ПРОТИВОВОЗРАСТНАЯ ИЛИ АНТИОКСИДАНТНАЯ КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ В КАЧЕСТВЕ АКТИВНОГО ИНГРЕДИЕНТА ЛИНИЮ РАСТИТЕЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК, ПОЛУЧЕННЫХ ИЗ КАМБИЯ Panax ginseng, ВКЛЮЧАЯ ЖЕНЬШЕНЬ ДИКОГО ТИПА И ЖЕНЬШЕНЬ КОРЕЙСКИЙ
ANTI-AGING OR ANTIOXIDANT COMPOSITION CONTAINING HERBAL STEM CELL LINE PREPARED OF CAMBIUM Panax ginseng, INCLUDING WILD GINSENG AND GINSENG AS ACTIVE INGREDIENT

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к противовозрастной или антиоксидантной композиции, содержащей, в качестве активного ингредиента, одну или более клеточную линию, полученную из камбия Panax ginseng, включая дикий женьшень и женьшень корейский, ее экстракт, лизат и культуру.
Предшествующий уровень техники
На сегодняшний день существует около 300000 видов растений и известно, что растения содержат полезные компоненты, обладающие различными физиологическими активностями. Полезными компонентами являются вторичные метаболиты, которые продуцируются вторично в процессе нормальных процессов метаболизма и аккумулируются во внутриклеточных специфических участках. Эти подходящие компоненты приковывают повышенное внимание, поскольку они защищают растения от микроорганизмов или животных с биохимической или экологической точки зрения и являются полезными относительно физиологической активности. Вторичные метаболиты, которые продуцируются растениями, включают алкалоиды, флавоноиды, каротиноиды, гликозиды, терпеноиды и др.
Многие такие вторичные метаболиты проявляют увлажняющее, успокаивающее и смягчающее, защищающее от действия УФ, отбеливающее, очищающее от кератина, противовозрастное, антиоксидантное, снижающее образование морщин, антибактериальное, противовоспалительное и протиоопухолевое действие и др. Соответственно, разрабатываются разные косметические продукты, содержащие полезные компоненты, которые получают из растений. Например, косметические продукты, содержащие полезные компоненты, полученные из растений, включают: отбеливающую косметическую композицию, содержащую мальберрин, выделенный из Morus alba (Патент Кореи №25582), косметическую композицию, содержащую экстракт Alpinia Katsumadai (Патент Кореи №295875), косметическую композицию для предотвращения старения кожи, содержащую экстракт женьшеня (Патент Кореи №361433), и косметическую композицию для уменьшения морщин, содержащую Ecklonia Cava (Патент Кореи №2001-25580). В дополнении, разрабатываются различные косметические продукты, которые содержат экстракты различных растений, включая кору каштана, Xanthii fructus, тыкву, Caesapinia sappan L., гигантский горец, мальву, мяту, Ainus juponica, злаки, березу, Рога cocos, гранат, ивовую кору, маш, розу и др. Такие полезные компоненты, полученные из растений, являются вторичными метаболитами, которые экстрагируют непосредственно из растений, поскольку пути биосинтеза их являются комплексными.
При этом кожа является главным защитным барьером организма человека, чьей функцией является защита разных частей организма от изменений температуры и влажности, и внешних стимулов окружающей среды, таких как УФ и загрязняющие вещества играют важную роль в поддержании гемостаза in vivo. Однако, УФ-свет, чрезмерные физические и химические стимулы от внешних факторов, стрессы, недостаточность питания и подобные ухудшают нормальное функционирование кожи и ускоряют процесс старение кожи, напр., потерю плотности кожи, кератинизацию и образование морщин и подобные. Для предотвращения этих процессов и сохранения кожи более здоровой и эластичной, предприняты усилия применения косметики, содержащей физиологически активные вещества, полученные из различных животных, растений и микроорганизмов, с тем, чтобы поддержать внутренние функции кожи и активировать клетки кожи, которые эффективно подавляют старение кожи. Однако сырье для косметических продуктов согласно уровню техники имеет разные проблемы в том, что они главным образом обладают недостаточными эффектами или вызывают побочные эффекты для кожи.
Соответственно, изобретатели настоящего изобретения приложили много усилий для разработки композиции, полученной из природных материалов, которая имеет минимизированное число побочных эффектов по сравнению с существующими противовозрастными агентами и антиоксидантами и обладает отличным противовозрастным и антиоксидантным действием, В итоге, изобретатели данного изобретения обнаружили, что гомогенная клеточная линия, полученная из камбия Panax ginseng, ее лизат, экстракт или культура, имеют отличные ингибирующие эффекты против старения и окисления, тем самым завершая настоящее изобретение.
Сущность изобретения
Целью настоящего изобретения является получение композиции из природных материалов, которая имеет минимизированные побочные эффекты по сравнению с существующими противовозрастными агентами и антиоксидантами и проявляет противовозрастную и антиоксидантную активность.
Для достижения вышеуказанной цели, настоящее изобретение обеспечивает противовозрастную или антиоксидантную композицию, содержащую любые одну или более клеточную линию (а также ее экстракт, лизат или культуру), которую получают из камбия Panax ginseng и которая имеет следующие характеристики:
(a) она находится в природно недифференцированном состоянии;
(b) она является гомогенной клеточной линией; и
(c) она морфологически характеризуется множеством вакуолей.
Настоящее изобретение также обеспечивает противовозрастную косметическую композицию, содержащую любые одну или более указанную клеточную линию, ее экстракт, лизат или культуру.
Настоящее изобретение также обеспечивает противовозрастные или антиоксидантные функциональные продукты питания, содержащие любые одну или более указанную клеточную линию, ее экстракт, лизат или культуру.
Другие признаки и воплощения настоящего изобретения будут более понятны из следующего подробного описания и прилагаемой формулы изобретения.
Краткое описание чертежей
Фиг.1 показывает фотографии, демонстрирующие процесс получения клеточной линии согласно настоящему изобретению, и фотографию самой клеточной линии, полученной из камбия женьшеня дикого типа.
Фиг.2 представляет собой графическую диаграмму, показывающую результаты обработки нормальных фибробластов человека (NHF) различными концентрациями экстракта полученной из камбия женьшеня дикого типа гомогенной клеточной линии настоящего изобретения или культуральной среды клеточной линии и оценку, цитотоксичен ли экстракт или культуральная среда клеточной линии для фибробластов. На Фиг.2, влажные: влажные клетки женьшеня, сухие: сухие клетки женьшеня, среда: культуральная среда клеток женьшеня, Е1: Элиситация-1 стадия, Е2: Элиситация-2 стадия, и G: стадия роста.
Фиг.3 представляет собой графическую диаграмму, показывающую результат обработки нормальных фибробластов человека (NHF) различными концентрациями экстракта полученной из камбия женьшеня дикого типа гомогенной клеточной линии настоящего изобретения или культуральной среды клеточной линии, культивирования фибробластов в 0,5% FBS минимальной эссенциальной среде, и оценку действия экстракта полученной из камбия женьшеня дикого типа клеточной линии или культуральной среды на пролиферацию фибробластов. На Фиг.3, влажные: влажные клетки женьшеня, сухие: сухие клетки женьшеня, среда: культуральная среда клеток женьшеня, Е1: Элиситация-1 стадия, Е2: Элиситация-2 стадия, и G: стадия роста.
Фиг.4 представляет собой графическую диаграмму, показывающую результат обработки нормальных фибробластов человека (NHF) различными концентрациями экстракта полученной из камбия женьшеня дикого типа гомогенной клеточной линии настоящего изобретения или культуральной среды клеточной линии, обработки фибробластов УФВ-излучением и оценку, ингибируется ли повышение экспрессии ММР-1, вызванное УФВ-излучением, экстрактом полученной из камбия женьшеня дикого типа гомогенной клеточной линии или культуральной средой. На Фиг.4, влажные: влажные клетки женьшеня, сухие: сухие клетки женьшеня, среда: культуральная среда клеток женьшеня, Е1: Элиситация-1 стадия, Е2: Элиситация-2 стадия, и G: стадия роста.
Фиг.5 представляет собой графическую диаграмму, показывающую результат обработки нормальных фибробластов человека (NHF) различными концентрациями экстракта полученной из камбия женьшеня дикого типа гомогенной клеточной линии или культуральной среды клеточной линии, обработки фибробластов УФВ-излучением и оценку, ингибируется ли увеличение активных форм кислорода, вызванное УФВ-излучением, экстрактом гомогенной клеточной линии, полученной из камбия женьшеня дикого типа, или культуральной средой. На Фиг.5, влажные: влажные клетки женьшеня, сухие: сухие клетки женьшеня, среда: культуральная среда клеток женьшеня, Е1: Элиситация-1 стадия, Е2: Элиситация-2 стадия, и G: стадия роста, и RA: ретиноевая кислота.
