Способ создания живой вакцины против коронавирусной инфекции COVID-19 на основе пробиотического штамма Enterococcus faecium L3 и живая вакцина Enterococcus faecium L3-pentF-covid-19
METHOD OF CREATING A LIVE VACCINE AGAINST COVID-19 BASED ON THE PROBIOTIC STRAIN ENTEROCOCCUS FAECIUM L3 AND A LIVE VACCINE ENTEROCOCCUS FAECIUM L3-PENTF-COVID-19

Coronaviridae
Изобретение относится к области медицины, вирусологии, микробиологии, молекулярной генетики и биотехнологии и может быть использовано в медицинской промышленности при производстве живых вакцин для профилактики и лечения инфекций, вызванных коронавирусом. Коронавирусы () — семейство вирусов, включающее на январь 2020 года 40 видов РНК-содержащих вирусов, объединённых в четыре подсемейства, которые поражают человека и животных. Название связано со строением вируса, который имеет шиповидные отростки. Они напоминают солнечную корону и содержат рецептор-связывающие белки на поверхности, которые связывают трансмембранные рецепторы клеток.
[
Известно, что ученые из Китая расшифровали и опубликовали 12 января 2020 г. в международной базе данных геном нового коронавируса 1- Guo YR, Cao QD, Hong ZS, Tan YY, Chen SD, Jin HJ, Tan KS, Wang DY, Yan Y. The origin, transmission and clinical therapies on coronavirus disease 2019 (COVID-19) outbreak - an update on the status. Mil Med Res. 2020 Mar 13;7(1):11. doi: 10.1186/s40779-020-00240-0. PMID: 32169119; PMCID: PMC7068984.] и что в настоящее время во всем мире  учеными ведутся интенсивные исследования  по разработке  вакцины от коронавируса SARS-CoV-2  и  их  лабораторные и тестовые испытании (краткая информация о коронавирусе  человека представлена в Приложении к описанию изобретения).
Enterococcus faecium
Enterococcus faecium
Известен пробиотический  штамм  L3 ND-79 ВНИИСХМ,  предназначенный  для изготовления лечебно-профилактических средств и продуктов питания лечебно-профилактического назначения, обладающий  устойчивостью к широкому спектру антибиотиков, более выраженным антагонизмом к патогенным бактериям, высокой жизнеспособностью и высоким уровнем продукции витаминов группы "В" и фолиевой кислоты; известный штамм положен в основу заявляемого изобретения   [2 – патент РФ №2220199 на штамм энтерококков  l-3 для изготовления лечебно-профилактических средств (патентообладатели и авторы Алехина Г.Г. и Суворов А.Н.)].
Streptococcus agalactiae
Еnterococcus faecium
Enterococcus Faecium
Streptococcus agalactiae
Известна созданная на основе этого штамма [2]  живая вакцина для профилактики вагинальной инфекции, вызванной  (СГВ). На основе штамма пробиотика  L3 была сконструирована первая генно-инженерная живая вакцина со встроенным в хромосому участком гена белка патогенного СГВ. [3-Т.В.Гупалова, Г.Ф.Леонтьева, Е.И.Ермоленко, К.Б.Грабоская, Т.А. Крамская, А.Н.Цапиева, И.В.Королева, А.Н.Суворов. Создание и опыт применения живой вакцины на основе штамма пробиотика L3 для профилактики вагинальной инфекции, вызванной , Медицинский академический журнал, 2013, 13(2), С. 64-70].
bac
Enterococcus faecium
Известен способ, основанный на введении  гена патогенных СГВ в хромосомную ДНК в области кодирования белков пилей пробиотического штамма  L3 с последующей экспрессией белка Bac, кодируемого этим геном, в пилях. Пили энтерококков выступают за пределы бактериальных клеток и способны проникать сквозь капсулу, которая экранирует большинство бактериальных белков-антигенов. Пили состоят из белковых мономеров, способных к агрегации. За счет этого процесса может увеличиваться доза чужеродного антигена, встроенного в белок пилей. Последнее должно способствовать увеличению титров антител, специфичных к встраиваемому в структуру поверхностного белка энтерококка полипептидного фрагмента штамма патогенного СГВ.
Еnterococcus faecium
Известный способ введения гена патогенных стрептококков в пили пробиотического штамма Enterococcus faecium L3 интересен тем, что рекомбинантный белок экспрессируется не в цитоплазме, а на поверхности бактерии [4- патент РФ №2640250 «Способ введения генов патогенных стрептококков в хромосомную ДНК пробиотического штамма  l3 для экспрессии в пилях», МПК:A61K39/092; авторы- Суворов А.Н. и др.].
Еnterococcus faecium
Известно, что штамм  L3 обладает выраженной антагонистической активностью в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий, способностью восстанавливать микробиоценоз кишечника на фоне дисбиотических состояний [5 - Yermolenko E., Suvorov A., Chernush A., et al. International Congress Series, 1289: 363-366 (2006)], а также оказывать иммуномодулирующее действие на организм хозяина [6 - TarasovaE., YermolenkoE. , DonetsV., SundukovaZ. , BochkarevaA. , BorsсhevI. , SuvorovaM. , Ilyasov. I., Simanenkov V., Suvorov A. The influence of probiotic enetrococci on the microbiota and cytokines expression in rats with dysbiosis induced by antibiotics// Beneficial Microbes. -2010- Т. 1. -№ 3.- С. 265-270].
