Способ ингибирования нуклеарного фактора каппа В с использованием 5-гидроксиникотината калия в культуре клеток
METHOD OF INHIBITING KAPPA NUCLEAR FACTOR WITH THE USE OF POTASSIUM 5-HYDROXYNICOTINATE IN A CELL CULTURE

Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной фармакологии.
По известным литературным источникам – нуклеарный фактор каппа В (NF-κB) на сегодняшний день является одной из перспективных мишеней для разработки инновационных лекарственных средств в рамках развития современной фармакологии и формирования концепции таргетной терапии [Test system for evaluation of the influence of the biological activity of substances on the signal system of NF-κB: focus on the derivatives of 3 hydroxypyridine / Skachilova S.Y., Ragulina V.A., Kostina D.A., Burda Y.E. // Research result: pharmacology and clinical pharmacology. – 2017. – Vol. 3, №2. – Р. 50-56. doi: 10.18413/2313-8971-2017-3-2-50-56].
Семейство транскрипционного фактора NF-κB играет важную роль в жизненном цикле клетки, регулируя процессы пролиферации, апоптоза, воспаления, миграции клеток, ангиогенез, иммунного ответа и прочие [NF-kB transcription factor: a key player in the generation of immune response / P. Tripathi, A. Aggarwal // Current Science. – 2006. – 90 (4). – P. 519-531; NF-κB in aging and disease / J.S. Tilstra, C.L. Clauson, L.J. Niedernhofer [et al.] // Aging and Disease. – 2011. – 2(6). – P. 449-465]. С другой стороны, сигнальная система NF-κB при неадекватной стимуляции приводит к формированию порочных кругов и ключевых патогенетических звеньев развития сердечно-сосудистых заболеваний, в том числе эндотелиальной дисфункции [Oxidative stress and inflammatory mediators contribute to endothelial dysfunction in high-fat diet-induced obesity in mice / R. Kobayasi, E.H. Akamine, A.P. Davel [et al.] // Journal of Hypertension. – 2010 – Vol. 28(10). – P. 2111–2119], заболеваний печени [Muriel, P. NF-κB in liver diseases: a target for drug therapy. / P. Muriel // J. Appl. Toxicol. – 2009. – № 29. – P. 91-100], поджелудочной железы [NF-κB in acute pancreatitis: Mechanisms and therapeutic potential / A. Jakkampudi [et al.] // Pancreatology. – 2016. – Vol. 16, № 4. – P.477-488], онкологических заболеваний [NF-κB, an active player in human cancers / Y. Xia, S. Shen and I.M. Verma // Cancer Immunol Res. – 2014. – 2 (9). – P. 823-830] и коморбидности.
Поэтому ингибирование патологической активации NF-κB и предупреждение формирования порочных кругов – ключевой вопрос современной фармакотерапии. В связи с этим, следует отметить актуальность изучения 5-гидроксиникотината калия в качестве ингибитора NF-κB in vitro с оценкой активности p65 субъединицы в мононуклеарных клетках (МНК) крови крыс линии Wistar, стимулированных бактериальным липополисахаридом.
Известен способ ингибирования NF-κB композициями тритерпенов (патент на изобретение RU 2288706, публ. 10.12.2006). Сущность его заключается в ингибировании воспаления путем обеспечения клетки монотерпеновыми композициями, которые ингибируют фактор NF-κB. Композиция может включать дополнительные химические функциональные агенты. Технический результат - повышение эффективности лечения воспалительных состояний, в частности предраковых.
Основным недостатком способа является то, что применяемые терапевтические дозы монотерпеновых/тритерпеновых соединений могут привести к значительным побочным эффектам или к другим неблагоприятным реакциям. У субъектов с далеко зашедшим заболеванием может наблюдаться определенная степень побочных эффектов при применении терапевтических доз монотерпеновых/тритерпеновых соединений.
