СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК СЛЮННОЙ ЖЕЛЕЗЫ ЧЕЛОВЕКА
METHOD FOR HUMAN SALIVARY GLAND CELLS CULTIVATION

Область изобретения
[001] Изобретение относится к области клеточной биологии. В частности, изобретение относится к культивированию клеток человека.
Уровень техники
[002] Культивирование клеток человека с целью наращивания биомассы целевой клеточной культуры в ряде случаев представляет собой непростую задачу. Значительные проблемы существуют при культивировании эпителиальных прогениторных клеток слюнной железы человека. Известны методы культивирования клеток слюнной железы млекопитающих, таких как крыса [Okumura K. et al., Hepatology. 2003. 38. 104-113], мышь [Hisatomi Y. et al., Hepatology. 2004. 39(3). 667-675; Ikeura, K. et al., Plos One. 2016, e0147407], свинья [Matsumoto S., et al., Cloning and Stem Cells. 2007. 9. 176-190]. Однако методы, подходящие для клеток животных оказываются неприменимы для длительного культивирования эпителиальных прогениторных клеток слюнных желез человека. Показано, что эти клетки человека при культивировании in vitro склонны к спонтанной дифференцировке, в результате которой они приобретают большие размеры, зернистую цитоплазму, теряют способность к пролиферации. Таким образом, длительное культивирование эпителиальных клеток слюнных желез становится невозможным [Sabatini, L.M., et al., In Vitro Cell Dev. Biol. 1991 27A 939-948]. Например, эпителиальные клетки слюнной железы мыши легко культивируются и проходят более 90 пассажей на среде DMEM/F12 1:1 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, тогда как клетки человека на данной среде вообще не способны к длительному культивированию.
3
[003] Таким образом, востребованы способы длительного культивирования эпителиальных клеток слюнных желез человека, позволяющие поддерживать эти клетки в недифференцированном состоянии в течение большего числа пассажей, например, не менее 15 пассажей. Такие методы позволят наращивать большую клеточную массу (более 200 млн. клеток) из небольшого биоптата (объемом 0,5-3 см).
[004] В некоторых работах описаны способы культивирования мезенхимных клеток из слюнной железы человека. Так в работе [Jeong J. et al., Exp. Mol. Med. 2013. 45:e58] описан способ культивирования клеток из околоушной или поднижнечелюстной слюнных желез человека: клетки были выделены с помощью коллагеназы, посажены на культуральные флаконы, покрытые коллагеном I типа, и культивированы в среде DMEM/F12 1:1 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 1% пенициллина/стрептомицина, 1% инсулина-трансферрина-селенита, 10 мМ никотинамида, 100 нМ дексаметазона, 1 мМ β-меркаптоэтанола, 20 нг/мл EGF (epidermal growth factor), 20 нг/мл HGF (hepatocyte growth factor), 20 нг/мл онкостатина M, 1000 Uml LIF (leukemia inhibitory factor). Эти клетки экспрессировали маркеры мезенхимных клеток, такие как CD44, CD49f, CD90 и CD105. Кроме того, они были способны к адипогенной, остеогенной и хондрогенной дифференцировке. Клетки были способны проходить 10 пассажей.
[005] В другой работе [Schwarz S., Rotter N. Methods Mol. Biol. 2012. 879. 403-442] клетки культивировали на пластике в среде DMEM/F12 1:1 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 1% пенициллина/стрептомицина. Клетки имели типичную фибробластоподобную морфологию, экспрессировали CD29, CD44, CD73, CD90, CD105 и были способны к дифференцировке в адипогенном, хондрогенном и остеогенном направлениях.
[006] Таким образом, при применении описанных в работах Jeong J. И соавторов и Schwarz S., Rotter N. [Jeong J. et al., Exp. Mol. Med. 2013. 45:e58; Schwarz S., Rotter N. Methods Mol. Biol. 2012. 879. 403-442] среды подходят для культивирования мезенхимных клеток, а рост эпителиальных клеток слюнных желез человека не наблюдается.
[007] Описан способ получения линий человеческих иммортализованных эпителиальных клеток из околоушной слюнной железы [Патент США №5462870 от 31.10.1995 «Human diploid salivary gland epithelial cell lines»]. Линии представляют собой диплоидные клетки, полученные из нормальной околоушной слюнной железы мужчины (HPAM1) и женщины (HPAF1). Клетки способны к длительному культивированию в безсывороточной среде KBM (Keratinocyte Basal Medium) с добавлением 5 мкг/мл инсулина, 0,5 мкг/мл гидрокортизона, 10 нг/мл EGF (эпидермальный ростовой фактор, от epidermal growth factor), 25 мкг/мл экстракта гипофиза быка (bovine pituitary extract), 100 IU/ml пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Для пассирования клетки промывают HBSS, снимают с пластика 0,125% трипсином и инкубируют с КВМ, содержащей 5% эмбриональной телячьей сыворотки для ингибирования трипсина. Затем клетки осаждают центрифугированием и ресуспендируют в безсывороточной ростовой среде, описанной выше. Клеточные линии способны к криозаморозке и длительному криохранению. Клетки экспрессируют α-кератин, амилазу и proline-rich protein (PRP).
[008] Иммортализованные клеточные линии можно использовать для изучения различных процессов: биохимических и молекулярных механизмов роста и дифференцировки, межклеточных взаимодействий, онкотрансформации, цитотоксичности различных веществ, экспрессии цитокинов и др. Однако такие клетки неприменимы в медицинских приложениях при клеточной терапии из соображений безопасности.
3
[009] Известен способ получения стволовых клеток слюнной железы человека [WO 2014092575 от 19.06.2014 «Means and methods for obtaining salivary gland stem cells and use thereof»]. Данный способ относится к получению стволовых клеток слюнной железы человека (предпочтительно поднижнечелюстной и околоушной слюнных желез), и их трансплантации с целью клеточной терапии, в том числе, ксеростомии. Биоптат слюнной железы механически измельчают на кусочки размером 1-5 мм, затем обрабатывают коллагеназой и гиалуронидазой, пропускают через фильтр с размером пор 100 мкм для получения моноклеточной суспензии. Из клеток можно отсортировать стволовые клетки с наибольшим потенциалом, экспрессирующие, в том числе, маркеры EpCAM, c-Kit, CD49f, CD29, CD133 и CD24. Затем клетки подвергают суспензионному культивированию для получения салисфер - трехмерных округлых структур. В среду культивирования вносят следующие добавки: антибиотик, глутамин, 20 нг/мл EGF, 20 нг/мл FGF (fibroblast growth factor), 10 мкг/мл инсулин, 1 мкМ дексаметазон и N-2. Полученные из одной клетки салисферы можно подвергать дальнейшему культивированию обработав их трипсином. После ресуспендирования и получения моноклеточной суспензии, клетки в среде культивирования с вышеописанными добавками помещают на 3D матрикс с целью получения второй генерации салисфер. В качестве 3D матрикса используют белки компонентов базальной мембраны, такие как коллагены IV типа и ламинины, например, матригель. От матрикса салисферы можно отделить диспазой, а затем, обработав трипсином, получить следующую генерацию салисфер. Для роста салисфер до размера 50-80 мкм в диаметре необходимо около 10 дней. Салисферы можно дифференцировать, получая из них органоиды - аналоги структур организма. Для этого единичные салисферы помещают на матригель, содержащий коллаген I типа в среде, описанной выше, к которой добавляют ингибитор гамма-секретазы или 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Салисферы дифференцируют около 1 месяца для получения органоида. Из недостатков указанного способа можно указать следующие: данный способ подразумевает трехмерное культивирование клеток, что довольно трудоемко и сложно технически. Известно, что в трехмерных структурах часть клеток гибнет, часть клеток дифференцируется и теряет свой пролиферативный потенциал [Lin R.Z., Chang H.Y. Biotechnol. J. 2008. 3(9-10). 1172-1184]. По этой причине прирост клеточной массы при пассировании оказывается очень малым. Для дифференцировки способ предлагает культивировать единичные салисферы, что технически сложно и дорого. Процесс получения органоида занимает около месяца, таким образом, весь процесс культивирования и дифференцировки довольно длительный. Таким образом, с помощью указанного способа невозможно наращивать большие объемы клеточного материала (более 200 млн клеток). Кроме того, в процессе культивирования и дифференцировки способ предлагает использование матригеля в качестве матрикса, что не соответствует нормам биологической безопасности, так как матригель получают из опухолевого материала.
[010] Известна работа, в которой получали клетки из малых слюнных желез человека [Jang S.I. et al., J. Dent. Res. 2015. 94(2). 304-311]. Клетки культивировали в покрытых коллагеном культуральных флаконах в среде Keratinocyte growth medium (KGM) с добавлением экстракта гипофиза быка, EGF, инсулина, гидрокортизона, гентамицина, эпинефрина и трансферрина. Клетки имели типичную эпителиальную морфологию, маленькие размеры и были способны проходить более 10 пассажей. Клетки экспрессировали цитокератины 5 и 18 и nanog. Таким образом, недостатком данного метода является сложность приготовления среды для культивирования и ее относительная дороговизна.
