СПОСОБ ОЧИСТКИ ЛЕЧЕБНЫХ БЕЛКОВ

1. Способ снижения уровня, по меньшей мере, одного белка, выбранного из группы, состоящей из плазминогена, тканевого активатора плазминогена и других протеаз, в растворе, содержащем, по меньшей мере, один белок, выбранный из группы, состоящей из фибриногена, фактора VIII и фактора фон Виллебранда (VWF), при этом указанный способ включает:
(i) пропускание исходного вещества, включающего, по меньшей мере, один белок, выбранный из группы, состоящей из фибриногена, фактора VIII и VWF, через смолу для гидрофобной хроматографии с индуцированным зарядом в условиях, выбранных таким образом, что, по меньшей мере, один белок, выбранный из группы, которая включает плазминоген, тканевой активатор плазминогена и другие протеазы, присутствующий в исходном веществе, связывается со смолой; и
(ii) выделение раствора, содержащего, по меньшей мере, один белок, выбранный из группы, которая включает фибриноген, фактор VIII и VWF, который проходит через смолу, при этом концентрация, по меньшей мере, одного из белков, выбранных из группы, которая включает плазминоген, тканевой активатор плазминогена и другие протеазы, в растворе уменьшается, по меньшей мере, на 50% по сравнению с исходным веществом.
2. Способ снижения уровня, по меньшей мере, одного белка, выбранного из группы, состоящей из плазминогена, тканевого активатора плазминогена и других протеаз, в растворе, содержащем, по меньшей мере, один белок, выбранный из группы, состоящей из фибриногена, фактора VIII и фактора фон Виллебранда (VWF), при этом указанный способ включает:
(i) пропускание исходного вещества, содержащего, по меньшей мере, один белок, выбранный из группы, состоящей из фибриногена, фактора VIII и VWF, через первую смолу для гидрофобной хроматографии с индуцированным зарядом;
(ii) выделение раствора, содержащего, по меньшей мере, один белок, выбранный из группы, состоящей из фибриногена, фактора VIII и VWF, который проходит через первую смолу для гидрофобной хроматографии с индуцированным зарядом;
(iii) пропускание раствора, который извлекают на стадии (ii), через вторую смолу для гидрофобной хроматографии с индуцированным зарядом; и
(iv) выделение раствора, содержащего, по меньшей мере, один белок, выбранный из группы, состоящей из фибриногена, фактора VIII и VWF, который проходит через вторую смолу для гидрофобной хроматографии с индуцированным зарядом,
где условия проведения стадий хроматографии таковы, что, по меньшей мере, один белок, выбранный из группы, состоящей из плазминогена, тканевого активатора плазминогена и других протеаз, присутствующий в исходном веществе, связывается с первой и/или второй смолой, и где концентрация, по меньшей мере, одного белка, выбранного из группы, состоящей из плазминогена, тканевого активатора плазминогена и других протеаз, в растворе, который выделяют на стадии (iv), уменьшается, по меньшей мере, на 50% по сравнению с исходным веществом.
3. Способ по п. 2, где первая и вторая смолы для гидрофобной хроматографии с индукцией заряда одинаковы.
4. Способ по п. 1, дополнительно включающий пропускание раствора, содержащего, по меньшей мере, один белок, выбранный из группы, состоящей из фибриногена, фактора VIII и VWF, который выделен на стадии (ii), через смолу для анионообменной хроматографии.
5. Способ по п. 2, дополнительно включающий пропускание раствора, содержащего, по меньшей мере, один белок, выбранный из группы, состоящей из фибриногена, фактора VIII и VWF, который выделен на стадии (ii) и/или стадии (iv), через смолу для анионообменной хроматографии.
6. Способ по любому из пп. 1-5, дополнительно включающий пропускание исходного вещества через смолу для анионообменной хроматографии перед проведением стадии (i).
7. Способ по п. 4, где анионообменная смола представляет собой сильную анионообменную смолу.
8. Способ по п. 4, где раствор, содержащий, по меньшей мере, один белок, выбранный из группы, состоящей из фибриногена, фактора VIII и VWF, пропускают через смолу для анионообменной хроматографии в присутствии от приблизительно 150 мМ до приблизительно 270 мМ NaCl.
9. Способ по п. 4, где фибриноген элюируют из смолы для анионообменной хроматографии с помощью элюирующего буферного раствора, содержащий от приблизительно 150 мМ до приблизительно 300 мМ NaCl.
10. Способ по п. 7, где фибриноген элюируют из смолы для анионообменной хроматографии с помощью элюирующего буферного раствора, содержащего свободную аминокислоту с концентрацией приблизительно 0,5-10% масс./масс.
