КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ, ЗАМЕДЛЕНИЯ ИЛИ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ У ЖИВОТНОГО СЛАБОУМИЯ, СТАРЕНИЯ МОЗГА, КОГНИТИВНОГО НАРУШЕНИЯ, ИНСУЛЬТА ИЛИ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ (ВАРИАНТЫ)
COMPOSITION FOR THERAPY, DELAY OR PREVENTION OF DEMENTIA, BRAIN AGEING, COGNITIVE DETERIORATION, APOPLECTIC ATTACK OR ALZHEIMER DESEASE WITH ANIMALS AND USAGE OF COMPOSITION (VERSIONS)

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение касается пищи млекопитающих и ее влияния на усиление целостности сосудов и защиту клеток от повреждения, связанного с ишемией или ишемическим приступом в мозге. В частности, настоящее изобретение использует комбинации соединений, высвобождающих оксид азота, длинноцепочечных полиненасыщенных жирных кислот и, не обязательно, других компонентов, включая антиоксиданты, противовоспалительные агенты, факторы роста и витамины группы В, которые вводятся как часть регулярной диеты для улучшения целостности сосудов, повышения выживания клеток и, таким образом, уменьшения ишемического повреждения в мозге и/или других органах, например в случае ишемии мозга.
Предшествующий уровень техники, к которому относится изобретение
Различные публикации, включая патенты, опубликованные заявки на изобретения, технические статьи и академические статьи, цитируются всюду в тексте описания. Каждая из этих процитированных публикаций включается в настоящую заявку во всей своей полноте путем отсылки.
Гипоксическое повреждение головного мозга происходит в результате уменьшенного снабжения мозга кислородом из-за временного или постоянного сокращения или прекращения притока крови к мозгу. Ишемия мозга приводит к инсульту с последующим апоптозом и некрозом мозговой ткани, что приводит к инфаркту. Подобно сердечно-сосудистой ишемии, ишемия мозга может быть вызвана различными факторами, такими как кровяные сгустки, тромбоз, эмболия, блокирование кровеносных сосудов атеросклеротическими бляшками или другими преградами. Гиперхолестеринемия, гипертония, диабет и тучность, среди других факторов, были идентифицированы как факторы риска для ишемических инсультов. Ишемические инсульты являются ведущей причиной смерти людей во всем мире, а также затрагивают других животных, включая домашних животных.
Известно, что ишемические повреждения также вносят значительный вклад в старение мозга и слабоумие. Слабоумие представляет собой главную болезнь, затрагивающую популяцию пожилых людей. Уровень слабоумия увеличивается от примерно 0,3-1% у людей в возрасте 60-64 лет до 50% у людей старше, чем 95 лет, с распространенностью, удваивающейся каждые 5 лет (McDowell, I., Aging (Milano) 13: (2001) 143-162). Среди населения стран Запада Болезнь Альцгеймера (AD) рассматривается в качестве главной формы слабоумия, в то время как сосудистое слабоумие (VD), вероятно, является преобладающей формой среди населения стран Востока (Fratiglioni, L. et al., Drugs Aging (1999) 15: 365-375; Ott, A., et al., The Rotterdam Study, BMJ (1995) 310: 970-973). Увеличивающееся число доказательств указывает, что сосудистое слабоумие и Болезнь Альцгеймера часто сосуществуют среди населения, страдающего слабоумием. Например, Kalaria (Neurobiol Aging (2000) 2k 321-330) сообщает, что примерно 90% пациентов с AD имели церебрально-сосудистые патологии и примерно 30% пациентов с VD имели AD патологию. Сосуществование церебрально-сосудистого повреждения и AD у слабоумных пожилых людей было подтверждено Snowdon et al. (J. Am. Med. Soc. (1997) 277:813-817). Кроме того, было установлено, что признаки патологического диагноза AD (амилоидные образования и нейрофибриллярные клубки) присутствуют у пожилых людей, не страдающих слабоумием (Snowdon et al., 1997, supra). Эти данные позволяют предположить, что наличие амилоидных образований и нейрофибриллярных клубков является недостаточным, чтобы вызвать слабоумие у пациентов с AD, что подчеркивает существенный вклад мозговых ишемических повреждений в старение мозга и развитие и прогрессирование как VD, так и AD (Korczyn, A.J. Neurol Sci. (2005) 230: 3-6). Таким образом, предотвращение вызванного ишемией повреждения мозга и апоптоза нейронов у людей и животных может задержать старение мозга, уменьшить риск когнитивного нарушения и задержать развитие слабоумия.
Ишемия может возникнуть в любой ткани, но наиболее часто она связана с повреждением мозга, сердца или почек. Как обсуждалось выше, ишемия в мозге может вызвать острое повреждение, например инсульт, или хронические нарушения, такие как слабоумие и связанные с ним состояния. В сердце ишемические приступы могут привести к остановке сердца; аналогично этому почечная недостаточность может быть результатом ишемических событий в почке.
Во время ишемического инсульта или приступов ишемии в мозговой или любой другой ткани в кровеносных сосудах происходят биохимические реакции, которые могут привести к отеку, геморрагической трансформации и дальнейшему нарушению в затронутой ткани, например к неврологическому нарушению. Таким образом, лечение и защита кровеносных сосудов были идентифицированы в качестве потенциального пути исследования острого ишемического инсульта для разработки новых методов лечения. Более того, защита сосудов играет важную роль в уменьшении повреждения ткани, которое происходит в результате приступа ишемии.
Установлено, что эндотелий сосудов выполняет разнообразные регуляторные функции, включая модуляцию тонуса сосудов, воспаление и гомеостаз, путем поддерживания неадгезивной антитромботической поверхности (Boak, L., et al., Cur. Vase. Pharmacol. (2004) 2:45-52). Гомеостаз сосудов отчасти является функцией сокращения и расслабления гладких мышц сосудов, которые опосредуются множеством факторов, включая свободный радикал оксида азота (NO), который является сильным релаксантом гладких мышц сосудов.