Фиг.6 представляет собой графическую диаграмму, показывающую действие экстракта гомогенной клеточной линии, полученной из камбия женьшеня дикого типа, культуральной среды клеточной линии по ингибированию продукции ММР-1, при индуцировании ММР-1 УФ-излучением.
Фиг.7 представляет собой графическую диаграмму, показывающую действие гомогенного экстракта клеточной линии, полученной из камбия женьшеня дикого типа, или культуральной среды настоящего изобретения на устранение активных форм кислорода, образующихся при воздействии УФ-излучения.
Подробное описание изобретения
Если не определено иное, то все используемые здесь технические и научные термины имеют общепринятые для специалиста в данной области значения. В целом, используемая в данном документе номенклатура хорошо известна и общепринята в уровне технике.
Основные термины, используемые для подробного описания изобретения, имеют следующие значения.
В используемом здесь значении, термин "камбий" относится к ткани, которая утолщает ствол и корень, что позволяет растению расти объемно. Сообщалось, что при использовании камбия, меристемы, в которой происходит наиболее активное деление клеток, в качестве эксплантата для культуры растительной ткани, то возможно быстрое и массовое размножение клеток (Патент Кореи №10-0533120).
В используемом здесь значении, термин "лизат" относится к клеточному лизату, полученному путем разрушения клеток посредством применения химического метода с использованием, например, детергента, или физического метода. Термин "экстракт" клеточной линии относится к субстанции, полученной путем растворения клеток в растворителе и выделении субстанции, при этом экстракт можно концентрировать посредством дистилляции или выпаривания. Также, термин "культуральная среда" клеточной линии относится к клеточной среде, из которой клетки удалены после их культивирования. В дополнении, термин "культура" клеточной линии, в используемом здесь значении, относится к материалу, содержащему культуральную среду и/или культивируемую клеточную линию, причем понятие "культивируемая клеточная линия" включает клеточную линию, которая дифференцируется в условиях культивирования или которая обладает повышенной способностью к продуцированию и/или секретированию подходящих субстанций.
В используемом здесь значении, термин "природно недифференцированные" не означает, что клетки находятся в недифференцированном состоянии в процессе дедифференцировки, а означает, что клетки исходно сохраняются в предифференцированном состоянии.
В одном аспекте, настоящее изобретение обеспечивает противовозрастную или антиоксидантную клеточную линию, полученную из камбия Panax ginseng, ее экстракт, лизат или культуру. В настоящем изобретении, Panax ginseng включает женьшень дикого типа или женьшень (Lian M.L. et al., J. Plant Biology, 45: 201, 2002; Han J.Y. et al., J. Plant Biology, 49: 26, 2006; Teng W.L. et al., Tissue and Organ Culture, 68: 233, 2002). В настоящем изобретении, женьшень дикого типа или женьшень включает культивированный на открытом воздухе или культивированный из ткани женьшень (придаточный корень и полученная из придаточного корня клеточная линия).
Клеточная линия, полученная из камбия Panax ginseng, согласно настоящему изобретение имеет следующие особенности: (a) она находится в природно недифференцированном состоянии; (b) она является гомогенной клеточной линией; и (c) она морфологически характеризуется множеством вакуолей.
Клеточная линия, полученная из камбия Panax ginseng, согласно настоящему изобретение дополнительно характеризуется следующим: (а) она присутствует в виде отдельных клеток во всей суспензионной культуре; (b) она имеет низкую чувствительность к сдвигу в биореакторе по сравнению с клеточными линиями, полученными из тканей, отличных от камбия Panax ginseng, и (с) она имеет более высокую скорость роста по сравнению с теми клеточными линиями, которые получены из тканей, отличных от камбия Panax ginseng, и стабильна в культуре.
Клеточную линию настоящего изобретения получают, используя способ выделения, который включает следующие стадии: (а) получение запасающей ткани корня, содержащей камбий Panax ginseng; (b) воздействие осмотического стресса на полученную ткань камбий-содержащей запасающей ткани корня, с последующим культивированием полученной камбий-содержащей запасающей ткани корня в среде, содержащей ИУК (Индол-3-уксусная кислота)- или ИМК (Индол-3-масляная кислота), получая тем самым происходящую из камбия клеточную линию; и (с) отбор индуцированной клеточной линии, происходящую из камбия.
В стадии (b) способа изобретения, применение осмотического стресса осуществляют для индукции клеточной линии, в особенности в камбии. Предпочтительно, его применяют перед культивированием ткани в среде, содержащей ИУК или ИМК, так что основные ткани (напр., кора, флоэма, ксилема и сердцевина), отличные от камбия, теряют способность к делению, и, следовательно, становятся некротическими, если их обрабатывают гормоном, специфичным к камбиальному делению, таким как ИУК или ИМК. Здесь, предпочтительно, осмотический агент используется в количестве 0,5-2М, и осмотический стресс применяется в условиях холода или при комнатной температуре в течение 16-24 часов, и затем агент удаляют. Однако объем настоящего изобретения этим не ограничивается, поскольку концентрация, время обработки и температура осмотического агента могут варьировать в зависимости от вида растения и состояния ткани. В стадии (b), ИУК или ИМК предпочтительно содержатся в количестве 0,1-5 мг/л.
Предпочтительно, стадия (с) осуществляется путем пролиферации индуцированной клеточной линии, происходящей из камбия, в среде, содержащей одно или более соединений, выбранных из 2,4-D (2,4-дихлофеноксиуксусной кислоты), пиклорама и ИМК, с последующим отбором полученной из камбия клеточной линии. Здесь, любое соединение, выбранное из 2,4-D, пиклорама и ИМК, предпочтительно содержится в количестве 1-5 мг/л, и более предпочтительно 2 мг/л.
3
В настоящем изобретении, культуру клеточной линии предпочтительно получают путем дополнительного культивирования клеточной линии в среде, которая, как элиситоры, содержит 3-5 вес.% сахара-сырца или сахара, и/или любой один или более метилжасмонат, хитозан, фенилаланин, бензойную кислоту, АВА, салициловую кислоту и ацетат натрия. Здесь, среда предпочтительно содержит 3-5 вес.% сахара-сырца или сахара; и по меньшей мере одно вещество, выбранное из группы, состоящей из метилжасмоната, грибкового экстракта, бактериального экстракта, дрожжевого экстракта, хитозана, глюкоманнана, глюкана, фенилаланина, бензойной кислоты, салициловой кислоты, арахидоновой кислоты, STS, мевалоналонат N-бензоилглицина, АВА, SNP, IPP, ВНТ, ССС, этефона, гиппуровой кислоты, цериевого нитрата аммония, AgNO, ванадилсульфата, p-аминобензойной кислоты, брассиностероидов, альгината натрия и ацетата натрия.
Также, в настоящем изобретении, возможно использовать культуру, полученную путем обработки клеточной линии элиситорами, включая УФ-излучение, нагревание, этилен, антигрибковый агент, антибиотик, соль тяжелых металлов и высококонцентрированную соль, для воздействия на нее физического и химического стресса.
Используемой в настоящем изобретении средой является традиционная среда для культуры растительной ткани, и ее примеры включают, но не ограничиваются, N6 среду, SH среду, MS среду, АА среду, LS среду, В5 среду, WPM среду, LP среду. White среду, GD среду, DKW среду, DCR среду и др.
В настоящем изобретении, экстракт предпочтительно получают, используя растворитель, выбранный из группы, состоящей из дистиллированной воды, спирта, ацетона, DMSO (диметилсульфоксида), и смеси растворителей. Здесь, примеры спирта включают спирты, имеющие 1-5 атомов углерода, такие как метанол и этанол.
В настоящем изобретении, экстракт может быть получен путем последовательного фракционирования клеточной линии дистиллированной водой, метанолом и ацетоном.
В одном примере настоящего изобретения, фибробласты, которые синтезируют коллаген (главный компонент кожи), обрабатывали указанным экстрактом клеточной линии или культуральной средой и, в итоге, обнаружили, что экстракт клеточной линии и культуральная среда оказывают отличный эффект на пролиферацию фибробластов, из чего можно сделать вывод, что экстракт клеточной линии и культуральная среда настоящего изобретения повышают упругость кожи. В другом примере настоящего изобретения, показано, что экстракт клеточной линии и культуральная среда настоящего изобретения ингибируют экспрессию ММР-1, которая разрушает коллаген с формированием морщинок на коже, из чего следует, что они предохраняют от и снижают образование морщин. В еще другом примере настоящего изобретения, обнаружили, что экстракт клеточной линии и культуральная среда настоящего изобретения ингибируют активные формы кислорода, образование которых вызвано воздействием УФ-излучения, из чего можно сделать вывод, что они обладают антиоксидантным действием. Поскольку для специалиста в данной области известно, что композиции, обладающие антиоксидантной активностью оказывают противовозрастное действие, то очевидно, что композиция настоящего изобретения обладает противовозрастным действием.