Еnterococcus faecium
Еnterococcus faecium
S.agalactiae и Staphylococcus aureus
Осуществлено физическое картирование штамма  L3 [7 - Suvorov A., Simanenkov V., Gromova L. et al. Prebiotics and probiotics potencial for human health, 104-112, (2011)]. В экспериментах на здоровых самках мышей  показано, что интравагинальное введение высоких доз штамма  L3 не только не оказывает токсического действия на организм, но не влияет на состояние слизистой оболочки влагалища [8 - Суворов А., Алехина Г.Г., Пигаревский П.В. и др. Гастробюллетень, 4: 29-31, (2001)] и способствует экспрессии IL-10 клетками слизистой оболочки влагалища крыс с экспериментальным вагинитом, вызванном [6 - TarasovaE., YermolenkoE. , DonetsV., SundukovaZ. , BochkarevaA. , BorsсhevI. , SuvorovaM. , IlyasovI., SimanenkovV., SuvorovA. The influence of probiotic enetrococci on the microbiota and cytokines expression in rats with dysbiosis induced by antibiotics// Beneficial Microbes. -2010.-  Т. 1. -№ 3.- С. 265-270].
Еnterococcus faecium
В штамме L3, как и у других грамположительных бактерий, имеются пили, которые представляют собой фимбрии длиной 0,3-3 μm и диаметром 2-10nm [9 - Telford JL, Barocchi MA, Margarit I, Rappuoli R, Grandi G. Pili in gram-positive pathogens. Nat Rev Microbiol. -2006- T.4, №7-С. 509-519. doi: 10.1038/nrmicro1443. PMID: 16778837]. Это длинные белок-подобные полимеры, тянущиеся на поверхности бактерий, представляют собой субъединицы белка пилина, соединенные ковалентной связью. Они играют большую роль в адгезии колонизации хозяина. Пили являются высокоиммуногенными структурами, которые находятся под селективным давлением иммунных реакций хозяина [10 - Danne C, Dramsi S. Pili of gram-positive bacteria: roles in host colonization. Res Microbiol. 2012 Nov-Dec;163(9-10):645-58. doi: 10.1016/j.resmic.2012.10.012. Epub 2012 Oct 29. PMID: 23116627]. Принцип модификации пилей энтерококков вакцинными антигенами является приоритетным подходом при создании эффективных живых вакцин благодаря экспозиции целевого антигена на поверхности энтерококка.
Enterococcus faecium
Еnterococcus faecium
Streptococcus pneumonie
Известен способ создания живой вакцины за счет введения генов патогенных стрептококков в хромосомную ДНК пробиотического штамма  L3 для экспрессии в пилях, и живая вакцины на основе модифицированного штамма пробиотиков  L3 для профилактики инфекции, вызванной  [11 - Суворов А.Н., Гупалова Т.В., Кулешевич Е.В., Леонтьева Г.Ф., Крамская Т.А, Патент РФ№ 2701733], который принят в качестве прототипа.
Enterococcus faecium
Streptococcus pneumonie
pspf.
Недостатком известного способа [11]является сложность конструирования такой вакцины за счет большого количества стадий необходимых для создания суммарного фрагмента ДНК, состоящего из двух отдельных фрагментов гена пробиотика L3 и химерного гена -
Streptococcus pneumoniae
pspf
Streptococcus pneumoniae
Указанный недостаток устраняется в заявленном способе создания живой вакцины за счет замены химерного гена -на фрагмент гена covid-19 методом клонирования, что сокращает получение вакцины в отличие от прототипа, а также позволяет создавать любые другие вакцинные кандидаты на этой платформе. Существенно, что созданный вакцинный кандидат в отличие от вакцины-прототипа, предназначен для обеспечения специфической профилактики заболеваний, вызванных вирусом SARS-Cov-2, а не .
Техническим результатом изобретения является значительное упрощение способа получения живой вакцины против коронавирусной инфекции.
Enterococcus faecium
Enterococcus faecium
pentF-covid
pentF-pspf (по патенту
РФ №2701733)
pspf
pentF-covid-19
SEQ ID No:1
Указанный технический результат достигается тем, что в способе  создания живой вакцины  против коронавирусной инфекции COVID-19 на основе пробиотического штамма  L3 (по патенту РФ №2220199), модифицированного в результате электропорации культуры энтерококков штамма  L3 рекомбинантной плазмидной ДНК -19,  содержащей последовательность в соответствии с заявленным изобретением,  для создания SEQ ID No:1в плазмиде , участок былзаменен на фрагмент гена шиповидного белка SARS-CoV-2, при этом ДНК  кодирует  аминокислотную последовательность SEQ ID No:2, которая выполняет функцию шиповидного белка вируса SARS-CoV-2, способного  осуществлять стимуляцию гуморального и клеточного иммунитета в отношении  вируса SARS-CoV-2 .При этом задача генетической части работы состояла в осуществлении интеграции участка ДНК вируса в структуру гена поверхностного белка пробиотика без нарушения открытой рамки считывания и повреждения участков кодирования компонентов, участвующих в процессинге поверхностного белка PilF.
Кроме того, указанный технический результат  достигается тем, что живая вакцина Enterococcus faecium L3-pentF-covid-19, в которой штамм Enterococcus faecium экспрессирует ген слитого белка, способного индуцировать образование антител, причем образующиеся специфические антитела классов А и G в отношении инфекции, в соответствии с заявленным изобретением,  в плазмидную ДНК вводят фрагмент гена, кодирующего шиповидный белок вируса SARS-CoV-2, способного  осуществлять стимуляцию гуморального и клеточного иммунитета в отношении  вируса SARS-CoV-2, т.е созданием  живой вакцины против коронавируса SARS-CoV-2, обладающей выраженным иммуногенным  эффектом.
