СПОСОБ СУПЕРАМПЛИФИКАЦИИ С ПЦР
METHOD OF SUPER-AMPLIFICATION WITH PCR

Область изобретения
Настоящее изобретение касается способа амплификации нуклеиновых кислот посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Предпосылки изобретения
Методики ПЦР на нынешнем техническом уровне известны. В тексте патента США US 4 683 202 В1 раскрыт способ, посредством которого можно амплифицировать по меньшей мере одну специфическую последовательность нуклеиновых кислот из нуклеиновой кислоты или из смеси нуклеиновых кислот, причем каждая нуклеиновая кислота состоит из двух отдельных комплементарных нитей равной или неравной длины. Способ включает в себя: (а) обработку нитей двумя праймерами для каждой отличной специфической последовательности, которая подлежит амплификации, в таких условиях, что для каждой различной последовательности, подлежащей амплификации синтезируется продукт элонгации (экстензии, достраивания) каждого праймера, комплементарный данной конкретной нити нуклеиновой кислоты; при этом указанные праймеры выбирают так, чтобы они были по существу комплементарны различным нитям каждой конкретной последовательности, так что продукт элонгации, который синтезируют из праймера, когда его отделяют от комплементарной ему нити, может служить матрицей для синтеза продукта элонгации другого праймера; (b) отделение продуктов элонгации праймеров от матриц, на которых они синтезированы, так чтобы образовывались одноцепочечные молекулы; (с) обработку одноцепочечных молекул с этапа (b) праймерами с этапа (а) в таких условиях, чтобы синтезировался продукт элонгации праймера, причем в качестве матрицы используют каждую из отдельных (одноцепочечных) нитей с этапа (b). Этапы можно реализовывать последовательно или одновременно. Кроме того, можно повторять этапы (b) и (с), пока не будет достигнута желательная степень амплификации последовательностей.
В публикации международной заявки WO 2007/143034 А1 раскрыты способы, которые, как утверждается, пригодны для реализации способа ПЦР. Способы могут включать в себя использование источника оптического излучения для нагрева в способе ПЦР. Способы могут также включать в себя применение поверхностного плазмонного резонанса или резонансного переноса энергии флуоресценции для контроля за процессом ПЦР в реальном масштабе времени. Кроме того, способы могут включать в себя иммобилизацию шаблона, праймера или полимеразы на поверхности, например, на золоте или на другой поверхности, активной относительно поверхностного плазмонного резонанса.
В заявке на патент США US 2002/0061588 А1 раскрыт способ придания нуклеиновым кислотам способности реагировать на локальный или непосредственно на внешний сигнал. Сигнал воздействует только на одну или несколько специфических локализованных частей нуклеиновой кислоты. Согласно изобретению сигнал способен изменять свойства конкретной нуклеиновой кислоты и благодаря этому также и ее функцию. Соответственно, изобретение обеспечивает способы, регулирующие структуру и функцию нуклеиновой кислоты в биологическом образце, не влияя на другие компоненты образца. В одной из форм исполнения модулятор переносит тепло на нуклеиновую кислоту или часть нуклеиновой кислоты, что приводит, например, к дестабилизации межмолекулярных или внутримолекулярных связей и изменению структуры и стабильности нуклеиновой кислоты. К числу предпочтительных модуляторов относятся наночастицы металлов, полупроводниковые наночастицы, магнитные наночастицы, оксидные наночастицы и хромофоры. Поднимается также вопрос применения этого способа вместе с методикой ПЦР. В частности, предлагается управлять процессом ПЦР с помощью модулятора.
Германская заявка на патент DE 10 2012 201 475 А1 касается способа амплификации нуклеиновых кислот. В этом способе возбужденные электромагнитным способом наночастицы в некотором объеме реакции благодаря возбуждению передают тепло своему окружению. Постольку, поскольку длительность теплоподачи меньше некоторого критического значения, которое зависит от среднего расстояния между частицами в растворе и таким образом от концентрации наночастиц, можно добиться очень быстрой денатурации, причем длительность возбуждения наночастиц очень существенно меньше, чем длительность цикла.
Германский патент DE 10 2013 215 166 В3 (дата публикации о выдаче патента 30.10.2014) изобретателей - авторов настоящей заявки на патент содержит способ суперамплификации, при осуществлении которого сокращение длительности циклов приводит к небольшому выходу на каждый цикл, что, однако, более чем компенсируется возможностью проводить больше циклов в единицу времени.
Заявка на патент США US 2003/0143604 А1 касается применения зондов-детекторов на основе наночастиц для мониторинга реакций амплификации, в частности, ПЦР. Эта заявка на патент рассматривает в основном применение конъюгатов наночастиц с олигонуклеотидами, которые обработаны защитным реагентом, например, бычьим сывороточным альбумином, для количественного и качественного детектирования целевого полинуклеотида. Заявка на патент раскрывает амплификацию и детектирование нуклеиновой кислоты с применением праймеров на наночастицах золота. При этом на первом этапе целевую нуклеиновую кислоту денатурируют в присутствии наночастиц золота, на которые нанесены праймеры. На втором этапе наночастицы золота с нанесенными на них праймерами гибридизируются с целевой нуклеиновой кислотой, и создается копия комплементарной последовательности ДНК, исходя из праймеров нуклеиновой кислоты, размещенных на наночастицах. Первый и второй этапы повторяют и измеряют оптический сигнал, возникающий при связывании комплементарных амплифицированных зондов на наночастицах.
Из текста европейского патента ЕР 1 842 924 В1 известен способ определения начальной концентрации нуклеиновой кислоты на основании данных об амплификации нуклеиновых кислот в реальном времени, при осуществлении которого измеренная интенсивность флуоресценции в силу амплификации претерпевает [изменения] по функции, зависящей от числа пройденных циклов.
Задача, лежащая в основе изобретения
Задача настоящего изобретения состоит в том, чтобы представить улучшенный способ амплификации нуклеиновых кислот посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР). В частности, задача состоит в том, чтобы обеспечить возможность более быстрой и/или интенсивной амплификации нуклеиновых кислот посредством ПЦР.
Решение согласно изобретению
Согласно изобретению эту задачу решают с помощью способа амплификации нуклеиновых кислот посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР), при которой многократно реализуются этапы денатурации, отжига и элонгации.
A
Согласно изобретению решить поставленную задачу также удается с помощью способа амплификации нуклеиновых кислот посредством ПЦР, при которой многократно реализуются этапы денатурации, отжига и элонгации, причем выход (g) экземпляров подлежащей амплификации нуклеиновой кислоты к концу по меньшей мере одного из прохождений цикла составляет менее 80% имевшихся к началу этого прохождения экземпляров нуклеиновой кислоты, и по меньшей мере при одном из прохождений цикла длительность воздействия (t) составляет менее одной секунды.
Далее, решить задачу также удается с помощью способа амплификации нуклеиновых кислот посредством ПЦР, при которой многократно реализуются этапы денатурации, отжига и элонгации, причем количество (k) причем количество прохождений цикла полимеразной цепной реакции больше 45.
c
c
При ПЦР многократно реализуется (проходится) цикл, который предпочтительно по одному разу включает в себя этапы денатурации, отжига (также называемого гибридизацией) и элонгации, и предпочтительно в этом порядке. Кроме того, одни и те же этапы предпочтительно обладают одинаковой длительностью при каждом прохождении. Необходимости в этом, однако, нет никакой; так, один из этапов или несколько этапов при одном прохождении вполне могут быть короче, чем при другом прохождении. Длительность t прохождения цикла в дальнейшем называется длительностью цикла. Задачу согласно изобретению решают с помощью способа амплификации нуклеиновых кислот посредством ПЦР, при реализации которого по меньшей мере при одном прохождении цикла длительность цикла t составляет менее 20 секунд.
c
Решения задачи удается достичь также с помощью способа амплификации нуклеиновых кислот посредством ПЦР, при которой многократно реализуется цикл, состоящий из этапов денатурации, отжига и элонгации, причем длительность цикла t уменьшена по сравнению с длительностью цикла эталонной полимеразной цепной реакции, в остальных отношениях реализуемой точно так же, на величину коэффициента х (в х раз), так что выход (g) экземпляров подлежащей амплификации нуклеиновой кислоты к концу по меньшей мере одного из прохождений цикла уменьшен по сравнению с выходом эталонной ПЦР, в остальных отношениях реализуемой точно так же, уменьшен на величину коэффициента у, причем справедливы соотношения x>0,9y и g<80%
Ниже подлежащая амплификации нуклеиновая кислота называется оригиналом; другое общепринятое название - "Ампликон". Оригинал - это одноцепочечная (непарная, одиночная, одинарная) нить, и в реакционном объеме она может образовывать двойную цепь (двухцепочечную нить) вместе с комплементарной нитью, которую называют комплементом. При этом копия оригинала, образовавшаяся при каждом прохождении, представляет собой оригинал для следующего прохождения, а образовавшаяся копия комплемента - это комплемент для следующего прохождения. При каждом прохождении цикла количество экземпляров оригинала и комплемента может увеличиваться. Отношение числа экземпляров оригинала, вновь образовавшихся за прохождение, к числу экземпляров, имевшихся непосредственно перед циклом, называют выходом g одного прохождения (одного цикла). Теоретически при ПЦР можно добиться удвоения количества оригиналов за каждый цикл, то есть выхода g в 100%. В реальности, однако, выход, как правило, меньше, чем 100%.
0
k
Цикл можно повторять до тех пор, пока не будет достигнута желаемая степень амплификации. Если к началу ПЦР в реакционном объеме находятся N молекул оригинала ДНК, и если g на протяжении длительности Т всей ПЦР (в дальнейшем называемой длительностью процесса) остается постоянным, то после k прохождений в реакционном объеме находятся N молекул ДНК с последовательностью оригинала:
k
0
По итогам определения коэффициента амплификации N/N выход g можно рассчитать следующим образом:
В данном случае принято упрощенное предположение, что выход g на цикл остается во время постоянным. В общем случае это предположение справедливо по крайней мере до тех пор, пока не проявятся эффекты насыщения, например, обусловленные расходом компонентов реакции.
c
Длительность Т ПЦР, которая необходима для достижения желательной степени амплификации, зависит от длительности каждого прохождения, в дальнейшем называемой длительностью цикла t, и от выхода: длительный цикл увеличивает и длительность процесса, но низкий выход также увеличивает длительность процесса, так как требует большего количества прохождений.
A
С одной стороны, изобретение пользуется тем, что выход, достижимый при одном прохождении цикла, в общем случае зависит от длительности цикла, существенным компонентом которой является длительность воздействия t. Таким образом, предпосылка теоретически достижимого значения выхода в 100% состоит в том, чтобы все оригиналы успешно прошли все этапы - денатурации, отжига и элонгации; по мере сокращения цикла это гарантировать уже не удается, например, все чаще возможны лишь частичный отжиг, или только частичная элонгация, или же лишь частичная денатурация. Кроме того, изобретение использует от факт, что по мнению изобретателей преимущество уменьшения длительности одного прохождения может перевесить недостаток снижения выхода, так что несмотря на меньший выход на каждое прохождение можно сократить длительность процесса, требуемую для желаемой степени амплификации.
Способ согласно изобретению реализуют в пространстве, которое в дальнейшем называют реакционным объемом. Реакционный объем может быть заключен в реакционном сосуде. В реакционном объеме содержится образец, в котором обычно присутствует подлежащая амплификации нуклеиновая кислота (подлежащие амплификации нуклеиновые кислоты). Образец может содержать жидкость, предпочтительно воду. Циклы способа согласно изобретению проходят как минимум в части образца. Жидкость может выгодным образом служить средой суспендирования и/или растворителем для оригиналов и комплементов и/или других компонентов образца.
Этап денатурации предназначен для того, чтобы денатурировать двойную нить нуклеиновой кислоты, то есть разделить ее на две одинарные нити. Так, на этапе денатурации можно, например, отделить оригинал от комплемента. Денатурацию также называют расплавлением. Денатурацию двойной нити нуклеиновой кислоты обычно запускают термическим путем, то есть по меньшей мере часть двойной нити ДНК или всю двойную нить подвергают воздействию температуры (называемой температурой денатурации), которая вызывает разделение двойных нитей нуклеиновой кислоты или как минимум способствует ему. Температура денатурации не обязательно должна быть задана жестко, а может представлять собой интервал температур, в пределах которого варьирует температура на этапе денатурации. С одной стороны, температуру денатурации выбирают настолько высокой, чтобы было возможно разделение двойных нитей нуклеиновой кислоты. С другой стороны, предпочтительную температуру денатурации выбирают настолько низкой, чтобы не нанести существенных повреждений ДНК-полимеразе, которая, возможно, также находится в образце. Типичное значение температуры денатурации составляет - 95°С.
Кроме того, в реакционном объеме предпочтительно содержатся по меньшей мере два олигонуклеотида, которые называют праймерами. Один из этих праймеров называют прямым праймером, а другой обратным. Прямой праймер комплементарен 3'-концу оригинала. Обратный праймер комплементарен 3'-концу комплемента. Под отжигом подразумевают гибридизацию прямого праймера с оригиналом и обратного праймера с комплементом. Этап отжига служит для гибридизации прямого и обратного праймеров с комплементарными им последовательностями в оригинале либо же, соответственно, комплементе. Отжиг обычно также инициируют термическим путем, то есть по меньшей мере часть оригинала либо же, соответственно, комплемента или весь оригинал либо же, соответственно, комплемент, подвергают воздействию температуры (называемой температурой отжига), которая вызывает гибридизацию прямого и обратного праймеров с комплементарными им последовательностями в оригинале либо же, соответственно, комплементе или как минимум способствуют ей. Как и температура денатурации, температура отжига также может представлять собой диапазон температур, в пределах которого варьирует температура на этапе отжига. Обычно этап отжига проходит при температуре от 50°С до 65°С. При этом температуру отжига выбирают так, чтобы была возможна максимально специфичная гибридизация праймеров.
В смысле настоящего изобретения понятие "гибридизация" означает формирование двойной нити из двух одинарных нитей, которые в каждом случае могут состоять из нуклеиновой кислоты и/или олигонуклеотида. В подходящих условиях реакции гибридизация, как правило, приводит к состоянию наименьшей возможной энергии, которое может быть достигнуто путем соединения обеих одиночных нитей. Иными словами, при надлежащих условиях обе одинарные нити предпочтительно соединяются друг с другом так, чтобы с точки зрения последовательностей обеих одинарных нитей создавалась максимально возможная комплементарность (то есть специфичность).