NO производится тремя различными ферментами - NO-синтетазами (NOS): нейрональными NOS (nNOS), которые локализованы преимущественно в нервной ткани и генерируют NO для передачи нервного возбуждения; индуцибельными NOS (iNOS), которые найдены прежде всего в макрофагах и могут отвечать на провоспалительные медиаторы; и эндотелиальными NOS (eNOS), которые продуцируются клетками эндотелия, такими как клетки, найденные в эндотелии сосудов (Michel, Т., et al. J. Clin. Invest. (1997) 100: 2146-2152, Moncada, S., et al. Pharmacol. Rev. (1991) 43: 109-142 и Nathan, С. (1992) FASEBJ6: 3051-3064). Продуцируемый eNOS NO играет главную роль в расширении кровеносных сосудов (вазодилатации), пролиферации гладких мышц, регуляции артериального давления крови и обладает антикоагулянтным и противовоспалительным действием за счет ингибирования адгезии и агрегации тромбоцитов и лейкоцитов (Gewaltig, М.Т., et al. Cardiovasc. Res. (2002) 55:250-260, De Graaf, J.C. et al. Circulation (1992) 85:2284-2290, Freedman, J.E., et al. Circ. Res. (1999) 84: 1416-1421, Furchgott, R.F., et al. FASEB J (1989) 3:2007-2018, Gaboury, J., et al. Am J Physiol. Heart. Circ. Physiol. (1993) 265: H862-H867 and Kubes, P., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88:4651-4655). Снижение продукции NO во время длительной ишемии было связано с повреждением эндотелия (Laude, L., et al. Braz. J. Med. Biol. Res. (2001) 34:1-7).
2
Ферменты NOS окисляют L-аргинин до цитруллина, что приводит к образованию NO как побочного продукта. Таким образом, было высказано предположение, что введение предшественников NO, таких как L-аргинин, может улучшить здоровье сосудов и может облегчить восстановление сосудов при болезненных состояниях. Действительно, было показано, что введение аргинина в качестве диетической добавки приводило к восстановлению вазодилатации и улучшало коронарное кровообращение в моделях на животных и у пациентов-людей с гиперхолестеринемией, а также увеличивало общую эндотелиальную функцию у пациентов с болезнью коронарных артерий (Boak, L., et al. 2004). Кроме того, было также установлено, что введение L-аргинина в качестве обогащающей добавки увеличивало уровни NO и уменьшало опосредованное свободными радикалами O повреждение миокарда у пациентов-людей. (Kiziltepe, U., et al. Int. J. Cardiol. (2004) 97:93-100). Более недавние исследования показали, что введение аргинина в качестве обогащающей добавки облегчает восстановление эндотелия в кишечнике крыс после искусственной ишемии и последующей реперфузии кишечника (Sukhotnik, I., et al., Pediatr. Surg. Int. (2005) 3:191-196). Таким образом, введение предшественников NO, таких как L-аргинин, может применяться для активации и защиты эндотелиальных клеток, особенно в отношении клеток эндотелия сосудов.
Были также установлено, что жирные кислоты модулируют активацию эндотелиальных клеток. Было обнаружено, что введение длинноцепочечных полиненасыщенных жирных кислот (ДЦПНЖК) ингибирует адгезию лимфоцитов к клеткам эндотелия сосудов (Khalfoun, В., et al. Transplantation (1996) 62:1649-1657). Дальнейшие исследования показали, что введение ДЦПНЖК уменьшает экспрессию эндотелиальными клетками молекул адгезии и цитокинов в ответ на возбуждение, что позволяет предполагать, что ДЦПНЖК обладают антиатерогенными и противовоспалительными свойствами (De Caterina, R., et al. Am. J. Clin. Nutr. (2000) 71 (suppl) 213S-223S). Приведенное доказательство показывает, что регулярное потребление ДЦПНЖК, в частности n-3 жирных кислот, защищает сердечно-сосудистую систему, уменьшает формирование атеросклеротических бляшек и уменьшает риск смерти от сердечно-сосудистой болезни, в частности после инфаркта миокарда (Calder, P.С. Clin. Sci. (Lond). 2004 107:1-11). В отличие от этого, было проведено только небольшое количество исследований влияния принимаемых с пищей ДЦПНЖК на сосуды и ткань мозга, особенно в отношении приступов ишемии в мозге.
Давно известно, что в процесс старения вовлечены окислительный стресс и окислительное повреждение. Также было установлено, что окислительный стресс играет важную роль в патогенезе многих нейродегенеративных болезней, включая Болезнь Альцгеймера и определенные формы слабоумия (например, Smith, M.A., Dementia & Geriatric Cognitive Disorders (1999), Vol.10, Supp.1). Соответственно этому, дополнительное введение антиоксидантов использовалось для замедления процесса старения и защиты против дегенеративных эффектов окислительного стресса. Аналогично этому, витамины группы В - фолиевая кислота, витамин В6 и витамин В12 - являются важными для здоровья и нормального функционирования мозга. У пожилых людей статус этих витаминов часто нарушен, и эти нарушения могут привести к гипергомоцистеинемии, недавно идентифицированному фактору риска для развития атеросклероза (Temple M.E., et al., Ann Pharmacother 2000; 34:57-65; Hankey G.J., et al., Lancet 1999; 354:407-413) и болезни Альцгеймера (Clarke R., et al., Arch Neurol 1998; 55:1449-1455). Эти нарушения могут привести к ишемии мозга или других тканей вследствие окклюзивной болезни сосудов, инсульта или тромбоза.
Сущность изобретения
Один аспект настоящего изобретения предоставляет композицию, включающую одну или более длинноцепочечную полиненасыщенную жирную кислоту (ДЦПНЖК) и одно или более соединение, высвобождающее оксид азота (NORC), в количестве, эффективном для повышения целостности сосудов, например в мозге, и/или подавления апоптоза у животного. Повышенная целостность сосудов, например в мозге, и/или повышенное выживание клеток обеспечивают уменьшение ишемического повреждения в тканях, например в мозге, в случае приступа ишемии и может также обеспечить защитный эффект против первоначального возникновения таких ишемических приступов.
В определенных воплощениях композиция представляет собой композицию корма для животных, диетическую добавку или пищевой продукт, предназначенный для потребления человеком. В различных воплощениях ДЦПНЖК включают, по меньшей мере, одну из арахидоновой кислоты, эйкозапентаеновой кислоты, докозапентаеновой кислоты или докозагексаеновой кислоты, и NORC включают, по меньшей мере, одно из L-аргинина или его производных. Композиции могут включать дополнительные компоненты. Например, могут быть включены один или более антиоксидантов, витамины группы В, факторы роста клеток или противовоспалительные вещества.
В определенных воплощениях композиции приготовлены для домашних животных, таких как собака или кошка. В других воплощениях композиции приготовлены для употребления человеком.
Другой аспект настоящего изобретения предоставляет способ для увеличения целостности сосудов и/или уменьшения вызванного ишемией повреждения головного мозга у животного, включая введение животному на регулярной основе композиции, включающей одну или более ДЦПНЖК и одно или более NORC, необязательно с добавлением дополнительных компонентов, как описано выше, в количестве, эффективном для повышения целостности сосудов в ткани(ях) животного и/или уменьшения вызванного ишемией повреждения головного мозга в случае приступа ишемии в мозге животного. В определенных воплощениях способ применяется к домашнему животному, такому как собака или кошка. В других воплощениях способ применяется к людям.