Еnterococcus faecium
pspf,
Streptococcus pneumoniae.
Еnterococcus faecium
pentF-pspf
Enterococcus faecium
В известном способе, использованном в качестве прототипа[11], на основе штамма пробиотика  L3 была сконструирована генно-инженерная живая вакцина со встроенным в хромосому, в области, кодирующей ген пилей, участком химерного гена сконструированного на основе генов патогенности Штамм  L3-PSPF+ был получен в результате трансформации плазмидой  штамма L3.
Еnterococcus faecium
Интраназальное введение вакцины  L3-PSPF+ стимулировало развитие специфического системного и местного иммунного ответа. На модели интраназальной летальной пневмококковой инфекции у мышей линии СВА было показано, что трехкратная интраназальная вакцинация созданной живой пробиотической вакциной повышала защиту от летальной пневмококковой инфекции.
Еnterococcus faecium
pentF-pspf
pspf
При реализации заявленного способа создания живой вакцины на основе пробиотического штамма  L3 был использован синтезированный фрагмент ДНК шиповидного белка коронавируса, который был смоделирован авторами патента, а затем синтезирован компанией Евроген. При этом в плазмиде  участок гена    был заменен на фрагмент гена шиповидного белка.
живой вакцины против коронавируса SARS-CoV-2,
Еnterococcus faecium
В итоге реализации этого способа достигается решение конечной технической задачи заявленного изобретения, заключающееся в создании  обладающей выраженными иммуногенными  свойствам, на основе биологически активного штамма  L3 за счет замещения в структуре участкаего гена пилей на участок гена корановируса SARS-CoV-2. Создание такой вакцины против инфекции, вызываемой корановирусом, основано на введении участка ДНК, кодирующего антигенный фрагмент иммуногенных эпитопов вируса SARS-CoV-2, в структуру гена пилей пробиотика.
covid
19
Еnterococcus faecium
Реализация указанной технической задачи поясняется конкретными примерами введения гена - коронавируса в хромосомную ДНК в области, кодирующей ген пилей, пробиотического штамма L3 для экспрессии в пилях иммуногенного участка шиповидного белка SARS-CoV-2:
entF-covid
19
а) получение слитого гена - и его клонирование
б) выявление бактериальных клонов, содержащих ген слитого белка COVID-19+ в хромосоме
в) пероральная вакцинация мышей живой пробиотической вакциной
г) определение COVID19+-специфических антител в крови и вагинальных смывах.
д) выявление клеточного звена специфического иммунного ответа на пероральную вакцинацию живой противовирусной вакциной.
Технической сущностью предлагаемого изобретения является создание живой вакцины против коронавируса SARS-CoV-2, обладающей выраженными иммуногенными свойствами.
Еnterococcus faecium
Пероральное введение вакцины  L3 с геном вируса SARS-CoV-2 стимулировало развитие специфического системного и местного иммунного ответа. На модели интраназальной летальной коронавирусной инфекции у мышей было показано, что трехкратная пероральная вакцинация созданной живой пробиотической вакциной повышала защиту от летальной коронавирусной инфекции.
Еnterococcus faecium
Конструирование живой вакцины на основе биологически активного пробиотического штамма  L3 за счет включения в его пили антигена SARS-CoV-2 позволило объединить в одном препарате эффективность полезных свойств пробиотика и специфического антигенного стимула.
entF-covid
19
Для получения слитого гена - и его клонирования были сконструированы ДНК праймеры, представленные в таблице «Олигонуклеотидные праймеры», в которой в графе 1 приведены 8 названий. праймеров;  в графе 2 приведена их ориентация по отношению к положительной цепочке ДНК.; а  в графе 3 приведены  нуклеотидные последовательности, которые были сконструированы в соответствии с направлением цепочки ДНК последовательность от 5' к 3'.
Олигонуклеотидные праймеры
Таблица
Название
Ориентация
Нуклеотидная последовательность от 5' к 3'
1
2
3
E1
прямой
TGATATGGTATCGGATGGGAAА
E2
обратный
TCAGTTGAATTTCTCGTCCATC
A1
прямой
GCTCTAGAGCCGATGAGAGCAGCTGGTATTG
D1
обратный
CAACAGGATCCAAAGCATCGTTGG
K1
прямой
TTG<b><u>CATATG</u></b>GGTTTCCAACCCACT
обратный
GTA<b><u>GAATTC</u></b>GTTGTTACATGTTCA
B1
прямой
TGAGTGAACCACAGCCAGAA
Seq F
прямой
GGACACCACAACCATCGAAG
Нуклеотидные последовательности в графе 3 с названиями К1 и К2 (в графе 1),  с участками, выделенными подчеркиванием, указывают на соответствующие им сайты гидролиза рестрикционными эндонуклеазами.
covid
19
covid
19
Фрагмент гена - был синтезирован с последующим клонированием в векторную плазмидную ДНК pAL2-T, фирмой Евроген. Для удобства последующего клонирования сайты рестрикции для NdEI и EcoRI были вставлены во фрагмент гена - при его синтезе.
pentF-pspf
Enterococcus faecium
pspf,
pentF-pspf
pspf
covid
19
pentF-psp
pspf
covid
19.