Если нуклеиновая кислота А частично комплементарна нуклеиновой кислоте В, то это означает, что нуклеиновая кислота А в некоторой части комплементарна некоторой части нуклеиновой кислоты В.
n
В контексте настоящего изобретения под понятиями "нуклеиновая кислота" и "олигонуклеотид" подразумевают не только (дезокси)рибонуклеиновые кислоты либо же, соответственно, олиго(дезокси)рибонуклеотиды, но также и нуклеиновые кислоты и олигонуклеотиды, содержащие один или несколько аналогов нуклеотидов с модификациями в своей главной молекулярной цепи (например, метилфосфонаты, фосфотиоаты или пептидо-нуклеиновые кислоты (ПНК)), в частности, на сахаре главной молекулярной цепи (например, 2'-O-алкилпроизводные, 3'- и/или 5'-аминорибозы, закрытые нуклеиновые кислоты [ЗНА], гекситоловые нуклеиновые кислоты (ГНК), треозные нуклеиновые кислоты (ТНК) или трициклические ДНК, ср. в связи с этим статью D. Renneberg and C.J. Leumann, "Watson-Crick base-pairing properties of Tricyclo-DNA", J. Am. Chem. Soc, 2002, Vol. 124, pp. 5993-6002, содержание которой по этому вопросу посредством ссылки является частью настоящей публикации) или же содержащие аналоги оснований, например. 7-деазапурин, или универсальные основания, например, нитроиндол, или модифицированные натуральные основания, как то: N4-этил-цитозин. В одном из вариантов исполнения изобретения нуклеиновые кислоты или олигонуклеотиды представляют собой конъюгаты или химеры с отличными от нуклеотидов аналогами, например, ПНК. В одном из вариантов исполнения изобретения в одной или нескольких позициях нуклеиновых кислот или олигонуклеотидов содержатся ненуклеотидные мономеры, например, спейсеры, например, гексаэтиленгликоль или C-спейсеры (спейсеры с углеродной цепью из n атомов), где n составляет от 3 до 6. Постольку, поскольку нуклеиновые кислоты или олигонуклеотиды содержат модификации, эти модификации выбирают так, чтобы при наличии модификации также была возможна гибридизация с естественными анализируемыми ДНК/РНК. Предпочтительные модификации влияют на показатели плавления, предпочтительно на температуру плавления, в частности, чтобы получить возможность различать гибриды с различными степенями комплементарности оснований (различение несоответствий/нарушений комплементарности). К предпочтительным модификациям относятся ЗНА, 8-аза-7-деаза-пурины, 5-пропинил-урацил и -цитозин и/или безосновные прерывания или модификации в нуклеиновой кислоте или в олигонуклеотиде. Прочие модификации в смысле изобретения - это, например, модификации с биотином, тиолом и молекулами - донорами и акцепторами флуоресценции.
Безосновную модификацию в смысле настоящего изобретения представляет собой участок олигонуклеотида, на котором последовательность нуклеотидов прервана вставкой одной или нескольких молекул, не являющихся нуклеотидами, таким образом, что на уровне этого участка полимераза полностью или частично прерывает синтез в ином случае полностью или частично гибридизированного комплементарного олигонуклеотида, так как на этом участке не имеется достаточной комплементарности оснований. Предпочтительно выбирать безосновную модификацию из группы, которая включает в себя: 1', 2'-дидезоксирибозу (dSpacer), гекса-этиленгликоль (Spacer18) и триэтиленгликоль (Spacer9).
Далее, реакционный объем содержит ДНК-полимеразу. На этапе элонгации ДНК-полимераза способна синтезировать копию комплемента из прямого праймера. Из обратного праймера ДНК-полимераза способна синтезировать копию оригинала. В силу синтеза копия комплемента гибридизирована с оригиналом, а копия оригинала гибридизирована с комплементом. В целях элонгации ДНК-полимеразу подвергают воздействию температуры, которую называют температурой элонгации и которая создает возможность или как минимум способствует элонгации. В случае температуры элонгации речь также может идти о диапазоне температур, в пределах которого варьирует температура на этапе элонгации. При использовании полимеразы из Thermus aquaticus (Taq) обычно применяется температура элонгации, равная 72°С. В некоторых формах исполнения ПЦР температуры отжига и элонгации идентичны, то есть, оба этапа проходят при одинаковой температуре.
В предпочтительной форме исполнения по меньшей мере два этапа ПЦР осуществляют при различных температурах, так что может оказаться необходимым предусмотреть в цикле один или несколько этапов нагрева и/или этапов охлаждения, во время которых реакционный объем или части реакционного объема нагревают либо же, соответственно, охлаждают. Этап нагрева или охлаждения может происходить до или после этапа денатурации, отжига и элонгации. При этом обычно этап нагрева или охлаждения перекрывается с предшествующим и/или со следующим этапом денатурации, отжига или элонгации.
A
В смысле настоящего изобретения длительность воздействия t прохождения цикла - это общее время, на протяжении которой источник энергии во время прохождения цикла с подходящей для денатурации мощностью воздействует на некоторую точку в образце с целью вызвать в образце нагревание.
A
A
На протяжении всего времени t источник энергии передает на указанную точку мощность, подходящую для денатурации. Например, источник энергии в виде лазера можно использовать при более высокой мощности для денатурации, а при меньшей мощности - для последующего измерения экстинкции. В этом случае t - это только время, на протяжении которого лазер воздействует на точку с более высокой, пригодной для денатурации мощностью.
A
Если для денатурации применяют несколько источников энергии, то величина t предпочтительно означает время, в течение которого все источники энергии с целью денатурации воздействуют на точку одновременно. При активации нескольких источников энергии к денатурации часто может приводить только одновременное воздействие.
A
A
A
При этом указанную точку в пределах той части образца, в которой реализуют способ, определяют таким образом, чтобы t приобретало максимально возможное значение. Так, например, если нагрев обеспечивается фиксированным элементом Пельтье, то t - это общая длительность периода, в который тепло от элемента Пельтье в этом цикле поступает в эту точку и вызывает в ней повышение температуры, подходящее для денатурации (обычно приблизительно продолжительность включенного состояния во время этапа разогрева; в любом случае короче длительности цикла). Если нагрев вызывается световым лучом диаметра d, который проводят через объем образца (выполняют "сканирование") со скоростью v, то t - это время , в течение которого световой луч при этом воздействует на точку в образце с мощностью, подходящей для денатурации. Если нагрев вызывается импульсным источником света, световой луч которого за длительность импульса не перемещается относительно образца, то длительностью воздействия является длительность импульса. Если нагрев обеспечивается пульсирующим источником света, который сканирует образец, то длительность воздействия - это кратчайший из двух отрезков времени (длительности импульса и времени ).
A
c
Благодаря выбору согласно изобретению особо малых значений длительности воздействия t и длительности цикла t можно реализовать особо быстрый процесс ПЦР. При малой длительности воздействия за малое время можно провести множество циклов, так что можно допустить и малый выход. Высокое количество циклов согласно изобретению позволяет выгодным образом достичь более высокого уровня амплификации ампликона.
Предпочтительные варианты исполнения изобретения
В предпочтительном варианте исполнения изобретения этап нагревания осуществляют перед этапом денатурации; предпочтительно, чтобы он перекрывался с этапом денатурации. На этапе нагревания предпочтительно как минимум локально, то есть в определенных областях реакционного объема, повышают температуру этапа денатурации по сравнению с температурой этапа элонгации, чтобы создать возможность денатурации. Предпочтительно, чтобы посредством воздействия источника энергии по меньшей мере в этих областях достигалась температура как минимум 90°С, особо предпочтительно как минимум 95°С.
В предпочтительной форме исполнения изобретения этап охлаждения осуществляют перед этапом отжига, особо предпочтительно - с перекрыванием с последним, для достижения необходимой для отжига температуры. Постольку, поскольку температуру на предыдущем этапе денатурации повышали только локально, охлаждение предпочтительно осуществлять путем диффузии теплоты в реакционном объеме.
Та часть образца, в которой проходят циклы способа согласно изобретению, предпочтительно составляет как минимум 1%, особо предпочтительно по меньшей мере 2%, особо предпочтительно по меньшей мере 5%, особо предпочтительно по меньшей мере 10%, а крайне предпочтительно по меньшей мере 20% всего реакционного объема. В то же время предпочтительно, чтобы указанная часть реакционного объема составляла самое большее 100%, особо предпочтительно самое большее 80%, особо предпочтительно самое большее 60%, а крайне предпочтительно самое большее 40% всего реакционного объема. Ускорения реализации способа можно добиться посредством того, что циклы проходят только в части образца.
Предпочтительно, чтобы выход g экземпляров подлежащей амплификации нуклеиновой кислоты в конце по меньшей мере одного прохождения цикла (в предпочтительной форме исполнения изобретения в конце каждого из 10, особо предпочтительно каждого из 20, особо предпочтительно каждого из 40, особо предпочтительно каждого из 80, в особенности каждого из 160 прохождений цикла) составлял менее чем 70%, особо предпочтительно менее чем 60%, особо предпочтительно менее чем 50%, особо предпочтительно менее чем 40%, особо предпочтительно менее чем 30%, особо предпочтительно менее чем 20%, особо предпочтительно менее чем 10%, особо предпочтительно менее чем 5%, особо предпочтительно менее чем 2%, особо предпочтительно менее чем 1%, особо предпочтительно менее чем 0,5% числа экземпляров нуклеиновой кислоты, имевшихся к началу этого прохождения. В этом способе исполнения изобретения используется тот факт, что, в частности, при особо низких выходах можно путем соответствующего выбора длительности цикла тем не менее добиться особо выгодной малой длительности процесса.
A
A
Предпочтительно, чтобы длительность воздействия t по меньшей мере при одном прохождении цикла (в предпочтительной форме исполнения изобретения по меньшей мере при 10, особо предпочтительно по меньшей мере при 20, особо предпочтительно по меньшей мере при 40, особо предпочтительно по меньшей мере при 80, особо предпочтительно по меньшей мере при 160 прохождениях цикла) была менее 10 с, особо предпочтительно менее чем 5 с, особо предпочтительно менее чем 3 с, особо предпочтительно менее чем 1 с, особо предпочтительно менее чем 500 мс (миллисекунд), особо предпочтительно менее чем 250 мс, особо предпочтительно менее чем 100 мс, особо предпочтительно менее чем 50 мс, особо предпочтительно менее чем 25 мс, особо предпочтительно менее чем 10 мс а крайне предпочтительно менее чем 8 мс, особо предпочтительно менее чем 3 мс, особо предпочтительно менее чем 1 мс, особо предпочтительно менее чем 500 мкс, особо предпочтительно менее чем 300 мкс, особо предпочтительно менее чем 100 мкс, особо предпочтительно менее чем 50 мкс, особо предпочтительно менее чем 30 мкс, особо предпочтительно менее чем 10 мкс. В этом способе исполнения изобретения используется тот факт, что, в частности, благодаря особо малой длительности воздействия t можно добиться особо выгодной малой длительности процесса.
A
В предпочтительной форме исполнения изобретения выход g экземпляров подлежащей амплификации нуклеиновой кислоты в конце по меньшей мере одного прохождения цикла (в предпочтительной форме исполнения изобретения в конце каждого из 10, особо предпочтительно каждого из 20, особо предпочтительно каждого из 40, особо предпочтительно каждого из 80, в особенности каждого из 160 прохождений цикла) составляет менее чем 80%, менее чем 70%, менее чем 60%, менее чем 50%, менее чем 40%, менее чем 30%, особо предпочтительно менее чем 20% либо же, соответственно, 10%, особо предпочтительно менее чем 5%, особо предпочтительно менее чем 1% числа экземпляров нуклеиновой кислоты, имевшихся к началу этого прохождения, а одновременно длительность воздействия t при этом прохождении или при этих прохождениях короче 5 секунд, особо предпочтительно составляет менее чем 3 с, особо предпочтительно менее чем 1 с, особо предпочтительно менее чем 250 мс, особо предпочтительно менее чем 50 мс, особо предпочтительно менее чем 10 мс, особо предпочтительно менее чем 3 мс, особо предпочтительно менее чем 1 мс, особо предпочтительно менее чем 300 мкс, особо предпочтительно менее чем 100 мкс, особо предпочтительно менее чем 30 мкс, особо предпочтительно менее чем 10 мкс. В этом способе исполнения изобретения используется тот факт, что добиться особо выгодной малой длительности процесса можно, в частности, тогда, когда особо малый выход сопровождается особо малой длительностью воздействия.
Предпочтительно, чтобы выход g экземпляров подлежащей амплификации нуклеиновой кислоты в конце по меньшей мере одного прохождения цикла (в предпочтительной форме исполнения изобретения в конце каждого из 10, особо предпочтительно каждого из 20, особо предпочтительно каждого из 40, особо предпочтительно каждого из 80, в особенности каждого из 160 прохождений цикла) составлял более 0,1%, особо предпочтительно более 1%, особо предпочтительно более 10% числа экземпляров нуклеиновой кислоты, имевшихся к началу этого прохождения. В этом способе исполнения изобретения используется тот факт, что не слишком низкий выход на одно прохождение может снизить вероятность ошибок при амплификации и таким образом обеспечить надежный результат амплификации.
A
Предпочтительно, чтобы длительность воздействия t по меньшей мере при одном прохождении цикла (в предпочтительном варианте исполнения изобретения по меньшей мере при 10, особо предпочтительно по меньшей мере при 20, особо предпочтительно по меньшей мере при 40, особо предпочтительно по меньшей мере при 80, особо предпочтительно по меньшей мере при 160 прохождениях цикла) превышала 1 пс, особо предпочтительно превышала 30 пс, особо предпочтительно превышала 100 пс, особо предпочтительно, чтобы превышала 300 пс, особо предпочтительно превышала 1 нс, особо предпочтительно превышала 10 нс, особо предпочтительно превышала 100 нс, особо предпочтительно превышала 300 нс, особо предпочтительно превышала 1 мкс, особо предпочтительно превышала 3 мкс, особо предпочтительно превышала 10 мкс.
Правильно выбранная длительность воздействия позволяет выгодным образом добиться более надежной денатурации, в частности, поскольку для деспирализации двойной нити ДНК и достаточного увеличения расстояния между двумя нитями посредством диффузии (во избежание повторной гибридизации) может потребоваться поддержание достаточно высокой температуры на протяжении некоторого определенного времени.