В определенных воплощениях регулярное введение композиции животному приводит к снижению повреждения головного мозга в случае приступа ишемии в мозге животного, или это приводит к замедлению старения мозга у животного. В другом воплощении регулярное введение композиции животному приводит к подавлению апоптоза клеток в очаге ишемии, происходящей у животного, которая (ишемия) может происходить в любой ткани, включая мозг, сердце и почки.
Другие особенности и преимущества настоящего изобретения станут очевидными при обращении к фигурам, из подробного описания изобретения и примеров, которые приведены ниже.
Краткое описание чертежей
Фиг.1. Гистограмма, демонстрирующая влияние контрольной и опытных диет на объем ишемического поражения у всех крыс, подвергнутых кратковременной мозговой ишемии. Составы контрольной и опытных диет описаны в примере 1 (*р 0,01 по сравнению с контролем).
Фиг.2. Гистограмма, демонстрирующая влияние контрольной и опытных диет на объем ишемического поражения у крыс, демонстрирующих повреждения кратковременной мозговой ишемии. Составы контрольной и опытных диет описаны в примере 1 (*р<0,01 по сравнению с контролем).
Фиг.3. Гистограмма, демонстрирующая влияние контрольной и опытных диет на индуцируемый ишемией апоптоз в мозге крыс. Составы контрольной и опытных диет описаны в примере 1 (*р<0,01 по сравнению с контролем).
Фиг.4. График, показывающий корреляцию между объемом ишемического поражения (ось X) и процентом апоптозных клеток, выявленных при окрашивании TUNEL (ось Y), у крыс, подвергнутых кратковременной мозговой ишемии. Составы контрольной и опытных диет описаны в примере 1.
Подробное описание изобретения в иллюстративных воплощениях
Определения
Различные термины, касающиеся способов и других аспектов настоящего изобретения, используются всюду по тексту описания и в формуле изобретения. Эти термины имеют свое обычное значение, применяемое в данной области техники, если не указано иначе. Другие специфически определяемые термины должны толковаться в манере, совместимой с предоставляемым здесь определением.
Следующие сокращения могут использоваться в спецификации и примерах: АК, арахидоновая кислота; АЛК, альфа-линолевая кислота; ANOVA, дисперсионный анализ; ДГК, докозагексаеновая кислота; DM, сухое вещество; ДПК, докозапентаеновая кислота; ЭПК, эйкозапентаеновая кислота; ЛК, линолевая кислота; ДЦПНЖК, длинноцепочечная полиненасыщенная жирная кислота; NORC, соединение, высвобождающее оксид азота; L-Arg, L-аргинин.
В контексте данной спецификации термин "примерно" интерпретируется для обозначения произвольно плюс или минус 20%; более предпочтительно произвольно плюс или минус 10%; еще более предпочтительно произвольно плюс или минус 5%; наиболее предпочтительно произвольно плюс или минус 2%.
"Эффективное количество" обозначает количество соединения, материала или композиции, как описано здесь, которое является эффективным для достижения специфического биологического результата. Такие результаты включают, но ими не ограничиваются, увеличение целостности сосудов или уменьшение ишемического повреждения головного мозга. Такая эффективность может быть достигнута, например, путем введения композиции настоящего изобретения животному.
Термин "целостность сосудов" обозначает здоровье кровеносных сосудов в целом у животного, включая, без ограничения, здоровые тонус сосудов и их структуру, здоровый рост сосудов, здоровое сокращение и расслабление, пониженную проницаемость, пониженную пролиферацию, пониженное воспаление, пониженную адгезию клеток и/или тромбоцитов, поддержание нормального давления крови и кровотока и т.п. "Повышенная целостность сосудов" обозначает любое улучшение здоровья кровеносных сосудов в целом у животного, что может быть измерено любым подходящем методом из данной области техники.
В используемом здесь значении термин "длинноцепочечная полиненасыщенная жирная кислота", или "ДЦПНЖК", обозначает любую монокарбоновую кислоту, имеющую, по меньшей мере, 20 углеродных атомов и, по меньшей мере, две двойных связи. Неограничивающие примеры ДЦПНЖК включают (n-6) жирные кислоты, такие как арахидоновая кислота, и (n-3) жирные кислоты, такие как кислота эйкозапентаеновая, докозапентаеновая кислота и докозагексаеновая кислота.
В используемом здесь значении термин "соединения, высвобождающие оксид азота", или "NORC", обозначают любое соединение, которое вызывает высвобождение свободного оксида азота у животного. Предпочтительные примеры таких соединений включают L-аргинин и аналоги или производные L-аргинина, такие как альфа-кетоглутарат аргинина, GEA 3175, нитропруссид натрия, глицерилтринитрат, S-нитрозо-N-ацетил-пеницилламин, нитроглицерин, S-NO-глутатион, NO-конъюгированные нестероидные противовоспалительные лекарства, такие как NO-напроксен, NO-аспирин, NO-ибупрофен, NO-диклофенак, NO-флурбипрофен и NO-кетопрофен, NO-выпускающий состав-7, NO-выпускающий состав-5, NO-выпускающий состав-12, NO-высвобождающее соединение-18, диазениумдиолаты и их производные, диэтиламин NONOaт или любое органическое или неорганическое соединение, биомолекула или аналог, гомолог, конъюгат или их производное, которое вызывает высвобождение свободного оксида азота у животного.
Термин "ишемия" обозначает любое уменьшение или прекращение кровоснабжения любого органа тела, ткани или части, вызванное любым сокращение или обструкцией кровеносного сосуда. "Приступ ишемии" обозначает любой временный или постоянный период ишемии.
Термин "кровеносные сосуды" обозначает любую сеть кровеносных сосудов в организме животного, кровеносные сосуды, включая, без ограничения, артерии, вены и капилляры.
Термин "клетки эндотелия сосудов" или "эндотелий сосудов" обозначает клетки, которые включают слой тонких, плоских клеток, которые выстилают внутреннюю поверхность кровеносных сосудов, формируя границу раздела между циркулирующей кровью в просвете сосуда и остальной частью стенки сосуда.
Настоящее изобретение касается любых животных, предпочтительно млекопитающих, более предпочтительно домашних животных и наиболее предпочтительно людей. "Домашнее животное" представляет собой любое одомашненное животное и включает, без ограничения, кошек, собак, кроликов, морских свинок, хорьков, хомячков, мышей, песчанок, лошадей, коров, коз, овец, ослов, свиней и т.п.