11. Способ по п. 10, где свободной аминокислотой является аргинин.
12. Способ по п. 1, где исходное вещество подвергают стадии инактивации вирусов перед проведением стадии (i).
13. Способ по п. 1, где раствор, содержащий, по меньшей мере, один белок, выбранный из группы, состоящей из фибриногена, фактора VIII и VWF, который выделяют из смолы для гидрофобной хроматографии с индукцией заряда, подвергают стадии инактивации вирусов.
14. Способ по п. 4, где исходное вещество или раствор, содержащие, по меньшей мере, один белок, выбранный из группы, состоящей из фибриногена, фактора VIII и VWF, подвергают стадии инактивации вирусов перед пропусканием через смолу для анионообменной хроматографии.
15. Способ по п. 13, где стадия инактивации вирусов включает пастеризацию или обработку с помощью органического растворителя и моющего средства.
16. Способ по п. 1, где исходное вещество представляет собой солюбилизованный криопреципитат плазмы.
17. Способ по п. 1, где перед проведением стадии (i) из исходного вещества удаляют зависимые от витамина K белки или уменьшают их содержание в исходном веществе.
18. Способ по п. 17, где зависимые от витамина K белки удаляют или уменьшают их содержание осаждением зависимых от витамина K белков из исходного вещества путем добавления гидроксида алюминия к исходному веществу.
19. Способ по п. 1, дополнительно включающий осаждение, по меньшей мере, одного белка, выбранного из группы, состоящей из фибриногена, фактора VIII и VWF, из исходного вещества путем добавления глицина к исходному веществу перед проведением стадии (i), выделение осажденного белка, солюбилизацию осажденного белка и пропускание солюбилизованного белка на стадии (i) через смолу для гидрофобной хроматографии с индукцией заряда.
20. Способ по п. 1, где исходное вещество или раствор, содержащие, по меньшей мере, один белок, выбранный из группы, состоящей из фибриногена, фактора VIII и VWF, который проходит через смолу для гидрофобной хроматографии с индукцией заряда, имеют рН от приблизительно 6,5 до приблизительно 8,5.
21. Способ по п. 1, где смолу для гидрофобной хроматографии с индукцией заряда уравновешивают при рН от приблизительно 6,5 до приблизительно 8,5 перед пропусканием исходного вещества и/или раствора, содержащих, по меньшей мере, один белок, выбранный из группы, состоящей из фибриногена, фактора VIII и VWF, через смолу для гидрофобной хроматографии с индукцией заряда.
22. Способ по п. 1, где смола для гидрофобной хроматографии с индукцией заряда содержит лиганд, выбранный из группы, состоящей из меркаптоэтилпиридина, н-гексиламина и фенилпропиламина.
23. Способ по п. 22, где смола для гидрофобной хроматографии с индукцией заряда содержит н-гексиламин.
24. Раствор, содержащий, по меньшей мере, один белок, выбранный из группы, состоящей из фибриногена, фактора VIII и VWF, который выделяют способом по любому из пп. 1-23.
25. Раствор по п. 24, содержащий, по меньшей мере, 80% фибриногена от общего количества белка.
26. Раствор, содержащий:
(a) по меньшей мере, 75% фибриногена от общего количества белка;
(b) менее чем 50 пг/мг тканевого активатора плазминогена от общего количества белка; и/или
(c) менее чем 1 мкг/мг плазминогена от общего количества белка.
-5
27. Раствор по п. 26, дополнительно содержащий менее чем 1,5×10 ед./мг фактора II от общего количества белка.
28. Раствор, содержащий:
(a) по меньшей мере, 90% фибриногена от общего количества белка;
(b) менее чем 50 пг/мг тканевого активатора плазминогена от общего количества белка; и/или
(c) менее чем 150 нг/мг плазминогена от общего количества белка.
29. Раствор по п. 28, который дополнительно содержит:
-6
(a) менее чем 3,5×10 ед./мг фактора II от общего количества белка; и/или
(b) менее чем 150 мг/мг фибронектина от общего количества белка.
30. Раствор, содержащий:
(a) по меньшей мере, 90% фибриногена от общего количества белка;
(b) менее чем 20 пг/мг тканевого активатора плазминогена от общего количества белка; и/или
(c) менее 10 нг/мг плазминогена от общего количества белка.
31. Раствор по п. 30, который дополнительно содержит:
-6
(a) менее чем 2,7×10 ед./мг фактора II от общего количества белка; и/или
(b) менее чем 15 мг/мг фибронектина от общего количества белка.
32. Раствор по любому из пп. 24-31, содержащий, по меньшей мере, 80% мономерного фибриногена от общего количества белка.