Рекомбинантная плазмидная ДНК , представляющая собой плазмидную ДНК, полученную в результате вставки суммарного фрагмента ДНК, состоящего из двух отдельных фрагментов гена пробиотика L3 и фрагмента гена  описанная в прототипе [11-патент РФ 2701733], была использована для заявляемой конструкции. Из плазмидной ДНК  была удалена  вставка  гена пневмококка  и заменена на вставку гена -. Для этого плазмидную ДНК   гидролизовали ферментами NdEI и EcoRI, сайты для которых ограничивают последовательность гена  (Фиг.1). Такие же сайты рестрикции были заложены в синтезированный фрагмент гена - Полученный верхний фрагмент после гидролиза был использован для дальнейшего клонирования.
covid
19,
pentF-pspf.
E.coli
Плазмидная ДНК pAL2-T, содержащая фрагмент гена - была гидролизована ферментами NdEI и EcoRI. Клонирование рестрицированного фрагмента, кодирующего COVID-19, осуществлялся  использованием  верхнего  фрагмента после гидролиза плазмиды  Продукты рестрикции разделялись с помощью электрофореза в 1% агарозном геле. ДНК рестрикты выделялись из агарозы с помощью набора «QIAquick Gel Extraction Kit» (Qiagen, USA), которые затем лигировали и трансформировали в гетерологичную систему  DH5α. Среда для отбора содержала 500 мкг/мл эритромицина. В результате трансформации был получен один клон. Из этого клона была выделена плазмидная ДНК.  Наличие вставки подтверждалось гидролизом плазмиды ферментами NdEI и EcoRI (Фиг.2).
Продукты ПЦР плазмидной ДНК, полученные с праймерами K1 и K2,и SeqF и K2 были просеквенированы. Результаты сиквенса показали правильность последовательности плазмидной ДНК, которая содержала нужные фрагмнты ДНК энтерококка и ДНК коронавируса (перечень последовательностей SEQIDNo:1).
ent
-covid
19
В результате клонирования были получена плазмида pF- спрогнозируемой вставкой и геном устойчивости к эритромицину.
В результате электропорации энтерококков созданной интегративной плазмидой было получено 14 трансформантов. Они были проверены в реакции ПЦР с праймерами K1 и K2.  Для этого из трансформантов выделяли ДНК, используя набор ДНК-экспресс (Литех, Россия). Положительный ответ дали 13трансформантов, все кроме 12. (Фиг3, верхний ряд)
pentF-covid
19
pentF-covid
19
covid
19
(
pentF-covid
19
Для определения интеграции плазмидной ДНК - в хромосомную ДНК энтерококка была проведена амплификация ДНК, выделенных из 13 клонов с праймерами B1 и K2. Интеграция плазмидной ДНК - в хромосомную ДНК энтерококка была обнаружена только у двух трансформантов (Фиг3, дорожки 22 и 23,нижний ряд). Секвенирование ДНК, выделенной из одного из положительных клонов, обозначенного, как COVID 19+,было проведено с праймерами, соответствующими последовательности гена -праймер K2) и последовательности хромосомной ДНК энтерококков (праймер B1) для подтверждения интеграции плазмидной ДНК - в хромосомную ДНК энтерококка (перечень последовательностей SEQIDNo:1).
pentF-covid
19.
На Фиг.4 показан результат после проведения ПЦР с ДНК клона COVID 19+ с разными парами праймеров. На Фиг. 4 приведены результаты ПЦР с хромосомной ДНК энтерококка и плазмидной ДНК -
Клон COVID 19+, экспрессирующий ген COVID-19 белка, был выбран в качестве вакцинного препарата для дальнейшего исследования.
Ниже приведены конкретные примеры, подтверждающие экспериментально проведение стадий получения живой вакцины против коронавирусной инфекции
Пример 1.
Синтез фрагмента ДНК коронавируса и его клонирование в плазмидный вектор pAL2-T
covid
19
Синтез фрагмента ДНК коронавируса и его клонирование в плазмидный вектор pAL2-T было проведено фирмой Евроген. Для удобства последующего клонирования сайты рестрикции для NdEI и EcoRI были вставлены во фрагмент гена - при его синтезе.
Пример 2.
Получение слитого гена
entF-covid
-
19
и его клонирование.
pentF-pspf
Enterococcus faecium
pspf,
entF-covid
19
pentF-psp f
pspf
pentF-pspf
Рекомбинантная плазмидная ДНК , представляющая собой плазмидную ДНК, полученную в результате вставки суммарного фрагмента ДНК, состоящего из двух отдельных фрагментов гена пробиотика L3 и фрагмента гена  описанная в прототипе [11- патент РФ 2701733], была использована для создания слитого гена -. Для этого из плазмидной ДНК  была вырезана  вставка  гена пневмококка , проведен гидролиз плазмидной ДНК  ферментами NdEI и EcoRI (Фиг.1). Полученный верхний фрагмент после гидролиза был использован для дальнейшего клонирования.
-pspf
На Фиг. 1 представлена электрофореграмма рестрицированной плазмидной ДНК pentF ферментами NdEI и EcoRI., где:
pentF-pspf
1 -  плазмида    - исходная
-pspf
2 -  плазмида pentF   рестрицированная
3 - 100 п.н. ДНК - маркер (сверху вниз: 3000, 2000, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200 и 100 нуклеотидных пар).
covid
19,
pentF-pspf.