-8
-6
4
2
[011] Наиболее близким аналогом является способ получения стволовых клеток из больших слюнных желез человека [WO 2004074465 от 02.09.2004 Human salivary gland-origin stem cell]. Материал биопсии слюнных желез человека массой 2-4 г механически измельчают на кусочки размером 1-2 мм, затем обрабатывают коллагеназой и гиалуронидазой, после этого - диспазой. Моноклеточную суспензию трижды промывают средой Williams'E и подвергают магнитной сепарации по маркеру CD49f. Отсортированные клетки высаживают на культуральные чашки, покрытые коллагеном I типа в среде Williams'E с добавлением 20 нг/мл EGF, 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 10 М инсулина, 10 М дексаметазона, 100 U/мл пенициллина, 100 μU/мл стрептомицина. Клетки в данных условиях имеют склонность терять эпителиальную морфологию и пролиферативную активность. Для предотвращения морфологических изменений и увеличения способности к пассированию, авторы предлагают: (1) сохранять высокую концентрацию клеток при пассировании (не менее 1×10 кл/см), (2) использовать кондиционированную среду при субкультивировании. При соблюдении этих условий клетки проходят не менее 10 пассажей. Клетки слюнной железы при определенных условиях могли быть дифференцированы в (1) нестин- и альбумин-экспрессирующие, (2) инсулин-экспрессирующие и (3) глюкагон-экспрессирующие. Из недостатков указанного способа можно указать следующие: использование среды, содержащей высокие концентрации кальция и сыворотку, приводит к низкому уровню пролиферации эпителиальных клеток слюнной железы и способствуют их дифференцировке. Кроме того, в данной среде происходит пролиферация мезенхимных клеток, которые остаются в первичной культуре в виде примесей. Таким образом, используемые в ближайшем аналоге методы культивирования клеток слюнной железы человека не являются оптимальными и не способствуют проведению большого числа пассажей с сохранением недифференцированного состояния клеток и их высокого пролиферативного потенциала. Данный способ не подходит для получения большой клеточной массы клеток слюнных желез человека.
3
Настоящее изобретение направлено на расширение технических средств культивирования эпителиальных прогениторных клеток больших слюнных желез человека, позволяющего получить культуру пролиферирующих эпителиальных клеток, проходящих более 20-ти пассажей и способных к наращиванию значительного объема клеток (не менее 200 млн на 2-6 пассажах из биоптата размером 0,5-1 см).
Сущность изобретения
[012] Настоящее изобретение относится к способам культивирования эпителиальных прогениторных клеток человека.
[013] В предпочтительных воплощениях, способ включает:
(а) получение эпителиальных прогениторных клеток слюнных желез человека от организма-реципиента;
2
(б) перенос клеток в среду PCT Epidermal Keratinocyte Medium и культивацию в указанной среде в культуральных флаконах, обеспечивающих адгезию клеток, при 37°C в присутствии 5% CO с заменой среды каждые 2-4 суток до достижения клетками монослоя;
(в) пассаж клеток с разведением 1:3-1:5, включающий снятие клеток с поверхности культурального флакона раствором трипсина в ЭДТА и перенос в новые культуральные флаконы;
(г) дальнейшее культивирование клеток как описано в (б) с заменой среды каждые 2-4 сутки в ходе культивирования и пассажами по достижении клетками монослоя как описано в п. (в) с разведением не более 1:2-1:3, где первая замена среды после каждого пассажа производится не позднее чем через 8-24 часа.
В преимущественных воплощениях в данном методе используется среда культивирования, выбранная из группы: PCT Epidermal Keratinocyte Medium CnT-07 (CELLnTEC, Швейцария); Epidermal Keratinocyte Medium CnT-09 (CELLnTEC, Швейцария); Epidermal Keratinocyte Medium CnT-57 (CELLnTEC, Швейцария); CnT-Prime, Epithelial Culture Medium CnT-PR (CELLnTEC, Швейцария); CnT-Prime 2D Diff, Epithelial Culture Medium CnT-PR-D (CELLnTEC, Швейцария); CnT-Prime Calcium Free, Epithelial Culture Medium CnT-PR-CA (CELLnTEC, Швейцария); Gingival Epithelium Progenitors, Pooled HGEPp (CELLnTEC, Швейцария); Gingival Epithelium Progenitors, Single Donor HGEPs (CELLnTEC, Швейцария).
2
[014] В преимущественных воплощениях способа инкубацию клеток по пунктам (б-г) осуществляют также в присутствии 5% O.
2
[015] В некоторых воплощениях сразу после получения клеток проводят их инкубацию в течение 6-48 ч в среде DMEM/F12 1:1, содержащий по крайней мере следующие добавки: глутамин и эмбриональную телячью сыворотку, где инкубация производится при 37°C в присутствии 5% CO. После чего среду меняют на PCT Epidermal Keratinocyte Medium.
[016] В преимущественных воплощениях среда DMEM/F12 1:1 содержит глутамин в конечной концентрации 1-4 мМ и эмбриональную телячью сыворотку в конечной концентрации 5-20%.
[017] В преимущественных воплощениях в среду культивирования DMEM/F12 1:1 также добавляют все или некоторые компоненты, выбранные из группы: инсулин, трансферрин, селенит натрия, эпидермальный фактор роста (EGF).
[018] В некоторых воплощениях в среду культивирования PCT Epidermal Keratinocyte Medium также добавляют все или некоторые компоненты, выбранные из группы: инсулин, трансферрин, селенит натрия, эпидермальный фактор роста.
[019] В некоторых воплощениях инсулин, трансферрин и селенит натрия добавляют в среду культивирования в виде коммерчески доступной добавки ITS (Insulin-Transferrin-Selenium), в других воплощениях - в виде отдельных компонентов.
[020] Технический результат - увеличение числа пассажей эпителиальных прогениторных клеток слюнной железы человека, поддержание их недифференцированного состояния и высокого пролиферативного потенциала в процессе культивирования, достигается за счет оптимизации условий культивирования клеток, использования оптимальной среды культивирования.
Краткое описание фигур
[021] Фигура 1 показывает фотографию клеток слюнной железы человека при культивировании на стандартной ростовой среде DMEM/F12 1:1 (Gibco, США) с добавлением 10% FBS (HyClone, США), 1xITS (Invitrogen, США), +2 мМ глутамина (Invitrogen, США) и 10 нг/мл EGF (Sigma, США), клетки через 2 дня культивирования (0 пассаж).
[022] Фигура 2 показывает фотографию клеток слюнной железы человека при культивировании на стандартной ростовой среде DMEM/F12 1:1 (Gibco, США) с добавлением 10% FBS (HyClone, США), 1xITS (Invitrogen, США), +2 мМ глутамина (Invitrogen, США) и 10 нг/мл EGF (Sigma, США) после 1-го пассажа.
[023] Фигура 3 показывает фотографию клеток слюнной железы человека при культивировании на среде PCT Epidermal Keratinocyte Medium (CELLnTEC, #CnT-07, Швейцария): клетки через 16 часов культивирования (0 пассаж).
[024] Фигура 4 показывает фотографию клеток слюнной железы человека при культивировании на среде PCT Epidermal Keratinocyte Medium (CELLnTEC, #CnT-07, Швейцария): клетки через 1 день культивирования (0 пассаж).
[025] Фигура 5 показывает фотографию клеток слюнной железы человека при культивировании на среде PCT Epidermal Keratinocyte Medium (CELLnTEC, #CnT-07, Швейцария): клетки через 2 дня культивирования (0 пассаж).
[026] Фигура 6 показывает фотографию клеток слюнной железы человека при культивировании на среде PCT Epidermal Keratinocyte Medium (CELLnTEC, #CnT-07, Швейцария): клетки через 3 дня культивирования (0 пассаж).
[027] Фигура 7 показывает фотографию клеток слюнной железы человека при культивировании на среде PCT Epidermal Keratinocyte Medium (CELLnTEC, #CnT-07, Швейцария): клетки через 6 дней культивирования (0 пассаж).
[028] Фигура 8 показывает фотографию клеток слюнной железы человека при культивировании на среде PCT Epidermal Keratinocyte Medium (CELLnTEC, #CnT-07, Швейцария): клетки через 7 дней культивирования (1 пассаж).
[029] Фигура 9 показывает фотографию клеток слюнной железы человека при культивировании на среде PCT Epidermal Keratinocyte Medium (CELLnTEC, #CnT-07, Швейцария): клетки через 10 дней культивирования (3 пассаж).
[030] Фигура 10 показывает фотографию клеток слюнной железы человека при культивировании на среде PCT Epidermal Keratinocyte Medium (CELLnTEC, #CnT-07, Швейцария): клетки через 13 дней культивирования (3 пассаж).
[031] Фигура 11 показывает фотографию клеток слюнной железы человека при культивировании на среде PCT Epidermal Keratinocyte Medium (CELLnTEC, #CnT-07, Швейцария) в присутствии 1xITS (Invitrogen, США), 10 нг/мл EGF (Sigma, США): клетки через 16 часов культивирования (0 пассаж).
[032] Фигура 12 показывает фотографию клеток слюнной железы человека при культивировании на среде PCT Epidermal Keratinocyte Medium (CELLnTEC, #CnT-07, Швейцария) в присутствии 1xITS (Invitrogen, США), 10 нг/мл EGF (Sigma, США): клетки через 1 день культивирования (0 пассаж).
[033] Фигура 13 показывает фотографию клеток слюнной железы человека при культивировании на среде PCT Epidermal Keratinocyte Medium (CELLnTEC, #CnT-07, Швейцария) в присутствии 1xITS (Invitrogen, США), 10 нг/мл EGF (Sigma, США): клетки через 2 дня культивирования (0 пассаж).
