Способ получения биогенного стимулятора для лечения и профилактики заболеваний сельскохозяйственных животных
METHOD OF PRODUCING BIOGENIC STIMULATOR FOR THE TREATMENT AND PREVENTION OF DISEASES OF FARM ANIMALS

Изобретение относится к ветеринарии, в частности к применению в качестве лекарственного средства для профилактики и лечения различных заболеваний у сельскохозяйственных животных денатурированных тканей этих же животных.
Известен препарат из плаценты человека для ветеринарии, получаемый в виде эмульсии путем предварительного измельчения и последующей обработки измельченных тканей до прекращения поглощения активного хлора и нейтрализацией полученной реакционной смеси до рН-4,5.
Другой известный препарат также из плаценты человека [заявка N 4935735-14-029528], представляет собой нерасслаивающуюся суспензию, получаемую путем химической обработки плацентарных тканей хлоритом натрия в кислой среде.
Также известен препарат противовоспалительного действия для профилактики и лечения послеродовых осложнений у коров и других сельскохозяйственных животных на основе тканей плаценты. Препарат противовоспалительного действия готовят из ткани плаценты человека - пуповины - с добавлением стерильной дистиллированной воды в соотношении (1:0,8)-(1:1,2) [Патент RU 2035910, МПК 6 А61К 35/50, дата публикации формулы 1995.05.27].
Кроме того, известен способ лечения и профилактики гинекологических заболеваний у коров и свиноматок с использованием препарата - плацента денатурированная эмульгированная, который изготавливается из плаценты человека. Препарат представляет собой стерильную эмульсию белого или белого с желтоватым оттенком цвета, специфического запаха [Ветеринарные препараты в России: справочник И.Ф. Кленова, Н.А. Яременко. - М.: Сельхозиздат, 2000. - с. 446].
Существенными недостатками отмеченных выше препаратов-аналогов является труднодоступность исходного сырья (плацента человека), вследствие чего низкое удовлетворение потребностей ветеринарии, а также видовая несовместимость белковых и полисахаридных компонентов препарата.
Близким к заявленному техническому решению является способ получения препарата спленин для лечения токсикозов при ранних сроках беременности [Патент RU 111934, заявлено 5.10.1957 г., опубликовано в 1958 г.]
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту является препарат, полученный для профилактики и лечения эндометриоза у коров и свиноматок [Патент РФ №2253466, заявлено 25.12.2003 г., опубликовано 10.06.2005 г.].
Недостатком указанных препаратов является низкая эффективность действия, причиной которой служит использование устаревших технологий его получения. В основе методов получения указанного препарата лежат процессы денатурирования тканей плаценты окислителями и перекисью водорода, вследствие чего разрушается большинство ценных биологически активных веществ, содержащихся в биоматериале крупного рогатого скота.
Также значительным недостатком является сложность и длительность технологии, связанная с использованием замораживания исходного сырья, криоизмельчения и дальнейшей экстракции с помощью хладона.
Технической задачей изобретения является упрощение технологии получения биогенного стимулятора, являющегося средством для лечения и профилактики различных заболеваний животных, с максимальным сохранением биологически активных веществ.
Для решения поставленной технической задачи предложен способ получения биогенного стимулятора для лечения и профилактики заболеваний сельскохозяйственных животных, включающий промывание селезенки проточной водой, очищение от соединительнотканных и жировых элементов, выдержку селезенки в асептических условиях при температуре 5-6°С в течение 72 часов, гомогенизацию с добавлением дистиллированной воды в соотношении 1:10, дальнейшую выдержку при температуре 22-23°С в течение 1 часа, ультрафильтрацию полученной смеси.
Технический результат изобретения заключается в упрощении технологии получения биогенного стимулятора, являющегося средством для лечения и профилактики различных заболеваний животных, с максимальным сохранением биологически активных веществ.
Способ получения биогенного стимулятора для лечения и профилактики заболеваний сельскохозяйственных животных осуществляется следующим образом.