В используемом здесь значении термин "корм для животных" или "композиция корма для животных" обозначает композицию, которая предназначена для кормления животных, и предпочтительно домашних животных. "Полный и сбалансированный корм для животных" представляет собой такой корм, который содержит все известные необходимые питательные вещества в соответствующем количестве и пропорциях на основе рекомендаций признанных органов в области корма для домашних животных и который поэтому может применяться в качестве единственного источника пищи для поддержания жизни или обеспечения воспроизводства без добавления дополнительных источников пищи. Сбалансированные композиции корма для животных широко известны и широко используются в данной области техники.
В используемом здесь значении термин "диетическая добавка" представляет собой продукт, который предназначен для потребления в дополнение к нормальной диете животного.
В используемом здесь значении термин "пищевой продукт, приготовленный для употребления человеком" представляет собой любую композицию, предназначенную для употребления в пищу человеком.
Описание
Изобретатели заметили, что у собак вводимый в качестве добавки аргинин увеличивал экспрессию многих факторов роста и противовоспалительных белков дозозависимым способом. Многие из этих факторов роста, включая NGF, nIGF и BDNF, проявляют мощные нейрозащитные эффекты (Mattson, M.P. et al. Neurobiol. Aging. (2002) 23:695-705 and Kruttgen, A. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1998) 95:9614-9619). В дальнейших исследованиях на собаках с использованием естественных источников аргинина, включая корма из отходов производства сельди (содержащие рыбий жир, богатый ДЦПНЖК), изобретатели получили такой же или лучший результат, чем тот, который наблюдался при использовании чистого L-аргинина. Как подробно описано здесь в примерах, функциональные исследования временной мозговой ишемии в овариэктомизированной модели на крысах показали, что диета, содержащая комбинацию L-аргинина, рыбьего жира, антиоксидантов и витаминов группы В, заметно уменьшала мозговые повреждения и апоптоз, больше чем диеты, содержащие только один аргинин или только один рыбий жир. Соответственно этому различные аспекты настоящего изобретения используют эти открытия путем предоставления пищевых композиций и способов, чтобы улучшить целостность сосудов у животного и уменьшить ишемическое повреждение в случае ишемии у животного, например повреждение головного мозга в случае мозговой ишемии у животного.
Ожидается, что диетические композиции будут эффективны при различных ишемических ситуациях, включая, но ими не ограничиваясь, старение мозга (инсульты и мини-инсульты) и связанные нарушения, ишемические сердечные приступы, вызванную хирургическим вмешательством ишемию и реперфузию (пред- и постоперативное введение), вызванную диабетом периферическую ишемию, и, как альтернативу пост-менопаузы, лечение эстрогенами для снижения риска инсульта и сердечно-сосудистого заболевания у женщин в период после менопаузы.
В различных воплощениях композиции и способы настоящего изобретения применяют многокомпонентный подход к улучшению функциональной целостности сосудов, подавлению апоптоза и повышению выживания клеток после появления ишемии. Эти компоненты включают (1) повышение целостности и функции сосудов, (2) усиление восстановление клеток, (3) улучшение противовоспалительных эффектов, (4) оптимизацию клеточного метаболизма и (5) снижение окислительного стресса.
Композиции
Один аспект настоящего изобретения предоставляет композиции, включающие одну или более длинноцепочечную полиненасыщенную жирную кислоту (ДЦПНЖК) и одно или более соединение, высвобождающее оксид азота (NORC), в количестве, эффективном для повышения целостности сосудов у животных. ДЦПНЖК и NORC могут присутствовать в композиции как основной компонент или добавка. В предпочтительных воплощениях композиции ДЦПНЖК включают, по меньшей мере, одну из (n-3) жирных кислот, таких как АЛК, ЭПК, ДПК и ДГК, и NORC включают, по меньшей мере, одно из L-Arg и его производных. Такие композиции обогащают плазму крови ДЦПНЖК и NORC у животных, которым вводится композиция.
Композиции по настоящему изобретению могут включать различные дополнительные компоненты с целью обеспечения многокомпонентного подхода к повышению целостности сосудов и усилению выживания клеток при ишемии, как обсуждалось в общих чертах выше. Они включают антиоксиданты, витамины группы В, факторы роста и противовоспалительные вещества.
В одном предпочтительном воплощении композиции настоящего изобретения представляют собой композиции корма для животных. Они будут преимущественно включать корма и нутриенты, предназначенные для удовлетворения необходимых диетических потребностей, а также обработанные продукты (например, гранулированные корма) или другие диетические добавки. Композиции корма для животных не обязательно могут представлять собой сухую композицию (например, крупные гранулы), полувлажную композицию, влажную композицию или любую их смесь.
В другом предпочтительном воплощении композиции по настоящему изобретению представляют собой продовольственные продукты, приготовленные для употребления человеком. Они будут преимущественно включать пищевые продукты и нутриенты вещества, предназначенные для удовлетворения необходимых диетических потребностей человека, а также как другие диетические добавки, предназначенные для людей. В конкретном воплощении продовольственные продукты, приготовленные для употребления человеком, являются полными и сбалансированными продуктами.
В другом предпочтительном воплощении композиция представляет собой диетическую добавку, такую как соус, вода для питья, напиток, жидкий концентрат, йогурт, порошок, гранула, паста, суспензия, жевательная таблетка, легкая закуска, обработанный продукт, батончик, шарик, пилюля, капсула, таблетка или любая другая форма доставки. Диетические добавки могут быть специально приготовлены для употребления конкретным животным, таким как домашнее животное или человек. В одном конкретном воплощении диетическая добавка может включать высокую концентрацию ДЦПНЖК и NORC таким образом, чтобы добавку можно было вводить животному в небольших количествах или, альтернативно этому, чтобы добавку можно было разводить перед введением животному. Диетическую добавку может быть необходимо смешивать с водой перед введением животному.
Композиция может быть заморожена. ДЦПНЖК и NORC могут быть предварительно смешаны с другими компонентами композиции для обеспечения необходимых полезных количеств, могут быть нанесены в качестве оболочки на композицию корма для животного, диетическую добавку или пищевой продукт, приготовленный для употребления человеком, или могут быть добавлены к композиции перед введением ее животному, например, с использованием порошка или смеси.
