Влияние каскатола и селена на канцерогенез печени и пищевода, индуцированный у крыс N-нитрозодиэтиламином

УДК 615.356:591.436.006.6.001.6

L.Z. Bolieva1, A.V. Sergeev2, M.Ya. Shashkina2

THE EFFECT OF KASKATOL AND SODIUM SELENITE ON N-NITROSODIETHYLAMINE-INDUCED CANCEROGENESIS IN RAT LIVER AND ESOPHAGUS

1North-Ossetian State Medical Academy, Vladikavkas 1N.N. Blochin Russian Cancer Research Center of RAMS, Moscow

ABSTRACT

We have shown that the combined treatment of Kaskatol and sodium selenite modify N-nitrosodiethylamin (NDEA)-induced carcinogenesis in male Wistar rats’ liver and esophagus. The combined administration of Kaskatol and sodium selenite at the beginning of NDEA treatment reduced the carcinogenicity induced by NDEA. This was expressed by a significant fall the early-onset neoplastic changes of liver tissue and tumor incidence to 52,6 % as compared to 91,7 % in control group. We have also observed the significant fall in esophagus tumor incidence up to 52,6 % in compare to 91,3 % in control group of animals).Study of the combination of Kaskatol with sodium selenite demonstrated the decrease in esophagus tumors number from 4,13 to 1,26 tumors per rat in control and experimental group of animals, as well as an inhibition of early-onset neoplastic changes in esophagus. In summary the combination of Kaskatol and sodium selenite seems to us as the most promising treatment to achieve the chemopreventive effect of studied micronutrients.

Key words: rat liver and esophagus cancerogenesis, N-nitrosodiethylamin, chemoprevention, Kaskatol, Vit E, C, P-carotin, sodium selenitero

Л.З. Болиева1, A.B. Сергеев2, М.Я. Шашкина2*

ВЛИЯНИЕ КАСКАТОЛА И СЕЛЕНА НА КАНЦЕРОГЕНЕЗ ПЕЧЕНИ И ПИЩЕВОДА, ИНДУЦИРОВАННЫЙ У КРЫС N-НИТРОЗОДИЭТИЛАМИНОМ

1 Северо-Осетинская государственная медицинская академия, Владикавказ 2 ГУ Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН,

115478 Москва, Каширское ш., 24

РЕЗЮМЕ

Изучалось влияние витаминного комплекса каскатол, содержащего бета-каротин, витамины Е, С и селенита натрия на канцерогенез печени и пищевода, индуцированный у крыс N-нитрозодиэтиламином (НДЭА). Комбинированное применение каскатола с селенитом натрия оказывало наиболее выраженное тормозящее действие на канцерогенез, что проявилось в статистически достоверном снижении частоты возникновения неопластических изменений в ткани печени (с 91,7 % в контрольной до 52,6 % в опытной группе животных) и опухолей пищевода (91,3 % и 52,6 % в контрольной и опытной группах соответственно), снижению множественности новообразований пищевода (с 4,13 в контрольной группе до 1,26 опухолей/крысу в опытной группе), более поздней малигнизации в печени и пищеводе. Полученные данные свидетельствуют, что комплексное применение витаминов Е,С, бета-каротина и селена расширяет спектр антиканцерогенной активности исследуемых микронутриентов и позволяет достичь более выраженного химиопрофилактического эффекта.

Ключевые слова: канцерогенез печени и пищевода, N-нитрозодиэтиламин, химиопрофилактика, каска-тол, витамин Е, витамин С, бета-каротин, селенит натрия.

*Болиева Лаура Зелимовна — д. мед. наук, профессор, заведующая кафедрой фармакологии с курсом клинической фармакологии Северо-Осетинской государственной медицинской академии; тел. (8672) 55 35 83; bolievaz@mail.ru Сергеев Александр Васильевич — д. мед. наук, профессор, заведующий лабораторией по созданию нетоксичных иммуномодуляторов НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей (ЭДиТО); тел.324 24 04

Шашкина Мария Яковлевна — к. хим. наук, ведущий научный сотрудник лаборатории по созданию нетоксичных иммуномодуляторов НИИ ЭДиТО; тел. (499) 612 80 62

