Разработка технологии производства симбиотического препарата Пролизэр на основе Escherichia coli VL-613. Часть 2. Оптимизация условий сохранения жизнеспособности Escherichia coli VL-613 в симбиотическом препарате Пролизэр

И. В. Павленко, А. Я. Самуйленко, В. И. Еремец,

А. А. Нежута, З. А. Канарская, А. В. Канарский

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПРОИЗВОДСТВА СИМБИОТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА ПРОЛИЗЭР

НА ОСНОВЕ Escherichia coli VL-613. ЧАСТЬ 2.

ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ СОХРАНЕНИЯ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ Escherichia coli VL-613

В СИМБИОТИЧЕСКОМ ПРЕПАРАТЕ ПРОЛИЗЭР

Ключевые слова: биомасса Escherichia coli VL-613, концентрирование, защитные среды, сушка, симбиотический препарат.

Оптимизированы условия сохранения жизнеспособности Escherichia coli VL-613 в симбиотическом препарате Пролизэр. Разработана технология производства симбиотического препарата Пролизэр, продуцирующего лизин в организме животных.

Keywords: strain Escherichia coli VL-613 concentration, the protective medium, drying, symbiotic formulation.

Optimized the conditions for preserving the viability of the strain Escherichia coli VL-613 in a symbiotic preparation Prolizer. The technology of production of symbiotic drug Prolizer, producing lysine in animals.

Актуальность. Технология изготовления сухих живых бактериальных препаратов -многоцелевая проблема, одной из ключевых

направлений которой является разработка

современных процессов концентрирования микроорганизмов, позволяющая увеличить выход конечного продукта и получить эффективные биопрепараты.

Для получения концентрированной микробной биомассы используют различные методы: флотацию, сепарирования, фильтрацию, экстракцию, ионный обмен, адсорбцию,

кристаллизацию, мембранные методы и др. Как правило, технология выделения и очистки продукта включает несколько стадий [1, 2, 3, 4].

Сушка - один из самых распространенных технологических процессов, используемый в биотехнологической промышленности. Как правило, сушка является завершающим этапом технологического процесса получения целевого продукта.

В промышленной технологии производства биологических препаратов сушка, как завершающий этап, существенным образом сказывается на качестве выпускаемой продукции (сухие экстракты, ферменты, витамины, антибиотики, вакцины и др.) [5, 6, 7]. Особое значение для ветеринарной практики имеет высушивание живых микробных вакцин, позволяющее длительно сохранять иммуногенные свойства этих препаратов. Совершенствованием оборудования и оптимизацией технологических режимов сублимационного высушивания нельзя добиться полного успеха без оптимизации состава питательных сред, условий культивирования, состава защитных сред и т.п. [8, 9, 10]. В этой связи всесторонний подход к оптимизации условий сохранения

жизнеспособности микроорганизмов, используемых для получения симбиотических препаратов весьма актуален.

Цель работы - оптимизация условий сохранения жизнеспособности Escherichia coli VL-613 в симбиотическом препарате Пролизэр.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

- определение влияния продолжительности хранения культуры перед концентрированием на сохранение жизнеспособности Escherichia rnli VL-613 в препарате Пролизэр;

- оптимизация состава защитной среды

высушивания Escherichia rnli VL-613,

используемого при изготовлении симбиотического препарата Пролизэр.

Определение влияния продолжительности хранения культуры перед концентрированием на сохранение жизнеспособности E. rnli VL-613 в препарате Пролизэр. Для решения этой задачи были изготовлены опытные серии препаратов в трех повторностях. Для каждой повторности технология культивирования, концентрирования, сушки и

защитная среда

была одинаковая.

Серии препарата готовили по следующей

схеме:

1 - бактериальную культуру сразу концентрировали;

2 - бактериальную культуру

концентрировали через один час после культивирования;

3 - бактериальную культуру

концентрировали через полтора часа после культивирования.

В экспериментах определялось количество жизнеспособных эшерихий в изготовленных препаратах при их хранении до 12 месяцев.