A
В предпочтительной форме исполнения изобретения выход g экземпляров подлежащей амплификации нуклеиновой кислоты в конце по меньшей мере одного из прохождений цикла (в предпочтительной форме исполнения изобретения в конце каждого из 10, особо предпочтительно каждого из 20, особо предпочтительно каждого из 40, особо предпочтительно каждого из 80, в особенности каждого из 160 прохождений цикла) составляет более 0,1%, особо предпочтительно более 1%, особо предпочтительно более 10% числа экземпляров нуклеиновой кислоты, имевшихся к началу этого прохождения, и одновременно при этом прохождении или этих прохождениях циклов длительность воздействия t превышает 1 пс, особо предпочтительно превышает 30 пс, особо предпочтительно превышает 300 пс, особо предпочтительно превышает 1ns, особо предпочтительно превышает 10 нс, особо предпочтительно превышает 100 нс, особо предпочтительно превышает 300 нс, особо предпочтительно превышает 1 мкс, особо предпочтительно превышает 3 мкс, особо предпочтительно превышает 10 мкс, особо предпочтительно превышает 30 мкс, особо предпочтительно превышает 100 мкс, особо предпочтительно превышает 300 мкс, особо предпочтительно превышает 1 мс, особо предпочтительно превышает 3 мс а крайне предпочтительно превышает 5 мс. В этом способе исполнения изобретения используется тот факт, что особо надежного результата амплификации можно добиться тогда, когда не слишком малый выход сочетается с достаточно высокой продолжительностью воздействия.
c
c
Произведение g⋅t выхода g и длительности цикла t мы называем характерной константой времени суперамплификации. Предпочтительно, чтобы эта характерная константа времени суперамплификации в конце по меньшей мере одного прохождения цикла (в предпочтительной форме исполнения изобретения в конце каждого из 10, особо предпочтительно каждого из 20, особо предпочтительно каждого из 40, особо предпочтительно каждого из 80, особо предпочтительно каждого из 160 прохождений цикла) составляла менее чем 20 с, особо предпочтительно менее чем 15 с, особо предпочтительно менее чем 12 с, особо предпочтительно менее чем 10 с, особо предпочтительно менее чем 8 с, особо предпочтительно менее чем 6 с, особо предпочтительно менее чем 4 с, особо предпочтительно менее чем 2 с. Достижимое преимущество таких форм исполнения изобретения состоит в том, что длительность всей процедуры ПЦР по протоколу сокращается. В связи с этим в основу изобретения положена та идея, что хотя сокращение длительности циклов и вызывает уменьшение прироста на каждый цикл, это можно с избытком компенсировать при сокращении продолжительности всей процедуры по протоколу путем введения дополнительных циклов.
c
Согласно изобретению выбирают такую длительность циклов t - в предпочтительной форме исполнения изобретения каждого из 10, особо предпочтительно каждого из 20, особо предпочтительно каждого из 40, особо предпочтительно каждого из 80, особо предпочтительно каждого из 160 прохождений цикла, которая уменьшена по сравнению с длительностью цикла  эталонной ПЦР, проведенной в остальном идентично, на величину, определяемую коэффициентом сокращения циклов х . При этом эталонная реакция ПЦР идентична, в частности, с точки зрения биохимического состава, поддержания тех же самых температур отжига, элонгации и денатурации, а прежде всего - с точки зрения подлежащей амплификации итоговой нуклеиновой кислоты и в особенности ее последовательности, концентрации и предварительной обработки; у эталонной ПЦР всего лишь больше длительность циклов, а при необходимости может быть выше количество циклов. Согласно изобретению в итоге получается выход на один цикл , который уменьшен по сравнению с выходом на цикл  эталонной ПЦР, в остальных отношениях реализуемой точно так же, на величину, определяемую коэффициентом потери эффективности y . В одной из форм исполнения справедливо неравенство x>0,9y, особо предпочтительно x=y, особо предпочтительно x>y, особо предпочтительно x>1,1y, особо предпочтительно x>1,2y, особо предпочтительно x>1,3y, особо предпочтительно x>1,5y, особо предпочтительно x>2y, особо предпочтительно x>2,5y, особо предпочтительно x>3y, особо предпочтительно x>5y, причем одновременно справедливо неравенство x>1,2, особо предпочтительно x>1,5, особо предпочтительно x>2, особо предпочтительно x>2,5, особо предпочтительно x>3, особо предпочтительно x>4, особо предпочтительно x>5, особо предпочтительно x>10.
Это создает ситуацию, когда эффект "сложных банковских процентов", обеспечиваемый умножением x на большее количество циклов в единицу времени, в ПЦР согласно изобретению более чем компенсирует потерю эффективности (то есть уменьшенный на коэффициент у выход на один цикл), то есть, что согласно изобретению во время ПЦР такой же или даже меньшей продолжительности возможно образование большего количества ампликона.
При этом в ПЦР согласно изобретению предпочтительно осуществляется больше циклов, чем в эталонной ПЦР, причем предпочтительно, чтобы ПЦР согласно изобретению проходила в x раз больше циклов (x - это коэффициент сокращения циклов), особо предпочтительно в 0,9x раз больше, особо предпочтительно в 0,8x раз больше, особо предпочтительно в 0,6x раз больше, особо предпочтительно в 0,4x раз больше, особо предпочтительно в 0,2x раз больше, а крайне предпочтительно - в 0,1x раз больше. Это позволяет добиться сокращения протокола по сравнению с эталонной ПЦР, так как длительность цикла уменьшена на величину, определяемую коэффициентом сокращения циклов х, но количество потребных циклов и, соответственно, длительность всего протокола увеличивается не в той же мере. В одной из форм исполнения коэффициент сокращения цикла ПЦР согласно изобретению по сравнению с эталонной ПЦР предпочтительно составляет как минимум x>1,2, особо предпочтительно по меньшей мере x>1,5, особо предпочтительно по меньшей мере x>2, особо предпочтительно по меньшей мере x>3, особо предпочтительно по меньшей мере x>4, особо предпочтительно по меньшей мере x>5, а крайне предпочтительно по меньшей мере x>10. Это позволяет добиться выраженного "эффекта сложных процентов" или эффекта суперамплификации.
Обязательное условие решения согласно изобретению состоит в том, что ПЦР еще не достигла состояния насыщения, которое возможно, например, в силу израсходования лимитирующих реагентов (например, праймера или dNTPs), поскольку такие эффекты насыщения могут привести к уменьшению выхода на цикл в процессе ПЦР. Поэтому в предпочтительной форме исполнения изобретения предусматривается, что концентрация лимитирующих реагентов уменьшилась с начала ПЦР менее чем на 80%, особо предпочтительно менее чем на 50%, особо предпочтительно менее чем на 25%, особо предпочтительно менее чем на 10%, особо предпочтительно менее чем на 5%, особо предпочтительно менее чем на 1%, особо предпочтительно менее чем на 0,1%.
Гарантированно избежать эффектов насыщения можно также таким способом, чтобы выход на каждый цикл предпочтительно оставался постоянным в процессе ПЦР (в предпочтительной форме исполнения изобретения в конце каждого из 10, особо предпочтительно каждого из 20, особо предпочтительно каждого из 40, особо предпочтительно каждого из 80, особо предпочтительно каждого из 160 прохождений цикла), предпочтительно составляя еще 95%, особо предпочтительно 90%, особо предпочтительно 80%, особо предпочтительно 70%, особо предпочтительно 50%, особо предпочтительно 20%, особо предпочтительно 10%, от выхода того цикла, у которого выход во время ПЦР был максимален (обычно первого цикла).
Избежать таких эффектов насыщения можно также посредством ограничения решения согласно изобретению первыми 80%, особо предпочтительно первыми 50%, особо предпочтительно первыми 25%, особо предпочтительно первыми 10% от всех подлежащих реализации в ПЦР прохождений цикла.
Предпочтительно, чтобы количество k прохождений цикла было больше 45, особо предпочтительно больше 50, особо предпочтительно больше 60, особо предпочтительно больше 70, особо предпочтительно больше 80, особо предпочтительно больше 90, особо предпочтительно больше 100, особо предпочтительно больше 120, особо предпочтительно больше 160, а крайне предпочтительно больше 200. При этом используется тот факт, что положительный эффект сокращения длительности отдельных прохождений становится заметен, в частности, тогда, когда количество прохождений велико.
Предпочтительно, чтобы количество k прохождений цикла было меньше 1000, особо предпочтительно меньше 750, а крайне предпочтительно - меньше 500. При этом используется то явление, что не слишком большое количество прохождений может положительно сказаться на надежности результата амплификации.
Ниже сокращения "М", "мМ", "мкМ", "нМ", "пМ" и "фМ" означают единицы моль/л, ммоль/л, мкмоль/л, нмоль/л, пмоль/л либо же, соответственно, фмоль/л.
-23
-21
-20
-19
Предпочтительно, чтобы концентрация ампликона, подлежащего амплификации, к началу реализации способа была больше нуля, предпочтительно больше 10М (моль/л), особо предпочтительно больше 10М, особо предпочтительно больше 10М, особо предпочтительно больше 10М. Этот вариант исполнения изобретения позволяет выгодным образом добиться достаточной чувствительности амплификации, чтобы синтезировать достаточное для обнаружения количество продуктов амплификации.
Предпочтительно, чтобы концентрация ампликона, подлежащего амплификации в ПЦР, была ниже 1 нМ, особо предпочтительно менее 30 пМ, особо предпочтительно менее 1 пМ, особо предпочтительно менее 0,1 пМ, особо предпочтительно менее 10 фМ, особо предпочтительно менее 1 фМ, особо предпочтительно менее 0,1 фМ. Этот способ реализации изобретения позволяет выгодным образом предотвратить достижение насыщения еще до конца амплификации.
Предпочтительно, чтобы количество [единиц] ампликона, которые следует амплифицировать при реализации способа, к началу реализации способа было меньше 500000, особо предпочтительно меньше 200000, особо предпочтительно меньше 100000, особо предпочтительно меньше 10000. Этот способ реализации способа позволяет выгодным образом предотвратить достижение насыщения еще до конца амплификации.
c
A
c
Важным параметром изобретения может быть общая продолжительность t одного прохождения цикла, то есть длительность цикла. В частности, несмотря на большую длительность воздействия t, можно путем экономии времени в другие моменты, например, благодаря краткой продолжительности отжига ввиду высокой концентрации праймера в образце или же благодаря малому времени элонгации с помощью быстродействующей ДНК-полимеразы, прийти к выгодной малой длительности цикла. Предпочтительно, чтобы длительность цикла t по меньшей мере при одном прохождении цикла (в предпочтительном варианте исполнения изобретения по меньшей мере при 10, особо предпочтительно по меньшей мере при 20, особо предпочтительно по меньшей мере при 40, особо предпочтительно по меньшей мере при 80, особо предпочтительно по меньшей мере при 160 прохождениях цикла) составляла менее 40 с, особо предпочтительно менее чем 30 с, особо предпочтительно менее чем 20 с, особо предпочтительно менее чем 15 с, особо предпочтительно менее чем 12,5 с, особо предпочтительно менее чем 10 с, особо предпочтительно менее чем 7,5 с, в особенности менее 5 с, особо предпочтительно менее чем 4 с, особо предпочтительно менее чем 3 с, особо предпочтительно менее чем 2 с а крайне предпочтительно менее чем 1 с.
c
С другой стороны, слишком быстрое прохождение цикла может отрицательно сказаться на надежности результата амплификации. Поэтому в предпочтительном варианте исполнения изобретения целесообразно, чтобы длительность цикла t по меньшей мере при одном прохождении цикла (в предпочтительном варианте исполнения изобретения по меньшей мере при 10, особо предпочтительно по меньшей мере при 20, особо предпочтительно по меньшей мере при 40, особо предпочтительно по меньшей мере при 80, особо предпочтительно по меньшей мере при 160 прохождениях цикла) превышала 0,5 с, особо предпочтительно превышала 1 с, особо предпочтительно превышала 2 с, особо предпочтительно превышала 3 с, особо предпочтительно превышала 4 с, особо предпочтительно - чтобы она превышала 5 с.
A
r
Способ согласно изобретению можно выгодным образом применять, в частности, при больших объемах образца, в том числе потому что по статистическим причинам в большом объеме с большей надежностью образуется достаточное число правильных дубликатов даже при малой продолжительности цикла. Предпочтительно, чтобы по меньшей мере при одном прохождении цикла (в предпочтительном варианте исполнения изобретения по меньшей мере при 10, особо предпочтительно по меньшей мере при 20, особо предпочтительно по меньшей мере при 40, особо предпочтительно по меньшей мере при 80, особо предпочтительно по меньшей мере при 160 прохождениях цикла) частное  от деления длительности воздействия t на облучаемый источником энергии реакционный объем V составляло менее чем 1 с/мкл (секунд на мкл), то есть <1 с/мкл, особо предпочтительно менее чем 0,1 с/мкл, особо предпочтительно менее чем 0,01 с/мкл а крайне предпочтительно менее чем 0,001 с/мкл.
A
r
A
r
С другой стороны, может оказаться целесообразным (в том числе из соображений удобства реализации способа), чтобы по меньшей мере при одном прохождении цикла (в предпочтительном варианте исполнения изобретения по меньшей мере при 10, особо предпочтительно по меньшей мере при 20, особо предпочтительно по меньшей мере при 40, особо предпочтительно по меньшей мере при 80, особо предпочтительно по меньшей мере при 160 прохождениях цикла) частное t/V от деления длительности воздействия t на облучаемый источником энергии реакционный объем V было больше 1 пс/мкл, особо предпочтительно больше 10 пс/мкл, особо предпочтительно больше 100 пс/мкл, особо предпочтительно больше 1 нс/мкл, особо предпочтительно больше 10 нс/мкл а крайне предпочтительно больше 100 нс/мкл.
Источник энергии, который вызывает общий, а особо предпочтительно - локальный нагрев в реакционном объеме, в предпочтительном варианте способа представляет собой источник электромагнитного излучения, особо предпочтительно источник света. Предпочтительный источник света для нагрева реакционного объема испускает свет предпочтительно в спектральной области 200-2000 нм, особо предпочтительно в диапазоне 300-1600 нм, особо предпочтительно в диапазоне 300-1100 нм, а крайне предпочтительно в диапазоне 400-800 нм. Крайне предпочтительно, чтобы источник энергии представлял собой лазер, например, непрерывный или квазинепрерывный диодный или твердотельный лазер или же наносекундный лазер.
Изобретение особо удобно в применении для амплификации нуклеиновых кислот, длина которых составляет менее чем 2000 оснований, особо предпочтительно менее чем 1000 оснований, особо предпочтительно менее чем 300 оснований, особо предпочтительно менее чем 200 оснований, особо предпочтительно менее чем 150 оснований, особо предпочтительно менее чем 100 оснований, особо предпочтительно менее чем 80 оснований, а крайне предпочтительно менее чем 60 оснований. Предпочтительно, чтобы подлежащий амплификации ампликон был длиннее 10 оснований, особо предпочтительно длиннее 30 оснований, а крайне предпочтительно - длиннее 50 оснований. Способ согласно изобретению позволяет особо эффективно амплифицировать ДНК с указанными значениями длины.
Целесообразные малые значения длительности циклов можно получить в том числе и благодаря быстрой элонгации. Предпочтительно выбирать ДНК-полимеразу и настраивать условия реакции ПЦР таким образом, чтобы ДНК-полимераза обладала скоростью записи как минимум в 1 основание/с, особо предпочтительно как минимум в 5 оснований/с, особо предпочтительно по меньшей мере 10 оснований/с, особо предпочтительно по меньшей мере 50 оснований/с, особо предпочтительно по меньшей мере 100 оснований/с, особо предпочтительно по меньшей мере 500 оснований/с, а крайне предпочтительно по меньшей мере 1000 оснований/с.
В предпочтительном варианте исполнения изобретения наночастицы в реакционном объеме благодаря возбуждению передают тепло своему окружению. Наночастицы предпочтительно представляют собой частицы, которые в силу своего размера обладают особыми оптическими свойствами, например, характерными спектрами поглощения или рассеяния и которые в материале объема таким образом не выделяются (не обращают на себя внимание) или выделяются не слишком отчетливо. Предпочтительно, чтобы диаметр наночастиц составлял от 2 до 500 нм (нанометров), особо предпочтительно от 3 до 300 нм, а крайне предпочтительно от 5 до 200 нм. Предпочтительные наночастицы имеют диаметр от 7 до 150 нм. Наночастицы могут иметь сферическую форму, возможно, однако, также, в частности, применение отличных от круглой форм, например, продолговатых наночастиц (наностержней). В предпочтительном варианте исполнения изобретения в состав наночастицы входит по меньшей мере один полупроводник или металл, предпочтительно благородный металл, например, золото или серебро. В одном из вариантов исполнения наночастицы полностью состоит из металла, а в другом металл образует лишь часть наночастицы, например, ее оболочку. Предпочтительная наночастица может представлять собой наночастицу из оболочки и ядра. На поверхности предпочтительной наночастицы могут иметься поры, которые могут занимать атомы или молекулы с размером и зарядом, определяемым свойствами пор; особо предпочтительно, чтобы эти атомы или молекулы откладывались на наночастице только тогда, когда она находится в растворе. Наночастица включает в себя также и атомы и молекулы, отложившиеся на ее поверхности. Предпочтительные наночастицы благодаря своему плазмонному резонансу или поглощению материала наночастиц пригодны для поглощения энергии света.