[034] Фигура 14 показывает фотографию клеток слюнной железы человека при культивировании на среде PCT Epidermal Keratinocyte Medium (CELLnTEC, #CnT-07, Швейцария) в присутствии 1xITS (Invitrogen, США), 10 нг/мл EGF (Sigma, США): клетки через 3 дня культивирования (0 пассаж).
[035] Фигура 15 показывает фотографию клеток слюнной железы человека при культивировании на среде PCT Epidermal Keratinocyte Medium (CELLnTEC, #CnT-07, Швейцария) в присутствии 1xITS (Invitrogen, США), 10 нг/мл EGF (Sigma, США): клетки через 6 дней культивирования (0 пассаж).
[036] Фигура 16 показывает фотографию клеток слюнной железы человека при культивировании на среде PCT Epidermal Keratinocyte Medium (CELLnTEC, #CnT-07, Швейцария) в присутствии 1xITS (Invitrogen, США), 10 нг/мл EGF (Sigma, США): клетки через 7 дней культивирования (1 пассаж).
[037] Фигура 17 показывает фотографию клеток слюнной железы человека при культивировании на среде PCT Epidermal Keratinocyte Medium (CELLnTEC, #CnT-07, Швейцария) в присутствии 1xITS (Invitrogen, США), 10 нг/мл EGF (Sigma, США): клетки через 10 дней культивирования (4 пассаж).
[038] Фигура 18 показывает фотографию клеток слюнной железы человека при культивировании на среде PCT Epidermal Keratinocyte Medium (CELLnTEC, #CnT-07, Швейцария) в присутствии 1xITS (Invitrogen, США), 10 нг/мл EGF (Sigma, США): клетки через 13 дней культивирования (4 пассаж).
[039] Фигура 19 показывает фотографию клеток слюнной железы человека при культивировании на среде PCT Epidermal Keratinocyte Medium (CELLnTEC, #CnT-07, Швейцария) в присутствии 1xITS (Invitrogen, США), 10 нг/мл EGF (Sigma, США): клетки через 21 день культивирования (4 пассаж).
[040] Фигура 20 показывает фотографию клеток слюнной железы человека при культивировании на среде PCT Epidermal Keratinocyte Medium (CELLnTEC, #CnT-07, Швейцария) в присутствии 1xITS (Invitrogen, США), 10 нг/мл EGF (Sigma, США): клетки через 21 день культивирования (4 пассаж).
[041] Фигура 21 показывает фотографию клеток слюнной железы человека через 5 дней после выделения при культивировании на среде DMEM/F12 1:1 (Gibco, США) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (HyClone, США), 2 мМ глутамина (Invitrogen, США), 1xITS (Invitrogen, США), 10 нг/мл EGF (Sigma, США) (0 пассаж).
[042] Фигура 22 показывает фотографию клеток слюнной железы человека через 5 дней после выделения при культивировании первые 3 дня на среде DMEM/F12 1:1 (Gibco, США) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (HyClone, США), 2 мМ глутамина (Invitrogen, США), 1xITS (Invitrogen, США), 10 нг/мл EGF (Sigma, США), следующие 2 дня культивировали на среде PCT Epidermal Keratinocyte Medium (CELLnTEC, #CnT-07, Швейцария) в присутствии 1xITS (Invitrogen, США), 10 нг/мл EGF (Sigma, США) (0 пассаж).
[043] Фигура 23 показывает фотографию клеток слюнной железы человека через 10 дней после выделения при культивировании первые 2 дня на среде DMEM/F12 1:1 (Gibco, США) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (HyClone, США), 2 мМ глутамина (Invitrogen, США), 1xITS (Invitrogen, США), 10 нг/мл EGF (Sigma, США), следующие 8 дней культивировали на среде PCT Epidermal Keratinocyte Medium (CELLnTEC, #CnT-07, Швейцария) в присутствии 1xITS (Invitrogen, США), 10 нг/мл EGF (Sigma, США) (0 пассаж).
[044] Фигура 24 показывает фотографию клеток слюнной железы человека через 10 дней после выделения при культивировании на среде PCT Epidermal Keratinocyte Medium (CELLnTEC, #CnT-07, Швейцария) в присутствии 1xITS (Invitrogen, США), 10 нг/мл EGF (Sigma, США) (0 пассаж).
[045] Фигура 25 показывает фотографию клеток слюнной железы человека после магнитной селекции по маркеру EpCAM: клетки через 5 дней после селекции по маркеру EpCAM (2 пассаж).
[046] Фигура 26 показывает фотографию клеток слюнной железы человека после магнитной селекции по маркеру EpCAM: селектированные по EpCAM клетки через 7 дней культивирования после 3-го пассажа.
[047] Фигура 27 показывает фотографию клеток слюнной железы человека при длительном культивировании на среде PCT Epidermal Keratinocyte Medium (CELLnTEC, #CnT-07, Швейцария) в присутствии 1xITS (Invitrogen, США), 10 нг/мл EGF (Sigma, США): клетки через 5 дней после 4-го пассажа.
[048] Фигура 28 показывает фотографию клеток слюнной железы человека при длительном культивировании на среде PCT Epidermal Keratinocyte Medium (CELLnTEC, #CnT-07, Швейцария) в присутствии 1xITS (Invitrogen, США), 10 нг/мл EGF (Sigma, США): клетки через 5 дней после 20-го пассажа.
[049] Фигура 29 показывает кариотип метафазной пластинки клеток слюнной железы человека на 5 пассаже (G-бендинг).
[050] Фигура 30 показывает фотографию клеток слюнной железы человека после иммуноцитохимического окрашивания антителами к цитокератину 8 (1 пассаж). Окрашены ядра клеток (краситель DAPI) и цитокератин в цитоплазме (Alexa Fluor 488).
[051] Фигура 31 показывает фотографию клеток слюнной железы человека после иммуноцитохимического окрашивания антителами к цитокератину 14 (1 пассаж). Окрашены ядра клеток (краситель DAPI) и цитокератин в цитоплазме (Alexa Fluor 488).
[052] Фигура 32 показывает фотографию клеток слюнной железы человека после иммуноцитохимического окрашивания антителами к цитокератину 18 (1 пассаж). Окрашены ядра клеток (краситель DAPI) и цитокератин в цитоплазме (Alexa Fluor 488).
[053] Фигура 33 показывает фотографию клеток слюнной железы человека после иммуноцитохимического окрашивания антителами к цитокератину 19 (1 пассаж). Окрашены ядра клеток (краситель DAPI) и цитокератин в цитоплазме (Alexa Fluor 488).
[054] Фигура 34 показывает фотографию клеток слюнной железы человека после иммуноцитохимического окрашивания антителами к маркеру прогениторных клеток GRP 49 (1 пассаж). Окрашены ядра клеток (краситель DAPI) и маркер в цитоплазме (Alexa Fluor 488).
[055] Фигура 35 показывает фотографию клеток слюнной железы человека после иммуноцитохимического окрашивания антителами к маркеру прогениторных клеток EpCAM (1 пассаж). Окрашены ядра клеток (краситель DAPI) и маркер в цитоплазме (Alexa Fluor 488).
[056] Фигура 36 показывает фотографию клеток слюнной железы человека после иммуноцитохимического окрашивания антителами к маркеру прогениторных клеток AFP (1 пассаж). Окрашены ядра клеток (краситель DAPI) и маркер в цитоплазме (Alexa Fluor 488).
[057] Фигура 37 показывает фотографию клеток слюнной железы человека после иммуноцитохимического окрашивания антителами к поверхностному маркеру CD49f (1 пассаж). Окрашены ядра клеток (краситель DAPI) и маркер в цитоплазме (Alexa Fluor 488).
[058] Фигура 38 показывает фотографию клеток слюнной железы человека после иммуноцитохимического окрашивания антителами к поверхностному маркеру c-Met (1 пассаж). Окрашены ядра клеток (краситель DAPI) и маркер в цитоплазме (Alexa Fluor 488).
Подробное описание изобретения
[059] Как указано выше, настоящее изобретение направлено на способы культивирования эпителиальных прогениторных клеток человека. Способы настоящего изобретения включают получение эпителиальных прогениторных клеток слюнных желез человека от организма-реципиента и их культивирование при условиях, позволяющих достичь увеличения числа пассажей, поддержания недифференцированного состояния клеток и их высокого пролиферативного потенциала в процессе культивирования с целью наращивания большой клеточной массы из небольшого биоптата.
Определения
[060] Различные термины, относящиеся к биологическим молекулам настоящего изобретения, используются выше и также в описании и в формуле изобретения.
[061] Термин «маркер» или «биомаркер» относится к белку или мРНК, которые присутствуют в определенном типе клеток и отличает его от другого типа клеток. Так для клеток, относящихся к настоящему изобретению, характерен определенный набор маркеров.
[062] Термины «прогениторный» или «недифференцированный» или подобный по отношению к клеткам обозначают стволовые клетки, детерминированные на дифференцировку в определенные типы клеток (однако не терминально дифференцированные). Прогениторные клетки обладают высоким пролиферативным потенциалом при культивировании in vitro и имеют биомаркеры, которые позволяют отличить их от клеток других типов.
[063] Используются прогениторные эпителиальные клетки из больших слюнных желез человека, селекция которых может быть проведена по следующим маркерам: EpCAM (NCBI Gene ID: 4072), c-Kit (NCBI Gene ID: 3815), CD49f (NCBI Gene ID: 3655), LGR5 (NCBI Gene ID: 8549).