E.coli
E.coli
Плазмидная ДНК pAL2-T, содержащая фрагмент гена -была гидролизована ферментами NdEI и EcoRI (Фиг.2). Клонирование рестрицированного фрагмента гена, кодирующего COVID-19, осуществлялось с  использованием верхнего фрагмента  после гидролиза плазмиды  Продукты гидролиза рестрикионными эндонуклеазами были разделены с помощью электрофореза в 1% агарозном геле. ДНК гидролизаты были выделены из агарозы с помощью набора «QIAquick Gel Extraction Kit» (Qiagen, USA), лигированы и трансформированы в гетерологичную систему  DH5α. Среда для отбора клонов  с плазмидой содержала 500 мкг/мл эритромицина. В результате трансформации был получен один клон. Из этого клона была выделена плазмидная ДНК. Наличие вставки подтверждалось гидролизом плазмиды ферментами NdEI и EcoRI (Фиг.2).
На Фиг. 2 представлена   электрофореграмма рестрицированных пазмид NdEI и EcoRI, где:
covid
19
1 - плазмидная ДНК pAL2-T, содержащая фрагмент гена -
ent
-covid
19
2 -  плазмидная ДНК pF-
3 - 100 п.н. ДНК - маркер (сверху вниз: 3000, 2000, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200 и 100 нуклеотидных пар).
Пример 3.
Трансформация  энтерококков методом электропорации.
Еnterococcus faecium
entF-covid
19
Для электропорации энтерококков культуру L3 сеяли в 3 мл бульона Tood-Hewitt (THB) («HiMedia», Индия) и выращивали в течение ночи при 37°С, затем пересевали в 50 мл бульона THB 1 мл ночной культуры и выращивали ее до оптической плотности при длине волны 650 нм 0.3. После этого культуру помещали в лед и затем отмывали трижды в 20 мл 10% глицерола при температуре 4°С, полученный осадок суспендировали в 0.5 мл стерильного раствора глицерола, переосаждали и конечный осадок ресуспендировали в 0.3 мл того же раствора, разлили по 50 мкл в пробирки и проводили электропорацию в кювете с расстоянием между электродами 1 мм при напряжении 2100 В.  Во льду к клеткам добавили ДНК (полученную интегративную плазмиду p- плазмиду, 300 нг). Оптимальная продолжительность импульса составила 4-5 миллисекунд. После проведения разряда тока в кювету добавляли 1 мл THB, инкубировали 1 час и высевали на чашки с селективной средой, которая содержала 10 мкг/мл эритромицина. Затем ожидали появления трансформантов через 24 часа.
В результате электропорации энтерококков, созданной интегративной плазмидой,  было получено 14 клоновтрансформантов. Они были проверены в реакции ПЦР с праймерами K1 и K2.  Для этого из трансформантов выделяли ДНК, используя набор ДНК-экспресс (Литех, Россия). Положительный ответ дали 13трансформантов (Фиг. 3, верхний ряд).
На Фиг. 3 в верхнем  ряду представлена электрофореграмма амплифицированных ДНК-фрагментов с праймерами К1 и К2.
1 – 14 – продукты ПЦР ДНК из полученных 14 клонов.
15 - 100 п.н. ДНК - маркер (сверху вниз: 3000, 2000, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200 и 100 нуклеотидных пар).
ent
-covid
19
16 – продукт ПЦР плазмидной ДНК pF-
17 - продукт ПЦР без добавления ДНК.
pentF- covid
19
pentF- covid
19
Была проведена амплификация ДНК, выделенных из  13 клонов для определения интеграции плазмидной ДНК - в хромосомную ДНК энтерококка с праймерами B1 и K2. Интеграция плазмидной ДНК - в хромосомную ДНК энтерококка была обнаружена только у двух трансформантов (Фиг. 3, нижний ряд).
На. Фиг. 3 в нижнем ряду представлена электрофореграмма амплифицированных ДНК-фрагментов с праймерами В1 и К2.
18 – 31 – продукты ПЦР ДНК из полученных 14 клонов.
32 - 100 п.н. ДНК - маркер (сверху вниз: 3000, 2000, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200 и 100 нуклеотидных пар).
33 - продукт ПЦР без добавления ДНК.
ых
ов
covid
19
(
pentF- covid
19
Секвенирование ДНК, выделенной из одного из положительн клон, обозначенного, как COVID 19+,было проведено с ДНКпраймерами, соответствующими последовательности гена -праймер K2) и последовательности хромосомной ДНК энтерококков (праймер B1) для подтверждения интеграции плазмидной ДНК - в хромосомную ДНК энтерококка (перечень последовательностей SEQ ID No: 1).
pentF- covid
19.
На Фиг. 4 показан результат, полученный  после проведения ПЦР сиспользованиемДНК клона COVID 19+ с разными парами праймеров. На Фиг. 4 приведены результаты ПЦР с хромосомной ДНК энтерококка и плазмидной ДНК -
На Фиг. 4 представлена электрофореграмма амплифицированных ДНК-фрагментов с разными парами праймеров, где:
1 – ДНКклона COVID 19+ с праймерами K1 и K2
2 - ДНКклона COVID 19+ с праймерами А1 и D2
3 – ДНКклона COVID 19+ с праймерами B1и K2
4 – ДНКклона COVID 19+ с праймерами K1 и E2
5 – ДНКклона COVID 19+ с праймерами E1 и K2
6 – ДНКклона COVID 19+ с праймерами E1 и E2
7 – ДНКклона COVID 19+ с праймерами seq F и K2
8 – ДНКклона COVID 19+ с праймерами B1 и E2
9 – ДНК L3 с праймерами B1 и E2
10 – ДНК L3 с праймерами E1 и E2
pentF- covid
19
11 – ДНК - с праймерами K1 и K2
pentF- covid
19
12 – ДНК - с праймерами seqF и K2
pentF- covid
19
13 – ДНК - с праймерами E1 и E2
14 - 100 п.н. ДНК - маркер (сверху вниз: 3000, 2000, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200 и 100 нуклеотидных пар).
