СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ РЕСПИРАТОНЫХ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ МЕТОДОМ МУЛЬТИПЛЕКСНОЙ ПЦР С ДЕТЕКЦИЕЙ В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ И ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

1. Способ дифференциальной диагностики респираторных вирусных инфекций, характеризующийся выявлением в клинических образцах нуклеиновых кислот основных возбудителей респираторных вирусных инфекций человека - вирусов гриппа А и В, коронавирусов, вирусов парагриппа 1, 2, 3, 4 типов, аденовирусов, респираторно-синцитиального вируса, риновирусов и энтеровирусов в присутствии внутреннего положительного контроля, предусматривающий проведение мультиплексной реакции обратной транскрипции и ПЦР-амплификации с детекцией в режиме реального времени, причем в качестве клинических образцов используют по выбору: мазки из носа, горла, носоглотки, носоглоточные аспираты, назальные смывы, мокроту, бронхоальвеолярный лаваж, секционный материал, образцы культуральной жидкости, отличающийся тем, что для его осуществления используют олигонуклеотиды - SEQ ID NO 1-45, на основе которых готовят смеси праймеров, зондов для проведения ОТ и ПЦР-РВ; затем с использованием подобранных праймеров и зондов формируют реакционные смеси для мультиплексной ПЦР, в которых флуоресцентномеченные зонды распределяют по реакционным смесям таким образом, чтобы в одной смеси находились зонды, меченные разными красителями; затем проводят мультиплексную реакцию обратной транскрипции и мультиплексную ПЦР-РВ (каждый образец анализируется в трех реакционных смесях); наличие в изучаемой пробе нуклеиновых кислот того или иного респираторного вируса определяют ростом сигнала флуоресценции определенного красителя в одной из реакционных смесей; причем при проведении анализа проводят ряд контролей для исключения ложноположительных и ложноотрицательных результатов, для чего формируют пулы положительных контрольных образцов, которые, наряду с ВПК, анализируются при анализе каждой серии образцов, а в состав пулов положительных контролей входят лабораторные штаммы респираторных вирусов, разведенные и смешанные в определенной концентрации так, чтобы в мультиплексной ПЦР-РВ они определялись на 31-33 цикле; в том случае, когда при постановке ПЦР-РВ наблюдается задержка в значениях пороговых циклов ВПК - это указывает на возможное присутствие ингибиторов в пробе, которые снизили чувствительность анализа, или на ошибки при постановке реакции; такой образец анализируют повторно.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что каждый вирусспецифический набор праймеров и зондов может быть использован для выявления в образцах нуклеиновых кислот соответствующих вирусов в моноспецифическом формате, в том числе для выявления аденовирусов - SEQ ID NO 1, 2, 3; коронавирусов SEQ ID NO 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11; энтеровирусов - SEQ ID NO12, 13, 14; вируса гриппа В - SEQ ID NO 18, 19, 20; респираторно-синцитиального вируса - SEQ ID NO 21, 22, 23; вирусов гриппа А - SEQ ID NO 24, 25, 26; риновирусов - SEQ ID NO 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33; вируса парагриппа 1 типа - SEQ ID NO 34, 35, 36; вируса парагриппа 2 типа - SEQ ID NO 37, 38, 39; вируса парагриппа 3 типа - SEQ ID NO 40, 41, 42; вируса парагриппа 4 типа - SEQ ID NO 43, 44, 45.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что для исключения ложноположительных результатов наряду со всеми образцами анализируют отрицательный контрольный образец (ОКО), в качестве которого используют дистиллированную воду.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что на стадии мультиплексной ПЦР с детекцией в режиме реального времени используют следующие олигонуклеотиды (распределенные по трем реакционным смесям): смесь №1: SEQ ID NO 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17; смесь №2: SEQ ID NO, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33; смесь №3: SEQ ID NO 34 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45.
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что анализ предусматривает выявление внутреннего положительного контроля, представленного РНК-содержащим вирусом с целью контроля эффективности и качества выделения нуклеиновых кислот, в том числе наличие в образце ингибиторов реакций обратной транскрипции и ПЦР.
6. Способ по п.3 или 4 отличающийся тем, что при анализе образцов в реакционных смесях №1 и №2, проводят дифференциальное выявление риновирусов и энтеровирусов.
