.31, №3. P.187-199., Berger M., Gray J. a, Roth B.L. The expanded biology of serotonin. // Annual review of medicine. 2009. Vol.60. P.355-366]. Достоверно известно, что уровень содержания нейротрансмиттеров в целом и серотонина в частности в значительной мере определяет поведенческие возможности животного или человека, его настроение, тонус и социальное поведение (McGuire, M.T., Troishi A., 1998. Darwinian psychiatry, New York: Oxford University Press, J.H. Turner, Handbook of Social theory//Springer, 2000, 745p), что впервые было показано на приматах (R.D. Masters, M.T. McGuire, The Neurotransmitter Revolution: Serotonin, Social Behavior, and the Law// Southern Illinois University, 1994, 285 p.).
Хорошо известны методы качественного и количественного анализа серотонина в различных биологических объектах, как животных, так и растительных. Наиболее популярными являются хромотография в различных модификациях (ВЭЖХ, капиллярная хроматография, газовая, часто комбинированы с методами масс-спектроскопии) и методы, основанные на УФ спектрах или спектрах люминисценции (Saracino M.A. et al. Chromatographic analysis of serotonin, 5-hydroxyindolacetic acid and homovanillic acid in dried blood spots and platelet poor and rich plasma samples. // Journal of chromatography. A. Elsevier B.V, 2010. Vol.1217, №29. P.4808-4814., Israel M. A chemiluminescent serotonin assay // Neurochemistry International. 2003. Vol.42, №3. P.215-220). Методом ВЭЖХ достоверно установлено повышенное содержание серотонина в неплодовых частях облепихи - молодых веточках и побегах, а именно в их молодой коре (I. Brad., G.A. Vlasceanu, I.L. Brad, S.T. Manea, Characterization of sea buckthorn fruits and copses in terms of serotonin and microelements// Innovative Romanian Food Biotechnology, Vol.1, P.24-30, 2007).
Как правило, получение продуктов из растительного сырья включает измельчение и экстракцию исходного сырья, например, заявка РФ №98122555/14.10.12,1998, в которой заявляемое средство получают экстракцией растительного сырья водно-углеводо-спиртовым экстрагентом.
Недостатком данного метода является получение жидкофазного продукта, что вызывает деградацию многих биологически активных соединений, в том числе серотонина.
В литературе не найдены упоминания о получении биологически активных добавок из растительного сырья, содержащих значительное количество серотонина (более 2% по массе) в принципе, и методом высокотемпературной распылительной сушкой в частности.
Коммерческие препараты, «увеличивающие содержание серотонина», основаны в основном на блокировке путей деградации и вывода серотонина (блокировка МАО и селективные ингибиторы обратного захвата серотонина) и не содержат непосредственно серотонин (MacGillivray S. et al. Efficacy and tolerability of selective serotonin reuptake inhibitors compared with tricyclic antidepressants in depression treated in primary care: systematic review and meta-analysis. // BMJ (Clinical research ed.). 2003. Vol.326, №7397. P.1014). Экспериментально было установлено, что получение порошков, содержащих серотонин, из экстракта растительного сырья невозможно классическим методом - упариванием растворителя, т.к. серотонин деградирует в растворах при продолжительном нахождении в жидкой фазе, особенно при повышенных температурах.
Задача изобретения состоит в разработке нового способа получения порошковых препаратов из неплодовых частей облепихи с содержанием серотонина более 2%.
Поставленная задача решена созданием способа, включающего измельчение сырья, экстракцию полезных веществ, фильтрование и сушку, в котором согласно изобретению экстракцию осуществляют в ультразвуковой ванне водным раствором пищевой кислоты в концентрации не более 5% в пересчете на адипиновую кислоту при температуре 20-40°C в течение 15-30 минут, а сушку производят методом высокотемпературного распыления при температуре 70-100°C и потоке экстракта, обеспечивающем получение порошкового продукта.
