СПОСОБ ПРОВЕДЕНИЯ ИММУНОХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО АНАЛИЗА С ДИССОЦИИРУЮЩЕЙ ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ МЕТКОЙ
METHOD FOR CARRYING OUT IMMUNOCHROMATOGRAPHIC ASSAY WITH DISSOCIATING FLUORESCENT TAG

Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии и представляет собой способ иммунохроматографического анализа с диссоциирующей флуоресцентной меткой.
Иммунохроматографический способ оценки содержания различных соединений широко используется в практике медицинской диагностики [Raphael С. Wong l Harley Y. Tse (Editors) (2009) Lateral Flow Immunoassay. Springer, USA].
Иммунохроматографический анализ может быть реализован в нескольких вариантах. Рассмотрим в общем виде схему «сэндвич»-формата иммунохроматографии как одного из наиболее часто используемых. Проба, потенциально содержащая определяемое соединение, под действием капиллярных сил перемещается вдоль тест-полоски. При этом она вначале взаимодействует с меченым компонентом (чаще всего антителами против определяемого соединения), затем фронт жидкости преодолевает участок (аналитическую зону) с иммобилизованным компонентом, связывающим определяемое соединение. Степень связывания метки в аналитической зоне и, соответственно, интенсивность окрашивания мембраны определяются концентрацией аналита в пробе. Основными преимуществами иммунохроматографического анализа являются быстрота получения результата (5-15 мин) и возможность бесприборной детекции. В качестве метки в подавляющем большинстве случаев используются частицы коллоидного золота. [Babacar Ngom & Yancheng Guo & Xiliang Wang & Dingren Bi. (2010) Development and application of lateral flow test strip technology for detection of infectious agents and chemical contaminants: a review // Anal Bioanal Chem 397:1113-1135]. Однако если требуется повысить чувствительность анализа, используются другие маркеры, например флуоресцентные красители [Yoo, Jisun, Jung, Young Мее, Hahn, Jong Hoon, Pyo, Dongjin (2010) 'QUANTITATIVE ANALYSIS OF A PROSTATE-SPECIFIC ANTIGEN IN SERUM USING FLUORESCENCE IMMUNOCHROMATOGRAPHY', Journal of Immunoassay and Immunochemistry, 31:4, 259-265]. Хотя в таком случае для регистрации сигнала требуется дополнительное оборудование, данный подход позволяет сочетать быстроту получения результата (благодаря использованию принципа иммунохроматографии) и высокочувствительную детекцию (благодаря низкому пределу обнаружения флуоресцентного красителя).
3+
3+
3+
3+
По сравнению с органическими флуоресцентными красителями флуоресцентные лантанидные (Eu, Sm, Tb, Dy, …) комплексы обладают такими преимуществами, как длительное время жизни флуоресценции (до 1000 микросекунд), большой стоксовский сдвиг (>250 нм), узкий профиль эмиссии, что позволяет применять их в методе микросекундной спектроскопии с временным разрешением [Yuan J., Wang G. (2005) Lanthanide complex-based fluorescence label for time-resolved fluorescence bioassay. J. Fluorescence, 15, 559-568].
Флуоресцентные метки на основе лантанидных комплексов успешно используют в высокочувствителых разрешенных во времени флуоресцентных иммунологических методах. Благодаря тому, что технология регистрации сигнала с временным разрешением позволяет легко отделить специфический долгоживущий флуоресцентный сигнал метки от короткоживущих фоновых шумов в биопробах и избавиться от эффектов светорассеяния (рассеяния Тиндалля, Релея и Рамана), предел детекции метода значительно повышается [Yuan J., Wang G. (2005) Lanthanide complex-based fluorescence label for time-resolved fluorescence bioassay. J. Fluorescence, 15, 559-568.], [Hemmila I. (1985) Fluoroimmunoassays and immunofluorometric assays. Clin. Chem., 31, 359-370].