Композиции по настоящему изобретению включают ДЦПНЖК и NORC в количестве, эффективном для повышения целостности сосудов у животного, которому эта композиция введена. Для кормов для животных и продовольственных продуктов, приготовленных для потребления человеком, количество ДЦПНЖК в процентах от всей композиции находится в диапазоне от примерно 0,1% до примерно 13% от сухой массы композиции, хотя может применяться и более высокое процентное содержание. В различных воплощениях это количество составляет примерно 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9%, 1,0%, 1,1%, 1,2%, 1,3%, 1,4%, 1,5%, 1,6%, 1,7%, 1,8%, 1,9%, 2,0%, 2,1%, 2,2%, 2,3%, 2,4%, 2,5%, 2,6%, 2,7%, 2,8%, 2,9%, 3,0%, 3,1%, 3,2%, 3,3%, 3,4%, 3,5%, 3,6%, 3,7%, 3,8%, 3,9%, 4,0%, 4,1%, 4,2%, 4,3%, 4,4%, 4,5%, 4,6%, 4,7%, 4,8%, 4,9%, 5,0% или больше, например, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13% или больше, от сухой массы композиции, и количество NORC в процентах от всей композиции находится в диапазоне от примерно 0,1% до примерно 12% от сухой массы композиции, хотя может применяться и более высокое процентное содержание. В различных воплощениях это количество составляет примерно 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9%, 1,0%, 1,1%, 1,2%, 1,3%, 1,4%, 1,5%, 1,6%, 1,7%, 1,8%, 1,9%, 2,0%, 2,1%, 2,2%, 2,3%, 2,4%, 2,5%, 2,6%, 2,7%, 2,8%, 2,9%, 3,0%, 3,1%, 3,2%, 3,3%, 3,4%, 3,5%, 3,6%, 3,7%, 3,8%, 3,9%, 4,0%, 4,1%, 4,2%, 4,3%, 4,4%, 4,5%. В определенном воплощении применяется 2-2,5% ДЦПНЖК и 2-2,5% чистого L-аргинина. Диетические добавки могут быть приготовлены таким образом, чтобы они содержали в несколько раз более высокие концентрации ДЦПНЖК и NORC для введения животному в форме таблетки, капсулы, жидкого концентрата или другой подобной дозированной формы или для разведения перед введением в воде, распыления или опрыскивания корма для животного и для других подобных способов введения.
В альтернативном воплощении количество ДЦПНЖК и NORC в композиции представляет собой функцию от количества, необходимого для достижения определенной концентрации ДЦПНЖК и NORC в сыворотке крови животного. Определенная концентрация ДЦПНЖК в сыворотке крови может быть рассчитана путем определения уровней ДЦПНЖК в сыворотке крови у животных, получивших рекомендуемое количество ДЦПНЖК и NORC, указанное выше, что легко может сделать специалист в данной области техники.
Источником каждой из ДЦПНЖК может быть любой подходящий источник, синтетический или натуральный. Предпочтительные источники ДЦПНЖК включают, но ими не ограничиваются, первоцвет (примулу), темно-зеленые овощи, такие как шпинат, водоросли и сине-зеленые водоросли, такие как спирулина, семена и масла растений, такие как льняное семя, рапс, соя, грецкий орех, тыква, сафлор, кунжут, зародыши пшеницы, подсолнечник, кукуруза и конопля, рыбу, особенно холодноводную рыбу, такую как лосось, тунец, макрель, сельдь, морской окунь, полосатый окунь (лаврак), акула, палтус, зубатка, сардины, креветки и моллюски и экстрагированные из них масла, или ДЦПНЖК могут быть синтезированы de novo согласно любым способам, применимым в данной области техники.
Источником каждого NORC может быть любой подходящий источник, синтетический или натуральный. Предпочтительные источники аргинина включают, но ими не ограничиваются, белки животных и растений. Неограничивающие примеры растений, содержащих особенно много аргинина, включают бобовые, такие как соя, люпин и плоды рожкового дерева, злаковые, такие как пшеница и рис, и фрукты, такие как виноград. Семена и орехи, такие как какао и арахис, также богаты содержанием аргинина. Неограничивающие примеры белков животных, содержащих особенно много аргинина, включает продукты из рыбы и домашней птицы. NORC могут быть синтезированы de novo согласно любым способам, применимым в данной области техники, или получены из коммерческих источников.
Композиции настоящего изобретения могут не обязательно включить дополнительные вещества, такие как минералы, витамины, соли, приправы, красители и консерванты. Не ограничивающие примеры дополнительных минералов включают кальций, фосфор, калий, натрий, железо, хлор, бор, медь, цинк, магний, марганец, йод, селен и т.п. Не ограничивающие примеры дополнительных витаминов включают витамин А, различные витамины группы В, витамин С, витамин D, витамин Е и витамин К. Могут также быть включены дополнительные пищевые добавки, например, ниацин, пантотеновая кислота, инулин, фолиевая кислота, биотин, аминокислоты и т.п.
10
Композиции по настоящему изобретению могут не обязательно включать одно или более из дополнительных веществ, которые повышают или поддерживают здоровье сосудов или дополнительно увеличивают целостность сосудов или выживание клеток. Такие вещества включают, но ими не ограничиваются, одно или более из винпоцетина, кофермента Q, фосфатидилсерина, ацетил-L-карнитина, альфа-липоевой кислоты, экстрактов, таких как экстракт черники (Vaccinium myrtilis), или антиоксидантов, включая токоферолы, токотриенолы, каротиноиды, такие как альфа - и бета-каротин, ликопин, лютеин, астаксантин, зеаксантин, и флавоноиды, такие как флаванолы, флаваноны, флавоны, флаван-3-олы (катехины), антоцианы и изофлавоны (изофлавоноиды) и т.п., а также противовоспалительные вещества и факторы роста (особенно применимые для повышения выживания клеток), что является понятным любому специалисту в данной области техники.
В различных воплощениях корма для животных или композиции диетических добавок по настоящему изобретению могут включать в перерасчете на сухое вещество от примерно 15% до примерно 50% общего белка от массы всей композиции. Общий белок может включать растительные белки, такие как соя, семена хлопчатника и арахис, или белки животных, такие как казеин, альбумин и белок мяса. Неограничивающие примеры белка мяса, применимого здесь, включают свинину, ягненка, лошадь, домашнюю птицу, рыбу и их смеси.
Композиции могут дополнительно включать в пересчете на сухое вещество от примерно 5% до примерно 40% жира от общей массы композиции. Композиции могут дополнительно включать источник углеводов. Композиции могут включать в пересчете на сухое вещество от примерно 15% до примерно 60% углеводов от общей массы композиции. Неограничивающие примеры таких углеводов включают зерновые или хлебные злаки, такие как рис, кукуруза, сорго обыкновенное, люцерна, ячмень, соя, рапс, овес, пшеница и их смеси. Композиции могут также не обязательно включать другие материалы, такие как сухая молочная сыворотка и другие молочные вторичные продукты.