Клон COVID 19+, экспрессирующий ген COVID-19белка, выбран в качестве вакцинного препарата для дальнейшего исследования.
Пример 4.
Пероральная вакцинация мышей живой пробиотической вакциной.
E.faecium
E.faecium
E.faecium,
Мышам, линии Balb/c (n=10),  самкам в возрасте 9-10 недель с помощью адаптера вводили перорально  L3 (n=10) и COVID 19+ (n=10). Курс вакцинации состоял из трех циклов иммунизации с интервалом в две недели. Каждый цикл включал трехкратное ежедневное введение 0,5 мл взвеси бактерий в дозе 109 КОЕ/мышь. Для вакцинации исходный и модифицированный варианты  культивировали в среде BL в течение 18 часов при 37°С в аэробных условиях.  модифицированный участком гена коронавируса, культивировали в присутствии эритромицина в концентрации 5 мкг/мл. Суспензию клеток отмывали дважды в ЗФФР и вводили мышам.
Пример 5.
Определение COVID-19+ - специфических антител в крови мышей и анализ специфических
цитотоксических лимфоцитов
(ЦТЛ).
Через две недели после окончания второго этапа иммунизации, то есть через шесть недель от начала иммунизации, у мышей забирали кровь для оценки уровня специфического гуморального иммунного ответа и получали селезенки для анализа специфических ЦТЛ.
Уровень специфических IgG и IgA определяли общепринятым методом ИФА. На дно 96-луночного планшета сорбировали рекомбинантный белок S (аналог вирусной вставки в энтерококк) в концентрации 0,5 мкг/мл в течение ночи при 4°С. Последовательные 4-кратные разведения сыворотки вносили в лунки в объеме 100 мкл и инкубировали 1 час при 37°С. Избыток антител отмывали ЗФФР с 0,5% Tween 20. Специфические антитела выявляли с помощью вторичных антител, конъюгированных с пероксидазой хрена. Для идентификации антител класса A использовали козий анти мышь –IgA-HRP конъюгат (Sigma), антител класса G - козий анти мышь–IgG-HRP конъюгат (Sigma). Раствор конъюгата вносили в объеме 100 мкл и инкубировали 1 час при 37°С. Планшеты отмывали четыре раза в ЗФФР с 0,5% Tween 20, связанный конъюгат выявляли в цветной реакции с ТМБ, интенсивность окраски оценивали при длине волны 450 нм.
Анализ сывороток показал, что в крови вакцинированных животных присутствовали антитела класса G, специфичные в отношении вирусного белка S, аналогичного вставке в энтерококк. Титры антител колебались в пределах 1: 400- 1:25600.
На Фиг. 5 представлено содержание иммуноглобулинов класса G в сыворотке мышей через 6 недель после начала вакцинации.
А – средние кривые титрования
На графике 1 - представлена кривая титрования сыворотки, полученной от мышей, получавших COVID 19+
E.faecium
На графике 2 представлена кривая титрования сыворотки, полученной от мышей, получавших штамм L3.
Б – средние титры специфического IgG
Столбец 1 – титр специфического IgG из сыворотки мышей, получавших COVID 19+
E.faecium
Столбец 2 - титр специфического IgG из сыворотки мышей, получавших L3
* - отличия между группами достоверны р≤0,05
Определение уровня специфических антител класса А позволило установить, что вакцинация приводит к появлению в сыворотке крови мышей специфических IgA в высоких титрах, значения колеблются в пределах 1: 10000- 1: 500000, что существенно превышает показатели для специфических IgG.
;
E.faecium
На Фиг. 6 представлено содержание иммуноглобулинов класса A в сыворотке мышей через 6 недель после начала вакцинации, где в столбце 1 представлены средние титры специфического IgA из сыворотки мышей, получавших COVID 19+встолбце 2 средний титр специфического IgA из сыворотки мышей, получавших  L3
* - отличия между группами достоверны р≤0,05.
Анализ клеточного звена специфического иммунного ответа на пероральную вакцинацию живой противовирусной вакциной проводили по оценке интенсивности индукции интерферона гамма после контакта суспензии клеток селезенки с S белком SARS-Cov-2.
2
Суспензии отдельных клеток селезенки иммунизированных мышей готовили путем протирания селезенок через сито BD Falcon (BD Biosciences, Бедфорд, США). Клетки отмывали средой RPMI-1640 (2000 об/мин, 5 мин) и ресуспендировали в полной среде RPMI-1640, содержащей 10 % фетальной телячьей сыворотки. Подсчет числа клеток и их жизнеспособность проводили, используя метод с 0.4% трипановым синим. Пул клеток от трех мышей, рассевали в 24-луночные планшеты в посевной дозе 105 клеток/мл в трех повторах. После этого клетки стимулировали рекомбинантным пептидом COVID 19+ в дозе 1-0,5-0,1 мкг/мл. После 6 дней культивирования при 37°С в атмосфере CO супернатанты собирали и содержание интерферона (IFN) -гамма определяли с помощью ИФА набора (Invitrogen, Waltham, Massachusetts, USA) в соответствии с инструкциями производителя.
На Фиг. 7 представлена концентрация внеклеточного ИФН-γ в супернатанте культуры клеток.
А - стимуляция рекомбинантным пептидом COVID 19+ в дозе 1 мкг/мл.
