УЛУЧШЕННЫЙ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОЗГОВЫХ ОРГАНОИДОВ
IMPROVED METHOD FOR OBTAINING BRAIN ORGANOIDS

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к биотехнологии и медицине и представляет собой способ получения мозговых органоидов из соответствующих нейроэпителиальных сфероидов.
Уровень техники
Создание 3D-органоидов из плюрипотентных стволовых клеток (ПСК) - эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) - значительно облегчило исследования в области моделирования органогенеза человека in vitro и стало мощным инструментом изучения механизмов развития различных патологий и разработки новых подходов к их терапии. Были сделаны успешные попытки создания многоклеточных органоидов мозга человека, толстой кишки, почек, сетчатки, печени. Из уровня техники известно множество способов (протоколов) получения органоидов, состоящих из нескольких типов клеток головного мозга, или же клеток определенных зон. Добавление в среду для культивирования факторов морфогенеза позволяет получать органоиды различных региональных подтипов мозга, что представлено в разработках, опубликованных в работах (Kelava, I., and Lancaster, M.A. (2016) Stem cell models of human brain development, Cell Stem Cell, 18, 736-748, doi: 10.1016/j.stem.2016.05.022.; Di Lullo, E., and Kriegstein, A.R. (2017) The use of brain organoids to investigate neural development and disease, Nat. Rev. Neurosci., 18, 573-584, doi: 10.1038/nrn.2017.107.; Camp, J.G., Badsha, F., Florio, M., Kanton, S., Gerber, T., Wilsch-Brauninger, M., Lewitus, E., Sykes, A., Hevers, W., Lancaster, M., Knoblich, J.A., Lachmann, R., Paabo, S., Huttner, W.B., and Treutlein, B. (2015) Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 112, 15672-15677, doi: 10.1073/pnas.1520760112). Разработаны протоколы получения коры головного мозга [Xiang, Y., Tanaka, Y., Patterson, B., Kang, Y.J., Govindaiah, G., Roselaar, N., Cakir, B., Kim, K.Y., Lombroso, A.P., Hwang, S.M., Zhong, M., Stanley, E.G., Elefanty, A.G., Naegele, J.R., Lee, S.H., Weissman, S.M., and Park, I.H. (2017) Fusion of regionally specified hPSC-derived organoids models human brain development and interneuron migration,Cell Stem Cell, 21, 383-398, doi: 10.1016/j.stem.2017.07.007], мозжечка [Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., and Sasai, Y. (2015) Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells, Cell Rep., 10, 537-550, doi: 10.1016/j.celrep.2014.12.051], среднего мозга, переднего мозга, гипоталамуса [Qian, X., Jacob, F., Song, M.M., Nguyen, H.N., Song, H., and Ming, G.L. (2018) Generation of human brain region specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor, Nat. Protoc., 13, 565-580, doi: 10.1038/nprot.2017.152.], гиппокампа [Sakaguchi, H., Kadoshima, T., Soen, M., Narii, N., Ishida, Y., Ohgushi, M., Takahashi, J., Eiraku, M., and Sasai, Y. (2015) Generation of functional hippocampal neurons from self-organizing human embryonic stem cell-derived dorsomedial telencephalic tissue, Nat. Commun., 6, 8896, doi: 10.1038/ncomms9896.]. Все эти вышеперечисленные протоколы разделяются на две группы по способу получения 3D-структур и дальнейшему их культивированию с дифференцировкой. Первая группа - это различные модификации протокола Ланкастер (2014) или схожие по технологии схемы дифференцировки, различающиеся между собой сроками культивирования и индукторами дифференцировки с последующим вызреванием органоидов на шейкере в специальных низкоадгезионных приспособлениях по типу микропробирок или планшетов. Вторая группа протоколов подразумевает использование специальных биореакторов. Близкий к настоящему изобретению аналог описан в работе Krefft et al. (2018), где показана возможность получения органоидов мозга за четыре этапа [Krefft, O., Jabali, A., Iefremova, V., Koch, P., and Ladewig, J. (2018) Generation of standardized and reproducible forebrain-type cerebral organoids from human induced pluripotent stem cells, J. Vis. Exp., 131, 56768-56776, doi: 10.3791/56768.]