Композиции могут также включать, по меньшей мере, один источник волокна. Может применяться множество растворимых или нерастворимых волокон, что известно любому специалисту средней квалификации в данной области техники. Источником волокна может быть жом свеклы (сахарной свеклы), аравийская камедь, камедь талха (gum talha), подорожник, отруби риса, камедь бобов рожкового дерева, мякоть цитрусовых, пектин, фруктоолигосахариды дополнительно к короткоцепочечной олигофруктозе, манноолигофруктоза, волокно сои, волокно люпинов, арабиногалактан, галактоолигосахарид, арабиноксилан или их смеси. Альтернативно этому источником волокна может быть ферментированное волокно. Как было описано ранее, ферментированное волокно полезно для иммунной системы домашних животных. Ферментированное волокно или другие композиции, известные специалистам в данной области техники, которые предоставляют пребиотическую композицию для усиления роста пребиотических микроорганизмов в кишечнике, могут также быть включены в композицию с целью усиления полезного действия на иммунную систему животного, представляемого в соответствии с настоящим изобретением. В композицию дополнительно могут быть включены, например, пребиотические микроорганизмы, такие как виды Lactobacillus или Bifidobacterium.
В конкретном воплощении композиция представляет собой комплексный и сбалансированный корм для животных. В этом контексте корм для животных может быть влажным кормом, сухим кормом или кормом с промежуточным содержанием влаги, что хорошо известно специалистам в области техники, касающейся составления и производства композиций корма для животных. Термин "влажная пища" относится к корму для животных, который обычно продается в банках или пакетах из фольги и имеет содержание влаги обычно в диапазоне от примерно 70% до примерно 90%. Термин "сухая пища" относится к корму для животных, который имеет состав, подобный составу влажной пищи, но содержит ограниченное количество влаги, обычно в диапазоне от примерно 5% до примерно 15%, и поэтому производится, например, в виде маленькие гранул или подушечек. Композиции и диетические добавки могут специально готовиться для взрослых животных или для старых или молодых животных, например "корм для щенка", "корм для котенка" или композиция для "старших животных". В целом специализированные композиции будут включать источники энергии и питательных веществ, подходящие для животных на разных стадиях развития или разного возраста.
Определенные аспекты настоящего изобретения предпочтительно применяются в комбинации с полной и сбалансированной пищей (например, как описано в National Research Council, 1985, Nutritional Requirements for Dogs, National Academy Press, Washington D.C., or Association of American Feed Control Officials, Official Publication, 1996). Таким образом, композиции, включающие ДЦПНЖК или ДГК согласно определенным аспектам настоящего изобретения, предпочтительно применяются в сочетании с высококачественными коммерчески доступными кормами. В используемом здесь значении термин "высококачественный коммерчески доступный корм" относится к корму, произведенному для обеспечения хорошего усвоения ключевых питательных веществ на 80% или больше, как, например, указано выше в рекомендациях National Research Council для собак. Подобные высокие стандарты в отношении кормов должны применяться и для других животных.
Квалифицированный специалист в данной области техники поймет, как определить соответствующее количество ДЦПНЖК и NORC, которые нужно добавить в данную композицию. Такие факторы, которые могут быть приняты во внимание, включают тип композиции (например, композиция корма для животного, диетическая добавка или пищевой продукт, приготовленный для употребления человеком), среднее потребление определенных типов композиций различными животными и условия производства, в которых приготовлена данная композиция. Предпочтительно, чтобы концентрации ДЦПНЖК и NORC, которые будут добавлены в композицию, рассчитывались на основе потребностей животного в энергии и питательных веществах. Согласно определенным аспектам настоящего изобретения, ДЦПНЖК и NORC могут быть добавлены в любое время во время изготовления и/или обработки композиции. Это означает, без ограничения, что они могут входить в качестве части в композицию корма для животного, диетической добавки или пищевого продукта, предназначенного для употребления человеком, или входить в состав покрытия, наносимого на поверхность композиции корма для животного, диетической добавки или пищевого продукта, предназначенного для употребления человеком.
Композиции могут быть приготовлены любым способом, применимым в данной области техники, таким как, например, описано в Waltham Book of Dog and Cat Nutrition, Ed. ATB Edney, глава, написанная A. Rainbird, под названием "A Balanced Diet" на страницах с 57 по 74, Pergamon Press, Oxford.
Способы
Другой аспект настоящего изобретения предоставляет способы для повышения целостности сосудов и/или повышения выживания клеток у животного, включающие введение животному композиции, включающей одну или более ДЦПНЖК и одно или более NORC в количестве, эффективном для повышения целостности сосудов и/или повышения выживания клеток у животного. Еще один аспект настоящего изобретения предоставляет способы профилактики для уменьшения вызванного ишемией повреждения мозга или других тканей животного, включающие введение животному на регулярной основе композиции, включающей одну или более ДЦПНЖК и одно или более NORC в количестве, эффективном для уменьшения вызванного ишемией повреждения, например, в мозге в случае приступа ишемии у животного, например в мозге животного.
В конкретных воплощениях любого из двух вышеупомянутых аспектов настоящего изобретения композиция представляет собой композицию корма для животного, диетическую добавку или пищевой продукт, предназначенный для употребления человеком, как здесь показано. В другом конкретном воплощении ДЦПНЖК представляет собой одну или более из (n-3) ДЦПНЖК, включая, но ими не ограничиваясь, ЭПК, ДПК и ДГК, и NORC представляет собой одно или более из L-Arg и его производных. Животные могут включать любое одомашненное или домашнее животное, как описано выше, или человека. В определенных воплощениях животное представляет собой домашнее животное, такое как собака или кошка. В другом воплощении животное представляет собой человека.
Композиции могут вводиться животному любым из множества альтернативных способов введения. Такие способы включают, без ограничения, пероральный, назальный, внутривенный, внутримышечный, внутрижелудочный, транспилорический, подкожный, ректальный и т.п. Предпочтительно, чтобы композиции вводились перорально. В используемом здесь значении термин "пероральное введение" или "перорально вводить" означает, что животное или человек употребляет в виде пищи, или действительно проглатывает, одну или более из композиций, описанных здесь.
В случае, когда человеку предписывается употребить в пищу композицию, необходимо обеспечить, чтобы человек был проинструктирован и/или проинформирован, что применение композиции может обеспечить и/или обеспечит положительный эффект, например повышение целостности сосудов у животного или выживание клеток у животного, предотвращение или задержку старения мозга или ишемические эпизоды, уменьшение вызванного ишемией повреждения, например, в мозге, сердце или других тканях, защиту от связанного с ишемией повреждения в случае приступа ишемии, например, при хирургическом вмешательстве с реперфузией, при вызванной диабетом периферической ишемии и в других случаях, как описано выше. Такое инструктирование может быть устным инструктированием (например, через устную инструкцию от, например, врача, ветеринара или другого работника здравоохранения или через радио или телевидение (то есть через рекламу) или письменным руководством (например, через письменную инструкцию от, например, врача, ветеринара или другого работника здравоохранения (например, в виде Предписания), через коммерческого работника или организацию (например, через издания по маркетингу, брошюры или другие просветительские издания), через письменные СМИ (например, Интернет, электронную почту или другие связанные с компьютером СМИ) и/или через связанную с композицией упаковку (например, этикетка на банке, содержащей композицию).