В качестве пищевой кислоты могут быть использованы адипиновая, ортофосфорная, яблочная, аскорбиновая, янтарная и уксусная кислоты.
Пример 1
Способ получения порошковых препаратов из неплодовых частей облепихи с содержанием серотонина более 1% на основе высокотемпературной распылительной сушки состоит из следующих стадий: подготовка растительного сырья, экстракция серотонина и других водорастворимых веществ из древесной дисперсии облепихи, фильтрование экстракта, применение высокотемпературной распылительной сушки
Подготовка растительного сырья
2
Исходное растительное сырье - неплодовые части облепихи (молодые веточки, побеги и листья) измельчали на ножевой мельнице до крупности, обеспечивающей площадь удельной поверхности не менее 0,1 см/г и сушили на воздухе. Полученный порошок использовали в дальнейших экспериментах. Влажность порошка составляла 8-10%, среднее содержание серотонина 1 ± 0,1%.
Экстракция серотонина и других водорастворимых веществ из древесной дисперсии облепихи
Полученный на стадии подготовки растительного сырья порошок подвергали исчерпывающей экстракции. Исчерпывающая экстракция серотонина и других водорастворимых веществ проводилась водным раствором адипиновой кислоты с использованием различных гидромодулей в диапазоне 1:5-1:40 (растворитель - 5% водный раствор адипиновой кислоты) в ультразвуковой ванне WiseClean WUC-A03H (частота УЗ - 40 кГц) в течение 15-30 мин при температуре 20-40°C. Экспериментально было показано, что принципиального влияния формы, объема и материала (стекло/пластмасса) реактора на процесс исчерпывающей экстракции нет.
Исчерпывающая экстракция серотонина обеспечивается при применении ультразвука в течении не менее 15 мин, в то время как при использовании ультразвука более 30 мин происходит деградация серотонина в растворе. Температурный диапазон 20-40°C выбран таким образом, чтобы экстракция проводилась в минимальный временной интервал (чем выше температура, тем быстрее экстракция), но не наблюдалось деградации серотонина и уменьшение его содержания в жидкой фазе в процессе экстракции.
Получение экстракта
Для получения экстракта смесь фильтровали последовательно через марлевый фильтр, фильтр «красная лента», «синяя лента», «мембранный фильтр» (50 мкм).
Серотонин идентифицировали в экстракте методом хромато-масс-спектрометрии (ВЭЖХ-МС). В состав системы для ВЭЖХ-МС анализа входили жидкостной хроматограф Agilent 1200 (с диодно-матричным детектором) и гибридный квадруполь-времяпролетный масс-спектрометр micrOTOF-Q (фирма Bruker). Колонка: Zorbax SB-Aq, 2.1×150 mm, 3.5 micron. Элюент: 2%HCOOH-ACN (0-5%, 0-10'; 5-100%, 10-20'). Скорость потока 0.2 мл/мин. УФ-детектирование велось на трех длинах волн: 260/8, 340/32 и 276/8 нм. Кроме этого, сохранялся каждый второй из доступных системе УФ-спектров (150 спектров в минуту) в диапазоне 230-500 нм для сопоставления с УФ-спектрами идентифицируемых соединений. Растворитель 1-0.01 М раствор хлорной кислоты в воде, растворитель 2 - метанол. Рабочие параметры масс-детектирования. Метод ионизации - электростатическое распыление при атмосферном давлении (API-ES). Сканирование положительных/отрицательных ионов в диапазоне m/z=100-1000. Поток газа-осушителя (азот) 8 л/мин, температура 250°C, давление на распылителе 1,6 бар.
Применение высокотемпературной распылительной сушки
Получение порошковых водорастворимых препаратов проводилось на установке распылительной сушки «BUCHI Mini Spray Dryer B-290». Температура - 70-100°C. Поток экстракта до 1 мл/мин, ограниченный техническими характеристиками прибора.