В еще другом примере настоящего изобретения, для обеспечения объективности, выполняли тестирование экстракта клеточной линии и культуральной среды настоящего изобретения относительно их противовозрастного и антиоксидантного действия с использованием метода наружного применения. В итоге, обнаружили, что экстракт клеточной линии и культуральная среда настоящего изобретения обладают более превосходным противовозрастным эффектом по сравнению с RA, которые как известно обладают отличным противовозрастным действием, и экстрактом женьшеня дикого типа. В дополнении, можно видеть, что экстракт клеточной линии и культуральная среда настоящего изобретения обладает более значимым антиоксидантным действием по сравнению с экстрактом женьшеня дикого типа, культивированным на открытом пространстве.
Соответственно, было обнаружено, как описано выше, что экстракт клеточной линии обладал противовозрастным действием и антиоксидантной активностью. Так, даже если в настоящем изобретении не приведены специфические примеры, показывающие, что композиция, содержащая клеточную линию, обладает противовозрастным действием и антиоксидантной активностью, то для специалиста в данной области очевидно, что композиция, содержащая клеточную линию согласно настоящему изобретение или ее лизат, также может обладать противовозрастным действием и антиоксидантной активностью.
Противовозрастная или антиоксидантная композиция, содержащая любые одну или более клеточную линию настоящего изобретения, ее экстракт, лизат или культуру, может быть обеспечена в виде фармацевтической композиции, содержащей любые одну или более указанную клеточную линию (ее экстракт, лизат или культуру) саму по себе или в сочетании с, по меньшей мере, одним фармацевтически подходящим носителем, эксципиентом или разбавителем. Клеточная линия, ее лизат, экстракт или культуральная среда может содержаться в фармацевтической композиции в фармацевтически эффективном количестве в зависимости от заболевания и его тяжести, возраста пациента, веса, состояния здоровья и пола, пути применения и периода лечения.
В используемом здесь значении, термин "фармацевтически подходящая композиция" относится к композиции, которая физиологически пригодна и не вызывает аллергические реакции или аналогичные реакции, такие как нарушения функции желудочно-кишечного тракта или головокружение, при применении для людей. Примеры указанного носителя, эксципиента или разбавителя могут включать лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбит, маннитол, кислит, эритрит, мальтит, крахмал, камедь, альгинат, желатин, фосфат кальция, силикат кальция, целлюлозу, метилцеллюлозу, поливинилпирролидон, воду, метилгидроксибензоат, пропилгидроксибензоат, стеарат магния и минеральные масла.
Фармацевтическая композиция может дополнительно содержать наполнители, агнеты, не вызывающие агрегацию, смазывающие агенты, увлажнители, ароматизаторы, эмульгаторы и консерванты. Также, фармацевтическая композиция настоящего изобретения может быть составлена с использованием способа, хорошо известного из уровня техники, такого, который обеспечивает быстрое, длительное или замедленное высвобождение активного ингредиента после применения млекопитающим. Композиция может быть в виде порошков, гранул, таблеток, эмульсий, сиропов, аэрозолей, мягких и твердых желатиновых капсул, стерильных растворов для инъекций, стерильных порошков и др.
В другом аспекте, настоящее изобретение относится к противовозрастной косметической композиции, содержащей, в качестве активного ингредиента, любые одну или более указанную клеточную линию, происходящую из камбия PAnax ginseng, ее экстракт, лизат или культуру.
В используемом здесь значении, термин "функциональная косметическая продукция" относится к косметической продукции, функциональность которой повышается при добавлении в нее любой одной или более клеточной линии настоящего изобретения, ее экстракта, лизата и культуральной среды. Например, противовозрастная косметическая композиция, содержащая клеточную линию настоящего изобретения, ее лизат, экстракт или культуральную среду, может использоваться для приготовления функциональной косметической продукции.
Косметическая композиция настоящего изобретения может содержать традиционные ингредиенты для косметических средств, дополнительно к клеточной линии или ее лизату, экстракту или культуральной среде, в качестве активного ингредиента. Например, косметическая композиция может содержать традиционные вспомогательные агенты, такие как антиоксиданты, стабилизаторы, солюбилизирующие агенты, витамины, пигменты и ароматизаторы, а также носители.
Косметическая композиция настоящего изобретения может быть составлена в виде любых составов, которые общеприняты в уровне техники. Предпочтительно, косметическая композиция составлена в виде состава, выбранного из группы, состоящей из лосьона для кожи, молочка для кожи, питательного крема, массажного крема, маски, основы для макияжа, тонального крема, масла для тела, масла для головы, шампуня и ополаскивателя.
Косметическая композиция настоящего изобретения, которая содержит любые одну или более клеточную линию настоящего изобретения, ее экстракт, лизат или культуру, обладает антиоксидантным действием и, следовательно, обладает эффектом элиминирования свободных радикалов, образующихся в коже, и защиты внутриклеточных антиоксидантных систем. Соответственно, косметическая композиция настоящего изобретения может проявлять эффекты предотвращения и замедления старения кожи вследствие окисления, что происходит за счет воздействия, например, свободных радикалов.
В другом аспекте, настоящее изобретение относится к противовозрастным или антиоксидантным функциональным продуктам питания, содержащим, в качестве активного ингредиента, любые одну или более клеточную линию, происходящую из камбия Panax ginseng, ее экстракт, лизат или культуру.
В используемом здесь значении, термин "функциональные продукты питания" относится к продуктам питания, функциональность которых повышается за счет добавления в них клеточной линии настоящего изобретения, ее лизата, экстракта или культуральной среды.
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения
В дальнейшем, настоящее изобретение будет описано более подробно посредством примеров. Необходимо понимать, что эти примеры представлены только в целях иллюстрации и не ограничивают объем настоящего изобретения.
В частности, хотя в следующих примерах приведены подтверждения эффектов омоложения кожи при применении экстракта и культуральной среды клеточной линии, полученной из камбия Panax ginseng, для специалиста в данной области техники очевидно, что применение клеточной линии или ее лизата может обеспечивать такие же результаты, что и при применении экстракта и культуральной среды клеточной линии.
Пример 1: Получение клеточной линии, происходящей из камбия женьшеня дикого типа
1-1: Подготовка растительного материала
"А" Фиг.1(а) показывает типичную часть, используемую в настоящем изобретении. Для использования стержневого корня приобретенного женьшеня дикого типа, приобретали стержневой корень и затем промывали его под проточной водой для удаления земли или других загрязнений с его поверхности и промывали поверхность стержневого корня жидким моющим средством. Затем, стержневой корень промывали под проточной водой. Промытую ткань корня помещали в стерилизованную колбу в боксе и дезинфицировали 70% этанолом в течение от около 30 секунд до около 1 минуты. Затем, ополаскивали стерильной водой и обрабатывали дезинфицирующим раствором, содержащим 1-1,5% гипохлорит натрия (Junsei, Japan), в течение около 5-15 минут. В это время, для эффективного проникновения дезинфицирующего раствора в ткань, к ткани добавляли несколько капель TWEEN 20 (монолаурата полиоксиэтиленсорбита, Junsei, Japan). После этого, ткань ополаскивали 3-5 раз стерильной водой. Для предотвращения потемнения дезинфицированной ткани, дезинфицированный стержневой корень помещали в содержащую антиоксиданты BIM (среду, ингибирующую потемнение) и культивировали с использованием перемешивания в течение от около 30 минут до 1 часа. Культивированную ткань помещали на стерильную фильтровальную бумагу для удаления воды.
Состав применяемой BIM и содержание ее компонентов приведены в Таблице 1 ниже.
Таблица 1.
Состав BIM и содержание ее компонентов
Состав
Содержание
Соль WPM (McCown)
1/4 крепости
Сахароза
1%(в/об)
PVP (поливинилпирролидон)
0,5%(в/об)
Аскорбиновая кислота
100 мг/л
Лимонная кислота
150 мг/л
Регулируют до рН 5,8
В Таблице 1 соль добавляют в количестве, равному общему объему BIM. Для предотвращения вышеуказанного обработанного материала от потемнения, материал помещали в сосуд, содержащий раствор CS (разделяющий раствор, Таблица 2), содержащий антиоксиданты, и очищали. Затем, материал разрезали на две равные части и каждую часть разрезали по размеру 0,5-0,7 см (ширина) × 0,5-0,7 см (длина) × 0,2-0,5 мм (толщина) таким образом, что каждый отрезанный элемент содержал часть камбия, имеющую способность активного деления. "В" на Фиг.1(а) показывает эксплантат, полученный путем разрезания стержневого корня женьшеня дикого типа на вышеуказанный размер таким образом, что эксплантат содержит камбий.