Введение может проводиться на основе «как необходимо» или «как желательно», например, раз в месяц, раз в неделю, ежедневно или несколько раз в день. Точно так же введение может проводиться через день, неделю или месяц, каждый третий день, неделю или месяц, каждый четвертый день, неделю или месяц и т.п. Введение может проводиться несколько раз в день. При применении в качестве добавки к обычной диете композиция может вводиться непосредственно животному или наноситься на или подмешиваться к ежедневной порции корма. При применении композиции в качестве основного ежедневного корма введение будет хорошо известно любому специалисту в данной области техники.
Введение может также выполняться на регулярной основе, например, как часть режима питания у животного. Режим питания может включить регулярный прием животным с кормом композиции, включающей одну или более ДЦПНЖК и одно или более NORC в количестве, эффективном, чтобы повысить целостность сосудов или уменьшить вызванное ишемией повреждение мозга в случае приступа ишемии у животного. Регулярный прием пищи может быть один раз в день, или два, три, четыре, или больше раз в день, на ежедневной или еженедельной основе. Аналогично этому регулярное введение композиции может быть через день или неделю, каждый третий день или неделю, каждый четвертый день или неделю, каждый пятый день или неделю или каждый шестой день или неделю, и в таком режиме питания, когда введение проводится несколько раз в день. Цель регулярного введения состоит в том, чтобы предоставить животному предпочтительную дневную дозу ДЦПНЖК и NORC, как здесь показано.
Согласно способам настоящего изобретения введение композиций, включающих одну или более ДЦПНЖК и одно или более NORC, включая введение в виде части режима питания, может охватить промежуток времени от внутриутробного развития в течение всей жизни животного.
Следующие примеры предоставлены для более детального описания настоящего изобретения в больших деталях. Они предназначены для иллюстрации настоящего изобретения, никак его не ограничивая.
Пример 1
Влияние 17 β-эстрадиола или диетической добавки с аргинином, рыбьим жиром или их комбинации на повреждение головного мозга при кратковременной мозговой ишемии в овариэктомизированной модели крысы
Хроническое лечение с 17 β-эстрадиолами (Е2) сравнивалось с тремя тестируемыми диетами, содержащими аргинин, ДЦПНЖК в виде рыбьего жира или их комбинацию соответственно по их влиянию на повреждение головного мозга, вызванное переходной мозговой ишемией в овариэктомизированной модели крысы.
Методы:
Животные. Самки крыс Charles Rivers Sprague-Dawley (250 г, Wilmington, MA) были акклиматизированы к условиям вивария для животных за три дня до операции при 12-часовом цикле дня и ночи. Двусторонняя овариэктомия была выполнена за 2 недели до того, как началось кормление тестируемыми композициями. Спустя четыре недели после начала кормления тестируемыми композициями была проведена временная окклюзия средней мозговой артерии (tMCA) под анестезией после внутрибрюшинной (i.p) инъекции кетамина (60 мг/кг) и ксилазина (10 мг/кг).
Введение Композиций и Гормона. По 14-15 крыс на группу были случайным образом объединены в одну из пяти исследуемых групп. Эти группы были следующими:
Группа 1: Контрольная диета (Белая Диета)
Группа 2: Контрольная диета + имплантация эстрадиола SILASTIC в течение 1 недели (Белая +Е2)
Группа 3: Диета I (Розовая Диета)
Группа 4: Диета II (Фиолетовая Диета)
Группа 5: Диета III (Серая Диета)
Контрольная диета была стандартной диетой крысы, содержащей 140 г/кг казеина, 100 г/кг сахарозы, 50 г/кг волокна, 155 г/кг декстрина, 466 г/кг кукурузного крахмала, 35 г/кг стандартной смеси солей, 40 г/кг соевого масла, 10 г/кг стандартной смеси витаминов, 1,8 г/кг L-цистина и 2,5 г/кг холин-хлорида. Все три тестируемые диеты (Диеты I, II и III) дополнительно содержали (1) дополнительные витамины группы В, включая 45 мг/кг никотиновой кислоты, 35 мг/кг пантотената, 24 мг/кг пиридоксина, 15 мг/кг тиамина, 9 мг/кг рибофлавина, 3 мг/кг фолиевой кислоты, 0,8 мг/кг биотина и 0,225 мг/кг витамина В 12, и (2) коктейль антиоксидантов, включающий 500 мг/кг витамина Е, 150 мг/кг витамина С, 100 мг/кг астаксантина и 0,4 мг/кг селена. Диета I дополнительно включала 2% аргинина (20 г/кг). Диета II дополнительно включала 2% аргинина и 2% рыбьего жира из менхэден (американская сельдь) (20 г/кг). Диета III дополнительно включала 2% рыбьего жира из менхэден.
Все диеты скармливались крысам ad libitum в течение четырех недель. Корм заменяли один раз в неделю. Также один раз в неделю определяли массу тела и потребление пищи. За одну неделю до начала окклюзии tMCA крысам Группы 2 вводили Е2 в дозе 4 мг/мл в виде таблетки SILASTIC, которая была имплантирована подкожно. Эта процедура использовалась, чтобы защитить мозг от множественных инсультов и обеспечить физиологический уровень Е2 в сыворотке крови (Simpkins et al., 1997; Jung et al., 2003). Это группа представляла собой положительный контроль, так как ранее было показано, что такая доза и время обработки Е2 обеспечивает защитное действие при окклюзии tMCA (Simpkins, et al., 1997; Yang et al., 2004a, Yang, et al., 2004b).
Окклюзия средней мозговой артерии и подготовка образцов. Животным проводили обезболивание внутрибрюшинной инъекцией кетамина (60 мг/кг) и ксилазина (10 мг/кг). Окклюзию tMCA проводили, как описано ранее (Simpkins et al., 1997), с небольшой модификацией. Вкратце, левая общая каротидная артерия, внешняя каротидная артерия и внутренняя каротидная артерия были открыты путем цервикального разреза по средней линии. Во внутренний просвет каротидной артерии был введен 3,0 одноволоконный шовный материал, который аккуратно продвигался вперед, пока не встретил сопротивление. Хирургическая процедура продолжалась в течение 20 минут с минимальным кровотечением. Шовный материал удерживался на месте в течение 60 минут и затем удалялся для проведения реперфузии. Ректальная температура контролировалась и поддерживалась между 36,5 и 37°С с помощью электрического подогрева в течение всей процедуры. Через 24 часа после начала реперфузии животные были умерщвлены, после чего были извлечены мозги. Мозги затем коронально рассекались на 2-миллиметровые срезы с использованием металлической матрицы для мозгов (ASI Instruments Inc; Warren, МА) и прокрашивались с помощью инкубации в 2% растворе 2,3,5-трифенилтетразолийхлорида (ТТС) в физиологическом растворе при 37°С и затем фиксировались в 10% формалине.