. Этот протокол включает в себя следующие этапы: получение агрегатов ИПСК (предварительно клетки культивировали до состояния монослоя); индукцию передней нейроэктодермы; инкапсуляцию нейроэктодермальных агрегатов в матрицу (экстракт базальной мембраны); дифференцировку мозгоподобных органоидов, характерных для переднего мозга. Данный протокол позволяет получить стандартные по размеру органоиды, но в небольшом количестве, по причине большой технической трудоемкости, связанной иммобилизацией каждого отдельного органоида в капле матрицы. Помимо этого, использование приспособлений типа «paraffin film» для иммобилизации в геле несет высокие риски контаминации и делает невозможным использование этого протокола для наработки большого количества органоидов, например, для скрининговых исследований. В протоколе, предложенном Qian et al. (2018), были использованы высокотехнологичные механические лопастные планшетные миниреакторы, позволяющие регулировать частоту вращения лопаток роторов во всех лунках. Однако, несмотря на высокую эффективность предложенного способа получения органоидов, при масштабировании стоимость таких реакторов является существенной составляющей в исследованиях. К тому же большое количество механических составляющих в таких реакторах затрудняет его деконтаминацию и снижает надежность при длительной эксплуатации. Анализ протоколов указывает на необходимость культивирования органоидов в условиях циркулирующей питательной среды. Эти недостатки устранены в предлагаемом изобретении, где используются простые по конструкции минибиореакторы, в которых динамические условия реализуются с помощью шейкера внутри СО2 инкубатора.
Другим близким аналогом способа получения органоидов мозга является изобретение, описанное в патенте Китая №108456659 B (опубл. 28.08.2018; МПК: C12N5/079), в котором описано получение органоидов мозга с помощью ассоциации клеток, полученных из диспергированных аккутазой нейросфер и поэтапным их культивированием в средах с нейротрофическими факторами (BDNF/GDNF) и ретиноевой кислотой. Данный способ отличается от предложенного в данной заявке тем, что присутствует этап энзиматической обработки нейросфер, что может снизить жизнеспособность. При этом длительный срок формирования органоидов через периодическое наслоение на сфероиды дифференцированных клеток, усложняет масштабирование. В настоящем изобретении также не использовали ретиноевую кислоту в связи с ее плейотропным эффектом и риском получения ненейрональных прогениторных клеток.
Наиболее близким аналогом (прототипом) способа получения мозговых органоидов по предлагаемому изобретению является способ, описанный в работе Еремеев и др., 2018 [А.В. Еремеев, Е.А. Воловиков, Л.Д. Шувалова, А.В. Давиденко, Е.А. Хомякова, М.Е. Богомякова, О. С. Лебедева, О.А. Зубкова, М. А. Лагарькова «ГОЛЬ НА ВЫДУМКИ ХИТРА», ИЛИ ДЕШЕВЫЙ, НАДЕЖНЫЙ И ВОСПРОИЗВОДИМЫЙ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОРГАНОИДОВ// БИОХИМИЯ, 2019, том 84, вып. 3, с. 448 - 456]. В данной публикации раскрыт способ получения органоидов с использованием минибиореактора, представляющего собой плоскую чашку Петри с приклеенным ко внутренней поверхности дна пластиковым цилиндром, при этом культивирование органоидов осуществляется на орбитальном шейкере. Цилиндры изготавливали из центрифужных пробирок, которые затем вклеивали в чашки Петри.
Задачей настоящего изобретения является расширение арсенала способов получения мозгоподобных органоидов, а также создание нового усовершенствованного способа, лишенного недостатков, присущих известным из уровня техники аналогам.
Под нейроэпителиальными сфероидами (далее сфероидами) понимают 3D структуры, состоящие из нейроэпителиальных (прогениторных) клеток и имеющие однородную структуру. Под мозговыми органоидами понимают клеточные структуры, состоящие из разных типов клеток нейрональной природы - глия, нейроны и т.п.), имеющие сложную морфологию и электрофизиологическую активность.