Столбец 1 – концентрация внеклеточного ИФН-γ в супернатанте культуры клеток мышей, получавших COVID 19+
Столбец 2 – концентрация внеклеточного ИФН-γ в супернатанте культуры клеток мышей, получавших L3
Столбец 3 - концентрация внеклеточного ИФН-γ в супернатанте культуры клеток интактных мышей
Б - стимуляция рекомбинантным пептидом COVID 19+ в дозе 0,1мкг/мл
Столбец 1 – концентрация внеклеточного ИФН-γ в супернатанте культуры клеток мышей, получавших COVID 19+
Столбец 2 – концентрация внеклеточного ИФН-γ в супернатанте культуры клеток мышей, получавших L3
Столбец 3 - концентрация внеклеточного ИФН-γ в супернатанте культуры клеток интактных мышей
В - концентрация внеклеточного ИФН-γ в супернатанте культуры клеток в отсутствие стимуляции рекомбинантным пептидом COVID 19+
Столбец 1 – концентрация внеклеточного ИФН-γ в супернатанте культуры клеток мышей, получавших COVID 19+
Столбец 2 – концентрация внеклеточного ИФН-γ в супернатанте культуры клеток мышей, получавших L3
Столбец 3 - концентрация внеклеточного ИФН-γ в супернатанте культуры клеток интактных мышей.
Полученные данные указывают на то, что на  6 день после внесения специфического антигена в суспензию спленоцитов мышей, вакцинированных живой пробиотической вакциной, в среде накапливается интерферон гамма в количестве, которое достоверно превышает аналогичный показатель для контрольных проб.   Последнее свидетельствует о том, что курс пероральной вакцинации живой пробиотической вакциной стимулирует цитотоксические лимфоциты Th1, которые координируют специфические клеточные реакции, в частности, активность, специфичную в отношении S белка вируса.
Как показывают результаты экспериментов, заявленное изобретение позволяет создать эффективную живую вакцину с профилактическим эффектом в отношении инфекции COVID-19.
Список используемых источников информации
1. Guo YR, Cao QD, Hong ZS, Tan YY, Chen SD, Jin HJ, Tan KS, Wang DY, Yan Y. The origin, transmission and clinical therapies on coronavirus disease 2019 (COVID-19) outbreak - an update on the status. Mil Med Res. 2020 Mar 13;7(1):11. doi: 10.1186/s40779-020-00240-0. PMID: 32169119; PMCID: PMC7068984.
2. Патент РФ №2220199 «Штамм энтерококков enterococcus faeciuml-3 для изготовления лечебно-профилактических средств и продуктов питания лечебно-профилактического назначения»; МПК: A23C 9/12, A61K 35/74 (патентообладатели и авторы: Алехина Г.Г. и Суворов А.Н.).
3. Гупалова Т.В. и др. «Создание и опыт применения живой вакцины на основе штамма пробиотика Enterococcus faecium L3 для профилактики вагинальной инфекции, вызванной Streptococcus agalactiae». Медицинский академический журнал, 2013.
4. Патент РФ №2640250 «Способ введения генов патогенных стрептококков в хромосомную днк пробиотического штамма Еnterococcus faecium l3 для экспрессии в пилях», МПК: A61K39/092; (авторы Суворов А.Н. и др.).
5. Yermolenko E., Suvorov A., Chernush A., et al. International Congress Series, 1289: 363-366; 2006.
6. Tarasova E., Yermolenko E., Donets V. et al. Beneficial Microbs, 1: 265-270, (2010).
7. Suvorov A., Simanenkov V., Gromova L. et al. Prebiotics and probiotics potencial for human health, 104-112, (2011).
8. Суворов А., Алехина Г.Г., Пигаревский П.В. и др. Гастробюллетень, 4: 29-31, (2001).
9. Telford JL, Barocchi MA, Margarit I et al. Nature Reviews Microbiology 4: 509-519, (2006).
10. Camille Danne, Shaynoor Dramsi. Research in Microbiology, 163: 645-658, (2012).
11. Патент РФ  № 2701733 (Авторы – Суворов А.Н., Гупалова Т.В., Кулешевич Е.В., Леонтьева Г.Ф., Крамская Т.А.) - прототип.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>
<120> Способ создания живой вакцины против коронавирусной инфекции COVID-19
Enterococcus faecium L3
на основе пробиотического штамма  и живая вакцина
Enterococcus faecium L3
-pentF-covid-19
<140>
<141>
<150>
<151>
1
<160>
<170>
1
<210>
<211> 1599
<212> Нуклеотидная последовательность
<213> Искусственная последовательность
<220>
19
<223> Нуклеотидная последовательность гена covid- коронавируса COVID-19,
Escherichia coli
экспрессированная в системе
<400> 1
Atgagagcagctggtattgagttgaatgatacatttctatctatttacagtttaaatgga          60
cagtatcagcaacgtgtgtcttggtataatgacaataatgaatctgtcggtgaacgtaat         120
attgatatgagagaatttgttgggtatgaaaaaatgggtagcttaccttattttgtcaca         180
acagatacagcatgtgcagaatacaaagctcctgcgttatcaacaaacaatttaacttca         240
aaagtagtgggaggacgtgcagaaaaggcttatagctcgaatgatcatttcaccgatgtt         300
gtaggagctgatacttatcacagaagtggtgtaacgtatacgcttcaaggcgcttcccca         360