[064] Термин «дифферон» означает совокупность клеточных форм, составляющих ту или иную линию дифференцировки, включающую несколько различных типов популяций клеток, например, (стволовые клетки, делящиеся клетки, простые транзитные клетки), т.е. гистогенетический ряд.
[065] Термин «эпителиальный» по отношению к клеткам обозначает клетки, полученные из эпителиальных тканей (эпителия) - совокупности дифферонов полярно дифференцированных клеток, тесно расположенных в виде пласта на базальной мембране, на границе с внешней или внутренней средой, а также образующих большинство желез организма. Различают две группы эпителиальных тканей: поверхностные эпителии (покровные и выстилающие) и железистый эпителий, составляющий основную ткань большинства желез.
[066] Термин «мезенхимный» обозначает тип клеток мезодермального происхождения, экспрессирующих по крайней мере следующие маркеры: CD29, CD44, CD73, CD90, CD105, а также способных при определенных условиях культивирования к адипогенной, хондрогенной и остеогенной дифференцировкам in vitro.
[067] Термин «иммортализованный» обозначает клеточные линии, которые способны к неограниченному количеству клеточных делений при культивировании in vitro, как правило, за счет активации теломеразы. Профиль экспрессии генов иммортализованных клеток отличается от профиля экспрессии неиммортализованных клеток.
[068] Термин «пассаж» или «пассирование» обозначает процедуру снятия адгезивных клеточных культур с культуральной посуды (как правило, с применением протеолитических ферментов), перевод клеток в суспензионное состояние для переноса их в новую культуральную посуду с последующим культивированием до образования адгезивной культуры. В терминах настоящего изобретения «нулевой («0») пассаж» в отношении клеточной культуры означает период инкубации до первого пассажа, «1 пассаж» - период инкубации после 1-го пассажа и до второго пассажа и т.д.
[069] Термин «адгезивная культура» относится к клеткам, которые находятся в прикрепленном к поверхности состоянии.
[070] Термин «биоптат» обозначает биологический материал, полученный путем биопсии от организма донора.
[071] Термин «культивирование» обозначает совокупность методов и протоколов, посредством которых поддерживают жизнеспособность и пролиферативные свойства клеток in vitro.
[072] Культивирование клеток осуществляется в культуральной среде. Культуральная среда - это питательная среда, обычно содержащая композицию незаменимых аминокислот, солей, витаминов, минералов, микроэлементов, Сахаров, липидов и нуклеотидов. Среда культивирования обеспечивает клетки компонентами, необходимыми для удовлетворения потребностей в питании и росте клеток. Для различных типов клеток, клеток и клеточных культур различной плотности используют среды, отличающиеся составом питательных веществ, pH и осмолярностью. В литературе описаны многочисленные культуральные среды. Многие среды коммерчески доступны, их идентификация проводится по названию и в ряде случаев каталожному номеру среды.
[073] Среды культивирования могут быть дополнены любыми компонентами, необходимыми, чтобы поддержать нужную клетку или культуру клеток. Например, в среду могут быть добавлены стимуляторы роста или ингибиторы роста клеток, гормоны, сыворотка крови млекопитающих, содержащая факторы роста, альбумин, глобулины и другие компоненты.
Получение эпителиальных прогениторных клеток из слюнной железы
[074] Биоптат из слюнной железы получают с помощью биопсии или хирургической операции способами хорошо известными из уровня техники. В преимущественных воплощениях забор клеток и/или тканей при биопсии осуществляется прижизненно. Если дальнейшее использование клеток предполагает медицинские цели, то донор тканевого материала не должен нести инфекционных заболеваний (ВИЧ, гепатиты B и C, сифилис), а также не должен иметь онкологических заболеваний.
[075] Биоптат сразу после забора переносят в стерильных условиях в чашку Петри, содержащую культуральную среду или изотонический раствор и антибиотик. Например, для нужд настоящего изобретения могут быть использованы культуральные среды DMEM/F12 1:1, 199, DMEM, ИГЛА, Alpha-MEM, Ham, F12, IMDM, RPMI-1640 и др., или изотонические растворы: фосфатно-солевой буфер, раствор Хенкса, физиологический раствор, раствор Версена и т.д. Составы изотонических растворов хорошо известны исследователям в данной области. В качестве антибиотика используют гентамицин в конечной концентрации 1-100 мкг/мл, например, в конечной концентрации 40 мкг/мл, или другие антибиотики: пенициллин в конечной концентрации 5-200 ед/мл, например, в конечной концентрации 50 ед/мл, стрептомицин в конечной концентрации 5-200 мкг/мл, например, в конечной концентрации 50 мкг/мл.
[076] Из уровня техники известно, что различия в условиях выделения клеток не оказывают существенного воздействия на качество дальнейшего культивирования.
[077] Изотонические растворы - растворы, обеспечивающие следующие свойства: pH: от 7,3 до 7,7; осмолярность: 280+/-20 мосмоль/кг; буферная емкость: не менее 1,4 мл.
3
3
[078] Все дальнейшие манипуляции проводят в стерильных условиях, отвечающих требованиям GMP (Good Manufacturing Practice). Эпителиальную ткань слюнной железы механически измельчают стерильными инструментами (скальпелем, пинцетами и др.) до небольших кусочков, например размером около от 0,5 до 10 мм, чаще размером 1-5 мм. Затем кусочки ткани дважды промывают изотоническим раствором (например, фосфатно-солевым буфером, Версеном, физиологическим раствором, раствором Хенкса, 7,5% раствором бикарбоната натрия и т.д.), осаждают центрифугированием, инкубируют с 0,1-10 мг/мл коллагеназы IV типа (оптимально 2 мг/мл коллагеназы) в среде DMEM/F12 1:1 с 1-4 мМ глутамина 20-60 минут при 37°C. После этого суспензию клеток пропускают через нейлоновый фильтр с диаметром пор 40-100 мкм и осаждают клетки центрифугированием.
[079] Способы центрифугирования клеток хорошо известны из уровня техники, например, используется центрифугирование в течение 5-15 минут при 100-400 g.
[080] Далее проводят отбор популяции клеток, обогащенных эпителиальными прогениторными клетками. Для этого могут быть использованы различные методики, известные из уровня техники. Например, клетки могут быть отсортированы по маркеру EpCAM (а также по маркерам с-Kit, CD49f, LGR5) с помощью магнитной селекции или флуоресцентной селекции.
6
[081] Например, клетки могут быть получены с помощью магнитной сепарации. Для этого суспензию клеток инкубируют с антителами anti-human EpCAM, коньюгированными с магнитными частицами. Манипуляции проводят по инструкциям производителя антител. Например, инкубацию проводят при температуре около 4°C (на льду) в течение 10-60 мин, как правило, 15-40 мин, используя антитела из расчета 0,1-10 мкг антитела на 10 клеток. Отсортированные клетки осаждают центрифугированием и ресуспендируют в культуральной ростовой среде, промывают фосфатно-солевым буфером и проводят магнитную сепарацию на колонках по инструкциям производителя.
Культивирование эпителиальных прогениторных клеток из слюнной железы
[082] Культивирование клеток осуществляют в специализированных стерильных культуральных флаконах, способных обеспечить адгезию клеток. В преимущественных воплощениях используются пластиковые флаконы. Как правило, для повышения адгезивной способности внутреннюю поверхность флакона покрывают биосовместимым матриксом, например, коллагеном I типа, коллагеном IV типа, фибронектином, или ламинином.
[083] Как правило, используют коммерчески доступные флаконы для культивации.
2
[084] Полученные, клетки переносят в культуральную среду PCT Epidermal Keratinocyte Medium и культивируют в культуральных флаконах при 37°C в присутствии 5% CO с заменой среды каждые 2-4 суток до достижения клетками монослоя.
[085] В некоторых воплощениях клетки сперва переносят в среду DMEM/F12 1:1, содержащую, по крайней мере, следующие добавки: глутамин и эмбриональную телячью сыворотку. В преимущественных воплощениях конечная концентрация глутамина в среде составляет 1-4 мМ, чаще 1,5-3 мМ, например, 2 мМ. В преимущественных воплощениях конечная концентрация эмбриональной телячьей сыворотки составляет 2-25%, чаще 5-20%, как правило 8-12%, например, 10%. В указанных воплощениях клети культивируют в среде DMEM/F12 не более 24 часов, чаще не более 18 часов, как правило 10-17 часов, после чего заменяют среду культивирования на PCT Epidermal Keratinocyte Medium.
В преимущественных воплощениях в данном методе используется среда культивирования, выбранная из группы: PCT Epidermal Keratinocyte Medium CnT-07 (CELLnTEC, Швейцария); Epidermal Keratinocyte Medium CnT-09 (CELLnTEC, Швейцария); Epidermal Keratinocyte Medium CnT-57 (CELLnTEC, Швейцария); CnT-Prime, Epithelial Culture Medium CnT-PR (CELLnTEC, Швейцария); CnT-Prime 2D Diff, Epithelial Culture Medium CnT-PR-D (CELLnTEC, Швейцария); CnT-Prime Calcium Free, Epithelial Culture Medium CnT-PR-CA (CELLnTEC, Швейцария); Gingival Epithelium Progenitors, Pooled HGEPp (CELLnTEC, Швейцария); Gingival Epithelium Progenitors, Single Donor HGEPs (CELLnTEC, Швейцария), например используется среда PCT Epidermal Keratinocyte Medium CnT-07.