Время нагрева - это время, которое проходит с момента, когда интенсивность возбуждающего света I(t) из источника в данном конкретном возбуждаемом объеме достигла своего максимального значения, и до момента, когда в каждой точке возбуждаемого объема устанавливается температура, которая даже при удвоении длительности воздействия изменяется максимум на 3°С.
Время охлаждения - это время, которое проходит от момента отключения источника возбуждающего света до момента, когда в каждой точке рассматриваемого объема устанавливается температура, которая отличается от температуры до воздействия максимум на 3°С.
Момент отключения  источника возбуждающего света определяют как момент времени, в которой интенсивность возбуждения I в рассматриваемом объеме упала до менее чем 5% максимальной интенсивности возбуждения (например, после импульса лазера).
Определение времени нагрева и охлаждения: изменение температуры со временем на расстоянии r от центра наночастицы с радиусом rNP получают путем численного решения уравнения теплопроводности в достаточно большом шаре воды с радиусом rMax, окружающем наночастицу, причем саму наночастицу из области симуляции изымают. Благодаря использованию сферической симметрии получается одномерное радиальное уравнение теплопроводности в области от rNP до rMax, t>0:
,
-7
2
причем T(r, t) означает температуру в точке r в момент времени t, а α означает термический коэффициент диффузии воды (α=1,43⋅10 m/s).
В качестве стартового условия температуру окружающей среды до оптического возбуждения задают на уровне .
Граничные условия в позициях rNP и rMax задают следующим образом: в точке r=rNP получают угол наклона графика температуры в момент t из мощности, поглощенной наночастицей в момент t (граничное условие Неймана):
,
причем P(t) - это поглощенная наночастицей мощность, а k - теплопроводность воды (k=0.6 Вт/(м⋅К)). Поглощенную мощность рассчитывают согласно P(t)=I(t)⋅σ, где I(t) - зависимая от времени интенсивность возбуждающего света от источника, а σ - сечение поглощения частицы. (То есть (при неизменном размере фокуса) для непрерывного лазера I(t) представляет собой константу, а в случае импульсного лазера I(t) отражает форму зависимости пульсации от времени).
В точке rMax температуру поддерживают на постоянном уровне , граничное условие Дирихле). Например, для случая rNP<100 нм выбирают rMax≥10000 нм.
Термический коэффициент диффузии и теплопроводность воды считают постоянными. В общем случае справедливо выражение α=k/(C⋅ρ), где С - удельная теплоемкость, а ρ - плотность воды.
С помощью надлежащих программ для численного решения таких дифференциальных уравнений в частных производных (например, с применением команды NSolve в пакете Mathematica, и т.д.) можно решить приведенное выше уравнение теплопроводности и получить значения температуры как функции места и времени, T(r, t).
2
0
Например, для сферической золотой наночастицы с rNP=30 нм, возбуждаемой с постоянной интенсивностью в 1 кВт/мм при длине волны 532 нм и длительностью 100 нс, для начальной температуры Т=30°С получают следующие значения: Т (r=30 нм, t=20 нс) = 70°С, Т(r=30 нм, t=100 нс) = 78°С, Т(r=30 нм, t=120 нс) = 36°С, Т(r=40 нм, t=20 нс) = 56°С, Т(r=40 нм, t=100 нс) = 64°С, Т(r=40 нм, t=120 нс) = 36°С.
auf
auf
auf
Для расчета времени разогрева согласно изобретению обрабатывают T(r, t) для различных значений времени. В этом случае время нагрева - это минимальное время t, для которого справедливо неравенство , где r ∈ [rNP; rMAX], то есть модуль разности распределения температур для моментов времени t и 2t должен быть меньше 3°С для всех точек за пределами наночастицы.
x
x
off
Время охлаждения получают как разность , причем t - это минимальное время, для которого справедливо неравенство , причем r ∈ [rNP; rMAX] и t>t.
Предпочтительно, чтобы время нагрева по меньшей мере при одном прохождении цикла (в предпочтительном варианте исполнения изобретения по меньшей мере при 10, особо предпочтительно по меньшей мере при 20, особо предпочтительно по меньшей мере при 40, особо предпочтительно по меньшей мере при 80, особо предпочтительно по меньшей мере при 160 прохождениях цикла) составляло предпочтительно более 1 наносекунды, особо предпочтительно более 5 наносекунд, особо предпочтительно более 10 наносекунд и предпочтительно менее чем 100 миллисекунд, особо предпочтительно менее чем 10 миллисекунд, особо предпочтительно менее чем 1 миллисекунду, особо предпочтительно менее чем 300 микросекунд, особо предпочтительно менее чем 100 микросекунд, особо предпочтительно менее чем 50 микросекунд, особо предпочтительно менее чем 30 микросекунд, особо предпочтительно менее чем 10 микросекунд, особо предпочтительно менее чем 5 микросекунд, особо предпочтительно менее чем 1,5 микросекунды. Краткое время нагрева позволяет обеспечить малую общую длительность процесса.
Предпочтительно, чтобы время охлаждения по меньшей мере при одном прохождении цикла (в предпочтительном варианте исполнения изобретения по меньшей мере при 10, особо предпочтительно по меньшей мере при 20, особо предпочтительно по меньшей мере при 40, особо предпочтительно по меньшей мере при 80, особо предпочтительно по меньшей мере при 160 прохождениях цикла) составляло более 1 наносекунды, особо предпочтительно более 5 наносекунд, особо предпочтительно более 10 наносекунд и предпочтительно менее чем 100 миллисекунд, особо предпочтительно менее чем 10 миллисекунд, особо предпочтительно менее чем 1 миллисекунду, особо предпочтительно менее чем 300 микросекунд, особо предпочтительно менее чем 100 микросекунд, особо предпочтительно менее чем 50 микросекунд, особо предпочтительно менее чем 30 микросекунд, особо предпочтительно менее чем 10 микросекунд, особо предпочтительно менее чем 5 микросекунд, особо предпочтительно менее чем 3 микросекунды, особо предпочтительно менее чем 1,5 микросекунды, особо предпочтительно менее чем 1 микросекунду, особо предпочтительно менее чем 300 наносекунд, особо предпочтительно менее чем 100 наносекунд. Краткое время охлаждения может способствовать ускорению ПЦР.
Если в силу нагрева наночастицы ее окружению передается теплота, то это означает, что наночастице передается энергия, причем в силу передачи энергии наночастицы нагревает свое окружение. При этом непосредственное окружение наночастицы предпочтительно сильнее нагревается от возбуждения наночастицы, чем дальнее окружение наночастицы. Обычно наночастицы сначала нагреваются путем возбуждения, а затем передают теплоту своему окружению. Предпочтительно, чтобы окружение наночастицы представляло собой сферический объем, диаметр которого превышает диаметр находящейся в его центре наночастицы в 100 раз, особо предпочтительно, чтобы этот диаметр превышал диаметр наночастицы в 10 раз, крайне предпочтительно в 4 раза, и предпочтительно, чтобы его диаметр превышал диаметр наночастицы менее чем в 2 раза.
Предпочтительно, чтобы в силу возбуждения наночастиц происходил локальный нагрев окружения наночастиц. Особенно быстрые изменения температуры возможны тогда, когда нагретый объем представляет собой лишь малую долю общего объема. В этом случае, во-первых, можно уже при небольшой подаче энергии путем облучения создать высокую разность температур. Во-вторых, возможно очень быстрое охлаждение нагретого объема, если в облученном объеме имеется достаточно большой холодный температурный резервуар для охлаждения наночастиц и их окружения после облучения. Этого можно добиться, облучая наночастицы достаточно сильно (чтобы добиться желательного повышения температуры) и достаточно недолго (чтобы сохранить локализацию теплоты). Благодаря локальному нагреву возможно подвергать полимеразы меньшему тепловому воздействию, так что можно реализовать и способы ПЦР с количеством циклов более 80.
a
-7
2
В смысле настоящего изобретения локальный нагрев имеет место в том случае, когда длительность возбуждения в облучаемом в каждом случае объеме (например, в фокусе лазера) t выбирают меньше или равной критической длительности возбуждения t1. При этом предпочтительно, чтобы длительность возбуждения t1 была равна длительности воздействия t. При этом t1 определяется временем, которое при среднем расстоянии между наночастицами необходимо для диффузии теплоты от одной наночастицы до другой, умноженным на коэффициент пересчета s1, так что при среднем расстоянии между наночастицами  и теплопроводности среды между наночастицами D величина t1 задана , причем в водном растворе теплопроводность D обычно имеет значение D=10 м/с.
Коэффициент масштабирования s1 - это мера того, насколько распространяется тепловой фронт частицы за время возбуждения. Обусловленное возбужденной наночастицей повышение температуры на расстоянии в несколько диаметров наночастицы представляет собой лишь очень малую долю от максимального повышения температуры на поверхности частицы. В одном из вариантов исполнения изобретения допускается перекрытие тепловых фронтов от нескольких наночастиц - в том смысле, что в определении критической длительности возбуждения t1 в соответствии с вышеприведенной формулой используется коэффициент масштабирования s1 больше 1. В другом варианте исполнения изобретения перекрытие тепловых фронтов от нескольких наночастиц во время возбуждения не допускается (соответствует строго локализованному нагреву) - в том смысле, что в определении критической длительности возбуждения t1 в соответствии с вышеприведенной формулой используется коэффициент масштабирования s1, меньший или равный 1. Для определения локализованного нагрева предпочтительно s1=100, предпочтительно s1=30, предпочтительно s1=10, предпочтительно s1=7, предпочтительно s1=3 а крайне предпочтительно s1=1, предпочтительно s1=0,7, предпочтительно s1=0,3.
Значения s1>1 в числе прочего могут быть полезны в тех случаях, когда облучаемый объем характеризуется большим соотношением длины и ширины (например, в фокусе умеренно сфокусированного лазерного луча), так что на поверхности облучаемого объема находится сравнительно большое количество наночастиц, и поэтому в их окружении находятся менее нагретые наночастицы, и имеет место сильный отток тепла из облучаемого объема, так что вклад в нагрев более дальних соседних частиц дольше остается пренебрежимо малым.
-7
2
Это означает, что, например, при концентрации наночастиц в 1 нМ, из которой следует среднее расстояние между наночастицами, равное  микрометрам, имеет место локальный нагрев, если только длительность возбуждения составляет менее t1=14 микросекунд (в этом случае коэффициент пересчета выбран на уровне s1=1, D=10 м/с). Следует полагать, что в случае выбора t>t1 теплота, которую отдают наночастицы, в силу диффузии может во время облучения преодолеть расстояние, которое больше среднего расстояния между наночастицами, что в итоге приведет к перекрыванию тепловых фронтов множества наночастиц, так что во всем объеме между наночастицами будет иметь место повышение температуры; чем дольше идет нагрев, тем более однородным в пространственном отношении будет повышение температуры в облучаемом объеме, так как в распределении температур вокруг одной наночастицы будут участвовать не только вклады ближайших наночастиц, но и более дальних соседей. Если реакционный объем облучают поглощаемым наночастицами излучением дольше, чем t1, то такой нагрев называют глобальным.
Глобальный нагрев возможен также, например, в силу того, что реакционный объем нагревают извне элементом Пельтье или резистивным нагревом. Глобальный нагрев можно также осуществлять, облучая, например, реакционный объем облучением, которое поглощается водой в образце сильнее, чем наночастицами, или сходным с ними образом. При этом повышение температуры означает разность между температурой в некотором месте в момент наблюдения непосредственно после возбуждения и температурой в том же месте в момент непосредственно перед возбуждением. Глобальный нагрев и локальный нагрев можно также осуществлять одновременно.
Благодаря возбуждению наночастиц можно добиться того, что в способе ПЦР нуклеиновых кислот не приходится нагревать весь реакционный объем. Напротив, возможно нагревать только конкретные части реакционного объема путем возбуждения наночастиц. Так, выгодным образом возможно нагревать только те части реакционного объема, которые необходимо нагревать для амплификации нуклеиновых кислот. Таким образом возможно щадящее отношение к термочувствительным компонентам образца, так что появляется возможность увеличить количество циклов. Локальный нагрев может быть быстрее, чем общий нагрев всего объема, если предстоит передать меньше энергии. Таким образом, изобретение позволяет выгодным образом представить способ ПЦР, который быстрее и требует меньше энергии.
Возбуждение наночастиц предпочтительно осуществлять с помощью переменного поля, особо предпочтительно с помощью переменного электромагнитного поля, крайне предпочтительно - оптическим способом. Предпочтительно осуществлять возбуждение светом в диапазоне от дальнего инфракрасного до дальнего ультрафиолетового (в диапазоне длин волн от 100 нм до 30 мкм), особо предпочтительно в диапазоне от ближнего инфракрасного до ближнего ультрафиолетового (в диапазоне длин волн от 200 нм до 3 мкм), крайне предпочтительно - видимым светом (в диапазоне длин волн от 400 до 800 нм). По сравнению с обычным общим нагревом реакционного сосуда извне это может дать то преимущество, что нет необходимости преодолевать термоизолирующую стенку реакционного сосуда, так как энергию передают непосредственно наночастицам. Это позволяет добиться более быстрого нагрева желательной части образца.
Особо предпочтительно, чтобы световое излучение обладало частотой, которая возбуждает поверхностный плазмонный резонанс наночастиц. Источник света может выдавать свет в импульсном или непрерывном режиме. Источником света может быть, например, газовый лазер, диодный лазер или твердотельный лазер с диодной накачкой.
A
Длительность периода возбуждения, на протяжении которого наночастицы в каждом цикле возбуждают оптическим путем в данном конкретном облучаемом объеме, предпочтительно составляет более 1 пикосекунды, особо предпочтительно более 30 пикосекунд либо же, соответственно, 100 пикосекунд, крайне предпочтительно более 1 наносекунды либо же, соответственно, 10 наносекунд. В то же время предпочтительно, чтобы длительность воздействия составляла менее чем 100 мс, особо предпочтительно менее чем 10 мс, особо предпочтительно менее чем 1 мс, особо предпочтительно менее чем 500 мкс, особо предпочтительно менее чем 100 мкс, особо предпочтительно менее чем 50 мкс а крайне предпочтительно менее чем 10 мкс. Постольку, поскольку возбуждение предназначено для денатурации, длительность возбуждения предпочтительно соответствует длительности воздействия t.