Анализ фрагментации ДНК проводили с использованием опосредованной TdT-метки dИТР однонитевых концов ДНК (TUNEL). Окклюзия МСА представляет собой широко используемую модель фокального ишемического инсульта (Bederson et al., 1986). Эта модель гибели нейронов in vivo может быстро индуцировать синхронизированный процесс апоптоза в большом количестве нейронов и других клеток (Li et al., 1997). Таким образом, влияние кратковременной ишемии на апоптоз было исследовано с помощью анализа фрагментации ДНК с помощью теста TUNEL. Окрашивание в тесте TUNEL было выполнено согласно модифицированным инструкциям изготовителя (Gavrieli et al., 1992). Зафиксированные в формалине залитые парафином срезы были обработаны ксилолом для удаления парафина, регидратированы путем проводки через ряд концентраций этанола и окончательно промыты в фосфатном буфере (PBS). Срезы были окончательно зафиксированы в 4% параформальдегиде в течение 20 минут. Срезы были затем промыты и обработаны протеиназой К (100 мкг/мл) в течение 15 минут в PBS, уравновешены буфером для уравновешивания в течение 10 минут и затем проинкубированы с буфером, содержащим фермент TdT и ФИТЦ-меченый дУТФ (Promega, Madison, WI) при 37°С во влажной камере. Реакцию останавливали инкубацией в 2×SSC буфере в течение 15 минут при комнатной температуре. Затем срезы обрабатывали реактивами, препятствующими выцветанию, содержащими DAPI (Molecular Probes, Eugene, OR). Срезы положительного контроля были погружены в раствор ДНКазы I в течение 10 минут при комнатной температуре перед уравновешиванием в буфере TdT. Срезы анализировались под флуоресцентным микроскопом с соответствующими парами фильтров для возбуждения/эмиссии.
Некоторые животные были удалены из исследования во время его проведения. Число животных, взятых для количественного определения объема ишемического повреждения, колебалось от 12 до 15 на группу.
Статистические методы. Результаты были проанализированы с использованием одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA) с использованием программного обеспечения Prism (Graphpad Inc; San Diego, CA). Достоверность различий между группами была определена односторонним ANOVA с последующими тестами множественного сравнения Tukey's. Все значения были выражены, как среднее±стандартная ошибка среднего (SEM).
Результаты:
Объем ишемического повреждения. Все четыре экспериментальные диеты (эстрадиол и Диеты I, II и III) снижали размер инфаркта (фиг.1). Обработка эстрадиолом (Группа 2) уменьшала объем инфаркта на 68%, значение, типичное для защиты эстрогеном от повреждения при инсульте (Simpkins, et al., 1997; Fan et al., 2003; Yang et al., 2004a; Yang et al., 2004b). Аналогичным образом Диета II достоверно уменьшала объем инфаркта на 67%. Две другие тестируемые Диеты также уменьшали средние объемы инфаркта, но данные были слишком вариабельны в своих значениях, чтобы быть статистически достоверными.
Поскольку в каждой группе присутствовали крысы без заметных повреждений (в наших вычислениях объема повреждения значение составило 0), данные были проанализированы после того, как эти значения были удалены, чтобы определить степень, до которой значение 0 влияло на различия между группами. Как показано на фиг.2, те же самые две группы были достоверно ниже, чем группа с контрольной диетой, после такой модификации данных. Таким образом, различия среди групп было обеспечено животными, у которых наблюдались повреждения, а также числом животных без видимых повреждений. Защитные эффекты как обработки эстрогеном, так и диет проявлялись, прежде всего, в коре, в области мозга, называемой пенумбра (полутень), поскольку эта область, как полагают, "может быть защищена" при экспериментальном инсульте. Это отличается от ситуации с базальными ганглиями, называемыми ядром инфаркта, которые при экспериментальном инсульте пока не удается защитить никакой обработкой, протестированной до настоящего времени.
Апоптоз. Оценка апоптоза с использованием окрашивания TUNEL была проведена для определения последствий обработки эстрадиолом и тремя тестируемыми диетами на ответ клеток в виде апоптоза при экспериментальной ишемии. Для оценки с окрашиванием TUNEL были выбраны три области мозга у всех животных, которые полностью прошли исследование. Окрашивание TUNEL было проведено в ядре коры головного мозга, в области пенумбры (тени) коры головного мозга и в ядре подкорки, на основе наших оценок поврежденных областей мозга с использованием окрашивания ТТС (Wen et al., 2004). Число клеток, положительных по окрашиванию TUNEL, было нормализовано к общему числу клеток в поле зрения с использованием окрашивания ядерной оболочки DAPI. Срезы из всех трех областей мозга были посчитаны, и средние количества клеток для каждого животного были использованы для расчета среднего значения для группы. Счет клеток проводился в случайно выбранных полях зрения в микроскопе (срезы по 320 квадратных микрон) в областях с максимально выраженной степенью инфаркта мозга, как было определено путем окрашивания ТТС. Во всех трех областях мозга у контрольных животных окрашивание TUNEL было обширным. Когда было проведено сравнение всех пяти тестируемых групп, окрашивание TUNEL в каждом мозге коррелировало с результатами, полученными с использованием окрашивания ТТС для количественного определения объема повреждения (фиг.3). Таким образом, было обнаружено значительное сокращение окрашивания TUNEL в обеих группах животных, как получавших Е2, так и животных, получавших Диету II. Животные, получавшие Диеты I и III, занимали промежуточное положением между контрольными животными и животными, получавшими Диету II. Эта корреляция между окрашиванием ТТС и окрашиванием TUNEL показана на фиг.4. Характеристика влияния гормонов и диет на окрашивание TUNEL указывает, что существенная часть защиты Е2 и Диеты II от смерти клеток опосредована подавлением апоптоза.
Заключение:
Все три тестируемые диеты уменьшали средний объем инфаркта, а также TUNEL-положительное количество клеток, и Диета II уменьшала эти параметры до уровня, наблюдаемого с известным нейропротектором - эстрадиолом.
Настоящее изобретение не ограничивается воплощениями, описанными и проиллюстрированными выше, но может быть изменено и модифицировано в рамках прилагаемой формулы изобретения.