Формирование комплексов с некоторыми органическими лигандами значительно усиливает флуоресценцию ионов лантаноидов. После поглощения света лигандом происходит эффективный перенос энергии с возбужденного синглетного энергетического уровня через триплетный уровень на резонансный энергетический уровень металла [Ferrari М., Ozkan М. and Heller М.J. (2007) BioMEMS and Biomedical Nanotechnology. Volume II: Micro/Nano Technologies for Genomics and Proteomics. - Springer US].
15
-1
Для диссоциативного метода анализа используют первичные комплексы полиаминополикарбоксилатных хелаторов с лантанидами, которые демонстрируют высокую стабильность и растворимость в воде. Большая часть комплексонов образует лантанидные хелаты с константами связывания порядка 10 M. Для конъюгирования метки с антителами в структуре комплексона присутствует соответствующая химическая группа, такая как, например, диазофенил-ЭДТА или аминофенил-ЭДТА. Эти комплексоны хорошо подходят для диссоциативного анализа с последующим усилением флуоресценции посредством добавления β-дикетонатов. На этом принципе построена система анализа DELFIA (Dissociative-Enhansed Lanthanide Fluorescence Immunoassay). В этой системе европий диссоциирует из комплексона (ИТЦ-ДТТА-Eu) в кислой среде, а затем измеряется флуоресценция хелата Eu с β-дикетон-три-н-октилфосфином в мицеллярном водном растворе [Yuan J., Wang G. (2005) Lanthanide complex-based fluorescence label for time-resolved fluorescence bioassay. J. Fluorescence, 15, 559-68].
Для регистрации флуоресценции лантанидных комплексов используют метод флуориметрии с временным разрешением. После краткосрочного облучения образца люминесценция всех молекул и кюветы (планшета) начинает экспоненциально расти. Короткоживущая фоновая флуоресценция быстро убывает и не мешает измерению флуоресценции метки. Это позволяет измерять исключительно долгоживущую флуоресценцию лантанидной метки. Обычно проводят множество циклов измерений для одного образца (в течение 1 с), что улучшает соотношение сигнал/шум при подсчетах [Hemmila I. (1985) Fluoroimmunoassays and immunofluorometric assays. Clin. Chem., 31, 359-70].
Несмотря на отмеченные выше достоинства диссоциирующих лантанидных меток, ранее данный подход не применялся для усиления сигнала в иммунохроматографических системах.
Если детекция сигнала метки производится не с поверхности мембраны, а из раствора, то в объеме раствора можно создать оптимальные условия для флуоресценции метки, а так же устранить экранирование светового сигнала мембраной тест-полоски. Для этого заявителями предлагается после проведения иммунохроматографического анализа экстрагировать связанные в аналитической зоне молекулы метки и проводить приборную регистрацию активности флуоресцентной метки в объеме экстрагирующего раствора.
Достоинства, сформулированные выше, подтверждены экспериментально и демонстрируются приведенным ниже примером.
Пример:
Определение концентрации моноклональных антител HTM81 против рекомбинантного антигена 38 кДа Mycobacterium tuberculosis.
1. Получение конъюгата антител с ИТЦ-ДТТА-Eu
Для конъюгации использовали набор «DELFIA Eu-Labelling kit 1244-302» производства компании PerkinElmer™ (Wallac Oy, Финляндия), содержащий:
1
1
2
3
4
3+
1) «Eu-labelling reagent» - 0,2 мг (300 нм) N-(п-изотиоцианатобензил)-диэтилентриамин-N,N,N,N-тетраацетат Eu(ИТЦ-ДТТА-Eu), лиофилизированный.
2) Усиливающий раствор «DELFIA Enhancement Solution)) - Тритон-X100, уксусная кислота и хелаторы.
3
2 мг моноклональных антител (мАт) ТВ38 с1.81 в 1 мл 0.1 М карбонатного буфера, pH 8.5 (антитела переводили в буфер диализом в течение 35 мин) перемешивали с 0.2 мл 7.5 мМ водного раствора «Eu-labelling reagent» (ИТЦ-ДТТА-Eu, 500-кратный избыток). Смесь оставляли на ночь при +4°C. Очистку конъюгата мАт-ИТЦ-ДТТА-Eu проводили методом гель-фильтрации с использованием колонки 1.5×28 см с носителем Sephadex G-50, уравновешенной 50 мМ трис-HCl с 0.15 М NaCl и 0.05% NaN, pH 7.75.