33. Раствор по п. 32, где фибриноген сохраняет от приблизительно 90% до 100% активности по прошествии, по меньшей мере, 4 недель при хранении раствора при температуре от приблизительно 0°С до приблизительно 8°С.
34. Раствор по п. 32, где фибриноген сохраняет от приблизительно 60% до приблизительно 70% активности по прошествии 5 недель при хранении раствора при температуре приблизительно 30°С.
35. Фармацевтическая композиция, содержащая раствор по любому из пп. 24-34 и фармацевтически приемлемый носитель.
36. Фармацевтическая композиция по п. 35, имеющая объем, равный, по меньшей мере, 5 мл, и содержащая, по меньшей мере, 5 мг/мл фибриногена.
37. Фармацевтическая композиция по п. 35, имеющая объем, равный, по меньшей мере, 5 мл, и содержащая, по меньшей мере, 20 мг/мл фибриногена.
38. Способ лечения или предупреждения состояния, связанного с недостаточностью фибриногена, при этом способ включает введение нуждающемуся в этом субъекту раствора по любому из пп. 24-34 или фармацевтической композиции по любому из пп. 35-37.
39. Способ по п. 38, где состояние выбрано из группы, включающей афибриногенемию, гипофибриногенемию и дисфибриногенемию.
40. Применение раствора по любому из пп. 24-34 для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения или предупреждения состояния, связанного с недостаточностью фибриногена.
41. Применение по п. 40, где состояние выбрано из группы, включающей афибриногенемию, гипофибриногенемию и дисфибриногенемию.
42. Фибриновый клей, включающий раствор по любому из пп. 24-34.
43. Способ получения стабильного жидкого раствора фибриногена, при этом указанный способ включает:
(i) пропускание исходного вещества, включающего фибриноген, через смолу для гидрофобной хроматографии с индуцированным зарядом в условиях, выбранных таким образом, что, по меньшей мере, один белок, выбранный из группы, которая включает плазминоген, тканевой активатор плазминогена и другие протеазы, присутствующий в исходном веществе, связывается со смолой; и
(ii) выделение раствора, содержащего фибриноген, который проходит через смолу, при этом концентрация, по меньшей мере, одного белка, выбранного из группы, которая включает плазминоген, тканевой активатор плазминогена и другие протеазы, в растворе уменьшается, по меньшей мере, на 50% по сравнению с исходным веществом.
44. Способ получения стабильного жидкого раствора фибриногена, при этом указанный способ включает:
(i) пропускание исходного вещества, содержащего фибриноген, через первую смолу для гидрофобной хроматографии с индуцированным зарядом;
(ii) выделение раствора, содержащего фибриноген, который проходит через первую смолу для гидрофобной хроматографии с индуцированным зарядом;
(iii) пропускание раствора, который извлекают на стадии (ii), через вторую смолу для гидрофобной хроматографии с индуцированным зарядом; и
(iv) выделение раствора, содержащего фибриноген, который проходит через вторую смолу для гидрофобной хроматографии с индуцированным зарядом;
где условия проведения стадий хроматографии таковы, что, по меньшей мере, один белок, выбранный из группы, состоящей из плазминогена, тканевого активатора плазминогена и других протеаз, присутствующий в исходном веществе, связывается с первой и/или второй смолой, и где концентрация, по меньшей мере, одного белка, выбранного из группы, состоящей из плазминогена, тканевого активатора плазминогена и других протеаз, в растворе, который выделяют на стадии (iv), уменьшается, по меньшей мере, на 50% по сравнению с исходным веществом.
45. Способ по п. 43 или 44, где фибриноген в выделенном растворе сохраняет от приблизительно 90% до 100% активности по прошествии, по меньшей мере, 4 недель при хранении при температуре от 0°С до приблизительно 8°С.
46. Способ по п. 43 или 44, где фибриноген в выделенном растворе сохраняет от приблизительно 60% до приблизительно 70% активности по прошествии, по меньшей мере, 5 недель при хранении при температуре приблизительно 30°С.
47. Сосуд, содержащий, по меньшей мере, 5 мл стабильного фармацевтически приемлемого раствора фибриногена, в котором концентрация фибриногена равна, по меньшей мере, 20 мг/мл.
48. Способ очистки фибриногена, при этом указанный способ включает стадии:
(i) пропускание раствора, содержащего фибриноген, через смолу для ионообменной хроматографии в условиях, выбранных таким образом, что мономерный фибриноген, присутствующий в указанном растворе, связывается со смолой;
(ii) элюирование мономерного фибриногена из смолы с помощью элюирующего буферного раствора; и
(iii) фильтрование элюированного мономерного фибриногена со стадии (ii) через фильтр с размером пор в диапазоне от приблизительно 15 нм до приблизительно 35 нм.