Селезенку крупного рогатого скота, полученную от здорового животного, прошедшую ветеринарно-санитарную экспертизу согласно требованиям технологического регламента по заготовке эндокринного сырья промывают проточной водой, очищают от соединительнотканных и жировых элементов, выдерживают в асептических условиях при температуре 5-6°С в течение 72 часов, гомогенизируют с добавлением дистиллированной воды в соотношении 1:10, выдерживают 1 час при температуре 22-23°С, затем полученную массу подвергают ультрафильтрации для концентрирования и очистки. Стерильно упакованный препарат хранят при температуре от 0 до 5°С в течение 1 года.
Для ультрафильтрации могут применяться различные керамические мембраны с размером пор от 0,05 до 0,1 мкм. При ультрафильтрации удаляются высокомолекулярные белковые соединения.
Полученный препарат содержит комплекс биологически активных веществ: аминокислоты, пептиды, нуклеиновые кислоты, гексуроновые кислоты, полисахариды, витамины, микроэлементы, и обладает иммуностимулирующим действием, нормализует показатели клеточного и гуморального иммунитета, оказывает противовоспалительное действие, стимулирует ферментную систему и нормализует микробный состав пищеварительного тракта, обладает адаптогенным и стресс-протекторным действием, повышает неспецифическую резистентность организма.
Биогенный стимулятор может применяться как инвазивно, так и орально, вместе с кормом.
По всем опытам и производственным испытаниям способа получены положительные результаты и хорошие отзывы.
Положительные результаты, полученные при испытании предложенного способа, свидетельствуют о перспективности его дальнейшего исследования и внедрения в производство, полученный препарат эффективен при различных заболеваниях сельскохозяйственных животных, причем его клиническая эффективность сравнима и даже несколько превосходит известные аналоги.
Эксперимент был проведен на белых мышах линии BALB/c массой 18-20 г. Биогенный стимулятор животным вводили 2-кратно, подкожно, с интервалом между инъекциями 14 суток, в дозе 0,2 мл. Изучение иммуностимулирующей активности препарата проводили на фоне вакцинации мышей инактивированной вакциной против парвовирусного энтерита собак, (животным опытной группы биогенный стимулятор вводили одновременно с вакциной). В качестве контроляиммуностимулирующей активности были использованы белые мыши, привитые только одной вакциной (контроль №1), а в качестве общего контроля (контроль №2) были использованы интактные животные (не привитые вакциной и не обработанные иммуномодулятором).
Функциональное состояние Т-клеток оценивали в реакции Е-розеткообразования и ее модификации с теофилином. Изучение иммуностимулирующего эффекта мы также проводили методом локального гемолиза по Ерне, который дает возможность определить количество и функциональную активность клеточной кооперации В-лимфоцитов, из которых дифференцируются антителообразующиеся клетки (АОК).
Уровень иммуноглобулинов в плазме крови определяли методом радиальной иммунодиффузии по Манчини. Уровень антител определяли в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) против парвовируса энтерита собак второго типа (CPV-2). Ранее нами также были проведены исследования сывороток крови мышей, в аналогичных опытах, где наличие специфических антител к парвовирусу собак (CPV) определяли методом непрямоготвердофазного ИФА. При постановке ИФА был использован стандартный вариант непрямого ИФА, основанный на взаимодействии специфических антител с антигеном (очищенный CPV-2), иммобилизованным на твердом носителе с последующим выявлением иммунного комплекса с помощью антивидового иммунопероксидазного конъюгата в ферментативной реакции.
Результаты ИФА оценивали с помощью фотометра при длине волны 492 нм по коэффициенту оптического поглощения (OD 492). Титры антител в испытуемых сыворотках определяли как последнее разведение, обеспечивающее окраску, превышающую в 2 раза интенсивность окраски в лунках с контрольной отрицательной сывороткой (сыворотка крови мышей, взятой до иммунизации).
Полученные данные показали, что введение вакцины без биогенного стимулятора вызывало достоверное снижение нейтрофилов (контроль №1-18,5%, контроль №2 - 33,1%) и повышение числа лимфоцитов (контроль №1 - 55,6%; контроль №2 - 49,0%). Количество Т-лимфоцитов оставалось практически на том же уровне. Однако увеличение общего числа лимфоцитов произошло за счет повышения количества В-клеток. Это косвенно подтверждается повышением уровня иммуноглобулинов (IgG) почти в два раза по сравнению с контролем №2.