A
Предпочтительно, чтобы длительность возбуждения была меньше, чем в среднем необходимо для того, чтобы теплота, вырабатываемая в окружении наночастиц, диффундировала на среднее расстояние между частицами, так чтобы в среднем не возникало значимое перекрывание тепловых фронтов соседствующих частиц. Особо предпочтительно выбирать временной интервал (период) возбуждения таким образом, чтобы вокруг каждой облученной наночастицы повышение температуры, вызванное облучением, снижалось до величины менее половины его максимума в среднем на удалении в 20 диаметров наночастицы, особо предпочтительно 2 диаметров наночастицы, крайне предпочтительно 1 диаметра наночастицы. В одном из вариантов исполнения предпочтительна минимальная длительность облучения на объем, так чтобы дегибридизированная одинарная нить ДНК во время денатурации могла диффундировать в направлении от наночастицы только на расстояние менее 100 нм, особо предпочтительно менее 20 нм, особо предпочтительно менее чем на 10 нм, особо предпочтительно менее чем на 5 нм. Благодаря этому высока вероятность того, что дегибридизированная одиночная нить ДНК свяжется с олигонуклеотидом на той же самой наночастице. Это дает возможность реализовать ускоренный способ согласно изобретению. В предпочтительной форме исполнения концентрация конъюгированных с праймером наночастиц меньше 10 нМ, при этом временной интервал возбуждения предпочтительно составляет от 1 нс до 10 мкс, особо предпочтительно от 10 нс до 1 мкс а крайне предпочтительно от 15 нс до 300 нс. Предпочтительно выбирать временной интервал возбуждения так, чтобы он не был значительно меньше 1 нс, поскольку в ином случае время нагрева двойной нити ДНК будет недостаточным для того, чтобы обе полученные одинарные нити могли достаточно отделиться друг от друга посредством диффузии, так чтобы они тут же не гибридизировались друг с другом снова. Постольку, поскольку период возбуждения предназначен для денатурации, предпочтительно, чтобы он соответствовал t.
c
-12
-10
-9
-8
Скважность - это отношение длительности воздействия к длительности цикла ПЦР t. Предпочтительно выбирать скважность на таком уровне, чтобы возбуждение приводило к достаточной денатурации двойных нитей ДНК от локального нагрева. В то же время предпочтительно выбирать скважность так, чтобы среднее повышение температуры всего образца удерживалось на достаточно низком уровне, так чтобы не возникали помеховые воздействия на гибридизацию, элонгацию и денатурацию. Предпочтительно, чтобы скважность для облучаемого объема составляла менее чем 50%, особо предпочтительно менее чем 20% а крайне предпочтительно менее чем 1%. Целесообразно, чтобы скважность в облучаемом объеме составляла более 10, предпочтительно более 10, особо предпочтительно более 10 а крайне предпочтительно более 10.
2
2
2
2
2
2
Плотность мощности в смысле настоящего изобретения представляет собой оптическую мощность на единицу площади падающего на образец света; если речь идет об импульсном источнике света, то определяющее значение имеет пиковая мощность. Плотность мощности, с которой осуществляют возбуждение наночастиц, по меньшей мере при одном прохождении цикла, особо предпочтительно по меньшей мере при 10 прохождениях цикла, особо предпочтительно по меньшей мере при 20 прохождениях цикла, особо предпочтительно по меньшей мере при 40 прохождениях цикла, особо предпочтительно по меньшей мере при 80 прохождениях цикла а крайне предпочтительно по меньшей мере при 160 прохождениях цикла, составляет более 10 Вт/мм, особо предпочтительно более 50 Вт/мм, особо предпочтительно более 100 Вт/мм, особо предпочтительно более 200 Вт/мм, особо предпочтительно более 300 Вт/мм, а крайне предпочтительно более 400 Вт/мм. Этот вариант исполнения изобретения позволяет выгодным образом добиться достаточной степени нагрева наночастиц от возбуждения.
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Плотность мощности, с которой осуществляют возбуждение наночастиц, по меньшей мере при одном прохождении цикла, особо предпочтительно по меньшей мере при 10 прохождениях цикла, особо предпочтительно по меньшей мере при 20 прохождениях цикла, особо предпочтительно по меньшей мере при 40 прохождениях цикла, особо предпочтительно по меньшей мере при 80 прохождениях цикла а крайне предпочтительно по меньшей мере при 160 прохождениях цикла, составляет менее чем 20000 кВт/мм, предпочтительно менее чем 10000 кВт/мм, особо предпочтительно менее чем 5000 кВт/мм, особо предпочтительно менее чем 3000 кВт/мм, особо предпочтительно менее чем 1000 Вт/мм, особо предпочтительно менее чем 500 кВт/мм, особо предпочтительно менее чем 300 кВт/мм, особо предпочтительно менее чем 150 кВт/мм, а крайне предпочтительно менее чем 80 кВт/мм. Этот вариант исполнения изобретения позволяет выгодным образом противодействовать повреждению наночастиц или связанной с ними ДНК и предотвратить такое повреждение.
Еще в одной предпочтительной форме исполнения энергия возбуждающего излучения передается наночастицам в силу поглощения ее материалом наночастиц. Свет, который применяют для возбуждения наночастиц, может также иметь источником термический излучатель, например, лампу-вспышку. Еще в одной предпочтительной форме исполнения изобретения наночастицы возбуждают переменным электромагнитным полем или электромагнитными волнами, которые вызывают в наночастицах появление вихревых токов. При надлежащем исполнении наночастиц возможно также возбуждать наночастицы ультразвуком.
В предпочтительной форме исполнения изобретения наночастицы конъюгированы с олигонуклеотидами. В этом случае наночастицы образуют конъюгаты из наночастиц и олигонуклеотидов. Это позволяет добиться того преимущества, что благодаря возбуждению наночастиц нагреваются конкретно олигонуклеотиды, представляющие собой часть способа согласно изобретению, без необходимости нагрева всего реакционного объема. В особо предпочтительной форме исполнения наночастицы конъюгированы с праймерами. Крайне предпочтительно, чтобы наночастицы были конъюгированы с прямыми и обратными праймерами способа ПЦР. В предпочтительном варианте исполнения изобретения на одном виде конъюгатов наночастиц с олигонуклеотидами размещены прямые, но не обратные праймеры, а на другом виде конъюгатов - обратные, но не прямые праймеры.
Еще в одной предпочтительной форме исполнения один из сортов конъюгатов наночастиц и олигонуклеотидов конъюгирован как с прямыми, так и с обратными праймерами. В этом варианте исполнения при реализации способа ПЦР на наночастице, исходя из прямого праймера, записывается новая одинарная нить ДНК, комплементарная оригиналу. Эта новая одинарная нить ДНК конъюгирована с наночастицей, так как новая одинарная нить ДНК содержит прямой праймер. Непосредственно после записи новая одинарная нить ДНК образует двойную нить с оригиналом. При последующей денатурации новая одинарная нить ДНК отделяется от оригинала. При температуре отжига новая одинарная нить ДНК гибридизируется с обратным праймером, который находится на поверхности наночастицы, так что образуется петля. Для гибридизации с обратным праймером той же самой наночастицы необходимо преодолеть лишь краткий путь. Для гибридизации с обратным праймером на другой наночастице при предпочтительных значениях концентрации наночастиц в среднем необходимо пройти более длинный путь. Таким образом, эта форма исполнения дает преимущество, позволяя добиться более быстрого отжига и более быстрого прохождения ПЦР.
В предпочтительном варианте исполнения изобретения наночастицы так соединены с олигонуклеотидами, что имеются ковалентные связи более чем с одним тиолом между олигонуклеотидами и наночастицами. Буферные растворы для ПЦР, как правило, содержат дитиотреитол, который дестабилизирует тиоловую связь между золотой наночастицей и олигонуклеотидом и который, в частности при термической нагрузке, как, например, во время денатурации, может привести к отделению олигонуклеотидов от наночастиц. Ковалентные связи более чем с одним тиолом между праймерами и наночастицами могут уменьшить степень отделения праймеров и таким образом повысить эффективность способа ПЦР.
В предпочтительном варианте исполнения применяют противоположные последовательности, способные связываться с такими нуклеотидами, что отделились от наночастиц, с которыми они ранее были соединены. Противоположные последовательности представляют собой олигонуклеотиды. При реализации способа может случиться, что олигонуклеотиды, конъюгированные с наночастицами, отделятся от последних и таким образом оказываются свободны. В том случае, когда этими свободными олигонуклеотидами являются праймеры согласно изобретению, эти свободные праймеры могут связываться с оригиналом или комплементом. Поскольку, однако, свободные праймеры не связаны с наночастицами, свободные праймеры не могут отделиться (дегибридизироваться) от оригинала либо же, соответственно, комплемента из-за возбуждения наночастиц. Из-за этого эффективность и чувствительность способа снижаются. Противоположные последовательности как минимум частично комплементарны свободным олигонуклеотидам и связываются с ними с достаточной аффинностью, так что функциональность свободных олигонуклеотидов ограничивается. Это позволяет повысить эффективность и чувствительность способа. В особо предпочтительной форме исполнения способа до введения в образец оригинала к образцу уже добавлены в достаточном количестве противоположные последовательности для блокировки свободных праймеров. В то же время это количество достаточно мало, чтобы на наночастицах находилось еще достаточно большое число не блокированных праймеров. Это возможно, если число праймеров на наночастицах превышает число свободных праймеров.
В предпочтительном варианте исполнения на наночастицах размещены заполняющие молекулы. Заполняющие молекулы предотвращают нежелательную агрегацию наночастиц в образце. Таким образом заполняющие молекулы вносят свой полезный вклад в стабилизацию наночастиц. С применением заполняющих молекул можно модулировать заряд наночастиц. Таким образом, концентрацию соли, которая присутствует в среде, окружающей наночастицы, можно отрегулировать так, чтобы ДНК-полимераза могла вести синтез как можно быстрее, и чтобы, способ можно было выгодным образом реализовывать быстро. Заполняющие молекулы могут состоять из олигонуклеотидов,
которые не являются праймерами и которые предпочтительно короче праймеров. Заполняющие молекулы могут также, например, состоять из полимеров, например, полиэтиленгликоля. В предпочтительном варианте исполнения заполняющие молекулы позволяют снизить число праймеров на наночастицах, а вместо этого применять больше заполняющих последовательностей, не вызывая существенного снижения эффективности способа.
Еще в одном предпочтительном варианте исполнения способа часть последовательности олигонуклеотидов на наночастицах представляет собой спейсерную последовательность. При этом спейсерная последовательность располагается с той стороны данного конкретного олигонуклеотида, которая обращена к наночастице. Таким образом, для остальной части олигонуклеотида спейсерная последовательность играет роль проставки (спейсера). В предпочтительной форме исполнения олигонуклеотид содержит как часть последовательности, исполняющую функцию праймера и называемую праймерной последовательностью, так и часть последовательности, представляющую собой спейсерную последовательность. В силу того, что праймерные последовательности удерживаются на некотором расстоянии от наночастиц с помощью спейсерных последовательностей, выгодным образом улучшается доступ подлежащих амплификации нуклеиновых кислот и ДНК-полимеразы к праймерным последовательностям. В предпочтительном варианте исполнения копии оригинала и комплемента после синтеза остаются прикреплены к поверхности наночастиц через спейсерные последовательности. В особо предпочтительном варианте осуществления спейсерные последовательности содержат сайты рестрикции (распознаваемые последовательности) для рестрикции эндонуклеазами, так чтобы синтезированные копии можно было отделить от наночастиц. Это происходит предпочтительно после окончания реализации способа, однако может происходить и во время реализации способа. Таким образом, способ дает возможность изготавливать копии нуклеиновых кислот, находящиеся в образце в свободном состоянии. В предпочтительном варианте исполнения способа спейсерные последовательности имеют как минимум ту же длину, что и заполняющие молекулы, так что праймерные последовательности не перекрываются заполняющими молекулами.
В предпочтительной форме исполнения теплоты, которая благодаря возбуждению наночастиц передается их окружению, достаточно, чтобы вызвать дегибридизацию олигонуклеотидов на поверхности наночастиц с отделением их от гибридизированных с ними нуклеиновых кислот. В этом варианте исполнения наночастицы конъюгированы с олигонуклеотидами, и по меньшей мере часть этих олигонуклеотидов гибридизированы с как минимум частично комплементарными нуклеиновыми кислотами. При возбуждении наночастиц тепловая энергия переносится на окружающую воду, так что температура воды вокруг наночастиц предпочтительно оказывается достаточной для отделения олигонуклеотидов от связанных с ними нуклеиновых кислот путем денатурации. В особо предпочтительной форме исполнения наночастицы конъюгированы с праймерами. Таким образом, при выполнении ПЦР предпочтительно образуются продукты ПЦР с двойной цепью, причем в каждом случае по меньшей мере одна одинарная цепь двухцепочечных продуктов ПЦР конъюгирована с наночастицей. В этой форме исполнения можно посредством возбуждения наночастиц выгодным образом добиться температуры денатурации вокруг наночастиц и проведения денатурации двухцепочечных продуктов ПЦР без необходимости нагревать весь реакционный объем. Это позволяет ускорить денатурацию, и способ ПЦР может таким образом осуществляться быстрее. Еще в одном предпочтительном варианте исполнения температуру отжига и температуру элонгации также обеспечивают путем возбуждения наночастиц. Так, по сравнению с нагревом всего образца до температуры отжига и элонгации, необходима передача лишь небольшой энергии. Особо предпочтительно, чтобы денатурация, отжиг и элонгация способа ПЦР проходили без общего нагрева, а исключительно путем локального нагрева посредством возбуждения наночастиц. Благодаря этому можно реализовывать способ без организации общего нагрева, так что расходы на оборудование для осуществления способа оказываются меньше.
Еще в одной предпочтительной форме исполнения способ включает в себя этап общего нагрева. При этом температуры по меньшей мере одного этапа способа как минимум частично достигают посредством общего нагрева. В особо предпочтительной форме исполнения путем общего нагрева достигают температуры отжига. Крайне предпочтительно, чтобы на всем протяжении реализации способа температура реакционного объема посредством общего нагрева удерживалась в предварительно заданном диапазоне температур, в котором проходит отжиг. При этом температуры элонгации и температуры денатурации достигают путем возбуждения наночастиц. Это выгодным образом позволяет обходиться простой конструкцией устройства, обеспечивающего общий нагрев, так как ему необходимо поддерживать только одну предварительно заданную температуру.
Еще в одной предпочтительной форме исполнения путем общего нагрева достигают температуры отжига и температуры элонгации, и лишь исключительно денатурацию обеспечивают путем возбуждения наночастиц. Это выгодным образом позволяет добиться того, что устройство, обеспечивающее общий нагрев, должно реализовывать температурный цикл только с двумя различными температурами, и поэтому в конструктивном отношении может быть прост. Элонгацию и отжиг обычно осуществляют в каждом случае в узком температурном диапазоне. Для денатурации, напротив, надо всего лишь превысить некоторую определенную температуру. Поэтому неоднородность в возбуждении наночастиц в целях денатурации может представлять собой меньшую проблему, чем при установке температуры отжига и элонгации. Следовательно, предпочтительный вариант исполнения, в котором возбуждение наночастиц предназначено исключительно для денатурации, проще реализовать технически. В частности, это справедливо для особо предпочтительного случая, в котором температура отжига и температура элонгации очень близки друг к другу, например, при температуре отжига в 60°С и температуре элонгации в 72°С, так что общий нагрев должен создать лишь небольшое повышение температуры.
