Испытательный стенд для оценки проницаемости роговицы

Полезная модель относится к офтальмологии и предназначена для оценки проницаемости роговицы.
Как известно, роговица является прозрачной, многослойной, сложноорганизованной структурой, образующей наружную (фиброзную) оболочку глаза. Она состоит из пяти слоев: эпителия, Боуменовой мембраны, стромы, Десцеметовой мембраны и эндотелия. Многорядный неороговевающий эпителий отличает наличие плотных межклеточных контактов, препятствующих попаданию слезной жидкости в межклеточное пространство. Боуменова мембрана, образованная волокнами коллагена различных типов, обладает высокой прочностью и также является барьером для проникновения слезной жидкости в строму. Однако основную роль в поддержании экстрацеллюлярного матрикса стромы в относительно дегидратированном состоянии и сохранении прозрачности роговицы играет эндотелиальный слой. Он характеризуется наличием различных типов межклеточных соединений, выраженной метаболической активностью клеток и высокой плотностью ионных каналов. Благодаря плотным и щелевидным межклеточным контактам, формируется эффективный барьер между влагой передней камеры и стромой роговицы. Динамическое равновесие между притоком жидкости в строму и ее оттоком в переднюю камеру определяется осмотическим давлением, создаваемым трансмембранным переносом веществ.
Основной причиной повышения проницаемости роговицы относят генетически детерминированные патологические изменения эндотелия и Десцеметовой мембраны, в том числе эндотелиальную дистрофию Фукса. Развитие хронического отека роговицы также может быть обусловлено повреждением эндотелиального слоя при интраокулярных хирургических вмешательствах, вследствие инфекционных заболеваний структур переднего отрезка глаза, а также отсутствия компенсации внутриглазного давления в течение длительного времени.
Изучение проницаемости интактной роговицы, при нарушении целостности ее эндотелиального и эпителиального слоя (в том числе после проведения кератопластики различных типов), является актуальной задачей, которая может быть решена благодаря использованию специальных диффузионных камер.
Так, в экспериментальной работе Deborah R.B. и соавт. были изучены особенности проникновения фибринолитического препарата через роговицу и склеру. В качестве прибора была использована диффузионная камера Франца, состоящая из донорской и приемной термостатных отсеков. В донорской части располагают кадаверный образец ткани человека или животного, а приемную заполняют исследуемой субстанцией, в данном случае фибринолитическим препаратом. Необходимо отметить, что в течение эксперимента поддерживается непрерывная циркуляция исследуемого вещества в приемном отсеке диффузионной камеры Франца [Deborah R.B., Peter Н., Simon P., Christoph Т., Katrin V., Corneal and scleral permeability of Desmoteplase in different species, Vet Ophthalmol 2020 Sep; 23(5): 785-791. doi: 10.1111/vop.12782]. Недостаток данного устройства состоит в том, что особенности его конструкции не позволяют исследуемому веществу в полном объеме контактировать с поверхностью образца ткани. Так, в расположенном внизу приемном отсеке, несмотря на создаваемую непрерывную циркуляцию исследуемой субстанции, происходит ее частичное осаждение. Оно исключает возможность создать полноценный контакт между двумя поверхностями - вещества и образца ткани, зафиксированного в донорском отсеке, в верхней части диффузионной камеры.
Как известно, внутриглазное давление непосредственно влияет на процессы гидратации роговицы и транспорта веществ. Однако в данном устройстве не создается давление, соответствующее уровню офтальмотонуса человека. Этот недостаток конструкции прибора может заметно исказить получаемые результаты эксперимента.
Также к недостаткам диффузионной камеры Франца можно отнести фиксированный размер донорского отсека (5, 7, 9, 11.28, 15, 20, 25 мм). В результате при исследовании может быть использован образец ткани только определенного диаметра, что является экономически нецелесообразным и затрудняет изучение образцов других размеров. Кроме того, неправильное закрепление образца в донорском отсеке приводит к нарушению его анатомо-функциональных параметров, а соответственно, к изменению проницаемости матрикса и искажению полученных результатов.
Ubels J.L. и соавт. проводили анализ проницаемости роговицы крупного рогатого скота с использованием специального держателя. Его конструкция включает в себя две камеры - эпителиальную и эндотелиальную. Их наружные стороны герметизированы специальными кольцами, а сами камеры отделены друг от друга уплотненным кольцом. Именно в нем авторы фиксировали исследуемую роговицу [Ubels JL, Paauw JD, Casterton PL, Kool DJ, A redesigned corneal holder for the bovine cornea opacity and permeability assay that maintains normal corneal morphology. Toxicol In Vitro. 2002 Oct; 16(5): 621-8. doi: 10.1016/s0887-2333(02)00046-2]. Данное устройство принято за ближайший аналог.