Введение биогенного стимулятора способствовало повышению числа нейтрофилов. Одновременное введение его с вакциной вызвало повышение Е-РОК до 44%, тогда как у животных привитых только одной вакциной (контроль №1) эти показатели были ниже и составляли 30%. В группе интактных животных (контроль №2) они составляли 33,4%.
Адъювантные свойства исследуемого препарата изучали в реакции простой и радиальной иммунодиффузии, определяя содержание иммуноглобулинов в плазме крови и суспензиях спленоцитов мышей. Полученные данные показали, что иммуноадъювантный эффект наблюдался при введении биогенного стимулятора в сочетании с вакциной и без нее. Уровень IgG в опытной группе составил 3,7, тогда как в контрольной группе №1-3,2 и контрольной группе №2 - 1,6.
При определении иммуностимулирующего эффекта методом локального гемолиза по Ерне было установлено, что разница уровней Т-зависимого антителообразования у животных контрольных и опытной групп была статистически достоверна (р<0,01).Индекс стимуляции составил 1,7.
2
2
Одновременно мы проводили исследования сывороток крови мышей опытной группы и контрольной группы №1 в реакции торможения гемагглютинации (РТГА). Реакцию ставили для каждой пробы при двойном разведении сывороток в двух вариантах: при первичном разведении 1/2 и 1/3 с целью более точного определения отличий в значениях титров при одинаковом логарифме разведений. В опыте установлено, что у животных контрольной группы №1 (мыши, иммунизированные только вакциной против парвовирусного энтерита собак) на 28 сутки после вакцинации титры специфических антител к парвовирусу собак второго типа составляли в первичном разведении 1/2 - 1:512 и вторичном разведении 1/3 - 1:384. У мышей опытной группы, привитых вакциной в сочетании с биогенным стимулятором, эти показатели составляли в первичном разведении 1:1024 и вторичном разведении 1:1536. При исследовании сывороток крови мышей методом непрямого твердофазного ИФА было установлено, что титры антител к CPV-2 в среднем по группе животных, привитых только вакциной, составляли 1:4800 (12,22 log). Однако у мышей, вакцинированных в сочетании с биогенным стимулятором, этот показатель составил 1:14080 (13,78 log).
Таким образом, экспериментально установлено, что при парентеральном введении 2%-ного водного раствора биогенного стимулятора у подопытных животных наблюдалась выраженная иммунная перестройка организма. Повышался уровень общего числа лимфоцитов на 44%, Т-зависимого антитело образования (индекс стимуляции 1,7), IgG до 3,7. Титры специфических антител в РТГА и ИФА в 2 и более раз превышали таковые в сыворотках крови животных контрольных групп.
Способ получения биогенного стимулятора для лечения и профилактики заболеваний сельскохозяйственных животных поясняется следующим примером.
Пример 1
Получают биогенный стимулятор согласно технологической схеме, представленной на фиг. 1.
Селезенку крупного рогатого скота, полученную от здорового животного, прошедшую ветеринарно-санитарную экспертизу согласно требованиям технологического регламента по заготовке эндокринного сырья, промывают проточной водой, очищают от соединительнотканных и жировых элементов выдерживают в асептических условиях при температуре 5-6°С 72 часов, гомогенизируют с добавлением дистиллированной воды в соотношении 1:10, выдерживают 1 час при температуре 22-23°С, затем полученную массу подвергают ультрафильтрации для концентрирования и очистки. Стерильно упакованный препарат хранят при температуре от 0 до 5°С в течение 1 года.
Для ультрафильтрации могут применяться различные керамические мембраны с размером пор от 0,05 до 0,1 мкм. При ультрафильтрации удаляются высокомолекулярные белковые соединения.
Предложенный способ может использоваться как в крупных животноводческих комплексах, так и в небольших фермерских хозяйствах.
Предложенный способ получения биогенного стимулятора для лечения и профилактики заболеваний сельскохозяйственных животных позволяет:
- расширить сырьевую базу для получения высокоактивных биогенных стимуляторов в ветеринарной практике;
- исключить видовую несовместимость;
- повысить эффективность препарата;
- существенно упростить технологию получения с максимальным сохранением биологически активных веществ.