Раскрытие изобретения
При воспроизведении способа, раскрытого в публикации [Еремеев и др., 2018], авторами был обнаружен ряд недостатков.
Основной недостаток заключался в том, что при использовании для выращивания мозгоподобных органоидов минибиореактора, содержащего цилиндрический островной элемент, наблюдалось повреждение органоидов в результате трения их об указанный элемент в процессе культивирования на орбитальном шейкере. Шлифование кромок и поверхности цилиндрического элемента не улучшило существенным образом эту проблему. В ходе дальнейших экспериментов с островными элементами разных форм нами было неожиданно обнаружено, что органоиды не повреждаются, если элемент имеет форму шарового сегмента. Дополнительным преимуществом использования сферического островного элемента вместо цилиндрического является увеличение полезного объем питательной среды примерно на 1-1,5 мл, что позволяет реже проводить ее замену и уменьшает риск контаминации. Также в предлагаемом способе используется более совершенные параметры культивирования по сравнению со способом, выбранным в качестве прототипа [Еремеев и др., 2018]. В частности, в указанной публикации, используется плотность клеток ИПСК на старте дифференцировки 80-85% конфлуэнтности и заменитель сыворотки, а также более низкая концентрация дорсоморфина, что несет риск дифференцировки в не нейрональном направлении.
Предлагаемое изобретение представляет собой способ получения мозговых органоидов in vitro из популяции плюрипотентных стволовых клеток, который включает следующие стадии:
1. Культивирование плюрипотентных стволовых клеток (индуцированные плюрипотентные или эмбриональные стволовые клетки) в стандартных для плюрипотентных клеток средах в монослойной культуре до достижения конфлюэнтной плотности не менее 90%.
2. Культивирование в среде, стимулирующей дифференцировку плюрипотентных клеток в нейрональном направлении до стадии нейроэпителиальных прогениторных клеток (розеткообразования) - без заменителя сыворотки и с повышенным содержанием дорсоморфина до 5 мкМ.
3. Снятие нейрональных предшественников с культуральной посуды щадящим неэнзиматическим способом с в виде суспензии и последующей реагрегацией в микролунках плашек AggreWell TM400.
4. После формирования сфероидов - агрегатов в микролунках плашек AggreWell TM400, сфероиды инкубировали в Матригеле и переносили в заранее приготовленные минибиореакторы.
5. Выращивание мозговых органоидов из сфероидов в минибиореакторе, представляющем собой чашку Петри с центральным островным элементом в форме шарового сегмента, выполненным из того же материала, что и чашка Петри. В предпочтительном варианте осуществления изобретения шаровой сегмент имеет диаметр от 0,83 до 1,17 внутреннего диаметра минибиореактора, а высота указанного шарового сегмента - не менее 3 мм. При этом предпочтительный внутренний диаметр минибиореактора составляет не менее 60 мм.
Главный технический результат, достигаемый при реализации способа по настоящему изобретению, заключается в реализации изобретением своего назначения (при решении задачи расширении арсенала технических средств, применяемых для получения электрофизиологически активных мозгоподобных органоидов). Дополнительный технический результат заключаются в получении мозгоподобных органоидов, не имеющих повреждений поверхностного слоя клеток. Представленные на Фиг. 4 микрофотографии наглядно показывают, что органоиды, полученные, согласно предлагаемому способу (Пример 2), характеризуются ровной гладкой поверхность по сравнению с органоидами, выращенными при аналогичных условиях в миниреакторе, имеющем цилиндрический центральный островной элемент (Пример 3).
Краткое описание чертежей
Для пояснения сущности заявляемого технического решения к описанию приложены Фиг. 1-6.
1
A
Б
На Фиг. 1 представлен способ создания минибиореактора с центральным островным элементом в форме шарового сегмента согласно Примеру  путем нанесения жидкого пластикового клея по центру на донышко чашки Петри () и готовый минибиореактор с центральным островным элементом в форме шарового сегмента ().