В таблице 1 представлены данные по сохраняемости жизнеспособных эшерихий от времени начала концентрирования бактериальной культуры после культивирования.

Таблица 1 - Зависимость жизнеспособности E. coli VL-613 в препарате от продолжительности хранении культуры перед центрифугированием

Повторность приготовления препарата Продолжительность хранения после культивирования до концентрирования, ч. Количество жизнеспособных эшерихий после сушки, млрд/см3 Количество жизнеспособных эшерихий (млрд/см3) при продолжительности хранения, месяцев

1 2 3 6 12

0 5,61 5,52 5,47 5,23 5,06 4,82

1 1,0 5,49 5,32 5,28 5,01 4,87 4,67

1,5 5,52 4,24 3,26 2,07 2,01 1,92

0 10,20 10,10 10,15 9,95 9,72 9,63

2 1,0 10,39 10,29 10,21 10,20 9,81 9,54

1,5 10,18 9,56 7,89 7,02 6,89 6,47

0 8,31 8,40 8,30 8,30 8,12 8,01

3 1,0 8,30 8,26 8,22 8,16 8,02 7,89

1,5 8,19 8,00 6,89 5,24 4,98 4,73

Представленные результаты позволяют сделать вывод о зависимости сохраняемости жизнеспособных эшерихий при хранении препаратов от продолжительности хранения перед центрифугированием. В частности, хранение бактериальной массы перед центрифугированием 1,5 часа приводит к снижению концентрации жизнеспосбных эшерихий в препарате при длительном его хранении в 1,57 - 2,9 раза.

Оптимизация состава защитной среды высушивания E. соН VL-613, используемого при изготовлении симбиотического препарата Пролизэр. Известны различные защитные среды для сохранения максимального количества живых бактерий рода Escherichia после лиофильного высушивания.

На начальном этапе разработки защитной среды E. coli VL-613 были выбраны семь сред:

1. сыворотка крови КРС + 75 %;

мясная вода с 5 % сахарозы 25 %;

2. декстран (1 % раствор) + 75 %;

мясная вода с 5 % сахарозы 25 %;

3. обезжиренное молоко (обрат) 100 %;

4. обезжиренное молоко (обрат) с 7 % сахарозы 100 %;

5. обезжиренное молоко (обрат) + 50 %;

сыворотка крови КРС 50 %;

6. СЖС на КФБ, ее состав:

- сахароза - 8 - 12 %;

- желатин - 0,4 - 0,6 %;

- тиомочевина - 0,4 - 0,6 %;

- калий фосфорнокислый двузамещенный - 0,4 - 0,6

%;

- калий фосфорнокислый однозамещенный - 0,14 -

0,2 %.

7. СЖС на КФБ ее состав:

- желатин - 1,5 %;

- сахароза - 5,0 %;

- декстран - 3,0 %.

Предварительные исследования по разработке защитной среды для эшерихий проводили в культуре, полученной во флаконах с перемешиванием на шуттель-аппарате, для концентрирования бактериальной культуры использовали лабораторные центрифуги К-70Д и S-60.

Результаты исследований были переведены в относительные единицы для того, чтобы достоверность выводов не зависела от начальной концентрации эшерихий после сублимационной сушки.

За относительную единицу была выбрана концентрация живых микроорганизмов при длительном хранении относительно концентрации эшерихий после сушки, принятой за 100 %, по месяцам хранения.

В таблице 2 представлены результаты экспериментов, отражающие зависимость жизнеспособности E. coli VL-613 от состава защитной среды, лиофильного высушивания и продолжительности хранения.