56

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОНКОЛОГИЯ

ВВЕДЕНИЕ

Утверждение о защитной роли микронутриентов в отношении злокачественных новообразований базируется на результатах большого числа исследований. Наиболее изучены в данном аспекте витамины А, С, каротиноиды, селен, некоторые макро- и микроэлементы. В эпидемиологических исследованиях получены убедительные доказательства о наличии обратной зависимости между количеством этих веществ, потребляемых с пищей, и заболеваемостью раком. Это подтверждается и результатами экспериментов, проведенных на моделях индуцированных опухолей различной локализации. [4; 5; 14; 15; 16]. Имея различные механизмы действия, микронутриенты дают возможность вмешиваться в процесс канцерогенеза и тормозить его развитие на стадиях инициации и/или промоции опухолей. Это наряду с относительно низкой токсичностью открывает широкие перспективы их использования в профилактике рака. Однако, несмотря на значительное количество проведенных исследований, остается еще немало нерешенных вопросов. Наиболее важные из них — определение спектра антиканцерогенной активности отдельных микронут-риентов, выбор показаний и оптимального режима их дополнительного применения, рациональное комбинирование указанных средств для повышения эффективности и снижения токсичности, создание комплексных препаратов для профилактики основных видов злокачественных новообразований у человека.

Целью настоящего исследования явилось изучение влияния витаминного комплекса каскатол, содержащего бета-каротин, витамины Е, С и селенита натрия на экспериментальный канцерогенез печени и пищевода, индуцированный у крыс N-нитрозодиэтиламином (НДЭА).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Эксперимент проводился на 90 крысах-самцах линии Вистар с исходной массой 100 - 120 г, полученных из вивария Пятигорской государственной фармацевтической академии. Животные находились на стандартном пищевом рационе вивария и получали питьевую воду без ограничений. Опухоли печени индуцировали по описанной методике [6] добавлением к питьевой воде НДЭА в концентрации 100 мг/л в течение 4 месяцев. В качестве модификаторов канцерогенеза изучали каскатол (ОАО «Холдинг «ЭДАС» по лицензионному соглашению с ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН) — витаминный комплекс, содержащий в 1 драже бета-картина 2,5 мг, аскорбиновой кислоты 25 мг, альфа-токоферола 12,5 мг, и неоселен (НПЦ «Исинга», г. Чита) — 0,05%-ный нейтральный раствор селенита натрия, содержащий 230 мкг селена в 1 мл.

Животные были разделены на 4 группы: 30 крыс 1-й группы служили контролем и получали только канцероген; 20 крыс 2-й группы получали с кормом каскатол по 4 драже на кг массы тела; 20 животных 3-й группы получали неоселен по 0,4 мг на кг массы

тела; 20 крыс 4-й группы получали каскатол в сочетании с неоселеном (2 драже и 0,2 мг на кг массы тела соответственно). Основанием для выбора доз исследуемых препаратов явились данные литературы, согласно которым используемая в данном эксперименте доза селена применялась в большинстве исследований антиканцерогенной активности микроэлемента как максимально эффективная [1; 10; 13]. Нами в предварительных исследованиях и в исследованиях на других моделях экспериментального химического канцерогенеза указанная доза также определена как максимально эффективная [3]. Каскатол применялся в дозе, рекомендованной согласно данным литературы и результатам собственных исследований [3; 7; 11; 12]. Препараты равномерно смешивались с творогом и вводились в рацион крыс опытных групп, начиная с 1-го дня применения НДЭА и до конца эксперимента. Корм, содержащий исследуемые вещества, поедался животными полностью. Продолжительность эксперимента составила 38 нед. Животных, доживших до его окончания, умерщвляли парами фторотана. При вскрытии печень оценивали макроскопически по шкале условных баллов [2]: 0 — печень без изменений; 1 — поверхность местами неоднородного цвета, очаговые изменения отсутствуют; 2 — единичные опухолевые узелки диаметром 0,1 - 0,2 см; 3 — множественные узелки диаметром 0,1 - 0,2 см или единичные узелки диаметром 0,3 - 0,5 см; 4 — множественные узелки диаметром 0,3 - 0,5 см или единичные узлы диаметром 0,6 - 1,0 см; 5 — множественные узлы диаметром 0,6 - 1,0 см или единичные узлы диаметром более 1 см; 6 — множественные узлы диаметром более 1 см; 7 — опухоли диаметром более 3 см, преобладает опухолевая ткань. Все новообразования в пищеводе подсчитывали и измеряли, индекс множественности рассчитывали по отношению к числу крыс в группе. Материал, взятый для гистологического исследования, фиксировали в 10%-ном растворе формалина, заливали в парафин, срезы окрашивали гематоксилином и эозином. При анализе микроскопических изменений в печени и пищеводе основывались на классификации опухолей лабораторных животных, предложенной Международным агентством по изучению рака. Микроскопическую оценку неопластических изменений проводили по 3-балльной шкале условных единиц [2]: ранние неопластические изменения оценивали в 1 балл, доброкачественные опухоли в

2 балла, злокачественные опухоли в 3 балла. Об эффективности модифицирующего воздействия на канцерогенез печени и пищевода судили по изменению числа крыс с неопластическими процессами указанной локализации, индекса множественности новообразований, среднего балла макро- и микроскопических изменений в опытных группах животных по сравнению с контролем.