2
На Фиг. 2 представлена схема получения органоидов согласно Примеру , из культуры ИПСК (А), которые дифференцируются в нейроэпителий (Б), с последующей диссоциацией на суспензию единичных клеток - нейрональных предшественников (В) и посадки их на микролунки плашек AgreWell, в которых они реагрегируют в нейроэпителиальные сфероиды (Г-Д) в течение суток. Через сутки сфероиды смывают с микролунок и переносят в минибиореактор (Е - сфероиды, посаженные в миниреакторы), в котором они образуют органоиды мозга при длительном культивировании (Ж - мозговые органоиды через 1 месяц культивирования).
2
На Фиг.3 представлена схема расположения минибиореакторов на шейкере в СО инкубаторе (А), а также внешний вид органоидов в минибиореакторе (Б).
2
1
А
Б
Б
На Фиг.4 представлена макрофотография мозгоподобных органоидов, полученных по Примеру , при культивировании в течение 1 месяца в минибиореакторах по Примеру  () и, для сравнения, в минибиореакторе того же размера, имеющего центральный островной элемент цилиндрической формы (). На изображении () видны некоторые повреждения на всех органоидах в виде неровной поверхности, при этом органоиды имеют меньший размер и более рыхлую структуру.
2
На Фиг.5. Показано иммуногистохимическое окрашивание, демонстрирующее, что в органоидах, полученных по Примеру , экспрессируются нейрональные маркеры -А -SOX2 (ранний маркер, красный), Б - β-3-тубулин (красный) , В - GFAP (красный), MAP2 (зеленый), Г - нестин (красный), Д - TH (тирозингидроксилаза) красный, FOXA2 - зеленый (ядерная локализация).
На Фиг.6. Изображена электрофизиологическая активность нейронов (справа), меченных флуоресцентной меткой (с помощью вируса AAV GFP под hSyn промотором). Анализ электрофизиологической активности нейронов в составе органоида (по Примеру 2) методом patch-clamp показал наличие потенциалов действия, характерных для зрелых нейронов.
Осуществление изобретения
Возможность осуществления заявленного изобретения иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Конструирование и подготовка минибиореактора
Вид и приготовление минибиореактора приведена на Фиг. 1 (А, Б). В центре чашки Петри с низкой адгезией (ultra low adhesion, «Corning», США или другого производителя) с внутренним диаметром не менее 6о мм создают центральный элемент в форме шарового сегмента диаметром от 0,83 до 1,17 внутреннего диаметра минибиореактора и высотой не менее 3 мм путем многократного наслаивания клея, приготовленного из таких же чашек Петри с низкой адгезией. Для получения клея пластиковую крошку, полученную из чашек Петри, растворяют в хлороформе в течение суток до получения вязкой однородной массы из расчета 1 г пластиковой крошки на 10 мл хлороформа. Поскольку растворенный пластик идентичен пластику чашки Петри, достигается высокая адгезия и растворенный пластик интегрируется в чашку.
2
Чашки оставляют открытыми до полного высыхания в ламинарном шкафу. После высыхания чашки дополнительно обрабатывают в ламинарном шкафу ультрафиолетовым светом в течение 45 мин. Собранные по нескольку штук в большие чашки Петри или другие стерильные контейнеры миниреакторы располагают ярусами на полках СО-инкубатора (Фиг. 3) при необходимости масштабирования работы.
Пример 2. Получение мозговых органоидов in vitro из популяции плюрипотентных стволовых клеток в минибиореакторе с центральным островным элементом в форме шарового сегмента.