Оптическую плотность полученных фракций измеряли на спектрофотометре Shimadzu 1202 при длине волны 280 нм. Для определения количества включившейся метки аликвоты антител разводили в усиливающем растворе в соотношении 1:10000 до конечного объема 200 мкл в лунках микропланшета, инкубировали 2 мин, а затем регистрировали флуоресценцию на планшетном ридере EnSpire 2300 производства компании PerkinElmer™.
2. Определение количества антител, меченных ИТЦ-ДТТА-Eu, с использованием усиления флуоресценции
3+
1
1
2
3
3
3+
3+
3
2
В методе использовали хелат Eu с N(п-изоцианатбензил)диэтилен триамин-N,N,N,N-тетрауксусной кислоты (ИТЦ-ДТТА-Eu) в качестве метящего реагента. К препарату меченых антитела или конъюгата антител с КЗ добавляли растор β-дикетона (2-нафтилтрифлуороацетон β-NTA) и слабокислый усиливающий флуоресценцию раствор (pH 3,2), содержащий триоктилфосфиноксид (ТОРО) и Тритон Х-100. Ион Eu из меченого агента переходил в раствор и связывался с лигандом. При этом раствор превращался в сильно флуоресцирующий мицеллярный раствор, содержащий Eu(β-ИТА)(ТОРО) хелат, флуоресценцию которого измеряли методом флуорометрии с временным разрешением на приборе Wallac 1234 Fluorimetr (Perkin Elmer, Финляндия) [Ferrari M., Ozkan M., Heller M.J. (2007) BioMEMS and Biomedical Nanotechnology. Volume II: Micro/Nano Technologies for Genomics and Proteomics. - Springer US]. Параметры регистрации флуоресценции Eu: время задержки 0.1 мс, частота вспышки 1 мс, время считывания сигнала 0.4 мс, возбуждение на 340 нм и регистрация флуоресценции на 615 нм.
Построение калибровочного графика для определения количества связавшейся метки на молекулу антитела. Меченые антитела (объемом 2-20 мкл, концентрация 1-100 мкг/мл) разводили в усиливающем растворе до конечного объема 200 мкл в лунках разборного прозрачного микропланшета из набора «DELFIA Eu-Labelling kit 1244-302», инкубировали 10 мин при комнатной температуре, затем измеряли флуоресценцию. Содержание антител во фракциях и количество включившейся метки в полученных препаратах меченых антител рассчитывали по следующим формулам:
<mrow><mi>C</mi><mrow><mo>(</mo><mrow><mi>E</mi><msup><mi>u</mi><mrow><mn>3</mn><mo>+</mo></mrow></msup></mrow><mo>)</mo></mrow><mo>=</mo><mfrac><mrow><msub><mi>E</mi><mrow><mn>613</mn></mrow></msub><mo>∗</mo><mi>A</mi></mrow><mrow><mn>1000</mn><mo>∗</mo><mi>B</mi></mrow></mfrac><mrow><mo>(</mo><mrow><mi>м</mi><mi>к</mi><mi>М</mi></mrow><mo>)</mo></mrow></mrow>
,
где A=10000 - фактор разведения;
3+
B=1000000 - сигнал стандартного препарата 1 нМ Eu;
<mrow><msub><mi>C</mi><mn>1</mn></msub><mrow><mo>(</mo><mrow><mi>м</mi><mi>А</mi><mi>т</mi></mrow><mo>)</mo></mrow><mo>=</mo><mfrac><mrow><msub><mi>A</mi><mrow><mn>280</mn></mrow></msub><mo>−</mo><mn>0,008</mn><mo>∗</mo><mi>C</mi><mrow><mo>(</mo><mrow><mi>E</mi><msup><mi>u</mi><mrow><mn>3</mn><mo>+</mo></mrow></msup></mrow><mo>)</mo></mrow></mrow><mrow><mn>1,34</mn></mrow></mfrac><mrow><mo>(</mo><mrow><mi>м</mi><mi>г</mi><mo>/</mo><mi>м</mi><mi>л</mi></mrow><mo>)</mo></mrow></mrow>
;