Результаты исследований обрабатывали статистически. Для оценки степени достоверности полученных различий в сравниваемых группах пользовались критериями 1 Стьюдента, Манна-Уитни и %2.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В ходе эксперимента не выявлено каких-либо различий физиологического состояния и поведенческих реакций крыс контрольной и опытных групп. Нарастание массы тела животных в опытных группах происходило равномерно по мере их роста при некотором отставании прироста массы тела у крыс контрольной группы в течение последних 8 - 10 нед опыта. В ходе проведенного исследования у животных развивались новообразования печени и пищевода. Метастазирова-ния развившихся опухолей нами обнаружено не было. При вскрытии животных не было выявлено каких-либо изменений органов и тканей, свидетельствующих о токсическом действии исследуемых средств.

Результаты исследования влияния каскатола и селенита натрия на канцерогенез печени представлены в табл. 1.

В контрольной группе неопластические изменения в ткани печени обнаружены у 22 животных, что составило 91,7 % от эффективного числа крыс. 1-я крыса с предопухолевыми изменениями в печени пала на 11-й нед эксперимента. Микроскопическое изучение ткани

печени показало наличие гиперплазии протоков и очагов эозинофильно- и базофильноклеточной гиперплазии гепатоцитов. Злокачественные новообразования в условиях данного эксперимента впервые идентифицированы у 2 крыс, павших на 22-й нед опыта: высокодифференцированный гепатоцеллюлярный рак и хо-лангиоцеллюлярный рак, в обоих случаях развившийся на фоне цирроза и гиперплазии протоков и/или гепатоцитов. Таким образом, в ходе эксперимента наблюдали проявления опухолевой прогрессии в ткани печени. Суммарно при морфологическом анализе неопластических изменений у 13 крыс контрольной группы идентифицирован высоко-, умеренно- или низкодифференцированный гепатоцеллюлярный рак, у 1 крысы холан-гиоцеллюлярный рак, у 2 — гепатоцеллюлярная аденома и у 1 — холангиофиброз. Эти процессы развивались на фоне диффузных и очаговых гиперплазий гепа-тоцитов и/или протоков, а также цирротических процессов разной степени выраженности.

В группе животных, получавших каскатол, неопластические изменения были зарегистрированы у 14 крыс (77,8 %) из 18, доживших до их появления.

Таблица 1

Влияние каскатола и селенита натрия на канцерогенез печени, индуцированный у крыс НДЭА

Группы животных Эффективное число крыс в группе С неопластическими изменениями

Количество крыс, в скобках % Макроскопическая оценка в баллах Микроскопическая оценка

Злокачест- венные опухоли Доброкаче- ственные опухоли Гиперплазия и дисплазия Микроскопическая оценка в баллах

Г X Г X гепато- цитов про- токов

1. Контроль, НДЭА 24 22 (91,7) 2,67±0,34 13 1 2 1 9 6 2,17+0,25

2. НДЭА + каскатол 18 14 (77,8) 1,06+0,17 2 - - 2 9 4 1,1+0,19

3. НДЭА + селен 19 12 (63,2)* 0,63±0,16** - - 1 1 3 8 0,74+0,16**

4. НДЭА + каскатол + селен 19 10 (52,6)* 0,53+0,16** - - 1 2 3 10 0,68+0,19**

Различия с контрольной группой достоверны: *р < 0,05; **р < 0,001. Г — гепатоцеллюлярный, X — холангиоцеллюлярный.

58 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОНКОЛОГИЯ

1-я крыса с неопластическими изменениями пала на 15-й нед опыта. Морфологический анализ выявил наличие очаговой эозинофильноклеточной гиперплазии гепатоцитов. В дальнейшем до окончания эксперимента пали еще 3 крысы с неопластическими процессами, при этом микроскопически идентифицированы очаговая гиперплазия гепатоцитов и протоков, холангио-фиброз и гепатоцеллюлярный псевдожелезистый рак. Суммарно у 2 животных данной группы идентифицирован гепатоцеллюлярный рак, у 2 — холангиофиброз, у 13 — гиперплазии протоков и/или гепатоцитов.