2
2
[086] Культивация в присутствии 5% CO осуществляется в специализированном инкубаторе, поддерживающим постоянный газовый состав (95% воздух и 5% CO), постоянный температурный режим 37°C и влажность 95-100%.
2
[087] Для уменьшения гибели клеток в процессе процедуры пассирования, культивирование осуществляется также в присутствии 5% O.
[088] Для повышения митотической активности и сохранения клеток в недифференцированном состоянии, в среды культивирования DMEM/F12 и/или PCT Epidermal Keratinocyte Medium могут быть добавлены все или некоторые добавки, выбранные из группы: инсулин, трансферрин, селенит натрия, эпидермальный фактор роста. Использование этих добавок приводит к увеличению числа пассажей, которые клетки могут пройти до деградации культуры, и к увеличению темпов пролиферации клеток.
[089] Инсулин, трансферрин и/или селенит натрия добавляют в среду культивирования в конечной концентрации не боле 30 мкг/мл, чаще не более 20 мкг/мл, как правило, не более 10 мкг/мл, например, 5-7 мкг/мл. В некоторых воплощениях инсулин, трансферрин и селенит натрия добавляют в среду культивирования в виде коммерчески доступной добавки ITS (Insulin-Transferrin-Selenium), в других воплощениях - в виде отдельных компонентов.
[090] EGF добавляют в среду культивирования в конечной концентрации не более 200 нг/мл, чаще не более 100 нг/мл, как правило, не более 50 нг/мл, например, 10 нг/мл.
[091] Процесс пассирования клеток осуществляют с целью обеспечения клеточной пролиферации при достижении клетками конфлюэнтного монослоя. Для пассирования из культурального флакона удаляют среду культивирования, промывают флакон с клетками изотоническим раствором для удаления остатков среды культивирования. Удаляют изотонический раствор, добавляют в культуральный флакон 0,05-0,25% раствор трипсина в ЭДТА в количестве 0,5-5 мл. Клетки с раствором трипсина инкубируют при 37°C, контролирую переход клеток в суспензионное состояние визуальным осмотром и осмотром под микроскопом. После того, как все клетки открепляются от пластика, суспензию клеток осаждают центрифугированием.
2
2
[092] Удаляют супернатант, клетки ресуспендируют в свежей культуральной среде и рассаживают в новые стерильные культуральные флаконы, способные обеспечить адгезию клеток. Клетки рассаживают из расчета 1-50 тыс клеток на 1 см площади культурального флакона, например, 5 тыс клеток на 1 см площади культурального флакона. Инкубируют клетки в среде культивирования в тех же условиях, что были описаны выше для первого пассажа.
[093] В некоторых воплощениях промывку культуральных флаконов изотоническим раствором проводят дважды, для лучшего удаления остатков среды культивирования.
[094] В преимущественных воплощениях через 8-24 часа после процедуры пассирования меняют среду культивирования на свежую для удаления мертвых клеток. Мертвые клетки после пассирования не прикрепляются и остаются в среде культивирования. Содержимое мертвых клеток, выделяемое в среду культивирования, может способствовать спонтанной дифференцировке клеток слюнной железы человека.
[095] В дальнейшем в ходе культивирования осуществляют замену среды каждые 2-4 суток и пассажи с разведением клеток не более 1:2-1:3.
3
[096] Методы настоящего изобретения обеспечивают получение биомассы из небольших биоптатов, например, из биоптатов размером от 0.5 см. Объем полученной биомассы составляет к моменту достижения клетками монослоя не менее 15 млн клеток, например, около 20-30 млн клеток. Через 7-10 суток после первого пассажа получают не менее 40 млн клеток, например, около 60-90 млн клеток. Через 7-10 суток после второго пассажа получают не менее 100 млн клеток, например, 120-180 млн клеток. Через 7-10 суток после третьего пассажа получают не менее 200 млн клеток, например, 240-360 млн клеток, что достаточно для трансплантации клеток при их использовании в целях клеточной терапии.
[097] Подсчет клеток осуществляется с помощью методов, известных специалистам в данной области. Например, количество клеток можно оценить с помощью проточной цитометрии с использованием стандартных антител к специфическим маркерам на поверхности клеток, на клеточном счетчике, в камере Горяева или клеточном сортере.
[098] Клетки, полученные с помощью методов настоящего изобретения, способны проходить более 3 пассажей, чаще более 10 пассажей, как правило, более 15 пассажей, обычно более 20 пассажей.
[099] Культура клеток, полученная методами настоящего изобретения, является преимущественно гомогенной, то есть она содержит не менее 70% прогениторных эпителиальных клеток, чаще не менее 75% прогениторных эпителиальных клеток, как правило, 80% или более прогениторных эпителиальных клеток, например, 90% или более прогениторных эпителиальных клеток. Для нужд настоящего изобретения прогениторные эпителиальные клетки могут быть выявлены в культуре с помощью методов иммуноокрашивания или ПЦР на один или несколько маркеров, выбранных из группы: EpCAM, AFP, CD49f, CK19, GRP 49, c-Met.
[0100] Культура клеток, полученная методами настоящего изобретения, может содержать клетки, экспрессирующие маркер CD90, в количестве не более 3%, чаще не более 1,5%. Например, менее 0,5%. Культура клеток, полученная методами настоящего изобретения, может содержать клетки, экспрессирующие маркер CD45, в количестве не более 0,5%, чаще не более 0,2%. Например, менее 0,1%.
[0101] Культура клеток, полученная методами настоящего изобретения, способна к пролиферации. Уровень пролиферации клеток можно, например, оценить визуально с помощью световой микроскопии по количеству метафаз в поле зрения микроскопа и по фенотипу клеток. В частности, в активно пролиферирующей культуре количество клеток в состоянии митоза составляет не менее 3-5%. В случае если произошла спонтанная дифференцировка культуры, количество клеток в состоянии митоза падает ниже 3-5%. Кроме того, недифференцированные активно пролиферирующие клетки имеют небольшие размеры (10-30 мкм), высокое ядерно-цитоплазматическое соотношение, полигональную форму, мало отростков, формируют эпителиальный пласт по типу булыжной мостовой. При спонтанной дифференцировке клетки приобретают большие размеры (более 50 мкм), зачастую теряют контакты между собой, приобретают множество отростков, имеют низкое ядерно-цитоплазматическое соотношение и гранулярную цитоплазму. Часто такие клетки имеют много ядер.
[0102] Скорость пролиферации можно также оценить по скорости достижения клетками конфлюэнтного монослоя. Скорость достижения клетками конфлюэнтного монослоя зависит от исходного разведения клеток, но у активно пролиферирующих клеток она выше, чем у дифференцированных. Например, при разведении клеток 1:3 скорость достижения клетками конфлюэнтного монослоя составляет не более 15 суток, как правило 7-10 суток. У дифференцированной культуры клетки достигают конфлюэнтного монослоя очень медленно (более 15 суток) или не достигают совсем.
[0103] Как здесь используется термин «конфлюэнтный монослой» означает монослой, при котором клетки покрывают более 97% поверхности культурального флакона.
Использование клеток
[0104] Полученные в настоящем изобретении клетки представляют собой активно пролиферирующую культуру эпителиальных клеток, способных проходить большое количество пассажей. Данные клетки находят применение в качестве модельных объектов для изучения in vitro процессов мутагенеза и полиплоидизации, спонтанной дифференцировки и клеточной гибели, анализа стабильности хромосомного аппарата при различных условиях.
[0105] Клетки, полученные способом настоящего изобретения, могут быть использованы для исследований биохимических и молекулярных механизмов пролиферации и дифференцировки клеток, межклеточных взаимодействий, онкотрансформации, экспрессии цитокинов, анализа цитотоксичности различных веществ и др. Поскольку полученные в изобретении клетки являются не модифицированными клетками организма, с их помощью можно изучать генетическую экспрессию, сигнальные пути, осуществляющиеся при естественных биологических процессах. Таким образом, эти клетки могут быть моделью для изучения механизмов дифференцировки эпителия, развития эпителиальных структур желез и сохранения целостности эпителиального пласта, исследований межклеточных контактов. При сокультивировании данных клеток с другими типами клеток, можно изучать межклеточные взаимодействия, влияние клеток друг на друга, паракринный и аутокринный эффекты, взаимную индукцию клеток. Поскольку данные клетки можно вырастить в больших количествах, на них можно тестировать различные вещества, например, для исследования их эффектов на биологические процессы (пролиферацию, апоптоз, дифференцировку), а также для оценки их влияния на жизнеспособность клеток, для анализа безопасности фармакологических препаратов, для разработки различных протоколов клеточной дифференцировки.
[0106] Клетки, полученные методами настоящего изобретения, могут быть использованы для аутологичной или аллогенной пересадки в целях клеточной терапии. В случаях радиационного облучения головы и шеи (например, при лучевой терапии), а также резекции части слюнных желез, возникает недостаточность слюнных желез, вызванная гибелью (отсутствием) эпителиальных клеток. Данный синдром сопровождается ксеростомией. В этом случае культивированные in vitro клетки (как аллогенные, так и аутологичные) могут быть пересажены пациенту для восполнения функций слюнных желез. Кроме того, данные клетки могут быть пересажены в другие эпителиальные органы для стимуляции их регенерации. При генетических дефектах, культивированные in vitro аллогенные клетки могут быть пересажены пациенту для восполнения функций дефектного гена.