7. Нуклеотидные последовательности праймеров и зондов для мультиплексной ПЦР-РВ
5'-3'
SEQ ID NO 1      CTCCAGCAACTTCATGTCYATGGG
SEQ ID NO 2      CACTCTGACCACGTCGAARACTTC
SEQ ID NO 3      FAM- AGGGTGGGCTCRTCCATGGGRTCCA -BHQ1
SEQ ID NO 4      GTGGCTGGGATGATATGTT
SEQ ID NO 5      TTATGGTGGTTGGAATAATATGTT
SEQ ID NO 6      GCGGGTGGGATAATATGTT
SEQ ID NO 7      TGGCATAGCACGATCACA
SEQ ID NO 8      TGTTAGGCAAAGCTCTATCACA
SEQ ID NO 9      GAGGGCATAGCTCTATCACA
SEQ ID NO 10    ROX- ATGGGTTGGGATTATCCTAAGTGTGAT -BHQ2
SEQ ID NO 11    ROX- ATGGGATGGGACTATCCTAAGTGTGAT -BHQ2
SEQ ID NO 12     CTCCGGCCCCTGAAT
SEQ ID NO 13     RATTGTCACCATAAGCAGCC
SEQ ID NO 14     R6G- CGGAACCGACTACTTTGGGTGTCCG  -BHQ1
SEQ ID NO 15     GTCATCACCCACCGTTGT
SEQ ID NO 16     CCTTCTGGAGGTCCTCCAT
SEQ ID NO 17    Cy-5- AGAGCCCCAGGGTGCCCGAAT -BHQ3
SEQ ID NO 18     GGAATGGGRACAACAGCAAC
SEQ ID NO 19     AGGTACATGACCATGAGACAR
SEQ ID NO 20    FAM- CATGAAGCATTTGAAATAGCAGAAGGC -BHQ-1
SEQ ID NO 21     CAGTCAGTAGTAGACCATGTGAATTC
SEQ ID NO 22     ATATCTTCATCWCCATACTTTTCTGT
SEQ ID NO 23     ROX- GTTCTATAAGCTGGTATTGATGCAGGGA -BHQ2
SEQ ID NO 24     TTCTAACCGAGGTCGAAACG
SEQ ID NO 25     CGTCTACGYTGCAGTCC
SEQ ID NO 26     R6G- TGGCTAAAGACAAGACCAATCCTGTCACC -BHQ-1
SEQ ID NO 27     TGCGTGGCTGCCTGC
SEQ ID NO 28    TGCGTGGCGGCCAAC
SEQ ID NO 29     TGCGTGGCGGCCAGC
SEQ ID NO 30     CTGCGTGGCTGCCT
SEQ ID NO 31     AGCCYGCGTGGTGC
SEQ ID NO 32     AACACGGACACCCAAAGTAGT
SEQ ID NO 33     Cy-5-  TTAGCCRCATTCAGGGGCCG -BHQ3
SEQ ID NO 34      CTATGACATCAACGACAACAGG
SEQ ID NO 35     TTTGGTCTTTCCCTTGAGATCTA
SEQ ID NO 36     FAM- TGCAGGAACAAGGGGTTATCAGTTATG -BHQ1
SEQ ID NO 37     CAGGACTATGAAAACCATTTACCT
SEQ ID NO 38     TGCAGGATTGATTGTGGC
SEQ ID NO 39     ROX- CTGATCTAGCTGAACTGAGACTTGCTTTC -BHQ2
SEQ ID NO 40      ATGGYTCAATCTCAACAACAAG
SEQ ID NO 41      TTGGATGTTCAAGACCTCCAT
SEQ ID NO 42      R6G- TACCCATCTGTTGGACCAGGGATATACT -BHQ1
SEQ ID NO 43     CCTGGAGTCCCATCAAAAGTAAG
SEQ ID NO 44   GCATCTATACGAACRCCTGCTC
SEQ ID NO 45   Cy5- TTTGTTGATCAAGACAATACAATTACACTTGA -BHQ3
Пояснения:
FAM, ROX, R6G, Cy5 - флуоресцентные красители; BHQ1, BHQ2, BHQ3 - гасители флуоресценции; R - А или G, Y - С или Т.