Температурный диапазон ограничен приборными характеристиками и характеристиками растворителя. Выбор диапазона гидромодуля обоснован тем, что при использовании массового соотношения растительное сырье - вода менее 1:5 возникают сложности с разделением жидкой и твердой фаз фильтрованием ввиду набухания растительного сырья, при использовании соотношения более 1:40 возникают сложности с достоверным определением серотонина в экстракте ввиду сильного разбавления. Экспериментально показано, что для экстракции могут быть использованы другие, используемые в пищевой промышленности кислоты (кислота ортофосфорная, кислота яблочная, кислота аскорбиновая, кислота янтарная, кислота уксусная) в концентрации 5 мас.% в пересчете на адипиновую кислоту, учитывая pKa, растворимость и другие индивидуальные особенности кислот.
По примеру 1 были проведены экперименты с указанными выше кислотами, результаты приведены в таблице 1
Таблица 1
Результаты экстракции серотонина различными пищевыми кислотами в температурном интервале 20-50°C в течение 20 мин в ультразвуковой ванне
Пищевая кислота
Температура экстракции, °C
Содержание серотонина в экстракте в пересчете на сухую массу растительного сырья, %
% экстрагированного серотонина от теоретически возможного (0,95% в пересчете на сухую массу)
Результат экстракции
Адипиновая
20
0,93±0,05
98%±5%
+
30
0,92±0,05
97%±5%
+
40
0,94±0,05
99%±5%
+
50
0,80±0,05
84%±5%
-
Ортофосфорная
20
0,95±0,05
100%±5%
+
30
0,95±0,05
100%±5%
+
40
0,94±0,05
99%±5%
+
50
0,76±0,05
80%±5%
-
Яблочная
20
0,92±0,05
97%±5%
+
30
0,92±0,05
97%±5%
+
40
0,94±0,05
99%±5%
+
0
0,83±0,05
87%±5%
-
Аскорбиновая
20
0,93±0,05
98%±5%
+
30
0,91±0,05
96%±5%
+
40
0,93±0,05
98%±5%
+
50
0,81±0,05
85%±5%
-
Янтарная
20
0,92±0,05
97%±5%
+
30
0,94±0,05
99%±5%
+
40
0,91±0,05
96%±5%
+
50
0,83±0,05
87%±5%
-
Уксусная
20
0,94±0,05
99%±5%
+
30
0,94±0,05
99%±5%
+
40
0,95±0,05
100%±5%
+
50
0,75±0,05
79%±5%
-
Из таблицы 1 можно сделать вывод о деградации серотонина при использовании температуры выше 40°C по уменьшению его содержания в экстракте. Экспериментально показано, что использование температур ниже 20°C не приводит к улучшению результатов, но приводит к увеличению времени экстракции.
Анализ содержания серотонина в полученных порошковых препаратах проводился следующим образом: навеска полученного порошкового препарата в количестве 0,1 г растворялась в 1 мл дистиллированной воды. Определялось содержание серотонина в растворе и пересчитывалось на массовые проценты в порошковом препарате.
Определение содержания серотонина в растворе проводилось методом ВЭЖХ на приборе «Миллихром А-02». Для расчетов содержания серотонина использовался калибровочный график, построенный на основе растворов фармацевтического препарата «адипинат серотонина» (ЗАО «ЛОРР М»). График является линейным в диапазоне концентрация 0,01-5 г/л. Для качественной оценки применялись такие параметры, как время удерживания и спектральные отношения на пяти длинах волн (232 нм, 250 нм, 260 нм, 290 нм, 330 нм).
В порошковом препарате содержание серотонина не менее 2% по массе. Таким образом, за счет удаления на стадии экстракции мажорных вводно-нерастворимых компонетов, таких как целлюлоза, гемицеллюлоза, лигнин, происходит увеличение серотонина в конечном порошковом продукте более чем в 2 раза относительно исходного содержания в растительном сырье.