Таблица 2 - Зависимость жизнеспособности E. coli VL-613 от состава защитной среды, лиофильного высушивания и

продолжительности хранения

№ защитной среды* Количество живых м.к. до сушки, млрд./см3 Количество живых м.к. после сушки, млрд./см3 / % Количество живых м. к. млрд. см3 / %, при хранении в течение, месяцев

1,0 2,0 4,0

1 12,9 0,3 / 100 0,23 / 76,7 0,03 / 13,0 0 / 0

2 38,3 6,7 / 100 6,1 / 91,0 5,9 / 88,1 5,2 / 77,6

3 21,0 0,2 / 100 0,15 / 75,0 0,06 / 3,0 0 / 0

4 24,2 9,9 / 100 6,7 / 67,7 4,2 / 42,4 3,1 / 31,3

5 17,8 0,06 / 100 0,01 / 16,7 0 / 0 0 / 0

6 33,0 9,9 / 100 6,8 / 68,7 5,7 / 57,6 4,6 / 46,5

7 29,0 15,7 / 100 10,9 / 69,4 10,2 / 65,0 9,5 / 60,5

* Состав указан выше

Из представленных таблицы 2 результатов следует, что лучшими защитными свойствами для эшерихий обладает среда № 7- СЖС на КФБ с соотношением компонентов:

- желатина - 1,5 %;

- сахарозы - 5,0 %;

- декстрана - 3,0 %.

Для решения задачи по оптимизации защитной среды для эшерихий использовали план полного факторного эксперимента (ПФЭ) типа 24.

Критерием оптимизации «У» для нахождения оптимальной по составу защитной среды при сушке эшерихий выбрана концентрация живых микроорганизмов после сушки относительно концентрации эшерихий до сушки, принятой за 100%.

Критерием оптимизации «У1» для нахождения оптимальной защитной среды при длительном хранении выбрана концентрация живых микроорганизмов при длительном хранении относительно концентрации эшерихий после сушки, принятой за 100 %, где 1 - месяц хранения.

Критерий оптимизации выбрали в относительных единицах для того, чтобы результаты не зависели от начальной концентрации эшерихий в препарате после сублимационной сушки.

По данным предварительных опытов выбраны следующие факторы защитной среды для сублимационной сушки эшерихий:

Х1 - концентрация желатина;

Х2 - концентрация сахарозы;

Х3 - концентрация декстрана;

Х4 - вода или калий-фосфатный буфер

(КФБ).

В таблице 3 представлен план ПФЭ 24.

Таблица 3 - План ПФЭ 24 в кодированной и натуральной размерностях

№ опыта Ко ра ф дированна я змерность акторов Натуральная размерность факторов

Х1 Х2 Х3 Х, Желатин, % Сахароза, % Декстран, % Вода или КФБ

1 - - - - 1,0 5,0 0 Вода

2 - + - - 1,0 10,0 0 Вода

3 + - - - 2,0 5,0 0 Вода

4 + + - - 2,0 10,0 0 Вода

5 - - + - 1,0 5,0 3 Вода

6 - + + - 1,0 10,0 3 Вода

7 + - + - 2,0 5,0 3 Вода

8 + + + - 2,0 10,0 3 Вода

9 - - - + 1,0 5,0 0 КФБ

10 - + - + 1,0 10,0 0 КФБ

11 + - - + 2,0 5,0 0 КФБ

12 + + - + 2,0 10,0 0 КФБ

13 - - + + 1,0 5,0 3 КФБ

14 - + + + 1,0 10,0 3 КФБ

15 + - + + 2,0 5,0 3 КФБ

16 + + + + 2,0 10,0 3 КФБ

Хпі 1,5 7,5 1,5 КФБ

ДХ1 0,5 2,5 1,5 Вода/КФБ

В таблице 4 представлены

экспериментальные данные по сохраняемости жизнеспособных эшерихий на составах защитных средах, согласно плану ПФЭ 24, при сушке.

После реализации экспериментов по плану ПФЭ и статистической обработке данных, получили уравнения регрессии (1), показывающие

зависимость сохраняемости жизнеспособных эшерихий от концентрации основных компонентов защитной среды при сушке.

По формулам рассчитывали построчные оценки дисперсии, дисперсию воспроизводимости единичного результата, дисперсию

воспроизводимости среднего результата в каждой строке, дисперсию среднего для каждого коэффициента регрессии и доверительную ошибку коэффициентов.

Коэффициенты уравнения регрессии рассчитывали по формулам.