Экспериментальная часть
[0107] Пример 1. Подбор оптимальной среды культивирования эпителиальных клеток слюнной железы человека
3
[0108] Биоптат был получен из поднижнечелюстной слюнной железы от донора мужского пола 37 лет. Материал был получен в ходе плановой операции по удалению части слюнной железы вследствие слюннокаменной болезни. Объем железистой ткани биоптата составил от 2 см.
[0109] Биоптат перенесли в стерильных условиях в чашку Петри со средой DMEM/F12 1:1 (Gibco, США) и гентамицином 40 мкг/мл (ПанЭко, Россия). Все дальнейшие манипуляции проводили в стерильных условиях, отвечающих требованиям GMP.
3
[0110] Эпителиальную ткань слюнной железы отделяли от жировой и мезенхимной тканей стерильными инструментами под бинокуляром и измельчали скальпелем до небольших кусочков (размером примерно 1-5 мм).
[0111] Затем кусочки ткани дважды промывали фосфатно-солевым буфером, осаждали центрифугированием в течение 10 минут при 1,5 тыс. об/мин, инкубировали 30-60 минут при 37°C в присутствии 2 мг/мл раствора коллагеназы IV типа (Gibco, США) в среде DMEM/F12 1:1 (Gibco, США) с 2 мМ глутамином (Invitrogen, США). Каждые 10-15 минут пробирки с кусочками слюнной железы активно встряхивали.
[0112] После инкубации к клеткам добавляли 10 мл среды DMEM/F12 1:1 (Gibco, США), активно пипетировали в течение 5 минут, затем пропускали через нейлоновый фильтр с диаметром пор 40-100 мкм и осаждали клетки центрифугированием в течение 10 минут при 1,5 тыс. об/мин.
6
[0113] Затем проводили магнитную сепарацию клеток по маркеру EpCAM, для чего суспензию клеток промывали 10 мл фосфатно-солевого буфера, ресуспендировали в 0,5 мл фосфатно-солевого буфера и подсчитывали число клеток на приборе для автоматизированного подсчета клеток (Bio-Rad, США). Далее клетки инкубировали с антителами anti-human EpCAM, коньюгированными с магнитными частицами (Miltenyi Biotec GmbH, Германия), в течение 15-40 минут при +4°C. Антитела добавляли из расчета 0,1-5 мкг на 10 клеток. После инкубации клетки промывали 10 мл фосфатно-солевого буфера и проводили магнитную сепарацию на колонках MiniMACS™ Separator (Miltenyi Biotec GmbH, Германия) по инструкциям производителя. Отсортированные клетки осаждали центрифугированием в течение 7 мин при 200 g.
3
2
2
2
[0114] Далее клетки помещали в стандартную ростовую среду DMEM/F12 1:1 (Gibco, США), содержащую 10% FBS (HyClone, США), 1xITS (Invitrogen, США), +2 мМ глутамина (Invitrogen, США) и 10 нг/мл EGF (Sigma, США) в количестве 5×10 клеток на 1 см и инкубировали в покрытых коллагеном I типа культуральных флаконах при 37°C и 5% CO. Среду культивирования меняли каждые 3 дня. По достижении клетками конфлюэнтного монослоя (обычно на 10-15 день после выделения клеток) клетки пассировали. Для этого удаляли среду культивирования, клетки дважды промывали раствором Версена (ПанЭко, Россия), затем инкубировали 5 минут с 0,05% раствором трипсина в ЭДТА (Gibco, США) в количестве 1 мл на 25 см площади культурального флакона. Затем клетки разводили в соотношении 1:3 и помещали в новые культуральные флаконы, покрытые коллагеном I типа. Пролиферацию и спонтанную дифференцировку клеток оценивали каждый день после выделения клеток: 1) по количеству метафаз в поле зрения микроскопа; 2) по скорости достижения клетками конфлюэнтного монослоя; 3) по фенотипу клеток.
[0115] Было показано, что при культивировании в стандартной ростовой среде DMEM/F12 с вышеуказанными добавками, происходит снижение уровня клеточной пролиферации и усиление клеточной дифференцировки. На первом пассаже клетки не достигают монослоя, приобретают большие размеры, содержат множество гранул, полиплоидизируются, зачастую содержат несколько ядер (фиг. 1-2). Дальнейшее наращивание клеточной массы становится невозможным.
[0116] Для оптимизации условий культивирования эпителиальных прогениторных клеток слюнной железы человека были протестированы другие среды культивирования:
[0117] PCT Epidermal Keratinocyte Medium (1Х, liquid), (CELLnTEC, Швейцария), #CnT-07;
[0118] PCT Epidermal Keratinocyte Medium (1X, liquid), (CELLnTEC, Швейцария), #CnT-07 с добавками: 1xITS (Invitrogen, США) и 10 нг/мл EGF (Sigma, США).
3
2
[0119] Клетки, полученные как описано выше, были посажены на покрытые коллагеном I типа культуральные флаконы (0 пассаж, 2 день после выделения) в количестве 5×10 кл/см в стандартной ростовой среде. На следующий день была произведена смена среды на тестируемую. День смены среды считали нулевым днем эксперимента.
[0120] Во всех случаях клетки культивировали как описано выше, отслеживая их фенотип, способность к пролиферации и число проходимых пассажей.
[0121] При культивировании на среде PCT Epidermal Keratinocyte Medium (CELLnTEC, Швейцария), клетки теряли способность формировать типичный эпителиальный пласт, приобретали «миграционный фенотип» (вид булыжной мостовой), быстро пролиферировали (фиг. 3-8). Большинство клеток сохраняли маленькие размеры и недифференцированный фенотип. Часть клеток имела большие размеры, низкое ядерно-цитоплазматическое соотношение, множество гранул. В течение 6-ти дней клетки достигли монослоя. Данная среда хорошо поддерживает состояние монослойной культуры, при длительном инкубировании клеток в состоянии монослоя возможно формирование многослойных структур. При дальнейшем пассировании клетки хорошо адгезировались к покрытому коллагеном I типа пластику, клеточной гибели практически не наблюдалось.
[0122] Клетки успешно пассировали в течение 3-х пассажей на среде PCT Epidermal Keratinocyte Medium (CELLnTEC, Швейцария) без значительной потери темпов пролиферации (фиг. 9-10). На 3-м пассаже наблюдали кластеры мелких активно пролиферирующих клеток. В культуре также присутствовали крупные клетки с множеством гранул и низким ядерно-цитоплазматическим соотношением.
[0123] Таким образом, среда PCT Epidermal Keratinocyte Medium (CELLnTEC, Швейцария) способна поддерживать высокие темпы пролиферации и мало дифференцированный фенотип культивируемых эпителиальных клеток слюнной железы человека. Данная среда подходит для пассирования эпителиальных клеток слюнной железы человека.
[0124] Основные результаты при культивировании клеток на среде PCT Epidermal Keratinocyte Medium CnT-07 (CELLnTEC, Швейцария) с добавками: 1xITS (Invitrogen, США) и 10 нг/мл EGF (Sigma, США) были аналогичны тем, которые наблюдаются для среды PCT Epidermal Keratinocyte Medium CnT-07 (CELLnTEC, Швейцария) без добавок (фиг. 11-16). Однако при использовании добавок, число клеток в митозе было выше. Помимо этого клетки лучше формировали контакты друг с другом при организации эпителиального пласта. По этой причине культивирование на данной среде вели до 4-го пассажа (фиг. 17-18). На 4-м пассаже часть клеток приобретала крупные размеры (фиг. 20), однако основная популяция клеток сохраняли способность к пролиферации, эпителиальный фенотип и маленькие размеры (фиг. 19). Таким образом, эпителиальные клетки слюнной железы человека способны проходить по крайней мере 4 пассажа без потери способности к пролиферации.
[0125] Таким образом, среда PCT Epidermal Keratinocyte Medium CnT-07 (CELLnTEC, Швейцария) с добавками: 1xITS (Invitrogen, США) и 10 нг/мл EGF (Sigma, США) способна поддерживать высокие темпы пролиферации и мало дифференцированный фенотип культивируемых эпителиальных клеток слюнной железы человека. Данная среда подходит для длительного культивирования эпителиальных прогениторных клеток слюнной железы человека.
[0126] Пример 2. Оптимизация условий культивирования эпителиальных клеток слюнной железы человека
3
[0127] Биоптаты были получены из поднижнечелюстных слюнных желез от доноров мужского пола 50, 51 и 55 лет. Материал был получен в ходе плановых операций по удалению части слюнной железы вследствие слюннокаменной болезни. Объем железистой ткани биоптата составил 2-3 см.
2
[0128] Выделение прогениторных эпителиальных клеток осуществляли как описано в Примере 1. Далее клетки высаживали в пластиковые культуральные флаконы, покрытые коллагеном I типа. Клетки культивировали в стандартных условиях при 37°C и 5% CO, варьируя время культивирования в различных средах:
[0129] В первом варианте, клетки инкубировали в среде DMEM/F12 1:1 (Gibco, США) с добавлением 10% FBS (HyClone, США), 1xITS (Invitrogen, США), 2 мМ глутамина (Invitrogen, США) и 10 нг/мл EGF (Sigma, США) в течение 10 дней. Во втором - первые дни культивировали в среде DMEM/F12 1:1 (Gibco, США) с добавлением 10% FBS (HyClone, США), 1xITS (Invitrogen, США), 2 мМ глутамина (Invitrogen, США) и 10 нг/мл EGF (Sigma, США), а на третий день переводили на среду PCT Epidermal Keratinocyte Medium (CELLnTEC, #CnT-07, Швейцария) с 1xITS (Invitrogen, США), 10 нг/мл EGF (Sigma, США). В третьем варианте перевод на среду PCT Epidermal Keratinocyte Medium (CELLnTEC, #CnT-07, Швейцария) с 1xITS (Invitrogen, США), 10 нг/мл EGF (Sigma, США) осуществляли на второй, в четвертом варианте - на первый день инкубации, а в пятом - клетки сразу инкубировали в среде PCT Epidermal Keratinocyte Medium (CELLnTEC, #CnT-07, Швейцария) с 1xITS (Invitrogen, США), 10 нг/мл EGF (Sigma, США). Нулевым днем всегда считали день выделения клеток.