В особо предпочтительном варианте исполнения температура отжига равна температуре элонгации. Если температура отжига равна температуре элонгации, то для реализации способа ПЦР обычно требуется только один температурный цикл с двумя различными температурами, благодаря чему способ можно осуществлять в простой установке. Особо предпочтительно выбирать температуры плавления праймеров и применяемую ДНК-полимеразу так, чтобы при температуре плавления применяемая ДНК-полимераза все еще могла синтезировать ДНК с достаточной скоростью. В особо предпочтительном варианте исполнения температуры элонгации, которая равна температуре отжига, достигают общим нагревом, а денатурации достигают путем возбуждения наночастиц. Благодаря этому конструктивное исполнение устройства, обеспечивающего общий нагрев, может быть простым, так как ему необходимо поддерживать только одну температуру.
В предпочтительной форме исполнения в каждой временной точке процесса происходит возбуждение только некоторой части наночастиц. В этих целях средства, например, которые служат для возбуждения наночастиц, можно конструктивно исполнить так, чтобы только в некоторой части реакционного объема они возбуждали находящиеся в нем наночастицы. В особо предпочтительной форме исполнения наночастицы возбуждают оптическим способом, а оптические приспособления, направляющие свет источника в реакционный объем, конструктивно исполнены так, что свет направляется только в некоторую часть реакционного объема. Предпочтительно, чтобы доля наночастиц, которым сообщается возбуждение, в процессе реализации способа изменялась. Иными словами, первое множество наночастиц, которые возбуждают в первый момент времени, не идентично второму множеству наночастиц, которые возбуждают во второй момент времени. В этом случае, если первое и второе множество не идентичны, то в первом множестве может присутствовать произвольное число наночастиц, и во втором множестве произвольное число наночастиц. Одно из указанных множеств может, например, частично пересекаться с другим, так что у двух множеств имеется пересечение. Одно множество может, например, представлять собой подмножество другого множества, так что одно множество содержит меньше наночастиц, чем другое множество. Также оба множества могут быть, например, таковы, что никакого пересечения они не образуют и таким образом ни одна наночастицы не присутствует одновременно как в первом множестве, так и во втором множестве. Одно из двух множеств может также представлять собой пустое множество, так что, например, в один момент времени происходит возбуждение наночастиц, а в другой момент времени никакие наночастицы не возбуждаются. В предпочтительном варианте исполнения первое и второе множество содержат по существу равное число наночастиц. Особо предпочтительно, чтобы источник света в различные моменты времени возбуждал различные доли (части множества) наночастиц. Благодаря этому в этом варианте реализации способа можно применять источник света с меньшей мощностью, которой как раз достаточно только для того, чтобы возбуждать некоторую часть наночастиц. В особо предпочтительной форме исполнения применяют два или более источника света для того, чтобы возбуждать различные части наночастиц. Благодаря этому оказывается возможным то преимущество, чтобы возбуждались различные части наночастиц без потребности в оптическом элементе, который направляет источник света на различные части реакционного объема.
Еще в одной предпочтительной форме исполнения изобретения осуществляется направленное движение образца относительно возбуждающего поля, так что в различные моменты времени возбуждаются наночастицы в различных частях объема образца. Особо предпочтительно, чтобы возбуждающее поле представляло собой свет лазера. В крайне предпочтительной форме исполнения свет источника направляется посредством оптического элемента таким образом, что в различные моменты времени свет возбуждает наночастицы в различных частях реакционного объема. В этих целях оптический элемент может быть расположен с обеспечением подвижности; например, оптический элемент может включать в себя подвижное зеркало, пространственный модулятор или акустико-оптический модулятор. Сам источник света также может располагаться с обеспечением подвижности. Перемещение образца можно осуществлять и таким образом, чтобы перемещался реакционный сосуд, содержащий образец. В особо предпочтительной форме исполнения перемещаются как световой луч, так и реакционный сосуд. Еще в одной предпочтительной форме исполнения перемещается образец в реакционном объеме, так что свет источника в различные моменты времени захватывает различные части объема образца. Этого можно добиться, например, посредством того, что образец в реакционном объеме перемешивают, например, магнитной мешалкой. Реакционный объем может, например, приобретать вытянутую вдоль форму, например, представлять собой канал или трубку. Образец может, например, перемещаться по каналу, причем в одном или нескольких местах образец проходит через луч света. Особо предпочтительно, чтобы образец протекал по каналу и проходил через n позиций, на которых в каждом случае на находящийся в канале образец направлен луч света, причем благодаря линейному протеканию образца через n лучей света реализуется способ ПЦР с n циклами. При этом предпочтительно, чтобы n было больше 80. Так можно выгодным образом реализовать способ с малым частей подвижных частей. Применение канала дает также возможность миниатюризации, например, в смысле "лаборатории на чипе" (Lab-on-a-Chip, микрожидкостная технология). Предпочтительно посредством светового луча вызывать денатурацию, в то время как температуру элонгации и отжига обеспечивают общим нагревом. Особо предпочтительно, чтобы температура элонгации была равна температуре отжига, так что путем общего нагрева приходилось бы удерживать только одну температуру. Это выгодным образом позволяет реализовывать способ согласно изобретению с небольшими затратами.
В предпочтительной форме исполнения в при реализации способа применяют термолабильную ДНК-полимеразу. В том случае, когда для денатурации используют возбуждение наночастиц, можно избежать воздействия высоких температур на весь реакционный объем. Скорее до температуры денатурации можно доводить только непосредственное окружение наночастиц. Таким образом, ДНК-полимеразы, которые не находятся в непосредственном окружении наночастиц, не подвергаются воздействию высоких температур. Благодаря этому можно применять также и ДНК-полимеразы, которые не относятся к термостабильным, то есть термолабильные. Соответственно, благодаря включению в рассмотрение термолабильных ДНК-полимераз имеется обширный выбор ДНК-полимераз для способа согласно изобретению. Благодаря большому выбору ДНК-полимераз условия реакции можно варьировать в широком диапазоне, в то же самое время поддерживая достаточную активность конкретной ДНК-полимеразы. Чтобы подлежащие амплификации нуклеиновые кислоты могли связываться с отрицательно заряженными олигонуклеотидами на наночастицах, может быть необходимо применять в образце вещества, в особенности соли, в концентрации, которая может отрицательно влиять на работу термостабильной ДНК-полимеразы, что снижает эффективность способа. Таким образом, больший выбор ДНК-полимераз, в частности тех, что обладают толерантностью к высокой концентрации соли, может привести к повышению эффективности способа. Частью большого выбора ДНК-полимераз являются малые ДНК-полимеразы, например, такие как фрагмент Кленова и Phi29. Вблизи от наночастиц возможно стерическое затруднение для больших термостабильных ДНК-полимераз, обусловленное нанесенными и в ряде случаев уже прошедшими элонгацию праймерами. Из-за этого может оказаться, что ДНК-полимераза не попадает к подлежащей копированию нуклеиновой кислоте или же ДНК-полимераза прервется, прежде чем она синтезирует полную копию оригинала или комплемента, что означает снижение эффективности способа. Поэтому больший выбор ДНК-полимераз дает возможность повысить эффективность способа. Благодаря большему выбору ДНК-полимераз оказывается выгодным образом возможно применение в том числе и ферментов с низкой стоимостью синтеза. ДНК-полимеразы, которые не находятся в непосредственном окружении наночастиц, в меньшей степени подвергаются термической инактивации. Это выгодным образом позволяет применять при реализации способа меньшее количество ДНК-полимеразы.
В предпочтительной форме исполнения изобретения в реакционном объеме присутствуют как растворимые праймеры, так и праймеры на наночастицах. Растворимые праймеры не конъюгированы с наночастицами, но растворены в образце. Предпочтительно, чтобы растворимые праймеры были меньше по размеру, чем конъюгаты наночастиц и праймеров, и таким образом могли присутствовать в большей концентрации, чем конъюгаты наночастиц и праймеров. Поэтому доступ растворимых праймеров к длинным двухцепочечным нуклеиновым кислотам, например, к геномной ДНК, может быть лучше и быстрее. В особо предпочтительной форме исполнения на первом этапе способа длинные двухцепочечные нуклеиновые кислоты денатурируют путем общего нагрева всего реакционного объема, после чего растворимые праймеры гибридизируют с нуклеиновыми кислотами. При этом способ ПЦР сначала проходит один или несколько циклов общего нагрева, при этом ДНК-полимераза синтезирует желательные короткие копии длинных двухцепочечных нуклеиновых кислот. После этого процесс ПЦР продолжают, причем применяют также и местный нагрев путем возбуждения наночастиц.
В предпочтительной форме исполнения способа диффузию конъюгатов наночастиц с праймерами можно усиливать с помощью оптических полей. Посредством оптических вихревых полей (в соответствии с Silvia Albaladejo et al., Nano Letters, 2009, volume 9, issue 10, pages 3527-3531, соответствующее содержание которого является частью настоящей публикации, включенной посредством ссылки), в которых наночастицы возбуждаются, или посредством оптических сил (в соответствии с Arthur Ashkin et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 1997, volume 94, issue 10, pages 4853-4860, соответствующее содержание которого является частью настоящего раскрытия, включенной посредством ссылки), которые воздействуют на наночастицы, можно повысить диффузию наночастиц. Это выгодным образом позволяет добиться того, что при некоторой заданной концентрации наночастиц происходит более быстрая гибридизация подлежащих амплификации нуклеиновых кислот с праймерами на наночастицах. Это можно использовать для ускорения реализации способа согласно изобретению.
В одном из вариантов исполнения изобретения концентрацию продуктов реакции амплификации определяют с помощью тестовых зондов. Тестовые зонды представляют собой наночастицы, на поверхности которых имеются олигонуклеотиды с тестовыми последовательностями. В предпочтительном варианте исполнения способа часть последовательности олигонуклеотидов тестовых зондов представляет собой спейсерную последовательность. При этом спейсерная последовательность располагается с той стороны данного конкретного олигонуклеотида, которая обращена к наночастице. Таким образом, для остальной части олигонуклеотида спейсерная последовательность играет роль проставки (спейсера). В предпочтительной форме исполнения олигонуклеотид тестовых зондов содержит как часть последовательности, называемую тестовой последовательностью, так и часть последовательности, представляющую собой спейсерную последовательность. В предпочтительном варианте исполнения на тестовых зондах размещены заполняющие молекулы. Тестовые последовательности могут гибридизироваться с продуктами реакции амплификации. При этом тестовые последовательности предпочтительно по меньшей мере частично комплементарны продуктам реакции амплификации. В предпочтительном варианте исполнения первые наночастицы конъюгированы с прямыми праймерами. В присутствии оригинала и ДНК-полимеразы происходит удлинение прямых праймеров, так что образуются комплементы, которые через прямые праймеры связаны с наночастицами. При этом комплемент состоит из прямого праймера и последовательности удлинения, которая образуется посредством удлинения прямого праймера. Особо предпочтительно реализовывать с применением свободных и связанных с наночастицами обратных праймеров способ ПЦР, так что в процессе экспоненциальной амплификации предпочтительно образуется большое число копий оригинала и связанных с наночастицами комплементов. Крайне предпочтительно, чтобы на поверхности первых наночастиц имелись как прямые праймеры, так и обратные праймеры. На промежуточном этапе, возможном в качестве опции, оригиналы и при необходимости их копии комплементов денатурируют путем локального или общего нагрева. Затем первые наночастицы объединяют с тестовыми зондами, если это еще не произошло ранее. Тестовые последовательности тестовых зондов комплементарны последовательностям удлинения, так что тестовые зонды могут через тестовые последовательности связываться с удлиненными прямыми праймерами на первых наночастицах. При надлежащих условиях реакции соединение первых наночастиц с тестовыми зондами происходит в той же степени, в которой имеются связанные с наночастицами комплементы. Это означает, что если не образуются последовательности удлинения, то не формируется соединение тестовых зондов и первых наночастиц. Особо предпочтительно выбирать условия реакции амплификации согласно изобретению и определения посредством тестовых зондов так, чтобы степень связывания первых наночастиц с тестовыми зондами давала возможность делать выводы, какова была концентрация оригинала до амплификации образца. В силу связывания первых наночастиц с тестовыми зондами может возникнуть поддающееся измерению изменение, например, красное смещение или уширение плазмонного резонанса в спектре экстинкции. В крайне предпочтительном варианте исполнения поддающееся измерению изменение, которое появляется в силу связывания тестовых зондов и первых наночастиц, пропорционально концентрации оригинала в образце перед амплификацией. Это выгодным образом позволяет простыми средствами осуществить анализ концентрации.
Еще в одной предпочтительной форме исполнения способ включает в себя прямые праймеры, которые конъюгированы с первыми наночастицами, и свободные и/или связанные с наночастицами обратные праймеры. Особо предпочтительно, чтобы на поверхности первых наночастиц имелись как прямые, так и обратные праймеры. На первом этапе в присутствии оригинала посредством ДНК-полимеразы происходит удлинение прямых праймеров с формированием соединенных с наночастицами комплементов. На втором этапе, исходя из обратных праймеров, которые связываются с соединенным с наночастицами комплементом, синтезируются копии оригинала. После этого первые наночастицы объединяют с тестовыми зондами, если это еще не произошло ранее. В этом варианте исполнения тестовые последовательности комплементарны прямым праймерам. Если удлинение прямых праймеров не произошло, то тестовые зонды хорошо соединяются с первыми наночастицами. Если удлинение прямых праймеров осуществилось, то связыванию тестовых последовательностей с прямыми праймерами препятствует стерическая затрудненность. Если с удлиненным прямым праймером гибридизирована вновь синтезированная копия оригинала, то связывание тестовой последовательности с удлиненным прямым праймером не происходит. Из-за этого степень связывания между первыми наночастицами и тестовыми зондами снижается в той мере, в которой осуществился синтез продуктов реакции амплификации, то есть комплементов и копий оригинала. Если условия реакции выбраны надлежащим образом, то так можно осуществить анализ концентрации оригинала в образце, так что поддающееся измерению изменение оказывается тем меньше, чем больше оригинала в присутствовало в образце до амплификации. При этом поддающееся измерению изменение может представлять собой, например, красное смещение или уширение плазмонного резонанса в спектре экстинкции. Это позволяет выгодным образом создать тест, который позволяет определять концентрацию конкретных нуклеиновых кислот.
Благодаря изобретению возможно представить улучшенный способ амплификации нуклеиновых кислот.
Краткое описание фигур
Представлены:
Фигура 1 схематическое изображение наночастиц, которые конъюгированы с заполняющими молекулами, спейсерными последовательностями, безосновными модификациями и праймерными последовательностями;
Фигура 2 схематическое изображение установки для реализации способа согласно изобретению с лазером, двухмерным зеркальным сканером и образцом;
Фигура 3 схематическое изображение еще одной установки для реализации способа согласно изобретению с лазером, двухмерным зеркальным сканером и пробирками для образцов в водяной бане;
Фигура 4 идеализированная температурная кривая обычной ПЦР (штрих-пунктирная линия);
k
0
Фигура 5 коэффициент амплификации N/N как функция времени для различных параметров;
и
Фигура 6 на четырех диаграммах - результаты реакций амплификации с различными длительностью и количеством циклов.