Если | Ъ] > е (ЬО, то оценка коэффициента Ъ значимо отличалась от нуля. В противном случае оценку коэффициента считали значимо не отличающейся от нуля, и ее приравнивали к нулю.

У=84,41+1,72Х1 +1,91Х2-2,22Хз + +1,24X4 + 1,58X2X4 + 2,46X1X2X4 --1,49X1X2X3 + 1,83X1X2X3X4

Уравнение регрессии (1) описывают сохраняемость жизнеспособных эшерихий при сушке.

На основании полученных данных с вероятностью q = 0,9 можно сделать вывод, что уравнения (1) адекватно описывают экспериментальные данные (Ррас. = 1,98 < Бтеор. = 2,18).

Выживаемость эшерихий повышается как при увеличении концентрации желатина, так и при увеличении концентрации сахарозы, и при использовании в качестве растворителя КФБ вместо воды, так как Хь Х2 и Х4 в уравнение (1) имеют положительные коэффициенты. При увеличении концентрации декстрана выживаемость эшерихий уменьшается, потому что Х3 в уравнении имеет знак «-».

Анализируя полученные данные по оптимизации состава защитной среды для сушки эшерихий, можно придти к выводу, что лучший опыт плана ПФЭ 24 № 12 (таблицы 4). Далее проведены эксперименты по оптимизации защитной среды при длительном хранении согласно плану ПФЭ 24 (таблицы 4). Количество жизнеспособных эшерихий при длительном хранении определялось через 1, 3,6,9 и 12 месяцев и рассчитывалось уравнение регрессии для каждого месяца хранения соответственно.

В таблице 4 представлены данные по сохраняемости жизнеспособных эшерихий на составах защитных сред по плану ДФЭ 24 при длительном хранении - с 1 по 12 месяц хранения.

После реализации экспериментов по плану ПФЭ и статистической обработке данных получили уравнения регрессии (2 - 6), показывающие

зависимость сохраняемости эшерихий от концентрации основных компонентов защитной среды после 1, 3, 6, 9, 12 месяцев хранения.

По формулам рассчитывали для указанных сроков хранения построчные оценки дисперсии, дисперсию воспроизводимости единичного результата, дисперсию воспроизводимости среднего результата в каждой строке, дисперсию среднего для каждого коэффициента регрессии и доверительную ошибку коэффициентов. Удаляем незначимые коэффициенты уравнений.

Таблица 4 - Сохраняемость жизнеспособных E. coli после сушки и хранения с 1 по 12 месяцев на составах защитных средах, согласно плану ПФЭ 24

Уср., млрд/см3 до сушки Уср., млрд/см3 после сушки 3 3м с лр S S с У 3 3м с лр S ,3 р с У 3 3м с лр S ю р с У 3 3м с лр S р с У 3 3м с /д лр 5 6 с У

10,33 8,50 7,50 7,00 5,67 5,17 4,83

9,33 7,50 6,17 5,50 5,00 4,83 4,83

9,83 9,00 7,33 6,50 6,17 6,00 5,83

8,00 7,00 6,00 5,50 5,45 5,33 5,17

8,33 6,00 4,00 3,00 2,50 2,33 2,00

7,67 6,67 6,00 4,83 4,50 4,00 3,83

9,17 7,83 7,00 6,17 6,17 6,00 5,83

10,33 8,17 7,17 5,83 5,33 5,17 5,00

9,17 7,67 5,17 4,33 4,00 3,83 3,17

7,83 7,17 5,33 3,83 3,33 3,00 2,83

9,67 8,00 6,67 6,17 6,00 5,83 5,50

12,83 12,00 11,50 10,83 10,50 10,00 9,33

9,00 7,50 6,83 6,00 5,17 4,83 4,83

6,75 5,50 3,83 3,33 3,17 2,83 2,67

10,33 8,17 6,67 6,50 5,67 5,67 5,50

10,17 9,17 8,17 7,83 7,50 7,42 7,33

(*) Результаты в строках соответствуют номеру опыта в таблице 3

Уравнения регрессий принимают вид:

У1=82,74+4,03Х1+1,59Х2+ +1,88Х1Х4++7,41Х2Х4+3,07Х1ХзХ4-

- 3,21X1X3X4+3,66X1X2X3X4

Уз=77,03+2,13Х1+2,47Х2+4,06Хз+4,64Х4--4,43X1X3+8,29X3X4-4,17X1X2X3--8,51X1X3X4+1,48X1X2X3X4 (3) y6=66,98+8,53X1+1,85X2+2,54X1X4+ +2,69X3X4-2,69X1X2X3+4,49X1X2X4-

-3,81X1X3X4+ +3,39X1X2X3X4

y9=63,82+9,83X1+1,36X2+2,50X1X4+

+2,94X3X4-2,15X1X2X3+4,48X1X2X4--3,35X1X3X4+2,89X1X2X3X4

У12=60,87+10,14X1+1,96X2+

+2,37X1X4+4,14X3X4+4,71X1X2X4--3,68X1X3X4 +3,54X1X2X3X4

Уравнения регрессии (2 - 6) описывают сохраняемость эшерихий при хранении через 1, 3, 6, 9 и 12 месяцев, соответственно. На основании полученных данных с вероятностью q = 0,9 можно сделать вывод, что уравнения (2 - 6) адекватно описывают экспериментальные данные (Ррас = 1,58; 2,12; 1,21; 1,08; 2,04 < Бтеор. = 2,15).

Это значит, что в указанных интервалах варьирования выживаемость эшерихий при хранении зависит от концентрации основных компонентов защитных сред в течение каждого месяца хранения:

Х1 - концентрация желатина;

Х2 - концентрация сахарозы;

Х3 -концентрация декстрана;

Х4 - КФБ.

Причем, выживаемость эшерихий

повышается при увеличении концентрации желатина, концентрации декстрана и сахарозы, и при использовании в качестве растворителя КФБ вместо воды, так как Х1, Х2, Х3 и Х4 в уравнениях (2 - 6) имеют положительные коэффициенты.

В уравнениях (2 - 6) значимыми являются эффекты межфакторного взаимодействия. Это означает, что опыты ПФЭ 24 поставлены в области факторного пространства с высокой кривизной поверхности отклика, т. е. вблизи оптимума.

Окончанием эксперимента по оптимизации состава защитной среды можем считать лучший опыт плана ПФЭ 24 № 12 (таблицы 3).

Наилучшей защитной средой высушивания является среда, в которой концентрация основных компонентов имеет следующие значения:

- желатин - 2,0 %;

- сахароза - 10,0 %;

- декстран - 0 %.

В качестве растворителя - калий фосфатный

буфер.

Выводы

Разработана модель основных

технологических этапов и технология

промышленного производства симбиотического препарата Пролизэр на основе E. coli VL-613. Применение разработанной модели технологии процесса получения и хранения симбиотического препарата при промышленном производстве:

- позволило в 1,8 раза повысить накопление E. coli VL-613 за счет лучших ростовых качеств разработанной питательной среды;

- разработанный управляемый режим культивирования E. coli VL-613 позволяет сократить

продолжительность культивирования с 8 - 24 часов до 4 - 6 часов;

- разработанная защитная среда высушивания позволяет увеличить сохраняемость жизнеспособных микроорганизмов при длительном хранении (12 месяцев) на 20 - 40 % по сравнению с использованием традиционной защитной среды высушивания.

Изготовленные опытно-промышленные

партии симбиотического препарата Пролизэр прошли успешные испытания, с положительным результатом, в птицеводческих и животноводческих хозяйствах [11, 12, 13, 14, 15, 16, 17].

Литература

1. В.М. Кантере. Теоретические основы технологии микробиологических производств. М.: Агропромиздат. 272 с. (1991).

2. И.В. Павленко. Ветеринария и кормление. М. № 6. С. 34

- 35 (2012).