Таблица 2.
CS (разделяющий раствор)
Компонент
Содержание
PVP (поливинилпирролидон)
0,5% (в/об)
Аскорбиновая кислота
100 мг/л
Лимонная кислота
150 мг/л
1-2: Обработка эксплантата, содержащего камбий стержневого корня женьшеня дикого типа. осмотическим агентом
Эксплантат, полученный в Примере 1-1, подвергали осмотическому стрессу для некроза дифференцированных тканей (т.е., лубяной, ксилемной, сердцевидной, и др.) и сохраняли только меристему-камбий. Содержащий камбий эксплантат промокали прекультуральной средой (среда 1, Таблица 3), содержащей фильтровальную бумагу, покрывающую ее, и помещали в колбу, содержащую 1М раствор сахарозы (Duchefa, Netherland) и подвергали осмотическому стрессу в состоянии холода в течение 16-24 часов. Затем, эксплантат обрабатывали 0,05М раствором сахарозы в течение 5 минут и 0,1М раствором сахарозы в течение 5 минут для устранения стресса, вызванного высококонцентрированной сахарозой. Содержащий камбий эксплантат, у которого устранен осмотический стресс, помещали на прекультуральную среду (среду 1), содержащую покрывающую ее фильтровальную бумагу, для удаления влаги.
Таблица 3.
Состав прекультуральной среды (среда 1)
Состав
мМ
мг/л
Макроэлементы
Ca(NO<sub>3</sub>)<sub>2</sub>
2,35
471,26
NH<sub>4</sub>NO<sub>3</sub>
5
400
MgSO<sub>4</sub>.7H<sub>2</sub>O
1,5
180,54
K<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
5,68
990
CaCl<sub>2</sub>.2H<sub>2</sub>O
0,65
72,5
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>
1,25
170
Состав
мкМ
мг/л
Микроэлементы
MnSO<sub>4</sub>.4H<sub>2</sub>O
131,94
22,3
ZnSO<sub>4</sub>.7H<sub>2</sub>O
29,91
8,6
Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub>.2H<sub>2</sub>O
1,03
0,25
H<sub>3</sub>BO<sub>3</sub>
100,27
6,2
CuSO<sub>4</sub>.5H<sub>2</sub>O
1,0
0,25
FeNa-EDTA
100
36,7
Витамин
Глицин
26,64
2,0
мио-Инозитол
554,94
100
Никотиновая кислота
4,06
0,5
Пиридоксин-HCl
2,43
0,5
Тиамин-HCl
2,96
1,0
1-3: Индукция выделенной из камбия гомогенной клеточной линии в эксплантат, содержащий камбий женьшеня дикого типа
Для индукции выделенной из камбия гомогенной клеточной линии, обладающей способностью к клеточному делению, эксплантат, подвергнутый осмотическому стрессу в Примере 1-2, переносили в среду для индукции клеточной линии (среда 2, Таблица 4). Состав используемой среды представлен в Таблице 4 ниже. Перенесенный эксплантат культивировали в условиях темноты при температуре 22±1°С.
Таблица 4.
Состав среды (среда 2), используемой для индукции выделенной из камбия гомогенной клеточной линии,
Компонент
Содержание и состояние
Соль
концентрированная WPM
Сахароза
3% (в/об)
IAA (индол-3-уксусная кислота)
2 мг/л
рН
5,8
Гельрит
0,3%(в/об)
Аскорбиновая кислота
100 мг/л
Лимонная кислота
150 мг/л
Как показано в Таблице 5 ниже, в эксплантатах, перенесенных непосредственно в гомогенную среду, индуцирующую клеточную линию без применения осмотической обработки, реакция окрашивания желтым цветом показывала, что, относительно камбия на начальной стадии (2-3 суток) после переноса и затем с течением времени, внесенный эксплантат окрасился желтым. Эксплантат, который окрасился в желтый цвет относительно камбия, пересевали в оптимальную среду (среда 3) для выделения и пролиферации происходящей из камбия клеточной линии для индукции и пролиферации полученной из камбия клеточной линии, при этом феномен окрашивания в коричневый цвет становился более выраженным, и любая реакция, отличная от коричневого окрашивания, не наблюдалась с течением времени.
Однако, после применения осмотического стресса и удаления, наблюдалось, как показано в Таблице 5, что, в эксплантате, инокулированном в среду, индуцирующую гомогенную клеточную линию, гомогенная клеточная линия была специфично индуцирована только в камбии, без индукции в других тканях. Специфично, наблюдалось, что перенесенный эксплантат, который обработан осмотическим стрессом и из которого осмотический стресс был высвобожден, эксплантат камбия начинал окрашиваться в желтый цвет через 3-7 суток культивирования, и через около 7-14 суток, круг клеточной линии был индуцирован в части, где изменилась окраска до желтого цвета. "С" на Фиг.1(а) показывает, что гомогенная клеточная линия, имеющая камбий-специфичную способность к делению, была индуцирована в эксплантате, содержащем камбий женьшеня дикого типа.
При этом эксплантат культивировали в 2,4-D-содержащей среде, которая не являлась средой, индуцирующей гомогенную клеточную линию, и которая использовалась в традиционной культуре Panax ginseng, включая женьшень и женьшень дикого типа. В этом случае, наблюдали, что весь эксплантат начинал изменять цвет на желтый на 7-10 сутки культивирования и через около 7-14 после этого клетки были индуцированы на всем протяжении среза.
1-4: Пролиферация изолированной гомогенной клеточной линии, полученной из камбия женьшеня дикого типа
Выделенная из камбия гомогенная клеточная линия, обладающая способностью к делению, индуцированная в Примере 1-3, подвергалась пролиферации. Используемая в пролиферации среда являлась оптимальной средой (Таблица 7) для пролиферации полученной из камбия гомогенной линии клеток, обладающей способностью к делению, причем среда содержала основной состав солей (Таблица 6).
Таблица 6.
основной состав солей оптимальной среды для выделения и пролиферации выделенной из камбия гомогенной клеточной линии, обладающей способностью к делению
Состав
мМ
мг/л
Макроэлементы
CaCl<sub>2</sub>.2H<sub>2</sub>O
2,99
332,02
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>
1,25
170
KNO<sub>3</sub>
18,79
1900
MgSO<sub>4</sub>
1,5
180,54
NH<sub>4</sub>NO<sub>3</sub>
20,61
1650
Состав
uM
МГ/Л
Микроэлементы
CoCl<sub>2</sub>.6H<sub>2</sub>O
0,11
0,025
CuSO<sub>4</sub>.5H<sub>2</sub>O
0,1
0,025
FeNa-EDTA
100
36,7
H<sub>3</sub>BO<sub>3</sub>
100,27
6,2
Kl
5,0
0.83
MnSO<sub>4</sub>.4H<sub>2</sub>O
100
16,9
Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub>.2H<sub>2</sub>O
1,03
0,25
ZnSO<sub>4</sub>.7H<sub>2</sub>O
29,91
8,6
Витамины
Глицин
26,64
2,0
мио-Инозитол
554,94
100
Никотиновая кислота
4,06
0,5
Пиридоксин-HCl
2,43
0,5
Тиамин-HCl
0,3
0,1
Таблица 7.
Состав оптимальной среды (среда) для выделения и пролиферации выделенной из камбия гомогенной клеточной линии, обладающей способностью к делению
Компонент
Содержание и состояние
Соль
Концентрированная MS
Сахароза
3% (в/об)
2,4-D(2,4-дихлофеноксиуксусная кислота)
2 мг/л
рН
5,8
Гельрит
0,3% (в/об)
Аскорбиновая кислота
100 мг/л
Лимонная кислота
150 мг/л
Как показано в "C" на Фиг.1(а), после того как гомогенная клеточная линия была специфично индуцирована только в камбии путем воздействия осмотического стресса и среды 2, гомогенную клеточную линию пересевали в среду 3, состав которой приведен в Таблице 7. В результате, выделенная из камбия гомогенная клеточная линия, обладающая способностью к делению, постоянно делилась и пролиферировала, и через около 10-20 суток культивирования, выделенную из камбия гомогенную клеточную линию, обладающую способностью к делению, можно было изолировать. Изолированную таким образом гомогенную клеточную линию, выделенную из камбия женьшеня дикого типа, снова подвергали пролиферации путем культивирования в той же среде. "D" на Фиг.1(а) показывает, что выделенная камбий-специфичная гомогенная клеточная линия подверглась пролиферации в среде 3.