Известно зависящее от концентрации влияние (R)- и (S)-флурбипрофена на активацию фактора транскрипции NF-κВ в RAW-клетках (патент на изобретение RU 2250103, публ. 20.04.2005). Анализ гельудерживания показывает, что липополисахарид (ЛПС) (1 мкг/мл) приводит к активации NF-κВ (комплекс р50/р65 NF-κВ). Микромолярные концентрации (R)-флурбипрофена были в состоянии ингибировать эту индуцированную ЛПС активацию NF-κВ.
Изобретение относится к области фармации, а именно к применению (R)-энантиомеров арилпропионовых кислот. Сущность изобретения - применение названных кислот для получения лекарственных средств, которые ингибируют каскад активации NF-κB. На основе их создана композиция. Технический результат - использование для лечения заболеваний, на которые может терапевтически положительно воздействовать ингибирование образования NF-κB.
Недостатком данного изобретения является то, что арилпропионовые кислоты и их производные обладают рядом побочных эффектов при их применении, а именно тошнота, анорексия, метеоризм, запор, изжога, диарея, НПВС-гастропатия, вплоть до эрозивно-язвенных поражений ЖКТ.
Наиболее близким к заявленному решению является способ ингибирования NF-κB с использованием производных 3-оксипиридина (Test system for evaluation of the influence of the biological activity of substances on the signal system of NF-κB: focus on the derivatives of 3hydroxypyridine / Skachilova S.Y., Ragulina V.A., Kostina D.A., Burda Y.E. // Research result: pharmacology and clinical pharmacology. – 2017. – Vol. 3, №2. – Р. 50-56), включающий добавление бактериального липополисахарида в концентрации 1 мкг/мл к свежевыделенным по стандартной методике на градиенте плотности фиколла МНК крови крыс Wistar, затем добавление к данной смеси исследуемого фармакологического агента, растворенного в фосфатно-солевом буфере, в соответствующей конечной концентрации, отличающийся тем, что в качестве фармакологического агента используют мексидол, этоксидол, 3-гидрокси-2-этил-6-метилпиридиния глутаминат, 3-гидрокси-2-этил-6-метилпиридиния аспарагинат, 3-гидрокси-2-этил-6-метилпиридиния 4-аминобензоат, 3-гидрокси-2-этил-6-метилпиридиния никотинат, 3-гидрокси-2-этил-6-метилпиридиния N-ацетиламиногексаноат, 3-гидрокси-2-этил-6-метилпиридиния N-ацетиламиноацетат, 3-гидрокси-2-этил-6-метилпиридиния N-ацетиламиноглутаминат, 3-гидрокси-2-этил-6-метилпиридиния ацетилсалицилат, бета-гидроксиникотиноилгидразон 2-метил-3-гидрокси-4-формил-5-оксиметилпиридина дигидрохлорид. Наибольшей ингибирующей способностью на ЛПС-индуцированную экспрессию p65 NF-κB в МНК обладали мексидол, этоксидол и бета-гидроксиникотиноилгидразон 2-метил-3-гидрокси-4-формил-5-оксиметилпиридина дигидрохлорид.
Недостатком данного решения является то, что наблюдаемая ингибирующая активность in vitro в отношении сигнального пути NF-κB мексидола, этоксидола и бета-гидроксиникотиноилгидразон 2-метил-3-гидрокси-4-формил-5-оксиметилпиридина дигидрохлорида не достигает целевых значений и более чем в 3,5 раза отличается от значений интактных крыс.
Задачей предлагаемого изобретения является создание эффективного способа ингибирования нуклеарного фактора каппа В с использованием 5-гидроксиникотината калия в культуре мононуклеарных клеток крови крыс Wistar.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является эффективный способ ингибирования NF-κB с использованием 5-гидроксиникотината калия, подтверждаемый результатами оценки активности p65 субъединицы в МНК крови крыс Wistar, стимулированных бактериальным липополисахаридом, обладающий наиболее благоприятным профилем безопасности по сравнению с рассмотренными аналогами и наиболее высокой ингибирующей активностью NF-κB по сравнению с прототипом.