Подробное описание изобретения на основании нескольких примеров исполнения
h
При реализации известных способов ПЦР для амплификации короткой нуклеиновой кислоты (имеющей, например, менее 300 пар оснований), которые используют поддержание температуры (подогрев) с помощью термоциклера, длительность процесса, как правило, ограничивается временем подогрева, на которое приходится наибольшая часть длительности цикла. Чтобы добиться по возможности краткой продолжительности процесса, в таких случаях стремятся приблизиться к теоретическому пределу выхода g (индекс h указывает на этот обычный случай) на одно прохождение цикла, равному 100%, чтобы достичь желательного результата при минимально возможном количестве циклов. Авторы изобретения, однако, обнаружили, что при реализации способов с малыми значениями времени поддержания температуры, например, способов, работающих с локальным нагревом посредством наночастиц, доведение выхода g до максимума не обязательно является наилучшей стратегией. Напротив, учтя сниженный выход, в этом случае можно добиться сокращения продолжительности цикла, которое перевешивает недостатки низкого выхода, так что в общей сложности, несмотря на меньший выход, продолжительность процесса в итоге оказывается меньше.
Не фиксируясь на какой-либо определенной теории, сначала необходимо рассмотреть характерные временные константы, необходимые для различных процессов во время ПЦР, и построить простую математическую модель.
t
Сначала будем исходить из обычного способа ПЦР, реализуемого в обычном торговом термоциклере, например, с применением элемента Пельтье или потока воздуха для поддержания температуры реакционного объема (обычно от 5 до 50 мкл) извне. Такие торговые термоциклеры обычно достигают скоростей нагрева и охлаждения около 5 К/с, даже если средняя скорость подогрева может быть значительно ниже. Это означает, что процесс нагрева образца от температуры отжига 60°С до температуры денатурации в 95°С и нового охлаждения до температуры отжига может потребовать как минимум приблизительно . В прежних способах к этому добавляется тот аспект, что термализация реакционного объема может дополнительно потребовать несколько секунд, пока приблизительно везде в образце не установится та же температура, что и у нагреваемых или охлаждаемых стенок сосуда. Следовательно, общее время поддержания температуры t на каждый цикл в стандартных протоколах обычно превышает 14 с.
Для ПЦР важны также продолжительность отжига и элонгации. При достаточно высоких концентрациях праймера (например, более 300 нМ) в надлежащих условиях нынешнего уровня техники время отжига часто составляет лишь несколько секунд, пока с большей частью (>90%) мишени не гибридизируется праймер. Осуществимо, например, также и время отжига в 1 с.
Время, которое требуется полимеразе для элонгации праймеров, зависит от длины ампликона и скорости записи, с которой работает исследуемая полимераза. Чтобы провести элонгацию, например, 80 пар оснований в надлежащих условиях с применением полимеразы с эффективной скоростью записи 100 ВР/с, необходимо время около 0,8 с.
Суммарно время гибридизации и время элонгации в дальнейшем обозначается как потребное продуктивное время . В приведенном выше примере потребное продуктивное время для короткого ампликона составляет, например, приблизительно , если считать время отжига равным приблизительно одной секунде, а время элонгации - еще одной секунде.
Продолжительность цикла ПЦР  в вышеуказанном примере представляет собой сумму времени поддержания температуры  и потребного продуктивного времени , т.е.,
,
если пренебречь возможным временем выдерживания при температуре денатурации, поскольку его можно выбрать очень кратким, например, менее одной секунды.
Если сравнить время поддержания температуры, составляющее ок. 14 с, с необходимым продуктивным временем приблизительно в 2 с в приведенном выше примере, то видно, что в обычном термоциклере для коротких нуклеиновых кислот, как правило, справедливы неравенства  и . Это означает, что время поддержания температуры, то есть длительность периодов нагрева и охлаждения, то есть время, которое требуется, чтобы довести образец от температуры отжига до температуры денатурации и опять равномерно охладить до температуры отжига, как правило, определяет продолжительность каждого цикла и таким образом также и общую продолжительность ПЦР.
0
k
k
Если с помощью ПЦР необходимо увеличить число копий N шаблона до N копий, то этого, как уже объяснялось выше, можно добиться k температурными циклами, причем , если средний выход в каждом цикле равен . При этом опять принято упрощенное предположение, что выход на цикл остается во время постоянным. Если осуществляют  циклов в единицу времени (причем ), то число копий N по истечении времени t можно указать как
,
h
где g=0…100%. Длительность процесса Т всей ПЦР в этом случае можно определить как длительность цикла , умноженную на необходимое количество циклов k:
.
k
0
12
Например, в этом случае амплификация в N/N=10 раз может в зависимости от значения  потребовать времени, представленного в таблице 1.
h
k
Из этого следует, что в случае обычной ПЦР, при которой справедливы выражения  и  малой продолжительности процесса можно добиться путем увеличения выхода на каждый цикл, то есть g близкого к 100%. У этом случае число копий N со временем может определяться, например,
,
min
то есть за каждый цикл к имеющемуся количеству копий добавляется такое же количество (то есть, каждый цикл происходит удвоение). Минимальная возможная продолжительность ПЦР T для амплификации в  раз может определяться
.
Иная картина возможна, если продолжительность поддержания температуры более не определяет длительность цикла. Этот вариант также охватывает частный случай, когда этапы нагрева и охлаждения, включая термализацию, обладают пренебрежимо малой длительностью, то есть когда справедливы неравенства  и .
Пример 1
Ниже рассматривается влияние сокращения длительности цикла. В этом примере продолжительность цикла обозначается через  (приведенный в качестве опции индекс i в дальнейшем применяется, чтобы подчеркнуть решение согласно изобретению для параметров, которые характеризуют ПЦР с сокращенной продолжительностью циклов), причем приведенная в качестве примере длительность цикла  короче продолжительности цикла  в обычном случае на коэффициент х, где , так что справедливо выражение . То есть из частоты циклов  обычного случая можно рассчитать новую частоту циклов . Выход в этом примере обозначен как . Выход, приведенный в качестве примера, может быть равен выходу в обычном случае , но может также быть и меньше него . Если имеет место такое уменьшение выхода на цикл, то его можно охарактеризовать коэффициентом потери эффективности y, причем . Следовательно, в этом примере
.
i
Соответственно, длительность всего процесса ПЦР T в этом примере составляет
,
для чего снова воспользовались тем, что предпочтительно . Сокращения длительности процесса по сравнению с обычным случаем можно добиться и когда , и когда , если только преимущество сокращения длительности цикла перевешивает недостаток уменьшенного выхода.
i
0
12
Если рассмотреть, например, амплификацию в N/N=10 раз, то согласно уравнению 9 для длительности процесса в единицах  в зависимости от выбранных значений для  и х получают следующие величины.
Значения, обозначенные звездочкой, означают в теоретическом рассуждении диапазон, в котором комбинация  и х не дает ускорения по сравнению с обычной ПЦР, где ≈100%.
Пример 2
Этот пример основан на примере 1 и рассматривает тот случай, когда, хотя длительность цикла согласно изобретению  предпочтительно можно выбрать короче, чем обычную продолжительность цикла , но по-прежнему таким образом, чтобы выход на каждый цикл мог оставаться приблизительно тем же, как и при выборе прежней продолжительности цикла , т.е. . (Для этого может, например, потребоваться, чтобы отжиг и элонгация в каждом цикле по-прежнему проходили приблизительно с той же эффективностью, как и при выборе прежней длительности цикла ). То есть в данном случае коэффициент потери эффективности y=1, поскольку в этом примере по определению какая-либо потеря эффективности отсутствует.
i
В этом случае количество циклов, необходимое для желательной амплификации, может оставаться неизменным, а продолжительность каждого цикла может сокращаться на величину, определяемую коэффициентом х и длительность процесса согласно изобретению может соответствующим образом сократиться на T=Т/х.
Иными словами, при значениях, приведенных в качестве примеров в таблице 2, длительность гипотетической обычной ПЦР 7 в рамках этого теоретического рассуждения приведена во втором столбце. Длительность процесса ПЦР согласно изобретению, где  в этом случае приводится в той же строке, что и обычное контрольное значение.
,
При реализации этого варианта в качестве примера длительность цикла выбирают так, чтобы она по-прежнему была больше, чем потребное продуктивное время,  так, чтобы приблизительно добиться соотношения .
Пример 3
Этот пример также основан на примере 1. Теперь, однако, предполагается, что в качестве примера сокращение длительности цикла  по сравнению с обычной длительностью цикла  приводит к уменьшению выхода на каждый цикл  по сравнению с прежним выходом  (то есть коэффициент потери эффективности ). В соответствии еще с одним предположением, это уменьшение выхода на цикл, которое может получиться из-за сокращения длительности цикла на величину, определяемую коэффициентом х, можно более чем компенсировать большим количеством температурных циклов (которые можно осуществлять в  раз быстрее), то есть прирост концентрации ампликона в единицу времени все равно оказывается выше (причем рассматриваемую единицу времени предпочтительно выбирать значительно больше, чем ).
Уменьшение среднего выхода на каждый цикл может иметь причиной, например, то, что длительность цикла становится даже меньше, чем потребное продуктивное время , причем сохраняется равенство , так что выход на цикл равен  (например, потому что за это время лишь малое количество копий шаблона могут гибридизироваться с праймером, и/или полимераза за это время не может элонгировать все праймеры, или денатурация проходит не полностью, например, потому что длительность воздействия столь мала, что невозможна достаточная деспирализация двойной нити ДНК).
Пример 3а
В этом примере предполагается, что для выхода действительно следующее соотношение:
.
Иными словам, в этой форме исполнения средний выход на один цикл предпочтительно уменьшается с сокращением х продолжительности цикла максимум линейно, что возможно, например, тогда, когда длительности цикла более недостаточно, чтобы большая часть ДНК шаблонов могла гибридизироваться с праймером. (То есть в этом случае коэффициент потери эффективности 1<y≤x). Благодаря этому уменьшение выхода на каждый цикл, которое составляет самое большее х, можно более чем компенсировать благодаря в х раз большему количеству циклов в единицу времени. В этом случае можно записать:
.
h
h
В этом случае основание показательной функции  может быть больше, чем при обычной ПЦР, где основание показательной функции может согласно уравнению 4 составлять (1+g) и в лучшем случае равняется двум. Это обобщено в следующей таблице, которая содержит значения для (1+g) и для α:
Это означает, что амплификация, имеющая место в единицу времени, может быть больше, чем обычная, пока  и справедливо уравнение 10. Поэтому авторы изобретения также называют процесс согласно изобретению "суперамплификацией".
Время, которое требуется в этой форме исполнения для ПЦР согласно изобретению, получают, если переписать уравнение 9 для продолжительности ПЦР следующим образом:
Иными словами, в случае примера в таблице 2 длительность гипотетической обычной ПЦР приведена во втором столбце. По сравнению с обычным значением сравнения длительность процесса согласно изобретению приведена в клетке со значениями без звездочек или плюсов в той же строке или выше, в зависимости от того, какая комбинация значений  и х реализуется.
i
Особо интересным получается вариант этой формы исполнения для обычных ПЦР, у которых выход на каждый цикл  (самая нижняя строка в таблице 3). В этом случае  в уравнении 11 приблизительно переписать как . Предпочтительно можно достичь того, что х оказывается очень велик, так что допустимо достижение предельного значения , то есть из уравнения 11 можно приближенно принять значение N равным
.
По сравнению с уравнением 6 здесь видно, что амплификация со временем может проходить уже не как , а как , то есть основание показательной функции может быть больше.
Исходя из уравнения 13 длительность процесса для того случая, когда х становится очень велик, можно приблизительно оценить как
.
для чего снова использовали, что . То есть, в этом случае длительность процесса может изменяться вместе с натуральным логарифмом коэффициента амплификации.
Пример 3b
Этот пример также основан на примере 1. В этой форме исполнения тоже можно использовать более короткие температурные циклы. Однако в этой форме исполнения сокращение длительности цикла  по сравнению с прежней длительностью  может привести к уменьшению выхода на цикл  по сравнению с прежним выходом , так что может быть справедливо
.
То есть, выход на каждый цикл в этой форме исполнения может уменьшаться с уменьшением х длительности цикла сильнее, чем линейно. (То есть в этом случае коэффициент потери эффективности y>x). В этом случае уменьшение выхода на каждый цикл также в подходящих обстоятельствах предпочтительно можно более чем компенсировать более высоким числом циклов, которые выполняются в х раз быстрее, чем обычно.
В примере таблицы 2 гипотетическую продолжительность процесса обычной ПЦР приводится в самой нижней клетке второго столбца для  (то есть в этом случае значение составляет 40). Длительность процесса в этой форме исполнения изобретения приведена в клетках, величины в которых помечены знаком "+", постольку, поскольку действительна комбинация значений  и х.
Фигура 1 демонстрирует пример исполнения способа согласно изобретению для амплификации нуклеиновых кислот 1, реализуемого в виде ПЦР. В реакционном объеме 2 содержатся первые наночастицы 3. Как показано на фигуре 1а, на поверхности первых наночастиц 3 имеются олигонуклеотиды 4. Один вид олигонуклеотидов 4 в качестве части последовательности в каждом случае содержит праймерную последовательность 5 с последовательностью А и в качестве еще одной части последовательности, присутствующей в качестве опции, спейсерную последовательность 6 S и (также в качестве опции) безосновную модификацию 7 между праймерной последовательностью 5 А и спейсерной последовательностью 6 S. При этом праймерная последовательность 5 служит прямым праймером 8. Спейсерная последовательность 6 S предназначена для того, чтобы удерживать праймерную последовательность 5 достаточно далеко от поверхности наночастиц 9, так чтобы подлежащая амплификации нуклеиновая кислота 1 с большей эффективностью могла связываться с праймерной последовательностью 5, а ДНК-полимераза 11 лучше находила доступ к праймерной последовательности 5. Безосновная модификация 7 предотвращает переписывание спейсерной последовательности полимеразой 11. Олигонуклеотиды 4 с праймерной последовательностью 5 А закреплены на поверхности первых наночастиц 3 тиоловой связью, так что 3'-конец обращен от первых наночастиц 3. В качестве опции на поверхности первых наночастиц 3 могут находиться олигонуклеотиды еще одного рода, которые представляют собой заполняющие молекулы 10 F. Заполняющие молекулы 10 позволяют модулировать заряд наночастиц 10, так что нежелательная агрегация наночастиц 10 не происходит. Кроме того, заполняющие молекулы 10 могут увеличивать расстояние, на котором праймерные последовательности 5 находятся друг от друга на поверхности наночастиц 9, так что доступ подлежащих амплификации нуклеиновых кислот 1 и ДНК-полимеразы 11 к праймерным последовательностям 5 улучшается. Это может повысить эффективность способа. При этом предпочтительно, чтобы спейсерная последовательность 6 имела как минимум ту же самую длину, что и заполняющие молекулы 10, так чтобы праймерные последовательности 5 выгодным образом выступали из-за заполняющих молекул 10.