Из 19 крыс, получавших селен, неопластические процессы зарегистрированы у 12, что составило 63,2 % и было достоверно ниже показателя в контрольной группе. Неопластические изменения в виде эозинофильноклеточной гиперплазии гепатоцитов впервые обнаружены у крысы, павшей на 25-й нед опыта. Микроскопические изменения ткани печени представлены холангиофиброзом, кистой, дисплазией и гиперплазией гепатоцитов и/или протоков. Злокачественных новообразований обнаружено не было.

При комбинированном применении каскатола и неоселена неопластические изменения зарегистрированы у 10 крыс (52,6 %), что было достоверно ниже показателя в контрольной группе животных. Суммарно неопластические процессы представлены следующими изменениями в ткани печени: у 1 крысы идентифицирована аденома, у 2 — холангиофиброз, у 10 — гиперплазия протоков и у 3 — диффузная или очаговая гиперплазия гепатоцитов. Злокачественных новообразований не выявлено.

При балльной оценке макро- и микроскопических изменений ткани печени нами были получены достоверные отличия между животными контрольной и опытных групп (см. табл. 1).

Комбинированное применение каскатола с селенитом натрия способствовало наиболее выраженному

снижению частоты возникновения и степени малигни-зации неопластических изменений в печени. Из результатов проведенного эксперимента следует, что каскатол не подавляет самостоятельно канцерогенез печени, однако потенцирует антиканцерогенное действие селена.

Результаты исследования влияния каскатола и селенита натрия на канцерогенез пищевода представлены в табл. 2.

В контрольной группе новообразования пищевода развились у 21 крысы из 23, доживших до появления 1-й опухоли, что составило 91,3 %. Индекс множественности, то есть количество новообразований на одно животное, составил 4,13 + 0,35. Гистологически большинство новообразований классифицировано как плоскоклеточные папилломы. Плоскоклеточные карциномы пищевода обнаружены у 5 животных контрольной группы в количестве 7 опухолей. В группе, получавшей каскатол, новообразования пищевода развились у 11 крыс, что составило 61,1 % от эффективного числа животных. Индекс множественности составил 1,83 + 0,46 опухолей на крысу. Как частота возникновения новообразований пищевода, так и индекс множественности были достоверно ниже контрольных значений. Селенит натрия (препарат неоселен) также активно вмешивался в процесс канцерогенеза пищевода и приводил к достоверному снижению частоты возникновения новообразований с 91,3 % в контрольной группе до 63,2 % (р < 0,05). Индекс множественности составил 1,84 + 0,4 (р < 0,001) опухоли на крысу, что было достоверно ниже контрольного показателя. При комбинированном введении каскатола и селенита натрия показано усиление антиканцерогенной активности, которое проявилось в достоверном снижении частоты возникновения новообразований до 52,6 % (р < 0,05), а индекса множественности до 1,53 + 0,45 (р < 0,001) опухоли на крысу. При

Таблица 2

Влияние каскатола и селенита натрия на канцерогенез пищевода, индуцированный НДЭА

Группа, воздействие Эффективное число крыс Число крыс с опухолями, в скобках % Индекс множественности Микроскопическая оценка в баллах

1. Контроль, НДЭА 23 21 (91,3) 4,13+0,35 2,13+0,11

2.НДЭА + каска-тол 18 11 (61,1)* 1,83+0,46** 1,56+0,17*

3. НДЭА + селен 19 12 (63,2)* 1,84+0,4** 1,37+0,24***

4. НДЭА + каска-тол + селен 19 10 (52,6)* 1,53+0,45** 1,26+0,03***

Различия с контрольной группой достоверны: *р < 0,05; **р < 0,001; ***р < 0,01.

гистологическом анализе срезов опухолей пищевода в группах животных, получавших исследуемые микро-нутриенты, все новообразования классифицированы как плоскоклеточные папилломы, злокачественных опухолей не выявлено. Микроскопический анализ выявил снижение выраженности малигнизации неопластических изменений в опытных группах по сравнению с контролем, что соответствует достоверно более низкой балльной оценке микроскопических изменений в пищеводе.