[0130] Для смены среды из культурального флакона удаляли среду культивирования, промывали флакон с клетками фосфатно-солевым буфером и добавляли в культуральный флакон новую среду.
[0131] При посадке на среду DMEM/F12 1:1 с 10% FBS, 2 мМ глутамина, 1xITS и 10 нг/мл EGF клетки слюнной железы человека стали дифференцироваться практически сразу (фиг. 21). Практически сразу после выделения (в течение 5-ти дней) и прикрепления к субстрату клетки становились крупными, содержали много гранул и плохо пролиферировали. После первого пассажа они так и не достигли монослоя, так как окончательно дифференцировались.
[0132] При переводе клеток на другую среду на 3-й день после выделения (фиг. 22), они успевали дифференцироваться и достигали монослоя позднее, чем клетки, которые перевели на среду PCT Epidermal Keratinocyte Medium (CELLnTEC, #CnT-07, Швейцария) с 1xITS (Invitrogen, США), 10 нг/мл EGF (Sigma, США) на 1-2 день после выделения. Если клетки переводили на среду PCT Epidermal Keratinocyte Medium (CELLnTEC, #CnT-07, Швейцария) с 1xITS (Invitrogen, США), 10 нг/мл EGF (Sigma, США) на 1-2 дни после выделения, плотного монослоя они достигали к 10-му дню (фиг. 23). Если клетки высаживали сразу на среду PCT Epidermal Keratinocyte Medium (CELLnTEC, #CnT-07, Швейцария) с 1xITS (Invitrogen, США), 10 нг/мл EGF (Sigma, США), они достигали монослоя на 1-2 дня позднее (фиг. 24), так как хуже прикреплялись к пластику.
[0133] На 1-м пассаже провели магнитный сортинг клеток, полученных на среде PCT Epidermal Keratinocyte Medium (CELLnTEC, #CnT-07, Швейцария) с 1xITS (Invitrogen, США), 10 нг/мл EGF (Sigma, США), по маркеру адгезии прогениторных эпителиальных клеток EpCAM как описано в Примере 1. Было показано, что около 70% первичной культуры клеток слюнной железы (КСЖ) человека экспрессируют маркер прогениторных эпителиальных клеток EpCAM. После магнитной селекции EpCAM экспрессирует около 95% КСЖ. После селекции культура выглядит гомогенной (фиг. 25) и содержит маленькие по размеру клетки с высоким ядерно-цитоплазматическим соотношением. На следующем пассаже в культуре появляется небольшой процент крупных клеток (фиг. 26). Таким образом, крупные дифференцированные клетки появляются в небольшом количестве в культуре de novo. Однако они не выживают после процедуры пассирования и не мешают культивированию КСЖ.
5
2
[0134] Далее было обнаружено, что КСЖ человека при культивировании на среде PCT Epidermal Keratinocyte Medium (1Х, liquid), (CELLnTEC, Швейцария), #CnT-07 с добавками: 1xITS (Invitrogen, США) и 10 нг/мл EGF (Sigma, США) плохо переносят трипсинизацию и часть клеток гибнет (иногда значительная часть - до 30-40%). С пассажами эта тенденция усиливалась (табл. 1). Для определения количества погибших при трипсинизации клеток, КСЖ снимали с поверхности культурального флакона раствором трипсина, как описано в выше. Затем клетки ресуспендировали в среде PCT Epidermal Keratinocyte Medium (1Х, liquid), (CELLnTEC, Швейцария), #CnT-07 с добавками: 1xITS (Invitrogen, США) и 10 нг/мл EGF (Sigma, США), высаживали в покрытые коллагеном I типа культуральные флаконы в количестве 1,5×10 на 1 см. Долю погибших клеток определяли по подсчету не прикрепившихся клеток в среде культивирования через 15 часов после процедуры пассирования на автоматическом счетчике клеток (BioRad, США).
5
2
2
2
[0135] Было показано, что гибель клеток при трипсинизации возникает из-за того, что среда PCT Epidermal Keratinocyte Medium (1Х, liquid), (CELLnTEC, Швейцария), #CnT-07 с добавками: 1xITS (Invitrogen, США) и 10 нг/мл EGF (Sigma, США) не способна ингибировать трипсин, который препятствует адгезии клеток. Если отмывать клетки от трипсина средой PCT Epidermal Keratinocyte Medium (1Х, liquid), (CELLnTEC, Швейцария), Cnt-07 с добавлением 5% FBS (HyClone, США) - значительной гибели клеток не возникает. Для этого клетки снимали с поверхности культуральных флаконов трипсином, как описано выше. Затем суспензию клеток с трипсином помещали в центрифужные пробирки с двойным объемом среды PCT Epidermal Keratinocyte Medium (1Х, liquid), (CELLnTEC, Швейцария), Cnt-07 с добавлением 5% FBS (HyClone, США) и осаждали центрифугированием 5 минут при 200 g. После этого удаляли супернатант, клетки ресуспендировали в среде PCT Epidermal Keratinocyte Medium (1Х, liquid), (CELLnTEC, Швейцария), #CnT-07 с добавками: 1xITS (Invitrogen, США) и 10 нг/мл EGF (Sigma, США) и высаживали в покрытые коллагеном I типа культуральные флаконы в количестве 1,5×10 на 1 см. Культивировали клетки в CO инкубаторе стандартных условиях при 37°C и 5% CO. Долю погибших клеток определяли по подсчету не прикрепившихся клеток в среде культивирования через 15 часов после процедуры пассирования на автоматическом счетчике клеток (BioRad, США). Однако было показано, что эмбриональная телячья сыворотка (fetal bovine serum - FBS) способствует дифференцировки клеток, они хорошо прикрепляются к пластику, постепенно дифференцируются и перестают пролиферировать (табл. 2).
5
2
2
2
[0136] Было определено, что оптимизированным методом пересадки КСЖ человека является отмывка от трипсина с центрифугированием, а на следующий день - обязательная смена среды. В этом случае гибель клеток от трипсинизации не превышает 30% (обычно около 10%) (табл. 3). Для этого клетки снимали с поверхности культуральных флаконов трипсином, как описано в Примере 2. Затем суспензию клеток с трипсином помещали в центрифужные пробирки с двойным объемом среды PCT Epidermal Keratinocyte Medium (1Х, liquid), (CELLnTEC, Швейцария), #CnT-07 с добавками: 1xITS (Invitrogen, США) и 10 нг/мл EGF (Sigma, США) и осаждали центрифугированием 5 минут при 200 g. После этого удаляли супернатант, клетки ресуспендировали в среде PCT Epidermal Keratinocyte Medium (1Х, liquid), (CELLnTEC, Швейцария), #CnT-07 с добавками: 1xITS (Invitrogen, США) и 10 нг/мл EGF (Sigma, США) и высаживали в покрытые коллагеном I типа культуральные флаконы в количестве 1,5×10 на 1 см. Культивировали клетки в CO инкубаторе стандартных условиях при 37°C и 5% CO. Долю погибших клеток определяли по подсчету не прикрепившихся клеток в среде культивирования через 15 часов после процедуры пассирования на автоматическом счетчике клеток (BioRad, США). Через 16-24 часа после пассирования среду культивирования меняли на свежую. Это способствует удалению из среды погибших клеток, которые выделяют различные факторы и продукты распада, способствующие спонтанной дифференцировке клеток.
2
2
2
2
2
2
5
2
[0137] Также было показано, что если клетки инкубировать в условиях низкого кислорода (то есть, в CO инкубаторе при 37°C, 5% CO и 5% O), то гибель клеток при трипсинизации составляет около 5% (табл. 4). Для этого клетки снимали с поверхности культуральных флаконов трипсином, как описано выше. Затем суспензию клеток с трипсином помещали в центрифужные пробирки с двойным объемом среды PCT Epidermal Keratinocyte Medium (1Х, liquid), (CELLnTEC, Швейцария), #CnT-07 с добавками: 1xITS (Invitrogen, США) и 10 нг/мл EGF (Sigma, США) и осаждали центрифугированием 5 минут при 200 g. После этого удаляли супернатант, клетки ресуспендировали в среде PCT Epidermal Keratinocyte Medium (1Х, liquid), (CELLnTEC, Швейцария), #CnT-07 с добавками: 1xITS (Invitrogen, США) и 10 нг/мл EGF (Sigma, США) и высаживали в покрытые коллагеном I типа культуральные флаконы в количестве 1,5×10 на 1 см. Культивировали клетки в CO инкубаторе при 37°C, 5% CO и 5% O. Долю погибших клеток определяли по подсчету не прикрепившихся клеток в среде культивирования через 15 часов после процедуры пассирования на автоматическом счетчике клеток (BioRad, США). Через 16-24 часа после пассирования среду культивирования меняли на свежую. Это способствует удалению из среды погибших клеток, которые выделяют различные факторы и продукты распада, способствующие спонтанной дифференцировке клеток.