1-5: Изучение характеристик изолированной клеточной линии
Гомогенную клеточную линию, выделенную из камбия женьшеня дикого типа, помещали в колбу, содержащую жидкую среду, представленную в Таблице 8. Затем, клеточную линию культивировали в ротационном шейкере при 100 rpm в условиях темноты при температуре 25±1°С. В данном документе, интервал между пересевами составлял 2 недели, при котором культивируемые клетки всегда сохраняли высокую жизнеспособность в экспоненциальной фазе роста. При этом каллус, полученный из котиледона женьшеня, также культивировали в среде 4, представленной в Таблице 8, и культивированный каллус сравнивали с выделенной из камбия женьшеня дикого типа гомогенной клеточной линией настоящего изобретения.
Таблица 8.
Суспензионная среда для Panax ginseng (среда 4)
Компонент
Содержание и состояние
Соль
Концентрированная MS
Сахароза
3% (в/об)
2,4-D(2,4-дихлофеноксиуксусная кислота)
2 мг/л
рН
5,8
Количественное определение клеточной агрегации проводили с помощью оптического микроскопа (биологический микроскоп СХ31, Olympus, Japan) и, как результат, можно было видеть, что, как показано в Таблице 9 ниже, более 90% клеток клеточных линий согласно настоящему изобретению присутствовали в виде одиночных клеток в суспензионной культуре. Как показано на Фиг.1(b), можно видеть, что клеточная линия настоящего изобретения морфологически характеризовалась большим количеством вакуолей и находилась в недифференцированном состоянии.
Таблица 9.
Тип клеточных агрегатов долгоживущих культур Panax ginseng
Большие клеточные агрегаты
Средние клеточные агрегаты
Мелкие клеточные агрегаты
Отдельная клеточная популяция
Источник эксплантата
90%
7%
2%
1%
котиледон
0
0
5%
95%
камбий
Большие клеточные агрегаты, размер больше 1,5×10<sup>3</sup> мкм;
Средние клеточные агрегаты 1×10<sup>3</sup> мкм;
Мелкие клеточные агрегаты 4×10<sup>2</sup> мкм < размер < 1×10<sup>3</sup> мкм
При этом для определения возможности культуры в масштабе производства, каждые каллус, полученный из котиледона женьшеня, и клеточную линию настоящего изобретения, полученную из камбия женьшеня дикого типа, культивировали в аэрлифтном биореакторе (Sung-Won Cytec, Корея), имеющем внутренний объем 3 л. Используемой в культуре среда являлась жидкая среда, представленная в Таблице 8, и ее поддерживали в условиях темноты при температуре 25±1°С.
В итоге, как показано в Таблице 10, время удвоения полученной из котиледона женьшеня клеточной культуры составляло 21 суток в колбе и 28 суток в реакторе. Другими словами, можно видеть, что при культивировании в колбе полученная из камбия клеточная линия настоящего изобретения показывала в около 3-5 раз более высокую скорость роста по сравнению с клеточными линиями, полученными из других тканей. При этом при культивировании в реакторе, полученная из камбия клеточная линия настоящего изобретения показывала в около 5-9 раз более высокую скорость роста по сравнению с клеточными линиями, полученными из других тканей, а не из камбия. Это происходит из-за того, что жизнеспособность клеток гетерогенной клеточной линии быстро снижается вследствие образования годичного кольца в реакторе, агрегации растительных клеток во время культивирования и чувствительности жестких клеточных стенок к сдвигу.
При этом время удвоения полученной из камбия клеточной культуральной среды настоящего изобретения в реакторе составляло 3-4 суток, что не отличалось от такового в колбе или было даже короче, чем в колбе. Полученная из камбия гомогенная клеточная культуральная среда формировала очень маленькую область годичного кольца в биореакторе, и кольцо на внутренней стенке легко растворялось при перемешивания среды обыкновенной палочкой в инкубаторе. Также, было показано, что клеточная линия настоящего изобретения имела меньшую агрегацию клеток и содержала большее количество вакуолей и, следовательно, имела низкую чувствительность к сдвигу, вследствие чего клеточная жизнеспособность не снижалась. Другими словами, можно видеть, что полученная из камбия клеточная линия согласно настоящему изобретению имела низкую чувствительность к сдвигу в результате перемешивания в биореакторе культуры в промышленном масштабе и, тем самым, может быть быстро получена в больших количествах в биореакторе. Соответственно, можно видеть, что полученная из камбия клеточная линия согласно настоящему изобретению имела в 5-9 раз более низкую чувствительность к сдвигу по сравнению с клеточными линиями, полученными из тканей, отличных от камбия.
Таблица 10.
Время удвоения клеточной линии, полученной из камбия женьшеня дикого типа, и клеточной линии, полученной из котиледона, в жидкой суспензионной культуре и в биореакторе
Источник эксплантата
Время удвоения (суток)
Колба
Биореактор
котиледон
21
28
камбий
5
3-4
1-6: Обработка в элиситоре
Клеточную линию, которую культивировали в суспензии в течение 14 суток, как описано в Примере 1-5, разделили на три группы для экспериментов.
Другими словами, отбирали следующие клеточные линии и подвергали последующим тестам: (1) клеточную линию (стадия роста), культивированную в суспензионной культуре в течение 14 суток, (2) клеточную линию (Элиситация 1), полученную путем культивирования 14-суточной клеточной линии, которую культивировали в суспензионнной культуре, в среде (содержащей стерильную воду, 3-5 вес % (г/л) сахара-сырца и 100 мкМ метилжасмоната) в условиях темноты в течение 14 суток, и (3) клеточную линию (Элиситация 2), полученную путем культивирования 14-суточной культивированной в суспензионной среде клеточной линии в среде (содержащей 100 мкМ метилжасмонат) в условиях темноты в течение 14 суток.
Пример 2: Приготовление экстракта клеточной линии, полученной из камбия женьшеня дикого типа
Активные вещества экстрагировали следующим образом из трех клеточных линий, приготовленных в Примере 1:
(1) Приготовление DMSO-(диметилсульфоксид) экстракта
(i) 500 г каждой клеточной линии, из которой удалили среду, и лиофилизированной клеточной линии растворяли в 500 мл DMSO при перемешивании при температуре 50°С в течение 6 часов.
(ii) После завершения растворения, клеточный раствор центрифугировали при 3000 g в течение 10 минут и собирали супернатант, получая таким образом DMSO-растворимую субстанцию.
(iii) Полученную DMSO-растворимую субстанцию концентрировали, используя ротационный вакуумный концентратор.
(iv) Концентрированный образец высушивали, используя лиофилизатор, получая таким образом DMSO-экстракт.
(2) Приготовление экстракта, полученного на дистиллированной воде, метанолового экстракта и ацетонового экстракта
(i) 500 г каждой клеточной линии, из которой удалили среду, и лиофилизированной клеточной линии растворяли в 500 мл дистиллированной воды при перемешивании при температуре 50°С в течение 6 часов.
(ii) После завершения растворения, клеточный раствор центрифугировали при 3000 g в течение 10 минут и собирали супернатант, получая таким образом растворимую субстанцию, приготовленную на дистиллированной воде.
(iii) После получения растворимой субстанции, приготовленной на дистиллированной воде, оставшуюся растворимую субстанцию, приготовленную на дистиллированной воде, растворяли в 500 мл метанола при перемешивании при комнатной температуре в течение 6 часов.
(iv) После завершения растворения, раствор центрифугировали при 3000 g в течение 10 минут и собирали супернатант, получая таким образом метанол-растворимую субстанцию.
(v) После получения метанол-растворимой субстанции, оставшуюся метанол-нерастворимую субстанцию растворяли в 500 мл ацетона при перемешивании при комнатной температуре в течение 6 часов.
(vi) После завершения растворения, раствор центрифугировали при 3000 g в течение 10 минут и собирали супернатант, получая таким образом ацетон-растворимую субстанцию.
(vii) Полученные, как описано выше, субстанции, растворимые в дистиллированной воде, метаноле и ацетоне, концентрировали, используя ротационный вакуумный испаритель.
(vii) Концентрированные образцы высушивали, используя лиофилизатор, и растворяли в дистиллированной воде, метаноле и ацетоне, получая тем самым экстракт, приготовленный на дистиллированной воде, метаноловый экстракт и ацетоновй экстракт.
(3) Приготовление контроля
(i) 500 г лиофилизированного корня женьшеня дикого типа растворяли в 500 мл DMSO при перемешивании при температуре 50°С в течение 6 часов.
(ii) После растворения, раствор центрифугировали при 3000 g в течение 10 минут и собирали супернатант, получая таким образом DMSO-растворимую субстанцию.
(iii) Субстанцию, растворенную в дистиллированной воде, концентрировали с помощью ротационного вакуумного испарителя.