Следовательно, в условиях проведенных экспериментов каскатол и селенит натрия оказывали ингибирующее влияние на химически индуцированный канцерогенез пищевода, что проявилось в достоверном снижении частоты возникновения, множественности и степени малигнизации неопластических изменений. Специфический эффект был наиболее выражен при одновременном применении каскатола с селенитом натрия в режиме доз в 2 раза меньших, чем при их раздельном использовании.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В условиях проведенного эксперимента показано, что комплексное применение каскатола с селенитом натрия расширяет спектр антиканцерогенной активности исследуемых микронутриентов и позволяет достичь более выраженный химиопрофилактический эффект при минимальном риске развития побочных эффектов. По данным Института питания РАМН, дефициты витаминов и минералов у жителей России носят сочетанный характер, наблюдаются в течение всего года и затрагивают практически все возрастные и профессиональные группы во всех регионах страны [8; 9]. С учетом этого факта полученные нами данные позволяют рекомендовать клинические исследования эффективности профилактического применения комплекса витаминов Е, С, бета-каротина и селенита натрия в группах повышенного риска возникновения рака печени и пищевода: среди лиц, инфицированных вирусами гепатитов В и С, проживающих в регионах с повышенной частотой заболеваемости раком печени и пищевода, больных с предопухолевыми заболеваниями пищевода.

ЛИТЕРАТУРА

1. Беспалов В.Г., Александров В.А. Влияние селена на трансплацентарный канцерогенез // Вопр. онкологии. - 1984. - № 9. - С. 81-84.

2. Бирк Р.В., Килъдема Л.А., Террас Л.Э. Влияние аскорбиновой кислоты на гепатоканцерогенное действие К-нитрозодиэтиламина // Эксперимент. онкология. - 1985. - Т. 7, № 5. - С. 24-27.

3. Болиева Л.З., Чочиева А.Р., Джиоев Ф.К., Алборова Б.Г. Влияние микронутриентов с антиокси-дантной активностью на возникновение опухолей молочной железы, индуцированных у крыс МНМ // Известия ВУЗов. Северо-Кавказский регион. Естественные науки. Спецвыпуск. Вопросы клинической медицины. - 2006. - С. 5-8.

4. Букин Ю.В. Молекулярно-биологические основы и перспективы витаминопрофилактики рака // Вопр. онкологии. - 1986. - № 11. - С. 35-49.

5. Букин Ю.В. Витамины и бета-каротин в профилактике злокачественных новообразований (итоги и перспективы) // Вопр. питания. - 1993. - № 4. - С. 9-12.

6. Джиоев Ф.К. Канцерогенные N-нитрозо-соединения — действие, синтез, определение. - Таллин: Балтия, 1973. - С. 42-43.

7. Коростелев С.А. Фармакология и механизм антиканцерогенного действия каротиноидов // Автореферат дисс. ... д-ра. мед. наук. М., 2002. - 41 с.

8. Спиричев В.Б. Сколько витаминов человеку надо? - М.: Медицина, 2000. - 112 с.

9. Тутелъян В.А. Микронутриенты в питании здорового и больного человека. - М.: Медицина, 2002. -225 с.

10. Тутелъян В.А., Княжев В.А., Хотимченко С.А. и др. Селен в организме человека: метаболизм, анти-оксидантные свойства, роль в канцерогенез. - М.: Издательство РАМН, 2002. - 224 с.

11. Шелепова В.М., Шашкин П.Н., Шашкина М.Я. и др. К вопросу о биологической доступности бета-каротина // Вопр. мед. химии. - 1992. - № 6. - С. 25-27.

12. Шеренешева Н.И., Финъко В.Е., Шелепова В.ММодифицирующий эффект каротиноидов на канцерогенезе преджелудка крыс, индуцированный N-метил^-нитро-№нитрозогуанидином // Вопр. мед. химии. - 1992. - Т. 38, № 6. - С. 21-23.

13. Horvath P.M., Ip C. Synergetic effect of vitamin E and selenium in the chemoprevention of mammary carcinogenesis in rats // Cancer Res. - 1983. - Vol. 43. - P. 5335-5341.

14. IARC Handbooks of Cancer Prevention. Vol. 2, Carotenoids. - Lyon, IARC, 1998. - 326 p.

15. Kelloff G.J., Boone C.W., Steele V.E. et al. Mechanistic considerations in the evaluation of chemo-preventive data // Principles of Chemoprevention. - Lyon, IARC Sci. Publ. - 1996. - № 139. - P. 203-219.

16. Reddy B.S. Micronutrients as Chemopreventive agents // Principles of Chemoprevention. - Lyon, IARC Sci. Publ. - 1996. - № 139. - P. 221-235.

Поступила 20.07.2006.