Для дифференцировки ИПСК в нейрональном направлении брали культуру при достижении максимальной 90-100% конфлуэнтности (пошаговая схема представлена на Фиг.2 А-Ж), то есть, по достижении полного монослоя (Фиг.2А). Дифференцировку проводили в среде advancedDMEM/F12 с добавлением 0,1 мкМ LDN-193189 («MACS Miltenyi Biotec», Германия), увеличенная концентрация до 5 мкМ дорсоморфина («MACS Miltenyi Biotec», Германия), 10 мкМ SB431542 («MACS Miltenyi Biotec», Германия), 50 мкМ β-меркаптоэтанола, добавок N2 и Neuromax (ПанЭко, Россия), глутамина (ПанЭко, Россия) или глутамакса (Thermofisher Sci, USA). При появлении «розеткоподобных» - нейроэпителиальных структур (обычно на через 1 неделю, Фиг. 2 Б) переходили к процедуре диспергирования на единичные клетки культуры ИПСК раствором Версена с добавлением ингибитора Rho киназы в концентрации 5 мкМ Y27632 («MACS Miltenyi Biotec», Германия) для увеличения выживаемости ИПСК в суспензии при дальнейших манипуляциях. Диспергированные клетки высаживали на плашки AggreWell TM400 или 800 (Фиг.2 В) в среде advanced DMEM/F12 с добавлением 5 мкМ Y27632 («MACS Miltenyi Biotec», Германия), 50 мкМ β-меркаптоэтанола, добавок N2 и Neuromax (ПанЭко, Россия). Клетки осаждали в мягких условиях при 500-600 об/мин на плашечном роторе при комнатной температуре в течение 1 минуты.
1
2
2
Через один день образовавшиеся нейроэпителиальные сфероиды (будущие органоиды, состоящие на этот момент только из прогениторных клеток) аккуратно собирали из лунок серологической пипеткой объемом 2-5 мл в пробирку на 15 мл, отстаивали 2-3 мин, затем супернатант отбирали. Будущие органоиды, которые под действием силы тяжести опускались на дно пробирки, помещали сначала в только что размороженный при 4 °С неразведенный Матригель («Corning», США), через 30 мин отмывали от него путем пассивной седиментации в пробирке объемом 15 мл или мягким центрифугированием в течение 1 мин при 100 g, затем сфероиды перемещали в описанные выше минибиореакторы по Примеру , которые размещали на орбитальном шейкере («Inforse» Швейцария) в СО инкубаторе. Дальнейшее культивирование органоидов проводили при 37±1 °С, в атмосфере 5±1% СО, относительной влажности 80±5%, при частоте вращения 60-70 об/мин. Островные элементы не давали сфероидам концентрироваться в центре чашки, что позволяло избежать образования агрегатов и адгезии клеток на чашке. Через сутки среду меняли на DMEM/F12 с добавлением 1×N2 и 1×Neuromax («ПанЭко», Россия), 100×GlutaMAX, 50 ед/мл смеси пенициллина и стрептомицина, 3 мкМ пурморфамина («MACS Miltenyi Biotec», Германия) и 50 мкМ β-меркаптоэтанола. Дальнейшую смену среды проводили через каждые 4-6 дней без центрифугирования за счет оседания органоидов под действием силы тяжести в серологической пипетке объемом 5-10 мл с последующим декантированием надосадочной жидкости. В пробирку добавляли объем среды, равный удаленному, после чего органоиды возвращали в миниреакторы.
Данный способ позволяет получать стандартные по размерам органоиды мозга в большом количестве с сохранением внешней и внутренней структурной целостности. Качество полученных органоидов оценивали с помощью фазово-контрастной микроскопии (внешний вид, Фиг.4), наличие неповрежденной нейрональной природы и внутренней структуры оценивали с помощью флуоресцентной микроскопии (Фиг.5). Оценку целостности нейрональной сети оценивали с помощью GFP-мечения клеток, включенных в структуру органоидов и образующих нейроны с отростками-дендритами, а также по наличию электрофизиологической активности, которая наблюдается только у зрелых, живых и неповрежденных нейронов (Фиг.6).
Пример 3. Получение мозговых органоидов in vitro из популяции плюрипотентных стволовых клеток в минибиореакторе с центральным островным элементом в форме цилиндра
Мозгоподобные органоиды получали по методике, приведенной в Примере 2, с тем отличием, что в качестве минибиореактора использовали аналогичные чашки Петри с центральным островным элементом в форме цилиндра.
Полученные органоиды имели неоднородную рыхлую структуру и неровную поверхность (Фиг. 4 Б).