[0138] Содержание клеток в состоянии конфлюэнтного монослоя без пассирования показало, что конфлюэнтный монослой КСЖ человека переносят, но в монослое эти клетки можно оставлять не более 5-7 дней, иначе культура деградирует.
[0139] Был проведен подбор оптимального разведения клеток при пассажах. Наилучший результат был получен при следующем режиме: на нулевом пассаже рекомендовано рассаживать клетки 1:3-1:5, на первом пассаже 1:2-1:3, на втором и последующих пассажах не реже 1:2. КСЖ человека не следует рассаживать реже чем рекомендовано, так как в этом случае они быстро дифференцируются, вся культура перестает пролиферировать и со временем деградирует.
[0140] В оптимальных условиях, описанных выше, клетки не теряли своих свойств и проходили более 20 пассажей (фиг. 27-28). Время удвоения культуры составляло 40±5 часов и было примерно одинаково на разных пассажах. На ранних пассажах в культуре обнаруживались мелкие пролиферирующие клетки и крупные дифференцированные (фиг. 27). Постепенно клетки теряли способность формировать крупные дифференцированные клетки, к 10-му пассажу культура выглядела гомогенной на более чем 95% (фиг. 28).
[0141] Для характеристики полученной культуры были проведены следующие эксперименты:
Был проведен анализ кариотипа клеток. К клеткам в состоянии около 70% конфлуентности в культуральную среду добавляли раствор колцемида (Sigma, США) до конечной концентрации 0,1 мг/мл и инкубировали 40 минут при 37°C. Клетки дважды промывали раствором Версена, снимали с поверхности культурального флакона трипсином в течение 5 минут при 37°C. Клетки осаждали центрифугированием при 200 g в течение 5 минут, осадок ресуспендировали в 10 мл холодного (4°C) гипотонического раствора 0,56% KCl (Sigma, США), инкубировали при комнатной температуре 10 минут, центрифугировали при 200 g в течение 5 минут. Супернатант удаляли, клетки ресуспендировали в остатках супернатанта и капали по каплям в пробирку с 10 мл холодного раствора фиксатора (-20°C), состоящего из смеси метанола (Sigma, США) и уксусной кислоты (Sigma, США) в соотношении 3:1. Инкубировали 10 минут при -20°C. Осаждали при 300 g в течение 10 минут. Затем проводили еще 2 смены фиксатора по 10 минут при -20°C. Клетки ресуспендировали в 300 мкл фиксатора, раскапывали на препаративные стекла с высоты 15 см из расчета 40 мкл на стекло (стекла готовят заранее, перед приготовлением препарата стекла помещают в 40% раствор этанола). Препараты готовили с выжиганием: до того как фиксатор испарится, препараты поджигали до полного выгорания фиксатора. Препараты инкубировали минимум 3 суток при 37°C (или на ночь при 60°C), затем обрабатывали 0,1% раствором трипсина в фосфатно-солевом буфере в течение 10-30 секунд при комнатной температуре, промывали в течение 15 секунд в 1% растворе FBS в фосфатно-солевом буфере и окрашивали раствором красителя Гимза (Sigma, США) в фосфатно-солевом буфере в течение 30 минут. Затем споласкивали дистиллированной водой, высушивали и анализировали под микроскопом с программным обеспечением Lucia Karyo (Laboratory Imaging s.r.o., Польша).
Было показано, что кариотип у культуры КСЖ остается нормальным, 46XY (фиг. 29).
6
[0142] Были исследованы особенности клеточного цикла клеток. Для анализа использовали клетки при конфлуентности 70% в количестве 1-2×10. Клетки снимали с пластика стандартным способом: промывали дважды раствором Версена, инкубировали с трипсином около 5 минут, добиваясь моноклеточной суспензии. Осаждали клетки центрифугированием 5 минут при 200 g в 10 мл фосфатно-солевого буфера. Далее осадок ресуспендировали и фиксировали холодным 70% этанолом в течение 10-30 минут при +4°C. Зафиксированные клетки трижды отмывали от фиксатора центрифугированием 5 минут при 200 g в 10 мл холодного фосфатно-солевого буфера. После чего осадок ресуспендировали в 1 мл фосфатно-солевого буфера, содержащем 40 мкг/мл пропидия иодида (Calbiochem, США) и 0,5 мг/мл рибонуклеазы A (Sigma, США), инкубировали 30 минут при 37°C. После этого клетки промывали фосфатно-солевым буфером, ресуспендировали в 1 мл фосфатно-солевого буфера и анализировали методом проточной цитометрии. Анализ клеточного цикла культивируемых клеток проводили на лазерном проточном цитофлуориметре Cell Lab Quanta SC (Beckman Coulter, США) или аналогичном, оборудованном аргоновым лазером с длинной волны возбуждения 488 нм и мощностью луча 15 мВт. Распределение ДНК по фазам клеточного цикла определяли путем анализа клеток, окрашенных иодидом пропидия, в интегральном канале флуоресценции с использованием барьерных фильтров 488BK, 488BP и 625BP. Для удаления из анализа агрегатов клеток в программу вводили логические ограничения. Полученные гистограммы подвергали математической обработке с использованием программ MultiCycle (Phoenix Flow Systems, США) либо FlowJo (Tree Star, Inc., США). Было показано, что на 1-3 пассажах около 2% клеток в апоптозе, около 9% в митозе, размер клеток около 10-13 мкм; на 20 пассаже около 2% клеток в апоптозе, около 10% в митозе, размер клеток около 10 мкм.
6
[0143] Клетки были проанализированы методом проточной цитометрии на ранних и поздних пассажах. Клетки снимали с пластика стандартным способом: промывали дважды раствором Версена, инкубировали с трипсином около 5 минут, добиваясь моноклеточной суспензии. Осаждали клетки центрифугированием 5 минут при 200 g в 10 мл фосфатно-солевого буфера. Осадок ресуспендировали в фосфатно-солевом буфере с 2% бычьего сывороточного альбумина (Sigma, США). Делили клетки на аликвоты (по 1×10 клеток на одно антитело плюс соответствующие изотип-контроли) и инкубировали с первичными антителами в разведении, рекомендованном производителем (1:500-1:1000) в течение 60 минут при комнатной температуре в темноте. Трижды промывали клетки фосфатно-солевым буфером по 10 минут, осаждали центрифугированием 5 минут при 200 g, затем фиксировали 1% параформальдегидом 5 минут в темноте. Трижды промывали клетки фосфатно-солевым буфером, ресуспендировали в 1 мл фосфатно-солевого буфера и анализировали с помощью проточного цитофлуориметра Cell Lab Quanta™ SC MPL (Beckman Coulter). В качестве контроля использовали соответствующий изотип-контроль, анализировали не менее 10000 клеток на одно антитело.
Методом проточной цитометрии было показано, что полученные клетки на ранних пассажах экспрессируют маркеры прогениторных клеток (EpCAM, GRP 49, CK19, AFP), а также эпителиальных клеток (CD49f). Данные клетки не экспрессируют маркер гемопоэтических клеток CD45 (табл. 5). На поздних пассажах культура становится еще более гомогенной.
[0144] Клетки были проанализированы иммуноцитохимически. Для иммуноцитохимического окрашивания клетки рассаживали на покрытые коллагеном I типа чашки за 48 часов до фиксации. Фиксировали 4% параформальдегидом в течение 10 минут при комнатной температуре, трижды промывали фосфатно-солевым буфером с 0,1% тритоном Х100 и проводили блокировку 1% бычьим сывороточным альбумином (Sigma, США) в фосфатно-солевом буфере в течение 30 минут при комнатной температуре. С первичными антителами инкубировали в фосфатно-солевом буфере 60 минут при 37°C в разведении, рекомендованном производителем (обычно - 1:200-1:500). Отмывали 3 раза по 10 минут фосфатно-солевым буфером при 37°C, после чего инкубировали с вторичными антителами в фосфатно-солевом буфере (разведение 1:1000) в течение 40 минут при 37°C. Снова отмывали 3 раза по 10 минут фосфатно-солевым буфером при 37°C, добавляя во время последней отмывки DAPI (Sigma, США). Анализировали под флуоресцентным микроскопом Olympus IX51 (Olympus, Япония). Список использованных антител представлен в таблице 6.
Методом иммуноцитохимии было показано, что КСЖ человека экспрессируют цитокератины 8, 14, 18 и 19 (фиг. 30-33), что говорит о том, что это эпителиальные клетки. Помимо этого они экспрессируют маркеры прогениторных клеток EpCAM, GRP 49 и AFP (фиг. 34-36), а также субъединицу рецептора к ламинину CD49f и рецептор к HGF c-Met, что говорит о том, что это протоковые клетки слюнной железы (фиг. 37-38).
[0145] Таким образом, представленные данные показывают достижение технического результата - увеличение числа пассажей эпителиальных прогениторных клеток слюнной железы человека, поддержание их недифференцированного состояния и высокого пролиферативного потенциала в процессе культивирования, достигается за счет оптимизации условий культивирования клеток, использования оптимальной среды культивирования.
[0146] Исследования показали, что полученные клетки являются эпителиальными прогениторными клетками слюнной железы человека, имеют нормальный диплоидный кариотип и обладают значительным пролиферативным потенциалом при оптимальных условиях выделения и культивирования.