Недостаток данного устройства состоит в том, что его конструкция предназначена для анализа роговицы только большого диаметра (в частности, у крупного рогатого скота он колеблется от 24 до 30 мм) и не позволяет оценить проницаемость роговой оболочки глаза человека. Отсутствие давления внутри прибора исключает получение достоверных результатов исследования.
Задачей предлагаемой полезной модели является создание устройства для изучения и оценки проницаемости и скорости движения жидкости в слоях роговицы.
Техническим результатом предлагаемой полезной модели является возможность оценки степени и скорости пропускания различных веществ через роговицу при условиях, схожих с физиологическими.
Технический результат достигается за счет конструкции испытательного стенда в виде лабораторного штатива-держателя с закрепленной на нем рабочей камерой в виде полого цилиндра, ориентированного вертикально, причем верхняя половине цилиндра снаружи снабжена металлической обечайкой, нижний конец которой соединен с кольцевидными пяльцами с помощью пружин растяжения, а нижний торец цилиндра представляет собой стеклянный прилив, внутри верхней части цилиндра расположены снабженная шкалой трубка для подачи жидкости и трубка для выпуска воздуха, снабженная герметически закрывающимся краном.
Конструкция устройства отражена на Фиг. с обозначением позиций:
1а, б, в - штатив с держателем, 2 - трубка для выпуска воздуха - 3 - трубка для подачи жидкости, снабженная шкалой, 4 - кран, 5 - металлическая обечайка, 6 - пружины растяжения 7 - рабочая камера 8 - биологический образец, 9 - кольцевидные пяльцы, 10 - стеклянный прилив.
Испытательный стенд позволяет оценивать «физический массаперенос» в ткани, который может быть пассивным (диффузия) или активным в результате разности давления по обе стороны биологического образца. В случае необходимости оценки скорости физического массы переноса жидкости, как правило, используют жидкости, близкие по физиологическим качествам к естественным жидкостям для данного образца ткани. В случае глаза таковой является внутриглазная жидкость. Очень важным является вопрос маркера. Идеальным маркером мог бы служить введение радиоактивного меченного изотопа, однако есть более экономически целесообразный и эффективный способ - заменить какой-либо из катионов на другой катион с аналогичными химическими и биологическими свойствами. Одна из допустимых замен - это небольшую часть калия заменить на цезий. Такой маркер не может быть обнаружен оптическими методами, но обнаруживается на сканирующей электронной микроскопии. Однако использование оптических красителей нежелательно, так как они являются крупными органическими молекулами или комплексонами со скоростью диффузии, отличающиеся от скорости проникновения физиологической жидкости.
Испытательный стенд используют следующим образом:
Образец корнеосклерального лоскута, полученного из кадаверного глаза, помещают между кольцевидными пяльцами и стеклянным приливом, после этого для создания герметичных условий фиксируют кольцевидные пяльца с металлической обечайкой с помощью пружин растяжения. Жидкость с маркером вливают через отверстие, расположенное в верхней части трубки для подачи жидкости, параллельно открывают кран, который расположен в трубке для выпуска воздуха, после полного выхода которого закрывают кран, и доводят жидкость с маркирующим веществом до определенной метки шкалы, соответствующей требуемому давлению гидростатического столба. Образец корнеосклерального лоскута экспонируется при заданном давлении то время, за которое исследователь хочет оценить глубину проникновения маркированной жидкости в ткань стромы. После этого образец извлекают из испытательного стенда, разрезают поперек слоев. Фронт распространения маркера оценивается соответствующим типу маркера методом (оптическим, методом электронной микроскопии, радиографическим). По времени экспозиции и длине пробега маркера в ткани делается суждение о скорости физического массопереноса.
Пример: при поступлении материала в глазной банк было произведено выкраивание корнеосклерального лоскута диаметром 15 мм, после этого образец поместили в испытательный стенд и заправили тестируемой жидкостью (раствор BSS «Балансол» с 5% нормотонического водного раствора CsCl) с целью изучения проницаемости и скорости проникновения жидкости в слои роговицы со стороны эндотелиального слоя. Время исследования первого образца составляло 30 минут, второго - 1 час, третьего - 2 часа. После этого извлекли образец из стенда и промыли раствором BSS «Балансол» и положили в одноразовую чашку Петри с диаметром 60 мм. Затем поместили в морозильную камеру с температурой -80°С и одновременным вакуумированием на 3 дня для лиофилизации с целью исключения перемещения маркера в ткани при разрезании образца. После разрезания поперечный срез исследовали с помощью электронного микроскопа. В режиме визуализации обратнорассеянных электронов и методом химического микрокартирования был найден фронт распространения маркирующего агента (цезия) в строме и измерена глубина и скорость проникновения жидкости.