В реакционном объеме 2 находится жидкий образец 12, который содержит первые наночастицы 3 с фигуры 1а с праймерными последовательностями 5, спейсерными последовательностями 6, безосновной модификацией 7 и заполняющими молекулами 10, а кроме того в нем имеются dNTPs и ДНК-полимераза 11. В образце 12 может присутствовать подлежащая обнаружению нуклеиновая кислота 1. В настоящем примере исполнения подлежащая обнаружению нуклеиновая кислота 1 представляет собой одинарную нить ДНК, которую также называют оригиналом 13 или ампликоном 13, и которая имеет часть последовательности А' и часть последовательности В'. Также у оригинала 13 могут иметься и другие части последовательности, например, в виде выступающей части на 5'- или 3'-конце или же между двумя частями последовательности А' и В'. На фигуре 1b оригинал 13 частью своей последовательности А' связан с праймерной последовательностью 5 А на поверхности первой наночастицы 3. На фигуре 1 с показано, что ДНК-полимераза 11 связывается с оригиналом 13 и гибридизированной с оригиналом 13 праймерной последовательностью 5 А. После этого ДНК-полимераза 11 на этапе элонгации, который показан на фигуре 1d, начиная с 3'-конца праймерной последовательности 5 А, синтезирует комплементарную оригиналу 13 нуклеиновую кислоту 1, которую называют комплементом 14 и которая соединена со спейсерной последовательностью 6 на поверхности первой наночастицы 3. Затем (на фигуре 1е) первую наночастицу 3 облучают светом, который поглощается первой наночастицей 3 в силу свойств ее материала или плазмона и преобразуется в теплоту. Теплота отдается среде, окружающей первую наночастицу 3, и в области оригинала 13 и гибридизированного с ним вновь синтезированного комплемента 14 ее достаточно для того, чтобы вызвать денатурацию с отделением оригинала 13 от комплемента. Теперь оригинал 13 опять свободен, как это показано на фигуре 1f, так что он может связаться с другой праймерной последовательностью, и в дальнейших циклах процесса могут синтезироваться другие связанные с наночастицами комплементы 14. При этом с ростом числа циклов получается линейное увеличение концентрации комплементов 14.
В одном из вариантов способа после удлинения праймерной последовательности 5 на поверхности 4 первой наночастицы 3, при котором образуется связанный с наночастицей комплемент 14, применяют свободный обратный праймер 15, который связывается с 3'-концом комплемента. На фигуре 1g изображено, что уже синтезированный комплемент 14 с частями последовательности А и В, который через спейсерную последовательность 6 и безосновную модификацию 7 соединен с поверхностью первой наночастицы 3, гибридизируется с имевшимся ранее в образце 12 в свободном состоянии обратным праймером 15 В'. При этом праймер 8 обладает последовательностью В' и связан с частью последовательности В комплемента 14.
Исходя из праймера 8 с последовательностью В', ДНК-полимераза синтезирует копию оригинала 13. Синтез проходит только до безосновной модификации 7, поскольку переписать ее полимераза 11 не может. На фигуре 1g также показано, что оригинал 13 соединился еще с одной праймерной последовательностью 5 А на поверхности первой наночастицы 3, а ДНК-полимераза 11 синтезирует на основе праймерной последовательности 5 А еще один комплемент 14. Оригинал 13, копия оригинала 13 и оба соединенных с первой наночастицей комплемента 14 представлены на фигуре 1h. Последующая денатурация путем возбуждения первой наночастицы 3 приводит к высвобождению оригинала 13 и его копии. При этом на последующих этапах способа как оригинал 13, так и его копия могут служить шаблоном для амплификации. По прошествии некоторого времени ожидания, которое в ряде случаев может потребоваться для гибридизации оригинала 13 и копий оригинала 13 с праймерными последовательностями 5 А на первых наночастицах 3 и свободных праймеров В' с уже элонгированными на первых наночастицах 3 праймерными последовательностями 5, можно повторным возбуждением первых наночастиц 3 провести следующий цикл способа. Цикл предпочтительно повторяют, пока на первых наночастицах 3 не окажется достаточно удлиненных праймерных последовательностей 5 и/или в образце 12 не окажется достаточно копий оригинала 13, чтобы было возможно экспериментально доказать факт амплификации либо же, соответственно, присутствие оригинала 13 в образце. Благодаря свободному праймеру 8 В', как показано на фигурах 1g и 1h, возможна экспоненциальная амплификация оригинала 13. На фигурах 1а - 1f без этого свободного праймера 8 удается, однако, добиться только линейной амплификации связанного с наночастицами комплемента 14.
2
На фигуре 2 изображена установка, которая пригодна для реализации способа согласно изобретению. Установка включает в себя источник света, который в настоящем примере конструктивно исполнен в виде лазера 16, и двухмерный зеркальный сканер 17, который способен направлять свет от лазера 16 на образец 12. При этом двухмерный зеркальный сканер 17 способен отклонять лазерный луч в двух измерениях. В этой установке денатурацию в образце 12 осуществляют посредством фокусировки лазерного луча на части образца 12. В процессе реализации способа лазерный луч отклоняют так, чтобы он попадал на различные части образца 12. В примере, показанном на фигуре 2, лазерный луч отклоняется зеркальным сканером 17 так, что лазерный луч проходит по реакционному объему 2, в котором находится образец 17, линия за линией (подобно построчной записи). На фигуре 2 путь, который проходит лазерный луч, изображен на образце 12 пунктирной линией. Благодаря тому, что в каждый момент времени при реализации способа возбуждаются только некоторые части образца 12, можно применять лазеры 16 меньшей мощности. Поскольку длительности возбуждения менее одной микросекунды достаточно, чтобы с помощью разогретых оптико-термическим методом наночастиц 9 денатурировать ДНК, то при обычных размерах фокуса лазера 16 приблизительно в 10-100 мкм лазерный луч способен сканировать образец 12 со скоростью 10-100 м/с и при этом в каждой точке, по которой проходит лазерный луч, вызывать денатурацию ДНК. Это позволяет очень быстро сканировать образцы в том числе большого объема. Полное сканирование площади в 1 см в случае, например, диаметра фокуса в 78 мкм, 128 строках с межстрочным расстоянием 78 мкм и длине строки 1 см продлится при скорости сканирующего луча в 10 м/с всего 128 мс. Если глубина объема составляет, например, 10 мм, то таким образом можно обработать объем в 1 мл (для этого, разумеется, необходимо обеспечить, чтобы интенсивность возбуждения была достаточна на всей глубине). Это (выгодным образом) существенно быстрее, чем, как правило, потребовалось бы для этапа денатурации путем общего нагрева. Применение оптических элементов, как то, например, показанного на фигуре 2 зеркального сканера 17 и так называемых F-тета-линз, позволяет добиться хороших показателей однородности качества и размера фокуса по всему сканируемому образцу 12. В качестве альтернативы лазеру 16, излучающему непрерывно, можно также применять и импульсный лазер 16 или термический излучатель.
2
2
В варианте реализации способа, который показан на фигуре 1, первые наночастицы 3 из золота диаметром 60 нм функционализируют олигонуклеотидами 4 ID1 (согласно J. Hurst et al., Anal. Chem., 78(24), 8313-8318, 2006, соответствующее содержание которого является частью настоящего публикации, включенной посредством ссылки). После функционализации и 6 этапов отмывки первые наночастицы 3 в концентрации 200 пМ находятся в буферном растворе ФБР (5 мМ PBS, 10 мМ NaCl, 0,01% Твин 20, рН 7,5). Реакцию амплификации проводят в общем объеме 10 мкл в пробирках для образцов 18 емкостью 100 мкл (2 мкл Apta Taq Mastermix 5х с MgCl (приобретен у Roche), 1 мкл NaCl 450 мМ, 1 мкл MgCl 90 мМ, 1 мкл Твин 20 1%ig, 2 мкл воды, 1 мкл функционализированных первых наночастиц 200 пМ, 1 мкл олигонуклеотида 4 ID2 5 мкМ в виде растворенного обратного праймера и 1 мкл олигонуклеотида ID3 как подлежащего амплификации оригинала 13). При этом подлежащая определению концентрация оригинала 13 в общем объеме 10 мкл составляет, например, 0,1 фМ олигонуклеотида ID3, растворенного в воде с 100 нМ олигонуклеотида 4 ID4 (при этом олигонуклеотид 4 ID44 служит для насыщения поверхностей, например, во время хранения оригинала 13 перед реакцией). Как показано на фигуре 3, пробирки с образцами 18, помещенные в стеклянную кювету 19, доводят на водяной бане 20 до температуры 64°С, которая представляет собой как температуру отжига, так и температуру элонгации. Помимо поддержания температуры, водяная баня 20 предназначена также для улучшения ввода лазера 16 в отличную от плоской поверхность пробирок с образцом 18. Благодаря наличию воды в водяной бане 20 появляется возможность снизить разность коэффициентов преломления между внешней и заполненной реакционной смесью для ПЦР внутренней средой пробирок с образцом 18 и таким образом подавить преломление лазерного луча и, соответственно, отрицательное воздействие на качество и резкость фокуса. Это выгодным образом улучшает качество ввода луча лазера 16 в среду. Лазер 16, который служит для возбуждения наночастиц, представляет собой неодимовый лазер с иттриево-алюминиевым гранатом (Nd : YAg) с удвоением частоты генерации с диодной накачкой (CNI Lasers Inc.), сфокусированным в пробирки для образцов 18 в водяной бане 20 (фокальный диаметр примерно 20 мкм) с мощностью на выходе 2,5 Вт с F-тета-линзой (Jenoptik, фокусное расстояние 100 мм) сзади зеркального сканера 17 (Cambridge Technologies, Pro Series 1). Зеркальный сканер 17 дает возможность перемещать фокус по пробиркам 18 с образцом построчно, как уже показано на фигуре 3, и таким образом задействовать в оптико-термической амплификации весь реакционный объем ПЦР. На каждой пробирке для образцов 18 выполняется сканирование фокусом 680 рядов (строк) с расстоянием между ними около 12 мкм при скорости ряда в пробирке для образцов 18 ок. 10 м/с. Это соответствует одному циклу в первой пробирке для образцов 18. Затем друг за другом обрабатывают все остальные пробирки 18 для образцов, так что каждая пробирка 18 для образцов проходит один цикл. По истечении времени ожидания, которое можно выбирать различным для каждой пробирки 18 для образцов, начинают следующий цикл. Это можно повторять различное количество раз для каждой пробирки для образцов.
2
На фигуре 6 показаны данные для пяти различных пробирок для образцов, в которых в каждом случае содержится ID3 в исходной концентрации 0,1 фМ. В первой пробирке для образцов выполнили в общей сложности 200 циклов со временем ожидания между отдельными циклами в 3 с, во второй пробирке для образцов 120 циклов по 5 с, в третьей пробирке для образцов 90 циклов по 6,6 с, в четвертой пробирке для образцов 60 циклов по 10 с, а в пятой пробирке для образцов 45 циклов по 13,3 с. Это представлено на фигуре 6b. Обозначения под диаграммами в каждом случае указывают время выдерживания. В каждой из пяти пробирок для образцов общая длительность от первого до последнего цикла составляет 10 минут. Это показано на фигуре 6а. Для определения общей амплификации, полученной посредством оптико-термической реакции амплификации, после завершения реакции амплификации из каждой пробирки для образцов отбирают 1 мкл образца и разбавляют 99 мкл воды. Из этого разведенного объема применяют в каждом случае по 1 мкл в реакции амплификации для количественного определения (количественной реакции амплификации, ПЦР в реальном времени), чтобы определить в них концентрацию копий оригинала, которые образовались в различных пробирках с образцами в силу оптико-термической реакции амплификации. Разведение служит для того, чтобы сильно разбавить, возможно, имеющиеся ингибирующие или мешающие компоненты из оптико-термической реакции амплификации, так чтобы они более не могли помешать последующей количественной реакции амплификации. Количественную реакцию амплификации проводят в аппарате LightCycler II (Roche). При этом цикл состоит из 10 с денатурации при 94°С, 10 с отжига при 62°С и 10 с элонгации при 72°С. В конце этапа с температурой 72°С также выполняют измерение флуоресценции. До начала первого цикла однократно осуществляют этап денатурации при 94°С в течение 30 с. Кроме 1 мкл оригинала из оптико-термической реакции амплификации реакционный объем 10 мкл для количественной реакции амплификации содержит также 2 мкл Apta Taq Mastermix 5х с MgCl (приобретенный у Roche), 2,8 мкл воды, 2 мкл олигонуклеотида 4 ID5 1 мкМ в качестве растворенного прямого праймера, 2 мкл олигонуклеотида 4 ID6 1 мкМ в качестве растворенного обратного праймера и 0,2 мкл SYBRGreen 100х в качестве интеркалирующего красителя, для создания возможности детектировать продукт ПЦР в процессе ПЦР в реальном времени. Дополнительная стандартная кривая (калибровочная кривая), которую определяют с применением ряда разведений олигонуклеотида ID3 в известной концентрации в качестве оригинала для количественной реакции амплификации, позволяет впоследствии установить количество использованных копий в количественной реакции амплификации. Таким способом определяют общую амплификацию, полученную во время оптико-термической реакции амплификации в различных пробирках для образцов. Это показано на фигуре 6d. Здесь отчетливо видно, что с ростом продолжительности циклов общая амплификация, несмотря на ту же самую длительность процесса (в каждом случае по 10 минут, ср. фиг. 6а), сильно снижается. Если предположить, что на протяжении всей реакции амплификации коэффициент амплификации на цикл остается неизменным, то выход g на цикл можно рассчитать по формуле (2). Определенный таким образом g представлен на фигуре 6 с. Здесь отчетливо видно, что по мере увеличения длительности цикла g возрастает. Несмотря на уменьшение g с уменьшением длительности цикла общая амплификация при уменьшении длительности цикла при той же продолжительности процесса возрастает.
На фигуре 4 показана идеализированная температурная кривая обычной ПЦР (штрих-пунктирная линия) с продолжительностью цикла . Для повышения и снижения температуры принят постоянный угол наклона (крутизна) в 5 К/с. В сравнении с этим изображена одна из форм исполнения способа ПЦР согласно изобретению с длительностью цикла  с постоянной крутизной 3000 К/с, которой можно достичь, например, посредством оптического возбуждения наночастиц согласно изобретению (сплошная линия, для улучшения видимости график температуры сдвинут на 1°С вниз).
k
0
На фигуре 5 показан коэффициент амплификации N/N как функция времени для различных параметров. Пунктирная линия показывает амплификацию типичной обычной ПЦР при длительности цикла, равной , и выходе на цикл, равном =100%. Штрих-пунктирная линия демонстрирует амплификацию в случае предпочтительной реализации согласно изобретению, где =25%, x=4 и und . Сплошная линия демонстрирует другую предпочтительную реализацию согласно изобретению, где =100%, x=2 und .
Признаки, раскрытые в вышеприведенном описании, в формуле изобретения и в рисунках, могут иметь значение для реализации изобретения в различных вариантах его исполнения как по отдельности, так и в различных комбинациях.
Список условных обозначений
1 Нуклеиновая кислота
2 Реакционный объем
3 Первая наночастицы
4 Олигонуклеотид
5 Праймерная последовательность
6 Спейсерная последовательность
7 Безосновная модификация
8 Прямой праймер
9 Наночастица
10 Заполняющая молекула
11 ДНК-полимераза
12 Образец
13 Оригинал, ампликон
14 Комплемент
15 Обратный праймер
16 Лазер
17 Зеркальный сканер
18 Пробирка для образцов
19 Стеклянная кювета
20 Водяная баня