(iv) Концентрированный образец высушивали, используя лиофилизатор, получая тем самым DMSO-экстракт женьшеня дикого типа в качестве контроля.
Пример 3: Анализ цитотоксичности
Для определения концентрации образца, используемого в опытах, осуществляли тест на цитотоксичность следующим образом.
2
Клетки NHF (нормальные фибробласты человека), используемые в опыте, изолировали из фетальной крайней плоти и культивировали. Среду, используемую в клеточной культуре, приготавливали путем добавления 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS, Hyclone, Logan, Utah, USA), инактивированной нагреванием при 56°С в течение 30 минут, 100 Ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 300 мкг/мл глутамина, к DMEM-среде (Invitrogen Gibco life tech. Vienna, Austriea). Клетки культивировали в вышеуказанной среда в 5% CO-инкубаторе при температуре 37°С при относительной влажности 95%, и пересевали в 3-4-суточные интервалы непосредственно до того, как клетки слипались друг с другом. NHF-клетки использовали в экспериментах данного Примера и Примеров 4 и 5, представленных ниже.
NHF(р5)-клетки (нормальные фибробласты человека) помещали в 96-луночные планшеты при плотности 5000 клеток/лунку и через 24 часа обрабатывали каждым DMSO-экстрактами и культуральной средой полученной из камбия женьшеня дикого типа клеточной линии, полученной в Примере 2, при разных концентрациях (жидкий и сухой DMSO-экстракты полученной из камбия женьшеня дикого типа клеточной линии: ppm; и культуральная среда клеточной линии: %). Затем, клетки оставляли для пролиферации. В качестве контроля использовали клетки, не обработанные ни экстрактом, ни культуральной средой. Затем, разбавляли раствор WST-1 100-кратно и добавляли к каждой лунке планшеты и через 2 часа измеряли оптическую плотность планшеты.
В итоге, как показано в Таблице 11 ниже и на Фиг.2, экстракты и культуральная среда не демонстрировали токсичность в интервале концентраций, используемом в эксперименте. Экстракты или культуральную среду, показывающие клеточную жизнеспособность, составляющую 80% или более, определяли как нетоксичные. В Таблице 11, "Элиситация 1" обозначает DMSO-экстракт клеточной линии Примера 1-6, обработанной 3-5 вес% (г/л) сахара-сырца и 100 мкМ метилжасмоната, "Элиситация 2" обозначает DMSO-экстракт клеточной линии Примера 1-6, обработанной 100 мкМ метилжасмоната, "Рост" обозначает DMSO-экстракт 14-суточной культивированной в суспензионной среде клеточной линии (стадия роста) Примера 1-6, и "Среда" обозначает культуральную среду, удаленную во время приготовления экстрактов из клеточных линий.
Таблица-11.
Анализ цитотоксичности выделенной из камбия женьшеня дикого типа гомогенной клеточной линии, экстрактов или культуральной среды
Состояние образцов
Стадия
Концентраия (ppm или %)
% контроля
Контроль
100
Влажный (ppm)
Элиситация 1
100
102
10
95
1
98
Элиситация 2
100
110
10
100
1
98
Рост
100
108
10
106
1
105
Сухой (ppm)
Элиситация 1
50
115
10
105
1
95
Элиситация 2
50
105
10
105
1
100
Рост
50
110
10
115
1
100
Среда (%)
Элиситация 1
10
110
5
125
1
135
Элиситация 2
10
110
5
115
1
115
Рост
10
98
5
100
1
98
Пример 4: Оценка эффекта на пролиферацию фибробластов - Оценка противовозрастного действия
Нормальные фибробласты человека (NHF-клетки), культивированные в 3,5% FBS-содержащей DMEM-среде (Doubecco's Modified Eagle's Media), распределяли в 96-луночном титрационном микропланшете с плотностью 5000 клеток/лунку и обедняли в течение 24 часов. Затем, клетки обрабатывали в течение 48 часов DMSO-экстрактом или культуральной средой клеточной линии, полученной из камбия женьшеня дикого типа, которую приготовили в Примере 2, в 0,5% FBS минимальной эссенциальной среде в различных концентрациях (жидкий и сухой DMSO-экстракты полученной из камбия женьшеня дикого типа клеточной линии: ppm; и культуральная среда клеточной линии: %).
После того, как клетки культивировали, раствор WST-1 разбавили 100-кратно и диспергировали в планшеты, и через 2 часа к каждой лунке планшета добавили 50 мкл 0,2% раствора МТТ (3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолий бромид). Затем, клетки культивировали при температуре 37°С в течение 4 часов, и полученный формазан растворяли в DMSO (диметилсульфоксид). Оптическую плотность растворенного формазана измеряли при длине волны 570 нм, используя планшет-ридер. Исследуемую группу, обработанную экстрактом клеточной линии, полученной из камбия женьшеня дикого типа, или культуральной средой, сравнивали с контролем, не обработанным ни экстрактом, ни культуральной средой, и результаты сравнения представлены в Таблице 12 ниже. В Таблице 12, «10% FBS» обозначает клетки, культивированные в 10% FBS, которая является питательной средой для максимального роста клеточной культуры животного происхождения, и «Контроль» является отрицательной контрольной группой и обозначает клетки, культивированные в 0,5% FBS эссенциальной среде без добавления экстракта клеточной линии или культуральнйо среды.
Таблица 12.
Действие гомогенной клеточной линии, выделенной из камбия женьшеня дикого типа, экстракта или культуральной среды на пролиферацию фибробластов
Состояние образцов
Стадия
Концентрация(ppm или %)
% контроля
Контроль
100
10% FBS
145
Влажный (ppm)
Элиситация 1
100
110
10
105
1
98
Элиситация 2
100
115
10
110
1
113
Рост
100
125
10
115
1
110
Сухой (ppm)
Элиситация 1
50
130
10
118
1
110
Элиситация 2
50
120
10
115
1
112
Рост
50
122
10
118
1
110
Среда (%)
10
108
Элиситация 1
5
105
1
105
10
108
Элиситация 2
5
103
1
105
10
102
Рост
5
98
1
102
Как показано в Таблице 12 и на Фиг.3, экстракт клеточной линии и культуральная среда согласно настоящему изобретению оказывали действие на пролиферацию фибробластов, в отличие от контроля, и в особенности лиофилизированный экстракт клеточной линии (Сухой) оказывал отличное действие на пролиферацию фибробластов.
Также сравнивали друг с другом лиофилизированные экстракты клеточных линий (Сухой) в разных стадиях роста, при этом экстракт Элиситации 1 оказывал наилучшее действие на пролиферацию фибробластов, и клетки Элиситации 2 и клетки стадии роста показывали одинаковые эффекты на пролиферацию фибробластов. Другими словами, можно наблюдать, что, поскольку фибробласты синтезируют коллаген (главный компонент кожи), экстракт клеточной линии согласно настоящему изобретение усиливает упругость кожи.
Пример 5: Оценка эффекта подавления экспрессии ММР-1, вызванного действием УФ-излучения - Оценка противовозрастного эффекта
Если уровень ММР повышался вследствие воздействия УФ-излучения, то происходило разрушение коллагена кожи с образованием морщинок. Так, для оценки ингибируется ли экспрессия ММР-1, которая повышается вследствие УФ-излучени, экстрактом или культуральной средой гомогенной клеточной линии, полученной из камбия женьшеня дикого типа, осуществляли следующее исследование.
NHF(p6)-клетки распределяли в 12-луночной планшете с плотностью 75000 клеток/лунку и обедняли в течение 24 часов. Затем, клетки облучали 40 мДж УФВ и обрабатывали различными концентрациями каждые образцы в течение 48 часов. Затем, выполняли исследование с использованием набора (Amersham, RPN 2610). В качестве положительного контроля использовали 10 мкМ ретиноевой кислоты.
Таблица 13.
Ингибирующее действие выделенной из камбия женьшеня дикого типа гомогенной клеточной линии, экстракта или культуральной среды на экспрессию ММР-1, вызванную УФ-излучением
Образец
Стадия
Концентрация (ppm или %)
% контроля
Без УФ
100
Контрольное УФ-излучение
230
Ретиноевая кислота
10 мкМ
85
Влажный (ppm)
Элиситация 1
100
125
10
130
Элиситация 2
100
125
10
135
Рост
100
140
10
160
Сухой (ppm)
Элиситация 1
50
120
10
140
Элиситация 2
50
135
10
180
Рост
50
100
10
165
Среда (%)
Элиситация 1
1/10
60
1/20
130
Элиситация 2
1/10
60
1/20
200
Рост
1/10
230
1/20
250
В итоге, как показано в Таблице 13 и на Фиг.4, экстракт клеточной линии и культуральная среда согласно настоящему изобретению эффективно ингибирует экспрессию ММР-1 по сравнению с отрицательным контролем (Контрольное УФ), полагая, что они предотвращают и снижают образование морщин. В частности, если "МНР(р6)-клетки были обработаны 0,1% каждой культуральной средой клеточной линии из Элиситации 1, обработаны сахаром-сырцом и метилжасмонатом из Элиситации 2, и обработаны только метилжасмонатом, то эта культуральная среда клеточной линии демонстрировала очень превосходный эффект по сравнению с ретиноевой кислотой, о которой известно, что она оказывает стойкий эффект по снижению образования морщин.