<mrow><msub><mi>C</mi><mn>2</mn></msub><mrow><mo>(</mo><mrow><mi>м</mi><mi>А</mi><mi>т</mi></mrow><mo>)</mo></mrow><mo>=</mo><mfrac><mrow><msub><mi>C</mi><mn>1</mn></msub><mrow><mo>(</mo><mrow><mi>м</mi><mi>А</mi><mi>т</mi></mrow><mo>)</mo></mrow><mo>∗</mo><mn>1000000</mn></mrow><mrow><mn>160000</mn></mrow></mfrac><mrow><mo>(</mo><mrow><mi>м</mi><mi>к</mi><mi>М</mi></mrow><mo>)</mo></mrow></mrow>
;
где 1,34 - поглощение 1 мг/мл антител при 280 нм, 160000 - молекулярная масса IgG, 0,008 - поглощение 1 мкМ хелатного комплекса европия при 280 нм.
Соотношение количества связавшейся метки к количеству антител составило 0,57.
3+
3. Построение калибровочного графика для определения концентрации меченых антител, иммобилизованных на иммунохроматографической мембране, по флуоресценции Eu
Антитела наносили на рабочую мембрану CNPC-SN12 L2-P25 (размер пор 15 мкм) «mdi Easypack» фирмы «Advanced Microdevices» (Индия). Затем отрезали участок рабочей мембраны с иммобилизованными антителами и помещали в эппендорф, заполняли эппендорф 100 мкл усиливающего раствора «DELFIA Enhancement Solution», инкубировали 2 мин, отбирали аликвоты 50 мкл и регистрировали флуоресценцию на планшетном ридере EnSpire 2300 производства компании PerkinElmer™.
Калибровочная кривая определения антител представлена на чертеже.
-12
Предел детекции согласно существующим рекомендациям [Бурдун Г.Д., Марков Б.Н. (1975) Основы метрологии, 2-е изд., М.], [Чарыков А.К. (1984) Математическая обработка результатов химического анализа, Л.] определяли как концентрацию, дающую значение сигнала, равное фоновому сигналу (640 единиц) плюс 3 стандартных отклонения фонового сигнала (3·197 единиц). Предел детекции антител составил 0,9 нг/мл, что соответствует пределу детекции метки 3,1·10М с учетом отношения количества связавшейся метки к количеству антител.
4. Определение предела детекции коллоидного золота, как метки в иммунохроматографическом анализе (для сравнения пределов детекции двух меток)
-10
На иммунохроматографическую мембрану CNPC-SN12 L2-P25 наносили растворы, представляющие собой ряд разведений частиц коллоидного золота размером 25 нм. Затем сканировали изображение тест-полоски и оцифровывали, количественно оценивая интенсивность окраски коллоидного золота на мембране с помощью программы «Nonlinear Dynamics TotalLab TL120 v2009». Как и в случае с флуоресцентной меткой, предел детекции определяли как концентрацию метки, дающую интенсивность окрашивания, на три стандартных отклонения превышающую фоновый сигнал. Предел детекции коллоидного золота составил 1,3·10М, что (при соотношении 1 антитело на 1 частицу коллоидного золота) соответствует пределу детекции антител, равному 20 нг/мл.
Таким образом, предел детекции антител при использовании диссоциирующей флуоресцентной метки более чем в 20 раз ниже, чем при использовании традиционной метки - коллоидного золота (0,9 нг/мл и 20 нг/мл соответственно).
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
3+
.
Чертеж. Калибровочный график для определения концентрации меченых антител, иммобилизованных на иммунохроматографической мембране, по флуоресценции Eu