3. H.A. Bardelmeijer, M. Ouwehand, J.H. Beijen, J.H.M. Schellens, O. Tellingen. J. Chromatogr. B. 763. P. 201. (2001).

4. L. Zhou, D. Tan, J. Theng. J. Chromatogr. B. 754. P. 20. (2001).

5. А.А. Нежута, Е.С. Сербис. Материалы Межд. научно-

практ. конф. «Научные основы производства

ветеринарных биологических препаратов». Щелково, С. 415 - 420. (2005).

6. А.Я. Самуйленко, А.А. Нежута, В.И. Еремец, Э.Ф. Токарик, Е.С. Сербис. Материалы Межд. научно-практ. конф. «Актуальные проблемы инфекционной патологии животных». Владимир. С. 379 - 383 (2003).

7. Е.С. Сербис, А.А. Нежута, В.И. Еремец, Т.А. Скотникова. Вестник РАСХН. М. № 4. С. 65 - 66 (2002).

8. А.А. Нежута, Э.Ф. Токарик, А.Я. Самуйленко Теоретические и практические основы технологии сублимационного высушивания биопрепаратов. Курск. Изд-во Курской гос. сельскохозяйственной академии. 240 с. (2002).

9. И.В. Павленко. Ветеринария и кормление. М. № 6. С. 34

- 35 (2012).

10. О.В. Провоторова, И.В. Павленко, Л.А. Неминущая, А.А. Нежута, А.Я. Самуйленко. Ветеринарный врач. Казань. № 1. С. 28 - 30 (2013).

11. Л. Эрнст, А. Самуйленко, Е. Школьников, В. Меньшенин, И. Павленко, А. Раевский, Е. Рахманина, И. Егоров, Е. Андрианова, И. Салеева. Птицеводство. М. №

4. С. 35-36 (2011).

12. И.В. Павленко, А. Гринь, В. Меньшенин, И. Егоров, И. Салеева, А. Иванов, Д. Ефимов. Птицеводство. М. № 6. С. 19-22 (2012).

13. А.Я. Самуйленко, Е.Э. Школьников, А.А. Раевский, И.В. Павленко, Л.В. Анисимова, Л.А. Коротеева. Материалы Межд. научно-практ. конф. посвященной 90-летию СибНИВИ - ВНИИБТЖ «Инфекционная патология животных». Омск. С. 220-223 (2011).

14. Cursino L. et al. Exoproducts of the Escherichia coli and in vivo //J.Appl. Microbiol. 100, № 4. Р. 821-829. (2006).

15. Weichselbaum E. Probiotics and health: A review of the evidence //Nutr.Bull. 34, № 4. Р. 340 - 373. (2009).

16. Скотникова Т.А., Неминущая Л.А., Еремец Н.К., Провоторова О.В., Бобровская И.В., Малышева М.А.,

З.А. Канарская. Вестник Каз. технол. ун. Т. 15. № 4. с. 82

- 87. (2012).

17. Неминущая Л.А., Скотникова Т.А., Титова Е.И., Провоторова О.В., Еремец Н.К., Бобровская И.В., З.А. Канарская. Вестник Каз. технол. ун. Т. 15. № 4.с. 69 -74. (2012).

© И. В. Павленко - канд. биол. наук, зав. экспериментально-производственной лаб. отдела бактерийных препаратов, ГНУ ВНИТИБП РАСХН РФ, polt65@yandex.ru; А. Я. Самуйленко - д-р ветер. наук, проф., академик РАСХН, академик НААН Украины, директор ГНУ ВНИТИБП РАСХН РФ, vnitibp@mail.ru; В. И. Еремец - д-р биол. наук, проф., зам. директора ГНУ ВНИТИБП РАСХН РФ, Ь^_74@ mail.ru; А. А. Нежута - д-р биол. наук, зав. отделом сушки изготовления биопрепаратов, ГНУ ВНИТИБП РАСХН РФ, vnitibp@mail.ru; З. А. Канарская - канд. тех. наук, доц. каф. пищевой биотехнологии КНИТУ, zosya_kanarskaya@mail.ru; А. В. Канарский - д-р техн. наук, проф. той же кафедры, alb46@mail.ru.