ВЫСОКОПРОДУКТИВНЫЙ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОСЛАБЛЕННЫХ ШТАММОВ SALMONELLA

1. Способ выращивания ослабленного мутантного штамма Salmonella typhi, утратившего активность эпимеразы галактозы и содержащего, по меньшей мере, одну копию рекомбинантной молекулы ДНК, содержащей кассету экспрессии, где способ включает в себя стадию культивирования штамма в буферной среде, содержащей пептон, примерно при нейтральном исходном значении pH в масштабе ферментации, в котором количество глюкозы в среде во время ферментации регулируют таким образом, чтобы количество глюкозы снижалось до нуля до достижения стационарной фазы.
2. Способ по п. 1, в котором глюкозу не добавляют в среду в процессе ферментации, а исходное количество глюкозы расходуется до достижения стационарной фазы.
3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что ослабленный мутантный штамм Salmonella typhi представляет собой Salmonella typhi Ty21a.
4. Способ по любому из пп. 1 или 3, отличающийся тем, что кассета экспрессии представляет собой эукариотическую кассету экспрессии, предпочтительно, кодирующую рецепторный белок VEGF, предпочтительно, белок рецептора VEGF, выбранный из группы, включающей в себя человеческий VEGFR-2 и его гомолог, степень гомологии которого составляет примерно 80%, в особенности, человеческий VEGFR-2, имеющий аминокислотную последовательность, описанную в SEQ ID NO 1.
5. Способ по любому из пп. 1 или 3, отличающийся тем, что буферная среда содержит пептон неживотного происхождения, где буферная среда предпочтительно представляет собой трипсиновый соевый бульон (TSB) неживотного происхождения.
6. Способ по любому из пп. 1 или 3, отличающийся тем, что объем среды составляет, по меньшей мере, примерно 10 л, предпочтительно примерно от 10 л до 10000 л, более предпочтительно примерно от 30 л до 1000 л, наиболее предпочтительно примерно от 100 л до 500 л.
7. Способ по любому из пп. 1 или 3, отличающийся тем, что исходная концентрация глюкозы не превышает концентрацию глюкозы в минимальной среде для культивирования бактерий, предпочтительно исходная концентрация глюкозы составляет примерно от 0 г/л до 4 г/л.
8. Способ по любому из пп. 1 или 3, отличающийся тем, что исходное значение pH составляет примерно от 5 до менее чем примерно 9, предпочтительно примерно от 6 до 8, более предпочтительно примерно от 6,5 до 7,5.
9. Способ по любому из пп. 1 или 3, отличающийся тем, что значение pH в течение указанного периода культивирования доводят до величины, составляющей примерно от 6 до 8, предпочтительно примерно от 6,5 до 7,5.
10. Способ по любому из пп. 1 или 3, отличающийся тем, что ход роста определяют путем (i) измерения оптической плотности (OD), предпочтительно путем (ia) мониторинга оптической плотности культуры in situ, или путем (ib) отбора образцов и измерения их оптической плотности, либо путем (ii) измерения плотности клеток, предпочтительно (iia) микроскопически, или (iib) путем измерения электрического сопротивления, или (iic) с помощью проточной цитометрии, или (iii) путем измерения колониеобразующих единиц (значения КОЕ) в результате отбора проб и нанесения их на чашки с агаром.
11. Способ по любому из пп. 1 или 3, отличающийся тем, что клетки собирают до достижения оптической плотности примерно 6, предпочтительно при оптической плотности примерно от 5 до 6.
12. Способ по любому из пп. 1 или 3, отличающийся тем, что ослабленный мутантный штамм Salmonella typhi представляет собой Salmonella typhi Ty21, а рекомбинантная молекула ДНК содержит ген устойчивости к канамицину, участок начала репликации рМВ1 и эукариотическую кассету экспрессии, кодирующую человеческий VEGFR-2, под контролем промотора CMV, в особенности, где человеческий VEGFR-2 имеет нуклеотидную последовательность, описанную в SEQ ID NO 2.
13. Ослабленный мутантный штамм Salmonella typhi, утративший активность эпимеразы галактозы и содержащий, по меньшей мере, одну копию рекомбинантной молекулы ДНК, содержащей кассету экспрессии, который можно получить по способу выращивания штамма, включающему в себя стадию культивирования штамма в буферной среде, содержащей пептон, примерно при нейтральном исходном значении pH, в масштабе ферментации, где количество глюкозы в среде во время ферментации регулируют таким образом, чтобы количество глюкозы снижалось до нуля до достижения стационарной фазы, предпочтительно, где глюкозу не добавляют в среду в процессе ферментации, а исходного количество глюкозы расходуется до достижения стационарной фазы.
14. Ослабленный мутантный штамм по п. 13, отличающийся тем, что кассета экспрессии представляет собой эукариотическую кассету экспрессии, кодирующую рецепторный белок VEGF, предпочтительно белок рецептора VEGF, выбранный из группы, включающей в себя человеческий VEGFR-2 и его гомолог, степень гомологии которого составляет, по меньшей мере, примерно 80%, в особенности, где человеческий VEGFR-2 имеет аминокислотную последовательность, описанную в SEQ ID NO 1.
15. Ослабленный мутантный штамм по п. 14, отличающийся тем, что ослабленный мутантный штамм представляет собой Salmonella typhi Ty21a, а рекомбинантная молекула ДНК содержит ген устойчивости к канамицину, участок начала репликации рМВ1 и эукариотическую кассету экспрессии, кодирующую человеческий VEGFR-2, под контролем промотора CMV, в частности, где человеческий VEGFR-2 имеет нуклеотидную последовательность, описанную в SEQ ID NO 2.
16. Ослабленный мутантный штамм Salmonella typhi Ty21a, содержащий, по меньшей мере, одну копию рекомбинантной молекулы ДНК, содержащей эукариотическую кассету экспрессии, кодирующую белок рецептора VEGF, предпочтительно белок рецептора VEGF, выбранный из группы, включающей в себя человеческий VEGFR-2 и его гомолог, степень гомологии которого составляет, по меньшей мере, примерно 80%, в особенности, где человеческий VEGFR-2 имеет аминокислотную последовательность, описанную в SEQ ID NO 1, для применения в качестве вакцины.