Пример 6: Измерение ингибирующего эффекта на активные формы кислорода, образующиеся вследствие УФ-излучения - Оценка антиоксидантного действия
Для оценки, ингибируются ли активные формы кислорода, уровень которых повышается под действием УФ-излучения, экстрактом или культуральной средой полученной из камбия женьшеня дикого типа гомогенной клеточной линии, кератиноциты человека НаСаТ (German Cancer Research Institute, Heidelberg, Германия) распределяли в 96-луночной черной планшете с плотностью 3,000 клеток/лунку и обрабатывали различными концентрациями каждые образцы в течение 3 часов. Через 3 часа, планшеты промывали один раз HBSS, каждую лунку обрабатывали 50 мкМ DCF и инкубировали при 37°С в течение 20 минут. После двукратного промывания планшеты HBSS, измеряли начальную оптическую плотность, используя люминатор. Клетки облучали 30 мДж УФВ, культивировали при 37°С в течение 2 часов, и затем измеряли оптическую плотность. В Таблице 14 ниже, "Контроль" обозначает группу, не обработанную УФВ, и "УФВ" обозначает группу, обработанную только УФВ без добавления образца.
Таблица 14.
Ингибирующие эффекты экстракта или культуральной среды гомогенной клеточной линии, выделенной из камбия женьшеня дикого типа, на активные формы кислорода, образованные под действием УФ-излучения
Образец
Стадия
Концентрация (ppm или %)
% контроля
Контроль
100
УФВ
140
Влажный (ppm)
Элиситация 1
100
80
10
170
Элиситация 2
100
140
10
135
Рост
100
150
10
170
Сухой (ppm)
Элиситация 1
50
50
10
135
Элиситация 2
50
140
10
135
Рост
50
105
10
145
Среда (%)
Элиситация 1
10
100
1
130
Элиситация 2
10
130
1
105
Рост
10
110
1
120
В итоге, как показано в Таблице 14 и на Фиг.5, в случаях, когда использовалась клеточная линия изобретения, из которой удалили культуральную среду (Влажный) и когда использовалась лиофилизированная клеточная линия (Сухой), экстракт клеточной линии Элиситации 1 показал прекрасный антиоксидантный эффект. Экстракт клеточной линии Элиситации 2 и экстракты клеточной линии стадии Роста показал аналогичные антиоксидантные эффекты. Также группа, обработанная 50 ppm лиофилизированного экстракта клеточной линии Элиситации 1, продемонстрировала наиболее превосходный антиоксидантный эффект.
Пример 7: Анализ гинзенозидных компонентов
Известно, что гинзенозиды экстрактов женьшеня дикого типа являются эффективными для предотвращения старения кожи и антиоксидации. Так, для оценки, присущи ли эффекты предотвращения старения кожи и антиоксидантные эффекты экстракта клеточной линии и культуральной среды согласно настоящему изобретение эффектам таким гинзенозидам, определяли содержание гинзенозидов. А именно, лиофилизировали выделенную из камбия женьшеня дикого типа гомогенную клеточную линию, приготовленную в Примере 2, и 20 мг лиофилизированной клеточной линии экстрагировали в 600 мкл метанола в течение 1 часа. Экстракт центрифугировали и выделяли супернатант. Содержание гинзенозидов в выделенном экстракте измеряли, используя ВЭЖХ, и измеренное содержание представлено в сравнении со стандартными Re, Rb1, Rb2 и Rd. Также культуральную среду Элиситации 1 фильтровали, используя 0,2-мкМ шприцевой фильтр, и содержание в нем гинзенозидов измеряли, используя ВЭЖХ. Измеренное содержание представлено в сравнении со стандартными Re, Rb1, Rb2 и Rd.
Таблица 15.
Сравнение содержания гинзенозидов между выделенной из камбия женьшеня дикого типа гомогенной клеточной линией и культуральной средой и женьшенем дикого типа
Клеточная линия, полученная из камбия женьшеня дикого типа
Культуральная среда полученной из камбия женьшеня дикого типа клеточной линии
Женьшень дикого типа
Рост
Элиситация 1
Элиситация 2
Гинзенозид (Rb1, Rb2, Rd, Re)
0%
0,003%
0,018%
0%
3%
В итоге, как показано в Таблице 15, клеточная линия Элиситации 2 показала наивысшее содержание гинзенозидов, при этом содержание гинзенозидов в экстракте женьшеня дикого типа, Контрольная группа, было в 167 раз выше содержания гинзенозидов в гомогенной клеточной линии, полученной из камбия женьшеня дикого типа. Также, не обнаружили гинзенозиды в клеточной линии, полученной из камбия женьшеня дикого типа, стадии роста или в культуральной среде клеточной линии. Это показывает, что противовозрастной и антиоксидантный эффекты экстракта клеточной линии и культуральной среды согласно настоящему изобретению не присущи гинзенозидам и что клеточная линия, выделенная в соответствии со способом настоящего изобретения, содержит активные ингредиенты, которые отличаются от тех, которые содержатся в обычных клетках женьшеня дикого типа.
Пример 8: Оценка ингибирующих эффектов на продукцию коллагеназы (ММР-1), индуцированную УФ-излучением (2)
Для сравнения противовозрастной активности полученной из камбия женьшеня дикого типа клеточной линии изобретения с противовозрастной активностью культивированного женьшеня дикого типа, следующий эксперимент проводили в Kyung Нее University Skin Biotechnology Center в соответствии со стандартным руководством, разработанным в этом центре.
4
2
Сначала, высеивали фибробласты (МСТТ, Korea) в 24-луночную планшету с плотностью 2×10 клеток/лунку и культивировали в течение 12 часов для прилипания к планшете. Затем, клетки обедняли в FBS-свободной среде в течение 12 часов. Клетки промывали буфером DPBS и облучали 100 мДж/см УФ по длине волны 365 нм. Затем, клетки обрабатывали каждым 1, 10 и 50 ppm DMSO-экстракта (Элиситация 1) лиофилизированной клеточной линии Примера 2 (обработанного 3-5 вес.% (г/л) сахара-сырца и 100 мкМ метилжасмоната) или каждым 0,05, 0,1 и 1 об.% культуральной среды Примера 2, в FBS-свободной среде в течение 24 часов. Также, положительные контрольные клетки обрабатывали 1 мкМ RA (ретиноевой кислоты), и дополнительно контрольные клетки обрабатывали каждым 1, 10 и 50 ppm DMSO-экстракта лиофилизированного корня женьшеня дикого типа Примера 2. Затем, каждую культуральную среду собирали и центрифугировали, и количество ММР-1 в супернатанте определяли с использованием анализа ELISA (Amersham). Жизнеспособность клеток измеряли, используя раствор WST-1, и корректировали.
В итоге, как показано на ФИГ.6, экстракт клеточной линии согласно настоящему изобретению показал ММР-1 - ингибирующую активность, составляющую около 55% (1 ppm), около 67% (10 ppm) и около 83%, и культуральная среда клеточной линии показала;ММР-1-ингибирующую активность, составляющую около 49% (0,05 об.%), около 63% (0,1 об.%) и 70% (1 об.%). Также, при обработке клеток 10 ppm или 50 ppm экстракта клеточной линии или 0,1 об.% или 1 об.% культуральной среды, обнаружили, что экстракт клеточной линии и культуральная среда показали отличные противовозрастные эффекты по сравнению с положительной контрольной RA, про которую известно, что она обладает прекрасным противовозрастным эффектом.
В особенности, экстракт клеточной линии и культуральная среда согласно настоящему изобретению показали значительно более превосходные эффекты по ингибированию экспрессии ММР-1 по сравнению с контролем (лиофилизированным DMSO-экстрактом женьшеня дикого типа корень, культивированного на открытом пространстве). Специфично, ММР-1-ингибирующая активность экстракта клеточной линии была увеличена на 27-51% относительно таковой культивированного женьшеня дикого типа, и ММР-1-ингибирующая активность экстракта клеточной линии была увеличена на 16-27%.
Соответственно, обнаружили, что экстракт клеточной линии и культуральная среда согласно настоящему изобретению показали очень превосходные противовозрастные эффекты по сравнению с RA, про которую известно, что она обладает прекрасным противовозрастным эффектом, и экстрактом женьшеня дикого типа, полагая, что клеточная линия и культуральная среда согласно настоящему изобретению являются в особенности подходящими в качестве противовозрастных композиций.