acattcatgattggcgcaaatacgaatagtatgatgtttagctttgatactgcattgcta         420
tggacaccacaaccatcgaagcctacaaaagaagtgtttaacaaagctaatactgaagag         480
gcagcacacaatattgacaaaaaagtgattccacaaggatcagatgtttactatcatatt         540
catcaaaagtttgatgcattaacagtcaacacaatgaacaaatacaaatcatttaaaatc         600
actgatacctttgacagcaaaaattttgatatggtatcggatgggaaaaactatgatggc         660
gcattgcatatgggtttccaacccactaatggtgttggttaccaaccatacagagtagta         720
gtactttcttttgaacttctacatgcaccagcaactgtttgtggacctaaaaagtctact         780
aatttggttaaaaacaaatgtgtcaatttcaacttcaatggtttaacaggcacaggtgtt         840
cttactgagtctaacaaaaagtttctgcctttccaacaatttggcagagacattgctgac         900
actactgatgctgtccgtgatccacagacacttgagattcttgacattacaccatgttct         960
tttggtggtgtcagtgttataacaccaggaacaaatacttctaaccaggttgctgttctt        1020
tatcaggatgttaactgcacagaagtccctgttgctattcatgcagatcaacttactcct        1080
acttggcgtgtttattctacaggttctaatgtttttcaaacacgtgcaggctgtttaata        1140
ggggctgaacatgtcaacaacgaattctacgaaaaaaacctgaaagaatacaccgacaag        1200
ctggataaactcgagaaaggttctgcgcgagtgatagatatgagtacaggaaaagatatt        1260
acttcagaaggtacactaacctatgatagcaatttaagaacgctgaaatgggaagcttcc        1320
gctgatttcttaagtaaaaatcttttagatggacgagaaattcaactgatatttacagct        1380
aaaactccactacagtcagaaaaaaatattgataaccaagccgtagcagcagtagagaat        1440
gtttctaataaaacgaatgttgtaacaattggtgttgatcctaacttaccacaagtcatt        1500
gttcctagaacaggttctacacatttagtaacaattttagtggttagcttagtattactt        1560
gtgttagctactcttagttatgtggctctgaagttcaat                             1599
2
<210>
533
<211>
<212> Аминокислотная последовательность
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Аминокислотная последовательность
2
<400>
MetArgAlaAlaGlyIleGluLeuAsnAspThrPheLeuSerIleTyr
5             10             15
SerLeuAsnGlyGlnTyrGlnGlnArgValSerTrpTyrAsnAspAsn
20             25             30
AsnGluSerValGlyGluArgAsnIleAspMetArgGluPheValGly
35             40             45
TyrGluLysMetGlySerLeuProTyrPheValThrThrAspThrAla
50             55             60
CysAlaGluTyrLysAlaProAlaLeuSerThrAsnAsnLeuThrSer
65             70             75             80
LysValValGlyGlyArgAlaGluLysAlaTyrSerSerAsnAspHis
85             90             95
PheThrAspValValGlyAlaAspThrTyrHisArgSerGlyValThr
100            105            110
TyrThrLeuGlnGlyAlaSerProThrPheMetIleGlyAlaAsnThr
115            120            125
AsnSerMetMetPheSerPheAspThrAlaLeuLeuTrpThrProGln
130            135            140
ProSerLysProThrLysGluValPheAsnLysAlaAsnThrGluGlu
145            150            155            160
AlaAlaHisAsnIleAspLysLysValIleProGlnGlySerAspVal
165            170            175
TyrTyrHisIleHisGlnLysPheAspAlaLeuThrValAsnThrMet
180            185            190
AsnLysTyrLysSerPheLysIleThrAspThrPheAspSerLysAsn
195            200            205
PheAspMetValSerAspGlyLysAsnTyrAspGlyAlaLeuHisMet
210            215            220
GlyPheGlnProThrAsnGlyValGlyTyrGlnProTyrArgValVal
225            230            235            240
ValLeuSerPheGluLeuLeuHisAlaProAlaThrValCysGlyPro
245            250            255
LysLysSerThrAsnLeuValLysAsnLysCysValAsnPheAsnPhe
260            265            270
AsnGlyLeuThrGlyThrGlyValLeuThrGluSerAsnLysLysPhe
275            280            285
LeuProPheGlnGlnPheGlyArgAspIleAlaAspThrThrAspAla
290            295            300
ValArgAspProGlnThrLeuGluIleLeuAspIleThrProCysSer
305            310            315            320
PheGlyGlyValSerValIleThrProGlyThrAsnThrSerAsnGln
325            330            335
ValAlaValLeuTyrGlnAspValAsnCysThrGluValProValAla
340            345            350
IleHisAlaAspGlnLeuThrProThrTrpArgValTyrSerThrGly
355            360            365
SerAsnValPheGlnThrArgAlaGlyCysLeuIleGlyAlaGluHis
370            375            380
ValAsnAsnGluPheTyrGluLysAsnLeuLysGluTyrThrAspLys
385            390            395            400
LeuAspLysLeuGluLysGlySerAlaArgValIleAspMetSerThr
405            410            415
GlyLysAspIleThrSerGluGlyThrLeuThrTyrAspSerAsnLeu
420            425            430
ArgThrLeuLysTrpGluAlaSerAlaAspPheLeuSerLysAsnLeu
435            440            445
LeuAspGlyArgGluIleGlnLeuIlePheThrAlaLysThrProLeu
450            455            460
GlnSerGluLysAsnIleAspAsnGlnAlaValAlaAlaValGluAsn
465            470            475            480
ValSerAsnLysThrAsnValValThrIleGlyValAspProAsnLeu
485            490            495
ProGlnValIleValProArgThrGlySerThrHisLeuValThrIle
500            505            510
LeuValValSerLeuValLeuLeuValLeuAlaThrLeuSerTyrVal
515            520            525
AlaLeuLysPheAsn
530            533
<---