Поставленная задача достигается тем, что предложен способ ингибирования нуклеарного фактора каппа В с использованием 5-гидроксиникотината калия в культуре клеток, включающий добавление бактериального липополисахарида в концентрации 1 мкг/мл к свежевыделенным по стандартной методике на градиенте плотности фиколла МНК крови крыс Wistar, затем добавление к данной смеси исследуемого фармакологического агента, растворенного в фосфатно-солевом буфере, в соответствующей конечной концентрации, а в качестве фармакологического агента используют 5-гидроксиникотинат калия.
Основным преимуществом предлагаемого способа является то, что введение 5-гидроксиникотината калия, в исследуемой in vitro концентрации, 35 мкг/мл, приводит к выраженному ингибированию NF-κB в культуре клеток, что подтверждается результатами оценки активности p65 субъединицы в МНК крови крыс Wistar, стимулированных бактериальным липополисахаридом. Помимо этого,  предлагаемый способ обладает наиболее благоприятным профилем безопасности по сравнению с рассмотренными аналогами и наиболее высокой ингибирующей активностью NF-κB по сравнению с прототипом.
Способ осуществляется следующим образом.

При изучении ингибирующей активности в отношении NF-κB были исследованы 5-гидроксиникотинат калия и Мексидол, ФАРМАСОФТ НПК, Россия (препарат сравнения), которые добавляли к свежевыделенным по стандартной методике на градиенте плотности фиколла (ρ = 1,077, «Панэко», Россия) МНК крови крыс линии Wistar. Исследуемая in vitro концентрация каждого препарата составляет 35 мкг/мл.
В каждой экспериментальной группе 6 крыс, 3 самца и 3 самки. Для исследования взяты крысы без внешних признаков заболевания, прошедшие карантинный режим, массой 225-275 г.
Исследование активности NF-κB проводили в 2 мл пробирках типа Eppendorf (Gen Follower, Китай), куда вносили 1мл суспензии МНК крови крыс, 1×106 клеток в 1 мл среды RPMI-1640 («Панэко», Россия) с 5% сыворотки эмбрионов коров (HiClone, США), затем добавляли бактериальный липополисахарид («Пирогенал», ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи, Россия) в концентрации 1 мкг/мл, затем добавляли исследуемый препарат, растворенный в фосфатно-солевом буфере, в соответствующей конечной концентрации.  Клетки инкубировали в течение 30 мин при 37°С на шейкере, после чего центрифугировали 5 мин при 200g, надосадочную жидкость удаляли, осадок МНК исследовали на активность p65 субъединицы NF-κB в строгом соответствии с инструкцией к набору NFkB p65 TotalMultispecies InstantOne™ ELISA Kit (Invitrogen / Thermo Fisher Scientific, cat. 85-86081-11).
МНК крови крыс в количестве 1×106 лизировали в 1 мл лизирующего буфера, входящего в состав набора, супернатант вносили в лунки 96-луночного планшета из указанного ИФА набора. После нескольких этапов продукты сэндвич-реакции определяли на микропланшетном ридере Multiskan FC (Thermo Fisher, Германия) при 450 нм.
Для упрощения расчетов относительного влияния исследуемых веществ были выбраны единицы оптической плотности, непосредственно получаемые с микропланшетного ридера, округленные до 2-го знака после запятой. Статистическую обработку результатов проводили в программе MS Excel 2013 с модулем Attestatv.13 с применением метода непараметрической статистики – критерия Крускала-Уоллиса, т.к. распределение активности p65 субъединицы NF-κB в клетках не являлось нормальным.
ПРИМЕР КОНКРЕТНОГО ВЫПОЛНЕНИЯ
Результаты оценки ингибирующей NF-κB активности исследуемых препаратов  представлены в табл. 1.

Как видно из табл. 1, наибольшей ингибирующей способностью на ЛПС-индуцированную экспрессию p65 NF-κB в МНК крови крыс Wistar в исследуемых концентрациях обладает 5-гидроксиникотинат калия. Ингибирующая активность NF-κB 5-гидроксиникотината калия в исследуемой конечной концентрации 35 мкг/мл выше на 41%, чем у Мексидола при индуцированной ЛПС активации NF-κВ.