Пример 9: Оценка эффектов по удалению активных форм кислорода, образующихся под действием УФ-излучения (2)
Для сравнения противовозрастной активности полученной из камбия женьшеня дикого типа клеточной линии изобретения с противовозрастной активностью культивированного на открытом пространстве женьшеня дикого типа, следующий эксперимент проводили в Kyung Нее University Skin Biotechnology Center в соответствии со стандартным руководством, разработанным в этом центре.
4
Сначала, кератиноциты человека НаСаТ (German Cancer Research Institute, Heidelberg, Германия) культивировали в 10% FBS-содержащей DMEM среде. Клетки высеивали в 96-луночные планшеты с плотностью 3×10 клеток/лунку в течение 12 часов для прилипания к культуральной планшете. Затем, клетки обрабатывали каждым 1, 10 и 50 ppm DMSO-экстрактом (Элиситация 1) лиофилизированной клеточной линии Примера 2 (обработанный 3-5 вес % (г/л) сахара-сырца и 100 мкМ метилжасмоната) или каждой 1, 5 и 10 об.% культуральной средой Примера 2 в FBS-свободной DMEM среде в течение 3 часов. Также, положительные контрольные клетки обрабатывали 10 мМ NAC (N-ацетил-цистеин), и дополнительные контрольные клетки обрабатывали каждым 1, 10 и 50 ppm DMSO-экстрактом лиофилизированного корня женьшеня дикого типа Примера 2.
2
Затем, клетки промывали буфером HBSS и инкубировали 50 мкМ F-DA (HBSS) при 37°С в течение 20 минут. Затем, клетки промывали дважды буфером HBSS, затем к ним добавляли 30 мкл HBSS, и клетки облучали 200 мДж/см УФ при длине волны 365 нм. Затем, клетки культивировали при 37°С в течение 2 часов и измеряли флуоресценцию (возбуждение, 485 нм; эмиссия, 535 нм; Infinite M-200, Tecan), и жизнеспособность клеток измеряли, используя раствор WST-1, и корректировали. Эффект каждого образца на удаление активных форм кислорода сравнивали с УФ-необлученной группой, чью флуоресценцию принимали за 100.
Как показано на Фиг.7, когда эффекты образцов на удаление активных форм кислорода сравнивали с отрицательным контролем (УФ-облученная группа), экстракт женьшеня дикого типа, как и контроль, показал ингибирующую активностью 17-26%, тогда как экстракт клеточной линии и культуральная среда согласно настоящему изобретению показали более того увеличенные ингибирующие активности, составляющие 28-36% и 35-58%, соответственно. Так, было обнаружено, что экстракт клеточной линии и культуральная среда согласно настоящему изобретению обладают более сильными антиоксидантными эффектами, чем экстракт культивированного женьшеня дикого типа.
Пример 10: Приготовление фармацевтических составов
Состав 1: Приготовление таблетки
100 мг экстракта клеточной линии, приготовленного в Примере 2, смешивали с 100 мг маисового крахмала, 100 мг лактозы и 2 мг стеарата магния, и смесь прессовали в таблетку в соответствии с традиционным методом изготовления таблеток.
Состав 2: Приготовление капсулы
500 мг экстракта клеточной линии, приготовленного в Примере 2, наполняли в мягкую желатиновую капсулу для изготовления капсулы.
Состав 3: Приготовление сиропа
1 г клеточной линии, приготовленной в Примере 1, смешивали с 10 г изомеризованного сахара, 5 г маннитола и подходящим количеством очищенной воды, и смесь приготавливали в 100 мл сиропа в соответствии с традиционным методом.
Состав 4: Приготовление раствора для инъекций
200 мг экстракта клеточной линии, приготовленного в Примере 2, нагревали и растворяли в 200 мг физиологического раствора, содержащего полиоксиэтилен-гидрогенизированное касторовое масло, получая таким образом раствор для инъекций, содержащий экстракт в концентрации 0,1%.
Пример 11: Приготовление косметических составов
Состав 1: Приготовление лосьона для кожи
Компоненты
вес.%
Экстракт клеточной линии, полученной из женьшеня дикого типа, или ее культуральная среда
0,1
Глицерин
3
Бутиленгликоль
2
Пропиленгликоль
2
Карбоксивиниловый полимер
0,1
PEG 12 нонилфеноловый эфир
0,2
Полисорбат 80
0,4
Этанол
10
Триэтаноламин
0,1
Антисептики, пигменты, ароматизаторы
q.s.
Очищенная вода
до 100
Состав 2: Приготовление молочка для кожи
Компоненты
вес.%
Экстракт клеточной линии, полученной из женьшеня дикого типа, или ее культуральная среда
0,5
Сквален
5
Воск
4
Полисорбат 60
1,5
Сорбитансесквиолеат
1,5
Жидкий парафин
0,5
Каприлик/каприк триглицерид
5
Глицерин
3
Бутиленгликоль
3
Пропиленгликоль
3
Карбоксивиниловый полимер
0,1
Триэтаноламин
0,2
Антисептики, пигменты, ароматизаторы
q.s.
Очищенная воды
до 100
Состав 3: Приготовление питательного крема
Компоненты
вес.%
Экстракт клеточной линии, полученной из женьшеня дикого типа, или ее культуральная среда
2
Воск
10
Полисорбат 60
1,5
PEG 60 гидрогенизированное касторовое масло
2
Сорбитансесквиолеат
0,5
Жидкий парафин
10
Сквален
5
Каприлик/каприк триглицерид
5
Глицерин
5
Бутиленгликоль
3
Пропиленгликоль
3
Триэтаноламин
0,2
Антисептики, пигменты, ароматизаторы
q.s.
Очищенная воды
до 100
Состав 4: Приготовление массажного крема
Компоненты
вес.%
Экстракт клеточной линии, полученной из женьшеня дикого типа, или ее культуральная среда
5
Воск
10
Полисорбат 60
1,5
PEG 60 гидрогенизированное касторовое масло
2
Сорбитансесквиолеат
0,8
Жидкий парафин
40
Сквален
5
Каприлик/каприк триглицерид
4
Глицерин
5
Бутиленгликоль
3
Пропиленгликоль
3
Триэтаноламин
0,2
Антисептики, пигменты, ароматизаторы
q.s.
Очищенная воды
до 100
Состав 5: Приготовление маски
Компоненты
вес.%
Экстракт клеточной линии, полученной из женьшеня дикого типа, или ее культуральная среда
5
Поливинилалкоголь
13
Натрий-карбоксиметилцеллюлоза
0,2
Глицерин
5
Аллантоин
0,1
Этанол
6
PEG 12 нонилфеноловй эфир
0,3
Полисорбат 60
0,3
Антисептики, пигменты, ароматизаторы
q.s.
Очищенная воды
до 100
Пример 12: Приготовление функциональных продуктов питания: приготовление энергетических напитков
Приготовление 1
200 мг клеточной линии, полученной в Примере 1, растворяли в 96 мл воды, и затем добавляли 500 мг витамина С в качестве добавки, 1 г каждых лимонной кислоты и олигосахарида в качестве усилителей вкуса и запаха и 0,05 г бензоата натрия в качестве консерванта. Затем, добавляли очищенную воду, получая таким образом 100 мл энергетического напитка.
Приготовление 2
200 мг экстракта клеточной линии, полученной в Примере 2, растворяли в 96 мл воды и затем добавляли 500 мг витамина С в качестве добавки, 1 г каждых лимонной кислоты и олигосахарида в качестве усилителей вкуса и запаха и 0,05 г бензоата натрия в качестве консерванта. Затем, добавляли очищенную воду, получая таким образом 100 мл энергетического напитка.
Промышленная применимость
Как описано выше, композиция согласно настоящему изобретению имеет минимизированные побочные эффекты по сравнению с существующими противовозрастными агентами и антиокисдантами и, следовательно, безопасна для кожи. Также, композиция настоящего изобретения оказывает антиоксидантный эффект ингибирующих активных форм кислорода, продукция которых вызвана воздействием УФ-излучения, которое является основной причиной старения кожи, при этом композиция может эффективно снижать или подавлять факторы, связанные со старением кожи. Таким образом, композиция настоящего изобретения является пригодной для предотвращения или подавления старения.
Хотя настоящее изобретение подробно описано с указанием специфических особенностей, для специалиста в данной области очевидно, что данное описание содержит только предпочтительное воплощение и не ограничивает объем настоящего изобретения. Таким образом, действительный объем притязаний настоящего изобретения будет определен прилагаемой формулой изобретения и ее эквивалентами.